(57)【要約】  バイオリアクター内の培地で光照射の下で培養されていた光合成微生物中のユビキノン（ＣｏＱ１０）およびユビキノール（ＣｏＱＨ２）の含有量を増加させる方法であって、光合成微生物が、藍藻類、緑藻類および黄緑藻類からなる群から選択され、酸化ストレスを誘発するステップを含む方法。光合成微生物をＦｅ３＋と一緒に培地でインキュベートすることで酸化ストレスが誘発されたという事実によって、ＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の含有量がより高くなる。さらに、このようにして得られた微生物の３価鉄含有量はより高く、このことはヒトの食事にとって特に今日的な意義がある。光合成微生物からは、油性抽出物を生成することおよび乾燥藻類製品を製造することも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクター内の培地で光照射の下で培養されている光合成微生物中のユビキノン（ＣｏＱ１０）およびユビキノール（ＣｏＱＨ２）の含有量を増加させる方法であって、前記光合成微生物が、藍藻類、緑藻類および黄緑藻類からなる群から選択され、前記方法が酸化ストレスを誘発するステップを含む方法において、
前記酸化ストレスの誘発が前記光合成微生物をＦｅ３＋と一緒に前記培地でインキュベートすることによって引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記インキュベーションが、前記培地中のＦｅ３＋含有量が約１ｍｇ／ｌ〜約６ｍｇ／ｌ、特に約３ｍｇ／ｌ〜約４ｍｇ／ｌ、藍藻類では好ましくは約２．７ｍｇ／ｌ、緑藻類および黄緑藻類では好ましくは約３．５ｍｇ／ｌのＦｅ３＋で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
藍藻類の前記インキュベーションが、初期の２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１から１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１まで時間的に増加する表面照射強度で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
緑藻類および黄緑藻類の前記インキュベーションが、約１１０μＥ・ｍ−２・ｓ−１〜約１３０μＥ・ｍ−２・ｓ−１、好ましくは約１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定の照射強度で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
０．０５〜０．５０ｍｌ／ｌ、特に０．１５〜０．３０ｍｌ／ｌ、好ましくは約０．２５ｍｌ／ｌのオレアートの前記培地への添加をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
乾燥バイオマスに対する重量での以下のＣｏＱ１０含有量：
−藍藻類では少なくとも６μｇ／ｇ、
−緑藻類および黄緑藻類では少なくとも３．６μｇ／ｇ
によって特徴づけられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法を適用することによって得られる光合成微生物。
【請求項７】
少なくとも４．３のＱＨ２／Ｑ１０比によって特徴づけられる、請求項６に記載の光合成微生物。
【請求項８】
前記バイオマスに対する重量での以下の３価鉄（Ｆｅ３＋）含有量：
−藍藻類では少なくとも１０μｇ／ｇ、
−緑藻類および黄緑藻類では少なくとも１０μｇ／ｇ
によって特徴づけられる、請求項６または７に記載の光合成微生物。
【請求項９】
前記バイオマスに対する重量での以下の３価鉄（Ｆｅ３＋）含有量：
−藍藻類では少なくとも３０μｇ／ｇ、
−緑藻類および黄緑藻類では少なくとも６０μｇ／ｇ
によって特徴づけられる、請求項６または７に記載の光合成微生物。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の光合成微生物から生成される油性抽出物。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の光合成微生物から製造される乾燥藻類製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成微生物中のＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の含有量を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキノン（２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−マルチプレニルｌ−１，４−ベンゾキノン、Ｃ５９Ｈ９０Ｏ４、８６３．３４ｇ／モル）は、コエンザイムＱ１０または略してＣｏＱ１０としても知られ、その抗酸化性のため、ほとんどすべての生細胞にとって特に重要である。ＣｏＱ１０はほとんどの好気性微生物およびすべての動物に存在し、ＣｏＱ１０は人体にも必須である。
【０００３】
ストレスを受けていない人体においては、ＣｏＱＨ２とも呼ばれる還元型のＣｏＱ１０、すなわちユビキノール（２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−マルチプレニルｌ−１，４−ヒドロキノン、Ｃ５９Ｈ９０Ｏ４、８６５．３６ｇ／モル）が優勢である。
【０００４】
ユビキノールは、ヒト血漿中のＣｏＱ１０の全含有量の８０％超を占め、したがってリポタンパク質にとって重要な血漿抗酸化物質である。ユビキノールは細胞膜中のタンパク質および脂質の酸化を抑制し、脂質過酸化およびＤＮＡ酸化変性から、さらには他の有害な分子からも保護する。あらゆるタイプの、特に炎症が引き起こす酸化ストレスによって細胞死が起こる可能性がある。Ｆ．Ｈ．エンズマン（Ｆ．Ｈ．Ｅｎｚｍａｎｎ）は、自著の論文（非特許文献１）で、酸化型のＣｏＱ１０対還元型のＣｏＱＨ２の割合は１０：９０であると指摘した。他の著者らによると、この比は、１０：３０から１０：９０の間で変化しうる。
【０００５】
モレ（Ｍｏｒｒｅ）およびモレ（Ｍｏｒｒｅ）（非特許文献２）は、彼らが「加齢関連性ＮＡＤＨオキシダーゼ」または「ａｒＮＯＸタンパク質」と呼んだ細胞外のＲＯＳの特別な供給源について記載している。諸研究では、皮膚上に塗布されたユビキノン（ＣｏＱ１０）が表皮層に浸透し、酸化の程度の低減およびａｒＮＯＸ活性の抑制をそれぞれ行うことが示された。対照的に、ＣｏＱＨ２ならびに分子ＣｏＱ０、ＣｏＱ２、ＣｏＱ４、ＣｏＱ６およびＣｏＱ７はこのような効果を示さなかった。この抑制は専らＣｏＱ１０の側鎖（ｎ−デカプレノール）によるものでありうるということが示されている可能性がある。
【０００６】
（特許文献１）は、バイオリアクター内の培地で標準的な条件下で培養された光合成微生物の増殖が対数増殖期および定常増殖期を示している状態で、前記微生物中のコエンザイム−Ｑ１０の含有量を増加させる方法を記載している。前記特許文献では、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）およびハプト植物門（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、詳細には単細胞紅藻チノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）またはクリコスファエラ・カルテラエ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｃａｒｔｅｒａｅ）から選択される微細藻類が、有用な光合成微生物として挙げられている。（特許文献１）に記載されている方法は、ストレス誘発物質の共インキュベーションによる、および／またはバイオリアクターでの表面照射強度の増加による、酸化ストレスの誘発を必須のステップとして含む。別法として、または追加として、これは培地にオレアートを添加することによって実現することができる。
【０００７】
酸化ストレスを誘発するための適切な処置として、（特許文献１）では、特に対数増殖期の終わりに、１３Ｓ−ヒドロペルオキシ−９Ｚ，１１Ｅ−オクタデカジエン酸および２価鉄（それぞれＦｅ（ＩＩ）およびＦｅ２＋）を培地で微生物と共インキュベートすることが提案されている。
【０００８】
（特許文献１）にも詳細に記載されているＣｏＱ１０の既知の有益な効果を考慮すると、ＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２を生成する方法のさらなる改善が依然として明らかに必要である。
【０００９】
ＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の含有量のさらなる増加は、遺伝子改変した藻類を用いて実現することができると考えられる。しかし、かかる微生物の使用には問題がなくはない。さらに、かかる手法のバイオアベイラビリティおよび有効性は、まず現在の品質基準の下で判定されなければならないということになろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／０５５９５１号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｆ．Ｈ．エンズマン（Ｆ．Ｈ．Ｅｎｚｍａｎｎ）の論文「Ｓｃｈｌｕｅｓｓｅｌ  ｚｕｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎ  Ｍｅｄｉｚｉｎ」
【非特許文献２】モレ，ＤＭ．，グオ，Ｆ．（Ｍｏｒｒｅ，ＤＭ．，Ｇｕｏ，Ｆ．）およびモレ，Ｄ．Ｊ．（Ｍｏｒｒｅ，Ｄ．Ｊ．）著、「加齢関連性細胞表面ＮＡＤＨオキシダーゼ（ａｒＮＯＸ）はスーパーオキシドを生成し、コエンザイムＣｏＱ１０によって抑制される。（Ａｎ  ａｇｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ＮＡＤＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  （ａｒＮＯＸ）  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ＣｏＱ１０．）」分子細胞生化学（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第２６４号、１０１〜１０９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、遺伝子的に形質転換されていない生物を使用して、天然物質が一定の高品質および高収率で採れる、商業的に競争力のある手法で、ＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２を産出する方法を提供することである。
【００１３】
この目的は、独立請求項に明示した方法によって達成される。本発明の方法によれば、酸化ストレスの誘発は、３価鉄（たとえばＦｅ３＋の形態のもの）を緑藻類、藍藻類および黄緑藻類とともに、それぞれ培地でインキュベートすることによって達成される。
【００１４】
驚くべきことに、上記の藻類の種に、既知の２価鉄を添加するのではなく、３価鉄を添加すると、ＣｏＱ１０の収率が高くなることを発見した。
本発明のさらなる目的は、ＣｏＱ１０含有量を増加させた光合成微生物を提供することである。この目的は、本発明によれば請求項６によって達成される。
【００１５】
本発明の有益な実施形態は、各独立請求項に明示する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
培地１リットル当たりのＦｅ３＋の添加量は、有利には、約１ｍｇ／ｌ〜約６ｍｇ／ｌ、特に約３ｍｇ／ｌ〜約４ｍｇ／ｌである。藍藻類では、好ましくは約２．７ｍｇ／ｌ、緑藻類および黄緑藻類では、好ましくは培地１リットル当たり約３．５ｍｇ／ｌのＦｅ３
＋をインキュベートする。
【００１７】
本発明によれば、３価鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ）またはＦｅ３＋）をインキュベートすると、藍藻類、緑藻類および黄緑藻類の群に酸化ストレスの増大をもたらす。理論に縛られるものではないが、この物質が脂質過酸化を引き起こし、これが膜破壊における初期反応ステップとして作用すると考えられる。このストレスの事象に対して、藻類が反応して抗酸化物質の形成が増加する。特にＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の形成が増加する。
【００１８】
結果として、鉄は、藻類中に乾燥質量３３μｇ／ｇ〜６６μｇ／ｇの量で存在したままとなる。特に、今日では鉄を含有する食品の供給が必要と考えられているため、このことは有利である。
【００１９】
好ましくは、光合成微生物は、バイオマスに対して、重量で、以下の３価鉄（Ｆｅ３＋）含有量を有する。
−藍藻類では、少なくとも１０μｇ／ｇ、
−緑藻類および黄緑藻類では、少なくとも１０μｇ／ｇ。
【００２０】
有利な実施形態において、光合成微生物は、バイオマスに対して、重量で、以下の３価鉄（Ｆｅ３＋）含有量を有する。
−藍藻類では、少なくとも３０μｇ／ｇ、
−緑藻類および黄緑藻類では、少なくとも６０μｇ／ｇ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
微細藻類の混合栄養増殖を、各種毎に予め決定した条件下での培養によって、光バイオリアクター内で実施した。
使用した微生物中のＣｏＱ１０／ＣｏＱＨ２形成の増加については、表面照射強度の最適化、さらには酸化ストレスを誘発する物質のインキュベーションも、形成されたバイオマス中の抽出可能なＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の量に好ましい影響を及ぼす。この理由として、一方では、表面照射強度をより高めることによって光酸化が増加すること、他方では、共インキュベートした物質によって引き起こされる脂質過酸化が酸化ストレスを増大させることがある。
【００２２】
微細藻類中の光酸化ストレスは、光バイオリアクター内で規定の照射強度を超えた場合にのみ発生する。しかし、バイオリアクター内で培養される微生物が増殖すると、培地の吸光度および付随的にバイオリアクターの光透過率を実質的に変化させる可能性がある。培地の吸光度が変化する中でも光酸化ストレスを一定に維持するために、バイオリアクターの表面照射強度Ｉ０は、光透過率の関数として有利になるように適合されるべきである。好ましくは、この表面照射強度Ｉ０の適合は、４０μＥ・ｍ−２・ｓ−１〜２５０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の間の範囲でなされる。光バイオリアクターでのこの表面照射強度Ｉ０が適合すると、バイオリアクター内に効果的に存在する照射強度が、光透過率が減少する場合においても、要求される閾値の上にあることが確実になり、したがって、培養条件の再現性および微生物からのＣｏＱ１０の一定した高収率が確保される。本発明を進める状況の中で、藻類のタイプによっては、光合成微生物の不所望な損傷を回避するために、照射強度の増加をあまり早期に発生させても、あまり強くしてもいけないということが理解された。したがって、本発明を進める間に、表面照射強度の適合および最適化については、藻類のタイプによって、表面照射強度を初期値から最終値まで漸増させるか、または目下の条件に慎重に適合させた、一定の増加した表面照射強度を選択するかのいずれかを必要とすることがわかった。
【００２３】
本発明による、３価鉄による酸化ストレスの誘発に加えて、本方法は、オレアートを培
地に添加する追加のステップをさらに含むことができる。これを添加すると次に、細胞内でミトコンドリアの増殖が増加する。ＣｏＱ１０／ＱＨ２は、膜中で、特にミトコンドリア内膜中で形成されるため、ミトコンドリア膜の重要な成分であるオレアートの添加は、ミトコンドリアの増殖の増加を通して、細胞内のＣｏＱ１０／ＱＨ２の濃度の増加に寄与する。培地１リットル当たりオレアート０．０５〜０．５０ｍｌを添加するのが有利である。このようにして、特に、オレアートを０．１５〜０．３０ｍｌ／ｌの量で、好ましくはオレアート０．２５ｍｌ／ｌを培地に添加することによって、ＣｏＱ１０／ＱＨ２の特に顕著な収率の増加が達成される。
【００２４】
培地にオレアートを補うのは培養の１日目と１２日目の間とすることが推奨される。詳細には、培養の３日目と６日目の間に添加される。好ましくは、オレアートは培養の５日目に添加される。これらの数値は培養される種によって変化しうる。
（実施例）
以下の実施例は、光合成微生物中のＣｏＱ１０／ＣｏＱＨ２の形成についての種々の培養パラメーターの変型の効果を示すものである。緑藻類クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、藍藻類スピルリナ・ブルガリス、スピルリナ・フシフォルミス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピルリナ・マキシマ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｘｉｍａ）ならびに緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）に属する黄緑藻類をモデル生物として使用する。モデル生物には、本発明による培養方法を使用して「ストレス」をかけて、培養時間を３日までに短縮することを達成した。
【００２５】
光バイオリアクター内でのスピルリナＳｐ．フシフォルミス／Ｃｈ．ケスレリおよび黄緑藻類の基礎培養には、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）らによるＡＳＷ培地を使用し（ジョーンズ，Ｒ．Ｆ．、スピアー，Ｈ．Ｌ．（Ｓｐｅｅｒ，Ｈ．Ｌ．）およびクーリー，Ｗ．（Ｋｕｒｙ，Ｗ．）著、１９６３年、「紅藻チノリモの増殖に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ
ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｄ  Ａｌｇａ  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）」、植物生理学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）第１６巻、６３６〜６４３ページ）、この培地は−変形を加えて−以下のプロトコルによって生成する。
【００２６】
【表１】
2014500031.tif 000002
プロトコル中に挙げた微量栄養素溶液ＩＩＩは、以下の成分を、表に記載した濃度で含有する。
【００２７】
【表２】
2014500031.tif 000003
さらに、以下の物質を、有機炭素供給源として培地に添加する。
・グルコース            ３．００ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・グリセリン            １．５３ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・サッカロース          ８．７０ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・フルクトース          ３．００ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・および酢酸ナトリウム  １．３７ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）。
【００２８】
特に、上記の培地は肉エキスを一切含有しない。
光バイオリアクター内でのスピルリナＳｐ．フシフォルミス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  Ｓｐ．ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）／Ｃｈ．ケスレリ（Ｃｈ．ｋｅｓｓｌｅｒｉ）および黄緑藻類の最適化した培養には、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（上記引用文献中）によるＡＳＷ培地を−やはり変形を加えて−使用し、以下のプロトコルによって生成する。
【００２９】
【表３】
2014500031.tif 000004
プロトコル中に挙げた微量栄養素溶液ＩＩＩは、以下の成分を、表に記載した濃度で含有する。
【００３０】
【表４】
2014500031.tif 000005
ここで、プロトコル溶液について、鉄（ＩＩ）を鉄（ＩＩＩ）に置き換えていることがきわめて重要である。
【００３１】
以下の物質を、有機炭素供給源として培地に添加する。
・グルコース            ３．００ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・グリセリン            １．５３ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・サッカロース          ８．７０ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・フルクトース          ３．００ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）
・および酢酸ナトリウム  １．３７ｇ・Ｌ−１（１．７・１０−２モル・Ｌ−１）。
【００３２】
上記の培地も肉エキスを一切含有しない。
適切な光バイオリアクターは、熱による滅菌が可能で、培養パラメーターを制御する適切な手段を備える任意の既知のリアクターである。この作業に特に有用な光バイオリアクターには、以下のタイプのものがある。
−  ラブフォーズ４ラックス（Ｌａｂｆｏｒｓ  ４  Ｌｕｘ）（インフォーズ（Ｉｎｆｏｒｓ）、スイス）
−  メドゥーサ（Ｍｅｄｕｓａ）、１０Ｌおよび２５Ｌサイズのもの（ＱＶＦ、ドイツ）−  フラットパネルエアリフト光バイオリアクター（Ｆｌａｔ−Ｐａｎｅｌ−Ａｉｒｌｉｆｔ−ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）（スビテック有限会社（Ｓｕｂｉｔｅｃ  ＧｍｂＨ）、ドイツ）
比較実施例１：天然の微生物中のＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の含有量の基準測定
スピルリナ属、たとえばスピルリナ・ブルガリスでの基準測定では、ＣｏＱ１０含有量は４．１・μｇ／ｇ、ＣｏＱＨ２含有量は１８．４μｇ／ｇであった。したがって、ＣｏＱＨ２含有量はＣｏＱ１０含有量の４．５倍の高さであった。
【００３３】
クロレラ・ケスレリでの基準測定では、ＣｏＱ１０含有量は２．５〜３．２・μｇ／ｇ、ＣｏＱＨ２含有量は１０．９〜μｇ／ｇであった。これはＱＨ２／Ｑ１０比４．３〜４．５に相当する。
比較実施例２：基礎培地中での表面照射強度（ＯＦＢＳ）の適合
スピルリナ属、たとえばスピルリナ・ブルガリスのサンプルの培養に、初期の２０から１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１までの表面照射強度（ＯＦＢＳ）の漸増、それに対して４０μＥ・ｍ−２・ｓ−１および１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１のそれぞれ一定のＯＦＢＳを、標準的な培養条件下で１３〜１５日間適用した。１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳでは、ＣｏＱ１０含有量は３・μｇ／ｇで、４０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳでの含有量（ＣｏＱ１０含有量は５．６・μｇ／ｇであった）よりわずかに劣って
いた。
【００３４】
ＯＦＢＳの漸増（２０〜１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１）によりＣｏＱ１０の最高収率（７．５μｇ／ｇ）が得られた。１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１での標準的な培養（３・μｇ／ｇのＣｏＱ１０）との比較では、２．５倍の生産性増加が達成された。４０μＥ・ｍ−２・ｓ−１での標準的な培養（５．６・μｇ／ｇのＣｏＱ１０）との比較では、１．３３倍の生産性増加が達成された。スクリーニング試験（４．１・μｇ／ｇのＣｏＱ１０）との比較では、１．８倍の生産性増加が達成された。
【００３５】
クロレラ・ケスレリの培養には、一定の表面照射強度（ＯＦＢＳ）を１４０μＥ・ｍ−２・ｓ−１まで上昇させたものを、８０μＥ・ｍ−２・ｓ−１および１００μＥ・ｍ−２・ｓ−１のそれぞれのＯＦＢＳと比較するものとして、標準的な培養条件下で採用した。
【００３６】
一定の８０μＥ・ｍ−２・ｓ−１のＯＦＢＳではＣｏＱ１０含有量が５・μｇ／ｇであり、したがってクロレラ・ケスレリ中でのＣｏＱ１０生成量には不利な影響を及ぼした。一定の１００μＥ・ｍ−２・ｓ−１のＯＦＢＳではＣｏＱ１０含有量が６．５・μｇ／ｇであり、一方、一定の１４０μＥ・ｍ−２・ｓ−１のＯＦＢＳではＣｏＱ１０含有量が６．２・μｇ／ｇであり、したがって得られたＣｏＱ１０の収率が似通っていたことを意味している。一定の１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１のＯＦＢＳではＣｏＱ１０含有量が７．０・μｇ／ｇであり、したがって、クロレラ・ケスレリのＣｏＱ１０生成量の最高収率が得られた。８０μＥ・ｍ−２・ｓ−１での標準的な培養（５・μｇ／ｇのＣｏＱ１０）との比較では、１．４倍の生産性増加が達成された。スクリーニング試験（２．５〜３．２・μｇ／ｇのＣｏＱ１０）との比較では、２．２〜２．８倍の生産性増加が達成された。
実施例１：最適化ＯＦＢＳを使用しない、Ｆｅ２＋のＦｅ３＋による置換
スピルリナ・フシフォルミス、スピルリナ・マキシマ、スピルリナ・ブルガリスの培養およびクロレラ・ケスレリの培養にも推奨される基礎条件からは明らかに逸脱するが、添加するＦｅ２＋の量を、同一量のＦｅ３＋で置き換え、微量栄養素溶液を介して添加した。次いで、ＣｏＱ１０／ＣｏＱＨ２の含有量を測定した。
【００３７】
スピルリナの群では、Ｆｅ（ＩＩ）をＦｅ（ＩＩＩ）に置換すると、乾燥バイオマス（ＤＢＭ：ｄｒｙ  ｂｉｏｍａｓｓ）で４．１・μｇ／ｇのＣｏＱ１０から６．２・μｇ／ｇのＣｏＱ１０へと、約５０％のＣｏＱ１０の増加がもたらされた）。
【００３８】
クロレラ・ケスレリの群では、Ｆｅ（ＩＩ）をＦｅ（ＩＩＩ）に置換すると、ＤＢＭで約４７〜５６％のＣｏＱ１０の増加がもたらされた（それぞれ２．５・μｇ／ｇおよび３．２・μｇ／ｇのＣｏＱ１０から、それぞれ３．６・μｇ／ｇおよび４．９・μｇ／ｇのＣｏＱ１０。
【００３９】
紅／褐藻類のサンプルでは比較可能な効果を達成することができなかった。
実施例２：生物特異的に適合したＯＦＢＳの条件下でのＦｅ２＋のＦｅ３＋による置換
手順は実施例１の手順と類似するものとしたが、種々の濃度のＦｅ３＋（０ｍｇ・Ｌ−１〜６・ｍｇ・Ｌ−１の間のＦｅ３＋）を培地に添加した。スピルリナでは、好ましくは約２．７・ｍｇ・Ｌ−１のＦｅ３＋を、クロレラでは、好ましくは約３．５・ｍｇ・Ｌ−１のＦｅ３＋を添加した。
【００４０】
これによって、スピルリナ・フシフォルミス／スピルリナ・マキシマの乾燥バイオマス中でのＣｏＱ１０生成量を２０倍、すなわち４．１・μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加せず）から８２μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加し、この生物に適合した、初期の２０から１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１までの漸増ＯＦＢＳを適用することによる）に増加させることが可能になり、ＱＨ２／Ｑ１０比４．５が可能になった。
【００４１】
スピルリナ・ブルガリスでは、２４倍、すなわち４．１・μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加せず）から９４μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加し、この生物に適合した、初期の２０から１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１までの漸増ＯＦＢＳを適用することによる）への改善が達成され、ＱＨ２／Ｑ１０比が４．５倍に改善された。さらに、対数増殖期が短縮し、付随的に基礎条件下での培養時間が短縮した（１０〜１３日間）。
【００４２】
さらに、クロレラ・ケスレリの乾燥バイオマス中でのＣｏＱ１０生成量における３１．２倍、すなわち３．２・μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加せず）から１００μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加し、この生物に適合した１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳを適用することによる）への増加が達成され、ＱＨ２／Ｑ１０が４．５倍になった。
【００４３】
クロレラ・ケスレリでのさらなる試験シリーズでは、３４．８、すなわち２．５・μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加せず）から８７μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋を添加し、この生物に適合した１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳを適用することによる）へのさらにより大きな改善が得られ、ＱＨ２／Ｑ１０比は４．３８倍に改善された。
実施例３：黄緑藻類のＣｏＱ１０生成量に対するＦｅ３＋の添加の効果
手順は実施例２の手順と類似するものとしたが、黄緑藻類を使用し、種々の濃度のＦｅ３＋（０ｍｇ・Ｌ−１〜６・ｍｇ・Ｌ−１の間のＦｅ３＋）、好ましくは約３．５・ｍｇ・Ｌ−１のＦｅ３＋を添加した。
【００４４】
黄緑藻類に、この生物に適合した１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳを使用し、「天然の条件」下で、すなわちＦｅ３＋を添加せずに、ＣｏＱ１０含有量１５μｇ／ｇが達成された。一方、３．５・ｍｇ・Ｌ−１のＦｅ３＋を添加し、やはり１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳではＣｏＱ１０含有量７５μｇ／ｇが達成された。これは、黄緑藻類のバイオマス中でのＣｏＱ１０生成量の５倍増加に相当する。
【００４５】
さらなる試験シリーズでは、黄緑藻類での改善倍率は５．６倍、すなわち１６μｇ／ｇのＣｏＱ１０（天然）から８９μｇ／ｇのＣｏＱ１０（Ｆｅ３＋の添加およびこの生物に適合した１２０μＥ・ｍ−２・ｓ−１の一定のＯＦＢＳで）であった。
【００４６】
双方の試験シリーズにおいて、ＱＨ２／Ｑ１０比は約４．５に到達した。
実施例４：最適化した条件下でのＦｅ３＋含有量の改良
Ｆｅ３＋の添加によって、バイオマス（ＢＭ）中の鉄（ＩＩＩ）の個別濃度を次のとおり高めることができた。
−  スピルリナ・フシフォルミスでは、１１μｇ／ｇＢＭ（初期含有量、「天然」）から最終含有量３３〜３７μｇ／ｇＢＭまで、
−  スピルリナ・マキシマでは、１２μｇ／ｇＢＭ（初期含有量、「天然」）から最終含有量３６〜４０μｇ／ｇＢＭまで、
−  スピルリナ・ブルガリスでは、１５μｇ／ｇＢＭ（初期含有量、「天然」）から最終含有量４５〜５１μｇ／ｇＢＭまで。
【００４７】
同様に、クロレラ・ケスレリのバイオマス中の鉄（ＩＩＩ）の個別濃度を、２２μｇ／ｇＢＭ（初期含有量、「天然」）から最終含有量６１〜６６μｇ／ｇＢＭまで高めることができた。
【００４８】
これは、藍藻類（スピルリナ）では３〜３．５倍、緑藻類（クロレラ）および黄緑藻類では２．８〜３倍のＦｅ３＋濃度−特にヒトの食事における利用可能性のための−の増加
にそれぞれ相当する。
結論
文献によると、分子ＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２の融点は４９℃である。上記の生成方法を適用したところ、相当する分子の安定性はより高い。具体的には、耐熱性は少なくとも８０℃とより高く、耐冷性も少なくとも−２４℃であることが見出された。
【００４９】
この固有の安定性の改善は、適切な安定化剤（化学的／物理的、たとえば脂肪酸モノ−トリグリセリド、脂肪族アルコールおよびこれらのエステル）によってさらに高めることができる。
【００５０】
本発明の培地およびさらに微量栄養素溶液の双方、ならびに炭素供給源は、動物性成分を一切含有せず、したがって、菜食主義ならびに／またはコーシャおよび／もしくはハラルの各指定の下で使用することができる。
【００５１】
さらに、上記の方法に続けて、以下のものを生成することができる。
ａ）緑藻類／藍藻類および黄緑藻類で、特にＦｅ３＋を適用することによって、酸化および任意選択のオレアートプロセスから生成される油性抽出物、
ｂ）乾燥藻類製品（既知の技術による乾燥ステップ、たとえば凍結乾燥、噴霧乾燥および流動床乾燥などを、温度によって使用することができる）、このプロセスでは、１００μｍまでの粒径の粒子が水中に分散可能（溶解可能）である、
ｃ）藻類の類脂質抽出物（藻類油とも呼ばれる）。
【００５２】
この方法で得られる生成物は、以下の用途の範囲／製品（さらに下も参照されたい）において使用することができる。
−  食品サプリメント／栄養サプリメント→錠剤、カプセル、種々の粒径の粉末の形態にて、
−  食品中の混合物／すべてのタイプの高級食品、
−  抗加齢製品、たとえばお手入れキット、クリーム、日焼け止め剤など、
−  自然化粧品、
−  皮膚細胞再生、
−  ホメオパシーの基材、
−  動物用餌および農業用用途。
【００５３】
ａ）任意選択で、たとえば可溶化剤としてポロクサマーを使用する活性成分複合体による可溶化、再結晶、濾過、クロマトグラフィー精製を伴う、蒸気抽出、ＣＯ２−抽出、液化ガス抽出の方法を使用しての藻類からの抽出物：
抽出物は、ＣｏＱ１０およびＣｏＱＨ２ならびにＣｏＱ１０／ＱＨ２を、任意選択で活性成分複合体とともにそれぞれ包含する。
【００５４】
還元剤および酸化剤（酵素のおよび／または化学的／物理的）をそれぞれ添加することによって、抽出物の内容物は変化しうる。
用途は以下の範囲において可能である。
−  食品サプリメント／栄養サプリメント
−  医薬品、注入剤の添加剤としても
−  スポーツ用栄養剤／経管栄養
−  抗加齢
−  食品および高級食品。
【００５５】
ｂ）組合せ
他の生成物／生成物群（ビタミン、ミネラル、微量元素およびコエンザイムの範囲からの
さらなる分子）との組合せは、予期しない可能性およびそこから得られる有効性の増加をもたらす。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
冷飲料またはジュース
乾燥藻類製品は、植物性の原材料として、通常の１日量として考えられている藻類２〜３ｇの量で、種々の飲料の中に混合することができる。
温飲料
乾燥藻類粉末または油性抽出物、さらには抽出物を原料とした製品も、温飲料に有用である。
−  茶葉にベルガモット油を噴霧するのと同様に、油性抽出物を噴霧することができる。茶の香気に対する影響は見られなかった。
−  藻類粉末、油性抽出物、さらには抽出物製品も、可溶性の茶、コーヒーおよびハーブティを作るための素材に混合することができる。
パン／ベーカリ製品／長期保存ベーカリ製品
重要な点は、安定化剤を用いてまたは用いないで達成される固有の安定性の改善によって「焼成可能性」がもたらされるという事実にある。したがって、乾燥藻類粉末は、続いて焼成するためのパン生地混成物に混合することができる。油性抽出物を使用することも可能であり、これは色に対して影響がないという利点を有する。抽出物製品もパン生地混成物中に使用することができるが、これは特別な法規制を受ける。
【００５７】
長期保存ベーカリに、または押出し機による製造用の混合物としての用途に、乾燥藻類製品を使用することは適切である。
特別なまたは改善された結果が、押出しプロセス後に油性抽出物または油中に溶解した抽出物製品を噴霧することによって得られた。
【００５８】
「水分量の多い食品」とは、押出し機による製品から得られる食品の特殊分類で、動物用餌としても使用され、これも本発明によって生成される原材料を用いて製造することができる。
動物用餌
乾燥藻類粉末は、ますます人気が高まっている菜食主義の動物用餌を製造するために使用することができる。油性抽出物および抽出物製品は、ペット用の１回分の餌または乾燥餌の中にさらなる材料として使用することができる。
お手入れキット／美容キット
抗加齢および皮膚／細胞再生の分野におけるお手入れキット中での用途が可能である。乾燥藻類粉末の混合によって、お手入れキットまたは美容キットはいわゆるタラソテラピーの意味での追加のケア成分を含有する。藻類には蜂巣炎に対して有益な効果があることが知られている。したがって、油性抽出物および抽出物製品は、蜂巣炎対策製品の添加物として使用することができる。
【国際調査報告】
2014500031.tif 000006
2014500031.tif 000007
2014500031.tif 000008