(57)【要約】【課題】ナノ粒子と、それを使用および作製する方法が提供される。【解決手段】本発明のナノ粒子は、ａ）非細胞性材料を含む内核、ｂ）細胞に由来する細胞膜またはウイルスに由来する膜を含む外面を含む。薬剤送達系または本発明のナノ粒子を含む医薬組成物も提供される。本発明は、本発明のナノ粒子を含む免疫原性組成物、ならびに免疫応答を誘発し、かつ新生物もしくは癌等の疾患または状態、あるいは細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するために本発明の免疫原性組成物を使用する方法をさらに提供する。本発明のナノ粒子を含む免疫原性組成物を含むワクチンも提供される。【選択図】図１
2014518200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）    非細胞性材料を含む、内核と、
ｂ）    細胞に由来する細胞膜またはウイルスに由来する膜を含む、外面と、
を含む、ナノ粒子。
【請求項２】
前記内核が、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン、およびポリグルタミン酸からなる群から選択される、生体適合性材料または合成材料を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記内核が、前記外面を支持する、請求項１〜２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記細胞膜が、形質膜または細胞内膜を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記細胞膜が、細菌および真菌から選択される単細胞生物、または植物、脊椎動物、非ヒト哺乳動物、およびヒトから選択される多細胞生物に由来する、請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記細胞膜が、血液細胞、腫瘍細胞、癌細胞、免疫細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞、またはシナプス小胞に由来する、請求項１〜５のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記細胞膜が、赤血球細胞に由来する形質膜を含む、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
放出可能なカーゴをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記放出可能なカーゴが、前記内核内もしくはその上、前記内核と前記外面との間、または前記外面内もしくはその上に位置する、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記放出可能なカーゴの前記放出が、前記ナノ粒子と標的細胞、組織、器官、もしくは対象との間の接触により、または前記ナノ粒子を取り囲む物理的パラメータの変化により引き起される、請求項８〜９のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記放出可能なカーゴが、治療剤、予防剤、診断薬もしくはマーカー剤、予後剤、またはそれらの組み合わせである、請求項８〜１０のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記放出可能なカーゴが、金属粒子、ポリマー粒子、デンドリマー粒子、または無機粒子である、請求項８〜１１のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、約１０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、前記細胞膜が由来する細胞の構成成分、または前記ウイルス膜が由来するウイルスの構成成分を実質的に欠く、請求項１〜１３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記細胞膜が、赤血球細胞に由来する形質膜を含み、前記ナノ粒子が、実質的にヘモグロビンを欠く、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、前記細胞膜、ウイルスに由来する前記膜、または前記細胞膜もしくはウイルス膜の前記構成成分の天然の構造的完全性または活性を実質的に維持する、請求項１〜１５のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、生体適合性または生分解性である、請求項１〜１６のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記内核がＰＬＧＡを含み、前記外面が、赤血球細胞に由来する形質膜を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、ＰＥＧコーティングされた同等のナノ粒子のインビボ血液循環中の半減期の少なくとも約２〜５倍の半減期を有するか、または少なくとも約５〜約４０時間のインビボ血液循環中の半減期を有する、請求項１８に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が、前記細胞膜が由来する種または対象に対する免疫原性を実質的に欠く、請求項１〜１９のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記外面が、天然に存在する細胞膜またはウイルス膜を含み、合成膜をさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の有効な量のナノ粒子を含む、薬剤送達系。
【請求項２３】
別の活性成分、または医学的もしくは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤をさらに含む、請求項２２に記載の薬剤送達系。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれかに記載の有効な量のナノ粒子、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
別の活性成分をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
有効な量の、請求項１〜２１のいずれかに記載のナノ粒子、請求項２２〜２３のいずれかに記載の薬剤送達系、または請求項２４〜２５のいずれかに記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、前記対象において、疾患または状態を治療または予防するための方法。
【請求項２７】
前記対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノ粒子中の前記細胞膜が、前記対象と同一種の細胞に由来するか、または前記対象の細胞に由来する、請求項２６〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子中の前記細胞膜が、前記対象と同一種の赤血球細胞に由来し、前記赤血球細胞が、前記対象と同一の血液型を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
別の活性成分、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を、必要とする前記対象に投与することをさらに含むか、あるいは前記ナノ粒子が、薬剤送達系を介して投与される、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
必要とする対象において疾患または状態を治療または予防するための薬剤を作製するための、請求項１〜２１のいずれかに記載の有効な量のナノ粒子の使用。
【請求項３２】
ａ）    非細胞性材料を含む内核と、細胞に由来する細胞膜またはウイルスに由来する膜を含む外面とを組み合わせることと、
ｂ）    前記組み合わせに外因的なエネルギーを印加して、前記内核および前記外面を含むナノ粒子を形成することと、
を含む、ナノ粒子を作製するためのプロセス。
【請求項３３】
前記外因的なエネルギーが、機械的エネルギー、音響エネルギー、または熱エネルギーである、請求項３２に記載のプロセス。
【請求項３４】
前記細胞膜が、細胞に由来する天然に存在する細胞膜であるか、または膜が、ウイルスに由来する天然に存在する膜である、請求項３２に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記外面が、合成膜をさらに含み、生成された前記ナノ粒子が、前記内核と、前記細胞膜またはウイルス膜および前記合成膜を含む外面と、を含む、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３６】
非細胞性材料を含む内核と、新生物細胞に由来する細胞膜を含む外面とを含む有効な量のナノ粒子を含む、新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記細胞膜が、良性の新生物細胞、潜在的に悪性の新生物細胞、癌細胞、癌細胞株、または対象の癌細胞に由来する、請求項３６に記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記ナノ粒子の前記外面中の前記細胞膜が、前記新生物細胞に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性を実質的に保持する、請求項３６または３７に記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記内核が、前記外面を支持する、請求項３６〜３８のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記内核が、ＰＬＧＡを含み、前記外面が、新生物細胞に由来する形質膜を含む、請求項３６〜３９のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４１】
前記ナノ粒子が、別の活性成分または放出可能なカーゴをさらに含む、請求項３７〜４０のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記ナノ粒子が、約１０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有する、請求項３７〜４１のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記ナノ粒子が、前記細胞膜が由来する前記新生物細胞の構成成分を実質的に欠く、請求項３７〜４２のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４４】
免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤をさらに含む、請求項３７〜４３のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記ナノ粒子の前記外面が、天然に存在する細胞膜またはウイルス膜を含み、かつ合成膜をさらに含む、請求項３７〜４４のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物。
【請求項４６】
請求項３７〜４５のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物を含む、ワクチン。
【請求項４７】
治療または予防を必要とする対象における新生物を治療または予防するための方法であって、前記対象に、有効な量の、請求項３７〜４５のいずれかに記載の新生物特異的免疫原性組成物、または請求項４６に記載のワクチンを投与することを含む、前記方法。
【請求項４８】
前記対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞膜が、前記対象と同一種の新生物細胞、または前記対象の新生物細胞に由来する、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象に、別の活性成分または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を投与することをさらに含む、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
新生物もしくは癌特異的免疫原性組成物の作製のための請求項１〜２１のいずれかに記載の有効な量のナノ粒子の使用、または新生物に対して対象を治療もしくは保護するためのワクチンの作製のための請求項３７〜４５のいずれかに記載の有効な量の新生物特異的免疫原性組成物の使用。
【請求項５２】
細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための医薬組成物であって、非細胞性材料を含む内核と、標的細胞に由来する細胞膜または形質膜を含む外面と、を含む、有効な量のナノ粒子を含む、医薬組成物。
【請求項５３】
前記毒素が、前記天然の病理学的機構の一環として、前記標的細胞の前記細胞膜もしくは形質膜に挿入するか、または前記ナノ粒子の前記外面中の前記細胞膜もしくは形質膜が、実質的に毒素を保持する、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記毒素が、細菌性、真菌性、または動物性毒素である、請求項５２または５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記内核が、前記外面を支持し、前記ナノ粒子の前記外面中の前記細胞膜が、前記毒素を実質的に保持するために、その構造的完全性を実質的に保持する、請求項５２〜５４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記ナノ粒子の前記外面が、天然に存在する細胞膜またはウイルス膜を含み、かつ合成膜をさらに含む、請求項５２〜５５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記ナノ粒子が、生体適合性、生分解性であるか、または合成材料を含む、請求項５２〜５６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記外面が、赤血球細胞に由来する形質膜を含む、請求項５２〜５７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５９】
別の活性成分、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤をさらに含む、請求項５２〜５８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６０】
治療または予防を必要とする対象における細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法であって、前記対象に、有効な量の請求項５２〜５９のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６１】
前記対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞膜または形質膜が、前記対象と同一種の細胞または前記対象の細胞に由来する、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記形質膜が、前記対象と同一種の赤血球に由来し、前記赤血球が、前記対象と同一の血液型を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象に、別の活性成分または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を投与することをさらに含む、請求項６０〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
対象における細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための薬剤の作製のための有効な量の請求項５２〜５９のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項６６】
非細胞性材料を含む内核と、細胞に由来する細胞膜および細胞膜挿入毒素を含む外面と、を含む有効な量のナノ粒子を含む、免疫原性組成物。
【請求項６７】
前記細胞膜が、細胞に由来する形質膜である、請求項６６に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
前記毒素が、前記天然の病理学的機構の一環として前記標的細胞の前記細胞膜もしくは形質膜に挿入するか、または前記ナノ粒子の前記外面中の前記細胞膜もしくは形質膜が、前記毒素を実質的に保持する、請求項６６または６７に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
前記ナノ粒子の前記外面中の前記毒素が、天然の毒素に対する免疫応答を誘発するために、その天然の構造的完全性を実質的に保持する、請求項６６〜６８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
前記毒素が、細菌性、真菌性、または動物性毒素である、請求項６６〜６９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
前記ナノ粒子の前記外面が、天然に存在する細胞膜またはウイルス膜を含み、かつ合成膜をさらに含む、請求項６６〜７０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
前記ナノ粒子が、生体適合性、生分解性であるか、または合成材料を含む、請求項６６〜７１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
前記内核が、前記外面を支持する、請求項６６〜７２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
前記外面が、赤血球細胞に由来する形質膜を含む、請求項６６〜７３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
別の活性成分または免疫原性アジュバントもしくは免疫増強剤をさらに含む、請求項６６〜７４のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
請求項６６〜７５のいずれかに記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
【請求項７７】
対象における細胞膜挿入毒素に対する免疫応答を誘発するための方法であって、前記対象にに、有効な量の請求項６６〜７５のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
細胞膜挿入毒素に対して対象を保護するための方法であって、前記対象に、有効な量の請求項７６に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項７９】
前記毒素が、細菌性、真菌性、または動物性毒素である、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項７７〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞膜または形質膜が、前記対象と同一種の細胞または前記対象の細胞に由来する、請求項７７〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記形質膜が、前記対象と同一種の赤血球細胞に由来し、前記赤血球細胞が、前記対象と同一の血液型を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象に、別の活性成分または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を投与することをさらに含む、請求項７７〜８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記免疫応答が、Ｔ細胞媒介性免疫応答またはＢ細胞媒介性免疫応答である、請求項７７〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
細胞膜挿入毒素に対する免疫原性組成物の作製のための有効な量のナノ粒子の使用であって、前記ナノ粒子が、非細胞性材料を含む内核と、細胞に由来する細胞膜および前記細胞膜挿入毒素を含む外面と、を含む、使用。
【請求項８６】
細胞膜挿入毒素に対して対象を保護するためのワクチンを作製するための有効な量の請求項６６〜７５のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４９２，６２６号に対する優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、ＮＳＦ助成金第ＣＭＭＩ１０３１２３９号、ＮＩＨ助成金第Ｕ５４ＣＡ１１９３３５号、およびＤＭＲ助成金第１２１６４６１号の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある権利を有する。
【０００３】
本発明は、薬学的に活性な薬剤を含む、細胞膜で被包された合成ナノ粒子材料の送達のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
長時間循環するポリマーナノ粒子は、受動的および能動的機構の両方を介して持続的な全身送達および良好な標的化を保証するため、重要な臨床的影響を有する（１〜３）。インビボの粒子滞留時間を延長するために、粒径、表面、形状、および可撓性の修正を含む異なるアプローチが探求されている（４〜６）。ナノ粒子ステルスコーティングの現在の認証基準は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ナノ粒子表面上のステルス部分としてのＰＥＧの採用は、いくつかの臨床的生成物により優れた成功をもたらしたが（２、３）、抗ＰＥＧ免疫学的応答に関する近年の観察は、その生物学的関連性に関するさらなる調査に対する関心のきっかけとなっている（７）。ポリ（カルボキシベタイン）およびポリ（スルホベタイン）等の合成双性イオン材料は、非特異的タンパク質吸着に対して高度に耐性を示すそれらの強力な水和に起因して、ＰＥＧの代替物として提案されている（８、９）。加えて、分子生物学および細胞生物学における近年の進歩は、科学者およびナノテク技術者に、天然の長時間循環する送達媒体である赤血球細胞（ＲＢＣ）後のナノ担体をモデル化させた。構造および表面タンパク質等のＲＢＣの特性は、次世代送達プラットフォームを考案するための設計の手掛かりとして採用された（１０〜１２）。
【０００５】
合成ナノ材料と生物学的実体との間の間隙を埋めるために、著しい努力が奉げられているが、ＲＢＣ様送達媒体は、生物医学の研究者にとって依然として理解し難いままである。１つの主な課題は、生物学的細胞の複雑な表面化学によりナノ粒子を機能化することの困難さにある。ポリスチレンビーズが免疫抑制ＲＢＣ膜タンパク質、ＣＤ４７（１１）との共役に続くそれらのマクロファージ巻き込みを低減することにおける近年の大きな進歩にかかわらず、現在の化学に基づくバイオ共役技術は、多くの場合、タンパク質変性をもたらす。加えて、これらのボトムアップアプローチは、ナノスケール基質上で複雑なタンパク質構成を複製する際に非常に不適切である。
【０００６】
したがって、合成ナノ粒子材料の送達のための方法および組成物の改善が必要とされている。本発明は、当該技術分野におけるこれらおよび他の関連した必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、新規のナノ粒子、ならびにそれを使用および作製する方法を提供する。より具体的に、発明のナノ粒子は、ａ）非細胞性材料を含む内核、ｂ）細胞に由来する細胞膜またはウイルスに由来する膜を含む外面を含む。ある実施形態において、発明のナノ粒子の内核は、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリリシン、ポリグルタミン酸、および任意の他の適切な合成材料等を含むが、これらに限定されない生体適合性材料および／または合成材料を含む。
【０００８】
ある実施形態において、発明のナノ粒子の外面は、形質膜を含む細胞膜、あるいは単細胞有機体（例えば、細菌もしくは真菌）または多細胞有機体（例えば、植物、動物、非ヒト哺乳動物、脊椎動物、もしくはヒト）に由来する細胞内膜を含む。ある実施形態において、発明のナノ粒子の外面は、天然に存在する細胞膜もしくはウイルス膜を含み、および／または合成膜をさらに含む。
【０００９】
ある実施形態において、発明のナノ粒子の外面の細胞膜は、血液細胞（例えば、赤血球細胞（ＲＢＣ）、白血球細胞（ＷＢＣ）、または血小板）に由来する。他の実施形態において、外面の細胞膜は、免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、もしくはＴ細胞）、腫瘍または癌細胞、及び上皮細胞、内皮細胞、もしくは神経細胞等の他の細胞に由来する。他の実施形態において、外面の細胞膜は、造血幹細胞、骨髄幹細胞、間葉幹細胞、心臓幹細胞、神経幹細胞を含む、幹細胞等の非末端分化細胞に由来する。非末端分化細胞は、組織から多能性状態に単離され得るか、または多能性になるように誘導され得る。さらにある他の実施形態において、細胞膜は、エキソソーム、分泌小胞、またはシナプス小胞、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、ミトコンドリア、液胞、または核を含むが、これらに限定されない細胞成分または細胞小器官に由来する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、発明のナノ粒子が、ナノ粒子の表面内または表面上の任意の場所に位置し得る、放出可能なカーゴ（ｃａｒｇｏ）を含むことをさらに提供する。発明のナノ粒子から放出可能なカーゴを放出するための引き起には、ナノ粒子と標的細胞、組織、器官、もしくは対象との間の接触、またはナノ粒子を取り囲む、ｐＨ、イオン状態、温度、圧力、および他の物理的もしくは化学的変化等の環境パラメータの変更が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、放出可能なカーゴは、１つ以上の治療剤薬、予防剤薬、診断剤薬もしくはマーカー剤薬、予後剤薬、例えば、撮像マーカー、またはそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態において、放出可能なカーゴは、金属粒子、ポリマー粒子、デンドリマー粒子、または無機粒子である。
【００１１】
本ナノ粒子は、任意の適切な形状を有し得る。例えば、本ナノ粒子および／またはその内核は、球、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、キューブ様形状、キューブ、長方形立方６面体（直方体）、円錐、円筒、角柱、ピラミッド、直角円筒形、および他の規則的もしくは不規則的形状を有し得る。本ナノ粒子は、任意の適切な寸法を有し得る。
【００１２】
本発明は、ある実施形態において、発明のナノ粒子が約１０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有することをさらに提供する。ある実施形態において、発明のナノ粒子の直径は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍである。他の実施形態において、ナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、および１０μｍ、または約１０ｎｍ〜約１０μｍの範囲内の任意の適切な小範囲、例えば、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径であり得る。ある実施形態において、内核は、外面を支持する。
【００１３】
本発明は、発明のナノ粒子が、細胞膜が由来する細胞の構成成分、またはウイルス膜が由来するウイルスの構成成分を実質的に欠くことをさらに提供する。例えば、本ナノ粒子は、種類および／または量に関して、細胞膜が由来する細胞の構成成分、またはウイルス膜が由来するウイルスの構成成分の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％を欠失し得る。
【００１４】
さらにある他の実施形態において、本発明のナノ粒子は、細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の構成成分の天然の構造的完全性もしくは活性を実質的に維持する。細胞膜の構造的完全性には、細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の構成成分の一次、二次、三次、もしくは四次構造が挙げられ、細胞膜の活性には、結合活性、受容体活性、シグナル伝達経路活性、および正常な天然に存在する細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の構成成分を有する任意の他の活性が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明のナノ粒子は、生体適合性および／または生分解性である。例えば、本ナノ粒子は、種類および／または量に関して、細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の構成成分の天然の構造的完全性もしくは活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を維持し得る。
【００１５】
ある実施形態において、本発明のナノ粒子は、赤血球細胞に由来する細胞形質膜、および乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含み、このナノ粒子は、実質的にヘモグロビンを欠く。例えば、本ナノ粒子は、種類および／または量に関して、形質膜が由来する赤血球細胞のヘモグロビンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を欠失し得る。
【００１６】
かかる発明のナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングされた同等のナノ粒子のインビボの血液循環中の半減期の少なくとも約２〜５倍の半減期を有する。ある実施形態において、かかる発明のナノ粒子は、少なくとも約５〜約４０時間以上のインビボの血液循環中の半減期を有する。
【００１７】
ある実施形態において、発明のナノ粒子は、細胞膜が由来する種または対象に対する免疫原性を実質的に欠く。例えば、本ナノ粒子は、種類および／または量に関して、細胞膜が由来する種または対象に対する免疫原性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を欠失し得る。
【００１８】
本発明は、発明のナノ粒子を含む薬剤送達系および／または医薬組成物をさらに提供する。ある実施形態において、本発明の薬剤送達系および／または医薬組成物は、１つ以上の付加的活性成分および／または医学的もしくは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤をさらに含み、本発明のナノ粒子と共に、もしくは組み合わせて投与され得る。
【００１９】
本発明は、発明のナノ粒子、薬剤送達系、またはそれを含む医薬組成物を使用して、必要とする対象において、疾患もしくは状態を治療および／もしくは予防するための方法をさらに提供する。ある実施形態において、発明の方法に使用されるナノ粒子の細胞膜は、対象と同一種の細胞に由来するか、または対象の細胞に由来する。ある実施形態において、発明の方法に使用されるナノ粒子の細胞膜は、対象と同一種の赤血球細胞に由来し、この赤血球細胞は、対象と同一の血液型を有する。ある実施形態において、ナノ粒子、薬剤送達系、または医薬組成物は、任意の適切な投与経路を介して投与される。例えば、ナノ粒子、薬剤送達系、または医薬組成物は、経口、経鼻、吸入、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、局所、または直腸経路を介して投与され得る。
【００２０】
他の実施形態において、ナノ粒子は、薬剤送達系を介して投与される。さらに他の実施形態において、発明の方法は、別の活性成分、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を、必要とする対象に投与することをさらに含む。発明の方法は、本発明のナノ粒子が、必要とする対象の全身または標的部位に投与され得る。必要とする対象において、疾患または状態を治療または予防するための薬物の作製のための有効な量の本発明のナノ粒子の使用も提供される。
【００２１】
さらに、本発明は、非細胞性材料を含む内核と、細胞および抗原もしくはハプテンに由来する細胞膜または形質膜を含む外面と、を含む、有効な量のナノ粒子を含む免疫原性組成物を提供する。本発明の免疫原性組成物を含むワクチンも提供される。本発明は、かかる誘発を必要とする対象において、抗原またはハプテンに対する免疫応答を誘発するための発明の免疫原性組成物の使用方法、および抗原またはハプテンに対して対象を保護するための免疫原性組成物を含む、発明のワクチンの使用方法をさらに提供する。ある実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞またはＢ細胞媒介性免疫応答である。抗原またはハプテンに対する免疫原性組成物の作製のための有効な量の本発明のナノ粒子の使用、および抗原またはハプテンに対して対象を保護するためのワクチンの作製のための有効な量の免疫原性組成物の使用も提供される。
【００２２】
本発明はさらに、細胞に由来する細胞膜またはウイルスに由来する膜を有する非細胞性材料を含むナノ粒子内核を混合する一方で、外因的なエネルギーを印加してナノ粒子を形成することを含む、発明のナノ粒子を作製するための方法を提供する。ある実施形態において、外因的なエネルギーは、機械的エネルギー、例えば、押出により印加される機械的エネルギーである。他の実施形態において、外因的なエネルギーは、音響エネルギー、例えば、音波により印加される音響エネルギーである。さらに他の実施形態において、外因的なエネルギーは、熱エネルギー、例えば、加熱により印加される熱エネルギーである。さらに他の実施形態において、発明の方法は、細胞に由来する天然に存在する細胞膜またはウイルスに由来する天然に存在する膜を有する非細胞性材料を含むナノ粒子内核を、合成膜と混合する一方で、外因的なエネルギーを印加して、内核と、細胞膜またはウイルス膜および剛性膜を含む外面と、を含むナノ粒子を形成することをさらに含む。
【００２３】
本発明は、非細胞性材料を含む内核と、新生物細胞に由来する細胞膜を含む外面と、を含む、有効な量のナノ粒子を含む新生物特異的免疫原性組成物をさらに提供し、細胞膜は、新生物細胞に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性を実質的に保持する。例えば、本ナノ粒子は、種類および／または量に関して、新生物細胞に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を維持し得る。
【００２４】
ある実施形態において、内核は、かかる粒子の外面を支持する。ある実施形態において、かかるナノ粒子の内核はＰＬＧＡを含み、外面は、新生物細胞に由来する形質膜を含む。他の実施形態において、かかるナノ粒子の外面は、天然に存在する細胞膜またはウイルス膜を含み、合成膜をさらに含む。
【００２５】
発明の新生物特異的免疫原性組成物に含有されるナノ粒子は、細胞膜が由来する新生物細胞の構成成分を欠く。例えば、本ナノ粒子は、種類および／または量に関して、細胞膜が由来する新生物細胞の構成成分の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を欠失し得る。
【００２６】
ある実施形態において、発明の新生物特異的免疫原性組成物中のナノ粒子は、約１０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有する。ある実施形態において、かかるナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、発明の新生物特異的免疫原性組成物中のナノ粒子はさらに、別の活性成分または放出可能なカーゴを含む。さらに他の実施形態において、発明の新生物特異的免疫原性組成物はさらに、免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤を含む。
【００２７】
本発明はさらに、新生物特異的免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。発明の新生物特異的免疫原性組成物またはワクチンを使用して、必要とする対象において新生物を治療または予防するための方法も提供される。本発明はさらに、新生物に対して対象を治療または予防するための癌もしくは新生物特異的免疫原性組成物またはワクチンの作製のための、有効な量の本発明の新生物の使用を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するために、本発明のナノ粒子を含む医薬組成物を提供し、この医薬組成物に含有されるナノ粒子は、非細胞性材料を含む内核と、標的細胞、例えば、赤血球細胞に由来する細胞膜もしくは形質膜を含む外面と、を含む。ある実施形態において、標的細胞の細胞膜もしくは形質膜に挿入される毒素は、天然の病理学的機構の一環であるか、またはナノ粒子の外面中の細胞膜もしくは形質膜は、実質的に毒素を保持する。ある実施形態において、毒素は、細菌性（例えば、黄色ブドウ球菌）、植物性、真菌性、または動物性毒素である。
【００２９】
ある実施形態において、内核は外面を支持し、ナノ粒子の外面中の細胞膜は、実質的に毒素を保持するために、その構造的完全性を実質的に保持する。さらにある他の実施形態において、ナノ粒子の外面は、天然に存在する細胞膜もしくはウイルス膜を含み、さらにその細胞膜に付加される合成膜または合成成分もしくは天然に存在する成分を含む。さらにある他の実施形態において、かかる医薬組成物に含有されるナノ粒子は、生体適合性、生分解性であるか、または合成材料を含む。さらにある他の実施形態において、本発明の医薬組成物はさらに、別の活性成分または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む。
【００３０】
本発明のナノ粒子を使用して、細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法、ならびにかかるナノ粒子を含む医薬組成物も提供される。本発明はさらに、必要とする対象において、細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための薬剤を作製するために、ナノ粒子を含む有効な量の医薬組成物の使用を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、非細胞性材料を含む内核と、細胞および細胞膜挿入毒素に由来する細胞膜または形質膜を含む外面と、を含む、免疫原性組成物を提供する。本発明の免疫原性組成物を含むワクチンも提供される。本発明はさらに、かかる誘発を必要とする対象において、細胞膜挿入毒素に対する免疫応答を誘発するために、発明の免疫原性組成物を使用する方法、および細胞膜挿入毒素に対して対象を保護するために、免疫原性組成物を含む発明のワクチンを使用する方法を提供する。ある実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞またはＢ細胞媒介性免疫応答である。細胞膜挿入毒素に対する免疫原性組成物を作製するための有効な量の本発明のナノ粒子の使用、および細胞膜挿入毒素に対して対象を保護するためのワクチンを作製するための有効な量の免疫原性組成物の使用も提供される。
【００３２】
本発明は、感染性疾患、寄生虫性疾患、新生物、血液および造血器官の疾患、免疫機構、内分泌、栄養性および代謝性疾患を伴う障害、精神疾患および行動障害、神経系の疾患、眼および付属器の疾患、耳および乳様突起の疾患、循環器系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚および皮下組織の疾患、筋骨格系および結合組織の疾患、泌尿生殖器系、妊娠、出産、および産褥期の疾患、周産期に発症する状態、先天性奇形、変形、染色体異常、傷害、中毒、外因の結果、ならびに罹患率および死亡率の外因を含むが、これらに限定されない任意の疾患、障害、または生理学的もしくは病理学的状態の治療、予防、診断、および／または予後を考慮する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子、薬剤送達系、医薬組成物、および方法を使用して、表１に列挙される例示の癌および腫瘍を治療または予防すること、表２に列挙される例示の癌薬物を送達すること、表３に列挙される例示の眼精疾患または状態を治療または予防すること、表４に列挙される例示の眼球薬物を送達すること、表５に列挙される肺に影響する例示の疾患または状態を治療または予防すること、表６に列挙される例示の肺／呼吸器系疾患薬物を送達すること、表７に列挙される心臓に影響する例示の疾患または状態を治療または予防すること、あるいは表８に列挙される例示の心臓薬物を送達することができる。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子、薬剤送達系、医薬組成物、および方法を使用して、表９に列挙される例示の状態を治療または予防することができる。表１〜９は、本明細書の最後に添付される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子、薬剤送達系、医薬組成物、および方法を使用して、米国食品医薬品局により発行されたＯｒａｎｇｅ  Ｂｏｏｋ：Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍａｒｃｈ  ２０１２）に列挙される例示の薬物、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（Ｕ．Ｓ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ  ｐｒｉｎｔｅｄ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）およびそのオンラインバージョン（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  ＯｎｌｉｎｅＳＭ，ウェブ上の最新更新：２０１２年５月１日火曜日）に列挙される例示の薬物、および米国食品医薬品局により発行されたＢｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＆Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｓに列挙される例示の薬物を送達することができ、対応する疾患および障害を治療または予防することができる。
【００３５】
当業者であれば、以下に記載される図面が単なる例示目的であることを理解するであろう。これらの図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子（ＮＰ）の調製プロセスの概略図。
【図２】ＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子の構造的特性化。図２Ａ。ナノ粒子は、酢酸ウラニルでネガティブ染色し、後次にＴＥＭで可視化した。図２Ｂ。１４日間にわたるナノ粒子の寸法、多分散性指数（ＰＤＩ）、および表面ゼータ電位のＤＬＳ測定値。図２Ｃ。ＨｅＬａ細胞により内在化された後のＲＢＣ膜（緑ローダミン−ＤＭＰＥ染料で可視化された）およびポリマー核（ＤｉＤ染料で可視化された）の共局在化を示す走査蛍光顕微鏡画像。ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子は、ＨｅＬａ細胞で６時間培養した。過剰なナノ粒子を洗浄し、撮像するために細胞を後次に固定した。
【図３】膜タンパク質保持、血清中の粒子安定性、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子（ＮＰ）のインビボ循環時間。図３Ａ。空のＲＢＣ、ＲＢＣ膜由来の小胞、および精製したＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子中のタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル上で可溶化および分解した。図３Ｂ。ＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧコーティングされた脂質ＰＬＧＡハイブリッドナノ粒子、および裸ＰＬＧＡナノ粒子を、１００％ウシ胎仔血清中で培養し、５６０ｎｍで４時間、吸収を監視した。図３Ｃ。ＤｉＤ負荷されたナノ粒子を、マウスの尾静脈を通じて静脈内注入した。様々な時点で、血液を眼窩内から抜き取り、６７０ｎｍでの蛍光を測定して、ナノ粒子の全身循環寿命を評価した（ｎ＝６／群）。
【図４】ＲＢＣ膜でコーティングされたポリマーナノ粒子の生体内分布。蛍光標識されたナノ粒子を、マウスに静脈内注入した。各時点で（それぞれ２４、４８、および７２時間）、ランダムにグループ化したマウスの小集団を集め、均質化して、蛍光を定量した。図４Ａ。組織１グラム当たりの蛍光強度（ｎ＝６／群）。図４Ｂ。器官当たりの相対シグナル。
【図５】低張液中の溶血処理前（左パネル）および後（右パネル）のマウス赤血球細胞（ＲＢＣ）の位相差顕微鏡画像。ＲＢＣ内容物（ヘモグロビン）の喪失は、ＲＢＣ内の媒質の改変を示す、位相差の変化により検証した。
【図６】動的光散乱（ＤＬＳ）により測定される、ＲＢＣゴーストの誘導、５分の音波処理、４００ｎｍ押出、および１００ｎｍ押出に続く、ＲＢＣ膜由来の小胞の平均直径。
【図７】７２時間の期間にわたるＰＥＧ化された脂質ＰＬＧＡハイブリッドナノ粒子（ＮＰ）中のＤｉＤ染料の蛍光保持。
【図８】ＤＬＳにより測定されるように、ＲＢＣ膜でコーティングする前（左）および後（右）のＰＬＧＡナノ粒子（ＮＰ）の平均粒径。
【図９】ＲＢＣｍで被覆されたＮＰの構築材料および調製プロセスの概略図。ＲＢＣゴースト、ＲＢＣｍ由来の小胞、ポリマー核、およびＲＢＣｍで被覆されたＮＰの流体力学的寸法を、ＤＬＳにより測定した。
【図１０】ドキソルビシン（ＤＯＸ）の負荷は、様々な初期薬物入力において、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰをもたらす。薬物分子は、それぞれ２つの明確な負荷機構：物理的カプセル化および化学的結合を通じてＮＰに負荷した。
【図１１】ＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰのインビボ安定性試験。ＤＯＸを化学的結合または物理的カプセル化のいずれかを通じてＮＰに負荷した。図１１（Ａ）ＰＢＳ緩衝液中の粒径（直径、ｎｍ）および多分散性指数（ＰＤＩ）に関して、ＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰの長期安定性を、室温で７日間監視した。図１１（Ｂ）１００％ＦＢＳ中のＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰおよび裸ＮＰ核の安定性（ＲＢＣｍ被覆なし）を、５６０ｎｍの波長で紫外線吸光度を測定することにより評価した。
【図１２】ＲＢＣｍで被覆されたＮＰおよびＰＥＧ化ＮＰのＤＯＸ放出特性。これらの放出研究の場合、ＮＰ内の初期ＤＯＸ濃度は、それぞれ化学的結合には５重量％、物理的カプセル化には１．８重量％であった。図１２（Ｂ）物理的カプセル化系について、時間の平方根に対する薬物放出率をプロットし、拡散優位のＨｉｇｕｃｈｉモデルを使用して、線状適合をもたらした。
【図１３】ＡＭＬ患者の末梢血から確立されたＫａｓｕｍｉ−１細胞株に対する比較細胞毒性研究であり、正方形は、化学的に結合されたＤＯＸを持つＲＢＣｍで被覆されたＮＰを表し、丸は、物理的にカプセル化されたＤＯＸを持つＲＢＣｍで被覆されたＮＰを表し、三角形は、遊離ＤＯＸを表す。すべての試料を、ＭＴＴアッセイ前に７２時間、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞で培養した（ｎ＝４）。
【図１４】癌治療ワクチンとしての癌細胞膜で被覆された免疫賦活ナノ粒子の概略図。
【図１５】癌細胞膜で被覆されたポリマーナノ粒子の３ステッププロセスの図：アジュバント負荷したポリマーナノ粒子を合成するステップ、癌細胞膜由来の小胞を形成するステップ、およびポリマーナノ粒子を小胞と融合するステップ。
【図１６】提案される個別の癌治療ワクチンの作用機構を示す概略図：（ｉ）癌細胞を個々の患者の腫瘍から採取し、天然の癌細胞膜を使用して、アジュバント負荷したナノ粒子を包む、（ｉｉ）これらの免疫賦活ナノ粒子は、未成熟の樹状細胞により取り込まれ、したがってそれらの成熟を誘起する、（ｉｉｉ）成熟した樹状細胞は、細胞毒性Ｔ細胞に対する癌抗原を提示し、抗原に対する免疫応答を活性化する、（ｉｖ）活性化した細胞毒性Ｔ細胞は、特定の癌抗原を発現する腫瘍を破壊する。
【図１７】ＴＥＭ画像は、癌細胞膜で被覆したＰＬＧＡナノ粒子のコアシェル構造を示す。図１７ｂ。ＤＬＳにより測定されるナノ粒子直径。図１７ｃ。全体癌細胞と比較したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび透析した癌細胞膜で被覆されたナノ粒子のＤＮＡ含有量。図１７ｄ。デコンボリューション蛍光顕微鏡画像は、ＰＬＧＡ核を持つ膜材料の共送達を示す。癌細胞膜は、ＮＢＤ染料（緑色）で染色し、ポリマー核は、ＤｉＤ染料（赤色）で負荷し、核はＤＡＰＩ（青色）で染色する。
【図１８】ＰＦＴを中和する際の毒素ナノスポンジの概略図。ナノスポンジは、ＰＦＴが組み込まれ得る、基質支持されたＲＢＣ二重層膜で構成される。図１８（Ｂ）α−毒素の存在下での単一ナノスポンジのＴＥＭ可視化。試料は、酢酸ウラニル中でネガティブ染色した（スケールバー＝２０ｎｍ）。図１８（Ｃ）α−毒素と混合されたナノスポンジのＴＥＭ可視化（スケールバー＝８０ｎｍ）。
【図１９】ＰＢＳ、ＰＥＧ化ＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、ＲＢＣ膜小胞、および毒素ナノスポンジ溶液中で調製されたα−毒素で３０分間培養した後遠心分離されたＲＢＣ。各管に、最終容積２ｍＬのＰＢＳ中の５％精製ＲＢＣ、３μｇのα−毒素、および２００μｇの対応するナノ製剤を入れた。図１９（Ｂ）５４０ｎｍでの吸光度に基づくＲＢＣ溶血の定量。図１９（Ｃ）３μｇのα−毒素と混合された２００μｇのナノ製剤を濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより毒素吸収について分析した。３μｇの濾過していないα−毒素を参照として調製した。図１９（Ｄ）脂溶性染料、ＤＭＰＥ−ローダミン（赤色）にナノ製剤を含有させて、細胞による培養時の膜材料の分布を示す。ヒト臍静脈内皮細胞による１時間の培養後、染料の広い分布（左）は、膜小胞が細胞膜と融合する能力があることを示唆し、特徴的な粒子（右）は、ナノスポンジの膜材料が細胞内に取り込まれたことを示した。図１９（Ｅ）ナノスポンジと事前混合した場合、またはしない場合の可変量のα−毒素の溶血活性。全体ナノスポンジ含有量を２００μｇで固定し、５％のＲＢＣを含有する２ｍＬのＰＢＳ溶液中で溶血を調べた。図１９（Ｆ）可変量のナノスポンジによるα−毒素溶血の阻害。全体毒素含有量を９μｇで固定し、５％のＲＢＣを含有する２ｍＬのＰＢＳ溶液中で溶血を調べた。
【図２０】１５０μＬの１２μｇ／ｍＬ  α−毒素および１００μｇのナノスポンジにより中和された同一の製剤を、マウスの側腹部に皮下注入した。図２０（Ａ）注入から３日後の毒素注入されたマウスの代表的な皮膚創傷を観察した。図２０（Ｂ）ナノスポンジで中和された毒素注入は、皮膚に対して観察可能な影響を示さなかった。図２０（Ｃ）組織学的切断は、毒素が表皮内に明白な炎症性浸潤、アポトーシス、壊死、および浮腫を与えたことを明らかにした（スケールバー＝８０μｍ）。図２０（Ｄ）ナノスポンジで中和された毒素の注入に続いて、表皮に異常は観察されなかった（スケールバー＝８０μｍ）。図２０（Ｅ）筋線維上の裂傷、原線維間浮腫、および周囲の血管系からの好中球の溢出は、筋肉上の毒素損傷を明らかにした（スケールバー＝２０μｍ）。図２０（Ｆ）正常な筋線維構造および炎症兆候の欠失は、ナノスポンジによる毒素中和を示唆する（スケールバー＝２０μｍ）。
【図２１】７５μｇ／ｋｇ  α−毒素（黒色）の静脈内注入後１５日間にわたるマウスの生存率。８０ｍｇ／ｋｇのナノスポンジを、毒素注入の後（赤色）または前（青色）のいずれかに２分間、静脈内投与した。ログランク検定を使用して、ｐ値を得た。毒素を注入したマウスのみが０％の生存率を有した。ナノスポンジを後接種したマウスは、４４％の生存率を有した（ｐ＜０．００９１）。ナノスポンジを事前に接種したマウスは、８９％の生存率を有した（ｐ＜０．０００１）。すべての注入は、尾静脈を介して静脈内経路を通じて行った（ｎ＝９）。
【図２２】毒素ナノスポンジの調製プロセスの概略図。
【図２３】毒素の能動免疫付与のための膜コーティングされたナノ粒子の概略図。
【図２４】ブドウ球菌α−溶血素、熱変性させた毒素、またはナノ粒子で中和した毒素のいずれかを皮下的に頸部に接種したマウスの代表的な画像。接種から７２時間後、マウスを調べたところ、粒子／毒素を接種したマウスに皮膚創傷は観察されなかった。
【図２５】熱変性させた毒素またはナノ粒子で中和した毒素のいずれかを週１回、３週間にわたって接種した後、接種したマウスの血清を抽出し、ＥＬＩＺＡを使用して、α溶血素に対する抗体力価について調べた。ナノ粒子／毒素群は、熱変性させた毒素群に同等の抗体力価を示した。
【図２６】最初に、接種したマウスからの血清希釈液で毒素を培養することにより、赤血球細胞溶血アッセイを行った。後次に混合液をＲＢＣと混合して、溶血活性について調べた。ナノ粒子／毒素を接種したマウスからの血清は、毒素活性の著しい阻害を示した。
【図２７】致死量のα溶血素を静脈内注入する毒素惹起を経る前に、マウスにナノ粒子で中和したα溶血素を週１回、３回にわたって接種した。対照として、非免疫付与マウスに同一用量の毒素を注入した。粒子／毒素で免疫付与したマウスは、７２時間のマークにおいて生存率１００％を示したが、非免疫付与マウスはいずれも６時間を超えて生存しなかった（ｎ＝１０）。
【図２８】毒素中和のための膜コーティングされたナノ粒子の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である、ナノ技術、ナノ工学、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学、および薬学の従来技術を用いる。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）等の文献において完全に説明されている。
【００３８】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において参照されるすべての特許、出願、公開出願、および他の出版物は、参照することによりそれら全体が組み込まれる。本セクションに記載される定義が、参照することにより本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の出版物に記載される定義に反するか、またはそうでなければ矛盾する場合、本セクションに記載される定義が、参照することにより本明細書に組み込まれる定義に優先する。
【００３９】
本発明の理解を容易にするために、本明細書で使用される多数の用語および省略語は、以下のように定義される。
【００４０】
本発明またはその好適な実施形態（複数可）の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、それらの要素のうちの１つ以上が存在することを意味するよう意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であり、列挙される要素の他に追加の要素が存在し得ることを意味するよう意図される。
【００４１】
用語「および／または」は、２つ以上の項目の一覧において使用されるとき、列挙される項目のうちのいずれか１つが、それ自体で用いられ得るか、または列挙される項目のうちのいずれか１つ以上と併せて用いられ得ることを意味する。例えば、表現「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢのいずれかまたは両方、すなわち、Ａ単独、Ｂ単独、またはＡおよびＢの併用を意味するものとする。表現「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢの併用、ＡおよびＣの併用、ＢおよびＣの併用、またはＡ、Ｂ、およびＣの併用を意味するものとする。
【００４２】
細胞膜：本明細書で使用されるとき、用語「細胞膜」は、細胞または緊急ウイルス粒子内または周囲の選択的障壁として作用する、生体膜包囲または分離構造を指す。細胞膜は、イオンおよび有機分子に対して選択的に透過性であり、細胞内外の物質の移動を制御する。細胞膜は、リン脂質単層または二重層、および任意に関連付けられたタンパク質および炭水化物を含む。本明細書で使用されるとき、細胞膜は、細胞もしくは細胞器官の天然に存在する生物膜から得られる膜、またはそれに由来するものを指す。本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在する」は、自然界に存在するものを指す。本明細書で使用されるとき、用語「それに由来する」は、天然の膜の任意の後次修飾、例えば、細胞膜を単離すること、膜の一部または断片を形成すること、細胞もしくは細胞器官から得た膜から脂質、タンパク質、もしくは炭水化物等のある成分を除去すること、および／またはそこに付加することを指す。膜は、任意の適切な方法により、天然に存在する膜に由来し得る。例えば、膜は、細胞またはウイルスから調製または単離され得、その調製または単離された膜を他の物質または材料と組み合わせて、由来膜を形成することができる。別の例において、細胞またはウイルスは、インビボでその膜に組み込まれる「非天然の」物質を生成するように、組換え技術により設計することができ、細胞膜またはウイルス膜は、由来膜を形成するように、細胞またはウイルスから調製または単離され得る。
【００４３】
様々な実施形態において、単層または単層ナノ粒子のいずれかを被覆する細胞膜は、コレステロール、遊離脂肪酸、およびリン脂質等の他の脂質成分で飽和または不飽和されるようにさらに修飾され得、また細胞表面抗原等の内因性または付加タンパク質および炭水化物を含み得る。かかる場合において、過剰な量の他の脂質成分を膜壁に付加することができ、膜壁中の濃度が平衡に達するまで流し、ナノ粒子環境に依存し得る。膜は、ナノ粒子の活性を高め得るか、または高め得ない他の薬剤も含んでよい。他の例において、抗体およびアプタマー等の官能基を膜の外面に付加して、癌細胞に見られる細胞表面エピトープ等の部位標的を強化することができる。ナノ粒子の膜は、金、銀、および合成ナノ粒子を含むが、これらに限定されない生分解性陽イオンナノ粒子であり得る粒子を含むこともできる。
【００４４】
合成膜または人工膜：本明細書で使用されるとき、用語「合成膜」または「人工膜」は、ポリマーおよび液体等の有機材料、ならびに無機材料から生成される人工の膜を指す。多様な合成膜が、当該技術分野においてよく知られている。
【００４５】
ウイルス膜：本明細書で使用されるとき、用語「ウイルスに由来する膜」は、ウイルスの拡散またはタンパク質カプシドを被覆するウイルスエンベロープを指し、典型的に、宿主細胞膜（リン脂質およびタンパク質）の一部に由来する細胞膜タンパク質を含有し、いくつかのウイルス糖タンパク質を含む。ウイルスエンベロープは、宿主の膜と融合し、カプシドおよびウイルスゲノムを宿主に進入させ、感染させる。
【００４６】
ナノ粒子：用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用されるとき、約１ｎｍ〜約１０μｍの間の少なくとも１つの寸法（例えば、高さ、長さ、幅、または直径）を有する、ナノ構造、粒子、小胞、またはその断片を指す。全身に使用する場合、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または１００ｎｍ〜２５０ｎｍの平均直径が好適であり得る。用語「ナノ構造」は、粒子および工学的特徴を含むが、必ずしもこれらに限定されない。粒子および工学的特徴は、例えば、規則的形状または不規則的形状を有し得る。かかる粒子は、ナノ粒子とも呼ばれる。ナノ粒子は、有機材料または他の材料で構成され得、あるいは多孔性粒子で実装され得る。ナノ粒子の層は、単層中のナノ粒子またはナノ粒子の凝集を有する層で実装され得る。本明細書で使用されるとき、内核からなるナノ粒子は、本明細書で論じられる膜を含む外面により被覆される。本発明は、本明細書に記載される膜でコーティングされ得る、現在既知および今後開発される任意のナノ粒子を考慮する。
【００４７】
薬学的に活性な：用語「薬学的に活性な」は、本明細書で使用されるとき、生命体上、および特にヒトの身体細胞および組織上での物質の有益な生物活性を指す。「薬学的に活性な薬剤」または「薬物」は、薬学的に活性な物質であり、「薬学的に活性な成分」（ＡＰＩ）は、薬物中の薬学的に活性な物質である。
【００４８】
薬学的に許容される：用語「薬学的に許容される」は、本明細書で使用されるとき、動物において、より具体的にはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物において使用するために安全である他の製剤に加えて、連邦政府または州政府の規制機関により承認され、米国薬局方、他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。
【００４９】
薬学的に許容される塩：用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用されるとき、本開示における化合物、例えば、多剤組み合わせの酸付加塩または塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩は、親化合物の活性を保持し、それが投与される対象に対して、およびそれが投与される文脈において、いかなる有害作用または望ましくない効果も付与しない、任意の塩である。薬学的に許容される塩は、システインを含むが、これに限定されないアミノ酸に由来し得る。化合物を塩として生成するための方法は、当業者に既知である（例えば、Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｚｕｒｉｃｈ，２００２、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１，１９７７を参照）。いくつかの実施形態において、「薬学的に許容される塩」は、非毒性、生物学的に許容される、またはそうでなければ対象に投与するために生物学的に適切である、本明細書に表される化合物の遊離酸または塩基の塩を意味する。一般に、Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照されたい。好適な薬学的に許容される塩は、不必要な毒性、刺激、またはアレルギー反応なしに対象の組織と接触するために薬学的に有効かつ適切なものである。本明細書に記載される化合物は、十分に酸性の基、十分に塩基性の基、両種の官能基、または各種複数の基を有してよく、したがって、多数の無機または有機塩基、および無機酸および有機酸と反応して、薬学的に許容される塩を形成する。
【００５０】
薬学的に許容される塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソブチル酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオン酸塩、オキサル酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブチル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシブチル酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、およびマンデル酸塩が挙げられる。
【００５１】
薬学的に許容される担体：用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用されるとき、多剤複合体等の化合物が一緒に投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバント、および／または媒体を指す。かかる担体は、水および油等の滅菌液であり得、石油、動物、植物起源もしくは合成起源のもの、例えば、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒を含む。抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）、キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）、および等張性調整剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）も担体であり得る。担体との組み合わせで組成物を生成するための方法は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、言語「薬学的に許容される担体」は、薬剤投与に適合する、任意およびすべての溶媒、分散媒質、コーティング、等張および吸収遅延剤等を含むものとする。薬学的に活性な物質のかかる媒質および薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）を参照されたい。任意の従来の媒質または薬剤が活性成分と適合する限りにおいて、組成物中のかかる使用が考慮される。
【００５２】
リン脂質：用語「リン脂質」は、本明細書で使用されるとき、ジグリセリド、リン酸基、およびコリン等の単純な有機分子を含む、多数の脂質のいずれかを指す。リン脂質の例としては、ホスファチジルイノシトールｆ（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸塩（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸塩（ＰＩＰ２）、およびホスファチジルイノシトール三リン酸塩（ＰＩＰ３）を含むが、これらに限定されない、ホスファチジン酸（ホスファチジン酸塩）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスホイノシチドが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣの追加の例としては、当該技術分野において定義される、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＲＰＣ、およびＤＥＰＣが挙げられる。
【００５３】
治療上有効な量：本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な量」は、特定の対象に投与されるとき、その対象の疾患もしくは状態の性質および重篤度を考慮して、所望の治療効果を有する量、例えば、標的の疾患もしくは状態を治癒、予防、阻害、または少なくとも部分的に停止もしくは部分的に予防する量を指す。より具体的な実施形態は、以下の薬学的調製物および投与方法のセクションに含まれる。いくつかの実施形態において、用語「治療上有効な量」または「有効な量」は、単独もしくは追加の治療薬との併用で、細胞、組織もしくは対象に投与されるとき、感染等の疾患もしくは状態、またはその疾患もしくは状態の進行を予防または軽減するために有効な治療薬の量を指す。治療上有効な用量は、症状の軽減、例えば、関連医療状態の治療、予防、もしくは軽減をもたらすか、またはかかる状態の治療、治癒、予防、もしくは軽減の速度を高めるために十分な治療薬の量をさらに指す。単独で投与される個別の活性成分に適用されるとき、治療上有効な用量は、その成分単独を指す。組み合わせに適用されるとき、治療上有効な用量は、併用で投与されるか、連続して投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の複合量を指す。
【００５４】
ワクチン：患者において、特定の抗原に対する有益な能動的または受動的免疫応答を誘発することができる組成物。保護的な免疫性が所望され得るが、様々なレベルの一次免疫応答が有益であり得ることが理解される。
【００５５】
「治療する」または「治療」または「軽減」は、標的とされた病理学的状態もしくは疾患を治癒しない場合に、遅延（減少）させること、またはその状態の再発を予防することを目的とする治療処置を指す。治療量の治療薬を受けた後、対象が特定疾患の１つ以上の兆候および症状において、観察可能および／または測定可能な減少もしくは不在を示す場合、その対象は良好に「治療される」。疾患の兆候または症状の減少は、患者によっても感じられ得る。患者が安定した疾患を経験している場合にも、その患者は治療されたと考慮される。いくつかの実施形態において、治療薬による治療は、治療の３ヶ月後、好ましくは治療の６ヶ月後、より好ましくは１年後、さらにより好ましくは２年後、またはそれより長い期間を超えて、患者が無病であるという結果をもたらすのに有効である。疾患において良好な治療および改善を評価するためのこれらのパラメータは、当該技術分野において適切な手技を有する医師に既知のルーチン手順により容易に測定可能である。
【００５６】
用語「併用（組み合わせ）」は、１つの用量単位形態の固定併用、または併用投与のための部品キットのいずれかを指し、化合物および併用パートナー（例えば、以下に説明される別の薬物、「治療薬」または「共薬」とも呼ばれる）は、同時に独立して、または時間間隔内で別個に投与されてよく、特にこれらに時間間隔は、併用パートナーが共同的効果、例えば、相乗効果を示すことを可能にする。用語「共投与」または「併用投与」等は、本明細書において利用されるとき、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に対する選択された併用パートナーの投与を包含することを意味し、必ずしも同一の投与経路または同時に投与される必要がない治療レジメンを含むものとする。用語「薬剤併用」は、本明細書で使用されるとき、複数の活性成分の混合または併用から生じる生成物を含み、活性成分の固定併用および非固定併用の両方を含む。用語「固定併用」は、活性成分、例えば、化合物および併用パートナーが、いずれも単一実体または用量の形態で、同時に患者に投与されることを意味する。用語「非固定併用」は、活性成分、例えば、化合物および併用パートナーが、いずれも特定の時間制限なしに、同時、並行、または連続のいずれかで、別個の実態として患者に投与されることを意味し、かかる投与は、患者の体内に治療上有効なレベルの２つの化合物を提供する。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用する。
【００５７】
本明細書に記載される発明の態様および実施形態が、態様および実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
【００５８】
本開示を通じて、本発明の様々な態様は、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡略化のためであることを理解するべきであり、本発明の範囲を柔軟に制限するものと見なされてはならない。したがって、範囲の記載は、すべての可能な小範囲ならびにその範囲内の個別の数値を特異的に開示したと考慮されるべきである。例えば、１〜６の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の小範囲、ならびに例えば、１、２、３、４、５、および６内の個別の数字を特異的に開示したと考慮されるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００５９】
本発明の他の目的、利益、および特徴は、添付の図面と併せて考慮される以下の明細書から明らかになるであろう。
【００６０】
本発明は、新規のナノ粒子、それを使用および作製する方法を提供する。より具体的に、発明のナノ粒子は、ａ）非細胞性材料を含む内核、ｂ）細胞に由来する膜またはウイルスに由来する膜を含む外面を含む。
【００６１】
ある実施形態において、発明のナノ粒子の内核は外面を支持し、球、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、キューブ様形状、キューブ、長方形立方６面体（直方体）、円錐、円筒、角柱、ピラミッド、直角円筒形、および他の規則的もしくは不規則的形状を含むが、これらに限定されない任意の形状であり得る。他の実施形態において、内核の非細胞性材料は、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリリジン、ポリグルタミン酸、および任意の他の適切な合成材料等を含むが、これらに限定されない生体適合性合成材料を含む。
【００６２】
ある実施形態において、発明のナノ粒子の外面の膜は、任意の単細胞有機体（例えば、細菌もしくは真菌）または多細胞有機体（例えば、植物、動物、非ヒト哺乳動物、もしくはヒト）からの細胞の形質膜に由来する、天然に存在する細胞膜を含む。天然に存在する細胞形質膜は、膜の天然の構造的完全性および活性を維持する。例えば、脂質二重層構造およびそれとともに埋め込まれる関連膜タンパク質の少なくともいくつかは正常であり、膜カプセル化が、膜が由来する種または対象に対する免疫原性を実質的に欠くようにする。
【００６３】
ある実施形態において、細胞は、例えば、赤血球細胞（ＲＢＣ）、白血球細胞（ＷＢＣ）、および血小板等の血液細胞、マクロファージ、単球、Ｂ−細胞、およびＴ細胞等の免疫細胞、腫瘍細胞または癌細胞、ならびに例えば、上皮細胞、内皮細胞、および神経細胞等の他の細胞を含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、外面の膜は、造血幹細胞、骨髄幹細胞、間充織幹細胞、心臓幹細胞、または神経幹細胞等の非最終分化した幹細胞または多能性幹細胞に由来する。さらに他の実施形態において、細胞膜は、エキソソーム、分泌小胞、またはシナプス小胞を含むが、これらに限定されない細胞成分に由来する。ある実施形態において、本発明のナノ粒子の外面は、天然由来の膜とともに、合成膜または合成成分をさらに含む。
【００６４】
本発明による膜は、本明細書に記載される方法および当該技術分野において既知の方法により取得および構築することができ、例えば、それらの内容全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｄｅｓｉｌｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１：１７４１−４７、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００９，８（６），３０７８−３０９０、Ｇｒａｈａｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９３，１９，９７−１０８、Ｖａｙｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９１，２７９（Ｐｔ  ３），８４３−８４８、Ｎａｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，４９（８），２１４７−２１５６、Ｈｅｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ  Ｒ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｈｅｂｄ  Ｓｅａｎｃｅｓ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｄ  １９７７，２８５（１），１２１−１２２、およびＢｏｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９６９，４１（２），３７８−３９２）を参照されたい。
【００６５】
本発明は、発明のナノ粒子が、そのナノ粒子の表面内または上の任意の場所に位置し得る、放出可能なカーゴを含むことをさらに提供する。ある実施形態において、放出可能なカーゴは、発明のナノ粒子の内核内または上に位置する。他の実施形態において、放出可能なカーゴは、内核と発明のナノ粒子の外面との間に位置する。さらに他の実施形態において、放出可能なカーゴは、発明のナノ粒子の外面内または上に位置する。発明のナノ粒子から放出可能なカーゴを放出するための引き起としては、ナノ粒子と標的細胞、組織、器官、もしくは対象との間の接触、またはナノ粒子を取り囲む環境パラメータ、例えば、ｐＨ、イオン状態、温度、圧力の変更、および他の物理的もしくは化学的変更が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
ある実施形態において、放出可能なカーゴは、１つ以上の治療剤薬、予防剤薬、診断剤薬もしくはマーカー剤薬、診断剤薬、またはそれらの組み合わせを含む。治療薬の例としては、抗生物質、抗菌薬、成長因子、化学療法薬、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示の診断薬または予後薬は、撮像マーカーであり得る。さらにある他の実施形態において、放出可能なカーゴは、金粒子、銀粒子、または酸化鉄粒子を含む金属粒子である。他の実施形態において、放出可能なカーゴは、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＣＬ）粒子、キトサン粒子、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー（ＨＰＭＡ）粒子を含むポリマー粒子である。他の実施形態において、放出可能なカーゴは、シリカ粒子、多孔性シリカ粒子、リン酸カルシウム粒子、もしくは量子ドットを含む、デンドリマー粒子または無機粒子、あるいは金粒子、銀粒子、または酸化鉄粒子を含む、金属粒子である。
【００６７】
本発明は、発明のナノ粒子が、球、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、キューブ様形状、キューブ、長方形立方６面体（直方体）、円錐、円筒、角柱、ピラミッド、直角円筒形、および他の規則的もしくは不規則的形状を含むが、これらに限定されない任意の適切な形状であり得、約１０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有することをさらに提供する。ある実施形態において、発明のナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍの直径を有する。
【００６８】
本発明は、ナノ粒子が、細胞膜が由来する細胞の構成素、またはウイルス膜が由来するウイルスの構成素を実質的に欠失し得ることをさらに提供する。ある実施形態において、本発明のナノ粒子は、細胞膜が由来する細胞の細胞質、核、および／または細胞器官を実質的に欠く。さらにある実施形態において、本発明のナノ粒子は、細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の構成素の天然の構造的完全性もしくは活性を実質的に維持する。細胞膜の構造的完全性は、細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の一次、二次、三次、もしくは四次構造を含み、細胞膜の活性としては、結合活性、受容体活性、シグナル伝達経路活性、および天然に存在する細胞膜、ウイルスに由来する膜、または細胞膜もしくはウイルス膜の構成素が有するであろう任意の他の活性が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明のナノ粒子は、生体適合性および／または生分解性である。
【００６９】
ある実施形態において、本発明のナノ粒子は、赤血球細胞に由来する細胞形質膜と、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含む内核と、を含み、このナノ粒子は、実質的にヘモグロビンを欠失し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）内核を有するナノ粒子の半減期の少なくとも約２〜５倍のインビボ血液循環中の半減期を有する。ある実施形態において、かかるナノ粒子は、少なくとも約５〜約４０時間のインビボ血液循環中の半減期を有する。
【００７０】
本発明は、有効な量の本発明のナノ粒子を含む薬剤送達系を含む、医薬組成物も提供する。ある実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のナノ粒子と一緒に、またはそれと併せて投与され得る、医学的もしくは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤の有無にかかわらず、１つ以上の追加の活性成分をさらに含む。
【００７１】
ある実施形態において、本発明の医薬組成物は、新生物または癌細胞に対する免疫応答を誘発するための構造的完全性を持つ、対象もしくは細胞株の良性新生物細胞、潜在的に悪性の新生物細胞、腫瘍もしくは癌細胞等の癌細胞に由来する細胞膜でコーティングされたナノ粒子を含む、新生物特異的免疫原性組成物である。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、新生物特異的免疫原性組成物を含む癌ワクチンである。
【００７２】
他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、細胞膜挿入毒素を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子の外面の細胞膜は、標的細胞または細胞成分もしくは細胞内成分に由来し、細菌源、真菌源、および動物源の毒素を維持する。ある実施形態において、標的細胞としては、赤血球細胞（ＲＢＣ）、白血球細胞（ＷＢＣ）、および血小板等の血液細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、およびＴ細胞等の免疫細胞、腫瘍または癌細胞、および上皮細胞、内皮細胞、および神経細胞等の他の細胞、または造血幹細胞、骨髄幹細胞、間充織幹細胞、心臓幹細胞、もしくは神経幹細胞等の非最終分化した幹細胞もしくは多能性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、標的細胞は、赤血球細胞である。他の実施形態において、細胞内成分は、エキソソーム、分泌小胞、またはシナプス小胞を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、医薬組成物は、毒素を保持するため、または天然の毒素に対する免疫応答を誘発するために、構造的完全性を保持する外面上に、ナノ粒子でコーティングされた細胞膜を含む、免疫原性組成物である。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、免疫原性組成物を含むワクチンである。
【００７３】
本発明のナノ粒子を含む発明の医薬組成物または薬剤送達系は、任意の適切な投与経路を介して投与され得、経口、経鼻、吸入、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、局所、または直腸経路を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明は、必要とする対象の標的細胞に対する免疫応答を誘発するための方法をさらに提供する。発明の方法は、本発明のナノ粒子を含む有効な量の医薬組成物または薬剤送達系を、必要とする対象に投与することを含み、投与されるナノ粒子の細胞膜は、標的細胞に対する免疫応答を誘発するために、構造的完全性を実質的に保持する。本明細書で使用されるとき、標的細胞は、任意の適切な細胞を指し、血液細胞（例えば、ＲＢＣ、ＷＢＣ、もしくは血小板）、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、もしくは単球）、腫瘍または癌細胞（例えば、良性新生物細胞、悪性新生物細胞）、あるいは幹細胞（例えば、造血性幹細胞、骨髄幹細胞、間充織幹細胞、心臓幹細胞、もしくは神経幹細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、標的細胞は赤血球細胞である。他の実施形態において、標的細胞は新生物または癌細胞である。ある実施形態において、免疫応答は、能動的免疫応答である。他の実施形態において、免疫応答は、受動的免疫応答である。さらに他の実施形態において、免疫応答は、予防接種である。ある実施形態において、ワクチン接種は、新生物または癌特異的ワクチン接種である。
【００７５】
本発明は、必要とする対象において、細胞膜挿入毒素に対する免疫応答を誘発するための方法をさらに提供する。発明の方法は、本発明のナノ粒子を含む有効な量の医薬組成物または薬剤送達系を、必要とする対象に投与することを含み、ナノ粒子の細胞膜は、標的細胞に対する免疫応答を誘発するように、標的細胞への送達のために結合される毒素の毒素および天然の構造的完全性を保持する。ある実施形態において、標的細胞は血液細胞であり、毒素は細菌性、真菌性、または動物性毒素である。ある実施形態において、免疫応答は能動的免疫応答である。他の実施形態において、免疫応答は受動的免疫応答である。さらに他の実施形態において、免疫応答は予防接種である。
【００７６】
本発明は、発明の方法が、必要とする対象において、疾患、障害、または状態の治療または予防するために使用され得ることをさらに提供し、かかる疾患または状態は、感染性疾患、寄生虫性疾患、新生物、血液および造血器官の疾患、免疫機構、内分泌、栄養性および代謝性疾患を伴う障害、精神疾患および行動障害、神経系の疾患、眼および付属器の疾患、耳および乳様突起の疾患、循環器系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚および皮下組織の疾患、筋骨格系および結合組織の疾患、泌尿生殖器系、妊娠、出産、および産褥期の疾患、周産期に発症する状態、先天性奇形、変形、染色体異常、傷害、中毒、外因の結果、ならびに罹患率および死亡率の外因を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
ある実施形態において、発明の方法は、病原微生物、例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、または真菌等により引き起こされる感染疾患を治療または予防するために使用される。他の実施形態において、発明の方法は、癌または新生物状態を治療または予防するために使用される。本明細書で使用されるとき、必要とする対象は、動物、非ヒト哺乳動物、またはヒトを指す。本明細書で使用されるとき、「動物」としては、ペット、農場動物、経済動物、スポーツ動物、および実験動物、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、雌牛、雄牛、ブタ、ロバ、ヒツジ、仔羊、ヤギ、マウス、ウサギ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、霊長類（サルおよびチンパンジーを含む）が挙げられる。ある実施形態において、発明の方法に使用されるナノ粒子の細胞膜は、対象と同一種の細胞に由来する。ある実施形態において、発明の方法に使用されるナノ粒子の細胞膜は、対象と同一種の赤血球細胞に由来し、赤血球細胞は、対象と同一の血液型を有する。ある実施形態において、発明の方法に使用されるナノ粒子の細胞膜は、対象の細胞に由来する。
【００７８】
本発明は、必要とする対象の標的細胞に対する免疫応答を誘発するため、または疾患、障害、もしくは状態を治療もしくは予防するための発明の方法が、薬学的に許容される担体、アジュバント、または賦形剤の有無にかかわらず、本発明のナノ粒子を含む医薬組成物もしくは薬剤送達系とともに、または併用して、１つ以上の他の活性成分を、必要とする対象に投与することをさらに含むことをさらに提供する。発明の方法は、本発明のナノ粒子が、標的皮膚部位、血液もしくは血漿、標的器官、標的腫瘍部位、または標的細胞を含むが、これらに限定されない、それを必要とする対象の標的部位に投与されることをさらに提供し、その標的部位において放出可能なカーゴの放出を引き起する機構をさらに提供する。放出可能なカーゴを引き起するための機構としては、本発明のナノ粒子と標的細胞、組織、器官、もしくは対象との間の接触、または本発明のナノ粒子を取り囲む環境パラメータ、例えば、ｐＨ、イオン状態、温度、圧力、および他の物理的もしくは化学的変更が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明は、ナノ粒子、ならびにそのナノ粒子を含む医薬組成物または薬剤送達系を作製するための方法をさらに提供する。ナノ粒子を作製するかかる発明の方法は、ａ）非細胞性材料を含む内核と、細胞またはウイルスに由来する膜、任意に合成膜を含む外面を合わせること、ｂ）その組み合わせに外因的なエネルギーを印加して、ナノ粒子を形成することを含み、内核は外面を支持する。ある実施形態において、外因的なエネルギーは、押出により印加される機械的エネルギーである。他の実施形態において、外因的なエネルギーは、音波により印加される音響エネルギーである。さらに他の実施形態において、外因的なエネルギーは、加熱により印加される熱エネルギーである。本発明の方法は、ナノ粒子を形成する際に使用される、現在存在するか、または今後開発される任意の他の好適な外因的なエネルギーを考慮する。
【００８０】
癌特異的な免疫原性組成物またはワクチン
本発明は、有効な量のナノ粒子を含む新生物特異的免疫原性組成物を提供し、非細胞性材料を含む内核と、新生物細胞に由来する細胞膜を含む外面と、任意に合成膜も含む。ある実施形態において、細胞膜は良性新生物細胞、潜在的に悪性の新生物細胞、または癌細胞に由来する。ある実施形態において、細胞膜は、癌細胞株に由来する。他の実施形態において、細胞膜は、対象の癌細胞に由来する。本発明の新生物特異的免疫原性組成物は、ナノ粒子の外面中の細胞膜が、新生物細胞に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性を実質的に保持する。本明細書で使用されるとき、構造的完全性は、細胞膜の一次、二次、三次、もしくは四次構造、またはその構成素を含む。
【００８１】
ある実施形態において、内核は、生体適合性材料または合成材料を含み、ナノ粒子の外面を支持する。内核材料の例としては、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン、ポリグルタミン酸、およびこの目的で使用され得る、現在既知であるか、または今後開発される任意の他の合成材料等が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、内核はＰＬＧＡを含み、外面は新生物細胞に由来する形質膜を含む。
【００８２】
ある実施形態において、本発明の新生物特異的免疫原性組成物は、１つ以上の活性成分または放出可能なカーゴをさらに含むナノ粒子を含み、球、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、キューブ様形状、キューブ、長方形立方６面体（直方体）、円錐、円筒、角柱、ピラミッド、直角円筒形、および他の規則的もしくは不規則的形状を含むが、これらに限定されない任意の形状であり得る。ナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ〜約１０μｍであり得る。ある実施形態において、新生物特異的免疫原性組成物中のナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、および１０μｍである。ある実施形態において、新生物特異的免疫原性組成物中のナノ粒子は、細胞膜が由来する新生物細胞の構成素を実質的に欠く。
【００８３】
本発明は、新生物特異的免疫原性組成物は、免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤をさらに含むことをさらに提供する。本明細書で使用されるとき、「免疫原性アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を誘導および／または強化することができる物質または組成物である。本明細書で使用されるとき、「免疫増強剤」は、接種時に免疫応答を強化する薬剤を指す。本発明は、現在既知であるか、または今後開発される任意の適切な免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤を考慮し、本発明のナノ粒子とともに、または併用で使用される免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤の種類は、特に限定されない。例示の免疫原性アジュバントは、軽鉱物油、Ａｒｌａｃｅｌ洗剤、および不活性化ヒト型結核菌の混合物である、フロイントの完全アジュバントであり得る。例示の免疫増強剤としては、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウムパルヴム、ブルセラアボルタス抽出物、グルカン、レバミゾール、チロロン、酵素、および非悪性ウイルスが挙げられる。
【００８４】
本発明は、前述の新生物特異的免疫原性組成物および抗原を含有するワクチンをさらに提供する。ある実施形態において、抗原は、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク質、および腫瘍抗原ペプチドからなる群から選択される抗原の１種または２種以上からなり、腫瘍の予防的および／または治療的処置において使用する。外因的なタンパク質が抗原として使用される場合、抗原を対象とする抗体は、前述の新生物特異的免疫原性組成物を用いて、ヒト以外の哺乳類において効率的に生成され得る。したがって、抗体を生成する動物、およびその抗体を生成する動物に由来する抗体を生成する細胞または抗体遺伝子は、本発明により提供される。本発明は、したがって、生きている哺乳類の体内で抗腫瘍免疫応答を誘発するように、ヒトを含む対象の腫瘍組織に投与するための前述の新生物特異的免疫原性組成物を含む腫瘍ワクチンを提供する。
【００８５】
本発明は、全身性または抗腫瘍免疫応答を誘発するための方法をさらに提供し、したがって、対象における新生物の治療または予防をもたらし、かかる方法は、有効な量の前述の新生物特異的免疫原性組成物またはそれに由来するワクチンを、必要とする対象に投与するステップを含む、前述の新生物特異的免疫原性組成物またはワクチン中のナノ粒子の外面の細胞膜は、新生物細胞に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性を実質的に保持する。本明細書で使用されるとき、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答、および／またはＢ細胞媒介性免疫応答であり得る。本明細書で使用されるとき、新生物は、良性新生物、潜在的に悪性の新生物、または癌を指す。ある実施形態において、新生物は癌であり、発明の方法により治療または予防され得る癌の種類は限定されない。
【００８６】
ある実施形態において、前述の新生物特異的免疫原性組成物またはワクチン中のナノ粒子の外面の細胞膜は、癌細胞株、または対象と同一もしくは異なる種の癌細胞、同一もしくは異なる対象に由来する。本明細書で使用されるとき、「対象」は、非ヒト哺乳動物、動物、またはヒトを指す。
【００８７】
本発明は、１つ以上の他の活性成分を、薬学的に許容される担体または賦形剤の有無にかかわらず、前述の新生物特異的免疫原性組成物またはワクチンとともに、または併用で、必要とする対象に投与することをさらに提供する。本発明の新生物特異的免疫原性組成物またはワクチン、ならびに他の活性成分は、単独または併用で、任意の適切な投与経路を介して投与され得、経口、経鼻、吸入、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、局所、または直腸が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明の新生物特異的免疫原性組成物またはワクチン、ならびに他の活性成分は、薬剤送達系を介して必要とする対象に投与される。投与経路の種類または本明細書で使用される他の活性成分の種類は、特に限定されない。
【００８８】
細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態の治療
本発明は、細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための医薬組成物を提供し、医薬組成物は、非細胞性材料を含む内核と、標的細胞に由来する細胞膜を含む外面と、任意に合成膜も含む、有効な量のナノ粒子を含む。ある実施形態において、内核は外面を支持し、生体適合性材料または合成材料を含む。生体適合性材料または合成材料の例としては、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン、ポリグルタミン酸、および適切な任意の他の生体適合性材料または合成材料が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ナノ粒子の内核中で使用され得る、現在既知であるか、または今後開発される任意の生体適合性材料または合成材料を考慮し、かかる材料の種類は、特に限定されない。
【００８９】
ある実施形態において、細胞膜は、赤血球細胞に由来する形質膜であり、ナノ粒子の外面中の細胞膜または形質膜は、毒素を実質的に保持するために、その構造的完全性を実質的に保持する。ある実施形態において、毒素は、天然の病理学的機構の一環として、標的細胞の細胞膜または形質膜に挿入する。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「毒素」は、植物、動物、微生物（細菌、ウイルス、真菌、リケッチア、もしくはプロトゾアを含むが、これらに限定されない）の毒性材料もしくは生成物、または感染性物質、あるいはそれらの起源および生成方法にかかわらず、組み換えもしくは合成分子を指す。ある実施形態において、「毒素」は、生きている細胞または生命体内で生成される細菌毒素、真菌毒素、または動物毒素を含む。
【００９１】
ある実施形態において、細菌毒素は、外毒素および内毒素を含む。本明細書で使用されるとき、「外毒素」は、細菌により生成され、活発に分泌される一方、「内毒素」は、細菌自体（例えば、細菌外膜）の一部であり、細菌が免疫系により死滅されるまで放出されない。本発明は、現在既知であり、今後発見される任意の外毒素および内毒素を考慮する。細胞膜内に挿入される細菌毒素の種類は、特に限定されない。ある実施形態において、細菌毒素は、α−溶血素等の黄色ブドウ球菌からの細胞膜挿入毒素である。
【００９２】
本発明は、アフラトキシン、シトリニン、エルゴタミン、フモニシン、エルゴバリン、オクラトキシン、ホモプシン、スラフラミン、スポリデスミン、トリコテセン（例えば、サトラトキシン、デオキシニバレノール）、ゼアラレノンを含むが、これらに限定されない、現在既知および今後発見される任意の真菌毒素をさらに考慮する。細胞膜に挿入される真菌毒素の種類は、特に限定されない。
【００９３】
本発明において考慮される動物毒素は、動物により生成される任意の毒物質を含む。動物毒素の例としては、心血管毒素、胃腸毒素、呼吸器毒素、神経毒素、腎臓／臓器不全毒素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、現在既知および今後発見される任意の動物毒素を考慮し、細胞膜に挿入される動物毒素の種類は、特に限定されない。ある実施形態において、細胞膜に挿入する動物毒素は、昆虫、クモ類、および甲殻類等の節足動物、またはワニ類、ムカシトカゲ、有鱗類（トカゲおよびヘビを含む）、およびカメ等の爬虫類に由来する。
【００９４】
ある実施形態において、細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤の有無にかかわらず、１つ以上の他の活性成分または放出可能なカーゴをさらに含むナノ粒子を含む。かかる医薬組成物中に含有されるナノ粒子は、生分解性であり、球、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、キューブ様形状、キューブ、長方形立方６面体（直方体）、円錐、円筒、角柱、ピラミッド、直角円筒形、および他の規則的もしくは不規則的形状を含むが、これらに限定されない任意の形状であり得る。ナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ〜約１０μｍであり得る。ある実施形態において、新生物特異的免疫原性組成物中のナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、および１０μｍである。
【００９５】
本発明は、対象において、細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法をさらに提供し、この方法は、有効な量の前述の医薬組成物を、かかる治療または予防を必要とする対象に投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「対象」は、非ヒト哺乳動物、動物、またはヒトを指す。ある実施形態において、前述の医薬組成物中のナノ粒子の外面の細胞膜は、対象と同一種の細胞に由来する。ある実施形態において、形質膜は、対象と同一種の赤血球細胞に由来し、ＲＢＣは、対象と同一の血液型を有する。他の実施形態において、細胞膜または形質膜は、対象の細胞に由来する。
【００９６】
本発明は、１つ以上の他の活性成分を、薬学的に許容される担体または賦形剤の有無にかかわらず、前述の医薬組成物とともに、または併用して、必要とする対象に投与することをさらに提供する。本発明の前述の医薬組成物、ならびに他の活性成分は、単独または併用で、経口、経鼻、吸入、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、局所、または直腸を含むが、これらに限定されない任意の適切な投与経路を介して投与され得る。ある実施形態において、本発明の前述の医薬組成物、ならびに他の活性成分は、薬剤送達系を介して必要とする対象に投与される。本明細書で使用される投与経路の種類または他の活性成分の種類は、特に限定されない。
【００９７】
細胞膜挿入毒素に関連した疾患または状態のワクチン
本発明は、免疫原性組成物を提供し、この免疫原性組成物は、有効な量のナノ粒子を含み、該ナノ粒子は、非細胞性材料を含む内核と、細胞および細胞膜挿入毒素に由来する細胞膜を含む外面と、任意に合成膜も含む。ある実施形態において、内核は外面を支持し、生体適合性材料または合成材料を含む。生体適合性材料または合成材料の例としては、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン、ポリグルタミン酸、および適切な任意の他の生体適合性材料または合成材料が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ナノ粒子の内核において使用され得る、現在既知であるか、または今後開発される、任意の生体適合性材料または合成材料を考慮し、かかる材料の種類は、特に限定されない。
【００９８】
ある実施形態において、細胞膜は、赤血球細胞等の細胞に由来する形質膜であり、ナノ粒子の外面中の細胞膜または形質膜は、実質的に毒素を保持するため、または天然の毒素に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性を実質的に保持する。本明細書で使用されるとき、毒素の構造的完全性は、標的細胞に結合される、毒素の一次、二次、三次、および／または四次構造を含む。ある実施形態において、毒素は、天然の病理学的機構の一環として、標的細胞の細胞膜または形質膜に挿入する。「毒素」の定義および種類は、完全に上述される。ある実施形態において、前述の免疫原性組成物中のナノ粒子は生分解性である。
【００９９】
ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、１つ以上の活性成分または放出可能なカーゴをさらに含むナノ粒子を含み、球、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、キューブ様形状、キューブ、長方形立方６面体（直方体）、円錐、円筒、角柱、ピラミッド、直角円筒形、および他の規則的もしくは不規則的形状を含むが、これらに限定されない任意の形状であり得る。ナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ〜約１０μｍである。ある実施形態において、新生物特異的免疫原性組成物中のナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、および１０μｍである。ある実施形態において、免疫原性組成物中のナノ粒子は、細胞膜が由来する細胞の構成素を実質的に欠く。
【０１００】
本発明は、免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤をさらに含むことをさらに提供する。免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤の定義および種類は、完全に上述される。本発明は、現在既知であるか、または今後開発される、任意の適切な免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤を考慮し、本発明のナノ粒子とともに使用されるか、または併用される免疫原性アジュバントまたは免疫増強剤の種類は、特に限定される。
【０１０１】
本発明は、前述の免疫原性組成物を含有するワクチンをさらに提供する。本実施形態において、細胞膜挿入毒素は、抗原として使用され、細胞膜挿入毒素を対象とする抗体は、前述の免疫原性組成物を用いて、ヒト以外の哺乳類において効率的に生成され得る。したがって、抗体を生成する動物およびその抗体を生成する動物に由来する抗体を生成する細胞または抗体遺伝子は、本発明により提供される。本発明は、したがって、生きている哺乳類の体内で免疫応答を誘発するように、ヒトを含む対象の標的組織に投与するための前述の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。
【０１０２】
本発明は、全身性または抗疾患免疫応答を誘発するための方法をさらに提供し、したがって、対象における標的疾患の治療または予防をもたらし、かかる方法は、有効な量の前述の免疫原性組成物またはそれに由来するワクチンを、必要とする対象に投与するステップを含み、前述の免疫原性組成物またはワクチン中のナノ粒子の外面の細胞膜は、標的疾患細胞に対する免疫応答を誘発するために、その構造的完全性を実質的に保持する。本明細書で使用されるとき、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答、Ｂ細胞媒介性免疫応答である。本発明は、任意の疾患、障害、または生理学的もしくは病理学的状態を考慮し、感染性疾患、寄生虫性疾患、新生物、血液および造血器官の疾患、免疫機構、内分泌、栄養性および代謝性疾患を伴う障害、精神疾患および行動障害、神経系の疾患、眼および付属器の疾患、耳および乳様突起の疾患、循環器系の疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、皮膚および皮下組織の疾患、筋骨格系および結合組織の疾患、泌尿生殖器系、妊娠、出産、および産褥期の疾患、周産期に発症する状態、先天性奇形、変形、染色体異常、傷害、中毒、外因の結果、ならびに罹患率および死亡率の外因が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
ある実施形態において、前述の免疫原性組成物またはワクチン中のナノ粒子の外面の細胞膜は、細胞株、または対象と同一もしくは異なる種の疾患細胞、あるいは同一もしくは異なる対象に由来する。本明細書で使用されるとき、「対象」は、非ヒト哺乳動物、動物、またはヒトを指す。
【０１０４】
本発明は、１つ以上の他の活性成分を、薬学的に許容される担体または賦形剤の有無にかかわらず、前述の免疫原性組成物またはワクチンとともに、または併用して、必要とする対象に投与することをさらに提供する。本発明の前述の免疫原性組成物またはワクチン、ならびに他の活性成分は、単独または併用で、経口、経鼻、吸入、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、局所、または直腸を含むが、これらに限定されない任意の適切な投与経路を介して投与され得る。ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物またはワクチン、ならびに他の活性成分は、薬剤送達系を介して、必要とする対象に投与される。本発明で使用される投与経路の種類および他の活性成分の種類は、特に限定されない。
【実施例】
【０１０５】
本教示の態様は、以下の例を考慮してさらに理解され得、いかなる方法においても本教示の範囲を限定するものと見なされてはならない。本明細書に記載される実施例のいくつかは、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０８（２７）：１０９８０−１０９８５（２０１１）にも記載され、その内容は参照することによりその全体が組み込まれる。
【実施例１】
【０１０６】
生物模倣型送達プラットフォームとしての赤血球膜偽装されたポリマーナノ粒子
乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子を、予形成されたＲＢＣ膜由来の小胞とともに押出することにより、発明者らは、１００ｎｍより小さいポリマー粒子を、脂質および対応する表面タンパク質の両方を含む二重層化ＲＢＣ膜でコーティングする。このアプローチは、ポリマー核の適用性を保持しながら、長時間循環するために、ナノ粒子表面を赤血球外部で偽装することを目的とする。発明者らは、この生物模倣型ナノ粒子送達プラットフォームの物理的特徴、物理化学的特性、タンパク質含有量、薬物動態、および生分布を報告する。
【０１０７】
ＲＢＣ膜コーティングされたナノ粒子の調製プロセスは、ＲＢＣからの膜小胞誘導および小胞−粒子の融合の２つの部分に分割される（図１）。ＲＢＣ膜小胞の誘導は、わずかな修飾を伴って、以前に報告された方法に従う（１３）。つまり、最初にＲＢＣを、遠心分離およびＰＢＳ洗浄により、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得た雄ＩＣＲマウス（６〜８週間）の新鮮な血液から精製した。次いで単離したＲＢＣは、低張性環境において膜破裂を受けてその細胞内含有物を除去する。次に、空になったＲＢＣを洗浄し、１００ｎｍ多孔質膜を通じて押出して、ＲＢＣ膜由来の小胞を形成した。ＲＢＣ膜偽装されたポリマーナノ粒子を合成するために、最初に、直径約７０ｎｍのＰＬＧＡ粒子を、溶媒置換法を使用して、０．６７ｄＬ／ｇカルボキシル末端ＰＬＧＡポリマーから調製した（１４）。
【０１０８】
後次に、得られるＰＬＧＡナノ粒子を、機械的押出を通じてＲＢＣ膜由来の小胞と融合した。ＰＬＧＡポリマー密度、ナノ粒子寸法、赤血球脂質含有量、および推定される脂質分子の突出面積からの計算に基づいて、完全な粒子コーティングのために、ＰＬＧＡナノ粒子の各ミリグラムを、１ｍＬの血液に由来する小胞と混合した。混合物を、１００ｎｍ孔を有する装置を通じて物理的に押出した。機械的な力は、１００ｎｍより小さいＰＬＧＡナノ粒子が、脂質二重層を横断し、小胞−粒子の融合をもたらした。押出機を繰り返し通過させることは、例えば、広範な粒径分布、不完全な粒子コーティング、および脂質シェル等のリポソーム−粒子の融合に伴う以前に報告された問題を克服する（１５）。ＲＢＣ膜の二重層構造は、膜タンパク質の喪失および損傷を最小限にするように、全体調製プロセスを通じて保持されることにも留意されたい。
【０１０９】
ＲＢＣ膜コーティングされたＰＬＧＡナノ粒子を特性化するために、最初に粒子を、酢酸ウラニルでネガティブ染色した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して可視化した（図２Ａ）。得られる画像は、脂質二重層コーティングされたポリマー粒子において予想されるように、コアシェル構造を明らかにする。粒径は、約８０であり、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された流体力学的径に一致する。より精密な試験は、直径約７０ｎｍのポリマー核、および厚さ７〜８ｎｍの外側脂質シェルを明らかにする。脂質層の厚さは、報告されたＲＢＣの膜幅と一致し（１６）、ポリマー粒子表面への良好な膜移行を示唆する。
【０１１０】
得られるＲＢＣ模倣ナノ粒子の長期安定性を調べるために、それらを１ｍｇ／ｍＬの濃度で１Ｘ  ＰＢＳ中に懸濁した後、ＤＬＳによりリュ系、多分散性指数（ＰＤＩ）、およびゼータ電位について監視した（図２Ｂ）。２週間の間に、粒径は８５から１３０ｎｍに増大し、ゼータ電位は、−１０．２から−１２．７ｍＶに減少し、ＰＤＩは０．２６で比較的同一のままである。寸法およびゼータ電位の変化は、粒子溶液中の少量の過剰小胞の融合により引き起こされる可能性がある。コアシェル粒子構造の完全性を検証するために、疎水性ＤｉＤ蛍光体（励起／排出＝６４４ｎｍ／６５５ｎｍ）および脂溶性ローダミン−ＤＭＰＥ染色（励起／排出＝５５７ｎｍ／５７１ｎｍ）を、小胞−粒子の融合前に、ポリマー核およびＲＢＣ膜由来の小胞にそれぞれ負荷した。得られる二重蛍光体標識されたナノ粒子を、ＨｅＬａ細胞により６時間培養し、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。図２Ｃにおいて、ＤｉＤ（赤色）およびローダミン−ＤＭＰＥ（緑色）は、それぞれが異なる粒子区画に対応し、同一の位置で重複する。この蛍光共局在化は、それらが細胞により内在化された後、ナノ粒子の正常なコアシェル構造を示す。
【０１１１】
構造研究に続いて、粒子をそれらのタンパク質含有量について調べた。ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子を、３０ｎｍ多孔質膜を用いて、２４時間透析し、非結合タンパク質を除去し、後次に硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）で処理し、膜タンパク質を可溶化した。空のＲＢＣおよびＲＢＣ膜由来の小胞の例を、比較として平行して調製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるタンパク質分離は、膜タンパク質の組成物が、大部分が粒子合成全体で保持され、ＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子上で同定され得ることを示す（図３Ａ）。この所見は、二重層化細胞膜の移行が、関連付けられた膜タンパク質もナノ粒子表面に移行させることを示唆する。固体ＰＬＧＡ核がタンパク質の進入を妨げ、非結合タンパク質が透析により濾過されるため、検出された膜タンパク質は、ナノ粒子を取り囲む二重層化脂質膜中で固定される可能性が最も高い。得られるタンパク質を含有する脂質膜でコーティングされた粒子は、十分に研究されたポリマー支持された平面脂質二重層モデルに結合され得、膜関連タンパク質の機能性を保持することが示された（１５）。しかしながら、５１ｋＤａ付近の帯域が顕著に弱くなるため、タンパク質構成のわずかな改変が観察された。弱い帯域は、約２００ｋＤａで欠損した帯域により観察され得るように、小胞−粒子の融合のために、機械的押出の間に喪失する、スペクトリン細胞骨格タンパク質と関連付けられた末梢膜タンパク質に対応する可能性がある。
【０１１２】
次に発明者らは、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子の血清安定性およびインビボ循環半減期を決定した。結果を観点に入れ込むために、同様に採寸された裸ＰＬＧＡナノ粒子（約７５ｎｍ）および構造的に類似するＰＥＧ（Ｍｗ  ２０００）機能化脂質−ポリマーハイブリッドナノ粒子（約８０ｎｍ）を、それぞれ負の対照および正の対照として使用した。血清安定性試験の場合、以前に引用された吸収法を使用して、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下での粒径変化を監視した（１７、１８）。より大きな粒子がより高い光散乱を誘導するため、吸収度値の増加を監視することにより、不安定な粒子の凝集が観察され得る。各種のナノ粒子を、１００％  ＦＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬの最終ナノ粒子濃度で懸濁した。すべての試料を３７℃で培養し、各吸収度測定前にやさしく攪拌した。いずれの試料も４時間以内に吸収度の任意の観察可能な変化を示さなかったため、５６０ｎｍで測定された吸収度値は、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子が、ＰＥＧ機能化された脂質−ポリマーハイブリッドナノ粒子と同等の血清安定性を有することを示唆する（図３Ｂ）。反対に、裸ＰＬＧＡナノ粒子は、血清溶液との混合時に即時に凝集するため、安定性をほとんど示さなかった。
【０１１３】
各種のナノ粒子の全身循環時間を研究するために、発明者らは、疎水性ＤｉＤ蛍光染料を全３種のナノ粒子に負荷した。染料は、最小放出を示し（７２時間で２０％未満）、ナノ粒子の循環研究のためのマーカーとして広く引用されている（１９、２０）。各粒子型について、１５０μＬの３ｍｇ／ｍＬ  ＤｉＤ負荷されたナノ粒子を、微静脈注入を通じて６匹の群に注入した。異なる血液型と関連付けられた免疫応答を回避するために、循環研究の対象となるマウスは、ナノ粒子を調製するためにＲＢＣが採取されるものと同一株である。注入後の様々な時点で、蛍光測定のために、２０μＬの血液をマウスの眼窩から採取した。
【０１１４】
図３Ｃは、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子が、ＰＥＧ機能化ナノ粒子よりも優れた血液保持を有したことを示す。２４時間および４８時間のマークにおいて、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子は、ＰＥＧコーティングされたナノ粒子により呈された１１％および２％と比較して、それぞれ２９％および１６％の全体保持を呈した。一方、裸ＰＬＧＡナノ粒子は、２分のマークでの最初の採決においてわずかなシグナルを示し、これは血清中のそれらの急速な凝集に基づいて予測された。循環半減期は、片対数シグナルの傾斜に由来し得るため、図３Ｃの挿入における片対数プロットは、薬物動態プロファイルの差をより良く示す。ナノ粒子の循環結果に適合するように、以前の研究において適用された２区画モデルに基づいて（２１、２２）、排除半減期は、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子の場合３９．６時間、およびＰＥＧコーティングされたナノ粒子の場合１５．８時間として計算した。
【０１１５】
あるいは、図３Ｃの循環データは、一方向非線形クリアランスモデルを通じて解釈され得、ナノ粒子クリアランスの原因（すなわち、クリアリング部位およびオプソニンタンパク質の可溶性）は、粒子の取り込みを遅延させるように、連続的に消耗される。Ｓｉｍｂｅｒｇらは、一次粒子の注入前に、「デコイ」粒子を注入することにより、一次粒子の循環半減期が、約５倍延長され得ることを報告した（２３）。ＲＥＳシステムの飽和は、追加の粒子の取り込みを遅延させ、非線形粒子排出速度を説明し得ると予測することは妥当である。この非線形排出モデルに基づいて、第１の明らかな半減期（すなわち、粒子の５０％がクリアされる）は、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子の場合９．６時間、ＰＥＧコーティングされたナノ粒子の場合６．５時間である。薬物動態モデルにかかわらず、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子は、より長い排出半減期を有し、これはＲＢＣ膜コーティングが、従来のＰＥＧステルスコーティングと比較して、インビボクリアランスを遅延させることにおいて優れていることを示唆する。この所見は、マクロファージの取り込みを阻害する免疫抑制タンパク質を含有するナノ粒子が、ＲＢＣ膜上の機能性要素で修飾されたことをさらに確認する（２４）。これらの膜タンパク質は、宿主血液から採取された天然のＲＢＣに由来するため、それらがポリマーナノ粒子の表面に移行された後、わずかな免疫応答を刺激することが予想される。ＴＥＭ可視化、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果、および循環半減期研究により、発明者らは、報告された技法を使用するナノ粒子機能化のための細胞膜の移行および対応する機能表面タンパク質を実証する。
【０１１６】
次に発明者らは、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子のインビボ組織分布を決定し、それらの電位を送達媒体としてさらに評価した。生分布研究の場合、１８匹のマウスは、尾静脈を通じて、１５０μＬの３ｍｇ／ｍＬ  ＤｉＤ負荷したナノ粒子の注入を受けた。粒子注入後２４、４８、および７２時間の時点のそれぞれにおいて、６匹のマウスに麻酔をかけ、それらの肝臓、腎臓、脾臓、脳、肺、心臓、および血液を採取した。蛍光定量の場合、異なる時点で収集された器官を、洗浄、計量、１ｍＬ  ＰＢＳ中で均質化した後、蛍光分光計により測定した。図４Ａは、組織１グラム当たりのナノ粒子含有量を示す。ＲＥＳ系、肝臓、および脾臓の２つの主要器官は、最高量のナノ粒子を含有した。しかしながら、３つの時点で、血液中の著しい蛍光レベルも観察された。
【０１１７】
全体粒子分布をより良く理解するために、蛍光シグナルに対応する器官の測定された重量を掛け、血液の重量を総体重の６％と推定した。図４Ｂは、総蛍光に対して正規化された各器官における相対シグナルを示す。組織質量を説明した後、ナノ粒子は、主に血液および肝臓内に分布することが観察され得る。血液からの蛍光シグナルは、循環半減期研究からのデータと良く相関し、それぞれ２４、４８、および７２時間の時点で、２１％、１５％、および１１％のナノ粒子保持を有した。また血液蛍光が減少するにつれて、対応するシグナルの増加が肝臓内で観察され、これは血液中の蛍光の源が、ＲＥＳ系により徐々に取り込まれたことを示す。この結果は、観察された血液蛍光が、染料の漏出よりも長期間循環するナノ粒子から生じたことを検証し、これは腎臓により分泌され、肝臓からのシグナル強度の減少をもたらす。ＲＢＣ膜でコーティングされたポリマーナノ粒子が、３０分未満で血液循環からクリアされる、以前に報告されたＲＢＣ由来のリポソームと比較して、著しく長い循環時間を有することは特筆に値する（１３）。ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子によるこの延長した循環時間は、より高い構造的合成、より良い粒子安定性、およびより信頼できるカーゴ／染料カプセル化に起因し得る。マウスモデルにおけるナノ粒子循環に関する他の公開されたデータと比較すると（１４、２５、２６）、それらの大部分は、２４時間後にわずかな血液保持を示し、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子は、優れたインビボ滞留時間を呈し、強健な送達プラットフォームとしての生物医学的応用について大きな可能性を保持する。
【０１１８】
本明細書で報告される赤血球膜でコーティングされたナノ粒子は、一般に引用される脂質−ポリマーハイブリッドナノ粒子に構造的に類似し、リポソームおよびポリマーナノ粒子の両方の望ましい特徴を含む、有望な多機能薬物送達プラットフォームとして速やかに出現する（２７、２８）。脂質−ポリマーハイブリッドナノ粒子は、脂質単層コーティングにより提供される拡散障壁に起因して、類似の寸法を持つポリマーナノ粒子と比較して、より持続性の薬物放出プロファイルを示した。ＲＢＣ膜が薬物拡散に対してより高密度の二重層化脂質障壁を提供するため、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子からの薬物放出動態は、さらに一層段階的となることが予想される。脂質コーティングの汎用性は、シリカナノ粒子および量子ドットにまで及んでいるため、この研究における膜コーティングアプローチは、他のナノ構造にも拡大され得る（２９〜３１）。さらなる粒子機能化は、ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ構造の調製前に、修飾された脂質、脂質誘導体、または脂質膜に対する膜貫通タンパク質を挿入することにより達成され得る。
【０１１９】
これらのＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子を臨床薬剤送達媒体として変換することに関して、多くの課題および機会が待ち受けている。動物研究とは異なり、ヒト赤血球は、多くの異なる血液群に分類され得る多数の表面抗原を含む。長時間循環する薬剤送達用に粒子を最適化するために、輸血の場合と同様に、粒子を患者の血液に交差適合させる必要がある。広範な患者集団へのより汎用性の高い適用のために、粒子は、合成ステップの間に、それらの免疫原性タンパク質を選択的に消耗し得る。あるいは、この生物模倣型送達プラットフォームは、個別化医療のための洗練された方法であり得、それにより薬剤送達ナノ担体は、粒子コーティングとしてそれら自身のＲＢＣ膜を使用することにより、少ない免疫原性のリスクで個別の患者に調整される。
【０１２０】
結論として、発明者らは、長時間循環するカーゴの送達のための、赤血球膜で偽装されたポリマーナノ粒子の合成を実証する。採用される技法は、タンパク質の同定、精製、および共役という労力を要するプロセスを回避する、トップダウンアプローチを通じて細胞模倣型ナノ粒子の作製を提供する。提案される方法は、膜貫通タンパク質固定のための二重層化媒体も提供し、標的タンパク質の完全性および機能性を補償し得る、化学的修飾を防ぐ。発明者らは、脂質層が、肝臓細胞に直接由来し得ることを実証する。天然の細胞膜およびそれらの関連機能の粒子表面への移行は、ナノ粒子機能化における固有かつ頑強なトップダウンアプローチを表す。
【０１２１】
材料および方法
赤血球細胞（ＲＢＣ）ゴースト誘導。細胞内容を欠くＲＢＣゴーストは、修正により以前に公開されたプロトコルに従って調製した（３２）。最初に、ヘパリン溶液（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）の滴を含有するシリンジを使用する心穿刺を通じて、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得られた雄ＩＣＲマウス（６〜８週間）から全血を採取した。次にその全血を２０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、血清および白血球層を慎重に除去した。得られた被包されたＲＢＣを、透析のための低張媒体処理に先立って、氷冷１Ｘ  ＰＢＳ中で洗浄した。洗浄したＲＢＣを、０．２５Ｘ  ＰＢＳ中に氷浴で２０分間懸濁し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ヘモグロビンを除去する一方で、ピンク色の小球を収集した。位相差顕微鏡を使用して、得られたＲＢＣゴーストを検証したところ、改変された細胞内容を持つ正常な細胞構造が明らかになった（図５）。
【０１２２】
ＲＢＣ膜由来の小胞の調製。収集したＲＢＣゴーストを、蓋をしたガラス瓶中で５分間、ＦＳ３０Ｄ音波洗浄器（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、周波数４２ｋＨｚおよび電力１００Ｗで音波処理した。後次に得られた小胞を、Ａｖａｎｔｉミニ押出機（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）を使用して、４００ｎｍ、次に１００ｎｍのポリカーボネート多孔質膜を通じて連続して押出した。ＲＢＣ膜由来の小胞中のリポソーム区画を可視化するために、小胞調製プロセスの間に、１ｍＬの全血を、２０μｇの１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（ＤＭＰＥ−ＲｈＢ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）と混合した。ＲＢＣ膜由来の小胞の寸法は、各調製ステップ後に動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した（図６）。
【０１２３】
ＰＬＧＡナノ粒子の調製。ＰＬＧＡポリマー核を、溶媒置換プロセスにおいて、０．６７ｄＬ／ｇのカルボキシ末端５０：５０ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＬＡＣＴＥＬ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を使用して調製した。最初に、ＰＬＧＡポリマーを、アセトン中に１ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解した。１ｍｇのＰＬＧＡナノ粒子を作製するために、１ｍＬの溶液を３ｍＬの水に滴下添加した。次に混合液を外気中で２時間攪拌した。得られたナノ粒子溶液を、１０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濾過し、１ｍＬ  ＰＢＳ（１Ｘ、ｐＨ＝７．４）中で再懸濁した。蛍光顕微鏡撮像およびインビボ粒子追跡の目的で、２μｇの１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドジカルボシアニン、４−クロロベンゼンスルホン酸塩（ＤｉＤ）染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＰＬＧＡナノ粒子合成前にＰＬＧＡアセトン溶液に添加した。ＰＬＧＡナノ粒子からのＤｉＤ染料の放出を、１００μＬの調製ナノ粒子溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析微細管に、分子量カットオフ３．５ｋＤａ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともに入れた透析法を使用して調べた。ナノ粒子をＰＢＳ緩衝液中３７℃で透析した。透析プロセスの間、１２時間毎にＰＢＳ溶液を変えた。各既定の時点において、３つのミニ透析ユニットから、染料定量のためのナノ粒子溶液を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マルチプレートリーダー（ＴｅＣａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、別個に収集した（図７）。対照粒子として、ＰＥＧコーティングされた脂質ＰＬＧＡハイブリッドナノ粒子を、ナノ沈殿法により調製した。
【０１２４】
組織培養およびナノ粒子細胞内取り込み。ヒト上皮がん細胞株（ＨｅＬａ）を、１０％ウシ胎仔アルブミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ＭＥＭ非必須アミノさん（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、重炭酸ナトリウム（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、およびピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補足したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で維持した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で培養し、前述の培地とともにチャンバスライド（Ｃａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ，ｅｉｇｈｔ  ｗｅｌｌｓ；Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に置いた。実験の日に、細胞を事前に加温したＰＢＳで洗浄し、事前に加温したＲＰＭＩ培地で３０分間培養した後、１００μｇのＤＭＰＥ−ＲｈＢおよびＤｉＤ標識ＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子を添加した。ナノ粒子を細胞とともに、３７℃で４時間培養した。次に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、組織定着薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、３０分間室温で定着させ、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核染色）で染色し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に載置し、逆重畳走査蛍光顕微鏡（ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）を使用して撮像した。青色、緑色、および赤色蛍光のデジタル画像を、それぞれＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびＣＹ５フィルタを用いて、１００Ｘ油浸対物レンズを使用して得た。画像を並べ、ｓｏｆｔＷｏＲｘソフトウェアを使用して逆重畳した。
【０１２５】
ＲＢＣ膜由来の小胞とＰＬＧＡナノ粒子との融合。ＲＢＣ膜由来の小胞をＰＬＧＡナノ粒子と融合するために、１ｍｇのＰＬＧＡナノ粒子を、１ｍＬの全血から調製されたＲＢＣ膜由来の小胞と混合し、次にＡｖａｎｔｉミニ押出機を使用して、１００ｎｍポリカーボネート多孔質膜を通じて７回押出した。混合比は、１ｍｇのＰＬＧＡナノ粒子を完全にコーティングするために必要なＲＢＣの膜容積および総膜容積に基づいて推定した。この推定に使用されるパラメータは、マウスＲＢＣの平均表面積（７５μｍ２）（３４）、ＲＢＣの膜厚（７ｎｍ）、５０：５０ＰＬＧＡナノ粒子（１．３４ｇ／ｃｍ３）の密度（３５）、マウス血液中の赤血球細胞濃度（７０億／ｍＬ）（３６）、およびＲＢＣ膜コーティング前後にＤＬＳにより測定される平均粒径を含む（図８）。血液の超過分を使用して、ＲＢＣゴーストの誘導および押出の間の膜喪失を補償した。得られたＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子を、３０ｎｍ多孔質膜（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）に対して２４時間透析し、窒素パージを通じて濃縮した。粒径および多分散性は、透析および濃縮後も同一のままであった。
【０１２６】
ＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子の特性化。ナノ粒子の寸法（直径、ｎｍ）、多分散性、および表面電荷（ゼータ電位、ｍＶ）を、Ｎａｎｏ−ＺＳ、モデル３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕ．Ｋ．）を使用してＤＬＳにより測定した。ナノ粒子（約５００μｇ）を１Ｘ  ＰＢＳ（約１ｍＬ）中に懸濁し、測定を室温で２週間３回行った。１００％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中に、１ｍｇ／ｍＬの最終ナノ粒子濃度でナノ粒子を懸濁することにより血清安定性試験を行った。最初に、粒子を２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次に濃縮された２Ｘ  ＦＢＳを等容量で添加した。吸収度の測定は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マルチプレートリーダーを使用して行った。各測定の前に、試料を３７℃で軽く撹拌しながら培養した。５６０ｎｍでの吸収度を、約３０分毎に４時間の期間をかけて測定した。
【０１２７】
透過電子顕微鏡撮像。ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子の構造を、透過電子顕微鏡を使用して調べた。４μｇ／ｍＬの濃度でのナノ粒子溶液の滴を、グロー放電した炭素コーティンググリッドの上に付着させた。試料が付着してから５分後に、グリッドを１０滴の蒸留水で洗浄した。１％酢酸ウラニル染色の滴をグリッドに添加した。後次にグリッドを乾燥させ、ＦＥＩ  ２００ＫＶ  Ｓｐｈｅｒａ顕微鏡を使用して可視化した。
【０１２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用したタンパク質特性化。ＲＢＣゴースト、ＲＢＣ膜由来の小胞、および透析されたＲＢＣ膜でコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子を、ＳＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製した。次に試料を、ＮｏｖｅｘＳｕｒｅＬｏｃｋＸｃｅｌｌ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）泳動用緩衝液中のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １０−ウェルミニゲル上で泳動させた。試料を１５０Ｖで１時間泳動させ、得られたポリアクリルアミドゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で一晩染色して可視化した。
【０１２９】
薬物動態および生体分布研究。すべての動物手順は、カリフォルニア大学サンディエゴ校施設内動物管理使用委員会のガイドラインに準拠した。実験は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得た雄ＩＣＲマウス（６〜８週間）に対して行った。ＲＢＣ膜でコーティングされたナノ粒子の循環半減期を評価するために、１５０μＬのＤｉＤ負荷されたナノ粒子を、マウスの尾静脈に注射した。２０μＬの血液を、注射から１、５、１５、３０分後、および１、２、４、８、２４、４８、および７２時間後に採取した。同一用量のＤｉＤを含有するＰＥＧコーティングされた脂質ＰＬＧＡハイブリッドナノ粒子および裸ＰＬＧＡナノ粒子も対照として並行して試験した。各粒子群は６匹であった。蛍光測定の前に、９６ウェルプレートにおいて、収集した血液試料を３０μＬ  ＰＢＳで希釈した。薬物動態パラメータを計算して、２区画モデルを適合させた。
【０１３０】
様々な組織中のナノ粒子の生体分布を研究するために、１８匹のマウスに１５０μＬの３ｍｇ／ｍＬ  ＤｉＤ負荷したナノ粒子を尾静脈注射した。粒子注射から２４、４８、および７２時間後の各時点で、６匹のマウスをランダムに選択し、安楽死させた。それらの肝臓、腎臓、脾臓、脳、肺、心臓、および血液を収集した。収集した器官を慎重に計量し、次に１ｍＬ  ＰＢＳ中で均質化した。血液の総重量を６％のマウス体重として推定した。各試料の蛍光強度は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マルチプレートリーダーにより決定した。
【０１３１】
参考文献
１．    Ｍｏｇｈｉｍｉ  ＳＭ，  Ｈｕｎｔｅｒ  ＡＣ，  Ｍｕｒｒａｙ  ＪＣ  （２００１）  Ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５３：２８３−３１８．
２．    Ｄａｖｉｓ  ＭＥ，  Ｃｈｅｎ  ＺＧ，  Ｓｈｉｎ  ＤＭ  （２００８）  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７：７７１−７８２．
３．    Ｐｅｅｒ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：７５１−７６０．
４．    Ｙｏｏ  ＪＷ，  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｅ，  Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ  （２０１０）  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ：  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １６：２２９８−２３０７．
５．    Ｇｅｎｇ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｓｈａｐｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：２４９−２５５．
６．    Ａｌｅｘｉｓ  Ｆ，  Ｐｒｉｄｇｅｎ  Ｅ，  Ｍｏｌｎａｒ  ＬＫ，  Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ  （２００８）  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ５：５０５−５１５．
７．    Ｋｎｏｐ  Ｋ，  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｒ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，  Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ＵＳ  （２０１０）  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ｐｒｏｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：６２８８−６３０８．
８．    Ｊｉａｎｇ  ＳＹ，  Ｃａｏ  ＺＱ  （２０１０）  Ｕｌｔｒａｌｏｗ−ｆｏｕｌｉｎｇ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｂｌｅ，  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ  ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２２：９２０−９３２．
９．    Ｙａｎｇ  Ｗ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｓ，  Ｗｈｉｔｅ  ＡＤ，  Ｊｉａｎｇ  Ｓ  （２００９）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｂｌｅ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙ（ｃａｒｂｏｘｙｂｅｔａｉｎｅ）  ｉｎ  ｕｎｄｉｌｕｔｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０：５６１７−５６２１．
１０．    Ｄｏｓｈｉ  Ｎ，  Ｚａｈｒ  ＡＳ，  Ｂｈａｓｋａｒ  Ｓ，  Ｌａｈａｎｎ  Ｊ，  Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ  （２００９）  Ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ−ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：２１４９５−２１４９９．
１１．    Ｔｓａｉ  ＲＫ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＰＬ，  Ｄｉｓｃｈｅｒ  ＤＥ  （２０１０）  Ｓｅｌｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ‘ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｓｅｌｆ’  ＣＤ４７  ｆｏｒ  ＳＩＲＰａｌｐｈａ  ｄｉｃｔａｔｅｓ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｏｎｌｙ  ａｔ  ｌｏｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ  ４５：６７−７４．
１２．    Ｍｅｒｋｅｌ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｕｓｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：５８６−５９１．
１３．    Ｄｅｓｉｌｅｔｓ  Ｊ，  Ｌｅｊｅｕｎｅ  Ａ，  Ｍｅｒｃｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｃｑｕａｕｄ  Ｃ  （２００１）  Ｎａｎｏｅｒｙｔｈｒｏｓｏｍｅｓ，  ａ  ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔ：  ＩＶ．  Ｆａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｅｒｙｔｈｒｏｓｏｍｅｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：１７４１−１７４７．
１４．    Ｃｈｅｎｇ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８：８６９−８７６．
１５．    Ｔａｎａｋａ  Ｍ，  Ｓａｃｋｍａｎｎ  Ｅ  （２００５）  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｓ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：６５６−６６３．
１６．    Ｈｏｃｈｍｕｔｈ  ＲＭ，  Ｅｖａｎｓ  ＣＡ，  Ｗｉｌｅｓ  ＨＣ，  ＭｃＣｏｗｎ  ＪＴ  （１９８３）  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：１０１−１０２．
１７．    Ｆａｎｇ  ＲＨ，  Ａｒｙａｌ  Ｓ，  Ｈｕ  ＣＭ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ  （２０１０）  Ｑｕｉｃｋ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２６：１６９５８−１６９６２．
１８．    Ｐｏｐｉｅｌａｒｓｋｉ  ＳＲ，  Ｐｕｎ  ＳＨ，  Ｄａｖｉｓ  ＭＥ  （２００５）  Ａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．  １．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １６：１０６３−１０７０．
１９．    Ｇｏｕｔａｙｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ７５：１３７−１４７．
２０．    Ｘｉａｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ａ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０：６００６−６０１６．
２１．    Ｇｒａｔｔｏｎ  ＳＥ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＰＲＩＮＴ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２１：１０−１８．
２２．    Ｐｅｒａｃｃｈｉａ  ＭＴ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｓｔｅａｌｔｈ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６０：１２１−１２８．
２３．    Ｓｉｍｂｅｒｇ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｈｏｍｉｎｇ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４：９３２−９３６．
２４．    Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ  ＰＡ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ４７  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｓｅｌｆ  ｏｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：２０５１−２０５４．
２５．    Ｇｕ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｂｉｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２５８６−２５９１．
２６．    Ａｖｇｏｕｓｔａｋｉｓ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２５９：１１５−１２７．
２７．    Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  （２０１０）  Ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｎｏ  ＬＩＦＥ  １：１６３−１７３．
２８．    Ｓｅｎｇｕｐｔａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：５６８−５７２．
２９．    Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＰＭ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ−ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｒａｐｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ４：１６７１−１６７９．
３０．    Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｓｔａｃｅ−Ｎａｕｇｈｔｏｎ  Ａ，  Ｊｉａｎｇ  Ｘ，  Ｂｒｉｎｋｅｒ  ＣＪ  （２００９）  Ｐｏｒｏｕｓ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ  （ｐｒｏｔｏｃｅｌｌｓ）  ａｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３１：１３５４−１３５５．
３１．    ｖａｎ  Ｓｃｈｏｏｎｅｖｅｌｄ  ＭＭ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｃ−ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｅｔｒｅ  ｌｅｖｅｌ．  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：５３８−５４４．
３２．    Ｄｏｄｇｅ  ＪＴ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｃ，  Ｈａｎａｈａｎ  ＤＪ  （１９６３）  Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｆｒｅｅ  ｇｈｏｓｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １００：１１９−１３０．
３３．    Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２：１６９６−１７０２．
３４．    Ｗａｕｇｈ  ＲＥ，  Ｓａｒｅｌｉｕｓ  ＩＨ  （１９９６）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｏｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｏｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１：Ｃ１８４７−１８５２．
３５．    Ａｒｎｏｌｄ  ＭＭ，  Ｇｏｒｍａｎ  ＥＭ，  Ｓｃｈｉｅｂｅｒ  ＬＪ，  Ｍｕｎｓｏｎ  ＥＪ，  Ｂｅｒｋｌａｎｄ  Ｃ  （２００７）  ＮａｎｏＣｉｐｒｏ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｐｏｒｏｕｓ  ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２１：１００−１０９．
３６．    Ｊａｃｏｂｓ  ＲＬ，  Ａｌｌｉｎｇ  ＤＷ，  Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ＷＦ  （１９６３）  Ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ４９：９２０−９２５．
３７．    Ｌｕｎｄ，  Ｒ．；  Ｌｅｔｈ−Ｌａｒｓｅｎ，  Ｒ．；  Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｏ．  Ｎ．；  Ｄｉｔｚｅｌ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００９，  ８  （６），  ３０７８−３０９０．
３８．    Ｇｒａｈａｍ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９３，  １９，  ９７−１０８．
３９．    Ｖａｙｒｏ，  Ｓ．；  Ｋｅｍｐ，  Ｒ．；  Ｂｅｅｃｈｅｙ，  Ｒ．  Ｂ．；  Ｓｈｉｒａｚｉ−Ｂｅｅｃｈｅｙ，  Ｓ．，  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｐｌａｓｍａ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｈｅｅｐ  ｐａｒｏｔｉｄ  ｇｌａｎｄｓ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９１，  ２７９  （  Ｐｔ  ３），  ８４３−８４８．
４０．    Ｎａｖａｓ，  Ｐ．；  Ｎｏｗａｃｋ，  Ｄ．  Ｄ．；  Ｍｏｒｒｅ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｍａｓ  ｂｙ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９，  ４９  （８），  ２１４７−２１５６．
４１．    Ｈｅｎｏｎ，  Ｍ．；  Ｂｅｄｏｕｉｎ，  Ａ．；  Ｐｏｌｏｎｏｖｓｋｉ，  Ｊ．，  ［Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ］．  Ｃ  Ｒ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｈｅｂｄ  Ｓｅａｎｃｅｓ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｄ  １９７７，  ２８５  （１），  １２１−１２２．
４２．    Ｂｏｏｎｅ，  Ｃ．  Ｗ．；  Ｆｏｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．；  Ｂｏｎｄ，  Ｈ．  Ｅ．；  Ｓｔｕａｒｔ，  Ｄ．  Ｃ．；  Ｌｏｒｅｎｚ，  Ｄ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９６９，  ４１  （２），  ３７８−３９２．
【実施例２】
【０１３２】
制御された薬剤負荷および放出のための赤血球膜で被覆されたポリマーナノ粒子
赤血球細胞膜（ＲＢＣｍ）により被覆されたポリマーナノ粒子（ＮＰ）は、長い循環寿命と、制御された薬剤保持および放出という複合利点を付与する。高度な送達アプリケーションのためのこの細胞模倣型ＮＰプラットフォームの開発に向けて、本明細書において、発明者らは、その薬剤負荷、薬剤放出動態、および細胞に基づく有用性に関するより良い理解を得るために研究を行った。具体的に、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰからの薬剤放出を研究するために、発明者は、モデル抗癌剤であるドキソルビチン（ＤＯＸ）をＲＢＣｍで被覆されたＮＰに負荷するための２つの方法：物理的カプセル化および化学共役を比較した。インビトロ有用性は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株を使用することにより調べた。
【０１３３】
発明者らは、化学共役法が、より持続的な薬物放出プロファイルをもたらすことを見出した。さらに、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰと同一のポリマー核であるが、異なる表面コーティングのＰＥＧ化ＮＰを製剤することにより、発明者らは、ＲＢＣｍ被覆が、カプセル化された薬剤分子の外側拡散を遅延させる障壁を提供した。ＡＭＬ  Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株に関する有用性研究において、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、遊離ＤＯＸと比較して、より高い毒性を呈した。これらの結果は、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰが、血液癌等の様々な疾患の治療のための治療剤薬の制御された持続性送達の価値ある送達プラットフォームであることを示す。
【０１３４】
導入
過去数十年にわたって、ナノメートルスケールの材料工学における進歩は、臨床適用における無数のナノ粒子（ＮＰ）ベースの薬剤送達系をもたらした［１，２］。これらのナノ医療に固有の利点、特に改変された薬物動態および生体分布プロファイルを通じた既存の治療薬剤に対するそれらの改善は、より長い期間の間、血流中を循環する能力による［３，４］。結果として、ＮＰにマクロファージの取り込みおよび全身クリアランスを回避させることができる、天然および合成で作製される新規の材料の検索に相当の研究関心が集められている［５，６］。その中で、寸法、形状、変形、および表面特徴を含むＮＰ物理化学的特性を修飾することにより、インビボの粒子滞留時間を延長させることを目的とする方法も広く探究されている［７，８］。
【０１３５】
この観点において、発明者は近年、ＲＢＣからの長い循環寿命と、ポリマー粒子からの制御された薬剤保持および放出という複合利点を持つ、赤血球細胞膜（ＲＢＣｍ）で被覆されたＮＰ薬剤送達系を開発した［９］。トップダウンアプローチは、予形成されたＲＢＣｍ由来の小胞と混合されたポリマー粒子の押出に基づいて、保存された膜タンパク質を持つＲＢＣｍ全体を、１００ｎｍより小さいポリマー孔の表面に移行させた結果、長時間の全身循環のための赤血球外部により被覆されたＮＰを得た。この細胞模倣法は、膜貫通タンパク質固定のためのポリマー核を取り囲む細胞膜媒質を提供し、したがってタンパク質の完全性および機能性を低下させ得る、従来のＮＰ表面機能化における科学的修飾を防ぐ。
【０１３６】
高度な薬剤送達適用のためのこの細胞模倣ＮＰプラットフォームをさらに開発する継続的な努力において、本明細書では、発明者らは、モデル抗癌剤であるドキソルビチン（ＤＯＸ）などの小分子化学療法剤をＮＰに負荷する製剤法を報告し、薬剤保持においてＲＢＣｍ被覆が果たす役割に重点を置いて薬剤放出動態を研究する。具体的に、ＤＯＸ分子をＮＰ核に負荷するために、発明者らは、２つの別箇の方法：薬剤分子をポリマーマトリックスに物理的にカプセル化すること、および薬剤分子をポリマー骨格に化学的に共役することを探究し、それらが明確な薬剤負荷収率および放出動態をもたらしたことを示した。発明者らは、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰと同一のポリマー核を有するが、ＲＢＣｍではなくポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、ＰＥＧ化ＮＰ）によりコーティングされたＮＰをさらに製剤した。２つの送達系の薬剤放出プロファイルの比較は、ＲＢＣｍ被覆が、カプセル化された薬剤分子の外部拡散を遅延させる障壁を提供し、したがって、薬剤放出をより良く制御するために潜在的に活用され得ることを実証した。加えて、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰの治療能力を調べる際に、発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株を選択し、ＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰが、同量の遊離ＤＯＸと比較して、より高い毒性を呈したことを示した。
【０１３７】
材料および方法
２．１．ＲＢＣゴーストの誘導
細胞内容を欠くＲＢＣゴーストを、以前に公開されたプロトコルに従って調製した［９，１０］。つまり、ヘパリン溶液（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）の滴を含有するシリンジによる心穿刺を通じて雄ＩＣＲマウス（６〜８週間、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から採取した全血を遠心分離し（８００×ｇで５分間、４℃）、血清および白血球層を除去した。被包されたＲＢＣを、氷冷１Ｘ  ＰＢＳ中で洗浄し、透析のために低張媒体処理した後、０．２５Ｘ  ＰＢＳ中に氷浴で２０分間懸濁した。懸濁液を８００×ｇで５分間遠心分離することにより、ヘモグロビンを除去した。ピンク色の小球の形態のＲＢＣゴーストを収集した。
【０１３８】
２．２．ＲＢＣｍ由来の小胞の調製
収集したＲＢＣゴーストを、蓋をしたガラス瓶中で５分間、ＦＳ３０Ｄ音波洗浄器（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、周波数４２ｋＨｚおよび電力１００Ｗで音波処理した。後次に得られた小胞を、Ａｖａｎｔｉミニ押出機（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用することにより、４００ｎｍ、次に２００ｎｍのポリカーボネート多孔質膜を通じて連続して押出した。各押出後、ＲＢＣ膜由来の小胞の寸法を、動的光散乱（ＤＬＳ，Ｎａｎｏ−ＺＳ，モデルＺＥＮ３６００）により監視した。
【０１３９】
２．３．Ｌ−ラクチドの開環重合化
ＤＯＸ−ポリ（ラクチド酸）（ＰＬＡ）抱合体を、公開されたプロトコルに基づいて合成した［１１，１２］。つまり、Ｌ−ラクチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）の開環重合化を、アルゴンで満たされたグローブボックス中、室温でアルコキシ組み合わせ（ＢＤＩ）ＺｎＮ（ＳｉＭｅ３）２により触媒した。（ＢＤＩ）ＺｎＮ（ＳｉＭｅ３）２）（６．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）およびＤＯＸ（Ｊｉｎａｎ  Ｗｅｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊｉｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）（５．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、０．５ｍＬ）中で混合し、２ｍＬの無水ＴＨＦ中に溶解したＬ−ラクチド（１０１ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を滴下添加した。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００ＭＨｚ分光計）により示されるように、Ｌ−ラクチドが完全に消費された後、粗生成物を冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、複数の溶解−沈殿サイクルにより精製した。１Ｈ  ＮＭＲにより共役を確認し、抱合体は、ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ，Ｖｉｓｃｏｔｅｋ，ＵＳＡ）により決定されるように、約１０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有した。
【０１４０】
２．４．ＮＰ核の調製およびＤＯＸの負荷  
最初に、ＤＯＸ−ＰＬＡ抱合体をアセトニトリルに溶解して１ｍｇ／ｍＬの溶液を形成し、
１ｍＬのかかる溶液を３ｍＬの水に滴下添加した。次に混合液を外気中で２時間撹拌し、アセトニトリルを蒸発させた。得られたＮＰ核の溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａカットオフ）により濾過した後、１ｍＬの蒸留水中で再懸濁した。ＤＯＸを物理的にカプセル化するために、１ｍｇの乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ、０．６７ｄＬ／ｇ、カルボキシ末端、ＬＡＣＴＥＬ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を、最初に１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、続いて２５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に事前に溶解されたＤＯＸを添加した。上記と同様の手順に従って、ＮＰ核を含有する懸濁液を生成した。
【０１４１】
２．５．ＲＢＣｍ由来の小胞とＮＰ核との融合
ＲＢＣｍ由来の小胞を前述のＮＰ核と融合するために、１ｍｇのＮＰ核を含有する懸濁液を最初に、１ｍＬの全血から調製されたＲＢＣｍ由来の小胞と混合した。次に混合液を、Ａｖａｎｔｉミニ押出機を用いて、１１回、１００ｎｍポリカーボネート多孔質膜を通じて押出した。１ｍｇのＮＰ核を完全にコーティングするために、血液の超過分を使用して、ＲＢＣゴーストの誘導および押出の間の膜喪失を補償した［９］。
【０１４２】
２．６．ＰＥＧ化ＮＰの調製
重量比１：１のＤＯＸ−ＰＬＡ抱合体およびＰＬＡ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（１０ｋＤａ，ＰＤＩ＝１．１２）［１３］を最初に、１ｍｇ／ｍＬの濃度でアセトニトリル中に溶解し、上記と同一の手順に従って、ＮＰ懸濁液を生成した。ＤＯＸをＰＥＧ化ＮＰに物理的にカプセル化するために、１ｍｇの乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ、０．６７ｄＬ／ｇ、カルボキシ末端、ＬＡＣＴＥＬ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を最初に、１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、続いて２５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に事前に溶解された１００μｇのＤＯＸを添加した。上記と同一の手順を使用して、ＮＰ懸濁液を生成した。
【０１４３】
２．７．ＮＰ安定性研究
ＤＬＳを使用して粒径を監視することにより、ＰＢＳ中のＮＰ安定性を評価した。具体的に、５００μｇのＮＰを１ｍＬの１×ＰＢＳ中に懸濁し、１週間の期間にわたって２４時間毎に室温で３回寸法を測定した。測定の間に、試料をやさしく撹拌しながら３７℃で培養した。５６０ｎｍの波長での紫外線吸収度を監視することによりＮＰ血清安定性を評価した。具体的に、最初にＮＰをＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、続いて等容量の２×ウシ胎孔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マルチプレートリーダーを３７℃で、２時間の期間にわたって約１分毎に使用することにより、吸収度を測定した。
【０１４４】
２．８．薬物負荷収率および放出の測定  
溶液中のＤＯＸ濃度を、４８０ｎｍの励起波長を用いて、５８０ｎｍでの蛍光強度を測定することにより決定した。ＮＰのＤＯＸ負荷収率を決定するために、１００μＬのＮＰ溶液をアセトニトリル中１００μＬの０．１Ｍ  ＨＣｌを用いて２４時間培養した後、上記蛍光測定を行った。ＤＯＸ放出プロファイルをプロットするために、２００μＬのＮＰ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析微小管（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、分子量カットオフ＝３．５ｋＤａ）に入れ、次に２ＬのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に対して３７℃で透析した。全体透析プロセスの間１２時間毎に、ＰＢＳ緩衝液を変えた。各規定の時点において、３つのミニ透析ユニットからのＮＰ溶液を収集し、ＤＯＸ濃度を測定した。
【０１４５】
２．９．細胞生存性アッセイ
遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ負荷したＮＰの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の末梢血から確立したＫａｓｕｍｉ−１細胞株に対して評価した。最初に細胞を９６ウェルプレートに播種し（約５×１０３／ウェル）、次に２４時間培養した。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ負荷したＮＰを添加した後、細胞をさらに７２時間培養した。次に製造者により提供されたプロトコルに従って、ＭＴＴアッセイを使用することにより細胞生存性を決定した。
【０１４６】
結果および考察
３．１．ＲＢＣｍで被覆されたＮＰの調製  
ＲＢＣｍで被覆されたＮＰの調製プロセスは、以前に公開されたプロトコルに基づき、図９に概略的に示される［９］。つまり、精製されたＲＢＣは最初に、低張性環境において膜破裂を受けて、その細胞内容を除去した。次に、空のＲＢＣ（直径約２μｍ）を洗浄し、１００ｎｍ多孔質膜を通じて押出して、ＲＢＣ膜由来の小胞（直径約２００ｎｍ）を形成した。一方ＰＬＡまたはＰＬＧＡから作製されたもの等のポリマー核（直径約７０ｎｍ）は、溶媒置換法を使用することにより調製した。得られたポリマー核を、ＲＢＣ膜由来の小胞と後次に混合し、混合物を１００ｎｍの孔を通じて物理的に押出して、２つの構成成分が機械力な力の下で融合し、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰ（直径約９０ｎｍ）を形成した。
【０１４７】
３．２．ドキソルビチン（ＤＯＸ）のＲＢＣｍで被覆されたＮＰへの負荷
この研究において、発明者らは、モデル薬剤としてのＤＯＸをＲＢＣｍ被覆されたＮＰに負荷するための２つの別箇の方法：物理的カプセル化および化学共役を調べた。物理的カプセル化は、最初にアセトニトリル中でＤＯＸおよびポリマーを混合し、続いて水に沈殿させることにより達成する。この場合、薬剤負荷収率は、異なる製剤パラメータを通じて変動し得る。例えば、初期ＤＯＸ：ＰＬＧＡ重量比を５％から２０％に変動させるとき、負荷収率は０．９％から１．８％に増加した（  図１０を参照）。
【０１４８】
あるいは、ＤＯＸ分子は、薬剤分子をポリマー骨格に共有結合することにより、ＮＰ核に負荷され得る。直観的に、ＤＯＸ分子は、ヒドロキシル基を通じてカルボキシル末端ＰＬＡ鎖に直接共役され得るが、このアプローチは、主にポリマー鎖の多分散性、複数のヒドロキシル基を含有するＤＯＸ分子の位置選択的および化学選択的共役に対する制御の欠如、および共役効率に対する制御の欠如に起因して、ポリマー−薬剤抱合体の不均質性をもたらす。したがって、発明者らは、Ｌ−ラクチドモノマーおよび（ＢＤＩ）ＺｎＮ（ＳｉＭｅ３）２の触媒としての存在下、ＤＯＸのヒドロキシル基を利用して、開環重合化（ＲＯＰ）を開始し、ＰＬＡ−ＤＯＸ抱合体の形成をもたらす、代替アプローチを採用した［１１，１２］。このアプローチにおいて、重合化反応は薬剤分子事態により開始されるため、約１００％の共役効率が達成され得る。加えて、金属アミド触媒（ＢＤＩ）ＺｎＮ（ＳｉＭｅ３）２は、好ましくは、そのより立体的に妨害されるＣ４′−およびＣ９−ＯＨ位置の代わりに、ＤＯＸのＣ１４−ＯＨ位置におけるＰＬＡの増殖を可能にする。反応が終了した後、溶解−沈殿サイクルを繰り返し使用することにより生成物を精製し、次に１Ｈ−ＮＭＲ分光計を使用して特性化した。δ＝７．５〜８．０ｐｐｍのＤＯＸ芳香族プロトン、δ＝１．５ｐｐｍでのＰＬＡの−ＣＨ３基のプロトン、およびδ＝５．２ｐｐｍでのＰＬＡの−ＣＨ基を含む、ＤＯＸ分子およびＰＬＡ骨格の両方に対応するプロトン共鳴ピークが存在し、したがってＰＬＡ−ＤＯＸ抱合体の形成を確認する［１１］。
【０１４９】
薬物負荷収率が主に製剤パラメータに依存する、物理的カプセル化とは対照的に、化学共役において、薬物負荷収率は、ポリマー鎖長により示され、順に開始剤（ＤＯＸ）：モノマー比等の重合化状態により決定される。例えば、当研究において合成されたＰＬＡ−ＤＯＸ抱合体は、その抱合体がＮＰに製剤された後、ＤＯＸの約５％の負荷収率に対応して、１０ｋＤａの分子量および１．１６の狭い多分散性指数（ＰＤＩ）を有することがわかった（図１０参照）。
【０１５０】
３．３．ＤＯＸ負荷されたＲＢＣｍ被覆されたＮＰのインビトロ安定性
次に、発明者は、生理学的に関連する緩衝液中のＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰの安定性を研究した。不安定な粒子は凝集する傾向があり、それらの寸法が増加するため、ＰＢＳ中のＮＰ安定性は、異なる辞典でＮＰ寸法を測定することにより監視する。この研究において（図１１Ａ）、物理的カプセル化および化学共役の両方を使用することによりＤＯＸ分子を負荷したＮＰは、１週間の期間にわたって著しく寸法が増大することなく、約９０ｎｍの類似の初期直径を有した。同様に、同一の期間にわたって、ＮＰのＰＤＩにおけるわずかな変化のみが観察され、ＰＢＳ中のＤＯＸ負荷されたＲＢＣｍ被覆されたＮＰの高い安定性を示す。粒子凝集の程度を反映する特徴的な波長である、５６０ｎｍでの紫外線吸収度を監視することにより、血清中のＮＰ安定性をさらに調べた［１４，１５］。物理的カプセル化または化学共役のいずれかによりＤＯＸ分子を負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、２時間の期間にわたって、５６０ｎｍでほぼ一定の吸収度を示し（図１１Ｂ）、ＮＰが１００％ウシ胎孔血清（ＦＢＳ）中で高度に安定することを示唆する。対照的に、ＲＢＣｍ被覆のないＰＬＧＡまたはＰＬＡ−ＤＯＸ抱合体から作製された裸ポリマー核の吸収は、ＦＢＳへの添加時に即時に増加した。これらの結果は、ＲＢＣｍ被覆が、緩衝液および血清の両方においてＮＰを安定化させる際に重要な役割を果たすことを示した。実践的な観点から、緩衝液中のコーティングされていないポリマー粒子の高速凝集は、選択的な沈殿およびそれらの沈殿後のＲＢＣｍで被覆されたＮＰからのコーティングされていない粒子の除去を提供した。
【０１５１】
３．４．ＲＢＣｍで被覆されたＮＰからのＤＯＸの放出動態
安定したＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰの製剤に続いて、発明者らは、それらのＤＯＸ放出動態の調査に進んだ（図１２）。発明者らは最初に、異なる薬剤負荷機構がＲＢＣｍで被覆されたＮＰからのＤＯＸ放出にどのように作用するかを調べた。結果は、ＤＯＸ分子の２０％が最初の２時間以内にＲＢＣｍで被覆されたＮＰから放出されたため、ＤＯＸ分子がポリマーマトリックスに物理的にカプセル化されたときに、薬剤放出率が著しく速くなることを示した。対照的に、化学共役の製剤を調べたとき、最初の２時間以内に、ＤＯＸ分子の５％のみが放出した。かかる差異は、ＤＯＸ分子のポリマー骨格への共有結合が、ポリマーマトリックスの外に拡散して放出し得る前に、バルク浸食により最初に薬剤分子がポリマーから水和される必要があるという事実に起因した［１１，１２，１６］。薬剤−ポリマー共有結合から得られるより持続性の放出プロファイルは、環境トリガに応答する化学リンカーが、高度の薬剤送達適用のためのＲＢＣｍで被覆されたＮＰを開発するときに、より良好に制御される薬剤放出を達成し得ることを示唆する［１３，１７］。
【０１５２】
薬剤保持においてＲＢＣｍ被覆により果たされる役割に関してより良い理解を得るために、発明者らは、確立された手順に従って、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロック子ポリマーを混合することによりＮＰを生成し、ＮＰ核がＲＢＣｍ被覆の代わりに周囲のＰＥＧ層によってコーティングおよび安定化された、ＰＥＧ化ＮＰを得た［１８］。２つの製剤が同様のＮＰ核を有する場合、薬剤放出の差異は、主に薬剤保持におけるＲＢＣｍ被覆および表面ＰＥＧコーティングの異なる能力によりもたらされる。ＲＢＣｍで被覆されたＮＰからのＤＯＸ放出と、ＰＥＧ化ＮＰからのものとを比較することにより、発明者らは、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰの放出率がより遅く、ＤＯＸの約２０％がＲＢＣｍで被覆されたＮＰ中で最初の７２時間以内に放出されたが、同一の期間にわたって、ＤＯＸの約４０％がＰＥＧ化ＮＰから放出されたことを見出した。実際に、ＰＬＧＡ−ＰＥＧジブロック子ポリマーにより製剤されたＮＰを使用することにより、表面ＰＥＧ分子は、ＮＰ核からの薬物放出を妨害することがわかった［１９］。
【０１５３】
したがって、ＤＯＸがＲＢＣｍで被覆されたＮＰと比較してＰＥＧでコーティングされたＮＰからより高速で放出されるという観察は、ＲＢＣｍが実際にＤＯＸ放出の拡散障壁として作用することを示す。この観察は、以前の研究により、リン脂質コーティングが薬剤拡散に対する障壁として作用し得ることも示す［２０］。ＲＢＣｍ被覆により果たされるかかる役割は、脂質膜コーティングを設計することを目的とする方法が、ポリマー核に埋め込まれた化学共役により達成されるものに加えて、ある環境条件下で、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰからの応答性薬剤放出を可能にし得ることを示唆する［２１］。
【０１５４】
薬剤保持に対する膜コーティング効果に関する定量的理解を得るために、以前の粒子薬剤放出研究において確立された数学モデルを使用して、薬剤放出プロファイルを分析した。ＰＬＧＡの分解は約数週間であるため［２２，２３］、物理的に負荷されたシステムについて観察された薬剤放出よりも顕著に遅く、拡散支配的Ｈｉｇｕｃｈｉモデルを、物理的にカプセル化されたＤＯＸを含有するＲＢＣｍでコーティングされたＮＰおよびＰＥＧ化ＮＰの両方に適用した。時間の平方根に対する薬剤放出率のプロットは、それぞれＲＢＣｍ被覆されたＮＰおよびＰＥＧ化ＮＰについて、Ｒ２＝０．９８および０．９６で線形適合をもたらした（図１２Ｂ）。適合の良さは拡散制御された薬剤放出機構を暗示し、以下のＨｉｇｕｃｈｉ式により拡散係数の誘導をさらに可能にする［２４，２５］：
【数１】
2014518200.tif 000003
式中、Ｍｔは、時間ｔ（時間）における薬剤放出であり、ＫはＨｉｇｕｃｈｉ定数であり、Ｃｉｎｉは初期薬剤濃度であり、Ｃｓは薬剤可溶性であり、Ａは粒子の総表面積であり、Ｄは拡散係数である。粒子寸法、薬剤負荷収率、水中のＤＯＸの可溶性（１．１８ｇ／Ｌ）、および薬剤放出データを考慮して、ＲＢＣｍ被覆されたＮＰおよびＰＥＧ化ＮＰの拡散係数をそれぞれ６．６×１０−１６ｃｍ２／秒および８．２×１０−１６ｃｍ２／秒と決定し、これらも以前に報告されたＰＬＧＡ／ＰＬＡ  ＮＰからの薬剤拡散と一致する［２６］。当研究において、二重層化膜コーティングは、薬剤拡散を１．２倍減少させた。このＲＢＣｍ被覆による遅延効果は、異なる粒径、ポリマー種、および治療カーゴにより変動する可能性がある。
【０１５５】
一方、ゼロ次、一次、およびＨｉｇｕｃｈｉモデルを化学共役されたＤＯＸの薬剤放出プロファイルに適用することは、不良な適合をもたらし（データ図示せず）、追加の薬剤分裂が、ポリマーマトリックス外の薬剤拡散と結合されるとき、複雑な放出動態を示す。ＲＢＣｍ被覆により化学的に共役されたＤＯＸに付与される遅延効果の精密なモデルは、本研究の範囲外である。
【０１５６】
それにもかかわらず、同一の粒子核はＲＢＣｍ被覆されたＮＰおよびＰＥＧ化ＮＰの両方で存在するため、結合のポリマーマトリックスの弛緩および加水分解開裂は、ＤＯＸ放出プロファイルにおいて観察される差異に起因する支配的要因ではない。代わりに、発明者らは、２つの拡散支配的要素：ポリマーマトリックスへの水の拡散およびポリマーマトリックスを越えて外側への開裂した薬剤の拡散に対して、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰのより遅い放出速度に寄与する［２７］。膜コーティングは、物理的捕捉系において薬剤拡散性を減少させることが示されたため、共役系における水の流入および開裂した薬剤の流出の両方に作用する可能性があり、それにより持続性の高い薬剤放出プロファイルをもたらす。
【０１５７】
３．５．ＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰの細胞毒性
最後に、発明者らは、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株に対するＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰの治療能力を調べた。血流中の白血球ブラストの未制御成長および蓄積を特徴とする疾病であるＡＭＬを、血流中のＲＢＣｍで被覆したＮＰの長い循環寿命およびそれらの持続性薬剤放出プロファイルに起因して、疾患標的として選択した。ＡＭＬに対する現在の治療標準は、高用量のアントラサイクリンであり、心毒性に対する深刻な懸念を引き起こす［２８］。持続性様式で治療化合物を放出する長期循環ＮＰは、必須用量を低減し、治療有用性を改善する機会を提供する。ＤＯＸが物理的に負荷されるか、または共有結合されるかのいずれかであるＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、７２時間の培養期間にわたって遊離ＤＯＸと比較すると、より高い毒性を呈した（図１３）。有用性のこの強化は、ＮＰの細胞内取り込みに起因する可能性があり得、高い薬剤の積荷が細胞内領域に進入することを可能にする［２９］。対照的に、遊離ＤＯＸは、細胞進入の受動的膜拡散に依存し、膜結合された薬剤流出ポンプの効率が低く、その影響を受けやすい［３０〜３２］。この研究は、延長した循環寿命、持続性薬剤放出、および改善された細胞内在化を伴うＲＢＣｍで被覆されたＮＰが、血液癌の治療に対するプラットフォームであることを示唆する。さらなる研究は、これらのＮＰのインビボの治療能力を調べることを保証する。
【０１５８】
結論
要約すると、本明細書において、発明者らは、薬剤をＲＢＣｍで被覆されたＮＰ送達系に負荷するための２つの方法：物理的カプセル化および化学共役を調べた。放出研究は、化学共役法が、より持続性の高い薬剤放出プロファイルをもたらしたことを示唆した。発明者らは、ＲＢＣｍで被覆したＮＰと比較して、同一のＮＰ核を有するが、異なる表面コーティングを有するＰＥＧ化ＮＰをさらに製剤した。これら２つの送達系の薬剤放出プロファイルを比較することにより、発明者らは、ＲＢＣｍ被覆が、カプセル化された薬剤分子の外側拡散を減速させる障壁を提供することを実証した。これらの結果は、ＮＰ核中の薬剤−ポリマー結合に対する化学修飾およびＮＰ表面コーティング上の設計が、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰの薬剤放出に対してより優れた制御を得ることができることを提供する。ＡＭＬ  Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株を使用することによる以下の有用性研究において、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、遊離ＤＯＸと比較して、より高い毒性を呈した。以前に観察された血流中の長い全身性循環寿命および本明細書で報告される持続性薬剤放出動態は、この生体模倣型薬剤送達系が、血液癌等の様々な疾患の治療に対して、実行可能な積荷の全身性送達を提供することを示す。これらのＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、全身性ポリマーおよび天然の細胞膜の両方の利点を組み合わせる、頑強な薬剤送達系を提供する。
【０１５９】
ＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、ＲＢＣの長い循環寿命と合成ポリマーの制御された薬物保持および放出の両方を一緒に合わせた新規のＮＰ製剤群を表す。このＮＰ製剤は、治療積荷の全身性送達を改善するように両方の部分を設計することによりさらに調整され得る。この製剤は、頑強な送達プラットフォームを提供し、生物医学的応用およびナノテクノロジー研究の両方に対して著しい影響を及ぼす。
【０１６０】
この実施例の実行上の要約は以下のとおり提供される。
ＲＢＣの長い循環寿命とポリマー粒子からの制御された薬物保持および放出という利点を組み合わせるために、発明者らは、ＰＬＡまたはＰＬＧＡから作製された１００ｎｍより小さいポリマー核、および保存膜タンパク質を持つＲＢＣｍから作製された赤血球外部を含有する、１００ｎｍより小さい寸法のＲＢＣｍで被覆されたＮＰを製剤した。
発明者らは、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰに対するモデル薬剤としてＤＯＸを負荷するための２つの別箇の方法を調べたところ、物理的カプセル化は、０．９％〜１．８％の範囲の負荷収率をもたらし、共有結合は、５％の近似負荷収率をもたらした。
ＮＰ寸法および紫外線吸収度を監視することにより、発明者らは、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰが、ＲＢＣｍ被覆のない裸ポリマー核と比較したときに、優れた安定性を有することがわかり、ＲＢＣｍ被覆が、生物学的溶液中でＮＰを安定化させる際に重要な役割を果たすことを示唆する。
放出研究は、薬物−ポリマー共有結合アプローチが、物理的カプセル化より持続性の高い放出プロファイルを有することを示し、環境的トリガに応答する化学リンカーが、高度な薬剤送達適用のためのＲＢＣｍで被覆されたＮＰを開発するときに、より良好に制御された薬剤放出を達成し得ることを実証する。
ＲＢＣｍで被覆されたＮＰをＰＥＧ化ＮＰと比較することにより、発明者らは、ＲＢＣｍがＤＯＸ放出の拡散障壁として作用することを見出した。この観察は、Ｈｉｇｕｃｈｉ式を使用する定量分析と一致した。したがって、脂質膜コーティングを設計することを目的とする方法は、ある環境条件下で、ＲＢＣｍで被覆されたＮＰからの応答性薬剤放出も可能にし得る。
ＤＯＸ負荷したＲＢＣｍで被覆されたＮＰは、遊離ＤＯＸと比較して、ＡＭＬ  Ｋａｓｕｍｉ−１細胞に対する有用性を強化した。有用性のこの強化は、ＮＰの細胞内取り込みに寄与する可能性があり得、細胞内領域に進入する薬剤の高い積荷を可能にする。
【０１６１】
参考文献
１．    Ｄａｖｉｓ  ＭＥ，  Ｃｈｅｎ  Ｚ，  Ｓｈｉｎ  ＤＭ．  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ７（９），  ７７１−７８２  （２００８）．
２．    Ｐｅｔｒｏｓ  ＲＡ，  ＤｅＳｉｍｏｎｅ  ＪＭ．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ９（８），  ６１５−６２７  （２０１０）．
３．    Ｐｅｅｒ  Ｄ，  Ｋａｒｐ  ＪＭ，  Ｈｏｎｇ  Ｓ，  ＦａｒｏＫｈｚａｄ  ＯＣ，  Ｍａｒｇａｌｉｔ  Ｒ，  Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２（１２），  ７５１−７６０  （２００７）．
４．    Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ，  Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ３（１），  １６−２０  （２００９）．
５．    Ａｌｅｘｉｓ  Ｆ，  Ｐｒｉｄｇｅｎ  Ｅ，  Ｍｏｌｎａｒ  ＬＫ，  Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ．  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  ５（４），  ５０５−５１５  （２００８）．
６．    Ｋｎｏｐ  Ｋ，  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｒ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，  Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ＵＳ．  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｐｒｏｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓ  ａｓ  Ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄｉｔ．  ４９（３６），  ６２８８−６３０８  （２０１０）．
７．    Ｇｅｎｇ  Ｙ，  Ｄａｌｈａｉｍｅｒ  Ｐ，  Ｃａｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｈａｐｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２（４），  ２４９−２５５  （２００７）．
８．    Ｙｏｏ  Ｊ−Ｗ，  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｅ，  Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ．  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ：  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓｉｇｎ  １６（２１），  ２２９８−２３０７  （２０１０）．
９．    Ｈｕ  ＣＭ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ａｒｙａｌ  Ｓ，  Ｃｈｅｕｎｇ  Ｃ，  Ｆａｎｇ  ＲＨ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃａｍｏｕｆｌａｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０８（２７），  １０９８０−１０９８５  （２０１１）．
１０．    Ｄｏｄｇｅ  ＪＴ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｃ，  Ｈａｎａｈａｎ  ＤＪ．  Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｆｒｅｅ  ｇｈｏｓｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １００，  １１９−１３０  （１９６３）．
１１．    Ａｒｙａｌ  Ｓ，  Ｈｕ  ＣＭ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｖｅｒ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  ８（４），  １４０１−１４０７  （２０１１）．
１２．    Ｔｏｎｇ  Ｒ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｊ．  Ｒｉｎｇ−ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｄｒｕｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３１（１３），  ４７４４−４７５４  （２００９）．
１３．    Ａｒｙａｌ  Ｓ，  Ｈｕ  ＣＭ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ−−ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ４（１），  ２５１−２５８  （２０１０）．
１４．    Ｐｏｐｉｅｌａｒｓｋｉ  ＳＲ，  Ｐｕｎ  ＳＨ，  Ｄａｖｉｓ  ＭＥ．  Ａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．  １．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １６（５），  １０６３−１０７０  （２００５）．
１５．    Ｆａｎｇ  ＲＨ，  Ａｒｙａｌ  Ｓ，  Ｈｕ  ＣＭ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  Ｑｕｉｃｋ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２６（２２），  １６９５８−１６９６２  （２０１０）．
１６．    Ｔｏｎｇ  Ｒ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ−Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２１（１），  １１１−１２１  （２０１０）．
１７．    Ｇａｏ  Ｗ，  Ｃｈａｎ  ＪＭ，  Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ．  ｐＨ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  ７（６），  １９１３−１９２０  （２０１０）．
１８．    Ｇｕ  Ｆ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｔｅｐｌｙ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｂｉｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５（７），  ２５８６−２５９１  （２００８）．
１９．    Ｔａｋａｅ  Ｓ，  Ｍｉｙａｔａ  Ｋ，  Ｏｂａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＥＧ−ｄｅｔａｃｈａｂｌｅ  ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｃａｔｉｏｍｅｒｓ  ａｓ  ｂｉｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０（１８），  ６００１−６００９  （２００８）．
２０．    Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｃｈａｎ  ＪＭ，  Ｇｕ  ＦＸ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２（８），  １６９６−１７０２  （２００８）．
２１．    Ｐｏｒｎｐａｔｔａｎａｎａｎｇｋｕｌ  Ｄ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｏｌｓｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３３（１１），  ４１３２−４１３９  （２０１１）．
２２．    Ａｖｇｏｕｓｔａｋｉｓ  Ｋ，  Ｂｅｌｅｔｓｉ  Ａ，  Ｐａｎａｇｉ  Ｚ，  Ｋｌｅｐｅｔｓａｎｉｓ  Ｐ，  Ｋａｒｙｄａｓ  ＡＧ，  Ｉｔｈａｋｉｓｓｉｏｓ  ＤＳ．  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７９（１−３），  １２３−１３５  （２００２）．
２３．    Ｌｉ  Ｊ，  Ｊｉａｎｇ  Ｇ，  Ｄｉｎｇ  Ｆ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐＨ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．  １０９（１），  ４７５−４８２  （２００８）．
２４．    Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｔ．  Ｒａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｏｉｎｔｍｅｎｔ  ｂａｓｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ５０，  ８７４−８７５  （１９６１）．
２５．    Ｓｉｅｐｍａｎｎ  Ｊ，  Ｐｅｐｐａｓ  ＮＡ．  Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｑｕａｔｉｏｎ：  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ，  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｍｉｓｕｓｅ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ４１８（１），  ６−１２  （２０１１）．
２６．    Ｂｕｄｈｉａｎ  Ａ，  Ｓｉｅｇｅｌ  ＳＪ，  Ｗｉｎｅｙ  ＫＩ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｆｏｒ  ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ−ｌｏａｄｅｄ  ＰＬＧＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ３４６（１−２），  １５１−１５９  （２００８）．
２７．    Ｐｉｔｔ  ＣＧ，  Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  Ａ．  Ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３３（３），  ３９１−３９５  （１９９５）．
２８．    Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ  Ｂ，  Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ  ＧＪ，  ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ  Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６１（１３），  １２３５−１２４８  （２００９）．
２９．    Ｈｕ  Ｃ−ＭＪ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｍｂａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  １０（８），  ８３６−８４１  （２００９）．
３０．    Ｈｕｗｙｌｅｒ  Ｊ，  Ｃｅｒｌｅｔｔｉ  Ａ，  Ｆｒｉｃｋｅｒ  Ｇ，  Ｅｂｅｒｌｅ  ＡＮ，  Ｄｒｅｗｅ  Ｊ．  Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．  １０（１），  ７３−７９  （２００２）．
３１．    Ｒａｐｏｐｏｒｔ  Ｎ，  Ｍａｒｉｎ  Ａ，  Ｌｕｏ  Ｙ，  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ  ＧＤ，  Ｍｕｎｉｒｕｚｚａｍａｎ  Ｍ．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ＭＤＲ  ｃｅｌｌｓ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９１（１），  １５７−１７０  （２００２）．
３２．    Ｓａｈｏｏ  ＳＫ，  Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ  Ｖ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖｉａ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  ２（５），  ３７３−３８３  （２００５）．
【実施例３】
【０１６２】
個別化された免疫療法のための癌細胞膜を有するナノ粒子
本実施例は、既存のアプローチを越えるいくつかの利点を有する、免疫治療系を提供する。
【０１６３】
１）現在の方法は、問題の一般的な癌種により発現される、個別の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）にのみ集中している。癌は、異種疾患であり、かかるアプローチの１つの限界は、ある患者の癌の抗原発現が、別の患者とは完全に異なり得ることである。これは、かかる治療を受けるための実際の候補である患者の最適な比率をもたらさない。別の懸念は、単一のＴＡＡを標的とすることが、癌に対する脆弱な全体免疫応答をもたらすことであり、最終的に突然変異して、耐性をもたせることができる。記載される発明は、それらの自家腫瘍からの膜材料の収集を介して、各個別の患者に向けた治療を調整することにより、これらの問題を解決する。このアプローチは、ナノ粒子上の抗原発現プロファイルの正確な再形成を可能にし、免疫系が癌に対する強力な多角的応答を装備する機会を与える。
【０１６４】
２）現在の方法の別の限界は、それらの大部分が免疫学的アジュバントに対するＴＡＡの化学共役を必要とすることである。これは、抗原をアジュバントと共局在化させるために行い、最終的に、免疫系が、そうでなければ免疫原性が低くなる自己抗原に対する応答を装備することを可能にする。かかるアプローチに伴う問題は、化学共役が、多くの場合、抗原を変形させる可能性があり、ＡＰＣによる不良な提示をもたらす。加えて、化学共役のランダム性質は、低い収率をもたらし得、異なる種類のＴＡＡとともに同時に使用するためのかかるシステムを生成することができない。記載される発明は、これらの前述の問題の両方に対処する。細胞膜全体をナノ粒子の上に移行させることにより、表面膜ＴＡＡのすべては、それらの天然の環境に存在し、したがって、それらの天然の形態でＡＰＣにより正確に提示される。ナノ粒子核の使用は、調整可能なアジュバント：抗原の比で、免疫原性アジュバントと抗原材料との共送達を可能にし、これは従来の化学的に共役されたシステムでは行うことができないことである。
【０１６５】
３）最近の癌ワクチンは、好ましくない薬物動態および生体分布を持つ小化合物である。インビボで注射されると、これらの化合物は、ＡＰＣによる取り込み前に、標的部位から離れて拡散するか、または分解され得る。記載される発明は、これを様々な方法で克服する。第１に、膜はナノ粒子により支持されるため、望ましくない標的と融合する可能性がはるかに低い。このようにして、抗原は、ＡＰＣにより取り込まれるまで、それらの最適な形態で保存および安定化され得る。加えて、ナノ粒子系は、小さな構成成分より大きく、ナノ粒子の寸法は、広範囲にわたって微調整することもできる。ナノ粒子核寸法を約２００〜３００ｎｍとなるように制御することにより、標的部位から離れる拡散を防止することができ、ＡＰＣが効率的に粒子に進入し、取り込むことを可能にする。同時に、小さな寸法のナノ粒子は、膜材料が常駐し得る表面積の最大化も可能にし、用量当たりより多くの抗原性材料の送達をもたらす。
【０１６６】
本実施例は、癌細胞膜材料が患者の腫瘍に由来するか、または確立された細胞株に由来し、有力な癌ワクチンを形成するために内部に負荷される免疫原性アジュバントでナノ粒子をコーティングするために使用されることを提供する（図１４）。このプラットフォームを使用して、癌細胞の表面から抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原性材料のすべてを送達することが可能である。加えて、免疫原性アジュバントの共送達により、免疫系は、そうでなければ脆弱な免疫原性材料に対して強力な応答を装備することができる。この方法を使用して、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、および前立腺癌を含むが、これらに限定されない広範囲の癌種を治療することができる。
【０１６７】
記載される癌ワクチンは、予防的目的および治療的目的の両方で使用され得る。膜源として確立された癌細胞株を使用して、患者は、一般的な抗原モチーフを発現する癌に対してワクチン接種され得る。一方、個別の患者の腫瘍に由来する膜材料を使用して、患者の正確な癌種に対して強力な免疫応答が装備され得る。これは、患者間の疾患の不均一性を考慮して、癌の治療のための広範な意味合いを有する。
【０１６８】
治療調製物：
１）    癌細胞は、患者の切除された腫瘍または一般的な癌細胞株に由来する。
２）    膜材料は、断片化等の方法を使用して、細胞に由来する。例は以下のとおりである。
−    癌細胞を機械的に均質化して、膜を破裂させる。
−    ホモジネートを遠心沈殿させて、細胞内容を小球化し、膜を有する上澄みを収集する。
３）    ナノ沈殿等の方法を使用して、アジュバントを負荷したナノ粒子を調製する。例は以下のとおりである。
−    ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）およびアジュバント（例えば、モノホスホリル脂質Ａ）を有機相に溶解する。
−    有機相を水性相にナノ沈殿させて、所望の寸法のナノ粒子を形成する。
４）    最終免疫治療粒子は、以下のように作製される。
−    癌細胞から収集された膜材料を物理的に押出して、より小さい膜小胞を作製する。
−    予形成されたアジュバント負荷された核を、小胞とともに押出して、最終粒子を形成する（図１５）。
治療薬投与：
１）    ナノ粒子製剤を非か投与する。
２）    あるいは治療薬を静脈内投与する。
作用機構（図１６）：
１）    患者に注射するとき、一次免疫応答が引き起される。
２）    ＡＰＣは炎症部位に移行し、粒子を取り込む。
３）    取り込み時に、粒子は分解され、免疫原性アジュバントを放出する。
４）    免疫原性アジュバントを検出するときに、ＡＰＣは成熟する
５）    ナノ粒子表面上に存在した抗原材料は、ここでＡＰＣの外部上に提示される。
６）    成熟したＡＰＣ上の抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に提示される。
７）    癌特異的抗原と相互作用するときに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化し、細胞毒性Ｔ細胞になる。
８）    癌細胞抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞は増殖し、腫瘍を攻撃する。
【０１６９】
本実施例は、癌細胞でコーティングされたナノ粒子ベースの免疫治療ワクチン、およびかかるワクチンの製造実行可能性を提供する（図１７）。発明者らは、カプセル化された積荷を持つ癌細胞膜でコーティングされたナノ粒子を製造することが可能であることを確認した。癌細胞に由来する膜材料は、大きな細胞内容を欠くため、ナノ粒子表面に効率的に移行する。加えて、発明者らは、細胞による取り込み時に、ナノ粒子核の内容および他の膜材料が共局在化することを確認し、良好な設計を検証する際に最も重要なデータを表す。本明細書において、発明者らは、プラットフォームの有用性を提供するために必要なインビトロおよびインビボ実験を行う。これらの実験は、１）本ナノ粒子製剤を用いて、未成熟樹状細胞の拍動を通じて、癌細胞抗原性材料の提示を確認すること、２）第１の実験からの成熟樹上細胞との共培養時の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を確認すること、３）治療薬の直接投与時に、Ｂ１６黒色腫マウスモデルを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６を使用して、インビボでの治療有用性を決定し、腫瘍寸法の減少を観察することを含む。
【０１７０】
記載される発明は、商品化の大きな可能性を保持する。製造することは容易であり、各個別の患者に対して個別化可能であり、ほぼすべての癌形態に一般化され得るため、かかる技術は、徐々に癌治療の最前線になりつつある。治療的側面では、この免疫療法治療薬は、手術とともに使用され得る。切除された腫瘍からの材料を使用して、ワクチンを作製し、それを患者に投与して、残存する任意の腫瘍を破壊し、腫瘍の再発を防止する。予防的側面では、治療薬を一般化して、多くの癌種に対してワクチン接種するために一般的な癌の確立された細胞株を使用することができる。
【０１７１】
参考文献：
１．    Ｃｈｏ，  Ｎａｍ−Ｈｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｅ−Ｓｈｅｌｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ６，  ６７５−８２  （２０１１）．
２．    Ｌｉ，  Ｈａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａｌｐｈａ−Ａｌｕｍｉｎａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｒｏｓｓ−Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，  ６４５−６５０  （２０１１）．
３．    Ｍｏｏｎ，  Ｊａｍｅｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｉｎｔｅｒｂｉｌａｙｅｒ−Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １０．３  （２０１１）：  ２４３−２５１．
４．    Ｔｏｎｇｃｈｕｓａｋ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ＰＬＧＡ−Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２０１１），  ３２（１４）：３６６６−７８．
【実施例４】
【０１７２】
生物模倣型毒素ナノスポンジ
抗毒素治療は、細菌感染、有毒な傷害、および生物学的兵器を含む、多数の健康障害の根底にある病原性因子の集団を一層する可能性を提供する。しかし、抗毒素の開発において益々の努力が成されているにもかかわらず、安全かつ有効な治療オプションは依然として限定されている。本明細書において、発明者らは、生物模倣型ナノスポンジを構成し、黄色ブドウ球菌からのα毒素を吸収および中和するその能力を実証する。ポリマーナノ粒子に支持されるＲＢＣ膜二重層で構成される、これらのナノスポンジは、膜を損傷する毒素に容易に取り込まれ、それらの細胞標的から逸れてしまう。マウスモデルにおいて、ナノスポンジは、毒素の毒性を顕著に低減させる。この生物学的に触発されたナノ製剤は、抗毒素治療のためのナノ医療における進歩を提示する。
【０１７３】
毒素媒介性疾患および傷害に関する意識の高まりは、より安全かつより有効な抗毒素溶液の研究に対する動機付けとなっている。さらに、毒素標的された抗病原性治療は、抗生物質耐性菌の脅威が高まる中、感染性疾患に対する強制的な戦略として出現している（１）。既存の抗毒素プラットフォーム、例えば、抗血清（２）、単クローナル抗体（３，４）、小分子阻害剤（５，６）、および分子的にインプリントされたポリマー（７，８）は、それらの分子構造を標的とすることにより毒素を中和する。しかしながら、高い免疫原性、低い生体適合性、不良な薬物動態を含む要因、ならびに毒素特異的カスタム合成の必要性が、それらの臨床適用を制限する。生分解性ＰＬＧＡポリマーおよび赤血球細胞の膜構成成分を使用して、発明者らは、孔形成毒素（ＰＦＴ）の作用機構を標的とする生物模倣型ナノスポンジを構成する。
【０１７４】
ＰＦＴは、自然界で見出される最も一般的なタンパク質毒素である（９，１０）。これらの毒素は、細胞膜中に孔を形成し、それらの透過性を改変させることにより細胞を破裂させる。細菌感染において、ＰＦＴによる攻撃は、微生物防御および育成において重要な役割を果たすことにより、主要な病原性機構を構成する（１０）。黄色ブドウ球菌において、膜損傷するα毒素の発現レベルは、株の病原性と直接相関することがわかった（１１）。研究は、α毒素の阻害が、黄色ブドウ球菌感染の重篤度を低減し得（１１，１２）、同様のＰＦＴ標的戦略は、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（１３）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（１４，１５）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（１６）、および肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（１７，１８）を含む他の病原体に対する治療能力を示した。
【０１７５】
細菌性病原体におけるそれらの役割とは別に、ＰＦＴは、一般に、イソギンチャク、サソリ、およびヘビを含む動物による有毒性攻撃に用いられる（１９）。これらの広範な細胞溶解的毒素に対する有効な治療薬が、多数の健康問題に対処することが明らかになった。８０族を越えるＰＦＴが同定されており、様々な分子構造および特有のエピトープ性標的を示す。これらの差異にかかわらず、細胞膜を穿孔することにおけるこれらの毒素の間の機能的類似性は、広い適用性を持つ機構標的された抗毒素プラットフォームの設計の手掛かりを提供する。一般に、ＰＦＴは、リン脂質二重層への同時統合を通じて、細胞膜を破裂させる。この脂質膜と相互作用する傾向は、二重層化膜プラットフォームに基づいて、多数の適用を触発した（２０〜２２）。本明細書において、発明者らは、膜損傷タンパク質を吸収および停止するために、ナノ粒子で安定化したＲＢＣ膜の使用を適用する。ブドウ球菌α毒素をＰＦＴモデルとして使用し、発明者らは、これらのナノスポンジが毒素の病原性孔形成活性を中和し得ることを実証する（図１８Ａ）。
【０１７６】
７０ｎｍ  ＰＬＧＡナノ粒子とともに、赤血球細胞膜小胞を押出すこと（図２２）、直径約８５ｎｍのコアシェルナノ構造を産出すること（図１８Ｂ、１８Ｃ）により毒素ナノスポンジを調製した。ＲＢＣ膜小胞は、マウスの全血から精製されたＲＢＣに由来し、ＰＬＧＡ粒子は、ナノ沈殿プロセスから調製した。この赤血球細胞膜コーティング技術は、ナノ粒子を偽装し、それらの血清安定性を改善して、それらのインビボ循環半減期を延長することが以前に報告されている（２３）。本研究では、これらの粒子に支持されたＲＢＣ膜と溶血性α毒素との間の相互作用について触れる。透過電子顕微鏡下で、ナノスポンジは、ＲＢＣ二重層で巻かれたポリマー核からなる、コアシェル構造を明らかにした（図１８Ｃ）。
【０１７７】
ナノスポンジがα毒素を中和する能力を確立するために、２００μｇのナノスポンジをＰＢＳ中の３μｇのα毒素と３０分間混合した、混合液を後次に、５％の精製されたマウスＲＢＣと混合した。比較として、相当する寸法の等量のＰＥＧ化ＰＬＧＡ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、およびＲＢＣ膜小胞を、毒素と混合した。３０分の培養に続いて、溶液を遠心分離し、放出されたヘモグロビンについて上澄みを観察した。図１９Ａに示されるように、ナノスポンジ試料は、他の試料とは顕著に異なり、ＲＢＣが損傷されなかったことを示す、透明な上澄みを呈した。毒素処理およびＰＢＳ処理されたＲＢＣ溶液を正および負の対照として使用し、５４０ｎｍでの上澄みの吸収度を測定することにより溶血の程度を定量した。ＰＥＧ化ＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、およびＲＢＣ膜小胞は毒素の溶血活性の阻止に失敗したが、ナノスポンジを持つ試料は、完全な毒素阻害を示した。
【０１７８】
α毒素阻害の背後にある機構をより良く解明するために、ナノ製剤／毒素混合物を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂカラムを通じて濾過し、浮遊性の非結合毒素を分離する。赤血球膜（２４）、および基質支持された膜二重層（２５）に自然発生的に組み込まれるα毒素の傾向を考慮して、ＲＢＣ膜小胞およびナノスポンジを、濾過カラムを通じて泳動した後の毒素を保持することが予想された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いて、毒素参照に対して同様の強度が３４ｋＤａタンパク質帯域により示されるように、ＲＢＣ膜小胞およびナノスポンジの両方が、α毒素の大部分（それぞれ９５．３および９０．２％）を保持することがわかった（図１９Ｃ）。一方で、毒素タンパク質帯域は、ＰＥＧ化ＰＬＧＡ  ＮＰおよびＰＥＧ化リポソーム試料（それぞれ３．４および４．７％）中にほとんど存在せず、これはＰＥＧ化製剤が毒素との相互作用をほとんど有しないことを示唆した。この毒素保持の欠失は、親水性ＰＥＧコーティングに起因し得、立体反発を通じてタンパク質相互作用を不可能にする。固体核により安定化され、ＲＢＣ膜構成成分により偽装されるナノスポンジは、毒素標的と直接相互作用し得る。
【０１７９】
ＲＢＣ膜小胞はα毒素も吸収したが、それらが毒素の溶血活性を低減に失敗したことは、ナノスポンジ中のポリマー核の役割を強調する。ＲＢＣ膜小胞およびナノスポンジの中和能力間の格差をより良く理解するために、膜染料、ＤＭＰＥ−ローダミンで調製された２つのナノ製剤を使用して、細胞取り込み研究を行った。蛍光顕微鏡は、細胞による培養時に、２つのナノ製剤の異なる運命を明らかにした（図１９Ｄ）。ＲＢＣ膜小胞を持つ試料において、広範に分布した赤色蛍光は細胞領域全体に投じられ、これはこれらの不安定化小胞と細胞膜との融合により説明され得る。この観察は、リポソームＲＢＣ膜小胞に関する以前の研究と一致し、細胞膜の上に容易に吸収され、細胞エンドサイトーシスを受けなかった（２６）。対照的に、ナノスポンジは、細胞内領域内の別個の蛍光粒子として出現し、ポリマー核がＲＢＣ膜構成成分を安定化させ、その細胞取り込みを可能にする能力を示す。これらの所見は、溶血研究からの結果を正当化する助けとなり、この場合、結合されたα毒素を持つＲＢＣ小胞は、ＲＢＣと融合される可能性があるため、溶血の阻止に失敗した。一方ナノスポンジは、毒素を停止し、それらを他のＲＢＣ膜から離すことができる。加えて、図１９Ｄは、ナノスポンジが、膜結合された毒素の細胞内取り込みを促進し得ることを示唆する。このナノ粒子に誘導される進入機構は、吸収されるタンパク質のエンドリソソーム消化を強化し、毒素が及ぼし得るさらなる損傷を防ぐ。
【０１８０】
ナノスポンジをさらに特性化するために、滴定研究を通じてそれらの毒素吸収能力を調べた。異なる量のα毒素をＰＢＳ中２００μＬの１ｍｇ／ｍＬナノスポンジで３０分間培養した。対照として、同一濃度のα毒素をナノスポンジの不在下で調製した。後次に、毒素／ナノスポンジ混合物を５％のＲＢＣを含有する１．８ｍＬのＰＢＳ溶液に添加し、３０分の培養に続いて溶血を監視した（図１９Ｅ）。ナノスポンジの不在下、著しい溶血は、１．２μｇのα毒素（４２％）で観察され、ほぼ完全な溶血は、３．６μｇのα毒素で達成された。しかしながら、ナノスポンジ処理を用いた場合、わずかな溶血が最大９μｇのα毒素で観察され、完全な溶血は、３０μｇの毒素で達成された。このデータは、ナノスポンジがα毒素の活性を著しく低減させたが、能力に限界があることを示す。９μｇで定着された毒素含有量全体を用いたナノスポンジの追加滴定研究は、溶血活性の阻害がナノスポンジの量と直接相関することを明らかにした（図１９Ｆ）。９μｇの毒素は２００μｇのナノスポンジにより完全に中和され得ることに近似した。滴定データに基づいて、ナノスポンジの寸法、ＰＬＧＡの密度、および毒素の分子量、ナノスポンジの吸収能力は、１粒子当たり１７３毒素モノマーであると推定された。比較として、１粒子当たり約２０００毒素モノマーの理論的能力は、ナノスポンジの表面積および毒素タンパク質の突出面積から推定した。より低い実験値は、毒素分子中の立体障害およびナノスポンジの表面上のＲＢＣ膜タンパク質の存在に起因し得る。
【０１８１】
α毒素を中和するナノスポンジの能力を、皮下投与によりインビボで試験した。マウスにおける皮膚創傷の形成を、右側腹部の皮膚の下にα毒素またはα毒素／ナノスポンジ混合物を注射してから７２時間後に比較した。１２μｇ／ｍＬの濃度で１５０μＬを注射した後、α毒素単独で、対照群において実証できる浮腫および炎症を伴う重篤な皮膚創傷を誘導した（図２０Ａ）。しかしながら、マウスに観察可能な損傷がなかったため、１００μｇのナノスポンジ（約６９：１の毒素：粒子比）との混合は、毒素を中和すると考えられた（図２０Ｂ）。対照群から採取した皮膚組織のさらなる精査は、壊死、アポトーシス、および皮膚浮腫を伴う好中球の炎症性浸潤っを示した（図２０Ｃ）。さらに、毒素は、原線維間浮腫、筋線維の断裂、および相当数の周囲の血管から浸出する好中球により証明されるように、その下にある筋肉に損傷を及ぼし（図２０Ｅ）。これは、毒素／ナノスポンジ混合物を受けたマウスの組織試料において観察されたものと大きく矛盾し図２０Ｄおよび２０Ｆ）、皮膚組織において正常な上皮構造を示し、筋組織において目に見える浸潤のない正常な線維構造を示した（図２０Ｄ、２０Ｆ）。
【０１８２】
ナノスポンジの解毒能力は、マウスにおける全身性投与を通じて評価した。ナノスポンジの安全性は、最初に８０ｍｇ／ｋｇのナノスポンジを静脈内注射することにより最初に検証した。接種群は２週間の期間にわたって死亡率を呈しなかったため、用量は十分に耐性であった（データ図示せず）。製剤の安全性を確認するとき、前接種および後接種の治療薬を調べた。マウスにおいて急死を誘導することが知られているボーラス致死量のα毒素（７５μｇ／ｋｇ）を、尾静脈を通じて注射した。２つの実験群において、８０ｍｇ／ｋｇのナノスポンジを毒素注射の２分前または２分後のいずれかに注入した。対照群において、毒素注射から６時間以内に１００％の死亡率が観察された（ｎ＝９、図２１）。ナノスポンジを後接種した群において、死亡率は５６％まで顕著に低減した（ｐ値は０．００９１、ｎ＝９）。生存率は、前接種群においてさらに改善し、わずか１１％の死亡率が観察された（ｐ値０．０００１未満、ｎ＝９）。結果は、ナノスポンジがインビボで毒素に対して保護を付与することを示唆する。ナノスポンジの利点は、予防的に付与されるとき、より高くなることがわかり、これはα毒素溶血の急速な動態を考慮すると驚くことではない（２７）。両治療群において、６時間のマークを越えてさらなる死亡は観察されず、吸収された毒素が単にその毒性を遅延させるのではなく、解毒されたことを示唆する。これらの結果は、予防的設定および緩和的設定の両方における、これらのナノスポンジの潜在的な臨床応用を示す。
【０１８３】
結論として、ＰＬＧＡナノ粒子で支持されるＲＢＣ膜で構成されるナノスポンジは、ＰＦＴの機能特性を考慮すると、抗毒素溶液として見なされた。発明者らは、膜近接性および構造安定性が、このプラットフォームを介して毒素中和を可能にする重要な態様であることを実証した。ナノスポンジは、インビトロでα毒素の溶血活性を阻害し、マウスにおいて毒素の損傷を大幅に減少させた。この毒素吸収プラットフォームは、治療的ナノ粒子および抗毒素治療の両方において新しいパラダイムを提示する。親水性コーティングを通じてタンパク質の相互作用を不可能にする従来の奇襲戦略とは異なり、ＲＢＣ膜で被覆されたナノスポンジは、毒素タンパク質と相互作用し、インビボで毒素デコイとして機能し得る。他の構造特異的抗毒素プラットフォームとは異なり、ナノスポンジは、一般的な膜破壊機構に対処し、多様なＰＦＴ誘導された損傷および疾患を治療する可能性を有する。より重要なことに、プラットフォームは、全体的に生体適合性および生分解性材料からなるため、局所または全身性投与時に、合併症のリスクがほとんどない。ポリマー核は、感染性疾患に対する多様な治療薬を形成するために、他の治療カーゴと置換することもできる。ＰＦＴは最も一般的な毒素であるため、ナノスポンジプラットフォームは、臨床において膨大な治療示唆を有する。
【数２】
2014518200.tif 000004
【０１８４】
材料および方法
毒素ナノスポンジの調製
ナノスポンジ粒子は、以前に報告されているように合成した（２）。ＲＢＣを単離するために、６週齢の雄ＩＣＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から採取した全血を８００×ｇで５分間遠心分離した。次にＲＢＣを低張処理に供し、ＲＢＣゴーストを８００×ｇで５分間遠心分離することにより収集した。得られたゴーストは、ミニ押出機（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ）を使用して、４００ｎｍおよび１００ｎｍポリカーボネート多孔質膜を通じて連続的に押出した。ＰＬＧＡポリマー核は、溶媒置換プロセスを使用して、０．６７ｄＬ／ｇカルボキシ末端５０：５０ポリ（-ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＬＡＣＴＥＬ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を用いて同時に調製した。ＰＬＧＡをアセトニトリル中に１ｍｇ／ｍＬで溶解した。１ｍｇの粒子を形成するために、１ｍＬのＰＬＧＡ溶液を３ｍＬの水に滴下添加した。得られた混合液を外気中で２時間攪拌し、１０ｋＤａ分子量カットオフ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。最終ＲＢＣナノスポンジを、１００ｎｍポリカーボネート膜を通じて新鮮な血液（１ｍｇ  ＰＬＧＡ／１ｍＬ血液）から調製された小胞を持つＰＬＧＡナノ粒子を押し出すことにより合成した。窒素パージを使用して、必要に応じてナノ粒子を濃縮した。ＰＬＧＡポリマーの重量を、ナノスポンジに引用されるすべての後次質量値に使用する。ナノスポンジの寸法は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺＥＮ３６００を使用して、３回の反復動的光散乱から得られ、平均寸法８５ｎｍを示した。
【０１８５】
毒素ナノスポンジの透過電子顕微鏡
１００μｇのＲＢＣナノスポンジを、３μｇの黄色ブドウ球菌α毒素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間培養した。ナノ粒子溶液の滴を、４μｇ／ｍＬのナノスポンジ濃度で、グロー放電された炭素コーティングされたグリッドの上に蒸着させた。蒸着から１分後、液滴を１０滴の蒸留水で洗い流し、１％酢酸ウラニルで染色した。試料をＦＥＩ  Ｓｐｈｅｒａ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して２００ｋＶで撮像した。
【０１８６】
ＰＥＧ化ＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、およびＲＢＣ膜小胞の調製
ＰＥＧ化ナノ粒子は、ナノ沈殿法に従って調製した。つまり、１ｍｇのＰＥＧ−ＰＬＧＡジブロックコポリマーを、１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、常に攪拌しながら３ｍＬの水を含有するバイアルに添加した。次に有機溶媒をフード内で２時間蒸発させた。次にＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、分子量カットオフ１０ｋＤａでＮＰ溶液を３回洗浄した。ＰＥＧ化リポソームは、機械的押出から調製した。つまり、１ｍｇのＥｇｇ  ＰＣおよび２００μｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−カルボキシ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を１ｍＬのクロロホルムに溶解した。次に有機溶媒を蒸発させて、乾燥脂質フィルムを形成した。脂質フィルムを１ｍＬのＰＢＳで再水和し、続いて１分間渦流させ、３分間ＦＳ３０Ｄ音波器（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で音波処理した。後次に、狭く分布するリポソームを形成するために、製剤を１００ｎｍ孔寸法のポリカーボネート膜を通じて１１回押出した。ＲＢＣ膜小胞は、ナノスポンジ調製について記載される、ＲＢＣ精製および膜押出プロトコルに従って調製した。ナノ製剤の寸法は、動的光散乱を使用し、３回測定を繰り返すことにより得られ、ＰＥＧ化ＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、およびＲＢＣ膜小胞についてそれぞれ９０、１０５、および１２０ｎｍの平均寸法を示した。
【０１８７】
ＲＢＣ  ナノスポンジ競合中和アッセイ
３μｇのα毒素を、１ｍｇ／ｍＬのＲＢＣナノスポンジ、ＰＥＧ化ＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、およびＲＢＣ膜小胞を含有する２００μＬのＰＢＳ溶液で３０分間培養した。負の対照をＰＢＳ中の９μｇのα毒素で調製した。次に溶液を、１．８ｍＬの５％精製されたマウスＲＢＣでさらに３０分間培養した。培養に続いて、各試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ（登録商標）２２Ｒ遠心分離器内で１０分間、１４，０００ｒｐｍで沈降させた。上澄み中のヘモグロビンの吸収度を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マルチプレートリーダーを使用して、５４０ｎｍで分析し、ＲＢＣ溶解の程度をアッセイした。実験は三回重複した行った。
【０１８８】
ＲＢＣナノスポンジ結合研究
９μｇのα毒素を、１ｍｇ／ｍＬのＲＢＣナノスポンジ、ＰＥＧ化ＰＬＧＡナノ粒子、ＰＥＧ化リポソーム、およびＲＢＣ膜小胞を含有する２００μＬのＰＢＳ溶液で３０分間培養した。培養後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＬ−４Ｂを通じて試料を濾過し、非結合毒素を除去した。次に試料を凍結乾燥し、ＳＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製した。９μｇの純粋なα毒素を、参照として濾過された試料とともに調製した。調製した試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＭＯＰＳ泳動緩衝液中の４〜１２％ビス−トリス１０−ウェルミニゲル上で分離した。試料を２００Ｖで５０分間泳動させ、得られたポリアクリルアミドゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で一晩染色して可視化した。毒素保持を定量するために、ＩｍａｇｅＪを使用し、０．３、１、３、および９μｇの純粋なα毒素から調製された毒素標準を用いて、３４ｋＤａでの帯域強度を分析した。
【０１８９】
α毒素滴定研究
ＰＢＳ中の２００μＬの１ｍｇ／ｍＬナノスポンジを、３０、９、３．６、１．２、０．６、および０．３μｇのα毒素で３０分間培養した。対照群として、同一濃度のα毒素を含有する溶液もナノスポンジの不在下で調製した。次に試料および対照溶液を、ＰＢＳ中の１．８ｍＬの５％マウスＲＢＣで３０分間培養した。各試料は、１４，０００ｒｐｍで１０分間沈降させた。上澄み中のヘモグロビンの吸収度を５４０ｎｍで分析し、ＲＢＣ溶解の程度をアッセイした。実験を三回重複して行った。
【０１９０】
ナノスポンジ滴定研究
ＰＢＳ溶液を、２００、６０、２０、６、および２μｇの様々な量の毒素ナノスポンジを含有するように調製した。各ナノスポンジ溶液を、９μｇのα毒素と混合し、最終容量２００μＬに希釈した。３０分間の培養に続いて、溶液をＰＢＳ中の１．８ｍＬの５％マウスＲＢＣに添加し、３０分間培養した。次に溶液を１４，０００ｒｐｍで１０分間沈降させた。上澄み中のヘモグロビンの吸収を５４０ｎｍで分析して、ＲＢＣ溶解の程度をアッセイした。実験を三回重複して行った。
【０１９１】
ＲＢＣナノスポンジの細胞取り込み
細胞取り込み後のナノスポンジおよびＲＢＣ膜小胞の膜材料を調べるために、１０μｇのＤＭＰＥ−ローダミン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を、膜小胞に機械的に押出する前に、１ｍＬの全血に由来するＲＢＣゴーストに添加した。得られる染料負荷されたＲＢＣ膜小胞を使用して、ナノスポンジを調製した。蛍光ナノスポンジおよび膜小胞を、１時間、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１７３０）で、Ｈａｎｋｓ′ＢＳＳ、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、および１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および５０μｇ／ｍＬ内皮細胞成長補助剤（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を補充した１．４ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（Ｌｏｎｚａ）含む培地１９９中、３００μｇ／ｍＬの濃度で培養した。次に媒質を吸引し、細胞を新鮮な媒質中で１時間培養した。第２の培養期間に続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で定着させて、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに装填した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎデコンボリューション走査蛍光顕微鏡上で６０Ｘ油浸対物レンズを使用して、細胞を撮像した。
【０１９２】
皮下経路を通じた毒素中和
ＲＢＣナノスポンジを、α毒素を用いて、ＰＢＳ中０．６７ｍｇ／ｍＬのナノスポンジおよび１２μｇ／ｍＬα毒素の最終濃度で１５分間培養した。次に容量１５０μＬの混合物を、６週齢の雌ｎｕ／ｎｕ裸マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の側腹領域に皮下注射した。注射後３日目に、マウスを撮像した。皮膚および筋肉試料を５μｍに切断し、Ｈ＆Ｅを使用して組織像を染色した。
【０１９３】
全身経路を通じた毒素中和
濃度２０ｍｇ／ｍＬのＲＢＣナノスポンジおよび濃度６０μｇ／ｍＬのα毒素を、蒸留水中で事前に調製した。前接種研究の場合、６週齢の雄ＩＣＲマウスに尾静脈を通じて、８０ｍｇ／ｋｇ（体重当たりの用量）のナノスポンジに続いて、２分後に７５μｇ／ｋｇのα毒素注射を静脈内注射した。後接種研究の場合、最初に６週齢の雄ＩＣＲマウスに７５μｇ／ｋｇのα毒素を注射し、２分後に８０ｍｇ／ｋｇのナノスポンジを注射した。対照には、７５μｇ／ｋｇのα毒素溶液のみを注射した。各群の試料サイズは９であった。
【０１９４】
１．    Ａ．  Ｅ．  Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙ，  Ｅ．  Ｐｉｅｒｓｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．  Ｈｕｎｇ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ：  ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３，  ５４１  （Ｓｅｐ，  ２００７）．
２．    Ｄ．  Ｇ．  Ｂｅｇｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ｓｅｒａ  ｒａｉｓｅｄ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｒｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｆｒｏｍ  Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｃａｓｃａｖｅｌｌａ  ｖｅｎｏｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ａｎｄ  ｃｒｏｔｏｘｉｎ．  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４４，  １４１  （Ａｕｇ，  ２００４）．
３．    Ｚ．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｈｒａｘ  ｅｄｅｍａ  ｔｏｘｉｎ  ｂｙ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｐｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｆｏｒ  ｅｄｅｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，  １３４８７  （Ａｕｇ  １１，  ２００９）．
４．    Ｗ．  Ｗ．  Ｋｕｍ，  Ａ．  Ｗ．  Ｃｈｏｗ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｌｅｔｈａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｏｘｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｏｘｉｎ−１．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８３，  １７３９  （Ｊｕｎ  １５，  ２００１）．
５．    Ｃ．  Ｃ．  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  Ａ．  Ｒ．  Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｂａｌｚｌｉ，  Ａ．  Ｔａｎｇ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ，  ａ  ｋｅｙ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５０，  ２８４８  （Ｊｕｎ，  ２００９）．
６．    Ｄ．  Ｔ．  Ｈｕｎｇ，  Ｅ．  Ａ．  Ｓｈａｋｈｎｏｖｉｃｈ，  Ｅ．  Ｐｉｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，  ６７０  （Ｏｃｔ  ２８，  ２００５）．
７．    Ｙ．  Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈａｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ  ａ  ｔｏｘｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９，  ３３  （Ｊａｎ  ３，  ２０１２）．
８．    Ｙ．  Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  ａ  ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２，  ６６４４  （Ｍａｙ  １９，  ２０１０）．
９．    Ｒ．  Ｊ．  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５９，  ８３２  （Ｍａｙ，  ２００２）．
１０．    Ｃ．  Ｊ．  Ｒｏｓａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＭＡＣＰＦ／ＣＤＣ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０，  １７６５  （Ｓｅｐ，  ２００８）．
１１．    Ｊ．  Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ，  Ｏ．  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５，  ２８７  （Ｆｅｂ  １８，  ２００８）．
１２．    Ｍ．  Ｓｈｏｈａｍ，  Ａｎｔｉｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｇｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＭＲＳＡ．  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３，  ７７５  （Ｍａｙ，  ２０１１）．
１３．    Ｐ．  Ｏ’Ｈａｎｌｅｙ，  Ｇ．  Ｌａｌｏｎｄｅ，  Ｇ．  Ｊｉ，  Ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｉｌｉａｔｅｄ  ｄｉｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ：  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９，  １１５３  （Ｍａｒ，  １９９１）．
１４．    Ｂ．  Ｔ．  Ｅｄｅｌｓｏｎ，  Ｅ．  Ｒ．  Ｕｎａｎｕｅ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４，  ５０３  （Ｍａｙ，  ２００１）．
１５．    Ｂ．  Ｔ．  Ｅｄｅｌｓｏｎ，  Ｐ．  Ｃｏｓｓａｒｔ，  Ｅ．  Ｒ．  Ｕｎａｎｕｅ，  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３，  ４０８７  （Ｏｃｔ  １５，  １９９９）．
１６．    Ａ．  Ｎａｋｏｕｚｉ，  Ｊ．  Ｒｉｖｅｒａ，  Ｒ．  Ｆ．  Ｒｅｓｔ，  Ａ．  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，  Ｐａｓｓｉｖｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｈｒｏｌｙｓｉｎ  Ｏ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌｅｔｈａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８，  １５９  （２００８）．
１７．    Ｊ．  Ｅ．  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ  ｔｏｘｏｉｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｎｉｎｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２，  ５６８３  （Ｄｅｃ，  １９９４）．
１８．    Ｌ．  Ａ．  Ｋｉｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７４，  ５８６  （Ｊａｎ，  ２００６）．
１９．    Ｉ．  Ａｎｄｒｅｅｖａ−Ｋｏｖａｌｅｖｓｋａｙａ  Ｚｈ，  Ａ．  Ｓ．  Ｓｏｌｏｎｉｎ，  Ｅ．  Ｖ．  Ｓｉｎｅｖａ，  Ｖ．  Ｉ．  Ｔｅｒｎｏｖｓｋｙ，  Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）  ７３，  １４７３  （Ｄｅｃ，  ２００８）．
２０．    Ｇ．  Ｍａ，  Ｑ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｐｏｌｙｄｉａｃｅｔｙｌｅｎｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１，  ６１２３  （Ｊｕｌ  ５，  ２００５）．
２１．    Ｄ．  Ｐｏｒｎｐａｔｔａｎａｎａｎｇｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｏｘｉｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３３，  ４１３２  （Ｍａｒ  ２３，  ２０１１）．
２２．    Ｄ．  Ｂｒａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６，  １１４６  （Ｏｃｔ，  ２００８）．
２３．    Ｃ．  Ｍ．  Ｈｕ，  Ｌ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｓ．  Ａｒｙａｌ，  Ｃ．  Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｒ．  Ｈ．  Ｆａｎｇ，  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃａｍｏｕｆｌａｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  １０９８０  （Ｊｕｌ  ５，  ２０１１）．
２４．    Ａ．  Ｓ．  Ｋｌａｉｎｅｒ，  Ｍ．  Ａ．  Ｍａｄｏｆｆ，  Ｌ．  Ｚ．  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｌ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ：  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４５，  ７１４  （Ａｕｇ  １４，  １９６４）．
２５．    Ｊ．  Ｃｈａｌｍｅａｕ，  Ｎ．  Ｍｏｎｉｎａ，  Ｊ．  Ｓｈｉｎ，  Ｃ．  Ｖｉｅｕ，  Ｖ．  Ｎｏｉｒｅａｕｘ，  ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８０８，  ２７１  （Ｊａｎ，  ２０１１）．
２６．    Ｍ．  Ｍｏｏｒｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏｅｒｙｔｈｒｏｓｏｍｅｓ，  ａ  ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｇｈｏｓｔ  ＩＩ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６，  ２８３１  （Ｓｅｐ−Ｏｃｔ，  １９９６）．
２７．    Ｓ．  Ｖａｎｄａｎａ，  Ｍ．  Ｒａｊｅ，  Ｍ．  Ｖ．  Ｋｒｉｓｈｎａｓａｓｔｒｙ，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，  ２４８５８  （Ｏｃｔ  ３，  １９９７）．
２８．    Ａ．  Ｖａｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，  １４８３５  （Ｍａｙ  ４，  ２００１）．
２９．    Ｃ．  Ｍ．  Ｈｕ，  Ｌ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｓ．  Ａｒｙａｌ，  Ｃ．  Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｒ．  Ｈ．  Ｆａｎｇ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  １０９８０  （Ｊｕｌ  ５，  ２０１１）．
【実施例５】
【０１９５】
毒素の能動免疫付与のための細胞膜コーティングされたナノ粒子
現在、毒素ワクチン接種における主要な方法は、変性した毒素の使用による。しかしながら、この方法は、毒素の毒性を中和するには効果的でない可能性があり、毒素タンパク質の抗原性に不可欠である天然の構造を破壊し得る。毒性の低い遺伝的に設計された毒素は、毒素ワクチン接種のために投与された。しかしながら、これらの製剤は、特定の毒素種に対してオーダーメードする必要があり、製造コストが高い。
【０１９６】
安全な毒素免疫付与のための毒素中和粒子は固有であり、以前に記載されていない。既存の毒素免疫付与アプローチは、毒素の免疫原性に影響し得る熱もしくは化学物質による変性、または費用が高く煩雑であり得る、非毒性タンパク質対応物の設計のいずれかを含む。毒素の毒性を低減することと、ワクチンの抗原性を保存することとの相殺は、毒素免疫付与において重大な課題を提示した。本発明は、それらの天然の構造を破壊することなく、毒素を中和するため、既存の技術を超える主な利点を提供する。それは容易に調製され、多数の毒素種に適用可能である。
【０１９７】
細胞膜でコーティングされたナノ粒子をプラットフォームとして使用し、能動免疫付与のための対象となる抗原を送達する。膜二重層でコーティングされた粒子は、細菌毒素を吸収し、解毒することができることが示された。これらの中和された粒子結合したタンパク質は、それらの毒性を欠くが、それらの免疫原性を保持し、免疫応答を誘導するようにインビボで送達される。この方法を使用して、能動免疫付与のために毒素を不動態化し、このとき対象は、初期毒素標的に対する防御を獲得する（図２３）。この技術は、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、および肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、および化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を含むが、これらに限定されない広範な感染および疾患を治療する。サブミクロンサイズの粒子は、プラットフォームを抗原提示細胞により容易に取り込まれるようにする。
【０１９８】
黄色ブドウ球菌からのα溶血素等の孔形成毒素は、細胞膜を穿刺することにより細胞損傷を引き起こす。本明細書に記載される毒素ナノスポンジは、赤血球細胞の膜材料でコーティングされる、ポリマー核で構成される。ナノ粒子上の膜は、実際の細胞に類似する毒素と相互作用する。毒素がナノスポンジに接着すると、それらは安定した構造により固定され、したがって、さらなる損傷を及ぼすことはない（図２４）。中和された毒素は、毒素標的に対して適応できる免疫性を誘導するために、それらの天然の構造および適合を保持する。
【０１９９】
本実施例は、毒素の能動免疫付与のための細胞膜コーティングされたナノ粒子を提供する。マウスの赤血球細胞およびＰＬＧＡポリマーから調製されたナノ粒子を使用して、発明者らは、黄色ブドウ球菌のα溶血素を良好に中和し、任意の観察できる損傷を及ぼすことなく、それらをマウスに皮下的に送達した（図２５）。粒子／毒素製剤を３回播種したとき、マウスは、熱変性した毒素を播種したものと同一レベルで、毒素標的に対する血清滴定を呈した（図２６）。したがって、発明者らは、粒子／毒素で免疫付与されたマウスの血清は、α溶血素の溶血活性を阻害し得ることを実証した（図２７）。１０匹のマウス群に致死量の毒素を静脈内注射した毒素惹起において、粒子／毒素で免疫付与したマウスは、１００％の生存率を示したが、６時間のマークを越えて生存した非免疫付与マウスはなかった（図２８）。
【０２００】
孔形成毒素は、ブドウ球菌感染、肺炎、炭疽菌、ガス壊疽、および連鎖球菌性咽頭炎を含むが、これらに限定されない多くの主要な感染疾患における重要な毒性要素である。本発明は、これらの感染を治療または予防するための毒素ワクチン接種として使用され得る。
【０２０１】
参考文献：
免疫付与のための変性毒素
１．    Ｅａｔｏｎ  Ｍ．，  “Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ．”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  １９３７  （３３）：  ４１９−４３６．
２．    Ｇｏｓｈｉ  Ｋ，  Ｃｌｕｆｆ  Ｌ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．  “Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  １９６１，  １１３（２）：  ２５９−２７０．
免疫付与のための不動態化毒素の設計
１．    Ｈｅｖｅｋｅｒ  Ｎ，  Ｋｉｅｓｓｉｇ  ＳＴ，  Ｇｌａｓｅｒ  Ｒ，  Ｈｕｎｇｅｒｅｒ  ＫＤ，  Ｖｏｎ  Ｂａｅｈｒ  Ｒ．，  “Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２００９，  ７７（７）：２７１２−２７１８．
２．    Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  Ｂ，  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  Ｏ．，  “Ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２００８，  ２０５（２）：  ２８７−２９４．
【０２０２】
上記の詳細な説明は、本発明を実践する際に当業者を支援するために提供される。しかしながら、本明細書で説明および請求される発明は、これらの実施形態が発明のいくつかの態様の例示として意図されるため、本明細書で開示される特定の実施形態によって範囲を制限されない。任意の相当する実施形態は、本発明の範囲内であることが意図される。実際に、本明細書で図示および説明されるものに加えて、本発明の様々な修正は、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない前述の説明から当業者に明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の請求書の範囲内に含まれるものとする。
【０２０３】
本出願において引用されるすべての出版物、特許、特許出願、および他の参考文献は、各個別の出版物、特許、特許出願、または他の参考文献が、あらゆる目的で参照することによりその全体が組み込まれることが示されるのと同程度で、特異的かつ個別に、あらゆる目的で参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の引用は、それが本発明の先行技術であるということを認めるものと見なされてはならない。
【表１−１】
2014518200.tif 000005
【表１−２】
2014518200.tif 000006
【表１−３】
2014518200.tif 000007
【表１−４】
2014518200.tif 000008
【表１−５】
2014518200.tif 000009
【表１−６】
2014518200.tif 000010
【表１−７】
2014518200.tif 000011
【表１−８】
2014518200.tif 000012
【表１−９】
2014518200.tif 000013
【表１−１０】
2014518200.tif 000014
【表１−１１】
2014518200.tif 000015
【表１−１２】
2014518200.tif 000016
【表２−１】
2014518200.tif 000017
【表２−２】
2014518200.tif 000018
【表２−３】
2014518200.tif 000019
【表２−４】
2014518200.tif 000020
【表３】
2014518200.tif 000021
【表４】
2014518200.tif 000022
【表５−１】
2014518200.tif 000023
【表５−２】
2014518200.tif 000024
【表６−１】
2014518200.tif 000025
【表６−２】
2014518200.tif 000026
【表６−３】
2014518200.tif 000027
【表７】
2014518200.tif 000028
【表８】
2014518200.tif 000029
【表９】
2014518200.tif 000030
【図１】
2014518200.tif 000031
【図２】
2014518200.tif 000032
【図３】
2014518200.tif 000033
【図４】
2014518200.tif 000034
【図５】
2014518200.tif 000035
【図６】
2014518200.tif 000036
【図７】
2014518200.tif 000037
【図８】
2014518200.tif 000038
【図９】
2014518200.tif 000039
【図１０】
2014518200.tif 000040
【図１１】
2014518200.tif 000041
【図１２】
2014518200.tif 000042
【図１３】
2014518200.tif 000043
【図１４】
2014518200.tif 000044
【図１５】
2014518200.tif 000045
【図１６】
2014518200.tif 000046
【図１７】
2014518200.tif 000047
【図１８】
2014518200.tif 000048
【図１９】
2014518200.tif 000049
【図２０】
2014518200.tif 000050
【図２１】
2014518200.tif 000051
【図２２】
2014518200.tif 000052
【図２３】
2014518200.tif 000053
【図２４】
2014518200.tif 000054
【図２５】
2014518200.tif 000055
【図２６】
2014518200.tif 000056
【図２７】
2014518200.tif 000057
【図２８】
2014518200.tif 000058
【国際調査報告】
2014518200.tif 000059
2014518200.tif 000060
2014518200.tif 000061