(57)【要約】  腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−a）、例えばヒトＴＮＦ−aに結合する単離された結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合部分、ならびに関連する抗体を使用した組成物および分子を開示する。抗体を含む医薬組成物、ならびに抗体を使用するための治療法および診断法も開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７のうちのいずれか１つに由来する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；または
（ｂ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７のうちのいずれか１つを含む少なくとも１つの重鎖可変領域（ＶＨ領域）を含む、結合タンパク質。
【請求項２】
（ａ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８のうちのいずれか１つに由来する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；または
（ｂ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、１０７８のうちのいずれか１つを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む、結合タンパク質。
【請求項３】
少なくとも１つの重鎖可変領域（ＶＨ領域）および少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む結合タンパク質であって、前記ＶＨ領域が、
（ａ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７のうちのいずれか１つに由来する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；または
（ｂ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７のうちのいずれか１つを含み；かつ、
前記ＶＬ領域が、
（ｃ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８のうちのいずれか１つに由来する３つのＣＤＲ；または
（ｄ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、１０７８のうちのいずれか１つを含む、結合タンパク質。
【請求項４】
前記結合タンパク質が、２つのＶＨ領域および２つのＶＬ領域を含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
前記結合タンパク質が、配列番号２２および２３；２４および２５；２６および２７；２８および２９；３０および３１；および３２および３３からなる群より選択される、少なくとも１つのＶＨ領域と少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列の組を含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記結合タンパク質が、
（ａ）ＴＮＦ−αの生物学的機能を調節し；
（ｂ）ＴＮＦ−αを中和し；
（ｃ）ＴＮＦ−αがその受容体に結合する能力を弱め；
（ｄ）前駆ヒトＴＮＦ−α、成熟ヒトＴＮＦ−α、または切断型ヒトＴＮＦ−αがその受容体に結合する能力を弱め；および／または
（ｅ）ＴＮＦ依存性サイトカインの生産、ＴＮＦ依存性細胞死、ＴＮＦ依存性炎症、ＴＮＦ依存性骨侵食、およびＴＮＦ依存性軟骨損傷のうちの１つ以上を低減する、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
前記結合タンパク質の結合速度定数（Ｋｏｎ）が、表面プラズモン共鳴で測定すると、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１である、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
前記結合タンパク質の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）が、表面プラズモン共鳴で測定すると、最大約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；または最大約１０−６ｓ−１である、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
前記結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）が最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍ；または最大１０−１３Ｍである、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
ヒトＴＮＦ−αに結合できる結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、
（ａ）配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域；
（ｂ）配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域；
（ｃ）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）；ならびに
（ｄ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む、結合タンパク質。
【請求項１１】
前記結合タンパク質が、免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ結合タンパク質、単一ドメイン結合タンパク質、ＣＤＲ移植結合タンパク質、ディアボディ、ヒト化結合タンパク質、多重特異性結合タンパク質、Ｆａｂ、双特異的結合タンパク質、Ｆａｂ’断片、二重特異性結合タンパク質、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合している２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、前記ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一のアームの前記ＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または一本鎖結合タンパク質を含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記結合タンパク質が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、およびビオチンからなる群より選択される造影剤に複合体化されている、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
前記結合タンパク質が、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生薬、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素、アポトーシス薬、およびＴＮＦ−αの活性が有害な疾患を治療するための少なくとも１つ追加の治療薬からなる群より選択される治療薬または細胞傷害性薬物をさらに含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
請求項３に記載のアミノ酸配列を含む結合タンパク質をコードする単離した核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離した核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
ＴＮＦ−αに結合するタンパク質の産生方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を培地中で、ＴＮＦ−αに結合する結合タンパク質を産生するのに十分な条件で培養するステップを含む、タンパク質の産生方法。
【請求項１８】
請求項３に記載の結合タンパク質および医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物の有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の治療方法。
【請求項２０】
ヒトＴＮＦ−αの活性が低下するように、ヒトＴＮＦ−αを請求項３に記載の結合タンパク質と接触させることを含む、ヒトＴＮＦ−α活性を低下させる方法。
【請求項２１】
ＴＮＦ−α活性が有害な疾患を患っているヒト対象におけるヒトＴＮＦ−αの活性を低下させる方法であって、前記ヒト対象におけるヒトＴＮＦ−αの活性が低下するおよび／または治療が達成されるように、前記ヒト対象に請求項３に記載の結合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
請求項３に記載の結合タンパク質を、患者に第二の薬剤を投与する前もしくは後またはその投与と同時に、前記患者に投与することを含む、ＴＮＦ−αが有害な疾患を患っている前記患者の治療方法であって、前記第二の薬剤が、ヒトＩＬ−１２に結合できる抗体もしくはその断片；ＰＧＥ２；ＬＰＡ；ＮＧＦ；ＣＧＲＰ；ＳｕｂＰ；ＲＡＧＥ；ヒスタミン；ヒスタミン受容体遮断薬；ブラジキニン；ＩＬ−１アルファ；ＩＬ−１ベータ；ＶＥＧＦ；ＰＬＧＦ；メトトレキサート；コルチコステロイド、グルココルチコイド受容体調節剤；シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、および非ステロイド性抗炎症剤からなる群より選択される、治療方法。
【請求項２３】
前記疾患が、自己免疫性の疾患および／または炎症性の疾患である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患が、クローン病、乾癬、尋常性乾癬、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、または若年性特発性関節炎、多発性硬化症および硬直性脊椎炎からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が、呼吸器疾患；喘息；アレルギー性および非アレルギー性喘息；感染症による喘息；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染による喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道の炎症を伴う症状；好酸球増加症；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性疾患；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症性および／または自己免疫性の状態；胃腸器官の炎症性および／または自己免疫性の状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；クローン病；肝臓の炎症性および／または自己免疫性の状態；肝硬変；肝線維症；肝炎Ｂおよび／またはＣウイルスに起因する肝線維症；強皮症；腫瘍または癌；肝細胞の癌腫；膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染；細菌感染；寄生虫感染；ＨＴＬＶ−１感染；保護的な１型免疫応答の発現の抑制および、ワクチンを接種している間の、保護的な１型免疫応答の発現の抑制からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
免疫アッセイにより、被検試料中のＴＮＦ−αまたはその断片の有無を決定する方法であって、前記免疫アッセイが、前記被検試料を、少なくとも１つの請求項３の結合タンパク質またはその断片、および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含む、方法。
【請求項２７】
（ｉ）前記被検試料を前記少なくとも１つの結合タンパク質またはその断片と接触させることであって、ここで前記結合タンパク質は、第一の複合体を形成するように、前記ＴＮＦ−αまたはその断片上のエピトープに結合し；
（ｉｉ）前記複合体を前記少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることであって、ここで前記検出可能な標識は、前記第一の複合体または、前記結合タンパク質またはその断片が結合していない前記ＴＮＦ−αまたはその断片上のエピトープに結合して第二の複合体を形成し；および
（ｉｉｉ）前記第二の複合体に含まれる前記検出可能な標識によって生成された前記シグナルに基づいて、前記被検試料中の前記ＴＮＦ−αまたはその断片の有無を検出することであって、ここで前記ＴＮＦ−αまたはその断片の有無は、前記検出可能な標識によって生成される前記シグナルと正相関すること、
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）前記被検試料を前記少なくとも１つの結合タンパク質またはその断片と接触させることであって、ここで前記結合タンパク質またはその断片は、第一の複合体を形成するように、前記ＴＮＦ−αまたはその断片上のエピトープに結合し；
（ｉｉ）前記複合体を前記少なくとも１つの検出可能な標識とを接触させることであって、ここで前記検出可能な標識は、第二の複合体を形成するように、前記結合タンパク質またはその断片への結合に関して前記ＴＮＦ−αまたはその断片と競合し；および
（ｉｉｉ）前記第二の複合体に含まれている前記検出可能な標識によって生成された前記シグナルに基づいて、前記被検試料中の前記ＴＮＦ−αまたはその断片の有無を検出することであって、ここで前記ＴＮＦ−αまたはその断片の存在は、前記検出可能な標識によって生成される前記シグナルと逆相関すること、
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が場合により、診断すること、予後診断すること、または前記患者の治療的／予防的処置の有効性を評価することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＴＮＦ−α結合タンパク質ならびに、急性および慢性の炎症性疾患の予防および／または治療におけるその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子α、ＴＮＦ、およびカケクチンとも呼ばれる）に結合可能な、改良された結合タンパク質が必要とされている。高い親和性でＴＮＦ−αに結合でき、かつ、ＴＮＦ−αを中和することができる、新規ファミリーの結合タンパク質、ＣＤＲ移植結合タンパク質、ヒト化結合タンパク質、およびそれらの断片を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ＴＮＦ−αに結合するＴＮＦ−α結合タンパク質またはその抗原結合部分を提供する。ある実施形態において抗原結合ドメインは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７のうちのいずれか１つから選択されるＶＨ領域、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において抗原結合ドメインは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８のうちのいずれか１つから選択されるＶＬ領域、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。特定の実施形態において抗原結合ドメインはＶＨ領域とＶＬ領域を含み、例えば、ＶＨ領域は、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含み、およびＶＬ領域は、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。
【０００４】
ある実施形態において結合タンパク質は、ＴＮＦ−αに結合する。別の実施形態においてこの結合タンパク質は、ＴＮＦ−αの生物学的機能を調節する。別の実施形態においてこの結合タンパク質は、ＴＮＦ−αを中和する。さらに別の実施形態においてこの結合タンパク質は、ＴＮＦ−αがその受容体に結合する能力を弱める。例えば結合タンパク質は、前駆ヒトＴＮＦ−α、成熟ヒトＴＮＦ−α、または切断型ヒトＴＮＦ−αがその受容体に結合する能力を弱める。さらに別の実施形態においてこの結合タンパク質は、ＴＮＦ依存性サイトカイン生産、ＴＮＦ依存性細胞死、ＴＮＦ依存性炎症、ＴＮＦ依存性骨侵食、およびＴＮＦ依存性軟骨損傷から選択される、１つ以上のＴＮＦ−αの生物活性を低減する。
【０００５】
ある実施形態では、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴で測定して、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；および少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１から選択される結合定数（Ｋｏｎ）を有する。別の実施形態では、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴で測定して、最大、約１０−３ｓ−１；最大約１０−４ｓ−１；最大約１０−５ｓ−１；および最大約１０−６ｓ−１から選択される解離定数（Ｋｏｆｆ）を有する。さらに別の実施形態では、結合タンパク質は、最大約１０−７Ｍ；最大約１０−８Ｍ；最大約１０−９Ｍ；最大約１０−１０Ｍ；最大約１０−１１Ｍ；最大約１０−１２Ｍ；および最大１０−１３Ｍから選択される解離定数（ＫＤ）を有する。
【０００６】
別の態様では、有効量の本明細書で開示の医薬組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の治療方法を提供する。別の実施形態では、ヒトＴＮＦ−αの活性を低下させる方法を提供し、この方法は、ヒトＴＮＦ−α活性が低下するように、ヒトＴＮＦ−αと本明細書で開示の結合タンパク質とを接触させることを含む。別の実施形態では、ＴＮＦ−αの活性が有害な疾患を患っているヒト対象における、ヒトＴＮＦ−α活性を低下させる方法を提供し、この方法は、ヒト対象におけるヒトＴＮＦ−αの活性が低下するように、本明細書で開示の結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む。別の実施形態では、病気またはＴＮＦ−αの活性が有害な疾患に関して、対象を治療する方法を提供し、この方法は、治療が達成されるように、本明細書で開示の結合タンパク質を対象に投与することを含む。
【０００７】
一実施形態においてこの方法は、免疫性および炎症性の要素を伴う病気、例えば自己免疫疾患、特に、クローン病、乾癬（尋常性乾癬を含む）、関節炎（関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、または若年性特発性関節炎を含む）、多発性硬化症および硬直性脊椎炎などの炎症に関連する病気を治療する。従って、本明細書の結合タンパク質を、これらの疾患を治療するために使用してもよい。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＴＮＦ−αに結合するＴＮＦ−α結合タンパク質、またはその抗原結合部分、その医薬組成物、ならびに、そのような結合タンパク質や断片を作成するための核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。さらに、本明細書で開示の結合タンパク質を、ヒトＴＮＦ−αを検出するために、インビトロまたはインビボのいずれかでヒトＴＮＦ−αを阻害するために、および遺伝子発現またはＴＮＦ−αに関連する機能を調節するために使用する方法も提供する。
【０００９】
本明細書に別段の指定のない限り、本開示との関連で使用される科学的および技術的な用語は、当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有するものとする。用語の意味および範囲は明確であるべきではあるが、潜在的に曖昧な場合には、本明細書で提供する定義が、いずれの辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈から別様に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、かつ、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願においては、「または」の使用は、別様に明示されていない限り、「および／または」を意味する。加えて、「含む」という用語、ならびにこの用語の他の形態、例えば「含んでいる」および「含まれた」の使用は限定的なものではない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、別様に具体的に明示されていない限り、１単位を含有している要素および構成要素、ならびに１を上回るサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。
【００１０】
基本的に、本明細書に記載の細胞培養および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法および技術は、当該分野において周知であり、かつ、一般的に使用されているものである。通常、本開示の方法および技術は、別段の指定のない限り、当該分野において周知であり、かつ、本明細書全体を通じて引用され、論じられている様々な一般的な参考文献やより具体的な参考文献に記載されている、標準的な方法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第二版、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））を参照のこと。酵素反応や精製技術は、当該分野において一般的に達成されるかまたは本明細書に記載するように、製造業者の説明に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに薬品および医薬品化学に関して使用する命名法、および実験手順や技術は、当該分野において周知、かつ、一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療には、標準的な技術を使用する。
【００１１】
「ヒトＴＮＦ−α」（本明細書ではｈＴＮＦ−αと略す）という用語は、三量体のサイトカインタンパク質を含むものである。この用語には、１７．５ｋＤのＴＮＦ−αタンパク質を３つ含む、ホモ単量体のタンパク質が含まれる。このホモ三量体タンパク質は、「ＴＮＦ−αタンパク質」と称される。ヒト「ＴＮＦ−α」という用語は、標準的な組換え法によって調製可能な、組換えヒトＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α）を含むことを意図している。表１にヒトＴＮＦ−αの配列を示す。
【００１２】
【表１】
2014534218.tif 000002
【００１３】
「抗体」という用語は広義には、４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはその抗原結合部分か、あるいは、Ｉｇ分子に必須のエピトープ結合特性を保持している、その任意の機能性断片、突然変異体、変異体、または誘導体を指す。そのような突然変異体、変異体、または誘導体の形式の抗体は当該分野において知られている。
【００１４】
完全長抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略す）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインであるＣＬから成る。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれ、より保存されている散在している領域とに分けられ得る。ＶＨとＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順番に配置されている。免疫グロブリン分子はいずれの型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。
【００１５】
結合タンパク質の「抗原−結合部分」または「抗原結合領域」（もしくは単に「抗原結合部分」）という用語は、抗原（例えばｈＴＮＦ−α）に特異的に結合する能力を保持している、結合タンパク質の１つ以上断片を指す。結合タンパク質の抗原結合機能は、完全長結合タンパク質の断片によって行われ得る。そのような結合タンパク質の実施形態は、双特異性、二重特異的、または多重特異的な形式を有し、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合し得る。結合タンパク質の「抗原−結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）；ヒンジ領域のジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ出願である国際公開第９０／０５１４４号Ａ１）、および（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬとＶＨが別個の遺伝子によってコードされているとしても、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域の対が一価の分子を形成する一本のタンパク質とすることができる合成リンカーを使った組換え法により、連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖結合タンパク質も、結合タンパク質の「抗原−結合部分」という用語に包含されることが意図される。他の形態の一本鎖結合タンパク質、例えばディアボディも包含される。ディアボディは二価の、双特異性結合タンパク質であり、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖として発現しているが、同じ鎖の２つのドメインを対合させるには短いリンカーを使うことで、ドメインが別の鎖の相補的なドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を作出している（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００１６】
「結合タンパク質」という用語は、本明細書で開示の抗原結合部分を１つ以上含むポリペプチドを指し、必要に応じて、リンカーポリペプチドまたは定常ドメインに連結されている。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合で結合している２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つ以上の抗原結合部分を連結するのに用いられる。このようなリンカーポリペプチドは、当該分野において良く知られている（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。定常ドメインは、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は当該分野では知られており、また、表２に示す。
【００１７】
【表２】
2014534218.tif 000003
2014534218.tif 000004
【００１８】
結合タンパク質またはその抗原結合部分は、結合タンパク質または結合タンパク質部分が、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドと、共有的にまたは非共有的に会合することによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部分であってもよい。そのような免疫接着分子の例としては、ストレプトアビジンのコア領域を使用した四量体ｓｃＦｖ分子の作成（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）ならびに、システイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを使用した二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子の作成（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：１０４７−１０５８）がある。抗体部分、例えばＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片は、慣習的な技術、例えば完全な抗体をそれぞれパパインまたはペプシンで消化することによって、完全な抗体から調製することができる。さらに、結合タンパク質、結合タンパク質部分および免疫接着分子は、本明細書に記載したように、組換えＤＮＡ技術によって得ることもできる。
【００１９】
「単離された結合タンパク質」とは、別の抗原特異性をもつ他の結合タンパク質を実質的に含まない、結合タンパク質またはその抗原結合部分を指す（例えば、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合する単離された結合タンパク質は、ｈＴＮＦ−α以外の抗原に特異的に結合する結合タンパク質を実質的に含まない）。しかしながら、ｈＴＮＦ−αに特異的に結合する単離された結合タンパク質は、他の抗原に対して、例えばＴＮＦ−α分子から他の種に対して、交差反応性を有してもよい。さらに、単離された結合タンパク質は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない。
【００２０】
「ヒト結合タンパク質」という用語は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に由来する可変領域と定常領域を有する結合タンパク質、またはその抗原結合部分を含む。本開示のヒト結合タンパク質は、例えばＣＤＲに、具体的にはＣＤＲ３に、ヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列にはコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為なもしくは部位特異的な突然変異生成によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト結合タンパク質」という用語は、そのＣＤＲ配列が別の哺乳類の種、例えばマウスの生殖系列に由来し、ヒトのフレームワーク配列に移植された結合タンパク質を含むことは意図しない。
【００２１】
「カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付け」、「カバットの定義」および「カバットのラベリング」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。当該技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域において、他のアミノ酸残基よりも変わりやすい（すなわち超可変な）アミノ酸残基に番号をつける体系を指す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７１）  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９０：３８２−３９１およびＫａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第五版，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）。ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００１）、第３１章、特に４３２−４３３頁の、Ｍａｒｔｉｎによる「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」もまた参照のこと。重鎖可変領域では、超可変領域は、ＣＤＲ１の３１番目から３５番目のアミノ酸に、ＣＤＲ２の５０番目から６５番目のアミノ酸に、およびＣＤＲ３の９５番目から１０６番目のアミノ酸にわたる。軽鎖可変領域では、超可変領域は、ＣＤＲ１の２４番目から３４番目のアミノ酸に、ＣＤＲ２の５０番目から５６番目のアミノ酸に、およびＣＤＲ３の８９番目から９７番目のアミノ酸にわたる。
【００２２】
「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列中の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域にはそれぞれ３つのＣＤＲが含まれ、これらは、各可変領域につき、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名されている。「ＣＤＲのセット」という用語は、抗原に結合できる単一の可変領域内に生じている、３つのＣＤＲの組を指す。これらのＣＤＲ間の正確な境界は、異なる体系によってそれぞれ個別に定義されている。Ｋａｂａｔらによって説明されたこの体系は（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９８７）  ａｎｄ  （１９９１））、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基の番号付けシステムを提供しているだけでなく、３つのＣＤＲを定義している、正確な残基境界も提供している。これらのＣＤＲは、カバットのＣＤＲと呼ぶこともできる。Ｃｈｏｔｈｉａと共同研究者らは（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）、カバットのＣＤＲに含まれる特定の小部分は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様性に富んでいるにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格の高次構造をとっていることを見出した。これらの小部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と命名されており、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ、軽鎖および重鎖領域を表している。これらの領域は、コチアのＣＤＲと呼ばれることもあり、カバットのＣＤＲと重複している境界をもつ。カバットのＣＤＲと重複していて、境界を明確にしている他のＣＤＲについては、Ｐａｄｌａｎ  （１９９５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１３３−１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２（５）：７３２−７４５）による記載がある。さらに他のＣＤＲ境界規定は上述の体系の１つに厳密に従わないかもしれないが、それでもカバットＣＤＲと重複しており、特定の残基、残基の群、または全ＣＤＲすら抗原結合に有意な影響を与えないという予想または実験的所見にてらして短縮または延長させることができる。本明細書で使用する方法は、これらの体系のいずれかによるＣＤＲの定義を用いてもよいが、特定の実施形態ではカバットの定義またはコチアが定義したＣＤＲを使用する。
【００２３】
ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は当該分野では公知である。本開示の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、Ｖ−ｂａｓｅ（ｈｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）またはＩＭＧＴ（登録商標）、  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／）から列挙された配列から選択される。本開示の別の実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列はそれぞれ、表３および表４に記載した配列から選択される。
【００２４】
【表３】
2014534218.tif 000005
2014534218.tif 000006
【００２５】
【表４】
2014534218.tif 000007
【００２６】
本明細書で使用される「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を表す。多価結合タンパク質は３つ以上の抗原結合部位を有するように改変されていてもよく、また、多価結合タンパク質は通常、天然に存在する抗体ではない。「多重特異性結合タンパク質」という用語は、２つ以上の、関連のある標的または関連のない標的に結合することができる結合タンパク質を指す。本明細書で使用する場合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質または二重可変免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）とは、２つ以上の抗原結合部位を有し、かつ、四価のまたは多価の結合タンパク質である。そのようなＤＶＤ結合タンパク質は単一特異性、つまり１つの抗原に結合するものであっても、または多重特異性、つまり２つ以上の抗原に結合できるものであってもよい。２つの重鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドと２つの軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇと称される。ＤＶＤ−Ｉｇの半分はそれぞれ、重鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドと軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチド、および２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含み、１つの抗原結合部位につき、合計で６つのＣＤＲが抗原結合に関与する。ＤＶＤ結合タンパク質およびＤＶＤ結合タンパク質の作成方法は、米国特許第７，６１２，１８１号に開示されている。
【００２７】
本開示の一態様は、ＴＮＦ−αに結合可能な結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質に関する。特定の実施形態では、このＤＶＤ結合タンパク質は、ＴＮＦ−αと第二の標的に結合できる。
【００２８】
「中和」という用語は、結合タンパク質がサイトカインに特異的に結合したときに、サイトカインの生物活性を中和することを指す。特定の実施形態では、中和結合タンパク質がｈＴＮＦ−αに結合すると、ｈＴＮＦ−αの生物活性が阻害される。例えば、中和結合タンパク質がｈＴＮＦ−αに結合するとｈＴＮＦ−αの生物活性は、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上低下する。中和結合タンパク質によるｈＴＮＦ−αの生物活性の阻害は、当該分野で良く知られている、ｈＴＮＦ−α生物活性の１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。例えば、Ｌ９２９細胞における、ＴＮＦ−αの細胞毒性の中和である。
【００２９】
別の実施形態では、「アゴニスト」または「刺激する」という用語は、結合タンパク質がＴＮＦ−α、例えばｈＴＮＦ−αに特異的に結合した場合の、ＴＮＦ−αの生物活性の上昇を指す。特定の実施形態では、刺激性の結合タンパク質がＴＮＦ−αに結合すると、ＴＮＦ−αの生物活性の上昇がもたらされる。特定の実施形態では、アゴニスト結合タンパク質はＴＮＦ−αに結合し、ＴＮＦ−αの生物活性を少なくともおよそ２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％上昇させる。アゴニスト結合タンパク質によるＴＮＦ−αの生物活性の阻害は、当該分野で良く知られている、ＴＮＦ−α生物活性の１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。
【００３０】
「活性」という用語は活性、例えば、結合タンパク質（例えば、ＴＮＦ−α抗原に結合するｈＴＮＦ−α結合タンパク質）の抗原に対する結合特異性／親和性、および／または結合タンパク質（例えば、ｈＴＮＦ−αへの結合がｈＴＮＦ−αの生物活性を阻害するｈＴＮＦ−α結合タンパク質）の中和（例えば、Ｌ９２９細胞におけるＴＮＦ−αの細胞毒性の中和）能力（または刺激能力）を含む。
【００３１】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデンおよびニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて検出することにより、リアルタイムの生物特異的な相互作用を分析することができる光学現象を指す。
【００３２】
「Ｋｏｎ」という用語は、当該分野で知られているように、例えば抗体／抗原複合体を形成するための結合タンパク質（例えば、抗体）の抗原に対する会合に対する結合速度定数を指す。「Ｋｏｎ」は、「会合速度定数」または「ｋａ」としても知られており、本明細書においては同じ意味で使用する。抗体のその標的抗原に対する結合速度または抗体と抗原間の複合体形成速度を示すこの値は以下の等式によっても示される：
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ。
【００３３】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、当該分野で知られているように、結合タンパク質（例えば抗体）が、例えば抗体／抗原複合体から離脱するための解離速度定数、つまり「解離定数」を指す。抗体がその標的抗原から解離する速度、または時間経過とともにＡｂ−Ａｇ複合体が分離して遊離抗体と抗原になるのを示すこの値は、以下の等式によっても表される：
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ。
【００３４】
「ＫＤ」という用語は「平衡解離定数」を指し、平衡状態での力価測定によって得られた値、または解離定数（Ｋｏｆｆ）を結合定数（Ｋｏｎ）で除すことによって得られた値を指す。結合定数、解離定数および平衡解離定数は、抗体の抗原に対する結合親和性を表すのに用いられる。結合定数および解離定数を決定するための方法は当該分野においてよく知られている。蛍光を使用した技術を用いることで、高感度と、試料を平衡状態の生理学的な緩衝液中で試験する能力が得られる。他の実験手法や装置、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用解析）アッセイを使用することができる（例えば、装置は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、ウプサラ、スウェーデンから入手可能である）。加えて、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ボイシ、アイダホ）から入手可能）も使用することができる。
【００３５】
Ｉ．ヒトＴＮＦ−αに結合する結合タンパク質
本開示の一態様は、ＴＮＦ−αに、高い親和性、遅い解離速度、および高い中和能力で結合する、単離された完全長ヒト抗ヒトＴＮＦ結合タンパク質、例えばモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。本開示の第二の態様は、ＴＮＦ−αに、高い親和性、遅い解離速度、および高い中和能力で結合する親和性成熟した完全長ヒト抗ＴＮＦ結合タンパク質、例えばモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３６】
Ａ．ＴＮＦ−α結合タンパク質の作成方法
本明細書で開示の結合タンパク質は、当該分野で知られているいくつかの技術のいずれによって作成してもよい。
【００３７】
１．トランスジェニック動物を使った抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体
本開示の別の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部または全てを含む非ヒト動物を、ＴＮＦ−α抗原で免疫することによって、結合タンパク質を産生する。特定の実施形態では、この非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウス、つまり、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のラージフラグメントを含み、マウス抗体の産生が欠損している、遺伝子改変された系統のマウスである。例えばＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３−２１および米国特許第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；同第５，９８５，６１５号；同第５，９９８，２０９号；同第６，０７５，１８１号；同第６，０９１，００１号；同第６，１１４，５９８号および同第６，１３０，３６４号を参照のこと。また、１９９１年７月２５日に公開の国際公開第９１／１０７４１号；１９９４年２月３日に公開の国際公開第９４／０２６０２号；１９９６年１０月３１日に両方とも公開された国際公開第９６／３４０９６号および同第９６／３３７３５号；１９９８年４月２３日に公開の国際公開第９８／１６６５４号；１９９８年６月１１日に公開の国際公開第９８／２４８９３号；１９９８年１１月１２日に公開の国際公開第９８／５０４３３号；１９９９年９月１０日に公開の国際公開第９９／４５０３１号；１９９９年１０月２１日に公開の国際公開第９９／５３０４９号；２０００年２月２４日に公開の国際公開第００／０９５６０号；ならびに２０００年６月２９日に公開の国際公開第００／３７５０４号も参照のこと。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全長ヒト抗体の、成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトＭａｂを生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、メガベースサイズの生殖細胞系統の構造をもったヒト重鎖遺伝子座とｘ軽鎖遺伝子座のＹＡＣ断片の導入を介して、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含有する。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６；  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９８）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５を参照のこと。
【００３８】
２．組換え抗体ライブラリーを使った抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体
所望の結合特異性を有する抗体を特定するために、抗体ライブラリーをスクリーニングするインビトロ法を使用して、本明細書で開示の結合タンパク質を作成することもできる。そのような、組換え抗体ライブラリーをスクリーニングする方法は当該分野で公知であり、また、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／１８６１９；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／０９６９０号；および国際公開第９７／２９１３１号；  Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３６９−１３７２；  Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；  Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：７２５−７３４；  Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；  Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；  Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：４１３３−４１３７；および  Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；および米国特許出願第２００３．０１８６３７４号に記載されている方法が含まれる。
【００３９】
組換え抗体ライブラリーは、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αの一部を使って免疫化した対象に由来するものであってよい。あるいは、組換え抗体ライブラリーはナイーブ対象、つまり、ＴＮＦ−αによって免疫化されていない対象に由来するもの、例えばヒトＴＮＦ−αによって免疫化されていないヒト対象に由来するヒト抗体ライブラリーであってもよい。本明細書で開示の抗体は、ＴＮＦ−αを認識する抗体を選択するために、ヒトＴＮＦ−αを含むペプチドを使って組換え抗体ライブラリーのスクリーニングを行うことで選択される。そのようなスクリーニングおよび選択を実施するための方法、例えば前段の参考文献に記載されている方法のように、当該分野において良く知られている。ｈＴＮＦ−αに対する特定の結合親和性を有する本明細書で開示の抗体、例えば特定のｋｏｆｆ速度定数でもってヒトＴＮＦ−αから解離する抗体を選択するためには、当該分野で公知の表面プラズモン共鳴法を使って、所望のｋｏｆｆ速度定数をもつ抗体を選択することができる。ｈＴＮＦ−αに対して特定の中和活性を有する本明細書で開示の抗体、例えば特定のＩＣ５０を有する抗体を選択するためには、ｈＴＮＦ−α活性の阻害を評価するための、当該分野で知られている標準的な方法を使用してもよい。
【００４０】
一態様では、ＴＮＦ−α、例えばヒトＴＮＦ−αに結合する単離された結合タンパク質またはその抗原結合部分を提供する。特定の実施形態では、この結合タンパク質は中和結合タンパク質である。様々な実施形態においてこの結合タンパク質は、組換え結合タンパク質またはモノクローナル抗体である。
【００４１】
例えば、本明細書で開示の結合タンパク質は、当該分野で知られている様々なファージディスプレー法を使って生成することもできる。ファージディスプレー法では、機能性の抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上に提示される。具体的には、そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウスの）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現しているファージを、抗原、例えば標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使って選択または特定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージのクラスＩＩＩ遺伝子またはクラスＶＩＩＩ遺伝子のタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインにより、ファージがら発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。本明細書で開示の結合タンパク質を作成するために使用することが可能なファージディスプレー法の例は、当該分野において見出すことができる。
【００４２】
上記の参考文献中に記載されているように、ファージを選択した後には、例えば以下に詳述するように、ファージ由来の結合タンパク質のコード領域を単離し、ヒト結合タンパク質もしくはその他の所望の抗原結合断片のいずれかを含む完全な結合タンパク質を生成するために使用し、その後、所望の宿主、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌内で発現させることができる。例えば、当該分野で知られている方法、例えば国際公開第９２／２２３２４号；  Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；および  Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３４：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３で開示されている方法を使用してＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に産生する技術も用いることができる。一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために用いることができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０３：４６−８８；  Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：７９９５−７９９９；および  Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１に記載されている技術が挙げられる。
【００４３】
ファージディスプレーによって組換え抗体ライブラリーのスクリーニングを行う代わりに、当該分野で知られている、大きなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法論を適用して、本明細書で開示の二重特異的結合タンパク質を特定することもできる。代替発現系の一様式としては、国際公開第９８／３１７００号およびＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に記載されているように、組換え抗体ライブラリーがＲＮＡ−タンパク質融合体として発現されるものがある。この系では、ｍＲＮＡと、ペプチドまたはタンパク質との共有融合が作られ、この融合体は、３’末端にピューロマイシン（ペプチジルアクセプター抗生物質）をその保持している合成ｍＲＮＡのインビトロの翻訳をコードしている。従って、コードされているペプチドもしくはタンパク質のレパートリーに基づいて、例えば抗体もしくはその一部、例えば抗体もしくはその一部の、二重特異的抗原に対する結合に基づいて、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えばコンビナトリアルライブラリー）から、特定のｍＲＮＡを濃縮することができる。そのようなライブラリーのスクリーニングから回収された、抗体をコードしている核酸配列またはその一部は、上述の組換え技術によって（例えば哺乳類の宿主細胞中で）発現させることができ、さらに、最初に選択した配列に変異を導入したｍＲＮＡ−ペプチド融合体のスクリーニングをさらに繰り返すこと、または上述の、組換え抗体をインビトロで親和性成熟させるためのその他の方法のいずれかによる親和性成熟に供することができる。
【００４４】
別のアプローチでは、本明細書で開示の結合タンパク質は、当該分野で知られている酵母ディスプレー法を使って生成することもできる。酵母ディスプレー法では、遺伝的な方法を使って、抗体ドメインを酵母の細胞壁につなぎ止め、そしてそれらを酵母の表面に提示させる。具体的には、そのような酵母を利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウスの）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。本明細書で開示の結合タンパク質を作成するために用いることができる酵母ディスプレー法の例としては、Ｗｉｔｔｒｕｐらに付与されている米国特許第６，６９９，６５８号およびＦｒｅｎｋｅｎらに付与されている米国特許第６，１１４，１４７号に開示されている方法が挙げられる。
【００４５】
Ｂ．組換えＴＮＦ−α結合タンパク質の産生
本明細書で開示する結合タンパク質は、当該分野で知られているいくつかの技術のいずれによって産生してもよい。例えば、宿主細胞からの発現、ここで、重鎖および軽鎖をコードしている発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞に導入される、がある。「導入」という用語の種々の形態は、外生のＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために一般的に使用されている多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン移入などを包含することを意図している。本明細書で開示する結合タンパク質は原核または真核の宿主細胞のいずれにおいても発現させることができるが、真核細胞、例えば、哺乳類の宿主細胞における結合タンパク質の発現を想定する。なぜならばそのような真核細胞（具体的には哺乳類の細胞）の方が原核細胞よりも、適切に折り畳まれていて、かつ、免疫学的に活性な結合タンパク質を構築し、分泌させるのに適しているからである。
【００４６】
本明細書で開示する組換え結合タンパク質を発現させるための哺乳類の宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−６２１のＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。結合タンパク質の遺伝子をコードしている組換え発現ベクターを哺乳類の宿主細胞に導入する場合、結合タンパク質は、その宿主細胞内で結合タンパク質が発現されるのに、特に、宿主細胞を生育させている培地中に抗体が分泌されるのに十分な期間宿主細胞を培養することで産生される。抗体は、標準的なタンパク質の精製法によって、培地から回収することができる。
【００４７】
宿主細胞を使用して、機能性の結合タンパク質断片、例えばＦａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を産生することもできる。上述の手順の変形も本開示の範囲内であると見なされる。例えば、宿主細胞に、本明細書で開示の結合タンパク質の軽鎖および／または重鎖のいずれかの機能性断片をコードしているＤＮＡを導入することが望ましいこともあり得る。組換えＤＮＡ技術を用いて、目的の抗原への結合に必要ではない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードしているＤＮＡの一部または全てを除去してもよい。そのような切断型ＤＮＡ分子から発現される分子もまた、本明細書で開示の結合タンパク質に包含される。加えて、本明細書で開示の結合タンパク質と第二の結合タンパク質を、標準的で化学的な架橋法によって架橋することで、一方の重鎖と一方の軽鎖が本明細書で開示の結合タンパク質で、他方の重鎖と軽鎖が目的の抗原以外の抗原に特異的な二機能性結合タンパク質が産生され得る。
【００４８】
本明細書で開示する結合タンパク質またはその抗原結合部分の組換え発現の例示的な系では、重鎖と軽鎖の両方をコードしている組換え発現ベクターを、カルシウムとリン酸で仲介する形質移入によって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターの中では、遺伝子の転写を高レベルで誘導するために、重鎖および軽鎖遺伝子はそれぞれ、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメントに操作可能に連結されている。この組換え発現ベクターは、メトトレキサート選抜／増幅を使って、ベクターが形質移入されたＣＨＯ細胞を選抜することを可能にするＤＨＦＲ遺伝子も含んでいる。重鎖および軽鎖を発現させるために、選抜された形質転換宿主細胞を培養し、完全な結合タンパク質を培地から回収する。標準的な分子生物学的手法を用いて、組換え発現ベクターを準備し、宿主細胞の形質転換を行い、形質転換体を選抜し、宿主細胞を培養して結合タンパク質を培地から回収する。さらに、本明細書で開示する宿主細胞を好適な培地中で、本明細書で開示する組換え結合タンパク質が合成されるまで培養することによる、本明細書で開示する組換え結合タンパク質の合成方法も提供する。この方法は、培地から組換え結合タンパク質を単離することをさらに含む場合がある。
【００４９】
ＩＩ．ｈＴＮＦ−α結合タンパク質
Ａ．個々のクローンの配列
表５に、各ＶＨおよびＶＬ配列に由来するＣＤＲを含む、完全長ヒト抗ヒトＴＮＦ結合タンパク質のＶＨおよびＶＬの配列を示す。
【００５０】
【表５】
2014534218.tif 000008
2014534218.tif 000009
2014534218.tif 000010
2014534218.tif 000011
2014534218.tif 000012
2014534218.tif 000013
2014534218.tif 000014
【００５１】
Ｂ．ＩｇＧ変換クローン
表６に、ＩｇＧクローンに変換した（実施例２で詳しく論じる）、ヒト化抗ＴＮＦ  ＭＡＫ−１９５抗体のＶＨの配列を示す。
【００５２】
【表６】
2014534218.tif 000015
2014534218.tif 000016
2014534218.tif 000017
2014534218.tif 000018
2014534218.tif 000019
2014534218.tif 000020
2014534218.tif 000021
2014534218.tif 000022
2014534218.tif 000023
2014534218.tif 000024
2014534218.tif 000025
2014534218.tif 000026
2014534218.tif 000027
2014534218.tif 000028
【００５３】
表７に、ＩｇＧクローンに変換した（実施例２で詳しく議論する）、ヒト化抗ＴＮＦ  ＭＡＫ−１９５抗体のＶＬの配列を示す。
【００５４】
【表７】
2014534218.tif 000029
2014534218.tif 000030
2014534218.tif 000031
2014534218.tif 000032
2014534218.tif 000033
2014534218.tif 000034
2014534218.tif 000035
2014534218.tif 000036
2014534218.tif 000037
【００５５】
Ｃ．変換したクローン由来の個々のｈＭＡＫ−１９９配列
表８に、ヒト化抗ＴＮＦ  ＭＡＫ−１９９の変換型クローン（実施例３で詳しく議論する）のＶＨの配列を示す。
【００５６】
【表８】
2014534218.tif 000038
2014534218.tif 000039
2014534218.tif 000040
2014534218.tif 000041
2014534218.tif 000042
2014534218.tif 000043
【００５７】
表９に、ヒト化抗ＴＮＦ  ＭＡＫ−１９９の変換型クローン（実施例３で詳しく議論する）のＶＬの配列を示す。
【００５８】
【表９】
2014534218.tif 000044
2014534218.tif 000045
2014534218.tif 000046
2014534218.tif 000047
2014534218.tif 000048
2014534218.tif 000049
【００５９】
ある実施形態において抗原結合ドメインは、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７のうちのいずれか１つから選択されるＶＨ領域、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において抗原結合ドメインは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８のうちのいずれか１つから選択されるＶＬ領域、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。特定の実施形態において抗原結合ドメインは、ＶＨ領域とＶＬ領域を含み、例えば、ＶＨ領域は配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４〜５８、７４〜８３、９４〜２６６、４７８〜４８６、４９６〜６７５、７３８〜７６２、７７８〜９５６、１０５３〜１０６２、１０７３、１０７５、および１０７７、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含み、ＶＬ領域は、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、５９〜７３、８４〜９３、２６７〜４７７、４８７〜４９５、６７６〜７３７、７６３〜７７７、９５７〜１０５２、１０６３〜１０７２、１０７４、１０７６、および１０７８、またはそれらに由来する１つ、２つ、もしくは３つのＣＤＲを含む。
【００６０】
ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ配列が上に示したものである実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、配列番号６〜２１から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、配列番号９、１０、１１、１２、１５、１６、１７、および２１から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、フレームワーク領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでフレームワークのアミノ酸配列は、ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、かつ、ヒトアクセプターフレームワークと同一のアミノ酸残基を少なくとも７０個含む。別の実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、フレームワーク領域の重要な残基に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。重要な残基は、ＣＤＲに隣接している残基；グリコシル化部位の残基；数の少ない残基；ヒトＴＮＦ−αと相互作用が可能な残基；ＣＤＲと相互作用が可能な残基；基準となる残基；重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間で接触している残基；バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒｚｏｎｅ）に含まれる残基；およびコチアの定義による重鎖可変ＣＤＲ１とカバット（Ｋａｂａｔ）の定義による第一重鎖フレームワークとの間で重複している領域にある残基、から選択される。ある実施形態では、重要な残基は、Ｈ１、Ｈ１２、Ｈ２４、Ｈ２７、Ｈ２９、Ｈ３７、Ｈ４８、Ｈ４９、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ７６、Ｈ７８、Ｌ１３、Ｌ４３、Ｌ５８、Ｌ７０、およびＬ８０から選択される。ある実施形態では、ＶＨ変異は、Ｑ１Ｅ、Ｉ１２Ｖ、Ａ２４Ｖ、Ｇ２７Ｆ、Ｉ２９Ｌ、Ｖ２９Ｆ、Ｆ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｖ６７Ｌ、Ｆ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｒ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｎ７６Ｓ、Ｌ７８Ｉ、およびＦ７８Ｉから選択される。別の実施形態では、ＶＬ変異は、Ｖ１３Ｌ、Ａ４３Ｓ、Ｉ５８Ｖ、Ｅ７０Ｄ、およびＳ８０Ｐから選択される。ある実施形態において結合タンパク質は、２つの可変ドメインを含み、この２つの可変ドメインは、配列番号２２と２３；２３と２４；２４と２５；２６と２７；２８と２９；３０と３１；または３２と３３から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００６１】
ＩＩＩ．結合タンパク質および結合タンパク質産生細胞株の生産
ある実施形態では、本明細書で開示のＴＮＦ−α結合タンパク質は、例えば当該分野で知られている複数のインビトロおよびインビボアッセイのいずれかによって評価した時に、ＴＮＦ−α活性を低減するまたは中和する高い能力を示す。あるいは、本明細書で開示のＴＮＦ−α結合タンパク質はさらに、ＴＮＦ−α活性を高めるはまた刺激する高い能力も示す。
【００６２】
特定の実施形態では、単離された結合タンパク質またはその抗原結合部分はヒトＴＮＦ−αに結合し、ここでこの結合タンパク質またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴で決定した時に、およそ０．１ｓ−１以下、例えば１×１０−２ｓ−１以下、１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下、１×１０−５ｓ−１以下および１×１０−６ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で、ヒトＴＮＦ−αから解離するかまたは、およそ１×１０−６Ｍ以下の、例えば１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下および１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０で、ヒトＴＮＦ−αの活性を阻害する。一定の実施形態では、結合タンパク質は重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域を含む。ある実施形態において重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、結合タンパク質は軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域のいずれかを含む場合もある。別の実施形態では、結合タンパク質はカッパ軽鎖定常領域を含む。あるいは、結合タンパク質部分は、例えばＦａｂ断片または一本鎖Ｆｖ断片であってもよい。
【００６３】
Ｆｃ部分のアミノ酸残基を置換して、結合タンパク質のエフェクター機能を変化させることが当該分野において知られている（米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号を参照のこと）。結合タンパク質のＦｃ部分は、サイトカインの誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体や抗原抗体複合体の半減期／排出速度などの、いくつかの重要なエフェクター機能を媒介する。いくつかの例では、これらのエフェクター機能は治療用抗体にとって望ましいものであるが、別の例では、治療目的によって、不必要であるかまたは有害ですらある場合もある。特定のヒトＩｇＧイソ型、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３はそれぞれ、ＦｃγＲへの結合とＣ１ｑの補完を介して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の血中半減期を決定するのに重要な成分である。その上さらに別の実施形態では、結合タンパク質の定常領域、例えば結合タンパク質のＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸残基を、その結合タンパク質のエフェクター機能が変化するように置換する。
【００６４】
一実施形態では、標識した結合タンパク質を提供し、ここで本明細書で開示する抗体または抗体部分は、誘導体化されているかまたは別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結されている。例えば、本明細書で開示する標識した結合タンパク質は、本明細書で開示する抗体または抗体部分を、１つ以上他の分子実体、例えば別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはディアボディ）、検出可能な薬剤、細胞傷害性薬物、医薬品、および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子との会合を媒介するタンパク質またはペプチド（例えばストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグ）に機能的に結合する（化学結合、遺伝子融合、非共有会合により）ことによって誘導体化することができる。
【００６５】
本明細書で開示する抗体または抗体部分と共に誘導体化してもよい検出可能な物質としては、蛍光化合物が挙げられる。検出可能な蛍光物質の例には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体は、検出可能な酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素などとも誘導体化することができる。抗体を検出可能な酵素で誘導体化する場合には、その酵素が検出可能な反応産物を生成するのに使用する別の試薬を追加することで、検出される。例えば、検出可能な薬剤である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素とジアミノベンジジンを加えることで、検出可能な、色のついた反応産物が生じる。抗体をビオチンで誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジンの間接的な測定を通じて検出してもよい。
【００６６】
本開示の別の実施形態は、結晶化した結合タンパク質を提供する。ある実施形態では、本明細書で開示の完全なＴＮＦ−α結合タンパク質およびその断片の結晶、ならびにそのような結晶を含む調製物および組成物を提供する。一実施形態においてこの結晶化結合タンパク質は、この結合タンパク質の可溶性の対応物よりも、インビボでの長い半減期を有する。別の実施形態では、結合タンパク質は結晶化した後も生物活性を保持する。
【００６７】
本明細書で開示の結晶化結合タンパク質は、当該分野で知られている方法および国際公開第０２／７２６３６号で開示されている方法に従って、生成することができる。
【００６８】
本開示の別の実施形態は、結合タンパク質またはその抗原結合部分が１つ以上の糖残基を含む、グリコシル化結合タンパク質を提供する。インビボにおいては、発生期のタンパク質合成は、翻訳後修飾として知られる、さらなる処理を受ける場合がある。具体的には、糖（グリコシル）残基が酵素によって付加される場合があり、この工程はグリコシル化として知られている。その結果生じた、共有結合によってオリゴサッカライド側鎖をもつタンパク質は、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として知られている。タンパク質のグリコシル化は、目的のタンパク質のアミノ酸配列、およびそのタンパク質が発現している宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素を生産し得（例えば糖転移酵素およびグリコシダーゼ）、また、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有している可能性がある。そのような要因により、タンパク質のグリコシル化のパターン、およびグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現する宿主の系に依存して異なるもので有り得る。本開示で有用なグリコシル残基としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸が挙げられるがこれらには限定されない。ある実施形態では、グリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトのパターンになるようなグリコシル残基を含む。
【００６９】
タンパク質のグリコシル化を変化させることで、タンパク質の特徴が変化し得ることが当業者には知られている。例えば、微生物宿主、例えば酵母で産生され、酵母に内在する経路を利用してグリコシル化された治療用タンパク質の治療効果は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞株で発現させた同じタンパク質の効果よりも低下することがある。そのような糖タンパク質もヒトにおいて免疫原性であり、および投与後にインビボで示す半減期は短い。ヒトおよび他の動物における特定の受容体は、特定のグリコシル残基を認識して、そのタンパク質の血流からの迅速な排出を促す場合がある。他の有害作用には、タンパク質の折り畳み、溶解度、プロテアーゼ感受性、細胞内輸送、運搬、区画化、分泌、その他のタンパク質もしくは因子による認識または、抗原性、またはアレルゲン性の変化が含まれ得る。従って実務者は、グリコシル化に関して特定の組成とパターンを有する治療用タンパク質、例えば、グリコシル化の組成とパターンが、ヒト細胞で産生された治療用タンパク質または目的の対象動物の種特異的な細胞で産生された治療用タンパク質と同一であるか、または少なくとも類似した治療用タンパク質を選ぶ可能性がある。
【００７０】
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質は、宿主細胞を遺伝的に改変し、異種のグリコシル化酵素を発現させることによって、達成させることができる。当業者は、当該分野で知られている技術を用いて、ヒトタンパク質のグリコシル化を示している抗体またはその抗原結合部分を生成してもよい。例えば、酵母の系統は、これらの酵母系統で産生されたグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が、動物細胞、特にヒト細胞のもとの同じグリコシル化を示すように、天然には生じないグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に改変されてきた（米国特許第７，４４９，３０８号および同第７，０２９，８７２号）。
【００７１】
さらに、ライブラリー宿主細胞のメンバーが変種のグリコシル化パターンを有する目的のタンパク質の産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞のライブラリーを使用して目的のタンパク質を発現させてもよいことを当業者は理解するであろう。その後、実務者は、新規のグリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択および単離してもよい。ある実施形態では、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、向上したまたは変化した生物学的特性を示す。
【００７２】
ＩＶ．ＴＮＦ−α結合タンパク質の使用
本明細書で開示する結合タンパク質のＴＮＦ−α、例えばヒトＴＮＦ−α結合タンパク質もしくはその一部に結合する能力を考えれば、それらを使用した標準的な免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学抗原（例えば、生物試料、例えば血清または血漿での）を用いて、ＴＮＦ−αを検出することができる。生物試料と本明細書で開示の結合タンパク質または結合タンパク質部分とを接触させること、およびＴＮＦ−αに結合した結合タンパク質（もしくは結合タンパク質部分）または未結合の結合タンパク質（もしくは結合タンパク質部分）のいずれかを検出し、それによって、生物試料中のＴＮＦ−αを検出すること、を含む生物試料中のＴＮＦ−αの検出方法を提供する。結合したまたは未結合の抗体の検出を促すために、結合タンパク質を直接的にまたは間接的に、検出可能な物質で標識する。好適な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが；好適な補欠分子族複合体の例としてはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが；好適な蛍光材料の例としてはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが；蛍光材料の例としてはルミノールが；および好適な放射性材料の例としては３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍが挙げられる。
【００７３】
結合タンパク質を標識する代わりに、検出可能な物質で標識したＴＮＦ−αの標準物質と未標識のヒトｒｈＴＮＦ−α結合タンパク質を利用した競合免疫アッセイで、生体液に含まれているヒトＴＮＦ−αを評価することができる。このアッセイでは、生物試料、標識したｒｈＴＮＦ−αの標準物質およびヒトＴＮＦ−α結合タンパク質を合わせて、未標識の結合タンパク質に結合した、標識したｒｈＴＮＦ−α標準物質の量を決定する。生物試料中のヒトＴＮＦ−αの量は、ＴＮＦ−α結合タンパク質に結合した、標識したｒｈＴＮＦ−α標準物質の量に反比例する。同様に、検出可能な物質で標識したＴＮＦ−αの標準物質と未標識のヒトＴＮＦ−α結合タンパク質を利用した競合免疫アッセイで、生体液に含まれているヒトＴＮＦ−αを評価することができる。
【００７４】
ある実施形態では、本明細書で開示の結合タンパク質および結合タンパク質部分は、ＴＮＦ−αの活性、例えばヒトＴＮＦ−αの活性を、インビトロとインビボの両方で、中和することができる。別の実施形態では、本明細書で開示の結合タンパク質および結合タンパク質部分は、ヒトＴＮＦ−αの活性、例えばヒトＴＮＦ−αの活性を、向上または刺激することができる。従って、そのような本明細書で開示の結合タンパク質および結合タンパク質部分を、ｈＴＮＦ−αの活性を阻害または上昇させるために、例えばｈＴＮＦ−αを含有する細胞培養において、本明細書で開示の結合タンパク質が交差反応するＴＮＦ−αを有するヒト対象または他の哺乳類対象において、使用することができる。一実施形態では、ｈＴＮＦ−αの活性が阻害または上昇するように、ｈＴＮＦ−αと本明細書で開示の結合タンパク質または結合タンパク質部分を接触させることを含む、ｈＴＮＦ−αの活性を阻害するまたは上昇させるための方法を提供する。例えば、ｈＴＮＦ−αを含有する、または含有すると予想される細胞培養物中に、本明細書で開示の結合タンパク質または結合タンパク質部分を培地に添加し、培養物中のｈＴＮＦ−α活性を阻害または上昇させることができる。
【００７５】
別の実施形態では、対象、特に、ＴＮＦ−αの活性が有害なもしくは有益な病気または疾患を患っている対象におけるｈＴＮＦ−α活性を低下または上昇させるための方法を提供する。そのような病気または疾患を患っている対象におけるＴＮＦ−α活性を低下または上昇させる方法を提供し、この方法は、対象におけるＴＮＦ−α活性が低下または上昇するように、本明細書で開示の結合タンパク質または結合タンパク質部分を対象に投与することを含む。特定の実施形態においてＴＮＦ−αはヒトＴＮＦ−αであり、および対象はヒト対象である。あるいは、対象は、提供する結合タンパク質が結合できるＴＮＦ−αを発現している哺乳類であってもよい。さらに対象は、ＴＮＦ−αが導入されている（例えばＴＮＦ−αの投与またはＴＮＦ−α導入遺伝子の発現によって）哺乳類であってもよい。本明細書で開示の結合タンパク質は、治療目的でヒト対象に投与することができる。また、本明細書で開示の結合タンパク質は、獣医学的な目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、この結合タンパク質が結合可能なＴＮＦ−αを発現している非ヒト哺乳類に投与することもできる。後者に関しては、そのような動物モデルは、本明細書で開示の結合タンパク質の治療効果を評価するのにも有用であり得る（例えば投与量の試験および投与の時間経過）。
【００７６】
「ＴＮＦ−αの活性が有害な疾患」という用語は、その疾患を患っている対象におけるＴＮＦ−α活性の存在が、その疾患の病態生理の原因であるか、またはその疾患の悪化に寄与する因子であることが分かっている、あるいはそう予想される病気やその他の疾患を包む。従って、ＴＮＦ−αの活性が有害な疾患とは、ＴＮＦ−αの活性の低減が疾患の症状および／または進行を軽減すると予測される疾患である。そのような疾患は、例えば上述の抗ＴＮＦ−α抗体の使用によって検出することができる。例えば、その疾患を患っている対象の体液中のＴＮＦ−α濃度の上昇（例えば、対象の血清、血漿、骨液などにおけるＴＮＦ−α濃度の上昇）によって証明され得る。本明細書で開示する結合タンパク質を用いて治療することができる疾患の非限定的な例としては、本明細書で開示する抗体の医薬組成物に関連する以下の節で論じる疾患が含まれる。
【００７７】
あるいは、「ＴＮＦ−αの活性が有益な疾患」という用語は、その疾患を患っている対象におけるＴＮＦ−α活性の存在が、その疾患の病態病理の治療に有益であるか、またはその疾患の治療に寄与する因子であることが分かっている、またはそう予想される病気やその他の疾患を含む。従って、ＴＮＦ−αの活性が有益である疾患とは、ＴＮＦ−αの活性を上昇させることが、疾患の症状および／または進行を軽減すると予測される疾患である。本明細書で開示の抗体で治療することができる疾患の非限定的な例には、本明細書で開示の抗体の医薬組成物に関する以下の節で議論する疾患が含まれる。
【００７８】
Ｖ．医薬組成物
本明細書で開示する結合タンパク質またはその抗原結合部分、および医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。本発明で開示する結合タンパク質を含む医薬組成物は、疾患もしくは１つ以上のその症状の予防、治療、管理、または軽減においておよび／または研究において、疾患を診断、検出、またはモニタリングするために使用されるが、医薬組成物の用途はこれらには限定されない。具体的な実施形態において組成物は、１つ以上の本発明で開示するタンパク質を含む。別の実施形態において医薬組成物は、ＴＮＦ−αの活性が有害な疾患を治療するための、１つ以上の本発明で開示する結合タンパク質と、本明細書で開示する結合タンパク質以外の１つ以上の予防薬または治療薬とを含む。特定の実施形態では、予防薬または治療薬は、疾患または１つ以上のその症状の予防、治療、管理または軽減に有用であることが知られているものであるか、あるいは疾患または１つ以上のその症状の予防、治療、管理または軽減においてこれまで、または現在使用されているものである。これらの実施形態に従えば、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【００７９】
本明細書で開示する結合タンパク質と結合タンパク質部分は、対象への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、本明細書で開示する結合タンパク質または結合タンパク質部分と、医薬として許容可能な担体とを含む。「医薬として許容可能な担体」という用語は、生理学的に適合する任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、殺菌および殺真菌剤、等張および吸収遅延剤、などを含む。医薬として許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、組成物に含まれる等張剤、例えば、糖、もしくはマンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウムが含まれてもよい。医薬として許容可能な担体はさらに、微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤や、結合タンパク質または結合タンパク質部分の有効期間または効果を高める防腐剤または緩衝剤などを含んでもよい。
【００８０】
様々な送達系が公知であり、例えば、リポソーム、微粒子、ミクロカプセル、結合タンパク質または結合タンパク質の断片を発現することができる組み換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ  （１９８７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸構築物などに封入して、本発明で開示する１つ以上の結合タンパク質を、または本発明で開示する１つ以上の結合タンパク質と疾患もしくは１つ以上のその症状を予防、管理、治療、または軽減するのに有用な予防薬または治療薬との組み合わせを投与するために使用することができる。本発明で提供する予防薬または治療薬の投与方法には、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与および粘膜投与（例えば、鼻内および経口経路）が含まれるが、これらには限定されない。さらに、例えば、吸入装置または噴霧器およびエアロゾル化剤を加えた製剤の使用によって、経肺投与を使用することが可能である。一実施形態では、本発明で開示する結合タンパク質、併用療法または本発明で開示する組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、ケンブリッジ、マサチューセッツ）を用いて投与される。具体的な実施形態では、本発明で開示する予防薬または治療薬は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、経肺または皮下投与される。予防薬または治療薬は、あらゆる都合のよい経路によって、例えば、注入若しくはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口粘粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通じた吸収によって投与してもよく、また、生物学的に活性な他の因子と一緒に投与してもよい。投与は、全身投与であっても局所投与であってもよい。
【００８１】
具体的な実施形態では、治療を必要としている部位へ局所的に、本明細書で開示する予防薬または治療薬を投与することが望ましい場合があり得る。これは例えば、これらに限定されるものではないが、局所的注入によって、注射によって、またはインプラントを用いて達成してもよく、前記インプラントは、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、ポリマー、繊維性マトリックス（例えば、Ｔｉｓｓｕｅｌ（登録商標））またはコラーゲンマトリックスなどの、膜およびマトリックスを含む多孔性または非多孔性材料である。一実施形態では、本明細書で開示する１つ以上の結合タンパク質のアンタゴニストの有効量を、疾患またはその症状を予防、治療、管理、および／または軽減するために、対象の罹患した部位へ局所投与する。別の実施形態では、本明細書で開示する１つ以上の結合タンパク質の有効量を、疾患または１つ以上のその症状を予防、治療、管理、および／または軽減するために、本明細書で開示する抗体以外の１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の予防薬または治療薬）の有効量と組み合わせて、対象の罹患した部位に局所投与する。
【００８２】
本明細書で開示する組成物が予防薬または治療薬をコードしている核酸である具体的な実施形態では、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）の使用によって、または直接の注射によって、もしくは微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏｎｔ）の使用によって、核酸が細胞内となるように核酸を投与し、または脂質若しくは細胞表面受容体若しくは形質移入剤でコーティングし、または核内に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して核酸を投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８を参照のこと）、核酸がコードしている予防薬または治療薬の発現を促進するために、核酸をインビボで投与することが可能である。あるいは、相同的組み換えによって発現させるために、核酸を細胞内に導入し、宿主細胞ＤＮＡ内に取り込むことが可能である。
【００８３】
本明細書で開示する方法には、注射による（例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与のために製剤化された組成物の投与が含まれ得る。注射用製剤を、添加された防腐剤とともに、単位容量形態で（例えば、アンプルまたは多回投薬容器に入れて）提示してもよい。組成物は、油性または水性媒体に溶解した懸濁液、溶液または乳液などの剤形であってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化のための薬剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適切な媒体（例えば、発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末形態であってもよい。
【００８４】
本発明で開示する方法はさらに、デポ調製物として製剤化された組成物の投与を含み得る。このような長時間作用型の製剤は、（例えば、皮下または筋肉内への）埋め込みによって、または筋肉内注射によって投与されてよい。従って、例えば、組成物は、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油に溶解したエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性の塩として）調合され得る。
【００８５】
本明細書で開示する方法は、中性または塩の形態として製剤化された組成物の投与を包含する。医薬として許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンとともに形成された塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンとともに形成された塩が含まれる。
【００８６】
組成物の成分は一般に、別個に、または単位容量形態中に（例えば、活性剤の量を示した注射器または小袋などの密閉された容器に入れた、凍結乾燥した乾燥粉末もしくは無水濃縮物として）一緒に混合されて供給される。投与の様式が注入である場合には、組成物は、医薬等級の無菌水または生理的食塩水を含有する注入瓶を用いて分配することができる。投与の様式が注射による場合には、注射用の無菌水または生理的食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るように提供することが可能である。
【００８７】
具体的には、１つ以上の予防薬もしくは治療薬または本明細書で開示する医薬組成物が、密閉された容器、例えば、活性剤の量を示したアンプルまたは小袋などの中に梱包されることも提供する。一実施形態では、１つ以上の予防薬もしくは治療薬または本明細書で開示する医薬組成物は、密閉された容器に入れた凍結乾燥した乾燥無菌粉末または無水濃縮物として供給され、対象に投与するための適切な濃度になるように（例えば、水または生理的食塩水で）再構成することができる。ある実施形態では、１つ以上の予防薬もしくは治療薬または本明細書で開示する医薬組成物は、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位用量で、密封された容器に入れた凍結乾燥した乾燥無菌粉末として供給される。凍結乾燥した予防もしくは治療薬または本明細書で開示する医薬組成物は、その元の容器中で、２℃〜８℃の範囲で保存すべきであり、予防薬もしくは治療薬または本明細書で開示する医薬組成物は、再構成後、１週以内、例えば、５日以内、７２時間以内、４８時間以内に、２４時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、５時間以内に、３時間以内に、または１時間以内に投与すべきである。別の実施形態では、１つ以上の予防薬もしくは治療薬または本明細書で開示する医薬組成物は、薬剤の量と濃度を示す密閉された容器に入れた液体形態で供給される。ある実施形態では、液体形態の投与される組成物は、密封された容器中に、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌで供給される。液体形態は、その元の容器中で、２℃〜８℃の範囲で保存すべきである。
【００８８】
本明細書で開示する結合タンパク質および結合タンパク質部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に取り込ませることができる。ある実施形態では、結合タンパク質または結合タンパク質部分は、０．１から２５０ｍｇ／ｍＬの結合タンパク質を含有する注射可能な溶液として調製される。注射可能な溶液は、フリント容器または琥珀色の容器、アンプルまたは充填済みのシリンジに入れた液体または凍結乾燥した剤形から構成され得る。緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）であってよく、５〜１０ｍＭ、ｐＨ５．０〜７．０（ｐＨ６．０が至適）が最適である。他の好適な緩衝剤としては、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが挙げられるが、これらには限定されない。塩化ナトリウムは、０〜３００ｍＭの濃度で（液体剤形のためには１５０ｍＭが至適）溶液の毒性を変化させる使用することができる。凍結乾燥した剤形には、凍結保護剤、主に、０〜１０％のショ糖（０．５〜１．０％が至適）を含めることができる。他の適切な凍結保護剤としては、トレハロースやラクトースが挙げられる。凍結乾燥された剤形には、増量剤、主に、１〜１０％のマニトール（２〜４％が至適）を含めることができる。液体および凍結乾燥された両剤形において、安定化剤、主に１〜５０ｍＭのＬ−メチオニン（５〜１０ｍＭが至適）を使用することができる。他の適切な充填剤には、グリシンおよびアルギニンが含まれ得、０〜０．０５％のポリソルベート−８０として含めることが可能である（０．００５〜０．０１％の濃度が至適）。その他の界面活性剤には、これらには限定されないが、ポリソルベート２０やＢＲＩＪ界面活性剤がある。
【００８９】
典型的な組成物は、ヒトの受動免疫用に使用される、他の抗体を含む組成物と同様の組成物など、注射可能溶液または注入可能溶液の形態である。治療用組成物は、典型的には、製造の条件および保存の条件で、無菌的および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高濃度の薬物に適した、その他の要求される構造として製剤化することができる。無菌的な注射可能溶液は、上で列記した成分の１つまたは組み合わせを加えた適切な溶媒中に、必要な量で活性な化合物（すなわち、結合タンパク質または結合タンパク質部分）を組み入れ、その後、必要に応じて、ろ過滅菌によって調製することができる。一般的に、分散液は、基本となる分散溶媒と、上で列記したものから得られる必要なその他の成分を含有する無菌的な媒体中に活性化合物を取り込ませることによって調製される。無菌的な注射可能溶液の調製のための凍結乾燥された無菌粉末の場合には、調製方法には真空乾燥および噴霧乾燥が含まれ、予め滅菌ろ過されたその溶液から、あらゆる追加の所望される成分を加えた活性成分の粉末を得る。溶液に適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、注射可能な組成物が吸収される期間を延長することができる。
【００９０】
当業者には当然のことであるが、投与の経路および／または様式は、所望される結果に応じて変わる。ある特定の実施形態では、活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製される場合があり、そのような例としては、インプラント、経皮パッチおよび微小封入された送達系を含む制御放出製剤などがある。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など、生物分解可能な生物適合性高分子を使用することができる。このような製剤の多くの調製方法は、特許が付与されているか、または、当業者に一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８を参照のこと。
【００９１】
補助的活性化合物も、組成物中に取り込ませることが可能である。有る特定の実施形態において、本発明で開示する結合タンパク質または結合タンパク質部分は、ＴＮＦ−αの活性が有害な疾患を治療するのに有用である。例えば、本明細書で開示する抗hＴＮＦ−α抗体または抗体部分を、他の標的に結合する１つ以上のさらな抗体（例えば、他のサイトカインに結合する抗体または細胞表面分子に結合する抗体）とともに製剤化し、および／または同時投与してもよい。さらに、本発明で開示する１つ以上の結合タンパク質を、先述の治療薬の２つまたはそれ以上と組み合わせて使用してもよい。このような併用療法では有利なことに、投与される治療薬の用量をより低くすることができるため、様々な単独療法に伴って生じ得る毒性または合併症が回避される。
【００９２】
有る特定の実施形態において、ＴＮＦ−αに対する結合タンパク質またはその断片は、当該分野で公知の半減期延長媒体に連結される。このような媒体には、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランが含まれるが、これらには限定されない。このような媒体は、例えば、米国特許第６，６６０，８４３号に記載されている。
【００９３】
具体的な実施形態では、本発明で開示する結合タンパク質または本発明で開示する別の予防薬もしくは治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列は、遺伝子治療によって、疾患または１つ以上のその症状を治療、予防、管理、または軽減するために投与される。遺伝子治療とは、発現された核酸または発現可能な核酸を対象に投与することによって実行される治療を指す。本開示のこの実施形態では、核酸は、それらがコードしている、予防的効果または治療的効果を媒介する、本発明で開示する結合タンパク質または予防薬もしくは治療薬を産生する。
【００９４】
本開示に従えば、当該分野で利用可能ないかなる遺伝子治療の方法にも使用できる。
【００９５】
ＴＮＦ−αは、自己免疫疾患などの免疫性および炎症性の要素を伴う様々な疾患に関連がある病理、特に、クローン病、乾癬（尋常性乾癬を含む）、関節炎（関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、または若年性特発性関節炎を含む）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、および強直性脊椎炎を含む炎症に関連する病理において非常に重要な役割を担っている。従って、本明細書中の結合タンパク質は、これら疾患の治療に使用してもよい。別の実施形態では、疾患は、呼吸器疾患；喘息；アレルギー性および非アレルギー性喘息；感染症による喘息；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染による喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道の炎症を伴う症状；好酸球増加症；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性障害；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症性および／または自己免疫状態；胃腸器官の炎症性および／または自己免疫状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；肝臓の炎症性および／または自己免疫状態；肝硬変；肝線維症；肝炎Ｂおよび／またはＣウイルスに起因する肝線維症；強皮症；腫瘍または癌；肝細胞の癌腫；膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染；細菌感染；寄生虫感染；ＨＴＬＶ−１感染；保護的な１型免疫応答の発現の抑制、ワクチンを接種している間の、保護的な１型免疫応答の発現の抑制、神経変性性疾患、ニューロン再生、および脊髄損傷である。
【００９６】
当業者であれば、本発明または本明細書に開示されている実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を用いることで、本発明に開示されている方法に、別の適切な変更および改変を施すことができる。ここまで本発明を詳述してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明をより深く理解できるだろう。ただしこれらの実施例は、例示する目的のためだけのものであり、本発明を限定することを意図してはいない。
【実施例】
【００９７】
実施例１：インビトロでのディスプレー系による、ＴＮＦに対する完全長ヒト抗体の特定
１．１：抗体の選択
インビトロディスプレー技術を用い、完全長ヒト抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体を、それらの組換えヒトＴＮＦタンパク質への結合能を指標として、ヒト抗体ライブラリーから単離した。重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列をＤＮＡ配列決定で決定し、表１０に示した。
【００９８】
【表１０】
2014534218.tif 000050
2014534218.tif 000051
2014534218.tif 000052
2014534218.tif 000053
2014534218.tif 000054
2014534218.tif 000055
2014534218.tif 000056
【００９９】
１．２：完全長ヒト抗ヒトＴＮＦ抗体ＡＥ１１−５の親和性成熟
インビトロディスプレー技術を用い、ヒトＴＮＦに対するＡＥ１１−５ヒト抗体を親和性成熟させた。２８、３１、３２、５１、５５、９１、９２、９３、９５ａおよび９６番目（カバットの番号付け）にのみ、限定的に突然変異を含む様に、軽鎖ライブラリーを１つ構築した。このライブラリーは同時に、ライブラリー選択を行っている間のフレームワークの生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）を可能にするための、フレームワーク生殖系列の逆突然変異、Ｄ１Ｅ、Ｍ４Ｌ、Ｈ１１Ｑ、Ｒ４９Ｋ、Ｈ７６ＮおよびＱ１０３Ｋ、ならびに５０（Ｒ／Ｋ）と９４（Ｓ／Ｌ）のトグル残基を含んだ。ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の３０、３１、３３、５０、５２、および５５〜５８番目の残基（カバットの番号付け）、またはＣＤＲＨ３の９５〜１００ｂ番目の残基（カバットの番号付け）にのみ限定的な突然変異が含まれるように、２つの重鎖ライブラリーを作成した。ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２が変化したライブラリーは、フレームワーク生殖系列の逆突然変異、Ａ１８ＶとＬ６４Ｑ、および５４（Ｌ／Ｆ）と７８（Ｖ／Ａ）にトグル残基を含み、ＣＤＲＨ３ライブラリーは１００ｃ（Ａ／Ｆ）にさらにトグル残基を含む。
【０１００】
低濃度のビオチン化ヒトまたはカニクイザルサルＴＮＦ抗原存在下で、ヒトまたはカニクイザルサルＴＮＦへの結合能を指標として、全３種類のライブラリーを別個に選択した。ライブラリーの選択で回収した変異したＣＤＲ配列の全てを、別のライブラリーに組換え、組み換えたライブラリーに関し、よりストリンジェントな条件で選択を行い、その後、個々の抗体を特定した。
【０１０１】
表１１に、ＡＥ１１−５に由来の親和性成熟した完全長ヒトＴＮＦ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列の一覧を示す。各ＶＨの個々のＣＤＲのアミノ酸残基を太字で示している。
【０１０２】
【表１１】
2014534218.tif 000057
2014534218.tif 000058
2014534218.tif 000059
2014534218.tif 000060
2014534218.tif 000061
2014534218.tif 000062
2014534218.tif 000063
2014534218.tif 000064
2014534218.tif 000065
2014534218.tif 000066
2014534218.tif 000067
2014534218.tif 000068
2014534218.tif 000069
2014534218.tif 000070
2014534218.tif 000071
2014534218.tif 000072
2014534218.tif 000073
2014534218.tif 000074
2014534218.tif 000075
2014534218.tif 000076
2014534218.tif 000077
2014534218.tif 000078
2014534218.tif 000079
2014534218.tif 000080
2014534218.tif 000081
2014534218.tif 000082
【０１０３】
表１２に、ＡＥ１１−５由来の親和性成熟した完全長ヒトＴＮＦ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列の一覧を示す。各ＶＨ配列の個々のＣＤＲのアミノ酸残基を太字で示している。
【０１０４】
【表１２】
2014534218.tif 000083
2014534218.tif 000084
2014534218.tif 000085
2014534218.tif 000086
2014534218.tif 000087
2014534218.tif 000088
2014534218.tif 000089
2014534218.tif 000090
2014534218.tif 000091
2014534218.tif 000092
2014534218.tif 000093
2014534218.tif 000094
2014534218.tif 000095
2014534218.tif 000096
2014534218.tif 000097
2014534218.tif 000098
2014534218.tif 000099
2014534218.tif 000100
2014534218.tif 000101
2014534218.tif 000102
2014534218.tif 000103
2014534218.tif 000104
2014534218.tif 000105
2014534218.tif 000106
2014534218.tif 000107
【０１０５】
【表１３】
2014534218.tif 000108
2014534218.tif 000109
2014534218.tif 000110
【０１０６】
【表１４】
2014534218.tif 000111
2014534218.tif 000112
2014534218.tif 000113
2014534218.tif 000114
2014534218.tif 000115
2014534218.tif 000116
【０１０７】
【表１５】
2014534218.tif 000117
2014534218.tif 000118
2014534218.tif 000119
2014534218.tif 000120
2014534218.tif 000121
【０１０８】
【表１６】
2014534218.tif 000122
2014534218.tif 000123
【０１０９】
１．３：ＴＮＦの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の手順およびアッセイの結果
以下の手順を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、ＴＮＦ抗体のビオチン化ヒトまたはＴＮＦ抗体に対する結合を解析する。ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）で一晩、４℃でコーティングした。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で５０μｌのＭａｂを１μｇ／ｍｌに希釈し、適したウェルに加えて、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μｌの段階希釈したビオチン−ヒトＴＮＦを適切なウェルに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で１：１０，０００に希釈した５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを適切なウェルに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢを適切なウェルに加え、１分間反応を進めた。１ウェル当たり５０μｌのＨ２ＳＯ４（２Ｎ）を加えて反応を停止させ、吸収を４５０ｎｍで測定した。結果を表１７に示す。
【０１１０】
【表１７】
2014534218.tif 000124
【０１１１】
１．４：Ｌ９２９バイオアッセイによる、ＴＮＦ抗体のＴＮＦ中和能力
ヒトＴＮＦをＡｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ウスター、マサチューセッツ、米国）で調製し、ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＰｈａｒｍａｃｙから受け取った。マウスＴＮＦをＡｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒで調製し、ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＰｈａｒｍａｃｙから受け取った。ラットＴＮＦをＡｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒで調製し、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｙから受け取った。ウサギＴＮＦはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。アカゲザルＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。アクチノマイシンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ＤＭＳＯで１０ｍｇ／ｍＬの保存用濃度に再懸濁した。
【０１１２】
アッセイ培地：１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３００７０．０３）、Ｇｉｂｃｏ試薬：ＲＰＭＩ１６４０（＃２１８７０）、２ｍＭのＬ−グルタミン（＃２５０３０）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（＃１５１４０）、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸（＃１１１４０）および５．５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（＃２１９８５−０２３）。
【０１１３】
Ｌ９２９細胞をセミコンフルエントの密度になるまで生育し、０．０５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ＃２５３００）を用いて回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、アクチノマイシンＤ（４μｇ／ｍＬ）を含有するアッセイ培地中に１×１０６個細胞／ｍＬで再懸濁した。この細胞５×１０４個を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９９）に、１ウェル当たり５０μＬの体積で播種した。ウェルに５０μＬのアッセイ培地を加えて、体積を１００μＬとした。
【０１１４】
被検試料を以下のように調製した。試験するＩｇＧタンパク質と対照のＩｇＧタンパク質を、アッセイ培地で１／４の濃度に希釈し、そこから１：３の段階希釈を行った。各ＴＮＦ種をアッセイ培地で、以下の濃度になるように希釈した：ヒトＴＮＦ（４００ｐｇ／ｍＬ）、マウスＴＮＦ（２００ｐｇ／ｍＬ）、ラットＴＮＦ（６００ｐｇ／ｍＬ）およびウサギＴＮＦ（１００ｐｇ／ｍＬ）。抗体試料（２００μＬ）を１：２の希釈スキームでＴＮＦ（２００μＬ）に加え、室温で０．５時間インキュベートした。
【０１１５】
このアッセイでヒトＴＮＦの中和能力を測定するために、抗体／ＴＮＦ溶液を、プレーティングした細胞に１００μＬ加え、最終濃度が３７５ｎＭ〜０．０１９ｎＭとなるようにした。ＴＮＦの最終濃度は以下の通りであった：ヒトＴＮＦが１００ｐｇ／ｍＬ、マウスＴＮＦが５０ｐｇ／ｍＬ、ラットＴＮＦが１５０ｐｇ／ｍＬ、およびウサギＴＮＦが２５ｐｇ／ｍＬ。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。生存率を定量するために、ウェルから１００μＬを除去し、１０μＬのＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１６４４８０７００１）を加えた。アッセイ条件でプレートを３．５時間インキュベートし、５００×ｇで遠心分離し、上清の７５μＬをＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３３６９）に移した。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ１９０ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用し、プレートをＯＤ４２０〜６００ｎｍで測定した。選択したいくつかのＴＮＦ／ＩＬ−１７  ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質の中和能力を表１８に示す。
【０１１６】
【表１８】
2014534218.tif 000125
【０１１７】
実施例２：ヒト化抗ヒトＴＮＦ抗体ｈＭＡＫ−１９５の親和性成熟
マウス抗ヒトＴＮＦ抗体であるＭＡＫ−１９５をヒト化、かつ、親和性成熟させて、サル−ＴＮＦに対する交差反応性をもち、ヒトおよびサルのＴＮＦの両方への親和性および結合動態が向上したヒト化ＭＡＫ１９５変異体のパネルを生成した。
【０１１８】
ｈＭＡＫ１９５のＴＮＦに対する親和性を向上させるために、ＩｇＢＬＡＳＴデータベースに含まれる、生殖系列ＶＨ３−５３とＩＧＫＶ１−３９との相同性が高い他のヒト抗体配列から、非常に変異の多いＣＤＲ残基を特定した。次いで、対応するｈＭＡＫ１９５のＣＤＲ残基をＰＣＲによる限定的な突然変異生成に供した。これらの位置での縮重が少ないプライマーを使用し、ｓｃＦｖ形式の３つの抗体ライブラリーを作成した。第一のライブラリーは、ＶＨのＣＤＲ１と２の３１、３２、３３、３５、５０、５２、５３、５４、５６および５８番目の残基（カバットの番号付け）に；第二のライブラリーではＶＨ  ＣＤＲ３の９５〜１００、１００ａ、１０１、および１０２の残基に；および第三のライブラリーでは３つのＶＬ  ＣＤＲの２８、３０、３１、３２、５０、５３、９２、９３、９４、および９５番目の残基に突然変異が生成された。ｈＭＡＫ１９５とヒト生殖系列のフレームワーク配列との相同性をさらに高めるために、第一のライブラリーでは、ＶＨの６０（Ｄ／Ａ）、６１（Ｓ／Ｄ）、６２（Ｔ／Ｓ）、６３（Ｌ／Ｖ）、および６５（Ｓ／Ｇ）の位置に、バイナリー縮重を導入した。さらに、第三のライブラリーでは、ＶＬの２４（Ｋ／Ｒ）、３３（Ｖ／Ｌ）、５４（Ｒ／Ｌ）、５５（Ｈ／Ｑ）、５６（Ｔ／Ｓ）、９１（Ｈ／Ｓ）および９６（Ｆ／Ｙ）の位置に、バイナリー縮重を導入した。
【０１１９】
これらのｈＭＡＫ１９５変異体を、低濃度のビオチン化ＴＮＦに対する高い結合速度、高い解離速度について選択するか、あるいはその両方を実施して、親和性調節したｈＭＡＫ１９５抗体タンパク質の配列を、ＩｇＧへと逆変換するために回収し、さらに特徴を解析した。低濃度のビオチン化ヒトまたはカニクイザルサルＴＮＦ抗原の存在下で、ヒトまたはカニクイザルサルＴＮＦへの結合能を指標として、３つ全てのライブラリーを別個に選択した。ライブラリーの選択から回収した、変異したＣＤＲ配列の全てを、別のライブラリーに組換え、組み換えたライブラリーをよりストリンジェントな条件での選択に供し、その後、個々の抗体を特定した。
【０１２０】
表１９に、親和性成熟の選択プロトコールに供した、ヒト化ＭＡＫ−１９５のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の一覧を示す。それぞれのＶＨおよびＶＬ配列の個々のＣＤＲのアミノ酸残基を太字で示している。
【０１２１】
【表１９】
2014534218.tif 000126
2014534218.tif 000127
2014534218.tif 000128
2014534218.tif 000129
2014534218.tif 000130
2014534218.tif 000131
2014534218.tif 000132
2014534218.tif 000133
2014534218.tif 000134
2014534218.tif 000135
2014534218.tif 000136
2014534218.tif 000137
2014534218.tif 000138
2014534218.tif 000139
2014534218.tif 000140
2014534218.tif 000141
2014534218.tif 000142
2014534218.tif 000143
2014534218.tif 000144
2014534218.tif 000145
2014534218.tif 000146
【０１２２】
表２０に、ｈＭＡＫ１９５由来の親和性成熟した完全長ヒトＴＮＦ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列の一覧を示す。各ＶＨ配列の個々のＣＤＲのアミノ酸残基を太字で示している。
【０１２３】
【表２０】
2014534218.tif 000147
2014534218.tif 000148
2014534218.tif 000149
2014534218.tif 000150
2014534218.tif 000151
2014534218.tif 000152
2014534218.tif 000153
2014534218.tif 000154
【０１２４】
【表２１】
2014534218.tif 000155
2014534218.tif 000156
【０１２５】
以下の表に、特徴解析のためにＩｇＧタンパク質に変換したヒト化ＭＡＫ−１９５抗体の一覧を示す。
【０１２６】
【表２２】
2014534218.tif 000157
2014534218.tif 000158
2014534218.tif 000159
2014534218.tif 000160
2014534218.tif 000161
2014534218.tif 000162
2014534218.tif 000163
2014534218.tif 000164
2014534218.tif 000165
2014534218.tif 000166
2014534218.tif 000167
2014534218.tif 000168
2014534218.tif 000169
【０１２７】
【表２３】
2014534218.tif 000170
2014534218.tif 000171
2014534218.tif 000172
2014534218.tif 000173
2014534218.tif 000174
2014534218.tif 000175
2014534218.tif 000176
2014534218.tif 000177
2014534218.tif 000178
【０１２８】
【表２４】
2014534218.tif 000179
【０１２９】
2.1  ＴＮＦ酵素結合免疫吸着アッセイの結果
【表２５】
2014534218.tif 000180
【０１３０】
2.2  Ｌ９２９バイオアッセイによる、ＴＮＦ抗体のＴＮＦ中和能力
【表２６】
2014534218.tif 000181
2014534218.tif 000182
【０１３１】
実施例３：ヒト化抗ヒトＴＮＦ抗体ｈＭＡＫ−１９９の親和性成熟
マウス抗ヒトＴＮＦ抗体であるＭＡＫ−１９９ヒト化、かつ、親和性成熟させて、ヒトおよびサルのＴＮＦ両方への親和性および結合動態が向上したヒト化ＭＡＫ１９５変異体のパネルを生成した。以下の仕様に従って、いくつかのライブラリーを作成した。
【０１３２】
Ｖ２Ｉの逆変異を最初に導入し、ＴＮＦに対するｓｃＦｖの親和性に影響が及んでいないことを確認した後、３つのＨＣライブラリーを作成した。
Ｈ１＋Ｈ２（ＤＤＫ）ライブラリー：
−７つの残基（Ｔ３０、Ｎ３１、Ｎ３５、Ｔ５２ａ、Ｔ５４、Ｅ５６、Ｔ５８）に限定的な突然変異を生成
−生殖系列トグル：Ｍ３４ＩおよびＦ６３Ｌ
Ｈ１＋Ｈ２（ＱＫＱ）ライブラリー：
−７つの残基（Ｔ３０、Ｎ３１、Ｎ３５、Ｔ５２ａ、Ｔ５４、Ｅ５６、Ｔ５８）に限定的な突然変異を生成
−生殖系列トグル：Ｍ３４ＩおよびＦ６３Ｌ
−生殖系列への逆変異：Ｄ６１Ｑ、Ｄ６２Ｋ、Ｋ６４Ｑ、Ｆ６７Ｖ、Ｆ６９Ｍ、Ｌ７１Ｔ
Ｈ３ライブラリー：
−１２つの残基（９５〜１００、１００ａ〜１００ｆ）に限定的な突然変異を生成
−生殖系列トグル：Ｆ９１Ｙ
ＬＣライブラリー：
−１１の残基（２８、３０〜３２、５０、５３、９１〜９４、９６）に限定的な突然変異を生成
−生殖系列トグル：Ｔ５１Ａ、Ｙ７１Ｆ、Ｆ８７Ｙ、およびＴ４３Ａ／Ｖ４４Ｐ（これら２つは共に進展した）
組換えライブラリー：
選択を少なくとも３回行い、ライブラリーの多様性が低下した後、ＶＨライブラリーをＶＬライブラリーと共に、およびＶＬライブラリーを含めずに組み換える。
【０１３３】
低濃度のビオチン化ヒトまたはカニクイザルサルＴＮＦ抗原の存在下で、ヒトまたはカニクイザルサルＴＮＦへの結合能を指標として、４つ全てのライブラリーを別個に選択した。ライブラリーの選択から回収した、変異したＣＤＲ配列の全てを、別のライブラリーに組換え、組み換えたライブラリーをよりストリンジェントな条件での選択にかけ、その後、個々の抗体を同定した。
【０１３４】
表２７に、親和性成熟の選択プロトコールに供した、ｈＭＡＫ−１９９抗体のＶＨのアミノ酸配列の一覧を示す。各ＶＨ配列の個々のＣＤＲのアミノ酸残基を太字で示している。
【０１３５】
【表２７】
2014534218.tif 000183
2014534218.tif 000184
2014534218.tif 000185
2014534218.tif 000186
2014534218.tif 000187
2014534218.tif 000188
2014534218.tif 000189
2014534218.tif 000190
2014534218.tif 000191
2014534218.tif 000192
2014534218.tif 000193
2014534218.tif 000194
2014534218.tif 000195
2014534218.tif 000196
2014534218.tif 000197
2014534218.tif 000198
2014534218.tif 000199
2014534218.tif 000200
2014534218.tif 000201
2014534218.tif 000202
2014534218.tif 000203
2014534218.tif 000204
2014534218.tif 000205
2014534218.tif 000206
2014534218.tif 000207
2014534218.tif 000208
2014534218.tif 000209
【０１３６】
表２８に、ｈＭＡＫ１９９由来の親和性成熟した完全長ヒトＴＮＦ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列の一覧を示す。各ＶＬ配列の個々のＣＤＲのアミノ酸残基を太字で示している。
【０１３７】
【表２８】
2014534218.tif 000210
2014534218.tif 000211
2014534218.tif 000212
2014534218.tif 000213
2014534218.tif 000214
2014534218.tif 000215
2014534218.tif 000216
2014534218.tif 000217
2014534218.tif 000218
2014534218.tif 000219
2014534218.tif 000220
【０１３８】
【表２９】
2014534218.tif 000221
2014534218.tif 000222
【０１３９】
【表３０】
2014534218.tif 000223
2014534218.tif 000224
2014534218.tif 000225
2014534218.tif 000226
2014534218.tif 000227
2014534218.tif 000228
【０１４０】
【表３１】
2014534218.tif 000229
2014534218.tif 000230
2014534218.tif 000231
2014534218.tif 000232
2014534218.tif 000233
2014534218.tif 000234
【０１４１】
【表３２】
2014534218.tif 000235
【０１４２】
3.1  ＴＮＦ酵素結合免疫吸着アッセイの結果
【表３３】
2014534218.tif 000236
【０１４３】
3.2  Ｌ９２９バイオアッセイによる、ＴＮＦ抗体のＴＮＦ中和能力
【表３４】
2014534218.tif 000237
【０１４４】
実施例４
実施例４．４：ＢＩＡＣＯＲＥ技術を用いた親和性の決定
【０１４５】
【表３５】
2014534218.tif 000238
【０１４６】
ＢＩＡＣＯＲＥ法
ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）は、結合速度および解離速度定数の速度論的決定を用いて、結合タンパク質の親和性を決定する。結合タンパク質の標的抗原（例えば、精製された組換え標的抗原）への結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）１０００または３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）を用い、移動相としてＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）を使用し、２５℃で行う表面プラズモン共鳴を基礎とする測定によって決定される。全ての化学物質は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）または本文中に記載されている別の入手先から取得した。例えば、約５０００ＲＵのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で希釈した断片特異的ポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、イリノイ州ロックフォード）を、製造業者の説明および手順に従う標準的なアミンカップリングキットで、研究等級のＣＭ５バイオセンサーチップに２５μｇ／ｍＬで、直接固定する。バイオセンサー表面の未反応部分は、エタノールアミンでブロックする。フローセル２および４中の修飾されたカルボキシメチルデキストラン表面を、反応表面として使用する。フローセル１および３中のヤギ抗マウスＩｇＧなしの修飾されていないカルボキシメチルデキストランを参照表面として使用する。動態解析のために、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．０．１ソフトウェアを用い、全８回の注入の結合相と解離相に、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルから誘導した速度方程式を同時にあてはめる（グローバルフィット解析を使用）。ヤギ抗マウスＩｇＧ特異的な反応表面全体を使って捕捉するために、ＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水で、精製した抗体を希釈する。リガンドとして捕捉される抗体（２５μｇ／ｍＬ）を、５μＬ／分の流速で反応マトリックスに注入する。２５μＬ／分で継続的に流れているところで、結合速度定数ｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）と解離速度定数ｋｏｆｆ（ｓ−１）を決定する。１０から２００ｎＭの範囲の様々な抗原濃度で結合動態の測定を行うことによって、速度定数が導かれる。次いで、式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎで、運動速度定数から、抗体と標的抗原間の反応の平衡解離定数（Ｍ）を計算する。結合は、時間の関数として記録され、運動速度定数が計算される。このアッセイでは、最大１０６Ｍ−１Ｓ−１の速さの結合速度および最小１０−６ｓ−１までの遅さの解離速度を決定することができる。
【０１４７】
本明細書の結合タンパク質は、高い親和性、遅い解離速度、および高い中和能力などの点で、有益な特性をもつことが予想される。
【０１４８】
実施例４．５：ヒトＴＮＦ−αの中和
Ｌ９２９細胞をセミコンフルエントの密度になるまで生育し、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ＃２５３００）を用いて回収する。細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、アクチノマイシンＤ（４μｇ／ｍＬ）を含有するアッセイ培地中に１×１０６個細胞／ｍＬで再懸濁する。この細胞５×１０４個を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９９）に、１ウェル当たり１００μＬの体積で播種する。アッセイ培地を使って結合タンパク質と対照ＩｇＧを４倍希釈し、１：４の段階希釈を行う。アッセイ培地で、ヒトＴＮＦαを４００ｐｇ／ｍＬになるように希釈する。１：２の希釈スキームで、結合タンパク質の試料（２００μＬ）をヒトＴＮＦα（２００μＬ）に添加し、室温で０．５時間インキュベートする。
【０１４９】
結合タンパク質／ヒトＴＮＦ−α溶液を、プレーティングした細胞に１００μＬ加え、最終濃度をヒトＴＮＦ−αが１００ｐｇ／ｍＬ、結合タンパク質が１５０ｎＭ〜０．０００１ｎＭとなるようにする。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートする。生存率を定量するために、ウェルから１００μＬを除去し、１０μＬのＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１６４４８０７００１）を加える。アッセイ条件でプレートを３．５時間インキュベートする。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ１９０  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用し、プレートをＯＤ４２０〜６００ｎｍで測定する。
【０１５０】
本明細書の結合タンパク質は、高い親和性、遅い解離速度、および高い中和能力などの点で、有益な特性をもつことが予想される
【０１５１】
実施例４．６：治療
ＴＮＦ−α結合タンパク質による治療を必要とする患者は、自己免疫疾患などの免疫性および炎症性の要素を伴う病気、特に、クローン病、乾癬（尋常性乾癬を含む）、関節炎（関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、または若年性特発性関節炎を含む）、多発性硬化症、および強直性脊椎炎などの炎症に関連する病気を有し得る。従ってこの結合タンパク質をこれら疾患の治療に使用することができる。
【０１５２】
ＴＮＦ−α結合タンパク質は、皮下注入によって投与することができる。患者が関節リウマチ、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎を有している場合には、患者は、初期投与量として、１週間おきに４０ｍｇの投与を受けてもよく、治療目標を達成するのに必要な場合には、毎週４０ｍｇの投与を受けてもよい。患者が若年性特発性関節炎を有していて、かつ、体重が１５ｋｇから３０ｋｇ未満の場合には、この患者は１週間おきに２０ｍｇの投与を受けてもよく、体重が３０ｋｇ以上の場合には、１週間おきに４０ｍｇの投与を受けてもよい。患者がクローン病の場合には、この患者は、初回投与量として１６０ｍｇ（１日に４０ｍｇの注入を４回、または１日に４０ｍｇの注入を２回を２日連続して）、２週間後に８０ｍｇ、そのまた２週間後からは、維持のために１週間おきに４０ｍｇの投与を受け始めてもよい。患者が尋常性乾癬の場合には、この患者は、初回投与量として８０ｍｇ、初回投与の１週間後からは１週間おきに４０ｍｇの投与を受けてもよい。
【０１５３】
結合タンパク質は、使い捨ての充填済みペン（４０ｍｇ／０．８ｍＬ）、使い捨ての充填済みガラスシリンジ（４０ｍｇ／０．８ｍＬまたは２０ｍｇ／０．４ｍＬ）として供給され得る。
【０１５４】
参照による組み込み
本出願全体を通じて引用される、引用した全参考文献（文献、特許、特許出願、およびウェブサイトなど）の内容は、ここではっきりと参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それら文献中で引用されている参考文献も同様である。本明細書で開示されている実践は、別段の指定のない限り、免疫学、分子生物学および細胞生物学の、標準的な当該分野で良く知られている技術を使用する。
【０１５５】
均等物
本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、全ての点において、本明細書中に記載した発明を限定するものというよりはむしろ例示的なものであると見なされる。従って、本発明の範囲は、前述した説明ではなく、添付の請求項によって示され、かつ、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲に入る全ての変更は、本発明に包含されることが意図される。
【０１５６】
本出願は、２０１１年１０月２４日に出願の米国仮特許出願一連番号第６１／５５０，５８７号の優先権を主張し、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【配列表】
2014534218000001.app
【国際調査報告】
2014534218.tif 000239
2014534218.tif 000240
2014534218.tif 000241
2014534218.tif 000242
2014534218.tif 000243
2014534218.tif 000244