(57)【要約】  本発明は、細菌感染の治療に使用するための式（１）の化合物（Ｅ，Ｚ）−アホエンに関する。本発明の別の態様は、式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンと、少なくとも１つの抗生物質とを含む組成物である。本発明のさらに別の態様は、内部−Ｃ＝Ｃ−結合の配座がＥまたはＺ、またはこれらの混合物である式（１）の（Ｅ，Ｚ）アホエンを製造する方法に関し、この方法は、溶媒存在下、式（３）のアリシンと酸とを反応させ、上に定義したような式（１）の（Ｅ，Ｚ  アホエン）を与えることを含む。本発明のさらに別の態様は、上に記載した方法によって得ることができる式１の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。
2014508719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌感染の治療に使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【化１】
2014508719.tif 000012
【請求項２】
前記細菌感染が、バイオフィルムを生成する細菌を含む感染である請求項１に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項３】
前記バイオフィルムを生成する細菌が、Ｎ−アシル−ホモセリンラクトンを産生する細菌である請求項２に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項４】
前記細菌が、ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・ステワティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・リクファシエン（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、及びエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からなる群から選択され、特に、シュードモナス・アエルギノーザである請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項５】
前記細菌感染が肺でのものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項６】
前記細菌感染が慢性創傷でのものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項７】
前記細菌感染が、免疫不全を患う哺乳動物でのものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項８】
前記免疫不全が、免疫低下疾患によるものであるか、または免疫抑制薬を用いた治療によるものである請求項７に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項９】
前記哺乳動物が、ヒト、ペットおよび家畜からなる群から選択される請求項７〜８のいずれかに記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項１０】
前記細菌感染が、嚢胞性線維症を患う哺乳動物でのものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項１１】
式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエン
【化２】
2014508719.tif 000013
と、少なくとも１つの抗生物質とを含む組成物。
【請求項１２】
前記抗生物質が、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、及びテトラサイクリンからなる群から選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗生物質が、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリンインダニル、メズロシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン−スルバクタム、ベンジルペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリンタゾバクタム、チカルシリンクラブラン酸、ナフシリン、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフメタゾール、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフチブテン、セフォペラゾン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフタジジム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、トロレアンドマイシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レポフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、オキソリン酸、ゲミフロキサシン、ペルフロキサシン、イミペネム−シラスタチン、メロペネム、アズトレオナム、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、マフェニド、スルファジアジン銀、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、スルファメチゾール、リファンピン、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、リネゾリド、キヌプリスチン  ダルホプリスチン、バシトラシン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、イソニアジド、メテナミン、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、ノボビオシン、ポリミキシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、コリスチン、サイクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、ピラジンアミド、パラ−アミノサリチル酸、及びエリスロマイシンエチルコハク酸からなる群から選択され、特に、トブラマイシンである請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
細菌感染の治療に使用するための請求項１１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記細菌がＮ−アシル−ホモセリンラクトンを産生する細菌である請求項１４に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１６】
前記細菌が、ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・ステワティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・リクファシエン（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、及びエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からなる群から選択され、特に、シュードモナス・アエルギノーザである請求項１４〜１５のいずれかに記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１７】
前記細菌感染が肺でのものである請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１８】
前記細菌感染が慢性創傷でのものである請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１９】
式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンを製造する方法であって、
【化３】
2014508719.tif 000014
内部−Ｃ＝Ｃ−の配座は、ＥもしくはＺ、またはこれらの混合物であってもよく、この方法は、溶媒存在下、式（３）のアリシン
【化４】
2014508719.tif 000015
と、酸とを反応させ、上に定義したような式（１）の（Ｅ，Ｚ−アホエン）を提供することを含む方法。
【請求項２０】
式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンの純度が、９５〜９９．５％、例えば、９７〜９９．５％、９８〜９９．５％、９９〜９９．５％、例えば、約９９．５％である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
式（３）のアリシンが、式（２）のジアリルジスルフィド
【化５】
2014508719.tif 000016
と、ＤＭＤＯ、ＭＣＰＢＡ、過酢酸、過マンガン酸カリウム、酸化マグネシウムおよびＳｗｅｒｎ酸化剤からなる群から選択される酸化剤とを反応させることによって提供される請求項１９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
酸化剤がＤＭＤＯである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アリシン（３）を、その後に行う酸処理の前に精製する請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
添加する酸は、カルボン酸、カルボン酸無水物またはスルホン酸である請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２４に記載の方法によって得ることができる（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項２６】
式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンが、請求項１９〜２４によって与えられる方法によって得られる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項２７】
式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンが、請求項１９〜２４によって与えられる方法によって得られる請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、直接的な医薬用途を示す最終生成物の化学プロセスに関する。アホエンとして知られるこの化学プロセスの生成物は、重要なクオラムセンシングによって制御される病原因子の発現を止めることによって、バイオフィルムを生成する細菌を含む細菌感染の治療に非常に有用であることがわかっている。さらに、本発明は、抗生物質と合わせて相乗的な抗菌効果を示す、上の化学プロセスによって得ることができる生成物にも関する。特に、本発明は、ジアリルジスルフィドをアリシンへと酸化し、次いで、酸で処理し、アホエンのＥ，Ｚ異性体を所与の比率で得ることによる、アホエン誘導体の合成に関する。アホエンを酸化し、酸化変形物を与えてもよい。本発明のさらなる態様は、アホエン誘導体と抗生物質との組成物、およびバイオフィルムを生成する細菌を含む細菌感染を治療するためのアホエン誘導体の使用を含む。
【０００２】
（背景技術）
細菌感染は、世界中で大きくなりつつある問題である。従来の抗生物質の広範囲な使用は、十分に有効な抗生物質の量が減っていくにつれ、ますます耐性細菌株の発生を引き起こした。
【０００３】
その結果、細菌感染が関与する機構をもっと深く理解することに関する研究が増えつつある。したがって、多種多様な細菌が、小さな拡散性シグナルが介在する細胞間の情報伝達を介し、連携して挙動していることがわかっている。この現象は、クオラムセンシング（ＱＳ）と呼ばれており［Ｗ．Ｃ．Ｆｕｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９４，１７６，ｐ２６９−２７５］、バイオフィルムと呼ばれる複雑な表面接続性の共同体を形成する細菌の間に多くみられる。持続性細菌感染の８０％がバイオフィルムを伴っているとアメリカ国立衛生研究所によって概算されている。ＱＳによって、細菌は数を保つことができ、十分な細菌が宿主の防御機能を圧倒するほどに蓄積するまで病原因子の産生を遅らせることによって、宿主の応答を最低限にする機構を与えていると考えられる。ＱＳを（完全または部分的に）止めることで、宿主の防御システムの適切な作用を回復し、その後で、侵入する細菌を排除する。したがって、ＱＳの阻害は、従来の抗生物質が介在する細菌の死または成長阻害の代わりとなる治療手法を提示する。
【０００４】
ニンニク抽出物がＱＳを止め、緑膿菌（シュードモナス・アエルギノーザ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌株によって引き起こされる肺感染の迅速な清浄化を促進することが示されている［Ｔ．Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．３８７３−３８８０］。緑膿菌は、バイオフィルム共同体を形成し、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）およびキノロン（ＰＱＳ）のような単一分子の産生を介してＱＳを利用する。ニンニク抽出物は、十分によく知られた天然の医療用産物でもあり、特に、抗菌効果およびコレステロール低下効果を有する。
【０００５】
アホエン［（Ｅ，Ｚ）−４，５，９−トリチアドデカ−１，６，１１−トリエン−９−オキシド］は、アリシンおよび他の有機硫黄誘導体とともに、抗菌性ニンニク抽出物の活性成分であることがすでに示されている。しかし、アホエン（Ｅ：Ｚ＝１：４異性体を使用）での研究において、アホエンは、グラム陽性菌の強い成長阻害剤であり、グラム陰性菌に対してさまざまな阻害効果を有するが、緑膿菌に対し、測定できる成長阻害効果を示さないことが示されている［Ｒ．Ｎａｇａｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６２，１９９６，ｐ．４２３８−４２４２］。
【０００６】
アホエン誘導体を製造する現行プロセスは、ニンニク抽出物からのアホエン誘導体またはアホエン前駆体の単離および種々の合成手法を含む。ニンニクからの単離は、原料のニンニク１ｋｇあたり利用可能なアホエンの量がわずかである（すなわち、１０ｍｇの範囲である）ため、非常に時間がかかり、非効率であり、ニンニク中の関連する化学物質からＨＰＬＣによって分離することが必要である。従来技術で、アホエンおよび種々の誘導体へのいくつかの合成手法および半合成手法が開示されている。Ｅｒｉｃ  Ｂｌｏｃｋおよび共同研究者らは、ジアリルジスルフィドまたは誘導体の酸化から始まり、次いで、得られた未精製アリシンまたは誘導体を加熱してアホエンおよび誘導体を生成する合成手法を開示している［ＥＰ１８５３２４およびＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，１０８，ｐ．７０４５−７０５５］。Ａｐｉｔｚ−Ｃａｓｔｒｏおよび共同研究者らは、ニンニクの球根からアリシン（アリル  ２−プロペンチオスルフィナート）を単離し、次いで、これを加熱し、低級アルキルアルコールで処理して（Ｅ，Ｚ）−アホエン誘導体を製造する半合成手法を提示した［ＵＳ４，６６５，０８８］。近年、アセトン中の酢酸を用い、抽出したアリシンをアホエンに変換する方法も報告されているが、未精製の不純な出発材料（すなわち、ニンニクから抽出した未精製アリシン）が使用されていた［ＷＯ２０１０／１００４８６］。しかし、上の方法の収率は悪いことが多く、または、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製が必要であり、必然的に精製コストが高くなり、アホエンの収率は低くなる。さらに、これらの合成手法は、高収率を維持しながらこの反応の（Ｅ，Ｚ）−異性体の結果を制御できないことが多い。
【０００７】
それゆえに、アホエン誘導体を製造するための代わりとなる改良法があれば、好都合であろう。
【０００８】
驚くべきことに、今回、反応条件中に特定の変形物を介して最終生成物の（Ｅ，Ｚ）異性体比を変えることができるとともに、アホエン誘導体を以前得られたよりも高収率、良好な不純物純度で合成可能であることがわかった。また、驚くべきことに、上の合成プロセスで得られ、１回のクロマトグラフィー精製工程を適用したものを含むアホエン誘導体および／または異性体の特定の混合物が、単独で適用した場合、および従来の抗生物質を含む組成物として適用した場合の両方において、バイオフィルムを生成する細菌の有効なＱＳ阻害剤であることがわかった。
【０００９】
（発明の概要）
したがって、本発明の目的は、ＱＳ阻害を用いた細菌感染の治療に適用可能なアホエン誘導体または特定のこれらの混合物を有効に製造するための合成手順を提供することに関する。
【００１０】
特に、本発明の目的は、生成物の収率が低く、時間がかかり、精製手順が高価であるという従来技術について上に述べた問題を解決し、制御可能なＥ：Ｚ比で（Ｅ，Ｚ）−アホエン［（Ｅ，Ｚ）−４，５，９−トリチアドデカ−１，６，１１−トリエン−９−オキシド］を製造するプロセスを提供することである。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、細菌感染の治療に使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。
【００１２】
本発明の別の態様は、式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンと、少なくとも１つの抗生物質とを含む組成物である。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエン
【００１４】
【化１】
2014508719.tif 000003
【００１５】
を製造する方法に関し、式中、内部の−Ｃ＝Ｃ−結合の配座は、ＥまたはＺまたはこれらの混合物であってもよく、この方法は、溶媒存在下、式（３）のアリシン
【００１６】
【化２】
2014508719.tif 000004
【００１７】
と、酸とを反応させ、上に定義したような式（１）の（Ｅ，Ｚ  アホエン）を提供することを含む。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、上に記載した方法によって得ることができる式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】異性体のＥ：Ｚ比の制御を含め、（Ｅ，Ｚ）−アホエン誘導体への合成経路を示す例示的なスキームを示す。反応条件は、ｉ）ジメチルジオキシラン（ＤＭＤＯ）、アセトン、−５０℃〜−２０℃、３０分、収率９６％；ｉｉ）Ａ）２０％ＡｃＯＨ、４０％アセトン水溶液、６４℃、４ｈ、収率３６％（Ｚ：Ｅ−４：１）またはＢ）２０％ＡｃＯＨ、４０％トルエン、４０℃、４８ｈ、収率３２％（Ｚ：Ｅ−１：１０）のいずれかであった。
【図２】さらに酸化されたアホエン誘導体への合成経路を示す例示的なスキームを示す。反応条件は、以下のとおりであった。ｉｉｉ）ジクロロメタン中、４当量の過酢酸、０℃〜室温で１２ｈ、収率３８％、またはアセトン中、４当量のＤＭＤＯ、−１０℃で６ｈ、収率８２％。ｉｖ）アセトン中、過マンガン酸カリウム、−２０℃で２ｈ、収率９６％。ｖ）アセトン中、２当量のＤＭＤＯ、−１０℃で６ｈによって、収率７８％を得た。ｖｉ）ＴＨＦ中、リチオ化スルフィド（ＰｈＳＬｉ）、−７８℃〜０℃で１ｈによって収率８６％を得た。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲで測定した場合（濃い灰色の棒）およびＤＮＡマイクロアレイで測定した場合（淡い灰色の棒）のｒｈｌＡおよびｌａｓＢの遺伝子発現における倍率変化（マイナスは、ダウンレギュレーションを示す）の比較結果を示す。データは、３回の個々の実験平均をあらわす。星印（＊）は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定でのＰ＜０．０５を示す。エラーバーは、平均±ＳＤである。
【図４】未処理（「無添加」）およびアホエンで処理したプランクトンで成長した緑膿菌の合計ラムノ脂質濃度を示す。アホエンを１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍ追加した培地中、培養物を成長させた（４０μｇ／ｍｌおよび８０μｇ／ｍｌで、ラムノ脂質の含有量は、ＯＤ＝１．５での検出レベル以下である）。サンプルをＯＤ６００＝１．５（濃い灰色の棒）、ＯＤ６００＝２．０（淡い灰色の棒）で回収した。データは、３回の個々の実験平均をあらわす。エラーバーは、平均±ＳＤである。
【図５】４日目に、３７℃で１８０分間ＰＭＮにさらし、次いで、ＤＮＡ染色ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した、緑膿菌のバイオフィルムを蛍光および光学顕微鏡で観察した結果を合わせたものを示す。Ａ）培地中、アホエンを含まずにバイオフィルムを成長させる。Ｂ）培地中、１００μｇ／ｍＬのアホエン存在下、バイオフィルムを成長させる。赤色蛍光は、壊死ＰＭＮがＤＮＡ内容物から漏れ出していることを示す（ＰＩで染色した場合）。緑色蛍光は、緑膿菌のバイオフィルムの上面領域を示す。
【図６】４日目に１０μｇ／ｍｌのトブラマイシンで処理してから２４時間後の緑膿菌ＰＡＯ１のバイオフィルム（淡い灰色）（Ａ）、臨床的な緑膿菌単離物ＣＦ４３８のバイオフィルム（淡い灰色、ｓｙｔｏ９で染色）（Ｂ）を示す。死んだ細胞は、ＤＮＡ染色ＰＩで染色される（濃い灰色／黒色）。バイオフィルムをＣＳＬＭで視覚化した。Ｃ）アホエンおよびトブラマイシンで処理したインプラントモデル。
【図７】肺感染マウスモデルを用い、アホエン治療と未治療（プラセボ）の３つの別個の実験を合わせた結果を示す。感染から１日後または３日後にマウスを殺し、肺の中の細菌含有量を決定した。白い四角は、それぞれの個々のマウスについて、肺あたりの細菌の肺含有量を示す。中央値は、黒い四角で示されている。クリアランスの統計的に有意な差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定（ノンパラメトリックデータの分析）によって検定し、０日目および３日目での差のｐ値は、それぞれ０．９および０．００２であった。
【図８】肺感染マウスモデルを用いた、ＨＰＬＣで精製したアホエンで治療した実験結果（上のグラフ、アホエンの純度＞９９．５％）およびＨＰＬＣで精製していないアホエンで治療した実験結果（下のグラフ、純度９５〜９９．５％）と、未治療（プラセボ）の実験結果を示す。感染から３日後にマウスを殺し、肺の中の細菌含有量を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下にさらに詳細に本発明を記載する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明をさらに詳細に記載する前に、まず、以下の用語および規則を定義する。
【００２２】
本発明の観点で、（Ｅ，Ｚ）−アホエン誘導体またはアホエン誘導体の（Ｅ，Ｚ）−異性体という用語は、実質的に純粋なＥ−アホエン誘導体、実質的に純粋なＺ−アホエン誘導体、またはＥ−アホエン誘導体とＺ−アホエン誘導体の混合物のいずれかとして単離されるアホエン誘導体を指す。（Ｅ，Ｚ）という記号は、配座がさまざまであってもよい場所を構造中に波線によって示しているようなアホエンの内部−Ｃ＝Ｃ−二重結合を指す。「誘導体」という用語は、２種類の異性体（Ｅ）および（Ｚ）、およびこれらの混合物の両方を指し、さらに、（Ｅ，Ｚ）アホエンおよびこれらの混合物の酸化誘導体および／または還元誘導体も指す。
【００２３】
酸化剤は、本明細書で定義されるように、元々の酸化状態から高酸化状態へと分子の酸化状態を変えることができる任意の化学反応剤である。同様に、還元剤は、元々の酸化状態から低酸化状態へと分子の酸化状態を変えることができる任意の化学反応剤である。
【００２４】
本発明の観点で、酸は、無機酸および有機酸の両方を含む。酸は、有機酸無水物または任意の他のプロ酸（ｐｒｏ−ａｃｉｄ）を含む。本明細書で定義されるように、プロ酸は、特定の条件下で酸へと変換することができる任意の化合物である。このような条件は、加熱することまたは水性環境にさらすことを含んでいてもよい。任意の酸混合物も想定される。
【００２５】
本明細書に記載するように、バイオフィルムは、バイオポリマーマトリックスに包まれ、例えば、プランクトン対応物と比較したときに抗生物質および自然免疫系の重要な対への耐性の上昇を示す、任意の凝集した、多くは、必須ではないが表面に結合した（固着性の）細菌共同体を指す。
【００２６】
本発明の観点で、クオラムセンシング（ＱＳ）という用語は、低分子量の拡散性シグナル分子によって送られる細胞間の情報伝達によって、細菌の挙動を協調させる機構を指す。ＱＳ系は、初期の感染事象の間、重要な役割をはたす。印象的な量の病原因子の発現を制御するために、その多くが抗原性の決定因子である３つのＱＳ系（Ｌａｓ、Ｒｈｌ、ＰＱＳで示した）を利用することによって、緑膿菌のような特定の細菌は、ＱＳ系が活性化され、病原性および免疫保護が作動する特定の細胞密度に達するまで、潜伏した様式で働くことができる。ＱＳ系が活性化したら、組織を損傷し、免疫による防御を弱らせる病原因子が協働しつつ放出が起こる。
【００２７】
また、この内容で、Ｎ−アシル−ホモセリンラクトンを産生する細菌は、クオラムセンシング中、細胞間の情報伝達にＮ−アシル−ホモセリンラクトンをメッセンジャー分子として利用する細菌であると定義される。
【００２８】
本明細書に定義されるように、クオラムセンシング阻害剤またはＱＳ−阻害剤は、細菌のＱＳに基づく情報伝達を阻害することができる物質または物質の混合物である。調節遺伝子の変異またはＱＳ阻害剤によるＱＳプロセスの停止によって、細菌は、従来の抗生物質、特に、アミノグリコシド（例えば、トブラマイシン）および細胞の宿主防御に重要な成分、例えば、ＰＭＮ−白血球（多形核球−白血球）の両方に攻撃されやすくなる。
【００２９】
上述のように、本発明の第１の態様は、一般式（１）の化合物
【００３０】
【化３】
2014508719.tif 000005
【００３１】
を製造する方法を提供し、この化合物は、（Ｅ，Ｚ）−アホエンとも呼ばれる。内部−Ｃ＝Ｃ−結合の配座は、ＥまたはＺ、またはこれらの混合物であってもよい。この方法は、アリシンとも呼ばれる式（３）の中間体化合物
【００３２】
【化４】
2014508719.tif 000006
【００３３】
を提供することと、溶媒存在下、式（３）の化合物を酸で処理し、上に定義したような式（１）の化合物を提供することとを含む。好ましい実施形態では、化合物（３）を含有する溶液の濃度は、０．０６〜６．０Ｍ、好ましくは、０．１２〜３．０Ｍ、０．２４〜１．５Ｍ、０．４８〜０．８Ｍ、例えば、０．６Ｍであってもよい。酸を過剰量または化学量論量で加えてもよいが、典型的には、５〜５０ｍｏｌ％、１０〜４０ｍｏｌ％、１５〜３０ｍｏｌ％、例えば、２０ｍｏｌ％のような触媒量で加えてもよい。好ましい実施形態では、中間体（３）から式（１）の化合物への変換のときに加えられる酸は、カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）、メタンスルホン酸（ＭｓＯＨ）、ショウノウスルホン酸（ＣＳＡ）のような多くの酸であってもよい。好ましい酸は酢酸である。酸の選択は、得られるＥ：Ｚ異性体の比率に影響を及ぼす。すなわち、使用される酸と、これに対応して得られるＥ：Ｚ比は、例えば、４０Ｖ／Ｖ％のアセトン水溶液を溶媒として用いるとき、トリフルオロ酢酸（Ｅ：Ｚ＝約１：１）、ｐ−トルエンスルホン酸（Ｅ：Ｚ＝約１：４）、メタンスルホン酸（Ｅ：Ｚ＝約１：４）、ショウノウスルホン酸（Ｅ：Ｚ＝約１：５）であってもよい。
【００３４】
式（１）の化合物を与える酸処理の好ましい実施形態では、使用する溶媒は、１０〜７０Ｖ／Ｖ％アセトン水溶液、好ましくは、２０〜６０Ｖ／Ｖ％、３０〜５０Ｖ／Ｖ％、例えば、４０Ｖ／Ｖ％アセトン水溶液（すなわち、４０％の水中、６０％のアセトン）である。酸を加えた後、０〜１００℃、好ましくは、２０〜８０℃、例えば、４０〜７０℃、好ましくは、５０〜６５℃の範囲、例えば、６４℃に反応温度を調節してもよい。反応時間は、１〜２４ｈ、好ましくは、２〜１０ｈ、例えば、３〜５ｈ、好ましくは、４ｈであってもよい。溶媒としてアセトン水溶液を使用すると、酸処理中に酢酸を用いるとき、Ｅ：Ｚ比が１：２〜１：６、好ましくは、１：３〜１：５、例えば、約１：４の式（１）の化合物が得られる。
【００３５】
式（１）の化合物を与える上述の方法のさらに別の好ましい実施形態では、中間体（３）の酸処理中に使用する溶媒は、トルエンまたはベンゼン水溶液である。ベンゼン水溶液は、１〜５０Ｖ／Ｖ％ベンゼン水溶液、好ましくは、５〜３０Ｖ／Ｖ％、例えば、７〜２０Ｖ／Ｖ％、好ましくは、１０Ｖ／Ｖ％のベンゼン水溶液（すなわち、１０％の水中、９０％のベンゼン）であってもよい。酸を加えた後、０〜１００℃、好ましくは、１０〜８０℃、例えば、２０〜６０℃、好ましくは、３０〜５０℃の範囲、例えば、４０℃に反応温度を調節してもよい。トルエンまたはベンゼン水溶液中の酸処理にかかる反応時間は、２〜９６ｈ、好ましくは、２４〜７２ｈ、例えば、３６〜６０ｈの範囲、好ましくは、４８ｈであってもよい。溶媒としてトルエンまたはベンゼン水溶液を使用すると、酸処理中に酢酸を用いるとき、Ｅ：Ｚ比が６：１〜２０：１、例えば、約１０：１の式（１）の化合物が得られる。
【００３６】
得られた生成物の精製は、典型的には、標準的な溶媒抽出技術を用いた後、カラムクロマトグラフィーによる精製を用いて行われてもよいが、蒸溜、分取薄層クロマトグラフィーまたは固体化合物の場合には結晶化のような他の方法を使用してもよい。
【００３７】
化合物（１）の精製の好ましい実施形態では、反応混合物を室温まで冷却し、３倍容積の水とエタノールの１：１混合物で希釈した後、ペンタンのような非極性溶媒で抽出する。水性画分を硫酸アンモニウムを用いて飽和状態にし、ペンタンよりも極性の溶媒（例えば、ジクロロメタン）でさらに抽出してもよい。合わせた有機抽出物を濃縮し、未精製生成物を、４０〜９９Ｖ／Ｖ％のペンタン中の酢酸エチル、好ましくは、５０〜９０Ｖ／Ｖ％、６０〜８０Ｖ／Ｖ％、例えば、７０Ｖ／Ｖ％を含む溶出移動相を用いたシリカカラムクロマトグラフィーにかけることによって、（Ｅ，Ｚ）−アホエン（１）を単離することができる。
【００３８】
上の手順の後の（Ｅ，Ｚ）−アホエンの純度は、９５〜９９．５％、例えば、９７〜９９．５％、９８〜９９．５％、９９〜９９．５％、例えば、約９９．５％であってもよい。驚くべきことに、本願発明者らは、カラムクロマトグラフィーの後で得られた生成物をさらに精製する（例えば、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーまたは他の精製工程を用いる）と、（Ｅ，Ｚ）−アホエン生成物は、例えば、実施例に記載するようなアッセイで、生体活性をすべて、または部分的に失うことがわかった。純粋な（Ｅ）−アホエンおよび／または純粋な（Ｚ）−アホエンを例えばＨＰＬＣを用いて単離するときも、同じことがわかった。少量の、例えば、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、例えば、０．５％未満のアホエンから誘導される化学物質（すなわち、アホエンに関連する化合物）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またもっと重要であるがｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、分解（例えば、酸化、還元および／または開裂）に対する（Ｅ，Ｚ）−アホエンおよび誘導体の安定化にとって非常に重要であると推察される。
【００３９】
本発明の一実施形態は、式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンについて、２回以上のクロマトグラフィー精製工程を行わずに、また、このクロマトグラフィー精製工程が逆相ＨＰＬＣを含まない、上述の方法である。
【００４０】
精製した後、（Ｅ，Ｚ）−アホエン誘導体を異性体混合物として、化合物（３）を基準として少なくとも１０ｍｏｌ％、好ましくは、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％、例えば、少なくとも３０ｍｏｌ％の収率で単離することができる。
【００４１】
一実施形態では、ジアリルジスルフィド（ＤＡＤＳ）とも呼ばれる式（２）の化合物
【００４２】
【化５】
2014508719.tif 000007
【００４３】
を酸化剤で処理することによって式（３）のアリシンを製造してもよい。この方法の有用な実施形態では、式（２）の化合物を酸化して式（３）の化合物にするのに用いられる酸化剤は、ＤＭＤＯ、ＭＣＰＢＡ、過酢酸、過マンガン酸カリウム、酸化マグネシウムおよびＳｗｅｒｎ酸化剤、例えば、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および有機塩基（例えば、トリエチルアミン）からなる群から選択されてもよく、ＤＭＤＯは、最も高い収率が得られるため、好ましい酸化剤である。酸化剤を、化合物（２）に対して触媒量または化学量論量で加えてもよいが、好ましくは、１．０１〜１０．０ｍｏｌ当量、好ましくは、１．０５〜５．０ｍｏｌ当量、例えば、１．０７〜２．０ｍｏｌ当量、好ましくは、１．１０ｍｏｌ当量の過剰量で加えてもよい。有利には、酸化剤溶液に対し、低温で数分間かけて式（２）の化合物を加えてもよい。溶液中の酸化物の濃度は、０．００１〜１．０Ｍ、好ましくは、０．００５〜０．５Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、例えば、０．０７Ｍであってもよい。溶液は、低温で流体のままであり得る溶媒であってもよく、例えば、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチルまたはテトラヒドロフランであってもよい。化合物（２）を加えている間の溶液の温度は、−１００℃〜１０℃、好ましくは、−８０℃〜−１０℃、−６０℃〜−４０℃、例えば、−５０℃であってもよい。化合物（２）を１〜１２０分、好ましくは、５〜９０分、７〜６０分、１０〜３０分、１２〜２０分、例えば、１５分かけて加えてもよい。この溶液に化合物（２）を加えた後、有利には、１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃、例えば、３０℃まで１０〜１２０分、好ましくは、１５〜９０分、２０〜６０分、２５〜４０分、例えば、３０分かけてゆっくりと加温してもよい。溶媒の蒸発を経た濃度は、未精製形態で中間体化合物（３）を少なくとも８０ｍｏｌ％、好ましくは、少なくとも８５ｍｏｌ％、少なくとも９０ｍｏｌ％、例えば、少なくとも９５ｍｏｌ％の純度で与える。
【００４４】
未精製アリシン（３）をさらに精製することなく使用してもよく、その場合でも、以下の工程で良好な収率を与える。このことは、酸化手順に、酸化と、その後の貯蔵の間のアリシンの分解に寄与すると思われる酸が存在しないためであると考えられる。しかし、好ましい実施形態では、有利には、その後に行われる酸処理の前に実質的にアリシン（３）を単離するために、アリシン（３）を精製してもよい。このことから、後の酸処理工程でもきれいな反応を与え、収率が高くなり、式（１）の化合物を与えることがわかった。任意の従来からある精製方法、好ましくは、シリカカラムクロマトグラフィーを用い、精製を行うことができる。ペンタン中のジエチルエーテル、好ましくは、ペンタン中、０．５〜２０Ｖ／Ｖ％のジエチルエーテル、例えば、１〜１０Ｖ／Ｖ％、２〜８Ｖ／Ｖ％、３〜７Ｖ／Ｖ％、４〜６Ｖ／Ｖ％、好ましくは、５Ｖ／Ｖ％の混合物からなる移動相溶出液を用い、クロマトグラフィーを行うことができる。それによって、式（３）の化合物が、化合物（２）を基準として、少なくとも８０ｍｏｌ％、好ましくは、少なくとも８５ｍｏｌ％、少なくとも９０ｍｏｌ％、例えば、少なくとも９５ｍｏｌ％の収率で得られる。
【００４５】
本発明の第２の態様では、式（４）の化合物を製造するプロセスが提供され、
【００４６】
【化６】
2014508719.tif 000008
【００４７】
式中、Ｙは、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）または−Ｓ（Ｏ２）−から選択され、Ｒは、アリル、フェニル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ベンジル、ｐ−トルオイル、ｍ−トルオイル、ｏ−トルオイルから選択され、内部の−Ｃ＝Ｃ−結合の配座は、ＥまたはＺ、またはこれらの混合物のいずれかであってもよい。このプロセスは、式（１）の化合物を製造した後、式（１）の（Ｅ，Ｚ）アホエンと少なくとも１つのさらなる酸化試薬とを反応させることを含むさらなる反応工程によって、式（４）の化合物（Ｒはアリルである）を得て、場合により、式（４）の化合物とＲ置換されたリチオ化スルフィド（Ｒ−ＳＬｉ）とを反応させ、式（４）の化合物（Ｒは、フェニル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ベンジル、ｐ−トルオイル、ｍ−トルオイルまたはｏ−トルオイルである）を得る、上に定義するような方法を含む。
【００４８】
上に定義した方法の一実施形態では、式（１）の化合物を酸化して式（４）の化合物にするために使用される第２の酸化剤は、ＤＭＤＯ、ＭＣＰＢＡ、過酢酸、過マンガン酸カリウム、過酸化水素、Ｂｉｓ  ＴＭＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ、または任意の穏和な過酸化物からなる群から選択されてもよい。Ｒ置換されたリチオ化スルフィドとの反応は、テトラヒドロフラン溶媒中、−７８℃〜０℃までの温度で行われてもよい。反応時間は、３０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜２時間であってもよい。
【００４９】
式（４）の化合物の精製は、上述の式（１）の化合物の精製と同様の様式で行ってもよい。
【００５０】
得られた一般式（４）の化合物を（Ｅ，Ｚ）−異性体の混合物として単離してもよく、またはこれらの異性体を分離して、実質的に純粋な（Ｅ）−異性体または実質的に純粋な（Ｚ）−異性体を得てもよい。また、異なる酸化状態Ｙを有する式（４）の化合物（すなわち、Ｙは、−Ｓ−、Ｓ（Ｏ）または−Ｓ（Ｏ２）−に等しい）を混合物として分離または単離してもよい。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、上述の方法によって得られる式（１）の化合物、またはそれに代えて、上述の方法によって得ることができる式（１）の化合物である。上述のように、上の方法によって、良好な純度の未精製物が得られ、これにより、たった１回のクロマトグラフィー精製工程の使用でよく、このことが、生物学的にさらに活性が高い（Ｅ，Ｚ）−アホエン誘導体（１）を得るのに重要であることがわかった。このような活性なアホエン誘導体は、純度が９５〜９９．５％、例えば、約９７〜９９．５％、９８〜９９．５％、９９〜９９．５％、例えば、約９９．５％であってもよい。得られる（Ｅ，Ｚ）アホエンのＥ：Ｚ比は、好ましくは、２０：１〜１：１０、例えば、１５：１〜１：６、１２：１〜１：５、好ましくは、約１０：１〜約１：４であってもよい。または、Ｅ：Ｚ比は、好ましくは、１：１〜１：１０、例えば、１：２〜１：８、１：３〜１：５、好ましくは、約１：４であってもよい。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、式（１）を有する（Ｅ，Ｚ）−アホエンと、少なくとも１つの抗生物質とを含む組成物である。化合物（すなわち、純粋なＥまたは純粋なＺを含め、得ることができるＥ：Ｚ比を有する（Ｅ，Ｚ）−アホエン）を上述の方法によって、または生物学的に活性なＱＳを阻害する（Ｅ，Ｚ）−アホエン生成物を与える任意の他の方法によって得てもよい。このような組成物を医薬製剤で使用してもよく、したがって、式（１）を有する（Ｅ，Ｚ）−アホエンと、少なくとも１つの抗生物質と、医薬的に許容される担体および／またはバインダーとを含む医薬または投薬形態として配合してもよい。医薬を液体または固体の投薬形態として配合してもよく、液体組成物には、局所投与のための液体組成物、静脈投与、筋肉内注射または皮下注射のための液体組成物、またはエアロゾルとして吸入するための液体組成物が含まれてもよい。固体投薬形態には、錠剤、カプセル、粉剤（吸入のための粉末を含む）が含まれてもよい。（Ｅ，Ｚ）−アホエンを上のいずれかの様式で投与しつつ、抗生物質を上のいずれかの様式で投与する実施形態も考慮される。例えば、アホエンを粉剤またはエアロゾルを経て吸入によって投与しつつ、抗生物質を静脈投与してもよい。
【００５３】
組成物中の（Ｅ，Ｚ）アホエンのＥ：Ｚ比は、好ましくは、２０：１〜１：１０、例えば、１５：１〜１：６、１２：１〜１：５、好ましくは、約１０：１〜約１：４であってもよい。または、Ｅ：Ｚ比は、好ましくは、１：１〜１：１０、例えば、１：２〜１：８、１：３〜１：５、好ましくは、約１：４であってもよい。
【００５４】
したがって、ある実施形態は、感染、好ましくはバイオフィルムを生成する細菌を含む細菌感染の治療で使用するための、式（１）を有する（Ｅ，Ｚ）−アホエンと、少なくとも１つの抗生物質とを含む上述の組成物である。
【００５５】
このような組成物の利点は、本明細書に示したように、ＱＳ−阻害剤を抗生物質と共に組成物として用いる場合に相乗効果が達成されることである。本発明の観点で、抗生物質は、抗菌効果がＱＳ阻害に基づかない任意の抗菌物質であると定義される。典型的には、ＱＳ−阻害剤と組み合わせて用いられる抗生物質は、殺菌性または静菌性と分類することができる。殺菌性は、細胞を直接殺し、静菌性は、細胞が分裂するのを防ぐ。抗生物質の種類としては、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリンが挙げられる。抗生物質は、これらの種類のいずれかから選択されてもよい。
【００５６】
抗生物質は、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリンインダニル、メズロシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン−スルバクタム、ベンジルペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリンタゾバクタム、チカルシリンクラブラン酸、ナフシリン、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフメタゾール、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフチブテン、セフォペラゾン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフタジジム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、トロレアンドマイシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レポフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、オキソリン酸、ゲミフロキサシン、ペルフロキサシン、イミペネム−シラスタチン、メロペネム、アズトレオナム、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、マフェニド、スルファジアジン銀、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、スルファメチゾール、リファンピン、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、リネゾリド、キヌプリスチン  ダルホプリスチン、バシトラシン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、イソニアジド、メテナミン、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、ノボビオシン、ポリミキシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、コリスチン、サイクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、ピラジンアミド、パラ−アミノサリチル酸、エリスロマイシンエチルコハク酸からなる群から選択されてもよい。抗生物質は、例えば、トブラマイシンであってもよい。
【００５７】
本発明の一態様は、細菌感染、好ましくは、バイオフィルムを生成する細菌を含む細菌感染の治療で使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。
【００５８】
本発明の別の態様は、細菌感染、好ましくは、バイオフィルムを生成する細菌を含む細菌感染の治療で使用するための本明細書に記載した方法によって得られる式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。
【００５９】
したがって、以下に記載する実施形態は、一般的には（Ｅ，Ｚ）−アホエンに関し、さらに、本明細書に記載した方法で与えられるような（Ｅ，Ｚ）−アホエンにも関し、最後に、（Ｅ，Ｚ）−アホエンと、上述のような抗生物質とを含む組成物にも関する。
【００６０】
得られた（Ｅ，Ｚ）アホエンのＥ：Ｚ比は、好ましくは、２０：１〜１：１０、例えば、１５：１〜１：６、１２：１〜１：５、好ましくは、約１０：１〜約１：４であってもよい。または、Ｅ：Ｚ比は、好ましくは、１：１〜１：１０、例えば、１：２〜１：８、１：３〜１：５、好ましくは、約１：４であってもよい。
【００６１】
バイオフィルムを生成する細菌を含む細菌感染を含め、細菌感染の治療は、予防のためであってもよい。使用される化合物は、抗生物質および／または医薬的に許容される担体を含む組成物の状態であってもよい。化合物または組成物を静脈注射、筋肉内注射または皮下注射によって投与してもよく、経口投与、局所投与してもよく、または、化合物または組成物を、好ましくは適切な吸入機器を用いて吸入してもよい。化合物または組成物を固体組成物（例えば、粉末）として吸入してもよく、またはエアロゾルの形態で液体組成物として吸入してもよい。
【００６２】
一実施形態では、治療される細菌感染は、免疫不全を患う哺乳動物の細菌感染である。本発明の観点で、免疫不全を患う哺乳動物は、何らかの理由で免疫が低下した哺乳動物であり、免疫が低下したとは、自然防御能の態様の一部またはすべての性能が通常よりも低いことを意味する。典型的には、免疫低下疾患が原因であるか、または免疫抑制薬を用いた治療が原因であろう。このような哺乳動物は、バイオフィルムを生成する細菌（例えば緑膿菌）による感染の危険性が高く、したがって、抗生物質との組成物であってもよいＱＳ阻害剤を用いた予防的治療および急性時の治療の両方が有益である可能性がある。哺乳動物は、ヒト、ペットおよび家畜を含んでいてもよく、または哺乳動物は、ヒト、ペットおよび家畜からなる群から選択されてもよい。免疫低下疾患としては、嚢胞性線維症、糖尿病、ＣＯＰＤ、血液性悪性疾患、癌、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、慢性創傷、熱傷創からなる群から選択される疾患が挙げられる。患者には、カテーテルを埋め込んでいる患者、医療機器、インプラント、ステントで治療した患者、ＩＣＵにいる患者が含まれてもよい。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、細菌、特に、上述の感染を引き起こすバイオフィルムを生成する細菌は、グラム陰性菌のような、病原性をＱＳで制御可能な細菌の群から選択されてもよく、特に、以下のグラム陰性菌群であってもよい。ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・ステワティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、緑膿菌、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・リクファシエン（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、特に、緑膿菌。
【００６４】
本発明のさらに好ましい実施形態は、感染した領域が創傷（例えば、慢性創傷および／または治癒していない創傷）であるような細菌感染の治療で使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。これらの場合には、この化合物を局所投与する方が利点があるだろう。
【００６５】
別の有用な実施形態は、感染した領域が肺であるような細菌感染の治療で使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。この治療は、嚢胞性線維症患者の免疫応答が低く、バイオフィルムを生成する細菌（例えば、緑膿菌）を含む持続性の肺感染を患っていることが多いため、特に、嚢胞性線維症患者と関連がある。したがって、好ましい実施形態は、感染した領域が嚢胞性線維症患者の肺であるような細菌感染の治療で使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエンである。これらの場合には、この化合物を吸入または静脈投与によって投与する方が利点があるだろう。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、感染した領域は、インプラントまたはインプラント周囲の領域である。本明細書で定義されるように、インプラントは、哺乳動物の失われた生体構造と置き換えるため、または失われた生体機能として機能させるために作られた医療用機器である。このようなインプラントとしては、人工ペースメーカーおよび人工内耳のような電子機器を備えたインプラント、埋め込み可能な丸薬または薬物を溶出するステントの形態をした、皮下での薬物送達機器、骨置換のような人工器官、支持機器または歯科用インプラントが挙げられる。
【００６７】
さらに別の実施形態では、感染した領域は、消化器系の一部、例えば、胃および／または腸であってもよい。このような感染としては、食中毒、または膵臓または胆管のステントから引き起こされる感染が挙げられる。
【００６８】
本発明のいずれかの態様の観点で記載した実施形態および特徴を本発明の他の実施形態にも適用することを注記しておくべきである。また、種々の徴候の治療に使用するための上に記載する化合物および組成物の上述の実施形態はすべて、この化合物または組成物を投与することによって徴候を治療する方法としてすべて同等に記載されていてもよい。
【００６９】
本明細書で引用したあらゆる特許文献および非特許文献は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【００７０】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに詳細に記載する。
【００７１】
（実施例）
（実施例１：化合物（３）アリシンの合成）
アセトン（１ｍＬ）中の化合物（２）ジアリルジスルフィド（０．２９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）に、アルゴン下、−５０℃でＤＭＤＯ（３１ｍＬ、０．０７Ｍ、２．２ｍｍｏｌ）のアセトン溶液を１５分かけて滴下した。得られた淡黄色反応混合物を−２０℃まで加温しつつ、３０分間撹拌した。得られた透明反応混合物を減圧下で濃縮した。未精製残渣（０．３１ｇ、９８％）をカラムクロマトグラフィー（ペンタン中、５％Ｅｔ２Ｏで溶出）によって精製し、化合物（３）アリシンを淡黄色液体として得た（０．３１ｇ、１．９ｍｍｏｌ、収率９６％、純度は９５％より大きく、９９．９％まで）。
【００７２】
溶媒および温度について条件を変えながら、上の反応を繰り返した。残りのパラメーターは同じにしておいた。以下の表１からわかるように、この反応は、多くの条件で効果的である。
【００７３】
【表１】
2014508719.tif 000009
【００７４】
（実施例２：アセトン溶媒を用いた化合物（１）（Ｅ，Ｚ）−アホエンの合成）
化合物（３）アリシン（０．１６２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を４０％アセトン水溶液（１．６ｍＬ）に溶かし、この溶液をＡｃＯＨ（０．０１１ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を６４℃で４時間加熱した。冷却した反応混合物を５０％メタノール水溶液（６ｍＬ）で希釈し、ペンタンで抽出した（１０ｍＬ×５回）。水性画分を固体ＮＨ４ＳＯ４で飽和状態にし、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（１０ｍＬ×５回）。有機抽出物を合わせ、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。未精製残渣（０．１６ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ペンタン中６０〜８０％ＥｔＯＡｃで抽出）でさらに精製し、化合物（１）（Ｅ，Ｚ）−アホエンを淡黄色液体として得た（Ｅ：Ｚ比＝１：４、０．０２５ｇ、０．１ｍｍｏｌ、収率３２％）。
【００７５】
種々の酸を用い、上の反応を繰り返した。残りのパラメーターは上と同じにしておいた。酸の置き換えは、以下の表２からわかるように、アホエンの収率にもＥ：Ｚ比にも影響を及ぼした。
【００７６】
【表２】
2014508719.tif 000010
【００７７】
重要なことに、それほど純度が高いというわけではないアリシン（３）を用いた場合、上の反応の収率はゼロではないものの、顕著に下がることがわかった。また、アリシン（３）を得るための従来技術の方法を用いたとき、ニンニク抽出物か、またはアリシンのブロック合成で用いられる反応剤または生成物のいずれかに起因する不純物の中には、アホエンの収率を６〜１２％以下にしてしまうものがあることもわかった。このことは、アホエン合成にどの溶媒およびどの酸を用いるかにかかわらず当てはまった。
【００７８】
（実施例３：化合物（１）（Ｅ，Ｚ）−アホエン［Ｅ：Ｚ＝１０：１］の合成）
化合物（３）アリシン（０．１６２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を１０％ベンゼン水溶液（１．６ｍＬ）に溶かし、この溶液をＡｃＯＨ（０．０１１ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を４８時間で３７℃まで加熱した。冷却した反応混合物を５０％メタノール水溶液（６ｍＬ）で希釈し、ペンタンで抽出した（１０ｍＬ×５回）。水性画分を固体ＮＨ４ＳＯ４で飽和状態にし、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（１０ｍＬ×５回）。有機抽出物を合わせ、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。未精製残渣（０．１５ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ペンタン中６０〜８０％ＥｔＯＡｃで抽出）でさらに精製し、化合物（１）（Ｅ，Ｚ）−アホエン（Ｅ：Ｚ比が１０：１、０．０２３ｇ、０．１ｍｍｏｌ、収率３０％）を淡黄色液体として得た。
【００７９】
（実施例４：式（４）の化合物の合成）
（Ｅ，Ｚ）アホエンの酸化したスルホン誘導体は、ＱＳ阻害効果をもつことが示されている。したがって、このような誘導体（すなわち、式（４）の化合物）を以下に記載するような種々の経路を用いて合成した（図２も参照のこと）。
【００８０】
Ｙ＝Ｓ、Ｒ＝アリル
式（１）の化合物（（Ｅ，Ｚ）アホエン）をアセトン中、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）を用いて−２０℃で２時間処理し、Ｙ＝Ｓであり、Ｒ＝アリルである式（４）の化合物を収率９６％で得た。処理および精製は、（Ｅ，Ｚ）アホエンについて用いたのと同様のものであった。
【００８１】
Ｙ＝Ｓ（Ｏ）２、Ｒ＝アリル
式（１）の化合物（（Ｅ，Ｚ）アホエン）をジクロロメタン中、過酢酸を用いて０℃で１２時間処理し、Ｙ＝Ｓ（Ｏ）２であり、Ｒ＝アリルである式（４）の化合物を収率３８％で得た。処理および精製は、（Ｅ，Ｚ）アホエンについて用いたのと同様のものであった。
【００８２】
または、式（１）の化合物（（Ｅ，Ｚ）アホエン）をアセトン中、４当量のＤＭＤＯ  を用いて−１０℃で６時間処理し、Ｙ＝Ｓ（Ｏ）２であり、Ｒ＝アリルである式（４）の化合物を収率８２％で得た。処理および精製は、（Ｅ，Ｚ）アホエンについて用いたのと同様のものであった。
【００８３】
さらに別の代替的な経路では、Ｙ＝Ｓであり、Ｒ＝アリルである上述の式（４）の化合物をアセトン中、２当量のＤＭＤＯを用いて−１０℃で６時間処理し、Ｙ＝Ｓ（Ｏ）２であり、Ｒ＝アリルである式（４）の化合物を収率７８％で得た。
【００８４】
Ｙ＝Ｓ、Ｒ＝フェニル
Ｙ＝Ｓ（Ｏ）２であり、Ｒ＝アリルである式（４）の化合物をテトラヒドロフラン中、リチオ化スルフィド（ＰｈＳＬｉ）を用いて−７８℃の温度で処理し、温度を１時間かけて０℃まで上げていき、Ｙ＝Ｓであり、Ｒ＝フェニルである式（４）の化合物をモル収率８６％で得た。
【００８５】
Ｙ＝Ｓ、Ｒ＝メチル、エチル、ベンジル
Ｙ＝Ｓであり、Ｒ＝フェニルである場合の上述の方法と類似した方法で、Ｒ＝メチル、エチル、ベンジルである式（４）の対応する化合物を、対応するリチオ化スルフィド（すなわち、ＭｅＳＬｉ、ＥｔＳＬｉ、アリルＳＬｉ）を用いて同様の収率で製造した。残りのパラメーターは同じにしておいた。
【００８６】
（実施例５：アホエン処理によって制御される緑膿菌遺伝子）
ＤＮＡマイクロアレイ分析を用い、アホエン処理によって制御される遺伝子を特定した。リファレンスとして、Ｈｅｎｔｚｅｒら［Ｍ．Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００３，２２，ｐ．３８０３−３８１５］によって以前特定されたＱＳレギュロンを使用し、これらのデータを用い、クオラムセンシングを阻害する（ＱＳＩ）と推定される化合物の標的特異性を検証した。指数関数的に成長する緑膿菌培養物を以下の４種類の濃度のアホエンで処理した。１０μｇ／ｍｌ（４２．７μＭ）、２０μｇ／ｍｌ（８５．４μＭ）、４０μｇ／ｍｌ（１７０．８μＭ）、８０μｇ／ｍｌ（３４１．６μＭ）。Ｅ：Ｚ比が１：４の（Ｅ，Ｚ）アホエンを使用した。これらの濃度では、成長阻害効果を発揮しない。サンプルをＯＤ６００ｎｍで２．０（光学密度）で再び得た。以前の観察結果では、この細胞密度でＱＳ遺伝子について最も高い活性を示したためである。処理した培養物の遺伝子発現を未処理のコントロールと比較した。
【００８７】
一般的に、上の４種類の異なる濃度のアホエンのうち、５分の１より大きくダウンレギュレーションされた遺伝子はほんのわずかであった。１０μｇ／ｍｌのアホエンでは０種類の遺伝子、２０μｇ／ｍｌのアホエンでは０種類の遺伝子、４０μｇ／ｍｌのアホエンでは２種類の遺伝子、８０μｇ／ｍｌのアホエンでは１１種類の遺伝子。５倍より大きくアップレギュレーションされた遺伝子の量は、処理した培養物間で著しい差はなかった。本願発明者らの実験設定によれば、合計数で１６３種類のＱＳによって制御される緑膿菌遺伝子のうち、１０種類の発現（Ｈｅｎｔｚｅｒら［Ｍ．Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００３，２２，ｐ．３８０３−３８１５］）がアホエン処理によってダウンレギュレーションされた。濃度が８０μｇ／ｍｌのアホエンは、合計で５５７０種類の緑膿菌遺伝子のうち、１１種類の発現に影響を与える。したがって、アホエンは、ＱＳによって制御される遺伝子の一部に対し、非常に特異性である（表３）。
【００８８】
【表３】
2014508719.tif 000011
【００８９】
アホエンによって有意にダウンレギュレーションされた遺伝子のうち、以下のものが、ＱＳによって制御された重要な病原因子であった。ＬａｓＡプロテアーゼ（ｌａｓＡ、ＰＡ１８７１）、キチナーゼ（ｃｈｉＣ、ＰＡ２３００）、細胞毒性のあるガラクトース親和性のレクチン（ｌｅｃＡ、ＰＡ２５７０）、ラムノシルトランスフェラーゼＡＢオペロン（ｒｈｌＡ、ＰＡ３４７８およびｒｈｌＢ、ＰＡ３４７９）、カゼイン、エラスチン、ラクトフェリン、トランスフェリンおよびデコリンを分解する、ＰｖｄＳによって制御されるエンドプロテアーゼ（ｐｒｐＬ、ＰＡ４１７５）、キチンを含有する物質への結合に介在し、おそらくバイオフィルムの生成を補助する、関連するキチン結合性タンパク質ｃｂｐＤ（ＰＡ０８５２）。ｌａｓＢは、５分の１よりも大きなダウンレギュレーションは起こさなかった。
【００９０】
（実施例６：マイクロアレイデータの検証）
マイクロアレイデータを検証するために、ｌａｓＢおよびｒｈｌＡという主要な２種類のＱＳ遺伝子を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（図３を参照）。この２種類の方法を比較すると、ｌａｓＢ遺伝子およびｒｈｌＡ遺伝子の発現抑制は同じ傾向に従っており、一般的に、ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法で観察されたものよりわずかに低下率が大きい。ＲＴ−ＰＣＲデータは、濃度が８０μｇ／ｍｌのアホエンが、ｒｈｌＡの発現をほぼ１２分の１、ｌａｓＢの発現をほぼ５分の１まで下げることを示す。ｒｈｌＡの発現は、主にＲｈｌ  ＱＳ系およびシグナルＢＨＬによって制御され、一方、ｌａｓＢの発現は、Ｌａｓ系およびＲｈｌ  ＱＳ系と、シグナル分子ＯｄＤＨＬおよびＢＨＬの濃度の両方によって影響を受ける。Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．１３２５−１３４０］によれば、表３に列挙した遺伝子は、（その制御が完全にＬａｓ  ＱＳ系によって制御されるｐｒｐＬを除き）Ｌａｓ系およびＲｈｌ  ＱＳ系の両方によって制御を受ける。このことは、アホエンが主にＲｈｌ  ＱＳを標的とすることを示唆している。Ｅ：Ｚ比が１：４の（Ｅ，Ｚ）アホエンをこれらの実験で使用した。
【００９１】
（実施例７：アホエンによるラムノ脂質産生の低下）
主要な病原因子の１つの合成を阻害することについて、アホエンの実際の有効性を実証するために、ＤＮＡアレイおよびＲＴ−ＰＣＲのために成長させた培養物中に存在するラムノ脂質の濃度をＬＣ−ＭＳによって直接定量した。ラムノ脂質の産生は、ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢ、ｒｈｌＣ遺伝子（ＰＡ３４７９、ＰＡ３４７８およびＰＡ１１３１）によってコードされるＲｈｌ  ＱＳ系によって協働して制御される静止期において初期に始まる［Ｖ．Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３，１８５，ｐ．２０８０−２０９５およびＲ．Ｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１，４０，ｐ．７０８−７１８］。したがって、サンプルをＯＤ６００ｎｍで１．５および２．０に調整し、ラムノ脂質の産生をその合成が完全に開始する前と開始した後に調べた。サンプル中のラムノ脂質の濃度は、アホエンの濃度を上げていくと徐々に下がっていくことがわかった。ＯＤ６００ｎｍで２．０のときに２０μｇ／ｍｌのアホエンで処理したとき、ラムノ脂質の含有量は、未処理の培養物と比較して約１／３まで下がり、細胞を８０μｇ／ｍｌのアホエンで処理したとき、サンプル中に存在するラムノ脂質はほとんど検出することができなかった。したがって、この濃度は、ラムノ脂質の合成をほぼ完全に止めている。Ｅ：Ｚ比が１：４の（Ｅ，Ｚ）アホエンを使用した。
【００９２】
（実施例８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルムからラムノ脂質を失わせ、ＰＭＮの死を防ぐアホエンによる処理）
バイオフィルムをＰＭＮ白血球にさらすと、ラムノ脂質が産生し、ラムノ脂質は、盾として機能し、バイオフィルムの細菌を食作用から守る機能を有する。ＰＭＮの溶解に対するアホエンの影響は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの連続培養による１回通過型フローチャンバーバイオフィルム系を用いて示された［Ｂ．Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３１０，ｐ．２０−４２］。１００μｇ／ｍｌのアホエンが存在する状態、または存在しない状態で、緑膿菌バイオフィルムを４日間成長させた。その後、フローチャンバーの中にあるアホエンが存在しない状態で成長させたバイオフィルムの上にＰＭＮを導入すると、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色は、ＰＭＮが壊死していることを示した（図５Ａ）。対照的に、バイオフィルムをアホエン存在下で成長させたときは、ＰＭＮの壊死は観察されなかった（図５Ｂ）。したがって、アホエンによって処理すると、アホエンのバイオフィルム合成を止めることによって、ＰＭＮ白血球を守る。守られたＰＭＮは、バイオフィルム細菌を貪食する能力を有することがすでに示されている［Ｔ．Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．３８７３−３８８０］。Ｅ：Ｚ比が１：４の（Ｅ，Ｚ）アホエンを使用した。
【００９３】
（実施例９：アホエンおよび抗生物質を用いた処理の相乗効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで確認）
細菌性バイオフィルムの感染における重要な課題の１つは、投与される抗生物質の有効性が下がることである。ＣＦ患者の気道での感染は、ＰＭＮおよび細菌のような溶解した炎症細胞から放出した、ＤＮＡのようなアニオン性高分子電解質を高濃度で生じるだろう［Ｔ．Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｏｒａｘ，１９９５，５０，ｐ．８８０−８８２］。アニオン性高分子電解質、特にＤＮＡが、トブラマイシンのようなカチオン性抗生物質と結合し、活性を下げてしまい、生体が利用可能なトブラマイシンが存在量の５％程度まで下がってしまう可能性があることが示されている。［Ｐ．Ｍ．Ｍｅｎｄｅｌｍａｎ，１９８５，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ．，１３２、ｐ．７６１−７６５］。このことは、ラムノ脂質およびｅＤＮＡの産生および放出を止めることによって、その後のトブラマイシンの不活性化を低減することができることを示唆している。
【００９４】
このことに従って、本願発明者らは、３日間成長させたバイオフィルム（連続培養による１回通過型フローセルにてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた）を、ニンニク抽出物と抗生物質であるトブラマイシンを組み合わせて処理すると、相乗的な殺菌効果を示すことをすでに発表している［Ｔ．Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．３８７３−３８８０］。しかし、何がニンニク抽出物の活性成分であるかはわかっていなかった。したがって、緑膿菌株のバイオフィルムを、１００μｇ／ｍｌのアホエンが存在する状態、または存在しない状態で成長させた。３日目に、バイオフィルムを１０μｇ／ｍｌのトブラマイシンを用いて２４時間処理した。従来の処理試験は、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまたは３４０μｇ／ｍｌを用いた処理が殺菌度に差がないことを示していた。したがって、この試験では１０μｇ／ｍｌのトブラマイシンを選択した。生存／死亡株および共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＳＬＭ）を用いて殺菌効力を評価し、アホエン［アホエンは、例えば、ＨＰＬＣ精製されていない］が存在する状態で成長させ、その後にトブラマイシンで処理したバイオフィルムは、ほぼ１００％死んでいることが示された（図６Ａ）。この相乗効果は、機能的なＱＳ系を有している臨床的なＣＦ単離物ＣＦ４３８（診断したＣＦ児から最初に単離したもの）を用いても評価され、この場合も、バイオフィルムのほぼ１００％が死んでいることが検出された（図６Ｂ）。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのアホエンとトブラマイシンの組み合わせ処理の影響を試験するために、本願発明者らは、異物感染モデルを使用した［Ｌ．Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１５３，ｐ．２３１２−２３２０］。野生型緑膿菌であらかじめコロニーを作成しておいた大きさが４ｍｍ（内径４ｍｍ／外径６ｍｍ）のシリコーン管インプラントをマウスの腹腔に挿入した。２４時間ごとに皮下注射によって治療し、アホエンとトブラマイシンによる治療を、それぞれ挿入の２日前および挿入後２４時間から開始した。挿入してから７２時間後に、インプラントをマウスから取り出し、インプラントあたり、コロニーの生成数を決定した。本願発明者らは、野生型緑膿菌をアホエンとトブラマイシンを組み合わせて治療すると、プラセボ群およびアホエンまたはトブラマイシンでの単剤治療と比較して、インプラントの清浄化が顕著に早まることを発見した（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．００９およびｐ＝０．０１）。清浄化の有意な差は、プラセボ群と単剤治療群との間でもみられた（ｐ＝０．００８およびｐ＜０．０００１）。本願発明者らは、２種類の単剤治療群の間には、清浄化に有意な差がないことを発見した（ｐ＝３０）（図６Ｃ）。Ｅ：Ｚ比が１：４の（Ｅ，Ｚ）アホエンを使用した。
【００９６】
本願発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１００μｇ／ｍｌのアホエンをバイオフィルムに加えた後、１０μｇ／ｍｌのトブラマイシンを加えると、バイオフィルムをほぼ１００％殺すのに対し、トブラマイシンまたはアホエンのみが存在する状態では、バイオフィルム細菌をまったく殺さないか、ほんの少ししか殺さないことを示した。ｅＤＮＡの放出がＱＳによって制御されることと、本願発明者らの結果を考慮し、この結果を組み合わせると、ｅＤＮＡの放出がアホエンによって弱められている可能性を示している。
【００９７】
（実施例１０：肺緑膿菌感染のアホエンによる治療）
この試験では、アホエンを予防的に投与し、その後、感染後にも続けた。腹膜に皮下から注射した。本願発明者らは、緑膿菌ＰＡＯ１を用いた肺感染マウスモデルにおいて、アホエンを用いて３回の個々のｉｎ  ｖｉｖｏ治療実験を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、１．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌの緑膿菌を含むアルギン酸ビーズで気管からチャレンジ試験を行った（０日目）。２グループのマウスには、１日に１回、治療しない（プラセボ）か、またはアホエン２５μｇ／マウス（ｇ）で治療した。マウスには、細菌チャレンジ試験の前に予防的治療またはプラセボを２日間与えておいた。治療を３日間続けた。プレート計測数の一覧は、３日目に治療グループとプラセボグループの間で有意な差を示した。この実験を組み合わせたとき、３日目に有意な差がみられ（ｐ＜０．００２）、グループ間でクリアランスに５００倍差があった（図７）。この結果は、生ニンニク抽出物を治療として使用した同様の肺感染モデルに関するＢｊａｒｎｓｈｏｌｔ（２００５年）らによって得られた結果と一致している。［Ｔ．Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．３８７３−３８８０］。このマウスは、２５μｇ／体重（ｇ）の投与量に十分に忍容性であった。
【００９８】
アホエンが上述のような緑膿菌感染のクリアランスを誘発する能力を比較する同様の実験は、非常に高純度（＞９９．５％、ＨＰＬＣで精製した）または９５％〜９９．５％の純度（すなわち、未精製アホエンまたは１回のカラムクロマトグラフィー工程を行ったアホエン）で使用した場合、非常に高純度のアホエンは、肺感染の清浄化に有効ではなかったが、一方、純度が９５〜９９．５％のアホエンは有効であったことを示している（図８、それぞれ上および下のグラフ）。このことは、ＨＰＬＣ精製の使用を避けるために、十分な純度の「未精製」アホエン生成物を与える合成が必須であることを強調するものである。この工程が生体活性に悪影響を与えるからである。したがって、処理し、場合によりカラムクロマトグラフィーにかけた後に、純度が９５％より高く、９９．５％未満であるアホエンを与える本発明のプロセスは、驚くべきことに、従来技術より有利である。Ｅ：Ｚ比が１：４である（Ｅ，Ｚ）アホエンを使用した。
【００９９】
アホエンを用いる今回の試験と、ニンニク抽出物を用いる従前の試験を比較すると、今回の試験は、アホエンおよびアホエンに近い誘導体が、緑膿菌感染を減らすことができるニンニクの主要な活性要素であるという説得力のある指標を与えている。
【０１００】
（結論）
要するに、本願発明者らは、アホエンを使用すると、緑膿菌の重要なＱＳによって制御される病原性遺伝子のうち、ほんの一部の転写を阻害することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで緑膿菌の病原性を弱めることを示した。本願発明者らのトランスクリプトーム解析から、本願発明者らは、アホエンの標的がおそらくＲｈｌ  ＱＳ系であることを示唆した。ＱＳを阻害しても緑膿菌のバイオフィルム生成能力がなくならないことは、認識しておく価値がある。しかし、あらゆる入手可能なデータは、ＱＳが不足したバイオフィルムは、ＱＳが豊富なバイオフィルムよりも脆いことを示す。例えば、マトリックス要素であるＤＮＡが失われている（マトリックスの産生はＲｈｌ  ＱＳが制御している）ため、バイオフィルムは、剪断力に弱く、流体力に依存して剥がれ落ちることがある。それに加え、ラムノ脂質は生成しないため、バイオフィルムは、ＰＭＮの作用に弱くなる（ＰＭＮは、バイオフィルムと接触しても死なないため）。本願発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＱＳが不足する細菌のバイオフィルムは、ＱＳが豊富なバイオフィルムとは対照的に、新しく単離したＰＭＮが貪食することができることを以前示した。ＰＭＮに対するバイオフィルムの忍容性にとって重要なことは、ラムノ脂質の産生によって、向かってくるＰＭＮに対する保護的な盾が作られることであり、本願発明者らは、この事実が今回の場合にも当てはまることを裏付けるいくつかの証拠を持っている。したがって、ＱＳ阻害剤を用いると、ＰＭＮの抗菌性を大きく高め、バイオフィルムを生成する細菌を有効に壊滅させることができるはずである。さらに、ラムノ脂質は、ＰＭＮを溶解し、その後、内在するＤＮＡ、加水分解酵素、酸素ラジカルが漏出する。これにより、特に、組織損傷、炎症の増大、ムコイド表現型の外観が顕著に症状の憎悪の原因となるような緑膿菌の変異の誘発に関して「悪いサイクル」が生じる。
【０１０１】
トブラマイシンとの組み合わせ実験におけるマウス実験での感染の低下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのバイオフィルムの除去は、慢性的な緑膿菌感染を治療するための将来的な抗菌薬物としてアホエンを用いる可能性を示唆している。
【０１０２】
（参考文献）
・Ｗ．Ｃ．Ｆｕｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９４，１７６，ｐ２６９−２７５
・Ｔ．Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．３８７３−３８８０
・Ｒ．Ｎａｇａｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６２，１９９６，ｐ．４２３８−４２４２
・ＥＰ１８５３２４
・Ｂｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９８６，１０８，ｐ．７０４５−７０５５
・ＵＳ４，６６５，０８８
・ＷＯ２０１０／１００４８６
・Ｍ．Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００３，２２，ｐ．３８０３−３８１５
・Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．１３２５−１３４０
・［Ｖ．Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３，１８５，ｐ．２０８０−２０９５
・Ｒ．Ｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１，４０，ｐ．７０８−７１８］
・Ｂ．Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３１０，ｐ．２０−４２
・Ｔ．Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｏｒａｘ，１９９５，５０，ｐ．８８０−８８２
・Ｐ．Ｍ．Ｍｅｎｄｅｌｍａｎ，１９８５，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ．，１３２，ｐ．７６１−７６５
・Ｌ．Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１５３，ｐ．２３１２−２３２０
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１０３】
【特許文献１】ＥＰ１８５３２４
【特許文献２】ＵＳ４，６６５，０８８
【特許文献３】ＷＯ２０１０／１００４８６
【非特許文献】
【０１０４】
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｆｕｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９４，１７６，ｐ２６９−２７５
【非特許文献２】Ｔ．Ｂｊａｒｎｓｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．３８７３−３８８０
【非特許文献３】Ｒ．Ｎａｇａｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６２，１９９６，ｐ．４２３８−４２４２
【非特許文献４】Ｂｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９８６，１０８，ｐ．７０４５−７０５５
【非特許文献５】Ｍ．Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００３，２２，ｐ．３８０３−３８１５
【非特許文献６】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１，ｐ．１３２５−１３４０
【非特許文献７】Ｖ．Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３，１８５，ｐ．２０８０−２０９５
【非特許文献８】Ｒ．Ｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１，４０，ｐ．７０８−７１８
【非特許文献９】Ｂ．Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３１０，ｐ．２０−４２
【非特許文献１０】Ｔ．Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｏｒａｘ，１９９５，５０，ｐ．８８０−８８２
【非特許文献１１】Ｐ．Ｍ．Ｍｅｎｄｅｌｍａｎ，１９８５，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ．，１３２，ｐ．７６１−７６５
【非特許文献１２】Ｌ．Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１５３，ｐ．２３１２−２３２０
【図１】
2014508719.tif 000017
【図２】
2014508719.tif 000018
【図３】
2014508719.tif 000019
【図４】
2014508719.tif 000020
【図７】
2014508719.tif 000021
【図８】
2014508719.tif 000022
【図５】
2014508719.tif 000023
【図６】
2014508719.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月14日(2013.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌感染の治療に使用するための式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエン
【化１】
2014508719.tif 000025
であって、前記細菌感染が、バイオフィルムを生成する細菌を含む感染である（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項２】
前記バイオフィルムを生成する細菌が、グラム陰性菌である請求項１に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項３】
前記細菌が、ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・ステワティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・リクファシエン（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、及びエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からなる群から選択される請求項１〜２のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項４】
前記細菌が、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項５】
前記細菌感染が肺でのものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項６】
前記細菌感染が慢性創傷でのものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項７】
前記細菌感染が、免疫不全を患う哺乳動物でのものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項８】
前記免疫不全が、免疫低下疾患によるものであるか、または免疫抑制薬を用いた治療によるものである請求項７に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項９】
前記哺乳動物が、ヒト、ペットおよび家畜からなる群から選択される請求項７〜８のいずれかに記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項１０】
前記細菌感染が、嚢胞性線維症を患う哺乳動物でのものである請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための（Ｅ，Ｚ）−アホエン。
【請求項１１】
式（１）の（Ｅ，Ｚ）−アホエン
【化２】
2014508719.tif 000026
と、少なくとも１つの抗生物質とを含む組成物であって、前記抗生物質が、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、及びテトラサイクリンからなる群から選択される組成物。
【請求項１２】
前記抗生物質が、アミノグリコシドである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗生物質が、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリンインダニル、メズロシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン−スルバクタム、ベンジルペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリンタゾバクタム、チカルシリンクラブラン酸、ナフシリン、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフメタゾール、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフチブテン、セフォペラゾン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフタジジム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、トロレアンドマイシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レポフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、オキソリン酸、ゲミフロキサシン、ペルフロキサシン、イミペネム−シラスタチン、メロペネム、アズトレオナム、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、マフェニド、スルファジアジン銀、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、スルファメチゾール、リファンピン、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、リネゾリド、キヌプリスチン  ダルホプリスチン、バシトラシン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、イソニアジド、メテナミン、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、ノボビオシン、ポリミキシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、コリスチン、サイクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、ピラジンアミド、パラ−アミノサリチル酸、及びエリスロマイシンエチルコハク酸からなる群から選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗生物質が、トブラマイシンである請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
細菌感染の治療に使用するための請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記細菌感染が、バイオフィルムを生成する細菌を含む感染である組成物。
【請求項１６】
前記細菌がグラム陰性菌である請求項１５に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１７】
前記細菌が、ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・ステワティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・リクファシエン（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、及びエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からなる群から選択される請求項１５〜１６のいずれかに記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１８】
前記細菌が、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である請求項１７に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１９】
前記細菌感染が肺でのものである請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【請求項２０】
前記細菌感染が慢性創傷でのものである請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の細菌感染の治療に使用するための組成物。
【国際調査報告】
2014508719.tif 000027
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2014508719.tif 000029
2014508719.tif 000030
2014508719.tif 000031