(57)【要約】  本明細書には、酵素的に発生された過酸を用いる脱毛製品のための基質を送達するための組成物および方法が開示されている。より具体的には、（ａ）過酸化水素および少なくとも１つのカルボン酸エステル基質を含む第１の水性組成物（ここで、第１の水性組成物のｐＨは４．０以下である）と、（ｂ）過加水分解活性を有する酵素触媒および緩衝液を含む第２の水性成分（ここで、第２の水性組成物のｐＨは少なくとも５．０である）とを含むｐＨ安定化２成分系が提供されており、第１および第２の水性組成物は、使用されるまで分離して保持される。過加水分解酵素触媒は、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分に任意選択的なペプチドリンカーを介して結合された過加水分解酵素を含む融合タンパク質の形態であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７について、場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１】
2014505046.tif 000037
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化２】
2014505046.tif 000038
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたはそれより多いエステル、および
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質、ならびに
２）過酸化水素
の混合物を含み、そのｐＨが４．０以下である第１の水性組成物と、
ｂ）１）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒、および
２）少なくとも１つの緩衝液
を含み、そのｐＨが少なくとも５．０である第２の水性組成物と
を含むヘアケア製品であって、第１の水性組成物および第２の水性組成物が使用される前は分離されたままであり、第１の水性組成物および第２の水性組成物を組み合わせると酵素発生の過酸が産生されるヘアケア製品。
【請求項２】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、
ｃ）ペルヒドロリシス活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｄ）毛髪に対する親和性を有するペプチド成分を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質の形態である、請求項１に記載のヘアケア製品。
【請求項３】
第２の部分が少なくとも１つの毛髪結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである、請求項２に記載のヘアケア製品。
【請求項４】
少なくとも１つの毛髪結合ペプチドが５〜６０の範囲のアミノ酸長さである、請求項３に記載のヘアケア製品。
【請求項５】
ヘアケア製品が、マルチコンパートメントパケット、マルチコンパートメントボトル、少なくとも２つの個々の容器、およびこれらの組み合わせの形態である、請求項１または２に記載のヘアケア製品。
【請求項６】
第１の水性組成物および第２の水性組成物がそれぞれ、２５℃で少なくとも２８日間保存に安定である、請求項１に記載のヘアケア製品。
【請求項７】
第１の水性組成物のｐＨが１．０〜４．０の範囲である、請求項１に記載のヘアケア製品。
【請求項８】
第２の水性組成物のｐＨが５．０〜８．５の範囲である、請求項１または７に記載のヘアケア製品。
【請求項９】
少なくとも１つの緩衝液が、使用前は第２の水性反応混合物をｐＨ５．０以上に保持することができ、酢酸、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、グリシン、重炭酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載のヘアケア製品。
【請求項１０】
第２の水性反応混合物中の緩衝液の濃度が１０ｍＭ〜１Ｍである、請求項９に記載のヘアケア製品。
【請求項１１】
第１の水性組成物、第２の水性組成物、または第１および第２の水性組成物の両方が、水中油エマルションである、請求項１に記載のヘアケア製品。
【請求項１２】
さらに、美容的に許容可能なキャリア媒体を含む、請求項１または２に記載のヘアケア製品。
【請求項１３】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒が、リパーゼ、エステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、プロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるペルヒドロリシス活性を有する少なくとも１つの酵素を含む、請求項１または２に記載のヘアケア製品。
【請求項１４】
アリールエステラーゼが、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヘアケア製品。
【請求項１５】
ペルヒドロリシス活性を有する酵素が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のヘアケア製品。
【請求項１６】
炭水化物エステラーゼが、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、該シグネチャーモチーフが、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
を含む、請求項１３に記載のヘアケア製品。
【請求項１７】
融合タンパク質が、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＨＳＢＤ
または
ＨＳＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
（式中、
ＰＡＨは、ペルヒドロリシス活性を有する酵素であり、
ＨＳＢＤは、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分であり、
Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意選択的なペプチドリンカーであり、
ｙは０または１である）
を含む、請求項２に記載のヘアケア製品。
【請求項１８】
毛髪に対する親和性を有するペプチド成分が、抗体、Ｆａｂ抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、ラクダ科抗体、スカフォールドディスプレイタンパク質または免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドである、請求項１７に記載のヘアケア製品。
【請求項１９】
毛髪に対する親和性を有するペプチド成分が、ヒト毛髪に対して１０−５Ｍ以下のＫＤ値またはＭＢ５０値を含む、請求項１８に記載のヘアケア製品。
【請求項２０】
免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドが２〜５０の毛髪結合ペプチドを含み、毛髪結合ペプチドが、独立して、そして場合により、１〜１００の範囲のアミノ酸長さのポリペプチドスペーサーによって分離されていてもよい、請求項１８に記載のヘアケア製品。
【請求項２１】
毛髪結合ペプチドが正味の正電荷を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のヘアケア製品。
【請求項２２】
第１の水性組成物および第２の水性組成物を組み合わせることによって形成されて得られる反応混合物が、ペルヒドロリシス酵素により過酸の生成が触媒されるｐＨを含む、請求項１または２に記載のヘアケア製品。
【請求項２３】
過酸ベースの利益を毛髪に提供するための方法であって、
ａ）請求項１または２に記載のヘアケア製品を備え付けるステップと、
ｂ）毛髪と、第１の水性組成物および第２の水性組成物を組み合わせたときに生じる酵素発生の過酸とを接触させ、それにより毛髪が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベースの有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受けるステップと
を含む、上記方法。
【請求項２４】
非過酸ベースの有益剤が、脱毛剤、染毛剤、ヘアコンディショニング剤、およびこれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
有効量の過酸が発生し、有効量が０．００１質量％〜４質量％の範囲である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
過酸が過酢酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１の水性組成物および第２の水性組成物を、ヒト毛髪との接触よりも前に組み合わせる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
第１の水性組成物および第２の水性組成物を同時にヒト毛髪に適用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
第１の水性組成物および第２の水性組成物を順次ヒト毛髪に適用する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
第１の水性組成物をヒト毛髪に適用し、次いで第２の水性組成物をヒト毛髪に適用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第２の水性組成物をヒト毛髪に適用し、次いで第１の水性組成物をヒト毛髪に適用する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
過酸ベースの利益をヒト毛髪に提供するための、請求項１または２に記載のヘアケア製品の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書中に援用される２０１０年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２４，８４７号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヘアケア有益剤（ｂｅｎｅｆｉｔ  ａｇｅｎｔ）として少なくとも１つの酵素的に生成された過酸を含むパーソナルケア製品の分野に関する。具体的には、２成分過酸発生系を含むヘアケア製品が提供されており、ここで、第１の成分はカルボン酸エステルおよび過酸化水素の混合物を含むｐＨ４．０以下の水性組成物であり、第２の成分は、過加水分解活性を有する酵素および緩衝液を含む水性組成物であり、第２の成分のｐＨは少なくとも５．０のｐＨを有する。２つの成分は混ぜ合わせられて、過酸有益剤を発生させる。過加水分解酵素は、毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を含有するように操作された融合タンパク質の形態であり得る。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシカルボン酸（「過酸」）は有効な抗菌剤である。望ましくない微生物の増殖に対して硬い表面、食品、生きた植物組織、および医療デバイスを清浄化、消毒、および／または衛生化するための方法が記載されている（例えば、特許文献１〜５）。また過酸は、洗濯洗剤用途のための漂白組成物の調製においても有用であることが報告されている（例えば、特許文献６〜８）。
【０００４】
また過酸は、毛髪、皮膚および爪などのケラチン材料を酸化し得ることも報告されている。例えば、特許文献９には、１００℃よりも低い温度において４個以下の炭素原子を有する飽和過脂肪酸（ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｐｅｒａｌｉｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ）の水溶液を用いて、ケラチン材料のジスルフィド結合をスルフィドリルまたはスルホン酸に酸化して、酸化された材料が容易に希アルカリ中に溶解するようにする方法が記載されている。Ｌｉｌｌｉｅら（非特許文献１）は、ケラチン構造の酸化誘発性の好塩基球増加症を開示している。特許文献１０は、毛髪などのケラチン含有源から水溶性ペプチドを得るための方法を開示しており、水溶性ペプチドを形成するために水溶液中のケラチン含有材料を酸化することを含む。酸化剤は、過酢酸を含み得る。
【０００５】
過酸の使用が記載されているヘアケア組成物および方法が報告されている。特許文献１１は、過酢酸およびカタラーゼで毛髪を処理した後、プロテアーゼで毛髪を処理する方法を開示している。特許文献１２〜１５、および１６には、ペルオキシ酸酸化剤および酸化ヘアカラーリング剤を含むヘアカラーリング組成物が記載されている。特許文献１７には、ペルオキシ化合物および反応染料によるヒト毛髪の染色が記載されている。特許文献１８には、有機過酸成分と、有機界面活性剤およびＣ１０〜Ｃ２１脂肪酸アミドを含有する水性発泡性溶液とを含む毛髪処理のための組成物が記載されている。特許文献１９には、モノ過フタル酸マグネシウムを含むヒト毛髪の酸化処理のための薬剤が開示されている。
【０００６】
非特許文献２は、過酢酸、Ｎａ２Ｏ２、およびＣＡＲＯＡＴ（登録商標）またはＣｌＯ２で毛髪ケラチンを酸化した後、酸化された毛髪をアルカリで溶解させることによる脱毛方法を開示している。特許文献２０には、皮膚（子ウシ皮、ヤギ皮、ヒツジ皮）および牛革の過酸による処理（０．５〜５重量％の過酢酸、ｐＨ２〜５．５で３時間の処理）の後、中性塩または弱もしくは強アルカリ性作用塩または塩基で処理することによる脱毛方法が開示されている。
【０００７】
過加水分解活性を有する特定の変異体スブチリシンカールスバーグプロテアーゼをボディケア製品に包含させることは、特許文献２１に開示されている。特定の変異体プロテアーゼ以外の過加水分解酵素は記載されておらず、パーソナルケア有益剤としての過酸の酵素的生成を実証する実施例も存在しない。
【０００８】
特許文献２２〜２５、および２６には、消毒剤および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度でカルボン酸エステル基質をペルオキシカルボン酸に転換するための有意な過加水分解活性を特徴とする、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのメンバーとして構造的に分類される酵素（すなわち、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）が開示されている。
【０００９】
「ヘアケア製品において使用するための酵素的な過酸の発生（ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＨＡＩＲ  ＣＡＲＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）」という表題の共有される同時係属中の特許出願（代理人事件整理番号ＣＬ５１７５）には、ヘアケア製品における有益剤としての過酸の使用が開示されている。過酸ベースの有益剤は、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベースの有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせなどの利益を提供するために使用される。
【００１０】
過酸を酵素的に発生させる場合の反応成分は、通常、（ａ）過加水分解酵素と、（ｂ）適切なカルボン酸エステルと、（３）過酸素源とを必要とし、成分のうちの１つまたは複数は、使用されるまで分離して保持される。従って、反応成分が貯蔵安定性であり、しかし適切な反応条件下で混ぜ合わせられたときに有効濃度の過酸を急速に発生させることができるように、多成分発生系が必要とされる。いくつかの発生系は、酵素成分が実質的に非水性のカルボン酸エステル中で貯蔵され、そして過酸化水素を含む水性成分と混合されて過酸と発生させるように設計されている。しかしながら、いくつかのヘアケア用途および製品は、酵素触媒がカルボン酸エステル基質中ではなく水性環境中に貯蔵される発生系を必要とし得る。
【００１１】
解決すべき問題は、使用されるまで酵素および基質の両方について長期間貯蔵安定性である、脱毛用途などの特定のヘアケア用途に適した酵素発生系を提供することである。
【００１２】
過酸は強酸化剤であり、所望の利益の標的ではない材料を含む様々な材料に対して反応性であり得る。従って、特定のパーソナルケア用途は、過酸の生成を所望の標的体表面またはその付近に局在化させることによって、過酸有益剤を所望の体表面に標的化する／焦点を合わせる能力から利益を得ることができる。酵素的な過酸の生成は、ペルヒドロラーゼを体表面に標的化することによって利益を得ることができる。
【００１３】
化粧用有益剤を体表面に標的化するためにより短いバイオパニングされた（ｂｉｏｐａｎｎｅｄ）ペプチドを使用することが記載されている（特許文献２７〜〜４０、ならびに公開されたと特許文献４１、４２および４３）。過酸有益剤の生成のために活性過加水分解酵素（すなわち、「標的化ペルヒドロラーゼ」）に結合するための、毛髪に対する親和性を有するペプチド材料の使用は記載されていない。
【００１４】
従って、解決すべきさらなる問題は、標的化酵素送達系と適合性である貯蔵安定性の水性ヘアケア組成物を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３−００２６８４６Ａ１号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献９】英国公開特許明細書のＧＢ６９２，４７８（Ａ）号明細書（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｐ．ら）
【特許文献１０】米国特許第６，２７０，７９１号明細書（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅら）
【特許文献１１】中国特許出願公開第ＣＮ１０１４４０５７５Ａ号明細書（Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．）
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００２−００５３１１０Ａ１号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，０２２，３８１号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，００４，３５５号明細書
【特許文献１５】国際公開第９７／２４１０６号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第９７／２４１０８号パンフレット（Ｄｉａｓら）
【特許文献１７】米国特許第３，６７９，３４７号明細書（Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．）
【特許文献１８】英国特許のＧＢ１５６０３９９Ａ号明細書（Ｃｌａｒｋら）
【特許文献１９】独国特許出願公開第ＤＥ１９７３３８４１Ａ１号明細書（Ｔｉｌｌら）
【特許文献２０】米国特許第３，４７９，１２７号明細書（Ｈａｈｎら）
【特許文献２１】米国特許第７，５１０，８５９号明細書（Ｗｉｅｌａｎｄら）
【特許文献２２】米国特許出願公開第２００８−０１７６７８３Ａ１号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９Ａ１号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２００９−０００５５９０Ａ１号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９Ａ１号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１０−００４１７５２Ａ１号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）
【特許文献２７】米国特許第７，２２０，４０５号明細書
【特許文献２８】米国特許第７，３０９，４８２号明細書
【特許文献２９】米国特許第７，２８５，２６４号明細書
【特許文献３０】米国特許第７，８０７，１４１号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９Ａ１号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２００７−０１９６３０５Ａ１号明細書
【特許文献３３】米国特許出願公開第２００６−０１９９２０６Ａ１号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２００７−００６５３８７Ａ１号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２００８−０１０７６１４Ａ１号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２００７−０１１０６８６Ａ１号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２００６−００７３１１１Ａ１号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第２０１０−０１５８８４６号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２０１０−０１５８８４７号明細書
【特許文献４０】米国特許出願公開第２０１０−０２４７５８９号明細書
【特許文献４１】ＰＣＴ出願の国際公開第２００８／０５４７４６号パンフレット
【特許文献４２】国際公開第２００４／０４８３９９号パンフレット
【特許文献４３】国際公開第２００８／０７３３６８号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，（１９５４）９５−１０２
【非特許文献２】Ｈａｈｎ，Ｆ．ら（Ｌｅｄｅｒ（１９６７）１８（８）：１８４−１９２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
毛髪除去（脱毛剤）、毛髪の引張強さの低減、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）を増強するために使用される毛髪の前処理、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニングなどの用途において使用され得る過酸有益剤を酵素的に生成するためのヘアケア製品および使用方法が提供される。
【００１８】
ヘアケア製品は、（１）カルボン酸エステル基質および過酸化水素を含む第１の水性組成物（ここで、第１の水性組成物のｐＨは４．０以下のｐＨを有する）と、（２）過加水分解酵素および少なくとも１つの緩衝液を含む第２の水性組成物（ここで、第２の水性組成物は少なくとも５．０のｐＨを有する）とを含む２成分系で構成されており、第１の水性組成物および第２の水性組成物は使用される前は分離して保持され、第１の水性組成物および第２の水性組成物が混ぜ合わせられると、酵素的に発生された過酸が生じる。
【００１９】
一実施形態では、
ａ）１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１】
2014505046.tif 000002
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化２】
2014505046.tif 000003
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、および
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質、ならびに
２）過酸化水素
の混合物を含み、そのｐＨが４．０以下である第１の水性組成物と、
ｂ）１）過加水分解活性を有する酵素触媒、および
２）少なくとも１つの緩衝液
を含み、そのｐＨが少なくとも５．０である第２の水性組成物と
を含むヘアケア製品が提供されており、第１の水性組成物および第２の水性組成物は使用される前は分離して保持され、第１の水性組成物および第２の水性組成物が混ぜ合わせられると酵素的に発生された過酸が生じる。
【００２０】
一実施形態では、酵素触媒は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｂ）毛髪に対する親和性を有するペプチド成分を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質の形態である。
【００２１】
一実施形態では、融合タンパク質は、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＨＳＢＤ
または
ＨＳＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
を含み、式中、
ＰＡＨは、過加水分解活性を有する酵素であり、
ＨＳＢＤは、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分であり、
Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意的なペプチドリンカーであり、
ｙは０または１である。
【００２２】
過酸ベースの利益を毛髪に提供するための方法が提供されており、本方法は、
ａ）本発明のヘアケア製品の少なくとも１つを提供するステップと、
ｂ）毛髪と、第１の水性組成物および第２の水性組成物が混ぜ合わせられたときに生じる酵素的に発生された過酸とを接触させ、それにより毛髪が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベースの有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受けるステップと
を含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、過酸ベースの利益をヒト毛髪に提供するための本発明のヘアケア製品の少なくとも１つの使用も提供される。
【００２４】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）、ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則の２０８項および付録Ｃの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【００２５】
配列番号１は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００２６】
配列番号２は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号３は、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００２８】
配列番号４は、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号５は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００３０】
配列番号６は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの酸配列である。
【００３１】
配列番号７は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００３２】
配列番号８は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号９は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００３４】
配列番号１０は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１１は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００３６】
配列番号１２は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１３は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００３８】
配列番号１４は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１５は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４０】
配列番号１６は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１７は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００４２】
配列番号１８は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１９は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの核酸配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４において報告されるようなバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列は、他のセファロスポリンＣデアセチラーゼとの配列アライメントと、他のＣＡＨ酵素の観察される長さ（通常は、３１８〜３２５のアミノ酸長さ、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−００８７５２８−Ａ１号明細書を参照）に対する報告される長さ（３４０のアミノ酸）の比較とに基づいて恐らく誤りである、１５アミノ酸Ｎ−末端付加をコードすると思われることに注意すべきである。従って、本明細書で報告される核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４で報告されるＮ−末端１５アミノ酸を含まないバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼ配列をコードする。
【００４４】
配列番号２０は、配列番号１９の核酸配列によってコードされるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２１は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号２２は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２３は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
【００４８】
配列番号２４は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２５は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）をコードする核酸配列である。
【００５０】
配列番号２６は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推定アミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２７は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書（参照によってその全体が本明細書中に援用される）からのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５２】
配列番号２８は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５３】
配列番号２９は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５４】
配列番号３０は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５５】
配列番号３１は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からの「ＲＱ２（ａ）」に由来するサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５６】
配列番号３２は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からの「ＲＱ２（ｂ）」に由来するサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７８のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５７】
配列番号３３は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３４は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３５は、本明細書において「ＲＱ２（ａ）」と記載されるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２からの第１のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号３６は、本明細書において「ＲＱ２（ｂ）」と記載されるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２からの第２のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３７は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼをコードするコドン最適化核酸配列である。
【００６２】
配列番号３８は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３９は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＥＵ２５５９１０）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００６４】
配列番号４０は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＢＸ７５６３４．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号４１は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＣ＿００２６７８．２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００６６】
配列番号４２は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＢ５３１７９．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＦ０３８５４７．２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００６８】
配列番号４４は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＦ７０２０２．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４５は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｆ２４Ｉ／Ｓ３５Ｔ／Ｑ１７９Ｌ／Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ／Ｓ３０８Ｇ／Ｆ３１７Ｓ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ（ａ．ｋ．ａ．変異体「Ａ３」）をコードする核酸配列である。
【００７０】
配列番号４６は、「Ａ３」変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号４７は、Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７２】
配列番号４８は、Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４９は、Ｃ２７７Ｓ／Ｆ３１７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７４】
配列番号５０は、Ｃ２７７Ｓ／Ｆ３１７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号５１は、Ｓ３５Ｔ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７６】
配列番号５２は、Ｓ３５Ｔ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号５３は、Ｑ１７９Ｌ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
【００７８】
配列番号５４は、Ｑ１７９Ｌ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号５５は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｌ８Ｒ／Ｌ１２５Ｑ／Ｑ１７６Ｌ／Ｖ１８３Ｄ／Ｆ２４７Ｉ／Ｃ２７７Ｓ／Ｐ２９２Ｌ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｈ９をコードする核酸配列である。
【００８０】
配列番号５６は、８４３Ｈ９変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号５７は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｋ７７Ｅ／Ａ２６６Ｅ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｆ１２をコードする核酸配列である。
【００８２】
配列番号５８は、８４３Ｆ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号５９は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｆ２７Ｙ／Ｉ１４９Ｖ／Ａ２６６Ｖ／Ｃ２７７Ｓ／Ｉ２９５Ｔ／Ｎ３０２Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｃ１２をコードする核酸配列である。
【００８４】
配列番号６０は、８４３Ｃ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号６１は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｌ１９５Ｑ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４２Ｈ３をコードする核酸配列である。
【００８６】
配列番号６２は、８４２Ｈ３変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８７】
配列番号６３は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｙ１１０Ｆ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４１Ａ７をコードする核酸配列である。
【００８８】
配列番号６４は、８４１Ａ７変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００８９】
配列番号６５〜２２１、２７１、２９０、および２９１は、毛髪に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列の非限定的なリストである。
【００９０】
配列番号２１７〜２６９は、皮膚に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号２７０〜２７１は、爪に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
【００９２】
配列番号２７２−２８５は、ペプチドリンカー／スペーサーのアミノ酸配列である。
【００９３】
配列番号２８６は、融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３をコードする核酸配列である。
【００９４】
配列番号２８７は、融合構築物Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０をコードする核酸配列である。
【００９５】
配列番号２８８は、融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３のアミノ酸配列である。
【００９６】
配列番号２８９は、融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０のアミノ酸配列である。
【００９７】
配列番号２９０は、毛髪結合ドメインＨＣ２６３のアミノ酸である。
【００９８】
配列番号２９１は、毛髪結合ドメインＨＣ１０１０のアミノ酸配列である。
【００９９】
配列番号２９２は、発現プラスミドｐＬＤ００１の核酸配列である。
【０１００】
配列番号２９３は、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｓのアミノ酸配列である。
【０１０１】
配列番号２９４は、Ｄ１２８Ｇ置換をさらに含む融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ２６３（「ＣＰＡＨ−ＨＣ２６３」）のアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号２９５は、Ｄ１２８Ｇ置換をさらに含む融合ペプチドＣ２７７Ｓ−ＨＣ１０１０（「ＣＰＡＨ−ＨＣ１０１０」）のアミノ酸配列である。
【０１０３】
配列番号２９６は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｆ２６８Ｓ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ａ１０（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書、参照によって本明細書に援用される）をコードする核酸配列である。
【０１０４】
配列番号２９７は、００６Ａ１０変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１０５】
配列番号２９８は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｒ２１８Ｃ／Ｃ２７７Ｔ／Ｆ３１７Ｌ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｅ１０（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１０６】
配列番号２９９は、００６Ｅ１０変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１０７】
配列番号３００は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｈ２２７Ｌ／Ｔ２３３Ａ／Ｃ２７７Ｔ／Ａ２９０Ｖ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｅ１２（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１０８】
配列番号３０１は、００６Ｅ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１０９】
配列番号３０２は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｄ２５４Ｇ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｇ１１（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１０】
配列番号３０３は、００６Ｇ１１変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１１】
配列番号３０４は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｒ２６１Ｓ／Ｉ２６４Ｆ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｆ１２（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１２】
配列番号３０５は、００６Ｆ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１３】
配列番号３０６は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｗ２８Ｃ／Ｆ１０４Ｓ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｂ１２（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書）をコードする核酸配列である。
【０１１４】
配列番号３０７は、００６Ｂ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１５】
配列番号３０８は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ａ２６６Ｐ／Ｃ２７７Ｓ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８７４Ｂ４（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書、参照によって本明細書に援用される）をコードする核酸配列である。
【０１１６】
配列番号３０９は、８７３Ｂ４変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１７】
配列番号３１０は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｗ２８Ｃ／Ｌ３２Ｐ／Ｄ１５１Ｅ／Ｃ２７７Ｔ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ００６Ｄ１０（米国仮特許出願第６１／４２５５６１号明細書、参照によって本明細書に援用される）をコードする核酸配列である。
【０１１８】
配列番号３１１は、００６Ｄ１０変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１１９】
配列番号３１２は、毛髪結合ドメイン「ＨＣ２６３ＫｔｏＲ」のアミノ酸配列であり、１０リジン残基が１０アルギニン残基によって置置換された毛髪結合ドメイン「ＨＣ２６３」（配列番号２９０）の変異体である。
【０１２０】
配列番号３１３は、荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈ６のアミノ酸配列である。
【０１２１】
配列番号３１４は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１２２】
配列番号３１５は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号３１６は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１２４】
配列番号３１７は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１２５】
配列番号３１８は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１２６】
配列番号３１９は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１２７】
配列番号３２０は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１２８】
配列番号３２１は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１２９】
配列番号３２２は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３０】
配列番号３２３は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号３２４は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３２】
配列番号３２５は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号３２６は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０（配列番号２９１）に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３４】
配列番号３２７は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号３２８は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３６】
配列番号３２９は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号３３０は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１３８】
配列番号３３１は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号３３２は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＫｔｏＲに融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４０】
配列番号３３３は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ２６３ＦｔｏＲに融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号３３４は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０（配列番号２９１）に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４２】
配列番号３３５は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で毛髪結合ドメインＨＣ１０１０に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号３３６は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【０１４４】
配列番号３３７は、可動性リンカーを介してそのＣ−末端で荷電ペプチド（ＧＫ）５−Ｈｉｓ６に融合された、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体のアミノ酸配列である。
【０１４５】
配列番号３３８は、野生型マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼのアミノ酸配列である。
【０１４６】
配列番号３３９は、野生型シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
本開示において、いくつかの用語および略語が使用される。他に具体的に記載されない限り、以下の定義が適用される。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非限定的であることが意図される。従って、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及される規定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、使用される材料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または使用溶液を製造するために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物を製造するためまたは方法を実行するために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって、および同類のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。
【０１５１】
存在する場合、全ての範囲は包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が列挙される場合、列挙される範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈されるべきである。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「接触させる」は、所望の結果（標的表面の結合、過酸ベースの効果など）を達成するのに十分な時間、組成物を標的体表面と接触した状態に置くことを指す。一実施形態では、「接触させる」は、所望の結果を達成するのに十分な時間、有効濃度の過酸を含む（または生成することができる）組成物を標的体表面と接触した状態に置くことを指すことができる。別の実施形態では、「接触させる」は、酵素的な過加水分解のために使用される反応成分の１つまたは複数などのパーソナルケア組成物の少なくとも１つの成分を、標的体表面と接触した状態に置くことを指すこともできる。接触には、噴霧、処理、浸漬、フラッシング、注入（上または中に）、混合、混ぜ合わせ、ペインティング、コーティング、適用、付着が含まれ、あるいは、有効濃度の過酸を含む過酸溶液もしくは組成物、有効濃度の過酸を形成する溶液もしくは組成物、または有効濃度の過酸を形成する組成物の成分を体表面と連通させることも含まれる。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「基質」、「適切な基質」、および「カルボン酸エステル基質」という用語は、具体的には：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘは式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または環状５員ヘテロ芳香族もしくは６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステルもしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｂ）構造
【化３】
2014505046.tif 000004
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、あるいは
（ｃ）式
【化４】
2014505046.tif 000005
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類、あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
を交換可能に指す。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「過酸」という用語は、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸およびペルオキソ酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）と同義である。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「過酢酸」という用語は「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０の全ての他の同義語と同義である。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同義である。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセテート、グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセテート、グリセロールトリアセテート、グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセテート、およびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全ての他の同義語と同義である。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、およびグリセリルモノブチレートと同義である。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチレートおよびグリセリルジブチレートと同義である。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチレート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全ての他の同義語と同義である。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、およびグリセリルモノプロピオネートと同義である。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオネートおよびグリセリルジプロピオネートと同義である。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアセチル基を含む単糖類、二糖類および多糖類を指す。例としては、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、もしくは三重結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子により置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子により置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置である。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールおよびこれらの混合物の「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏの少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を指し、式中、ＲはＣ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分である。一実施形態では、カルボン酸エステル基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＤＧＡ）、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「プロピレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシプロパン、プロピレンジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号６２３−８４−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「エチレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシエタン、エチレンジアセテート、グリコールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号１１１−５５−７の全ての他の同義語と同義である。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「適切な酵素反応混合物」、「その場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）過酸の発生に適した成分」、「適切な反応成分」、「適切な水性反応混合物」、「反応混合物」、および「過酸発生成分」という用語は、反応物および過加水分解酵素触媒が接触される材料および水を指す。一実施形態では、過酸発生成分は、好ましくは毛髪などの体表面に対する親和性を有する結合ドメインを含む融合タンパク質の形態の、少なくとも１つのペルヒドロラーゼと、少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質と、過酸素源と、水とを含むであろう。好ましい態様では、ペルヒドロラーゼはＣＥ−７ペルヒドロラーゼであり、好ましくは、髪などの体表面に標的化された融合タンパク質の形態である。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「過加水分解」という用語は、過酸を形成するための、選択された基質と過酸化物との反応であると定義される。通常、無機過酸化物が触媒の存在下で選択された基質と反応されて、ペルオキシカルボン酸を生成する。本明細書で使用される場合、「化学的な過加水分解」という用語は、基質（ペルオキシカルボン酸前駆体）が過酸化水素源と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、ペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。本明細書で使用される場合、「酵素的な過加水分解」という用語は、カルボン酸エステル基質（過酸前駆体）が過酸化水素源および水と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、酵素触媒が過酸の形成を触媒する。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの触媒活性を指す。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度で１分あたり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量であると定義される。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態であり得る。また酵素触媒は化学修飾されていてもよい（ペグ化、あるいは架橋試薬との反応などによる）。またペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られている方法を用いて可溶性または不溶性の担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７が参照される。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、ＡＸＥ）を指す。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を指す（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（６）：２２２４−２２２９）。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）」という用語は、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）を有する、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された細菌細胞を指す。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からの有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号２として提供される（米国特許出願公開２０１０−００４１７５２号明細書を参照）。単離酵素のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＡ０１７２９．１によって提供されるセファロスポリンＣデアセチラーゼに対して１００％のアミノ酸同一性を有する（上記のＭｉｔｓｕｓｈｉｍａら）。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１、米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書を参照）。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１６として提供される。
【０１７９】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。
【０１８０】
【表１】
2014505046.tif 000006
【０１８１】
例えば、所与の部位で化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野においてよく知られている。本発明の目的のために、置換は、以下の５つの群：
１．  小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．  極性の負帯電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３．  極性の正帯電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．  大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、ならびに
５．  大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ
のうちの１つの中での交換であると定義される。
【０１８２】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、別のあまり疎水性でない残基（グリシン残基）またはより疎水性の残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負帯電残基による別の残基（アスパラギン酸によるグルタミン酸など）の置換、あるいは１つの正帯電残基による別の残基（リジンによるアルギニンなど）の置換をもたらす変化も、機能的に等価な産物を生じることが予想され得る。多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の改変をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性を変更しないと予想されるであろう。提唱される修飾のそれぞれは、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当該技術分野において十分にルーチン的な技能の範囲内である。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「シグネチャーモチーフ」および「診断モチーフ」という用語は、定義される活性を有する酵素のファミリーの間で共有される保存構造を指す。シグネチャーモチーフは、定義される基質ファミリーに対して同様の酵素活性を有する構造的に関連する酵素ファミリーを定義および／または同定するために使用することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続アミノ酸配列であっても、あるいは一緒にシグネチャーモチーフを形成する不連続の保存モチーフの集まりであってもよい。通常、保存モチーフはアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、過加水分解酵素はＣＥ−７炭水化物エステラーゼシグネチャーモチーフを含む。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５を組み込んだＦＡＳＴＡプログラムが含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた、ソフトウェア製造業者により設定された任意の値またはパラメータのセットを意味するであろう。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「体表面」という用語は、過酸有益剤などの有益剤の標的としての役割を果たすことができる人体の任意の表面を指す。典型的な体表面としては、毛髪、皮膚、爪、歯、および歯肉が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法および組成物は、ヘアケア用途および製品に関する。従って、体表面は毛髪を含む。一実施形態では、体表面はヒト毛髪である。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「パーソナルケア製品」は、毛髪、皮膚、頭皮、および歯の清浄化、漂白および／または消毒において使用される製品を意味し、シャンプー、ボディローション、シャワージェル、局所保湿剤、歯磨き粉、歯磨きジェル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、および／または他の局所クレンザーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの特定の好ましい実施形態では、これらの製品はヒトにおいて用いられるが、他の実施形態では、これらの製品の非ヒト動物による用途を見出す（例えば、獣医学用途において）。好ましい実施形態では、「パーソナルケア製品」という用語はヘアケア製品を指す。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中に存在する場合に約１ｍＭ以上の濃度の過酸化水素を提供することができる化合物を指し、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明のヘアケア組成物および方法は、具体的には、少なくとも１つのカルボン酸エステル基質および過酸化水素の混合物を含む第１の水性組成物の使用に関し、第１の水性組成物は、使用される前は、４．０以下のｐＨを有する。第２の水性組成物は、過加水分解活性を有する酵素触媒と、少なくとも１つの緩衝液とを含み、第２の水性混合物のｐＨは、少なくともｐＨ５．０である。２つの組成物は混ぜ合わせられて、所望の過酸を酵素的に発生させる。一実施形態では、反応成分を混ぜ合わせたときに提供されて得られる過酸化水素の濃度は、最初は、少なくとも０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、もしくは５００ｍＭ、またはそれ以上である。水性反応製剤中の酵素基質、例えばトリグリセリドに対する過酸化水素のモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は約０．００２〜２０でよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５でよい。
【０１８８】
本発明のヘアケア製品設計は、（１）カルボン酸エステル基質および過酸化水素を含む第１の組成物と、（２）過加水分解酵素触媒および緩衝液を含む第２の水性組成物とを含み、第１の組成物のｐＨは、第１の組成物を安定化するために貯蔵中４．０以下に保持され、第２の水性組成物のｐＨは、第２の水性組成物を安定化するために貯蔵中少なくとも５．０である。
【０１８９】
一実施形態では、酵素が水溶液（例えば、貯蔵中に酵素によって加水分解され得る有意な濃度のカルボン酸エステル基質を含有しない溶液）中で安定であるように発生系が設計されれば、過加水分解酵素は水溶液中に貯蔵され得る。過加水分解酵素は、酵素の貯蔵安定性のために所望されるｐＨを提供することができる１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、グリシン、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）を含む第２の水性組成物中に貯蔵される。好ましい態様では、緩衝液は、酵素触媒を含む第２の水性組成物に対して、５．０以上のｐＨ（貯蔵中）を提供および保持することができる。
【０１９０】
別の実施形態では、貯蔵中の酵素の安定性をさらに高めるために製剤中に酵素安定剤を添加することができる。酵素安定剤としては、ウシ血清アルブミン、多糖類、オリゴ糖、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリセロール、非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロックコポリマー、ポリアルコール、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１９１】
過加水分解活性を有する酵素
過加水分解活性を有する酵素は、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼと分類されるいくつかの酵素、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（スブチリシンカールスバーグ変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解アリールエステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、配列番号３１５［Ｌ２９Ｐ変異体］および配列番号３３９［野生型］、米国特許第７，３８４，７８７号明細書）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からの過加水分解アリールエステラーゼ（配列番号３１４［Ｓ５４Ｖ変異体］および配列番号３３８［野生型］、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書）、および過加水分解炭水化物エステラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、過加水分解酵素は、配列番号３１４として提供されるマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）Ｓ５４Ｖアリールエステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、過加水分解炭水化物エステラーゼはＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。
【０１９２】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、本明細書において報告されるような過加水分解活性を有する酵素をコードするアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０１９３】
別の実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０１９４】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０１９５】
別の実施形態では、実質的に類似の過加水分解酵素は、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる洗浄の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の最終洗浄）下で、本発明の過加水分解酵素のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列によってコードされるものを含むことができる。
【０１９６】
好ましい実施形態では、ペルヒドロラーゼは、少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を有する融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼ（融合タンパク質）が、本明細書において記載されるペルヒドロラーゼのいずれかと実質的に類似の配列を含むかどうかを決定するために使用される全てのアライメントは、体表面に対する親和性を有するペプチド成分を持たない過加水分解酵素のアミノ酸配列に基づく。
【０１９７】
ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ
好ましい実施形態では、本発明のヘアケア組成物および方法は、構造的に酵素の炭水化物ファミリーエステラーゼファミリー７（ＣＥ−７ファミリー）のメンバーであると分類される過加水分解活性を有する酵素を含む（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ｉｎ「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ａｎｄ  Ｂ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｄｓ．，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．３−１２を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーは、過酸素源と混ぜ合わせられたときに様々なカルボン酸エステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するために特に有効であることが実証されている（国際公開第２００７／０７０６０９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書、同第２００８−１７６７８３号明細書、同第２００９−０００５５９０号明細書、同第２０１０−００４１７５２号明細書、および同第２０１０−００８７５２９号明細書、ならびに米国特許出願第１２／５７１７０２号明細書および米国仮特許出願第６１／３１８０１６号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）、それぞれ参照によって本明細書中に援用される）。
【０１９８】
ＣＥ−７ファミリーのメンバーには、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が含まれる。ＣＥ−７エステラーゼファミリーのメンバーは、保存されたシグネチャーモチーフを共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３））。ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むペルヒドロラーゼ（「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」）および／または実質的に類似の構造は、本明細書に記載される組成物および方法において使用するのに適している。実質的に類似の生物分子を同定するための手段は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、配列アライメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、および／または保存シグネチャーモチーフの存在）。１つの態様では、ペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、本明細書において提供される配列の１つに対する少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４２％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素が含まれる。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「酵素は構造的にＣＥ−７酵素と分類される」、「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」または「構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７酵素と分類される」という語句は、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類される過加水分解活性を有する酵素を指すために使用されるであろう。この酵素ファミリーは、シグネチャーモチーフの存在によって定義することができる（上記のＶｉｎｃｅｎｔら）。ＣＥ−７エステラーゼのためのシグネチャーモチーフは、３つの保存モチーフ：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０と、
ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３と、
ｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９と
を含む（残基位置の番号付けは、参照配列の配列番号２（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ）に対する）。
【０２００】
通常、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒トライアドに属する３つのアミノ酸残基のうちの２つは太字である。一実施形態では、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびスレオニンからなる群から選択される。
【０２０１】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存モチーフのさらなる分析は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼをさらに定義するために使用され得る付加的な保存モチーフ（配列番号２のアミノ酸位置２６７〜２６９のＬＸＤ）の存在を示す。さらなる実施形態では、上記で定義されたシグネチャーモチーフは、
Ｌｅｕ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９
と定義される付加的な（第４の）保存モチーフを含むことができる。
【０２０２】
アミノ酸残基位置２６８のＸａａは、通常、イソロイシン、バリン、またはメチオニンである。第４のモチーフは、触媒トライアド（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）に属するアスパラギン酸残基（太字）を含む。
【０２０３】
ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を有する融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼ（融合タンパク質）がＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むかどうかを決定するために使用される全てのアライメントは、体表面に対する親和性を有するペプチド成分を持たない過加水分解酵素のアミノ酸配列に基づくであろう。
【０２０４】
いくつかのよく知られているグローバルアライメントアルゴリズム（すなわち、配列分析ソフトウェア）を用いて、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を表す２つ以上のアミノ酸配列をアラインさせ、酵素が本発明のシグネチャーモチーフで構成されているかどうかを決定することができる。アラインされた配列は参照配列（配列番号２）と比較され、シグネチャーモチーフの存在が決定される。一実施形態では、参照アミノ酸配列（本明細書で使用される場合、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのペルヒドロラーゼ配列（配列番号２））を用いるＣＬＵＳＴＡＬアライメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷなど）を使用して、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定する。保存アミノ酸残基の相対的な番号付けは、アラインされた配列内の小さい挿入または欠失（例えば、通常は５アミノ酸以下）を考慮に入れるために、参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基づく。
【０２０５】
本発明のシグネチャーモチーフを含む配列を同定する（参照配列と比較したときに）ために使用され得る他の適切なアルゴリズムの例としては、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３（１９７０）、グローバルアライメントツール）、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１）、ローカルアライメントツール）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントは、デフォルトパラメータを用いて実行される。適切なデフォルトパラメータの例としては、ＧＡＰオープンペナルティ＝１０およびＧＡＰ伸長ペナルティー＝０．５と共にＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用が挙げられる。
【０２０６】
ペルヒドロラーゼ間での全体的な同一性パーセントの比較により、配列番号２に対してわずかほぼ３０％のアミノ酸同一性を有する酵素（シグネチャーモチーフを保持しながら）が有意なペルヒドロラーゼ活性を示し、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類されることが示される。一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、配列番号２に対する少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素が含まれる。
【０２０７】
過加水分解活性を有する適切なＣＥ−７炭水化物エステラーゼの例としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１などのアミノ酸配列を有する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、酵素は、１４、１６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ（配列番号１６）に由来する。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「ＣＥ−７変異体」、「変異体ペルヒドロラーゼ」または「変異体」という用語は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび関連の過加水分解活性が保持される限り、変異体が由来する対応する酵素（通常、野生型酵素）と比較したときに少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換をもたらす遺伝子改変を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼを指すであろう。ＣＥ−７変異体ペルヒドロラーゼも本発明の組成物および方法において使用することができる。ＣＥ−７変異体の例は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１として提供される。一実施形態では、変異体は、配列番号２７、２８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、および６４を含み得る。
【０２０９】
当業者は、本発明の組成物および方法において、実質的に類似のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ配列（シグネチャーモチーフを保持する）が使用され得ることを認識する。一実施形態では、実質的に類似の配列は、高ストリンジェント条件下で、本明細書において例示される配列に関連する核酸分子とハイブリッド形成するその能力によって定義される。別の実施形態では、配列アライメントアルゴリズムを用い、本明細書において提供されるＤＮＡまたはアミノ酸配列に対する同一性パーセントに基づいて、実質的に類似の酵素を定義することができる。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で第１の分子の一本鎖が他の分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）において例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した分子（遠縁の生物からの相同配列など）から、高度に類似した分子（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、通常、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間の洗浄から始まり、次に、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、そして次に、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましい条件セットはより高温を用い、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける最後の２回の３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。別の好ましい高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件セットは０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃であり、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより洗浄された後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の最終洗浄が行われる。
【０２１１】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）。１つの態様では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）、「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、ならびに「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）において記載される方法を含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．７．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）：２７６−２７７（２０００））を用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３など）（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）、およびＣｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３））Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介してＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）を、デフォルトパラメータと共に用いて実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントのための適切なパラメータには、ＧＡＰ  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、���ｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントがデフォルト設定と共に使用されるが、遅いアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）を用いるパラメータを修正して、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５も使用することができる。
【０２１３】
１つの態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、ただし、ポリペプチドはＣＥ−７シグネチャーモチーフを保持することを条件とする。適切な核酸分子は上記の相同性を有するだけでなく、通常、約２１０〜３４０のアミノ酸長さ、約３００〜約３４０のアミノ酸長さ、好ましくは約３１０〜約３３０のアミノ酸長さ、最も好ましくは約３１８〜約３２５のアミノ酸長さを有するポリペプチドもコードし、各ポリペプチドは、過加水分解活性を有すると特徴付けられる。
【０２１４】
標的化ペルヒドロラーゼ
本明細書で使用される場合、「標的化ペルヒドロラーゼ」および「過加水分解活性を有する標的化酵素」という用語は、標的表面、好ましくは標的化体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分に融合／結合された少なくとも１つの過加水分解酵素（野生型またはその変異体）を含む融合タンパク質を指すであろう。標的化ペルヒドロラーゼ内の過加水分解酵素は任意の過加水分解酵素でよく、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、配列番号３１５［Ｌ２９Ｐ変異体］および配列番号３３９［野生型］）、過加水分解アリールエステラーゼ（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号３１４［Ｓ５４Ｖ変異体］および３３８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、「毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つの結合ドメイン」、「体表面に対する親和性を有するペプチド成分」、「毛髪に対する親和性を有するペプチド成分」、および「ＨＳＢＤ」という用語は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の少なくとも１つのポリマーを含む、過加水分解酵素の一部ではない融合タンパク質のペプチド成分を指し、この成分は、毛髪、好ましくはヒト毛髪に対する親和性を有するであろう。
【０２１６】
一実施形態では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、抗体、Ｆａｂ抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、ラクダ科抗体（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）７４：２７７−３０２）、非抗体スキャフォールドディスプレイタンパク質（種々のスキャフォールド補助によるアプローチの概説については、Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．（２００６）１５（１）：１４−２７およびＢｉｎｚ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３、１２５７−１２６８）、または免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドであり得る。別の態様では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチド（すなわち、毛髪に対する親和性を有する体表面結合ペプチドまたは少なくとも１つの体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメイン）である。好ましい実施形態では、ペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた毛髪に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
【０２１７】
毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は、任意的なペプチドリンカーによって過加水分解酵素から分離され得る。特定のペプチドリンカー／スペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
【０２１８】
一実施形態では、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は１つまたは複数の毛髪結合ペプチドを含むことができ、それぞれは、場合によりそして独立して、１〜１００のアミノ酸長さのペプチドスペーサーによって分離される。毛髪結合ペプチドおよび／または毛髪結合ペプチドを含む毛髪結合ドメインの例としては、配列番号６５〜２２１、２７１、２９０、２９１、３１２、および３１３を挙げることができるが、これらに限定されない。ペプチドリンカー／スペーサーの例としては、配列番号２７２〜２８５を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２１９】
１つの体表面に対する親和性を有することが既に確認されたペプチドは、毛髪に対しても親和性を有し得る。従って、融合ペプチドは、皮膚（配列番号２１７〜２６９）または爪（配列番号２７０〜２７１）などの別の体表面に対する親和性を有することが既に報告されている少なくとも１つのペプチドを含むことができる。別の実施形態では、融合ペプチドは、標的体表面に対する静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
【０２２０】
一実施形態では、標的化過加水分解酵素の例は、配列番号２８８、２８９、２９４、２９５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、および３３７の１つまたは複数を含むことができる。好ましい実施形態では、標的化過加水分解酵素の例は、配列番号２８８、２８９、２９４、２９５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、および３２９の１つまたは複数を含むことができる。
【０２２１】
標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ
好ましい実施形態では、「標的化ペルヒドロラーゼ」は、過加水分解活性を有する標的化ＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。本明細書で使用される場合、「標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」および「標的化ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ」という用語は、標的表面、好ましくは毛髪に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分に融合／結合された少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（野生型または変異体ペルヒドロラーゼ）を含む融合タンパク質を指すであろう。体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、上記で記載されたもののいずれであってもよい。好ましい態様では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ中のペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチド（すなわち、毛髪に対する親和性を有する体表面結合ペプチドまたは少なくとも１つの体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメイン）である。好ましい実施形態では、ペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた毛髪に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
【０２２２】
毛髪／毛髪表面に対する親和性を有するペプチド成分は、任意的なペプチドリンカーによってＣＥ−７ペルヒドロラーゼから分離され得る。特定のペプチドリンカー／スペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
【０２２３】
従って標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例としては、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分に結合された配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼの例としては、毛髪に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドに（場合により、ペプチドスペーサーを介して）結合された配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２２４】
融合ペプチドは、皮膚（配列番号２１７〜２６９）または爪（配列番号２７０〜２７１）などの別の体表面に対する親和性を有することが既に報告されている少なくとも１つのペプチドを含むことができる。一実施形態では、ＣＥ−７融合ペプチドは、配列番号６５−２２１、２７１、２９０、および２９１を含む群からの少なくとも１つの毛髪結合ペプチドを含む。別の実施形態では、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合ペプチドは、標的体表面に対する静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
【０２２５】
別の実施形態では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例としては、配列番号２８８、２８９、２９４、２９５、３１７、３１９、および３２１を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２２６】
体表面に対する親和性を有するペプチド
少なくとも１つの体表面に結合することができる免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチドは「体表面結合ペプチド」（ＢＳＢＰ）と呼ばれ、例えば、毛髪、皮膚、または爪に結合するペプチドを含むことができる。少なくともヒト毛髪に結合することが確認されたペプチドは、「毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）」とも呼ばれる。少なくともヒト皮膚に結合することが確認されたペプチドは、「皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）」とも呼ばれる。少なくともヒト爪に結合することが確認されたペプチドは、「爪結合ペプチド（ＮＢＰ）」とも呼ばれる。短い単鎖体表面結合ペプチドは実験的に生成されてもよいし（例えば、負帯電表面に標的化された正帯電ポリペプチド）、あるいは標的体表面に対するバイオパニングを用いて生成されてもよい。
【０２２７】
種々の体表面に対して強い親和性を有する短いペプチドが報告されている（米国特許第７，２２０，４０５号明細書、同第７，３０９，４８２号明細書、同第７，２８５，２６４号明細書、および同第７，８０７，１４１号明細書、米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９号明細書、同第２００７−０１９６３０５号明細書、同第２００６−０１９９２０６号明細書、同第２００７−００６５３８７号明細書、同第２００８−０１０７６１４号明細書、同第２００７−０１１０６８６号明細書、同第２００６−００７３１１１号明細書、同第２０１０−０１５８８４６号明細書、および同第２０１０−０１５８８４７号明細書、ならびに公開されたＰＣＴ出願の国際公開第２００８／０５４７４６号パンフレット、国際公開第２００４／０４８３９９号パンフレット、および国際公開第２００８／０７３３６８号パンフレット）。体表面結合ペプチドは、有益剤を標的体表面に結合することができるペプチドベースの試薬を構築するために使用されている。しかしながら、これらのペプチドを使用して、過酸有益剤の生成のために活性ペルヒドロラーゼを標的体表面に結合させる（すなわち、「標的化ペルヒドロラーゼ」）ことは記載されていない。
【０２２８】
少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する体表面結合ペプチドの非限定的なリストは本明細書において提供されており、毛髪に対する親和性を有するもの（配列番号６５〜２２１、２７１、２９０、および２９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する毛髪結合ペプチド）、皮膚に対する親和性を有するもの（皮膚結合ペプチドは配列番号２１７〜２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）、および爪に対する親和性を有するもの（爪結合ペプチドは配列番号２７０〜２７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）が含まれる。いくつかの実施形態では、体表面結合ドメインは、約６０までのアミノ酸長さである体表面結合ペプチドで構成される。一実施形態では、体表面結合ペプチドは、５〜６０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、体表面結合ペプチドは、７〜５０のアミノ酸長さ、または７〜３０のアミノ酸長さである。さらに他の実施形態では、７〜２７のアミノ酸長さである体表面結合ペプチドである。
【０２２９】
単一の毛髪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、爪結合ペプチドを含む体表面結合ペプチドを含む融合ペプチドは本発明の特定の実施形態であるが、本発明の他の実施形態では、複数の体表面結合ペプチドを使用することが有利であり得る。複数、すなわち２つ以上の体表面結合ペプチドを包含すると、例えば、単一の体表面結合を含む結合要素よりもさらにより耐久性であるペプチド成分を提供することができる。いくつかの実施形態では、体表面結合ドメインは、２〜約５０または２〜約２５の体表面結合ペプチドを含む。他の実施形態は、２〜約１０または２〜５の体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメインを含む。
【０２３０】
複数の結合要素（すなわち、体表面結合ペプチドまたは体表面結合ドメイン）は、直接結合されていてもよいし、あるいはペプチドスペーサーを用いて結合されていてもよい。特定のペプチドスペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
【０２３１】
体表面結合ドメイン、およびこれらを構成するより短い体表面結合ペプチドは、例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびこれらの組み合わせなどの任意の既知のバイオパニング技術を含む、当業者に既知のいくつもの方法を用いて同定することができる。通常、ランダムまたは実質的にランダムな（バイアスが存在する場合）ペプチドライブラリーが標的体表面に対してバイオパニングされ、標的体表面に対する親和性を有するライブラリー内のペプチドが同定される。
【０２３２】
ペプチドのランダムライブラリーの生成は周知であり、細菌ディスプレイ（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（７）：４５２０−４５２４（１９８１）、およびＨｅｌｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０（１）：３１−３５，（１９８３））、酵母ディスプレイ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８（２１）：９５７８−８２（１９９１））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、およびファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）、リボソームディスプレイ（米国特許第５，６４３，７６８号明細書、米国特許第５，６５８，７５４号明細書、および米国特許第７，０７４，５５７号明細書）、およびｍＲＮＡディスプレイ技術（ＰＲＯＦＵＳＩＯＮ（商標）、米国特許第６，２５８，５５８号明細書、同第６，５１８，０１８号明細書、同第６，２８１，３４４号明細書、同第６，２１４，５５３号明細書、同第６，２６１，８０４号明細書、同第６，２０７，４４６号明細書、同第６，８４６，６５５号明細書、同第６，３１２，９２７号明細書、同第６，６０２，６８５号明細書、同第６，４１６，９５０号明細書、同第６，４２９，３００号明細書、同第７，０７８，１９７号明細書、および同第６，４３６，６６５号明細書を参照）を含む様々な技術によって達成することができる。
【０２３３】
結合親和性
体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、ヒト毛髪、皮膚、または爪に対する結合親和性、あるいは１０−５モル濃度（Ｍ）以下の結合親和性を含む。特定の実施形態では、ペプチド成分は、１０−５モル濃度（Ｍ）以下のヒト毛髪、皮膚、または爪に対する結合親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドおよび／または結合ドメインである。いくつかの実施形態では、結合ペプチドまたはドメインは、少なくとも約５０〜５００ｍＭの塩の存在下で１０−５Ｍ以下の結合親和性値を有するであろう。「結合親和性」という用語は、結合ペプチドと、そのそれぞれの基質、この場合はヒト毛髪、皮膚、または爪との相互作用の強度を指す。結合親和性は、結合ペプチドの解離定数（「ＫＤ」）、または「ＭＢ５０」に関して定義または判断することができる。
【０２３４】
「ＫＤ」は、標的上の結合部位の半分が占有される、すなわち、ペプチド結合を有する標的（結合標的材料）の濃度がペプチド結合を有さない標的の濃度と等しい場合のペプチドの濃度に相当する。解離定数が小さいほど、ペプチドはより堅く結合される。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）の解離定数を有するペプチドは、マイクロモル濃度（μＭ）の解離定数を有するペプチドよりも堅く結合する。本発明の特定の実施形態は１０−５以下のＫＤ値を有するであろう。
【０２３５】
「ＭＢ５０」は、ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイにおいて得られる最大シグナルの５０％であるシグナルを与える結合ペプチドの濃度を指す。例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２２６８３号明細書の実施例３を参照されたい。ＭＢ５０は、複合体の成分の結合相互作用または親和性の強度の表示を提供する。ＭＢ５０の値が低いほど、ペプチドとその対応する基質との相互作用はより強い、すなわち「より良い」。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）のＭＢ５０を有するペプチドは、マイクロモル濃度（μＭ）のＭＢ５０を有するペプチドよりも堅く結合する。本発明の特定の実施形態は、１０−５Ｍ以下のＭＢ５０値を有するであろう。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、ＫＤまたはＭＢ５０値により測定される場合に、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下、または約１０−１０Ｍ以下の結合親和性を有することができる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、体表面結合ペプチドおよび／または体表面結合ドメインは、ＫＤまたはＭＢ５０値により測定される場合に、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下の結合親和性を有することができる。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、「強い親和性」という用語は、約１０−５Ｍ以下、好ましくは約１０−６Ｍ以下、より好ましくは約１０−７Ｍ以下、より好ましくは約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、または最も好ましくは約１０−１０Ｍ以下のＫＤまたはＭＢ５０値を有する結合親和性を指すであろう。
【０２３９】
多成分ペルオキシカルボン酸発生系
複数の活性成分を分離および結合するための系および手段の設計は、通常、個々の反応成分の物理的な形態に依存し得る。例えば、複数の活性流体（液体−液体）系は、通常、反応性流体を混合したときに所望の漂白剤が生成されるいくつかの漂白用途において見出されるような、マルチチャンバディスペンサーボトルまたは２相系を使用する（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第５，６２４，６３４号明細書、米国特許第６，３９１，８４０号明細書、欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書、およびＰＣＴ公報の国際公開第００／６１７１３号パンフレット）。ペルオキシカルボン酸を発生させるために使用される多成分系の他の形態には、粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、多数のコンパートメントを有する水溶性パケット（例えば、米国特許第６，９９５，１２５号明細書）および水が添加されると反応する固体凝集体（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。個々の成分は、取扱いが安全であり、長期間安定でなければならない（すなわち、混合時に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度によって評価される）。一実施形態では、多成分酵素的ペルオキシカルボン酸発生系の貯蔵安定性は、酵素触媒の安定性に関して評価され得る。別の実施形態では、多成分系の貯蔵安定性は、酵素触媒安定性および基質（例えば、カルボン酸エステル）安定性の両方に関して評価される。
【０２４０】
所望のペルオキシカルボン酸濃度を有する水性過酸溶液を急速に生成するために酵素触媒を使用する多成分ペルオキシカルボン酸発生製剤を含むパーソナルケア製品が本明細書において提供される。混合は使用の直前に、そして／あるいは適用部位において（その場で）起こり得る。一実施形態では、パーソナルケア製品製剤は、使用されるまで分離して保持される少なくとも２つの成分で構成され得る。成分の混合は、水性過酸溶液を急速に形成する。各成分は、得られる水性過酸溶液が、意図される最終用途（例えば、過酸に基づいた脱毛、過酸に基づいた毛髪引張強さの低下、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）と共に使用するための過酸で増強される毛髪除去、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、スキンホワイトニング、皮膚漂白、スキンコンディショニング、皮膚のしわの出現の低減、皮膚の若返り、真皮の接着の低減、体臭の低減もしくは除去、爪の漂白、または爪の消毒）に適した効果的な過酸濃度を含むように設計される。個々の成分の組成は、（１）長期の貯蔵安定性を提供するように、そして／あるいは（２）ペルオキシカルボン酸で構成される適切な水性反応製剤の形成を高める能力を提供するように設計されなければならない。
【０２４１】
多成分製剤は、少なくとも２つの実質的に液体の成分で構成されている。一実施形態では、多成分製剤は、第１の液体成分および第２の液体成分を含む２成分製剤であり得る。「第１」または「第２」の液体成分という用語の使用は相対的であるが、ただし、特定の材料を含む２つの異なる液体成分は使用されるまで分離して保持されるものとする。最低でも、多成分ペルオキシカルボン酸製剤は、（１）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素触媒と、（２）カルボン酸エステル基質と、（３）過酸素源（例えば過酸化水素）および水とを含み、成分が混ぜ合わせられたときに製剤は所望の過酸を酵素的に生成する。酵素的な過酸発生系の性能および／または触媒安定性を改善するための種々の方法が開示されている。米国特許出願公開第２０１０−００４８４４８号明細書、同第２０１０−００８６５３４号明細書、および同第２０１０−００８６５３５号明細書。
【０２４２】
２成分製剤において使用される種々の原料のタイプおよび量は、（１）酵素触媒の過加水分解活性、および各基質の安定性／反応性を含む各成分の貯蔵安定性と、（２）溶解度および／または所望の水性ペルオキシカルボン酸溶液を効果的に形成する能力を増強する物理特性（例えば、基質および酵素触媒の活性を増強する条件、水性反応混合物中のエステル基質の溶解度を増強する原料、および／または液体成分［すなわち、酵素的な過加水分解活性に著しい悪影響を与えない少なくとも１つの共溶媒］の少なくとも１つの粘度および／濃度を変更する原料）とを提供するように慎重に選択され、バランスがとられるべきである。
【０２４３】
本発明のヘアケア組成物および方法は共溶媒を使用してもよい。一実施形態では、カルボン酸エステル基質を含む成分は、約２未満のｌｏｇ  Ｐ値を有する有機溶媒を含む。ここで、ｌｏｇ  Ｐは、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水で表される、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義される。酵素活性に著しい悪影響を与えない、２以下のｌｏｇ  Ｐ値を有するいくつかの共溶媒が記載されている。別の実施形態では、共溶媒は、カルボン酸エステル基質を含む反応成分内の約２０重量％〜約７０重量％である。
【０２４４】
過加水分解活性を有する酵素触媒を含む成分と混合される前に反応成分が４．０以下のｐＨを有する限り、カルボン酸エステル基質および過酸化水素を含む成分は、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、グリシン、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）を含むことができる。ｐＨを４．０よりも低く保持すると、エステルの有意な化学的過加水分解および加水分解からカルボン酸エステルおよび過酸化水素の混合物が安定化される。
【０２４５】
酵素を含む水性成分がカルボン酸エステルおよび過酸化水素の混合物を含む成分と混合される前に５．０以上のｐＨを有する限り、酵素を含む水性成分は、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、グリシン、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）を含む。
【０２４６】
本発明のヘアケア製品は、使用されるまで分離して保持される２つの水性組成物を含む。第１の組成物は、
１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する前記エステル、
ｉｉ）構造
【化５】
2014505046.tif 000007
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化６】
2014505046.tif 000008
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、および
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類、
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
２）過酸化水素と
の混合物を含む水性組成物であり、第１の水性組成物のｐＨは４．０以下である。
【０２４７】
第２の水性組成物は、
１）過加水分解活性を有する酵素触媒と、
２）少なくとも１つの緩衝液と
を含み、第２の水性組成物のｐＨは少なくとも５．０である。
【０２４８】
第１および第２の組成物は使用される前は分離して保持され、組成物を混ぜ合わせると、酵素的に発生された過酸が生じる。
【０２４９】
水性組成物中に取り込まれる緩衝液のタイプおよび量は、第１の水性組成物のｐＨ（使用前）が４以下のｐＨに保持され、第２の水性組成物のｐＨ値が使用前（すなわち、貯蔵中）は少なくとも５．０であるように選択される。反応成分は、第１の水性組成物および第２の水性組成物を混ぜ合わせたときに得られる反応混合物が、酵素触媒が過加水分解活性を有することにより少なくとも１つの過酸が生成されるｐＨを含むように選択される。
【０２５０】
本明細書において記載される２つの組成物における成分の配置は、酵素触媒（反応を開始させたときに観察される酵素活性により評価）および基質（カルボン酸エステルおよび過酸素源は貯蔵中にあまり分解しない）の両方について貯蔵安定性を示す。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、「実質的に安定」または「安定」または「貯蔵安定」は、問題の成分の貯蔵安定性が活性（酵素触媒活性など）を保持すること、あるいは貯蔵中（すなわち、使用前）に組成が著しく変化しない（例えば、貯蔵中に基質濃度が実質的に変化しない）ことを意味する。一実施形態では、貯蔵条件は２５℃で少なくとも１４日間の組成物の貯蔵（非反応性材料で作られた閉鎖容器中）を含み、ここで、組成物を作る際に得られる活性／濃度に関して、最初の活性（例えば、酵素触媒活性）および最初の基質濃度（例えば、カルボン酸エステル基質）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは約１００％が保持される。触媒安定性および基質安定性を測定するための手段は本明細書において記載されている。
【０２５２】
カルボン酸エステルおよび過酸化水素から酵素触媒により過酸を調製するための適切な反応条件
過加水分解活性を有する１つまたは複数の酵素は、本発明のパーソナルケア組成物および方法において有効濃度の所望の過酸を発生させるために使用され得る。所望のペルオキシカルボン酸は、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下でカルボン酸エステルを過酸化水素と反応させることによって調製することができる。
【０２５３】
標的化ペルヒドロラーゼ内の過加水分解酵素は任意の過加水分解酵素でよく、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、配列番号３１５［Ｌ２９Ｐ変異体］および配列番号３３９［野生型］）、過加水分解アリールエステラーゼ（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号３１４［Ｓ５４Ｖ変異体］および３３８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、過加水分解酵素触媒は、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアリールエステラーゼを含む。
【０２５４】
一実施形態では、酵素触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を含み、前記酵素は、構造的にいくつかのＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー（ＣＥ−７、上記のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．を参照）に分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にセファロスポリンＣデアセチラーゼに分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にアセチルキシランエステラーゼに分類される。
【０２５５】
一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、過加水分解活性と、
ａ）配列番号２のアミノ酸残基１１８〜１２０とアラインするＲＧＱモチーフ、
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１７９〜１８３とアラインするＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２９８〜２９９とアラインするＨＥモチーフ
を含むＣＥ−７シグネチャーモチーフとを有する酵素を含む。
【０２５６】
好ましい実施形態では、参照配列番号２に対するアライメントはＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて実施される。
【０２５７】
さらなる実施形態では、ＣＥ−７シグネチャーモチーフはさらに、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２にアラインされたときに、アミノ酸残基２６７〜２６９においてＬＸＤモチーフと定義される付加的な（すなわち、第４の）モチーフを含むことができる。
【０２５８】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含み、前記酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８および３３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０２５９】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含み、前記酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、および３１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、シグネチャーモチーフが保存され、ペルヒドロラーゼ活性が保持される限り、前記酵素は１つまたは複数の付加、欠失、または置換を有していてもよい。
【０２６０】
上記のように、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、ペルヒドロラーゼが所望の体表面に「標的化される」ように、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼを含む第１の部分と、標的体表面に対する親和性を有するペプチド成分を含む第２の部分とを有する融合タンパク質であり得る。一実施形態では、任意のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（ＣＥ−７シグネチャーモチーフの存在によって定義される）は、酵素を体表面に標的化することができる任意のペプチド成分／結合要素に融合され得る。１つの態様では、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は、抗体、抗体断片（Ｆａｂ）、ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖ、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合物）、単一ドメインラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体、スキャフォールドディスプレイタンパク質、および免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖親和性ペプチドを含むことができる。抗体、抗体断片および他の免疫グロブリン由来の結合要素、ならびに大型スキャフォールドディスプレイタンパク質を含む組成物は、多くの場合、経済的に実行可能ではない。従って、好ましい態様では、ペプチド成分／結合要素は、免疫グロブリンの折り畳みおよび／または免疫グロブリンドメインを欠いた単鎖親和性ペプチドである。短い単鎖体表面結合ペプチドは実験的に生成されてもよいし（例えば、負帯電表面に標的化された正帯電ポリペプチド）、あるいは標的体表面に対するバイオパニングを用いて生成されてもよい。いくつものディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡディスプレイ）を用いて親和性ペプチドを同定する／得るための方法は、当該技術分野においてよく知られている。個々の毛髪結合ペプチドは、より大きい結合「ドメイン」（本明細書では、結合「ハンド」とも呼ばれる）を形成して過加水分解酵素の毛髪への付着／局在化を高めるために、任意的なスペーサー／リンカーを介して結合されてもよい。
【０２６１】
融合タンパク質は、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ酵素と毛髪結合ドメインとを分離し、そして／あるいは異なる毛髪結合ペプチド間を分離する（例えば、より大きい標的毛髪結合ドメインを形成するために複数の毛髪結合ペプチドが結合されている場合）、１つまたは複数のペプチドリンカー／スペーサーを含むこともできる。例示的なペプチドスペーサーの非限定的なリストは、配列番号２９０、２９１、３１２、および３１３のアミノ酸配列によって提供される。
【０２６２】
毛髪に対する親和性を有する適切なペプチドは、本明細書において上記で記載されている。上記の「ディスプレイ」技術のいずれかを用いて追加の毛髪結合ペプチドを同定するための方法はよく知られており、追加の毛髪結合ペプチドを同定するために使用することができる。
【０２６３】
適切なカルボン酸エステル基質は、以下の式を有するエステルを含むことができる：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｂ）構造
【化７】
2014505046.tif 000009
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、あるいは
（ｃ）式
【化８】
2014505046.tif 000010
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類、あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ。
【０２６４】
適切な基質は、アシル化単糖類、二糖類、および多糖類からなる群から選択される１つまたは複数のアシル化糖類を含むこともできる。別の実施形態では、アシル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース（キシローステトラアセテートなど）、アセチル化グルコース（α−Ｄ−グルコースペンタアセテート、β−Ｄ−グルコースペンタアセテート、１−チオ−β−Ｄ−グルコース−２，３，４，６−テトラアセテートなど）、β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，４−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、β−Ｄ−キシロフラノーステトラアセテート、α−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテート、β−Ｄ−グルコピラノース−１，２，３，４−テトラアセテート、β−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４、６−テトラアセテート、２−アセトアミド−２−デオキシ−１，３，４，６−テトルアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、２−アセトアミド−２−デオキシ−３，４，６−トリアセチル−１−クロリド−α−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−マンノピラノースペンタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、スクロースオクタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。
【０２６５】
別の実施形態では、付加的な適切な基質は、５−アセトキシメチル−２−フルアルデヒド、３，４−ジアセトキシ−１−ブテン、４−アセトキシ安息香酸（ａｃｅｔｏｘｙｂｅｎｅｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、酢酸バニリン、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、および２−アセチルクエン酸トリエチルも含むことができる。
【０２６６】
別の実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、これらの混合物からなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、１つまたは複数のエステル基を含むＣ１〜Ｃ６ポリオールである。好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ６ポリオールのヒドロキシル基の１つまたは複数は、１つまたは複数のアセトキシ基によって置換されている（１，３−プロパンジオールジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、１，４−ブタンジオールジアセテート、１，５−ペンタンジオールジアセテートなど）。さらなる実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＧＤＡ）、またはこれらの混合物である。
【０２６７】
さらなる実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、およびトリブチリンからなる群から選択される。さらに別の態様では、基質は、ジアセチンおよびトリアセチンからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、適切な基質はトリアセチンを含む。
【０２６８】
好ましい実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの組み合わせ（すなわち、混合物）からなる群から選択される液体基質である。カルボン酸エステルは、酵素に触媒される過加水分解の際に所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに十分な濃度で、反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルは反応製剤中に完全に溶解性である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒によってエステルが対応するペルオキシカルボン酸に転換できるようにするために十分な溶解度を有する。カルボン酸エステルは、反応製剤の０．０５重量％〜４０重量％の濃度、好ましくは反応製剤の０．１重量％〜２０重量％の濃度、より好ましくは反応製剤の０．５重量％〜１０重量％の濃度で反応製剤中に存在する。
【０２６９】
過酸素源は過酸化水素である。反応製剤中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％の範囲、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％の範囲、より好ましくは０．１重量％〜約３０重量％の範囲であり得る。
【０２７０】
過酸素源（すなわち、過酸化水素）は、有効量の過酸化水素を生成することができる酵素を用いて、酵素的に発生されてもよい。例えば、グルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、エチレングリコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、およびアミノ酸オキシダーゼを含むがこれらに限定されない種々のオキシダーゼを本発明の組成物および方法において使用して、有効量の過酸化水素を生成することができる。
【０２７１】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過処理された全細胞、および部分精製全細胞抽出物）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ  １．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素から酸素および水への転換を触媒する。１つの態様では、過加水分解触媒にはカタラーゼ活性がない。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が反応製剤に添加され得る。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調整することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜約１Ｍの範囲であり、好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。
【０２７２】
別の実施形態では、酵素触媒は有意なカタラーゼ活性を持たないか、あるいはカタラーゼ活性を低減または除去するように操作され得る。宿主細胞におけるカタラーゼ活性は、トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含むがこれらに限定されないよく知られた技術を用いて、カタラーゼ活性の原因である遺伝子の発現を破壊することによって下方制御または除去することができる。好ましい実施形態では、内在性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、下方制御または破壊（すなわち、ノックアウト）される。本明細書で使用される場合、「破壊された」遺伝子は、修飾された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および／または機能がもう存在しないものである。遺伝子を破壊するための手段は当該技術分野においてよく知られており、対応するタンパク質の活性および／または機能が存在しなくなる限り、遺伝子への挿入、欠失、または突然変異を含むことができるが、これらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生宿主である（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書を参照）。別の実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および／または破壊を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。
【０２７３】
水性反応製剤中の触媒の濃度は触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒の重量は、通常、全反応体積の０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７が参照される。固定化触媒の使用により、その後の反応における触媒の回収および再利用が可能になる。酵素触媒は、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製または精製酵素、およびこれらの混合物の形態であり得る。
【０２７４】
１つの態様では、カルボン酸エステルの化学的な過加水分解および酵素的な過加水分解の組み合わせによって発生されるペルオキシカルボン酸の濃度は、選択されるパーソナルケア用途のために有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分である。別の態様では、本発明の方法は、所望の有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するための酵素および酵素基質の組み合わせを提供しており、添加される酵素が存在しないと、著しくより低い濃度のペルオキシカルボン酸が生成される。場合によっては、無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応によって酵素基質の実質的に化学的な過加水分解が起こり得るが、所望の用途において有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するために十分な濃度のペルオキシカルボン酸は発生されないことがあり、全ペルオキシカルボン酸濃度の著しい増大は、適切なペルヒドロラーゼ触媒の反応製剤への添加によって達成される。
【０２７５】
少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生されるペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の濃度は、過加水分解反応の開始から１０分以内、好ましくは５分以内に、少なくとも約０．１ｐｐｍであり、好ましくは少なくとも０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、３００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、７００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍ、５０００ｐｐｍまたは１０，０００ｐｐｍの過酸である。ペルオキシカルボン酸を含む製品製剤は、場合により、標的用途に基づいて所望されるより低い濃度のペルオキシカルボン酸を含む製剤を生成するために、水、または主に水で構成される溶液で希釈されてもよい。明らかに、当業者は、選択されるパーソナルケア製品に対する所望の過酸濃度を達成するために反応成分および／または希釈量を調整することができる。
【０２７６】
本明細書に記載される方法に従って形成される過酸はパーソナルケア製品／用途において使用され、過酸は標的体表面と接触されて、毛髪除去（過酸脱毛剤）、毛髪の引張強さの低減、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）を増強するために使用される毛髪の前処理、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニングなどの過酸ベースの利益を提供する。一実施形態では、ヒト毛髪などの毛髪に対して過酸を生成するための方法はその場で実行される。
【０２７７】
反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を調節するように選択され得る。特定のパーソナルケア用途では明らかに、標的体表面の温度が反応の温度であり得る。反応の温度は、反応製剤の氷点（約０℃）のすぐ上の温度から約９５℃までの範囲であり得るが、好ましい範囲は５℃〜約７５℃であり、さらに好ましい反応温度範囲は、約５℃〜約５５℃である。
【０２７８】
ペルオキシカルボン酸を含有する最終反応製剤のｐＨは約５〜約１０であり、好ましくは約５〜約９、より好ましくは約５．５〜約８、さらにより好ましくは約６〜約８、またさらにより好ましくは約６．０〜約７．５である。緩衝液の濃度は、使用される場合には、通常０．１ｍＭ〜１．０Ｍであり、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【０２７９】
別の態様では、酵素的な過加水分解反応製剤は有機溶媒を含有することができる。このような溶媒としては、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびこれらの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２８０】
単一段階適用方法と多段階適用方法との対比
通常、過酸有益剤を酵素的に生成するための最低限の反応成分のセットは、（１）ＣＥ−７ペルヒドロラーゼなどの、本明細書に記載されるような過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素（場合により、標的化された融合タンパク質の形態である）と、（２）少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質と、（３）過酸素源（例えば、過酸化水素）とを含むであろう。
【０２８１】
パーソナルケア（例えば、ヘアケア）組成物の過酸発生反応成分は、使用されるまで分離して保持される。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから標的体表面と接触され、それにより、得られる過酸ベースの有益剤は、体表面に利益を提供する。成分は混ぜ合わせられてから標的体表面と接触されてもよいし、あるいは標的化体表面上で混ぜ合わせられてもよい。一実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。
【０２８２】
多段階の適用が用いられてもよい。過酸発生系（すなわち、これらの基本的な反応成分の少なくとも１つを体表面に順次適用する）組成物の個々の成分のうちの１つまたは２つは、酵素的な過酸の生成に必要とされる残りの成分を適用する前に毛髪と接触され得る。一実施形態では、過加水分解酵素および緩衝液を含む水性組成物（少なくとも５．０のｐＨを有する）は、毛髪がカルボン酸エステル基質および過酸化水素を含む第２の水性組成物と接触されるよりも前に毛髪と接触され、ここで、第２の水性組成物は、４．０以下においてｐＨ安定化されている（すなわち、「２段階適用」）。第１の水性組成物が適用後に洗い流されたら、第１の水性組成物と同一の緩衝液、または第１の水性組成物と同様のｐＨを保持する任意の緩衝液であり得る適切な緩衝液が第２の水性組成物中に添加されなければならない。第１および第２の組成物を混ぜ合わせると、あるいは第２の組成物および適切な緩衝液を混ぜ合わせると（第１の組成物が洗い流される場合）、得られる反応混合物は、酵素触媒が活性であるｐＨを提供し、有効濃度の過酸を生成する。通常、得られる反応混合物のｐＨは、少なくとも５．０、好ましくは少なくとも５．５、より好ましくは少なくとも６．０、最も好ましくは約６．０〜約９．０であろう。一実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は標的化ペルヒドロラーゼであり、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分を混ぜ合わせるよりも前に毛髪に適用される。
【０２８３】
好ましい実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分と混ぜ合わせる前に毛髪に適用される「標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」（すなわち、ＣＥ−７融合タンパク質）である（すなわち、２段階適用方法）。標的化ペルヒドロラーゼは、融合タンパク質の毛髪表面への非共有結合を促進するのに適切な条件下で毛髪と接触される。任意的なすすぎステップを使用して、残りの反応成分を混ぜ合わせる前に、過剰および／または非結合の融合タンパク質を除去することができる。
【０２８４】
さらなる実施形態では、カルボン酸エステル基質および過酸化水素を含む水性組成物は、過加水分解酵素（場合により、毛髪に標的化された融合タンパク質の形態である）を含む水性組成物を適用する前に毛髪に適用される。
【０２８５】
さらなる実施形態では、第１の水性組成物および第２の水性組成物は同時に体表面（毛髪）に適用される。
【０２８６】
別の態様では、第１および第２の水性組成物は混合されて反応混合物を形成し、これは次に体表面（毛髪）に適用される。
【０２８７】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかを、本発明を実行するためのキットに組み込むことができる。キットは、過酸の酵素的な生成を促進するための材料および試薬を含むことができる。例示的なキットは、（１）カルボン酸エステル基質、および場合により１つまたは複数の有機共溶媒、ならびに過酸化水素を含む水性組成物（ここで、組成物はｐＨ４．０以下においてｐＨ安定化されている）を含む第１の容器またはコンパートメントと、（２）過加水分解活性を有する酵素触媒、および少なくとも１つの緩衝液（すなわち、緩衝液は貯蔵中に５．０以上のｐＨを保持できるように選択される）を含む第２の水性組成物（ｐＨ５．０以上においてｐＨ安定化）を有する第２の容器またはコンパートメントとを含み、ここで、酵素触媒は、場合により、毛髪または毛髪を含む体表面に標的化され得る。その他のキット成分は、以下の：サンプル管、固体担体、教材（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、および過酸を酵素的に生成する際に有用な許容可能な成分またはキャリアなどの他の溶液または他の化学試薬のうちの１つまたは複数を含むことができるがこれらに限定されない。
【０２８８】
皮膚科学的に許容可能な成分／キャリア／媒体
本明細書に記載される組成物および方法はさらに、ヘアケアまたは他のパーソナルケア製品において使用するために既知であるか、あるいは有効である１つまたは複数の皮膚科学的または美容的に許容可能な成分を含むことができるが、ただし、任意的な成分は、本明細書に記載される不可欠な成分と物理的および化学的に適合性であるか、あるいは、製品の安定性、美観、または性能を過度に損なわないことを条件とする。このような任意的な成分の非限定的な例は、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２、およびＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４に開示されている。
【０２８９】
一実施形態では、皮膚科学的に許容可能なキャリアは、約１０重量％〜約９９．９重量％、あるいは約５０重量％〜約９５重量％、あるいは約７５重量％〜約９５重量％の皮膚科学的に許容可能なキャリアを含むことができる。組成物と共に使用するのに適したキャリアは、例えば、ヘアスプレー、ムース、トニック、ジェル、皮膚の保湿剤、ローション、およびリーブオン（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）コンディショナーの製剤において使用されるものを含むことができる。キャリアは、水と、有機油と、揮発性シリコーン、アミノまたは非アミノシリコーンガムまたは油、およびこれらの混合物などのシリコーンと、鉱油と、オリーブ油、ヒマシ油、菜種油、ココナッツ油、小麦胚芽油、スィートアーモンド油、アボカド油、マカダミア油、アプリコット油、ベニバナ油、キャンドルナッツ油、亜麻仁油（ｆａｌｓｅ  ｆｌａｘ  ｏｉｌ）、タマヌ油、レモン油およびこれらの混合物などの植物油と、ワックスと、Ｃ２〜Ｃ１０アルカン、アセトン、メチルエチルケトン、揮発性有機Ｃ１〜Ｃ１２アルコール、Ｃ１〜Ｃ２０酸およびＣ１〜Ｃ８アルコールのエステル（エステルの選択は、ペルヒドロラーゼに対するカルボン酸エステル基質としての役割を果たし得るかどうかに依存し得るという理解の下で）（酢酸メチル、酢酸ブチル、酢酸エチル、およびミリスチン酸イソプロピルなど）、ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルコール（ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびベヘニルアルコールなど）、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪酸（ラウリン酸およびステアリン酸など）、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アミド（ラウリン酸ジエタノールアミドなど）、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルキルエステル（Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルキル安息香酸エステルなど）、ヒドロキシプロピルセルロース、およびこれらの混合物などの有機化合物とを含むことができる。一実施形態では、キャリアは、水、脂肪アルコール、揮発性有機アルコール、およびこれらの混合物を含む。
【０２９０】
本発明の組成物はさらに、約０．１％〜約１０％、あるいは約０．２％〜約５．０％のゲル化剤を含み、組成物に所望される粘度を提供するのに役立つことができる。適切な任意的なゲル化剤の非限定的な例には、架橋カルボン酸ポリマー；中和されていない架橋カルボン酸ポリマー；中和されていない変性架橋カルボン酸ポリマー；架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー；中和されていない架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー（例えば、Ｍｏｎｓａｎｔｏから市販されているＥＭＡ８１）；中和されていない架橋アルキルエーテル／アクリレートコポリマー（例えば、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販されているＳＡＬＣＡＲＥ（商標）ＳＣ９０）；ポリアクリル酸ナトリウム、鉱油、およびＰＥＧ−１  ｔｒｉｄｅｃｅｔｈ−６の中和されていない架橋コポリマー（例えば、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販されているＳＡＬＣＡＲＥ（商標）ＳＣ９１）；メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸の中和されていない架橋コポリマー（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されているＳＴＡＢＩＬＥＺＥ（商標）ＱＭ―ＰＶＭ／ＭＡコポリマー）；疎水的に変性された非イオン性セルロースポリマー；疎水的に変性されたエトキシレートウレタンポリマー（例えば、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅから市販されているアルカリ膨潤性ポリマーのＵＣＡＲＥ（商標）Ｐｏｌｙｐｈｏｂｅ  Ｓｅｒｉｅｓ）；およびこれらの組み合わせが含まれる。これに関連して、「中和されていない」という用語は、任意的なポリマーおよびコポリマーゲル化剤材料が、中和されていない酸モノマーを含有することを意味する。好ましいゲル化剤には、中和されていない水溶性架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー、中和されていない水溶性架橋カルボン酸ポリマー、疎水的に変性された水溶性の非イオン性セルロースポリマー、および界面活性剤／脂肪アルコールゲルネットワーク、例えば、ヘアコンディショニング製品において使用するのに適したものなどが含まれる。
【０２９１】
ヘアケア組成物／製品
過酸発生成分は、ヘアケア組成物および製品に取り込まれて、有効濃度の少なくとも１つの過酸を発生させることができる。所望の量の過酸を発生させるために使用されるペルヒドロラーゼは融合タンパク質の形態で使用することができ、ここで、融合タンパク質の第１の部分はペルヒドロラーゼを含み、第２の部分は毛髪に対する親和性を有する。
【０２９２】
生成される過酸は毛髪に利益を提供する（すなわち、「過酸ベースの有益剤」）。過酸は、脱毛剤、毛髪の引張強さを低下させるための毛髪処理剤、他の脱毛製品（チオグリコレートベースの毛髪除去製品など）の性能を高めるために使用される毛髪前処理剤、毛髪漂白剤、染毛の前処理剤、ヘアカーリング／スタイリング剤として、そしてヘアコンディショニング製品中の成分として使用され得る。
【０２９３】
過酸ベースの有益剤に加えて、ヘアケア製品および製剤は、ヘアケア製品において通常見出されるいくつもの付加的な成分を含むこともできる。付加的な成分は、毛髪の外観、感触、色、および光沢を改善すると共に、毛髪のボリュームまたは柔軟性を増大するのに役立つことができる。
【０２９４】
ヘアコンディショニング剤は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｇｒｅｅら（国際公開第０１０７００９号パンフレット）が参照され、種々の供給元から市販されている。ヘアコンディショニング剤の適切な例としては、カチオン性ポリマー（カチオン化グァーガム、ジアリル第４級アンモニウム塩／アクリルアミドコポリマー、４級化ポリビニルピロリドンおよびその誘導体、ならびに種々のポリクオタニウム化合物など）、カチオン性界面活性剤（塩化ステアラルコニウム、塩化セントリモニウム、およびサパミン塩酸塩など）、脂肪アルコール（ベヘニルアルコールなど）、脂肪アミン（ステアリルアミンなど）、ワックス、エステル、非イオン性ポリマー（ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコールなど）、シリコーン、シロキサン（デカメチルシクロペンタシロキサンなど）、ポリマーエマルション（アモジメチコンなど）、ならびにナノ粒子（シリカナノ粒子およびポリマーナノ粒子など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９５】
ヘアケア製品は、美容的に許容可能な媒体中に通常見出される付加的な成分を含むこともできる。このような成分の非限定的な例は、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２、およびＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４に記載されている。またヘアケアのための美容的に許容可能な媒体中に含まれることが多い成分の非限定的なリストは、Ｐｈｉｌｉｐｐｅらにより米国特許第６，２８０，７４７号明細書において、そしてＯｍｕｒａらにより米国特許第６，１３９，８５１号明細書において、そしてＣａｎｎｅｌｌらにより米国特許第６，０１３，２５０号明細書において記載されている（これらは全て、参照によって本明細書中に援用される）。例えば、ヘアケア組成物は水性、アルコール性または水−アルコール性の溶液でよく、水−アルコール性溶液の場合、好ましくは、アルコールは全重量に対して約１〜約７５重量％の割合のエタノールまたはイソプロパノールである。さらに、ヘアケア組成物は、酸化防止剤、保存剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢ日焼け止め、香料、増粘剤、ゲル化剤、湿潤剤およびアニオン性、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または顔料を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の従来の化粧品または皮膚科用添加剤または補助剤を含有し得る。
【０２９６】
ヘアケア組成物および方法は、毛髪、皮膚、または爪の色を変化させるために使用することができる任意の染料、レーキ（ｌａｋｅ）、顔料などの少なくとも１つのカラーリング剤を含むこともできる。ヘアカラーリング剤は当該技術分野においてよく知られており（例えば、Ｇｒｅｅｎら（上記）、ＣＦＴＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２）およびＣｏｓｍｅｔｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ／ＩＡＳ  Ｂｏｏｋｌｅｔ（１９９２）を参照）、種々の供給元（例えば、Ｂａｙｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ、ＩＣＩ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ、Ｓａｎｄｏｚ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ、ＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ、およびＨｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。適切なヘアカラーリング剤には、４−ヒドロキシプロピルアミノ−３−ニトロフェノール、４−アミノ−３−ニトロフェノール、２−アミノ−６−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、Ｈｅｎｎａ、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  ２、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ４、ＨＣ  Ｒｅｄ  ３、ＨＣ  Ｒｅｄ  ５、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌａｃｋ  ９、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  ７、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １２、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ８、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  １２、ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ  ２、Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  １、Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ３、Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌｕｅ  ３、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｖｉｏｌｅｔ  １、エオシン誘導体（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１など）、およびハロゲン化フルオレセイン誘導体（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．５と、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１０と組み合わせなど）などの染料と、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３６およびＤ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．１７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏｓ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．１２のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．１３のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．５、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２１、およびＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛、酸化バリウム、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、ならびにカーボンブラック粒子などの顔料とが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ヘアカラーリング剤は、Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  １および３、ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６および８、Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １、ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １、ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ  ２、ＨＣ  Ｒｅｄ  ５、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、ならびにカーボンブラックである。金属および半導体ナノ粒子も、その強力な発光のためにヘアカラーリング剤として使用され得る（米国特許出願公開第２００４−００１０８６４号明細書（Ｖｉｃら））。
【０２９７】
ヘアケア組成物には、シャンプー、コンディショナー、ローション、エアロゾル、ジェル、ムース、および染毛剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２９８】
一実施形態では、
ａ）１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する前記エステル、
ｉｉ）構造
【化９】
2014505046.tif 000011
（式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
【化１０】
2014505046.tif 000012
（式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、および
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質、ならびに
２）過酸化水素
の混合物を含み、そのｐＨが４．０以下である第１の水性組成物と、
ｂ）１）過加水分解活性を有する酵素触媒、および
２）少なくとも１つの緩衝液
を含み、そのｐＨが少なくとも５．０である第２の水性組成物と、
を含むヘアケア製品が提供されており、第１の水性組成物および第２の水性組成物は使用される前は分離して保持され、第１の水性組成物および第２の水性組成物が混ぜ合わせられると酵素的に発生された過酸が生じる。
【０２９９】
一実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素を含む第１の部分と、
ｂ）毛髪に対する親和性を有するペプチド成分を有する第２の部分と
を含む融合タンパク質の形態である。
【０３００】
別の実施形態では、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分は、少なくとも１つの毛髪結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
【０３０１】
別の実施形態では、少なくとも１つの毛髪結合ペプチドは、５〜６０の範囲のアミノ酸長さである。
【０３０２】
別の実施形態では、上記ヘアケア製品は、マルチコンパートメントパケット、マルチコンパートメントボトル、少なくとも２つの個々の容器、およびこれらの組み合わせの形態である。
【０３０３】
別の実施形態では、第１の水性組成物および第２の水性組成物はそれぞれ、２５℃で少なくとも２８日間貯蔵安定性である。
【０３０４】
別の実施形態では、第１の水性組成物のｐＨは１．０〜４．０の範囲である。
【０３０５】
別の実施形態では、第２の水性組成物のｐＨは５．０〜８．５の範囲である。
【０３０６】
別の実施形態では、ヘアケア製品は、使用前は第２の水性反応混合物をｐＨ５．０以上に保持することができ、酢酸、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、グリシン、重炭酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸からなる群から選択される少なくとも１つの緩衝液を含む。
【０３０７】
別の実施形態では、ヘアケア製品の第１の水性組成物、第２の水性組成物、または第１および第２の水性組成物の両方は、水中油エマルションである。
【０３０８】
別の実施形態では、ヘアケア製品はさらに、美容的に許容可能なキャリア媒体を含む。
【０３０９】
別の実施形態では、ヘアケア製品中の過加水分解活性を有する酵素触媒は、リパーゼ、エステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、プロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素を含む。
【０３１０】
好ましい態様では、ヘアケア製品は、配列番号３１４に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む過加水分解アリールエステラーゼを含む。
【０３１１】
別の好ましい実施形態では、上記ヘアケア製品中で使用される炭水化物エステラーゼは、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、前記シグネチャーモチーフは、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む。
【０３１２】
好ましい態様では、ヘアケア製品は融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＨＳＢＤ
または
ＨＳＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
を含み、式中、
ＰＡＨは、過加水分解活性を有する酵素であり、
ＨＳＢＤは、毛髪に対する親和性を有するペプチド成分であり、
Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意的なペプチドリンカーであり、
ｙは０または１である。
【０３１３】
さらに別の実施形態では、上記ヘアケア製品は、正味の正電荷を有する毛髪結合ペプチドを含む。
【０３１４】
一実施形態では、任意的な有機共溶媒は、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、ヘキシレングリコール、またはこれらの任意の組み合わせである。
【０３１５】
一実施形態では、緩衝液は、酢酸、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、グリシン、重炭酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０３１６】
一実施形態では、第１および第２の水性組成物を混ぜ合わせたときにヘアケア製品によって形成される過酸は過酢酸である。ヘアケア製品の成分は、使用されるまで分離して保持され得る。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから毛髪表面と接触され、それにより、得られる過酸ベースの有益剤は、毛髪除去、毛髪弱化（毛髪の引張強さの低減により評価される）、毛髪漂白、染毛の前処理（酸化染毛剤）、ヘアカーリング、およびヘアコンディショニングからなる群から選択される利益を提供する（すなわち、１段階適用方法）。別の実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。ヘアケア組成物中の原料の相対的な量は、所望の効果に応じて変化され得る。
【０３１７】
好ましい実施形態では、上記の過酸ベースのヘアケア方法は、毛髪を除去し、そして／あるいは毛髪の引張強さを弱めるために使用される。毛髪の除去または引張強さの低下を対象とするヘアケア製品は、除去の標的となる毛髪を含む表面からの毛髪の弱化および／または除去を増強するために、場合により、チオグリコレートなどの還元剤を含んでいてもよい。
【０３１８】
さらなる実施形態では、上記の脱毛方法は、チオグリコレートベースの毛髪除去製品などの少なくとも１つの還元剤を含む市販の毛髪除去製品を後で適用するための前処理として使用されてもよい。従って、上記の方法は、過酸処理された毛髪を還元剤と接触させるステップを含むことができる。好ましくは、還元剤は、チオグリコール酸ナトリウムまたはチオグリコール酸カリウムなどのチオグリコレートである（例えば、ＮＡＩＲ（登録商標）などの毛髪除去製品において使用されることが多い活性成分）。
【０３１９】
別の実施形態では、ヘアケア製品中の過加水分解活性を有する酵素は、配列番号配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３２０】
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号３１４、３１５、３３８、および３３９に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができる。
【０３２１】
さらなる実施形態では、ペルヒドロラーゼは、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼでり、各酵素は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、前記シグネチャーモチーフは、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む。
【０３２２】
過酸ベースの利益を毛髪に適用する方法も提供されており、本方法は、
ａ）本発明のヘアケア製品の少なくとも１つを提供するステップと、
ｂ）毛髪と、第１の水性組成物および第２の水性組成物が混ぜ合わせられたときに生じる酵素的に発生された過酸とを接触させ、それにより、毛髪が、毛髪除去、毛髪弱化、毛髪漂白、ヘアスタイリング、ヘアカーリング、ヘアコンディショニング、非過酸ベースの有益剤を適用する前の毛髪前処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受けるステップと
を含む。
【０３２３】
好ましい態様では、非過酸ベースの有益剤は、脱毛剤、染毛剤、ヘアコンディショニング剤、およびこれらの組み合わせである。
【０３２４】
さらに好ましい態様では、本方法は有効量の過酸を生成し、前記有効量は０．００１重量％〜４重量％の範囲である。好ましくは、過酸は過酢酸である。
【０３２５】
組換え微生物の発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞において、特に微生物宿主の細胞において産生され得る。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーにおいて見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌はどれも適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせにおいて発現され得るが、ここで、細胞外発現によって、発酵産物からの所望のタンパク質の回収は、細胞内発現により産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞原料に対して不変なままであり、それにもかかわらず機能遺伝子は発現されるであろう。宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピキア属、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、クルイベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ヤロウィア属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ザイモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、ディノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パンテア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス属、メチロサイナス属、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、シネココッカス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミキソコッカス属などの細菌、真菌または酵母種が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属、バチルス属、クルイベロミセス属、およびシュードモナス属が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０３２６】
大規模の微生物の増殖および機能遺伝子の発現は、様々な単純または複合糖質、有機酸、およびアルコール、またはメタンなどの飽和炭化水素、または二酸化炭素（光合成または化学独立栄養宿主の場合）、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または任意の微量栄養素（小さい無機イオンを含む）の形態および量を使用し得る。増殖速度の制御は、特定の制御分子を培養に添加するか否かによって影響され得るが、これらは通常、栄養分またはエネルギー源とは考えられない。
【０３２７】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは当該技術分野でよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、関連の遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の調節を包含する遺伝子の５’領域と、転写の終結を調節するＤＮＡ断片の３’領域とを含む。両方の調節領域が形質転換宿主細胞に相同および／または産生宿主に天然の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、このような調節領域はそのような由来でなくてもよい。
【０３２８】
所望の宿主細胞における本発明のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の発現を駆動するために有用な開始調節領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるあらゆるプロモーターが本発明に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピキア属における発現に有用）、ならびにｌａｃ、ａｒａＢ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、そしてバチルス属における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび種々のファージプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２９】
終結調節領域も、好ましい宿主細胞に天然の種々の遺伝子に由来し得る。一実施形態では、終結調節領域の包含は任意的である。別の実施形態では、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞に由来する終結調節領域を含む。
【０３３０】
工業的な産生
ペルヒドロラーゼ触媒を産生するために様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模産生は、バッチ培養、流加培養、および連続培養法によって行うことができる。バッチおよび流加培養法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−２３４（１９９２）において見出すことができる。
【０３３１】
所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的な産生は、連続培養を用いて達成することもできる。連続培養は開放系であり、定義される培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に、等量の条件培地が処理のために除去される。一般に、連続培養は、細胞が主に対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は固定化細胞を用いて実施することもでき、ここで、炭素および栄養分は連続的に添加され、価値のある産物、副産物または老廃物は細胞塊から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される様々な固体担体を用いて実施することができる。
【０３３２】
バッチ発酵、流加発酵、または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に知られている方法のいずれかによって達成され得る。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストは遠心分離または膜ろ過によって培地から分離され、場合により水または所望のｐＨの水性緩衝液で洗浄され、次に、所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペーストの懸濁液は均質化されて、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生じる。細胞抽出物は、場合により、セライトまたはシリカなどの適切なろ過助剤を通してろ過され、酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させるための加熱処理ステップの前に細胞片が除去されてもよい。次に、所望の酵素触媒を含有する溶液は、膜ろ過または遠心分離によって、沈殿した細胞片およびタンパク質から分離されてもよく、得られた部分精製酵素触媒溶液は、付加的な膜ろ過によって濃縮され、次に場合により、適切なキャリア（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合物）と混合され、噴霧乾燥されて所望の酵素触媒を含む固体粉末を生じ得る。
【０３３３】
量、濃度、またはその他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の一覧のいずれかで与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲の上限または好ましい値と、任意の範囲の下限または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が列挙される場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲を定義する場合、本発明の範囲は、列挙される特定の値に限定されることは意図されない。
【０３３４】
一般的な方法
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するための技術に従い、従って、その実施のために好ましいモードを構成すると考えられることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変化が成され、そしてそれでもなお本発明で開示される方法および実施例の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができると認識すべきである。
【０３３５】
全ての試薬および材料は、他に指定されない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ｉｎ）またはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０３３６】
本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、技術、特性、または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ｇｆ」は最大グラム重量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｇｒａｍｓ  ｆｏｒｃｅ）を意味し、「ｄｅｎ」はデニールを意味し、「Ｎ」はニュートンを意味し、「ｔｅｘ」はヤードの質量における基本的なテックス単位／長さ１０００メートル当たりの繊維のグラム数を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄＨ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は１分間の回転数を意味し、「Ｔｇ」はガラス転移温度を意味し、「Ｔｅｎ．」は靭性を意味し、「ＴＳ」は引張強さを意味し、そして「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
【０３３７】
発現ベクターｐＬＤ００１
プラスミドｐＬＤ００１（配列番号２９２）はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための適切な発現ベクターであることが既に報告されている（参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１０−０１５８８２３Ａ１号明細書（Ｗａｎｇら）を参照）。
【０３３８】
ベクターｐＬＤ００１は、市販のベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に由来した。これは、酵素ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）の断片をコードする、市販のベクターｐＥＴ３１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に由来する配列を含む。ＫＳＩ断片は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において不溶性封入体へのペプチドの分割を促進するための融合パートナーとして含有された。ｐＥＴ３１ｂからのＫＳＩコード化配列は、標準的な変異誘発手順（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、野生型ＫＳＩ配列において見出される１つのＣｙｓコドンに加えて、３つの追加のＣｙｓコドンを含むように改変した。さらに、コード配列内の全てのＡｓｐコドンは、Ｇｌｕコドンによって置換した。配列番号２９２で与えられるプラスミドｐＬＤ００１は、当業者によく知られている標準組換えＤＮＡ法を用いて構築した。
【０３３９】
ＢａｍＨＩ部位およびＡｓｃＩ部位によって結合されたコード配列は、標準組換えＤＮＡ法を用いて、ｐＬＤ００１のＢａｍＨＩ部位およびＡｓｃＩ部位の間に連結され得る。対象のペプチドにおいて結果として得られた遺伝子融合物は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてペプチドを不溶性封入体内に押し込む働きをするケトステロイドイソメラーゼの改変された断片（ＫＳＩ（Ｃ４）Ｅ）の下流側に融合された（参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００２９４２０Ａ１号明細書を参照）。
【０３４０】
実施例８
毛髪標的化ペルヒドロラーゼ融合物の構築
以下に、毛髪結合配列により毛髪に標的化されたペルヒドロラーゼの産生のための発現系の設計を記載する。
【０３４１】
毛髪結合ドメイン（配列番号２９０および配列番号２９１）に対する過加水分解活性を有する酵素（「ペルヒドロラーゼ」）の融合物をコードする遺伝子（配列番号２８６および配列番号２８７）は、可動性リンカー（それ自体はさらに、毛髪結合ドメインＨＣ２６３またはＨＣ１０１０（それぞれ、配列番号２９０および配列番号２９１）に融合される）をコードするヌクレオチド配列に対して３’端部で融合したサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ変異体（配列番号２９３）のポリヌクレオチド配列を有するように設計した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために遺伝子をコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により合成した。ＮｄｅＩおよびＡｓｃＩ制限部位間で発現ベクターｐＬＤ００１（配列番号２９２）において遺伝子をＴ７プロモーターの後ろでクローン化し、それぞれプラスミドｐＬＲ１０２１およびｐＬＲ１０２２を生じた。融合タンパク質を発現するために、プラスミドをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に移し、株ＬＲ３３１１（ＨＣ２６３に対するペルヒドロラーゼ融合物、配列番号２８８）およびＬＲ３３１２（ＨＣ１０１０に対するペルヒドロラーゼ融合物、配列番号２８９）を生じた。
【０３４２】
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの非標的化Ｃ２７７Ｓ変異体を同様にクローン化した。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異体の調製および組換え発現は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書においてＤｉＣｏｓｉｍｏらにより既に報告されている。
【０３４３】
ＨＰＬＣ  Ｋａｒｓｔ検定手順
以下の検定手順は、Ｕ．Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６９（１７）：３６２３−３６２７によって報告される手順から適合させた。
【０３４４】
検定手順
１．  ３００μＬのｄｄＨ２Ｏ（サンプルなしのブランクについては４００μＬ）を、２．０ｍＬのＨＰＬＣスクリューキャップバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ−５１８２−０７１５）に添加する。各サンプルに対して１つのバイアルを準備する。
２．  ２５０μＬの気密性シリンジを用いて、１００μＬの２０ｍＭのＭＴＳ（メチルｐ−トリルスルフィド、Ａｌｄｒｉｃｈ  ７５９６−２５ｇ、ｆｗ  １３８．２３、９９％純度）／アセトニトリル溶液を各バイアルに添加し、回転させて混合する。
３．  １００μＬのＨ３ＰＯ４で希釈および反応停止させたサンプルを各バイアルに添加し、回転させて混合する。
４．  バイアルを遮光ボックスに入れ、検定反応を暗所で１０分間、攪拌せずに進行させる。
５．  バイアルを遮光ボックスから取り出し、４００μＬのアセトニトリルを各バイアルに添加し、回転させて混合する。
６．  ２５０μＬの気密性シリンジを用いて、１００μＬの１２０ｍＭのＴＰＰ（トリフェニルホスフィン、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ８４４０９−２５ｇ、ＦＷ  ２６２．２９、９９％純度）／アセトニトリル溶液を各バイアルに添加し、バイアルにフタをする（Ａｇｉｌｅｎｔ−５１８２−０７２３）。ボルテックスして混合する。
７．  バイアルを遮光ボックスに入れ、検定を暗所で３０分間、攪拌せずに継続させる。８．  バイアルを遮光ボックスから取り出し、２５０μＬの気密性シリンジを用いて、１００μＬの２．５ｍＭのＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｄ１００９５１−１００ｇ、ＦＷ−１９１．２７、９７％純度）／アセトニトリル溶液（ＨＰＬＣ外部標準として使用される）を各バイアルに添加し、分析のために直ちにＨＰＬＣに注入する（検定溶液の全体積は１１００μＬである）。
【０３４５】
ＨＰＬＣ分析
以下のＨＰＬＣ条件を使用した：Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄカートリッジを有するＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１５ｃｍ×４．０ｍｍ、５ｕｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ♯５９３５３−Ｕ４０）。
移動相：４１〜１００％アセトニトリル／５９〜０％蒸留水、１ｍＬ／分勾配。注入体積１５μＬ、分析時間１０分間。検出器−２２５ｎｍにおけるＵＶ吸光度。
【０３４６】
【表２】
2014505046.tif 000013
【０３４７】
毛髪房の引張強さ試験手順
この引張強さ試験手順は多数の毛髪繊維を含有する毛髪束のために開発され、結果は、多数の毛髪繊維に対して平均化された処理効果を反映し得る。毛髪サンプルを、約３０〜７０ｍｇの毛髪の４ｃｍ長さ、２ｍｍ幅の毛髪束に切断し、厚さ１ｍｍおよび長さ５ｍｍの接着剤ストリップで結合させた。速乾性の接着剤（例えば、ＤＵＣＯ（登録商標）ＣＥＭＥＮＴ（登録商標）、ニトロセルロース家庭用接合剤）を用いて、この房の５ｍｍの自由端部をさらに接着した。接着剤を乾燥させた後、緩んだ毛髪ストランドはどれも切り落とし、サンプルを秤量した。
【０３４８】
引張試験のために、１００ポンド（約４５．４ｋｇ）のロードセルが取り付けられたＣＯＭ−ＴＥＮ（登録商標）Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｔｅｓｔｅｒ  ９５−ＶＤ（Ｃｏｍ−Ｔｅｎ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｐｉｎｅｌｌａｓ  Ｐａｒｋ，ＦＬ）を使用した。サンプルの滑りを低減するために、工業グレードのＶＥＬＣＲＯ（登録商標）（Ｖｅｌｃｒｏ  ＵＳＡ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ）の幅５ｍｍのストリップをクランプのエッジの内側に取り付けた。試験の前に、ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮを「オフ」に設定し、ＦＯＲＣＥ  ＵＮＩＴＳを「グラム」に設定し、クランプ間の距離を３ｃｍに調整した。試験サンプルを水中に３０秒間浸漬した。ペーパータオルで優しく吸収することにより過剰な水分を除去し、１００％の湿度レベルであるとみなすために毛髪に十分な水分を残した。ＶＥＬＣＲＯ（登録商標）ストリップが毛髪を接着剤の真下に保持するような形で、試験サンプルの接着した端部を上部および下部クランプの両方で固定した。コントロールノブの速度を調整することにより試験速度を約２．５インチに設定した。ＲＵＮモードのＦｏｒｃｅメーターを用いて、開始ＰＥＡＫ  ＦＯＲＣＥを０に設定するためにＴＡＲＥをＺＥＲＯに設定した。試験を開始するために、ＤＩＲＥＣＴＩＯＮトグルスイッチをＵＰ位置に押した。試験の最後には、サンプルが失敗したときに、ＤＩＲＥＣＴＩＯＮスイッチをＳＴＯＰに動かし、ピーク力を記録した。下側および上側クランプの両方で毛髪をクランプのエッジに沿って切り落とした。クランプを開き、切れ端（ｓｔｕｂ）を除去し、空気中で乾燥させ、秤量した。元のサンプル重量と、切れ端の合わせた重量との差異が、引張伸びを受けている毛髪の重量であり、この量を用いて引張強さを計算した。
【０３４９】
処理後のサンプルを比較するために、引張強さを以下のように定義した：
引張強さ（Ｎ／ｍｇ毛髪）＝ピーク力（ニュートン）／（初期サンプル重量−切れ端の重量）
【０３５０】
検定のベンチマーキングは、ココアバターを有する市販の脱毛製品のＮＡＩＲ（登録商標）ローション（Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｗｉｇｈｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙからのアルカリ／チオグリコール酸カリウムベースの毛髪除去製品）による処理の後、毛髪房の引張強さ（毛髪の弱化）を測定することによって達成した。ＮＡＩＲ（登録商標）製品の使用説明書に基づいて、推奨される処理時間は５〜１０分間である。従って、ＮＡＩＲ（登録商標）で５分〜１０分間処理された毛髪サンプルの引張強さを用いて、目標レベルを決定した。長さ４ｃｍの約５０ｍｇの毛髪の毛髪束からなる試験毛髪サンプルを、厚さ１ｍｍ、幅２ｍｍおよび長さ５ｍｍの接着剤ストリップで結合させた。試験サンプルをガラスプレート上に置いた。手袋をはめた指で、約１ｍＬのＮＡＩＲ（登録商標）ローションを房に適用した。ローションを房の上に優しく延ばし、押し付けて、毛髪繊維全体を被覆した。室温で所望の処理時間の後、房を水道水で十分にすすいで、ローションの痕跡をすべて除去した。サンプルを風乾し、その引張強さを試験した。
【０３５１】
これらの処理時間に対して、房（湿った房、１００％の湿度）の引張強さは、１０分では約０．２Ｎ／ｍｇ毛髪までの間であり、５分では０．７〜１．４Ｎ／ｍｇ毛髪の間であることが分かった。データは表１で提供される。引張強さの変動を考えると、毛髪弱化効力の所望のレベルは、ＮＡＩＲ（登録商標）５分処理の基準として１．５Ｎ／ｍｇＨが標的とされた。
【０３５２】
【表３】
2014505046.tif 000014
【０３５３】
毛髪の色測定手順
毛髪房を空気中で乾燥させ、４ｍｍポートのＸ−ＲＩＴＥ（登録商標）ＳＰ６４分光光度計（Ｘ−Ｒｉｔｅ，Ｇｒａｎｄｖｉｌｌｅ，ＭＩ）を用いて色測定を行った。色数は、反射率からＤ６５／１０°においてＣＩＥＬＡＢ７６に従って測定した。毛髪房（４回の反復全て）を、孔を開けたカードペーパーの下に置き、バックグラウンドが見えないことを確認した。分光光度計のポートホールを孔の中心に置き、下側の毛髪サンプルをスキャンした。房−束をひっくり返し、カードの下に置き、さらなる測定を行った。平均Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊（ＣＩＥＬＡＢ７６に従う色）値を記録した。
【０３５４】
色抜けのΔＥは、以下の式：
ΔＥ＝（（Ｌ＊−Ｌ＊ｒｅｆ）２＋（ａ＊−ａ＊ｒｅｆ）２＋（ｂ＊−ｂ＊ｒｅｆ）２）０．５
に従って計算した。式中、
Ｌ＊、ａ＊およびｂ＊は、処理後のサンプル房のＬ＊、ａ＊およびｂ＊値である。
Ｌｒｅｆ＊、ａｒｅｆ＊およびｂｒｅｆ＊は、未処理毛髪のＬ＊、ａ＊およびｂ＊値である。
【実施例】
【０３５５】
実施例１
融合タンパク質の産生
この実施例は、毛髪結合ドメインを介して毛髪に標的化されたペルヒドロラーゼの発現および精製を記載する。
【０３５６】
株ＬＲ３３１１および株ＬＲ３３１２は、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する１リットルの自己誘導培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７５％のグリセロール、０．０７５％のグルコースおよび０．０５％のアラビノース）において、２００ｒｐｍの攪拌下、３７℃で２０時間増殖させた。非標的化ペルヒドロラーゼの産生は、米国特許出願公開第２０１０−０
０８７５２９号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）において既に記載されている。
【０３５７】
細胞を４℃で８０００ｒｐｍの遠心分離によって収集し、組織ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒモデルＰＣＵ１１、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を３５００ｒｐｍで用いて、３００ｍＬの氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に細胞ペレットを再懸濁させることにより洗浄した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、４℃）を行った。組織ホモジナイザーを用いて７５ｍｇのニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を含有する冷却した溶解緩衝液中に再懸濁させることによって細胞を溶解させた。細胞懸濁液を氷の上に３時間置き、組織ホモジナイザーにより定期的に均質化しながら、リゾチームによる細胞壁の消化を可能にした。この段階では、抽出物の発泡を回避するように気を付けた。抽出物を分割して（５００ｍＬのボトル当たり１５０ｍＬ）、−２０℃で凍結させた。凍結細胞抽出物を室温（約２２℃）で解凍し、組織ホモジナイザーで均質化し、５ｍｍのプローブを備えたソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ、Ｓｏｎｉｆｉｅｒモデル４５０）を２０％の最大出力、２パルス／秒で１分間用いて超音波処理により破壊した。溶解細胞抽出物を４×５０ｍＬの円錐ポリプロピレン遠心管に移してから、４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞片および破壊されていない細胞を含有するペレットを凍結した。ライセートのアリコートを１５ｍＬの円錐ポリプロピレン管（１２×５ｍＬ）に移し、８０℃で１５分間加熱し、氷上で冷却し、４×５０ｍＬの円錐ポリプロピレン遠心管中にプールした。４℃における１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、熱安定性酵素を含有する可溶性画分および沈殿したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を分離した。超音波処理ステップの後に細胞破壊が不完全であれば、凍結ペレットを再度解凍し、２回目の超音波処理、遠心分離および加熱処理を受けさせた。この精製プロトコルの出力は、通常、２〜４ｍｇのタンパク質／ｍＬをもたらし、融合ペルヒドロラーゼの純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析で評価される場合に９０％〜７５％のタンパク質であった。ウシ血清アルブミンの溶液を標準として使用するビシンコニン酸（ＢＣＡ）検定（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって、全タンパク質を定量化した。
【０３５８】
実施例２
毛髪標的化ペルヒドロラーゼ融合物の毛髪への結合
この実施例は、毛髪結合配列のペルヒドロラーゼへの融合に依存する形でペルヒドロラーゼの毛髪への結合を実証する。
【０３５９】
毛髪結合実験のために、茶色の毛髪房（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｌｅｎｓｄａｌｅ  ＮＹ）を使用した。毛髪を２％のＳＬＥＳで洗浄し、脱イオン水で徹底的にすすぎ、風乾した。
【０３６０】
約２０ｍｇの１ｃｍの茶色の毛髪断片を１．８ｍＬの微量遠心管中に添加した。ヒドロラーゼ検定緩衝液（１．２ｍＬ）を毛髪に添加した後、ペルヒドロラーゼ酵素を溶液に添加した。Ａｄａｍｓ  Ｎｕｔａｔｏｒ（モデル１１０５、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において、穏やかに攪拌（２４ｒｐｍ）しながら３０分間、酵素を毛髪に結合させた。ｐＮＰＡヒドロラーゼ試薬の非酵素的加水分解を説明するために、酵素を含まない対照（毛髪を含むものと含まないもの）を結合実験に含ませた。結合ステップの後、結合緩衝液の１．０ｍＬのアリコートを新しい管に移し、非結合酵素の量を定量化した。付加的な結合緩衝液を除去し、毛髪断片を１ｍＬのヒドロラーゼ緩衝液中の１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で４回洗浄した後、１ｍＬ（それぞれ）のヒドロラーゼ緩衝液中で２回洗浄した。次に、毛髪断片を１ｍＬのヒドロラーゼ検定中に再懸濁させ、毛髪に結合したままのヒドロラーゼ活性を測定した。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ変異体（配列番号２９３）は、非標的化ペルヒドロラーゼのための対照として使用した。結果は表２で提供される。
【０３６１】
【表４】
2014505046.tif 000015
【０３６２】
表２のデータは、１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０中での徹底的な洗浄の後に、毛髪に標的化されたペルヒドロラーゼ融合物は毛髪上に保持されたが、非標的化ペルヒドロラーゼは保持されなかったことを実証する。
【０３６３】
実施例３
他のペルヒドロラーゼの構築および産生
毛髪への標的化
以下の実施例は、毛髪に標的化される付加的なペルヒドロラーゼの産生のための発現系の設計を表す。構築物の要約は表３で提供される。
【０３６４】
簡単に言うと、ポリヌクレオチド配列（配列番号９、３９、および４１）は、１８アミノ酸可動性リンカー（ＧＰＧＳＧＧＡＧＳＰＧＳＡＧＧＰＧＳ、配列番号２８５）（それ自体は毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）に融合される）に対するバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのキシランエステラーゼ（配列番号１０、４０、および４２）の融合物をコードするように設計した。これらの酵素は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのように、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーに属する。
【０３６５】
ポリヌクレオチド配列（配列番号３２２、３２４、３２６および３２８）は、１８アミノ酸可動性リンカー（配列番号２８５）（それ自体は毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）に融合される）に対するマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（配列番号３１４）からのアリールエステラーゼのＳ５４Ｖ変異体の融合物をコードするように設計した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアリールエステラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼとは異なる加水分解酵素の種類に属する。
【０３６６】
ポリヌクレオチド配列（配列番号３３０、３３２、３３４、および３３６）は、１８アミノ酸可動性リンカー（配列番号２８５）（それ自体は毛髪結合ドメインＨＣ２６３（配列番号２９０）に融合される）に対するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（配列番号３１５）からのヒドロラーゼのＬ２９Ｐ変異体の融合物をコードするように設計した。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのエステラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼまたはマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）とは異なる加水分解酵素の種類種に属する。
【０３６７】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために遺伝子をコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により合成した。実施例１に記載されるものと同様の方法で、コード配列をＴ７プロモーターまたはｐＢＡＤプロモーターの後ろでプラスミドにおいてクローン化した。Ｔ７プロモーター下での構築のために、あるいはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５のＡｒａＢＡＤ誘導体ではｐＢＡＤプロモーター下での構築のために、プラスミドを適切な発現宿主：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に移した。
【０３６８】
【表５】
2014505046.tif 000016
【０３６９】
実施例４
代替的なエステラーゼ／ペルヒドロラーゼおよび毛髪結合ドメインを含む融合タンパク質の産生
この実施例は、実施例３に記載される毛髪に標的化された種々の代替的なエステラーゼ／ペルヒドロラーゼの発現および精製を表す。
【０３７０】
実施例３の表３中のペルヒドロラーゼに対する融合物をコードする遺伝子を発現する株は、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する１Ｌの自己誘導培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７５％のグリセロール、０．０７５％のグルコースおよび０．０５％のアラビノース）において、２００ｒｐｍの攪拌下、３７℃で２０時間増殖させた。全てのタンパク質融合物は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で十分に発現した。細胞を４℃で８０００ｒｐｍの遠心分離によって収集し、組織ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒモデルＰＣＵ１１）を３５００ｒｐｍで用いた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、４℃）を用いて、３００ｍＬの氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に細胞ペレットを再懸濁させることにより洗浄した。１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２ＭＰａ）でＦｒｅｎｃｈ圧力セルを２回通過させることにより細胞を破壊した。溶解細胞抽出物を４×５０ｍＬの円錐ポリプロピレン遠心管に移し、４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。酵素を含有する上澄みを新しい管に移し、クーマシー染色されたＰＡＧＥゲル上のウシ血清アルブミン標準のバンドに対する比較により各抽出物中のおよその量の融合タンパク質を評価した。
【０３７１】
ペルヒドロラーゼ融合物は好熱性ではないので、これらは、Ｃｏ−ＮＴＡアガロース（ＨｉｓＰｕｒ  Ｃｏｂａｌｔ  Ｒｅｓｉｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる金属キレート化クロマトグラフィにより、そのＣ−末端Ｈｉｓ６を用いて精製した。通常、４体積の平衡緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、１ｍＭのイミダゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ）を備えたＣｏ−ＮＴＡアガロースの５〜１０ｍＬカラムに細胞抽出物を負荷した。カラムに負荷される各抽出物の量は、Ｃｏ−ＮＴＡアガロースビーズ１ｍＬ当たり５〜１０ｍｇのペルヒドロラーゼ融合物を含有するように調整した。樹脂を２ベッド体積の平衡緩衝液で洗浄し、２体積の溶離緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、１５０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）で溶出させた。画分を収集し、精製タンパク質の存在をＰＡＧＥにより検出した。溶出したタンパク質をＰＡＧＥにより分析した。これらの全てのタンパク質は、親和性クロマトグラフィにより精製することができた。その事実は、融合タンパク質が全長型で産生されたことを示す。
【０３７２】
この実施例は、融合ヒドロラーゼ／ペルヒドロラーゼを、毛髪に対する親和性を有する様々な結合ドメインを有する異なるファミリーから産生することの実行可能性を実証する。
【０３７３】
実施例５
毛髪結合ドメインに融合された代替のペルヒドロラーゼのペルヒドロラーゼ活性
以下の実施例は、毛髪に標的化された代替のペルヒドロラーゼの活性を実証する。
【０３７４】
実施例４に記載されるように産生された様々な標的ドメインを有する毛髪に標的化された酵素のペルヒドロラーゼ活性は、ＡＢＴＳ検定により測定した。結果は表４に報告され、ＣＥ−７（炭水化物エステラーゼファミリー７）も非ＣＥ−７ヒドロラーゼも過加水分解活性を有することが示される。
【０３７５】
【表６】
2014505046.tif 000017
【０３７６】
この実施例は、ＣＥ−７ファミリーまたはその他のファミリーからのヒドロラーゼ酵素の他の毛髪標的融合物が過加水分解活性を示し、毛髪用途において直接または酵素発生の後に使用され得ることを実証する。
【０３７７】
実施例６
毛髪に標的化された他のペルヒドロラーゼの毛髪結合
以下の実施例は、種々の標的化ペルヒドロラーゼ（ＣＥ−７サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ以外）が毛髪に結合できることを実証する。
【０３７８】
標的化ペルヒドロラーゼＨＣ１１２１（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）、ＨＣ１１６９（ＡｒＥ−ＨＣ２６３、配列番号３２３）、およびＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ペルヒドロラーゼの変異体（配列番号３３１）を、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液中の５％のＰＥＧ−８０ラウリン酸ソルビタンの溶液中で、５０μｇ／ｍＬに希釈した。１０ｍｇのヒト毛髪を２ｍＬの上記製剤に添加し、穏やかに攪拌しながら室温で５分間インキュベートして、酵素を毛髪に結合させた。無酵素対照サンプルもインキュベートした。結合したら、結合溶液を吸引により除去し、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の２ｍＬの１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で毛髪を洗浄した。毛髪を管から取り出し、ペーパータオルで吸い取り乾燥し、新しい管のセットに移した。毛髪を、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液中の１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０で２回すすいでから、５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム緩衝液で２回すすいだ。毛髪に結合したままである酵素の量は、毛髪を２〜３ｍｍ断片に切断することによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で決定した。断片を５００μＬポリプロピレン微量遠心管に入れ、８０μＬのゲル負荷緩衝液（２０μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７）、８μＬの５００ｍＭのＤＴＴ、および５２μＬ５０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸カリウム）で被覆した。毛髪サンプルを９０℃で１０分間加熱してから、４度まで冷却した。
【０３７９】
上澄み（２５μＬ）をＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０３２２）上に負荷し、１５０ｖで４０分間実行した。ゲルを水で３回洗浄し、１５ｍＬのＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ（商標）Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、ＬＣ６０６０）中で１時間染色し、３回すすいでから、水中で３時間脱染した。結果はゲルに結合した酵素の相対強度として報告され、表５で提供される。
【０３８０】
【表７】
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【０３８１】
データによって、異なるヒドロラーゼファミリーからの様々なペルヒドロラーゼを毛髪に標的化させることができ、毛髪結合配列は、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）ペルヒドロラーゼ以外のペルヒドロラーゼに対する融合物の場合において機能的であることが示される。
【０３８２】
実施例７
低ｐＨで共配合された基質ストックの安定性
この実施例の目的は、低ｐＨにおいて２つの反応性基質のトリアセチン（ＴＡ）およびＨ２Ｏ２の共製剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の安定性を示すことである。
【０３８３】
表６に示されるように、適切な体積のトリアセチン（食品グレード、Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ  Ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＭＷ２１８．２１、９９＋％純度、密度１．２）および３０％のＨ２Ｏ２（ＥＭＤ  ＨＸ０６３５−２、ＭＷ−３４．０１）を脱イオン（ＤＩ）水に添加することにより、広範な基質濃度について、共配合された（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）２Ｘ基質ストックを作り、数滴の５ｍＭのリン酸を添加してｐＨを約ｐＨ４に調整した。
【０３８４】
【表８】
2014505046.tif 000019
【０３８５】
１体積の２Ｘ基質ストックと、同じ１体積の２０μｇ／ｍＬのペルヒドロラーゼ溶液（室温で貯蔵された５ｍｇ／ｍＬストックから希釈した）とを混合することによって、これらの基質ストックの活性を試験した。反応をローテーター上で１時間継続させた後、５ｍＭのＨ３ＰＯ４による１０倍の酸性化により反応を停止させた。ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＭＦ遠心装置（３０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ、Ｐ／Ｎ  ＯＤ０３０Ｃ３５）を用いて、反応停止したサンプルを、１２，０００ｒｐｍで６分間の遠心分離によりろ過した。ろ液をＨＰＬＣ  Ｋａｒｓｔ検定（上記）によりデュプリケートで検定して、１時間の反応時間で発生した過酢酸（ＰＡＡ）の量を決定した。試験を４週間にわたって繰り返して、これらの共配合基質ストックの安定性を決定した。これらの試験では標的化ペルヒドロラーゼ（ＨＣ１１２１、配列番号２８８）および非標的化ペルヒドロラーゼ（Ｃ２７７Ｓ、配列番号２９３）の両方を使用した。結果は、４週間の試験期間のデュプリケート試験からの１時間の平均のＰＡＡ発生および標準偏差に関して、表７に要約した。全ての酵素含有サンプルについて、共配合基質ストックは、最初に発生されるＰＡＡの量と比較して、第４週の最後に少なくとも９０％のＰＡＡ発生を保持した。
【０３８６】
ここで示されるｐＨ４の共配合基質ストックの安定性は、ｐＨ７で配合される基質ストックの安定性と比較して大きな改善である。ｐＨ７、５０ｍＭのピロリン酸緩衝自家製皮膚保湿剤中に１００ｍＭのトリアセチンおよび２５０ｍＭのＨ２Ｏ２が一緒または別々に貯蔵されたこれまでの１つの実験では、３つのの試験を３週間にわたって種々の時点で行った：１）５０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１（配列番号２８８）を、５分間の反応のためにｐＨ７のトリアセチン／Ｈ２Ｏ２共ストック（ｃｏ−ｓｔｏｃｋ）に添加する、２）新しい２５０ｍＭのＨ２Ｏ２および５０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１（配列番号２８８）を、５分間の反応のためにｐＨ７の１００ｍＭのトリアセチンストックに添加した、３）新しい１００ｍＭのトリアセチンおよび５０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１（配列番号２８８）を、５分間の反応のためにｐＨ７の２５０ｍのＭＨ２Ｏ２のストックに添加した。これらの３つの試験に対して様々な日に５分間で発生されるＰＡＡの量を表８に要約した。結果は、ｐＨ７で共配合されたトリアセチンおよびＨ２Ｏ２により発生されるＰＡＡの量が、試験期間の３週間以内に最初の量の１７％まで低下するが、別々に貯蔵されたトリアセチンおよびＨ２Ｏ２により発生されたＰＡＡの量は比較的安定していることを示した。これにより、ｐＨ７の共配合基質の不安定性は、主に、ｐＨ７におけるこれらの２つの基質の非酵素的な反応によって生じるが、上記で実証されるように、これらの２つの基質間の非酵素的な反応は、より低いｐＨ（ｐＨ４）では著しく阻害されることが示唆された。
【０３８７】
【表９】
2014505046.tif 000020
【０３８８】
【表１０】
2014505046.tif 000021
【０３８９】
実施例８
１段階適用において低ｐＨ共配合基質ストックと共にペルヒドロラーゼを用いた毛髪弱化効力
この実施例の目的は、より高いｐＨ緩衝液中で低ｐＨ共配合基質ストックをペルヒドロラーゼと共に用いて発生されるｐＰＡＡの量が毛髪を効果的に弱化し得ることを示すことである。
【０３９０】
２Ｘ酵素ストック溶液、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１（配列番号２８８）および２０μｇ／ｍＬのＣ２７７Ｓ（配列番号２９３）をｐＨ６．６の２００ｍＭのリン酸緩衝液中で調製した。表９に示されるように、種々の基質濃度の組み合わせで、実施例７で調製した低ｐＨ共配合基質ストックを、ＨＣ１１２１およびＣ２７７Ｓの両方を用いて毛髪において試験した。それぞれの試験条件に対して、トリプリケートの毛髪房を試験した。毛髪房は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｌｅｎｓｄａｌｅ  ＮＹ）からのミディアムブラウンの毛髪であった。各毛髪房を一端で接着し、５ｍｍ幅および４ｃｍ長さ（接着した部分を除いて）、１００＋／−２０ｍｇの正味の毛髪重量で切断した。各毛髪房を清浄なプラスチック秤量トレイ（ＶＷＲ、Ｃａｔ．＃１２５７７−０５３）に入れた。約０．５ｍＬの２Ｘ酵素ストック溶液を毛髪房に適用し、アプリケータで毛髪房に擦り込んだ。次に、０．５ｍＬの２Ｘ基質ストック溶液を適用し、毛髪房に擦り込んだ。毛髪房をこの反応混合物中に１時間入れたままにした後、乾燥皿に取り出した。毛髪房を２３時間風乾させてから、１ｍＬの１％のＳＬＥＳ（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム）（Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙによるＲＨＯＤＡＰＥＸ（登録商標）ＥＳ  ２Ｋ」）で洗浄した後、水道水ですすぎ、ペーパータオルで乾燥させた。これにより、２４時間の処理サイクルが完了された。処理サイクルを１０回繰り返した。毛髪房はより明るい色になり、処理中に弱化した。最終のすすぎおよび風乾の後、一般的な方法において上記で記載された引張強さ試験を各毛髪房において実行し、毛髪弱化を定量化した。表１０に示される引張強さ試験の結果は、試験した毛髪房が全て、１．５Ｎ／ｍｇの毛髪（ＮＡＩＲ（登録商標）クリームで５分間処理された毛髪の基準強度）よりも著しく低い強度を有することを示した。
【０３９１】
試験条件において基質濃度が高いほど、処理された毛髪房の強度は低く、従って毛髪弱化効力は大きくなる。試験した最低の基質濃度、２５０ｍＭのトリアセチンおよび５０ｍＭのＨ２Ｏ２でさえ、処理された毛髪房の平均強度は０．７８Ｎ／ｍｇ毛髪であり、ＮＡ
ＩＲ（登録商標）５分の基準よりもはるかに低い。標的化ペルヒドロラーゼＨＣ１１２１は、非標的化ペルヒドロラーゼＣ２７７Ｓよりもわずかに優れた効力を示した。
【０３９２】
【表１１】
2014505046.tif 000022
【０３９３】
【表１２】
2014505046.tif 000023
【０３９４】
さらに、各毛髪サンプルに対してＬ＊、ａ＊、ｂ＊色測定を行い、毛髪の色抜けを定量化し、ΔＥ色差計算の参照として、未処理毛髪についてもＬ＊、ａ＊、ｂ＊色測定を行った。ΔＥは、ΔＥ＝（（Ｌ＊−Ｌ＊ｒｅｆ）２＋（ａ＊−ａ＊ｒｅｆ）２＋（ｂ＊−Ｂ＊ｒｅｆ）２）０．５として標準的な方法で計算した。表１１に示される結果は、処理毛髪サンプル全てについて強力な毛髪の淡色化（ｈａｉｒ  ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）（漂白効果）を示した。
【０３９５】
【表１３】
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【０３９６】
実施例９
低ｐＨ共配合基質ストックおよび緩衝ペルヒドロラーゼストックを用いる２コンパートメント脱毛製品
この実施例の目的は、１つのコンパートメントに低ｐＨ共配合基質ストックを有し、第２のコンパートメントに緩衝ペルヒドロラーゼストックを有する２コンパートメント試作製品の安定性および脱毛効力を示すことである。
【０３９７】
実施例７に記載されるものと同じ手順を用いて、５００ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を有する２Ｘ基質ストックを調製した。基質ストックのｐＨをｐＨ３に調整し、１つの管中で貯蔵した。２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１（配列番号２８８）を有する２Ｘペルヒドロラーゼストックを、２００ｍＭのｐＨ６．６のリン酸緩衝液中で調製し、別の管中で貯蔵した。この２コンパートメント試作製品の安定性を試験するために、１体積の２Ｘ基質ストックおよび同じ１体積の２Ｘペルヒドロラーゼストックをそれぞれの貯蔵管から取り出し、１時間の反応のために一緒に混合した後、１００ｍＭＨ３ＰＯ４による１０倍の酸性化によって反応を停止させた。ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＭＦ遠心装置（３０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ、Ｐ／Ｎ  ＯＤ０３０Ｃ３５）を用いて、反応停止したサンプルを、１２，０００ｒｐｍで６分間の遠心分離によりろ過した。ろ液をＨＰＬＣ  Ｋａｒｓｔ検定（上記）によりデュプリケートで分析して、１時間の反応時間で発生した過酢酸（ＰＡＡ）の量を決定した。この試験を４週間にわたって繰り返して、この２コンパートメント試作製品の安定性を決定した。
【０３９８】
上記のように調製したサンプルを「老化（ａｇｅｄ）酵素サンプル」と呼んだ。１）酵素を含まない対照（２Ｘ酵素ストックの代わりに同じ体積の２００ｍＭのｐＨ６．６のリン酸緩衝液を２Ｘ基質ストックと混合した）と、２）新鮮な酵素サンプル（５ｍｇ／ｍＬのＨＣ１１２１ストックを２００ｍＭのｐＨ６．６のリン酸緩衝液中に希釈することによって２０μｇ／ｍＬの溶液を毎日調製した）とについても同じ試験を実行した。表１２に示される結果は、この２コンパートメント製品（老化酵素サンプルおよび新鮮な酵素サンプルの両方）から、１日目と比較して３分の２の量のＰＡＡが２９日目に発生したが、酵素を含まない対照サンプルの非酵素的なＰＡＡの発生は同じままであったことを示す。これにより、低ｐＨ共配合基質ストックは室温で少なくとも４週間安定であり、新鮮な酵素サンプルおよび老化酵素サンプルは同様の経時的な安定性を示すことが暗示されたが、新鮮な酵素は、老化酵素サンプルよりも２０％高い過加水分解活性を示した。老化酵素サンプルのより低い活性は、アンフォールディングの確率がより高く、従って長期間希釈溶液中に存在する酵素の安定性がより低いことによって生じ得る。室温の緩衝液中の低濃度の酵素の安定性および活性は、非反応性の不活性タンパク質または当該技術分野において知られている他の添加剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖、グリセリンおよびポリオールなど）の添加によりさらに改善され得る。あるいは、酵素は、より高い濃度で貯蔵され、基質ストックと混ぜ合わせられるときにより少ない体積で使用され得る。
【０３９９】
【表１４】
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【０４００】
この２コンパートメント試作製品による毛髪処理を、毛髪房（５ｍｍ幅、４ｃｍ長さ、１００＋／−２０ｍｇの正味の毛髪重量で一端を接着）において、以下のように実行した：等しい体積の２Ｘ基質ストックおよび２Ｘペルヒドロラーゼストックを管内で混合してから、０．５ｍＬの反応混合物を、清浄なプラスチックトレイに載せた１つの毛髪房上に移した。反応混合物をアプリケータで毛髪房内に擦り込んだ。毛髪を２４時間トレイに入れたままにしてから、風乾させた後、１ｍＬの１％のＳＬＥＳで洗浄し、その後水道水ですすぎ、ペーパータオルで乾燥させた。２４時間の処理サイクルを各毛髪房において１４サイクル繰り返した後、引張強さ試験および色測定を行った。１）酵素を含まない対照（２Ｘ酵素ストックの代わりに同じ体積の２００ｍＭ、ｐＨ６．６のリン酸緩衝液を２Ｘ基質ストックと混合した）と、２）新鮮な酵素サンプル（５ｍｇ／ｍＬのＨＣ１１２１ストックを２００ｍＭのｐＨ６．６のリン酸緩衝液中に希釈することによって２０μｇ／ｍＬの溶液を毎日調製した）とを用いて、同じ毛髪処理を実行した。それぞれの試験条件に対して、トリプリケートの毛髪房を用いた。引張強さ試験結果および色抜け測定を表１３および１４に要約した。各サンプル中のＰＡＡの発生量と一致して、酵素を含まないサンプルは毛髪をあまり弱化させなかったが、２つの酵素含有サンプルと同程度に毛髪を淡色化した。一方、新鮮な酵素サンプルおよび老化酵素サンプルは、ＮＡＩＲ（登録商標）５分の基準よりもはるかに毛髪を弱化させた。新鮮な酵素サンプルでは２０％多いＰＡＡが発生されたので、新鮮な酵素サンプルで処理した毛髪の強度は老化酵素サンプルで処理した毛髪の強度の半分の値を有した、
【０４０１】
【表１５】
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【０４０２】
【表１６】
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【０４０３】
実施例１０
低ｐＨ共配合基質ストックおよび皮膚保湿剤中の緩衝ペルヒドロラーゼストックを用いる２コンパートメント脱毛製品
この実施例の目的は、１つのコンパートメントに低ｐＨ共配合基質ストックを有し、第２のコンパートメントに緩衝ペルヒドロラーゼ／皮膚保湿剤ストックを有する２コンパートメント試作製品の安定性および脱毛効力を示すことである。
【０４０４】
実施例９とは違って、２Ｘペルヒドロラーゼストックは、緩衝液中２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）Ｄａｉｌｙ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｌｏｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｒｙ  ｔｏ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｓｋｉｎ（本出願を通して「ＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）」と呼ばれる）中で作った。２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）は、１０ｍＬのＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローションを４０ｍＬのｐＨ６．６のリン酸緩衝液中に添加した後、ボルテックスして均一のローションにすることによって作った。これらの２Ｘペルヒドロラーゼストックの４つを、表１５に示されるように、２つの異なるペルヒドロラーゼ濃度レベルおよび２つの異なる緩衝液濃度レベルで作り、個々の管内に貯蔵した。実施例９に記載されるものと同じ手順を用いて、５００ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を有する２Ｘ基質ストックを調製した。基質ストックのｐＨをｐＨ３に調整し、１つの管に貯蔵した。実施例９に記載されるものと同じ安定性試験手順を４週間実行して、これらの２コンパートメント脱毛ローションサンプルの安定性を、１時間に発生されるＰＡＡの量に関してモニターした。結果は表１６に要約される。３週間の最後に、全てのサンプルについて、ＰＡＡの発生は初期レベルの７７〜９５％に保持された。４週間の最後には、ＰＡＡの発生は、３つのサンプルについては初期レベルの６０％まで降下し、より高いペルヒドロラーゼ濃度（２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１、配列番号２８８）およびより高い緩衝液濃度（１００ｍＭの緩衝液）を有するサンプルでは、初期レベルの８２％に保持された。実施例７の結果と比較して、より低いｐＨで貯蔵された基質ストックを有するこの２コンパートメント脱毛ローション試作製品からの安定性は中性ｐＨ（ｐＨ７）で貯蔵された基質よりもはるかに優れているが、４週間の最後に９０％のＰＡＡを発生させた新鮮なペルヒドロラーゼと併用した同様の製品よりは劣る。従って、この２コンパートメント脱毛ローション製品の安定性は、非反応性の不活性タンパク質または当該技術分野において知られている他の添加剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖、グリセリンおよびポリオールなど）を添加して、より低い濃度におけるペルヒドロラーゼの安定性を高めることによりさらに改善され得る。
【０４０５】
【表１７】
2014505046.tif 000028
【０４０６】
【表１８】
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【０４０７】
この２コンパートメント脱毛ローション試作製品による毛髪処理を、毛髪房（５ｍｍ幅、４ｃｍ長さ、１００＋／−２０ｍｇの正味の毛髪重量で一端を接着）において以下のように実行した：等しい体積の２Ｘ基質ストックおよび２Ｘペルヒドロラーゼストックを管内で混合してから、１ｍＬの反応混合物を、清浄なプラスチックトレイに入れた１つの毛髪房上に移した。反応混合物をアプリケータで毛髪房内に擦り込んだ。毛髪を３時間〜１６時間トレイに入れたままにしてから、風乾させた後、１ｍＬの１％のＳＬＥＳで洗浄し、その後水道水ですすぎ、ペーパータオルで乾燥させた。この処理サイクルを各毛髪房において１５サイクル繰り返した後、引張強さ試験および色測定を行った。引張強さ試験結果および色抜け測定を表１７および１８に要約した。この場合もやはり、酵素を含まないサンプルは毛髪を著しく淡色化したが、毛髪をあまり弱化させなかった。全ての酵素含有サンプルについて、酵素作用濃度が高く（２０μｇ／ｍＬ対１０μｇ／ｍＬ））、そして反応中の緩衝液濃度が高い（１００ｍＭ対５０ｍＭのリン酸）ほど、毛髪はより淡色化および弱化された。最も弱い条件の５０ｍＭの緩衝ローション中１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１では、毛髪はＮＡＩＲ（登録商標）５分処理と同程度に弱化され、毛髪強度は１．５Ｎ／ｍｇ毛髪まで低下された。最も強い条件の１０ｍＭの緩衝ローション中２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１では、毛髪は劇的に弱化され、毛髪強度は０．２Ｎ／ｍｇまで低下した。従って、２コンパートメント脱毛ローションは安定性および効力の両方を実証し、脱毛効力は、ペルヒドロラーゼレベルおよび緩衝液濃度により調整され得る。
【０４０８】
【表１９】
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【０４０９】
【表２０】
2014505046.tif 000031
【０４１０】
実施例１１
過酢酸を発生させるための異なるペルヒドロラーゼおよび異なる基質の使用
この実験のこの目的は、異なるペルヒドロラーゼおよび異なる基質を用いてＰＡＡが発生され得ることを実証することである。
【０４１１】
ＨＣ１１２１は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）からのＣＥ−７クラス炭水化物エステラーゼ（Ｃ２７７Ｓ−ＨＣ２６３、配列番号２８８）であり、ＨＣ１１６９は、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からのアシルエステラーゼ（ＡｒＥ−ＨＣ２６３、配列番号３２３）である。基質のトリアセチンまたはプロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ  ５２８０７２）と、ｐＨ５〜ｐＨ７．２の間の過酸化水素とを用いて、両方の酵素をその過加水分解活性について試験した。酵素、基質および緩衝液の濃度、ならびに反応時間は表１９に記載される。いくつかの反応条件に対して酵素を含まない反応を行い、非酵素的な過酢酸の発生も決定した。反応の最後に、１００ｍＭＨ３ＰＯ４による１０または２５倍の酸性化により反応を停止させた。ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＭＦ遠心装置（３０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ、Ｐ／Ｎ  ＯＤ０３０Ｃ３５）を用いて、反応停止したサンプルを、１２，０００ｒｐｍで６分間の遠心分離によりろ過した。ろ液をＨＰＬＣ  Ｋａｒｓｔ検定（上記）によりデュプリケートで検定して、これらの反応条件で発生した過酢酸（ＰＡＡ）の量を決定した。
【０４１２】
酵素を用いない第１の試験群（１００ｍＭのトリアセチンおよび２００ｍＭのＨ２Ｏ２を異なる緩衝液中で使用した）では、トリアセチンおよび過酸化水素は、５分間に非常に少量のＰＡＡ（１１０ｐｐｍのＰＡＡまたはそれ以下）を発生させたが、５０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１を添加すると、ｐＨに依存して、５分間に約２７７ｐｐｍ〜４８３２ｐｐｍＰＡＡが発生された。ｐＨが高いほど、ＰＡＡがより多く発生された。酵素を用いない第２の試験群（１００ｍＭのｐＨ７．２のリン酸緩衝液中２０％のＬＵＢＲＩＤＥＲＭ（登録商標）ローションにおいて２５０ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍのＭＨ２Ｏ２を使用した）では、トリアセチンおよび過酸化水素は、６０分間に３３２ｐｐｍのＰＡＡを発生させたが、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９を添加すると６０分間に３４３３ｐｐｍのＰＡＡが発生され、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１２１を添加すると６０分間に４４５１ｐｐｍのＰＡＡが発生された。第３の試験群（２５０ｍＭのトリアセチンおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を異なる緩衝液中で使用した）では、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は、３０分間に３６８０ｐｐｍ〜４８１２ｐｐｍのＰＡＡを発生させ、ｐＨに対する依存性は低いことが示された。第４の試験群（２５０ｍＭのＰＧＤＡおよび１００ｍＭのＨ２Ｏ２を異なる緩衝液中で使用した）では、１０μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は３０分間に４１４０ｐｐｍ〜４７２６ｐｐｍのＰＡＡを発生させ、この場合も、ｐＨに対す
る依存性は低いことが示された。さらに、１０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は提供された基質との反応を既に飽和させており、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９はＰＡＡの発生における付加的な利得を示さなかった。
【０４１３】
【表２１】
2014505046.tif 000032
【０４１４】
【表２２】
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【０４１５】
実施例１２
水中油エマルション中に共配合された低ｐＨ基質ストックの安定性および効力
この実施例の目的は、トリアセチンおよび過酸化水素基質ストックを水中油（ｏ／ｗ）エマルションベースの皮膚保湿剤中に共配合することができ、この基質含有皮膚保湿剤ストックが、ペルヒドロラーゼと効果的に反応してＰＡＡを生成できることを実証することである。
【０４１６】
全部で１００ｇの皮膚保湿剤製剤のスケールで、表２０に記載される順序および重量に従って、全ての油相成分をガラス瓶内に秤量した。次に、混合物を５０℃に加熱して、固体成分を可溶化した。水相の成分を互いに混合し、これも油相と同じ温度に加熱した。次に、水相を油相に添加し、ＩＫＡ（登録商標）Ｔ２５デジタルホモジナイザーを用いて２１０００〜２２０００ｒｐｍで５分間均質化してエマルションにした。最後に、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）ＸＢ（１ｇ）を防腐剤としてエマルションに添加した。このエマルションを２Ｘ基質ストックとして使用した。
【０４１７】
各試験時点で、酵素を含まない対照として、１体積のこのエマルションと、同じ１体積の２００ｍＭのｐＨ６のクエン酸緩衝液とを混合した。酵素含有サンプルについては、１体積のこのエマルションと、同じ１体積の酵素溶液（２００ｍＭのｐＨ６のクエン酸緩衝液中、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９作用濃度レベル）とを混合した。反応をローテーター上で１時間継続させた後、１００ｍＭのＨ３ＰＯ４による１０倍の酸性化により反応を停止させた。ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＭＦ遠心装置（３０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ、Ｐ／Ｎ  ＯＤ０３０Ｃ３５）を用いて、反応停止したサンプルを、１２，０００ｒｐｍで６分間の遠心分離によりろ過した。ろ液をＨＰＬＣ  Ｋａｒｓｔ検定（上記）によりデュプリケートで検定して、１時間の反応時間で発生した過酢酸（ＰＡＡ）の量を決定した。この試験を４週間にわたって繰り返して、これらの共配合基質ストックの安定性を決定した。安定性の結果は、表２１に要約した。１か月の貯蔵の後、ＰＡＡの発生は、初期レベルの７０％よりも高く保持された。
【０４１８】
また安定性試験からの反応混合物を使用して、実施例１０に記載されるように毛髪房を処理した：０．７ｍＬの反応混合物を、清浄なプラスチックトレイに載せた１つの毛髪房上に移した。反応混合物をアプリケータで毛髪房内に擦り込んだ。毛髪を３〜１６時間トレイに入れておき、風乾させてから、１ｍＬの１％のＳＬＥＳで洗浄し、その後、水道水ですすぎ、ペーパータオルで乾燥させた。この処理サイクルを各毛髪房において１０サイクル繰り返した後、引張強さ試験および色測定を行った。表２２に示される引張強さ試験結果および色抜け結果により、２０μｇ／ｍＬのＨＣ１１６９は０．２３Ｎ／ｍｇ毛髪の引張強さレベルまで毛髪を劇的に弱化し、２５ΔＥの色抜けを生じるが、酵素を含まない対照で処理された毛髪は依然として２．８Ｎ／ｍｇ毛髪の引張強さを有し、６ΔＥの色抜けを生じることが示された。これらの結果は、緩衝ペルヒドロラーゼ溶液と共に作用する場合に、低ｐＨ共配合基質／皮膚保湿剤ストックの大きい毛髪弱化効力および大きい毛髪淡色化効力を実証した。
【０４１９】
【表２３】
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【０４２０】
【表２４】
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【０４２１】
【表２５】
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【配列表】
2014505046000001.app
【国際調査報告】
2014505046.tif 000039
2014505046.tif 000040
2014505046.tif 000041