(57)【要約】  本明細書では、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする改変ポリヌクレオチドをさらに含んでなるアルコール産生微生物を提供することによって、発酵中にアルコールエステルを生産する方法が開示される。
2014518066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）バイオマスフィードストックに由来する発酵性炭素基質と、バイオマスフィードストックに由来する発酵性炭素基質から生成されるアルコールと、アルコール生成酵母微生物とを含んでなる、発酵培地を提供するステップのアルコール生成微生物が、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作したポリヌクレオチドを含み、微生物が、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、該ポリペプチドを発現して、提示または分泌する、該ステップと；
ｂ）発酵培地をカルボン酸に接触させるステップと；
を含んでなり、ここでリパーゼ活性が、微生物によって生成されるアルコールの少なくとも一部を細胞外でアルコールエステルに変換するのに十分な量で、発酵培地中に存在する、上記方法。
【請求項２】
発酵培地を抽出剤に接触させて、水相と有機相とを含む二相混合物を形成するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出剤が前記カルボン酸を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生成物アルコールが、Ｃ２〜Ｃ８アルキルアルコールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生成物アルコールがエタノールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アルコールエステルが、脂肪酸エチルエステルを含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生成物アルコールがブタノールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アルコールエステルが、脂肪酸ブチルエステルを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルコールエステルが、脂肪酸エチルエステルをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、酵母微生物の表面上に提示される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２４９、２５０、２５１、２５２、２５３のいずれか１つと少なくとも約７０％の同一性を有する配列、またはその断片を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１、３、５、７、８、９、４６、４８、５０、５２、５４、２５５、２７１または２７３を有するポリヌクレオチドと、少なくとも約７０％の同一性がある配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２、４、６、２５６、４７、４９、５１、５３、５５、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２７２、または２７４を有するポリペプチドと少なくとも約７０％の同一性がある配列、またはその活性断片を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、グリコシル化モチーフを含有しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リパーゼ活性を有するポリペプチドがグリコシル化されない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
カルボン酸が、トウモロコシ油、カノーラ油、パーム油、亜麻仁油、ジャトロファ油、またはダイズ油に由来する、遊離脂肪酸を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
カルボン酸が、発酵性炭素基質と同一のバイオマスフィードストックに由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
カルボン酸が、Ｃ１２〜Ｃ２２の線状または分枝状脂肪族鎖を有するカルボン酸を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抽出剤に接触させるステップと、カルボン酸に接触させるステップが同時に起きる、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
微生物によって生成されるアルコールの有効力価の少なくとも約６０％が、アルコールエステルに変換される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
発酵培地が、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせをさらに含んでなり、ここでリパーゼ活性が、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部を加水分解して、遊離脂肪酸を形成する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
発酵中に生成されるアルコールの有効力価が、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないアルコール生成微生物による発酵中に生成されるそれを上回り、微生物がリパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、ポリペプチドを発現して、分泌または提示する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
発酵中に生成されるアルコールの有効速度が、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないアルコール生成微生物による発酵中のアルコール生成速度を上回り、微生物が、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、ポリペプチドを発現して、分泌または提示する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
操作したアルコール生成経路；および
リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、操作したポリヌクレオチド
を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項２５】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２、４、６、２５６、４７、４９、５１、５３、５５、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２７２、または２７４と少なくとも約７０％の同一性を有する配列、またはその活性断片を含んでなる、請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２４９、２５０、２５１、２５２、２５３のいずれか１つと少なくとも約７０％の同一性を有する配列、またはその断片を含んでなる、請求項２４または２５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、グリコシル化モチーフを含有しない、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、グリコシル化されない、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２９】
リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作したポリヌクレオチドが、配列番号１、３、５、７、８、９、４６、４８、５０、５２、５４、２５５、２７１または２７３と、少なくとも約７０％の同一性を有する配列を含んでなる、請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３０】
アルコール生成経路；および
リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、操作したポリヌクレオチド；
を含んでなり、ここでリパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２、４、６、２５６、４７、４９、５１、５３、５５、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２７２、または２７４と少なくとも約７０％の同一性を有する配列、またはその活性断片を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項３１】
リパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２４９、２５０、２５１、２５２、２５３のいずれか１つと少なくとも約７０％の同一性を有する配列、またはその断片をさらに含んでなる、請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３２】
アルコール生成経路がブタノール生成経路である、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３３】
ブタノール生成経路がイソブタノール生成経路である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞は、さらにピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下しているか、または除去される、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
リパーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、そして分泌または提示するように微生物を操作するステップと；
操作した微生物を、微生物がアルコールを生成する条件下で、
トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、またはその混合物、および
炭素基質、
に接触させるステップと；
を含んでなる、生成アルコールに対するアルコール生成微生物の耐性を増大させる方法。
【請求項３６】
操作した微生物をトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせに接触させ、ここで分泌または提示されたリパーゼが、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部を遊離脂肪酸に変換する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
リパーゼがアルコールエステルの形成を触媒する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
微生物が、リパーゼ活性のあるポリペプチドを発現して分泌するように操作されていない微生物によって生成される有効力価を上回る有効力価でアルコールを生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
アルコール生合成経路が、操作したアルコール生合成経路である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
操作したアルコール生合成経路が、イソブタノール生合成経路である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記イソブタノール生合成経路が、
ピルビン酸からアセト乳酸への
アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への
２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への
２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの；および
イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
炭素基質およびトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはその混合物を含んでなる、発酵培地を提供するステップと；
発酵培地をブタノール生合成経路を含んでなるアルコール生成微生物に接触させるステップ；
とを含んでなり、ここで該微生物が、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作したポリヌクレオチドをさらに含んでなり、微生物が、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、ポリペプチドを発現して、分泌または提示する、
発酵中にブチルエステルを生成する方法。
【請求項４３】
発酵培地が１つまたは複数のカルボン酸をさらに含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
炭素基質がバイオマスに由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
バイオマスがトウモロコシまたはサトウキビである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
炭素基質と、トリグリセリドジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質の双方が、同一バイオマスに由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
ブタノール生合成経路を含んでなり、発現されて、分泌または提示されるリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作したポリヌクレオチドをさらに含んでなる、アルコール生成微生物と、ブチルエステルと、ブタノールとを含んでなる、発酵培地。
【請求項４８】
請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の微生物を含んでなる、動物飼料製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールおよびブタノールをはじめとするアルコールの発酵生産と、原位置生成物除去法を用いた、アルコール発酵を改善する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコールは産業および科学において、多様な用途を有する。例えばアルコールは、飲料（すなわちエタノール）、燃料、試薬、溶剤、および消毒剤として使用し得る。例えばブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における原材料化学物質として、および食品およびフレーバ産業における食品等級抽出剤としての用途をはじめとする、多様な用途のある重要な工業的化学物質であるアルコールである。したがってブタノールなどのアルコールに対する、ならびに再生不能資源に依存しない効率的な生産法に対する、高い需要がある。
【０００３】
微生物による発酵を利用するアルコール生産は、再生可能な原材料からの基質を利用する、１つの生産法である。特にブタノールの生産では、高収率でブタノールを産生するいくつかの微生物は、ブタノール毒性閾値もまた低いため、ブタノールが生成するに従って、それを発酵容器から除去する必要がある。したがって発酵培地中のブタノール産生微生物のブタノール毒性閾値が低いにもかかわらず、ブタノールを高収率で生産するための効率的な方法とシステムを開発する継続的必要性がある。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を使用して、ブタノール（またはその他の発酵性アルコール）が生成するに従って、それを発酵容器から除去し得て、それによって微生物がブタノールを高収率で産生できるようにする。当該技術分野で記載される、発酵性アルコールを除去するＩＳＰＲの一方法は、液液抽出である（特許文献１）。一般に、例えばブタノール発酵に関しては、発酵培地を有機抽出剤に接触させる。有機抽出剤と発酵培地は、二相混合物を形成する。ブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物と接触する水相中の濃度が低下し、それによって阻害性ブタノールに対する微生物の曝露が制限される。製品アルコールを抽出剤中に移動させる抽出剤と発酵ブロスの接触；水相からの抽出剤相の分離；および好ましくは、長期の工程にわたり抽出剤の分配係数の劣化が最小である抽出剤の再循環によって、液液抽出がもたらされる。
【０００４】
抽出剤は、例えば加水分解性デンプンの原材料として発酵容器に供給されるバイオマス中に存在する脂質の蓄積によって、各再循環毎に経時的に汚染され得る。一例として、（グルコースを生成するグルコアミラーゼ添加による発酵中に起きる、液化マッシュの糖化を伴う）同時糖化と発酵によるグルコースのブタノールへの変換中に、発酵容器に装入される液化コーンマッシュは、コーンオイルを含有する発酵ブロスをもたらし得る。ＩＳＰＲ中の抽出剤中へのコーンオイル脂質の溶出は、各抽出剤再循環毎に脂質濃度の蓄積をもたらし得て、各再循環毎に抽出剤中の脂質濃度が増大するにつれて、抽出剤中の製品アルコールの分配係数を低下させる。
【０００５】
液化マッシュ中に存在する脂質をＩＳＰＲで使用し得る抽出剤に変換することは、発酵容器に供給される脂質量を低下させる方法であり、リパーゼをエステル化触媒として発酵に添加することで、発酵中に生成物アルコールが生じるにつれて、それを脂肪酸でエステル化することも同様である。このような方法については、例えば特許文献２および３、および特許文献４で記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１０３１２０４４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１０３１２０４３号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発酵へのリパーゼ添加に付随する経費も低下させ得る、代案の抽出発酵法に対する継続する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で提供されるのは、ａ）バイオマス原材料に由来する発酵性炭素基質と、バイオマス原材料に由来する発酵性炭素基質から生産されるアルコールと、アルコール産生微生物とを含んでなる、発酵培地を提供し、アルコール産生微生物が、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように前記ポリペプチドを発現して、提示または分泌するステップと；ｂ）発酵培地をカルボン酸に接触させるステップとを含んでなり；リパーゼ活性が、微生物によって産生されるアルコールの少なくとも一部を細胞外でアルコールエステルに変換するのに十分な量で、発酵培地中に存在する方法である。実施形態では、アルコール産生微生物は酵母である。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを遺伝子操作して作り出す。実施形態では、方法は、発酵培地を抽出剤に接触させて、水相と有機相を含んでなる二相混合物を形成するステップをさらに含んでなる。実施形態では、抽出剤はカルボン酸を含んでなる。実施形態では、生成物アルコールは、Ｃ２〜Ｃ８アルキルアルコールである。実施形態では、生成物アルコールはエタノールである。実施形態では、アルコールエステルは、脂肪酸エチルエステルを含んでなる。実施形態では、生成物アルコールはブタノールである。実施形態では、アルコールエステルは、脂肪酸ブチルエステルを含んでなる。実施形態では、アルコールエステルは、脂肪酸エチルエステルをさらに含んでなる。
【０００９】
実施形態では、リパーゼ活性を有する本明細書で提供されるポリペプチドは、微生物表面に提示される。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは分泌される。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４９、２５０、２５１、２５２、２５３のいずれか１つと、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列、またはその断片を含んでなる。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、８、９、４６、４８、５０、５２、５４、２５５、２７１または２７３を有するポリヌクレオチドと、少なくとも約７０％の同一性がある配列を含んでなる。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２、４、６、２５６、４７、４９、５１、５３、５５、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２７２、または２７４を有するポリペプチドと、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性がある配列、またはその活性断片を含んでなる。実施形態では、リパーゼ活性を有すポリペプチドは、グリコシル化モチーフを含有しない。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、グリコシル化されていない。
【００１０】
実施形態では、カルボン酸は、コーンオイル、カノーラ油、パーム油、亜麻仁油、ジャトロファ油、またはダイズ油に由来する、遊離脂肪酸を含んでなる。実施形態では、カルボン酸は、発酵性炭素基質と同一のバイオマス原材料に由来する。実施形態では、カルボン酸は、Ｃ１２〜Ｃ２２の直鎖または分枝脂肪族鎖を有するカルボン酸を含んでなる。実施形態では、抽出剤との接触、およびカルボン酸との接触は、同時に起きる。実施形態では、微生物によって産生されるアルコールの有効力価の少なくとも約６０％は、アルコールエステルに変換される。実施形態では、発酵培地は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせをさらに含んでなり、リパーゼ活性は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部を加水分解して、遊離脂肪酸を形成する。
【００１１】
実施形態では、発酵中に生成するアルコールの有効力価は、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない、アルコール産生微生物による発酵中に生成するものを上回り、微生物は、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、前記ポリペプチドを発現して、分泌または提示する。実施形態では、発酵中のアルコール生成有効速度は、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない、アルコール産生微生物によるアルコール生成速度を上回り、微生物は、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、前記ポリペプチドを発現して、分泌または提示する。
【００１２】
改変アルコール生成経路と；リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、改変ポリヌクレオチドとを含んでなる組換え宿主細胞もまた、本明細書で提供される。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２、４、６、２５６、４７、４９、５１、５３、５５、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２７２、または２７４と、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列、またはその活性断片を含んでなる。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４９、２５０、２５１、２５２、２５３のいずれか１つと、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列、またはその断片を含んでなる。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、グリコシル化モチーフを含有しない。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、グリコシル化されていない。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする改変ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、８、９、４６、４８、５０、５２、５４、２５５、２７１または２７３と、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含んでなる。
【００１３】
アルコール生成経路と；リパーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２、４、６、２５６、４７、４９、５１、５３、５５、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２７２、または２７４と、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列、またはその活性断片を含んでなる、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、改変ポリヌクレオチドとを含んでなる組換え宿主細胞もまた、本明細書で提供される。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４９、２５０、２５１、２５２、２５３のいずれか１つと、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列、またはその断片をさらに含んでなる。実施形態では、アルコール生成経路はブタノール生成経路である。実施形態では、ブタノール生成経路はイソブタノール生成経路である。実施形態では、宿主細胞は、低減または排除されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をさらに含んでなる。
【００１４】
微生物が、リパーゼ活性を有するポリペプチドを発現して、分泌または提示するように、遺伝子操作するステップと；微生物がアルコールを産生する条件下で、遺伝子操作微生物をトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、またはその混合物、および炭素基質に接触させるステップとを含んでなる、生成アルコールに対するアルコール産生微生物の耐性を増大させる方法もまた、本明細書で提供される。実施形態では、遺伝子操作微生物は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせに接触されて、分泌または提示されるリパーゼが、トリグリセリド（ｔｒｉｇｙｌｃｅｒｉｄｅｓ）、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部を遊離脂肪酸に変換する。実施形態では、リパーゼが、アルコールエステルの形成を触媒する。実施形態では、微生物は、リパーゼ活性のあるポリペプチドを発現して分泌するように遺伝子操作されていない微生物によって産生されるものを上回る有効力価で、アルコールを産生する。実施形態では、微生物は、改変アルコール生合成経路をさらに含んでなる。実施形態では、改変アルコール生合成経路は、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノール生合成経路である。実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含んでなる：ピルビン酸からアセト乳酸、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸、２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；およびイソブチルアルデヒドからイソブタノール。
【００１５】
本明細書では、炭素基質、およびトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質、またはその混合物を含んでなる、発酵培地を提供するステップと；発酵培地をブタノール生合成経路を含んでなるアルコール産生微生物に接触させるステップとを含んでなり、前記微生物が、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする改変ポリヌクレオチドをさらに含んでなり、リパーゼ活性が発酵培地中に存在するように、ポリペプチドを発現して、分泌または提示する、発酵中にブチルエステルを生産する方法が提供される。実施形態では、発酵培地は、１つまたは複数のカルボン酸をさらに含んでなる。実施形態では、炭素基質はバイオマスに由来する。実施形態では、バイオマスはトウモロコシまたはサトウキビである。実施形態では、炭素基質、およびトリグリセリドジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質は、同一のバイオマスに由来する。
【００１６】
本明細書では、ブタノール生合成経路を含んでなり、発現されて、分泌または提示される、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする改変ポリヌクレオチドをさらに含んでなる、アルコール産生微生物と、ブチルエステルと、ブタノールとを含んでなる、発酵培地が提供される。
【００１７】
本明細書に記載される微生物を含んでなる、動物飼料製品もまた提供される。
【００１８】
本明細書に組み込まれて明細書の一部を形成する添付図面および配列表は、本発明を例証して、記述と合わせて、本発明の原理をさらに説明するのに役立ち、関連技術分野の当業者が、本発明を作成し、それを使用できるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】微生物が、カルボン酸および／または天然油と共に発酵容器に提供される、本発明の例示的な方法とシステムを概略的に図示する。
【図２】ピルビン酸からのイソブタノール生合成のための生合成経路の例を描写する。
【図３】酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター中で、構成的ＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーターの転写制御下にあるカンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）ＬＩＰ１リパーゼ（Ｎｅｖｏｉｇｔ  Ｅ，Ｋｏｈｎｋｅ  Ｊ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＣＲ，Ａｌｐｅｒ  Ｈ，Ｓｔａｈｌ  Ｕ，＆  Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ（２００６），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ａｐｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：５２６６−５２７３）と、ＣＹＣ１転写ターミネーターとを有する、プラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ＣｄＬＩＰ１（「ｐＮＡＫ１０」；配列番号４５；実施例１を参照されたい）のマップである。
【図４】酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター中で、構成的ＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーターの転写制御下にあるテルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）Ｔｌａｎリパーゼ（Ｎｅｖｏｉｇｔ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．）と、ＣＹＣ１転写ターミネーターとを有する、プラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ＴＨｌｉｐ（「ｐＴＶＡＮ２」；配列番号１００；実施例２を参照されたい）のマップである。
【図５】酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター中で、構成的ＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーター転写制御下にあるカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）ＣａｌＢリパーゼ（Ｎｅｖｏｉｇｔ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．）と、ＣＹＣ１転写ターミネーターとを有する、プラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ＣａｌＢ（「ｐＴＶＡＮ３」；配列番号；実施例７を参照されたい）のマップである。
【図６】酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター中で、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素ＯＲＦを有する、プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号４３；実施例を参照されたい）のマップである。
【図７】酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクター中で、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素とアルコールデヒドロゲナーゼ酵素とをコードするＯＲＦを有する、プラスミドｐＢＰ９１５（配列番号４４；実施例９および１０を参照されたい）のマップである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列番号１および２は、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼＢ（「ＣａｌＢ」）の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号３および４は、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）からのリパーゼ１（「ＬＩＰ１」）の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号５および６は、テルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）からのＴｌａｎリパーゼ（「Ｔｌａｎ」）の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号２５５および２５６は、アスペルギルス・チュービンゲネシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）からのリパーゼ３（「ｌｉｐ３」）の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号７、８、９、および２５７は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化された、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、テルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、およびアスペルギルス・チュービンゲネシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）からのＣａｌＢ、ＬＩＰ１、Ｔｌａｎ、およびｌｉｐ３リパーゼのコード配列である。
【００２５】
配列番号４６および４７は、修飾Ｎ９９ＡがあるＣａｌＢ変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号４８および４９は、修飾Ｎ１４６ＡがあるＬＩＰ１変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号５０および５１は、修飾Ｎ１６７ＡがあるＬＩＰ１変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号５２および５３は、修飾Ｎ１４６ＡおよびＮ１６７ＡがあるＬＩＰ１変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号５４および５５は、修飾Ｎ５５ＡがあるＴｌａｎ変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号２７１および２７２は、修飾Ｎ５９Ａがあるｌｉｐ３変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号２７３および２７４は、修飾Ｎ２６９Ａがあるｌｉｐ３変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号２７５および２７６は、修飾Ｎ５９ＡおよびＮ２６９Ａがあるｌｉｐ３変種の核酸およびアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号２４１および２４８は、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのリパーゼのアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号２４９および２５４は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞表面アンカードメインのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号２５８および２５９は、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）およびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）からのアルコールデヒドロゲナーゼ酵素のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号２６０および２６１は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）からのケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号２６２および２６３は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｅｈｄｒａｔａｓｅｓ）のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１０〜４５、５６〜１４４、１５３〜２３８、２４０、２６４〜２７０、および２７８は、実施例に記載される合成コンストラクトおよびプライマーの配列である。
【００３９】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。また文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本明細書で参照される全ての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって援用する。
【００４０】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書で提供される。
【００４１】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、または任意のその他のバリエーションは、記述される整数または整数群の包含を暗示するが、任意のその他の整数または整数群の排除を暗示しないものと理解される。例えば要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含み得る。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００４２】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００４３】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００４４】
本明細書の用法では、本発明で用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際の濃縮物または調製溶液の作成で使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物作成または方法実施で用いられる成分の、生産、供給元または純度の差異などを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、代案としては報告される数値の５％以内を意味する。
【００４５】
「バイオマス」は、本明細書の用法では、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類、二糖類および／または単糖類、およびそれらの混合物を含んでなる、トウモロコシ、サトウキビ、コムギ、セルロース系またはリグノセルロース系材料および材料群などの天然資源に由来する、あらゆる糖類およびデンプンをはじめとする、発酵性糖類を提供する加水分解性多糖類を含有する、天然物を指す。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得る；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなってもよい。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、牧草、コムギ、ライムギ、麦藁、オオムギ、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、ダイズ、穀物製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花卉、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えばマッシュまたはジュースまたは糖蜜または加水分解物は、製粉、処理および／または液化などにより、発酵目的でバイオマスを加工するための技術分野で公知の任意の加工によって、バイオマスから生成されてもよく、発酵性糖を含んでなり、一定量の水を含んでなってもよい。例えばセルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスを加工して、当業者に知られている任意の方法によって、発酵性糖類を含有する加水分解物を得てもよい。低アンモニア前処理が、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書で開示される。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、セルロースおよびヘミセルロースを分解するための酵素共同体を典型的に活用して、グルコース、キシロース、およびアラビノースをはじめとする糖類を含有する、加水分解物を生じる。（Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ａｎｄ／ｏｒ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ  ａｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）。
【００４６】
マッシュまたはジュースまたは糖蜜または加水分解物は、本明細書に記載される原材料１２および原材料スラリー１６を含んでもよい。水性供給流は、製粉、処理および／または液化などにより、発酵目的でバイオマスを加工するための当該技術分野で公知の任意の加工によって、バイオマスから誘導または生成されてもよく、発酵性炭素基質（例えば糖）および水を含んでなる。水性供給流は、本明細書に記載される原材料１２および原材料スラリー１６を含んでもよい。
【００４７】
「生成物アルコール」は、本明細書の用法では、発酵性炭素基質の原料としてバイオマスを利用する発酵プロセスにおいて、微生物によって産生され得るあらゆるアルコールを指す。生成物アルコールとしては、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアルコールが挙げられるが、これに限定されるものではない。実施形態では、生成物アルコールは、Ｃ２〜Ｃ８アルキルアルコールである。追加的な実施形態では、生成物アルコールは、Ｃ２〜Ｃ５アルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８アルキルアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられるが、これに限定されるものではないことが理解されるであろう。同様にＣ２〜Ｃ８アルキルアルコールとしては、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられるが、これに限定されるものではない。「アルコール」はまた、生成物アルコールに関連して、本明細書で使用される。
【００４８】
「ブタノール」は、本明細書の用法では、限定的に、ブタノール異性体である、１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）および／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨまたはｉ−ＢｕＯＨまたはＩ−ＢＵＯＨ、２−メチル−１−プロパノールとしてもまた知られる）のいずれかに、個々にまたはそれらの混合物として言及する。
【００４９】
「プロパノール」は、本明細書の用法では、プロパノール異性体である、イソプロパノールまたは１−プロパノールを指す。
【００５０】
「ペンタノール」は、本明細書の用法では、ペンタノール異性体である、１−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、３−ペンタノール、２−ペンタノール、３−メチル−２−ブタノール、または２−メチル−２−ブタノールを指す。
【００５１】
「原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）」は、本明細書の用法では、生成物が生じるにつれて、生物学的過程中の生成物濃度を制御するために、発酵などの生物学的過程から、特定の発酵産物を選択的に除去することを意味する。
【００５２】
「発酵性炭素源」または「発酵性炭素基質」は、本明細書の用法では、発酵性アルコールの生産のために、本明細書で開示される微生物が代謝できる炭素源を意味する。適切な発酵性炭素源としては、グルコースまたは果糖などの単糖類；乳糖またはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖類；デンプンまたはセルロースなどの多糖類；メタンをはじめとする一炭素基質；およびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
「原材料」は、本明細書の用法では、発酵プロセス中の供給物、不溶解固形分ありまたはなしの発酵性炭素源を含有する供給物、および当てはまる場合、液化、糖化、またはその他の処理などのさらなる処理によって、発酵性炭素源がデンプンから放出され、または複合糖類の分解から得られる前または後の発酵性炭素源を含有する供給物を意味する。原材料は、バイオマスを含み、またはそれに由来する。適切な原材料としては、ライムギ、コムギ、トウモロコシ、トウおよびそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
「不溶解固形分」は、本明細書の用法では、例えば胚芽、繊維、およびグルテンなどの原材料の非発酵性部分を意味する。
【００５５】
「発酵ブロス」は、本明細書の用法では、水、糖類、溶解固形分、アルコール産生微生物、生成物アルコール、および発酵容器内に保持される材料の全てのその他の構成物の混合物を意味し、発酵容器内では、存在する微生物による、糖類からアルコール、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への反応によって、生成物アルコールが生産される。時折、本明細書の用法では、「発酵培地」および「発酵混合物」という用語は、「発酵ブロス」の同意語として使用し得る。
【００５６】
「発酵容器」は、本明細書の用法では、糖類からブタノールなどの生成物アルコールが生産される発酵反応が、その中で起きる容器を意味する。
【００５７】
「有効力価」という用語は、本明細書の用法では、発酵培地１リットルあたりの、発酵によって生じる特定のアルコール（例えばブタノール）の、またはアルコールエステル化によって生じるアルコールエステルのアルコール当量の総量を指す。例えば単位発酵体積中のブタノールの有効力価は、（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノールの量；（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合は、気相から回収されるブタノールの量、および（ｉｖ）有機相または水相のいずれかの中のブタノールエステルのアルコール当量を含む。
【００５８】
「糖化」は、本明細書の用法では、オリゴ糖類の単糖類への分解を意味する。「同時糖化発酵」は、発酵と糖化が、同一容器内で同時に起きることを意味する。
【００５９】
本明細書の用法では、「糖化酵素」は、例えばグリコーゲン、デンプンのα−１，４−グルコシド結合などの多糖類および／またはオロゴ糖類（ｏｌｏｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を加水分解できる１つまたは複数の酵素を意味する。糖化酵素としては、セルロース系またはリグノセルロース系材料もまた加水分解できる酵素も挙げられる。
【００６０】
本明細書の用法では、「リパーゼ活性」は、水不溶性のまたは水溶性不十分の脂質基質中で、エステルの化学結合の加水分解を触媒する酵素活性を意味する。リパーゼはエステラーゼのサブクラスであり、したがって「リパーゼ活性」は、エステルのカルボン酸とアルコールへの加水分解を触媒する酵素活性もまた意味し、本明細書の用法では、「リパーゼ活性」は、アルコールとカルボン酸をカルボン酸のアルコールエステルにエステル化する、酵素活性もまた意味する。
【００６１】
本明細書の用法では、「グリコシル化」は、タンパク質が細胞からの分泌の対象になる場合に起こり得る、タンパク質などの生物学的巨大分子への炭水化物分子の酵素的付加である。タンパク質のＯ−グリコシル化では、炭水化物は、セリン、スレオニン、またはチロシン残基のヒドロキシル基に付着する。タンパク質のＮ−グリコシル化では、炭水化物は、共通配列ＮＸＳ／Ｔ中のアスパラギン（Ｎ）残基のアミド側鎖に付着し、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはスレオニンである。「グリコシル化」は、本明細書の用法では、炭水化物が共有結合的に付着するタンパク質分子を指す。
【００６２】
「液化容器」は、本明細書の用法では、その中で液化が起こる容器を意味する。液化は、オリゴ糖類が原材料から放出される過程である。原材料がトウモロコシである実施形態では、オリゴ糖類は、液化中にコーンスターチ内容物から放出される。
【００６３】
「分離」という用語は、本明細書の用法では、「回収」と同義であり、化合物を最初の混合物から取り出して、最初の混合物中の化合物の純度または濃度よりも、さらに高純度または高濃度の化合物を得ることを指す。
【００６４】
「水不混和性」または「不溶性」という用語は、発酵ブロスなどの水溶液と混合できずに１つの液相を形成する、抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。
【００６５】
「抽出剤」または「ＩＳＰＲ抽出剤」は、本明細書の用法では、ブタノールなどの任意の生成物アルコールを抽出するのに使用され、または生成物アルコールとカルボン酸または脂質から触媒によって産生される任意の生成物アルコールエステルを抽出するのに使用される、有機溶剤を意味する。時折、本明細書の用法では、「溶媒」という用語が、「抽出剤」の同意語として使用されることがある。本明細書に記載される方法では、抽出剤は水不混和性である。
【００６６】
「天然油」は、本明細書の用法では植物（例えばバイオマス）または動物から得られる脂質を指す。「植物由来油」は、本明細書の用法では、特に植物から得られる脂質を指す。時折、「脂質」は、「油」および「アシルグリセリド」の同意語として使用されることがある。天然油としては、獣脂、トウモロコシ、カノーラ、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ココナツ、綿実油、魚油、ホホバ油、豚脂、亜麻仁油、牛脚油（ｎｅｅｔｓｆｏｏｔ）、オイチシカ油、パーム油、落花生油、ナタネ油、米油、紅花油、大豆油、ヒマワリ、桐油、ジャトロファ油、および植物油混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
「有機相」という用語は、本明細書の用法では、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤に接触させて得られる、二相混合物の内の非水相を指す。
【００６８】
「脂肪酸」という用語は、本明細書の用法では、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２８炭素原子（通常Ｃ１２〜Ｃ２４炭素原子）を有するカルボン酸（例えば脂肪族モノカルボン酸）を指す。脂肪酸また、分枝または非分枝であってもよい。脂肪酸は、動物または植物性脂肪、油、またはワックスから誘導されてもよく、またはエステル化形態でその中に含有されてもよい。脂肪酸は、脂肪および脂肪油中のグリセリドの形態で自然発生してもよく、または脂肪の加水分解によって、または合成によって得られてもよい。脂肪酸という用語は、脂肪酸の単一化学種または混合物を記述してもよい。脂肪酸は、プロトン化および非プロトン化脂肪酸の双方の混合物を含んでなってもよく、非プロトン
化脂肪酸は、非プロトン化脂肪酸の塩（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはカルシウムイオン塩）である。これに加えて、脂肪酸という用語は、遊離脂肪酸もまた包含する。
【００６９】
「脂肪アルコール」という用語は、本明細書の用法では、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２炭素原子の脂肪族鎖を有するアルコールを指す。
【００７０】
「脂肪アルデヒド」という用語は、本明細書の用法では、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２炭素原子の脂肪族鎖を有するアルデヒドを指す。
【００７１】
「カルボン酸」という用語は、本明細書の用法では、−ＣＯＯＨの一般化学式がある任意の有機化合物を指し、その中で炭素原子は二重結合によって酸素原子に結合してカルボニル基（−Ｃ＝Ｏ）を形成し、単結合によってヒドロキシル基（−ＯＨ）に結合する。カルボン酸は、プロトン化カルボン酸の形態、またはカルボン酸塩（例えばアンモニウム、ナトリウムまたはカリウム塩）の形態、またはプロトン化カルボン酸とカルボン酸塩との混合物の形態であってもよい。カルボン酸という用語は、１つの化学種（例えばオレイン酸）を記述してもよく、または例えばバイオマス由来脂肪酸エステルまたはトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリエリド（ｍｏｎｏｇｌｙｅｒｉｄｅｓ）、およびリン脂質（ｐｈｏｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）の加水分解によって生産され得る、カルボン酸の混合物を記述してもよい。
【００７２】
「ブタノール生合成経路」または「ブタノール生成経路」という用語は、本明細書の用法では、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００７３】
「１−ブタノール生合成経路」または「１−ブタノール生成経路」という用語は、本明細書の用法では、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００７４】
「２−ブタノール生合成経路」または「２−ブタノール生成経路」という用語は、本明細書の用法では、ピルビン酸から２−ブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００７５】
「イソブタノール生合成経路」または「イソブタノール生成経路」という用語は、本明細書の用法では、ピルビン酸からイソブタノールを生成する酵素経路を指す。
【００７６】
「アルコール生合成経路」または「アルコール生成経路」という用語は、本明細書の用法では、炭素基質をアルコールに変換する酵素経路を指す。「改変アルコール生成経路」を含んでなる組換え宿主細胞は、常態で宿主細胞中に存在するものとは異なる様式でアルコールを生成する、改変経路を含有する宿主細胞を指す。このような差異としては、典型的に宿主細胞によって産生されないアルコールの生産、または増大したまたはより効率的な生産が挙げられる。
【００７７】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現されることができ、任意選択的に、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）制御配列を含む、核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界で一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でない（すなわちその天然状態から修飾され、または別の起源に由来する）任意の遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配置される制御配列とコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来遺伝子」または「異種遺伝子」とは、常態では天然遺伝子として宿主生物中に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
【００７８】
本明細書の用法では「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または結合コード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでもよい。
【００７９】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）などの核酸分子またはコンストラクトを指す。本明細書の用法では、「遺伝子」はポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、完全長遺伝子またはｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、または非翻訳５’および３’配列およびコード配列をはじめとする、その断片を含有し得る。ポリヌクレオチドは、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば異種ＤＮＡ）であってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えばポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖またはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよい、ＤＮＡとＲＮＡを含んでなる、ハイブリッド分子から構成され得る。「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的修飾形態を包含する。
【００８０】
「改変ポリヌクレオチド」は、本明細書の用法では、天然に見られる形態から修飾されたポリヌクレオチド、または形質転換などの遺伝子移入によって宿主生物に導入されたポリヌクレオチドを指す。このような修飾としては、例えば、自然界ではコード配列と作動的に連結して見られないプロモーターと、コード配列を作動可能に連結すること、または２つのコード配列を一緒に連結してキメラコード配列を作成することなど、自然界では連結して見られない２つの配列を連結することが挙げられる。このような修飾は、天然に見られるポリヌクレオチドの塩基置換、挿入、または欠失をはじめとする、１つまたは複数のヌクレオチド変化を作り出すこともまた含む。
【００８１】
ポリヌクレオチド配列は「単離された」と称されてもよく、その中ではそれはその天然環境から取り出されている。例えばベクター中に含有される、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有する、ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的で単離していると見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的）精製ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に従った単離ポリヌクレオチドまたは核酸としては、合成的に生成された分子がさらに挙げられる。ＤＮＡポリマーの形態の単離ポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなってもよい。
【００８２】
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、単数形「ポリペプチド」ならびに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としてもまた知られている）によって直線的に連結するモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または鎖群を指し、生成物の特定長を指さない。したがって２つ以上のアミノ酸の鎖または鎖群を指すのに使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意のその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと同義的に使用されてもよい。ポリペプチドは、天然生物学的起源に由来してもよく、または組換え技術によって生産されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列に翻訳されない。それは化学合成をはじめとする、任意の様式で作成されてもよい。
【００８３】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、変種、または誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドが意図される。特定レベルの精製は、必要ない。例えば単離ポリペプチドは、その固有のまたは天然環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現される、組換え的に生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的で（ｆｏｒ  ｐｕｒｐｏｓｅｄ  ｏｆ）単離されていると見なされ、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的または実質的に精製された天然または組換えポリペプチドについても同様である。
【００８４】
本明細書の用法では、「組換え微生物」は、ブタノールなどの生合成経路を含んでなるように宿主細胞を遺伝子操作するなど、組換えＤＮＡ技術の使用によって修飾された、細菌または酵母などの微生物を指す。
【００８５】
本明細書の用法では、「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列の多様性を可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００８６】
様々な宿主の形質転換のための、遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する「コドン最適化」という用語は、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更しない、遺伝子または核酸分子コード領域のコドン変更を指す。このような最適化としては、その生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンによって、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなり大きい数のコドンを置換することが挙げられる。
【００８７】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含んでなるヌクレオチド配列の偏向は、遺伝子をコードする配列の多様性を可能にする。各コドンは３個のヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定塩基に限定されるので、ヌクレオチドの６４個の可能な組み合わせがあり、その内６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは、翻訳終了シグナルをコードする）。いずれのコドンがいずれのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は、本明細書で表１として再現される。その結果、多数のアミノ酸が、２個以上のコドンによって指定される。例えばアミノ酸、アラニンおよびプロリンは４個の三つ組み、セリンおよびアルギニンは６個の三つ組みによってコードされるのに対し、トリプトファンおよびメチオニンは１個の三つ組みのみによってコードされる。この縮重が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、広範囲にわたるＤＮＡ塩基組成の変動を可能にする。
【００８８】
【表１】
2014518066.tif 000003
【００８９】
多数の生物は、成長するペプチド鎖への特定アミノ酸挿入をコードする、特定のコドン使用についてバイアスを示す。生物間のコドン選択、またはコドンバイアス、コドン使用頻度の差は、遺伝コードの縮重によって提供され、文献で多数の生物において十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、それは次に、特に翻訳されるコドンの特性、および特定の移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に左右されると思われる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現のために調整し得る。
【００９０】
多種多様な動物、植物、および微生物種で利用できる多数の遺伝子配列を所与として、コドン使用頻度の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用頻度データベース」（２００８年３月２０日閲覧）で容易に入手でき、これらの表はいくつかの方法で応用し得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋリリース１２８．０［２００２年２月１５日］から計算された酵母のコドン使用頻度表は、下で表２として再現される。この表はｍＲＮＡ命名法を使用し、表は、ＤＮＡに見られるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡに見られるウラシル（Ｕ）を使用する。表２では、頻度が、全ての６４個のコドンでなく、各アミノ酸について計算されるように適応されている。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【００９４】
この表または同様の表を利用することで、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが、所与の種に最適のコドンを使用する、コドン最適化コード領域の核酸断片を生成し得る。
【００９５】
所与のポリペプチド配列をコードする最適化頻度で、コドンを無作為に割り当てることは、各アミノ酸についてコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手動で成し得る。それに加えて、当業者は、様々なアルゴリズム、およびコンピュータソフトウェアプログラムを容易に利用できる。例えばＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できるＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージの「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手できるＶｅｃｔｏｒＮＴＩスイートのｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手できるＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージの「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能。これに加えて、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇで利用できる「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」機能（２００８年４月１５日閲覧）およびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用できる「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能（２００２年７月９日閲覧）などのコドン最適化コード領域配列の様々な資源が公的に入手可能である。初歩的アルゴリズムを構築し、所与の頻度に基づいてコドンを割り当てることもまた、当業者によって、基本的数学機能により容易に達成され得る。
【００９６】
コドン最適化コード領域は、「合成遺伝子デザイナー」などのソフトウェアパッケージをはじめとする、当業者に知られている様々な方法によって、デザインされ得る（ｕｓｅｒｐａｇｅｓ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／〜ｗｕｇ１／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／、２０１２年３月１９日閲覧）。
【００９７】
ポリヌクレオチドまたは核酸断片は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本鎖形態が、その他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１で例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、（遠縁の生物からの相同的な配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間に始まり、次２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃で３０分間で繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分間を２回繰り返す、ひと続きの洗浄を使用する。より望ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、その中では、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されたことを除いて、洗浄は上と同一である。高度にストリンジェントな条件の別の好ましいセットは、６５℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最後の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件の追加的なセットは、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、それに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を含む。
【００９８】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸がハイブリダイズするためのＴｍ値は、より大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する方程式が導かれている（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１１．７−１１．８を参照されたい）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識する。
【００９９】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、またはＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、遺伝子のポリペプチドまたはヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が、既知のタンパク質または遺伝子と相同的であると推定的に同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含んでなる、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。これに加えて、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、１２〜１５個の塩基の短鎖オリゴヌクレオチドをＰＣＲ中で増幅プライマーとして使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を構成する核酸断片を明確に同定および／または分離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする、完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、開示される配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、本明細書で提供される完全配列と、ならびに上で定義される配列のかなりの部分とを含んでなる。
【０１００】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【０１０１】
「％同一性」と言う用語は、当該技術分野で公知のように、配列を比較して判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では「同一性」はまた、場合によっては、このような一連の配列間の一致によって測定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に開示されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって、容易に計算され得る。
【０１０２】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２））によって開示され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）にある、標識Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されるアラインメント法に相当する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」をはじめとする、アルゴリズムのいくつかの変種を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。さらに「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が利用でき、（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２））によって開示され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）にある、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されるアラインメント法に相当する。多重アラインメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【０１０３】
その他の種からの同一の、または同様の、機能または活性を有する変種またはポリペプチドをはじめとするポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。％同一性の有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これに限定されるものではなく、または５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５５％〜１００％の任意の整数百分率が、本発明を説明する上で有用であってもよい。適切な核酸断片は、上の相同性を有するだけでなく、典型的に、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好適には少なくとも２００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１０４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターの任意の組を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載される。本明細書で使用される追加的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。
【０１０６】
本明細書で開示される組換え宿主細胞の遺伝子操作は、標準遺伝子技術およびスクリーニングを使用して実施し得て、遺伝子操作に適する任意の宿主細胞中で実施し得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）。実施形態では、組換え宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。実施形態では、本明細書で開示される組換え宿主細胞は、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用な、任意の酵母または真菌宿主であり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、クリヴェロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の成員、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種であり得る。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。
【０１０７】
出願人らは、リパーゼ酵素を発現して発酵培地中に分泌できる組換え宿主細胞が、アルコールとカルボン酸のエステル化を触媒する触媒を産生することを発見した。アルコールのエステル化は、細胞がアルコールをより高い効率で産生できるようにし、または宿主細胞が毒性効果を及ぼすアルコール量を超えるアルコール量を産生できるようにしてもよいので、このような宿主細胞は、アルコールの発酵生産で使用される宿主細胞の改善に相当する。またこのような組換え微生物の使用は、本明細書に記載される方法を実施するために、発酵培地に精製リパーゼ酵素を添加する必要性を低減または排除し、それはコストと作業上の利点を提供してもよい。
【０１０８】
さらにアルコールの発酵生産は、典型的に、再生可能なバイオマス原材料を利用して炭素基質を供給し、それを組換え微生物が生成物アルコールに変換する。このような原材料は、一定量のトリグリセリドを含有し得る。抽出発酵を実施して、発酵から生成物アルコールを除去する場合、トリグリセリドが経時的に蓄積することもあり、抽出剤の分配係数および再生利用可能性を低下させる。本明細書で提供される組換え宿主細胞によって分泌されるリパーゼは、有利にはトリグリセリドを加水分解して遊離脂肪酸にし得て、それはエステル化の基質になってもよく、それはまた、生成物アルコールの抽出剤分配係数に対する影響がより小さくあってもよい。
【０１０９】
リパーゼ活性を有するポリペプチド
本明細書で開示される組換え宿主細胞は、リパーゼ活性を有するポリペプチドを有するポリヌクレオチドを含んでなる。リパーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれらが由来する生物の例が、表３に提供される。
【０１１０】
【表５】
2014518066.tif 000007
【０１１１】
高い（＞９０％）配列類似性があるタンパク質を同定するために、表３に記載されるリパーゼをクエリー配列として使用して、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の非重複タンパク質配列データベースのＢＬＡＳＴ分析を実施した。結果は、表４に示される（２０１２年１月２２日に国立生物工学情報センターで非重複タンパク質配列データベース情報をオンライン取得した）。９０％を超える配列類似性があるタンパク質は、本明細書に記載されるリパーゼと同様に機能することが予測されるリパーゼと見なされるのに対し、クエリー配列に対する類似性が約３０％程度に低い配列は、リパーゼとアノテートされて、本明細書に記載される方法および組成物と共に使用することが検討される。
【０１１２】
【表６】
2014518066.tif 000008
【０１１３】
上記のおよび表３および４のリパーゼの他に、適切なリパーゼ配列は、例えば、アブシディア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビューベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、ブロコトリックス属（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロモバクター属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ハイフォザイマ属（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イノシシ属（Ｓｕｓ）、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、チアロスポレラ属（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、および／またはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株をはじめとする任意の起源に由来してもよい。実施形態では、リパーゼ源は、アブシディア・ブラケスレーナ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅｎａ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アクロモバクター・イオファグス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｏｐｈａｇｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、アルタナリア・ブラシキコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｏｌａ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・チュービンゲネシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ストレアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｒｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブロコトリクス・サーモソハタ（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ  ｔｈｅｒｍｏｓｏｈａｔａ）、カンディダ・シリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ））、カンジダ・パラリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、カンジダ・エルノビイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｒｎｏｂｉｉ）、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、カンジダ・サーモフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、クロモバクター・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、コプリナス・シネリウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｉｕｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ）、フザリウム・ロゼウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ゲオトリクム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム・ペニシラタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ  ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）、フミコラ・ブレビスポラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｂｒｅｖｉｓｐｏｒａ）、フミコラ・ブレビス変種テルモイデ（Ｈｉｍｉｃｏｌａ  ｂｒｅｖｉｓ  ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ラクトバチルス・カルバータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、リゾプス  ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）、ペニシリウム・クラストサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）Ｉ種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ＩＩ種、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス‐セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）（バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）の同義語）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス・メフィチカ・リポリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｐｈｉｔｉｃａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プランタリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌａｎｔａｒｉ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、およびシュードモナス・ウィスコンシネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ノドサス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロマイセス・シバタナス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、タラロミセス・サーモフィレス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、テルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（以前のフミコラ・ラヌギノース（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ））、チアロスポレラ・ファセオリナ（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。実施形態では、リパーゼは、テルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）リパーゼ、アスペルギルス・チュービンゲネシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）ｌｉｐ３、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種リパーゼ、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）リパーゼ、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）リパーゼ、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種リパーゼ、カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）リパーゼ、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼ、ゲオトリクム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）からのリパーゼＡおよびＢ、ニューロス���ラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）リパーゼ、ネクトリア・ハエマトコカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）リパーゼ、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）リパーゼ  リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ、およびリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）リパーゼからなる群から選択される。
【０１１４】
当業者は、上の表中の、または指示される起源に由来する、ポリヌクレオチド配列などのリパーゼ活性があるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、組換え宿主細胞のためにコドン最適化され得ることを理解するであろう。さらに当業者は、ポリペプチドのリパーゼ活性を排除することなく、所与のポリペプチド配列にトランケーションおよび保存的置換を実施し得ることを理解するであろう。したがって本明細書では、提供される配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドおよびその活性断片が提供される。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【０１１５】
本明細書に記載される方法および宿主細胞の実施形態では、生成物アルコールが生じる間に、発酵培地中でリパーゼが活性を有するように、リパーゼ活性を有するポリペプチドが微生物によって発現され分泌されてもよい。細胞表面に発現されるポリペプチドの活性は、細胞外部で利用可能であるので、当業者は、分泌経路を通じてプロセッシングされる、細胞壁タンパク質などの微生物表面に発現されるポリペプチドが、分泌されると見なされることを理解するであろう。したがって実施形態では、分泌されるリパーゼは微生物表面に発現される。タンパク質の表面発現は当該技術分野で公知であり、ポリペプチドを表面発現の対象にするための修飾についても同様である。（Ｗａｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｓ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．Ｕｅｄａ  ａｎｄ  Ａ．Ｔａｎａｋａ（２００１）。“Ｓｐａｃｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．”Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５６（５−６）：６８１−６８６，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｈ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｕｅｄａ，Ａ．Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ａ．Ｋｏｎｄｏ（２００２）。“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｆｌｏ１ｐ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ．”Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８（９）：４５１７−４５２２，Ｍｏｒｍｅｎｅｏ，Ｍ．，Ｉ．Ａｎｄｒｅｓ，Ｃ．Ｂｏｆｉｌｌ，Ｐ．Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｊ．Ｚｕｅｃｏ（２００８）。“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｌｉｐａｓｅ  Ａ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｉｒ４  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０（３）：４３７−４４５，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｈ．Ｚｈａｏ，Ｂ．Ｊｉａ，Ｌ．Ｘｕ  ａｎｄ  Ｙ．Ｙａｎ（２０１０）。“Ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｗｐ２  ａｓ  ａｎ  ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２（２）：２５５−２６０，Ｓｕ，Ｇ．−ｄ．，Ｘ．Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｙ．Ｌｉｎ（２０１０）。“Ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｄ１  ａｓ  ａｎ  ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２（８）：１１３１−１１３６，Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍ．Ｕｅｄａ（２０１１）。“Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３（１）：���−９）。実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドはタンパク質のドメインに融合され、それはポリペプチドを細胞表面に標的化する。実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドは、Ｆｌｏ１ｐ、Ｐｉｒ４、Ｓｅｄ１、Ｓａｇ１ｐ、Ｃｗｐ２、またはＡｇａ２のドメインに融合される。実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドは、ＧＰＩアンカーモチーフを有する、タンパク質、またはタンパク質断片に融合される。ＧＰＩアンカーモチーフは、当業者に知られており、バイオインフォマティクスによって例えば予測エンジンを使用して予測し得る。（例えばｍｅｎｄｅｌ．ｉｍｐ．ａｃ．ａｔ／ｇｐｉ／ｆｕｎｇｉ＿ｓｅｒｖｅｒ．ｈｔｍｌの予測エンジンオンライン、２０１２年３月１９日閲覧）。（Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＧＰＩ  ｌｉｐｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｆｕｎｇａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ，Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ，  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ａｎｄ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｍａｒ  １９；３３７（２）：２４３−５３。）ポリペプチドをサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞表面を標的化するのに使用されてもよいポリペプチド配列ドメインの例は、表５に示される。表５中のタンパク質の系統名は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ゲノムデータベース（「ＳＧＤ」；ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／でオンライン；２０１２年３月１３日情報検索）に従う。本開示を持ち合わせている当業者は、ポリペプチド配列の実例および当該技術分野で公知のその他のこのような配列を使用して、リパーゼ活性を組換え微生物の細胞表面に標的化する、ポリペプチドを構築できるであろう。
【０１１６】
【表７】
2014518066.tif 000009
【０１１７】
実施形態では、本明細書で提供されるリパーゼポリペプチド配列は、Ｎ−グリコシル化をはじめとするがこれに限定されるものではないグリコシル化が、低減または排除されるように修飾されてもよい。このような修飾は、１つまたは複数のグリコシル化モチーフが除去されるように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変異させることで起こり得る。実施形態では、グリコシル化モチーフはＮ−グリコシル化モチーフである。実施形態では、グリコシル化モチーフはＮＸＳ／Ｔである。実施形態では、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、グリコシル化モチーフＮＸＳ／Ｔを含有しない。
【０１１８】
グリコシル化は、当該技術分野で公知の任意の手段によって、低減または排除され得る。例えばツニカマイシンなどのグリコシル化阻害剤を用いてもよく、または宿主細胞中のグリコシル化機序を改変してもよい。また当該技術分野で公知の技術を使用して、部位特異的変異誘発によって、グリコシル化モチーフを除去し得る。例えば部位特異的変異誘発は、市販のキット（例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５２４；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施し得る。部位特異的変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、変異されるテンプレートへのウラシル組み込みを伴う、Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ（１９８５）Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２）によって、またはホスホロチオエート組み込み法（Ｔａｙｌｏｒ  ＪＷ，Ｏｔｔ  Ｊ，＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ（１９８５），Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：８７６５−８７８５）によって、または当該技術分野で公知のその他の生体外および生体内法によって実施し得る。変異誘発のための標的部位のためのプライマーデザインは、当該技術分野で周知であり、変異誘発のための標的部位を同定する多重配列アラインメントなどの配列分析もまた同様に周知である。
【０１１９】
実施形態では、変異誘発は、モチーフのＮが、任意のその他の天然アミノ酸（Ａ、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶ；表１を参照されたい）で置換されるように実施される。実施形態では、モチーフのＮはＡで置換される。実施形態では、変異誘発は、モチーフのＳ／Ｔが、任意のその他の天然アミノ酸（Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、またはＶ；表１を参照されたい）で置換されるように実施される。実施形態では、ＮおよびＳ／Ｔの双方が、任意のその他の天然アミノ酸（Ｎ残基におけるＡ、Ｒ、Ｊ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、またはＶ、またはＳまたはＴ；Ｔ残基における、Ａ、Ｒ、Ｊ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、またはＶ、ＳまたはＮ；Ｓ残基における、Ａ、Ｒ、Ｊ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、またはＶ、またはＴまたはＮ）で置換される。実施形態では、グリコシル化モチーフＮＸＳ／ＴがモチーフＡＸＳ／Ｔで置換される。
【０１２０】
非限定的一例では、Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）は、２つのグリコシル化配列である、コドン１４６のＮＩＳおよびコドン１６７のＮＮＴを含有する。実施形態では、これらのグリコシル化部位の片方または両方が置換の対象になり、指示されるグリコシル化部位は、それぞれＡＩＳとＡＮＴで置換される。Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）はコドン９９にＮＤＴを有し、Ｔ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）はコドン５５にＮＩＴを有する。実施形態では、指示されるグリコシル化部位は、指示される位置で配列がＡＤＴおよびＡＩＴになるように変異する。
【０１２１】
表６に示されるのは、Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、およびＴ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）からの予測されたグリコシル化部位リパーゼ読み取り枠、およびこれらの部位を消滅させる変異の例である。第１の列は、そこでグリコシル化部位が生じる、ポリペプチド中の位置を列挙する。第２の列は、その位置におけるグリコシル化配列と、コドン最適化ポリヌクレオチド中でそれをコードするＤＮＡ配列とを示す。第３の列は、変異誘発後のその位置におけるポリペプチド配列と、アミノ酸変化をもたらすのに必要なＤＮＡ配列とを示す。
【０１２２】
【表８】
2014518066.tif 000010
【０１２３】
これに加えて、表６に列挙される修飾（Ｎ１４６ＡおよびＮ１６７Ａ）の双方があるカンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼの核酸およびアミノ酸配列が、配列番号５２および５３として示される。表６に列挙される修飾（Ｎ５９ＡおよびＮ２６９Ａ）の双方があるＡ．チュービンゲネシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼの核酸およびアミノ酸配列は、配列番号２７５および２７６として示される。
【０１２４】
実施例で示されるように、当該技術分野で公知の、および／または本明細書で提供される技術を使用して、当業者は、本明細書で提供される方法および組成物中で、リパーゼ中のグリコシル化モチーフを容易に修飾して、このようなリパーゼの活性を判定し得る。
【０１２５】
当業者は、提供される配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドおよびその活性断片が、本明細書で提供されることを理解するであろう。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。当業者はまた、本明細書に記載される方法および組成物中で使用するために、当該技術分野で公知の、または本明細書に記載される技術を使用して、本明細書で提供される配列の活性変種を作成し得ることも認識するであろう。
【０１２６】
組換え微生物およびブタノール生合成経路
理論による拘束は望まないが、本明細書に記載される改善および方法は、任意のアルコール産生微生物と併せて、特にそれらの耐性レベルを超える力価でアルコールを産生する組換え微生物と併せて、有用であってもよいと考えられる。
【０１２７】
アルコール産生微生物は、当該技術分野で公知である。例えばメタン資化性細菌（例えばメチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））によるメタンの発酵性酸化はメタノールを生じ、メタノール（Ｃ１アルキルアルコール）と、カルボン酸と、カルボン酸およびメタノールをエステル化できる触媒との接触は、カルボン酸のメタノールエステルを形成する。野生型酵母株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０，ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｏ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ；ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎ  ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０６−７１４）は、エタノールを産生し得て；エタノールと、カルボン酸と、カルボン酸およびエタノールをエステル化できる触媒との接触は、エチルエステルを形成する。
【０１２８】
アルコールを産生する組換え微生物もまた、当該技術分野で公知である。（例えば参照によって本明細書に援用する、Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，２００８，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０：３１２−３２０；Ｈａｈｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８；米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書；国際公開第１９９５０２８４７６号パンフレット；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３；２００７００３１９１８Ａ１；米国特許第７，２２３，５７５号明細書，米国特許第７，７４１，１１９号明細書；米国特許出願公開第２００９０２０３０９９Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６Ａ１号明細書；および国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット）。
【０１２９】
ブタノールを産生できる適切な組換え微生物は、当該技術分野で公知であり、ブタノールを産生できる特定の適切な微生物は、本明細書に記載される。生合成経路によってブタノールを生成する組換え微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の構成員が挙げられる。一実施形態では、組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。一実施形態では、組換え微生物は酵母である。一実施形態では、組換え微生物は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）から、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択される、クラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ミキタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋｉｔａｅ）、サッカロミセス・パラドクサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、およびカンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない��いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は、当該技術分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄをはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な供給元から入手できる。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母としては、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）ｙｅａｓｔ、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）ｙｅａｓｔ、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ  ｙｅａｓｔ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｙｅａｓｔ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｙｅａｓｔ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ  ｙｅａｓｔ、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ｙｅａｓｔ、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ  ｙｅａｓｔ、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）ｙｅａｓｔ、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３０】
それに加えて、１−ブタノール生合成経路（参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書）、２−ブタノール生合成経路（参照によって本明細書に援用する、米国特許公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書、および参照によって本明細書に援用する、米国特許公開第２００７０２９２９２７号明細書）、およびイソブタノール生合成経路（参照によって本明細書に援用する、米国特許公開第２００７００９２９５７号明細書）を含んでなる組換え微生物産生宿主について、記載されている。
【０１３１】
微生物による発酵を利用するブタノール生産、ならびにブタノール産生微生物は、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書で開示される。いくつかの実施形態では、微生物はブタノール生合成経路を含んでなる。実施形態では、基質の経路の生成物への変換を触媒する、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つポリペプチドが、微生物中の異種ポリヌクレオチドによってコードされる。実施形態では、経路の基質から生成物への変換を触媒する全てのポリペプチドは、微生物中の異種ポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低下または排除を含んでなる。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まない微生物は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書に記載される。ＧＰＤ２などのＮＡＤ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物についてもまた、その中に記載される。
【０１３２】
ブタノール生合成経路
特定の適切なイソブタノール生合成経路は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書で開示される。開示されるイソブタノール生合成経路の略図を図２に提供する。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されるように、イソブタノール生合成経路の実例中のステップには、
−例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒される、ピルビン酸からアセト乳酸への（図２中の経路ステップａを参照されたい）、
−例えばＫＡＲＩによって触媒される、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への（図２中の経路ステップｂを参照されたい）；
−例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）とも称されるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への（図２中の経路ステップｃを参照されたい）；
−例えば分枝鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される、２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（図２中の経路ステップｄを参照されたい）；および
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの（図２中の経路ステップｅを参照されたい）
変換が含まれる。
【０１３３】
代替経路のステップｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、およびｋのための生成物変換のための基質は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７Ａ１号明細書に記載される。
【０１３４】
上記の基質の生成物への転換のために、ならびに追加的なイソブタノール経路のために、使用し得る遺伝子およびポリペプチドは、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載される。米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書および米国特許出願公開第２０１０００８１１５４号明細書は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（配列番号２６２）からのＤＨＡＤおよびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２６３）からのＤＨＡＤをはじめとする、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）酵素について記載する。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０２６９１９９Ａ１号明細書は、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号２５８）からのアルコールデヒドロゲナーゼ、およびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）（配列番号２５９）からのアルコールデヒドロゲナーゼをはじめとする、アルコールデヒドロゲナーゼについて記載する。ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、全て参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９０１６３３７６号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９７５１９号明細書、および国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレットに記載される。ケト酸デカルボキシラーゼとしては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２６０）およびリステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）（配列番号２６１）からのものが挙げられる。
【０１３５】
さらに参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書および米国特許第７，９９３，８８９号明細書には、開示される生合成経路を使用した、イソブタノール生産のためのキメラ遺伝子の構築と細菌および酵母の遺伝子操作が記載される。
【０１３６】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
−例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
−例えばケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
−例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
−例えばトランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からバリンへの；
−例えばバリンデカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、バリンからイソブチルアミンへの；
−例えばω−トランスアミナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの；および
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１３７】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、
−例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からアセト乳酸への；
−例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒されてもよい、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への；
−例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への；
−例えば分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの；
−例えばアシル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの；および
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１３８】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、図２でステップｋ、ｇ、およびｅとして示される、基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１３９】
使用されてもよい１−ブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されてもよい、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの；
−ｂ）例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの；
−ｃ）例えばクロトナーゼによって触媒されてもよい、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの；
−ｄ）例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの；
−ｅ）例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの；および
−ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１４０】
使用されてもよい２−ブタノール生産のための生合成経路としては、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されるものが挙げられる。一実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
−ｃ）例えばアセトニン（ａｃｅｔｏｎｉｎ）アミナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの；
−ｄ）例えばアミノブタノールキナーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェートへの；
−ｅ）例えばアミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒されてもよい、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの；および
−ｆ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、２−ブタノンから２−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１４１】
別の実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、
−ａ）例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されてもよい、ピルビン酸からα−アセト乳酸への；
−ｂ）例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されてもよい、α−アセト乳酸からアセトインへの；
−ｃ）例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、アセトインから２，３−ブタンジオールへの；
−ｄ）例えばダイアル（ｄｉａｌ）デヒドラターゼによって触媒されてもよい、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの；および
−ｅ）例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されてもよい、２−ブタノンから２−ブタノールへの
基質から生成物への変換を含んでなる。
【０１４２】
原位置生成物除去法
本明細書に記載される改善された微生物（ｍｉｃｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）および方法は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレットに記載されるものなどのその他の原位置生成物除去法と併せて使用してもよい。図１は、本発明の実施形態に従った、エタノールまたはブタノールなどの生成物アルコール生産のための工程流れ図の実例を示す。示されるように、原材料１２を液化容器１０の入口に装入し、液化して原材料スラリー１６を生成し得る。原材料１２は、発酵性炭素基質（例えばグルコースなどの発酵性糖）を提供する、加水分解性多糖類を含有し、ライムギ、コムギ、トウまたはトウモロコシなどであるが、これに限定されるものではない、バイオマスであり得て、またはそうでなければバイオマスに由来し得る。いくつかの実施形態では、原材料１２は、分画バイオマスの１つまたは複数の成分であり得て、および別の実施形態では、原材料１２は粉砕未分画バイオマスであり得る。いくつかの実施形態では、原材料１２は、乾燥粉砕、未分画トウモロコシ穀粒などのトウモロコシであり得て、不溶解粒子は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。不溶解固形分は、原材料１２の非発酵性部分である。図で示される実施形態を参照して、本明細書における考察の目的で、原材料１２は、不溶解固形分が分離されていない、粉砕未分画トウモロコシからなると記載されることが多い。しかし当業者には明らかなように、本明細書に記載される例示的な方法とシステムは、分画されているか否かに関わらず、異なる原材料のために修正し得るものと理解すべきである。
【０１４３】
液化原材料１２の処理は、原材料１２中の多糖類を例えばデキストリンおよびオリゴ糖類をはじめとする糖類に加水分解することを伴う。酸処理、酸−酵素処理、または酵素処理をはじめとするが、これに限定されるものではない、産業によって常態で利用される、任意の既知の液化処理、ならびに対応する液化容器を使用し得る。このような処理は、単独で、または組み合わせて使用し得る。いくつかの実施形態では、酵素処理を利用し得て、例えばα−アミラーゼなどの適切な酵素１４が液化容器１０の入口に装入される。水もまた、液化容器１０に装入し得る。実施形態では、例えばグルコアミラーゼなどの糖化酵素もまた、液化容器１０に装入してもよい。
【０１４４】
液化原材料１２から生成する原材料スラリー１６は、発酵性炭素基質（例えば糖）を含んでなり、任意選択的に、原材料次第で、原材料に由来する、油形態のトリグリセリドおよび不溶解固形分を含んでなる。原材料スラリー１６は、液化容器１０の出口から排出され得る。いくつかの実施形態では、原材料１２は、トウモロコシまたはトウモロコシ穀粒であり、したがって原材料スラリー１６は、コーンマッシュスラリーである。いくつかの実施形態では、原材料１２は、リグノセルロース系原材料であり、したがって原材料スラリー１６は、リグノセルロース系加水分解物であってもよい。いくつかの実施形態では、発酵容器への装入に先だって、原材料スラリー１６から不溶解固形分が除去される。
【０１４５】
原材料スラリー１６は、本発明に従って提供される、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる微生物３２と共に、発酵容器３０に装入される。発酵容器３０は、スラリー１６を発酵して、アルコールを生成するように構成される。特に微生物３２は、スラリー１６中の発酵性炭素基質に接触して、生成物アルコールを産生する。スラリーは、例えばオリゴ糖類の形態の発酵性炭素源、および水を含み得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、スラリー１６中の複合糖類（例えばオリゴ糖類）を微生物３２によって容易に代謝され得る単糖類に切断するために、スラリー１６に糖化処理を実施する。酸処理、酸−酵素処理、または酵素処理をはじめとするが、これに限定されるものではない、産業によって常態で利用される、任意の既知の糖化処理を使用し得る。いくつかの実施形態では、同時糖化発酵（ＳＳＦ）は、図１で示されるように、発酵容器３０内部で実施し得る。いくつかの実施形態では、デンプンまたはオリゴ糖類を微生物３２が代謝できるグルコースに分解するために、グルコアミラーゼなどの酵素３８を発酵容器３０の入口に装入し得る。
【０１４７】
カルボン酸２８および／またはトリグリセリド含有天然油２６は、任意選択の触媒４２と共に発酵容器３０に装入される。任意選択の触媒４２は、酵素３８の前、後、またはそれと同時に装入し得る。したがっていくつかの実施形態では、酵素３８と任意選択の触媒４２の添加は、段階的であり得て（例えば触媒４２、次に酵素３８、またはその逆）、または実質的に同時であり得る（すなわち人間または機械が添加を一気に遂行するのにかかる時間において全く同時点であり、または人間または機械が添加を２回に分けて遂行するのにかかる時間において、１つの酵素／触媒がその他の触媒／酵素に即座に続く）。任意選択の触媒４２は、生成物アルコールとカルボン酸２８をエステル化してアルコールエステルを形成でき、実施形態では精製リパーゼである。例えばブタノール生産の場合、任意選択の触媒４２は、ブタノールとカルボン酸２８をエステル化して、ブタノールエステルを形成できる。組換え微生物は、リパーゼを発現して、提示しまたは発酵培地中に分泌して、エステル化を触媒するので、触媒４２は、本明細書に記載される方法における使用について、任意選択的であると考えられる。しかし精製リパーゼ（任意選択の触媒４２）の添加が望ましいことがあり、本明細書で提供される方法および微生物は、添加される任意選択の触媒４２の量の低減を可能にする。
【０１４８】
トリグリセリド含有天然油２６が発酵容器３０に提供される場合、本明細書で提供される微生物によって分泌または提示されるリパーゼ活性を有するポリペプチドおよび／または任意選択の触媒４２に、油２６を接触させることで、油２６中のアシルグリセリドの少なくとも一部は、カルボン酸２８に加水分解され得る。いくつかの実施形態では、得られた酸／油組成物は、油中のアシルグリセリドの部分的加水分解からのモノグリセリドおよび／またはジグリセリドを含む。いくつかの実施形態では、得られた酸／油組成物は、アシルグリセリド加水分解の副産物であるグリセロールを含む。
【０１４９】
これに加えて、原材料次第で、原材料１２に由来してスラリー１６中に存在する、油中のアシルグリセリドもまた、カルボン酸２８に加水分解され得る。いくつかの実施形態では、ブロス中のカルボン酸濃度は、有機相と水相を含んでなる二相発酵混合物を形成するのに十分である。
【０１５０】
カルボン酸２８は、ブタノールまたはエタノールなどの生成物アルコールとエステル形成して、カルボン酸のアルコールエステルを生成できる任意のカルボン酸であり得る。例えばいくつかの実施形態では、カルボン酸２８は遊離脂肪酸であり得て、カルボン酸または遊離脂肪酸は、いくつかの実施形態では４〜２８個の炭素、別の実施形態では４〜２２個の炭素、別の実施形態では８〜２２個の炭素、別の実施形態では１０〜２８個の炭素、別の実施形態では１０〜２２個の炭素、別の実施形態では１２〜２２個の炭素、別の実施形態では４〜１８個の炭素、別の実施形態では１２〜２２個の炭素、およびなおも別の実施形態では１２〜１８個の炭素、およびなおも別の実施形態では１６〜２２個の炭素の鎖長を有する。いくつかの実施形態では、カルボン酸２８は、以下の１つまたは複数の脂肪酸である：アザレ酸、カプリン酸、カプリル酸、トウゴマ、ココナツ（すなわち例えばラウリン酸、ミリスティック（ｍｙｒｉｓｉｔｉｃ）、プラミティック（ｐｌａｍｉｔｉｃ）、カプリル酸、カプリン酸、ステアリン酸、カプロン酸、アラキジン酸、オレイン酸、およびリノレン酸、をはじめとする脂肪酸の天然の組み合わせ）、イソステアリン酸、ラウリン酸、亜麻仁、ミリスチン酸、オレイン酸、パーム油、パルミチン酸、パーム核、ペラルゴン酸、リシノール酸、セバシン酸、ダイズ、ステアリン酸、トール油、獣脂、および＃１２ヒドロキシステアリン酸。いくつかの実施形態では、カルボン酸２８は、例えばアゼライン酸およびセバシン酸などの１つまたは複数の二酸である。いくつかの実施形態では、カルボン酸２８は、定義された炭素鎖分枝がある、１つまたは複数の飽和一級カルボン酸であり、前記カルボン酸またはその混合物は、カルボン酸が１２〜２２個の全炭素数を有するゲルベアルコールとして周知の２−アルキル−１−アルカノールの酸化によって調製される。
【０１５１】
したがって、いくつかの実施形態では、カルボン酸２８は、２つ以上の異なる脂肪酸の混合物であり得る。いくつかの実施形態では、カルボン酸２８は、化学的または酵素加水分解をはじめとする、当該技術分野で公知の任意の方法による、アシルグリセリドの加水分解から生じる遊離脂肪酸を含んでなる。上述のように、いくつかの実施形態では、カルボン酸２８は、酵素を触媒４２として使用して、油グリセリドの酵素加水分解によって天然油２６から誘導し得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸またはその混合物は、不飽和脂肪酸を含んでなる。不飽和脂肪酸の存在は融点を低下させ、取り扱い上の利点を提供する。不飽和脂肪酸の内、一不飽和のもの、すなわち単一炭素−炭素二重結合を保持するものは、プロセス考察のために、適切な熱および酸化安定性を犠牲にすることなく、融点に関して利点を提供してもよい。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、天然油２６は、獣脂、トウモロコシ、カノーラ、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ココナツ油、綿実油、魚油、ホホバ油、豚脂、亜麻仁油、牛脚油（ｎｅｅｔｓｆｏｏｔ）、オイチシカ油、パーム油、落花生油、ナタネ油、米、紅花、大豆油、ヒマワリ、桐油、ジャトロファ油、カボチャ種子油、パーム油、ブドウ種子油、および植物油混合物（またはより高濃度の異なる鎖長および不飽和レベルに精製し得る油（すなわち１８：１））であり得る。いくつかの実施形態では、天然油２６は、例えばパームとダイズ油の混合物などの２つ以上の天然油の混合物である。いくつかの実施形態では、天然油２６は、植物由来の油である。いくつかの実施形態では、植物由来油は、必須ではないが、発酵プロセスで使用し得るバイオマスに由来し得る。バイオマスは、原材料１２が得られる起源と同一であり、または異なり得る。したがって例えばいくつかの実施形態では、油２６はトウモロコシに由来し得るのに対し、原材料１２はトウであり得る。例えばいくつかの実施形態では、油２６はトウモロコシに由来し得て、原材料１２のバイオマス資源もまたトウモロコシである。当業者には明らかなように、油２６と原材料１２とのために、異なるバイオマス源の任意の可能な組み合わせを使用し得る。いくつかの実施形態では、油２６は、発酵プロセスで使用されるバイオマスに由来する。したがっていくつかの実施形態では、油２６は原材料１２から直接誘導される。例えば原材料１２がトウモロコシであれば、油２６は原材料の構成コーンオイルであり、スラリー１６と共に発酵容器３０に装入されてもよい。
【０１５３】
発酵容器３０内では、微生物３２によって産生されたアルコールは、微生物によって分泌されるリパーゼ活性を有するポリペプチド（および任意選択的に触媒４２）によって、カルボン酸２８とエステル化されてアルコールエステルを形成する。例えばブタノール生産の場合、微生物３２によって産生されたブタノールは、カルボン酸２８とエステル化されてブタノールエステルを形成する。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を利用して、アルコールエステルを発酵ブロスから除去し得る。ＩＳＰＲと併せて、リパーゼ活性を有するポリペプチドを発現して、分泌または提示する、組換え微生物利用して、エステルを形成することは、発酵能力を改善し得る。理論による拘束は望まないが、発酵培地中のリパーゼ活性と、発酵中の生成物アルコールのエステル化は、生成物アルコールを産生する微生物の能力を改善することもあると考えられ、それは産生宿主細胞にとって毒性の生成物アルコールでは、特に望ましい。したがって本明細書では、リパーゼ活性を有するポリペプチドを産生して分泌するように微生物を遺伝子操作することで、生成物アルコールに対する微生物の耐性を改善する方法が提供される。
【０１５４】
実施形態では、（例えば液液抽出などの）ＩＳＰＲと併せて、微生物を使用してリパーゼを生成してエステルを形成することで、リパーゼを産生する微生物なしでＩＳＰＲを使用した類似発酵中の有効力価と比較して、有効力価を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％増大させ得る。同様に、実施形態では、（例えば液液抽出などの）ＩＳＰＲと併せて、微生物を使用してリパーゼを生成してエステルを形成することで、リパーゼを産生する微生物なしでＩＳＰＲを使用した類似発酵中の有効速度と比較して、有効速度を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％増大させ得る。実施形態では、有効収量は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％増大する。いくつかの実施形態では、アルコールエステル化後に得られた発酵ブロスは、遊離（すなわち非エステル化）アルコールを含んでなり得て、いくつかの実施形態では、生成物アルコールがブタノールである場合、アルコールエステル化後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、１、３、６、１０、１５、２０、２５、３０  ２５、４０、４５、５０、５５、または６０ｇ／Ｌ以下であり、または生成物アルコールがエタノールである場合、アルコールエステル化後の発酵ブロス中の遊離アルコール濃度は、１５、２０、２５、３０  ２５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｇ／Ｌ以下である。いくつかの実施形態では、アルコールの有効力価の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％は、アルコールエステルに変換される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、発酵中に抽出剤に接触して、水相と有機相を含んでなる二相混合物を形成する。このような液液抽出は、その開示全体を本明細書に組み込んだ、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法に従って実施し得る。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書は、液液抽出を使用して発酵ブロスからブタノールを生産して回収する方法について記載し、方法は、発酵ブロスに水不混和性抽出剤を接触させて、水相と有機相を含んでなる二相混合物を形成するステップを含んでなる。典型的に、抽出剤は、飽和、一不飽和、多不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、有機抽出剤であり得る。抽出剤はまた、飽和、一不飽和、多不飽和（およびそれらの混合物）Ｃ４〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ４〜Ｃ２８脂肪酸、Ｃ４〜Ｃ２８脂肪酸のエステル、Ｃ４〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、有機抽出剤であってもよい。適切な抽出剤の例としては、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、２−ブチルオクタノール、２−ブチル−オクタン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１つの溶媒を含んでなる、抽出剤が挙げられる。実施形態では、抽出剤は、オレイルアルコールを含んでなる。実施形態では、抽出剤は、例えばＩＳＯＦＡＬ（登録商標）１２（Ｓａｓｏｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）またはＪａｒｃｏｌＩ−１２（Ｊａｒｃｈｅｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ）として市販される、２−ブチルオクタノールなどの分枝鎖飽和アルコールを含んでなる。実施形態では、抽出剤は、例えばそれぞれＩＳＯＣＡＲＢ（登録商標）１２、ＩＳＯＣＡＲＢ（登録商標）１６、およびＩＳＯＣＡＲＢ（登録商標）２４として市販される、２−ブチル−オクタン酸、２−ヘキシル−デカン酸、または２−デシル−テトラデカン酸などの分枝鎖カルボン酸を含んでなる（Ｓａｓｏｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）。本明細書に記載される方法との併用において、ＩＳＰＲのための抽出剤は典型的に非アルコール抽出剤であり、それによって生成物アルコールとのエステル化に利用できるカルボン酸がより少なくなる、カルボン酸２８とアルコール抽出剤との触媒性エステル化による、発酵容器３０内のカルボン酸２８の消費が回避される。例えばオレイルアルコールがＩＳＰＲ抽出剤として使用される場合、リパーゼ活性の存在のために、発酵容器内で、カルボン酸のオレイルアルコールエステルが生成されることもある。
【０１５６】
図１の実施形態を参照して、カルボン酸２８はまた、ＩＳＰＲ抽出剤２８またはその成分としての役割を果たし得る。前述のように、天然油２６が発酵容器３０に提供される場合、カルボン酸２８が提供され、および／または原位置で形成され得て、および／または原材料１６が、加水分解され得る油の形態のトリグリセリドを含む場合は、カルボン酸２８が原位置形成される。いくつかの実施形態では、ＩＳＰＲ抽出剤２８は、遊離脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ＩＳＰＲ抽出剤２８は、コーンオイル脂肪酸（ＣＯＦＡ）を含む。いくつかの実施形態では、油２６はコーンオイルであり、ＩＳＰＲ抽出剤２８はＣＯＦＡである。ＩＳＰＲ抽出剤（カルボン酸）２８は発酵ブロスと接触して、水相３４および有機相を含んでなる、二相混合物を形成する。発酵ブロス中で成形される生成物アルコールエステルは、有機相内に優先的に分配されて、エステル含有有機相３６を形成する。発酵ブロス中の任意の遊離生成物アルコールもまた、エステル含有有機相内に優先的に分配される。二相混合物は、発酵容器３０からストリーム３９として除去され、容器３５に装入され得て、その中でエステル含有有機相３６は水相３４から分離される。二相混合物３９のエステル含有有機相３６および水相３４への分離は、サイフォン、吸引、デカンテーション、遠心分離、重力沈降槽使用、膜支援型相分離などをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の当該技術分野で公知の方法を使用して達成し得る。水相３４の全部または一部は、（示されるように）発酵培地として発酵容器３０内に再循環され、またはそうでなければ廃棄されて新鮮培地で置き換えられ、または任意の残留生成物アルコール除去のために処理されて、次に発酵容器３０に再循環され得る。
【０１５７】
図１を参照して、エステル含有有機相３６は容器５０に導入されて、その中でアルコールエステルは、１つまたは複数の物質５２と反応されて、生成物アルコール５４が回収される。生成物アルコール５４は、アルコールをアルコールエステルから得るために、当該技術分野で公知のおよび／または国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレット（参照によって援用する）に記載される、任意の方法を使用して回収され得る。
【実施例】
【０１５８】
本明細書の用法では、使用される略号の意味は、次のとおりである：「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味する。
【０１５９】
一般方法
水性相および抽出剤相中の反応生成物のＧＣ解析
抽出剤としてコーンオイル脂肪酸（ＣＯＦＡ）を含有する、撹拌される反応混合物または発酵ブロスからサンプル（約５．０ｇ）を取り出し、遠心分離して水相および抽出剤相を分離させた。得られた水相または抽出剤相（約０．５０ｇ、記録実重量）のサンプルは、４．５０ｍＬのイソプロパノール中の５．５５５６ｍｇ／ｍＬのペンタデカン酸メチルエステル（Ｃ１５：０ＦＡＭＥ、外部標準）溶液に溶解した。得られた溶液を遠心分離してあらゆる懸濁固形分を除去し、次に約１．２５ｍＬの得られた上清を２．０ｍＬのＡｇｉｌｅｎｔ  ＧＣサンプルバイアルに入れて、ＰＴＦＥセプタでバイアルに蓋をした。７６８３Ｂ注入器およびオートサンプラー付きＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ上で、イソブタノールまたは脂肪酸ブチルエステルについて、サンプルを分析した。カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＢ−ＦＦＡＰカラム（内径３０ｍ×０．２５ｍｍ、フィルム０．２５μｍ）であった。キャリアガスは、上部圧一定の８０℃における測定で、流速１．８ｍＬ／分のヘリウムであった；注入器スプリットは、２５０℃で２０：１であった；オーブン温度は、８０℃で２．０分間、１０℃／分で８０℃から２５０℃、次に２５０℃で２０分間であった。火炎イオン化検出を２５０℃で使用した。以下のＧＣ標準物質（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ；Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を使用して、脂肪酸イソブチルエステル生成物の同一性を確認した：パルミチン酸イソブチル、ステアリン酸イソブチル、オレイン酸イソブチル、リノール酸イソブチル、リノレン酸イソブチル、イソブチルアラキジン酸。
【０１６０】
株の構築
【０１６１】
【表９】
2014518066.tif 000011
【０１６２】
【表１０】
2014518066.tif 000012
【０１６３】
【表１１】
2014518066.tif 000013
【０１６４】
【表１２】
2014518066.tif 000014
【０１６５】
【表１３】
2014518066.tif 000015
【０１６６】
【表１４】
2014518066.tif 000016
【０１６７】
ＰＮＹ１５００の構築
ＢＰ８５７株（「ＰＮＹ１５００」）は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来して、遺伝子ＵＲＡ３およびＨＩＳ３の欠失を含有する。
【０１６８】
ＵＲＡ３欠失
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットをｐＬＡ５４テンプレートＤＮＡ（配列番号２５）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、ｌｏｘＰ部位で挟まれて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えおよびマーカー除去を可能にする。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、およびプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号２６および２７）を使用して実施した。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ＵＲＡ３プロモーター上流の５’領域およびコード領域下流の３’領域に由来し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みは、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらした。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を使用してＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄに形質転換され、形質転換体は、３０℃でＧ４１８（１００μｇ／ｍｌ）含有ＹＰＤ上で選択された。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号２８および２９）を使用して、ＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして正しい組み込みを確認し、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸと命名した。
【０１６９】
ＨＩＳ３欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号３０）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号３１）によって、ＨＩＳ３断片Ａを増幅した。ＨＩＳ３断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号３２）と、ＨＩＳ３断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号３３）とによって、ＨＩＳ３断片Ｂを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号３４）と、ＨＩＳ３断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号３５）とによって、ＨＩＳ３断片Ｕを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号３６）と、プライマーｏＢＰ４５９（配列番号３７）とによって、ＨＩＳ３断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢは、ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号３０）およびｏＢＰ４５５（配列番号３３）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＨＩＳ３断片ＵＣは、ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号３４）およびｏＢＰ４５９（配列番号３７）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットは、ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号３０）およびｏＢＰ４５９（配列番号３７）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１７０】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号３８）およびｏＢＰ４６１（配列番号３９）を用いたＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３株として選択した。
【０１７１】
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３をｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号４０）で形質転換し、ヒスチジン欠損ウラシル添加２％グルコース合成完全培地上に３０℃で播種して、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体をＹＰ添加１％ガラクトース中で約６時間３０℃で培養して、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のために、ＹＰＤ（２％グルコース）プレート上に３０℃で播種した。単離株をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために、５−ＦＯＡ耐性単離株をＹＰＤ中で培養して、その上に播種した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地プレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地プレート上の増殖をアッセイすることで、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの喪失について、単離株をチェックした。Ｇ４１８感受性でウラシルおよびヒスチジン栄養要求性である、正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３株として選択し、ＢＰ８５７と命名した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用した、Δｕｒａ３ではプライマーｏＢＰ４５０（配列番号４１）およびｏＢＰ４５１（配列番号４２）による、Δｈｉｓ３ではプライマーｏＢＰ４６０（配列番号３８）およびｏＢＰ４６１（配列番号３９）による、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。
【０１７２】
ＰＮＹ２２０５株の構築
ＰＤＣ６欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１８）およびプライマーｏＢＰ４４１（配列番号１９）によって、ＰＤＣ６断片Ａを増幅した。ＰＤＣ６断片Ａの３”末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４２（配列番号２０）と、ＰＤＣ６断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４３（配列番号２１）とによって、ＰＤＣ６断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４４（配列番号２２）と、ＰＤＣ６断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４５（配列番号２３）とによって、ＰＤＣ６断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ４４６（配列番号２４）と、プライマーｏＢＰ４４７（配列番号５６）とによって、ＰＤＣ６断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢは、ＰＤＣ６断片ＡとＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１８）およびｏＢＰ４４３（配列番号２１）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ６断片ＵＣは、ＰＤＣ６断片ＵとＰＤＣ６断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号２２）およびｏＢＰ４４７（配列番号５６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＰＤＣ６  ＡＢＵＣカセットは、ＰＤＣ６断片ＡＢとＰＤＣ６断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１８）およびｏＢＰ４４７（配列番号５６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１７３】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ６  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物は、ウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号５７）およびｏＢＰ４４９（配列番号５８）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ６ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３株として選択した。
【０１７４】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号５７）およびｏＢＰ４４９（配列番号５８）による、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。単離株中のＰＤＣ６遺伝子の不在は、ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号５９）、およびｏＢＰ５５５（配列番号６０）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６株として選択し、ＢＰ８９１と命名した。
【０１７５】
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組み込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させて、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ＃７００６１０からのｉｌｖＤコード領域で置換した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＮＹＬＡ８３ゲノムＤＮＡとを使用して、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのための、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード領域がそれに続くＡ断片を増幅した。ＮＹＬＡ８３は、（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載される、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する株である（構築はその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載される）。ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号６１）およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号６２）によって、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍを増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのためのＢ、Ｕ、およびＣ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１６（配列番号６３）と、ＰＤＣ１断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１７（配列番号６４）とによって、ＰＤＣ１断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１８（配列番号６５）と、ＰＤＣ１断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５１９（配列番号６６）とによって、ＰＤＣ１断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５２０（配列番号６７）と、プライマーｏＢＰ５２１（配列番号６８）とによって、ＰＤＣ１断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂは、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１７１）とＰＤＣ１断片Ｂを混合して、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号６１）およびｏＢＰ５１７（配列番号６４）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＤＣ１断片ＵＣは、ＰＤＣ１断片ＵとＰＤＣ１断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号６５）およびｏＢＰ５２１（配列番号６８）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＰＤＣ１  Ａ−���ｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号１７２）は、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢとＰＤＣ１断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号６１）およびｏＢＰ５２１（配列番号６８）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１７６】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損２％グルコース添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号６９）およびｏＢＰ５１２（配列番号７０）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ１ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。単離株中のＰＤＣ１遺伝子の不在は、ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号７１）、およびｏＢＰ５５１（配列番号７２）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３株として選択した。
【０１７７】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ＰＤＣ１欠失およびｉｌｖＤＳｍ組み込みは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号６９）およびｏＢＰ５１２（配列番号７０）による、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ株として選択し、ＢＰ９０７と命名した。
【０１７８】
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組み込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させて、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのｓａｄＢコード領域で置換した（ｓａｄＢ遺伝子は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に記載される）。最初に、ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組み込みのためのＰＣＲカセット断片をプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳは、ｐＵＣ１９（配列番号９４）ベースであり、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における複製と選択のための、ｐＭＢ１レプリコンおよびβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のためのコード配列の他に、酵母中のＵＲＡ３遺伝子発現のために、この遺伝子の上流および下流からの配列が含まれた。クローニング目的でベクターを使用し得て、酵母組み込みベクターとして使用し得る。
【０１７９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号８９）と、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ４３９（配列番号９０）とによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからのＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐおよび下流１５０ｂｐと共に、ＵＲＡ３コード領域を包含するＤＮＡを増幅した。ゲノムＤＮＡは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによってＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９をライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。ベクターをＰＣＲによって確認し、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号９１）およびｏＢＰ２６５（配列番号９２）によって配列決定した。
【０１８０】
ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂのコード配列をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化して、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を作成した。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号７３）と、ＰＤＣ５断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５３１（配列番号７４）とによって、テンプレートとしてｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号９３）を使用して、ｓａｄＢのコード配列を増幅した。ｓａｄＢの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５３２（配列番号７５）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号７６）とによって、ＰＤＣ５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂは、ｓａｄＢとＰＤＣ５断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号７３）およびｏＢＰ５３３（配列番号７６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドは、ＰＤＣ５断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号７７）およびｏＢＰ５４６（配列番号７８）を使用した、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４７（配列番号７９）と、プライマーｏＢＰ５３９（配列番号８０）とによって、ＰＤＣ５断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃは、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵとＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号７７）およびｏＢＰ５３９（配列番号８０）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。天然ＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０ヌクレオチドとの相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５４２（配列番号８１）と、ｏＢＰ５３９（配列番号８０）とによる、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃの増幅によって、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１７３）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１８１】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号８２）およびｏＢＰ５４１（配列番号８３）を用いたＰＣＲによって、ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組み込みがある形質転換体をスクリーニングした。単離株中のＰＤＣ５遺伝子の不在は、ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号８４）、およびｏＢＰ５５３（配列番号８５）のコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい形質転換体をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３株として選択した。
【０１８２】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３をＹＰＥ（１％エタノール）中で一晩培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ＰＤＣ５欠失、ｓａｄＢ組み込み、およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号８２）およびｏＢＰ５４１（配列番号８３）を用いたＰＣＲによって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ株として選択し、ＢＰ９１３と命名した。
【０１８３】
ＧＰＤ２欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、テンプレートＤＮＡとしてｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ  ＰＣＲを使用して、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１７４）をＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号１７０）は、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位で挟まれる、ｐＲＳ４２６からのＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼとプライマーＬＡ５１２（配列番号９５）およびＬＡ５１３（配列番号９６）とを使用して、ＰＣＲを実施した。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２コード領域上流の５’領域およびコード領域下流の３’領域に由来し、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みは、ＧＰＤ２コード領域の置換をもたらした。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体をウラシル欠損１％エタノール添加（グルコース無添加）合成完全培地上で選択した。プライマーｏＢＰ５８２（配列番号８６）およびＡＡ２７０（配列番号８７）を使用したＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正しい組み込みを確認した。
【０１８４】
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅによって形質転換し、ヒスチジン欠損１％エタノール添加合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを再循環させた。１％エタノール添加５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に、形質転換体を画線塗抹して３０℃で培養し、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミド除去のために、ＹＰＥ（１％エタノール）中で５−ＦＯＡ耐性単離株を培養した。欠失およびマーカー除去は、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号８６）およびｏＢＰ５９１（配列番号８８）を用いたＰＣＲによって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ株として選択し、ＢＰ１０６４（ＰＮＹ１５０３）命名した。
【０１８５】
ＦＲＡ２欠失
ＦＲＡ２欠失をデザインして、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドを欠失させ、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドは無処理のままにした。インフレームの停止コドンは、欠失から７ヌクレオチド下流に存在する。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、無瘢痕ＦＲＡ２欠失のためのＰＣＲカセットのための４つの断片を増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有する、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９９）およびプライマーｏＢＰ５９５（配列番号１０２）によって、ＦＲＡ２断片Ａを増幅した。ＦＲＡ２断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９６（配列番号１０３）と、ＦＲＡ２断片Ｕの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９７（配列番号１０４）とによって、ＦＲＡ２断片Ｂを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９８（配列番号１０５）と、ＦＲＡ２断片Ｃの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５９９（配列番号１０６）とによって、ＦＲＡ２断片Ｕを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６００（配列番号１０７）と、プライマーｏＢＰ６０１（配列番号１０８）とによって、ＦＲＡ２断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＦＲＡ２断片ＡＢは、ＦＲＡ２断片ＡとＦＲＡ２断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９９）およびｏＢＰ５９７（配列番号１０４）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＦＲＡ２断片ＵＣは、ＦＲＡ２断片ＵとＦＲＡ２断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号１０５）およびｏＢＰ６０１（配列番号１０８）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）がそれに続いた。ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットは、ＦＲＡ２断片ＡＢとＦＲＡ２断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９９）およびｏＢＰ６０１（配列番号１０８）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１８６】
ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＦＲＡ２  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１０９）およびｏＢＰ６０３（配列番号１１０）を用いたＰＣＲによって、ｆｒａ２ノックアウトがある形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（酵母抽出物、ペプトン、１％エタノール）中で培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１０９）およびｏＢＰ６０３（配列番号１１０）を用いたＰＣＲによって確認された。単離株中のＦＲＡ２遺伝子の不在は、ＦＲＡ２、ｏＢＰ６０５（配列番号１１１）、およびｏＢＰ６０６（配列番号１１２）の欠失したコード配列に対して特異的なプライマーを使用した、陰性ＰＣＲ結果によって実証された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ株として選択し、ＰＮＹ１５０５（ＢＰ１１３５）と命名した。
【０１８７】
ＡＤＨ１欠失およびｋｉｖＤＬｌ（ｙ）組み込み
ＡＤＨ１遺伝子を欠失させ、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化したラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域で置換した。ＡＤＨ１欠失−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みのための無瘢痕カセットを最初にプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０１８８】
ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１３）と、ＡＤＨ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１１４）とによって、テンプレートとしてｐＬＨ４６８（配列番号１２９）を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域を増幅した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６４（配列番号１１５）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６５（配列番号１１６）とによって、上のように調製されたゲノムＤＮＡから、ＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂは、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１３）およびｏＢＰ５６５（配列番号１１６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＳａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０５（配列番号１１７）と、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０６（配列番号１１８）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｃを増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＡｓｃＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０７（配列番号１１９）と、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０８（配列番号１２０）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ａを増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ  ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳａｌＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号１２１）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７５（配列番号１２２）とによって、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号１３０）から、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１ＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。プライマーｏＢＰ５０５（配列番号１１７）およびｏＢＰ５０８（配列番号１２０）によって、得られたプラスミドから組み込みカセット全体を増幅し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０１８９】
ＰＮＹ１５０５のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、上で構築したＡＤＨ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。ＡＤＨ１欠失およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みは、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、外部プライマーｏＢＰ４９５（配列番号１２３）およびｏＢＰ４９６（配列番号１２４）を用いた、およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）特異的プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１３）および外部プライマーｏＢＰ４９６（配列番号１２４）を用いた、ＰＣＲによって確認された。正しい単離株をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ株として選択し、ＰＮＹ１５０７（ＢＰ１２０１）と命名した。
【０１９０】
組み込みベクターｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１の構築
（その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載される）ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ：：ａｌｓＳ：：ＣＹＣから１．７ｋｂのＢｂｖＣＩ／ＰａｃＩ断片をあらかじめＢｂｖＣＩ／ＰａｃＩで消化してＩＬＶ５遺伝子を遊離して、（その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載される）ｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ：：ＩＬＶ５：：ＣＹＣに移動して、ＦＢＡ−ａｌｓＳ−ＣＹＣｔカセットを構築した。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換して、プライマーＮ９８ＳｅｑＦ１（配列番号１２５）およびＮ９９ＳｅｑＲ２（配列番号１２６）を使用したＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングした。ＡｆｌＩＩ部位におけるｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１へのクローニングのために、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを使用して、ベクターからＦＢＡ−ａｌｓＳ−ＣＹＣｔカセットを単離した（クレノウ断片を使用して、末端がライゲーションに適合するようにした）。ベクター中の双方の配向でａｌｓＳカセットを含有する形質転換体が得られ、配置「Ａ」ではプライマーＮ９８ＳｅｑＦ４（配列番号１２７）およびＮ１１１１（配列番号１２８）、配置「Ｂ」ではＮ９８ＳｅｑＦ４（配列番号１２７）およびＮ１１１０（配列番号１５３）を使用して、ＰＣＲによって確認された。次にＵＲＡ３遺伝子（１．２ｋｂのＮｏｔＩ／ＮａｅＩ断片）を除去し、ジェネテシンカセットを添加することで、「Ａ」配置ベクターのジェネテシン選択可能バージョンを作成した。クレノウ断片を使用して、全ての末端がライゲーションに適合するようにし、プライマーＢＫ４６８（配列番号１３１）およびＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１５４）を使用して、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、先のＵＲＡ３マーカーと同じ配向のジェネテシン耐性遺伝子があるクローンを選択した。得られたクローンをｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１（クローンＡ）（配列番号１５５）と称した。
【０１９１】
ａｌｓＳ組み込み株の構築
上述のｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ組み込みベクターをＰｍｅＩで直線化し、ＰＮＹ１５０７に形質転換した。ＰｍｅＩは、クローン化したｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域内でベクターを切断し、したがってその位置に標的組み込みをもたらす（Ｒｏｄｎｅｙ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ．２８１−３０１）。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのＧ４１８添加ＹＰＥ上で選択した。プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１５４）およびｏＢＰ５１２（配列番号７０）を使用したＰＣＲによって、パッチド形質転換体を組み込み事象についてスクリーニングした。株のイソブタノール産生能力を評価することで、２つの形質転換体をアセト乳酸シンターゼ機能について間接的に試験した。これを行うために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター上に、追加的なイソブタノール経路遺伝子（ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳおよびｐＢＰ９１５；それぞれ配列番号４３および４４）を提供した。１つのクローンをＰＮＹ２２０５と命名した。プラスミド非含有親株は、ＰＮＹ２２０４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−ｐＵＣ１９−ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１  ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ）と命名した。
【０１９２】
ＰＮＹ２２１１株の構築
以下の段落で記載されるように、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５０７株から、数段階でＰＮＹ２２１１を構築した。最初に、ホスホケトラーゼ遺伝子を含有するように、株を改変した。次にホスホケトラーゼ遺伝子に隣接する配列を標的とする組み込みベクターを使用して、アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ）を株に入れた。最後に、相同的組換えを使用して、ホスホケトラーゼ遺伝子と組み込みベクター配列を除去し、染色体ＸＩＩのｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤと天然ＴＲＸ１遺伝子の遺伝子間領域に、ａｌｓＳの無瘢痕挿入をもたらした。得られたＰＮＹ２２１１の遺伝子型は、ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜  ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔである。
【０１９３】
相同的組換えによって、ホスホケトラーゼ遺伝子カセットをＰＮＹ１５０７に導入した。組み込みコンストラクトを次のように作成した。プラスミドｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡ（その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書で以前記載されている）をＮｏｔＩおよびＸｍａＩで消化して、１．８ｋｂのＦＢＡ−ｂｕｄＡ配列を除去し、ベクターをクレノウ断片での処理後に再度ライゲートした。次にＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）のＤＮＡ合成およびベクター構築サービスにより、ＣＵＰ１プロモーターをＴＥＦ１プロモーター変種（その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｎｅｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：５２６６−５２７３（２００６）によって以前記載されているＭ４変種）で置換した。得られたプラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ａｌｓＳをＳｔｕＩおよびＭｌｕＩで切断し（ａｌｓＳ遺伝子とＣＹＣ１ターミンター（ｔｅｒｍｉｎｔｏｒ）の部分を含有する１．６ｋｂ部分を除去する）、プライマーＮ１１７６（配列番号１６４）およびＮ１１７７（配列番号１６５）によって、ｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ−ｘｐｋ１＋ＡＤＨ−ｅｕｔＤ（配列番号１７５）から作成された４ｋｂのＰＣＲ産物、およびプライマーＮ８２２（配列番号１６０）およびＮ１１７８（配列番号１６６）によって酵母ゲノムＤＮＡ（ＥＮＯ１プロモーター領域）から作成された０．８ｋｂのＰＣＲ産物ＤＮＡと組み合わせて、ギャップ修復クローニング手順を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１株（ＡＴＣＣ＃２０１３８８）に形質転換した；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ５８：２０１−２１６（１９８７）を参照されたい。形質転換体は、細胞をヒスチジン非含有合成完全培地上に播種して得られた。予想されたプラスミド（ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ、配列番号１５６）の適切なアセンブリーは、ＰＣＲプライマーＮ８２１およびおよびＮ１１１５（それぞれ配列番号１５９および１６３）によって、および制限消化（ＢｇｌＩ）によって確認された。２つのクローンを引き続いて配列決定した。３．１ｋｂのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１遺伝子をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化して単離し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１ベクター（クローンＡ、ＡｆｌＩＩで切断）にクローン化した。クローン化断片をクレノウ断片で処置して、ライゲーションのための平滑末端を作成した。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換して、アンピシリン耐性について選択した。ＴＥＦ１（Ｍ４）−ｘｐｋ１の挿入は、ＰＣＲ（プライマーＮ１１１０（配列番号１５３）およびＮ１１１４（配列番号１６２））によって確認された。ベクターをＡｆｌＩＩで直線化し、クレノウ断片で処理した。（参照によって本明細書に援用する）国際公開第２０１１１５９８５３Ａ１号パンフレットに記載される１．８ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩジェネテシン耐性カセットをクレノウ断片処理後に、ライゲーションによってクローン化した。連結反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏ��ｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換して、アンピシリン耐性について選択した。ジェネテシンカセットの挿入は、ＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１５４）およびＢＫ４６８（配列番号１３１））によって確認された。プラスミド配列（ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ｋａｎ、配列番号１５７）が、本明細書で提供される。
【０１９４】
得られた組み込みカセット（ｐｄｃ１：：ＴＥＦ１（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ＫａｎＭＸ：：ＴＲＸ１）を単離して（ＡｓｃＩおよびＮａｅＩ消化は５．３ｋｂのバンドを生成し、それをゲル精製した）、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎキット（カタログ番号Ｔ２００１）を使用して、ＰＮＹ１５０７に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのＧ４１８添加ＹＰＥ上に播種して選択した。予想された位置の組み込みは、ＰＣＲ（それぞれプライマーＮ８８６およびＮ１２１４、配列番号１６１および１６７）によって確認された。次にＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−Ｃｒｅ（配列番号１６９）を使用して、ｌｏｘＰに挟まれるＫａｎＭＸカセットを除去した。カセットの適切な除去は、ＰＣＲ（プライマーｏＢＰ５１２およびＮ１６０ＳｅｑＦ５（それぞれ配列番号１６８および１５４））によって確認された。最後に、ジェネテシン選択マーカーを使用して、本明細書に記載されるａｌｓＳ組み込みプラスミド（配列番号１５５；ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１、クローンＡ）をこの株に形質転換した。２つの組み込み体は、プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号４３）およびｐＢＰ９１５（配列番号４４）による形質転換によって、アセト乳酸シンターゼ活性について試験され、Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”（２００５）のプロトコル＃２を使用して形質転換されて、グルコース含有培地中の増殖およびイソブタノール生成の評価（増殖およびイソブタノール測定の方法は、次のとおりである：全ての株は、ヒスチジンおよびウラシル非含有で炭素源として０．３％グルコースおよび０．３％エタノールを含有する、合成完全培地中で培養した（１２５ｍＬ通気式エルレンマイアーフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０内の１０ｍＬの培地）。一晩の培養後（３０℃、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｈａｋｅｒ内で２５０ｒｐｍ）、培養物を２％グルコースおよび０．０５％エタノール含有合成完全培地で希釈して、０．２のＯＤ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ測定）に戻した（１２５ｍＬのきつく栓をしたエルレンマイアーフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０）内の２０ｍｌの培地）。４８時間の培養後（３０℃、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｈａｋｅｒ内で２５０ｒｐｍ）、培養物上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管濾過ユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して収集した）を米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載される方法に従って、ＨＰＬＣによって分析した）。２つのクローンの１つは陽性であり、ＰＮＹ２２１８と命名された。
【０１９５】
ＰＮＹ２２１８をＣｒｅリコンビナーゼで処理して、ＰＣＲによってｘｐｋ１遺伝子およびｐＵＣ１９組み込みベクター配列の喪失について、得られたクローンをスクリーニングした（プライマーＮ８８６およびＮ１６０ＳｅｑＲ５；それぞれ配列番号１６１および１５８）。これによって、組み込みベクター挿入中に導入されたｘｐｋ１上流のＤＮＡと相同ＤＮＡの組換え後に、ｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域に組み込まれたａｌｓＳ遺伝子のみが残った（ベクター、マーカー遺伝子、およびｌｏｘＰ配列が喪失するため「無瘢痕」挿入）。この組換えは任意の時点で発生し得たが、ベクター組み込みはジェネテシン選択がなくても安定しているようであり、組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼ導入後にのみ観察された。１つのクローンをＰＮＹ２２１１と命名した。
【０１９６】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ２２４２株の構築
ＰＮＹ２２４２株は、ＰＮＹ１５０７（上述）から数段階で構築された。最初に、ＦＢＡ１プロモーターとａｌｓＳコード領域とＣＹＣ１ターミネーターとを含んでなるキメラ遺伝子をＴＲＸ１遺伝子上流の染色体ＸＩＩに組み込んだ。修飾遺伝子座の配列は、配列番号１７６として提供される。次にウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の２つのコピーを、染色体（Ｃｈｒｏｍｓｏｍｅｓ）ＶＩＩおよびＸＶＩに組み込んだ。染色体ＶＩＩ上で、ＰＤＣ１プロモーターとｈＡＤＨコード領域とＡＤＨ１ターミネーターとを含んでなるキメラ遺伝子をｆｒａ２Δ位置に入れた（ＦＲＡ２の元の欠失については上述した）。修飾遺伝子座の配列は、配列番号１７７として提供される。染色体ＸＶＩ上で、ＰＤＣ５プロモーターとｈＡＤＨコード領域とＡＤＨ１ターミネーターとを含んでなるキメラ遺伝子を、末端に長い反復配列を有する要素ＹＰＲＣｄｅｌｔａ１５によって先に占められていた領域に組み込んだ。修飾遺伝子座の配列は、配列番号１７８として提供される。次に天然遺伝子ＹＭＲ２２６ｃおよびＡＬＤ６を欠失させた。ＹＭＲ２２６ｃの除去は、コード領域のみの無瘢痕欠失であった。修飾遺伝子座の配列は、配列番号１７９として提供される。得られた位置が、１つのｌｏｘＰ部位を含有するように、ＣＲＥ−ｌｏｘ媒介マーカー除去を使用して、ＡＬＤ６コード領域に加えて７００ｂｐの上流配列を欠失させた（手順については上述した）。修飾遺伝子座の配列は、配列番号１８０として提供される。最後にアナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ（ｐＬＨ７０２、配列番号１８１）およびＤＨＡＤ（ｐＹＺ０６７ＤｋｉｖＤＤｈＡＤＨ、配列番号１８２）変種の発現のために、プラスミドを株に導入してＰＮＹ２２４２株を得た。
【０１９７】
ＰＮＹ１５２８の構築
ＰＮＹ１５２８（ＰＮＹ２２１１へのｈＡＤＨ組み込み）
標的範囲の上流および下流の相同領域と、形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子とを含有するＰＣＲ産物を使用して、相同的組換えによって欠失／組み込みを作成した。相同的組換えによってＵＲＡ３遺伝子を除去して、無瘢痕欠失／組み込みを作成した。
【０１９８】
無瘢痕欠失／組み込み手順は、Ａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９（２００６）から適応された。欠失／組み込み手順のためにＰＣＲによってカセット全体を増幅するのに先だって、個々の断片をプラスミドにクローニングして、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃと組み込まれる遺伝子とを組み合わせることで、各欠失／組み込みのためのＰＣＲカセットを作成した。組み込まれる遺伝子は、断片ＡおよびＢの間のカセットに含まれた。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の２５０ｂｐ上流）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の１５０ｂｐ下流）領域と共に、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能／逆選択可能マーカーであるＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有した。断片ＡおよびＣ（それぞれおよそ１００〜５００ｂｐ長さ）は、標的範囲のすぐ上流の配列（断片Ａ）、および標的範囲の３’配列（断片Ｃ）に相当した。相同的組換えによる、染色体へのカセット組み込みのために、断片ＡおよびＣを使用した。断片Ｂ（５００ｂｐ長さ）は、標的範囲のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、断片Ｂに相当する直列反復配列が、カセットの染色体への組み込み時に生じる際に、相同的組換えによって、染色体からＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃを切除するために使用された。
【０１９９】
ＹＰＲＣΔ１５欠失およびウマ肝臓ａｄｈ組み込み
ＹＰＲＣΔ１５遺伝子座を欠失させて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ５プロモーター範囲（５３８ｂｐ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨ１ターミネーター範囲（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓ａｄｈ遺伝子で置換した。ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みのための無瘢痕カセットは、最初にプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２００】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを増幅した。ＫｐｎＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２２（配列番号１４２）と、ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂの５’末端相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６２３（配列番号１４３）とによって、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ａを増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ａの３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ６２４（配列番号１４４）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２５（配列番号１８９）とによって、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＹＰＲＣΔ１５断片ＡとＹＰＲＣΔ１５断片Ｂ  ＰＣＲ産物とを混合し、オーバーラップＰＣＲによってＹＰＲＣΔ１５断片Ａ−ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを作成し、プライマーｏＢＰ６２２（配列番号１４２）およびｏＢＰ６２５（配列番号１８９）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２６（配列番号１９０）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２７（配列番号１９１）によって、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ｃを増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ｃ  ＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ２１（配列番号１９２）と、ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ２４（配列番号１９３）とによって、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＰＤＣ５プロモーター範囲を増幅した。Ｐ［ＰＤＣ５］の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ２５（配列番号１９４）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ４（配列番号１９５）とによって、ｐＢＰ９１５（配列番号４４）からａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｐ［ＰＤＣ５］とａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ＰＣＲ産物とを混合して、オーバーラップＰＣＲによって、Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成し、プライマーＨＹ２１（配列番号１９２）およびプライマーＨＹ４（配列番号１９５）によって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。プライマーｏＢＰ６２２（配列番号１４２）およびｏＢＰ６２７（配列番号１９１）によって、組み込みカセット全体を得られたプラスミドから増��した。
【０２０１】
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＮＹ２２１１のコンピテント細胞を作成し、ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０Ｃで播種した。プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ  Ｆ（配列番号１９６）およびｏＢＰ６３７（配列番号１９７）を用いて、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、１％ＥｔＯＨ添加、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０Ｃで播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。ＹＰＲＣΔ１５の欠失およびＰ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組み込みは、ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、外部プライマーｏＢＰ６３６（配列番号１９８）およびｏＢＰ６３７（配列番号１９７）を用いたＰＣＲによって確認された。以下の遺伝子型の正しい単離株をさらなる改変のために選択した：ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。
【０２０２】
ｆｒａ２Δにおけるウマ肝臓ａｄｈ組み込み
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ１プロモーター範囲（８７０ｂｐ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨ１ターミネーター範囲（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓ａｄｈ遺伝子をｆｒａ２欠失部位に組み込んだ。ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みのための無瘢痕カセットは、最初にプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。
【０２０３】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、テンプレートとしてＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製されたＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡとを使用して、断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを増幅した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９５（配列番号１９９）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９６（配列番号１３７）によって、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ｃを増幅した。ｆｒａ２Δ断片ＣＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９３（配列番号２０１）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９４（配列番号２０２）によって、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ｂを増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｆｒａ２Δ断片Ｃ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＢａｍＨＩおよびＡｓｉＳＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ６９１（配列番号１３６）と、ＡｓｃＩおよびＳｗａＩ制限酵素認識部位を含有するプライマーｏＢＰ６９２（配列番号２０４）とによって、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ａを増幅した。ｆｒａ２Δ断片Ａ  ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｆｒａ２Δ断片ＢＣ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１６（配列番号２０５）と、ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ１９（配列番号２０６）とによって、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＰＤＣ１プロモーター範囲を増幅した。Ｐ［ＰＤＣ１］の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーＨＹ２０（配列番号２０３）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ４（配列番号１９５）とによって、ｐＢＰ９１５からａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｐ［ＰＤＣ１］とａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ＰＣＲ産物とを混合して、オーバーラップＰＣＲによって、Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成し、プライマーＨＹ１６（配列番号２０５）およびＨＹ４（配列番号１９５）によって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ｆｒａ２Δ断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートした。プライマーｏＢＰ６９１（配列番号１３６）およびｏＢＰ６９６（配列番号１３７）によって、組み込みカセット全体を得られたプラスミドから増幅した。
【０２０４】
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＹＰＲＣΔ１５にａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）が組み込まれたＰＮＹ２２１１変異体のコンピテント細胞を作成し、ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組み込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ  Ｆ（配列番号１９６）およびｏＢＰ７３１（配列番号１３９）を用いて、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、１％ＥｔＯＨ添加、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組み込みは、ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製されたゲノムＤＮＡを使用して、内部プライマーＨＹ３１（配列番号２００）および外部プライマーｏＢＰ７３１（配列番号１３９）を用いたコロニーＰＣＲと、外部プライマーｏＢＰ７３０（配列番号１３８）およびｏＢＰ７３１（配列番号１３９）によるＰＣＲとによって確認された。以下の遺伝子型の正しい単離株をＰＮＹ１５２８と命名した：ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。
【０２０５】
ＰＮＹ１５５６の構築
ここでは、ＰＮＹ１５２８中のａｄｈ１Δ位置において、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の染色体コピーをｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）またはｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）で置換するのに使用されるコンストラクトのアセンブリーと、ｋｉｖＤ遺伝子を発現するＰＮＹ１５５６株の構築とが記載される。
【０２０６】
前項に記載されるように、標的範囲の上流および下流の相同領域と、形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子とを含有するＰＣＲ産物を使用して、相同的組換えによって欠失／組み込みを作成した。
【０２０７】
ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を組み込むためのプラスミドは、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＤＨ１位置に組み込むために構築されたプラスミドに由来する。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をＡＤＨ１位置に組み込むのに使用されるプラスミドの構築については、下述される。プラスミドは、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳ中で構築した。
【０２０８】
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みプラスミドの構築
ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１３）と、ＡＤＨ１断片Ｂの５’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１１４）とによって、テンプレートとしてｐＬＨ４６８（配列番号１２９）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を増幅した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端との相同性がある５’テールを含有するプライマーｏＢＰ５６４（配列番号１１５）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６５（配列番号１１６）とによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂは、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１３）およびｏＢＰ５６５（配列番号１１６）で増幅することで、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＳａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０５（配列番号１１７）と、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０６（配列番号１１８）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ａを増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＡｓｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０７（配列番号１１９）と、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０８（配列番号１２０）とによって、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｃを増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ  ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳａｌＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂ含有プラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号１２１）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７５（配列番号１２２）とによって、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号１３０）から、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１  ＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にライゲートして、ｐＢＰ１１８１を作成した。
【０２０９】
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組み込みプラスミドｐＢＰ１１８１から、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を除去した。プラスミドをＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化し、大型ＤＮＡ断片をアガロースゲルと、それに続くゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２１（配列番号２０７）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４８４（配列番号２０８）とによって、ｐＢＰ１１８１からＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂ  ＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、ゲル精製した大型ＤＮＡ断片の対応する部位にライゲートした。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＮＹ１５２８のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の標的化欠失のために、３’  ５００ｂｐのｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）に対応するＰＣＲ断片を得られたベクターにクローン化した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２２（配列番号２０９）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２３（配列番号２１０）とによって、ｐＢＰ１１８１から断片を増幅した。断片をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な制限酵素による消化後に、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失がある上記プラスミドのＵＲＡ３下流の対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドをｐＢＰ１７１６と命名した。
【０２１０】
ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためにコドン最適化された、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）からのｋｉｖＤコード領域（配列番号２１１）であるｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を合成した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２８（配列番号２１２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２９（配列番号２１３）とで、ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩで消化して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、適切な酵素による消化後に、ｐＢＰ１７１６の対応する部位にライゲートした。プライマーＦＢＡｐ−Ｆ（配列番号９７）およびｏＢＰ８２９（配列番号２１３）を用いたＰＣＲによって、クローン遺伝子の配向をチェックした。正しい方向のｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）がある単離株をｐＢＰ１７１９と命名した。
【０２１１】
プライマーｏＢＰ５０５（配列番号１１７）およびｏＢＰ８２３（配列番号２１０）によって、ｐＢＰ１７１９からｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失／ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）組み込みカセットを増幅した。Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＮＹ１５２８のコンピテント細胞を作成して、ＰＣＲ産物に形質転換した。形質転換混合物をウラシル欠損１％エタノール添加合成完全培地上に、３０℃で播種した。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）中で培養し、１％ＥｔＯＨ添加、５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地上に３０℃で播種して、ＵＲＡ３マーカーが欠失した単離株を選択した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の欠失とｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）の組み込みは、ＹｅａＳｔａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって調製されたゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６７４（配列番号１６２）およびｏＢＰ８３０（配列番号２１４）を用いたＰＣＲによって確認された。正しい単離株は、ＰＮＹ１５２８中のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）と同一位置にｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を含有して、同一プロモーターから発現され、ＰＮＹ１５５６と命名された。
【０２１２】
実施例１
カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）ＬＩＰ１リパーゼの酵母中の発現
Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）からの天然ＬＩＰ１リパーゼのＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＪ４２８３９３）から入手し、酵母中の発現のために読み取り枠（ＯＲＦ）を最適化した（ＤＮＡ２．０）。得られたＤＮＡ配列は、野性型配列と７６％の配列同一性を有し、同一タンパク質をコードした。
【０２１３】
発現最適化ＯＲＦ配列を含んでなるＤＮＡを合成し（ＤＮＡ２．０）、得られたＤＮＡ分子をギャップ修復クローニングによって、酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターにクローン化した（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ＫＲ，Ｖｏ  ＫＴ，Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｓ，＆  Ｐａｄｄｏｎ  Ｃ（１９９７）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：４５１−４５２）。簡単に述べると、ＬＩＰ１リパーゼＯＲＦは、プラスミドｐＮＡＫ３４（配列番号２３２）領域と相同性を有する５’領域を含む、プライマーＡＫ１０−３３＿ＣｄＬ５およびＡＫ１０−３４＿ＣｄＬ３（それぞれ配列番号１０および１１）を使用して増幅された。得られたＰＣＲ産物は、本質的に（Ｇｉｅｔｚ  ＲＤ  ＆  Ｗｏｏｄｓ  ＲＡ（２００６）Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１３：１０７−１２０）に記載されるような酢酸リチウム／ＰＥＧ形質転換によって、ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化されたｐＮＡＫ３４と共に、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５００株に同時形質転換した。形質転換反応は、２％グルコースおよびドロップアウトミックス含有ヒスチジン非含有合成完全寒天培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，ＵＫ、カタログ番号ＤＳＣＫ−０４２；ＳＣＤ−Ｈｉｓ培地）上に播種した（Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｆ（２００２）Ｇｅｔｔｉｎｇ  ｓｔａｒｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｙｅａｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：３−４１）。３０℃で３日間の培養後、Ｈｉｓ＋コロニーを拾ってさらに分析した。
【０２１４】
ＬＩＰ１リパーゼ陽性単離株をトリブチリン含有ＳＣ−Ｈｉｓ培地上に播種し、３０℃で３日間培養した。ＬＩＰ１リパーゼ陽性単離株は、それらの周囲に透明帯を有し、それらがトリブチリンを加水分解できる機能的リパーゼ酵素を分泌していることが示唆され；対照的に、対照酵母株は、寒天培地中でトリブチリンの除去を引き起こさなかった。プラスミドレスキューによって、３つの単離株からプラスミドを回収し（Ｒｏｂｚｙｋ  Ｋ  ＆  Ｋａｓｓｉｒ  Ｙ（１９９２）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｃｕｉｎｇ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７９０）、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇケミストリーを使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ分析器上で、Ｍ１３−逆方向およびＴ７−プロモータープライマー（それぞれ配列番号１６および１７）を使用して配列決定した。配列は、ギャップ修復クローニングストラテジーの予測されたプラスミド産物と完全に一致した（データ示さず）。得られたプラスミドは、ｐＮＡＫ１０（配列番号４５；図３）である。
【０２１５】
実施例２
テルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの酵母中の発現
テルモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）からの天然リパーゼ（Ｔｌａｎリパーゼ）のＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＦ０５４５１３）から入手して、酵母中の発現のために最適化した（ＤＮＡ２．０）。得られたＤＮＡ配列は、野生型配列と７６％の配列同一性を有し、同一タンパク質をコードした。
【０２１６】
実施例１と同様に、発現最適化ＯＲＦ配列を含んでなるＤＮＡを合成し（ＤＮＡ２．０）、得られたＤＮＡ分子をギャップ修復クローニングによって酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターにクローン化した。簡単に述べると、プラスミドｐＮＡＫ１０（配列番号４５；図３）中の領域と相同性を有する５’領域を含む、プライマーＡＫ１０−４２＿Ｔｌ５−１およびＡＫ１０−４３＿Ｔｌ３（それぞれ配列番号１２および１３）を使用して、合成Ｔ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＴｌａｎリパーゼＯＲＦを増幅した。得られたＰＣＲ産物は、酢酸リチウム／ＰＥＧ形質転換によって、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化されたｐＮＡＫ１０と共に、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ１５００株に同時形質転換した。形質転換反応をＳＣＤ−Ｈｉｓ培地上に播種した）。３０℃で３日間の培養後、プライマーＡＫ１０−４１＿Ｔｌ５−１およびＡＫ１０−４２＿Ｔｌ３（配列番号１２およびｄ１３）を使用したコロニーＰＣＲによって、Ｔｌａｎリパーゼ配列を含有するプラスミドについてコロニーを分析した。
【０２１７】
Ｔｌａｎリパーゼ陽性単離株をトリブチリン含有ＳＣＤ−Ｈｉｓ培地上に播種し、３０℃で３日間培養した。Ｔｌａｎリパーゼ陽性単離株は、それらの周囲に透明帯を有し、それらが機能的リパーゼ活性を分泌していることが示唆され；対照的に、対照酵母株は、寒天培地中でトリブチリンの除去を引き起こさなかった。プラスミドレスキューによって、３つの単離株からプラスミドを回収し、Ｍ１３−逆方向およびＴ７−プロモータープライマー（配列番号１６および１７）を使用して配列決定した。配列は、ギャップ修復クローニングストラテジーの予測されたプラスミド産物と完全一致した（データ示さず）。１つのプラスミドをｐＴＶＡＮ２（配列番号１００）と命名した。
【０２１８】
実施例３
Ｔ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの酵母中のスケールアップ発現
実施例２からの１つの陽性単離株ＰＮＹ１０２０をＳＣＤ−Ｈｉｓ培地中で一晩前培養し、これを使用してＳＣＤ−Ｈｉｓ培地の４つの５００ｍＬ培養物に接種した；２つの培養物をアスパラギニルグリコシル化阻害剤ツニカマイシン（５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で処理した。フラスコを振盪培養器内で、３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。８時間後、５０ｍＬのＹＰＤ培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ；ペプトン２０ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ）を各フラスコに入れて、培養物を一晩培養した。翌朝、グルコースが枯渇した後、培養物を４℃および８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を１０，０００ダルトン分子量カットオフフィルターに通過させて、加圧下でほぼ５００倍に濃縮した。残余分のタンパク質濃度を測定し、製造会社の使用説明書に従って４〜１２％アクリルアミドビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、２０μｇのタンパク質を分析した。ゲルをクマシーブルーＲ−２５０で染色し、脱染した。ツニカマイシン処理タンパク質は、ゲル中でのそのより高い運動性によって実証されるように、より低い分子量を有した（図示せず）。バンドのＴｌａｎリパーゼとしての同一性は、アミノ末端配列決定によって確認された。
【０２１９】
残余分中の（ツニカマイシン処理ありまたはなしで発現される）Ｔｌａｎリパーゼタンパク質の濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて全可溶性タンパク質の２５％と推定され、（ツニカマイシン処理ありまたはなしで発現される）Ｔｌａｎリパーゼタンパク質を含有するこれらの２つの残余分は、イソブタノールとコーンオイル脂肪酸との生体外エステル化のための触媒として用いられた（実施例５）。
【０２２０】
実施例４
コーンオイル脂肪酸の生成
５Ｌ丸底フラスコに、機械的撹拌機、熱電対、加熱マントル、凝縮器、および窒素Ｔ字管を装着し、７５０ｇの粗製コーンオイル、２１１２ｇの水、および２８５ｇの５０％水酸化ナトリウム溶液を装填した。混合物を９０℃に加熱して２時間保ち、その間に、それは濃厚なエマルション様単相になった。この時間の終了時、薄層クロマトグラフィーは、混合物中に残留コーンオイルを示さなかった。次に混合物を７４℃に冷却し、９００ｇの２５％硫酸を添加して混合物を酸性化し、次にそれを５０℃に冷却して水層を分離させた。油層を１５００ｍＬの４０℃の水で２回、次に１Ｌの飽和鹹水で１回洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥させてセライトを通して濾過した。収量は、６１０ｇの透明な赤色油であった。ＡＯＣＳ法Ｃａ  ５ａ−４０による遊離脂肪酸の滴定は、オレイン酸として表される、９５％の脂肪酸含量を示す。１ｍＬの乾燥ピリジン中の１００μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）−トリフルオロアセタミドとの反応によって、サンプル（１０４ｍｇ）をシリル化した。シリル化産物のガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣＭＳ）は、１６：０、１８：２、１８：１、１８：０、および２０：０カルボン酸のＴＭＳ誘導体の存在を示した。
【０２２１】
実施例５
分泌リパーゼによって触媒されるイソブタノールとコーンオイル脂肪酸の反応によるイソブチル−ＣＯＦＡエステルの生成
３．６ｇのイソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）と、コーンオイルから調製された１４．７ｇのコーンオイル脂肪酸（ＣＯＦＡ）（実施例４）と、４５．１ｇの水性２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．２０Ｍ、ｐＨ５．４）と、０．４８７ｍｇ（水相中の１０ｐｐｍ；表７）または０．９７４ｍｇ（水相中の２０ｐｐｍ；表９）のいずれかのＴｌａｎリパーゼタンパク質（ツニカマイシン処理ありまたはなしで発現；実施例３）とを含有する反応混合物を３０℃で撹拌し、所定時にサンプルを各反応混合物から取り出して即座に遠心分離し、水性および有機層に分割して、イソブタノール（ｉＢｕＯＨ）およびコーンオイル脂肪酸（ｉＢｕＯ−ＣＯＦＡ）のイソブチル−エステルについて分析した（表１０）。Ｔｌａｎリパーゼを含有する反応は、対照反応よりも大幅により多くのｉＢｕＯ−ＣＯＦＡを生成し；ツニカマイシン存在下で酵母から分泌されたリパーゼサンプルは、阻害剤の存在なしで生成されるよりも大幅により多くのｉＢｕＯ−ＣＯＦＡを生成した。
【０２２２】
【表１５】
2014518066.tif 000017
【０２２３】
【表１６】
2014518066.tif 000018
【０２２４】
実施例６
酵母培養中における脂肪酸ブチルエステルの生成
Ｔｌａｎリパーゼ単離株ＰＮＹ１０２０および対照株ＰＮＹ９０８をＳＣＤ−Ｈｉｓ培地中で前培養して、２５ｍＬのＳＣ−Ｈｉｓ培地を含有する（非通気栓付き）フラスコを接種するのに使用した。フラスコを８．２５ｇの無菌ＣＯＦＡ（３３％ｗ／ｗ）、イソブタノール（０．５０ｇ、８時間の増殖後に添加）、ツニカマイシン（Ｔｎｍ、最終濃度５μｇ／ｍｌ）で、次のように補正した（表１１）：
【０２２５】
【表１７】
2014518066.tif 000019
【０２２６】
フラスコを３０℃および２５０ｒｐｍで培養し、２４時間および９６時間の培養後に試料採取した。サンプルは、ＨＰＬＣまたはＧＣによって水相内のグルコース、エタノール、イソブタノール、および脂肪酸アルキルエステルについて、ＧＣによって有機相内のイソブタノールおよび脂肪酸アルキルエステルについて分析した（表１２および１３）。培養物にイソブタノールおよびＣＯＦＡの双方を添加した場合、リパーゼ発現株（フラスコＦ８およびＦ９）は、対照株（フラスコＦ４）よりもさらに多くのｉＢｕＯ−ＣＯＦＡを産生した。ツニカマイシン処理細胞は、阻害剤処理なしの細胞よりもさらに多くのエステルを産生した。
【０２２７】
【表１８】
2014518066.tif 000020
【０２２８】
【表１９】
2014518066.tif 000021
【０２２９】
実施例７
カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢの酵母中の発現
カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣａｌＢリパーゼ）のＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（受入番号Ｚ３０６４５）から入手して、酵母中の発現のために配列を最適化した（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）。得られたＤＮＡ配列は、野生型配列と７２％の配列同一性を有し、同一タンパク質をコードした。
【０２３０】
発現最適化ＣａｌＢ読み取り枠（ＯＲＦ）配列を含んでなるＤＮＡを合成し（ＤＮＡ２．０）、得られたＤＮＡ分子をギャップ修復クローニングによって酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターにクローン化した。簡単に述べると、プラスミドｐＮＡＫ３４（配列番号２３２）中の領域と相同性を有する５’領域を含む、プライマーＣＡＬＢＬ＿ｇａｐ＿ｆｏｒおよびＣＡＬＢＬ＿ｇａｐ＿ｒｅｖ（配列番号１４および１５）を使用して、ＣａｌＢリパーゼＯＲＦを増幅した。得られたＰＣＲ産物を酢酸リチウム／ＰＥＧ形質転換によって、ＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化された、プラスミドｐＮＡＫ３３（配列番号２３１）、ｐＮＡＫ３４（配列番号２３２）、またはｐＮＡＫ３５（配列番号２３３）と共に、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ１５００に同時形質転換した。形質転換反応をＳＣＤ−Ｈｉｓ培地上に播種した。３０℃で３日間の培養後、プライマーＣＡＬＢＬ＿ｇａｐ＿ｆｏｒおよびＣＡＬＢＬ＿ｇａｐ＿ｒｅｖ（配列番号１４および１５）を使用したコロニーＰＣＲによって、ＣａｌＢリパーゼ配列を含有するプラスミドについてコロニーを分析した。
【０２３１】
ＣａｌＢリパーゼ陽性単離株をトリブチリン含有ＳＣＤ−Ｈｉｓ培地上に播種して、３０℃で３日間培養した。ＣａｌＢリパーゼ陽性単離株は、それらの周囲に透明帯を有し、それらが機能的リパーゼ活性を分泌していることが示唆され；対照的に、対照酵母株は、寒天培地中でトリブチリンの除去を引き起こさなかった。プラスミドレスキューによって、３つの単離株からプラスミドを回収し、Ｍ１３−逆方向およびＴ７−プロモータープライマー（配列番号１６および１７）を使用して配列決定した。配列は、ギャップ修復クローニングストラテジーの予測されたプラスミド産物と完全一致した。得られたプラスミドをｐＴＶＡＮ７（ＴＥＦ１（Ｍ２）プロモーター）、ｐＴＶＡＮ３（ＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーター）、およびｐＴＶＡＮ８（ＴＥＦ１（Ｍ６）プロモーター）（それぞれ配列番号２７８、１０１、および２４０）と命名した。
【０２３２】
実施例８
Ｔｌａｎリパーゼの表面提示
分泌されるＴ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼを酵母細胞表面に係留するドメインは、次のように導入された。酵母ゲノムＤＮＡ（ＰＮＹ１５００）をプライマーＡＫ１１−４６およびＡＫ１１−４７（それぞれ配列番号２１５および２１６）によるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用し、それはＳＡＧ１によってコードされる酵母のα−凝集素タンパク質Ｃ末端の３２０個のアミノ酸のコドンを増幅し、グリシン−およびセリン−富化リンカー領域を含有する５’末端に配列を付加した。製造会社の使用説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）によって増幅を実施した。
【０２３３】
このＧＳ−ＳＡＧ１  ＤＮＡをｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯクローン化して、ＤＨ５αに形質転換した。ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）によってｐＧＳ−ＳＡＧ１プラスミド（配列番号２１７）を回収し、正しい配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。リパーゼ発現ベクターｐＴＶＡＮ１１、ｐＴＶＡＮ１２、およびｐＴＶＡＮ１３（それぞれ配列番号２２０、２２１、および２２２）へのギャップ修復クローニングのための相同領域を含む、プライマーＳａｇｔｇａｐ１およびＳａｇｔｇａｐ２（それぞれ配列番号２１８および２１９）によって、ＤＮＡを増幅した。精製ＰＣＲ産物をＰａｃＩ−消化ｐＴＶＡＮ１１（ＴＥＦ１（Ｍ２）プロモーター）、ｐＴＶＡＮ１２（ＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーター）、またはｐＴＶＡＮ１３（ＴＥＦ１（Ｍ６）プロモーター）と共に、酵母ＰＮＹ１５００株に形質転換した。形質転換反応をＳＣＤ−Ｈｉｓ培地上に播種し；出現したコロニーは、トリブチリンプレート上で、リパーゼ活性の発現について陽性と判定された。これらの単離株からプラスミドをレスキューして（Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに形質転換し精製した。配列分析は、リパーゼ−ＳＡＧ１キメラの予想されたヌクレオチド配列を示した。
【０２３４】
２５０ｍＬの通気栓フラスコ内の５０ｍＬのＳＣＤ−Ｈｉｓ培地中で、リパーゼ発現株（ＰＮＹ１０５２、ＰＮＹ１０５３、およびＰＮＹ１０５４）および対照株（ＰＮＹ１５００）を３０℃および２５０ｒｐｍで一晩培養した。翌朝、１．７５ｍＬのグルコース（５００ｇ／Ｌ）、２．５ｍＬの１０×ＹＥＰ（１００ｇ／Ｌ酵母抽出物、２００ｇ／Ｌペプトン）、および０．３１３ｍＬのイソブタノールを添加して、２１．５ｍＬの培養物を１２５ｍＬのフラスコ（非通気栓）に移した。サンプルを採取し、次に１０．３ｍＬのＣＯＦＡおよび無菌撹拌棒を入れて、フラスコを培養に戻した。ＨＰＬＣａｎｄＧＣ分析のために、サンプル（５ｍＬ）を２４時間後に採取し、１．７５ｍＬのグルコースおよび０．３１３ｍＬのイソブタノールを添加した。第２のサンプルを７２時間後に採取した。サンプルは、上述したように分析された（表１４）。ＳＡＧ１−リパーゼキメラ発現株は、対照株よりもさらに多くの脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）を産生した。キメラ転写を駆動する最強のプロモーターを有したＰＮＹ１０５４株が対照の６倍を上回るＦＡＢＥ産生したのに対し、より弱いプロモーターがある株は、対照よりも約３０％だけ高いＦＡＢＥを産生した。
【０２３５】
【表２０】
2014518066.tif 000022
【０２３６】
実施例９
細胞表面提示：細胞結合試験
この実験は、ＳＡＧ１−リパーゼキメラによって発現されるリパーゼ活性が、事実上細胞結合型かまたは培養ブロス中に分泌されるかどうかを判定するために実施した。
【０２３７】
２５０ｍＬの通気栓フラスコ内の２５ｍＬのＳＣＤ−Ｈｉｓ培地（アミノ酸非含有の６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、ヒスチジン非含有の１９２６ｍｇのドロップアウトミックス、２０ｇ／Ｌのグルコース）中で、リパーゼ発現株（ＰＮＹ１０５２、ＰＮＹ１０５３、およびＰＮＹ１０５４）および対照株（ＰＮＹ１５００）を３０℃および２５０ｒｐｍで２４時間培養した。次に細胞および培養ブロスを遠心分離によって分離し；細胞ペレットを２回洗浄して、２５ｍＬの５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．５に再懸濁した。消耗無細胞培養液を１ＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．５で、５０ｍＭに補正したイソブタノール（最終濃度２０ｇ／Ｌ）およびＣＯＦＡ（３３％ｗｔ／ｗｔ）を消耗培地および細胞懸濁液に添加した。２つの反応を３０℃および２５０ｒｐｍで７２時間培養した。サンプルは、上述したようにＧＣによって分析された（表１５）。リパーゼ発現細胞の懸濁液は、ＣＯＦＡおよびイソブタノールとの７２時間の培養後に、対照細胞懸濁液の約２．５倍のＦＡＢＥを形成した。対照的に、無細胞培地サンプルではＦＡＢＥ蓄積に差はなく、Ｓａｇ１−リパーゼキメラタンパク質が、これらの条件下では細胞結合型のみであることが実証された。
【０２３８】
【表２１】
2014518066.tif 000023
【０２３９】
実施例１０
イソブタノール産生酵母にＴ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼを分泌させる遺伝子操作
Ｔｌａｎリパーゼ導入遺伝子をそれらの５’末端にＡｓｃＩ部位を含むオリゴヌクレオチドＡＫ１１−２４（配列番号１３２）およびＡＫ１１−２５（配列番号１３３）によって、プラスミドｐＴＶＡＮ６（配列番号１８３）から増幅した。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩで消化し、ＡｓｃＩ−消化ｐＢＰ１２３６（配列番号１８５）にライゲートした。酵母のｆｒａ２Δ位置での導入遺伝子組み込みのために、このプラスミドを使用して、Ａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（ＡｋａｄａＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄｓｅａｍｌｅｓｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９−４０５）の技術を応用した。ライゲーション混合物をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）に形質転換して、ＬＢ−アンピシリン寒天上に播種した。このプレートからのコロニーをＬＢ−アンピシリン中で一晩培養し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。ＡｓｃＩでの消化とアガロースゲル電気泳動によって、組換えプラスミドを同定した。ＤＮＡ配列決定を使用して、コンストラクト中のリパーゼ導入遺伝子の配向を同定した。プラスミドｐＮＡＫ１５（配列番号１８６）は、逆方向で野生型リパーゼ導入遺伝子を含有し、ｐＮＡＫ１６（配列番号１８７）は、野生型リパーゼ導入遺伝子を順方向で含有する。
【０２４０】
リパーゼ導入遺伝子は、プライマーｏＢＰ６９１（配列番号１３６）およびｏＢＰ６９６（配列番号１３７）を使用して、それらをｆｒａ２Δにおける組み込みに標的化する（そして選択可能なマーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を含む）側面に位置するＤＮＡと共に、これらのプラスミドから増幅された。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し濃縮した。酵母株ＰＮＹ２２１１（構築については上述した）は、ＹＰＥ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、２０ｍＬ／Ｌの９５％エタノール）中で３０℃および２５０ｒｐｍで一晩培養して、ＰＣＲ産物で形質転換し、ＳＣＥ−Ｕｒａ寒天培地（アミノ酸非含有６．７ｇ／Ｌの酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ；Ｄｉｆｃｏ  ２９１９４０，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ  ＮＪ）、１９２６ｍｇ／Ｌのドロップアウトミックス−Ｕｒａ（ＤＳＣＫ１０２，Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  ＵＫ）、２０ｍＬ／Ｌの９５％エタノール）への播種がそれに続いた。Ｕｒａ＋コロニーを新鮮培地に播種し、次にＦＯＡ培地（６．７ｇ／ＬＹＮＢ、１ｇ／Ｌの５−フルオロオロト酸、２００ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍＬ／ｌの９５％エタノール）に再度播種して、ＵＲＡ３選択マーカーを喪失した単離株を選択した。
【０２４１】
ＦＯＡ耐性形質転換体は、組み込みカセットの各側面のためのプライマー対を用いたコロニーＰＣＲによって、導入遺伝子の正しい組み込みと選択マーカーの喪失について、次のようにチェックした：順方向の導入遺伝子があるコンストラクト（ｐＮＡＫ１６から）では、プライマー対ＡＫ１１−２６（配列番号１３４）およびｏＢＰ７３０（配列番号１３８）と、ＡＫ１１−２７（配列番号１３５）およびｏＢＰ７３１（配列番号１３９）が使用され；逆方向の導入遺伝子があるコンストラクト（ｐＮＡＫ１５およびｐＮＡＫ１７から）では、プライマー対ＡＫ１１−２７（配列番号１３５）およびｏＢＰ７３０（配列番号１３８）と、ＡＫ１１−２６（配列番号１３４）およびｏＢＰ７３１（配列番号１３９）が使用された。正しいＰＣＲ産物を産生する単離株をさらなる研究のために選択し、ＰＮＹ９３１（逆方向）、ＰＮＹ９３２（順方向）、およびＰＮＹ９３３（逆方向、Ｎ５５Ａ変異株）と命名した。
【０２４２】
プラスミドｐＮＡＫ１５（配列番号１８６）と以下のプライマーを組み合わせて、製造会社の使用説明書に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を用いて、Ｔｌａｎリパーゼ（Ｎ−グリコシル化部位中）の残基５５におけるアスパラギンのアラニンへの変異誘発を実施した。
【０２４３】
【表２２】
2014518066.tif 000024
【０２４４】
キットで提供される熱安定性ポリメラーゼを使用した、変異原性プライマーによるプラスミド主鎖の増幅後、ＤＮＡをＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。処理プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞に形質転換し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して回収した。変異クローンは、変異誘発プラスミドのＤＮＡ配列分析によって同定された。このような１つのプラスミドをｐＮＡＫ１７（配列番号１８９）と命名した。
【０２４５】
イソブタノール代謝経路を導入するために、リパーゼ組み込み酵母株、およびそれらの親株ＰＮＹ２２１１をプラスミドｐＢＰ９１５（配列番号４４）およびｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号４３）で形質転換した。株をＹＰＥ培地中で一晩培養して、次に上述したプラスミドＤＮＡで形質転換し、ＳＣＥ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ寒天培地（６．７ｇ／ＬのＹＮＢ、１８５０ｍｇ／Ｌのドロップアウトミックス−Ｈｉｓ−Ｕｒａ（ＤＳＣＫ１６２，Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）、２０ｍＬ／ｌの９５％エタノール）に播種した。コロニーをＳＣＥ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ寒天培地に再度播種して、ＰＮＹ９３４、ＰＮＹ９３５、およびＰＮＹ９３６と命名した。
【０２４６】
実施例１１
異種リパーゼ発現によるイソブタノールおよび脂肪酸イソブチルエステルの生成
ＰＮＹ９３４およびＰＮＹ９３５株をＳＣ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ  ＤＥ寒天培地（６．７ｇ／ＬのＹＮＢ、１８５０ｍｇ／Ｌドロップアウトミックス−Ｈｉｓ−Ｕｒａ、３ｇ／Ｌのグルコース、３ｍＬ／ｌの９５％エタノール）に再度播種して；これらの細胞を（イソブタノールを産生するが異種リパーゼを分泌しない）対照株ＰＮＹ２２４２の細胞と共に使用して、３ｍＬのＳＣ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ  ＤＥ培地の前培養物に接種した。これらを約６時間培養した。２ｍＬを使用して、通気栓付き２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬの同一培地に接種した；これらを約１の光学濃度（ＯＤ６００）に一晩培養した。翌朝、グルコース、酵母抽出物、およびペプトンをそれぞれ３５、１０、および２０ｇ／Ｌの濃度に添加して、最終容積７５ｍＬにした。これを三連の１２５ｍＬの振盪フラスコ（非通気栓、撹拌棒を含有する）に均等に分割し、次に１０．３ｍＬのコーンオイル脂肪酸（ＣＯＦＡ）を添加して、フラスコを３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。サンプルは、０時間目（０．６ｍＬ、ＣＯＦＡ添加前）、および２４時間目および７２時間目（各５ｍＬ、水性およびＣＯＦＡ相の徹底的混合後）に採取した。サンプルは、既に記載されているように、ＨＰＬＣおよびＧＣによって分析した。２４時間目に、１．５ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースを添加した。
【０２４７】
これらの発酵中で生成したイソブタノールは、３画分に分配された：水性およびＣＯＦＡ相中の遊離イソブタノール、およびイソブタノールと脂肪酸のエステル化によって生成した脂肪酸イソブチルエステル（ＦＡＢＥ）画分。表１６に示されるように、リパーゼ分泌株がかなりの量のＦＡＢＥを産生したのに対し、対照株はリパーゼ分泌株の約１２％の少量のみを産生した。イソブタノールのＦＡＢＥへのリパーゼ触媒エステル化によって、システム中のイソブタノール総量の百分率としての水性イソブタノール濃度は、２４時間目に５３％から４３％へ、７２時間目に４５％から約３１％へ、約１０％低下した。
【０２４８】
【表２３】
2014518066.tif 000025
【０２４９】
実施例１２
異種リパーゼ分泌によるイソブタノールおよび脂肪酸イソブチルエステルの生成−グリコシル化および非グリコシル化リパーゼの比較
ＴｌａｎリパーゼのＮ５５Ａ変異体を分泌するＰＮＹ９３６株を含めて、先の実施例の実験を繰り返した。この実験では、グルコースを２４時間後と４８時間後の２回、添加した（１．５ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコース）。
【０２５０】
リパーゼ分泌株は、対照株よりもさらに多くのＦＡＢＥを産生した（この場合約５〜６倍）。ＦＡＢＥ形成の結果として、水性画分中の全イソブタノールの比率は、２４時間目に約１０％  ７２時間目に約１５％低下した。その中でリパーゼ分泌イソブタノール産生菌が培養された培養物は、対照よりも顕著により多くのＦＡＢＥ画分を生成した。（グリコシル化変異リパーゼを分泌する）ＰＮＹ９３６株による発酵中に生成するＦＡＢＥの量は、野生型リパーゼ酵素を分泌する株による生成量と顕著に異ならなかった。
【０２５１】
【表２４】
2014518066.tif 000026
【０２５２】
実施例１３
イソブタノール産生酵母にＣ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）およびＣ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼを発現させる遺伝子操作
それぞれＣ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）およびＣ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの野生型リパーゼをコードする、ＬＩＰ１およびＣａｌＢリパーゼ導入遺伝子をそれらの５’末端にＡｓｃＩ部位を含むオリゴヌクレオチドＡＫ１１−２４（配列番号１３２）およびＡＫ１１−２５（配列番号１３３）によって、プラスミドｐＮＡＫ１０（配列番号４５）、ｐＮＡＫ３１（配列番号２３８）、およびｐＴＶＡＮ８（配列番号２４０）から増幅した。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩで消化し、ＡｓｃＩ−消化ｐＮＡＫ３６（配列番号２２３）にライゲートした。ライゲーション混合物をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換して、ＬＢ−アンピシリン寒天上に播種した。このプレートからのコロニーをＬＢ−アンピシリン中で一晩培養し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。ＡｓｃＩでの消化とアガロースゲル電気泳動によって、組換えプラスミドを同定した。プラスミドｐＮＡＫ３８（配列番号２２４）はＴＥＦ１（Ｍ６）プロモーター制御下のＣａｌＢリパーゼを含有し、ｐＮＡＫ３７（配列番号２２５）はＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーター制御下のＬＩＰ１リパーゼを含有し、ｐＮＡＫ３９（配列番号２２６）はＴＥＦ１（Ｍ６）プロモーター制御下のＬＩＰ１リパーゼを含有する。
【０２５３】
リパーゼ導入遺伝子は、プライマーｏＢＰ６９１（配列番号１３６）およびｏＢＰ６９６（配列番号１３７）を使用して、それらをｇｐｄ２Δにおける組み込みに標的化する（そして選択可能なマーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を含む）側面に位置するＤＮＡと共に、これらのプラスミドから増幅された。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し濃縮した。酵母株ＰＮＹ１５５６は、ＹＰＥ培地（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２０ｇ／ｌペプトン、２０ｍｌ／ｌ９５％エタノール）中で３０℃および２５０ｒｐｍで一晩培養し、ＰＣＲ産物で形質転換して、ＳＣＥ−Ｕｒａ寒天培地への播種がそれに続いた。Ｕｒａ＋コロニーを新鮮培地に播種し、次にＦＯＡ培地に再度播種して、選択可能なマーカーを喪失した単離株を選択した。
【０２５４】
ＦＯＡ耐性形質転換体は、組み込みカセットの各側面のためのプライマー対を用いたコロニーＰＣＲによって、導入遺伝子の正しい組み込みと選択可能なマーカーの喪失について、次のようにチェックした：ゲノムＤＮＡは、本質的に製造会社が説明するようにした、ＰｕｒｅＧｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。これをｏｌｉｇｏｓ  ＨＹ４８（配列番号２２７）およびＨＹ４９（配列番号２２８）によるＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。陽性組み込み体をＦＯＡ培地に播種して、ＦＯＡ耐性単離株を回収した。上述したようなｏｌｉｇｏｓ  ＨＹ４８およびＨＹ４９を使用して、ＰＣＲによって、ｇｐｄ２Δ位置からＵＲＡ３マーカーを喪失した単離株を同定した。
【０２５５】
イソブタノール代謝経路を導入するために、リパーゼ組み込み体酵母株および対照株ＰＮＹ１５５６をプラスミドｐＢＰ２０９２（配列番号２３７）で次のように形質転換した：株をＹＰＥ培地中で一晩培養して、次に上述したようなプラスミドＤＮＡで形質転換し、ＳＣＥ−Ｈｉｓ寒天培地に播種した。コロニーをＳＣＥ−Ｕｒａ寒天培地に再度播種して、ＰＮＹ１０２２（ＴＥＦ１（Ｍ４）−ＬＩＰ１）、ＰＮＹ１０２３（ＴＥＦ１（Ｍ６）−ＬＩＰ１）、およびＰＮＹ１０２４（ＴＥＦ１（Ｍ４）−ＣａｌＢ）と命名した。
【０２５６】
実施例１４
Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）およびＣ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼのイソブタノール産生菌中における異種性発現によるイソブタノールおよび脂肪酸イソブチルエステルの生成
ＰＮＹ１０２２、ＰＮＹ１０２３、およびＰＮＹ１０２４株を  ＳＣ−ＵｒａＤＥ寒天培地に再度播種し；これらの細胞を使用して、ＳＣ−Ｈｉｓ−ＵｒａＤＥ培地の３ｍｌの前培養物に接種し、約６時間培養した。２ｍＬを使用して、通気栓付き２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬの同一培地に接種した；これらを約１の光学濃度（ＯＤ６００）に一晩培養した。翌朝、グルコース、酵母抽出物、およびペプトンをそれぞれ３５、１０、および２０ｇ／Ｌの濃度に添加して、最終容積７５ｍｌにした。これを三連の１２５ｍｌの振盪フラスコ（非通気栓、撹拌棒を含有する）に均等に分割し、次に１０．３ｍｌのコーンオイル脂肪酸（ＣＯＦＡ）を添加して、フラスコを３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。サンプルは、０時間目（ＣＯＦＡ添加前）、および２４時間目、４８時間目、および９４時間目に、水性およびＣＯＦＡ相の徹底的混合後に採取した。サンプルは、ＨＰＬＣおよびＧＣによって分析した。２４時間目に、１．５ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースを添加し（ＰＮＹ１５５６培養物には１．２ｍＬ）；４８時間目に１．６ｍＬのグルコースを各フラスコに添加した。
【０２５７】
これらの発酵中で生成したイソブタノールは、３相に分配された：水性およびＣＯＦＡ相中の遊離イソブタノール、およびイソブタノールと脂肪酸のエステル化によって生成した脂肪酸イソブチルエステル（ＦＡＢＥ）。表１８に示されるように、Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼ発現する株は、２４および９４時間目の双方において、かなりの量のＦＡＢＥを産生する。Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼ導入遺伝子の発現を駆動するより強力なプロモーターを有するＰＮＹ１０２３は、ＰＮＹ１０２２のおよそ２倍のＦＡＢＥを産生する。興味深いことに、９４時間目には、ＰＮＹ１０２３は、その他の株よりも顕著により多くの総イソブタノールを産生した。
【０２５８】
そのフラスコ内には、対照発酵よりも顕著により多くのＦＡＢＥがあったが、ＣａｌＢリパーゼを発現する株は、Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）酵素を発現する株よりもはるかにより少ないＦＡＢＥを産生した。対照株（リパーゼ導入遺伝子なし）は、恐らく内在性リパーゼ活性のために、９４時間目までに１０ｍｇのイソブタノールのみをＦＡＢＥにエステル化した。リパーゼ発現イソブタノール産生菌によって起こる発酵は、全て、対照発酵よりも顕著により低い水性イソブタノール濃度を特徴とする。Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）発現株（ＰＮＹ１０２２およびＰＮＹ１０２３）による発酵の場合、これはかなり大きいＦＡＢＥ蓄積に相当し；Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を発現する株は、より少ないエステルを蓄積した。Ｃ．デフォルマンス（Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）発現株では、リパーゼ遺伝子を発現するのにより弱いプロモーターが使用される場合、総イソブタノール生産量は、リパーゼなしの対照と同等である；強力なプロモーターが使用される場合、総イソブタノール生産量は、対照よりも２４％高い。
【０２５９】
【表２５】
2014518066.tif 000027
【０２６０】
実施例１５
アスペルギルス・チュービンゲネシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）ＬＩＰ３リパーゼの酵母中の発現
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現のためにコドン使用頻度を最適化して、アスペルギルス・チュービンゲネシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）ＬＩＰ３リパーゼをコードするＤＮＡを合成した（ＤＮＡ２．０）。ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって、プライマーＡｔｕｂｌｉｐ１およびＡｔｕｂＬｉｐ２（それぞれ配列番号２２９および２３０）を使用して、このＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をギャップのあるプラスミドｐＮＡＫ３３（ＴＥＦ１（Ｍ２）プロモーター）、ｐＮＡＫ３４（ＴＥＦ１（Ｍ４）プロモーター）、およびｐＮＡＫ３５（ＴＥＦ１（Ｍ６）プロモーター）（それぞれ配列番号２３１、２３２、および２３３）と共に、酵母株ＰＮＹ１５００に形質転換した。形質転換反応をＳＣＤ−Ｈｉｓ培地上に播種し；出現したコロニーは、トリブチリンプレート上で、リパーゼ活性の発現について陽性と判定された。これらの単離株からプラスミドをレスキューして（Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに形質転換し、精製した。配列分析は、Ａ．チュービンゲネシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ導入遺伝子の予想されたヌクレオチド配列を示した。それらは、それぞれＴＥＦ１（Ｍ２）、ＴＥＦ１（Ｍ４）、およびＴＥＦ１（Ｍ６）プロモーター変異について、それぞれｐＴＶＡＮ９、ｐＴＶＡＮ４、およびｐＴＶＡＮ１０と命名された（（それぞれ配列番号２３４、２３５、および２３６））。
【０２６１】
２５０ｍＬの通気栓フラスコ内の５０ｍＬのＳＣＤ−Ｈｉｓ培地中で、リパーゼ発現株
ＰＮＹ１０５５（ｐＴＶＡＮ９）、ＰＮＹ１０５６（ｐＴＶＡＮ４）、およびＰＮＹ１０５７（ｐＴＶＡＮ１０）、および野生型対照株（ＰＮＹ８２７）を３０℃および２５０ｒｐｍで一晩培養した。翌朝、１．７５ｍＬのグルコース（５００ｇ／Ｌ）、２．５ｍＬの１０×ＹＥＰ（１００ｇ／Ｌ酵母抽出物、２００ｇ／Ｌペプトン）、および０．３１３ｍＬのイソブタノールを添加して、２２ｍＬの培養物を１２５ｍＬのフラスコ（非通気栓）に移した。サンプルを採取し、次に１０．３ｍＬのＣＯＦＡおよび無菌撹拌棒を入れて、フラスコを培養に戻した。ＨＰＬＣおよびＧＣ分析のために、サンプル（５ｍＬ）を２４時間後に採取し、１．７５ｍＬのグルコースおよび０．３１３ｍＬのイソブタノールを添加した。第２のサンプルを９６時間後に採取した。サンプルを上述したように分析した。リパーゼ発現株は、イソブタノールをＦＡＢＥにエステル化することができ；９６時間目には、これらの株によって形成されたＦＡＢＥ量が、対照株によって形成された量の１０倍を上回った。示されるように、ＦＡＢＥ形成の最大量は、リパーゼ転写を駆動する中程度の強度のプロモーターがある株によって、達成される。
【０２６２】
【表２６】
2014518066.tif 000028
【０２６３】
実施例１６
酵母中で発現されるリパーゼのグリコシル化の遺伝的廃絶
アスパラギニルグリコシル化のコンセンサス部位にマッチするＮ−グリコシル化配列、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ  Ｋ  ＆  Ｔａｙｌｏｒ  ＭＥ（２００６）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．）．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ）をＬＩＰ１およびＣａｌＢ中で同定した。ＬＩＰ１は２つ（残基１４６のＮＩＳおよび残基１６７のＮＮＴ）を有し、ＣａｌＢは１つ（残基９９のＮＤＴ）の２つのグリコシル化部位を有する。これらを部位特異的変異誘発によって改変し、次のように全例でＮをＡで置換した（そしてＬＩＰ１中で二重変異体もたらした）。
【０２６４】
変異誘発は、以下のプラスミドとプライマーを組み合わせて、製造会社の使用説明書に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を用いて実施した。
【０２６５】
【表２７】
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【０２６６】
キットで提供される熱安定性ポリメラーゼを使用した、変異原性プライマーによるプラスミド主鎖の増幅後、ＤＮＡをＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。処理プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞に形質転換し、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して回収した。変異クローンは、変異誘発プラスミドのＤＮＡ配列分析によって同定された。プラスミドをそれぞれｐＴＶＡＮ２０、ｐＴＶＡＮ２５、ｐＴＶＡＮ２６、およびｐＴＶＡＮ２７と命名した。プラスミド（および野生型リパーゼ遺伝子がある対照プラスミド）をＰＮＹ１５００酵母株に形質転換した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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