(57)【要約】ブロックコポリマーと任意に一つ又は複数の活性薬剤を含むナノ粒子、前記ナノ粒子を含む組成物、及び前記ナノ粒子の製造法を開示する。ブロックコポリマーは、ブロック（ｉ）ポリエステル又はポリアミドである第一のポリマー、及び（ii）エステル又はエーテル結合を含有し、ヒドロキシル価≧１０を有する炭化水素鎖を含む第二のポリマーを含む。活性薬剤はナノ粒子内又はナノ粒子の表面上に存在できる。ナノ粒子は、薬物送達デバイス及び分子イメージングデバイスとして役立つように、任意に表面改質部分を結合していてもよい。表面改質部分は、ナノ粒子を、所望の標的、細胞、組織又はバイオマーカーに標的化できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブロックコポリマーと、任意に一つ又は複数の活性薬剤とを含むナノ粒子であって、
（ｉ）ブロックコポリマーはブロックＡ及びＤを含み；
（ii）ブロックＡはモノマー単位Ｂ及びＣを含む第一のポリマーからなり、ここでＢは炭素原子の総数が≦３０の脂肪族ジカルボン酸であり、そしてＣはジヒドロキシ又はジアミノモノマーであり； 
（iii）ブロックＤは、エステル又はエーテル結合を含有し、ヒドロキシル価≧１０を有する炭化水素鎖を含む第二のポリマーからなる
ナノ粒子。
【請求項２】
Ａが、式−［（Ｂ−Ｃ）ｎ−Ｂ］−を有し、式中、ｎは各ブロックＡのために独立に選ばれる少なくとも１の数的添字である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
Ｃが、４〜１０個の炭素原子を含む直鎖脂肪族ジオールである、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
Ｃが１，８−オクタンジオールである、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項５】
Ｂが４〜１０個の炭素原子を含む、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
Ｂが５〜１０個の炭素原子を含む、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
Ｄが、ポリエチレングリコール、ポリアミドアミン、ポリアミン、ポリオール及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項８】
ナノ粒子が少なくとも一つの活性薬剤を組み込んでいる、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
少なくとも一つの活性薬剤が、−１．０〜＋５．６のｌｏｇＰ値を有する、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１０】
少なくとも一つの活性薬剤が、ドセタキセル及びパクリタキセルを含む群から選ばれる、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１１】
ナノ粒子が、一つ又は複数の表面改質剤を前記ナノ粒子に共有結合させるのに適切な一つ又は複数のカップリング剤を含む、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１２】
ナノ粒子が、少なくとも一つの表面改質剤を結合又は組み込んでいる、前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの表面改質剤が、診断薬、標的化剤、イメージング剤、及び治療薬からなる群から選ばれる、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
少なくとも一つの表面改質剤が、チオール化ポリマー、蛍光色素分子、ＢＢＢシグナルペプチド及びＲＧＤＳを含む群から選ばれる、請求項１１又は１２に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
少なくとも一つの表面改質剤が、配列番号１、２、３又は４を含むペプチドである、請求項１１、１２又は１３に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
表面改質剤が、
【化１】
2014518862.tif 000021
［式中、ｍは、１以上の数的添字であり；ｐは、１より大きい数的添字であり；ｑは、１より大きい数的添字であり；そして、“ポリマーＰ”はブロックコポリマーである］からなる群から選ばれるカップリング剤を介して共有結合されている、請求項１０、１１、１２、１３又は１４に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
カップリング剤が、式（IV）：
【化２】
2014518862.tif 000022
の基である、請求項１０〜１４のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記請求項のいずれかに記載のナノ粒子及びビヒクルを含む組成物。
【請求項１９】
前記ビヒクルが製薬学的に許容可能な希釈剤又は賦形剤である医薬組成物である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
ビヒクルが極性液体である、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２１】
ビヒクルが生体液である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１６に記載のナノ粒子の製造法であって、
ｉ）ブロックコポリマーと活性薬剤（存在する場合）を拡散媒に溶解して第一の溶液を形成し；
ii）前記第一の溶液を分散媒と混合して、前記ブロックコポリマーと前記活性薬剤（存在する場合）を含む沈殿ナノ粒子、及び拡散媒と分散媒を含む液相を形成させ；そして
iii）ナノ粒子を液相から分離する
ことを含み、
ここで、拡散媒は、ブロックコポリマーと活性薬剤（存在する場合）が可溶性である溶媒を含み、分散媒は、ブロックコポリマーと活性薬剤（存在する場合）が不溶性である溶媒を含み、そして拡散媒と分散媒は混和性である
製造法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の工程を含み、さらに、
iv）ナノ粒子をビヒクル中に再懸濁させる
工程を含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載の組成物の製造法。
【請求項２４】
請求項１〜２０に記載の活性薬剤含有ナノ粒子及び組成物の製造法であって、方法は、活性薬剤を含む少なくとも一つの液体媒体の使用を含み、活性薬剤は液体媒体中に溶解されている製造法。
【請求項２５】
請求項１〜１６に記載の活性薬剤含有ナノ粒子の製造法であって、前記方法は、
ｉ）ナノ粒子を製造し；
ii）前記ナノ粒子を活性薬剤の濃縮溶液とインキュベートし；そして
iii）前記活性薬剤を含むナノ粒子を液相から分離する
工程を含む方法。
【請求項２６】
請求項１７〜２０のいずれかに記載の活性薬剤含有組成物の製造法であって、前記方法は、請求項２４に記載の工程を含み、さらに
iv）ナノ粒子をビヒクル中に再懸濁させる
工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロックコポリマーを含むナノ粒子の分野に関する。本発明はまた、それらが薬物送達デバイス及び分子イメージングデバイスとして役立つように、活性薬剤を組み込んでいても任意に表面改質部分を結合していてもよいナノ粒子にも関する。本発明はまた、そのようなナノ粒子の製造法及びそれらの表面の改質法にも関する
【背景技術】
【０００２】
生分解性ナノ粒子は、天然又は合成の有機又は無機実体、タンパク質、ペプチド及び核酸のような活性薬剤を投与するための徐放性ビヒクルとして使用されている。活性薬剤は、ナノ粒子マトリックスに、溶解、取込み(entrapment)、封入(encapsulation)又は結合される。生分解性ナノ粒子、特にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のような親水性ポリマーで被覆されたものは、長時間循環し、特定の送達部位を標的にできるので、薬物送達デバイスとして有用である（Ｍｏｈａｎｒａｊ  ＆  Ｃｈｅｎ  Ｔｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５，５６１−５７３（２００６））。
【０００３】
送達システムとしてのナノ粒子の設計における主目的は、薬物の部位特異的作用を治療上最適な速度及び投与計画で達成するために、粒径、表面特性、及び薬理活性剤の放出を制御することである。ナノ粒子は、タンパク質、多糖類及び合成ポリマーのような様々な材料から製造できる。マトリックス材料の選択は、必要とされるナノ粒子のサイズ、封入薬物の固有の性質（例えば、水に対する溶解性及び安定性）、表面特性（電荷及び浸透性など）、生分解性の程度、生体適合性及び毒性、所望される薬物放出プロフィール、及び最終製品の抗原性などの多数の因子に依存する。
【０００４】
リポソームは、薬物を分解から保護、作用部位への標的化、及び低減された毒性又は副作用といった利点を有する有力な担体として使用されているが、それらの用途は、低い封入効率、血液成分の存在下における水溶性薬物の迅速漏出、及び乏しい貯蔵安定性などの問題によって制限されているようである。ナノ粒子はリポソームに優るいくつかの特定の利点を提供する。例えば、それらは、貯蔵中もっと安定であり、薬物及びタンパク質の安定性の増大に役立ち、そして有用な制御放出特性を有している。
【０００５】
ナノ粒子を薬物送達システムとして使用することの利点は多種多様である。ナノ粒子の粒径及び表面特性は、全身通過後の受動的及び能動的薬物標的化を達成するために容易に操作することができる。それらは、輸送中及び局在化部位での薬物放出を制御及び持続することにより、薬物の臓器分布とその後の薬物クリアランスを変更する。その結果、薬物の治療効果の増大及び他の臓器との相互作用を最小化することによる副作用の低減を達成できる。制御放出と粒子分解特性はマトリックス成分の選択によって容易に調節できる。薬物担持量(drug loading)は比較的高く、薬物はシステムに何らの化学反応もなしに組み込むことができる。このことは薬物活性を保つための重要な因子である。部位特異的標的化は、標的化リガンドを粒子表面に結合させるか又は磁気誘導の使用によって達成できる。ナノ粒子のサイズ、表面電荷及び表面装飾は調節できる。該システムは、経口、鼻腔、非経口、肺、膣及び眼内を含む様々な投与経路に使用できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｈａｎｒａｊ  ＆  Ｃｈｅｎ  Ｔｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５，５６１−５７３（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
薬物送達用の新規ナノ粒子、すなわち正確な放出プロフィールの調整が可能で、極性活性薬剤を含む広範囲の活性薬剤をナノ粒子の高い重量パーセンテージで封入できるナノ粒子の開発に対する継続的な需要が存在する。これらのナノ粒子の表面を改質するための新規方法も求められている。活性薬剤を脳に送達するためのベクターとして機能できるナノ粒子も求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ブロックコポリマーと、任意に一つ又は複数の活性薬剤とを含むナノ粒子を提供する。ここで、
（ｉ）ブロックコポリマーはブロックＡ及びＤを含み；
（ii）ブロックＡはモノマー単位Ｂ及びＣを含む第一のポリマーからなり、ここでＢは炭素原子の総数が≦３０の脂肪族ジカルボン酸であり、そしてＣはジヒドロキシ又はジアミノモノマーであり；そして
（iii）ブロックＤは、エステル又はエーテル結合を含有し、ヒドロキシル価≧１０を有する炭化水素鎖を含む第二のポリマーからなる。
【０００９】
本発明はさらに、ナノ粒子を含む組成物、特に医薬組成物も提供する。ここで、前記ナノ粒子は、ブロックコポリマーと任意に一つ又は複数の活性薬剤とを含み、ここで、
（ｉ）ブロックコポリマーはブロックＡ及びＤを含み；
（ii）ブロックＡはモノマー単位Ｂ及びＣを含む第一のポリマーからなり、ここでＢは炭素原子の総数が≦３０の脂肪族ジカルボン酸であり、そしてＣはジヒドロキシ又はジアミノモノマーであり；
（iii）ブロックＤは、エステル又はエーテル結合を含有し、ヒドロキシル価≧１０を有する炭化水素鎖を含む第二のポリマーからなり；そして
（iv）組成物は任意にビヒクルをさらに含む。
【００１０】
本発明はさらに、（ｉ）本明細書中に記載のブロックコポリマーを含むナノ粒子と、（ii）本明細書中に記載の異なるブロックコポリマーを含むナノ粒子との混合物を含む組成物も提供する。
【００１１】
本発明のナノ粒子は、様々な極性の活性薬剤を担持することが可能である。活性薬剤は、存在する場合、ナノ粒子に、例えば吸着、吸収又は取込みによって組み込まれ、ナノ粒子から、例えば脱着、拡散、ポリマー浸食、酵素媒介放出、急速放出の場合ナノ粒子崩壊、又はこれらの機序のいくつかの組合せによって放出されうる。
【００１２】
活性薬剤（単数又は複数）は、ナノ粒子内又はナノ粒子の表面上に存在しうる。活性薬剤（単数又は複数）とナノ粒子間の相互作用は、典型的には非共有結合、例えば水素結合、静電相互作用、又は物理的封入である。しかしながら、代替の態様において、活性薬剤（単数又は複数）とナノ粒子は共有結合又はリンカーによって連結される。
【００１３】
本発明のナノ粒子の更なる利点は、組み込まれた活性薬剤の破裂放出の防止である。投与後、制御送達システムからの活性薬剤の早期破裂放出は、毒性レベルの活性薬剤をもたらしたり、又は活性薬剤がその目的とする標的部位に到達するのを妨げることがある。ポリマーの生分解性、従ってナノ粒子の放出プロフィールは、ブロックＡ及びＤ中のモノマー数；ブロックの分子量の比率；ポリマーの総分子量；又はポリマーの親水性を変更することによって調整できる。例えば、ブロックＡの長さを変えることによって、長期又は短期放出プロフィールを得ることができる。ポリソルベート、ソルビタンの脂肪酸エステル、糖及びリパーゼのような賦形剤もナノ粒子内に封入できる。
【００１４】
ナノ粒子は、活性薬剤の放出を補助するために崩壊剤、超崩壊剤又は湿潤剤をさらに含むこともできる。あるいは、ナノ粒子は、溶解してナノ粒子中に孔又はチャンネルを形成する水溶性分子を含んでいてもよい。その場合、活性薬剤はそこを通って放出されうる。
【００１５】
本発明のナノ粒子の更なる利点は、活性薬剤の放出が体内、例えば消化管における異なるｐＨ環境に影響されないように、ｐＨ非依存性の放出を可能にすることである。ｐＨ非依存性の放出とは、本明細書においては、ｐＨ１〜９の環境においてナノ粒子から拡散される活性薬剤の速度の変動が１０％未満であると定義される。
【００１６】
ナノ粒子は、生体適合性であり、また、それらの使用環境において十分耐性がある。すなわち、所望の標的に到達して所望の生理的効果を達成できるように、十分量のナノ粒子は哺乳動物体内に入った後も実質的に無傷のままである。本明細書中に記載のブロックコポリマー及びそれらの構成ブロックは、生体適合性であり、好ましくは生分解性である。
【００１７】
本明細書において、“生体適合性”という用語は、有害応答を引き起こすことなく生体に挿入又は注入できる物質のことを言う。例えば、それは、適切に制御できない免疫系による炎症又は急性拒絶を起こさない。“生体適合性”は相対的用語であり、生体組織と高度に適合性のある物質でさえ、一定程度の免疫応答は予期されることは認識されている。物質の生体適合性を評価するためのインビトロ試験は、それを細胞に暴露することである。生体適合性物質は、典型的には、中程度の濃度（例えば５０μｇ／１０６細胞）で有意の細胞死（例えば、＞２０％）を招かない。
【００１８】
本明細書において、“生分解性”という用語は、生理的環境中で分解して、細胞によって再使用されうるか又は重大な毒作用なしに廃棄されうるモノマー及び／又はその他の非ポリマー性部分を形成するポリマーのことを言う。分解は、生物的でも（例えば酵素活性又は細胞機構により）又は化学的でもよい。ポリマーの分解は、使用されるポリマー又はコポリマーに応じて様々な速度で起こり得、半減期は日、週、月、又は年の単位となる。
【００１９】
ナノ粒子は血液適合性でもある。血液適合性は、ＩＳＯ  １０９９３−４に従って決定できる。本発明のナノ粒子を含む組成物は、容易に内毒素除去（好ましくは、カブトガニ の血球抽出成分(Limulus Amebocyte Lysate)（ＬＡＬ) 試験により＜２ＥＵ／ｍｌ）であるように調製できる。さらに、空のナノ粒子は低い細胞毒性を示す（がん細胞及び非がん細胞に対して、好ましくはＩＣ５０＞１μＭ、さらに好ましくは＞１０μＭ、さらに好ましくは＞１００μＭ、さらに好ましくは＞１ｍＭ）。
【００２０】
本明細書において、“ナノ粒子”という用語は、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する固体粒子のことを言う。本発明のナノ粒子の平均直径は、当該技術分野で公知の方法によって、好ましくは動的光散乱によって決定できる。特に、本発明は、動的光散乱により、散乱角９０°及び温度２５℃で、ろ過水で適切に希釈されたサンプル及び適切な装置、例えばＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（ＵＫ）製ＺｅｔａｓｉｚｅｒＴＭ装置を用い、標準試験法ＩＳＯ  ２２４１２：２００８（キュムラント法Ａ．１．３．２）に従って分析された場合に、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する固体粒子であるナノ粒子に関する。粒子がｘｎｍの直径を有すると言われる場合、一般的にはこの平均の周りに粒子の分布があるが、粒子の数の少なくとも５０％（例えば、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、又はそれより大）は、範囲ｘ±２０％内の直径を有する。
【００２１】
好ましくは、ナノ粒子の直径は、約１０〜約１０００ｎｍ、さらに好ましくは約５〜約５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜約４００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜約１５０ｎｍである。あるいは、ナノ粒子の直径は約１〜約１００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子は、１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは１％未満の凝集度を示し、好ましくは、ナノ粒子は透過電子顕微鏡法による測定で実質的に非凝集である。
【００２２】
本発明のナノ粒子は、哺乳動物、特にヒト用の許容可能な医薬組成物中に提供できる。それらは典型的にはビヒクル中に提供される。ビヒクルは典型的には液体であり、組成物中で連続相を形成する。従って、本発明の好適な組成物は、組成物の連続相を構成する液体ビヒクル中におけるナノ粒子の分散である。特に、ビヒクルは、投与後、哺乳動物体内の標的への前記ナノ粒子の輸送を可能にするものである。ビヒクルは、当該技術分野で公知のような、任意の製薬学的に許容可能な希釈剤又は賦形剤でよい。ビヒクルは、典型的には、薬理学的に不活性である。好ましくは、ビヒクルは極性液体である。特に好適なビヒクルは、水及び塩を含有する生理学的に許容可能な水溶液及び／又は緩衝液、例えば生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水などである。ビヒクルは生体液であってもよい。液体ビヒクルは、貯蔵のため、又は肺もしくは鼻腔内投与用の粉末、注入（点滴・輸液）用の懸濁液用の粉末、又は経口投与用の錠剤又はカプセルを提供するために、例えば、凍結乾燥、蒸発又は遠心分離によって除去することができる。
【００２３】
ビヒクルの選択は、組成物の意図する投与様式などの因子によって影響される。例えば、固体ビヒクルは、肺又は鼻腔内投与用の粉末、注入用の懸濁液用の粉末、又は経口投与用の錠剤又はカプセルを提供するために使用でき、液体ビヒクルは、静注用の懸濁液、又は鼻腔内投与用の溶液を提供するために使用できる。
【００２４】
好ましくは、ナノ粒子は、組成物の約１％〜約９０重量％を構成する。さらに好ましくは、ナノ粒子は、組成物の約５％〜約５０重量％、さらに好ましくは約１０％〜約３０％を構成する。
【００２５】
本発明のナノ粒子は、薬剤及び薬物送達以外の他の分野、例えば農業、エレクトロニクス、塗料及び接着剤の分野でも利用法を見出すことができる。
【００２６】
ブロックコポリマーは、少なくとも一つのブロックＡと少なくとも一つのブロックＤを含む。複数のブロックＡ及び／又はブロックＤ反復単位がある場合、各ブロックＡ及び／又は各ブロックＤは、ブロックコポリマー全体にわたって同一でも、又はブロックコポリマーは、本明細書における定義の範囲内の異なるタイプのブロックＡ及び／又は異なるタイプのブロックＤを含んでいてもよい。ブロックＡ及びＤが何であるか(identity)の変動(variation)は、モノマーが何であるか(identity)（すなわち化学組成）及び各ブロックの分子量を含む。同様に、任意のブロックＡ中の各モノマーＢ及びＣも、ブロック全体にわたって同一でも、又はブロックは、本明細書における定義の範囲内に入る独立に選ばれたモノマーを含んでいてもよい。ブロックコポリマーはランダムブロックコポリマーでもよい。好適な態様において、コポリマー中の各ブロックＡは同じ化学組成を有し、及び／又は各ブロックＤは同じ化学組成を有する。好ましくは、各ブロックＡは同じ分子量又は分子量分布を有し、及び／又は各ブロックＤは同じ分子量又は分子量分布を有する。
【００２７】
好ましくは、ブロックコポリマーは、Ａが剛性ブロックでＤが柔軟性ブロックの剛性−柔軟性ブロックコポリマーである。ブロックコポリマーは、末端にブロックＡのみ、又はブロックＤのみ、又はブロックＡ及びＤの混合物を持つことができる。好ましくは、ブロックコポリマーは、各末端にブロックＤを持つ。好ましくは、Ａは疎水性ブロックであり、Ｄは親水性ブロックである。
【００２８】
好ましくは、Ａは、式−［（Ｂ−Ｃ）ｎ−Ｂ］−又は−［（Ｃ−Ｂ）ｎ−Ｃ］−を有し、式中、ｎは各ブロックＡのために独立に選ばれる少なくとも１の数的添字である。Ａが式−［（Ｃ−Ｂ）ｎ−Ｃ］−を有する場合、ブロックＡをブロックＤに連結するために、連結基が使用されうる。連結基はジカルボン酸でよい。好ましくは、Ａは式−［（Ｂ−Ｃ）ｎ−Ｂ］−を有する。好ましくは、ｎは少なくとも５、さらに好ましくは５〜２０、さらに好ましくは、５〜１５である。
【００２９】
好ましくは、Ｂは２〜２０個の炭素原子、さらに好ましくは２〜１５個の炭素原子、さらに好ましくは４〜１０の炭素原子を含有する。あるいは、Ｂは、５〜２０個の炭素原子、さらに好ましくは５〜１０個の炭素原子を含有する。好ましくは、Ｂは、直鎖飽和ジカルボン酸である。Ｂは、≧２個の官能基を含有しうる。好ましくは、Ｂは、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸及びセバシン酸を含む群から、好ましくは、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸及びセバシン酸から、さらに好ましくは、グルタル酸及びアジピン酸から選ばれる。一態様において、Ｂは、マレイン酸、フマル酸又はグルタコン酸のような、一つ又は複数の炭素炭素二重結合を含有する直鎖ジカルボン酸である。
【００３０】
好ましくは、Ｃは、≦３０個の炭素原子を含有する、好ましくは４〜１０個の炭素原子を含有する脂肪族ジアミン又はジオールである。好ましくは、Ｃは、２〜１５個、さらに好ましくは好ましくは４〜１０個のの炭素原子を含有する直鎖脂肪族ジオールであり、さらに好ましくは１，８−オクタンジオールである。あるいは、Ｃは、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは４〜１０個の炭素原子を含有する直鎖脂肪族ジアミンである。
【００３１】
好ましくは、ブロックＤは、ポリアルキレングリコール（特にポリエチレングリコール）、ポリアミドアミン、ポリアミン、ポリオール及びそれらの組合せの群から選ばれる。好ましくは、ブロックＤは、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選ばれる。
【００３２】
ポリマーＤの分子量は、好ましくは、１５０〜２０，０００ｋＤａ、さらに好ましくは１５００〜１０，０００ｋＤａ、さらに好ましくは２０００〜３０００ｋＤａである。ポリマーＤの分子量は、好ましくは１５０〜２０，０００Ｄａ、さらに好ましくは１５００〜１０，０００Ｄａ、さらに好ましくは２０００〜３５００Ｄａである。ポリマーＤの分子量は、１５０Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、４００Ｄａ、６００Ｄａ、１０００Ｄａ、１４５０Ｄａ、１５００Ｄａ、３３５０Ｄａ、４０００Ｄａ、６０００Ｄａ又は８０００Ｄａであろう。
【００３３】
ブロックの分子量は、活性薬剤の親和性及びその結果の封入効率、活性薬剤の放出動力学、水の取込み及びナノ粒子分解などのナノ粒子の特性を調節するために選ぶことができる。例えば、ブロックＡとＤの相対的平均長は、ブロックコポリマー中の親水性／親油性比率、従って活性薬剤の放出プロフィールを調節するために変更できる。ある態様において、ｎは５〜２０又は５〜１５であり、ブロックＤは分子量２５００〜５０００Ｄａである。
【００３４】
本発明で使用されるブロックコポリマーは、当該技術分野で公知の従来技術によって合成できる。好適な方法は以下の工程を含む。（ｉ）モノマー単位Ｂをモノマー単位Ｃと、好ましくは、Ｂが得られるブロックＡの末端に位置するような割合で反応させ；（ii）ブロックＡをブロックＤと、好ましくは、Ｄが得られるブロックコポリマーの末端に位置するような割合で反応させてブロックコポリマーを製造する。反応は、例えばエネルギー源としてマイクロ波照射（すなわち、１ｍｍ〜１ｍの波長）の使用によって実施できる。
【００３５】
本発明で使用されるブロックコポリマーは、ナノ粒子の製造に使用できる。該ブロックコポリマーは、ナノ粒子の様々な製造法に使用するのに適切であるという利点を有している。本発明のナノ粒子は、当該技術分野で公知の方法によって製造できる。これは、（ｉ）重合反応を含む形成；及び（ii）予備形成されたコポリマーの分散による形成という二つの主な部門に分割できる。
【００３６】
重合反応を含むナノ粒子の形成は、さらに乳化重合及び界面重合に分類できる。乳化重合は、連続相に応じて有機でも水性でもよい。
【００３７】
予備形成されたコポリマーの分散によるナノ粒子の形成は、下記の技術を含みうる。すなわち、乳化／溶媒蒸発、溶媒置換(solvent displacement)及び界面堆積(interfacial deposition)、乳化／溶媒拡散、及び塩濃度の増大による沈殿である。これらの技術では、まずブロックコポリマーが製造され、その後、さらに加工されてナノ粒子となる。
【００３８】
方法は、ナノ粒子製造のために、界面縮合、超臨界流体加工技術、イオン性ゲル化又はコアセルベーションを利用することができる。
【００３９】
本発明のナノ粒子が活性薬剤を含む場合、活性薬剤はナノ粒子の製造中に存在しうる。典型的には、活性薬剤（単数又は複数）は、ナノ粒子の製造に使用される液体媒体中に存在する。あるいは、又はさらには、活性薬剤（単数又は複数）は、ナノ粒子の製造後に吸収によってそれらに組み込まれてもよい。
【００４０】
好ましくは、ナノ粒子は、溶媒置換及び界面堆積の技術を用い、予備形成されたコポリマーの分散によって形成される。溶媒置換法（Ｆｅｓｓｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ５５，Ｒ１−Ｒ４（１９８９））は、ナノ粒子の形成に使用されている。Ｂｉｌａｔｉら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２４，６７−７５（２００４））は、この方法によって親水性薬物の封入を達成するために取られた手法について述べている。
【００４１】
溶媒置換法は、高撹拌速度、超音波処理又は非常に高温を必要としない。例えば、２５℃で５０〜１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは約１００ｒｐｍの撹拌速度で実施できる。それは、油性−水性界面が存在しないことを特徴とするので、活性薬剤を損なう恐れを低減する。その手順は、界面活性剤を使用せず、有毒であるがゆえに許容限界を超えた残渣がナノ粒子中に残留すると製薬及び獣医学的用途に不適合となる有機溶媒も使用せずに実施できる。
【００４２】
溶媒置換法は、拡散媒及び分散媒で構成される混和性の二つの溶媒を使用する。好ましくは、コポリマー及び活性薬剤（単数又は複数）（存在する場合）は、拡散媒（典型的には“溶媒”と呼ばれる）に可溶性であるが、どちらも分散媒（典型的には“非溶媒”と呼ばれる）には可溶性でない。コポリマー及び任意に活性薬剤（単数又は複数）を拡散媒に溶解し、得られた溶液を分散媒に加える。任意に、分散媒は界面活性剤を含んでいてもよい。拡散媒が分散媒中に拡散するや否や、コポリマーの急速脱溶媒によってナノ沈殿が生じ、活性薬剤がコポリマー内に位置するナノ粒子が形成される。拡散媒は、好ましくは、工程に気液界面の導入を避けるために、例えばシリンジによって分散媒に直接添加される。ナノ粒子を分散媒及び拡散媒から分離するための様々な方法が利用できる。例えば、凍結乾燥、接線型ろ過(tangential filtration)、遠心分離及び超遠心分離、又はこれらの方法の組合せなどである。場合によっては、例えばナノ粒子が大きい場合、遠心分離が好適である。場合によっては、例えば大量バッチの製造においては、ナノ粒子組成物は接線型ろ過によって濃縮された後、凍結乾燥される。好ましくは、分散媒及び拡散媒は、遠心分離又は回転蒸発によって除去される。粒子は任意に溶媒中に再懸濁されて、接着した活性薬剤をナノ粒子表面から除去してもよい。この溶媒は更なる遠心分離工程によって除去できる。ナノ粒子は、最終的には適切な極性液体中に再懸濁できる。
【００４３】
従って、本発明のナノ粒子を製造するための好適な方法（溶媒置換法）は、
ｉ）ブロックコポリマーと活性薬剤（単数又は複数）（存在する場合）を拡散媒に溶解して第一の溶液を形成し；
ii）前記第一の溶液を分散媒と混合して、前記ブロックコポリマーと前記活性薬剤（単数又は複数）（存在する場合）を含む沈殿ナノ粒子、及び拡散媒と分散媒を含む液相を形成させ；そして
iii）ナノ粒子を液相から分離する
ことを含み、
ここで、拡散媒は、ブロックコポリマーと活性薬剤（単数又は複数）（存在する場合）が可溶性である溶媒を含み、分散媒は、ブロックコポリマーと活性薬剤（単数又は複数）（存在する場合）が不溶性である溶媒を含み、そして拡散媒と分散媒は混和性である。
【００４４】
本発明のナノ粒子は、封入のための活性薬剤が存在していても又はしていなくても合成できる。ブロックコポリマーは、十分に疎水性なので水に不溶であり、ナノ粒子形成のための適切な水素結合が、活性薬剤ともそれ自体とも可能である。
【００４５】
本発明の組成物を製造するための好適な方法は、ナノ粒子を製造するための前記方法を含み、さらに、
iv）ナノ粒子をビヒクル中に再懸濁させる
工程を含む。
【００４６】
本発明はさらに、本明細書中に定義のナノ粒子及び組成物の製造法も提供し、該方法は、活性薬剤（単数又は複数）を含む少なくとも一つの液体媒体（好ましくは、活性薬剤（単数又は複数）はその中に溶解されている）の使用を含む。
【００４７】
本明細書中に記載の溶媒置換法は、工程のパラメーター及びその中で使用される成分の性質を選択することによって、ナノ粒子の性質を調節することができる。特に、ナノ粒子サイズ、多分散性、ゼータ電位、活性薬剤封入効率、活性薬剤取込み、活性薬剤（単数又は複数）の放出プロフィール及びナノ粒子の分解プロフィールを制御できる。ゼータ電位は、好ましくは−４５ｍＶ〜＋２０ｍＶ、さらに好ましくは約−４０ｍＶ〜約−２０ｍＶである。あるいは、ゼータ電位は、−２０ｍＶ〜＋２０ｍＶであろう。
【００４８】
本明細書において、活性薬剤封入効率とはナノ粒子中に組み込まれる活性薬剤のことで、活性薬剤含有ナノ粒子の製造法に使用される全活性薬剤の重量パーセンテージとして表される。典型的には、９５％を含むそれ以下、さらに典型的には７０％〜９５％である。
【００４９】
本明細書において、活性薬剤取込みとは、活性薬剤担持(active agent-loaded)ナノ粒子中の活性薬剤の重量パーセンテージのことを言う。活性薬剤取込みは、好ましくは少なくとも２ｗｔ％、さらに好ましくは少なくとも５ｗｔ％、さらに好ましくは少なくとも１０ｗｔ％、及び典型的には２ｗｔ％〜２０ｗｔ％、さらに好ましくは５ｗｔ％〜２０ｗｔ％、さらに好ましくは１０ｗｔ％〜２０ｗｔ％の範囲である。
【００５０】
高い活性薬剤取込みを可能にするのは、本発明のナノ粒子の製造に使用されるブロックコポリマーの利点である。活性薬剤の取込みは、他のナノ粒子でこれまでに示されているそれより大きい。例えば、本発明のナノ粒子を溶媒置換法で製造した場合、活性薬剤の取込みは１〜１０ｗｔ％、又は２〜５ｗｔ％であるが、溶媒置換法による当該技術分野で公知のナノ粒子の製造は、〜１ｗｔ％の取込みしか可能にしない。好ましくは、活性薬剤取込みは＞４ｗｔ％である。本発明のナノ粒子が二重エマルション法によって製造された場合、活性薬剤の取込みは、典型的には少なくとも５ｗｔ％、好ましくは少なくとも１０ｗｔ％である。これに対し、二重エマルション法による他の材料からのナノ粒子の製造は、約３〜４ｗｔ％の活性薬剤取込みしか提供しない。
【００５１】
本発明のナノ粒子は、高い活性薬剤含有量（例えば＞５％）及び高い封入効率（例えば７０〜９５％）で形成できる。
【００５２】
様々な非溶媒、溶媒：非溶媒比、ポリマー濃度、溶解薬物のパーセンテージ、及び媒体からのナノ粒子の分離法を使用することにより、これらの性質を調節することができる。
【００５３】
溶媒は、ポリマー及び活性薬剤（存在する場合）が可溶性の液体から適切に選ばれる。好ましくは、極性、非プロトン性溶媒である。好適な溶媒は、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドン、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、又はそれらの混合物などである。非溶媒は、ポリマー及び活性薬剤（単数又は複数）（存在する場合）が不溶性の液体から適切に選ばれる。好適な非溶媒は、水、メタノール及びエタノール、又はそれらの混合物などである。欧州医薬品庁ガイドライン参照番号(European Medicines Agency Guidelines Reference Number）ＥＭＡ／ＣＨＭＰ／ＩＣＨ／８２２６０／２００６において許容可能と見なされる任意の物質が溶媒又は非溶媒として使用できる。活性薬剤が溶けないｐＨを得るために緩衝液を使用してもよい。非溶媒の素生(identity)は得られるナノ粒子のサイズに影響する。溶媒及び非溶媒は、好ましくは、１：１〜１：５０の溶媒：非溶媒、さらに好ましくは１：２〜１：２０、さらに好ましくは１：１０の体積比で存在する。
【００５４】
拡散媒中のブロックコポリマーの濃度は制限されない。しかしながら、好ましくは、１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍｌの濃度である。ポリマー濃度が高すぎると、ナノ粒子の形成を妨害しうる。
【００５５】
拡散媒又は分散媒中の活性薬剤、又は各活性薬剤（二つ以上存在する場合）の濃度は、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍｌである。活性薬剤の濃度が高いほど、高い活性薬剤封入効率及び高い活性薬剤取込みが得られる。
【００５６】
ナノ粒子を製造するための更なる方法は、
ｉ）ブロックコポリマーを水非混和性溶媒中に溶解し；
ii）活性薬剤（存在する場合）を水混和性溶媒中に溶解し；
iii）油中水エマルションを形成させ；そして
iv）第一の溶媒を蒸発させてナノ粒子を形成させる
ことを含む。ここで、水非混和性溶媒と水混和性溶媒は非混和性である。
【００５７】
ナノ粒子を製造するための更なる方法（二重エマルション法）は、
ｉ）ブロックコポリマーを水非混和性溶媒中に溶解し；
ii）活性薬剤（存在する場合）を水混和性溶媒中に溶解し；
iii）油中水エマルションを形成させ；
iv）前記油中水エマルションを、ポリマー性界面活性剤を含有する水混和性溶媒中に分散させ；
ｖ）水中油中水エマルションを形成させ；そして
vi）水中油中水エマルションをろ過してナノ粒子を得る
ことを含む。ここで、水非混和性溶媒と水混和性溶媒（単数又は複数）は非混和性である。
【００５８】
ナノ粒子を製造するための更なる方法（改変二重エマルション法）は、下記の工程を含む。
【００５９】
ｉ）ブロックコポリマーを水非混和性溶媒中に溶解し；
ii）活性薬剤（存在する場合）を水混和性溶媒中に溶解し；
iii）水中油エマルションを形成させ；
iv）前記水中油エマルションを、ポリマー性界面活性剤を含有する水非混和性溶媒中に分散させ；
ｖ）油中水中油エマルションを形成させ；そして
vi）油中水中油エマルションをろ過してナノ粒子を得る。
ここで、水非混和性溶媒と水混和性溶媒（単数又は複数）は非混和性である。
【００６０】
本明細書において、“活性薬剤”は、動物に投与したときに生物学的効果をもたらす生物活性部分又は治療的部分を意味する。哺乳動物体内への送達が望ましいあらゆる活性薬剤は、本発明のナノ粒子との結合、又はその中への組込みが想定される。本発明のナノ粒子は、一つ又は複数の活性薬剤を含むことができ、一態様においては一つの活性薬剤のみを含む。活性薬剤は親油性でも又は親水性でもよく、天然又は合成の有機又は無機実体、タンパク質（抗体、抗体フラグメント及びインターフェロンを含む）、ペプチド、核酸、脂質又は多糖でありうる。好ましくは、少なくとも一つの活性薬剤は、パクリタキセル及びドセタキセルを含む群から選ばれる。好ましくは、少なくとも一つの活性薬剤はパクリタキセルを含む。
【００６１】
本発明のナノ粒子が活性薬剤を組み込んでいる場合、前記ナノ粒子は、好ましい特性、例えば活性薬剤単独と比べて同様か又は高い効果を示す。活性薬剤が、例えばパクリタキセルのような細胞毒性薬の場合、ナノ粒子は、同様の又は高い抗腫瘍活性を示すが、健常細胞に対しては同様の又は低減された毒性しか示さない。
【００６２】
ナノ粒子が溶媒置換法によって製造される場合、活性薬剤の素生(identity)は、拡散媒中でのその溶解度によってのみ制限される。溶解度が高すぎるとナノ粒子に組み込まれない。しかしながら、本発明のナノ粒子の製造に使用されるブロックコポリマーの利点は、封入できる薬物の範囲を拡大できることである。従って、活性薬剤は、好ましくは−１．０〜＋５．６のｌｏｇＰ値を有する。例えば、＋３．０〜＋５．６のｌｏｇＰ値を有する疎水性活性薬剤が本発明に使用できる。−１．０〜＋３．０のｌｏｇＰ値を有する親水性活性薬剤も使用できる。
【００６３】
ナノ粒子は、二つ以上の活性薬剤の組合せを含みうる。例えば、二つ以上の活性薬剤をナノ粒子内に組み込んでも、及び／又は二つ以上の活性薬剤をナノ粒子の表面に接着させてもよい。第一の活性薬剤（又は第一の活性薬剤混合物）を含むナノ粒子と第二の活性薬剤（又は第二の活性薬剤混合物）を含むナノ粒子の混合物も本発明の範囲内である。
【００６４】
ナノ粒子は、第一の活性薬剤画分と第二の活性薬剤画分を含むことができる。第一の活性薬剤画分はナノ粒子内に組み込むことができ、第二の活性薬剤画分はナノ粒子の表面上に吸着させることができる。活性薬剤又は活性薬剤画分は特異的放出プロフィールを有しうる。例えば、それは、即時放出、非即時放出又は遅延放出でありうる。好ましくは、放出速度は、放出期間の少なくとも８０％、さらに好ましくは放出期間の少なくとも９０％にわたってほぼゼロ次である（すなわち時間に依存しない）。
【００６５】
ナノ粒子からの活性薬剤の放出プロフィールは、透析法によって決定できる。例えば、１Ｍのサリチル酸ナトリウムを含有する水性媒体において、１ｍｌの活性薬剤担持ナノ粒子溶液（０．１ｍｇの活性薬剤を含有）を透析バッグ（ＭＷＣＯ  １４０００Ｄａ、透析法により１Ｍのサリチル酸ナトリウム含有）に導入し、端部を密封した透析バッグを３７℃の１Ｍサリチル酸ナトリウム溶液５０ｍｌ中に１００ｒｐｍで撹拌しながら９６時間、完全に沈める。適当な時間間隔で０．２ｍｌの分量を抜き取り、等体積の新鮮媒体で置換する。サンプル中の活性薬剤の濃度をＨＰＬＣにより体積置換に対する補正をして測定した。
【００６６】
“即時放出”という用語は、例えば、１２時間後、活性薬剤又は活性薬剤画分の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％が放出されていることを示す。あるいは、２４時間後、活性薬剤又は活性薬剤画分の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％が放出されていることを示してもよい。
【００６７】
“非即時放出”という用語は、例えば、１２時間後、活性薬剤又は活性薬剤画分の５０％未満、好ましくは７０％未満、さらに好ましくは９０％未満が放出されていることを示す。あるいは、２４時間後、活性薬剤又は活性薬剤画分の５０％未満、好ましくは７０％未満、さらに好ましくは９０％未満が放出されていることを示してもよい。
【００６８】
“遅延放出”という用語は、例えば、２４時間後、活性薬剤又は活性薬剤画分の５０％未満、好ましくは４０％未満、さらに好ましくは３０％未満が放出されていることを示す。あるいは、４８時間後、活性薬剤又は活性薬剤画分の５０％未満、好ましくは４０％未満、さらに好ましくは３０％未満、なおさらに好ましくは２０％未満が放出されていることを示してもよい。
【００６９】
第一の活性薬剤画分は、第二の活性薬剤画分とは異なる放出プロフィールを有していてもよい。例えば、第一の活性薬剤画分は遅延放出画分であり、第二の活性薬剤画分は即時放出画分であるか、又はその逆である。第一の活性薬剤画分に含まれる活性薬剤（単数又は複数）は、第二の活性薬剤画分に含まれる活性薬剤（単数又は複数）と同じでも異なっていてもよい。
【００７０】
例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子内に組み込まれた第一の活性薬剤画分と、ナノ粒子の表面上に吸着された第二の活性薬剤画分を含みうる。ここで、第一の活性薬剤画分と第二の活性薬剤画分は同じ活性薬剤を含む。この場合、第一の活性薬剤画分は遅延放出画分であり、第二の活性薬剤画分は即時放出画分でありうる。この場合、好ましくは遅延放出画分の３０％未満は４８時間後に放出される。
【００７１】
第一の活性薬剤画分と第二の活性薬剤画分が同じ活性薬剤（単数又は複数）を含む場合、第一の活性薬剤画分対第二の活性薬剤画分の比率（ｗｔ：ｗｔ）は、２０：１〜１：１、１０：１〜１：１、２：１〜１：１、１：１〜２：１、１：１〜１０：１又は１：１〜２０：１でありうる。
【００７２】
あるいは、（ｉ）特定の活性薬剤放出プロフィールを有するナノ粒子と、（ii）異なる活性薬剤放出プロフィールを有するナノ粒子の混合物も、本発明の範囲内である。異なる放出プロフィールを有するナノ粒子は、異なる活性薬剤（単数又は複数）を含んでいても又は同じ活性薬剤（単数又は複数）を含んでいてもよい。
【００７３】
本発明はさらに、本明細書中に定義の一つ又は複数の活性薬剤を含むナノ粒子の製造法も提供し、前記方法は、下記の工程を含む。
【００７４】
ｉ）ナノ粒子を製造し；
ii）前記ナノ粒子を活性薬剤の濃縮溶液とインキュベートし；そして
iii）前記活性薬剤を含むナノ粒子を液相から分離する。
【００７５】
本発明はさらに、ナノ粒子が一つ又は複数の活性薬剤を含む本発明の組成物の製造法も提供し、前記方法は、下記の工程を含む。
【００７６】
ｉ）ナノ粒子を製造し；
ii）前記ナノ粒子を活性薬剤の濃縮溶液とインキュベートし； 
iii）前記活性薬剤を含むナノ粒子を液相から分離し；そして
iv）ナノ粒子をビヒクル中に再懸濁させる。
【００７７】
本発明のナノ粒子は、その薬理学的特性を調節する目的のために、一つ又は複数の表面改質剤を都合よく含むことができる。本発明での使用が想定される表面改質剤は、診断薬、標的化剤、イメージング剤及び治療薬などである。正電荷を持つ表面改質剤が使用できる。表面改質剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、脂肪酸、脂質、並びに天然及び合成小分子でありうる。異なる表面改質剤を含むナノ粒子の混合物も本発明の範囲内である。
【００７８】
（ｉ）表面改質剤、例えば血液脳関門の標的化剤である表面改質剤を含むナノ粒子と、（ii）表面改質剤を含まないナノ粒子の混合物も本発明の範囲内である。そのような混合物は、脳の二次性腫瘍と肺又は乳房のような身体の別の部分の原発腫瘍の両方の治療に使用することができる。
【００７９】
標的化剤は、ナノ粒子を、所望の標的、細胞、組織又はバイオマーカーに向かわせ、細胞表面上の疾患関連バイオマーカーを認識することができる。それらは、シグナルペプチド、抗体及びアプタマーなどでありうる。標的化剤は標的に応じて変動し、適切な標的化剤は当業者には容易に利用可能である。好適な標的化剤は、チオール化ポリマー（例えば粘膜接着を改良するため）、血液脳関門（ＢＢＢ）シグナルペプチド及び細胞接着ペプチド、例えばこれらに限定されないが、ＲＧＤ、ＲＧＤＣ、ＲＧＤＶ及びＲＧＤＳペプチド（例えばインテグリン受容体を標的化するため）などである。表面改質剤は、ペプチド、好ましくは配列番号１であろう。
【００８０】
本発明のナノ粒子はＢＢＢを越えることができる。本発明のナノ粒子がＢＢＢシグナルペプチドである表面改質剤（すなわち標的化剤）を含む場合、シグナルナノ粒子はナノシャトルとして働き、多様な活性薬剤部分をＢＢＢの向こう側に送達することができる。好適なＢＢＢシグナルペプチドは、表１に１文字コードで示された配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８を含むペプチドなどである（５−ＴＡＭＲＡは５−カルボキシテトラメチルローダミンを表し；ＢＩＯはビオチンを表し、ＣＡＲＢはサッカリドを表す）。
【００８１】
【表１】
2014518862.tif 000002
【００８２】
診断薬及びイメージング剤は、造影剤、磁気材料、感光剤、放射性標識、及び蛍光化合物、例えばカルボキシフルオレセインなどである。そのような薬剤はインビトロ及びインビボにおける生体内分布試験のために使用できる。本発明のナノ粒子の脳への送達はそのような試験によって実証されている。例えば、インビボにおける生体内分布試験で、表面改質剤を含むパクリタキセル担持ナノ粒子が脳で検出されている。さらに、蛍光標識ナノ粒子は、血液脳関門を模擬する細胞試験で使用できる。
【００８３】
表面改質剤の更なる例はビオチンである。
【００８４】
表面改質剤は、予備形成されたナノ粒子との接触、又はナノ粒子形成前のブロックコポリマー又はその構成ポリマーもしくはモノマーの一つとの接触によって、ナノ粒子の中又は上に導入できる。表面改質剤とナノ粒子又はブロックコポリマーとの結合は、共有結合、静電相互作用又は特異的もしくは非特異的吸着によるものであろう。
【００８５】
従って、本発明のナノ粒子は、それに結合されうる表面改質剤の範囲内で特に多用途である。
【００８６】
本発明の好適な態様において、表面改質剤は、カップリング剤を介してナノ粒子又はブロックコポリマーの中又は上に導入される。従って、本発明の更なる側面によれば、本明細書中に定義のナノ粒子は、ナノ粒子の中又は上に導入されたカップリング剤を有する。カップリング剤は、目的とする表面改質剤とナノ粒子との結合を可能にする。典型的には、表面改質剤をナノ粒子と結合させる場合、カップリング剤のすべて又は一部は保持される。
【００８７】
表面改質剤は、ナノ粒子の形成前又は後にブロックコポリマーに結合させることができる。表面改質剤がナノ粒子形成前のブロックコポリマーに結合されたペプチドの場合、それは典型的には溶媒置換法によって形成されたナノ粒子の表面上に位置する。表面改質剤が疎水性でナノ粒子形成前のブロックコポリマーに結合している場合、それは典型的には溶媒置換法によって形成されたナノ粒子内に位置する。放射性標識のような表面改質剤は、ナノ粒子内に位置するのが有益であろう。
【００８８】
好ましくは、ナノ粒子は、スルフヒドリル反応基を含有するカップリング剤が結合している改質ポリマーを含むブロックコポリマーから形成される。あるいは、ナノ粒子は、表面改質剤が結合している改質ポリマーを含むブロックコポリマーから形成される。
【００８９】
ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰ及び改質ポリマーＰ’から形成できる。改質ポリマーＰ’は、ブロックコポリマーＰと式（Ｉ）：
【００９０】
【化１】
2014518862.tif 000003
【００９１】
の改質ＰＥＧとの反応によって形成される。
【００９２】
式（Ｉ）の改質ＰＥＧの末端ヒドロキシルは、ブロックコポリマーＰのブロックＡと反応し、Ｐを切断して、末端スルフヒドリル基とＰより低い分子量とを有する改質ポリマーＰ’を形成する。末端“スルフヒドリル”は、当該技術分野で公知の方法又は以下に開示された方法に基づく方法によって、ナノ粒子形成前又は後に表面改質剤と結合できる。
【００９３】
カップリング剤は、ブロックコポリマー（又はナノ粒子中に存在する場合そのブロックコポリマー）に、可逆的又は非可逆的方法によって導入できる。以下のスキーム１〜４において、“ポリマーＰ”という用語は、ナノ粒子形成前又は後のブロックコポリマーを表す。
【００９４】
好適な可逆的方法において、式（Ｉ）の化合物はポリアルキレングリコールリンカーを提供し、２，２’−ジピリジルジスルフィドは、スルフヒドリル基を含有する化合物に可逆的に結合できる末端ピリジン−２−イルジスルファニル基を提供する。
【００９５】
ブロックコポリマーがジオール又はジアミン基を末端に持つブロックＡを末端に持つ場合、式（II）の化合物を２，２’−ジピリジルジスルフィドと反応させ、得られた化合物をブロックコポリマーに直接結合させる。以下のスキーム１で詳述するとおり、ブロックコポリマーは末端ピリジン−２−イルジスルファニル基を保持する。
【００９６】
【化２】
2014518862.tif 000004
【００９７】
ブロックコポリマーがジカルボン酸基を末端に持つブロックＡを末端に持つ場合、式（II）の化合物を最初にポリアルキレングリコールと反応させた後、ピリジン−２−イルジスルファニル基で改質する。次に、これは、以下のスキーム２で詳述するとおり、ポリアルキレングリコールセグメントを通じてブロックコポリマーに結合する。この場合、ポリアルキレングリコールはＰＥＧである。
【００９８】
【化３】
2014518862.tif 000005
【００９９】
スキーム１又は２のようにカップリング剤を結合させたら、例えばスルフヒドリル基を含む目的とする表面改質剤を、末端ピリジン−２−イルジスルファニル基との反応によってピリジン−２−チオンを置換してブロックコポリマーに結合させる。
【０１００】
好適な非可逆的方法は、式IIIのポリアルキレングリコール化カルボン酸保持マレイミドに基づく。
【０１０１】
【化４】
2014518862.tif 000006
【０１０２】
ブロックコポリマーがヒドロキシル又はアミノ基を末端に持つブロックＡを末端に持つ場合、ブロックコポリマーは、以下のスキーム３にヒドロキシル末端ブロックコポリマーについて例示されているように、式（III）の化合物と直接反応できる。
【０１０３】
【化５】
2014518862.tif 000007
【０１０４】
ブロックコポリマーがカルボン酸基を末端に持つブロックＡを末端に持つ場合、反応は以下のスキーム（４）に従って進行する。ポリアルキレングリコール化マレイミド上のカルボン酸部分をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化させ、エタノールアミンと反応させ、その後ブロックコポリマーに結合させる。
【０１０５】
【化６】
2014518862.tif 000008
【０１０６】
スキーム３又は５のようにカップリング剤を結合させたら、例えばスルフヒドリル基を含む目的とする表面改質剤を、マレイミドの炭素炭素二重結合との反応によってブロックコポリマーに結合させる。
【０１０７】
上記スキーム中、ｍは、１以上、好ましくは１〜８、さらに好ましくは２〜５、最も好ましくは２の数的添字であり；ｐは、１より大、好ましくは２〜２０、さらに好ましくは４〜１０、最も好ましくは７の数的添字であり；そしてｑは、１より大、好ましくは１０〜４５０、さらに好ましくは４５〜７０の数的添字である。
【０１０８】
そこで、本発明は、以下のスキーム５に示すように、カップリング剤の全部又は一部によって接続された一つ又は複数の表面改質剤を含むナノ粒子（ＮＰ）を提供する。スキーム中、ＮＰは、ブロックコポリマーと、それに組み込まれた又は封入された一つ又は複数の活性薬剤と、又は活性薬剤なしで、好ましくは活性薬剤とを含むナノ粒子を表し、ＳＭＡは一つ又は複数の表面改質剤を表す。
【０１０９】
【化７】
2014518862.tif 000009
【０１１０】
発明者らはさらに、本発明のナノ粒子の表面を迅速及び効果的に改質する方法も開発した。これにより、より広範囲の標的を認識させるために、より広範囲の表面改質剤をナノ粒子と結合させることが可能になる。方法は、式（IV）の基を含むカップリング剤を利用する。これは、予備形成されたナノ粒子との接触、又はナノ粒子形成前のブロックコポリマー又はその構成ポリマーもしくはモノマーの一つとの接触によって、ナノ粒子の中又は上に導入できる。
【０１１１】
【化８】
2014518862.tif 000010
【０１１２】
本発明のナノ粒子への式（IV）の基の結合は、当該技術分野で公知の方法によって達成できる。好適な方法においては、ナノ粒子を凍結乾燥工程後にコールドプラズマを用いて処理し、ナノ粒子の表面上にラジカルを作り出し、該表面に式（IV）の基をグラフトする。あるいは、ナノ粒子をコアシェル法を用いたエマルション法によって形成させる。次に過硫酸塩のようなラジカル開始剤を用いて、予備形成されたナノ粒子表面上の基をペンタフルオロフェニルメタクリレートと反応させて、ナノ粒子のシェル上に式（IV）の基を形成させる。別の好適な方法において、モノマー単位Ｂの少なくとも一つは一つ又は複数の炭素炭素二重結合を含むので、これをペンタフルオロフェニルメタクリレートと反応させて、式（IV）の基をナノ粒子の表面に、それらの形成後にグラフトしてもよい。
【０１１３】
式（IV）の基は、ナノ粒子と目的とする表面改質剤との間に共有結合を促進するための反応性エステル官能基を提供する。特に、方法は、アミン部分を含有する表面改質基をナノ粒子に共有結合させるのに使用できる。特に好適な表面改質は、粘膜接着を改良するためのチオール化ポリマーによるもの、取込みをモニターするための蛍光色素分子によるもの、又は標的化のためのＢＢＢシグナルペプチドもしくはＲＧＤ誘導体によるものである。このように、本発明は特に、本明細書中に定義のナノ粒子及び組成物を提供し、そのナノ粒子はそれに共有結合された式（III）のカップリング剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、本発明の例示的ブロックコポリマーの合成工程を示す。
【図２】図２は、非溶媒（水、メタノール、エタノール）、溶媒：非溶媒比（１：２０、１：１０、１：２）及びポリマー濃度（５０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ）の変動がナノ粒子サイズに及ぼす影響を示す。
【図３】図３は、ブロックコポリマー（Ｐ）、及び表面改質剤と任意にカップリング剤のすべて又は一部が結合したブロックコポリマー（２Ｐ）からのナノ粒子（Ｎ）の形成を示す。
【図４Ａ】図４は、異なる濃度の空のナノ粒子（ＮＮＰ）、パクリタキセル、及びパクリタキセル担持ナノ粒子（パクリタキセル−ＮＮＰ）が、１４日間のコロニー形成後ＣＧＬ−１細胞に及ぼす影響を示す。
【図４Ｂ】図４は、異なる濃度の空のナノ粒子（ＮＮＰ）、パクリタキセル、及びパクリタキセル担持ナノ粒子（パクリタキセル−ＮＮＰ）が、１４日間のコロニー形成後ＣＧＬ−１細胞に及ぼす影響を示す。
【図４Ｃ】図４は、異なる濃度の空のナノ粒子（ＮＮＰ）、パクリタキセル、及びパクリタキセル担持ナノ粒子（パクリタキセル−ＮＮＰ）が、１４日間のコロニー形成後ＣＧＬ−１細胞に及ぼす影響を示す。
【図５Ａ】図５は、異なる濃度のＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰが、２１日間のコロニー形成後ＬＮ−２２９細胞に及ぼす影響を示す。
【図５Ｂ】図５は、異なる濃度のＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰが、２１日間のコロニー形成後ＬＮ−２２９細胞に及ぼす影響を示す。
【図５Ｃ】図５は、異なる濃度のＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰが、２１日間のコロニー形成後ＬＮ−２２９細胞に及ぼす影響を示す。
【図６Ａ】図６は、異なる濃度のＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰが、１４〜２１日間のコロニー形成後Ｕ−８９７ＭＧ細胞に及ぼす影響を示す。
【図６Ｂ】図６は、異なる濃度のＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰが、１４〜２１日間のコロニー形成後Ｕ−８９７ＭＧ細胞に及ぼす影響を示す。
【図７Ａ】図７は、正常ヒトアストロサイト（ＮＨＡ）に対するＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図７Ｂ】図７は、正常ヒトアストロサイト（ＮＨＡ）に対するＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図７Ｃ】図７は、正常ヒトアストロサイト（ＮＨＡ）に対するＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図８Ａ】図８は、正常ヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰ）に対するＮＮＰ、ＤＭＳＯ中パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図８Ｂ】図８は、正常ヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰ）に対するＮＮＰ、ＤＭＳＯ中パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図９Ａ】図９は、不死化ヒト神経前駆細胞（ＲｅｎＣｅｌｌ）に対するＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図９Ｂ】図９は、不死化ヒト神経前駆細胞（ＲｅｎＣｅｌｌ）に対するＮＮＰ、パクリタキセル、及びパクリタキセルＮＮＰの毒性を示す。
【図１０】図１０は、本発明の代表的ナノ粒子からのパクリタキセルの放出プロフィールを示す。
【実施例】
【０１１５】
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。当然のことながら、実施例は説明のためだけに提供されるものであり、上記の本発明を制限する意図はないことは理解されるであろう。詳細の修正は本発明の範囲を逸脱することなくなされうる。
【０１１６】
実施例１
１２ｇのグルタル酸（０．０９モル）と１１．１ｇの１，８−オクタンジオール（０．０８モル）を電子レンジ（マイクロ波オーブン）（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＣＥＭ）中で出力１００Ｗで１時間反応させる。作業は真空下（１００ｍｂａｒ）で実施され、圧縮空気による系の冷却によって温度を一定の１２０℃に維持する。こうして硬質ブロックが生成する。
【０１１７】
次に、この硬質ブロックを、２０００ポリエチレングリコール（Ｍｗ  ２０００Ｄａ；６．５ｇ、３ｍＭ）と、同じマイクロ波反応器にて、２４０分間、出力１００Ｗ、１２０℃、真空下、及び圧縮空気による冷却とともに反応させる。このようにして、１０ｇのブロックバイオポリマーを得る。
【０１１８】
実施例２
拡散媒はアセトンで、その中に実施例１のブロックコポリマーを１０、２０及び５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、そしてパクリタキセルをブロックコポリマーの３重量％の量で溶解した。分散媒は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、メタノール又はエタノールを含んでいた。
【０１１９】
拡散媒を分散媒に１：２、１：１０又は１：２０の比率及び５０μｌ／分の流速で加えた。添加法としては、シリンジポンプによって制御されているシリンジにより、針を媒体中に直接配置し、１３０ｒｐｍの磁気撹拌下、２５℃で実施した。次に、得られたナノ懸濁液を６０００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、分散媒、取り込まれなかった何らかのパクリタキセル、及び拡散媒を徐々に除去した。上清を廃棄し、ペレットをＭｉｌｌｉ−Ｑ水（１５ｍｌ）中に再懸濁した後、最終洗浄工程で、再度同じ条件下で遠心分離した。上清は廃棄し、ペレットは溶液中に貯蔵されても又は水中に再分散させて凍結乾燥後に貯蔵されてもよい。
【０１２０】
遠心分離され貯蔵されたナノ粒子は膨潤し、貯蔵５日後に膨潤平衡に達するまでサイズが増大する。ナノ粒子は貯蔵１５日後に特徴付けされた。
【０１２１】
実施例３
実施例２で製造されたナノ粒子のサイズ及び多分散性を、動的光散乱により、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用い、散乱角９０°及び温度２５℃で、ろ過水で適切に希釈されたサンプルを用いて分析した。結果を表２に示す。
【０１２２】
【表２】
2014518862.tif 000011
【０１２３】
実施例４
実施例２．６で製造されたナノ粒子のゼータ電位を、電気泳動移動度からゼータ電位値を得るために、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｙ定数１．５を用い、電気泳動分析装置にて分析した。ゼータ電位は−３５〜−４０ｍＶの範囲であることが分かった。
【０１２４】
実施例５
実施例２で製造されたナノ粒子の、活性薬剤封入効率、活性薬剤取込み、活性薬剤放出プロフィール及び動力学的分解プロフィールを、ＨＰＬＣ分析により、逆相Ｃ−１８カラムを用い、アセトニトリル／水（７０／３０  ｖ／ｖ）で定組成溶離して決定した。流速は１ｍｌ／分に固定し、検出は２２７ｎｍにおけるＵＶ検出によって得た。表３に、活性薬剤封入効率及び活性薬剤取込みデータを示す。
【０１２５】
【表３】
2014518862.tif 000012
【０１２６】
実施例６．１：グリオーマ細胞における細胞毒性
グリオーマ細胞株に対する装飾パクリタキセル担持ナノ粒子の毒性を、パクリタキセル及び空のナノ粒子のそれと比較して観察するためにクローン原性アッセイ(clonogenic assay)を実施し、長期作用（２〜３週間の増殖）におけるＩＣ５０値を決定した。表面改質剤（配列番号５）あり又はなしのナノ粒子を、実施例２の方法に従い、パクリタキセルを含めて又は含めずに形成した。
【０１２７】
３種類の細胞株を使用した。ＣＧＬ−１細胞株（Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ，フランス・ディジョン）は、ヌードラットに皮下（ＳＣ）移植されたＴＧ−１腫瘍から単離された。コロニー形成のために１４日間放置された。ヒトＵ−８７  ＭＧ細胞株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）は、４４歳の白人女性のグレードIIIグリア芽腫由来であった。コロニー形成のために２１日間放置された。最後に、ＬＮ−２２９細胞株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）は、１９７９年に右前頭頂後頭葉グリア芽腫患者から採取した細胞から確立された。コロニー形成のために１４〜２１日間放置された。
【０１２８】
試験された製剤は次の通りであった。ナノ粒子（ストック溶液  ＮａＣｌ  ０．９％）；パクリタキセル担持ナノ粒子（３．３３重量％のパクリタキセル；ストック溶液  ＮａＣｌ  ０．９％）；及びパクリタキセル（ストック溶液  ＤＭＳＯ  １００％）。全試験物質をそれぞれのビヒクル中で１００μＭに希釈してストック溶液を得た。５つの濃度（１：５又は１：３の段階希釈）を三つ組で使用した。製剤は１００μＭのストック溶液をそれぞれのビヒクル中に希釈して５つの濃度のシリーズを１：５又は１：３の段階希釈で得た。次に、各溶液をさらにＲＰＭＩ  １６４０で１：２０に希釈し、その後、軟寒天中に１：１０に最終希釈した。
【０１２９】
試験された初期濃度は、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ及び５００ｎＭであった。繰返しは、ＧＣＬ−１では、２ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ及び１０００ｎＭ、ＬＮ−２２９では、１．２ｎＭ、３．７ｎＭ、１１ｎＭ、及び３３ｎＭで実施された。少なくとも２回の独立した実験を最高濃度で実施し、段階希釈は、必要な場合、変更した。細胞は、異なる処理とともに１４〜２１日間インキュベートされた。
【０１３０】
結果は表４に示されており、初期３００クローンからの生存率％を示している。ビヒクルの結果は含まれていない（全例で生存率１００％）。結果を図４、５及び６にグラフ表示する。クローン原性試験は細胞のクローンを基にしたものであり、細胞単独ではない。従って、与えられているＩＣ５０値は、クローンの５０％を阻害する濃度に相当する。
【０１３１】
【表４】
2014518862.tif 000013
【０１３２】
３種類の各腫瘍細胞株について、空のナノ粒子はほとんど又は全く細胞毒性を示さず、パクリタキセル担持ナノ粒子は、パクリタキセル単独と比べて同様か又は高い細胞毒性を示した。従って、ナノ粒子はパクリタキセルの活性を低減しない。３つの腫瘍細胞株間の活性の差は、細胞を数日間処理し、代謝アッセイで検査した場合に観察されたＩＣ５０に相関した。
【０１３３】
結果は、パクリタキセル担持ナノ粒子はパクリタキセルと同じだけ効果的で、空のナノ粒子はがん細胞に対して無毒であることを示している。Ｕ８７−ＭＧのＩＣ５０は１．１〜２．３ｎＭで、これはパクリタキセル単独の文献値（１０〜２０ｎＭ）より低い。
【０１３４】
試験は、Ｕ８７−ＭＧ細胞についても繰り返され、担持ナノ粒子のパクリタキセル単独に対する優越傾向を示した（ＩＣ５０値はそれぞれ０．８〜４ｎＭ対４〜２０ｎＭ）。
【０１３５】
実施例６．２：正常神経細胞における細胞毒性
表面改質剤を含むパクリタキセル担持ナノ粒子の健常脳細胞株に対する細胞毒性を、パクリタキセル及び空のナノ粒子のそれと比較して決定するためにＡＴＰ−ｌｉｔｅアッセイを４８〜７２時間にわたって実施し、ＩＣ５０値を決定した。
【０１３６】
試験された製剤は次の通りであった。ビヒクル、空のナノ粒子、装飾パクリタキセル担持ナノ粒子（３．３３重量％のパクリタキセル；装飾：配列番号５）、パクリタキセル及びエトポシド（エトポシドは脳腫瘍の治療において軽度の毒性を有するとされる）。
【０１３７】
試験された濃度は、０．０００２６ｎＭ、０．００１３ｎＭ、０．００６４ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ及び５００ｎＭであった。エトポシドは５０μＭであった。
【０１３８】
３種類の細胞株を試験した。正常ヒトアストロサイト（ＮＨＡ；Ｌｏｎｚａ）は、制限された分裂数を有する接着細胞の初代由来培養物である。正常ヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰ；初代細胞株；Ｌｏｎｚａ）は、特定の条件下で（ラミニン被覆プレート、分化因子による誘導）、接着グリオーマ細胞及びニューロンに分化する高分裂数を有する神経球増殖細胞である。最後に、不死化ヒト神経前駆細胞（ＲｅｎＣｅｌｌｓ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、ｃ−ｍｙｃがん遺伝子で形質転換された胎児脳細胞である。
【０１３９】
細胞は、処理と共に２４時間（アストロサイト）及び７２時間（前駆細胞株）インキュベートした。
【０１４０】
１）アストロサイト
結果を図７に示す。空のナノ粒子は試験した全濃度範囲で無毒であり、従ってＩＣ５０＞５００ｎＭである。パクリタキセル及び装飾パクリタキセル担持ナノ粒子は、同様の毒性を示し、ＩＣ５０値は約１００ｎＭである。５０μＭではエトポシドで処理された細胞の１２％しか生存しなかった。
【０１４１】
パクリタキセル用ビヒクルとして生理食塩水を用いて実験を繰り返した（ＤＭＳＯの代わり：生理食塩水；結果は図７に示す）。ここでも、空のナノ粒子は試験した全範囲で毒性を示さず、パクリタキセル担持ナノ粒子及びパクリタキセル単独ではあまり著明でない毒性を示し、ＩＣ５０＞５００ｎＭとなった。エトポシドの生存率は４５％で、およそ５０μＭのＩＣ５０を示した。
【０１４２】
２）正常ヒト神経前駆細胞
結果を図８に示す。ここでも空のナノ粒子は試験範囲全体を通して無毒であった。パクリタキセル担持ナノ粒子は、濃度と共に毒性が増大するわずかな傾向を示したが、ＩＣ５０＞５００ｎＭを示した。ＤＭＳＯ：生理食塩水に溶解したパクリタキセルは１００〜５００ｎＭのＩＣ５０を示し、生理食塩水では＞５００ｎＭを示した。エトポシドは、アストロサイトでの試験と同様に挙動し、５０μＭで２１％の生存率を示した。
【０１４３】
３）不死化ヒト神経前駆細胞（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）
結果を図９に示す。ここでも空のナノ粒子は試験された全範囲を通して無毒であった。パクリタキセル担持ナノ粒子は、濃度と共に毒性が増大する一定の傾向を示し、ＩＣ５０はおよそ５００ｎＭであった。ＤＭＳＯ：生理食塩水に溶解したパクリタキセルは約２ｎＭ、生理食塩水では５７ｎＭのＩＣ５０を示した。エトポシドは、５０μＭで３％の生存率を示した。
【０１４４】
ＩＣ５０データのまとめを表６に示す。試験した濃度では、空のナノ粒子で毒性は観察されなかった。パクリタキセル担持ナノ粒子のＩＣ５０値はパクリタキセル単独のそれより高い。これは、ナノ粒子との接触時間が７８時間以下であったため、ナノ粒子がわずかな割合の含有パクリタキセルしか放出しなかったためであろう。パクリタキセルは、実験で単独投与された場合ある程度の毒性を生じる。このことは、ナノ粒子が持続放出（徐放性）挙動を有することを示している。
【０１４５】
【表５】
2014518862.tif 000014
【０１４６】
実施例７：ラットのグリオーマ腫瘍モデルに対するパクリタキセル担持ナノ粒子のインビボ活性の観察
試験材料
【０１４７】
【表６】
2014518862.tif 000015
【０１４８】
各バイアルは、表７に示された量の注射用水（ｗｆｉ、Ａｇｕｅｔｔａｎｔ）で再構成される。
【０１４９】
【表７】
2014518862.tif 000016
【０１５０】
再構成後、溶液を数秒間渦撹拌し、３０分間超音波処理する（周波数：５０／６０Ｈｚ、出力：３６０Ｗ）。こうして粒子分散液（乳液）は注射の準備が整う。注射時、サンプルは０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＶ  −  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ膜と同等）でろ過する。
【０１５１】
急性毒性の定義：最大耐量（ＭＴＤ）の決定
ラットを体重に基づいて無作為化した（４群、３匹／群、合計１２匹）。活性薬剤担持ナノ粒子組成物を５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇ／注射で調製した。試験に使用されたナノ粒子は、凍結乾燥されたもので、等張であり、０．４５ミクロンメッシュを通して難なくろ過できる。
【０１５２】
【表８】
2014518862.tif 000017
【０１５３】
ラットの体重は週２回モニターした。ラットの挙動及び生存については毎日モニターした。副作用は検出されず、ラットの体重減少もなかった。場合によっては体重増加が観察された。生存ラットの屠殺及び剖検（肉眼検査）は処置１４日後に実施した。臓器の肉眼的変化についてラットを検査した。何も観察されなかった。
【０１５４】
これらの結果は、ナノ粒子が動物に対して非毒性であることを示しており、最高用量でも毒性が見られなかったので、結果は持続放出（徐放性）プロフィールを示唆しうる。原則的に、パクリタキセル単独を同一用量で注射したとすると、特に最高用量では副作用が観察されていたはずである。
【０１５５】
等価最高試験濃度（５０ｍｇのナノ粒子／ｍｌ、薬物含有量４．４％）で、血液脳関門通過＜１％及び持続放出プロフィール約２週間と仮定すると、そのような製剤は、ＩＣ５０よりかなり高い脳濃度を達成するために、少量（２００ｍｌ）ヒトに投与すればよいと予測される。
【０１５６】
治療毒性の定義：最大総耐量（ＭＴＴＤ）の決定
ラットを体重に基づいて無作為化した（４群、３匹／群、合計１２匹）。試験される活性薬剤担持ナノ粒子組成物を３つの用量で調製する。
【０１５７】
【表９】
2014518862.tif 000018
【０１５８】
ラットの体重は週２回モニターする。ラットの挙動及び生存については毎日モニターする。生存ラットの屠殺及び剖検（肉眼検査）は処置７日後に実施する。試験した用量のすべてが有毒の場合、追加のラットでそれより低い用量を試験する。ＭＴＴＤが定義されたら、同所Ｕ−８７ＭＧ腫瘍モデルを持つヌードラットで抗腫瘍活性試験を実施できる。
【０１５９】
抗腫瘍活性試験：
Ｕ−８７ＭＧヒトグリオーマ細胞株をインビトロで増幅する。４４匹の雌ヌードラットに放射線照射する。次に、ラット脳内へのＵ−８７ＭＧヒトグリオーマ細胞の同所注射を実施する。Ｇｄ−ＤＴＰＡ造影剤を麻酔下で全ラットの尾静脈に１つの時点で静脈内注射した後、腫瘍形態を評価するためにＭＲＩ分析を実施する（４４匹、４４スキャン）。得られた画像を分析して腫瘍容積を決定する。ラットを体重及び腫瘍容積に基づいて無作為化する（５群、８匹／群、４０匹）。試験物質は３つの用量で調製し、テモゾロミドは５０ｍｇ／ｋｇ／注射で調製する。
【０１６０】
【表１０】
2014518862.tif 000019
【０１６１】
ラットの体重は週２回モニターした。ラットの挙動及び生存については毎日モニターした。腫瘍形態のためのＭＲＩ分析を、Ｇｄ−ＤＴＰＡ造影剤を麻酔下で全ラットの尾静脈に２つの時点で静脈内注射した後、実施する（８匹／群／時点、５群、２時点、８０スキャン）。得られた画像を分析して腫瘍容積を決定する。全ラットの屠殺及び剖検（肉眼検査）は最大２ヶ月後に実施する。腫瘍及び脳サンプル内のパクリタキセルレベルは、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定量化できる。
【０１６２】
ヌードラットにおける薬物担持ナノ粒子の薬物動態及び生体内分布
３８匹のヌードラットを個体の体重に従って３匹の１群と５匹の７群に無作為化した。各群の平均体重は他と違わない（分散分析）。ラットのモニターは上記のように実施する。
【０１６３】
・第１群：３匹のラットは処置せず。
【０１６４】
・第２〜８群：３５匹のラットは、パクリタキセル担持ナノ粒子をＭＴＤで１回静脈内注射（ＱＩＤ×１）、異なる時点（Ｔ１〜Ｔ７）で、別々の群から麻酔下で心穿刺により屠殺。
【０１６５】
全血を抗凝固剤としてリチウム−ヘパリン（参照  Ｔ−ＭＬＨＧ、テルモ）含有Ｃａｐｉｊｅｃｔ（登録商標）キャピラリー採血管に採取し、徹底混合して、２５００ｒｐｍ、＋４℃で１０分間遠心分離する。得られた血漿を回収し、５分量に分割し、分析まで−８０℃で貯蔵する。脳も回収し、二つに切り分ける。サンプルを乾燥プラスチック管に移し、直ちに即時凍結して（液体窒素中で）、分析まで−８０℃で貯蔵する。全動物とも肉眼検査により剖検する。
【０１６６】
注射溶液、血漿サンプル及び脳サンプル中のパクリタキセルレベルを測定する。ラットサンプル中のパクリタキセル測定のための分析手順は、血漿からの被検体の抽出及びドセタキセルを内部標準として用いるＨＰＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析を含む。
【０１６７】
実施例８
本発明の代表的ナノ粒子の放出プロフィールを決定した。実施例２に従い、３ｗｔ％のパクリタキセル含有量を用いて製造された、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び１０％のエタノールの溶液（２ｍｌ）中ナノ粒子を、透析バッグ（８〜１０ｋＤａ）に導入した。透析バッグを、３７℃、４ｍｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ中に１５０ｒｐｍで撹拌しながら沈めた。放出されたパクリタキセルのパーセンテージを一連の時点で測定した。結果を表１１及び図１０に示す。
【０１６８】
【表１１】
2014518862.tif 000020
【図１】
2014518862.tif 000023
【図２】
2014518862.tif 000024
【図３】
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【図４Ａ】
2014518862.tif 000026
【図４Ｂ】
2014518862.tif 000027
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2014518862.tif 000029
【図５Ｂ】
2014518862.tif 000030
【図５Ｃ】
2014518862.tif 000031
【図６Ａ】
2014518862.tif 000032
【図６Ｂ】
2014518862.tif 000033
【図７Ａ】
2014518862.tif 000034
【図７Ｂ】
2014518862.tif 000035
【図７Ｃ】
2014518862.tif 000036
【図８Ａ】
2014518862.tif 000037
【図８Ｂ】
2014518862.tif 000038
【図９Ａ】
2014518862.tif 000039
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014518862.tif 000043
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