(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプルを染色するための方法に関し、特に、ヘマトキシリン染色による生物学的サンプルを染色するための自動化方法に関する。本発明の方法とシステムにおいて、生物学的サンプルへ適用の前に前もって混合され得る、別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液が提供される。この方法は、ヘマテイン染色溶液に共通であって、自動化スライド／サンプル処理装置を汚染する沈殿を防止する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む生物学的サンプルを染色するための自動化方法であって、
別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液を提供し；
別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液を混合することにより新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液を調製し；及び
前記生物学的サンプルを、前記生物学的サンプル中の細胞の構造が染色される条件下で、前記新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液と接触させることを含む自動化方法。
【請求項２】
前記ヘマテイン溶液と媒染剤溶液は、生物学的サンプルを接触させる前に、約４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分間未満、３０分未満、１０分未満、５分未満、１分未満、３０秒未満及び２０秒未満からなる群から選択される時間混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘマテイン溶液と媒染剤溶液は別個の溶液としてサンプルに適用され、生物学的サンプル上で混合され、新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液を提供する、請求項１又は２の何れかに記載の方法。
【請求項４】
別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液の比率は、ヘマテイン−媒染剤溶液の少なくとも一特性を調整するように可変される、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一特性が染色強度である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘマテイン溶液が半酸化ヘマトキシリン溶液である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
半酸化ヘマトキシリン溶液は、ヘマテイン溶液中の約５０％のヘマトキシリンを酸化するのに十分な量で酸化剤を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記媒染剤溶液が硫酸アルミニウムを含む、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルがスライド上にマウントされる、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘマテイン溶液及び媒染剤溶液が低揮発性溶媒を含む、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記低揮発性溶媒が、グリセロール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヘマテイン溶液と媒染剤溶液が混合されて、ヘマテイン−媒染剤溶液を与えることができるように、第一容器と第二容器が混合容器に流体的に連結された、該ヘマテイン溶液を含む該第一容器と該媒染剤溶液を含む該第二容器と；
基体が基体ホルダーを占有するときに、ヘマテイン−媒染剤溶液が基体上にマウントされた生物学的サンプルに適用され得るように、混合容器と流動的に連通している基体ホルダーを含む、基体上にマウントされた生物学的サンプルを染色するシステム
【請求項１３】
前記混合容器は第一容器と第二容器に流体的に連結されるチューブである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記システムが自動化された、請求項１２又は１３の何れかに記載のシステム。
【請求項１５】
一以上の組織染色剤又は標識剤を含む付加的容器を更に含む、請求項１２から１４の何れかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的サンプルを染色するための方法に関し、特に、ヘマトキシリン染色による生物学的サンプルを染色するための自動化プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびパパニコロー（ＰＡＰ）染色を含む幾つかの組織化学的染色プロトコルは、細胞学的サンプル及び組織サンプルを染色する色素のヘマトキシリンに依存する。特に、細胞核のヘマトキシリン染色は、病理学者による腫瘍生検サンプル中の悪性及び／又は転移性細胞の存在を検出すために使用される。
【０００３】
ヘマトキシリンは、ヘマトキシロン属の木の赤い心材に見いだされる天然に存在する化合物である。ヘマトキシリン自体は、水溶液中で無色であり、組織成分を染色する活性成分ではない。むしろ、ヘマトキシリンの酸化生成物のヘマテインが、特に媒染剤との複合体を形成して、ヘマトキシリン染色液の活性な染色成分となる。ヘマテインは空気と日光への曝露を通じて自然に生成される。その自然のプロセスは、「熟成」と称され、染色細胞に適した液体を提供するのに、３ヶ月以上かかることがある。
【０００４】
自動化染色の手順とシステムは、生物学的サンプルに染色液を送るために機械システムを使用する。標準的ヘマテイン染色の手順はヘマトキシリン／ヘマテインと媒染剤の両方を含む事前混合ストックを利用した。沈殿物がこの事前混合ストックで形成する。このことは、スライドがガラス容器などの容器中のヘマトキシリン染色液で処置される、手動染色手順においては一般的に問題ではない。しかし、自動化染色システムでは、沈殿物が送達ラインを汚染または詰まらせる場合があり、送達ラインの洗浄又は浄化を困難にするので沈殿物は問題である。ヘマトキシリン染色液に対するこれらの変化は染色の不一致をもたらし得る。例えば、媒染剤を含むヘマトキシリン染色ストックはしばしば長期間にわたって熟成を許容され、ヘマテイン−媒染剤の複合体の形成を可能にする。このプロセスは良好な染色結果を可能にし得るが、望まない沈殿物の形成をも生じる。沈殿物は、金属との接触によって悪化する。このことは、沈殿物で詰まる可能性がある非常に小さな開口を持つノズル及びスプレーヘッドなどの金属部分を含有する自動化システムにおいて特に問題である。
【０００５】
従って、自動化サンプル処理と互換性があるヘマトキシリン染色手順の開発についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、生物学的サンプルを染色するための方法に関し、特に、ヘマトキシリン染色による生物学的サンプルを染色するための自動化方法に関する。
【０００７】
幾つかの実施態様において、本発明は、ヘマテインと媒染剤の別個の溶液を提供し；ヘマテインと媒染剤の別個の溶液を混合して新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液を調製し；そして生物学的サンプルの細胞中の構造が染色されるような条件下で、新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液と生物学的サンプルを接触させることを含む、細胞を含有する生物学的サンプルを染色するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、ヘマテインと媒染剤溶液は、生物学的サンプルに対する適用の前に、約４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分間未満、３０分未満、１０分未満、５分未満、１分未満、３０秒未満及び２０秒未満からなる群から選択される時間混合される。幾つかの実施態様において、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液は別個の溶液としてサンプルに適用され、該サンプル上で混合され、新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液を提供する。幾つかの実施態様において、別個のヘマテインと媒染剤溶液の比率は、ヘマテイン−媒染剤溶液の少なくとも一特性で調整するように可変される。幾つかの実施態様において、その少なくとも一特性は染色強度である。幾つかの実施態様において、ヘマテイン溶液は半酸化ヘマトキシリン溶液である。幾つかの実施態様において、半酸化ヘマトキシリン溶液は、ヘマテイン溶液中の約５０％のヘマテインを酸化するのに十分な量で酸化剤を含有する。幾つかの実施態様において、媒染剤溶液は硫酸アルミニウムを含有する。幾つかの実施態様において、サンプルはスライド上にマウントされる。幾つかの実施態様において、ヘマテイン及び媒染剤溶液は低揮発性溶媒を含有する。幾つかの実施態様において、低揮発性溶媒は、グリセロール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールからなる群から選択される。
【０００８】
幾つかの実施態様において、本発明は、ヘマテインと媒染剤の別個の溶液を提供し；生物学的サンプルに対して適用の前に別個のヘマテイン溶液と媒染剤の溶液を混合してヘマテイン−媒染剤溶液を提供し；そして生物学的サンプルの細胞中の構造が染色されるような条件下で、ヘマテイン−媒染剤溶液を生物学的サンプルに対して適用することを含む、細胞を含有する生物学的サンプルを染色するための方法を提供する。
【０００９】
幾つかの実施態様において、本発明は、ヘマテインと媒染剤の別個の溶液を提供し；生物学的サンプルに対して適用の前に約３０分未満の時間、別個のヘマテイン溶液と媒染剤の溶液を混合してヘマテイン−媒染剤溶液を提供し；そして生物学的サンプルの細胞中の構造が染色されるような条件下で、ヘマテイン−媒染剤溶液を生物学的サンプルに対して適用することを含む、細胞を含有する生物学的サンプルを染色するための方法を提供する。幾つかの実施態様において、ヘマテイン溶液は半酸化ヘマテイン溶液である。幾つかの実施態様において、媒染剤溶液は硫酸アルミニウムを含有する。幾つかの実施態様において、組織はスライド上にマウントされる。幾つかの実施態様において、ヘマテイン及び媒染剤溶液は低揮発性溶媒を含有する。幾つかの実施態様において、低揮発性溶媒は、グリセロール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールからなる群から選択される。
【００１０】
幾つかの実施態様において、本発明は、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液が混合されて、ヘマテイン−媒染剤溶液を与えることができるように、第一容器と第二容器が混合容器に流体的に連結された、ヘマテイン溶液を含む第一容器と媒染剤溶液を含む第二容器；基体が基体ホルダーを占有するときに、ヘマテイン−媒染剤溶液が基体上にマウントされた生物学的サンプルに適用され得るように、混合容器と流動的に連通している基体ホルダーを含む、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上にマウントされた生物学的サンプルを染色するためのシステムを提供する。幾つかの実施態様において、混合容器は第一容器と第二容器に流体的に連結されるチューブである。幾つかの実施態様において、システムは自動化されている。幾つかの実施態様において、システムは、一以上の組織染色剤又は標識化剤を含む付加的容器を更に包含する。
【００１１】
幾つかの実施態様において、本発明は、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液が混合されて、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液が基体上にマウントされたサンプルに適用できるようにディスペンサーに流体的に連結された、ヘマテイン溶液を含む第一容器と媒染剤溶液を含む第二容器；該基体が基体ホルダーを占有するときに、ヘマテイン−媒染剤溶液が基体上にマウントされた生物学的サンプルに適用され得るように、混合容器と流動的に連通している基体ホルダーを含む、基体上にマウントされた生物学的サンプルを染色するためのシステムを提供する。
【００１２】
定義
文脈が明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ホスト化合物」は、一以上のホスト化合物、例えば２以上のホスト化合物、３以上のホスト化合物、又は実に４以上のホスト化合物を指す。
【００１３】
用語「生物学的サンプル」は、例えば、動物のような生物学的実体からから得られる、あるいは由来する任意の試料、例えばヒト又はイヌ、ネコ、ウマ又は牛などの獣医学動物から得られたサンプルを意味する。生物学的サンプルの例としては、細胞学的サンプル、組織サンプル及び体液が挙げられる。生物学的サンプルの限定しない特定例としては、血液、尿、尿道球腺液、乳頭吸引液、精液、乳汁、喀痰、粘液、胸水、骨盤液（ｐｅｌｖｉｃ ｆｌｕｉｄ）、滑液、腹水、体腔洗浄液、眼ブラッシング液（ｅｙｅ ｂｒｕｓｈｉｎｇｓ）、皮膚擦過物、頬側スワブ、膣スワブ、乳首スメア、直腸スワブ、吸引物、針生検、例えば外科手術若しくは剖検により得られる組織の切片、血漿、血清、髄液、リンパ液、汗、涙液、唾液、腫瘍、臓器、及びインビトロ細胞若しくは組織培養物から得られるサンプルを包含する。典型的には、サンプルは、固定され、水分を除去するために処理され、組織切片に切断するため、パラフィン又は他の適切な油性物質中に埋め込まれている生検サンプルであろう。生物学的サンプルは、治療及び／又は検査のために顕微鏡スライドなどの基体上にマウントすることができる。
【００１４】
本明細書で使用される用語「ヘマテイン溶液」は、一般的に、ヘマテイン（ヘマトキシリンの酸化生成物）を直接溶媒に溶解することにより形成される組成物及び、ヘマトキシリンを溶媒に溶解し、ヘマトキシリンのヘマテインへの酸化を許容する又は促進することにより形成される組成物の両方を指す。
【００１５】
本明細書で使用される用語「新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液」は、生物学的サンプルに適用する直前、例えば、生物学的サンプルに適用前に、約４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分間未満、３０分間未満、１０分間未満、５分間未満、１分間未満、３０秒間未満、及び２０秒間未満からなる群から選択される時間混合することにより、又はヘマテイン溶液と媒染剤溶液が別々に生物学的サンプルに適用され、例えばガスや空気の噴流による撹拌によりサンプル上で混合されて、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液を混合することにより調製される溶液を指す。
【００１６】
用語「酸化剤」は、第二分子よりも大きい還元電位、例えば、ヘマトキシリンと反応しヘマテインへ酸化するように、ヘマトキシリンより大きい還元電位を有する原子又は分子を指す。酸化剤は、拡散してヘマトキシリンを酸化する、大気中に自然に生じる分子酸素、及びヘマトキシリンの少なくとも一部分をヘマテインに変換するために能動的にヘマトキシリンと（典型的には溶液中で）組み合わされる「化学酸化剤」を包含する。半酸化ヘマトキシリンの溶液は、本明細書において参照によりその全体が援用されるＧｉｌｌ，Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ，１８（４）：３００−１１（１９７４）に説明されるように、酸化剤が利用可能なヘマトキシリンのおよそ半分を酸化する量で含まれる溶液である。有用な化学的酸化剤の例は、（ヨウ素酸ナトリウムおよびヨウ素酸カリウムのような）ヨウ素酸塩、酸化第二水銀、（過マンガン酸カリウムのような）過マンガン酸塩、（過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムのような）過ヨウ素酸塩、及び（過酸化水素のような）過酸化物の１種若しくはそれ以上を包含する。特定の実施態様において、化学的酸化剤はヨウ素酸ナトリウムを包含する。
【００１７】
「媒染剤」という用語は、（ヘマテインのような）色素が、核ＤＮＡ、ミエリン、弾性およびコラーゲン線維、筋線条（ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｉａｔｉｏｎｓ）およびミトコンドリアのような特定の細胞成分に（ヘマテインのような）色素を結合するのに役立つ（陽イオン性複合体のような）複合体を形成し得る、イオン性金属種を指す。媒染剤の例は、（例えば硫酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム又は硫酸アルミニウムアンモニウムのようなミョウバンの形態の）アルミニウム、鉄、タングステン、ジルコニウム、ビスマス、モリブデン（リンモリブデン酸又はモリブデン酸）、バナジウム（バナジン酸塩）を包含する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的サンプルを染色するための方法に関し、特に、ヘマトキシリン染色による生物学的サンプルを染色するための自動化方法に関する。幾つかの実施態様において、本発明は、別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液が生物学的サンプルへの適用の直前に混合される、生物学的サンプルを染色するための方法を提供する。驚くべきことに、ヘマテインと媒染剤が長時間染色溶液中に存在している溶液の使用とは対照的に、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液が適用の直前で混合されるときに、一貫した染色結果が得られることが見出された。幾つかの実施態様において、ヘマテインと媒染剤溶液は、生物学的サンプルに対する適用の前に、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分間未満、３０分未満、１０分未満、５分未満、１分未満、３０秒未満又は２０秒未満からの時間混合される。幾つかの実施態様において、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液は、生物学的サンプルへの適用前に、約１分未満、３０秒未満又は２０秒未満、混合される。
【００１９】
本発明の方法は、自動化処理システムと互換性がある。幾つかの実施態様において、本システムは、別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液を含む別々のリザーバー又は容器を包含する。幾つかの実施態様において、本システムは、溶液を生物学的サンプル、好ましくはスライド上にマウントされた生物学的サンプルへ送達する分配システムを包含する。幾つかの実施態様において、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液は、生物学的サンプルへの適用前に混合される。幾つかの実施態様において、容器又は媒染剤溶液及びヘマテイン溶液の容器は、加圧され、混合容器に流体的に連結される。混合容器は、剛性又はフレキシブルなチューブなど、混合液を保持するか又は輸送することができる任意の容器であり得る。幾つかの実施態様において、混合容器はディスペンサーに流体的に連結されるチューブである。幾つかの実施態様において、ヘマテイン溶液と媒染剤溶液は、チューブ類を経由してＴ−継ぎ手に流体的に連結される。Ｔ−継ぎ手からの出力は順にディスペンサーに流体的に連結される。これらの実施態様において、媒染剤溶液とヘマテイン溶液はＴ−継ぎ手へ送り込まれ、溶液の混合がＴ−継ぎ手から延びるチューブで生じる。幾つかの実施態様において、別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液が別々に生物学的サンプルへ分注される。これらの実施態様において、溶液は、サンプル上での拡散により混合することができ、又は機械的に、例えば、ピペットによる攪拌により混合することができる。
【００２０】
組成物の幾つかの実施態様において利用される化学酸化剤の量は、ヘマトキシリンをヘマテインへ完全に酸化するのに十分であるか、又はヘマトキシリンをヘマテインへ部分的に酸化することのみに十分であり得る。特定に実施態様において、ヘマトキシリンの半分以上が化学酸化剤によりヘマテインへと酸化され、別においては、ヘマトキシリンの半分未満が化学酸化剤によりヘマテインへと酸化される。例えば、ヘマトキシリンの１％から５０％が化学酸化剤により酸化され得るが、より典型的には、約１０％から約５０％のヘマトキシリンが化学酸化剤により酸化される。特定の実施例において、組成物中で使用される酸化剤に対するヘマトキシリンのモル比は、６：１から１：１の間である。化学酸化剤は組成物の部分と考えられるものの、ヘマトキシリンとの反応の際にその還元生成物へと変換され、その還元生成物は組成物中に残存するままであろうことは理解されるべきである。
【００２１】
組成物の媒染剤は、アルミニウム媒染剤、鉄媒染剤、ビスマス媒染剤、銅媒染剤、モリブデン媒染剤、バナジウム媒染剤、及びジルコニウム媒染剤の一又は複数など任意の媒染剤であって良い。幾つかの実施態様において、媒染剤はミョウバンを含み、より特定の実施例においては、媒染剤は、硫酸アルミニウムを含む。媒染剤は、（屈折率測定、薄層クロマトグラフィー又は分光法によって決定できる）組成物中のヘマテインの濃度より濃い濃度で存在することができ、又は組成物中のヘマテインの濃度未満の濃度で存在することができる。あるいは、幾つかの実施態様において、組成物中で媒染剤に対するヘマトキシリンのモル比は、２：１と１：１００の間であり、特定の実施態様において、組成物中で媒染剤に対するヘマトキシリンのモル比は、１：５と１：２０の間である。
【００２２】
従って、幾つかの実施態様において、本発明のヘマテイン溶液は、（ヘマテインへと酸化される）ヘマトキシリン、バッファー系、水性溶媒、及び化学酸化剤を含んでなる。幾つかの実施態様において、バッファーは、ｐＨが１から４の間の近傍でのｐＨ、例えばｐＨが２．４〜２．８を調整するのに十分な濃度で使用される。幾つかの実施態様において、バッファー系は、フタル酸及びフタル酸水素カリウムを含む。幾つかの実施態様において、ヘマトキシリンを溶解するために使用される溶媒は、水及びポリオールなど低揮発性溶剤を含有する組成物など水性組成物を含んでなる。有用なポリオールは、グリセロール、エチレングリコール、及びプロピレングリコールを包含する。幾つかの実施態様において、本発明の媒染剤溶液は、媒染剤、バッファー系、及び水性溶媒を含んでなる。幾つかの実施態様において、バッファーは、ｐＨが１から４の間の近傍でのｐＨ、例えばｐＨが２．４〜２．８を調整するのに十分な濃度で使用される。幾つかの実施態様において、バッファー系は、フタル酸及びフタル酸水素カリウムを含む。幾つかの実施態様において、媒染剤を溶解するために使用される溶媒は、水及びポリオールなど低揮発性溶剤を含有する組成物など水性組成物を含んでなる。有用なポリオールは、グリセロール、エチレングリコール、及びプロピレングリコールを包含する。
【００２３】
本明細書に開示される方法及びシステムは、既存の自動化処理システムと使用のために適合され得る。例えば、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号、第５，６５４，２００号、第６，２９６，８０９号、第６，３５２，８６１号、第６，８２７，９０１号および第６，９４３，０２９号、及び米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む、自動化された分析を実行するためのシステムおよび方法を開示する数々の米国特許の譲受人であり、それらの各々が参照により本明細書に援用される。これらのシステムは本発明と互換性を持つように適合され得る。簡単に言えば、上述した出願に記載されるスライド処理システムは、（交差汚染を最小にするために）実質的に水平位置に複数のスライドを保持しているトレイを、スライド上で様々なスライド処理操作を行うワークステーションの間で往復させる大容量のスライド処理システムである。新鮮な試薬を、処理の最中に各スライドに適用することができ、スライドはトレイで間隔を空けた様式で別々に処理されるため、試薬によるスライドの交差汚染を実質的になくすことができる。一つの構成において、そのシステムは、輻射ヒーター、複合脱パラフィン処理機／染色器／溶媒交換ワークステーション、対流式オーブン及びカバーガラスを含む。パラフィン包埋組織サンプルを有するスライドのトレイは、除去を容易にするためにサンプル中でパラフィンを広げ、また、スライドにサンプルを付着させるために、システムの輻射ヒーターの下で加熱することができる。トレイは次いで多機能脱パラフィン処理機／染色器／溶媒交換ワークステーションへ移され、そこでスライドが脱パラフィン処理され、染色され、溶媒が交換される。カバーガラス装着の用意ができている染色されたスライドのトレイは、システムのカバーガラス装着機へシャトル輸送され、そこでカバーガラスがスライド上に付加される。一度スライドにカバーガラスが装着されると、次いでトレイは対流式オーブンへと移送され、染色スライド上でカバーガラスを硬化する。説明した高容量の染色器は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚから市販で入手可能である。説明された染色システムは、任意の組織学染色工程を行うように構成されることが可能であり、典型的なＨ＆Ｅプロトコールは：スライドにサンプルを付着させるベーキング工程、パラフィン包埋サンプルからパラフィンを除去する脱パラフィン処理工程、ヘマトキシリン染色工程（開示されたヘマトキシリンの組成物を利用することができる）、ｐＨを上げかつヘマトキシリンを青色に変え、終了時点で添加されるエオシンとのより良好な対比を提供するための青色化（ｂｌｕｉｎｇ）工程、エオシン染色工程、過剰のエオシンを除去しかつ赤色のエオシンの多様な影を桃色に変えるのに使用される識別工程、１００％エタノールを使用してサンプルから水を除去するための脱水工程、スライドを高温および空気流に曝露してエタノールを除去する工程、リモネンをサンプルに分注する封入工程、ならびに硬化工程を包含する。
【００２４】
別個のヘマテイン溶液と媒染剤溶液の使用に関する本開示に概説される原理は、硫酸アルミニウム媒染剤染色の変形物に適用される一方、それらは生物学的サンプルの組織化学的染色に使用される他のヘマトキシリン−媒染剤システムに適用され得ることが理解されるべきである。ホスト化合物及び／又は抗酸化剤を添加して安定性を改良し得るミョウバン媒染ヘマトキシリン組織学的染色液の特定の例は、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、アパシー（Ａｐａｔｈｙ）、ベイカー（Ｂａｋｅｒ）、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）、ベーマー（Ｂｏｈｍｅｒ）、ボスマ（Ｂｏｓｍａ）、バラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）、カラジ（Ｃａｒａｚｚｉ）、コール（Ｃｏｌｅ）、デビデン（Ｄｅｂｉｄｅｎ）、ド・グルート（ｄｅ Ｇｒｏｏｔ）、デラフィールド（Ｄｅｌａｆｉｅｌｄ）、デュバル（Ｄｕｖａｌ）、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、フリートランダー（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ）、ガズドン（Ｇａｄｓｄｏｎ）、ゲージ（Ｇａｇｅ）、ガライアー（Ｇａｌｉｇｈｅｒ）、ガーベイ（Ｇａｒｖｅｙ）、ギル（Ｇｉｌｌ）、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、ハリス＆パワー（Ｈａｒｒｉｓ＆Ｐｏｗｅｒ）、ハウク（Ｈａｕｇ）、ホルネヨルト（Ｈｏｒｎｅｙｌｏｄ）、クライネンベルク（Ｋｌｅｉｎｅｎｂｅｒｇ）、クルツェイ（Ｋｒｕｔｓａｙ）、ランゲロン（Ｌａｎｇｅｒｏｎ）、ラウノイ（Ｌａｕｎｏｙ）、リー（Ｌｅｅ）、リリー（Ｌｉｌｌｉｅ）、ルゴール（Ｌｕｇｏｌ）、マクラクラン（ＭｃＬａｃｈｌａｎ）、マロリー（Ｍａｌｌｏｒｙ）、マン（Ｍａｎｎ）、マルチノッティ（Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉ）、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）、モルナー（Ｍｏｌｎａｒ）、パパミルディアデス（Ｐａｐａｍｉｌｔｉａｄｅｓ）、ピュージー（Ｐｕｓｅｙ）、ラウィッツ（Ｒａｗｉｔｚ）、レディ（Ｒｅｄｄｙ）、サス（Ｓａｓｓ）、シュモール（Ｓｃｈｍｏｒｌ）、スリッダー（Ｓｌｉｄｄｅｒ）、ウナ（Ｕｎｎａ）、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）およびワイゲルト＆ライト（Ｗｅｉｇｅｒｔ＆Ｗｒｉｇｈｔ）のものを包含する。鉄媒染ヘマトキシリン染色液の特定の例は、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、クレティン（Ｃｒｅｔｉｎ）、フォーレ（Ｆａｕｒｅ）、ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）、ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、ハイデンハイン（Ｈｅｉｄｅｎｈａｉｎ）、ヤンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ケファラス（Ｋｅｆａｌａｓ）、クラジアン（Ｋｒａｊｉａｎ）、クルツェイ（Ｋｒｕｔｓａｙ）、ラ・マンナ（Ｌａ Ｍａｎｎａ）、リリー（Ｌｉｌｌｉｅ）、リリー＆アール（Ｌｉｌｌｉｅ＆Ｅａｒｌｅ）、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）、モア＆バサル（Ｍｏｒｅ＆Ｂａｓｓａｌ）、マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、パキン＆ゴッダード（Ｐａｑｕｉｎ＆Ｇｏｄｄａｒｄ）、ルゴー（Ｒｅｇａｕｄ）、ロザス（Ｒｏｚａｓ）、ザイデリン（Ｓｅｉｄｅｌｉｎ）、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、ワイゲルト（Ｗｅｉｇｅｒｔ）およびヤスボイン（Ｙａｓｖｏｙｎ）のものを包含する。ビスマス媒染ヘマトキシリンはローチ＆スミス（Ｒｏａｃｈ＆Ｓｍｉｔｈ）のものである。銅媒染ヘマトキシリンはベンズレ���（Ｂｅｎｓｌｅｙ）、クック（Ｃｏｏｋ）およびフォーレ（Ｆａｕｒｅ）のものを包含する。モリブデン媒染ヘマトキシリンはヘルド（Ｈｅｌｄ）のものである。バナジウム媒染ヘマトキシリンはヘデンハイン（Ｈｅｄｅｎｈａｉｎ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）のものを包含する。ジルコニウム媒染ヘマトキシリンはマクナルティ＆スミス（ＭｃＮｕｌｔｙ＆Ｓｍｉｔｈ）のものである。こうした媒染ヘマトキシリン溶液を作成および使用する処方箋および方法は、例えば、ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ（Ｂｒｙａｎ Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎにより管理される組織技術者のためのインターネット情報源）；Ｋｉｅｒｎａｎ、“Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”、第３版Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、英国オックスフォード；及びＨｏｒｏｂｉｎとＫｉｅｒｎａｎ、“Ｃｏｎｎ’ｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎｓ：ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｄｙｅｓ，ｓｔａｉｎｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｆｏｒ ｕｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、第１０版、オックスフォード：ＢＩＯＳ，ＩＳＢＮ １８５９９６０９９５、２００２に見出し得る。
【００２５】
幾つかの実施態様において、本システムと方法は、対比染色などの更なる染色による生物学的サンプルの染色を更に包含する。幾つかの実施態様において、サンプルを対比染色液と接触させることは、エオシンＹ、オレンジＧ、ライトグリーンＳＦ黄口、ビスマルクブラウン、ファストグリーンＦＣＦ、ＯＡ−６、ＥＡ２５、ＥＡ３６、ＥＡ５０およびＥＡ６５の１種若しくはそれ以上とサンプルを接触させることを包含する。こうした対比染色液を作成する処方箋（ｆｏｒｍｕｌａ）及び方法は、例えば、ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ（Ｂｒｙａｎ Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎにより維持される組織技術者のためのインターネット情報源）；Ｋｉｅｒｎａｎ、“Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”、第３版Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、英国オックスフォード；及びＨｏｒｏｂｉｎとＫｉｅｒｎａｎ、“Ｃｏｎｎ’ｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎｓ：ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｄｙｅｓ，ｓｔａｉｎｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｆｏｒ ｕｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、第１０版、オックスフォード：ＢＩＯＳ，ＩＳＢＮ １８５９９６０９９５、２００２に見出し得る。他の実施態様において、サンプルをヘマトキシリン組成物と接触させることは進行性ヘマトキシリン染色プロトコルを包含する。他の実施態様において、サンプルをヘマトキシリン組成物と接触させることは退行性ヘマトキシリン染色プロトコルを包含する。該方法は自動化し得、そして、顕微鏡用スライドガラスのような基体上に支持される生物学的サンプルで実施し得る。特定の実施態様において、該方法は顕微鏡用スライドガラス上にマウントした組織切片若しくは細胞学サンプルを染色するのに使用する。対比染色段階をさらに包含する特定の実施態様において、該方法はＨ＆Ｅ染色法又はＰＡＰ染色法、及びより具体的には自動化Ｈ＆Ｅ又はＰＡＰ染色法であり得る。
【００２６】
本発明の染色手順と連結して有用な他の組織学的染色は、アクリジン色素、アントラキノン色素、アリールメタン色素、アゾ色素、ジアゾニウム色素、ニトロ色素、フタロシアニン色素、キニンイミン色素、テトラゾリウム色素、チアゾール色素及びキサンテン色素のような色素を包含する。組織学的染色に有用な色素の例は、アセチルイエロー、アシッドブラック１、アシッドブルー２２、アシッドブルー９３、酸性フクシン、アシッドグリーン、アシッドグリーン１、アシッドグリーン５、アシッドマゼンタ、アシッドオレンジ１０、アシッドレッド４、アシッドレッド２６、アシッドレッド２９、アシッドレッド４４、アシッドレッド５１、アシッドレッド６６、アシッドレッド７３、アシッドレッド８７、アシッドレッド９１、アシッドレッド９２、アシッドレッド９４、アシッドレッド１０１、アシッドレッド１０３、アシッドロゼイン（ａｃｉｄ ｒｏｓｅｉｎｅ）、アシッドルビン（ａｃｉｄ ｒｕｂｉｎ）、アシッドバイオレット１９、アシッドイエロー１、アシッドイエロー９、アシッドイエロー２３、アシッドイエロー２４、アシッドイエロー３６、アシッドイエロー７３、アシッドイエローＳ、アシッドイエローＴ、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アルシアンブルー、アルシアンイエロー、アルコール溶解性エオシン、アリザリン、アリザリンブルー、アリザリンブルー２ＲＣ、アリザリンカーマイン、アリザリンシアニンＢＢＳ、アリザロールシアニンＲ、アリザリンレッドＳ、アリザリンプルプリン、アルミノン、アミドブラック１０Ｂ、アミドナフトールレッド、アミドシュワルツ、アニリンブルーＷＳ、アニリンパープル、アントラセンブルーＳＷＲ、アントラセンブルーＳＷＸ、オーラミンＯ、アゾエオシン、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アゾエオシンＧ、アゾイックジアゾ５、アゾイックジアゾ４８、アゾフロキシン、アゾバンブルー、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、ベーシックブルー８、ベーシックブルー９、ベーシックブルー１２、ベーシックブルー１５、ベーシックブルー１７、ベーシックブルー２０、ベーシックブルー２６、ベーシックブラウン１、塩基性フクシン、ベーシックグリーン４、ベーシックグリーン５、ベーシックオレンジ１４、ベーシックレッド２、ベーシックレッド５、ベーシックレッド９、ベーシックバイオレット２、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット１４、ベーシックイエロー１、ベーシックイエロー２，ビーブリッヒスカーレット、ビーブリッヒスカーレットＲ、ビスマルクブラウンＹ、ブラジレイン、ブラジリン、ブリリアントクロセイン、ブリリアントクリスタルスカーレット６Ｒ、カルシウムレッド、カルミン、カルミン酸カルモイシン６Ｒ、セレスティンブルーＢ、チャイナブルー、クロランチンファストレッド５Ｂ、コヒニール、コエレスチンブルー（ｃｏｅｌｅｓｔｉｎｅ ｂｌｕｅ）、シカゴブルー４Ｂ、クロムバイオレットＣＧ、クロモトロープ２Ｒ、クロモキサンシアニンＲ、コンゴコリント、コンゴーレッド、コットンブルーコットンレッド、クロセインスカーレットクロセインスカーレット３Ｂ、クロセインスカーレットＭＯＯ、クロシン、クリスタルポンソー６Ｒ、クリスタルスカーレット、クリスタルバイオレット、ダリア（ｄａｈｌｉａ）、ダイアモンドグリーンＢ、ダイレクトブルー１４、ダイレクトブルー５８、ダイレクトレッド、ダイレクトレッド１０、ダイレクトレッド２８、ダイレクトレッド８０、ダイレクトレッド８１、ダイレクトイエロー７、デュラゾールブルー４Ｒ、デュラゾールブルー８Ｇ、エオシンＢ、エオシンＢ（ｅｏｓｉｎ ｂｌｕｉｓｈ）、エオシン、エオシンＹ、エオシンＹ（ｅｏｓｉｎ ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ）、エオシノール、エリーガーネットＢ、エリオクロムシアニンＲ、エリスロシンＢエチルエオシン、エチルグリーン、エチルバイオレット、エバンスブルー、ファーストブルーＢ、ファストグリーンＦＣＦ、ファストレッドＢ、ファストイエロー、ファストイエローエクストラ、ファストイエローＧ、ファットブラックＨＢ、フルオレセイン、緑色３号、ガレオン、ガラミンブルーガロシアニン、ゲンチアンバイオレット、ヘリオファストルビンＢＢＬ、ヘルベチアブルー、ホフマンバイオレット、ヒドラジンイエロー、インペリアルレッド、イングレインブルー１、イングレインイエロー１、ＩＮＴ、ケルメス、ケルメス酸、ケルネヒトロート、ラック、ラッカイン酸、ラウツバイオレット、ライトグリーン、リッサミンファーストイエロー、リッサミングリーンＳＦ、ルクソールファーストブルー、マゼンタ０、マゼンタＩ、マゼンタＩＩ、マゼンタＩＩＩ、マラカイトグリーン、マンチェスターブラウン、マルチウスイエロー、モーブ、モーベイン、メルブロミン、マーキュロクロム、メタニルイエロー、メチレンアズールＡ、メチレンアズールＢ、メチレンアズールＣ、メチレンブルー、メチレングリーン、メチルブルー、メチルグリーン、メチルバイオレット、メチルバイオレット２Ｂ、メチルバイオレット１０Ｂ、ミーリングイエロー３Ｇ、モーダントブルー３、モーダントブルー１０、モーダントブルー１４、モーダントブルー２３、モーダントブルー３２、モーダントブルー４５、モーダントレッド３、モーダントレッド１１、モーダントバイオレット２５、モーダントバイオレット３９、ナフタレンブルーブラック、ナフトールブルーブラック、ナフトールグリーンＢ、ナフトールイエローＳ、ナチュラルブラック１、ナチュラルレッド、ナチュラルレッド３、ナチュラルレッド４、ナチュラルレッド８、ナチュラルレッド１６、ナチュラルレッド２４、ナチュラルレッド２５、ナチュラルレッド２８、ナチュラルイエロー６、ＮＢＴ、ニュートラルレッド、ニューフクシン、ナイアガラブルー３Ｂ、ナイトブルー、ナイルブルー、ナイルブルーＡ、硫酸ナイルブルー、ナイルレッド、ニトロＢＴ、ニトロブルーテトラゾリウム、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オルセイン、パラロザニリン、パーキンバイオレット、フロキシンＢ、ピクリン酸、ポンソー２Ｒ、ポンソー６Ｒ、ポンソーＢ、ポンソードキシリジン（Ｐｏｎｃｅａｕ ｄｅ Ｘｙｌｉｄｉｎｅ）、ポンソーＳ、ポンタミンスカイブルー５Ｂ、プリムラ、プリムリン、プルプリン、ピロニンＢ、ピロニンＧ、ピロニンＹ、ローダミンＢ、ロザニリン、ローズベンガル、サフロン、サフラニンＯ、スカーレットＲスカーレットレッド、シャーラッハＲ��Ｓｃｈａｒｌａｃｈ Ｒ）、セラック、シリウスレッドＦ３Ｂ、シリウスレッド４Ｂ、シリウススープラブルーＦ３Ｒ、ソロクロームシアニンＲ、ソルブルブルー、ソルベントブラック３、ソルベントブルー３８、ソルベントレッド２３、ソルベントレッド２４、ソルベントレッド２７、ソルベントレッド４５、ソルベントイエロー９４、スピリットソルブルエオシン、スダンＩＩＩ、スダンＩＶ、スダンブラックＢ、スダンレッドＢＫ、サルファーイエローＳ、スイスブルー、タートラジン、チオフラビンＳ、チオフラビンＴ、チオニン、トルイジンブルー、トルイリンレッド、トロペオリンＧ、トリパフラビン、トリパンブルー、ウラニン、ビクトリアブルー４Ｒ、ビクトリアブルーＢ、ビクトリアブルーＲ、ビクトリアグリーンＢ、ウォーターブルーＩ、水溶性エオシン、ウッドステインスカーレット、キシリジンポンソーおよび黄口エオシン（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ ｅｏｓｉｎ）ならびにそれらの組合せを包含する。（特定の組織学的状況の又は対比染色液としての「特殊染色」手順でのような）本段落で議論される組織化学的色素溶液を作成および使用する処方箋および方法は、例えば、ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ（Ｂｒｙａｎ Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎにより管理される組織技術者のためのインターネット情報源）；Ｋｉｅｒｎａｎ、“Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”、第３版Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、英国オックスフォード；およびＨｏｒｏｂｉｎとＫｉｅｒｎａｎ、“Ｃｏｎｎ’ｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎｓ：ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｄｙｅｓ，ｓｔａｉｎｓ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｆｏｒ ｕｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、第１０版、オックスフォード：ＢＩＯＳ，ＩＳＢＮ １８５９９６０９９５、２００２に見出し得る。すぐ上で引用された２件の結合された参考文献の内容は本明細書に引用することにより組み込まれる。
【実施例】
【００２７】
実験
実施例１：
溶液の調製
以下の溶液が調製された：
2014505248.tif 000002
溶液ＡとＢに対して、プロピレングリコールがホットプレート上で６０℃で加熱される。フタル酸を添加し、固体が溶解するまで組成物を加熱する。加熱を停止し、撹拌しながらフタル酸水素カリウムのＤＩ Ｈ２Ｏ溶液をプロピレングリコール溶液に添加する。硫酸アルミニウムカリウムを固体として溶液に添加する。次いで、溶液Ａを一晩攪拌し、次いで２５ミクロンのひだ付き濾紙を用いて濾過する。ヘマトキシリンを溶液Ｂに添加し、組成物をおよそ１５分間攪拌する。固体のヨウ素酸ナトリウムを添加し、溶液を一晩撹拌し、次いで２５ミクロンのひだ付き濾紙を用いて濾過した。
【００２８】
実施例２：
生物学的サンプルの染色
材料：ＫＡｌ（ＳＯ４）２緩衝溶液（２倍の強度；２ｘ溶液Ａ）；ヘマテイン緩衝溶液（２倍の強度；２Ｘ溶液Ｂ），５０／５０プロピレングリコールｌ／Ｈ２Ｏ）１％Ｍｅｒｐｏｌ洗浄剤を含む；５０／５０ ０．１ Ｔｒｉｓブルーイング；９５％プロピレングリコール；輸送液体；３Ｘ３ＭＴＢスライド。
【００２９】
以下のプロトコールが、厚膜（オープン）ボックスで使用された。スライドは手動で脱パラフィン処理され、軽くブロットし、ボックスに配置された。４００μＬの２×溶液Ａが組織に分注され、直ちに４００μＬの２×溶液Ｂが分注された。次いでスライドを３分間インキュベートした。次いで、スライドを８００μＬの１％水性Ｍｅｒｐｏｌで１０秒間２回すすいだ。次いで、スライドを８００μＬの９５％のプロピレングリコールで１０秒間処理した。次に、スライドを８００μＬの輸送液体で１０秒間３回すすいだ、次いで、カバーガラスがサクラＴｉｓｓｕｅＴｅｋ機器にアプライされる。
【００３０】
このプロトコールは複製スライド並びに以下の修飾を含むスライド上で使用された。２枚のスライドは混合しない別個の溶液ＡとＢとともに６分間インキュベートされ、そして２枚のスライドはピペットで溶液Ｂを添加五に手動で混合された溶液ＡとＢとともに８分間インキュベートした。
【００３１】
実施例３：
二成分染色溶液の調製
溶液Ａ：０．７５Ｍフタル酸緩衝ＫＡｌ（ＳＯ４）２．２５０ｍｌのプロピレングリコールに８．９７ｇのフタル酸が添加され、その混合物は固体が溶解するまで６０℃で攪拌される。フタル酸水素カリウム溶液（７５０ｍＬのＤＩ Ｈ２Ｏ中に４．３ｇ）を攪拌して添加し、その溶液を加熱から外す。次いで、１２．０ｇ ＫＡｌ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏを添加し、その混合物はそれが均一になるまで攪拌される。次いで、溶液を濾過する。ｐＨは２．５９である。
【００３２】
溶液Ｂ：０．７５Ｍのフタル酸緩衝化ヘマテイン。２５０ｍＬのプロピレングリコールに８．９７ｇのフタル酸が添加され、その混合物は固体が溶解するまで６０℃で攪拌される。フタル酸水素カリウム溶液（７５０ｍＬのＤＩ Ｈ２Ｏ中に４．３ｇ）を攪拌して添加し、その溶液を加熱から外す。１２．０ｇのヘマトキシリンを攪拌して添加する。１５〜２０分後に、１．２ｇのヨウ素酸ナトリウムを添加し、混合物を一晩攪拌する。次いで、溶液を濾過する。ｐＨは２．７１である。
【００３３】
これらの溶液が以下に記載される実験で使用された。
【００３４】
実施例４：
染色溶液の自動化混合
別個のＡとＢの溶液を実験用回路板上のボトルに入れ、ボトルからの出力をＴ−継ぎ手により連結し、２つの別個の溶液を予混合させた。スライド（３×３手動で脱パラフィン処理済）が開放された薄膜染色箱に配置され、組織は組織の乾燥を予防するために、８００μＬの５０／５０プロピレングリコール／Ｈ２Ｏ混合物で覆われた。上記の予混合装置が加圧され、２〜３ｍＬの溶液がチューブに分注され、開放薄膜箱へと移された。５０／５０溶液が組織サンプルからエアナイブされ（ａｉｒ−ｋｎｉｖｅｄ）、８００μＬの予混合溶液ＡとＢがスライドの上に分注された。スライドを３分間インキュベートし、次いで、実施例２のプロトコールからの残りの工程が実施された。この手順が追加のスライドで、染色混合物による３分間の反復処置が繰り返され（即ち、２回の３分間のインキュベーション）、６分間のインキュベーションを含む。次いで、実施例２のプロトコールからの残りの工程が実施された。
【００３５】
実施例５：
生物学的サンプルの染色
上述された新鮮な溶液が二成分ヘマトキシリン染色の実証用にスライドを染色するために使用された。全てのスライドが、実施例４に記載されるように加圧された実験用回路板装置を用いて作成された混合物で染色された。４枚のスライドが、３又は６分間のインキュベーションで重複して染色された。染色の適用後に、スライドを実施例２に記載されるように処理した。スライドは、核染色強度について病理学者によって評価された。スライドは、ヘマトキシリンと媒染剤が実験前に長時間混合された伝統的なヘマテイン溶液（ＮＧＨ ＩＩＩとして表記）で染色されたスライドに対して比較された。
以下の処置が試験された：
処置
2014505248.tif 000003
新鮮なヘマテイン−媒染剤溶液を使用すると満足のいく染色結果が得られることが見いだされた。
【００３６】
実施例６：
生物学的サンプルの染色
二成分染色溶液は、構成化学物質の化学量論（アルミニウム塩／ヘマテイン）が、適切な溶液濃度の調整を介して維持されるという条件で、異なる体積の各成分を混合することにより用いることができる。本発明の更なる実例は、実施例３からの溶液Ｂに対する別の処方により例示される。ヘマトキシリン（２．４ｇ）が５０ｍＬのプロピレングリコールに攪拌して添加され、続いて１５０ｍＬのＤＩ Ｈ２Ｏが添加された。ひとたび全ての固体が溶解すると、ヨウ素酸ナトリウム（０．２４ｇ）が添加され、その混合物が一晩攪拌されると染色実験される状態となる（溶液Ｂ１）。ヘマテインの濃度が減少したが、緩衝系は０．０７５Ｍで維持されたヘマテイン含有溶液の別の実施態様が以下により例示される：プロピレングリコール（３１．２５ｍＬ）が６０℃に加熱され、フタル酸（１．１２ｇ）が溶解するまで攪拌して添加された。加熱から混合物を外し、９３．７５ｍＬのＤＩ Ｈ２Ｏ中のフタル酸水素カリウム（０．５４ｇ）の溶液をそれに添加する。ヘマトキシリン（１．０ｇ）が次に攪拌して添加され、溶解後に、ヨウ素酸ナトリウム（０．１ｇ）が添加され、その混合物が一晩攪拌された。濾過後に、混合物が使用される状態となった（溶液Ｂ２）。
【００３７】
ヘマテインの濃度と緩衝系の濃度の両方が減少した更に別の実施態様は以下により説明される：プロピレングリコール（３１．２５ｍＬ）が６０℃に加熱され、フタル酸（０．５６ｇ）が溶解するまで攪拌して添加された。加熱から混合物を外し、９３．７５ｍＬのＤＩ Ｈ２Ｏ中のフタル酸水素カリウム（０．２７ｇ）の溶液をそれに添加する。ヘマトキシリン（１．０ｇ）が次に攪拌して添加され、溶解後に、ヨウ素酸ナトリウム（０．１ｇ）が添加され、その混合物が一晩攪拌された。濾過後に、混合物が使用される状態となった（溶液Ｂ３）。
【００３８】
これらの実施例は、沈殿物を形成することに向いたそれらの相対的傾向を評価するために、種々の金属と接触して上昇した温度における安定性について全て試験された。この試験において、上述されたヘマテイン溶液の各製剤の２５ｍＬアリコートが、テフロン密封されたふた付きホウケイ酸ガラス瓶に分注され、次いで、４５℃のオーブンに配置された。３３．５日［室温（ＲＴ）で１２ヶ月におよそ相当する］にわたって各週に、溶液が検査され、任意の変化が書き留められた。各液体において、コントロールが４５℃とＲＴで確保された。シンフォニーＮ２＋ヘマトキシリン溶液の標準的な製剤が、参考のために試験された。シンフォニーＮ２＋ヘマトキシリン溶液は、米国特許出願公開第２００８／０２２７１４３号の図２の製剤２に記載され、その全内容は参照により本明細書に援用される。
2014505248.tif 000004
【００３９】
上記の明細書に記載されている全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に援用される。本発明の記載された方法及びシステムの様々な変更及び変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して説明されてきたが、請求された発明が不当にそのような特定の実施態様に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明の分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された方法の様々な変更は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【国際調査報告】
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