(57)【要約】  筋廃用期間後の筋肉の回復を促進させるためのβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）の使用方法が開示されている。ＨＭＢは個人における筋肉量の回復を促進し、典型的には個人における長期の筋廃用期間後の筋肉再荷重に関連する更なる筋萎縮を予防するためにも使用できる。開示されている方法は高齢者のために特に適している。
2014506254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋廃用期間に生じた筋萎縮をもつ個人に対して、有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む組成物を筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与することを含む、前記個人における筋肉回復を促進させるための方法。
【請求項２】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中毎日投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用後少なくとも１ヶ月間投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用後１ヶ月〜６ヶ月間投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを約１年間投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
個人に約０．１ｇ／日〜約１０ｇ／日のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
筋廃用期間に曝されている筋肉をもつ個人に対して、有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む組成物を筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与することを含む、前記個人における筋萎縮を最小限に抑えるための方法。
【請求項８】
筋肉が、１週間以上廃用の状態にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
筋肉が、１週間〜１年間廃用の状態にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中毎日投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間後少なくとも１ヶ月間投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間後１ヶ月〜６ヶ月間投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
個人に約０．１ｇ／日〜約１０ｇ／日のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
筋廃用期間に生じた筋萎縮をもつ高齢者に対して、有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む組成物を筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与することを含む、前記高齢者において筋肉回復を促進させるための方法。
【請求項１５】
高齢者にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中毎日投与する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）を含む栄養組成物を用いて筋廃用及び／または筋肉無活動の期間後の筋肉の回復を促進させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベッドでの安静、入院、ギブス固定等のために長期間の筋廃用または不動は迅速な筋萎縮及び筋肉低下を引き起こす場合がある。萎縮及び筋力低下は通常老化と共に悪化する。動物研究から、長期間の廃用後の筋肉量及び筋力の回復はゆっくりで難しいプロセスであり、老化した筋肉では不完全な場合があることが示唆された。
【０００３】
筋肉量、機能及び筋力の低下は可動性を損なうことがあり、個人が更なる筋肉または他の損傷を受けやすくなる場合がある。特に高齢者では、こうなると自立及び生活の質の低下をもたらす恐れがある。
【０００４】
慣習的に、筋廃用後の回復／再荷重期間中に運動することが若干の筋肉を付ける唯一の療法である。しかしながら、運動は必ずしも実行可能な選択肢でなく、高齢者及び／または重篤な病気または手術から回復している患者の場合には特にそうである。今まで、長期にわたる無活動または不動期間後の筋肉回復を早めることができる栄養療法は利用されていない。
【０００５】
よって、筋廃用、無活動または不動の期間後の筋肉回復及び再荷重を効果時に促進させるために使用され得る栄養組成物及び前記栄養組成物の使用方法を考察することが望ましい。また、前記した栄養組成物及び方法が運動することができない個人において筋肉をつけ、筋力を向上させるために使用され得るならば、有益であろう。加えて、前記した栄養組成物及び方法が長期間廃用後の筋肉の再構築中の更なる筋萎縮を予防し得るならば、有益であろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、一般的に筋廃用期間後の個人における筋肉回復を促進させる方法に関する。前記個人は筋廃用のために筋萎縮を患っている恐れがあり、本発明の方法は筋萎縮後に筋肉を再構築するのに必要な時間を短縮することができる。筋肉回復を促進させる方法はβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む栄養組成物を利用する。本発明の幾つかの実施形態は、深刻な筋喪失及び筋萎縮から回復するのが特に困難である成人、例えば高齢者に対して特に適切な場合がある。
【０００７】
１つの実施形態は、筋廃用期間に生じた筋萎縮を患っている個人において筋肉回復を促進させるための方法に関する。この方法は、前記個人に対して有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む組成物を筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与することを含む。
【０００８】
別の実施形態は、筋廃用期間に曝された筋肉の個人において筋萎縮を最小限に抑えるための方法に関する。この方法は、前記個人に対して有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む組成物を筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与することを含む。
【０００９】
別の実施形態は、筋廃用期間に生じた筋萎縮を患っている高齢者において筋肉回復を促進させるための方法に関する。この方法は、前記高齢者に対して有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを含む組成物を筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与することを含む。
【００１０】
長期間のギブス固定に起因する廃用のような筋廃用から生ずる筋萎縮を最小限に抑え、個人における筋肉の回復を促進させるためにβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）を個人に対して投与することができることが知見された。個人に対してＨＭＢを廃用期間及び回復期間中投与することにより、該個人の筋肉量及び／または筋力が強化される。驚くことに、ＨＭＢは筋肉を損傷することなく、且つ運動せずに、回復／再荷重期間（すなわち、筋肉が再可動化された後の）中に筋肉タンパク質合成を刺激することが知見された。
【００１１】
従って、本発明の方法は筋廃用に曝された個人における健康な筋肉量及び筋力の回復に寄与し得る代替治療オプションを与える。これらの効果は活発な日常の運動を必要とせずに効果的に達成され、高齢者において特に有利であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における体重の変化を示すグラフである。
【図２】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における筋力の変化を示すグラフである。
【図３Ａ】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における足底筋及びヒラメ筋の筋肉重量の変化を示す。
【図３Ｂ】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における足底筋及びヒラメ筋の筋肉重量の変化を示す。
【図４Ａ】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における足底筋及びヒラメ筋の筋線維断面の変化を示す。
【図４Ｂ】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における足底筋及びヒラメ筋の筋線維断面の変化を示す。
【図４Ｃ】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における足底筋及びヒラメ筋の筋線維頻度分布の変化を示す。
【図４Ｄ】実施例１において評価した廃用期間後の高齢動物における足底筋及びヒラメ筋の筋線維頻度分布の変化を示す。
【図５】実施例１において評価した足底筋中のＴＵＮＥＬポジティブ筋核の頻度を示すグラフである。
【図６】実施例１において評価したヒラメ筋中のＴＵＮＥＬポジティブ筋核の頻度を示すグラフである。
【図７Ａ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中のＢａｘタンパク質含量を示す。
【図７Ｂ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中のＢａｘタンパク質含量を示す。
【図８Ａ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中の切断型カスパーゼ−９タンパク質含量を示す。
【図８Ｂ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中の切断型カスパーゼ−９タンパク質含量を示す。
【図９Ａ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中の切断型カスパーゼ−３タンパク質含量を示す。
【図９Ｂ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中の切断型カスパーゼ−３タンパク質含量を示す。
【図１０Ａ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中のＢｃｌ−２タンパク質含量を示す。
【図１０Ｂ】実施例１において評価した後肢懸垂及び再荷重後の足底筋及びヒラメ筋中のＢｃｌ−２タンパク質含量を示す。
【図１１】１４日間の再荷重時のＢｒｄＵ標識を用いる随伴細胞のＨＭＢによる活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の筋廃用期間後に筋肉回復させるための方法は、筋廃用に生じた筋萎縮を患っている個人において筋肉回復を促進させるためにβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）を利用する。この方法の特徴、並びに多くの任意の変更及び付加の幾つかを以下に詳細に記載する。
【００１４】
本明細書中で使用されている用語「カルシウムＨＭＢ」は、別段の定めがない限り、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（β−ヒドロキシル−３−メチル酪酸、β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸、β−ヒドロキシイソ吉草酸、またはＨＭＢとも称される）のカルシウム塩を指し、最も典型的には一水和物形態である。カルシウムＨＭＢの特性を決定するために本明細書中で使用されているすべての重量、パーセンテージ及び濃度は、別段の定めがない限り、カルシウムＨＭＢ一水和物の重量に基づく。
【００１５】
本明細書中で使用されている用語「栄養製品」は、別段の定めがない限り、栄養液体、栄養粉末、栄養半固体及び栄養半液体を指し、そのうちの幾つかは栄養液を形成するように再構成することができ、ヒトが経口消費するのに適している。
【００１６】
本明細書中で使用されている用語「筋肉回復」は、別段の定めがない限り、筋肉量及び／または筋力の増加を指す。
【００１７】
本明細書中で使用されている用語「筋廃用期間」は、別段の定めがない限り、長期間の筋肉無活動を含めた筋肉無活動、或いはベッドでの安静、入院、ギブス固定等により生ずる体筋の完全または部分的不動の期間を指す。１つの具体的な実施形態では、「筋廃用期間」は長期間の廃用を含めた廃用を患った腕または足の筋肉を含む。
【００１８】
本明細書中で使用されている「長期間の無活動」または「長期間の廃用」を言うときの用語「長期間」は、別段の定めがない限り、少なくとも１週間、例えば少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、および１年以上の期間のベッドでの安静、入院、ギブス固定等により生ずる体筋の無活動、或いは完全または部分的不動を指す。
【００１９】
本明細書中で使用されている用語「筋肉回復期間」は、別段の定めがない限り、筋廃用が終わった後の筋肉の使用及び回復が始まる期間を指す。
【００２０】
本明細書中で使用されている用語「促進させる」は、別段の定めがない限り、「筋肉回復を促進させる」が筋肉回復を援助する、筋肉回復を補佐する、または筋肉回復を助けることを指すように援助する、補佐する、または助けることを指す。
【００２１】
本明細書中で使用されている用語「期間」は、別段の定めがない限り、「筋廃用期間」は筋廃用が生じた時間の単位を指すような時間の単位を指す。
【００２２】
本明細書中で使用されている用語「高齢者」は、別段の定めがない限り、少なくとも５５才の年齢、例えば５５〜約８５才の年齢の成人を指す。
【００２３】
本明細書中で使用されているすべてのパーセンテージ、部及び比は、別段の定めがない限り全製品の重量による。リストされている成分にかかわるすべての重量は活性レベルに基づいており、従って別段の定めがない限り市販されている材料中に含まれているかもしれない溶媒または副生成物を含めない。
【００２４】
本発明の１つの特徴または限定に対する言及は、別段の定めがない限り、または言及している内容により反対のことがはっきり暗示されていない限り、対応する複数の特徴または限定並びにその逆を包含する。
【００２５】
本明細書中で使用されている方法またはプロセスステップのすべての組合せは、別段の定めがない限り、または組合せが言及されている内容により反対のことがはっきり暗示されていない限り、任意の順序で実施される。
【００２６】
本発明の方法で使用される栄養製品の各種実施形態は、残りの組成物が本明細書に記載されている必要な成分または特徴のすべてを含んでいるならば、本明細書に記載されている任意のまたは特定の必須成分または特徴を実質的に含んでいなくてもよい。これに関連して、別段の定めがない限り、用語「実質的に含んでいない」は、選択した製品が任意成分を有効量未満、典型的には任意のまたは選択した必須成分の約１重量％未満、例えば約０．５重量％未満、約０．１重量％未満、０重量％しか含有していないことを意味する。
【００２７】
栄養製品及び方法は、本明細書に記載されている製品の必須要素、及び本明細書に記載されているかまたは栄養製品分野で有用な追加または任意の要素を含み、これらから構成され、または本質的にこれらから構成されてもよい。
【００２８】
製品形態
本発明の方法において有用なＨＭＢを含む栄養製品は、経口または非経口投与のための公知のまたはそれ以外に適切な製品の形態で製剤化することができる。経口製品形態が通常好ましく、かかる製剤化により、選択した製品形態から必須成分及び他の選択成分を安全且つ効果的に経口デリバリーできるならば、その中には本発明で使用するのに適した固体、半固体、液体、半液体または粉末製剤が含まれる。
【００２９】
本発明の方法において使用するのに適した固体栄養製品形態の非限定例には、スナック及びミールリプレースメント製品、例えばバー、スティック、クッキーまたはパン、ケーキまたは他のオーブンで焼いた食べ物、冷凍液体、キャンディー、朝食用シリアル、粉末または顆粒化固体、或いは他の粒子、成形または圧縮粉末、スナックチップまたはバイト、冷凍またはレトルト前菜等として製剤化されるものが含まれる。
【００３０】
本発明の方法において使用するのに適した液体製品の非限定例には、スナック及びミールリプレースメント製品、温かいまたは冷たい飲料、炭酸または非炭酸飲料、ジュースまたは他の酸っぱい飲料、牛乳または大豆を主成分とする飲料、シェイク、コーヒー、ティー、経腸栄養組成物等が含まれる。これらの液体組成物は、最も典型的には懸濁液またはエマルジョンとして製剤化されるが、透明な液体、実質的に透明な液体、溶液等のような他の適切な形態でも製剤化することができる。
【００３１】
先に言及したように、栄養製品は半固体の形態である場合があり、その中には特性（例えば、硬さ）の点で固体と液体の中間である形態が含まれる。幾つかの半固体例には、プディング、ゼラチン及びパン生地が含まれる。
【００３２】
加えて言及したように、栄養製品は半液体の形態である場合があり、その中には特性（例えば、流動特性）の点で固体と液体の中間である形態が含まれる。半液体の例には、濃厚シェイク及び液体ゲルが含まれる。
【００３３】
適切な経口製品形態の他の非限定例には、慣用の製品形態、例えばカプセル、錠剤、カプセル様錠剤、ピル等が含まれる。
【００３４】
対象使用者に対して有効量のＨＭＢを与えるための栄養製品の量は、１日あたり１回以上で投与することができる１個以上の個別の投与形態中に含めることができる。
【００３５】
ＨＭＢを含む栄養製品は、唯一、主要または補助の栄養ソースを与えるために、或いは特定の疾患または状態を患っている個人において使用するためのまたは目標とする栄養効果を有する特殊化栄養製品を提供するために、十分な種類及び量の栄養素を用いて製剤化することができる。多くの実施形態では、栄養製品はＨＭＢに加えてタンパク質、脂肪及び炭水化物を含む。
【００３６】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）
栄養製品はＨＭＢを含み、このことは製品がＨＭＢを最も典型的にはカルシウム一水和物として添加して製剤化されるかまたは最終製品中にＨＭＢが含有されるように他の方法で製造されることを意味する。最終製品がＨＭＢを含有するならば任意のＨＭＢ源が本発明で使用するために適しているが、ＨＭＢ源は好ましくはカルシウムＨＭＢであり、最も典型的には製剤化中栄養製品にそのまま添加される。
【００３７】
カルシウムＨＭＢ一水和物が本発明で使用するためのＨＭＢの好ましい源であるが、他の適切な源には遊離酸、塩、無水塩、エステル、ラクトン、または栄養製品からバイオアベイラブルな形態のＨＭＢを与える他の製品形態としてのＨＭＢが含まれ得る。本発明で使用するためのＨＭＢの適切な塩の非限定例には、水和または無水のナトリウム、カリウム、マグネシウム、クロム、カルシウム、または他の非毒性塩形態のＨＭＢの塩が含まれる。カルシウムＨＭＢ一水和物が好ましく、ユタ州ソルトレークシティーのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｏｕｒｃｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＴＳＩ）及びＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．（スイス国バーゼル）から市販されている。
【００３８】
栄養製品が液体の場合、液体中のＨＭＢの有効濃度は栄養液体の最高約１０重量％、例えば約０．０１重量％〜約１０重量％、約０．１重量％〜約５．０重量％、約０．３重量％〜約２重量％、約０．４重量％〜約１．５重量％、約０．３重量％〜約０．６重量％の範囲であってもよい。
【００３９】
栄養製品が固体の場合、固体中のＨＭＢの有効濃度は栄養粉末の最高約１０重量％、例えば約０．１重量％〜約８重量％、約０．２重量％〜約５．０重量％、約０．３重量％〜約３重量％、約０．３重量％〜約１．５重量％、約０．３重量％〜約０．６重量％の範囲であってもよい。
【００４０】
栄養製品は、本明細書に記載されている方法に従って約０．１〜約１０ｇ／日のＨＭＢを与えることができる。従って、栄養製品は１サービスあたり約０．１〜約１０ｇ、例えば約０．５〜約５．０ｇ、約０．５〜約２．５ｇ、約１．０〜約１．７ｇ、約１．５ｇのＨＭＢを与え、例示的サービスは約２４０ｍｌのすぐに摂食できる栄養液体または約２４０ｍｌの再構成される栄養固体である。個人は、１回サービス／日、２回サービス／日、３回サービス／日、または４回以上のサービス／日で投与されて、栄養製品から所望量のＨＭＢを受け取る。
【００４１】
主要栄養素
栄養製品は更に、本明細書に記載されているＨＭＢに加えて１つ以上の任意主要栄養素を含むことができる。任意の主要栄養素には、タンパク質、脂質、炭水化物及びその組合せが含まれる。幾つかの実施形態では、栄養製品をＨＭＢに加えて３つすべての主要栄養素を含有している栄養液体として製剤化することが望ましい。
【００４２】
本発明で使用するのに適した主要栄養素には、任意の主要栄養素が経口投与のために安全且つ有効であり、栄養製品中の他の成分と相容性であるならば、経口栄養製品中に使用することが公知でありまたは適したタンパク質、脂質または炭水化物、またはその源が含まれる。
【００４３】
栄養製品中の任意の脂質、炭水化物及びタンパク質の濃度または量は製品の特定栄養用途に応じて大きく変更する場合がある。これらの任意の主要栄養素は、最も典型的には下表に記載されている具体的範囲の範囲内で製剤化される。
【００４４】
【表１】
2014506254.tif 000003
【００４５】
炭水化物
栄養製品中に使用するのに適した任意の炭水化物は単純、複合、或いはその変形物または組合せであり、いずれも本明細書に記載されているＨＭＢに加えて場合により存在する。適切な炭水化物の非限定例には、加水分解または加工デンプンまたはコーンスターチ、マルトデキストリン、イソマルツロース、スクロマルト、グルコースポリマー、スクロース、コーンシロップ、コーンシロップ固体、コメ由来炭水化物、グルコース、フルクトース、ラクトース、異性化糖、蜂蜜、糖アルコール（例えば、マルチトール、エリトリトール、ソルビトール）及びその組合せが含まれる。
【００４６】
栄養製品中に使用するのに適した任意の炭水化物には可溶性食物繊維も含まれ、その非限定例にはアラビアガム、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、グアーガム、シトラスペクチン、低及び高メトキシペクチン、オート麦及び大麦グルカン、カラギーナン、オオバコ及びその組合せが含まれる。不溶性食物繊維も本発明における炭水化物源として適切であり、その非限定例にはオート麦外皮繊維、エンドウ豆外皮繊維、大豆外皮繊維、大豆子葉繊維、甜菜繊維、セルロース、トウモロコシふすま及びその組合せが含まれる。１つの具体的な実施形態では、炭水化物系にはマルトデキストリン（場合により、低ＤＥマルトデキストリン）及びスクロース含む炭水化物源の組合せが含まれる。
【００４７】
幾つかの具体的な実施形態では、栄養液体実施形態中の炭水化物の濃度は、栄養液体の約５．０重量％〜約４０重量％、例えば約７．０重量％〜約３０重量％、約１０重量％〜約２５重量％、約１０．２重量％の範囲であってもよい。
【００４８】
他の具体的な実施形態では、粉末実施形態中の炭水化物の濃度は、栄養粉末の約１０重量％〜約９０重量％、例えば約２０重量％〜約８０重量％、約４０重量％〜約６０重量％の範囲であってもよい。１つの具体的な実施形態では、炭水化物は栄養粉末中に約５８重量％の量で存在している。
【００４９】
タンパク質
栄養製品中に使用するのに適した任意のタンパク質には、加水分解した、部分加水分解した、または加水分解されていないタンパク質またはタンパク質源が含まれ、乳（例えば、カゼイン、乳清）、動物（例えば、肉、魚、卵白）、穀物（例えば、米、トウモロコシ）、野菜（例えば、大豆、エンドウ豆、ジャガイモ）、またはその組合せのような、公知でありまたは適切な源から誘導することができる。本発明で使用するタンパク質には栄養製品中に使用することが公知の遊離アミノ酸も含まれ、或いはこれらにより完全にまたは部分的に置換してもよい。前記アミノ酸の非限定例には、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、タウリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−カルニチン及びその組合せが含まれる。
【００５０】
幾つかの具体的な実施形態では、栄養液体実施形態中のタンパク質の濃度は、栄養液体の約１．０重量％〜約３０重量％、例えば約１．０重量％〜約１５重量％、約１．０重量％〜約１０重量％、約１．０重量％〜約７．０重量％の範囲であってもよい。
【００５１】
他の具体的な実施形態では、粉末実施形態中のタンパク質の濃度は、栄養粉末の約１．０重量％〜約５０重量％、例えば約１０重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約３０重量％の範囲であってもよい。
【００５２】
１つの具体的な実施形態では、タンパク質系にはカゼインカルシウム（または、ナトリウム）及び大豆タンパク質単離物を含むタンパク質源の組合せが含まれる。別の具体的な実施形態では、タンパク質系にはカゼインナトリウム（または、カルシウム）、乳タンパク質濃厚物、大豆タンパク質単離物及び乳清タンパク質濃厚物を含むタンパク質源の組合せが含まれる。
【００５３】
脂質
栄養製品中に使用するのに適した任意の脂質には、ヤシ油、分留ヤシ油、大豆油、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレインサフラワー油、高ＧＬＡサフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、サンフラワー油、高オレインサンフラワー油、パーム及びパーム核油、パームオレイン、カノーラ油、アマ種子油、ボリジ油、大豆油、綿実油、月見草油、ブラックカラント種油、トランスジェニック油源、真菌油、魚油（例えば、マグロ、イワシ）等が含まれる。１つの具体的な実施形態では、脂肪系には高オレインサフラワー油、カノーラ油及び大豆油を含む脂肪源の組合せが含まれる。
【００５４】
幾つかの具体的な実施形態では、栄養液体実施形態中の脂質の濃度は、栄養液体の約１．０重量％〜約３０重量％、例えば約１．０重量％〜約２０重量％、約１．０重量％〜約１５重量％、約１．５重量％〜約５．０重量％の範囲であってもよい。１つの具体的な実施形態では、栄養液体は脂質を栄養液体の約１．６重量％の量含んでいる。
【００５５】
他の具体的な実施形態では、粉末実施形態中の脂質の濃度は、栄養粉末の約１．０重量％〜約３０重量％、例えば約１．０重量％〜約２０重量％、約１．０重量％〜約１５重量％、約５．０重量％〜約１０重量％の範囲であってもよい。Ｉつの具体的な実施形態では、栄養粉末は脂質を栄養粉末の約７．５重量％の量含んでいる。
【００５６】
任意成分
ＨＭＢ及び場合により１つ以上の主要栄養素を含む栄養製品は、更に製品の物理的、栄養的、化学的、快楽的または加工特性を修飾し、または対象集団に使用したときに医薬または追加の栄養成分として役立ち得る他の任意成分を含んでよい。前記任意成分が経口投与のために安全且つ有効であり、選択した製品形態中の必須成分及び他の成分と相容性であるならば、他の栄養製品中に使用することが公知のまたは適した多くの前記任意成分が本明細書に記載されている栄養製品中にも使用され得る。
【００５７】
前記任意成分の非限定例には、保存剤、抗酸化物、β−アラニン、乳化剤、緩衝剤、医薬活性成分、本明細書に記載されている追加の栄養素、着色料、着香料、増粘剤及び安定化剤等が含まれる。
【００５８】
栄養製品は更にビタミンまたは関連栄養素を含み、その非限定例にはビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビタミンＢ１２、カロテノイド、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コリン、イノシトール、その塩及び誘導体、及びその組合せが含まれる。
【００５９】
栄養製品は更に追加のミネラルを含み、その非限定例にはリン、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム、モリブデン、クロム、セレン、クロリド及びその組合せが含まれる。
【００６０】
栄養製品は１つ以上の着香料またはマスキング剤をも含んでよい。適切な着香料またはマスキング剤には、天然及び人工甘味料、ナトリウム源（例えば、塩化ナトリウム）、親水コロイド（例えば、グアーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ジェランガム、アカシアガム）及びその組合せが含まれる。
【００６１】
製造方法
栄養製品は、エマルジョンのような栄養液体を含めた栄養製品を製造するための公知のまたは適した方法により製造することができる。
【００６２】
１つの適切な製造方法では、栄養液体は脂肪中タンパク質（ＰＩＦ）スラリー、炭水化物−ミネラル（ＣＨＯ−ＭＩＮ）スラリー及び水中タンパク質（ＰＩＷ）スラリーを含めた少なくとも３つの別々のスラリーを用いて製造される。ＰＩＦスラリーは、選択した油（例えば、カノーラ油、コーン油、魚油等）を加熱し、混合した後、乳化剤（例えば、レシチン）、脂溶性ビタミン及び全タンパク質の一部（例えば、乳タンパク質濃厚物等）を連続加熱及び撹拌しながら添加することにより形成する。ＣＨＯ−ＭＩＮスラリーは、水にミネラル（例えば、クエン酸カリウム、リン酸二カリウム、クエン酸ナトリウム等）、微量及び超微量ミネラル（ＴＭ／ＵＴＭプレミックス）、増粘剤または懸濁剤（例えば、ジェランガム、カラギ-ナン等）、及び典型的にはカルシウムＨＭＢとしてのＨＭＢを加熱撹拌しなから添加することにより形成する。生じたＣＨＯ−ＭＩＮスラリーを連続加熱及び撹拌しながら１０分間保持した後、追加のミネラル（例えば、塩化カリウム、炭酸マグネシウム、ヨウ化カリウム等）及び／または炭水化物（例えば、フルクトオリゴ糖、スクロース、コーンシロップ等）を添加する。次いで、ＰＩＷスラリーは、水に残りのタンパク質（例えば、カゼインナトリウム、大豆タンパク質濃厚物等）を加熱及び撹拌しながら混合することにより形成する。
【００６３】
次いで、生じた複数のスラリーを加熱撹拌しながら混合し、ｐＨを所望の範囲、典型的には６．６〜７．０に調節し、その後組成物を高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセッシングにかける。その間に、組成物は加熱処理され、乳化され、均質化された後放冷される。水溶性ビタミン及びアスコルビン酸を添加し、必要に応じてｐＨを再び所望範囲に調節し、着香料を添加し、所望の全固体レベルに達するように水を添加する。次いで、組成物を無菌包装して、無菌包装した栄養エマルジョンを形成する。或いは、組成物をレトルト安定な容器に添加した後、レトルト殺菌にかけて、レトルト殺菌した栄養エマルジョンを形成する。
【００６４】
栄養液体のための製造方法は、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本明細書中に記載されている以外の方法で実施することができる。従って、本発明の実施形態はすべての点で非限定的例示であり、すべての変化及び均等物が本明細書の記載の範囲に入ると見なされる。
【００６５】
噴霧乾燥した栄養粉末、乾式混合した栄養粉末またはその組合せのような栄養固体は、栄養粉末を作成し、製剤化するのに適した公知のまたは有効な技術の集合により製造することができる。
【００６６】
例えば、栄養粉末が噴霧乾燥した栄養粉末の場合、噴霧乾燥ステップは栄養粉末の製造において使用することが公知のまたは適した噴霧乾燥技術をも含む。多くの各種噴霧乾燥方法及び技術が栄養分野で使用することが公知であり、そのすべてが本発明の噴霧乾燥した栄養粉末の製造において使用するのに適している。
【００６７】
噴霧乾燥した栄養粉末を製造する１つの方法は、ＨＭＢ、典型的にはカルシウムＨＭＢ、及び場合によりタンパク質、炭水化物及び脂肪を含む水性スラリーまたは液体を形成し、均質化した後、そのスラリーまたは液体を噴霧乾燥して、噴霧乾燥した栄養粉末を生成することを含む。この方法は、更に噴霧乾燥する、乾式混合する、または噴霧乾燥した栄養粉末に１つ以上の本明細書に記載されている成分を含めた追加栄養成分を添加するステップを含む。言及したように、製造方法は、この方法において使用するためのＨＭＢ源として、最も典型的にはカルシウムＨＭＢ一水和物として製剤化されるカルシウムＨＭＢを利用することが望ましい。
【００６８】
ＨＭＢを用いる筋肉回復の促進方法
ＨＭＢを含む栄養製品を筋廃用または不動後の筋肉回復を促進させるために必要とされる個人に対して本発明に従って経口投与する。不動は、先に言及したように例えばベッドでの安静、入院、ギブス固定、無重力、無活動等を含めた多数の理由に起因している。ＨＭＢ含有栄養製品を、高齢者を含めた個人に対して筋廃用期間だけまたは筋肉回復期間だけ投与してもよいが、筋肉回復をより十分に促進させるために、通常ＨＭＢ含有栄養製品を個人に対して筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間の少なくとも一部の間投与することが望ましい。望ましい実施形態では、ＨＭＢ含有栄養製品を個人に対して筋廃用の全期間または実質的に全期間、及び筋肉回復の全期間または実質的に全期間投与する。個人は、筋廃用または不動のために筋萎縮を受けやすい、筋廃用または不動のために筋萎縮のリスクがある、または筋廃用または不動のために実際筋萎縮を患っている成人または高齢者である。本明細書に記載されている幾つかの実施形態では、個人は筋廃用または不動後に筋肉回復の促進の助けを必要としている。よって、幾つかの実施形態では、すべての個人が筋廃用または不動後の筋肉回復を必要としていないので、すべての個人が本発明の栄養製品及び方法の恩恵を受けないことがある。
【００６９】
筋廃用期間が過ぎたら、ＨＭＢ含有栄養製品を、筋肉回復を促進させるために筋肉回復期間中少なくとも１週間、例えば少なくとも１ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、１年以上投与してもよい。１つの具体的な実施形態では、ＨＭＢ含有栄養製品を筋廃用期間後１週間〜６ヶ月間、例えば１ヶ月〜６ヶ月間連続投与する。先に言及したように、ＨＭＢ含有栄養製品を筋廃用の一部の期間または全期間中投与してもよい。
【００７０】
本発明の方法は更に、筋廃用期間に生じた筋萎縮を患っている成人及び高齢者を含めた個人における筋肉回復の促進に関する。当業者は、個人の筋萎縮の速度が例えば年齢により異なる場合があることを認識している。すなわち、高齢者は、青年または十代の若者に比してより急速な筋萎縮を経験する成人に比してより急速な筋萎縮を経験する場合がある。本発明の方法は、筋廃用期間中に個人が経験する筋萎縮の速度に関係なく、これらの年齢カテゴリーのすべてに対して使用するのに適している。本明細書に記載されている方法は、個人の筋肉量を増加させるために使用することができ、典型的には個人における長期の筋廃用期間後の筋肉再荷重に関係する更なる筋萎縮を予防するためにも使用することができる。これらの方法は、（１）タンパク質合成を刺激し、筋肉を作る；（２）筋肉タンパク質分解を予防することにより筋喪失を減少または減衰させる；（３）長期の筋廃用期間後に筋力を増加させる；（４）筋廃用により誘発される筋核アポトーシスを減衰させる；（５）筋廃用期間に曝された筋肉をもつ個人において筋萎縮を最小限に抑える；（５）筋廃用期間に生じた筋萎縮を患っている高齢者において筋肉回復を促進させる；及び（６）随伴細胞を活性化して、筋肉再生及び／または回復を促進させる；という方法のためにＨＭＢ含有栄養製品を投与することをも含む。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例により、本発明の具体的な実施形態及び／または特徴を例示する。これらの実施例は例示の目的のみで挙げられており、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく多くの改変が可能であるので本発明の限定と解釈されるべきでない。例示されているすべての量は、別段の定めがない限り製品の全重量に基づく重量％である。
【００７２】
例示されている製品は、栄養エマルジョン及び粉末を製造するために栄養業界で公知であり、本発明の方法において使用するのに適している製造方法に従って製造されるカルシウムＨＭＢ含有栄養製品である。
【００７３】
［実施例１］
本実施例では、高齢動物における筋廃用後の筋萎縮を減らし、筋肉回復を促進させるＨＭＢの効果を評価する。
【００７４】
６４匹の高齢（３４ヶ月齢）Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４ｘ  Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットを後肢懸垂（ＨＳ）群または再荷重（Ｒ）群にランダムに割り当てる。各試験群のラットには、経管栄養により1日あたり（１）１ｍｌのＣａ−ＨＭＢ（１７０ｍｇ／ｍｌ−蒸留水）または（２）１ｍｌの蒸留水を与える。１週間後、３２匹のラット（Ｃａ−ＨＭＢを投与されたＨＳ群から８匹のラット；Ｃａ−ＨＭＢを投与されたＲ群から８匹のラット；水を投与されたＨＳ群から８匹のラット；及び水を投与されたＲ群から８匹のラット）を対照群（ＨＳ対照群（１６匹のラット）またはＲ対照群（１６匹のラット））の部分として指名する。対照群は試験期間を通して正常の可動性を維持しており、ケージの周囲を自由に動き回ることができる。データをＨＳ対照群から研究の開始から１４日後に、屠殺前と後に集める。データをＲ対照群から研究の開始から２８日後に、屠殺前と後に集める。
【００７５】
残りの３２匹のラット（ＨＳ群の１６匹のラット及びＲ群の１６匹のラット）にはＣａ−ＨＭＢまたは水のいずれかを与え続け、後肢懸垂を１４日間施す。後肢懸垂のために、テープを尾の１／３近くに沿って貼った後、特別に設計された後肢懸垂ケージの上部の魚様スイベルに取り付けたワイヤハーネスを用いて付ける。懸垂により、ラットはケージの周りを３６０°動ける。テープの周りを滅菌ガーゼでくるみ、その後熱可塑性材料で覆う。尾の露出先端をモニターして、懸垂が尾への血流を邪魔していないことを示すピンク色のままであることを確かめる。懸垂高さをモニターし、後肢がケージの支持面と接触しないように調整する。更に、懸垂角度は３０°を超えない。前肢はグリッド床と接触し続けており、動物は動いたり、身繕いしたり、餌及び水を自由に摂取することができる。
【００７６】
１４日間の後肢懸垂した後、後肢を開放する。データをＨＳ群から屠殺前と後に集める。Ｒ群には正常なケージ歩行を更に１４日間させた後、データを屠殺前と後に集める。
【００７７】
データをすべての試験群から集めて、（１）試験期間にわたる筋力の変化、（２）試験期間にわたる体重変化；（３）試験期間の終了時の筋肉量、（４）試験期間の終了時のアポトーシスシグナルタンパク質の存在、及び（５）試験期間の終了時の筋線維（断面）の変化を分析する。
【００７８】
実験手順
力測定：すべて動物に９８％酸素及び２％イソフルランガスで麻酔をかけながら力測定を実施する。特注ラット動力計を用いて加熱したＸ−Ｙ位置決めテーブル上に動物を仰向けに置き、左足は９０°の足首角度で足板に固定した。垂直方向力を足板上のロードセル取付具でロードセル変換器に移す。白金刺激電極（Ｇｒａｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，マサチューセッツ州クインシー）を皮下に挿入し、膝窩の脛骨神経に架ける。足底屈筋群の最大等尺力を、脛骨神経を４Ｖ、１００Ｈｚである過最大矩形波パルスを用いてＳＤ９刺激装置（Ｇｒａｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，マツチューセッツ州クインシー）を用いて３秒間刺激することにより評価する。最大力をＬａｂｖｉｅｗベースのソフトウェアを用いて測定する。３等尺性収縮の最大力をデータポイント毎に平均化する。最大等尺力は１４日間の後肢懸垂の前（０日目）、１４日間の後肢懸垂の直後、及び１４日間の後肢懸垂後の後肢の１４日間の再荷重（回復）後に測定する。
【００７９】
体重及び組織作成：各動物の体重を実験開始時、１４日間の後肢懸垂後、及び１４日間の再荷重後に測定する。動物に深く麻酔をかけて、ヒラメ筋及び足底筋を両肢から外した後、ブロットし、重量を測定する。この手順後動物を安楽死させる。筋肉の中腹から得たブロックを最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ａｎｄｗｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州アディスン）中に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタンを用いて瞬間凍結し、−８０℃で保存する。残りの筋肉を液体窒素で瞬間凍結し、その後の分析のために必要となるまで−８０℃で保存する。
【００８０】
アポトーシス核の同定：ヒラメ筋及び足底筋由来の１０μｍ厚の凍結横断切片を帯電スライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルベニア州ピッツバーグ）に載せる。切片を末端ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）（１１６８４７９５９１０；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナ州インディアナポリス）及びラミナの蛍光標識で標識することによりアポトーシス核を同定する。簡単に説明すると、組織切片をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００で透過処理する。次いで、組織をラット抗ラミナモノクローナル抗体（ＭＡＢ  １９１４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，マサチューセッツ州ビレリカ）と４℃で一晩インキュベートして、各筋線維の基底膜を可視化する。次いで、切片を湿潤チャンバーにおいてロバ抗ラットローダミンコンジュゲートした二次抗体（７１２−０２５−１５０，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ペンシルベニア州ウェストグローブ）及びＴＵＮＥＬ反応混合物と暗所、３７℃で１時間インキュベートする。各スライド上の組織切片の１つのＴＵＮＥＬ反応混合物中のＴｄＴ酵素を省いたものをネガティブ対照として含める。すべての核を可視化するために切片を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と一緒に載せ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマンティングメディウム；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンゲーム）、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて見る。基底膜の真隣または真下にあるＴＵＮＥＬ及びＤＡＰＩポジティブ核の数をカウントする。データは、核の全数（すなわち、ＤＡＰＩポジティブ核）で割ったＴＵＮＥＬポジティブ核の数をカウントすることにより計算したアポトーシス指数として表示する。アポトーシス指数は各組織断面の４つの非重複領域から得た〜１２００線維から求める。
【００８１】
線維形態：ラミナについて染色した各組織断面の４つの非重複領域から得た７５０〜１２００線維から面積測量により筋線維断面積（ＣＳＡ）を求める。線維ＣＳＡをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて計算する。
【００８２】
ウェスタン免疫ブロット：約７５μｇの筋肉をプロテアーゼ阻害剤（Ｐ８３４０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ミズーリ州セントルイス）及びホスファターゼ阻害剤（Ｐ２８５０；Ｐ５７２６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有している氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（１％  トリトンｘ−１００，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  トリス；ｐＨ７．４）中でホモジナイズする。筋肉ホモジネートを４℃、１０００×ｇで５分間遠心し、上清のタンパク質含量を測定する（５００−０１１６；ＢｉｏＲａｄ，カリフォルニア州ハーキュリーズ）。４０μｇのタンパク質を４〜１２％勾配のポリアクリルアミドゲル（ＮＰ０３３５ＢＯＸ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）の各ウェルに充填し、ルーチンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により１２０Ｖで１時間分離する。タンパク質を２５Ｖでニトロセルロース膜に１．５時間移す。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含有しているトリス緩衝食塩液中５％脱脂乳中で膜を室温でインキュベートすることにより非特異的タンパク質結合を阻止する。膜をＢｃｌ−２（＃２８７６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，マサチューセッツ州ボストン）、Ｂａｘ（＃２７７２，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、切断型カスパーゼ−３（＃９６６４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び切断型カスパーゼ−９（＃９５０９，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する一次抗体と４℃で一晩インキュベートする（１：１０００）。膜をＴＢＳＴで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ミズーリ州セントルイス）にコンジュゲートした二次抗体の適切な希釈物（５％脱脂乳で希釈）中でインキュベートする。シグナルを化学発光基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＴＭＡ−６；Ｌｕｍｉｇｅｎ，ミズーリ州サウスフィールド）を用いて発生させ、膜をＸ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ  ＭＳ−１；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）に露出させることにより可視化する。デジタル記録をＫｏｄａｋ  ２９０カメラを用いて捕捉し、タンパク質バンドを１Ｄ分析ソフトウェアを用いて定量する。バンドを光学密度Ｘバンド面積として定量し、任意単位で表示する。
【００８３】
ＢｒｄＵ投与：再荷重時点で皮下持効性ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ペレット（２１日間放出，０．２２μｇのＢｒｄＵ／ｇ−体重／日，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，フロリダ州サラソタ）を各ラットに埋め込んだ。動物に２％  イソフルランで麻酔をかけ、ＢｒｄＵペレットを上位胸椎上の背部に皮下挿入した。ＢｒｄＵはチミジンアナログであり、ＤＮＡ合成中核中に取り込まれるので、筋肉再荷重の期間中の活性化随伴細胞／筋肉前駆体細胞を同定するためにＢｒｄＵを使用する。
【００８４】
免疫蛍光染色：既に記載されているように（Ｓｉｕ  ２００５）、ＢｒｄＵ及びラミニンを免疫蛍光染色することにより活性化増殖随伴細胞／筋肉前駆体細胞を同定した。検出のために抗ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体及び抗マウスＩｇＧ  Ｃｙ３コンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片を使用した。線維基底膜を可視化するために、抗ラットラミニンマウスモノクローナル、次いで抗マウスＩｇＧビオチンコンジュゲート抗体を使用した。最後に、切片を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、ＤＡＰＩ青色蛍光に対して３３０〜３８０ｎｍ、Ｃｙ３赤色蛍光に対して４８５〜５８５ｎｍ、フルオレセイン緑色蛍光に対して４５０〜４９０ｎｍの励起波長を用いて蛍光顕微鏡で調べた。像をＳＰＯＴ  ＲＴカメラ及びソフトウェアを用いて得た。ＢｒｄＵ及びＤＡＰＩポジティブ核の数を６つの無作為の非重複フィールドから４０倍の対物レンズの倍率でカウントした。切片中の非筋肉核を排除するためにラミニン染色された標識核のみをカウントした。
【００８５】
統計分析：結果を平均±ＳＥとして報告する。群間の平均の差は多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）及びホッテリングのＴ二乗検定により調べる。有意平均間でボンフェローニポストホック分析を実施する。線維面積−頻度データについては実験群間でカイ二乗分析を実施する。Ｐ値≦０．０５が有意と見なされる。
【００８６】
結果
体重：研究の開始時、実験群間で動物の体重に差はない。通常、ＨＭＢ及び水治療群の両方において１４日間の後肢懸垂により体重は治療後劇的に約１５％低下した。両群において動物の体重は再荷重期間中減り続ける。水治療ラットの体重は、それぞれ実験プロトコルで３週間（１週間の前治療及び１４日間の後肢懸垂）後１．６％、５週間（前治療、後肢懸垂及び１４日間の再荷重）後９．３％減少した。ＨＭＢでそれぞれ３週間及び５週間治療した対照ラットでは、動物の体重が実験１日目に比して１．３％及び７％減少する。ＨＭＢ及び水治療ラットの両方で動物の体重は２週間の再荷重後減り続ける。全体として、１４日間の再荷重後、ＨＭＢ治療ラットの体重は対照動物の体重と比較して４％減少し、水治療ラットの体重は６％減少する（図１を参照されたい）。
【００８７】
最大等尺力：ＨＭＢは後肢懸垂及び再荷重での力の低下を減衰させるようである。最大等尺力は後肢懸垂前には群間で差はない。後肢懸垂は最大インビボ足底屈等尺力を水治療ラットにおいて３４．３％、ＨＭＢ治療ラットにおいて２３．７％低下させる。対照動物における等尺力と比較して、再荷重後の水治療ラット（４２．４％）の最大等尺底底屈力がＨＭＢ治療動物（２７．３％）よりも大きく低下する（Ｐ＜０．０１，図２を参照されたい）。
【００８８】
筋湿重量：ＨＭＢはＨＳ誘発の萎縮の程度を有意に低下させなかったが、再荷重群の足底筋の筋湿重量をビヒクル対照動物に比して向上させた。ＨＳはＨＭＢ及びビヒクル治療動物（ｎ＝１６／群）の両方の足底筋（１９％）及びヒラメ筋（１５％）の湿重量を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１）。１４日間のＨＳ後の実験群間で筋喪失の程度に有意な差はなかった。再荷重はヒラメ筋及び足底筋湿重量の更なる低下を防止しが、ＨＳによる誘発される筋喪失を逆転させなかった。ＨＭＢ治療は１４日間の再荷重後の足底筋重量をビヒクル治療動物（ｎ＝８／群）に比して有意に改善した（図３Ａ）。ＨＭＢは、ビヒクル治療動物（図３Ｂ）に比してヒラメ筋におけるＨＳ誘発低下に対して保護効果を与えなかったし、１４日間の再荷重後のヒラメ筋湿重量回復も改善させなかった。
【００８９】
筋線維ＣＳＡの変化：ＨＭＢはＨＳまたは再荷重後に生じたヒラメ筋及び足底筋の両方の線維萎縮の程度を低下させた。ＨＳは足底（図４Ａ）及びヒラメ（図４Ｂ）後肢筋中の平均線維ＣＳＡを劇的に低下させた。しかしながら、ビヒクル治療動物のＨＳ誘発による線維ＣＳＡの減少は、ＨＭＢ治療動物の場合よりも足底筋（４８．８％対２６．４％、ｐ＜０．０５）及びヒラメ筋（４５．６％対３２．５％、ｐ＜０．０５）で大きい。ＨＭＢは、ＨＳと比較して１４日間の再荷重後の足底筋（図４Ａ）またはヒラメ筋（図４Ｂ）のいずれでも線維ＣＳＡを更に改善させなかった。足底筋（図４Ｃ）及びヒラメ筋（図４Ｄ）の線維面積−線維頻度分布を回復群について示す。１４日間の回復後、足底筋及びヒラメ筋中の筋線維の線維面積−頻度分布は対照筋肉の分布と比較して左にシフトしていた。カイ二乗分析は、ビヒクル治療動物の足底筋及びヒラメ筋の線維＜１５００μｍ２の頻度はＨＳ後１４日間回復させたＨＭＢ治療動物と比較して有意に高かったことを示した。ＨＳ後の線維面積−頻度分布の分布（図４Ｃ、図４Ｄ）は回復（データを示さず）について示したものと同様であった。
【００９０】
ＴＵＮＥＬ標識により同定したアポトーシス筋核：ＴＵＮＥＬポジティブ筋核の頻度により示されるアポトーシス指数はＨＳ及び再荷重により大きく上昇し、ＨＭＢはアポトーシス指数を減衰させた。ＨＳは足底筋及びヒラメ筋の両方中のＴＵＮＥＬポジティブ核を有意に増加させた。組織切片内で幾つかの領域差があったが、ＨＳ後の足底筋及びヒラメ筋から得た各組織断面切片全体でＴＵＮＥＬポジティブ核が生じた。アポトーシス指数は、歩行対照動物と比較してビヒクル治療動物の足底筋（９．９倍，ｐ＜０．０５）及びヒラメ筋（３．２倍，ｐ＜０．０５）において有意に上昇した。ＨＭＢ治療は筋核アポトーシスを抑制したが、完全には排除しなかった。ＨＳは、歩行対照動物と比較してＨＭＢ治療動物の足底筋（３．０倍，ｐ＜０．０５）及びヒラメ筋（１．８倍，ｐ＜０．０５）の両方のアポトーシス指数を上昇させた。アポトーシス指数は、ＨＭＢ治療動物と比較してビヒクルの足底筋（図５）及びヒラメ筋の両方で有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図６）。ＴＵＮＥＬ標識により同定されるアポトーシスは再荷重中、特にビヒクル治療筋肉では高いままであった。ＨＳ後の結果と同様に、ＨＭＢは再荷重した足底筋（図５）及びヒラメ筋（図６）における筋核のＴＵＮＥＬ標識を抑制し続けた。にもかかわらず、水またはＨＭＢ治療群のいずれでも再荷重状態と比較してＨＳ後の筋肉のアポトーシス指数間で有意な差はなかった。
【００９１】
アポトーシスシグナルタンパク質：ＨＭＢ治療は、水治療ラットと比較して後肢懸垂及び再荷重後の後肢懸垂誘発のプロアポトーシスタンパク質の増加を抑制する。ミトコンドリアアポトーシスシグナルに関係するプロアポトーシスタンパク質は、後肢懸垂後の後肢筋肉の存在量を増加させ、再荷重中高いままである。Ｂａｘ（図７）、切断型カスパーゼ−９（図８）及び切断型カスパーゼ−３（図９）を含めたプロアポトーシスタンパク質は後肢懸垂及び再荷重後増加する。ＨＭＢは、後肢懸垂及び再荷重状態後の足底筋及びヒラメ筋中のＢａｘ（図７）、切断型カスパーゼ−９（図８）及び切断型カスパーゼ−３（図９）のタンパク質存在量を抑制する。プロアポトーシスシグナルタンパク質の存在量は後肢懸垂及び再荷重後の足底筋（図７Ａ、８Ａ、９Ａ）及びヒラメ筋（図７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ）中と同様であり、これはＨＭＢにより変化しない。ＨＭＢは歩行動物の対照筋肉（ＨＳ  Ｃｏｎ及びＲ  Ｃｏｎ）中のＢａｘ（図７Ｂ）及び切断型カスパーゼ−３（図９Ｂ）のタンパク質存在量を減少させる。後肢懸垂も再荷重も足底筋（図１０Ａ）及びヒラメ筋（図１０Ｂ）中の抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２を約１００％（Ｐ＜０．０５）増加させるが、後肢懸垂または再荷重のいずれの後もＨＭＢ及び水治療筋肉間に有意な差はないようである。
【００９２】
ＨＭＢ治療により、筋肉修復及び再生のために必要な筋肉前駆体細胞である随伴細胞が活性化された。ＢｒｄＵ標識により、通常活性化分化された随伴細胞の存在する筋線維への融合により得られる新しい筋核が既存の筋線維内に同定される。これは筋肉修復及び再生の自然なプロセスである。筋廃用からの回復中、ＨＭＢ治療群はビヒクル治療ラットよりもほぼ２倍のＢｒｄＵポジティブ核の数を有していた（ＨＭＢ＝８．１±２、対照＝４．２±１．７（ｐ＝０．００１））。図１１は、活性化／増幅筋肉随伴細胞核の推定値としてヒラメ筋中のＢｒｄＵポジティブ核を同定するために使用したＢｒｄＵ及びラミニンの免疫蛍光標識の結果を示す。ＢｒｄＵを二次フルオレセインで染色した二次Ｃｙ３ラミニン及びＤＡＰＩで標識した核で染色した。全核に対するＢｒｄＵポジティブ核の数を％として表示した。１群あたり２５００個以上の核を評価した。先に言及したように、ＨＭＢ群では、１４日間の回復期間でほぼ２倍のＢｒｄＵポジティブ核の数を示したが、これは治療群中の随伴細胞の活性化による筋肉肥大の早期兆候を示す。
【００９３】
結果の分析
上のデータが示すように、ＨＭＢは後肢懸垂及び続く再荷重後の筋肉回復を改善させる。更に、ＨＭＢは、（１）非荷重（不動）後再荷重（回復）中の更なる筋力低下を予防する；（２）再荷重した筋肉の足底中の筋肉量を改善する；（３）非荷重及び再荷重に応答して速骨格筋及び遅骨格筋の両方の線維萎縮の程度を弱める；（４）ＨＳにより誘発される筋核アポトーシスを有意に減衰させる；（５）足底筋及びヒラメ筋の両方において再荷重後のアポトーシス指数を低下させる；及び（６）再荷重した足底筋及びヒラメ筋中の切断型カスパーゼ−３、切断型カスパーゼ−９及びＢａｘタンパク質存在量のより低いレベルにより示されるようにミトコンドリアアポトーシスシグナルを抑える。これらの結果は、ＨＭＢが筋廃用期間後の筋肉回復の促進において非常に有効であることを示している。
【００９４】
［実施例２〜６］
実施例２〜６は、本発明の方法において使用するのに適したＨＭＢ含有栄養粉末を例示し、これらの成分を下表にリストする。これらの製品は、別々のバッチで噴霧乾燥方法により製造し、使用直前に所望の目標成分濃度まで水で再構成される。すべての成分量は、別段の定めがない限り製品の１０００ｋｇバッチあたりのｋｇとしてリストされている。
【００９５】
【表２】
2014506254.tif 000004
2014506254.tif 000005
【００９６】
［実施例７〜１１］
実施例７〜１１は、本発明の方法において使用するのに適したＨＭＢ含有栄養液体を例示し、これらの成分を下表にリストする。すべての量は、別段の定めがない限り製品の１０００ｋｇバッチあたりのｋｇとしてリストされている。
【００９７】
【表３】
2014506254.tif 000006
2014506254.tif 000007
【図１】
2014506254.tif 000008
【図２】
2014506254.tif 000009
【図３Ａ】
2014506254.tif 000010
【図３Ｂ】
2014506254.tif 000011
【図４Ａ】
2014506254.tif 000012
【図４Ｂ】
2014506254.tif 000013
【図４Ｃ】
2014506254.tif 000014
【図４Ｄ】
2014506254.tif 000015
【図５】
2014506254.tif 000016
【図６】
2014506254.tif 000017
【図７Ａ】
2014506254.tif 000018
【図７Ｂ】
2014506254.tif 000019
【図８Ａ】
2014506254.tif 000020
【図８Ｂ】
2014506254.tif 000021
【図９Ａ】
2014506254.tif 000022
【図９Ｂ】
2014506254.tif 000023
【図１０Ａ】
2014506254.tif 000024
【図１０Ｂ】
2014506254.tif 000025
【図１１】
2014506254.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月27日(2013.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを個人に対して筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与し、個人における筋肉回復を促進させることによって、筋廃用期間に生じた筋萎縮の治療において使用するためのβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項２】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを個人に対して筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中毎日投与する、請求項１に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項３】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを個人に対して筋廃用後少なくとも１ヶ月間投与する、請求項２に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項４】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを個人に対して筋廃用後１ヶ月〜６ヶ月間投与する、請求項３に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項５】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを個人に対して約１年間投与する、請求項２〜４のいずれか１項に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項６】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを約０．１ｇ／日〜約１０ｇ／日の用量で筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中投与する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項７】
個人が、高齢者である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項８】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを高齢者に対して筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中毎日投与する、請求項７に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項９】
β−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間に曝されている筋肉をもつ個人に対して筋廃用期間及び筋肉回復期間中投与し、前記個人における筋萎縮を最小限に抑えることによって、筋廃用期間に生じた筋萎縮の治療において使用するためのβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項１０】
筋肉が、１週間以上廃用の状態にある、請求項９に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項１１】
筋肉が、１週間〜１年間廃用の状態にある、請求項９に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項１２】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中毎日投与する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項１３】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間後少なくとも１ヶ月間投与する、請求項１２に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項１４】
個人にβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間後１ヶ月〜６ヶ月間投与する、請求項１２に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【請求項１５】
個人に約０．１ｇ／日〜約１０ｇ／日のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレートを筋廃用期間及び筋肉回復期間の両期間中投与する、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート。
【国際調査報告】
2014506254.tif 000027
2014506254.tif 000028
2014506254.tif 000029