(57)【要約】サンプルを分析し、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも１つの化合物のレベルを決定し、サンプル中のレベルを対照レベルと比較することによって肝がんを診断するための方法が、本明細書中に開示される。サンプルの分析は、サンプルについてのプロフィールの決定を含み得る。開示される方法は、肝がんを有する患者と肝硬変を有する患者とを区別することにおいて有用である。
2014505254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験被験体からのサンプルを分析するための方法であって、該方法は、
ｉ）該試験被験体からの該サンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも１つの化合物のレベルを決定するステップ、ならびに
ｉｉ）ステップｉ）において決定された該少なくとも１つの化合物のレベルを少なくとも１つの対照レベルと比較するステップであって、該少なくとも１つの化合物のレベルは、該被験体が肝がんを有するかどうかの指標となるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記対照レベルは、健康な被験体からのサンプルから決定され、該対照レベルと比較して低減したレベルは、肝がんの指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対照レベルは、肝がん患者からのサンプルから決定され、該対照レベルと比較して同様であるレベルは、肝がんの指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも２つの化合物のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも３つの化合物のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートのレベルを決定するステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの化合物のレベルを用いて、前記試験被験体からの前記サンプルについてのプロフィールを決定するステップ；および該試験被験体からの該サンプルの該プロフィールを、健康な被験体からのサンプルから決定された少なくとも１つの対照レベルを用いて決定された対照プロフィールと比較するステップを含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ａ）クレアチニン、クレアチン、カルニチン、およびアセトンからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる化合物のレベルを決定するステップ；ならびに
ｂ）ステップａ）において決定された該少なくとも１つの化合物のレベルを健康な被験体からのサンプルから決定された対照レベルと比較するステップであって、
ｉ）クレアチニンおよび／もしくはアセトンのレベルの低減；および／または
ｉｉ）クレアチンおよび／もしくはカルニチンのレベルの増大
は、肝がんの指標となる、ステップ
をさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルは哺乳動物から得られる、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物はヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、選択された、血液、血漿、血清、脳脊髄液、胆汁酸、唾液、滑液、胸膜液、囲心腔液、腹膜液、排泄物、鼻液（ｎａｓａｌ  ｆｌｕｉｄ）、眼液（ｏｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、細胞内液、細胞間液、リンパ液、および尿である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルは尿である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記肝がんは肝細胞癌である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
化合物のレベルを決定するステップは、前記サンプルを、該化合物に特異的に結合する抗体と接触させるステップを含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
化合物のレベルを決定するステップは、前記サンプルにおいて比色アッセイまたは分光光度アッセイを実施するステップを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、肝がんを有する患者と肝硬変を有する患者とを区別することができる、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
肝がんを診断することにおいて使用するためのキットであって、該キットは、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される化合物のレベルを決定するための、少なくとも１つの試薬を含む、キット。
【請求項１８】
グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される化合物のレベルを決定するための、少なくとも２つの試薬を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される化合物のレベルを決定するための、少なくとも３つの試薬を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートのレベルを決定するための試薬を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの化合物のレベルを決定するための前記試薬は、前記アッセイにおいて、該少なくとも１つの化合物のレベルに依存して色の変化をもたらす、請求項１７〜２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの化合物のレベルを決定するための前記試薬は、該少なくとも１つの化合物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、肝がんに罹患した被験体を同定するための診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝がんは、肝臓に由来するがんであると考えられる原発性肝がんの形態、またはがんが、肝臓において生じ、別の器官に移動する続発性肝がんの形態を取り得る。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、原発性肝がんの最も一般的な形態であり、世界中で３番目に一般的ながんの死因である１，２，３。上記疾患は、開発途上世界、および特にサハラ砂漠以南のアフリカ諸国およびアジアにおいて特に流行しており４、そこでは、数カ国が、１００，０００人につき２０症例を越える高い発生率を示す。がんが完全に除去されることができない場合、上記疾患は、通常、３ヶ月〜６ヶ月以内に致死的である５。ＨＣＣの症状は、非常に重症であり得、黄疸、腹水による膨満（ｂｌｏａｔｉｎｇ）、血餅異常による容易な挫傷、食欲不振、故意でない体重損失、特に右上部における腹部の疼痛、吐き気、嘔吐、および疲労を含み得る６。
【０００３】
現在の診断の方法としては、通常、生まれてすぐには検出不可能である血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（胎児の糖タンパク質）を用いてＨＣＣについてスクリーニングすることが挙げられる。ほとんどのＨＣＣは、ＡＦＰを分泌するが、ＡＦＰは、７０％未満の乏しい感度および特異度を有する７，８，９，１０。さらに、血清のＡＦＰ試験はひどく高価であるので、アフリカおよびアジアの地域において利用不可能であり得る。多くの他の血清マーカー（デス−γ−カルボキシプロトロンビン、抗−ｐ５３、γ−グルタミル−トランスペプチダーゼ、およびイソフェリチンが挙げられる）も、ＨＣＣについてスクリーニングすることにおいて使用されるが、ＡＦＰのように、低い度合いの感度および特異度を示す１１，１２。
【０００４】
ＨＣＣについての血清マーカーの感度および特異度の問題は、現在の方法を用いて、肝硬変に罹患した患者をＨＣＣに罹患した患者から区別することが難しい場合があるという事実によってさらに強調される。ＨＣＣの早期診断は、２ｃｍ以下の病変が切除または移植により治療できるので非常に重要である。従って、当該分野において、疾患の早期ステージにおいてでさえ、ＨＣＣを有する患者と、肝硬変を有する患者と、健康な対照とを区別するために十分に高い感度および特異度のレベルを有する試験の開発の真の必要性が存在する。
【０００５】
血清マーカーの低い感度および特異度に関与する問題の他に、上記疾患が最も流行している地域は、倫理的考慮を生じる。多くのアフリカおよびアジアの国々において、宗教信仰は、疾患についてスクリーニングすることにおける侵襲性技術の使用を禁止する。開発途上世界における患者は、健康診断所から何日もの行程に住んでいる場合があるので、試験からの情報が、試験が行われた後すぐに利用可能であることも重要である。
【０００６】
ＨＣＣは、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、および生検を用いて、より正確に診断され得る１３。しかし、これらの技術に関与する費用および時間、ならびに生検の侵襲性性質は、これらの試験が、上記疾患が最も高い流行を示している開発途上の地域に適していないことを意味する。
【０００７】
従って、特異度および感度が高く、ならびに先進国および開発途上世界の両方において使用するために実用的であり、利用可能であるＨＣＣを診断する方法の開発の必要性が存在する。感度および特異度が高い試験は、早期ステージにおける上記疾患の検出を可能にし、ＨＣＣ患者についての予後において重要な改善をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
従って、本発明は、試験被験体からのサンプルを分析するための方法を提供し、上記方法は、
ｉ）試験被験体からのサンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート（ｈｉｐｐｕｒａｔｅ）、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも１つの化合物のレベルを決定するステップ、ならびに
ｉｉ）ステップｉ）において決定された少なくとも１つの化合物のレベルを少なくとも１つの対照レベルと比較するステップであって、少なくとも１つの化合物のレベルは、被験体が肝がんを有するかどうかの指標となるステップ
を含む。
【０００９】
驚くことに、本発明者らは、健康な被験体から取得されたサンプルと比較して、肝がんを有する被験体から取得されたサンプルにおいて、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートのレベルが有意により低いことを見出した。そのような化合物のレベルが、肝がんを診断するための方法の一部として測定されたことは以前に全くない。これらの特定の化合物のレベルの測定は、肝がんについての、感度および特異度が高いスクリーニングを可能にし、そして上記化合物が、広範囲の単純なアッセイを用いて測定され得るという事実は、上記疾患が最も流行している開発途上世界において、肝がんについての診断を助ける。
【００１０】
本発明の方法は、ｉ）試験被験体からのサンプル中のグリシンのレベルを決定するステップ；およびステップｉ）において決定されたグリシンのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１１】
本発明の方法は、ｉ）試験被験体からのサンプル中のトリメチルアミン−Ｎ−オキシドのレベルを決定するステップ；およびステップｉ）において決定されたトリメチルアミン−Ｎ−オキシドのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１２】
本発明の方法は、ｉ）試験被験体からのサンプル中のヒップレートのレベルを決定するステップ；およびステップｉ）において決定されたヒップレートのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１３】
本発明の方法は、ｉ）試験被験体からのサンプル中のシトレートのレベルを決定するステップ；およびステップｉ）において決定されたシトレートのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１４】
本発明の方法は、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも２つの化合物のレベルを決定するステップ；ならびに少なくとも２つの化合物のレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。１つの実施形態において、上記方法は、グリシンおよびトリメチルアミン−Ｎ−オキシドのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。別の実施形態において、上記方法は、グリシンおよびヒップレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。別の実施形態において、上記方法は、グリシンおよびシトレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。別の実施形態において、上記方法は、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドおよびヒップレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。別の実施形態において、上記方法は、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドおよびシトレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。別の実施形態において、上記方法は、ヒップレートおよびシトレートのレベルを決定するステップを含み得る。
【００１５】
本発明の方法は、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される少なくとも３つの化合物のレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。１つの実施形態において、上記方法は、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、およびヒップレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。１つの実施形態において、上記方法は、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、およびシトレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。１つの実施形態において、上記方法は、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。１つの実施形態において、上記方法は、グリシン、ヒップレート、およびシトレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１６】
本発明の方法は、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートのレベルを決定するステップ、ならびにそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１７】
必要に応じて、本発明の方法は、１つ以上のさらなるマーカーのレベルを決定するステップ、およびそのレベルを対照レベルと比較するステップを含み得る。
【００１８】
上で議論された方法のうちの任意のものにおける対照レベルは、健康な被験体からのサンプルから決定され得る。この実施形態に従って、上記対照レベルと比較して低減している少なくとも１つの化合物のレベルは、肝がんの指標となる。
【００１９】
あるいは、対照レベルは、肝がんを有する被験体からのサンプルから決定され得る。この実施形態に従って、上記対照レベルと比較して同様である少なくとも１つの化合物のレベルは、肝がんの指標となる。
【００２０】
対照被験体からのサンプルは、試験被験体からのサンプルと並行してアッセイされ得るが、経験的データに基づいて絶対対照レベルを使用することが、より便利であり得る。絶対対照レベルは、閾値（例えば、少なくとも１つの化合物の閾値レベルまたは閾値プロフィールレベル）を提供する。少なくとも１つの化合物のレベル、または試験被験体からのサンプルのプロフィールレベルは、閾値絶対対照レベルと比較され得、ここで絶対対照値よりも高いか、またはより低いいずれかのレベルは、肝がんの指標となる。
【００２１】
本発明の方法は、２つ以上の異なる時点において、同じ被験体からのサンプルを試験するために使用され得る。同じ被験体において、時間の経過とともに複数の試験を実施することは、疾患の重症度が測定されることを可能にし、例えば、疾患が悪化しているかどうかを観測する。あるいは、複数の試験を行うことは、薬物の効力が時間の経過とともにモニタリングされることを可能にし得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ａ．  ＨＣＣを有する患者；Ｂ．  肝硬変を有する患者；およびＣ．  健康な対照からのメジアン１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２Ａは、ＨＣＣ被験体  対  健康な対照の主成分分析（ＰＣＡ）スコアのプロット（ｓｃｏｒｅｓ  ｐｌｏｔｓ）である。図２Ｂは、ＨＣＣ被験体  対  肝硬変の被験体の主成分分析（ＰＣＡ）スコアのプロットである。図２Ｃは、健康な被験体  対  ＨＣＣ被験体の直交シグナル補正（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）−部分最小二乗法判別分析（ＯＳＣ−ＰＬＳ−ＤＡ）である。図２Ｄは、ＨＣＣ被験体  対  肝硬変の被験体の直交シグナル補正−部分最小二乗法判別分析（ＯＳＣ−ＰＬＳ−ＤＡ）である。
【図３−１】図３は、健康な被験体、肝硬変の被験体、およびＨＣＣ被験体からのサンプル中の、Ａ．  クレアチニン；Ｂ．  シトレート；Ｃ．  カルニチン；Ｄ．  クレアチン；Ｅ．  ヒップレート；Ｆ．  グリシン；Ｇ．  トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのメジアン積分値である。
【図３−２】図３は、健康な被験体、肝硬変の被験体、およびＨＣＣ被験体からのサンプル中の、Ａ．  クレアチニン；Ｂ．  シトレート；Ｃ．  カルニチン；Ｄ．  クレアチン；Ｅ．  ヒップレート；Ｆ．  グリシン；Ｇ．  トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのメジアン積分値である。
【図３−３】図３は、健康な被験体、肝硬変の被験体、およびＨＣＣ被験体からのサンプル中の、Ａ．  クレアチニン；Ｂ．  シトレート；Ｃ．  カルニチン；Ｄ．  クレアチン；Ｅ．  ヒップレート；Ｆ．  グリシン；Ｇ．  トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのメジアン積分値である。
【図３−４】図３は、健康な被験体、肝硬変の被験体、およびＨＣＣ被験体からのサンプル中の、Ａ．  クレアチニン；Ｂ．  シトレート；Ｃ．  カルニチン；Ｄ．  クレアチン；Ｅ．  ヒップレート；Ｆ．  グリシン；Ｇ．  トリメチルアミン−Ｎ−オキシドのメジアン積分値である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
グリシンとは、式ＮＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。
【００２４】
トリメチルアミン−Ｎ−オキシドとは、式（ＣＨ３）３ＮＯを有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。
【００２５】
本明細書中で、ヒップレートとは、式
【００２６】
【化１】
2014505254.tif 000003
を有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。
【００２７】
本明細書中で、シトレートとは、式
【００２８】
【化２】
2014505254.tif 000004
を有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。
【００２９】
上の化合物のうちの任意の１つがイオン性である場合、対イオンは、任意のイオンであり得る。好ましくは、上の化合物は、中性形態である。
【００３０】
肝がん
本発明の方法によって検出され得る肝がんは、任意の肝臓がんを含み得る。肝がんは、原発性肝がん（肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層板肝細胞癌（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）（または血管肉腫（ｈａｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、および胚芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。あるいは、肝がんは、肝臓から他の器官（肺、腎臓、乳房、胃および結腸、皮膚（例えば、黒色腫）、前立腺、膵臓、ならびに頸部が挙げられるが、これらに限定されない）に転移したがんを含む続発性肝がんを含み得る。
【００３１】
被験体
被験体は、任意の動物（例えば、脊椎動物または非脊椎動物）であり得る。脊椎動物は、哺乳動物であり得る。脊椎動物の哺乳動物は、ヒトであり得る。哺乳動物の例としては、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、霊長目などが挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、霊長目であり得る。好ましくは、被験体はヒトである。
【００３２】
試験被験体は、診断が実施される被験体である。試験被験体は、肝がんのリスクがあると考えられる被験体であり得る。例えば、試験被験体は、肝がんの症状（例えば、黄疸、腹水による膨満、血餅異常による容易な挫傷、食欲不振、故意でない体重損失、特に右上部における腹部の疼痛、吐き気、嘔吐、および疲労））を示し得る。あるいは、試験被験体は、肝がんに対して公知の繋がりを有する遺伝マーカーを示すので、肝がんのリスクがあると考えられ得る。あるいは、試験被験体は、試験で血清α−フェトプロテインに対して陽性と出ることから、肝がんのリスクがあると考えられ得る。
【００３３】
本発明の方法は、非ヒト動物である被験体からのサンプルを分析するために使用され得、その動物は、肝がんのための薬物のスクリーニングのために使用される。少なくとも１つの化合物のレベルに及ぼされる潜在的な薬物の作用は、潜在的な薬物が有効であるかどうかの指標となり得る。
【００３４】
対照被験体は、それに対して試験被験体が比較される被験体である。対照被験体は、肝がんを有する被験体であり得、その場合、対照プロフィールのプロフィールと同様のプロフィールを示す試験被験体は、肝がんを有すると診断される。あるいは、対照被験体は、健康な被験体であり得、その場合、対照被験体のプロフィールと異なるプロフィールを示す試験被験体は、肝がんを有すると診断される。好ましくは、対照被験体は、健康な被験体である。
【００３５】
健康な被験体は、肝がんを有さない任意の被験体であり得る。好ましい実施形態において、本発明の方法は、肝がんを有する患者と肝硬変を有する患者とを区別することができる。少なくとも１つの化合物のレベルを考慮することにより被験体のプロフィールを決定することによって、本発明の方法は、非常に感度および特異度が高い試験を可能にし、上記試験は、肝がんに罹患した患者と肝硬変に罹患した患者とを差異化することができる。
【００３６】
サンプル
本発明の方法において試験されたサンプルは、被験体から得られた任意の生物学的標本であり得る。サンプルは、組織サンプルであり得る。サンプルは、最小限に侵襲性または非侵襲性に得られ得、例えば、サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、尿、大便、涙、任意の他の体液、組織サンプル（例えば、生検）、およびその細胞抽出物（例えば、赤血球細胞抽出物）であり得るか、またはそれらから得られ得る。当業者は、サンプル（例えば、血清サンプル）が化合物のレベルの分析前に希釈され得ることを認識する。
【００３７】
好ましくは、サンプルは、尿サンプルである。本発明の方法における尿サンプルの使用は、被験体からサンプルを得ることが完全に非侵襲性であるので、特に有益である。これは、被験体が、肝がんについて試験されるために侵襲性手順を受けることを、例えば、倫理的理由または宗教的理由のために望まない場合がある場合に有用である。さらに、尿サンプルの使用は、簡単な手法でサンプルが得られることを意味し、いくつかの実施形態において、上に記載された本発明の方法または下に記載されるキットは、自己診断（ｓｅｌｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ）を実施するために使用され得る。
【００３８】
さらなる化合物
本発明の方法は、サンプル中の、血清α−フェトプロテイン、クレアチニン、クレアチン、カルニチン、アセトン、ラクテート、グルタメート、ロイシン、アラニン、コリン、ホスホリルエタノールアミン、トリグリセリド、グルコース、グリコーゲン、アセテート、Ｎ−アセチル糖タンパク質、ピルベート、グルタミン、α−ケトグルタレート、グリセロール、チロシン、１−メチルヒスチジン、フェニルアラニン、低密度リポタンパク質、イソロイシン、バリン、およびアセトアセテート、またはそれらの任意の天然に存在するバリアントからなる群から選択される少なくとも１つの化合物のレベルを決定するステップ、ならびに少なくとも１つの化合物のレベルを少なくとも１つの対照レベルと比較するステップをさらに含み得る。
【００３９】
本発明の方法の一部としてさらなる化合物を測定することは、生成され得るサンプルのプロフィールがより正確となることを可能にし、従って、本発明の感度および特異度を増大させる。試験される化合物のレベルが上がれば上がるほど、肝がんを有する被験体のプロフィールに似たプロフィールを示すけれども肝がんに罹患していない被験体（例えば、肝硬変患者）を区別するための上記方法の能力が、より高くなる。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明の方法は、クレアチニンのレベルを決定するステップ、およびクレアチニンのレベルを対照レベルと比較するステップを含み、上記対照レベルは、ａ）健康な被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して低減したレベルは、肝がんの指標となり、および／または上記対照レベルは、ｂ）肝がんを有する被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して同様であるレベルは、肝がんの指標となる。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明の方法は、クレアチンのレベルを決定するステップ、およびクレアチンのレベルを対照レベルと比較するステップを含み、上記対照レベルは、ａ）健康な被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して増大したレベルは、肝がんの指標となり、および／または上記対照レベルは、ｂ）肝がんを有する被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して同様であるレベルは、肝がんの指標となる。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明の方法は、カルニチンのレベルを決定するステップ、およびカルニチンのレベルを対照レベルと比較するステップを含み、上記対照レベルは、ａ）健康な被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して増大したレベルは、肝がんの指標となり、および／または上記対照レベルは、ｂ）肝がんを有する被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して同様であるレベルは、肝がんの指標となる。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、試験被験体からのサンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、シトレート、クレアチニン、クレアチン、およびカルニチンのレベルを決定するステップ、ならびにそれらの化合物のレベルを対照レベルと比較するステップを含み、上記対照レベルは、健康な被験体からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して低減したレベルは、肝がんの指標となる。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、試験被験体からのサンプル中のグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、シトレート、クレアチニン、クレアチン、およびカルニチンのレベルを決定するステップ、ならびにそれらの化合物のレベルを対照レベルと比較するステップを含み、上記対照レベルは、肝がん患者からのサンプルから決定され、上記対照レベルと比較して同様であるレベルは、肝がんの指標となる。
【００４５】
本明細書中で、クレアチニンとは、式
【００４６】
【化３】
2014505254.tif 000005
を有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。
【００４７】
本明細書中で、クレアチンとは、式
【００４８】
【化４】
2014505254.tif 000006
を有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。
【００４９】
本明細書中で、カルニチンとは、式
【００５０】
【化５】
2014505254.tif 000007
を有する化合物またはその任意の天然に存在するバリアントを意味する。１つの実施形態において、カルニチンは、Ｌ−カルニチンエナンチオマーである。
【００５１】
上の化合物のうちの任意の１つがイオン性である場合、対イオンは、任意のイオンであり得る。好ましくは、上の化合物は、中性形態である。
【００５２】
化合物のレベルを決定するステップ
本明細書中で、化合物のレベルを決定するステップは、当該分野において公知である任意の定量方法または定性方法を用いて達成され得、それにより、試験サンプルからの少なくとも１つの化合物のレベルは、対照サンプルからの少なくとも１つの化合物のレベルと比較され得る。
【００５３】
少なくとも１つのレベルの決定は、単一の方法、または方法の組み合わせを用いて達成され得る。
【００５４】
化合物のレベルの決定は、その化合物の濃度を決定するステップを含み得るか、または代替的に、相対尺度において、その化合物のレベルを決定するステップを含み得る。
【００５５】
少なくとも１つの化合物のレベルを決定するために使用され得る方法としては、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）１４、キャピラリー電気泳動、ならびに質量分析法と組み合わせたこれらの技術の各々、すなわち、液体クロマトグラフィー−質量分析法１５、ガスクロマトグラフィー−質量分析法１６、高速液体クロマトグラフィー−質量分析法、キャピラリー電気泳動−質量分析法１７が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５６】
少なくとも１つの化合物のレベルを決定するために使用され得る他の方法としては、熱分解質量分析法、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、近赤外分光法（Ｎｅａｒ−ＩＲ）、マイクロ波分光法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）１８、ラマン分光法、光散乱分析（ＬＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、電気化学分析、蛍光分析、放射化学分析、ネフェロメトリー、タービジメトリー（ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｙ）、電気抵抗分析、流体−固体相互作用ベースの検出（ｆｌｕｉｄ−ｓｏｌｉｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、分光光度法、比色定量、光反射、燃焼熱分析、免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、および当該分野において公知である他の方法が挙げられ得る。
【００５７】
１つの実施形態において、少なくとも１つの化合物のレベルの決定は、分光光度アッセイを用いて達成される。分光光度アッセイは、物質を含む溶液の、特定の波長の光を吸収する能力を測定することによって、特定の化合物の量が決定され得る任意のアッセイであり得る。分光光度アッセイは、サンプル中に存在する化合物の直接検出を含み得、ここで上記化合物は、存在する化合物のレベルに依存して、公知の波長において異なる吸光度を提供する。あるいは、上記アッセイは、特定の化合物の存在下での吸光度の変化を受ける試薬の添加を含み得る。吸光度のこの変化は、目的の特定の化合物のレベルを決定するために測定され得る。
【００５８】
比色アッセイ
１つの実施形態において、少なくとも１つの化合物のレベルの決定は、比色アッセイを用いて達成され得る。比色アッセイは、色の変化を測定すること、または色の変化を観測することによって化合物のレベルが決定され得る任意のアッセイであり得る。比色アッセイは、物質の吸光度が測定される波長が電磁スペクトルの可視領域内である分光光度アッセイであり得る。比色アッセイは、色チャートとサンプルとの色の比較を含み得る。比色アッセイは、特定の化合物の存在下での測定可能な色の変化を受ける試薬の添加を含み得る。
【００５９】
少なくとも１つの化合物の各々のレベルの決定は、別個の比色アッセイを用いて決定され得る。任意の比色アッセイは、化合物のレベルの決定のために使用され得、上記アッセイは、サンプル中の化合物のレベルのみに依存し、かつ任意の他の変数には重要な程度まで依存しない色の変化をもたらす。
【００６０】
当該分野において公知である任意のアッセイは、サンプル中の少なくとも１つの化合物のレベルを検出するために使用され得る。使用され得るアッセイの例は、
シトレートアッセイ（例えば、ＡｂＣａｍ（製品コード−ａｂ８３３９６）から入手可能なもの）（それは、オキサロアセテートを介してシトレートをピルベートに変換することを含む。ピルベートは、その後、無色のプローブを、容易に検出可能な強く着色した（ラムダマックス（Ｌａｍｂｄａ  ｍａｘ）＝５７０ｎｍ）蛍光の（Ｅｘ／Ｅｍ，５３５／５８７ｎｍ）生成物に変換する。）
グリシンアッセイ（それは、クロラミンＴによるグリシンのホルムアルデヒドへの分解を含む。ホルムアルデヒドは次に、アセチルアセトンおよびアンモニアが反応物であるハンチ反応によって、３，５−ジアセチル−１，４−ジヒドロルチジンに変換され得る。低い範囲（０．１μｇ〜３μｇのグリシンのレベル）におけるこの反応生成物は、蛍光光度法により測定され得るのに対して、より高い範囲においては、比色分析が使用され得る１９。）
ＴＭＡＯアッセイ（アセテートバッファー（０．８Ｍ、ｐＨ４．５）中の硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）とエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム（０．１Ｍ）との等モルの混合物によるＴＭＡへの還元後、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてピクレートの使用を含む２０，２１。）
である。
【００６１】
ヒトまたは機械が読み取り可能な細片（ｓｔｒｉｐ）
少なくとも１つの化合物のレベルは、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片の使用を通して決定され得、上記少なくとも１つの化合物のレベルは、上記ヒトまたは機械が読み取り可能な細片における変化を測定することによって決定され得る。ヒトまたは機械が読み取り可能な細片における変化は、上記ヒトまたは機械が読み取り可能な細片の、中または上に存在する試薬と上記少なくとも１つの化合物との間の化学反応を介して起こるヒトまたは機械が読み取り可能な細片における変化であり得る。例えば、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片は、少なくとも１つの化合物のレベルを決定するために、少なくとも１つの比色アッセイを実施するための試薬を含み得る。
【００６２】
ヒトまたは機械が読み取り可能な細片は、複数の領域を含み得、別個の化学反応が各領域において行われる。各領域における化学反応は、少なくとも１つの化合物のうちの１つを検出するために使用され得る。各領域に存在する試薬は、サンプルと接触すると、サンプル中に存在する化合物との化学反応を受けることができる。少なくとも１つの化合物の各々のレベルは次に、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片の各領域において起こった変化（例えば、色の変化）の度合いに従って決定され得る。
【００６３】
１つの実施形態において、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片における変化が色の変化である場合、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片は、ヒトによって読み取られ得、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片を、様々な度合いの色を示し、かつ様々な度合いの色が特定のレベルの化合物に帰するチャートと比較する。
【００６４】
別の実施形態において、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片は、特定の波長において溶液の吸光度を測定することによって、または任意の他の手段によって、各領域中のヒトまたは機械が読み取り可能な細片において起こった変化（例えば、色の変化）の度合いを計算する機械によって読み取られ得る。
【００６５】
ヒトまたは機械が読み取り可能な細片の各領域に提供されるアッセイは、ヒトまたは機械が読み取り可能な細片の領域に起こる変化に関与する任意のアッセイであり得、その変化は、少なくとも１つの化合物のレベルのみに依存する。
【００６６】
結合アッセイ
少なくとも１つの化合物のレベルは、結合アッセイを含む方法によって決定され得る。結合アッセイは、少なくとも１つの化合物のうちの１つが、１つ以上の他の分子によって特異的に結合される任意のアッセイであり得、１つ以上の他の分子は、その後検出され得る。１つの実施形態において、１つ以上の他の分子は、１つ以上のタンパク質であり得る。少なくとも１つの化合物のうちの１つに特異的に結合するタンパク質は、１つ以上のタンパク質に特異的な抗体を用いて、その後検出され得る。
【００６７】
１つの実施形態において、１つ以上の他の分子は、少なくとも１つの化合物のうちの１つに特異的に結合する抗体であり得る。
【００６８】
抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらのフラグメントであり得る。
【００６９】
少なくとも１つの化合物のレベルは、免疫アッセイまたは免疫組織化学アッセイを用いて決定され得る。本発明の方法において使用することに適した免疫組織化学アッセイの例としては、免疫蛍光アッセイ、例えば、直接蛍光抗体アッセイ、間接蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイ、抗補体免疫蛍光アッセイ、およびアビジン−ビオチン免疫蛍光アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。他のタイプの免疫組織化学アッセイとしては、免疫ペルオキシダーゼアッセイが挙げられる。
【００７０】
少なくとも１つの化合物のレベルは、上記化合物に特異的に結合する抗体を用いて決定され得、別様に当該分野において公知である比色分析手段または放射分析手段を通して上記抗体は検出され得る。１つの実施形態において、少なくとも１つの化合物のレベルは、サンドイッチアッセイを用いて決定され得、それにより少なくとも１つの化合物のうちの１つは、１つのタンパク質によって特異的に結合され、第２のタンパク質によって特異的に検出される。
【００７１】
化合物のレベルは、上記化合物に特異的に結合することが知られる結合タンパク質を提供することによって決定され得る。上記結合タンパク質は、その後、上記結合タンパク質に特異的な抗体によって検出され得る。
【００７２】
サンプルのプロフィールを作製すること（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）
サンプルのプロフィールは、少なくとも１つの化合物のレベルを分析することによって決定され得る。サンプルのプロフィールを作製することにより、単一の代謝産物ではなく、代謝産物比の組み合わせ（「代謝プロフィール」）によって特徴付けられるべき被験体の群間に違いを与える。
【００７３】
サンプルのプロフィールは、少なくとも１つの化合物のレベルを基準として、被験体が肝がんを有するかどうかを決定するために使用され得る。サンプルのプロフィールは、試験被験体からのサンプル中の化合物のレベルおよび対照被験体からのサンプル中の化合物のレベルの全体比較を可能にする。
【００７４】
プロフィールを作製することは、外的化合物（例えば、尿のクレアチニン）に対する少なくとも１つの化合物のレベルの考慮を含み得る正規化を含み得る。これは、例えば、健康な被験体と比較して肝がんを有する被験体において変わらない他の化合物のレベルを比較することによって、サンプルの希釈に依存してレベルを正規化し得る。あるいは、プロフィールを作製することは、少なくとも１つの化合物の比を計算することを含み得る。プロフィールを作製することは、他のものと比較して、少なくとも１つの化合物のうちの特定の化合物により重点を置き得る。
【００７５】
キット
本発明は、肝がんを診断することにおいて使用するためのキットを提供し、上記キットは、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される化合物のレベルを決定するための、少なくとも１つの試薬を含む。
【００７６】
本発明のキットは、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される化合物のレベルを決定するための、少なくとも２つの試薬を含み得る。
【００７７】
本発明のキットは、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートからなる群から選択される化合物のレベルを決定するための、少なくとも３つの試薬を含み得る。
【００７８】
本発明のキットは、グリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒップレート、およびシトレートのレベルを決定するための試薬を含み得る。
【００７９】
少なくとも１つの化合物のレベルを決定するための、本発明のキットにおいて使用される試薬は、アッセイにおいて、少なくとも１つの化合物のレベルに依存して、色の変化をもたらし得る。
【００８０】
少なくとも１つの化合物のレベルを決定するための、本発明のキットにおいて使用される試薬は、少なくとも１つの化合物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含み得る。
【００８１】
本発明のキットは、使用のための指示をさらに含み得る。
【００８２】
本発明のキットは、試験細片の上に置かれた少なくとも１つの化合物のレベルを決定するための試薬を含み得る。試験細片の異なる領域は、複数の化合物のレベルを決定するための試薬を含み得、従って、異なるアッセイは、試験細片の異なる領域において実施され得る。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１つの化合物のレベルを決定するための試薬を含む試験細片、および比較チャートを含み得る。比較チャートは、様々な度合いの色を示し得、その色に対して試験細片に存在する色が測定され得る。比較チャートは、試験細片に存在し得る様々な度合いの色が特定のレベルの化合物に帰するとされ得る。
【実施例】
【００８４】
実施例１：患者の選択
エジプト人の尿および血清のサンプルをＮａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｅｎｏｕｆｉｙａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｂｅｅｎ  Ｅｌ  Ｋｏｍ，Ｅｇｙｐｔに通う患者から収集した。倫理的承認は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｅｎｏｕｆｉｙａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＨａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎにおける研究倫理委員会によって与えられた。
【００８５】
合計５８人の患者を研究のために起用した：（早期の動脈の増強、および門脈相における迅速なウォッシュアウトを示す２つの撮像技術によって、または血清ＡＦＰ＞４００ｎｇｍＬ−１とともに１つの撮像によって診断された）ＨＣＣを有する１８人の患者；臨床的または組織学的に認められた肝硬変疾患を有する２０人の患者；および２０人の健康なエジプト人の対照被験体。３つ全てのコホートからの１１サンプルを、主成分分析（ＰＣＡ）、多変量解析技術に従って、「アウトライアー」と同定した。これは、多変量データに不正に影響を与える異常なスペクトルの発見の指標となり、これらのサンプルをさらなる分析から除外した。これによりＨＣＣ群において１６サンプル、肝硬変群において１４、および健康な対照群において１７が残った。ＨＣＣ群のメジアン年齢は、肝硬変群よりも有意に高くなかった（ｐ＝０．３７）が、健康な対照よりも有意に高かった（ｐ＝０．０１）。健康な対照群（９／１７）よりもＨＣＣ群（１５／１６）において有意に男性が多かった（ｐ＝０．０２）が、肝硬変群（１１／１４）は、それには匹敵しなかった（ｐ＝０．３２）。ＨＣＣステージの病期分類は、Ｏｋｕｄａ病期分類システム（ｓｔａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に従ったものであり、腫瘍の体積および肝代償不全に基づいて、ステージＩは、早期の疾患を表し、ステージＩＩＩは、進行した疾患を表す（２８）。ＨＣＣ被験体の１人は、ステージＩの疾患を有し、１０人はステージＩＩ、および５人はステージＩＩＩを有した。ＨＣＣを有する患者の大部分および肝硬変を有する患者の５０％は、ＨＣＶ抗体陽性であった：それぞれ、１１／１６（６９％）、および７／１４（５０％）。ＨＣＣまたは肝硬変を有する残りの患者は、多様な病因を有した。全ての健康な対照は、エジプトの生まれであり、肝臓疾患の病歴を有さなかった。
【００８６】
実施例２：尿サンプルの収集
無作為の５ｍＬの尿サンプルを、エジプトにおいて、透明のガラスチューブの中に収集し、収集後、Ａ．Ｉ．Ｇ，Ｍ．Ｍ．Ｅ．Ｃ、およびＳ．Ｄ．Ｔ−ＲによるＩｍｐｅｒｉａｌへのドライアイス上での航空輸送まで−８０℃にて２時間〜４時間保存した。サンプルをロンドンにおいて解凍させ、標準的な方法に従って調製した２２：４００μＬの尿を２００μＬのバッファー溶液（０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）と混合し、６０μＬの３−トリメチルシリル−（２，２，３，３−２Ｈ４）−１−プロピオネート（ＴＳＰ）／Ｄ２Ｏ溶液（ＴＳＰの最終濃度＝１ｍＭ）を加えた。ＴＳＰは、内部化学シフトの参照として役立ち（δ  ０．００ｐｐｍ）、Ｄ２Ｏは、磁場ロックを提供した。緩衝化尿サンプルを１０分間静置させ、次に１３，０００ｇで１０分間、遠心分離した。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）分光法のために、５５０μＬの上清を５ｍｍの直径のガラスＮＭＲチューブ（Ｗｉｌｍａｄ  ＬａｂＧｌａｓｓＴＭ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）の中に移した。サンプルは、データ獲得まで最高４時間までＮＭＲ自動分析器におけるサンプル列（ｑｕｅｕｅ）の中に残った。
【００８７】
実施例３：血清の実験室試験
方法
血清ＡＦＰ、クレアチニン、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、およびアルブミンを、エジプトにおいて、尿サンプルの収集時にＣｏｂａｓ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００−Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。
【００８８】
結果
研究被験体の血清ＡＦＰ、クレアチニン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、およびアルブミンについてのメジアン（範囲）値の概要を表１に示す。血清ＡＦＰレベルを肝硬変群およびＨＣＣ群においてのみ測定した。メジアン血清ＡＦＰは、ＨＣＣ患者において有意により高かった（７４５ＩＵ  ｍＬ−１対７７ＩＵ  ｍＬ−１、ｐ＜０．００１）が、肝硬変群における最も低い血清ＡＦＰは、２０ＩＵ  ｍＬ−１であり、２０ＩＵ  ｍＬ−１のカットオフを用いると、全ての肝硬変患者は、血清ＡＦＰレベルに基づいて誤ってＨＣＣと分類されてしまう。メジアン血清クレアチニンは、対照と比較して、ＨＣＣ群において有意により高かった（１０６ｍｍｏｌ  Ｌ−１対６２ｍｍｏｌ  Ｌ−１、ｐ＜０．００１）が、これは、肝硬変の被験体に対して、有意に異ならなかった（１０６ｍｍｏｌ  Ｌ−１対１５０ｍｍｏｌ  Ｌ−１、ｐ＝０．１６）。血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびビリルビンのレベルは、健康な対照と比較して、ＨＣＣ群において全てが有意により高かったが、肝硬変の被験体は、それには匹敵しなかった。血清アルブミンは、健康な対照と比較して、ＨＣＣ群において有意により低かったが、肝硬変の被験体は、それには匹敵しなかった。
【００８９】
表１
【００９０】
【表１】
2014505254.tif 000008
＊２つのサンプルは、血清クレアチニンレベル測定をされなかった。
記号説明：ａＨＣＣ  対  健康な対照；ｂＨＣＣ  対  肝硬変。
【００９１】
実施例４：１Ｈ  ＮＭＲ分光法のスペクトル獲得および加工
サンプルを、無作為の、群に分けられていない順序で行った。１Ｈ  ＭＲスペクトルを、水プリサチュレーションした状態でパルス収集順序（ＪＥＯＬ  ５００ＭＨｚ  Ｅｃｌｉｐｓｅ＋  ＮＭＲ分光計）を用いて得た。１６のデータ収集物を合計（ｓｕｍｍａｔｅ）した。１８．７ｓの合計繰返し時間を用いて９０°のパルス角度を使用し、その結果、完全に解きほぐした（ｆｕｌｌｙ−ｒｅｌａｘｅｄ）データを得た。獲得時間は、８．７ｓであった。データを６４Ｋポイントに収集した。ＭＲスペクトルを、ＫｎｏｗＩｔＡｌｌＴＭ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ７．８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ）を用いて加工した。自由誘導減衰を２の倍数でゼロフィリング（ｚｅｒｏ−ｆｉｌｌｅｄ）し、０．３Ｈｚのラインブロードニングファクター（ｌｉｎｅ−ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）を有する指数窓関数を掛け、その後フーリエ変換を行った。全てのＭＲスペクトルの位相を等しくし（ｐｈａｓｅｄ）、ベースライン補正を適用した。全てのスペクトルは、ＴＳＰを基準とし（δ  ０．００ｐｐｍ）、メチル−クレアチニンのピークをδ  ３．０５ｐｐｍに合わせた。ＭＲスペクトル共鳴を、文献に従って割り当てた２３，２４，２５。ＭＲスペクトルの分析は、溶媒内のプロトンの交換に起因する、残留の水のシグナル、および尿素のシグナルの変動を除くために、δ  ４．５０ｐｐｍ〜δ  ６．４０ｐｐｍの領域を除いて、δ  ０．２０ｐｐｍ〜δ  １０．００ｐｐｍの範囲を含んだ。
【００９２】
実施例５：多変量統計的解析
方法
患者群間の違いを、単一の代謝産物ではなく、代謝産物比の組み合わせ（「代謝プロフィール」）を用いて特徴付けた。主成分分析（ＰＣＡ）、および部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）の形態での多変量統計的解析を、最初の分析のために使用した２６。ＰＣＡは、共分散構造の調査を通して複雑なデータの概観を提供する目的変数なし（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）の分析ツールであり、サンプルのアウトライアーおよびクラスター化を強調する。ＰＬＳ−ＤＡは、代謝産物データをクラスメンバーシップ（ｃｌａｓｓ  ｍｅｍｂｅｒｓｈｉｐ）に関連付ける目的変数あり（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）の分析方法であり、群間の分離をはっきりさせる。複雑なスペクトルを、０．０２＋／−０．０１ｐｐｍのより小さい領域または「バケット」に分け、ソフトウェアアプリケーションＫｎｏｗＩｔＡｌｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ７．８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ）における「インテリジェントバケッティング（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｂｕｃｋｅｔｉｎｇ）」アルゴリズムを用いて、特定の代謝産物のピークを表した。これらの領域を次に積分し、総スペクトル積分の和に対して正規化し、そのデータを、多変量解析の前に平均化した（ｍｅａｎ−ｃｅｎｔｒｅｄ）。パレート測定した（Ｐａｒｅｔｏ−ｓｃａｌｅｄ）データも使用したが、結果は、平均化したデータと同様であり、モデルスペクトルノイズの傾向があったので、平均化したデータのみを全ての分析のために使用した。クラスター化およびアウトライアーを強調するために、同じソフトウェアを用いてＰＣＡを実施した。データを次に、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ  ｖ４．０（Ｉｎｆｏｍｅｔｒｉｘ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、ＰＬＳ−ＤＡによって分析した。研究されている生理学的状態と直接関係しないスペクトルにおける変動を除くため、および個体間の変動の、可能性のある影響を最小限にするために、直交シグナル補正（ＯＳＣ）のデータフィルタリング技術を使用した２７，２８。各分析について、モデルを生み出すために、１つのＯＳＣ構成要素を除いた。各モデルの区別力（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ  ｐｏｗｅｒ）を２つの技術を用いて確認した。１つ目は、リーブワンアウト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）交差検定であり、それにより、各サンプルを順番に分析から排除し、残りのサンプルおよび排除されたサンプルのクラスメンバーシップから作り出されるモデルを予測した２９。２つ目は、完全な外的確認法（ｆｕｌｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）であり、訓練事例（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）（無作為に選択された、サンプルの７０％）からモデルを作り出し、それらの予測力を、独立した「試験」事例（サンプルのうちの残しておいた３０％）を用いて試験した。完全な外的確認法を、サンプルの３０％の異なる事例を除いて３回繰り返し、平均をとった。両方の技術について、モデルの誤分類マトリックスは、正しく予測されたサンプルの数を記載し、このことからモデルの感度および特異度が計算され得た。
【００９３】
結果
３つの被験体コホートからの代表的な尿のスペクトルを図１に示す。１１サンプルをＰＣＡによって「アウトライアー」と同定し、さらなる分析から除外した。これらは、ＨＣＣ群からの２つのサンプルスペクトル（そのうちの１つは、優位を占めるグルコース代謝産物を示し、それは、未診断の糖尿病からもたらされたかもしれない糖尿を示しており、もう１つのサンプルは、適切に位相を等しくすることができなかった）；肝硬変群からの６つのスペクトル（そのうちの３つは、著しい（ｍａｒｋｅｄ）グルコース代謝産物を示した（適切に位相を等しくされることができなかった１つのサンプル、優位を占めるラクテートのピークを有する１つのサンプル、ならびに多変量解析に強く影響するδ１．４５ｐｐｍおよびδ１．６０ｐｐｍにおいて顕著な未同定ピークを示した１つのサンプル））；ならびに健康な対照群からの３つのスペクトル（それらの全ては、優位を占めるグルコース代謝産物を示し、それは糖尿を示す）を含んだ。得られた群のＰＣＡスコアのプロットは、ＨＣＣサンプル  対  健康な対照のサンプルのはっきりとしたクラスター化を示した（図２Ａ）。ＯＳＣ−ＰＬＳ−ＤＡは、リーブワンアウトアルゴリズムを用いて、１００％の感度および９４％の特異度でＨＣＣコホートおよび健康な対照コホートを区別した（Ｒ２＝０．８、Ｑ２＝０．７４）（図２Ｃ）。完全な外的確認法パラダイムを用いて、区別的な感度は１００％、および特異度は９３％であった。ＰＬＳ−ＤＡモデルに最も寄与する共鳴は、グリシン（δ  ３．５７ｐｐｍ）、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）（δ  ３．２７ｐｐｍ）、ヒップレート（δ  ３．９６ｐｐｍ）、シトレート（δ  ２．６６ｐｐｍ）、クレアチニン（δ  ３．０５ｐｐｍ）、クレアチン（δ  ３．９３ｐｐｍ）、およびカルニチン（δ  ３．２３ｐｐｍ）であった。
【００９４】
ＨＣＣサンプル  対  肝硬変サンプルのＰＣＡスコアのプロットは、より悪い群クラスター化を示した（図２Ｂ）。ＯＳＣ−ＰＬＳ−ＤＡは、リーブワンアウトアルゴリズムを用いて、８１％の感度および７１％の特異度でＨＣＣコホートおよび肝硬変コホートを区別した（Ｒ２＝０．５４、Ｑ２＝０．２５）（図２Ｄ）。完全な外的確認法パラダイムを用いて、区別的な感度は７５％、および特異度は６７％であった。ＰＬＳ−ＤＡの区別化に最も強く寄与する共鳴は、ＴＭＡＯ（δ  ３．２７ｐｐｍ）、クレアチン（δ  ３．９３ｐｐｍ）、およびカルニチン（δ  ３．２３ｐｐｍ）であった。
【００９５】
肝臓疾患群におけるサンプルの男性優勢に起因して、発見が、性ではなくＨＣＣの作用によるものであることを確認するために、男性のみの分析を始めた。男性ＨＣＣの尿は、１００％の感度および９３％の特異度で健康な対照の尿から区別化され得、８０％の感度および５５％の特異度で肝硬変を有する患者の尿から区別化され得た。区別的な代謝産物（グリシン、ＴＭＡＯ、ヒップレート、シトレート、クレアチニン、クレアチン、およびカルニチン）は、合わせた性の比較と同様であった。
【００９６】
実施例６：単変量統計的解析
方法
ＰＬＳ−ＤＡ負荷プロット（ｌｏａｄｉｎｇｓ  ｐｌｏｔｓ）によって決定される最も重要な区別的な代謝産物の共鳴を積分し、総スペクトル積分の和に対して正規化した。値を、総スペクトル積分に対して、パーセント指標として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０１（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、ＨＣＣ群、肝硬変群、および健康な対照群の間の違いをマン−ホイットニー検定法を用いて分析し、正常ではないデータの分布を仮定し、ｐ−値＜０．０５を有意であると考えた。
【００９７】
結果
ＨＣＣ被験体の尿において低減した代謝産物
尿のグリシンレベル（総スペクトル積分に対して正規化された％として表される）は、健康な対照と比較して、ＨＣＣ被験体の尿において有意に低減した（メジアン［四分位数間範囲］０．４６［０．２４〜０．７１］および２．４１［１．３０〜２．９５］（ｐ＜０．００１））が、肝硬変の被験体と比較して、有意に低減しなかった（０．５３［０．１３〜１．２７］（ｐ＝０．８８））（図３Ｆ）。尿のＴＭＡＯレベルは、健康な対照と比較して、ＨＣＣ被験体の尿において有意に低減した（１．１７［０．４７〜１．５６］、および３．９８［２．６９〜４．６７］（ｐ＜０．００１））が、肝硬変の被験体と比較して、有意に低減しなかった（２．０３［０．４７〜３．０７］（ｐ＝０．１８））（図３Ｇ）。尿のヒップレートレベルは、健康な対照と比較して、ＨＣＣ被験体において有意に低減した（０．５３［０．２３〜０．９８］、および１．６２［１．０８〜１．８８］（ｐ＜０．００１））が、肝硬変の被験体と比較して、有意に異ならなかった（０．６６［０．０〜０．８９］（ｐ＝０．６５））（図３Ｅ）。尿のシトレートは、健康な被験体と比較して有意に低減し（０．０４［０．０〜０．８４］、および１．６８［１．０６〜２．７４］（ｐ＜０．００１））、肝硬変の被験体と比較して、有意性に対して低減した傾向を有した（０．９１［０．０９〜１．３６］（ｐ＝０．１２））（図３Ｂ）。尿のクレアチニンレベルは、健康な対照および肝硬変の被験体と比較して、ＨＣＣの尿において低減したが、有意なレベルまでではなかった（１３．７［１１．５９〜１８．６９］、１７．４９［１３．８２〜２４．１１］、および１７．７１［１１．７８〜２２．２８］（それぞれ、ｐ＝０．１２および０．３３））（図３Ａ）。
【００９８】
ＨＣＣ被験体の尿において上昇した代謝産物
尿のクレアチンレベルは、健康な対照および肝硬変の被験体と比較して、ＨＣＣ被験体の尿において有意に上昇した：１．５［０．９２〜３．３２］；０．５４［０．０４〜１．２８］、および０．２６［０．１２〜０．３９］（それぞれ、ｐ＝０．００３およびｐ＜０．００１）（図３Ｄ）。尿のカルニチンレベルは、健康な対照および肝硬変の被験体と比較して、ＨＣＣ被験体の尿において有意に上昇しなかった：１．１６［０．２５〜２．５９］；０．５８［０．３６〜０．８６］、および０．３９［０．２９〜０．９７］（ｐ＝０．２９およびｐ＝０．３０）（図３Ｃ）。
【００９９】
【化６】
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【０１００】
【化７】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【国際調査報告】
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