(57)【要約】  代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を含む組成物、ならびに使用方法を記載する。この代謝馴化成長培地および代謝細胞抽出物組成物は、許容可能な担体と配合して、例えば、クリーム、ローション、またはゲルとしての注射用または局所用製剤にしてもよく、また薬用化粧品または医薬品用途で使用してもよい。また、この代謝馴化成長培地および代謝細胞抽出物をさらに処理して、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物中の１つまたは複数の要素もしくは成分を濃縮しても、または減少させてもよい。成長培地は、いかなる真核細胞で馴化してもよい。代謝馴化成長培地および代謝細胞抽出物は、状態、例えば皮膚状態を予防または治療するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  代謝馴化成長培地と、
ｂ．  好適なビヒクルと、
を含み、皮膚状態を治療または予防するために使用される、局所用組成物。
【請求項２】
前記代謝馴化成長培地が酵母細胞によって代謝された馴化成長培地である、請求項１に記載の局所用組成物。
【請求項３】
前記馴化成長培地が、酵母細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地で、前記細胞を培養することによって調製される、請求項１に記載の局所用組成物。
【請求項４】
前記代謝馴化成長培地が、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項５】
前記代謝馴化成長培地が、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項６】
日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項７】
水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項８】
前記局所用組成物が、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項９】
ａ．  代謝細胞抽出物と、
ｂ．  好適なビヒクルと、
を含み、皮膚状態を治療または予防するために使用される、局所用組成物。
【請求項１０】
前記代謝細胞抽出物が酵母細胞によって代謝された細胞抽出物である、請求項９に記載の局所用組成物。
【請求項１１】
前記細胞抽出物が線維芽細胞に由来する、請求項９または１０に記載の局所用組成物。
【請求項１２】
前記代謝馴化成長培地が、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項１３】
前記代謝細胞抽出物が、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で存在する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項１４】
水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項１５】
前記局所用組成物が、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の局所用組成物。
【請求項１７】
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地で前記細胞を培養し、前記培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  前記酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  前記酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
（ｆ）  前記代謝馴化成長培地を好適なビヒクルと混合すること、
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の局所用組成物の調製方法。
【請求項１８】
ステップ（ｅ）の前記回収された代謝馴化成長培地が、前記代謝馴化成長培地を好適なビヒクルと混合する前に、濃縮、濾過、および／または精製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵母が、ピキア・パストリスである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  前記酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  前記酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
（ｆ）  前記代謝細胞抽出物を好適なビヒクルと混合すること、
を含む、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の代謝細胞抽出物の調製方法。
【請求項２１】
ステップ（ｅ）の前記回収された代謝細胞抽出物が、前記代謝細胞抽出物を好適なビヒクルと混合する前に、濃縮、濾過、および／または精製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵母がピキア・パストリスである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象における皮膚状態を予防または治療するための方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載の局所用組成物を含む治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記皮膚状態が、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記皮膚状態が、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記局所用組成物の前記対象への前記投与により、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質が上方調節される、請求項２３〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞外マトリックスタンパク質が約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、または約６０％〜約１００％上方調節される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞外マトリックスタンパク質がコラーゲンタンパク質またはリシルヒドロキシラーゼタンパク質である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子またはＰＬＯＤ１遺伝子によってコードされる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物の前記対象への前記投与により、少なくとも１つの修復タンパク質が上方調節される、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記修復タンパク質が約１０％〜約７０％、約３５％〜約５０％、または約２５％〜約５０％上方調節される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記修復タンパク質がフィブロネクチンタンパク質である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記修復タンパク質がＦＮ１遺伝子によってコードされる、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象への前記組成物の投与により、少なくとも１つの細胞結合性タンパク質が上方調節される、請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞結合性タンパク質が約５％〜約２００％、約１０％〜約８０％、または約３０％〜約５０％上方調節される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞結合性タンパク質がインボルクリンタンパク質である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞結合性タンパク質がＩＶＬ遺伝子によってコードされる、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物の前記対象への前記投与により、少なくとも１つの抗酸化タンパク質が上方調節される、請求項２３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗酸化タンパク質が約５％〜約３００％、約１０％〜約５０％、または約２００％〜約２５０％上方調節される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗酸化タンパク質がスーパーオキシドジスムターゼタンパク質である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗酸化タンパク質がＳＯＤ２遺伝子によってコードされる、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである、請求項２３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１０年１１月１２日に申請された米国仮出願第６１／４１３，１６６号の利益を主張するものであり、前記出願は参照により全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を含む組成物、ならびにこの組成物を対象に投与することにより、状態、例えば皮膚状態を予防または治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
培養培地組成物は、典型的には、必須アミノ酸、塩、ビタミン、ミネラル、微量金属、糖類、脂質、およびヌクレオシドを含む。細胞培養培地は、制御された人工的インビトロ環境で細胞を成長させるために必要とされる栄養必要量を満たすのに必要な成分を供給するよう意図される。栄養素の配合、ｐＨ、および容量オスモル濃度は、使用する細胞型、細胞密度、および培養系などのパラメータにより様々である。多くの細胞培養培地配合物は、文献に記載されており、また複数の培地が市販されている。一旦細胞とともにインキュベートした培養培地は、「使用済み」または「馴化培地」として当業者に知られる。馴化培地は、培地の本来の成分の多くの他に、種々の細胞内代謝物および分泌タンパク質、例えば、成長因子、炎症性メディエーター、および他の細胞外タンパク質を含む。
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態において、本開示は、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、酵母細胞によって代謝された馴化成長培地である。一部の実施形態において、馴化成長培地は、細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養することによって調製される。他の実施形態において、組成物は、局所用または注射用組成物である。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。一実施形態において、組成物は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。一実施形態において、組成物は、細い線状皺および皺の外観を軽減する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚のきめ、色合い、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；皮膚の自己再生能力を強化する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚を滑らかにし、引き締める；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；細いおよび太い線状皺および皺を軽減する；細いおよび太い目周囲の皺の外観を改善する；法令線の外観を改善する；口周囲の皺を改善する；顔面の細いおよび太い線状皺を改善する；皮膚の色合い、輝き、および均一性を改善する；皮膚の張りを改善する；触知できる粗さを軽減する；皮膚のきめ、全体的光損傷、全体的色素沈着過剰を改善する；全般的改善；しみおよび／または斑点の外観の軽減；皮膚の明るさの外観および若々しい外観を改善する；皮膚の全体的状態を改善する；光により老化した皮膚の外観を改善する；内因的および外因的に老化した皮膚の外観を改善する；皮膚細胞のターンオーバーを改善する；皮膚バリアを改善する；皮膚の水分保持能力を改善する；茶色および赤色のあざ、赤みの外観を軽減する；皮膚の表皮厚を増加する；真皮表皮接合部を強化する；毛穴サイズおよび毛穴の外観を軽減する；滑らかさを改善する、あるいはそれらの組み合わせである。
【０００５】
特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の少なくとも２倍の改善をもたらし得る。１つまたは複数の症状または状態の倍数改善には、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上、あるいはそれらの間の任意の数が含まれるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、約１％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約５０％の改善をもたらし得る。他の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、またはそれ以上の１つまたは複数の症状または状態の改善をもたらし得る。
【０００６】
他の実施形態において、本開示は、代謝細胞抽出物と許容可能な担体とを含む組成物も提供する。一部の実施形態において、代謝細胞抽出物は、酵母細胞によって代謝された細胞抽出物である。一部の実施形態において、細胞抽出物は、動物細胞、皮膚細胞、または線維芽細胞に由来する。他の実施形態において、組成物は局所用または注射用組成物である。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。
【０００７】
一実施形態において、本開示は、（ａ）細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から馴化成長培地を取り出すこと、（ｂ）酵母細胞を培養すること、（ｃ）その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、（ｄ）その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、（ｅ）前記代謝馴化成長培地を回収すること、を含む方法によって調製された代謝馴化成長培地を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本開示は、（ａ）細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から馴化成長培地を取り出すこと、（ｂ）酵母細胞を培養すること、（ｃ）その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、（ｄ）その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、（ｅ）前記代謝馴化成長培地を回収すること、を含む代謝馴化成長培地を調製するための方法を提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本開示は、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物を提供する。別の実施形態において、本開示は、局所用組成物が皮膚状態を治療または予防するために使用される、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。一部の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。
【００１０】
別の実施形態において、本開示は、局所用組成物が皮膚状態を治療または予防するために使用される、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物であって、この代謝馴化成長培地が組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在し、またこの代謝馴化成長培地が、酵母細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養することによって調製される、組成物を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、対象における皮膚状態を予防または治療するための方法を提供する。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。
【００１２】
一実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、脱毛を治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、発毛を刺激するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、対象における先天性欠陥を予防または治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、対象における美容上の欠陥を予防または治療するための方法を提供する。一実施形態において、美容上の欠陥の治療は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、対象における後天性欠陥を予防または治療するための方法を提供する。前記方法は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせること；細い線状皺および皺の外観を改善すること；細胞再生を促進すること；皮膚の色合い、きめ、および／または張りを改善すること；皮膚をふっくらさせること；皮膚を明るくすること；皮膚の色を薄くすること；皮膚の自己再生能力を強化すること；年齢によるしみの外観を改善すること；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善すること；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填すること；目の下のくまの外観を減少させること；唇のきめまたは状態を改善すること；自然の唇の色を鮮やかにすること；唇のボリュームを増加させること；術後の皮膚の上皮化を促進すること；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻すこと；年齢によるしみの外観を改善すること；皮膚色素沈着の外観を改善すること；細い線状皺および皺の外観を軽減すること；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させること；皮膚のきめ、色合い、および弾力性を改善すること；粗さおよび光損傷を軽減すること；皮膚の自己再生能力を強化すること；環境的損傷を予防または軽減すること；皮膚を滑らかにし、引き締めること；年齢によるしみを明るくし、色を薄くすること；細いおよび太い線状皺および皺を軽減すること；細いおよび太い目周囲の皺の外観を改善すること；法令線の外観を改善すること；周囲の皺を改善すること；顔面の細いおよび太い線状皺を改善すること；皮膚の色合い、輝き、および均一性を改善すること；皮膚の張りを改善すること；触知できる粗さを軽減すること；皮膚のきめ、全体的光損傷、全体的色素沈着過剰を改善すること；全般的改善；しみおよび／または斑点の外観の軽減；皮膚の明るさの外観および若々しい外観を改善すること；皮膚の全体的状態を改善すること；光により老化した皮膚の外観を改善すること；内因的および外因的に老化した皮膚の外観を改善すること；皮膚細胞のターンオーバーを改善すること；皮膚バリアを改善すること；皮膚の水分保持能力を改善すること；茶色および赤色のあざ、赤みの外観を軽減すること；皮膚の表皮厚を増加すること；真皮表皮接合部を強化すること；毛穴サイズおよび毛穴の外観を軽減すること；滑らかさを改善すること、あるいはそれらの組み合わせが可能である。
【００１３】
別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、細い線状皺および皺の外観を軽減するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させるための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、皮膚のきめ、色合い、および弾力性を改善するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、粗さおよび光損傷を軽減するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、皮膚の自己再生能力を強化するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、環境的損傷を予防または軽減するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、皮膚を滑らかにし、引き締めるための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝馴化成長培地を投与することを含む、年齢によるしみを明るくし、色を薄くするための方法を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本開示は、（ａ）細胞抽出物を提供すること、（ｂ）酵母細胞を培養すること、（ｃ）その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、（ｄ）その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、（ｅ）前記代謝馴化細胞抽出物を回収すること、を含む方法によって調製される代謝細胞抽出物を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本開示は、（ａ）細胞抽出物を提供すること、（ｂ）酵母細胞を培養すること、（ｃ）その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、（ｄ）その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、（ｅ）前記代謝細胞抽出物を回収することを含む、代謝細胞抽出物を調製するための方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本開示は、代謝細胞抽出物と許容可能な担体とを含む組成物を提供する。別の実施形態において、本開示は、局所用組成物が皮膚状態を治療または予防するために使用される、代謝細胞抽出物と許容可能な担体とを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。
【００１７】
別の実施形態において、本開示は、局所用組成物が皮膚状態を治療または予防するために使用される、代謝細胞抽出物と許容可能な担体とを含む組成物であって、この代謝細胞抽出物が組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在し、またこの代謝細胞抽出物が、酵母細胞によって代謝された細胞抽出物である、組成物を提供する。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。一実施形態において、美容上の欠陥の治療は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。
【００１８】
別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、対象における皮膚状態を予防または治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、脱毛を治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、発毛を刺激するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、対象における先天性欠陥を予防または治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、対象における美容上の欠陥を予防または治療するための方法を提供する。一実施形態において、美容上の欠陥の治療は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、対象における後天性欠陥を予防または治療するための方法を提供する。前記方法は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせること；細い線状皺および皺の外観を改善すること；細胞再生を促進すること；皮膚の色合い、きめ、および／または張りを改善すること；皮膚をふっくらさせること；皮膚を明るくすること；皮膚の色を薄くすること；皮膚の自己再生能力を強化すること；年齢によるしみの外観を改善すること；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善すること；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填すること；目の下のくまの外観を減少させること；唇のきめまたは状態を改善すること；自然の唇の色を鮮やかにすること；唇のボリュームを増加させること；術後の皮膚の上皮化を促進すること；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻すこと；年齢によるしみの外観を改善すること；皮膚色素沈着の外観を改善すること；細い線状皺および皺の外観を軽減すること；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させること；皮膚のきめ、色合い、および弾力性を改善すること；粗さおよび光損傷を軽減すること；皮膚の自己再生能力を強化すること；環境的損傷を予防または軽減すること；皮膚を滑らかにし、引き締めること；年齢によるしみを明るくし、色を薄くすること；細いおよび太い線状皺および皺を軽減すること；細いおよび太い目周囲の皺の外観を改善すること；法令線の外観を改善すること；周囲の皺を改善すること；顔面の細いおよび太い線状皺を改善すること；皮膚の色合い、輝き、および均一性を改善すること；皮膚の張りを改善すること；触知できる粗さを軽減すること；皮膚のきめ、全体的光損傷、全体的色素沈着過剰を改善すること；全般的改善；しみおよび／または斑点の外観の軽減；皮膚の明るさの外観および若々しい外観を改善すること；皮膚の全体的状態を改善すること；光により老化した皮膚の外観を改善すること；内因的および外因的に老化した皮膚の外観を改善すること；皮膚細胞のターンオーバーを改善すること；皮膚バリアを改善すること；皮膚の水分保持能力を改善すること；茶色および赤色のあざ、赤みの外観を軽減すること；皮膚の表皮厚を増加すること；真皮表皮接合部を強化すること；毛穴サイズおよび毛穴の外観を軽減すること；滑らかさを改善すること、あるいはそれらの組み合わせが可能である。
【００１９】
別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、細い線状皺および皺の外観を軽減するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させるための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、皮膚のきめ、色合い、および弾力性を改善するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、粗さおよび光損傷を軽減するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、皮膚の自己再生能力を強化するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、環境的損傷を予防または軽減するための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、皮膚を滑らかにし、引き締めるための方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、対象に治療有効量の代謝細胞抽出物を投与することを含む、年齢によるしみを明るくし、色を薄くするための方法を提供する。
【００２０】
一実施形態において、代謝馴化成長培地が酵母細胞によって代謝された馴化成長培地である、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物も提供される。一実施形態において、馴化成長培地は、細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養することによって調製される。別の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。また別の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。また別の実施形態において、代謝馴化成長培地は、カプセル材に封入される。一実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、組成物は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせを治療または予防するために使用される。また他の実施形態において、組成物は、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥を治療または予防するために使用される。一部の実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。他の実施形態において、美容上の欠陥の治療は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、または感染後に生じる医学的状態である。他の実施形態において、後天性欠陥は医療処置後の欠陥である。さらに他の実施形態において、後天性欠陥は、陥凹性瘢痕、皮下萎縮、角化性病変、眼球摘出した目における眼球陥入、顔面のざ瘡後陥凹、皮下萎縮を伴う線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルグ病、または一側性声帯麻痺である。
【００２１】
また、代謝細胞抽出物が、酵母細胞によって代謝された細胞抽出物である、代謝細胞抽出物と許容可能な担体とを含む組成物も提供される。一部の実施形態において、細胞抽出物は動物細胞に由来する。他の実施形態において、細胞抽出物は皮膚細胞に由来する。別の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。一部の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。一部の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、カプセル材に封入される。一実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、組成物は、皮膚状態を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。
【００２２】
さらに他の実施形態において、組成物は、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥を治療または予防するために使用される。一部の実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。一部の実施形態において、美容上の欠陥の治療は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、または感染後に生じる医学的状態である。他の実施形態において、後天性欠陥は医療処置後の欠陥である。さらに他の実施形態において、後天性欠陥は、陥凹性瘢痕、皮下萎縮、角化性病変、眼球摘出した目における眼球陥入、顔面のざ瘡後陥凹、皮下萎縮を伴う線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルグ病、または一側性声帯麻痺である。さらに他の実施形態において、組成物は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせを治療または予防するために使用される。
【００２３】
また、本明細書において、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝馴化成長培地も提供される。一部の実施形態において、上記の方法で使用する酵母はピキア属である。他の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は皮膚細胞である。さらに他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞である。また他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は動物細胞である。また他の実施形態において、代謝馴化成長培地を調製するための方法は、（ｅ）代謝馴化成長培地を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、培養ステップ（ａ）または（ｂ）に連続フローシステムまたはバイオリアクターシステムを含む。さらに他の実施形態において、細胞は成長培地に懸濁または浮遊させる。
【００２４】
本明細書において、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む、上記の代謝馴化成長培地を調製するための方法が提供される。一実施形態において、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物が提供される。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％の量で存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約１０重量％〜約２０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または９５重量％の量で存在する。非限定的な一例において、代謝馴化成長培地は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。一実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、カプセル材に封入される。一部の実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。
【００２５】
また、本明細書において、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
を含む方法によって調製される代謝細胞抽出物が提供される。一部の実施形態において、酵母はピキア属である。他の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。さらに他の実施形態において、細胞抽出物は皮膚細胞に由来する。また他の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。また他の実施形態において、細胞抽出物は動物細胞に由来する。さらに他の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝細胞抽出物を処理すること、をさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一実施形態において、培養は、連続フローシステムまたはバイオリアクターシステムを含む。
【００２６】
また他の実施形態において、上記の代謝細胞抽出物の製造方法は、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
を含む。
【００２７】
また、本明細書において、許容可能な担体ならびに、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝馴化成長培地と、を含む組成物が提供される。一部の実施形態において、酵母はピキア属である。他の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。一部の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は皮膚細胞である。他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞である。また別の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は動物細胞である。一部の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝馴化成長培地を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、ステップ（ａ）または（ｂ）の培養は、連続フローシステムまたはバイオリアクターシステムを含む。さらに他の実施形態において、細胞は成長培地に懸濁または浮遊させる。また他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％の量で存在する。また他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在する。さらに他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または９５重量％の量で存在する。非限定的な一例において、代謝馴化成長培地は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。また他の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。また他の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。さらに他の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、カプセル材に封入される。一実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。
【００２８】
また、本明細書において、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
を含む方法によって調製される代謝細胞抽出物と、を含む組成物が提供される。一部の実施形態において、酵母はピキア属である。他の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。他の実施形態において、細胞抽出物は皮膚細胞に由来する。さらに他の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。また他の実施形態において、細胞抽出物は動物細胞に由来する。一実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝細胞抽出物を処理すること、をさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態において、培養は、連続フローシステムまたはバイオリアクターシステムを含む。また他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％の量で存在する。また別の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で存在する。また他の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％〜約２０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または９５重量％の量で存在する。非限定的な一例において、代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。一実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。また他の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。また別の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。一実施形態において、代謝馴化成長培地は、カプセル材に封入される。別の実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。
【００２９】
また、本明細書において、対象における皮膚状態を予防または治療するための方法であって、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む方法によって調製される代謝馴化成長培地と、を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。一実施形態において、皮膚状態は美容上の欠陥である。別の実施形態において、この状態は脱毛である。別の実施形態において、この状態は先天性欠陥または後天性欠陥である。一実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、または感染後に生じる医学的状態である。別の実施形態において、後天性欠陥は医療処置後の欠陥である。また別の実施形態において、後天性欠陥は、陥凹性瘢痕、皮下萎縮、角化性病変、眼球摘出した目における眼球陥入、顔面のざ瘡後陥凹、皮下萎縮を伴う線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルグ病、または一側性声帯麻痺である。一実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。特定の実施形態において、この状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の少なくとも２倍の改善をもたらし得る。１つまたは複数の症状または状態の倍数改善には、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上、あるいはそれらの間の任意の数が含まれるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、約１％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約５０％の改善をもたらし得る。他の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、またはそれ以上の１つまたは複数の症状または状態の改善をもたらし得る。一部の実施形態において、酵母はピキア属である。一部の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。一実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は皮膚細胞である。別の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞である。一部の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は動物細胞である。他の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝馴化成長培地を処理すること、をさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一実施形態において、ステップ（ａ）または（ｂ）の培養は、連続フローシステムまたはバイオリアクターシステムを含む。別の実施形態において、細胞は成長培地に懸濁または浮遊させる。また他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％の量で組成物中に存在する。別の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で組成物中に存在する。一実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約１０重量％〜約２０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または９５重量％の量で存在する。非限定的な一例において、代謝馴化成長培地は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。一部の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。一実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。別の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。一実施形態において、代謝馴化成長培地は、カプセル材に封入される。一部の実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％〜約１００％上方調節される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約１０％〜約５０％上方調節される。別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約６０％〜約１００％上方調節される。また別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％上方調節される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲンタンパク質またはリシルヒドロキシラーゼタンパク質である。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子またはＰＬＯＤ１遺伝子によってコードされる。他の実施形態において、少なくとも１つの修復タンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。一実施形態において、修復タンパク質は、約１０％〜約７０％上方調節される。別の実施形態において、修復タンパク質は、約２５％〜約５０％上方調節される。一部の実施形態において、修復タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％上方調節される。一実施形態において、修復タンパク質はフィブロネクチンタンパク質である。また別の実施形態において、修復タンパク質は、ＦＮ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態において、少なくとも１つの細胞結合性タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％〜約２００％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約１０％〜約８０％上方調節される。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約３０％〜約５０％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％上方調節される。他の実施形態において、細胞結合性タンパク質はインボルクリンタンパク質である。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質はＩＶＬ遺伝子によってコードされる。一実施形態において、少なくとも１つの抗酸化タンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。また別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％〜約３００％上方調節される。一部の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約１０％〜約５０％上方調節される。他の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約２００％〜約２５０％上方調節される。一部の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、または約３００％上方調節される。一実施形態において、抗酸化タンパク質はスーパーオキシドジスムターゼタンパク質である。別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、ＳＯＤ２遺伝子によってコードされる。
【００３０】
また、本明細書において、対象における皮膚状態を予防または治療するための方法であって、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
を含む方法によって調製される代謝細胞抽出物と、を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。
【００３１】
一実施形態において、この状態は美容上の欠陥である。別の実施形態において、この状態は脱毛である。別の実施形態において、この状態は先天性欠陥または後天性欠陥である。一実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、または感染後に生じる医学的状態である。別の実施形態において、後天性欠陥は医療処置後の欠陥である。また別の実施形態において、後天性欠陥は、陥凹性瘢痕、皮下萎縮、角化性病変、眼球摘出した目における眼球陥入、顔面のざ瘡後陥凹、皮下萎縮を伴う線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルグ病、または一側性声帯麻痺である。一実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。特定の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。さらなる実施形態において、この皮膚状態は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせである。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の少なくとも２倍の改善をもたらし得る。１つまたは複数の症状または状態の倍数改善には、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上、あるいはそれらの間の任意の数が含まれるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、約１％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約５０％の改善をもたらし得る。他の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、またはそれ以上の１つまたは複数の症状または状態の改善をもたらし得る。一部の実施形態において、酵母はピキア属である。一部の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。一実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は皮膚細胞に由来する。別の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞に由来する。一部の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は動物細胞に由来する。他の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝細胞抽出物を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一実施形態において、ステップ（ａ）または（ｂ）の培養は、連続フローシステムまたはバイオリアクターシステムを含む。別の実施形態において、細胞は成長培地に懸濁または浮遊させる。また他の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％の量で組成物中に存在する。別の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で組成物中に存在する。一実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。一部の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％〜約２０重量％の量で組成物中に存在する。一部の実施形態において、代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または９５重量％の量で存在する。非限定的な一例において、代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。一部の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。一実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。別の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。一実施形態において、代謝細胞抽出物は、カプセル材に封入される。一部の実施形態において、カプセル材は、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、およびローションのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％〜約１００％上方調節される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約１０％〜約５０％上方調節される。別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約６０％〜約１００％上方調節される。また別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％上方調節される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲンタンパク質またはリシルヒドロキシラーゼタンパク質である。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子またはＰＬＯＤ１遺伝子によってコードされる。他の実施形態において、少なくとも１つの修復タンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。一実施形態において、修復タンパク質は、約１０％〜約７０％上方調節される。別の実施形態において、修復タンパク質は、約２５％〜約５０％上方調節される。一部の実施形態において、修復タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％上方調節される。一実施形態において、修復タンパク質はフィブロネクチンタンパク質である。また別の実施形態において、修復タンパク質は、ＦＮ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態において、少なくとも１つの細胞結合性タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％〜約２００％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約１０％〜約８０％上方調節される。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約３０％〜約５０％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％上方調節される。他の実施形態において、細胞結合性タンパク質はインボルクリンタンパク質である。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質はＩＶＬ遺伝子によってコードされる。一実施形態において、少なくとも１つの抗酸化タンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。また別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％〜約３００％上方調節される。一部の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約１０％〜約５０％上方調節される。他の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約２００％〜約２５０％上方調節される。一部の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、または約３００％上方調節される。一実施形態において、抗酸化タンパク質はスーパーオキシドジスムターゼタンパク質である。別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、ＳＯＤ２遺伝子によってコードされる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】三次元組織製品であるＴｒａｎｓｃｙｔｅ（商標）およびＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）による、経時的に沈積するグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの沈着の動態を表すグラフである。グリコサミノグリカンの沈着量は成長期間に依存するが、コラーゲンの沈着は成長期間に依存しない。
【図２】細胞外マトリックス（Ｔｒａｎｓｃｙｔｅ（商標）から除去され、ヒト線維芽細胞および角化細胞の単層培養物に１：２、１：５、１：１０、および１：１００の希釈で添加）の効果を表すグラフである。例示される最も著しい効果は、１：１０希釈のマトリックスである。
【図３】馴化培地（Ｔｒａｎｓｃｙｔｅ（商標）で細胞の成長をすでに支持した細胞培養培地）に接触させたヒト線維芽細胞および角化細胞の相対増殖を表すグラフである。細胞応答の増加がわずか３日で示された。
【図４】細い皺および太い皺の研究者評価を示すグラフである。細い皺および太い皺の平均スコアの著しい減少は、全訪問で認められた（全てＰ＜０．０００１）。各データセットにおいて、細い皺の評価は左に示され、太い皺の評価は右に示される。
【図５】皮膚の色合い、張り、および輝きの研究者評価を示すグラフである。皮膚の張り、皮膚の色合い、および輝きの平均スコアの有意な改善は、全訪問で認められた（全てＰ≦０．０２）。各データセットにおいて、４週目の結果は左に示され、８週目の結果は中央に示され、１２週目の結果は右に示される。
【図６】触知できる粗さの研究者評価を示すグラフである。皮膚の張り、皮膚の色合い、および輝きの平均スコアの有意な改善は、全訪問で認められた（全てＰ＜０．０００１）。ベースラインからの変化率は、４週目が左列に、８週目が中央列に、１２週目が右列にそれぞれ示される。
【図７】実施例１８に記載の１２週間臨床使用（複合剤／配合剤）研究からの被験者の自己評価質問票の１２週目の結果を提示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、任意の真核細胞型または三次元組織構築物を用いて培養された、代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を含む新規の組成物、ならびにその組成物を使用するための方法に関する。細胞は、単層または三次元で培養される。細胞は、好ましくはヒト細胞であり、間質細胞、実質細胞、間葉幹細胞、肝臓補充細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、および／または胚幹細胞を含む。細胞および組織培養によって馴化された培地は、様々な天然の分泌タンパク質、例えば生物活性成長因子を含むことになる。また、馴化細胞培地由来の生成物を含む新規の組成物、およびそのような組成物の使用も開示される。
【００３４】
「前馴化」細胞培養培地は、培養される細胞の栄養必要量に適切に対処するいかなる細胞培養培地であってもよい。細胞培地の例には、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、イスコフ、マッコイ、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｆｏｒ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、およびＣｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ  １９９６（両文献は、参照により本明細書に全体が援用される）に記載されているものを含む、当業者が容易に認識する他の培地配合物が含まれるが、それらに限定されない。培地には、所望の細胞または組織培養を支持するために必要ないかなる成分を補充してもよい。さらに、所望であれば、アルブミン、グロブリン、成長促進物質、および成長阻害物質の複合溶液であるウシ血清などの血清を添加してもよい。血清は病原体を含むべきではなく、マイコプラズマ、細菌、真菌、およびウイルス汚染を慎重にスクリーニングすべきである。また、血清は、一般に米国から入手すべきであり、原産の家畜が伝染性の物質を保有する国から入手すべきではない。培地へのホルモン添加は、望ましいことも望ましくないこともある。培地は、無血清であってもよく、すなわち細胞を血清補充の不在下で成長させてもよい。
【００３５】
「馴化成長培地」は、本明細書において開示されるように馴化されたいかなる成長培地であってもよく、例えば、米国特許第６，３７２，４９４号、第７，１１８，７４６号、第７，１６０，７２６号（これら全ては参照により全体が本明細書に援用される）に開示されるように調製することができる。
【００３６】
他の原料、例えばビタミン、成長因子および接着因子、タンパク質などは、当業者がその特定の必要に応じて選択することができる。一部の実施形態では、所望の馴化培地を達成するために適切ないかなる細胞型を使用してもよい。遺伝子操作した細胞を使用して培地を培養してもよい。かかる細胞を改変して、例えば、培地中の１つまたは複数の発現タンパク質の濃度が特定の所望の用途に対して最適化されるように、所望の１つまたは複数のタンパク質を発現するようにしてもよい。本開示に従って、培地を馴化するために使用される細胞および組織培養を操作して、生理的反応と類似するタンパク質の発現における特性の改善、具体的な用途、例えば創傷治癒に有用な特定のタンパク質の発現の増加、または所定のタンパク質、例えばプロテアーゼ、乳酸などの阻害を含むがそれらに限定されない、多様な機能を付与し得る標的遺伝子産物を発現してもよい。
【００３７】
細胞を操作して、選択される生物学的機能を提供する、選択される生理学的状態のレポーターとして作用する、遺伝子産物の不完全または不良な発現を増加させる、あるいは抗ウイルス、抗菌、抗微生物、または抗癌活性を提供する、生物学的に活性な標的遺伝子産物を発現してもよい。本開示によると、標的遺伝子産物は、ペプチドまたはタンパク質、例えば酵素、ホルモン、サイトカイン、抗原、もしくは抗体、調節タンパク質、例えば転写因子もしくはＤＮＡ結合タンパク質、構造タンパク質、例えば細胞表面タンパク質であってもよく、あるいは標的遺伝子産物は、核酸、例えばリボソームもしくはアンチセンス分子であってもよい。標的遺伝子産物には、細胞成長を増進する遺伝子産物が含まれるが、これに限定されない。例えば、この遺伝子改変は、内因性タンパク質を上方調節しても、新しいタンパク質を導入しても、または異種イオンチャネルを発現するか、もしくは内因性イオンチャネル機能を変更することによってイオン濃度を調節してもよい。例には、全身に送達される遺伝子産物（例えば、成長因子、ホルモン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、神経伝達物質、およびエンケファリンを含むタンパク質などの分泌遺伝子産物）を発現する人工組織が含まれるが、これに限定されない。
【００３８】
一部の実施形態において、当業者に既知の任意の方法によって、細胞を二次元単層で成長させる。参考として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  １９９９）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．１９８６）に記載されているものなどの細胞培養技術を参照されたい。
【００３９】
一部の実施形態において、細胞を三次元間質支持体上で成長させ、この細胞は多層で成長して、細胞マトリックスを形成する。このマトリックス系は、インビボで認められる生理的条件に、すでに記載されている単層組織培養系よりも高度に近似する。三次元培養物、例えばＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）「Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）」およびＴｒａｎｓＣｙｔｅ（商標）（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ，ＰＬＣ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）「Ｔｒａｎｓｃｙｔｅ（商標）」は、生理学的比率および濃度で培地に分泌される、多数の成長因子および他のタンパク質を生成する。Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）は、生分解性ポリグラクチン上で培養される同種異系新生児線維芽細胞から構成される。ＴｒａｎｓＣｙｔｅ（商標）は、米国特許第５，４６０，９３９号に記載されているように、一時的被覆に結合させた三次元間質組織を含む一時的生存皮膚代用品である。さらに、細胞培地を馴化する三次元組織培養物は、骨髄、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、副腎および神経組織、ならびに、胃腸管および泌尿生殖器、ならびに、循環系を含むがそれらに限定されない多種の組織に認められる間葉幹細胞、肝臓補充細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、および／または胚幹細胞、および／または実質細胞、および／または実質幹細胞を含んでもよい。米国特許第４，７２１，０９６号、第４，９６３，４８９号、第５，０３２，５０８号、第５，２６６，４８０号、第５，１６０，４９０号、および第５，５５９，０２２号を参照されたい（それぞれ参照により全体が本明細書に援用される）。
【００４０】
Ｉ．  定義
以下の本明細書で使用する用語は、下記に示す意味を有するものとする。
【００４１】
細胞：動物、植物、菌類、原生生物、またはモネラを含む、あらゆる生物に由来する細胞を含む。一実施形態において、細胞源は動物または植物である。別の実施形態において、この動物は哺乳動物である。別の実施形態において、この哺乳類はヒトである。
【００４２】
細胞抽出物：細胞粒子状物質を含んでも含まなくてもよい、溶解または断片化した細胞含有物を含む。
【００４３】
接着層：三次元支持体に直接付着した、またはそれら自体が支持体に直接付着した細胞との付着により間接的に連結した細胞。
【００４４】
馴化培地：所望の真核細胞型の成長をすでに支持した、細胞外タンパク質と細胞内代謝物とを含む配合物であり、前記細胞は二次元または三次元のいずれかで培養されている。また、「馴化細胞培地」または「馴化細胞および組織培養培地」とも呼ばれる。
【００４５】
間質細胞：疎性結合組織に認められる他の細胞および／または要素を場合によって含む線維芽細胞であり、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞、間葉幹細胞、肝臓補充細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞などを含むが、それらに限定されない。
【００４６】
組織特異的細胞または実質細胞：器官の本質的かつ特有の組織を形成する細胞であり、その支持フレームワークと区別される。
【００４７】
二次元細胞培養物：例えば平面上などの単層で培養された細胞。
【００４８】
三次元フレームワーク：（ａ）細胞が付着でき（または、細胞が付着できるように改変でき）、また（ｂ）細胞が複数の層で成長できるような、任意の材料および／または形状からなる三次元スキャフォールド。この支持体に間質細胞を接種して、生存三次元間質組織を形成する。フレームワークの構造には、メッシュ、スポンジを含み得、またはヒドロゲルで形成されていてもよい。
【００４９】
三次元間質組織または生存間質マトリックス：支持体上で成長させる間質細胞を接種した三次元フレームワーク。間質細胞によって産生された細胞外マトリックスタンパク質は、フレームワーク上に沈着し、それにより生存間質組織を形成する。生存間質組織は、のちに三次元細胞培養物を形成するために接種される組織特異的細胞の成長を支持することができる。
【００５０】
組織特異的三次元細胞培養物または組織特異的三次元構築物：組織特異的細胞を接種して培養された三次元生存間質組織。一般的には、三次元間質マトリックスに接種するために使用される組織特異的細胞は、その組織の「幹」細胞（または「補充」細胞）、すなわち成熟して組織の実質を形成する特殊化した細胞になる新しい細胞を発生させる細胞を含むべきである。
【００５１】
以下の略語は、以下に示す意味を有するものとする。
【００５２】
ＢＣＳ＝仔ウシ血清
【００５３】
ＢＦＵ−Ｅ＝赤芽球バースト形成細胞
【００５４】
ＴＧＦ−β＝形質転換成長因子β
【００５５】
ＣＦＵ−Ｃ＝コロニー形成単位−培養物
【００５６】
ＣＦＵ−ＧＥＭＭ＝コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、単球、巨核球
【００５７】
ＣＳＦ＝コロニー刺激因子
【００５８】
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地
【００５９】
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸
【００６０】
ＦＢＳ＝ウシ胎仔血清
【００６１】
ＦＧＦ＝線維芽細胞成長因子
【００６２】
ＧＡＧ＝グリコサミノグリカン
【００６３】
ＧＭ−ＣＳＦ＝顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子
【００６４】
ＨＢＳＳ＝ハンクス平衡塩類溶液
【００６５】
ＨＳ＝ウマ血清
【００６６】
ＩＧＦ＝インスリン様成長因子
【００６７】
ＬＴＢＭＣ＝長期骨髄培養
【００６８】
ＭＥＭ＝最小必須培地
【００６９】
ＰＢＬ＝末梢血白血球
【００７０】
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
【００７１】
ＰＤＧＦ＝血小板由来成長因子
【００７２】
ＲＰＭＩ  １６４０＝ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地番号１６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）
【００７３】
ＳＥＭ＝走査型電子顕微鏡
【００７４】
ＶＥＧＦ＝血管内皮成長因子
【００７５】
ＩＩ．  代謝馴化成長培地および代謝細胞抽出物
一実施形態において、本開示は、（ａ）細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から馴化成長培地を取り出すこと、（ｂ）酵母細胞を培養すること、（ｃ）その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、（ｄ）その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、（ｅ）前記代謝馴化成長培地を回収すること、を含む方法によって調製される代謝馴化成長培地を提供する。一部の実施形態において、細胞は、植物源および／またはヒトを含む動物源に由来してよい。
【００７６】
別の実施形態において、本開示は、（ａ）細胞抽出物を提供すること、（ｂ）酵母細胞を培養すること、（ｃ）その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、（ｄ）その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、（ｅ）前記代謝細胞抽出物を回収すること、を含む方法によって調製される代謝細胞抽出物を提供する。一部の実施形態において、細胞抽出物は、細胞をインビトロで成長させるために必要とされる栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、得られた細胞抽出物をその成長培地から除去することによって得られる。一部の実施形態において、細胞は、植物源および／またはヒトを含む動物源に由来してよい。
【００７７】
成長因子、サイトカイン、およびストレスタンパク質などの細胞外タンパク質を馴化成長培地または細胞抽出物中で代謝することは、組織修復、例えば創傷および組織欠陥、例えば美容上の欠陥の治療、ならびにヒト用および動物飼料用の栄養補助剤を含む幅広い分野で使用するための生成物の調製における新たな可能性を開く。例えば、成長因子は、創傷治癒過程において重要な役割を果たすことが知られている。これらの成長因子の少なくとも１つの活性が、本開示の代謝過程によって馴化細胞培地または細胞抽出物に付与される。
【００７８】
細胞のサイトカインおよび成長因子は、細胞増殖、接着、形態的外観、分化、遊走、炎症反応、血管形成、および細胞死を含む複数の重要な細胞過程に関与している。研究により、細胞に対する低酸素ストレスおよび損傷は、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、およびＩＧＦ（インスリン様成長因子）などの成長因子に対応するｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの上昇を含む反応を誘導することが証明されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｕｂｉｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０（１）：１６４−７３、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７８（２）：５７−７０、Ｓｔｅｉｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（１０）：５３６３−８、Ｙａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０３（２）：１３９−４２、Ｗｅｓｔ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４０（５）：６４７−５９）。
【００７９】
ＴＧＦ−βとしても知られる形質転換成長因子βなどの成長因子は、創傷治癒中に特定のストレスタンパク質によって誘導される。２つの既知のストレスタンパク質は、ＧＲＰ７８およびＨＳＰ９０である。これらのタンパク質は、細胞構造を安定化させ、細胞を悪条件に対して耐性にする。二量体タンパク質のＴＧＦ−βファミリーは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３を含み、多くの細胞型の成長および分化を調節する。さらに、このタンパク質のファミリーは様々な生物学的効果を示し、一部の細胞型の成長を刺激し、（Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２４：２９９１−２９９５）、他の細胞型の成長を阻害する（Ｇｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：８７７−８８０、Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３７５８−３７６２）。また、ＴＧＦ−βは、コラーゲンおよびフィブロネクチンを含む細胞外マトリックスタンパク質の発現を増加させること（Ｉｇｎｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４３３７−４３４５）、および創傷の治癒を促進すること（Ｍｕｓｔｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１３３３−１３３５）が示されている。
【００８０】
別のかかる成長因子はＰＤＧＦである。ＰＤＧＦは、最初は間葉系由来細胞の強力な分裂促進因子であることが発見された（Ｒｏｓｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７１（４）：１２０７−１２１０、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．８７：２９７−３０１）。さらなる研究により、ＰＤＧＦが組織形成における細胞充実性および肉芽形成の比率を増加させることが示された。ＰＤＧＦで治療された創傷は、創傷部位における好中球およびマクロファージ細胞型の増加を含み、初期段階の炎症反応のように見える。このような創傷は、線維芽細胞機能の向上も示す（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：９７４−９８７）。ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βの両者は、動物研究において、コラーゲン形成、ＤＮＡ含量、およびタンパク質レベルを増加させることが示されている（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２３２３−２３２９、Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ  ＤＣ）２１９：１３２９）。ＰＤＧＦは、ヒト創傷の治療に有効であることが示されている。ヒト創傷において、治癒中の褥瘡内でＰＤＧＦ−ＡＡ発現が増加する。ＰＤＧＦ−ＡＡの増加は、創傷の活性化された線維芽細胞、細胞外マトリックス沈着、および活発な血管新生の増加に対応する。さらに、そのようなＰＤＧＦ−ＡＡの増加は、慢性の非治癒創傷では見られない（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．１３３−１４１（Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏ．ＴＸ  １９９７）。血管形成および創傷治癒を誘導する能力を有する複数の他の成長因子には、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、および塩基性ＦＧＦが含まれる。
【００８１】
Ａ．  成長培地  細胞培養のための成長培地配合物は、文献において周知であり、多くは市販されている。
【００８２】
前馴化培地の原料には、以下に記載するものが含まれるが、それらに限定されない。さらに、原料の濃度は当業者に周知である。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（上記参照）を参照されたい。原料には、アミノ酸（Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸）、例えばグルタミン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン、ならびにそれらの誘導体；酸可溶性の下位群、例えばチアミン、アスコルビン酸、第二鉄化合物、第一鉄化合物、プリン、グルタチオン、および一塩基性リン酸ナトリウムが含まれる。
【００８３】
さらなる原料には、糖類、デオキシリボース、リボース、ヌクレオシド、水溶性ビタミン、リボフラビン、塩、微量金属、脂質、酢酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、ピルビン酸塩、および緩衝剤が含まれる。
【００８４】
培地配合物にしばしば使用される他の原料には、脂溶性ビタミン（Ａ、Ｄ、Ｅ、およびＫを含む）、ステロイドおよびそれらの誘導体、コレステロール、脂肪酸および脂質、Ｔｗｅｅｎ  ８０、２−メルカプトエタノールピリミジン、ならびに種々のサプリメント、例えば血清（胎児、ウマ、仔ウシなど）、タンパク質（インスリン、トランスフェリン、成長因子、ホルモンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢなど）、全卵限外濾過物、および接着因子（フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、テネイシンなど）が含まれる。
【００８５】
培地には、成長因子および他のタンパク質、例えば接着因子を補充する必要がある場合と、その必要がない場合があるが、これは細胞構築物の多く、特に本出願に記載される三次元細胞および組織培養構築物は、それら自体がそのような成長因子および接着因子、ならびに他の生成物を培地中に産生するためである。
【００８６】
Ｂ．  細胞培養物
１．  細胞
いかなる細胞を細胞培養物に使用してもよい。例えば、細胞は、間質細胞、実質細胞、間葉幹細胞（系統が決定されたまたは未決定の前駆細胞）、肝臓補充細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、および／または胚幹細胞であってよい。細胞には、いくつか例を挙げると、骨髄、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、神経組織、副腎、粘膜上皮、および平滑筋を含んでもよいが、それらに限定されない。線維芽細胞および線維芽細胞様細胞、ならびに他の細胞および／または間質を含む要素は、胎児または成人由来であってよく、皮膚、肝臓、膵臓、粘膜、動脈、静脈、臍帯、および胎盤組織などの従来の供給源から得ることができる。かかる組織および／または器官は、適切な生検によって、または剖検時に得ることができる。実際に、死体の器官を用いて、間質細胞および要素を豊富に供給することができる。
【００８７】
胚幹細胞および／または間質を含む他の要素は、当分野で既知の方法を用いて単離してもよい。例えば、近年、ヒト胚幹細胞集団およびこれらの細胞を単離および使用するための方法が、Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：１５１−１５２（１９９９），Ｓｍｉｔｈ  Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ８０２−８０４（１９９８）に、始原生殖細胞から単離されたものが、Ｓｈａｍｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６−１３７３（１９９８）に、未分化胚芽細胞から単離されたものが、Ｔｈｏｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７（１９８８）において報告されている。間葉幹細胞の単離および培養は、当分野で既知である。Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．４：４１５−４２８（１９８８）、Ｗｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｓｕｒｇ．６５：２２−２６（１９９９）を参照されたい。これらの細胞の接種は、下記の第５．３項に記載する。同様に、神経幹細胞は、Ｆｌａｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：１０３３−１０３９（１９９８）、およびＦｒｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５４：９３５−９４５（１９９８）に記載されているように単離することができる。
【００８８】
細胞は、単層、ビーズ、または三次元を含む当分野で既知のあらゆる形式で、またあらゆる手段（すなわち、培養皿、ローラーボトル、連続フローシステムなど）で培養してもよい。細胞および組織培養の方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（上記参照）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（下記参照）に記載されている。
【００８９】
一般的には、使用する細胞株は、ヒトおよび動物病原体について慎重にスクリーニングされる。用途によって、かかるスクリーニングは決定的な重要性を有することがあり、病原体を含まない細胞のみが許容される（例えば、創傷治癒および食品添加物など）。病原体についてスクリーニングする方法は、当分野で周知である。二次元で培養しても、三次元で培養しても、細胞型は馴化培地の特性に影響を与えることになる。一部の実施形態において、細胞は二次元で培養される。他の実施形態において、細胞は三次元で培養される。
【００９０】
ａ．  遺伝子操作した細胞
一部の実施形態において、細胞は、例えば組織欠陥の修復および／または再生を促進する遺伝子産物を培地または抽出物に導入するためのビヒクルとしての役割を果たすことができる。細胞は、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＧ−ＣＳＦなどの炎症性メディエーターを発現するように、遺伝子操作してもよい。細胞は、付加的または代替的に、抗炎症因子、例えば、抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２などを発現するように遺伝子操作することができる。
【００９１】
別の実施形態において、細胞は、例えば、軟骨生成を刺激するＴＧＦ−β、または軟骨形成を促進するＢＭＰ−１３などの他の因子、あるいは間質細胞の遊走および／またはマトリックス沈着を促進する刺激因子の生成において、治療効果を与えるであろう遺伝子を培地または抽出物中に発現するように遺伝子操作することができる。この構築物は真核細胞を含むことから、遺伝子産物は適切に発現および処理されて、活性産物を形成する。好ましくは、使用する発現制御要素は、産物を培養で過剰合成できるように、遺伝子の調節された発現を可能にすべきである。概して選択される転写プロモーター、具体的にはプロモーター要素は、培養する組織および細胞の種類に一部依存する。タンパク質を分泌することができる細胞および組織が好ましい（例えば、粗面小胞体およびゴルジ複合体細胞小器官を豊富に含むもの）。次いで、遺伝子操作された細胞により、過剰産生された遺伝子産物が馴化培地中に分泌される。
【００９２】
細胞を遺伝子操作して１つまたは複数の遺伝子を調節してもよく、あるいは遺伝子発現の調節は、一時的または長期的であってもよく、または遺伝子活性は、非誘導性または誘導性であってよい。
【００９３】
また、細胞は、炎症を促進する因子の発現を「ノックアウト」するように遺伝子操作してもよい。標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させるための負調節方法は、下記に述べる。「負調節」とは、本明細書において使用する際、その調節処置の不在下での標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性と比較した、標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性の減少を指す。その細胞の天然の遺伝子の発現は、多くの技術を用いて減少させる、またはノックアウトすることができ、例えば、発現は、標準的相同的組み換え技術を用いて、遺伝子を完全に不活性化すること（一般に、「ノックアウト」と称される）によって阻害することができる。通常、タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（または、その領域の５’側のエキソン）は、正の選択可能なマーカー（例えばｎｅｏ）により分断され、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの生成を阻止して、その遺伝子の不活性化をもたらす。また、遺伝子の一部に欠失または不活性化挿入を作成することによって、あるいは遺伝子全体を消失させることによって、遺伝子を不活性化させてもよい。標的遺伝子と相同であり、ゲノム中で遠く離れた２つの領域を有する構築物を用いることにより、それら２つの領域に挟まれる配列を欠失させることができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４−３０８７）。あるいは、遺伝子は、上流または下流の発現要素を欠失させることによって不活性化することもできる。
【００９４】
また、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス分子およびリボザイム分子を用いて、標的遺伝子の活性レベルを低下させることもできる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答に関して最も万能であることが示されている。さらに、適切なリボザイム分子は、例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１、Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５７４−５７８、およびＺａｕｇ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：４７０−４７５により記載されているように設計することができる。またさらに、標的遺伝子の活性レベルを低下させる際に、三重らせん分子を利用することができる。これらの技術は、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．１９９４により詳細に記載されている。
【００９５】
細胞を遺伝子操作するのに有用であろう方法は当分野で周知であり、米国特許第４，９６３，４８９号および第５，７８５，９６４号（これらの開示内容は参照により本明細書に援用される）にさらに詳細に記載される。例えば、外来性核酸、例えば対象遺伝子産物をコードするものを含む、組み換えＤＮＡ構築物またはベクターを構築し、間質細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用してもよい。外来性核酸を担持し、前記核酸を発現することができる形質転換細胞またはトランスフェクト細胞を選択し、本開示の三次元構築物でクローン増殖させる。
【００９６】
対象遺伝子を含むＤＮＡ構築物を調製するための方法、細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法、ならびに対象遺伝子を担持および発現する細胞を選択するための方法は、当分野で周知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載の技術を参照されたい。
【００９７】
細胞は、組み込み型ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター；あるいは非組み込み型複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；あるいは複製欠損ウイルスベクターを含むがそれらに限定されない、様々なベクターのいずれを用いて操作してもよい。一時的発現が望ましい場合、非組み込み型ベクターおよび複製欠損ベクターが好ましいが、これはこれらの系で対象遺伝子の発現を制御するために誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターのいずれかを使用することができるためである。あるいは、対象遺伝子が誘導性プロモーターによって制御されるという条件で、組み込み型ベクターを使用して一時的発現を達成することもできる。細胞にＤＮＡを導入する他の方法には、リポソーム、リポフェクション、電気穿孔、パーティクルガンの使用、または直接ＤＮＡ注入によるものがある。
【００９８】
細胞は、好ましくは、核酸、例えばＤＮＡで形質転換もしくはトランスフェクトされ、１つまたは複数の適切な発現制御要素、とりわけプロモーターもしくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および選択可能なマーカーによって制御され、すなわち、これらと作用可能に関連する。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を強化培地で成長させてから、選択培地に切り替えてもよい。外来ＤＮＡ中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、例えばプラスミド上の外来ＤＮＡを細胞がその染色体に安定に組み込み、成長して増殖巣を形成することを可能にし、次いでその増殖巣をクローニングして細胞株に拡大することができる。この方法は、培地中に遺伝子産物を発現する細胞株を作り出すために、有利に使用することができる。
【００９９】
挿入された遺伝子の発現を推進するために、いかなるプロモーターを用いてもよい。例えば、ウイルスプロモーターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、エラスチン遺伝子プロモーター、およびβグロビンを含むが、それらに限定されない。好ましくは、対象遺伝子の発現を制御するために使用する制御要素は、遺伝子の調節された発現を可能にして、産物がインビボで必要なときのみ合成されるようにするべきである。一時的発現が望ましい場合、非組み込み型ベクターおよび／または複製欠損ベクター中に、好ましくは構成的プロモーターが使用される。あるいは、誘導性プロモーターを使用して、必要時に挿入した遺伝子の発現を推進することもできる。誘導性プロモーターは、組み込み型ベクターおよび／または複製ベクター内に組み込んでもよい。例えば、誘導性プロモーターは、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質を含むが、それらに限定されない。
【０１００】
一実施形態によると、対象外来性遺伝子を発現するために使用する誘導性プロモーターは、凍結保存およびその後の解凍の結果として誘導される、本明細書において開示される調節タンパク質の天然プロモーターであるものである。例えば、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、または種々の既知の熱ショックタンパク質のプロモーターを発現制御要素として使用して、すなわち、このプロモーターを対象外来性遺伝子に作用可能に結合させて、細胞培地を馴化する組織構築物中で所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【０１０１】
種々の方法を用いて、操作した遺伝子産物の細胞内への構成的発現または一時的発現を達成することができる。例えば、Ｓｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：７１４−７１８によって記載されているトランスカリオティック（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ）移植法を使用することできる。本明細書中で使用する「トランスカリオティック（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ）」とは、移植した細胞の核が、安定または一時的なトランスフェクションによるＤＮＡ配列の付加によって変更されていることを示す。好ましくは、細胞は、そのような遺伝子産物を、術後の回復期の間に一時的におよび／または誘導性制御下で、あるいは間質細胞に固定されたキメラ融合タンパク質として、例えば、細胞外ドメインとしての遺伝子産物に融合した、受容体または受容体様分子の細胞内および／または膜貫通ドメインから構成されるキメラ分子として発現するように操作される。
【０１０２】
さらに、のちに馴化培地中に認められる、外来遺伝子産物、成長因子、調節因子などを含む細胞外マトリックスを有する構築物を調製することが望ましいこともある。この実施形態は、ヒト間質細胞が、三次元支持体フレームワーク上での成長中に、正常ヒト組織において生成されるのと同様に、ヒト細胞外マトリックスを合成し、フレームワーク上に沈着させるという発見に基づく。この細胞外マトリックスは、細胞により局所的に分泌され、細胞と組織とを結合させるだけでなく、それが接触する細胞の発達および挙動に影響を及ぼす。細胞外マトリックスは、種々の結合組織タンパク質、例えばグリコサミノグリカン鎖の網目からなる水和ゲルに織り込まれた繊維形成タンパク質を含む。グリコサミノグリカンは長い負荷電多糖鎖の異種群であり、これら（ヒアルロン酸以外）はタンパク質と共有結合してプロテオグリカン分子を形成する。この実施形態によると、間質細胞は、細胞外マトリックス中、そして最終的には細胞培地中に存在することとなる、所望の遺伝子産物または遺伝子産物の変更形態を発現するように遺伝子操作してもよい。
【０１０３】
２．  細胞の培養
一部の実施形態において、細胞は二次元細胞培養で成長させる。他の実施形態において、細胞は三次元細胞培養で成長させる。例えば、参照により全体が本明細書に援用される、米国特許第６，３７２，４９４号を参照されたい。細胞培養に使用する間質細胞は、好ましくは、線維芽細胞、間葉幹細胞、肝臓補充細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、および／または胚幹細胞を場合によっては本明細書でより完全に記載する付加的な細胞および／または要素とともに含む。
【０１０４】
細胞は当分野で既知のいかなる手段で培養してもよい。好ましくは、細胞は、無菌での処理および取扱いが可能な環境で培養する。細胞および組織培養の従来の手段は、人による培地の監視および管理の必要性により限界があった。これは、１回で培養可能な細胞および組織の量、ひいては１回で得ることができる馴化細胞培地の容積を制限する。この理由から、例えば、共有米国特許第５，７６３，２６７号（‘２６７特許）（参照によりあらゆる目的で全体が本明細書に援用される）に記載されているような無菌大規模培養のための装置を用いて、大規模な成長（大規模な馴化培地を生じる）を可能にする形で培地を馴化することが好ましい。‘２６７特許に記載の無菌閉鎖システムを用いて、前馴化培地は、液体リザーバから入口多岐管へと輸送され、連続フローシステム内の培養物に均等に分配され、これは例えばＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）などの三次元細胞および組織培養物の培養に有用である。とりわけ、’２６７特許に記載の装置は、１つまたは複数の個別の培養用ポケットを含む複数の可撓性または半可撓性の処理用チャンバー、複数の硬質スペーサー、入口液体多岐管、出口液体多岐管、液体リザーバ、およびシステム内で流体を輸送するための手段を含む。
【０１０５】
処理時、液体培地は、液体リザーバから入口多岐管に輸送され、これにより連結した処理用チャンバーおよび内部の培養用ポケットそれぞれに培地が均等に分配される。また、出口液体多岐管が備えられて、各処理用チャンバーが均等に満たされることを確実にし、また処理中に形成された全ての気泡が処理用チャンバーから除去されることを確実にする。処理用チャンバーは、培養移植片の濯ぎ時および使用時にエンドユーザーが容易に取り扱えるように、可撓性または半可撓性である。処理用チャンバーが可撓性であるため、硬質スペーサーも備えられ、これは処理時にチャンバー内の均等な液体分配を確実にする。
【０１０６】
別の実施形態において、組織は、米国特許第５，８４３，７６６号（‘７６６特許）（参照によりあらゆる目的で全体が本明細書に援用される）に記載されているような組織培養物の無菌成長のための装置で培養する。‘７６６特許は、組織培養チャンバーを開示しているが、このチャンバーは、組織の成長を提供するケースであり、その組織は、同じ無菌容器中で、成長させ、凍結形態で保管し、エンドユーザーに搬送することができる。この組織培養チャンバーはケースを備え、このケースは内部に基質を含み、その基質の表面上での三次元組織成長を容易にするように設計される。このケースは、培地の流入および流出を援助する流入口および流出口を含む。また、ケースは、少なくとも１つの分流器も含む。一実施形態において、この分流器はバッフルであり、これを使用して、チャンバー内の培地の流れを分配して、連続的で均一な組織片を作成する。第２の実施形態において、この分流器は、偏向板、分配チャネル、および流動チャネルの組み合わせである。各実施形態において、ケースは、組織の成長および保管中にチャンバー内の無菌環境を確保するように、シールをさらに含む。
【０１０７】
線維芽細胞は、多くの異なる細胞および組織の三次元培養系での成長を支持し、そのためマトリックス上に接種して、様々なあらゆる細胞および組織を培養するための「汎用」間質支持マトリックスを形成することができる。しかしながら、場合によって、「汎用」ではなく「特異的」間質支持マトリックスを使用することが好ましいことがあり、その場合には、間質細胞および要素は、特定の組織、器官、または個体から得ることができる。さらに、線維芽細胞および他の間質細胞および／または要素は、三次元系で培養するものと同じ種類の組織に由来してもよい。これは、特殊化した間質細胞が特定の構造的／機能的役割を果たし得る組織、例えば、動脈の平滑筋細胞、神経組織のグリア細胞、肝臓のクッパー細胞などを培養する場合に有利となり得る。
【０１０８】
一旦三次元支持体に接種すると、間質細胞は、フレームワーク上で増殖し、その間質細胞によって自然に分泌される結合組織タンパク質、例えば成長因子、調節因子、および細胞外マトリックスタンパク質を沈着させる。間質細胞およびそれらによって自然に分泌された結合組織タンパク質は、フレームワークを実質的に覆い、それにより生存間質組織を形成し、これが本発明の三次元培養系中に接種された組織特異的細胞の成長を支持することになる。実際に、三次元間質組織は、組織特異的細胞を接種すると、長期間にわたり、培養物の活発な増殖を維持する。重要なことに、メッシュの開口が培養間質細胞の流出を可能にするため、コンフルエントな間質培養物は接触阻止を示さず、間質細胞は、継続して成長し、分裂し、機能的活性を保持する。
【０１０９】
成長および調節因子は、間質組織によって培地中に産生される。成長因子（例えば、αＦＧＦ、βＦＧＦ、インスリン成長因子、またはＴＧＦ−βであるが、それらに限定されない）、あるいは、天然または改変血液製剤または他の生物活性生体分子（例えば、ヒアルロン酸またはホルモンであるが、それらに限定されない）は、三次元フレームワークもしくはスキャフォールドのコロニー形成を強化し、培養培地を馴化する。
【０１１０】
培養物をインビボで使用する前に間質細胞を成長させる程度は、三次元組織培養で成長させる組織の種類に応じて異なり得る。培地を馴化する生存間質組織は、それらをインビボで移植することによって矯正構造物として使用することができる。あるいは、生存間質組織に別の細胞型を接種して、インビボで移植してもよい。間質細胞を遺伝子操作して、培養培地中に分泌されるタンパク質産物のレベルを調節して、この馴化培地から得られる回収産物の濃度を向上させることもできる。例えば、間質細胞を遺伝子操作して、馴化培地から得られる産物である抗炎症因子、例えば、抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２などのうちの１つまたは複数の濃度を向上させることができる。あるいは、間質細胞は、炎症を促進する天然遺伝子産物、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２の発現を「ノックアウト」する、またはＭＨＣの発現を「ノックアウト」して、拒絶反応の危険性を低下させることもできる。
【０１１１】
三次元での間質細胞の成長は、単層系よりはるかに長い期間にわたって、培養下の間質細胞および組織特異的細胞の両者の活発な増殖を維持することになる。さらに、三次元系は、インビトロ培養下の細胞の成熟、分化、および分泌を支持して、インビボで認められる対応物と類似する成体組織の成分を形成し、生理学的比率により近似して、タンパク質を馴化培地中に確保する。
【０１１２】
ａ．  三次元間質組織の確立
三次元支持体またはフレームワークは、（ａ）細胞が付着でき（または、細胞が付着できるように改変でき）、また（ｂ）細胞が複数の層で成長できる、いかなる材料および／または形状のものであってもよい。多数の異なる材料を用いてフレームワークを形成することができ、これには、非生分解性材料、例えば、ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；テフロン）、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ（ＴＰＸ）、ニトロセルロース、綿；および生分解性材料、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、コラーゲン、コラーゲンスポンジ、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、デキストラン、ポリアルカノエートなどが含まれるが、それらに限定されない。これらの材料はいずれも例えばメッシュになるように織る、組む、または編むなどして、三次元フレームワーク形成することができる。このフレームワークは、次いで矯正構造物として望ましいいかなる形状、例えば、管、ロープ、フィラメントなどに形成してもよい。ナイロン、ポリスチレンなどの特定の材料は、細胞接着には不十分な基質である。これらの材料を三次元フレームワークとして使用する場合、間質細胞の接種前に、支持体への間質細胞の付着を強化するためにフレームワークを前処理することが望ましい。例えば、間質細胞を接種する前に、ナイロン製フレームワークを０．１Ｍ酢酸で処理し、ポリリジン、ＦＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、このナイロンを被覆することができる。ポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理することができる。
【０１１３】
培養物をインビボで移植する場合、例えば、生分解性マトリックス、例えばポリグリコール酸、コラーゲン、コラーゲンスポンジ、織ったコラーゲン、腸線縫合材料、ゼラチン、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸およびそのコポリマーを使用することが好ましいであろう。培養物を長期間維持する場合、または凍結保存する場合には、非分解性材料、例えば、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿などが好ましいであろう。本開示に従って使用することができる都合のよいナイロンメッシュは、平均孔径２１０μｍおよび平均ナイロン繊維直径９０μｍを有するナイロン濾過メッシュ、ＮＩＴＥＸ（登録商標）（＃３−２１０／３６，Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）である。
【０１１４】
線維芽細胞、間葉幹細胞、肝臓補充細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、および／または胚幹細胞を含み、場合によっては後述の他の細胞および要素を含む間質細胞をフレームワーク上に接種する。また、疎性結合組織に認められる細胞を線維芽細胞とともに三次元支持体上に接種してもよい。このような細胞には、平滑筋細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞などが含まれるが、それらに限定されない。すでに説明したように、胎児線維芽細胞を使用して、様々な異なる細胞および／または組織の成長を支持する「汎用」三次元間質マトリックスを形成することができる。しかしながら、培養するものと同じ種類の組織および／またはこの三次元系により成長させた細胞および／または組織をのちに受け入れることになる特定の個体に由来する線維芽細胞を三次元フレームワークに接種することにより、「特異的」間質組織を調製することもできる。
【０１１５】
このようにして、一実施形態において、特定の組織に特殊化した間質細胞を培養することができる。例えば、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、脂肪細胞、および細網細胞を含むがそれらに限定されない造血組織の間質細胞を用いて、インビトロでの骨髄の長期培養のための三次元サブコンフルエント間質を形成することができる。造血性の間質細胞は、例えば３０００ｘｇの弱い力の遠心分離によって、骨髄懸濁液中に形成される「軟膜」から容易に得ることができる。動脈の内壁を形成する間質層において、高い割合の未分化平滑筋細胞を添加して、タンパク質に弾性を与えることができる。肝臓の間質細胞は、線維芽細胞、クッパー細胞、ならびに血管および胆管内皮細胞を含み得る。同様に、グリア細胞を間質として使用して、神経細胞および組織の増殖を支持することもでき、この目的でのグリア細胞は、胚脳または成体脳のトリプシン処理またはコラゲナーゼ消化によって得ることができる（Ｐｏｎｔｅｎ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，１９８０，ｉｎ  Ｆｅｄｅｒｏｆ，Ｓ．Ｈｅｒｔｚ，Ｌ．，ｅｄｓ，“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｖｏｌ．１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２０９−２２７）。三次元間質細胞培養での細胞の成長は、タンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックス、および／または他の材料をフレームワークに添加する、あるいはこれらで支持体を被覆することによって、さらに強化することができる。
【０１１６】
さらに、間葉幹細胞（系統が決定されたまたは未決定の前駆細胞）は、フレームワーク上への接種に有利な「間質」細胞である。この細胞は、内因性または補充された成長因子および調節因子、ならびに増殖および／または分化を調節するプロスタグランジン、インターロイキン、および天然に存在するケイロンを含む他の因子に応じて、骨細胞、腱および靱帯の線維芽細胞、骨髄間質細胞、脂肪細胞、および他の結合組織の細胞、軟骨細胞に分化する。
【０１１７】
線維芽細胞は、線維芽細胞の供給源となる適切な器官または組織を脱凝集させることにより、容易に単離することができる。これは、当業者には既知の技術を用いて、容易に達成することができる。例えば、組織または器官を機械的に脱凝集させ、および／または隣接細胞間の結合を弱める消化酵素および／またはキレート剤で処理して、認知可能な細胞破壊を伴わずに、組織を分散させて個々の細胞の懸濁液を形成することができる。酵素による解離は、組織を細分化し、多数の消化酵素のいずれかを単独または組み合わせて、細分化した組織を処理することによって達成することができる。これらには、いくつか例を挙げると、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および／またはヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロナーゼ、ジスパーゼなどが含まれるが、それらに限定されない。また、粉砕機、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、圧力式粉砕機、または超音波破砕機の使用を含むがそれらに限定されない多数の方法によって、機械的破砕を達成することもできる。組織の脱凝集技術の概説については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．９，ｐｐ．１０７−１２６を参照されたい。
【０１１８】
一旦組織が個々の細胞の懸濁液に分解されると、この懸濁液を分集団に分割することができ、そこから線維芽細胞および／またはその他の間質細胞および／または要素を得ることができる。また、これは標準的細胞分離方法を用いて達成してもよく、これには特定の細胞型のクローニングおよび選択、不要な細胞の選択的破壊（負の選択）、混合集団における異なる細胞凝集性に基づく分離、凍結解凍法、混合集団における細胞の異なる接着性、濾過、従来の遠心分離法およびゾーン遠心分離法、遠心水簸（向流遠心分離法）、単位重力分離、向流分配、電気泳動、ならびに蛍光活性化細胞選別が含まれるが、それらに限定されない。クローン選択および細胞分離技術の概説については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．１１  ａｎｄ  １２，ｐｐ．１３７−１６８を参照されたい。
【０１１９】
線維芽細胞の単離は、例えば、以下のように実施することができる。新鮮組織試料をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で十分に洗浄して粉砕し、血清を取り除く。粉砕組織を新たに調製したトリプシンなどの解離酵素の溶液中で１〜１２時間インキュベートする。かかるインキュベーション後、解離細胞を懸濁させ、遠心分離によりペレット化し、培養皿上に播く。全ての線維芽細胞は他の細胞よりも前に付着するため、適切な間質細胞を選択的に単離し、成長させることができる。次に、単離した線維芽細胞をコンフルエントまで成長させ、コンフルエントな培養物から取り除き、三次元マトリックス上に接種する（Ｎａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．  Ｍｅｄ．１８（３  ａｎｄ  ４）２１９−２５０を参照）。例えばおよそ１０６〜５×１０７細胞／ｍｌの高濃度の間質細胞を三次元フレームワークに接種すると、より短い時間で三次元間質組織が確立される。
【０１２０】
間質細胞の接種後、三次元フレームワークは、適切な栄養培地でインキュベートすべきである。すでに記載したように、ＲＰＭＩ  １６４０、フィッシャー、イスコフ、マッコイなどの多くの市販の培地が使用に適しているであろう。インキュベート時間中に、増殖活性を最大限にするために、三次元間質細胞培養物を培地に懸濁または浮遊させることが重要である。培養物を定期的に「供給」し、下記の第５．６項および第５．７項に記載のように馴化培地を回収および処理する。したがって、培養する組織および所望のコラーゲンの種類に応じて、適切な間質細胞を選択して、三次元マトリックスに接種することができる。
【０１２１】
三次元間質細胞培養物のインキュベーション中、増殖細胞がマトリックスから放出されることがある。このような放出された細胞は、培養容器の壁に付着することがあり、そこで継続して増殖し、コンフルエントな単層を形成し得る。これは、例えば、供給時に放出した細胞を除去することによって、または三次元間質培養物を新しい培養容器に移すことによって、阻止または最小化すべきである。容器中のコンフルエントな単層の存在は、三次元マトリックスおよび／または培養物での細胞の成長を「停止」させることになる。コンフルエントな単層の除去、または新しい容器中の新鮮培地への培養物の移動により、三次元培養系の増殖活性が回復する。必要であれば、馴化培地が全細胞も含まないようにするために、この培地を処理することに留意すべきである（全細胞を特定の用途に用いる場合を除く）。このような除去または移動は、培養密度２５％を超える間質単層を有するあらゆる培養容器で実施すべきである。あるいは、培養系を攪拌して放出された細胞が付着するのを阻止することもでき、あるいは定期的に培養物を供給する代わりに、新鮮培地がシステム中を連続的に流れるように培養システムを設定することもできる。流量を調節して、三次元培養物中での増殖を最大限にし、かつ培養物から放出された細胞を洗い流して除去することにより、それらの細胞が容器の壁に付着してコンフルエンスまで成長しないようにすることもできる。
【０１２２】
実質細胞などの他の細胞を三次元生存間質組織上に接種して成長させることもできる。
【０１２３】
ｂ．  細胞培養物中への追加細胞の接種
一旦細胞培養物が、特定の程度の成長に到達すると、追加細胞を細胞培養物中に接種して、細胞培養物中の細胞とともに培養してもよい。この追加細胞をインビトロで生存組織上で成長させて、天然組織の培養対応物を形成し、生理学的レベルに近似する比率で培地中に細胞外産物を産生することによって培地を馴化する。接種材料中の高濃度細胞は、有利にも、低濃度の場合よりもはるかに早く培養下での増殖の増加をもたらす。
【０１２４】
接種に選択される細胞は培養する組織に応じて異なり、いくつか例を挙げると、骨髄、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、神経組織、副腎、粘膜上皮、平滑筋を含むが、それらに限定されない。このような細胞は、特徴的な細胞外タンパク質、例えば特定の成長因子を培地中に産生し、その結果特定の組織に特異的な特定の用途に対して最適化された培地をもたらす。
【０１２５】
例えば、限定するものではないが、様々な上皮細胞を三次元生存組織上で培養することができる。このような上皮細胞の例には、角化細胞、口腔粘膜、および胃腸（Ｇ．Ｉ．）管細胞が含まれるが、それらに限定されない。このような上皮細胞は、当分野で既知の方法によって組織の酵素処理により単離し、その後これらの細胞を培養下で増殖させ、上皮細胞を例えば三次元間質支持体細胞マトリックスに適用する。間質支持体の存在は、上皮細胞の正常な分裂および分化を促進する成長因子および他のタンパク質をもたらす。
【０１２６】
一般的には、この接種材料は、その組織の「幹」細胞（「補充」細胞とも称される）、すなわち成熟してその組織の種々の成分を形成する特殊化した細胞になる新しい細胞を生成する細胞を含むべきである。
【０１２７】
接種材料に用いられる実質細胞または他の表層細胞は、上述の間質細胞を取得するための標準的技術を用いて、所望の組織を脱凝集させることによって調製される細胞懸濁液から得ることができる。全細胞懸濁液自体を用いて、三次元生存間質組織に接種することもできる。結果として、ホモジネート中に含まれる再生細胞は、そのマトリックス上で適切に増殖、成熟、および分化するが、非再生細胞は増殖、成熟、および分化しない。あるいは、上述の間質細胞の分画のための標準的技術を用いて、特定の細胞型を細胞懸濁液の適切な画分から単離することもできる。「幹」細胞または「補充」細胞を容易に単離できる場合には、これらを用いて、三次元間質支持体に優先的に接種することができる。例えば、骨髄を培養する場合、新鮮な骨髄細胞または凍結保存試料からの骨髄細胞のいずれかを間質に接種することができる。皮膚を培養する場合、三次元間質にメラニン細胞および角化細胞を接種することができる。肝臓を培養する場合、三次元間質に肝細胞を接種することができる。膵臓を培養する場合、三次元間質に膵臓内分泌細胞を接種することができる。種々の組織から実質細胞を得るために使用可能な方法の概説については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．  ２０，ｐｐ．２５７−２８８を参照されたい。
【０１２８】
実際に、接種前に間質マトリックスに沈着させた様々な割合の各種コラーゲンは、後に接種する組織特異的細胞の成長に影響を与え得る。例えば、造血細胞の最適成長のために、マトリックスは、好ましくは、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＩ型コラーゲンを近似比率６：３：１で初期マトリックス中に含むべきである。三次元皮膚培養系の場合、好ましくは、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンを初期マトリックスに沈着させる。沈着させるコラーゲン型の割合は、適切なコラーゲン型を産生する線維芽細胞を選択することによって、操作または増強することができる。これは、補体を活性化することができ、かつ特定のコラーゲン型を定める適切なアイソタイプまたはサブクラスのモノクローナル抗体を用いて達成することができる。これらの抗体および補体は、所望のコラーゲン型を発現する線維芽細胞の負の選択をするために使用することができる。あるいは、マトリックスに接種するために使用する間質細胞は、適切な所望のコラーゲン型を合成する細胞の混合物であってもよい。各種のコラーゲンの分布および起源を表Ｉに示す。
【表１】
2014500872.tif 000002
【０１２９】
インキュベーション時、細胞培養系は栄養培地に懸濁または浮遊させるべきである。培養物に新鮮培地を定期的に供給すべきである。この際も細胞が増殖してコンフルエントな単層を形成する可能性がある容器の壁に、培養物から放出される細胞が付着しないように注意すべきである。培養物からの細胞の放出は、構造化組織と対照的な拡散性組織を培養した場合により容易に発生すると思われる。例えば、皮膚培養物は、組織学的および形態学的に正常であり、別個の真皮層および上皮層は周囲の培地に細胞を放出しない。これに反して、骨髄培養物は、成熟した非接着細胞をインビボでかかる細胞が骨髄に放出されるのとほぼ同じように培地に放出する。すでに説明したように、放出された細胞は培養容器に付着してコンフルエントな単層を形成した場合、三次元培養物の増殖は「停止」される。これは、供給時に放出された細胞を除去することによって、培養物を新しい容器に移すことによって、培養物を攪拌して放出された細胞が容器の壁に付着するのを阻止することによって、または培養物に栄養分を補給し、かつ放出された細胞を除去するのに十分な速度で新鮮培地を連続的に流すことによって回避することができる。すでに記載したように、必要であれば、馴化培地を処理して、全細胞および細胞残屑を含まないようにする。
【０１３０】
培養下の細胞の成長および活性は、種々の成長因子、例えばインスリン、成長ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリトロポエチン、上皮成長因子、肝臓赤血球生成因子（ヘパトポエチン）、および肝細胞成長因子の影響を受けることがある。増殖および／または分化を調節する他の因子には、プロスタグランジン、インターロイキン、および天然に存在するケイロンがある。
【０１３１】
Ｃ．  馴化成長培地および細胞抽出物
１．  細胞培養物からの馴化成長培地または細胞抽出物の回収
得られた馴化成長培地は、当業者に既知のいかなる手段によって細胞培養物から分離してもよい。一実施形態では、馴化成長培地を細胞培養系からポンプで汲み出して、使用するために処理する。一部の実施形態において、馴化成長培地は、一旦細胞培養物が成長培地を十分な程度まで馴化してから（すなわち、一旦培地が、成長因子などの細胞外タンパク質が培地中で所望のレベルに達するように馴化されてから）回収する。好ましくは、馴化成長培地は、特定の成長因子および結合組織タンパク質の分泌レベルがその最大レベルとなる組織の成長の後期（図１を参照）に回収される。好ましい実施形態において、馴化成長培地は、培養１０日目〜１４日目に、成長培地を細胞に接触させたあとに回収する。
【０１３２】
細胞培養物によって産生された細胞抽出物は、当業者に既知のいかなる手段で馴化成長培地から単離してもよい。
【０１３３】
２．  馴化成長培地または細胞抽出物の処理
馴化成長培地または細胞抽出物の回収後、得られた上澄みをさらに処理する必要がある場合がある。そのような処理には、流束濾過（ｗａｔｅｒ  ｆｌｕｘ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）装置による、またはＣｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（上記参照），ｐｐ２９  Ｄ：０．１−２９Ｄ：０．４に記載の方法を用いた濾別による濃縮を含みうるが、それらに限定されない。
【０１３４】
さらに、培地は、１０，０００ｍlの分画フィルターを有する加圧濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて１０〜２０倍に濃縮してもよい。
【０１３５】
また、馴化成長培地または細胞抽出物を生成物の単離および精製のためにさらに処理して、例えば不要なプロテアーゼを除去してもよい。最適な生物活性が維持されるように生成物の単離および精製のために使用する方法は、当業者には明らかであろう。例えば、成長因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体などを精製することが望ましいかもしれない。そのような方法には、馴化培地のゲルクロマトグラフィー（セファデックスなどのマトリックスを使用）、イオン交換、架橋アガロースなどの不溶性マトリックスを用いる金属キレート親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれるが、それらに限定されない。そのような技術は、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（上記参照）により詳細に記載されている。馴化成長培地または細胞抽出物、および／またはそれらに由来する生成物の所望の用途に応じて、滅菌性を維持するために適切な手段をとらなければならない。あるいは、滅菌が必要な場合もあり、これは所望の生物活性を維持するよう注意して、当業者に既知の方法、例えば加熱滅菌および／または濾過滅菌によって達成することができる。
【０１３６】
３．  馴化成長培地中または細胞抽出物中に認められる一部の生成物
下表２は、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）組織培養で成長させた細胞の成長をすでに支持した本出願人らの馴化培地に用いる、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ）で決定した複数の成長因子の濃度を示す。本発明による細胞抽出物もこれらの成長因子も含むと考えられる。下表は、因子の包括的な一覧ではなく、本開示の培地中に存在する生物学的に活性な因子の一部の濃度を提示することにより、馴化培地をさらに特徴付ける目的でのみ提示されていると理解すべきである。
【表２】
2014500872.tif 000003
【０１３７】
三次元組織培養物であるＴｒａｎｓＣｙｔｅ（商標）中およびＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）中に認められる線維芽細胞によって分泌される主要な分子成分を定量化および特徴付けするために、様々な方法が用いられている。ＴｒａｎｓＣｙｔｅ（商標）中およびＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）中に存在するヒトのマトリックスタンパク質およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン、デコリン、バーシカン、ベータグリカン、シンデカン、ならびに他の成分（データは示さず）が含まれるが、それらに限定されない。これらの分泌タンパク質およびＧＡＧは、主要な構造機能を果たし、また細胞の分裂、遊走、接着、およびシグナル伝達を刺激する。三次元成長系におけるグリコサミノグリカンの沈着（沈着量は成長期間に依存する）およびコラーゲンの沈着（沈着量は成長期間に依存しない）を図１に示す。これらの成分は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学法、およびＰＣＲによって測定した。例えば、ＴｒａｎｓＣｙｔｅ（商標）中に認められる成分の一部には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびＶＩＩ型コラーゲン（ＲＮＡ）、フィブロネクチン、テネイシン、トロンボスポンジン２、エラスチン、プロテオグリカン、デコリン、バーシカン、および他の成分（データは示さず）がある。組織の発達、治癒、および正常機能におけるこれらの成分の活性は、詳細に記載されている。さらに、本出願人らは、生物工学によって作製されたヒトマトリックスの、インビボでの細胞機能に対する一定の効果を記載する。例えば、本出願人らは、生物工学によって作製されたマトリックスを添加することによって、細胞増殖が増加することに注目した。細胞増殖に対するその効果を研究するために、マトリックスをＴｒａｎｓＣｙｔｅ（商標）およびＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）から物理的に除去し、様々な希釈度でヒト線維芽細胞および角化細胞の単層培養物に添加した。細胞増殖の増加の結果を図２に示す。
【０１３８】
さらに、本出願人らは、無血清培地、培地、または三次元馴化培地の存在下で培養された組織の細胞外マトリックス中に分泌されたコラーゲンの量を測定することによって、三次元組織の調製および組成に対する三次元馴化培地の効果を調査したことを特筆する。三次元組織の調製および組成に対する三次元馴化培地の効果は、無血清培地、培地、または三次元馴化培地の存在下で培養された組織の細胞外マトリックス中に分泌されたコラーゲンの量を測定することによって調査した。本開示の馴化培地は、インビトロでの組織のコラーゲン沈着を著しく増加させる。
【０１３９】
Ｄ．  馴化成長培地または細胞抽出物の代謝
１．  酵母
馴化成長培地または細胞抽出物の代謝過程は、様々な微生物、例えば酵母、桿菌、カビ、植物細胞などによって生じる。本開示に特に好適なものは、酵母を用いてなされる発酵である。本明細書で使用する「酵母」という用語は、単一酵母細胞、多酵母細胞、および／または酵母細胞の培養物を含むよう意図される。この酵母は、当業者に既知の種々の菌類の科のものであってよく、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、セラトストメラ（Ｃｅｒａｔｏｓｔｏｍｅｌｌａ）、バッカクキン（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、キシラリア（Ｘｙｌａｒｉａ）、ロゼリニア（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ）、ヘロチウム（Ｈｅｌｏｔｉｕｍ）、スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、ツロストマ（Ｔｕｌｏｓｔｏｍａ）、リゾポゴン（Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ）、トルンココルメッラ（Ｔｒｕｎｃｏｃｏｌｕｍｅｌｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、ディクトステリウム（Ｄｉｃｔｏｓｔｙｌｉｕｍ）、ブラストクラジア（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉａ）、シンキトリウム（Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）、ツユカビ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、アルブゴ（Ａｌｂｕｇｏ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、プラスモディオフォラ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ）、ツベル（Ｔｕｂｅｒ）、ヒュドヌム（Ｈｙｄｎｕｍ）、レカノラ（Ｌｅｃａｎｏｒａ）、ロッセラ（Ｒｏｃｃｅｌｌａ）、ペルツサリア（Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａ）、ウスネア（Ｕｓｎｅａ）、エベルニア（Ｅｖｅｒｎｉａ）、ラマリナ（Ｒａｍａｌｉｎａ）、アレクトリア（Ａｌｅｃｔｏｒｉａ）、クラドニア（Ｃｌａｄｏｎｉａ）、パルメリア（Ｐａｒｍｅｌｉａ）、セトラリア（Ｃｅｔｒａｒｉａ）、ハラタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アンズタケ（Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ）、オンファロツス（Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ）、ヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、チチタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ）、ホウライタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）、ベニタケ（Ｒｕｓｓｕｌａ）、チチタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ）、ストロファリア（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ）、エントロマ（Ｅｎｔｏｌｏｍａ）、レピオタセア（Ｌｅｐｉｏｔａｃｅａｅ）、コルチシウム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ）、ペッリクラリア（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ）、キシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）、ボルバリア（Ｖｏｌｖａｒｉａ）、カヤタケ（Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ）、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセタセエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、チャワンタケ（Ｐｅｚｉｚａ）、プレクタニア（Ｐｌｅｃｔａｎｉａ）、アミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）、ユンネア（Ｗｙｎｎｅａ）、ヘルベッラ（Ｈｅｌｖｅｌｌａ）、シャグマアミガサタケ（Ｇｙｒｏｍｉｔｒａ）、スッポンタケ（Ｐｈａｌｌａｌｅｓ）、ディクチオフェラ（Ｄｉｃｔｙｏｐｈｅｒａ）、ムチヌス（Ｍｕｔｉｎｕｓ）、クラトルス（Ｃｌａｔｈｒｕｓ）、プセウドコルス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｕｓ）、ホコリタケ（Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ）、カルバチア（Ｃａｌｖａｔｉａ）、ゲアストルム（Ｇｅａｓｔｒｕｍ）、ラジイゲラ（Ｒａｄｉｉｇｅｒａ）、アストレウス（Ａｓｔｒｅｕｓ）、ニズラリア（Ｎｉｄｕｌａｒｉａ）、ガストロキュベ（Ｇａｓｔｒｏｃｙｂｅ）、マコワニテス（Ｍａｃｏｗａｎｉｔｅｓ）、ガストロボレツス（Ｇａｓｔｒｏｂｏｌｅｔｕｓ）、アルバトレッルス（Ａｌｂａｔｒｅｌｌｕｓ）、ネオレンチヌス（Ｎｅｏｌｅｎｔｉｎｕｓ）、ニグロポルス（Ｎｉｇｒｏｐｏｒｕｓ）、オリゴポルス（Ｏｌｉｇｏｐｏｒｕｓ）、タマチョレイタケ（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、フィスツリナ（Ｆｉｓｔｕｌｉｎａ）、ツリガネタケ（Ｆｏｍｅｓ）、ヤマドリタケ（Ｂｏｌｅｔｕｓ）、フスコボレチヌス（Ｆｕｓｃｏｂｏｌｅｔｉｎｕｓ）、レッキヌム（Ｌｅｃｃｉｎｕｍ）、フィロポルス（Ｐｈｙｌｌｏｐｏｒｕｓ）、スイッルス（Ｓｕｉｌｌｕｓ）、ストロビロミセス（Ｓｔｒｏｂｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ボレテッルス（Ｂｏｌｅｔｅｌｌｕｓ）、トレメッラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）、オーリクラリア（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）、ダクリミセス（Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ）、メラムプソラ（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ）、クロナルチウム（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ）、プッキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、ギュムノスポランギウム（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、チッレチア（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）、ウロキュスチス（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ）、セプトバシジウム（Ｓｅｐｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヒュグロキュベ（Ｈｙｇｒｏｃｙｂｅ）、ヒュグロポルス（Ｈｙｇｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ヒュグロトラマ（Ｈｙｇｒｏｔｒａｍａ）、ネオヒュグロポルス（Ｎｅｏｈｙｇｒｏｐｈｏｒｕｓ）、フウセンタケ（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ）、ギュムノピルス（Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ）、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、ミクロスポラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、モニリア（Ｍｏｎｉｌｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、セルコスポレラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、ウスチラギノイデア（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ）、ツベルクラリア（Ｔｕｂｅｒ  ｃｕｌａｒｉａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、リゾクチニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｉｎｉａ）、オゾニウム（Ｏｚｏｎｉｕｍ）、菌核（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）、ゲオグロッスム（Ｇｅｏｇｌｏｓｓｕｍ）、またはアルミラリア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ）を含むが、それらに限定されない。特に興味深いのは、サッカロミセス科に属する菌類である。さらに興味深いのは、ピチア属に属する菌類である。最も興味深いのは、パストリス種に属する菌類である。好ましい実施形態において、発酵過程においてピキア・パストリスが使用される。一部の実施形態において、酵母は好気的に生育する。
【０１４０】
２．  発酵過程
酵母発酵過程は、攪拌槽型バイオリアクター内で実施することができる。そのようなバイオリアクターの例には、例えば、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪ）またはＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）から入手可能な発酵槽を含み得る。
【０１４１】
本開示の酵母抽出物には、酵母の細胞質および細胞外成分が含まれ、これには普通ブロス、細胞のタンパク質材料、細胞の核酸材料、細胞の原形質材料、および／または細胞壁成分が含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、抽出物は、比較的水溶性であり、例えば１グラムの水に１グラム以上の酵母抽出物が溶解する。抽出物は、水性グリコールおよび水性グリセロールなどであるがそれらに限定されない水／有機溶媒混合物に対して可溶性であってもよい。
【０１４２】
３．  代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物の回収／処理
代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、上述の馴化成長培地または細胞抽出物を回収および処理するための手順によって、回収および／または処理することができる。一部の実施形態において、処理にはいくつかのステップが含まれ、この処理は、連続フロー遠心分離、バイオマスの清澄化のためのレンズ状（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ）デッドエンド濾過、ならびに滅菌および限外濾過能力を有する接線流濾過を含む技術の使用を含み得る。一実施形態において、最終処理過程は、生物活性成分を選択的に標的とするための特定の分画分子量の接線流濾過を含む。例えば、参照により本明細書に援用される、“Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  Ｗ．Ｘｉａｏ  ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００６）を参照されたい。
【０１４３】
Ｅ．  代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物の活性／特徴付け
上述の酵母代謝において、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、凝固因子、および調節タンパク質が含まれるがそれらに限定されない、馴化成長培地中および細胞抽出物中に存在する治療生成物が、酵母によって代謝される。「代謝される」という用語は、当業者には既知であるが、本質的に、酵母が馴化栄養培地または細胞抽出物の成分の消化過程を開始することを意味する。この代謝過程は、大きい分子を小さくより容易に使用できる成分にするが、これは本発明の用途で代謝されていない馴化成長培地または細胞抽出物と比較してより有用である。代謝可能な治療用タンパク質には、炎症性メディエーター、血管新生因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、α−１抗トリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、ヒト成長ホルモンおよび誘導体、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびアポリポタンパク質Ｅ、ＩＬ−２受容体およびそのアンタゴニスト、インスリン、グロビン、イムノグロブリン、触媒抗体、インターロイキン（ＩＬ）、インスリン様成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫応答因子変更因子、ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、副甲状腺ホルモンおよびインターフェロン、神経成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、ならびにコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が含まれるが、それらに限定されない。これらの代謝された成分は、それらの前駆物質の活性を維持してもよく、またはより高い強化された活性を有するように変換されてもよく、これには例えば皮膚の維持および状態に影響を与える種々の生理系の下方調節または上方調節を含む。
【０１４４】
培地または抽出物は、培地または抽出物中に含まれる１つまたは複数の代謝された因子または成分を濃縮する、または減少させるためにさらに処理してもよく、これは例えば、免疫親和性クロマトグラフィーを用いた代謝成長因子の濃縮化、または逆に、本明細書に記載の任意の所定の用途にとってあまり望ましくない成分の除去である。
【０１４５】
他の実施形態において、本発明の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、酵母の１つまたは複数の細胞質および細胞外成分を含有し、これには、普通ブロス、細胞のタンパク質材料、細胞の核酸材料、細胞の原形質材料、および／または細胞壁成分が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４６】
ＩＩＩ．  組成物
一実施形態において、本開示は、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物と、許容可能な担体とを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物はパーソナルケア組成物である。
【０１４７】
一部の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約５重量％〜約３０重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％〜約２０重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約１３重量％〜約１７重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。他の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。
【０１４８】
他の実施形態において、組成物は、水、保存剤、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、湿潤剤、保湿剤、安定剤、希釈剤、溶剤、および香料のうちの少なくとも１つをさらに含む。付加的原料の非限定例には、パルミトイルトリペプチド５、加水分解シルク（セリシン）、ジパルミトイルヒドロキシプロリン、エルゴチオネイン（ＥＧＴ）、ユビキノン（コエンザイムＱ１０）、緑茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  Ｓｉｎｅｎｓｉｓ）葉抽出物、アスコルビン酸テトラヘキシルデシル、酢酸トコフェロール、ブラックベリー（Ｒｕｂｕｓ  Ｆｒｕｔｉｃｏｓｕｓ）葉抽出物、サッカロミセス発酵濾液溶解物、αアルブチン、γアミノ酪酸、および／またはヒアルロン酸フィリングスフィアが含まれるが、それらに限定されない。
【０１４９】
一実施形態において、組成物は少なくとも１つの保存剤をさらに含む。好適な保存剤には、酸、アルコール、グリコール、パラベン、第４級窒素含有化合物、イソチアゾリノン、アルデヒド放出化合物、およびハロゲン化化合物が含まれるが、それらに限定されない。例となるアルコールには、フェノキシエタノール、イソプロピルアルコール、およびベンジルアルコールが含まれ、例となるグリコールには、プロピレングリコール、ブチレングリコール、およびペンチレングリコールが含まれ、例となるパラベン（パラヒドロキシ安息香酸としても知られる）には、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびブチルパラベンが含まれ、例となる４級窒素含有化合物には、塩化ベンザルコニウム、クォータニウム１５が含まれ、例となるイソチアゾールには、メチルイソチアゾリン、メチルクロロイソチアゾリンが含まれ、例となるアルデヒド放出剤には、ＤＭＤＭヒダントイン、イミダゾリジニル尿素、およびジアゾリジニル尿素が含まれ、例となる抗酸化物質には、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロールが含まれ、例となるハロゲン化化合物には、トリクロサンおよびジグルコン酸クロルヘキシジンが含まれる。本開示の目的で有用な保存剤の例は、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．  “Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ  ２００７”  Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔ．１１７，４１−４４（２００２）、および“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ”  Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔ．１１７，８０−９６（２００２）に記載されている。さらに、Ｃｉｃｃｏｇｎａｎｉ  Ｄ．Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｉｎ  “Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｏｒｔｈ  ＤＳ  ｅｄ．，Ｆｒａｎｃｉｓ  ＆  Ｔａｙｌｏｒ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（２００６）による論文に記載されているものなどの酵素保存剤系も本開示の組成物との使用に有効となり得る。
【０１５０】
一実施形態において、組成物は活性成分をさらに含む。好適な活性成分には、植物成分、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ステロイド、鎮痛剤、抗腫瘍薬、治験薬、または代謝馴化培地または代謝細胞抽出物中の因子との相補的もしくは相乗的組み合わせをもたらす任意の化合物が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５１】
組成物は、錠剤、カプセル、皮膚パッチ、吸入器、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、坐薬、クリーム、軟膏、注射剤、ヒドロゲルの形態であってもよく、当業者に既知の他のあらゆる適切な製剤にしてもよい。経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、事前にゼラチン化したトウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモでんぷん、またはでんぷんグリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの許容可能な賦形剤または担体を用いて従来の手段で調製された錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。錠剤は、当分野で周知の方法を用いてコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ剤または懸濁剤の形態をとってもよく、あるいはこれらは使用前に水または他の好適なビヒクルを用いて構成するための乾燥生成物として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの許容可能な賦形剤または担体を用いて従来の手段で調製することができる。またこの調製物は、適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含んでもよい。
【０１５２】
一実施形態において、組成物は、化粧用途に適した形態であり、これにはローション、軟膏、クリーム、スプレー、噴霧剤、水性または水性−アルコール性混合ゲル、ムース、パッチ、パッド、マスク、湿潤布、ワイプ、固形スティック、透明スティック、口紅、エアロゾルクリーム、無水粉末、タルク、トニック、オイル、乳液、またはバスソルトを含むが、それらに限定されない。
【０１５３】
一実施形態において、組成物中の代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、化学物質送達ビヒクル中に存在する。化学物質送達ビヒクルには、リポソーム、ニオソーム、サブミクロンエマルジョン、ポリマーカプセル封入剤、ゲル、クリーム、ローション、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物は、カプセル材に封入される。
【０１５４】
本開示の組成物は、当業者に周知の標準的手順を用いて、様々な経路を介して対象に送達することができる。例えば、かかる送達は、部位特異的、経口、経鼻、静脈内、皮下、皮内、経皮、筋肉内、または腹腔内投与であってもよい。また、これらは制御放出ビヒクルまたは持続放出ビヒクルとして機能するように製剤化することもできる。
【０１５５】
代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、いかなる状態で使用してもよく、すなわち液体または固体で、凍結乾燥または乾燥により粉末に形成、局所的創傷の治療用フィルムとして、および接着防止用途で、注射剤として使用してもよい（参照により全体が本明細書に援用される、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／３９１０１号を参照）。
【０１５６】
あるいは、本開示の馴化細胞培地は、米国特許第５，７０９，８５４号、第５，５１６，５３２号、第５，６５４，３８１号、および国際公開第ＷＯ９８／５２５４３号（それぞれ参照により全体が本明細書に援用される）に記載されているような重合性または架橋性のヒドロゲルとともに製剤化してもよい。ヒドロゲルを形成するために使用可能な材料の例には、修飾アルギン酸塩が含まれる。アルギン酸塩は、海草から単離された炭水化物ポリマーであり、例えば国際公開第ＷＯ９４／２５０８０号（参照により本明細書に援用される）に記載されているように、カルシウムなどの２価カチオンに接触させることにより架橋してヒドロゲルを形成することができる。アルギン酸塩は、室温の水中で２価カチオンの存在下イオン架橋して、ヒドロゲルマトリックスを形成する。本明細書で使用する「修飾アルギン酸塩」という用語は、ヒドロゲル特性が変更された、化学修飾されたアルギン酸塩を指す。
【０１５７】
さらに、ジェランガムなどの細菌性多糖類、およびカラギナンなどの植物性多糖類を含む、１価カチオンとの接触によってゲル化する多糖類は、上述のアルギン酸塩の架橋に使用可能な方法と類似する方法を用いて、架橋してヒドロゲルを形成することができる。
【０１５８】
修飾ヒアルロン酸誘導体は特に有用である。本明細書において使用する「ヒアルロン酸」という用語は、天然ヒアルロン酸および化学修飾ヒアルロン酸を指す。修飾ヒアルロン酸は、事前に選択された化学修飾を用いて設計および合成して、架橋および生分解の速度および程度を調整することができる。
【０１５９】
また、共有結合架橋性ヒドロゲル前駆物質も有用である。例えば、キトサンなどの水溶性ポリアミンは、ポリエチレングリコールジイソチオシアネートなどの水溶性ジイソチオシアネートと架橋可能である。
【０１６０】
あるいは、ラジカル開始剤との接触時にラジカル反応によって架橋する置換基を含むポリマーを使用してもよい。例えば、参照により開示内容が本明細書に援用される国際公開第ＷＯ９３／１７６６９号に開示されているような、光化学的に架橋可能なエチレン性不飽和基を含むポリマーを使用してもよい。この実施形態では、少なくとも１つの水溶性領域と、１つの生分解性領域と、少なくとも２つのラジカル重合可能な領域とを含む水溶性マクロマーが提供される。これらのマクロマーの例は、エオシン色素などのラジカル開始系を用いて、または紫外線または可視光線との短時間の接触によって、アクリレート基が重合される、ＰＥＧ−オリゴラクチル−アクリレートである。あるいは、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＡＩＤ  Ｔｒａｎｓ．，３８：１５４−１５７（１９９２）に開示されているような、光化学的に架橋可能なシナモイル基を含む水溶性ポリマーを使用してもよい。
【０１６１】
好ましい重合性基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、および他の生物学的に許容可能な光重合性基である。アクリレートは、最も好ましい活性種の重合性基である。
【０１６２】
天然に存在するポリマーおよび合成ポリマーは、当分野で利用可能であり、例えばＭａｒｃｈ，“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている化学反応を用いて修飾することができる。
【０１６３】
重合は、好ましくは光開始剤を用いて開始する。有用な光開始剤は、細胞傷害性を伴わずに、少なくとも数分、最も好ましくは数秒の短時間でマクロマーの重合を開始するために使用可能なものである。
【０１６４】
光重合には多数の色素が使用可能である。好適な色素は当業者に周知である。好ましい色素には、エリトロシン、フロキシン、ローズベンガル、チオニン、カンファキノン、エチルエオシン、エオシン、メチレンブルー、リボフラビン、２，２−ジメチル−２−フェニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−フェニルアセトフェノン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、他のアセトフェノン誘導体、およびカンファキノンが含まれる。好適な共触媒には、アミン、例えばＮ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン、トリエタノールアミン、トリチルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジルエタノールアミン、Ｎ−イソプロピルベンジルアミンが含まれる。トリエタノールアミンが好ましい共触媒である。
【０１６５】
別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物、あるいはこの培地中に産生される特定の代謝細胞外マトリックスタンパク質を使用して、縫合糸をコーティングするための優れた物質を提供することができる。代謝された自然に分泌される細胞外マトリックスは、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン、グリコサミノグリカン、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β、ＫＧＦ、バーシカン、デコリン、ならびに他の分泌型ヒト皮膚マトリックスタンパク質の活性を有する馴化培地をもたらす。同様に、本開示の馴化細胞培地またはこの馴化培地に由来する細胞外マトリックスタンパク質を使用して、身体の欠陥を矯正するための外科的アプローチにおいて、人工血管を含む従来の移植装置をコーティングすることにより優れた移植装置をもたらすこともできる。移植片は、欠陥のある機能を代用または置換する生体適合性の不活性材料で作製すべきであり、非生分解性物質もしくは生分解性物質のいずれかで作製すべきである。これらの細胞外タンパク質を含む培地で移植装置をコーティングすることにより、移植片は適切な細胞接着を誘導し、移植部位に優れた組織をもたらす。したがって、馴化細胞培地またはこの培地由来のタンパク質でコーティングされた縫合糸、包帯、および移植片は、損傷範囲内への白血球および線維芽細胞などの細胞の動員を増進し、細胞の増殖および分化を誘導して、創傷治癒の改善をもたらす。
【０１６６】
別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、体内投与のためのビヒクルとしての薬学的に許容可能な担体とともに製剤化してもよい。また、培地は、培地中に含まれる１つまたは複数の因子または成分を濃縮する、または減少させるためにさらに処理してもよく、これは例えば、免疫親和性クロマトグラフィーを用いた成長因子または他のタンパク質の濃縮化、または逆に、本明細書に記載の任意の所定の用途にとってあまり望ましくない成分の除去である。
【０１６７】
ＩＶ．  状態を治療または予防するための方法
一実施形態において、本開示は、許容可能な担体と代謝馴化成長培地とを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における状態を予防または治療するための方法を提供する。
【０１６８】
別の実施形態において、本開示は、許容可能な担体と代謝細胞抽出物とを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における状態を予防または治療するための方法を提供する。
【０１６９】
処置される状態には、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、および後天性欠陥を含む皮膚状態が含まれるが、これに限定されない。一部の実施形態において、治療を受ける状態には、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【０１７０】
Ａ．  皮膚状態
一部の実施形態において、治療または予防する状態は皮膚状態である。他の実施形態において、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。また、皮膚状態には、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【０１７１】
非限定的な一例において、本明細書に記載される局所用組成物は皮膚に適用される。本明細書において開示される組成物の適用は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；年齢によるしみおよび色素沈着異常の外観を減少させる；皮膚の色合い、きめ、および弾力性を改善する；粗さおよび光損傷を軽減する；環境的損傷を予防または軽減する；皮膚をふっくらさせる；皮膚を明るくする；皮膚の色を薄くする；皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；年齢によるしみを明るくし、色を薄くする；皮膚の張り、弾力性、反発力を改善する；皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、または充填する；目の下のくまの外観を減少させる；唇のきめまたは状態を改善する；自然の唇の色を鮮やかにする；唇のボリュームを増加させる；術後の皮膚の上皮化を促進する；皮膚のバリアまたは水分バランスを取り戻す；年齢によるしみの外観を改善する；皮膚色素沈着の外観を改善する、あるいはそれらの組み合わせである。
【０１７２】
特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の少なくとも２倍の改善をもたらし得る。１つまたは複数の症状または状態の倍数改善には、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上、あるいはそれらの間の任意の数が含まれるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、約１％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約５０％の改善をもたらし得る。他の実施形態において、本明細書に記載される組成物の投与は、１つまたは複数の症状または状態の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、またはそれ以上の１つまたは複数の症状または状態の改善をもたらし得る。
【０１７３】
ヒト皮膚に影響を与える上述の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物の効果は、当業者に既知の複数の方法で測定することができる。特に、上述の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、例えば、角化細胞または線維芽細胞などの特定の皮膚細胞に対してヒトゲノムマイクロアレイなどの分析技術を使用することにより、あるいは個々の皮膚細胞、組織モデル、またはエクスビボもしくはインビボ皮膚モデルに対するタンパク質発現分析によって、それらの皮膚に対する効果についてスクリーニングすることができる。これらの試験モデルにおいて、抽出物処置の結果として、特定の遺伝子および／またはタンパク質は、上方調節または下方調節され得る。皮膚状態を調節することができる遺伝子およびタンパク質は、このスクリーニングにおいて特に興味深い。本開示の目的で特に興味深いものは、炎症、細胞外マトリックスの発現、メラニン調節、皮膚保湿、剥脱などに関連する遺伝子およびタンパク質である。特に興味深いものは、シクロオキシゲナーゼの発現、特にシクロオキシゲナーゼ−１および２、また細胞外マトリックスタンパク質の発現、特に、Ｉ型、ＩＶ型、およびＶＩ型コラーゲンの発現、ならびにエラスチンおよびフィブロネクチンの発現に関連するタンパク質である。さらに、抽出物の皮膚のメラニン発現に対する影響も非常に興味深い。
【０１７４】
これらのタンパク質および他の重要な皮膚タンパク質の発現に対する本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物の効果は、ヒトゲノムマイクロアレイ分析およびタンパク質発現によって、ならびに保湿の改善、皺の減少、色素沈着の減少、皮膚の色合いの改善などを含むがそれらに限定されない当業者に周知の非侵襲的試験方法によってモニターすることができる。本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物の適用は、ＳｉＩＦＩｏシリコーンモデリング、ＰＲＩＭＯＳ、およびＶＩＳＩＯ写真システムなどの技術によって測定した際に、例えば皮膚の皺の測定値の減少によって示され得る。さらに、保湿は、経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）、またはキュートメーターもしくは角質測定の測定値を用いて測定される場合もある。同様に、皮膚色素沈着は、比色計を用いて測定することができる。そのような試験技術は、当業者に周知であり、また“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｋｉｎ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｒｕｐ  Ｊ，Ｊｅｍｅｃ  ＧＢＥ，Ｇｒｏｖｅ  ＧＬ（ｅｄ．），Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ  ２００６に記載されている。
【０１７５】
ヒト表皮角化細胞に対するヒト遺伝子マイクロアレイ分析は、代謝馴化成長培地が、種々の皮膚機能に関与するいくつかの遺伝子を上方調節することを示している（実施例１８参照）。したがって、本開示による酵母代謝馴化成長培地または酵母代謝細胞抽出物を皮膚状態の治療のためのパーソナルケア組成物に使用できることが理解される。
【０１７６】
Ｂ．  創傷治癒用途
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、創傷および熱傷の治癒を促進するために処理してもよい。組織を損傷した場合、一連の生物活性を示すポリペプチド成長因子が創傷中に放出されて、治癒が促進される。創傷治癒は、いくつかの段階を含む複雑な過程であり、制御された形で外皮の損傷個所を封止し、機能的に有能な組織を形成する。この過程は、止血から始まり、好中球およびマクロファージが関与する炎症期が続く。この過程は、肉芽組織の発生および最上皮化へと継続し、創傷を閉鎖する。続いて、瘢痕組織が形成し、これがその後数ヶ月かけて、元の解剖学的構造に近似するように再形成される。健常組織、つまり組織学的および生理的に元の正常組織と類似する機能的に有能な組織が形成できるように、瘢痕組織は最小限であることが理想的である。
【０１７７】
治癒過程のそれぞれの段階は、サイトカイン、成長因子、および炎症性メディエーターなどの調節タンパク質による細胞間相互作用、ならびに細胞接触機序によって制御される。例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＧ−ＣＳＦなどの炎症性メディエーターは、リンパ球分化および急性期タンパク質、ならびに創傷治癒の炎症段階において重要な過程である好中球の浸潤、成熟、および活性化を誘導する。創傷治癒過程に関与する調節タンパク質の他の例には、炎症および肉芽組織形成時に血管形成を誘導するＶＥＧＦ、骨形成を誘導するＢＭＰ、角化細胞を活性化するＫＧＦ、ならびに細胞外マトリックスの沈着を誘導するＴＧＦ−β１がある。
【０１７８】
慢性創傷では、治癒過程が止血後の再上皮化前の時点で中断し、再開できないものと思われる。創傷床で見られる炎症のほとんどは感染症に関連するが、この炎症は、調節タンパク質を分解することにより創傷治癒過程を妨げるプロテアーゼが豊富な環境をもたらす。
【０１７９】
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、創傷治癒において重要であると考えられる、創傷治癒のインビボモデルで減少が示された活性を含む。例えば、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、治癒過程を支持する複数の成長因子、例えばＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＫＧＦ、およびＴＧＦ−βのうちの１つまたは複数の活性を含み得る。さらに、糖尿病などの一部の医学的状態において、創傷治癒に必要な調節タンパク質の一部が供給不足となっている。例えば、インスリン非依存性糖尿病のマウスモデル（例えば、ｄｂ／ｄｂマウス）において、正常マウスの創傷におけるレベルと比較して、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの分泌、ならびにＰＤＧＦ受容体の発現が全て抑制されることが判明した。
【０１８０】
また、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、組織の欠陥または障害の修復および／または再生が望まれる他の種類の組織障害（例えば外傷性または先天性）の治療にも有用であるが、これはこれらの成長因子のうちの多くの活性が本出願人らの代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物中に認められたためであり、これには例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、および形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）、および塩基性ＦＧＦなどの血管新生を調節するもの；血管形成因子および抗血管形成因子が含まれる。ＧＲ７８およびＭＳＰ９０などのストレスタンパク質は、ＴＧＦ−βなどの成長因子を誘導する。ＴＧＦ  β−１、ＴＧＦ  β−２、ＴＧＦ  β−３、ＴＧＦ  β−４、およびＴＧＦ  β−５を含むＴＧＦ−βは、成長および分化を調節し、創傷治癒を加速させる（Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１２４：２９９１−２９９５、Ｇｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：８７７−８８０、Ｍｕｔｏｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１３３３−１３３５）。ＰＤＧＦなどの分裂促進因子は、組織形成における細胞充実性および肉芽形成の比率を増加させる（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７４，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．８７：２９７−３０１）。すでに記載したように、細胞は、免疫原性の問題を最小限に抑えるために、好ましくはヒト細胞である。
【０１８１】
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、一連の創傷治癒因子の活性を含むため、馴化培地は、皮膚創傷、骨折、胃潰瘍、膵臓、肝臓、腎臓、脾臓、血管の損傷、および他の体内創傷を含む、創傷および熱傷治癒の治療に有利に使用される。さらに、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、抗生物質および鎮痛剤などの他の医薬成分と組み合わせてもよい。実施形態には、局所適用のための膏薬または軟膏を含む本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物の製剤が含まれる。
【０１８２】
あるいは、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、創傷治癒を促進および／または加速するために包帯（粘着性または非粘着性）と組み合わせてもよい。
【０１８３】
特殊化した組織における創傷は、その特殊化した組織によって馴化された培地を必要とすることがある。例えば、神経組織への損傷は、神経細胞培養物によって馴化された培地に含まれるタンパク質を必要とすることがある。特定の生成物を誘導してもよく、あるいは免疫親和性クロマトグラフィーによって代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を濃縮化してもよく、または例えばＮＧＦなどの所望のタンパク質の特定の培地からの発現を増強してもよい。ＮＧＦによって制御される特性には、コリン作動性神経伝達物質の機能（アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）およびアセチルコリン合成酵素（ＣｈＡＴ））、神経細胞のサイズ、およびＩＩ型ＮＧＦ受容体の発現が含まれるが、それらに限定されない。三次元的間質組織上で培養したグリア細胞および他の神経細胞によって馴化された馴化培地中にＮＧＦが分泌され、これを神経治癒用の組成物に使用することができる。
【０１８４】
内因性ＮＧＦの欠損は、特定のヒト神経変性障害を悪化させ、損傷を受けた成熟ＣＮＳニューロンの再生は明らかに不能である。具体的には、神経の損傷後、細胞体から軸索が分離した結果、その損傷遠位の神経線維の変性が生じる。中枢神経系において、損傷部位には顕著な成長が存在せず、典型的には損傷を受けたニューロンの死を引き起こす。ＮＧＦは、細胞体レベル（例えば中隔）、介在組織空間（例えば神経ブリッジ）、および再神経支配範囲（例えば海馬体）における、成熟ＣＮＳコリン作動性ニューロンの再生能力において極めて重要な役割を果たす。さらに、ＮＧＦは、認知障害の改善において有益な場合がある。例えば、グリア細胞で馴化した代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、外因性のＮＧＦおよび他の神経成長因子の活性を供給することによって、損傷を受けた神経の切断端から新しい軸索を成長させて（例えば、成長円錐の発生）、元の結合部位まで伸長させることができる。
【０１８５】
さらに、脳および脊髄の損傷は、併発する軸索変性に対するグリアの応答をしばしば伴い、その結果瘢痕組織を生じる。この瘢痕組織が、最初は神経発育に対する物理的障壁であると考えられたが、非常に重要なことは、ニューロン外の環境における神経栄養因子の存在の有無である。星状膠細胞は、損傷に応答してラミニンを合成することができると思われる（ラミニンは、代謝馴化成長培地中にも認められる）。コラーゲンおよびフィブロネクチン、また特にラミニンは、インビボでの培養したニューロンまたは神経外植片からの神経突起の成長を促進することが判明している。これらの細胞外マトリックスタンパク質は、成長円錐の前方移動および軸索の伸長を促進する接着性の基層を提供すると思われる。したがって、神経栄養因子および支持基層の存在が神経再生の成功に必要であるが、これは再生に、神経細胞体が適切な生合成応答を開始できること、および損傷部位の周囲環境が軸索の伸長および最終的な機能的再結合を支持できることが必要であると考えられるためである。星状細胞およびグリア細胞などの神経細胞によって馴化された代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、脳および脊髄の損傷における神経再生に必要な神経栄養成長因子および細胞外マトリックスタンパク質の活性を含む。したがって、一実施形態において、代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、そのような損傷の治療のために製剤化される。
【０１８６】
他の実施形態において、皮膚、骨、肝臓、膵臓、軟骨、および他の特殊化した組織の治療は、それらのそれぞれの特殊化した細胞型によって馴化した培地を用いて治療することができ、この培地は、好ましくは三次元で培養され、結果としてそのそれぞれの種類の組織の創傷の治療に有用な、特徴的な細胞外タンパク質およびその種類の組織の他の代謝物を含む馴化培地を生じる。
【０１８７】
また、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、均一な組織修復を促進するために歯周外科で使用する装置に添加してもよく、生分解性コンタクトレンズ、角膜シールド、または骨移植片を提供するため、外科的空間充填剤を提供するため、特に皮膚において皮膚の皺の軽減を目的として、軟組織増大を促進するため、ならびに失禁の制御を目的として尿道括約筋の増強物として添加してもよい。
【０１８８】
別の実施形態において、組成物は、凍結乾燥／フリーズドライし、創傷充填剤（例えば、移植用のヘアプラグによって残された孔を充填する）として添加しても、または創傷治癒を加速するために既存の創傷充填組成物に添加してもよい。別の実施形態では、培地を遺伝子操作した細胞で馴化して、培地中の創傷治癒タンパク質の濃度を増加させる。例えば、遺伝子産物、例えば上記に挙げた成長因子のいずれかを発現するように、細胞を遺伝子操作してもよい。
【０１８９】
Ｃ．  先天性奇形、後天性欠陥、および美容上の欠陥の修復および矯正
上記に開示したように、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、先天性および後天性の様々な奇形、ならびに表在性および浸潤性の美容上の欠陥を修復または矯正するためにも使用することができる。一実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、細い線状皺および皺；年齢によるしみおよび色素沈着異常；皮膚のきめ、色合い、および弾力性の低下；粗さおよび光損傷；皮膚の自己再生能力の低下；環境的損傷；皮膚の滑らかさおよび締まりの減少；年齢によるしみ；細いおよび太い線状皺および皺；細いおよび太い目周囲の皺；法令線；顔面の細いおよび太い線状皺；皮膚の輝きおよび均一性の低下；皮膚の張りの低下；色素沈着過剰；しみおよび／または斑点；皮膚の明るさおよび若々しい外観の低下；光により老化した皮膚；内因的および外因的に老化した皮膚；皮膚細胞のターンオーバー異常；皮膚バリアの低下；皮膚の水分保持能力の低下；茶色および赤色のあざ；赤み；皮膚の表皮厚の異常；真皮表皮接合部の減少；毛穴サイズおよび毛穴数の増加；あるいはそれらの組み合わせを治療または予防するために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、日光による損傷を受けた皮膚および加齢皮膚を若返らせる；細い線状皺および皺の外観を改善する；細胞再生を促進する；および／または皮膚の色合い、きめ、および／または張りを改善するために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、皮膚をふっくらさせる、および／または皮膚を明るくするおよび／または色を薄くするために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、皮膚の自己再生能力を強化する；年齢によるしみの外観を改善する；および／または皮膚の張り、弾力性、および／または反発力を改善するために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、皮膚の細い線状皺を滑らかにする、引き締める、および／または充填するために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、目の下のくまの外観を減少させるために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、唇のきめおよび／または状態を改善する、自然の唇の色を鮮やかにする、および／または唇のボリュームを増加させるために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、術後の皮膚の上皮化を促進する、および／または皮膚のバリアおよび／または水分バランスを取り戻すために使用することができる。別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、年齢によるしみおよび／または色素沈着の外観を改善するために使用することができる。
【０１９０】
例えば、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を含む組成物は、いかなる形態で添加してもよく、ヒドロゲル、注射剤、クリーム、軟膏として使用してもよく、さらにアイシャドウ、固形ファンデーション、コンパクト、または他の化粧品に添加して皮膚を局所的に強化してもよい。
【０１９１】
別の実施形態において、代謝馴化成長培地の局所適用または注射や経口などの任意の既知の方法による適用を実施して、皺、ならびに例えば紫外線、種々の汚染物質への曝露、および正常な加齢によって誘発される多くの有害効果を逆転させる、および／または予防する。
【０１９２】
さらに、別の実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を使用して、細胞老化を軽減し、皮膚癌を引き起こす因子の活性を阻害する。代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物が抗酸化活性を有することは、実施例において示される。ここでも、哺乳動物への適用は、局所適用または注射や経口などの任意の既知の方法による適用であってよい。本出願人らは、本出願人らの代謝馴化成長培地と接触させたヒト角化細胞において、およそ５０％の細胞内酸化の統計的に有意な（ｐ＜０．００３）低下が認められることを発見した。
【０１９３】
したがって、表皮細胞および真皮細胞の増殖ならびにインビトロでのコラーゲン分泌を誘導することに加えて、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は抗酸化活性を有する（実施例１８を参照）。
【０１９４】
この滅菌濃縮栄養溶液は、容易に大量入手でき、またヒトの皮膚、毛髪、および爪における成長因子およびマトリックス分子のレベルを補うための様々な皮膚用、化粧用、および皮膚科用の製品の添加物として有用となり得る、生物工学によって作製された薬用化粧品を表す。製品は、αヒドロキシ酸剥脱剤とともに使用して、成長因子および他の生体分子の皮膚への浸透を潜在的に最適化すること、および化学的ピーリング剤とともに使用して、潜在的に治癒を促進し炎症を軽減することが想定されている。
【０１９５】
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、シリコーンまたは他の製品を用いて行う代わりに、皺、眉間の縦皺、瘢痕、および他の皮膚状態を除去するために製剤化してもよい。代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、成長因子および炎症性メディエーター、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、およびＴＦＧβ、ならびに細胞外マトリックスタンパク質、例えばＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン、グリコサミノグリカン、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、ＫＧＦ、バーシカン、デコリン、ベータグリカン、シンデカン、ならびに他の種々の分泌型ヒト皮膚マトリックスタンパク質の活性を含み、これらは身体的奇形や美容上の欠陥を修復するのに有用である。
【０１９６】
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、注射用製剤に製剤化することができる。あるいは、馴化培地に由来する生成物を製剤化することもできる。例えば、本開示の組成物の注射後のタンパク質および薬物などの生物学的に活性な物質の放出または制御放出のために、これらの活性物質を本開示の組成物に組み込んでもよい。例示的な生物学的に活性な物質には、注射部位における治癒および組織修復を促進する、ＴＧＦ−βなどの組織成長因子を含み得る。生成物の精製方法には、馴化培地のＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）などのマトリックスを使用したゲルクロマトグラフィー、イオン交換、架橋アガロースなどの不溶性マトリックスを用いた金属キレート親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれるが、それらに限定されない。このような技術は、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（上記参照）、Ｓａｎｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにより詳細に記載されている。
【０１９７】
注射用の実施形態では、水性懸濁液を使用し、この水性懸濁液の製剤は、生理的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．８〜７．５）を有してもよい。さらに、通常はリドカインなどの局所麻酔薬を（通常は濃度約０．３重量％で）添加して、注射時の局所的な痛みを軽減する。最終的製剤は、マルトースなどの液体潤滑剤も含んでよく、これは身体が耐性を有するものでなければならない。例示的な潤滑剤成分には、グリセロール、グリコーゲン、マルトースなどがある。また、有機ポリマー系材料、例えばポリエチレングリコールおよびヒアルロン酸、ならびに非線維性コラーゲン、好ましくはサクシニル化コラーゲンも潤滑剤として機能し得る。そのような潤滑剤は、注射部位における注射される生体材料の注射性、侵入性、および分散性を改善し、組成物の粘度を変更することによりスパイキング量を減少させるために一般に使用される。最終的製剤は、当然ながら、薬学的に許容可能な担体中の処理された代謝馴化成長細胞培地である。
【０１９８】
続いて、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を組織欠陥部位に正確に配置するための注射器または他の注射装置に、処理された本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を入れる。皮膚増大用の製剤の場合、「注射用」という用語は、その製剤が、通常圧力下の通常の条件下で、実質的なスパイキングを用いずに、２５程度の低ゲージの注射器から分注可能であることを意味する。スパイキングにより、組成物が組織内に注入されずに注射器から滲出する可能性がある。この正確な配置のためには、針は２７ゲージ（内径２００μ）程度か、またはさらに３０ゲージ（内径１５０μ）の細い針が望ましい。そのような針を通して押し出し可能な最大粒子サイズは、少なくとも以下のものの複合関数である：粒子の最大寸法、粒子のアスペクト比（長さ：幅）、粒子の剛性、粒子の表面粗さ、および粒子間接着に影響を与える関連因子、懸濁流体の粘弾性特性、ならびに針を通過する流速。ニュートン流体に懸濁させた剛性球体ビーズは最も単純な例であり、粘弾性流体中の繊維状または分岐状の粒子はより複雑なものであり得る。
【０１９９】
注射用の本開示の分泌型代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物を調製するための方法における上述のステップは、好ましくは、滅菌材料を使用して滅菌条件下で実施する。薬学的に許容可能な担体中の処理された本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、皮内注射または皮下注射して、軟組織を増大し、先天性奇形、後天性欠陥、または美容上の欠陥を修復または矯正することができる。そのような状態の例には、先天性奇形、例えば顔面半側萎縮症、頬部および頬骨の形成不全、片側性乳房発育不全、漏斗胸、大胸筋欠損（ポーランド奇形）、ならびに口蓋裂修復または粘膜下口蓋裂に続発する口蓋帆咽頭不全（咽頭後移植片として）；後天性欠陥（外傷後、手術後、感染後）、例えば、陥凹性瘢痕、皮下萎縮（例えば、円板状エリテマトーデスに続発する）、角化性病変、眼球摘出した目における眼球陥入（また肺尖部症候群）、顔面のざ瘡後陥凹、皮下萎縮を伴う線状強皮症、鞍鼻変形、ロンベルグ病および一側性声帯麻痺；さらに美容上の欠陥、例えば、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、ならびに乳房発育不全がある。また、本発明の組成物を身体の括約筋を画成する組織などの内部組織に注射して、かかる組織を増大させることもできる。
【０２００】
培地を馴化するために使用する他の組織の種類には、骨髄、皮膚、上皮細胞、および軟骨が含まれるが、それらに限定されない。しかしながら、この三次元培養系を他の種類の細胞および組織とともに使用してもよいことは明確に理解される。
【０２０１】
あるいは、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、創傷治療に関して前項に記載したように、重合性または架橋性のヒドロゲルとともに製剤化してもよい。
【０２０２】
Ｄ．  薬学的用途
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、本明細書全体にわたり記載するように、成長因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体などの様々な有用な薬学的因子および成分を含有するため、様々な薬学的用途で有用である。また、添加可能な生成物には、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ステロイド、鎮痛剤、抗腫瘍薬、治験薬、または馴化培地中の因子との相補的もしくは相乗的組み合わせをもたらす任意の化合物が含まれるが、それらに限定されない。すでに記載したように、細胞を培養して無菌条件下で回収する。さらに、この培地を病原体について試験してもよい。滅菌を実施する場合、上述のように、所望の生物活性に対する影響を最小限に抑える形で実施しなければならない。培地は、培地中に含まれる１つまたは複数の因子または成分を濃縮する、または減少させるためにさらに処理してもよく、これは例えば、免疫親和性クロマトグラフィーを用いた成長因子の濃縮化、または逆に、本明細書に記載の任意の所定の用途にとってあまり望ましくない成分の除去である。好ましい実施形態において、三次元細胞構築物によって馴化された培地から製剤を作製する。三次元的培養は多数の成長因子およびタンパク質を産生し、それらは最適な生理学的比率および濃度で培地中に分泌される。例えば、表２を参照されたい。したがって、この培地は、インビボで認められるものに近似する因子と特定の比率との固有の組み合わせを提供する。本出願において、ウシ血清は一般に好ましくない。細胞の残屑または他の特定の物質、ならびにプロテアーゼ、乳酸、および細胞成長に悪影響を及ぼす可能性がある他の成分を除去することが好ましいことがある。
【０２０３】
当業者によって一般に使用されるアッセイを利用して、特定の（１つまたは複数の）因子の活性を試験することによって、付着分子もしくはカプセル化分子が許容可能なレベルの生物活性（例えば、治療上有効な活性）を保持していることを確認できる。
【０２０４】
したがって、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物ならびにその培地に由来する生成物を使用して、例えば、糖尿病の治療におけるインスリン、アルツハイマー病治療用の神経成長因子、血友病治療用の第ＶＩＩＩ因子および他の凝固因子、パーキンソン病治療用のドーパミン、慢性疼痛治療用の副腎クロマフィン細胞を介したエンケファリン、筋ジストロフィー治療用のジストロフィン、ならびに成長異常治療用のヒト成長ホルモンを提供することができる。
【０２０５】
このような治療用タンパク質剤の用量は当業者に周知であり、ＰＨＹＳＩＣＩＡＮＳ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ，ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｕｂｌ．，ＴＨＥ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ  ＳＯＵＲＣＥ  ＢＯＯＫ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓなどの薬学全書に記載されている。
【０２０６】
上記の薬物または薬剤のいずれの治療有効用量も、当業者に周知の技法を用いて慣習的に決定することができる。「治療有効」用量とは、治療される過程および／または疾病の少なくとも１つの症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量を指す。
【０２０７】
薬物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療上有効用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数であり、これは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を減少させるために、かかる化合物に罹患組織部位を標的とさせる送達系を設計するように注意すべきである。
【０２０８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から取得したデータは、ヒトに使用するための投薬量範囲を処方する際に使用できる。かかる化合物の投薬量は、ほとんどまたは全く毒性を有さないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。投薬量は、使用する剤型および利用する投与経路に応じて、この範囲内で異なってもよい。本開示の方法において使用するいかなる化合物についても、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。循環血漿濃度範囲は、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２０９】
さらに、細胞および組織を遺伝子操作して、例えばインスリンなどの所望の産物の発現を増強してもよく、および／または標的遺伝子発現および／または活性に対する抑制効果を有し得る、例えばリボザイム、アンチセンス分子、および三重ヘリックスなどの上記の遺伝子産物を標的とするヌクレオチド配列および／もしくは部分を発現させてもよい。これは、培地中の特殊化した間質細胞が特定の構造的／機能的役割を果たし得る組織、例えば、神経組織のグリア細胞、肝臓のクッパー細胞などを培養する場合に有利となり得る。
【０２１０】
Ｅ．  毛髪の成長刺激
培地は、例えばヒト毛乳頭細胞を用いて馴化してもよい。好ましくは、かかる細胞によって馴化した培地は、三次元で成長させる。毛乳頭細胞は、毛髪の形成、成長、および回復において極めて重要な役割を果たす間葉幹細胞の一種である（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ，６：５２４−５３０（１９９８））。続いて代謝された馴化成長培地は、好ましくは濃縮し、局所用製剤として適用する。代謝馴化培地組成物は、皮膚内への化合物の浸透を容易にする薬剤、例えばＤＭＳＯを用いて局所適用のために製剤化し、毛髪の成長を刺激するための局所適用として適用してもよい。
【０２１１】
本開示の組成物は、局所適用時に毛包への上皮細胞の遊走を増加させる因子を提供することにより、毛髪の成長を促進または回復させる。さらに、代謝馴化培地に認められる因子以外に、ミノキシジルおよび抗生物質などの他の化合物を使用することもできる。毛髪の成長において、退行期（成長期と休止期との間の毛包の移行期）および休止期（静止期）に血液供給が減少する。男性型脱毛症のベニガオザルモデルを含む、当分野で既知のアッセイを使用して、毛髪成長のこれらの期に使用するための代謝馴化細胞培地由来の生物活性分子を決定および最適化することができる。例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｐ．ａ．，Ａ．Ｃａｐｐａｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｕｎｏ，Ｔｈｅ  Ｓｔｕｍｐｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ  Ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｒａｍ，Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９８８，６（４）：ｐ．１７７−８７、Ｄｉａｎｉ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｍｉｌｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｃａｌｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｍｐｔａｉｌ  Ｍａｃａｑｕｅ  Ｍｏｎｋｅｙ，ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９４，１０２（４）：ｐ．５１１−４、Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｌｏｐｅｃｉａ，Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９８８，６（４）：ｐ．１５９−１６２、Ｐａｎ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＵ５８８４１  ａｓ  ａｎ  Ａｎｔｉ−Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ＰＣ３  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ａｎｔｉ−Ａｌｏｐｅｃｉａ  Ａｇｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｌｄ  Ｓｃａｌｐ  ｏｆ  Ｓｔｕｍｐｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１９９８，９（１）：ｐ．３９−４３、Ｒｉｔｔｍａｓｔｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｏｘｏ−４−ａｚａ−５  ａｌｐｈａ−ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ−１７  ｂｅｔａ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ａ  ５  ａｌｐｈａ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ，ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂａｌｄｎｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｍｐｔａｉｌ  Ｍａｃａｑｕｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，１９８７，６５（１）：ｐ．１８８−９３（それぞれ参照により全体が援用される）を参照されたい。さらなるモデルには、無毛部および有毛部から培養した毛包からの毛包増殖の差を測定する新生児ラットモデルならびに円形脱毛症のラットモデルが含まれる。Ｎｅｓｔｅ，Ｄ．Ｖ．，Ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ｈａｉｒ  ｉｎ  Ｎｕｄｅ  Ｍｉｃｅ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｃｌｉｎ．，１９９６，１４（４）：ｐ．６０９−１７、ＭｃＥｌｗｅｅ，Ｋ．Ｊ．，Ｅ．Ｍ．Ｓｐｉｅｒｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｏｌｉｖｅｒ，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｈａｉｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＥＢＲ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｌｏｐｅｃｉａ  Ａｒｅａｔａ，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９６，１３５（２）：ｐ．２１１−７、Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ａｒａｂｉｎｏｗｉｄｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｌｏｐｅｃｉａ  ｂｙ  Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９５，３４（７）：ｐ．４７０−３、Ｏｌｉｖｅｒ，Ｒ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＤＥＢＲ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｌｏｐｅｃｉａ  Ａｒｅａｔａ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９１，９６（５）：ｐ．９７８、Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｌｏｐｅｃｉｃ（ＤＥＢＥＲ）  Ｒａｔ，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９０，１２３（５）：ｐ．５５７−６７（それぞれ参照により全体が援用される）を参照されたい。
【０２１２】
Ｖ．  他の用途
Ａ．  食品添加物および栄養補助食品
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、食品添加物として使用してもよく、栄養補助食品に配合してもよい。本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、個々の食品または商品群には認められない必須アミノ酸、ミネラル、およびビタミンを含む多くの有用な栄養素を豊富かつ多様に含有する。本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、体重減少のため、あるいは特に第三世界諸国において、食品の栄養含有量を強化するための、バランスの取れた栄養補助剤の安価な供給源として使用することができる。本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、滅菌性であり、ヒト病原体により汚染されていない（すなわち無菌）。本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、濃縮および／または凍結乾燥してもよく、好ましくは摂取用のカプセル剤または錠剤として投与してもよい。あるいは、組成物を、成人用または乳児用の食品に直接添加して、栄養含有量を強化してもよい。この豊かな栄養源は、比較的安価に加工することができ、また栄養不良の老人、また特に、感染に対する応答の不良による死亡率の増加が栄養失調に関連している発展途上諸国の子供達には、極めて有益となり得る。
【０２１３】
さらに、鉄およびマグネシウムなどの多くの微量元素は、哺乳動物の生存および生殖には不可欠であり、わずかな微量元素の欠乏が公衆衛生問題となり得るという懸念がある。種々の必須微量栄養素の摂取は、感染症を減少させ、また発癌の特定の段階を変化させて癌の危険性を低下させることが示されている。また、微量栄養素は、特に種々のサイトカインの産生を増進して、侵入病原体に対するそれらの食細胞作用および細胞傷害作用を促進することによって、および／または種々の重要器官に出現する前癌性細胞を破壊することによって、免疫系の機能活性、またそのＴ細胞およびＢ細胞、Ｍφｓ、ならびにＮＫ細胞の相互作用機序を強化する。Ｃｈａｎｄｒａ，Ｒ．Ｋ．ｅｄ．（１９８８），Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。したがって、バランスの取れた栄養素の比較的安価な供給源が必要とされている。馴化培地で強化するのに理想的な食品は、パン、シリアル、ならびにパスタ、クラッカーなどの他の穀物製品である。また、代謝培地は、培地中に含まれる１つまたは複数の因子または成分を濃縮する、または減少させるためにさらに処理してもよく、これは例えば、免疫親和性クロマトグラフィーを用いた成長因子の濃縮化、または逆に、本明細書に記載の任意の所定の用途にとってあまり望ましくない成分の除去である。
【０２１４】
Ｂ．  動物飼料用の栄養補助剤
本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、動物飼料の栄養補助剤として使用してもよい。一実施形態において、本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、畜牛および他の反芻動物、例えば乳牛、シカなどの哺乳動物にとって有益なタンパク質および他の因子の供給源を提供するウシ血清を含有する。培地は、病原体についてスクリーニングされ、ウシ病原体およびマイコプラズマを含まない。本開示の代謝馴化成長培地および／または代謝細胞抽出物は、好ましくはアメリカ合衆国で育てた乳牛に由来することにより、病原体の可能性が著しく低下する。
【０２１５】
一実施形態において、代謝馴化成長培地が酵母細胞によって代謝された馴化成長培地である、代謝馴化成長培地と許容可能な担体とを含む組成物が提供される。一部の実施形態において、馴化成長培地は、細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために要求される栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養することによって調製される。一部の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。一部の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。他の実施形態において、組成物は、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。一部の実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、感染後に生じる医学的状態、または医療処置後の欠陥である。
【０２１６】
他の実施形態において、代謝細胞抽出物が酵母細胞によって代謝された細胞抽出物である、代謝細胞抽出物と許容可能な担体とを含む組成物が提供される。一部の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。他の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。さらに他の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。また他の実施形態において、組成物は、皮膚状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥を治療または予防するために使用される。一部の実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。さらに他の実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、感染後に生じる医学的状態、または医療処置後の欠陥である。
【０２１７】
また他の実施形態において、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために要求される栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝馴化成長培地が提供される。
【０２１８】
一部の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞である。さらに他の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝馴化成長培地を処理すること、をさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。
【０２１９】
さらに他の実施形態において、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために要求される栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の代謝馴化成長培地を調製するための方法が提供される。
【０２２０】
一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、許容可能な担体と混合してもよい。さらに他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、または組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で存在する。また他の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。また他の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。一部の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。
【０２２１】
また、本明細書において、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、を含む方法によって調製された代謝細胞抽出物も提供される。
【０２２２】
一部の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。他の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。一部の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝細胞抽出物を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。
【０２２３】
一実施形態において、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために要求される栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝馴化成長培地と、を含む組成物が提供される。
【０２２４】
一部の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞である。一部の実施形態において、この組成物は、（ｅ）代謝馴化成長培地を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、または組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で存在する。他の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。さらに他の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。
【０２２５】
また、本明細書において、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝細胞抽出物と、を含む組成物も提供される。
【０２２６】
一実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。一部の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。他の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝細胞抽出物を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、または組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で存在する。一部の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。他の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。また他の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。
【０２２７】
また、本明細書において、対象における状態を予防または治療するための方法であって、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞をインビトロで成長させて馴化成長培地を形成するために要求される栄養必要量を満たすのに十分な成長培地でその細胞を培養し、その培養細胞から前記馴化成長培地を取り出すこと、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記馴化成長培地に暴露させること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記馴化成長培地の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝馴化成長培地を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝馴化成長培地と、を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。
【０２２８】
一実施形態において、この状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。他の実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、感染後に生じる医学的状態、または医療処置後の欠陥である。さらに他の実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。他の実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。他の実施形態において、ステップ（ａ）の細胞は線維芽細胞である。他の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝馴化成長培地を処理すること、をさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、または組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。非限定的な一例において、代謝馴化成長培地は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。また他の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。さらに他の実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。他の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。また他の実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。一実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、または約６０％〜約１００％上方調節される。別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲンタンパク質またはリシルヒドロキシラーゼタンパク質である。また別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子またはＰＬＯＤ１遺伝子によってコードされる。一実施形態において、少なくとも１つの修復タンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。別の実施形態において、修復タンパク質は、約１０％〜約７０％、約３５％〜約５０％、または約２５％〜約５０％上方調節される。別の実施形態において、修復タンパク質はフィブロネクチンタンパク質である。別の実施形態において、修復タンパク質は、ＦＮ１遺伝子によってコードされる。また別の実施形態において、少なくとも１つの細胞結合性タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％〜約２００％、約１０％〜約８０％、または約３０％〜約５０％上方調節される。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質はインボルクリンタンパク質である。また他の実施形態において、細胞結合性タンパク質はＩＶＬ遺伝子によってコードされる。一実施形態において、少なくとも１つの抗酸化タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％〜約３００％、約１０％〜約５０％、または約２００％〜約２５０％上方調節される。別の実施形態において、抗酸化タンパク質はスーパーオキシドジスムターゼタンパク質である。また他の実施形態において、抗酸化タンパク質は、ＳＯＤ２遺伝子によってコードされる。
【０２２９】
また、本明細書において、対象における状態を予防または治療するための方法であって、許容可能な担体と、
（ａ）  細胞抽出物を提供すること、
（ｂ）  酵母細胞を培養すること、
（ｃ）  その酵母細胞を前記細胞抽出物に暴露すること、
（ｄ）  その酵母細胞を培養して、前記細胞抽出物の少なくとも一部を代謝させること、
（ｅ）  前記代謝細胞抽出物を回収すること、
を含む方法によって調製された代謝細胞抽出物と、を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。
【０２３０】
一部の実施形態において、この状態は、美容上の欠陥、先天性欠陥、脱毛、または後天性欠陥である。一部の実施形態において、後天性欠陥は、外傷後、手術後、感染後に生じる医学的状態、または医療処置後の欠陥である。他の実施形態において、美容上の欠陥は、眉間の縦皺、深い鼻唇溝、口囲地図状（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）皺、落ちくぼんだ頬、または乳房発育不全である。一実施形態において、酵母はピキア・パストリスである。別の実施形態において、細胞抽出物は線維芽細胞に由来する。また別の実施形態において、この方法は、（ｅ）代謝細胞抽出物を処理することをさらに含み、この処理は、濃縮、濾過、精製、またはそれらの組み合わせである。また他の実施形態において、代謝馴化成長培地は、組成物の約０．０００１重量％〜約９５重量％、組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、または組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。非限定的な一例において、代謝細胞抽出物は、組成物の約１０重量％、約１５重量％、または約２０重量％の量で組成物中に存在する。また他の実施形態において、組成物は、水、界面活性剤、乳化剤、調整剤、軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、固定剤、着色剤、栄養補助剤、薬用化粧品、治療薬、医薬品、抗真菌剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、抗ニキビ成分、日焼け止め剤、および保存剤のうち少なくとも１つをさらに含む。一実施形態において、組成物は注射用組成物または局所用組成物である。別の実施形態において、局所用組成物は、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、またはローションである。一実施形態において、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質は、この組成物の対象への投与により上方調節される。別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、または約６０％〜約１００％上方調節される。さらに別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲンタンパク質またはリシルヒドロキシラーゼタンパク質である。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子またはＰＬＯＤ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態において、少なくとも１つの修復タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。一実施形態において、修復タンパク質は、約１０％〜約７０％または約２５％〜約５０％上方調節される。別の実施形態において、修復タンパク質はフィブロネクチンタンパク質である。また別の実施形態において、修復タンパク質は、ＦＮ１遺伝子によってコードされる。一実施形態において、少なくとも１つの細胞結合性タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。別の実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％〜約２００％、約１０％〜約８０％、または約３０％〜約５０％上方調節される。また別の実施形態において、細胞結合性タンパク質はインボルクリンタンパク質である。また別の実施形態において、細胞結合性タンパク質はＩＶＬ遺伝子によってコードされる。一実施形態において、少なくとも１つの抗酸化タンパク質は、この組成物の対象への投与によって上方調節される。別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％〜約３００％、約１０％〜約５０％、または約２００％〜約２５０％上方調節される。別の実施形態において、抗酸化タンパク質はスーパーオキシドジスムターゼタンパク質である。また別の実施形態において、抗酸化タンパク質は、ＳＯＤ２遺伝子によってコードされる。
【実施例】
【０２３１】
実施例１：線維芽細胞の単層細胞培養
前馴化細胞培養培地（この実施例では、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）に１０％仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、非必須アミノ酸（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン−２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を補充したもの（「ＤＭＥＭ  １」））を用い、１５０ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）中、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターで、ヒト包皮から単離した正常ヒト皮膚線維芽細胞を単層培養物として培養した。単層培養物に新鮮な前馴化培地を週２回供給し、記載のように１：１０分割を用いて週１回継代した。概して、Ｐｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏ．，１８３：７４  ８２（２０００）を参照されたい。また、皮膚線維芽細胞は、ＤＭＥＭ  １を含むローラーボトルで増殖させてもよい。これらの単層培養物からの馴化培地を回収して後の使用のために確保する。
【０２３２】
この実施例では例示目的で線維芽細胞を使用したが、当業者は、他の種類の上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、筋細胞、角化細胞、軟骨細胞などを含むがそれらに限定されない多くの他の種類の細胞を単層培養および三次元培養で成長させてもよいことを理解するであろう。
【０２３３】
実施例２：培地の馴化
‘７６６特許に記載され、また上記に詳細に記載した装置の基質上にヒト皮膚線維芽細胞を播種した。この基質は、基質の表面上での三次元組織成長を容易にするように設計されたケース内にあり、細胞を高グルコースＤＭＥＭ（１０％  ＢＣＳに２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５０ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸を補充）中、３７℃、加湿、５％  ＣＯ２の環境の閉鎖システム内で培養した。１０日後、細胞培養物を取り出し、新鮮培地を添加した。この細胞をさらに４日間上述のように培養した。細胞および組織培養物と４日間（１０日目〜１４日目）接触させて得られた馴化培地を、次いで個々のチャンバーから取り出してプールした。この馴化培地（およそ５〜１０リットル／プール）を２００ｍｌの一定分量に分注し、１０，０００ＭＷ分画分子量のフィルターを有する加圧濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてさらに１０〜２０倍に濃縮した。得られた１０〜２０ｍｌの濃縮馴化培地を分析のためにｌｍｌの一定分量に分注して−２０℃で凍結した。１倍濃度の馴化培地は、１０倍の馴化培地を１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液として基本培地に添加して得られる。同様に、１倍濃度の「培地」または「無血清培地」は、１０倍の培地（すなわち、基本培地）または１０倍の無血清培地（血清を含まない基本培地）を１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液として基本培地に添加して得られ、これを対照として使用する。
【０２３４】
実施例３：代謝馴化成長培地の調製
ａ．  生物および培地
ピキア・パストリス（野生型株）を酵母細胞培養物として発酵研究に用いた。保存株を酵母−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）寒天平板上で維持した。親保存株をＹＰＤブロス中で培養し、−２０℃に維持した。グリセロールを補充した酵母窒素基本（ＹＮＢ）成長培地（２．７％  Ｈ３ＰＯ４、０．０９％  ＣａＳＯ４、１．８％  Ｋ２ＳＯ４、１．５％  ＭｇＳＯ４、０．４１％  ＫＯＨ、４％  グリセロール（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有）中で発酵を実施した。馴化成長培地は、ＳｋｉｎＭｅｄｉｃａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により提供された。
【０２３５】
ｂ．  発酵槽
この発酵過程をこの酵母の標準成長条件を用いた２Ｌおよび１５Ｌの発酵段階（２ＬはＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪおよび１５ＬはＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）にスケールアップした。
【０２３６】
ｃ．  馴化成長培地の代謝条件
グリセロールを補充した酵母窒素基本（ＹＮＢ）成長培地（２．７％  Ｈ３ＰＯ４、０．０９％  ＣａＳＯ４、１．８％  Ｋ２ＳＯ４、１．５％  ＭｇＳＯ４、０．４１％  ＫＯＨ、４％  グリセロール）中、流加培養物を２９℃で成長させた。２Ｍ  ＮＨ４ＯＨを用いた滴定によって、ｐＨを５．０±０．５で一定に維持した。溶存酸素濃度を滅菌可能なＤＯプローブで測定し、撹拌速度を１００〜６００ｒｐｍで調節することによって酸素飽和度を３０％に維持した。酵母の活発な増殖期に液体培地を発酵槽内に接種することによって、馴化成長培地をサプリメントとして発酵過程に導入した。ピキア・パストリスの対数増殖期に流加過程を開始した。発酵中にピキア・パストリスの光学密度をモニターすることによって、成長を測定した。ピキア・パストリスによって馴化成長培地が代謝されるまで（ピキア・パストリスの増殖期の対数期から定常期への変化で判断される）発酵を実施した。発酵は、馴化成長培地が完全に代謝される完了まで実施してもよく、または部分的に発酵（すなわち部分的に代謝）してもよい。
【０２３７】
馴化成長培地は、この代謝馴化成長培地を好適なビヒクルと混合する前に、濃縮、濾過、および／または精製してもよい。
【０２３８】
実施例４：代謝細胞抽出物の調製
ａ．  細胞抽出物
全細胞抽出物は、当業者に既知の方法によって、例えば動物細胞または植物細胞から取得する。
【０２３９】
ｂ．  生物および培地
ピキア・パストリス（野生型株）を酵母細胞培養物として発酵研究に用いる。保存株を酵母−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）寒天平板上で維持する。親保存株をＹＰＤブロス中で培養し、−２０℃に維持する。グリセロールを補充した酵母窒素基本（ＹＮＢ）成長培地中（２．７％  Ｈ３ＰＯ４、０．０９％  ＣａＳＯ４、１．８％  Ｋ２ＳＯ４、１．５％  ＭｇＳＯ４、０．４１％  ＫＯＨ、４％  グリセロール（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有）で発酵を実施する。
【０２４０】
ｂ．  発酵槽
この発酵過程をこの酵母の標準成長条件を用いた２Ｌおよび１５Ｌの発酵段階（２ＬはＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪおよび１５ＬはＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）にスケールアップする。
【０２４１】
ｃ．  細胞抽出物代謝条件
グリセロールを補充した酵母窒素基本（ＹＮＢ）成長培地（２．７％  Ｈ３ＰＯ４、０．０９％  ＣａＳＯ４、１．８％  Ｋ２ＳＯ４、１．５％  ＭｇＳＯ４、０．４１％  ＫＯＨ、４％  グリセロール）中、流加回分培養物を２９℃で成長させる。２Ｍ  ＮＨ４ＯＨを用いた滴定によって、ｐＨを５．０±０．５で一定に維持する。溶存酸素濃度を滅菌可能なＤＯプローブで測定し、撹拌速度を１００〜６００ｒｐｍで調節することによって酸素飽和度を３０％に維持する。酵母の活発な増殖期に液体培地を発酵槽内に接種することによって、細胞抽出物をサプリメントとして発酵過程に導入する。ピキア・パストリスの対数増殖期に流加過程を開始する。発酵中にピキア・パストリスの光学密度をモニターすることによって、成長を測定する。ピキア・パストリスによって細胞抽出物が代謝されるまで（ピキア・パストリスの増殖期の対数期から定常期への変化で判断される）発酵を実施する。細胞抽出物は、この代謝細胞抽出物を好適なビヒクルと混合する前に、濃縮、濾過、および／または精製してもよい。
【０２４２】
ｄ．  三次元馴化培地の増殖活性
実施例２〜４の馴化培地および代謝馴化成長培地および代謝細胞抽出物は、場合によって、ヒト線維芽細胞および角化細胞の増殖を促進する能力について検査してもよい。ヒト線維芽細胞またはヒト基底角化細胞を９６ウェルプレート内に播種し（約５，０００細胞／ウェル）、最終濃度１倍の無血清培地、培地、または上記の実施例２〜４に記載した三次元馴化培地、代謝馴化成長培地、もしくは代謝細胞抽出物を補充した高グルコースＤＭＥＭ（１０％  ＢＣＳに２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１×抗生物質／抗真菌剤を補充したもの）中で培養する。これらの培養物を３７℃、加湿、５％  ＣＯ２の環境で３日間維持する。
【０２４３】
細胞増殖の評価として総核酸含有量を測定する市販の蛍光に基づく染色アッセイ（ＣｙＱｕａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒ）を用いて、細胞増殖を測定する。全アッセイを製造業者の使用説明に従って実施する。ブロッティングにより培地を取り出し、緑色蛍光色素であるＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ色素を含有する溶解緩衝液を用いて細胞を溶解させた。この色素は細胞の核酸と結合したとき強い蛍光増大を示し、その蛍光の量は試料中に存在する核酸の量に比例する。試料を遮光下で５分間インキュベートし、約４８０ｎｍ励起および約５２０ｎｍ発光極大に適したフィルターを備えるマイクロタイタープレートリーダーを用いて、試料の蛍光を測定した。標準物質として既知の濃度の仔ウシ胸腺ＤＮＡを使用して導いた標準曲線に対して、各ウェルで観測された蛍光の量を比較することによって、各試料中の核酸の量を算出した。
【０２４４】
例示的な結果を図３に示すが、馴化培地を含有する培地で培養した細胞は、２つの対照と比較したとき、線維芽細胞および角化細胞の両者の細胞増殖の増加をもたらした。
【０２４５】
実施例５：代謝馴化成長培地によるコラーゲンの組織内沈着の調節
ａ．  創傷治癒用途
無血清培地、培地、または三次元馴化培地の存在下で培養した組織の細胞外マトリックス中に分泌されたコラーゲンの量を測定することによって、三次元組織の調製および組成に対する代謝馴化成長培地の効果を検査した。
【０２４６】
ナイロンスキャフォールドをレーザーで切断して１１ｍｍ×１１ｍｍの正方形にし、０．５Ｍ  酢酸で洗浄し、ＦＢＳで十分に濯ぎ、８継代目の１２Ｆ臨床線維芽細胞を播種する（約３８，０００個／ｃｍ２）。最終濃度１倍の無血清培地、培地、または上述の代謝馴化成長培地を補充したＤＭＥＭ（１０％  ＢＣＳに２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびｌ×抗生物質／抗真菌剤を補充したもの）１ｍｌ中で、供給ごとにアスコルビン酸塩５０ｍｇ／ｍｌを添加して、培養物を成長させる。硫酸銅を最終濃度２．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、標準的インキュベーターの調節されたガス供給によって高酸素（４０％、大気中酸素の約２倍）に維持する。培養物（ｎ＝３以上）を３７℃、加湿、５％  ＣＯ２の環境で１０日間維持する。アスコルビン酸塩を含まない対照も含めた。
【０２４７】
ｂ．  コラーゲンの単離 
上述の最終濃度１倍の無血清培地、培地、または代謝馴化成長培地を補充した基本培地の存在下で成長させた三次元組織培養物から、コラーゲンを単離し、ほぼ均質になるまで精製する。精製したコラーゲン試料に勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動を実施し、クマシーブルーを用いて個々のタンパク質バンドを可視化し、総タンパク質（下記）と比較したコラーゲン特異的アルファ、ベータ、およびガンマバンドの量を評価することによって、最終試料調製物の純度を評価する。精製方法は、全試料で同様のパターンを生じるべきである。
【０２４８】
試料をＰＢＳ中、次いで滅菌水中で濯ぎ、その後０．５Ｍ  酢酸中で２〜６時間濯ぐ。次にこの試料を０．０１２Ｎ  ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍｌペプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｉｎｃ．）中、４℃で一晩消化させる。４℃で１３０００ｒｐｍの遠心分離を行い、試料を清澄化した。５Ｍ  ＮａＣｌを最終濃度０．７Ｍまで添加後、４℃で３０〜６０分間コラーゲンを沈殿する。沈殿したコラーゲンを４℃、１３０００ｒｐｍで３０〜６０分間の遠心分離により分離し、０．０１２Ｎ  ＨＣｌ中に再懸濁させる。
【０２４９】
ｃ．  分析
市販の比色アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．ＢＣＡ  アッセイキット）を用いて総タンパク質を測定し、このアッセイは製造業者の使用説明に従って実施する。総タンパク質を定量化するために、ウシ皮膚コラーゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃｏｈｅｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を標準物質として使用する。
【０２５０】
次いで、試料（１０ｍｇ）に３〜８％勾配ゲル上での電気泳動によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施する。単離したコラーゲンの試料を還元試料緩衝液中で９５℃まで加熱する。ゲルをクマシーブルーで染色し、脱染し、可視化のためにコンピュータでスキャンする。
【０２５１】
インビボでの向上したコラーゲン沈着には、傷治癒、加齢に伴って現れる皺および輪郭線の治療などの複数の用途があり、また麻痺のある患者または寝たきりの患者における褥瘡を生じやすい骨の隆起上へのマトリックス沈着を促進することもできる。
【０２５２】
実施例６：代謝馴化成長培地のインビボでの効果を評価する閉鎖パッチ試験
ａ．  実験計画：
６名の同意した健康な成人女性（３０〜６０歳）を登録する。除外基準には、タンパク質に対する過敏性、皮膚疾患、試験部位もしくはその付近の皮膚損傷、糖尿病、腎障害、心臓障害、もしくは免疫学的障害、抗炎症薬、免疫抑制薬、抗ヒスタミン薬、もしくは局所用薬、または化粧品の使用、および妊娠が含まれる。試験物質は、位置または順番の偏りを最少にするための交代方式で各被験者の右または左前腕上の試験部位（２部位、３．８ｃｍ２）に割り当てる。部位１はビヒクル対照に、部位２は治療薬（すなわち、代謝馴化成長培地）に指定する。閉鎖パッチは０．２ｍｌのビヒクルまたは治療薬のいずれかを含むＷｅｂｒｉｌ不織コットンパッドからなる。３Ｍプラスチック製低刺激性閉鎖テープでパッチを覆って留める。３名の被験者の前腕上に、２４時間周期で連続５回、毎日閉鎖パッチを配置する。残りの３名の被験者には、２４時間周期で連続１２回、毎日閉塞性パッチを配置する。最後のパッチの適用の翌日、各部位から２−ｍｍの生検を採取する。このプロトコルは研究機関Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓｋｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）のＩＲＢ承認を受け、またＣＦＲの第２１章、第５０部および第５６部に準拠する。
【０２５３】
ｂ．  評価：
光沢、剥皮、痂皮、亀裂、色素沈着過剰、および色素脱失について、総括的観察を採点する。刺激を５段階評価を用いて視覚的に点数化し、紅斑、浮腫、丘疹、および小疱（パッチ部位の２５％を上回る）、ならびに認識可能な反応（パッチ部位の２５％を下回る）、すなわち滲出、拡散、および硬化を場合によって伴う水疱反応について、数値的に採点した。有資格病理学者によるＨ＆Ｅ組織学的評価には、生存表皮の厚さ、表皮過形成（表皮肥厚）、顆粒細胞層の厚さ、炎症性浸潤、有糸分裂像、コラーゲンおよび弾性線維の外観、ならびに脈管に関するパラメータが含まれる。
【０２５４】
実施例７：ヒト内皮細胞の挙動の調節
代謝馴化成長培地の血管形成および内皮細胞運動性に対する効果を判定する。代謝馴化成長培地を濃縮（１０倍）または凍結乾燥する。
【０２５５】
ａ．  内皮細胞細管形成アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた内皮細胞細管形成アッセイを使用して、血管形成を評価する。
【０２５６】
ｂ．  創傷アッセイ
内皮細胞のコンフルエント層を引っ掻き、その結果生じた「創傷」の閉塞速度を測定し、細胞運動性を評価するために使用する。この「創傷」アッセイは、ｍｍ／ｈ（ミリメートル／時）での閉鎖の速度として測定する。
【０２５７】
実施例８：酵母抽出物の調製
ａ．  生物および培地
酵母細胞培養物は、ＡＴＣＣから入手した（ピキア・パストリス＃６０３７２）。保存株を酵母−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）寒天平板上で維持した。親保存株をＹＰＤブロス中で培養し、−２０℃に維持した。グリセロールを補充した酵母窒素基本（ＹＮＢ）成長培地（２．７％  Ｈ３ＰＯ４、０．０９％  ＣａＳＯ４、１．８％  Ｋ２ＳＯ４、１．５％  ＭｇＳＯ４、０．４１％  ＫＯＨ、４％  グリセロール（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有）中で発酵を実施した。この過程を通してＡｎｔｉｆｏａｍ  ｓｉｇｍａ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した。
【０２５８】
ｂ．  発酵槽
振盪フラスコ試験による処理の最適化後、この過程を２Ｌおよび１５Ｌの発酵段階にスケールアップした（２ＬはＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪおよび１５ＬはＡｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）。
【０２５９】
ｃ．  ストレス条件
グリセロールを補充した酵母窒素基本（ＹＮＢ）成長培地（２．７％  Ｈ３ＰＯ４、０．０９％  ＣａＳＯ４、１．８％  Ｋ２ＳＯ４、１．５％  ＭｇＳＯ４、０．４１％  ＫＯＨ、４％  グリセロール）中、流加回分培養物を２９℃で成長させた。２Ｍ  ＮＨ４ＯＨを用いた滴定によって、ｐＨを５．０±０．５で一定に維持した。溶存酸素濃度を滅菌可能なＤＯプローブで測定し、撹拌速度を１００〜６００ｒｐｍで調節することによって酸素飽和度を３０％に維持した。通気量をＩＶＶＭに設定した。
【０２６０】
実施例９：全層評価
上記に開示する代謝細胞抽出物をＭａｔＴｅｋ全層皮膚組織モデルで試験する。この皮膚モデルは、１）ヒト表皮の多層高分化モデルを形成するように培養した正常ヒト由来表皮角化細胞と、２）真皮を形成するようににコラーゲンマトリックス中に播種したヒト線維芽細胞と、からなる。組織は、到着次第、使用まで４℃で保管する。使用の際、組織をアガロース輸送用トレイから取り出し、アッセイ培地４ｍｌを含む６ウェルプレートに入れ、３７±２℃および５±１％  ＣＯ２で一晩平衡化する。一晩平衡化した後、この培地を新鮮培地４ｍｌと交換し、次いで試験材料（すなわち、代謝細胞抽出物）５０μｌを組織に局所的に適用する。次いでこの組織を３７＋２℃および５＋１％  ＣＯ２で２４時間インキュベートし、この処置の生理学的効果を経時的に測定する。
【０２６１】
実施例１０：リポソームカプセル化代謝馴化成長培地の調製
ダイズ由来のリン脂質およびレシチン層を含むリポソームに、代謝馴化成長培地の試料を混合する。Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒｅａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した高圧ホモジナイザーを使用して、溶解物をリポソームと一緒にスラリーにする。この乳白色の混合物は、リポソーム成分でカプセル化された代謝馴化成長培地を含有する。
【０２６２】
実施例１１：マルトデキストリンカプセル化代謝細胞抽出物の調製
国際公開第ＷＯ２００３／０６８１６１号の方法を使用して、代謝細胞抽出物の試料をマルトデキストリン中にカプセル化し、噴霧乾燥してマルトデキストリンカプセル化代謝細胞抽出物の無水粉末を本質的に提供する。
【０２６３】
実施例１２：油中水型エマルジョン
この実施例は、上記に開示する代謝馴化成長培地を組み込む高内相油中水型エマルジョンを例示する。
【表３】
2014500872.tif 000004
【０２６４】
実施例１３：油中水型クリーム
この実施例は、上記に開示するように調製した代謝馴化成長培地を組み込む油中水型クリームを例示する。
【表４】
2014500872.tif 000005
【０２６５】
実施例１４：アルコール性ローション
この実施例は、上記に開示するように調製した代謝馴化成長培地を組み込むアルコール性ローションを例示する。
【表５】
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【０２６６】
実施例１５：サブミクロンエマルジョン濃縮物
この実施例は、上記に開示するように調製した代謝馴化成長培地を含有するサブミクロンエマルジョン濃縮物を例示する。
【表６】
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【０２６７】
実施例１６：代謝細胞抽出物の希釈物
この実施例は、上記に開示するように調製した代謝細胞抽出物を含有する希釈物を例示する。
【表７】
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【０２６８】
実施例１７：正常ヒト皮膚線維芽細胞のヒトＤＮＡマイクロアレイ研究
正常ヒト皮膚線維芽細胞を２４時間接触のために以下のように処理した：（ｉ）対照１：Ｎｏｕｒｉｃｅｌ（１０倍）、すなわち馴化成長培地（例えば、実施例２を参照）；（ｉｉ）対照２：ピキア発酵濾過物（２０倍）、すなわち酵母発酵抽出物（実施例８）；（ｉｉｉ）部分発酵Ｎｏｕｒｉｃｅｌ（２０倍）、すなわち部分代謝馴化成長培地（実施例３を参照）；および（ｉｖ）完全発酵Ｎｏｕｒｉｃｅｌ（２０倍）、すなわち完全代謝馴化成長培地（実施例３を参照）。
【０２６９】
この結果を下表に提示するが、これらは処理試料と未処理試料と間の比率の中央値として表す。比率の中央値が１．３を上回る場合は、遺伝子の強い上方調節を示し、下回る場合は強い下方調節を示す。
【表８】
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【０２７０】
第２のアッセイの結果を下表に提示するが、これらは処理試料と未処理試料との間の比率の中央値として示す。比率の中央値が１．３を上回る場合は、遺伝子の強い上方調節を示し、下回る場合は強い下方調節を示す。
【表９】
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【０２７１】
一実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物の対象への投与は、少なくとも１つの細胞外マトリックスタンパク質の上方調節をもたらす。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約２５％〜約５０％上方調節される。他の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約１０％〜約５０％または約６０％〜約１００％上方調節される。また別の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％上方調節される。一部の実施形態において、上方調節される細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲンまたはリシルヒドロキシラーゼタンパク質である。一部の実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子またはＰＬＯＤ１遺伝子によってコードされる。
【０２７２】
一実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物の対象への投与は、少なくとも１つの修復タンパク質の上方調節をもたらす。一部の実施形態において、修復タンパク質は、約５％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約２５％〜約５０％上方調節される。他の実施形態において、修復タンパク質は約１０％〜約７０％上方調節される。一部の実施形態において、修復タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％上方制御される。一部の実施形態において、修復タンパク質はフィブロネクチンである。一部の実施形態において、修復タンパク質は、ＦＮ１遺伝子によってコードされる。
【０２７３】
一実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物の対象への投与は、少なくとも１つの細胞結合性タンパク質の上方調節をもたらす。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％〜約２００％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約１０％〜約８０％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約３０％〜約５０％上方調節される。一実施形態において、細胞結合性タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％上方調節される。他の実施形態において、細胞結合性タンパク質はインボルクリンタンパク質である。一部の実施形態において、細胞結合性タンパク質はＩＶＬ遺伝子によってコードされる。
【０２７４】
一実施形態において、代謝馴化成長培地または代謝細胞抽出物の対象への投与は、少なくとも１つの抗酸化タンパク質の上方調節をもたらす。一部の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％〜約３００％、約５％〜約２００％、約５％〜約１５０％、約５％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約６０％、または約２５％〜約５０％上方調節される。他の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約１０％〜約５０％または約２００％〜約２５０％上方調節される。一部の実施形態において、抗酸化タンパク質は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、または約３００％上方調節される。一部の実施形態において、上方調節される抗酸化タンパク質はスーパーオキシドジスムターゼである。一部の実施形態において、上方調節される抗酸化タンパク質はＳＯＤ２によってコードされる。
【０２７５】
実施例１８：インビトロおよび臨床研究
患者および方法
方法：インビトロ研究
遺伝子アレイ分析
ヒト皮膚線維芽細胞９６ウェルプレート（細胞傷害性アッセイ）またはＴ−２５フラスコ（サイトカインアレイ）のいずれかに播種し、線維芽細胞成長培地（ＦＧＭ）を用いて、３７±２℃および５±１％  ＣＯ２で成長させた。各試験材料の安全な作業濃度は、ＭＴＴアッセイを用いて決定した。コンフルエンスに達した時点で、細胞を試験材料で２４時間処理した。この２４時間の処理後、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の使用説明通りに使用して、ＲＮＡを単離した。精製後、まずＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）  ａＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の使用説明通りに用いてＲＮＡを増幅し、次にＡＳＡＰ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）製造業者の使用説明通りに用いてそのａＲＮＡをＣｙ３またはＣｙ５で蛍光標識することによって、全ＲＮＡをアレイでの使用のために調製した。蛍光標識したａＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用し、そのチップを一晩ハイブリダイズし、製造業者の推奨プロトコル通りに洗浄した。洗浄後、マイクロアレイをＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ａ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。マイクロアレイの蛍光強度に、グローバルノーマライゼーションを実施した。両色素に対する全強度比を１にする補正係数で両色素に対する全蛍光シグナル値を正規化した。この研究において、１．３を上回るかまたは０．７未満のＣｙ３／Ｃｙ５（未処理／処理）蛍光強度比（これは少なくとも３０％の遺伝子発現の変化に関連する）をそれぞれ上方調節された遺伝子および下方調節された遺伝子のカットオフ値として使用した。さらに、遺伝子マーカーの蛍光強度は、バックグラウンド強度を上回らなければならないものとした。
【０２７６】
タンパク質アレイ分析
ヒト皮膚線維芽細胞９６ウェルプレート（細胞傷害性アッセイ）またはＴ−２５フラスコ（サイトカインアレイ）のいずれかに播種し、線維芽細胞成長培地（ＦＧＭ）を用いて、３７±２℃および５±１％  ＣＯ２で成長させた。各試験材料の安全な作業濃度は、ＭＴＴアッセイを用いて決定した。コンフルエンスに達した時点で、細胞を試験材料で２４時間処理し、その後サイトカインアレイ（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、培養培地中へのサイトカイン放出を評価した。マイクロアレイをＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ａ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２７７】
方法：１２週間の臨床使用試験（配合剤）
１２週間の非盲検臨床試験で、軽度から重度の顔面光損傷を有する被験者における配合治療用セラムの有効性および耐容性を検査した。試験参加の基準には、軽度から重度の目周囲の範囲に細い皺および太い皺が臨床的に特定された３０〜６０歳の女性被験者（ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋのスキンフォトタイプのＩ〜ＩＶを有する）であることを含んだ。被験者が試験開始前３ヶ月以内に局所用レチノイドを使用したことがある場合、６ヶ月以内に皮膚充填剤もしくはボツリヌス毒素の注入した、またはフェイシャルピーリングもしくはフェイシャルリサーフェイシング法を受けた場合、あるいは試験開始前３０日以内に他の形態の老化防止製品を顔面に使用した場合、その被験者を試験から除外した。顔面用製品療法に対して既知のアレルギーがある被験者も除外した。
【０２７８】
被験者は、１２週間にわたり１日２回（朝晩）顔面皮膚全体に治療用セラムを塗布するよう指示された。治療用セラムの他に、被験者は、洗顔剤、軽い保湿剤、および日焼け止め剤を含む基礎スキンケア方法の使用に同意した。また、被験者は、試験期間中、提供される物質以外のいかなる新しい顔面用製品の使用も開始しないことにも同意した。
【０２７９】
ＩｎｔｅｇＲｅｖｉｅｗ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）からこの非盲検単一施設試験のＩＲＢ承認を取得した。この試験は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎおよび優良臨床試験基準による倫理および規制の原則に従って実施した。
【０２８０】
臨床評価は、ベースライン（１回目訪問）、４週目（２回目訪問）、８週目（３回目訪問）、および１２週目（４回目訪問）において実施した。それぞれの訪問時に以下の手順を実施した。
【０２８１】
有効性評価：各被験者の右および左目周囲の範囲について、１０段階評価を用いて細い皺および太い皺を臨床的に採点した（０＝なし、０．５〜３．５＝軽度、４〜６．５＝中等度、および７〜９＝重度）。また、１０段階評価を用いて、皮膚の触知できる粗さ（０＝滑らか、９＝粗い）、皮膚の色合い（０＝しみが多い／むらがある、９＝しみがない／むらがない）、皮膚の張り（０＝皮膚が締まりなくたるんで見える、９＝皮膚が張っているように見える）、皮膚の輝き（０＝くすんでいる／光沢がない／艶がない、９＝明るい／光沢がある／輝いている）も評価した。採点の一貫性を確保するために、訪問のたびに同じ研究者が全ての採点評価を実施した。
【０２８２】
安全性評価：有害事象を報告することによって、また客観的および主観的評価によって、毎回の訪問で治療用製品の耐容性を評価した。客観的刺激（紅斑、浮腫、および剥離）は研究者が評価し、主観的刺激（ヒリヒリ感／チクチク感、痒み、およびピリピリ感）は被験者が評価したが、全て４段階評価を用いた（０＝なし、１＝軽度、２＝中等度、および３＝重度）。
【０２８３】
標準化撮影：側光（標準色）を用いて、被験者の左、右、および正面の顔面画像の標準化デジタル画像を撮影した。
【０２８４】
自己評価質問票：被験者は１２週目に自己評価質問票に記入し、このとき顔面の皮膚状態および治療用セラムの有効性を４段階で評価した（強く同意する、同意する、同意しない、極めて同意しない）。被験者は、治療用セラムに対する全般的満足度を４段階で評価した（１＝非常に満足、２＝満足、３＝普通、および４＝不満）。
【０２８５】
統計的分析：対応のあるスチューデントｔ検定を用いて、４週目、８週目、および１２週目の平均臨床採点スコアを平均ベースラインスコアと比較した。ベースラインからの変化は、ｐ＜０．０５のレベルで有意とみなした。被験者の自己評価質問票に関して、肯定的な回答者の発生率を治療用セラムの有効性および審美的特性の項目について記録した。
【０２８６】
結果
結果：インビトロ研究
Ｂｉｏｍｅｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（酵母代謝馴化成長培地）によるヒト皮膚線維芽細胞の処理後、老化防止カスケードに関与する遺伝子に特に重点を置いて、特定した遺伝子発現を分析した。下表に、Ｂｉｏｍｅｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘによって調節される主要な遺伝子の一部を記載する。Ｂｉｏｍｅｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘは、細胞外マトリックスの再生に関与する複数の遺伝子を刺激する。
【表１０】
2014500872.tif 000011
【０２８７】
さらに、ＭＭＰ（コラーゲンおよびエラスチンの分解を担う酵素）の下方調節も認められた。このＭＭＰの下方調節は、ＴＩＭＰＳ（ＭＭＰの天然阻害剤）の上方調節とよく相関していた。また、Ｂｉｏｍｅｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘは、皮膚の全般的健康を維持するのに必要な他の遺伝子、例えばストレスタンパク質（ＨＳＰ）、抗酸化ンパク質（ＳＯＤ１）、および皮膚バリアを維持するのに重要なタンパク質（ＴＪ１）を上方調節した。
【０２８８】
また、Ｂｉｏｍｅｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘは、処理後に培地中に放出されるタンパク質の分析に基づき、線維芽細胞を刺激して、ｂＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＴＩＭＰ−１（組織メタロプロテアーゼ阻害物質）、およびＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）を含む、皮膚の修復および再形成への関与が知られている主要タンパク質（サイトカイン、成長因子など）を発現および合成させた。このデータは、遺伝子発現とタンパク質合成との間の良い相関を示す。これらの結果は、Ｂｉｏｍｅｔａ  Ｃｏｍｐｌｅｘが線維芽細胞を刺激することによって加齢の兆候を軽減する能力を有することを示している。
【０２８９】
結果：１２週間の臨床使用試験
軽度から重度の目周囲の細い皺および太い皺を有する３５〜５６歳の３３名の女性被験者が登録され、１２週間の試験を終了した。
【０２９０】
配合治療用セラムの１日２回の局所使用後、４週目、８週目、および１２週目に、光老化パラメータ全ての平均スコアの統計的に有意な改善が達成された。研究者評価は、図４に示すように、４週目に目周囲の細い皺および太い皺の有意な減少を示し、１２週目まで継続して有意な減少を示した（全てＰ＜０．０００１）。最も留意すべきことは、目周囲の太い皺の平均スコアが、１２週目に３０％低下したことである。さらに、図５および図６に示すように、皮膚の張り、皮膚の色合い、輝き、および触知できる粗さの平均スコアは、ベースラインから、また次のフォローアップ訪問の全てで、同様の有意かつ漸進的な改善を示した（全てＰ≦０．０２）。特に顕著であったのは、触知できる粗さの平均スコア（Ｐ＜０．０００１）における有意な軽減（７９．５％）によって示される、４週目に早くも達成された皮膚のきめの改善である。
【０２９１】
自己評価質問票における１２週目の被験者の回答は、８５％を上回る被験者が全ての質問に好意的に回答しており、研究者評価において観察された改善を強く裏付けている。１２週目に質問票に応えて「強く同意する」または「同意する」を選択した被験者の割合を図７に示す。
【０２９２】
標準化デジタル写真（データは示さず）は、１日２回の配合治療用セラムの使用後の臨床応答の例を示す。簡潔に述べると、目周囲の細い皺および太い皺改善ならびに皮膚の色合いの改善が、製品使用のわずか４週間後に４９歳の白人女性被験者において示された。さらに、４６歳のラテンアメリカ系女性被験者は、４週目に目周囲の細い皺、皮膚の色合い、触知できる粗さ、および輝きの目に見える改善を示した。目周囲の細い皺および太い皺ならびにむらのある皮膚の色合いを示す４６歳の韓国人と白人の混血女性被験者は、製品使用の４週間後に目に見えて改善した。
【０２９３】
この混合治療用セラムは良好な耐用性を示し、試験期間中に治療に関連する有害事象は報告されなかった。浮腫、剥離、ヒリヒリ感／チクチク感、痒み、およびピリピリ感の平均スコアは、試験を通じて軽度未満を維持した（０〜４段階で全スコアが＜０．０９）。特に、紅斑の平均スコアは、全てのフォローアップ訪問でベースラインから低下し、８週目には統計的に有意な低下（Ｐ＜０．０３）が観察された。
【０２９４】
結論
この治療用セラムは、医師および患者に、皮膚の老化の兆候を改善する固有かつ有効な局所用配合剤を提供する。
【０２９５】
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、上述の説明および添付の図面から、記載される以外の種々の変更が当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０２９６】
本明細書において様々な参考文献を引用したが、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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