(57)【要約】  本発明は、原則として、アルカロイド、特に、シクロクラビンの組換え製造の分野に関する。本発明は、シクロクラビンの生合成に関与する酵素の遺伝子クラスターに関する、ポリヌクレオチド並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞を提供する。さらに、本発明に包含されるシクロクラビンの製造方法に利用できる、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15又は17に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列;
b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16又は18に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
c)配列番号1、3、7、9、11、13、15若しくは17に示される核酸配列と少なくとも70%同一である核酸配列又は配列番号5に示される核酸配列と少なくとも80%同一である核酸配列であって、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする、核酸配列;
d)シクロクラビン合成に関与し、配列番号2、4、8、10、12、14、16若しくは18に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一である、又は配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;及び
e)ストリンジェントな条件下でa)からd)のいずれか一つとハイブリダイズできる核酸配列であって、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする、核酸配列
からなる群から選択される1以上の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
(i)配列番号30若しくは31に示される核酸配列、
(ii)配列番号30若しくは31と少なくとも70%同一であり、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記ポリペプチドは、配列番号2、4、8、10、12、14、16若しくは18に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であり、配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、核酸配列、又は
(iii)ストリンジェントな条件下で(i)若しくは(ii)の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列
を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４】
発現ベクターである、請求項3に記載のベクター。
【請求項５】
請求項1若しくは2に記載のポリヌクレオチド又は請求項3若しくは4に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
細菌細胞、菌細胞、酵母細胞、植物細胞又は藻類細胞である、請求項5に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの製造方法であって、
a)前記ポリペプチドの産生を可能にさせる条件下で請求項5又は6に記載の宿主細胞を培養するステップ;及び
b)ステップa)の宿主細胞から前記ポリペプチドを得るステップ
を含む、方法。
【請求項８】
請求項1若しくは2に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、又は請求項7に記載の方法によって得られ得る、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項8に記載のポリペプチドと特異的に結合する、抗体。
【請求項１０】
a)宿主細胞においてシクロクラビンの産生を可能にさせる条件下で請求項5又は6に記載の宿主細胞を培養するステップ;及び
b)前記宿主細胞から前記シクロクラビンを得るステップ
を含む、シクロクラビン又はその前駆体の製造方法。
【請求項１１】
シクロクラビンの前記前駆体が、DMAT、メチル-DMAT、カノクラビンI、カノクラビンアルデヒド、アグロクラビン及びフェスツクラビンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
シクロクラビン又はその前駆体の製造のための請求項1若しくは2に記載のポリヌクレオチド、請求項3若しくは4に記載のベクター又は請求項5若しくは6に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１３】
シクロクラビンの前記前駆体が、DMAT、メチル-DMAT、カノクラビンI、カノクラビンアルデヒド及びアグロクラビン及びフェスツクラビンからなる群から選択される、請求項12に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基本的には、アルカロイド、特に、シクロクラビンの組換え製造の分野に関する。本発明は、シクロクラビンの生合成に関与する酵素の遺伝子クラスターに関する、ポリヌクレオチド並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞を提供する。さらに、本発明に包含されるシクロクラビンの製造方法に利用できる、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供される。
【背景技術】
【０００２】
シクロクラビンが属するプレニル化インドールアルカロイドは、プレニル二リン酸及びトリプトファン又はその前駆体に由来するハイブリッド型天然物であり、糸状菌、特に、子嚢菌のペニキリウム(Penicillium)及びアスペルギルス(Aspergillus)属に広く分布する。こうした化合物は、種々の化学構造及び生物学的活性を有する天然物の群である。近年、それらの生合成に関して著しい進展があった。それは、ゲノム配列からの生合成遺伝子クラスターの特定並びに分子生物学的及び生化学的調査によるものである。さらに、一連のプレニル化インドール誘導体は、過剰産生及び精製された酵素を使用した化学酵素合成によって生成されてきた。これらは、陸生及び海洋生物、特に、子嚢菌のペニキリウム及びアスペルギルス属に広く分布しており、幅広い構造多様性を示す。これらの化合物は、その非プレニル化芳香族の前駆体とは異なる生物学的及び薬理学的活性を持っている場合が多い。
【０００３】
麦角アルカロイドは、種々の構造及び生物学的活性を持つインドール誘導体の複合ファミリーである(Flieger、1997年、Folia Microbiol(Praha)42:3〜30ページ; Schardl、2006年、Chem Biol 63:45〜86ページ)。麦角アルカロイドは、二つの目の菌及び三つの科の植物によって産生される。重要な生成者は、クラウイケプス(Claviceps)、ペニキリウム及びアスペルギルス属の菌である(Flieger、1997年、上記文献; Schradl、上記文献)。天然の麦角アルカロイド及びその半合成誘導体は共に、広く現代医学に使用されており、子宮収縮活性、血圧の調節、下垂体ホルモン分泌の制御、偏頭痛予防並びにドーパミン作動性及び神経遮断作用などの広範囲の薬理学的活性を示す(de Groot、1998年、Drugs 56:523〜535ページ; Haarmann、2009年、Mol Plant Pathol 10:563〜577ページ; Schardl、2006年、上記文献)麦角アルカロイドは、その構造的な特徴により二種類、すなわち、D-リゼルグ酸のアミド誘導体及びクラビンアルカロイドに分けることができる(Flieger、1997年、上記文献)Groger、1998年、Alkaloids Chem Biol 50:171〜218ページ)。
【０００４】
第1の群のメンバーは、一般にリゼルグ酸及びペプチド部分からなる、例えば、エルゴタミンである。シクロクラビン、アグロクラビン及びフミガクラビンのようなクラビン又はカノクラビン-I及びそのアルデヒドのようなクラビンの前駆体は、単に、ペプチド部分を含まない三環系又は四環系からなる。クラビン型アルカロイド、フミガクラビンは、ペニキリウム及びアスペルギルス、例えば、A.フミガツス(fumigatus)によって産生されるが(Flieger、1997年、上記文献)、麦角菌科、例えば、C.プルプレア(purpurea)によっては産生されない(Flieger、1997年、上記文献)、反対に、エルゴペプチン(ergopeptine)は、C.プルプレアによって産生されるが、A.フミガツスによっては産生されない。前駆体の比較から、その生合成経路の初期段階は、A.フミガツス及びC.プルプレアによって共有されているが、経路の後のステップは、二つの菌分類群で異なる可能性が非常に高いことが示唆される(Li、2006年、Chembiochem 7:158〜164ページ; Panaccione、2005年、FEMS Microbiol Lett 251:9〜17ページ; Schardl、2006年、上記文献)。
【０００５】
生物情報学的アプローチを用いることで、A.フミガツス、Af293及びA1163のゲノムにおいてフミガクラビンCの生合成遺伝子クラスターが特定された(Li、2006年、Chembiochem 7; Steffan、2009年、Curr Med Chem 16:218〜231ページ; Unsold、2005年、Microbiology 151:1499〜1505ページ)。このクラスターの発見により、C.プルプレア(Tudzynski、1999年、Mol Gen Genet 261:133〜141ページ)とA.フミガツスとのクラスターを比較することによって、麦角アルカロイド生合成の初期段階に関する候補遺伝子を特定するための都合のよい方法がもたらされる。A.フミガツスのフミガクラビン生合成遺伝子クラスターとC.プルプレアの麦角アルカロイド生合成遺伝子クラスターに七つのオルソロガス遺伝子が見つかった(Panaccione、2005年、FEMS Microbiol Lett 251:9〜17ページ; Unsold、2005年、Microbiology 151:1499〜1505ページ)。これら七つの遺伝子は、A.フミガツスにおけるフミガクラビンの生合成及びC.プルプレアにおける麦角アルカロイドの生合成の共通ステップを触媒する酵素をコードすると提言されている(Unsold、2006年、Chembiochem 7:158〜164年)。現在まで、機能的に特定されたのは、麦角アルカロイドの生合成の初期のステップに関与する遺伝子、すなわち、クラウイケプス・フシフォルミス(fusiformis)及びA.フミガツスのdmaW(fgaPT2とも称される)並びにA.フミガツスのfgaMTの二つに過ぎない(Coyle、2005年、FEMS Microbiol Lett 251:9〜17ページ; Unsold、2005年、Microbiology 151:1499〜1505)。DmaW及びFgaPT2は、C4位のL-トリプトファンのプレニル化を触媒して、結果として4-ジメチルアリルトリプトファン((S)-4-(3-メチル-2-ブテニル)-トリプトファン、4-DMAT)を生成し、それは、その後、N-メチルトランスフェラーゼ、FgaMTによって4-ジメチルアリル-L-アブリン(4-DMA-L-アブリン)に変換される(Rigbers、2008年、J Biol Chem 283:26859〜26868)。1970年代及び1980年代の、同位体標識された前駆体を用いたクラウイケプス属の種の培養における供給実験により、カノクラビン-I及びそのアルデヒドは4-DMA-L-アブリンのアグロクラビンへの変換における中間体であることが示唆された(Floss、1974年、J AM Chem Soc 96:1898〜1909ページ; Hassam、1981年、J Nat Prod 44:756〜758ページ)。しかしながら、過剰産生及び精製された酵素又は生成者からの粗製酵素抽出物によるカノクラビン-Iのカノクラビン-Iアルデヒドへの酵素変換については未だ証明されていない。麦角アルカロイド生成者の粗製抽出物によるカノクラビン-Iのアグロクラビンへの直接変換(Sajdl、1975年、Folia Microbiol(Praha)20:365〜367ページ)は、少なくとも三つの異なる酵素の触媒の結果が合わさったものであると解釈された(Schardl、上記文献)。カノクラビン-Iのカノクラビン-Iアルデヒドへの変換は、A.フミガツスにおけるフミガクラビン及びC.プルプレアにおけるエルゴペプチンの生合成に関与する。
【０００６】
前述のクラスターに共通する、機能が不明な残りのWve遺伝子の検証により、この反応に関する一つの候補遺伝子、すなわち、A.フミガツス、Af293におけるfgaOx2(=AFUA_2G18000、GenBankにおいては)及びC.プルプレアにおけるcpox2(easD)が明らかになった。この遺伝子は、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ/レダクターゼ(SDR)であると提言されている(Schardl、上記文献; Unsold、上記文献)。実際に、fgaDHの推定される産物の配列を検証することにより、classical SDRの典型的な補酵素結合モチーフ、TGxxx[AG]xG(アミノ酸12〜19がTGGASGIG)及び活性部位モチーフ、YxxxK(アミノ酸166〜170がYGTSK)の存在が明らかにされた(Kavanagh、2008年、Cell Mol Life Sci 65:3895〜3906ページ)。しかしながら、この文献からは、麦角アルカロイドの生合成における機能の証明もその役割の示唆も見つけられない。オルソロガス遺伝子、AFUB_033690もまた、A.フミガツス、A1163において特定された。A.フミガツス、Af293のfgaDHは、おそらく、67bpのイントロンによって分断された、それぞれ589及び197bpの二つのエクソンからなる。
【０００７】
イポメア・ヒルデブランドチイ（Ipomoea hildebrandtii）の種子からのシクロクラビンの単離は、Sandoz研究グループによって早くも1969年には公表された(Stauffacher、1969年、Tetrahedron、25(24)、5879〜87ページ)。不斉炭素原子の相対及び絶対立体配置を含む構造の解明も、そのメトブロミド誘導体のX線解析よって行われた。しかしながら、分子の絶対立体配置については、Sandozグループによって示された構造に対応する適切な絶対立体配置(5R,8S,10S)の代わりに5R,8R,10Rと不適切に記載されていた。後に、他の研究グループ3は、異なるアスペルギルス及びアルギレイア(Argyreia)菌の他の麦角アルカロイドの中からシクロクラビンを発見した。現在までに、シクロクラビンを除くすべてのクラビン型アルカロイドが全合成によって既に調製されてきた4。今までのところ、クラビン型アルカロイドに著しい生物学的活性は見つかっていないが、そのエルゴリン骨格の炭素原子8、9及び10が、9、10二重結合の代わりにシクロプロパン環を形成する、この特徴的な環系の全合成には、相当な難題が存在する。
【０００８】
クラビンアルカロイドファミリーのうちこれまでの合成されていなかった最後のメンバーであるシクロクラビンが調製された。Et 3-メチルアミノ-プロピオナートを使用したアルキル化ステップにより4-ブロモ-ユーレケトンから開始し、続く、分子内アルドール縮合、エステル基のMe基への変換、最後に8，9二重結合のシクロプロパン化により、6ステップからなるラセミのシクロクラビンの全合成がもたらされる。シクロクラビンは、アルカロイドファミリーの薬学的に活性な別のLSDタイプの向精神薬を開発するための興味深い出発材料になるであろう。しかしながら、シクロクラビンの生合成経路は解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Flieger、1997年、Folia Microbiol(Praha)42:3-30
【非特許文献２】Schardl、2006年、Chem Biol 63:45-86
【非特許文献３】de Groot、1998年、Drugs 56:523-535
【非特許文献４】Haarmann、2009年、Mol Plant Pathol 10:563-577
【非特許文献５】Groger、1998年、Alkaloids Chem Biol 50:171-218
【非特許文献６】Li、2006年、Chembiochem 7:158-164
【非特許文献７】Panaccione、2005年、FEMS Microbiol Lett 251:9-17
【非特許文献８】Unsold、2005年、Microbiology 151:1499-1505
【非特許文献９】Tudzynski、1999年、Mol Gen Genet 261:133-141
【非特許文献１０】Panaccione、2005年、FEMS Microbiol Lett 251:9-17
【非特許文献１１】Unsold、2005年、Microbiology 151:1499-1505
【非特許文献１２】Coyle、2005年、FEMS Microbiol Lett 251:9-17
【非特許文献１３】Unsold、2005年、Microbiology 151:1499-1505
【非特許文献１４】Rigbers、2008年、J Biol Chem 283:26859-26868
【非特許文献１５】Floss、1974年、J AM Chem Soc 96:1898-1909
【非特許文献１６】Hassam、1981年、J Nat Prod 44:756-758
【非特許文献１７】Sajdl、1975年、Folia Microbiol(Praha)20:365-367
【非特許文献１８】Kavanagh、2008年、Cell Mol Life Sci 65:3895-3906
【非特許文献１９】Stauffacher、1969年、Tetrahedron、25(24)、5879-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の根底を成す技術的課題は、シクロクラビン又はその前駆体の組換え製造のための手段及び方法の提供であると考えられる。この技術的課題は、請求項及び本明細書の以下で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、
a)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15又は17に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列;
b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16又は18に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
c)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15若しくは17に示される該核酸配列と少なくとも70%同一である核酸配列又は配列番号5に示される該核酸配列と少なくとも80%同一である核酸配列であって、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする、核酸配列;
d)シクロクラビン合成に関与し、配列番号2、4、8、10、12、14、16若しくは18に示される該アミノ酸配列と少なくとも70%同一である又は配列番号6に示される該アミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;及び
e)ストリンジェントな条件下でa)からd)のいずれか一つとハイブリダイズできる核酸配列であって、前記核酸配列は、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする、核酸配列
からなる群から選択される1以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】シクロクラビン遺伝子クラスターの概略図である。
【図２】シクロクラビンの生合成経路図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明に従って使用される場合、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用される場合、シクロクラビン合成は、シクロクラビンの生合成のあらゆるステップを包含する。したがって、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドは、基質をシクロクラビン又はシクロクラビン生合成において生じるあらゆる前駆体のいずれかに変換することもある。上記シクロクラビンの合成及びそのために必要とされる触媒作用についての詳細は、本明細書中の別の場所で詳しく開示する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、生物、好ましくは、本明細書中の別の場所で詳述するような宿主細胞における発現時にシクロクラビン又はその前駆体の量を増加させることができるであろう。そのような増加は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを発現しない対照生物と比較した場合に、統計学的に有意なものである。増加が有意であるか否かは、例えば、スチューデントのt-検定などの当該技術分野において周知の統計的検定によって確認できる。より好ましくは、この増加とは、上記対照と比較して、シクロクラビン又はその前駆体の量が少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%又は少なくとも30%増加することである。シクロクラビン又はその前駆体の量を測定するための適切なアッセイについては、本明細書に共に記載される実施例に記載されている。
【００１４】
上に記載のとおり、本明細書中で使用される場合、「シクロクラビン合成」という用語は、シクロクラビンの生合成のあらゆるステップを包含する。アミノ酸のトリプトファンから出発するシクロクラビン合成に必要とされるステップは、(i)好ましくは、DMA-PPiを使用したDMATシンターゼによって触媒されるトリプトファンのDMAT(4-ジメチルアリルトリプトファン((S)-4-(3-メチル-2-ブテニル)-トリプトファン)への変換、(ii)好ましくは、DMATメチルトランスフェラーゼによって触媒されるDMATのメチル-DMATへの変換、(iii)好ましくは、カノクラビンシンターゼによって触媒されるメチル-DMATのカノクラビンIへの変換、(iv)好ましくは、カノクラビンIデヒドロゲナーゼによって触媒されるカノクラビンIのカノクラビンアルデヒドへの変換、(v)好ましくは、カノクラビンシクラーゼ及び旧黄色酵素によって触媒されるカノクラビンアルデヒドのアグロクラビン又はフェスツクラビンへの変換及び(vi)アグロクラビン又はフェスツクラビンのシクロクラビンへの変換が好ましい。したがって、本発明により言及されるようなシクロクラビンの前駆体は、DMAT、メチル-DMAT、カノクラビンI、カノクラビンアルデヒド、アグロクラビン及びフェスツクラビンからなる群から選択される。
【００１５】
より好ましくは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号9に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、トリプトファンのDMATへの変換を行い、好ましくは、DMATシンターゼ活性を示す(DmaW)。
【００１６】
配列番号16に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号15に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、DMATのメチル-DMATへの変換を行い、好ましくは、DMATメチルトランスフェラーゼ活性を示す(EasF)。
【００１７】
配列番号12に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号11に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、メチル-DMATのカノクラビンIへの変換を行い、好ましくは、カノクラビンシンターゼ活性を示す。
【００１８】
配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号5に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、カノクラビンIのカノクラビンアルデヒドへの変換を行い、好ましくは、カノクラビンIデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【００１９】
配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号3に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、カノクラビンアルデヒドのアグロクラビン及び  又はフェスツクラビンへの変換を行い、好ましくは、カノクラビンフェスツクラビンシクラーゼ活性を示す。
【００２０】
配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号7に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、アグロクラビン又はフェスツクラビンのシクロクラビンへの変換を行い、好ましくは、シクロクラビンシンターゼ活性を示す。
【００２１】
配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号1に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、アグロクラビン若しくはフェスツクラビン又はシクロクラビンの経路において役目を果たし、好ましくは、調節作用を示す。
【００２２】
配列番号14に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号13に示される核酸配列を有するポリヌクレオチド又はその変異体は、アグロクラビン又はフェスツクラビンのシクロクラビンへの変換を行い、好ましくは、シクロクラビンシンターゼ活性を示す。
【００２３】
上述したようなシクロクラビン合成に関与する  をコードするポリヌクレオチドは、本発明に従って、好ましくは、ボトリオチニア・フケリアナから得られた。しかしながら、オルソログ、パラログ又はその他のホモログがその他の属の種から特定されることもある。好ましくは、それらは、アスペルギルス属の種、クラウイケプス属の種又はペニキリウム属の種などの菌（菌類）から得られる。
【００２４】
したがって、「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明に従って使用される場合、本発明のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログ又はその他のホモログである上記の特定のポリヌクレオチドの変異体をさらに包含する。さらに、本発明のポリヌクレオチドの変異体は、人工的に生成される変異タンパク質も含む。上記変異タンパク質は、例えば、突然変異誘発技術によって生成され、改善若しくは改変された基質特異性を示す酵素又はコドン最適化ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド変異体は、好ましくは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15又は17のいずれか一つに示される上記の具体的な核酸配列に由来し得ることを特徴とする核酸配列を含み、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16又は18のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列によって、少なくとも一つのヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失によって、特徴付けられ、それによって、変異型核酸配列は、依然としてシクロクラビン合成に関与し、特に、変異体がそれに由来する、対応するリード配列(配列番号で示される)に関して、上述したような活性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、本発明による変異型ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにおいて想定されるアミノ酸置換は、活性に全く影響がないか又はほとんど影響がない改変である。そのような保存的置換は、ポリペプチドの活性が本質的に変わらないような方法で、一つのアミノ酸残基又は複数のアミノ酸残基が化学的に類似しているが異なるアミノ酸残基により置換されたことを意味する。特定の疎水性アミノ酸残基が別の疎水性アミノ酸残基で置換される場合及び特定の極性アミノ酸残基が別の極性アミノ酸残基で置換される場合が例として挙げられる。そのような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、類似のアミノ酸として当該技術分野において知られている。実際の例としては、非極性(疎水性)アミノ酸としてアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなど及び極性(中性)アミノ酸としてグリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、シスチンなどが挙げられる。正の電荷を持つ(塩基性)アミノ酸としてアルギニン、ヒスチジン、リシンなどが挙げられ、負の電荷を持つ(酸性)アミノ酸としてアスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。変異体とは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の特定の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含する。こうしたストリンジェントな条件は、当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク(1989年)、6.3.1〜6.3.6から見つけることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件についての好適な例は、およそ45℃の6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(=SSC)、続いて0.2×SSC中での1回以上の洗浄ステップ、50から65℃の0.1%SDSのハイブリダイゼーション条件である。当業者は、こうしたハイブリダイゼーション条件は、核酸の種類及び例えば、有機溶媒が存在する場合に応じて、緩衝液の温度及び濃度が変動することを知っている。例えば、「���準的なハイブリダイゼーション条件」下では、濃度が0.1から5×SSC(pH7.2)の水性緩衝液において、核酸の種類によって42℃から58℃の間で温度が変動する。上記緩衝液中に有機溶媒、例えば、50%ホルムアミドが存在する場合、標準的な条件下での温度はおよそ42℃である。DNA:DNAハイブリッドについてのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、0.1×SSC、20℃から45℃、好ましくは、30℃から45℃の間である。DNA:RNAハイブリッドについてのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、0.1×SSC、30℃から55℃、好ましくは、45℃から55℃の間である。上記のハイブリダイゼーション温度は、例えば、長さがおよそ100bp(=塩基対)で、G+C含有量が50%のホルムアミドの非存在下の核酸について決定される。上記のテキストブック又は以下のテキストブックなどのテキストブックを参照することによって、当業者には、必要とされるハイブリダイゼーション条件の決定方法がわかる:Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory、1989年; Hames及びHiggins(編)1985年、「Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press、オックスフォード; Brown(編)1991年、「Essential Molecular Biology: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press、オックスフォード。あるいは、ポリヌクレオチド変異体は、混合されたオリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNAの増幅、すなわち、本発明のポリペプチドの保存領域に対する縮重プライマーを用いたDNAの増幅などのPCRに基づく技術によって得られ得る。本発明のポリペプチドの保存領域は、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列又はポリペプチドのアミノ酸配列の配列を比較することによって特定してもよい。PCRプライマーとして適したオリゴヌクレオチドと共に適したPCR条件については、本明細書に共に記載の実施例に記載されている。鋳型として、細菌、菌、植物又は動物からのDNA又はcDNAが使用されてもよい。さらに、変異体は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15又は17のいずれか一つに示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み、それによって、変異型核酸配列が、シクロクラビン合成に関与し、特に、変異体の派生元の対応するリード配列(配列番号で示される)に関して上述したような活性を有するポリペプチドを依然としてコードすることになる。さらに、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16又は18のいずれか一つに示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含され、それによって、変異型核酸配列がシクロクラビン合成に関与し、特に、変異体の派生元の対応するリード配列(配列番号で示される)に関して上述したような活性を有するポリペプチドを依然としてコードすることになる。パーセント同一性の値は、好ましくは、アミノ酸又は核酸配列の全範囲にわたって算出される。当業者は、異なる配列を比較するための、さまざまなアルゴリズムに基づく一連のプログラムを利用可能である。好適な実施形態において、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、遠縁のタンパク質についてはBLOSUM45若しくはPAM250スコア行列のいずれか、又は近縁のタンパク質についてはBLOSUM62若しくはPAM160スコア行列のいずれかを使用し、16、14、12、10、8、6若しくは4のギャップ開始ペナルティ及び0.5、1、2、3、4、5若しくは6のギャップエクステンションペンタルティを用いたEMBOSSソフトウェアパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice,P.、Longden,I.及びBleasby,A、Trends in Genetics 16(6)、276〜277、2000年)のneedleプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschアルゴリズム(Needleman、1970年、J. Mol. Biol.(48):444〜453ページ)を使用して求められる。EMBOSSパッケージのローカルインストールについての手引き並びにウェブサービスへのリンクは、http://emboss.sourceforge.netから見つけることができる。needleプログラムを使用して二つのアミノ酸配列を比較するために使用されるパラメータの好適な非限定例は、EBLOSUM62スコア行列、10のギャップ開始ペナルティ及び0.5のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータである。さらに別の好適な実施形態において、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、EDNAFULLスコア行列及び16、14、12、10、8、6若しくは4のギャップ開始ペナルティ及び0.5、1、2、3、4、5若しくは6のギャップ伸長ペナルティを用いたEMBOSSソフトウェアパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice,P.、Longden,I.及びBleasby,A、Trends in Genetics 16(6)、276〜277ページ、2000年)のneedleプログラム使用して求められる。needleプログラムを使用して二つの核酸配列を比較するために同時に使用されるパラメータの好適な非限定例は、EDNAFULLスコア行列、10のギャップ開始ペナルティ及び0.5のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータである。本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば、その他のファミリーメンバー又は関連配列を特定するために公共のデータベースに対して検索をかけるための「問い合わせ配列」としてさらに使用可能である。そのような検索は、AltschulらのBLASTシリーズのプログラム(バージョン2.2)(Altschul、1990年、J. Mol. Biol. 215:403〜10ページ)を使用して行うことができる。
【００２５】
上記の核酸配列のいずれかのフラグメントを含むポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドとして包含される。このフラグメントは、依然としてシクロクラビン合成に関与し、及び/又は上述したような活性を有するポリペプチドをコードすることになる。したがって、本ポリペプチドは、上記の生物学的活性を付与する本発明のポリペプチドの領域を含んでも又はそれからなってもよい。本明細書において意図されるようなフラグメントは、好ましくは、上記の核酸配列のいずれか一つの少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250若しくは少なくとも500の連続したヌクレオチドを含む又は上記のアミノ酸配列のいずれか一つの少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも80、少なくとも100若しくは少なくとも150の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。前述の変異型ポリヌクレオチド又はフラグメントは、好ましくは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16又は18のいずれか一つに示されるポリペプチドのいずれかによって示される活性を、有効な程度、好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%保持するポリペプチドをコードする。活性は、本明細書に共に記載の実施例に記載されているとおりに試験してもよい。トリプトファンからの、クラビン経路における酵素の酵素活性の測定についての例は、Geblerら、Archives of Biochemistry and Biophysics、296巻、1992年、308〜313ページ(DAMT-シンターゼ)、Rigbersら、J of Biological Chemsitry 283巻、26859〜26868ページ、2008年(DMATメチルトランスフェラーゼ)、Wallweyら、Arch Microbiol 192:127〜134ページ、2010年から見つけることができる。のための一般的な酵素アッセイ
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、本質的に上記の核酸配列からなる、又は上記の核酸配列を含む、のいずれかである。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、さらに追加の核酸配列を含むこともある。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームに加えて、コード遺伝子領域の3'及び5'末端に以下の非翻訳配列をさらに含んでもよい:コード領域の5'末端の上流に少なくとも500、好ましくは200、より好ましくは100ヌクレオチドの配列及びコード遺伝子の3'末端領域の下流に少なくとも100、好ましくは50、より好ましくは20ヌクレオチドの配列。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードしてもよく、その場合、融合タンパク質の一方のパートナーは、上記の核酸配列によってコードされるポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、発現を観察するためのポリペプチド(例えば、緑、黄色、青若しくは赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ及び同種のもの)、すなわち、いわゆる、検出可能なマーカーとして又は精製用途のための補助的な基準としてとして働くこともある「タグ」を含んでもよい。さまざまな用途のためのタグは、当該技術分野において周知であり、FLAG-タグ、6-ヒスチジン-タグ、MYC-タグ及び同種のものが挙げられる。
【００２７】
一方、本発明は、好ましくは、上記の活性を有し、シクロクラビンの合成に関与するポリペプチドをコードする1以上、好ましくは、すべての核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。したがって、より好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、
(i)配列番号30若しくは31に示される核酸配列、
(ii)配列番号30若しくは31と少なくとも70%同一であり、シクロクラビン合成に関与するポリペプチドをコードする核酸配列であって、上記ポリペプチドは配列番号2、4、6、8、10、12、14、16若しくは18に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であり、配列番号6に示される該アミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、核酸配列又は
(iii)ストリンジェントな条件下で(i)若しくは(ii)の該核酸配列とハイブリダイズする核酸配列
を含む。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離ポリヌクレオチドとして(すなわち、精製されるか若しくはその本来の遺伝子座などのその本来の状況から少なくとも単離された)又は遺伝子操作されるか若しくは外因的に(すなわち、人為的に)操作された形態のいずれかで提供されることになる。単離ポリヌクレオチドは、例えば、核酸が由来する細胞のゲノムDNA中でもともとその核酸分子と隣接するおよそ5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb又は0.1kb未満のヌクレオチド配列を含んでもよい。本ポリヌクレオチドは、好ましくは、二本鎖又は一本鎖分子の形態で提供される。当然のことながら、本発明の上記のポリヌクレオチドのいずれかを言及する本発明は、特定の配列の相補的若しくは逆相補的な鎖又は前で述べたその変異体も指す。本ポリヌクレオチドは、cDNA及びゲノムDNAなどのDNA又はRNAポリヌクレオチドを包含する。
【００２９】
一方、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに由来し、本発明のポリヌクレオチドの転写又は翻訳を妨げることができるポリヌクレオチド変異体にも関する。そのような変異型ポリヌクレオチドとしては、アンチセンス核酸、リボザイム、siRNA分子、モルホリノ核酸(ホスホロジアミダートモルホリノオリゴ)、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、阻害性オリゴヌクレオチド又はマイクロRNA分子が挙げられ、そのすべては、相補的な配列又は実質的に相補的な配列の存在により本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識することになる。こうした技術は、当業者には周知である。上記の種類の適した変異型ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの構造に基づいて容易に設計することができる。
【００３０】
さらに、グリコシル化若しくはメチル化ポリヌクレオチドなどの天然に生じる修飾されたポリヌクレオチド又はビオチン化ポリヌクレオチドなどの人為的に修飾されたポリヌクレオチドを含む化学的に修飾されたポリヌクレオチドも含まれる。
【００３１】
本発明の基となる研究において、有利にも、シクロクラビンの合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特定された。特に、シクロクラビンの合成に必要とされるすべてのポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含む遺伝子クラスターがボトリオチニア・フケリアナにおいて特定された。本発明のポリヌクレオチドは、シクロクラビン又はその前駆体の組換え製造に特に適している。エルゴリン骨格の炭素原子8、9、及び10が、9、10二重結合の代わりにシクロプロパン環を形成するシクロクラビンの特徴的な環系の全合成には、相当な難題がある。本発明の結果、シクロクラビン又は任意のその前駆体などの複合化合物を、例えば、さらなるアルカロイドの有機合成のための出発材料として生成することができる。
【００３２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３３】
「ベクター」という用語は、好ましくは、ファージ、プラスミド、フォスミド、ウイルスベクター並びに細菌又は酵母の人工染色体などの人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、ターゲティングコンストラクトのランダム又は部位特異的なゲノムDNAへの組込みを可能にするターゲティングコンストラクトに関する。そのようなターゲットコンストラクトは、好ましくは、下で詳細に記載されるような相同(ホモロガス)又は非相同組換えのいずれかに対して十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、好ましくは、宿主中での増殖及び/又は選択のための選択可能なマーカーをさらに含む。ベクターは、当該技術分野において周知のさまざまな技術によって宿主細胞に導入されてもよい。宿主細胞に導入される場合、ベクターは、細胞質に存在してもよく、又はゲノムに組み込まれてもよい。後者の場合、当然のことながら、ベクターは、相同組換え又は非相同挿入(heterologous insertion)を可能にする核酸配列をさらに含んでもよい。ベクターは、従来のトランスフォーメーション又はトランスフェクション技術により原核又は真核細胞に導入することができる。「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」、コンジュゲーション及びトランスダクションという用語は、本明細書の文脈において使用される場合、リン酸カルシウム、塩化ルビジウム若しくは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、天然コンピテンス、炭素ベースのクラスター、化学的に仲介されたトランスファー、エレクトロポレーション又は微粒子銃などの、外来核酸(例えば、DNA)を宿主細胞に導入するための多様な先行技術のプロセスを含むことが意図される。植物細胞を含む宿主細胞のトランスフォーメーション又はトランスフェクションに適した方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、NY、1989年)及びMethods in Molecular Biology、1995年、44巻、Agrobacterium protocols、編: Gartland及びDavey、Humana Press、トトワ、ニュージャージーなどの他の実験手順書から見つけることができる。あるいは、プラスミドベクターは、ヒートショック又はエレクトロポレーション技術によって導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、宿主細胞に使用する前に適したパッケージング細胞株を使用してインビトロパッケージングしてもよい。
【００３４】
好ましくは、本明細書中で言及されるベクターは、クローニングベクターとして適している、すなわち、微生物系で複製可能である。そのようなベクターは、細菌及び好ましくは、酵母又は菌中での効率的なクローニングを確実にし、植物の安定したトランスフォーメーションを可能にする。
【００３５】
さらに、好ましくは、本発明のベクターは、発現ベクターである。そのような発現ベクターにおいて、すなわち、発現制御配列と作動可能に連結された核酸配列(「発現カセット」とも称される)を有し、原核若しくは真核細胞又はその単離画分において発現を可能にする本発明のポリヌクレオチドを含むベクター。本明細書中で言及される場合、発現制御配列とは、対象の核酸配列、本件では上記の核酸配列の転写を調節、すなわち、開始及び制御することができる核酸配列である。そのような配列は、一般にプロモーター若しくはプロモーター及びエンハンサー配列の組み合わせを含む又はそれからなる。ポリヌクレオチドの発現には、核酸分子の、好ましくは、翻訳可能なmRNAへの転写が含まれる。付加的な調節エレメントには、転写並びに翻訳エンハンサーが含まれてもよい。以下のプロモーター及び発現制御配列は、好ましくは、本発明による発現ベクターに使用されてもよい。cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR又はλ-PLプロモーターは、好ましくは、グラム陰性菌に使用される。グラム陽性菌に対しては、プロモーターamy及びSPO2が使用されてもよい。酵母又は菌のプロモーターからは、ADC1、AOX1r、GAL1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH trpC、GAL10、cbh1、hfb2 amyBが、好ましくは使用され、別の例については、MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS 70、ページ: 583-ff、2006年から選ぶことができる。動物細胞又は動物の発現については、プロモーター、CMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサーが好ましくは使用される。植物からは、プロモーター、CaMV/35S(Franck、1980年、Cell 21: 285〜294ページ]、PRP1(Ward、1993年、Plant. Mol. Biol. 22)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos又はユビキチン若しくはファゼオリンプロモーター。発現制御配列は、好ましくは、作用するよう本発明のポリヌクレオチドに連結されることになり、これは、上記発現制御配列によって上記ポリヌクレオチドの発現が調節され得るように発現制御配列とポリヌクレオチドが連結される、すなわち、発現制御配列は、発現するようにポリヌクレオチドに機能的に連結されることを意味する。したがって、発現制御配列と発現させるポリヌクレオチドを、例えば、発現される核酸配列の5'末端に発現制御配列を挿入することによって互いに物理的に連結してもよい。あるいは、発現制御配列と発現させるポリヌクレオチドを、発現制御配列が、上記ポリヌクレオチドの発現を調節することができるように単に物理的に近接させてもよい。発現制御配列と発現させるポリヌクレオチドは、好ましくは、500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp又は5bpを超えない距離で離れている。本発明による発現ベクターの文脈においてポリヌクレオチドはまた、好ましくは、作用するようターミネーター配列に連結されることになる。本明細書中で使用される場合、ターミネーターとは、転写を終結させることができる核酸配列を指す。こうした配列は、転写される核酸配列から転写装置を分離させることになる。好ましくは、このターミネーターは、本明細書中の別の場所で言及される宿主細胞において有効であろう。適したターミネーターは、当該技術分野では知られており、好ましくは、SV40-ポリ-A部位又はtk-ポリ-A部位などのポリアデニル化シグナルが挙げられる。天然化合物の産生に関与する遺伝子又は遺伝子クラスターを誘導するためのその他の方法は、Brakhageら: Fungal Genet Biol 48、15〜22ページ(2011年)から見つけることができる。
【００３６】
好適な発現ベクターは、当該技術分野では知られており、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)又はpSPORT1(GIBCO BRL)である。一般的な融合発現ベクターの別の例は、pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith、1988年、Gene 67:31〜40ページ)、pMAL(New England Biolabs、ビバリー、MA)及びpRIT5(Pharmacia、ピスカタウェイ、NJ)であり、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE-結合タンパク質及びタンパク質Aは、それぞれ組換え型ターゲットタンパク質と融合する。適当な誘導可能非融合大腸菌発現ベクターの例は、とりわけ、pTrc(Amann、1988年、Gene 69:301〜315ページ)及びpET 11d(Studier、1990年、Methods in Enzymology 185、60〜89ページ)である。pTrcベクターのターゲット遺伝子発現は、宿主RNAポリメラーゼによるハイブリッドtrp-lac融合プロモーター(hybrid trp-lac fusion promoter)からの転写に基づく。pET 11dベクターからのターゲット遺伝子発現は、T7-gn10-lac融合プロモーターの転写に基づき、これには、共発現するウイルスRNAポリメラーゼ(T7 gn1)が介する。このウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写制御下で宿主株BL21(DE3)又はHMS174(DE3)によってT7 gn1遺伝子を持つ内在するλ-プロファージから供給される。当業者は、原核生物に適したその他のベクターについて精通しており;こうしたベクターは、例えば、大腸菌(E.coli)では、pLG338、pACYC184、pBR322などのpBRシリーズ、pUC18若しくはpUC19などのpUCシリーズ、M113mpシリーズ、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11又はpBdCl、ストレプトミセス(Streptomyces)では、plJ101、plJ364、plJ702又はplJ361、バチルス(Bacillus)では、pUB110、pC194又はpBD214、コリネバクテリア(Corynebacterium)では、pSA77又はpAJ667である。酵母である出芽酵母(S. cerevisiae)における発現のためのベクターの例としては、pYep Sec1(Baldari、1987年、Embo J. 6:229〜234ページ)、pMFa(Kurjan、1982年、Cell 30:933〜943ページ)、pJRY88(Schultz、1987年、Gene 54:113〜123ページ)及びpYES2(Invitrogen Corporation、サンディエゴ、CA)が挙げられる。ベクター及び糸状菌などのその他の菌に使用するのに適したベクターを構築するためのプロセスとしては、以下に詳細に記載されるものが挙げられる: van den Hondel、C.A.M.J.J., & Punt, P.J.(1991年)「Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi、in: Applied Molecular Genetics of Fungi、J.F. Peberdyら編、1〜28ページ、Cambridge University Press:ケンブリッジ又は:More Gene Manipulations in Fungi(J.W. Bennett & L.L. Lasure編、396〜428ページ: Academic Press:サンディエゴ)。別の適した酵母ベクターは、例えば、pAG-1、YEp6、YEp13又はpEMBLYe23である。別の方法として、本発明のポリヌクレオチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現させることもできる。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)においてタンパク質を発現させるために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ(Smith、1983年、Mol. Cell Biol. 3:2156〜2165ページ)及びpVLシリーズ(Lucklow、1989年、Virology 170:31〜39ページ)が挙げられる。
【００３７】
相同組換えが使用される遺伝子破壊は、通常の方法で行うことができ、遺伝子破壊に使用できるベクターの作製及びベクターの宿主への導入は当業者に自明である。そのようなベクターは、好ましくは、本発明によるベクターとしても想定される。
【００３８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３９】
好ましくは、上記宿主細胞は、微生物である。より好ましくは、上記微生物は、細菌、酵母、放線菌、菌、例えば、子嚢菌、不完全菌若しくは担子菌など又は藻類細胞である。本発明の宿主細胞として使用される好適な細菌は、大腸菌(Escherichia coli)及び枯草菌(Bacilus subtilis)からなる群から選択される。好適な菌は、以下からなる群から選択される:アスペルギルス・ヤポニクス(japonicus)、アスペルギルス・ニガー(niger)、アスペルギルス・オリザエ(oryzae)、アスペルギルス・ニデュランス(nidulans)、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・アクレアツス(aculeatus)、アスペルギルス・カエシエルス(caesiellus)、アスペルギルス・カンジヅス(candidus)、アスペルギルス・カルネウス(carneus)、アスペルギルス・クラワツス(clavatus)、アスペルギルス・デフレクツス(deflectus)、アスペルギルス・フィスケリアヌス(fischerianus)、アスペルギルス・フラウス(flavus)、アスペルギルス・グラウクス(glaucus)、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・オクラケウス(ochraceus)、アスペルギルス・パラシチクス(parasiticus)、アスペルギルス・ペニキロイデス(penicilloides)、アスペルギルス・レストリクツス(restrictus)、アスペルギルス・ソーヤ(sojae)、アスペルギルス・タマリ(tamari)、アスペルギルス・テレウス(terreus)、アスペルギルス・ウスタス(ustus)、アスペルギルス・ウエルシコロル(versicolor)などのアスペルギルス属;ペニキリウム・アウランチオグリセウム(aurantiogriseum)、ペニキリウム・ビライアエ(bilaiae)、ペニキリウム・カメンベルティ(camemberti)、ペニキリウム・カンディヅム(candidum)、ペニキリウム・クリソゲヌム(chrysogenum)、ペニキリウム・クラウィフォルメ(claviforme)、ペニキリウム・コムネ(commune)、ペニキリウム・クルストスム(crustosum)、ペニキリウム・ディギタツム(digitatum)、ペニキリウム・エクスパンスム(expansum)、ペニキリウム・フニクロスム(funiculosum)、ペニキリウム・グラブルム(glabrum)、ペニキリウム・グラウクム(glaucum)、ペニキリウム・イタリクム(italicum)、ペニキリウム・ラクサルミエンテイ(lacussarmientei)、ペニキリウム・マルネッフェイ(marneffei)、ペニキリウム・プルプロゲヌム(purpurogenum)、ペニキリウム・ロックエフォルチ(roqueforti)、ペニキリウム・ストロニフェルム(stoloniferum)、ペニキリウム・ウライエンセ(ulaiense)、ペニキリウム・ウエルコスム(verrucosum)、ペニキリウム・ウイリディカツム(viridicatum)などのペニキリウム属;クラウイケプス・アフリカナ(Claviceps africana)、クラウイケプス・フシフォルミス、クラウイケプス・パスパリ(paspali)、クラウイケプス・プルプレア、クラウイケプス・ソルグヒ(sorghi)、クラウイケプス・ジザニアエ(zizaniae)などの麦角菌(ergot)すなわちクラウイケプス(Claviceps)属。好適な酵母は、以下からなる群から選択される:シゾサッカロミケス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)及びピキア(Pichia)。また、好ましくは、上記宿主細胞は、植物又は動物宿主細胞であってもよい。
【００４０】
一方、当然のことながら宿主細胞に応じて、宿主細胞に、例えば、組換え技術によって酵素活性がさらに付与されてもよい。したがって、本発明は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドに加えて、本明細書中で言及するとおりのシクロクラビンの合成のための出発材料としてのトリプトファンの合成に必要とされる、又はそれを容易にするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞を想定する。より好ましくは、そのような酵素は、トリプトファンシンターゼである。トリプトファンの生合成についてのさらなる詳細は、例えば、Radwanski、1995年、Plant Cell 7(7): 921〜934ページから見つけられる。
【００４１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの製造方法に関し、該方法は、
a)前記ポリペプチドの産生を可能にさせる条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ;及び
b)ステップa)の該宿主細胞から該ポリペプチドを得るステップ
を含む。
【００４２】
宿主細胞に含まれる本発明のポリヌクレオチドの発現を可能にさせる適した条件は、宿主細胞並びに上記ポリヌクレオチドの発現を調節するために使用される発現制御配列によって決まる。こうした条件及びその選択方法は、当業者に非常によく知られている。発現ポリペプチドは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)及び抗体沈降などの沈降技術を含むあらゆる従来の精製技術によって得られてもよい。本方法は、好適ではあるが、必ずしもポリペプチドの本質的に純粋な調製物をもたらすとは限らないことを理解すべきである。上記の方法に使用される宿主細胞に応じて、それによって生成されるポリペプチドは、翻訳後に修飾される、又は別の方法で処理されることがあることも理解すべきである。
【００４３】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド又は本発明の上記の方法によって得られ得るポリペプチドに関する。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、本質的に精製されたポリペプチド又はその他のタンパク質をさらに含むポリペプチド調製物を包含する。さらに、この用語は、前述の本発明のポリヌクレオチドによって少なくとも部分的にコードされる融合タンパク質又はポリペプチドフラグメントにも関する。さらに、これには、化学的に修飾されたポリペプチドが含まれる。そのような修飾は、人為的な修飾又は自然に起こる修飾であってもよく、例えば、リン酸化、グリコシル化、ミリスチル化などである(Mann、2003年、Nat. Biotechnol. 21、255〜261ページの概説)。現在、300を超える翻訳後修飾が知られている(http://www.abrf.org/index.cfm/dm.homeにある全ABFRC Delta mass一覧を参照のこと)。本発明のポリペプチドは、上述したシクロクラビンの合成に関与し、好ましくは、前述の酵素変換のうちの一つを実行でき及び/又は前述の酵素活性を有することになる。
【００４５】
本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体に関する。
【００４６】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明による精製ポリペプチド又はそれ由来の抗原として適したフラグメントを使用して周知の方法によって作製できる。抗原として適したフラグメントは、当該技術分野において周知の抗原性測定アルゴリズムによって特定してもよい。そのようなフラグメントは、タンパク質消化によって本発明のポリペプチドから得てもよく、又は合成ペプチドであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体又はこれらの抗体のいずれかのフラグメント、例えば、Fab、Fv若しくはscFvフラグメントなどである。また、本発明による抗体として、二重特異性抗体、合成抗体又は任意の上記抗体の化学的に修飾された誘導体が含まれる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する(すなわち、その他のポリペプチド又はペプチドとは全く交差反応しない)。特異的結合は、さまざまな周知の技術によって試験することができる。抗体又はそのフラグメントは、例えば、Harlow及びLane、「Antibodies, A Laboratory Manual」、CSH Press、コールドスプリングハーバー、1988年に記載される方法を使用することによって得られる。モノクローナル抗体は、もともと、Kohler、1975年、Nature 256、495ページ及びGalfre、1981年、Meth. Enzymol. 73、3ページに記載された技術によって作製でき、これには、免疫された哺乳動物由来の脾臓細胞とのマウス骨髄腫細胞の融合が含まれる。本抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫沈降、免疫局在又は(例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる)精製のため並びに例えば、組換え型生物において上記変異型ポリペプチドの存在を観察するため及び本発明によるタンパク質と反応するタンパク質又は化合物の同定のために使用できる。
【００４７】
本発明はまた、シクロクラビン又はその前駆体の製造方法に関し、該方法は、
a)宿主細胞においてシクロクラビン又はその前駆体の産生を可能にさせる条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ;及び
b)前記宿主細胞から前記シクロクラビン又はその前駆体を得るステップ
を含む。
【００４８】
「シクロクラビン又はその前駆体」という用語については、本明細書の別の場所において既に詳細に定義した。好ましくは、シクロクラビンの前駆体は、DMAT、メチル-DMAT、カノクラビンI、カノクラビンアルデヒド及びアグロクラビンからなる群から選択される。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「培養すること」という用語は、前述の上記シクロクラビン又はその前駆体を宿主細胞に産生させる培養条件下で宿主細胞を維持し、増殖させることを指す。これは、少なくとも一つの核酸配列によってコードされるポリペプチド(複数可)が、生物学的に活性な状態で宿主細胞中に存在するように本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞において発現されることを意味する。宿主細胞を培養するための適した培養条件については、本明細書に共に記載されている下記の実施例により詳細に記載されている。特に、本発明の宿主細胞は、好ましくは、例えば、培養培地の炭素源として、グルコース、スクロース、ハチミツ、デキストリン、デンプン、グリセロール、モラセス、動物又は植物油及び同種のものを使用して培養することができる。さらに、窒素源として、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、綿実粕(cotton seed waste)、肉エキス、ポリペプトン、マルツエキス、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素及び同種のものを使用することができる。ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸(リン酸水素二カリウム及び同種のもの)、硫酸(硫酸マグネシウム及び同種のもの)をもたらすことができる無機塩並びに必要とされる場合は、その他のイオンの添加も有効である。さらに、必要とされる場合は、チアミン(塩酸チアミン及び同種のもの)などの各種ビタミン、グルタミン(グルタミン酸ナトリウム及び同種のもの)、アスパラギン(DL-アスパラギン及び同種のもの)などのアミノ酸、ヌクレオチド及び同種のものなどの微量栄養素並びに抗生物質及び同種のものなどの選択薬剤も添加してよい。さらに、微生物の増殖を助け、シクロクラビン又はその前駆体の産生を促進するために有機物質及び無機物質を適切に添加することができる。培養培地のpHは、例えば、ほぼpH5.5からpH8程度である。培養は、好気条件下での固体培養法、振盪培養法、通気撹拌培養法又は液内好気培養法などの方法を用いて行うことができるが、液内好気培養法が最も適している。培養に適した温度は、15℃から40℃であるが、多くの場合、増殖は22℃から30℃の範囲において起こる。シクロクラビン又はその前駆体の産生は、培養培地及び培養条件又は使用される宿主により異なるが、いずれの培養法によっても、シクロクラビンの蓄積は、一般に2から10日間で最大に達する。培養物中のシクロクラビン又はその前駆体の量が最高レベルに達すると培養は停止され、目的の材料が培養物から単離され、培養材料からシクロクラビン又はその前駆体を単離するために精製される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「得ること」という用語は、宿主細胞及び培養培地を含む細胞培養物の供給並びに好ましくは、遊離型のシクロクラビン又はその前駆体を含む精製された又は部分的に精製されたその調製物の供給を包含する。精製技術についてのさらなる詳細は、本明細書中の以下の別の場所に見出すことができる。こうした状況で一般に使用される、単離法などの通常の抽出及び精製方法、例えば、溶媒抽出、イオン交換樹脂を伴う方法、吸着若しくは分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、透析、沈殿、結晶化及び同種のものを個々に又は適切な組み合わせで使用することができる。特に、シクロクラビンは、シクロクラビンを単離するための既知の方法を使用してシクロクラビン含有培地又はライセートから単離することができる。好ましくは、Furuta、1982年、Agricultural and Biological Chemistry(1982年)、46(7)、1921〜2ページに開示されている単離プロセスが本発明の方法により想定される。
【００５１】
最後に、本発明は、概して、シクロクラビン又はその前駆体の製造のための本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞の使用も包含する。前に記載のように、上記シクロクラビンの前駆体は、好ましくは、DMAT、メチル-DMAT、カノクラビンI、カノクラビンアルデヒド及びアグロクラビンからなる群から選択される。
【００５２】
本明細書において引用したすべての参考文献は、その全開示内容及び本明細書において具体的に言及した開示内容を参照により本明細書に組み込んだものとする。
【００５３】
ここで、本発明を以下の実施例によって説明するが、これが本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【００５４】
（実施例）
[実施例1]
シクロクラビンの組換え産生のための発現カセットのクローニング
配列番号30の塩基58から塩基10057に示されるとおりのシクロクラビン遺伝子クラスターの第1の部分を以下のプライマーを使用して増幅する。
【００５５】
P1_5': CTAGTGCACCGCTTCCACCTATTCTACCTG(配列番号37)
及び
P2_3': TCTCGGACCACCCTTCCCACAGCGGTGAAA(配列番号38)
配列番号30の塩基10072から塩基19947に示されるとおりのシクロクラビン遺伝子クラスターの第2の部分を以下のプライマーを使用して増幅する。
【００５６】
P3_5': AAGGGCAGGCCAAAAATCCGCTCCCAAGATGCT(配列番号39)
及び
P4_3': TTGGGGTTCTGGTGGGTTGGGTTGGTGGGTTCT(配列番号40)
Phusionポリメラーゼ(New England Biolabs Inc.)を使用し、手順書に記載のパラメータを使用してPCR増幅を行う。PCRは、以下のサイクルパラメータを使用して行う:98℃で1分(98℃で20秒、66℃で30秒、72℃で5分)を33サイクル及び72℃で5分。
【００５７】
予想されるサイズのPCR産物をアガロースゲル(0.7%)から切り取り、配列番号28に示されるベクターpHS Nat1に特有のEcoRV制限部位及び配列番号29に示されるベクターpHS delta Nat1にクローン化して、プラスミドpHS Nat1 CC_1、配列番号35及びpHS delta Nat1 CC_2、配列番号36を得る。CCクラスターの部分1 CC_1(配列番号33)又は部分2 CC_2(配列番号34)を含むCcクラスター遺伝子DNAフラグメントのコトランスフォーメーションについては、これらの部分の一方を、Nat1耐性遺伝子を含むベクターpHS Nat1 CC_1(配列番号35)の制限酵素消化産物を使用してプラスミドpHS Nat1 CC_1(配列番号33)を直線化することによって単離し、もう一方の部分を、pHS delta Nat1 CC_2(配列番号36)から得られるSwaI制限酵素消化産物によって単離する。トランスフォーメーションのために両フラグメントを混合する。Nat1配列を含むフラグメントは、Nat1配列を欠く部分の1/5又は1/10の量で添加する。
【００５８】
[実施例2]
異種プロモーター(heterologous promoter)を使用するシクロクラビンの組換え産生のための高発現カセットのクローニング
A.ニデュランス(配列番号32)からのPtrpcプロモーターなどの異種プロモーターを使用して、シクロクラビンの生合成をコードしている遺伝子を発現させる。プロモーター-遺伝子-ターミネーターの融合物は、当業者に既知のいくつかの技術によって得られる。技術は、プロモーター3'側と遺伝子5'側についてのオーバーラップしたプライマー並びにプロモーター5'プライマー及び遺伝子-ターミネーター3'プライマーを使用したPCR融合である。PCR融合を実施するための方法は、Nucl. Acids Res.(1989年)17: 4895ページから見つけることができる。プロモーター-遺伝子-ターミネーター-融合物を得るための別の可能な方法は、既知の方法によるDNA合成でもよい(Czarら、2009, Trends in Biotechnology、27、63ページ72及びその参考文献)。
【００５９】
プロモーター-遺伝子-ターミネーターの融合物を含むフラグメントは、Biobrick法、Golden Gate法、SLIC法、CEPC法などのいくつかの方法によって結合することができる(Liら、Nature Methods 2007年、4: 251〜256ページ、Quanら、PLOS ONE 4: e6441、Englerら、PLOS ONE、2008年、3 e3647、Englerら、PLOS ONE、2009年、4 e5553)。
【００６０】
プロモーターPtrpC(配列番号32)及びorf 11 easG(配列番号1)、orf 12 easA oyeI(配列番号3)、orf 13カノクラビンDH(配列番号5)、orf 14(配列番号7)、orf 15(配列番号9)、orf 16(配列番号11)、orf 17(配列番号13)、orf 18(配列番号15)、orf 19(配列番号17)をコードする遺伝子を含む全カセットを、上記の方法によって構築し、一緒に又は2以上の部分においてベクターpHS1 nat1又はベクターpHS1 delta nat1にクローン化する。
【００６１】
すべてのプロモーター-orf-ターミネーターカセットを含むフラグメントは、SwaI消化を使用してベクターから単離することができ、適した菌株のトランスフォーメーションに使用される。
【００６２】
orf 11、12、13、14、15、16、17、18及び19のプロモーター-orf-終止配列を含む遺伝子フラグメントについての例を配列番号11に記載する。
【００６３】
[実施例3]
糸状不完全菌に導入するための発現ベクターの作製
糸状不完全菌に導入するための発現ベクター、pHS Nat1、配列番号28及びpHS delta Nat1、配列番号29の作製を遺伝子合成によって行う。
【００６４】
[実施例4]
シクロクラビンクラスターDNAのアスペルギルス・ヤポニクス及びペニキリウム・クリソゲヌムへのトランスフォーメーション
250μlの胞子懸濁液を、一つのバッフルを備え、100mlのCCM培地(一つのトランスフォーメーション実験に二つのフラスコ)を含む500mlのフラスコに接種し、27C及び120rpmで3日間インキュベートする。濾過によって菌糸体を回収し、20mlのPP-バッファ(0.9M NaCl)を添加することによってした。乾燥させた菌糸体を殺菌したフラスコに移す、30mlの3%Glucanex溶液を添加する。27C、100rpmにおいて2時間インキュベーションを行った後、生成されたプロトプラストを顕微鏡を用いて操作する。フリット(孔径1)を使用してプロトプラストを濾過する
プロトプラスト懸濁液の遠心分離を4C、2500rpmにおいて5分間行う。  
上清を捨て、プロトプラストのペレットを10mlのPP-バッファに溶解させる。  
プロトプラスト懸濁液を殺菌したチューブ中で4C、2500rpmにおいて5分間遠心分離する
そのペレットを5mlのTP1-バッファに溶解させる(0.9M NaCl、50mM CaCl2)。
【００６５】
Abbe-Zeiss細胞カウントチャンバーを使用してプロトプラスト力価を求め、力価を1×108プロトプラスト/ml TP1-バッファに調節する。10マイクログラムの直鎖DNA1及び2を50μlのプロトプラスト懸濁液と混合する。12.5μlのTP2-バッファ(25%PEG 6000、50mM CaCl2、10mM Tris、pH7.5)を添加し、氷上で20分間インキュベートする。500μlのTP2-バッファを添加し、穏やかに混合し、RTで5分インキュベートする。1mlのTP1-バッファを添加する。2×780μlのトランスフォーメーションアプローチを4mlのトップアガーI(CCM+20%スクロース+0.8%寒天)と混合し、CCMSプレートに注ぐ。プレートを27Cで一晩インキュベートする。再生対照が期待されるすべてのプレートの表面を11mlのトップアガーII(0.8M NaCl、0.8%寒天+ノーセオスリシン(Nourseothricine)50μg/ml)により覆い、27Cにおいて6日未満インキュベートする。ノーセオスリシン(Nourseothricin)に対して耐性のあるクローンを単離し、精製し、振盪フラスコ実験においてCC産生について分析する。
【００６６】
[実施例5]
シクロクラビンクラスターDNAのアスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリザエへのトランスフォーメーション
CD-Met(40μg/mlのL-メチオニンを含む)寒天培養培地でアスペルギルス・オリザエ(菌株)を30℃で1週培養する。分生子(>108)をペトリ皿から回収し、500mlのフラスコ中の100mlのYPD液体培養培地に接種する。20時間(30℃、180rpm)の培養後、毬藻様のバイオマスが得られる。そのバイオマスを3G-1ガラス濾過器により回収し、0.8M NaClで洗浄した後、完全に脱水し、TF溶液I(プロトプラスト化溶液)に懸濁し、30℃、60rpmで2時間振盪する。30分間毎に顕微鏡で材料を調べ、プロトプラストの存在を確認する。その後、その培養液を濾過し、遠心分離(2000rpm、5分間)によってプロトプラストを回収した後、TF溶液IIで洗浄する。洗浄後、0.8volのTF溶液II及び0.2volのTF溶液IIIを添加し、混合して、プロトプラスト懸濁液を得る。
【００６７】
プラスミドDNA(10μg)を、200μlの上記液体懸濁液に添加し、そのまま氷上に30分間置き、TF溶液III(1mL)を添加した後、穏やかに混合する。その後、その混合物をそのまま室温に15分間置き、プラスミドDNAを上記のプロトプラストに導入する。TF溶液II(8mL)を添加し、その混合物を(5分間、2,000rpmにおいて)遠心分離し、1から2mlの残留したプロトプラストを回収する。その回収したプロトプラスト液を再生培養培地(下層)に滴下する、再生培養培地(上層)を注ぎ、ペトリ皿を回転させることによって混合した後、その混合物を30℃で4から5日間培養する。現われたクローンを再生培養培地(下層)中で単離し、一連の精製によってトランスフェクタント(アスペルギルス・オリザエ(ATCC 1015及びアスペルギルス・オリザエ、ATCC 42149)を得る。
【００６８】
以下に詳述する組成を使用して、上記のTF溶液I(プロトプラスト化溶液)を調製する。
【００６９】
化合物                                      濃度
ヤタラーゼ(Yatalase, タカラバイオ社製造)    25mg/ml
硫酸アンモニウム                            0.65M
マレイン酸-NaOH                              55mM
上記組成物を調製後(pH5.6)、濾過滅菌する。以下に詳述する組成を使用して、上記のTF溶液IIを調製する。
【００７０】
化合物
1.1M  ソルビトール
50mM CaCl2                                    10ml 1M CaCl2(1/20)
35mM NaCl                                    1.4ml 5M NaCl
10mM Tris-HCl                                2ml 1M Tris-HCl(1/100)
総量が200mlになるまで
上記の組成物を調製後、オートクレーブ滅菌する。以下に詳述する組成を使用して、上記のTF溶液IIIを調製する。
【００７１】
化合物
60%PEG 4000                                  6g
50mM CaCl2                                    500μl 1M CaCl2(1/20)
50mM Tris-HCl                                500μl 1M Tris-HCl(1/100)
総量が10mlになるまで
上記の組成物を調製後、濾過滅菌する。
【００７２】
以下に詳述する組成を使用して、上記の培養培地を調製する。
【００７３】
化合物                                          濃度
ソルビトール(MW=182.17)    218.6g                1.2M
NaNO3                      3.0g                  0.3%(w/v)
KCl                        2.0g                  0.2%(w/v)
KH2PO4                      1.0g                  0.1%(w/v)
MgSO4・7H2O                  2mlの1M MgSO4        0.05% 2mM
微量元素溶液                1ml
グルコース                  20.0g                2%(w/v)
総量が1Lになるまで
上記の組成物(pH5.6)を調製後、オートクレーブ滅菌する。
【００７４】
[実施例6]
A.ニデュランス及びA.フミガツスのトランスフォーメーション
Ballanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun. I I2(1983年)284-2X9に示されるとおりに、A.ニデュランス(ATCC 11414、ATCC 10864)又はA.フミガツス(ATCC 46645)の五つのセロファン培養物からプロトプラストを調製する。ナイロンフィルタークロス(Gallenkamp、GMX-500-V)及び焼結ガラス(多孔度I)を通して濾過した後、そのプロトプラストを、1000×gで5分間遠心分離し、その後、0.6M KClで2回、0.6M KCl、50mM CaClで1回洗浄する。そのプロトプラストを0.2mLの0.6M KCl、50mM CaCl(0.5〜5×108mlに再懸濁した後、スクリューキャップチューブ(Sarstedt)に50-4アリコートを分注する。DNA(1pg)を、その後、添加し、続いて12.5〜1 25%PEG 6000(BDH)、50mM CaCl、10mM Tris'HCl、pH7.5を添加する。氷上で20分インキュベーションした後、0.5mlの上記PEG溶液を添加し、その混合物をそのまま室温で5分間置く。1mlの0.6M KCl、50mM CaClを添加し、アリコートをKCl(0.6 M)及び寒天(2%w/v)を含む溶融した最小培地に添加した後、それに最小限の寒天プレートを注ぎ入れる。必要な場合、0.6M KCl、50mM CaCl中のトランスフォーメーション混合物の濃度を下げる。10-3希釈の最終的なトランスフォーメーション混合物のアリコートをKCl及びノーセオスリシンを含む完全培地に蒔くことによって再生効率を評価する。再生対照が期待されるすべてのプレートの表面を11mlのトップアガーII(0.8M NaCl、0.8%寒天+ノーセオスリシン50μg/ml)により覆い、27Cにおいて6日未満インキュベートする。
【００７５】
抗生物質上で増殖できたクローンを単離し、ノーセオスリシンを含む寒天プレート上で繰り返しインキュベートすることによって精製し、シクロクラビン産生実験に使用する。
【００７６】
[実施例7]
DNAによるトランスフォーメーション後の菌株の増殖
DNAによるトランスフォーメーション後の菌株の増殖  培地及び微生物の培養:
シクロクラビンクラスターの遺伝子でのトランスフォームが成功したA.ニデュランス、A.フミガツス、A.ヤポニクス、SAITO IFO 4060、ペニキリウム・クリソゲヌム(ATCC11500)及びA.ニガー(ATCC 10864)株を適切なインキュベーション温度(ペニキリウム・クリソゲヌムに対しては26℃、A.ニガー及びA.ヤポニクスに対しては30℃、A.フミガツス及びA.ニデュランスに対しては37℃)でYG(0.5%酵母エキス、2%グルコース)、完全培地又は炭素源として1%(w/v)グルコース及び窒素源として5mMのグルタミン酸ナトリウム及びトリプファン(Biophys Acta 113:51-56)を含むアスペルギルス用最小培地中で培養する。
【００７７】
B.あるいは、以下を含む培地で菌株を増殖させる
グルコース-一水和物80g/l、脱脂小麦胚芽ミール10g/l、脱脂大豆ミール16g/l、L-グルタメート3g/l、NaCl 1.25g/l、CaCO3 1.5g/l、シリコンオイルKM-72 0.03g/l。あるいは、30g/lマンニトール、10g/lグルコース、10g/lコハク酸、1g/l KH2PO4 0.3g/l MgSO4*7H2O及びpHを5.6に調節するためのNH4OH。あるいは、エルゴタミンの合成を促進する培地で菌株を増殖させる(Hernandez、Process Biochemistry 1993年 28 23〜27ページ)あらゆる場合において、CCを含む経路からの生成化合物の量を増加させるのために適した量のL-トリプトファン及び  又はメバロン酸を添加してもよい。固体培地は、1.5%バクト-アガー又は最小限の寒天プレートの場合は、Difco-寒天を含んだものとした。必要であれば、p-アミノ安息香酸(0.11mM)、ノーセオスリシン(50μg/ml)を添加する)。
【００７８】
250mlのバッフル付振盪フラスコ中、動力行程5cm、160〜250rpmで抗生物質に対して耐性のあるクローンを増殖させる。新たに増殖させた菌糸体を25mlの培地に接種し、適切なインキュベーション温度(ペニキリウムに対しては26℃、A.ニガーに対しては30℃、A.フミガツス及びA.ニデュランスに対しては37℃)で7日間インキュベートする。すべてのシクロクラビン産生実験は、改善されたシクロクラビン合成のためにトリプトファン並びにメバロン酸を添加した状況下で行ってもよい。
【００７９】
細胞並びにブロスを回収し、Furuta、Takaki; Koike、Masami; Abe、Matazo、Agricultural and Biological Chemistry(1982年)、46、1921〜22ページに示されるとおりに抽出する
[実施例8]
トランスフォームされた菌株によって産生されたCCは、適したHPLC法によって分析することができる
Ccを以下のHPLC法によって分析する:2μlのサンプルサイズの注入量をROD-HLPCカラム、50x4.6mm(Merck KGa Darmstadt Germany)、に40℃の温度において注入する。溶出のために、次の溶媒を使用する:アセトニトリル+0.1%TFA;水+0.1%TFA。流速を1.8ml/分に設定する、溶出化合物の検出は電気化学検出によって行う。標準のA.ヤポニクス、SAITO IFO4060から得られるCCをHPLCの較正に使用する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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