(57)【要約】  本発明は、リポソームワクチン組成物、その製造方法、および動物において免疫応答を刺激するするためのその使用方法に関する。これらの組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）またはジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＭＴＡＰ」）のいずれか、あるいはＤＭＰＣおよびＤＭＴＡＰの両方；および少なくとも１つのステロール；ならびに、第１のポリペプチド配列、および第１のポリペプチド配列とは異種の第２のポリペプチド配列（膜タンパク質由来の膜貫通配列を含む）を含む、抗原ポリペプチドから形成されるリポソームを含み、前記膜貫通配列は、脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、その少なくとも９の近接残基は約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測される。【選択図】図１
2014518620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む組成物であって：
ａ）水性ビヒクル；および
ｂ）下記を含むリポソーム：
（ｉ）ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、
（ｉｉ）ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＭＴＡＰ」）、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのステロール；ならびに
ｉｖ）Ｔ細胞抗原配列を含む第１のポリペプチド配列、および
第２のポリペプチド配列（自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を含む）、
前記第２のポリペプチド配列は脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、そのうちの少なくとも９の近接残基は、約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、
前記抗原ポリペプチド配列は、前記第２のポリペプチド配列のＮまたはＣ末端に直接または間接的に結合され、水溶性融合ポリペプチドを提供し、前記融合ポリペプチドの抗原ポリペプチド配列は、前記リポソームの外表面上に提示される、組成物。
【請求項２】
下記を含む組成物であって：
水性ビヒクル；および
下記を含むリポソーム：
ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、
ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＭＴＡＰ」）、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方、
少なくとも１つのステロール；ならびに
下記を含む抗原ポリペプチド：
インフルエンザＡ  Ｍ２細胞外ドメインの少なくとも１０の近接残基を含む第１のポリペプチド配列（その配列は、前記Ｍ２細胞外ドメインにおける自然発生する１つ以上のシステイン残基を除去するように修飾されている）、および
膜タンパク質由来の膜貫通配列を含むインフルエンザＡ  Ｍ２とは異種の第２のポリペプチド配列、
第２のポリペプチド配列は、インフルエンザＡ  Ｍ２とは異種の自然発生膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を含み、前記第２のポリペプチド配列は脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、そのうちの少なくとも９の近接残基は、約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、
前記第１のポリペプチド配列は、前記第２のポリペプチド配列のＮまたはＣ末端に直接または間接的に結合され、水溶性融合ポリペプチドを提供し、前記融合ポリペプチドの前記第１のポリペプチド配列は、前記リポソームの外表面上に提示される、組成物。
【請求項３】
ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージは、５０％〜９８％ＤＭＰＣ：１％〜２５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１％〜２５％ステロールである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージは７０％〜９８％ＤＭＰＣ：１％〜１５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１％〜１５％ステロールである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージは、７０％〜８５％ＤＭＰＣ：５％〜１５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１０％〜１５％ステロールである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージは、約７５％ＤＭＰＣ、約１０％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、および約１５％ステロールである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記リポソームはＤＭＰＧを含む、請求項１−６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記リポソームはＤＭＴＡＰを含まない、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
さらに、ペプチドグリカン、リポペプチド、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ、リポテイコ酸、レシキモド、イミキモド、フラゲリン、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド、α−ガラクトシルセラミド、ムラミルジペプチド、オールトランスレチノイン酸、二本鎖ウイルスＲＮＡ、ヒートショックタンパク質、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、カチオン界面活性剤、トール様受容体アゴニスト、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン、およびｎｏｄ様受容体アゴニストからなる群より選択される１つ以上の追加の構成成分を含む、請求項１−８の１つに記載の組成物。
【請求項１０】
コレステロール、クロロぎ酸コレステリル、スチグマステロール、シトステロール、エルゴステロール、ラノステロール、デスモステロール、およびカンプエステロールからなる群より選択されるステロールを含む、請求項１−９の１つに記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチド配列は、配列番号：１−９の１つの残基２−２２由来の少なくとも１０の近接残基を含む、請求項１−１０の１つに記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチド配列は、配列番号：１０−１２の１つ由来の少なくとも１０の近接残基を含む、請求項１−１０の１つに記載の組成物。
【請求項１３】
１つ以上のシステイン残基が、対象となるシステイン残基（複数可）の別の残基への突然変異により、または対象となるシステイン残基（複数可）前の細胞外ドメイン配列のトランケーションにより、インフルエンザＡ  Ｍ２細胞外ドメイン配列から除去される、請求項１−１２の１つに記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１のポリペプチド配列は、配列番号：１３−１５の１つ由来の少なくとも１０の近接残基を含む、請求項１−１０の１つに記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１のポリペプチド配列は配列番号：１６を含む、請求項１−１０の１つに記載の組成物。
【請求項１６】
前記第２のポリペプチド配列はチトクロムｂ５、ムチン−４β鎖、トランスフェリン受容体、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、アミノペプチダーゼＮ、ジペプチジルペプチダーゼ４、腫瘍壊死因子シンタキシン３、ＢｃｌＸＬ、およびＲ９ＡＰからなる群より選択されるタンパク質によりコードされる膜貫通配列を含む、請求項１−１５の１つに記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２のポリペプチド配列は配列番号：１７−２５の１つ由来の少なくとも１０の近接残基を含む、請求項１−１５の１つに記載の組成物。
【請求項１８】
前記第２のポリペプチド配列はチトクロムｂ５タンパク質によりコードされる膜貫通配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第２のポリペプチド配列は、配列番号：２６−４２の１つによりコードされる膜貫通配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１のポリペプチド配列は、配列番号：６０−８１からなる群より選択される１つ以上の配列を含む、請求項１、３−１０または１６の１つに記載の組成物。
【請求項２１】
動物を免疫化する方法であって、請求項１−２０の１つに記載の組成物を、非経口的経路を介して前記動物に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
請求項１または２に記載のリポソーム組成物を調製するための方法であって、
化学的方法により、抗原ポリペプチドを組換えにより発現または合成すること（前記抗原ポリペプチドは未変性条件下で単量体形態である）；
前記抗原ポリペプチドを水溶液中に精製すること；
前記抗原ポリペプチドを含む水溶液を、（ｉ）ＤＭＰＣ、（ｉｉ）ＤＭＰＧ、ＤＭＴＡＰ、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのステロールを含む脂質混合物に添加すること；
前記抗原ポリペプチドおよび脂質混合物を乾燥させること；ならびに
前記乾燥させた抗原ポリペプチドおよび脂質混合物を、水性ビヒクルの存在下超音波処理し、リポソームを形成させること
を含む、方法。
【請求項２３】
融合タンパク質をコードする単離された核酸配列であって、下記を含み:
チオレドキシンをコードする第１の核酸配列；
対象となるポリペプチド配列をコードする第２の核酸配列；および
自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列をコードする第３の核酸配列、
前記第２のポリペプチド配列は、脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、その少なくとも９の近接残基は約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、
前記核酸配列は、核酸が発現される場合、チオレドキシンが膜貫通配列のＮ末端で発現されるように構成される、核酸配列。
【請求項２４】
さらに、前記融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む、請求項２３に記載の単離された核酸配列。
【請求項２５】
さらに、親和性マーカーをコードする１つ以上の追加の核酸配列を含む、請求項２３または２４に記載の単離された核酸配列。
【請求項２６】
さらに、プロテアーゼ切断部位をコードする１つ以上の追加の核酸配列を含む、請求項２３−２５の１つに記載の単離された核酸配列。
【請求項２７】
前記単離された核酸配列の少なくとも一部は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項２３−２６の１つに記載の単離された核酸配列。
【請求項２８】
前記単離された核酸配列の少なくとも一部は大腸菌における発現のためにコドン最適化される、請求項２７に記載の単離された核酸配列。
【請求項２９】
前記第２の核酸配列は抗原配列、ポリペプチド標的リガンド、または融合ポリペプチド配列をコードする、請求項２３−２８の１つに記載の単離された核酸配列。
【請求項３０】
前記第３の核酸配列は、チトクロムｂ５、ムチン−４β鎖、トランスフェリン受容体、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、アミノペプチダーゼＮ、ジペプチジルペプチダーゼ４、腫瘍壊死因子シンタキシン３、ＢｃｌＸＬ、およびＲ９ＡＰからなる群より選択されるタンパク質によりコードされる膜貫通配列をコードする、請求項２３−２９の１つに記載の組成物。
【請求項３１】
前記第３の核酸配列は、配列番号：１７−２５の１つ由来の少なくとも１０の近接残基を含む、請求項２３−２９の１つに記載の組成物。
【請求項３２】
前記第３の核酸配列は、チトクロムｂ５タンパク質によりコードされる膜貫通配列を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第３の核酸配列は、配列番号：２６−４２の１つによりコードされる膜貫通配列を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項２３−３３の１つに記載の単離された核酸配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項３５】
対象となるポリペプチド配列を取得する方法であって、請求項３４に記載の宿主細胞から単離された核酸配列によりコードされる融合タンパク質を発現することを含む、方法。
【請求項３６】
さらに、前記発現された融合タンパク質の全てまたは部分を水溶液中に精製することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、
前記精製タンパク質を含む水溶液を、（ｉ）ＤＭＰＣ、（ｉｉ）ＤＭＰＧ、ＤＭＴＡＰ、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方、ならびに（ｉｉｉ）少なくとも１つのステロールを含む脂質混合物に添加すること；
前記精製タンパク質および脂質混合物を乾燥させること；ならびに
前記乾燥させた精製タンパク質および脂質混合物を、水性ビヒクルの存在下超音波処理し、リポソームを形成させること
を含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１１年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／４７９，３０２号（全ての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
連邦政府による資金提供受けた研究の記載
米国政府は、この出願において一括払いライセンスを有し、限られた環境において、国立アレルギー感染病研究所（ＮＩＨ）助成金番号Ｕ０１ＡＩ０７４５０８および１Ｒ４３ＡＩ０７８６５４の条件により、規定される妥当な条件で他のものにライセンスを供与することを特許権者に要求する権利を有する。
【０００３】
下記発明の背景の記載は、読み手に本発明を理解する手助けを提供するにすぎず、本発明の先行技術を記載し、またはこれを構成することを認めるものではない。
【０００４】
リポソームはリン脂質の１つ（「単層膜」）または複数（「多重膜」）の層から形成される小胞である。リン脂質基本単位の両親媒性のために、リポソームは典型的には、親水性外面を表し、親水性コアを封入する親水性層を含む。親水性／疎水性構成成分の組み入れにおけるリポソームの万能性、それらの無毒性、生分解性、生体適合性、アジュバント活性、細胞性免疫の誘導、徐放性およびマクロファージによる迅速取込みは、これらを、抗原の送達のための魅力的な候補にしている。
【０００５】
リポソームは、多種多様の細菌、原虫、ウイルスおよび腫瘍細胞抗原に対する体液性および細胞免疫の両方を誘導することが証明されている。リポソームワクチンの広範な使用が長く期待されているが、そのようなワクチンは商業的にほとんど開発されていない。リポソームの免疫アジュバント作用は、様々な構造特性に依存する。そのような特性としては、リポソームにより提供される抗原の三次元立体構造が挙げられ、これは必ずしも抗原の天然立体構造を模倣しない。
【０００６】
例えば、ＨＩＶ  ｇｐ４１の膜近位領域（ＭＰＲ）、膜貫通ドメインに対しＮ末端のおよそ３５アミノ酸からなるセグメントは、望ましいワクチン標的と考えられており、というのも、これは、ウイルスクレードにわたってよく保存され、ウイルス・細胞融合に必須であるからである。しかしながら、今日までの努力は有用な免疫応答を誘発するのに成功しておらず、担体タンパク質にコンジュゲートされたか、組換えコンストラクト上でグラフトされた、構造的に制約されたエピトープを提示する試みは中和抗体を誘発していない。エピトープ構造に関してコンセンサスがないことに加えて、ＭＰＲの比較的弱い免疫原性は、ＭＰＲを抗体認識からマスクするｇｐ４１上の免疫優性領域に向けられる組換えエンベロープ免疫原への免疫応答となってしまう可能性がある。
【０００７】
加えて、リポソーム形成前に抗原をリポソーム結合させるための方法は、しばしば抗原を清浄剤および／または有機溶媒に曝露させる。対照的に、形成後、抗原をリポソームに結合するための方法は、リポソームを不都合な化学的処理に曝露させる可能性がある。リポソームはまた、網内系およびマクロファージにより迅速に除去される可能性があり、リポソームのワクチンとしての効率が低減する。
【０００８】
加えて、そのような特性はまた、小胞運命をインビボで制御する因子を含み得る。リポソーム形成前に、抗原をリポソームと結合するための方法は、しばしば抗原を清浄剤および／または有機溶媒に曝露させる。対照的に、形成後に抗原をリポソームと結合させるための方法は、リポソームを不都合な化学的処理に曝露させる可能性がある。リポソームは網内系およびマクロファージにより迅速に除去される可能性があり、リポソームのワクチンとしての効率が低減する。
【０００９】
免疫応答を刺激するために有用な様式で抗原を送達するリポソームワクチンを提供することができる方法および組成物が当技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、リポソーム組成物、その製造方法、およびその使用方法を提供することである。そのような組成物は、動物において免疫応答を刺激するためにワクチン製剤として使用され得る。
【００１１】
１つの態様では、本発明は下記を含む組成物に関し：
ａ）水性ビヒクル；および
ｂ）下記を含むリポソーム：
（ｉ）ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、
（ｉｉ）ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＭＴＡＰ」）、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方，
（ｉｉｉ）少なくとも１つのステロール；ならびに
ｉｖ）抗原ポリペプチド配列、および
第２のポリペプチド配列（自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を含む）、
前記第２のポリペプチド配列は脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、そのうちの少なくとも９の近接残基は、約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、
前記抗原ポリペプチド配列は、前記第２のポリペプチド配列のＮまたはＣ末端に直接または間接的に結合され、水溶性融合ポリペプチドを提供し、融合ポリペプチドの抗原ポリペプチド配列は、リポソームの外表面上に提示される。
【００１２】
「約」という用語はこの文脈では一定の測定値の＋／−１０％を示す。
【００１３】
本発明のために、ポリペプチド配列のαらせん度および疎水性は、Ｅｓｉｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８４）  １７９：１２５−１４２の方法論を使用して、下記パラメータを用いて計算される：９のウィンドウサイズ、エッジ１００％の相対重量、線形重量変化、および下記の通りのアミノ酸スケール値：
Ａｌａ：０．６２０    Ａｒｇ：−２．５３０    Ａｓｎ：−０．７８０    Ａｓｐ：−０．９００    Ｃｙｓ：０．２９０    Ｇｌｎ：−０．８５０    Ｇｌｕ：−０．７４０    Ｇｌｙ：０．４８０    Ｈｉｓ：−０．４００    Ｉｌｅ：１．３８０    Ｌｅｕ：１．０６０    Ｌｙｓ：−１．５００    Ｍｅｔ：０．６４０    Ｐｈｅ：１．１９０    Ｐｒｏ：０．１２０    Ｓｅｒ：−０．１８０    Ｔｈｒ：−０．０５０    Ｔｒｐ：０．８１０    Ｔｙｒ：０．２６０    Ｖａｌ：１．０８０。
【００１４】
前述のように、好適な疎水性配列は、典型的に脂質二重層を通過するのに十分な長さ（約１５−３０残基；より好ましくは約１８−２５残基）を有し、そのうちの少なくとも９の近接残基は、約＋０．７の疎水性（Ｅｓｉｅｎｂｅｒｇスコア）を有するαヘリックスを形成すると予測される。
【００１５】
前記のある実施形態では、本発明は下記を含む組成物に関し：
ａ）水性ビヒクル；および
ｂ）下記を含むリポソーム：
（ｉ）ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、
（ｉｉ）ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＭＴＡＰ」）、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのステロール；ならびに
ｉｖ）抗原ポリペプチド（Ｍ２細胞外ドメインの少なくとも１０の近接残基を含む第１のポリペプチド配列を含み、その配列は、前記Ｍ２細胞外ドメインにおける自然発生する１つ以上のシステイン残基を除去するように修飾されている）および
第２のポリペプチド配列（自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を含む）、
前記第２のポリペプチド配列は脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、そのうちの少なくとも９の近接残基は、約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、
前記抗原ポリペプチド配列は、前記第２のポリペプチド配列のＮまたはＣ末端に直接または間接的に結合され、水溶性融合ポリペプチドを提供し、融合ポリペプチドの抗原ポリペプチド配列は、リポソームの外表面上に提示される。
【００１６】
「Ｍ２細胞外ドメイン」という用語は本明細書では、天然またはコンセンサスＭ２タンパク質配列の細胞外ドメイン由来の少なくとも１０のアミノ酸残基を含む、ＩＡＶ  Ｍ２タンパク質由来のポリペプチドを示し、これは、Ｍ２タンパク質膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠いており、よって、得られたＭ２細胞外ドメインポリペプチドは水性媒質中で可溶性である。
【００１７】
天然ＩＡＶ  Ｍ２タンパク質配列の例としては下記が挙げられる:
【化１】
2014518620.tif 000003
【化２】
2014518620.tif 000004
【化３】
2014518620.tif 000005
【化４】
2014518620.tif 000006
【化５】
2014518620.tif 000007
【化６】
2014518620.tif 000008
【化７】
2014518620.tif 000009
【化８】
2014518620.tif 000010
【化９】
2014518620.tif 000011
このリストは制限することを意味しない、というのも、何百ものＩＡＶ単離物が、配列決定されており、Ｍ２タンパク質配列が推定されているからである。これらの配列では、残基２−２２は細胞外ドメイン（イニシエータメチオニンは典型的には除去される）；残基２３−４３は、膜貫通ドメインを表し；残基４４−９７は細胞質ドメインを表す。
【００１８】
コンセンサスＩＡＶ  Ｍ２細胞外ドメイン配列は、多数のＩＡＶ単離物の相関により決定されている。異なる種由来のウイルス単離物に対する３つのコンセンサス配列がＢｅｔａｋｏｖａ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ２００７，  １３，  ３２３１−３２３５により記載されている：
ヒト（配列番号：１０）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ
ブタ（配列番号：１１）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＧＷＥＣＫＣＮＤＳＳＤ
トリ（配列番号：１２）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＧＷＥＣＫＣＳＤＳＳＤ
【００１９】
ある実施形態では、システイン残基は、これらの配列から除去される。これはシステイン残基の別の残基（例えば、セリン）への突然変異により、またはシステイン残基前の細胞外ドメインのトランケーションにより実施され得る。好ましい実施形態では、本明細書で記載される抗原ポリペプチドで用途が見出されるＩＡＶ  Ｍ２細胞外ドメイン配列は少なくとも１０の近接残基、最も好ましくは下記配列の１つ以上由来の１５残基全てを含む：
ヒト（配列番号：１３）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧ；
ブタ（配列番号：１４）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＧＷＥ；または
トリ（配列番号：１５）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＧＷＥ
【００２０】
そのような好ましいＩＡＶ  Ｍ２細胞外ドメイン配列の１つの例では、システインがセリンに突然変異されており、本明細書で記載される抗原ポリペプチドで用途が見出されるＩＡＶ  Ｍ２細胞外ドメイン配列は下記を含む：
（配列番号：１６）：ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＳＲＳＮＤＳＳＤ。
【００２１】
【表１】
2014518620.tif 000012
2014518620.tif 000013
【００２２】
本発明のために、ポリペプチド配列は、自然発生タンパク質の配列に少なくとも９０％同一、より好ましくは９５％同一、および最も好ましくは少なくとも９７％同一である場合、特定の自然発生タンパク質配列から「誘導」される。
【００２３】
本発明のために、配列が、抗原ポリペプチド配列がこれから取得され、または誘導されるタンパク質とは異なる自然発生タンパク質から取得され、または誘導される場合、膜貫通配列は「異種」である。本発明で用途が見出される自然発生タンパク質の例示的な膜貫通ドメインは以下で記載される。
【００２４】
便宜上、上記部分（ｉｉ）で選択される脂質（複数可）は、下記でＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰと呼ばれ、これは、ＤＭＰＧ、ＤＭＴＡＰ、またはこの２つの混合物を意味することが意図される。ある実施形態では、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージは、５０％〜９８％ＤＭＰＣ：１％〜２５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１％〜２５％ステロールであり、ある一定の他の実施形態では、７０％〜９８％ＤＭＰＣ：１％〜１５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１％〜１５％ステロールである。これは、他の構成成分がリポソーム中に存在しないことを暗示することを意味せず；むしろ、これらは、モル基準での互いに対するＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージを表す。ある実施形態では、リポソームはまた、当技術分野でよく知られた１つ以上の追加の構成成分、例えばペプチドグリカン、リポペプチド、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ、リポテイコ酸、レシキモド、イミキモド、フラゲリン、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド、α−ガラクトシルセラミド、ムラミルジペプチド、オールトランスレチノイン酸、二本鎖ウイルスＲＮＡ、ヒートショックタンパク質、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、カチオン界面活性剤、トール様受容体アゴニスト、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン、およびｎｏｄ様受容体アゴニストを含むことができる。
【００２５】
好ましい実施形態では、これらの相対パーセンテージは７０％〜８５％ＤＭＰＣ：５％〜１５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１０％〜１５％ステロールであり、より好ましくは約７５％ＤＭＰＣ、約１０％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、および約１５％ステロールである。本明細書でこの文脈で使用される「約」という用語は、一定の測定値の＋／−１０％を示す。ＤＭＰＧは上記部分（ｉｉ）で選択される脂質として特に好ましい。
【００２６】
「ステロール」という用語は本明細書では、ステロイドに特徴的な４−員環構造および３−炭素位でのヒドロキシル（−ＯＨ）またはエステル（−ＯＲ）置換を有する任意の分子を示す：
【化１０】
2014518620.tif 000014
【００２７】
当業者は、ステロールはさらに、１つ以上の他の環炭素で置換することができ、環内に様々な二重結合を含み得ることを理解するであろう。ある実施形態では、ステロールはコレステロール、クロロぎ酸コレステリル、スチグマステロール、シトステロール、エルゴステロール、ラノステロール、デスモステロール、およびカンプエステロールからなる群より選択される。このリストは制限することを意味しない。
【００２８】
本明細書で記載されるように、便宜的に抗原ポリペプチドは、融合タンパク質として調製され、これは疎水性膜貫通ドメインの存在に関わらず、水溶液中で可溶性である。水溶性抗原コンストラクトの提供は、（１）生物からの融合タンパク質としての発現のための水性系または従来の水性合成化学方法を使用して、コンストラクトをリポソームとは別に生成させることを可能にし、；（２）その後の標準水性精製手順を可能にする。ＷＯ００／０１６７４６号（全ての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００２９】
本発明のために、２つのポリペプチド間のペプチド結合間に介在化学結合がない場合、２つのポリペプチドは互いに「直接結合され」、一方、連結化学構造が２つのポリペプチドを連結させる場合、２つのポリペプチドは「間接的に結合され」る。間接カップリングの一例は、１つ以上のアミノ酸残基、ジスルフィド結合、または二官能性化学架橋試薬であり得る。このリストは制限することを意味しない。２つのポリペプチド配列を共有結合的に結合させるための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、抗原ポリペプチドは、標準分子生物学的技術を用いてＭ２細胞外ドメイン残基および膜貫通ドメイン残基の両方を含む単一の「融合」タンパク質として合成または発現され得る。Ｍ２細胞外ドメイン残基および膜貫通ドメイン残基が別個の分子として合成または発現される場合、化学架橋剤、例えばＷｏｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．，  １９９１において記載されるものが使用され得る。これらの試薬は、典型的には、ペプチドのアミノ酸側鎖に結合する官能基を提供する。架橋剤を用いて標的にすることができる部分としては、一級およびε−アミン、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、およびカルボン酸が挙げられる。加えて、多くの反応基は架橋剤、例えば光反応性フェニルアジドを使用して非選択的に結合させることができる。２つの配列は末端間で直接結合することができ、あるいは追加の連結原子またはアミノ酸残基を対象となる２つのポリペプチド配列間に含めることができる。
【００３０】
脂質混合物からリポソームを調製するための好適な方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｂａｓｕ  ＆  Ｂａｓｕ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００２；  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，  ２００６を参照されたい。好ましい方法としては、その中で記載される押出、均質化、および超音波処理方法が挙げられる。本発明のリポソームを調製するための例示的な方法は、脂質混合物を乾燥させること、続いて水性ビヒクル中での水和および超音波処理をしてリポソームを形成させることを含み、以下で記載される。好ましいステロイド誘導体、免疫原性ポリペプチドまたは炭水化物をそのような誘導体に共有結合的に結合させるための方法、および共有結合が、上記で、および以下で詳細に記載される。
【００３１】
ある実施形態では、リポソームは特定の平均サイズ範囲内で提供され、というのも、サイズはリポソームが粘膜によって送達された時に取り込まれ、および／または静脈内で送達された時に除去される効率に影響し得るからである。リポソームサイズは、当技術分野でよく知られた方法、例えば光子相関分光法、動的光散乱、などにより決定され得る。好ましい実施形態では、リポソームは、実質的に５０〜５００ｎｍの間の直径、より好ましくは実質的に５０〜３００ｎｍの間の直径である。「実質的に」という用語は、本明細書ではこの文脈では、リポソームの少なくとも７５％、より好ましくは８０％、および最も好ましくは少なくとも９０％が指定された範囲内にあることを意味する。
【００３２】
ある実施形態では、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージは５０％〜９８％ＤＭＰＣ：１％〜２５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１％〜２５％ステロール、およびある一定の他の実施形態では７０％〜９８％ＤＭＰＣ：１％〜１５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１％〜１５％ステロールである。上記のように、これは、他の構成成分が脂質混合物中（よって、リポソーム中）に存在しないことを暗示することを意味せず；むしろ、これらは、モル基準での互いに対するＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、およびステロールの相対パーセンテージを表す。ある実施形態では、脂質混合物はまた、当技術分野でよく知られた１つ以上の追加の構成成分、例えばペプチドグリカン、リポペプチド、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ、リポテイコ酸、レシキモド、イミキモド、フラゲリン、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド、α−ガラクトシルセラミド、ムラミルジペプチド、オールトランスレチノイン酸、二本鎖ウイルスＲＮＡ、ヒートショックタンパク質、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、カチオン界面活性剤、トール様受容体アゴニスト、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン、およびｎｏｄ様受容体アゴニストを含むことができる。
【００３３】
好ましい実施形態では、これらの相対パーセンテージは７０％〜８５％ＤＭＰＣ：５％〜１５％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ：１０％〜１５％ステロールであり、より好ましくは約７５％ＤＭＰＣ、約１０％ＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ、および約１５％ステロールである。「約」という用語は本明細書ではこの文脈では一定の測定値の＋／−１０％を示す。ＤＭＰＧは上記部分（ｉｉ）で選択される脂質として特に好ましい。
【００３４】
最終組成物中の抗原ポリペプチドの好ましい濃度は、約０．０５〜１ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約０．１〜０．６ｍｇ／ｍＬの範囲にある。「約」という用語は本明細書ではこの文脈では一定の測定値の＋／−１０％を示す。
【００３５】
ある実施形態では、方法はさらに、特定の平均サイズ範囲内のリポソームを選択することを含む。リポソームサイズは、例えば、リポソームを含む水性ビヒクルを予め選択された細孔サイズを有する膜を通して押出し、膜を通って流れる材料を収集することにより選択することができる。好ましい実施形態では、リポソームは、実質的に５０〜５００ｎｍの間の直径、より好ましくは実質的に５０〜２００ｎｍの間の直径、最も好ましくは実質的に５０〜１５０ｎｍの間の直径となるように選択される。「実質的に」という用語は本明細書ではこの文脈ではリポソームの少なくとも７５％、より好ましくは８０％、および最も好ましくは少なくとも９０％が指定された範囲内にあることを意味する。
【００３６】
ある実施形態では、膜貫通配列は、その天然構成において、シグナル・アンカー配列を有する異種膜タンパク質から取得され、または誘導される。本明細書では、これは、タンパク質、例えばＩＩ型またはＩＩＩ型膜タンパク質の膜貫通ドメイン由来の少なくとも１０の近接残基（ある実施形態では少なくとも１５の近接残基、さらに他の実施形態では少なくとも１８の近接残基、さらに別の実施形態では少なくとも２０の近接残基、いくつかの実施形態では２５以上の近接残基）を含むポリペプチド配列を示す。そのような配列は典型的に、脂質二重層を通過するのに十分な長さ（約１５−３０残基；より好ましくは約１８−２５残基）を有し約＋１．５／残基の疎水性（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、スコア）を有するαヘリックスを形成すると予測される。「約」という用語はこの文脈では、一定の測定値の＋／−１０％を示す。ＩＩ型およびＩＩＩ型膜タンパク質は、膜挿入および形態を制御する切断可能なＮ末端シグナルペプチドを欠き、代わりに、ポリペプチドのトランスロケーションを媒介し、膜内でタンパク質を固定させる切断不可能なシグナル配列である疎水性「シグナル・アンカー配列」を介して、翻訳後に膜内挿入する。
【００３７】
そのようなタンパク質の１つの例はチトクロムｂ５である。チトクロムｂ５ポリペプチドは、トリプシン感受性セグメントにより連結された２つの別個のドメインから構成される。アミノ近位ドメインは、電子伝達に関与する触媒ドメインであり、疎水性「カルボキシル近位」ドメインは、タンパク質を膜内に固定するように機能する。当技術分野で知られている他の好適な１回貫通膜タンパク質としては、ムチン−４β鎖、トランスフェリン受容体、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、アミノペプチダーゼＮ、ジペプチジルペプチダーゼ４、腫瘍壊死因子シンタキシン３、ＢｃｌＸＬ、およびＲ９ＡＰが挙げられる。このリストは制限することを意味しない。
【００３８】
ある一定の別の実施形態では、膜貫通配列は、複数のシグナル・アンカー配列を有する複数回貫通膜タンパク質である異種膜タンパク質、例えばバクテリオロドプシン、Ｇタンパク質共役型受容体、例えばＣＣＲｓ１−１０、ＣＸＣＲ１、アセチルコリン受容体、アドレノメデュリン受容体、など、チトクロムＣオキシダーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体、ｍＧｌｕＲｓおよびアクアポリンから取得され、または誘導される。このリストは制限することを意味しない。
【００３９】
好適な膜貫通ドメインの例は、１つ以上の下記配列由来の１０以上の近接残基を含む。多数の他のそのようなドメインは当技術分野でよく知られており、配列は、ＤＡＳサーバを用いて計算される膜貫通ドメインを形成すると予測され得る（Ｃｓｅｒｚｏ，  Ｍ．，  Ｅ．  Ｗａｌｌｉｎ，  Ｉ．  Ｓｉｍｏｎ，  Ｇ．  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ．  １９９７．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：６７３−６７６）。
Ｒ９ＡＰ  ＴＭ（配列番号：１７）：  ＬＩＶＳＬＬＬＣＧＴＡＬＶＡＩＴＬ
ｍＧｌｕＲ１  ＴＭ（配列番号：１８）：ＩＩＡＩＡＦＳＣＬＧＩＬＶＴＬＦＶＴＬＩＦＶＬＹ
Ｃｙｔ  ｂ５ａ  ＴＭ（配列番号：１９）：ＶＩＰＡＩＳＡＶＡＶＡＬＭＹ
Ｃｙｔ  ｂ５ａ  ＴＭ  ｂｏｖ（配列番号：２０）：ＬＩＰＡＩＳＡＬＦＶＡＬＩＹ
Ｃｙｔ  ｂ５ａ  ＴＭ  ｓｕｓ（配列番号：２１）：ＶＩＰＡＩＳＡＬＶＶＳＬＭＹ
Ｃｙｔ  ｂ５ａ  ＴＭ  ｘｅｎ（配列番号：２２）：ＬＩＰＡＡＡＶＶＬＬＧＦＭＹ
ＢｃｌＸＬ  ＴＭ（配列番号：２３）：ＴＧＭＴＶＡＧＶＶＬＬＧＳ  
Ｓｔｘ  ３  ＴＭ（配列番号：２４）：ＩＭＩＬＩＣＣＶＩＬＡＩＶＩＡＳＴＩ  
ＭＧＣ８０３２７  ｘｅｎ  ＴＭ（配列番号：２５）：ＩＩＰＧＩＳＡＭＩＶＡＬＭＹ
【００４０】
Ｃｙｔ  ｂ５ａ配列を例示的な疎水性膜貫通ドメインと取ると、本発明の抗原融合タンパク質は、下記配列の１つの全て、または任意の近接部分を含むことができるが、ただし、配列が少なくとも下線を引いた残基を含むことを条件とする：
ヒト（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００１６７）（配列番号：２６）ＮＫＰＰＥＴＬＩＴＴＩＤＳＳＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＶＡＶＡＬＭＹＲＬＹＭＡＥＤ
ドブネズミ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００１７３）（配列番号：２７）ＡＫＰＳＥＴＬＩＴＴＶＥＳＮＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＬＶＶＡＬＭＹＲＬＹＭＡＥＤ
ハツカネズミ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ５６３９５）（配列番号：２８）ＡＫＰＳＤＴＬＩＴＴＶＥＳＮＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＬＡＶＡＬＭＹＲＬＹＭＡＥＤ
アナウサギ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００１６９）（配列番号：２９）ＳＫＰＭＥＴＬＩＴＴＶＤＳＮＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＬＩＶＡＬＭＹＲＬＹＭＡＤＤ
ニワトリ  （Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００１７４）（配列番号：３０）ＱＫＰＡＥＴＬＩＴＴＶＱＳＮＳＳＳＷＳＮＷＶＩＰＡＩＡＡＩＩＶＡＬＭＹＲＳＹＭＳＥ
イノシシ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００１７２）（配列番号：３１）ＡＫＰＳＥＴＬＩＴＴＶＥＳＮＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＬＶＶＳＬＭＹＨＦＹＴＳＥＮ
ウマ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ００１７０）（配列番号：３２）ＡＫＰＶＥＴＬＩＴＴＶＤＳＮＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＶＶＶＡＬＭＹＲＩＹＴＡＥＤ
ゴールデンハムスター（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ７０１１６）（配列番号：３３）ＡＫＰＳＥＳＬＩＴＴＶＥＳＮＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＶＳＡＬＡＶＡＬＭＹＲＬＹＭＧＲＲ
ヒツジ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｃ９Ｅ８Ｍ７）（配列番号：３４）ＴＫＰＳＥＳＩＩＴＴＩＤＳＮＳＳＷＷＴＮＷＬＩＰＡＩＳＡＬＶＶＡＬＭＹＨＬＹＴＳＥＮ
アフリカツメガエル（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ２８ＥＡ４）（配列番号：３５）ＫＮＱＧＫＮＤＶＬＬＴＴＳＳＳＳＳＳＳＷＳＳＷＬＩＰＡＡＡＶＶＬＬＧＦＭＹＲＦＹＭＶＤ
カイコ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ２Ｆ５Ｓ４）（配列番号：３６）ＱＹＳＷＥＤＴＡＫＴＳＥＴＥＡＳＦＶＮＳＷＫＦＰＶＬＬＧＬＡＬＴＬＬＹＳＹＩＦＧ
オリーブ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｏ：２４６５１）（配列番号：３７）ＫＱＰＨＹＮＱＤＫＴＳＤＦＩＩＫＬＬＱＦＬＶＰＬＦＩＬＧＶＡＶＧＩＨＦＹＴＫＳＳＡ
ロドシュードモナス・パルストリス（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ０７Ｐ４４）（配列番号：３８）ＷＣＧＫＥＡＴＥＡＹＡＴＫＴＫＧＲＡＨＴＲＥＡＤＥＬＬＰＫＹＲＩＧＲＦＡＰ
ゼノパス・トロピカリス（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ２８ＥＡ４）（配列番号：３９）ＱＫＰＴＥＴＦＩＴＴＴＤＳＤＳＳＷＷＳＮＷＩＩＰＧＩＳＡＦＩＶＡＬＭＹＲＦＹＭＡＳＥ
ミサキマメイタボヤ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ９ＧＶ２１）（配列番号：４０）ＱＥＥＱＰＱＦＶＴＴＨＥＳＭＡＥＴＳＳＷＳＮＷＶＩＰＡＩＶＡＬＡＶＡＬＶＹＲＹＹＩＳＮ
【００４１】
ｃｙｔ  ｂ５タンパク質配列の前記リストは制限することを意味しない。他の同様のタンパク質はまた、当技術分野でよく知られている。好ましくは、そのようなポリペプチド配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号により上記で列挙されるｃｙｔ  ｂ５タンパク質配列の１つに対し少なくとも７０％の配列同一性、および、上記で列挙される全４２残基長にわたって配列番号：２６として上記で列挙されるヒト配列に対し好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、および最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を含む。配列同一性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）(Altschul, S.F. et al.
(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)を用いて決定され、デフォルトパラメータに設定される。遺伝子コードの縮重を使用して核酸配列を変化させ、全てが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸配列を生成させることができることが理解される。例として、本発明の抗原融合タンパク質は下記配列の全て、または任意の近接部分を含むことができ、ただし、配列は少なくとも下線を引いた残基を含むことを条件とする：
アフリカツメガエルＭＧＣ８０３２７タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ６ＤＥ１３）（配列番号：４１）ＱＫＰＳＥＴＦＩＴＴＴＤＳＤＳＳＷＷＳＮＷＩＩＰＧＩＳＡＭＩＶＡＬＭＹＲＦＹＭＶＳＥ
アカゲザルＥＭＢＬ：ＣＯ：６４６５５１（配列番号：４２）ＳＫＰＰＥＴＬＩＴＴＶＤＳＳＳＳＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＶＡＶＡＬＭＹＲＬＹＭＡＥＤ
【００４２】
関連する態様では、本発明は動物において体液性および／または細胞免疫応答を確立するために選択された第１のポリペプチド配列を含む精製抗原ポリペプチドに関し、第１のポリペプチド配列は、自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を含む第２のポリペプチド配列のＮまたはＣ末端に直接または間接的に結合され、前記第２のポリペプチド配列は、脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、その少なくとも９の近接残基は、約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、前記精製抗原ポリペプチド配列は水溶性である。
【００４３】
ある一定の例示的な実施形態では、本発明は、Ｍ２細胞外ドメインの少なくとも１０の近接残基を含む第１のポリペプチド配列を含み、その配列は、前記Ｍ２細胞外ドメイン中の自然発生する１つ以上のシステイン残基を除去するように修飾されており、任意で、自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を含む第２のポリペプチド配列を含む、精製抗原ポリペプチドを提供し、前記第２のポリペプチド配列は、脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、その少なくとも９の近接残基は約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、前記精製抗原ポリペプチド配列は水溶性であり、前記第１のポリペプチド配列は、前記第２のポリペプチド配列のＮまたはＣ末端に直接または間接的に結合される。
【００４４】
他の態様では、本発明は、動物を免疫化するための方法に関する。これらの方法は、前記動物に非経口的または経腸経路により、有効量の本発明の組成物を送達することを含む。そのような組成物を製造するための好ましい材料、方法、および条件は、上記および以下で詳細に記載される。
【００４５】
好ましい経腸投与経路は口（経口）、経鼻、直腸、および腟内経路による送達を含む。好ましい非経口的投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内経路が挙げられる。
【００４６】
ある実施形態では、本発明の方法は、一般に「プライムブースト」免疫化プロトコルと呼ばれる、本発明の組成物の複数送達を含む。好ましい実施形態では、１つ以上のプライムブースト送達は、動物に非経口的または経腸経路により本発明のリポソーム組成物を送達することを含む。そのような免疫化プロトコルでは、プライミング送達は、１つ以上のブースト送達とは異なる投与経路を介してもよい。例えば、プライミング送達は、免疫原の皮下送達によるものとしてもよく、ブースト送達は、筋肉内送達により実施してもよい。
【００４７】
加えて、対象となる抗原のプライムおよび１つ以上のブースト送達は、「同種」とすることができ、プライムおよびブーストの両方が本発明のリポソーム組成物の送達を含むことを意味し；あるいは、「異種」とすることができ、プライムまたはブースト送達の１つが本発明のリポソーム組成物の送達を含むが、別の送達は、異なるワクチンプラットフォームによりなされ得ることを意味する。そのような別のワクチンプラットフォームとしては、非リポソームワクチン製剤での抗原の送達、抗原をコードするＤＮＡワクチンの送達、組換えウイルスワクチンの送達、などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４８】
別の態様では、本発明は、本発明のリポソーム組成物を調製するための方法に関する。これらの方法は、抗原ポリペプチドを発現または合成すること（抗原ポリペプチドは未変性条件下で単量体形態である）；抗原ポリペプチドを精製すること；抗原ポリペプチドを含む水溶液を、（ｉ）ＤＭＰＣ、（ｉｉ）ＤＭＰＧ、ＤＭＴＡＰ、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方、および（ｉｉＩ）少なくとも１つのステロールを含む脂質混合物に添加すること；抗原ポリペプチドおよび脂質混合物を乾燥させること；ならびに乾燥させた抗原ポリペプチドおよび脂質混合物を、水性ビヒクルの存在下超音波処理し、リポソームを形成させることを含む。
【００４９】
本発明の別の目的は、対象となるポリペプチドを自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列を有する融合タンパク質として発現するように構成され、配列された核酸を提供することである。そのような核酸は好ましくは単離または精製され、それらの用語は本明細書で規定される。
【００５０】
第１の態様では、本発明の核酸は、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、その配列は下記を含み：
チオレドキシンをコードする第１の核酸配列；
対象となるポリペプチド配列をコードする第２の核酸配列；および
自然発生異種膜タンパク質の、またはこれから誘導される膜貫通配列をコードする第３の核酸配列、
前記第２のポリペプチド配列は、脂質二重層を通過するのに十分な多数の残基を有し、その少なくとも９の近接残基は約０．７以上の疎水性スコアを有するαヘリックスを形成すると予測され、
前記核酸配列は、核酸が発現される場合、チオレドキシンが膜貫通配列のＮ末端で発現されるように構成される。
【００５１】
ある実施形態では、本発明の核酸はさらに、１つ以上の追加の核酸配列を含み、これらは、発現系におけるそのような核酸の使用を促進する。そのような核酸配列は発現調節配列、例えば、発現ベクターを提供するためにそのような核酸に作動可能に連結されたプロモーター配列およびリボソーム結合部位を含むことができる。さらに他の追加の核酸配列は、親和性マーカー、検出マーカー、および／またはプロテアーゼ切断部位を含む。このリストは制限することを意味しない。
【００５２】
様々な実施形態では、そのようなベクターにおける核酸配列の順序は、融合タンパク質において、Ｎ末端〜Ｃ末端の発現順序が下記となるように構成される：チオレドキシン−対象となるポリペプチド配列−膜貫通配列；またはチオレドキシン−親和性マーカー−プロテアーゼ切断部位−対象となるポリペプチド配列−膜貫通配列；チオレドキシン−プロテアーゼ切断部位−対象となるポリペプチド配列−膜貫通配列；またはチオレドキシン−膜貫通配列−対象となるポリペプチド配列；またはチオレドキシン−親和性マーカー−プロテアーゼ切断部位−膜貫通配列−対象となるポリペプチド配列；またはチオレドキシン−プロテアーゼ切断部位−膜貫通配列−対象となるポリペプチド配列。各々の場合において、そのような核酸配列は好ましくは発現ベクター中に存在し、好適な発現調節配列に作動可能に連結される。
【００５３】
以下で記載されるように、発現宿主とは異種であるタンパク質配列の発現は、発現されるべき配列中の希なコドンを組換えにより、宿主系のコドンバイアスをより厳密に反映する他のものと置換することによりしばしば改善することができ、アミノ酸配列は変更されない（「コドン最適化」と呼ばれる）。様々な実施形態では、本発明の核酸の少なくとも一部がコドン最適化される。例として、大腸菌が発現のための種として選択される場合、上記で記載される第１、第２、および第３の核酸配列の１つ以上が、大腸菌中に存在することが知られているコドンバイアスを占めるようにコドン最適化される。
【００５４】
様々な実施形態では、対象となるポリペプチド配列をコードする第２の核酸配列は、抗原配列、ポリペプチド標的リガンド（例えば、本明細書では「受容体」と呼ばれる標的に結合する抗体または他のアミノ酸配列）、融合ポリペプチド配列、などをコードすることができ、それは、チオレドキシンおよび膜貫通配列の両方に対し異種である。
【００５５】
関連する態様では、本発明は、そのような核酸ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。ある一定の態様では、形質転換宿主細胞は、ベクターによりコードされる選択可能なマーカーおよび宿主細胞により発現される融合タンパク質をコードする核酸を用いて選択することができる。任意で、融合タンパク質は宿主細胞から分離され、水性媒質中で精製され得る。この融合タンパク質はその後、上記のようにリポソームに組み込むことができ、よって、対象となるポリペプチド配列がリポソームの表面上で提示される。
【００５６】
本発明は、その適用において、下記説明において明記され、または図面において図示される構成の詳細および構成成分の配列に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、実施形態を、記載されているものに加えて、様々な様式で実行し、実施することができる。また、本明細書、ならびに要約において使用される表現および専門用語は、説明目的のためであり、制限するものと考えるべきではないことが理解されるべきである。
【００５７】
そのようなものとして、当業者は、本開示が基本とする概念は、本発明のいくつかの目的を実施するために他の構造、方法および系を設計するための基本として容易に使用することができることを認識するであろう。よって、特許請求の範囲は、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、そのような等価の構成を含むものと考えられることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−１０】Esienberg et al., J. Mol. Biol. (1984) 179:125-142の方法論を使用して計算した、本発明の実施において使用するための様々なポリペプチド膜貫通配列の疎水性プロットである。
【００５９】
【発明を実施するための形態】
【００６０】
「投与」は、ヒト、哺乳類、哺乳類対象、動物、獣医学対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官、または生物流体に適用される場合、非制限的に、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬、または組成物の対象、細胞、組織、器官、または生物流体、などとの接触を示す。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、および実験方法を示すことができる。細胞の治療は試薬の細胞との接触、ならびに試薬の流体との接触を含み、この場合、流体は、細胞と接触する。「投与」はまた、例えば、細胞の試薬、診断薬、結合組成物、または別の細胞によるインビトロおよびエクスビボ処理を含む。
【００６１】
「アゴニスト」はリガンドおよび受容体に関する場合、受容体を刺激する分子、分子の組み合わせ、複合体、または試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアゴニストはＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦのムテインもしくは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣物、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体を含むことができる。
【００６２】
「アンタゴニスト」はリガンドおよび受容体に関する場合、受容体を阻害、対抗、下方制御、および／または脱感作する分子、分子の組み合わせ、または複合体を含む。「アンタゴニスト」は、受容体の恒常的活性を阻害する任意の試薬を含む。恒常的活性は、リガンド／受容体相互作用が存在しない場合顕著となるものである。「アンタゴニスト」はまた、受容体の刺激（または制御）された活性を阻害または防止する任意の試薬を含む。例として、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアンタゴニストとしてはリガンド（ＧＭ−ＣＳＦ）に結合し、それが受容体に結合しないように防止する抗体、または受容体に結合し、リガンドが受容体に結合しないように防止する抗体、あるいは、抗体が受容体を不活性立体構造でロックする場合が挙げられるが、いかなる制限も意味しない。
【００６３】
「保存的修飾バリアント」はアミノ酸および核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関しては、保存的修飾バリアントは、同一のアミノ酸配列、または１つ以上の保存的置換を有するアミノ酸配列をコードする核酸を示す。保存的置換の一例は、下記群の１つにおける１つのアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸と交換することである（Ｌｅｅらに発行された米国特許第５，７６７，０６３号；  Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１３２）。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（７）小アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ。
【００６４】
「有効量」は、限定はされないが、病状または障害の症状または徴候を寛解、逆転、緩和、防止、または診断することができる量を含む。明確にまたは文脈により別記されない限り、「有効量」は、状態を寛解させるのに十分な最小量に限定されない。
【００６５】
「遺伝子」は、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を示す。オリゴペプチドまたはポリペプチドは、生物学的に活性、抗原的に活性、生物学的に不活性、または抗原的に不活性、などとすることができる。遺伝子という用語は、例えば、下記を含む：特定のオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の和；ＯＲＦ＋イントロンをコードする核酸の和；ＯＲＦおよび作動可能に連結されたプロモーター（複数可）の和；ＯＲＦおよび作動可能に連結されたプロモーター（複数可）および任意のイントロンの和；ＯＲＦおよび作動可能に連結されたプロモーター（複数可）、イントロン（複数可）、およびプロモーター（複数可）、および他の調節エレメント、例えばエンハンサー（複数可）の和。ある実施形態では、「遺伝子」は、遺伝子の発現をシス制御するのに必要とされる任意の配列を含む。遺伝子という用語はまた、抗原もしくは抗原的に活性なペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の断片を含むペプチドをコードする核酸を示すことができる。遺伝子という用語は、コードされたペプチドまたはタンパク質がいずれかの生物活性を有すること、あるいはさらに、ペプチドまたはタンパク質が抗原的に活性であることを必ずしも暗示しない。発現できない配列をコードする核酸配列は一般に偽遺伝子と考えられる。遺伝子という用語はまた、リボ核酸、例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはリボザイムをコードする核酸配列を含む。
【００６６】
「リガンド」は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである小分子、ペプチド、ポリペプチド、または膜結合もしくは膜結合型分子を示す。「リガンド」はまた、アゴニストまたはアンタゴニストではなく、アゴニストまたはアンタゴニスト特性を有しない結合剤を含む。慣例により、リガンドが第１の細胞上で膜結合型である場合、受容体は通常第２の細胞上で起こる。第２の細胞は、第１の細胞と同じアイデンティティー（同じ名称）を有してもよく、または異なるアイデンティティー（異なる名称）を有してもよい。リガンドまたは受容体は完全に細胞内にある場合があり、すなわち、サイトゾル、核、またはいくつかの他の細胞内区画内に存在し得る。リガンドまたは受容体はその位置を、例えば、細胞内区画から細胞膜の外面上へ変化させ得る。リガンドおよび受容体の複合体は、「リガンド受容体複合体」と呼ばれる。リガンドおよび受容体が、シグナル経路に関与する場合、リガンドは、シグナル経路の上流位置で生じ、受容体は下流位置で生じる。リガンドは抗体であり得る。「抗体」という用語は本明細書では、抗原またはエピトープに特異的に結合することができる、１つまた複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片に由来する、これをモデルにする、またはこれにより実質的にコードされる、ペプチドまたはポリペプチドを示す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗ．Ｅ．  Ｐａｕｌ，  ｅｄ．，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９３）；  Ｗｉｌｓｏｎ  （１９９４；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：２６７−２７３；  Ｙａｒｍｕｓｈ  （１９９２）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：８５−９７を参照されたい。抗体という用語は、抗原に結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含み、例えば、下記が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨｌドメインから構成される一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨｌドメインから構成されるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）（ＶＨドメインから構成される）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。単鎖抗体はまた、「抗体」という用語において言及されることにより含められる。
【００６７】
「核酸」はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドならびに一本鎖、二本鎖形態、または多本鎖形態のいずれかのそれらのポリマを示す。核酸の非制限的例は、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドである。特定の核酸配列はまた、「アレルバリアント」および「スプライスバリアント」を暗に含むことができる。
【００６８】
「作動可能に連結された」は、プロモーターおよびｍＲＮＡをコードする核酸との関連で、そのプロモーターをその核酸の転写を開始するために使用することができることを意味する。
【００６９】
「パーセント配列同一性」および「％配列同一性」という用語は２以上のアミノ酸または核酸配列の比較またはアライメントより見出される配列類似性のパーセンテージを示す。パーセント同一性は２つの分子間の配列情報の直接比較により、配列を整列させ、２つの整列された配列の間の整合の正確な数を計数し、より短い配列の長さにより割り、その結果に１００をかけることにより決定することができる。パーセント同一性を計算するためのアルゴリズムはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムである（例えば、Ｋａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  （２００２）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４８：３６７−３７６；  Ａｒｓｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：３２７−３３７を参照されたい)。
【００７０】
「精製」および「単離」により、ポリペプチドについて言及された場合、ポリペプチドが、自然において関連する他の生体高分子が実質的になしで存在することが意味される。「精製」という用語は本明細書では、同定されたポリペプチドが、存在するポリペプチドの、しばしば少なくとも５０％を占め、よりしばしば少なくとも６０％を占め、典型的には少なくとも７０％を占め、より典型的には少なくとも７５％を占め、最も典型的には少なくとも８０％を占め、通常的には少なくとも８５％を占め、より通常的には少なくとも９０％を占め、最も通常的には少なくとも９５％を占め、慣習的には少なくとも９８％（重量で）、またはそれ以上を占めることを意味する。水、緩衝液、塩、清浄剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、安定剤（添加されたタンパク質、例えばアルブミンを含む）、および賦形剤、ならびに１０００未満の分子量を有する分子の重量は、ポリペプチド純度の決定には一般に使用されない。例えば、Ｃｏｖａｃｃｉらに発行された米国特許第６，０９０，６１１号における純度の記載を参照されたい。
【００７１】
「ペプチド」は、アミノ酸の短い配列を示し、この場合、アミノ酸は互いにペプチド結合により連結される。ペプチドは、自由で、または別の部分、例えば高分子、脂質、オリゴまたは多糖、および／またはポリペプチドに結合されて生じ得る。ペプチドがポリペプチド鎖に組み込まれる場合、「ペプチド」という用語は依然として、アミノ酸の短い配列を特定的に示すために使用され得る。「ペプチド」は、ペプチド結合、またはいくつかの他の型の結合により別の部分に連結され得る。ペプチドは少なくとも２つのアミノ酸の長さであり、一般に約２５アミノ酸未満の長さであり、最大長は慣習または状況の関数である。「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、同じ意味で使用され得る。
【００７２】
「タンパク質」は一般にポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を示す。タンパク質はまた、ポリペプチドの三次元構造を示し得る。「変性タンパク質」は、いくらかの残留三次元構造を有する部分的に変性されたポリペプチド、または、本質的にランダムな三次元構造、すなわち、完全に変性された構造を示す。本発明は、ポリペプチドバリアントの試薬およびポリペプチドバリアントを使用する方法を含み、例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ジスルフィド結合形成、脱アミド、異性化、シグナルまたはリーダー配列プロセシングにおける切断点、共有結合および非共有結合的に結合された補助因子、酸化バリアント、などが関与する。ジスルフィド結合されたタンパク質の形成は、記載されている（例えば、Ｗｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４：５３３−５３９；  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：１８−２３を参照されたい）。
【００７３】
「組換え」は、例えば、核酸、細胞、動物、ウイルス、プラスミド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ベクター、などに関して使用される場合、外因性の非天然核酸の導入、天然核酸の変更による、または組換え核酸、細胞、ウイルス、プラスミド、またはベクターからの全体もしくは部分誘導による修飾を意味する。組換えタンパク質は、例えば、組換え核酸、ウイルス、プラスミド、ベクター、などから誘導されたタンパク質を示す。「組換え細菌」は、ゲノムが組換え方法により、例えば、突然変異、欠失、挿入、および／または再配列により操作された細菌を含む。「組換え細菌」はまた、組換え追加ゲノム核酸、例えば、プラスミドまたは第２の染色体を含むように修飾された細菌、または現存の追加ゲノム核酸が変更された細菌を含む。
【００７４】
「選択可能なマーカー」は、選択可能なマーカーを含む細胞のために、またはこれに対して選択することができる核酸を含む。選択可能なマーカーの例としては、限定はされないが、例えば、下記が挙げられる：（１）他の毒性化合物（例えば、抗生物質）に対する抵抗性を提供する産物をコードする、または他の無害な化合物（例えば、スクロース）に対する感受性をコードする核酸；（２）そうでなければ受容細胞に不足している産物をコードする核酸（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸；（４）容易に同定することができる産物をコードする核酸（例えば、表現型マーカー、例えばβガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細胞表面タンパク質、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ）；（５）ハイブリダイゼーション技術、例えば、ＰＣＲまたは分子ビーコンにより同定することができる核酸。
【００７５】
リガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原、または他の結合対（例えば、サイトカイン対サイトカイン受容体）に言及する場合、「特異的に」または「選択的に」結合するは、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。よって、指定された条件下、特定のリガンドは特別な受容体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意の量で結合しない。特異的結合はまた、例えば、企図される方法の、結合化合物、核酸リガンド、抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物はその標的に、任意の他の結合化合物との親和性よりも、しばしば少なくとも２５％超、よりしばしば少なくとも５０％超、最もしばしば少なくとも１００％（２倍）超、通常少なくとも１０倍超、より通常少なくとも２０倍超、最も通常少なくとも１００倍超の親和性で結合することを意味することができる。
【００７６】
「対象」という用語は本明細書では、ヒトまたは非ヒト生物を示す。よって、本明細書で記載される方法および組成物はヒトおよび獣医疾患の両方に適用可能である。ある実施形態では、対象は「患者」、すなわち、疾患または病状のための医療を受けている生存しているヒトである。これは、病態の徴候を調べられている規定された疾病を有しない個人を含む。既存のマラリア感染を有する対象が好ましい。
【００７７】
「治療的有効量」は患者に利益を示す、すなわち、治療される病状の症状の減少、防止、または寛解を引き起こすのに十分な試薬または医薬組成物の量として規定される。薬剤または医薬組成物が診断薬を含む場合、「診断的有効量」は、シグナル、画像、または他の診断パラメータを生成させるのに十分な量として規定される。医薬製剤の有効量は、因子、例えば個体の感受性度、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体の特異体質応答によって変動するであろう（例えば、Ｎｅｔｔｉらに発行された米国特許第５，８８８，５３０号を参照されたい）。
【００７８】
「治療」または「治療すること」（病状または疾患に関して）は、有益なまたは所望の結果、例えば、好ましくは臨床結果を得るためのアプローチである。この発明のために、疾患に関する有益なまたは所望の結果としては、下記の１つ以上が挙げられるが、それらに限定されない：疾患と関連する病状の改善、疾患治癒、疾患重篤度の低減、疾患の進行の遅延、疾患と関連する１つ以上の症状の軽減、疾患を患うものの生活の質の増加、および／または生存延長。同様に、この発明のために、病状に関する有益なまたは所望の結果としては、下記の１つ以上が挙げられるが、それらに限定されない：病状の改善、病状治癒、病状重篤度の低減、病状の進行の遅延、病状と関連する１つ以上の症状の軽減、病状を患うものの生活の質の増加、および／または生存延長。
【００７９】
「ワクチン」は予防ワクチンを含む。ワクチンはまた、治療ワクチン、例えば、ワクチンにより提供される抗原またはエピトープと関連する病状または障害を含む哺乳類に投与されるワクチンを含む。
【００８０】
ワクチン製剤の目的は、対象となる抗原を有する病原体、腫瘍細胞、などに迅速に反応する、メモリＴ細胞およびＢ細胞の十分な集団を生成させることができる抗原およびアジュバントの組み合わせを提供することである。本発明は、動物において免疫応答を刺激するために、リポソームワクチン組成物を提供するための方法、その製造方法、およびその使用方法に関し、これはこの目的に一致し得る。
【００８１】
インフルエンザおよびヘルペスウイルスワクチンに関して以下で詳細に記載するが、当業者は、これらの例示的な実施形態は制限することを意味しないことを理解するであろう。
【００８２】
米国において毎年のインフルエンザ（「季節性インフルエンザ」または「ヒトインフルエンザ」とも呼ばれる）は、報告によれば、各年で、およそ３６，０００の死亡および２００，０００を超える入院となっている。インフルエンザ伝染病は典型的には毎冬中に現れるので、「季節性」と呼ばれる。北および南半球において異なる時に起こる２つのインフルエンザ季節が存在する。世界的に、季節性インフルエンザは推定２５０，０００〜５００，０００の人々を毎年死に至らしめる。工業世界における死亡のほとんどは、６５歳以上の成人において起きる。季節性インフルエンザは、米国では７番目の死因であり、その経済的な費用は米国単独で＄８００億ドルと推定されている。３つの型の季節性インフルエンザ−Ａ、ＢおよびＣが存在する。おそらく最も致命的な季節性インフルエンザ大流行は、１９１８インフルエンザパンデミック（スペイン風邪パンデミック；Ａ型インフルエンザ、Ｈ１Ｎ１サブタイプ）であり、これは１９１８〜１９１９まで続いた。この大流行で死亡した個体数の推定値は、２０〜１億人の範囲である。
【００８３】
インフルエンザＡウイルス（「ＩＡＶ」）は、オルトミクソウイルスファミリーのウイルスのメンバーである。インフルエンザＡウイルスは、一本鎖、セグメント化、ネガティブセンスＲＮＡゲノムを含む。８のＲＮＡセグメントは以下である：
「ＨＡ」、ウイルスヘマグルチニンをコードする（約５００分子のヘマグルチニンが１つのビリオンを生成させるのに必要とされる）；
「ＮＡ」、ウイルスノイラミニダーゼをコードする（約１００分子のノイラミニダーゼが１つのビリオンを生成させるのに必要とされる）；
「ＮＰ」、ウイルス核タンパク質をコードする；
「Ｍ」、同じＲＮＡセグメント由来の異なるリーディングフレームの使用により２つのマトリクスタンパク質Ｍ１およびＭ２をコードする（後者はウイルスエンベロープにおけるイオンチャネルである）（約３０００のマトリクスタンパク質分子が１つのビリオンを生成させるのに必要とされる）；
「ＮＳ」、同じＲＮＡセグメント由来の異なるリーディングフレームの使用により非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＥＰをコードする；
「ＰＡ」、ウイルスＲＮＡポリメラーゼをコードする；
「ＰＢ１」、同じＲＮＡセグメント由来の異なるリーディングフレームの使用により、別のＲＮＡポリメラーゼを、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質と共にコードする；ならびに
「ＰＢ２」、ＲＮＡポリメラーゼをコードする。
【００８４】
よって、ＩＡＶゲノムは、１１のタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２）をコードする。ＩＡＶは、典型的にはサブタイプに分類され、その命名は、Ｈ（ヘマグルチニン）数およびＮ（ノイラミニダーゼ）数に従い生じる。新しいインフルエンザウイルスは突然変異またはゲノム再集合により常に進化している。ＩＡＶゲノムは、ゲノムのセグメント化性質と共に、固有の高い突然変異率のために柔軟性が高く、これにより、異なるウイルス株間で全遺伝子の交換が可能となる。この結果、頻繁な抗原バリエーションを表すウイルスとなり、ＩＡＶワクチンの毎年の再製剤化が必要となる。
【００８５】
現在のワクチンにより生成される防御免疫応答は、ウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に主に基づくと考えられる。米国および世界中で使用されるインフルエンザワクチンは、受精鶏卵においてウイルスを増殖させ、その後、ウイルスを死滅させるか、または生ウイルスを弱毒化することにより製造される。ＩＡＶワクチンを生成するためのこの卵に基づく技術は、１９５０年代に作成された。ワクチン生産目標を達成するために、何百万もの１１日めの受精卵が製造の毎日で入手されなくてはならない。ＩＡＶにおける頻繁な抗原バリエーションのために、現在の季節性インフルエンザに基づくワクチンは、将来の季節性インフルエンザの場合に機能すると当てにすることができない。関連インフルエンザ株に対するいくらかの交差防御が存在し得るが、最良の防御は任意の将来のパンデミックインフルエンザウイルス株のために特異的に生成されるワクチンに由来するものであろう。
【００８６】
Ｈ５Ｎ１ワクチン製造の問題は、全体の生産力の欠如、および急激な生産力の欠如を含む（待機状態で何億もの１１めの特定の卵に依存するシステムを開発するのは実際的ではない）。
【００８７】
現代分子生物学技術に基づくいくらかのＩＡＶワクチンが、初期臨床試験を開始した。ウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に向けられたいくつかのそのようなワクチンが記載されているが、新規標的、例えばＮＰおよびＭ２タンパク質由来の抗原もまた調査されている。
【００８８】
単純ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスファミリーのウイルスのメンバーである。単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）により引き起こされる性器ヘルペスは、ヒトにおいて最も一般的な性感染症の１つである。疫学的研究は、６人中１人という多くのアメリカ人成人がＨＳＶ２に感染していることを示す。疾患は、正常および免疫抑制成人の両方に影響し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染への感受性の増加と関連する。重篤な臨床疾患が、新生児では、感染した母親からのＨＳＶ２の伝染後に起こる可能性があり、これらの母親は、非感染女性よりも子宮頸癌を発症する可能性がより高い。ＨＳＶ２伝染に寄与する主な因子は、臨床症状が存在しない場合の、ウイルスの生殖器からの排出である。現在、疾患の蔓延を防止するのに有効なワクチンは入手できない。サブユニットタンパク質に基づく抗原を含むいくつかのＨＳＶ２ワクチン候補が、ＨＳＶ２による感染または臨床疾患に対する防御免疫を提供する目的を達成することに失敗している。試験されたワクチン候補の不成功結果に照らして、ＨＳＶ２に感染した人々は、ＨＩＶによる感染に対し感受性がより高いという実感、およびウイルス排出はしばしば「臨床的に無症状」のＨＳＶ２キャリアにおいて起こるという事実、ＨＳＶ２疾患管理への新規アプローチを開発するための努力（新規免疫化戦略を含む）は、重要な医療目的のままである。
【００８９】
糖タンパク質ＢおよびＤ（それぞれ、ｇＢおよびｇＤ）の組換え型を含む２つの異なるＨＳＶ２ワクチンが第３相臨床試験において試験されている。これらのワクチンの１つは、組換えＨＳＶ２  ｇＢおよびｇＤを、アジュバントＭＦ５９と組み合わせて含み、タンパク質の水中油エマルジョンを生成させた。ワクチンは、ワクチン接種されたレシピエントにおいて高レベルのＨＳＶ２特異中和抗体を刺激したが、第１の臨床エピソードまたは感染の再活性化のその後の頻度に対する有意の効果は観察されず、このワクチンは特に有効ではないと示唆される。第２のＨＳＶ２ワクチンは、ＨＳＶ２  ｇＤならびに水酸化アルミニウムおよび３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡを含むアジュバント系、ＡＳ０４から構成された。予備的結果は、このワクチンがＨＳＶ１血清陰性女性（男性ではない）において症候性ＨＳＶ２性器ヘルペスの発症を防止するめに有効であることを示唆したが、より大規模な研究から得られた最近の結果は、初期所見を確認しなかった。ＧＳＫ  ＨＳＶ２  ｇＤ−に基づくワクチンの予期せぬ失敗は、疑いようもなく、有効なＨＳＶ２ワクチンを開発するために、ｇＤ抗原の標的としての役割に関するさらなる推測へと導くであろう。
【００９０】
これらのワクチン製剤の臨床的失敗の一因となる多くの可能な因子が存在する。最も明らかなものの１つは、ｇＤ抗原単独では、異種ヒト集団に完全な防御免疫を提供するのに必要なエピトープを含まないことである。ヒトおよびマウスにおける研究は、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞が、ＨＳＶ２感染の制御に重要であることを示す。ｇＤエピトープはヒトＣＤ４  Ｔ細胞により認識されるが、ｇＤ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は観察されていない。最近では、ＨＳＶ１血清陽性個体由来の４７の新規ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープが同定され、これらのＣＤ８  Ｔ細胞のいずれもｇＤに応答しなかった。これらの研究は、ｇＤ  タンパク質は中和抗体を生成させ、ＣＤ４  Ｔ細胞を刺激し得るが、強いＣＤ８  Ｔ細胞応答（これが、潜在的感染細胞の排除または制御に最も適している）を誘導しないことを示す。ＣＤ８  Ｔ細胞なしでは、ｇＤワクチン単独ではヒトにおいてＨＳＶ２感染に対する防御免疫応答を刺激することができないと考えられる。第２の可能性は、使用されるアジュバント系は、防御免疫応答を刺激するのに最適ではなかったというものである。臨床的に試験された製剤は、強い細胞免疫応答アジュバントを組み入れなかった。最後に、他の因子、例えば特定の領域で風土性のＨＳＶ２の株におけるわずかな差により引き起こされる交差防御の潜在的欠如はまた、ｇＤ−に基づくワクチンの全体効力において役割を果たす可能性がある。統合すると、今日までのＨＳＶ２ワクチン候補の失敗に対する可能な理由の全てに対処することを目的とする研究は、真に有効なＨＳＶ２ワクチンを同定するために著しい努力を要求するであろう。
【００９１】
以前、リポソームＨＳＶ２  ｇＤ１−３０６ワクチン（Ｌ−ｇＤ１−３０６−ＨＤ）が腟内（雌）または直腸内（雄または雌）誘発の急性マウスＨＳＶ２感染モデルにおいて試験された（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：  ５４８−５６０，  ２００９、参照により本明細書に組み込まれる）。６０μｇ  ｇＤ１−３０６−ＨＤおよび１５μｇモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）／投与を含む２つの用量のＬ−ｇＤ１−３０６−ＨＤが、報告によればＨＳＶ２腟内誘発に対する防御を提供した（８６−１００％生存、Ｐ≦０．０００３対対照リポソーム；Ｐ＝０．０６対Ｌ−ｇＤ１−３０６−ＨＤ  ＭＰＬなし）。Ｌ−ｇＤ１−３０６−ＨＤ／ＭＰＬで免疫化された雄および雌の両方のマウス（ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６）は、ＨＳＶ２直腸内誘発に対し有意に防御され、対照に比べより高い生存率を有した（７１−１００％、Ｐ≦０．００７）。Ｌ−ｇＤ１−３０６−ＨＤ／ＭＰＬはまた、リポソームペプチドワクチン、Ｌ−ｇＤ２６４−２８５−ＨＤ／ＭＰＬと比べた場合、生存の増加を提供した（雄ＢＡＬＢ／ｃ、Ｐ≦０．００１；雌ＢＡＬＢ／ｃおよび雄Ｃ５７ＢＬ／６、Ｐ＝０．０６）。Ｌ−ｇＤ１−３０６−ＨＤ／ＭＰＬを与えられたマウスはまた、最小の疾患の徴候、脊髄におけるウイルス負荷の低減および雌における中和抗体力価の上昇を有した。ワクチンはまた、雄および雌両方のマウスのｇＤ１−３０６−ＨＤ特異的脾細胞を刺激し、ＩＬ−４に比べＩＦＮ−γのレベルが著しく上昇し（Ｐ≦０．０１）、Ｔｈ１応答の増強が存在することが示された。
【００９２】
上記のように、本発明のリポソーム製剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）を；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（「ＤＭＴＡＰ」）、またはＤＭＰＧおよびＤＭＴＡＰの両方と共に；および１つ以上のステロールを用いて調製したリポソームを含む。リポソームの構成成分は、自然発生または合成とすることができる。ステロールはまた、ステロイドアルコールとしても知られている。それらは、Ａ−環の３位にヒドロキシル基を有するステロイドのサブグループである。
【００９３】
加えて、これらのリポソーム製剤は抗原ポリペプチドを含む。「抗原ポリペプチド」という用語は、本明細書では、少なくとも１つの抗原エピトープを含むポリペプチドを示し、それはレシピエント動物に対して異物であり、全体または一部として、本明細書で記載されるリポソーム製剤を使用して動物に送達されると、抗原特異抗体の形成および／または抗原特異Ｔ細胞応答を刺激する。本発明の実施において使用され得る抗原ポリペプチドは、例にすぎないが、ウイルス病原体、細菌毒素、細菌病原体、病原真菌、癌細胞に由来し得る。好ましい抗原ペプチドは、ＩＡＶ  Ｍ２タンパク質細胞外ドメイン由来の残基および／またはＨＳＶ２  ｇＤタンパク質、ＤＮＡパッケージングテグメントタンパク質、テグメントタンパク質ＶＰ１１／１２、核放出ラミナタンパク質、および／またはエンベロープ糖タンパク質Ｌ由来の残基を含む。
【００９４】
本明細書で記載されるように、本発明の抗原ポリペプチドは、対象となる抗原配列に加えて、好適な疎水性ドメインを含む。好適な抗原配列の例としては、１つ以上のＴ細胞エピトープを含むポリペプチド配列、ＩＡＶ  Ｍ２タンパク質配列、下記からなる群より選択されるタンパク質から得られるＨＳＶ２タンパク質配列が挙げられる：テグメント宿主シャットオフタンパク質、テグメントタンパク質ＶＰ１３／１４、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット１、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２、テグメントタンパク質ＶＰ１１／１２、エンベロープ糖タンパク質Ｂ、ＤＮＡパッケージングテグメントタンパク質、核放出ラミナタンパク質、多機能発現制御因子、転写制御因子、感染細胞タンパク質８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、カプシド成熟プロテアーゼ、エンベロープ糖タンパク質Ｉ。図１−１０は好ましくは本発明において用途が見出される自然発生タンパク質由来の多数の例示的な疎水性ドメインのＥｉｓｅｎｂｅｒｇら(J. Mol. Biol. 179:125-142(1984)疎水性プロファイルを示す。これらの疎水性ドメイン配列、および例として本明細書で提供される他のものは、本質的に例示にすぎない。これらのまたは他の疎水性配列は、保存的アミノ酸置換を使用して修飾することができ、例えば、ヒトチトクロムｂ５膜貫通ドメインのそれに類似する疎水性プロファイルを有する追加の合成配列が得られる。本発明のために、疎水性プロファイルは、Ｅｓｉｅｎｂｅｒｇらの方法論を使用し、下記パラメータを用いて計算される：９のウィンドウサイズ、エッジ１００％の相対重量、および線形重量変化。アミノ酸スケール値は下記の通りである：
Ａｌａ：０．６２０    Ａｒｇ：−２．５３０    Ａｓｎ：−０．７８０    Ａｓｐ：−０．９００    Ｃｙｓ：０．２９０    Ｇｌｎ：−０．８５０    Ｇｌｕ：−０．７４０    Ｇｌｙ：０．４８０    Ｈｉｓ：−０．４００    Ｉｌｅ：１．３８０    Ｌｅｕ：１．０６０    Ｌｙｓ：−１．５００    Ｍｅｔ：０．６４０    Ｐｈｅ：１．１９０    Ｐｒｏ：０．１２０    Ｓｅｒ：−０．１８０    Ｔｈｒ：−０．０５０    Ｔｒｐ：０．８１０    Ｔｙｒ：０．２６０    Ｖａｌ：１．０８０。
【００９５】
疎水性ドメイン部分に対する好適な配列は、典型的には脂質二重層を通過するのに十分な長さを有し（約１５−３０残基；より好ましくは約１８−２５残基）、その少なくとも９の近接残基は、約＋０．７の疎水性（Ｅｓｉｅｎｂｅｒｇスコア）を有するαヘリックスを形成すると予測される。この文脈では「約」という用語は、一定の測定値の＋／−１０％を示す。ＩＩ型およびＩＩＩ型膜タンパク質は、膜挿入および形態を制御する切断可能なＮ末端シグナルペプチドを欠いており、代わりに、翻訳後に疎水性「シグナル・アンカー配列」（ポリペプチドのトランスロケーションを媒介し、タンパク質を膜中に固定する切断不可能なシグナル配列である）を介して膜に挿入される。
【００９６】
融合タンパク質：
上記のように、免疫原性ポリペプチド配列を異種膜貫通配列に共有結合的に連結させるための方法は当技術分野でよく知られている。本発明の抗原ポリペプチドは、化学的に合成され、または組換えＤＮＡ方法論を用いて発現され得る。様々な実施形態では、１つ以上の抗原エピトープは、シグナル・アンカー配列を有する異種１回貫通膜タンパク質由来の膜貫通配列を備えた融合タンパク質の一部として発現される。そのような組換えタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスコートタンパク質、細菌外膜タンパク質、および真核生物膜タンパク質からなる群より選択される抗原配列を含み得る。
【００９７】
融合タンパク質は、細胞に基づく系および無細胞系において発現され得る。大規模タンパク質発現および精製のために、細菌発現がしばしば、典型的には細菌またはＴ７プロモーターのいずれか、細菌株によって、およびＲＢＳ（原核生物リボソーム結合配列）の制御下で使用される。好適な発現調節配列、タンパク質切断部位、などに作動可能に連結され、任意で隣接され、もしくはスペーサ残基により分離された対象となるポリペプチド配列をコードする核酸は適切なベクターに、標準組換えＤＮＡ技術により挿入される(一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。対象となる核酸は、最終的に抗原ポリペプチドとして発現される（スペーサまたはフレームワーク残基ありまたはなし）。
【００９８】
大腸菌は、特に本発明の抗原ポリペプチドの発現に有用な１つの原核生物宿主である。他の使用に好適な微生物宿主としては、桿菌、例えば枯草菌、および別の腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチア、および様々なシュードモナス種が挙げられる。これらの原核生物宿主では、発現ベクターを製造することもでき、これは典型的に宿主細胞と適合する発現調節配列を含むであろう（例えば、複製開始点）。加えて、多くの様々なよく知られたプロモーターが存在し、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは典型的には、任意でオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためにリボソーム結合部位配列などを有する。
【００９９】
他の微生物、例えば酵母もまた発現のために使用される。サッカロマイセスは好ましい宿主であり、好適なベクターは、発現調節配列、例えばプロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素を含む）、および複製開始点、終結配列などを所望の通りに有する。
【０１００】
哺乳類組織細胞培養物もまた、本発明の抗原ポリペプチド発現および生成させるために使用することができる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ  （ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｎ．Ｙ．，  １９８７を参照されたい)。無傷の免疫グロブリンを分泌することができる多数の好適な宿主細胞系が開発されており、バキュロウイルス発現のための昆虫細胞、ＣＨＯ細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製開始点、プロモーター、およびエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８９：  ４９−６８  （１９８６））、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含むことができる。好ましい発現調節配列は免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターである。
【０１０１】
異なる生物は、しばしば「コドンバイアス」を示す；すなわち、特定のアミノ酸をコードするあるコドンが遺伝子コードで出現する程度は、生物間で著しく変動する。一般に、遺伝子が含む希なコドンが多いほど、異種タンパク質が、その特定の宿主系内で妥当なレベルで発現される可能性が低くなる。これらのレベルは、希なコドンがまとまって、またはタンパク質のＮ末端部分で現れる場合いっそう低くなる。組換えにより発現される配列中の希なコドンを、アミノ酸配列を変更せずに、宿主系のコドンバイアスをより厳密に反映する他のものと置換する（「コドン最適化」と呼ばれる）は、機能性タンパク質発現のレベルを増加させることができる。様々な実施形態では、少なくとも１パーセントの任意の非最適コドンが変更され、最適コドンが提供され、より普通には、少なくとも５パーセントが変更され、最も普通には、少なくとも１０パーセントが変更され、しばしば少なくとも２０％が変更され、よりしばしば少なくとも３０％が変更され、最もしばしば少なくとも４０％、通常少なくとも５０％が変更され、より通常少なくとも６０％が変更され、最も通常少なくとも７０％が変更され、最適に少なくとも８０％が変更され、より最適に少なくとも９０％が変更され、最も最適に少なくとも９５％が変更され、ならびに慣例的に、１００％の任意の非最適コドンが発現のためにコドン最適化される。遺伝子最適化ツール、例えばＧｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ２．０（ＤＮＡ２．０）、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ(Puigbo
et al., Nucl. Acids Res. 35
(Suppl 2): W126-31, 2007)、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＧｅｎｅＡｒｔ）、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｅｒ（Ｌｏｒｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９，  ９：３６  ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−３６）、および米国特許７，５６１，９７３号、７，５６１，９７２号において開示される方法が当技術分野で知られており、所望の融合タンパク質の発現を最適化するために使用され得る。
【０１０２】
対象となるポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型によって変動する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞に対して一般に使用され、リン酸カルシウム処理または電気穿孔が他の細胞宿主のために使用され得る（一般に  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  上記を参照されたい）。
【０１０３】
ある実施形態では、融合タンパク質は追加のペプチド配列、例えば親和性マーカー、検出マーカー、および／またはプロテアーゼ切断部位を含み得る。そのような親和性／検出マーカーの例としては、ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ポリ−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、およびポリ−Ｈｉｓは、それぞれ、固定化グルタチオン、マルトース、フェニルアルシンオキシド、カルモジュリン、および金属キレート樹脂上でのそれらの同族融合タンパク質の精製を可能にする。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用して融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。他の好適なタグ配列は当業者に明らかであろう。同様に、多数のタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、スブチリシン、サーモリシン、キモトリプシン、パパイン、など）および対応するプロテアーゼ切断部位は当業者に知られている。好ましい実施形態では、本方法において使用するための１つ以上のタンパク質分解酵素は、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ、およびヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼからなる群より選択される。さらに他の好ましい実施形態では、導入されるプロテアーゼ切断部位は、ＩＥＧＲ（配列番号：５５）、ＤＤＤＤＫ（配列番号：５６）、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号：５７）、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：５８）、およびＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号：５９）からなる群より選択される。
【０１０４】
そのような融合タンパク質はまた、融合されると言われたポリペプチド間の化学構造を含み得る。ペプチドの１つの配列の最後の残基が、他の配列の第１の残基に連結される場合、２つのポリペプチドは「直接」融合される。追加の化学構造（例えば追加のアミノ酸、時として「リンカー」残基と呼ばれる）がペプチドの１つの配列の最後の残基と他の配列の第１の残基の間に存在する場合、２つのポリペプチドは「間接的に」融合される。
【０１０５】
タンパク質化学カップリング
融合タンパク質に代わるものとして、１つ以上の抗原エピトープが、シグナル・アンカー配列を有する異種１回貫通膜タンパク質由来の膜貫通配列とは別に、化学的に合成され、または発現され、別々のペプチドが化学結合を使用して結合される。化学架橋剤は、多数の書籍およびカタログに記載される。例えば、Ｗｏｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．，  １９９１を参照されたい。これらの試薬はしばしば、ペプチドのアミノ酸側鎖に結合する官能基を使用する。架橋剤の設計は使用される官能基部分の選択を含む。官能基部分の選択は、架橋される種上で有効な標的部位に完全に依存する。いくつかの種（例えば、タンパク質）は標的とするための多数の有効な部位を提供することができ（例えば、リジンε−アミノ基、システインスルフヒドリル基、グルタミン酸カルボキシル基、など）、ならびにステロールへの包含のための特定の官能基部分の選択は、対象となる生物学的特性（例えば、抗体の結合親和性、酵素の触媒活性、など）を最もよく保存するために経験的に実施され得る。
【０１０６】
アミン基を介するカップリング：
イミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（「ＮＨＳ」）エステルは、典型的にアミン特異的官能基部分として使用される。ＮＨＳエステルは、一級または二級アミンとの反応で安定生成物を得る。カップリングは、生理的ｐＨで効率的であり、ＮＨＳ−エステル架橋剤はそれらのイミダート対応物よりも溶液中で、安定である。ホモ二官能性ＮＨＳ−エステル結合が、一段階または二段階反応のいずれかでアミン含有タンパク質を架橋させるのに一般に使用される。一級アミンは、ＮＨＳ−エステルの原則標的である。タンパク質のＮ末端に存在するアクセス可能なα−アミン基は、ＮＨＳ−エステルと反応しアミドを形成する。しかしながら、タンパク質上のαアミンは必ずしも利用可能ではないので、アミノ酸の側鎖との反応が重要となる。５つのアミノ酸は、それらの側鎖中に窒素を有するが、リジンのε−アミノ基のみがＮＨＳ−エステルと有意に反応する。ＮＨＳ−エステル架橋剤が一級アミンと反応すると共有アミド結合が形成され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが放出される。
【０１０７】
スルフヒドリル基を介するカップリング：
マレイミド、アルキルおよびアリールハロゲン化物、α−ハロアシル、ならびにピリジルジスルフィドは、典型的にスルフヒドリル特異的官能基部分として使用される。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５〜７．５の間に維持される場合、スルフヒドリル基に特異的である。ｐＨ７では、マレイミドのスルフヒドリルとの反応は、アミンとより１０００倍速い。マレイミドはチロシン、ヒスチジンまたはメチオニンと反応しない。遊離スルフヒドリルが十分な量で存在しない場合、これらはしばしば有効なジスルフィド結合の還元により生成させることができる。
【０１０８】
カルボキシル基を介するカップリング：
カルボジイミドはカルボキシルを一級アミンまたはヒドラジドに結合させ、アミドまたはヒドラゾン結合が形成する。カルボジイミドは、他の結合反応とは、カルボジイミドと結合される分子の間に架橋が形成されないという点で異なり；むしろ、ペプチド結合が有効なカルボキシル基と有効なアミン基の間で形成される。タンパク質のカルボキシ末端は、グルタミン酸およびアスパラギン酸側鎖と同様に標的にされ得る。過剰の架橋剤の存在下、重合が起こり得る。というのも、タンパク質はカルボキシルおよびアミンの両方を含むからである。架橋が形成されず、アミド結合がペプチド結合と同じであり、そのため、架橋結合の逆転は、タンパク質の破壊なしでは不可能である。
【０１０９】
非選択的反応基：
光親和性試薬は化学的に不活性であるが、紫外または可視光に曝露されると反応性となる化合物である。アリールアジドは光親和性試薬であり、これは、２５０−４６０ｎｍの波長で光分解され、反応性アリールニトレンを形成する。アリールニトレンは非選択的に反応し、共有結合を形成する。還元剤は慎重に使用されなければならず、というのも、それらはアジド基を還元し得るからである。
【０１１０】
アルギニンを介するカップリング：
グリオキサールはアルギニン残基のグアニジニル部分を標的にする有用な化合物である。グリオキサールは弱アルカリ性ｐＨでアルギニンを標的にする。リジンとのいくらかの交差反応性（より高いｐＨで最も高い）が存在する。
【０１１１】
カルボニル基を介するカップリング：
カルボニル（アルデヒドおよびケトン）は、アミンおよびヒドラジドとｐＨ５−７で反応する。ヒドラジドとの反応は、アミンとよりも速く、これは部位特異的架橋結合に有用である。カルボニルはタンパク質中に容易に存在しない；しかしながら、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いた糖部分の穏やかな酸化は、近接ヒドロキシルをアルデヒドまたはケトンに変換するであろう。還元末端（複数可）を有する炭水化物では、カルボニル基（複数可）は、ヒドラジン部分に対し反応性であり、ヒドラゾン結合を形成し得る。Ｓ‐ＨｙＮｉｃはＨｙＮｉｃ（６‐ヒドラジノニコチンアミド）部分を分子に、遊離アミノ基により活性化エステル（すなわち、ＮＨＳ）を介して組み入れるために使用されるヘテロ二官能性リンカーである。ＨｙＮｉｃヒドラジンリンカーの付加により、弱酸性緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６）中でのコンジュゲートの形成が可能になる。還元末端を有さない炭水化物では、ＣＤＡＰ特異的活性化が使用され得る。緩やかな条件下（活性化のためにｐＨ９．５および結合のためにｐＨ７）、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（「ＣＤＡＰ」）はヒドロキシル基をシアニルエステルに変換し、これはその後、アミン基の存在下、カルバメートを形成する。
【０１１２】
結合化学に任意で含まれるポリマ物質は好ましくはポリ（アルキレンオキシド）である。本明細書では、「アルキレンオキシド」という用語は、構造−Ｘ−Ｏ−を示し、Ｘは酸素Ｏに共有結合的に連結されたアルキレン部分であり；よって、ポリ（アルキレンオキシド）は、構造−（Ｘ−Ｏ−）ｍ）−を示す。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマは非分枝ホモポリマ（すなわち、構造−（（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−）ｍ）−のポリマ、式中、ｎは変動しない）例えば、エチレングリコールから誘導されるポリ（エチレンオキシド）であることが好ましい。別のポリマ、例えば他のポリアルキレンオキシドホモポリマ（例えば、メチレンオキシド、プロピレンオキシド、イソプロピレンオキシド、およびブチレンオキシドポリマ）およびポリ（アルキレンオキシド）のコポリマまたはブロックコポリマもまた使用され得る。ＰＥＧ系ポリマが使用される本発明のそれらの態様では、４０〜１０００の単量体単位の平均長ｎを有することが好ましい。他のアルキレンオキシドのモル当量は、他のホモポリマおよびコポリマのための好ましい平均分子量に到達するために、当業者により容易に決定され得る。
【０１１３】
本発明の平均分子量は、「数平均」方法を用いて測定される。特定の分子量、Ｍｉ、を有する分子の数がＮｉにより与えられる、異なる分子量を有するポリマ分子の混合物では、存在するある質量の「数平均」確率は下記であり、
【数１】
2014518620.tif 000015
数平均分子量は下記式により与えられる：
【数２】
2014518620.tif 000016
数平均は簡単な算術平均であり、存在する分子の総重量を、分子の総数で割ったものを表す。ポリマの数平均分子量は、蒸気圧浸透圧法により、当業者によく知られた方法および装置を用いて測定され得る。
【０１１４】
ポリ（アルキレンオキシド）の代わりに使用され得る別のポリマ物質としては、材料、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、多糖、デンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドまたは他の同様のポリマが挙げられる。当業者は、前記は例示にすぎず、本明細書で使用するのに好適な非抗原ポリマ物質の型を制限することを意図しないことを認識するであろう。
【０１１５】
「投与」は、本明細書では動物、例えば、好ましくは哺乳類および最も好ましくはヒトに関しては、外因性試薬の対象の細胞、組織、器官、生物流体への送達を示す。
【０１１６】
「有効量」は、本明細書では、病状または障害の症状または徴候を寛解、逆転、緩和、または防止することができる試薬の量を示す。明確にまたは他の様式で別記されない限り、「有効量」は、病状を寛解するのに十分な最小量、または病状の最適または最大寛解が得られる量に限定されない。ワクチンの投与との関連での「有効量」は、哺乳類において免疫応答を引き起こすものである。そのような有効量は、それ自体、そのような免疫応答を引き起こすのに十分ではない可能性があるが、前のまたはその後の追加の試薬の送達（例えば、プライムブーストワクチン接種）と共に使用され得る。「免疫学的応答」または「免疫応答」は、本明細書では少なくとも１つ以上の下記効果を含む：Ｂ細胞による抗体産生；および／またはサプレッサーＴ細胞および／または対象となるベクター、組成物またはワクチン中に存在する１つまたは複数の抗原に特異的に向けられるＴ細胞の活性化。
【０１１７】
様々なインビトロおよびインビボアッセイが、免疫応答を測定する、例えば体液性および細胞免疫応答を測定するために当技術分野で知られており、下記が挙げられるが、それらに限定されない：標準イムノアッセイ、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡアッセイ；細胞内染色；Ｔ細胞アッセイ、例えば、例としてリンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイ、または感作対象における抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイすることによるもの。そのようなアッセイは当技術分野でよく知られている。
【０１１８】
リポソーム調製：
リポソームの調製は、先行技術においてよく知られている。一般に、リポソームは、多数の異なる技術、例えば下記により製造されてきた：エタノール注射（Ｂａｔｚｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ２９８：１０１５，  １９７３）；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ４４３：６２９，  １９７６；  Ｓｃｈｉｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ５４２：１３７，  １９７８）; 清浄剤除去（Ｒａｚｉｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ２６５：２４  １９７２）；溶媒蒸発（Ｍａｔｓｕｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．  ６２：１４９，  １９７７）；クロロホルムを含む水エマルジョンからの有機溶媒の蒸発（ＲＥＶ）（Ｓｚｏｋａ  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５：４１９４，  １９７８）；ＭＬＶまたはＥＵＶのヌクレオポアポリカーボネート膜を介する押出（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ５５７：９，  １９７９）；リン脂質混合物の凍結乾燥（Ｐｉｃｋ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２１２：１８６，  １９８１）ならびに、超音波処理および均質化。慣例により、リポソームはサイズにより分類され、３文字アクロニムを使用して、記載されるリポソームの型が示される。多重膜小胞は一般に「ＭＬＶ」と示される。小単層膜小胞は「ＳＵＶ」と示され、大単層膜小胞は「ＬＵＶ」と示される。これらの命名には時として、リポソームの化学組成が続く。リポソームの抗体の型の命名および概要の記載については、Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＳＩＴ、１：  １９−３、１９９８を参照されたい。
【０１１９】
本発明のリポソーム組成物はさらに、リポソーム自体の一部として、あるいはリポソームが懸濁されるビヒクルの一部として様々な賦形剤、アジュバント、担体、補助物質、調節薬、などを含み得る。
【０１２０】
担体は、任意で存在し、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体産生を誘導しない分子である。好適な担体は典型的には、大きな、徐々に代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマアミノ酸、アミノ酸コポリマ、脂質凝集物（例えば油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。粒状担体の例としては、ポリメチルメタクリレートポリマに由来するもの、ならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして知られているポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来する微小粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １０：３６２，  １９９３；  ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．  １４：  １９７，  １９９７；  Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：１４９，  １９９３を参照されたい。そのような担体は当業者によく知られている。
【０１２１】
アジュバントとしては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、など；（２）水中油エマルジョン製剤（他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（下記を参照されたい）または細菌細胞壁構成成分ありまたはなし）、例えば例として（ａ）ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ：９０／１４８３７号）、５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５を含み（任意で様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含む（下記を参照されたい）が、要求されない）、マイクロフルイダイザー、例えばモデル１１ＯＹマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化される（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、（ｂ）ＳＡＦ、１０％スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロック化ポリマＬｌ  ２１、およびＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョン中にマイクロ流動化されるか、あるいはボルテックスされ、より大きなサイズのエマルジョンが生成される、ならびに（ｃ）Ｒｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）下記から構成される群由来の１つ以上の細菌細胞壁構成成分：モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘｕ）；（４）サポニンアジュバント、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）；（５）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（６）サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１−α、１−βランテス、など）；（７）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素、例えばコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）の解毒突然変異体、特にＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンは、６３位で野生型アミノ酸の代わりに置換される）ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンは７２位で野生型アミノ酸の代わりに置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンは１０９位で野生型アミノ酸の代わりに置換される）、ならびにＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここで、リジンは９位で野生型アミノ酸の代わりに置換され、グリシンは１２９位で置換される）（例えば、国際公開第ＷＯ：９３／１３２０２号およびＷＯ：９２／１９２６５号を参照されたい）；ならびに（８）免疫刺激剤として機能し、組成物の有効性を増強する他の物質。
【０１２２】
好ましいアジュバントとしては病原体−結合分子パターン（ＰＡＭＰ）が挙げられ、これは、トール様受容体（ＴＬＲ）、（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、レチノイン酸誘導遺伝子に基づく（ＲＩＧ）−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、および／またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）による自然免疫活性化を媒介する。ＰＡＭＰの例としては、リポタンパク質、リポポリペプチド、ペプチドグリカン、ザイモサン、リポ多糖、ナイセリアポリン、フラゲリン、プロフィリン、α−ガラクトシルセラミド、ムラミルジペプチドが挙げられる。ペプチドグリカン、リポタンパク質、およびリポテイコ酸は、グラム陽性の細胞壁構成成分である。リポ多糖はほとんどの細菌に発現されより、ＭＰＬが一例である。フラゲリンは、病原および生細菌により分泌される細菌鞭毛の構造構成成分を示す。α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性化因子である。ムラミルジペプチドは全ての細菌に共通の生物活性ペプチドグリカンモチーフである。
【０１２３】
他の好ましいアジュバントとしては、ウイルス二本鎖ＲＮＡ（細胞内受容体ＴＬＲ３により感知される）；細菌またはウイルスＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ上に存在するＣｐＧモチーフ（ＴＬＲ７、８、および９により感知される）；オールトランスレチノイン酸；ならびにヒートショックタンパク質、例えばＨＳＰ７０およびＧｐ９６（交差提示のために非常に有効な担体分子である）が挙げられる。医薬アジュバントとしては、レシキモド、ＴＬＲ７／８アゴニスト、およびイミキモド、ＴＬＲ７アゴニストが挙げられる。
【０１２４】
医薬組成物：
本発明のリポソームは、好ましくは非経口的または経腸送達のための医薬組成物として製剤化される。動物への投与のための典型的な医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、例として水溶液、無毒性賦形剤、例えば塩、保存剤、緩衝液などを含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｅａｓｔｏｎ  ｅｄ．  ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ｐｐ  １４０５−１４１２  ａｎｄ  １４６１−  １４８７  （１９７５）；  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ，  １４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ  （１９７５）を参照されたい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射用有機エステル、例えばエチルオレエートである。水性担体としては水、アルコール性／水溶液、生理食塩水、非経口的ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース、などが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては流体および栄養分補充薬が挙げられる。保存剤としては抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが挙げられる。医薬組成物のｐＨおよび様々な構成成分の正確な濃度は、当技術分野における所定の技術に従い調節される。
【０１２５】
特定のワクチンの反復投与（同種ブースティング）は、体液性応答をブーストするのに有効であることが証明されている。そのようなアプローチは細胞性免疫をブーストするのに有効ではない可能性があり、というのも、ベクターに対する前の免疫は、強い抗原提示および適切な炎症シグナルの生成を障害する傾向があるからである。この問題を回避する１つのアプローチは、異なる抗原−送達系（異種ブースティング）を使用するワクチンの連続投与である。
【０１２６】
異種ブースティングレジメンでは、少なくとも１つのプライムまたはブースト送達は、本明細書で記載されるリポソーム製剤の送達を含む。レジメンの異種アームは下記の１つ以上の戦略を使用する抗原の送達を含み得る：
対象となる抗原を含む弱毒化および／または不活性化細菌またはウイルス（いくつかの変性条件を用いて処理され、病原性侵襲を開始するのに無効または非効率的なものとされた粒子である）；
精製抗原（病原体または、病原体、またはその組換えバージョンを含む組織試料の細胞培養物から精製された、典型的に自然に生産された抗原である）；
組換えにより、対象の宿主細胞において、抗原を発現および／または分泌するように操作された生ウイルスまたは細菌送達ベクター。これらの戦略は、非病原性および無毒性となるようにウイルスベクターを遺伝子操作することに依存する；
抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベクター、例えば樹状細胞（ＤＣ）ベクター（抗原が負荷され、または抗原をコードする核酸を含む組成物でトランスフェクトされた細胞を含む）；
腫瘍細胞、例えば、自己および同種腫瘍細胞；ならびに
ネイキッドＤＮＡベクターおよびネイキッドＲＮＡベクター（遺伝子銃、電気穿孔、細菌ゴースト、ミクロスフェア、微小粒子、リポソーム、ポリカチオンナノ粒子、などにより投与され得る）。
【０１２７】
プライムワクチンおよびブーストワクチンは、下記経路のいずれか１つまたは組み合わせにより投与することができる。１つの態様では、プライムワクチンおよびブーストワクチンは、同じ経路により投与される。別の態様では、プライムワクチンおよびブーストワクチンは、異なる経路により投与される。「異なる経路」という用語は、身体上の異なる部位、例えば、口腔、非口腔、腸内、非経口的、直腸、結節内（リンパ節）、静脈内、動脈、皮下、筋肉内、腫瘍内、腫瘍周囲、腫瘍内、注入、粘膜、鼻、脳脊髄腔または脳脊髄流体内、などである部位、ならびに異なる様式による、例えば、経口、静脈内、および筋肉内を含むが、それらに限定されない。
【０１２８】
有効量のプライムまたはブーストワクチンは、単回投与で投与され得るが、単回投与に制限されない。よって、投与は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のワクチン投与とすることができる。１を超えるワクチン投与である場合、投与は、１分、２分、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の分の時間間隔だけ、約１時間、２時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、などの間隔だけ空けることができる。時間との関連で、「約」という用語は、３０分以内の任意の時間間隔のプラスマイナスを意味する。投与はまた１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、およびその組み合わせの時間間隔だけ空けることができる。本発明は、時間的に等しく空けられた投与間隔に限定されず、等しくない間隔での投与、例えば、単に非制限的例を提供すると、１日、４日、７日、および２５日での投与から構成されるプライミングスケジールを含む。
【０１２９】
実施例
下記実施例は本発明を説明するのに役立つ。これらの実施例は本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【０１３０】
実施例１．インフルエンザＡウイルス材料および方法
Ａ．ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  ｐＥＴ２８ａベクター
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  ｐＥＴ２８ａプラスミド設計は以前に記載されている[Ernst et al., 2006]。
【０１３１】
Ｂ．ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  ｐＥＶベクター
【表２】
2014518620.tif 000017
【０１３２】
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を生成させるために、Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素部位およびエンテロキナーゼ（ＥＫ）部位を含むＩＡＶＭ２ｅ１遺伝子をコードする、５’オリゴヌクレオチドプライマーを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を生成させるために、Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素部位、ＥＫ部位およびｐＥＴ２８ａベクターのＬＤＲ配列を含むＩＡＶＭ２ｅ１遺伝子をコードする、５’オリゴヌクレオチドプライマーを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。同様に、Ｘｈｏ  Ｉ制限酵素部位を含む疎水性ドメインのための遺伝子をコードする３’オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ遺伝子を生成させるために、プライマーを使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓにより前に構築された、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  ｐＥＴ２８ａベクターテンプレートをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。簡単に言うと、ＰＣＲチューブに、７．５μＬの１０Ｘ  Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）緩衝液、１μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの２０μＭ５’および３’プライマー、１０ｎｇのＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  ｐＥＴ２８ａプラスミド、１μＬのＰｆｘポリメラーゼおよび全量を５０μＬとした。反応混合物を２５回サイクルさせ（９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分）、その後最終伸長を７２℃で７分とした。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を使用して精製した。ＰＣＲ産物およびｐＥＶ１ベクターを、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＸｈｏ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で酵素的に消化させた。ｐＥＶ１ベクターはｐＥＴ３２ｂおよびｐＥＴ２８ａの複合ベクターであり、ここで、ｐＥＴ３２ｂのチオレドキシン−６Ｈｉｓ−マルチクローニング部位をｐＥＴ２８ａに挿入した。ｐＥＶ１ベクターはｐＥＴ３２ｂのチオレドキシン−６Ｈｉｓおよびトロンビン切断部位を、ｐＥＴ２８ａベクターのカナマイシン抵抗性下で提供する。消化されたＤＮＡをゲル精製し（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、その後、連結し、ＤＨ５−α大腸菌に形質転換した。プラスミドを、形質転換大腸菌から精製し、配列決定し、遺伝子の適正な配列、フレームおよび配向を確認した。
【０１３３】
Ｃ．切断型およびシステイン突然変異ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクト
突然変異ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を生成させるために、Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素部位、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ部位およびＩＡＶＭ２ｅ１配列の第１の２２塩基をコードする５’プライマーを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。同様に、様々な突然変異ＩＡＶＭ２ｅ１遺伝子および切断型ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）のための配列をコードする３’プライマーを合成し、これはＨｉｎｄ  ＩＩＩ  制限酵素部位を含む（表１）。これらのコンストラクトのためのベクターは、前のコンストラクト由来のＨＤを含み、これはＨＤをコードする領域のＨｉｎＤ  ＩＩＩ部位５’を有する。
【０１３４】
各システインからセリンへの突然変異体では、反応は、５’プライマーおよび３’プライマーの１つを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓにより前に構築されたｐＥＶ１−ＩＡＶＭ２ｅ１テンプレートからＩＡＶＭ２ｅ１領域を増幅するように設定した。簡単に言うと、ＰＣＲチューブに、７．５μＬの１０Ｘ  Ｐｆｘポリメラーゼ緩衝液、１μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、それぞれ１μＬの、２０μＭ  ５’および３’プライマー、１０ｎｇのＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  ｐＥＶ１、０．７５μｌのＰｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、蒸留水を適量で５０μＬとした。反応混合物９４℃まで５ｍｉｎ間加熱し、ポリメラーゼを活性化させた。その後、９５．５℃で２０ｓｅｃ、続いて７０℃で４０ｓｅｃの３０サイクルに供した。サイクリング後６８℃での１０分の最終伸長期間インキュベートし、その後４℃で維持した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。その後、１Ｘ  Ｒｅａｃｔ  ２緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３０ｍｉｎ、３７℃でＢｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎＤ  ＩＩＩの各々を５ユニット使用して消化させた。産物の各々を３．５％Ｎｕｓｅｉｖｅアガロースゲル上でゲル精製した。バンドをゲルから切除し、ＤＮＡ断片を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製した。ＤＮＡ濃度を様々な量のＤＮＡを有する、公知の量のＬｏｗ  Ｍａｓｓ  ＤＮＡ標準の隣の２％アガロースゲル上での分析により決定した。
【０１３５】
アミノ酸１−１５のみを含む欠失突然変異体では、インサートは下部プライマーが上部プライマーに１３塩基だけ重なるのに十分短い。この場合、同様の反応をＰＣＲチューブ中で、２つのプライマーを用いて設定し、テンプレートＤＮＡを添加しなかった。ポリメラーゼを活性化するための５分の変性相後、反応物を４８℃で２ｍｉｎ間インキュベートし、その後、温度を７０℃まで、２０％勾配速度で増加させ、そこで５分間維持した。４８℃および７０℃工程をもう一度繰り返し、続いて、１０分７０℃の伸長工程とした。得られた産物をゲル精製し、同じ手順により、わずかに長い突然変異ＩＡＶＭ２ｅ１  ＰＣＲ産物として分析した。
【０１３６】
ＨＤを有するｐＥＶ１ベクターを、３μｇのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｌａｓｍｉｄ（ＭＥＰ）−１８０を、５５μＬの１Ｘ  Ｒｅａｃｔ  ２中で一晩中３７℃で、２４ユニットのＢｇｌ  ＩＩおよび１０ユニットのＨｉｎＤ  ＩＩＩを用いて消化することにより調製した。ベクターを１％アガロースゲル上でゲル精製した。切除したバンドをＱｉａｇｅｎゲル精製キットを使用して精製した。ＤＮＡ濃度を、公知の量のＨｉｇｈ  Ｍａｓｓ  ＤＮＡ標準の隣の１％アガロースゲル上で移動させることにより決定した。
【０１３７】
消化された、精製ＰＣＲ産物の各々をその後、ベクターに、３倍モル比のＰＣＲ産物対ベクター、および１ｘライゲーションミックス（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｌｏｎａｂｌｅｓ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎキット）を含む、１０μＬ反応物中で１６℃で８０ｍｉｎ間連結させた。１マイクロリットルのこの反応物をその後、Ｎｏｖａｂｌｕｅ化学的コンピテント細胞に形質転換し、３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ−アガロースプレート上に蒔き、一晩中インキュベートした。ＩＡＶＭ２ｅ１配列は非常に短いので、コロニーをコロニーＰＣＲおよびＰＣＲ産物の限定解析の両方を使用して分析した。ＰＣＲ反応は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓオリゴヌクレオチド（ＭＥＯ）プライマーＭＥＯ２４８およびＭＥＯ２５０を使用して実施した。ＭＥＯ２４８プライマー部位は、Ｂｇｌ  ＩＩ部位の５４０ｂｐ上流で始まり、ＭＥＯ２５０はＨＤの５’端のＨｉｎＤ  ＩＩＩ部位の２５０ｂｐ下流で終わる。ＩＡＶＭ２ｅ１の２３アミノ酸配列＋ＴＥＶ部位の７アミノ酸は９０ｂｐを必要とする。およそ９００ｂｐの断片を生じるＰＣＲを、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎＤ  ＩＩＩにより２つの別の追加の反応において消化させ、３．５％アガロースゲル上で分析した。ゲルが、両方の切断部位が存在したことを示した場合、コロニーは、一晩中、３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを有する１６ｍｌのＬＢ中、２２５ｒｐｍ、３７℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット）を、プライマーＭＥＯ３０２およびＭＥＯ２５０（Ｄａｖｉｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いた配列決定により確認するために、精製した。配列決定結果を、意図されたＤＮＡ配列と「ＢＬＡＳＴを使用する２以上の配列の整列（Ａｌｉｇｎ  ２  ｏｒ  ｍｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＢＬＡＳＴ）」を用いて比較した。
【０１３８】
配列番号：５３および５４はＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクトを示し、それらは、それぞれ、ヒトチトクロムｂ５およびツメガエルＭＧＣ８０３２７タンパク質から得られた疎水性ドメインを含む（下線）。コンストラクトの調製中に使用される制限部位から得られるアミノ酸の短いリンカー配列（二重下線）は、チトクロムｂ５またはツメガエルＭＧＣ８０３２７残基をＩＡＶＭ２ｅ１配列に連結させる。よって、ＩＡＶＭ２ｅ１配列（下線なし）は疎水性ドメインのアミノ末端に架橋アミノ酸残基を介して間接的に融合される。
【０１３９】
Ｄ．ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクトの発現
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を発現させるために、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤを含むｐＥＶ１プラスミドまたはＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ−ｐＥＴ２８ａプラスミドを、大腸菌発現株Ｃ−４３（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換させた。開始培養物を３０ｍｇ／Ｌカナマイシンが補充された動物質を含まないＬＢブロス（ＡｔｈｅｎａＥＳ）中で、一晩中Ｇ−２５環境振盪機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において３７℃で増殖させた。３０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび１％グリセロールを補充された０．５Ｌの動物質を含まないＬＢブロスを含む４−２Ｌの滅菌振盪機フラスコに、開始培養物を、０．０９−０．１２（Ａ６００ｎｍ）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）となるまで添加した。培養物を、３７℃で、軌道振盪（２２５ｒｐｍ）を用いて０．５−０．７Ｏ．Ｄ．（Ａ６００ｎｍ）までインキュベートし、この時点で、培養物を、０．７５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ＢｉｏＷｏｒｌｄ）を用いて誘導した。培養物をさらに５時間、３７℃で振盪しながらインキュベートした。細菌を２５分間４℃での遠心分離（４０００ｘｇ）により収集し、ペレットを秤量した。
【０１４０】
Ｅ．６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤの精製
６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を精製するために、細菌を８Ｍ尿素、２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０緩衝液に溶解し、マイクロフルイダイザーＭ−１１０Ｌ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）において１５，０００ｐｓｉで３回ホモジナイズし、細菌ＤＮＡをせん断し、細菌を破壊した。溶解させた細菌をその後、遠心分離し（３０，０００ｘｇ）、細胞デブリを除去した。精製は、洗浄したニッケル荷電キレートアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を含む上清と共にインキュベートすることにより達成した。樹脂を５カラム体積の、２０ｍＭイミダゾールを含む尿素緩衝液で洗浄し、その後、５カラム体積の０．３％デオキシコール酸ナトリウムで洗浄し、最後に２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．９で溶離した。タンパク質画分を４％−１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動させ、クーマシーブルーで染色し、６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を含む画分を同定した。６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を含む２５０ｍＭイミダゾール溶離画分をプールし、０．１ｍｌの充填ポリミキシンＢ−アガロースと共にインキュベートし、残留エンドトキシンを除去した。ポリミキシンＢ−アガロース処理後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２に対して透析し、残留イミダゾール、尿素およびデオキシコール酸ナトリウムを除去した。タンパク質濃度およびエンドトキシン濃度をそれぞれ、ＢＣＡおよびリムルスアメボサイトアッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ．）により決定した。
【０１４１】
Ｆ．ｐＥＶ１プラスミドからのＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤの精製
大腸菌ペレットを４体積（ｗｔ／ｖｏｌ）の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．１；２０％スクロース；１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で懸濁させた。細菌が完全に懸濁された時点で、リゾチーム粉末（Ｓｉｇｍａ）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度まで添加し、室温で２０分撹拌した。スフェロプラストを、３０，０００ｘｇで、３０分４℃での遠心分離により収集した。ペレットを１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ＤＮａｓｅ（１０ユニット／ｍｌ）を含む氷冷蒸留水中に再懸濁させ、１０分間撹拌した。膜を、３０，０００ｘｇで、３０分４℃での遠心分離により収集した。ペレット状膜を、３００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．１；１ｍＭ  ＰＭＳＦに再懸濁させた。撹拌しながら、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）（Ｓｉｇｍａ）（２０％ストック）を一滴ずつ添加し、１％の最終濃度とした。混合物をマイクロフルイダイザーＭ−１１０Ｌ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）において１５，０００ｐｓｉで３回ホモジナイズし、その後、さらに１６時間４℃で撹拌した。混合物をその後、３０，０００ｘｇで３０分、４℃で遠心分離し、微粒子を除去した。清澄なライセートに、塩化ナトリウムおよびイミダゾールを添加し、それぞれ、５００ｍＭおよび２０ｍＭの最終濃度とした。その後、ライセートを、充填Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と共に４５分間、４℃で回転させながらインキュベートした。樹脂を、２２５ｘｇで５分の遠心分離により収集し、Ｋｏｎｔｅｓ  ２．５ｃｍｘ２５ｃｍカラムに移し、１０カラム体積の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．１、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％ＣＨＡＰＳで洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で溶離し、画分を収集し、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。標的タンパク質を含む画分をプールし、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１に対して１５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を用いて透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒ）。
【０１４２】
Ｇ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質のアイデンティティーを、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上の適切なＭＷを証明することにより決定した。試験試料中の不純物の濃度を、これらのバンドの染色強度を公知の濃度の参照タンパク質の染色強度と比較することにより推定した。
【０１４３】
Ｈ．Ｔｒｘ−６−Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤのＨＰＬＣ分析
タンパク質試料のＨＰＬＣ分析を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＧＰ５０  ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。システムは、ＧＰ５０グラジエントポンプ、ＧＭ−３グラジエントミキサ、ＡＳ５０オートサンプラー、およびＰＤＡ−１００光ダイオードアレイ検出器から構成された。構成成分を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、Ｄｉｏｎｅｘ  Ａｃｃｌａｉｍ１２０  Ｃ８カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ；５μｍ；１２０Ａ）上で、アセトニトリル勾配溶離、１ｍｌ／ｍｉｎ、２５℃：溶媒Ａ（１０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）；溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）；（０ｍｉｎ、４０％Ｂ）；（１ｍｉｎ、４０％Ｂ）；（２５ｍｉｎ、１００％Ｂ）を使用して分離した。構成成分の検出を、２２０ｎｍでのＵＶ吸光度により実施した。典型的には、２０μＬの試料を１分析につき注入した。チオレドキシン−ＩＡＶＭ２ｅ（１−１５）−ＨＤ融合タンパク質は、およそ１１−１２ｍｉｎで溶離する。１．１７ｘ１０−４  ｍｇ／ｍＡＵ２２０ｎｍ＊ｍｉｎの換算係数を使用して、１１−１２ｍｉｎピーク面積から融合タンパク質の量を推定した。ＩＡＶＭ２ｅ（１−１５）−ＨＤは、およそ１４ｍｉｎで溶離し；７．２７ｘ１０−５ｍｇ／ｍＡＵ２２０ｎｍ＊ｍｉｎの換算係数を使用して、１４ｍｉｎピーク面積からＩＡＶＭ２ｅ（１−１５）−ＨＤの量を推定した。
【０１４４】
Ｉ．Ｎｉ−ＮＴＡ精製タンパク質のプロテアーゼ切断
エンテロキナーゼ切断部位を含む組換えタンパク質を１０ｎｇのエンテロキナーゼ／ｍｇタンパク質（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）または１０ユニットのＴＥＶ／ｍｇタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で切断した。
【０１４５】
Ｊ．ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤを濃縮し、チオレドキシンを除去するための限外濾過
切断されたタンパク質溶液を限外濾過により、Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦセル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、およそ２０ｍｇ／ｍｌのＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ濃度とした。その後、濃縮試料を４回（それぞれ、１／１０希釈）、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄し、素通り画分におけるチオレドキシン構成成分のバルクを除去した。
【０１４６】
Ｋ．ｐＥＶ１からのＨＰＬＣ精製ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤおよびＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤのＨＰＬＣ精製を、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。システムは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ポンプおよびＵｌｔｉｍａｔｅ３０００可変波長検出器から構成される。タンパク質を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりＶｙｄａｃ  Ｃ８カラム（２２ｘ２５０ｍｍ；１０μｍ；３００Ａ）上でアセトニトリル勾配溶離：溶媒Ａ（水、０．１％トリフルオロ酢酸）；溶媒Ｂ（アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）；（０ｍｉｎ、５％Ｂ）；（１ｍｉｎ、５％Ｂ）；（６０ｍｉｎ、１００％Ｂ）；（６５ｍｉｎ、１００％Ｂ）；（７０ｍｉｎ５％Ｂ）；（７５ｍｉｎ、５％Ｂ）を使用して分離した。構成成分の検出を２２０ｎｍでのＵＶ吸光度により実施した。
【０１４７】
Ｌ．精製ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤを濃縮するための限外濾過
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤを含むＨＰＬＣ画分を限外濾過により、Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦセル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して、単量体ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤに対して５ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および二量体ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤに対して１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、濃縮し、およそ２０ｍｇ／ｍｌ作用濃度とした。濃縮タンパク質試料を、一連の４回洗浄（それぞれ、１／１０希釈）により、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に緩衝液交換した。最終試料は４℃で貯蔵した。
【０１４８】
Ｍ．エンドトキシン濃度
エンドトキシン濃度を、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）アッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ）により決定した。ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質調製物の８の１０倍希釈および８の対照エンドトキシン標準の２倍希釈を、エンドトキシンを含まない滅菌水を用いて調製した。対照およびＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ試料を滅菌したエンドトキシンを含まない１０ｘ７５ｍｍホウケイ酸ガラスチューブ中に分注し、等体積（１００μＬ）のＬＡＬを添加した。加えて、１００μＬのＬＡＬを１００μＬのエンドトキシンを含まない滅菌水に、陰性対照として注射するために添加した。試料中のエンドトキシン濃度（ＥＵ／ｍＬ）を、ＬＡＬ標識感度に、塊を示さなかった第１の希釈の逆数をかけることにより計算した。
【０１４９】
Ｎ．ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ純度および配列
タンパク質の純度をイオンスプレー質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により評価した。タンパク質の配列を、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤのトリプシン切断、続いてイオントラップ質量分析（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により確認した。
【０１５０】
Ｏ．ウェスタンブロット解析
精製タンパク質を確認するために、標的組換えタンパク質（ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ）、精製タンパク質試料（２μｇ）を、４％−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で移動させた。タンパク質を、０．２μＭニトロセルロース膜（ＮＣＭ）（ＢｉｏＲａｄ）にＴｒｉｓ−グリシン−メタノール緩衝液中、１．５ｈｒ、１００ｍＡｍｐで転写させた。ＮＣＭを、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＥＭＤ、ＰＮ２９６０）で１６時間４℃ブロックした。ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤを検出するために、ＮＣＭを１．５％ＢＳＡを有する、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＴＴＢＳ）中で希釈させた、１：１０００希釈の抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ＃ＭＡ１０８２）と共にインキュベートした。ブロットを、二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（１：７５００）と、ＴＴＢＳ中でインキュベートした。ブロットを、さらに１時間ロッキングしながらインキュベートした。ブロットを２０ｍｌのＴＴＢＳで１５分間、３回洗浄した。その後、ブロットを１０ｍｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ＃３４１０８）を添加することにより発色させ、１５−３０分振盪なしでインキュベートした。反応を、ＮＣＭを蒸留水で穏やかにすすぐことにより停止させた。
【０１５１】
Ｐ．リポソーム調製物
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ、Ｌｉｐｏｉｄ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）をクロロホルム、メタノール（１：１比）に溶解し、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質を６５：１脂質対タンパク質濃度まで添加した。３つの異なる用量を、試験試料に対して与えたので、異なる濃度を有する３つの異なる調製物を調製した。このように、同じ体積の用量を各動物に与えることができた。脂質およびＭＰＬの同一の試料を、タンパク質なしで、対照として（Ｌ−対照）（表２）調製した。脂質およびタンパク質を、窒素流下で乾燥させた。乾燥させた脂質フィルムを真空下に４８時間置き、残留有機溶媒を除去した。乾燥させた脂質フィルムに、適切な量の緩衝液（リン酸ナトリウム（１０ｍＭ）緩衝液、９％スクロースｐＨ７．４）を添加し、０．６、０．３または０．１ｍｇ／ｍｌ  ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤの濃度とした。脂質タンパク質混合物を６０℃で約１０分加熱し、１５秒間ボルテックスし、その後、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ上で３−５分間１０−２０％粉末で、半透明となるまでプローブ超音波処理し、リポソームを調製した。リポソームを、ラミナーフローフードにおいて、０．２μＭポリエーテルスルホンシリンジフィルタを通して、滅菌された発熱物質を含まないチューブ中に滅菌濾過し、標識した。リポソーム調製物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．からＤｒ．Ｊｉｌｌ  Ａｄｌｅｒ−Ｍｏｏｒｅ（Ｃａｌ  Ｐｏｌｙ  Ｐｏｍｏｎａ）へ直接移され、リポソームの受け取りとして署名された。リポソームは氷上で輸送され、４℃で、Ｃａｌ  Ｐｏｌｙ  Ｐｏｍｏｎａにて貯蔵された。リポソームサイズ分布をＭｉｃｒｏｔｒａｃ（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ−ＵＰＡ１５０、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ）により決定した。各リポソーム調製物のタンパク質濃度をＨＰＬＣアッセイにより確認した。
【表３】
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【０１５２】
Ｑ．インフルエンザウイルス感染モデル
インフルエンザ誘発モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝１７／群）を、０週に皮下で、８週に鼻腔内にＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤワクチン、または等用量のＬ−対照（タンパク質以外の全ての構成成分を有するリポソーム）で免疫化した。５匹の未誘発マウスを６日に屠殺し、血清をＥＬＩＳＡアッセイのために収集した（下記に記載）。残りの１２匹の免疫化マウスは、鼻腔内で（４０μＬ／誘発用量）ポストブースト１週（９週）に、感染肺ホモジネートから単離された１０ＬＤ５０のＩＡＶ（Ｈ１Ｎ１  （Ａ／ＰＲ／８／３４）で誘発した。ウイルス誘発は、最初に、動物を腹腔内でケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の混合物により麻酔することにより実施した。２００μＬマイクロピペット先端を使用して、ウイルスを、マウスの鼻孔に直接投与し、ウイルスを自然に吸入するようにさせた。７匹の動物を罹患率（体重減少、毛づくろいの欠如および活動の減少）の徴候および死亡率に対し、２８日にわたりモニタした。５匹のマウスを誘発後５日に屠殺し、それらの肺をウイルス負荷に対し、フォーカスアッセイ（下記に記載）によりアッセイした。
【０１５３】
Ｒ．ＥＬＩＳＡによる抗体力価およびアイソタイプキャラクタリゼーション
５匹のマウス／群から、血清を最後の免疫化後６日に収集した。簡単に言うと、マウスを腹腔内注射によりケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で深く鎮静させ、血液を心穿刺により除去した。血液をヘパリンですすいでおいた微量遠心機チューブに移した。血液を１５００ｒｐｍで２０分遠心分離し、血清を血液細胞から分離した。収集した血清を分割し、−８０℃で使用するまで貯蔵した。
【０１５４】
マウスから心穿刺により収集した血清を使用して、ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．）により、ＩＡＶＭ２ｅ１に対する抗体アイソタイプ力価についてアッセイした。簡単に言うと、手順は、４℃一晩中、５μｇ／ウェルのＩＡＶＭ２ｅ１タンパク質（ＵＣＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を含む１００μＬ／ウェルのコーティング緩衝液（６５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）でインキュベートした平底９６−ウェルＩｍｍｕｌｏｎマイクロタイタープレートを使用することを含む。プレートを３回２７５μＬ洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）ですすぎ、２７５μＬブロッキング緩衝液（１％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ）を各ウェルに添加し、２ｈ室温でプレートをインキュベートすることによりブロックした。その後、プレートを７回２７５μＬ洗浄緩衝液／ウェルで洗浄し、１００μＬ希釈マウス血清試料（ブロッキング緩衝液中で希釈）を各ウェルに添加し、２ｈ室温でインキュベートした。２ｈのインキュベーションの終了５分前に、ビオチン標識検出抗体（抗マウス免疫グロブリンアイソタイプ抗体：抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ａ、抗ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、抗ＩｇＡ）を、ブロッキング緩衝液中で調製した。ウェルを、７回２７５μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で洗浄し、１００μＬのビオチン抗マウス免疫グロブリンアイソタイプ抗体を添加した。プレートを密封し、１ｈ室温でインキュベートした。ウェルを７回２７５μＬ洗浄緩衝液で洗浄し、緩衝液を各洗浄に対し、除去前にウェル中に１分間留まらせた。ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰを各ウェル（１００μＬ／ウェル）に添加し、１ｈ室温でインキュベートし、続いて７回２７５μＬ洗浄緩衝液で洗浄した。基質試薬（ペルオキシダーゼ検出試薬）を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に添加し、ウェル中で４０分室温、暗闇でインキュベートした。停止液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に添加し、プレートをＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。抗体力価を、バックグラウンド（ＩＡＶＭ２ｅ１でコートされていないウェル）より上のＯＤ読み取り値を与える最後の血清希釈の逆数として計算した。
【０１５５】
Ｓ．ウイルス中和アッセイ
免疫化マウス由来の血清をＰＢＳ中で希釈し、５０μＬの各血清希釈を９６−ウェル丸底プレート内の四つ組ウェルにおいて５０μＬの１：１００−１：１２０希釈のＨ１Ｎ１ウイルスに添加した。プレートを、３７℃の、５％ＣＯ２を有する湿度室で８ｈの間インキュベートした。２４ウェル平底プレート、２００μＬの１ｘ１０６ＭＤＣＫ細胞／ｍｌ、および４００μＬのウイルス／血清希釈混合物（９６ウェルプレートの４つのウェルからのプールされた材料）を、各ウェルに添加した。２４ウェルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で４８ｈインキュベートした。その後、細胞を２５０ｍｌの１００％メタノールで固定し、室温で２０分間インキュベートした。メタノールをその後、デカントし、細胞を１０分間室温で２５０ｍｌの０．１％クリスタルバイオレットを含む２０％エタノール溶液で染色した。細胞を蒸留水ですすぎ、室温で乾燥させた。中和力価を、Ｈ１Ｎ１ウイルスによる５０％ＭＤＣＫ細胞溶解を防止することができる最低希釈として決定した。５０％ＭＤＣＫ細胞溶解を決定するために、プレートにおける各ウェルの密度を、ＵＶＰ  Ｇｅｌ  ＤＯＣシステムを用いて計算した。
【０１５６】
Ｔ．インビトロウイルスフォーカス（または「プラーク」）アッセイ
肺におけるウイルス力価を評価するために、各群中の５匹のマウス由来の肺を、誘発後５日に収集し、ホモジナイズし、ホモジナイズした肺の１０倍段階希釈物を、氷上、ＣＭＥＭ（ＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン）において調製した。肺試料の２００μＬのアリコートを、２００μＬのＭＤＣＫ細胞（７ｘ１０５−１ｘ１０６細胞／ｍｌ）と、２４のウェルプレートで混合し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ＭＤＣＫ細胞をプレートの底に付着させた。６ｈ後、３００μＬのＣＭＥＭで希釈した３％メチルセルロースを各ウェルに添加した。プレートを４０−４８ｈ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。ウイルスフォーカスの形成を可視化するために、免疫組織化学的染色手順を実施した。３％メチルセルロースを除去し、プレートを１回ＰＢＳで洗浄した、その後、４００μＬの４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳを各ウェルに添加し、細胞を固定した。プレートを、３０分、室温でインキュベートし、固定液を除去し、細胞を４００μＬ／ウェルの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで透過処理した。プレートを２回ＰＢＳで洗浄し、その後、ＰＢＳ、１０％ＦＢＳで９０分、室温でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを１回ＰＢＳで洗浄し、１５０μＬ／ウェルのモノクローナル抗ＮＰ−インフルエンザ抗体（ＰＢＳ中１：１００希釈）を添加した。９０分室温でインキュベートした後、プレートを７回ＰＢＳで洗浄し、１５０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ（ＰＢＳ中１：１０００希釈、１０％ＦＢＳ）を各ウェルに添加した。プレートを９０分インキュベートし、７回ＰＢＳで洗浄し、３００μＬの発色基質を添加した（２４．３ｍｌのクエン酸（０．０５Ｍ）および２０ｍｇのジアミノベンジジンおよび２０μＬのＨ２Ｏ２と混合した２５．７ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４（０．１Ｍ））。プレートを１０〜３０ｍｉｎ間インキュベートし、プレートを蒸留水で洗浄することにより反応を停止させた。フォーカス形成ユニットの数（すなわち、各ウェルにおける褐色に着色した細胞の限局領域の数）を、倒立顕微鏡を用いて計数した。各ウェルにおけるフォーカスの数に希釈係数をかけ、フォーカスまたは「プラーク」形成ユニット／ｍｌを決定するために使用した。
【０１５７】
Ｕ．統計解析
統計解析は、ランク付けＡＮＯＶＡ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用した。選択した特定の検定（複数可）は、解析されるデータ／試料の型に依存する。
【０１５８】
実施例２．結果
この研究では、我々は、ｐＥＴ２８ａ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤに加えて、４つの新規ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクトを構築した；（ｉ）上記で記載されるＬＤＲ配列を有するｐＥＶ１  ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ、（ｉｉ）ｐＥＶ１−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ，Ｃ１８Ｓ）−ＨＤ（ｉｉｉ）ｐＥＶ１−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ）−ＨＤ、（ｉｖ）ｐＥＶ１−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１８Ｓ）−ＨＤおよび（ｖ）ｐＥＶ１−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ。全ての新規プラスミドは配列決定され、インフレームであり、正確な配列を含むことを確認した。ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクトの各々に対するＰＣＲ産物は、ＰＣＲ産物の各々が、個々のＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤインサートの予測されるサイズと一致することを示す。プラスミドを大腸菌株Ｃ−４３に形質転換させ、発現させた。小規模発現研究を実施し、コンストラクトがタンパク質を発現することを確認した。オリジナルのｐＥＴ２８ａ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクトとは異なり、ＩＡＶＭ２ｅ−ＨＤコンストラクトを含むｐＥＶは、個々の非誘導性対照に比べ、高レベルのタンパク質発現を示した。標的Ｍ２ｅタンパク質が発現されたことを確認するために、ウェスタンブロット解析を実施した。ＩＡＶＭ２ｅ１タンパク質は、抗Ｍ２ｅ  ｍＡｂにより発色させた。対照的に、陰性対照炭疽菌防御抗原は、予想通り検出されなかった。複数のバンドが、ＩＡＶＭ２ｅ１試料のいくつかにおいて見られ、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールの存在下であっても、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤは、多量体を形成することができることが示された。
【０１５９】
膜画分をさらに処理し、その後、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性精製に供した。チオレドキシン−ＩＡＶＭ２ｅ−ＨＤ融合タンパク質画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８で溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、標的タンパク質を含む画分をプールし、さらに精製した。様々な組換えチオレドキシン−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ融合タンパク質の処理および様々なＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドの精製を同様に実施した。ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤペプチドの精製は、詳細にここでは代表的なデータセットとして記載される。溶離緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）中のＮｉ−ＮＴＡ親和性精製された融合タンパク質の試料を、ＨＰＬＣにより分析し、タンパク質量を評価した。チオレドキシン−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ融合タンパク質試料の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、およそ９および１２ｍｉｎで溶離する２つの主構成成分を示し；溶媒前端（３ｍｉｎ）の大きなピークは主に残留イミダゾールおよびより極性の構成成分から構成された。９ｍｉｎ構成成分は、約１７ｋＤａの見かけの分子量を有する主汚染物質であった（データ示さず）。１２ｍｉｎ構成成分は標的チオレドキシン−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ融合タンパク質であった。
【０１６０】
試料を濃縮し、汚染小分子、例えばイミダゾールおよび／または他の構成成分を激減させるため、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性精製された融合タンパク質試料を限外濾過し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８に緩衝液交換した。限外濾過は、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過撹拌セル、５０ｍｌ容量の使用により、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ膜を用いて達成した。典型的に、４以上の限外濾過サイクルを上記で記載されるように実施し、溶離緩衝液およびその構成成分の１０，０００以上倍希釈を得た。限外濾過プロセスから得られた素通り画分（プール）および残余分画分をＨＰＬＣにより分析した。この方法により、９ｍｉｎの汚染構成成分のほとんどが除去できる。残余分画分は、１２ｍｉｎ融合タンパク質構成成分のほとんどを保持した。限外濾過プロセスは前に観察されたが、未調査の現象を利用し、この場合、低分子量ＨＤタンパク質が高ＭＷＣＯ膜により保持され得る。この場合、約２４．０ｋＤａの単量体融合タンパク質を、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ膜に保持させることができ、一方、他の構成成分、例えば約１７ｋＤａの汚染物質は流れた。タンパク質の−ＨＤ構成成分は、５０ｋＤａより大きく安定なマルチサブユニット複合体または凝集物を組み立て、残余分画分中の−ＨＤタンパク質の保持が可能になることが提案されている。
【０１６１】
融合タンパク質をその後、１８ｈｒにわたり２５℃で、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノールの存在下、５ユニットのＴＥＶプロテアーゼ／１ｍｇの融合タンパク質の使用により、ＴＥＶプロテアーゼで切断し、チオレドキシン構成成分をＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤペプチドから分離した。融合タンパク質のＴＥＶプロテアーゼによる切断で、チオレドキシンおよびＩＡＶＭ２ｅ（１−１５）−ＨＤ構成成分を得た後、試料を５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ膜を通るＡｍｉｃｏｎ撹拌セル限外濾過に供し、チオレドキシン構成成分を部分的に激減させた。限外濾過させた試料は、８−９ｍｉｎのチオレドキシン構成成分が、８５％を超えて激減し、１１−１２ｍｉｎの残留融合タンパク質および１４ｍｉｎのＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤがほぼ１００％保持されたことを示した。
【０１６２】
推定ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤおよび著しく激減したチオレドキシン構成成分を含む、限外濾過プロセスからの残余分を希釈し、およそ１０ｍｇのＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ／ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８とし、その後、分取ＲＰ−ＨＰＬＣに供し、ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤを、残りの汚染構成成分から精製した。およそ２０ｍｇのＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤを含む２ｍＬの試料を、分取Ｃ１８カラム（２２ｘ２５０ｍｍ）上に注入し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル勾配で溶離した。この方法は、３０−３５ｍｉｎの間の残留チオレドキシン構成成分および３５−４０ｍｉｎの間の未切断融合タンパク質を溶離する。４０−４２ｍｉｎからの画分は、ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤペプチドとして典型的に収集した。方法は、チオレドキシンおよび融合タンパク質構成成分を推定ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ構成成分から有効に分離すると考えられ、これは高純度であると予測される。
【０１６３】
様々な組換えＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ融合タンパク質を同様に処理した。ＴＥＶプロテアーゼ切断試料を、分取ＨＰＬＣに供し、ペプチドの単量体形態を同様に回収した。様々なＨＰＬＣ精製ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドを含む画分を、純度を評価するためにＨＰＬＣにより分析した。分析用ＨＰＬＣクロマトグラムは、１１〜１５ｍｉｎの間で溶離する比較的純粋なＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドが、分取ＨＰＬＣ画分から回収され、検出可能なレベルの、チオレドキシンおよび融合タンパク質を含む任意の他の汚染タンパク質構成成分はなかったことを示す。
【０１６４】
ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤおよびＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ，Ｃ１８Ｓ）−ＨＤペプチドをシステイン残基なしで設計した。よって、これらは、ジスルフィド連結二量体または多量体を形成することができない。そのようなものとして、これらのペプチドは５ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜を通るＡｍｉｃｏｎ撹拌セル限外濾過により単量体として回収され、ペプチドは保持され、アセトニトリル／ＴＦＡ溶媒から１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８に、緩衝液交換された。
【０１６５】
ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ）−ＨＤおよびＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１８Ｓ）−ＨＤペプチドを１つのシステインを含むように設計し、よって、これらは二量体を形成することができた。これらのペプチドを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８に緩衝液交換させ、その後、周囲温度で空気の存在下７２ｈｒにわたり酸化させた。酸化後、二量体を残りの単量体から分取ＨＰＬＣにより精製した。二量体は典型的に単量体のおよそ２−３ｍｉｎ後に溶離し、別個の画分が精製二量体として収集できた。二量体画分を、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜を通る撹拌セル限外濾過により緩衝液交換させた。１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８に緩衝液交換されると、二量体は容易に沈殿した。最終試料を８０％エタノール中に交換し、回収し、これはより容易に二量体ペプチドを可溶化した。
【０１６６】
ＬＤＲ−６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチド（ｐＥＶベクター由来）を、ｐＥＴ２８ａにより生成されたＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドを模倣するように設計した。ｐＥＴ２８ａ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドは、典型的には精製され、その後、凍結乾燥され、ｐＨ８の緩衝液中で再構成された。２つのシステインの存在のために、ｐＥＴ２８ａ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドは容易に、二量体および多量体形態を主分子種として仮定することが観察された。よって、精製ＬＤＲ−６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ単量体を、二量体および多量体の形成を模倣するように同様に処理した。ＨＰＬＣ精製されたＬＤＲ−６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ単量体を限外濾過し、緩衝液を１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８に交換させ、その後、凍結乾燥させ、水で再構成し、緩衝能力を１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８で維持した。再構成させたＬＤＲ−６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤのＨＰＬＣ分析は、単量体の他の種への有意の酸化を示唆した。
【０１６７】
リン酸ナトリウム緩衝液または８０％エタノール中で再構成させた精製ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより非還元条件下（ジスルフィド連結多量体の単量体への還元を回避するためにβ−メルカプトエタノールなし）で分析し、ペプチドの泳動パターンを評価した。各ペプチドに対する計算した分子量を表３、列３に示す。
【表４】
2014518620.tif 000019
【０１６８】
ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤペプチドは、単量体であることが予測され、６．９ｋＤａの単量体種の計算されたサイズと一致するおよそ５ｋＤａの見かけの分子量を有する唯一のバンドとして溶離する。ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ，Ｃ１８Ｓ）−ＨＤペプチドもまた、単量体であることが予測され、８．０ｋＤａの単量体種の計算されたサイズと一致するおよそ６ｋＤａの見かけの分子量を有する唯一のバンドとして溶離する。ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ）−ＨＤおよびＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１８Ｓ）−ＨＤペプチドは、二量体であることが予測され、１６ｋＤａのそれらの二量体形態の計算されたサイズと一致する１４および２２ｋＤａマーカーの間の唯一のバンドとして溶離する。これらの試料の還元は単量体形態と一致する６ｋＤａマーカー近くを泳動する唯一のバンドを示す。ＬＤＲ−６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドは、多重形態を含むことが予測され、非還元条件下で５つの別個のバンドを示す。試料の還元はたった２つの別個のバンド、１０．３ｋＤａ単量体形態と一致する６ｋＤａマーカーより上の主なもの、および１４ｋＤａマーカーのすぐ上の微量バンドを示す。１４ｋＤａマーカーより上の微量バンドは、無視できるレベルの汚染チオレドキシン構成成分である可能性がある。およそ２０、３０、および４０ｋＤａのバンドは、それぞれ、二量体、三量体、および四量体の分子サイズと一致する。図６、レーン４における泳動パターンに基づき、この調製におけるＬＤＲ−６Ｈｉｓ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドは主に単量体および二量体形態で存在すると考えられる。全体としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、適切な分子種の比較的純粋なＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドを示した。
【０１６９】
ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドの質量を正確に確認するために、試料をＳＥＣ−ＥＳＩ−ＭＳに供した。結果は表３、列３および４にまとめて示す。全体としては、質量分析データは、精製ペプチドの測定質量は、様々なＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドの計算質量と同じであることを証明し、標的とされたＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤペプチドが回収されたことが確認された。
【０１７０】
精製プロセスがエンドトキシンを無視できるレベルまで除去することができたことを確認するために、様々なＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ試料を、エンドトキシンレベルに対してＬＡＬアッセイによりアッセイした。結果を表３、列５において、ＥＵ／１５μｇタンパク質で示す（後の動物試験における予測タンパク質量／用量）。全体としては、様々な試料中のエンドトキシンのレベルは無視でき、ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ試料は、６．９ＥＵ／１５μｇで最も高いレベルを示した。
【０１７１】
新しいコンストラクトを試験するために使用した多数のマウスのために、異なるＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ製剤の２つの別々の研究を実施した。各群において、オリジナルのＬ−ＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ（ｐＥＴ２８ａ）、Ｌ−ＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ（ｐＥＶ１、これは、ｐＥＴ２８ａバージョンと同一のタンパク質であるが、高発現プラスミドにおけるものである）を陽性対照として、Ｌ−対照を陰性対照として使用した。第１の群はＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ、Ｃ１８Ｓ）−ＨＤおよびＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤを含み、その各々は、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質の単量体形態を生成すると予測された。
【０１７２】
サイズ分布は異なるリポソーム製剤の各々に対し、変動した。全体としては、リポソームは、二峰性分布を示し、１つのピークは４１．８ｎｍ〜８４．５ｎｍの範囲であり、第２のピークは１８９．９ｎｍ〜２９８．２ｎｍの範囲であった。対照的に、Ｌ−ＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ（ｐＥＶ１）調製物は１８８ｎｍの単峰性分布を示した（表４）。リポソームタンパク質試料に対する二峰性サイズ分布は、ＵＰＡ測定中の水性表面でのＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤの膜内移動による可能性がある。対照的に、タンパク質を含まないＬ−対照は、５７．８ｎｍの単峰性Ｇａｕｓｓｉａｎサイズ分布を有する。
【表５】
2014518620.tif 000020
【０１７３】
タンパク質濃度をＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ、Ｃ１８Ｓ）−ＨＤおよびＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤ調製物の各々に対し決定した。タンパク質濃度のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、試料が８０％〜１００％のオリジナルの開始材料を含んだことを示した。タンパク質の損失は、チューブの側面に付着したタンパク質、プローブ超音波処理による損失および滅菌濾過中の損失に起因し得る。ｐＥＴ２８およびｐＥＶ由来のＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤコンストラクトの多量体形態および分割の欠如のために、タンパク質濃度は決定しなかった。
【０１７４】
第２の群は２つの単一突然変異体バッチ（すなわち、Ｃ１６ＳおよびＣ１８Ｓ  ＩＡＶＭ２ｅペプチド）を含み、これらはタンパク質の二量体形態を生成すると予測された。リポソームは、様々なサイズ分布を有する典型的な半透明溶液を生成した。第１の群における単量体ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ  コンストラクトで見られるように、単峰性分布を示す調製物もあり、二峰性分布を示すものもあった（表５）。この分布における変動性は、タンパク質型またはタンパク質濃度と相関すると考えられない。典型的に、第１のピークは４８ｎｍ〜１７３ｎｍの範囲であり、第２のピークは１４９ｎｍ〜２５４ｎｍの範囲であった。最終リポソーム調製物のタンパク質濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。データは、これらの試料の調製中、ほとんどのタンパク質は損失されなかったことを示す（表５）。
【表６】
2014518620.tif 000021
【０１７５】
以前、我々はＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤワクチンがマウスにおいて、致死的インフルエンザウイルス誘発に対し強い防御免疫応答を誘導することができることを示した[Ernst et al., 2006]。この応答は、体液性免疫応答と関連した。というのも、Ｌ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ免疫化マウス血清は、未処理マウスを致死的インフルエンザ誘発に対して防御することができるからである。新規コンストラクトを試験するために使用したマウスの総数のために、２つの別々の研究を実施した。第１の研究では、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、材料および方法セクションにおいて記載されるように、オリジナルＬ−ＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ（ｐＥＴ２８ａ）、Ｌ−ＬＤＲ−ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ（ｐＥＶ；これは、ｐＥＴ２８ａバージョンと同一のタンパク質であるが、高発現プラスミドにおけるものである）、Ｌ−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤおよびＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ、Ｃ１８Ｓ）−ＨＤで免疫化した。この実験では、切断型（ＩＡＶＭ２ｅ１−１５）および二重突然変異体ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ、Ｃ１８Ｓ）タンパク質をオリジナルＩＡＶＭ２ｅ１タンパク質と比較した。１５μｇのオリジナル製剤（ｐＥＴ２８ａ由来）およびオリジナル製剤（ｐＥＶ由来）で免疫化したマウスは７２％生存の良好な免疫防御応答を示した。マウスを、５μｇ、１５μｇまたは３０μｇのＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤで免疫化した場合、８６％のマウスが致死的インフルエンザ誘発を生き延びた（Ｌ−対照と比較してｐ＜０．０５）。Ｌ−対照を受け、その後誘発されたマウスはすべて、９日までに死亡した（図７Ａ）。さらに、免疫化マウスは、対照処置群と比較して、疾患および体重減少の最小限の徴候しか示さなかった。Ｌ−ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）−ＨＤで免疫化したマウスとは対照的に、５μｇ、１５μｇまたは３０μｇのＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ、Ｃ１８Ｓ）−ＨＤで免疫化したマウスのうち、３０μｇ用量を受けたマウスのみが、対照とは著しい違いを示した（ｐ＝０．００６、８６％生存）。５μｇまたは１５μｇのＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ、Ｃ１８Ｓ）−ＨＤを受けたマウスは、それぞれ５７％および４２％生存しか示さなかった（図８Ａ）。マウスはまた、体重減少および疾患の徴候に対して評価したが、これらはパーセント生存と相関した。
【０１７６】
第２の研究では、マウスを、リポソーム調製物として単一システインＩＡＶＭ２ｅ１突然変異体（Ｃ１６ＳまたはＣ１８Ｓ）で免疫化した。これらの突然変異体はＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤの二量体形態を生じさせ、インビボで、上記で記載される単量体ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ形態と比較された。マウスの群を５μｇ、１５μｇまたは３０μｇのＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１６Ｓ）−ＨＤで免疫化し、その後１０ＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４で誘発した。免疫防御応答は、試験された３つの用量間で変動した。５μｇ、１５μｇまたは３０μｇの用量で免疫化したマウスは、それぞれ８６％、７１％および５７％生存を示した。５μｇ（ｐ＝０．００４）および１５μｇ（ｐ＝０．０３２）の用量のみがＬ−対照と比較して著しい違いを示し、この場合、Ｌ−対照で処置したマウスは全て誘発後９日までに死亡した。マウスを５μｇ、１５μｇまたは３０μｇのＬ−ＩＡＶＭ２ｅ１（Ｃ１８Ｓ）−ＨＤで処理すると、Ｃ１６Ｓ突然変異体よりもずっと良好な応答を示した。１５μｇ用量を受けたマウスは全て致死的誘発を生き延び、５μｇおよび３０μｇ用量を受けた７匹のマウスマウスのうち１匹を除く全て（８６％）が生存した。これらの用量の各々はＬ−対照を受けたマウス（ｐ＜０．００５）よりも著しく良好であった。興味深いことに、単一システイン突然変異コンストラクトはどちらも、未突然変異Ｌ−ＬＤＲＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤワクチンよりも良好な防御を生じさせた。免疫化マウスのさらなる評価は、対照処置群と比較して、疾患および体重減少最小限の徴候を示した。
【０１７７】
実施例３．結論
ＩＡＶＭ２ｅ１セグメントは２つのシステイン（１６位および１８位；表２を参照されたい）を含み、ペプチドは、ジスルフィド結合し、二量体〜多量体を形成することができるので、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質の精製は困難であった。タンパク質は様々な形態として発現されるので、精製物の分割は所望より低い。たった１つのシステインを有する、またはいずれのシステインも有さないＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤを発現させ、精製することにより、本発明は、より均一のタンパク質分子を提供する。我々のデータは、単一システインＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤ突然変異体は、二量体を形成し、チオレドキシンの下流で発現された場合、オリジナルＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤと比較して相当量のタンパク質を提供したことを示す。ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤの単量体形態を試験するために、２つの追加のコンストラクトを調製した。両方のシステインが突然変異された１つのコンストラクト、およびＩＡＶＭ２ｅ１の最初の１５残基のみが使用された第２のコンストラクトを製造した。どちらの場合でも、タンパク質は、単量体として形成され、オリジナルおよび単一システイン突然変異形態と同様によく発現された。これらのデータは、酸化環境（すなわち、リポソームの調製において使用される緩衝液）に置かれると、システインが、タンパク質の二量体化および多量体化のタンパク質構造において決定的な役割を果たすことを示した。タンパク質の単量体形態の精製は直接的であり、精製は高純度に達成された。さらに、タンパク質がチオレドキシンのＣ末端に融合された場合、ＩＡＶＭ２ｅ１−ＨＤタンパク質の発現に差はないことは明らかであった。
【０１７８】
本明細書で記載される前臨床結果は、ＩＡＶＭ２ｅ１抗原セグメントは、普遍的インフルエンザワクチンのための生存候補であるという証拠を提供する。使用されるペプチドの異なる形態間には変動性が存在したが、コンストラクトのほとんど全てが、対照と比較して、少なくとも１つの用量で有意の防御免疫応答を刺激した。予想外に、これらのデータから、二重システイン突然変異体および切断型ＩＡＶＭ２ｅ１（１−１５）タンパク質の両方ともが防御免疫応答を刺激したので、システインは防御免疫応答に何の役割も果たさないことが明らかである。
【０１７９】
実施例４．参考文献
Ｅｒｎｓｔ  ＷＡ，  Ｋｉｍ  ＨＪ，  Ｔｕｍｐｅｙ  ＴＭ，  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ１，  Ｈ５，  Ｈ６  ａｎｄ  Ｈ９  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｍａｔｒｉｘ  ２  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．    Ｖａｃｃｉｎｅ    ２００６；２４（２４）：５１５８−６８。
Ｆａｎ  Ｊ，  Ｌｉａｎｇ  Ｘ，  Ｈｏｒｔｏｎ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ  Ｍ２  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，  ｆｅｒｒｅｔｓ，  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．    Ｖａｃｃｉｎｅ    ２００４；２２（２３−２４）：２９９３−３００３。
Ｌｉｕ  Ｗ，  Ｌｉ  Ｈ，  Ｃｈｅｎ  ＹＨ．  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｍ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｌｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．    ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．    ２００３；３５（２）：１４１−６。
Ｎｅｉｒｙｎｃｋ  Ｓ，  Ｄｅｒｏｏ  Ｔ，  Ｓａｅｌｅｎｓ  Ｘ，  Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ  Ｐ，  Ｊｏｕ  ＷＭ，  Ｆｉｅｒｓ  Ｗ．  Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ２  ｐｒｏｔｅｉｎ．    Ｎａｔ．Ｍｅｄ    １９９９；５（１０）：１１５７−６３。
【０１８０】
実施例５．ＨＳＶ２
ＨＳＶ２タンパク質ワクチンの有効性を証明するために、好適なＨＳＶ抗原含有リポソーム製剤を実施例１に記載されるように、ＩＡＶＭ２ｅ１と置き換わる下記ＨＳＶ２配列の１つ以上を含む、好ましくはそれらから構成されるポリペプチドを用いて製造する：
ＨＴＤＬＨＰＮＮＴＹ、ＲＳＳＬＧＳＬＬＹ、ＹＭＥＳＶＦＱＭＹ、ＦＬＶＤＡＩＶＲＶＡ、ＦＬＩＡＹＱＰＬＬ、ＦＬＷＥＤＱＴＬＬ、ＩＬＩＥＧＩＦＦＡ、ＲＩＬＧＶＬＶＨＬ、ＳＶＹＰＹＤＥＦＶ、ＥＹＱＲＬＹＡＴＦ、ＫＹＦＹＣＮＳＬＦ、ＬＹＰＤＡＰＰＬＲＬ、ＡＬＡＴＶＴＬＫＹ、ＡＬＬＡＫＭＬＦＹ、ＬＬＡＹＶＳＶＬＹ、ＳＩＶＨＨＨＡＱＹ、ＳＳＧＶＶＦＧＴＷＹ、ＶＹＭＳＰＦＹＧＹ、ＹＭＡＮＱＩＬＲＹ、ＹＶＡＧＦＬＡＬＹ、ＣＰＲＲＰＡＶＡＦ、およびＶＶＲＧＰＴＶＳＬ（配列番号：６０−８１）。
【０１８１】
ＨＳＶ２ワクチンの、ヒトにおいて防御免疫応答を刺激する可能性を証明するために、ヒトＨＬＡ  Ａ２：０１トランスジェニック（Ｔｇ）マウス（ｎ＝２０／群）を動物モデルとして使用する。このワクチンにおいて表される５つのＨＬＡハプロタイプのうち、ＨＬＡ  Ａ２：０１が最良モデルである。というのも、このＨＬＡハプロタイプは、全てのヒト民族の中で最も一般的なＨＬＡハプロタイプを表すからである。上記のように、本明細書で記載される適切な疎水性ドメインに融合されたＨＳＶ２配列（複数可）のリポソーム製剤は、ＭＰＬまたはＣｐＧアジュバントを用いて調製される。ワクチン接種したマウス（Ｎ＝２０／群）を、それらの、ＨＳＶ２ペプチドの各々に対する応答について、ＬｕｍｉｎｅｘマルチビーズＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴ分析（５マウス／群）により評価し、マウスを腟内誘発し、上記で記載される手順を使用して防御の程度をモニタする。
【０１８２】
当業者は、本発明は目的を実施する、ならびに言及された結果および利点、およびそれらの中の固有のものを得るために、うまく適合されることを容易に認識する。本明細書で提供される実施例は、好ましい実施形態を表し、例示であり、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１８３】
本発明について、当業者がこれを製造し、使用するのに十分詳細に記載し、例示してきたが、様々な代替案、改変、および改善は、本発明の精神および範囲から逸脱せずに明らかである。本明細書で提供される実施例は、好ましい実施形態を表し、例示であり、本発明の範囲を制限することを意図しない。その中の改変および他の用途は、当業者に思いつくものであろう。これらの改変は、本発明の精神内に含まれ、特許請求の範囲により規定される。
【０１８４】
本明細書で開示された本発明に対し、本発明の範囲および精神から逸脱せずに様々な置換および改変をすることができることは、当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１８５】
本明細書で言及される全ての特許および出版物は、本発明が関連する当技術分野における当業者のレベルを示す。全ての特許および出版物は、各それぞれの出版物が参照により組み込まれることが特定的に、かつ個々に示されるかのように、同じ程度まで、本明細書において参照により組み込まれる。
【０１８６】
実例として本明細書で記載される本発明は、本明細書で特定的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制約が存在しない場合でも、好適に実施され得る。よって、例えば、本明細書における各場合において、「含む」、「から本質的に構成される」および「から構成される」という用語のいずれも、他の２つの用語と置換され得る。採用されている用語および表現は、説明するが限定しない用語として使用され、そのような用語および表現において、図示され、および記載される特徴の任意の等価物またはその部分を排除する意図はないが、様々な改変が特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。よって、本発明は、好ましい実施形態および任意的な特徴により特定的に開示されているが、本明細書で開示される概念の改変および変更は当業者に用いられる可能性があり、そのような改変および変更は添付の特許請求の範囲により規定されるこの発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。
【０１８７】
他の実施形態は下記特許請求の範囲内で明記される。
【図１】
2014518620.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014518620.tif 000031
【国際調査報告】
2014518620.tif 000032
2014518620.tif 000033