(57)【要約】  本発明は、胎盤抽出物、および胎盤抽出物を安全かつ有効に製造する方法に関する。本発明の胎盤抽出物製造方法は、界面活性剤および溶剤を用いてウイルスを不活化する段階、紫外線を照射してウイルスを不活化する段階、並びにナノフィルターを用いてウイルスを除去する段階よりなる群から選ばれる少なくとも一つの段階を含む。こうして得た胎盤抽出物は、哺乳類の更年期障害症状の予防または治療に使用できる。
2014506921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤抽出物製造方法であって、
界面活性剤および溶剤を用いてウイルスを不活化する段階、紫外線を照射してウイルスを不活化する段階、およびナノフィルターを用いてウイルスを除去する段階よりなる群から選ばれる少なくとも一つの段階を含むことを特徴とする、胎盤抽出物製造方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール）、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン（２３）ドデカノール）、Ｂｒｉｊ−５８（ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、およびＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）よりなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項３】
前記溶剤がＴＮＢＰ(tri-n-butyl phosphate)であることを特徴とする、請求項１に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項４】
前記紫外線のエネルギーが１，０００Ｊ／ｍ２〜３，０００Ｊ／ｍ２であることを特徴とする、請求項１に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項５】
前記ナノフィルターの孔径が１５ｎｍ〜３０ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項６】
（ｉ）胎盤組織を水性媒質内で粉砕して胎盤溶液を得る段階と、
（ii）前記胎盤溶液を液相部分と固相部分に仕分ける段階と、
（iii）前記（ii）段階で得た液相部分に界面活性剤および溶剤を添加してウイルスを不活化する段階と、
（iv）前記（iii）段階で得た混合溶液から前記界面活性剤および前記溶剤を除去する段階と、
（ｖ）前記（iv）段階で得た溶液に紫外線を照射してウイルスを不活性化する段階と、
（vi）前記（ｖ）段階の紫外線で照射された溶液をナノフィルターおよび除菌フィルターを用いて濾過し、ウイルスと細菌を除去する段階とを含んでなる、胎盤抽出物製造方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール）、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン（２３）ドデカノール）、Ｂｒｉｊ−５８（ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、およびＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）よりなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項６に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項８】
前記溶剤がＴＮＢＰ(tri-n-butyl phosphate)であることを特徴とする、請求項６に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項９】
前記（iv）段階がＳＤＲ樹脂(solvent/detergent removal resin)を用いて行われることを特徴とする、請求項６に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項１０】
前記紫外線のエネルギーが１，０００Ｊ／ｍ２〜３，０００Ｊ／ｍ２であることを特徴とする、請求項６に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項１１】
前記ナノフィルターの孔径が１５ｎｍ〜３０ｎｍであることを特徴とする、請求項６に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項１２】
前記除菌フィルターの孔径が０．２μｍ〜０．３μｍであることを特徴とする、請求項６に記載の胎盤抽出物製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項の方法によって製造される胎盤抽出物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項の方法によって製造される胎盤抽出物と、薬学的に許容される担体とを含む、哺乳類の更年期障害症状の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記胎盤抽出物を２ｐｇ／ｍＬ〜２０ｐｇ／ｍＬ含むことを特徴とする、請求項１４に記載の哺乳類の更年期障害症状の予防または治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、胎盤抽出物、および胎盤抽出物を安全かつ有効に製造する方法に関する。より詳しくは、本発明は、界面活性剤および溶剤を用いてウイルスを不活化する段階、紫外線を照射してウイルスを不活化する段階、およびナノフィルターを用いてウイルスを除去する段階よりなる群から選ばれる少なくとも一つの段階を含むことを特徴とする胎盤抽出物製造方法、並びにこうして得た胎盤抽出物の哺乳類更年期障害症状の予防または治療への用途に関する。
［背景技術］
胎盤(placenta)は、妊娠した哺乳類動物の子宮に形成される器官である。胎盤は、出産の際に子宮から娩出され、胎盤の娩出を後産と呼ぶ。胎盤には必須アミノ酸、メラトニン、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸成分、抗酸化酵素ＳＯＤ(super oxide dismutase)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)、抗酸化剤、サイトカイン、並びに各種成長因子(growth factor)などが存在すると知られている。
【０００２】
従来の胎盤抽出物の製造方法としては、塩酸などの強酸または強アルカリを用いて胎盤を加水分解することによりその産物を得る方法と、酵素を用いて胎盤を加水分解する方法が知られている。ところが、これらの従来の方法は、加水分解条件だけでなく、長時間高温処理を行う過程で、胎盤の持つ様々な生理活性物質が変性または破壊されてしまうという欠点がある。
【０００３】
一方、酸、アルカリまたは酵素を用いた加水分解と高温処理方法を使用しないマイルド(mild)な方法で胎盤を抽出する場合、様々な生理活性物質を変性または破壊することなく抽出することはできるものの、胎盤からの潜在的ウイルスが問題となるおそれがあるため、これを不活化または除去する工程が必ず求められるが、熱処理以外に、ウイルスを不活化または除去する胎盤抽出物製造方法は未だ報告されていない。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明の基本的な目的は、界面活性剤および溶剤を用いてウイルスを不活化する段階、紫外線を照射してウイルスを不活化する段階、およびナノフィルターを用いてウイルスを除去する段階よりなる群から選ばれる少なくとも一つの段階を含むことを特徴とする胎盤抽出物製造方法を提供することにある。
【０００４】
本発明の他の目的は、（ｉ）胎盤組織を水性媒質内で粉砕して胎盤溶液を得る段階と、（ii）前記胎盤溶液を液相部分と固相部分に仕分ける段階と、（iii)前記（ii）段階で得た液相部分に界面活性剤および溶剤を添加してウイルスを不活化する段階と、（iv）前記（iii）段階で得た混合溶液から前記界面活性剤および前記溶剤を除去する段階と、（ｖ）前記（iv）段階で得た溶液に紫外線を照射してウイルスを不活性化する段階と、（vi）前記（ｖ）段階の紫外線で照射された溶液をナノフィルターおよび除菌フィルターを用いて濾過し、ウイルスと細菌を除去する段階とを含んでなる、安全かつ有効な胎盤抽出物製造方法を提供することにある。
【０００５】
本発明の別の目的は、上記の方法によって製造される胎盤抽出物、並びにこの胎盤抽出物と薬学的に許容される担体とを含む、哺乳類の更年期障害症状の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
本発明の基本的な目的は、界面活性剤および溶剤を用いてウイルスを不活化する段階、紫外線を照射してウイルスを不活化する段階、およびナノフィルターを用いてウイルスを除去する段階よりなる群から選ばれる少なくとも一つの段階を含むことを特徴とする胎盤抽出物製造方法を提供することにより達成できる。
【０００６】
この方法によれば、従来の技術に係る熱処理工程を採用することなく、胎盤に含まれたウイルスを不活化または除去することができる。本発明の方法において、前記胎盤組織はヒト、豚、馬または羊などの哺乳動物に由来するものであってもよい。
【０００７】
本発明の方法において、前記界面活性剤と溶剤は、細胞膜を融解しながら、細胞膜に結合した成分、例えばタンパク質の活性を不活化しないものを使用することが好ましい。
また、前記界面活性剤はタンパク質を変性させてはならない。前記界面活性剤として非イオン系および両性界面活性剤が使用できる。
【０００８】
より具体的に、前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール）、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン（２３）ドデカノール）、Ｂｒｉｊ−５８（ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）またはＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、またはこれらの組み合わせが例示される。前記界面活性剤は、前記液相部分の体積を基準として０．１ｖｏｌ％〜２ｖｏｌ％程度添加されることが好ましい。また、前記溶剤はＴＮＢＰ(tri-n-butyl phosphate)であることが好ましい。例えば、前記界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、前記溶剤としてＴＮＢＰがそれぞれ０．３％（ｖ／ｖ）および１％（ｖ／ｖ）で含まれてもよい。
【０００９】
本発明の方法において、前記紫外線の照射は、胎盤抽出物に含まれている可能性のあるウイルスを不活化するためのものである。紫外線照射によって、ヒト由来ウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＨＡＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶおよびＰＰＶを不活化することにより、生物物質の汚染をさらに減らすことができる。好ましくは、前記紫外線のエネルギーは１０００Ｊ／ｍ２〜３０００Ｊ／ｍ２であることが好ましい。
【００１０】
本発明の方法において、前記ナノフィルターを用いるナノ濾過工程は、汚染可能性のあるウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＨＡＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶ、ＰＰＶに対する除去および不活化工程の効率性検証のためのものである。前記ナノフィルターの孔径は１５ｍｍ〜３０ｍｍであることが好ましい。
【００１１】
本発明の他の目的は、前述した本発明の方法に対する一つの公的な実施様態として、（ｉ）胎盤組織を水性媒質内で粉砕して胎盤溶液を得る段階と、（ii）前記胎盤溶液を液相部分と固相部分に仕分ける段階と、（iii）前記（ii）段階で得た液相部分に界面活性剤および溶剤を添加してウイルスを不活化する段階と、（iv）前記（iii）段階で得た混合溶液から前記界面活性剤および前記溶剤を除去する段階と、（ｖ）前記（iv）段階で得た溶液に紫外線を照射してウイルスを不活性化する段階と、（vi）前記（ｖ）段階の紫外線で照射された溶液をナノフィルターおよび除菌フィルターを用いて濾過し、ウイルスと細菌を除去する段階とを含んでなる胎盤抽出物製造方法を提供することにより達成できる。
【００１２】
本発明の方法において、前記胎盤組織は、ヒト、豚、馬または羊などの哺乳動物に由来するものでよい。また、本発明において、水性媒質は水、または水を溶媒とする媒質を意味する。前記水性媒質は水またはＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）であることが好ましい。
【００１３】
前記粉砕はブレンダーまたはホモジナイザーを用いて行われる。前記粉砕は胎盤組織を小さい粒子に作ると同時に胎盤組織中の細胞を物理的に溶解させることができる。前記粉砕は胎盤組織を例えば３ｍｍ以下のサイズに作るものでよい。このような粉砕は胎盤組織を小さい粒子に作って胎盤組織中の有用な成分、例えば、タンパク質を媒質中に溶解させる表面積を増加させることができる。前記粉砕された溶液は均質な溶液(homogenous solution)であることが好ましい。前記粉砕は２℃〜８℃で行われることが好ましい。
【００１４】
また、前記胎盤組織を細切した後、水性媒質内で粉砕することもできる。胎盤組織の細切はミンサー(mincer)またはチョッパー(chopper)を用いて行うことができる。このような細切は２℃〜８℃で行われることが好ましい。
【００１５】
前記胎盤組織は、洗浄によって血液が除去されたものを使用することが好ましい。胎盤組織から血液を除去することは、例えば、赤血球溶解バッファ(RBC lysis buffer)を用いて行われてもよい。前記赤血球溶解バッファは、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨＣＯ３およびＥＤＴＡを含有する水溶液、例えば、水１０００ｍＬ中に８．３ｇのＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇのＫＨＣＯ３および１．８ｍＬの５％ＥＤＴＡを含有する水溶液であってもよい。
【００１６】
本発明の方法において、前記（ｉ）段階の後、前記液相部分に含まれた固体を除去するための予備濾過を選択的に行うことができる。前記予備濾過は遠心分離によって行われてもよい。
【００１７】
前記液相部分は水性媒質に溶解性成分が溶解している部分であり、前記固相部分は液相部分を除いた部分である。前記固相部分は細胞残屑(cell debris)と細胞小器官などを含むことができる。前記遠心分離は、例えば１０，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍで行われてもよい。前記液相部分は遠心分離された試料のペレットから分離されるものでよい。分離の後に得られる液相部分を採取し、固相部分は除外される。前記予備濾過段階は孔径０．４μｍ〜０．６μｍのフィルターを用いて行われることが好ましい。このような予備濾過によって、前記液相部分に含まれる不純物を除去することができる。
【００１８】
本発明の方法において、前記界面活性剤と溶剤は細胞膜を溶解させながら、細胞膜に結合した成分、例えばタンパク質の活性を不活化しないものを使用することが好ましい。また、前記界面活性剤はタンパク質を変性させてはならない。前記界面活性剤として非イオン系および両性界面活性剤が使用できる。
【００１９】
より具体的に、前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール）、Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン（２３）ドデカノール）、Ｂｒｉｊ−５８（ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）またはＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、またはこれらの組み合わせが例示される。前記界面活性剤は、前記液相部分の体積を基準として０．１ｖｏｌ％〜２ｖｏｌ％程度添加されることが好ましい。また、前記溶剤はＴＮＢＰ(tri-n-butyl phosphate)であることが好ましい。例えば、前記界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、前記溶剤としてＴＮＢＰがそれぞれ０．３％（ｖ／ｖ）および１％（ｖ／ｖ）で含まれてもよい。
【００２０】
本発明の方法の（iv）段階で、前記液相部分に含まれた界面活性剤と溶剤を除去するために、特定の成分と結合する樹脂を用いて除去するうえ、赤血球（ＲＢＣ）を除去し且つ純度を高めた抽出液を得ることができる。好ましくは、前記（iv）段階はＳＤＲ樹脂(solvent/detergent removal resin)を用いて行われる。
【００２１】
本発明の方法の（ｖ）段階で、紫外線の照射は、前記（iv）段階で得た溶液中に含まれている可能性のあるウイルスを不活化するためのものである。 紫外線の照射によって、ヒト由来ウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＨＡＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶおよびＰＰＶを不活化することにより、生物物質の汚染をさらに減らすことができる。好ましくは、前記紫外線のエネルギーは１，０００Ｊ／ｍ２〜３，０００Ｊ／ｍ２であることが好ましい。
【００２２】
本発明の方法の（vi）段階で、汚染可能性のあるウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＨＡＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶ、ＰＰＶに対する除去および不活化工程の効率性検証のためにナノ濾過(nano-filtration)工程が行われる。そして、極微細フィルター（ナノフィルター）を介して潜在的ウイルス感染から胎盤抽出物の安全性を確保することができる。また、極微細フィルターを介して精製された胎盤抽出物に含まれうる菌を除去することができる。前記ナノフィルターの孔径は１５ｎｍ〜３０ｎｍであることが好ましい。また、前記除菌フィルターの孔径は０．２μｍ〜０．３μｍであることが好ましい。
【００２３】
本発明の別の目的は、上述した方法により製造される胎盤抽出物、およびこの胎盤抽出物と薬学的に許容される担体とを含む、哺乳類の更年期障害症状の予防または治療用薬学的組成物を提供することにより達成できる。前記胎盤抽出物の最終タンパク質濃度は２ｐｇ／ｍｌ〜２０ｐｇ／ｍｇであることが好ましい。
【００２４】
前記「薬学的に許容される担体」は、希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、安定剤および防腐剤よりなる群から選ばれるものである。前記薬学組成物は添加剤をさらに含んでもよい。前記添加剤は香料、ビタミンおよび抗酸化剤が含まれうる。前記担体は薬学的に許容されるものであればいずれでもよい。例えば、希釈剤としては乳糖、コーンスターチ、大豆油、微晶質セルロースまたはマンニトール、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウムまたはタルク、結合剤としてはポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルセルロースであってもよい。また、崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロースカルシウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、ポラクリルリンカリウムまたはクロスポビドン、甘味剤としては白糖、果糖、ソルビトールまたはアスパルテーム、安定剤としてはカルボキシメチルセルロースナトリウム、β−シクロデキストリン、白蝋またはキサンタンガム、防腐剤としてはパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸カリウムであってもよい。
【００２５】
前記薬学的組成物は、当該技術分野に公知になっている通常の薬剤学的剤形に製剤化できる。前記薬学的組成物は経口投与製剤、注射剤、坐薬、経皮投与製剤、および経鼻投与製剤の剤形に製剤化されて投与できる。例えば、前記剤形は液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸薬またはエキス剤などの経口投与用剤形であってもよい。
【００２６】
前記薬学的組成物は、更年期障害の改善、予防または治療効果を得るために、有効成分として成人を基準に１日総投与量が前記抽出物の形で０．１ｇ／ｋｇ〜１００ｇ／ｋｇ、０．１ｇ／ｋｇ〜５０ｇ／ｋｇ、または０．１ｇ／ｋｇ〜３０ｇ／ｋｇとなるように投与する。前記投与量は、治療または予防しようとする更年期障害の改善の種類、疾病の進行程度、投与経路、性別、年齢、体重などに応じて適切に増減できる。前記更年期障害の改善は更年期障害全体の改善であってもよい。前記哺乳動物はヒトであってもよい。
［発明の効果］
本発明の胎盤抽出物を製造する方法によれば、胎盤組織中の生理活性成分を含む胎盤抽出物を安全かつ有効に製造することができる。胎盤組織中の天然活性成分を不活化することなく抽出することができ、潜在的なウイルスの汚染を完全に除去することができる。
【００２７】
本発明の胎盤抽出物によれば、胎盤組織中の天然生理活性成分を含むことができる。
本発明の薬学組成物によれば、哺乳動物の更年期症状を予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施例３で本発明の胎盤抽出物を投与した場合におけるヌードマウスの子宮および膣の重量変化を示す図である。
【図２】本発明の実施例３で本発明の胎盤抽出物を投与した場合におけるヌードマウスの総コレステロールおよびＩＰの変化を示す図である。
【図３】本発明の実施例３で本発明の胎盤抽出物を投与した場合におけるヌードマウスの子宮および皮膚の厚さ変化を示す図である。
【図４】本発明の実施例３で本発明の胎盤抽出物を投与した場合におけるヌードマウスの膣表皮の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、下記の実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、下記の実施例についての説明は本発明の具体的な実施様態を特定して説明するものに過ぎず、本発明の権利範囲を限定または制限解釈するものではない。
実施例１．ヒト胎盤組織からの胎盤抽出物の製造
冷凍したヒト胎盤組織を２℃〜８℃で解凍させた。解凍した胎盤組織５ｋｇを５０Ｌの注射用水で洗浄した。洗浄によって、胎盤組織の外部に露出した血液を一部除去した。また、胎盤組織から臍帯と羊膜を除去した。次いで、胎盤組織を、ミキサーを用いて細切した。細切した結果、粒径３ｍｍ以下の粒子からなる胎盤組織を得た。
【００３０】
細切および洗浄された胎盤組織をホモジナイザー（ＩＫＡ社製）を用いて、２℃〜８℃で前記細切された胎盤組織体積の３倍に該当するＰＢＳバッファ（水１Ｌ中の４ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．５７５ｇのＮａ２ＨＰＯ４および０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４）の中で粉砕し、粉砕された胎盤組織溶液を得た。こうして得た溶液は、実質的に均質な溶液であった。
【００３１】
次に、前記粉砕された溶液を遠心分離器（ハンイル科学産業製）を用いて、１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。遠心分離の後、上澄み液を回収して２℃〜８℃で保管し、ペレットを除去した。
【００３２】
約１２Ｌの前記上澄み液を０．４５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）によって予備濾過して精製液を得た。予備濾過したタンパク質混合物に、濃度が１ｖｏｌ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．３ｖｏｌ％ ＴＮＢＰとなるように各界面活性剤と溶剤を添加した後、２℃〜８℃で３０分間静置した。その後、界面活性剤と溶剤を除去するために、ＳＤＲレジン(solvent-Detergent Removal Resin)を用いてＳ／Ｄ除去工程を行い、ＲＢＣを除去し且つ純度を高める工程を行った。
【００３３】
こうして得た混合物を、ＵＶｉｖａｔｅｃｈ社製のＵＶＣ装備を用いて、３０００Ｊ／ｍ２のエネルギーで紫外線(UV-C irradiation)を通過させ、通過した溶液に対して汚染可能性のあるウイルスに対する除去および不活化工程の効率性検証のためにナノフィルター（Ｐａｌｌ社製）を用いて濾過によって精製した。
【００３４】
前記濾過工程の後、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて菌を除去する目的で精製し、最終胎盤抽出物を得た。
実施例２．動物実験の結果
（１）胎盤抽出物の効能分析
本実施例では、雌ヌードマウス（Ｍｏｕｓｅ／ＣａｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎｌ ｎｕ／ＣｒｌｊＯｒｉ）の卵巣を切除（Ovariectomy、ＯＶＸ）して更年期を誘発した後、胎盤由来試験物質を繰り返し皮下投与して試験物質の更年期改善効果を評価するために、臓器重量測定、血清生化学分析および組織病理分析を行った。
【００３５】
（２）胎盤抽出物の投与
Ｍｏｕｓｅ／ＣａｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎｌ ｎｕ／ＣｒｌｊＯｒｉヌードマウスは、免疫性に劣る特性を考慮して飼育環境を無菌状態にして検疫および馴化を経た後、個体別体重を測定した。馴化期間中に体重増加および一般症状に異常がない健康な動物を選抜し、群の分離を行った。群の構成は下記表１のとおりである。
【００３６】
【表１】
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Ｇ１は対照群として非卵巣切除仮想手術を行い、Ｇ２〜Ｇ６群は卵巣切除手術を施して更年期を誘発した。３週の回復および更年期誘発期間が経過した後、Ｇ２群は生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）を投与し、Ｇ３群は低用量の試験物質、Ｇ４群は中用量の試験物質、Ｇ５群は高用量の試験物質、Ｇ６群は陽性対照群として日本から輸入の更年期症状治療用胎盤医薬品「ｍｅｌｓｍｏｎ」を皮下投与し始めた。投与の際には、マウスの体重を投与直前に測定して個体別投与液量（０．１５ｍｌ／ｋｇ）に換算し、週３回４週間総１２回投与した。試験終了の際に、ＣＯ２ガス吸込法を用いて安楽死させた後、採血して血清生化学測定を実施した。その後、剖検して肉眼的観察記録、臓器重量測定および組織病理的検査を行った。
【００３７】
（３）臓器重量および臨床病理分析
全ての個体から死亡個体は観察されなかったうえ、体重も正常的な増加曲線を示した。卵巣を除去した群、および卵巣除去の後に試験物質および陽性対照物質を投与した群は正常群に比べて体重が高く観察された。
【００３８】
臓器重量測定の結果、Ｇ２（ＯＶＸ＋ｓａｌｉｎｅ）と比較して試験物質投与群の子宮および膣が用量相関的に増加する傾向が観察されたとともに、Ｇ６（ＯＶＸ＋ｍｅｌｓｍｏｎ）でも増加する傾向が観察された。Ｇ１（Ｓｈａｍ＋ｓａｌｉｎｅ）と比較してＧ２の子宮および膣の重量は有意的に（ｐ＜０．０１）低く観察された（図１を参照）。膀胱および腹部脂肪の場合、群間に有意的な増減は観察されなかった。
【００３９】
臨床病理測定の結果、総コレステロール(total cholesterol)の場合は、Ｇ２（ＯＶＸ＋ｓａｌｉｎｅ）と比較してＧ１（ｓｈａｍ＋ｓａｌｉｎｅ）、Ｇ５（ＯＶＸ＋試験物質１３．３３μｇ／ｋｇ）およびＧ６（ＯＶＸ＋ｍｅｌｓｍｏｎ）で有意的に（ｐ＜０．０５）低く観察されたとともに、試験物質投与群で用量相関的に低い傾向が観察された。ＩＰおよびＡＬＰ項目の場合は、Ｇ２と比較してＧ１で有意的に低く（ｐ＜０．０５）観察されたとともに、試験物質投与群の場合は、統計学的有意性は観察されなかったが、用量相関的に低い傾向が観察された（図２参照）。
【００４０】
（４）組織病理検査の分析
剖検動物の子宮および皮膚に対して顕微鏡で写真を撮影し、イメージ分析を行った。Ｇ２（ＯＶＸ＋ｓａｌｉｎｅ）と対比し、試験物質投与群の子宮の厚さが用量相関的に増加する傾向が観察されたとともに、Ｇ５（ＯＶＸ＋試験物質１３．３３μｇ／ｋｇ）およびＧ６（ＯＶＸ＋ｍｅｌｓｍｏｎ）で有意的な変化（ｐ＜０．０５）が観察された。Ｇ１（ｓｈａｍ＋ｓａｌｉｎｅ）と比較して、Ｇ２の子宮の厚さは有意的に（ｐ＜０．０１）低く観察された（図３参照）。
【００４１】
皮膚の場合、Ｇ２（ＯＶＸ＋ｓａｌｉｎｅ）と対比して試験物質投与群の皮下組織の厚さ(subcutis thickness)が用量相関的に増加する傾向が観察されたとともに、Ｇ５（ＯＶＸ＋試験物質１３．３３μｇ／ｋｇ）では有意的な変化（ｐ＜０．０５）が観察された。Ｇ１（ｓｈａｍ＋ｓａｌｉｎｅ）と比較し、Ｇ２の皮下組織の厚さでは大きな差が観察されなかった（図３参照）。
【００４２】
海綿骨組織体積(trabecular bone volume)の場合、更年期誘発期間が３ヶ月以上のモデルから効果を観察することが可能な項目であるが、自社試験の場合、誘発期間が短くて群間の有意的な差は観察されなかったが、試験物質投与群で海綿骨組織体積が増加する傾向が観察された。
【００４３】
膣の場合、膣上皮の角質層が消失して上皮が薄くなる膣上皮の萎縮程度がＧ２（ＯＶＸ＋ｓａｌｉｎｅ）では顕著に観察されたが、これに対し、試験物質投与群およびｍｅｌｓｍｏｎを投与した群では弱く観察された（図４参照）。
【００４４】
実施例３．胎盤抽出物製造工程によるウイルスの不活化および除去の検証
（１）溶剤（Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理工程によるウイルス不活化の検証
ウイルス貯蔵溶液(stock solution)を融解して直ちに力価測定(titration)を行い、これをＣｏｎ．Ｔｉｔｅｒと命名した。ヒト胎盤抽出物４ｍＬに５ｍＬのウイルスをスパイキング(spiking)した。ウイルスのスパイキングされた試料から５ｍＬを採取して直ちに力価測定し、これをスパイキングされたタイター(titer)と称した。残り４５ｍＬの試料に１０×Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ［３％トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］５ｍＬを添加して最終トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート(tri(n-butyl)phosphate)とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の濃度が０．３％と１％となるようにした。添加したトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がウイルスのスパイキングされた試料と混合されるように攪拌しながら、５分、１０分、３０分、６０分の後にそれぞれ５ｍＬの試料を採取して直ちに力価測定した。このように行われた結果に基づいて、溶剤（Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理工程によるウイルス不活化の程度を照射量に応じて計算した。
【００４５】
胎盤抽出物のウイルス安全性を検証するために、胎盤抽出物製造工程中の溶剤（Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理工程でヒト由来ウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＢＨＶおよびＢＶＤＶ不活化効果を検証した。
【００４６】
溶剤処理工程でＨＩＶ、ＢＨＶおよびＢＶＤＶが検出されないことから、いずれも検出限界以下に不活化されたことが分かった。２回の独立的な実験で、溶剤処理工程によるＨＩＶログクリアランスファクタ(log clearance factor)は≧２．７３であり、ログリダクションファクタ(log reduction factor)は≧２．４４であった。ＢＨＶログクリアランスファクタは≧３．４７であり、ログリダクションファクタは≧３．０５であった。ＢＶＤＶログクリアランスファクタは≧３．６３であり、ログリダクションファクタは≧３．５０であった。
【００４７】
このような結果より、胎盤抽出物製造工程中の溶剤処理工程によってウイルスが効果的に不活化されると判断される。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
【表３】
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（２）ＵＶＣ処理工程によるウイルス不活化の検証
ＵＶＣ照射工程は、ＵＶｉｖａｔｅｃ Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。ＵＶＣマニュアルにしたがって機械装置を取り付け、設置、洗浄および貯蔵過程(Installation, Cleaning & Storage procedure)によって蒸留水を充填した。１５Ｌ／ｈｒの速度で１０分間、２．５Ｌの蒸留水で機械装置を洗浄した。１５Ｌ／ｈｒの速度で１０分間２．５Ｌの１Ｍ ＮａＯＨで機械装置を洗浄しながら殺菌した後、２０分間１Ｍ ＮａＯＨを循環させた。機械装置内に充填されている１Ｍ ＮａＯＨ溶液を除去した後、１５Ｌ／ｈｒの速度で１０分間２．５ＬのＰＢＳで機械装置を洗浄した。ＵＶランプを活性化させた後、ＵＶの強さ(intensity)を１，０００Ｊ／ｍ２、２，０００Ｊ／ｍ２または３，０００Ｊ／ｍ２に設定した。１００ｍＬのＰＢＳで機械装置を循環させた後、約１５分の後にＵＶの強さは所定の値に到達した。ＵＶの強さが所定の値に到達した後、ＰＢＳに入っている試料注入チューブ(inlet tube)を、１００ｍＬのウイルスがスパイキングされた工程試料入りの容器に移した。ウイルス不活性化工程モードを開始した後、スパイキングされた工程試料１００ｍＬが機械装置内に流れ込み次第、試料注入チューブをさらに１００ｍＬのＰＢＳ入りの容器に移した。ＵＶＣ機械装置を介して順次ＰＢＳ１００ｍＬ、ウイルスのスパイキングされた工程試料１００ｍＬ、およびＰＢＳ１００ｍＬが流れ出た。最初の流れ出るＰＢＳ５０ｍＬを捨てた後、約２００ｍＬの試料を受け取って直ちに力価測定を行った。
【００５０】
ウイルス貯蔵溶液を融解して直ちに力価測定分析(titration assay)を行い、これをＣｏｎ．Ｔｉｔｅｒと命名した。ＵＶ照射工程開始物質に１０％のウイルス貯蔵溶液を添加した。この際、一部をサンプリング(sampling)して直ちに力価測定分析を行い、これをスパイキングされたタイヤー(spiked titer)と称した。ウイルスの添加された試料１００ｍＬに製造社の処理条件に応じてＵＶＣ工程を施しながら、サンプリングを行って直ちに力価測定を行った。このように行われた結果に基づき、ＵＶＣ処理工程によるウイルス不活化の程度を照射量に応じて計算した。
【００５１】
胎盤抽出物のウイルス安全性を検証するために、胎盤抽出物製造工程中のＵＶＣ照射工程でヒト由来ウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＨＡＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶおよびＰＰＶ不活化効果を検証した。
【００５２】
ＵＶＣ照射工程でＨＩＶ、ＨＡＶ、ＢＶＤＶおよびＰＰＶが検出されないことから、検出限界以下に不活化されたことが分かった。ＢＨＶの場合、ＵＶＣ照射の後にタイター(titer)が急激に低くなることを確認することができた。このような結果は、ＵＶＣによってウイルスが完全に不活化されることを示す。２回の独立的な実験において、ＵＶＣ照射工程によるＨＩＶログクリアランスファクタは≧４．１８であり、ログリダクションファクタは≧３．８９であった。ＢＨＶログクリアランスファクタは５．３１であり、ログリダクションファクタは５．３０であった。ＢＶＤＶログクリアランスファクタは≧６．０２であり、ログリダクションファクタは≧５．９６であった。ＰＰＶログクリアランスファクタは≧４．５０であり、ログリダクションファクタは≧４．１８であった。ＨＡＶログクリアランスファクタは≧５．３４であり、ログリダクションファクタは≧５．２７であった。
【００５３】
このような結果より、胎盤抽出物製造工程中のＵＶＣ照射工程によってウイルスが効果的に不活化されると判断される。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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（３）ナノ濾過工程(Nano-filtration)によるウイルス除去の検証
胎盤抽出物製造工程中のナノ濾過工程でウイルス除去および不活化効果を検証した。
【００５６】
ウイルス貯蔵溶液を融解して直ちに力価測定分析を行い、これをＣｏｎ．Ｔｉｔｅｒと命名した。検体溶液にウイルスストック(stock)を適切に希釈した希釈液を作った。ウイルスをスパイキングした直後に、一部をサンプリングして直ちに力価測定分析を行い、これをスパイキングされたタイター(spiked titer)と称した。比較試験用検体(Hold sample)のタイターは、ウイルスをスパイキングしたサンプルを工程中に常温に放置した後、ウイルスを定量した。ウイルスフィルターは、予めプリウェット(pre-wetting)した後、ウイルスフィルターの表面をバッファでコートさせ、ウイルスフィルター濾過工程を行う準備をした。事前作業済みのウイルスフィルターカートリッジにウイルスのスパイキングされた検体をロードし、製造社の工程による圧力で溶液を濾過する。濾過された溶液の体積を測定し、ナノ濾過工程後の濾過液のウイルスタイターを測定した。
【００５７】
胎盤抽出物のウイルス安全性を検証するために、胎盤抽出物製造工程中のナノ濾過工程でヒト由来ウイルスおよびモデルウイルスであるＨＩＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶ、ＨＡＶおよびＰＰＶ除去効果を検証した。ナノ濾過工程でＨＩＶ、ＢＨＶ、ＢＶＤＶ、ＨＡＶおよびＰＰＶが検出されなないことから、検出限界以下に前記ウイルスが除去されたことが分かった。
【００５８】
前記２回の独立的な実験で、ナノ濾過工程によるＨＩＶログクリアランスファクタは≧３．６６であり、ログリダクションファクタは≧３．９６であった。ＢＨＶログクリアランスファクタは≧４．４５であり、ログリダクションファクタは≧４．５９であった。ＢＶＤＶログクリアランスファクタは≧５．８６であり、ログリダクションファクタは≧５．４９であった。ＨＡＶログクリアランスファクタは≧５．６３であり、ログリダクションファクタは≧５．４６であった。ＰＰＶログクリアランスファクタは≧５．１９であり、ログリダクションファクタは≧４．９８であった。
【００５９】
このような結果から、胎盤抽出物製造工程中のナノ濾過工程によってウイルスが効果的に除去されると判断される。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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