(57)【要約】核酸の分析のための改善された方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。これらの改善された方法、組成物およびキットは、サンプル中の核酸のコピー数推定を可能にし得る。サンプル中の標的核酸の２つ以上のコピーの連鎖（例えば、該２つ以上のコピーが同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのか）を決定するための、または対立遺伝子をフェージングするための方法、組成物およびキットも本明細書において提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、
ａ．少なくとも１つの薬剤と、第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルとを接触させる工程；
ｂ．前記薬剤が、前記２つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に位置するときに前記２つの標的核酸間の特異的に選択された標的部位を開裂させて、その結果、前記２つの標的核酸を分離できるようにする条件に、前記サンプルを供する工程；
ｃ．前記薬剤と接触した前記サンプルを複数の空間的に孤立した区画に分ける工程；
ｄ．前記標的核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数する工程；ならびに
ｅ．前記計数する工程に基づき前記標的核酸のコピー数を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記空間的に孤立した区画が、エマルジョン中の液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が、１液滴につき約５コピー未満の平均濃度で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記特異的に選択された標的部位が、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を増幅反応に供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同一配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、異なる配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記特異的に選択された標的部位が、制限酵素での消化が可能な部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、１つ以上の制限酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記特異的に選択された部位および前記第一の標的核酸が、同じ遺伝子内に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が、疾患または障害と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
参照核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照核酸が、前記サンプルが由来するゲノム内に固定コピー数で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照核酸が、ハウスキーピング遺伝子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記参照核酸が、前記サンプルが由来する二倍体ゲノム１つにつき２コピーで存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸のコピー数を決定する工程が、計数された標的核酸の数を計数された参照核酸の数で割ることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、前記標的核酸の配列を切断しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、前記参照核酸の配列を切断しない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸が、単一ポリヌクレオチド上に複数のコピーで存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の制限酵素が、前記２つの標的配列の間に１つより多い認識配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の制限酵素が、有意なスター活性を呈さない、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の制限酵素が、２つ以上の制限酵素を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の制限酵素を選択するためにソフトウェアが使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の制限酵素が、前記ポリヌクレオチドを消化した後に熱不活化される、請求項９に記載の方法。
【請求項２５】
前記熱不活化の温度が、制限された標的断片の融点よりも、前記標的断片の二本鎖性を維持するために、低い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の制限酵素による核酸の消化の効率を測定するために対照制限酵素消化が行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプル中の断片化される連鎖した標的配列の百分率が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、
ａ．複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを提供する工程であって、前記複数のポリヌクレオチドは、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド内に位置する第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む、工程；
ｂ．前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド中に存在するとき、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間で開裂させて、開裂されたサンプルを形成する工程；
ｃ．前記開裂されたサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分ける工程；
ｄ．前記標的核酸を含む空間的に孤立した領域の数を計数する工程；ならびに
ｅ．少なくとも２つの前記標的核酸のうちの２つが同じポリヌクレオチドの同じ領域内に位置する場合、前記計数する工程に基づき前記標的核酸のコピー数を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
１メガベース未満の塩基が、前記２つの標的核酸を隔てている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１キロベース未満の塩基が、前記２つの標的核酸を隔てている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記開裂する工程が、制限酵素で果たされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の空間的に孤立した領域が、エマルジョン中の液滴である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
工程ｄの計数する工程の前にＰＣＲ反応を行う工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
シークエンシング反応を含まない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、
ａ．（ｉ）複数のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、第一標的核酸、および前記第一標的核酸のコピーを含む、複数のポリヌクレオチドと（ｉｉ）前記標的核酸を検出するための蛍光標識を有するプローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程；
ｂ．平均で５未満の標的核酸を含む複数の空間的に孤立した区画に前記サンプルを分ける工程；
ｃ．前記標的核酸を検出するために前記サンプルをＰＣＲ増幅反応に供する工程；
ｄ．前記ＰＣＲ反応のための前記試薬のいずれかが限界になる前に前記蛍光標識の蛍光強度を検出する工程であって、ここで、区画内のより高い蛍光強度がポリヌクレオチド上の１つより多くの標的核酸の存在の指標となる、工程；
ｅ．前記標的核酸の１個のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程；
ｆ．前記標的核酸の複数のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程；ならびに
ｇ．（ｉ）工程ｅおよび工程ｆにおいて得た数に基づいて前記標的核酸のコピー数を算出する工程、または（ｉｉ）２つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に存在するかどうかを決定する工程のいずれか
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記標的核酸のコピー数増加が、疾患または障害と相関する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
同じポリヌクレオチド上に存在する場合の複数の標的核酸を同定する方法であって、
ａ．第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも２つのサブサンプルを分ける工程；
ｂ．前記第一の標的核酸と第二の標的核酸を、それらが同じポリヌクレオチド上に存在する場合に物理的に分離することが可能な薬剤と第一のサブサンプルとを接触させる工程；
ｃ．工程ｂの後、前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程；
ｄ．前記第一セットの区画の中の前記標的核酸を含む区画の数を決定する工程；
ｅ．第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程；
ｆ．前記第二セットの区画の中の標的核酸を含む区画の数を決定する工程；ならびに
ｇ．工程ｄで得た値と工程ｆで得た値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じポリヌクレオチド内に存在するかどうかを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じ配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤が、制限酵素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
工程ｄにおいて得た数が、工程ｆにおいて得た数より有意に高いとき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の連鎖が示される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記制限酵素が、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間の部位を認識する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
第一の標的配列および第二の標的配列が、互いに１メガベース未満以内に位置する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプルを１つ以上の制限酵素と接触させた後、前記サブサンプルを分ける前に２４時間未満の間、前記サンプルが保管される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的配列が、前記第二のサブサンプルでは物理的に分離されない、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのかを決定する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記第一の標的核酸の配列が、前記第二の標的核酸の配列と異なる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記第一の標的核酸の配列が、前記第二の標的核酸の遺伝的変異である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝的変異が、一塩基多型である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じ遺伝子内にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つが染色体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、別々の染色体上に位置する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第一の標的核酸および第二の標的核酸が、同じ染色体上に位置する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記染色体の少なくとも一方が、前記第一の標的核酸の２個のコピーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記染色体の少なくとも一方が、前記第一の標的核酸の少なくとも３個のコピーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記制限酵素のうちの１つ以上が、メチル感受性制限酵素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
サンプル中のポリヌクレオチドの断片化の確率を決定する方法であって、
ａ．（ｉ）複数のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む、複数のポリヌクレオチドと（ｉｉ）前記第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと（ｉｉｉ）前記第二の標的核酸を検出するための第二の標識プローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程；
ｂ．前記サンプルを、平均で５未満の標的ポリヌクレオチドを含む複数の空間的に孤立した区画に分ける工程；
ｃ．前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を検出するために、前記サンプルをＰＣＲ増幅反応に供する工程；
ｄ．前記区画内の前記標識プローブを検出する工程；
ｅ．工程ｄに基づき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数を計数する工程；ならびに
ｆ．前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数と前記サンプルの断片化の程度とを相関させる工程
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、１メガベース以内で離れている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
健常被験体では、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が１キロベースより多い塩基によって隔てられている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
第一の標的核酸および第二の標的核酸の両方を含有する区画の期待数を、前記標的核酸が物理的に連鎖している場合に算出する工程をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記断片化の確率が、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含有する区画数の減少と正に相関する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドのサンプル中の２つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の断片化の確率を決定するための方法であって、
ａ．前記サンプルを用いてデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を行う工程であって、ここで、前記ｄＰＣＲは、前記ポリヌクレオチドを分離されたユニットに分離することを含む、工程；
ｂ．第一の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と前記第一の遺伝子座および第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数との第一の合計を決定する工程；
ｃ．前記第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数との第二の合計を決定する工程；ならびに
ｄ．前記第一の合計および前記第二の合計をアルゴリズムにインプットして、断片化されている前記サンプル中の前記２つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の百分率を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項６２】
前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドが、部分的に分解される、請求項５６または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項５６または６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項５６または６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、請求項５６または６１に記載の方法。
【請求項６６】
ハプロタイプ分析方法であって、
（Ａ）核酸を含有する水性相を複数の別個の容積に分配する工程；
（Ｂ）前記核酸内の配列変動を呈する第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも１つの対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程；
（Ｃ）同じ容積内の両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも１つの測定値を決定する工程；ならびに
（Ｄ）共増幅の前記少なくとも１つの測定値に基づき、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。
【請求項６７】
前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座が、前記核酸の標的領域内に含有され、前記分配する工程が、１容積につき数コピー未満の前記標的領域という平均濃度をもたらす結果となる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記分配する工程が、１容積につき約５コピー未満の前記標的領域という平均濃度をもたらす結果となる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸が、二倍体被験体から得られる、または二倍体被験体に由来する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの測定値を決定する工程が、同じ容積からの前記第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データと相関する前記第一の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データについての少なくとも１つの相関係数を決定する工程を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの測定値を決定する工程が、同じ容積からの前記第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データとそれぞれ相関する前記第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列および第二の対立遺伝子配列の対立遺伝子特異的増幅データについての第一の相関係数および第二の相関係数を決定する工程をさらに含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、前記第一の相関係数と前記第二の相関係数を互いに比較する工程に基づく、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの測定値を決定する工程が、前記第一の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列と前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列との共増幅を呈する容積の数を決定する工程を含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、前記容積の数に基づく、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記容積の数を決定する工程が、前記第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列または第二の対立遺伝子配列と前記第二遺伝子座の特定の対立遺伝子配列とのそれぞれの共増幅を呈する、容積の第一の数および容積の第二の数を決定する工程を含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、容積の第一の数および容積の第二の数に基づく、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記分配する工程が、前記容積が液滴であるエマルジョンを形成する工程を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
ハプロタイプ分析方法であって、
（Ａ）核酸を含有する水性相を複数の別個の容積に分配する工程；
（Ｂ）前記核酸内の標的領域に含有される第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも１つの対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程；
（Ｃ）個々の容積からの各々の前記遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集する工程；
（Ｄ）同じ容積からの前記第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと前記第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを相関させる工程；ならびに
（Ｅ）前記相関させる工程に基づき、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座についての前記標的領域のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記分配する工程が、エマルジョンを形成する工程を含み、かつ前記収集する工程が、前記エマルジョンの個々の液滴からのデータを収集する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記エマルジョンを形成する工程が、前記水性相をオリフィスに通して、前記水性相の単分散液滴を生じさせる工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記分配する工程が、各容積に平均で約１コピー未満の前記標的領域を配置する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記分配する工程が、各容積に平均で約１ゲノム当量未満の前記核酸を配置する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記分配する工程が、少なくとも約１０００容積を形成する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記分配する工程が、直径が約１０から１０００マイクロメートルである液滴を形成する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記分配する工程が、増幅された各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができる光学的に区別可能な蛍光プローブを含む水性相を分配する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸が、被験体から得た遺伝物質である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
前記被験体が多細胞生物である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記被験体が人である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸が、被験体から得たＲＮＡの逆転写によって得たｃＤＮＡを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
前記増幅させる工程が、前記第一の遺伝子座から１対の異なる対立遺伝子配列を増幅させる工程を含み、かつ前記データを収集する工程が、個々の液滴中の前記対の各対立遺伝子配列の増幅を区別するデータを収集する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８８】
前記相関させる工程が、前記第一の遺伝子座の各対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データを前記第二の遺伝子座の対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データと別々に相関させる工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８９】
前記ハプロタイプを選択する工程が、前記第一の遺伝子座についてのどの対立遺伝子特異的増幅データが前記第二の遺伝子座についてのかかる対立遺伝子特異的増幅データとのより高い相関を呈するかに基づく、請求項７５に記載の方法。
【請求項９０】
前記収集する工程が、前記容積から逐次的にデータを収集する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項９１】
前記相関させる工程が、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の増幅データについての少なくとも１つの相関係数を決定する工程を含み、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程が、前記少なくとも１つの相関係数に基づく、請求項７５に記載の方法。
【請求項９２】
前記ハプロタイプを選択する工程が、前記第一の遺伝子座から増幅されたそれぞれの別個の対立遺伝子配列に対応する相関係数に基づく、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
閾値を前記対立遺伝子特異的増幅データに適用してそれをバイナリ形式に変換する工程をさらに含み、前記相関させる工程が、前記バイナリ形式のデータを用いて行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項９４】
前記相関させる工程が、両方の遺伝子座からの特定の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の数を決定する工程を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記相関させる工程が、（１）前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第一の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の第一の数、および前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第二の対立遺伝子配列の共増幅を呈する液滴の第二の数を決定する工程、および（２）容積の前記第一の数と前記第二の数を比較する工程を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ハプロタイプを選択する工程が、前記相関させる工程が、同じ容積内の前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列の共増幅について負の相関を示すか、正の相関を示すかに基づく、請求項７５に記載の方法。
【請求項９７】
ハプロタイプ分析方法であって、
（Ａ）核酸を含む水性相を複数の別個の容積に分配する工程；
（Ｂ）前記核酸内の第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程；
（Ｃ）個々の容積中の各対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データを収集する工程；ならびに
（Ｄ）前記増幅データが同じ容積内の前記対立遺伝子配列の増幅について負の相関を示すか、正の相関を示すかに少なくとも一部は基づいて、前記核酸のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。
【請求項９８】
ハプロタイプ分析方法であって、
（Ａ）核酸を含有する水性相を、複数の液滴に、前記核酸の標的領域が１液滴につき約１コピー未満の平均濃度で存在するように分配する工程；
（Ｂ）前記核酸の配列変動を呈し、かつ前記標的領域に含有される第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも１つの対立遺伝子配列を前記液滴内で増幅させる工程；
（Ｃ）同じ液滴内での両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも１つの測定値を決定する工程；ならびに
（Ｄ）共増幅の前記少なくとも１つの測定値に基づき前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座についての前記標的領域のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。
【請求項９９】
前記増幅させる工程が、前記第一の遺伝子座から第一の対立遺伝子配列および第二の対立遺伝子配列を増幅させる工程を含み、かつ前記決定する工程が、前記第一の対立遺伝子配列についての共増幅の第一の測定値および前記第二の対立遺伝子配列についての共増幅の第二の測定値を決定する工程を含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、共増幅の前記第一の測定値および前記第二の測定値の比較に基づく、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ハプロタイプ分析用システムであって、
核酸を含む水性相の液滴を形成するように構成された液滴発生器と、
個々の液滴からの各々の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集するように構成された検出器と、
同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データとを相関させ、かつ前記対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座についての前記核酸のハプロタイプを選択するように構成されたプロセッサと
を備える、システム。
【請求項１０１】
第一の標的核酸が第二の標的核酸と同じポリヌクレオチド上に存在する確率を決定するための方法であって、
ａ）ポリヌクレオチドのサンプルを少なくとも２つのサブサンプルに分割する工程；
ｂ）第一のサブサンプルにおいて、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸をショートサイクルＰＣＲで事前増幅させる工程；
ｃ）前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程；
ｄ）前記第一のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程；
ｅ）第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程；
ｆ）前記第二のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程；ならびに
ｇ）工程ｆの値と工程ｄの値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上で連鎖している確率を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０２】
前記ショートサイクルＰＣＲが、２４サイクル未満のＰＣＲ反応を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
アルゴリズムを使用して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上でフェージングされる確率を決定する工程をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
染色体からの標的核酸の欠失の確率を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）１対の染色体であって、前記染色体の少なくとも一方が第一の標的核酸を含有し、かつ両方の染色体が同じマーカー核酸を含有する、１対の染色体と（ｉｉ）前記第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと（ｉｉｉ）前記マーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程；
（ｂ）増幅反応を行って、前記区画内の前記第一の標的核酸および前記マーカー核酸を検出する工程；
（ｃ）前記マーカー核酸を含有し、標的核酸を含有しない区画の数を計数する工程；ならびに
（ｄ）工程ｃの値に基づき前記染色体の少なくとも一方からの前記標的核酸の欠失の確率を決定する工程を包含し、
ここで、工程ｃにおけるより高い値は、前記標的核酸が前記一対の染色体内の前記染色体の一方に不在である確率の増大と相関する、方法。
【請求項１０５】
前記標的核酸が、前記染色体の少なくとも一方の上に複数のコピーで存在すると推測される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記マーカー核酸および前記標的核酸が、前記染色体の少なくとも一方の上に互いに極めて近接して位置する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記マーカー核酸と前記標的核酸とが、５０００塩基対以内、離れている、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記マーカー核酸が、一塩基多型を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
工程ｄの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていることの決定によって強化される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
別のアッセイを行って、前記サンプル中の高分子量ＤＮＡの存在を決定する工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
ポリヌクレオチドからの標的領域の欠失または転座の確率を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）第一のマーカー核酸および第二のマーカー核酸を含むと推測されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸が少なくとも１メガベースの塩基によって隔てられており、かつ前記標的領域が前記第一のマーカー核酸と前記第二のマーカー核酸との間に位置すると推測される、ポリヌクレオチドと（ｉｉ）前記第一のマーカー核酸を検出するための第一の標識プローブと（ｉｉｉ）前記第二のマーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程；
（ｂ）増幅反応を行って、前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸を検出する工程；
（ｃ）前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸の両方を含有する区画の数を計数する工程；ならびに
（ｄ）工程ｃの値に基づいて前記標的領域の欠失または転座の確率を決定する工程を包含し、
ここで、工程ｃにおけるより高い値は、前記標的核酸が前記ポリヌクレオチドに不在である確率の増大と相関する、方法。
【請求項１１３】
前記ポリヌクレオチドが染色体である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記標的領域が、野生型被験体に存在することが公知の染色体の特異的領域である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
工程ｄの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失または転座の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていないことの決定によって強化される、請求項１１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１１年２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，２０９号；２０１１年２月１８日に出願された同第６１／４４４，５３９号；２０１１年３月１８日に出願された同第６１／４５４，３７３号；２０１１年４月１５日に出願された同第６１／４７６，１１５号；２０１１年４月２５日に出願された同第６１／４７８，７７７号；２０１１年５月９日に出願された同第６１／４８４，１９７号；ならびに２０１１年５月２５日に出願された同第６１／４９０，０５５号（これらの出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
被験体からのサンプル中の標的核酸のコピー数を決定することにより、様々な臨床応用に有用な情報を得ることができる。しかし、標的核酸のコピー数を決定するための一部のアッセイは、標的核酸の複数のコピーがサンプル中の同じポリヌクレオチド上にある場合、標的核酸のコピー数を過小推定することがある。例えば、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）の場合、標的配列の２個のコピーを含む空間的に孤立したポリヌクレオチドは、標的核酸の１個のコピーしか有さないとカウントされることがある。標的核酸配列の連鎖（例えば、標的核酸配列の複数のコピーがサンプル中の同じポリヌクレオチド上にあるのかどうか）を考慮に入れる、ｄＰＣＲアッセイなどのアッセイでの核酸標的配列のコピー数推定のための改善された方法、組成物およびキットが必要とされている。
【０００３】
隣接多型のハプロタイプまたはフェージングの知識は、様々な設定に有用であり得る。人の各々の体細胞において各染色体タイプは１対の個々の染色体の二倍で表されるので、ヒトは二倍体生物である。この対の一方のコピーはその人の父親から遺伝され、他方のコピーはその人の母親から遺伝される。したがって、殆どの遺伝子は、各二倍体細胞に２個のコピーとして存在する。しかし、前記コピーは、配列の変動が該コピー間で発生して、対立遺伝子として公知の別個の配列を形成する、多くの遺伝子座を一般に有する。
【０００４】
染色体対の個々の染色体各々についての対立遺伝子のパターン、ハプロタイプ、を知ることは、多くの場合、有用であり得る。例えば、ある人が遺伝子内の２つの異なる遺伝子座に不活性化変異を有する場合、該変異は、同じ個々の染色体上に一緒に存在する場合にはあまり重要でないだろうが、染色体対の個々の染色体両方の間に分布している場合は大きな効果を発揮するだろう。最初のケースでは、遺伝子の一方のコピーは、２つの異なる遺伝子座で不活性化されるが、他方のコピーは、活性遺伝子産物を供給するために利用可能である。第二のケースでは、遺伝子の各コピーが不活性化変異の１つを有し、そのためいずれの遺伝子コピーも活性遺伝子産物を供給しない。問題となる遺伝子によっては、遺伝子の両方のコピーの変異は、数ある中でも生育不能表現型、疾患リスク増加、またはある種の薬物の代謝不能をはじめとする、様々な生理的帰結につながり得る。
【０００５】
ハプロタイプに関する情報は、生命科学応用のための、医療分野のための、および法医学などの応用マーケットに関する有用な情報であり得る。ヒト（および非ヒト）遺伝学の多くの状況でハプロタイプ決定（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）の問題が生ずる。例えば、多くの遺伝的関連性がハプロタイプに結びつけられ、それ故、ハプロタイプによって予測される。ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）領域は、特定の遺伝性疾患が主要組織適合性複合体の様々なハプロタイプと関連づけられている１つの顕著な例である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の遺伝子型決定技術は、配列変動、例えばＳＮＰ（一塩基多型）、の異なる遺伝子座を互いに孤立して照合する。したがって、これらの技術は、遺伝物質のサンプルにおいて一対の別個の対立遺伝子が２つの連鎖遺伝子座の各々に存在することを確信的に決定することができる。しかし、これらの技術は、２つの遺伝子座からの対立遺伝子のどの組み合わせが同じ染色体コピー上に位置するのかを告げることはできない。この障害を克服するためにハプロタイプを決定するための新規アプローチが必要とされている。
【０００７】
同様に、サンプル中の２つの標的核酸配列間での断片化の確率の決定、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のサンプル中の分解レベルの決定、選択的スプライシングの評価、または逆位、転座もしくは欠失の検出のための新規方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一部の態様において、本開示は、標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、ａ．少なくとも１つの薬剤と、第一および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルとを接触させる工程；ｂ．前記薬剤が、前記２つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に位置するときに該２つの標的核酸間の特異的に選択された標的部位を開裂させて、その結果、該２つの標的核酸を分離できるようにする条件に、前記サンプルを供する工程；ｃ．前記薬剤と接触した前記サンプルを複数の空間的に孤立した区画に分ける工程；ｄ．前記標的核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数する工程；ならびにｅ．前記計数する工程に基づき前記標的核酸のコピー数を決定する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記空間的に孤立した区画は、エマルジョン中の液滴である。一部の実施形態において、前記標的核酸は、１液滴につき約５コピー未満、１液滴につき約４コピー未満、１液滴につき約３コピー未満、１液滴につき約２コピー未満、または１液滴につき約１コピー未満の平均濃度で存在する。一部の実施形態において、前記特異的に選択された標的部位は、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間に位置する。一部の実施形態において、前記方法は、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を増幅反応に供する工程をさらに含む。
【０００９】
本態様の一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同一のまたはほぼ同一の配列を有する。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、異なる配列を有する。一部の実施形態において、前記特異的に選択された標的部位は、制限酵素での消化が可能な部位である。一部の実施形態において、前記薬剤は、１つ以上の制限酵素である。一部の実施形態において、前記特異的に選択された部位および前記第一の標的核酸は、同じ遺伝子内に位置する。一部の実施形態において、前記標的核酸は、疾患または障害と相関する。一部の実施形態において、前記方法は、参照核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数（カウント）する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記参照核酸は、前記サンプルが由来するゲノム内に固定コピー数で存在する。一部の実施形態において、前記参照核酸は、ハウスキーピング遺伝子である。一部の実施形態において、前記参照核酸は、前記サンプルが由来する二倍体ゲノム１つにつき２コピーで存在する。一部の実施形態において、前記標的核酸のコピー数を決定する工程は、計数された標的核酸の数を計数された参照核酸の数で割ることを含む。
【００１０】
本態様の一部の実施形態において、前記薬剤は、前記標的核酸の配列を切断しない。一部の実施形態において、前記薬剤は、前記参照核酸の配列を切断しない。一部の実施形態において、前記標的核酸は、単一ポリヌクレオチド上に複数のコピーで存在する。一部の実施形態において、前記１つ以上の制限酵素は、前記２つの標的配列の間に１つより多い認識配列を有する。一部の実施形態において、前記１つ以上の制限酵素は、有意なスター活性を呈さない。一部の実施形態において、前記１つ以上の制限酵素は、２つ以上の制限酵素を含む。一部の実施形態では、ソフトウェアを使用して、前記１つ以上の制限酵素を選択する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドを消化した後に前記１つ以上の制限酵素を熱不活化する。一部の実施形態において、標的断片の二本鎖性を維持するために、前記熱不活化の温度は、該制限された標的断片の融点より低い。一部の実施形態では、前記１つ以上の制限酵素による核酸の消化の効率を測定するために対照制限酵素消化（ｄｉｇｅｓｔ）を行う。一部の実施形態では、前記サンプル中の断片化される連鎖した標的配列の百分率を決定する。
【００１１】
もう１つの態様において、本開示は、核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、ａ．複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを提供する工程（該複数は、該複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド内に位置する第一および第二の標的核酸を含む）；ｂ．前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド中に存在するとき、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記第一の標的核酸と第二の標的核酸との間で開裂させて、開裂されたサンプルを形成する工程；ｃ．前記開裂されたサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分ける工程；ｄ．前記標的核酸を含む空間的に孤立した領域の数を計数する工程；ならびにｅ．少なくとも２つの標的核酸のうちの２つが同じポリヌクレオチドの同じ領域内に位置する場合、前記標的核酸のコピー数を前記計数する工程に基づき決定する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、１メガベース未満の塩基が前記２つの標的核酸を隔てている。一部の実施形態では、１キロベース未満の塩基が前記２つの標的核酸を隔てている。一部の実施形態では、前記開裂を制限酵素で果たす。一部の実施形態において、前記複数の空間的に孤立した領域は、エマルジョン中の液滴である。一部の実施形態において、前記方法は、工程ｄの計数の前にＰＣＲ反応を行う工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、シークエンシング反応を含まない。
【００１３】
もう１つの態様において、前記方法は、標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、ａ．（ｉ）複数のポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、第一標的核酸、および該第一標的核酸のコピーを含む）と（ｉｉ）前記標的核酸を検出するための蛍光標識を有するプローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程；ｂ．平均で５未満の標的核酸を含む複数の空間的に孤立した区画に前記サンプルを分ける工程；ｃ．前記標的核酸を検出するために前記サンプルをＰＣＲ増幅反応に供する工程；ｄ．前記ＰＣＲ反応のための試薬のいずれかが限界になる前に前記蛍光標識の蛍光強度を検出する工程（この場合、区画内のより高い蛍光強度がポリヌクレオチド上の１つより多くの標的核酸の存在の指標となる）；ｅ．前記標的核酸の１個のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程；ｆ．前記標的核酸の複数のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程；ならびにｇ．（ｉ）工程ｅおよび工程ｆにおいて得た数に基づいて前記標的核酸のコピー数を算出する工程、または（ｉｉ）２つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に存在するかどうかを決定する工程のいずれかを含む方法を含む。
【００１４】
一部の実施形態において、前記標的核酸のコピー数増加は、疾患または障害と相関する。
【００１５】
さらにもう１つの態様において、本開示は、同じポリヌクレオチド上に存在する場合の複数の標的核酸を同定する方法であって、ａ．第一および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも２つのサブサンプルを分ける工程；ｂ．前記第一の標的核酸と第二の標的核酸を、それらが同じポリヌクレオチド上に存在する場合に物理的に分離することが可能な薬剤と第一のサブサンプルとを接触させる工程；ｃ．工程ｂの後、前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程；ｄ．前記第一セットの区画の中の前記標的核酸を含む区画の数を決定する工程；ｅ．第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程；ｆ．前記第二セットの区画の中の標的核酸を含む区画の数を決定する工程；ならびにｇ．工程ｄで得た値と工程ｆで得た値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じポリヌクレオチド内に存在するかどうかを決定する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同じ配列を含む。一部の実施形態において、前記薬剤は制限酵素である。一部の実施形態では、工程ｄにおいて得た数が、工程ｆにおいて得た数より有意に高いとき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の連鎖が示される。一部の実施形態において、前記制限酵素は、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間の部位を認識する。一部の実施形態において、前記第一および第二の標的配列は、互いの１メガベース未満以内に位置する。一部の実施形態では、前記サンプルを１つ以上の制限酵素と接触させた後、サブサンプルを分ける前に２４時間未満の間、該サンプルを保管する。一部の実施形態において、前記標的配列は、前記第二のサブサンプルでは物理的に分離しない。一部の実施形態では、前記方法は、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのかを決定する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸の配列は、前記第二の標的核酸の配列と異なる。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸の配列は、前記第二の標的核酸の遺伝的変異である。一部の実施形態において、前記遺伝的変異は、一塩基多型である。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同じ遺伝子内にある。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つは染色体である。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、別々の染色体上に位置する。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同じ染色体上に位置する。一部の実施形態において、前記染色体の少なくとも一方は、前記第一の標的核酸の２個のコピーを含む。一部の実施形態において、前記染色体の少なくとも一方は、前記の第一標的核酸の少なくとも３個のコピーを含む。他の実施形態において、染色体は、前記第一の標的核酸の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のコピーを含む。一部の実施形態において、前記制限酵素のうちの１つ以上は、メチル感受性制限酵素である。
【００１７】
さらにもう１つの態様において、本開示は、サンプル中のポリヌクレオチドの断片化の確率を決定する方法であって、ａ．（ｉ）複数のポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む）と（ｉｉ）前記第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと（ｉｉｉ）前記第二の標的核酸を検出するための第二の標識プローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程；ｂ．前記サンプルを、平均で５未満の標的ポリヌクレオチドを含む複数の空間的に孤立した区画に分ける工程；ｃ．前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を検出するために、前記サンプルをＰＣＲ増幅反応に供する工程；ｄ．前記区画内の標識プローブを検出する工程；ｅ．工程ｄに基づき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数を計数する工程；ならびにｆ．前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数と前記サンプルの断片化の程度とを相関させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、１メガベース以内で離れている。一部の実施形態において、健常被験体では、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が１キロベースより多い塩基によって隔てられている。一部の実施形態において、前記方法は、第一および第二の標的核酸の両方を含有する区画の期待数を、該標的核酸が物理的に連鎖している場合に算出する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記断片化の確率は、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含有する区画数の減少と正に相関する。
【００１８】
さらにもう１つの異なるが関連のある態様において、本開示は、ポリヌクレオチドのサンプル中の２つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の断片化の確率を決定するための方法であって、ａ．前記サンプルを用いてデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を行う工程（この場合のｄＰＣＲは、ポリヌクレオチドを分離されたユニットに分離することを含む）；ｂ．第一の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と第一の遺伝子座および第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数の第一の合計を決定する工程；ｃ．第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と第一の遺伝子座および第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数の第二の合計を決定する工程；ならびにｄ．前記第一の合計および前記第二の合計をアルゴリズムにインプットして、断片化される前記サンプル中の前記２つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の百分率を決定する工程を含む方法を提供する。
【００１９】
一部の実施形態において、前記サンプル中のポリヌクレオチドは、部分的に分解される。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む。
【００２０】
本開示は、第一の標的核酸が第二の標的核酸と同じポリヌクレオチド上に存在する確率を決定するための方法であって、ａ）ポリヌクレオチドのサンプルを少なくとも２つのサブサンプルに分割する工程；ｂ）第一のサブサンプルに関して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸をショートサイクルＰＣＲで事前増幅させる工程；ｃ）前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程；ｄ）前記第一のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程；ｅ）第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程；ｆ）前記第二のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程；ならびにｇ）工程ｆの値と工程ｄの値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上で連鎖している確率を決定する工程を含む方法も提供する。
【００２１】
一部の実施形態において、前記ショートサイクルＰＣＲは、２４サイクル未満のＰＣＲ反応を含む。一部の実施形態において、前記方法は、アルゴリズムを使用して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上でフェージングされるかまたは存在する確率を決定する工程をさらに含む。
【００２２】
もう１つの態様において、本開示は、染色体からの標的核酸の欠失の確率を同定する方法であって、（ａ）（ｉ）１対の染色体であって、該染色体の少なくとも一方が第一の標的核酸を含有し、かつ両方の染色体が同じマーカー核酸を含有するような染色体と（ｉｉ）第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと（ｉｉｉ）前記マーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程；（ｂ）増幅反応を行って、前記区画内の前記第一の標的核酸および前記マーカー核酸を検出する工程；（ｃ）前記マーカー核酸を含有し、標的核酸を含有しない区画の数を計数する工程；ならびに（ｄ）工程ｃの値に基づき前記染色体の少なくとも一方からの標的核酸の欠失の確率を決定する工程を含み、工程ｃにおけるより高い値が、前記標的核酸が前記一対の染色体の一方に不在である確率の増大と相関する方法を提供する。
【００２３】
一部の実施形態において、前記標的核酸は、前記染色体の少なくとも一方の上に複数のコピーで存在すると推測される。一部の実施形態において、前記マーカーおよび前記標的核酸は、前記染色体の少なくとも一方の上に互いに極めて近接して位置する。一部の実施形態において、前記マーカーと前記標的核酸は、５０００塩基対以内、離れている。一部の実施形態において、前記マーカー核酸は、一塩基多型を含む。一部の実施形態において、前記方法は、別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、工程ｄの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていることの決定によって強化される。一部の実施形態において、前記方法は、別のアッセイを行って、前記サンプル中の高分子量ＤＮＡの存在を決定する工程をさらに含む。
【００２４】
さらにもう１つの態様において、本開示は、ポリヌクレオチドからの標的領域の欠失または転座の確率を同定する方法であって、（ａ）（ｉ）第一のマーカー核酸および第二のマーカー核酸を含むと推測されるポリヌクレオチドであって、前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸が少なくとも１メガベースの塩基によって隔てられており、ならびに前記標的領域が前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸間に位置すると推測されるものであるポリヌクレオチドと（ｉｉ）前記第一のマーカー核酸を検出するための第一の標識プローブと（ｉｉｉ）前記第二のマーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程；（ｂ）増幅反応を行って、前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸を検出する工程；（ｃ）前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸の両方を含有する区画の数を計数する工程；ならびに（ｄ）工程ｃの値に基づいて前記標的領域の欠失または転座の確率を決定する工程を含み、工程ｃにおけるより高い値が、前記標的核酸が前記ポリヌクレオチドに不在である確率の増大と相関する方法を提供する。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、染色体である。一部の実施形態において、前記標的領域は、野生型被験体に存在することが公知の染色体の特異的領域である。一部の実施形態において、前記方法は、別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、工程ｄの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失または転座の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていないことの決定によって強化される。
【００２５】
１つの態様において、本開示は、ハプロタイプ分析方法であって、（ａ）核酸を含有する水性相を複数の別個の容積に分配する工程；（ｂ）前記核酸内の配列変動を呈する第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも１つの対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程；（ｃ）同じ容積内の両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも１つの測定値を決定する工程；ならびに（ｄ）共増幅の前記少なくとも１つの測定値に基づき、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座のハプロタイプを選択する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
この態様の一部の実施形態において、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座は、前記核酸の標的領域内に含有され、前記分配する工程が、１容積につき数コピー未満の標的領域という平均濃度をもたらす結果となる。一部の実施形態において、前記分配する工程は、１容積につき約１コピー未満の標的領域という平均濃度をもたらす結果となる。
【００２７】
この態様の一部の実施形態において、前記少なくとも１つの測定値を決定する工程は、同じ容積からの第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データと相関する第一の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データについての少なくとも１つの相関係数を決定する工程を含む。場合によっては、前記少なくとも１つの測定値を決定する工程は、同じ容積からの第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データとそれぞれ相関する第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列および第二の対立遺伝子配列の対立遺伝子特異的増幅データについての第一の相関係数および第二の相関係数を決定する工程を含み、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程は、その第一の相関係数と第二の相関係数を互いに比較する工程に基づく。場合によっては、前記少なくとも１つの測定値を決定する工程は、前記第一の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列と前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列との共増幅を呈する容積の数を決定する工程を含み、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程は、共増幅を呈する容積の数に基づく。前記容積の数を決定する工程は、前記第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列または第二の対立遺伝子配列と前記第二遺伝子座の特定の対立遺伝子配列とのそれぞれの共増幅を呈する、容積の第一の数および容積の第二の数を決定する工程をさらに含むことがあり、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程は、容積の第一および第二の数に基づく。
【００２８】
一部の実施形態において、前記少なくとも１つの測定値を決定する工程は、個々の容積からの各々の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集すること、ならびに同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データとを相関させることを含む。
【００２９】
この態様の一部の実施形態において、前記分配する工程は、前記容積が液滴であるエマルジョンを形成する工程を含む。一部の実施形態において、前記収集する工程は、前記エマルジョンの個々の液滴から対立遺伝子特異的増幅データを収集することを含むことがある。
【００３０】
一部の実施形態において、前記エマルジョンを形成する工程は、前記水性相をオリフィスに通して、該水性相の単分散液滴を生じさせる工程を含む。一部の実施形態において、前記分配する工程は、直径が約１０から１０００マイクロメートルである液滴を形成する工程を含む。一部の実施形態において、前記分配する工程は、少なくとも約１０００容積を形成する工程を含む。場合によっては、前記分配する工程は、増幅された各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができる光学的に区別可能な蛍光プローブを含む水性相を分配する工程を含む。
【００３１】
一部の実施形態において、前記核酸は、二倍体被験体から得られる、または二倍体被験体に由来する。場合によっては、前記核酸は、被験体から得た遺伝物質である。場合によっては、前記核酸は、被験体から得たＲＮＡの逆転写によって得たｃＤＮＡを含む。場合によっては、前記被験体が多細胞生物である。場合によっては、前記被験体は人である。
【００３２】
一部の実施形態において、前記増幅させる工程は、前記第一の遺伝子座から１対の異なる対立遺伝子配列を増幅させる工程を含み、および前記データを収集する工程は、個々の液滴中の該対の各対立遺伝子配列の増幅を区別するデータを収集する工程を含む。
【００３３】
一部の実施形態において、前記相関させる工程は、前記第一の遺伝子座の各対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データを前記第二の遺伝子座の対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データと別々に相関させる工程を含む。
【００３４】
場合によっては、前記相関させる工程は、閾値を前記対立遺伝子特異的増幅データに適用してそれをバイナリ形式に変換する工程をさらに含み、該バイナリ形式のデータを用いて該相関工程を行う。場合によっては、前記相関させる工程は、両方の遺伝子座からの特定の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の数を決定する工程をさらに含む。場合によっては、前記相関させる工程は、前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第一の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の第一の数、および前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第二の対立遺伝子配列の共増幅を呈する液滴の第二の数を決定する第一の工程と、容積の第一の数と第二の数を比較する第二の工程とをさらに含む。
【００３５】
一部の実施形態において、前記ハプロタイプを選択する工程は、前記第一の遺伝子座についてのどの対立遺伝子特異的増幅データが、前記第二の遺伝子座についてのかかる対立遺伝子特異的増幅データとのより高い相関を呈するか、に基づく。一部の実施形態において、前記ハプロタイプを選択する工程は、前記第一の遺伝子座から増幅されたそれぞれの別個の対立遺伝子配列に対応する相関係数に基づく。一部の実施形態において、前記ハプロタイプを選択する工程は、前記相関させる工程が、同じ容積内の前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列の共増幅について負の相関を示すか、正の相関を示すかに基づく。
【００３６】
もう１つの態様において、本開示は、ハプロタイプ分析用システムであって、（ａ）核酸を含む水性相の液滴を形成するように構成された液滴発生器と、（ｂ）個々の液滴からの各々の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集するように構成された検出器と、（ｃ）同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データとを相関させるように、ならびにその対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて該第一および第二の遺伝子座についての核酸のハプロタイプを選択するように構成されたプロセッサとを備えるシステムを提供する。
【００３７】
一部の態様において、本開示は、ゲノムＤＮＡのサンプル中のＣｐＧアイランドのメチル化の程度を決定する方法であって、ａ．ＣｐＧアイランドによって第二の標的核酸から隔てられている第一の標的核酸を含むゲノムＤＮＡのサンプルを得る工程；ｂ．前記ゲノムＤＮＡサンプルとメチル感受性制限酵素とを該ゲノムＤＮＡ中の非メチル化核酸の消化を可能にするのに好適な条件下で接触させる工程；ｃ．前記サンプルと前記第一の標的核酸の存在を検出するプローブとを接触させる工程；ｄ．前記サンプルと前記第二の標的核酸の存在を検出するプローブとを接触させる工程；ｅ．前記サンプルを複数の空間的に孤立した区画に分ける工程；ｆ．それらの区画内で、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の検出に好適な増幅反応を行う工程；ｇ．前記第一と第二両方の標的核酸を含む区画の数を決定する工程；ｈ．工程ｇで得た数と第一または第二の標的核酸を含む区画の数とを比較する工程；ならびにｉ．工程ｈでの比較から、前記ゲノムＤＮＡサンプル中のＣｐＧアイランドのメチル化の程度を決定する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記ゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡである。一部の実施形態において、前記ゲノムＤＮＡは、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含む。一部の実施形態において、前記ゲノムＤＮＡは、胎児ＤＮＡを含む。
【００３８】
参照による援用
本明細書中で言及するすべての出版物、特許および特許出願は、各々個々の出版物、特許または特許出願が参照により援用されていると具体的にかつ個々に示されている場合と同じ程度に、参考として本明細書に援用されている。
【００３９】
本発明の新規特徴を詳細に添付の特許請求の範囲に示す。本発明の原理を用いる例証となる実施形態を示す後続の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、標的配列のコピー数を推定するためのフローチャートを図示する。
【図２】図２は、２つの標的配列が母性染色体上にある一例、および１つの標的配列が母性染色体上にあり、１つが父性染色体上にある一例を図示する。
【図３Ａ】図３ａは、標的配列の連鎖を決定するためのフローチャートを図示する。
【図３Ｂ】図３ｂは、標的配列の連鎖を決定するための代替ワークフローを図示する。
【図４】図４は、本開示の態様による、サンプル区画内で行われる増幅を用いるハプロタイプ分析の例示的方法で行うことができる工程を列挙するフローチャートである。
【図５】図５は、本開示の態様による、図４の方法を実施するための例示的システムの選択された態様の略図である。
【図６】図６は、本開示の態様による、被験体の遺伝物質中の同じ染色体タイプ上に位置する１対のＳＮＰによって作られ得る例示的ハプロタイプの略図である。
【図７】図７は、本開示の態様による、区画として液滴を用い、および図６に提示した可能性のあるハプロタイプを区別するために分析した図６の被験体からの遺伝物質を用いる、図４の方法の例示的バージョンの性能を図示するフローチャートの略図である。
【図８】図８は、本開示の態様による、図７の増幅データを相関させる代替アプローチを図示するグラフである。
【図９】図９は、２つの標的間での断片化を予測するためのフローチャートを図示する。
【図１０】図１０は、連鎖している標的と連鎖していない標的を図示する。図１０Ａは、連鎖していない標的Ｔ１およびＴ２を図示する。図１０Ｂは、連鎖しているＴ１とＴ２および連鎖していないＴ１とＴ２の混合物を図示する。図１０Ｃは、Ｔ１とＴ２間の多様な間隔を図示する。
【図１１】図１１は、メチル化負荷（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）を分析するためのフローチャートを図示する。
【図１２】図１２は、メチル化負荷アッセイの実施形態を図示する。
【図１３】図１３は、制限酵素を選択するときに考慮され得る情報を図示する。
【図１４】図１４は、制限酵素を選択するときに考慮され得る情報を図示する。
【図１５Ａ】図１５Ａは、データベースに入力することができるアッセイ情報を図示する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、データベースに入力することができるアッセイ情報を図示する。
【図１６】図１６は、ｄｄＰＣＲ実験のためのワークフローの一例を図示する。
【図１７】図１７は、液滴発生における最大伸長を図示する。
【図１８】図１８は、最大伸長をサンプル流量の関数として図示する。
【図１９】図１９は、未消化のサンプル１〜１０および消化されたサンプル１１〜２０の液滴特性を描写する。
【図２０Ａ】図２０Ａは、保管された消化ＤＮＡのＣＮＶ値のドリフトを図示する。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、保管された消化ＤＮＡのＣＮＶ値のドリフトを図示する。
【図２１】図２１は、個体間のアミラーゼ遺伝子のコピー数の高い変動性を図示する。
【図２２】図２２は、ＣＣＬ３Ｌ１についてのコピー数変動を図示する。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＭＲＧＰＲＸ１についてのコピー数変動を図示する。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ＭＲＧＰＲＸ１についてのコピー数変動を図示する。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＣＹＰ２Ｄ６についてのコピー数変動を図示する。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＣＹＰ２Ｄ６についてのコピー数変動を図示する。
【図２５】図２５は、単純勾配プレートを使用して同定した最適共通アニーリング温度を図示する。
【図２６】図２６は、単純勾配プレートを使用して同定した最適共通アニーリング温度を図示する。
【図２７】図２７は、ＳＭ１およびＳＭＮ２コピー数を図示する。
【図２８】図２８は、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２についてのコピー数変動を図示する。
【図２９】図２９は、ＨＥＲ２の分析を図示する。
【図３０】図３０は、連鎖実験の結果を図示する。６つのサンプルを制限消化に供して、または供さずに、標的配列のコピー数を決定した。このデータは、サンプル４および５が同じ染色体上に２つの標的配列を有することを示唆している。
【図３１】図３１は、ＭＲＧＰＲＸ１およびＲＰＰ３０についてのリアルタイムＰＣＲ実験における２５サイクル後の蛍光強度の分析を図示する。
【図３２】図３２は、リアルタイムＰＣＲ実験における４つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に２個の標的を有し、もう一方の染色体上に０個の標的を有すると推測されるサンプル（１８８５３および１９１０８）は、染色体上に標的の１個のコピーを有する（トランス配置）と推測されるサンプル（１８５０７およびＢＣ１０６）より高い蛍光を有する。
【図３３】図３３は、ＭＲＧＰＲＸ１およびＲＰＰ３０についてのリアルタイムＰＣＲ実験における２８サイクル後の蛍光強度の分析を図示する。
【図３４】図３４は、ｄｄＰＣＲ濃度およびコピー数変動の比較を図示する。サンプル１８８５３および１９１０８では、非切断サンプルについてのＣＮＶ低減が２８サイクルで観察された。
【図３５】図３５は、ｄｄＰＣＲ実験における２８サイクル後の４つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に２個の標的を有し、もう一方の染色体上に０個の標的を有すると推測されるサンプル（１８８５３および１９１０８）は、２つの各々の染色体の上に標的の１個のコピーを有する（トランス配置）と推測されるサンプル（１８５０７およびＢＣ１０６）より高い蛍光を有する。
【図３６】図３６は、ｄｄＰＣＲ実験における３１、３４および４０サイクル後の４つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に２個の標的を有し、もう一方の染色体上に０個の標的を有すると推測されるサンプル（１８８５３および１９１０８）は、２つの各々の染色体の上に標的の１個のコピーを有する（トランス配置）と推測されるサンプル（１８５０７およびＢＣ１０６）より高い蛍光をサイクル３１で有するが、サイクル３４または４０では有さない。
【図３７】図３７は、ロングレンジＰＣＲ実験についての実験構成を図示する。シナリオＡおよびＢのロングレンジＰＣＲは、プライマー間の距離が長すぎるため、失敗すると予想される。しかし、ＰＣＲは、ＭＲＧＰＲＸ１が欠失している染色体を含有するシナリオＣについてはうまくいくはずである。矢印はプライマーを示す。
【図３８】図３８は、６つのサンプルでのロングレンジＰＣＲ実験を図示する。１５００に移動するバンドは、ＭＲＧＰＲＸ１内部プライマーからのＰＣＲ産物を示し、３０００の直ぐ下に移動するバンドは、ＭＲＧＰＲＸ１遺伝子に隣接するプライマーからのＰＣＲ産物を示す。
【図３９】図３９は、６つのサンプルからのロングレンジＰＣＲ産物およびＭＲＧＰＲＸ１  ＣＮＶ結果を図示するものであり、同じ染色体上に１つまたは２つのＭＲＧＰＲＸ１コピーを有する前記サンプルを制限消化物分析によってさらに区別する。
【図４０】図４０は、推定コピー数の消化サンプルからの百分率の差を図示する。
【図４１】図４１は、１Ｋ、１０Ｋまたは１００Ｋ塩基によって隔てられているＦＡＭおよびＶＩＣプローブにより認識される配列を図示する略図である。
【図４２】図４２は、核酸の断片を図示する。Ｔ１およびＴ２は、標的配列である。図４２Ａは、Ｔ１およびＴ２が常に別の核酸上にあるシナリオ（完全断片化）を図示する。図４２Ｂは、Ｔ１およびＴ２が常に核酸上で連鎖しているシナリオ（断片化なし）を図示する。図４２Ｃは、Ｔ１およびＴ２が幾つかの核酸上で連鎖しており、別の核酸上にもあるシナリオ（部分的断片化）を図示する。
【図４３】図４３は、ＤＮＡ品質評価を図示する。
【図４４】図４４は、血漿への大きなＤＮＡによる混入がＣＮＶ値に影響を及ぼすことを図示する。
【図４５】図４５は、ＣＮＶ分析のための力価測定のための制限酵素を図示する。
【図４６】図４６は、ＣＮＶ分析のための制限酵素力価測定を図示する。
【図４７】図４７は、難しいｄｄＰＣＲ  ＣＮＶアッセイを最適化するためのプロトコルの開発を図示する。
【図４８】図４８は、ｄｄＰＣＲでの制限酵素活性の測定を図示する。
【図４９】図４９Ａおよび４９Ｂは、併置によるハプロタイプ決定を図示する。
【図５０】図５０は、併置アッセイで分析することができる遺伝子再配列の例を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
概観
一般に、核酸配列を分析するための、例えばデジタル分配する（ｄｉｇｉｔａｌ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）ための、方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。例えば、サンプル、例えばゲノム、中の標的核酸配列のコピー数を推定するための方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。サンプル、例えばゲノム、中の１つ以上の標的配列の連鎖またはハプロタイプ情報を決定するための方法、組成物およびキットも本明細書において提供する。ハプロタイプ決定情報は、１つの標的配列の複数のコピーが単一のまたは複数の染色体上にあるのか否かに関する情報であり得る。同じ区画内の異なる標的の併置の概念を用いて、フェーズ、すなわち、ある変異またはＳＮＰの特定の対立遺伝子が、別の変異またはＳＮＰの対立遺伝子に物理的に連鎖しているかどうか、を推断することは、実用的であり得る。もう１つの態様では、核酸サンプル（例えば、ゲノムＤＮＡサンプル、ＲＮＡサンプル、ｍＲＮＡサンプル、ＤＮＡサンプル、ｃＲＮＡサンプル、ｃＤＮＡサンプル、ｍｉＲＮＡサンプル、ｓｉＲＮＡサンプル）における断片化または分解の程度を、例えば併置シグナルのデジタル分析により、決定するための方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。もう１つの態様では、核酸メチル化状態の分析、選択的スプライシングの分析、逆位、転座および欠失の発見のための方法を本明細書において提供する。
【００４２】
コピー数変動の推定
１つ以上の標的配列のコピー数変動は、多数の疾患および障害において一定の役割を果し得る。標的配列のコピー数変動を分析するための１つの方法は、デジタル分析、例えばデジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ、による方法である。しかし、標的配列のコピー数のデジタル分析は、サンプル中の標的核酸の複数のコピーが同じポリヌクレオチド上にあると、そのサンプル中の標的核酸配列のコピー数を過小推定することがある。例えば、複数のコンパートメント（例えば、区画、空間的に孤立した領域）を有するデジタルＰＣＲアッセイの場合、各コンパートメントが平均で約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドを受け取るようにサンプル中の核酸を分配することができる。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。ポリヌクレオチドを含有するコンパートメントの数を計数することができる。しかし、標的核酸配列の２個のコピーが単一ポリヌクレオチド上にある場合、そのポリヌクレオチドを含有するコンパートメントは、１つの標的配列しか有さないとカウントされることがある。
【００４３】
標的核酸配列を物理的に分離するための方法を本明細書において提供する。多くの場合、本明細書において提供する方法は、単一ポリヌクレオチド上の標的配列の複数のコピーの存在に起因する標的配列のコピー数の過小推定を回避する。図１は、コピー数推定方法の１つの実施形態の概要（１０１）を図示するものであり、本開示において提供するこの図および残りの図は、例証のみを目的とするものであり、本発明を制限することを意図したものではない。図１における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドの第一のサンプルを得る（１２１）；この第一のサンプルは、例えばゲノムＤＮＡサンプルであり得る。第一のサンプル中の標的核酸配列を（例えば、第一のサンプルを１つ以上の制限酵素と接触させることにより）物理的に分離することができる（１４１）。その第一のサンプルを複数の区画に分けることができる（１６１）。標的配列を有する区画の数を計数することができる（１８１）。その標的のコピー数を推定することができる（２０１）。
【００４４】
前記標的核酸は同一であることがあり、または他の場合、前記標的核酸は異なることがある。場合によっては、前記標的核酸は、同じ遺伝子内に位置する。場合によっては、前記標的核酸は、遺伝子の異なるコピー（同一のまたはほぼ同一のコピー）中に各々位置する。さらに他の場合、標的配列はイントロン内に、または遺伝子間の領域に位置する。ときとして、１つの標的配列は遺伝子内に位置し、第二の標的配列はその遺伝子の外部に位置する。場合によっては、標的配列はエキソン内に位置する。
【００４５】
場合によっては、ゲノムは１つの標的配列を含む。場合によっては、ゲノムは２つ以上の標的配列を含む。ゲノムが２つ以上の標的配列を含むとき、該標的配列は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上同一、または１００％同一である。
【００４６】
２つの標的配列の物理的分離は、核酸配列上の特定の部位を開裂させることによる標的配列の物理的分離を含み得る。場合によっては、標的核酸配列の物理的分離は、１つ以上の制限酵素と第一のサンプルを接触させることを含むことがある。標的核酸配列の物理的分離は、標的核酸配列間に位置する部位でのポリヌクレオチドの消化を含むことがある。場合によっては、前記標的核酸配列は、各々、遺伝子内に位置する。場合によっては、消化の標的になる部位は、２つの遺伝子間に位置する。場合によっては、消化に選ばれる部位は、遺伝子内に位置し、および場合によっては、該遺伝子は、標的配列を含有する遺伝子と同じ遺伝子である。他の場合、消化に選ばれる部位は、標的配列のものとは異なる遺伝子内に位置する。場合によっては、標的配列および消化の標的になる部位は同じ遺伝子内に位置し、該標的配列は、該消化の標的になる部位の上流に位置する。他の場合、標的配列および消化の標的になる部位は同じ遺伝子内に位置するが、該標的配列は、該消化の標的になる部位の下流に位置する。場合によっては、１つ以上の制限酵素での核酸サンプルの処理により標的核酸を分離することができる。場合によっては、剪断により標的核酸を分離することができる。場合によっては、音波処理により標的核酸を分離することができる。
【００４７】
物理的分離工程（例えば、１つ以上の制限酵素での消化）後、そのサンプルを複数の区画に分配することができる。その複数の区画の各々が、約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドを含むことができる。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００個の液滴が、標的核酸の０個のコピーを有する。
【００４８】
多くの場合、標的核酸を前記区画内で増幅させる。場合によっては、この増幅は、１つ以上のＴａｑＭａｎプローブの使用を含む。
【００４９】
もう１つの実施形態において、前記方法は、参照核酸配列を含む区画の数を計数する工程をさらに含む。参照核酸配列は、１ゲノムにつき一定数のコピーで存在することが公知であり、サンプル中の標的核酸配列のゲノムコピーの数を推定するために使用することができる。もう１つの実施形態において、前記コピー数の推定は、標的配列を含む区画の数を参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含み得る。もう１つの実施形態では、参照配列に対する標的核酸配列の濃度の比によってＣＮＶ推定値を決定する。
【００５０】
もう１つの実施形態において、前記方法は、第二のサンプルを分析する工程をさらに含み、該第二のサンプルと第一のサンプルは、同じサンプルに由来する（例えば、核酸サンプルを第一のサンプルと第二のサンプルに分割する）。前記方法は、前記第二のサンプルを１つ以上の制限酵素と接触させる工程をさらに含まない場合がある。場合によっては、前記方法は、前記第二のサンプルを複数の区画に分ける工程をさらに含む。前記方法は、標的配列を含む第二のサンプルの区画の数を計数する工程をさらに含むことがある。もう１つの実施形態において、前記方法は、参照配列を含む第二のサンプルの区画の数を計数する工程をさらに含む。もう１つの実施形態において、前記方法は、第二のサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程を含む。もう１つの実施形態において、前記第二のサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、前記標的配列を有する第二のサンプルからの区画の数と前記参照配列を有する第二のサンプルからの区画の数を比較することを含む。
【００５１】
第一のサンプルからの標的配列のコピー数と第二のサンプル中の標的配列のコピー数を比較して、第二のサンプル中の標的配列のコピー数が過小推定されたかどうかを決定することができる。コピー数が過小推定された程度は、照合したコピーがすべて１つの染色体上にあったかどうかの指標となり得、または少なくとも１個のコピーが１つの相同染色体上にあり、少なくとも１個のコピーが他の相同染色体上にあったかどうかの指標となり得る。１つの二倍体ゲノムにつき、１により近い値は最初の場合を示すことができ、２により近い値は第二の場合を示すことができる。
【００５２】
増幅によってコピー数差を決定するさらなる方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２０３５３８号明細書に記載されている。コピー数変動を決定するための方法は、米国特許第６，１８０，３４９号明細書およびＴａｙｌｏｒら（２００８）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３（９）：ｅ３１７９に記載されている。
【００５３】
本明細書に記載する方法を利用するとき、様々な特徴が考慮され得る：
サンプル調製：考慮すべき核酸の特性としては、二次構造、アンプリコン長、および断片化の程度を挙げることができる。アッセイを行って核酸サンプルの断片化の程度を決定することができる。核酸サンプルの断片化の程度が高すぎる場合には、そのサンプルを分析から外すことができる。サンプル中の核酸の二次構造を排除する工程をとることもできる。例えば、サンプルの温度を調節することによって、またはサンプルに添加剤を添加することによって、核酸の二次構造を調整することができる。可能性のあるアンプリコンが、効率的に増幅させるために長すぎるかどうかを決定することができる。１つの実施形態では、バイオアナライザー（ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して核酸（例えば、ＤＮＡ）断片化を評価することができる。もう１つの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して核酸（例えば、ＤＮＡ）断片化を評価することができる。
【００５４】
ダイナミックレンジ：区画または空間的に孤立した領域の数を増加させることで、方法のダイナミックレンジを増大させることができる。テンプレート核酸をダイナミックレンジに希釈することができる。
【００５５】
正確度：同種サンプルを使用する場合、ＣＮＶ値は整数値になると予想することができる（自己参照）。ドロップアウト増幅は、不正確な濃度測定およびしたがって不正確なＣＮＶ決定の原因となり得る。高ＧＣアッセイには添加剤（例えば、ＤＭＳＯ）を加えることができる。
【００５６】
多重化：実験を多重化することができる。例えば、本明細書において提供する方法で２色を使用することができる：ＦＡＭ：ＢＨＱおよびＮＦＱ−ＭＧＢアッセイ；ＶＩＣ：ＮＦＱ−ＭＧＢ、ＴＡＭＲＡ。ＨＥＸ：ＢＨＱ。５’および３’標識を使用することができ、内部標識色素を使用することができる。場合によっては、本明細書において提供する方法で使用する色の数は２色より多い、例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０色より多い。
【００５７】
精度：幾つかの方法において精度を増大させることができる。場合によっては、ｄＰＣＲ実験における液滴の数を増加させることで、標的核酸と参照核酸間の濃度の小さな差を分析する能力を増加させることができる。ソフトウェアは、個々のウェルから複製物をプールすることにより「メタウェル（ｍｅｔａｗｅｌｌ）」分析を可能にすることができる。場合によっては、本明細書において提供する方法は、３０％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満であるコピー数の差の検出を可能にする。
【００５８】
アッセイの展望：本明細書に記載する標的遺伝子アッセイを、市販のまたは特別設計の標的遺伝子アッセイと併用することができる。
【００５９】
本明細書に記載するコピー数変動は、核酸配列の喪失を伴うこともあり、または獲得を伴うこともある。コピー数変動は、遺伝されることもあり、またはデノボ変異によって引き起こされることもある。ＣＮＶは、１つ以上の異なる種類であることがある。例えば、Ｒｅｄｏｎら（２００６）Ｇｌｏｂａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４  ｐｐ．４４４−４５４を参照されたし。ＣＮＶは、単純デノボ欠失に起因することもあり、単純デノボ重複に起因することもあり、または欠失と重複の両方に起因することもある。ＣＮＶは、多対立遺伝子バリアント（ｍｕｌｔｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）の組み合わせに起因することもある。ＣＮＶは、デノボ獲得に伴う複合ＣＮＶであることもある。ＣＮＶは、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の、または約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個より多くの隣接遺伝子を含むことがある。ＣＮＶは、約１から約１０、約１から約５、約１から約４、約１から約３、約１から約２、約０から約１０、約０から約５、または約０から約２個の隣接遺伝子を含むことがある。コピー数変動は、約１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１００万、５００万もしくは１０００万の、または約１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１００万、５００万もしくは１０００万より多い塩基対の獲得または喪失を伴うことがある。場合によっては、コピー数変動は、核酸配列の約１，０００から約１０，０００，０００、約１０，０００から約１０，０００，０００、約１００，０００から約１０，０００，０００、約１，０００から約１００，０００、または約１，０００から約１０，０００塩基対の獲得または喪失を伴うことがある。コピー数変動は、核酸配列の欠失、挿入または重複であることがある。場合によっては、コピー数変動は、タンデム重複であることがある。
【００６０】
もう１つの実施形態では、分配されたサンプルのリアルタイムＰＣＲまたはｄｄＰＣＲによって生成された蛍光シグナルからＣＮＶハプロタイプを推定することができる。試薬が限界になり得るリアルタイムＰＣＲまたはｄｄＰＣＲ実験の後期の前、標的配列のより高いコピー数を有する区画は、該標的配列のより低いコピー数を有する区画より高いシグナルを有することができる。１つの実施形態では、サンプル（例えば、連鎖実験で使用したサンプルのサブサンプル）を分配することができ、それらの区画（例えば、液滴）を用いてＰＣＲを行うことができる。区画が標的および／または参照核酸配列について指数増幅されると、区画の平均蛍光強度を決定することができる。この平均強度は、標的の開始コピーの数に相当し得る。複数の標的が単一ポリヌクレオチド鎖に沿って連鎖している場合、この鎖を捕捉する区画（例えば、液滴）における強度は、標的の単一コピーしか有さない鎖を捕捉する区画（例えば、液滴）のものより高いだろう。より高い平均強度（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を有する陽性液滴の過剰な存在は、複数のＣＮＶコピーを有するハプロタイプの存在を示唆し得る。逆に、低い平均強度しか有さない陽性液滴の存在は、単一ＣＮＶコピーを有するハプロタイプしかそのサンプル中に存在しないことを示唆し得る。もう１つの実施形態では、ＣＮＶを推定するために用いるサイクル数を区画のサイズおよび区画内の試薬の量に基づいて最適化することができる。例えば、少ない試薬量を有する小さい区画のほうが、多い試薬量を有すると予想される大きい区画より少ない増幅サイクルですむだろう。
【００６１】
前記方法は、ポリヌクレオチド上の互いに近くにある、例えば約１０、９、８、７、６、５、４、５、２、１、０．７  ０．５、０．３、０．２、０．１、０．０５もしくは０．０１メガベース以上離れていない、またはポリヌクレオチド上の互いに非常に近くにある、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１キロベース以上離れていない標的コピーでさえ分析できるので、有用であり得る。場合によっては、前記方法は、ポリヌクレオチド上の互いに非常に近くにある、例えば、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または９５０塩基対（ｂｐ）以内離れている標的コピーの分析に有用である。場合によっては、前記方法は、ゼロ（０）個の塩基対によって隔てられている標的コピーの分析に有用である。場合によっては、前記方法を同一の、ほぼ同一の、および完全に異なる標的に適用することができる。
【００６２】
１つ以上の標的配列のコピー数を推定するための方法のさらなる実施形態を本明細書に記載する。
【００６３】
標的配列の連鎖の決定
本明細書に記載する方法は、２つ以上の標的配列がポリヌクレオチド上で連鎖しているかどうかを示すことができる（例えば、これらの方法を用いて、標的配列の連鎖を決定することができる）。１つの実施形態では、標的配列コピーを（例えば、１つ以上の制限酵素を用いて）物理的に分離して、デジタル読み出しのために該コピーを独立して区画に分配することができるようにする工程、および未消化のＤＮＡの読み出しを消化されたＤＮＡからの読み出しと共に用いて、標的コピーがどのように連鎖しているかを推定する工程を含む方法を提供する。例えば、本明細書に記載する方法を用いて、標的配列が同じ染色体上に存在するのか、または異なる染色体上に存在するのかを決定することができる（例えば図２を参照されたし）。図２は、母性染色体が標的配列の２個のコピーを含むが、対応する父性染色体はコピーを含まない核（左）を図示するものであり、右の核の場合は、母性染色体および対応する父性染色体各々が標的の１個のコピーを含む。
【００６４】
図３ａは、方法の実施形態のワークフローを工程のいずれの順序にも縛られることなく図示する。１つの態様では、ａ）複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも２つのサブサンプルを分ける工程（３２２）；ｂ）第一のサブサンプル中の物理的に連鎖している標的配列を物理的に分離する工程（３２４）；ｃ）前記第一のサブサンプルを第一セットの複数の区画に分ける工程（３２６）；ｄ）前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程（３２８）；ｅ）第二のサブサンプルを第二セットの複数の区画に分ける工程（３３０）；ｆ）第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程（３３２）；ｇ）第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を比較して、サンプル中の標的配列のハプロタイプを決定する工程（３３４）を含む方法（３２０）を提供する。
【００６５】
１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の物理的に連鎖している標的配列を物理的に分離する工程は、該第一のサブサンプルを１つ以上の制限酵素と接触させることを含む。もう１つの実施形態において、前記ポリヌクレオチドを含むサンプルを１つ以上の制限酵素と接触させることは、少なくとも２つの標的核酸配列間の核酸配列を消化することを含む。場合によっては、物理的に連鎖している標的核酸を、核酸サンプルと１つ以上の制限酵素を接触させることにより分離することができる。場合によっては、物理的に連鎖している標的核酸を剪断により分離することができる。場合によっては、物理的に連鎖している標的核酸を音波処理により分離することができる。
【００６６】
もう１つの実施形態において、前記第一および第二のサブサンプルの複数の区画の各々は、約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドを含む。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２、または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。
【００６７】
もう１つの実施形態では、標的配列を前記区画内で増幅させる。
【００６８】
もう１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照核酸配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を、該第一のサブサンプル中の参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含む。
【００６９】
もう１つの実施形態において、前記方法は、前記第二のサブサンプルを１つ以上の制限酵素と接触させる工程をさらに含まない。もう１つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、前記標的配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数を、前記参照配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数と比較することを含む。もう１つの実施形態において、前記第一および第二のサブサンプルについての参照配列は、同じ配列または異なる配列である。
【００７０】
もう１つの実施形態において、前記標的配列のハプロタイプを決定する工程は、前記第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を、前記第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と比較することを含む。もう１つの実施形態において、前記ハプロタイプは、単一ポリヌクレオチド上に標的配列の２個のコピーを含み、その相同ポリヌクレオチド上にコピーを含まない。もう１つの実施形態において、前記ハプロタイプ決定工程は、第一のポリヌクレオチド上に標的配列の１個のコピーを含み、第二の（ことによると相同）ポリヌクレオチド上に標的配列の第二のコピーを含む。
【００７１】
多くの場合、第一のサブサンプル中のコピー数と第二のサブサンプル中のコピー数の差が大きいほど、染色体の一方がその標的のコピーを保有しない可能性が高い。
【００７２】
図３ｂは、方法のもう１つの実施形態のワークフローを工程のいずれの順序にも縛られることなく図示する。１つの態様では、ａ）複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのサンプルを得て（３３８）少なくとも２つのサブサンプルにする工程（３４０）；ｂ）第一のサブサンプル中の標的配列をショートサイクルＰＣＲで事前増幅させる工程（３４２）；ｃ）第一のサブサンプルを第一セットの複数の区画に分ける工程（３４４）；ｄ）第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程（３４６）；ｅ）事前増幅されていない第二のサブサンプル（３４８）を第二セットの複数の区画に入れる工程（３５０）；ｆ）第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程（３５２）；ｇ）第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と比較して、サンプル中の標的配列の連鎖を決定する工程（３５４）を含む方法（３３６）を提供する。
【００７３】
場合によっては、標的を分離するために用いる事前増幅は、短い事前増幅工程を行って標的核酸の別の非連鎖アンプリコンを生成することを必然的に伴う特異的標的増幅（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＴＡ）（Ｑｉｎら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６  ｅ１６）である。
【００７４】
１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列を事前増幅させる工程は、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、および標的配列に特異的なプライマーを含む反応混合物と第一のサブサンプルを接触させること、およびその標的配列を限定数のサイクルにわたり増幅させることを含む。必要に応じて、前記方法は、参照配列のためのプライマーを使用することおよび、必要に応じて、その参照配列を限定数のサイクルにわたり増幅させることも含む。一部の実施形態において、前記サイクル数の数は、４〜２５サイクルにわたり得る。場合によっては、前記サイクル数は、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４サイクル未満である。前記サイクル数は、液滴サイズ、および利用可能な試薬の量に依存して様々であり得る。例えば、より小さいサイズのものである区画（例えば、液滴）には少数のサイクルしか必要としない。
【００７５】
事前増幅された第一のサブサンプルを、各区画が平均で１個未満の標的ポリヌクレオチドを含む複数の区画に分配することができる。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２、または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。
【００７６】
もう１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照核酸配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を、該第一のサブサンプル中の参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含む。
【００７７】
もう１つの実施形態において、前記方法は、第二のものを事前増幅工程に供する工程をさらに含まない。もう１つの実施形態では、前記第二のサブサンプルを、各区画が平均で約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドを含有する複数の区画に分配する。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２、または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。もう１つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう１つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、前記標的配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数と前記参照配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数を比較することを含む。もう１つの実施形態において、前記第一および第二のサブサンプルについての参照配列は、同じ配列または異なる配列である。
【００７８】
もう１つの実施形態において、前記標的配列のハプロタイプを決定する工程は、前記第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を前記第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と比較することを含む。もう１つの実施形態において、前記ハプロタイプは、単一ポリヌクレオチド上に標的配列の２個のコピーを含み、その相同ポリヌクレオチド上にコピーを含まない。もう１つの実施形態において、前記ハプロタイプは、第一のポリヌクレオチド上に標的配列の１個のコピーを含み、第二の（ことによると相同）ポリヌクレオチド上に標的配列の第二のコピーを含む。
【００７９】
第一のサブサンプル中のコピー数と第二のサブサンプル中のコピー数の差が大きいほど、染色体の一方がその標的のコピーを保有しない可能性が高い。
【００８０】
さらにもう１つの態様において、本開示は、同じポリヌクレオチド上に存在する場合の複数の標的核酸を同定する方法であって、ａ．第一および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも２つのサブサンプルに分離する工程；ｂ．前記第一の標的核酸と第二の標的核酸を、それらが同じポリヌクレオチド上に存在する場合に物理的に分離することが可能な薬剤と第一のサブサンプルを接触させる工程；ｃ．工程ｂの後、前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程；ｄ．前記第一セットの区画の中の前記標的核酸を含む区画の数を決定する工程；ｅ．第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程；ｆ．前記第二セットの区画の中の標的核酸を含む区画の数を決定する工程；ならびにｇ．工程ｄで得た値と工程ｆで得た値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じポリヌクレオチド内に存在するかどうかを決定する工程を含む方法を提供する。
【００８１】
前記サンプルは、１対の標的が同じ染色体上にある場合、それらが溶液中でもほぼ連鎖していることができるような十分に高い分子量のものであり得る。サンプル中の核酸（例えば、ＤＮＡ）が完全に断片化している場合、読み出しは、標的の０、１または２コピー（整数）であり得る。しかし、核酸（例えば、ＤＮＡ）は部分的に分解されることがあるので、コピー数は非整数値にわたることがあり、２より大きい数にわたることもある。別の工程をとって、例えばゲル、バイオアナライザー、サイズ排除クロマトグラフィーまたはデジタルＰＣＲコロケーション法（マイルポストアッセイ（ｍｉｌｅｐｏｓｔ  ａｓｓａｙ））の使用により、サンプルの核酸断片化を評価することができる。核酸サンプルが過剰に断片化していると判明した場合、これは、連鎖についての情報を収集することができる尤度を減少させる。
【００８２】
このアプローチを用いて、より少ないコピー数状態、例えば２、３、４、を決定することができる。
【００８３】
もう１つの実施形態では、同じ標的配列を検出するために２つの異なる標識（ＶＩＣおよびＦＡＭ）を有するプローブを使用する、標的核酸配列の連鎖決定方法を提供する。例えば、核酸配列を複数の空間的に孤立した区画に分けることができ、それらの区画内で標的核酸を増幅させることができ、２つの異なるプローブを使用して標的配列を検出することができる。核酸サンプルを、平均で約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドが各区画にあるように分配することができる。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２、または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。
【００８４】
区画が、ポリヌクレオチド上に連鎖している２つの標的を含む場合、該区画は、ＶＩＣのみについてのシグナル（ＶＩＣ／ＶＩＣ）、ＦＡＭのみについてのシグナル（ＦＡＭ／ＦＡＭ）、またはＶＩＣおよびＦＡＭについてシグナルを有することがある。ＦＡＭおよびＶＩＣ標的のランダム分散から予想されるものと比較してある区画におけるＶＩＣおよびＦＡＭシグナルを有する区画の過剰存在量は、そのサンプルが、ポリヌクレオチド上に連鎖している少なくとも２つの標的を有するポリヌクレオチドを含有することを示し得る。ＶＩＣおよびＦＡＭシグナル両方を有する区画の過剰存在量がないことは、サンプル中の２つの標的核酸配列が連鎖していないことを示し得る。
【００８５】
共局在
サンプルの分配、および区画内の複数の標的を分析する能力は、そのサンプル中の標的が空間的にクラスター化している場合、検出を可能にすることができる。これは、標的の特定の組み合わせを有する区画の数が、標的が区画内にランダムに分布している場合に予想されるものと比較して統計的に過剰であるかどうかを評価することによって行うことができる。かかる区画の過剰存在量の程度を用いて、標的の組み合わせの濃度を推定することができる。
【００８６】
例えば、デジタルＰＣＲ（例えば、ｄｄＰＣＲ）を用いて次の２つの標的：ＡおよびＢを測定することができる。例えば、４タイプの液滴があるだろう：両方の標的について陰性の液滴、Ａについて陽性の液滴、Ｂについて陽性の液滴、および両方について陽性の液滴。ランダム分布のもとでは、二重陽性液滴の数は、（全液滴数）＊（少なくともＢを有する液滴の割合）＊（少なくともＡを有する液滴の割合）に近いはずである。二重陽性液滴の数が、期待値を有意に超える場合、サンプル中の２つの標的が互いに近接していると推断することができる。この結果は、標的ＡおよびＢが、例えば、同じポリヌクレオチド上にあることで、同じタンパク質／核酸複合体の一部であることで、同じエキソソームの一部であることで、または同じ細胞の一部であることで、物理的に連鎖していることを意味し得る。
【００８７】
区画内の特定の標的の存在を、その標的に特異的なフルオロフォアをプローブベースＴａｑＭａｎアッセイスキームの一部として使用することにより、評価することができる。例えば、２つの標的ＡおよびＢを測定するとき、ＡのためにＦＡＭを使用し、ＢのためにＶＩＣを使用することができる。一部の実施形態では、エンドポイント蛍光を用いて同じフルオロフォアまたはインターカレート色素で異なる標的を評価して、Ａを含有する区画と、Ｂを含有するものと、ＡおよびＢを含有するものとを区別することができる。
【００８８】
選択的スプライシング
選択的スプライシングは、真核生物生物学の周知の特徴である。この現象は、細胞タイプ、細胞状態または外部シグナルに多くの場合依存して異なる構成でのエキソンを利用することにより、異なる転写物が同じゲノム領域から構築されると発生する。例えば、ある特定の遺伝子は、２つのエキソン（エキソンＡおよびＢ）および３つの可能性のある転写物（Ａのみを含有する転写物１、Ｂのみを含有する転写物２、ＡおよびＢを含有する転写物３）を有し得る。どの転写物が実際に発現されるのか、およびそれらのレベルを特定することができることは、基礎生物学、疾患、診断および療法についての本発明者らの理解のために多くの含意を有し得る。
【００８９】
関心対象の２つ以上のエキソンを有するＲＮＡ分子の濃度を測定することにより、共局在を用いて選択的スプライシングを検出し、定量することができる。例えば、１つのアッセイは１つのエキソンが標的にすることができ、その一方でもう１つのアッセイは、もう１つのエキソンを標的にすることができる。２つのアッセイの統計的に有意な共局在は、両方のエキソンを含有するＲＮＡ分子の存在を示唆し得る。このようにして、可能性のある転写物分子上のさらなるエキソンおよび位置を標的にすることおよび評価することができる。
【００９０】
再配列
もう１つの実施形態では、ポリヌクレオチド上で通常は互いにはるかに離れている２つのアッセイ（アンプリコン）（例えば、染色体上の数百万のｂｐによって隔てられている２つの遺伝子）を構築することができる。一方のアッセイは、１つのチャネル（例えば、ＦＡＭ）に基づき、他方のアッセイは、もう１つのチャネル（例えば、ＶＩＣ）に基づく。デジタル増幅法、例えばｄＰＣＲまたはｄｄＰＣＲ、では、通常、同じ区画（例えば、液滴）内での共局在は、ベースライン統計的期待値より上で観察されないはずである。ＦＡＭとＶＩＣの共局在が（例えば、本明細書に記載する連鎖分析を考量して）発生したら、それは、２つの遺伝子座がゲノム上で互いの近傍にあった目安であり得る。この結果は、遺伝子座が通常ある場所に依存して逆位を示すこともあり、または転座を示すこともある。前記アッセイは、それらのエンドポイント蛍光が十分異質であるならば同じチャネルで多重化することもできる。複数の逆位／転座事象を捕えるために、または所与の転座が異なる切断点に伴って存在し得る事実を説明するために、２つより多くのアッセイを多重化してもよい。
【００９１】
がんおよび胎児における欠陥をはじめとする様々な状態の診断および予後判定に再配列の検出を用いることができる。再配列の検出を用いて、被験体のための１つ以上の治療的処置を選択することができる。例えば、転座ｔ（９；２２）（ｑ３４．１；ｑ１１．２）の検出は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と関連づけられる、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質の生成につながり得る。ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＣＭＬ患者は、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）（Ｇｌｅｅｖｅｃ）で処置することができる。
【００９２】
本明細書に記載する方法で検出することができる再配列としては、例えば、逆位、転座、重複、または欠失が挙げられる（例えば、図５０を参照のこと）。
【００９３】
デジタル実験によって生成された連鎖（ハプロタイプ）情報の確認
もう１つの実施形態において、サンプルのデジタル分析および制限酵素消化物を用いて決定された連鎖情報を、１以上の他のアッセイによって確認することができる。１つの実施形態では、本明細書に記載する分配サンプルのリアルタイムＰＣＲまたはｄｄＰＣＲ実験中のシグナル生成を使用して、連鎖情報を確認することができる。１つの実施形態では、サンプル（例えば、連鎖実験において使用したサンプルのサブサンプル）を分配することができ、それらの区画（例えば、液滴）を用いてＰＣＲを行うことができる。区画が標的および／または参照核酸配列について指数増幅されると、区画の平均蛍光強度を決定することができる。標的核酸配列の複数（例えば、２個）の連鎖コピーを伴うポリヌクレオチドを有する区画は、標的核酸配列の１個だけのコピーを有する液滴より高い蛍光強度を有することができる。
【００９４】
もう１つの実施形態では、ロングレンジＰＣＲを用いて連鎖情報を確認することができる。例えば、ＰＣＲを用いて、同じ染色体上の標的核酸配列の２つのタンデムに配列されたコピー（シス配置）の存在を検出することができ、およびそれを用いて、別の染色体上の標的核酸配列の欠失を検出することができる。１つの実施形態では、増幅領域（標的のタンデムコピーを有すると推測される領域）外のプライマーを使用することができる。もう１つの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドを液滴に分配することができる。ＤＮＡポリヌクレオチドの液滴への分配は、次の２タイプのＤＮＡ種の検出を可能にすることができるので有益であり得る：ａ）標的がタンデムに配列されているＤＮＡセグメントおよびｂ）標的が欠失しているＤＮＡセグメント。同様の反応をバルクで（例えば、ポリヌクレオチドを分配せずに）行うと、標的が欠失しているＤＮＡを表す、より小さいＰＣＲ産物が、標的配列がタンデムに配列されているＤＮＡセグメントを表すＰＣＲ産物に競り勝つことがある。結果として、１つのＰＣＲ産物しか生成することができない。これらのＰＣＲ産物のサイズの差を、例えばゲル電気泳動またはバイオアナライザーを使用して、推定することができる。
【００９５】
場合によっては、標的核酸配列のコピーがタンデムに配列されているＤＮＡは、大きすぎて（例えば、サイズが＞２０ＫＢ）うまくＰＣＲ増幅されないことがある。これらの場合、標的核酸配列が欠失しているＤＮＡセグメントを表す、より小さなＰＣＲ産物しか増幅されないことが多い。標的核酸配列が長すぎてＰＣＲ産物を生成できない場合、標的核酸配列の欠失を含有する染色体を用いてＰＣＲを行うことができる。この場合、ＰＣＲが、配列が欠失している領域を超えると産物が生成され得るが、その標的配列が存在すると、プライマー間の距離が長すぎる場合があるため、産物が生成されないことがある。
【００９６】
一部の実施形態では、ロングレンジＰＣＲを用いて、連鎖を分解することができ、またはコピー数推定を決定することができる。場合によっては、ロングレンジＰＣＲを本明細書において提供する方法と併用する。場合によっては、親または他の類縁の遺伝子型を（単独で、または本明細書において提供する方法との組み合わせで）使用して、標的個体のコピー数状態を推断することができる。
場合によっては、前記方法は、組換えＤＮＡ技術を用いて染色体領域をクローニングする工程、および前記染色体領域の個々のコピーをシークエンシングする工程を含むことがある。一部の実施形態において、前記方法は、（ａ）次世代シークエンシングを使用して、近接した間隔で配置されており（例えば、約２０００ヌクレオチド未満、約１０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、または約１００ヌクレオチド未満）かつ同じシークエンシングリード内に一緒に存在する、多型に関連した情報を同定する工程および（ｂ）本明細書において提供する方法を用いて、さらに離れている（例えば、約５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００ヌクレオチドを超えて離れている）多型に関連した情報を同定する工程を含む。一部の実施形態において、前記方法は、本明細書において提供する方法を用いて、さらに離れている（例えば、約５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００ヌクレオチドを超えて離れている）多型に関連した情報を同定する工程を含む。場合によっては、前記方法は、本明細書に提供する方法を被験体の親または他の近親者についての遺伝子型情報の使用と併用して、メンデルの遺伝の法則を用いてフェーズ情報を推断する工程を含む。しかし、このアプローチは、すべての多型をフェージングできない。一部の実施形態は、連鎖決定への統計的アプローチと併用される、本明細書に提供する方法を含む。
【００９７】
ハプロタイプ
ハプロタイプは、単一染色体上（例えば、同じ染色体コピー上）ならびに／または核酸および／もしくは遺伝物質の同じ小片上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する２つ以上の対立遺伝子を指し得る。フェージングは、対立遺伝子が同じ染色体上に一緒に存在するか否かを決定するプロセスである。ゲノム内のどの対立遺伝子が連鎖しているか決定うすることは、どのように遺伝子が遺伝されるのかを考究するのに有用であり得る。本開示は、分配されたサンプルの増幅によるハプロタイプ分析用のシステム（方法および装置を含む）を提供する。
【００９８】
図４は、ハプロタイプ分析の例示的方法（２０）を行うことができる工程を列挙するフローチャートを示す。これらの工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。一般に、染色体の二倍体以上の相補体を有する被験体から、サンプルを得ることができる（２２）。そのサンプルを分配することができる（２４）。サンプルを分配する工程は、そのサンプルの核酸を含む水性相を分配または分割することを含み得る。１対（以上）の多型性遺伝子座を増幅させることができる（２６）。各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集することができる（２８）。多型性遺伝子座についてのおよび同じ容積からの増幅データを相関させることができる（３０）。多型性遺伝子座についてのハプロタイプを選択することができる（３２）。
【００９９】
人などの被験体から得たサンプルを用いてハプロタイプ分析方法を行うことができる。そのサンプルの核酸を含有する水性相を複数の別個の容積、例えば液滴、に分配することができる。各容積は、平均で約１ゲノム当量未満の核酸を含有することができるので、各容積は、第一の多型性遺伝子座の対立遺伝子および連鎖している第二の多型性遺伝子座の対立遺伝子の平均で約１個未満のコピーを含有する。前記核酸における第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも１つの対立遺伝子配列を増幅させることができる。各遺伝子座についての区別可能な対立遺伝子特異的増幅データを個々の容積から収集することができる。第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを、同じ容積からの第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと相関させることができる。その対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の各々についての核酸のハプロタイプを選択することができる。一般に、前記方法は、同じ容積内での別個の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅に、該対立遺伝子配列が被験体のハプロタイプを構成する場合、依存することがあり、および逆に、それらが被験体のハプロタイプを構成しない場合、共増幅がないことがある。
【０１００】
ハプロタイプ分析用のシステムは、本明細書に開示する方法を行うことが可能であり得る。前記システムは、核酸を含む水性相の液滴を形成するように構成された液滴発生器を備えることができる。前記システムは、個々の液滴からの遺伝子座の各々についての対立遺伝子特異的増幅データを収集するように構成された検出器を備えることができる。前記システムは、プロセッサをさらに備えることができる。前記プロセッサを、同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを相関させるように、かつ、その対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて核酸のハプロタイプを選択するように構成することができる。
【０１０１】
必要に応じて、前記サンプルをサブサンプルに分割することができる。必要に応じて、第一のサブサンプルを、多型性遺伝子座間の部位を開裂させることができる制限酵素と接触させることができ、第二のサブサンプルを必要に応じて制限酵素に曝露することができる。必要に応じて、前記第一のサブサンプルからの対立遺伝子特異的増幅データを前記第二のサブサンプルからの対立遺伝子特異的増幅データと相関させることができる。
【０１０２】
本開示のさらなる態様を後続のセクションにて提示する：（Ｉ）定義、（ＩＩ）システム概観、（ＩＩＩ）連鎖しているＳＮＰによって作られる可能性のある例示的ハプロタイプ、（ＩＶ）液滴内での増幅に関する例示的ハプロタイプ分析、および（Ｖ）選択実施形態。
【０１０３】
Ｉ．定義
本開示において用いる専門用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。しかし、以下の用語は、下で説明するような追加の意味を有することがある。
【０１０４】
配列変動（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、集団のメンバー中または被験体および／もしくはサンプルの染色体タイプのコピー間／中で見いだされるゲノム配列の任意の相違であり得る。配列変動は、多型性と呼ばれることもある。
【０１０５】
遺伝子座は、ゲノムの特定の領域、一般に、約１キロベース未満または約１００ヌクレオチド未満の比較的短い領域であり得る。
【０１０６】
多型性遺伝子座は、配列変動が集団内に存在するならびに／または被験体および／もしくはサンプル中に存在する遺伝子座であり得る。多型性遺伝子座は、ゲノムの同じ位置に共存する２つ以上の別個の配列によって生成され得る。前記別個の配列は、数ある中でも、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失／挿入、および／または任意の数のヌクレオチド、一般には比較的少数のヌクレオチド、例えば約５０、１０もしくは５ヌクレオチド未満、の重複によって互いに異なり得る。例示的実施形態において、多型性遺伝子座は、一塩基多型（「ＳＮＰ」）、すなわち集団内で様々である単一ヌクレオチド位置、によって作られる。
【０１０７】
対立遺伝子は、多型性遺伝子座に共存する２つ以上の形態の一方であり得る。対立遺伝子は、バリアントと呼ばれることもある。対立遺伝子は、多型性遺伝子座に存在する、主要なまたは優勢な形態であることもあり、あるいは少数のまたはさらには非常に稀な形態であることもある。したがって、同じ多型性遺伝子座からの一対の対立遺伝子が集団内に任意の好適な比で、例えば約１：１、２：１、５：１、１０：１、１００：１、１０００：１などで存在し得る。
【０１０８】
対立遺伝子配列は、対立遺伝子を特徴づける、包含するおよび／またはオーバラップさせる一続きのヌクレオチドであり得る。対立遺伝子配列の増幅を利用して、対応する対立遺伝子がサンプル区画内の多型性遺伝子座に存在するかどうかを決定することができる。
【０１０９】
ハプロタイプは、単一染色体上（例えば、同じ染色体コピー上）ならびに／または核酸および／もしくは遺伝物質の同じ小片上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する２つ以上の対立遺伝子であり得る；ハプロタイプは、単一染色体上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する２つ以上の標的核酸を指すこともある。前記標的核酸は、同じこともあり、または異なることもある。
【０１１０】
連鎖は、別個の多型性遺伝子座に由来する対立遺伝子間またはそれらの中の接続であることもあり、および同一またはほぼ同一である標的核酸間またはそれらの中の接続でもあることもある。連鎖を示す（および／または連鎖している）多型性遺伝子座は、一般に、染色体の同じコピー上に一緒に存在するそれぞれの対立遺伝子であって、同じコピー上に互いの比較的近くに、例えば、数ある中でも、約１０、１または０．１メガ塩基以内にあり得る対立遺伝子を含む。
【０１１１】
ＩＩ．ハプロタイプ分析のためのシステム概観
図４は、ハプロタイプ分析の例示的方法２０において行うことができる工程を列挙するフローチャートを示す。前記工程を任意の順序でおよび組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。
【０１１２】
２２に示すように、サンプルを得ることができる。前記サンプルは、被験体、一般には染色体の二倍体以上の相補体を有する被験体、から得ることができる。言い換えると、前記被験体は、典型的に、該被験体の細胞内の少なくとも２セットの染色体および少なくとも一対の各タイプの染色体を有する。例えば、ヒトの体細胞は、各々、２３染色体対（２セットの染色体）および合計４６の染色体になるように２コピーの第１染色体、第２染色体、第３染色体などを含有する。
【０１１３】
２４に示すように、サンプルを分配することができる。サンプルを分配する工程は、該サンプルの核酸を含む水性相を分配または分割することを含む。分配は、区画と呼ばれることもある複数の別個のおよび別々の容積に水性相を分割する。前記容積は、流体、例えば連続相（例えば、油）、によって互いに隔てられていることがある。あるいは、前記容積は、壁、例えばサンプルホルダーの壁、によって互いに隔てられていることがある。前記容積は、逐次的に形成されることもあり、または並列に形成されることもある。一部の実施形態において、前記容積は、エマルジョンの分散相を形成する液滴である。
【０１１４】
２６に示すように、１対（以上）の多型性遺伝子座を増幅させることができる。より詳細には、各々の多型性遺伝子座からの少なくとも１つの対立遺伝子配列を増幅させることができる。各対立遺伝子配列は、その遺伝子座の対応する対立遺伝子に特有のものである。一部の実施形態では、各遺伝子座から１つの対立遺伝子配列のみを増幅させることができ、または前記遺伝子座の少なくとも１つから１対の対立遺伝子配列を増幅させることができる。増幅される特定の対立遺伝子配列および別個の対立遺伝子配列の数は、水性相を分配する前に水性相に含まれている特定のプライマーセットによって決まるだろう。
【０１１５】
２８に示すように、各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集することができる。前記データは、個々の容積内の各々の対立遺伝子配列の区別可能な増幅（またはそれがないこと）に関連することがある。増幅される各々の対立遺伝子配列に特異的に対応するおよびハイブリダイズすることができる区別可能なプローブからデータを検出することができる。前記容積からのデータを並行して収集することができ、または逐次的に収集することができる。例示的実施形態では、増幅シグナルの光学的検出によってデータを収集することができる。例えば、光学的検出としては、各対立遺伝子配列の区別可能な増幅を表す蛍光シグナルの検出が挙げられる。
【０１１６】
３０に示すように、多型性遺伝子座についてのおよび同じ容積からの増幅データを相関させることができる。相関により、一般に、どの対立遺伝子配列が、個々の容積内に一緒存在する、およびしたがって、被験体の遺伝物質中の同じ染色体コピー上に元々互いに連鎖している状態で存在する可能性が最も高いのかが決まる。相関は、同じ容積内での別個の対立遺伝子配列の共増幅に対応する少なくとも１つの相関係数の決定を含むことがある。場合によっては、相関は、同じ遺伝子座の１対の対立遺伝子配列の各々と別の遺伝子座の対立遺伝子配列についての共増幅に対応する１対の相関係数の決定を含むことがある。相関は、相関係数の互いのおよび／もしくは閾値との比較を含むこともあり、または相関係数が負であるのか、正であるのかの決定を含むことがある。一部の実施形態では、増幅陽性シグナルと増幅陰性シグナルを区別する閾値を適用することによりバイナリ形式に変換された増幅データを用いて相関を行うことができる。その上に、または代替的に、相関は、異なるセットの対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の数の比較、および／または対立遺伝子配列の一方のみについての増幅を提示する数に対する１セットの対立遺伝子配列についての共増幅を呈する容積の数の比較を含むことがある。
【０１１７】
一部の実施形態では、２８および３０に示す工程の一方または両方を、同じ容積内の両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも１つの測定値を決定する工程に置き換えることができる。共増幅の任意の好適な測定値（単数または複数）を使用することができ、例えば、同じ容積からの多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データの相関によって得た少なくとも１つの相関係数を使用することができる。他の例では、前記共増幅の測定値は、各遺伝子座からの対立遺伝子配列についての少なくとも１つの共増幅数または頻度を表す少なくとも１つの値であり得る。増幅データを相関させるおよび共増幅の測定値を決定するさらなる態様は、本開示の他の箇所、例えばセクションＩＶに記載する。
【０１１８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含有するサンプルを２つ以上のサブサンプルに分割することができる。２つの多型性遺伝子座間の部位で開裂する制限酵素に第一のサブサンプルを曝露することができる。その後、その第一のサブサンプルを複数の区画に分配することができる。その後、本明細書に記載するように、各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集することができる。２つの多型性遺伝子座間の部位で開裂する制限酵素に曝露されていない第二のサブサンプルを複数の区画に分配することができる。その後、各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅を収集することができる。前記第一のサブサンプルからの増幅データと第二のサブサンプルからの増幅データを相関させて、それらの多型性遺伝子座についてのハプロタイプを決定することができる。
【０１１９】
３２に示すように、多型性遺伝子座についてのハプロタイプを選択することができる。選択は、増幅データの相関に基づくことがあり、および／または共増幅の少なくとも１つの測定値に基づくことがある。調査している多型性遺伝子座についての１セットの可能性のあるハプロタイプの中からハプロタイプを選択することができる。選択されるハプロタイプは、一般に、被験体の同じ染色体上の互いに連鎖している可能性が高い少なくとも１対の特定の対立遺伝子の呼称を含む。
【０１２０】
図５は、図４の方法２０を行うための例示的システム４０の選択態様の略図を示す。このシステムは、液滴発生器（ＤＧ）４２、サーモサイクラ（ＴＣ）４４、検出器（ＤＥＴ）４６およびプロセッサ（ＰＲＯＣ）４８を備えることができる。矢印５０〜５４は、液滴の移動（５０および５２）およびデータの移動（５４）をそれぞれ示すためにシステム要素間に延びている。
【０１２１】
液滴発生器４２は、核酸を含む水性相の液滴を形成することができる。これらの液滴を逐次的に形成することができ、または並行して形成することができる。
【０１２２】
サーモサイクラ４４は、対立遺伝子配列の増幅、例えばＰＣＲ増幅、を駆動するために複数の加熱および冷却サイクルに液滴を曝露することができる。このサーモサイクラは、数ある中でも、すべての液滴を並行して増幅させる回分式サーモサイクラであることがあり、または液滴を逐次的に増幅させるフロー式サーモサイクラであることがある。
【０１２３】
検出器４６は、増幅データ、例えば液滴からの対立遺伝子特異的増幅データ、を収集する。この検出器は、例えば、蛍光検出器であることがあり、液滴を逐次的にまたは並行して検出することができる。
【０１２４】
プロセッサ４８は、コントローラと呼ばれることもあり、検出器４６と連通していることがあり、ならびにプロセッサ４８を、検出器からの増幅データをプロセッシングするようにプログラムすることができる。前記プロセッサは、デジタルプロセッサであることがあり、前記プロセッサを、検出器からの生データをプロセッシングするように、例えば、バックグラウンドを減算するように、および／または液滴サイズに基づいて液滴データを正規化するようにプログラムすることができる。同様に、または代替的に、前記プロセッサを、閾値を適用してデータをバイナリ形式に変換するように、増幅データの相関を行うように、共増幅の１つ以上の測定値を算出および／もしくは比較するように、前記相関および／もしくは測定値に基づいてハプロタイプを選択するように、またはこれらの任意の組み合わせのためにプログラムすることができる。
【０１２５】
液滴発生器、サーモサイクラ、検出器およびコントローラのさらなる態様は、参考として本明細書に援用されている、２０１０年７月８日に発行された米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号Ａ１明細書に記載されている。
【０１２６】
ＩＩＩ．連鎖しているＳＮＰによって作られる可能性のある例示的ハプロタイプ
図６は、二倍体被験体６０の遺伝物質が２つの異なる遺伝子座の各々に２つの異なるヌクレオチドを有する、連鎖しているＳＮＰによって作られるハプロタイプ決定状況を概略的に図示する。ハプロタイプ決定の目的は、各染色体コピー上で第一の遺伝子座のどのヌクレオチドが第二の遺伝子座のどのヌクレオチドと組み合わせられているのかを決定することである。
【０１２７】
被験体６０は、１対の一塩基多型６６、６８によって作られる２つの代替的ハプロタイプ構成６２、６４のいずれかを有し得る。各構成は、２つのハプロタイプを表す：構成６２は、ハプロタイプ（Ｇ、Ｃ）および（Ａ、Ｔ）を有し、構成６４は、ハプロタイプ（Ｇ、Ｔ）および（Ａ、Ｃ）を有する。被験体の細胞７０は、同じタイプの１対の染色体コピー７２、７４を含む。（前記細胞内に存在し得る他のタイプの染色体を示していない）。染色体コピー７２、７４は、配列の点で互いにほぼ同一であるが、これらのコピーは、２つの染色体コピーが配列の点で異なる配列変動の多くの遺伝子座、例えば多型性遺伝子座７６、７８、も概して有する。遺伝子座７６、７８は、ゲノム領域または標的領域８０に含有され、これを細胞７０の核内に点線の囲み枠によって概要を示し、そして遺伝子座７６、７８についての遺伝子型８２を表す混成配列として前記細胞の近傍に拡大して示す。（表現を単純にするために、各染色体コピーの１本の鎖のみと標的領域を図６（および図７）に示す）。
【０１２８】
遺伝子型８２を任意の適する遺伝子型決定技術によって、ハプロタイプ分析前に、またはハプロタイプ分析の一部として、決定することができる。遺伝子型８２は、遺伝子座７６の単一の多型ヌクレオチドが、染色体コピー７２および７４上の「Ｇ」および「Ａ」であり（またはその逆であり）、遺伝子座７８については「Ｃ」および「Ｔ」であることを示す。しかし、前記遺伝子型は、前記２つの遺伝子座の個々のヌクレオチドが染色体コピー７２、７４上でどのように組み合わせられているかを示さない。したがって、前記遺伝子型は、可能性のある代替ハプロタイプ構成６２、６４によって生産されることがある。本明細書に開示されるハプロタイプ分析は、可能性のあるどのハプロタイプが被験体の遺伝物質中に存在するかの決定を可能にする。
【０１２９】
ＩＶ．液滴内での増幅を伴う例示的ハプロタイプ分析
図７は、図４の方法の例示的バージョン８８の実施を概略的に図示する。ここでは、図６の被験体からの遺伝物質を分析して、前のセクションにおいて説明した可能性のある代替的ハプロタイプ構成を区別する。
【０１３０】
サンプル９０を得、それを９２に示す。前記サンプルを、被験体の核酸９６を含む水性相９４内に配置する。この図には、単純化のために、ゲノム領域８０を含有する断片９８しか描かれていない。断片９８は、遺伝子座７６、７８の両方から対立遺伝子配列１０４〜１１０を含むことができないのがほんの少数（例えば、不完全断片１００、１０２）だけであるのに十分な長さである（図６も参照されたし）。水性相を対立遺伝子配列１０４〜１１０のＰＣＲ増幅用に構成することができる。
【０１３１】
液滴１１２を形成し、それを１１４に示す。前記液滴はエマルジョン１１６の一部であり得、このエマルジョン１１６は、液滴を互いに隔てる連続相１１８を含む。前記液滴は、単分散性、すなわち実質的に同じサイズのもの、であり得る。好適であり得る単分散の例示的な程度は、参考として本明細書に援用されている、２０１０年７月８日に発行された米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号Ａ１明細書に記載されている。
【０１３２】
断片９８は、それらが形成されるときに液滴内にランダムに分布し得る。分配される水性相中での断片９８の妥当な希釈時、および液滴サイズの妥当な選択で、標的領域８０の平均約１個未満のコピーまたは分子が各液滴に含有される。したがって、幾つかの液滴、例えば、１２０に示す空の液滴は、標的のコピーを含有せず、多くは、標的領域の１個だけのコピーを含有し、幾つかは、標的の２個以上のコピーを含有し（例えば、１２２に示す液滴）、および幾つかは、標的領域の対立遺伝子配列の一方のみを含有する（例えば、１２４に示す液滴）。
【０１３３】
対立遺伝子配列を増幅させることができ、それを１２６に示す。ここでは、２つの対立遺伝子配列、１０４および１０８、を遺伝子座７６から増幅し、対立遺伝子配列１１０だけを遺伝子座７８から増幅させる（図６も参照されたし）。各対立遺伝子配列の増幅コピーを１０４’、１０８’および１１０’に示す。他の実施形態では、数あるなかでも、１つだけの対立遺伝子配列を各遺伝子座から増幅させることができ、または少なくとも２つの対立遺伝子配列を各遺伝子座から増幅させることができる。（例えば、対立遺伝子配列１１０を増幅させるのと同じプライマーで対立遺伝子配列１０６を増幅させることができるが、表現を単純にするために対立遺伝子配列１０６の増幅をここには示さない）。
【０１３４】
対立遺伝子特異的増幅データを液滴から収集することができ、それを１３０に示す。この実施例では、異なる、区別可能な蛍光色素であって、各々が異なる対立遺伝子特異的プローブ内に含まれており、各対立遺伝子配列１０４’、１０８’、１１０’についての増幅シグナルをもたらすものである蛍光色素を用いて、蛍光データを収集する。詳細には、色素ＦＡＭ、ＶＩＣおよびＲＯＸは、対立遺伝子配列１０４、１０８および１１０の増幅にそれぞれ関係づけられるＦＡＭシグナル、ＶＩＣシグナルおよびＲＯＸシグナル１３２〜１３６を発する。他の実施形態では、４つの対立遺伝子配列１０４〜１１０のすべての、または２つだけの対立遺伝子配列（各遺伝子座から１つ）の、対立遺伝子特異的増幅を検出することができる。
【０１３５】
増幅データを収集し（１４０に示す）、および／または同じ液滴内での対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも１つの測定値を決定する。グラフ１４２、１４４は、共増幅の測定値の相関および／または決定のアプローチを概略的に図示する。グラフ１４２は、個々の液滴についての（プロット内に点によって表す）ＦＡＭおよびＲＯＸシグナル強度のプロットであり、一方、グラフ１４４は、個々の液滴についてのＶＩＣおよびＲＯＸシグナル強度のプロットである。所与のシグナルタイプ（およびしたがって所与の対立遺伝子配列）について増幅陰性（「−」）および増幅陽性（「＋」）液滴を表すシグナル値をこれらのグラフの各軸に隣接して示す。
【０１３６】
線１４６、１４８は、各グラフの増幅データの線形関係へのベストフィットを表す。しかし、前記２つのフィットは、反対の極性の関連相関係数を有する。グラフ１４２中の増幅データは、同じ液滴中での対立遺伝子配列１０４（ＦＡＭシグナルによって報告される）と対立遺伝子配列１１０（ＲＯＸシグナルによって報告される）の共増幅に負の相関関係があるので、負の相関係数をもたらす。対照的に、グラフ１４４中の増幅データは、同じ液滴中での対立遺伝子配列１０８（ＶＩＣシグナルによって報告される）と対立遺伝子配列１１０（ＲＯＸシグナルによって報告される）の共増幅に正の相関関係があるので、正の相関係数をもたらす。これらの相関係数を互いに比較して、ハプロタイプを選択することができる。例えば、どちらの相関係数のほうが大きい（例えば、より１．０に近い）か、および／またはどちらが正であるか（一方だけが正である場合）に基づいて、ハプロタイプを選択することができる。ここで、ＶＩＣおよびＲＯＸシグナルの正の相関に基づいて、対立遺伝子配列１０４および１０６を含む第一のハプロタイプと、対立遺伝子配列１０８および１１０を含む第二のハプロタイプを選択することができる。一部の実施形態では、１つの相関のみに基づいて、例えば、相関係数が正であるか、負であるかに基づいて、または定義済みの値と相関係数の比較に基づいて、ハプロタイプを選択することができる。
【０１３７】
図８は、図７の増幅データを相関させる代替アプローチを図示する棒グラフ１６０を示す。各タイプの液滴シグナル（ＦＡＭ、ＶＩＣおよびＲＯＸ）を、各対立遺伝子配列についての増幅陽性液滴（「１」を割り当てる）と増幅陰性液滴（「０」を割り当てる）を区別する閾値と比較することにより、図７の増幅データをバイナリ形式に変換した。グラフ１６０は、単独でのまたは組み合わせでの様々な対立遺伝子配列についての増幅陽性液滴の数を提供するためのバイナリ形式のデータを表にしている。１６２で示す左側の２本のバーにより、対立遺伝子配列番号１０４（ＦＡＭ）のみを含有する液滴の数と、対立遺伝子配列１０４（ＦＡＭ）および１１０（ＲＯＸ）両方を含有するものの数とを比較することができる。左側のデータは、対立遺伝子配列１０４の増幅が対立遺伝子配列１１０の増幅とあまり相関しないことを示す。言い換えると、対立遺伝子配列１０４および１１０は、同じ液滴内で共増幅されない傾向がある。１６４で示す右側の２本のバーにより、対立遺伝子配列１０８（ＶＩＣ）のみを含有する液滴の数と、対立遺伝子配列１０８（ＶＩＣ）および１１０（ＲＯＸ）両方を含有するものの数とを比較することができる。右側のデータは、対立遺伝子配列１０８の増幅が対立遺伝子配列１１０の増幅とよく相関することを示す。言い換えると、対立遺伝子配列１０８および１１０は、同じ液滴内で共増幅される傾向がある。別々にまたは併せて考えて、左側の対のバーおよび右側の対のバーは、対立遺伝子配列１０８が対立遺伝子配列１１０に関連するハプロタイプを示す。
【０１３８】
遺伝的に連鎖した遺伝子座を含むサンプルを、本明細書に示す方法、組成物またはキットによる分析前に、断片化に供することができる。例えば、機械的剪断により、該サンプルをシリンジに通すことにより、音波処理により、熱処理（例えば、９０℃で３０分）により、および／または（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素での）ヌクレアーゼ処理により、遺伝的に連鎖した遺伝子座を含むサンプルを断片化することができる。遺伝的に連鎖した遺伝子座を含むサンプルを、分析前に、プロセッシングに供さないこともあり、限られたプロセッシングに供することもある。
【０１３９】
もう１つの実施形態では、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて、２つのゲノム遺伝子座、例えば、共通染色体上の２つの遺伝子、を標的にするデュプレックス反応を行うことができる。液滴は、その蛍光にしたがって４つの集団に分類され得る。例えば、ＦＡＭ標識プローブを使用して一方の遺伝子座を検出し、ＶＩＣ標識プローブを使用してもう一方の遺伝子座を検出する場合、その４集団は、ＦＡＭ＋／ＶＩＣ＋、ＦＡＭ＋／ＶＩＣ−、ＦＡＭ−／ＶＩＣ＋、およびＦＡＭ−／ＶＩＣ−であり得る。これらの各々の集団に関する液滴の数を比較することにより、遺伝子座が同じ液滴に同時分離する頻度を決定することが可能である。ポアソン統計学を用いて、２つの分離された遺伝子座が偶然に同じ液滴内にある事例に対する実際に互いに連鎖している種の百分率を推定することができる。
【０１４０】
遺伝的に連鎖した遺伝子座であって、本明細書に記載する方法、組成物およびキットを用いて検査して、それらがサンプル中で依然として連鎖しているのか、サンプル中で分離しているのかを決定することができる遺伝子座の数は、約、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０であり得、または約２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０より多いことがあり得る。遺伝的に連鎖した遺伝子座であって、本明細書に記載する方法、組成物およびキットを用いて検査して、それらがサンプル中で依然として連鎖しているのか、サンプル中で分離しているのかを決定することができる遺伝子座の数は、約２から約１０、約２から約８、約２から約６、約２から約４、約３から約１０、約３から約８、約３から約６、約４から約１０、または約４から約６であり得る。
【０１４１】
遺伝的に連鎖した遺伝子座の各々の間の塩基対の数は、約、少なくとも約１０ｂｐ、２５ｂｐ、５０ｂｐ，７５ｂｐ、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、１５，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３３，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、７５，０００ｂｐ、１００，０００ｂｐ、２５０，０００ｂｐ、５００，０００ｂｐ、７５０，０００ｂｐ、１，０００，０００ｂｐ、１，２５０，０００ｂｐ、１，５００，０００ｂｐ、２，０００，０００ｂｐ、５，０００，０００ｂｐもしくは１０，０００，０００ｂｐであり得、または約１０ｂｐ、２５ｂｐ、５０ｂｐ，７５ｂｐ、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、１５，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３３，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、７５，０００ｂｐ、１００，０００ｂｐ、２５０，０００ｂｐ、５００，０００ｂｐ、７５０，０００ｂｐ、１，０００，０００ｂｐ、１，２５０，０００ｂｐ、１，５００，０００ｂｐ、２，０００，０００ｂｐ、５，０００，０００ｂｐもしくは１０，０００，０００ｂｐ未満であり得る。遺伝的に連鎖した遺伝子座の各々の間の塩基対の数は、約１０から約１０，０００，０００ｂｐ、約１００から約１０，０００，０００ｂｐ、約１，０００から約１０，０００，０００ｂｐ、約１，０００から約１，０００，０００ｂｐ、約１，０００から約５００，０００ｂｐ、約１，０００から約１００，０００ｂｐ、約３０００から約１００，０００ｂｐ、約１０００から約３３，０００ｂｐ、約１，０００から約１０，０００ｂｐ、または約３，０００から約３３，０００ｂｐであり得る。各遺伝的に連鎖した対立遺伝子間の塩基対の数が０ｂｐであることもある。
【０１４２】
一部の実施形態において、ハプロタイプ決定方法は、２つの異なる遺伝子座の２つの対立遺伝子が同じ空間的に孤立した区画に共局在するかどうか検査する工程を含む。１つの実施形態では、前記２つの遺伝子座の追加の対立遺伝子を分析することができる。例えば、２つの異なる遺伝子座の２つの対立遺伝子が、デジタル実験において共局在しない場合、該２つの遺伝子座の１つ以上の他の対立遺伝子を分析して、共局在についての陽性対照を得ることができる。例えば、母性遺伝染色体が、遺伝子座１にある対立遺伝子Ａ、および遺伝子座１から１００ｂｐ離れた遺伝子座２に対立遺伝子Ｙを有すると仮定する。対応する父性遺伝染色体に関しては、対立遺伝子Ｂが遺伝子座１にあり、対立遺伝子Ｚが遺伝子座２にあると仮定する。これらの核酸を含む核酸サンプルを空間的に孤立した区画に分け、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｚについての増幅を行った場合、対立遺伝子Ａと対立遺伝子Ｚは連鎖していないため、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｚについての増幅シグナルは、単一区画にめったに共局在しないかまたは決して共局在しないはずである。デジタル分析を行って、対立遺伝子Ａと対立遺伝子Ｙが母性遺伝染色体上で連鎖していること、または対立遺伝子Ｂと対立遺伝子Ｚが父性遺伝染色体上で連鎖していることを確認することができる。
【０１４３】
２色を用いるハプロタイプ決定
本明細書に示す実施形態は、フェージングを測定するための３色系の使用を実証するが、２色系を使用してフェージングを測定することもできる。例えば、２つのヘテロ接合性ＳＮＰ（ＡａおよびＢｂ）をフェージングする必要がある場合、Ａを標的にするＦＡＭアッセイおよびＢを標的にするＶＩＣアッセイを設計することができる。ＡとＢ両方を含有する過剰な区画はＡとＢの間の連鎖の指標となり、これは、２つのハプロタイプが、Ａ−Ｂおよびａ−ｂであることを示唆する。かかる過剰の不在は、ハプロタイプの代替的組み合わせ：Ａ−ｂおよびａ−Ｂを示唆し得る。ＤＮＡはこの後述の推論を行うのに十分高分子量のものであると判断することができる。前記ハプロタイプの代替的組み合わせを確認するために、対立遺伝子の異なる組み合わせを標的にするもう１つのデュプレックスアッセイを別のウェルで実行する必要がある場合がある。例えば、Ａを標的にするＦＡＭアッセイおよびｂを標的にするＶＩＣアッセイを実行することができる。Ａとｂ両方を含有する過剰な区画はＡとｂの間の連鎖の指標となり、これは、２つのハプロタイプが、Ａ−ｂおよびａ−Ｂであることを示唆する。
【０１４４】
参照配列
コピー数の分析を伴う方法（または本明細書に記載する他の応用）において、特定の配列（例えば、標的）が、例えば所与のゲノム中で、見つかる回数をカウントすることは有用である。一部の実施形態では、標的核酸配列の濃度とあらゆるゲノム中に何らかの固定数のコピーで存在することが公知である参照核酸配列の濃度とを評価する（または比較する）ことにより、この分析を行う。前記参照には、１つの二倍体ゲノムにつき２コピーで存在するハウスキーピング遺伝子（例えば、基本的な細胞機能の維持に必要とされる遺伝子）を使用することができる。前記標的の濃度または量を前記参照の濃度または量で割ることにより、１ゲノムあたりの標的コピー数の推定値を得ることができる。１つ以上の参照を使用して標的連鎖を決定することもできる。
【０１４５】
本明細書に記載する方法において参照として使用することができるハウスキーピング遺伝子としては、転写因子、転写リプレッサー、ＲＮＡスプライシング遺伝子、翻訳因子、ｔＲＮＡシンセターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質、リボソームタンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質プロセッシングタンパク質、熱ショックタンパク質、ヒストン、細胞周期調節因子、アポトーシス調節因子、がん遺伝子、ＤＮＡ修復／複製遺伝子、炭水化物代謝調節因子、クエン酸サイクル調節因子、脂質代謝調節因子、アミノ酸代謝調節因子、ヌクレオチド合成調節因子、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣオキシダーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ミトコンドリアタンパク質、リソソームタンパク質、プロテオソームタンパク質、リボヌクレアーゼ、オキシダーゼ／レダクターゼ、細胞骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、チャネルまたは輸送体、受容体、キナーゼ、成長因子、組織壊死因子などをコードする遺伝子を挙げることができる。本明細書に記載する方法において使用することができるハウスキーピング遺伝子の具体例としては、例えば、ＨＳＰ９０、ベータ−アクチン、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＡＴＦ４、ＲＰＰ３０およびＲＰＬ３が挙げられる。
【０１４６】
標的の連鎖を決定するための、別の遺伝子座に遺伝的に連鎖している遺伝子座のうちの１つは、一般的な参照、例えばＲＰＰ３０であり得る。任意の遺伝的に連鎖した遺伝子座を本明細書に記載する方法において使用することができる。
【０１４７】
単一コピー参照核酸（例えば、遺伝子）を使用してコピー数変動を決定することができる。ダイナミックレンジを拡大するために、多コピー参照核酸（例えば、遺伝子）を使用してコピー数を決定することができる。例えば、多コピー参照遺伝子は、ゲノム内に約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００個のコピー、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００個より多くのコピーを含むことができる。複数の異なる核酸（例えば、複数の異なる遺伝子）を参照として使用することができる。
【０１４８】
核酸断片化の確率の決定
デジタル分析を行って、核酸サンプル中の２つのマーカー間での断片化の程度を決定することができる。図９は、ワークフロー（９００）を図示する。図９における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドのサンプルを得ることができる（９２０）。各区画が平均で約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドしか含有しないように、複数の区画にサンプルを分けることができる（９４０）。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２、または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。
【０１４９】
前記区画をアッセイして、第一の標的配列および第二の標的配列を有する区画を計数することができ（９６０）、アルゴリズムを使用して、該第一の標的配列と第二の標的配列との間での断片化を予測することができる（９８０）。
【０１５０】
２つの異なる遺伝子座（Ｔ１およびＴ２）が異なるポリヌクレオチド上にある場合、ポリヌクレオチドを有するサンプル（９２０）は、Ｔ１のみを有するポリヌクレオチドおよびＴ２のみを有するポリヌクレオチドを含有することとなる（図１０Ａも参照されたし）。しかし、Ｔ１およびＴ２が同じポリヌクレオチド上にある場合、Ｔ１およびＴ２を有するポリヌクレオチドを含有するサンプルは、次の３種を有する場合がある：Ｔ１を有する断片化ポリヌクレオチド、Ｔ２を有する断片化ポリヌクレオチド、およびＴ１とＴ２を有する断片化ポリヌクレオチド（図１０Ｂ）。Ｔ１とＴ２の間の距離が長いほど、Ｔ１とＴ２の間での断片化の確率が高くなる。そのサンプルを分配することができる（図９：９４０）。デジタル分析、例えばデジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ、を行うことができ、Ｔ１、Ｔ２ならびにＴ２およびＴ２についてのシグナルを有する区画を計数することができる（９６０）。アルゴリズムを開発し、使用して、Ｔ１とＴ２の間での断片化の確率を決定することができる（９８０）。前記アルゴリズムは、Ｔ１とＴ２間の塩基または塩基対の数を、公知の場合、使用することができる。この方法を用いて、ＤＮＡサンプルの断片化の程度を決定することができる。Ｔ１およびＴ２についてのシグナルを含有する複数の区画があり、それが、Ｔ１およびＴ２が同じ区画内にあると予想される区画数より多い場合、この観察結果は、Ｔ１とＴ２が連鎖していることを示し得る。
【０１５１】
連鎖情報がサンプル中に保存されるＤＮＡが十分高分子量のものであることを保証するために核酸（例えば、ＤＮＡ）サンプルで上記方法を用いることは、有利であり得る。
【０１５２】
ＤＮＡを使用する、本明細書に記載するいずれの方法においても、アッセイを行ってサンプル中のＤＮＡの断片化を推定することができ、そのＤＮＡの断片化に関する情報をそれらの方法に組込むことができる。もう１つの実施形態では、サンプル中のＤＮＡの断片化の程度に基づいてアッセイの結果を正規化することができる。
【０１５３】
例えばゲル、バイオアナライザー、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、核酸断片化を測定することもできる。
【０１５４】
メチル化負荷の測定
マイルポストアッセイを用いて、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定することができる。１つの実施形態では、ｄｄＰＣＲによって測定することができるアンプリコンの連鎖の使用（マイルポストアッセイ）を含む方法を本明細書において提供する。アンプリコン間の距離は、１０ｋｂより長い距離にわたり得るので、ＣｐＧアイランドについて観察されるサイズの範囲を十分に網羅する。
【０１５５】
ＣｐＧアイランドは、プロモーター配列におけるものを含めて、ヒト遺伝子の５’領域において一般的である。ＣｐＧアイランドのメチル化は、Ｘ染色体不活性化および刷り込み中の遺伝子サイレンシングに一定の役割を果たすことができる。プロモーター領域ＣｐＧアイランドの異常なメチル化は、新形成の際の腫瘍サプレッサー遺伝子の転写不活性化と関連づけることができる。例えば、腫瘍抑制遺伝子ｐ１６、ｈＭＬＨ１およびＴＨＢＳ１の異常メチル化が観察された。マイクロサテライト不安定性とプロモーター関連ＣｐＧアイランドメチル化との間には関連性がある。メチル化状態の決定は、母体血漿中の胎児ＤＮＡ負荷量の決定に一定の役割を果たすことができる。ＣｐＧ配列のメチル化は、がんのマーカーである。
【０１５６】
図１１は、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定する方法のワークフロー（１１００）を図示する。図１１における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドのサンプルを得ることができる（１１１０）。そのポリヌクレオチドサンプルをメチル化感受性酵素で処理することができる（１１２０）。各区画が平均で約０、１、２または数個の標的ポリヌクレオチドしか含有しないように、複数の区画にサンプルを分配することができる（１１３０）。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２、または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。ＣｐＧアイランドの５’および３’末端に隣接する核酸配列を増幅させることができる（１１４０）。それらの区画をアッセイして、ＣｐＧアイランドに隣接する配列が同じ区画内にあるのか、異なる区画内にあるのかを決定して（１１５０）、メチル化状態を決定することができる（１１６０）。ＣｐＧがメチル化される場合、それは、メチル化感受性酵素によって開裂されず、隣接する配列（マイルポスト）は同じ区画にあることができる。ＣｐＧがメチル化されていない場合、ＣｐＧアイランドは、メチル化感受性酵素によって開裂され得、隣接配列（マイルポスト）は異なる区画にあることができる。もう１つの実施形態では、メチル化配列を開裂させることができるが、非メチル化配列を開裂させることはできないメチル化感受性酵素によって、メチル化ＣｐＧアイランドを開裂させることができる。もう１つの実施形態では、非メチル化配列によりメチル化配列を認識（例えば、結合）することができるメチル化感受性酵素によって、メチル化ＣｐＧアイランドを開裂させることができる。
【０１５７】
もう１つの実施形態において、マイルポスト（マーカー）は、ＣｐＧアイランド内にあることがある。もう１つの実施形態において、マイルポスト（マーカー）は、単一ＣｐＧ配列に隣接していることがある。もう１つの実施形態において、マイルポスト（マーカー）は、約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または５００個のＣｐＧに隣接していることがある（例えば、一方のマーカーは、ＣｐＧの５’であり、他方のマーカーは、ＣｐＧの３’である）。
【０１５８】
もう１つの実施形態では、ＣｐＧアイランドの脱メチル化を決定することができる。ＣｐＧアイランドのメチル化状態を一定の時間にわたり（例えば、異なる時点、例えば日、月、年、に取ったサンプルにおいて）測定することができる。異なる個体からのサンプル間でＣｐＧアイランドのメチル化状態を比較することができる。
【０１５９】
ＣｐＧは、ホスホジエステル結合によってグアニンに連結されたシトシンであることがあり、およびＣｐＧアイランドは、かかるジヌクレオチド配列のクラスターであることがある。ＣｐＧアイランド、またはＣＧアイランドは、高頻度のＣｐＧ部位を含有するゲノムの領域であり得る。ＣｐＧアイランドは、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００または６０００塩基対の長さであることがあり、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００または６０００塩基対未満の長さであることがあり、または約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００または６０００塩基対より長い長さであることがある。ＣｐＧアイランドは、約１００から約６０００ｂｐ、約１００から約５０００ｂｐ、約１００から約４０００ｂｐ、約１００から約３０００ｂｐ、約１００から約２０００ｂｐ、約１００から約１０００ｂｐ、約３００から約６０００ｂｐ、約３００から約５０００ｂｐ、約３００から約４０００ｂｐ、約３００から約３０００ｂｐ、約３００から約２０００ｂｐ、または約３００から約１０００ｂｐであることがある。１つの実施形態において、ＣｐＧアイランドは、少なくとも５０％のＣ＋Ｇ含有率および少なくとも０．６の実測ＣｐＧ／期待ＣｐＧ比を有する、少なくとも２００ｂｐの長さのＤＮＡストレッチであり得る（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ，Ｍ．およびＦｒｏｍｍｅｒ  Ｍ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１−２８２）。もう１つの実施形態において、ＣｐＧアイランドは、５５％以上のＧ＋Ｃ含有率および少なくとも０．６５の実測ＣｐＧ／期待ＣｐＧ比を有する、５００ｂｐより長いＤＮＡストレッチであり得る（Ｔａｋａｉ  Ｄ．およびＪｏｎｅｓ  Ｐ．（２００１）ＰＮＡＳ  ９９：３７４０−３７４５）。
【０１６０】
メチル化シトシンを同定するための１つの方法では、亜硫酸水素塩処理を用いてシトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンは保護される。その後のＰＣＲによりウラシルをチミジンに変換し、その結果、関心対象の同じ領域についての異なる配列アウトプットを得る。あるいは、亜硫酸水素塩処理によるＣ−＞Ｔの変換は、アンプリコンの融解温度を変化させることがあり、増幅後の融点曲線分析によってそれを測定することができる。しかし、この方法での感度の限界は、約１〜５％である。その上、完全変換には大規模な亜硫酸水素塩処理が必要であり、これはＤＮＡの破壊をもたらし得る。
【０１６１】
前記方法の１つの実施形態では、関心対象のＣｐＧアイランドに隣接する２つのアンプリコン（例えば、ＦＡＭおよびＶＩＣ標識されたもの）を設計する。ＤＮＡサンプルを１つ以上のメチル化感受性制限酵素で消化し、消化されたサンプルと未消化のサンプルをデジタルＰＣＲ、例えばｄｄＰＣＲ、によって分析することができる。未消化のサンプルはＦＡＭおよびＶＩＣアンプリコンの１００％連鎖を呈するはずであり、消化されたサンプルはＦＡＭおよびＶＩＣアンプリコンの０％連鎖を呈し、メチル化状態の差を示す。このシステムの拡張精度は、２サンプル間のメチル化状態の少なくとも約１／１０、１／５０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／２０００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１０，０００の差を検出できる。図１２は、前記方法の実施形態を図示する。
【０１６２】
増幅される領域は、ＣｐＧアイランドの５’または３’末端の約または少なくとも約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｂｐ以内にあり得る。
【０１６３】
本明細書において提供する方法、組成物およびキットで１つ以上のメチル化感受性制限酵素を使用することができる。前記１つ以上のメチル化感受性酵素としては、例えば、ＤｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＡｐａＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＭｂｏＩ、ＢｓｐＯＩ、ＮｈｅＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＳｍａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＲｓａＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭｖａＩ、ＨｐａＩＩ、ＭＳｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｎＥＩ、ＤｐｎＩＩ、ＭｃｒＢｃまたはＭｓｐＩを挙げることができる。１つの実施形態において、メチル化感受性酵素は、メチル化されない核酸を開裂させることができるが、メチル化された核酸を開裂させることはできない。前記１つ以上のメチル化感受性酵素は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のメチル化感受性酵素であり得る。
【０１６４】
一部の実施形態では、核酸をＤａｍメチル化およびまたはＤｃｍメチル化に供する。
【０１６５】
表１は、ＤＮＡを開裂する制限酵素の能力がＣｐＧメチル化によって遮断され得るまたは損なわれ得る制限酵素のリストを含む。
【０１６６】
【表１−１】
2014506465.tif 000002
【０１６７】
【表１−２】
2014506465.tif 000003
【０１６８】
【表１−３】
2014506465.tif 000004
【０１６９】
【表１−４】
2014506465.tif 000005
もう１つの実施形態では、ＣｐＧ配列またはＣｐＧアイランドを含む核酸を１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）と接触させ、本明細書に記載するＣｐＧ配列のメチル化分析方法を行う。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンからメチル基をシトシン残基またはアデニン残基に移すことができる。前記メチルトランスフェラーゼは、例えば、ＣｐＧ  ＭＴａｓｅであり得る。ＤＮＡ  ＭＴａｓｅは、ｍ６ａ  ＭＴａｓｅ（Ｎ６−メチルアデニンを生成することができるＭＴａｓｅ）、ｍ４Ｃ  ＭＴａｓｅ（Ｎ４−メチルシトシンを生成することができるＭＴａｓｅ）、またはｍ５Ｃ  ＭＴａｓｅ（Ｃ５メチルシトシンを生成することができるＭＴａｓｅ）であり得る。前記ＭＴａｓｅは、例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂであり得る。
【０１７０】
分離
標的配列の物理的分離を配列特異的または非配列特異的様式で行うことができる。標的配列を分離するための非配列特異的手段としては、シリンジ、音波処理、熱処理（例えば、９０℃で３０分）、および何らかのタイプのヌクレアーゼ処理（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼでの処理）の使用が挙げられる。
【０１７１】
制限酵素
核酸配列の分離の配列特異的方法は、１つ以上の制限酵素の使用を伴うことがある。本明細書に記載する任意の方法で１つ以上の制限酵素を使用することができる。例えば、制限酵素を使用して標的コピーを分離して、数ある中でも、コピー数状態を正確に推定することができ、フェージングを評価することができ、ハプロタイプを生成することができ、または連鎖を決定することができる。標的核酸配列間の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を制限するが、増幅または分析すべき領域を制限しないように、１つ以上の酵素を選択することができる。一部の実施形態では、制限酵素が標的配列内で、例えば、標的配列の５’末端または３’末端内で開裂するように、制限酵素を選択することができる。例えば、標的配列が、スペーサー配列なしでタンデムに配列されている場合、該標的の物理的分離は、該標的配列内の配列の切断を伴うことがある。コピー数推定、連鎖決定、ハプロタイプ決定、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分解の検査、またはメチル化負荷、例えばＣｐＧアイランドのメチル化負荷、の決定のためのデジタル分析（例えばｄｄＰＣＲ）反応において消化サンプルを使用することができる。
【０１７２】
広範な応用、例えば、ＣＮＶ決定のためのデジタルＰＣＲ（例えばｄｄＰＣＲ）および本明細書に記載する任意の他の方法のために、制限酵素を選択することができ、非常に多数のサンプルおよびアッセイタイプにわたって最適な条件を同定および検証することができる
コンピュータソフトウェアを使用して、本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットのための１つ以上の制限酵素を選択することができる。例えば、前記ソフトウェアは、Ｑｔｏｏｌソフトウェアであることがある。
【０１７３】
本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットにおいて使用する１つ以上の制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍを参照されたし）から入手できる制限酵素をはじめとする任意の制限酵素であり得る。制限酵素は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、または高忠実度（ＨＦ）制限酵素であることがある。制限酵素は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型酵素またはホーミングエンドヌクレアーゼであることがある。場合によっては、高スター活性条件下で制限消化がおこる。場合によっては、低スター活性条件下で制限消化がおこる。
【０１７４】
Ｉ型酵素は、認識部位から遠隔部位で開裂することができ；機能するためにＡＴＰとＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの両方を必要とし得；ならびに制限活性とメチラーゼ活性の両方を有する多機能性タンパク質であり得る。Ｉ型制限エンドヌクレアーゼについての認識配列は、二部構成であるか、または分断型である（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ことがある。制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構成は、ペナトメリック（ｐｅｎａｔｍｅｒｉｃ）複合体であることがある。Ｉ型制限エンドヌクレアーゼの共活性化因子および活性化因子としては、例えば、マグネシウム、ＡｄｏＭｅｔ（Ｓ−アデノシルメチオニン；ＳＡＭ  ＳＡＭｅ、ＳＡＭ−ｅ）およびＡＴＰが挙げられる。Ｉ型制限エンドヌクレアーゼは、認識部位から遠い可変的な開裂部位で開裂することができる。Ｉ型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、ＥｃｏＫＩ、ＥｃｏＡＩ、ＥｃｏＢＩ、ＣｆｒＡＩ、ＳｔｙＬＴＩＩ、ＳｔｙＬＴＩＩＩおよびＳｔｙＳＰＩを挙げることができる。
【０１７５】
ＩＩ型酵素は、認識部位内で開裂させるまたは認識部位から短い特定の距離をおいて開裂することがあり、マグネシウムを必要とし得、およびメチラーゼとは無関係に機能することができる。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、パリンドローム型または分断パリンドロームであることがある。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、ホモ二量体であることがある。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼでの開裂部位の開裂は、結果として３’オーバーハング、５’オーバーハング、または平滑末端を有する断片を生じさせ得る。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ｐｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩが挙げられる。
【０１７６】
ＩＩｂ型、ＩＩｓ型およびＩＩｅ型をはじめとする、ＩＩ型制限酵素の幾つかのサブタイプがある。
【０１７７】
ＩＩｂ型制限エンドヌクレアーゼは、二部構成または分断型である認識配列を有することがある。ＩＩｂ型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、ヘテロ三量体であり得る。ＩＩｂ型制限エンドヌクレアーゼの補因子および活性化因子としては、マグネシウムおよびＡｄｏＭｅｔ（メチル化用）を挙げることができる。ＩＩｂ型制限エンドヌクレアーゼは、両方の鎖上の認識部位の両側の定義された、対称の、短い距離離れた開裂部位で開裂し、３’オーバーハングを残すことができる。ＩＩｂ型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、ＢｃｇＩ、Ｇｓｐ２４Ｉ、ＣｊｅＩおよびＣｊｅＰＩが挙げられる。
【０１７８】
ＩＩｅ型制限エンドヌクレアーゼは、パリンドローム型、不正確さのあるパリンドローム型、または非パリンドローム型である認識部位を有することができる。ＩＩｅ型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、ホモ二量体または単量体であることがある。ＩＩｅ型制限エンドヌクレアーゼの補因子および活性化因子としては、マグネシウムを挙げることができ、およびエンドヌクレアーゼに対してシスまたはトランスで作用することができる第二の認識部位がアロステリック作用因子として作用し得る。ＩＩｅ型制限酵素は、開裂部位を、認識配列について定義された様式でまたは短距離離隔して、開裂することができる。活性化剤ＤＮＡを使用して開裂を完了することができる。ＩＩｅ型制限酵素の例としては、例えば、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩ、ＨｐａＩＩ、Ｓａ  ＩＩ、ＥｃｏＲＩＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＡｔｕＢＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＳａｕＢＭＫＩおよびＫｓｐ６３２Ｉが挙げられる。
【０１７９】
ＩＩｓ型制限酵素は、非パリンドローム型である認識配列を有することがある。前記認識配列は、隣接していてかつ不正確ではないことがある。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、単量体であることがある。ＩＩｓ型制限酵素と共に使用することができる補因子は、マグネシウムであり得る。ＩＩｓ型制限酵素は、開裂部位を、認識配列外の少なくとも１つの開裂部位について定義された様式で、開裂することができる。ＩＩｓ型制限酵素の例としては、例えば、ＦｏｋＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｓｒＩ、ＥａｒＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＳｆａＮＩおよびＴｔｈ１１１Ｉが挙げられる。
【０１８０】
ＩＩＩ型酵素は、認識部位から短い距離を隔てて開裂することができ、およびＡＴＰを必要とし得る。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンは、ＩＩＩ型酵素との反応を刺激することができるが、必須ではない。ＩＩＩ型酵素は、修飾メチラーゼとの複合体の一部として存在することがある。ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、非パリンドローム型であることがある。ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼと共に使用することができる補因子および活性化因子としては、例えば、マグネシウム、ＡＴＰ（加水分解されていないもの）、および可変距離離れた逆向きの第二の非修飾部位が挙げられる。ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＰＩ、ＨｉｎｆＩＩＩおよびＳｔｙＬＴＩが挙げられる。
【０１８１】
ＩＶ型酵素は、メチル化ＤＮＡを標的にすることができる。ＩＶ型制限酵素の例としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＭｃｒＢＣおよびＭｒｒ系が挙げられる。
【０１８２】
前記制限酵素は、ホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮａｓｅであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、大きい非対称認識部位（例えば、１２〜４０塩基対）を有することがある。ホーミングエンドヌクレアーゼのコーディング配列は、イントロンまたはインテインに埋め込まれていることがある。インテインは、それ自体を切除し、残りの部分（エクステイン）をペプチド結合で再接合する「タンパク質イントロン」であり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、その認識配列内の一部の配列縮重を許容することができる。ホーミングエンドヌクレアーゼの特異性は、１０〜１２塩基対であり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−Ｐｐｏｌ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩが挙げられる。
【０１８３】
本明細書における方法、組成物および／またはキットにおいて使用する制限酵素は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体などであることがある。
【０１８４】
本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットにおいて使用する１つ以上の制限酵素は、ハイブリッドまたはキメラタンパク質の成分であることがある。例えば、酵素活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を含む制限酵素のドメインを別のタンパク質、例えばＤＮＡ結合タンパク質、と融合させることができる。前記ＤＮＡ結合タンパク質により、前記ハイブリッドはＤＮＡの特異的配列を標的にすることができる。酵素活性を有するドメインの核酸開裂活性は、配列特異的であることがあり、または配列非特異的であることもある。例えば、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的開裂ドメインをハイブリッドヌクレアーゼの酵素（開裂）ドメインとして使用することができる。酵素活性を有するドメインが開裂することができる配列は、ＤＮＡ結合ドメインによるＤＮＡへの前記ハイブリッドの物理的係留によって限定され得る。前記ＤＮＡ結合ドメインは、真核生物または原核生物転写因子からのものであることがある。前記ＤＮＡ結合ドメインは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５塩基対の、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５塩基対の連続核酸配列を認識することができる。場合によっては、前記制限酵素は、４塩基カッター、６塩基カッター、または８塩基カッターである。前記ＤＮＡ結合ドメインは、約９から約１８塩基対の配列を認識することができる。前記ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであり得る。前記ハイブリッドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）であり得る。前記ハイブリッドタンパク質は、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体など）として機能することができる。
【０１８５】
本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットにおいて使用することができる具体的な制限酵素の例としては、ＡａａＩ、ＡａｇＩ、ＡａｒＩ、ＡａｓＩ、ＡａｔＩ、ＡａｔＩＩ、ＡａｕＩ、ＡｂａＩ、ＡｂｅＩ、ＡｂｒＩ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｃＩＩＩ、Ａｃｃ１６Ｉ、Ａｃｃ３６Ｉ、Ａｃｃ６５Ｉ、Ａｃｃ１１３Ｉ、ＡｃｃＢ１Ｉ、ＡｃｃＢ２Ｉ、ＡｃｃＢ７Ｉ、ＡｃｃＢＳＩ、ＡｃｃＥＢＩ、ＡｃｅＩ、ＡｃｅＩＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｌＮＩ、ＡｃｌＷＩ、ＡｃｐＩ、ＡｃｐＩＩ、ＡｃｒＩＩ、ＡｃｓＩ、ＡｃｕＩ、ＡｃｖＩ、ＡｃｙＩ、ＡｄｅＩ、ＡｅｕＩ、ＡｆａＩ、Ａｆａ２２ＭＩ、Ａｆａ１６ＲＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｇｅＩ−ＨＦ、ＡｇｌＩ、ＡｈａＩ、ＡｈａｌＩ、ＡｈａｌＩＩ、ＡｈａＢ８Ｉ、ＡｈｄＩ、ＡｈｌＩ、ＡｈｙＩ、ＡｉｔＩ、ＡｊｎＩ、ＡｊｏＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｆＩ、ＡｌｉＩ、ＡｌｉＡＪＩ、ＡｌｏＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２１Ｉ、Ａｌｗ２６Ｉ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＡｌｗＸＩ、Ａｍａ８７Ｉ、ＡｃｏＩ、ＡｏｃＩＩ、ＡｏｒＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＡｏｓＩ、ＡｏｓＩＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＢ１、ＡｐａＣＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐａＯＲＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｉＩ、ＡｐｏＩ、ＡｐｙＩ、ＡｑｕＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｅｌＩＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｍＨＩ−ＨＦ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡｉ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＩ−ＨＦ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢＳｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔｅＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒａＩＩＩ−ＨＦ（商標）、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｇＩ−ＨＦ（商標）、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ（商標）、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＶ−ＨＦ（商標）、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＥＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（商標）、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＫｐｎＩ−ＨＦ（商標）、ＬｐｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｆｅＩ−ＨＦ（商標）、ＭｌｕＣＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｐＪＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｃｏＩ−ＨＦ（商標）、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｈｅＩ−ＨＦ（商標）、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ（商標）、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｈｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ−ＨＦ（商標）、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩ−ＨＦ（商標）、ＰｖｕＩＩ、ＰｖｕＩＩ−ＨＦ（商標）、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩ−ＨＦ（商標）、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ（商標）、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｂｆＩ−ＨＦ（商標）、ＳｃａＩ、ＳｃａＩ−ＨＦ（商標）、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｈＩ−ＨＦ（商標）、ＳｓｐＩ、ＳｓｐＩ−ＨＦ（商標）、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｔｙＩ−ＨＦ（商標）、ＳｗａＩ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩおよびＺｒａＩが挙げられる。
【０１８６】
本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットにおいて使用する１つ以上の制限酵素は、様々な源に由来し得る。例えば、１つ以上の制限酵素を組換え核酸から生成することができる。前記１つ以上の制限酵素を異種宿主における（例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞における）組換え核酸から生成することができる。前記１つ以上の制限酵素を異種宿主における組換え核酸から生成し、その異種宿主から精製することができる。前記１つ以上の制限酵素を天然源、例えば細菌または古細菌、から精製することができる。１つより多くの制限酵素を使用する場合、該制限酵素のうちの少なくとも１つは、組換え源からのものであり得、および該１つより多くの制限酵素のうちの少なくとも１つは、天然源からのものであり得る。
【０１８７】
前記１つ以上の制限酵素についての認識部位は、任意の様々な配列のものであり得る。例えば、前記１つ以上の制限酵素についての認識部位は、パリンドローム配列であることがある。前記１つ以上の制限酵素についての認識部位は、部分的パリンドローム配列であることがある。一部の実施形態において、前記１つ以上の制限酵素についての認識部位は、パリンドローム配列ではない。前記１つ以上の制限酵素についての認識部位は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基もしくは塩基対であることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基もしくは塩基対より多いことがある。制限酵素についての認識部位は、約２から約２０、約５から約２０、約５から約１５、約５から約１０、約７から約２０、約７から約１５、または約７から約１０塩基または塩基対であることがある。
【０１８８】
２つ以上の制限酵素を使用して、ポリヌクレオチドを消化することができる。前記２つ以上の制限酵素は、同じ認識部位を認識することがあり、または異なる認識部位を認識することもある。単一のポリヌクレオチド上の２つの標的核酸配列間に単一の制限酵素のための１つ以上の認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の２つの標的核酸配列間に単一の制限酵素のための約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０もしくはそれより多くの認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の２つの標的核酸配列間に２つ以上の異なる制限酵素認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の２つの標的核酸配列間に約１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０もしくはそれより多くの、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０もしくはそれより多くの異なる制限酵素認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の２つの標的核酸配列間に１つ以上の異なる制限酵素認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の２つの標的核酸配列間に約１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０もしくはそれより多くの、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０もしくはそれより多くの制限酵素認識部位があることがある。
【０１８９】
制限酵素消化物は、１つ以上のアイソシゾマーを含むことがある。アイソシゾマーは、同じ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼである。アイソシゾマーは、異なる開裂部位を有することがあり、これらの酵素は、ネオシゾマーと呼ばれる。
【０１９０】
一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、平滑末端を生じさせる結果となる。一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、平滑末端を生じさせる結果とならない。一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、それぞれが５’オーバーハングを有する２つの断片を生じさせる結果となる。一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、それぞれが３’オーバーハングを有する２つの断片を生じさせる結果となる。
【０１９１】
制限酵素開裂部位の上流および下流の配列を増幅させるように、１以上の増幅反応のためのプライマーを設計することができる。
【０１９２】
１つの実施形態において、制限酵素は、標的核酸配列または参照アンプリコンを切断しない。参照配列、例えばゲノム配列、を使用して、制限酵素が核酸配列を切断するかどうかを予測することができる。もう１つの実施形態において、制限酵素は、標的核酸配列を切断する。この開裂は、標的配列内の、該標的配列の５’または３’末端の付近（約５、１０、１５、２５、５０または１００ｂｐ以内）で生じ得る。
【０１９３】
もう１つの実施形態において、制限酵素は、標的または参照核酸配列またはアンプリコンを、該配列またはアンプリコンが１つ以上のＳＮＰを含有する場合でさえ、切断しない。ＳＮＰ情報は、幾つかのデータベースから得ることができ、ｄｂＳＮＰ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／）から最も容易に得ることができる。
【０１９４】
１つ以上のメチル化感受性制限酵素を、本明細書において提供する方法、組成物およびキットで使用することができる。前記１つ以上のメチル化感受性酵素としては、例えば、ＤｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＡｐａＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＭｂｏＩ、ＢｓｐＯＩ、ＮｈｅＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＳｍａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＲｓａＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭｖａＩ、ＨｐａＩＩまたはＭｓｐＩを挙げることができる。一部の実施形態において、メチル化感受性制限酵素は、メチル化されていない核酸を開裂させることができるが、メチル化されている核酸を開裂させることができない。
【０１９５】
核酸配列の選択領域を特異的消化するように、本開示において使用する制限酵素を選択することができる。１つの実施形態において、１つ以上の制限酵素は、標的核酸配列または標的アンプリコン間で切断する。認識配列が標的核酸配列または標的アンプリコンの付近に、例えば１回または複数回、出現する、１つ以上の酵素を選択することができる。１つの実施形態では、これらの認識配列がＳＮＰの存在による影響を確実に受けないように気をつける。
【０１９６】
１つの実施形態において、制限酵素は、効率的だが特異的な（スター活性のない）カッターである。適切な酵素力価測定実験を行うことによりこの特性を、消化時間および酵素濃度と共に、事前に決定することができる。１つの実施形態において、制限酵素は、スター活性を有することがある。スター活性は、定義された認識配列と同一ではないが類似している配列の開裂であり得る。
【０１９７】
制限酵素の「ユニット」の数の、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の量に対する比は、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．  １８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１５０００、１６，０００、１８，０００もしくは２０，０００ユニット／μｇの核酸であるか、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．  １８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１５０００、１６，０００、１８，０００もしくは２０，０００ユニット／μｇの核酸であり得る。制限酵素のユニットの数の、核酸の量に対する比は、約１から約２０，０００、約１から約１０，０００、約１から約５，０００、約１００から約１０，０００、約１００から約１，０００、約５０から約５００、または約５０から約２５０ユニット／μｇであり得る。
【０１９８】
ポリヌクレオチドを含むサンプルと共に１つ以上の制限酵素を約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０分間より長くインキュベートすることができる。ポリヌクレオチドを含むサンプルと共に１つ以上の制限酵素を約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８時間より長くインキュベートすることができる。ポリヌクレオチドを含むサンプルと共に１つ以上の制限酵素を約１から約６０分間、約１分間から約４８時間、約１分間から約２４時間、約１分間から約２０時間、約１分間から約１６時間、約０．５時間から約６時間、約０．５時間から約３時間、約１時間から約１０時間、約１時間から約５時間、または約１時間から約３時間インキュベートすることができる。
【０１９９】
制限酵素消化を約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４もしくは６５℃の温度で、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４もしくは６５℃より高い温度で行うことができる。制限酵素消化を約１０から約６５℃、約２０から約６５℃、約３０から約６５℃、約３７から約６５℃、約４０から約６５℃、約５０から約６５℃、約２５℃から約３７℃、または約３０℃から約３７℃の温度で行うことができる。
【０２００】
１つ以上の制限酵素を使用する制限酵素消化のｐＨは、約２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２または１２．５であることがある。制限酵素消化のｐＨは、約５から約９、約５から約８、約５から約７、約６から約９、または約６から約８であることがある。
【０２０１】
制限酵素消化には、１つ以上の緩衝剤を含む場合がある。前記１つ以上の緩衝剤は、例えば、トリス−ＨＣｌ、ビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、ＴＡＰｓ、ビシン、トリス、トリス−酢酸、トリス−ＨＣｌ、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、ＳＳＣ、リン酸バッファー、コリジン、酢酸ベロナール、ＭＥＳ．、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、コラミンクロリド、アセトアミドグリシン、グリシンアミド、マレイン酸塩、ＣＡＢＳ、ピペルジン（ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ）、グリシン、クエン酸塩、グリシルグリシン、リンゴ酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ヒスチジン、ビス−トリス、エタノールアミン、炭酸塩、ＭＯＰＳＯ、イミダゾール、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＢＳ、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ヒドラジン、Ｔｒｉｚｍａ（トリス）、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ビシン、ＨＥＰＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ホウ酸塩、ＣＨＥＳ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、水酸化アンモニウムまたはメチルアミンであってよい。溶液中の緩衝剤の濃度は、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｍＭであることがある。溶液中の緩衝剤の濃度は、約１０から約ｔ１００ｍＭ、約１０から約７５ｍＭ、約２５から約７５ｍＭ、または約１０から約５０ｍＭであることがある。
【０２０２】
１つ以上の制限酵素を使用する制限酵素消化には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む場合がある。制限消化におけるＢＳＡの濃度は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｍＬであることがあり、または約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｍＬより高いことがある。制限消化におけるＢＳＡの濃度は、約０．０１から約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．０１から約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５から約１ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５から約０．５ｍｇ／ｍＬであることがある。
【０２０３】
１つ以上の制限酵素を使用する制限酵素消化には、グリセロールを含むことがある。グリセロールは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５パーセントの濃度（容積対容積）であるか、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５パーセントの濃度（容積対容積）であることがある。制限酵素消化におけるグリセロールの濃度は、約１から約２５％、約１から約２０％、約１から約１５％、約１から約１０％、または約１から約５％であることがある。
【０２０４】
制限酵素消化物は、１つ以上の有機溶媒、例えば、ＤＭＳＯ、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはスファラン（ｓｕｐｈａｌａｎｅ）を含むことがある。制限酵素消化には１つ以上の有機溶媒を含まないことがある。
【０２０５】
制限酵素消化には、１つ以上の二価カチオンを含むことがある。前記１つ以上の二価カチオンは、例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、またはＺｎ２＋であってよい。
【０２０６】
制限消化には、１つ以上の塩を含むことがある。前記１つ以上の塩としては、例えば、酢酸カリウム、塩化カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを挙げることができる。前記１つ以上の塩の各々の濃度は、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．  １８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５もしくは２５０ｍＭであることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．  １８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５もしくは２５０ｍＭより高いことがある。前記１つ以上の塩の各々の濃度は、約５から約２５０、約５から約２００、約５から約１５０、約５から約１００、約１０から約１００、約１０から約��０、約１０から約８０、約１０から約７０、約１０から約６０、または約１０から約５０ｍＭであることがある。
【０２０７】
制限消化には、１つ以上の還元剤を含むことがある。前記１つ以上の還元剤は、タンパク質中のジスルフィド結合の形成を阻害することができる。還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）（ＴＣＥＰ）、またはシステイン−ＨＣｌであってよい。制限酵素消化における前記１つ以上の還元剤の濃度は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２５ｍＭであることがあり、または約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２５ｍＭより高いことがある。制限酵素消化における前記１つ以上の還元剤の濃度は、約０．０１から約２５ｍＭ、約０．０１から約１５ｍＭ、約０．０１から約１０ｍＭ、約０．０１から約５ｍＭ、約０．１から約５ｍＭ、または約０．５から約２．５ｍＭであることがある。
【０２０８】
１つより多くの制限酵素を核酸の制限酵素消化において使用することができる。例えば、制限酵素のうちの１つ以上が核酸を効率的に切断しない場合、またはそれらが（例えば、ＳＮＰのため）必ずしもすべてのサンプルにわたって例外なくよく働くとは限らない場合、複数回の消化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｉｇｅｓｔｓ）を用いることができる。制限消化において使用することができる異なる制限酵素の数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０であるか、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０であることがある。制限酵素消化において使用することができる異なる制限酵素の数は、例えば、約１から約２０、約１から約１５、約１から約１０、約１から約７、約１から約６、約１から約５、約１から約４、約１から約３、または約１から約２であることがある。
【０２０９】
アンプリコンまたは標的を含有する断片のサイズが比較的小さいときのほうが、ＰＣＲがうまくいく証拠がいくつかある。それ故、アンプリコンまたは標的の付近に切断部位を有する制限酵素を選択することが望ましいことがある。例えば、制限酵素認識部位または開裂部位は、ポリヌクレオチド上の標的のうちの１つについての５’末端または３’末端から、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１５０００、１６，０００、１８，０００もしくは２０，０００塩基対以内、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１５０００、１６，０００、１８，０００もしくは２０，０００塩基対未満にあることがある。制限酵素認識部位または開裂部位は、標的核酸配列の５’末端または３’末端から約１から約１０，０００、約１から約５，０００、約１から約２，５００、約１から約１，０００、約１から約１００、約１００から約１０００、約１００から約５００または約１００から約２５０ｂｐの範囲内にあることがある。
【０２１０】
単一のサンプルを複数のＣＮＶについて分析することができる。この場合、完全セットのＣＮＶのためによく働くことになる最小数の消化を選択することが望ましいことがある。１つの実施形態では、任意のアンプリコンまたは標的核酸配列内では切断しないが、それらのうちの各々１つの付近に認識部位または開裂部位を有する、単一制限酵素カクテルを見出すことができる。制限酵素認識部位または開裂部位は、ポリヌクレオチド上の標的のうちの１つについての５’末端または３’末端から、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１５０００、１６，０００、１８，０００もしくは２０，０００塩基対以内、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０．１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１５０００、１６，０００、１８，０００もしくは２０，０００塩基対未満にあることがある。制限酵素認識部位または開裂部位は、ポリヌクレオチド上の標的のうちの１つについての５’末端または３’末端から約１から約２０，０００、約１０からから約２０，０００、約１００から約２０，０００、約１０００から約２０，０００、約１０から約１０，０００、約１０から約１０００、約１０から約１００、約５０から約２０，０００、約５０から約１０００、約５０から約５００、約５０から約２５０、約５０から約１５０、または約５０から約１００塩基対の範囲内にあることがある。
【０２１１】
適切なソフトウェアを記載かつ／または使用することにより、制限酵素選択プロセスを自動化することおよび、使用者、例えば実験生物学者が上記の基準を考慮して最も適切な酵素を選択するためのインターフェースを提供することが可能となる。追加の考慮事項、例えば、酵素費用、酵素効率、制限酵素のバッファー相溶性、メチル化感受性、核酸のセグメント内の開裂部位の数、または入手可能性をそのソフトウェアによって採用することができる。前記ソフトウェアをコンピュータで使用することができる。アルゴリズムをコンピュータ可読媒体で生成し、それを使用して核酸消化用の１つ以上の制限酵素を選択することができる。コンピュータをインターネットに接続し、それを使用して、制限エンドヌクレアーゼの選択を可能にし得るウェブサイトにアクセスすることができる。ウェブツールを使用することで、アンプリコンの周囲で切断する制限酵素を選択して、ＣＮＶ推定のために連鎖遺伝子コピーを分離することができる。例えば、酵素およびアッセイをデータベースに記憶することができ、制限酵素の選択は自動であり得る。考慮され得る追加の統計量としては、例えば、最短断片長、％ＧＣ含有率、アンプリコン周囲（または内）での切断頻度、および酵素の費用が挙げられる。ＱＴｏｏｌを使用して、１つ以上の制限酵素の選択を支援することができる。図１３および１４は、制限酵素を選択する際に考慮され得る情報を図示する。
【０２１２】
データ分析のためのアッセイ記憶のために、研究者は、アッセイを位置またはプライマー配列によって入力することができる。ＱＴｏｏｌは、アンプリコン配列および公知ＳＮＰを自動的に取得し、記憶し、熱力学的パラメータを計算することができる。研究者は、アッセイをもっと使用する場合、確定サンプルＣＮＶおよびアニーリング温度をはじめとする追加データを入力することができる。
【０２１３】
単一のチューブで逐次的にまたは一緒に行う、１つより多くの酵素による消化が、困難な標的の切断を確実に完了するのに役立つこともある。１つのサンプルの一連の制限酵素消化を異なる酵素、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の酵素で行うことができる。
【０２１４】
その制限酵素消化の後に消化物中の１つ以上の制限酵素を不活性化することができる。一部の実施形態では、前記１つ以上の制限酵素は、熱への曝露によって不活性化されないことがある。殆どの制限酵素は、制限後、制限反応の温度を上昇させることによって熱不活化することができる。熱不活化のための温度は、例えば、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃であることがあり、または約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００℃より上であることがある。前記熱不活化のための温度は、約５０から約１００、約５０から約９０、約６０から約９０、約６５から約９０、約６５から約８５、または約６５から約８０℃であることがある。熱不活化の継続時間は、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１８０、２４０もしくは３００分間であることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１８０、２４０もしくは３００分間より長いこともある。前記熱不活化の継続時間は、約５から約３００、約５から約２００、約５から約１５０、約５から約１００、約５から約７５、約５から約５０、約５から約４０、約５から約３０、約５から約３５、約５から約２５、約５から約２０、または約１０から約２０分間であることがある。前記熱不活化の温度は、二本鎖テンプレートコピーを維持するために、制限された標的断片の融点より低くてよい。
【０２１５】
制限酵素消化に対し１つ以上のキレート剤を添加することにより、該制限酵素消化を停止させることができる。前記１つ以上のキレート剤は、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、またはホスフェートであってよい。制限酵素消化における前記１つ以上のキレート剤の濃度は、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００ｍＭであるか、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００ｍＭであってよい。前記１つ以上のキレート剤の濃度は、約１から約１００ｍＭ、約１から約７５ｍＭ、または約２５から約７５ｍＭであってよい。
【０２１６】
対照アッセイおよびテンプレートを使用して、制限酵素消化工程の効率を測定することができる。
【０２１７】
サンプル
本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して分析されるサンプルは、核酸（例えば、ウイルス）を含む非細胞エンティティーに由来することもあり、または細胞に基づく生物（例えば、古細菌、細菌または真核生物ドメインのメンバー）に由来することもある。場合によっては、病院、研究所、臨床検査所または医学研究所からサンプルを得ることができる。前記サンプルは、核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、を含み得る。前記サンプルは、無細胞核酸を含み得る。場合によっては、ドアまたはベンチトップなどの表面のスワブからサンプルを得る。
【０２１８】
サンプルは、被験体、例えば、植物、真菌、真正細菌、古細菌、プロテストまたは動物からのものであってもよい。前記被験体は、生物であってよく、単細胞生物または多細胞生物のいずれであってもよい。前記被験体は、培養細胞であってもよく、これは、数ある中でも、初代細胞であってもよいし、または樹立細胞系からの細胞であってもよい。サンプルを最初に多細胞生物から任意の好適な形態で単離することができる。前記動物は、魚類、例えばゼブラフィッシュ、であってよい。前記動物は、哺乳動物であってよい。前記哺乳動物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラットまたはブタであってよい。前記哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒト、チンパンジー、オランウータンまたはゴリラであってよい。前記ヒトは、男性であってもよく、または女性であってもよい。サンプルは、ヒト胚またはヒト胎児からのものであってよい。前記ヒトは、乳児、小児、ティーンエージャー、成人または老人であってよい。前記女性は、妊娠していることがあり、妊娠していると推測されることがあり、または妊娠するつもりであることがある。
【０２１９】
サンプルは、健常である被験体（例えば、ヒト被験体）からのものであってよい。一部の実施形態では、サンプルを被験体（例えば、妊婦）から少なくとも妊娠第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６週に採取する。一部の実施形態において、前記被験体は、遺伝性疾患に罹患しており、遺伝性疾患の保因者であり、または遺伝性疾患を発現するもしくは伝えるリスクがあり、この場合の遺伝性疾患は、遺伝的バリエーション、例えば、変異、挿入、付加、欠失、転座、点変異、トリヌクレオチド反復異常および／または一塩基多型（ＳＮＰ）に関連づけることができる任意の疾患である。他の実施形態では、サンプルを出産可能年齢の女性患者から採取し、場合によっては、前記女性患者は、妊娠しておらず、または妊娠状態不明である。さらに他の場合、前記被験体は、男性患者、妊婦の夫である男性、または特定の遺伝子異常のリスクのある、特定の遺伝子異常を有すると診断された、もしくは特定の遺伝子異常を有する男性患者である。場合によっては、前記女性患者は、遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションに罹患している、または遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションの保因者である、または特定の遺伝子異常のリスクがある、または特定の遺伝子異常を有すると診断された、または特定の遺伝子異常を有することが分かっている。場合によっては、遺伝性疾患または遺伝的バリエーションに関する前記女性患者の状態が不明であることがある。さらなる実施形態では、遺伝子配列のコピー数変動に関する状態が分かっているまたは不明である任意の小児または成人患者からサンプルを採取する。場合によっては、前記小児または成人患者は、遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションに罹患しているまたは遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションの保因者であることが分かっている。
【０２２０】
サンプルは、特定の疾患、障害もしくは状態を有する被験体からのものであることがあり、または特定の疾患、障害もしくは状態を有すると推測される（または有するリスクがある）被験体からのものであることもある。例えば、サンプルは、がん患者、がんを有すると推測される患者、またはがんを有するリスクがある患者からのものであることがある。前記がんは、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん腫、カポジ肉腫、肛門がん、基底細胞がん腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄上皮種（ｍｅｄｕｌｌｏｅｐｔｉｔｈｅｌｉｏｍａ）、松果体実質腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管がん腫、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、口唇がん、口腔がん、肺がん、非小細胞がん腫、小細胞がん腫、黒色腫、口内がん（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、骨髄異型性症候群、多発性骨髄腫、髄芽細胞腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、神経芽細胞腫、鼻咽頭がん、口のがん（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザール症候群、皮膚がん、非黒色腫、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん腫、睾丸がん、咽喉がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍であることがある。サンプルは、がん患者のがんからのものであることもあり、および／またはがん患者の正常組織からのものであることもある。
【０２２１】
サンプルは、遺伝性疾患、障害または状態が分かっている被験体からのものであることがある。場合によっては、前記被験体は、遺伝子（例えば、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、ベータグロビン、血色素症（ｈｅｍａｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、ベータアミロイドまたはピルビン酸キナーゼ遺伝子）または遺伝子の一部が野生型である、または変異体であることが分かっている。場合によっては、前記被験体の状態が分かっており、または分かっておらず、該被験体を遺伝子、例えば、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、ベータグロビン、血色素症、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、ベータアミロイドまたはピルビン酸キナーゼ遺伝子の変異または遺伝的バリエーションの存在について試験する。
【０２２２】
サンプルは、房水、硝子体液、胆汁、全血、血清、血漿、母乳、脳脊髄液、耳垢、内リンパ（ｅｎｏｌｙｍｐｈ）、外リンパ、胃液、粘液、腹水、唾液、皮脂、精液、汗、涙、膣分泌物、嘔吐物、糞便または尿であることがある。病院、研究所、臨床検査所または医学研究所からサンプルを得ることができる。被験体からサンプルを採取することができる。前記サンプルは、核酸を含み得る。前記核酸は、例えば、ミトコンドリアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはＣＤＮＡであり得る。前記サンプルは、無細胞核酸を含むことがある。前記サンプルは、細胞系、ゲノムＤＮＡ、無細胞血漿、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプル、または瞬間冷凍サンプルであることがある。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルは、核酸を抽出する前に脱パラフィンすることができる。サンプルは、器官、例えば心臓、皮膚、肝臓、肺、乳房、胃、膵臓、膀胱、結腸、胆嚢、脳などからのものであることがある。
【０２２３】
核酸がＲＮＡであるとき、該ＲＮＡの源は、本明細書に記載する任意の源であり得る。例えば、前記ＲＮＡは、無細胞ｍＲＮＡであることがあり、組織生検の、コア生検の、細針吸引の、凍結乾燥のまたはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のサンプル由来のものであることがある。ＦＦＰＥサンプルは、ＲＮＡを抽出する前に脱パラフィンすることができる。抽出したＲＮＡを分析前に約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７  ３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９℃に加熱することができる。抽出したＲＮＡをこれらのいずれかの温度に、約１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間もしくは１０時間、または少なくとも約１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間もしくは１０時間、加熱することができる。
【０２２４】
様々な下流での応用にＲＮＡを使用することができる。例えば、ＲＮＡをリバーストランスクリプターゼでｃＤＮＡに変換し、該ｃＤＮＡを必要に応じてＰＣＲ、例えばリアルタイムＰＣＲ、に供することができる。前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡを等温増幅反応、例えば等温線形増幅反応、において使用することができる。前記ＲＮＡ、結果として得られるｃＤＮＡ、またはそれらから増幅された分子を、マイクロアレイ実験、遺伝子発現実験、ノーザン分析、サザン分析、シークエンシング反応、次世代シークエンシング反応などにおいて使用することができる。特定のＲＮＡ配列を分析してもよいし、またはＲＮＡ配列を包括的に分析してもよい。
【０２２５】
当業者が利用可能な手段によってサンプルから核酸を抽出することができる。
【０２２６】
増幅について競合するようにサンプルを加工することができる。例示的サンプル加工としては、核酸を放出させるためのサンプルにおける細胞の溶解、サンプルの精製（例えば、増幅を阻害し得る他のサンプル成分から核酸を単離するために）、サンプルの希釈／濃縮、ならびに／またはサンプルと増幅用の試薬との組み合わせを挙げることができ、該増幅用の試薬は、例えばＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰＣＲ増幅用の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（および／またはｄＵＴＰ））、各対立遺伝子配列もしくは多型性遺伝子座を増幅させるためのプライマーセット、増幅すべき各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができるプローブ（例えば、蛍光プローブ、例えば、数ある中でも、ＴＡＱＭＡＮプローブもしくは分子ビーコンプローブ）、Ｍｇ２＋、ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、緩衝剤もしくはこれらの任意の組み合わせである。一部の実施例では、サンプルを制限酵素、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、リバーストランスクリプターゼまたは任意の他の核酸プロセッシング酵素と併用することができる
標的ポリヌクレオチド
本明細書に記載する方法を、１つ以上の標的核酸分子を分析または検出するために使用することができる。用語ポリヌクレオチド、または文法上の相当語句は、共有結合で互いに連結されている少なくとも２つのヌクレオチドを指すことができる。本明細書に記載する核酸は、ホスホジエステル結合を含有し得るが、場合によっては、下で（例えば、プライマーおよびプローブ、例えば標識プローブ、の構築の中で）概説するように、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；ならびにＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６））、ホスホロチオアート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；ならびに米国特許第５，６４４，０４８明細書）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）ならびにペプチド核酸（本明細書では「ＰＮＡ」とも呼ぶ）主鎖および連結（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）参照、これらのすべてが参照により援用されている）を含む代替主鎖を有し得る核酸類似体を含む。他の類似体核酸としては、ロックド核酸（本明細書では「ＬＮＡ」とも呼ぶ）、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０．１３２５２  ３（１９９８）；陽性主鎖（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５）；非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号明細書；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆ａｍｐ；Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）；第２および３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、編集Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース主鎖（米国特許第５．２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号明細書、ならびに第６および７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、編集Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されているものを含む）を含む二環式構造を有するものが挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ．１６９  １７６を参照されたし）。幾つかの核酸類似体が、Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日号、３５頁に記載されている。「ロックド核酸」も核酸類似体の定義内に含まれる。ＬＮＡは、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子を接続するメチレン橋架けによってリボース環が「ロックされている」核酸類似体の１クラスである。これらの参考文献のすべてが参照により本明細書に明確に援用されている。リボース−ホスフェート主鎖のこれらの修飾を行って、生理環境におけるかかる分子の安定性および半減期を増すことができる。例えば、ＰＮＡ：ＤＮＡおよびＬＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、より高い安定性を呈示することができ、それ故、一部の実施形態においてそれらを使用することができる。前記標的核酸は、明記したように一本鎖であることがあり、もしくは二本鎖であることがあり、または二本鎖もしくは一本鎖配列両方の部分を含有することがある。応用に依存して、核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む）またはハイブリッドであることがあり、前記核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミジン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどをはじめとする塩基の任意の組み合わせを含有する。
【０２２７】
本明細書において提供する方法および組成物を用いて、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）の量を評価することができる。前記方法および組成物を使用して、第二のポリヌクレオチドの量と比較して第一のポリヌクレオチド量を評価することができる。前記方法を用いて、溶液中の合成プラスミドの量を分析することができ；被験体から得たまたはある環境から得たサンプル中の病原性生物（例えば、微生物、細菌、ウイルス、寄生虫、レトロウイルス、レンチウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、インフルエンザウイルスなど）を検出することができる。ポリヌクレオチドの稀な集団がより大きなポリヌクレオチド集団内に存在する他の応用にも前記方法を用いることができる。
【０２２８】
本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して被験体のサンプルが分析される、該被験体のサンプル（例えば、ゲノム）中の標的核酸配列のコピーの数は、０であることがあり、あるいは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００もしくは１００，０００であるか、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００もしくは１００，０００であることもある。本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して被験体のサンプルが分析される、該被験体のゲノム中の標的核酸配列のコピーの数は、約１から約２０、約１から約１５、約１から約１０、約１から約７、約１から約５、約１から約３、約１から約１０００、約１から約５００、約１から約２５０、約１から約１００、約１０から約１０００、約１０から約５００、約１０から約２５０、約１０から約１００、約１０から約５０、約１０から約２０、約０から約１００、約０から約５０、約０から約２５または約０から約１０であることがある。
【０２２９】
前記標的核酸配列は、１つの染色体上にあることがある。標的核酸が、ヒト被験体に由来するサンプル中にある場合、該標的核酸配列は、第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体のうちの１つ以上の上にあることがある。前記標的核酸は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３個の染色体上にあることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３個より多くの染色体上にあることもある。標的核酸配列の２個以上のコピーが同じまたは異なる染色体上にあることがある。ヒト被験体の場合、標的核酸配列の２個以上のコピーが第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体上にあることがある。前記標的核酸配列の２個以上のコピーは、被験体の１つのポリヌクレオチド（例えば、染色体）上にあることもあるが、前記標的核酸は、該被験体から採取されたサンプル中で、該サンプルの取り扱いに起因して（例えば、断片化により）分離されていることもある。
【０２３０】
前記標的核酸の２個のコピーが同じポリヌクレオチド上、例えば同じ染色体上にあるとき、該２個のコピーは、該ポリヌクレオチド上で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、百万、２百万、３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１千万、２千万、３千万、４千万、５千万、６千万、７千万、８千万、９千万または１億塩基もしくは塩基対離隔して配置されていることがあり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、百万、２百万、３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１千万、２千万、３千万、４千万、５千万、６千万、７千万、８千万、９千万または１億塩基もしくは塩基対より大きく離隔して配置されていることもり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、百万、２百万、３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万、９百万、１千万、２千万、３千万、４千万、５千万、６千万、７千万、８千万、９千万または１億塩基もしくは塩基対未満離隔して配置されていることもある。２つの標的核酸は、約１００から約１００，０００、約１００から約１０，０００、約１００から約１，０００、約１０から約１０，０００、または約１０から約１，０００塩基または塩基対離隔して配置されていることがある。
【０２３１】
標的配列は、遺伝子であることがある。例えば、前記遺伝子は、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、ＣＹＰ２Ｄ６、低コピー反復（ＬＣＲ）リッチ配列（例えば、Ｂａｌｉｋｏｖａら（２００８）Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．８２：１８１−１８７参照）、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＮＡＴ１、ＩＭＰＤＨ１、ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＲ２Ａ１２、ＯＲ２Ａ１４、ＯＲ２Ａ２、ＯＲ２Ａ２５、ＯＲ２Ａ５、ＯＲ２Ａ１、ＯＲ２Ａ４２、ＯＲ２Ａ７、ＯＲ４Ｆ２１、ＯＲ４Ｆ２９、ＯＲ４Ｃ６、ＯＲ４Ｐ４、ＯＲ４Ｓ２、ＯＲ５Ｄ１３、ＲＯＭ１、ＴＡＳ＠Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＯＲ６Ｃ２、ＯＲ６Ｃ４、ＯＲ６Ｃ６８、ＯＲ６Ｃ７０、ＯＲ４Ｍ１、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ４Ｋ１、ＯＲ４Ｋ２、ＯＲ４Ｋ５、ＯＲ４Ｎ２、ＯＲ４Ｋ１３、ＯＲ４Ｋ１４、ＯＲ４Ｋ１５、ＯＲ４Ｍ２、ＯＲ４Ｎ４、ＯＲ１Ｆ１、ＡＣＴＧ１、ＦＳＣＮ２、ＯＲ２Ｚ１、ＯＲ１１Ｈ１、ＭＹＨ９、ＳＫＩ、ＴＰ７３、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＲＡＢ３Ｂ、ＶＡＶ３、ＲＡＬＢ、ＢＯＫ、ＮＡＴ６、ＴＵＳＣ２、ＴＵＳＣ４、ＴＡＢ３３Ｂ、Ｃ６ｏｒｆ２１０、ＥＳＲ１、ＭＡＦＫ、ＭＡＤ１Ｌ１、ＭＹＣ、ＶＡＶ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＷＴ１、ＷＩＴ−１、Ｃ１ＱＴＮＦ４、ＭＥＮ１、ＣＣＮＤ１、ＯＲＡＯＶ１、ＭＬＬ２、Ｃ１３ｏｒｆ１０、ＴＮＦＡＩＰ２、ＡＸＩＮ１、ＢＣＡＲ１、ＴＡＸ１ＢＰ３、ＮＦ１、ＰＨＢ、ＭＡＦＧ、Ｃ１ＱＴＮＦ１、ＹＥＳ１、ＤＣＣ、ＳＨ３ＧＬ１、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ１４、ＶＡＶ１、ＲＡＢ３Ａ、ＰＴＯＶ１、ＢＡＸ、ＲＲＡＳ、ＢＣＡＳ４、ＨＩＣ２、ＮＲＯＢ２、ＴＴＮ、ＳＧＣＢ、ＳＭＡ３、ＳＭＡ４、ＳＭＮ１、ＬＰＡ、ＰＡＲＫ２、ＧＣＫ、ＧＰＲ５１、ＢＳＣＬ２、Ａ２Ｍ、ＴＢＸＡ２Ｒ、ＦＫＲＰまたはＣＯＭＴであることがある。
【０２３２】
標的配列は、マイクロＲＮＡ、例えば、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３５ａ−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−９５、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ａ−１、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆ−１、ｈａｓ−ｍｉｒ−２０２、ｈａｓ−ｍｉｒ−１３０ａ、ｈａｓ−ｍｉｒ−１３０ａ、ｈａｓ−ｍｉｒ−３３８、ｈａｓ−ｍｉｒ−１９９ａ−１、ｈａｓ−ｍｉｒ−１８１ｃ、ｈａｓ−ｍｉｒ−１８１ｄ、ｈａｓ−ｍｉｒ−２３ａ、ｈａｓ−ｍｉｒ−２４−２、ｈａｓ−ｍｉｒ−２７ａ、ｈａｓ−ｍｉｒ−１５０、ｈａｓ−ｍｉｒ−４９９、ｈａｓ−ｍｉｒ−１２４ａ−３、またはｈａｓ−ｍｉｒ−１８５をコードしていることがある。
【０２３３】
標的配列は、Ｗｏｎｇら（２００７）Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８０：９１−１０４に収載されているいずれかの配列であることもある。
【０２３４】
増幅および検出
本明細書に記載する方法は、核酸増幅を用いることができる。標的核酸の増幅を当該技術分野において公知の任意の手段によって行うことができる。増幅を熱サイクリングによって行うことができ、または等温的に行うことができる。例示的実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅を果たすことができる。
【０２３５】
使用することができるＰＣＲ技法の例としては、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、マルチプレックス蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、シングルセルＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチューコロニーＰＣＲ（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ）、インサイチュー・ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、分子反転プローブ（ＭＩＰ）ＰＣＲ、自立配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、アービトラリリー・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書で使用することができる他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号および同第６，５８２，９３８号明細書に記載されているものが挙げられる。ビーズを用いて標的核酸の増幅を行うことができる。他の実施形態では、ビーズを用いて増幅を行わない。等温増幅、例えば、等温線形増幅によって増幅を行ってもよい。ポリメラーゼの添加前に２分間、反応を９５℃に加熱する、またはサイクル１の第一の加熱工程までポリメラーゼを不活性に保つことができる、ホットスタートＰＣＲを行ってもよい。ホットスタートＰＣＲを用いて、非特異的増幅を最少にすることができる。増幅のための他の戦略および態様は、参考として本明細書に援用されている、２０１０年７月８日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号Ａ１明細書に記載されている。
【０２３６】
標的配列および参照配列の増幅のための技法は当該技術分野において公知であり、米国特許第７，０４８，４８１号明細書に記載されている方法を含む。簡単に言うと、前記技法は、場合により１液滴につき平均で約５、４、３、２または１未満の標的核酸分子（ポリヌクレオチド）を各々が含有する小液滴にサンプルを分け、各液滴内の核酸を増幅し、標的核酸配列の存在を検出する方法および組成物を含み得る。場合によっては、増幅される配列は、ゲノムＤＮＡ自体ではなくゲノムＤＮＡに対するプローブ上に存在する。場合によっては、少なくとも２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または０個の液滴に含まれる標的核酸のコピー数が０である。
【０２３７】
増幅反応についての情報をデータベースに入力することができる。例えば、図１５Ａおよび１５Ｂは、データベースに入力することができるアッセイ情報を図示する。
【０２３８】
プライマー
二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するために公知のパラメータに従ってプライマーを設計することができる。異なるプライマー対を、ほぼ同じ温度で、例えば別のプライマー対の約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃以内で、アニールし、融解することができる。場合によっては、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００個より多くの、またはそれより多くのプライマーを最初に使用する。かかるプライマーは、本明細書に記載する遺伝子標的にハイブリダイズすることが可能であり得る。一部の実施形態では、約２から約１０，０００、約２から約５，０００、約２から約２，５００、約２から約１，０００、約２から約５００、約２から約１００、約２から約５０、約２から約２０、約２から約１０、または約２から約６個のプライマーを使用する。
【０２３９】
様々な方法によってプライマーを調製することができ、それらの方法としては、当該技術分野において周知の方法を用いる適切な配列のクローニングおよび直接化学合成（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９））が挙げられるが、これらに限定されない。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳｉｇｍａおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの供給業者からプライマーを入手することもできる。前記プライマーは、同一の融解温度を有することがある。プライマーの融解温度は、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４または８５℃であることがある。一部の実施形態において、前記プライマーの融解温度は、約３０から約８５℃、約３０から約８０℃、約３０から約７５℃、約３０から約７０℃、約３０から約６５℃、約３０から約６０℃、約３０から約５５℃、約３０から約５０℃、約４０から約８５℃、約４０から約８０℃、約４０から約７５℃、約４０から約７０℃、約４０から約６５℃、約４０から約６０℃、約４０から約５５℃、約４０から約５０℃、約５０から約８５℃、約５０から約８０℃、約５０から約７５℃、約５０から約７０℃、約５０から約６５℃、約５０から約６０℃、約５０から約５５℃、約５２から約６０℃、約５２から約５８℃、約５２から約５６℃、または約５２から約５４℃である。
【０２４０】
前記プライマーの長さを５’末端または３’末端で延長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プライマー対のプライマーの一方が他方のプライマーより長いことがある。プライマー対の中のプライマーの３’アニーリング長が異なることがある。また、各プライマー対のアニーリング位置を、それらのプライマー対の配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように設計することができる。２５塩基対より小さいプライマーの融解温度を決定するための方程式がウォレスの法則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇからのＤＮＡｓｉｓをはじめとする（しかしこれらに限定されない）コンピュータプログラムを使用してプライマーを設計することもできる。Ｎｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌの無料ウェブベースプログラム）などのソフトウェアプログラムを使用して、各プライマーのＴＭ（融解またはアニーリング温度）を算出することができる。約サイクル１、２、３、４、５、約サイクル６から約サイクル１０、約サイクル１０から約サイクル１５、約サイクル１５から約サイクル２０、約サイクル２０から約サイクル２５、約サイクル２５から約サイクル３０、約サイクル３０から約サイクル３５、または約サイクル３５から約サイクル４０をはじめとする（しかしこれらに限定されない）任意の増幅サイクル後に、プライマーのアニーリング温度を再び算出し、上昇させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’半分を関心対象の各遺伝子座からの産物に組み込むことができ、かくして各プライマーの５’半分と３’半分の配列両方に基づいてＴＭを再び算出することができる。
【０２４１】
約サイクル１、２、３、４、５、約サイクル６から約サイクル１０、約サイクル１０から約サイクル１５、約サイクル１５から約サイクル２０、約サイクル２０から約サイクル２５、約サイクル２５から約サイクル３０、約サイクル３０から約サイクル３５、または約サイクル３５から約サイクル４０をはじめとする（しかしこれらに限定されない）任意の増幅サイクル後に、プライマーのアニーリング温度を再び算出し、上昇させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’半分を関心対象の各遺伝子座からの産物に組み込むことができ、かくして各プライマーの５’半分と３’半分の配列両方に基づいてＴＭを再び算出することができる。
【０２４２】
ＤＮＡポリメラーゼ
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）、ゲノムＤＮＡポリメラーゼまたはシーケナーゼをはじめとする（しかしこれらに限定されない）、プライマー伸長を触媒する任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。前記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有することがある。前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を保有することがある。前記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を保有することがある。
【０２４３】
サーモサイクリング
任意の数のＰＣＲサイクル、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５のサイクル、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５より多くのサイクル、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５未満のサイクルを用いてＤＮＡを増幅させることができる。前記増幅サイクル数は、約１から約４５、約１０から約４５、約２０から約４５、約３０から約４５、約３５から約４５、約１０から約４０、約１０から約３０、約１０から約２５、約１０から約２０、約１０から約１５、約２０から約３５、約２５から約３５、約３０から約３５、または約３５から約４０であることがある。
【０２４４】
液滴内に含有されているサンプルを用いてサーモサイクリング反応を行うことができる。前記液滴は、サーモサイクリング中、無損傷のままであることができる。液滴は、サーモサイクリング中、約１０，０００液滴／ｍＬ、１００，０００液滴／ｍＬ、２００，０００液滴／ｍＬ、３００，０００液滴／ｍＬ、４００，０００液滴／ｍＬ、５００，０００液滴／ｍＬ、６００，０００液滴／ｍＬ、７００，０００液滴／ｍＬ、８００，０００液滴／ｍＬ、９００，０００液滴／ｍＬまたは１，０００，０００液滴／ｍＬより高い密度で、無損傷のままであることができる。他の場合、サーモサイクリング中に２つ以上の液滴が合体することがある。他の場合、１００個より多くの、または１，０００個より多くの液滴がサーモサイクリング中に合体することがある。
【０２４５】
プローブ
当該技術分野において公知の方法によって汎用プローブを設計することができる。一部の実施形態において、前記プローブは、ランダム配列である。アッセイにおいて標的ポリヌクレオチドを、またはサンプル中にある可能性がある他の非標的ポリヌクレオチド（例えば、標的ポリヌクレオチドによって占有されている領域外のゲノムＤＮＡ）に結合しないことを保証するように、汎用プローブを選択することができる。
【０２４６】
本明細書に記載する方法において標的核酸配列または参照核酸配列を検出するためにプローブ（例えば、Ｔａｑｍａｎプローブ）に対して使用する標識（蛍光体、色素）は、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ）、４，７，２’−トリクロロ−７’−フェニル−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ  ３．５、Ｃｙ  ５、Ｃｙ  ５．５、Ｃｙ  ７、テトラメチルローダミン、ＲＯＸおよびＪＯＥであることがある。前記標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６６０、６８０、７００および７５０であることがある。前記標識は、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−Ｘ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−ＸおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘであることがある。前記標識は、プローブの５’末端にあることもあり、プローブの３’末端にあることもあり、プローブの５’および３’両末端にあることもあり、またはプローブの内側にあることもある。独自の標識を使用して実験中に異なる遺伝子座各々を検出することができる。
【０２４７】
プローブ、例えばＴａｑｍａｎプローブは、クエンチャー、例えば３’クエンチャーを含むことがある。前記３’クエンチャーは、例えば、ＴＡＭＡＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２またはＢＨＱ−３であることがある。場合によっては、本明細書において提供する方法で使用するクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）である。場合によっては、前記クエンチャーは、浅い方の溝への結合剤（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）（ＭＧＢ）である。場合によっては、前記クエンチャーは、蛍光クエンチャーである。他の場合、前記クエンチャーは、非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）である。
【０２４８】
プローブは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長であるか、または少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長であり得る。プローブは、約８から約４０、約１０から約４０、約１０から約３５、約１０から約３０、約１０から約２５、約１０から約２０、約１５から約４０、約１５から約３５、約１５から約３０、約１５から約２５、約１５から約２０、約１８から約４０、約１８から約３５、約１８から約３０、約１８から約２５、または約１８から２２塩基であることがある。
【０２４９】
試薬および添加剤
ＰＣＲ反応を行うための溶液および試薬は、緩衝剤を含むことがある。緩衝溶液は、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭのトリス、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭより多くのトリス、または約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭ未満のトリスを含むことがある。場合によっては、塩化カリウムの濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭであることがあり、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭより高いこともあり、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ未満であることもある。緩衝溶液は、約１５ｍＭのトリスと５０ｍＭのＫＣｌを含むことがある。前記ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをはじめとするデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を、各々、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭの濃度で、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭより高い濃度で、または約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭ未満の濃度で含むことがある。場合によっては、非標準ヌクレオチド、例えばｄＵＴＰ、を増幅反応に、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００、８００、９００もしくは１０００μＭの濃度、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００、８００、９００もしくは１０００μＭより高い濃度、または約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００、８００、９００または１０００μＭ未満の濃度まで添加する。場合によっては、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を増幅反応に、約１．０．２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭの濃度、約１．０．２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭより高い濃度、または約１．０．２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭ未満の濃度で添加する。ＭｇＣｌ２の濃度は、約３．２ｍＭであることがある。
【０２５０】
非特異的ブロッキング剤、例えばＢＳＡまたはウシ皮膚からのゼラチンを使用することができ、その場合、ゼラチンまたはＢＳＡは、おおよそ０．１から約０．９％  ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。他の可能なブロッキング剤としては、ベータラクトグロブリン、カゼイン、ドライミルク、または他の一般的なブロッキング剤を挙げることができる。場合によっては、ＢＳＡおよびゼラチンの好ましい濃度は、約０．１％  ｗ／ｖである。
【０２５１】
一部の実施形態において、増幅反応は、非特異的バックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオプリザバティブ（ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲ増進剤（例えば、ベタイン、トリハロースなど）および阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）をはじめとする（しかしこれらに限定されない）１つ以上の添加剤も含むことがある。前記１つ以上の添加剤としては、例えば、２−ピロリドン、アセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｂ−ヒドロキシエチルピロリドン（ＨＥＰ）、プロピオンアミド、ＮＮ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルホルムアミド（ＭＭＰ）、ＮＮ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド（ＮＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール、ベタイン、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、グリセロール、または非イオン性洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｗｅｅｎ  ４０、ＳＤＳ（例えば、約０．１％ＳＤＳ））、サケ精子ＤＮＡ、アジ化ナトリウム、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン；［カルボキシメチル］トリメチルアンモニウム）、ホルムアミド、トレハロース、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、植物多糖類、またはＲＮａｓｅ阻害剤を挙げることができる。
【０２５２】
一部の実施形態において、増幅反応は、１つ以上の緩衝剤を含む。前記１つ以上の緩衝剤は、例えば、ＴＡＰＳ、ビシン、Ｔｒｉｓ、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、ＳＳＣ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、コラミンクロリド、アセトアミドグリシン、グリシンアミド、マレイン酸塩、リン酸塩、ＣＡＢＳ、ピペルジン、グリシン、クエン酸塩、グリシルグリシン、リンゴ酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ヒスチジン、ビス−トリス、エタノールアミン、炭酸塩、ＭＯＰＳＯ、イミダゾール、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＢＳ、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ヒドラジン、Ｔｒｉｚｍａ（トリス）、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ビシン、ＨＥＰＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ホウ酸塩、ＣＨＥＳ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、水酸化アンモニウム、メチルアミンまたはＭＥＳを含み得る。
【０２５３】
場合によっては、非イオン性エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを増幅反応に、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１．０％の濃度で添加する。一般的なバイオサーファクタントとしては、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮが挙げられる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が約０．５％  ｗ／ｖの濃度で存在することがある。
【０２５４】
場合によっては、硫酸マグネシウムを塩化マグネシウムの代わりに類似した濃度で用いることができる。様々な供給業者からの広範な一般商用ＰＣＲバッファーを前記緩衝溶液の代わりに用いることができる。
【０２５５】
検出
蛍光剤によって吸収され得る励起光を発生させるためのモジュールはもちろん、蛍光剤によって放射される光を検出するためのモジュールも装備した様々な検出デバイスを使用して、蛍光検出を果たすことができる。場合によっては、サンプル（例えば、液滴）をバルクで検出することができる。例えば、サンプルをプラスチックチューブに配分することができ、プラスチックチューブからのバルク（ｂｕｌｋ）蛍光を測定する検出器の中にそれらのチューブを配置する。場合によっては、１つ以上のサンプル（例えば、液滴）を、プレート、例えば９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート、の１つ以上のウェルに分配することができ、蛍光プレート読取装置を使用して個々のウェルの蛍光を検出することができる。
【０２５６】
場合によっては、前記検出器は、個々の液滴が検出器に入り、検出を受け、その後、検出器を出る、液滴サンプルのためのハンドリング機能をさらに備える。例えば、フロー・サイトメトリー・デバイスを液滴サンプルからの蛍光検出での使用に適応させることができる。場合によっては、液滴移動を制御するためにポンプを装備したマイクロ流体デバイスを使用して、一列縦隊の液滴から蛍光を検出する。場合によっては、液滴を二次元の表面に配列し、その表面に対して検出器を移動して、単一液滴を含有する各位置での蛍光を検出する。
【０２５７】
コンピュータ
蛍光検出データの収集後、コンピュータを使用してデータを記憶し、加工することができる。コンピュータ実行可能なロジックを利用して、バックグランド蛍光の減算、標的および／または参照配列の割り当てならびにデータの定量化などの機能を遂行することができる。コンピュータは、分子プロファイリングからの診断結果の表示、記憶、取得もしくは算出；ゲノムもしくは核酸発現分析からの生データの表示、記憶、取得もしくは算出；または本発明の方法において有用な任意のサンプルもしくは患者情報の表示、記憶、取得もしくは算出に有用であり得る。
【０２５８】
デジタル分析
デジタル読み出しアッセイ、例えばデジタルＰＣＲ、を用いて、サンプル中の標的の分配および該標的を含有する区画の同定により標的（例えば、標的核酸配列）をカウントすることができる。デジタル読み出しは、所与の区画が関心対象の標的を含有するかどうかを特定する点で二者択一的分析であるが、標的の幾つのコピーが区画内にあるかを必ずしも示すとは限らない。例えば、２つの標的を含有する単一のポリヌクレオチドが１区画内にあることもあるが、通常の分析条件下では区画が１つの標的を含有するとしか考えない。同じポリヌクレオチド上の標的が多数の塩基対によって隔てられている場合、一部の標的核酸配列は、サンプルの精製中に断片化によって分離されることがあり−−一部の連鎖している標的核酸配列は、サンプル調製後に物理的連鎖を保てないことがある。デジタルＰＣＲは、一般に、例えばＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：９２３６−９２４１に、記載されている。この技術の応用としては、例えば、高分解能ＣＮＶ測定、ゲノムワイド関連研究の追跡調査、細胞遺伝学分析、がん組織におけるＣＮＶ変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、およびＣＮＶ連鎖分析が挙げられる。
【０２５９】
一般に、ｄＰＣＲは、サンプルからの個々のポリヌクレオチドを空間的に孤立させる（または分配する）工程、および各区画を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を伴うことがある。前記区画は、例えば、ウェル（例えば、マイクロウェルプレートのウェル）、キャピラリー、エマルジョンの分散相、チャンバ（例えば、小型化チャンバのアレイの中のチャンバ）、液滴、または核酸結合表面であることがある。各区画が約０、１または２個の標的ポリヌクレオチドを有するようにサンプルを配給することができる。各区画は、１区画（例えば、液滴）につき平均で標的核酸の５、４、３、２または１個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５または２００の区画（例えば、液滴）に含まれる標的核酸のコピー数が０である。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物を有するまたは有さない区画の数を計数することができる。区画の総数は、約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００もしくは１，０００，０００であることがあり、または約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００もしくは１，０００，０００より多いこともある。区画の総数は、約５００から約１，０００，０００、約５００から約５００，０００、約５００から約２５０，０００、約５００から約１００，０００、約１０００から約１，０００，０００、約１０００から約５００，０００、約１０００から約２５０，０００、約１０００から約１００，０００、約１０，０００から約１，０００，０００、約１０，０００から約１００，０００、または約１０，０００から約５０，０００であることがある。
【０２６０】
１つの実施形態において、前記デジタルＰＣＲは、液滴デジタルＰＣＲである。液滴デジタルＰＣＲ実験の一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの約０．００００１、０．００００５、０．０００１０、０．０００５０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９または１０個未満のコピーを検出することができる。場合によっては、標的ポリヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００個未満のコピーを検出する。場合によっては、本明細書に記載する液滴を１、２、３、４、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００液滴／秒より速い速度で発生させる。
【０２６１】
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ（商標））は、次世代シークエンサーまたはマイクロアレイによって同定されたコピー数変動を検証するための実際的な解決策を提供することができる。ｄｄＰＣＲ（商標）を用いる方法は、一人の人にＣＮＶ分析のための多くのサンプル、例えば、数百ものサンプルを１回の勤務シフト中にスクリーニングする能力を授けることができる。１つの実施形態では、該標的核酸配列（例えば、第一の遺伝子）と単一コピー参照核酸配列（例えば、第二の遺伝子）の両方を検出する試薬を含むデュプレックスＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを組み立てる前に１つ以上の制限酵素を使用して標的核酸配列のタンデムコピーを分離することを含む、ｄｄＰＣＲ（商標）ワークフローを提供する。ｄｄＰＣＲを用いるときには、反応混合物を約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００ナノリットルの液滴、約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００ナノリットル未満の液滴、または約５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００もしくは１０，０００，０００ナノリットルより大きい液滴に分配し、それらを終点までサーモサイクリングした後、分析することができる。場合によっては、前記液滴は、１ナノリットルより大きく、他の場合、前記液滴は、１ナノリットル未満（例えば、ピコリットル）である。１反応あたりの液滴の数は、約１０００から約１，０００，０００、約１０００から約７５０，０００、約１０００から約５００，０００、約１０００から約２５０，０００、約１０００から約１００，０００、約１０００から約５０，０００、約１０００から約３０，０００、約１０００から約１０，０００、約１０，０００から約１，０００，０００、約１０，０００から約７５０，０００、約１０，０００から約５００，０００、約１０，０００から約２５０，０００、約１０，０００から約１００，０００、約１０，０００から約５０，０００、または約１０，０００から約３０，０００であることがある。１反応あたりの液滴の数は、約２０，０００から約１，０００，０００、約２０，０００から約７５０，０００、約２０，０００から約５００，０００、約２０，０００から約２５０，０００、約２０，０００から約２００，０００、約２０，０００から約５０，０００、約５０，０００から約１００，０００、約５０，０００から約２００，０００、または約５０，０００から約３００，０００であることがある。
【０２６２】
分析を２色読取装置で行うことができる。陽性にカウントされる液滴の画分により、標的および参照核酸配列（例えば、遺伝子）の絶対濃度を測定することが可能になり得る。この情報を用いて、相対コピー数を決定することができる。例えば、１ウェルにつき少なくとも２０，０００のＰＣＲ複製は、高次のコピー数差を解明するための統計的検出力をもたらすことができる。この低コスト法は、隣接コピー数状態のオーバラップなしに整数にわたる９５％信頼区間を有するコピー数測定値を確実に生じさせることができる。この技術は、コピー数変動に関する連鎖を決定することができ、この技術を用いて、遺伝子コピーが同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのかを決定することができる。
【０２６３】
前記容積は、任意の好適なサイズを有し得る。一部の実施形態において、前記容積は、約１０から１０００マイクロメートルの直径または特徴的断面寸法を有することがある。
【０２６４】
分配される核酸は、任意の好適な特徴を有することができる。前記核酸としては、数ある中でも、被験体の遺伝物質（例えば、被験体のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、被験体のメッセンジャーＲＮＡ、および／または被験体のＲＮＡに由来するｃＤＮＡを挙げることができる。前記核酸は、任意の好適な平均長を有することができる。一般に、前記平均長は、染色体上の分析すべき多型性遺伝子座間の距離より実質的に長い。この平均長では、被験体内で連鎖している対立遺伝子が、多くの場合、単離された核酸においても連鎖しており、したがって、水性相に分配したときに同じ容積に一緒に分布する傾向がある。一部の実施形態において、各プライマーセットは、多型性遺伝子座から少なくとも一対の別個の対立遺伝子を増幅させることが可能であり得る。
【０２６５】
任意の好適な平均核酸濃度を含有するように各体積を分配することができる。一般に、水性相中での好適な出発核酸濃度と併用で、前記分配プロセスは、１容積につき平均で約数ゲノム当量未満の核酸を有する容積を生じさせる。前記方法を、１容積につき平均で１ゲノム当量より多い当量（例えば、１容積につき約２ゲノム当量）で行うことができるが、１容積につき平均で約１ゲノム当量未満に濃度を限定することにより、分析は、一般に、より効率的になり、より信頼性が高くなり、バックグラウンドを殆ど伴わない。したがって、各容積は、各多型性遺伝子座を含む標的領域の平均約１個未満のコピーもしくは分子、および／または各多型性遺伝子座の任意の対立遺伝子配列の平均で約１個未満のコピーを含有し得る。
【０２６６】
統合高速フロースルー・サーマルサイクラ・デバイスを、本明細書に記載する方法において使用することができる。例えば、２００９年９月２３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７号パンフレットを参照されたし。かかる統合デバイスでは、２、３または４つの温度ゾーンを保持するシリンダーの周囲にキャピラリーが巻き付いている。液滴は、そのキャピラリーを通って流れるにつれて、異なる温度ゾーンにさらされて、熱サイクリングを果たす。液滴が各温度ゾーンに入ると、その小容積の各液滴が超高速温度転移を生じさせる。
【０２６７】
本明細書に記載する方法、組成物およびキットと共に使用するためのデジタルＰＣＲデバイス（例えば、液滴デジタルＰＣＲデバイス）は、複数のシグナルを検出することができる（例えば、その全体が参考として本明細書に援用されている、２０１１年３月１８日出願の米国仮特許出願第６１／４５４，３７３号を参照されたし）。
【０２６８】
液滴デジタルＰＣＲは、毎秒数千もの別個の強健なな微小液滴リアクターの生成を伴うことができる。ｄｄＰＣＲは、研究者が直ちにアクセスできるデジタルデータを作成することができるインストールベース計器を備えた標準的熱サイクリングを伴うことができる。各液滴の迅速な照合により、最初のサンプル中に存在する標的分子のカウントを得ることができる。
【０２６９】
図１６は、ｄｄＰＣＲ実験についての一般的ワークフローの一例を図示する。図１６に示すように、このプロセスは、サンプルを複数の区画（例えば、液滴）に分配する工程によって開始し、サーマルサイクラにおけるそのサンプルの熱サイクリングがそれに続く。その後、読取装置（例えば、光学読取装置）を使用して液滴の蛍光を検出することができる。
【０２７０】
液滴発生
本開示は、液滴デジタルＰＣＲを使用する組成物および方法を含む。本明細書に記載する液滴は、米国特許第７，６２２，２８０号明細書に記載されているエマルジョン組成物（または２つ以上の不混和性流体の混合物）、および２００９年９月２３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７号パンフレットに記載されているデバイスによって発生される液滴を含む。本明細書において用いる場合、用語エマルジョンは、不混和性液体（例えば、油と水）の混合物を指し得る。油相および／または油中水型エマルジョンは、水性液滴内の反応混合物のコンパートメント形成を可能にする。前記エマルジョンは、連続油相内に水性液滴を含むことができる。本明細書において提供するエマルジョンは、液滴が連続水性相中の油滴である水中油型エマルジョンであることがある。各コンパートメントが、その内容物を蒸発しないようにおよび他のコンパートメントの内容物と合体しないように保護することで、コンパートメント間での混合を防止するように、本明細書において提供するエマルジョンを設計する。
【０２７１】
本明細書に記載する混合物またはエマルジョンは、安定していることもあり、または不安定であることもある。前記エマルジョンは、比較的安定していて合体が最少であり得る。小液滴が結合して漸進的により大きなものを形成すると、合体が起こる。場合によっては、液滴発生器から発生した液滴の約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％未満が他の液滴と合体する。前記エマルジョンにはフロック形成（分散相がフレーク状で懸濁液から出てくるプロセス）も僅かであり得る。
【０２７２】
本明細書に記載の小反応容積へのサンプルの分割は、低減量の試薬の使用を可能にすることができ、それによって、分析の材料費を低下させることができる。分配によりサンプルの複雑さを低減させることで、検出のダイナミックレンジを向上させることもできる。なぜなら、より存在量の高い分子を存在量の低い分子から別のコンパートメントに分けることにより、より存在量が低い分子が反応試薬により大きな比率で接近することができるようになり、その結果、より存在量が低い分子の検出が増進されるからである。
【０２７３】
約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００マイクロメートルの、約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００マイクロメートル未満の、または約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００マイクロメートルより大きい平均直径を有する液滴を発生させることができる。液滴は、約０．００１から約５００、約０．０１から約５００、約０．１から約５００、約０．１から約１００、約０．０１から約１００、または約１から約１００マイクロメートルの平均直径を有することもある。マイクロチャネルクロスフローフォーカシング（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ  ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）または物理的撹拌を用いるエマルジョン液滴の生成のマイクロ流体方法が単分散エマルジョンまたは多分散エマルジョンのいずれかを生成することは公知である。前記液滴は、単分散液滴であることがある。前記液滴を該液滴のサイズが該液滴の平均サイズのプラスマイナス５％より大きく変動しないように発生させることができる。場合によっては、前記液滴を、該液滴のサイズが該液滴の平均サイズのプラスマイナス２％より大きく変動しないように発生させることができる。液滴発生器は、液滴の全集団の平均サイズのプラスマイナス約０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または１０％より大きくサイズが変動する液滴のない液滴の集団を、単一サンプルから発生することができる。
【０２７４】
より高い機械的安定性は、マイクロ流体操作およびより高剪断の流体加工（例えば、マイクロ流体キャピラリーでの、または流路の９０℃の曲り角、例えば弁、を通るもの）に有用であり得る。プレおよびポスト熱処理液滴またはカプセルは、標準的ピペット操作および遠心分離に対して機械的安定であり得る。
【０２７５】
水性サンプルに油相を流すことにより液滴を形成することができる。前記水性相は、ＰＣＲ反応を行うための緩衝溶液および試薬（ヌクレオチド、プライマー、蛍光検出用のプローブ（単数または複数）、テンプレート核酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、および必要に応じてリバーストランスクリプターゼ酵素を含む）を含むことがある。
【０２７６】
前記水性相は、本明細書に記載する１つ以上の緩衝液および／または添加剤を含むことがある。
【０２７７】
前記水性相中の増幅用プライマーは、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７もしくは２．０μＭの濃度、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７もしくは２．０μＭより高い濃度、または約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７もしくは２．０μＭ未満の濃度を有することがある。前記水性相中のプライマー濃度は、約０．０５から約２、約０．１から約１．０、約０．２から約１．０、約０．３から約１．０、約０．４から約１．０、または約０．５から約１．０μＭであることがある。前記プライマーの濃度は、約０．５μＭであることがある。前記水性相は、蛍光検出用の１つ以上のプローブを、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８もしくは２．０μＭの濃度、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８もしくは２．０μＭより高い濃度、または約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８もしくは２．０μＭ未満の濃度で含むことがある。前記水性相は、蛍光検出用の１つ以上のプローブを約０．０５から約２．０、約０．１から約２．０、約０．２５から約２．０、約０．５から約２．０、約０．０５から約１、約０．１から約１、または約０．１から約０．５μＭの濃度で含むことがある。前記蛍光検出用のプローブの濃度は、約０．２５μＭであることがある。ＰＣＲにおける標的核酸濃度に適用できる範囲は、約１ｐｇと約５００ｎｇの間である。
【０２７８】
前記油相は、フッ素化された基油を含み、過フッ素化ポリエステルなどのフッ素化界面活性剤との併用によりこの基油をさらに安定させることができる。場合によっては、前記基油は、ＨＦＥ  ７５００、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０または別の一般的なフッ素化油のうちの１つ以上であり得る。場合によっては、アニオン性界面活性剤は、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｋｒｙｔｏｘ（Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＭ）、Ｋｒｙｔｏｘ  ＦＳＨのアンモニウム塩、またはＫｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体である。Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳは、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％  ｗ／ｗの濃度、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％  ｗ／ｗより高い濃度、または約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％  ｗ／ｗ未満の濃度で存在することがある。一部の好ましい実施形態において、Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳの濃度は、１．８％である。他の好ましい実施形態において、Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＳの濃度は、１．６２％である。Ｋｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％もしくは４．０％  ｗ／ｗの濃度で存在することがある。Ｋｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体の濃度は、約１．８％であることがある。Ｋｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体の濃度は、約１．６２％であることがある。
【０２７９】
前記油相は、油の特性、例えば蒸気圧または粘度または表面張力、を調整するための添加剤をさらに含むことがある。非限定的な例としては、ペルフルオロオクタノールおよび１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールが挙げられる。１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールを約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．００％、１．２５％、１．５０％、１．７５％、２．００％、２．２５％、２．５０％、２．７５％もしくは３．００％  ｗ／ｗの濃度、約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．００％、１．２５％、１．５０％、１．７５％、２．００％、２．２５％、２．５０％、２．７５％もしくは３．００％  ｗ／ｗより高い濃度、または約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．００％、１．２５％、１．５０％、１．７５％、２．００％、２．２５％、２．５０％、２．７５％もしくは３．００％  ｗ／ｗ未満の濃度まで添加することができる。１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールを約０．１８％  ｗ／ｗの濃度まで添加することができる。
【０２８０】
前記エマルジョンを配合して、液体様界面膜を有する高単分散液滴を生成することができ、該液滴を加熱によって固体様界面膜を有するマイクロカプセルに変換することができる。かかるマイクロカプセルは、ＰＣＲ増幅などの反応プロセスを通してそれらの内容物を保持することができるバイオリアクターとして動作することができる。マイクロカプセル形態への変換を加熱によって行うことができる。例えば、かかる変換を約５０、６０、７０、８０、９０または９５℃より高い温度で行うことができる。場合によっては、サーモサイクラを使用してこの加熱を行う。加熱プロセスの間、流体または鉱油オーバーレイを使用して蒸発を防止することができる。加熱前に過剰な連続相油を除去してもよいし、またはしなくてもよい。これらの生体適合性カプセルは、広範な熱的および機械的加工にわたって耐合体性および／または耐フロック形成性であり得る。
【０２８１】
変換後、これらのカプセルを約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃で、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃より上で、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０℃未満で保管することができる。前記カプセルは、生物医学的応用、例えば、高分子の安定なデジタル化されたカプセル化、特に、核酸もしくはタンパク質の混合物を含有する、または両方を一緒に含有する水性生体液；薬物およびワクチン送達；生体分子ライブラリー；臨床画像診断応用ならびにその他に有用であり得る。
【０２８２】
前記マイクロカプセルは、１つ以上のポリヌクレオチドを含有することができ、特に高温で、合体に耐性であり得る。したがって、ＰＣＲ増幅反応を非常に高密度（例えば、１単位容積あたりの反応の数）でおこなうことができる。場合によっては、１ｍＬあたりで約１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００または１０，０００，０００より多くの別々の反応を行うことができる。場合によっては、複数の反応を単一のウェル、例えばマイクロタイタープレートのウェルで、反応容積間の相互混合なく、行うことができる。前記マイクロカプセルは、ＰＣＲ反応の発生を可能にするのに必要な他の成分、例えばプライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなど、も含有することがある。これらのカプセルは、広範な熱的および機械的プロセッシングにわたって耐合体性および耐フロック形成性を呈示する。
【０２８３】
１つの実施形態では、ＤＮＡのサイズを低減させた後、例えば、消化、熱処理または剪断によって、液滴発生を向上させることができる。
【０２８４】
図１７は、ａ）側部からの油の流入によって液滴を狭窄させる場合の液滴形成、およびｂ）液滴をバルク流体から引き離す場合の伸長／局部絞りを示す、幾つかの液滴画像を表示する。
【０２８５】
図１８は、増大するＤＮＡ負荷量の影響を示す。図１８は、流量に対して最大伸長をプロットしている。液滴がちょうど離れるときのクロスの中心からその液滴の最も遠い範囲までの伸長を測定する。ある程度の液滴伸長は許容され得るが、それが過剰になると、液滴をバルク流体につなぐ長い「糸」が引き出される。液滴が離れると、この糸はつぶれて微小液滴になって、望ましくない多分散性をもたらし得る。極端な場合、液滴は離れず、その代り、水性相が連続相としてチャネルの中央を流下し、その一方で油はチャネル壁に沿って流れるので、液滴は形成されない。
【０２８６】
伸長を減少させる１つの方法は、流量を減少させることである。流量の減少は、より低い処理能力およびまた液滴サイズ増大という望ましくな副作用を有することがある。紫（Ｂ）、緑色がかった青（Ｅ）および緑（Ａ）の曲線は、ゼロＤＮＡを有する。これらのサンプルは、チャネルへのそれらの伸長を実質的に増大することなく高い流量を許容することができる。
【０２８７】
青（Ｄ）、橙（Ｆ）および赤（Ｃ）の曲線は、より高いＤＮＡ負荷量を有する。これらの条件については、より高い流量がチャネルへの液滴伸長を生じさせる。低流量を用いて、過剰な液滴伸長を回避することができる。
図１９は、液滴特性を調査するための実験における未消化サンプル１〜１０および消化サンプル１１〜２０を示す。ＤＮＡ負荷量を最も右の列に示し、圧力（流量にほぼ比例）を第二行に示す。この表は、色分けされており、文字をコードしている：Ｊ（赤）は噴出を示し、Ｅ（黄）は伸長を示し、およびＮ（緑）は正常な（噴出および伸長のない）液滴発生を示す。認めることができるように、（制限酵素での）消化は、高ＤＮＡ負荷量および高流量においてさえ、液滴発生を向上させる結果となった。
【０２８８】
応用
本明細書に記載する方法を障害または疾患の診断または予後判定のために使用することができる。
【０２８９】
本明細書において提供する方法および組成物は、ヒト被験体と非ヒト被験体の両方に有用であり得る。本明細書において提供する方法および組成物の応用は非常に多い；例えば、高分解能ＣＮＶ測定、ゲノムワイド関連研究の追跡調査、細胞遺伝学分析、がん組織におけるＣＮＶ変化、ＣＮＶ連鎖分析、ならびにハプロタイプ分析。
【０２９０】
本明細書において提供する応用は、胎児または胚の遺伝子の特徴の診断、予測、決定または評価のための応用を含む。場合によっては、これらの応用は、体外受精または他の生殖補助医療（Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって生成された胚中の核酸を診断、予測、決定または評価するために用いることができる。さらに、本明細書において提供する方法は、発育中の胎児のゲノム内のＣＮＶまたは遺伝学的フェージングを評価するための情報を出産を控えた両親（例えば、妊婦）に提供するために用いることができる。他の場合、本明細書において提供する方法は、未来の子孫の可能性ある遺伝性状に関する両親への助言に役立てるために用いることができる。場合によっては、前記方法を生殖補助医療と併用することができる。例えば、体外受精によって生成された胚から採取したサンプルにおけるＣＮＶまたは遺伝学的フェージングを評価するためにその情報を用いることができる。
【０２９１】
がん細胞では１つ以上のＣＮＶを見出すことができる。例えば、非小細胞肺がんではＥＧＦＲコピー数が増加され得る。ＣＮＶを治療の効力と関連づけることができる。例えば、ＨＥＲ２遺伝子コピー数増加は、進行非小細胞肺がんでのゲフィチチブ療法への応答を強化することができる。Ｃａｐｐｕｚｚｏ  Ｆ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：５００７−５０１８を参照されたし。高ＥＧＦＲ遺伝子コピー数により、ラパチニブおよびカペシタビンへの感受性増加を予測することができる。Ｆａｂｉら（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８：１５ｓ（２０１０  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）を参照されたし。高ＨＧＦＲ遺伝子コピー数は、セツキシマブおよびパニツムマブへの感受性増加と関連づけられる。
【０２９２】
１つの実施形態では、本明細書に記載する方法を用いて標的配列のコピーの数を決定する工程、および該決定に基づいて治療法を設計する工程を含む方法を提供する。１つの実施形態において、前記標的はＥＧＦＲであり、前記治療法は、セツキシマブ、パニツムマブ、ラパチニブおよび／またはカペシタビンの投与を含む。もう１つの実施形態において、前記標的はＥＲＢＢ２であり、前記治療法は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を含む。
【０２９３】
コピー数変動は、ヒト間の遺伝的バリエーションの一因となり得る。例えば、Ｓｈｅｂａｔ  Ｊ．ら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：５２５−５２８を参照されたし。
【０２９４】
コピー数変動と関連づけられる疾患としては、例えば、ディジョージ／口蓋心顔面症候群（２２ｑ１１．２欠失）、プラダー・ウィリー症候群（１５ｑ１１−ｑ１３欠失）、ウィリアムズ・ビューレン症候群（７ｑ１１．２３欠失）、ミラー・ディーカー症候群（ＭＤＬＳ）（１７ｐ１３．３微小欠失）、スミス・マゲニス症候群（ＳＭＳ）（１７ｐ１１．２微小欠失）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）（１７ｑ１１．２微小欠失）、Ｐｈｅｌａｎ−ＭｃＥｒｍｉｄ症候群（２２ｑ１３欠失）、レット症候群（Ｘ染色体ｑ２８上のＭＥＣｐ２の機能喪失型変異）、メルツバッハー病（ＰＬＰ１のＣＮＶ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）（第５染色体ｑ１３上のテロメアＳＭＮ１のホモ接合不在）、ポットキ・ラプスキ症候群（ＰＴＬＳ、第１７染色体ｐ．１１．２の重複）を挙げることができる。ＰＭＰ２２遺伝子の追加のコピーをシャルコー・マリー・トゥース・ニューロパチーＩＡ型（ＣＭＴ１Ａ）および圧迫性麻痺傾向を伴う遺伝性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）と関連づけることができる。本明細書に記載するＣＮＶの検出方法は、本明細書に記載するおよび参照により援用されている出版物に記載されているＣＮＶ障害を診断するために使用することができる。前記疾患は、Ｌｕｐｓｋｉ  Ｊ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：Ｓ４３−Ｓ４７に記載されている疾患であり得る。
【０２９５】
異数性（ａｎｅｕｐｌｏｉｄｅｓ）、例えば、胎児異数性としては、例えば、１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミー（ダウン症候群）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、１つ以上の染色体のモノソミー（Ｘ染色体モノソミー、ターナー症候群）、Ｘトリソミー、１つ以上の染色体のトリソミー、１つ以上の染色体のテトラソミーまたはペンタソミー（例えば、ＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ、ＸＸＸＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＹＹＹＹおよびＸＸＹＹＹ）、三倍体性（すべての染色体が３つ、例えば、ヒトの場合は６９染色体）、四倍体性（すべての染色体が４つ、例えば、ヒトの場合は９２染色体）、および多倍体性を挙げることができる。一部の実施形態において、異数性は、部分異数性（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）であることがある。部分異数性としては、例えば、１ｐ３６重複、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、ダウン症候群、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、およびネコ眼症候群を挙げることができる。場合によっては、異常遺伝子型、例えば、胎児の遺伝子型は、性染色体または常染色体の１つ以上の欠失に起因し、この欠失は、ネコ鳴き症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムズ・ビューレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫性麻痺傾向を伴う遺伝性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損症、カルマン症候群、線状皮膚欠損を伴う小眼球症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、Ｙ上の精巣決定因子、無精子症（Ａｚｏｓｐｅｒｍｉａ）（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、または１ｐ３６欠失などの状態を生じさせる結果となり得る。一部の実施形態において、染色体数の減少は、ＸＯ症候群を生じさせる結果となる。
【０２９６】
過剰なゲノムＤＮＡコピー数変動がリー・フラウメニがん素因症候群において見出された（Ｓｈｌｉｅｎら（２００８）ＰＮＡＳ  １０５：１１２６４−９）。ＣＮＶは、ＣＨＡＲＧＥ（コロボーム、心奇形、後鼻腔閉鎖、遅延、性器、および耳奇形）、ピータース・プラス、ピット・ホプキンス、および血小板減少・橈骨欠損症候群（例えば、Ｒｏｐｅｒｓ  ＨＨ（２００７）  Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８１：１９９−２０７を参照されたし）をはじめとする、先天異常症候群に関連づけられる。コピー数変動とがんの関係は、例えば、Ｓｈｌｉｅｎ  Ａ．およびＭａｌｋｉｎ  Ｄ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．１（６）：６２に記載されている。コピー数変動は、例えば、自閉症、統合失調症および特発性学習障害と関連づけられる。例えば、Ｓｅｂａｔ  Ｊ．ら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：４４５−９；Ｐｉｎｔｏ  Ｊ．ら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６６：３６８−７２；Ｃｏｏｋ  Ｅ．Ｈ．およびＳｃｈｅｒｅｒ  Ｓ．Ｗ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：９１９−９２３を参照されたし。
【０２９７】
コピー数変動を一定の治療法に対するがん患者の耐性と関連づけることができる。例えば、チミジル酸シンターゼの増幅は、転移性結腸直腸がん患者において５−フルオロウラシル処置に対する耐性をもたらす結果となり得る。Ｗａｎｇら（２００２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、第９９巻、ｐｐ．１６１５６−６１を参照されたし。
【０２９８】
ＣＣＬ３Ｌ１の高コピー数は、ＨＩＶ感染へのより低い感受性と関連づけられる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｅ．ら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：１４３４−１４４０）。ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６細胞表面免疫グロブリン受容体）の低コピー数は、全身性エリテマトーデスへの感受性を増大させ得る（Ａｉｔｍａｎ  Ｔ．Ｊ．ら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：８５１−８５５）。常染色体優性小耳症は、第４染色体ｐ１６でのコピー数可変領域の５個のタンデムコピーに関連していることが判明した（Ｂａｌｉｋｏｖａ  Ｉ．（２００８）Ａｍ  Ｊ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．８２：１８１−１８７）。本明細書に記載する方法、組成物およびキットは、これらの状態のいずれかを調査するためにも使用することができる。
【０２９９】
高デンプン食を摂る集団からの個体は、一般に、低デンプン食を摂る集団からの個体より多いアミラーゼ遺伝子（ＡＭＹ１）コピーを有する（Ｐｅｒｒｙ  Ｈ．ら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：１２５６−１２６０）。したがって、コピー数は、進化中に陽性選択を受け得る。本明細書に記載する方法、組成物およびキットは、進化の研究に用いることができる。
【０３００】
疾患と関連づけられるコピー数変動の他の例としては、例えば、２１トリソミー（ダウン症候群）、１８トリソミー（エドワード症候群）および１３トリソミー（パトー症候群）が挙げられる。
【０３０１】
核酸が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかを決定することで、様々な応用のための有用な情報を提供することができる。例えば、本明細書に記載する方法は、障害または疾患、例えば、遺伝性障害を診断または予後判定するために用いることができる。本明細書に記載する方法は、胎児の障害、例えば、胎児の異数性を診断および予後判定するために用いることができる。
【０３０２】
本明細書に記載する方法は、感染、例えば、ウイルスまたは細菌感染を評価するのに有用であり得る。例えば、前記方法は、２つの変異が単一のウイルスもしくは細菌内に存するかどうか、または２つ以上の変異が異なる個体のウイルスもしくは細菌内にあるかどうかを決定するために用いることができる。
【０３０３】
本明細書に記載する方法は、トランスジェニックマウスの産生をモニターするのに有用であり得る。例えば、前記方法は、導入遺伝子がトランスジェニック生物のゲノムに１回導入されたのか、複数回導入されたのかを決定するために用いることができる。
【０３０４】
アポトーシス
核酸が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかの決定を、アポトーシスを研究するために、またはアポトーシスに関係する疾患を診断もしくは予後判定するために用いることができる。アポトーシスは、プログラムされた細胞死の過程である。アポトーシスの徴候としては、例えば、小疱形成、細胞膜非対称性および付着の喪失、細胞収縮、核断片化、染色質凝縮、ならびに染色体ＤＮＡ断片化を挙げることができる。アポトーシス中、内因性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋依存性エンドヌクレアーゼ）は、染色質ＤＮＡを約１８０〜２００塩基対のヌクレオソーム間断片または約１８０〜２００塩基対の集まりに開裂させることができる。本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットを使用して、異なるアポトーシス期の異なる形態の遺伝物質の断片化状態を決定することができる。本明細書に記載する方法は、例えばフローサイトメトリー、蛍光アッセイまたは（ＴＵＮＥＬ）（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング）をはじめとする１つ以上の他のアポトーシス分析方法と共に用いることができる。
【０３０５】
アポトーシスは、外因性もしくはデス受容体経路を伴うことがあり、または内因性もしくはミトコンドリア経路を伴うことがあり、ならびに／またはＴ細胞媒介細胞傷害性およびパーフォリン−グランザイム依存性細胞死を伴う経路を伴うことがある。デス受容体経路は、デスリガンドのデス受容体への結合を含むことがある（例えば、ＦａｓＬ（脂肪酸シンセターゼリガンド、ＴＮＦＳＦ６、Ａｐｏ１、アポトーシス抗原リガンド１、ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８、ＡＰＴ１ＬＧ１）／ＦａｓＲ（脂肪酸シンセターゼ受容体、ＴＮＦＲＳＦ６、ＡＴＰ１、ＣＤ９５）；ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ、ＴＮＦリガンド、ＴＮＦＡ、カケクチン）／ＴＮＦＲ１（腫瘍壊死因子受容体１、ＴＮＦ受容体、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ｐ５５  ＴＮＦＲ、ＣＤ１２０ａ）；Ａｐｏ３Ｌ（Ａｐｏ３リガンド、ＴＮＦＳＦ１２、Ａｐｏ３リガンド、ＴＷＥＡＫ、ＤＲ３ＬＧ）／ＤＲ３（デス受容体３、ＴＮＦＲＳＦ１２、Ａｐｏ３、ＷＳＬ−１、ＴＲＡＭＰ、ＬＡＲＤ、ＤＤＲ３）；Ａｐｏ２Ｌ（Ａｐｏ２リガンド、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド）／ＤＲ４（デス受容体４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＡＰＯ２）；ならびにＡｐｏ２Ｌ／ＤＲ５（デス受容体５、ＴＮＦＲＳ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＫＩＬＬＥＲ、ＺＴＮＦＲ９）。ＴＮＦ受容体は、システインリッチ細胞外ドメインおよび細胞質「デスドメイン」を含むことができる。Ｆａｓ受容体へのＦａｓの結合は、ＦＡＤＤアダプタータンパク質の結合を生じさせる結果となり得る。ＴＮＦ受容体へのＴＮＦリガンドの結合は、ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦ受容体関連デスドメイン）アダプタータンパク質の結合、ならびにＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連デスドメイン、ＭＯＲＴ１）およびＲＩＰ（受容体相互作用性タンパク質、ＲＩＰＫ１）の動員を生じさせる結果となり得る。そのとき、ＦＡＤＤは、デスエフェクタードメインとの二量体化によってプロカスパーゼ−８と会合してデス誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を形成することができる。この作用は、プロカスパーゼ−８の自己触媒性活性化を生じさせる結果となり得る。カスパーゼ−８の活性化は、以下に記載するアポトーシスの「実行フェーズ」を生じさせる結果となり得る。
【０３０６】
デス受容体媒介アポトーシスは、ＦＡＤＤに結合し得るｃＦＬＩＰ（Ｃａｓｐｅｒ、Ｉ−ＦＬＩＣＥ、ＦＬＡＭＥ−１、ＣＡＳＨ、ＣＬＡＲＰ、ＭＲＩＴ）およびカスパーゼ−８（ＦＬＩＣＥ、ＦＡＤＤ様Ｉｃｅ、Ｍａｃｈ−１、Ｍｃｈ５）によって阻害され得る。Ｔｏｓｏは、Ｔ細胞におけるＦａｓ誘導アポトーシスをカスパーゼ−８プロセッシングの阻害によって阻止することができる。
【０３０７】
パーフォリン／グランザイム経路において、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、膜貫通型細孔形成分子であるパーフォリンを分泌し、その後、その細孔を通して細胞質顆粒を標的細胞に放出することにより、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を死滅させることができる。セリンプロテアーゼであるグランザイムＡおよびグランザイムＢは、前記顆粒の成分であり得る。グランザイムＢは、プロカスパーゼ−１０を開裂させ、それによってそれを活性化することができ、かつＩＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮＡｓｅのインヒビター）を開裂させることができる。グランザイムＢは、Ｂｉｄを開裂させることおよびシトクロムｃ放出を誘導することによりミトコンドリア経路において役割を果たすことができる。グランザイムＢはまた、カスパーゼ−３を直接活性化することができる。グランザイムＡは、ＤＮＡｓｅ  ＮＭ２３−Ｈ１を介してＤＮＡニッキングを活性化することができ、そのＮＭ２３−Ｈ１はＳＥＴ複合体によって阻害することができる。グランザイムＡは、ＳＥＴ複合体を開裂させてＮＭ２３−Ｈ１の阻害を解除することができる。
【０３０８】
内因性アポトーシス経路は、非受容体媒介刺激を有し得、この刺激は、陽性様式で作用することもあり、または陰性様式で作用することもある。例えば、一定の因子（例えば、成長因子、ホルモン、サイトカイン）の不在がアポトーシスを誘導することができる。陽性の様式で作用することができる刺激としては、例えば、放射線、フリーラジカル、ウイルス感染、毒素、低酸素、および高体温が挙げられる。これらの刺激は、ミトコンドリア透過性遷移（ＭＰＴ）細孔の開口、ミトコンドリア膜内外電位差の喪失、および膜間腔からサイトゾルへのアポトーシス促進タンパク質の放出を生じさせ得る。放出されるタンパク質の１つ群は、シトクロムｃ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、およびセリンプロテアーゼＨｔｒＡ２／Ｏｍｉを含み、これらは、カスパーゼ依存性ミトコンドリア経路を活性化することができる。シトクロムｃは、Ａｐａｆ−１およびプロカスパーゼ−９を結合し、活性化して、アポトソームを形成することができ、ならびにカスパーゼ−９を活性化することができる。Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯおよびＨｔｒＡ２／Ｏｍｉは、ＩＡＰ（アポトーシスタンパク質のインヒビター）を阻害することにより、アポトーシスを促進することができる。アポトーシス促進タンパク質の２番目の群、ＡＩＦ、エンドヌクレアーゼＧおよびＣＡＤは、アポトーシス中にミトコンドリアによって放出され得る。ＡＩＦは、核に移動することができ、ＤＮＡを約５０から約３００ｋｂの小片に断片化させることができる。ＡＩＦは、末梢核染色質の凝縮（「第Ｉ期」凝縮）を生じさせることができる。エンドヌクレアーゼＧは、核に移動し、そこで核染色質を開裂させてオリゴヌクレオソームＤＮＡ断片を形成することができる。ＡＩＦおよびエンドヌクレアーゼＧは、カスパーゼとは無関係に機能することができる。ＣＡＤは、ミトコンドリアにより放出され、核に移動することができ、そこでオリゴヌクレオソームＤＮＡ断片化および高度の染色質凝縮（「第ＩＩ期」凝縮）をもたらすことができる。
【０３０９】
タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーは、ミトコンドリア膜透過性を調節することができる。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、アポトーシス促進性であることもあり、抗アポトーシス性であることもある。抗アポトーシスタンパク質としては、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ＸＳ、Ｂｃｌ−２およびＢＡＣが挙げられる。アポトーシス促進タンパク質としては、例えば、Ｂｃｌ−１０、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、ＢｉｋおよびＢｌｋが挙げられる。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーは、ミトコンドリア膜透過性の改変によりミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を調節することができる。タンパク質１４−３−３は、Ｂａｄのリン酸化状態に基づいてＢａｄを調節することができる。
【０３１０】
Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ＸＩまたはＢｃｌ−２とヘテロ二量体化することができ、これは、それらの保護作用を中和し、細胞死を促進することができる。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＩがＢａｄによって隔離されない場合、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＩは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を防止することができる。Ｂｃｌ−ＸＩおよびＡｐａｆ−１へのＡｖｅｎの結合は、プロカスパーゼ−９の活性化を防止することができる。
【０３１１】
他のＢｃｌ２ファミリーメンバーとしては、ＰｕｍａおよびＮｏｘａが挙げられる。ＰｕｍａおよびＮｏｘａは、ｐ５３媒介アポトーシスにおいて役割を果たすことができる。また、ＭＹＣは、ｐ５３依存的および非依存的様式でアポトーシスを調節することができる。
【０３１２】
デス受容体経路（外因性）およびミトコンドリア経路（内因性）は、実行フェーズで終了し得る。カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、およびカスパーゼ−７は、実行カスパーゼとして機能することができ、ＰＡＲＰ、サイトケラチン、フォドリン、ＮｕＭＡ、ゲルソリンおよびその他をはじめとする基質を開裂させることができる。カスパーゼ−３は、開始因子のカスパーゼ、例えば、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−１０によって活性化され得る。カスパーゼ−３は、エンドヌクレアーゼＣＡＤを、その阻害剤、ＩＣＡＤ、を開裂させることによって活性化することができる。ＣＡＤは、核内の染色体ＤＮＡを分解し、染色質凝縮を生じさせることができる。アポトーシスは、アポトーシス細胞の食作用性取り込みを伴うことがあり、これは、リン脂質非対称性の認識およびホスファチジルセリンの外在化を伴い得る。
【０３１３】
アポトーシスの概観は、例えば、Ｅｌｍｏｒｅ  Ｓ．（２００７）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３５：４９５−５１６（その全体が参考として本明細書に援用されている）において見出すことができる。
【０３１４】
本明細書に記載する方法、組成物およびキットを、自食作用中のＤＮＡ断片化を分析するために使用することができる。
【０３１５】
チェックポイント、ＤＮＡ損傷、および細胞周期
遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかの決定を、ＤＮＡ損傷修復、二本鎖切断修復、相同組換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、切断誘導複製、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を研究するために用いることができる。本明細書に記載する方法をこれらのプロセスと関連づけられる疾患の診断および予後判定に用いることができる。
【０３１６】
ＤＮＡ損傷は、環境因子から生ずることもあり、内因性または正常代謝プロセスから生ずることもある。ＤＮＡを損傷させ得る内因性因子としては、例えば、反応性酸素種および複製エラーが挙げられる。生理的二本鎖ＤＮＡ切断は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え切断およびクラススイッチ切断を挙げることができる。病的二本鎖ＤＮＡ切断は、電離放射線、酸化性フリーラジカル、ニック全体にわたっての複製、脆弱部位での偶発性酵素作用、トポイソメラーゼ機能不全、および機械的ストレスの結果として生ずることがある。ＤＮＡ損傷を生じさせることがある環境または外因性因子としては、紫外線照射、Ｘ線、ガンマ線、ＤＮＡ挿入剤、一部の植物毒素、ウイルス、熱破壊、および化学療法が挙げられる。減数分裂細胞は、酵素Ｓｐｏ１１をはじめとする、さらなるＤＳＢ源を有し得る。
【０３１７】
二本鎖ＤＮＡ切断を例えばＮＨＥＪによって修復することができる。ＮＨＥＪに関与し得る因子としては、例えば、Ｋｕ７０／８６、ＤＮＡ−ＰＫｃ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ｐｏｌ  μおよびλ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣ４４、ならびにＸＬＦ−Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓが挙げられる。二本鎖切断部の形成後、Ｋｕは、その切断部に結合してＤＮＡ複合体を形成し得る。このＤＮＡ末端複合体は、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびリガーセ活性を動員することができる。ＤＮＡの末端のＫｕは、ＤＮＡ−ＰＫｃと安定した複合体を形成することができる。ＤＮＡ−ＰＫｃは、５’エンドヌクレアーゼ活性、３’エンドヌクレアーゼ活性、およびヘアピン開放活性（ｏｐｅｎｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を含むことができる。Ａｒｔｅｍｉｓは、５’エンドヌクレアーゼ活性を含むことができる。ＰＡＬＦ（ＡＰＬＦ）の３’エンドヌクレアーゼは、ＮＨＥＪにおいて役割を果たすことができる。ポリメラーゼミューおよびラムダは、Ｋｕ：ＤＮＡ複合体をそれらのＢＲＣＴドメインによって結合することができる。ＤＮＡリガーゼＩＶは、ギャップ全体にわたってライゲートすることができ、不適合ＤＮＡ末端をライゲートすることができ、かつ一本鎖ＤＮＡをライゲートすることができる。ＮＨＥＪは、鎖の切断を伴い得る。ＸＲＣＣ４は、四量体化することができ、およびＰＮＫ（ポリヌクレオチドキナーゼ）、ＡＰＴＸ（アプラタキシン、中断したライゲーション産物の脱アデニル化に役割を果たすことができるタンパク質）およびＰＡＬＦは、ＸＲＣＣ４と相互作用することができる。ＮＨＥＪによる二本鎖ＤＮＡ切断修復は、例えば、その全体が参考として本明細書に援用されている、Ｌｉｅｂｅｒ，Ｍ（２０１１）のＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１−２１１に総説されている。ＮＨＥＪを細胞周期の任意の時点で行うことができる。
【０３１８】
ＮＨＥＪタンパク質は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにおいて役割を果たすことができる。タンパク質ＲＡＧ１およびＲＡＧ２は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにおいて役割を果たすことができる。クラススイッチ組換えは、Ｂ細胞においてＶ（Ｄ）Ｊ組換え後に行うことができ、かつ免疫グロブリン重鎖遺伝子を交換するために用いることができる。このプロセスは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＲＮａｓｅＨ、ウラシルグリコシラーゼ、ＡＰＥ１およびＥｘｏ１を伴い得る。
【０３１９】
二本鎖ＤＮＡ切断を相同指向修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（例えば、相同組換えまたは一本鎖アニーリング）によって修復することができる。これらのプロセスに関与し得る因子の例としては、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、Ｎｂｓ１（まとめて、ＭＲＮ複合体）；ＲＡＤ５１（Ｂ、Ｃ、Ｄ）、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４ＢおよびＢＲＣＡ２が挙げられる。細胞周期のＳおよびＧ２期中には極めて近接して２つの姉妹染色分体が存在し、そのため相同指向修復は、これらの期においてより一般的であり得る。
【０３２０】
ＡＴＭおよびＡＴＲキナーゼは、損傷したＤＮＡを認識することができる。ＤＮＡ−ＰＫと共にこれらのキナーゼは、Ｈ２ＡＸをリン酸化し、γＨ２ＡＸフォーカスを生じさせることができる。ＡＴＲは、複製フォーク停止または嵩高い損傷部のプロセッシングの結果として生ずる一本鎖ＤＮＡ領域によって活性化され得る。ＡＴＲは、ＡＴＲＩＰと相互作用することができる。９−１−１複合体（Ｒａｄ９、Ｈｕｓ１およびＲａｄ１）は、ＡＴＲによる基質リン酸化において役割を果たすことができる。ＲＰＡは、ｓｓＤＮＡを結合することができ、ＡＴＲによる基質リン酸化において役割を果たすことができる。
【０３２１】
ＡＴＭは、ＤＮＡ末端をＭＲＮによって認識することができる。リン酸化したＨ２ＡＸは、ＭＤＣ１、ユビキチンリガーゼＲＮＦ８およびＲＮＦ１６８、ならびに５３ＢＰ１を動員することができる。ＡＴＭは、Ｃｈｋ２およびｐ５３をリン酸化することができる。
【０３２２】
チェックポイントおよび細胞周期調節も本明細書に記載する方法、組成物およびキットを用いて分析することができる。細胞は、細胞周期を進めることができ、該細胞周期は、Ｇ１期、Ｓ期（ＤＮＡ合成）、Ｇ２期およびＭ期（有糸分裂）を含み得る。分裂を停止した細胞は、Ｇ０期（静止期）にあり得る。チェックポイントを用いて、細胞周期を停止させ、ＤＮＡ損傷の修復を可能にすることができ、その後、細胞周期を継続することが可能になる。ＤＡＮ損傷チェックポイントは、Ｇ１期とＳ期の境界およびＧ２期とＭ期の境界で生じ得る。もう１つのチェックポイントは、Ｓ期内チェックポイントである。
【０３２３】
他のプロセス
核酸が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかの決定を、ＤＮＡ複製および転写などのプロセスにおけるポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リバーストランスクリプターゼ）を研究するために用いることができる。例えば、ポリメラーゼのプロセッシング能力を決定することができる（例えば、完全長である初期の鎖の、部分長である初期の鎖に対する百分率を決定するために、遺伝子の前半のコピー数を後半のコピー数に対してカウントすることにより、トランケートバージョンの遺伝子が幾つ存在するかを測定することができる）。合成は５’から３’へと起こるので、合成される産物の前半（５’末端）のほうが、後半（３’末端）より多く産生されると予想される。
【０３２４】
サンプル中の遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかを決定することは、１つ以上の制限酵素、ＲＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅなどを研究して、これらの酵素による開裂（例えば、２つの連鎖標的への分離）の効率を決定するのに有用であり得る。
【０３２５】
遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかを決定することは、ＲＮＡスプライシング、遺伝子再配列、遺伝子の局在、およびがんの際のＤＮＡ再配列の研究に有用であり得る。前記遺伝子再配列は、例えば、染色体転座であることがある。前記転座は、非相同染色体間の物質の交換を行ない得る相互転座（非ロバートソン型転座）であることがある。前記転座は、ロバートソン型転座であることがある。ロバートソン型転座は、動原体付近で融合する２つの末端動原体型染色体の再配列を伴い得る。疾患に関連づけられる転座としては、例えば、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ａ３２）（バーキットリンパ腫；ｃ−ｍｙｃとＩＧＨの融合）；ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）（マントル細胞リンパ腫；サイクリンＤ１とＩＧＨの融合）；ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）（濾胞性リンパ腫；ＩＧＨとＢｃｌ−２の融合）；ｔ（１０；（様々））（ｑ１１；（様々））（乳頭状甲状腺がん（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）；第１０染色体上にＲＥＴがん原遺伝子を伴う）；ｔ（２；３）（ｑ１３；ｐ２５）（濾胞性甲状腺がん；ＰＡＸ８とＰＰＡＲγ１の融合））；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）（急性骨髄芽球性白血病）；ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）フィラデルフィア染色体（慢性骨髄性白血病；急性リンパ芽球性白血病；ＥＴＯとＡＭＬ１の融合）；ｔ（１５；１７）（急性前骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｏｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ））；ＰＭＬとＲＡＲ−αの融合）；ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）（急性骨髄性白血病、先天性線維肉腫、分泌性乳がん腫；ＴＥＬとＴｒｋＣ受容体の融合）；ｔ（９；１２）（ｐ２４；ｐ１３）（ＣＭＬ、ＡＬＬ；ＪＡＫとＴＥＬの融合）；ｔ（１２；２１）（ｐ１２；ｑ２２）（ＡＬＬ；ＴＥＬとＡＭＬ１の融合）；ｔ（１１；１８）（ｑ２１；ｑ２１）（ＭＡＬＴリンパ腫；Ｂｃｌ−２とＭＬＴの融合）；ならびにｔ（１；１１）（ｑ４２．１；ｑ１４．３）（統合失調症）が挙げられる。
【０３２６】
本明細書に記載するコピー数変動分析を用いて、出生前の状態、例えば、胎児異数性、例えば１３トリソミー、１８トリソミーまたは２１トリソミーを診断することができる。
【０３２７】
法医遺伝学用材料の分解（断片化）の程度の決定は、貴重なサンプルを浪費する前にどの分析が首尾よく行うことができるかを決定するのに役立ち得る。核酸が連鎖しているのか、または分離している（フラグメント化されている）のかを決定することは、ＤＮＡのランダム剪断に起因する完全整数値のコピー数推定値から予想される欠損を決定するのに有用であり得る。
【０３２８】
種の併置
マイクロＲＮＡと他のＲＮＡの併置を決定するための方法を本明細書において提供する。例えば、マイクロＲＮＡおよび他のタイプのＲＮＡは、血液中のエキソソームにパッケージされていることがある。エキソソームは、タンパク質とＲＮＡの両方を含むことができる３０〜９０ｎｍの小胞であり得る。例えばマイクロＲＮＡを含めて、ＲＮＡは、タンパク質複合体内に共にパッケージされていることがある。１つの実施形態では、転写物がエキソソームまたはタンパク質複合体内に共局在するかどうかを決定するための方法を提供する。
【０３２９】
１つの実施形態では、関心対象のエキソソームまたはタンパク質複合体を保存するように、例えばホルムアルデヒドと架橋させることにより、血漿または血漿の誘導体をプロセッシングし、その後、その血漿を複数の空間的に孤立した区画に分配する。エキソソームを破壊することができ、タンパク質を消化することができ、それらの区画内でＰＣＲ反応を（逆転写と併用で）行うことができる（例えば、ｄｄＰＣＲ）。ＰＣＲ反応は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多くの標的核酸配列を増幅させることができる。標的核酸配列が同じ区画に共局在する場合、標的転写は、同じタンパク質複合体中に存在した可能性がある。もう１つの実施形態では、サンプルをエキソソームまたはタンパク質複合体を保存するためのプロセスに付さずに対照を行う。１つの実施形態では、エキソソームの破裂（破壊）を温度調整によって果たすことができる。もう１つの実施形態では、エキソソームの破裂（破壊）を、エキソソームまたはタンパク質複合体破壊剤を有する区画内に内部エマルジョンを放出することによって果たすことができる。
【０３３０】
もう１つの実施形態では、無細胞ＤＮＡの２つ以上の種の併置を決定する方法を提供する。無細胞ＤＮＡ分子は、血液または血漿サンプル中で凝集することがある。凝集した無細胞ＤＮＡ分子を有するサンプルを空間的に孤立した領域に分配することができ、凝集を破壊することができ、２つ以上の異なる無細胞ＤＮＡ分子についての増幅を行うことができ、かつそれらの区画を分析して、無細胞ＤＮＡ分子が同じ区画にあるのか否か、または異なる区画にあるのか否かを決定することができる。
【０３３１】
本明細書において提供する方法により、特定のＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質標的が血漿中で共に移動するかどうかの決定が可能になる。追加の蛍光チャネルにより、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくはそれより多く）の標的の併置を同時に測定することが可能になり得る。例えば、３つの異なる蛍光体を有するプローブを使用して、３つの標的核酸配列にわたって併置頻度を決定することができる。
【０３３２】
標的配列の欠失の検出
併置により連鎖情報を獲得するための方法を提供する。この方法は、標的核酸配列の欠失があるかどうかを決定するために、またはＣＮＶコピーのハプロタイプ決定のために用いることができる。マーカー配列（例えばＶＩＣ標識プローブで検出されるもの）は、コピー数変動領域内の標的配列（例えばＦＡＭ標識プローブで検出されるもの）外だがその付近にあることができる。核酸を含むサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分配することができ、前記マーカーおよび標的核酸配列を（例えば、増幅およびプローブでの検出によって）検出することができる。ＶＩＣ（マーカー）およびＦＡＭ（標的）の併置を図４９に描いたように分析することができる。ＶＩＣおよびＦＡＭが、ある区画に常に共局在する場合、標的配列の欠失がない可能性がある（図４９Ｂ）。ＦＡＭと共局在していないＶＩＣのみを有する区画がある場合、この結果は、標的配列の欠失を示唆する（図４９Ａ）。
【０３３３】
消化核酸の保管
消化核酸（例えば、ＤＮＡ）の保管の長さは、コピー数変動測定値に影響を及ぼし得る。長期保管は、推定されるコピー数の低減の原因になり得る。例えば、長期保管は、核酸分解を生じさせる結果となることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００時間であることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００時間未満であることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００日間であることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００日間未満であることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００年間であることがあり、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００年間未満であることがある。
【０３３４】
図２０Ａおよび２０Ｂは、保管された消化ＤＮＡのＭＲＧＰＲＸ１  ＣＮＶ値のドリフトを図示する。図２０Ａにおいて、消化サンプルは、一貫して整数より下のＣＮＶ値を示す。図２０Ｂにおいて、ＣＮＶ値は、より整数に近かった（実施例２０を参照されたし）。
【０３３５】
１つの実施形態において、消化ＤＮＡの４℃での長期間にわたる保管は、ＣＮ推定値の質に影響を及ぼし得る（例えば、コピー数推定値は、経時的により小さくなり得、例えば、６．０の推定ＣＮＶを有する標的を有するサンプルは、３週間、４℃で保管すると、５．７のＣＮＶを生じさせ得る）。
【０３３６】
核酸サンプル（例えば、消化核酸サンプル）の保管温度は、約４、０、−１０、−２０、−３０、−４０、−５０、−６０、−７０、−８０、−９０、−１００、−１１０、−１２０、−１３０、−１４０、−１５０、−１６０、−１７０、−１８０、−１９０もしくは−２００℃であることがあり、または約４、０、−１０、−２０、−３０、−４０、−５０、−６０、−７０、−８０、−９０、−１００、−１１０、−１２０、−１３０、−１４０、−１５０、−１６０、−１７０、−１８０、−１９０もしくは−２００℃未満であることがある。
【０３３７】
１つの実施形態では、消化ＤＮＡを緩衝溶液（例えば、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）中で保管することができる。
【０３３８】
ＣＮＶ分析に対する核酸長の影響
サンプル中の長い核酸の存在は、標的核酸配列が連鎖していない場合（例えば、それらが異なる染色体上にある場合）でさえ、コピー数変動値に影響を及ぼすことがある。例えば制限消化、熱処理、剪断、音波処理、濾過などによる、サンプル中の核酸サイズの縮小は、コピー数変動実験の結果を向上させることができる。核酸長の縮小はまた、ＰＣＲのための標的利便性を向上させることができる。
【０３３９】
高い核酸負荷量で、核酸長の縮小を用いて、液滴デジタルＰＣＲ実験での一貫した液滴形成を確保することができる。長い核酸を有する核酸の負荷量が多いと、液滴形成は低減されるまたは妨げられることがあり、流れが生ずる結果となり得る。例えば、音波処理、熱処理、制限酵素消化、濾過または剪断によって、核酸長を縮小することができる。
【０３４０】
液滴デジタルＰＣＲを用いて、制限酵素効率および特異性を測定することができる。
【０３４１】
本願は、あらゆる目的のため次の資料をその全体において参照として援用している：２００６年５月９日発行の米国特許第７，０４１，４８１号明細書；２０１０年７月８日公開の米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号Ａ１明細書；ならびにＪｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ、ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（第２版、１９９９）。
【０３４２】
キット
本発明において提供する方法を行うためのキットを本明細書において提供する。これらのキットは、１つ以上の制限酵素、デバイス、バッファー、試薬、および使用のための指示を備えることができる。キットは、制限酵素、バッファー、塩および使用のための指示を備えることができる。キットは、１つ以上のプライマーおよび１つ以上のプローブを備えることができる。１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つの制限酵素、４つのプライマーおよび２つのプローブを備える。もう１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つの制限酵素、少なくとも４つのプライマーおよび少なくとも１つのプローブを備える。もう１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つの制限酵素、少なくとも４つのプライマーおよび少なくとも２つのプローブを備える。
【０３４３】
関連技術
本明細書に記載する方法において従来の技術を用いることができる。かかる従来の技術は、標準的な実験室マニュアル、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（第Ｉ−ＩＶ巻）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（すべてＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓからのもの）；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、（２００４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．およびＢｅｒｇら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．において見出すことができ、これらのすべては、あらゆる目的のためにそれら全体が参考として本明細書に援用されている。
【０３４４】
例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＳＮＰアレイを用いるバーチャル核型分析、および次世代シークエンシングをはじめとする様々な手段によって、コピー数変動を検出することができる。デジタルＰＣＲによってコピー数変動を決定する方法は、例えば米国特許出願公開第２００９／０２３９３０８号明細書に記載されている。核酸を希釈することによるデジタルＰＣＲによってコピー数変動を検出することができる。個々のＤＮＡ分子を別々の反応チャンバに分配することができるナノ流体チップ（デジタルアレイ）（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍナノ流体チップ）を使用することによるデジタルＰＣＲによってコピー数変動を検出することができる。液滴デジタルＰＣＲによってコピー数変動を検出することができる。本明細書に記載する方法は、１つ以上の上述の技術を用いて行ったコピー数変動分析の結果を確認するために用いることができる。
【０３４５】
コピー数変動を決定するために用いることができる次世代シークエンシング技術としては、例えば、ＤＮＡナノボールシークエンシング（ローリングサークル複製を用いて、ＤＮＡナノボールへとゲノムＤＮＡの小断片を増幅させる）（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって用いられている）、ナノ細孔シークエンシング（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって用いられている）（Ｓｏｎｉ  Ｇ．Ｖ．およびＭｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：１９９６−２００１）、イオン半導体シークエンシング（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書）、ＳＯＬｉＤシークエンシング（ライゲーションによるシークエンシング；例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって使用されている）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング（ブリッジ増幅を用いる）、４５４パイロシークエンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって用いられている）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら、２００５  Ｎａｔｕｒｅ、４３７：３７６−３８０）、真の単分子シークエンシング（ｔｒｕｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓによって用いられている）（Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ．Ｄ．ら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：１０６−１０９）、またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって用いられている単分子リアルタイムシークエンシング（ＳＭＲＴ）が挙げられる。本明細書に記載する方法、組成物および／またはキットは、これらの方法のうちの１つによって行ったＣＮＶ分析を追跡調査するために用いることができる。
【０３４６】
範囲を「約」１つの特定の値から、および／または「約」もう１つの特定の値までと本明細書中で表現することがある。このような範囲を表現するとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。類似して、先行詞「約」の使用により値を近似値で表すとき、その特定の値が別の実施形態を構成することは理解される。さらに、各々の範囲の終点が他の終点に対して有意でもあり、他の終点とは無関係に有意でもあることは、理解される。本明細書において用いる場合の用語「約」は、その特定の使用状況の中で述べている数値からプラスまたはマイナス１５％である範囲を指す。例えば、約１０は、８．５から１１．５の範囲を含むこととなる。
【０３４７】
別の定義がない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様のまたは等価の任意の方法および材料も本発明の実施または試験の際に使用することができるが、今般、代表的例証的方法および材料を記載する。
【実施例】
【０３４８】
実施例１
アミラーゼＣＮＶ分析
本明細書に記載する方法を用いて、アミラーゼ遺伝子のコピー数変動を決定することができる。アミラーゼは、多糖類の結合を加水分解することができる酵素である。群間のコピー数変動は、食事に基づく進化的変化を示唆する。アミラーゼアッセイは、別個のＣＮＶ状態に対応する別個の推定値を生じさせる。１５のＣｏｒｉｅｌｌ参照ＤＮＡサンプルでの結果は、この遺伝子についてのコピー数のヒトでの高い差異を明示する。図２１参照。
【０３４９】
Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからのサンプルを使用する。サンプルＤＮＡを１０Ｕ／μｇ  ＤＮＡのＡｌｕＩで、３７℃で１時間消化する。約２０〜１００μｇの消化されたＤＮＡを各ｄｄＰＣＲ反応に負荷する。各サンプルを三重反復でプロセッシングし、データをマージして図２１に示す値に達する。アミラーゼアッセイのためのフォワードプライマーの配列は、５’−ＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡ−３’であり、リバースプライマーは、５’−ＣＣＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣ−３’であり、およびプローブは、５’−６ＦＡＭ−ＣＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’である。上記アッセイはＲＰＰ３０  に対して反復する：ＦＷＤプライマー：５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３’、ＲＥＶプライマー  ５’−ＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴ−３’、およびプローブ  ５’−ＶＩＣ−ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’。次の熱サイクリング条件を用いる：９５℃１０分間（９４℃３０秒間＋６０℃１分間）を５５サイクル。
【０３５０】
実施例２
ＣＣＬ３Ｌ１  ＣＮＶ分析
本明細書に記載する方法を用いて、ＣＣＬ３Ｌ１遺伝子のコピー数変動を決定することができる。ＣＣＬ３Ｌ１のコピー数変動は、ＨＩＶ−１感受性に関係づけられているが、これらの関連性は、標準的ｑＰＣＲを用いる不正確なコピー数評価に起因して一致性がなかった。ＣＣＬ３Ｌ遺伝子クラスターは、特異的増幅を困難にすることができる５つの偽遺伝子を含む。整数ベースのＣＮＶ分析は、正しい定量に忠実度を加える。Ａｌｋａｎら（（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４１：１０６１−１０６７）は、ＮＡ１８５０７がＣＣＬ３Ｌ１の５．７個のコピーを有することを見出した。ここでの分析では、「６」を横切るエラーバーを有する５．９４個のコピーが見出された。図２２を参照されたし。本明細書に記載する方法は、遺伝子を標的にするアッセイを的確に設計する能力、およびこの遺伝子を遊離させ、その一方ではまた偽遺伝子を切断して、コピー数推定値を上昇させる偽陽性の機会を低減させるような制限酵素を的確に選択する能力をもたらす。
【０３５１】
５７℃のアニーリング温度を用いることで、結果として、一部の偽遺伝子を増幅し、期待値より約１大きいＣＮＶ値を得ることができる。
【０３５２】
ＣＣＬ３Ｌ１については、８１５ｎｇの各精製ヒトゲノムＤＮＡサンプル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、１０μＬ中の７．５ユニットのＭｓｅＩ（ＮＥＢ）で１時間、３７℃で消化する。消化物をＴＥ緩衝液で３．５倍希釈して３５μＬにし、その後、２０μＬ  ｄｄＰＣＲ反応につき６９ｎｇ（３μＬ）をアッセイする。修飾ＣＣＬ３Ｌ１アッセイ配列１９は、（フォワードプライマー）５’−ＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＴ−３’；（リバースプライマー）５’−ＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＧ−３’；ならびに（プローブ）６ＦＡＭ−ＴＴＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡ−ＭＧＢＮＦＱである。ＲＰＰ３０参照アッセイ（フォワードプライマー）５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３’；（リバースプライマー）５’−ＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴ−３’；ならびに（プローブ）ＶＩＣ−ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴ−  ＭＧＢＮＦＱを用いてすべてのＣＮＶアッセイを反復する。熱サイクリング条件は、９５℃１０分間（１サイクル）、９５℃３０秒間および６０℃６０秒間（４０サイクル）、９８℃１０分間（１サイクル）、および１２℃での保持。Ｓｕｄｍａｎｔ，Ｐ．Ｈ．；Ｋｉｔｚｍａｎ，Ｊ．Ｏ．；Ａｎｔｏｎａｃｃｉ，Ｆ．；Ａｌｋａｎ，Ｃ．；Ｍａｌｉｇ，Ｍ．；Ｔｓａｌｅｎｋｏ，Ａ．；Ｓａｍｐａｓ，Ｎ．；Ｂｒｕｈｎ，Ｌ．；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．；Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｅ．Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０、３３０、６４１−６４６も参照されたし。
【０３５３】
実施例３
ＭＲＧＰＲＸ１  ＣＮＶ分析
本明細書に記載する方法を用いて、ＭＲＧＰＲＸ１遺伝子についてのコピー数変動を決定することができる。Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ１は、ヒトにおいてＭＲＧＰＲＸ１遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＭＲＧＰＲＸ１は、痒み感および痛覚に関与する感覚ニューロン特異的受容体である。ＭＲＧＰＲＸ１タンパク質は、疼痛の遮断に関与すると考えられ、そのため欠失は慢性疼痛と関連づけられる。図２３Ａおよび２３Ｂは、ＭＲＧＰＲＸ１遺伝子についてのコピー数変動を図示する。
【０３５４】
ＭＲＧＰＲＸ１については、４．４μｇの各精製ヒトゲノムＤＮＡサンプル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、５０μＬ中の１０ユニットのＲｓａＩ（ＮＥＢ）で１時間、３７℃で消化した。消化物をＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で８倍希釈して４００μＬにし、その後、２０μＬ  ｄｄＰＣＲ反応につき３３ｎｇ（３μＬ）をアッセイした。ＭＲＧＰＲＸ１アッセイ配列は、（フォワードプライマー）５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＣＡ−３’、（リバースプライマー）５’−ＣＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡ−３’、および（プローブ）６ＦＡＭ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＴＣＣＴ−ＭＧＢＮＦＱであった。ＲＰＰ３０参照アッセイ（フォワードプライマー）５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３’、（リバースプライマー）５’−ＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴ−３’、および（プローブ）ＶＩＣ−ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴ−ＭＧＢＮＦＱを用いてＣＮＶアッセイを反復した。熱サイクリング条件は、９５℃×１０分間（１サイクル）、９４℃×３０秒間および６０℃×６０秒間（４０サイクル）、９８℃×１０分間（１サイクル）、および１２℃での保持であった（Ｈｉｎｄｓｏｎ  Ｂら（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４−８６１０も参照されたし）。
【０３５５】
実施例４
ＣＹＰ２Ｄ６  ＣＮＶ分析
本明細書に記載する方法を用いて、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子についてのコピー数変動を決定することができる。シトクロムＰ４５０混合機能オキシダーゼ系のメンバーであるシトクロムＰ４５０  ２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）は、体内での生体異物代謝に関与する。ＣＹＰ２Ｄ６コピー数は、薬物の代謝と関連づけられる。不良な薬物代謝を生じさせる結果となり得るＣＹＰ２Ｄ６機能は、殆どまたは全くない。多量のＣＹＰ２Ｄ６機能は、広範囲の薬物代謝を生じさせる結果となり得る。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の複数のコピーを発現させ、通常より大きいＣＹＰ２Ｄ６機能（超高速代謝群）を生じさせる結果となり得る。図２４Ａおよび２４Ｂは、ＣＹＰ２Ｄ６についてのコピー数変動を図示する。
【０３５６】
ＣＹＰ２Ｄ６については、４．４μｇの各精製ヒトゲノムＤＮＡサンプル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、５０μＬ中の１０ユニットのＲｓａＩ（ＮＥＢ）で１時間、３７℃で消化した。消化物をＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で８倍希釈して４００μＬにし、その後、２０μＬ  ｄｄＰＣＲ反応につき３３ｎｇ（３μＬ）をアッセイした。ＣＹＰＤ２Ｄ６（Ｈｓ０００１０００１＿ｃｎ）をプライマーとＦＡＭ−ＭＧＢＮＦＱプローブの２０×プレミックスとして購入した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＲＰＰ３０参照アッセイ（フォワードプライマー）５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３’、（リバースプライマー）５’−ＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴ−３’、および（プローブ）ＶＩＣ−ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴ−ＭＧＢＮＦＱを用いて、ＣＮＶアッセイを反復した。熱サイクリング条件は、９５℃×１０分間（１サイクル）、９４℃×３０秒間および６０℃×６０秒間（４０サイクル）、９８℃×１０分間（１サイクル）、および１２℃での保持であった（Ｈｉｎｄｓｏｎ  Ｂら（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４−８６１０も参照されたし）。
【０３５７】
実施例５
脊髄性筋萎縮症ＣＮＶ分析
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２によってコードされている運動ニューロンタンパク質の少ない生存量に起因する脊髄エリアの運動ニューロン減少によって生じ得る。ＳＭＮ１およびＳＭＮ２は、欠失および増幅に付される。これらの遺伝子は、ＳＭＮ２から転写される完全長転写物のレベルを低減させる１つのヌクレオチドを除いて、同一である。ＳＭＡは、ＳＭＮ１コピーの減少によって生じ得る。疾患重症度は、ＳＮＭ２がＳＭＮ１減少をどれ程よく補償するかに関係し得る。対立遺伝子特異的遺伝子検出および鑑別のためのアッセイを設計することができる（例えば、ｄｄＰＣＲを含む）。
【０３５８】
遺伝形質は、常染色体劣性であり得る。１／６，０００の出生がＳＭＡに冒され得、１／４０人が欠陥ＳＭＮ１の保因者である。０および１型は、２歳より前に結果として死亡がもたらされ得る。２〜４型は、２歳より後に結果として発症がもたらされ得る（重度から軽度の脱力）。
【０３５９】
図２５および２６は、単純勾配プレートを使用して同定した最適共通アニーリング温度を図示する。図２７は、ＳＭ１およびＳＭＮ２コピー数を図示する。
【０３６０】
独立したデュプレックス（ＳＭＮ１／Ｈｅｒ２およびＳＭＮ２／Ｔｅｒｔ）を使用して、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２コピー数を決定する。デュプレックスからのＳＭＮ１／ＳＭＮ２コピーの比を用いて、測定コピー数値を確認する。トライアンギュレーション（ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｉｏｎ）によって検証を行う（例えば、図２８の上部の概略図を参照されたし）。トライアンギュレーションは、２つの異なる参照を用いてＣＮＶを評価することにより標的のＣＮＶを検証し得ることを意味し得る。例えば、２つの異なる参照の比（ＣＮＶ）を、それらを一緒に反復することにより測定することができる。それによって、予想される２コピー／二倍体ゲノムを含有しない参照を使用してＣＮＶを推定する可能性を回避することができる。３つの異なる標的のコピー数をＣＮＶの決定の際に評価することができ、それによって、ＣＮＶ推定値の誤差を生ずる可能性をはるかに低くすることができる。
【０３６１】
この実験のために、Ｈｅｒ２（ＦＡＭ）アッセイに対して反復した（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）ＳＭＮ１（ＶＩＣ）を使用してＳＭＮ１コピー数を評価した。ＣｖｉＱＩを使用して、おおよそ５０ｎｇ／アッセイのＤＮＡを消化した。標準的なＰＣＲプロトコルを行った。ＴＥＲＴ（ＶＩＣ）を検出するためのアッセイに対して反復したＳＭＮ２（ＦＡＭ）を使用してＳＭＮ２コピー数を決定した。ＳＭＮ１（ＶＩＣ）とＳＭＮ２（ＦＡＭ）のデュプレックスを行うことにより、ＳＭＮ１／ＳＭＮ２の比を決定した。ＣｖｉＱＩを使用し、およそ５０ｎｇ／アッセイを用いて、ＤＮＡを消化する。熱サイクリング条件は、９５℃１０分間（１サイクル）、９４℃３０秒間および６０℃６０秒間（４０サイクル）、９８℃１０分間（１サイクル）および１２℃での保持である。
【０３６２】
図２８は、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２についてのコピー数変動を図示する。
【０３６３】
同じプライマー対を使用し、プローブを変えることにより、ＳＭＮ遺伝子の検出を行うことができる。共通プライマー対は、ＦＷＤプライマー：５’−ＡＴＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＣ−３’；ＲＥＶプライマー  ５’−ＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡ−３’である。ＳＭＮ１プローブ配列は、５’−ＶＩＣ−ＴＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’であるのに対して、ＳＭＮ２プローブ配列は、５’−６ＦＡＭ−ＴＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣ−３’である。Ｔｅｒｔ参照遺伝子ＦＷＤプライマーは、５’−ＧＧＣＡＣＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＣＧ−３’であり、ＲＥＶプライマーは、５’−ＧＧＴＧＡＡＣＣＴＣＧＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡ−３’である。プローブは、５’−ＶＩＣ−ＴＣＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’である。Ｈｅｒ２アッセイ配列は、ＦＷＤプライマー５’−ＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＡ−３’、ＲＥＶプライマー  ５’−ＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＴ−３’、プローブ：５’−６ＦＡＭ−ＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’である。
【０３６４】
実施例６
Ｈｅｒ２  ＣＮＶ分析
乳がんの３０％がＨｅｒ２増幅を有する。Ｈｅｒ２＋がんは、高侵襲性であるが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎに応答することができる。ＨＥＲ２レベルは、広範に試験されているが、既存の技術に伴う多くの欠点がある。Ｈｅｒ２は、ＥＲＢＢ２としても公知であり、ＧＲＢ７から２０ＫＢ離開しており、このＧＲＢ７も幾つかのがんにおいて過発現されることが多い。２つの臨床的に関連する遺伝子を標的にするアッセイにより、各コピー数決定を検証することができる。予想外ではなく、一方のサンプルはＨｅｒ２（ＥＲＢＢ２）についてのみ増幅され、もう一方はモザイク現象を提示する。図２９を参照されたし。
【０３６５】
正常および腫瘍乳房組織サンプル各々からの精製ＤＮＡ（２０ｎｇ）（Ｄ８２３５０８６−Ｂｉｏｃｈａｉｎ）を１０μＬ中で０．２ユニットのＮｌａＩＩＩにより１時間、３７℃で消化した。その制限ＤＮＡを２０μＬのｄｄＰＣＲ反応につき８．８ｎｇ（４．４μＬ）でｄｄＰＣＲマスターミックスに直接添加した。ＥＲＢＢ２（Ｈｓ０２８０３９１８＿ｃｎ）およびＧＲＢ７（Ｈｓ０２１３９９９４＿ｃｎ）アッセイをプライマーとＦＡＭ−ＭＧＢＮＦＱプローブの２０×プレミックスとして購入し（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、上に記載したＲＰＰ３０参照アッセイを用いて反復した。熱サイクリング条件は、９５℃×１０分間（１サイクル）、９４℃×３０秒間および６０℃×６０秒間（４０サイクル）、９８℃×１０分間（１サイクル）、および１２℃での保持であった（Ｈｉｎｄｓｏｎ  Ｂら（２０１１）  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４−８６１０も参照されたし）。
【０３６６】
実施例７
連鎖分析
標的核酸配列のコピー数（ＣＮ）が、消化後の特定のアッセイについて２．０である場合、（Ａ）一方の染色体上に該標的の２個のコピーおよびもう一方の上に０個があるのか、それとも（Ｂ）該標的核酸配列の１個のコピーが２つの異なる染色体の各々の上にあるのかは不明確である。未消化のＤＮＡを使用するアッセイ操作を用いてこれらの２つの可能性を解明することができる。未消化のＤＮＡを使用すると、原則的に、配列させたものが（Ａ）（１つの染色体上に標的核酸配列の２個のコピー）である場合には１のＣＮになるはずであり、配列させたものが（Ｂ）（２つの異なる染色体の各々の上に１個のコピー）である場合には２のＣＮになるはずである。サンプル中のＤＮＡは断片化されている場合があるので、結果は、正確でないことがある−−（Ａ）は、ＣＮについて１．０より高いが、おそらく２．０より有意に低い読取りを生じさせることがあり、（Ｂ）は、正確に２．０を生じさせるはずである。
【０３６７】
出発材料の断片化が高度であるほど、（Ａ）においてもたらされるＣＮ読取りは２．０に近くなることになる。例として、所与のアッセイについては、連鎖コピーは、約１０ｋｂだけ隔てられており、本発明者らの断片化分析に基づき１０ｋｂセグメントの３０％が断片化されていることが予想される。その場合、シナリオ（Ａ）は１．３の読取りを、およびシナリオ（Ｂ）は２．０の読取りを生じさせるはずである。
【０３６８】
実施例８
連鎖分析
ＣＮ読取りが、消化後に３．０である場合、（Ａ）一方の染色体上に３個のコピーおよびもう一方の上に０個があるのか、それとも（Ｂ）一方の上に２個およびもう一方の上に１個があるのかは不明確である。同じアッセイを未消化のＤＮＡで実行し、１０ｋｂ離隔および３０％断片化という上と同じパラメータを仮定すると、シナリオ（Ａ）は、１．６コピーの読取り（＝０．７＊０．３＊２＋０．７＊０．３＊１＋０．３＊０．７＊２＋０．３＊０．３＊３）を生じさせることとなり、これに対して（Ｂ）は、２．３コピーの読取りを生じさせることとなる。
【０３６９】
デジタルＰＣＲ−リアルタイムハイブリッド（例えば、ＬｉｆｅのＢｉｏｔｒｏｖｅアレイ）のために、未消化のＤＮＡからの追加の連鎖情報の抽出を試みることができる。例えば、各区画内でのリアルタイム曲線を分析することにより、標的のコピーを２個、３個等々含有する区画の数を推定することができる。
【０３７０】
終点蛍光を検査して、標的核酸配列の２個のコピーを有するセグメントが、標的核酸配列の１個のコピーを有するセグメントより高い強度を生じさせるかどうかを決定することができる。シナリオ（Ａ）のもとでは、閾値（ｔｈｅｒｅｓｈｏｕｌｄ）は、より少ない正量（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）であるが、これらの正量は、平均してより高い蛍光を有するはずである。
【０３７１】
前記サイクル数を微調整して（例えば、１個のコピーを保有するセグメントが終点に達しないようにそれを行うことにより）、最高離隔を獲得することができる。
【０３７２】
実施例９
ＣＮＶ＝２であるサンプルをハプロタイプ決定する（例えば、遺伝子のシス配置コピーとトランス配置コピーを区別する）ために用いることができるｄｄＰＣＲの確認
染色体のハプロタイプ決定戦略は、１）消化サンプルのＣＮＶと未消化サンプルのＣＮＶを（例えば、ｄｄＰＣＲを用いて）比較すること；２）液滴が指数増幅されている一方で（任意の試薬が限界になる（これは、ＰＣＲの後のほうのサイクル中に起こることがある）前に）該液滴の平均蛍光強度を検査すること、および３）ロングレンジＰＣＲを行って、同じ染色体上の遺伝子（もしくは標的）の２個のコピーの存在（シス配置）を検出すること、または、遺伝子（もしくは標的、もしくは重複領域）が長すぎる場合には、他の染色体を検査して関心対象の遺伝子（もしくは標的）についての欠失を確認すること（例えば、欠失セクションを横断するＰＣＲはうまくいくが、適所に遺伝子（もしくは標的）があるＰＣＲは、プライマー間の距離が長すぎるため、うまくいかない）を含む。
【０３７３】
一般プロトコルガイドライン
１）ｄｄＰＣＲ：制限酵素消化サンプルを未消化サンプルと比較し、その結果を、シス配置コピーを有するサンプルのうちの未消化サンプルについての推定ＣＮＶの有意な降下について検査する。ポアソンの統計学についてのスイートスポット（ポアソン補正因子の統計誤差の最小量があるポイント）にＤＮＡを含めることができる。２０，０００個の液滴についてのスイートスポットは、約１．６ｃｐｄ（ｃｏｐｙ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ：液滴あたりのコピー）であり得る。
【０３７４】
２）蛍光に基づく確認：適切なサイクル（単数または複数）（これは、実験により決定することができ、およびアッセイ効率に依存してアッセイごとに異なることがある）で、シス配置サンプルを含有する小滴の平均強度がトランス配置サンプルのものより高い（これは、２個の連鎖コピーが同じ液滴中に含有される場合に起こる）かどうかを検査することができる。この実験には、低ｃｐｄを用いることができる。０．１ｃｐｄを目指して、２個の連鎖していないコピーが同じ液滴中にある機会を最少にすることができる。良好な光学系を用いて、蛍光強度のバンド形成を認めることができる（２個のコピーを有する液滴は、１個のコピーしか有さない液滴の２倍明るいはずである）。蛍光を例えば、約サイクル１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０で検査することができる。蛍光を１サイクルより多いサイクルで検査することができる。例えば、蛍光を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の異なるサイクルで検査することができる。例えば、蛍光をサイクル２５、２８、３１および４０で測定することができる。
【０３７５】
３）ロングレンジＰＣＲによる連鎖の確認。一般に、ＣＮＶにおける増幅領域のサイズは、２つのタンデム配置遺伝子（または標的）のＰＣＲ増幅を可能にできないほど大きいことがある。したがって、並んでいる標的の２個のコピーではなく遺伝子（または標的）欠失の存在を検出する方が容易であり得る。この分析のために、増幅されると推測される領域外にある、互いに向かい合っているプライマーを選択することができる。ロングレンジポリメラーゼを使用してもよい。適切な長さの伸長時間を用いてＰＣＲを行うことができる（長すぎるまたは短すぎる時間は反応を失敗させることがあることに留意されたし）。このロングレンジＰＣＲをバルクで行うこともでき、または液滴で行うこともできる。
【０３７６】
図３０は、各々が制限酵素で切断されたまたは切断されていない６つのサンプルについてのコピー数推定を図示する。このデータは、サンプル４および５は同じ染色体上に連鎖している２つの標的配列を有するが、他のサンプルは両方の染色体上に単一標的配列を含有することを示唆している。
【０３７７】
サンプルＤ１２３４０９０（結腸）、Ｄ１２３４１０６（食道）およびＤ１２３４１５２（肺）は、ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃからのものである。サンプルＮＡ１８８５３、ＮＡ１９１０８およびＮＡ１８５０７は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからのものである。Ｃｏｒｉｅｌｌサンプルは、Ｂリンパ球ＤＮＡを含む。
【０３７８】
１マイクログラムのＤＮＡにつき約１０ＵのＲｓａＩを使用し、１時間、３７℃で消化を続けた。４０サイクル後に液滴読取装置を使用して液滴の蛍光を読取った。
【０３７９】
ＭＲＧＰＲＸ１アッセイ配列は、（フォワードプライマー）５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＣＡ−３’；（リバースプライマー）５’−ＣＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡ−３’；ならびに（プローブ）６ＦＡＭ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＴＣＣＴ−ＭＧＢＮＦＱであり得る。ＲＰＰ３０参照アッセイ（フォワードプライマー）５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３’、（リバースプライマー）５’−ＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴ−３’、および（プローブ）ＶＩＣ−ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴ−ＭＧＢＮＦＱを用いてＣＮＶアッセイを反復することができる。熱サイクリング条件は、９５℃×１０分間（１サイクル）、９４℃×３０秒間および６０℃×６０秒間（４０サイクル）、９８℃×１０分間（１サイクル）、および１２℃での保持であり得る（Ｈｉｎｄｓｏｎ  Ｂら（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４−８６１０も参照されたし）。
【０３８０】
図３１は、ＭＲＧＰＲＸ１およびＲＰＰ３０についての、ｄｄＰＣＲ実験における２５サイクル後の蛍光強度の分析を図示する。事象数は、液滴のカウントを指す。
【０３８１】
図３２は、ｄｄＰＣＲ実験における４つのサンプルについての三重反復測定のサイクル２５での平均蛍光を図示する。一方の染色体上に２つの標的およびもう一方の上に０個を有すると推測されるサンプル（ＮＡ１８８５３およびＮＡ１９１０８）は、染色体上に１コピーの標的を有する（トランス配置）と推測されるサンプル（ＮＡ１８５０７およびＤ１２３４１０６）より高い蛍光を有する。
【０３８２】
図３３は、ＭＲＧＰＲＸ１およびＲＰＰ３０についての、ｄｄＰＣＲ実験における２８サイクル後の蛍光強度の分析を図示する。
【０３８３】
図３４は、ｄｄＰＣＲ濃度およびコピー数変動の比較を図示する。サンプルＮＡ１８８５３およびＮＡ１９１０８では、非切断サンプルについてのＣＮＶ低減が２８サイクルで観察される。ＶＩＣ（ＲＰＰ３０）濃度、ＦＡＭ（ＭＲＧＰＲＸ１）濃度およびＭＲＧＰＲＸ１コピー数についてのシグナルを示す。
【０３８４】
図３５は、ｄｄＰＣＲ実験における２８サイクル後の、４つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に２個の標的、およびもう一方の上に０個の標的を有すると推測されるサンプル（１８８５３および１９１０８）は、２つの染色体の各々の上に標的の１個のコピーを有する（トランス配置）と推測されるサンプル（１８５０７およびＢＣ１０６）より高い蛍光を有する。
【０３８５】
図３６は、ｄｄＰＣＲ実験における３１、３４および４０サイクル後の、４つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に２個の標的、およびもう一方の上に０個の標的を有すると推測されるサンプル（ＮＡ１８８５３およびＮＡ１９１０８）は、２つの染色体の各々の上に標的の１個のコピーを有する（トランス配置）と推測されるサンプル（ＮＡ１８５０７およびＤ１２３４１０６）より高い蛍光をサイクル３１で有するが、サイクル３４および４０では有さない。
【０３８６】
要するに、前記ｄｄＰＣＲ実験は、サンプル１８８５３および１９１０８が単一染色体上にＭＲＧＰＲＸ１の２個の連鎖コピーを有するという考えを支持する。
【０３８７】
液滴デジタルＰＣＲ実験からの標的の連鎖に関する発見を支持するためにロングレンジＰＣＲ実験も行う。ＣＮ＝１サンプルは、欠失領域の増幅についての対照として役立ち得る。
【０３８８】
図３７は、ロングレンジＰＣＲ実験についての実験構成を図示する。シナリオＡおよびＢについてのロングレンジＰＣＲは、プライマー間の距離が長すぎるため、失敗すると予想される。しかし、ＰＣＲは、ＭＲＧＰＲＸ１が欠失している染色体を含有するシナリオＣについてはうまくいくはずである。矢印はプライマーを示す。
【０３８９】
図３８は、ｄｄＰＣＲによる連鎖を確認するための６つのサンプルでのロングレンジＰＣＲ実験のバイオアナライザー画像を図示する（構成の概略図については図３９を参照されたし）。各レーンにおける約１５００でのバンドは、ＭＲＧＰＲＸ１  ＰＣＲ産物（ＭＲＧＰＲＸ１配列に対する内部のプライマー）である。プライマーをＭＲＧＰＲＸ１配列に対して外部にアニールするようにも設計した。サンプル１１９９４および１８５７３は、１のコピー数を有する：一方の染色体がＭＲＧＰＲＸ１のコピーを含有し、もう一方が欠失を含有する。３０００と１５００の間のＰＣＲ産物は、おそらく、この欠失を有する染色体からの増幅からのものである。サンプル１９２３９および１８５０７は、異なる染色体上にＭＲＧＰＲＸ１の２個のコピーを有する。これらのサンプルは、おそらくＭＲＧＰＲＸ１遺伝子の存在がＰＣＲについて産物を生成するには長すぎる（２５ＫＢ）ため、３０００と１５００の間にバンドを有さない。サンプル１９１０８および１８５５３は、同じ染色体上のＭＲＧＰＲＸ１の２個のコピーと、ＭＲＧＰＲＸ１が欠失している染色体とを有する。３０００と１５００の間のＰＣＲ産物は、おそらく、この欠失を有する染色体からの増幅からのものである。これらのデータは、前記液滴デジタルＰＣＲ実験の結果を裏づける。
【０３９０】
図３９は、６つのサンプルについてのロングレンジＰＣＲ結果およびＭＲＧＰＲＸ１コピー数結果を図示する。上部の概略図は、ＰＣＲプライマー位置、およびＰＣＲ産物の予想長を図示する。サンプルＳ１およびＳ２は、一方の染色体上にＭＲＧＰＲＸ１の１個のコピー、およびもう一方の染色体上に欠失を有する。プライマーは、ＭＲＧＰＲＸ１遺伝子に対して内部にあり、約１．６ｋｂの産物を生成することができる。プライマーはまた、ＭＲＧＰＲＸ１遺伝子に対して外部にアニールする。サンプルＳ３およびＳ４は、ＭＲＧＰＲＸ１の２個のコピーをトランスで（異なる染色体上に）有する。最も外側のプライマーからのＰＣＲ産物は、約２４ｋｂであると推定される。サンプルＳ５およびＳ６は、一方の染色体上にＭＲＧＰＲＸ１の２個のコピー、およびもう一方の染色体上にＭＲＧＰＲＸ１の欠失を有する。欠失を有する染色体上の最も外側のプライマーを使用して生成されるＰＣＲ産物の長さは、約２．７ｋｂである。ＰＣＲ構成の概略図の下に、ロングレンジＰＣＲ結果の実例がある。すべてのサンプルは、１．６ｋｂの内部ＭＲＧＰＲＸ１プライマーからの産物に対応するＰＣＲ産物を有する。サンプルＳ１、Ｓ２、Ｓ５およびＳ６は、染色体欠失を有するサンプルからの約２．７ｋｂのＰＣＲ産物を有する。サンプルＳ３およびＳ４は、約２．７ｋｂのＰＣＲ産物を有さない。ＭＲＧＰＲＸ１の１または２個のコピーを含む染色体上の最も外側のプライマーを使用するＰＣＲは、プライマー間の距離のため失敗する。ロングレンジＰＣＲの実例の下に、制限酵素消化を伴うまたは伴わない、ｄｄＰＣＲによって決定されたＭＲＧＰＲＸ１コピー数の実例がある（ＲＥ＝制限酵素消化；ＮＤ＝消化なし）。サンプルＳ１およびＳ２は、サンプルが制限酵素で消化されても、されなくても、ＭＲＧＰＲＸ１の１個のコピーを有すると推定される。サンプルＳ３およびＳ４は、サンプルが消化されても、されなくても、ＭＲＧＰＲＸ１の約２個のコピーを有すると推定される。サンプルＳ５およびＳ６は、サンプルが消化されるとＭＲＧＰＲＸ１の約２個のコピーを有するが、サンプルが消化されないと２個未満のコピーを有すると推定される。サンプルが消化されるか否かに依存する、Ｓ５およびＳ６におけるコピー数推定の差は、ＭＲＧＰＲＸ１のこれらの２個のコピーが同じ染色体上にあることを示唆する。
【０３９１】
ロングレンジＰＣＲについてのプロトコルは、以下である：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを、次の熱サイクリング条件を用いて使用した：２分間９５℃（１サイクル）、２０秒間９５℃、２０秒間６０℃、７５秒間７２℃（４０サイクル）、７２℃で３分間（１サイクル）。２００ｎＭでのプライマー、２５０ｕＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのＤＮＡ、１ｕＬのＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ、１ＸのＡｇｉｌｅｎｔ供給マスターミックスを５０ｕＬの反応物に含めた。フォワードプライマーの配列は、５’−ＧＡＴＣＴＡＧＣＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’であり、リバースプライマー配列は、５’−ｃａｇｔａｔｔｔｔｔｇｃａｃｔｇｃｔｔｔｃｃｔｃａｔ−３’であった。
【０３９２】
図４０は、推定コピー数の消化サンプルからの百物率差を図示する。
【０３９３】
実施例１０
断片化を決定するためのアルゴリズム
この実施例では、２つの異なるタイプの標的核酸を分析している。一方をＦＡＭプローブで検出し、一方をＶＩＣで検出している。２つの標的核酸配列は、同じポリヌクレオチド上にあると仮定する。サンプル中には、３タイプのＤＮＡ断片が存在し得る：１）Ｆａｍ−Ｖｉｃ一緒にあわせて（細断されていない）、２）Ｆａｍ断片、および３）Ｖｉｃ断片。幾つかの確率が実測され（ＦＡＭ−ＶＩＣクロスプロットにおけるカウント）、目標は、濃度を推定することである。フォワードを先ず行う。濃度を与え、カウントを計算する。その後、逆を行い、異なる濃度値を試してみて、実際のカウントを与えるものを選択する。
【０３９４】
【化１】
2014506465.tif 000006
【０３９５】
【化２】
2014506465.tif 000007
【０３９６】
【化３】
2014506465.tif 000008
実施例１１
マイルポストアッセイ分析−断片化の確率
問題の陳述
２つの異なる遺伝子座が異なる分子上にあるならば、２つの種（ＦＡＭプローブおよびＶＩＣプローブに対応する）があり得る。異なる遺伝子座が同じ分子上にあるならば、３つの種−断片化ＦＡＭ、断片化ＶＩＣ、および連鎖ＦＡＭ−ＶＩＣ−があり得る（図４１を参照されたし）。
【０３９７】
２つの色素があり、そのため不正確さがあり得る。３つすべての種の濃度を計算する必要がある。
【０３９８】
アルゴリズム：ＦＡＭカウント対ＶＩＣカウントの２×２表を得る。断片化ＦＡＭの濃度および１つの種があるかのごとき連鎖ＦＡＭ−ＶＩＣの濃度を計算する。断片化ＶＩＣの濃度および１つの種があるかのごとき連鎖ＦＡＭ−ＶＩＣの濃度を計算する。種々の濃度の連鎖ＦＡＭ−ＶＩＣ（これらから断片化ＦＡＭおよびＶＩＣの濃度を見出すことができる）を試し、実測されたカウントを用いて確率表のベストフィットを見出す：
【０３９９】
【表１−５】
2014506465.tif 000009
次の工程は、閉論理式が容易に誘導できるかを調べること、および／またはＱＴｏｏｌと統合することを含み得る。
【０４００】
実施例１２
断片化分析
ｄｄＰＣＲを用いて、２つのゲノム遺伝子座、例えば共通染色体上の２つの遺伝子を標的にするデュプレックス反応を行うことができる。液滴をそれらの蛍光に従って４集団にカテゴリー分けすることができる（ＦＡＭ＋／ＶＩＣ＋、ＦＡＭ＋／ＶＩＣ−、ＦＡＭ−／ＶＩＣ＋、およびＦＡＭ−／ＶＩＣ−）。これらの集団に関する液滴の数を比較することにより、標的が同じ液滴に相互に分離する頻度を決定することが可能である。ポアソン統計学を用いて、２つの分離されたコピーが偶然に同じ液滴内にある事例に対する実際に互いに連鎖している種の百分率を推定することができる。
【０４０１】
遺伝子座が共通の参照（ＲＰＰ３０）から１Ｋ、３Ｋ、１０Ｋ、３３Ｋおよび１００Ｋ離隔しているアッセイを設計する。２つの遺伝子座が１Ｋ、１０Ｋおよび１００Ｋまで隔てられている研究を行った。これら３つのデュプレックス（または１つだけのデュプレックス）を有する未切断（制限酵素消化されていない）ＤＮＡをプロセッシングし、４つの異なる液滴集団をカウントして、統計分析を用いて遺伝物質の断片化状態を評価することができる。コピー数変動研究についての９５％信頼限界が常に整数値にわたるとは限らない理由の説明に役立てるためにこれらのデータを用いることができる。
【０４０２】
実施例１３
ＤＮＡ断片化の計算のためのまたはデジタルＰＣＲ多重化のためのアルゴリズム
標的間の完全断片化
２つの色素、ＦＡＭおよびＶＩＣそれぞれに対応する２つのＤＮＡ標的Ｔ１およびＴ２。この実施例では、Ｔ１およびＴ２は常に別々のＤＮＡ断片上にある。Ｔ１およびＴ２標的を有するＤＮＡ断片の数は、それぞれＭ１およびＭ２である。図４２Ａを参照されたし。
【０４０３】
複数の区画を用いるデジタルＰＣＲ実験において、ＦＡＭおよびＶＩＣ陽性区画のカウントは、それぞれＮ１およびＮ２である。１区画に複数のＤＮＡ断片がある場合があるので、Ｎ１およびＮ２は、それぞれＭ１およびＭ２より小さい。区画の総数はＮである。予測されたとおりの区画のカウントを表２に示す。
【０４０４】
【表２】
2014506465.tif 000010
ＦＡＭ陽性区画を認める確率をｐ１＝Ｎ１／Ｎとして示し、ＶＩＣ陽性区画を認める確率をｐ２＝Ｎ２／Ｎとして示す場合の対応する確率表は表３である。
【０４０５】
【表３】
2014506465.tif 000011
この場合、Ｔ１とＴ２の間での１００％断片化が存在する。
【０４０６】
Ｔ２およびＴ２分子の数、それぞれＭ１およびＭ２を次のように計算することができる：
Ｍ１＝−Ｎ  ｌｏｇ（１−ｐ１）
Ｍ２＝−Ｎ  ｌｏｇ（１−ｐ２）
（Ｐが正であるＮ個デジタル区画を仮定すると、分子の数は、Ｍ＝−Ｎ  ｌｏｇ（１−Ｐ／Ｎ）である）。
【０４０７】
標的間での断片化なし
Ｔ１とＴ２両方が常に同じＤＮＡ断片上にあるならば、（おそらく、それらの遺伝子座は、染色体の同じ部分上の互いの相当近くにあるため、および制限酵素消化はＴ１とＴ２の間で消化しなかったため）それらは連鎖している。図４２Ｂを参照されたし。したがって、Ｎ１＝Ｎ２。
【０４０８】
【表４】
2014506465.tif 000012
【０４０９】
【表５】
2014506465.tif 000013
この場合、０％断片化が存在する。
【０４１０】
Ｔ１およびＴ２分子の数を次のよう計算するにことができる（式中、ｐ１＝Ｎ１／Ｎ）：
Ｍ１＝−Ｎ  ｌｏｇ（１−ｐ１）
Ｍ２＝−Ｎ  ｌｏｇ（１−ｐ１）。
【０４１１】
部分断片化
中間の状況では、Ｔ１およびＴ２は、幾つかの断片の上で連鎖しているが、ことによると離隔断片上にもある。図４２Ｃを参照されたし。
【０４１２】
連鎖しているＴ１およびＴ２断片のＭ３分子、別々のＴ１断片のＭ１分子、および別々のＴ２断片のＭ２分子がある場合、区画のカウントについての下記の表を作ることができる：
【０４１３】
【表６】
2014506465.tif 000014
Ｍ１＝Ｍ２＝Ｍ３ならば、連鎖している分子の５０％は別々の断片へと断片化され、５０％は無損傷のままであったので、５０％断片化がある。
【０４１４】
実施例１４
マイルポストアッセイでの血漿中のＤＮＡの質の評価
より高いＤＮＡ収量を有するサンプル中の余分のＤＮＡは、たいていはサイズが大きいようである。図４３に示すように、ＤＮＡ収量がおよそ２ｋＧＥ（ゲノム当量）／ｍＬであるとき、ＤＮＡの大体半分は１Ｋｂ未満のサイズであり；該収量が極めて高い（１０ｋＧＥ／ｍＬ以上の）とき、ＤＮＡの９０％は１Ｋｂより大きい。これは、小さいＤＮＡの濃度が比較的一定していることを示唆している。これは、より高い収量が細胞ＤＮＡからの混入に起因することをさらに示唆している。
【０４１５】
実施例１５
血漿中の大きいＤＮＡによる混入はＣＮＶ値に影響を及ぼす
大きいサイズのＤＮＡの混入は、測定されたＣＮＶ値を低下させ得る。上部の図（図４４）は、測定されたＣＮＶ値とＤＮＡサイズとの良好な相関を示す。このサイズの影響は、ＤＮＡの前処理によって大きく除かれる（下部の図、菱形）。予備データは、ＣＮＶ測定前のＤＮＡの適切な断片化で、異なる種間の測定されたＣＮＶ値が同一になることを示す（ここではデータを示さない）。
【０４１６】
実施例１６
ＣＮＶ分析のための制限酵素力価測定
制限酵素（ＲＥ）の力価を測定して、試験アッセイにおけるＣＮＶ分析のためのそれらの使用を決定することができる。１７の制限酵素（殆どが４カッター）を分析する。図４５を参照されたし。制限酵素濃度は、４倍希釈系列：２０、５、１．２５、０．３１、０．０８  、０．０２および０．００５Ｕ／（μｇ  ＤＮＡ）を含む；未消化対照＋バッファー；１濃度につき４反復ｄｄＰＣＲ；ＤＮＡインプット：０．５ｃｐｄ。効率的／完全制限消化を０．０２Ｕ／μｇ  ＤＮＡほどもの低い濃度で果たすことができる。効率的ＲＥ濃度範囲は、標的および酵素によって様々であり得る。５Ｕ／μｇ  ＤＮＡは、ＣＮＶ分析のためのより普遍的な消化プロトコルを可能にする、殆どの制限酵素についての最高ｄｄＰＣＲ濃度をもたらすようである。試験した１７すべての制限酵素に関して、２０Ｕ  ＲＥ／μｇ  ＤＮＡで非特異的ＲＥ活性は観察されなかった。図４６を参照されたし。
【０４１７】
実施例１７
難しいｄｄＰＣＲ  ＣＮＶアッセイを最適化するためのプロトコルの開発
温度勾配の使用により、最適なアニール温度の決定が可能になり得る。ＧＣ添加剤（ＧＣ  ａｄｄｉｔｉｖｅ）の使用は、二次構造を低減させることができ、この二次構造は、別の方法で、ポリメラーゼ活性を遮断することがあり、または競合する非特異的増幅産物の形成をもたらすことがある。添加剤の一例は、ＧＣ  Ｒｉｃｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５Ｘ）（Ｒｏｃｈｅ）である。図４７を参照されたし。
【０４１８】
実施例１８
ｄｄＰＣＲでの制限酵素活性の測定
Ａｌｕ  ＩおよびＭｓｅ  Ｉは、広範な濃度にわたって許容可能に動作する。完全切断が発生すると推測される酵素濃度で少量の残留標的が残存する。ＮＥＢ酵素とＦｅｒｍｅｎｔａｓ酵素は両方ともよく動作するが、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ酵素のほうが多少有効である。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ酵素は、使用の容易さの点で有利である。
【０４１９】
図４８の左のパネルは、ＮＥＷおよびＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入したＡｌｕ  Ｉを使用するアッセイを描写するものである。このアッセイにおいて使用するプライマーは、ＦＷＤプライマー５’−ＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣ−３’、ＲＥＶプライマー５’−ＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴ−３’であり得る。プローブは、５’−６ＦＡＭ−ＴＣＣＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’であり得；  Ａｌｕ  Ｉは、このアプリコン配列を２回切断する。図４８の右のパネルは、Ｍｓｅ  Ｉを使用するアッセイを描写するものである。このアッセイにおいて使用するプライマーは、５’−ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＡＧＣＴＡＣＴＴＡＡＧＧＡ−３’、ＲＥＶ  ５’−ＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＴＡＡＣＣＡＡＴＧＧＡ−３’であり得、一方、プローブは５’−６ＦＡＭ−ＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＴＡＡＡＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ−３’であり得る。Ｍｓｅ  Ｉは、このアプリコン配列を２回切断する。図４８に示すように、Ａｌｕ  ＩまたはＭｓｅＩのいずれかは、参照遺伝子を切断する。この実験では、サンプルに添加するＲＥ量の力価を測定する。ＲＥが高レベルで存在するとき、ＲＥは、アッセイが増幅させるように設計されている標的を消化するはずである。標的が消化されるにつれて陽性液滴数が減少する。標的が消化されると、陽性液滴は殆どまたは全く現れない。図４８を参照されたし。
【０４２０】
実施例１９
併置によるハプロタイプ決定
併置によりハプロタイプ決定情報を獲得するための方法を提供する。この方法は、標的核酸配列の欠失があるかどうかを決定するために用いることができる。（例えば、ＶＩＣ標識プローブで検出される）マーカー配列は、コピー数変動領域内の、（例えば、ＦＡＭ標識プローブで検出される）標的配列の付近だが、外側であり得る。核酸を含むサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分配することができ、マーカーおよび標的配列を（例えば、増幅、およびプローブでの検出によって）検出することができる。図４９に描写するように、ＶＩＣ（マーカー）およびＦＡＭ（標的）の併置を分析することができる。ＶＩＣおよびＶＡＭが１つの区画内に常に共局在する場合には、標的配列の欠失が存在しない可能性がある（図４９Ｂ）。ＦＡＭと共局在していないＶＩＣのみを有する区画がある場合、この結果は、標的配列の欠失を示唆する（図４９Ａ）。
【０４２１】
実施例２０
ＤＮＡサンプルの保管
図２０Ａおよび２０Ｂは、保管された消化ＤＮＡのＭＲＧＰＲＸ１  ＣＮＶ値のドリフトを図示する。図２０Ａにおいて、消化サンプルは、一貫して整数より下のＣＮＶ値を示す。図２０Ｂにおいて、ＣＮＶ値は、より整数に近かった。分析したサンプルには、Ｃｏｒｉｅｌｌ精製ＤＮＡサンプル：ＮＡ１１９９４、ＮＡ１８５０７、ＮＡ１８５０２、ＮＡ１９２２１、ＮＡ１９２０５、ＮＡ１８９１６およびＮＡ１９１０８が含まれた。図２０Ａに描写したサンプルは、図２０Ｂにおけるサンプルとは異なる日に分析した。簡単に言うと、ＲｓａＩを使用してサンプルを消化し、標準的なｄｄＰＣＲ熱サイクリング条件を用いた：９５℃１０分間（１サイクル）、９４℃３０秒間および６０℃１分間（４０サイクル）、９８℃１０分間（１サイクル）、１２℃での保持。
【０４２２】
ＭＲＧＰＲＸ１アッセイ配列は、（フォワードプライマー）５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＣＡ−３’、（リバースプライマー）５’−ＣＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡ−３’、および（プローブ）６ＦＡＭ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＴＣＣＴ−ＭＧＢＮＦＱであった。ＲＲＰ３０（ＶＩＣ標識したもの）に対してサンプルを反復した；ＲＰＰ３０参照アッセイ（フォワードプライマー）５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧ−３’、（リバースプライマー）５’−ＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴ−３’、および（プローブ）ＶＩＣ−ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴ−ＭＧＢＮＦＱ。ＤＮＡを直ぐに（消化の２４時間以内に）プロセッシングした。
【０４２３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、かかる実施形態を単に例として提供したことは当業者には明らかである。今や、本発明を逸脱しない非常に多数の変形、変更および置換が当業者に想起される。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する様々な代案を本発明の実施の際に用いることができることは、理解されるはずである。後続の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すると解釈されるものとし、また本特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、本特許請求の範囲よって包含されると解釈されるものとする。
【図５】
2014506465.tif 000015
【図３７Ａ】
2014506465.tif 000016
【図３７Ｂ】
2014506465.tif 000017
【図３７Ｃ】
2014506465.tif 000018
【図１】
2014506465.tif 000019
【図２】
2014506465.tif 000020
【図３Ａ】
2014506465.tif 000021
【図３Ｂ】
2014506465.tif 000022
【図４】
2014506465.tif 000023
【図６】
2014506465.tif 000024
【図７】
2014506465.tif 000025
【図８】
2014506465.tif 000026
【図９】
2014506465.tif 000027
【図１０】
2014506465.tif 000028
【図１１】
2014506465.tif 000029
【図１２】
2014506465.tif 000030
【図１３】
2014506465.tif 000031
【図１４】
2014506465.tif 000032
【図１５Ａ】
2014506465.tif 000033
【図１５Ｂ】
2014506465.tif 000034
【図１６】
2014506465.tif 000035
【図１７】
2014506465.tif 000036
【図１８】
2014506465.tif 000037
【図１９】
2014506465.tif 000038
【図２０Ａ】
2014506465.tif 000039
【図２０Ｂ】
2014506465.tif 000040
【図２１】
2014506465.tif 000041
【図２２】
2014506465.tif 000042
【図２３Ａ】
2014506465.tif 000043
【図２３Ｂ】
2014506465.tif 000044
【図２４Ａ】
2014506465.tif 000045
【図２４Ｂ】
2014506465.tif 000046
【図２５】
2014506465.tif 000047
【図２６】
2014506465.tif 000048
【図２７】
2014506465.tif 000049
【図２８】
2014506465.tif 000050
【図２９】
2014506465.tif 000051
【図３０】
2014506465.tif 000052
【図３１】
2014506465.tif 000053
【図３２】
2014506465.tif 000054
【図３３】
2014506465.tif 000055
【図３４】
2014506465.tif 000056
【図３５】
2014506465.tif 000057
【図３６】
2014506465.tif 000058
【図３８】
2014506465.tif 000059
【図３９】
2014506465.tif 000060
【図４０】
2014506465.tif 000061
【図４１】
2014506465.tif 000062
【図４２】
2014506465.tif 000063
【図４３】
2014506465.tif 000064
【図４４】
2014506465.tif 000065
【図４５】
2014506465.tif 000066
【図４６】
2014506465.tif 000067
【図４７】
2014506465.tif 000068
【図４８】
2014506465.tif 000069
【図４９】
2014506465.tif 000070
【図５０】
2014506465.tif 000071
【配列表】
2014506465000001.app
【国際調査報告】
2014506465.tif 000072
2014506465.tif 000073
2014506465.tif 000074
2014506465.tif 000075