(57)【要約】本願は標的送達剤としての細菌ミニ細胞のインビボおよびインビトロでの使用に関連する。本願は、抗体または他のＦｃ含有標的化部分融合体および複合体に結合し、それらを提示することができるミニ細胞表面結合分子を使用して治療関連薬剤を優先的に標的送達するように企図されている、遺伝子操作された真正細菌ミニ細胞について記載する。
2014506893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全にインタクトな細菌ミニ細胞であって、
（ｉ）前記ミニ細胞の表面に提示されるプロテインＧのＦｃ結合部分またはプロテインＡのＦｃ結合部分、
（ｉｉ）１つ以上の生理活性分子、および
（ｉｉｉ）前記Ｆｃ結合部分に結合した１つ以上のＦｃ含有標的化分子
を含み、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子が真核生物性抗原を認識する、前記細菌ミニ細胞。
【請求項２】
プロテインＧのＦｃ結合部分を含む、請求項１に記載のミニ細胞。
【請求項３】
プロテインＡのＦｃ結合部分を含む、請求項１に記載のミニ細胞。
【請求項４】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つがタンパク毒素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項５】
前記タンパク毒素が、ゲロニン、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素Ａ／Ｂ断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＩおよび／またはＬＴＩＩ）、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素Ａ、志賀毒素、炭疽菌毒素、ＭＴＸ（バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の殺虫毒素）、ペルフリンゴリシンＯ、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素ＬＦおよびＥＦ、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンＢ、ボツリノリシンＥ３、ボツリノリシンＣ、ボツリヌス毒素Ａ、コレラ毒素、クロストリジウム毒素Ａ、Ｂおよびα、リシン、志賀Ａ毒素、志賀様Ａ毒素、コレラＡ毒素、百日咳ＳＩ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＢ）、リステリオリシンＯのｐＨ安定性異型体（ｐＨ非依存性；Ｌ４６１Ｔのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯの熱安定性異型体（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋのアミノ酸置換）、リス
テリオリシンＯのｐＨおよび熱安定性異型体（Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０ＫおよびＬ４６１Ｔのアミノ酸置換）、ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＯ  ｃ、ストレプトリシンＯ
ｅ、スフェリコリシン（ｓｐｈａｅｒｉｃｏｌｙｓｉｎ）、アントロリシン（ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、セレオリシン（ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ）、チューリンゲンシリシン（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）Ｏ、ワイヘンステファネンシリシン（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）、アルベオリシン（ａｌｖｅｏｌｙｓｉｎ）、ブレビリシン（ｂｒｅｖｉｌｙｓｉｎ）、ブチリクリシン（ｂｕｔｙｒｉｃｕｌｙｓｉｎ）、テタノリジンＯ、ノビリシン（ｎｏｖｙｉｌｙｓｉｎ）、レクチノリシン（ｌｅｃｔｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ニューモリシン、ミチリシン（ｍｉｔｉｌｙｓｉｎ）、シュードニューモリシン、スイリシン（ｓｕｉｌｙｓｉｎ）、インターメジリシン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、イバノリシン（ｉｖａｎｏｌｙｓｉｎ）、ゼーリゲリオリシン（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、バジノリシン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ピオリシン（ｐｙｏｌｙｓｉｎ）、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項４に記載のミニ細胞。
【請求項６】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つが小分子治療薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項７】
前記小分子治療薬が、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ合成阻害剤、微小管およびチューブリン結合剤、抗代謝剤、酸化損傷誘導剤、抗血管新生剤、内分泌治療剤、抗エストロゲン剤、Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのシグナル伝達系の阻害剤、ヒートショックタンパク質の阻害剤、レチノイド、成長因子受容体の阻害剤、抗有糸分裂化合物、抗炎症剤、細胞周期調節因子、転写因子阻害剤およびアポトーシス誘導剤、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項６に記載のミニ細胞。
【請求項８】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つが治療用核酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項９】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つが治療用ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１０】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つが小分子薬と治療用核酸の組合せである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１１】
前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つが腫瘍細胞表面分子に特異的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１２】
前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つが内皮細胞表面分子に特異的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１３】
前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つが腫瘍細胞と内皮細胞の両方に共通の標的に特異的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１４】
エンドソーム脱出剤をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のミニ細胞および薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項１６】
対象の疾患を治療する方法であって、請求項１５に記載の組成物を前記対象に投与し、
それにより前記疾患を治療することを含む方法。
【請求項１７】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つが感染性因子由来のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項１８】
前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つがプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的である、請求項１７に記載のミニ細胞。
【請求項１９】
前記プロフェッショナル抗原提示細胞が真核生物の樹状細胞またはマクロファージである、請求項１８に記載のミニ細胞。
【請求項２０】
前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つが腫瘍由来のタンパク質抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項２１】
前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つが真核生物の樹状細胞、好酸球、好中球、好塩基球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞またはマクロファージに特異的である、請求項２０に記載のミニ細胞。
【請求項２２】
エンドソーム脱出剤をさらに含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のミニ細胞。
【請求項２３】
免疫調節性アジュバントをさらに含む、請求項２２に記載のミニ細胞。
【請求項２４】
請求項１７〜２３のいずれか１項に記載のミニ細胞および薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項２５】
免疫の方法であって、それを必要とする対象に請求項２４に記載の組成物を投与することを含む免疫の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１１年２月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／４４２，９９９号および２０１１年８月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／５２６，２１９号の優先権を主張する。これらの関連出願の内容は、それらの全体の参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表と共に出願されている。その配列表は、２０１２年２月１４日に作成された「ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴ」という表題のファイルとして提出されており、そのサイズは２４８Ｋｂである。その配列表の電子形式の情報はその全体の参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本発明の分野
本願は、疾患の阻害または予防ならびに標的化インビボ画像化診断技術のために核酸、タンパク質、放射性核種および小分子薬をインビボ送達およびインビトロ送達するための標的送達媒体として真正細菌ミニ細胞を作製、精製、製剤および使用するための組成物および方法に関する。
【０００４】
関連技術の説明
本発明の理解の補助のために本発明の背景を以下に説明するが、それは本発明の先行技術を説明または構成するものと認めるわけではない。本願で言及または引用される論文、特許および特許出願、および他の全ての文献および電子的に入手可能な情報の内容は、それぞれ個々の公開物が具体的および個々に参照により組み込まれると示された場合と同じ程度で、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。出願者はそのような任意の論文、特許、特許出願、または他の文献のあらゆる情報資料を本願に物理的に組み込む権利を保持する。
【０００５】
多様な生理活性分子種を封入することができ、また特定の細胞、器官および組織タイプを選択的に標的とすることができる堅固な送達用媒体が非常に必要とされている。（ｉ）健康な細胞、器官および組織への対象内効果または対象外効果に起因する有害な傷害性副作用、（ｉｉ）貧弱な薬物動態（ＰＫ）、ならびに（ｉｉｉ）貧弱な細胞内取込を含む、１つ以上の生体内の制限事項が多くの分子治療を妨げる。疾患を引き起こす部位および細胞への直接的な細胞傷害性薬、イメージング剤、治療用核酸および他の生物学的活性がある治療用分子の標的送達であれば、病気ではない組織に及ぶ対象内または対象外の傷害性作用を減少させることによってこれらの欠陥の多くを取り除くことができ、治療薬の薬物動態の改善がより効果的な投与を可能とし、細胞内取込を向上させるだろう。したがって
、特定の細胞、器官および組織タイプを標的とした治療法の開発が、臨床的に重要な治療技術、診断技術、治療診断（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）技術およびイメージング技術にとって重要な新境地を意味することが良く理解されている。
【０００６】
ほとんどの癌の治療で使用される化学療法剤（例えば、小分子細胞傷害薬）およびタンパク毒素の場合、その化学療法薬またはタンパク毒素の効力は正常組織への傷害性によって大いに制限される。さらに、特に同一の細胞標的または機序が抗腫瘍活性と対正常組織傷害性の原因であるとき、全身性曝露レベルに寄与する薬物動態（ＰＫ）パラメータがしばしば、抗腫瘍活性を最大にするとともに副作用を最小にするように十分に最適化されていないし、最適化され得ない。このことの結果が非常に低い治療指数であり、それはほとんどの細胞傷害性化学療法薬とタンパク毒素に共通している。
【０００７】
既存の薬品の治療指数を高める１つの方法は、投与した用量のより大きなパーセンテージが腫瘍の近傍に届くように（受動的標的化）、および／または腫瘍細胞内に届くように（能動的標的化）、それらを結合、複合体化またはパッケージすることである。今日までに多種多様な標的送達アプローチがとられているが、市販されている製品はほとんどない。ポピュラーなアプローチには、リポソーム製剤の使用、免疫リポソーム製剤の使用、様々な高分子ナノテクノロジーの使用、抗体‐薬品融合体／複合体（ＡＤＣ）の使用、抗体またはリガンド‐タンパク毒素融合体／複合体の使用、およびデントリマーの使用が含まれる。「ステルス」アプローチを含むリポソーム製剤には限界があるが、（ｉ）それらが受動的標的化によってのみ機能すること、および（ｉｉ）それらは大規模に製造するのが困難であることが理由である。免疫リポソーム製剤は標的化コンポーネント（典型的には、抗体またはその抗原結合部分）を付加することによりリポソーム製剤の標的化の欠点を克服している。しかしながら、免疫リポソーム製剤は、「ステルス」技術を組み込んだものを含み、リポソーム製剤よりも製造がさらに困難である。標的化高分子ナノテクノロジーには限界があるが、積載物と標的化部分の共有結合を必要とすることが理由である。このことが製造を複雑にし、積載物の大きさと種類を制限し、また、血液中で循環している間に積載物を分解させる。抗体‐薬品融合体／複合体は、たいていは、積載量と積載物の代謝のため限界がある。抗体またはリガンド‐タンパク毒素融合体／複合体も対象外傷害性ならびに不十分な効力のため限界があるが、それは、標的細胞による取込みの後にエンドソーム小胞からタンパク毒素積載物が脱出して、それがその細胞質内の標的に効果的に到達することができないことが主な原因である。デンドリマーは抗体‐薬品融合体／複合体よりも大きい積載量を持ち、抗体を含む標的化部分と結合し、それらを提示することもできる。しかしながら、構築過程に伴う複雑な化学と化学操作のため、デンドリマーも製造が非常に困難である。したがって、任意の抗体（または、ＶＥＧＦ‐Ａなどの可溶性受容体リガンドのような他の標的化部分）が簡単に非共有結合的に結合または連結することができ、大量、および複数の組合せの生理活性積載物を封入することもでき、そして、大規模製造することができる送達系が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、完全にインタクトな細菌ミニ細胞であって、（ｉ）前記ミニ細胞の表面に提示されるプロテインＧのＦｃ結合部分またはプロテインＡのＦｃ結合部分、（ｉｉ）１つ以上の生理活性分子、および（ｉｉｉ）前記Ｆｃ結合部分に結合した１つ以上のＦｃ含有標的化分子を含み、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子が真核生物性抗原を認識する、ミニ細胞を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞はプロテインＧのＦｃ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞はプロテインＡのＦｃ結合部分を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つはタ
ンパク毒素である。いくつかの実施形態では、そのタンパク毒素は、ゲロニン、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素Ａ／Ｂ断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＩおよび／またはＬＴＩＩ）、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素Ａ、志賀毒素、炭疽菌毒素、ＭＴＸ（バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の殺虫毒素）、ペルフリンゴリシンＯ、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素ＬＦおよびＥＦ、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンＢ、ボツリノリシンＥ３、ボツリノリシンＣ、ボツリヌス毒素Ａ、コレラ毒素、クロストリジウム毒素Ａ、Ｂおよびα、リシン、志賀Ａ毒素、志賀様Ａ毒素、コレラＡ毒素、百日咳ＳＩ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＢ）、リステリオリシンＯのｐＨ安定性異型体（ｐＨ非依存性；Ｌ４６１Ｔのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯの熱安定性異型体（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯのｐＨおよび熱安定性異型体（Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０ＫおよびＬ４６１Ｔのアミノ酸置換）、ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＯ  ｃ、ストレプトリシンＯ  ｅ、スフェリコリシン（ｓｐｈａｅｒｉｃｏｌｙｓｉｎ）、アントロリシン（ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、セレオリシン（ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ）、チューリンゲンシリシン（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）Ｏ、ワイヘンステファネンシリシン（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）、アルベオリシン（ａｌｖｅｏｌｙｓｉｎ）、ブレビリシン（ｂｒｅｖｉｌｙｓｉｎ）、ブチリクリシン（ｂｕｔｙｒｉｃｕｌｙｓｉｎ）、テタノリジンＯ、ノビリシン（ｎｏｖｙｉｌｙｓｉｎ）、レクチノリシン（ｌｅｃｔｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ニューモリシン、ミチリシン（ｍｉｔｉｌｙｓｉｎ）、シュードニューモリシン、スイリシン（ｓｕｉｌｙｓｉｎ）、インターメジリシン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、イバノリシン（ｉｖａｎｏｌｙｓｉｎ）、ゼーリゲリオリシン（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、バジノリシン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ピオリシン（ｐｙｏｌｙｓｉｎ）、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つは小分子治療薬である。いくつかの実施形態では、その小分子治療薬は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ合成阻害剤、微小管およびチューブリン結合剤、抗代謝剤、酸化損傷誘導剤、抗血管新生剤、内分泌治療剤、抗エストロゲン剤、Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのシグナル伝達系の阻害剤、ヒートショックタンパク質の阻害剤、レチノイド、成長因子受容体の阻害剤、抗有糸分裂化合物、抗炎症剤、細胞周期調節因子、転写因子阻害剤およびアポトーシス誘導剤、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つは治療用核酸である。いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つは治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つは小分子薬と治療用核酸の組合せである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つは腫瘍細胞表面分子に特異的である。いくつかの実施形態では、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つは内皮細胞表面分子に特異的である。いくつかの実施形態では、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つは腫瘍細胞と内皮細胞の両方に共通の標的に特異的である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞はエンドソーム脱出剤をさらに含む。
【００１５】
本明細書に包含されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示されるミニ細胞のいずれかと薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００１６】
本明細書に包含されるいくつかの実施形態は、対象の疾患を治療する方法であって、本明細書に開示される組成物のいずれかをその対象に投与し、それによってその疾患を治療することを含む方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つは感染性因子由来のタンパク質である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つはプロフェッショナル抗原提示細胞に特異的である。いくつかの実施形態では、そのプロフェッショナル抗原提示細胞は真核生物の樹状細胞、好酸球、好中球、好塩基球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞またはマクロファージである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記の１つ以上の生理活性分子のうちの少なくとも１つは腫瘍由来のタンパク質抗原である。いくつかの実施形態では、前記の１つ以上のＦｃ含有標的化分子のうちの少なくとも１つは真核生物の樹状細胞またはマクロファージに特異的である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞はエンドソーム脱出剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞は免疫調節性アジュバントをさらに含む。
【００２１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、免疫の方法であって、それを必要とする対象に本明細書に開示される組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ミニ細胞に基づく水平流動免疫アッセイの例示的実施形態の模式図による呈示である。
【図２】ＥＬＩＳＡで測定した、ミニ細胞表面でのプロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合領域の発現および提示のレベルを示すグラフである。
【図３】プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分を発現および提示するミニ細胞の表面へのＶＥＧＦＲ２抗体の結合と提示を示すウエスタンブロットである。
【図４】プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分を発現および提示するミニ細胞の表面へのＥＧＦＲ１抗体の結合と提示を示すウエスタンブロットである。
【図５Ａ】プロテインＧを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図５Ｂ】プロテインＧを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図５Ｃ】プロテインＧを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図６Ａ】プロテインＡを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図６Ｂ】プロテインＡを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図６Ｃ】プロテインＡを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図６Ｄ】プロテインＡを発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞を使用して、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞が抗体依存的に蛍光染色ＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞を取り込むことを示す画像である。
【図７】トリプシン処理した細胞のＦＡＣＳ分析により測定した、プロテインＡを発現および提示する蛍光性ミニ細胞のＨ４６０ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍細胞によるＥＧＦＲ１標的化細胞内への取込の相対レベルを示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ結合性ミニ細胞」という用語は、ミニ細胞組成物であって、そのミニ細胞組成物では、ミニ細胞およびそのミニ細胞が由来するミニ細胞産生細菌株は、（ｉ）外膜輸出（分泌）シグナル、（ｉｉ）外膜アンカードメインまたは任意のその機能性同等物、および（ｉｉｉ）プロテインＡまたはプロテインＧのどちらかのＦｃ結合ドメインのうちの１つ以上から構成される融合タンパク質をその細胞表面に発現および提示し、そのミニ細胞が抗体および／または融合体／複合体分子のＦｃ領域との相互作用を介して外来性の抗体、Ｆｃ含有抗体派生物またはＦｃ含有融合体／複合体分子に結合することができる、そのミニ細胞組成物を指す。いくつかの実施形態では、ミニ細胞は、（ｉ）外膜輸出（分泌）シグナル、（ｉｉ）外膜アンカードメインまたは任意のその機能性同等物、および（ｉｉｉ）哺乳類Ｆｃ受容体のＦｃ結合ドメイン（および任意のその機能性同等物）から構成されるＦｃ結合性融合タンパク質を発現および提示し、そのミニ細胞は抗体および／または融合体／複合体分子のＦｃ領域との相互作用を介して外来性の抗体またはＦｃ含有融合体／複合体分子に結合することができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「標的化治療用ミニ細胞」という用語は、選択された生理活性分子を封入し、そして、抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子が提示されるように、組換え発現した表面局在性のプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域との相互作用により標的化抗体および／または他のＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をそのミニ細胞の外表面に提示する細菌ミニ細胞であって、前記ミニ細胞の分子内容物を標的細胞、組織および器官タイプにインビトロまたはインビボで送達するために、疾患の発生、進行および／または持続に関わる特定の細胞、器官または組織タイプに特異的に結合し、それに結合され、またはどうにかして特異的にそれを認識し、それによりそれに送達する、それに局在する、またはその表面もしくは内部で凝集することができる細菌ミニ細胞を指す。本明細書に記載される種類の疾患の治療に対する治療アプローチが望ましい、標的とされる細胞、器官および組織タイプに治療用積載物を送達するため、この特異的標的化にミニ細胞を使用することが企図されている。標的化治療用ミニ細胞は、細菌細胞溶解素（リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）およびペルフリンゴシンＯ（ＰＦＯ）など）および任意のそれらの機能性異型体または同等物を含むが、これらに限定されないエンドソーム破壊剤を含有することもできる。エンドソーム破壊剤としてＰＣ‐ＰＬＣまたはＰＩ‐ＰＬＣなどのホスホリパーゼを使用することもできる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「標的化診断用ミニ細胞」という用語は、選択されたイメージング分子を封入し、そして、抗体が提示されるように、組換え発現した表面局在性のプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域との相互作用により標的化抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をそのミニ細胞の外表面に提示する細菌ミニ細胞であって、前記ミニ細胞の分子イメージング内容物を標的細胞、組織および器官タイプにインビトロまたはインビボで送達するために、疾患の発生、進行および／または持続に関わる特定の細胞、器官または組織タイプに特異的に結合し、それに結合され、またはどうにかして特異的にそれを認識し、それによりそれ送達する、それに局在する、またはその表面もしくは内部で凝集することができる細菌ミニ細胞を指す。いくつかの実施形態では、疾患の診断アプローチの全体または一部が望ましい、標的とされる細胞、器官および組織タイプに分子イメージング剤を濃縮するため、この特異的標的化にミニ細胞を使用することが企図されている。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「標的化ミニ細胞ワクチン」という用語は、選択された感染性疾患因子または腫瘍細胞に由来するタンパク質抗原および／または核酸系ワクチン（例えば、ＤＮＡ系ワクチンまたはＲＮＡ系ワクチン）を封入し、そして、抗体が提示されるように、組換え発現した表面局在性のプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域との相互作用により免疫系の抗原提示細胞に特異的な標的化抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をそのミニ細胞の外表面に提示する細菌ミニ細胞であって、ミニ細胞の抗原性内容物を抗原提示性の標的細胞、組織および器官タイプにインビトロまたはインビボで送達するために、受容者側の免疫応答の発生、進行および／または持続に関わる抗原提示性の細胞、器官または組織タイプに特異的に結合し、それに結合され、またはどうにかして特異的にそれを認識し、それによりそれに送達する、それに局在する、またはその表面もしくは内部で凝集することができる細菌ミニ細胞を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特定の種類の感染性疾患または自己疾患に対する受容者側の防御免疫応答を誘発することが望ましい、抗原提示性の細胞、器官および組織タイプにタンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントを濃縮するため、抗原提示細胞特異的標的化に標的化ミニ細胞ワクチンを使用することが企図されている。その標的化ミニ細胞ワクチンは、細菌細胞溶解素（ＬＬＯおよびＰＦＯなど）および任意のそれらの機能性異型体または同等物を含むが、これらに限定されないエンドソーム破壊剤を含むことができる。エンドソーム破壊剤としてＰＣ‐ＰＬＣまたはＰＩ‐ＰＬＣなどのホスホリパーゼを使用することもできる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「標的化能がある」という用語はプロテインＧまたはプロテインＡの１つ以上のＦｃ結合ドメインを発現および提示し、目的の標的化抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子にさらに結合し、それを提示するミニ細胞を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「インテグリン標的化ミニ細胞」という用語は、パン‐β１インテグリン標的化細胞表面分子であるエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のインベイシン（Ｉｎｖａｓｉｎ）および任意のその機能性同等物を発現および提示するミニ細胞を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「インテグリン標的化治療用ミニ細胞」という用語は、パン‐β１インテグリン標的化細胞表面分子であるエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のインベイシン（Ｉｎｖａｓｉｎ）および任意のその機能性同等物を発現および提示するミニ細胞であって、治療用ポリペプチド、小分子薬、治療用核酸、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない生理活性分子を含むミニ細胞を指す。そのインテグリン標的化治療用ミニ細胞は、細菌細胞溶解素（ＬＬＯおよびＰＦＯなど）および任意のそれらの機能性異型体または同等物を含むが、これらに限定されないエンドソーム破壊剤を含有することができる。エンドソーム破壊剤としてＰＣ‐ＰＬＣまたはＰＩ‐ＰＬＣなどのホスホリパーゼを使用することもできる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「細胞特異的表面抗原」という用語は、任意の組織、器官もしくは細胞タイプの表面に優先的に発現する、または任意の組織、器官もしくは細胞タイプが優先的に分泌する任意のタンパク質、ペプチド、炭水化物または核酸を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「原核生物性細胞分裂遺伝子」という用語は、原核生物の細胞分裂過程に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。多くの細胞分裂遺伝子が
当技術分野で発見および特性解析されている。細胞分裂遺伝子の例にはｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＺ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｓｅｑＡ、ｃｃｄＢ、ｓｆｉＣ、およびｄｄｌＢが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、１つの生物から別の生物に自然に伝達される、または多数の遺伝子操作技術のうちのいずれかにより伝達される遺伝子または遺伝物質を指す。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、１つの生物から単離され、異なる生物に導入される遺伝子配列を含むＤＮＡの断片である。このＤＮＡの非天然セグメントは遺伝子導入生物でＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持することができ、または遺伝子導入生物の遺伝コードの正常な機能を変更することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、それが遺伝子コード配列を含むかどうかに関係なく、人工的に構築されたＤＮＡ配列であり、その導入遺伝子が以前には認められなかった生物に導入される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、ある作用剤が精製される組成物と比較して、組成物中でその作用剤の濃度が上昇する場合、および／または１つ以上の好ましくない混入汚染物質の濃度が低下する場合、その作用剤が「精製されている」と言う。いくつかの実施形態では、精製には組成物中での作用剤の濃縮および／または組成物からの作用剤の単離が含まれる。
【００３４】
「親細胞がほとんど無い」という用語は、「ほとんど無い」と同義であり、本明細書で使用される場合、標的化治療用ミニ細胞の傷害性プロファイルおよび／または治療効果に影響がほとんど、または全く無いレベルの親細胞の混入を有する、精製されたミニ細胞からなる組成物を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」という用語は、共通した物理的特徴および／または化学的特徴を共有する分子または構造からなる領域を指す。タンパク質ドメインの非限定的な例には疎水性膜貫通領域または周辺膜結合領域、球状酵素領域または球状受容体領域、タンパク質間相互作用ドメイン、および／または核酸結合ドメインが挙げられる。
【００３６】
「真正細菌」および「原核生物」という用語は、これらの用語が当業者によって使用される通りに本明細書で使用される。本明細書で使用される「真正細菌の」および「原核生物の」という用語は、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方を含む真正細菌、原核生物ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、および偏性細胞内寄生体（例えば、リケッチア、クラミジアなど）を包含する。
【００３７】
本明細書で使用される「治療用核酸」という用語は、真核生物（例えば、ヒトなどの哺乳類）に導入されると治療効果を有する様々な核酸分子の任意の集合を指す。治療用核酸はｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）、ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、ｔＲＮＡ（低使用頻度のコドンに対応するｔＲＮＡを含む）、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【００３８】
本明細書で使用される「治療用ポリペプチド」という用語は、真核生物（例えば、ヒトなどの哺乳類）に投入されると治療効果を有する様々な種類のタンパク質分子の任意の集合を指す。治療用ポリペプチドはタンパク毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、機能
性酵素、活性型カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、または前述のものの任意の組合せおよび／または前述のもののうちの複数のものであり得る。
【００３９】
本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、ＤＮＡがコードする機能性核酸、ポリペプチドまたはタンパク質の宿主細胞における発現であって、その核酸、ポリペプチドまたはタンパク質がその宿主細胞に元々存在しないか、その宿主細胞でその核酸、ポリペプチドまたはタンパク質が、その核酸、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする内在性遺伝子から通常発現されるレベルよりも高いレベルでそれらが存在するときの発現を指す。
【００４０】
「調節する」という用語は、本明細書で使用される場合、標的と直接的か間接的のどちらかで相互作用して標的の生物学的プロセスを制御する活性を変化させることを意味する。「調節」の様式には、標的の活性の増強、標的の活性の阻害、標的の活性の制限、および標的の活性の拡大が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
「異種性の」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、遺伝子、核酸、イメージング剤、緩衝成分、または他の任意の生物学的に活性が有る、もしくは不活性な物質であって、自然ではミニ細胞またはミニ細胞産生細菌株で通常は見つからず、そして、前記の異種性の物質をコードする、または前記の異種性の物質（例えば、親細胞に本来備わっていない生理活性代謝物）を産生することができる遺伝子をコードする組換え遺伝物質を持つミニ細胞産生細菌株が発現、転写、翻訳、増幅、そうでなければ生成する物質を指す。
【００４２】
「外来性」という用語は、本明細書で使用される場合、ある細胞、またはミニ細胞の場合はそのミニ細胞の親細胞に本来備わっていないタンパク質（抗体を含む）、遺伝子、核酸、小分子薬、イメージング剤、緩衝液、放射性核種、または他の任意の生物学的に活性が有る、もしくは不活性な物質を指す。外来性物質は、それが別々に産生され、精製され、そして付加されるため、異種性の物質とは異なる。
【００４３】
「治療に役立つ」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患、または動物における他の異常な生物学的プロセスを予防する、阻害する、またはその進行を妨げる生物学的効果または生物学的効果の組合せを有することを意味する。
【００４４】
「診断に役立つ」という用語は、本明細書で使用される場合、動物（ヒトを含む）で、または血液、尿、唾液、汗および便を含むが、これらに限定されない生物試料から疾患または健康状態を検出、モニター、経過観察および／または特定する能力を有することを意味する。
【００４５】
「治療診断に役立つ（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）」という用語は、本明細書で使用される場合、治療用組成物と診断用組成物の混合効果を有することを意味する。
【００４６】
「組換え発現した」という用語は、本明細書で使用される場合、現代の遺伝子操作技術を用いて人工的に構築した核酸分子であって、ミニ細胞および／またはミニ細胞産生細菌株に自然では生じず、エピソーム性核酸分子またはミニ細胞産生細菌の染色体の一部として存在する核酸分子からの１つ以上の核酸および／またはタンパク質の発現を意味する。
【００４７】
「エピソーム性」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の生物または細胞の染色体から独立した核酸分子を意味する。
【００４８】
「無害化された」という用語は、本明細書で使用される場合、組成物またはその成分になされた改変であって、改変された組成物またはその成分に属する急性毒性が、その組成物またはその成分に属する毒性の原因となる生物学的原理が何であるかに関係なく、著しく低下することになる改変を指す。
【００４９】
「遺伝子サイレンシング」という用語は、本明細書で使用される場合、標的化ミニ細胞により送達される治療用核酸の送達の結果として、所与のタンパク質をコードするｍＲＮＡの細胞内プールがそのｍＲＮＡの正常レベルと比較して、特異的に減少することを指す。治療用核酸には二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）および一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）およびそれらをコードする任意の真核生物発現プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
「真核生物発現プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、環状二本鎖ＤＮＡ分子であって、真核細胞がその二本鎖ＤＮＡ分子から遺伝子産物を転写および翻訳することができるように、真核生物の発現制御配列に機能するように結合した１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「生理活性分子」という用語は、真核生物または真核細胞に導入されると真核生物（例えば、ヒトなどの哺乳類）に対する生物学的効果を有する分子を指す。生理活性分子には治療用核酸、治療用ポリペプチド（タンパク毒素を含む）、および小分子治療薬が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ含有標的化分子」という用語は、Ｆｃ結合分子（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分）に結合することができ、そして、標的分子（例えば、抗原または受容体）の認識部位を含有する分子を指す。Ｆｃ含有標的化分子にはＦｃ領域を有する抗体およびＦｃ領域を含むように設計された可溶性受容体リガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「真核生物性抗原」という用語は真核生物起源の抗原、例えば、真核細胞の表面に提示される抗原を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「タンパク毒素」という用語は、真核細胞に対して傷害性作用を有するタンパク質を指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、生物学的効果を有し、そして、５０００ダルトン未満の分子量を有する分子を指す。いくつかの実施形態では、小分子は２５００ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、小分子は１０００ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、小分子は８００ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、小分子は５００ダルトン未満の分子量を有する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「小分子治療薬」または「小分子薬」という用語は、真核生物（例えば、ヒトなどの哺乳類）に導入されると治療効果を有する小分子を指す。
【００５７】
説明
本願はインビトロおよびインビボ標的化生理活性分子送達剤およびワクチン剤としての細菌ミニ細胞の使用法に関連する。真正細菌ミニ細胞は、インビボで特定の細胞タイプを標的とし、多種多様な生理活性分子を送達するようにそれらを設計することができるという点で送達媒体として明白な利点を有する。細菌ミニ細胞は、動物で疾患または他の異常な生物学的プロセスの発生、進行、維持および持続に関与する細胞タイプまたは組織に対
してミニ細胞を特異的に標的化する抗体および／または他のＦｃ含有融合体／複合体をそのミニ細胞の表面に提示するように設計されている。
【００５８】
ミニ細胞は、細菌細胞の正常な細胞分裂装置の破壊後に細菌によって形成される、染色体が無い、膜で被包された生物的ナノ粒子（直径約２５０〜５００ｎｍ）である。本質的に、ミニ細胞は、染色体ＤＮＡを含まず、したがって、分裂せず、生育不能であることを除いて正常な細菌細胞の小型で代謝的に活性が有る複製物である。ミニ細胞は細菌の染色体を含まないが、（染色体よりも小さい）プラスミドＤＮＡ分子、（あらゆるサブタイプの）ＲＮＡ分子、天然および／または組換え発現タンパク質、ならびに他の代謝物の全てがミニ細胞に分配されることが示されている。ミニ細胞は、他の送達技術の個々の利点の多くを組み合わせて単一の多用途送達媒体にしているので、インビボ治療送達用、診断用、治療診断用、およびイメージング用媒体として比類ないほど適している。疾患の検出、予防、持続および／または阻害が望ましい予防的医療用途および治療的医療用途の両方での後続の送達のため、ミニ細胞は、様々な核酸、タンパク質、小分子薬、およびそれらの任意の組合せを含む、生物学的活性がある分子を優先的に封入し、それらと結合し、またはそれらを吸着するように「設計」され得る。本明細書に記載されるように、ミニ細胞は、任意のＦｃ領域含有抗体またはＦｃ領域含有抗体派生物、ならびにポリペプチド、核酸、ＤＡＲＰｉｎ、放射性核種、炭水化物、小分子およびイメージング剤を含むが、これらに限定されないＦｃ領域含有融合体または複合体を提示することができる新規の表面提示システムを使用することで疾患の原因である特定の細胞タイプを選択的に標的とするように設計され得る利点を有する。
【００５９】
送達媒体としてミニ細胞を使用することの別の利点は（それらが標的化されているかいないかに関係なく）、その全体の参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１８３，１０５号に記載される組合せで生理活性分子を送達することができることである。例えば、ミニ細胞は、プラスミドＤＮＡワクチンの送達媒体として使用されると異種性の抗原に対する液性免疫応答を発生させることに成功することができることが示されている。ミニ細胞を使用してＤＮＡワクチンおよび対応するタンパク質抗原の両方を同時に送達すると、液性応答が大いに向上したが、これは送達の選択肢に関してミニ細胞の柔軟性による利益を示している。本明細書に記載されるように、ミニ細胞は小分子薬およびイメージング剤の負荷を可能とする独自の特徴、ならびに治療用核酸送達分子、ペプチドおよびタンパク質を組換え発現し、送達のために封入する特徴的な能力を有する。これらの独自の特徴によって、分子的起源が異なる複数の積載物を共に送達することができる非常に柔軟な送達システムが可能になる。
【００６０】
ミニ細胞を真核細胞に対してインビトロおよびインビボで標的化するためのアプローチには、（ｉ）当技術分野において公知の無数の化学カップリング技術を使用する、抗体、抗体断片または他の抗体派生物のミニ細胞表面への無作為化学カップリング、（ｉｉ）ミニ細胞表面に標的化抗体を非共有結合する二特異性抗体、二特異性抗体断片または二特異性抗体派生物の使用、および（ｉｉｉ）細菌外膜タンパク質などのミニ細胞膜‐アンカータンパク質との連続的な融合体の形状をとる単鎖抗体または他の抗体断片のミニ細胞表面での発現が含まれる。本願は、治療用ミニ細胞の作製、免疫原性および標的化に関する重要な利点を提供する新規のアプローチについて説明する。
【００６１】
溶液中に遊離状態で存在する外来性抗体をミニ細胞表面に架橋する場合では、これらの分子は多様な方向でミニ細胞の表面に無作為に架橋するので、抗体またはＦｃ融合体／複合体の配向に対する制御が無い。これは、製造を複雑にし、効力を減じる可能性がある、最終産物に対する２つの潜在的な効果を有する。第一の有害な効果は全長型抗体の架橋、およびそれの結合領域ではなくＦｃ領域の露出にのみ当てはまり、それは抗体または他のＦｃ領域含有融合体／複合体のどちらの末端がミニ細胞表面と結合するかに依存する。Ｆ
ｃ領域は、免疫系の様々な構成要素（例えば、ナチュラルキラー細胞の表面上のＦｃ受容体）とのＦｃ領域の相互作用によって免疫系を刺激する能力を有する。第二の有害な効果は、表面上の抗体（または他のＦｃ領域含有融合体／複合体）の配向に関して固有の不均一性が存在し、その結果、全ての結合領域が露出するわけではないことである。可変結合部分の露出は、ミニ細胞表面上の機能性結合部分の数が少なくなることの結果として効力が消失する、および／または多様になる可能性を有する。これらの制限のどちらか、または両方がミニ細胞の免疫原性および／またはクリアランスを上昇させる可能性があり、それらを効果が弱い治療用送達媒体とする。しかしながら、本開示の背景で使用されるとき、本開示のＦｃ結合性ミニ細胞は抗体の方向付けに役立ち、（ｉ）抗体のＦｃ領域が覆い隠され、ならびに（ｉｉ）結合した抗体および架橋した抗体の抗原結合部位が適切に提示される（すなわち、無作為方向付けと反対の、ミニ細胞から外側への方向付け）ので、ミニ細胞表面への抗体の化学架橋は上記の問題を回避する。本明細書で使用される場合、架橋試薬は「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」であり得る（それぞれ、同一または異なる反応性基を有する）。架橋試薬の例には表１に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。この点では、架橋に関する好ましい方法には、当技術分野において公知の標準的方法を用いて本明細書に記載されるようなＦｃ結合性ミニ細胞を産生および精製すること、選択された標的化抗体を含有する溶液中でミニ細胞をインキュベートすること、結合を発生させること、過剰な未結合の抗体を洗い流すこと、架橋反応を実行すること、および、引き続いて過剰な架橋試薬を除去することが含まれる。
【００６２】
本明細書に開示される組成物および方法は、二特異性抗体、二特異性抗体断片および二特異性抗体派生物を使用する組成物および方法のうちのいくつかよりも利点がある。例えば、一方の抗体腕に天然のミニ細胞表面構成要素への特異性を有し、他方の腕に真核細胞表面標的への特異性を有する二特異性抗体の作製には金がかかる場合がある。さらに、二特異性抗体は、ミニ細胞表面に化学的に結合した抗体のように、Ｆｃ領域を露出し、補体を活性化する可能性、および／または、インビボで免疫系のＦｃ結合細胞に対してＦｃ領域を接近しやすくする可能性がある。Ｆｃ領域を含まない二特異性抗体断片は、これらの種類の分子は二特異性抗体の場合よりも多くの遺伝子操作を必要とすることを除いて、インビボでのＦｃ領域の露出に関連する問題を回避することができる。二特異性抗体複合体を構築する場合、複数の欠点が存在する。当技術分野において公知の共有結合性架橋方法を用いて二特異性抗体複合体を作製する場合、精製して過剰な化学架橋薬剤を除去しなくてはならないことに関して、抗体をミニ細胞に直接架橋する場合と同じ制限が当てはまる。等モル量の抗体を一緒に混合し、続いて外来性の化学架橋薬剤を添加して反応を触媒することにより生体特異的抗体複合体を作製するので、望まれない二重一特異的種を除去するためのさらなる精製が必要である。望まれない二重一特異的種を除去することができないと、ミニ細胞に対する親和性を有する一特異的抗体が存在する結果としてミニ細胞の他のミニ細胞への架橋が引き起こされるだろう。米国特許第７，１８３，１０５号の教示により不必要になった関連のアプローチでは、２つの異なる一特異的抗体を連結して米国特許出願公開第２００８００５１４６９号、第２００７０２９８０５６号および第２００７０２３７７４４号に記載される「二特異性リガンド」を形成するための非共有結合性の足場としてハイブリッドプロテインＡ／Ｇ分子を使用する。これらの特許出願公開のそれぞれが全体の参照により本明細書に組み込まれる。前記の足場として使用されるプロテインＡ／Ｇ分子はプロテインＡ／Ｇ分子当たり６つの異なる抗体と無差別的に結合するので、このアプローチを用いることで凝集の問題が拡大する。また、２つの別個の抗体種を当量で混合し、続いてプロテインＡ／Ｇを添加してその２つの異なる抗体を非共有結合して連結する。このアプローチでは、７２０種の異なる順列の抗体複合体が作製され、その大半が２個〜６個のミニ細胞への親和性を有する。この制限によって、ＧＭＰ基準に従うために、費用が掛かり複雑な製造方法が導入されることが必要になる。これは、この種のミニ細胞製品の製造に必要とされる様々な構成要素全ての費用に付加される。その他の問題は、患者に凝集産物を投与することに伴う毒性の可能性が大きいことである。化学架橋を用
いるときのように、これらの制限もミニ細胞の免疫原性および／またはクリアランスを上昇させる可能性があり、それらを効果が弱い治療用送達媒体とする。本明細書に開示されるＦｃ結合性ミニ細胞は、治療法としてそれらが投与される種に抗体が由来するとき、免疫原性を低下させる。Ｆｃ結合性ミニ細胞は抗体またはＦｃ含有融合体／複合体のＦｃ領域に結合するので、それによってＦｃ領域が免疫系のＦｃ受容体発現細胞（例えば、マクロファージおよびＮＫ細胞）から隠匿される。さらに、利用する抗体が、治療法としてミニ細胞が投与される予定の種に由来するとき、そのミニ細胞は、その時には「自己」タンパク質（抗体）によって表面が覆われているという点で「ステルス性」になる。免疫能を有する生物は「自己」タンパク質を容易に認識することはない。「自己」タンパク質（例えば、抗体）に結合し、それらを提示するミニ細胞はそれによって免疫系からさらに隠匿される。標的化治療用ミニ細胞を免疫系から隠匿することは、ミニ細胞のインビボ半減期を長くすることができ、そのミニ細胞の企図されている標的に到達するより長いウインドウを提供するので、利点がある。
【００６３】
細菌外膜タンパク質の細胞外ドメインへの連続的な融合タンパク質の形状でミニ細胞表面上に単鎖抗体を発現および提示する場合では、２つの制限が存在する。第一の制限は、全てのモノクローナル抗体配列が単鎖抗体断片に変換され、元の親モノクローナル抗体分子と同じ結合特性を維持することができるわけではないことである。第二の制限は、モノクローナル抗体が単鎖抗体断片に変換され得る場合でも、時には、様々な融合配列およびリンカーコンストラクトの生成により結合能を最適化しなくてはならないということである。したがって、単鎖抗体提示アプローチは、親抗体分子の全体または大部分の活性を維持する単鎖抗体だけに限定される。多数の単鎖抗体が存在し、そして、単鎖抗体または抗体断片を発現および提示するミニ細胞組成物にそれらを組み込むことができるが、本明細書で教示されるように、全長型モノクローナル抗体を提示することができることがさらなる利点である。なぜなら、そのことが抗体のレパートリーをさらに拡大し、それにより、当業者が成功の可能性がある薬品開発候補を選択し、その選択過程をスピードアップすることができるからである。いくつかの実施形態では、ミニ細胞表面上での発現と提示のために単鎖に変換するときに有用な抗体候補の選択に外来性の全長型抗体のライブラリーを「スクリーニング」するために本明細書に開示されるＦｃ結合性ミニ細胞を使用することができる。他の実施形態では、どの単鎖抗体が、ミニ細胞表面上で発現および提示されるように設計された融合タンパク質に変換される場合にその結合特性および取込特性を維持するのか決定するための一次選択過程として、単鎖抗体のライブラリーをスクリーニングするために本明細書に開示されるＦｃ結合性ミニ細胞を使用することができる。さらに別の例では、Ｆｃ含有融合タンパク質または複合体化タンパク質をスクリーニングするためにＦｃ結合性ミニ細胞を使用することができる。そのようなＦｃ含有融合体および複合体が本明細書においてより詳細に説明される。
【００６４】
上記の制限の多くを克服するための新規のアプローチが本明細書に開示され、そのアプローチでは、（ｉ）外膜輸出（分泌）配列、（ｉｉ）外膜タンパク質またはその膜アンカー部分、および（ｉｉｉ）プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分から構成される融合タンパク質をミニ細胞表面上で発現および提示するミニ細胞の表面に直接的に抗体または他のＦｃ領域含有融合体／複合体を非共有結合する。プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合領域の１つ以上を提示するミニ細胞は、ミニ細胞、抗体またはＦｃ領域含有融合体／複合体に何の修飾または操作をすることなく、ミニ細胞と抗体またはＦｃ領域含有融合体／複合体との共インキュベーションにより、抗体または融合体／複合体のＦｃ領域を介して全長型抗体および／または他のＦｃ領域含有融合体／複合体に結合することができる。
【００６５】
本明細書に開示される組成物および方法は上記のカップリングアプローチよりも利点がある。例えば、それらは、ミニ細胞表面上のプロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合
性融合分子への抗体またはＦｃ含有融合体／複合体の結合により、（ｉ）抗体のＦｃ領域を覆い隠し、および（ｉｉ）抗体および／または融合体／複合体の抗原結合／エフェクタードメインを最適に露出するように、抗体または他のＦｃ含有融合体／複合体を提示する。次に、生理活性積載物のうちの１つ以上の種をミニ細胞にさらに負荷することができるが、それは、精製されたミニ細胞へその積載物を外部から添加するか、ミニ細胞の形成前または形成中にミニ細胞産生親細菌からその積載物を組換え発現するかのどちらかによるものである。ミニ細胞で発現する、またはミニ細胞に負荷される生理活性積載物には、小分子薬および／または放射性核種、治療用一本鎖短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡとしても知られるｓｓＲＮＡ）、治療用二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、治療用ポリペプチド（例えば、タンパク毒素）、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする真核生物の発現プラスミド、および前述の生理活性積載物の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生理活性積載物またはその組合せが負荷され、また、真核細胞表面分子を認識する抗体または他の融合体／複合体を提示するミニ細胞は、本明細書に記載される変異型無害化リポ多糖（ＬＰＳ）分子から構成される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、生理活性積載物を含む標的化ミニ細胞はインビボまたはインビトロでそれらの同種の真核細胞表面分子を標的とし、およびそれと相互作用し、ミニ細胞のエンドサイトーシスを促進し、そして、分解され、それにより標的とした真核細胞に直接的にその内容物を放出する。いくつかの他の実施形態では、生理活性積載物を含むミニ細胞はインビボまたはインビトロでそれらの同種の真核細胞表面分子を標的とし、およびそれと相互作用するが、ミニ細胞のエンドサイトーシスを促進しない。これらは「局在化」ミニ細胞と呼称され、最終的には標的細胞表面またはその近傍で分解され、それにより標的とされた真核細胞の近傍で直接的にその内容物を放出し、それによって積載物が標的細胞に治療効果を及ぼすことができる。本明細書に開示されるミニ細胞およびミニ細胞産生細菌株はプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合部分のうちの１つ以上を発現および提示するように遺伝子操作されており、その結果、それらは抗体および／または他のＦｃ含有融合体／複合体のＦｃ領域を認識および結合することができる。プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域のうちの１つ以上を提示するミニ細胞が結合する抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体は、ミニ細胞本明細書に開示される標的化ミニ細胞の標的性コンポーネントを構成する。
【００６７】
プロテインＧは、グラム陽性細菌Ｇ群連鎖球菌が発現する細胞表面タンパク質である。その自然の生物学的機能は、抗体のＦｃ領域に結合して免疫系からそのＦｃ領域を隠匿することにより感染過程の間にＧ群連鎖球菌のオプソニン化を防ぐことである。通常、抗細菌細胞表面抗原抗体は細菌細胞の表面に結合し、細菌細胞表面結合性抗体のＦｃ領域の外部露出に依存してオプソニン化および／または補体の活性化を誘導する。プロテインＧは、抗体のＦｃ領域に結合し、露出したＦｃ領域をそれにより免疫系から隠匿することによって、Ｇ群連鎖球菌においてこれを防ぐように働く。プロテインＧは１３個の別個のドメインからなる５１キロダルトンのタンパク質であり、そのドメインは通常Ａ／Ｂドメイン、Ｓドメイン、Ｃ／ＤドメインおよびＷ／Ｍドメインを含むようにさらに整理される。プロテインＧのＡ／Ｂドメインは、抗体のＦａｂ領域（中程度の親和性）と血清アルブミン（高親和性）への重複する結合部位を有する３つの近縁の反復配列（Ａ１‐Ｂ１；Ａ２‐Ｂ２；Ａ３）からなる。ＳドメインはＡ／ＢドメインとＣ／Ｄドメインの間のスペーサードメインである。Ｃ／Ｄドメインは３つのより近縁の反復配列（Ｃ１‐Ｄ１；Ｃ２‐Ｄ２；Ｄ３）からなり、前記分子のＦｃ結合領域を構成する。Ｃ／Ｄドメインは抗体のＦｃ領域により２つの異なる抗体に結合することができる。このように、プロテインＧは２つのＦｃ結合ドメインを含有し、そのどちらか、または両方が本明細書に開示される実施形態において利用され得る。血清（または他の供給源）から抗体を親和性精製するために通常Ｃ／Ｄ領域を使用する。Ｗ／Ｍドメインはグラム陽性の細胞壁と相互作用し、そして、細
胞膜の外葉への輸出を促進するようにそれぞれ機能する。したがって、本明細書に開示されるプロテインＧ融合タンパク質にはプロテインＧのＳ領域およびＣ／Ｄ領域が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換え融合タンパク質の設計において、Ｓ領域およびＣ／Ｄ領域のみを含むことが、（Ｆｃ領域を露出する）抗体のＦａｂ領域の、または血清アルブミンへの望まない結合を避けるために有利である。いくつかの実施形態では、抗体に加えて血清アルブミンをミニ細胞表面に結合させることにより、ミニ細胞を「増強型ステルスミニ細胞」にすることができるようにプロテインＧの血清アルブミン結合ドメインが含まれる。ミニ細胞表面結合性血清アルブミンは、抗体に加えて、受容者の免疫系からミニ細胞を隠匿するのに役に立つ。これらの場合では、抗体と血清アルブミンの両方が起源とする種と受容側の種の両方が合致することが好ましい。
【００６８】
プロテインＡは、グラム陽性細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が発現する細胞表面タンパク質である。プロテインＧのように、プロテインＡの自然の生物学的機能も感染過程の間に黄色ブドウ球菌のオプソニン化を防ぐことである。黄色ブドウ球菌はプロテインＡを使用して抗体のＦｃ領域に結合する。表面結合性抗体のＦｃ領域は配向または外部露出依存的に補体を活性化することができ、または、好中球などの貪食性細胞上のＦｃ受容体に結合することができる。プロテインＡは７個の別個のドメインからなる５８キロダルトンのタンパク質であり、それらのドメインは通常Ｓドメイン、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、ＣドメインおよびＸドメインと称される。Ｓドメインは分泌シグナルを構成する。Ｅドメインはよく特徴解析されておらず、免疫グロブリン結合活性を持たない。Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインは、多くの場合、一緒にまとめられてＺドメインと称されているが、４つの連続する免疫グロブリン結合ドメインを含み、そして、それらは黄色ブドウ球菌の遺伝子重複の結果として進化したと考えられている。Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインを切り離すことができるが、それぞれがその免疫グロブリン結合特性を維持し、親和性／特異性にほとんど、または、全く影響が無い。プロテインＡは４つの別個のＦｃ結合ドメインを含み、それらのいずれも本明細書では単独で、または組み合わせて利用することができる。したがって、様々なプロテインＡ由来Ｆｃ結合性融合タンパク質が１つ、２つ、３つ、または４つのＦｃ結合ドメインを含むことができ、そして、当業者の自由裁量で本明細書に開示される組成物および方法にそれらを組み込むことができる。Ｘドメインは免疫グロブリン結合活性を持たず、グラム陽性環境のペプチドグリカンの璧にＣ末端を固定する原因である。Ｘドメインは必ずしも必要ではなく、Ｄドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインの結合特性に全く影響が無い。したがって、本明細書に開示されるプロテインＡ融合タンパク質にはプロテインＡのＤドメイン、Ａドメイン、ＢドメインおよびＣドメインまたはこれらのドメインのうちの１つ以上からなるＦｃ結合能を保持する派生物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい派生物は、グリシン２９がアラニンに置換され、Ｆ（ａｂ’）２結合が失われたドメイン、および／またはＯｍｐＴプロテアーゼの推定上の切断部位が機能保存的アミノ酸残基での置換により消失した派生物を含む。
【００６９】
ミニ細胞の特定の細胞、組織および器官タイプへのインビボでの標的化を促進するように働く抗体および／または他のＦｃ含有融合体／複合体のミニ細胞表面上での適切な提示のために、プロテインＧのＦｃ結合領域かプロテインＡのＦｃ結合領域のどちらかを発現するＦｃ結合性ミニ細胞を使用することができる。疾患の発生、進行、持続または発現に関与する特定の組織、器官および細胞タイプへのミニ細胞の標的化を補助することが企図されている抗体またはその任意のＦｃ含有部分は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＥを含むが、これらに限定されない任意の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンサブクラスに由来し得る、またはその一部であり得る。同じ目標を達成する適応免疫を介した抗体応答を生起することが知られている任意の動物において細胞特異的抗原に対する任
意のサブクラスの任意の抗体を産生することができるが、ミニ細胞の標的化機能を促進することが企図されている任意のサブクラスの抗体を「ヒト化」することができる。自然では、抗体は、それぞれが特定の抗原の同一のエピトープを認識する２つの異なる腕（Ｆａｂ’）を含むように産生される。しかしながら、下記のように、分子生物学の発展により、研究者が、同一または異なる抗原に存在しても存在しなくてもよい、明確に異なるエピトープを認識するように各腕（または、いくつかの場合では、前記分子のＦｃ領域）の特異性を改変することが可能になった。これらの抗体派生物は「二特異性」抗体または「二特異性」標的化部分と呼ばれる。
【００７０】
研究室では、単一の抗体が同時に２つの異なる抗原を標的とするように、異なる抗原に独立して特異的であるように抗体を設計することができる。非限定的な例として、所与の真正細菌ミニ細胞の推定上の表面コンポーネント（例えば、ＬＰＳ  Ｏ‐抗原）を二特異性抗体の一方のＦａｂ’で認識するように抗体を設計することができ、そして、他方のＦａｂ’が真核細胞特異的表面抗原を認識するようにそれを設計することができる。この主題の別の非限定的なバリエーションでは、抗体重鎖のＦｃ領域が所与の抗原（例えば、ＬＰＳ）内の特定のエピトープに特異的に結合するようにそれを設計することができるが、その分子のＦａｂ’部分は別の真核細胞特異的表面抗原内の異なるエピトープを認識する、または、この逆も同様である。
【００７１】
さらに、当業者は、異なる特異性を有する２つの異なる抗体を可溶性のプロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡ／Ｇ（または２つ以上の抗体を認識し、結合する他の結合性分子）にカップリングさせることによりそれらを非共有結合して、ミニ細胞表面に接着することができる二特異性抗体派生物を形成することができる。しかし、その複合体内で一方の抗体はミニ細胞の表面に特異的に接着し、そして、他方の抗体は、真核細胞特異的表面抗原を発現する特定の細胞、組織または器官タイプをインビボで特異的に認識し、それによりそれを「標的」とするように提示されることを容易に理解する。同様に、当業者は、無数の架橋技術を用いて異なる特異性を有する２つの異なる抗体を共有結合して同じ効果を達成することができることを理解する。
【００７２】
本願で開示される他の非抗体ベースの標的化アプローチは全体としてＦｃ含有融合体または複合体に基づく。本明細書に記載されるように、分子標的化部分の例には受容体リガンド、ポリペプチド、ホルモン、炭水化物、アプタマー、抗体様分子、ナノボディ、アフィボディ、抗体様単鎖Ｔ細胞抗原受容体（ＳＴＡＲ）、ｍＴＣＲ、トランスボディ、ＸｍＡｂおよびＤＡＲＰｉｎが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野において公知の様々なアプローチを用いてＦｃ複合体化を達成することができる。非限定的な例として、可溶性のＥＧＦリガンドまたはＶＥＧＦリガンドをＦｃ含有ポリペプチド（Ｆｃ領域）に遺伝的に融合または結合し、Ｆｃ結合性ミニ細胞表面に結合させることができ、その結果、そのＦｃ結合性ミニ細胞が標的化能を持ち、それぞれ、ＥＧＦＲ受容体またはＶＥＧＦＲ２受容体を発現する細胞に選択的に局在し、その細胞によって取り込まれることができる。別の非限定的な例として、治療用積載物それ自体をＦｃ含有ポリペプチドに遺伝的に融合または連結することができ、Ｆｃ結合性ミニ細胞の表面に結合させることができる。例えば、Ｆｃ含有抗体、Ｆｃ含有抗体派生物、および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子に加えて、Ｆｃ複合体化ｓｉＲＮＡ分子はＦｃ結合性ミニ細胞の表面に結合することができる。Ｆｃ含有ポリペプチド融合体には受容体リガンド／Ｆｃ融合体、Ｆｃ含有ペプチド融合体およびＦｃ含有ＤＡＲＰｉｎが含まれるが、これらに限定されない。融合体の組換え発現は好ましい構築方法である。組換え発現環境では、Ｆｃ領域への融合が受容体への結合および受容体介在性エンドサイトーシスの促進に関するリガンド活性に影響しないように、当業者の自由裁量で所与の組換え融合体のアミノ末端かカルボキシ末端のどちらかにＦｃ領域を融合させることができる。Ｆｃ含有ポリペプチド、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎを作製する別の例示的なアプローチは、精製された組換えＦｃ領域分子の
組換えポリペプチド、ペプチド、および／またはＤＡＲＰｉｎ分子への、当技術分野において公知の架橋技術のいずれかを用いる化学的結合（架橋とも呼ばれる）によるものである。化学架橋の環境では、精製された組換えＦｃ領域か複合体化されるポリペプチド、ペプチドおよび／もしくはＤＡＲＰｉｎ分子のどちらか、または両方に「反応性」アミノ酸基を含むことが有利である。反応性アミノ酸の例にはスルフヒドリル基を含むもの、好ましくはシステイン残基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、一般的なヘテロ二官能性架橋試薬と共に使用するには、対応するコンジュゲートの連結部にリシン残基を含むことが好ましい（例えば、Ｆｃ領域がシステイン残基を含み、標的化ポリペプチドまたは積載物ポリペプチドがリシンを含む、または、その逆も同様）。精製された組換えＦｃ領域がホルモン、炭水化物、アプタマー、ならびに他の非アミノ酸および／またはペプチド系の分子に架橋する例では、当業者は、同じことを達成するために他の多くの架橋試薬を使用することができることを理解する。架橋試薬は「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」であり得る（それぞれ、同一または異なる反応性基を有する）。架橋試薬の例には表１に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。表１は各複合体化分子種／アプローチに使用され得る架橋試薬の非限定的な例も示す。
【００７３】
いくつかの好ましい実施形態では、ミニ細胞およびミニ細胞産生細菌株を「操作」して、それらの表面でプロテインＧまたはプロテインＡの組換えＦｃ結合部分を発現および提示する。Ｃｈｌａｍ１２またはＣＴＰ３への特異性を有する単鎖ＦｃＶ抗体断片に融合した抗原４３‐α外膜アンカードメインを含む融合タンパク質を使用することにより、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）において組換えポリペプチドの表面局在化を達成することに成功している。同様の研究では、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ）の外膜局在型ＩｇＡプロテアーゼに融合した抗コロナウイルスエピトープ単鎖ＦｃＶ抗体断片を発現および提示する大腸菌細胞がインビトロでコロナウイルスを無力化し、感染を予防することが示された。所望のＦｃ結合性タンパク質のコード配列を大腸菌の拡散粘着関与型アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ‐ｉｎｖｏｌｖｅｄ‐ｉｎ‐ｄｉｆｆｕｓｅ‐ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）（ＡＩＤＡ‐Ｉ）オートトランスポーターのコード配列と融合することにより表面局在化を達成することもできる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３４８，８６７号に記載されるＬｐｐ‐ＯｍｐＡ全細胞提示システムを用いてこれを達成することもできる。いくつかの実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合領域を含むが、これらに限定されない抗体Ｆｃ結合部分をミニ細胞表面上に発現および提示するためにＬｐｐ‐ＯｍｐＡを使用する。外膜融合パートナーとして働き得る他の天然の外膜タンパク質にはグラム陰性腸内細菌科メンバーのＬａｍＢ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＰｈｏＥ、ＰＡＬ、繊毛タンパク質および様々なフラジェリンが挙げられるが、これらに限定されない。プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合断片を任意の腸内細菌科またはバシラス科のメンバー由来のミニ細胞の表面に発現および提示するためにこのアプローチを使用するが、その結果、そのミニ細胞は細胞表面抗原に対する抗体に結合し、それらを提示し、それにより細胞表面抗原発現性の細胞、組織または器官への特異的な標的送達媒体になることができる。（ｉ）推定上または予想上の外膜タンパク質または外膜局在化配列とプロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合ドメインの間の融合タンパク質をコードする核酸配列の作製、（ｉｉ）その融合タンパク質を発現するミニ細胞（Ｆｃ結合性ミニ細胞としても知られる）の作製と精製、（ｉｉｉ）小分子薬または他の生理活性積載物のミニ細胞への負荷（ミニ細胞が組換え発現した積載物または積載物の組合せ；例えば、タンパク毒素、またはタンパク毒素とｓｈＲＮＡの組合せを封入するときは必要ない）、（ｉｖ）積載物負荷ミニ細胞の標的化抗体または他のＦｃ含有融合体／複合体との標的化治療用ミニ細胞を作製するためのインキュベーション、（ｖ）過剰な積載物（該当する場合）と抗体またはＦｃ含有融合体／複合体分子を除去するための調製物の洗浄、および（ｖｉ）患者への企図した投与経路向けの医薬組成物としてのミニ細胞の調製がこの目標を達成するための問題であると当業者は理解する。
【００７４】
細菌ミニ細胞は小分子薬およびイメージング剤の負荷について他の送達技術よりも明白な利点を有する。死滅化した細菌細胞と同様に、精製されたミニ細胞を高濃度の小分子薬またはイメージング剤と単純に共インキュベーションすることにより高濃度の小分子薬およびイメージング剤を標的化ミニ細胞に負荷することが簡単にできる。保存型多剤排出ポンプの不活性状態を維持するようにいかなる外部のエネルギー源も無い負荷緩衝液中でミニ細胞と小分子薬および／またはイメージング剤をインキュベートすることが最適である。多剤排出ポンプは大部分がプロトン駆動力（ＰＭＦ）依存性であり、当業者は、ＰＭＦおよび、その結果、排出ポンプが外部のエネルギー源に依存することをよく理解する。したがって、エネルギー源が無い緩衝液中でのミニ細胞への負荷がミニ細胞の排出ポンプシステムの不活性状態を確実にし、薬物が負荷されたミニ細胞がその薬物の濃度勾配を逆転させる媒体（すなわち、薬物が無い媒体）に戻されたときでもミニ細胞からの薬物の排出を減らすように働く。単一の送達事象でいくつかの細胞内標的を対象とするように、２つ以上の小分子薬またはイメージング剤を同時に送達するために標的化ミニ細胞を使用することもできる。さらに、１つ以上の治療用核酸と共に１つ以上の小分子薬を送達するために標的化ミニ細胞を使用することもできる。
【００７５】
送達される小分子が標的の真核細胞の細胞質に放出される前にエンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントの厳しい環境に非常に長い時間曝される場合、受容体介在性エンドサイトーシスによるその小分子の効果的な送達が制限され得る。したがって、当業者は、この経路で標的化ミニ細胞により送達される小分子のエンドソーム脱出の向上が望ましい場合があることを理解する。しかしながら、これは常に必要なわけではなく、当業者の自由裁量の対象とされることができ、そして、核酸、ペプチド、タンパク質および放射性ヌクレオチド、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない他の標的化ミニ細胞担持積載物の送達においてこれを用いることもできる。細胞内病原体は同じ問題に直面しており、結果として、エンドソームの環境を調節してそれを住みやすいものにするか、エンドソームを完全に避けるかのどちらかのための精巧な機構を発達させている。後者の場合、通常、侵入性生物が産生するタンパク質コンポーネントまたはタンパク質複合体がこれを仲介する。例えば、細胞内グラム陽性病原性細菌リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ；配列番号２９）タンパク質を本明細書に開示される方法および組成物において使用することができる。リステリオリシンＯは、リステリア・モノサイトジェネスのｈｌｙＡ遺伝子がコードする５８キロダルトンの分泌型ｐＨおよびコレステロール依存性タンパク質であり、それはエンドソームの膜に少数の孔を形成し、それがその侵入性生物の感染細胞の細胞質への脱出を促進する。いくつかの実施形態では、全長型ＬＬＯ（シグナル分泌配列を含む）をエンドソーム膜破壊剤として使用する。当業者は、記述されている他の有用なＬＬＯの異型体も本願で使用することができることを理解する。例えば、自然界では、リステリア・モノサイトジェネス（および他のグラム陽性細菌種）によるＬＬＯの分泌は、「成熟型」ＬＬＯを形成するための膜プロテアーゼによる２４アミノ酸シグナル分泌配列の切断を伴う。組換え方法を用いてＬＬＯから２４アミノ酸長の分泌シグナルを除去することにより、短縮型ＬＬＯ（ｃＬＬＯ；配列番号３０）が発現すると、細菌の細胞質にそれが隔離されることになる。ｃＬＬＯは分泌されないが、それは、ｐＨおよびコレステロール依存性エンドソーム膜孔形成能を含む、分泌型の特性の全てを維持する。いくつかの実施形態では、当技術分野において公知の組換え技術を用いて遺伝子レベルでＬＬＯのシグナル配列を除去する。ＬＬＯは中性のｐＨおよび３０℃より上の温度で活性を抑制する非可逆的な立体構造変化を受ける熱不安定性タンパク質であることが示されている。ある組合せのアミノ酸置換（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋ；配列番号３１）がなされると、ＬＬＯの熱安定性が上昇し得る。いくつかの実施形態では、熱安定型のＬＬＯを使用する。ミニ細胞の標的化を受けて、受容体介在性エンドサイトーシスがそのミニ細胞をエンドソームに輸送する。エンドソームの厳しい環境が貪食したミニ細胞
を分解し始め、ＬＬＯと共に小分子積載物を共放出する。次に、放出されたＬＬＯコンポーネントは小分子のエンドソームからその小分子がその生物学的効果を及ぼすことができる細胞質への放出を促進するように補助する。本明細書に開示されるように、特定の温度および分解安定化異型体（ｓＬＬＯ）およびｐＨ安定化異型体（ｐＨ非依存性；ｓＬＬＯｐＨ）のＬＬＯ（配列番号３２）は治療用ポリペプチド積載物ならびにエンドソーム破壊剤として働くことができる。本明細書で使用される場合、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質には全長型ＬＬＯならびに短縮型ＬＬＯ（ｃＬＬＯ）が含まれる。様々な変異が報告されており、その変異がエンドソーム破壊活性を著しく損なうことなくＰＦＯの細胞傷害性を調節する。エンドソーム膜を破壊する目的にＰＦＯおよび前記変異型異型体をＬＬＯの代わりに使用することができる。
【００７６】
ミニ細胞は、治療用核酸および治療用ポリペプチド（例えば、タンパク毒素）の負荷について他の標的送達技術と異なる機構と利点を有する。例えば、ミニ細胞産生親細胞を使用して、ミニ細胞が産生される前、または、産生されているのと同時に１つ以上の治療用核酸分子および／または治療用ポリペプチドを組換え発現／産生することができる。組換え治療用核酸および／または治療用ポリペプチドはミニ細胞によって発現され、ミニ細胞に分配され、そして、ミニ細胞によって封入され、その後、標的化ミニ細胞によってインビボまたはインビトロで真核細胞に送達される。
【００７７】
ミニ細胞が送達する組換え発現した／産生した治療用核酸の例には、ＲＮＡ干渉分子またはリボザイム、二本鎖治療用ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）、一本鎖治療用ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、治療用ポリペプチドおよび／または治療用核酸をコードする真核生物の発現プラスミド、ならびに前述のものの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。治療用核酸の組換え発現は、プラスミド、コスミド、ファージミドおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の様々な原核生物性エピソーム性組換え発現ベクターのうちのいずれかからの発現の結果であり得る。組換え発現はまた、１コピー以上のミニ細胞産生親細胞の染色体に存在する染色体局在型の原核生物性発現カセットによって達成され得る。送達される治療用核酸分子が「遺伝子サイレンシング」作用機序を介してそれらの治療効果を及ぼす場合では、その治療用核酸は１つ以上の異なる真核生物性ｍＲＮＡ転写物に特異的である。単一の送達事象で１つ以上の遺伝子がサイレンシングを受けるように、同一のミニ細胞によって複数の治療用核酸を送達することができる。これらの治療用核酸のうちのいずれかを併用して送達するためにも標的化ミニ細胞を使用する。さらに、１つ以上の治療用核酸と共に１つ以上の小分子薬を送達するために標的化ミニ細胞を使用する。
【００７８】
送達される核酸が標的の真核細胞の細胞質に放出される前にエンドソームコンパートメントの高プロテアーゼ環境に非常に長い時間曝される場合、受容体介在性エンドサイトーシスによる治療用核酸の効果的な送達が制限され得る。したがって、当業者は、この経路で標的化ミニ細胞により送達される治療用核酸のエンドソーム脱出の向上が望ましい場合があることを理解する。しかしながら、これは常に必要なわけではなく、当業者の自由裁量内に含まれ、そして、小分子、ペプチド、タンパク質および放射性核種、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない他の標的化ミニ細胞担持積載物の送達においてこれを用いることもできる。細胞内病原体は同じ問題に直面しており、結果として、エンドソームの環境を調節してそれを住みやすいものにするか、エンドソームを完全に避けるかのどちらかのための精巧な機構を発達させている。後者の場合、通常、侵入性生物が産生するタンパク質コンポーネントまたはタンパク質複合体がこれを仲介する。細胞内グラム陽性病原性細菌リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ；配列番号２９）タンパク質は興味深く、そして、治療用核酸積載物コンポーネントを含むが、これに限定されない本願
の実施形態に組み込まれる。治療用核酸も発現するＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌株で発現すると、ＬＬＯは治療用核酸と共にＦｃ結合性ミニ細胞によって共封入され得るが、その後、Ｆｃ結合性ミニ細胞の表面への抗体またはＦｃ含有融合体／複合体分子の付加によりそのミニ細胞が標的化能を得る。ミニ細胞の標的化を受けて、受容体介在性エンドサイトーシスがそのミニ細胞をエンドソームに輸送する。エンドソームの厳しい環境が貪食したミニ細胞を分解し始め、ＬＬＯと共に治療用核酸積載物を共放出する。次に、放出されたＬＬＯは治療用核酸のエンドソームからその核酸がその生物学的効果を及ぼすことができる細胞質への放出を促進する。
【００７９】
親細胞が、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、またはヘアピン構造を形成するためにそれら自体に折り返すことができる一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）として治療用核酸分子を原核生物性発現カセット（染色体またはエピソームのどちらかに位置する）からの組換え発現により前もって形成し、その後、ミニ細胞の内部に治療用核酸分子がパッケージされる場合では、細胞内の二本鎖および／またはヘアピンＲＮＡ分子の分解の原因であるＲＮａｓｅ遺伝子（例えば、原核生物のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ）に欠失または他の機能欠損性変異を有するＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌株を使用することにより、ミニ細胞内でのその治療用ＲＮＡの半減期が増加する。ＲＮａｓｅが存在しないと、治療用ＲＮＡ分子がより高いレベルまで蓄積し、治療用核酸分子を送達する標的化ミニ細胞の効力が上昇する。大腸菌ミニ細胞産生株の場合、この種で唯一知られている体細胞性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩをコードするｒｎｃ遺伝子に変異または欠失を導入する。
【００８０】
標的化ミニ細胞が送達する組換え発現した／産生した治療用ポリペプチドにはタンパク毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、機能性酵素、活性型カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、および前述の例の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。治療用ポリペプチドの組換え発現は、プラスミド、コスミド、ファージミドおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および前述の例の任意の組合せを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の様々な原核生物性エピソーム性組換え発現ベクターのうちのいずれかからの発現の結果であり得る。同様に、組換え発現は、１コピー以上のミニ細胞産生親細胞の染色体に存在する染色体局在型の原核生物性発現カセットによって達成され得る。本願の標的化ミニ細胞を使用するタンパク毒素の送達は、インビボでの細胞の選択的排除が望ましい応用例で有利なアプローチである。積載物のエンドソーム性送達を促進することができる、および／または、毒性積載物として機能することができるタンパク毒素にはジフテリア毒素のＡ／Ｂ断片、ジフテリア毒素のＡ断片、炭疽菌毒素ＬＦおよびＥＦ、アデニル酸シクラーゼ毒素、ゲロニン、ボツリノリシンＢ、ボツリノリシンＥ３、ボツリノリシンＣ、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、クロストリジウム毒素Ａ、Ｂおよびα、リシン、志賀Ａ毒素、志賀様Ａ毒素、コレラＡ毒素、百日咳ＳＩ毒素、ペルフリンゴリシンＯ、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＢ）、メリチン、リステリオリシンＯのｐＨ安定性異型体（ｐＨ非依存性；Ｌ４６１Ｔのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯの熱安定性異型体（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯのｐＨおよび熱安定性異型体（Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０ＫおよびＬ４６１Ｔのアミノ酸置換）、ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＯ  ｃ、ストレプトリシンＯ  ｅ、スフェリコリシン（ｓｐｈａｅｒｉｃｏｌｙｓｉｎ）、アントロリシン（ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、セレオリシン（ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ）、チューリンゲンシリシン（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）Ｏ、ワイヘンステファネンシリシン（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）、アルベオリシン（ａｌｖｅｏｌｙｓｉｎ）、ブレビリシン（ｂｒｅｖｉｌｙｓｉｎ）、ブチリクリシン（ｂｕｔｙｒｉｃｕｌｙｓｉｎ）、テタノリジンＯ、ノビリシン（ｎｏｖｙｉｌｙｓｉｎ）、レクチノリシン（ｌｅｃｔｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ニューモリシン、ミチリシン（ｍｉｔｉｌｙｓｉｎ）、シュードニューモリシン、スイリシン（ｓｕｉｌｙｓｉｎ）、インターメジリシン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、イバノリシン（ｉｖａｎｏｌｙｓｉｎ
）、ゼーリゲリオリシン（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、バジノリシン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）およびピオリシン（ｐｙｏｌｙｓｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者の自由裁量でミニ細胞の様々な細胞内コンパートメントに治療用ポリペプチドを局在させることができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陰性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、内膜の内葉、内膜の外葉、ペリプラズム、外膜の内葉、外膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陽性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、細胞壁、膜の内葉、膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。
【００８１】
送達されるポリペプチドが標的の真核細胞の細胞質に放出される前にエンドソームコンパートメントの高プロテアーゼ環境に非常に長い時間曝される場合、受容体介在性エンドサイトーシスによる治療用ポリペプチドの効果的な送達が制限され得る。実際に、大半の治療用ポリペプチドは、コレステロール依存性細胞溶解素／毒素（例えば、ＬＬＯ、ペルフリンゴリシンＯ（ＰＦＯ）、およびストレプトリシンＯ（ＳＬＯ））ならびにジフテリア毒素のＡ／Ｂ断片（Ｂ断片介在性脱出）、リシンおよびシュードモナス外毒素Ａを例外に、エンドソームコンパートメントから脱出する固有の能力を持たない。固有のエンドソーム脱出特性を含むタンパク毒素は効果的であるために標的化ミニ細胞中に別のエンドソーム破壊性コンポーネントが共存することを必ずしも必要とせず、そして、エンドソーム破壊剤を含めることの決定は当業者の自由裁量による。ゲロニンおよびジフテリア毒素Ａ断片などの他のタンパク毒素はエンドソームコンパートメントを脱出する固有の能力を持たない。したがって、当業者は、エンドソーム経路で送達される多種多様の治療用ポリペプチドのエンドソーム脱出の向上が望ましいことを理解する。上記のように、細胞内グラム陽性病原性細菌リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質は興味深く、そして、最大の活性を付与するためにエンドソーム脱出を必要とする治療用ポリペプチド積載物コンポーネントまたは他の治療用積載物を含むが、これらに限定されない本願の実施形態に組み込まれる。いくつかの実施形態では、全長型ＬＬＯ（シグナル分泌配列を含む）をエンドソーム破壊剤として使用する。いくつかの実施形態では、当技術分野において公知の組換え技術を用いて遺伝子レベルでＬＬＯのシグナル配列を除去し（ｃＬＬＯを作製する；配列番号３０）、そして、ｃＬＬＯをエンドソーム破壊剤として使用する。いくつかの実施形態では、熱安定性型および／またはｐＨ非依存性型のＬＬＯ（それぞれ、変異Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０Ｋおよび／またはＬ４６１Ｔを有する。ｓＬＬＯｐＨ；配列番号３１および３２）を使用する。治療用ポリペプチドも発現するＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌株で発現すると、ＬＬＯ（または、ＬＬＯ異型体もしくは他のエンドソーム脱出促進因子のいずれか）は治療用ポリペプチドと共にＦｃ結合性ミニ細胞内に共封入され得るが、その後、Ｆｃ結合性ミニ細胞の表面への抗体またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子の付加によりそのミニ細胞が標的化能を得る。ミニ細胞の標的化を受けて、受容体介在性エンドサイトーシスがそのミニ細胞をエンドソームに輸送する。エンドソームの厳しい環境が貪食したミニ細胞を分解し始め、エンドソーム破壊剤（例えば、ＬＬＯ、その異型体のいずれか、または他のエンドソーム破壊剤）と共に治療用積載物を共放出する。次に、放出されたエンドソーム破壊剤コンポーネントは治療用積載物のエンドソームからその積載物がその生物学的効果を及ぼすことができる細胞質への放出を促進する。好ましいエンドソーム破壊剤には、ＬＬＯに加えてＰＦＯおよびＳＬＯ、およびそれらの派生物などの他の細胞溶解素、ならびにＰ���‐ＰＬＣまたはＰＣ‐ＰＬＣなどのホスホリパーゼが含まれる。
【００８２】
親細胞が治療用ポリペプチドを原核生物性発現カセット（染色体またはエピソームのどちらかに位置する）からの組換え発現により前もって形成し、その後、ミニ細胞の内部に治療用ポリペプチドが治療用積載物としてパッケージされる場合では、タンパク質分解の
原因であるプロテアーゼ遺伝子（例えば、大腸菌のｌｏｎプロテアーゼ）に欠失または他の機能欠損性変異を有するＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌株を使用することにより、ミニ細胞内のその治療用ポリペプチドの半減期が増加する。プロテアーゼが存在しないと、治療用ポリペプチド分子がより高いレベルまで蓄積し、治療用ポリペプチド分子を送達する標的化ミニ細胞の効力が上昇する。大腸菌ミニ細胞産生株の場合では、ｌｏｎ遺伝子、ｔｏｎＢ遺伝子、ａｂｇＡ遺伝子、ａｍｐＡ遺伝子、ａｍｐＭ遺伝子、ｐｅｐＰ遺伝子、ｃｌｐＰ遺伝子、ｄｃｐ遺伝子、ｄｄｐＸ／ｖａｎＸ遺伝子、ｅｌａＤ遺伝子、ｆｒｖＸ遺伝子、ｇｃｐ／ｂ３０６４遺伝子、ｈｓｌＶ遺伝子、ｈｃｈＡ／ｂｌ９６７遺伝子、ｈｙａＤ遺伝子、ｈｙｂＤ遺伝子、ｈｙｃＨ遺伝子、ｈｙｃｌ遺伝子、ｉａｄＡ遺伝子、ｌｄｃＡ遺伝子、ｙｃｂＺ遺伝子、ｐｅｐＤ遺伝子、ｐｅｐＥ遺伝子、ｐｅｐＱ遺伝子、ｐｅｐＴ遺伝子、ｐｍｂＡ遺伝子、ｐｑｑＬ遺伝子、ｐｒｌＣ遺伝子、ｐｔｒＢ遺伝子、ｓｇｃＸ遺伝子、ｓｐｒＴ遺伝子、ｔｌｄＤ遺伝子、ｙｅａｈ遺伝子、ｙｅａＺ遺伝子、ｙｅｇＱ遺伝子、ｙｇｅＹ遺伝子、ｙｇｇＧ遺伝子、ｙｈｂＯ遺伝子、ｙｉｂＧ遺伝子、ｙｄｐＦ遺伝子、ｄｅｇＳ遺伝子、ｆｔｓＨ／ｈｆｌＢ遺伝子、ｇｌｐＧ遺伝子、ｈｏｆＤ／ｈｏｐＤ遺伝子、ｌｅｐＢ遺伝子、ｌｓｐＡ遺伝子、ｐｐｐＡ遺伝子、ｓｏｈＢ遺伝子、ｓｐａ遺伝子、ｙａｅＬ遺伝子、ｙｆｂＬ遺伝子、ｄａｃＡ遺伝子、ｄａｃＢ遺伝子、ｄａｃＣ遺伝子、ｄｅｇＰ／ｈｔｒＡ遺伝子、ｄｅｇＱ遺伝子、ｉａｐ遺伝子、ｍｅｐＡ遺伝子、ｎｌｐＣ遺伝子、ｐｂｐＧ遺伝子、ｔｓｐ遺伝子、ｐｔｒＡ遺伝子、ｔｅａｓ遺伝子、ｕｍｕＤ遺伝子、ｙｄｃＰ遺伝子、ｙｄｇＤ遺伝子、ｙｄｈＯ遺伝子、ｙｅｂＡ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｙｈｊＪ遺伝子およびｎｌｐＤ遺伝子のうちの１つ以上に変異または欠失を導入することができる。
【００８３】
標的化小分子薬および治療用核酸の媒体として使用されることに加えて、本明細書に開示されるミニ細胞を標的化ミニ細胞ワクチンとして使用することもできる。以下により詳細が記載されるように、特定の抗原提示細胞が発現する真核細胞表面マーカーに特異的な抗体またはＦｃ含有融合体／複合体分子を利用することにより、タンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンが負荷されたミニ細胞が直接的に抗原提示細胞に標的化される。いくつかの実施形態では、細胞免疫を刺激するＭＨＣクラスＩ負荷を促進する、真核細胞の細胞質への抗原またはＤＮＡワクチンの移転を容易にするために、ＬＬＯまたは（上記の）その異型体の１つを含むことが望ましい場合もあるが、必須ではない。大部分のＭＨＣクラスＩＩの結合が起こるエンドソームコンパートメントの内部に抗原を保持することにより、液性（抗体介在性）免疫を刺激するＭＨＣクラスＩＩ負荷を促進することが望ましい場合もある。標的化ミニ細胞ワクチンのＬＬＯコンポーネントを排除する、または減少させることによりこれを達成することができる。さらに、当業者によって適切だと見なされるように、外来性のアジュバントを発現するか、それが負荷されるように標的化ワクチンミニ細胞をさらに設計する。アジュバントは一般的なアジュバント（キーホールリンペットヘモシアニンまたは完全フロイントアジュバントなど）であり得る、または標的化分子アジュバントであり得る。標的化分子アジュバントにはＴｏｌｌ様受容体のアンタゴニストまたはアゴニストであるもの、ならびに免疫調節性特性を有する他の細胞性成分が含まれる。標的化ワクチンは、細菌、ウイルスおよび寄生生物が起源である感染症因子を含むが、これらに限定されない感染症因子に対する受容者免疫を提供する。標的化ワクチンはまた、腫瘍および他の自己性の異常疾患に対する受容者免疫を提供する。
【００８４】
インビボおよびインビトロでの標的送達媒体として利用されることに加えて、本明細書に開示されるＦｃ結合性ミニ細胞は、側方流動免疫アッセイ（ＬＦＩＡ）を含むが、これに限定されない診断アッセイの分析物検出試薬としても利用される。いくつかの実施形態では、分析物検出用Ｆｃ結合性ミニ細胞は（ｉ）Ｆｃ結合性ミニ細胞、（ｉｉ）Ｆｃ含有ミニ細胞に結合した分析物特異的抗体または他の分析物特異的Ｆｃ含有融合体／複合体分子、ならびに（ｉｉｉ）小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成され得るが、その検出試
薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。関連の置換では、競合性ＬＦＩＡで使用する負のリードアウト検出試薬としてＦｃ結合性ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、負のリードアウト検出試薬としてのＦｃ結合性ミニ細胞は、（ｉ）Ｆｃ結合性ミニ細胞、（ｉｉ）Ｆｃ含有ミニ細胞に結合したＦｃ／分析物融合体／複合体、ならびに（ｉｉｉ）小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成され、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。溶解している所与の関連する分析物の存在または非存在について臨床の、獣医学の、環境の、固形および液体の食品、医薬品、および飲料水を分析するために使用されるキットの検出試薬としてミニ細胞を使用することができる。（ｉ）製品支持体、（ｉｉ）試料パッド、（ｉｉｉ）粒子コンジュゲートパッド、（ｉｖ）多孔性膜（例えば、ニトロセルロース）、（ｖ）試験ライン、（ｖｉ）対照ライン、および（ｖｉｉ）ウィック材を含むように側方流動免疫アッセイを構成する。ＬＦＩＡは短時間のポイント・オブ・ケア診断として、ならびに家庭内での使用（例えば、妊娠検査）、および様々なフィールド検査（例えば、飲料水または土壌中の毒物レベルの測定）に用いられる。ＬＦＩＡ検出試薬は現在のところ金コロイドコンジュゲート（１０ｎｍ）、ラテックスビーズ（着色された、または蛍光性のもの；様々なサイズのもの）、および常磁性ラテックス被覆ビーズ（着色された、または蛍光性のもの；様々なサイズのもの）に限定される。それぞれにそれぞれの制限が有り、現時点では新しい改善型の検出試薬が必要であることがその分野の重大なハードルである。金コロイドコンジュゲートはその感受性とコストのため制限があり、ラテックスビーズはその感受性の無さのため制限があり、そして、常磁性ラテックスビーズはそのコストのため制限がある。したがって、より定量的で信頼できる検定を可能にする、および／または製造コストの低減を可能にする、費用効果があり、非常に感受性が高い種類の粒子ベースの検出試薬が診断分野に必要である。検出シグナルを増幅し、感受性を上昇させることができる機能性酵素を含む多種多様な検出法（現在利用できる検出粒子を用いるオプションではない）をミニ細胞に負荷することができるので、それらは、現在利用されている検出システムよりもかなりの利点を提供する。
【００８５】
標的化ミニ細胞がヒトで治療用薬剤および診断用薬剤として使用されるためには、ミニ細胞は生存可能な親細菌細胞などの混入汚染物質を少しでも含んではならない。生存可能な汚染混入細胞および他の混入汚染物質のレベルは患者において有害な副作用を引き起こさないほど、またはミニ細胞の活性を干渉しないほど低くなくてはならない。遺伝的自殺機構と称されるホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子の誘導性発現は、特に従来の濾過方法と併用するとき、生存している汚染混入親細胞を排除するのに好ましい機構である。病原性である、または日和見的に病原性であるいくつかの細菌からミニ細胞を得るので、全身性投与、特に静脈内投与の前に所与の集団からいかなる汚染混入親細胞をも機能的に排除することが重要である。したがって、所望のミニ細胞製剤は、その中に残存している生存している親細胞の数が、有害な副作用を引き起こさないように、または企図されているミニ細胞の活性を干渉しないようにできるだけ少ない製剤である。安全性への懸念を最小限に抑えるため、本明細書に開示されるミニ細胞は安全特性、例えば、下記の３つの安全特性のうちの１つ以上を含むミニ細胞産生株に由来する。いくつかの実施形態では、そのミニ細胞産生株は少なくともこれら３つの共働的な安全特性を含む。第一の特性は、ミニ細胞形成ステップが完了した後に残存している生存している親細胞を溶解（して遊離状態のリポ多糖を排出）することなく、それらを殺滅する遺伝的自殺機構である。本願は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００１１２６７０号に記載されるように、適切な誘導物質に曝されるとミニ細胞産生親細胞の染色体に修復不可能な損傷を導入する調節型遺伝的自殺機構を使用することを組み込む。その自殺機構は親細胞の染色体に修復不可能な二本鎖切断を導入するように働き、そして、従来の分離技術の補助として用いられてミニ細胞の精製を改善する。第二の安全特性は、必ずというわけではないが、好ましくは大腸菌ミニ細胞産生株のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）生合
成経路に、そして最も好ましくはｄａｐＡ遺伝子に限定された栄養要求性である。ＤＡＰ栄養要求性（ｄａｐＡ−）を示す大腸菌のミニ細胞産生株はＤＡＰを添加しないと研究室の外では生き残ることができない。さらに、ＤＡＰはヒトを含む哺乳類では見つかっておらず、したがって、偶然に遺伝的自殺機構を逃れたいかなるミニ細胞産生親細胞もその環境または生体内では生き残ることができない。様々なグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌について、この主題について多数のバリエーションが存在する。例えば、サルモネラ属の種では、芳香族アミノ酸生合成経路（ａｒｏ遺伝子）の栄養要求性が事実上同じ結果をもたらす。シゲラ属の種の場合では、グアニン生合成経路の栄養要求性が事実上同じ効果をもたらす。第三の安全性特性は任意であり、大腸菌ミニ細胞産生株のｌｐｘＭ遺伝子の欠失を必要とする。ｌｐｘＭ遺伝子の欠失の結果、無害化したリポ多糖（ＬＰＳ）分子を産生することができる。ｌｐｘＭ遺伝子（ｍｓｂＢ遺伝子とも称される）はＬＰＳ分子のリピドＡ部分に末端ミリストレイン酸基を付加するように機能し、そして、（ｌｐｘＭ遺伝子の除去による）この基の除去はＬＰＳの著しい無害化をもたらす。具体的に、無害化はＬＰＳへの曝露に反応する炎症誘発性サイトカインの産生の低下を特徴とする。任意のグラム陰性またはグラム陽性のミニ細胞産生株の任意の機能的に同等な遺伝子にこの欠失を導入して同じ効果を達成することができる。向上した安全性プロファイルが感染のリスクと敗血症発生の可能性を低下させ、他の細菌との組換え事象を介した遺伝的復帰の可能性を低下させ、そして、宿主での挿入事象のリスクを最小化することができる。規制面および製造面から、抗生物質耐性マーカーをミニ細胞産生親細胞株の細菌染色体から除去することも好ましい。ヒトでの使用について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により課された規制事項に従うためには、大半の抗生物質耐性遺伝子マーカーを細菌のミニ細胞産生株で使用することは好ましくない。ＦＤＡは、ヒトで使用することが最終製品で企図されている細菌または細菌性産生株の選択目的にカナマイシン耐性遺伝子マーカーを使用することだけを許す。
【００８６】
本明細書に記載されるように、Ｆｃ結合性真正細菌ミニ細胞は標的化能を持たされ、数種類の生理活性積載物を共同または単独で送達することができるが、ミニ細胞の最終調製品は従来の分離技術と併せて使用される新規誘導性遺伝的自殺機構の複合的な効果により無害化ＬＰＳから構成され、いかなる生存可能な汚染混入親細胞も十分存在しない。
【００８７】
本明細書に記載されるように、細菌ミニ細胞は標的化インビボ治療送達剤、診断薬剤、治療診断薬剤およびイメージング剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、細菌ミニ細胞は、生理活性積載物を取り込むように、ならびに動物で疾患の発生、進行、維持および持続に関与する細胞タイプにミニ細胞を特異的に標的化する抗体および／または他のＦｃ含有分子標的化融合体／複合体を新規の機構によりそれらの表面上に提示するように設計されている。いくつかの実施形態は、プロテインＧのＦｃ結合領域をミニ細胞表面上に発現および提示するミニ細胞を提供するが、そのミニ細胞は、そのＦｃ領域によってミニ細胞表面上にあるプロテインＧのＦｃ結合部分に結合する、真核細胞表面受容体に特異的な抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をさらに含み、その抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子で被覆されたミニ細胞は、小分子薬、治療用核酸、放射性核種、イメージング剤、タンパク質、および前述の生理活性積載物の任意の組合せを含むが、これらに限定されない生理活性積載物をさらに含む。いくつかの実施形態は、プロテインＡのＦｃ結合領域をミニ細胞表面上に発現および提示するミニ細胞を提供するが、そのミニ細胞は真核細胞表面受容体に特異的な抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をさらに含み、その抗体またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子はそのＦｃ領域によってミニ細胞表面上にあるプロテインＡのＦｃ結合部分に結合し、その抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子で被覆されたミニ細胞は、小分子薬、治療用核酸、放射性核種、イメージング剤、タンパク質、および前述の生理活性積載物の任意の組合せを含むが、これらに限定されない生理活性積載物をさらに含む。
【００８８】
いくつかの実施形態は、プロテインＧのＦｃ結合領域をミニ細胞表面上に発現および提示するミニ細胞を提供するが、そのミニ細胞は真核細胞表面受容体に特異的な抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をさらに含み、その抗体またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子はそのＦｃ領域によってミニ細胞表面上にあるプロテインＧのＦｃ結合部分に結合し、その抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子で被覆されたミニ細胞は、小分子薬、治療用核酸、放射性核種、イメージング剤、タンパク質、および前述の生理活性積載物の任意の組合せを含むが、これらに限定されない生理活性積載物をさらに含む。
【００８９】
本明細書に記載されるように、診断試験検出試薬として細菌ミニ細胞を使用することができる。側方流動免疫アッセイを含むが、これに限定されない多種多様な種類のポイント・オブ・ケア／ポイント・オブ・ニード診断用製品の検出試薬としてそのような試薬を利用することができる。いくつかの実施形態では、細菌ミニ細胞は、検出試薬を取り込むように、ならびに試験される特定の分析物または一連の分析物へのそのミニ細胞検出試薬の特異性を付与する抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子を新規のアプローチによりそれらの表面に直ぐに提示するように設計され得る。いくつかの実施形態は、プロテインＡのＦｃ結合領域をミニ細胞表面上に発現および提示するミニ細胞を提供するが、そのミニ細胞は真核細胞表面受容体に特異的な抗体をさらに含み、その抗体またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子はそのＦｃ領域によってミニ細胞表面上にあるプロテインＡのＦｃ結合部分に結合し、その抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子で被覆されたミニ細胞は、小分子フルオロフォア、磁性粒子、金コロイド粒子、活性酵素、蛍光タンパク質、および前述の検出試薬の任意の組合せを含むが、これらに限定されない検出可能試薬をさらに含む。
【００９０】
本明細書に記載されるように、診断試験検出試薬として細菌ミニ細胞を使用することができる。側方流動免疫アッセイを含むが、これに限定されない多種多様な種類のポイント・オブ・ケア／ポイント・オブ・ニード診断用製品の検出試薬としてそのような試薬を利用することができる。いくつかの実施形態では、細菌ミニ細胞は、検出試薬を取り込むように、ならびに試験される特定の分析物または一連の分析物へのそのミニ細胞検出試薬の特異性を付与する抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子を新規のアプローチによりそれらの表面に直ぐに提示するように設計されている。いくつかの実施形態は、プロテインＧのＦｃ結合領域をミニ細胞表面上に発現および提示するミニ細胞を提供するが、そのミニ細胞は真核細胞表面受容体に特異的な抗体をさらに含み、その抗体またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子はそのＦｃ領域によってミニ細胞表面上のプロテインＧのＦｃ結合部分に結合し、その抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子で被覆されたミニ細胞は、小分子フルオロフォア、磁性粒子、金コロイド粒子、活性酵素、蛍光タンパク質、および前述の検出試薬の任意の組合せを含むが、これらに限定されない検出可能試薬をさらに含む。
【００９１】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化生理活性分子送達媒体として細菌ミニ細胞をインビボで使用する。いくつかの実施形態では、標的化治療用ミニ細胞は、動物で疾患または別の異常なプロセスに関わる細胞に対して負の効果および／または治療効果を有する生理活性（生物学的活性があると同義）積載物を含む。いくつかの実施形態では、生理活性積載物には、動物で病気の細胞、組織もしくは器官に負の影響を与える「生物学的効果」（生物学的反応と同義）、または病気の細胞、組織もしくは器官の状態を間接的に軽減するシグナルの生成を積極的に引き起こす「生物学的効果」をもたらす小分子薬、生理活性核酸、生理活性タンパク質、生理活性放射性核種、イメージング剤および生理活性リポ多糖、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、動物の疾患を治療または予防するために、疾患の開
始、進行または持続の原因である細胞を殺滅する効果；動物において疾患を軽減するシグナルの生成に正の影響を与える効果；動物において疾患の活性化の原因である生物学的プロセスに負の影響を与える効果；疾患に負の影響を与える先天的免疫応答を動物において誘発する効果、および動物において疾患に負の影響を与える（液性および／または細胞性）適応免疫応答を誘発する効果を含むが、これらに限定されない疾患に負の影響を与える生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、上記の生物学的効果のうちのいずれかからなる組合せの生物学的効果を及ぼすことにより動物において疾患に相乗的に負の影響を与える生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、（ｉ）外膜輸出（分泌）配列、（ｉｉ）外膜タンパク質またはその膜アンカー部分、および（ｉｉｉ）ミニ細胞表面上のプロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分を含む連続的な融合タンパク質の形状でミニ細胞の表面に発現および提示されるプロテインＡまたはプロテインＧのどちらかのＦｃ結合領域に結合する抗体、Ｆｃ含有抗体派生物、および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子である。プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合領域を提示するミニ細胞は、全長型抗体、Ｆｃ含有抗体派生物、および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子にその分子のＦｃ領域との相互作用を介して結合することができる。いくつかの実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧの結合部分は、ミニ細胞表面上で発現および提示されるように企図されている融合タンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧの結合部分はナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｅｈａｅ）のＩｇＡＰオートトランスポータータンパク質との融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧの結合部分は、本明細書にさらに詳細が記載されるグラム陰性細菌で見いだされる推定上または予想上の外膜タンパク質との融合体である。いくつかの実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧの結合部分は、米国特許第５，３４８，８６７号に記載され、その全体の参照により本明細書に組み込まれるＬｐｐ‐ＯｍｐＡ提示システムとの融合体である（それぞれ、配列番号２２および配列番号２３）。ミニ細胞表面上の抗体、Ｆｃ含有抗体派生物、および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡおよびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、部分的には、ミニ細胞表面が提示する、抗原に特異的な抗体標的化部分、Ｆｃ含有抗体派生物、および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子が標的化ミニ細胞の細胞内取込を誘導し、細胞内積載物送達を促進するので、標的化部分が選択される。いくつかの実施形態では、標的
化コンポーネントとして使用される、これまでに記載された標的特異的抗体にはｍＡｂ３Ｆ８、ｍＡｂＣＳＬ３６２、ｍＡｂＣＳＬ３６０、ｍＡｂＪ５９１、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシツマブ（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アナツモマブ（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アトリツマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブ、セツキシマブ、ｍＡｂ５２８、シタツズマブ（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クレノリキシマブ、クリバツズマブ（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デノスマブ、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドルリモマブ（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ）、ドルリキシズマブ（Ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エンリモマブ（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）、エピツモマブ（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ）、エプラツズマブ、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、エクシビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フォントリズマブ、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、ガリキシマブ、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イルビツモマブ（Ｉｒｂｉｔｕｍｏｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、インフリキシマブ、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、Ｊ５９１、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レクサツムマブ、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リンツズマブ、ロルボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マツズマブ、メポリゾマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｏｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モタビズマブ、ムロモナブ、ナコロマブ（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、ナプツモマブ（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツツマブ（Ｎｅｃｉｔｕｔｕｍａｂ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オクレリズマブ、オヅリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オマリズマブ、オポルツズマブ（Ｏｐｏ
ｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ１４０、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レガビルマブ、レシリズマブ（Ｒｅｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、シプリズマブ、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、タカツズマブ（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、
テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブ（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプリズマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、ティガツズマブ、ＴＮＸ‐６５０、トシリズマブ、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾリモマブ（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ）、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化小分子送達媒体としてインビボで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患の進行を防止、阻害および／または制限するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の種類の小分子薬を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＧのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、ならびに（ｉｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。小分子薬の種類は、（１）ＤＮＡ損傷剤およびＤＮＡ合成阻害剤、例えば、アントラサイクリン類（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン）、アルキル化剤類（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブチル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミン）、プラチナ誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、ｃｉｓ‐ジアミンジクロロプラチナ）、テロメラーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサル（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ））、（２）タキサン類およびタキサン派生物（パクリタキセル、ドセタキセルクロラムブシル、ＢＡＹ５９‐８８６２）を含むが、これらに限定されない微小管およびチューブリン結合剤、（３）抗代謝剤、例えば、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型である
ａｒａ‐ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５‐フルオロウラシル、５‐ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６‐メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、および６‐チオグアニン（４）抗血管新生剤（サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド）、血管破壊剤（フラボノイド／フラボン類、ＤＭＸＡＡ、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａのようなコンブレスタチン派生物、など）、（５）アロマターゼ阻害剤（４‐ヒドロアンドロステンジオン（４‐ｈｙｄｒｏａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール）などの内分泌療法、（６）抗エストロゲン剤（タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ））、デキサメタゾンなどのステロイド、（７）Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、（８）インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害剤、（９）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、（１０）シグナル伝達の阻害剤、例えば、イマチニブ（グリベック）のようなチロシンキナーゼの阻害剤、（１１）ヒートショックタンパク質の阻害剤、（１２）トランスレチノイン酸などのレチノイド、（１３）成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、（１４）ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどの抗有糸分裂化合物、（１５）ＣＯＸ阻害剤などの抗炎症剤、および（１６）チェックポイント調節因子などの細胞周期調節因子およびテロメラーゼ阻害剤、（１７）転写因子阻害剤、およびＢｃｌ‐２、Ｂｃｌ‐ｘおよびＸＩＡＰの阻害剤などのアポトーシス誘導剤、ならびに前述の（１〜１７）の任意の組合せから選択されるが、これらに限定されない。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１���ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９３】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化小分子送達媒体としてインビボで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患の進行を防止、阻害および／または制限するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の種類の小分子薬を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的
表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、ならびに（ｉｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。小分子薬の種類は、（１）ＤＮＡ損傷剤およびＤＮＡ合成阻害剤、例えば、アントラサイクリン類（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン）、アルキル化剤類（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブチル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミン）、プラチナ誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、ｃｉｓ‐ジアミンジクロロプラチナ）、テロメラーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサル（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ））、（２）タキサン類およびタキサン派生物（パクリタキセル、ドセタキセルクロラムブシル、ＢＡＹ５９‐８８６２）を含むが、これらに限定されない微小管およびチューブリン結合剤、（３）抗代謝剤、例えば、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型であるａｒａ‐ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５‐フルオロウラシル、５‐ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６‐メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、および６‐チオグアニン（４）抗血管新生剤（サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド）、血管破壊剤（フラボノイド／フラボン類、ＤＭＸＡＡ、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａのようなコンブレスタチン派生物、など）、（５）アロマターゼ阻害剤（４‐ヒドロアンドロステンジオン（４‐ｈｙｄｒｏａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール）などの内分泌療法、（６）抗エストロゲン剤（タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ））、デキサメタゾンなどのステロイド、（７）Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、（８）インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害剤、（９）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、（１０）シグナル伝達の阻害剤、例えば、イマチニブ（グリベック）のようなチロシンキナーゼの阻害剤、（１１）ヒートショックタンパク質の阻害剤、（１２）トランスレチノイン酸などのレチノイド、（１３）成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、（１４）ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどの抗有糸分裂化合物、（１５）ＣＯＸ阻害剤などの抗炎症剤、および（１６）チェックポイント調節因子などの細胞周期調節因子およびテロメラーゼ阻害剤、（１７）転写因子阻害剤、およびＢｃｌ‐２、Ｂｃｌ‐ｘおよびＸＩＡＰの阻害剤などのアポトーシス誘導剤、ならびに前述の（１〜１７）の任意の組合せから選択されるが、これらに限定されない。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦｐＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、Ｐ
ＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９４】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化治療用核酸送達媒体としてインビボで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患の進行を防止、阻害および／または制限するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の治療用核酸分子を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＧのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）エンドソーム破壊剤をさらに含み、ならびに（ｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングにより効果を及ぼす治療用核酸（ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ、またはそれらをコードする真核生物のＤＮＡ発現プラスミド）は、野生型遺伝子配列に対する相同性を有する１つ以上の連続的なヌクレオチド配列を含むこと、ならびに／または癌などの疾患に関係することが知られている生殖細胞および体細胞の変異を含有する１つ以上の連続的な配列を含むが、これらに限定されない。治療用核酸配列が、目的の標的遺伝子に対して相同である２２ヌクレオチドを有することが好ましい。治療用核酸分子は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＡＢＣＢ１／ＭＤＲ１／ＰＧＹ１（Ｐ‐糖タンパク質；Ｐｇｐ）、ＣＨＫ‐１、ＨＩＦ‐１、Ｍｃｌ‐１、ＰＤＧＦＲ、Ｔｉｅ‐２、ＡＢＬ１、ＡＢＵ、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ５、ＢＣＬ６、ＢＬＣ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、Ｂｃｌ‐ｘ、Ｂｃｒ‐Ａｂｌ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＨＫ‐１、ｃ‐Ｍｅｔ、ｃ‐ｍｙｃ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＫＣ１、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ‐１、ＥＺＨ２、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ‐４、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＦＬＴ２、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＲＡＳ、ＩＧＦＲ、インターロイキン８（ＩＬ‐８）、ＪＡＫ、ＪＡＫ２、ＫＤＲ／Ｆｌｋ‐１（ＶＥＧＦＲ‐２）、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ２、ＭＥＴ、ＭＲＰ、ｍＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩ３ＫＣＡ、ＰＰＡＲ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５３、ＲａｌＡ、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＳＴＡＴ３、サービビン、テロメラーゼ、ＴＥＰ１、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｂ、ＶＥＧＦ‐Ｃ、ＶＥＧＦ‐Ｄ、ＶＥＧＦ‐Ｅ、Ｗｎｔ‐１、およびＸＩＡＰを含むが、これらに限定されない遺伝子のｍＲＮＡ転写物を対象とすることができる。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４��ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ
１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｗ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９５】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化治療用核酸送達媒体としてインビボで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患の進行を防止、阻害および／または制限するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の治療用核酸を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）エンドソーム破壊剤をさらに含み、ならびに（ｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングにより効果を及ぼす治療用核酸（ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ、またはそれらをコードする真核生物のＤＮＡ発現プラスミド）は、野生型遺伝子配列に対する相同性を有する１つ以上の連続的なヌクレオチド配列を含むこと、ならびに／または癌などの疾患に関係することが知られている生殖細胞および体細胞の変異を含有する１つ以上の連続的な配列を含むが、これらに限定されない。治療用核酸配列が、目的の標的遺伝子に対して相同である２２ヌクレオチドを有することが好ましい。治療用核酸分子は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＡＢＣＢ１ＩＭＤＲ１／ＰＧＹ１（Ｐ‐糖タンパク質；Ｐｇｐ）、ＣＨＫ‐１、ＨＩＦ‐１、Ｍｃｌ‐１、ＰＤＧＦＲ、Ｔｉｅ‐２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ５、ＢＣＬ６、ＢＬＣ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、Ｂｃｌ‐ｘ、Ｂｃｒ‐Ａｂｌ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＨＫ‐１、ｃ‐Ｍｅｔ、ｃ‐ｍｙｃ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＫＣ１、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ‐１、ＥＺＨ２、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ‐４、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＦＬＴ２、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＲＡＳ、ＩＧＦＲ、インターロイキン８（ＩＬ‐８）、ＪＡＫ、ＪＡＫ２、ＫＤＲ／Ｆｌｋ‐１（ＶＥＧＦＲ‐２）、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ２、ＭＥＴ、ＭＲＰ、ｍＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩ３ＫＣＡ、ＰＰＡＲ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５３、ＲａｌＡ、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＳＴＡＴ３、サービビン、テロメラーゼ、ＴＥＰ１、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｂ、ＶＥＧＦ‐Ｃ、ＶＥＧＦ‐Ｄ、ＶＥＧＦ‐Ｅ、Ｗｎｔ‐１、およびＸＩＡＰを含むが、これらに限定されない遺伝子のｍＲＮＡ転写物を対象とすることができる。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、��Ｄ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ
、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｗ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９６】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化治療用ポリペプチド送達媒体としてインビボで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患の進行を防止、阻害および／または制限するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の治療用ポリペプチドを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）エンドソーム破壊剤をさらに含み、ならびに（ｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性（タンパク毒素）により効果を及ぼす治療用ポリペプチドにはコレステロール依存性細胞溶解素、ＡＤＰ‐リボシル化毒素、植物性毒素、細菌性毒素、ウイルス性毒素、孔形成性毒素および細胞透過性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。治療用ポリペプチドは、ゲロニン、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素Ａ／Ｂ断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＩおよび／またはＬＴＩＩ）、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素Ａ、志賀毒素、炭疽菌毒素、ＭＴＸ（バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の殺虫毒素）、ペルフリンゴリシンＯ、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素ＬＦおよびＥＦ、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンＢ、ボツリノリシンＥ３、ボツリノリシンＣ、ボツリヌス毒素Ａ、コレラ毒素、クロストリジウム毒素Ａ、Ｂおよびα、リシン、志賀Ａ毒素、志賀様Ａ毒素、コレラＡ毒素、百日咳ＳＩ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＢ）、リステリオリシンＯのｐＨ安定性異型体（ｐＨ非依存性；Ｌ４６１Ｔのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯの熱安定性異型体（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯのｐＨおよび熱安定性異型体（Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０ＫおよびＬ４６１Ｔのアミノ酸置換）、ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＯ  ｃ、ストレプトリシンＯ  ｅ、スフェリコリシン（ｓｐｈａｅｒｉｃｏｌｙｓｉｎ）、アントロリシン（ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、セレオリシン（ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ）、チューリンゲンシリシン（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）Ｏ、ワイヘンステファネンシリシン（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）、アルベオリシン（ａｌｖｅｏｌｙｓｉｎ）、ブレビリシン（ｂｒｅｖｉｌｙｓｉｎ）、ブチリクリシン（ｂｕｔｙｒｉｃｕｌｙｓｉｎ）、テタノリジンＯ、ノビリシン（ｎｏｖｙｉｌｙｓｉｎ）、レクチノリシン（ｌｅｃｔｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ニューモリシン、ミチリシン（ｍｉｔｉｌｙｓｉｎ）、シュードニューモリシン、スイリシン（ｓｕｉｌｙｓｉｎ）、インターメジリシン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、イバノリシン（ｉｖａｎｏｌｙｓｉｎ）、ゼーリゲリオリシン（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、
バジノリシン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）およびピオリシン（ｐｙｏｌｙｓｉｎ）を含むが、これらに限定されない群より選択され得る。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｗ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９７】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化治療用ポリペプチド送達媒体としてインビボで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患の進行を防止、阻害および／または制限するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の治療用ポリペプチドを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＧのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）エンドソーム破壊剤をさらに含み、ならびに（ｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性（タンパク毒素）により効果を及ぼす治療用ポリペプチドにはコレステロール依存性細胞溶解素、ＡＤＰ‐リボシル化毒素、植物性毒素、細菌性毒素、ウイルス性毒素、孔形成性毒素および細胞透過性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。治療用ポリペプチドは、ゲロニン、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素Ａ／Ｂ断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＩおよび／またはＬＴＩＩ）、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素Ａ、志賀毒素、炭疽菌毒素、ＭＴＸ（バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の殺虫毒素）、ペルフリンゴリシンＯ、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素ＬＦおよびＥＦ、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンＢ、ボツリノリシンＥ３、ボツリノリシンＣ、ボツリヌス毒素Ａ、コレラ毒素、クロストリジウム毒素Ａ、Ｂおよびα、リシン、志賀Ａ毒素、志賀様Ａ毒素、コレラＡ毒素、百日咳ＳＩ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＢ）、リステリオリシンＯのｐＨ安定性異型体（ｐＨ非依存性；Ｌ４６１Ｔのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯの熱安定性異型体（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯのｐＨおよび熱安定性異型体（Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０ＫおよびＬ４６１Ｔのアミノ酸置換）、ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＯ  ｃ、ストレプトリシンＯ  ｅ、スフェリコリシン（ｓｐｈａ
ｅｒｉｃｏｌｙｓｉｎ）、アントロリシン（ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、セレオリシン（ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ）、チューリンゲンシリシン（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）Ｏ、ワイヘンステファネンシリシン（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）、アルベオリシン（ａｌｖｅｏｌｙｓｉｎ）、ブレビリシン（ｂｒｅｖｉｌｙｓｉｎ）、ブチリクリシン（ｂｕｔｙｒｉｃｕｌｙｓｉｎ）、テタノリジンＯ、ノビリシン（ｎｏｖｙｉｌｙｓｉｎ）、レクチノリシン（ｌｅｃｔｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ニューモリシン、ミチリシン（ｍｉｔｉｌｙｓｉｎ）、シュードニューモリシン、スイリシン（ｓｕｉｌｙｓｉｎ）、インターメジリシン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、イバノリシン（ｉｖａｎｏｌｙｓｉｎ）、ゼーリゲリオリシン（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、バジノリシン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）およびピオリシン（ｐｙｏｌｙｓｉｎ）を含むが、これらに限定されない群より選択され得る。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦｐＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９８】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化診断用イメージング剤としてインビボで標的化診断用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患を診断、検出および／またはモニターするために標的化診断用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の分子イメージング剤を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＧのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、ならびに（ｉｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０
、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【００９９】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化診断用イメージング剤としてインビボで標的化診断用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患を診断、検出および／またはモニターするために標的化診断用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の分子イメージング剤を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＧのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞しても受容体介在性エンドサイトーシスを促進しない抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、ならびに（ｉｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｗ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。分子イメージング剤の非限定的な例にはガドリニウム、６４Ｃｕジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ‐フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ‐フルオリド、３’‐デオキシ‐３’‐［１８Ｆ］フルオロチミジン、１８Ｆ‐フルオロミソニダゾール、ガ
リウム、テクネチウム‐９９、タリウム、バリウム、ガストログラフィン、ヨード造影剤、酸化鉄、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、および前述のものの任意の組合せが挙げられる。
【０１００】
いくつかの好ましい実施形態では、標的化診断用イメージング剤としてインビボで標的化診断用ミニ細胞を使用し、そして、動物で疾患を診断、検出および／またはモニターするために標的化診断用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）１つ以上の分子イメージング剤を負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核細胞特異的表面抗原を認識し、そして、真核細胞特異的表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、ならびに（ｉｖ）静脈内投与に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。ミニ細胞表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含む細胞特異的表面抗原を優先的に認識することができるが、これらを含む細胞特異的表面抗原を認識することに限定されない。
【０１０１】
分子イメージング剤の例にはガドリニウム、６４Ｃｕジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ‐フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ‐フルオリド、３’‐デオキシ‐３’‐［１８Ｆ］フルオロチミジン、１８Ｆ‐フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム‐９９、タリウム、バリウム、ガストログラフィン、ヨード造影剤、酸化鉄、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、および前述のものの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
いくつかの好ましい実施形態では、感染性疾患因子に対する標的化ミニ細胞ワクチンとしてインビボ、エクスビボおよび／またはインビトロで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、その疾患因子に負の影響を与えるレシピエント動物宿主の免疫応答を生起させることにより動物で感染性疾患因子の進行を防止、阻害および／または遅延化するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）いず
れも感染性疾患因子に由来する、１つ以上の抗原性炭水化物、タンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原を認識し、そして、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）ＬＬＯを含むが、これに限定されないエンドソーム破壊剤をさらに含み、（ｖ）一般的なアジュバントおよび／または標的化分子アジュバントをさらに含み、ならびに（ｖｉ）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与および／または経鼻投与を含むが、これらに限定されないインビボ投与経路に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞ワクチンは動物において液性（抗体介在性）および／または細胞性（細胞傷害性Ｔ細胞介在性）の防御免疫応答を誘発する。１つの態様では、免疫応答は、細菌、ウイルスおよび寄生生物に起源がある因子を含むが、これらに限定されない感染性疾患因子に対する防御である。いくつかの実施形態では、ミニ細胞ワクチンの表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＣＤ８、ＤＥＣ‐２０５、ＣＤ１０５、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１５、ＣＤ４５、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ７、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０５、ＤＣＩＲ２、ＣＤ４０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、Ｆ４／８０、ＣＤ１２３、およびＣＤ６８のうちの１つ以上を認識するが、それらのうちの１つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
【０１０３】
いくつかの好ましい実施形態では、感染性疾患因子に対する標的化ミニ細胞ワクチンとしてインビボ、エクスビボおよび／またはインビトロで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、その疾患因子に負の影響を与えるレシピエント動物宿主の免疫応答を生起させることにより動物で感染性疾患因子の進行を防止、阻害および／または遅延化するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。この好ましい実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）いずれも感染性疾患因子に由来する、１つ以上の抗原性炭水化物、タンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原を認識し、そして、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）ＬＬＯを含むが、これに限定されないエンドソーム破壊剤をさらに含み、（ｖ）一般的なアジュバントおよび／または標的化分子アジュバントをさらに含み、ならびに（ｖｉ）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与および／または経鼻投与を含むが、これらに限定されないインビボ投与経路に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞ワクチンは動物において液性（抗体介在性）および／または細胞性（細胞傷害性Ｔ細胞介在性）の防御免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、細菌、ウイルスおよび寄生生物に起源がある因子を含むが、これらに限定されない感染性疾患因子に対する防御である。いくつかの実施形態では、ミニ細胞ワクチンの表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＣＤ８、ＤＥＣ‐２０５、ＣＤ１０５、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１５、ＣＤ４５、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ７、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０５、ＤＣＩＲ２、ＣＤ４０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、Ｆ４／８０、ＣＤ１２３、およびＣＤ６８のうちの１つ以上を認識するが、それらのうちの１つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ
８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
【０１０４】
いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍に対する標的化ミニ細胞ワクチンとしてインビボ、エクスビボおよび／またはインビトロで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、腫瘍に負の影響を与えるレシピエント動物宿主の免疫応答を生起させることにより腫瘍の進行を防止、阻害および遅延化するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。この好ましい実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）いずれも腫瘍細胞に由来する１つ以上の抗原性炭水化物、タンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原を認識し、そして、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）ｃＬＬＯを含むが、これらに限定されないエンドソーム破壊剤をさらに含み、（ｖ）一般的なアジュバントおよび／または標的化分子アジュバントをさらに含み、ならびに（ｖｉ）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与および／または経鼻投与を含むが、これらに限定されないインビボ投与経路に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞ワクチンは動物において液性（抗体介在性）および／または細胞性（細胞傷害性Ｔ細胞介在性）の防御免疫応答を誘発する。１つの態様では、免疫応答は自己起源の悪性腫瘍および／または良性腫瘍に対する防御である。いくつかの実施形態では、ミニ細胞ワクチンの表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＣＤ８、ＤＥＣ‐２０５、ＣＤ１０５、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１５、ＣＤ４５、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ７、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０５、ＤＣＩＲ２、ＣＤ４０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、Ｆ４／８０、ＣＤ１２３、およびＣＤ６８のうちの１つ以上を認識するが、それらのうちの１つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
【０１０５】
いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍に対する標的化ミニ細胞ワクチンとしてインビボ、エクスビボおよび／またはインビトロで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、腫瘍に負の影響を与えるレシピエント動物宿主の免疫応答を生起させることにより腫瘍の進行を防止、阻害および遅延化するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。この好ましい実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）いずれも腫瘍細胞に由来する１つ以上の抗原性炭水化物、タンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＡのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原を認識し、そして、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）ＬＬＯを含むが、これに限定されないエンドソーム破壊剤をさらに含み、（ｖ）一般的なアジュバントおよび／または標的化分子アジュバントをさらに含み、ならびに（ｖｉ）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与および／または経鼻投与を含むが、これらに限定されないインビボ投与経路に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞ワクチンは動物において液性（抗体介在性）および／または細胞性（細胞傷害性Ｔ細胞介在性）の防御免疫応答を誘発する。１つの態様では、免疫応答は悪性腫瘍および／または良性腫瘍に対する防御である。いくつかの実施形態では、ミニ細胞ワク
チンの表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＣＤ８、ＤＥＣ‐２０５、ＣＤ１０５、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１５、ＣＤ４５、ＣＸ３ＣＲＩ、ＣＣＲ７、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０５、ＤＣＩＲ２、ＣＤ４０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、Ｆ４／８０、ＣＤ１２３、およびＣＤ６８のうちの１つ以上を認識するが、それらのうちの１つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
【０１０６】
いくつかの好ましい実施形態では、腫瘍に対する標的化ミニ細胞ワクチンとしてインビボ、エクスビボおよび／またはインビトロで標的化治療用ミニ細胞を使用し、そして、腫瘍に負の影響を与えるレシピエント動物宿主の免疫応答を生起させることにより腫瘍の進行を防止、阻害および遅延化するために標的化治療用ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合部分を表面に提示するＦｃ結合性ミニ細胞に由来し、（ｉｉ）いずれも腫瘍細胞に由来する１つ以上の抗原性炭水化物、タンパク質抗原および／またはＤＮＡワクチンを負荷されており、（ｉｉｉ）表面に提示されたプロテインＧのＦｃ結合領域のＦｃ結合部分に結合する表面局在性の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子であって、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原を認識し、そして、真核生物の抗原提示細胞に特異的な表面抗原に標的化ミニ細胞が結合すると受容体介在性エンドサイトーシスを促進することができる抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子をさらに含み、（ｉｖ）ＬＬＯを含むが、これに限定されないエンドソーム破壊剤をさらに含み、（ｖ）一般的なアジュバントおよび／または標的化分子アジュバントをさらに含み、ならびに（ｖｉ）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与および／または経鼻投与を含むが、これらに限定されないインビボ投与経路に適した薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的化ミニ細胞ワクチンは動物において液性（抗体介在性）および／または細胞性（細胞傷害性Ｔ細胞介在性）の防御免疫応答を誘発する。１つの態様では、免疫応答は悪性腫瘍および／または良性腫瘍に対する防御である。いくつかの実施形態では、ミニ細胞ワクチンの表面上の抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、ＣＤ８、ＤＥＣ‐２０５、ＣＤ１０５、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１５、ＣＤ４５、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ７、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０５、ＤＣＩＲ２、ＣＤ４０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、Ｆ４／８０、ＣＤ１２３、およびＣＤ６８のうちの１つ以上を認識するが、それらのうちの１つ以上を認識することに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化分子アジュバントはＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、Ｍ‐ＣＳＦＲ、および前述のものの任意の組合せを刺激する。
【０１０７】
いくつかの好ましい実施形態では、側方流動免疫アッセイ（ＬＦＩＡ）を含むが、これらに限定されない診断アッセイ用の分析物検出試薬として本明細書に記載されるＦｃ結合性ミニ細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では、分析物検出用Ｆｃ結合性ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＡのＦｃ結合領域を発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞、（ｉｉ）Ｆｃ含有ミニ細胞に結合した分析物特異的抗体または他の分析物特異的Ｆｃ含有融合体／複合体分子、ならびに（ｉｉｉ）小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成されるが、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。関連の置換では、競合性ＬＦＩＡで使用する負のリードアウト検出試薬としてＦｃ結合性ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、負のリードアウト検出試薬としてのＦｃ結合性ミニ細胞は、（ｉ）Ｆｃ結合性ミニ細胞、（ｉｉ）Ｆｃ含有ミニ細胞に結合したＦｃ／分析物融合体／複合体、ならびに（ｉｉｉ）小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定さ
れない検出試薬から構成され、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。溶解している所与の関連する分析物の存在または非存在について臨床の、獣医学の、環境の、固形および液体の食品、医薬品、および飲料水を分析するために使用されるキットの検出試薬としてミニ細胞を使用する。（ｉ）製品支持体、（ｉｉ）試料パッド、（ｉｉｉ）粒子コンジュゲートパッド、（ｉｖ）多孔性膜（例えば、ニトロセルロース）、（ｖ）試験ライン、（ｖｉ）対照ライン、および（ｖｉｉ）ウィック材を含むように側方流動免疫アッセイを構成する。ＬＦＩＡは短時間のポイント・オブ・ケア診断として、ならびに家庭内での使用（例えば、妊娠検査）、および様々なフィールド検査（例えば、飲料水または土壌中の毒物レベルの測定）に使用される。製品支持体は、ポリスチレンおよび／または別のプラスチックポリマーを含むが、これらに限定されない群より選択され、そして、当業者の自由裁量で製品支持体を抗粘着性媒体で被覆することができる。試料パッドは、セルロース、グラスファイバー、レーヨン、ポリプロピレン、および／または当技術分野において公知の他の一般的に使用される濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。粒子コンジュゲートパッドは、グラスファイバー、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン、および当技術分野において公知の他の濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することによりコンジュゲートパッドコンポーネントを「ブロック」することができる。多孔性分析試験膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ヒュージョン５マトリックス（Ｗｈａｔｍａｎ）、４キャストチップマトリックス（Ａｍｉｃ、ウプサラ、スウェーデン）、および前述のものの任意の組合せを含む材種から選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することにより多孔性分析試験膜コンポーネントを「ブロック」することができる。試験ラインおよび対照ラインを多孔性分析膜に組み込んだ後に多孔性分析膜のブロッキングを行う。非接触ポンプ駆動性ソレノイド型分注器、接触チップ型分注器、定量性エアブラシ型分注器、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない製造装置を使用して多孔性分析膜に試験ラインと対照ラインを組み込む。試験ストリップは多孔性分析試験膜に共有結合または非共有結合している抗体または他の試験分析物特異的結合パートナーから構成される。対照ストリップは、検出粒子（すなわち、ミニ細胞）の試験分析物への結合と無関係にその検出粒子が対照ストリップと結合することができるように、抗体または他の検出粒子特異的結合パートナー（例えば、抗ミニ細胞抗体）から構成される。ウィックコンポーネントは、高密度セルロースを含むが、これらに限定されない材種から選択され得る。多くのウィックコンポーネントが当業者に知られており、そして、当業者の自由裁量でそれらを最終製品に利用することができる。図１にミニ細胞ベースの側方流動免疫アッセイの例示的実施形態が示されている。いくつかの実施形態では、試験溶液を液体の溶液の状態で得る、または調製し、それを試料パッドにアプライし、分析物検出試薬（ミニ細胞）と混合し、その後、試験溶液がウィックに向かって多孔性分析膜を通過する。分析物が結合した検出試薬は正の試験ラインに蓄積し、測光性電荷結合素子カメラ、蛍光測定分析（例えば、ＬＥＤ励起）、放射測定分析を含む、当技術分野において公知の方法のうちの任意の数の方法を用いて、および磁性アッセイリーダーによりそれを検出することができる。
【０１０８】
いくつかの好ましい実施形態では、側方流動免疫アッセイ（ＬＦＩＡ）を含むが、これらに限定されない診断アッセイ用の分析物検出試薬として本明細書に記載されるＦｃ結合性ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、分析物検出用Ｆｃ結合性ミニ細胞は、（ｉ）プロテインＧのＦｃ結合領域を発現および提示するＦｃ結合性ミニ細胞、（ｉｉ）Ｆｃ含有ミニ細胞に結合した分析物特異的抗体または他の分析物特異的Ｆｃ含有融合体／複合体分子、ならびに（ｉｉｉ）小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成され、その検出
試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。関連の置換では、競合性ＬＦＩＡで使用する負のリードアウト検出試薬としてＦｃ結合性ミニ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、負のリードアウト検出試薬としてのＦｃ結合性ミニ細胞は、（ｉ）Ｆｃ結合性ミニ細胞、（ｉｉ）Ｆｃ含有ミニ細胞に結合したＦｃ／分析物融合体／複合体、ならびに（ｉｉｉ）小分子フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、磁性粒子、および金コロイドを含むが、これらに限定されない検出試薬から構成され、その検出試薬はミニ細胞によって封入され、提示され、またはそうでない場合は、ミニ細胞と結合する。溶解している所与の関連する分析物の存在または非存在について臨床の、獣医学の、環境の、固形および液体の食品、医薬品、および飲料水を分析するために使用されるキットの検出試薬としてミニ細胞を使用する。（ｉ）製品支持体、（ｉｉ）試料パッド、（ｉｉｉ）粒子コンジュゲートパッド、（ｉｖ）多孔性膜（例えば、ニトロセルロース）、（ｖ）試験ライン、（ｖｉ）対照ライン、および（ｖｉｉ）ウィック材を含むように側方流動免疫アッセイを構成する。ＬＦＩＡは短時間のポイント・オブ・ケア診断として、ならびに家庭内での使用（例えば、妊娠検査）、および様々なフィールド検査（例えば、飲料水または土壌中の毒物レベルの測定）に使用される。製品支持体は、ポリスチレンおよび／または別のプラスチックポリマーを含むが、これらに限定されない群より選択され、そして、当業者の自由裁量で製品支持体を抗粘着性媒体で被覆することができる。試料パッドは、セルロース、グラスファイバー、レーヨン、ポリプロピレン、および／または当技術分野において公知の他の一般的に使用される濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。粒子コンジュゲートパッドは、グラスファイバー、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン、および当技術分野において公知の他の濾材を含むが、これらに限定されない材種から当業者の自由裁量で選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することによりコンジュゲートパッドコンポーネントを「ブロック」することができる。多孔性分析試験膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ヒュージョン５マトリックス（Ｗｈａｔｍａｎ）、４キャストチップマトリックス（Ａｍｉｃ、ウプサラ、スウェーデン）、および前述のものの任意の組合せを含む材種から選択される。さらに、タンパク質、高分子、界面活性剤、および前述のものの任意の組合せを含有する溶液に浸漬して付加することにより多孔性分析試験膜コンポーネントを「ブロック」することができる。試験ラインおよび対照ラインを多孔性分析膜に組み込んだ後に多孔性分析膜のブロッキングを行う。非接触ポンプ駆動性ソレノイド型分注器、接触チップ型分注器、定量性エアブラシ型分注器、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない製造装置を使用して多孔性分析膜に試験ラインと対照ラインを組み込む。試験ストリップは多孔性分析試験膜に共有結合または非共有結合している抗体または他の試験分析物特異的結合パートナーから構成される。対照ストリップは、検出粒子（すなわち、ミニ細胞）の試験分析物への結合と無関係にその検出粒子が対照ストリップと結合することができるように、抗体または他の検出粒子特異的結合パートナー（例えば、抗ミニ細胞抗体）から構成される。ウィックコンポーネントは、高密度セルロースを含むが、これらに限定されない材種から選択され得る。多くのウィックコンポーネントが当業者に知られており、そして、当業者の自由裁量でそれらを最終製品に利用することができる。図１にミニ細胞ベースの側方流動免疫アッセイの完全な略図が示されている。いくつかの実施形態では、試験溶液を液体の溶液の状態で得る、または調製し、それを試料パッドにアプライし、分析物検出試薬（ミニ細胞）と混合し、その後、試験溶液がウィックに向かって多孔性分析膜を通過する。分析物が結合した検出試薬は正の試験ラインに蓄積し、測光性電荷結合素子カメラ、蛍光測定分析（例えば、ＬＥＤ励起）、放射測定分析を含む、当技術分野において公知の方法のうちの任意の数の方法を用いて、および磁性アッセイリーダーによりそれを検出することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態は、（ｉ）隔壁形成、二分裂および染色体分配のうちの１つ以上を
調節するミニ細胞産生遺伝子産物をコードする発現可能遺伝子、（ｉｉ）ミニ細胞産生細菌の染色体にその認識部位が１つ以上含まれる異種性のエンドヌクレアーゼをコードする発現可能な「遺伝的自殺」遺伝子、（ｉｉｉ）限定的な栄養要求性；（ｉｖ）ｌｐｘＭ／ｍｓｂＢ遺伝子（または他の機能上の同等物）の欠失または変異、ならびに（ｖ）プロテインＧのＦｃ結合領域の機能発現と表面提示が可能である組換え発現カセットを含むＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌を提供する。いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞産生遺伝子は細胞分裂遺伝子である。細胞分裂遺伝子にはｆｔｓＺ、ｓｕｌＡ、ｃｃｄＢおよびｓｆｉＣが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で前記ミニ細胞産生遺伝子が発現する。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌の染色体上にエンドヌクレアーゼ自殺遺伝子が位置する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼにはＩ‐ＣｅｕＩ、ＰＩ‐ＳｃｅＩ、Ｉ‐ＣｈｕＩ、Ｉ‐ＣｐａＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ‐ＣｒｅＩ、Ｉ‐ＭｓｏＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＶ、Ｉ‐ＣｓｍＩ、Ｉ‐ＤｍｏＩ、Ｉ‐ＰｏｒＩ、ＰＩ‐ＴｌｉＩ、ＰＩ‐ＴｌｉＩＩおよびＰＩ‐ＳｃｐＩが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で前記エンドヌクレアーゼが発現する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の原因は必須代謝遺伝子の欠失または不活性化変異である。いくつかの実施形態では、ｄａｐＡ遺伝子またはその機能的ホモログに欠失または不活性化変異が存在する。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、リポ多糖合成に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子の欠失または不活性化変異をさらに含み、その遺伝子は対応する野生型遺伝子と比較して遺伝的に改変されている。いくつかの実施形態では、前記の不活性型遺伝子はｌｐｘＭ／ｍｓｂＢであり、それは、対応する野生型細菌のリピドＡ分子と比較して変化したリピドＡ分子を前記細菌が産生する原因になる遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態では、その変異型リピドＡ分子は、対応する野生型細菌のリピドＡ分子と比較して、リポ多糖分子のリピドＡ部分へのミリストレイン酸の付加に関して欠陥がある。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、相同組換えに関わる遺伝子の欠失または不活性化変異をさらに含み、その遺伝子は対応する野生型遺伝子と比較して遺伝的に改変されており、そのミニ細胞産生細菌はＤＮＡ損傷修復に欠陥がある。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、リボヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子（例えば、大腸菌のｒｎｃ遺伝子；大腸菌で二本鎖ＲＮＡを分解する）に変異をさらに含む、またはその遺伝子を欠き、その結果生じるミニ細胞がこのリボヌクレアーゼに欠陥を持ち、それによりｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡ分子の半減期をミニ細胞において上昇させる。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌株は組換えｃＬＬＯタンパク質をさらに含み、その結果生じるミニ細胞がｃＬＬＯタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合性ミニ細胞産生細菌は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブルセラ属の種、フランシセラ・ツラレミア（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｍｉａ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、クリーブセラ（Ｋｌｉｅｂｓｅｌｌａ）、エルシニア属の種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、サルモネラ属の種、シゲラ属の種、緑膿菌、および大腸菌を含むが、これらに限定されないグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合性ミニ細胞産生細菌は、ブドウ球菌属の種、ラクトバシラス属の種、ストレプトコッカス属の種、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）を含むが、これらに限定されないグラム陽性細菌である。
【０１１０】
いくつかの実施形態は、（ｉ）隔壁形成、二分裂および染色体分配のうちの１つ以上を調節するミニ細胞産生遺伝子産物をコードする発現可能遺伝子、（ｉｉ）ミニ細胞産生細菌の染色体にその認識部位が１つ以上含まれる異種性のエンドヌクレアーゼをコードする発現可能な「遺伝的自殺」遺伝子、（ｉｉｉ）限定的な栄養要求性；（ｉｖ）ｌｐｘＭ／ｍｓｂＢ遺伝子（または他の機能上の同等物）の欠失または変異、ならびに（ｖ）プロテインＡのＦｃ結合領域の機能発現と表面提示が可能である組換え発現カセットを含むＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌を提供する。いくつかの実施形態では、前記ミニ細胞産生遺伝子は細胞分裂遺伝子である。細胞分裂遺伝子にはｆｔｓＺ、ｓｕｌＡ、ｃｃｄＢおよびｓｆｉＣが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で前記ミニ細胞産生遺伝子が発現する。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌の染色体上にエンドヌクレアーゼ自殺遺伝子が位置する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼにはＩ‐ＣｅｕＩ、ＰＩ‐ＳｃｅＩ、Ｉ‐ＣｈｕＩ、Ｉ‐ＣｐａＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ‐ＣｒｅＩ、Ｉ‐ＭｓｏＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＶ、Ｉ‐ＣｓｍＩ、Ｉ‐ＤｍｏＩ、Ｉ‐ＰｏｒＩ、ＰＩ‐ＴｌｉＩ、ＰＩ‐ＴｌｉＩＩおよびＰＩ‐ＳｃｐＩが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で前記エンドヌクレアーゼが発現する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の原因は必須代謝遺伝子の欠失または不活性化変異である。いくつかの実施形態では、ｄａｐＡ遺伝子またはその機能的ホモログに欠失または不活性化変異が存在する。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、リポ多糖合成に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子の欠失または不活性化変異をさらに含み、その遺伝子は対応する野生型遺伝子と比較して遺伝的に改変されている。いくつかの実施形態では、前記の不活性型遺伝子はｌｐｘＭ／ｍｓｂＢであり、それは、対応する野生型細菌のリピドＡ分子と比較して変化したリピドＡ分子を前記細菌が産生する原因になる遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態では、その変異型リピドＡ分子は、対応する野生型細菌のリピドＡ分子と比較して、リポ多糖分子のリピドＡ部分へのミリストレイン酸の付加に関して欠陥がある。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、相同組換えに関わる遺伝子の欠失または不活性化変異をさらに含み、その遺伝子は対応する野生型遺伝子と比較して遺伝的に改変されており、そのミニ細胞産生細菌はＤＮＡ損傷修復に欠陥がある。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌は、リボヌクレアーゼＩＩＩをコードする遺伝子（例えば、大腸菌のｒｎｃ遺伝子；大腸菌で二本鎖ＲＮＡを分解する）に変異をさらに含む、またはその遺伝子を欠き、その結果生じるミニ細胞がこのリボヌクレアーゼに欠陥を持ち、それによりｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡ分子の半減期をミニ細胞において上昇させる。いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生細菌株は組換えｃＬＬＯタンパク質をさらに含み、その結果生じるミニ細胞がｃＬＬＯタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合性ミニ細胞産生細菌は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブルセラ属の種、フランシセラ・ツラレミア（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｍｉａ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、クリーブセラ（Ｋｌｉｅｂｓｅｌｌａ）、エルシニア属の種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、サルモネラ属の種、シゲラ属の種、緑膿菌、および大腸菌を含むが、これらに限定されないグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合性ミニ細胞産生細菌は、ブドウ球菌属の種、ラクトバシラス属の種、ストレプトコッカス属の種、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）を含むが、これらに限定されないグラム陽性細菌である。
【０１１１】
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるＦｃ結合性ミニ細胞産生細菌を培養すること、およびそのミニ細胞産生親細胞からミニ細胞を実質的に分離することを含む、Ｆｃ結合性ミニ細胞の作製方法を提供するが、それによりＦｃ結合性ミニ細胞を含む組成物が作製される。いくつかの実施形態では、前記方法は、ミニ細胞産生親細胞からミニ細胞形成を誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、遺伝的自殺エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の発現を誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態では、イソプロピルβ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ラムノース、アラビノース、キシロース、フルクトース、メリビオースおよびテトラサイクリンから選択される１つ以上の化学化合物の存在によってミニ細胞形成が誘導される。いくつかの実施形態では、温度の変更によって遺伝的自殺エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の発現が誘導される。いくつかの実施形態では、前記方法は、組成物からＦｃ結合性ミニ細胞を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、遠心分離、濾過、限外濾過、超遠心分離、濃度勾配、免疫親和性、免疫沈殿、および前述の精製方法の任意の組合せを含むが、これらに限定されない群より選択される方法により、ミニ細胞が親細胞から実質的に分離される。
【０１１２】
いくつかの実施形態は、そのリポ多糖成分がミリストレイン酸部分を持たないリピドＡ分子を含む（「無害化リポ多糖」または「無害化ＬＰＳ」）外膜を含む真正細菌ミニ細胞を提供する。無害化ＬＰＳは、対応する野生型細菌に由来する真正細菌ミニ細胞の外膜によって誘導される炎症反応と対照的に、哺乳類宿主で炎症誘発性免疫応答の低下をもたらす。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、標的化治療用ミニ細胞は、１つ以上の生物学的活性がある化合物をさらに含む。いくつかの実施形態では、生物学的活性がある化合物のうちの少なくとも１つは、放射性同位体、ポリペプチド、核酸および小分子薬からなる群より選択される。生物学的活性がある化合物は、治療用核酸、小分子薬、プロドラッグ、治療用ポリペプチド、小分子イメージング剤、タンパク質系イメージング剤、タンパク質系イメージング剤をコードする真核生物の発現プラスミド、プロドラッグ転換酵素、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない群から選択される。生物学的活性がある化合物は、核酸と小分子の組合せ、小分子イメージング剤と小分子薬の組合せ、小分子薬、小分子イメージング剤および核酸の組合せ、または核酸とポリペプチドの組合せであり得る。
【０１１４】
本願は、抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体分子に結合し、それらを提示することができ、いくつかのクラスの生理活性積載物の共同または単独でのミニ細胞ベースの標的送達を促進するＦｃ結合性真正細菌ミニ細胞を含む組成物について説明するが、生存可能な汚染混入親細胞は標的化ミニ細胞の最終調製品に十分残っていない。前記ミニ細胞は、選択肢として、および当業者の自由裁量で無害化型のリポ多糖をさらに含んでも、含まなくてもよい。
【０１１５】
１．ミニ細胞の産生
ミニ細胞は、正常な細胞分裂装置の破壊後に細菌によって形成される、染色体が無い、膜で被包された生物的ナノ粒子（使用する株の種類と培養条件に応じて、直径約２５０〜５００ｎｍ）である。本質的に、ミニ細胞は、染色体ＤＮＡを含まず、したがって、分裂せず、生育不能であることを除いて、正常な細菌細胞の小型で代謝的に活性が有る複製物である。ミニ細胞は染色体ＤＮＡを含まないが、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、天然および／または組換え発現したタンパク質、ならびに他の代謝物が全てミニ細胞に分配されることが示されている。
【０１１６】
染色体の複製と細胞分裂の間の共調を破壊することで、ほとんどの桿状原核生物の極領域からミニ細胞が形成される。染色体の複製と細胞分裂の間の共調の破壊は、隔壁形成と二分裂に関与する遺伝子のうちのいくつかの過剰発現によって促進され得る。あるいは、隔壁形成と二分裂に関与する遺伝子に変異を有する株でミニ細胞が産生され得る。染色体分配機構の欠損も、多種多様な原核生物で示されているように、ミニ細胞形成を引き起こすことができる。
【０１１７】
同様に、新しくできた染色体の娘細胞への分配に関与する遺伝子の過剰発現または変異によってミニ細胞の産生を達成することができる。例えば、大腸菌のｐａｒＣ遺伝子座またはｍｕｋＢ遺伝子座の変異がミニ細胞を産生することが示されている。その両方が腸内細菌科の染色体分配過程の異なる必要なステップに影響する。上記の細胞分裂遺伝子のように、ミニ細胞を産生することになる、染色体分配に関与する任意の所与の遺伝子の野生型レベルの操作が他の科のメンバーで同様の効果を持つことが考えられ得る。
【０１１８】
細胞分裂と染色体複製の過程は生存にとって非常に重要なので、これらの過程に重要な遺伝子に関して原核生物の科のメンバーの間で高レベルの遺伝的および機能的保存性が存在する。結果として、１つの科のメンバーでミニ細胞の産生を誘導することができる細胞分裂遺伝子の過剰発現または変異は別のメンバーでミニ細胞を産生するために使用され得る。例えば、サルモネラ属の種およびシゲラ属の種などの他の腸内細菌科のメンバーならびにシュードモナス属の種などの他の科のメンバーにおける大腸菌ｆｔｓＺ遺伝子の過剰発現は、類似したレベルのミニ細胞産生をもたらすことが示されている。
【０１１９】
腸内細菌科の変異に基づくミニ細胞産生株で同じことが示され得る。例えば、腸内細菌科のメンバーのうちのいずれでも、ｍｉｎ座位の欠失がミニ細胞産生を引き起こす。変異によってミニ細胞形成を引き起こすことができる腸内細菌の細胞分裂遺伝子にはｍｉｎ遺伝子（ＭｉｎＣＤＥ）が含まれるが、これらに限定されない。ｍｉｎ変異株からのミニ細胞産生が可能であるが、これらの株が持つ産生株としての商業上の価値は限定的である。ｍｉｎ遺伝子に欠失または変異を有する株がミニ細胞を産生するレベルは常に低レベルであることが、このことの理由である。このことは商業化と規模の経済に関して２つの問題をもたらす。これらの株からのミニ細胞の収率が低く、生産コストを上昇させることが第一の問題である。ミニ細胞の収率が変異株によって非常に変わりやすく、ロット毎の変動性が生産コスト、製造品質管理および規制対応に対して非常に大きい影響を有することが第二の問題である。タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および診断用送達または治療用送達される他の代謝物などの生物学的活性がある分子を封入するミニ細胞を作製するために細胞分裂変異株を使用することは問題である。変異株でのミニ細胞産生の開始を制御することができず、低レベルでそれが生じるので、いくつかのミニ細胞は生物学的活性がある分子を含まず、他のミニ細胞は非常に様々な量の生物学的活性がある分子を含むことになる。これらの欠点は、まとまると、または、一つ一つが、商業目的でのこれらの変異株の実用性を制限する。
【０１２０】
過剰発現される細胞分裂遺伝子が誘導性または他の条件的活性真正細菌プロモーターシステムの制御下に置かれている限り、ミニ細胞産生表現型は制御可能であるので、細胞分裂遺伝子を過剰発現するミニ細胞産生株（「過剰発現体」）が変異に基づく株よりも好ましい。細胞分裂遺伝子ｆｔｓＺを過剰発現する株からのミニ細胞産生は、プラスミドベースの相補性試験を用いて大腸菌の必須細胞分裂遺伝子を同定していた研究者によって発見された。これらの研究では、ｆｔｓＺ遺伝子は細胞あたり１０コピー以上存在した。複数コピーのｆｔｓＺ遺伝子が存在することによりミニ細胞と極端に長い繊維状の細胞が産生されることが示された。最終的には、産生されるミニ細胞の数はいかなる変異株から産生されるミニ細胞の数よりもずっと多いが、この不可逆的な繊維状表現型への移行がマルチコピープラスミドからｆｔｓＺを過剰発現する株からのミニ細胞の収率に負の影響を与え
る。その後、ｆｔｓＺ遺伝子のコピー数を染色体上に２コピーまで減少させることにより、ｆｔｓＺがマルチコピープラスミド上に位置する株よりも産生されるミニ細胞の数が増え、繊維状表現型が顕著ではなくなることが示されている。したがって、２コピーの染色体に挿入されたｆｔｓＺコピーからｆｔｓＺ遺伝子を誘導的に過剰発現するミニ細胞産生株が好ましい組成物である。その使用される２コピーのｆｔｓＺ遺伝子は、ミニ細胞産生表現型が設計されている細菌種に直接由来してよく、および、他の種の細菌のｆｔｓＺ遺伝子配列に由来してもよい。非限定的な例として、大腸菌およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からミニ細胞を生成するために大腸菌ｆｔｓＺ遺伝子の過剰発現を用いることができる。結果として生じる株は、染色体上に存在する野生型ｆｔｓＺ遺伝子およびそれとは別の重複性で誘導性コピーのｆｔｓＺ遺伝子、ならびにその全体の参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１１２６７０号に記載される誘導性遺伝的自殺機構から構成される。非限定的な例として、腸内細菌科でミニ細胞を産生するために過剰発現され得る分裂遺伝子にはｆｔｓＺ、ｍｉｎＥ、ｓｕｌＡ、ｃｃｄＢおよびｓｆｉＣが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい組成物は、誘導性プロモーターの制御下にある重複コピーの細胞分裂遺伝子を持ち、それが所与の真正細菌株の染色体に安定的に組み込まれているべきである。当業者は、誘導性細胞分裂遺伝子カセットがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、組換えバクテリオファージまたは細胞に存在する他のエピソーム性ＤＮＡ分子に存在する場合は、この同じ戦略をとることができることを容易に理解する。
【０１２１】
このミニ細胞産生の誘導性表現型アプローチは変異体システムよりも明白な利点をいくつか有している。第１の利点は、これらの株には恒常的な遺伝的変異が存在しないので、正常に生育している間は選択圧が存在せず、ミニ細胞表現型が誘導されるまで、培養されている細胞が非常に安定で正常な生理機能を維持することである。その結果、誘導性ミニ細胞産生株はより健康でより安定的であり、最終的にミニ細胞の収率がより高くなる。ミニ細胞産生に誘導性表現型アプローチを用いることの別の明白な利点は、タンパク質、治療用ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびミニ細胞産生親細胞が産生することができる他の生理活性代謝物などの生物学的活性がある分子を送達するためにミニ細胞が使用される場合、産生されるミニ細胞がそれらの生物学的活性がある分子を封入することである。これらの場合では、好ましい方法は、産生されたミニ細胞の全てが所望の量の生物学的活性がある分子を含有するように、ミニ細胞表現型を誘導する前に親細胞で生物学的活性が有る分子の形成を誘導することである。あるいは、ミニ細胞自体が親細胞から分離された後に生理活性分子を産生することができる。これには、ミニ細胞内に存在する、生理活性分子をコードするエピソーム性の核酸またはＲＮＡから生理活性分子を形成すること、または、親細胞からの分離後にミニ細胞に前から存在するタンパク質構成要素により生理活性分子を形成することが含まれるが、これらに限定されない。ミニ細胞表面に結合部分を発現および提示するためにこれらの発現ストラテジーのうちのいずれかを用いることができる。これらの利点が、組み合わされて用いられると、より高品質で大量のミニ細胞をもたらす。さらに、これらのミニ細胞は、以下でより詳細が説明されるように、ミニ細胞に導入し得る小分子薬をさらに含むことができる。
【０１２２】
２．ミニ細胞の精製
病原性である、または日和見的に病原性であるいくつかの細菌からミニ細胞を得るので、投与前に所与の集団からいかなる汚染混入親細胞をも機能的に排除することが最も重要である。従来、物理的方法か生物学的方法のどちらか、またはその両方により生存している親細胞を排除してきた。
【０１２３】
物理的方法には遠心分離ベースの分離法、濾過法、クロマトグラフィー法、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１２４】
生物学的排除は、非限定的だが、親細胞の優先的溶解、栄養要求性親株の使用、抗生物質処理、ＵＶ照射処理、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）欠乏、親細胞の選択的吸着、他のＤＮＡ損傷剤処理、および自殺遺伝子の誘導によって達成される。
【０１２５】
親細胞の優先的溶解には溶原プロファージの溶菌サイクルの誘導が通常介在する。ミニ細胞産生株の場合、ミニ細胞が後で感染され、溶解表現型の活性化の最中に溶解することがないように、溶解能があるが再感染能が無いプロファージを使用することが最も有用である。代わりに、および、非限定的な例として、ｈｏｌｉｎ遺伝子ファミリーのメンバーとして分類される遺伝子のような個々の遺伝子を発現して、溶原性プロファージの使用につきものの再感染を心配することなく、同様のレベルの溶解を達成することができる。溶解事象により、それを達成するために用いる方法に関係なく、許容できない量の遊離エンドトキシンが培地に放出されるという点で、両方のアプローチは制限される。そのような大量の遊離エンドトキシンの除去は時間を費やすものであり、ロット毎の変動性に苦しみ、究極的には、法外な費用がかかる。
【０１２６】
栄養要求性株の使用が遺伝的復帰についての懸念を生じさせるので、片利共生性細菌株または非病原性細菌株からミニ細胞を産生する予定の場合にのみ、それを使用することができる。したがって、それらの応用は、ミニ細胞産生に使用される生存している非病原性親細胞を排除する方法として用いられることに関して限定される。
【０１２７】
抗生物質の使用は、（例えば、分画遠心分離または準備濾過により）ミニ細胞が濃縮されている試料に対して使用されるとき、ミニ細胞の産生に有益であり得る。親細胞がほとんど存在しない場合、抗生物質耐性が生じる可能性はほぼ０にまで低下する。多数の生存可能な親細胞をなお含む初期ミニ細胞産生培養物への抗生物質の使用は、生存可能な親細胞の数に比例して抗生物質耐性を生じさせる機会が上昇するので、好ましくない。
【０１２８】
ＵＶ照射処理は、ＵＶ照射の核酸に対する効果に関してランダムであり、結果がロット毎に非常にまちまちであるということを除いて、ミニ細胞の産生に関して生存している親細胞の排除に有用であり得る。さらに、ＵＶ照射は全ての核酸に無作為に損傷を与えるので、治療用核酸または予防用核酸を送達するためにミニ細胞を使用するときにこの方法は好ましくない。例えば、プラスミドＤＮＡもＵＶ照射によるＤＮＡ損傷を非常に受けやすく、それでもミニ細胞によって効果的に送達されるが、効力がなくなる場合がある。
【０１２９】
ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）欠乏は、このアプローチを用いることができる種の数によってこのアプローチが制限されることを除いて、生存している親細胞の排除に有用であり得る。言い換えると、ミニ細胞を産生することができる種類の親細胞の全てがＤＡＰを生存に必要とするわけではない。大腸菌ミニ細胞産生株のＤＡＰ変異体は非常に利点があり、いくつかの場合では野生型よりも好ましい。ＤＡＰを使用することの利点は、この化合物（ジアミノピメリン酸、大腸菌細胞壁の構成成分）が大腸菌の生育に重要であること、および、動物に存在しない、または動物によって産生されないことである。したがって、「生存可能な」大腸菌ミニ細胞産生親細胞が標的化ミニ細胞と共に投与されなくてはならない場合、親細胞は生育することができず、その結果、動物に対して、およびミニ細胞の活性に関して不活性である。サルモネラ属の種に基づくミニ細胞産生親株について、その場合、ａｒｏ遺伝子、好ましくはａｒｏＢを除去することを除いて同様のアプローチを用いることができる。
【０１３０】
生存可能な親細胞からのミニ細胞の精製に関して、選択的吸着法はまだ検討されていない。選択的吸着は、親細胞またはミニ細胞が基材へのそれらの親和性によってその基材に優先的に吸着される任意の方法として定義される。非限定的な例として、高親和性タンパク質間相互作用をこの使用法に利用することができる。非限定的な例として、グラム陰性
種であるエルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の外膜タンパク質であるインベイシンは哺乳類のインテグリンに対して高親和性を有する。誘導性プロモーターの制御下にあるインベイシンをコードする遺伝子は、ミニ細胞産生株の染色体に容易に導入され得る。産生されるミニ細胞がその細胞表面にインベイシンを発現および提示しないように、インベイシン遺伝子の発現を活性化する前にこの株からミニ細胞を産生することができる。その株から所望の量のミニ細胞が産生されると、生存可能な細胞にのみインベイシンが発現および提示されるように、インベイシンタンパク質を産生するためのシグナルが培養物中の生存可能な細胞に与えられ得る。インベイシンが生存可能な親細胞の表面に優先的に発現すると、それらは、インテグリンまたは他のインベイシン特異的タンパク質結合モチーフが埋め込まれた合成ポリペプチドもしくは他の組換えタンパク質で被覆されている基材に容易に吸着され得る。一旦、吸着されると、使用した基材の種類に応じて多種多様な方法により生存可能な親細胞からミニ細胞を選択的に精製することができる。基材には、重力式濾過用途に使用される固相クロマトグラフィーカラム、磁性ビーズ、イオン交換カラムまたはＨＰＬＣカラムが含まれるが、これらに限定されない。単一のタンパク質間相互作用が全ての種類のミニ細胞産生親細胞に機能することはないという欠点によりこのアプローチは制限される。例えば、上記のインベイシンインテグリン間アプローチはほとんどのグラム陰性腸内細菌科メンバーには有用であるが、ミニ細胞産生グラム陽性バシラス科メンバーとの使用については有用ではないだろう。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞を含む組成物中で、ミニ細胞はミニ細胞産生親細胞から実質的に分別される。例えば、分別後に、ミニ細胞を含む組成物は約９９．９％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％または３０％未満ミニ細胞産生親細胞フリーである。いくつかの実施形態では、前記組成物は約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％未満のミニ細胞産生親細胞を含有する。
【０１３２】
治療を目的にインビボで投与されるときに、毒性が強すぎないように、または標的化ミニ細胞の活性を邪魔しないように、生存可能であってもなくても、最終組成物に含まれる汚染混入性親細胞が十分に少ないことが好ましい。
【０１３３】
汚染混入性の生存可能な親細菌細胞を十分に排除するいくつかの好ましい方法は、当技術分野において公知の標準的な濾過技術などのさらなる物理的分離法の前に誘導性遺伝的自殺機構を組み込み、それを活性化することによるものであるが、それには米国特許出願公開第２０１００１１２６７０号に記載されるホーミングエンドヌクレアーゼまたはその機能性同等物の活性化と発現が含まれるが、これに限定されない。
【０１３４】
３．特定の細胞、組織および器官へのミニ細胞の標的化
ミニ細胞の産生、遺伝的自殺機構の活性化、およびその後のミニ細胞の精製の後に、標的送達媒体としてミニ細胞を使用する。プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域を発現し、さらに抗体、Ｆｃ含有抗体派生物、および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をそれらの表面に提示するミニ細胞を使用して、インビボで疾患に関係する特定の細胞タイプを標的として、標的にされた組織、器官および細胞タイプにそれらの生理活性積載物を優先的に送達する。
【０１３５】
疾患に関係する特定の組織、器官および細胞タイプへのミニ細胞の標的化を補助することが企図されている抗体またはその任意の部分は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧまたはＩｇＥを含むが、これらに限定されない任意の免疫グロブリンサブクラスに由来し得る、またはその一部であり得る。同じ目標を達成する適応免疫を介した抗体応答を生起することが知られている任意の動物において細胞特異的抗原に対する任意のサブクラスの任意の抗体を産生することができるが、ミニ細胞の標的化機能を促進することが企図されている任意のサブクラスの抗体を「ヒト化」することができる。自然では、抗体は、それぞれが特定の抗原の同一のエピトープを認識する２つの異なる腕（Ｆａｂ’）を含むように産生される。
【０１３６】
研究室では、単一の抗体が同時に２つの異なる抗原を標的とするように、異なる抗原に独立して特異的であるように抗体を設計することができる。非限定的な例として、所与の真正細菌ミニ細胞の推定上の表面コンポーネント（例えば、ＬＰＳ  Ｏ‐抗原）を一方の腕で認識するように抗体を設計することができ、他方の腕が上記の抗原のような真核細胞特異的表面抗原を認識するようにそれを設計することができる。さらに、当業者は、他の二特異性抗体アプローチが実行されて同じ効果を達成することができることを容易に理解する。非限定的な例として、当業者であれば、異なる特異性を有する２つの異なる抗体をプロテインＡ／Ｇに結合させてそれらを非共有結合してミニ細胞表面に接着することができる粗「二特異性」抗体派生物を形成することができるが、その複合体の一方の抗体はミニ細胞表面に特異的に接着し、他方の抗体は提示されて、疾患に関係する特定の細胞、組織、または器官タイプをインビボで特異的に認識し、それによりそれを「標的とする」ことを容易に理解するだろう。同様に、当業者は、異なる特異性を有する２つの異なる抗体が様々な架橋技術を用いて共有結合されて同じ効果を達成することができることを理解する。当業者はこれらの潜在的な標的化アプローチの全てを容易に理解する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、集団的にＦｃ含有融合体／複合体に基づく他の非抗体ベースの標的化アプローチを用いることができる。使用することができる分子標的化部分の例には受容体リガンド、ポリペプチド、ホルモン、炭水化物、アプタマー、抗体様分子およびＤＡＲＰｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において公知の様々なアプローチを用いてＦｃ複合体化を達成することができる。受容体リガンド／Ｆｃ融合体、Ｆｃ含有ペプチド融合体およびＦｃ含有ＤＡＲＰｉｎを含むが、これらに限定されないＦｃ含有ポリペプチド融合体の場合では、融合体の組換え発現が好ましい構築方法である。組換え発現の背景では、Ｆｃ領域への融合が受容体への結合と受容体介在性エンドサイトーシスの促進に関するリガンドの活性に影響しないように、当業者の自由裁量で所与の組換え融合体のアミノ末端またはカルボキシ末端にＦｃ領域を融合することができる。Ｆｃ含有ポリペプチド、ペプチドおよびＤＡＲＰｉｎを作製する別のアプローチは、当技術分野において公知の周知の架橋技術のうちのいずれかを用いて組換えポリペプチド分子、組換えペプチド分子、および／または組換えＤＡＲＰｉｎ分子に精製された組換えＦｃ領域分子を化学的結合（架橋としても知られる）することによるものである。化学的架橋の背景では、精製された組換えＦｃ領域か複合体化されるポリペプチド分子、ペプチド分子および／もしくはＤＡＲＰｉｎ分子のどちらか、または両方に「反応性」アミノ酸基を含むことが有利である。通常、反応性アミノ酸にはスルフヒドリル基を含むもの、好ましくはシステイン残基が含まれるが、これらに限定されない。一般的なヘテロ二官能性架橋試薬と共に使用するには、対応するコンジュゲートの連結部にリシン残基を含むことが好ましい（例えば、Ｆｃ領域がシステイン残基を含み、ポリペプチドがリシンを含む、または、その逆も同様）。精製された組換えＦｃ領域がホルモン、炭水化物、アプタマー、ならびに他の非アミノ酸および／またはペプチド系の分子に架橋する例では、当業者は、同じことを達成するために他の多くの架橋試薬を使用することができることを理解する。架橋試薬は「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」であり得る（それぞれ、同一または異なる反応性基を有する）。架橋試薬の例には表１に記載されるものが挙げられるが、これ
らに限定されない。表１は、どの架橋試薬が各複合体化分子種／アプローチにとって適切および好適であるかも示す。このアプローチの利用では、（ｉ）組換えＦｃ領域の作製または購入、（ｉｉ）Ｆｃ領域に結合される標的化分子の作製または購入、（ｉｉｉ）適切な架橋試薬（表１を参照のこと）の存在下での組換えＦｃ領域の標的化分子との混合と架橋を生じさせる条件下でのその混合物のインキュベーション、（ｉｖ）結果生じるＦｃ含有複合体の反応混合物からの精製とその後のＦｃ含有複合体の定量、（ｖ）ミニ細胞の表面上にある全てのＦｃ結合部位を占めるのに十分な量のＦｃ含有複合体と積載物含有ミニ細胞の適切な結合緩衝液中でのインキュベーション、（ｖｉ）任意の１つ以上の従来法（例えば、接線流濾過）によるあらゆる未結合の複合体の除去、（ｖｉｉ）標的化治療用ミニ細胞の濃縮および／または凍結乾燥、（ｖ）適切な容量の薬学的に許容可能な担体中での再構成による標的化治療用ミニ細胞の製品投与用の製剤によって、標的化治療用ミニ細胞の構築と投与を達成することができる。
【０１３８】
本明細書に記載されるミニ細胞は遺伝子操作されてプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域をそれらの表面に発現および提示する。プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ領域の発現および表面提示を達成するために好ましい方法は、「オートトランスポーター」ファミリーの外膜とのＦｃ結合領域の融合によるものである。オートトランスポーターのサブクラス５型分泌システム（通常、タイプ５ａと分類される）に属する単量体オートトランスポーターが最も好ましい。タイプ５ａとして分類されるそのファミリーのオートトランスポーターにはナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のＩｇＡプロテアーゼ（ＩｇＡＰ）が含まれる。ＩｇＡＰオートトランスポーターパッセンジャードメインはプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域によって容易に置換される。大腸菌でＩｇＡＰシステムを使用していくつかの異なる抗体断片および抗体断片タイプが提示され、特徴づけられているが、このアプローチは、プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域を発現および提示してＦｃ結合性ミニ細胞を産生するためにＩｇＡＰシステムを使用することに関して全く新しい。プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域を提示するために大腸菌の拡散粘着関与型アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ‐ｉｎｖｏｌｖｅｄ‐ｉｎ‐ｄｉｆｆｕｓｅ‐ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）（ＡＩＤＡ‐Ｉ）オートトランスポーターを使用することもできる。Ｆｃ結合性ミニ細胞が抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子に結合すると、それらは標的化能を持ち、標的組織、器官または細胞タイプに優先的に局在し、蓄積することができる。
【０１３９】
ミニ細胞表面上でのプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ領域の提示に適したいくつかの好ましい実施形態にはＬｐｐ‐ＯｍｐＡとの融合体（それぞれ、配列番号２２および配列番号２３）の使用が含まれる。ＯｍｐＡは、リポタンパク質リーダー配列に融合して目的のタンパク質を提示すると、大腸菌の表面へと輸出され得る大腸菌の外膜タンパク質である。大腸菌ミニ細胞は親大腸菌から得られるので、Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ融合タンパク質は同様にミニ細胞表面に局在する。大腸菌でＬｐｐ‐ＯｍｐＡシステムを使用していくつかの異なる抗体断片および抗体断片タイプが提示され、特徴づけられているがこのアプローチは、プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域を発現および提示してＦｃ結合性ミニ細胞を産生するためにＬｐｐ‐ＯｍｐＡシステムを使用することに関して全く新しい。Ｆｃ結合性ミニ細胞が抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子に結合すると、それらは標的化能を持ち、標的組織、器官または細胞タイプに優先的に局在し、蓄積することができる。
【０１４０】
プロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域のうちの１つ以上をミニ細胞表面に発現および提示する融合パートナーとして使用することができる他の天然外膜タンパク質にはＬａｍＢ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＰｈｏＥ、ＰＡＬ、ＩＩＩ型分泌システム、繊毛タンパク質、細菌オートトランスポータータンパク質ファミリーメンバーおよび様々なフラジェリンタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。一般に、プロテイン
ＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域のうちの１つ以上を腸内細菌科またはバシラス科の任意のメンバーに由来するミニ細胞の表面に発現および提示するために同じアプローチを用いることができ、その結果、ミニ細胞は、真核細胞特異的表面抗原に特異的な抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子をさらに結合することができるＦｃ結合性ミニ細胞になり、それによって疾患に関係する標的組織、器官または細胞タイプに優先的に局在し、蓄積することができる、標的化能を有するミニ細胞になる。当業者は、この目標の達成では、推定上または予想上の外膜タンパク質または外膜局在化配列とプロテインＧまたはプロテインＡのＦｃ結合領域のうちの１つ以上との間の融合タンパク質をコードする核酸配列の作製が問題であることを理解する。
【０１４１】
Ｆｃ結合性ミニ細胞は、細胞特異的表面抗原に特異的な抗体および／またはＦｃ含有融合体／複合体標的化分子に結合して標的化能を有するミニ細胞になる。標的化能を有するミニ細胞は生理活性積載物をさらに負荷される、および／または組換え発現し、封入するが、生理活性積載には、動物で病気の細胞、組織もしくは器官に負の影響を与える「生物学的効果」（生物学的反応と同義）、または病気の細胞、組織もしくは器官の状態を間接的に軽減するシグナルの生成を積極的に引き起こす「生物学的効果」をもたらす小分子薬、生理活性核酸、生理活性タンパク質、生理活性放射性核種、イメージング剤および生理活性リポ多糖、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。標的化能を有するミニ細胞は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲｌ、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴｌ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰｌ、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含むことを含むが、これに限定されない選択された真核細胞特異的表面抗原を標的とするように作製される。いくつかの実施形態では、標的化コンポーネントとして使用される、これまでに記載された標的特異的抗体にはｍＡｂ３Ｆ８、ｍＡｂＣＳＬ３６２、ｍＡｂ３６０、ｍＡｂＪ５９１、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシツマブ（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アナツモマブ（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）、��ポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アトリツマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビバツズマブ（Ｂ
ｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブ、セツキシマブ、ｍＡｂ５２８、シタツズマブ（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クレノリキシマブ、クリバツズマブ（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デノスマブ、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドルリモマブ（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ）、ドルリキシズマブ（Ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エンリモマブ（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）、エピツモマブ（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ）、エプラツズマブ、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、エクシビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フォントリズマブ、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、ガリキシマブ、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イルビツモマブ（Ｉｒｂｉｔｕｍｏｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、インフリキシマブ、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、Ｊ５９１、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レクサツムマブ、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リンツズマブ、ロルボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マツズマブ、メポリゾマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｏｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モタビズマブ、ムロモナブ、ナコロマブ（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、ナプツモマブ（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ）、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツツマブ（Ｎｅｃｉｔｕｔｕｍａｂ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オクレリズマブ、オヅリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オマリズマブ、オポルツズマブ（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ１４０、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レガビルマブ、レシリズマブ（Ｒｅｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎタリズマブ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、シブロツズマブ
（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、シプリズマブ、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、タカツズマブ（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブ（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テプリズマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、ティガツズマブ、ＴＮＸ‐６５０、トシリズマブ、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾリモマブ（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ）、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
４．ミニ細胞への積載物の負荷
真正細菌ミニ細胞は、動物にとって治療的、予防的、または診断的利益がある数種類の生物学的活性がある化合物を封入し、送達することができる。ミニ細胞が送達することができる生物学的活性がある化合物（積載物）の種類には小分子（小分子薬を含む）、核酸、ポリペプチド、放射性同位体、脂質、リポ多糖、およびそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
小分子には、現在知られており、使用されている任意の数の治療薬が含まれ得る、または小分子は生物学的機能のスクリーニングを目的にそのような分子のライブラリー内で合成された小分子であり得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態は、親細胞からのＦｃ結合性ミニ細胞の精製の後に薬品、プロドラッグまたはホルモンを含むが、これらに限定されない小分子をそれに「負荷」することができるように最適化された、非限定的だが腸内細菌科由来の真正細菌ミニ細胞産生株からミニ細胞産生表現型を誘導することに関連する。所望の量の「空」Ｆｃ結合性ミニ細胞を所与の培養物と条件から産生した後に、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。精製後、４℃から６５℃までの範囲の温度で高濃度の小分子と単にインキュベーションすることでその小分子をＦｃ結合性ミニ細胞に「負荷」する。本明細書に記載されるものの多くを含む小分子の負荷に関するさらなる詳細が当技術分野において公知である。
【０１４５】
小分子には有機化合物、ペプチド模倣物およびそれらの融合体／複合体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「有機化合物」という用語は巨大分子である核酸およびポリペプチド以外の任意の炭素系化合物を指す。有機化合物は炭素に加えてカルシウム、塩素、フッ素、銅、水素、鉄、カリウム、窒素、酸素、イオウおよび他の元素を含有することができる。有機化合物は芳香族型または脂肪族型であり得る。有機化合物の非限定的な例にはアセトン類、アルコール、アニリン類、炭水化物、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、プロテオグリカン、ケトン、アルデヒド、飽和、不飽和および多価不飽和脂肪、油およびワックス、アルケン、エステル、エーテル、チオール、スルフィド、環式化合物、複素環式化合物、イミダゾール類、およびフェノール類が挙げられる。有機化合物には、本明細書で使用される場合、ニトロ化有機化合物およびハロゲン化（例えば、塩素付加）有機化合物も含まれる。
【０１４６】
小分子は合成でも、天然でも、天然の供給源から精製されてもよい。小分子の例には小分子薬、毒素、放射性核種および小分子イメージング剤が挙げられるが、これらに限定されない。小分子薬の種類には、体細胞性、生殖細胞性、感染性であろうとなかろうと、病気に冒されている動物の利益になるように、細胞、組織タイプまたは器官で生物的プロセスまたは生化学的プロセスを防止、阻害、促進、模倣または修飾するものが含まれる。薬品の例には化学療法剤（制癌剤）、抗生物質、抗ウイルス剤、抗鬱剤、抗ヒスタミン剤、抗凝血剤、および医師用添付文書集（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に記載されるそれらの他の任意のクラスまたはサブクラスが含まれる。小分子には集合的にフルオロフォアとして知られる種類の分子も含まれる。フルオロフォアを封入し、細胞特異的標的化部分を提示するミニ細胞を動物における細胞タイプ、組織、器官または腫瘍のインビボイメージングに使用することができる。小分子フルオロフォアにはＤＡＰＩ、Ｃｙｂｒゴールド、Ｃｙｂｒグリーン、臭化エチジウム、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ、テキサスレッド、ＣＦＳＥなどが含まれるが、これらに限定されない。他の種類の分子イメージング剤は、ガドリニウム、６４Ｃｕジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ‐フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ‐フルオリド、３’‐デオキシ‐３’‐［１８Ｆ］フルオロチミジン、１８Ｆ‐フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム‐９９、タリウム、バリウム、ガストログラフィン、ヨード造影剤、酸化鉄、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない群より選択される。
【０１４７】
標的化分子を提示するミニ細胞を使用して、小分子化学療法剤を組織、細胞および器官に標的化し、送達することができる。本明細書で使用される「化学療法薬」という用語は、抗癌剤、抗転移剤、抗血管新生剤および他の抗増殖剤を指す。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、細胞の増殖を阻害する、または細胞を殺滅することを企図されている化学薬剤である。化学療法薬の例には、（１）ＤＮＡ損傷剤およびＤＮＡ合成阻害剤、例えば、アントラサイクリン類（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン）、アルキル化剤類（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブチル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミン）、プラチナ誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、ｃｉｓ‐ジアミンジクロロプラチナ）、テロメラーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサル（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ））、（２）タキサン類およびタキサン派生物（パクリタキセル、ドセタキセルクロラムブシル、ＢＡＹ５９‐８８６２）を含むが、これらに限定されない微小管およびチューブリン結合剤、（３）抗代謝剤、例えば、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型であるａｒａ‐ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５‐フルオロウラシル、５‐ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６‐メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、および６‐チオグアニン（４）抗血管新生剤（サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド）、血管破壊剤（フラボノイド／フラボン類、ＤＭＸＡＡ、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａのようなコンブレスタチン派生物、など）、（５）アロマターゼ阻害剤（４‐ヒドロアンドロステンジオン（４‐ｈｙｄｒｏａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール）などの内分泌療法、（６）抗エストロゲン剤（タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ））、デキサメタゾンなどのステロイド、（７）Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫調節因子、（８）インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害剤、（９）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、（１０）シグナル伝達の阻害剤、例えば、イマチニブ（グリベック）のようなチロシンキナーゼの阻害剤、（１
１）ヒートショックタンパク質の阻害剤、（１２）トランスレチノイン酸などのレチノイド、（１３）成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、（１４）ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどの抗有糸分裂化合物、（１５）ＣＯＸ阻害剤などの抗炎症剤、および（１６）チェックポイント調節因子などの細胞周期調節因子およびテロメラーゼ阻害剤、（１７）転写因子阻害剤、およびＢｃｌ‐２、Ｂｃｌ‐ｘおよびＸＩＡＰの阻害剤などのアポトーシス誘導剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
核酸はＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、天然のホスホジエステル骨格と対照的にホスホロチオエート骨格を利用するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子などのそれらの構造的同等物を包む。ＤＮＡ分子はエピソーム性ＤＮＡ（宿主細胞染色体上に位置しない、またはその一部ではない）を含み、それはプラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ）などをさらに含む。ＤＮＡ分子は、分子生物学のセントラルドグマによって説明されるように、タンパク質をコードする。したがって、ＤＮＡは、天然タンパク質でも合成タンパク質でも、任意の起源のタンパク質をコードする。同様に、コードされるタンパク質の発現を活性化する宿主細胞の機構によって認識される「プロモーター配列」を含むようにＤＮＡを設計することができる。プロモーター配列は細胞特異的、組織特異的、または誘導物質特異的であり得る。インデューサーは、プロモーターを活性化してタンパク質を産生するのに役立つ、外部から加えられるシグナルである。インデューサーは性質が化学的または物理的であり得る。多くのプロモーターシステムが当業者に知られているが、それらを機能的とする配列も当業者に知られている。好ましい原核生物性発現配列にはｐＲＨＡシステム、ｐＢＡＤシステム、Ｔ７ポリメラーゼシステム、ｐＬａｃシステムおよびその無数の派生物、ｐＴｅｔシステム、ならびにＣＩ８５７ｔｓシステムが含まれるが、これらに限定されない。好ましい真核生物のプロモーターシステムにはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターシステム、およびＢＧＨプロモーターシステムが含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡの例にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンスＲＮＡとして分類される多くのＲＮＡには低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および全長型アンチセンスＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。マイクロＲＮＡも含まれる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの好ましい標的にはアンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＡＢＣＢ１ＩＭＤＲ１／ＰＧＹ１（Ｐ‐糖タンパク質；Ｐｇｐ）、ＣＨＫ‐１、ＨＩＦ‐１、Ｍｃｌ‐１、ＰＤＧＦＲ、Ｔｉｅ‐２、ＡＢＬ１、ＡＢＵ、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ５、ＢＣＬ６、ＢＬＣ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、Ｂｃｌ‐ｘ、Ｂｃｒ‐Ａｂｌ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＨＫ‐１、ｃ‐Ｍｅｔ、ｃ‐ｍｙｃ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＫＣ１、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ‐１、ＥＺＨ２、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ‐４、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＦＬＴ２、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＲＡＳ、ＩＧＦＲ、インターロイキン８（ＩＬ‐８）、ＪＡＫ、ＪＡＫ２、ＫＤＲ／Ｆｌｋ‐１（ＶＥＧＦＲ‐２）、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ２、ＭＥＴ、ＭＲＰ、ｍＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ｐ５３、ＰＡＲＰｌ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩ３ＫＣＡ、ＰＰＡＲ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５３、ＲａｌＡ、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＳＴＡＴ３、サービビン、テロメラーゼ、ＴＥＰ１、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｂ、ＶＥＧＦ‐Ｃ、ＶＥＧＦ‐Ｄ、ＶＥＧＦ‐Ｅ、Ｗｎｔ‐１、ＸＩＡＰ、および野生型遺伝子配列と比較して体細胞または生殖細胞の変異を含む、上記の遺伝子リストのいずれかのヌクレオチド配列に対するあらゆる配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
タンパク質はポリペプチドから構成され、ＤＮＡによってコードされる。タンパク質は、酵素、毒素またはシグナル伝達タンパク質などのように、生物学的に機能的であり得る
。タンパク質は、アクチンなどの場合のように、構造的であり得る。タンパク質は蛍光性または生物発光性であることで局在を示すシグナルを提供することができる。タンパク質は免疫原として働くことができ、または他の治療目的を果たすことができる（例えば、標的細胞、組織、器官または動物において酵素を供給または回復する）。タンパク質はエンドサイトーシス後に他の種類の積載物の細胞内輸送を補助することができる。例えば、標的細胞のエンドサイトーシスコンパートメントから標的細胞の細胞質へのミニ細胞積載物の輸送を促進するためにリステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリシンＯなどのタンパク質を使用することができる。タンパク質はまたプロドラッグ転換酵素であり得る。好ましいタンパク質にはリステリオリシンＯ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質プロテインおよびルシフェラーゼファミリータンパク質のあらゆるメンバーが含まれる。標的化ミニ細胞が送達する組換え発現した／産生した治療用ポリペプチドにはタンパク毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、機能性酵素、活性型カスパーゼ、プロカスパーゼ、サイトカイン、ケモカイン、細胞透過性ペプチド、および前述のものの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。治療用ポリペプチドの組換え発現は、プラスミド、コスミド、ファージミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および前述のものの任意の組合せを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の様々な原核生物性エピソーム性組換え発現ベクターのうちのいずれかからの発現の結果であり得る。同様に、組換え発現は、１コピー以上のミニ細胞産生親細胞の染色体に存在する染色体局在型の原核生物性発現カセットによって達成され得る。本明細書に開示される標的化ミニ細胞を使用するタンパク毒素の送達は、インビボでの細胞の選択的排除が望ましい応用例で特に魅力的なアプローチである。タンパク毒素にはゲロニン、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素Ａ／Ｂ断片、破傷風毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＩおよび／またはＬＴＩＩ）、コレラ毒素、ウエルシュ菌のイオタ毒素、シュードモナス外毒素Ａ、志賀毒素、炭疽菌毒素、ＭＴＸ（バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）の殺虫毒素）、ペルフリンゴリシンＯ、ストレプトリシン、オオムギ毒素、メリチン、炭疽菌毒素ＬＦおよびＥＦ、アデニル酸シクラーゼ毒素、ボツリノリシンＢ、ボツリノリシンＥ３、ボツリノリシンＣ、ボツリヌス毒素Ａ、コレラ毒素、クロストリジウム毒素Ａ、Ｂおよびα、リシン、志賀Ａ毒素、志賀様Ａ毒素、コレラＡ毒素、百日咳ＳＩ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴＢ）、リステリオリシンＯのｐＨ安定性異型体（ｐＨ非依存性；Ｌ４６１Ｔのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯの熱安定性異型体（Ｅ２４７ＭおよびＤ３２０Ｋのアミノ酸置換）、リステリオリシンＯのｐＨおよび熱安定性異型体（Ｅ２４７Ｍ、Ｄ３２０ＫおよびＬ４６１Ｔのアミノ酸置換）、ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＯ  ｃ、ストレプトリシンＯ  ｅ、スフェリコリシン（ｓｐｈａｅｒｉｃｏｌｙｓｉｎ）、アントロリシン（ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、セレオ���シン（ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ）、チューリンゲンシリシン（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）Ｏ、ワイヘンステファネンシリシン（ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｌｙｓｉｎ）、アルベオリシン（ａｌｖｅｏｌｙｓｉｎ）、ブレビリシン（ｂｒｅｖｉｌｙｓｉｎ）、ブチリクリシン（ｂｕｔｙｒｉｃｕｌｙｓｉｎ）、テタノリジンＯ、ノビリシン（ｎｏｖｙｉｌｙｓｉｎ）、レクチノリシン（ｌｅｃｔｉｎｏｌｙｓｉｎ）、ニューモリシン、ミチリシン（ｍｉｔｉｌｙｓｉｎ）、シュードニューモリシン、スイリシン（ｓｕｉｌｙｓｉｎ）、インターメジリシン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ）、イバノリシン（ｉｖａｎｏｌｙｓｉｎ）、ゼーリゲリオリシン（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ、バジノリシン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）およびピオリシン（ｐｙｏｌｙｓｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。当業者の自由裁量でミニ細胞の様々な細胞内コンパートメントに治療用ポリペプチドを局在させることができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陰性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、内膜の内葉、内膜の外葉、ペリプラズム、外膜の内葉、外膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。本明細書に開示される標的化ミニ細胞がグラム陽性ミニ細胞産生親株に由来するとき、それから産生された組換え発現治療用ポリペプチドはミニ細胞の細胞質、細胞壁、膜の
内葉、膜、および前述の場所の任意の組合せに局在することができる。
【０１５０】
本明細書に記載されるありとあらゆる種類の積載物を使用者の自由裁量で組み合わせて、または単独で使用することができる。当業者は、どの治療目的にどの組合せを用いるべきか認識および理解する（例えば、小分子細胞毒性抗癌剤とその薬品への耐性を付与する遺伝子産物に対するｓｉ／ｓｈＲＮＡの組合せ）。
【０１５１】
５．医薬組成物
本願は、医薬組成物を含むが、これに限定されない組成物にも関連する。本明細書で使用される「組成物」という用語は、少なくとも１つの担体、好ましくは生理的に許容可能な担体、および１つ以上のミニ細胞組成物を含む混合物を指す。本明細書で使用される「担体」という用語は、細胞または組織への生物学的活性があるペプチドの取込を阻害または妨害しない化学化合物を指す。担体は通常は有効成分の適切な剤形（例えば、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、フィルム剤、錠剤、微粒子剤（例えば、細粒剤）、液剤、軟膏、ペースト剤、エアロゾル剤、滴剤、コロイド剤または乳剤など）への製剤または調合を可能にする不活性物質である。「生理学的に許容可能な担体」は生理条件下での使用に適した担体であって、化合物の生物活性および特性を抑制（低下、阻害または妨害）しない担体である。例えば、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）は、多数の有機化合物の生物の細胞または組織への取込を促進するような担体である。好ましくは、前記担体は生理学的に許容可能な担体であり、好ましくは薬学または獣医学的に許容可能な担体であり、その担体の中にミニ細胞組成物が配置される。
【０１５２】
「医薬組成物」は、その中の担体が薬学的に許容可能な担体である組成物を指し、「獣医学的組成物」は、その中の担体が獣医学的に許容可能な担体である組成物である。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」または「獣医学的に許容可能な担体」という用語は、生物学的に、または、その他の点で望ましくないことがないあらゆる媒体または物質を含む。すなわち、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに、または、複合体、もしくはその要素のいずれか、もしくは生物と害を及ぼすように相互作用せずに、前記担体をミニ細胞組成物と共に生物に投与することができる。薬学的に許容可能な試薬の例はメリーランド州、ロックビルにある米国薬局方協会の米国薬局方、米国国民医薬品集（１９９０年）において提供されており、ここで参照により本願に組み込まれる。「治療上有効量」および「薬学的有効量」という用語は、生物の標的細胞、組織または身体で測定可能な反応を誘導または実現するのに十分な量を指す。治療上有効量を構成するものは様々な要因に依存し、知識がある専門家はそれを考慮して所望の投与計画を立てる。
【０１５３】
前記組成物は、希釈剤および添加剤などの他の化学成分を含むこともできる。「希釈剤」は溶媒、好ましくは水性溶媒中で希釈される化学化合物であって、組成物のその溶媒中での溶解を促進する化学化合物であり、そして、それは組成物またはその成分のうちの１つ以上の生物学的活性型を安定化するように働くこともできる。当技術分野では緩衝溶液に溶解した塩を希釈剤として利用する。例えば、好ましい希釈剤は１つ以上の異なる塩を含有する緩衝溶液である。好ましい緩衝溶液の非限定的な例は、ヒトの血液に塩条件が似ているので、リン酸緩衝生理食塩水（特に、医用投与に企図された組成物と共に）である。緩衝塩は低濃度で溶液のｐＨを制御することができるので、緩衝希釈剤は所与の化合物または医薬組成物の生物活性を改変することがほとんどない。
【０１５４】
「添加剤」は適切な特性、例えば、適切な硬度を付与するために、または、製剤を製造するために組成物に添加され得る、多少なりとも不活性である物質である。適切な添加剤および担体には、ラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む糖、セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、イネデンプン、寒天、ペ
クチン、キサンタンガム、グアーガム、ローカストビーンガム、ヒアルロン酸、カゼインジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル‐セルロース、ポリアクリレート、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤が特に含まれる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を含むこともできる。他の適切な添加剤および担体にはヒドロゲル、ゲル化ヒドロコロイドおよびキトサンが含まれる。キトサンの細粒およびマイクロカプセルを担体として使用することができる。例えば、国際公開第９８／５２５４７号を参照のこと（それは、胃を標的とする化合物の細粒製剤について記載しており、その製剤は、１つ以上の有効成分を含有する内核（ゲル化ヒドロコロイドを含んでもよい）、有効成分の放出速度を制御するための非水溶性高分子（例えば、エチルセルロース）から構成される膜、および生体付着性陽イオン性高分子、例えば、陽イオン性ポリサッカリド、陽イオン性タンパク質および／または合成陽イオン性高分子から構成される外被層を含む；米国特許第４，８９５，７２４号）。通常、キトサンは適切な薬剤、例えば、グルタルアルデヒド、グリオキサール、エピクロルヒドリンおよびスクシンアルデヒドを使用して架橋される。担体としてキトサンを使用する組成物は、有効成分の制御放出をもたらす剤形を含む、丸剤、錠剤、微粒子剤および細粒剤を含む様々な剤形に製剤され得る。他の適切な生体付着性陽イオン性高分子には酸性ゼラチン、ポリガラクトサミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチンなどのポリアミノ酸、高分子量四級化合物、プロラミン、ポリイミン、ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ）、ＤＥＡＥ‐イミン、ＤＥＡＥ‐メタクリレート、ＤＥＡＥ‐アクリルアミド、ＤＥＡＥ‐デキストラン、ＤＥＡＥ‐セルロース、ポリ‐ｐ‐アミノスチレン、ポリオキセタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅ）、メタクリレート共重合体、ポリアミドアミン、陽イオン性デンプン、ポリビニルピリジン、およびポリチオジエチルアミノメチルエチレンが含まれる。
【０１５５】
前記組成物はあらゆる適切な方法で製剤化され得る。担体中にミニ細胞組成物を均一に（均質に）または不均一に（不均質に）分散させることができる。適切な製剤には乾燥製剤および液体製剤が含まれる。乾燥製剤にはフリーズドライした粉剤および凍結乾燥した粉剤が含まれ、それらは洞もしくは肺へのエアロゾル送達に、または投与前に適切な希釈剤に再構成するまでの長期保存に特によく適している。他の好ましい乾燥製剤には、本明細書に開示される組成物が、経口投与に適切な錠剤もしくは丸剤の剤形に圧縮されている製剤、または徐放性製剤に調合されている製剤が含まれる。腸の上皮へ組成物を送達するために経口投与が企図されているとき、製剤を保護し、その中に含まれるミニ細胞組成物の早期放出を防ぐために腸溶性コーティングで製剤を被包することが好ましい。当業者が認識するように、本明細書に開示される組成物を任意の適切な剤形にすることができる。丸剤および錠剤はそのような剤形を代表する。例えば、圧縮、浸漬、パンコーティング、噴霧乾燥などにより前記組成物を任意の適切なカプセルまたは他のコーティング材に封入することもできる。適切なカプセルにはゼラチンおよびデンプンから作られるカプセルが含まれる。次に、所望により１つ以上の付加的な材料、例えば、腸溶コーティングでそのようなカプセルを被覆することができる。液体製剤には水性製剤、ゲル剤および乳剤が含まれる。
【０１５６】
いくつかの好ましい実施形態は、生体付着性コーティング、好ましくは粘膜付着性コーティングを含む組成物を提供する。「生体付着性コーティング」は、物質（例えば、ミニ細胞組成物）が生体の表面に付着することを可能にする、または、コーティングが無いときよりも物質の生体の表面へ付着することを可能にするコーティングである。「粘膜付着性コーティング」は、物質、例えば、組成物が、コーティングがないときよりも粘膜へ付着することを可能にする好ましい生体付着性コーティングである。例えば、粘膜付着性物質でミニ細胞を被覆することができる。次に、被覆された粒子を生物への送達に適切な剤形に構築することができる。次に、好ましくは、および、標的とされる細胞表面輸送部分
が発現する場所に応じて、粘膜付着性により製剤を保持することができ、標的細胞表面輸送部分と組成物が相互作用する所望の場所に到達するまで製剤を保護するために剤形を別のコーティングで被覆する。
【０１５７】
任意の生物、好ましくは動物、好ましくは、哺乳類、鳥類、魚類、昆虫またはクモ類に本明細書に開示される組成物を投与することができる。好ましい哺乳類にはウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、およびブタ、および非ヒト霊長類が含まれる。ヒトは特に好ましい。経口投与、経直腸投与（例えば、浣腸または坐剤）、エアロゾル（例えば、経鼻送達または肺性送達用）、非経口投与および局所投与を含むが、これらに限定されない、化合物を投与または送達する複数の技術が当技術分野に存在する。企図されている効果を達成するために十分な量の生物学的活性があるペプチドを送達することが好ましい。送達される組成物の特定の量は、達成すべき効果、組成物が送達される生物の種類、送達経路、投与計画、ならびに生物の年齢、健康状態、および性別を含む多数の要因に左右される。したがって、所与の製剤に組み込まれる組成物の特定の投薬量は当業者の自由裁量に委ねられる。
【０１５８】
当業者は、治療効果、診断効果または保護的効果（ワクチンを含む）を含むことができる特定の所望の生物学的結果を達成するための薬剤として、本明細書に開示される組成物を投与するとき、ミニ細胞組成物を適切な医薬担体と組み合わせることが可能であり得ることを認識する。治療薬または予防薬としての医薬担体の選択とミニ細胞の調製は使用目的と投与様式に左右される。治療薬の適切な製剤と投与方法には経口送達、肺性送達、経鼻送達、バッカル送達、経眼送達、経皮送達、経直腸送達、静脈内送達、または経膣送達用のものが含まれる。
【０１５９】
使用する送達様式に応じて、様々な薬学的に許容可能な形態で状況依存的機能性実体を送達することができる。例えば、丸剤、カプセル剤、錠剤、坐剤、エアロゾル剤、滴剤、またはスプレー剤に組み込まれている固形物、溶液、乳液、分散体などの形態で状況依存的機能性実体を送達することができる。丸剤、錠剤、坐剤、エアロゾル剤、粉剤、滴剤およびスプレー剤は複合多層構造を持つことができ、そのサイズが広範囲であってよい。エアロゾル剤、粉剤、滴剤およびスプレー剤のサイズは小さいもの（１ミクロン）から大きいもの（２００ミクロン）までに及んでよい。
【０１６０】
固形物、凍結乾燥粉末、乳液、分散体などの形態で本明細書に開示される医薬組成物を使用することができ、結果生じる組成物は、有効成分として本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を経腸投与または非経口投与に適切な有機または無機の担体または添加剤と混合して含む。例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、溶液、乳剤、懸濁剤、および使用するのに適切な他の任意の形態にふさわしい通常の毒性が無い薬学的に許容可能な担体と共に有効成分を調合することができる。使用することができる担体にはグルコース、ラクトース、マンノース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および調製物の製造で使用するのに適切な固形、半固形または液体の他の担体が含まれる。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤および着色剤および芳香剤を使用することができる。安定化乾燥剤の例にはトリウロース、好ましくは０．１％以上の濃度のトリウロースが含まれる（例えば、米国特許第５，３１４，６９５号を参照のこと）。疾患の経過または状態に対して所望の効果をもたらすのに十分な量の活性化合物が医薬組成物に含まれる。
【０１６１】
６．適応症
本願は、固形腫瘍、転移性腫瘍および液性腫瘍を含むが、これらに限定されない癌の診断イメージングおよび治療に関連する。固形腫瘍および転移性腫瘍には上皮起源の腫瘍が
含まれ、ならびに、乳腺、肺、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、胃部、腸部、口腔、舌、咽頭、肝臓、肛門、直腸、結腸、食道、膀胱、胆嚢、皮膚、子宮、膣、刑事および腎臓の癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される標的化ミニ細胞を用いて治療することができる他の種類の固形癌には腺癌、肉腫、線維肉腫ならびに眼、脳および骨の癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される標的化ミニ細胞が治療することができる液性腫瘍には非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、および他の白血病が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される標的化ミニ細胞は、α３β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、５Ｔ４、ＣＡＩＸ、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１５２、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ‐Ｂ、ＧＤ２、ＴＭＥＦＦ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、デスレセプター５（Ｔｒａｉｌ‐Ｒ２）、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＦＡＰ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＩＬ‐１３Ｒα２、ＭＵＣ‐１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ‐１）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ‐３）、ＩＧＦ‐１Ｒ、ＩＧＦ‐２Ｒ、ｃ‐Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、メソテリン、ＰＤＧＦＲ、ＥＤＧＲ、ＴＡＧ‐７２、トランスフェリン受容体、ＥｐＣＡＭ、ＣＴＬＡ‐４、ＰＳＭＡ、テネイシンＣ、α‐フェトプロテイン、ビメンチン、Ｃ２４２抗原、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＣＡ‐１２５、ＧＰＮＭＢ、ＣＡ‐ＩＸ、ＧＤ３ガングリオシド、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ‐６Ｒ、ＴＡＧ‐７２、ＨＡＭＡ、およびＣＤ１６６を含むが、これらに限定されない真核生物の癌細胞特異的表面抗原を標的とする。
【０１６２】
本願は、異常な脈管形成または血管新生が少なくとも部分的に引き起こす動物の健康状態および疾患の診断イメージングおよび治療にも関連する。そのような健康状態および疾患には癌、リウマチ性関節炎、乾癬および炎症性腸疾患を含むがこれらに限定されない炎症性疾患、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症を含む代謝性障害、ならびに滲出型（ウェット型）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および黄斑浮腫を含むがこれらに限定されない眼症状が含まれるが、これらに限定されない。遺伝的、機構的、病理組織学的、前臨床的、および／または臨床的研究の結果として、これらの疾患または健康状態のそれぞれにおける脈管形成または血管新生の役割が立証されている。例えば、腫瘍は、血管新生が無い場合、直径１〜２ｍｍを越えて増殖することができない。癌用のベバシズマブおよびＡＭＤ用のラニビズマブを含むいくつかの抗血管新生治療薬の認証を経て、癌および特定の眼疾患における血管新生の重要な役割が臨床的に確認されている。さらに、異常な血管再構築と血管新生は炎症のいくつかのステージで重要な役割を果たす。炎症の第１急性期は、拡張、膜透過性の上昇および内皮細胞活性化などの血管構造の変化を伴う。炎症の第２亜急性期は内皮細胞の有糸分裂活性の増大と共に毛細血管および細静脈の再構築を伴う。慢性期では、血管新生および／または微小血管構造の拡張が観察され、それはリウマチ性関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症に見られる。これらの血管系の変化の全てが栄養、サイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼおよび炎症性白血球の浸潤および／または放出を増大することにより炎症反応を促進および持続する。したがって、所与の疾患環境において血管新生の誤制御の原因である細胞タイプの細胞表面抗原を認識する抗体を組み込むことにより、抗血管新生治療薬として本明細書に記載される標的化ミニ細胞を使用することができる。非限定的な例として、内皮細胞、循環内皮細胞、アンジオブラスト、ヘマ
ンジオブラスト、周皮細胞、筋線維芽細胞および内皮前駆細胞は全て脈管形成または血管新生を防止するための標的である。内皮細胞およびそれらの前駆細胞は、抗血管新生性ミニ細胞を使用して標的とすることができる、特に重要な脈管形成性および血管新生性細胞タイプである。多くの内皮細胞が脈管形成部位および血管新生部位で特徴的な細胞表面タンパク質を過剰発現する、優先的に発現する、および／または差次的に発現する。さらに、循環内皮細胞および循環内皮前駆細胞（血液およびリンパ液に存在する）は抗血管新生性ミニ細胞の標的である。循環内皮細胞および内皮前駆細胞は、それらを他の細胞タイプから区別し、抗血管新生性ミニ細胞の優先的標的化の基盤として機能する細胞表面抗原も発現する。集合的に、これらの細胞表面分子は血管新生特異的抗原と呼称される。血管新生特異的抗原を特異的に認識する多くの抗体およびそれらの可変領域の核酸配列は既に当技術分野において公知である。本願に関連して、これらの抗体のいずれも生体外より使用することができる。報告された抗体が存在しない血管新生特異的抗原が数多く特定されている。しかしながら、これらの抗原に対する抗体を作製する方法は当技術分野において周知であり、血管新生特異的抗原または他の任意の血管新生関連表面抗原に対するありとあらゆる抗体を、説明されたように前記組成物に組み込むことができる。選択される血管新生特異的抗原にはα４β１インテグリン、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、β１インテグリン、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＮＧＰＴ１、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＮＲＰ１、ＴＥＫ（ＣＤ２０２Ｂ）、ＴＧＦβＲ、ＤＬＬ４、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭおよびＰＳＭＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
７．ミニ細胞の調製
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が親細胞またはミニ細胞自体による治療用ＲＮＡ分子の発現の後の封入により大量の治療用ＲＮＡ分子を含むように、アンチセンスＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、リボザイムおよびｍｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない任意のサブクラスの治療用ＲＮＡを含有または産生する、非限定的だが、腸内細菌科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。前記の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。あるいは、（生じるミニ細胞が治療用ＲＮＡを含むように、ミニ細胞産生親株が同一または異なる治療用ＲＮＡを発現するのと別に、またはそれと共に）ミニ細胞を高濃度の外来性ＲＮＡ分子とインキュベートすることによって、上記のＲＮＡ分子のいずれかのＦｃ結合性ミニ細胞への負荷を達成することもできる。
【０１６４】
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が、親細胞またはミニ細胞自体によるタンパク質分子の発現の後の封入によりそのタンパク質分子を含むように、タンパク質分子を含有または産生する、非限定的だが、腸内細菌科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。
【０１６５】
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が封入により分子の組合せを含むように、治療用の、または有害な遺伝子または遺伝子産物、すなわち、任意のサブクラスのＲＮＡおよび／もしくはタンパク質をコードするＤＮＡ分子（例えば、真核生物の発現プラスミド）を含有または産生する、非限定的だが、腸内細菌科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺
機構の活性化が達成される。
【０１６６】
いくつかの実施形態は、精製後に薬品、プロドラッグまたはホルモンを含むが、これらに限定されない小分子をミニ細胞に「負荷」することができるように、非限定的だが、腸内細菌科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。精製後、０℃から６５℃までの範囲の温度で高濃度の小分子とインキュベーションすれば、ミニ細胞がその小分子で「負荷」される。小分子が、生じる標的化ミニ細胞中の唯一の外来性の治療用分子であるように、「空の」Ｆｃ結合性ミニ細胞を有するミニ細胞を使用してこの手法を実行する。最終組成物が小分子ならびに治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡおよび／または治療用タンパク質の任意の組合せを含むように、治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡまたは治療用タンパク質の任意の組合せをさらに含むミニ細胞を使用してこの手法を実行することもできる。Ｆｃ結合性ミニ細胞はそれらの表面への抗体および／またはＦｃ融合／結合標的化分子の付加により標的化能を得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が封入によりＤＮＡ分子を含むように、治療用の、または有害な遺伝子または遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有または産生する、非限定的だが、バシラス科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。
【０１６８】
いくつかの実施形態は、親細胞またはミニ細胞自体による治療用ＲＮＡ分子の発現の後の封入により大量の治療用ＲＮＡ分子を含むように、アンチセンスＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、リボザイムおよびｍｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない任意のサブクラスの治療用ＲＮＡを含有または産生する、非限定的だが、バシラス科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。前記の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。あるいは、（生じるミニ細胞が治療用ＲＮＡを含むように、ミニ細胞産生親株が同一または異なる治療用ＲＮＡを発現するのと別に、またはそれと共に）ミニ細胞を高濃度の外来性ＲＮＡ分子とインキュベートすることによって、上記のＲＮＡ分子のいずれかのＦｃ結合性ミニ細胞への負荷を達成することもできる。
【０１６９】
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が、親細胞またはミニ細胞自体によるタンパク質分子の発現の後の封入によりそのタンパク質分子を含むように、タンパク質分子を含有または産生する、非限定的だが、バシラス科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。
【０１７０】
いくつかの実施形態は、生じるミニ細胞が封入により分子の組合せを含むように、治療用の、または有害な遺伝子または遺伝子産物、すなわち、任意のサブクラスのＲＮＡおよび／もしくはタンパク質をコードするＤＮＡ分子の既定または計画上の組合せを含有または産生する、非限定的だが、バシラス科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。最終調製物中の生存可能な細胞を最も多く殺滅することを確実にするために、精製過程の各ステップで前記シグナルが加えられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態は、精製後に薬品、プロドラッグまたはホルモンを含むが、これらに限定されない小分子をミニ細胞に「負荷」することができるように、非限定的だが、バシラス科から最適化された株を作製すること、およびＦｃ結合性ミニ細胞を調製することに関連する。所与の培養および条件から所望の量のミニ細胞を産生した後、培養物または細胞を既知のシグナルに曝露すると遺伝的自殺機構の活性化が達成される。精製後、０℃から６５℃までの範囲の温度で高濃度の小分子とインキュベーションすれば、ミニ細胞がその小分子で「負荷」される。小分子が、生じる標的化ミニ細胞中の唯一の外来性の治療用分子種であるように、「空の」Ｆｃ結合性ミニ細胞を有するミニ細胞を使用してこの手法を実行する。最終組成物が小分子ならびに治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡおよび／または治療用タンパク質の任意の組合せを含むように、治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡまたは治療用タンパク質の任意の組合せをさらに含むミニ細胞を使用してこの手法を実行することもできる。Ｆｃ結合性ミニ細胞はそれらの表面への抗体および／またはＦｃ融合／結合標的化分子の付加により標的化能を得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０７個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０８個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０９個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１０個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１１個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１２個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１３個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１４個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１５個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ミニ細胞産生親細胞の汚染混入のレベルは１０１６個の標的化治療用ミニ細胞に１個未満である。
【０１８２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本願は実施形態と実施例を引用することにより説明されているが、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変を行うことができると理解されるべきである。本明細書中に引用される全ての参照文献はそれらの全体の参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
以下の実施例で本願の実施形態がさらに詳しく開示されるが、それらの実施例は本願の範囲を限定することを多少なりとも意図しているわけではない。
【実施例】
【０１８４】
実施例１
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により示される、プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合領域のミニ細胞表面上での発現および提示。ミニ細胞産生大腸菌株ＶＡＸ１２Ｂ４を（ｉ）Ｌ‐ラムノース誘導性発現プラスミドｐＶＸ‐１１９（Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡΩプロテインＡをコードする；配列番号１）、（ｉｉ）Ｌ‐ラムノース誘導性発現プラスミドｐＶＸ‐１２０（Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡΩプロテインＧをコードする；配列番号２）または（ｉｉｉ）空ベクター対照プラスミドのいずれかで形質転換し、それぞれ、ミニ細胞産生株ＶＡＸ１３Ｂ７（プロテインＡ）、ＶＡＸ１３Ｃ４（プロテインＧ）およびＶＡＸ１２Ｃ４（ベクター対照）を作製した。ＶＡＸ１３Ｂ７、ＶＡＸ１３Ｃ４およびＶＡＸ１２Ｃ４のそれぞれを、０．２％グルコース、１０ｍｇ／ｍＬジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）、１１ｍｇ／ｍＬリシンおよび５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２０ｍＬのルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中で一晩培養した。翌日、上記のようにＤＡＰ、リシンおよびカナマイシンを含有する７００ｍＬの新しいＬＢ培地に一晩培養物を１／１００に希釈して加えることによりそれぞれの株を別々に継代した。培養物を０．１の光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）まで培養し、融合タンパク質の発現を誘導するために、その時点で１０μＭの終濃度までＬ‐ラムノースを添加した。培養物が１．０のＯ．Ｄ．６００に到達したときに、２０μＭのイソプロピルβ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してミニ細胞の形成を誘導した。Ｌ‐ラムノースによる誘導から８時間後に培養物を４２℃に移し、一晩培養して親細胞の自殺を誘導した。次に、ショ糖密度分画により培養物からミニ細胞を精製し、ＥＬＩＳＡによりプロテインＡかプロテインＧのどちらかの表面提示についてそれらを分析した。９６ウェルポリスチレンプレートの炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中でＶＡＸ１３Ｂ７、ＶＡＸ１３Ｃ４またはＶＡＸ１２Ｃ４由来の１×１００７個のミニ細胞を一晩インキュベートしてそのプレートにミニ細胞を結合させることによりＥＬＩＳＡを実行した。翌日、０．０５％のツイーン２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）でプレートのウェルを３回ずつ洗浄し、次に、１％のゼラチンを含有するＰＢＳを室温で１時間使用してプレートのウェルをブロックした。その後、０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳでウェルを３回ずつ洗浄し、次に、プロテインＡまたはプロテインＧのどちらかに対するＨＲＰ複合体化ニワトリＩｇＹ抗体と室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、０．５％のツイーン２０を含有するＰＢＳでプレートを５回ずつ洗浄し、次に、各ウェルにＴＭＢを添加した。標準品（組換えプロテインＡ／Ｇ）のシグナルが飽和する前に１Ｍの硫酸を添加して反応を停止し、その後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でプレートを分析した。組換えプロテインＡ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．）のタイトレーションにより作成された検量線に対して実験区のＥＬＩＳＡシグナルを比較することにより表面融合タンパク質の提示の程度が決定され、図２にそれが示されている。
【０１８５】
図２に示されるように、プロテインＡ提示型ミニ細胞は、ＨＲＰ複合体化抗プロテインＡニワトリＩｇＹ二次抗体を使用したときに検出されるだけである。プロテインＧ提示型ミニ細胞は、ＨＲＰ複合体化抗プロテインＡニワトリＩｇＹ二次抗体を使用したときに検出されるだけである。これらの結果により、融合タンパク質の発現、正体およびミニ細胞表面提示が確認された。
【０１８６】
実施例２
プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分を発現するミニ細胞によるＶＥＧＦＲ
２抗体の結合と提示。ＶＡＸ１３Ｂ７株（プロテインＡ提示型）、ＶＡＸ１３Ｃ４株（プロテインＧ提示型）およびＶＡＸ１２Ｂ５株（陰性対照）から精製されたミニ細胞（１×１００９個）を、ヒトＶＥＧＦＲ２に対するマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を使用せずに（−）、または使用して（＋）、１μｇずつのその抗体と室温で１時間インキュベートして抗体をミニ細胞に結合させた。インキュベーションの後、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）でミニ細胞を３回ずつ洗浄してあらゆる未結合の抗体を除去した。その後、ＨＲＰ複合体化ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を二次抗体として使用するウエスタンブロットによりミニ細胞（１×１００８個）を分析した。図３にそのウエスタンブロットが示されている。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して二次抗体の特異的結合を可視化した。マウス抗ＶＥＧＦＲ２抗体（１００ｎｇ）を陽性対照として負荷した（１２Ｂ５の次のレーン）。
【０１８７】
図３は、ＶＥＧＦＲ２抗体と無関係に、１３Ｂ７ミニ細胞および１３Ｃ４ミニ細胞中のプロテインＡ融合タンパク質およびプロテインＧ融合タンパク質（それぞれ、４９．１ｋＤａおよび３８．５ｋＤａ）がＨＲＰ複合体化ウサギ抗マウス二次抗体のＦｃ領域に結合したことを示す。さらに、二次抗体のＦａｂ領域が、１３Ｂ７ミニ細胞および１３Ｃ４ミニ細胞に結合した完全型ＶＥＧＦＲ２抗体（約１５０ｋＤａ）に結合し、それを検出する。
【０１８８】
実施例３
プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合部分を発現するミニ細胞によるＥＧＦＲ１抗体の結合と提示。ＶＡＸ１３Ｂ７株（プロテインＡ提示型）、ＶＡＸ１３Ｃ４株（プロテインＧ提示型）およびＶＡＸ１２Ｂ５株（陰性対照）から精製されたミニ細胞（１×１００９個）を、ヒトＥＧＦＲ１に対するマウスモノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ５２８）を使用せずに（−）、または使用して（＋）、１μｇずつのその抗体と室温で１時間インキュベートして抗体をミニ細胞に結合させた。インキュベーションの後、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）でミニ細胞を３回ずつ洗浄してあらゆる未結合の抗体を除去した。その後、ＨＲＰ複合体化ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を二次抗体として使用するウエスタンブロットによりミニ細胞（１×１００８個）を分析した。図４にそのウエスタンブロットが示されている。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して二次抗体の特異的結合を可視化した。マウス抗ＥＧＦＲ抗体（１００ｎｇ）を陽性対照として負荷した（１２Ｂ５の次のレーン）。
【０１８９】
図４に示されるように、ＥＧＦＲ１抗体と無関係に、１３Ｂ７ミニ細胞および１３Ｃ４ミニ細胞中のプロテインＡ融合タンパク質およびプロテインＧ融合タンパク質（それぞれ、４９．１ｋＤａおよび３８．５ｋＤａ）がＨＲＰ複合体化ウサギ抗マウス二次抗体のＦｃ領域に結合した。さらに、二次抗体のＦａｂ領域が、１３Ｂ７ミニ細胞および１３Ｃ４ミニ細胞に結合した完全型ＥＧＦＲ１抗体（約１５０ｋＤａ）に結合し、それを検出する。
【０１９０】
実施例４
抗ヒトＥＧＦＲ１抗体ｍＡｂ５２８と結合し、それを提示するミニ細胞はインビトロでＥＧＦＲ１発現ヒト非小細胞性肺癌細胞株Ｈ４６０に対して選択的に標的化される。Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧを発現および提示するミニ細胞（１３Ｃ４）と適切なＬｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧ欠損ミニ細胞対照（１２Ｂ４）を膜特異的蛍光イメージング剤であるＦＭ‐１４３で１時間染色し、その後、等量の１×ＰＢＳで３回ずつ洗浄した。染色後、１３Ｃ４ミニ細胞（Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧ融合体を発現する）を過剰なｍＡｂ５２８またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；哺乳類細胞に存在しない）に対する種／アイソタイプ適合対照抗体と共インキュベートして１３Ｃ４ミニ細胞の表面へ抗体を結合させた。さらなる対照として、Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧ融合体
を発現しない１２Ｂ４ミニ細胞も等濃度のｍＡｂ５２８と共インキュベートした。抗体の結合後、試料を３回ずつ洗浄し、その後、５０００：１のミニ細胞対Ｈ４６０の比率でＨ４６０培養細胞と２時間インキュベートさせた。２時間のインキュベーション後、細胞培養培地中で細胞を３回ずつ洗浄し、その後、蛍光顕微鏡観察を用いて蛍光性ミニ細胞の取込について細胞を視覚化した。図５に蛍光顕微鏡観察の結果が示されている。
【０１９１】
図５の左のパネルに示されるように、Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧを発現しないミニ細胞（１２Ｂ４）はＥＧＦＲ１標的化抗体を結合せず、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０細胞によって効率的に取り込まれなかった。図５の中央のパネルは、Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧを発現するミニ細胞（１３Ｃ４）はＥＧＦＲ１標的化抗体と結合し、ＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０細胞によって容易に取り込まれたことを示し、このことが標的化依存的取込を実証している。図５の右のパネルは、Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＧを発現し（１３Ｃ４）、非特異的アイソタイプ適合対照抗体（ＫＬＨを標的とする抗体；ＫＬＨはＨ４６０細胞で発現しない）を提示するミニ細胞はＥＧＦＲ１発現Ｈ４６０細胞によって効率的に取り込まれなかったことを示し、このことが特異的な標的化の必要性を実証している。
【０１９２】
実施例５
細菌を３０℃で培養した後、ミニ細胞を濃縮するために低速遠心分離の代わりに１．０ミクロンカットフィルターを使用し、次にショ糖の代わりにフィコールを使用することにより、融合タンパク質を有するＬｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＡ２Ｆｃ（プロテインＡ）ミニ細胞を精製した。融合タンパク質のプロテインＡ部分は抗体のＦｃ領域を介して抗体に結合することができるが、Ｆ（ａｂ’）２とは結合できず、そして、ＯｍｐＴプロテアーゼに対して耐性である。精製後、プロテインＡミニ細胞（Ｌｐｐ‐ＯｍｐＡ‐プロテインＡ２Ｆｃ発現型）を蛍光イメージング剤ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）で染色し、その後、実施例４に記載されるように抗ヒトＥＧＦ受容体抗体、抗ＫＬＨ抗体または抗ヒトＣＤ１２３（ＩＬ‐３受容体；Ｈ４６０は発現しない）抗体でそれらを修飾した。過剰な未結合抗体の除去後、ミニ細胞をＨ４６０細胞（ＥＧＦＲ１を発現するヒト非小細胞性肺癌細胞株）と４０分間インキュベートし、そして、洗浄した。蛍光顕微鏡観察により蛍光性ミニ細胞の腫瘍細胞による取込を判定した。図６は様々な抗体で修飾されているミニ細胞とインキュベートしたＨ４６０細胞単層の蛍光顕微鏡像を示し、抗ＫＬＨ標的化ミニ細胞（図６Ｂ）または抗ＣＤ１２３標的化ミニ細胞（図６Ｃ）と対照的にＥＧＦＲ１標的化ミニ細胞の顕著な取込が図６Ａで示されている。予想したように、無抗体対照も取込を示さなかった（図６Ｄ）。図６に概説される同じ実験で、トリプシン処理された細胞のＦＡＣＳ分析により定量的に測定された相対的ミニ細胞取込の結果が図７に示されている。
【０１９３】
【表１−１】
2014506893.tif 000003
【０１９４】
【表１−２】
2014506893.tif 000004
【０１９５】
【表１−３】
2014506893.tif 000005
【０１９６】
【表２−１】
2014506893.tif 000006
【０１９７】
【表２−２】
2014506893.tif 000007
【図１】
2014506893.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2014506893.tif 000012
【図５Ｂ】
2014506893.tif 000013
【図５Ｃ】
2014506893.tif 000014
【図６Ａ】
2014506893.tif 000015
【図６Ｂ】
2014506893.tif 000016
【図６Ｃ】
2014506893.tif 000017
【図６Ｄ】
2014506893.tif 000018
【図７】
2014506893.tif 000019
【配列表】
2014506893000001.app
【国際調査報告】
2014506893.tif 000020
2014506893.tif 000021
2014506893.tif 000022