(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染を有する患者への投与に好適なＴ細胞をプライミングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。本発明はまた、前記方法により得られる組成物およびその使用に関する。  【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を有する患者への投与に好適な抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、治療される患者に由来する標的Ｔ細胞、単球由来樹状細胞、ウイルス材料またはウイルス関連タンパク質またはペプチド、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球を共培養することを含み、前記抗原提示細胞は前記リンパ球に対して同種異系である、方法。
【請求項２】
前記感作は、非増殖性抗原提示細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とともに培養することを含む混合白血球反応により誘導され、前記ＰＢＭＣは前記非増殖性抗原提示細胞に対して同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単球由来樹状細胞は、患者または健常ドナーに由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単球由来樹状細胞は、まず、単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約１〜７日間培養して未熟樹状細胞を得ること、次に、少なくとも約１２時間培養することで前記未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とすることができる第２の組成物を加えることによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンαまたはβ、およびＴＬＲ３リガンド、例えばポリ−Ｉ：Ｃおよび／またはＴＬＲ４リガンドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、インターフェロンγ、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ４リガンド、ならびにＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ−Ｉ：Ｃであり、かつ、前記ＴＬＲ８アゴニストはＲ８４８である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記感染性材料または感染関連タンパク質もしくはペプチドは、患者由来の不活化ウイルス粒子、前記患者のウイルスと同じタイプの同種異系ウイルス粒子、ならびに既知の単離および精製されたウイルスタンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス材料は、ウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションにより成熟樹状細胞に負荷された前記ウイルスタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は少なくとも約２０日間、好ましくは約６〜２０日間、より好ましくは約８〜１４日間培養される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培養に抗ＣＤ３抗体および／または外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１が添加される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライミングされた抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、前記細胞を新たな樹状細胞、新たな感作リンパ球とともに培養すること、および所望により、抗ＣＤ３抗体および／または外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養に添加することにより再刺激される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルス感染は慢性ウイルス感染である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記慢性ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶおよびＥＢＶからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により得られる、抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項１７】
患者への投与に好適な抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞であって、
・すぐにアポトーシスに至らずに増殖する能力を有し、
・低レベルのアネキシン−Ｖを発現し、かつ／または
・細胞表面にＣＤ２７および／またはＣＤ２８を発現する
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項１８】
薬剤として使用するための請求項１６または１７に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項１９】
ヒトにおいて、ウイルス感染の治療に使用するため、または抗ウイルス免疫応答を惹起するための、請求項１６または１７に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項２０】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は治療用ウイルスワクチンと組み合わせて投与される、請求項１９に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項２１】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は初回刺激の後に投与される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項２２】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は再刺激後に投与される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞。
【請求項２３】
薬剤の製造のための請求項１６または１７のいずれか一項に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の使用。
【請求項２４】
ヒトにおいて、慢性ウイルス感染を治療するため、または抗ウイルス免疫応答を惹起するための薬剤の製造のための、請求項１６または１７のいずれか一項に記載の抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の使用。
【請求項２５】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は治療用抗ウイルスワクチンと組み合わせて投与される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は初回刺激後に投与される、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は再刺激後に投与される、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および感染性疾患の治療の分野、より具体的には、抗原特異的Ｔ細胞の活性化方法および前記方法により生産されるＴ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞がウイルスおよび腫瘍特異的抗原を認識する機構に関する理解の高まりは、感染および悪性疾患に対する養子免疫療法として特異的Ｔ細胞を使用することへの多大な関心を後押ししてきた。細胞免疫療法は、広義には、疾患の治療を目的とする免疫系のエフェクター細胞の投与と定義することができる。細胞性免疫系の主要な機能は、急性および持続的感染を含め、病原体に対して防御することができることである。
【０００３】
Ｔ細胞は感染細胞を認識し、これらの標的細胞を殺傷することによって疾病の発症を防ぐ。しかしながら、特異的Ｔ細胞の存在下で発症する慢性感染により示されるように、病原体と免疫系の相互作用は複雑であり、それにより、これらの病原体は明らかにＴ細胞の監視を逃れることができる。
【０００４】
病原性侵入物を実質的に検知するＴ細胞の能力は、その極めて多様な受容体レパートリーにより付与されるものであり、これにより、Ｔ細胞プールは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示された際に莫大な数のペプチドを認識することが可能となる。それにもかかわらず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したシグナル伝達（シグナル１）は、共刺激分子が増殖、生存、および分化に不可欠なシグナル（シグナル２）を提供するので、十分なＴ細胞の活性化には及ばない。実際に、シグナル２を受け取らずにシグナル１のみを受け取るナイーブＴ細胞は無力（不応答）となるか、またはアポトーシスを経て死に至る。完全なＴ細胞の活性化にはシグナル１と２の組込みが必要であり、これらのシグナルの強度はその後のＴ細胞プールのサイズを定める。さらに、エフェクターＴ細胞への完全な分化は一般に第３のシグナルに依存し、この第３のシグナルは抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって可溶型で供給され、必要とされるエフェクターＴ細胞のタイプを指示するシグナルを提供する。この「３シグナル」の概念は、ナイーブＴ細胞の活性化とそれに続くエフェクターＴ細胞の形成の１つのモデルを表している。さらに、免疫系は多数の多様な共刺激分子を提供し、これらの種々のタイプのシグナル２および３は全て、それら固有のユニークな方法でＴ細胞応答の質に寄与している。共刺激シグナルおよび可溶型のシグナル３は、生存、細胞周期の進行、発達するエフェクター細胞のタイプ、およびエフェクター細胞またはメモリー細胞のいずれに分化するかなどの、Ｔ細胞活性化の特定の側面に働き得る。
【０００５】
今般、成熟抗原提示樹状細胞（ＤＣ）は、長命のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するためには、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む他のリンパ球による「助け」が必要であることが一般に認知されている。この「助け」は成熟ＤＣをさらに分化させ、このプロセスはライセンシングとして知られる。「ヘルパー」シグナルは、ＤＣに対して、共刺激分子のアップレギュレーション、サイトカインの分泌、および数種の抗アポトーシス分子のアップレギュレーションを含む複数の作用を持ち、これらは全て、同族Ｔ細胞、特にＣＤ８+Ｔ細胞を最適に活性化するＤＣの能力を累積的に増強する。さらに、「ヘルパー」リンパ球はまた、Ｔ細胞の生存、細胞周期の進行、発達するエフェクター細胞のタイプ、およびエフェクター細胞またはメモリー細胞のいずれに分化するかに直接影響を及ぼす因子を発現または分泌し得る。
【０００６】
ＨＩＶ、ＨＢＶ、もしくはＨＣＶ、またはヘルペスウイルスＣＭＶおよびＥＢＶなどの持続的または慢性的ウイルス感染は社会の大きな脅威であり、感染個体の治療選択肢が差し迫って必要である。ウイルス存続中は、ウイルスと宿主免疫応答の間のバランスが重要である。免疫系はウイルスを確認し続け、ウイルスは排除を回避するために免疫応答を逃れることによって対抗し、最後にはウイルスに有利なバランスに傾き、多くの場合で疾病が発症する。ほとんどの持続的ウイルス感染では、ウイルス抗原が存在し続けることでウイルス特異的Ｔ細胞が機能不全となる。
【０００７】
ここ２０年の間に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染はパンデミックとなり、４０００万を超える人々が感染し、すでに２０００万人超が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）から死に至っている。曝露非感染者および長期非進行者から得られたデータは、ＨＩＶ特異的ＣＤ８+およびＣＤ４+の両Ｔ細胞の機能が感染防御免疫に不可欠であることを強く示唆している。
【０００８】
ＨＩＶ感染患者では、ウイルスに対するＣＤ４（＋）Ｔヘルパー応答が損なわれているにもかかわらず、ＨＩＶ特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞は高頻度で存続するが、分化した他のエフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球とは異なり、ほとんどが腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーＣＤ２７を発現し続ける。ＣＤ２７のリガンド（ＣＤ７０）もＨＩＶ感染宿主で過剰発現され、従って、ＨＩＶ特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞上でのＣＤ２７発現の性質とその潜在的な機能的帰結が注目される。同じＨＩＶ特異的クローンに由来するＣＤ２７（＋）およびＣＤ２７（−）Ｔ細胞を分析したところ、ＣＤ２７の保持はエフェクター機能の獲得に干渉しないこと、およびＴ細胞受容体の刺激後、同時にＣＤ２７によって誘発されるＣＤ２７（＋）細胞は、ＣＤ２７（−）Ｔ細胞よりも高いアポトーシス耐性、インターロイキン２生産、および増殖を示すことが明らかになった。ＨＩＶ感染患者に再導入すると、自己ＨＩＶ特異的ＣＤ２７（−）Ｔ細胞は急速に消失するが、同じクローンに由来するＣＤ２７（＋）Ｔ細胞は高頻度で存続する。従って、ＨＩＶ感染におけるＣＤ２７とＣＤ７０の相互作用はＣＤ２７（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞に生存の優位性を与え、ＣＤ４（＋）Ｔの助けの制限または不在を補償してＣＤ８応答を維持することが示唆されている（非特許文献１）。
【０００９】
ＨＩＶと同様に、ＨＩＶ以外の持続的ウイルス感染に感染した患者も完全に分化していない中間型の機能的エフェクター−メモリーＴ細胞のサブセットを有するが、ＣＤ２８だけではなくＣＤ２７も発現することが判明している。これらの細胞はＣＤ２８およびＣＤ２７の両方を欠く成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高い増殖能を有することが示されている（非特許文献２）。
【００１０】
よって、ウイルス特異的ＣＴＬ応答の効力および特異性と、慢性ウイルス性疾患に感染したほとんどの個体におけるウイルス量の程度および臨床転帰、長期非進行者における疾病進行の遅延または停止、ならびに一部のウイルス曝露個体の感染からの保護との間には強い相関がある。ウイルス特異的ＣＴＬ応答の質および範囲を引き上げることは、慢性感染個体におけるウイルス複製の制御を高め、臨床経過を安定化または改善すると思われる。
【００１１】
従って、ウイルス感染に対抗し、ＣＴＬ応答を増強するための１つの戦略は、宿主において特異的Ｔ細胞応答を回復させるためのエフェクターＴ細胞の移入を含む養子Ｔ細胞療法であると考えられる。養子細胞移入療法とは、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化し、拡大培養した自己ウイルス反応性Ｔ細胞の投与である。
【００１２】
ＨＩＶ患者の養子免疫療法の現行法では、移入したＣＴＬの減衰による問題が著しい。移入したＣＴＬの末梢血での減衰は１つにはリンパ節部位への移動を反映するが、抗ウイルス活性の経時的低下はＣＴＬが死滅しているか、またはこれらＨＩＶ複製の現場で機能不全となっていることを示す。移入されたＣＤ８+ＣＴＬの助けとなるための戦略は、ＣＴＬの生存率を改善し、ＨＩＶ感染及び他のウイルス感染の進行を制御するためのＣＴＬの治療能を解明しなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２００４  Ｄｅｃ  ６；２００（１１）：  １４０７−１７
【非特許文献２】Ｄｅｃｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １２１，  ４０５−４１５，  ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
よって、ウイルス感染に対する養子免疫療法に使用するための、抗原特異的Ｔ細胞の活性化時の増殖および生存を高める、Ｔ細胞集団を調製する改良法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
概要
本発明は、ウイルス感染を有する患者への投与に好適な抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。この方法は、治療される患者に由来する標的Ｔ細胞、樹状細胞、感染性材料または感染関連タンパク質またはペプチドおよびリンパ球を共培養することを含む。前記リンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作している。前記リンパ球は混合白血球反応の方法で感作される。
【００１６】
本発明はまた、前記方法により得ることができる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞およびそれらの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上で発現されたＭＨＣ抗原に感作したリンパ球が、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟単球由来ＤＣ上でのＣＤ７０発現を著しく増強することを示す。
【図２】図２は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作したγ線照射リンパ球が、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟単球由来ＤＣ上でのＣＤ７０発現を著しく増強することを示す。
【図３】図３は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作したリンパ球を、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣとともに６日間共培養すると、実質的なＩＬ−１２の生産が誘導されることを示す。
【図４】図４は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作したリンパ球を、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣとともに６日間共培養すると、実質的なＩＦＮ−γの生産が誘導されることを示す。
【図５】図５は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作したリンパ球を、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣとともに６日間共培養すると、実質的なＩＬ−２の生産が誘導されることを示す。
【図６】図６は、ａ）従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作した照射リンパ球を、ｂ）初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣとともに共培養すると、第三者ドナーから、より多数のＣＤ２７発現同種異系反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導されることを示す。
【図７】図７は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作した照射リンパ球を、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣに加えると、第三者ドナーからのアポトーシス性（アネキシン−Ｖ陽性）の同種異系反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が減ることを示す。
【図８】図８は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作した照射リンパ球を、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣに加えると、初回刺激の際に用いたＤＣに対して自己であるＢ細胞で再刺激された同種異系反応性ＣＤ８＋リンパ球に、より強い（６倍の）二次的増殖性応答が誘導されることを示す。
【図９】図９は、従来のＭＬＲにおいて照射した同種異系ＰＢＭＣ上で発現されたＭＨＣ抗原に感作した照射リンパ球を、初回感作ＭＬＲの際に刺激細胞として用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である単球由来ＤＣに加えると、初回刺激の際に用いたＤＣに対して自己であるＢ細胞で再刺激された同種異系反応性ＣＤ８＋リンパ球により、ＩＦＮ−γ生産のある程度の（３倍の）増強が誘導されることを示す。
【図１０】図１０は、活性化された同種異系細胞および抗原を負荷した自己ＤＣを伴う拡大培養（ａ、ｂおよびｃ）、抗原を負荷した自己ＤＣを伴うが、活性化された同種異系細胞を伴わない拡大培養（ｄ、ｅおよびｆ）、ならびに活性化された同種異系細胞を伴い、負荷無しの自己ＤＣを伴う拡大培養（ｇ、ｈおよびｉ）の後のウイルス特異的ＣＤ８陽性細胞（それぞれＣＭＶ、ＥＢＶまたはＡ型インフルエンザウイルスに特異的）の頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本発明を記載する前に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるので、本明細書で使用する用語は単に特定の実施形態を記載する目的で用いられ、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうではないことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含むことを述べておかなければならない。
【００２０】
また、用語「約」は、適切であれば、示された値の＋／−２％、好ましくは＋／−５％、最も好ましくは数値の＋／−１０％の偏差を示すために用いられる。
【００２１】
本発明に関して、用語「抗原特異的」とは、自己のＭＨＣ分子上に提示される短いユニークなペプチド配列の、ユニークなＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による特異的認識／結合に関する。
【００２２】
本発明に関して、用語「プライミング」および「活性化」とは、「ヘルパー」細胞が同時に存在する状態または同時に存在しない状態で抗原提示細胞により刺激されるようになったナイーブ抗原特異的Ｔ細胞で起こるプログラムされた活性化プロセスに関する。
【００２３】
本発明に関して、用語「レスポンダー細胞」とは、共培養された同種異系ＰＭＢＣに対して活性化および／または増殖により応答する、限定されるものではないがＴ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む、種々のリンパ球部分集団に関する。
【００２４】
本発明に関して、用語「感作した細胞」とは、共培養された、ＰＢＭＣを含む、同種異系細胞により予め活性化された、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む、種々のリンパ球部分集団に関する。
【００２５】
本発明に関して、用語「標的細胞」とは、同種異系もしくは自己ＡＰＣかまたは抗原提示自己ＡＰＣのいずれかにより刺激されるようになったＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。患者のリンパ球（標的細胞）採取部位は、例えば、末梢血または骨髄である。
【００２６】
本発明に関して、単球由来ＤＣに関して用語「成熟」とは、未熟ＤＣをＬＰＳなどの微生物産物またはＴＮＦ−αおよび／もしくはＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターで刺激することにより誘導される、限定されるものではないがＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＣＲ７を含む、それらの「成熟マーカー」の発現に関する。
【００２７】
未熟ＤＣは、高いエンドサイトーシス活性と低いＴ細胞活性化能を特徴とする細胞である。未熟ＤＣは、周囲環境をウイルスおよび細菌などの病原体に関して絶えずサンプリングしている。未熟ＤＣは病原体を貪食し、それらのタンパク質を分解して小片とし、成熟時には、ＭＨＣ分子を用いて、それらの細胞表面にこれらの断片を提示する。同時に、未熟ＤＣは、それらのＴ細胞活性化能を著しく増強するＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０など、Ｔ細胞の活性化において共受容体として働く細胞表面受容体をアップレギュレートする。未熟ＤＣはまた、樹状細胞を血流を通じて脾臓へ、またはリンパ系を通じてリンパ節へ送る走化性受容体ＣＣＲ７もアップレギュレートする。ここで、未熟ＤＣは抗原提示細胞として働き、それらは、非抗原特異的共刺激シグナルとともに、病原体に由来する抗原を提示することにより、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。成熟ＤＣはおそらく、体内を循環し適切なシグナルに応じてＤＣまたはマクロファージのいずれかに変化することができる白血球細胞である単球から生じる。そして、これらの単球は骨髄中の幹細胞から形成される。単球由来ＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏでは末梢血単球から生成できる。
【００２８】
本発明に関して、細胞の「非増殖性」という用語は、細胞分裂による後代形成が不能となった細胞を示すために用いる。この細胞はそれでもなお、刺激に対して応答したり、またはサイトカインなどの細胞産物の生合成および／または分泌を行ったりすることができる。細胞を非増殖性とする方法は当技術分野で公知である。細胞を非増殖性とする好ましい方法は、マイトマイシンＣなどの抗増殖薬による処理、またはγ線照射などの照射である。固定または透過処理を施された分裂不能の細胞も、非増殖性細胞の例である。
【００２９】
本発明に関して、用語「混合リンパ球反応」、「混合リンパ球培養」、「ＭＬＲ」、およびＭＬＣは、アロタイプが異なる最低２つの異なるＴ細胞集団を含む混合物を表すために互換的に用いられる。少なくとも１つの、アロタイプが異なる細胞はリンパ球である。これらの細胞は一定時間一緒に培養されると、好適な条件下でリンパ球が刺激される。ＭＬＲの目的の多くは、リンパ球の増殖を誘導するなどの同種異系刺激を提供することであるが、示されない限り、培養中の増殖は必要でない。適切な文脈では、これらの用語はあるいはこのような培養に由来する細胞の混合物を意味する場合もある。
【００３０】
本明細書において、用語「治療」とは、治療される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を意味し、予防のため、または臨床病理学の過程で行われる場合もある。望ましい効果としては、疾病の発生または再発の予防、症状の緩和、および疾病の任意の直接的または間接的病理帰結の軽減、疾病進行の減速、病態の改善または軽減、および予後の緩解または改善が含まれる。
【００３１】
用語「抗原提示細胞」、または「ＡＰＣ」などは、治療される患者に由来するか、または治療される患者由来のＡＰＣ上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ抗原と同一の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する無関連の血液ドナーに由来する、ＰＢＭＣ、単球、Ｂ細胞または単球由来ＤＣを含む。
【００３２】
本発明に関して、「慢性感染」とは、その宿主の免疫系を逃れている長期の持続的感染である。慢性感染は細菌またはウイルスにより引き起こされる。慢性感染を引き起こすウイルスの限定されない例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）である。
【００３３】
本発明に関して、用語「培養する」とは、様々な種類の培地での細胞または生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を意味する。培養増殖された細胞の後代はその親細胞と完全に（形態的、遺伝的、または表現型的に）同一でない場合があると理解される。好適な培養培地は当業者により選択可能であり、このような培地の例としては、ＲＰＭＩ培地またはイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）がある。
【００３４】
用語「主要組織適合複合体」および「ＭＨＣ」とは、Ｔ細胞に対する抗原提示および迅速な移植片拒絶に必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を意味する。ヒトでは、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても知られる。ＭＨＣ複合体によりコードされているタンパク質は「ＭＨＣ分子」として知られ、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子には、ＭＨＣにコードされている鎖がβ２−ミクログロブリンと非共有結合的に会合したものからなる膜ヘテロ二量体タンパク質が含まれる。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞により発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原提示において機能を果たすことが示されている。クラスＩ分子には、ヒトではＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃが含まれる。クラスＩ分子は一般に、８〜１０アミノ酸長のペプチドと結合する。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子もまた、膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。
【００３５】
クラスＩＩ  ＭＨＣはＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗原提示に関与することが知られており、ヒトでは、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、およびＤＲが含まれる。クラスＩＩ分子は一般に、１２〜２０アミノ酸残基長のペプチドと結合する。用語「ＭＨＣ拘束」とは、プロセシングを受けた後にのみ抗原の認識が可能となるＴ細胞の特徴を意味し、結果として生じた抗原ペプチドは自己クラスＩまたは自己クラスＩＩ  ＭＨＣ分子のいずれかと会合して提示される。
【００３６】
用語「ワクチン」、「免疫原」、または「免疫原性組成物」は、ヒトまたは動物被験体に投与された際に一定程度の特異的免疫を付与することができる化合物または組成物を意味するために本明細書で用いられる。本開示に使用する場合、「細胞ワクチン」または「細胞免疫原」とは、所望により不活性化された少なくとも１つの細胞集団を有効成分として含む組成物を意味する。本発明の免疫原、および免疫原性組成物は活性型であるが、これはそれらが宿主の免疫系により少なくとも部分的に媒介される特異的免疫応答（抗ウイルス抗原または抗ウイルス応答など）を刺激し得ることを意味する。この免疫応答は、抗体、免疫反応性細胞（ヘルパー／インデューサーまたは細胞傷害性細胞など）、またはそれらの任意の組合せを含んでよく、好ましくは、その治療が対象とするウイルス上に存在する抗原に向けられたものである。この応答は、単回用量または多回用量のいずれかの投与によって被験体において惹起または再刺激される。
【００３７】
化合物または組成物は、ａ）ナイーブ個体における抗原（ウイルス抗原など）に対する免疫応答の生成；またはｂ）個体における、その化合物または組成物が投与されなかった場合に生じるものを超える免疫応答の再構築、追加免疫、または維持、のいずれかが可能であれば「免疫原性」である。組成物は、単回用量または多回用量で投与された際にこれらの判定基準のいずれかを達成可能であれば、免疫原性である。
【００３８】
説明
本発明は、樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞による活性化の際に、抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存の増大を促進するための、同種感作した同種異系リンパ球（ＡＳＡＬ）の生産に関する。
【００３９】
本発明は、ヒト健常血液ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびその部分集団を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づくが、ここで、抗原特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導におけるＡＳＡＬの正の調節の役割が実証された。同種異系ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて、ＡＳＡＬの存在下で同種異系反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および生存を追跡すると、再刺激後の増殖能は５倍を超える増大を示し、アポトーシス細胞死は１０％から５％に減少した。
【００４０】
ＡＳＡＬの添加は、抗原提示ＤＣ上での共刺激分子ＣＤ７０の強くアップレギュレートされた発現をもたらし、かつ、Ｔ細胞の１型ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への運命決定によく知られた正の影響を持つ２つの因子ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生産をもたらす。さらに、ＡＳＡＬの添加は、Ｔ細胞に関するよく知られた増殖因子ＩＬ−２の生産をももたらした。特に、ＣＤ７０が介在する相互作用は、最近、連続して何回も分裂することで活性化されたＴ細胞の生存を増進し、それにより、エフェクターＴ細胞の蓄積に寄与することが示された。
【００４１】
本発明は、ウイルス感染を有する患者への投与に好適な抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。この方法は、治療される患者に由来する標的Ｔ細胞を、ＤＣ、好ましくは、単球由来ＤＣ、自己または同種異系感染性材料または感染関連タンパク質もしくはペプチド、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球と共培養することを含む。前記ＡＰＣは好ましくは前記リンパ球に対して同種異系である。前記ＤＣは自己または同種異系であり得る。
【００４２】
本発明はまた、標的抗原を認識するＴ細胞受容体またはキメラＴ細胞受容体を発現するように操作された（ウイルス形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の遺伝物質導入法による）Ｔ細胞を含む養子免疫療法に用いるためのＴ細胞集団を調製し；これらの操作Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および感作したリンパ球の存在下で、抗原負荷ＤＣで活性化し；これらの標的細胞を培養で拡大し；及び、これらの細胞を患者に再導入する方法も提供する。より具体的には、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞が遺伝子操作されている、ウイルス感染を有する患者への投与に好適な抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。前記方法は、治療される患者由来の標的Ｔ細胞をウイルス抗原受容体でトランスフェクトしたものをＤＣ（好ましくは、単球由来）、抗ＣＤ３抗体、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球と共培養することを含む。
【００４３】
標的Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）コード遺伝子で形質転換させることもできるし、あるいはまた興奮性シグナルをＭＨＣにより制限を受けない方法でＴ細胞に中継することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用によって形質転換させることもできる。従って、細胞内Ｔ細胞活性化ドメインと融合した細胞外抗原認識ドメインから構成されるこれらのハイブリッドタンパク質は、それらのヒト白血球抗原の遺伝子型にかかわらず患者に使用することができる。トランスフェクション前に、標的Ｔ細胞は、続いての形質導入を最適化するために抗ＣＤ３抗体で予め刺激することが好ましい。好適ないずれのＣＡＲを本発明に用いてもよい。ＣＡＲリガンドはウイルスによって発現されなければならない。好適なＣＡＲの選択および調製は当業者が知る技術上の範囲内である。
【００４４】
ＴＣＲコード遺伝子またはＣＡＲコード遺伝子のＴ細胞への導入は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターなどの当業者に知られている好適ないずれの方法を用いて行ってもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ．  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ参照）。ウイルスベクターの限定されない例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられ、限定されない非ウイルスベクター系としては、プラスミドの電気転移およびトランスポゾン／トランスポゼース系が挙げられる。
【００４５】
拡大培養される患者由来のリンパ球は、末梢血または骨髄に起源するものであり得る。
【００４６】
ウイルス感染は慢性ウイルス感染であり得る。慢性ウイルス感染を引き起こすウイルスの限定されない例としては、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶおよびＥＢＶがある。慢性ウイルス感染を有する患者は、不活性なウイルス特異的ＣＴＬを有し、従って、抗原特異的Ｔｈ１細胞またはＣＴＬをプライミングする本発明の方法の好適な標的である。不活性なＨＩＶ特異的ＣＴＬはＨＩＶ患者に高濃度で存在する。不活性なＣＴＬはＣＤ７０受容体であるＣＤ２７を高い程度で発現し、本発明のプライミングされた抗原特異的Ｔｈ１細胞またはＣＴＬをＨＩＶ患者に投与するために特に好適なものとする。
【００４７】
ＡＳＡＬは、ＤＣおよび標的細胞とともに培養された混合白血球反応から得られるレスポンダー細胞である。前記標的Ｔ細胞が遺伝子操作される場合には、抗ＣＤ３抗体も培養に加える。ＡＳＡＬは、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む末梢血リンパ球からなる群から選択される。前記標的細胞は好ましくはＤＣに対して自己であるＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞であり、前記ＤＣは好ましくは単球由来のものである。単球由来ＤＣには、ウイルス材料もしくはウイルス関連タンパク質もしくはペプチド、またはウイルス由来抗原が負荷される。
【００４８】
ＡＳＡＬの添加はさらに、高レベルのＣＤ２７を発現する標的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の富化をもたらす。ＣＤ２７+  ＣＤ８+Ｔ細胞は、増殖のための抗原由来自己分泌シグナルを提供できることから、おそらく養子免疫療法にとってより有効なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）である。このようなヘルパー非依存性ＣＤ８  Ｔ細胞は、生存および拡大培養のためにＩＬ−２またはＣＤ４＋Ｔ細胞の形での外因的助けを必要としないであろう。よって、本発明は、ＩＬ−２などの付加的サイトカイン、またはＣＤ４+Ｔ細胞の不在下または低存在下での強い細胞傷害活性に関してプログラムされたＣＤ８+Ｔ細胞集団を被験体に提供することにより、免疫介在性疾患を治療するための方法を提供する。この方法は細胞溶解性ウイルス特異的ＣＤ８+Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大培養に特に有用であるが、ウイルス特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の拡大培養にも使用可能である。
【００４９】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球の総数に対するパーセンテージとして表した細胞溶解性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、いっそうより好ましくは少なくとも約２５％、いっそうより好ましくは少なくとも約３０％、最も好ましくは少なくとも約３５％である。
【００５０】
より具体的には、本発明の方法は、ウイルス感染を有する患者への投与に好適な抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関し、前記方法は、以下の工程：
ａ）非増殖抗原提示細胞を、前記非増殖抗原提示細胞に対して同種異系である末梢血単核細胞とともに培養する工程、
ｂ）単球を、その単球を成熟ＤＣへ成熟させる組成物中で培養する工程（この組成物はさらに下記に記載される）、および
ｃ）工程ａ）から得られた、限定されるものではないがＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ球を、工程ｂ）から得られた成熟ＤＣとともに培養する工程
を含む。
【００５１】
前記単球由来ＤＣは、まず、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約２〜７日間、好ましくは約５日間単球を培養して未熟ＤＣを得て、次に、少なくとも約１２〜７２時間、好ましくは約２４〜４８時間培養することにより未熟ＤＣを成熟ＤＣとすることができる第２組成物を加えることによって得られる。この第２の組成物は、未熟ＤＣを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するために使用可能な成熟単球由来ＤＣとすることができる成分を含む。一実施形態では、第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンβおよびＴＬＲ３リガンド、例えばポリ−Ｉ：Ｃ（Ｍａｉｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｐｈａ−ｔｙｐｅ−１  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ＤＣｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＴＬ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４；６４：５９３４−５９３７）を含む。別の実施形態では、第２の組成物は、インターフェロンγ、ＴＬＲ３および／もしくはＴＬＲ４リガンドならびにＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８リガンドならびに／またはＴＬＲ９リガンドを含む。ＴＬＲ３リガンドの限定されない例はポリ−Ｉ：Ｃであり、ＴＬＲ７／８リガンドの限定されない例はＲ８４８であり、ＴＬＲ９リガンドの限定されない例はＣｐＧである。
【００５２】
同種異系リンパ球の感作は、不活性化した抗原提示細胞を、その抗原提示細胞に関して同種異系である末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養することを含む従来の混合白血球反応（ＭＬＲまたはＭＬＣ混合白血球培養）によって誘導される。ＭＬＲの性能は当業者にはよく知られている（Ｊｏｒｄａｎ  ＷＪ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ＭＡ．  Ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２；２６０：  １−１４）。ＭＬＲでは、２個体からの末梢血リンパ球を組織培養において数日間混合する。不適合個体からのリンパ球は互いに刺激し合って有意に増殖するが（例えば、トリチウム化チミジンの取り込みにより測定される）、適合個体からのリンパ球はそうではない。一方向性ＭＬＣでは、これらの個体の一方からのリンパ球が不活性化され（通常、マイトマイシンなどの毒素による処理またはγ線照射などの照射による）、それにより、処理されずに残っている細胞集団のみが外来の組織適合抗原に応答して増殖することができる。
【００５３】
このＭＬＲに用いられる抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来ＤＣからなる群から選択される。単球由来ＤＣは患者または健常ドナーに由来し、すなわち、自己または同種異系であり得る。
【００５４】
感染性材料または感染関連タンパク質もしくはペプチドは、患者由来の不活化ウイルス粒子、患者のウイルス感染と同じタイプの同種異系ウイルス粒子、ならびに単離および精製されたウイルスタンパク質またはペプチドからなる群から選択される。単離および精製されたウイルスタンパク質またはペプチドは当業者に周知である。一実施形態では、ウイルス材料は、ウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションにより単球由来ＤＣに負荷されたウイルスタンパク質である。
【００５５】
本発明の方法では、これらの細胞（治療される患者由来のＴ細胞、単球由来樹状細胞、ウイルス材料またはウイルス関連タンパク質またはペプチド、ならびにリンパ球に対して同種異系である抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に感作したリンパ球）は少なくとも約２０日間、好ましくは約６〜２０日間、より好ましくは約８〜１４日間共培養される。
【００５６】
本発明の方法の一実施形態では、細胞増殖および生存を最適化するために細胞培養に抗ＣＤ３抗体、外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を加える。
【００５７】
プライミングされた抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、前記細胞を新たなＤＣ、新たな感作リンパ球とともに培養すること、および所望により抗ＣＤ３抗体ならびに／または外因性のＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−２１を細胞培養に加えることによって再刺激することもできる。
【００５８】
本発明はまた、上記の方法により得ることができる免疫原性組成物、ならびに上記の方法により得ることができる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。
【００５９】
抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は患者への投与に好適であり、好ましくは、下記の特徴のうち少なくとも１つを有する。
・すぐにアポトーシスに至らずに増殖する能力
・低レベルのアポトーシスマーカーアネキシン−Ｖの発現
・細胞表面におけるＣＤ２７および／またはＣＤ２８の発現
【００６０】
本発明はまた、薬剤として使用するためならびに薬剤の製造に使用するための、本発明の方法により得られる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。
【００６１】
さらに、本発明は、慢性ウイルス感染などのウイルス感染の治療に用いるため、またはヒトにおいて抗感染免疫応答を惹起するため、ならびに慢性ウイルス感染などのウイルス感染の治療もしくはヒトにおいて抗ウイルス免疫応答の惹起を目的とした薬剤の製造のための、本発明のまたは上記で定義された方法によって得ることができる抗原特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の使用に関する。ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は初回刺激後あるいはまた再刺激後に投与することができる。一実施形態では、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、治療用抗ウイルスワクチンと組み合わせて投与される。
【００６２】
ヒト被験体の治療における養子細胞療法にＴ細胞集団を使用する方法は、当技術分野の臨床家に知られている。本明細書に記載され、当技術分野で公知の方法に従って調製されたＴ細胞集団は、このような方法で使用可能である。例えば、ＣＭＶ感染の治療のためにＣＭＶ特異的Ｔ細胞を使用する養子細胞療法（Ｅｉｎｓｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ；  ２００２  （９９）  ３９１６−３９２２）およびＨＩＶ感染患者においてＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する養子細胞療法（Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．；  ２００４（２００）  １４０７−１４１７）がある。
【００６３】
抗原でプライミングしたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＤＣにより媒介されるそれらの初期プライミングの際にＡＳＡＬに曝した場合、再刺激時に増殖の増大およびアポトーシスの低減を受ける。よって、ワクチン接種前および／または接種中に養子移入により患者に戻された場合に、ワクチン接種時の二次的Ｔ細胞応答を増強するための方法も本発明により企図される。
【００６４】
本発明はまた、ウイルスワクチン療法を改善するための方法も提供する。多くのウイルスは、免疫系による破壊の標的として働く可能性のある外来抗原を発現する。ウイルスワクチンは、被験体において、体液成分と細胞成分の両方を含む全身性のウイルス特異的免疫応答を生成する。この応答は、ワクチン組成物を皮下、筋肉内または経口投与することにより、被験体自身の免疫系から惹起される。抗体または免疫細胞はウイルス抗原に結合し、ウイルスを溶解させる。しかしながら、ウイルス感染を受けた患者のワクチン接種時にＴ細胞の応答性を増強する必要がなおある。従って、ワクチン接種前または接種時の、高増殖能を有する予め活性化されたアポトーシス耐性ウイルス特異的Ｔ細胞の養子移入は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるワクチンにより媒介される免疫応答を増強する可能性がある。
【００６５】
本発明による組成物はまた、治療用抗ウイルスワクチンと組み合わせて投与することもできる。
【００６６】
本発明の方法により得ることができる細胞は、ヒトなどの生物に直接投与して、それらの活性化の際の抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存を高めることができる。これらの細胞の投与は、多くの場合、薬学上許容される担体を伴い、細胞を導入して最終的に哺乳類の血液または組織細胞と接触させるために通常使用される任意の経路による。
【００６７】
例えば静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路などの非経口投与に好適な製剤および担体は、酸化防止剤、バッファー、静菌剤、およびその製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性等張無菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液を含む。静脈投与が本発明のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の好ましい投与方法である。
【００６８】
本発明に関して患者に投与されるＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の用量は、患者において免疫応答を増強するために十分なものでなければならない。よって、細胞はウイルス抗原に対して有効な免疫応答を惹起するため、かつ／または症状および／もしくはその疾患由来の合併症を緩和、軽減、治癒または少なくとも部分的に阻止するために十分な量で患者に投与される。これを遂行するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量は、生産される細胞の活性および患者の病態、ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定される。疾患の治療または予防において投与される細胞の有効量を決定するに当たり、医師は疾患の進行および関連するいずれのウイルス抗原に対する免疫応答の誘導も評価する必要がある。
【００６９】
上記に開示された実施形態のいずれの組合せも本発明に包含される。
【００７０】
本発明を以下の限定されない例によりさらに説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１  ＣＤ７０の発現
材料および方法  同種感作した同種異系リンパ球は、組織培養フラスコ内の血清不含Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地中で５〜７日間、健常血液ドナー由来のγ線照射ＰＢＭＣと同種異系ドナー（前記健常血液ドナーに対して）由来の非照射ＰＢＭＣを１：１の比で共培養することによる標準的な一方向性混合白血球反応（ＭＬＲ）において生成した。未熟ＤＣの増殖のために、健常血液ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配（ノルウェー、オスロ、Ｎｙｃｏｍｅｄ社、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で単離した。単離されたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（ＵＫ、ペイズリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に再懸濁させ、２４ウェルプラスチック培養プレートに２．５×１０6細胞／ウェルで播種し、２時間接着させた。非接着細胞を除去し、残った接着単球を組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（ＵＫ、アビンドン、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；共に１，０００Ｕ／ｍＬ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地で４〜６日間培養した。未熟ＤＣの成熟は、インキュベーションの最後の２４時間に培養培地にＩＦＮ−α（３，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ−γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（２５ｎｇ／ｍＬ）（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびｐ−Ｉ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；２０μｇ／ｍＬ）を添加することにより誘導した。
【００７２】
ＦＡＣＳ分析により測定したところ、成熟ＤＣ集団は全て７０％を超えるＣＤ８３＋ＤＣを含有していた。
【００７３】
洗浄後、成熟ＤＣを同種感作した非照射またはγ線照射（２５グレイ）同種異系リンパ球とともにＸ−ＶＩＶＯ  １５培地で２４時間共培養し、ＦＡＣＳにより分析した。同種異系反応性リンパ球の感作は、刺激細胞としてγ線照射ＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞として非照射ＰＢＭＣを用いて血清不含培養培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５）中で５〜６日間、初回の一方向性ＭＬＲを行うことにより実施した。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ７０をＦＡＣＳ試験に用いた。
【００７４】
結果  図１に示されるように、照射ＰＢＭＣに対する従来のＭＬＲでプライミングされた同種異系リンパ球（同種感作同種異系リンパ球、ＡＳＡＬ）は、前記ＭＬＲに用いた照射ＰＢＭＣに対して自己である成熟単球由来ＤＣ上でのＣＤ７０の発現を著しく増強する。
【００７５】
図２に示されるように、γ照射同種異系リンパ球も同様にＣＤ７０の発現を増強する。
【００７６】
図３、４および５に示されるように、成熟ＤＣと感作同種異系リンパ球の共培養は、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の実質的な生産を誘導する。
【００７７】
実施例２
材料および方法：  実施例１の材料および方法を参照。
ＣＤ８＋リンパ球はＤＣ、照射同種感作リンパ球およびＰＢＭＣ（前記ＤＣに対して同種異系）を６日間共培養した後に単離し（抗体コーティング磁性ビーズによる陰性選択を使用）、次に、Ｂ細胞（初回刺激の際に用いたＤＣに対して自己）で再刺激し、ＣＤ２７およびアネキシン−Ｖの発現に関して染色を行った。続いての分析はＦＡＣＳにより行った。
【００７８】
結果：
図６に示されるように、初回刺激の際に同種感作リンパ球を添加すると、ＣＤ８＋細胞をＢ細胞で再刺激した場合のＣＤ２７の発現が実質的に増強された。
【００７９】
初回刺激の際に同種感作リンパ球を添加すると、ＣＤ８＋細胞をＢ細胞で再刺激した場合のアネキシン−Ｖ（アポトーシスマーカー）の発現が実質的に低減された（図７参照）。
【００８０】
実施例３
材料および方法：  実施例２の材料および方法を参照。
Ｂ細胞による再刺激の前に、プライミングおよび単離を行ったＣＤ８＋細胞を３Ｈ−チミジンでパルス処理した。
【００８１】
結果：
図８に示されるように、初回刺激の際に同種感作リンパ球を添加すると、再刺激後のＣＤ８＋細胞の増殖性応答が著しく増強された（３Ｈ−チミジンの組み込みにより測定、ｃｐｍ／分、３日目）。
【００８２】
実施例４
材料および方法：  実施例３の材料および方法を参照。
Ｂ細胞と予め活性化したＣＤ８＋細胞を２日間共培養した後、培養上清を採取し、従来のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によりＩＦＮ−γ生産に関して分析した。
【００８３】
結果：
図９は、初回刺激の際に同種感作リンパ球を添加すると、再刺激後のＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γの生産が実質的に増強されたことを示す。
【００８４】
実施例５：  ＡＳＡＬは初回ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に生成される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を高める
材料および方法：  健常血液ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度媒体を用いて単離し、標準的な手順に従い、モノクローナル抗体およびフローサイトメトリーを用いてＨＬＡ−Ａ２に関して分類し、冷凍した。解凍後、ＰＢＭＣをプラスチックウェル内でインキュベートして、プラスチック接着により単球を富化し、非接着細胞を洗い流した後にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含有する細胞培養培地中で５日間インキュベーションを行った。次に、これらの未熟ＤＣをサイトカインカクテル（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、およびＩＮＦ−γ含有）ならびにＣＭＶ、ＥＢＶおよびＡ型インフルエンザウイルス由来抗原のオーバーラッピングＭＨＣクラスＩ結合ペプチド混合物（ＰＸ１４  ＰｒｏＭｉｘ  ＣＥＦプール（スタンダード）；ＵＫ、オックスフォード、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ  ＬＴＤ社製のペプチドライブラリー、この混合物の使用はあるＨＬＡ型に限定されない）とともに４８時間インキュベートした（ＤＣの成熟および抗原ペプチドによるパルス処理）。
【００８５】
並行して、種々の血液ドナー由来のＰＢＭＣとの混合白血球反応；ＭＬＲ；において活性化した同種異系ＰＢＭＣを作製した。７日目に新たなＰＢＭＣバッチを解凍し、パルス処理したＤＣおよび上記のように活性化した同種異系ＰＢＭＣを用いて７日間拡大培養した。次に、これらの細胞を、ＩＬ−２を含有する細胞培養培地で７日間インキュベートして、Ｔ細胞受容体を細胞表面上に再出現させた（活性化の間にＴ細胞はそれらの受容体をインターナライズする）。その後、これらの細胞をパルス処理したＤＣで再刺激し（上記の通り）、１時間後にペンタマー染色を行い、２４時間後にＩＦＮ−γ形成細胞に関するアッセイ（スウェーデン、ストックホルム、Ｍａｂｔｅｃｈ社、ヒトインターフェロン−γ用ＥＬＩＳｐｏｔ  ＰＬＵＳ）を製造者の指示に従って行った。ウイルス特異的細胞の数は、加えた１０6細胞当たりのＩＦＮ−γスポットとして測定した。フィコエリトリンコンジュゲートペンタマー  ＣＭＶ用Ａ*０２：０１−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＥＢＶ用Ａ*０２：０１−ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ、およびＡ型インフルエンザウイルス用Ａ*０２：０１−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（全てＰｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｌｔｄ社製）を加え、暗所、室温で１０分間のインキュベーション後に、ＣＤ３およびＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＵＳＡ、カリフォルニア州、サンノゼ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた。暗所、氷上で２０分間のインキュベーション後、細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＤｄｉｖａソフトウエアを用いたＦＡＣＳＣａｎｔｏ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。ウイルス特異的Ｔ細胞の頻度はＣＤ８陽性細胞の％として表した。
【００８６】
結果：  結果を図１０および下表１に示す。
ウイルス特異的ＣＤ８陽性細胞（それぞれＣＭＶ、ＥＢＶまたはＡ型インフルエンザウイルスに特異的）の頻度は、図１０に見られるように、活性化した同種異系細胞を用いた拡大培養後および活性化した同種異系細胞を用いない対照培養物中でのインキュベーション後に増加する。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
本明細書では特定の実施形態を詳細に開示したが、これは単に説明のために例として示したものであり、以下の添付の特許請求の範囲に関して限定を意図するものではない。特に、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な置換、変更および改変を行うことができることが本発明者により意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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