(57)【要約】  本発明は、ポリフェムシン由来ペプチドに基づくＣＸＣＲ４に特異的な標的化部分を含んでなるコンジュゲートおよび治療剤または造影剤に関する。本発明はまた、ＣＸＣＲ４＋細胞への特異的標的化に必要な治療および診断のためのコンジュゲートの適用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列：
【化１】
2014508515.tif 000027
（配列番号５）を含んでなる標的化ペプチド、または機能的に等価なその変種と、
（ｉｉ）治療剤と
を含んでなるコンジュゲートであって、
標的化ペプチドは、ＣＸＣＲ４に特異的に結合し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内における治療剤の細胞内移行を促進することができる、
コンジュゲート。
【請求項２】
治療剤がポリペプチドである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
治療剤と標的化ペプチドとが、融合タンパク質の一部である、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
請求項３で定義されるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４で定義されるポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項７】
治療剤がポリヌクレオチドである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
治療剤がナノ輸送体内に提供され、ナノ輸送体は標的化ペプチドと結合している、請求項１で定義されるコンジュゲート。
【請求項９】
治療剤が抗腫瘍剤である、請求項１〜３、７若しくは８に記載のコンジュゲート、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または、請求項５に記載のベクター。
【請求項１０】
抗腫瘍剤が、
（i）細胞毒性ポリペプチド、
（ii）抗血管新生ポリペプチド、
（iii）癌抑制遺伝子によりコードされるポリペプチド、
（iv）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（v）抗転移活性を有するポリペプチド、
（vi）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（vii）癌抑制遺伝子、
（viii）サイレンシング剤、
（ix）自殺遺伝子、
（x）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチド、
（xi）化学療法剤、および
（xii）抗血管新生分子
からなる群から選択される、請求項９に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１１】
サイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１０に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１２】
医薬に用いるための請求項１１または１２に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１３】
ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌を処置する方法に用いるための、請求項１１または１２に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１４】
癌が、膵臓癌または直腸結腸癌である、請求項１３に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１５】
治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項１〜３、７若しくは８に記載のコンジュゲート、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または、請求項５に記載のベクター。
【請求項１６】
医薬に用いるための請求項１４に記載の、コンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１７】
治療剤が、
（i）抗レトロウイルス剤、
（ii）細胞毒性ポリペプチド、
（iii）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（iv）サイレンシング剤および、
（v）自殺遺伝子
からなる群から選択される、ＨＩＶ感染に伴う疾患の処置に用いるための、請求項１〜３、７若しくは８に記載のコンジュゲート、請求項４に記載のポリヌクレオチド、または、請求項５に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的化部分と治療的または診断的部分とを含んでなるコンジュゲートおよびその治療のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体は、ある細胞の表面に発現し、ケモカインと呼ばれるサイトカインと相互作用する。ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）は、その内在性リガンドであるケモカインＣＸＣＬ１２（間質細胞由来因子−１、ＳＤＦ−１）のシグナルを伝達するＧタンパク質共役型受容体である。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２の相互作用に続き、細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）イオン流が開始される。これは、細胞を生物内で移動させる化学遊走性などの細胞応答を引き起こす。
【０００３】
ＣＸＣＲ４は、骨髄細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、上皮細胞、内皮細胞および樹状細胞上で発現する。従って、この分子の腫瘍細胞表面での発現は、この分子を発現する細胞に治療化合物を特異的に標的化するためのリガンドとしての好適な候補にする。例えば、ＷＯ２００６０２９０７８は、Ｔａｔタンパク質により形成されるタンパク質移行ドメイン、ＣＸＣＲ４受容体結合ＤＶ３ペプチドドメインおよび治療剤（ｃｄｋ２アンタゴニストペプチドまたはｐ５３活性化ペプチドのいずれか）を含んでなる、融合構築物を開示する。これらの構築物は、ＣＸＣＲ４発現細胞に標的化され、タンパク質移行ドメインにより、治療剤は細胞内に移行する。しかし、これらの構築物では、細胞への構築物のドッキングに単独で働くＣＸＣＲ４リガンドに加えて、細胞内に治療剤を送達する移行ドメインが必要である。
【０００４】
Driessen et al. (Molecular Therapy, 2008, 16: 516-524)は、脂質を基礎とする遺伝子送達ビヒクルをＣＸＣＲ４＋-細胞に標的化するために、リン脂質に共有結合させた、ペプチド類似体である４−フルオロベンゾイル−ＲＲ−（Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン）−ＣＹＥＫ−（１−シトルリン）−ＰＹＲ−（１−シトルリン）−ＣＲ（配列番号１）を開示する。しかし、この方法は、効率が低く、コンジュゲートと接触させる前に細胞をＶＥＧＦと接触させることにより、標的細胞の表面のＣＸＣＲ４の発現を増加させる必要がある。
【０００５】
Le Bon et al. (Bioconjugate Chem. 2004, 15, 413-423)は、脂質とポリカチオン性コンジュゲートを用いてＣＸＣＲ４発現細胞内への特異的遺伝子の移行を促進させるためのＣＸＣＲ４特異的リガンドであるＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３１００の使用を開示する。しかし、この方法は、標的細胞の表面上のＣＸＣＲ４の発現を増大させるために、ポリカチオン性脂質治療剤にホルボールエステル誘導体をコンジュゲートする必要がある。
【０００６】
Egorova et al. (J Gene Med 2009; 11: 772-781)は、ＣＸＣＲ４リガンド（ペプチド：）により形成されるコンジュゲート（ペプチド：ＫＰＶＳＬＳＹＲＳＰＳＲＦＦＥＳＨ−Ｋ９−ビオチン［（配列番号２）−ビオチン］、ＫＰＶＳＬＳＹＲ−Ｋ９−ビオチン［（配列番号３）−ビオチン］およびＤ−ＬＧＡＳＷＨＲＰＤＫ−Ｋ９−ビオチン［（配列番号４）−ビオチン］およびポリリジン領域に静電的に結合するＤＮＡにより形成されるコンジュゲート、並びにＣＸＣＲ４陽性細胞に拡散を送達するためのその使用を開示する。しかし、これらのコンジュゲートは、効率が低く、ＣＸＣＲ４に対するアゴニスト活性を示すペプチドの使用に依存しており、このことがリガンドによりＣＸＣＲ４の刺激の応答として腫瘍増殖の増大を引き起こし得る。
【０００７】
Tamamura et al. (Bioinorganic & Medicinal Chemistry, 2001, 9: 2179-2187)は、Ｔ１４０  ＣＸＣＲ４アゴニストの様々なアゴニストと３’−アジド−３−デオキシチミジン（ＡＺＴ）とのコンジュゲートおよびＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ−１誘発型細胞病原性の予防のためのそれらのを開示する。しかし、これらのコンジュゲートがインビボでＣＸＣＲ４発現細胞を標的化できるという証拠も、ＣＸＣＲ４にコンジュゲートしたＡＺＴがＣＸＣＲ４により細胞内移行することができるとの証拠も提供されていない。
【０００８】
さらに、これらすべてのコンジュゲートは、細胞表面に治療剤を送達することにより働き、そこからの治療剤の細胞内移行は細胞表面上の特異的受容体へのその結合が必要である。それ故に、先行技術で開示されたコンジュゲートの問題を解消するＣＸＣＲ４細胞に目的分子を特異的に送達するに適したさらなるコンジュゲートの必要性がある（ここで、治療剤の細胞内移行は、ＣＸＣＲ４標的化分子に結合した治療剤と共にＣＸＣＲ４発現細胞により取り込まれるＣＸＣＲ４標的化分子の使用により生じる）。
【発明の概要】
【０００９】
第一の面では、本発明は、
（i）配列：
【化１】
2014508515.tif 000002
（配列番号５）を含んでなる標的化ペプチドまたは機能的に等価なその変種と、
（ii）治療剤
とを含んでなるコンジュゲートであって、
標的化ペプチドはCXCR4に特異的に結合し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞における治療剤の細胞内移行を促進する、コンジュゲートに関する。
【００１０】
さらなる面では、本発明は、本発明のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００１１】
さらなる面では、本発明は、医薬に用いるための、コンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞に関する。
【００１２】
さらなる面では、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌を処置する方法に用いるための、本発明のコンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞に関する。
【００１３】
さらなる面では、本発明は、ＨＩＶ感染に伴う疾患を処置する方法に用いるための、本発明のコンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｈｅｌａ細胞におけるＴ２２、ｖＣＣＬ２、Ｖ１およびＣＸＣＬ１２−  ＧＦＰ−Ｈ６融合タンパク質の細胞内移行。未処理ＨｅＬａ細胞、並びに、Ａ）ＰＢＳ＋１０％グリセロール緩衝液中またはＢ）Ｔｒｉｓ２０ｍＭ＋ＮａＣｌ５００ｍＭ緩衝液中の、０．６μＭのＣＸＣＲ４リガンド−ＧＦＰ−Ｈ６融合タンパク質であるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、Ｖ１−ＧＦＰ−Ｈ６、ｖＣＣＬ２−ＧＦＰ−Ｈ６およびＣＸＣＬ１２−ＧＦＰ−Ｈ６に暴露して２０時間後のＨｅＬａ細胞の、フローサイトメトリーにより測定された緑色蛍光タンパク質の蛍光。ＨｅＬａ細胞は、ＧＦＰ融合タンパク質が付着した細胞表面による、潜在的な残存蛍光を除去するために、トリプシン処理を延ばして行った（実験項目を参照）。
【図２】ＨｅＬａ細胞における細胞内移行時のＴ２２、ｖＣＣＬ２、Ｖ１およびＣＸＣＬ１２−ＧＦＰ−Ｈ６の共焦点分析。細胞膜をＣｅｌｌＭａｓｋでラベルし、細胞ＤＮＡをヘキスト３３３４２でラベルした。ＣＸＣＲ４リガンド−ＧＦＰ−Ｈ６融合タンパク質は、細胞内で強いドットとして見ることができる緑色シグナルを生み出した。培養細胞は、ＰＢＳ＋１０％グリセロール緩衝液に溶解させた０．６μＭのＡ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、Ｂ）Ｖ１−ＧＦＰ−Ｈ６、Ｃ）ｖＣＣＬ２−ＧＦＰ−Ｈ６およびＤ）ＣＸＣＬ１２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質に２０時間暴露した。
【図３】ＨｅＬａ細胞におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６侵入の特徴。Ａ）フローサイトメトリーにより測定された未処理ＨｅＬａ細胞および各種濃度のＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６に２０時間暴露した後のＨｅＬａ細胞の、フローサイトメトリーにより測定された緑色蛍光タンパク質の蛍光。Ｂ）フローサイトメトリーにより測定された２μＭのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６に２０時間暴露し、サイトメトリー分析の前に様々なトリプシン処理を行ったＨｅＬａ細胞の、フローサイトメトリーにより測定された緑色蛍光タンパク質の蛍光。Ｃ）完全培地（右）またはＯｐｔｉｐｒｏ（左）の存在下でタンパク質添加２０時間後に、フローサイトメトリーにより測定され、共焦点顕微鏡により分析された、２μＭ  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の細胞内移行に対する血清の影響。Ｄ）２μＭのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６でのインキュベーション後の３次元体積測定ｘ−ｙ−ｚデータ野内でのＨｅＬａ細胞の等位面の描写。Ｅ）Ｔｒｉｓ２０ｍＭ＋ＮａＣｌ５００ｍＭ緩衝液中のランダムなＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６粒子のＴＥＭ像。Ｆ）３０分、１時間、２時間、３時間、４時間および２４時間での共焦点顕微鏡により２μＭ  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の細胞内移行。
【図４】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６のＤＮＡ結合および遺伝子輸送特性の評価。Ａ）増加させたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６量により促進される、アガロースゲル電気泳動におけるプラスミドＤＮＡ移動の遅延。Ｂ）、Ｃ）およびＤ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ｔｄ  ｔｏｍａｔｏ遺伝子複合体に２４時間暴露した後のＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６を内部に有するＨｅＬａ細胞（強いシグナルドット）の共焦点顕微鏡法であり、ＨｅＬａ細胞は、ｔｄ  ｔｏｍａｔｏ遺伝子（柔らかいシグナル）を発現する。
【図５】様々なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６／ＳＤＦアルファの比（１：０、１：１、１：１０）における、ＣＸＣＲ４の天然リガンドであるＳＤＦアルファタンパク質によるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の細胞内移行の阻害。２つの無縁のタンパク質であるＧＦＰ−Ｈ６およびＧＬＡを１：１０の比で対照として用いた。
【図６】免疫抑制マウスの盲腸に異種間移植したＣＸＣＲ４＋のＳＷ１４１７ヒト直腸結腸癌細胞に由来する一次腫瘍組織への、標的化部分（ＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する）としてのＴ２２と緑色蛍光タンパク質とを含んでなる融合タンパク質Ｔ２２−ＧＦＰの選択的な生体分布。静脈内単一用量投与後、様々な時点（５、２４または４８時間）で、２０〜５００μｇにわたる用量範囲で、ＩＶＩＳ２００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いた蛍光定量により測定された、８〜４７倍のＴ２２−ＧＦＰの蓄積に注目。ビヒクルで処置された対照マウスの一次腫瘍組織では、蛍光は検出されなかった。胃における蛍光は、消化された食物によるものであり、実験動物および対照動物間で差がなかった。黒いアスタリスク：一次腫瘍。
【図７】免疫抑制マウスの盲腸に異種間移植したＣＸＣＲ４＋のＳＷ１４１７ヒト直腸結腸癌細胞に由来する腹腔転移並びに腸間膜および横隔膜のリンパ節に対するＴ２２−ＧＦＰの選択的生体分布。静脈内単一用量投与５時間または２４時間後、５００μｇの用量で、ＩＶＩＳ２００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いた蛍光定量により測定された、腹腔転移病巣におけるＴ２２−ＧＦＰの２０〜４０倍の蓄積に注目。実験群または対照動物（ビヒクル対照）の肝臓実質、膵臓実質、腎臓、心臓、非腫瘍腸管、非腫瘍リンパ節、肺または脾臓では蛍光は検出されなかった。Ｔ２２−ＧＦＰ融合タンパク質の蓄積が腫瘍組織内で観察されたが、正常組織ではＴ２２−ＧＦＰの蓄積は観察されなかった。実験群および対照動物の両方において胆管（肝臓に付着した）または膵臓で蛍光が観察されたが、これは、これらの臓器から分泌された蛍光タンパク質に起因し得る。黒いアスタリスク：一次腫瘍；黒い矢：腹腔転移。
【発明の具体的な説明】
【００１５】
本発明者らは、驚くべきことに、ポリフェムシンＩＩ（polyphemusin II）（［Ｔｙｒ５，１２，Ｌｙｓ７］−ポリフェムシンＩＩ、以降、Ｔ２２ペプチド）の配列に由来するペプチドが、機能的で可溶性の融合化合物の標的ＣＸＣＲ４＋細胞への細胞内移行を促進させることができることを観察した。本発明の実施例に例示されるように、Ｔ２２ペプチドとマーカータンパク質とを含んでなる融合タンパク質は、細胞内移行し、細胞質で放たれた。このペプチドはＣＸＣＲ４リガンドとして先行技術で報告されていた（Murakami et al. J. Virol., 1999, 73: 7489-7496）ものであるが、受容体へのこのペプチドの結合の結果としては受容体の細胞内移行率においては増加が見られないことが報告されていたため、結果は予想外であった。この結果はまた、Ｔ２２ペプチドと結合させた時に細胞内移行できた分子は２６ｋＤａのポリペプチドであった点でも驚きであった。この種の分子は、その比較的大きなサイズのために、小さな有機分子よりも非常に低い効率でしか細胞内移行しない。その上、本発明で提供される実験によれば、他の高親和性ＣＸＣＲ４リガンド（ｖＣＣＬ２のＮ末端領域に対応するＶ１ペプチド、完全ｖＣＣＬ２またはＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１）は、リガンドのエンドサイトーシスを促進することができる一方で、このペプチドに付着したタンパク質のエンドソーム排出を起こさないことを示す。
【００１６】
本発明の治療的コンジュゲート
従って、第一の面では、本発明は、
（i）配列：
【化２】
2014508515.tif 000003
（配列番号５）を含んでなる標的化ペプチドまたは機能的に等価なその変種と、
（ii）治療剤と
を含んでなるコンジュゲートであって、
標的化ペプチドは、ＣＸＣＲ４に特異的に結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞において治療剤の細胞内移行を促進させることができる、コンジュゲートに関する。
【００１７】
Ａ．標的化ペプチド
本発明のコンジュゲートの第一の構成要素は、配列：
【化３】
2014508515.tif 000004
（配列番号５）（以降、Ｔ２２ペプチド）を含んでなる標的化ペプチドまたは機能的に等価なその変種である。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、一般的には、ペプチド結合により互いに連結した約２〜４０アミノ酸残基の直鎖を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸残基」は、当技術分野で知られている、天然に生じたアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物を意味する。ある態様では、タンパク質またはペプチドの残基は、アミノ酸残基の配列を遮る非アミノ酸を有さず、連続的である。他の態様では、１以上の非アミノ酸部分を含んでなってもよい。特定の態様では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１以上の非アミノ酸部分で遮られていてもよい。
【００２０】
本明細書で用いられる「機能的に等価な変種」は、１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含み、ＣＸＣＲ４と相互作用し、それに付着した治療分子の細胞内移行および／またはエンドソーム排出を促進するためのＴ２２の能力を実質的に維持したＴ２２のあらゆる変種を意味する。与えられたペプチドが機能的に等価なその変種として捉えることができるか否かを決定するための好適な分析は、例えば、本発明の実施例１に記載された分析である。この分析では、Ｔ２２変種の推定上の機能的に等価な変種がマーカーポリペプチド（例えば、蛍光タンパク質）にインフレームとなるように融合され、ＣＸＣＲ４を発現する細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）とインキュベートされる。ペプチドがＴ２２の機能的に等価な変種であれば、マーカータンパク質は、細胞内移行し、細胞質で発現する。
【００２１】
一つの態様では、標的化ペプチドは、
−  配列：
【化４】
2014508515.tif 000005
（配列番号６）を有し、Ｘ１はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｘ２はＤ−Ｌｙｓであり、かつＸ３はＬ−シトルリンである、Ｔ１４０ペプチド、
−  配列：
【化５】
2014508515.tif 000006
（配列番号７）を有し、Ｘ１はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｘ２はＣｉｔであり、Ｘ３はｄＬｙｓであり、かつＸ４はＬ−シトルリンである、ＴＮ１４００３ペプチド、
−  配列：
【化６】
2014508515.tif 000007
（配列番号８）を有し、Ｘ１はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｘ２はｄ−シトルリンであり、かつＸ３はＬ−シトルリンである、ＴＣ１４０１２ペプチド、
−  配列：
【化７】
2014508515.tif 000008
（配列番号９）を有し、Ｘ１はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｘ２はＬ−シトルリンであり、Ｘ３はｄＧｌｕであり、かつＸ４はＬ−シトルリンである、ＴＥ１４０１１ペプチド、および
−  配列
【化８】
2014508515.tif 000009
（配列番号９）を有し、Ｘ１はＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｘ２はＬ−シトルリンであり、Ｘ３はＤ−Ｌｙｓであり、かつＸ４はＬ−シトルリンであるＴＺ１４０１１ペプチドか、またはＮ末端のアルギニン残基がアセチル化されているその変種（Ａｃ−ＴＺ１４０１１として知られる）、
からなる群から選択される。
【００２２】
他の態様では、標的化ペプチドは、Ｔ１４０ペプチド、ＴＮ１４００３ペプチド、ＴＣ１４０１２ペプチド、ＴＥ１４０１１、ＴＺ１４０１１、またはＴＺ１４０１１のＮ末端がアセチル化された変種、および、
【化９】
2014508515.tif 000010
の配列を有し、Ｘ１がＤ−ＬｙｓであるＴ１３１ペプチド（配列番号３８）から選択されるペプチドではない。
【００２３】
当業者であれば、標的化ペプチドの三次構造が一次構造に見出されるシステイン残基間のジスルフィド架橋の存在に依存することを理解するであろう。好ましい態様では、Ｔ２２ペプチドは、４位と１７位のシステインの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む。他の好ましい態様では、Ｔ２２ペプチドは、８位と１３位のシステインの間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む。さらにより好ましい態様では、Ｔ２２ペプチドは、４位と１７位のシステインの間に第一のジスルフィド架橋を含み、８位と１３位のシステインの間に第二のジスルフィド架橋を含む。
【００２４】
Ｔ２２ペプチドは、Ｎ末端位置にメチオニン残基をさらに含んでいてもよい。
【００２５】
標的化ペプチドの好適な機能的な変種は、Ｔ２２ペプチドとの同一性の度合いにおいて、約２５％以上の、例えば、２５％、４０％、６０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示すものである。２つのポリペプチド間の同一度は、当業者に広く知られたコンピュータアルゴリズムおよび方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、従来開示されているＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定される[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]。本発明のタンパク質は、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、ミリストイル化、タンパク質分解加工などの翻訳後修飾を含んでいてもよい。
【００２６】
あるいは、標的化ペプチドの好適な機能的変種は、１以上の位置が上述のＴ２２タンパク質に存在するアミノ酸の保存的置換であるアミノ酸を含むものである。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸を類似した構造および／または化学的性質を有する他のアミノ酸に置換することにより得られる。例えば、下記６つの群：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。そのような保存的アミノ酸置換の選択は、当業者の技術の範囲であり、例えば、Dordo et al. et al., (J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739)およびTaylor et al., (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218)に記載されている。
【００２７】
第一の構成要素は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合し、第二の構成要素の細胞内移行を促進させることができる。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「ＣＸＣＲ４」は、Ｇタンパク質共役型の７回膜貫通型ケモカイン受容体を意味する。他のケモカイン受容体と同様に、ＣＸＣＲ４は白血球の指向的な遊走および活性化を仲介することにより免疫および炎症応答で重要な役割を果たす。ＣＸＣＲ４は、様々な癌細胞系統、並びに、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌および脳癌などの組織、および非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病において発現し、または過剰発現する。ＣＸＣＲ４の唯一知られるリガンドは、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１またはＣＸＣＬ１２）である。ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との間の相互作用は、腫瘍増殖、浸潤、血管新生および転移などの腫瘍形成の複数の段階で重要な役割を果たす。
【００２９】
結合親和性は、例えば、Tamamura et al.により記載されるように、ＣＸＣＲ４トランスフェクション済み細胞系統（例えば、ＣＨＯ細胞）および標識したＣＸＣＲ４リガンド（例えば、１２５Ｉ−ＳＤＦ−１α）とペプチドとを接触させること、並びに、標識したＣＸＣＲ４リガンドの結合に対する標的化ペプチドの阻害パーセントを測定することを含んでなるオイルクッション法（Hesselgesset et al, 1998, J.Immunol., 160:877-883を参照）により測定される。
【００３０】
本明細書で用いられる表現「ＣＸＣＲ４に特異的に結合すること」は、他の分子に実質的に結合せずに、他の受容体や細胞と結合するよりも、ＣＸＣＲ４またはそれを発現する細胞に、より頻度高く、より迅速に、より長く、および／または、より大きな親和性を持って結合する本発明のコンジュゲートの能力を意味する。
【００３１】
結合親和性は、例えば、Tamamura et al.により記載されるように、ＣＸＣＲ４トランスフェクション済み細胞系統（例えば、ＣＨＯ細胞）および標識したＣＸＣＲ４リガンド（例えば、１２５Ｉ−ＳＤＦ−１α）とペプチドとを接触させること、並びに、標識したＣＸＣＲ４リガンドの結合に対する標的化ペプチドの阻害パーセントを測定することを含んでなるオイルクッション法（Hesselgesset et al, 1998, J.Immunol., 160:877-883を参照）により測定される。
【００３２】
特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性標的化剤により示され得るものであり、例えば、もしＣＸＣＲ４がリガンドに対して１以上の結合部位を有するならば、低親和性を有するリガンドを標的化に用いることができる。特異的結合はまた、高親和性リガンド、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有するリガンドにより示され得るものであり、少なくとも例えば、１０−１１Ｍ若しくは１０−１２Ｍまたはそれ以上のＫｄを有し得る。低親和性および高親和性の標的化リガンドの両方が本発明のコンジュゲート中への取込みに有用である。
【００３３】
本明細書で用いられる「細胞内移行」とは、分子または分子を含んでなる構築物が、細胞膜の外表面上の標的要素に分子が結合し、得られた複合体が細胞により細胞内移行する過程を意味する。細胞内移行後は、細胞質内での得られた複合体の解離が続き得る。その分子または構築物に加えて標的要素がその後特定の細胞コンパートメントに局在し得る。
【００３４】
ＣＸＣＲ４発現細胞による本発明のコンジュゲートの細胞内移行能は、コンジュゲートがＧＦＰなどの蛍光タンパク質を含んでなる場合には、蛍光法により容易に測定し得る。このような融合タンパク質は、Ｔ２２ペプチドと蛍光タンパク質をコードする核酸がインフレームで融合し、適切な宿主細胞または生物中で発現する組換え核酸を調製することにより得られ得る。融合タンパク質は、その後、ＣＸＣＲ４発現細胞の培養物と接触させ、またはインビボで適切な時間ＣＸＣＲ４を発現する組織と接触させて、その後、蛍光顕微鏡法を用いて構築物が細胞に浸透したか否かを決定し得る。細胞質における蛍光の存在は、蛍光タンパク質から生じる蛍光顕微鏡像を既知の細胞質染色で得られる像と比較することによりさらに調査され得る。
【００３５】
あるいは、ＣＸＣＲ４発現細胞による本発明のコンジュゲートの細胞内移行能は、コンジュゲートの第一の構成要素を含んでなる融合タンパク質と蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、赤色蛍光タンパク質をコードするＴｄＴｏｍａｔｏ遺伝子）との間の非共有結合性の複合体を調製することによっても試験することができる。この複合体は、その後、ＣＸＣＲ４発現細胞の培養物と接触させられ、またはインビボで適切な時間ＣＸＣＲ４を発現する組織と接触させて、その後、蛍光顕微鏡法を用いて構築物が細胞に浸透したか否かおよび蛍光タンパク質をコードする遺伝子が発現しているか否かを決定し得る。核における蛍光の存在は、蛍光タンパク質から生じる蛍光顕微鏡像を既知の細胞質染色（例えば、ＤＡＰＩ）で得られる像と比較することによりさらに調査され得る。
【００３６】
好ましい態様では、第一の構成要素は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合し、第二の構成要素の細胞内移行とエンドソーム排出を促進することができる。
【００３７】
本明細書で用いられる表現「エンドソーム排出を促進すること」とは、受容体媒介性エンドサイトーシスによる細胞内移行の後の、エンドソームのコンパートメントからのコンジュゲートの放出を誘導する標的化ペプチドの能力を意味する。
【００３８】
Ｂ．治療剤
治療剤（本発明のコンジュゲートの第二の構成要素としても知られる）は治療目的の化合物である。
【００３９】
用語「治療（therapeutic）」は、一般的意味で用いられ、処置剤、予防剤および置換剤が挙げられる。
【００４０】
治療剤の性質は、標的化ペプチドにコンジュゲートできる限り、または、標的化ペプチドとの複合体として提供できる限り、特に限定されない。従って、治療剤は、ポリペプチドまたは核酸であり得る。従って、治療剤の下記の代替物が可能である：
−  治療剤は、共有結合で標的化ペプチドに結合しているポリペプチドである。
−  治療剤は、ポリペプチドであり、標的化ペプチドと融合タンパク質を形成している。
−  治療剤は、標的化ペプチドに直接結合し得るか、ＤＮＡに親和性を示す追加のタンパク質ドメインにより、特に静電的相互作用により直接結合し得るポリヌクレオチドである。静電的相互作用を介してＤＮＡに結合可能な好適なタンパク質ドメインとしては、特に限定されないが、ポリリジン、プロタミン、アルブミンおよびカチオン化アルブミンが挙げられる。
−  治療剤は、低有機分子である。
−  治療剤は、標的化ペプチドに共役し、ナノトランスポーター内に提供される上記のいずれか（ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは低有機分子）である。
【００４１】
好ましい態様では、治療剤は、高分子量化合物である。本明細書で用いられる「高分子量化合物」とは、１ｋＤａを超える、好ましくは５ｋＤａを超える、より好ましくは１０ｋＤａを超える、さらにより好ましくは１００ｋＤａを超える分子量を有する、核酸、ペプチド、タンパク質、天然および合成ポリマー、並びに抗生物質などの薬剤などの化学物質または分子を意味する。
【００４２】
Ｂ．１．  治療剤としてのポリペプチド
好ましい態様では、治療剤はポリペプチドである。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１以上のアミノ酸残基が天然のアミノ酸に対応する人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４４】
治療剤がポリペプチドである場合、コンジュゲートは、治療剤と標的化ペプチドとの共有結合性複合体であり得る。ある態様では、治療剤と標的化ペプチドは融合タンパク質を形成する。好ましくは、治療剤がポリペプチドであり、第一および第二の構成要素が融合タンパク質を形成する場合、コンジュゲートは、ポリフェムシン−１またはポリフェムシン−２ではない。
【００４５】
好ましい態様では、活性成分として働くポリペプチドまたは該ポリペプチドと標的化ペプチドとにより形成される融合タンパク質は、該タグに対して特異的親和性を示す試薬を用いて、コンジュゲートの検出または精製のために用いられ得るタグをさらに含んでいてもよい。適切な検出／精製タグは、タグがコンジュゲートの安定性や標的化能に影響しない限り、６−ｈｉｓ（金属キレート部分）、６−ｈａｔ  ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）グルタチオン親和性、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ｓｔｒｅｐ−タグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、Ｓ−ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫応答性エピトープ、エピトープタグ、Ｅ２タグ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、ＡＵ１およびＡＵ５エピトープ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープ、ＫＴ３エピトープ、ＩＲＳエピトープ、Ｂタグエピトープ、プロテインキナーゼＣエピトープ、ＶＳＶエピトープまたはその他のタグが挙げられる。
【００４６】
治療剤として用いることができる好適なポリペプチドとしては、細胞増殖速度の減少を促進することができるあらゆるポリペプチドが挙げられる。
【００４７】
Ｂ．２．  治療剤としてのポリヌクレオチド
ある態様では、本発明のコンジュゲートの一部を形成する治療剤は、核酸である。治療剤がポリヌクレオチドである場合、これは、ペプチドがＤＮＡと静電的相互作用を形成し得る正電荷を全体的に有している場合には、標的化ペプチドの相互作用と直接関連する。あるいは、標的化ペプチドは、全体として正電荷を有する標的化ペプチド中に存在する追加のタンパク質ドメインを含んでいてもよく、従って、ＤＮＡと静電的相互作用を形成することができる。静電的相互作用を介してＤＮＡと会合することができる好適なタンパク質ドメインとしては、特に限定されないが、ポリリジン、プロタミン、アルブミンおよびカチオン化アルブミンが挙げられる。
【００４８】
本明細書で相互互換的に用いられる「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して結合したヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然の構造的変種および非天然合成類似体、またはこれらの組合せ）で構成されるポリマー、関連する天然の構造的変種およびその非天然合成類似体を意味する。
【００４９】
核酸は、コード領域と標的細胞中での発現を促進するための適切な調節シグナルとを含み、欠陥のある遺伝子機能を細胞内で回復させるか、サイレンシング核酸を含み、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００５０】
一般的に、コード領域を含む核酸は、適切な調節配列と作動可能に連結される。そのような調節配列は、少なくともプロモーター配列を含んでなる。本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置する１以上の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を意味し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位の存在、転写開始部位、特に限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクティベータータンパク質結合部位などの他のＤＮＡ配列、並びに、プロモーターからの転写量の制御に直接的または間接的に働くとして当業者に知られるその他のヌクレオチド配列により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、多くの生理学的および発生学的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的または発生学的条件に依存して制御されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の分化した細胞／組織でのみ活性である。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現に適した遺伝子治療ベクターのプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス末端反復配列プロモーター（ＬＴＲ）、例えば、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルスまたはＨＴＬＶ−１などに由来するもの、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターおよびヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。
【００５１】
核酸がコード領域を含む場合には、コード領域は、癌抑制遺伝子、自殺遺伝子または腫瘍に対して免疫応答を活性化させることができるポリヌクレオチドからなる群から選択される。好適な遺伝子またはｃＤＮＡは、ポリペプチドである活性成分に関して上述した、細胞毒性ポリペプチド、アポトーシス促進性ポリペプチドまたは転移抑制ポリペプチドをコードするものである。
【００５２】
Ｂ．３．  治療剤としての低有機分子
一般的に、「低分子」とは、実験室で調製されるか天然に見出される、実質的に非ペプチド性、非オリゴマー性の有機化合物を意味する。本明細書で用いられる低分子とは、「天然物様」の化合物を意味することができるが、しかし、用語「低分子」は、「天然物様」化合物に限定されない。むしろ、低分子は、典型的には、いくつかの炭素−炭素結合を含み、１５００ｇ／モル未満、１２５０ｇ／モル未満、１０００ｇ／モル未満、７５０ｇ／モル未満、５００ｇ／モル未満、２５０ｇ／モル未満の分子量を有するが、この特徴は本発明の目的のために限定することを意図したものではない。他のある態様では、天然物様の低分子が用いられる。
【００５３】
本発明のコンジュゲートの一部を形成するナノトランスポーターに組み込まれうる好適な低分子としては、限定されないが、抗癌剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤および抗レトロウイルス剤が挙げられる。
【００５４】
Ｂ．４．  治療剤としてのナノトランスポーター
本明細書で用いられる「ナノトランスポーター」とは、制御された寸法、例えば、目的化合物を含み約１〜約１０００ナノメートルのオーダーの直径または半径を有する多構成要素複合体を意味する。
【００５５】
本発明のナノトランスポーターとしては、上述の１以上の活性成分（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）、および、低分子などの細胞増殖の減少に適した他の細胞毒性剤を含み得る。
【００５６】
本発明における使用のための好ましいナノトランスポーターとしては、ナノ粒子、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、タンパク質ケージなどが挙げられる。
【００５７】
Ｂ．４．ｉ．  ナノ粒子に基づくナノトランスポーター
ある態様では、ナノトランスポーターはナノ粒子である。本発明における使用に適したナノ粒子としては、脂質ナノ粒子およびポリマー性ナノ粒子が挙げられる。
【００５８】
ポリマー性ナノ粒子は、Ｔ２２ペプチド標的化部分に結合したポリマー性マトリックスにより形成される。本発明のポリマー性ナノ粒子に有用であり得る生体適合性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、または、ポリアミン、ポリグルタミン、デキストラン、ポリアンヒドリド、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、または、ポリシアノアクリレート、ポリヂオキサノン（ＰＤＯ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（グリセロールセバケート）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトンまたはこれらの組合せが挙げられる。
【００５９】
あるいは、本発明のナノ粒子は、リポソームまたはミセルなどの脂質ナノ粒子であり得る。
【００６０】
例えば、小胞形成脂質からのミセルおよびリポソームの形成は当技術分野で知られている。小胞形成脂質とは、ゲル−液体結晶相転移温度範囲を超えると自発的に脂質二重層を形成する脂質を意味する。そのような脂質は、典型的には、自発的に二重層形成を許すある特性を有し、例えば、その疎水性部分および親水性部分の同一の横断面の近くで層状相にパックされ得る。コレステロールやその様々な類似体などの脂質二重層に安定的に取り込まれることができる脂質は、二重層の形成時に脂質二重層に取り込まれることができる。小胞形成脂質は、好ましくは、２つの炭化水素鎖、典型的には、アクリル鎖および極性または非極性の頭部基を有する脂質である。様々な合成小胞形成脂質および天然小胞形成脂質が存在し、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールおよびスフィンゴミエリンなどの、２つの炭化水素鎖が典型的には約１４〜２２の炭素原子長であり、飽和または様々な不飽和度を有するリン脂質が挙げられる。アクリル鎖が様々な飽和度を有する上記脂質およびリン脂質は、商業的に得られ、または公表されている方法に従い調製することができる。他の好適な脂質としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質およびコレステロールなどのステロールが挙げられる。
【００６１】
用語「リポソーム」とは、水相を包む１以上の同心的に配列した脂質二重層から構成される小胞を意味する。水相は、典型的には、標的部位に送達される化合物を含む。標的部位に到達すると、リポソームは局所の腫瘍細胞または腫瘍血管細胞の細胞膜と融合し、これにより、化合物を細胞質に放出する。あるいは、リポソームは、輸送小胞（例えば、エンドソームまたはファゴソーム）の内容物として、腫瘍細胞または腫瘍血管細胞によりエンドサイトーシスされ、若しくは取り込まれる。輸送小胞中では、リポソームは分解するかまたは小胞の膜と融合してその内容物を放出する。当業者に知られる様々な方法がリポソームを調製するために得られる。好適な方法としては、例えば、音波破砕、押出し、高圧／ホモジェナイズ、顕微溶液化、界面活性剤透析、カルシウム誘発による小リポソーム小胞の融合およびエーテル融合法などが挙げられ、すべて当技術分野において周知である。
【００６２】
ポリマー性および脂質性ナノトランスポーターは、ポリマー性材料を取り囲んで粒子のための殻を形成する両親媒性化合物のコーティング、または、粒子が免疫系構成要素による認識から逃れ、粒子の血液循環半減期を増加させることを可能にするステルス材料をさらに含んでいてもよい。
【００６３】
Ｂ．４．ｉｉ．  ウイルスナノトランスポーター
ある態様では、本発明のナノトランスポーターは、ウイルスである。当業者は、Ｔ２２ペプチドまたは機能的に等価なその変種による外部構成要素の修飾を可能とする十分な情報が得られる限り、当技術分野で知られるあらゆるウイルスが本発明でナノトランスポーターとして用い得ることを理解する。従って、非エンベロープウイルスの場合、本発明のナノトランスポーターは、合成されキャプシド（capsid）に組み上がる際に、Ｔ２２ペプチドまたは機能的に等価なその変種がキャプシドの外表面に暴露するように、Ｔ２２ペプチド若しくは機能的に等価なその変種の化学的結合によるか、または、Ｔ２２ペプチド若しくは機能的に等価なその変種をコードする配列のキャプシドタンパク質をコードするウイルス遺伝子への挿入により、少なくとも１のキャプシドタンパク質を直接改変することにより得られる。上記方法で改変できる好適なウイルスキャプシドの例としては、限定されないが、シンドビスウイルスおよびその他のアルファウイルス、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルス、アイチウイルス）、トガウイルス（例えば、ルベラウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、トゴトウイルス、バトケンウイルス、鶏ペストウイルス）、ポリオーマウイルス（例えば、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、トリポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＰ１、バクテリオファージＭ１３、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＧ４、バクテリオファージＰ２、バクテリオファージＰ４、バクテリオファージ１８６、バクテリオファージΦ６、バクテリオファージΦ２９、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＮ４、バクテリオファージΦＸ１７４、バクテリオファージＡＰ２０５、ノーウォークウイルス、手足口病ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、サテライトペニカムモザイクウイルス（ＳＰＭＶ）、フロックハウスウイルスおよびヒトパピローマウイルスが挙げられる。
【００６４】
あるいは、ナノトランスポーターがエンベロープウイルスの場合、標的化ペプチドは、エンベロープ糖タンパク質の一部に結合し、または、置き換わることが好ましい。この短い繊維状タンパク質を挿入するために用いられ得る表面糖タンパク質の非限定的な例としては、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３などの表面糖タンパク質を含んでなる、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）およびオーラウイルス（ＡＶ）などのアルファウイルス由来の糖タンパク質が挙げられる。シンドビスウイルス（ＳＩＮ）由来のＥ２糖タンパク質およびインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）は、細胞表面上の特定の分子（Ｅ２に対してはヘパリン硫酸グリコサミノグリカン、ＨＡに対してはシアル酸）に特異的に結合する非レトロウイルス性糖タンパク質であり、ある遺伝学的改変に寛容であり、レトロウイルス表面上に依然として効率的に組み上がることで知られる（Morizono et al. J. Virol. 75, 8016-8020）；ラッサ熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンタンウイルスまたはＳＡＲＳ−ＣｏＶの糖タンパク質；フラビウイルスに基づく表面糖タンパク質、インフルエンザＡ／鶏ペストウイルス／ロストク／３４（ＦＰＶ）由来のヘマグルチニン（ＨＡ）、クラスＩフソゲンが用いられる（T. Hatziioannou, S. Valsesia-Wittmann, S. J. Russell, F. L. Cosset, J. Virol. 72, 5313 (1998)）。本発明の使用に適したウイルスとしては、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、ミクソウイルス、レオウイルス、ブニヤウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、フィロウイルス、アレナウイルス、アルテリウイルスまたはカリシウイルスが挙げられる。
【００６５】
Ｂ．４．ｉｉｉ．  ＶＬＰに基づくナノトランスポーター
ある態様では、本発明で用いられるナノトランスポーターは、ＶＬＰである。本明細書で用いられる用語「ＶＬＰまたはウイルス様粒子」とは、ウイルスの遺伝物質が除去され、これらの起源であるウイルスの三次構造に似た三次構造をもたらすウイルスのヌクレオキャプシドにより形成される自己組織化高分子構造を意味する。
【００６６】
本発明の使用のためのＶＬＰは、整列した繰り返し構造を有する当技術分野で知られたあらゆるウイルス由来のポリペプチドから形成され得る。ＶＬＰは、ウイルス感染した細胞培養物から生産し、精製することができる。ワクチン目的では、得られたウイルスまたはウイルス様粒子は、毒性が取り除かれている必要がある。遺伝子工学に加えて、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理などの物理的または化学的方法を用いてウイルスのゲノム機能を不活性化することができる。あるいは、ＶＬＰは、組換えＶＬＰである。被覆タンパク質またはタンパク質群をコードする遺伝子が当業者により容易に同定できるならば、既知の配列の一般的に知られたほぼすべてのウイルスがＶＬＰの生産に用いられ得ることを理解する。宿主内での被覆タンパク質またはタンパク質群の組換え発現によるＶＬＰの調製は、当業者の常識の範囲である。好適なＶＬＰＳは、ＲＮＡ−バクテリオファージ、アデノウイルス、パパイヤモザイクウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、パピローマウイルス、ヘパドナウイルス、呼吸器性シンシチウムウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス；シンドビスウイルス；ロタウイルス、手足口病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ノーウォークウイルス、アルファウイルス；ＳＡＲＳ、パラミクソウイルス、転移性胃腸炎ウイルスレトロウイルス、レトロトランスポゾンＴｙ、ポリオーマウイルス；タバコモザイクウイルス；フロックハウスウイルス、ササゲクロロティックモトルウイルス；ササゲモザイクウイルス；およびアルファルファモザイクウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質から得ることができる。
【００６７】
Ｂ．４．ｉｖ．  タンパク質ケージに基づくナノトランスポーター
ある態様では、本発明で用いられるナノトランスポーターは、タンパク質ケージ（protein cage）である。本明細書で用いられる用語「タンパク質ケージ」は、制約された内部環境を形成することができる１以上の異なるタンパク質により形成される自己組織化高分子構造を意味する。タンパク質ケージは、１〜３０ｎｍの範囲（例えば、殻の内部直径）の様々なコアサイズを有することができる。本発明での使用に適した好ましいタンパク質ケージとしては、フェリチンタンパク質ケージ、ＷＯ０８１２４４８３に記載された熱ショックタンパク質ケージなどが挙げられる。
【００６８】
Ｃ．  リンカー領域
標的化ペプチドとペプチドの性質を有する治療剤とを含んでなる本発明のコンジュゲート目的物は、標的化ペプチドと治療剤とを直接結合する結合を含むか、あるいは、標的化ペプチドと治療剤との間のリンカーとして働く追加のアミノ酸配列を含むことができる。リンカーペプチドは、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸またはおおよそ１００アミノ酸を含んでなる。
【００６９】
本発明では、非天然介在性アミノ酸配列は、ドメイン間のヒンジ領域として働き、ここのドメインの三次元的形態を維持しながら互いに独立して動くことを可能とする。この意味で、本発明の非天然介在性アミノ酸配列は、この動きを可能にする構造的変形能により特徴付けられるヒンジ領域である。特定の態様では、非天然介在性アミノ酸配列は、非天然の柔軟なリンカーである。好ましい態様では、柔軟なリンカーは、２０アミノ酸長かそれ以下の柔軟なリンカーペプチドである。より好ましい態様では、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択される２以上のアミノ酸を含んでなる。本発明の好ましい態様では、柔軟なリンカーはポリグリシンリンカーである。
【００７０】
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましい例としては、結合タンパク質の機能を実質的に低下させることなく、または、結合タンパク質の少なくとも一つの機能を実質的に低下させることなく、タンパク質に結合させるために用いられるものが挙げられる。より好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、
−  テトラネクチンの残基５３〜５６および残基５７〜５９により形成されるペプチド：
【化１０】
2014508515.tif 000011
（配列番号１９）（Nielsen, B.B. et al., FEBS Lett. 412: 388-396, 1997）；
−  アミノ酸１９９２〜２１０２（SWISSPROT付番、受付番号P02751）に対応する、ヒトフィブロネクチン由来の連結鎖３（connecting strand 3）、
−  フィブロネクチンのアミノ酸番号２０３７〜２０４９に対応する部分配列：
【化１１】
2014508515.tif 000012
（配列番号２０）および、その内部のアミノ酸番号２０３８〜２０４２に対応する部分配列断片：
【化１２】
2014508515.tif 000013
（配列番号２１）、
−  マウスIgG3の上方のヒンジ領域の１０アミノ酸残基の配列：
【化１３】
2014508515.tif 000014
（配列番号２２）、および、好ましい態様では、リンカーペプチドは配列：
【化１４】
2014508515.tif 000015
（配列番号２３）のペプチドおよび配列ＧＡＰのペプチドからなる群から選択され、
−  ８アミノ酸配列：
【化１５】
2014508515.tif 000016
（配列番号３３）
などのコイル化ヘリックスを有する構造を含んでなる結合タンパク質に用いられてきた。
【００７１】
あるいは、本発明のンジュゲートの２つの構成要素は、プロテアーゼの開裂標的を含むペプチドにより連結することもでき、従って、治療剤から標的化ペプチドを分離することができる。本発明のポリペプチド中へのそれらの取込みに適したプロテアーゼ開裂部位としては、エンテロキナーゼ（開裂部位ＤＤＤＤＫ、配列番号２４）、因子Ｘａ（開裂部位ＩＥＤＧＲ、配列番号２５）、トロンビン（開裂部位ＬＶＰＲＧＳ、配列番号２６）、ＴＥＶプロテアーゼ（開裂部位ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号２７）、プレシジョン（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ）プロテアーゼ（開裂部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号２８）、インテインなどが挙げられる。
【００７２】
Ｄ．  ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
コンジュゲートが標的化ペプチドと活性（治療または診断）成分である場合、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いてレシピエント対象によりインビボで製造することができる。従って、ある面では、本発明は、本発明のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００７３】
本発明では、表現「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」が相互互換的に用いられ、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）若しくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル、または、チオリン酸エステルおよびチオエステルなどのこれらのリン酸エステル類似体の、単鎖または二本鎖形態のポリマー形態を意味する。従って、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡにより形成されるらせんが可能である。用語「核酸配列」および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次構造または二次構造をもっぱら意味し、特定の型の三次構造を限定しない。従って、この用語は、直鎖または環状ＤＮＡ分子、スーパコイルＤＮＡプラスミドおよび染色体中に表われる二本鎖ＤＮＡを含む。
【００７４】
ある側面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。
【００７５】
本発明で用いられる用語「ベクター」は、ビヒクルを意味し、それによりポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子が操作されまたは細胞に導入される。ベクターは、直鎖または環状ポリヌクレオチドであり得、または、ＤＮＡの操作と細胞へのその導入を可能にするウイルスゲノム、ビリオンまたはその他のあらゆる生物学的構築物由来のＤＮＡまたはＲＮＡなどの大きなサイズのポリヌクレオチドまたはその他の型の構築物であり得る。表現「組換えベクター」および「組換えシステム」は、用語「ベクター」と相互互換的に用いられ得ることが理解できる。ベクターは増殖に適したクローニングベクターであり得るから、コンジュゲートを精製するために適した異なる異種生物において適切なポリヌクレオチド若しくは遺伝子構築物または発現ベクターを得るために用い得るベクターの型の点では制限が無いことが当業者であれば気づくであろう。従って、本発明の好適なベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびこれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージなどの原核生物における発現ベクター、並びに、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などの「シャトル」ベクター、２ミクロン系プラスミド型のベクター、統合プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドおよび類似したものなどの酵母における発現ベクター、ｐＡＣ系列およびｐＶＬ系列のベクターなどの昆虫細胞における発現ベクター、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系列由来のベクターおよび類似するものなどの植物における発現ベクター、ウイルスベクターに基づく高等真核生物細胞における発現ベクター（アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス並びにレトロウイルスおよびレンチウイルス）、並びに、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１などの非ウイルスベクターが挙げられる。
【００７６】
本発明のベクターは、ベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染に感受性の細胞に形質転換させ、トランスフェクションし、または感染させるために用いられ得る。
【００７７】
従って、本発明のある側面は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含んでなる細胞に関し；このために、細胞は、本発明により提供される構築物またはベクターで形質転換されており、トランスフェクションされており、または感染させられている。形質転換され、トランスフェクションされ、または感染した細胞は、当業者に知られる従来法により得ることができる（Sambrook et al., 2001、上記引用）。特定の態様では、宿主細胞は、適切なベクターでトランスフェクションされ、または感染させられた動物細胞である。
【００７８】
本発明のコンジュゲートの発現に適した宿主細胞としては、特に限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌由来の細胞が挙げられる。細菌細胞としては、バチルス属（Bacillus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびスタフィロコッカス属（Staphylococcus）由来の種などのグラム陽性細菌由来の細胞、並びに、大腸菌属（Escherichia）およびシュードモナス属（Pseudomonas）由来の細胞などのグラム陰性細菌由来の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、好ましくは、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）およびハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などの酵母由来の細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、限定されないが、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられる。植物細胞としては、数ある中で、穀類、薬用植物、観葉植物または球茎などの栽培植物由来の細胞が挙げられる。本発明に適した哺乳動物細胞としては、上皮細胞系統（ブタなど）、骨肉腫細胞系統（ヒトなど）、神経芽腫細胞系統（ヒトなど）、上皮癌（ヒトなど）、グリア細胞（マウスなど）、肝細胞系統（サル由来など）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＮＴＥＲＡ−２ＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ系統由来のＤ３細胞、ヒト胚性幹細胞、例えば、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＤＦ−７細胞並びにｈＭＳＣ細胞が挙げられる。
【００７９】
Ｅ．  抗腫瘍剤を含んでなる本発明のコンジュゲートおよび癌の処置のためのその使用
本発明のコンジュゲートとＣＸＣＲ４＋細胞との効率的特異的相互作用により、あらゆる疾患の処置のためのコンジュゲートの使用が可能となるが、ここでＣＸＣＲ４発現細胞に目的の化合物を送達することが望まれる。従って、ある側面では、本発明は、治療剤が抗腫瘍剤である本発明のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクターに関する。
【００８０】
本明細書で用いられる用語「抗腫瘍剤」は、腫瘍の成長、増殖および／または発達を阻害するための用いることができる抗増殖性、抗発癌性および／または制癌性の特性を有するあらゆる化学剤若しくは生物学剤または化合物を意味する。
【００８１】
本発明における使用に適した抗腫瘍剤としては、限定されないが、
（i）細胞毒性ポリペプチド、
（ii）抗血管新生ポリペプチド、
（iii）癌抑制遺伝子によりコードされるポリペプチド、
（iv）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（v）癌抑制遺伝子、
（vi）サイレンシング剤、
（vii）自殺遺伝子、
（viii）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチド、
（ix）化学療法剤および
（x）抗血管新生分子
が挙げられる。
【００８２】
Ｅ．１．  細胞毒性ポリペプチド
本明細書で用いられる用語細胞毒性ポリペプチドは、細胞機能を阻害することができる作用剤を意味する。作用剤は、増殖を阻害し得、または細胞に毒性であり得る。細胞により細胞内移行されたときに、細胞の代謝を阻害し、若しくは有害に変化させ、または、細胞の成長若しくは増殖を如何なる様式でも阻害する如何なるポリペプチドも、本発明の範囲に含まれ、特に限定されないが、細胞に移送されたときにその毒性効果をもたらす作用剤、および細胞表面でその毒性効果をもたらす作用剤が挙げられる。有用な細胞毒性ポリペプチドとしては、タンパク質様毒素および細菌毒素が挙げられる。
【００８３】
本発明のコンジュゲートへの取込みに有用なタンパク質性細胞毒素の例としては、特に限定されないが、Ｉ型およびＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）が挙げられる。有用なＩ型植物ＲＩＰとしては、特に限定されないが、ジアンシン（Dianthin）３０，ジアンシン３２、リチニン、サポニン１〜９、ヨウシュヤマゴボウ活性化タンパク質（ＰＡＰ）、ＰＡＰＩＩ、ＰＡＰ−Ｒ、ＰＡＰ−Ｓ、ＰＡＰ−Ｃ、マパルミン、ドデカンドリン、ブリオジン−Ｌ、ブリオジン、コリシン１および２、ラフィン（Luffin）−Ａ、ラフィン−Ｂ、ラフィン−Ｓ、１９Ｋ−タンパク質合成阻害タンパク質（ＰＳＩ）、１５Ｋ−ＰＳＩ、９Ｋ−ＰＳＩ、アルファ−キリロウィン（Kirilowin）、ベータ−キリロウィン、ゲロニン、モモルジン、モモルジン−ＩＩ、モモルジン−Ｉｃ、ＭＡＰ−３０、アルファ−モモルカリン、ベータ−モモルカリン、トリコサンチン、ＴＡＰ−２９、トリコリキン；オオムギＲＩＰ；アマＲＩＰ、トリンチン、トウモロコシＲＩＰ、アスパリン１および２（Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992）が挙げられる。有用なＩＩ型ＲＩＰとしては、限定されないが、ボルケンシン、リシン、ニグリン−ｂ、ＣＩＰ−２９、アブリン、モデッシン、エブリチン−［アルファ］、エブリチン−［ベータ］、エブリチン−［ガンマ］、ビルクミン、ポレクチン並びにこれらの生物学的に活性な酵素サブユニット（Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992; Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994;およびSandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996）が挙げられる。
【００８４】
細胞毒素として有用な細菌毒素の例としては、限定されないが、志賀毒素および志賀様毒素（すなわち、同じ活性または構造を有する毒素）、並びに、その触媒サブユニットおよび生物学的に機能的な断片が挙げられる。これらの細胞毒素は、ＩＩ型ＲＩＰでもある（Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis., 171:1042-5, 1995; Kim et al., Microbiol. Immunol. 41:805-8, 1997, および Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998）。有用な細菌毒素の追加の例としては、限定されないが、シュードモナスエキソトキシンおよびジフテリアトキシン（Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54;およびBrinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994）が挙げられる。毒素の酵素サブユニットの切断形態および変異体もまた、細胞毒性部分として用いることができる（Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; Mesri et al., J. Biol. Chem. 268:4852-62, 1993; Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998; および U.S. Pat. No. 5,082,927）。他の標的化剤としては、限定されないが、コリシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ１〜９、クロアシンＤＦ１３などの３４を超える既知のコリシンファミリーのＲＮアーゼ毒素および真菌ＲＮアーゼ、［アルファ］−サルシン（Ogawa et al. Science 283: 2097-100, 1999; Smarda et al., Folia Microbiol (Praha) 43:563-82, 1998; Wool et al., Trends Biochem. Sci., 17: 266-69, 1992）が挙げられる。
【００８５】
Ｅ．２．  抗血管新生ペプチドおよびポリペプチド
腫瘍細胞の増殖は過剰な腫瘍の血管新生に強く依存しており、癌の進展と同時に起こる。従って、抗血管新生剤を用いた新しい血管形成の阻害と既存の欠陥の標的化された破壊は、腫瘍処置に対する効果的かつ比較的非毒性の手法として導入されてきた。
【００８６】
本明細書で用いられる用語「抗血管新生ペプチド」は、血管新生を阻害することができるポリペプチドを表す。好適な抗血管新生ペプチドとしては、限定されないが、アンジオスタチン、エンドスタチン、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、ＷＯ２００７１１５３７６に開示されたｓＦＲＰ−４、アニビズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体、ベバシズマブ（アバスチン）、Ｆａｂ  ＩＭＣ  １１２１およびＦ２００  Ｆａｂが挙げられる。
【００８７】
Ｅ．３．  癌抑制遺伝子によりコードされるポリペプチド
本明細書で用いられる「癌抑制（因子）」は、細胞の制御されていない増殖を抑制する通常の生物学的役割を有する遺伝子または遺伝子産物である。癌抑制因子の機能的な対照物が癌遺伝子である。通常の細胞増殖を促進する遺伝子は、「原癌遺伝子」として知られ得る。そのような遺伝子または遺伝子産物を活性化する変異は、それを「癌遺伝子」にさらに変換し、細胞増殖活性を制御されていない様式で継続させる。癌抑制遺伝子および遺伝子産物の例は、文献で周知であり、ＰＴＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ１６、ＡＰＣ、ＲＢ、ＷＴｌ、ＥＸＴｌ、ｐ５３、ＮＦｌ、ＴＳＣ２、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＳＴ７、ＳＴ１４、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＣＤ９５またはＳＰＡＲＣが挙げられ得る。
【００８８】
Ｅ．４．  アポトーシス促進ペプチド
本明細書で用いられる用語「アポトーシス促進ペプチド」は、細胞または細胞集団において細胞死を誘導し得ることができるタンパク質を意味する。好適なアポトーシス促進ペプチドとしては、限定されないが、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＥＧＬ−Ｉ、およびウイルスホモログなどのＢＣＬ−２ファミリータンパク質のアポトーシス促進因子、カスパーゼ−８などのカスパーゼ、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、ＴＮＦ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬなどのアポトーシス促進リガンド、および／または、ＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２などのこれらの受容体が挙げられる。
【００８９】
Ｅ．５．  抗転移活性を有するポリペプチド
本明細書で用いられる用語「転移抑制因子」は、癌を有する生物の体内で転移（二次腫瘍）を遅延させ、拡散するのを防ぐように働くタンパク質を意味する。好適な転移抑制因子としては、限定されないが、ＢＲＭＳｌ、ＣＲＳＰ３、ＤＲＧｌ、ＫＡＩ１、ＫＩＳＳ−ｌ、ＮＭ２３、ＴＩＭＰファミリータンパク質およびウテログロビンなどのタンパク質が挙げられる。
【００９０】
Ｅ．６．  免疫刺激性ポリペプチド
本明細書で用いられる免疫刺激性ポリペプチド剤は、単独で、または他の作用剤、フラジェリン、ムラミルジペプチド、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／変異体形態）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３−リガンドなど）などのサイトカイン、免疫刺激性抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３またはこれらの分子の単鎖／抗体断片）などと組み合わせて、それが投与される対照において免疫応答（既存の免疫応答を増強することを含む）を刺激するポリペプチドである。
【００９１】
Ｅ．７．  癌抑制遺伝子
好適な癌抑制遺伝子としては、上記で定義したいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子産物が挙げられる。癌抑制遺伝子および遺伝子産物の例は、文献で周知であり、ＰＴＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ１６、ＡＰＣ、ＲＢ、ＷＴｌ、ＥＸＴｌ、ｐ５３、ＮＦｌ、ＴＳＣ２、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＳＴ７、ＳＴ１４、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＣＤ９５またはＳＰＡＲＣが挙げられる。
【００９２】
Ｅ．８．  サイレンシング剤
核酸がサイレンシング剤である場合、サイレンシング剤は、その過剰発現が細胞増殖および腫瘍成長を引き起こす遺伝子の発現を遮断することを狙う。サイレンシング剤を有する本発明のコンジュゲートにより阻害することができる遺伝子としては、限定されないが、ＨＲＡＳ（ｖ−Ｈａ−ｒａｓ  ハービーラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＮＲＡＳ（神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ）、ＫＲＡＳ（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ  骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ、トリ）、ＭＹＣＮ（ｖ−Ｍｙｃ  骨髄球腫症ウイルス関連ホモログ、神経芽腫由来、トリ）、ＭＹＢ（ｖ−ｍｙｂ  骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ、トリ）、Ｊｕｎ−癌遺伝子、ＦＯＳ（ｖ−ｆｏｓ  ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、癌遺伝子性ＡＢＬ１（ｖ−ａｂｌ  アベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（この遺伝子は、ある白血病で一定割合で生じるがＳＨ３ドメインが中断している））、ＳＲＣ（ｖ−ｓｒｃ  肉腫（シュミット−ルッパンＡ−２）ウイルス癌遺伝子ホモログ、トリ）、ＦＥＳ（ネコ肉腫癌遺伝子）、ＲＡＦ１（ｖ−ｒａｆ−１  マウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）ＲＥＬ（ｖ−ｒｅｌ  網内皮細胞症（reticuloendotheliosis）ウイルス癌遺伝子ホモログ、トリ）、ＲＥＬＡ（ｖ−ｒｅｌ  網内皮細胞症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ、nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3、ｐ６５、トリ）、ＲＥＬＢ（ｖ−ｒｅｌ  網内皮細胞症ウイルス癌遺伝子ホモログＢ、nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3、トリ）、ＦＧＲ（ガードナー−ラシード  ネコ肉腫ウイルス（ｖ−ｆｇｒ）癌遺伝子ホモログ）、およびＫＩＴ（ｖ−ｋｉｔ  ハーディー−ザッカーマン４ネコ肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）が挙げられる。
【００９３】
本発明における使用に適した他のサイレンシング剤としては、サイクリンＧ１、サイクリンＤ１、Ｂｃｌ−２（Ｂ細胞慢性白血球性白血病関連タンパク質２）、Ｂｃｌ−ＸＬ（Ｂｃｌ−２関連遺伝子ｘｌ）、ＨＬＡ−Ｇ（ヒト白血球抗原クラスＧ）、ＩＦＧ−１（インスリン様増殖因子−１）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＶＥＧＦＲ（血管内皮細胞増殖因子受容体）、ＩＧＦＲ（インスリン様増殖因子受容体）、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＦＧＦＲ（繊維芽細胞増殖因子受容体）、ＴＧＦ−ベータ（トランスホーミング増殖因子ベータ）、カスパーゼ３、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）、ＨＰＶ−Ｅ６（ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６）、ＨＰＶ−Ｅ７（ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７）、Ｈ−Ｒａｓ遺伝子、Ｐ１００ａ遺伝子、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合）、ＢＲＡＦ遺伝子、ＡＴＦ２（活性化転写因子２）、ＨＥＲ２（ヒトＥＧＦ様受容体２番）およびＮ−ｍｙｃが挙げられる。
【００９４】
治療分子の例としては、限定されないが、細胞周期制御剤；サイクリンＧ１およびサイクリンＤ１遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドなどのサイクリンタンパク質を阻害する作用剤が挙げられる。
【００９５】
ある態様では、サイレンシング剤は、ＣＸＣＲ４に対して標的化することができる。好適なＣＸＣＲ４サイレンシング剤としては、限定は無いが、
−  配列：
【化１６】
2014508515.tif 000017
（配列番号１０）、
【化１７】
2014508515.tif 000018
（配列番号１１）および
【化１８】
2014508515.tif 000019
（配列番号１２）を有するＣＸＣＲ４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに
ＵＳ６４２９３０８に開示されたＣＸＣＲ４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド；
−  配列：
【化１９】
2014508515.tif 000020
（配列番号１３）を有するセンス鎖および
【化２０】
2014508515.tif 000021
（配列番号１４）
を含んでなるＷＯ２００８００８８５２で開示されたＣＸＣＲ４特異的ｓｉＲＮＡ。
−  ＷＯ２００７１４３５８４で開示されたＣＸＣＲ４内の配列を標的としたＣＸＣＲ４特異的干渉ＲＮＡ。
−  ＵＳ２００５０１２４５６９で開示されたＣＸＣＲ４内の配列を標的としたＣＸＣＲ４特異的干渉ＲＮＡ。
−  配列：
【化２１】
2014508515.tif 000022
（配列番号１５）（式中、Ｘは、触媒配列であり、Ｙはステムループ領域の配列である）を有するＣＸＣＲ４特異的リボザイム。このリボザイムの詳細構造および前記配列をコードするＤＮＡカセットはＵＳ６９１６６５３に記載されている；
−  US2009210952に記載された配列：
5’-GATCCAGGATGGTGGTGTTTCAATTCCTTCAAGAGAGGAATTGAAACACCACCATCCTTTTTGG-3 ' (SEQ ID NO: 16)（配列番号１６）を有するＣＸＣＲ４特異的ｓｈＲＮＡ。
−  WO2004087068に記載されたＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ内の配列を標的としたＣＸＣＲ４特異的ｓｉＲＮＡ：
【化２２】
2014508515.tif 000023
（配列番号１７）
および
【化２３】
2014508515.tif 000024
−  US2009235772およびUS2005124569に記載された、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ内の配列を標的としたＣＸＣＲ４特異的干渉ＲＮＡが挙げられる。
【００９６】
ＲＮＡ干渉剤の設計のためのｍＲＮＡの潜在的な標的部位は、標的の接触容易性および二次構造予測などの合理的な設計原理に基づいて同定される。これらの各々は、再現性、ｍＲＮＡ標的の発現のノックダウンの程度および治療効果のために要求されるｓｉＲＮＡの濃度に影響し得る。加えて、ｓｉＲＮＡの二重構造の熱力学的安定性（例えば、アンチセンスｓｉＲＮＡ結合エネルギー、内部安定性プロフィールおよびｓｉＲＮＡの二重構造の末端の特異的安定性）は、ＲＮＡ干渉を生み出すその能力と関連し得る。(Schwarz et al., Cell 115:199-208, 2003; Khvorova et al., Cell 115:209-216, 2003)。Tuschl laboratory (Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001; Elbashir et al., Genes Dev. 15:188-200, 2001)により提供されるルールなどの実験科学的なルールもまた用いられる。ｓｉＲＮＡ設計のためのソフトウェアおよびインターネットの対話型サービスがアンビオン（Ambion）社およびインビトロジェン（Invitrogen）社のウェブサイトで入手できる。Levenkova et al.は、ｓｉＲＮＡオリゴの設計と優先順位決定のためのソフトウェアシステムを記載する（Levenkova et al., Bioinformatics 20:430-432, 2004）。レベンコバ（Levenkova）のシステムは、インターネットで入手可能であり、学術および商業的目的のいずれでも無料でダウンロード可能である。本明細書で開示されるｓｉＲＮＡ分子は、アンビオン社、インビトロジェン社およびレベンコバの推奨に基づいたものである。
【００９７】
典型的には、特定の標的に対して特異的なｓｉＲＮＡオリゴは、主には、独特さ対ヒト配列（すなわち、単一の良好なヒット対ヒトユニジーン（Unigene）および二番目に良好なヒットに対するハイブリダイゼーション温度Ｔｍの大きな相違）およびＧＣ含有率（すなわち、４０〜６０％の範囲のＧＣ％を有する配列）に基づいて行われる。ＲＮＡ標的接触容易性およびン肘構造予測は、例えば、Ｓｆｏｌｄソフトウェア（Ding Y and Lawrence, C. E. (2004) Rational design of siRNAs with Sfold software In: RNA Interference: from Basic Science to Drug Development. K. Appasani (Ed.), Cambridge University Press; Ding and Lawrence, Nucleic Acids Res. 29:1034-1046, 2001; Nucleic Acids Res. 31:7280-7301, 2003）を用いて行うことができる。Ｓｆｏｌｄは、インターネットで入手可能である。ＲＮＡ二次構造決定は、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage et al., ed, 2000, at 11.2.1-11.2.10に記載されている。
【００９８】
本発明の文脈においてサイレンシング剤の作用の型および様式は特に限定的ではない。好適なサイレンシング剤としては、限定されないが、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス剤として用いられることを意図したその他のオリゴヌクレオチドが挙げられる。目的遺伝子に対する好適なサイレンシング剤は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法などの遺伝子発現のレベルを検出する標準的な技術を用いて同定することができる。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド；三重式分子；ダンベル型オリゴヌクレオチド；細胞外タンパク質結合オリゴヌクレオチド（Extracellular Protein Binding Oligonucleotides）；およびヌクレオチド分子（Nucleotide Molecules）などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な配列を有し、ｍＲＮＡに特異的に結合し、それにより、ｍＲＮＡの翻訳を防止するオリゴヌクレオチドである（ダンベル型アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する、Altman et al.に対する米国特許第 5,168,053号、イノウエに対する米国特許第5,190,931号、Burchに対する米国特許第 5,135,917号; Smith and Clusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:3405-3411に対する米国特許第5,087,617号を参照）。三重式分子とは、二重式ＤＮＡを標的とする単鎖ＤＮＡを意味し、これにより転写を防止する（二重式ＤＮＡの標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを作製する方法を記載する、Hogan et al.に対する米国特許第5,176,996号を参照）。
【０１００】
Ｅ．９．  自殺遺伝子
ある態様では、活性剤として用いるポリヌクレオチドは、自殺遺伝子のコード領域を含んでなる。用語「自殺遺伝子」は、その産物がそれ自身により、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす産物をコートする核酸を意味する。自殺遺伝子の代表的な例は、ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘−帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼおよび細菌遺伝子シトシンデアミナーゼであり、５−フルオロシトシンを高細胞毒性の５−フルオロウラシルに変換することができる。
【０１０１】
自殺遺伝子は、細胞毒性である産物にプロドラッグを変換することにより細胞毒性を生み出してもよい。一つの態様では、用語「プロドラッグ」は、細胞に対する毒性産物に変換され得るあらゆる化合物を意味する。そのようなプロドラッグの代表的な例は、ＨＳＶ−チミジンキナーゼによりインビボで毒性化合物に変換されるガンシクロビル（gancyclovir）である。続くガンシクロビル誘導体が細胞に対して毒性である。プロドラッグの他の代表的な例としては、アシクロビル（acyclovir）、ＦＩＡＵ［１−（２−デオキシ−２−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル］、ＶＺＶ−ＴＫに対する６−メトキシプリンアラビノシドおよびシトシンデアミナーゼに対する５−フルオロシトシンが挙げられる。
【０１０２】
Ｅ．１０．  腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチド
腫瘍に対する免疫応答を活性化できる好適なポリヌクレオチドとしては、上記で定義した免疫刺激性ペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１０３】
Ｅ．１１．  化学療法剤
本明細書で用いられる抗癌剤は、短期であったとしても癌に付随する症状を完全にまたは部分的に阻害することなどの、癌の発達または進展を少なくとも部分的に阻害する剤である。様々な抗癌剤がＤＮＡ傷害剤として分類され、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、ランプトテシン、トポテカン、テニポシド、マイトキサントロン）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン）、ＤＮＡ鎖切断誘発剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、抗代謝剤（例えば、シタラビン、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、フロックスウリジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイドまたはエピポフィロトキシンが挙げられる。
【０１０４】
抗癌剤の限定のない例としては、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシンサルフェート；ボルテゾミブ（ベルケード）；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン（プラチナ含有養生法）；カルムスチン；カルビシン塩酸；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン（プラチナ含有養生法）；クラドリビン；クリスナトールメシレート；クロロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン、デキソルマプラチン；デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル（タキソテール）；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニシン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン；エルブロゾール；エルロチニブ（タルセバ）；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトポシド；エトプリン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロックスウリジン；フルダラビン；５−フルオロウラシル；フルオロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ゲニチニブ（イレッサ）；ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イマチニブメシレート（グリベック（ＧＬＥＥＶＡＣ））；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン；ランレオチド；レナリドミド（レブリミド（ＲＥＶＬＬＭＩＤ）、レビミド（ＲＥＶＩＭＩＤ））；レトロゾール；ロイプロリド；リアロゾール；ロメトレキソール；ロムスチン；ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メゲストロール；メレンゲストール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスパー；ミトタン；ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシフラン；パクリタキセル；ペメトレキセド（アリムタ）、ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペントモン；ペプロマイシン；パーホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピリトレキシムイセチオネート；ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；シトグルシド；スパルホセート；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；タムスロシン；タキソール；タキソテール；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド（テモダール（ＴＥＭＯＤＡＲ））；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；タリドミド（サロミド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ））およびその誘導体；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン；トレミフェン；トレストロン；トリシリビン；トリメトレキセート；トリプトレリン；ツブロゾール；ウラシル；マスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビングリシネート；ビンリューロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシンが挙げられる。
【０１０５】
抗癌剤は、限定されないが、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤などの酵素阻害剤であり得る。チロシンキナーゼ阻害剤は、限定されないが、ゲニステイン（４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン）、トリホスチン２５（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）、メチレン］−プロパンジニトリル、ハービマイシンＡ、ダイドゼイン（４’，７−ジヒドロキシイソフラボン）、ＡＧ−１２６、トランス−１−（３’−カルボキシ−４’−ヒドロキシフェニル）−２−（２”，５”−ジヒドロキシ−フェニル）エタン、またはＨＤＢＡ（２−ヒドロキシ５−（２，５−ジヒドロキシベンジルアミノ）−２−ヒドロキシ安息香酸とすることができる。ＣＤＫ阻害剤は、限定されないが、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８またはｐ１９とすることができる。ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、限定されないが、ＫＹ１２４２０（Ｃ２３Ｈ２４Ｏ８）、ＣＮＩ−１４９３、ＰＤ９８０５９、または４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾールとすることができる。ＥＧＦＲ阻害剤は、限定されないが、エルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ＷＨＩ−ｐ９７（キナゾリン誘導体）、ＬＦＭ−Ａ１２（レフルノミド代謝物類似体）、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＺＤ−６４７４（ザクティマ（ＺＡＣＴＩＭＡ））、ＡＥＥ７８８およびＡＧ１４５８とすることができる。
【０１０６】
抗癌剤は、ＶＥＧＦ阻害剤とすることができ、限定されないが、ベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルーセンティス）、ペガプタニブ（マクジェン）、ソラフェニブ、スニチニブ（スーテント）、バタラニブ、ＺＤ−６４７４（ザクティマ）、アネコルタブ（ＲＥＴＡＡＮＥ）、スクアラミンラクテートおよびセマホリンが挙げられる。抗癌剤は、抗体または抗体断片とすることができ、特に限定されないが、抗体または抗体断片が挙げられ、特に限定されないが、ベバシズマブ（アバスチン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に適応する）、ゲムツズマブ（マイロターグ、ｈＰ６７．６、抗ＣＤ３３、急性骨髄性白血病などの白血病に適応する）、リツキシマブ（リツキサン）、トシツモマブ（ベキサール、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性疾患に適応する）、ＭＤＸ−２１０（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質産物および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＩ型Ｆｃ受容体（ＦｃガンマＲＩ）に同時に結合する二重特異性抗体）、オレゴボマブ（オバレックス（ＯＶＡＲＥＸ）、卵巣癌に適応する）、エドレコロマブ（パノレックス（ＰＡＮＯＲＥＸ））、ダクリズマブ（ゼネパックス（ＺＥＮＡＰＡＸ））、パリビズマブ（シナジス、ＲＳＶ感染などの呼吸器症状に適応する）、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン、非ホジキンリンパ腫に適応する）、セツキシマブ（アービタックス）、ＭＤＸ−４４７、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２２０（抗ＴＡＧ−７２）、Ｉ０Ｒ−Ｃ５、１０Ｒ−Ｔ６（抗ＣＤ１）、ＩＯＲ  ＥＧＦ／Ｒ３、セロゴバブ（オンコシント（ＯＮＣＯＳＣＩＮＴ）  ＯＶ  １０３）、エパラツズマブ（リンホシド（ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ））、ペンツモマブ（セラジン（ＴＨＥＲＡＧＹＮ））、およびグリオマブ−Ｈ（脳癌、メラノーマに適応する）が挙げられる。
【０１０７】
他の好適な活性剤は、ＤＮＡ開裂剤である。方法の実践に用いられるコンジュゲートにおいて細胞毒素として含めるに適したＤＮＡ開裂剤の例としては、限定されないが、アントラキノン−オリゴピロール−カルボキサミド、ベンズイミダゾール、レイナマイシン；ダイネマイシンＡ；エネジイン；および生物学的に活性な類似体またはこれらの誘導体（すなわち、実質的に等価な生物学的活性を有するもの）が挙げられる。既知の類似体および誘導体が、例えば、Islam et al., J. Med. Chem. 34 2954-61, 1991; Skibo et al., J. Med. Chem. 37:78-92, 1994; Behroozi et al., Biochemistry 35:1568-74, 1996; Helissey et al., Anticancer Drug Res. 11:527-51, 1996; Unno et al., Chem. Pharm. Bull. 45:125-33, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5:903-19, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5: 883-901, 1997;および Xu et al., Biochemistry 37:1890-7, 1998で開示されている。他の例としては、限定されないが、エネジインキノンイミン（米国特許第5,622,958号）；２，２ｒ−ビス（２−アミノエチル）−４−４’−ビチアゾール（Lee et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 40:151-7, 1996）；エピリチシン−サレン銅コンジュゲート（Routier et al., Bioconjug. Chem., 8: 789-92, 1997）が挙げられる。
【０１０８】
Ｅ．１２．  抗血管新生分子
本発明のある態様では、血管新生阻害剤として働くタンパク質が腫瘍に標的化されることが考えられる。これらの作用剤としては、上記抗血管新生ポリペプチドに加えて、マリマスタット；ＡＧ３３４０；ＣＯＬ−３；ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、２−メトキシエストラジオール（2-methoxyoestradiol）、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭｌＯｌ、ペントサン、ポリサルフェート、アンジポイエチン２（レゲネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンが挙げられる。
【０１０９】
従って、ある側面では、本発明は、医薬に用いるための本発明のコンジュゲートに関する。さらに別の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲートと薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容可能な担体」とは、非毒性で不活性な固体、半固体または液体の、充填剤、希釈剤、カプセル化剤、あらゆる型の製薬助剤を意味する。Remington's Pharmaceutical Sciences. Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, Pa., 1995は、医薬組成物の製剤化に用いられる様々な担体および既知のその調製技術を開示する。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、経口および非経口経路などの当技術分野でしられるあらゆる手段により患者に投与され得る。そのような態様によれば、発明の組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内注射）、直腸、膣、局所（粉末剤、クリーム剤、軟膏またはドロップ剤により）または吸入により（スプレーにより）投与され得る。
【０１１２】
ＣＸＣＲ４は一連の腫瘍細胞で過剰発現しているから、本発明のコンジュゲートは、腫瘍細胞への目的化合物の送達に特に有用である。活性化合物が細胞増殖抑制活性または細胞毒性活性を有する場合には、コンジュゲートは、ＣＸＣＲ４を過剰発現する癌の処置に特に有用である。
【０１１３】
従って、別の側面では、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌を処置する方法に用いるための、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の宿主細胞に関する。
【０１１４】
あるいは、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌を処置する方法に用いるための薬剤の製造における、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞の使用に関する。
【０１１５】
あるいは、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌を対象において処置する方法であって、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の宿主細胞を該対象に投与することを含んでなる方法に関する。
【０１１６】
「ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌」としては、限定されないが、卵巣癌、膀胱癌、直腸結腸癌、肺癌、頭頸部癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌、急性リンパ芽球性白血病および子宮頸癌が挙げられる。好ましい態様では、本発明の方法を用いて治療される癌は、直腸結腸癌または膵臓癌である。
【０１１７】
本明細書で用いられる「直腸結腸癌」あらゆる型の結腸癌、直腸癌および虫垂新生物が挙げられ、早期または後期腺腫の両方を意味し、および癌腫を意味し、並びに遺伝性、家族性または散発性の癌を意味する。遺伝性ＣＲＣとしては、過誤腫性ポリポーシス症候群および最も知られる家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）などのポリープ並びに遺伝性非ポリポーシス直腸結腸癌（ＨＮＰＣＣ）などの非ポリポーシス症候群、またはＩ型リンチ症候群の存在を含む、症候群が挙げられる。
【０１１８】
本発明の好ましい態様では、直腸結腸癌（ＣＲＣ）は、結腸癌、直腸癌および／または虫垂癌である。本発明のある態様では、直腸結腸癌は、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよび／またはステージＩＶの直腸結腸癌である。本明細書で言及されるＣＲＣのステージは、デュークス分類（Dukes staging）およびアストラー−コラー分類（Astler-Coller staging）などの他の分類方法が同等に用いられているが、米国対癌共同委員会（ＡＪＣＣ）のＣＲＣステージに対応する。
【０１１９】
本明細書で用いられる句「膵臓癌」は、限定されないが、腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌および膵島細胞癌などの膵臓の悪性新生物を意味する。
【０１２０】
本明細書で用いられる「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。非ヒト動物としては、例えば、家畜および愛玩動物、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、および、海洋哺乳動物、は虫類、鳥類および魚類が挙げられる。好ましくは対象はヒトである。
【０１２１】
癌を処置する場合、例えば、増強した免疫応答が以下の１以上の効果を観察することによりモニターできる：（１）（i）減速すること（ii）血管新生を阻害すること（ii）完全な成長停止などの、ある程度の腫瘍成長の阻害；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの維持；（４）腫瘍サイズの減少；（５）周辺臓器への腫瘍細胞の浸潤の（i）減少、（ii）減速または（iii）完全な阻止などの、阻害；（６）転移の（i）減少、（ii）減速または（iii）完全な阻止などの、阻害；（７）（i）腫瘍サイズの維持、（ii）腫瘍サイズの減少または（iii）完全な阻止、（iv）浸潤の減少、減速または阻止を起こす抗腫瘍免疫応答の増強、および／または（８）重篤度または障害に伴う１以上の症状の数のある程度の軽減。
【０１２２】
作用剤は、有効量投与される。有効量は、医学的に望まれる結果を提供する十分な作用剤の用量である。有効量は、治療する特定の状態、治療する患者の年齢および身体的状態、状態の重篤度、処置の期間、（もしあれば）同時のまたは組み合わせた療法の性質、特定の投与経路および健康実務者の知識と専門の範囲内の因子などにより変化する。一般的に、最大用量、すなわち、確かな医学的判断に従った最も高い安全用量が用いられることが好ましい。例えば、対象が腫瘍を有するならば、有効量は、（例えば、腫瘍の画像化により決定される）腫瘍容量または負荷を減じる量であり得る。有効量は、血中若しくはその他の体液または組織における癌細胞の存在および／または頻度により評価されうる（例えば、生検）。もし、腫瘍が組織または臓器の正常な機能に影響を与えているならば、有効量は、組織または臓器の正常な機能を測定することによっても評価され得る。
【０１２３】
コンジュゲートは、限定されないが、局所、関節内、槽内、眼内、心室内、髄膜内、静脈内、筋肉内、気管内、腹腔内および皮内などの選択された送達経路用に製剤化される。
【０１２４】
Ｆ．  抗ウイルス剤を含んでなる本発明のコンジュゲート、およびＨＩＶ感染により引き起こされる疾患の処置のためのその使用
ＣＸＣＲ４は主にはＣＤ４＋細胞に発現するため、本発明のコンジュゲートは、ＣＤ４＋細胞に目的化合物を送達するために特に有用である。活性化合物が抗レトロウイルス活性を有するか、細胞死を誘発することができるならば、コンジュゲートは、ＨＩＶ感染に伴う疾患の処置に特に有用である。
【０１２５】
従って、ある側面では、本発明は治療剤が抗レトロウイルス剤である、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞に関する。
【０１２６】
本明細書で用いられる用語「抗レトロウイルス剤」は、レトロウイルスが宿主に効率的に感染する能力を阻害する化合物を意味する。抗レトロウイルス剤は、ウイルスの遺伝物質の複製などの様々な工程、または細胞へのレトロウイルスの侵入を阻害することができる。ある態様では，抗レトロウイルス剤は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、およびウイルス融合阻害剤からなる群から選択される。
【０１２７】
好ましい態様では、活性化合物は、ＨＩＶ感染に伴う疾患の処置のために用いることができる抗ＨＩＶ剤である。本発明の治療剤としての使用のための好適な抗ＨＩＶ剤としては、限定されないが、
１）エファビレンツ、エムトリシタビンまたはフマル酸テノホビルジソプロキシル（Atripla(R)/BMS、ギリアド社）；ラミブジンまたはジドブジン（コンビビル(R)/GSK）；アバカビルまたはラミブジン（エプジコム(R)/GSK）；アバカビル、ラミブジンまたはジドブジン（Trizivir(R)/GSK）；エムトリシタビン、フマル酸テノホビルジソプロキシル（Truvada(R)/ギリアド社）。
２）侵入および融合阻害剤：マラビロク（シーエルセントリ(R)、Selzentry(R)/ファイザー社）；ペンタフシドまたはエンフビルチド（フゼオン(R)/ロッシュ社、トリメリス（Trimeris））。ある態様では、ウイルス侵入阻害剤は、ウイルス侵入阻害剤は、融合阻害剤であるＣＤ４受容体結合阻害剤であり、ＣＤ４模倣物またはｇｐ１２０模倣物である。さらなる態様では、ウイルス侵入阻害剤は、ｇｐ４１アンタゴニスト、ＣＤ４モノクローナル抗体、または例えば、ジンクフィンガー阻害剤などのＣＣＲ５アンタゴニストの下位分類などのＣＣＲ５アンタゴニストである。さらなる態様では、ウイルス侵入阻害剤は、ＣＸＣＲ４共受容体アンタゴニストである。
３）インテグラーゼ阻害剤：ラルテグラビルまたはＭＫ−０５１８（Isentress(R)/メルク社）。
４）逆転写酵素阻害剤：本発明の組成物に用いるための好適な逆転写酵素は、エムトリシタビン、カプラビリン、テノホビル、ラミブジン、ザルシタビン、デラビルジン、ネビラピン、ジダノシン、スタブジン、アダカビル、アロブジン、ジドブジン、ラセミ体エムトリシタビン、アプリシタビン、エミビリン、エルブシタビン、ＴＭＣ−２７８、ＤＰＣ−０８３、アムドキソビル、（−）−ベータ−Ｄ−２，６−ジアミノプリンジオキソラン、ＭＩＶ−２１０（ＦＬＧ）、ＤＦＣ（デクセルブシタビン）、ジオキソランチミジン、カラノリドＡ、エトラビリン（ＴＭＣ−１２５）、Ｌ６９７６３９、アテビルジン（Ｕ８７２０１Ｅ）、ＭＩＶ−１５０、ＧＳＫ−６９５６３４、ＧＳＫ−６７８２４８、ＴＭＣ−２７８、ＫＰ１４６１、ＫＰ−１２１２、ロデノシン（ＦｄｄＡ）、５−［（３，５−ジクロロフェニル）チオ］−４−イソプロピル−１−（４−ピリジルメチル）イミダゾール−２−メタノールカルバミン酸、（−）−Ｉ２−Ｄ−２，６−ジアミノプリンジオキソラン、ＡＶＸ−７５４、ＢＣＨ−１３５２０、ＢＭＳ−５６１９０（（４Ｓ）−６−クロロ−４−［（１Ｅ）−シクロプロピルエテニル］−３，−４−ジヒドロ−４−トリフルオロメチル−２（１Ｈ）−キナゾリノン）、ＴＭＣ−１２０およびＬ６９７６３９からなる群から選択される１以上の化合物であり、併用療法に用いる場合には、ＨＩＶの処置に有効な量存在する。
５）プロテアーゼ阻害剤：本発明のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと組み合わせることができる好適なプロテアーゼ阻害剤は、リトナビル、ロピナビル、サキナビル、アンプレナビル、ホサンプレナビル、ネルフマビル、チプラナビル、インジナビル、アタザナビル、ＴＭＣ−１２６、ダルナビル、モゼナビル（ＤＭＰ−４５０）、ＪＥ−２１４７（ＡＧ１７７６）、Ｌ−７５６４２３、ＫＮＩ−２７２、ＤＰＣ−６８１、ＤＰＣ−６８４、テリナビル（ＳＣ−５２１５１）、ＢＭＳ１８６３１８、ドロキシナビル（ＳＣ−５５３８９ａ）、ＤＭＰ−３２３、ＫＮＩ−２２７、１−［（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］−６−（フェニルチオ）−チミン、ＡＧ−１８５９、ＲＯ−０３３−４６４９、Ｒ−９４４、ＤＭＰ−８５０、ＤＭＰ−８５１およびブレカナビル（ＧＷ６４０３８５）からなる群から選択される。本発明の化合物と組み合わせて用いるための好ましいプロテアーゼ阻害剤としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ダルナビル、ブレカナビル、ホサンプレナビルおよびチプラナビルが挙げられる。特に有用なそのような組み合わせとしては、例えば、ＡＺＴ＋３ＴＣ；ＴＤＦ＋３ＴＣ；ＴＤＦ＋ＦＴＣ；ＡＢＣ＋３ＴＣ；およびアバカビル＋３ＴＣが挙げられる。
【０１２８】
加えて、本発明の組成物は、ワクチン、遺伝子治療処置、サイトカイン、ＴＡＴ阻害剤および免疫調節剤から選択される抗レトロウイルス剤を併用療法に用いるときにはＨＩＶの処置のために有効な量さらに含んでいてもよい。
【０１２９】
ある側面では、本発明は、ＨＩＶ感染に伴う疾患の処置に用いるための、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の宿主細胞に関し、治療剤は、
（i）抗レトロウイルス剤、
（ii）細胞毒性ポリペプチド、
（iii）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（iv）サイレンシング剤および
（v）自殺遺伝子
から選択される。
【０１３０】
あるいは、本発明は、上記処置の方法に用いるための薬剤の製造のための、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の宿主細胞に関し、治療剤は、
（i）抗レトロウイルス剤、
（ii）細胞毒性ポリペプチド、
（iii）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（iv）サイレンシング剤および
（v）自殺遺伝子
から選択される。
【０１３１】
あるいは、本発明は、その必要のある対象にＨＩＶ感染に伴う疾患を処置する方法であって、治療剤が、
（i）抗レトロウイルス剤、
（ii）細胞毒性ポリペプチド、
（iii）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（iv）サイレンシング剤および
（v）自殺遺伝子
からなる群から選択される、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを対象に投与することを含んでなる方法に関する。
【０１３２】
用語「レトロウイルス剤」は上記で定義されている。
【０１３３】
用語「細胞毒性ポリペプチド」、「アポトーシス促進性ポリペプチド」、「サイレンシング剤」および「自殺遺伝子」は、本発明の抗腫瘍剤に関して上記で詳細に説明されており、本発明の方法に関しても同等に適用される。
【０１３４】
好適なサイレンシング剤としては、限定されないが、ＨＩＶの複製の抑制のためのｓｉＲＮＡ構築物が挙げられる。これらのｓｉＲＮＡ構築物は、様々なＨＩＶ標的に対して特異的であり得る（Morris (2006) Gene Ther 13:553-558; Rossi (2006) Biotechniques Suppl:25- 29; Nekhai (2006) Curr Opin Mol Ther 8:52-61;およびCullen (2005) AIDS Rev 7:22-25で概説されている）。宿主Ｔ細胞のＨＩＶ感染を防止するために、本発明は、Ｔ細胞共受容体（例えば、ＣＣＲ５およびＣＣＲ４）の発現を低下させるさらなる構成要素を特徴付ける。ＣＣＲ５Ａ３２変異を有するヒトがＨＩＶ感染に耐性であることから、そのような抑制は、宿主Ｔ細胞の感染を妨げると期待される。本発明はまた、集合的ｓｉＲＮＡ構築物（例えば、ＨＩＶ遺伝子およびＨＩＶ感染のために用いられるＴ細胞受容体に対する構築物）を含むことで特徴付ける。ここで、一方のｓｉＲＮＡ構築物は感染を遮断し、第二のｓｉＲＮＡ構築物は感染の進展を防ぐ。
【０１３５】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ感染に伴う疾患」は、ＡＩＤＳを発症している対象における状態、およびＨＩＶに感染した対象が疾患の徴候や症状を示していない状態を含む。従って、感染の臨床的徴候を有さない対象に投与する場合、本発明の組成物は、疾患の発症を防止することができるので、予防的作用を有し得る。組成物は、そのような対象において、健康なＣＤ４＋Ｔ細胞の感染および破壊を予防しまたは遅くすることができる。これはまた、極度の低ＣＤ４＋Ｔ細胞数、並びに、マイコバクテリア菌種（Mycobacteria spp.）、ニュモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）およびニューモシスチス・クリプトコッカス（Pneumocystis cryptococcus）などの日和見性病原体による繰り返しの感染などの後天性免疫不全疾患の症状の開始の予防および遅延に関する。有益または望まれる臨床的結果としては、限定されないが、ナイーブＣＤ４＋細胞の絶対数の増加（１０〜３５２０の範囲）、全循環免疫細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の増加（１〜５０％の範囲）、および／または、未感染対象における正常ＣＤ４＋Ｔ細胞数の割合としてのＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加（１〜１６１％の範囲）などが挙げられる。「処置」は、対象がＨＩＶ標的化処置を受けなかったときに期待される生存と比較して、感染対象の生存を延ばすことを意味する。
【０１３６】
本発明は、ＨＩＶに関連した症状を予防すること、または軽減することにも関する。これらは、ＨＩＶ感染の生命に関わらない症状段階に伴う症状、例えば、帯状疱疹、皮膚発疹および爪感染、口内炎、再発性鼻喉感染および体重減少などが挙げられる。加えて、ＨＩＶ感染の重大な症状段階に伴う症状、例えば、口および膣のカンジダ症（カンジダ）、持続性下痢、体重減少、持続性咳および再活性化結核または単純疱疹などの再発性ヘルペス感染（ヘルペス単純）などが挙げられる。本発明に従って治療できる発達しきったＡＩＤＳの他の症状はとしては、例えば、下痢、吐き気およびおう吐、カンジダおよび口内炎、持続性、再発性膣感染および子宮頸癌、持続性全身性リンパ節腫大（ＰＧＬ）、深刻な皮膚感染、いぼおよび白癬、呼吸器感染、肺炎、特にカリニ肺炎（ＰＣＰ）、帯状ヘルペス（または帯状疱疹）、手足の痛み、無感覚または「しびれ（pins and needles）」などの神経系の問題、神経学的異常、カポジ肉腫、白血病、結核または同様の日和見感染が挙げられる。
【０１３７】
本発明のコンジュゲートの調製
コンジュゲートの調製方法が提供される。これらの方法には、化学的なコンジュゲーションとコンジュゲートの組換え生産に依存する方法が挙げられる。
【０１３８】
本発明に実施に用いられる標的化ペプチドは、化学修飾により治療または診断目的の活性化合物に結合させ得る。典型的には、化学的方法は、望まれるリンク剤を用いる活性剤（治療または診断）の誘導とその後の標的化ペプチドと反応に依存する。誘導の化学的方法は、二官能基性架橋結合剤を用いて行われ得る。
【０１３９】
化学的方法を実施する際には、いずれかの方法で製造された、典型的には細菌または真核生物宿主でＤＮＡを発現させることにより、または化学的合成により製造された標的化ペプチドは、活性剤と化学的に結合される。標的化ペプチドまたは活性剤が化学的連結を引き起こす好適な部分を含まない場合には、それは、誘導することができる。例えば、志賀毒素、ゲロニンまたはそのような他の作用剤などの作用剤は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジイジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのリンク剤を用いた反応などにより誘導することができる。他の態様では、志賀Ａ鎖などの標的化剤は、Ｎ末端でまたはＮ末端付近で修飾してシステイン残基を導入すると、得られる修飾された作用剤は、さらなる誘導なしに、ケモカイン受容体結合部分タンパク質と反応できる。
【０１４０】
このようなコンジュゲートに含ませることができる化学基の非限定的な例は、標的化ペプチドのカルボン酸基であり、活性剤のアミノ基（例えば、リジン側鎖のイプシロン−アミノ基）と反応して、標的化ペプチドと活性剤を結合するアミド基を形成し；標的化ペプチドのアミノ基であり、活性剤のカルボン酸基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸側鎖のカルボン酸基）と反応して標的化ペプチドと活性剤を結合するアミド基を形成し；標的化ペプチドのジスルフィド基であり、活性剤のチオール基（例えば、システイン側鎖のチオール基）と反応して標的化ペプチドと活性剤を結合するジスルフィド基を形成する。
【０１４１】
一旦コンジュゲートされると、コンジュゲートは、一般的には、精製され、コンジュゲートしなかった標的化剤または他の夾雑物からコンジュゲートを分離させる。数多くの精製技術が化学的な有用性を得るための十分な精製度のコンジュゲートを提供することに用いるために入手可能である。ゲル濾過、ゲル浸透または高速液体クロマトグラフィーなどのサイズ分離に基づく精製法が一般的に最も使われるものである。ブルー−セファロース分離などの他のクロマトグラフィー技術もまた用いられ得る。
【０１４２】
ある態様では、コンジュゲートは、標的化ペプチドと治療剤との融合タンパク質であり、この場合、融合タンパク質または融合ペプチドが単離または精製され得る。タンパク質の精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルでは、細胞、組織または臓器のホモジェナイズおよびポリペプチドおよび非ポリペプチド分アックへの粗分画を含む。目的のタンパク質またはポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよく、部分的または完全な精製（または均質性のための精製）が達成される。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル除外クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィーおよび等電点である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【０１４３】
精製されたタンパク質またはペプチドは、他の構成要素から単離可能な組成物を意味することが意図されており、タンパク質またはペプチドはその天然に得られる状態と比較して如何なる程度であっても精製されていてもよい。従って、単離または精製した、タンパク質またはペプチドはまた、天然に生じ得る環境が除去されたタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に「精製される」とは、分画に供され、様々な他の構成要素を除去したタンパク質またはペプチド組成物を意味し、発現する生物活性を実質的に維持している。用語「実質的に精製された」が用いられる場合、この意味は、タンパク質またはペプチドが組成物のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成する、組成物の主要構成成分を形成する組成物を意味する。
【０１４４】
タンパク質精製における使用に適した様々な技術が当業者に周知である。これらには、例えば、アンモニウムサルフェート、ＰＥＧ、抗体などでの沈殿、加熱変性と続く遠心分離、イオン交換、ゲル濾過、逆走、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点；ゲル電気泳動およびこれらおよびその他の技術の組み合わせによるものが含まれる。一般的に知られていることだが、様々な精製工程を行う順序は、変更でき、ある工程は省略でき、それでもなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの精製に適した方法である。
【０１４５】
タンパク質またはペプチドは、常に最高の精製状態で提供される必要は一般的にはない。実際、ある態様では、実質的な精製未満の製品が有用性を有することが考えられる。部分精製は、より少ない精製工程を組み合わせて、または同じ一般的精製スキームの異なる形態のものを用いて達成され得る。例えば、HPLC装置を用いて実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術よりも、大きな「−倍率」の精製を生じる。低い相対的精製度を示す方法は、タンパク質製品の総回収率、または発現したタンパク質の活性を維持することにおいて利点を有する。
【０１４６】
本発明は、単なる例示として構成され、発明の範囲を限定しない下記実施例の方法により記載される。
【実施例】
【０１４７】
材料と方法
タンパク質の製造と精製
標準的な組換えＤＮＡ技術によりＧＦＰ融合遺伝子を作製し、Ｃ末端にＨｉｓタグ、Ｎ末端に関連するＣＸＣＲ４リガンドを含むハイブリッドタンパク質をコードさせた。コードされたタンパク質であるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、Ｖ１−ＧＦＰ−Ｈ６、ｖＣＣＬ２−ＧＦＰ−Ｈ６およびＣＸＣＬ１２−ＧＦＰ−Ｈ６（表２）は、大腸菌株ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＯｍｐＴ−、ｌｏｎ−、ｔｒｘＢ−、ｇｏｒ−（ノバジェン社製））中で可溶形態で作製された。各融合タンパク質をコードする様々なｐＥＴ２２ｂバージョン（ノバジェン社製、６９７４４−３）を持つ細菌は、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地中で増殖させ、タンパク質発現は、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピロナシド（ＩＰＴＧ）により誘導させた。細菌培養物は、遠心分離し、ＥＤＴＡ−フリーのプロテアーゼ阻害剤（コンプリートＥＤＴＡフリー；ロッシュ社製）の存在下で、緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）中に再懸濁させた。その後、フレンチプレス（Ｔｈｅｒｍｏ社製ＦＡ−０７８Ａ）を用いて１１００ｐｓｉで圧力を掛けて細胞を破壊した。
【０１４８】
タンパク質は、ＡＫＴＡ精製ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）中でＨｉＴｒａｐキレートＨＰ  １ｍＬ  Ｎｉ２＋カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた６×Ｈｉｓタグ親和性クロマトグラフィーにより、細胞の粗抽出物から精製した。陽性分画を溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）中に回収し、ＰＢＳ＋１０％グリセロールまたは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌで透析し、ブラッドフォードの手法で定量した。タンパク質の完全性は、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）とＮ末端配列解読により特徴付けた。
【０１４９】
ＤＮＡゲルシフトアッセイおよび透過型電子顕微鏡法
ＤＮＡ−タンパク質のインキュベーションおよびＤＮＡ移動性分析は、従前から公表されているプロトコル（２）により、ＰＢＳ  ｐＨ６＋１０％グリセロール中で行われた。
【０１５０】
透過型電子顕微鏡法では、精製されたタンパク質は、０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。すべてのタンパク質試料は、２％酢酸ウランで炭素被覆グリッド上でネガティブ染色を行った。試料は、グリッドを含むサンプル上で蒸発させた１ｎｍプラチナ層を沈着させることにより、プラチナ化した。すべてのサンプルは、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００透過型電子顕微鏡中で可視化した。
【０１５１】
細胞培養および共焦点レーザー走査顕微鏡
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−２）系統をすべての実験で用い、固定することなくインビボでモニターした。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）で補完したＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製、ロックビル、ＭＤ）中で維持し、湿潤雰囲気下３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。時間経過試験および血清存在下（完全培地）での細胞移行試験を除いては、示された濃度のＧＦＰ融合タンパク質をＯｐｔｉｐｒｏ培地（ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン）の存在下で共焦点解析の２０時間前に細胞培養物に加えた。共焦点分析のため、細胞はＭａｔ−Ｔｅｃｋ培養皿（Ｍａｔ  Ｔｅｃｋ社製、アッシュランド、マサチューセッツ、米国）上で増殖させた。核は、２０μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２（モレキュラープローブ社製、ユージーン、オレゴン、米国）で標識し、細胞膜は、２．５μｇ／ｍＬのＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（モレキュラープローブ、インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）で、暗闇下で５分間標識した。細胞はＰＢＳ（Sigma-Aldrich Chemie GmbH、Steinheim、ドイツ）で洗浄した。生細胞は、ＴＣＳ−ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica Microsystems、Heidelberg、ドイツ）とＰｌａｎ  Ａｐｏ  ６３×／１．４（油ＨＣ×ＰＬ  ＡＰＯラムダブルー）接眼レンズを用いて記録した。ヘキスト３３３４２ＤＮＡ標識は、青色ダイオード（４０５ｎｍ）で励起し、４１５〜４６０ｎｍの範囲で検出した。ＧＦＰ−タンパク質は、Ａｒレーザー（４８８ｎｍ）で励起し、５２５ｎｍ〜５４５ｎｍの範囲で検出した。ＣｅｌｌＭａｓｋは、ＨｅＮｅレーザー（６３３ｎｍ）で励起し、６５０〜７７５ｎｍの範囲で検出した。細胞内部のタンパク質局在を決定するために、細胞の厚みに沿って０．５μｍ毎に１０〜２０切開面のスタックを回収した。得られた連続物の等映像は、Ｌｅｉｃａ  ＬＡＳ  ＡＦソフトウェアで作成し、三次元モデルは、Ｉｍａｒｉｓ  ｖ．６．１．０ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ；チューリッヒ、スイス）を用いて作成した。
【０１５２】
タンパク質で媒介されるプラスミドのトランスフェクション
発現実験のため、２０、４０、６０および８０μｇのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質（１、２、３および４ゲルシフト単位−ＲＵ−）と１μｇのＴｄＴｏｍａｔｏ発現ベクターとを最終容量８５μＬのＰＢＳ＋１０％グリセロール緩衝液中に混合し、室温で１時間後に複合体が形成され、その後、適量のＯｐｔｉｐｒｏを添加した。複合体をＨｅＬａ細胞に穏やかに加え、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間および４８時間インキュベートした。ＴｄＴｏｍａｔｏの遺伝子発現は、フローサイトメトリーによりおよび共焦点顕微鏡によりモニターした。実験対照として、未処理細胞、発現ベクターとインキュベートしただけの細胞またはタンパク質単独を用いた。
【０１５３】
フローサイトメトリー
細胞試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏシステム（ベクトンディキンソン社製）上で４８８ｎｍの励起で１５ｍＷの空冷式アルゴンイオンレーザーを用いて０．５ｍｇ／ｍＬトリプシン、ＨＢＳＳ中４Ｎａで処理した後に分析した。蛍光の発光は、ＥＧＦＰは検出器Ｄ（５３０／３０ｎｍバンドパスフィルター）を用い、ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質は検出器Ｃ（５８５／４２ｎｍバンドパスフィルター）を用いて測定した。我々の細胞内移行結果において様々な公表されたトリプシン処理（Lundberg, 2003, Mol.Ther., 8:143および Egorova et al., 2009, J. Gene Med.,11:772）の効果を試験するため、我々は、サイトメトリー分析前に、１Ｍ  ＮａＣｌ有りまたは無しで０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬのトリプシンを１分間または１５分間用いた。
【０１５４】
競合分析
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６のＣＸＣＲ４への結合特異性を分析するため、競合分析においては、ＨｅＬａ細胞を２４穴のプラーク中で７０％コンフルエントで増殖させた。細胞は、Ｏｐｔｉｐｒｏ中、２５ｎｍおよび２５０ｎＭに達する増加系列の天然ＣＸＣＲ４リガンドであるＳＤＦ１アルファで、または、無関係のタンパク質ＧＦＰ−Ｈ６およびヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（両方とも２５０ｎＭにて）で、３０分間事前インキュベートした。その後、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６を２５ｎＭにて培養物に添加し、さらにインキュベートした。１時間後、細胞を１ｍｇ／ｍＬのトリプシンで１５分間処理して、細胞内の蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。データは、ＷｉｎＭＤＩ、マイクロソフトエクセル２００３およびＳｉｇｍａｐｌｏｔ１０ソフトウェアで分析した。
【０１５５】
実施例１
ペプチドＴ２２は、機能的で可溶性の融合タンパク質の標的ＣＸＣＲ４＋細胞への細胞内移行を促進させることができる。
【０１５６】
この研究では、既にＣＸＣＲ４リガンドとして記載した４つのペプチド、すなわち、Ｔ２２、Ｖ１、ｖＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２（表１を参照）の細胞内移行特性を調査した。これは、これらのペプチドがＧＦＰ−Ｈ６に融合している４つのモデルタンパク質（完全な蛍光タンパク質を与える）を構築することにより行った。これらの構築物に培養したＨｅＬａ細胞を暴露する際に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と接触させたこれらは、他のペプチドに対して緑色蛍光で顕著に標識された（図１および２）。この取込は、濃度依存的であり（図３Ａ）、融合タンパク質の結合後にトリプシンで細胞を処理して表面に付着したタンパク質を除去した後でも観察された（図３Ｂ）。シグナルが実際のタンパク質の取込みによることを評価するために、培養した細胞を共焦点分析に課し、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の高効率の細胞内移行を確認し、他の試験ペプチドの乏しい透過性を確認した（図３Ｃ、３Ｄ、３ＥおよびＦ）。
【０１５７】
従って、ペプチドＴ２２は、機能的で可溶性の融合タンパク質の標的ＣＸＣＲ４＋細胞への細胞内移行を促進させることができる。
【０１５８】
実施例２
ペプチドＴ２２は、プラスミドＤＮＡの標的ＣＸＣＲ４＋細胞への取込みと発現を促進させることができる。
【０１５９】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の様々な生物学的および物理化学的特性は他の手順により測定された（図３）。それらの中で、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の核周囲への局在と、核膜におけるタンパク質の推定されるドッキングが注目すべきことであった（図３Ｄ、挿入図参照）。このことは、機能性タンパク質の送達におけるＴ２２の可能性とは別に、このペプチドが発現可能なＤＮＡを送達することもでき、最終的には核コンパートメントへのそれらの侵入を促進することを示唆した。この可能性を探究するため、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６がインビトロでプラスミドＤＮＡに結合するか否かを初めて決定し、それは、ＤＮＡゲルシフト分析により完全に証明された（図４）。さらに、赤色蛍光タンパク質をコードするレポーターであるＴｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の遺伝子発現を、この遺伝子をＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６複合体に会合させて、分析した。トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の分析により、レポーター遺伝子が発現することが示され（図４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ）、赤色（ＤＮＡ発現）および緑色（Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６）の蛍光は、これらの培養細胞では重ならないことが明確に観察された。
【０１６０】
実施例３
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の細胞内移行はＣＸＣＲ４の天然リガンドにより阻害される。
【０１６１】
ＣＸＣＲ４＋細胞を様々なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６／ＳＤＦアルファ比率（１：０、１：１、１：１０）でタンパク質ＳＤＦアルファの存在下でＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と接触させることにより、天然のＣＸＣＲ４リガンド（ＳＤＦアルファ）のＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の細胞内移行を阻害する能力を試験した。実験対照として、２つの無関係のタンパク質であるＧＦＰ−Ｈ６とＧＬＡを１：１０の比率で用いた。結果は、未処理タンパク質ではなんら効果が観察されなかった一方で、ＳＤＦアルファはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の細胞内移行を用量依存的に抑制することができることを示した（図５）。
【０１６２】
実施例４
インビボでのＴ２２−ＧＦＰの一次腫瘍への選択的な生体分布
【０１６３】
標的化部分（ＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する）と緑色蛍光タンパク質とを含んでなる融合タンパク質は、マウスの盲腸に異種移植されたＣＸＣＲ４＋のＳＷ１４１７ヒト直腸結腸癌細胞から生じた一次腫瘍を含む免疫抑制マウスに投与した。Ｔ２２−ＧＦＰの分布は、２０〜５００μｇで変化する用量範囲での静脈内単一用量投与後のいくつかの時点（５、２４または４８時間）で決定した。ＩＶＩＳ２００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いた蛍光定量により測定されたが、Ｔ２２−ＧＦＰは対照動物の観点で８〜４７倍蓄積した。ビヒクルで処理した対照マウスでは一次腫瘍組織中では蛍光は検出されなかった。
【０１６４】
実施例５
Ｔ２２−ＧＦＰの腹腔転移並びに腸間膜および横隔膜リンパ節への選択的な生体分布
【０１６５】
５００μｇのＴ２２−ＧＦＰの静脈内単一用量がマウスに投与され、免疫抑制マウスの盲腸に異種移植されたＣＸＣＲ４＋のＳＷ１４１７ヒト直腸結腸癌細胞に由来する腹腔転移並びに腸間膜および横隔膜リンパ節を示した。ＩＶＩＳ２００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いた蛍光定量により５時間または２４時間後に測定されたが、Ｔ２２−ＧＦＰは、腹腔転移病巣で２０〜４０倍蓄積した。実験動物または対照動物（ビヒクル対照）の肝臓実質、膵臓実質、腎臓、心臓、非腫瘍腸管、非腫瘍リンパ節、肺若しくは脾臓では蛍光は観察されなかった。腫瘍組織ではＴ２２−ＧＦＰ融合タンパク質の蓄積が観察されたが、正常組織ではＴ２２−ＧＦＰの蓄積は観察されなかった。蛍光は、実験動物および対照動物の両方の胆管（肝臓に付着した）または膵臓で観察されたが、これは、これらの臓器から分泌された蛍光タンパク質に起因し得た。
【０１６６】
【表１】
2014508515.tif 000025
【０１６７】
【表２】
2014508515.tif 000026
【図１】
2014508515.tif 000028
【図２Ａ】
2014508515.tif 000029
【図２Ｂ】
2014508515.tif 000030
【図２Ｃ】
2014508515.tif 000031
【図２Ｄ】
2014508515.tif 000032
【図３−２】
2014508515.tif 000033
【図５】
2014508515.tif 000034
【図７】
2014508515.tif 000035
【図３−１】
2014508515.tif 000036
【図３−３】
2014508515.tif 000037
【図３−４】
2014508515.tif 000038
【図３−５】
2014508515.tif 000039
【図３−６】
2014508515.tif 000040
【図４−１】
2014508515.tif 000041
【図４−２】
2014508515.tif 000042
【図６】
2014508515.tif 000043
【配列表】
2014508515000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月17日(2013.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列：
【化１】
2014508515.tif 000044
（配列番号５）を含んでなる標的化ペプチド、または機能的に等価なその変種と、
（ｉｉ）治療剤と
を含んでなるコンジュゲートであって、
標的化ペプチドは、ＣＸＣＲ４に特異的に結合し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内における治療剤の細胞内移行を促進することができる、
コンジュゲート。
【請求項２】
治療剤が、配列：
【化２】
2014508515.tif 000045
（配列番号５）からなるポリペプチドである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
治療剤がポリペプチドである、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
治療剤と標的化ペプチドとが、融合タンパク質の一部である、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
請求項４で定義されるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５で定義されるポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項８】
治療剤がポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
治療剤がナノ輸送体内に提供され、ナノ輸送体は標的化ペプチドと結合している、請求項１、２および８のいずれか一項で定義されるコンジュゲート。
【請求項１０】
治療剤が抗腫瘍剤である、請求項１〜４、８若しくは９に記載のコンジュゲート、請求項５に記載のポリヌクレオチド、または、請求項６に記載のベクター。
【請求項１１】
抗腫瘍剤が、
（i）細胞毒性ポリペプチド、
（ii）抗血管新生ポリペプチド、
（iii）癌抑制遺伝子によりコードされるポリペプチド、
（iv）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（v）抗転移活性を有するポリペプチド、
（vi）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（vii）癌抑制遺伝子、
（viii）サイレンシング剤、
（ix）自殺遺伝子、
（x）腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるポリヌクレオチド、
（xi）化学療法剤、および
（xii）抗血管新生分子
からなる群から選択される、請求項１０に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１２】
サイレンシング剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１３】
医薬に用いるための請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１４】
ＣＸＣＲ４を発現する細胞を含む癌を処置する方法に用いるための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１５】
癌が、膵臓癌または直腸結腸癌である、請求項１４に記載のコンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１６】
治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項１〜４、８若しくは９に記載のコンジュゲート、請求項５に記載のポリヌクレオチド、または、請求項６に記載のベクター。
【請求項１７】
医薬に用いるための請求項１６に記載の、コンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはベクター。
【請求項１８】
治療剤が、
（i）抗レトロウイルス剤、
（ii）細胞毒性ポリペプチド、
（iii）アポトーシス促進性ポリペプチド、
（iv）サイレンシング剤および、
（v）自殺遺伝子
からなる群から選択される、ＨＩＶ感染に伴う疾患の処置に用いるための、請求項１〜４、８若しくは９に記載のコンジュゲート、請求項５に記載のポリヌクレオチド、または、請求項６に記載のベクター。
【請求項１９】
（iii）配列：
【化３】
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（配列番号５）または機能的に等価なその変種を含んでなる標的化ペプチド、および
（iv）治療剤
を含んでなる剤コンジュゲートのＣＸＣＲ４発現細胞の内部に治療剤を送達するための使用であって、
標的化ペプチドがＣＸＣＲ４に特異的に結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞において治療剤の細胞内移行を促進することができる、
使用。
【国際調査報告】
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