(57)【要約】  本発明は、患者自身の血液または適合血液を用いて、細胞増殖および運搬のためのフィブリンゲルを生成することを目的とする。ゲル調製プロセスは、一定量の血液を患者から採取するステップと、クエン酸ナトリウムを抗凝固剤として用いるステップと、クエン酸血漿を遠心分離によって分離するステップと、血漿中に運搬されるべき細胞を再懸濁するステップとからなる。得られた懸濁液にＣａＣｌ２を付加して、ゲルを（分離された凝固物としてまたは多孔性キトサン、ゼラチンまたはヒアルロン酸マトリックス中に）形成し、このゲルを培養器中で培養して、細胞成長を促進する。本発明は、組織工学分野において、特に、皮膚、軟骨、歯肉および骨の病変において、移植を目的とする細胞成長で有用である。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）自己または適合血液を提供し、抗凝固剤を適切な濃度で付加するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）において得られた前記血漿を遠心分離によって分離するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において得られた前記血漿中に細胞を再懸濁するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）において得られた前記懸濁液に凝固剤溶液を付加して、自己フィブリンのゲルを形成するステップと、
ｅ）凝塊が形成されるまで、ステップ（ｄ）の生成物を適切な条件下でインキュベートするステップと、
を含む、自己移植システムの調製方法。
【請求項２】
ａ）適合または自己血液を、調製すべき移植片１ｃｍ２あたり２００μｌ提供し、クエン酸ナトリウムを、血液１ｍｌあたり０．０９ｇの濃度で付加するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）において得られた前記血漿を、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離によって分離するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において得られた前記血漿中に細胞を、血漿２００μｌあたり１×１０４個の濃度で再懸濁するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）において得られた前記懸濁液に、ＣａＣｌ２溶液を１０％で付加して、自己フィブリンゲルを形成するステップと、
ｅ）凝塊形成が視認されるまで、ステップ（ｄ）の生成物を、３７°Ｃ、加湿雰囲気および５％のＣＯ２中でインキュベートするステップと、
を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記自己移植システムは、単一の凝塊の形態で調製される、請求項１および２の方法。
【請求項４】
前記自己移植システムは、多孔性マトリックス内に形成される、請求項１および２の方法。
【請求項５】
前記自己移植植システムは、キトサン−ゼラチン−ヒアルロン酸のポリマーマトリックス内に形成される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記細胞は、真皮細胞および幹細胞からなる群より選択される、請求項１〜５の方法。
【請求項７】
前記真皮細胞は、線維芽細胞、ケラチン生成細胞およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
自己または適合血液から得られたフィブリンゲルと、真皮細胞および幹細胞からなる群より選択された細胞とを含む、自己移植システム。
【請求項９】
前記真皮細胞は、線維芽細胞、ケラチン生成細胞およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項８の自己移植システム。
【請求項１０】
前記細胞は、血漿２００μｌあたり１×１０４個の濃度である、請求項８および９の自己移植システム。
【請求項１１】
適合血液から得られた前記自己移植システムは、分離された凝塊である、請求項８〜１０の自己移植システム。
【請求項１２】
適合血液から得られた前記自己移植システムは、キトサン−ゼラチン−ヒアルロン酸のポリマーマトリックス中に含まれる、請求項８〜１０の自己移植システム。
【請求項１３】
外傷の組織接着、皮膚病変、軟骨損傷、歯肉病変、骨病変からなる群より選択された病変において、生物学的成分の授受、置換、外科縫合の一体化あるいは他の組織工学関連用途のために用いられる、請求項８〜１２の自己移植システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
皮膚は、３つの細胞層（すなわち、表皮、真皮および皮下組織）からなる臓器である（Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｐ．；Ｒｅｖ．Ｃｈｉｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．７２（５）：４６６−４７２，２００１）。表皮は、皮膚の最外層であり、異物から身体を保護するための第１の障壁である。表皮は、ケラチン生成細胞を含む異なる細胞群を含む（Ｎａｖａｒｒｅｔｅ  Ｇ．；Ｒｅｖ  Ｆａｃ  Ｍｅｄ  ＵＮＡＭ．，４６（４）：１３０−１３３，２００３）。真皮は、表皮の下側にあり、結合組織と、グリコサミノグリカンおよび線維性タンパク質と共に細胞外マトリックスを形成する基質と、主に線維芽細胞である細胞とからなる。この細胞は、皮膚を支持し、皮膚に弾性を付与するコラーゲンおよびエラスチンを産生する（Ｇｒｅｅｎ  Ｈ．；Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６５（５）：９６−１０２，１９９１）。また、真皮は、病原体に対する防御を補助する免疫細胞を有する。
【背景技術】
【０００２】
この臓器へ影響を与え得る病変のうち、熱傷は、最も緊急の診察を要する病変の１つであり、最も一般的には極めて過酷な苦痛を伴い、患者に外傷を残す種類の病変である（Ａｇｕａｙｏ  Ｂ．，Ｒｅｖ．Ｃｈｉｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，７０（４）：３３７−３４７，１９９９）。
【０００３】
皮膚潰瘍も、治療が困難な種類の損傷である。皮膚潰瘍は、静脈鬱滞、糖尿病、血管炎または動脈閉塞に起因して発生することが多い（Ｂｏｌｉｖａｒ−Ｆｌｏｒｅｓ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｈｏｍｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔ，７（４）：１１−１６，２０００）。
【０００４】
広範な熱傷を迅速に創傷治癒するためには、真皮および表皮の自己または異種細胞の増殖および複製をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う方法を開発する必要がある（Ｇｒｅｅｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６（１１）：５６６５−５６６８，１９７９）。現在、異なる細胞組成（純粋なケラチン生成細胞または線維芽細胞との混合物）の連続培養を行うことが可能になっている。小規模生検から、ヒトの表皮を３〜４週間かけて大量に培養し、自家移植片として用いて、成人の全ての体表面を被覆することができる（Ｃｕｅｎｃａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒ．Ｐｌａｓｔ．，１３（１）：１３−１７，２００３）。
【０００５】
現在、細胞外微小環境として機能することにより、天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭｓ）の調節機能を再現する人工生体材料のセットが開発されている。生体材料は、再生医療および組織工学の現在の戦略において、細胞機能および性能を誘導する生物物理学的および生化学的環境を設計する際の中心的役割を果たしている。これにより、機能障害または損傷組織の構造または機能の回復を促進することができる。
【０００６】
したがって、細胞成長を促進させる生体材料を見出すことが、常に求められている。これらの生体材料のうち、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩および他の材料が既に用いられている。これらのうち、フィブリンを用いた場合、皮膚細胞の成長を促進させる顕著な特性が見られることがわかった。しかしながら、これらの培養物を皮膚病変の治療のために臨床用途に用いる場合には、「臨床グレード」の材料しか利用できないという不利な点がある。「臨床グレード」の材料には、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）およびＢｅｒｉｐｌａｓｔ（登録商標）と呼ばれるものが存在しており、病院では異なる外科手術においてフィブリン組織接着剤として用いられている。これらの製品は、研究グレードのフィブリノーゲンおよびトロンビンの組み合わせによりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて認められる細胞成長を促進する特性を維持することがわかっている。それにも関わらず、複雑な微生物学的分析が必要であるため、これらの製品を、フィブリン含有し、かつ広範囲の損傷皮膚を被覆する商品とするにはコスト面において折り合いがつかない。さらに、ヒトにとって安全であり、動物成分を含まず、既知および新たな疾患に対する感染リスクの無い材料が必要となっている。自己由来（すなわち、特定の個体から）の製品は、別の個体由来の異種製品よりも、微生物学的観点において常に安全である。なぜならば、仮に製品が汚染されたとしても、当該製品は同一の個体（ｓａｍｅ  ｈｏｓｔ）に戻されるからである。さらに、免疫学的観点から、抗体およびその中の他のタンパク質は、個体中に既に存在しているものであるため、免疫学的拒絶の可能性が排除される。
【０００７】
よって、生体材料は、細胞との分子レベルで相互作用する一時的な支持体を提供することにより、組織形成および再生の複雑な多細胞性のプロセスを時間的かつ空間的に誘導する（Ｌｕｔｏｌｆ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３（１）：４７−５５，２００５；ＢａｃａｋｏｖａＬ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｓ．，５３（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３５−Ｓ４５，２００４）。したがって、これらの生体材料の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生ずるプロセスをある程度再現することにある。理想的な人工生体材料または代用真皮は、非抗原性、組織適合性、および局所的または全身的非毒性のような重要な特徴を持つ必要がある（Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎ  ＡＰＡ，１５（１）：５−１１，２００６；Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｕｒｎｓ  Ｉｎｃｌ  Ｔｈｅｒｍ  Ｉｎｊ．１４（５）：４０５−４０８，１９８８）。
以下の３つの主要な戦略に基づいて、組織工学によって開発された製品のための治療法が進展している。
−マトリックス無しでの細胞の使用（例えば、自己細胞移植または幹細胞治療）
−成長因子およびサイトカインを含むかまたは含まない人工ポリマーの使用
【０００８】
−内部に細胞を含む三次元マトリックスの使用（Ｊｉｍｅｎｅｚ  ａｎｄ  Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．２００４；１８７（５Ａ）：５６Ｓ−６４Ｓ  ２００４）
【０００９】
これらの実験システムの多くが利用可能である。Ｓｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）の外側被覆を有し、ウシコラーゲンおよびコンドロイチン−６−硫酸塩に基づいたコラーゲン類似体を用いた第１の代用真皮が市販されている（Ｂｕｒｋｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ．１９４（４）：４１３−４２８，１９８１）。Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）は、上記の代用真皮複合材料の変更例であり、ウシコラーゲンの代わりに、新生児包皮から得られた線維芽細胞をナイロンメッシュ上で培養し、外側シリコーン層で被覆してなる（Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖｅｒｉｎｇ）。これは、皮膚の真皮層を被覆し、創傷治癒プロセスの改善を刺激するように設計される（Ｍａｎｓｂｒｉｄｇｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．４（４）：４０３−１４，１９９８）。
【００１０】
表皮および真皮成分の双方（混合または複合材料代替物）を組み込んだ、他の種類の代用真皮も存在する。第１の複合材料代替物は、Ｏｒｔｅｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．によって開発され、Ｉ型ウシコラーゲンを含む多孔性の架橋マトリックス上で成長させた新生児由来の線維芽細胞およびケラチン生成細胞の一体化物である（Ｐｈａｍ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｌｏｗ  Ｅｘｔｒｅｍ  Ｗｏｕｎｄｓ．１（１）：２７〜３２，２００２；Ｅｉｓｅｎｂｕｄ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，Ｗｏｕｎｄｓ，１６（１）：２−１７，２００４）。
【００１１】
Ｃｈｉｌｅａｎ（特許出願番号１３９７−２００６）において、別の重要な先例が記載されている。この特許出願において、一体化移植システム（ＩＢＳ）と呼ばれる代用真皮が開示されている。この一体化移植システムは、マトリックス中に自己線維芽細胞およびケラチン生成細胞を組み込んだポリマー支持体からなる。なお、自己線維芽細胞およびケラチン生成細胞は、キトサン−ゲル−ヒアルロン酸のマトリックス上にｉｎ  ｓｉｔｕで重合するフィブリン上に配置および結合されている。この開発されたシステムは、細胞が支持面上に配置されているのではなく、支持面中に埋設されているため、一体化と呼ばれる。このシステムは、損傷部に対して優れた密着性を示し、さらには、システムの成分に対する毒性反応も観察されていない。
【００１２】
本出願の発明者らによる他の研究によれば、フィブリンに内包された皮膚細胞は、培養フラスコ中において成長された従来の細胞と異なるパターンを表すことが示されている（図１）。
【００１３】
発明者らによって見い出された欠陥は、臨床グレード材料が高コストである点にあるが、臨床グレード材料は、その高い安全性のため感染症の危険性が制限されるので、上記一体化移植システムをヒトに組み込むのに不可欠である。これらの材料のうち、フィブリノーゲンおよびトロンビンは、ヒト用途のために認可された同等物を用いるため、より高額となっている。そのため、コスト低減のために患者血漿を用いた自己フィブリン凝塊を生成すると同時に、患者に安全な製品を提供することが必要とされている。したがって、特にＳＩＩ内部において細胞成長を可能にする最適な凝塊を生成するための条件の検討が必要とされている。
【００１４】
Ｂｅｒｅｔｔａ＆Ｇｒｉｐｐｉ（特許出願番号ＵＳ２００９２５８０５６およびＷＯ２００７０２１３４４）およびＢｅｒｅｔｔａ＆Ｌｏｄｉ（特許番号ＵＳ６，３６８，２９８）において、生体中の組織を再生させる方法が開発されている。この方法は、成長因子を放出する血小板を含む固体フィブリン網に患部を接触させる工程を含む。このゲルは、無細胞であり、自己血液由来の血小板を含む。同様に、Ｂａｕｇｈ＆Ｌｉｍ（特許出願番号ＵＳ２００５１５２８８６およびＵＳ２００２１５９９８５ならびに特許番号ＵＳ６，４４４，２２８）およびＨｉｒｓｃｈ＆Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（特許番号ＥＰ０８２０３１４）において、組み込まれた細胞を含まず血小板のみを含む自己フィブリン組織接着剤を得るための方法についての記載がある。Ｇａｌａｎａｋｉｓ  Ｄ（特許番号ＵＳ５，１８５，００１）において、止血（創傷の凝固）するのに用いられる、自己血漿からフィブリン凝塊を生成するための全因子を含むキットが開示されているが、細胞を含有することは報告されていない。
【００１５】
さらに、Ｃｈｉｌｅａｎ（特許出願番号ＣＬ１４３９−２００２）においては、ゲル化時に塩化カルシウムを用いて血漿から代用真皮を得ることが記載されているが、上記に開示した発明の場合と同様に、培養物からの細胞成分は組み込まれていない。同文献中においては、細胞成分が細胞および血管から侵入し得ることが記載されているが、創傷床にけるものについて言及し、体外から提供されたものではない。
さらに、上記特許と同様に同じ技術的問題の研究について言及する多数の科学文献が存在している。しかしながら、これらは、いずれもフィブリン凝塊を生成するための方法についてであり、組織工学の目的のために、細胞をフィブリン凝塊と一体化するための方法ではない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、自己移植システムを調製する方法に関し、以下の一般的なステップを含む：
ａ）適合または自己血液を提供し、抗凝固剤を適切な濃度で付加するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）において得られた血漿を遠心分離によって分離するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において得られた血漿中に細胞を再懸濁するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）において得られた懸濁液に凝固剤溶液を付加して、自己フィブリンのゲルを形成するステップと、
ｅ）凝塊が形成されるまで、ステップ（ｄ）の生成物を適切な条件下でインキュベートするステップ。
本発明の実施形態において、自己移植システムを調製するプロセスは、以下のステップを含むことによって特徴付けられる。
【００１７】
ａ）適合または自己血液を、調製すべき移植片１ｃｍ２あたり２００μｌの割合で提供し、クエン酸ナトリウムを、血液１ｍｌあたり０．０９ｇの濃度で付加するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）において得られた血漿を、３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃での遠心分離によって分離するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において得られた血漿中に細胞を、血漿２００μｌあたり１ｘ１０４個の濃度で再懸濁するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）において得られた懸濁液に、ＣａＣｌ２溶液を１０％で付加して、自己フィブリンのゲルを十分に形成するステップと、
ｅ）凝塊形成が視認できるまで、ステップ（ｄ）の生成物を、３７℃、加湿雰囲気および５％のＣ０２中でインキュベートするステップ。
別のさらなる実施形態において、本発明のプロセスは、単一の凝塊の形態で調製される自己移植システムによって特徴付けられる。
【００１８】
別のさらなる好適な実施形態において、本発明のプロセスは、キトサン−ゲル−ヒアルロン酸のポリマーマトリックスである多孔性マトリックス内に形成された自己移植システムによって特徴付けられる。
【００１９】
本発明の特定の実施形態において、上記プロセスは、真皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞および幹細胞からなる群より選択された細胞によって特徴付けられる。
【００２０】
さらに、本発明は、上記の自己移植設のシステムに関連する。このシステムは、適合または自己血液からの自己フィブリンゲルを含むこと、さらに、線維芽細胞、ケラチン生成細胞およびこれらの混合物からなる群より選択された皮膚細胞と、幹細胞と含むことによって特徴付けられる。
一実施形態において、本発明の植設システムは、細胞が血漿２００μｌあたり１ｘ１０４個の濃度で存在する点において特徴付けられる。
本発明の別の実施形態において、移植システムは、自己移植システムまたは適合血液が単離された凝塊であることによって特徴付けられる。
【００２１】
別のさらなる実施形態において、移植システムは、適合血液または自己フィブリンゲルがキトサン−ゲル−ヒアルロン酸のポリマーマトリックス中に含まれることによって特徴付けられる。
【００２２】
さらに、本発明は、このような移植システムの皮膚病変のための使用に関連する。使用は、外傷または皮膚病変、軟骨病変、骨または歯肉病変の組織接着、生物学的成分の授受、置換、外科縫合の一体化、または、組織工学の分野における任意の用途からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、マイクロカプセル化された細胞の組織構造および免疫組織化学構造を示す。Ａ．メチレンブルーで染色されたフィブリンの均質領域における細胞（マイクロカプセル化日）、Ｂ．エリトロシンで染色されたフィブリンに隣接して位置する中期の細胞（マイクロカプセル化４８時間後）、Ｃ．フィブリンゲル中に埋設された３つの細胞（マイクロカプセル化２４時間後）、Ｄ．フィブリンマトリックスの細孔中に位置する一対の細胞（マイクロカプセル化４８時間後）、Ｅ．フィブリンゲル内に位置する細胞群（マイクロカプセル化９６時間後）、Ｆ．Ｅ（矢印）の細胞クラスターの拡大、中期の細胞が観測される。Ｇ〜Ｉ．フィブリンゲル中で成長する細胞クラスターの免疫組織化学構造。Ｇ．Ａｒｔｅｔａ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色で制御、Ｈ．サイトケラチンの免疫学的局在決定、および、Ｉ．ビメンチンの免疫学的局在決定（Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  Ｅｎｇ．，３２（３）：３４１−５１，２００９）。
【図２】は、選択された凝塊の安定性の試験（Ｆ１７、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２７）を示す。パネルＡ：開始時における外観。パネルＢ：３７℃での培養３日後の外観。
【図３】は、上記表面上で成長させたヒト線維芽細胞の成長曲線を示す。０日目に対して成長に統計的な有意差がある場合、符号（＊）が付されている（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０、０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本出願における技術的目的は、組織再生の目的のために、マトリックス内部の細胞を固定、増殖および輸送または運搬することを可能にする自己生成物および手技を提供することにある。
【００２５】
本発明は、自己血液または適合血液自体から、細胞増殖および輸送のための自己移植システムを生成することに関する。本明細書中において、「細胞輸送（ｃｅｌｌ  ｖｅｈｉｃｕｌｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、意図される機能を発揮することが可能な場所まで細胞を運搬することを指す。
【００２６】
調製すべき移植片１ｃｍ２あたり２００μｌの血液を、抗凝固剤としてのクエン酸ナトリウムを、血液１ｍｌあたり０．０９ｇの割合で用いて取り出す。クエン酸血漿を遠心分離によって分離する。その後、細胞を血漿中に再懸濁する。単離された凝塊としてまたは多孔性マトリックス中でフィブリンゲルを形成するために、ＣａＣｌ２溶液を付加する。このようにして得られた生成物は、市販の「フィブリン糊」または「フィブリン組織接着剤」よりもずっと低コストであり、また、自己生成物であるため、感染および免疫拒絶の危険性が回避される。また、大量の血液を患者から得るのは困難である場合があるが、これは、適合血液を使用することによって解消することができる。このシステムは、皮膚病変の治療に用いられており、良い結果が得られている。その用途は、特に、皮膚病変移植、軟骨、骨および歯肉病変における細胞成長の目的にある。組織工学分野における任意の用途において、この技術を用いることが可能であることが期待される。
本発明の新規な点は、精製フィブリンおよびトロンビンの代わりに、血漿を用いて細胞をフィブリン凝塊中に取り込むことにある。
これは、自己血液から細胞成長のためのフィブリンを生成して、ゲルを単離された凝塊としてまたは多孔性マトリックス中に形成するという考えに基づく。
【００２７】
上記によれば、本発明において生成された生成物は、公知の市販の製品よりもずっと低コストであるという主な利点があり、また、自己生成物であるため、感染および免疫拒絶の危険性を回避し、血液ドナーが存在する限り利用することが可能である。一方、可能性がある不利な点としては、減弱した患者から大量の血液を得ることがあり得るが、その場合も、本発明においては、適合血液を使用することによって解消される。
【００２８】
本発明を実施可能とするために、自己血液を用いて、多孔性マトリックス中に細胞を取り込むいくつかの臨床試験を行った。このシステムを用いて皮膚病変を治療したところ、良い結果が得られた。しかしながら、このシステムは、特に、皮膚、軟骨、歯肉および骨病変への移植の目的で、細胞成長の用途においても用いることも可能である。
【００２９】
本発明は、幹細胞および分化した真皮細胞を包含し、好適には、予め生検から得られ、研究室中において培養され、自己移植システムに取り込まれた線維芽細胞およびケラチン生成細胞を包含する。
実施例
以下の実施例は、本発明の理解を促すためだけの例示的なものであり、特許請求の範囲をいかなる意味においても制限するものではない。
実施例１：ヒト線維芽細胞の入手および培養
【００３０】
ヒト線維芽細胞を皮膚生検から入手する。生検サンプルを、無菌ペトリ皿中において、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水溶液、１００Ｕ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質の混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を含有する０．１ＭのｐＨ７．４（ＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ（登録商標））およびアンフォテリシンＢ２５０μｇ／ｍｌ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄する。別個の線維芽細胞およびケラチン生成細胞を得るために、サンプルを０．５％のトリプシン、５．３ｍのＭＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ（登録商標））中において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｏｒｍａ（登録商標）培養器を用いて、３０分間、３７℃でインキュベートする。その後、無菌鉗子を用いて、真皮および表皮を機械的に分離する。真皮を、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を用いて、３７℃で２０分間処理する。その後、得られた細胞懸濁液を遠心分離にかけ、得られた沈殿物をＰＢＳで洗浄して、酵素を除去する。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除染色によって確認する。これは、トリパンブルー色素を１：１の比で混合した細胞懸濁液の一部を顕微鏡検査することにより行うことができる。その後、この懸濁液をニューバウアーチャンバに供給し、生存している細胞を倒立顕微鏡Ｌｉｅｄｅｒ（登録商標）でカウントする。酵素消化後に得られたヒト線維芽細胞を、培養フラスコＴ−２５（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））中で、１０％のウシ胎児血清（（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））、５０％のハムＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標））および１０μｌ／ｍｌのＢｉｏｍｙｃ  １（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（登録商標））が付加されたダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））に再懸濁させ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｏｒｍａ（登録商標）培養器を用いて、加湿雰囲気において、５％ＣＯ２、温度３７℃でインキュベートする。
【００３１】
実施例２：ヒト由来フィブリン凝塊の入手および評価
血漿の入手：３．２％のクエン酸ナトリウムが入ったチューブに収集された全血を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、この全血から血漿を分離する。バイオセーフティーフード下において得られた無菌血漿を使用するまで−２０℃で保存する。
視認による凝固試験：初期凝固試験を、処方（Ｆ）と名付けたカルシウムの種々の濃度で、微小遠心チューブ中で実施する。そのために、一定量（１００μｌ）のクエン酸血漿を、異なる量のＣａＣｌ２希釈液と共に用いて、異なる最終濃度にして、表１（ＣａＣｌ２の濃度に応じた凝塊処方）に示すような３０種類の処方を調製する。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
３０種類の凝塊処方の全てを、一定量の血漿とともに、３７℃で２０分間インキュベートする。各処方における凝塊形成を視認により確認する。さらに、その機械的強度を評価するために、各凝塊を鉗子を用いて微小遠心チューブから取り出し、凝塊の存在および最大機械的強度に基づいて、上位６種の処方を選択する。凝固時間を測定するために、凝塊の形成時間を高精度に測定することができる凝塊タイマ（ＢＢＬ  Ｆｉｂｒｏｓｙｓｔｅｍ）を用いる。予備段階において事前に選択された６種類の処方のみを、この試験に供する。選択された６種類の凝塊処方において、１０％のウシ胎児血清（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））および５０％のハムＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標））が付加された培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））を用いて、凝塊の安定性を測定する。その後、これらを３７℃でインキュベートする。３日目において、崩壊の範囲を視認によって評価する（図２）。
【００３４】
実施例３．ポリマーマトリックスの調製
ベースポリマーの調製：以下のプロトコルに従って、ベースポリマーを調製するために、１％ｗ／ｖのゼラチン溶液、２％ｗ／ｖでキトサンを含む１％ｖ／ｖの酢酸溶液、および、０．０１％ｗ／ｖのヒアルロン酸溶液を調製する。
ゼラチン溶液を、キトサンおよびヒアルロン酸と混合し、磁気攪拌による均質化を５０℃で３０分間行う。
【００３５】
次に、ゲルが形成されるまで、４℃で冷蔵されたペトリ皿中に混合液を注加する。その後、ゲルをゆっくり−２０℃で８時間冷凍する。温度を−８０℃まで８時間増加させる。
ポリマーを液体窒素中に３分間ゆっくり浸漬する。その後、このポリマーを凍結乾燥器  Ｌｉｏｂｒａｓ  ＬＴ０１中において４８時間凍結乾燥する。
架橋：ベースポリマーを架橋するために、以下の手技を行う。
【００３６】
凍結乾燥物（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）を、５０ｍＭのＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）中に３０分間浸漬する。その後、この溶液を廃棄し、５０ｍＭのＭＥＳ、３０ｍＭのＥＤＣ（ｌ−エチル−［３、３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）および８ｍＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）によって構成される架橋溶液を付加する。これを２時間反応させる。
その後、反応物をエタノールで洗浄し、凍結する。
凍結後、これを液体窒素中に３分間浸漬する。
最後に、これを２４時間凍結乾燥させる。
実施例４：選択された表面に対する細胞成長および増殖の検討
【００３７】
この実験のため、生存している細胞の定量化を行うことができるＭＴＴ［（３−４、５−ジメチルチアゾリル−２）−２、５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物］技術を用いる。この技術は、代謝的に活性な細胞によってのみ、ＭＴＴが「ホルマザン」という化合物に還元されることに基づくものである。なお、ホルマザンは、溶解性の紫青色結晶であり、５４０ｎｍでの分光光度法により定量化することができる。
ＭＴＴアッセイ：このアッセイのために、線維芽細胞を以下のようにして入手する。
【００３８】
線維芽細胞が入った培養フラスコＴ−７５（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））をＰＢＳで洗浄した後、トリプシンで処理する。細胞懸濁液を、５０ｍｌの使い捨て遠心分離チューブに入れ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その後、得られた沈殿物を再懸濁して、生存している細胞の数を確認する。
【００３９】
細胞カウントの後、懸濁液を再度遠心分離し、細胞の一部を、１０％のウシ胎児血清（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））、５０％のハムＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標））と、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌ）の混合物（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））および血漿の他の成分を付加した培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））中に再懸濁する。このアッセイを、平底の９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））において行う。ここで、成長させるために異なる表面を用いて、線維芽細胞の増殖を評価する。アッセイを０〜３日目（すなわち、０時間、２４時間、４８時間および７２時間後）に行い、各状態を毎日３回評価する。さらに、予め選択された処方のうちの上位２種のみをアッセイのために検討する。
【００４０】
以下、異なる表面上での線維芽細胞の増殖を評価するためのＭＴＴアッセイについて詳述する。
実験条件（図３）：
単分子層：培地中に再懸濁されたヒト線維芽細胞（５ｘ１０６個／ウェル）を、１５０μｌの培養培地と共に、ウェル内で直接成長させる。
ポリマーマトリックス：ポリマーマトリックスを各ウェル内に配置し、培地中に再懸濁されたヒト線維芽細胞を供給（５×１０６個／ウェル）する。培養培地を１５０μｌまで付加する。
【００４１】
凝塊Ｆ１７：ヒト線維芽細胞を含む血漿を３０μｌ供給（５×１０６個／ウェル）し、３０ｍＭのＣａＣｌ２を４５μｌ付加する。凝塊が形成されるまで、これを３７℃でインキュベートする。その後、培養培地を１５０μｌまで付加する。
【００４２】
凝塊Ｆ２７：ヒト線維芽細胞を含む血漿を３０μｌ供給（５×１０６個／ウェル）し、５０ｍＭのＣａＣｌ２を２２．５μｌ付加する。凝塊が形成されるまで、これを３７℃でインキュベートする。その後、培養培地を１５０μｌまで付加する。
【００４３】
Ｆ１７を含むＳＩＩ：ポリマーマトリックス上に、ヒト線維芽細胞を含む血漿を３０μｌ（５×１０６個／ウェル）および３０ｍＭのＣａＣｌ２を４５μｌ供給する。凝塊が形成されるまで、これを３７℃で培養する。その後、培養培地を１５０μｌまで付加する。
【００４４】
Ｆ２７を含むＳＩＩ：ポリマーマトリックス上に、ヒト線維芽細胞を含む血漿を３０μｌ（５×１０６個／ウェル）および５０ｍＭのＣａＣｌ２を２２．５μｌ供給する。凝塊が形成さられるまで、これを３７℃で培養する。その後、培養培地を１５０μｌまで付加する。
【００４５】
ＭＴＴ手順：異なる細胞培養条件で実験を準備した後、０日目（０時間）のＭＴＴアッセイを行って、実験の開始時における細胞生存率の値を確認する。この手順を２４時間、４８時間および７２時間において繰り返す。この手順は、以下からなる。
評価日に応じて、ＭＴＴ溶液５０μｌを各ウェルに供給し、３７℃で４時間インキュベートする。
次に、ウェル内の各溶液を除去し、各サンプルに対応する微小遠心チューブに移す。
各ウェルに、１０％のトリプシン１５０μｌを供給する。プレートを再度３７℃で１時間インキュベートする。
【００４６】
最後に、各ウェル内に、溶解緩衝液３００μｌ（単分子層の場合４００μｌ）を供給し、その後激しくピペットで取り、溶液を各微小遠心チューブに移す（これは、溶解緩衝液の量に応じて第１ステップで１００μｌまたは２００μｌを供給し、第２ステップにおいて残りの２００μｌを供給する２つのステップで行う）。
測光定量化まで、これらのチューブを−２０℃で維持する。測光定量化を行うために、サンプルが入った微小遠心チューブを解凍する。
チューブを解凍した後、これらをボルテックスによって激しく攪拌する。
その後、超音波を３０分間付与する。
これらのチューブをボルテックスによって再度均質化する。
超音波を再度３０分間付与する。
その後、１４，０００ｒｐｍ、１５分間で遠心分離を行う。
各チューブから粒子を含まない上清を注意深く取り出し、各サンプル２００μｌを９６ウェルプレートに供給する。
最後に、プレートリーダー  ＥＬＩＳＡ  ＳＥＮＳＩＳＣＡＮ（ＭＥＲＫ（登録商標））上で、５４０ｎｍの吸光度を読み取る。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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