(57)【要約】  本発明は、（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物をさらに含む組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アリルイソチオシアネートと；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸と；を含み、任意に、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；をさらに含む組成物。
【請求項２】
（ａ）アリルイソチオシアネートと；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸と；
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
有機酸が、酢酸とプロピオン酸との混合物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
緑茶抽出物が、茶ポリフェノールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
緑茶抽出物が、カテキンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
緑茶抽出物が、
【化１】
2014500038.tif 000042
およびそれらの混合物から選択される化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
組成物に基づいて少なくとも０．１質量％の量のアリルイソチオシアネートを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
組成物に基づいて少なくとも０．１５質量％の量のアリルイソチオシアネートを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
組成物に基づいて少なくとも０．１質量％の量のアリルイソチオシアネートを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物に基づいて少なくとも３質量％の量の有機酸を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物に基づいて少なくとも５質量％の量の有機酸を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物に基づいて少なくとも６質量％の量の有機酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
組成物に基づいて少なくとも２質量％の量の酢酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物に基づいて少なくとも３質量％の量の酢酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物に基づいて少なくとも４質量％の量の酢酸を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物に基づいて少なくとも０．５質量％の量のプロピオン酸を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物に基づいて少なくとも１質量％の量のプロピオン酸を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物に基づいて少なくとも１．５質量％の量のプロピオン酸を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
組成物に基づいて少なくとも１．０質量％の量の緑茶抽出物を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物に基づいて少なくとも１．５質量％の量の緑茶抽出物を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物に基づいて少なくとも２．０質量％の量の緑茶抽出物を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
−組成物に基づいて少なくとも０．１質量％の量のアリルイソチオシアネートと；
−組成物に基づいて少なくとも２質量％の量の酢酸と；
−組成物に基づいて少なくとも０．５質量％の量のプロピオン酸と；
−組成物に基づいて少なくとも１．０質量％の量の緑茶抽出物と
を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および任意に、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；が、
酵母、カビまたは酵母およびカビの両方に関して殺菌または静菌の相乗効果を与える量で存在する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
殺菌または静菌効果が、チゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アスペルギルス・パラジチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の種から選択される生物に関するものである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２５】
食品への添加に適した保護剤組成物である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
乳化剤をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
乳化剤が、ポリソルベート、モノグリセリド、ジグリセリド、モノ−ジグリセリドの酢酸エステル、モノ−ジグリセリドの酒石酸エステルおよびモノ−ジグリセリドのクエン酸エステルから選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
キレート剤をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
キレート剤が、ＥＤＴＡ、クエン酸、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートおよびポリホスフェートから選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
キレート剤が、抗菌性材料の抗菌活性および／または抗菌スペクトルを向上させる、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
キレート剤が、グラム陰性菌に関して抗菌性材料の抗菌活性および／または抗菌スペクトルを増強する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
溶菌酵素をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
溶菌酵素がリゾチームである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗菌性保護剤組成物を含む食品。
【請求項３５】
生肉、調理肉、生の家禽製品、調理された家禽製品、生の海産物、調理された海産物、インスタント食品、パスタソース、殺菌スープ、マヨネーズ、サラダドレッシング、水中油型エマルジョン、マーガリン、低脂肪スプレッド、油中水型エマルジョン、乳製品、チーズスプレッド、プロセスチーズ、乳製品デザート、フレーバードミルク、クリーム、発酵乳製品、チーズ、バター、コンデンスミルク製品、アイスクリームミックス、大豆製品、殺菌液卵、ベーカリー製品、菓子製品、果実製品、および脂肪ベースフィリングまたは水含有フィリングを含む食品から選択される、請求項３４に記載の食品。
【請求項３６】
食品に基づいて１５，０００ｐｐｍ以下の量の組成物を含む、請求項３４または３５に記載の食品。
【請求項３７】
食品に基づいて３５ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネートを含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項３８】
食品に基づいて１２，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸を含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項３９】
食品に基づいて２２５ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物を含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の食品。
【請求項４０】
食品に基づいて８，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸を含む、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の食品。
【請求項４１】
食品に基づいて４，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸を含む、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の食品。
【請求項４２】
材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための方法であって、材料を
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物、
の一方または両方；と接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項４３】
材料を
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；
と接触させる工程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
材料を
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；
と接触させる工程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
材料を
（ａ）アリルイソチオシアネート；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；
と接触させる工程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
材料との接触が同時である、請求項４２または４５に記載の方法。
【請求項４７】
材料との接触が連続である、請求項４２または４５に記載の方法。
【請求項４８】
材料が食品である、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項２〜３３のいずれか一項に記載の特徴によって特徴付けられる、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物、
の一方または両方；
の使用。
【請求項５１】
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；
が、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させる、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；
が、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させる、請求項５０に記載の使用。
【請求項５３】
（ａ）アリルイソチオシアネート；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；
が、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させる、請求項５０に記載の使用。
【請求項５４】
材料が食品である、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５５】
請求項２〜３３のいずれか一項に記載の特徴によって特徴付けられる、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５６】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物を調製するためのキットであって、任意に、混合および／または接触および／または使用のための説明書とともに；別個のパッケージまたは容器中に、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；
を含み、任意に、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物；
をさらに含む、上記キット。
【請求項５７】
実施例のいずれか１つに関して上文に実質的に記載される組成物。
【請求項５８】
実施例のいずれか１つに関して上文に実質的に記載される方法。
【請求項５９】
実施例のいずれか１つに関して上文に実質的に記載される使用。
【請求項６０】
実施例のいずれか１つに関して上文に実質的に記載されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺菌または静菌作用を示す組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特に、即席の食事、スープ、ソースまたは軽食などのインスタント食品の増加傾向とともに、食品の安全性および食品の腐敗の防止は、世界中に絶えず存在する問題である。食品の腐敗は、食品メーカーにとって大きな経済問題である。食品メーカーは、食べても安全な製品を供給することによって、人々の健康および安全を保護する必要がある。このような食品は、冷蔵保存または常温保存のいずれかで保証された保存期間を有しなければならない。消費者は、高品質の味の良い食品を好み、これは、化学保存料、強すぎる加熱法および他の加工手段を用いると、得るのが難しい。食品の安全性および保護は、より穏やかな加工および天然保存料を組み合わせた手法を用いた複数の防腐系によって最良に達成される。また、食品が媒介する微生物は、様々な防腐手段を用いて防腐処理された食品中では順応および増殖しにくくなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
食品保護およびジゴサッカロマイセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）などの食品腐敗生物の増殖についての大きな問題がある。この特定の種は、最も問題となっている腐敗酵母の１つであり、果汁、ソース、炭酸清涼飲料、サラダドレッシング、マヨネーズおよびケチャップの主な腐敗生物であることが多い。抗菌剤に対する非常に高い耐性などの独特の生理的特徴が、これらの腐敗生物が腐敗を引き起こす能力に大きく関与している。さらに、腐敗生物は、時として、様々な保存および貯蔵条件に順応することができるため、保存手段の組合せは、個々の手段より成功し得る。
【０００４】
保証された保存期間を有する、便利で、天然で、安全で、健康的で、良好な品質の製品に対する人々の需要を満たすために、経済的で、天然でかつ有効な防腐系を開発する必要性が高まっている。植物由来のものなどの抗菌性材料が、この必要性を満たすのに役立つ食品中の保存料として使用され得る。このような植物抽出物は、天然であるとみなされるため、望ましいと考えられる。さらに、規制上の観点から、長期間の使用のため、植物抽出物は、典型的に、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）ステータスを有する。より少ない量の抗菌性材料を用いる微生物防除剤（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を提供することも引き続き必要とされている。したがって、新規な抗菌性材料または抗菌性材料の新規なより有効な組合せを提供することが必要とされている。
【０００５】
天然由来であるにもかかわらず、植物由来の抗菌性製品は、できる限り最少の量で使用されるのが望ましい。これは、コストの理由だけではなく、食品中の「添加物」の量を最小限に抑えたいという消費者の要求を満たすためにも望ましい。さらに、多くの植物材料には味が付随している。したがって、要求の厳しい多くの食品用途において、植物由来の保護剤（ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）の量を減少させるのが有利である。
【０００６】
これらの目的および他の目的が、本発明によって対処される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物をさらに含む組成物を提供する。
【０００８】
一態様において、本発明は、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための方法であって、（ａ）アリルイソチオシアネート；ならびに（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸および（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物の一方または両方と材料を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための、（ａ）アリルイソチオシアネート；ならびに（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物の一方または両方の使用を提供する。
【００１０】
一態様において、本発明は、本発明の組成物を調製するためのキットであって、任意に、混合および／または接触および／または使用のための説明書とともに；別個のパッケージまたは容器中に、（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に、（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物をさらに含むキットを提供する。
【００１１】
一態様において、本発明は、保護剤組成物を含む食品であって、（ａ）アリルイソチオシアネート；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に、（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物をさらに含む食品を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、本明細書および添付の特許請求の範囲に規定される。
【００１３】
本発明は、食品などの材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための成分の相乗的組合せを提供する。成分のこの組合せにより、有効な作用を提供し、抗菌性材料に対する耐性の発現を防止するために使用される、より低いレベルの（ａ）アリルイソチオシアネート；および／または（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および／または（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物などの、より低いレベルの活性薬剤成分が可能になる。これは、用量の減少および／または耐性の発現の回避が商業上および規制上の理由から望ましい食品用途において特に重要である。相乗作用は、比較的少量の異なる化合物を用いることで、それらのマイナスの特性の影響を最小限に抑えながら、比較的大きい抗菌効果が得られることから特に関心を集めている。さらに、微生物細胞の代謝の複雑性を考えると、原核生物（細菌）または真核生物（酵母および真菌）のいずれかにかかわらず、単一の物質が、全ての作用に影響を及ぼす可能性は極めて低いため、主な抗菌剤の組合せは、より広範囲の微生物を標的とするのに役立つ。さらに、活性化合物の組合せに対する微生物個体群の耐性発現がより起こりにくい。
【００１４】
本発明に用いられる特定の材料、すなわち、（ａ）アリルイソチオシアネート；ならびに（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸および（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物の一方または両方に関して、成分のそれぞれは、好ましくない特性を有する。例えば、アリルイソチオシアネートの使用は、極めて低い濃度で顕著なカラシの香りを伴うその副鼻腔を刺激する香りにより、現在制限されている。高濃度での緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物の使用は、考慮される必要のあるカテキン成分の一日摂取許容量（ＡＤＩ）値として規制上の制限を受け得る。
【００１５】
参照しやすいように、これより、本発明のこれらの態様およびさらなる態様は、適切な項の見出しの下で説明される。しかしながら、各項における教示は、各特定の項に必ずしも限定されるわけではない。
【００１６】
好ましい態様
有機酸
本明細書に記載されるように、本発明は、酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸を用い得る。
【００１７】
一態様において、有機酸は酢酸である。一態様において、有機酸はプロピオン酸である。好ましい一態様において、有機酸は、酢酸とプロピオン酸との混合物である。
【００１８】
酢酸および／またはプロピオン酸は、任意の公知の方法によって調製されるかまたは任意の供給源から提供され得る。しかしながら、天然源からのこれらの成分を提供するために、それらが培養された生成物から得られることが好ましい。したがって、好ましい一態様において、有機酸は、培養酵素（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｅｒｍｅｎｔ）の形態でまたは培養酵素から提供される。好ましい一態様において、酢酸は、培養酵素の形態でまたは培養酵素から提供される。好ましい一態様において、プロピオン酸は、培養酵素の形態でまたは培養酵素から提供される。好ましい一態様において、酢酸およびプロピオン酸は、培養酵素の形態でまたは培養酵素から提供される。
【００１９】
当業者は、培養酵素が、所望の有機酸を提供する任意の好適な微生物に由来し得ることを理解するであろう。一態様において、培養酵素は、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）；プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）およびそれらの組合せから選択される１つ以上の菌株から調製される。一態様において、培養酵素は、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）の１つ以上の菌株から調製される。一態様において、培養酵素は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の１つ以上の菌株から調製される。一態様において、培養酵素は、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）の１つ以上の菌株から調製される。一態様において、培養酵素は、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）の１つ以上の菌株と、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の１つ以上の菌株との組合せから調製される。
【００２０】
所望の有機酸が培養酵素として調製され得るさらなる好適な微生物としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・セロビオス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
【００２１】
好ましい培養酵素は、活性成分が、発酵物（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅ）を基準にして１２〜１５重量％の量の酢酸および発酵物を基準にして２０〜２５重量％の量のプロピオン酸である発酵物である。好ましい培養酵素は、活性成分が、発酵物を基準にして７〜８重量％の量の酢酸および発酵物を基準にして２．５〜４重量％の量のプロピオン酸である発酵物である。好ましい培養酵素は、活性成分が、発酵物を基準にして７〜８重量％の量の酢酸および発酵物を基準にして２．５〜４重量％の量のプロピオン酸である培養されたデキストロース生成物である。
【００２２】
有機酸は、所要の殺菌または静菌効果を提供する任意の量で存在し得る。この効果は、典型的に、微生物増殖が阻害されるべき最終的な材料におけるものであり得る。したがって、本発明が保護剤組成物を提供する場合、有機酸は、組成物が、指示される量で「保護される」べき材料に加えられる場合、有機酸が、保護されるべき材料中に、所要の殺菌または静菌効果を提供する量で存在するような量で存在し得る。
【００２３】
一態様において、有機酸は、殺菌または静菌効果を提供する量で存在する。
【００２４】
一態様において、組成物は、抗菌性保護剤組成物である。この態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、組成物を基準にして少なくとも０．５重量％の量の有機酸を含む。有機酸は、組成物を基準にして少なくとも１重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして少なくとも２重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして少なくとも３重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして少なくとも５重量％の量で存在し得る。さらに他の有機酸は、組成物を基準にして少なくとも６重量％の量で存在し得る。これらの態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、組成物を基準にして１５重量％以下の量の有機酸を含む。有機酸は、組成物を基準にして１２重量％以下の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして１０重量％以下の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして８重量％以下の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして７重量％以下の量で存在し得る。組成物は、組成物を基準にして０．５〜１５重量％の量の有機酸を含み得る。組成物は、組成物を基準にして０．５〜１２重量％の量の有機酸を含み得る。有機酸は、組成物を基準にして１〜１５重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして２〜１５重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして３〜１２重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして５〜１２重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして３〜１０重量％の量で存在し得る。有機酸は、組成物を基準にして５〜１０重量％の量で存在し得る。さらに他の有機酸は、組成物を基準にして６〜１０重量％の量で存在し得る。
【００２５】
一態様において、組成物は、抗菌性保護剤組成物である。この態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、組成物を基準にして少なくとも０．５重量％の量の酢酸を含む。酢酸は、組成物を基準にして少なくとも１重量％の量で存在し得る。酢酸は、組成物を基準にして少なくとも２重量％の量で存在し得る。酢酸は、組成物を基準にして少なくとも２．５重量％の量で存在し得る。酢酸は、組成物を基準にして少なくとも３重量％の量で存在し得る。さらに他の酢酸は、組成物を基準にして少なくとも４重量％の量で存在し得る。組成物は、組成物を基準にして０．５〜１０重量％の量の酢酸を含み得る。酢酸は、組成物を基準にして１〜１０重量％の量で存在し得る。酢酸は、組成物を基準にして２〜１０重量％の量で存在し得る。酢酸は、組成物を基準にして２．５〜１０重量％の量で存在し得る。酢酸は、３〜８重量％の量で存在し得る。酢酸は、５〜８重量％の量で存在し得る。酢酸は、組成物を基準にして３〜７重量％の量で存在し得る。さらに他の酢酸は、組成物を基準にして４〜６重量％の量で存在し得る。
【００２６】
一態様において、組成物は、抗菌性保護剤組成物である。この態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、組成物を基準にして少なくとも０．１重量％の量のプロピオン酸を含む。プロピオン酸は、組成物を基準にして少なくとも０．２重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして少なくとも０．５重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして少なくとも１．０重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして少なくとも１．２重量％の量で存在し得る。さらに他のプロピオン酸は、組成物を基準にして少なくとも１．５重量％の量で存在し得る。組成物は、組成物を基準にして０．１〜５重量％の量のプロピオン酸を含み得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして０．２〜５重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして０．５〜３重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして１．０〜３重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして１．０〜２．５重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして１．０〜２重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして１．５〜３重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして１．５〜２．５重量％の量で存在し得る。プロピオン酸は、組成物を基準にして１．５〜２重量％の量で存在し得る。さらに他のプロピオン酸は、組成物を基準にして４〜６重量％の量で存在し得る。
【００２７】
緑茶抽出物
本明細書に記載されるように、組成物は、緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物を含み得る。本明細書における緑茶抽出物への全ての言及が、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）種の植物に由来する抽出物を意味することが、当業者によって理解されよう。
【００２８】
「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」または「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔｓ）」という用語によって、全植物から単離され得る植物の任意の成分を意味することが、当業者によって理解されよう。
【００２９】
好ましい態様において、緑茶「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」または「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔｓ）」という用語によって、植物の葉または全植物の葉から単離され得る成分を意味する。
【００３０】
多くのインビトロおよびインビボ試験が、抗酸化、および抗菌活性を含む、緑茶（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））および茶ポリフェノールの有益な健康特性を示唆している［Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ］。要約すると、カテキン（フラボノイド）は、緑茶の重要な成分である。ＹＡＭ  ｅｔ．ａｌ．（１９９７）によれば、緑茶抽出物の抗菌活性を担う主な化学部分はカテキンおよびそのガラートであり、エピ−立体配置を有する物質は、より活性が高いようである［Ｙａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｋｉｇａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｋａｊｉｙａ  ｅｔ  ａｌ］。
【００３１】
好ましい一態様において、緑茶抽出物は茶ポリフェノールである。好ましくは、緑茶抽出物はカテキンである。非常に好ましい態様において、緑茶抽出物は、
【化１】
2014500038.tif 000002
およびそれらの混合物から選択される化合物である。これらの６つの化合物が、本明細書において緑茶カテキンまたは緑茶抽出物カテキンと呼ばれる。緑茶抽出物は、緑茶抽出物を基準にして約７５重量％の合計量でこれらの６つのカテキンを含有する。上記の化合物は、緑茶植物から単離されるのが理想であるが、合成経路によって得てもよいことが、当業者によって理解されよう。したがって、一態様において、本発明は、以下を提供し得る。
【００３２】
・（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に、（ｃ）
【化２】
2014500038.tif 000003
およびそれらの混合物から選択される化合物をさらに含む組成物、
【００３３】
・材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための方法であって、（ａ）アリルイソチオシアネート；ならびに（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸および（ｃ）
【化３】
2014500038.tif 000004
およびそれらの混合物から選択される化合物の一方または両方と材料を接触させる工程を含む方法、
【００３４】
・材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための、（ａ）アリルイソチオシアネート；ならびに（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および（ｃ）
【化４】
2014500038.tif 000005
およびそれらの混合物から選択される化合物の一方または両方の使用、
【００３５】
・本発明の組成物を調製するためのキットであって、任意に、混合および／または接触および／または使用のための説明書とともに；別のパッケージまたは容器中に、（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に、（ｃ）
【化５】
2014500038.tif 000006
およびそれらの混合物から選択される化合物をさらに含むキット、
【００３６】
・保護剤組成物を含む食品であって、（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に、（ｃ）
【化６】
2014500038.tif 000007
およびそれらの混合物から選択される化合物をさらに含む食品。
【００３７】
緑茶抽出物は、所要の殺菌または静菌効果を提供する任意の量で存在し得る。この効果は、典型的に、微生物増殖が阻害されるべき最終的な材料におけるものであり得る。したがって、本発明が保護剤組成物を提供する場合、緑茶抽出物は、組成物が、指示される量で「保護される」べき材料に加えられる場合、緑茶抽出物が、保護されるべき材料中に、所要の殺菌または静菌効果を提供する量で存在するような量で存在し得る。
【００３８】
一態様において、緑茶抽出物は、殺菌または静菌効果を提供する量で存在する。
【００３９】
緑茶抽出物の量は、典型的に、緑茶抽出物によって提供されるカテキンの量によって表されることが、当業者によって理解される。本発明に使用するための緑茶抽出物の好適な量が以下に示される。好ましい一態様において、本明細書に記載される緑茶抽出物の量は、７５重量％のカテキンを含有する緑茶抽出物を基準にしている。この態様において、当業者は、使用される緑茶抽出物が７５重量％超または７５重量％未満の量のカテキンを含有する場合、本明細書に記載される量を修正することができるであろう。
【００４０】
一態様において、組成物は、抗菌性保護剤組成物である。この態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、組成物を基準にして少なくとも０．１重量％の量の緑茶抽出物を含む。緑茶抽出物は、組成物を基準にして少なくとも０．２重量％の量で存在し得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして少なくとも０．５重量％の量で存在し得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして少なくとも１．０重量％の量で存在し得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして少なくとも１．５重量％の量で存在し得る。さらに他の緑茶抽出物は、組成物を基準にして少なくとも２．０重量％の量で存在し得る。組成物は、組成物を基準にして０．１〜５重量％の量の緑茶抽出物を含み得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして０．２〜５重量％の量で存在し得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして０．５〜３重量％の量で存在し得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして１．０〜３重量％の量で存在し得る。緑茶抽出物は、組成物を基準にして１．５〜３重量％の量で存在し得る。
【００４１】
一態様において、組成物は、抗菌性保護剤組成物である。この態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、緑茶抽出物カテキン、すなわち、
【化７】
2014500038.tif 000008
を、組成物を基準にして少なくとも０．１重量％の合計量で含む。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして少なくとも０．２重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして少なくとも０．５重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして少なくとも１．０重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして少なくとも１．５重量％の合計量で存在し得る。さらに他の緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして少なくとも２．０重量％の合計量で存在し得る。組成物は、組成物を基準にして０．１〜５重量％の合計量の緑茶抽出物カテキンを含み得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして０．２〜３重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして０．５〜３重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして１．０〜３重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして１．５〜２．５重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして２．０〜２．５重量％の合計量で存在し得る。緑茶抽出物カテキンは、組成物を基準にして２．１〜２．３重量％の合計量で存在し得る。
【００４２】
アリルイソチオシアネート
本明細書に記載されるように、組成物は、アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）を含み得る。アリルイソチオシアネートの構造は以下のとおりである。
【化８】
2014500038.tif 000009
【００４３】
アリルイソチオシアネートは、カラシ精油と呼ばれることもあり、静菌および静真菌特性を有することが知られている。精油（ＥＯ）は、一般に、芳香族化合物を含有する疎水性液体である。精油は、主にそれらのフェノール性の性質に起因して、抗菌活性を示す［３］。したがって、一態様において、アリルイソチオシアネートは、カラシの種子から得られる。一態様において、アリルイソチオシアネートは、クロガラシ（ブラッシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ））またはカラシナ（ブラッシカ・ユンケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ））の種子から得られる。
【００４４】
一態様において、組成物は、抗菌性保護剤組成物である。この態様および他の態様において、好ましくは、組成物は、組成物を基準にして少なくとも０．０１重量％の量のアリルイソチオシアネートを含む。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして少なくとも０．０５重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして少なくとも０．１重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして少なくとも０．１５重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして少なくとも０．２重量％の量で存在し得る。さらに他のアリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして約０．２５重量％の量で存在し得る。組成物は、組成物を基準にして０．０１〜１重量％の量のアリルイソチオシアネートを含み得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして０．０５〜１重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして０．１〜１重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして０．１〜０．５重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして０．２〜０．５重量％の量で存在し得る。アリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして０．２〜０．４重量％の量で存在し得る。さらに他のアリルイソチオシアネートは、組成物を基準にして０．２〜０．３重量％の量で存在し得る。
【００４５】
組成物
本発明は、（ａ）アリルイソチオシアネートと；（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸とを含み、任意に、（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物をさらに含む組成物を提供する。
【００４６】
好ましい成分（ｃ）が存在し、組成物は、
（ａ）アリルイソチオシアネートと；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸と；
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物と
を含む。
【００４７】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のそれぞれの好ましい量のそれぞれは、好ましい組成物を提供するように組み合わせられ得る。一態様において、組成物は、
−組成物を基準にして少なくとも０．１重量％の量のアリルイソチオシアネートと；
−組成物を基準にして少なくとも２重量％の量の酢酸と；
−組成物を基準にして少なくとも０．５重量％の量のプロピオン酸と；
−組成物を基準にして少なくとも１．０重量％の量の緑茶抽出物と
を含む。
【００４８】
（ａ）アリルイソチオシアネートと；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸と、
任意に、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物と
を含む好ましい組成物が、酵母、カビまたは酵母およびカビの両方に関して殺菌または静菌の相乗効果を提供する量で存在する。さらなる好ましい態様において、材料は、（ｉ）酵母、カビまたは酵母およびカビの両方に関して、および（ｉｉ）グラム陰性菌に関して殺菌または静菌の相乗効果を提供する量で存在する。
【００４９】
本発明の組成物は、任意の所要の用途に使用され得る。一態様において、組成物は、食品への添加に適した保護剤組成物である。
【００５０】
本発明の組成物または本発明に使用するための組成物は、１つ以上の追加の成分を含有し得る。しかしながら、ある態様において、（食品への添加に適した）本発明の保護剤組成物は、追加の成分を含有せず、すなわち組成物の特性に実質的に影響を与える追加の成分を含有しない。
【００５１】
本発明の組成物または本発明に使用するための組成物は、培養物、発酵の副産物、バクテリオシン、植物抽出物、酵素、有機酸およびそれらの混合物から選択される１つ以上の追加の成分を含有し得る。好ましい培養物としては、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）発酵物およびラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）発酵物が挙げられる。好ましい精製された代謝産物としては、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ  ＣＳ１−５０、ＣＭ１−５０、ニサプリン、ナイシン、ペディオシンおよびサカシンが挙げられる。好ましい植物抽出物が以下に挙げられる。好ましい酵素としては、卵白リゾチームが挙げられる。好ましい有機酸としては、乳酸が挙げられる。
【００５２】
好ましい一態様において、組成物は、（さらなる）植物抽出物をさらに含む。好ましくは、植物抽出物は、ホップ抽出物（アルファおよびベータ酸、フムロンおよびルポロン（ｌｕｐｏｌｏｎｅｓ）を含む）、ローズマリー抽出物（カルノシン酸を含む）、バニリン、シナモン抽出物（トランスケイ皮アルデヒドを含む）、松樹皮抽出物、ブドウ抽出物、レスベラトロール、ピノシルビン、セイヨウトチノキ、セージ、チモール、ユッカ抽出物、ビルベリーおよびシトラスバイオフラボノイドから選択される。
【００５３】
好ましい一態様において、組成物は、乳化剤をさらに含む。好ましくは、乳化剤は、別名ポリソルベート（例えばＴｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ２０）としても知られているポリオキシ−エチレンソルビタンエステル（Ｅ４３２−Ｅ４３６）、モノグリセリド、ジグリセリド、モノ−ジグリセリドの酢酸エステル、モノ−ジグリセリドの酒石酸エステルおよびモノ−ジグリセリドのクエン酸エステルから選択される。
【００５４】
好ましい一態様において、組成物は、キレート剤をさらに含む。好ましくは、キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートおよびポリホスフェートから選択される。
【００５５】
さらなる好適なキレート剤が、米国特許第５５７３８０１号明細書に教示されており、これらとしては、カルボン酸、ポリカルボン酸、アミノ酸およびホスフェートが挙げられる。特に、以下の化合物およびそれらの塩が有用であり得る：
【００５６】
酢酸、アデニン、アジピン酸、ＡＤＰ、アラニン、Ｂ−アラニン、アルブミン、アルギニン、アスコルビン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ＡＴＰ、安息香酸、ｎ−酪酸、カゼイン、シトラコン酸、クエン酸、システイン、デヒドロ酢酸、デフェリ−フェリクリシン、デフェリ−フェリクロム、デフェリ−フェリオキサミンＥ、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジメチルグリオキシム、Ｏ，Ｏ−ジメチルプルプロガリン、ＥＤＴＡ、ギ酸、フマル酸、グロブリン、グルコン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グリシン、グリコール酸、グリシルグリシン、グリシルサルコシン、グアノシン、ヒスタミン、ヒスチジン、３−ヒドロキシフラボン、イノシン、イノシン三リン酸、鉄非含有フェリクロム、イソ吉草酸、イタコン酸、コウジ酸、乳酸、ロイシン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、メチオニン、サリチル酸メチル、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、オルニチン、オルトホスフェート、シュウ酸、オキシステアリン、Ｂ−フェニルアラニン、リン酸、フィテート、ピメリン酸、ピバリン酸、ポリホスフェート、プロリン、プロピオン酸、プリン、ピロホスフェート、ピルビン酸、リボフラビン、サリチルアルデヒド、サリチル酸、サルコシン、セリン、ソルビトール、コハク酸、酒石酸、テトラメタホスフェート、チオサルフェート、トレオニン、トリメタホスフェート、トリホスフェート、トリプトファン、ウリジン二リン酸、ウリジン三リン酸、ｎ−吉草酸、バリン、バニリン、およびキサントシン。
【００５７】
上記の金属イオン封鎖剤の多くは、それらの塩形態において食品加工に有用であり、これは、一般的に、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩または第四級アンモニウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩である。複数の原子価を有する金属イオン封鎖化合物は、ｐＨを調整するかあるいは金属イオンを、例えば食品系コーティング中に選択的に導入するかまたは取り込むのに有益に用いられ得る。キレート剤についてのさらなる情報は、Ｔ．Ｅ．Ｆｕｒｉａ（Ｅｄ．），ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｐｐ．２７１−２９４（１９７２，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｃｏ．）、およびＭ．Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｅｄｓ．），Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．６９４−６９９（１９７８，ＡＶＩ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）に開示されており、これらの論文は両方とも、参照により本明細書に援用される。
【００５８】
「キレート剤」という用語は、金属と配位錯体を形成することが可能な有機または無機化合物と定義される。また、「キレート剤」という用語が本明細書において使用される際、この用語は、シクロデキストリンまたはマルトデキストリンなどの分子封入化合物を含む。キレート剤は、無機であってもまたは有機であってもよいが、有機であるのが好ましい。
【００５９】
好ましいキレート剤は、哺乳動物に対して非毒性であり、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩（特にそのジ−およびトリ−ナトリウム塩）などのアミノポリカルボン酸およびそれらの塩、およびクエン酸などのヒドロキシカルボン酸およびそれらの塩を含む。しかしながら、酢酸、ギ酸、乳酸、酒石酸およびそれらの塩などの非クエン酸および非クエン酸塩ヒドロキシカルボン酸キレート剤も、本発明に有用であると考えられる。
【００６０】
上述されるように、「キレート剤」という用語は、金属イオン封鎖剤の同義語として本明細書において定義および使用され、シクロデキストリンなどの分子封入化合物を含むものとしても定義される。シクロデキストリンは、ドーナツ形の環に配置された６つ、７つ、または８つのグルコースモノマーを有する環状炭水化物分子であり、それぞれ、アルファ、ベータまたはガンマシクロデキストリンと表される。本明細書において使用される際、シクロデキストリンは、非変性および変性シクロデキストリンモノマーおよびポリマーの両方を指す。シクロデキストリン分子封入剤（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｉｚｅ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｉｎｄ．から市販されている。シクロデキストリンは、Ｊ．Ｓｚｅｊｔｌｉによる「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ」と題された第１１章（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４）の３３１−３９０ページ）にさらに記載されており、この章は、参照により本明細書に援用される。
【００６１】
好ましい一態様において、アリルイソチオシアネートは、シクロデキストリンと複合される。この態様において、アリルイソチオシアネートは、その際、粉末の形態で容易に提供される。
【００６２】
好ましい一態様において、有機酸は、マルトデキストリンと混合される。
【００６３】
好ましい一態様において、緑茶抽出物は、マルトデキストリンと混合される。この態様において、緑茶抽出物は、標準形態でより容易に提供され得る。
【００６４】
好ましくは、キレート剤は、抗菌性材料の抗菌活性および／または抗菌スペクトルを向上させる。より好ましくは、キレート剤は、グラム陰性菌および他の微生物に関して、抗菌性材料の抗菌活性および／または抗菌スペクトルを向上させる。
【００６５】
好ましい一態様において、組成物は、溶菌酵素をさらに含む。好ましくは、溶菌酵素はリゾチームである。
【００６６】
微生物
本発明の文脈において、「抗菌剤」という用語は、殺菌および／または静菌および／または殺真菌および／または静真菌効果および／または殺ウイルス効果があることを意味することが意図され、ここで、用語の定義は以下のとおりである。
【００６７】
「殺菌」という用語は、細菌細胞を死滅させることが可能であることと理解されるべきである。
【００６８】
「静菌」という用語は、細菌増殖を阻害し、すなわち細菌細胞の増殖を阻害することが可能であることと理解されるべきである。
【００６９】
「殺真菌」という用語は、真菌細胞を死滅させることが可能であることと理解されるべきである。
【００７０】
「静真菌」という用語は、真菌の増殖を阻害し、すなわち真菌細胞の増殖を阻害することが可能であることと理解されるべきである。
【００７１】
「殺ウイルス」という用語は、ウイルスを不活性化することが可能であることと理解されるべきである。
【００７２】
「微生物細胞」という用語は、細菌または真菌細胞を表し、微生物という用語は、真菌（酵母を含む）または細菌を表す。
【００７３】
本発明の文脈において、「微生物細胞の増殖を阻害する」という用語は、細胞が非増殖状態であること、すなわち、細胞が繁殖することができないことを意味することが意図される。
【００７４】
本明細書に記載されるように、本発明は、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させ得る。これは、本発明の組成物との接触により、細菌などの微生物を不活性化する（ｓｌｏｗ）かまたは抑制するか、あるいは存在する微生物を死滅させることによって行われ得る。
【００７５】
非常に好ましい態様において、殺菌または静菌効果は、殺細菌または静細菌効果である。
【００７６】
殺菌または静菌効果は、酵母、カビまたは酵母およびカビの両方に関するものであるのが有利である。好ましくは、殺菌または静菌効果は、（ｉ）酵母、カビまたは酵母およびカビの両方に関し、および（ｉｉ）グラム陰性菌に関するものである。
【００７７】
好ましい態様において、殺菌または静菌効果は、ジゴサッカロマイセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、カンダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス・パラジチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の種から選択される生物に関するものである。
【００７８】
好ましい態様において、殺菌または静菌効果は、ジゴサッカロマイセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アスペルギルス・パラジチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の種から選択される生物に関するものである。
【００７９】
食品
本発明の組成物、方法および使用は、任意の材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または任意の材料中の微生物を死滅させ得る。しかしながら、食品の腐敗および汚染と関連する問題を考慮して、および食品における本発明の特定の有効性を考慮して、好ましくは、組成物は、食品であるかまたは食品に加えられ得る。成分は、食品に連続して加えられたものであってもよい。さらなる一態様において、成分の１つ以上は、食品中でその場で形成されたものであってもよい。例えば有機酸および／またはＡＩＴＣは、食品中でその場で形成され得る。
【００８０】
本発明は、食品および／または飼料酵素組成物における本明細書において規定される抗菌性組成物の使用をさらに包含してもよく、本明細書において規定される抗菌性組成物を含む食品および／または飼料組成物を包含し得る。このような組成物は、１つ以上のさらなる食品成分または添加物を含有し得る。食品および／または飼料組成物中に本発明の抗菌性組成物を配合することによって、組成物は、食品および／または飼料製造に使用する前に（好適な条件下で）延長された保存を可能にするように安定化され得る。さらに、本発明の抗菌性組成物は、食品および／または飼料の調理の用途のための安全な使用に適した形態の抗菌剤、あるいは食品および／または飼料の調理に使用するための成分を提供する。このような組成物は、液体、半流動体、結晶、塩または固体／顆粒形態のいずれかであり得る。
【００８１】
一態様において、本発明の組成物は、食品への添加に適した抗菌性保護剤組成物である。
【００８２】
多くの食品が、本発明によって保護され得る。典型的な食品は以下のとおりである：
テーブルソース−テーブルソース、マリネードおよび／または、フレッシュサルサを含むサルサ、またはバーベキュー（ＢＢＱ）ソースなどの調理用ソース（例えば炒める、蒸すなどの際）として使用され得る多目的のソースを含むテーブルソースとして使用されるソース。様々なタイプの発酵ソースが、様々な地域に存在し、国ごとに様々な異なる形態が含まれる。例としては、ブラウンソース、チリソース、ウスターソース、プラムソース、肉用のミントソース、タルタルソース、肉用のアップルソース、ワサビソース、肉用のクランベリーソースなどおよびオイスターソース、海鮮醤などが挙げられる。
醤油ベースのソース−醤油ベースの発酵ソース。例としては、濃口醤油および薄口醤油を混合した醤油ベースのソース、例えば−てりやきソース（追加の砂糖およびみりんと混合した醤油）−すきやきソース（追加の砂糖、みりんおよびだしを含む）−焼き鳥ソース（追加のみりん、酒、砂糖を含む）が挙げられる。
パスタソース−調理されたパスタに直接加えられるかまたは事前に数分間加熱されるか、あるいは新鮮な食材、例えば肉または野菜に加えられ、ソースを作製するように加熱され、次に、調理されたパスタに加えられることになる。例としては、ボロネーゼ、カルボナーラ、キノコ、トマト、野菜、ペストなどが挙げられる。
ウェット／調理用ソース−食事を作るために食材（肉および／または野菜）に加えられる液体（すなわち非乾燥）レシピの調理用ソース／ペースト。これには、調理の過程の前に加えられ得るレシピソース／ペースト（マリネード）および／または調理の過程中（例えば蒸す、グリルする、炒める、煮るなど）に加えられ得るレシピソース／ペーストが含まれる。
乾燥ソース／粉末混合物−熱湯または牛乳が食べる前に加えられる乾燥ソース。ここでは乾燥レシピ粉末混合物および乾燥粉末マリネードが含まれる。乾燥ソースの中には、水／牛乳を加えた後にソースを増粘するためにコンロで加熱する必要があり得るものがある。例としては、オランデーズソース、ホワイトソース、ペッパーソース、甘酸っぱいソース、スパゲティボロネーゼなどが挙げられる。
通常のサラダドレッシング（標準的な既製品）：即席の形態ではないが、乾燥サラダドレッシング（すなわち油／酢と混合された、小袋に包装さえた粉末）も含まれる。例としては、オイルベースの製品、サウザンドアイランド、ブルーチーズ、シーザー、サラダクリーム、ランチドレッシングなどが挙げられる。
低脂肪サラダドレッシング：例としては、オイルベースの製品、サウザンドアイランド、ブルーチーズ、シーザー、サラダクリーム、ランチドレッシングなどが挙げられる。
ビネグレットソース：全ての酢をベースとするサラダドレッシングを含む。例としては、ビネグレットソースが挙げられる。
他のソース、ドレッシングおよび調味料：例としては、１）非発酵テーブルソース２）ワサビ３）非レシピ（Ｎｏｎ−ｒｅｃｉｐｅ）ピューレ、ペースト（例えばニンニクピューレ／ペースト）４）乾燥マリネード５）乾燥レシピ粉末混合物（例えばファヒータスパイス混合物）５）乾燥レシピ衣用生地／コーティング（調理（例えば油で揚げる、グリルする、焼く）のために使用される）が挙げられる。
スープ：缶詰のスープ−即席または濃縮（水を加えるべき状態）の形態のあらゆる種類の缶詰のスープを含む。ブリックパックまたはレトルトパックに入れられた即席または濃縮スープも、超高温処理（ＵＨＴ）スープとして分類される。例としては、ミックスベジタブル、エンドウ、リーキ、魚、キノコ、トマト、チキンスープ、肉のスープ、ビーフスープ、チキンとキノコ、アイントプフなどが挙げられる。
乾燥スープ−水を加えてから、食べる前に数分間調理するための粉末状スープ。
即席スープ−食べる直前に熱湯を加えるための粉末状スープ。
チルドスープ：新鮮な食材から作製され、チルドケースに保存されるスープ。これらの製品は、通常、限られた保存期間を有する。
超高温処理（ＵＨＴ）スープ：常温で販売される（すなわちチルドケースに保存されない）即席または濃縮（水を加えるべき状態）の形態のあらゆる種類のスープを含む。製品タイプとしては、ミックスベジタブル、エンドウ、リーキ、魚、キノコ、トマト、チキンスープ、肉のスープ、ビーフスープ、チキンとキノコが挙げられる。
冷凍スープ：冷凍形態で販売されるあらゆる種類のスープを含む。製品タイプとしては、ミックスベジタブル、エンドウ、リーキ、魚、キノコ、トマト、チキンスープ、肉のスープ、ビーフスープ、チキンとキノコ、アイントプフなどが挙げられる。
【００８３】
さらなる応用分野としては、以下が挙げられる。
−マフィン、トルティーヤ、ワッフル、パンケーキ、ピザ、ペストリー、スポンジケーキなどの、ファインベーカリー製品（ｆｉｎｅ  ｂａｋｅｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、中間水分および高水分ファインベーカリー製品を含む焼いた食品、
−果実含有、野菜含有および乳製品含有飲料を含む飲料、
−ヨーグルト、サワークリーム、チーズ、カッテージチーズを含む乳製品、
−果実の調理品、ジャム、ゼリー、保存物、
−冷蔵および冷凍した調理済みの食事（肉／野菜／穀物を含む）、ディップ（野菜／乳製品／穀物を含む）、デリサラダおよび他の調理済みの副菜（肉／野菜／穀物を含む）。
【００８４】
一態様において、食品は、サルサ、バーベキュー（ＢＢＱ）ソースおよびランチドレッシングから選択される。一態様において、食品はサルサである。一態様において、食品はバーベキュー（ＢＢＱ）ソースである。一態様において、食品はランチドレッシングである。
【００８５】
本明細書において使用される際の「食品」という用語は、人間の食用および／または飼料用に適した物質を意味する。
【００８６】
好適には、本明細書において使用される際の「食品」という用語は、食べる準備ができた形態の食品を意味し得る。しかしながら、その代わりにまたはそれに加えて、本明細書において使用される際の食品という用語は、食品の調理に使用される１つ以上の食品材料を意味し得る。単なる例として、食品という用語は、生地から作られる焼いた食品ならびに前記焼いた食品の調理に使用される生地の両方を包含する。
【００８７】
別の態様において、本発明に係る食品は、動物飼料であり得る。好適には、動物飼料は、ペットフードであり得る。本発明に係る食品は、液体美味剤（ｐａｌａｔａｎｔ）および食味増強剤、乾燥食味増強剤、トリーツ（特にやや湿ったトリーツ）、粗引きの穀物（ｋｉｂｂｌｅ）および飼料から選択される動物飼料であり得る。
【００８８】
一態様において、好ましくは、食品は、以下のもの：即席の加工された食事、例えば即席のパスタ、即席のパスタソース、即席の肉、即席の野菜および即席の野菜ソース、デリサラダ、特にコールスロー、チキンサラダ、ポテトサラダなどの即席の「副」菜；ならびにビネグレットソース、ドレッシングおよびソース、特にバーベキューソース、トマトベースのソース、パスタソースおよびサラダドレッシングのうちの１つ以上から選択される。
【００８９】
好ましくは、本発明に係る食品は、水含有食品である。好適には、食品は、１０〜９９％の水、好適には１４〜９９％、好適には１８〜９９％の水、好適には２０〜９９％、好適には４０〜９９％、好適には５０〜９９％、好適には７０〜９９％、好適には７５〜９９％を含み得る。
【００９０】
抗菌性組成物は、典型的に、保護された食品を製造するために抗菌性組成物を食品成分と接触させることによって、食品中に組み込まれる。これは、食品の通常の製造中に行われ得る。さらなる態様において、抗菌性組成物は、組成物を食品の表面に噴霧するかあるいは組成物を成形物（ｃａｓｔｉｎｇ）またはコーティングまたは可食性フィルムに適用することによって、食品を浸漬または表面コーティングすることによって、食品に適用される。
【００９１】
さらなる態様において、組成物は、食品中に混合され得る。
【００９２】
一態様において、食品は、食品を基準にして３０，０００ｐｐｍ以下の量の組成物を含み得る。一態様において、食品は、食品を基準にして１５，０００ｐｐｍ以下の量の組成物を含み得る。一態様において、食品は、食品を基準にして１，０００ｐｐｍ以上の量の組成物を含み得る。一態様において、食品は、食品を基準にして２，５００ｐｐｍ以上の量の組成物を含み得る。例えば、食品または抗菌剤で保護される材料は、以下のものを含み得る。
・食品を基準にして２５，０００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして２０，０００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして１５，０００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして１０，０００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして７，５００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして５００ｐｐｍ以上の量の組成物、または
・食品を基準にして１，０００ｐｐｍ以上の量の組成物、または
・食品を基準にして２，０００ｐｐｍ以上の量の組成物、または
・食品を基準にして３，０００ｐｐｍ以上の量の組成物、または
・食品を基準にして５，０００ｐｐｍ以上の量の組成物、または
・食品を基準にして２，５００〜３０，０００ｐｐｍの量の組成物、または
・食品を基準にして５，０００〜２０，０００ｐｐｍの量の組成物、または
・食品を基準にして１，０００〜１５，０００ｐｐｍの量の組成物、または
・食品を基準にして５，０００〜１５，０００ｐｐｍの量の組成物、または
・食品を基準にして約１０，０００ｐｐｍの量の組成物、または
・食品を基準にして１５０ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして１００ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして５０ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして４０ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして３７．５ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２．５ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして５ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして１０ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして１５ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２０ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２５ｐｐｍ以上の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２０〜１５０ｐｐｍの量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２０〜１００ｐｐｍの量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２５〜５０ｐｐｍの量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２〜４０ｐｐｍの量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして２．５〜３７．５ｐｐｍの量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして約３５ｐｐｍの量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして１２，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして１０，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして５，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして２，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして１，５００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして１，３００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして１，２７５ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして１，２００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして２０ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして４０ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして６０ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして８０ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして８５ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして１００ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして２００ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして５００ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして１，０００ｐｐｍ以上の量の有機酸、または
・食品を基準にして２００〜１２，０００ｐｐｍの量の有機酸、または
・食品を基準にして５００〜１０，０００ｐｐｍの量の有機酸、または
・食品を基準にして１，０００〜５，０００ｐｐｍの量の有機酸、または
・食品を基準にして８０〜１，５００ｐｐｍの量の有機酸、または
・食品を基準にして８５〜１，２７５ｐｐｍの量の有機酸、または
・食品を基準にして約１，１５０ｐｐｍの量の有機酸、または
・食品を基準にして５，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして２，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして１，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして９００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして５０ｐｐｍ以上の量の酢酸、または
・食品を基準にして６０ｐｐｍ以上の量の酢酸、または
・食品を基準にして１００ｐｐｍ以上の量の酢酸、または
・食品を基準にして２００ｐｐｍ以上の量の酢酸、または
・食品を基準にして５００ｐｐｍ以上の量の酢酸、または
・食品を基準にして１００〜５，０００ｐｐｍの量の酢酸、または
・食品を基準にして２００〜２，０００ｐｐｍの量の酢酸、または
・食品を基準にして５００〜１，０００ｐｐｍの量の酢酸、または
・食品を基準にして６０〜１，０００ｐｐｍの量の酢酸、または
・食品を基準にして６０〜９００ｐｐｍの量の酢酸、または
・食品を基準にして約８００ｐｐｍの量の酢酸、または
・食品を基準にして５，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして１，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして７５０ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして５００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして４００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして３７５ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２０ｐｐｍ以上の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２５ｐｐｍ以上の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして５０ｐｐｍ以上の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして１００ｐｐｍ以上の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２００ｐｐｍ以上の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして３００ｐｐｍ以上の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして１００〜５，０００ｐｐｍの量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２００〜２，０００ｐｐｍの量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして３００〜１，０００ｐｐｍの量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２０〜４００ｐｐｍの量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして２５〜３７５の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして約３５０ｐｐｍの量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして３００ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）、または
・食品を基準にして２００ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）、または
・食品を基準にして１５０ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１０ｐｐｍ以上の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１５ｐｐｍ以上の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１００ｐｐｍ以上の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１２０ｐｐｍ以上の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１３０ｐｐｍ以上の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１００〜３００ｐｐｍの量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１０〜２００ｐｐｍの量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１５〜２００ｐｐｍの量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１２０〜２００ｐｐｍの量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして１３０〜１５０の量の緑茶抽出物（７５％のカテキンを含む場合）
・食品を基準にして約１３５ｐｐｍの量の緑茶抽出物。
【００９３】
一態様において、食品は、加工後、特に加熱後に、食品が、上記の量の組成物を含むような量の組成物を含み得る。食品の加工、特に加熱により、活性な保護剤組成物の量が減少され得ることが、当業者によって理解される。したがって、一態様において、食品に、任意に、その後の加工、特に加熱が行われる場合、食品は、食品を基準にして３０，０００ｐｐｍ以下の量の組成物を含み得る。食品に、任意に、その後の加工、特に加熱が行われる場合、例えば、食品または抗菌剤で保護される材料は、以下のものを含み得る。
・食品を基準にして２５，０００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして２０，５００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして１５，０００ｐｐｍ以下の量の組成物、または
・食品を基準にして１００ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして７５ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして６０ｐｐｍ以下の量のアリルイソチオシアネート、または
・食品を基準にして３６，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして３０，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして２４，０００ｐｐｍ以下の量の有機酸、または
・食品を基準にして２４，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして１８，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして１２，０００ｐｐｍ以下の量の酢酸、または
・食品を基準にして１８，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして１２，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして６，０００ｐｐｍ以下の量のプロピオン酸、または
・食品を基準にして６７５ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物、または
・食品を基準にして３７５ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物、または
・食品を基準にして３００ｐｐｍ以下の量の緑茶抽出物。
【００９４】
方法
本明細書に記載されるように、一態様において、本発明は、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための方法であって、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸、
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物の一方または両方と材料を接触させる工程を含む方法を提供する。
【００９５】
一態様において、本方法は、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸と材料を接触させる工程を含む。
【００９６】
一態様において、本方法は、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物と材料を接触させる工程を含む。
【００９７】
一態様において、本方法は、
（ａ）アリルイソチオシアネート；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物と材料を接触させる工程を含む。
【００９８】
一態様において、材料との接触は同時である。一態様において、材料との接触は連続である。
【００９９】
本明細書に記載されるように、一態様において、本発明は、材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるための、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物の一方または両方の使用を提供する。
【０１００】
一態様において、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸が；
材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるために使用される。
【０１０１】
一態様において、
（ａ）アリルイソチオシアネート；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物が；
材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるために使用される。
【０１０２】
一態様において、
（ａ）アリルイソチオシアネート；
（ｂ）酢酸、プロピオン酸およびそれらの混合物から選択される有機酸；および
（ｃ）緑茶［カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）］抽出物が；
材料中の微生物の増殖を防止および／または阻害し、および／または材料中の微生物を死滅させるために使用される。
【０１０３】
これより、本発明を、添付の図をあくまでも例として参照してさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】グラフである。
【図２】グラフである。
【図３】グラフである。
【図４】グラフである。
【図５】グラフである。
【図６】グラフである。
【図７】グラフである。
【図８】グラフである。
【０１０５】
これより、本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１０６】
試料材料
表１には、この研究に使用される様々な化合物およびそれらの組合せが列挙されている。これらの化合物を、商業的供給源から入手し、次に混合した。
【０１０７】
【表１】
2014500038.tif 000010
【０１０８】
細菌培養物の調製
抗菌活性の評価に使用される標的菌株は、グリセロール５０％（ｖ／ｖ）を含有する好適なブロス中で−８６℃に維持された、社内のＤａｎｉｓｃｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＣＳ）（Ｄａｎｉｓｃｏ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に収集された、様々な起源の分離株、例えば食品腐敗分離株、顧客、米国の菌株保存期間（例えばＤＳＭＺ、ＡＴＣＣ）によって提供される腐敗生物である。菌株を、グラム陰性の真菌の菌株であるように選択した。使用される全ての種は好気性であった。各実験の前に、保存培養物を、好適な培地および温度において２つの連続した増殖サイクルによって繁殖させた。一晩培養物を、生理食塩溶液中で希釈して、試験用培養物を得る。
【０１０９】
カビ胞子接種材料を以下のように準備した：約２ｍｌの滅菌した脱塩水を用いて、増殖した（ｏｕｔ−ｇｒｏｗｎ）カビから胞子を洗い流した（最少で５日齢のプレート）。この懸濁液を滅菌容器に移す。
【０１１０】
酵母およびカビの菌株を、２５℃で培養し、細菌分離株を、特定の菌株に好ましい条件に応じて好気条件下で３０℃で増殖させた（方法番号ＡＰ−００２）。
【０１１１】
【表２】
2014500038.tif 000011
【０１１２】
最小発育阻止濃度の決定
最小発育阻止濃度アッセイ（ＭＩＣ）は、自動化された評価システムのために開発された９６ウェルの液体ベースのアッセイであり、このアッセイを、実質的に（方法番号ＡＰ−００３）に記載されるように行う。指示菌株（表２）を、（化合物に応じて）幅広い濃度範囲を用いて、この場合、ｐＨ６．０（±０．２））で各試料の２／３倍希釈系列を実施することによって、推定上の抗菌物質およびそれらの組合せによる、増殖の阻害について試験する。１０倍に希釈した一晩培養物から、５μｌの各菌株を、１つのウェルに接種した。これは、１０３〜１０４個の細胞／ウェルのおよその接種密度に相当する。使用される培地は、酵母およびカビについてはＹＭ−ブロスであり、細菌分離株についてはＣＡＳＯ−ブロスであった。菌株を、菌株に応じて２４℃または３０℃で２４〜４８時間培養した。培養後の光学密度（Ｏ．Ｄ．）の増加を、増殖対照と比較して、物質が静菌効果を有するかどうかを推定し、ＭＩＣを決定した。ＭＩＣは、測定可能な増殖を阻害する抗菌剤の最小濃度と定義される。静菌効果は、ＯＤ６２０が、培養後の増殖対照の２０％以下であることとして定義される。
【０１１３】
値のより正確な推定を得るために、Ｅｘｃｅｌマクロを用いて、生データを処理した。マクロは、生データを走査し、Ｏ．Ｄ．２０％の閾値の両端にある２つの濃度を見出す。次に、マクロは、線形相関を用いて、Ｏ．Ｄ．が閾値にわたる実際の濃度を特定する。全てのデータが、各微生物のデュプリケートの平均値として示される。
【０１１４】
ＭＩＣアッセイを、９つの（９−ｈｏｔｅｌ）Ｃｙｔｏｈｏｔｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ）、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰ分注ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、３メートルのレール上のＯＲＣＡロボットアーム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、２つのＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｃｙｔｏｍａｔ  ６００１培養器（Ｔｈｅｒｍｏ）およびＣｙｔｏｍａｔ  ２Ｃ培養器（Ｔｈｅｒｍｏ）からなる完全に自動化された評価システムで行った。
【０１１５】
結果
最小発育阻止濃度の決定
試験菌株の増殖を、個々の化合物、カラシ精油（ＭＥＯ−Ｓ）、緑茶抽出物（ＧＴＥ）およびＯＡ−Ｆ、２成分系および３つ全ての組合せの存在下で調べた。表３〜６は、６つの酵母および３つのカビに対する、さらにはグラム陰性菌に対するＭＥＯ−Ｓ（Ａ）、ＯＡ−Ｆ（Ｂ）およびＧＴＥ（Ｃ）の考えられる組合せの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を含む。比較のため、表は、各成分単独および試験される菌株の全阻害を引き起こした組合せの濃度における（計算された）その存在についてのＭＩＣ（ｐｐｍ）データも含む。得られた全ての最小発育阻止濃度データは、各微生物のデュプリケートの平均値として示される。ＭＩＣ値が低くなるほど、静菌活性レベルは高くなる。以下の図１〜図３は、グラム陰性生物および酵母およびカビに対する提供される配合物中の個々の成分の著しい効力を示し、図１がＭＥＯ−Ｓを示し、図２がＧＴＥを示し、図３がＯＡ−Ｆの効果を示す。
【０１１６】
酵母およびカビに対するＭＥＯ−Ｓの最小発育阻止濃度（表３）は、３８〜３８０ｐｐｍであった。これらの知見は、アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、ＭＥＯ−Ｓの活性成分が、食品保存のための天然の抗真菌剤である可能性があり得ることを示唆している。カラシ精油では、細菌菌株に対する活性は、有効でないようであった。グラム陰性菌は、カラシ精油生成物によって一般に阻害されないかまたはやや阻害されるに過ぎない。０．１３ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの試験範囲内の場合、グラム陰性菌に対する最小発育阻止濃度は４．２ｍｇ／ｍＬであり、これは、このタイプの化合物の感覚刺激に関する（ｏｒｇａｎｏｌｅｐｔｉｃａｌ）影響を特に考慮すると一般に高い。
【０１１７】
指示菌株の増殖に対するＯＡ−Ｆの効果を、０．７８ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲で調べた。対照の増殖と比較した最終的な増殖のほんのわずかな差が、試験菌株のほとんどについて観察された。蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の増殖は、より高い濃度（１０．３ｍｇ／ｍＬ）の発酵物である程度阻害された。ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）が、最も感受性の酵母であった。この菌株では、３．２８ｍｇ／ｍＬのＭＩＣが見られた。
【０１１８】
緑茶抽出物の抗菌活性も、表３に示される。グラム陰性菌に対するＧＴＥの平均ＭＩＣは４．１３ｍｇ／ｍＬであり、これは、酵母菌株に対する平均発育阻止濃度（４．９ｍｇ／ｍＬ）よりわずかに低い。しかしながら、試験されるカビは、ＧＴＥに対して最も感受性であり、平均して０．７８ｍｇ／ｍＬで阻害された。
【０１１９】
微生物細胞の代謝の複雑性を考えると、原核生物（細菌）または真核生物（酵母および真菌）のいずれかにかかわらず、単一の物質が、全ての作用に影響を及ぼす可能性は極めて低い。上記の物質の組合せが、配合物に使用される場合、おそらく複数の作用機序のためにより効率的な細胞溶解が生じた。したがって、より広い範囲の阻害が見られるだけでなく、個々の微生物を防除するのに必要な濃度も低くなる。組合せ中の個々の化合物の発育阻止濃度の減少は、相乗作用を示す。ＭＥＯ、ＧＴＥおよびＯＡ−Ｆの相乗的組合せにより、個々の成分の効力が最大で１３６倍まで増加される。これは、例えば試験菌株カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）について、図２（参照のために表３も参照）に見ることができ、ここで、単独のＧＴＥが、精油および発酵物と組み合わせて、わずか４ｍｇ／ｍＬで酵母を阻害しており、わずか０．０２９ｍｇ／ｍＬの植物抽出物が、酵母を防除するのに必要とされる。調べられた全ての試験菌株を考慮すると、組合せ中のＧＴＥの抗菌活性は、単一の化合物に対して一般に５〜１３６倍高い。
【０１２０】
図３（参照のために表３も参照）に見られるように、ＯＡ−Ｆを考慮すると、個々の成分より最大で１１５倍高い効力が、アスペルギルス・パラジチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）について示されており、ここで、ＯＡ−Ｆは、３０ｍｇ／ｍＬの濃度でカビの増殖を十分に抑制することができなかった。対照的に、精油および植物抽出物と組み合わせて、わずか０．２６ｍｇ／ｍＬの発酵物が、カビを防除するのに必要である。
【０１２１】
ＧＴＥおよびＯＡ−Ｆと同様に、３種の化合物の組合せが、図１および表３にそれぞれ見られるように、個々の化合物より３〜２５倍低い発育阻止濃度によって、ＭＥＯについても相乗効果を生じた。
【０１２２】
提供される相乗的組合せ「ＦＰ１０００−Ｓ」についてのＭＩＣは、酵母およびカビ生物に対して０．５５ｍｇ／ｍＬ〜５．４ｍｇ／ｍＬの範囲であり、グラム陰性菌に対して５．８ｍｇ／ｍＬ〜＞１０ｍｇ／ｍＬの範囲であった（列「ＦＰ１０００−Ｓ」）、表３）。３成分系のＭＩＣと、考えられる２成分の組合せとを比較すると、「ＦＰ１０００−Ｓ」が、ＭＥＯおよびＯＡ−Ｆの組合せより１５％効果が高く（ＭＩＣ値の列「ＦＰ１０００−ＡＢ」）、表４）、ＭＥＯおよびＧＴＥの組合せより４０％効果が高く（ＭＩＣ値の列「ＦＰ１０００−ＡＣ」）、表５）、さらには、ＯＡ−ＦおよびＧＴＥの組合せより７０％効果が高い（ＭＩＣ値の列「ＦＰ１０００−ＢＣ」）、表６）ことが分かる。さらに、特に、グラム陰性試験菌株を考慮すると、発育阻止範囲は、「ＦＰ１０００−Ｓ」において、２成分の組合せにおけるより広い。例えば、「ＦＰ１０００−Ｓ」の５．４〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲では、実験の終了時に達した光学密度が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）についての対照値よりわずかに低かった。しかしながら、「ＦＰ１０００−ＡＢ」と「ＦＰ１０００−ＢＣ」との組合せは、これらの試験菌株の増殖を抑制しなかった。「ＦＰ−１０００−ＡＣ」は、より高い濃度でグラム陰性菌の増殖を抑制したが、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を阻害しなかった。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
結論
本発明の新規な配合物は、食品中に直接使用することが認められた成分、ＦＤＡによっ
てＧＲＡＳとみなされた成分または人間の接触および環境に安全であることが実証された成分のいずれかを含有する。
【０１２８】
カラシ精油、ＯＡ−Ｆおよび緑茶抽出物の３成分全てを含有する配合物が、それぞれ０．８６ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬおよび０．１２ｍｇ／ｍＬの平均最小発育阻止活性でグラム陰性菌および酵母およびカビを阻害するのに最も有効であった。さらに、記載される組合せの相乗的な性質により、個々の成分のより少ない用量が可能になる。
【０１２９】
組み合わせたカラシ精油およびＯＡ−Ｆは、３成分系より１５％低い効力を示す。カラシ精油および緑茶は、さらには、４０％効果が低く、ＯＡ−Ｆおよび緑茶は、平均して７０％効果が弱い。
【０１３０】
２成分ブレンドと比較して、３成分配合物のかなり低い最小発育阻止濃度に加えて、より広い発育阻止範囲も観察された。
【０１３１】
応用試験−バーベキューソース
この試験の目的は、殺菌されたバーベキューソース中の腐敗酵母およびカビに対する２つの濃度の本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）の効果を監視し、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００、従来技術の競合発酵物、およびソルビン酸カリウムと比較した上記製品の能力を評価することであった。
【０１３２】
カラシナに由来するアリルイソチオシアネート、緑茶に由来するカテキンおよびプロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する有機酸からなる本発明の抗真菌剤を、１％および０．５％の濃度で加え、バーベキューソース（ｐＨ３．８）を、それぞれ５００〜１０００ＣＦＵ／ｍｌの規定の接種率で、４つの酵母種のプールおよび４つのカビ種のプールに曝した。
【０１３３】
負荷試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｓｔｕｄｙ）の実験結果は、０．５％（ｗ／ｗ）の本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）が、試験菌株に対する殺菌作用を提供し、少なくとも１５週間の保存の間、ベンチマーク用のソルビン酸カリウムに匹敵したことを示した。
【０１３４】
それぞれ１．２５％および１％で用いられる競合の抗菌剤およびＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００は、防腐処理されていない（ｕｎｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）対照と比較してわずかな遅延が観察されたに過ぎないことから、適用される試験条件下で、試験されるバーベキューソースを酵母腐敗から納得がいくほど保護しなかった。２０℃で培養した場合、カビは、バーベキューソースとの好適な基質を見つけなかった。目に見えるカビの増殖は検出されなかった。
【０１３５】
結論として、この試験の結果は、ここで調べられた抗真菌剤配合物、本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）が、周囲温度（２０℃）で貯蔵した場合、バーベキューソース（ｐＨ＜４．０）中の接種された酵母（５００〜１０００ＣＦＵ／ｇ）プールの増殖を防除する能力を有していたことを示した。
【０１３６】
導入部
本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）は、カラシナに由来するアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）（三菱化学フーズ株式会社（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｆｏｏｄ，Ｉｎｃ．）製のワサオーロ（ＷａｓａＯＵＲＯ）Ｄの形態で）、緑茶カテキン（太陽化学株式会社（Ｔａｉｙｏ  Ｌｔｄ．）から入手した水で抽出される緑茶）およびプロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する有機酸（ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００の形態で）を含有する。
【０１３７】
ブレンドおよびその個々の成分は、インビトロおよびインサイチュで試験した場合、抗真菌および抗菌活性を証明した。バーベキューソースなどの料理用製品における本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）の潜在的な使用を実証するために、ソルビン酸カリウム、競合製品、およびＤａｎｉｓｃｏの抗菌剤製品ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００（表７）をベンチマークとして、腐敗酵母およびカビに対する様々な用量の機能性ブレンドでの新規に開発されたブレンドのインサイチュでの効果を監視することを目的として、負荷試験を行った。
【０１３８】
バーベキューソースを、９０日間の予測保存期間を有する料理用製品の代表として選択した。
【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
実験
実験用ブレンドを含む場合および含まない場合のバーベキューソースの試料（表９中の処方）を、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｃｕｌｉｎａｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｒａｂｒａｎｄ）において製造した。一般的に使用されるレベルでのソルビン酸カリウム；競合製品およびＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００をベンチマークとして、提供されたレベルでの概念上の抗真菌剤の抗真菌有効性についての実現可能性を実証する目的で変数を設計した。
【０１４１】
各バッチを、９０グラムのプローブに分割し（スキーム表８）、滅菌した瓶に入れた。各バッチの４２のプローブに所望のレベルの酵母を、各バッチの５つのプローブにカビ胞子を、それぞれ５００〜１０００ＣＦＵ／ｇの目標とする接種率で接種した。
【０１４２】
接種の１０分以内に粘性生成物を完全に混合して（２分間）、接種材料が確実に生成物全体にわたって均一に分配されるようにした。１つの試料を接種されないままにし、陰性対照として用いて、天然の汚染フローラ（ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｌｏｒａ）を監視した。全ての試料を周囲温度（２０℃）で培養し、酵母について検定し、それぞれ、損傷が確認されるまで（≧１．０Ｅ＋０６ＣＦＵ／ｇ）または目に見えるカビの増殖が確認されるまで適切な酵母培地で平板培養した。並行して、乳酸菌の増殖および総細胞数を、全てのバッチ中のＭＲＳおよびＰＣＡおよび接種されていないブラインドのそれぞれについて監視した。
【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
実験配合物：バーベキューソース
この試験で調べられるバーベキューソースを、以下の変数を用いた標準的なレシピにし
たがって製造した：
【０１４５】
【表９】
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【０１４６】
手順
乾燥した成分および抗菌剤＊を混合する。
乾燥した混合物をゆっくりと水に加え、５〜８分間せん断にかけ、数分間水和させる。
（トマトベースの）成分の残りを加える。
３００ＲＰＭで混合しながら９０℃まで加熱し、５〜７分間保持する。
最後に２５℃まで冷却してから、充填する（ｆｉｌｌ）。
＊抗菌剤を水５０ｍｌに溶解させ、クエン酸を用いてｐＨを４に調整する。
【０１４７】
細菌培養物の調製
この負荷試験で調べた酵母およびカビの菌株は、表１０に示される。Ｄａｎｉｓｃｏ’ｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＣＳ）（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能な合計８つの菌株を、それぞれのバーベキューソース中の１つの酵母および１つのカビのプールとして用いた。最初に、それらを、例えば腐敗したケチャップ、マヨネーズ、サルサドレッシングから単離するかまたはＤＭＳＺなどの公的な微生物株保存機関から入手した。
【０１４８】
【表１０】
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【０１４９】
各実験の前に、グリセロール５０％（ｖ／ｖ）を含有する好適なブロス中で−８６℃に維持された、各酵母の保存培養物を、ｐＨ６．０±０．２および温度（２５℃）で、好適な培地（ＹＧＣ−寒天（ＶＷＲ）ｐＨ５．１＋０．２；ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ）中で２つの連続した増殖サイクルによって繁殖させた。一晩培養物を、生理食塩溶液中で希釈して、試験用培養物を得る。等しい細胞数の各培養物を滅菌した容器に加え、適切に混合することによって、酵母の混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を生成した。酵母の混合物を希釈し、最終的な所望の濃度を得るために生成物中に接種した。合計菌数（ｐｏｏｌ  ｃｏｕｎｔ）を、生菌数（ｐｌａｔｅ  ｃｏｕｎｔ）によって確認した。
【０１５０】
カビ胞子を以下のように準備した：約２ｍｌの滅菌した脱塩水を用いて、増殖したカビ品種から胞子を洗い流した（最少で５日齢のプレート）。この懸濁液を滅菌容器に移す。合計菌数を、生菌数によって確認した。
【０１５１】
試料の分析
バーベキューソースを、時間ゼロ、２日、５日、１２日の時点で、１０週（６８日）まで毎週（ｗｅｅｋｌｙ）、その後、１９週（１３１日）まで隔週で（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）検定した。ＣＦＵ／ｇを、酵母が接種された各バッチから３つの試料について検出した。各試料採取（密閉瓶）の前に、試料を十分に混合した。１０グラムの試料を、各瓶から無菌で抜き取り、ペプトン水で希釈した。各試料を消化し（１分間、通常の設定）、ＹＧＣ寒天（ＶＷＲ）およびＭＲＳ（ＶＷＲ）上で２通り平板培養し、それぞれ２５℃で５日間および３７℃で３日間培養した。
【０１５２】
カビが接種された各バッチからの５つの試料を、カビの増殖について視覚的に分析した。
【０１５３】
接種されていない試料材料のｐＨ測定を、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＳｅｖｅｎＥａｓｙ  ｐＨ計を用いて試料採取日ごとに行った。
【０１５４】
結果および説明
試料の分析
図４および表１１中の対応するデータは、約５００ＣＦＵ／ｍｌで接種された酵母プールの増殖に対する、防腐処理されていない対照と比較した様々な抗菌剤の影響を示す。図から分かるように、接種された酵母は、対照（図４中の赤色のグラフ）中の周囲温度（２０℃）での培養の１２日後に増殖を開始した。したがって、４９日後に９．２Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｇのＹＧＣ寒天における細胞数で定常増殖に達した。バッチＦ、１．２５％の競合製品は、対照の増殖曲線であり、保護されていないバッチと比較してほんのわずかに少ない細胞数が１９日後に見られた。５．４Ｅ＋０５ＣＦＵ／ｇの細胞数で４週間（２６日）後に定常増殖に達した。ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ  ２００、バッチＣは、最大で１２日まで細胞数を接種レベルに維持することができた。しかしながら、次の試料採取の時点で、保護されていない対照および競合製品によるバッチと同じ高い酵母数が測定された。
【０１５５】
他方、初期充填量（ｉｎｉｔｉａｌ  ｌｏａｄ）を検出限界（３ｌｏｇ  ｋｉｌｌ（３対数死滅））未満に減少させることによって、１％および０．５％の抗真菌剤、本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）（図４中の緑色および紫色のグラフ）およびソルビン酸カリウム（図４中のオレンジ色のグラフ）を含むバーベキュー試料において殺菌効果が見られた。０．５％で投与された抗真菌剤は、少なくとも１０４日までソルビン酸カリウムに匹敵することができた。加えられた酵母の増殖が、１１７日目の試料採取日に開始するのが観察された。最後の試料採取日（１３１日目）に、生菌数も、ソルビン酸カリウム試料において測定した。それにもかかわらず、９０日の保存期間を目標としており、これは、０．５％の本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）を用いた場合に達成することができた。興味深いことに、１％の本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）の投与率は、開始時に観察される３Ｌｏｇの減少にかかわらず、酵母の増殖を防除することができなかった。１９日で既に、３．６Ｅ＋０３ＣＦＵ／ｍｌを測定した。細胞数は、６週間で、最大で５．０Ｅ＋０５ＣＦＵ／ｍｌまで増加した。
【０１５６】
【表１１】
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【０１５７】
酵母の増殖に加えて、カビの増殖も監視した。したがって、異なる試料（ｓａｍｐｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ）につき５つの管を試験した。接種されたカビ胞子は、保護されていない試料でさえ、周囲温度で目に見える増殖を示さなかった。
【０１５８】
さらに、乳酸菌による腐敗も、関心の対象であった。しかしながら、バッチのいずれにおいても、１３１日の試験期間にわたって培養可能な細胞が見られなかった。
【０１５９】
上述されるように、より少ない用量の本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）を用いたバッチにおいてより優れた保護が見られ、これはいくらか予想外であった。この増殖挙動を説明し、新規に開発された抗真菌剤を含有する２つのバッチの混合の可能性を除外するために、本発明者らは、分析方法（ＧＣ／ＭＳ；Ａ２７２９）によって２つの異なるバーベキューソースバッチの有機酸含量を調べた。表１２は、有機酸含量の測定の結果を含む。
【０１６０】
プロピオン酸は、この試験の重要なマーカーである。バッチＢ（１％のＹＭ  １０）およびＣ（０．５％のＹＭ  １０）中に抗菌剤とともに加えられるプロピオン酸の濃度を考慮すると、予測される濃度は、約３００および１５０ｐｐｍであろう。見られる濃度は、順位（ｒａｎｋｉｎｇ）の点で予測された濃度とよく適合する。その結果として、本発明者らは、２つのバッチが混合された可能性を除外する。
【０１６１】
【表１２】
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【０１６２】
ｐＨは、非常に重要なパラメータおよび細菌増殖の障害であり、例えばｐＨの増加により、異なる抗菌フローラ（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｌｏｒａ）が生成され得るが、その理由は障害としてのｐＨ−レベルが減少されるためである。異なるバッチ中のｐＨの差を避けるために、クエン酸を用いてｐＨを調整した。バーベキューソースの配合にしたがい、予測されるｐＨは、約ｐＨ３．８であるとされていた。
【０１６３】
全てのバッチ中のｐＨは、防除されていない試料を除いて、試験期間にわたって安定したままであったことが示された。これは、（上述されるように）生存乳酸が見出されなかったことも裏付ける。ｐＨのわずかな増加が、対照バッチにおいて測定された。
【０１６４】
【表１３】
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【０１６５】
結論
結論として、この試験の結果は、ここで調べられた抗真菌剤配合物、本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）が、周囲温度（２０℃）で貯蔵した場合、バーベキューソース（ｐＨ＜４．０）中の接種された酵母（５００〜１０００ＣＦＵ／ｇ）プールの増殖を防除し得ることを示す。１％および０．５％の用量の抗真菌剤、本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）、また、ソルビン酸カリウムも、接種された細胞負荷の初期の３ｌｏｇの減少を生じさせた。０．５％で投与された抗真菌剤は、少なくとも１０４日（１５週）までソルビン酸カリウムに匹敵することができた。加えられた酵母の増殖が、１１７日目の試料採取日（１７週）に開始するのが観察された。最後の試料採取日（１３１日目）に、生菌数も、ソルビン酸カリウム試料において測定した。
【０１６６】
それぞれ１．２５％および１％で用いられる競合製品およびＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００は、防腐処理されていない対照と比較してわずかな遅延が観察されたに過ぎない場合、適用される試験条件下で、試験されるバーベキューソースを酵母腐敗から納得がいくほど保護しなかった。
【０１６７】
調べられたカビは、選択された食品モデルとの好適な基質を見つけなかった。目に見えるカビの増殖を検出できなかった。さらに、乳酸菌の増殖を、これらの腐敗生物が関心の対象であったため、試験期間にわたって監視した。しかしながら、全てのバッチにおいて、１３１日の試験期間にわたって培養可能な細胞が見られなかった。これは、ｐＨの実質的な変化が記録されなかったことと深く関係し得る。
【０１６８】
この負荷試験により、本発明者らは、提供される組合せ（ＹＭ  １０）が、添加の際に直ぐに有効な抗真菌効果を示し、周囲温度における少なくとも１７週間の保存にわたって調べられる製品（バーベキューソース）中の標的とする酵母の増殖を防除したことを確認した。したがって、この試験は、新規な抗真菌剤製品としての本発明の抗真菌剤（ＹＭ１０）の販売促進を支持するものである。
【０１６９】
応用試験−（フレッシュ）サルサ
この試験の目的は、殺菌されていないサルサソースモデル中の腐敗酵母およびカビに対する２つの形態の新規な抗真菌剤ブレンドＦＰ  １０００の効果を監視し、それによって、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００およびソルビン酸カリウムと比較した上記製品の能力を評価することであった。
【０１７０】
異なる比率におけるカラシナに由来するアリルイソチオシアネート、緑茶に由来するカテキンおよびプロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する有機酸からなるＦＰ  １０００−Ｄ１およびＦＰ  １０００−Ｄ２を、１％の濃度で加え、フレッシュサルサ（ｐＨ４．２）を、５００ＣＦＵ／ｍｌの２つの規定された各接種率で、４つの酵母種のプールおよび４つのカビ種のプールのそれぞれに曝した。
【０１７１】
負荷試験の実験結果は、１％（ｗ／ｗ）のＦＰ  １０００−Ｄ１およびＦＰ  １０００−Ｄ２が、試験菌株に対する殺菌効果を与え、ベンチマーク用のソルビン酸カリウムをわずかながら上回ったことを示した。１％で用いられる商業用抗菌剤ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００は、最高の酵母細胞数がこのバッチにおいて見られたことから、適用される試験条件下で、試験されるサルサソースを酵母腐敗から納得がいくほど保護しなかった。
【０１７２】
非処理の試料（対照バッチ）中の生存酵母細胞の数は、増殖が予想外に遅く（４２日目）に開始したものの、９２日の負荷試験の間に１．２Ｅ＋０５ＣＦＵ／ｇまで増加した。ＧＣ／ＭＳによって試験の終了時に測定した際に、全てのバッチのうちで最高の酢酸濃度が、対照において見られた。
【０１７３】
４℃で培養した場合、カビは、サルサソースとの好適な基質を見つけなかった。目に見えるカビの増殖は検出されなかった。
【０１７４】
抗菌の観点から、本発明者らの結果に基づいて、両方の形態が同様に機能したため、配合物のいずれか１つを区別することはできなかった。抗真菌剤製品ＦＰ  １０００−Ｄ１が、より低い濃度の活性成分アリルイソチオシアネートおよび緑茶カテキンを有し、したがって官能上の影響がより低いと考えられるため、好ましいであろう。
【０１７５】
導入部
カラシナに由来するアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）（三菱化学フーズ株式会社（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｆｏｏｄ，Ｉｎｃ．）製のワサオーロ（ＷａｓａＯＵＲＯ）Ｄの形態で）、緑茶カテキン（太陽化学株式会社（Ｔａｉｙｏ  Ｌｔｄ）から入手した水で抽出される緑茶）およびプロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する有機酸（ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００の形態で）を含有するＦＰ  １０００が、新規なブレンドである。
【０１７６】
ブレンドおよびその個々の成分は、インビトロおよびインサイチュで試験した場合、抗真菌および抗菌活性を証明した。サルサソースなどの料理用製品におけるＦＰ  １０００の潜在的な使用を実証するために、ソルビン酸カリウムおよびＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００（表１４）をベンチマークとして、腐敗酵母およびカビに対する様々な用量の活性成分（ＦＰ  １０００−Ｄ１およびＦＰ  １０００−Ｄ２）での新規に開発されたブレンドのインサイチュでの効果を監視することを目的として、負荷試験を行った。
【０１７７】
本明細書において「フレッシュサルサソース」と呼ばれる殺菌されていないサルサソースを、３０日間の予測保存期間を有する料理用製品の代表として選択した。比較的短い予測保存期間は、加工中に加熱工程がないことによるものであった。
【０１７８】
【表１４】
2014500038.tif 000023
【０１７９】
実験
実験用ブレンドを含む場合および含まない場合のサルサソースの試料（表１７中の処方）を製造した。一般的に使用されるレベルでのソルビン酸カリウムおよびＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００をベンチマークとして、提供されたレベルでの概念上の抗真菌剤の抗真菌有効性についての実現可能性を実証する目的で変数を設計した。サルサソースを殺菌しなかったことに言及する必要がある。
【０１８０】
各バッチを、９０グラムのプローブに分割し（スキーム表１５）、滅菌した瓶に入れた。各バッチの２１のプローブに所望のレベルの酵母を、各バッチの５つのプローブにカビ胞子を、それぞれ３００〜８００ＣＦＵ／ｇの目標とする接種率で接種した。
【０１８１】
接種の１０分以内に粘性生成物を完全に混合して（２分間）、接種材料が確実に生成物全体にわたって均一に分配されるようにした。１つの試料を接種されないままにし、陰性対照として用いて、天然の汚染フローラを監視した。全ての試料を冷却温度（４℃）で暗所で培養し、酵母について検定し、それぞれ、損傷が確認されるまで（≧１．０Ｅ＋０６ＣＦＵ／ｇ）または目に見えるカビの増殖が確認されるまで適切な酵母培地で平板培養した。並行して、乳酸菌の増殖および総細胞数を、全てのバッチ中のＭＲＳおよびＰＣＡおよび接種されていないブラインドのそれぞれについて監視した。
【０１８２】
【表１５】
2014500038.tif 000024
【０１８３】
細菌培養物の調製
この負荷試験で調べた酵母およびカビの菌株は、表１６に示される。Ｄａｎｉｓｃｏ’ｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＣＳ）（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能な合計８つの菌株を、それぞれのサルサソース中の１つの酵母および１つのカビのプールとして用いた。最初に、それらを、例えば腐敗したケチャップ、マヨネーズ、サルサドレッシングから単離するかまたはＤＭＳＺなどの公的な微生物株保存機関から入手した。
【０１８４】
【表１６】
2014500038.tif 000025
【０１８５】
各実験の前に、グリセロール５０％（ｖ／ｖ）を含有する好適なブロス中で−８６℃に維持された、各酵母の保存培養物を、ｐＨ６．０±０．２および温度（２５℃）で、好適な培地（ＹＧＣ−寒天（ＶＷＲ）ｐＨ５．１＋０．２；ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）中で２つの連続した増殖サイクルによって繁殖させた。一晩培養物を、生理食塩溶液中で希釈して、試験用培養物を得る。等しい細胞数の各培養物を滅菌した容器に加え、適切に混合することによって、酵母の混合物を生成した。酵母の混合物を希釈し、最終的な所望の濃度を得るために生成物中に接種した。合計菌数を、生菌数によって確認した。
【０１８６】
カビ胞子を以下のように準備した：約２ｍｌの滅菌した脱塩水を用いて、増殖したカビ品種から胞子を洗い流した（最少で５日齢のプレート）。この懸濁液を滅菌容器に移す。合計菌数を、生菌数によって確認した。
【０１８７】
実験配合物：サルサソース
この試験で調べられるサルサソースを、以下の変数を用いた標準的なレシピにしたがって製造した：
【０１８８】
【表１７】
2014500038.tif 000026
【０１８９】
手順
乾燥した成分および抗菌剤を混合する。
乾燥した混合物をゆっくりと水に加え、数分間水和させる。
(トマトベースの)成分の残りを加える。
処理の間、均質にする。
【０１９０】
試料の分析
サルサソースを、時間ゼロ、３日、７日、１４日の時点で検定し、その後、９２日まで隔週で平板培養した。ＣＦＵ／ｇを、酵母が接種された各バッチから３つの試料について検出した。各試料採取（密閉瓶）の前に、試料を十分に混合した。１０グラムの試料を、各瓶から無菌で抜き取り、ペプトン水で希釈した。各試料を消化し（１分間、通常の設定）、ＹＧＣ寒天（ＶＷＲ）およびＭＲＳ（ＶＷＲ）上で２通り平板培養し、それぞれ２５℃で５日間および３７℃で３日間培養した。
【０１９１】
カビが接種された各バッチからの５つの試料を、カビの増殖について視覚的に分析した。
【０１９２】
未処理の接種されていない試料では、ＰＣ−寒天およびＭＲＳ−寒天（ＶＷＲ）上に平板培養することによって、総細胞計数を行った。
【０１９３】
接種されていない試料材料のｐＨ測定を、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＳｅｖｅｎＥａｓｙ  ｐＨ計を用いて試料採取日ごとに行った。
【０１９４】
結果および説明
試料の分析
図５および表１８中の対応するデータは、防腐処理されていない対照と比較して約５００ＣＦＵ／ｍｌで接種された酵母プールの増殖に対する異なる抗菌剤の影響を示す。図から分かるように、接種された酵母は、対照（図５中の青色のグラフ）中の冷却温度（４℃）での４２日の培養の後に初めて増殖した。特に、１％（ｗ／ｗ）のＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００を含有するバッチ（この場合、酵母が１週間後に既に増殖を開始した（４２日後に定常計数に達する））と比較した場合の、防腐処理されていないサルサ試料中の標的とする指示菌株の遅い増殖は予想外であった。９２日後の試験の終了時でさえ、防腐処理されていないバッチ中の酵母数は、ＹＧＣ寒天上の酵母細胞数が２．０Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｇまで達した１％のＭｉｒｃｏＧＡＲＤ（登録商標）２００の添加と比較して約２ｌｏｇ低かった。
【０１９５】
他方、１％の実験用ブレンドＦＰ  １０００−Ｄ１およびＦＰ  １０００−Ｄ２（図５中の桃色および黄色のグラフ）は、殺菌効果を示したため、ソルビン酸カリウム（図７中の紫色のグラフ）と比較しても最良に機能した。しかしながら、細胞数の差がそれほど大きくなかったため、結果に基づく２つのブレンドの区別ができなかった。
【０１９６】
サルサソースの製造中に殺菌工程がないことにより、乳酸菌が、関心の対象であった。しかしながら、図６および表１９中の対応するデータは、乳酸菌が、自然に存在するものの、高い細胞数に達しなかったことを示す。図から分かるように、ソルビン酸カリウム（図６中の紫色のグラフ）を含有するバッチを除いて、ＭＲＳ−寒天上の細菌数は、３日の培養後に約１Ｌｏｇ増加した。しかしながら、培養が長くなるほど、全ての試料において細胞数が減少した。ＦＰ  １０００−Ｄ１およびＦＰ  １０００−Ｄ２（図６中の桃色および黄色のグラフ）を含有するバッチ中の細胞数は、これによって、対照（図６中の青色のグラフ）と比較して速く減少した。ソルビン酸カリウムは、いずれの他の処理と比較しても乳酸菌の増殖をより良好に防除するようであった。４２日後にＭＲＳ−寒天上にさらなるコロニーが検出されなかった。しかしながら、細菌増殖の勾配は、ＦＰ  １０００試料と同等であった。
【０１９７】
【表１８】
2014500038.tif 000027
【０１９８】
【表１９】
2014500038.tif 000028
【０１９９】
酵母の増殖に加えて、カビの増殖も監視した。したがって、異なる試料につき５つの管を試験した。接種されたカビ胞子は、保護されていない試料でさえ、４℃で目に見える増殖を示さなかった。しかしながら、保存期間の終了まで、いずれの防腐系も用いない酵母を接種された試料においてカビが見られた（生菌数）。他方、１％の３成分の実験用ブレンドが、１２週間にわたってカビの増殖を防除することができた。これは、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００およびソルビン酸カリウムの適用についても見られた。
【０２００】
対照バッチ中の標的生物の遅い増殖を説明するために、本発明者らは、分析方法（ＧＣ／ＭＳ；Ａ２７２９）によって５つの異なるサルサソースバッチの有機酸含量を調べた。表２０は、有機酸含量の測定の結果を含む。
【０２０１】
プロピオン酸は、この試験の重要なマーカーであった。バッチＢ、ＣおよびＤに抗菌剤とともに加えられるプロピオン酸濃度を考慮すると、予測される濃度は、０．０３６％、０．０３５％および０．０３９％であろう。見られる濃度は、加えられたものよりわずかに低いが、順位の点で予測された濃度とよく適合する。より正確には、０．０３％、０．０２８％および０．０３２％のプロピオン酸が、バッチＢ、ＣおよびＤにおいて見られた。
【０２０２】
サルサソース（表１５中の配合にしたがう）中の酢酸の初期濃度は、ソルビン酸カリウムを含有する試料（バッチＥ）（さらなる酢酸が加えられない；腐敗なし）において見られたように、約０．１３％（ｗ／ｗ）であることができた。
【０２０３】
防腐処理されていない対照は、いくらか意外なことに、最高濃度の酢酸を有していた。酢酸含量は、０．５２％で、バッチＥよりおよそ３倍高く、バッチＢ、ＣおよびＤの２倍程度であり、用いられる抗菌剤とともに、バッチＡおよびＥと比較して、０．０６４〜０．０８％多い酢酸を加えた。これらの高いレベルの酢酸は、細菌発酵、所与の環境条件、低いｐＨ、冷却温度、基質利用性に起因する可能性が比較的低い。しかしながら、乳酸菌が乳酸と一緒に酢酸も生成するため、細菌が、ある程度まで寄与していた可能性がある。グラム陰性菌のアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）を形成する酢酸が、使用されるハーブおよび香辛料から汚染され、グルコースを酢酸に代謝していた可能性がある。
【０２０４】
サルサソース中の低いｐＨ（４．２）および冷却保存条件は、対照における遅い増殖の理由であり得る。標的酵母のピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）およびジゴサッカロマイセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）が、増殖を開始すると、高い酢酸濃度が見られる原因になり得る。酢酸が試験の開始時に試料中にあった場合、より高い酢酸および乳酸濃度の両方が、この試料（バッチＡ）中の遅い増殖を説明し得る別の場合があり得る。
【０２０５】
【表２０】
2014500038.tif 000029
【０２０６】
さらに、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００を含有するバッチに由来する支配的なコロニーを単離し、ＶＩＴＥＫおよび１８Ｓシークエンシングによって同定したことは言及するに値する。野生酵母が試料中で増殖したかどうかまたはそれが標的とする生物の１つであったかどうかを示すためにこれを行った。
【０２０７】
興味深いことに、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００バッチにおいて単離された酵母が、サッカロマイセス・セレバジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ）として同定され、これは、プールとともに加えなかった。対照バッチにおいて支配的な酵母を追跡したところ、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）であった。これは、ＤＣＳ  １１７５菌株に加えられる可能性が高い。汚染物質酵母がどの時点で生じたかは不明である。汚染物質酵母、サッカロマイセス・セレバジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ）を、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００、アリルイソチオシアネート、およびＦＰ１０００の変形のＦＰ  １０００−Ｄ１に対する感受性について、最小発育阻止濃度（データは示されていない）の測定によって、インビトロで試験した。結果は、１％（ｗ／ｖ）におけるＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００に対する酵母の耐性およびアリルイソチオシアネート０．０１％および１％（ｗ／ｖ）におけるＦＰ  １０００−Ｄ１のそれぞれに対する感受性を確認した。したがって、全てのバッチ中に最終的に存在するが、サッカロマイセス・セレバジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ）は、防腐処理されたバッチ中で抑制されたが、バッチＤ中で増殖することができた。防腐処理されていないバッチＡ中の高い酢酸濃度および競合酵母フローラが、それらの試料中の汚染物質の抑制を生じさせた。
【０２０８】
これらの知見をまとめると、バッチＤ中の高い細胞酵母数およびより早い増殖が、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００に耐性のある汚染物質に関連しており、したがって、対照バッチＡと直接比較されるべきではない。
【０２０９】
サルサソースの配合の後、予測されるｐＨは、ｐＨ４．１であるとされていた。しかしながら、対照のｐＨが図７に見られるようにわずかにより高いｐＨ４．２３であったことが示された。実験用ブレンドおよび発酵物ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００の適用によって、ｐＨがそれぞれｐＨ４．４４（４．５１）および４．５０（表２１）に増加したことが実証された。この観察はより早くなされ、発酵物の製造によっておよび概念上のブレンドの組成によって説明される。いくらか意外なことは、０．１％のソルビン酸カリウムの添加のｐＨの影響であった。これはまた、ｐＨ４．３２へのｐＨの増加をもたらした。
【０２１０】
ｐＨは、非常に重要なパラメータおよび細菌増殖の障害であり、例えばｐＨの増加により、異なる抗菌フローラが生成され得るが、その理由は障害としてのｐＨ−レベルが減少されるためである。しかしながら、抗菌活性にも影響し得るさらなる酸を生じさせないために、バッチ中のｐＨを調整せず、むしろ、総細胞数の決定および好適な増殖培地における乳酸菌の計数のいずれかによって微生物学的影響を監視することが決定された。全てのバッチ中のｐＨが同じ傾向に沿っており、試験期間にわたってわずかに減少したことが示された。
【０２１１】
【表２１】
2014500038.tif 000030
【０２１２】
結論
結論として、この試験の結果は、ここで調べられたＦＰ１０００配合物（ＦＰ１０００−Ｄ１およびＦＰ１０００−Ｄ２）が、４℃で貯蔵した場合、殺菌されていないサルサソース（ｐＨ＜４．２）中の接種された酵母（３００〜８００ＣＦＵ／ｇ）およびカビ（３００〜８００ＣＦＵ／ｇ）プールの増殖を防除する能力を有していたことを示した。非処理の試料中の生存酵母細胞の数が、９２日の負荷試験の間に１．２Ｅ＋０５ＣＦＵ／ｇに増加したが、増殖は予想外に遅く（４２日目）開始した。このバッチは、全てのバッチのうちで最高の酢酸濃度を含んでいた。１％のＦＰ  １０００−Ｄ１およびＦＰ  １０００−Ｄ２が、試験菌株に対する殺菌効果を示し、ベンチマーク用のソルビン酸カリウムをわずかながら上回ったことが明らかであった。１％で用いられる商業用抗菌剤ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００は、最高の酵母細胞数がこのバッチにおいて見られたことから、適用される試験条件下で、試験されるサルサソースを酵母腐敗から納得がいくほど保護しなかった。しかしながら、分離株は、サッカロマイセス・セレバジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ）として同定され、これは、接種された酵母プールの一部ではなく、インビトロで試験した場合、発酵物に対する耐性を示した。
【０２１３】
調べられたカビは、選択された食品モデルとの好適な基質を見つけなかった。目に見えるカビの増殖を検出できなかった。
【０２１４】
さらに、乳酸菌の増殖を、これらの腐敗生物が関心の対象であったため、試験期間にわたって監視した。初期の１Ｌｏｇの増加が観察されたが、細胞数は、試験期間にわたって安定したままであり、１．３Ｅ＋０４ＣＦＵ未満であった。
【０２１５】
全てのバッチ中のｐＨが同じ傾向に沿っており、試験期間にわたってわずかに減少したことが示される。腐敗細菌による酸性化は、この効果を部分的に説明し得るが、細胞数との相関が全ての試料において見られなかった。
【０２１６】
抗菌の観点から、本発明者らの結果に基づいて、両方の形態が同様に機能したため、配合物のいずれか１つを区別することはできなかった。
【０２１７】
応用試験−ランチドレッシング
この試験の目的は、通常のランチドレッシング中の腐敗酵母およびカビに対する新規に開発された抗真菌剤組成物「ＦＰ  １０００」の効果を監視し、それによって、ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００、およびソルビン酸カリウムと比較した２つの組成の製品の能力を評価することであった。２つの異なる比率における、カラシナに由来するアリルイソチオシアネート、緑茶に由来するカテキンおよびプロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する有機酸からなる「ＦＰ  １０００−Ｄ１」および「ＦＰ１０００−Ｄ２」を、１％（ｗ／ｗ）の濃度で加え、通常のランチドレッシング（ｐＨ４）を、それぞれ５００〜１０００ＣＦＵ／ｇの規定された接種率で、４つの酵母種のプールおよび４つのカビ種のプールに曝した。
【０２１８】
負荷試験の実験結果は、１％で適用される抗真菌剤配合物、「ＦＰ１０００  Ｄ１」および「ＦＰ１０００  Ｄ２」が、周囲温度（２０℃）で貯蔵した場合、通常のランチドレッシング中の接種された酵母プールの増殖を防除する能力を有していたことを示した。試験菌株に対する提供される殺菌効果（初期の２ｌｏｇの減少）は、少なくとも２９週間（１９８日）の保存にわたってベンチマーク用のソルビン酸カリウムに匹敵した。２０℃で培養した場合、カビは、ランチドレッシングとの好適な基質を見つけなかった。目に見えるカビの増殖は検出されなかった。
【０２１９】
導入部
カラシナに由来するアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）（三菱化学フーズ株式会社（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｆｏｏｄ，Ｉｎｃ．）製のワサオーロ（ＷａｓａＯＵＲＯ）Ｄの形態で）、緑茶カテキン（太陽化学株式会社（Ｔａｉｙｏ  Ｌｔｄ．）から入手した水で抽出される緑茶）およびプロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する有機酸（ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００の形態で）を含有する「ＦＰ  １０００」。
【０２２０】
ブレンドおよびその個々の成分は、インビトロおよびインサイチュで試験した場合、抗真菌および抗菌活性を証明した（上記を参照）。しかしながら、通常のランチドレッシングなどの料理用製品における「ＦＰ１０００」の潜在的な使用を評価するために、ソルビン酸カリウム、およびＤａｎｉｓｃｏの抗菌剤製品ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００（表２２）をベンチマークとして、腐敗酵母およびカビに対する様々な用量のブレンド成分での新規に開発されたブレンドのインサイチュでの効果を監視することを目的として、負荷試験を行った。
【０２２１】
通常のランチドレッシングを、周囲温度における９０〜１２０日の予測保存期間を有する料理用製品の代表として選択した。
【０２２２】
【表２２】
2014500038.tif 000031
【０２２３】
実験
実験用ブレンドを含む場合および含まない場合の通常のランチドレッシングの試料（表２４中の処方）を、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｃｕｌｉｎａｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｒａｂｒａｎｄ）において製造した。一般的に使用されるレベルでのソルビン酸カリウムおよびＭｉｃｒｏＧＡＲＤ（登録商標）２００をベンチマークとして、提供されたレベルでの概念上の抗真菌剤の抗真菌有効性についての実現可能性を実証する目的で変数を設計した。
【０２２４】
各バッチを、９０グラムのプローブに分割し（スキーム表２３）、滅菌した瓶に入れた。それぞれ５００〜１０００ＣＦＵ／ｇの目標とする接種率で、各バッチの３６のプローブに所望のレベルの酵母を接種し、各バッチの５つのプローブにカビ胞子を接種した。
【０２２５】
接種の１０分以内に粘性生成物を完全に混合して（２分間）、接種材料が確実に生成物全体にわたって均一に分配されるようにした。１つの試料を接種されないままにし、陰性対照として用いて、天然の汚染フローラを監視した。全ての試料を周囲温度（２０℃）で培養し、酵母について検定し、それぞれ、損傷が確認されるまで（≧１．０Ｅ＋０５ＣＦＵ／ｇ）または目に見えるカビの増殖が確認されるまで適切な酵母培地で平板培養した。並行して、乳酸菌の増殖および総細胞数を、全てのバッチ中のＭＲＳおよびＰＣＡおよび接種されていないブラインドのそれぞれについて監視した。
【０２２６】
【表２３】
2014500038.tif 000032
【０２２７】
実験配合物：ランチドレッシング
この試験で調べられるランチドレッシングを、以下の変数を用いた標準的なレシピにしたがって製造した：
【０２２８】
【表２４】
2014500038.tif 000033
【０２２９】
手順
砂糖およびキサンタンガムを乾式混合する。
それを水相に加え、親水コロイドを数分間水和させる。
卵黄を加える。
バターミルクパウダーを加える。
乾燥した成分の残り全て（塩、香辛料、ハーブ、抗菌剤（バッチＢ〜Ｅ）を加える。
高せん断下で油を乳化する。
酸性成分（酢およびレモン汁）を加える。
【０２３０】
細菌培養物の調製
この負荷試験で調べた酵母およびカビの菌株は、表４に示される。Ｄａｎｉｓｃｏの社内のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＣＳ）（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からの合計８つの菌株を、それぞれのランチドレッシング中の１つの酵母および１つのカビのプールとして用いた。最初に、それらを、例えば腐敗したケチャップ、マヨネーズ、サルサドレッシングから単離するかまたはＤＭＳＺなどの公的な微生物株保存機関から入手した。
【０２３１】
【表２５】
2014500038.tif 000034
【０２３２】
各実験の前に、グリセロール５０％（ｖ／ｖ）を含有する好適なブロス中で−８６℃に維持された、各酵母の保存培養物を、ｐＨ６．０±０．２および温度（２５℃）で、好適な培地（ＹＧＣ−寒天（ＶＷＲ）ｐＨ５．１＋０．２；ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ）中で２つの連続した増殖サイクルによって繁殖させた。一晩培養物を、生理食塩溶液中で希釈して、試験用培養物を得る。等しい細胞数の各培養物を滅菌した容器に加え、適切に混合することによって、酵母の混合物を生成した。酵母の混合物を希釈し、最終的な所望の濃度を得るために生成物中に接種した。合計菌数を、生菌数によって確認した。カビ胞子を以下のように準備した：約２ｍｌの滅菌した脱塩水を用いて、増殖したカビ品種から胞子を洗い流した（最少で５日齢のプレート）。この懸濁液を滅菌容器に移す。合計菌数を、生菌数によって確認した。
【０２３３】
試料の分析
ランチドレッシングを、時間ゼロ、３日、７日、１４日の時点で、その後、１３週（９０日）まで隔週で、２９週まで４〜６週間ごとに検定した。ＣＦＵ／ｇを、酵母が接種された各バッチから３つの試料について検出した。各試料採取（密閉瓶）の前に、試料を十分に混合した。１０グラムの試料を、各瓶から無菌で抜き取り、ペプトン水で希釈した。各試料を消化し（１分間、通常の設定）、ＹＧＣ寒天（ＶＷＲ）、ＰＣ寒天およびＭＲＳ寒天（ＶＷＲ）上で２通り平板培養し、それぞれ２５℃で５および７日間および３７℃で３日間培養した。
【０２３４】
カビが接種された各バッチからの５つの試料を、カビの増殖について視覚的に分析した。
【０２３５】
接種されていない試料材料のｐＨ測定を、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＳｅｖｅｎＥａｓｙ  ｐＨ計を用いて試料採取日ごとに行った。
【０２３６】
結果および説明
試料の分析
図８および表２６中の対応するデータは、約５００ＣＦＵ／ｍｌで接種された酵母プールの増殖に対する、防腐処理されていない対照と比較した様々な抗菌剤の影響を示す。図から分かるように、接種された酵母は、保存料を含まない対照（図８中の赤色のグラフ）中の周囲温度（２０℃）での培養の７日後に増殖を開始した。したがって、１４日後に１．９３Ｅ＋０４ＣＦＵ／ｇのＹＧＣ寒天における細胞数で定常増殖に達した。これは、規定のレベルの腐敗を約１Ｌｏｇ下回った。ＭｉｃｒｏＧＡＲＤ  ２００、バッチＤは、細胞数を最大６４日まで接種レベルに維持することができ、概して高い細胞数４．７Ｅ＋０３ＣＦＵ／ｇが検出された。しかしながら、バッチＤについてのＹＧＣ寒天上の細胞数が、この場合も、試料採取日の後、検出限界（１．０Ｅ＋０１ＣＦＵ／ｇ）を下回った。
【０２３７】
初期充填量を検出限界（２ｌｏｇ  ｋｉｌｌ（２対数死滅））未満に減少させることによって、殺菌効果が、「ＦＰ  １０００」の１％の２つの抗真菌剤組成物（図８中の深緑色および薄緑色のグラフ）を含むランチドレッシング試料ならびに０．１％のソルビン酸カリウム（図８の青色のグラフ）を含む試料において見られた。酵母のプールは、防腐処理されたバッチのいずれにおいても、１９８日の調査にわたって、初期の死滅率（ｋｉｌｌ）から回復することができなかった。
【０２３８】
【表２６】
2014500038.tif 000035
【０２３９】
酵母の増殖に加えて、カビの増殖も監視した。したがって、異なる試料につき５つの容器を試験した。表６中、試験管当たりの目に見える増殖を記録した。接種されたカビ胞子は、保護されていない試料でさえ、周囲温度で目に見える増殖を示さなかった。
【０２４０】
【表２７】
2014500038.tif 000036
【０２４１】
ｐＨは、非常に重要なパラメータおよび細菌増殖の障害であり、例えばｐＨの増加により、異なる抗菌フローラが生成され得るが、その理由は障害としてのｐＨ−レベルが減少されるためである。
【０２４２】
しかしながら、配合を変化させないようにｐＨを調整せず、むしろ、総細胞数の測定および好適な増殖培地における乳酸菌の計数によって効果を監視することが決定された。最も低いｐＨ（３．８４）が対照バッチについて見られたが、発酵物を含有する全ての試料が、４．１を超えるｐＨを有していた。ソルビン酸カリウムバッチのｐＨでさえ、対照バッチより４．０２高いｐＨを有していた。経時的なｐＨ発現が、表２８に見られる。全てのバッチ中のｐＨが同じ傾向に沿っており、保存時間にわたって約０．１ｐＨ単位減少することが示される。細胞数（総細胞数の計数についてのデータは示されていない）との相関は見られなかった。（乳酸のための選択的な培地についての細胞数は、試験期間全体にわたって検出限界未満であった）。したがって、腐敗細菌による酸性化は、この効果を説明しないようである。さらに、試料の異なる出発ｐＨが、負荷試験に対する直接の影響を与えないようであった。
【０２４３】
【表２８】
2014500038.tif 000037
【０２４４】
結論
結論として、この試験の結果は、ここで調べられた抗真菌剤配合物、「ＦＰ１０００  Ｄ１」および「ＦＰ１０００  Ｄ２」が、周囲温度（２０℃）で貯蔵した場合、通常のランチドレッシング（ｐＨ４．０）中の接種された酵母（５００〜１０００ＣＦＵ／ｇ）プールの増殖を防除する能力を有していたことを示した。
【０２４５】
活性成分である有機酸、アリルイソチオシアネート、およびカテキンの組成が異なる、１％の用量の抗真菌剤組成物が、接種された細胞充填量の初期の２ｌｏｇの減少を生じさせた。これは、１％のＭｉｃｒｏＧＡＲＤ  ２００および０．１％のソルビン酸カリウムについても当てはまる。
【０２４６】
酵母のプールは、防腐処理されたバッチのいずれにおいても、１９８日の調査にわたって、初期の死滅率から回復することができなかった。
【０２４７】
調べられたカビは、選択された食品モデルとの好適な基質を見つけなかった。目に見えるカビの増殖を検出できなかった。
【０２４８】
さらに、乳酸菌の増殖を、これらの腐敗生物が関心の対象であったため、試験期間にわたって監視した。しかしながら、全てのバッチにおいて、１９８日の試験期間にわたって培養可能な細胞が見られなかった。これは、ｐＨの実質的な変化が記録されなかったことと深く関係し得る。
【０２４９】
この負荷試験により、本発明者らは、「ＦＰ１０００  Ｄ１」および「ＦＰ１０００  Ｄ２」の提供される組合せが、添加の際に直ぐに有効な抗真菌効果を示し、周囲温度における少なくとも２９週間の保存にわたって調べられる製品（通常のランチドレッシング）中の標的とする酵母の増殖を防除したことを確認した。
【０２５０】
応用試験−ペットフード
この試験の目的は、ｐＨ３．０およびｐＨ４．０におけるペットフード美味剤中の酵母のプールおよびカビのプールに対する選択された実験用ブレンドの影響を評価することであった。実験用ブレンド「ＦＰ１０００」は、０．９５％の、カラシナに由来するアリルイソチオシアネート、７．５％の、緑茶に由来するカテキンおよび８〜１１％の、プロピオニバクテリア（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）発酵物に由来する全有機酸からなっていた。配合物を、０．３５％および０．７％（ｗ／ｗ）の濃度で応用モデルに加えた。
【０２５１】
負荷試験の実験結果は、ここで調べられた抗真菌剤配合物、「ＦＰ１０００」が、４２℃で貯蔵した場合、両方の試験されるｐＨレベルで通常の美味剤中の接種された酵母プールの増殖を防除する能力を有し、したがって、使用される産業用抗菌剤に匹敵することを示した。これは、カビの増殖にも当てはまり、カビの増殖は、保護されていない対照と比較してより高いｐＨの製品において「ＦＰ  １０００」によって抑制された。
【０２５２】
実験設備
いずれの防腐手段も用いないｐＨ３およびｐＨ４におけるペットフード美味剤の試料は、ＡＦＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって提供された。当業界に典型的に使用される保存料をベンチマークとして、提供されたレベルでの概念上の抗真菌剤の抗真菌有効性についての実現可能性を実証する目的で変数を設計した。一般的に使用される濃度のこの保存料を含有する美味剤（ｐＨ４）のバッチも、ＡＦＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって提供された。
【０２５３】
各バッチを２００ｍｌのプローブに分割し（スキーム表３０）、滅菌した瓶に入れた。それぞれ５００〜１０００ＣＦＵ／ｇの目標とする接種率で、各バッチのプローブに、所望のレベルの酵母を接種し、１０ｍｌの各バッチに、カビ胞子を接種した。
【０２５４】
接種の１０分以内に粘性生成物を完全に混合して（２分間）、接種材料が確実に生成物全体にわたって均一に分配されるようにした。全ての試料を４２℃で培養し、酵母の増殖について検定し、それぞれ６週間の保存期間になるまでまたは目に見えるカビの増殖が生じるまで、適切な培地上で平板培養した。試験期間は、ペットフード美味剤の提供される体積により制限された。
【０２５５】
【表２９】
2014500038.tif 000038
【０２５６】
細菌培養物の調製
この負荷試験で調べた酵母およびカビの菌株は、表３２に示される。Ｄａｎｉｓｃｏの社内のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＣＳ）（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からの合計８つの菌株を、それぞれのペットフード美味剤中の１つの酵母および１つのカビのプールとして用いた。最初に、それらを、例えば腐敗した食品およびペットフードから単離するかまたはＤＭＳＺおよびＡＴＣＣなどの公的な微生物株保存機関から入手した。
【０２５７】
【表３０】
2014500038.tif 000039
【０２５８】
各実験の前に、グリセロール５０％（ｖ／ｖ）を含有する好適なブロス中で−８６℃に維持された、各酵母の保存培養物を、ｐＨ６．０±０．２および温度（２５℃）で、好適な培地（ＹＧＣ−寒天（ＶＷＲ）ｐＨ５．１＋０．２；ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ）中で２つの連続した増殖サイクルによって繁殖させた。一晩培養物を、生理食塩溶液中で希釈して、試験用培養物を得る。等しい細胞数の各培養物を滅菌した容器に加え、適切に混合することによって、酵母の混合物を生成した。酵母の混合物を希釈し、最終的な所望の濃度を得るために生成物中に接種した。合計菌数を、生菌数によって確認した。
【０２５９】
カビ胞子を以下のように準備した：約２ｍｌの滅菌した脱塩水を用いて、増殖したカビ品種から胞子を洗い流した（最少で５日齢のプレート）。この懸濁液を滅菌容器に移す。合計菌数を、生菌数によって確認した。
【０２６０】
試料の分析
代表的な試料を得るために、２相の液体美味剤を、試験中の接種および試料採取の前に常に混合した。４２℃で貯蔵された、接種されたペットフード美味剤を、時間ゼロの時点で、その後、６週まで毎週検定した。（保存および試料採取は、提供される美味剤の体積によって制限された）。ＣＦＵ／ｇを、酵母を接種された各バッチからの２つの試料について２通り検出した。試料の一部を、各瓶から無菌で抜き取り、リンゲル液で１０倍に希釈し、好適な寒天上でスパイラルプレータ技術を用いて平板培養した。酵母について検定される試料を、ＹＧＣ−寒天［ＡＭ−０１５］上で３０℃で４８時間培養した。
【０２６１】
カビが接種された各バッチからの５つの試料を、カビの増殖について視覚的に分析した。（カビを接種したそれらの試料は混合しなかった）。
【０２６２】
結果
酵母の計数
６週間の保存の間の実験用美味剤中の酵母の計数の結果が、表３１に示される。従来の防腐系ならびに実験用ブレンド「ＦＰ  １０００」は、両方のｐＨレベルで保存期間にわたって標的生物の増殖を許容しなかった。他方、ｐＨ３およびｐＨ４における保護されていないバッチは、２週間以内に腐敗したとみなされた。しかしながら、指示酵母の調べられたプールが、ｐＨ３の製品中で低いｐＨに対して感受性であるようであったことに言及する必要がある。時間とともに、細胞密度は、保護されていない対照を含む全ての試料において減少した。
【０２６３】
【表３１】
2014500038.tif 000040
【０２６４】
カビ
異なる試料につき５つの管の美味剤を、カビの目に見える増殖について監視した。表３２から分かるように、試験期間にわたって、カビは、ｐＨ４で保護されていないバッチにおいて見られたに過ぎなかった。提供される他の試料のいずれも、カビの増殖に好都合な環境を提供しなかった。
【０２６５】
【表３２】
2014500038.tif 000041
【０２６６】
結論
より高いｐＨは、腐敗生物の減少された障害であり、したがって、保護するのにより負荷が高かった。酵母細胞密度の増加が、１週間の培養の後に、ｐＨ４で防腐処理されていない対照において見られた。しかしながら、指示酵母の調べられたプールは、ｐＨ３の製品中で低いｐＨに対して感受性であるようであった。時間とともに、細胞密度は、保護されていない対照を含む全ての試料において減少した。しかしながら、緑茶抽出物、カラシ油および発酵物を含有する両方の濃度（０．３５％および０．７％）の実験用ブレンド（「ＦＰ  １０００」）が、酵母汚染を防除しており、両方のｐＨレベルにおいて製品の腐敗を防いだ。したがって、当業界において典型的に使用されるような保存料に匹敵し、試験生物は、試験期間内に増殖しなかった。接種されたカビ胞子は、２日後にｐＨ４で保護されていない試料において目に見える増殖を示した。
【０２６７】
参照文献
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【０２６８】
上記の明細書に記載される全ての刊行物は、参照により本明細書に援用される。本発明の記載される方法およびシステムの様々な変更形態および変形形態が、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、権利請求される本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際には、化学、生物学、食品科学または関連の分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載される形態の様々な変更形態が、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
2014500038.tif 000043
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014500038.tif 000048
【図７】
2014500038.tif 000049
【図８】
2014500038.tif 000050
【国際調査報告】
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2014500038.tif 000052
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