(57)【要約】  本発明は一般式Ｉに示されたチアゾール系化合物及びその調製方法並びに用途に関し、より具体的に言うと、本発明は、新規の天然物ｌａｒｇａｚｏｌｅの誘導体、その調製方法及びヒストン脱アセチル化酵素阻害薬として、抗腫瘍及び多発性硬化症の治療における用途に関する。【化１】2014517831.tif 000066
2014517831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式に示されたチアゾール系化合物であって、
【化１】
2014517831.tif 000048
式中、
Ｒ１がＲ１ａ、Ｒ１ｂまたはＲ１ｃであり、
【化２】
2014517831.tif 000049
Ｒ４ａ及びＲ５ａがそれぞれ独立にＡ、またはＢｏｃ保護のアミノＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立にＡから選ばれ、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂが、これらと結合するＣと共に、３〜１０員環、またはＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有する３〜１０員複素環を形成し、
Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ及びＲ６がそれぞれ独立にＡから選ばれ、
前記Ａが、Ｈ、ハロゲノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、フルオロＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、フルオロＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニル基、フルオロＣ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または、５〜７員ヘテロアリール基であり、前記５〜７員ヘテロアリール基はＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有し、
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲノ基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ８アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されたＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基とＣ１〜Ｃ４アルコキシ基とハロゲン原子とベンジルオキシ基とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル基、ヒドロキシル基とＣ１〜Ｃ４アルコキシ基とハロゲン原子とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基、ヒドロキシル基とＣ１〜Ｃ４アルコキシ基とハロゲン原子とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ２〜Ｃ８アルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、ハロゲン原子とニトロ基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基、または、５〜７員ヘテロアリール基であり、前記５〜７員ヘテロアリール基はＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有し、
ｎが０、１または２であり、
Ｘは−Ｎ（Ｒ７）−または
【化３】
2014517831.tif 000050
であり、
そのうち、Ｒ７がＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル基から選ばれ、
Ｙが存在せず、または、Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基）−、−（Ｃ２〜Ｃ９アルケニル基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基）−、−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基）−、−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−、−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−もしくは−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ９アルケニル基）−であり、
Ｒ３がＲ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄまたはＲ３ｅで、
【化４】
2014517831.tif 000051
そのうち、Ｒ８がＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルカルボニル基で、
Ｒ９がＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルカルボニル基である、チアゾール系化合物。
【請求項２】
前記一般式Ｉで示されるチアゾール系化合物において、
前記Ｒ２が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基とベンジルオキシ基とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、または、ハロゲン原子とニトロ基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基で、
ｎが０で、
Ｘが−ＮＨ−で、
Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、または−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基）−で、
Ｒ８がＨである、請求項１に記載のチアゾール系化合物。
【請求項３】
一般式ＩＩａ、ＩＩｂまたはＩＩｃで示されるチアゾール系化合物あって、
【化５】
2014517831.tif 000052
式ＩＩａにおいて、
Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＲ３の定義が請求項１に記載されたと同様で、
Ｒ４ａ及びＲ５ａがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基またはＢｏｃ保護のアミノＣ１〜Ｃ６アルキル基であり、
または、
【化６】
2014517831.tif 000053
式ＩＩｂにおいて、
Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＲ３の定義が請求項１に記載されたと同様で、
Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基もしくはＣ６〜Ｃ１０アリール基であり、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがこれらと結合するＣと共に３〜１０員環を形成し、
または、
【化７】
2014517831.tif 000054
式ＩＩｃにおいて、
Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＲ３の定義が請求項１に記載されたと同様で、
Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ及びＲ６がそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル基である、請求項１に記載のチアゾール系化合物。
【請求項４】
一般式ＩＶで示されるチアゾール系化合物であって、
【化８】
2014517831.tif 000055
そのうち、Ｒ２、Ｒ４ｂ、Ｒ５ｂ及びＹの定義が請求項１に記載されたと同様である、請求項１に記載のチアゾール系化合物。
【請求項５】
前記Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されたＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ８アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基もしくはベンジルオキシ基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ８アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ８アルコキシ基、ハロゲノ基により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基、またはニトロ基により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基であり、
前記Ｒ４ｂ及び前記Ｒ５ｂがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、フルオロＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、フルオロＣ２〜Ｃ６アルケニル基もしくはＣ６〜Ｃ１０アリール基であり、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがこれらと結合するＣと共に、３〜１０員環、もしくはＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有する３〜１０員複素環を形成し、
前記Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、または−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基）−である、請求項４に記載のチアゾール系化合物。
【請求項６】
前記化合物は、具体的に、
【化９−１】
2014517831.tif 000056
【化９−２】
2014517831.tif 000057
【化９−３】
2014517831.tif 000058
【化９−４】
2014517831.tif 000059
【化９−５】
2014517831.tif 000060
である、請求項１に記載のチアゾール系化合物。
【請求項７】
請求項１に記載のチアゾール系化合物の調製方法であって、前記調製方法は、下記のルート１〜ルート５のいずれか１種によって実施され、
【化１０】
2014517831.tif 000061
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、Ｘ及びＹの定義が請求項１と同様であり、
化合物１と活性化した亜鉛粉末とがＴＨＦにおいて化合物２を形成し、化合物２と２−ブロモチアゾール化合物３とが、酢酸パラジウム及びトリフェニルホスフィンの触媒作用下でトルエンにおいてＮｅｇｉｓｈｉカップリング反応を行うことによって化合物４を得、化合物４が水酸化ナトリウム／メタノール−水系において加水分解し、対応する酸５を得、化合物５が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−ＣＯＯＭｅと、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下でＤＭＦにおいて縮合反応を行い、化合物６を得、化合物６が新たに調製されたヒドロキシルアミンのメタノール溶液と反応して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉａを得、
【化１１】
2014517831.tif 000062
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ８、ｎ、Ｘ及びＹの定義が請求項１と同様であり、
化合物６がメタノールまたはＴＨＦ／水系においてアルカリ加水分解することによって化合物Ｉｅを得、化合物ＩｅがモノＢｏｃ保護のｏ−フェニレンジアミンと、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下でＤＭＦにおいて縮合反応して化合物７を得、化合物７が塩酸酢酸エステル溶液の作用下でＢｏｃ保護基を除去して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｂを得、または化合物７が種々の求核試薬Ｒ８Ｈと反応して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｂを得、
【化１２】
2014517831.tif 000063
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、Ｘ及びＹの定義が請求項１と同様であり、
化合物５が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−ＮＨＣＯＣＨ２ＳＴｒｔと、縮合剤ＥＤＣＩ、ＤＭＡＰをアルカリとして存在する条件下で、ジクロロメタンにおいて縮合反応して化合物８を得、化合物８がトリフルオロ酢酸の条件下で保護基を除去して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｃを得、
【化１３】
2014517831.tif 000064
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、Ｒ９、Ｘ及びＹの定義が請求項１と同様であり、
化合物５が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−ＳＲ９と、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下で、ＤＭＦにおいて縮合反応して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｄを得、
【化１４】
2014517831.tif 000065
そのうち、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ、Ｒ６、ｎ、Ｘ及びＹの定義が請求項１と同様であり、
化合物９がＬａｗｅｓｓｏｎ’ｓ試薬の作用下で化合物１０を生成し、化合物１０が種々のＲ２により置換されたブロモプロピオン酸エチルと、Ｈａｎｔｚｓｃｈ反応を行い、チアゾール環を構築して化合物１１を得、化合物１１がメタノール／水系においてアルカリ性条件下で加水分解して化合物１２を得、化合物１２が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−Ｒ３と、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下で、ＤＭＦにおいて縮合反応して本発明に係るチアゾール系化合物ＩＩｃを得ることを特徴とする、チアゾール系化合物の調製方法。
【請求項８】
請求項１に記載のチアゾール系化合物の、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬の薬物を調製することにおける用途。
【請求項９】
請求項１に記載のチアゾール系化合物の、抗腫瘍の薬物を調製することにおける用途。
【請求項１０】
前記腫瘍が結腸ガン、膵臓ガン、白血病、肺ガンまたは乳腺ガンである、請求項９に記載の用途。
【請求項１１】
請求項１に記載のチアゾール系化合物の、多発性硬化症の治療薬を調製することにおける用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチアゾール系化合物及びその調製方法並びに用途に関し、より具体的に言うと、本発明は新規の天然物ｌａｒｇａｚｏｌｅの誘導体、その調製方法及びヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬として、抗腫瘍及び多発性硬化症の治療方面における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は全世界の範囲の中で心血管疾患に次ぐ２番目の「キラー」であり、近年の発症率が上昇の一途を辿り、ガンに対する治療はずっと人間を困っている難題である。従来の化学治療薬はターゲット選択性が乏しく、しばしば深刻な副作用を発生するため、高効率・低毒性の特異性分子ターゲットの抗腫瘍薬の開発が要求される。いくつかの腫瘍細胞の分化増殖及び移転と相関する細胞シグナル伝達通路のキー酵素を薬物のスクリーニングターゲットとし、特定ターゲットに選択性に作用する高効率、低毒性、特異性の強い新型抗ガン薬を発見することはすでに当世抗腫瘍薬の研究開発の重要な方向になる。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）はちょうどこんな一種類の蛋白である。
【０００３】
多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）  は１種類の典型的な自己免疫性疾患である。ＭＳ疾病の病理表現は中枢神経係統の急性炎症を起こして且つ脱髄鞘現象に至り、若い人に無創性神経麻痺や障害に至る最も重要な誘因の一つである。ＭＳ臨床表現が多いと非均質型で、８０％以上の患者の表現が繰り返しの緩和に再発表現型である。疾患の発生メカニズムが不明で、且つ現在敏感な診断マークがまだ欠乏しているため、ＭＳに対する診断が疾病の時間と空間上の多発性にしか頼られない。これに加えて他の多くの疾患例えば視神経脊髄炎とＭＳが似ているから、現在ＭＳに対する治療、ひいては診断に対しても依然として非常に困難である。
【０００４】
現在の研究結果によると、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＳの発症、少なくとも早期疾病の起動に対して重要な役割をしている。以前の研究はＴＨ１細胞（ＩＦＮ−−γを生成することを特徴とする）が疾病の発生に対して重要な役割を持っていることを認識していたが、ＴＨ１７の発見に伴って、ますます多くの証拠は、後者のＭＳの発症に対する役割がＴＨ１より劣らないことを表明し、例えば、ＴＨ１７細胞の数が少ないマウスがＥＡＥ（実験性自己免疫性脳脊髄炎）を患うことが難しく、ＭＳ病人の脳組織の病巣の中でＴＨ１７細胞が鑑定されたなど。
【０００５】
染色質のヒストンアセチル化及び脱アセチル化が遺伝子発現を調節する肝心な一環の一つで、異常な遺伝子発現が腫瘍といくつかの遺伝と代謝疾患の発生の分子生物学の基礎である。ヒストンのアセチル化程度は、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）とによって協調に制御されている。ＨＤＡＣが過度に発現し且つ転写因子によって募集される時に、特定の遺伝子の不正常な阻害を至り、それによって、腫瘍や他の疾患の発生に至る。
【０００６】
ＨＤＡＣｓが十八種亜型を有し、四大類に分けられ、それぞれＩ型（ＨＤＡＣ１、２、３、８）、ＩＩ型（ＨＤＡＣ４、５、６、７、９）、ＩＩＩ型（ＳＩＲ１〜７）とＩＶ型（ＨＤＡＣ１１）である。（Johnstone、R . W . 2002 Nature Rev . Drug Disc . 1:287）。報道によると、ＨＤＡＣの活性が癌の発生に関っている（Archer、S . Y .等。1998 Proc . Nat . Acad . Sci . USA、95:6791-6796）。ＨＤＡＣが過度に発現する時に、生体内の天然の腫瘍抑制因子例えばｐ５３の遺伝子発現が阻害される（Ｇｕ、Ｗ  ．等。1997 Cell、90:595-606）。そしてＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）が染色質のヒストンアセチル化レベルの向上に至ることができるため、特定遺伝子による発現の活性化されることに至り、相応に、細胞の末端分化やガン細胞のアポトーシスに至る。臨床研究によると、ＨＤＡＣの活性を阻害することによってヒストンの高アセチル化レベルを得ることができる。
【０００７】
現在すでに発見されたＨＤＡＣｉは構造に基づいて、短鎖脂肪酸類、ヒドロキサム酸類、求電子エポキシケトン基、ｏ−フェニレンジアミン類及び大環ペプチド類に分けられることができる（Miller、T . A .等。2003 J . Med . Chem . 46:5097;Rosato,R.R.等. 2004 Expert.Opin. Invest.Drugs 13:21; Monneret,C.,2005 Eur.J.Med.40:1; Yoo,C.B.等. 2006Nat.Rev.DrugDiscovery5:37）。ＨＤＡＣｉ構造効果関係は、多くのＨＤＡＣｉは表面識別ドメイン、亜鉛イオンキレート部位（ＺＢＧ）及び２部分を連接する疎水脂肪鎖に分けることができることを表明した（Marks、P . 2007 Oncogene 26:1351）。
【０００８】
ヒストンアセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は重要なエピジェネティック制御蛋白であり、クロマチン再構成、遺伝子発現及び転写因子、ヒストン、細胞骨格蛋白質等を含む多種の蛋白質の機能を制御する。ＨＤＡＣｉはＨＤＡＣ活性を遮断できる１種の小分子化合物で、それらは細胞周期の遮断、細胞分化及び細胞のアポトーシスに至ることができ、現在すでに腫瘍治療に応用される。最近の実験の結果、ＨＤＡＣｉは抗炎症及び免疫調節の機能を持っていることを表明した。Ｃａｍｅｌｏ等は、ＨＤＡＣｉ  ＴＳＡがＭＳのマウス動物モデル（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ＥＡＥ）においてＴ細胞のマウス中枢神経係に対する侵襲を有効に防止でき、それによって、その臨床症状を軽減することを発見した。Ｃｈｕｎｇ等は、ＨＤＡＣｉフェニル酪酸とＴＳＡが動物関節炎モデルにおいてＴＮＦ−ａｌｐｈａの発現を阻害し、単核の浸潤を軽減することによって、病気の症状を軽減できることを発見した。Ｂｏｓｉｓｉｏ等の研究は、ＨＤＡＣｉが抗原の提示する樹状細胞分泌を阻害でき、ＴＨ１とＴＨ１７により誘導されたＩＬ−１２、ＩＬ−２３などを含む細胞因子に有利であることを証明した。Ｔａｏ等の研究は、ＨＤＡＣｉが阻害性Ｔｒｅｇ細胞の分化を強化し、それのＴＨ１とＴＨ１７細胞に対する阻害機能を増強できることを表明した。上記研究は、ＨＤＡＣの阻害が自己免疫疾患の発生進行と密接に関係することを表明した。毒性のより低い、選択性のより良いＨＤＡＣｉを見つけることはＭＳ疾患の治療を含む自己免疫性疾患の治療に寄与し得る。
【０００９】
Ｌａｒｇａｚｏｌｅはフロリダの海洋シアノバクテリアSymploa sp.から分離し得た高度官能基化の１６員環状ペプチド（Taori、K .等。2008 J . Am . Chem . Soc . 130:1806-1807;Ying、Y .等。2008 J . Am . Chem . Soc . 130:8455-8459）で、その構造は以下の通りである。この天然産物の骨組構造は斬新で、その構造が、４−メチル置換のジヒドロチアゾール環とチアゾール環とのカップリング部分、Ｌ−バリン及び（３Ｓ、４Ｅ）−３−ヒドロキシ−７−メルカプト−４−ヘプテン酸を含む。薬理実験では、ｌａｒｇａｚｏｌｅが乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び繊維芽細胞骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）の生長を選択的に抑制できるが、正常な乳腺上皮細胞（ＮｍｕＭＧ）や正常な繊維細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）に対する影響が少ないことを表明した。その後の研究はｌａｒｇａｚｏｌｅがＩ型ＨＤＡＣを選択性に抑制できることを表明した。この基礎上で、発明者はその構造を最適化及び改造並びに評価を行い、それによって、一連のさらなる開発に潜在力を持つ化合物を得た。
【００１０】
【化１】
2014517831.tif 000003
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的はヒストン脱アセチル化酵素阻害薬とすることができる新型のチアゾール系化合物を設計及び合成することにあり、それによって、抗腫瘍及び多発性硬化症の薬物を見つけ出すための新しい道が切り開かれる。
【００１２】
本発明の他の１つの目的は前記チアゾール系化合物の調製方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は前記チアゾール系化合物の用途を提供することにある。
【００１４】
本発明のチアゾール系化合物は以下の一般式Ｉの構造を有し、
【００１５】
【化２】
2014517831.tif 000004
式中、
Ｒ１がＲ１ａ、Ｒ１ｂまたはＲ１ｃである。
【００１６】
【化３】
2014517831.tif 000005
Ｒ４ａ及びＲ５ａがそれぞれ独立にＡ、またはＢｏｃ保護のアミノＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００１７】
Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立にＡから選ばれ、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがこれらと結合するＣと共に、３〜１０員環、またはＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有する３〜１０員複素環を形成する。
【００１８】
Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ及びＲ６がそれぞれ独立にＡから選ばれる。
【００１９】
前記Ａが、Ｈ、ハロゲノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、フルオロＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、フルオロＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニル基、フルオロＣ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、５〜７員ヘテロアリール基のうちの１種であり、前記５〜７員ヘテロアリール基はＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有する。
【００２０】
Ｒ２が、Ｈ、ハロゲノ基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ８アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されたＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基とＣ１〜Ｃ４アルコキシ基とハロゲン原子とベンジルオキシ基とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル基、ヒドロキシル基とＣ１〜Ｃ４アルコキシ基とハロゲン原子とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基、ヒドロキシル基とＣ１〜Ｃ４アルコキシ基とハロゲン原子とＣ６〜Ｃ１０アリール基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ２〜Ｃ８アルキニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、ハロゲン原子とニトロ基とからなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基、または、５〜７員ヘテロアリール基であり、前記５〜７員ヘテロアリール基はＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有する。好ましくは、Ｒ２が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基とベンジルオキシ基とＣ６〜Ｃ１０アリール基からなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、ハロゲン原子及びニトロ基からなる群より任意に選択された少なくとも１種により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基のうちの１種である。
【００２１】
ｎが０、１または２、好ましくは０である。
【００２２】
Ｘは−Ｎ（Ｒ７）−または
【化４】
2014517831.tif 000006
であり、
そのうち、Ｒ７がＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル基から選ばれ、Ｘは好ましくは−ＮＨ−である。
【００２３】
Ｙが存在せず、または、Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基）−、−（Ｃ２〜Ｃ９アルケニル基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基）−、−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基）−、−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−、−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−もしくは−（Ｃ１〜Ｃ５アルキル基）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ９アルケニル基）−であり。好ましくは、Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基）−である。
【００２４】
Ｒ３がＲ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ３ｃ、Ｒ３ｄまたはＲ３ｅである。
【００２５】
【化５】
2014517831.tif 000007
そのうち、Ｒ８がＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルカルボニル基で、好ましくは、Ｒ８がＨである。
Ｒ９がＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルカルボニル基である。
【００２６】
本発明の更なる実施形態において、一般式Ｉにおいて、
Ｒ１がＲ１ａであり、
ｎ＝０、
Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＲ３の定義が前記の通りであり、具体的には以下の構造ＩＩａを有し、
【００２７】
【化６】
2014517831.tif 000008
そのうち、
Ｒ４ａ及びＲ５ａの定義が前記の通りであり、好ましくは、Ｒ４ａ及びＲ５ａがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基またはＢｏｃ保護のアミノＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２８】
本発明の更なる実施形態において、一般式Ｉにおいて、
Ｒ１がＲ１ｂであり、
ｎ＝０、
Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＲ３の定義が前記の通りであり、具体的には以下の構造ＩＩｂを有し、
【００２９】
【化７】
2014517831.tif 000009
そのうち、
Ｒ４ｂ及びＲ５ｂの定義が前記の通りであり、好ましくは、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基もしくはＣ６〜Ｃ１０アリール基であり、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがこれらと結合するＣと共に３〜１０員環を形成する。
【００３０】
本発明の更なる実施形態において、一般式Ｉにおいて、
Ｒ１がＲ１ｃであり、
ｎ＝０、
Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＲ３の定義が前記の通りであり、具体的には以下の構造ＩＩｃを有し、
【００３１】
【化８】
2014517831.tif 000010
そのうち、
Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ及びＲ６の定義が前記の通りであり、好ましくは、Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ及びＲ６がそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
【００３２】
本発明のより好適な実施形態において、前記Ｘが−ＮＨ−で、且つｎ＝０、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４ｂ、Ｒ５ｂ及びＹの定義が前記の通りであり、以下の構造ＩＩＩを有する。
【００３３】
【化９】
2014517831.tif 000011
本発明の特別な好適な実施形態において、前記Ｘが−ＮＨ−で、且つｎ＝０、Ｒ３が具体的にＲ３ａであり、以下の構造ＩＶを有し、
【００３４】
【化１０】
2014517831.tif 000012
そのうち、Ｒ２、Ｒ４ｂ、Ｒ５ｂ及びＹの定義が前記の通りである。
【００３５】
好ましくは、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されたＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ８アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基もしくはベンジルオキシ基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ８アルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基により置換されたＣ２〜Ｃ８アルコキシ基、ハロゲノ基により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基、またはニトロ基により置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール基である。
【００３６】
好ましくは、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、フルオロＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ２〜Ｃ６アルケニル基、フルオロＣ２〜Ｃ６アルケニル基、もしくはＣ６〜Ｃ１０アリール基であり、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがこれらと結合するＣと共に形成する３〜１０員環、もしくはＮ、Ｏ及びＳから選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含有する３〜１０員複素環を形成する。より好ましくは、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基、ヒドロキシル基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基、フルオロＣ１〜Ｃ６アルキル基またはＣ６〜Ｃ１０アリール基である。最も好ましくは、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基（Ｃ１〜Ｃ６直鎖または側鎖アルキル基を含み）、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基もしくはＣ６〜Ｃ１０アリール基であり、または、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂが、これらと結合するＣと共に３〜１０員環を形成する。
【００３７】
好ましくは、Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル基）−、−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−、または−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール基）−（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基）−である。
【００３８】
本発明の一般式Ｉで示される構造を有するチアゾール系化合物は、具体的には以下の通りである。
【００３９】
【化１１−１】
2014517831.tif 000013
【化１１−２】
2014517831.tif 000014
【化１１−３】
2014517831.tif 000015
【化１１−４】
2014517831.tif 000016
【化１１−５】
2014517831.tif 000017
【００４０】
本発明は一般式Ｉの構造を有するチアゾール系化合物の調製方法を提供する。当該調製方法は下記のルート１〜ルート５のいずれか１種によって実施することができる。
【００４１】
【化１２】
2014517831.tif 000018
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、Ｘ及びＹの定義が前記の通りである。
【００４２】
具体的には、化合物１と活性化した亜鉛粉末とがＴＨＦにおいて化合物２を形成し、化合物２が２−ブロモチアゾール化合物３と、酢酸パラジウム及びトリフェニルホスフィンの触媒作用下でトルエンにおいてＮｅｇｉｓｈｉカップリング反応を行うことによって化合物４を得、化合物４が水酸化ナトリウム／メタノール−水系において加水分解し、対応する酸５を得、化合物５が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−ＣＯＯＭｅと、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下でＤＭＦにおいて縮合反応を行い化合物６を得、化合物６が新たに調製されたヒドロキシルアミンのメタノール溶液と反応して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉａを得る。
【００４３】
【化１３】
2014517831.tif 000019
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ８、ｎ、Ｘ及びＹの定義が前記の通りである。
【００４４】
具体的には、化合物６がメタノールまたはＴＨＦ／水系においてアルカリ（例えばＮａＯＨまたはＬｉＯＨ）加水分解することによって化合物Ｉｅを得、ＩｅがモノＢｏｃ保護のｏ−フェニレンジアミンと、縮合剤１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルエチルアミン（ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ）の作用下でＤＭＦにおいて縮合反応して化合物７を得、化合物７が塩酸酢酸エステル溶液の作用下でＢｏｃ保護基を除去して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｂを得、または化合物７が種々の求核試薬Ｒ８Ｈと反応して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｂを得る。
【００４５】
【化１４】
2014517831.tif 000020
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、Ｘ及びＹの定義が前記の通りである。
【００４６】
具体的には、化合物５が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−ＮＨＣＯＣＨ２ＳＴｒｔと、縮合剤ＥＤＣＩ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をアルカリとして存在する条件下で、ジクロロメタンにおいて縮合反応して化合物８を得、化合物８がトリフルオロ酢酸の条件下で保護基を除去して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｃを得る。
【００４７】
【化１５】
2014517831.tif 000021
そのうち、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、Ｒ９、Ｘ及びＹの定義が前記の通りである。
【００４８】
具体的には、化合物５が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−ＳＲ９と、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下で、ＤＭＦにおいて縮合反応して本発明に係るチアゾール系化合物Ｉｄを得る。
【００４９】
【化１６】
2014517831.tif 000022
そのうち、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４ｃ、Ｒ５ｃ、Ｒ６、ｎ、Ｘ及びＹの定義が前記の通りである。
【００５０】
具体的には、化合物９がＬａｗｅｓｓｏｎ’ｓ試薬の作用下で化合物１０に生成され、化合物１０が種々のＲ２により置換されたブロモプロピオン酸エチルと、Ｈａｎｔｚｓｃｈ反応によってチアゾール環を構築して化合物１１を得、化合物１１がメタノール／水系においてアルカリ性条件下で加水分解して化合物１２を得、化合物１２が種々の求核試薬ＨＸ−Ｙ−Ｒ３と、縮合剤ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔの作用下で、ＤＭＦにおいて縮合反応して本発明に係るチアゾール系化合物ＩＩｃを得る。
【００５１】
本発明の一般式Ｉで示される構造のチアゾール系化合物はヒストン脱アセチル化酵素阻害薬の薬物を調製することに用いられることができるため、抗腫瘍及び多発性硬化症の薬物の調製に応用されることができ、前記腫瘍細胞株が結腸ガン細胞ＨＣＴ−１１６、膵臓ガン細胞Ｂｘ−ＰＣ３、白血病細胞ＨＬ６０、ヒト肺腺癌細胞Ａ５４９、乳腺ガン細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、乳腺上皮細胞ＨＭＥＣを含む。それによって、結腸ガン、膵臓ガン、白血病、肺ガンまたは乳腺ガンの治療に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＥＡＥを有効に緩和するＨＤＡＣｉ  ＣＦＨ３６７−Ｃの臨床評価点数である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、具体的な実施例に合わせて本発明に対してさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
［化合物調製の実施例］
【００５４】
以下の調製実施例において、ＮＭＲがＶａｒｉａｎ  製のＭｅｒｃｕｒｙ−Ｖｘ  ３００Ｍ機器で測定され、ＮＭＲ校正は、δ  Ｈ  ７．２６  ｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）、２．５０  ｐｐｍ（ＤＭＳＯ−ｄ６）、３．１５  ｐｐｍ（ＣＤ３ＯＤ）である。試薬は主に上海化学試薬公司により提供され、ＴＬＣ薄層クロマトシリカゲルプレートは三東煙台会友シリカゲル開発有限公司により生産され、型番がＨＳＧＦ  ２５４である。化合物純度に使用される順相カラムクロマトグラフィーシリカゲルは山東青島海洋化工工場の支工場により生産されたもので、型番がｚｃｘ−１１、２００〜３００メッシュである。
調製実施例１（化合物番号ＣＦＨ３６７−Ｃ）
【００５５】
【化１７】
2014517831.tif 000023
【００５６】
活性化したＺｎ粉末（２９８ｍｇ，４．５８ｍｍｏｌ）を再蒸留の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶かし、Ｎ２で置換を行い、化合物１３（８７５ｍｇ，５．３４ｍｍｏｌ  ）を滴下し、滴下の速度を制御して、突沸を防止する。滴下完了した後、１．５ｈ還流し、静置し冷却して化合物１４を得た。
【００５７】
化合物１５（１ｇ，３．８２ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２０ｍＬ）に溶かし、Ｎ２で置換を行い、前記Ｚｎ試薬１４を反応液に移した。触媒酢酸パラジウム（４３ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１００ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）を加え、８０−９０℃に加熱し、原料１５が消えるまで反応させた。ろ過して不溶物を除去し、有機相を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）を加えて１０ｍｉｎ撹拌して有機相を分離し、水相をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ×２回）で抽出した。さらに、有機相を混合して濃縮し、カラムを通過させて（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝４：１）化合物１６（７５０ｇ，７３．５％，黄色油状物）を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.85 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J=3.0 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.10-3.14 (m, 1H), 1.31-1.38 (m, 2H), 0.84-0.89 (m, 2H)。
【００５８】
化合物１６（７００ｍｇ，２．６３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６ｍＬ）に溶かし、ＮａＯＨ（２１０ｍｇ，５．２６ｍｍｏｌ）固体を加え、１ｈ加熱還流した。反応完了した後、ＭｅＯＨを回転蒸発させ、Ｈ２Ｏで希釈し、水相を１Ｎ塩酸でｐＨ＝２まで酸化し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３回）で抽出し、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して固体１７（６６０ｍｇ，９９．５％，薄黄色固体）を得た。得られた固体１７は、次の反応に直接使用された。
【００５９】
化合物１７（１００ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を乾燥のＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かし、氷浴で０℃まで冷却し、ＥＤＣＩ（７６ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５４ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を加え、０℃に保持して１０ｍｉｎ撹拌し、化合物１８（７３ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（１２０ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温条件下で１２ｈ撹拌した後、２０ｍＬの水を加えて希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し（１５ｍＬ×３回）、有機相を混合した。有機相をそれぞれ１Ｎ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶剤を回転蒸発した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝２：１）精製し、製品１９（１０４ｍｇ，７１．７％，薄黄色油状物）を得る。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.74 (d, J=3.0 Hz 1H), 7.42 (t, J=5.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J=3.0 Hz 1H), 3.58 (s, 3H), 3.37 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.30 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.58-1.69 (m, 4H), 1.19-1.25 (m, 2H), 0.68-0.74 (m, 2H)。
【００６０】
ヒドロキシルアミン塩酸塩（１９７ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に懸濁し、ＫＯＨ（２３５ｍｇ，４．２０ｍｍｏｌ）を加え、５ｍｉｎ撹拌した後、ろ過して不溶物を除去し、ろ液を収集して用意しておいた。化合物１９（１０４ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）  を無水ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）  に溶かし、前記新たに調製されたヒドロキシルアミンのＭｅＯＨ溶液を加え、室温下で１ｈ撹拌した。反応が完全に終了したことをＴＬＣで確認し、ＥｔＯＡｃで希釈を行い、１Ｎ塩酸でｐＨ＝５〜６まで中和し、ＭｅＯＨを減圧濃縮して回転蒸発した。ＥｔＯＡｃで抽出を行い（１５ｍＬ×３回）、飽和食塩水で洗浄し（１０ｍＬ）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、さらに、濃縮して粗生成物を得た。さらに、カラムクロマトグラフィーで精製して（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２０：１−１０：１）製品ＣＦＨ３６７−Ｃ（７１ｍｇ，６８．３％，薄黄色固体）を得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.36 (t, J=5.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J=3.0 Hz 1H), 7.74 (d, J=3.0 Hz 1H), 3.41 (q, J=6.6 Hz, 2H), 3.31-3.36 (m, 1H), 2.16 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.64-1.69 (m, 4H), 1.29-1.34 (m, 2H), 0.82-0.86 (m, 2H)。
同様な方法で以下の化合物を合成した。
【００６１】
【表１−１】
2014517831.tif 000024
【表１−２】
2014517831.tif 000025
【表１−３】
2014517831.tif 000026
【表１−４】
2014517831.tif 000027
【表１−５】
2014517831.tif 000028
【表１−６】
2014517831.tif 000029
【表１−７】
2014517831.tif 000030
【表１−８】
2014517831.tif 000031
【表１−９】
2014517831.tif 000032
【表１−１０】
2014517831.tif 000033
【表１−１１】
2014517831.tif 000034
調製実施例２（化合物番号ＣＦＨ４９４）
【００６２】
【化１８】
2014517831.tif 000035
【００６３】
化合物２０（９０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（５ｍＬ，４：１）に溶かし、ＮａＯＨ（１２ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）を加え、２ｈ室温で撹拌し、反応液を１Ｎ  塩酸でｐＨ＝２〜３になるまで酸化し、ＥｔＯＡｃで抽出を行い（１０ｍＬ×３回）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥を行い、濃縮して化合物２１（８５ｍｇ，９８％，白色固体）を得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7.86 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J=3.3 Hz, 1H), 3.38 (t, J=6.3 Hz, 2H), 3.20 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.36 (t, J=6.9 Hz, 2H), 1.89-2.00 (m, 1H), 1.66-1.68 (m, 4H), 0.96 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
【００６４】
化合物２１（９３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を乾燥のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）  に溶かし、化合物２２（７４ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４１ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（３６ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、０℃下で１０ｍｉｎ撹拌し、ＥＤＣＩ（８２ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液をそれぞれ１Ｎ  塩酸（１０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０ｍＬ）、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥を行い、濃縮してカラムを通過させ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝２：１−１：１）、化合物２３を得た（７４ｍｇ，５２．５％，無色透明油状物）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.66 (t, J=5.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.45 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.06-7.14 (m, 2H), 3.40 (q, J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (d, J=6.9 Hz, 2H), 2.38 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.98-2.01 (m, 1H), 1.66-1.76 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 0.98 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
【００６５】
化合物２３（７３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶かし、１Ｎ  塩酸のＥｔＯＡｃ溶液（２ｍＬ）を加え、室温下で１０ｍｉｎ撹拌した後、濃縮して生成物ＣＦＨ４９４（６０ｍｇ，９３．８％，白色固体）を得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7.93 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.80 (d, J=3.3 Hz 1H), 7.47-7.52 (m, 2H), 7.35-7.42 (m, 3H), 3.45 (q, J=6.6 Hz, 2H), 3.31 (d, J=7.2 Hz, 2H), 2.59 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.81-2.00 (m, 1H), 1.74-1.79 (m, 4H), 0.98 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
同様な方法で以下の化合物を合成した。
【００６６】
【表２−１】
2014517831.tif 000036
【表２−２】
2014517831.tif 000037
調製実施例３（化合物番号ＣＦＨ４１２）
【００６７】
【化１９】
2014517831.tif 000038
【００６８】
化合物２４（５００ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）を乾燥のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に溶かし、化合物２５（７５４ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４８８ｍｇ，２．８０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、室温で一晩反応させた。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０ｍＬ）、飽和食塩水でそれぞれ洗浄し、水相をＣＨＣｌ３（１０ｍＬ×２回）で抽出し、有機相を混合した。無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥を行い、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝２：１−１：１）で分離して生成物２６（６４０ｍｇ，５２．５％，黄色油状物）  を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.51 (t, J=6.3 Hz, 1H), 7.35 (d, J=8.1 Hz, 6H), 7.29 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.11-7.23 (m, 9H), 6.15 (t, J=6.0 Hz, 1H), 3.32 (q, J=6.0 Hz, 2H), 3.22 (d, J=7.2 Hz, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.96 (q, J=6.0 Hz, 2H), 1.94-1.96 (m, 1H), 1.44-1.46 (m, 2H), 1.35-1.40 (m, 2H), 0.94 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
【００６９】
化合物２６（３２０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶かし、Ｅｔ３ＳｉＨ（１８８ｍｇ，１．６５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５．６ｇ，０．０５ｍｏｌ）を加え、室温下で２ｈ撹拌し、濃縮してカラムを通過させて（ＰＥ／ＥＡ＝１：１−１：５）生成物ＣＦＨ４１２（１５０ｍｇ，７４．４％，薄黄色油状物）を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, J=3.0 Hz, 1H), 7.59 (t, J=5.7 Hz, 1H), 7.38 (d, J=3.0 Hz 1H), 7.31 (t, J=5.7 Hz, 1H), 3.36 (q, J=6.3 Hz, 2H), 3.26 (q, J=5.7 Hz, 2H), 3.19 (s, 2H), 3.17 (d, J=7.2 Hz, 2H), 1.86-1.97 (m, 1H), 1.47-1.58 (m, 4H), 0.89 (d, J=6.6 Hz, 6H)。
同様な方法で以下の化合物を合成した。
【００７０】
【表３】
2014517831.tif 000039
調製実施例４（化合物番号ＣＦＨ５３８）
【００７１】
【化２０】
2014517831.tif 000040
化合物２７（１００ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を乾燥のＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かし、氷浴で０℃まで冷却し、ＥＤＣＩ（１０８ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７６ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）を加え、０℃に保持して１０ｍｉｎ撹拌し、化合物２８（８１ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（９１ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を加え、室温下で維持して１２ｈ撹拌した後、２０ｍＬ水を加えて希釈を行い、ＥｔＯＡｃで抽出し（１５ｍＬ×３回）、有機相を混合した。有機相を飽和食塩水で（２０ｍＬ）洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥を行い、溶剤を減圧回転で除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝３：１）、製品２９（１２９ｍｇ，７７．９％，無色油状物）を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.83 (s, 1H), 8.10 (s,1H), 8.05 (s,1H), 7.81 (d,J=9.0 Hz, 1H ), 5.87 (dddd, J=17.1, 10.5, 5.7, 5.1 Hz, 1H), 5.31 (d, J=17.1 Hz, 1H), 5.23 (d, J=10.5 Hz, 1H), 4.73 (dd, J=9.3, 5.1 Hz, 1H), 4.65 (dd, J=17.1, 5.7 Hz, 2H), 2.23-2.33 (m, 1H), 0.96 (t, J=6.9 Hz, 6H)。
【００７２】
化合物２９（５５ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）を、再蒸留したトルエン（５ｍＬ）に溶かし、Ｎ２ガスで置換を行い、Ｇｒｕｂｂｓ第２世代触媒（６６ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）のトルエン（１ｍＬ）溶液、化合物３０（１００ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のトルエン（１ｍＬ）溶液をそれぞれ加え、１１０℃に加熱して１２ｈ還流した。濃縮を行い、カラムを通過させて（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝２：１）生成物ＣＦＨ５３８（２３ｍｇ，５０％，薄黄色油状物）を得たとともに、原料２９（２５ｍｇ）を回収した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.86 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.83 (d, J=9.0 Hz, 1H), 5.74 (dt, J=15.3, 6.6 Hz, 1H), 5.63 (dt, J=13.2, 6.0 Hz, 1H), 4.74(dd, J=9.0, 5.4 Hz, 1H), 4.66 (dd, J=15.3, 5.4 Hz, 2H), 2.91 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.52 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.35-2.43 (m, 2H), 2.22-2.32 (m, 1H), 1.60-1.67 (m, 2H), 1.19-1.26 (m, 8H), 1.04 (t, J=6.3 Hz, 6H), 0.86 (t, J=6.9 Hz, 3H)。
同様な方法で以下の化合物を合成した。
【００７３】
【表４】
2014517831.tif 000041
調製実施例５（化合物番号ＣＦＨ３２５−Ｂ）
【００７４】
【化２１】
2014517831.tif 000042
【００７５】
化合物３１（１ｇ，７．８６ｍｍｏｌ）を乾燥のＤＭＥ（３０ｍＬ）に溶かし、Ｎ２ガスの保護下でＬａｗｅｓｓｏｎ’ｓ試薬（１．６ｇ，３．９ｍｍｏｌ）を加え、室温下で１２ｈ反応し、ろ過を行い、溶剤を除去し、カラムを通過させて（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１０：１−２：１）化合物３２（１．０ｇ，８８．８％，白色固体）を得た。得られた化合物３２は、次のステップの反応に直接使用された。
【００７６】
化合物３２（５００ｍｇ，３．４９ｍｍｏｌ）を乾燥のＤＭＥ（３０ｍＬ）に溶かし、ＫＨＣＯ３（２．１ｇ，２１ｍｍｏｌ）を加え、室温下で１０ｍｉｎ撹拌し、化合物３３（１．５ｇ，７．６８ｍｍｏｌ）を滴下し、１ｈ反応した後、氷浴で冷却し、トリフルオロ酢酸無水物（２．２ｇ，１０．４８ｍｍｏｌ）及び２，６−ジメチルピリジン（１．８７ｇ，１７．４６ｍｍｏｌ）のＤＭＥ（１０ｍＬ）溶液を滴下し、０℃に保持して１ｈ反応し、室温まで温度を上げて一晩反応させた。ＴＬＣで化合物３２が完全に反応したことを確認し、溶剤を回転蒸発し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈を行い、有機相を１Ｎ塩酸（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）でそれぞれ洗浄を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮してカラムを通過させて（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝４：１−２：１）化合物３４（６４７ｍｇ，７７．４％，薄黄色固体）を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.00 (s, 1H), 7.50 (d, J=3.9 Hz, 1H), 7.36 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.00 (dd, J=4.8, 3.9 Hz, 1H), 4.34 (q, J=7.2 Hz, 2H), 1.33 (t, J=7.2 Hz, 3H)。
【００７７】
化合物３４（４４７ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（２０／５ｍＬ）に溶かし、０℃下でＮａＯＨ（１４９ｍｇ，３．７４ｍｏｌ）固体を加え、室温で一晩反応させた。反応完了した後、ＥｔＯＨを回転蒸発し、Ｈ２Ｏを加えて希釈し、ｐＨ＝２になるまで１Ｎ  塩酸で酸化し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３回）で抽出を行い、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して化合物３５（３１４ｇ，７９．５％，白色固体）を得た。得られた化合物３５は、次のステップの反応に直接使用された。
【００７８】
化合物３５（１１０ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を乾燥のＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かし、氷浴で０℃まで冷却し、ＥＤＣＩ（１５０ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１０６ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）を加え、０℃に保持して１０ｍｉｎ撹拌し、化合物１８（９６ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（１３４ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で維持して１２ｈ撹拌した後、水２０ｍＬを加えて希釈し、ＥｔＯＡｃで（１５ｍＬ×３回）抽出を行い、有機相を混合した。有機相を１Ｎ塩酸（１５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）でそれぞれ洗浄を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶剤を減圧回転して除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝２：１）で精製して、製品３６（１４６ｍｇ，８６．４％，薄黄色油状物）を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.95 (s, 1H), 7.47 (d, J=3.9 Hz, 1H), 7.39 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.03 (dd, J=5.1, 3.9 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.42 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.31 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.65-1.71 (m, 4H)。
【００７９】
ヒドロキシルアミン塩酸塩（２１５ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）  に懸濁し、ＫＯＨ（２６０ｍｇ，４．６５ｍｍｏｌ）を加え、５ｍｉｎ撹拌した後、ろ過して不溶物を除去し、ろ液を収集して用意しておいた。化合物３６（１００ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）  に溶かし、前記新たに調製されたヒドロキシルアミンのＭｅＯＨ溶液を加え、室温下で１ｈ撹拌した。ＴＬＣで反応が完全に終了したことを確認し、ＥｔＯＡｃで希釈を行い、１Ｎ塩酸でｐＨ＝５〜６になるまで中和し、ＭｅＯＨを減圧濃縮して回転蒸発し、ＥｔＯＡｃで抽出を行い（１５ｍＬ×３回）、飽和食塩水で洗浄し（１０ｍＬ）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して粗生成物を得た。さらに、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製して（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２０：１−１０：１）製品ＣＦＨ３２５−Ｂ（８６ｍｇ，８６％，白色固体）を得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.09 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.66 (d, J=3.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.14 (dd, J=3.9, 5.1 Hz, 1H), 3.42 (q, J=6.3 Hz, 2H), 2.16 (t, J=6.6 Hz, 2H), 1.68-1.71 (m, 4H)。
【００８０】
生物実験の実施例
実例１：ヒストン脱アセチル化酵素１，３，６（ＨＤＡＣ１，３，６）の阻害活性テスト実験
【００８１】
１．実験目的
本発明の化合物のヒトヒストン脱アセチル化酵素１，３，６の阻害活性テストを行う。
【００８２】
２．材料由来
ヒト  ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３及びＨＤＡＣ６、バキュロウイルス発現システムを使用することによって得られた。
【００８３】
３．テスト原理
Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＡＭＣ（ＨＤＡＣ１，３）及びＢｏｃ−ｌｙｓ（Ａｃ）−ＡＭＣ（ＨＤＡＣ６）を基質とし、蛍光検出法を使用し、９６ウェルまたは３８４ウェル平底マイクロプレートにおいて酵素活性を測定した。基質がＨＤＡＣによって脱アセチル化された後、トリプシンによって加水分解して得た生成物ＡＭＣについて、蛍光検出装置の波長３５５ｎｍで励起を行い、４６０ｎｍ蛍光波長における蛍光信号を検出することができる。時間の経過に伴う蛍光信号の変化を検出することによって、反応の初期速度を算出する。
【００８４】
４．実験過程
サンプル処理：サンプルをＤＭＳＯで溶かし、低温で保管し、最終システムにおけるＤＭＳＯの濃度が活性の検出に影響しない範囲内に制御される。
【００８５】
データ処理及び結果についての説明：初期スクリーニングは、単一の濃度条件、例えば、２０  μｇ／ｍｌを選用してサンプルの活性に対して測定を行う。一定の条件下で活性を示し、例えば阻害率が５０％以上のサンプルに対して、活性の用量依存関係即ちＩＣ５０／ＥＣ５０値を測定する。当該ＩＣ５０／ＥＣ５０値は、サンプルの濃度に対するサンプルの活性の非線形フィッティングによって算出される。計算に使用されるソフトウェアがＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４で、フィッティングに使用されるモデルがｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｖａｒｉｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ）で、多くの阻害剤スクリーニングモデルに対して、フィット曲線の底部及び頂部を０及び１００に設定する。普通の状況下で、各サンプルのテストにおいて、複数のウェル（ｎ≧２）が設置され、結果においては標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＳＤ）または標準誤差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｒｒｏｒ，ＳＥ）で表示する。テストのいずれにおいても、既に開示された化合物ＳＡＨＡ（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）を対照とした。
【００８６】
５．実験結果
【表５−１】
2014517831.tif 000043
【表５−２】
2014517831.tif 000044
【００８７】
上記表の実験結果から次のことが教示された。すなわち、Ｒ２部の変更について、生物結果から見ると、アルキル基、オレフィン基及びアリール基置換は共に良好なＨＤＡＣ阻害活性を表し、置換基の多様化が化合物の生物活性に有利である。イソブチレン基置換の化合物ＣＦＨ３９５は、ＨＤＡＣ１に対する阻害活性に最も優れている。化合物ＣＦＨ３５５、ＣＦＨ４３７、ＣＦＨ４１７がＨＤＡＣ１（ＨＤＡＣ１／ＨＤＡＣ６＝〜３０倍）を選択的に阻害する。また、ＨＤＡＣ１及びＨＤＡＣ３に対する化合物ＣＦＨ３５５の選択性は８倍である。
【００８８】
また、生物活性が、Ｒ２部の置換基が同一で、Ｙが−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基）−である時に、鎖の長さが活性に対して大きな影響を示した。また、側鎖の長さが同じで、Ｒ２置換基が異なる場合の化合物の活性も非常に異なる。例えば、イソブチル基により置換された化合物類において、鎖長が７つのメチレン基である時にＨＤＡＣ１阻害活性が最もよいが、シクロプロピル基により置換された場合に、鎖長が６つのメチレンである時にＨＤＡＣ１阻害活性が最もよい。
【００８９】
Ｒ２基がイソブチル基により置換された場合について、発明者らは側鎖セクションＹ及び種々の異なるＺｎイオンキレート基（ＺＢＧ）を考察した。ＨＤＡＣ１に対する阻害作用、ＺＢＧがヒドロキサム酸である時に活性が最もよく、ＺＢＧがα−メルカプトケトンである時に、ＨＤＡＣ６を選択的に阻害し、特に化合物ＣＦＨ３９８−Ｓの場合である。
【００９０】
Ｒ２基がシクロプロピル基により置換された場合について、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂの置換を考察した。ＨＤＡＣに対する阻害活性について、Ｒ４ｂ及びＲ５ｂがこれらと結合するＣと６員環を形成する時、即ち化合物ＣＦＨ４２１−ＣはＨＤＡＣ１に対して最も強い阻害活性を示し、且つＨＤＡＣ１（ＨＤＡＣ１／ＨＤＡＣ６＝〜７５倍）を選択的に阻害することが分かった。
実例２：細胞レベルの抗腫瘍活性テスト実験
【００９１】
１．実験目的
本発明の化合物の抗腫瘍活性テストを行い、ヒト結腸ガンＨＣＴ−１１６細胞株に対する化合物の生長阻害活性を測定することによって化合物の体外抗腫瘍活性を評価する。
【００９２】
２．テスト原理
メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）比色法を使用し、該分析方法は３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を代謝還元することをベースとする。生細胞のミトコンドリアにはＮＡＤＰと関る脱水素酵素が存在しており、黄色のＭＴＴを不溶性の青紫色のホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に還元でき、死細胞には該酵素が消えたため、ＭＴＴが還元されない。ＤＭＳＯでＦｏｒｍａｚａｎを溶解した後マイクロプレートリーダーによって５５０／６９０ｎｍ波長の処で光密度を測定できる。
【００９３】
３．実験過程
サンプル処理：サンプルをＤＭＳＯで溶解し、低温で保管し、活性の検出に影響を与えない範囲内に、最終体系におけるＤＭＳＯの濃度を制御する。
【００９４】
ＭＴＴ法を使用して細胞の生存率を測定し、即ち対数成長期に生長している細胞を、０．０５％のトリプシンによって消化し、計数を行い、２．０×１０３／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレート内に１００ｍＬ接種し、５％ＣＯ２インキュベータ内に３７°Ｃ一晩培養する。各化合物が６つの濃度勾配を設け、各濃度について３つのウェルを設け、各濃度のものを対応するウェル内に入れ、５％  ＣＯ２の３７°Ｃインキュベータ内に７２ｈ培養し、２０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴを加える。３７℃で３ｈ経過した後、上澄み液を吸引して廃棄し、１００ｍＬのＤＭＳＯを加えて溶解し、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ３４０を使用して５５０ｎｍ（Ｌ１）の光吸収値を測定し、参照波長が６９０ｎｍ（Ｌ２）で、を阻害剤の異なる濃度における（Ｌ１−Ｌ２）値で図を作成し、数式でフィッティングすることによってＩＣ５０を得る。
【００９５】
データ処理及び結果についての説明：初期スクリーニングが単一の濃度条件下で、例えば、２０μｇ／ｍｌの濃度でサンプルの活性に対して測定を行う。一定の条件下で活性を表すサンプル、例えば阻害率が５０％以上のサンプルに対して、活性用量の依存関係即ちＩＣ５０／ＥＣ５０値を測定する。当該ＩＣ５０／ＥＣ５０値は、サンプルの濃度に対するサンプルの活性の非線形フィッティングによって算出される。計算に使用されるソフトウェアがＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４で、フィッティングに使用されるモデルがｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｖａｒｉｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ）で、多くの阻害剤スクリーニングモデルに対して、フィット曲線底部及び頂部を０及び１００に設定する。普通の状況下で、各サンプルはテスト中に複数のウェル（ｎ≧２）が設置され、結果において標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＳＤ）または標準誤差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｒｒｏｒ，ＳＥ）で表示する、毎回の測定は共にドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を参照とする。
【００９６】
４．実験結果
４．１：ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞株における化合物の活性結果
【００９７】
【表６】
2014517831.tif 000045
４．２：ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓癌細胞株における化合物の活性結果。
【００９８】
【表７】
2014517831.tif 000046
４．３：その他の腫瘍細胞株における化合物の阻害活性結果。
【００９９】
【表８】
2014517831.tif 000047
【０１００】
５．結論：ＨＤＡＣＩに対する阻害活性を有する化合物のいずれも、良好な腫瘍細胞増殖を阻害する活性を有し、特に、結腸ガン、膵臓ガン、肺腺ガン、乳腺ガン等に対して優れた効果を有する。腫瘍細胞株の生長に対する阻害活性から見て、化合物の細胞における活性がほぼ酵素における活性と一致する。
【０１０１】
実例３：多発性硬化症（ＭＳ）を治療する薬物としてのＨＤＡＣ阻害剤
１．実験方法及び結果
【０１０２】
ＨＤＡＣｉ  ＣＦＨ３６７−ＣのＥＡＥを有効に緩和できる臨床点数。本発明者は８周齢のメスＣ５７マウスに対して１００μＬフロイント完全アジュバントにより乳化されたＭＯＧ３５−５５（１５０μｇ／匹）及び熱不活性化ＭＴ毒素（５ｍｇ／ｍＬ）を皮下注射し、且つ当日及び三日目において二回でＰＴＸ（２００ｎｇ／匹／回，ＰＢＳ溶解）を腹腔内注射する。免疫した後三日目から一日二回で、胃管を用いて注入投与し、毎回の用量が１０ｍｇ／ｋｇ体重である。毎日にてマウスの表現を観察し、且つ以下の基準に基づいて点数をつけ：０点：いかなる発病の症状がない；尾部無力（０．５点）または麻痺（１点）。以上の点数を足して最終の点数を得る。結果は、ＣＦＨ３６７−ＣがＥＡＥの臨床症状に対して良好な治療作用を有し、治療群マウスの疾患の重症度が溶剤対照群より顕著に低い（Ｐ＜０．０１）ことを示した（図１）。
【０１０３】
ＨＤＡＣｉ  ＣＦＨ３６７−ＣがＥＡＥ動物脊髄の脱髄現象を顕著に軽減する。正常対照群、ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）及びＥＡＥ治療群マウスの脊髄サンプルを取り、固定した後、パラフィン包埋し、５μｍ切片し、脱蝋・水和して９５％アルコールへ、ルクソール・ファースト青染色して５６℃で一晩経過し、９５％アルコール洗浄、水洗浄し、その後０．０５％炭酸リチウム溶液で色だしを行い、さらに７０％アルコールで２回洗浄し、蒸留水で洗浄し、その後、２分間エオジン染色し、勾配エタノール脱水を行い、キシレンで透明化させ、中性ゴムで封入する。ルクソール・ファースト青染色の主な部位が脊髄の白質であり、主に神経線維及び髄鞘によって構成される。実験結果は、正常のマウスの白質は青色に染められ、構造が比較的緻密であるが、ＥＡＥマウスの脊髄の白質エリアには大量の空胞が認められ、且つ着色の程度が顕著に低下し、深刻な脱髄現象が現れることを表明した。一方、ＣＦＨ３６７−Ｃ投与されたマウスの脊髄の白質は構造が緻密で、着色が均一で、正常対照群のマウスのレベルと接近するため、その顕著な治療作用が現れた。
【０１０４】
ＨＤＡＣｉ  ＣＦＨ３６７−Ｃが  ＥＡＥ動物脊髄における末梢性免疫細胞の浸潤現象を顕著に軽減する。正常対照群、ＥＡＥマウス及びＥＡＥ治療群マウスの脊髄サンプルを取り、固定した後、パラフィン包埋し、５μｍ切片し、切片をキシレンで脱蝋し、各クラスのアルコールで再水和した後、５分間ヘマトキシリン染色し、その後水道水で洗浄し、塩酸で色だしを行い、水道水で洗浄し、さらに２分間エオジン染色し、勾配エタノール脱水を行い、キシレンで透明化させ、中性ゴムで封入シする。実験結果は、正常のマウスの脊髄には浸潤の末梢性免疫細胞がほぼないが、ＥＡＥマウスの脊髄白質エリアには大量の末梢性免疫細胞の浸潤が認められ、且つ付属組織の損傷に至り、空胞が現れたことを表明した。一方、ＣＦＨ３６７−Ｃ投与されたマウスの脊髄の白質は構造が緻密で、明らかな末梢性免疫細胞の浸潤が認められないため、その顕著な治療作用を示した。
【０１０５】
ＨＤＡＣｉ  ＣＦＨ３６７−Ｃが  ＥＡＥ動物脊髄におけるＣＤ４５陽性白血球の浸潤現象を顕著に軽減する。マウス脊髄を取り、固定した後、ＯＣＴパラフィン包埋し、１０μｍ冷凍切片を作る。切片をＰＢＳで３回、毎回５分間洗浄し、その後抗ＣＤ４５の抗体（一次抗体）を使用して４℃で一晩培養し、ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光マークを有する二次抗体を使用して３７℃で１ｈ染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、グリセリンで封入する。ＣＤ４５が白血球共通抗原であり、実験結果は、細胞核染色はＥＡＥ実験マウスの脊髄には大量の細胞凝集を有し、その大部分がＣＤ４５陽性の白血球であることを表明した。この現象は正常のマウスには存在しないが、ＣＦＨ３６７Ｃ投与されたマウスにおいてもＣＤ４５陽性白血球の凝集が確認されないため、ＣＦＨ３６７−Ｃが白血球のＥＡＥマウス脊髄に対する浸潤現象を抑制できることを表した。
【０１０６】
ＨＤＡＣｉ  ＣＦＨ３６７−Ｃが  ＥＡＥ動物脊髄におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の浸潤現象を顕著に軽減する。  前期研究はＣＤ４陽性Ｔ細胞がＥＡＥの発病に対して重要な作用を有することを表明した上で、本発明者が薬物のＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する浸潤作用についても観察した。マウス脊髄を取り、固定した後、ＯＣＴパラフィン包埋し、１０μｍ冷凍切片を作る。切片をＰＢＳで３回、毎回５分間洗浄し、その後抗ＣＤ４の抗体（一次抗体）を使用して４℃で一晩培養し、ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光マークを有する二次抗体を使用して３７℃で１ｈ染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、グリセリンで封入する。実験結果は、細胞核染色はＥＡＥ実験マウスの脊髄には大量の細胞凝集を有し、多くの部分がＣＤ４陽性のＴ細胞であることを表明した。この現象は正常のマウスには存在しないが、ＣＦＨ３６７Ｃ投与がＥＡＥマウス脊髄におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の浸潤及び凝集を顕著に減少できる。
【０１０７】
２．結論
ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬ＣＦＨ３６７−ＣがＭＳの実験マウス動物モデルＥＡＥの臨床症状を有効に緩和できる。ＥＡＥマウスの脊髄に対して染色を行う実験によって、ＣＦＨ３６７−Ｃが末梢性免疫細胞の、特にＣＤ４陽性Ｔ細胞のマウス中枢神経系に対する浸潤を抑制し、ＥＡＥ動物ニューロンの脱髄現象を軽減し、それによって、ＥＡＥの臨床表現を緩和することができることを発見した。本研究の結果は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬ＣＦＨ３６７−ＣがＭＳ疾患の治療に用いられることができ、且つさらに関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス等を含むその他の自己免疫疾患の治療に応用されることが可能であることを表した。
【図１】
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【国際調査報告】
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