(57)【要約】  場合によっては自食作用阻害剤と組み合わせた細胞浸透性鉄キレート剤が、ヒトの固形癌腫瘍の治療に使用される。好ましいキレート剤はアルキル置換Ｎ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジンである。好ましい自食作用阻害剤はクロロキンである。鉄キレート剤、薬学的に許容される担体、及び場合によっては自食作用阻害剤を含む薬学的組成物、及び癌撲滅有効量の該鉄キレート剤、又は該鉄キレート剤と自食作用阻害剤との組み合わせを投与する癌の治療方法もまた開示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合によっては自食作用阻害剤と組み合わせた、細胞浸透性鉄キレート剤のヒトにおける固形癌腫瘍の治療への使用。
【請求項２】
前記細胞浸透性鉄キレート剤が、一般式（Ｉ）のＮ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジン、又はその薬学的許容塩若しくはその複合体若しくはプロドラッグであり、ここでＲはＨ又はメチル、Ｒ１はＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル、Ｒ２はＨ又はＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１に記載の使用。
【化１】
2014508804.tif 000006
【請求項３】
Ｒがメチルである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ及びＲ１の両方がメチルである、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１がメチル、特に６−メチル又は８−メチルである、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項６】
Ｒがメチル、Ｒ１が８−メチル、Ｒ２がＨ；又はＲがメチル、Ｒ１がＨ、Ｒ２がＨ；又はＲがメチル、Ｒ１が６−メチル、Ｒ２がＨ；又はＲがＨ、Ｒ１が６−メチル、Ｒ２がＨ；又は、特にＲがＨ、Ｒ１が８−メチル、Ｒ２がＣＨ３である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記細胞浸透性鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロックスから成る群から選ばれる、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記自食作用阻害剤がクロロキンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記自食作用阻害剤が、ヒドロキシクロロキン、３−メチルアデニン、アデノシン、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾール  カルボキサミド  リボシド、ウオルトマニン及びビニブラスチンから成る群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
請求項２〜７のいずれか１項の細胞浸透性鉄キレート剤と薬学的に適切な担体とを含む、又はから成る薬学的組成物。
【請求項１１】
更に請求項８又は９の自食作用阻害剤を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ヒトにおける固形癌腫瘍の治療方法であって、該ヒトに薬理学的に癌撲滅有効量の請求項１０又は１１の組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項１３】
ヒトにおける固形癌腫瘍の治療方法であって、該ヒトに薬理学的に癌撲滅有効量の請求項２〜７のいずれか１項の細胞浸透性鉄キレート剤と薬理学的に癌撲滅有効量の請求項８又は９の自食作用阻害剤とを、近い時間関係で、例えば１時間以内、又は１日以内、又は１週間以内に、別々に投与することを含む、治療方法。
【請求項１４】
前記の投与が、薬学的に適切な担体を含む別個の薬学的組成物により構成される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に冒された人における固形腫瘍、特に播種性固形腫瘍、の治療、及びかかる治療のための手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
播種性固形腫瘍を患う患者のために、新しいそして効果的な抗ガン剤を開発する必要がある。固形腫瘍用薬剤の開発は、生体外系での実験で真似るには困難であり得る３−Ｄ腫瘍組織における複雑な生物物理的及び代謝性状態により、特定の問題を伴う。低酸素症及び栄養の制限された拡散は、従来の抗ガン剤及び放射線療法に対する無活動及び抵抗性に導くことが知られている。更に、抗ガン剤は腫瘍柔組織に侵入して毒性濃度で癌細胞に到達できなければならない。固形腫瘍の治療に臨床的に一層使用されている薬剤のいくつかは３−Ｄ腫瘍塊への低い侵入性を示し、それが該薬剤の限定された効能の理由の一つであり得る(1)。多細胞性回転楕円体（ＭＣＳ）はヒト固形腫瘍を、２−Ｄ単層培養物よりも良くまねる（２−４）。そして多くの臨床的に使用される薬剤はＭＣＳとして成長した癌細胞に対して限定された効能を示す（５、６）。従って、ＭＣＳは、固形腫瘍に活性の薬剤のスクリーニングに、単層培養物よりも適する。
【０００３】
細胞死はしばしば、３タイプの細胞死：アポトーシス（タイプI）、自食症細胞死（タイプII）及び壊死（タイプIII）に分類される。アポトーシスはカスパーゼの活性化により媒介される。自食症は、長生きした細胞タンパク質及び損傷された細胞小器官の分解に対して進化的に保存された機構である。自食胞の形成は自食作用の主な特徴である。自食胞形成はクラスIIIホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの活性化を必要とし、そして２つのユビキチン様共役システム(Atg-Atg12及びAtg8)にも依存性である（７）。自食症は、栄養剥奪の状態中、細胞を保護し、そして自食症が阻害された時、細胞はアポトーシスを蒙る（８−１０）。自食症の形態的特徴もまた、カスパーゼ阻害の条件下での細胞死の間、観察された（１１）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によると、ヒトの固形癌腫瘍の治療用のための、場合によっては自食作用阻害剤と組み合わせた、細胞浸透性鉄キレート剤の使用が開示される。
【０００５】
本発明によると、癌に冒されたヒトの固形腫瘍を治療するための、一般式（Ｉ）の、Ｎ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジン又はその薬学的許容塩が開示され、ここでＲはＨ又はメチル、Ｒ１はＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル、Ｒ２はＨ又はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【０００６】
【化１】
2014508804.tif 000002
【０００７】
本願で、一般式（Ｉ）の化合物は、そのあらゆる薬学的に適した塩又は複合体又はプロドラッグを含むことが意図される。
【０００８】
Ｒはメチルであるのが特に好ましい。Ｒ及びＲ１の両方がメチルであるのが好ましい。
【０００９】
Ｒ１はメチル、特に６−メチル又は８−メチルであるのが好ましい。
【００１０】
本発明の好ましい化合物で、Ｎ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジンは次のように置換される。
【００１１】
Ｒ        Ｒ１        Ｒ２
メチル    ８−メチル    Ｈ
メチル    Ｈ            Ｈ
メチル    ６−メチル    Ｈ
Ｈ      ６−メチル    Ｈ
Ｈ      ８−メチル    ＣＨ３
【００１２】
本発明の好ましい側面によると、Ｒ１がＣ１−Ｃ４アルキルである一般式Ｉの化合物は更に、Ｒ１で置換されていないテトラアザフルオレニル基の６、７又は８の位置の一つでＣ１−Ｃ４アルキルで更に置換されていてもよい。
【００１３】
本発明の好ましい側面によると、本発明の化合物及び薬学的担体を含む薬学的組成物が開示される。本発明の薬学的組成物は適当な経路、例えば経口的又は非経口的に、投与することができる。適当な担体には、ジメチルスルホキシド及び水性媒体、例えばジメチルスルホキシドと水を含む混合物、が含まれる。好ましい流体担体は、本発明の化合物を溶解できるものである。他の好ましい流体担体、特に水性担体は、本発明の化合物を微分散形、例えば１０μｍ又はそれ未満のサイズの微粒子の形体、で含むものである。
【００１４】
本発明の別の好ましい側面によると、本発明の化合物又はその薬学的許容塩の薬理学的有効量をヒトに投与することを含む、ヒトの固形癌を治療する方法が開示される。薬理学的有効量は、本発明の薬学的組成物に含まれて投与するのが好ましい。
【００１５】
本発明の化合物は、細胞浸透性鉄キレート剤である。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明の化合物の抗ガン効果は、その鉄キレート化性に基づくと信じる。
【００１６】
本発明の特に好ましい側面によると、本発明の化合物のような鉄キレート剤の抗腫瘍効能は、自食作用(autophagy)阻害剤により向上される。好ましい自食作用阻害剤はクロロキン(chloroquine)である。この観点から、固形腫瘍の治療に、自食作用阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせの使用が開示される。”組み合わせ”とは、自食作用阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤とを近い時間的関係、例えば同時に又は１日まで及び１週間までの期間内に投与することと理解されたい。自食作用阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤とは、それらを含む薬学的組成物の形態で、又は別個の薬学的組成物の形態で投与することができる。一つの薬学的組成物の形態で投与する場合、その組み合わせは薬学的に許容される担体を含む。
【００１７】
自食作用阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせにおいて、該細胞浸透性鉄キレート剤は、癌に冒されたヒトの固形腫瘍を治療するために、好ましくは一般式（Ｉ）のＮ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジン又はその薬学的許容塩であり、ここでＲはＨ又はメチル、Ｒ１はＨ又はＣ１−Ｃ４アルキルである。Ｒ及びＲ１の両方がメチルであるのが好ましい。Ｒ１は特に６−メチル又は８−メチルであるのが好ましい。
【００１８】
組み合わせて使用するために好ましい本発明の鉄キレート化(chelating)化合物は、一般式（Ｉ）のＮ−（１−ピリジン−２−イル−メチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−フルオレン−２−イル）−ヒドラジンを含み、ここで
Ｒ        Ｒ１        Ｒ２
メチル    ８−メチル    Ｈ        特に好ましい  ＣＢ２１として認定される
メチル      Ｈ          Ｈ        好ましい
メチル    ６−メチル    Ｈ        好ましい
Ｈ      ６−メチル    Ｈ        好ましい
Ｈ      ８−メチル    ＣＨ３    好ましい
【００１９】
【化２】
2014508804.tif 000003
【００２０】
本発明の自食作用阻害剤と組み合わせて使用する別の鉄キレート化化合物には、デフェロキサミン(deferoxamine)、デフェリプロン(deferiprone)、及びデフェラシロックス(deferasirox)が含まれる。
【００２１】
自食作用阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせにおいて、該自食作用阻害剤は好ましくはクロロキン(chloroquine)から選ばれる。他の好ましい自食作用阻害剤には、ヒドロキシクロロキン、３−メチルアデニン、アデノシン、バフィロマイシン(bafilomycin)Ａ１、５−アミノ−４−イミダゾール  カルボキサミド  リボシド、ウォルトマニン(wortmannin)、及びビニブラスチン(viniblastine)が含まれる。
【００２２】
本発明で使用する別の自食作用阻害剤は、参照用に本願に含めるＷＯ２０１１／０１１５２２  Ａ２に開示された一般式（ＩＩ）のものである：
【００２３】
【化３】
2014508804.tif 000004
【００２４】
本発明によると、癌に冒されたヒトの固形腫瘍を治療する方法も開示され、該方法は、自食作用阻害剤と本発明の細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせを薬理学的に有効量で、近い時間的関係で、例えば同時に又は１日以内若しくは１週間以内に投与することを含む。投与はいかなる適当な経路でもよく、例えば非経口又は経口で、一方は自食作用阻害剤と薬学的に許容される担体、例えばジメチルスルホキシド、とを含む別個の薬学的組合せ物の形態で、或いは同時に投与する場合は薬学的に許容される担体、例えばジメチルスルホキシド、を含む単一の薬学的組合せの形態であってもよい。
【００２５】
本発明の更に別の好ましい側面によると、ヒトの固形癌を治療する方法が開示され、該方法は、該ヒトに自食作用阻害剤と細胞浸透性鉄キレート剤との組み合わせを薬理学的に有効量で、同時に又は近い時間的関係で、例えば１時間以内又は１日以内又は１週間以内に投与することを含む。投与は、前に開示した薬学的組成物の形態であるのが好ましく、そして非経口又は経口又はその他の適当な経路による。
【００２６】
本発明を、多くの図面を含む図に例示された多くの好ましい具体例を参照して、更に詳しく記述する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＦａＤｕ頭−首癌(carcinoma)異種移植片(xenografts)に対するＣＢ２１の生体内（インビボ）活性を示す図である。ＦａＤｕ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスをｍｇ／ｋｇのＣＢ２１で処理し、そして腫瘍容積を計算した。
【００２８】
【図２ａ−２ｈ】ＨＣＴ１１６ＭＣＳに対するＮ−（１−ピリジン−２−イル−エチリデン）−Ｎ−（９Ｈ−１，３，４，９−テトラアザ−８−メチル−フルオレン−２−イル）−ヒドラジン（以下、”ＣＢ２１”と記載する）の細胞毒性、及び細胞毒性効果の治療濃度域(window)を示す。図２ａ：ＣＢ２１で処理したＭＣＳにおける形態学及びカスパーゼ−３誘発。ＨＣＴ１１６ＭＣＳを６μＭのＣＢ２１で６時間処理し、次いで薬物なしの媒体に変え、そして更にインキュベーションした。ＭＣＳを区分しそして活性カスパーゼ−３を染色した。図２ｂ：指示した化合物で処理した細胞のクローン化副生物。図２ｃ：ＣＢ２１の存在下又は不存在下での単層ＨＣＴ１１６細胞の増殖。細胞を９６穴プレートに７，０００細胞／穴で蒔き、そして３μＭ、６μＭ、及び１２．５μＭのＣＢ２１で処理した。図２ｄ：６μＭのＣＢ２１の添加後、単層ＨＣＴ１１６細胞へＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）混入。細胞をＥｄＵで３０分間培養し、固定し、そしてＡｒｒａｙＳｃａｎで分析した。図２ｅ：図２ｄに示した実験におけるＥｄＵシグナルの定量化。図２ｆ：ＣＢ２１の存在下又は不存在下での単層ｈＴＥＲＴＲＰＥ１細胞の増殖。細胞を９６穴プレートに７，０００細胞／穴で蒔き、そして３μＭ、６μＭ、及び１２．５μＭのＣＢ２１で処理した。図２ｇ：ＣＢ２１は集密的ｈＴＥＲＴＲＰＥ１細胞の生存率に影響を及ぼさない。細胞をＣＢ２１の存在下又は不存在下で９６穴プレートに１穴につき７，０００個又は７０，０００個蒔いた。図２ｈ：６μＭのＣＢ２１に曝した後のＨＣＴ１１６及びｈＴＥＲＴＲＰＥ１の形態。
【００２９】
【図３ａ−３ｅ】ＣＢ２１は有力な鉄キレート剤である事を示す。図３ａ：連結性マップ（Ｃｍａｐ）データベースによるスコア。図３ｂ：塩化鉄の存在下又は不存在下で６μＭのＣＢ２１で処理した細胞の生存率。左：ＨＣＴ１１６細胞；右：ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞。図３ｃ：種々の鉄キレート剤で処理したＨＣＴ１１６細胞の生存率。図３ｄ：ＣＢ２１に関連する構造を有する７種の化合物で処理したＨＣＴ１１６細胞の生存率。図３ｅ：ＣＢ２１は一連の関連化合物の中でＭＣＳ生存率を低減するのに最も有効である。
【００３０】
【図４ａ−４ｆ】ＣＢ２１及び他の鉄キレート剤による自食症の誘発を示す。図４ａ：６μＭのＣＢ２１に６時間曝し、そして薬物なしの媒体中で更に４２時間又は９０時間曝した単層ＨＣＴ１１６細胞の形態。図４ｂ：LC3に対する抗体を用いたCB21処理細胞の染色。図４ｃ：単層及びＭＣＳ  ＨＣＴ１１６中のＣＢ２１によるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩタンパク質の誘発。細胞を６時間処理し（６μＭ）、そして次ぎに更に培養した。タンパク質を抽出し、そしてウエスタンブロット（western blot)分析に付した。図４ｄ：単層及びＭＣＳ  ｈＴＥＲＴＲＰＥ１細胞中のＣＢ２１によるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩタンパク質の誘発。図４ｅ：いろいろな鉄キレート剤によるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの誘発。細胞をＶＬＸ５０（５０μＭ）；デフェラシロックス（deferasirox）（６０μＭ）、デフェロキサミン(deferoxamine)（２００μＭ）、シクロピロキサミン(ciclopiroxamine)（１５μＭ）、ＣＢ２１（５μＭ）、ラパマイシン(rapamycin)（０．１μＭ）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（０．２μＭ）で処理した。図４ｆ：電子顕微鏡で可視化した周辺細胞及びコア細胞の形態。ＭＣＳを６μＭのＣＢ２１で処理し、そして薬物なしの媒体中で指示した時間更に培養し、そして区分した。ＣＢ２１処理２４時間での膨張したミトコンドリアの外観に注目されたい。
【００３１】
【図５】ＣＢ２１で誘発された自食作用の阻害は、ＣＢ２１細胞毒性を増加させることを示す。図５ａ：ＨＣＴ１１６単層を６μＭのＣＢ２１及び／又は１０μＭの３−ＭＡで処理し、細胞生存率を４８時間後に測定した。図５ｂ：ＨＣＴ１１６単層を、Ｂｅｃｌｉｎ／Ａｔｇ６へのｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞を指示したように６μＭのＣＢ２１で処理した。図５ｃ：バフィロマイシンＡ（１０μＭ）は、ＣＢ２１処理細胞におけるＬＣ３陽性小胞の形成を阻止する。細胞を固定し、そして薬物処理後の指示した時点においてＬＣ３について染色した。図５ｄ：バフィロマイシンＡはＣＢ２１の細胞毒性を増加させる。細胞を６μＭのＣＢ２１及び／又は１０μＭのバフィロマイシンＡで処理し、そして細胞を指示した時点で撮影した。図５ｅ：クロロキンは単層培養物中のＣＢ２１の細胞毒性を増加させる。ＨＣＴ１１６細胞を６μＭのＣＢ２１及び／又は１０μＭのクロロキンで処理した。細胞増殖を、培養密集度の計算により監視した。図５ｆ：クロロキンはＭＣＳ培養物中のＣＢ２１の細胞毒性を増加させる。細胞生存率を、酸性ホスファターゼテストを用いて決定した。酸性ホスファターゼのバックグラウンドレベルを、多分酵素捕捉によるであろう生存細胞を含まない（一般に〜３０％）ＨＣＴ１１６ＭＣＳ培養物中で観察したことに注意されたい。
【００３２】
【図６ａ−６ｅ】図６ａ−６ｅは、ＣＢ２１がｐ５３及び低酸素症反応を誘発することを示す。図６ａ：ＣＢ２１により誘発された遺伝子発現プロフィールをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘミクロアレーで分析した。低酸素症、ｐ５３ネットワーク及び細胞分裂に関連する遺伝子の表示を示す。図６ｂ：ｐ５３及びＨＩＦ−１ａのウエスタンブロットによる分析。ＨＣＴ１１６細胞を６μＭのＣＢ２１で指示した時間処理した。図６ｃ：ＣＢ２１によるＨＩＦ−１ａ−プロモータドライバーＧＦＰレポーターの誘発。図６ｄ：ＨＣＴ１１６及びｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞におけるＣＢ２１によるＢＮＩＰ３の誘発。図６ｅ：ＢＮＩＰ３のノックダウンはＣＢ２１誘発細胞死に影響を及ぼさない。ＨＣＴ１１６細胞をＢＮＩＰ３へのｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトさせ、そして２４時間後、６．２５μＭのＣＢ２１で処理した。４８時間後、アシッドホスファターゼアッセーを用いて生存率を測定した。
【００３３】
【図７】ＣＢ２１は呼吸を減少させ、そしてｍＴＯＲを阻害することを示す。図７ａ：グルコース輸送に対する効果。図７ｂ：ＣＢ２１は酸素消費を低減させる。図７ｃ：ＣＢ２１はＨＣＴ１１６ＭＣＳにおける低酸素症を低減させる。ＨＣＴ１１６ＭＣＳを指示したように処理し、そしてピモニダゾール免疫組織化学用に加工した。ＣＢ２１は、ピモニダゾール付加物に対して正に染色する領域を低減させることに注目されたい（＜１０ｍｍ  Ｈｇ  Ｏ２）。図７ｄ：ＣＢ２１は４ＥＢＰ１のリン酸化(phosphorylation)反応を阻害する。ＨＣＴ１１６細胞をＣＢ２１で指示した時間処理し、そしてタンパク質抽出物をウエスタンブロット用に加工した。４ＥＢＰ１のリン酸化反応の低減、及びＡＫＴリン酸化反応の誘発に注目されたい。
【００３４】
【図８】ＣＢ２１細胞毒性はグルコース枯渇により向上することを示す。図８ａ：グルコースの存在又は不存在下での２４時間の培養後のＨＣＴ１１６ＭＣＳの形態学。図８ｂ：ＨＣＴ１１６単層細胞を、グルコース含有又はグルコースなしの媒体中の種々の濃度のＣＢ２１で処理した。カスパーゼ分割（ｃｌｅａｖｅｄ）Ｋ１８のレベルをＭ３０  ＣｙｔｏＤｅａｔｈ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した。図８ｃ：ＨＣＴ１１６単層細胞を図８ｂにおけるように処理した。生存率を、アシッドホスファターゼアッセーを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
材料及び方法
本発明の化合物を化合物ライブラリーから得た。それらはWO 02/089809のような文献に記載された方法に従って、又はそれらの非発明的変更により調製できる。該化合物をDMSOに溶解した。細胞培養液中で０．５％DMSOの最終濃度に達した。
【００３６】
細胞培養液、ＭＣＳの生成及びスクリーニング
ＨＣＴ１１６結腸癌細胞をＭｃＣｏｙの５Ａ修飾媒体／１０％ウシ胎児血清中に３７℃で５％ＣＯ２中に維持した。ＭＣＳを、前に記載した方法（１２）の変更法を用いて調製した。１０，０００細胞を含む細胞懸濁液（２００μｌ）をポリ−ＨＥＭＡ被覆９６穴プレートの各穴に加えた。該穴を追加の１７０μｌの媒体を加えることによりいっぱいにして、凸表面曲線を得た。塑像用粘土スペーサー（３ｍｍ）を各プレートの隅部に置いて、蓋が該媒体に触れるのを防止した。該プレートを次に逆にして該細胞を液体／空気界面に沈殿させ、そして静かに振って培養した。２４時間の培養後、該プレートを正常状態に戻した。第１の過剰媒体を吸引により除去し、次ぎに塑像用粘土スペーサーを除去した。該プレートを薬物処理前に４日間培養した。薬物処理２４時間の後、ＮＰ４０を培養媒体に加えて０．１％の濃度にして、カスパーゼ分割(cleaved)Ｋ１８をＭＣＳから抽出し、そして死んだ細胞から媒体に放出された物質を含ませた。カスパーゼ分割ケラチン−１８（Ｋ１８−Ａｓｐ３９６）を、２５ｍＬ媒体／抽出物を用いて、Ｍ３０ＣｙｔｏＤｅａｔｈ  ＥＬＩＳＡアッセー（生体外使用に開発されたＭ３０−Ａｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（１３）の一種）（Ｐｅｖｉｖａ  ＡＢ，ブロマ、スエーデン）を用いて測定した。
【００３７】
生存率測定を、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ外（１４）に記載されたアシッドホスファターゼ（ＡＰＨ）法により行った。背景活性を差し引いた。
【００３８】
ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞をクロンテク研究所、マウンテンビュー、カルフォルニア州、から得た。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を安定に発現した不死化ヒトレチナール上皮細胞系である。
【００３９】
ＤＮＡ合成の評価
ＥｄＵ添加を測定するために、蛍光顕微鏡ＡｒｒａｙＳｃａｎ  Ｖ  ＨＣＳシステム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国）を使用した。テスト化合物の添加前に、ＨＣＴ１１６細胞を９６穴プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，ウェレスレー、マサチュセッツ州、米国）に播種し、一夜取り付けたままにした。細胞をＣＢ２１で２４時間、又はビヒクル対照で処理した。細胞をＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  ＨＣＳアッセー（Ｃ１０３５４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，オレゴン州，米国）を用いて、製造者の指示に従って染色した。加工したプレートをＡｒｒａｙＳｃａｎに載せ、そして分析した。１０×対象(objective)を有する適当なフィルターを使用して、画像を各蛍光チャンネルについて獲得し、そして各穴で少なくとも１０００個の細胞を分析した。該ＢｄＵチャンネルにおける平均合計強度を測定した。結果は２回の独立した実験の平均として示す。各実験は重複して穴中で行い、平均±ＳＤとして示す。
【００４０】
免疫学的アッセー
９６穴プレート中で懸滴法により製造したＭＣＳをパラホルムアルデヒド中に固定し、脱水し、パラフィンに埋め込み、そして区分けした。各サンプルは３２ＭＣＳを含んだ（各９６穴プレートからのＭＣＳを３グループに分けてプールした）。該区分を、キシレンを用いて脱パラフィンし、再水和し、そして電子レンジにかけ、次ぎに、１％（重量／容積）ウシ血清アルブミン中に希釈したモノクローン性一次抗体を用いて培養し、そして標準アビジン−ビオチン−パーオキシターゼ複合体技術（ベクター  ラボラトリーズ、バーリンゲーム、カルフォルニア州、米国）により可視化した。対比染色を、メーヤーのヘマトキシリンを用いて行った。（核増殖に関連した抗原Ｋｉ６７に対する）抗体ＭＩＢ−１をイムノテク  エスエー、マルセル、フランスから得て、１：１５０の希釈で使用し、活性カスパーゼ−３に対する抗体をファーミンゲンから得て、１：５０の希釈で使用した。
【００４１】
ウエスタンブロッテング
細胞抽出タンパク質を、トリス−アセテートＰＡＧＥゲル（インビトロゲン、カリスバッド、カルフォルニア州）により溶かし、ポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜に移した。該膜を、抗体を用いて一夜培養し、洗浄し、そしてＨＲＰ−共役抗ウサギＩｇ（アマーシャム  ビオサイエンス、リットル  カルフォント、英国）を用いて１時間培養した。パーオキシターゼ活性を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（ピアース  ビオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ州）により、製造者の指示に従って発展させた。
【００４２】
連結度(Connectivity)マップ
０２に確立された連結度マップ（ＣＭＡＰ）（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｍａｐ）は１３００個の化合物についてゲノム幅発現データを含む（６１００例、レプリカ、いろいろな投与量及び細胞系を含む）。Ｌａｍｂ外（１５）に記載されたようにＭＣＦ−７乳癌細胞を使用した元のプロトコルに従った。細胞を６穴プレートに０．４×１０６細胞／穴の密度で置き、２４時間取り付けたままにし、次いでＮＳＣ７６０２２，ＮＳＣ６２０３５８又はＮＳＣ６４７８８９に最終濃度１０μｍで、又はベヒクル対照物（ＤＭＳＯ）に暴露した。６時間の処理後、該細胞をＰＢＳで洗った。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン、チャツワース、カルフォルニア州）を用いて調製した。全ＲＮＡの２マイクログラムから出発して、遺伝子発現分析を、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙｓを使用して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ｒｅｖ．５，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，サンタクララ、カルフォルニア州）に従って行った。生のデータを、ＭＡＳ５（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて規格化し、そして薬物処理細胞対ベヒクル対照細胞についての遺伝子発現比を計算して、制御した遺伝子のリストを作製した。フィルター基準は、処理した細胞系における全遺伝子のために、及び少なくとも１００の任意の発現ユニットの発現切除のために提示した。ＣＭＡＰ両立性の理由から、ＨＧ  Ｕ１３３Ａ上に存在するプローブのみを使用した。ランク付け化合物リストを検索するために、各化合物について４０の最も上下する調節された遺伝子（即ちプローブ）をＣＭＡＰにアップロードし、そしてＣＭＡＰデータベース中の６１００例と比較した。
【００４３】
酸素消費
呼吸の測定を（１６）に記載されたように行った。レテノン（２ｍＭ）の存在下でのコハク酸塩（５ｍＭ）、リンゴ酸塩＋ピルビン酸塩（各５ｍＭ）、及びＴＭＰＤ（０．５ｍＭ）＋アスコルビン酸塩（１ｍＭ）をミトコンドリア基質として使用した。酸素の変化を酸素電極（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ノルフォーク、英国）を用いて監視し、そしてＯｘｙｇｒａｐｈＰｌｕｓソフトウェア（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ノルフォーク、英国）を用いて分析した。細胞中の基底Ｖ４呼吸を、ＡＤＰがミトコンドリアに入るのを阻止するアトラクチロシド１Ｍの存在下で評価した。
【００４４】
マウス異種移植片の処理
ＳＣＩＤマウス中のＨＣＴ１１６腫瘍が２００ｍｍ３の大きさに生長した時に、該マウスに薬物を腹腔内注射し、そして腫瘍の大きさを毎日測定した。
【００４５】
実施例１：本発明の化合物はアポトーシスを誘発しそしてＭＣＳの生存率を低減する
ＭＣＳをＣＢ２１で６時間処理し、次いで薬物なしの媒体中で９６時間培養すると、中央領域が壊死した小さいサイズのＭＣＳとなった（図２ａ）。カスパーゼ−３誘発はＮＳＣ６４７８８９と比べると穏やかであった。重要なことには、ＭＣＳをＣＢ２１で６時間処理すると、クローン化を＜５％に減少させた（図２ｂ）。クローン化の減少は、シスプラチン(cisplatin)、イリノテカン(irinotecan)及びドキソルビシン（doxorubicin)で観察したクローン化減少よりも（５−１０μＭの濃度で使用；単層培養物中のこれらの化合物のＩＣ５０の１０倍より多い濃度で使用にかかわらず）強かった。単層ＨＣＴ１１６細胞をＣＢ２１で処理すると、０−２４時間の間、細胞数に僅かな増加が生じ、次いで細胞の損失が生じた（図２ｃ）。ＣＢ２１処理細胞中の５−エチニル−２’−デオキシウリジン導入（ＥｄＵ）を調べると、ＤＮＡ合成がほぼ完全に２４時間の時点で廃止されたことを示した（図２ｄ，２ｅ）。ＣＢ２１は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子が崩壊した細胞に対して、ｗｔ  ｐ５３を発現する細胞に対するのと同等に有効であった（図２ｂ）。不死化ヒト上皮細胞（ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞）の反応は、ＨＣＴ１１６細胞の反応と相違した。これらの細胞の生長は止められたが、細胞数は減少しなかった（図２ｆ）。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞を高密度でプレートすると（７０，０００細胞／穴）、ＣＢ２１での処理後に本質的に細胞損失は観察されなかった（図２ｇ）。ＣＢ２１に対するＨＣＴ１１６とｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞との反応の差異を図２ｈに示す。
【００４６】
実施例２：本発明の化合物は細胞浸透性鉄キレート剤である
ＣＢ２１の作用のメカニズムに関する仮説を作製するために、連結度マップ（ＣＭａｐ）、即ち、薬物処理細胞系からの遺伝子発現形跡の概要、を使用した。ＣＢ２１により誘発された遺伝子発現における変化は、鉄キレート化能力を有する抗かび剤（１７）であるシクロピロキソールアミン(ciclopiroxolamine)（ＣＰＸ）のそれと殆ど類似した（図３ａ）。ＣＢ２１の細胞毒性活性は鉄の枯渇に依存したか否かを試験するために、ＣＢ２１の添加前に塩化鉄をＨＣＴ１１６細胞に添加した。塩化鉄は、ｗｔｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞とｐ５３遺伝子が崩壊したＨＣＴ１１６細胞の両方に対するＣＢ２１の効果（図３ｂ）を全く無効にすることが見出された。
【００４７】
ＣＢ２１の抗増殖活性を他の公知の鉄キレート剤の抗増殖活性と比較した。ＣＢ２１はＶＬＸ５０、デフェラシロックス(deferasirox)、シクロピロキソールアミン(ciclopiroxolamine)、デフェロキサミン(deferoxamine)よりも強力であることが見出された（図３ｃ）。構造−活性の関連性を、多くの構造的に関連する化合物を使用して調査した（図３ｄ，３ｅ）。これらの研究は、ＣＢ２１が単層及びＭＣＳ培養物の両方中で最も有効な化合物であることを示した。
【００４８】
実施例３：本発明の化合物は広範の自食作用反応を誘発する
鉄キレート剤の抗腫瘍活性（anti-tumourigenic activity)は一般に、リボヌクレオチドレダクターゼの阻害に起因し、細胞増殖の阻害となることによる（１８）。ＭＣＳは殆ど非増殖性の細胞を含む。従って、鉄キレート剤ＣＢ２１によるＭＣＳに対する細胞毒性効果の誘発の発見は予想外であった。作用のメカニズムを更に詳細に研究した。ＣＢ２１処理細胞の肉眼調査は、細胞が多数の大きい原形質小胞を含むことを明らかにした（図４ａ）。これらの小胞は微管状が結合したタンパク質１軽鎖３（ＬＣ３）に対する抗体で正に染色したが、それらは自食作用と関連することを示唆する。ＬＣ３染色は２４時間の時点で観察され、４２時間の時点でより強かった（図４ｂ）。ウエスタンブロット分析は、ＨＣＴ１１６単層細胞のＣＢ２１での処理は、ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの両方にレベルの強い増加を引き起こしたことを示した（図４ｃ）。ＬＣ３−ＩＩ（ＬＣ３のＰＥ−結合型）は、自食胞に最も確実に関連するとみなされるタンパク質マーカーである（１９）。ＬＣ３−ＩＩレベルはＨＣＴ１１６ＭＣＳにおいてもＣＢ２１によって強く誘発された（図４ｃ）。ＣＢ２１はまた、ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞においてＬＣ３−ＩＩを誘発したが、誘発レベルはＨＣＴ１１６細胞と比べてずっと弱かった（図４ｄ）。この結果は、ＣＢ２１誘発自食作用の程度がこれらの２つの細胞型において、化合物の細胞毒性効果と相関することを示す。
【００４９】
ＨＣＴ１１６細胞を種々の鉄キレート剤の細胞毒性濃度で２４時間処理した。ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの誘発を全ての例で観察すると、ＬＣ３誘発は鉄キレート剤の全般的効果であることが示された（図４ｅ）。鉄キレート剤によるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの誘発は、ラパマイシン又はＮＶＰ−ＢＥＺ２３５で処理した後に観察された該誘発（２４時間後の観察で誘発なし、６時間後で弱い誘発）に比べてずっと強かった。
【００５０】
ＣＢ２１がＭＣＳの内部コア細胞において細胞変化を誘発できるか否かを調べるために、ＨＣＴ１１６ＭＣＳをＣＢ２１で６時間処理し、洗浄し、そしていろいろな時間培養し、固定し、区分し、そして電子顕微鏡で調査した。処理から２４時間後に始まる大きな小胞が観察された（図４ｆ）。注目すべきことは、ＣＢ２１処理ＭＣＳの大きい共通の特徴は、大きくなったそして膨張したミトコンドリアの早期の出現であった（図４ｆ）。最も重要なことは、大きい空胞変性が時間依存的に、ＭＣＳ周辺の細胞だけでなくＭＣＳの中心の細胞にも起きたことである（図４ｆ）。ＣＢ２１は、ＭＣＳの中心コアの細胞に、アポトーシスに抵抗性であることが見出された小胞の形成を誘発すること、そしてこの反応はこれらの細胞の生存率の損失と関連すると結論された。
【００５１】
実施例４：自食作用又は自食胞(autophagosomes)−リソソーム熔融の阻止は、本発明の化合物による細胞死を増大させる
自食作用は一般に、ストレス症状に対する生存反応と考えられるが、プログラムされた細胞死の機構でもあり得る（２０、２１）。ＣＢ２１誘発細胞死に対する種々の自食作用阻害剤の効果を調べるために、ＣＢ２１の細胞毒性効果を３−ＭＡ、即ち自食作用の阻害剤として通常使用されるＰ１３Ｋ阻害剤、により増強にした（図５ａ）。次ぎに、ｓｉＲＮＡを使用したＢｅｃｌｉｎ／Ａｔｇ６のノックダウンを行った。この結果、このタンパク質の発現をほぼ完全にノックダウンした。Ｂｅｃｌｉｎ／Ａｔｇ６ノックダウンはＨＣＴ１１６細胞の生存率を５０％だけ減少させた。生存率はＣＢ２１毒性により更に減少した（図５ｂ）。自食胞及びリソソームの熔融を防止する抗生物質であるバフィロマイシンＡの効果の調査は、バフィロマイシンＡがＨＣＴ１１６細胞中の大きな細胞質ＬＣ３−ＩＩ陽性小胞の出現を抑制したことを示した（図５ｃ）。一方、バフィロマイシンＡは約７２時間の時点で細胞毒性を誘発し、バフィロマイシンＡとＣＢ２１の組み合わせでは細胞毒性がより早期に（約４８時間目）に観察された（図５ｄ）。これらの発見は、自食作用の阻害は本発明の化合物の細胞毒性効果を増大し、そしてＣＢ２１処理細胞に観察された大きな小胞は、自食胞及びリソソームの熔融によって引き起こされることを示す。
【００５２】
クロロキン（ＣＱ）は自食胞が減成オートリソソームに成熟するのを阻害するために広く使用されるリソソーム向性剤である（２２）。ＣＱは、それ自身はＨＣＴ１１６細胞の増殖に効果がない。ＣＱとＣＢ２１の組み合わせは、単層ＨＣＴ１１６細胞に対して細胞死の強い増強作用を生じた（図５ｅ）。ＣＱとＣＢ２１の組み合わせのＭＣＳに対する細胞毒性の調査は、ＣＱ又はＣＢ２１のいずれかのＭＣＳに対する効果と比較して、増強された効果を明らかにした（図５ｆ）。
【００５３】
実施例５：ＬＣ３誘発はＢＮＩＰ３により媒介されない
ＣＢ２１は多くの低酸素症応答性遺伝子を誘発し、そしてまたｐ５３により制御されることが知られた多くの遺伝子を誘発した（図６ａ）。ウエスタンブロッチングによるＨＩＦ−１ａレベル及びｐ５３タンパク質レベルの誘発（図６ｂ）が確認された。ＧＦＰがＨＩＦ−１ａプロモータにより制御されるレポーター細胞系を使用して、多くの誘発もまた観察された（図６ｃ）。
【００５４】
ＣＢ２１により強く誘発される種々の遺伝子の中で、ＢＨ３−オンリータンパク質ＢＮＩＰ３をコードする遺伝子が注目された。ＢＮＩＰ３はＨＩＦ−１ａの公知の標的である（２３）。ＢＮＩＰ３発現は、強力な細胞質空胞変性及び自食作用を誘発することが報告されている（２４）。ＣＢ２１はＨＣＴ１１６細胞中でＢＮＩＰ３タンパク質の発現を誘発することが見出された（図６ｄ）。しかしＢＮＩＰ３発現はまた、ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞中のＣＢ２１により強く誘発された（図６ｄ）。この発見はＢＮＩＰ３がＣＢ２１誘発自食作用の仮定された機構であることと両立しない。ｓｉＲＮＡを使用したＢＮＩＰ３のノックダウンは、ＣＢ２１によるＬＣ３−ＩＩの誘発及び細胞死を減少させなかった（図６ｅ）。
【００５５】
実施例６：本発明の化合物は酸素消費を阻害しそしてｍＴＯＲ活性を減少させる
上記の結果は、自食作用はＣＢ２１により誘発された毒性損傷から細胞を救助するために誘発されることを示唆する。細胞エネルギー代謝に関係する多く主要タンパク質はＦｅ−Ｓ複合体を含むので（２５）、本発明者等は、ＣＢ２１による鉄キレート化が、自食作用の引き金となるであろう細胞代謝における撹乱を引き起こすかもしれないと推測した。この推測を評価するために、ＡＴＰの細胞内レベルに対するＣＢ２１の効果を調べた。しかしながら、自食作用を誘発する濃度では、細胞内ＡＴＰレベルの減少は観察されず、ＡＭＰＫ（ＡＭＰで活性化されるタンパク質キナーゼ）のリン酸化反応の誘発は検出されなかった（図示なし）。次ぎに、ＣＢ２１によるグルコース輸送の可能性を、蛍光性ｄ−グルコース類似体である２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−アミノ］−２−デオキシ−ｄ−グルコース（２−ＮＢＤＧ）を使用して、フローサイトメトリーにより行った。図７ａに示されるように、２−ＮＢＤＧ摂取の約２５％の増加がＣＢ２１処理細胞内で観察された。
【００５６】
細胞酸素消費に対するＣＢ２１の効果の調査は、ＨＣＴ１１６単層培地において、Ｖ３（状態３）及びＶｕ（脱共役）呼吸はＣＢ２１処理から６時間後に著しく減少した（ｐ＜０．０５）ことを明らかにした（図７ｂ）。該ＭＣＳ中の腫瘍細胞中の呼吸がＣＢ２１により影響されるか否かを調べるために、間接的な方法を使用した。ミトコンドリア呼吸の阻害は組織酸素分圧の増加を引き起こし、それは減少したピモニダゾール染色として目で見ることができることが知られている（２６）。実際に、ピモニダゾールで陽性に染色される区分したＭＣＳの領域は、ＣＢ２１で処理されたＭＣＳでは対照の約５０％であることが見出された（図６ｃ；表）。該効果は、薬物暴露から３時間後に観察され、２４時間の時点まで続いた（図７ｃ）。対照として、ＨＣＴ１１６単層培養物を、酸素消費を増加させることが知られたミトコンドリア脱共役剤、カルボニルシアニド−３−クロロフェニルヒドラゾン、ＣＣＣＰ、で処理した。予期したように、ＣＣＣＰで処理したＭＣＳはピモニダゾール染色の一層大きい領域を表示した（図７ｃ；表）。
【００５７】
【表１】
2014508804.tif 000005
【００５８】
ラパマイシンの哺乳類標的(mTOR)は、栄養状態に反応して細胞成長を調節するセリン/トレオニンキナーゼである。代謝ストレスはmTOR経路の活性に影響を及ぼすことが確立されている(27)。該mTOR経路はミトコンドリア酸素消費と酸化能力を調節する（２８、２９）。ＣＢ２１処理後に観察される減少した酸素消費がmTOR阻害と関連したか否かを決定するために、mTOR基質４ＥＢＰ１のリン酸化を調査した。図７Ｄに示すように、４ＥＢＰ１リン酸化はＣＢ２１により阻害される。リン酸化における減少は、増加したＡＫＴリン酸化と関連する。mTORC1の阻害は関連する負のフィードバックループ(feedback loop)を開放し、強力なＡｋｔ活性化の結果となることが知られている（３０）。mTOR阻害は酸素消費を減少させるか否かを試験するために、ＨＣＴ１１６ＭＣＳをラパマイシン（mTOR−ラプター複合体形成の特異的薬理学的阻害剤）で処理し、そして区域をピモニダゾールで染色した。ピモニダゾール染色の減少が観察されたが、ＣＢ２１で処理したほどは強くなかった（図７ｃ，表１）。
【００５９】
これらの発見は、mTORの直接的阻害はＣＢ２１によるのと同様な効果に導くか否かを調査することを促した。これらの実験のために、２重にＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５を使用した。該ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５は臨床的審理における化合物である。重要なことは、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５はＨＣＴ１１６細胞成長における４ＥＢＰ１リン酸化を、単層条件及びＭＣＳ条件の両方で減少させることが見出された（図７ｄ）。ＣＢ２１とは対照的に、ＮＢＰＢＥＺ２３５はＭＣＳのコア中の細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。
【００６０】
実施例７：本発明の化合物により誘発される細胞死はグルコース窮乏により向上する。
腫瘍細胞中の細胞ＡＴＰ産生のほぼ５０％は酸化的リン酸化による（３１）。酸素消費は、多分減少した増殖活性の結果として、腫瘍ＭＣＳの内部領域で減少すると報告されている（３２、３３）。他の調査で、酸素消費はＭＣＳの生存に適した領域ではむしろ均一であることが発見された（３４）。ＭＣＳ培養において、変換の同じ段階で線維芽細胞クローンは全く区別できる代謝活性を有し得ることが報告されている（３３）。中央コアの細胞において、細胞酸素消費が低い場合でも、ＣＢ２１により誘発される更なる減少は、グルコース依存性の増加に導くと予想される。（図８ａに示すように）単層細胞は増加したグルコース依存性を、増加した摂取により補償し得るが、グルコースはＭＣＳにおいて制限的であろう。図８ａに示すように、ＨＣＴ１１６ＭＣＳコア細胞は生存のためにグルコースに依存性である。グルコースの枯渇は中央領域の壊死を導き、効果はＣＢ２１の効果を連想させる（図２）。これらの考察に基づき、グルコース窮乏はＣＢ２１に対するＨＣＴ１１６単層細胞の感度を増加させるか否かを試験した。これは全く事実であった：グルコース窮乏は細胞生存率を減少させそしてＣＢ２１によるアポトーシスを増加させた。これらの発見は、中央コア細胞のＣＢ２１に対する感度を少なくとも部分的に説明する。
【００６１】
実施例８：本発明の化合物の抗腫瘍活性
ＣＢ２１によるイン  ビボ抗腫瘍活性をＨＣＴ１１６モデルで調べた。腫瘍を約０．２ｍＬのサイズに生長させ、次ぎにＣＢ２１で処理した。化合物ＣＢ２１の明らかな抗腫瘍効果が観察された（図１）。
トリアピン(Triapine)（３５）、タキピル(Tachpyr)（３６）及びトレンソックス(Trensox)（３７）を含めて、抗腫瘍活性を示す多くの鉄キレート剤が開発された。鉄は、リボヌクレオチド還元酵素によるリボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドの形成を含む、多くの代謝反応に重要である。Ｆｅが存在しないと、細胞は細胞サイクルのＧ１からＳ相へと進行することができない。これは、観察されたＨＣＴ１１６細胞及びｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞の両方に対するＣＢ２１の抗増殖作用を説明する。鉄キレート剤は原則として増殖細胞に特異的であると見なされているので、ＭＣＳに対して細胞毒性を示す薬剤のスクリーニングにおいて、鉄キレート剤の確認は予想されなかった。更なる研究で、ＭＣＳコア内の非増殖性細胞に対するＣＢ２１の効果についての可能なメカニズムが明らかにされた。直接測定及びＭＣＳのピモニダゾール染色の使用の両方で観察されたように、ＣＢ２１はＨＣＴ１１６細胞及びｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞の酸素消費を減少させたことが更に見出された。ミトコンドリア酸素消費及び酸化能力はmTOR経路により調節されることが知られている（２８、２９）。鉄キレート剤のデフェラシロックスはmTOR信号伝達を阻害することも報告された（３９）。ＣＢ２１は４ＥＢＰ１のリン酸化を阻害しそして高く調整されたＡＫＴリン酸化に導くことが実際見出された。デフェラシロックスによるmTOR信号伝達の阻害は、低酸素症により誘発される遺伝子であるＲＥＤＤ１（ＲＴＰ８０１とも云う）の誘発とされており、それは次ぎにＴＳＣ２タンパク質を活性化する（４０）。酸素消費に対するＣＢ２１の効果はこのメカニズムによって少なくとも部分的に媒介されると考えられる。別の可能性は、鉄枯渇により誘発される代謝ストレスは、mTOR経路の活性に、いくつかの他のメカニズムにより影響を及ぼすことである。
【００６２】
他の鉄キレート剤により共有されるＣＢ２１の別の効果は（４１）、ＬＣ３陽性細胞質小胞及びＬＣ３−ＩＩタンパク質の誘発である。ＬＣ３誘発はｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１細胞で多少顕著であることが見出された。鉄キレート剤によるＬＣ３−ＩＩの誘発は、mTOR阻害剤を用いた場合に観察される該誘発よりもかなり強かったが、これはＬＣ３−ＩＩ誘発はmTOR阻害により独占的に媒介されるのではないことを示唆する。Ｐ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５は、ＨＣＴ１１６コア内の細胞に対して検出可能な細胞毒性効果を誘発しない（Hernlund外、未公開)。これはｍＴＯＲ阻害が、ＣＢ２１による自食症誘発及び細胞死の原因となる唯一の因子ではないことを示唆する。ＣＢ２１処理後に観察される減少した酸素消費は、ラパマイシンについて報告されたことと同様に（４２）、ＡＴＰ産生へのグルコース依存性の増大となる。この提案は、ＭＣＳコアに存在する細胞の集落が、低酸素症及び制限されたグルコース供給により誘発される症状である構成性(constitutive)ＥＲストレス（Ｇｒｐ７８陽性）のサインを示した、との観察により確認されたように見える。ＭＣＳのグルコース枯渇はコア細胞の細胞死を誘発したが、この細胞集落の生存はグルコースに依存性であるとの概念と一致する。ＣＢ２１での処理後に観察される増大したグルコース依存性は、コア細胞の集落の細胞死に寄与するらしい。末梢細胞におけるカスパーゼ−３の強い誘発に比べて弱いカスパーゼ−誘発により明らかにされるように（図示なし）、アポトーシスはＣＢ２１による細胞死の主なメカニズムであるようには見えなかった。低い細胞エネルギー状態の条件は、アポトーシスに対する抵抗に導くようである（コア細胞のＮＳＣ６４７８８９誘発アポトーシスに対する抵抗をも説明する）（図示なし）。ＣＢ２１はＨＣＴ１１６細胞の増大したグルコース依存性を誘発するようであり、そしてこれがＭＣＳコア中の低酸素細胞の低下した生存率に導くようである。
【００６３】
自食作用は、代謝性ストレスに反応性の異化分解であり、タンパク質及び小器官の分解により恒常性を維持するように奮闘する。Ｐ１３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ、ＬＫＢ１−ＡＭＰＫ−ｍＴＯＲ及びｐ５３は自食作用経路の主な調節剤である。自食作用は、癌細胞の抗ガン療法への抵抗を媒介するのに関与し、そして抗ガン薬抵抗における好ましい治療標的であると信じられている（２０、４３）。ＣＢ２１は顕著な自食作用応答を誘発し、強力なＬＣ３−Ｉ及び−ＩＩ誘発を特徴とした。本発明は、ＣＢ２１の細胞毒性を増強するために、自食作用の阻害を明らかにする。
【００６４】
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【図１】
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【図２ｂ．２ｃ．２ｅ】
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【図２ｆ．２ｇ】
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【図３ｂ】
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【図２ａ．２ｄ．２ｈ】
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【図３ａ．３ｃ．３ｄ．３】
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【図４ａ−４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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