(57)【要約】  本発明は、生体試料（例えば、組織試料、糞便試料、血液試料、血漿試料、細胞試料、胆嚢試料、胆液試料、血清試料）中の消化管癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））を検出するための方法および生体マーカー（例えば、エピジェネティック生体マーカー）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象内の胃腸腫瘍を検出する方法であって、
（ａ）前記対象の生体試料からＤＮＡを取得する工程、および、
（ｂ）ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子に対応する核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度を決定する工程、を備える方法。
【請求項２】
少なくとも１つのさらなる遺伝子に対応する核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度を決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記少なくとも１つのさらなる遺伝子はＳＦＲＰ１であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記核酸重合体のメチル化のレベルまたは頻度をメチル化の基準レベルまたは基準頻度と比較することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度をメチル化の基準レベル、基準存在、または基準頻度と比較する工程をさらに備え、前記基準と比較したときの患者のメチル化の変化したレベル、存在、または頻度は、上記対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆を与えることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
核酸は、ＣｐＧアイランドおよびＣｐＧアイランドのショアからなる一群から選択される領域を含むことを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記ＣｐＧアイランドまたは上記ＣｐＧアイランドのショアはコード領域または調節領域に存在することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記調節領域はプロモーターであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
核酸重合体の変化したメチル化のレベルを決定する上記工程は、上記ＣｐＧアイランドまたは上記ＣｐＧアイランドのショアのメチル化の頻度を決定する工程を備えることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
変化したメチル化の核酸重合体のレベルを決定する上記工程は、メチル化特異的ＰＣＲ法、定量的メチル化特異的ＰＣＲ法、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析法、メチル化非感受性ＤＮＡ制限酵素分析法、定量的重亜硫酸パイロシークエンス法、および重亜硫酸ゲノム配列決定ＰＣＲ法からなる一群から選択される技術によって実現されることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）および工程（ｂ）の結果を用いてリスクプロファイルを作成する工程（ｃ）をさらに備える請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記胃腸腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌すなわち胆管癌であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記対象内の消化管癌を少なくとも８５％の特異性且つ少なくとも８５％の感度で検出することを可能にすることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記対象の体内の消化管癌を少なくとも９０％の特異性且つ少なくとも８０％の感度で検出することを可能にすることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記生体試料は、組織試料、糞便試料、細胞試料、胆汁試料、および血液試料からなる一群から選択されることを特徴とする請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子に対応するメチル化特異的核酸検出配列。
【請求項１７】
対象内の癌状態を検出するための、請求項１６に記載の核酸配列の使用。
【請求項１８】
上記癌状態は胃腸腫瘍であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
上記胃腸腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌すなわち胆管癌であることを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
上記胃腸腫瘍は結腸直腸癌または胆管癌であることを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１の１つ以上に対応する検出配列に加えて、さらなるメチル化特異的核酸検出配列を使用することを特徴とする請求項１７〜２０の何れか１項に記載の使用。
【請求項２２】
上記さらなるメチル化特異的核酸検出配列はＳＦＲＰ１に対応することを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
基準と比較したときの患者のメチル化の変化したレベル、存在、または頻度は、上記対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆とを与えることを特徴とする請求項１７〜２２の何れか１項に記載の使用。
【請求項２４】
哺乳類の胃腸腫瘍の存在を検出するためのキットであって、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の検出および／または特性の決定を行うのに有効であるか、十分であるか、または必要である試薬を備えるキット。
【請求項２５】
コンピュータに読み取り可能な媒体を備えるシステムであって、前記コンピュータに読み取り可能な媒体は、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の情報を使用して、対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆とを与える指示を含んでいる、システム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、生体試料（例えば、組織試料、糞便試料、血液試料、細胞試料、胆嚢試料、胆汁試料、血清試料）中の消化管癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢、および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））の検出方法および検出マーカー（例えば、エピジェネティックマーカー）に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
胆管癌（ＣＣＡ）は、発症率が２番目に高い原発性の肝胆道悪性腫瘍であり、消化管癌全体の約３％を占める（１；２）。ＣＣＡは、発生位置の特定法により肝外胆管癌または肝内胆管癌に分類される。これら胆管癌の亜類型の共通点は、何れも胆管上皮で発生し、診断することが困難であるということである。ＣＣＡは胆管系の炎症状態の発生を伴い、原発性の硬化性胆管炎および肝ジストマ病などのリスク要因を抱える患者は、こうした悪性腫瘍が発生するリスクが高くなる（３；６）。一般的にＣＣＡの臨床所見が遅くなる結果、死亡率が高くなり、報告される５年生存率は僅か５〜１５％である（１；２）。
【０００３】
ＣＣＡの診断は依然として困難なままである。患者が悪性腫瘍を患っていることへの可能性を指摘するための現行の臨床戦略は、多様な画像診断法の組み合わせ、並びに胆管のブラシ細胞診および僅かばかりの血清マーカーの分析を含む（４；７；８）。しかし、ＣＣＡは、腹腔鏡検査が行われるまで確認できないことが頻繁である（４）。ＣＣＡの検出に最も頻繁に使用する分子マーカーは、糖鎖抗原体１９‐９である（９）。ＣＣＡの検出に最も頻繁に使用する分子マーカーは糖鎖抗原体１９‐９である（９）。しかし残念なことに、この分子マーカーには、ルイス表現型への依存性、および、他の消化管悪性腫瘍の存在または急性胆管炎および肝硬変症などの良性症状の存在によってさえもレベルが高くなるなどの限界がある（１０〜１２）。
【０００４】
遺伝子異常およびエピジェネティック異常を含む腫瘍に特異的な分子改変は、癌発生に重要な役割を果たしていることが示されてきた（１３〜１６）。癌では、ＤＮＡの異常なメチル化を含むエピジェネティック制御障害が頻繁に報告されている（１３；１６〜１８）。ヒトの場合では、ＤＮＡメチル化はＣｐＧ配列中のシトシンの５の位置で発生する（１９）。これらＣｐＧ部位の大部分において大量のゲノムがメチル化する一方で、高密度のＣｐＧクラスタ（所謂ＣｐＧアイランド）では通常の場合メチル化が発生しない。遺伝子のプロモーター領域に位置するＣｐＧアイランドのＤＮＡの異常な過剰メチル化は転写サイレンシングに関連している（２０；２１）。主要な腫瘍抑制遺伝子の発現欠失によって腫瘍発生に繋がることがある。ＤＮＡの異常なメチル化は腫瘍形成において発生する初期変化であることも示されている（１７；２２〜２４）ので、こうした標的は、早期検出を行うための魅力的な生体マーカーを示すものである。ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）を含む幾つかの遺伝子はこれまでに、ＣＣＡ中で発生するプロモーターのメチル化について分析されてきた（表４）。しかし、腫瘍中で高頻度でメチル化し、且つ正常組織中では非メチル化状態にある遺伝子のみが有望な生体マーカーを意味する。ＣＣＡは根治的治療によってのみ治療することができる。または、特定の場合では、肝移植によってのみ治療することができる。患者は、診察時点において、外科手術の施術候補となるには病気が進行し過ぎていることが最も頻繁である。高感度および高特異性の好適なＣＣＡ用のエピジェネティック生体マーカーを特定することにより、早期に癌を診断することが容易になり、したがって、現在では成果の乏しいような患者群の生存率の向上に貢献することになる。
【０００５】
結腸直腸癌は西洋諸国において最も一般的な悪性腫瘍の１つであり、ノルウェーだけでも毎年３６００件の新規症例が発生している。結腸癌は、消化器系の下方部分である大腸（結腸）の癌である。直腸癌は、結腸の終端の最後の数インチの部分の癌である。結腸癌および直腸癌は併せてしばしば結腸直腸癌と称される。大抵の場合の結腸癌は、腺腫性ポリープと呼ばれる非癌性（良性）の小さな細胞集塊として発症する。やがて、腺腫性ポリープの一部は結腸癌となる。
【０００６】
早期の検出および治療を行うことにより、結腸直腸癌の死亡率は低下する。しかし、より末期の癌の場合では、不快な副作用を伴う侵襲的治療を行うことが必要になり、より高い死亡率が示される。
【０００７】
結腸直腸癌に関連する疾病率および死亡率を低下させるためには、胆管癌、結腸直腸癌、および他の消化管癌の早期検出を行うためのより良好且つより効果的な非侵襲的検査が必要である。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明は、生体試料（例えば、組織試料、糞便試料、血液試料、血漿試料、細胞試料、胆嚢試料、胆汁試料、血清試料）中の消化管癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））を検出するための方法および生体マーカー（例えば、エピジェネティック生体マーカー）に関する。
【０００９】
本発明の一部の実施形態を構築していく過程において実施した、マイクロアレイ解析とin vitro, in vivo およびin silico分析との複合アプローチを用いた実験では、結腸直腸癌中のエピジェネティックに下方制御された新規の遺伝子としてＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａを特定した。両遺伝子は、正常粘膜の試料中では非メチル化状態であるが、大腸腫瘍中では高頻度でメチル化している。その結果、ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａの感度はそれぞれ６０％および５７％であり、特異性は１００％であった。
【００１０】
さらなる実験では、過剰にメチル化した遺伝子を幾つか特定した。ここで、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＮＦ３３１の「ｃ」型アイソフォームおよびＺＳＣＡＮ１８の「ｂ」型アイソフォームは、胆管癌細胞株および結腸直腸癌細胞株において１００％メチル化していることが見出された。原発性腫瘍においてプロモーターのメチル化が高頻度で確認されたことに加えて、アプローチ法全体へ厳格な選択基準を適用することにより、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＮＦ３３１の「ｃ」型アイソフォームおよびＺＳＣＡＮ１８の「ｂ」型アイソフォームを癌の早期検出用の有効な生体マーカーとした。
【００１１】
例えば、一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の遺伝子（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８またはＺＮＦ３３１）に対応するメチル化特異的核酸検出配列を提供する。一部の実施形態では、本発明は、対象の癌の状態（例えば、胃腸腫瘍；例えば、結腸直腸癌）を検出するための上記核酸配列の使用を提供する。一部の実施形態では、上記検出配列は、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１（それぞれ、配列番号１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０）の１つ以上に特異的なプローブである。一部の実施形態では、上記検出配列は、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１（それぞれ、配列番号１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０）の１つ以上に特異的なプライマーである。一部の好適な実施形態では、メチル化特異的核酸検出配列はＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）プライマーである。典型的なプライマーセットは、ＣＤＯ１に特異的なプライマーセット（配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、および配列番号２１および２２）、ＤＣＬＫ１に特異的なプライマーセット（配列番号３９および４０、配列番号４１および４２、および配列番号４３および４４）、およびＺＳＣＡＮ１８に特異的なプライマーセット（配列番号１６１および１６２、配列番号１６３および１６４、および配列番号１６５および１６６）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記メチル化特異的核酸検出配列は、定量ＰＣＲ用のプライマーとプローブとの組を備える。典型的なプライマーとプローブとの組は、ＣＤＯ１に特異的なプライマーとプローブとの組（配列番号１７０、１７１、および１７２）、ＤＣＬＫ１に特異的なプライマーとプローブとの組（配列番号１７３、１７４、および１７５）、ＺＳＣＡＮ１８に特異的なプライマーとプローブとの組（配列番号１７９、１８０、および１８１）、およびＳＦＲＰ１に特異的なプライマーとプローブとの組（配列番号１７６、１７７、および１７８）を含むが、これらに限定されない。上記検出配列は、標的遺伝子の上流側の領域、標的遺伝子内の領域、または標的遺伝子の下流側の領域に特異的であってよい。一部の好適な実施形態では、上記検出配列は、標的遺伝子の開始コドンから数えて約−５００、−４００、−３００、−２００、−１５０、−１００、−７５、または−５０番目の塩基対から開始して、前記標的遺伝子の開始コドンから数えて−１０、−１０、０、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２０、１５０、または２００番目の塩基対で終わる領域によって規定される標的配列の領域に特異的である。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、対象の胃腸腫瘍を検出する方法であって、前記対象の生体試料からＤＮＡを取得する工程、および１つ以上の遺伝子（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、またはＺＮＦ３３１）に対応する核酸ポリマーのメチル化のレベル、存在、または頻度を決定する工程を備える方法を提供する。一部の実施形態では、上記核酸は、ＣｐＧアイランドまたはＣｐＧアイランドのショアを含む。一部の実施形態では、上記ＣｐＧアイランドまたは上記ＣｐＧアイランドのショアは、コーディング領域または調節領域（例えば、プロモーター）内に存在する。一部の実施形態では、核酸ポリマーの改変メチル化のレベルを測定する工程は、上記ＣｐＧアイランドまたは上記ＣｐＧアイランドのショアのメチル化頻度を測定する工程を備える。一部の実施形態では、改変メチル化を含む核酸のレベルの測定は、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ法、定量的メチル化特定的ＰＣＲ法、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析法、定量的重亜硫酸パイロシークエンス法、次世代配列決定法、および重亜硫酸ゲノム配列決定ＰＣＲ法から選択される技術を用いて達成される。一部の実施形態では、上記方法は、上述の記載で詳細に説明した上記メチル化特異的核酸検出配列を使用する。一部の実施形態では、上記方法は、リスクプロファイルを作成する工程をさらに備える。一部の実施形態では、上記胃腸腫瘍は結腸直腸癌である。一部の実施形態では、上記方法は、対象の消化管癌を少なくとも８５％の特異性且つ少なくとも８５％の感度で検出することを可能にする。一部の実施形態では、上記方法は、対象内の消化管癌を少なくとも９０％の特異性且つ少なくとも８０％の感度で検出することを可能にする。一部の実施形態では、上記生体試料は、組織試料、糞便試料、血液試料、血漿試料、細胞試料、胆嚢試料、胆汁試料、または血清試料である。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態では、哺乳類の胃腸腫瘍の存在を検出するキットであって、例えばＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の検出および／または特性決定を行ううえで有益であるか、十分であるか、または必要な試薬を備えるキットを提供する。一部の実施形態では、上記キットは、上述の記載で詳細に説明したメチル化特異的核酸検出配列を使用する。
【００１４】
当該技術分野の当業者であれば、本願の教示内容からさらなる実施形態が明らかになるであろう。
【００１５】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、新規のＤＮＡメチル化候補遺伝子を選択する方法である。
【００１６】
図２は、ＧＬＤＣのメチル化特異的ＰＣＲの定量的な結果からのＲＯＣ曲線分析である。
【００１７】
図３は、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａのメチル化特異的ＰＣＲの定量的結果からのＲＯＣ曲線分析である。
【００１８】
図４は、ＧＬＤＣに従来のＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとＧＬＤＣに定量ＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとの比較である。
【００１９】
図５は、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａに従来のＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとＰＰＰ１Ｒ１４Ａに定量ＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとの比較である。
【００２０】
図６は、重亜硫酸配列決定法により、ＧＬＤＣプロモーター内の部位特異的メチル化を検証する図であり、図６の上部のＡ）は、重亜硫酸配列決定プライマーにより増幅させたＣｐＧ部位の概略を示し、Ｂ）は、結腸癌細胞株内の上記ＧＬＤＣプロモーターの典型的な重亜硫酸配列電気泳動図である。
【００２１】
図７は、重亜硫酸配列決定法により、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａプロモーター内の部位特異的メチル化を検証する図であり、図７の上部のＡ）は、重亜硫酸配列決定プライマーにより増幅させたＣｐＧ部位の概略を示す。Ｂ）は、結腸癌細胞株内の上記ＰＰＰ１Ｒ１４Ａプロモーターの典型的な重亜硫酸配列電気泳動図である。
【００２２】
図８は、胆管癌中の過剰メチル化遺伝子を特定するためのエピゲノム全域の実験アプローチ法である。エピジェネティック薬剤（５‐アザ‐２’デオキシシチジンおよびトリコスタチンＡ）の混合物を添加して、または無添加で、６系統のＣＣＡ細胞株を培養した。エピジェネティック薬剤処理に反応するアレイ要素と、従来の文献に記載の癌の発生していない組織と比較して下方制御されたＣＣＡ内の遺伝子とを比較した。プロモーター領域内にＣｐＧアイランドを含む一般的な遺伝子を結腸、胆管、肝臓、胆嚢、および膵臓に由来の癌細胞株中の過剰メチル化について調べた。その後、ＣＣＡ細胞株において高頻度でメチル化している遺伝子をＭＳＰを使用して患者材料中で調べた。この分析により特定した最も有力な候補の評価をｑＭＳＰ法を使用してさらに行った。図中に記載の数字は、各実験工程の選択基準を満たし、その後にさらなる分析が行われた遺伝子の数を示す。
【００２３】
図９は、典型的な標的遺伝子の配列である。
【００２４】
図１０は、癌細胞および胆管癌の間で重複する、脱制御を受けた遺伝子を示すベン図である。マイクロアレイ分析法を使用して、６種類の遺伝子を、従来の刊行物に記載のデータセットと比較して非悪性対照エピジェネティック薬剤処理後のＣＣＡ細胞株内において上方制御を受ける一方で、腫瘍内において下方制御を受ける遺伝子として特定した。略記：ＩＣＣ、肝内胆管癌；ＥＣＣ、肝外胆管癌である。
【００２５】
図１１は、癌細胞株中のプロモーターのメチル化状態の要約である。ＭＳＰ法を使用して４０の遺伝子座を細胞株内で分析し、ＣＣＡ細胞株内におけるそれらのメチル化頻度に応じて分類した。グループＩ；高頻度にメチル化（６系統の細胞株のうち最少でも５系統）、グループＩＩ；中程度にメチル化（１〜４系統の細胞株）、グループＩＩＩ；非メチル化である。
【００２６】
図１２は、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８に直接重亜硫酸配列決定法を行うことにより、ＭＳＰ法により評価を行ったメチル化状態を検証する。Ａ）ＣＤＯ１。Ｂ）ＤＣＬＫ１。Ｃ）ＺＳＣＡＮ１８。全ての集団に関して、上側の線は、重亜硫酸配列決定プライマーを使用して増幅させた断片中の個々のＣｐＧ部位を示す。転写開始部位は＋１で示し、矢印によりＭＳＰの位置とその後に設計するｑＭＳＰプライマーおよびプローブとを示す。集団の下側部では、黒色の丸印はメチル化ＣｐＧを示し、灰色の丸印は部分的にメチル化したＣｐＧを示し、白色の丸印は非メチル化ＣｐＧを示す。各集団の右側の列（Ｍ、Ｕ／Ｍ、Ｕ）は、ＭＳＰ法で評価を行ったメチル化状態を一覧表にして示す。
【００２７】
図１３は、胆管癌試料および非悪性腫瘍試料中の個々の遺伝子および複合遺伝子の受信者動作特性曲線である。集団は、個々の生体マーカーのＰＭＲに基づいて、得られる受信者動作特性曲線値の下側面積を示す。Ａ）は、新鮮凍結試料シリーズを使用した場合に得られる受信者動作特性曲線値の下側面積を個々の生体マーカーのＰＭＲに基づいて示す。Ｂ）は、保存試料シリーズを使用した場合に得られる受信者動作特性曲線値の下側面積を個々の生体マーカーのＰＭＲに基づいて示す。Ｃ）は、新鮮凍結材料および保存材料を組み合わせた材料を使用した場合に得られる受信者動作特性曲線値の下側面積を個々の生体マーカーのＰＭＲに基づいて示す。Ｄ）〜Ｆ）は複合生体マーカー集団の性能を示す。Ｄ）は、新鮮凍結試料一式の複合生体マーカー集団の性能を示す。Ｅ）は、保存試料一式中の複合生体マーカー集団の性能を示す。Ｆ）は、複合試料一式中の複合生体マーカー集団の性能を示す。
【００２８】
図１４は、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ）法で評価を行った、患者材料中のメチル化頻度である。グループＩに属する１２種類の遺伝子を新鮮凍結試料一式中で調べた。非悪性試料中のメチル化の帯強度は、癌腫中のメチル化の帯強度と比較して著しく弱かった。
【００２９】
〔定義〕
本発明の理解を容易にするために多数の用語および語句を以下に説明する。
【００３０】
本願に使用するように、用語「感度」は、真陽性の数と偽陰性の数との和で真陽性の数を除算して算出する、アッセイ（例えば、方法、試験）の性能の統計的尺度として定義される。
【００３１】
本願に使用するように、用語「特異性」は、真陰性の数と偽陽性の数との和で真陰性の数を除算して算出する、アッセイ（例えば、方法、試験）の性能の統計的尺度として定義される。
【００３２】
本願に使用するように、用語「情報提供的（有用）」または「情報提供性（有用性）」は、マーカーまたはマーカー集団の性質を指し、特に陽性試料からマーカー（またはマーカー集団）を発見できる可能性を指す。
【００３３】
本願に使用するように、用語「ＣｐＧアイランド」は、平均的なゲノムＣｐＧの出現率（同一種毎、同一固体毎、または部分母集団毎（例えば、株、または民族的背景を基にした部分母集団など））と比較して高率でＣｐＧ部位を含むゲノムＤＮＡ領域を指す。ＣｐＧアイランドに関しては多様なパラメータおよび定義が存在している。例えば、一部の実施形態では、ＣｐＧアイランドは、５０％を超えるＧＣ百分率を有し、且つＣｐＧ比の実測値／期待値が６０％を超えるものとして定義される（Gardiner-Garden et al. (1987) J Mol. Biol. 196:261-282; Baylin et al. (2006) Nat. Rev. Cancer 6:107-116; Irizarry et al. (2009) Nat. Genetics 41:178-186;各文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）。一部の実施形態では、ＣｐＧアイランドは、５５％を超える（＞５５％）ＧＣ含有量および０．６５の実測ＣｐＧ／予測ＣｐＧを含む（Takai et al. (2007) PNAS 99:3740-3745；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）。ＣｐＧアイランドの長さに関しても多様なパラメータが存在する。本願に使用するように、ＣｐＧアイランドは、その長さが１００ｂｐ未満、１００〜２００ｂｐ、２００〜３００ｂｐ、３００〜５００ｂｐ、５００〜７５０ｂｐ、７５０ｂｐ〜１０００ｂｐ、１００ｂｐ以上である。一部の実施形態では、ＣｐＧアイランドは、対照と比較して変化しているメチル化パターン（例えば、癌に罹患していない対象と比較して変化している、癌に罹患した対象内で発生する改変メチル化；組織特異的な改変メチル化パターン；胃腸の新生組織形成（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））が発生していない対象と比較して変化している、胃腸の新生組織形成が発生している対象に由来の生体試料中（例えば、組織、糞便、血液、血漿、血清、細胞、胆汁）の改変メチル化）を示す。一部の実施形態では、改変メチル化は過剰メチル化を含む。一部の実施形態では、改変メチル化は低メチル化を含む。
【００３４】
本願に使用するように、用語「ＣｐＧの岸」または「ＣｐＧアイランドのショア」は、改変メチル化パターンであるか、または改変メチル化パターンを有する可能性のあるＣｐＧアイランド外部のゲノム領域を指す（例えば、Irizarry et al. (2009) Nat. Genetics 41:178-18を参照；この文献については、参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）。ＣｐＧアイランドのショアは、対照と比較して変化しているメチル化パターン（例えば、癌に罹患していない対照と比較して変化している、癌に罹患している対象内で発生する改変メチル化；組織特異的なメチル化パターン；胃腸の新生組織形成（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））が発生していない対象と比較して変化している、胃腸の新生組織形成が発生している対象に由来の生体試料中（例えば、組織、糞便、血液、血漿、血清、細胞、胆汁）の改変メチル化）を示す。一部の実施形態では、改変メチル化は過剰メチル化を含む。一部の実施形態では、改変メチル化は低メチル化を含む。ＣＰＧアイランドのショアは、ＣｐＧアイランドに対して様々な領域に位置し得る（例えば、Irizarry et al. (2009) Nat. Genetics 41;178-186参照；上述の文献については、参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）。したがって、一部の実施形態では、ＣｐＧアイランドのショアは、ＣｐＧアイランドから１００ｂｐ未満、１００〜２５０ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、１０００〜１５００ｂｐ、１５００〜２０００ｂｐ、２０００〜３０００ｂｐ、または３０００ｂｐ以上離れて位置している。
【００３５】
本願に使用するように、用語「エピジェネティック」は、細胞分裂を介して引き継がれる、配列に起因しない変化を指す。例えば、一部の実施形態では、エピジェネティック変化は、改変メチル化のパターンまたはレベル（例えば、過剰メチル化）である。
【００３６】
本願に使用するように、用語「メチル化状態」は、少なくとも１つの核酸配列中の１つ以上のＣｐＧ部位におけるメチル修飾の有無を測定する尺度である。一部の実施形態では、１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化状態は、対象となる特定の遺伝子の多重コピーによって決定されることが理解されるであろう。
【００３７】
本願に使用するように、用語「メチル化レベル」は、対象の遺伝子または核酸配列の１つ以上のコピーに発生するメチル化の量を指す。メチル化レベルは、対象の遺伝子または核酸配列中に発生するメチル化の絶対尺度として算出されてもよい。また、「相対メチル化レベル」は、存在するＤＮＡの総量と比較したときのメチル化ＤＮＡの量として決定されてもよい。または、対象の遺伝子または核酸配列の総コピー数と比較したときのメチル化コピーの数として決定されてもよい。したがって、「メチル化レベル」は、対象のＤＮＡ伸長鎖中のメチル化ＣｇＰ部位の百分率として決定することが可能である。
【００３８】
用語「メチル化レベル」はまた、例えばプロモーター領域の１つ以上のＣｐＧ部位がメチル化する一方で、そのメチル化の量が増幅閾値より低くなるような事態を含む。したがって、メチル化レベルは、対象となる遺伝子のメチル化の量の推定値であってもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、対象の遺伝子のメチル化レベルは１５％〜１００％（５０％〜１００％など）である。より好ましくは６０％〜１００％である。さらに好ましくは７０％〜１００％である。さらに好ましくは８０％〜９０％である。さらに好ましくは９０％〜１００％である。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の遺伝子のメチル化レベルは、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【００４０】
本願に使用するように、用語「メチル化に特異的な核酸検出配列」は、標的の核酸配列（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、およびＺＮＦ３３１をコードする配列（それぞれ、配列番号１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０の配列））のメチル化状態を特異的に検出、決定、または分析するために用いられるプローブ、プライマー、またはそれらの一式を指す。検出配列は単一のプローブであってよい。または、標的配列に特異的なＰＣＲプライマーセットの場合のように、複数のプローブを含んでもよい。「メチル化に特異的な核酸検出配列」の具体例は、ＭＳＰプライマーおよびｑＭＳＰプライマーの一式を含むが、これに限定されない。
【００４１】
本願に使用するように、用語「転移」は、体内の一組織または部分で発生した癌細胞が他の部分に移転して複製し続ける過程を指すように意図される。その後、転移細胞は腫瘍を形成し、この腫瘍がさらに転移することがある。したがって、用語「転移」は、癌が最初に発生した体内部位から他の体内部位へ広がることを指す。本願に使用するように、用語「転移消化管癌細胞」は、転移した消化管癌細胞、すなわち、胃腸系以外の体内部分に局在する消化管癌細胞を指すように意図されている。
【００４２】
本願に使用するように、「転移性消化管癌細胞の影響を受けやすいことが疑われる個体」は、転移消化管癌細胞の発生について平均より高いリスクを有する個体を指すように意図されている。転移消化管癌細胞の発生について特定のリスクを有する個体の例は、個体の血縁者の医療記録から血縁者間の消化管癌の発生率が平均よりも高いことが示される個体、および／または、既に消化管癌に罹って効果的な治療を受けており、したがって再発のリスクに直面する個体である。平均より高い転移性消化管癌の発生リスクに寄与し、したがって個体が転移性消化管癌細胞の影響を受けやすいことが疑われる個体であると分類されることに繋がる他の要因は、個体の特定の遺伝的、医学的、および／または行動的背景および特性に基づいている。
【００４３】
本願で使用する用語「新生物」は、組織の新生で異常な成長を指す。したがって、新生物は、前癌状態の新生物または悪性の新生物とすることができる。用語「新生物特異的マーカー」は、新生物の存在を示すのに使用することのできる任意の生体マーカーを指す。上記生体マーカーの例は、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜およびミトコンドリア）、および細胞全体を含むが、これらに限定されない。用語「気道・消化器系の新生物に特異的なマーカー」は、胃腸系の新生物（例えば、胃腸系の前癌状態の新生物；胃腸系の悪性の新生物）の存在を示すのに使用することのできる任意の生体マーカーを指す。胃腸系に特異的なマーカーの例は、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、およびＺＮＦ３３１を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
本願で使用するように、用語「アンプリコン」は、プライマー対を用いて生成される核酸を指す。アンプリコンは一般的には、一本鎖ＤＮＡ（例えば、不斉増幅の生成物）であるが、ＲＮＡまたはｄｓＤＮＡであってもよい。
【００４５】
核酸との関連で使用する用語「増幅性」または「増幅」は、ポリヌクレオチドまたはその一部（一般的には、少量（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から開始）の複数のコピーを作成することを指し、この場合の増幅産物またはアンプリコンは通常は検出可能な増幅産物またはアンプリコンである。ポリヌクレオチドの増幅は様々な化学的および酵素的処理を含む。増幅手法の種類としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；例えば、米国特許第５，４９４，８１０号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）中に標的ＤＮＡ分子または鋳型ＤＮＡ分子の１つまたは少数のコピーから複数のＤＮＡコピーを発生させることがある。さらなる増幅手法の種類は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法（例えば、米国特許第５，６３９，６１１号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、アセンブリＰＣＲ法（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ヘリカーゼ依存増幅法（例えば、米国特許第７，６６２，５９４号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ホットスタートＰＣＲ法（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および米国特許第５，３３８，６７１号参照；当該米国特許を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、配列間特異的ＰＣＲ法、インバースＰＣＲ法（例えば、Triglia, et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16:8186参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ライゲーション介在ＰＣＲ法（例えば、Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997)および米国特許第５，５０８，１６９号を参照；当該文献および当該米国特許を参照することにより、それらの全開示内容を本願に援用するものとする）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、Herman, et al., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、ミニプライマーＰＣＲ法、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅法（例えば、Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、マルチプレックスＰＣＲ法（例えば、Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156およびBallabio, et al., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）、ネステッドＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ法（例えば、Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Higuchi, etl al., (1992) Biotechnology 10:413-417およびHiguchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）、逆転写ＰＣＲ法（例えば、Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193を参照；当該文献を参照することにより、その全開示内容��本願に援用するものとする）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ法、およびタッチダウンＰＣＲ法（例えば、Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008、Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814、およびHecker, et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの増幅処理はまた、デジタルＰＣＲ（例えば、Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997)、Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999)、国際公開第ＷＯ  ０５０２３０９１Ａ２号、および米国公開特許出願第２００７  ０２０２５２５号を参照；当該各文献を参照することにより、それぞれの全開示内容を本願に援用するものとする）を用いることにより達成することが可能である。
【００４６】
本願に使用するように、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合則に関するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関連して使用される。例えば、配列「５’‐Ａ‐Ｇ‐Ｔ‐３’」は、配列「３’‐Ｔ‐Ｃ‐Ａ‐５’」に相補的な配列である。相補性は、幾つかの核酸塩基のみが塩基対合則にしたがって一致しているような部分的な相補性であってもよい。または、核酸間には“完全”または“全体”相補性が存在してもよい。核酸の螺旋構造間の相補性の度合いは、核酸の螺旋構造間の交配の効率性および強度に多大な効果をおよぼす。このことは、増幅反応ならびに核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
【００４７】
本願に使用するように、用語「プライマー」は、精製した制限消化産物において自然発生するような天然のオリゴヌクレオチドまたは合成的に作成されるような非天然のオリゴヌクレオチドの区別なく、核酸に対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される状態（例えば、ヌクレオチドおよび生体触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）などの誘発剤の存在下であって、適切な温度およびｐＨ条件下）におかれた場合に合成反応の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅処理における最大の効率性を得るために、一般的には一本鎖のプライマーを使用するが、代わりに二本鎖のプライマーを使用してもよい。二本鎖のプライマーを使用する場合では、プライマーを用いて伸長生成物を調製する前に、先ず処理を行ってプライマーの二重鎖を分離させる。一部の実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。上記プライマーは、誘発剤の存在下において伸長生成物の合成の事前準備を行うのに十分な長さを有している。上記プライマーの具体的な長さは、温度、プライマーのソース、および上記方法の使用を含む多数の要因に応じて決定される。特定の実施形態では、上記プライマーは捕捉プライマーである。
【００４８】
本願に使用するように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む任意の核酸含有分子を指すが、これらに限定されない。上記用語が表す対象は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体を有する配列を含み、このような塩基類似体は、４‐アセチルシトシン、８‐ヒドロキシ‐Ｎ６‐メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５‐（カルボキシヒドロキシル‐）ウラシル、５‐フルオロウラシル、５‐ブロモウラシル、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオウラシル、５‐カルボキシメチル‐アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６‐イソペンテニルアデニン、１‐メチルアデニン、１‐メチルシュード‐ウラシル、１‐メチルグアニン、１‐メチルイノシン、２，２‐ジメチル‐グアニン、２‐メチルアデニン、２‐メチルグアニン、３-メチル‐シトシン、５‐メチルシトシン、Ｎ６‐メチルアデニン、７‐メチルグアニン、５‐メチルアミノメチルウラシル、５‐メトキシ‐アミノ‐メチル‐２‐チオウラシル、β‐Ｄ‐マンノシルケウオシン、５’‐メトキシカルボニルメチルウラシル、５‐メトキシウラシル、２‐メチルチオ‐Ｎ‐イソペンテニルアデニン、ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２‐チオシトシン、５‐メチル‐２‐チオウラシル、２‐チオウラシル、４‐チオウラシル、５‐メチルウラシル、Ｎ‐ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸、シュードウラシル、ケウオシン、２‐チオシトシン、および２，６‐ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本願で使用するように、用語「核酸塩基」は、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、「ヌクレオチド残基」、「デオキシヌクレオチド残基」、「ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）」、または「デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）」を含む、当該分野で用いられる他の用語の同義語である。
【００５０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個の核酸単量体単位（例えば、ヌクレオチド）を含む核酸を指し、前記少なくとも２個の核酸単量体単位は、一般的には３個を超える単量体単位であり、より一般的には１０個を超える単量体単位である。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは一般的には、最終機能またはオリゴヌクレオチドの使用を含む多様な要因に応じて決定される。さらに説明すると、オリゴヌクレオチドは一般的には２００残基未満（例えば、１５残基〜１００残基）の長さである。しかし、本願に使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、より長いポリヌクレオチド鎖を含むよう意図されている。オリゴヌクレオチドはその長さによって称されることが頻繁にある。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは「２４‐ｍｅｒ」と称される。一般的には、ヌクレオシド単量体は、ホスホロチオデート、ホスホロジチオデート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、およびホスホラミデートなどを含み、付随する対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、およびＮａ+など）が存在する場合にはこれを含むリン酸ジエステル結合またはその類似物により結合される。さらに、オリゴヌクレオチドは一般的には一本鎖である。オリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法により適宜調製され、前記任意の好適な方法は、既存または天然の配列の単離法、ＤＮＡの複製法または増幅法、逆転写法、適当な配列のクローニング法および制限消化法、または、Narang et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99に記載のホスホトリエステル方法、Brown et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151に記載のホスホジエステル方法、Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862に記載のdiethylphosphoramidite方法、Matteucci et al. (1981) J Am Chem Soc. 103:3185-3191に記載のトリエステル方法、自動合成方法、米国特許第４，４５８，０６６号（"PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES"、発効日：１９８４年７月３日、Caruthers et al.）に記載の固相支持方法、または当業者に公知の他の方法により実現される直接化学合成法を含むが、これらに限定されない。上述の全ての文献については、参照することにより各々の開示内容を本願に援用するものとする。
【００５１】
生重合体の「配列」は、生重合体中の単量体単位（例えば、ヌクレオチドなど）の順番および識別性を指す。核酸の配列（例えば、塩基配列）は一般的には５’末端側から３’末端側に読まれる。
【００５２】
「サブ配列」は、配列全体の任意の部分である。したがって、サブ配列は、より長い核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド）の一部である、アミノ酸または核酸の連続した配列を指す。
【００５３】
本願に使用するように、用語「対象」は、特定の処理を受ける任意の動物（例えば、哺乳類）を指し、前記任意の動物は、ヒト、ヒト以外の霊長類、および齧歯類などを含むが、これらに限定されない。通常、本願において用語「対象」および「患者」は互いに互換可能にヒト対象と関連して使用される。
【００５４】
本願に使用するように、用語「ヒト以外の動物」はヒト以外の全ての動物を指し、前記ヒト以外の全ての動物は、齧歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻類、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などの脊椎動物を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、または前駆体の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチド、ＲＮＡ、または前駆体は、全長コード配列によってコードされることが可能であり、全長コード配列または断片の所望の活性特性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド配位子結合、シグナル伝達など）が保持されている場合に限ってはコード配列の任意の部分によってコードされることが可能である。用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域も含み、コード領域に隣接して５’末端側および３’末端側に約１ｋｂ離れて位置する配列を含んでいるので、遺伝子は全長ｍＲＮＡの長さに対応する。上記コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ中に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流側に位置してｍＲＮＡ中に現れる配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形式およびゲノム形式の両方を含む。遺伝子のゲノム形式またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と称される非コード領域によって分断化されるコード領域を含む。イントロンは、転写されて核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）となる遺伝子断片である。イントロンは、エンハンサーなどの制御要素を含んでよい。イントロンは、核転写産物または一次転写産物から除去されるか、またはスプライシングにより取り出される。したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）処理された転写産物中には不在となる。ｍＲＮＡは翻訳中に作用して、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を指定する。
【００５６】
本願に使用する用語「遺伝子座」は、染色体上または連鎖地図上の核酸配列を指し、コード配列並びに遺伝子制御に関与する５’配列および３’配列を含む。
【００５７】
〔発明の詳細〕
本発明は、生体試料（例えば、組織試料、糞便試料、血液試料、血漿試料、血清試料、細胞試料、胆汁試料、ヒト胆汁試料）中の消化管癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢、および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））を検出する方法および生体マーカー（例えば、エピジェネティック生体マーカー）に関する。
【００５８】
ヒト癌の場合、エピジェネティック調節障害は遺伝子の突然変異と同じくらい一般的な事象である。これらの機序は遺伝子発現の定量的および定性的な変化に繋がり、選択的増殖の優位性を生じさせる。この結果、癌への形質転換が生じる。転写不活性化に関与する遺伝子プロモーター中の異常に過剰メチル化したＣｐＧアイランドは、癌において最も頻繁に見られるエピジェネティック変化の１つである。疾患を早期に検出する結果、大抵の種類の癌について臨床成果を向上させることができる。そのため、癌に関連して生ずる異常な遺伝子のメチル化を特定することは、有望な新規生体マーカーを示すことになる。胃腸系内の癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））に関しては、初期の研究によって、患者の血液および糞便内に異常なメチル化を示すＤＮＡの存在が確認されてきた。良性腫瘍においてさえ異常な過剰メチル化を高頻度で示す一方で、正常粘膜内においては異常な過剰メチル化をほとんど示さない遺伝子は、高リスクの腺腫並びに癌腫の低リスクの病期を早期に検出するという潜在的な臨床的有用性をもたらすことから、診断用の生体マーカーの良好な候補である。
【００５９】
しかし、一般的には、胃腸系内の癌を検出するための既存の初期マーカーは、感度および特異性が低度に留まっている。したがって、癌中において高い頻度および特異性でメチル化する個々の遺伝子、またはそのような遺伝子の集団が必要とされている。具体的には、非侵襲的技術（糞便試料の使用を含む技術など）または簡易に取得される試料材料（血液、血液製剤、または粘膜など）に対して用いられる技術において有用な遺伝子集団が必要とされている。このような遺伝子集団により、上記癌を早期に検出できる可能性が向上する。
【００６０】
したがって、本発明の実施形態は、組成物と、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、およびＺＮＦ３３１の１つ以上のメチル化状態を検出することを含む方法とを提供する。上記組成物および方法は、研究、スクリーニング、および臨床の用途（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌）に関する研究、スクリーニング、および臨床の用途）に使用される。
【００６１】
したがって、癌に関連して発生するプロモーターのメチル化を検出するために高感度の自動定量手法を使用して、消化管癌中において高頻度で特異的にメチル化する新規のエピバイオマーカーおよびその集団を特定した。
【００６２】
本願発明では、消化管癌の検出に特異的な幾つかのマーカーを例示するが、消化管癌の有無に対して相関性を有する任意のマーカーを使用してもよい。本願に使用するように、マーカーは、例えば、その産生または突然変異またはその産生の欠如が胃腸腫瘍に特有である核酸を含む。所定の分析に採用される特定のマーカー一式に応じて統計的分析は異なる。例えば、特定のマーカーの組み合わせが消化管癌に対して高い特異性を有する場合では、陽性結果の統計的有意性は高くなる。しかし、そのような特異性は感度を代償にして実現されるものである（例えば、消化管癌が発生していたとしても陰性結果が示される場合がある）。同様に、異なるマーカーの組み合わせを使用して、極めて高い感度を実現することがある（例えば、偽陰性を得ることは少なくなるが、特異性が低くなる）。
【００６３】
異なる民族集団または性別、異なる地理的分布、異なる病期、または、異なる特異性または感度の度合いに対して最適に機能する特定のマーカーの組み合わせを使用してもよい。また、疾患の進行に対する治療法の効果に特に特異的な特定のマーカーの組み合わせを開発してもよい。治療および／または一連の措置後に患者をモニタリングして、特にその治療および／または一連の措置の有効性を判断してもよい。
【００６４】
本発明の方法は、胃腸腫瘍を示す特定の標識物に限定されない。一部の実施形態では、胃腸腫瘍を示す標識物は、例えば、エピジェネティック変化を含む。エピジェネティック変化は、ＤＮＡのメチル化（例えば、ＣｐＧのメチル化）を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、メチル化（例えば、対照と比較した場合の過剰メチル化、対照と比較した場合の低メチル化）のレベル（例えば、頻度、スコア）の測定は、このような測定に用いる技術を制限することなく実現される。本発明の方法は、特定のエピジェネティック変化（例えば、ＤＮＡのメチル化）（例えば、ＣｐＧのメチル化）（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、またはＺＮＦ３３１のコーディング領域または調節領域内に発生するＣｐＧのメチル化）に限定されない。メチル化の変化は、例えば、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧアイランドのショア、またはＣｐＧアイランドおよびＣｐＧアイランドのショア以外の領域で発生してもよい。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明の方法、キット、およびシステムは、対象の遺伝子座（例えば、ヒトＤＮＡ中）（例えば、糞便試料、胃腸組織試料、腫瘍試料、血液試料、血清試料、血漿試料、細胞試料、胆汁試料などから抽出したヒトＤＮＡ中）のメチル化状態の測定を含む。任意の適当な方法を用いて、特定のＤＮＡが過剰メチル化しているものか、または低メチル化しているものかを決定することができる。例えば、非メチル化シトシンは変換してウラシルとなり、ＰＣＲ処理の最中にチミジン残基によって置換されるので、標準的なＰＣＲ技術を使用して、どの残基がメチル化したものであるかを決定することが可能になる。ＰＣＲ反応物は、例えば、亜硫酸水素ナトリウムで処理済みまたは未処理の１０μＬの捕捉ＤＮＡと、ＩＸＰＣＲバッファと、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、０．５μＭの配列特異的プライマー（例えば、捕捉ＤＮＡ中でＣｐＧアイランドまたはＣｐＧアイランドのショアの側面位置するプライマー）と、５単位のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、PE Applied Biosystems（Norwalk, CT）のAmplitaq DNA polymerase）とを総量が５０μｌとなるように含むことができる。典型的なＰＣＲの手順は、例えば、９４℃で５分間の初期変性工程と、９４℃で１分間の増幅処理、６０℃で１分間の増幅処理、および７２℃で１分間の増幅処理から構成される４０サイクルの増幅処理と、７２℃で５分間の最終伸長工程とを含むことができる。
【００６６】
捕捉ＤＮＡ内の何れの残基がメチル化しているかを分析するために、亜硫酸水素ナトリウムで処理済みの試料に対応するＰＣＲ反応物の配列と、亜硫酸水素ナトリウムで未処理の試料に対応するＰＣＲ反応物の配列とを比較することができる。未処理のＤＮＡに由来の配列より、ＰＣＲ生成物内の全シトシン残基の位置が明らかになる。硫酸水素ナトリウムで処理したＤＮＡの配列中では、非メチル化のシトシンは変換してチミジン残基となる一方で、メチル化している残基は、亜硫酸水素塩を用いた処理の作用を受けない。
【００６７】
本発明の一部の実施形態は次世代または高性能の配列決定法を使用する。例えば、連鎖停止剤配列決定方法（chain terminator (Sanger) sequencing method）、ダイターミネータ配列決定方法（dye terminator sequencing method）、および高速大量処理配列決定方法（high-throughput sequencing method）を含む多様な核酸配列決定法を本発明の方法に使用することを意図している。これら配列決定方法の多くは当該技術分野に周知の方法である。Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1997); Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977); Drmanac, et al., Nat. Biotechnol. 16:54-58 (1998); Kato, Int. J. Clin. Exp. Med. 2:193-202 (2009); Ronaghi et al., Anal. Biochem. 242:84-89 (1996); Margulies et al., Nature 437:376-380 (2005); Ruparel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5932-5937 (2005), and Harris et al., Science 320:106-109 (2008); Levene et al., Science 299:682-686 (2003); Korlach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:1176-1181 (2008); Branton et al., Nat. Biotechnol. 26(10):1146-53 (2008); Eid et al., Science 323:133-138 (2009)を参照。上述の各文献を参照することにより、その全開示内容を本願に援用するものとする。
【００６８】
同様に、一部の実施形態では、本発明の方法は、試料（例えば、糞便、ヒト胆汁、または血液から抽出したＤＮＡ試料）中の胃腸腫瘍の指標のメチル化レベル（例えば、遺伝子座のコーディング領域または調節領域中のＣｐＧアイランドまたはＣｐＧの岸のメチル化レベル）を決定（例えば、アセスメント、解明、定量化）することを含む。当業者であれば、増加した、減少した、情報提供的、または他の判別可能な程度に異なる、メチル化レベルは、基準（例えば、基準レベル、対照レベル、または閾値レベルなど）との比較において表現されるものであることを理解するであろう。例えば、遺伝子座（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、またはＺＮＦ３３１）のメチル化状態（例えば、ＣｐＧのＤＮＡのメチル化）について本願に使用する用語「高度メチル化」は、胃腸腫瘍（例えば、結腸直腸癌または胆管癌）の発症していない哺乳類のランダムな母集団（例えば、個体数が１０、２０、３０、４０、５０、１００、または５００の哺乳類のランダムな母集団）に由来の試料におけるメチル化スコアの中央値よりも高い任意のメチル化レベルである。メチル化の高レベルは、対応の基準レベルより高いレベルであれば任意のレベルとすることができる。例えば、対象遺伝子座（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、またはＺＮＦ３３１）のメチル化の高レベルは、正常試料において実測した基準メチル化レベルと比較して０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍以上大きい値とすることができる。なお、基準レベルは任意の量とすることができる。特定の核酸マーカーのマトリクス集団において検出したメチル化事象について本願で使用している用語「高メチル化スコア」は、胃腸腫瘍（例えば、結腸直腸癌または胆管癌）の発症していない哺乳類のランダムな母集団（例えば、個体数が１０、２０、３０、４０、５０、１００、または５００の哺乳類のランダムな母集団）に由来の試料におけるメチル化スコアの中央値よりも高い任意のメチル化スコアである。特定の核酸マーカーのマトリクス集団の高メチル化スコアは、対応の基準スコアより高いスコアであれば任意のスコアとすることができる。例えば、対象遺伝子座（例えば、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、またはＺＮＦ３３１）中の高メチル化スコアは、正常試料に実測した基準メチル化スコアと比較して０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍以上大きいスコアとすることができる。なお、基準スコアは任意の量とすることができる。
【００６９】
上記方法は特定の哺乳類種に限定されるものではない。一部の実施形態では、哺乳類はヒトである。一部の実施形態では、胃腸腫瘍は前癌状態の腫瘍である。一部の実施形態では、胃腸腫瘍は悪性腫瘍である。一部の実施形態では、胃腸腫瘍は、癌の病期（例えば、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ期）に関係無く、胃腸腫瘍（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））である。
【００７０】
本発明はまた、医療または研究の専門家が哺乳類の胃腸腫瘍（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／またはヒト胆管の癌（例えば、胆管癌））の有無を決定するのを支援する方法および材料を提供する。医療専門家は、例えば、医師、看護師、医療研究の技術者、および薬剤師とすることができる。研究専門家は、例えば、主研究者、研究技術者、博士研修者、および大学院生とすることができる。専門家への支援は、例えば、（１）試料中の特定のマーカーの比率を決定すること、および（２）決定後に試料中の特定のマーカーの比率の情報を専門家に伝えることにより実現することができる。
【００７１】
医療専門家は、糞便試料、血液試料、血清試料、胆汁試料、または血漿試料中の特定のマーカーのレベル（スコア、頻度）についての報告を取得した後、患者治療に作用し得る１つ以上の措置を講ずることができる。例えば、医療専門家は、報告結果を患者の医療記録に記録することができる。医療専門家は、新生腫瘍組織形成の診断結果を記録するか、または他の方法で患者の医療記録に変更を加えて、患者の病状を医療記録に反映させることができる。一部の場合では、医療専門家は、患者の容体に対して臨床的介入を行うために、患者の全医療記録を評価検討して、複数の治療戦略について評価を行うことができる。一部の場合では、医療専門家は、報告を受けた指標に基づいて腫瘍の発生を予測し、記録することができる。一部の場合では、医療専門家は、患者の容体に対して臨床的介入を行うために、患者の全医療記録を評価検討し、複数の治療戦略について評価を行うことができる。
【００７２】
医療専門家は、患者の糞便試料、血液試料、血清試料、胆汁試料、または血漿試料中のマーカーに関連のレベル（スコア、頻度）についての情報を受け取った後、胃腸腫瘍の治療を開始するか、または変更することができる。一部の場合では、医療専門家は、以前に受け取った報告と最近伝達されたマーカーのレベル（スコア、頻度）とを比較して、治療内容の変更を勧めることができる。一部の場合では、医療専門家は、胃腸腫瘍への新規な治療的介入のために、患者を臨床試験に登録させることができる。一部の場合では、医療専門家は、患者の症状が臨床的介入を必要とするまで治療の開始を待機させることを選択することができる。
【００７３】
医療専門家は、評価結果を患者または患者の家族に知らせることができる。一部の場合では、医療専門家は、新生腫瘍組織形成に関する情報（治療オプション、予後診断、専門家（例えば、癌専門医師および／または放射線科医師）への紹介を含む）を患者および／または患者の家族に提供することができる。一部の場合では、医療専門家は、患者の医療記録のコピーを提供して、専門家に評価結果を伝達することができる。研究専門家は、対象の評価結果に関する情報を利用して胃腸腫瘍の研究を発展させることができる。例えば、研究者は、新生腫瘍組織形成の治療薬の有効性に関する情報を用いて上記評価結果上でデータ編集を行い、効果的な治療を特定することができる。一部の場合では、研究専門家は、アッセイ結果を取得して、調査研究または臨床試験への対象の登録または継続した参加についての評価を行う。一部の場合では、研究専門家は、アッセイ結果に基づいて対象の容体の重篤性を分類することができる。一部の場合では、研究専門家は、対象のアッセイ結果を医療専門家へと伝達することができる。一部の場合では、研究専門家は、新生腫瘍組織形成の臨床的評価および治療のために対象を医療専門家へ紹介することができる。任意の適当な方法を用いて、情報を他の者（例えば、専門家）へ伝達することが可能である。例えば、専門家に情報を直接的または間接的に提供することができる。例えば、検査技師は、コンピュータを用いて作成した記録にアッセイ結果を入力することができる。一部の場合では、医療記録または研究記録に物理的変化を加えて情報を伝える。例えば、医療専門家は、医療記録の内容を検討している他の医療専門家に診断結果を伝達するために、恒久的に残る注釈を作成するか、または医療記録を警告することが可能である。さらに、任意の種類の伝達手法を用いて情報を伝達することができる。例えば、郵便物、電子メール、電話、対面やりとりを使用することができる。また、伝達対象の情報を専門家に電子的に利用可能とすることで、この情報を専門家に伝達することができる。例えば、情報をコンピュータのデータベース上に移して専門家がアクセスできるようにすることで、専門家に情報を伝達することができる。さらに、病院、診療所、または専門家の代理人としての役割を担う研究機関に情報を伝達することができる。
【００７４】
なお、単一の試料を１つ以上の胃腸腫瘍特異的なマーカーについて分析することができる。好適な実施形態では、例えば、多重マーカー分析法を用いて、単一の試料を複数の胃腸腫瘍特異的なマーカーについて分析をする。さらに、単一の哺乳動物について複数の試料を収集して、本願に記載のように分析することができる。一部の実施形態では、細胞学的解析を行う第１の部分と、さらなる精製または加工処理（例えば、配列特異的な捕捉工程）を（例えば、メチル化レベルの分析のために特定マーカーを単離することを目的として）行う第２の部分とに試料を分ける。一部の実施形態では、上記試料を上記第１の部分および上記第２の部分に分ける前に、上記試料に対して１つ以上の事前処理工程を行う。一部の実施形態では、ＤＮＡの完全性の向上および／またはＤＮＡの分解の抑制（例えば、分解防止剤（例えば、キレート剤、ＤＮａｓｅ阻害剤）を添加した貯蔵バッファの使用を介する、またはＤＮＡの完全性を向上させる取扱い技術または処理技術（例えば、低温（例えば、−８０℃）での即時処理法または保存法）を介する）を実現するような方法で、上記試料の処理、取扱い、または保存を行う。
【００７５】
本発明の一部の実施形態では、ＧＬＤＣ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、またはＺＮＦ３３１の例えば１つ以上から選択される遺伝子のメチル化状態を検出するための１つ以上の試薬を備える、癌の診断またはスクリーニングを行うための診断キットを提供する。例えば、一部の実施形態では、上記試薬は核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブなど）を含む。一部の実施形態では、キットは、メチル化状態の検出および／または診断または予後診断の提供を行うのに有用、必要、または十分な試薬を提供する。
【００７６】
上記診断キットは、メチル化特異的制限酵素の使用または上記遺伝子の発現レベルの測定によって分析（メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）配列分析法などのＰＣＲ分析法、重亜硫酸処理法、重亜硫酸配列決定法、電気泳動法、パイロシークエンス法、制限消化法による質量分析法および配列分析法、次世代配列決定法、定量的および／または定性的メチル化法、パイロシークエンス法、サザンブロット法、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）法、単一ヌクレオチドプライマー伸長法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ法、ＳＮＵＰＥ法、ＣＯＢＲＡ法、質量分析法など）を行うために必要、十分、または有用な任意の試薬または培地をさらに備えてもよい。具体的には、上記キットは、デオキシリボヌクレオシド、三リン酸塩、緩衝剤、安定剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ（メチル化特異的エンドヌクレアーゼを含む）、標識（蛍光標識、化学発光標識、および放射性標識を含む）からなる一群から選択される１つ以上の要素をさらに備えてもよい。本発明に係る診断アッセイ法は、ＤＮＡの単離に必要な１つ以上の試薬をさらに備えてもよい。
【００７７】
一部の実施形態では、本発明のキットは、商業販売用に試薬を厳重な閉鎖環境に閉じ込めて含む手段（例えば、所望の試薬を保持する射出成形容器または吹き込み成形容器）を備える。また、本願に開示の方法の特定の工程を実施するのに好適な他の容器を提供してもよい。
【００７８】
一部の実施形態では、本願に開示の方法は、胃腸内の新生組織（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））の治療をモニタリングするのに役立つ。例えば、一部の実施形態では、上記方法を治療の直前、最中、および／または直後に行って、治療の成功を観察してもよい。一部の実施形態では、治療の成功を確実なものにするために、上記方法は無病患者に周期的に行われる。
【００７９】
本発明はまた、多様なコンピュータ関連の実施形態を提供する。特に、一部の実施形態では、本発明は、対象から採取した試料から得られた胃腸腫瘍特異的マーカーの検出結果パターンを分析し、これを、例えば、胃腸腫瘍の有無、または特定の病期または胃腸腫瘍を示すことが知られているようなマーカーのパターンのライブラリと比較するためのコンピュータプログラミング手法を提供する。
【００８０】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの異なる時点で採取した試料から得られた、胃腸腫瘍に特異的なマーカーの検出結果の第１のパターンおよび第２のパターンを分析し、これらを比較するコンピュータプログラミング手法を提供する。一部の実施形態では、上記第１のパターンは、消化管癌の前癌症状および／または低リスク状態、および／または前癌症状から癌症状までの進行を示すものであってよい。そのような実施形態では、上記比較によって、第１の時点から第２の時点までの進行の様子がモニタリングされる。
【００８１】
さらに他の実施形態では、本発明は、試料から得られた、胃腸腫瘍に特異的なマーカーの検出結果のパターンを分析し、これを、消化管癌の有無を示すことが知られている胃腸腫瘍に特異的なマーカーのパターンのライブラリと比較するコンピュータプログラミング手法を提供し、前記比較によって、例えば、良性胃腸腫瘍および侵攻性の悪性胃腸腫瘍は鑑別して診断される（例えば、マーカーのパターンによって、癌の状態は、病期決定および／または等級付けされる）。
【００８２】
本願に記載の方法およびシステムは、多数の方法で実施することができる。一実施形態では、上記方法は情報通信基盤（例えば、インターネット）の使用を含む。本発明の幾つかの実施形態を以下に説明する。なお、本発明は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサ、分散サーバ（例えば、クラウドコンピューティングに用いられるような分散サーバ）、またはこれらの組み合わせの多様な形式で実現してよいことも理解されるであろう。本願に記載の方法およびシステムは、ハードウェアおよびソフトウェアの組み合わせとして実施することができる。ソフトウェアは、プログラム記憶装置上で実体的に具現化されるアプリケーションプログラムとして実施することができる。または、ソフトウェアは、ユーザ側のコンピュータ環境およびリモートサイト（サービス提供者機関）側の校閲者のコンピュータ環境に実装されたソフトウェアの異なる部分（例えばアプレット）として実施することができる。
【００８３】
例えば、ユーザによるデータ入力の最中またはデータ入力の後、一部のデータ処理をユーザ側のコンピュータ環境で行うことができる。例えば、ユーザ側のコンピュータ環境は、プラットホームを示す規定コードまたはキャリア／診断試験、またはその両方（すなわち、処理または一部処理が行われた応答として、応答を試験コードおよびフラグ構成の形式で検閲者側のコンピュータ環境に伝達して、検閲者側のコンピュータ環境において後段の処理が１つ以上のアルゴリズムを実行して結果の提供および／または報告の作成を行うようにする、規定フラグを用いたデータ処理および／またはフラグ構成の作成）を提供するようにプログラミングされることができる。
【００８４】
本願に記載のアルゴリズムを実行するためのアプリケーションプログラムは、任意の好適なアーキテクチャを備える機械にアップロードされて実行されてもよい。一般的には、上記機械は、１つ以上の中央演算処理装置（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、および入出力（Ｉ／Ｏ）インターフェースなどのハードウェアを含むコンピュータプラットフォームを備える。また、上記コンピュータプラットフォームは、オペレーティングシステムおよびマイクロインストラクションコードを備える。本願に記載の多様な処理および機能は、上記オペレーティングシステムを介して実行される、マイクロインストラクションコードの一部またはアプリケーションプログラムの一部（またはその組み合わせ）であってよい。さらに、さらなるデータ記憶装置および印刷機器などの多様な他の周辺機器を上記コンピュータプラットフォームに接続してもよい。
【００８５】
コンピュータシステムとして、上記システムは通常はプロセッサ装置を備える。上記プロセッサ装置は、試験データ（例えば、アッセイを行った特定の遺伝子産物）および試験結果データ（例えば、試料から得られる、胃腸腫瘍に特異的なマーカーの検出結果パターン）を通常含む情報を受信するように動作する。受信した上記情報は、少なくとも一時的にデータベースに記憶し、前癌症状の有無を示すことが知られているかマーカーのパターンのライブラリまたは消化管癌の病期および／または悪性度を示すことが知られているマーカーのパターンのライブラリと比較してデータ分析することができる。
【００８６】
入出力データの一部または全体についても、電子的に送信することができる。特定の出力データ（例えば、報告）を電子的または電話を用いて（例えば、ファックスバックなどの装置を使用するファクシミリを使用して）送信することが可能である。典型的な出力受信装置は、表示要素、印刷機、およびファクシミリ装置などを備えることができる。電子形式の通信および／または表示は、電子メールおよび双方向テレビなどを含むことができる。一部の実施形態では、入力データの全体または一部、および／または出力データの全体または一部（例えば、通常の場合では、少なくとも、前癌状態の有無を示すことが知られている、胃腸腫瘍に特異的なマーカーの検出結果パターンのライブラリ）は、アクセス（例えば、機密アクセス）できるようにサーバ上に保持される。上記結果は、所望されるように、専門家にアクセスされるか、または専門家へ送信されてよい。
【００８７】
本願に記載の方法に使用するシステムは、通常、少なくとも１つのコンピュータプロセッサ（例えば、本願に記載の方法全体が単一部位において実行されるようなコンピュータプロセッサ）またはネットワーク化された少なくとも２つのコンピュータプロセッサ（例えば、対象から取得した試料について検出したマーカーのデータがユーザ（例えば、技術者またはアッセイの実行者）によって入力され、分析用の第２のコンピュータプロセッサ例えば、胃腸腫瘍に特異的なマーカーの検出結果パターンは、前癌状態の有無を示すことが知られているパターンのライブラリと比較される）に向けてリモートサイトへ送信される（ここで、第１および第２のコンピュータプロセッサはネットワークにより（例えば、イントラネットまたはインターネットを介して）接続されている）を備える。また、上記システムは、入力用のユーザコンポーネントと、データ確認用および報告作成（前癌状態の検出、胃腸腫瘍の病期決定および／または等級付け、または、前癌状態または胃腸腫瘍の進行のモニタリングを含む）用の校閲者コンポーネントとを備える。上記システムのさらなるコンポーネントは、サーバコンポーネントと、データ格納用のデータベース（例えば、レポート要素のデータベース（例えば、前癌状態の有無を示すことが知られているか、および／または胃腸腫瘍の悪性度および／または病期を示すことが知られているマーカーのパターンのライブラリ）またはユーザによるデータ入出力を含むことが可能な関係型データベース（ＲＤＢ））とを備えることが可能である。上記コンピュータプロセッサとして、個人用のデスクトップ型コンピュータ（例えば、ＩＢＭ、Ｄｅｌｌ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）、携帯用コンピュータ、大型汎用コンピュータ、ミニコン、または他のコンピュータ装置において一般的に見ることのできるプロセッサを使用することが可能である。
【００８８】
上記入力コンポーネントとして、アプリケーションを実行する全ての電力および特性を提供する完全で独立した個人用コンピュータを使用することができる。上記ユーザコンポーネントは、通常、任意の所望のオペレーティングシステムの下で動作し、且つ、通信要素（例えば、ネットワークに接続するためのモデムまたは他のハードウェア）、１つ以上の入力装置（例えば、キーボード、マウス、キーパッド、または、情報または命令を伝達するための他の装置）、記憶素子（例えば、ハードドライブまたは他のコンピュータ読み取りおよび書き込み可能な記憶素子）、および表示要素（例えば、モニター、テレビ受信機、ＬＣＤ、ＬＥＤ、または、ユーザに情報を伝達する他の表示装置）を備える。ユーザは、入力装置を介して上記コンピュータプロセッサに入力コマンドを入力する。通常、上記ユーザインターフェースは、ウェブブラウザアプリケーション用に書かれたグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）である。
【００８９】
上記サーバコンポーネントとして、個人用コンピュータ、ミニコンピュータ、または大型汎用コンピュータを使用することができる。または、上記サーバコンポーネントを（例えば、クラウドコンピュータ用途の場合のように）複数のサーバ上に分散させることができる。また、上記サーバコンポーネントは、データ管理、クライアント間の情報共有、ネットワーク管理、およびセキュリティを提供する。使用する上記アプリケーションおよび任意のデータベースは、同一または異なるサーバ上に置くことができる。ユーザおよびサーバ用の他のコンピュータ構成も意図され、意図される他のコンピュータ構成は、大型汎用コンピュータなどの単一の機械、一群の機械、または他の好適な構成で行われる処理を含む。一般的には、ユーザ機械およびサーバ機械は協働して本発明の処理を実現する。
【００９０】
上記データベースの使用場面では通常、上記データベースはデータベースサーバコンポーネントに接続されている。上記データベースとして、データを保持する任意の装置を使用することができる。例えば、上記データベースとして、コンピュータ用の任意の磁気記憶装置または光学記憶装置（例えば、ＣＤＲＯＭ、内蔵ハードドライブ、テープドライブ）を使用することができる。上記データベースは、上記サーバコンポーネントから離して配置することができる（この場合では、ネットワークやモデムなどを介してアクセスを行う）。または、上記データベースは、上記サーバコンポーネントに局所的に配置することもできる。
【００９１】
上記データベースを上記システムおよび上記方法に使用する場合では、上記データベースとして、データ項目間の関係性にしたがって編成およびアクセスされる関係型データベースを使用することができる。関係型データベースは、通常、複数のテーブル（エンティティ）から構成されている。テーブルの行は記録（個々の項目の情報の集合）を示し、テーブルの列はフィールド（記録の特定の属性）を示す。最も単純な考案では、上記関係型データベースは、少なくとも１つの共通のフィールドを介して互いに「関連している」データエントリの集合である。
【００９２】
コンピュータおよび印刷機器を設置したさらなるワークステーションをサービス時に用いてデータ入力を行ってもよい。一部の実施形態においては、所望の場合では、これにより適当なレポートを作成してもよい。コンピュータは、アプリケーションを開始するためのショートカットを（例えば、デスクトップ上に）設けて、データエントリ、データ送信、データ分析、レポート受信などの開始を所望通りに容易にすることが可能である。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明は、胃腸腫瘍（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））を発症させる対象のリスクプロファイルを取得する方法を提供する。一部の実施形態では、このような方法は、対象（例えば、消化管癌を発症するリスクを有するヒト；定期健康診断を受診しているヒト）から糞便試料、ヒト胆液試料、または血液試料を取得すること、取得した前記糞便、血液、血漿、胆液、または血清試料中の糞便、血液、血漿、胆液、または血清において、またはこれに関連して、胃腸腫瘍に特異的な１つ以上のマーカーの有無またはそのレベル（例えば、メチル化頻度またはスコア）を検出すること、および、胃腸新生組織形成を示す指標の検出レベル（スコア、頻度）または有無の検出に応じて、胃腸腫瘍（例えば、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌（例えば、胆管癌））を発症するリスクプロファイルの作成を行うことを含む。例えば、一部の実施形態では、作成したリスクプロファイルは、特定のマーカーに応じて変化し、有無または規定の閾値レベルであることが検出される。本発明は、上記リスクプロファイルを作成する特定の様式に限定されない。一部の実施形態では、プロセッサ（例えば、コンピュータ）を用いてこのようなリスクプロファイルを作成している。一部の実施形態では、上記プロセッサは、本発明の方法とともに決定されるような、特定の剥離上皮マーカーの有無の解釈に特異的なアルゴリズム（例えば、ソフトウェア）を使用する。一部の実施形態では、このようなアルゴリズムに対して、本発明の方法と一緒に決定される特定マーカーの有無を入力して、この入力と設定基準（例えば、前癌状態用の設定基準、消化管癌を発症する多様なリスクレベルの設定基準、消化管癌の多様な病期に診断された対象用の設定基準）との比較に基づいてリスクプロファイルの報告を行う。一部の実施形態では、上記リスクプロファイルは、消化管癌を発症する対象のリスクまたは消化管癌を再発症する対象のリスクを示唆する。一部の実施形態では、上記リスクプロファイルは、例えば、患者が消化管癌を発症または再発する危険性が極めて低いこと、低いこと、中程度であること、高いこと、極めて高いことを示す。一部の実施形態では、ヘルスケアの提供者（例えば、癌専門医）は、一連の治療または介入（例えば、生体検査、静観、癌専門医への紹介、外科医への紹介）を決定するうえで、このようなリスクプロファイルを使用することになる。
【００９４】
以下に実施例を提供して本発明の特定の好適な実施形態および態様を実証するとともに、さらなる説明を行う。但し、以下の実施例は本発明の範囲を限定するよう構成したものではない。
【００９５】
〔実施例１〕
結腸直腸癌中における、新規のエピジェネティック生体マーカー（ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａ）の特定
（材料）
本プロジェクトでは、２０系統の結腸癌細胞株からなる集団の分析を行う。上記結腸癌細胞株の集団は、１１系統のマイクロサテライト安定性細胞株（ＭＳＳ；ＡＬＡ、Ｃｏｌｏ３２０、ＥＢ、ＦＲＩ、ＨＴ２９、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＬＳ１０３４、ＳＷ４８０、Ｖ９Ｐ）および９系統のマイクロサテライト不安定性細胞株（ＭＳＩ；Ｃｏ１１５、ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ、ＬＳ１７４Ｔ、ＲＫＯ、ＳＷ４８、ＴＣ７、ＴＣ７１）を含んでおり、結腸直腸癌の表現型サブ集団の両方を代表するものであった。本研究では、４７種類の原発性結腸直腸癌の試料（２７種類のＭＳＳ腫瘍および２０種類のＭＳＩ腫瘍）についてＤＮＡプロモーターのメチル化分析を行った。上記試料全体のうち２４種類の試料については、１９８７年から１９８９年にかけてノルウェー南西部の７つの病院から回収した一連の材料に由来の試料を使用した。残りの２３種類の試料については、２００５年から２００７年にかけてAker大学病院で収集した。また、本プロジェクトには、生前に結腸直腸癌を未発症の個体に由来する４９種類の正常な結腸直腸粘膜も含めた。
【００９６】
（方法）
（ゲノム全域の遺伝子発現解析）
ＡＺＡおよびＴＳＡを用いて処理を行った前後に、ＡＢ１７００マイクロアレイプラットフォームを用いて結腸癌細胞株の遺伝子発現解析を行い、結腸直腸の腫瘍形成においてエピジェネティックに不活化した新規遺伝子標的を特定した。３種類のＭＳＩ細胞株（ＳＷ４８、ＲＫＯ、ＨＣＴ１５）および３種類のＭＳＳ細胞株（ＳＷ４８０、ＬＳ１０３４、ＨＴ２９）を含む６種類の細胞株を分析した。上記処理後に上記６系統の細胞株の少なくとも５系統以上において４倍以上の上方制御を受けた遺伝子のみを選択し、これをさらなる調査用の対象とした。正しいエピジェネティック標的を選択する可能性を向上させるために、同一の遺伝子について、原発性結腸直腸癌および正常組織試料中での遺伝子発現を同一のマイクロアレイプラットフォームを用いて解析した。上記細胞株中で反応を示すとともに、同時に正常組織と比較して癌腫中に下方制御が見られた遺伝子のみを選択し、これをさらなる調査用の対象とした。新たな過剰メチル化遺伝子を発見するための上記選択の工程を要約して図１に示す。
【００９７】
（メチル化特異的な実験解析法）
遺伝子発現の欠如は頻繁に、プロモーターＣｐＧアイランドの異常なメチル化に伴って発生する。そのため、ＤＮＡメチル化の分析法に好適な標的遺伝子では、プロモーター領域内にはＣｐＧアイランドが含まれているべきである。したがって、CpG Island Searcherを利用して、１つ以上のアイランドが存在することについて候補遺伝子の分析を行った。ゲノム全域の遺伝子発現研究から最も有望とされた遺伝子に対して、重亜硫酸処理、定性的および定量的なメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応法、並びに直接重亜硫酸配列決定法を行った。
【００９８】
（統計）
フィッシャーの正確確立検定（両側検定）を用いて２×２の全分割表についての分析を行った。一方、２×３および２×４の分割表に対しては、ピアソンのカイ二乗検定（両側検定）を用いた。なお、ｐ値が０．０５（５％）以下である場合には有意であるものとみなした。二値回帰分析法を用いてＤＮＡのメチル化と患者の年齢との間に存在する可能性のある関連性を調べた。ＰＭＲ値および組織の種類（癌腫組織および正常組織）を入力値に用いて、個々の遺伝子の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。ＳＰＳＳ１６．０ソフトウェアを用いて、統計的検定（両側検定）から全計算を導き出した。
【００９９】
（結果）
（細胞株および組織試料の候補遺伝子の定性的および定量的なメチル化分析）
２０系統の結腸癌細胞株のうちＢＮＩＰ３、ＣＢＳ、ＤＤＸ４３、ＧＬＤＣ、ＩＱＣＧ、ＰＥＧ１０、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＲＡＳＳＦ４、ＲＢＰ７、およびＷＤＲ２１Ｂは、それぞれ７０％、７４％、８９％、７５％、０％、９０％、９５％、５％、４５％、および１００％の比率でメチル化した。原発性結腸直腸癌および正常組織の試料を用いた試験において、過剰メチル化の頻度が最も高かった６つの遺伝子にメチル化分析を行った。ＢＮＩＰ３、ＧＬＤＣ、およびＰＰＰ１Ｒ１４Ａは、上記癌種の８系統、１４系統、および１１系統でそれぞれメチル化し、上記正常組織の試料の１系統、０系統、および０系統でそれぞれメチル化した。
【０１００】
悪性および正常の結腸直腸組織のより大きな一連の試料においてリアルタイム定量的ＭＳＰによるさらなる調査を行うために、ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａを選択した。
【０１０１】
（ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａの定量的メチル化プロファイル）
ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａのプロモーターはそれぞれ上記原発性結腸直腸腫瘍の６０％および５７％においてメチル化していることが見出された。ＰＰＰ１Ｒ１４Ａに関しては、ＰＭＲ値が３．５より大きい値（＞３．５）の試料については、メチル化陽性であるとのスコア付けを行った。ＧＬＤＣに関しては、ＰＭＲ値が２．５より大きい値（＞２．５）の試料については、メチル化陽性であるとのスコア付けを行った。上記のカットオフ値を用いることで、何れの遺伝子に関しても、正常な粘膜の試料をメチル化粘膜として記録することがなかったので、両アッセイにおいて１００％の特異性を実現した。
【０１０２】
ＲＯＣ曲線分析を利用して、バイオマーカーとしての遺伝子の診断精度の評価を行う統計的方法を提供した。曲線下面積（area under the curve）（AUC）の値が０．８１９（Ｐ＝７・１０-8）の場合では、ＧＬＤＣの感度および選択性はそれぞれ６４％および１００％であった。曲線下面積（AUC）の値が０．７９２（Ｐ＝８．５９・１０-7）の場合では、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａの感度および選択性はそれぞれ５７．５％および１００％であった。ＲＯＣ曲線を図２および３に示す。
【０１０３】
（従来のＭＳＰ法と定量的リアルタイムＭＳＰ法との整合性）
結腸癌細胞株（ｎ＝２０）、原発性腫瘍（ｎ＝１１）、および正常組織の試料（ｎ＝８）について、ｑＭＳＰ分析を用いて取得した結果と従来のＭＳＰ法を用い取得した結果とを比較した。上記従来のＭＳＰ法では、細胞株試料を「メチル化」、「部分的にメチル化」、および「非メチル化」の何れかにスコア付けし、組織試料を「メチル化」および「非メチル化」の何れかにスコア付けする。一方、ｑＭＳＰ法のデータは、０〜１００の範囲のＤＮＡメチル化レベルの定量測定結果を提供する（図４）。ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａのカットオフ値をそれぞれ２．５および３．５とした場合では、上記ｑＭＳＰ法を用いて得られたデータと上記従来のＭＳＰ法を用いて得られたデータとの間に良好な整合性が得られた。ＧＬＤＣに関しては、３９種類の試料のうち３９種類全て（１００％）が整合性を示した（Ｐ＝０．０００）。しかし、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａに関しては、３９種類の試料のうち１種類が、定量的なゲル系ＭＳＰ法において「非メチル化」とスコア付けされる一方で、定性的なリアルタイムＭＳＰ分析法において「メチル化」とスコア付けされる結果となった。したがって、両方法が判別するメチル化状態は、上記３９種類の試料のうち３８種類（９７％）（Ｐ＝２・１０−9）について一致していた。この結果を図４および図５に示すとともに、要約して表１および表２に示す。
【０１０４】
【表１】
2014508528.tif 000002
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
（重亜硫酸配列決定法による、ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａのプロモーターのメチル化状態の確認）
結腸癌細胞株のＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａについて重亜硫酸配列決定法を行ったところ、非ＣｐＧシトシンの全てが完全に変換されてチミンとなっていることが示された。この結果を配列決定法の詳細な結果およびＭＳＰの詳細な状態と一緒に図６および図７に示す。一般的に、ＭＳＰ法によって「完全にメチル化」したとスコア付けられる細胞株の大部分は、重亜硫酸配列決定分析法においても、「完全にメチル化」したものであると判断される。
【０１０７】
（ＤＮＡ腫瘍メチル化と遺伝的および臨床病理学的特徴との関連性）
ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４ＡのＤＮＡメチル化状態を腫瘍の遺伝的および臨床病理学的特徴と比較した。プロモーターのメチル化は、患者の腫瘍病期、年齢、および性別とは無関係であった。ＰＰＰ１Ｒ１４Ａのメチル化はマイクロサテライト不安定性を示す腫瘍（したがって、結腸の右側に位置する腫瘍）においてより顕著であった。
【０１０８】
〔実施例２〕
消化管癌（胆管癌）内の新規のエピジェネティックな生体マーカー（ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＮＦ３３、およびＺＳＣＡＮ）の特定
胆管癌（ＣＣＡ）は診断が困難なことで有名であり、臨床所見の遅れから死亡率が高くなる。ＣｐＧアイランドのプロモーターの過剰メチル化は癌の発生と関係している。本願発明者は、ＣＣＡの診断精度を向上させる可能性を有する新規のエピジェネティックな生体マーカーを特定することを目標とした。ＣＣＡ細胞株に行ったマイクロアレイ解析手法と、従来の刊行物に非悪性の腫瘍対照中の発現プロファイルと比較して記載された腫瘍中の発現プロファイルとを比較した。定性的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）法を使用して、胃腸管に由来の癌細胞株内の一般的な候補遺伝子をプロモーターのメチル化状態について調べた。新鮮凍結組織（ｎ＝３４）およびホルマリンで固定したパラフィン包埋組織（ｎ＝５９）を含む２種類のＣＣＡ試料シリーズ内のメチル化頻度の高い遺伝子に定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ）法を行った。マイクロアレイ解析法より、胆管癌内のプロモーター領域にＣｐＧアイランドを有する４３種類の遺伝子は、非エピジェネティック処理に反応を示し、且つ同時に、非悪性の対照腫瘍と比較して下方制御を受けた。本願発明者は、ＣＣＡ細胞株内のメチル化頻度の高い遺伝子として、１２種類の遺伝子を特定した。特定した上記遺伝子のうち、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＳＦＲＰ１、およびＺＳＣＡＮ１８は、腫瘍中においても高いメチル化頻度を示した。同一の遺伝子について、非悪性の試料では非メチル化が生じた。４種類のマーカーのうち陽性を示す少なくとも１種類のマーカーは、総感度が新鮮凍結腫瘍において１００％であり、保存後の腫瘍において８１％であり、特異性がこれら両方の試料シリーズにおいて１００％であった。その結果生じる受信者動作特性曲線の下面積はそれぞれ０．９９６および０．９０４であった。新規のエピジェネティック生体マーカーの集団は、ＣＣＡの場合において高い感度および特異性を示した。
【０１０９】
本実施例では、エピゲノム全域のアプローチ手法（２５）を利用してＣＣＡ内のＤＮＡメチル化候補遺伝子のリストを特定することについて記載する。癌細胞株および患者由来の材料内の潜在的な標的遺伝子に定性的および定量的プロモーターメチル化分析法を行い、ＣＣＡを示す３種類の新規の潜在的な生体マーカーを特定した。
【０１１０】
（材料および方法）
（実験アプローチ法）
本研究で使用する段階的な実験アプローチ法を図８に示す。簡潔には、エピジェネティック薬剤処理に反応を示す癌細胞株内の遺伝子を非悪性組織と対比して下方制御されたＣＣＡ試料内の遺伝子リストと比較する。上記エピジェネティック薬剤処理に反応を示し、これと同時に下方制御を受けた、プロモーター領域内にＣｐＧアイランドを含む癌細胞株内の遺伝子に対して、定性的メチル化分析法を行った。メチル化頻度の最も高い遺伝子については、患者由来の材料内の遺伝子にも定性的メチル化分析法を行い、その後に定量的メチル化分析法を行った。
【０１１１】
（癌細胞株）
２４系統の癌細胞株を分析した。分析を行った上記２４系統の細胞株は、胆管癌由来の細胞株（ｎ＝６；ＥＧＩ‐１、ＨｕＣＣＴ１、ＫＭＢＣ、ＫＭＣＨ‐１、ＳＫ‐ＣｈＡ‐１、およびＴＦＫ‐１）、結腸癌由来の細胞株（ｎ＝６；ＨＣＴ１５、ＨＴ２９、ＬＳ１０３４、ＲＫＯ、ＳＷ４８、およびＳＷ４８０）、膵臓癌由来の細胞株（ｎ＝６；ＡｓＰｃ‐１、ＢｘＢｃ‐３、ＣＦＰＡＣ‐１、ＨＰＡＦＩＩ、ＰａＣａ‐２、およびＰａｎｃ‐１）、肝臓癌由来の細胞株（ｎ＝４；ＨＢ８０６５、ＪＨＨ‐１、ＪＨＨ‐４、およびＪＨＨ‐５）、および胆嚢癌由来の細胞株（ｎ＝２；Ｍｚ‐ＣｈＡ‐１およびＭｚ‐ＣｈＡ‐２）を含むものであった。上記細胞株を製造者の定めるガイドラインに従って培養した。培養時の条件を表５に要約する。融合状態に達する前に全細胞株を回収した。
【０１１２】
AmpFLSTR IdentifilerＰＣＲ増幅キット（Applied Biosystems、CA、USA）を製造者の定める手順に従って使用して、細胞株の認証を行った。試料をAB Prism 3730に掛けて、GeneMapper（Applied Biosystems）で分析した。市販の癌細胞株に関しては、遺伝子型を従来の刊行物に記載のデータと比較した。市販の細胞株以外の細胞株について得られた結果の一覧を表６に示す。
【０１１３】
６系統の胆管癌細胞株を脱メチル化薬剤の５‐アザ‐２’デオキシシチジン（７２時間の処理に対して１ｍＭ；Sigma-Aldrich Company Ltd.、Dorset、UK）およびヒストン脱アセチル化トリコスタチンＡ（処理の最後の１２時間に１ｍＭ添加；Sigma-Aldrich、Dorset、UK）の組み合わせで処理した。上記処理を行わなかった対照を並行して培養した。
【０１１４】
（患者試料）
（新鮮凍結材料）
オスロ大学病院（Rikshospitalet）およびImperialカレッジ（ロンドン、UK）で外科手術を施術した患者から１３系統の胆管癌を得た。外科手術直後に試料を瞬間凍結し、これを−８０℃で保存した。癌腫を製造者の規定する手順に従ってTissue-Tek（Sakura Finetek、CA、USA）の内部へ埋め込み、その後、専門の病理学者による評価を行う前にこれを低温切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。含まれる全ての癌腫試料（ｎ＝１３）は、５％を超える（＞５％）腫瘍細胞を示した。自己免疫性肝炎（ｎ＝２）、アルコールによる肝疾患（ｎ＝５）、特発性肝硬変（ｎ＝１）、ヘモクロマトーシス（ｎ＝１）、原発性胆汁性肝硬変症（ｎ＝３）、および原発性硬化性胆管炎（ｎ＝９）を含む非悪性の肝疾患に由来の２１系統の試料の集団を非悪性の対照として使用した。さらに、癌を発症していない６人の原発性硬化性胆管炎患者から切除した胆管に由来の組織を独立した試料集合として含めた。非悪性の生検については、オスロ大学病院（Rikshospitalet）で外科手術を施術した患者の肝臓の末梢領域から得た。
【０１１５】
（保存後の材料）
保存後の材料は、オスロ大学病院の病理学部から入手した２６種類のホルマリン固定を行ったＣＣＡのパラフィン包埋試料および３３種類のホルマリン固定を行った非悪性のパラフィン包埋試料を含む。組織標本をヘマトキシリンおよびエリトロシンで定期的に染色した。含まれる全ての癌腫試料（ｎ＝２６）は、５％を超える（＞５％）腫瘍細胞を示した。非悪性組織対照として、自己免疫性肝炎（ｎ＝４）、アルコールによる肝疾患（ｎ＝１）、原発性胆汁性肝硬変症（ｎ＝４）、および原発性硬化性胆管炎（ｎ＝２１）を含む非悪性肝疾患の患者由来の組織、並びにこれらの疾患の発生していない患者（ｎ＝３）に由来の組織を含めた。肝生検を肝外胆管、肝門、および肝臓の末梢領域から取得した。
【０１１６】
（癌細胞株の遺伝子発現マイクロアレイ解析）
６系統のＣＣＡ細胞株に由来のＲＮＡおよびエピジェネティック薬剤で処理した対照ＲＮＡに遺伝子発現マイクロアレイ解析（Applied Biosystems）を行った。上記遺伝子発現マイクロアレイ解析を行った癌細胞株のうち最小でも４系統の癌細胞株において、５‐アザ‐２’デオキシシチジンおよびトリコスタチンＡを用いた処理後に少なくとも２倍の上方制御を受けた遺伝子は、ＤＮＡメチル化の潜在的な標的としてみなされた。
【０１１７】
（胆管癌患者および健康な対照患者から取得したマイクロアレイ遺伝子発現データ一式）
ＣＣＡ中の過剰メチル化遺伝子と考えられる推定遺伝子を特定する可能性を向上させるために、マイクロアレイアプローチ手法により作成したＣＣＡ細胞株内の遺伝子のリストを、ＣＣＡと非悪性の対照腫瘍とを比較した刊行物（２６；２７）に記載の利用可能な遺伝子マイクロアレイデータから作成した遺伝子のリストと比較した。細胞株アプローチ手法に由来の遺伝子のうちで、反応を示す、非悪性の対照腫瘍と比較してＣＣＡ内において同時に下方制御を受けた遺伝子のみをメチル化候補であるとみなし、これにさらなる分析を行った。
【０１１８】
（ＤＮＡプロモーターのメチル化の分析）
プロモーター領域中のＣｐＧアイランドについて候補遺伝子を調べた。ＤＮＡのメチル化の分析を行う前に重亜硫酸処理を行った。癌細胞株中の候補遺伝子に定性的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）法を行った。少なくとも５系統のＣＣＡ細胞株でメチル化した候補遺伝子については、新鮮凍結試料（ｎ＝３４）中の候補遺伝子にＭＳＰ法をさらに行った。パフォーマンスの最も良かった遺伝子（ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８）に直接プロモーター重亜硫酸配列決定法を行った。プライマーの配列および位置、アンプリコンの長さ、ＭｇＣｌ2の濃度、およびアニール温度の一覧を表１に示す。最後に、新鮮凍結患者材料および保存後患者材料において、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ）手法を用いて、上記の３系統の遺伝子と従来報告されたＳＦＲＰ１とについて、メチル化状態の評価を行った。配列の一覧を表２に示す。上記遺伝子の詳細な情報を表３に示す。表３に示す遺伝子の配列を図９に示す。
【０１１９】
（核酸の単離）
癌細胞株について、標準的なフェノール／クロロホルム処置を使用してＤＮＡの単離を行い、Trizol（Invitrogen、Carlsbad、CA）を製造者の定める使用説明に従って使用して全ＲＮＡの単離を行った。2100 bioanalyzer（Agilent Technologies、Palo Alto、CA）を使用してＲＮＡの質の評価を行った。新鮮凍結試料については、AllPrepＤＮＡ／ＲＮＡキット（Qiagen Inc、Valencia、CA）を使用して約２５ｍｇの組織からＤＮＡの抽出を行った。保存後の材料については、QIAampＤＮＡキット（Qiagen）を使用してパラフィン包埋組織の５つの切片（各２０μｍ）からＤＮＡの単離を行った。ND-1000 Nanodrop（NanoDrop Technologies、Wilmington、DE）を使用して核酸の濃度を測定した。
【０１２０】
（遺伝子発現のマイクロアレイ解析の説明）
NanoAmp RT-IVT標識キット（Applied Biosystems）を製造者の定める手順に従って使用して、標準的な１ラウンド増幅法を行った。簡潔には、オリゴｄＴプライム反応において、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。in vitro標識反応において、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）‐ＵＴＰの存在下で二本鎖ｃＤＮＡから標識された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を取得した。試料を、２９，０９８種類の個々の遺伝子を示す３２，８７８種類のオリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子発現マイクロアレイ（Human Genome Survey Microarray V2.0, Applied Biosystems）とハイブリダイズさせた。上記遺伝子発現マイクロアレイにアルカリホスファターゼ結合ジゴキシゲニン抗体を用いて培養を行った後、AB1700化学発光分析器（Applied Biosystems）を使用して化学発光を測定した。プローブシグナルに後処理を行い、R-script（R 2.5.0）“ABarray” file 1.2.0およびBioconductor（www.bioconductor.org）を使用して分位点正規化を行い、さらにExcel（Microsoft office, version 2007）上で分析を行った。信号対雑音比が３未満（＜３）および／またはフラグ値が８１９１を超える（＞８１９１）アレイ素子は、さらなる処理を行う対象から取り除いた。
【０１２１】
（ＣｐＧアイランドの探索）
ＣｐＧアイランド探索用アルゴリズム（４８）を用いて、プロモーター領域内のＣｐＧアイランドの有無についてＤＮＡメチル化の候補遺伝子を調べた。ＣｐＧアイランドの検出（４９）には規定の基準を利用した。
【０１２２】
（ＤＮＡの重亜硫酸処理）
ＤＮＡの重亜硫酸処理を行った結果、メチル化シトシンを除く非メチル化シトシンは変換されてウラシルとなった（５０；５１）。EpiTect重亜硫酸キット（Qiagen）を製造者の定める手順に従って使用してＤＮＡ（１．３μｇ）に重亜硫酸処理を行った。QIAcube（Qiagen）を使用して脱スルホン化工程および洗浄工程を行い、重亜硫酸処理後のＤＮＡを４０μｌの溶出緩衝液中に溶出させた。
【０１２３】
（定性的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ））
Methyl Primer Express Software v1.0（Applied Biosystems）を用いて、Human Genome browser（genome.ucsc.edu）に従って、転写開始部位に近接近してＭＳＰプライマーを設計した。プライマーはMedProbe（MedProbe, オスロ, ノルウェー）から購入した。メチル化鋳型に特異的なプライマー対と非メチル化鋳型に特異的なプライマー対とからなる２組のプライマー対を使用して対象遺伝子座の増幅を行った。ＭＳＰ混合物は、１単位のHotStarTaq DNAポリメラーゼ（Qiagen）、１×ＰＣＲバッファ（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ＫＣｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１５ｍＭのＭｇＣｌ2;ｐＨ８．７；Qiagen）、デオキシヌクレオチド三リン酸（各々２．５ｍＭ）、プライマー（各々１０μＭ）、および２４ｇの鋳型ＤＮＡを総量が２５μｌとなるように含んでいた。全ＭＳＰ反応のＭｇＣｌ2濃度、アニール温度、および伸長時間を最適化した（表２）。熱サイクリング（Tetrad 2, Bio-Rad, CA, USA）は、１５分間は９５℃とし、その後３５サイクル（９５℃で３０秒間、可変のアニール温度で３０秒間（表２）、および、７２℃で３０〜６０秒間伸長）行い、最後に７２℃で７分間伸長させた。in vitroにおいてＳｓｓＩメチル基転移酵素(New England Biolabs Inc., Beverly, MA)で処理したヒト胎盤ＤＮＡ（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）をメチル化の陽性対照として使用し、正常なリンパ球に由来のＤＮＡを非メチル化の陽性対照として使用した。両反応において、鋳型を置換する水を陰性対照として使用した。ＭＳＰ生成物を５μｌのゲルローディングバッファ（１×ＴＡＥバッファ、２０％Ｆｉｃｏｌｌ（Sigma Aldrich）、および０．１％キシレンシアノール（Sigma Aldrich））と混合させて、これを１×ＴＡＥおよびエチジウムブロマイド（Sigma Aldrich）中の２％アガロースゲル（BioRad, Hercules, CA, USA）中に充填した。上記ＭＳＰ生成物の可視化をGel Doc XR+（BioRad）を用いて行う前に、電気泳動法を２００Ｖで２５分間行った。これにより得られた全結果をＭＳＰの第２の独立したラウンドで検証して、著者２名により独立してスコア付けを行った。スコア間に相違が生じた場合には、分析の第３ラウンドを行った。上記スコアリングは、上記陽性対照のメチル化帯強度を基準として用いて行われた。組織試料中では、メチル化の帯強度を０〜５の範囲の尺度でスコア付けした。腫瘍試料については、帯強度が３以上の場合にのみ、メチル化状態にあると判定した。非悪性試料に関しては、３以上のメチル化の帯強度を過剰メチル化としてスコア付けする一方で、２以下のメチル化の帯強度を弱メチル化としてスコア付けした。メチル化についてＭＳＰ断片を示さない非悪性試料のみを「非メチル化」としてスコア付けした。
【０１２４】
（ＤＮＡの直接重亜硫酸配列決定法）
１４系統の癌細胞株（結腸、ｎ＝６；胆管癌、ｎ＝６；および胆嚢癌、ｎ＝２）に対して重亜硫酸配列決定法を行った。ＤＮＡ重亜硫酸プライマーは、Methyl Primer Express Software v1.0（Applied Biosystems）を用いてＭＳＰによる増幅領域をカバーして設計をした。実験手順は従来の刊行物（５２）に記載されたものである。簡潔には、HotStarTaq（Qiagen）を用いて断片の増幅を３５サイクル行い、これを製造者（GE Healthcare, USB Corporation, Ohio, USA）の定める手順に従ってExoSAP-ITを用いて精製した。AB Prism 3730にdGTP BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（Applied Biosystems）を用いて、配列決定を行った。重亜硫酸処理後の完全メチル化ＤＮＡ（CpGenome Universal Methylated DNA, Millipore, MA, USA）および正常リンパ球に由来のＤＮＡをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。従来の報告（５３）によれば、各ＣｐＧ部位のメチルシトシンの量は、シトシンシグナルとシトシンおよびチミンのシグナルの合計とのピーク高さ比から算出される。個々のＣｐＧ部位のメチル化は、以下の基準に沿って決定される：０〜０．２であれば「メチル化」として決定し、０．２１〜０．８であれば「部分的にメチル化」として決定し、０．８１〜１．０であれば「過剰メチル化」として決定した。
【０１２５】
（定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ））
プライマーおよびプローブはPrimer Express v3.0を用いて設計され、それぞれMedprobeおよびApplied Biosystemsから購入されたものである。ｑＭＳＰの全反応を３８４ウェルプレートで３通り行った。反応体積は２０μｌであり、０．９μＭの各プライマー、０．２μＭのプローブ（６‐ＦＡＭおよび非蛍光性消光剤を用いて標識）、重亜硫酸処理を施した３０ｎｇの鋳型、および１×TaqMan Universal PCR master mix NoAmpErase UNG（Applied Biosystems）を含んでいた。増幅処理は、TaqMan 7900HF（Applied Biosystems）を用いて、９５℃での１５分間の処理、および、その後の、９５℃での１５秒間と６０℃での伸長１分間との４５サイクルの処理にて行った。重亜硫酸変換後の完全メチル化ＤＮＡ（Millipore）は陽性対照の役割を果たすとともに、１：５の連続希釈（３２．５‐０．０５２ｎｇ）により標準曲線を作成するように使用した。ＡＬＵ‐Ｃ４遺伝子（５４）を正規化に使用した。さらに、重亜硫酸処理を施した正常リンパ球由来のＤＮＡ、重亜硫酸処理を施していない正常リンパ球由来のＤＮＡ、および水ブランクを陰性対照として使用した。
【０１２６】
３５回目のサイクル後、全試料を（Applied Biosystemsの定める手順に従って）検閲し、中央値をさらなる処理に用いた。簡潔にいえば、試料のＧＥＮＥ：ＡＬＵ比を陽性対照（完全メチル化ＤＮＡ）のＧＥＮＥ：ＡＬＵ比で除して得た値に１００を乗じて、メチル化の基準パーセント値（ＰＭＲ）を算出した。高特異性を確実に得るために、全ての正常試料のうちでの最大のＰＭＲ値を超える整数を用いて、各アッセイ（新鮮凍結材料に対するアッセイおよび保存材料に対するアッセイ）ごとに個々の固定閾値を設定した。ＰＭＲ値が閾値より高い試料については、「メチル化陽性」であるとしてスコア付けを行った。ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＳＦＲＰ１、およびＺＳＣＡＮ１８に関しては、一連の新鮮凍結試料の閾値はそれぞれ１、２、１、および１であった。一連の保存試料に関しては、閾値は２、２、５、および３に設定した。
【０１２７】
（統計分析）
統計分析にはPASW 18.0（SPSS, Chicago, IL, USA）を使用した。カテゴリ変数にはピアソンのカイ二乗検定およびフィッシャーの正確確立検定を使用した。Student T-testおよびMann-Whitney U testを使用して、腫瘍ＤＮＡメチル化および患者の年齢との潜在的関係性を調べた。メチル化した標的遺伝子の適合性評価を行って非悪性対照からＣＣＡを分離するために、個々のメチル化基準パーセント（ＰＭＲ）値を用いて受信者動作特性曲線を作成した。同様に、ＰＭＲ値の合計値を用いて、候補遺伝子集団としての個々の遺伝子の成績の組み合わせの評価を行った。ｐ値は、ｐ＜０．０５となる場合において、統計学的に有意であると考慮した。
【０１２８】
【表３】
2014508528.tif 000004
【０１２９】
【表４】
2014508528.tif 000005
【０１３０】
【表５】
2014508528.tif 000006
【０１３１】
【表６】
2014508528.tif 000007
【０１３２】
【表７】
2014508528.tif 000008
【０１３３】
【表８】
2014508528.tif 000009
【０１３４】
【表９】
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【０１３５】
【表１０】
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【０１３６】
【表１１】
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【０１３７】
【表１２】
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【０１３８】
【表１３】
2014508528.tif 000014
【０１３９】
【表１４】
2014508528.tif 000015
【０１４０】
（結果）
（胆管癌中のプロモーターＤＮＡの過剰メチル化の候補遺伝子の特定）
本願発明者は、遺伝子発現のマイクロアレイ解析により、エピジェネティック薬剤処理（５‐アザ‐２’デオキシシチジンおよびトリコスタチンＡ）後、６系統のＣＣＡ細胞株のうち最低でも４系統において２倍以上に上方制御されている６７２個のアレイ要素を観察した。従来の刊行物に記載のデータセット（２６；２７）では、ＣＣＡ試料中の上記遺伝子のうち６０個は、非悪性対照と比較して下方制御されていることが同時に見出された（図１０）。ＣｐＧアイランドは、全候補のうち４３個の候補のプロモーター領域（および全候補のうち３個の候補の４種類のアイソフォーム）において見出され、潜在的なＤＮＡメチル化標的遺伝子としてみなされた。
【０１４１】
（癌細胞株中の候補遺伝子のＤＮＡプロモーターメチル化分析）
２４系統の癌細胞株中の４０種類の遺伝子座のプロモーターのメチル化状態を、ＭＳＰを使用して調べ、ＣＣＡ細胞株におけるこれらのメチル化の頻度に応じてグループ分けを行った（図１１）。グループＩの遺伝子（ｎ＝１２）は、メチル化の頻度が高かった（≧５／６；ＢＥＸ４、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＦＡＭ３Ｂ、ＧＲＥＭ１、ＬＨＸ６、ＮＡＰ１Ｌ２、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ４、ＴＰＭ２、ＺＮＦ３３１の「アイソフォームｃ」、およびＺＳＣＡＮ１８の「アイソフォームｂ」）。グループＩＩの遺伝子（ｎ＝１０）は、中級のメチル化頻度を示した（１／６〜４／６；ＡＳＲＧＬ１、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＣＳＲＰ１、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＧＮＧ１１、ＩＮＰＰ５Ａ、ＭＴ１Ｆ、ＰＤＥ２Ａ、ＲＥＥＰ１、およびＳＬＣ４６Ａ３）。残りの１８種類の遺伝子は、全系統のＣＣＡ細胞株において非メチル化であった（ＡＴＦ３、ＣＡＬＣＯＣＯ１、ＣＬＵ、ＣＴＧＦ、ＤＵＳＰ５、ＥＧＲ２の「アイソフォームｂ」、ＦＨＬ１、ＧＰＲ１２４、ＨＡＢＰ４、ＩＤ３、ＩＴＰＲ１、ＬＭＣＤ１、ＭＬＬＴ１１、ＭＴ１Ｘ、ＭＴ２Ａ、ＮＲ４Ａ３、ＲＮａｓｅ４、およびＳＹＴ１１）。遺伝子ＣＸＣＬ１４、ＤＰＹＳＬ３、ＥＧＲ２の「アイソフォームａ」、ＳＴＸＢＰ１、ＺＮＦ３３１の「アイソフォームａ」、ＺＮＦ３３１の「アイソフォームｂ」、およびＺＳＣＡＮ１８の「アイソフォームａ」は、以下の対照反応のうちの一つにおける弱帯域の存在に基づいて、さらなる分析から排除した：正常血液を用いたメチル化、完全メチル化ＤＮＡを用いた非メチル化、または重亜硫酸未処理のＤＮＡを用いたメチル化。
【０１４２】
興味深いことに、上記グループＩ，ＩＩ、およびＩＩＩのメチル化の頻度は、本願の研究に含まれる消化管癌細胞株同士を比較したところ互いに類似していたが、例外として、ＬＨＸ６およびＮＡＰ１Ｌ２は肝細胞癌由来の細胞株中において僅かなメチル化を示すのみか、またはメチル化を示さず、ＴＰＭ２およびＺＮＦ３３１の「アイソフォームｃ」は膵臓癌由来の細胞株中においてメチル化を示さないか、または僅かなメチル化を示すのみであった。
【０１４３】
（組織試料中の標的遺伝子の定性的ＤＮＡ特異的プロモーターメチル化分析）
上記グループＩの全遺伝子に対して、１３系統のＣＣＡの新鮮凍結臨床試料および２１系統の非悪性対照の新鮮凍結臨床試料中でＭＳＰ分析を行った。本願発明者は、ＢＥＸ４、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＧＲＥＭ１、ＮＡＰ１Ｌ２、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ４、ＺＮＦ３３１、およびＺＳＣＡＮ１８のメチル化が、腫瘍中において６９％、６２％、８３％、２３％、６９％、８５％、２３％、２３％、および３１％であり、非悪性対照中において３３％、１４％、１００％、１３％、３８％、８６％、０％、０％、および０％であることを観察した（図１４）。上記グループＩのうち残りの３つの遺伝子座であるＦＡＭ３Ｂ、ＬＨＸ６、およびＴＰＭ２については、腫瘍中におけるメチル化頻度は低度であり（＜１０％）、非悪性対照中におけるメチル化頻度は様々であった（１９〜９０％）。上記非悪性対照中のメチル化の帯域強度は、腫瘍中のメチル化の帯域強度と比較して著しく弱かった。これは、定量的メチル化解析のほうが上記グループ同士をより正確に区別していたことを示唆するものである。その後、腫瘍中において３０％を超えるメチル化を示す遺伝子プロモーター（ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＳＦＲＰ１、およびＺＳＣＡＮ１８）に対して、定量的メチル化解析（ｑＭＳＰ）を行った。ＢＥＸ４およびＮＡＰ１Ｌ２は、女性患者の正常血液の試料中においてメチル化を示したため、さらなる分析からは除外した。各アッセイの試験には正常血液の対照を含めた。
【０１４４】
（直接重亜硫酸配列決定法によるプロモーターのメチル化状態の検証）
ＭＳＰで評価を行ったプロモーターのメチル化状態の検証を行うために、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８のプロモーター領域に対して、典型的な癌細胞系中で直接重亜硫酸配列決定法を行った。ＭＳＰで得た結果と重亜硫酸配列決定法で得た結果との間では良好な整合性が確認された（図１２）。上記結果を用いて、定量ＤＮＡメチル化アッセイ法の設計が導き出された。ＳＦＲＰ１は従来においてはｑＭＳＰ法により分析されており、したがって重亜硫酸配列分析法には含まれていなかった。
【０１４５】
（新鮮凍結臨床材料および保存臨床材料中のＤＮＡメチル化の定性分析）
ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＳＦＲＰ１、およびＺＳＣＡＮ１８は、１３系統のＣＣＡおよび２１系統の非悪性対照を含む新鮮凍結材料と２６系統の腫瘍および３３系統の非悪性対照を含む保存材料との２種類の一連の試料中でｑＭＳＰ法により分析した。上記一連の新鮮凍結試料に関して、本願発明者は、ＤＣＬＫ１、ＳＦＲＰ１、ＺＳＣＡＮ１８、およびＣＤＯ１は、腫瘍中においてそれぞれ４６％、６９％、７７％、および８５％のプロモーター過剰メチル化を示し、非悪性対照中においてメチル化を示さないことを検出した。４つ全ての遺伝子を組み合わせ、この４つの遺伝子のうち最低でも１つの遺伝子中においてメチル化を示す試料を「陽性」としてスコア付けしたところ、上記腫瘍の１００％および上記非悪性試料の０％がメチル化陽性であった。上記遺伝子の個々の成績およびその組み合わせを、受信者動作特性曲線（図１３）を用いて調べた。上記４つの遺伝子を組み合わせた（ＰＭＲ値を要約した）結果、曲線の曲線下面積として０．９９６が得られた。
【０１４６】
一連の保全試料中のメチル化頻度は、一般に、統計学的に有意ではないものの、新鮮凍結試料一式での研究結果よりも低度であった。ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＳＦＲＰ１、およびＣＤＯ１の４つの遺伝子は、腫瘍中においてそれぞれ４２％、４２％、５４％、および７３％のメチル化頻度を示す一方で、非悪性対照中においてはメチル化が確認されなかった。個々の遺伝子の組み合わせからなる集団は腫瘍の８１％においてメチル化陽性を示した。この結果得られた、上記試料一式の曲線下面積は０．９０４であった（図１３）。
【０１４７】
本願発明者は、硬化性胆管炎を発症した胆管を切除したものに由来の６つの新鮮凍結試料のうち非悪性試料一式中における、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＳＦＲＰ１、およびＣＤＯ１の４つの遺伝子のメチル化の頻度をさらに調べた。興味深いことに、２つの試料（３３％）は４つ全ての生体マーカーについてメチル化陽性であり、１つの試料（１７％）はＺＳＣＡＮ１８についてメチル化陽性であった。
【０１４８】
（考察）
本願の研究において、本発明者は、従来報告されていたＳＦＲＰ１遺伝子（２８；２９）に加えて、胆管癌においてＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８をメチル化頻度の高い新規の遺伝子として特定した。癌腫に罹患していない患者に由来の組織試料は、同一の遺伝子について非メチル化であった。これは、プロモーターの過剰メチル化は腫瘍に特異的であることを示している。上記遺伝子の高い感度および特異性は、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８が胆管癌に対する新規で有望な生体マーカーを個別に表していることを示唆している。ＳＦＲＰ１を含めることで、生体マーカーの組み合わせからなる生体マーカー集団は、新鮮凍結材料において１００％の感度および特異性を有した。保存材料においては感度が多少低下するものの、本願の生体マーカー集団は、既存の臨床アプローチ手法（４；７；８）と比較して、ＣＣＡの診断精度を向上させる可能性を持っている。
【０１４９】
本発明者のグループによる以前の研究（２５）にしたがい、本発明者は段階的な実験アプローチ手法を用いて新規のメチル化生体マーカーを特定した。上記実験アプローチ手法は、偽陽性のメチル化候補を選択してしまう確率を最小限に抑えるために、厳格な選択基準を備えている。エピジェネティック薬剤で処理した癌細胞株のマイクロアレイ分析により、６系統の胆管癌細胞株のうち最少でも４系統において少なくとも２倍に上方制御された遺伝子のみを選択した。利用可能なマイクロアレイデータセット（２６；２７）において上記候補の遺伝子発現をさらに調査し、癌に罹患していない対照と比較して下方制御された原発性ＣＣＡ腫瘍中の遺伝子のみをさらなる研究のために選択し、これに対して癌細胞株中でプロモーターメチル化分析を行った。メチル化の頻度が高い遺伝子座に関しては、その後に患者由来の材料中で分析を行った。メチル化の定性分析によれば、３つの遺伝子（ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＳＦＲＰ１）は、腫瘍試料中のメチル化頻度が５０％を超えていた。ＺＳＣＡＮ１８を含めた上記遺伝子に対して、メチル化の定量分析をさらに行った。この結果、新鮮凍結組織中において、生体マーカーの組み合わせからなる集団への１００％の感度および特異性を実現した。
【０１５０】
生体マーカーの組み合わせからなる集団は、胆管癌の全体のうち１００％でメチル化し、非悪性対照の全試料において非メチル化した。癌試料の数を増やすために、本願発明者は、ホルマリンで固定した保存パラフィン包埋試料からなる第２の一連の試料を含めた。予期された通り、上記保存材料中における上記生体マーカー集団の性能は、新鮮凍結試料中における性能と比較して多少劣るものであった。しかし、上記一連の試料の両方への総合感度（８７％）および総合特異性（１００％）は、この生体マーカー集団が高性能であることを示している。
【０１５１】
さらに、原発性硬化性胆管炎に罹患して切除された胆管に由来の非悪性試料中で、上記生体マーカー集団の評価を行った。興味深いことに、２つの試料が、４つ全ての生体マーカーにおいてプロモーターメチル化陽性反応を示した。本願発明者は、この生体マーカー集団によって検出されるメチル化陽性反応を基にして、上述の発見は、現行のＣＣＡ診断が抱える課題により検出を免れ得るような初期段階の癌が発生していることを示唆するものであるとの仮説を立てた。したがって、この生体マーカー集団は、臨床場面でのＣＣＡ検出に対して積極的な価値を付加するものとなり得る。
【０１５２】
ＣＣＡを下位分類および病期の背景に関係なく検出するために、本願の研究に使用した腫瘍材料は、原発性硬化性胆管炎の発症した肝外および肝内の病変と原発性硬化性胆管炎の発症していない肝外および肝内の病変との両方を含むものであった。肝臓の異なる箇所から採取した生検の良性肝臓疾患を集めたプールは対照としての役割を担った。これを行うことにより、胆管上皮由来の腫瘍を胆管上皮以外の非悪性試料と比較する場合に発生し得る潜在的な歪曲を避けた。
【０１５３】
エピゲノム全域の発現プロファイリングは、従来、膀胱、膵臓、および前立腺を含む幾つかの腫瘍の種類中の潜在的なエピジェネティックマーカーを特定するために用いられてきた（３０‐３２）。本発明者は以前に、上記研究（２５）に提示の実験プロトコールと同様の実験プロトコールを用いて、結腸直腸癌の早期検出用のエピジェネティックマーカーを特定した（３３；３４）。これらのマーカーは、頻度こそ異なるものの、胃腸管の他の癌においても存在することを、細胞株の分析から本願発明者は観察した（３４）。したがって、本願の研究には、幾つかの肝胆膵腫瘍並びに結腸癌に由来の細胞株が含まれていた。本願発明者は、癌細胞株の大部分全てのメチル化頻度に類似性があることを観察した。このことは、遺伝子は他の胃腸腫瘍に由来の組織試料中においても異常にメチル化したことを示唆するものであった。
【０１５４】
本願に提示の４種類の生体マーカーの１つであるＳＦＲＰ１は、ＣＣＡを含む幾つかの癌における潜在的なエピジェネティック生体マーカーとして以前から調査されてきた（２８；２９；３５；３６）。縮れ関連分泌タンパク質（secreted frizzled-related protein：ＳＦＲＰ）族に属する個々のタンパク質はＷｎｔ経路の調節因子として作用し、これらのプロモーター領域の過剰なメチル化は、こうした経路の脱制御およびその後の癌発生に繋がり得る（３７）。Uhm et al.（２９）およびSriraksa et al.（２８）が発表したＳＦＲＰ１の場合のメチル化頻度（６４％）は、本願に提示のメチル化頻度と同一の範囲のものである。
【０１５５】
システインジオキシゲナーゼのＩ型（ＣＤＯ１）は、肝臓で高度に発現されることが報告されている（３８）。これは、胆液の主成分であるタウリンを含むピルビンおよび硫黄化合物に関する代謝経路の開始に関与している。近年、ＣＤＯ１プロモーターの過剰メチル化は、リンパ節陽性でエストロゲン受容体陽性の乳癌患者の遠隔転移を示す強力なマーカーであることが示された（３９）。さらに、ＣＤＯ１は、結腸直腸癌、肺癌、およびウィルムス腫瘍においてはエピジェネティックに脱制御されていることが特定されてきた（４０〜４２）。本願の研究により得た結果はこうした発見を支持するものであるとともに、ＣＤＯ１のプロモーター過剰メチルがＣＣＡにも関与していることを初めて示したものである。
【０１５６】
ダブルコルチン様キナーゼ１（doublecortin like kinase 1：ＤＣＬＫ１）は、自己リン酸化を遂げることのできる微小管結合キナーゼである。本願発明者の知る限りでは、本願の研究は、癌中の上記遺伝子のプロモーター過剰メチル化を報告した最初の研究である。しかし、従来の研究では、ＤＣＬＫ１タンパク質の発現が、上皮から間葉への変化に関与する腸幹細胞を示すマーカーとして提案されてきた（４３；４４）。プロモーターの過剰メチル化は上記遺伝子の抑制を示唆しているので、さらなる研究を行って、異常制御されたＤＣＬＫ１のＣＣＡ中での役割を明らかにするべきである。
【０１５７】
近年、Morrisらは、腎細胞癌におけるジンクフィンガーおよびＳＣＡＮドメイン含有タンパク質１８（ＺＳＣＡＮ１８）の腫瘍抑制機能について報告を行った（４５）。本願発明者は、ＺＳＣＡＮ１８のメチル化頻度は、腎臓癌と比較して胆管癌のほうが僅かに高い（３２％）ことを本願の研究において示した。
【０１５８】
分析した試料の数は、本願の研究の限界を示すものである。新鮮凍結の腫瘍試料および正常試料、および／または保存の腫瘍試料および正常試料の数を増やすことで、本願に提示の集団の生体マーカーの評価を行ううえで統計的検出力を増大させられる。したがって、より大きな試料一式を用いた検証が保証される。
【０１５９】
要約すると、本願発明者は４つの過剰メチル化遺伝子（ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＳＦＲＰ１、ＺＳＣＡＮ１８）を特定し、このうち３つの遺伝子（ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８）に関してはＣＣＡ内のものが記載されることは従来は皆無であった。この集団の生体マーカーの総パフォーマンスは、新鮮凍結材料および保存した材料の全てにおいて感度８７％および特異性１００％に達した。本願に提示の生体マーカー集団が非侵襲性から最小侵襲性のＣＣＡ診断に貢献をもたらすか否かの評価を行うために、最小侵襲試料（例えば、胆液、胆汁のブラシ細胞診試料、および／または血液）に対してさらなる研究を行うべきである。
【０１６０】
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本願明細書の上述の部分において言及した全ての刊行物および特許を参照することにより、それらの開示内容を本願に援用する。上で説明した本願の方法およびシステムについては、本発明の範囲および要旨を逸脱しない範囲で多様な変更および変形が加えられることは、当事者にとって明らかであろう。本願発明を特定の好適な実施形態に関連させて説明してきたが、特許請求の範囲に記載する発明がこれら特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるであろう。実際、発明を実現するために本願に記載の様態を多様に変更して得られる、当業者にとって明らかな様態についても、添付の特許請求の範囲に含めるよう意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】新規のＤＮＡメチル化候補遺伝子を選択する方法である。
【図２】ＧＬＤＣのメチル化特異的ＰＣＲの定量的な結果からのＲＯＣ曲線分析である。
【図３】ＰＰＰ１Ｒ１４Ａのメチル化特異的ＰＣＲの定量的結果からのＲＯＣ曲線分析である。
【図４】ＧＬＤＣに従来のＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとＧＬＤＣに定量ＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとの比較である。
【図５】ＰＰＰ１Ｒ１４Ａに従来のＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとＰＰＰ１Ｒ１４Ａに定量ＭＳＰ分析法を行って得られるスコアとの比較である。
【図６】重亜硫酸配列決定法により、ＧＬＤＣプロモーター内の部位特異的メチル化を検証する図である。
【図７】重亜硫酸配列決定法により、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａプロモーター内の部位特異的メチル化を検証する図である。
【図８】胆管癌中の過剰メチル化遺伝子を特定するためのエピゲノム全域の実験アプローチ法である。
【図９】典型的な標的遺伝子の配列である。
【図１０】癌細胞および胆管癌の間で重複する、脱制御を受けた遺伝子を示すベン図である。
【図１１】癌細胞株中のプロモーターのメチル化状態の要約である。
【図１２】ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、およびＺＳＣＡＮ１８に直接重亜硫酸配列決定法を行うことにより、ＭＳＰ法により評価を行ったメチル化状態を検証する図である。
【図１３】胆管癌試料および非悪性腫瘍試料中の個々の遺伝子および複合遺伝子の受信者動作特性曲線である。
【図１４】定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ）法で評価を行った、患者材料中のメチル化頻度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ）】
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【図１２Ｂ）】
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【図１２Ｃ）】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月7日(2013.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象内の胃腸腫瘍を検出する方法であって、
（ａ）前記対象の生体試料からＤＮＡを取得する工程、および、
（ｂ）ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子に対応する核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度を決定する工程、を備える方法。
【請求項２】
上記工程（ｂ）は、ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａからなる一群から選択される１つ以上の遺伝子に対応する核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度を決定する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのさらなる遺伝子に対応する核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度を決定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記少なくとも１つのさらなる遺伝子はＳＦＲＰ１であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記核酸重合体のメチル化のレベルまたは頻度をメチル化の基準レベルまたは基準頻度と比較することを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記核酸重合体のメチル化のレベル、存在、または頻度をメチル化の基準レベル、基準存在、または基準頻度と比較する工程をさらに備え、前記基準と比較したときの患者のメチル化の変化したレベル、存在、または頻度は、上記対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆を与えることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸は、ＣｐＧアイランドおよびＣｐＧアイランドのショアからなる一群から選択される領域を含むことを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記ＣｐＧアイランドまたは上記ＣｐＧアイランドのショアはコード領域または調節領域に存在することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記調節領域はプロモーターであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸重合体の変化したメチル化のレベルを決定する上記工程は、上記ＣｐＧアイランドまたは上記ＣｐＧアイランドのショアのメチル化の頻度を決定する工程を備えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
変化したメチル化の核酸重合体のレベルを決定する上記工程は、メチル化特異的ＰＣＲ法、定量的メチル化特異的ＰＣＲ法、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析法、メチル化非感受性ＤＮＡ制限酵素分析法、定量的重亜硫酸パイロシークエンス法、および重亜硫酸ゲノム配列決定ＰＣＲ法からなる一群から選択される技術によって実現されることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）および工程（ｂ）の結果を用いてリスクプロファイルを作成する工程（ｃ）をさらに備える請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記胃腸腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌すなわち胆管癌であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記対象内の消化管癌を少なくとも８５％の特異性且つ少なくとも８５％の感度で検出することを可能にすることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記対象の体内の消化管癌を少なくとも９０％の特異性且つ少なくとも８０％の感度で検出することを可能にすることを特徴とする請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
上記生体試料は、組織試料、糞便試料、細胞試料、胆汁試料、および血液試料からなる一群から選択されることを特徴とする請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子に対応するメチル化特異的核酸検出配列。
【請求項１８】
対象内の癌状態を検出するための、請求項１７に記載の核酸配列の使用。
【請求項１９】
ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１の１つ以上に対応する検出配列に加えて、ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａの１つ以上に対応するさらなるメチル化特異的核酸検出配列を使用することを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
上記癌状態は胃腸腫瘍であることを特徴とする請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
上記胃腸腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆嚢および／または胆管の癌すなわち胆管癌であることを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
上記胃腸腫瘍は結腸直腸癌または胆管癌であることを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１の１つ以上に対応する検出配列に加えて、さらなるメチル化特異的核酸検出配列を使用することを特徴とする請求項１８〜２２の何れか１項に記載の使用。
【請求項２４】
上記さらなるメチル化特異的核酸検出配列はＳＦＲＰ１に対応することを特徴とする請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
基準と比較したときの患者のメチル化の変化したレベル、存在、または頻度は、上記対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆とを与えることを特徴とする請求項１８〜２４の何れか１項に記載の使用。
【請求項２６】
哺乳類の胃腸腫瘍の存在を検出するためのキットであって、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の検出および／または特性の決定を行うのに有効であるか、十分であるか、または必要である試薬を備えるキット。
【請求項２７】
ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａからなる一群から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の検出および／または特性の決定を行うのに有効であるか、十分であるか、または必要である試薬をさらに備えることを特徴とする請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
コンピュータに読み取り可能な媒体を備えるシステムであって、前記コンピュータに読み取り可能な媒体は、ＣＤＯ１、ＤＣＬＫ１、ＺＳＣＡＮ１８、およびＺＮＦ３３１からなる一群から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の情報を使用して、対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆とを与える指示を含んでいる、システム。
【請求項２９】
前記コンピュータに読み取り可能な媒体は、ＧＬＤＣおよびＰＰＰ１Ｒ１４Ａからなる一群から選択される１つ以上の遺伝子のメチル化のレベル、存在、または頻度の情報を使用して、対象が消化管癌に罹患しやすい性質であることの示唆、上記対象が消化管癌に罹患していることの示唆、上記対象が消化管癌を再発する可能性の示唆、上記対象の生存の示唆、および、消化管癌の悪性度の示唆からなる一群から選択される示唆と、消化管癌の治療により起こり得る結果の示唆と、上記対象が特定の治療法が行われる候補であることの示唆とを与える指示をさらに含んでいることを特徴とする請求項２８に記載のシステム。
【国際調査報告】
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