(57)【要約】  本発明は、表面に一般式（Ｉ）の残基を含む固体支持材料を含む吸着材であって、前記残基が、バルク状の固体支持材料自身の表面、または前記固体支持材料の表面上におけるポリマーフィルムの表面のいずれかの官能基に、共有単結合により付着している吸着材に関する。さらに、本発明は、好ましくはクロマトグラフィーの適用において、有機分子、特に薬理活性化合物を精製するための、本発明に従う前記吸着材の使用にも関する。【選択図】図１
2014534411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持材料を含む吸着材であって、表面に以下の一般式（Ｉ）の残基を含む吸着材：
【化１】
2014534411.tif 000007
ここで、前記残基は、個体支持材料がポリマーフィルムを含むか否かに応じて、バルク状の固体支持材料自身の表面、または前記固体支持材料の表面上のポリマーフィルムの表面、のいずれかの官能基に、式（Ｉ）の点線で表される共有単結合を介して付着している；
使用された記号及びパラメータは、以下の意味を有する；
Ｌは、共有単結合、又は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選ばれた２価のユニットを意味する。
Ｘは、１〜３０個の炭素原子を有する１価の直鎖状脂肪族炭化水素基、又は、３〜３０個の炭素原子を有する分枝鎖状若しくは環状炭化水素基を意味し、
ここで、
前記基における１つ以上のＣＨ2部分は、Ｏ、Ｓ、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−又は−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−に置換されていてもよく、
１つ以上の水素原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ又は−ＮＣに置換されていても良く、
前記基は２つの炭素原子間における二重結合を１つ以上含んでいてもよい。
【請求項２】
式（１）に従う残基が、前記固体支持材料の表面上にあるポリマーフィルムの表面の官能基に結合している、請求項１に記載の吸着材。
【請求項３】
Ｌが、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−である、請求項１又は２に記載の吸着材。
【請求項４】
Ｌが、−Ｃ（Ｏ）−である、請求項３に記載の吸着材。
【請求項５】
Ｘが、直鎖状又は分枝鎖状のアルキルである、請求項１乃至４の何れか１項に記載の吸着材。
【請求項６】
Ｘが直鎖状Ｃ1−Ｃ22−アルキルである、請求項５に記載の吸着材。
【請求項７】
Ｘが直鎖状Ｃ6−Ｃ15−アルキルである、請求項６に記載の吸着材。
【請求項８】
前記ポリマーのフィルムのポリマーは、共有結合により互いに架橋しているが前記固体支持材料の表面には共有結合によって結合されていない個々の鎖を含み、又は、それらにより構成されている、請求項１乃至７の何れか１項に記載の吸着材。
【請求項９】
前記ポリマーが、親水基を含むポリマーである請求項８記載の吸着材。
【請求項１０】
前記ポリマーが、ポリアミン、ポリビニルアミン、またはポリアミンを含むコポリマーもしくはポリマー混合物である、請求項９に記載の吸着材。
【請求項１１】
有機分子の精製のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の吸着材の使用。
【請求項１２】
前記有機分子が薬理活性化合物である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記有機分子が、親水性の部分及び疎水性の部分の両方を有している、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記有機分子が、エベロリムス、エベロリムスの誘導体、インスリン、インスリン及びびエンドトキシンの誘導体からなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面に一般式（Ｉ）の残基を含む固体支持材料を含む吸着材であって、前記残基が、バルク状の固体支持材料自身の表面、または前記固体支持材料の表面上におけるポリマーフィルムの表面のいずれかの官能基に、共有単結合により付着している吸着材に関する。さらに、本発明は、好ましくはクロマトグラフィーの適用において、有機分子、特に薬理活性化合物を精製するための本発明に従う前記吸着材の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、有機分子及び生体分子のためのクロマトグラフィー媒体は、以下の試料との相互作用様式のうち、１つ以上の可能な様式に従って分類されている。
−疎水性相互作用（逆相）
−親水性相互作用（順相）
−陽イオン交換
−陰イオン交換
−サイズ排除
−金属イオンキレート
【０００３】
新規な化学化合物が提供されると、植物抽出物または動物からの発見によるものであれ、または化学合成によるものであれ、新規なクロマトグラフィー材料の提供や、既知のクロマトグラフィー材料のさらなる発展、または単純でコスト効率の良い該化学化合物の新規精製方法の発見が常に求められる。すなわち、同じ要因によって必要とされる液体容積のスケールアップなしに大容量を扱うことのできる、新規な選択性の高いダウンストリーム精製技術が、常に求められている。
【０００４】
所定の分離問題に対する、上記クロマトグラフィー分類の従来における段階的な適用は、それに応じて生産物の純度の一歩ずつ着実な改善において反映されてきたが、各段階における生産物の損失にも反映され、該損失は最終的に著しく蓄積し、操作時間や商品コストについては言うまでもない。一連の逐次的クロマトグラフィー工程をただ１つに減少させることが数多く実証され得たことから、アフィニティークロマトグラフィーを早い段階でダウンストリームプロセスへ導入することは、この要求に対する解答となり得る。アフィニティークロマトグラフィーは、化学的観点からすると、上記と同じ相互作用様式に基づき、通常、２つ以上の様式の組み合わせに基づくにもかかわらず、それ自身がしばしば１つの種類として見なされる。アフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、検体とクロマトグラフィー材料のマトリクス表面に結合された活性残基との間、及び該検体と該マトリクス自身の表面特性との間の両方において、該検体と吸着材との間の特定の相互作用が検証され得る。
【０００５】
アフィニティークロマトグラフィーは、大抵はバルクのゲル相樹脂を用いて行われている。優れたゲル形成材料としては、媒体に架橋した多糖類、ポリアクリルアミド及びポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。そのようなヒドロゲルでは、その柔軟性（配座柔軟性、弾性係数）、大きい細孔系、高い極性、高い含水量により、また、反応性の化学基や変性させる化学基が無いため、配位子の活性残基及びそれと相互作用する検体の両方によく適合する適合性の表面がしばしば確認される。それらは、タンパク質などの検体を天然状態で保持することができる。即ち、タンパク質の正確に折り畳まれた３次元構造、会合状態及び機能的な完全性を保存し、または、複雑な薬理活性化合物の構造を化学的に変化させない。しかしながら、これら媒体は圧力が適用されると圧縮するものであり、撹拌、カラム充填または高い液流量によるせん断応力に耐えられないため、これら媒体の機械的抵抗は、無機支持材料よりもはるかに弱い。そのため、過酷なＨＰＬＣ工程条件に対して十分に適合可能なアフィニティー吸着材はほとんどない。
【０００６】
ごく最近において、固定相の機械抵抗は吸着材支持材のバルク特性であり、吸着材支持体では、固定相と移動相との間の界面における薄層だけが、質量交換及び生物学的検体との相互作用の原因となることが認識されてきている。従って、機械的に非常に強固かつ寸法的に安定な多孔質３次元コアと、検体を拘束するための活性残基を支持するゲル状の界面層との機能を組み合わせる思想が提起されており、関連する合成上の問題は、技術的に解決されている。そのようなハイブリッド材料としては、無機酸化物または密に架橋した極性の低いポリマーのいずれかを基材にした、緩く架橋した極性の高いポリマーが採用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、クロマトグラフィーの適用のための新規な吸着材であって、機械的応力を考慮して、または溶離液の溶液特性を考慮して、材料の高い安定性を要求するクロマトグラフィーの用途において用いた場合であっても、単純でコスト効率の良い有機分子の精製を可能にする新規な吸着材を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、表面に一般式（Ｉ）の残基を含む固体支持材料を含む吸着材を提供する：
【化１】
2014534411.tif 000003
ここで、前記残基は、個体支持材料がポリマーフィルムを含むか否かに応じて、バルク状の固体支持材料自身の表面、または前記固体支持材料の表面上におけるポリマーフィルムの表面のいずれかの官能基に、式（Ｉ）の点線で表される共有単結合を介して付着している；
使用された記号及びパラメータは、以下の意味を有する；
Ｌは、共有単結合、又は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選ばれた２価のユニットを意味する。
Ｘは、１〜３０個の炭素原子を有する１価の直鎖状脂肪族炭化水素基、又は、３〜３０個の炭素原子を有する分枝鎖状若しくは環状炭化水素基を意味し、
ここで、前記基における１つ以上の、好ましくは１つのＣＨ2部分は、Ｏ、Ｓ、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−又は−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−に置換されていてもよく、
１つ以上の水素原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ又は−ＮＣに置換されていても良く、
前記基は２つの炭素原子間の二重結合を１つ以上含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２における、エベロリムスの分画におけるクロマトグラム。
【図２】粗混合物（実線）と精製エベロリムス（破線）とを比較した分析クロマトグラム。
【図３】４−トルエンスルホン酸を用いた漏出測定法（前分析）による、アミン基の量を決定するための試料曲線。
【図４】実施例３より生成された本発明の吸着剤による、実施例４の方法に従うインスリン及びその副生成物である脱アミド−インスリン−Ａ２１の分画における分取クロマトグラム。
【図５】実施例４の分離方法における出発混合物として適用されたインスリン及び脱アミド−インスリン−Ａ２１の粗混合物における分析クロマトグラム。
【図６】実施例４の分離方法により得られた第１の分画における分析クロマトグラム。
【図７】実施例４の分離方法により得られた第２の分画における分析クロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に従う一実施形態では、式（Ｉ）に従う前記残基は、前記固体支持材料の表面上のポリマーフィルムの前記官能基に、共有単結合により付着していることが好ましい。
【００１１】
１〜３０個の炭素原子を有する１価の直鎖状脂肪族炭化水素基又は３〜３０個の炭素原子を有する分枝鎖状若しくは環状炭化水素基は、好ましくは、以下の群の１つである：メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル（１−メチルプロピル）、ｔｅｒｔ−ブチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル（１，１−ジメチルプロピル）、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル（ネオペンチル）、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル、１，２−ジメチルブチル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチルブチル、１−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、１−ヘキシルノニル、ｎ−ヘキサデシル、１−ヘキシル−デシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−ノナデシル、−（ＣＨ2）20ＣＨ3、−（ＣＨ2）21ＣＨ3、−（ＣＨ2）22ＣＨ3、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−エチルヘキシル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、シクロペンテニル、ヘキセニル、シクロヘキセニル、ヘプテニル、シクロヘプテニル、オクテニルまたはシクロオクテニル、
ここで、
前記基の１つ以上、好ましくは１つのＣＨ2部分は、水素供与体、及び／又は、水素受容体部分、例えば、Ｏ、Ｓ、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−又は−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−を有する基によって置換されていてもよく、
そして、１つ以上の水素原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ又は−ＮＣに置換されていても良く、Ｆと−ＣＮが好ましい。
【００１２】
好ましくは、Ｘは、１〜２２個の炭素原子を有する１価の直鎖状脂肪族炭化水素基又は３〜２０個の炭素原子を有する１価の分枝鎖状（linear branched）若しくは環状炭化水素基であり、
ここで、
前記基における１つ以上、好ましくは１つのＣＨ2部分は、Ｏ、Ｓ、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−又は−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−に置換されていてもよく、
１つ以上の水素原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ又は−ＮＣに置換されていても良く、
前記基は２つの炭素原子間の二重結合を１つ以上含んでいてもよい。
【００１３】
更に好ましくは、Ｘは、それぞれ、１〜２２個の炭素原子を有する又は３〜２２の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状の脂肪族炭化水素基であり、ここで、より好ましくは、Ｘは、１〜２２個の炭素原子を有する１価の直鎖状脂肪族炭化水素基である。上記の通り、前記基における１つ以上、好ましくは１つのＣＨ2部分は、Ｏ、Ｓ、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−又は−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−に置換されていてもよく、１つ以上の水素原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＮ又は−ＮＣに置換されていても良く、Ｆと−ＣＮがより好ましい。
【００１４】
しかしながら、より好ましくは、脂肪族炭化水素基は、直鎖状又は分枝鎖状のアルキルである。本発明においては、アルキルはヘテロ原子を有しない。
【００１５】
直鎖状アルキルは、好ましくは、式  −（ＣＨ2）nＣＨ3で示される基を意味するＣ1−Ｃ22−アルキルである。
ここで、ｎは１〜２２、好ましくは６〜１５、より好ましくは８〜１３、最も好ましくは１１である。
【００１６】
分枝鎖状アルキルは、好ましくは、他の炭素原子又はＬのいずれかと結合する少なくとも１つの３級又は４級の炭素原子が存在する基を意味するＣ3−Ｃ22−アルキルである。
【００１７】
分枝鎖状Ｃ3−Ｃ22−アルキルの好ましい例は、ｉｓｏ−プロピル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル（１−メチルプロピレン）、ｔｅｒｔ−ブチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル（１，１−ジメチルプロピル）、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル（ネオペンチル）、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、ｉｓｏ−ヘキシル、１，２−ジメチルブチル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチルブチル、１−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−ヘキシルノニル、及び１−ヘキシル−デシルである。
【００１８】
前記脂肪族炭化水素基における１つ以上のＣＨ2部分が、Ｏ、Ｓ又は−Ｓ（Ｏ）2−に置換されている場合、好ましくは、全てのＣＨ2部分及び置換された基の両方をベースとして、多くとも３０モル％ＣＨ2部分が、これらの基の１つ以上、好ましくは１つと置換されている。このような基の好ましい例は、−（Ｃ1−Ｃ6−アルキレン）−Ｙ−（Ｃ1−Ｃ15−アルキル）又は−（Ｃ1−Ｃ6−アルキレン）−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｈ−（Ｃ1−Ｃ15−アルキル）、ここで、ＹはＯ、Ｓ又は−Ｓ（Ｏ）2−であり、Ｃ1−Ｃ6−アルキレンは、−（ＣＨ2）m−を意味し、ｍは１〜６であり、Ｃ1-15−アルキルは、−（ＣＨ2）k−ＣＨ3を意味し、ｋは１〜１５であり、ｈは１〜２０である。
【００１９】
上記の通り、Ｌは、共有単結合、又は、水素供与体及び／若しくは水素受容体部分を有する２価のユニットを意味する。前記二価のユニットは、好ましくは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2、ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−の群から選ばれたものであり、より好ましくは、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−及び−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−であり、更により好ましくは、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｓ（Ｏ）2−であり、最も好ましくは、−Ｃ（Ｏ）−である。Ｌが共有単結合である場合、基Ｘは、前記個体支持材料の官能基に直接結合する。Ｌが−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−のユニットの１つである場合、好ましくは、自由末端線を有する第１の上記の元素が、この位置で個体支持材料に結合し、自由末端線を有する第２の上記の元素が、この位置でＸに接続される。
【００２０】
特に好ましくは、Ｌ及びＸの少なくとも１つは、水素供与体及び／又は水素受容体部分を含む前記基の１つを含むものである。このことは、本発明の吸着剤が、一方で水素結合によって且つ他方でＸの脂肪族化合物部分による疎水性相互作用によって、化合物と結合する能力を有する観点から、重要である。このことは、構造に疎水性及び親水性の部分の両方を有する化合物が精製可能となることを保証する。それゆえ、Ｌが共有単結合である場合、好ましくは、脂肪族化合物基Ｘの少なくとも１つのＣＨ2部分は、水素供与体及び／又は水素受容体部分を有する基によって置換されている。Ｌが水素供与体及び／又は水素受容体部分を有するユニットの１つである場合、Ｘは好ましくは直鎖状の又は分枝鎖状のアルキルである。
【００２１】
本発明の吸着剤の１つの実施形態においては、好ましくは、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｘは、それぞれ、直鎖状又は分枝鎖状（好ましくは直鎖状）の１〜２２の炭素原子を有する又は３〜２２の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基であり、より好ましくは直鎖状Ｃ1−Ｃ22−アルキル又は分枝鎖状Ｃ3−Ｃ22−アルキルであり、更に好ましくは、直鎖状Ｃ1−Ｃ22−アルキルであり、ここで、Ｃ6−Ｃ15−アルキルが更により好ましく、Ｃ8−Ｃ13−アルキルがまた更に好ましく、Ｃ11−アルキルが最も好ましい。
【００２２】
本発明の吸着剤の１つの実施形態においては、単に、式（Ｉ）に従った残基を含んでいる。
【００２３】
本発明の吸着剤の１つの実施形態においては、更なる残基であって、式（Ｉ）に従ったもう１つの残基であってもよく、また式（Ｉ）に従った残基と異なる残基（例えば、芳香族化合物又は複素芳香族化合物を含む残基）であってもよい残基を含んでいても良い。
【００２４】
前記固体支持材料は、好ましくはマクロ多孔質材料である。前記固体支持材料の孔サイズは、好ましくは少なくとも６ｎｍであり、より好ましくは１０〜４００ｎｍであり、最も好ましくは１０〜２５０ｎｍである。この範囲の孔サイズは、精製容量を十分に高くすることを確実にするために重要である。前記孔サイズが上述の上限を超えると、より多くの表面上のポリマーが架橋されなければならず、そのため、ポリマーの柔軟性が不十分となる。精製される化合物を拘束するために重要となる位置に、拘束基が十分に入り込むことができないかもしれないということが考えられる。孔サイズが小さすぎる場合には、ポリマーフィルムが孔を被覆することがあり、吸着材の空隙率による効果が失われる。
【００２５】
本発明に従う吸着材の一実施形態によれば、前記固体支持材料は、１ｍ2／ｇ〜１０００ｍ2／ｇの比表面積を有し、より好ましくは３０ｍ2／ｇ〜８００ｍ2／ｇ、最も好ましくは５０〜５００ｍ2／ｇの比表面積を有する。
【００２６】
好ましくは、前記固体支持材料は、３０〜８０容積％の空隙率を有し、より好ましくは４０〜７０容積％、最も好ましくは５０〜６０容積％の空隙率を有する。該空隙率は、ＤＩＮ  ６６１３３に従う水銀圧入法により決定し得る。前記固体支持材料の孔サイズもまた、ＤＩＮ  ６６１３３に従う水銀圧入法を用いた細孔充填により決定し得る。該比表面積は、ＤＩＮ  ６６１３２に従うＢＥＴ法を用いた窒素吸着により測定し得る。
【００２７】
前記固体支持材料は、有機ポリマー材料であってもよく、無機材料であってもよい。特に、本発明に従った吸収材が１つ以上の残基を含む場合、前記固体支持材料は、好ましくは無機材料である。
【００２８】
前記固体支持体がポリマー材料の場合、それは実質的に非膨潤性である。そのため、最も好ましくは、前記ポリマー材料は高い架橋度を有する。
【００２９】
前記ポリマー材料は、前記ポリマー材料における架橋可能な基の総数に基づき、少なくとも５％の架橋度、好ましくは少なくとも１０％の架橋度、最も好ましくは少なくとも１５％の架橋度で架橋されている。好ましくは、前記ポリマー材料の架橋度は５０％を超えない。
【００３０】
好ましくは、前記固体支持材料に用いられる前記ポリマー材料は、汎用の又は表面修飾のポリスチレン（例えば、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー）、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、多糖類（例えば、澱粉、セルロース、セルロースエステル、アミロース、アガロース、セファロース、マンナン、キサンタン及びデキストラン）及びそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３１】
本発明で用いられ得る前記ポリマー材料は、架橋が行われる前において、好ましくは１０〜１００００個、特に好ましくは２０〜５０００個、非常に好ましくは５０〜２０００個の繰り返し単位を有する。架橋が行われる前の前記ポリマー材料の分子量Ｍwは、好ましくは１００００〜２００００００ｇ／ｍｏｌであり、特に好ましくは１０００００〜１５０００００ｇ／ｍｏｌであり、非常に好ましくは２０００００〜１００００００ｇ／ｍｏｌの範囲である。Ｍwの決定は、例えば、内部標準物質としてポリスチレンを用いたゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、当業者にとって既知の標準的な技術に従い行われる。
【００３２】
前記固体支持材料が無機材料の場合、前記無機材料は、何らかの無機鉱物酸化物であり、好ましくは、シリカ、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニア、フルオロシラン、マグネタイト、ゼオライト、ケイ酸塩（セライト、ケイ藻土）、マイカ、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、金属有機構造体、セラミックス、制御多孔質ガラス（controlled pore glass）（例えば、trisoperl）のようなガラス、アルミニウム、ケイ素、鉄、チタン、銅、銀、金などの金属、及び、グラファイトまたは非晶質炭素からなる群より選択される。
【００３３】
前記固体支持材料がポリマー材料であるか無機材料であるかに関わらず、前記固体支持材料は、最小限の剛直性及び硬度を有しており、不溶性支持体として機能する固体基材を提供する。また、前記固体支持材料は、固定相と移動相との間の分配工程の分子的基盤として検体と相互作用する場である前記相間の界面を拡大するための、及び、特に流動及び／または加圧環境下において機械的強度及び摩損性を向上させるための基盤を提供する。
【００３４】
本発明に従う前記固体支持材料は、均質または不均質な組成物であってもよく、したがって、１種以上の上記材料の組成物である材料、特に多層複合材料をも包含する。
【００３５】
前記固体支持材料は、粒子状材料であってもよく、好ましくは、５〜５００μｍの粒子径を有していてもよい。前記固体支持材料は、膜のようなシート状または繊維状材料であってもよい。したがって、前記固体支持材料の外表面は、平面状（板、シート、箔、円盤、スライド、フィルター、膜、織布または不織布、紙）であってもよく、曲面状（凹面または凸面：球、ビーズ、粒、（中空）繊維、管、毛細管、小瓶、試料トレイのウェル）であってもよい。
【００３６】
前記固体支持材料の内表面における孔構造は、特に、規則的な途切れのない毛管路または不規則な（フラクタル）配置の空洞より構成されていてもよい。微視的には、製造方法に応じて、該構造は滑らかでも粗くてもよい。細孔系は、前記固体支持材料全体を途切れなく貫通して延びていてもよく、（分枝した）空洞内にて止まっていてもよい。前記移動相での溶媒和と前記固定相の表面での保持力との間における検体の界面平衡の速度、及びそれによる連続流分離系の効率は、前記固体支持材料の孔を通じた拡散による物質移送、及びそれによる特徴的な粒度及び孔サイズ分布により、概ね決定される。孔サイズは、場合により、非対称な、多モードの、及び／または空間的に（例えば、断面的に）不均質な分布として現れてもよい。
【００３７】
上述したように、前記固体支持材料の表面は、好ましくは、ポリマーのフィルムにより被覆されている。前記ポリマーは、好ましくは共有結合により互いに架橋されている個別の鎖を含み、又は、それらにより構成されている。更に、前記ポリマーは、好ましくは、前記固体支持材料の表面には共有結合によっては結合されない。驚くべきことに、特に疎水性部分及び親水性部分の両方を有する化合物の精製のためには、前記疎水性部分及び親水性部分の両方が、精製される対象の前記化合物の疎水性部分及び親水性部分と接触し得ること（例えば、水素供与体又は水素受容体の相互作用）が可能となる配置を取るのに十分な程度に、前記ポリマーが柔軟であることが重要であることを、本発明の発明者らは見出した。前記支持材料の表面に共有結合により結合されたポリマーフィルムが用いられる場合では、精製容量が顕著に低下することを本発明の発明者らは観測した。すなわち、ポリマーフィルムとしての架橋されたポリマーとの共有結合のない表面の使用は、以下の３つの利点を有する：（１）表面で結合されないことによるポリマーの柔軟性；（２）架橋により、前記フィルムが前記支持材料の表面に粘着し、失われないことを確実にする；（３）前記ポリマーが前記ポリマーに共有結合により結合されない場合、前記ポリマーの厚みは所望の薄さに調整され得る。
さらに好ましくは、前記支持材料を被覆する前記ポリマーは、親水性ポリマーである。前記ポリマーの親水性能は、前記吸着材と精製される化合物との間の親水性相互作用が起こり得ることを確実にする。
【００３８】
前記架橋可能なポリマーとしてのポリマーは、好ましくは、少なくとも（好ましくは、その側鎖に）親水性基を含むモノマーによって集合させられる。好ましい親水性基は、−ＮＨ2、−ＮＨ−、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＯＣＣＨ3、酸無水物、−ＮＨＣ（Ｏ）−及び糖類であり、−ＮＨ2及び−ＯＨがより好ましく、−ＮＨ2が最も好ましい。
【００３９】
コポリマーが採用される場合には、好ましいコモノマーは、単純なアルケンモノマー、またはビニルピロリドンのような極性を有する貧反応性モノマーである。
【００４０】
前記支持材料を被覆するポリマーの例としては、以下の通りである：ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアミン酸（例えば、ポリリジン等）のようなポリアミン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸のようなアミノ基を含むもの以外の機能性高分子材料、ポリ（無水マレイン酸）、ポリアミドのようなそれらの前駆体ポリマーまたは多糖類（セルロース、デキストラン、プルランなど）。ここで、ポリビニルアミン及びポリアリルアミンのようなポリアミンがより好ましく、ポリビニルアミンが最も好ましい。
【００４１】
より優れた精製容量に関し、さらに好ましくは、本発明に従う吸着材では、前記ポリマーの官能基の量に対する式（Ｉ）に従う前記残基のモル比（誘導体化度（degree of derivatization））が、好ましくは０．４〜０．８、より好ましくは０．５〜０．７の範囲である。ここで、式（Ｉ）に従う残基の量は、元素分析により決定され、前記官能基の量は、式（Ｉ）に従う前記残基が適用される前に、前記吸着材の滴定により決定される。
【００４２】
さらに、本発明に従う吸着材は、式（Ｉ）に従う残基を、前記吸着材の総容積に対して、好ましくは４０〜２４０μｍｏｌ／ｍＬ、より好ましくは７０〜２１０μｍｏｌ／ｍＬの範囲で含んでいる。このとき、残基の量は、元素分析により決定される。
【００４３】
本発明に従う吸着材の遊離官能基の量は、前記吸着材全体の容積に対して、５〜１９０μｍｏｌ／ｍＬである。この量は、滴定により決定される。（１）上記モル比と式（Ｉ）に従う残基の量とから決定され得る遊離官能基の量と、（２）滴定により直接決定される値との不一致は、元素分析による決定と、滴定による決定との差異によるものである。
【００４４】
前記ポリマーは、吸収、気相堆積、液相、気相またはプラズマ相からの重合、スピンコーティング、表面凝縮、湿潤（wetting）、液浸（soaking）、浸漬（dipping）、突流（rushing）、噴霧（spraying）、給湿（damping）、蒸発、電場または圧力の適用や、例えば液晶、ラングミュア−ブロジェットまたは交互吸着(layer-by-layer)フィルム形成法などの分子自己集合に基づいた方法のような、当業者に既知のあらゆる手段により、マクロ多孔質支持体に塗布され得る。したがって、前記ポリマーは、単層として、または多層として、または互いの層の上に個々の単層を段階的に並べたものとして、直接的に被覆される。好ましくは、本発明では、未架橋ポリマーが水溶液中の前記支持材料に与えられ、その後に架橋されるようにして、前記ポリマーが前記支持材料に被覆させられる。
【００４５】
本発明に従う吸着剤では、前記支持材料の重量に対する前記支持体を被覆する前記ポリマーの重量の比率は、好ましくは０．００５〜０．１５、より好ましくは０．０１〜０．０８の範囲である。上記比率が上限を超えると、前記ポリマーフィルムが厚すぎて前記支持材料の孔が完全に被覆され、その結果、吸着剤が有効な孔を有さなくなる。上記比率が下限を下回ると、ポリマーの量が前記支持材料全体を被覆するのに不十分となる。さらに、後者の場合には、前記ポリマーを支持体に定着させるために、より多くの架橋剤を用いることが必要となり、またその結果、ポリマーフィルムの柔軟性が不十分となる。
【００４６】
本発明に従う吸着材の好ましい実施形態では、前記架橋ポリマーの架橋度は、架橋ポリマーの架橋可能な基の総数に基づき、少なくとも２％である。より好ましくは、架橋ポリマーの架橋可能な基の総数に基づき、該架橋度は、架橋ポリマーの架橋可能な基の総数に基づき、５〜５０％であり、さらに好ましくは５〜３０％であり、最も好ましくは１０〜２０％である。該架橋度は、用いられる架橋剤の化学量論量によって容易に調整され得る。該架橋剤のほぼ１００％が反応し、架橋を形成すると思われる。このことは、分析方法によって確認され得る。該架橋度は、ＭＡＳ−ＮＭＲ分光法及びポリマー量に対する架橋剤の量の定量決定によって決定され得る。この方法は、最も好ましい。該架橋度は、例えば、較正曲線を用いたＣ−Ｏ−ＣまたはＯＨの振動に基づく赤外分光法（ＩＲ）によっても決定され得る。いずれの方法も、当業者にとって標準的な分析方法である。該架橋度が上述の上限を超えると、前記ポリマーフィルムの柔軟性が不十分となり、その結果として精製容量が低下する。該架橋度が上述の下限を下回ると、前記フィルムの前記支持材料の表面における安定性が不十分となる。
【００４７】
ポリマーを架橋させるために用いる架橋剤は、好ましくは、ジカルボン酸、ジアミン、ジオール、尿素及びビスエポキシドからなる群より選択され、より好ましくは、テレフタル酸、ビフェニルジカルボン酸、１，１２−ビス−（５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド）−デカンジカルボン酸及びエチレングリコールジグリシジルエーテルであり、エチレングリコールジグリシジルエーテルが最も好ましい。一実施形態では、前記少なくとも１種の架橋剤が、４〜２０原子の長さを有する直鎖状の立体構造的に柔軟な分子である。
【００４８】
用いられる前記ポリマーの好ましい分子量は、限定されないが、５０００〜５００００ｇ／ｍｏｌであり、これは特にポリビニルアミンに当てはまる。上記範囲の下限に近い分子量を有するポリマーは、担体の狭い孔にも貫入することを示すため、大きい表面積を有し、結果的に良好な物質移送速度、良好な溶解性、良好な拘束容量を備えた固体状態の材料が、本発明の吸着材において用いられ得る。
【００４９】
さらなる実施形態によれば、前記架橋ポリマーは、官能基、すなわち上述の親水基を有する。
【００５０】
前記用語「官能基」は、前記固体支持材料の表面上の前記架橋ポリマーまたは前記固体支持材料の表面上に前記ポリマーフィルムを調製する間に架橋可能な前記ポリマーの有する、区別され得る単純な化学的部分を意味する。従って、該官能基は、化学的な付着点またはアンカーとして機能してもよい。該官能基は、好ましくは、少なくとも１種の弱い結合及び／または少なくとも１種のヘテロ原子を含み、好ましくは、求核剤または求電子剤として機能する基を含む。
【００５１】
好ましい官能基としては、式（Ｉ）の前記残基がこれらの基に結合される前においては  第１級、第２級のアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基またはエステル基が挙げられる。前記残基が該官能基に結合される際に、これらの基の性質が、結合される前記残基の構造によって変化する。
【００５２】
本発明は、吸着材、好ましくは本発明に従う吸着材を調製する方法にも関し、以下を含む。
（ｉ）官能基を有するポリマーを提供する；
（ｉｉ）担体の表面上に前記ポリマーを吸着させる；
（ｉｉｉ）少なくとも１種の架橋剤により、前記吸着させたポリマーの前記官能基の所定の部分を架橋させる；
（ｉｖ）更に、式（Ｉ）に従う１つ以上の残基によって、架橋した前記ポリマーの前記官能基の所定の部分を誘導体化する。
【００５３】
前記担体の表面上に吸着させる対象の前記ポリマーは、好ましくは、前記ポリマーを溶解または懸濁させるためにｐＨが適切に調整された水性媒体に溶解される。前記担体の表面上における前記ポリマーの吸着は、好ましくは、前記ポリマーを含有する溶液または懸濁液の中に、前記担体を浸漬することにより行われる。次に、該混合物は、材料の完全な混合を得るため、好ましくは振とうされる。毛細管力によって、前記担体の孔が溶媒または懸濁液に確実に漬される。続いて、４０〜６０℃の間の温度において、水を真空中にて蒸発させ、それによって前記ポリマーを前記孔の内壁にフィルム形状にて堆積させる。次に、前記被覆された材料は、イソプロパノールまたはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような有機溶媒中に、好ましくは懸濁され、エチレングリコールジグリシジルエーテルのような架橋剤により、好ましくは２５〜６０℃の間の温度において４〜８時間、好ましくは架橋される。
【００５４】
前記官能基の種類に応じて、及び式（Ｉ）に従う前記残基に応じて、前記固体支持体の誘導体化において異なる方策が用いられ得る。前記固体支持材料が官能基としてアミノ基を含む場合には、カルボン酸基を含む残基が、カルボキシルの炭素原子を介して前記アミンの窒素原子に付着され得る。該付着は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＣＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢＯＰ）、プロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）等のようなカップリング試薬を用いるペプチド化学により行われ得るか、イソシアネート、エポキシドまたは無水物のような反応試薬を用いることにより行われ得る。前記固体支持材料がアミノ基を含む場合には、式（Ｉ）に従う残基における脂肪族炭素原子が、脂肪族求核置換反応によりアミンの窒素原子に結合されてもよい。
【００５５】
前記固体支持材料がヒドロキシル基を含む場合には、カルボン酸基を含む式（Ｉ）に従う残基が、前記官能基に付着される前に、カルボキシルの炭素原子を介して前記ヒドロキシル基の酸素原子に付着され得る。該付着は、カルボン酸基の塩化物またはカルボン酸基のエステルを用いることにより行われ得る。前記固体支持材料がヒドロキシル基を含む場合には、式（Ｉ）に従う残基における脂肪族炭素原子が、脂肪族求核置換反応によりヒドロキシル基の酸素原子に結合されてもよい。
【００５６】
本発明に従う吸着剤を得るための、前記支持材料の官能基と、式（Ｉ）に従う前記残基の前駆体化合物との起こり得る反応は、有機合成分野における当業者にとって既知である。
【００５７】
本発明の吸着材は、有機分子（有機化合物）を精製するため、またはある有機分子から溶液を精製するために使用され得る。すなわち、本発明はさらに、有機分子、ペプチドを精製するため、またはある有機分子群から溶液を精製するための、本発明の吸着材の使用に関する。
【００５８】
前記用語「有機分子」は、低分子量の有機化合物だけでなく、ペプチドや酵素のような生体分子を含んでいてもよい。
【００５９】
前記用語「精製」は、前記有機分子を含む混合物から有機分子を分離すること、または有機分子の濃度及び／または純度を上げることを含むものともされる。
【００６０】
換言すると、本発明は、本発明の吸着材を用いることにより、不要な有機分子を溶液から分離することを含む、有機分子の精製方法についても向けられている。
【００６１】
有機分子の精製のための本発明の吸着材の使用、または本発明に従う吸着材の使用により有機分子を精製する方法は、以下のステップを備える：
（ｉ）本発明に従う吸着材または本発明に従う方法により製造された吸着材を含有するクロマトグラフィーカラムに、液体中に溶解または懸濁した有機分子を含む粗混合物を適用する；
（ｉｉ）溶離液を用いて、前記カラムから前記有機分子を溶離させる。
【００６２】
工程（ｉｉ）で用いられる前記溶離液は、前記有機分子の精製に必要とされる状況に応じて、工程（ｉ）にて用いられる液体と同じ溶媒であってもよく、異なっていてもよい。工程（ｉ）の液体または工程（ｉｉ）の溶離液としては、クロマトグラフィー分野において利用される様々な種類の溶媒や緩衝系が用いられ得る。本発明では、有機溶媒が好ましく、特に、酢酸エチル及びジクロロメタン等が好ましい。
【００６３】
本発明の吸着材によって精製される有機分子は、好ましくは、薬理活性化合物である。
【００６４】
精製される対象の前記有機分子は、好ましくは、分子内に親水性部分及び疎水性部分を有する化合物である。より好ましくは、前記有機分子は、疎水性炭化水素部分の下で、水素供与体または水素受容体として機能し得る基を有する化合物である。前記有機分子は、好ましくは、−ＯＨ、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群より選択される１つ以上の部分を有する化合物である。
【００６５】
前記有機分子は、好ましくは５００〜２０００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは５００〜１５００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは５００〜６０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。
【００６６】
本発明の使用／工程において用いられる有機分子として特に好ましいものは、エベロリムスまたはそのの誘導体であり、より好ましくは、以下の構造を有するエベロリムスである：
【化２】
2014534411.tif 000004
【００６７】
さらには、本発明に従う吸着材は、溶液からエンドトキシンを分離するために用いられてもよい。本発明にて用いられる前記用語「エンドトキシン（内毒素）」は、生化学物質の分野に関する。エンドトキシンは、ヒトにおいて様々な生理的反応を開始させ得る、細菌の分解生成物である。エンドトキシンは、グラム陰性菌または藍藻類の細胞外膜（ＯＭ）の成分である。化学的な観点からは、エンドトキシンは、親水性の多糖成分と、親油性の脂質成分とで構成されるリポ多糖（ＬＰＳ）である。エンドトキシンの起源である細菌と対照的に、エンドトキシンは熱的に非常に安定であり、滅菌に耐える。現段階で最も感度の高いエンドトキシンの測定方法は、アメリカカブトガニから単離された変形細胞の溶解物における凝固カスケードの活性化によって行われる。この試験は、いわゆるＬＡＬ試験として公知である。
【００６８】
本発明のさらに好ましい例は、本発明に従う吸着剤の、インスリンをその副生成物から精製するための使用である。
【００６９】
本発明は、液体クロマトグラフィーまたは固相抽出のためのカラムにも関し、該カラムは、管状格納容器内に固定相として本発明に従う吸着材または本発明に従う方法に従って調製された吸着材を含み、場合により、フリット、濾板、分流器、封止材、継手、ねじ、バルブまたはその他の流体取扱要素や接続要素のような構成要素を含む。一実施形態では、前記方法は、２０ｂａｒまでの圧力の適用、１１０℃までの熱の適用及び一般的な消毒手順に対するその物理的及び化学的抵抗力により特徴付けられ、それによって１０００回まで、好ましくは５０００回までの繰り返し使用を可能となる。本発明はまた、本発明に従う（または本発明に従う方法に従って調製された）複数の同じまたは異なった吸着材によるによる、または並列処理可能なマイクロプレート、マイクロチップアレイ、マルチキャピラリーもしくはマイクロ流体デバイス様式の本発明に従う複数のカラムによる集合体にも関する。
【００７０】
本発明は、診断または実験室における精製キットにも関し、該キットは、本発明に従う吸着材、本発明に従う方法に従って調製された吸着材、本発明に従うカラムまたは本発明に従う吸着材もしくはカラムの集合体を含み、さらに、同じパッケージ単位内に、本発明に従う方法、または別の分析、診断、またはそれらと異なる実験室的方法を行うために必要な化学的または生物学的な試薬及び／または消耗品を含む。
【００７１】
本発明は、さらに以下の実施形態にも関する。
（ｉ）本発明に従う吸着材を用いることによる有機分子の精製方法。
（ｉｉ）前記有機分子が薬理活性化合物である、実施形態（ｉ）の方法。
（ｉｉｉ）前記有機分子の有する分子量が、５００〜２０００００ｇ／ｍｏｌの範囲内である、実施形態（ｉ）または（ｉｉ）の方法。
（ｉｖ）前記有機分子が、エベロリムス、エベロリムスの誘導体、インスリン、インスリンの誘導体及びエンドトキシンからなる群から選択される、実施形態（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの方法。
【００７２】
本発明は以下の図面及び実施例によりさらに説明されるが、それらは本発明の範囲を限定するものとは理解されない。
【実施例】
【００７３】
分析方法：
４−トルエンスルホン酸を用いた漏出測定法（break-through measurment）によるアミン基の量の決定（前分析）（滴定方法）
それぞれの吸着材を、３３．５×４ｍｍ寸法のカラムに充填する（ベッド容積０．４２ｍＬ）。次に、前記充填されたカラムを、以下の媒体により流速１．０ｍＬ／分にて洗い流す。
・水      ５ｍＬ
・１００ｍＭ  酢酸アンモニウム水溶液      １０ｍＬ
・水  １ｍＬ
・１００ｍＭ  トリフルオロ酢酸水溶液      １０ｍＬ
・水  １０ｍＬ
【００７４】
ポンプ及びＵＶ検出器を有するＨＰＬＣ装置を通して、水を０．５ｍＬ／分にて５分間送液した後、該ＨＰＬＣ装置でベースラインを検出する。その後、１０ｍＭ  ４−トルエンスルホン酸水溶液を送液すると、溶離液の吸光度が２７４ｎｍに検出される。前記吸光度は、数分の間に約７００ｍＡＵの水準まで上昇し、該水準を維持する（流入曲線（flush-in curve））。２５分後、ポンプと検出器との間に前記カラムを適用し、前記カラムを１０ｍＭ  ４−トルエンスルホン酸により０．５ｍＬ／分にて洗い流す。その後、４−トルエンスルホン酸が前記カラムに拘束されるため、前記吸光度は０ｍＡＵに落ちる。前記カラムの容量が使い果たされると、溶離液の前記吸光度は、再び開始時の水準である７００ｍＡＵまで上昇する。
【００７５】
４−トルエンスルホン酸の容量を決定するため、流入曲線の水準より低い範囲を比較範囲として統合し、それによって表面積と４−トルエンスルホン酸との関係を得る。その後、トルエンスルホン酸溶液が前記カラムに吸着された範囲（漏出範囲）を滴定し、該装置の容積及び前記カラムの死容積（０．５ｍＬ）を減じる。前記漏出範囲は、前記カラムに拘束された４−トルエンスルホン酸の量を直接的に示している。この量を前記カラムの容積で割ることにより、前記吸着材におけるトルエンスルホン酸のｍＬあたりの容量が得られ、その結果、前記吸着材におけるアミン基の量も得られる。この方法について理解を深めるため、図３にこのような例における曲線を示す。
【００７６】
実施例１：式−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）10ＣＨ3の残基を含む、本発明に従う吸着材の製造方法：
ポリビニルアミン水溶液（４．５ｇ（水３００ｇ中）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてｐＨ８に調整される）を、Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ＳＰ１２０  １０  Ｐ  ３００ｇに加えた。該混合物を振動篩において５時間撹拌した後、真空中にて５０℃で乾燥させた。重量が一定となった後、該吸着材をイソプロパノール９００ｍＬに懸濁し、更に、エチレングリコールジグリシジルエーテル３．６４ｇ（５０ｍＬ中）を加えた。該混合物を７０℃で６時間撹拌した。その後、前記吸着材を濾過し、イソプロパノール６００ｍＬ、０．５Ｍ  ＴＦＡ（水中）２４００ｍＬ、水６００ｍＬ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６００ｍＬ、０．１Ｍ  トリエチルアミン（ＴＥＡ）（ＤＭＦ中）１８００ｍＬ及びＤＭＦ６００ｍＬにより洗浄した。
【００７７】
得られた中間体におけるアミン基の量は、滴定により決定可能であり、約１４４μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００７８】
前記吸着材をＤＭＦ９００ｍＬ中に再び懸濁し、ラウリル酸１２．０ｇ、ＨＢＴＵ２２．８ｇ及びトリエチルアミン８．４ｍＬを加えた。該混合物を５０℃にて２時間撹拌し、その後濾過した。前記吸着材をＤＭＦ１００ｍＬ、０．５Ｍ  ＴＦＡ（ＤＭＦ中）３００ｍＬ、０．５Ｍ  ＴＦＡ（水中）３００ｍＬ、水１００ｍＬ、ＤＭＦ１００ｍＬ、０．５Ｍ  ＴＥＡ（ＤＭＦ中）３００ｍＬ、水１００ｍＬ及びメタノール２００ｍＬにより洗浄した。真空中にて５０℃で乾燥させた後、前記吸着材は使用できる状態となる。
【００７９】
得られた吸着剤は、遊離アミン基を約１５μｍｏｌ／ｍＬ含み、これは滴定により決定される。また、得られた吸着剤は、残基−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）10ＣＨ3を約８５μｍｏｌ／ｍＬ含み、これは元素分析より決定される。
【００８０】
実施例２：実施例１にて製造された吸着材を用いるエベロリムスの精製：
実施例１にて製造された吸着材を、ベットサイズ２５０×２５．４ｍｍの軸圧縮ＭｏｄＣｏｌスチール製カラムに充填した。酢酸エチル／ジクロロメタン  １／１の移動相を４０ｍＬ／分にて用いて、１．０％のサンプルロードを適用した。実質的にエベロリムス８０〜８５重量％及びラパマイシン１５〜２０重量％からなる粗混合物を、図１に従い分画した。図２は、該粗混合物（実線）と比較した際の精製エベロリムス（破線）の分析クロマトグラムを示す。該結果を、以下の表１にも示す。
【００８１】
【表１】
2014534411.tif 000005
【００８２】
ラパマイシンが主な不純物である。分画ＢＴ２〜ＢＴ７を合わせると、エベロリムスを純度９９．１８％及び収率７３％にて得ることができた。
【００８３】
実施例１と同様に製造され、５μｍｏｌ／ｍＬを下回る量の遊離アミンを含む吸着材では、得られるエベロリムスの純度が９９％未満、及び収率が７０％未満となる。同様に、１９０μｍｏｌ／ｍＬを超える量の遊離アミンを含む吸着剤でもまた、得られるエベロリムスの純度が９９％未満、及び収率が７０％未満となる。
【００８４】
同様に、前記ポリマーの（誘導体化前における）官能基の量に対する式（Ｉ）に従う前記残基のモル比が０．４を下回る、あるいは０．８を超える吸着材では、得られるエベロリムスの純度及び収率が２０％を超えて低下する。該同様の範囲が０．５を下回る、あるいは０．７を超える吸着材では、その保持力が低すぎるため、得られるエベロリムスの純度及び収率が３０％を超えて低下する。
【００８５】
実施例３：式−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）10ＣＨ3の残基を含む、本発明に従う吸着材の製造方法：
ポリビニルアミン水溶液（３０ｇ（水４００ｇ中）、塩化水素酸（ＨＣｌ）を加えてｐＨ８に調整される）を、Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ＳＰ１２０−１０  Ｐ  ６００ｇに加えた。該混合物を振動篩において６時間撹拌した後、真空中にて５０℃で乾燥させた。重量が一定となった後、該吸着材をイソプロパノール３０００ｍＬに懸濁し、更にエチレングリコールジグリシジルエーテル１２．１ｇ（１５０ｍＬイソプロパノール中）を加えた。該混合物を５５℃で６時間撹拌した。その後、前記吸着材を濾過し、イソプロパノール３０００ｍＬ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（水中）９０００ｍＬ、水３０００ｍＬ及びメタノール４５００ｍＬにより洗浄した。以後の使用まで、前記吸着材を乾燥させた。
【００８６】
得られた中間体におけるアミン基の量は、滴定により決定可能であり、約３１６μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００８７】
前記吸着材５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３００ｍＬ、０．５Ｍ  トリエチルアミン（ＴＥＡ）（ＤＭＦ中）３００ｍＬ及びＤＭＦ３００ｍＬにより再び洗浄した。その後、ＤＭＦ１５０ｍＬ中に懸濁し、ラウリル酸５．０ｇ、ＨＢＴＵ９．５ｇ及びトリエチルアミン３．４ｍＬを加えた。該混合物を５０℃にて４時間撹拌し、その後濾過した。前記吸着材をＤＭＦ３００ｍＬ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（ＤＭＦ中）３００ｍＬ、０．１Ｍ  ＨＣｌ（水中）３００ｍＬ、水３００ｍ及びメタノール３００ｍＬにより洗浄した。真空中にて５０℃で乾燥させた後、前記吸着材は使用できる状態となる。
【００８８】
得られた吸着剤は、遊離アミン基を約１７３μｍｏｌ／ｍＬ含み、これは滴定により決定される。また、得られた吸着剤は、残基−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）10ＣＨ3を約２０２μｍｏｌ／ｍＬ含み、これは元素分析より決定される。
【００８９】
実施例４：実施例３にて製造された吸着材を用いるインスリンの精製：
インスリンと、主な不純物としての脱アミド（desamido）−インスリン−Ａ２１を含む粗試料（３ｍｇ／ｍＬ、水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（９５／５／０．１）中）を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ装置を用いて分離した。該装置は、４チャンネル低圧グラジエントポンプ（ＬＰＧ  ５８０、ＬＰＧ  ６８０またはＬＰＧ  ３４００）、オートサンプラー（Ｇｉｎａ  ５０，ＡＳＩ−１００またはＷＰＳ−３００）、６チャンネルカラム切替バルブ（Ｂｅｓｔａ製）、カラムオーブン及びダイオードアレイＵＶ検出器（ＵＶＤ  １７０Ｕ、ＵＶＤ  ３４０ＳまたはＶＷＤ  ３４００）により構成される。該吸着材を、２５０×４ｍｍのスチール製カラムに充填した。精製のため、以下の表２に示される３つの溶離液の異なるグラジエントを用いた。第１の溶離液は１０ｍＭ  ＮａＫＨＰＯ4（水中）であり、第２の溶離液は１０ｍＭ  ＮａＫＨＰＯ4／１Ｍ  ＮａＣｌ（水中）であり、第３の溶離液は１−プロパノールである。流速は１ｍＬ／分であった。注入容積は１ｍＬであった。分画の推移を図４に示す。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
図４に示されるように、実施例３に従う吸着剤を用いると、非常に良好な分離が得られる。インスリンは、脱アミド−インスリン−Ａ２１より４０分超も早くカラムより溶出される。すなわち、本発明に従う吸着剤における脱アミド−インスリン−Ａ２１の保持力は、インスリンの保持力に比べて非常に高い。
【００９２】
実施例４の分析方法における開始混合物として、インスリンと脱アミド−インスリン−Ａ２１との粗混合物の分析クロマトグラムが適用される。
【００９３】
薬局方（Pharmakopoe）の方法に従う、ＹＭＣ  Ｐａｃｋ、Ｐｒｏ  Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、１２ｎｍ、移動相：緩衝液Ａ：アセトニトリル１００ｍｌ、水７００ｍｌ、ｐＨ２．０硫酸塩緩衝溶液Ｒ２００ｍｌ。緩衝液：Ｂアセトニトリル４００ｍｌ、水４００ｍｌ、ｐＨ２．０硫酸塩緩衝溶液Ｒ２００ｍｌ）を用いた、当技術分野において知られる分離分析では、該粗混合物における分析クロマトグラムにおいて、脱アミド−インスリン−Ａ２１が３０分後に溶出することが示された。
【００９４】
本発明に従う方法を用いた第１の分画は、分析クロマトグラムにおいて、３０分後における脱アミド−インスリン−Ａ２１の溶出を示さなかった（図６）。しかしながら、本発明に従う方法を用いた第２の分画における分析クロマトグラムは、脱アミド−インスリン−Ａ２１の溶出を示した（図７）。該分析は、脱アミド−インスリン−Ａ２１からのインスリンの分離品質を示す。
【００９５】
実施例３と同様に製造され、前記ポリマーの（誘導体化前における）官能基の量に対する式（Ｉ）に従う前記残基のモル比（誘導体化度）が０．４を下回る吸着材では、脱アミド−インスリン−Ａ２１の保持力が悪くなるため、インスリンと脱アミド−インスリン−Ａ２１とのベースライン分離が得られない。同様に、誘導体化度が０．８を超える吸着剤でも、インスリンの保持力が良いため、該２つの基質のベースライン分離が得られない。該同様の範囲が０．５を下回る、あるいは０．７を超える吸着材では、該２つの基質のベースライン分離は得られるが、インスリンについての収率が５０％を下回る。
【００９６】
同様に、５μｍｏｌ／ｍＬ〜１９０μｍｏｌ／ｍＬの遊離アミンを含む吸着材では、インスリンと脱アミド−インスリン−Ａ２１とのベースライン分離が得られるが、５μｍｏｌ／ｍＬを下回る、または１９０μｍｏｌ／ｍＬを超える量の遊離アミンを含む吸着剤では、インスリンと脱アミド−インスリン−Ａ２１とのベースライン分離（すなわち、純粋な収集）は示されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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