(57)【要約】【課題】インフルエンザウイルス及びワクチンシードの製造を改善する方法の提供。【解決手段】本発明は、インフルエンザウイルス、特にインフルエンザワクチンシード又はインフルエンザウイルスワクチンの製造を改善する方法に関し、上記製造をＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤の存在下で実施することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｄｍ２アンタゴニストの存在下で実施することを特徴とする、インフルエンザウイルス、特にワクチンシードの製造方法。
【請求項２】
前記Ｍｄｍ２アンタゴニストは、前記インフルエンザウイルスの製造を量的に改善するのに使用されることを特徴とする、請求項１に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項３】
前記Ｍｄｍ２アンタゴニストは、Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項４】
前記インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型及びＣ型、特にＡ型インフルエンザウイルスの亜型であるＨ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株及びＨ９Ｎ２株、特にＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルスから選択されることを特徴とする、請求項１〜３に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項５】
ヒト以外の細胞システムで実施し、該細胞システムにはインフルエンザウイルスを感染させ、その感染前、感染後又は感染と同時に前記Ｍｄｍ２アンタゴニストを添加することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項６】
発育鶏卵の尿膜細胞で実施することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養により実施することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ、ＣＶ−１、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ２１、ＰＥＲＣ６、Ａ５４９、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＡＧＥ１．ＣＲ、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ、ＥＢ６６、ＥＢｘ、及び、Ｈｅｐ−２から選択される細胞株においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することを特徴とする、請求項７に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項９】
（ａ）発育鶏卵、又は、細胞培地中の細胞株の細胞のいずれかであってもよい細胞システムにインフルエンザウイルス、特にインフルエンザワクチンシードを感染させる工程、
（ｂ）前記インフルエンザウイルス、特にインフルエンザワクチンシードを複製できる条件下で、工程（ａ）で選択、感染させた製造用細胞システムを培養する工程、並びに、
（ｃ）培養上清及び／又は培養細胞中に製造されたインフルエンザウイルス全粒子、特にワクチンシードを回収する工程
を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）で回収した前記ウイルスを不活化する工程を有することを特徴とする、請求項９に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項１１】
前記ウイルスは、野生型ウイルス、感染個体から得られた一次ウイルス分離株、組換ウイルス、弱毒化ウイルス、リアソートメントにより得られたウイルス、又は、逆遺伝学的に製造されたウイルスであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項１２】
前記Ｍｄｍ２アンタゴニストは、Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤であり、イミダゾリン誘導体、イミダゾール誘導体、オキシインドール誘導体、スピロインドリノン誘導体、キノリン誘導体特にイソキノリン誘導体、ビスアリールスルホンアミド誘導体、ベンゾジアゼピン誘導体、ピペリジン誘導体、フェノキシ酢酸誘導体、フェノキシメチルテトラゾール誘導体、カルコン誘導体、テトラゾール誘導体、ジスルフィド誘導体、ジアミノアリール誘導体、及び、ペプチド誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記Ｍｄｍ２アンタゴニストは、Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤であり、下記式：
【化１】
2014500008.tif 000012
で表されるＮｕｔｌｉｎ−３（（±）−４−［４，５−ビス（４−クロロフェニル）−２−（２−イソプロポキシ−４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾール−１−カルボニル］ピペラジン−２−オン）、下記式：
【化２】
2014500008.tif 000013
で表されるＮＳＣ６６８１１分子（２−メチル−７−［フェニル（フェニルアミノ）メチル］−８−キノリノール）、及び、下記式：
【化３】
2014500008.tif 000014
【化４】
2014500008.tif 000015
【化５】
2014500008.tif 000016
【化６】
2014500008.tif 000017
【化７】
2014500008.tif 000018
【化８】
2014500008.tif 000019
【化９】
2014500008.tif 000020
で表される各分子から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によりインフルエンザウイルスを製造することを特徴とする、インフルエンザウイルスワクチンの調製方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造したインフルエンザウイルス全粒子を用いて抗原性表面タンパク質を製造することを特徴とする、請求項１３に記載のワクチンの調製方法。
【請求項１６】
得られたワクチンは、死滅病原体又は生きた弱毒化病原体に相当することを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルス及びワクチンシードの技術分野に関する。より詳しくは、本発明はインフルエンザウイルス及びインフルエンザワクチンシードの製造を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、世界中で見られる一般的なウイルス性呼吸器感染症であり、インフルエンザウイルスを原因として、冬季に温帯地域で集団発生する。今日でも、肺炎に次いで二番目に多い感染死の原因である。ヒトの病態に関与するインフルエンザウイルスは、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスである。Ｂ型インフルエンザウイルスは系統型で循環するが、Ａ型インフルエンザウイルスは、２つの主要な表面糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原特性に応じて各種のウイルス亜型に分類される。インフルエンザウイルスは表面に３００〜７００の糖タンパク質を有し、ＮＡ／ＨＡ理論比は１：１０である。ヒトの間で循環して季節的流行を引き起こすウイルスは、Ａ（Ｈ１Ｎ１）型及びＡ（Ｈ３Ｎ２）型ウイルスである。インフルエンザウイルスの主な宿主は動物（鳥及び豚）であるため、動物ウイルスは種の壁を越えてヒトに感染し得る。高病原性鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）型ウイルスや、２００９年のパンデミックを引き起こしたＡ（Ｈ１Ｎ１）型ウイルスなどは、公衆衛生に深刻な問題をもたらし得る。
【０００３】
ワクチン接種は、インフルエンザウイルスから人々を守るのに現時点で唯一有効な手段である。「季節性」ワクチンを接種すると、循環する季節性Ａ（Ｈ１Ｎ１）型ウイルス及びＡ（Ｈ３Ｎ２）型ウイルス並びにＢ型ウイルスに対して免疫を獲得できる。季節性ワクチンは、前年のプロトタイプ株に基づいてＷＨＯが毎年定めている。宿主の主な免疫応答は、ＨＡ及びＮＡタンパク質に対する中和抗体の合成を伴う体液性のものである。これら２種類のタンパク質は、特にＡ型ウイルスについて、かなりの抗原不連続変異を起こすため、ワクチンの組成は毎年、再評価しなければならない。
【０００４】
ワクチン製造の分野だけでなく、インフルエンザウイルスの基礎研究及び生物医学研究の分野においても、インフルエンザウイルスの培養が重要な要素となっている。リアソータントインフルエンザウイルスワクチンは、主に発育鶏卵システムで培養されている。現在のところ、鶏卵１個につき一回分の３価ワクチン量を製造できると見積もられている（非特許文献１）。鶏卵でワクチンを製造する方法では、５〜６ヶ月の期間を要し、これ以上は短くできない。季節性株の循環に対するワクチンの需要だけでなく、（予測するのが難しい）パンデミックを起こし得る突発的な一種（以上）の株に対するワクチンの需要の高まりにも対応する上で、また養鶏場で鳥インフルエンザパンデミックが発生するリスクが残っていることから見ても、鶏卵の入手性が制限要因であることが分かる。更に、家禽類自体もインフルエンザウイルスに感染し得るため、ウイルス製造用の養鶏場そのものがインフルエンザウイルスパンデミックに巻き込まれた場合、供給が困難となり得る。そのため、また経済的な観点からも、ワクチンシードの新規且つ最適な製造方法（期間短縮及び／又はコスト削減）を模索、開発するのは当然至極である。
【０００５】
ここ数年、ワクチン用量を得る代替手法が開発されている。事実、細胞株を用いてワクチン用リアソータントを増幅することによって、とりわけ「鶏卵」システム（パンデミックに対処するには鶏卵量が不十分となり得る）にもはや依存しないものとすることができ、尿膜による製造で定期的に見られる表面抗原の変異を抑制し、アレルギーのリスクを減らすこともできる。だが、現時点でこの新規な製造法を選択する製造業者は少ない。これは、このような工業的プロセスの効率は、尿膜システムでの効率には程遠いからである。実際、細胞培養でのウイルス製造及びウイルス抗原（ＨＡ及びＮＡ）製造はいずれも、収率、従ってウイルス又は抗原の製造量の点で困難に直面している。現在、多くの研究チームがウイルス製造用細胞システムの開発を進め、鶏卵での製造モデルを補完しようとしたり、更には置き換えようとしたりしている。概して、これらの細胞システムは尿膜システムよりも多くのウイルス株の複製を許容し、迅速に工業規模で実施できる（非特許文献２）。更に、これらのシステムを逆遺伝学的手法と組み合わせることができ、迅速且つ柔軟に組換ウイルス（ワクチンシード）を製造できる他、これら組換ウイルスのウイルス学的特性（複製、抗原発現等）も最適化できる。健康上の安全面及び制御面での理由から、細胞株は、動物由来タンパク質フリー合成培地（動物由来血清を含まない合成培地）において高力価のウイルスを製造できるものを選ばなければならない。また、懸濁液中の細胞で製造する細胞システムも記載されている（非特許文献３）。今のところ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＰＥＲＣ６株等の規制当局により認可された細胞株では、製造業者にとって十分な製造収率は達成できていない。
【０００６】
主な経済的課題の一つは、１回分のワクチン量を製造するためのコストの削減及び時間の短縮（製造一回当たりのワクチン量の増加、及び／又は、その量を得るのにかかる時間の短縮）を可能とすることである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．，２００８  Ｎｏｖ．２（６），１９１−２
【非特許文献２】Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２０１０  Ｆｅｂ；１２（１）：２１−３０
【非特許文献３】Ｌｅ  Ｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０  Ｍａｙ  ７；２８（２１）：３６６１−７１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｍｄｍ２活性への拮抗作用、とりわけ、ｐ５３−Ｍｄｍ２相互作用を阻害する作用がインフルエンザウイルスの複製サイクルに影響を及ぼすという予想されなかった観察結果に基づいている。
【０００９】
こうして、本発明は、Ｍｄｍ２タンパク質アンタゴニストの存在下で実施することを特徴とする、インフルエンザウイルス及びワクチンシードの新規な製造方法を提供する。
【００１０】
Ｍｄｍ２タンパク質アンタゴニストは、特に上記インフルエンザウイルスの製造を量的に改善するのに使用されるものであり、従来技術には開示も示唆もされていない。
【００１１】
特定の一実施形態によれば、Ｍｄｍ２タンパク質アンタゴニストは、Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤である。
【００１２】
本発明を詳述する前に、本発明の文脈で使用される用語の明確な定義を記載する。
【００１３】
「インフルエンザウイルス」とは、あらゆるインフルエンザウイルスを意味するものであり、特にヒト、トリ、ウマ、ブタ及びネコの各インフルエンザウイルスを意味するものである。上記インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型及びＣ型から選択できる。特に、上記インフルエンザウイルスはＡ型であってもよく、特にＨ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株及びＨ９Ｎ２株、特にＡ（Ｈ１Ｎ１）型ウイルス及びＡ（Ｈ３Ｎ２）型ウイルスであってもよい。Ｈ１Ｎ１株の具体例としては、Ａ／ポルトリコ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４とも言う）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９、Ａ／北京／２６２／９５、Ａ／ヨハネスブルグ／２８２／９６、Ａ／テキサス／３６／９１、及び、Ａ／カリフォルニア／９６９／０９  Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｓｏｖ等が挙げられる。Ｈ３Ｎ２株の具体例としては、Ａ／パナマ／２００７／９９、Ａ／モスクワ／１０／９９、及び、Ａ／ヨハネスブルグ／３３／９４等が挙げられる。Ｂ型インフルエンザウイルスとしては、例えばＢ／ポルトリコ／８／３４、Ｂ／ヨハネスブルグ／５／９９、Ｂ／ウィーン／１／９９、Ｂ／アナーバー／１／８６、Ｂ／メンフィス／１／９３、Ｂ／ハルビン／７／９４、Ｎ／山東／７／９７、Ｂ／香港／３３０／０１、及び、Ｂ／山梨／１６６／９８型等が挙げられる。由来を問わず全てのインフルエンザウイルスが本発明の対象ではあるが、本発明は、ヒトインフルエンザウイルス、特にヒト個体群で循環するインフルエンザウイルスに対して最も有益である。特定の一実施形態によれば、インフルエンザウイルスは、ヒトＡ（Ｈ１Ｎ１）型ウイルス及びヒトＡ（Ｈ３Ｎ２）型ウイルスから選択される。本発明の文脈において、「ウイルス」とは、野生型ウイルス、感染個体から得られた一次ウイルス分離株、組換ウイルス、弱毒化ウイルス、リアソートメントにより得られたウイルス、及び、逆遺伝学的に製造されたウイルスを包含する。ワクチンの製造に使用される「ワクチンシード」は、多くの場合、遺伝子リアソートメントにより又は逆遺伝学的に得られ、従って、ワクチンシードは本発明におけるウイルスの一具体例である。
【００１４】
現在、従来のワクチン製造方法は、各インフルエンザウイルスについてＷＨＯが毎年定めるプロトタイプシード３種それぞれに対し、Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）株を用いた遺伝子リアソートメントにより鶏卵においてワクチンシードを得ることを第一の基礎としている。ほとんどのワクチン製造業者は、通常、これらの主にＡ／ＰＲ／８／３４親ウイルスに由来するリアソータントウイルスを使用している。従って、ワクチンシードはそれぞれ、プロトタイプ株と、鶏卵内での所望の複製能を有するＡ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスとの遺伝子リアソートメントのプロセスの結果として得られる。
【００１５】
野生型インフルエンザウイルス（自然循環するウイルスであるプロトタイプウイルスとしても知られる）のウイルス粒子には、一本鎖ＲＮＡで構成された異なる遺伝子セグメント（分節）８本が含まれており、各遺伝子は、ウイルスのタンパク質：ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＢ１、ＰＢ１Ｆ２、ＰＢ１Ｎ４０、ＰＢ２及びＰＡのうち所定の１〜３種をコードする。リアソートメントにより得られたワクチンシードは、大量生産に適合したプロトタイプウイルス（現時点では、Ａ／ＰＲ／８／３４親株（組成「６＋２」）に相当する）の遺伝的背景に基づいて、少なくともプロトタイプ株のＨＡ及びＮＡをコードする遺伝子セグメントを含むリアソータントワクチンに相当する。このような遺伝子リアソートメントの結果、３種類の年次プロトタイプ株（ワクチンシードとして知られる）から得られたリアソータントワクチンは、その後、鶏卵内で又は細胞培養により増幅することができる。現在のところ、工業規模では鶏卵システムが非常に広く用いられている。ここ数年で開発された他のワクチンシードの製造手法として逆遺伝学に基づくものも挙げられるが、逆遺伝学によるワクチンシードの製造は、ＷＨＯによって認可、登録された方法ではない。
【００１６】
どのような手法がワクチンシードの製造に採用されたとしても、多くの場合、ワクチンは、尿膜細胞又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で製造されたワクチンシードを精製したＨＡ及びＮＡ抗原に相当する。ワクチンにおいて、場合によっては、これらの糖タンパク質をアジュバントと組み合わせてもよい。現在、ワクチン量は一定量のＨＡ抗原によって定義されている（１回分当たり１５μｇ／ウイルス亜型）。ワクチンバッチのバリデーションには、ＮＡ抗原の陽性検出が必要である。
【００１７】
本発明の文脈において、「Ｍｄｍ２アンタゴニスト」とは、Ｍｄｍ２と相互に作用して、その生物活性を少なくとも部分的にブロックできる分子を意味するものである。中でも、本発明の文脈において、使用されるＭｄｍ２アンタゴニストは、Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤のように作用するものである。
【００１８】
「Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤」とは、ｐ５３タンパク質とＭｄｍ２タンパク質との相互作用を妨げる化合物と定義できる。これらの化合物は、例えばＭｄｍ２標的アンチセンスデオキシヌクレオチド、より広義にはペプチド性又は非ペプチド性低分子量分子であり、ｐ５３とＭｄｍ２との界面に結合して、それらの会合を妨げる。
【００１９】
ガン抑制タンパク質ｐ５３は、細胞周期、アポトーシス、ＤＮＡ修復、及び、多くの代謝経路を制御するのに中心的な役割を担っている。その中心的な位置付けのため、ｐ５３タンパク質は、ヒトのガンにおいて突然変異するタンパク質として最も一般的なものである。実際、５０％近くのガンにおいてｐ５３遺伝子の突然変異が見られ、該タンパク質の不活化又は喪失が引き起こされる。更に広く見れば、ほとんどの場合、ガンにおいてｐ５３の機能は阻害される。通常の条件下では、ｐ５３の活性及び量は、Ｍｄｍ２タンパク質（Ｍｕｒｉｎｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２、Ｈｄｍ２としても知られる）によって厳密に制御されている。このユビキタスタンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼであり、特に、ｐ５３と直接、相互作用することができる。これら２つのタンパク質の複合体の形成は、自己調節ループの工程であり、すなわち、ｐ５３は活性化されると、Ｍｄｍ２のＰ２プロモーターと結合してＭｄｍ２の転写及び発現を誘導する。一方、Ｍｄｍ２はと言うと、ｐ５３と結合することができ、様々なメカニズムでｐ５３を阻害することができる（ｐ５３転写活性化能の阻害、ｐ５３の細胞核からの非局在化、及び、プロテアソームによるｐ５３の分解）（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，１９９９  Ｊａｎ，５５（１），９６−１０７）。
【００２０】
本発明の文脈では、任意のＭｄｍ２アンタゴニスト、特にＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の任意の阻害剤を使用できる。このような化合物が有する特性のうち、最も周知であるのは、ｐ５３タンパク質の活性の誘導及び細胞増殖の阻害である。ｐ５３タンパク質とＭｄｍ２タンパク質との相互作用には、両パートナーのアミノ末端領域が関与している。これらの相互作用領域は、（酵母）ツーハイブリッド法だけでなく免疫沈降法でも確認されている。上記領域は、ｐ５３では領域１〜４１／５２に相当し、Ｍｄｍ２では領域１／１９〜１１８／２０２に相当する。部位特異的突然変異誘発実験から、Ｍｄｍ２との相互作用において重要な、ｐ５３上のいくつかの残基：Ｌｅｕ１４、Ｐｈｅ１９、Ｌｅｕ２２及びＴｒｐ２３が示された（Ｋｌｅｉｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００４  Ｏｃｔ  １８；９１（８）：１４１５−９）。
【００２１】
ｐ５３タンパク質とＭｄｍ２タンパク質との相互作用を阻害する化合物の有効性を評価する主な方法は、阻害される生物学的パラメータ、すなわちｐ５３／Ｍｄｍ２相互作用の関数として反応曲線を作成することによって、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び間接的には阻害定数（Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式によるＫｉ）を算出する方法である。
【００２２】
例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉｏｃｏｒｅ）測定によって阻害分子をＭｄｍ２と競合させることでＩＣ５０値を算出できる。「Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２００４  Ｆｅｂ  ６；３０３（５６５９）：８４４−８」に記載されるように、様々な濃度の化合物をＭｄｍ２組換タンパク質と培養し、ｐ５３組換タンパク質がグラフトされたチップを備えた容器（ＳＰＲ）に注入する。他に、蛍光測定法に基づいた試験を採用してもよい（Ｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００  Ｆｅｂ  １；２７８（１）：２９−３８；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００６  Ｊｕｎ  ２９；４９（１３）：３７５９−６２）。Ｎｕｔｌｉｎ−３等の分子ファミリーの場合、該化合物のＩＣ５０値は約１００〜３００ｎｍである（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（上記文献））。ＮＳＣ６６８１１分子の場合、Ｋｉ定数は１２０ｎＭである（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（上記文献））。
【００２３】
このような競合実験では、ｐ５３由来の天然ペプチド、特にｐ５３の残基１３〜２９に対応するペプチド、及び、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１：ＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ−ＮＨ２のペプチドをコントロールとして導入することができる（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（上記文献）を参照、この文献において測定及び記載されたＫｉ定数：６６７０ｎＭ）。本発明の文脈では、特に、上記文献（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に記載された競合試験の少なくとも１つにおいて上記ペプチドより低いＫｉ値又はＩＣ５０値を示す化合物を、Ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用の阻害剤と考慮している。より一般的には、上記文献（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）及び補足情報ＪＭ０６００２３に記載された競合試験において、１０μＭ未満、好ましくは５μＭ未満、更に好ましくは１μＭ未満のＫｉ値を示す化合物が好ましい。
【００２４】
本発明の文脈において使用できる「Ｍｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤」の例として、イミダゾリン誘導体（特に米国特許第６，７３４，３０２号明細書；国際公開第０３／０５１３５９号；国際公開第２００７／０８２８０５号；国際公開第２００７／０６３０１３号；欧州特許第１４６３５０１号明細書；国際公開第２００６／０９７２６１号；米国特許出願公開第２００８／０２５５１１９号明細書；及び、国際公開第２００８／１３０６１４号に記載のもの）、イミダゾール誘導体（特に国際公開第２００８／１３０６１４号明細書；及び、国際公開第２００８／１１９７４１号に記載のもの）、オキシインドール誘導体（特に米国特許第７，５７６，０８２号明細書；及び、国際公開第２００８／０３４７３６号に記載のもの）、スピロインドリノン誘導体（特に欧州特許第１８５６１２３号明細書；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００６，４９，３４３２−５；米国特許出願公開第６０／７８１９５８号明細書；米国特許第７，４９５，００７号明細書；国際公開第２００７／１０４７１４号；及び、国際公開第２００８／１４１９７５号に記載のもの）、キノリン誘導体、特にイソキノリン誘導体（特に国際公開第２００８／０３４０３９号；米国特許出願公開第２００９／００６８１４４号明細書；及び、ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ，２００８，３，１１１８−２８に記載のもの）、ビスアリールスルホンアミド誘導体（特に欧州特許第１５１９９３２号明細書に記載のもの）、ベンゾジアゼピン誘導体（特にＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００５，４８，９０９−１２；欧州特許第１４４３９３７号明細書；及び、米国特許第７，１１５，５９８号明細書に記載のもの）、ピペリジン誘導体（特に米国特許第７，０６０，７１３号明細書；及び、国際公開第２００８／００５２６８号に記載のもの）、フェノキシ酢酸誘導体及びフェノキシメチルテトラゾール誘導体（特に欧州特許第０９４７４９４号明細書に記載のもの）、カルコン誘導体（特にＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０，３３６−４４；及び、米国特許第７，５１４，５７９号明細書に記載のもの）、テトラゾール誘導体（特に米国特許出願公開第２００８／０２６２２００号明細書に記載のもの）、ジスルフィド誘導体（特に米国特許出願公開第２００９／００８５５３号明細書に記載のもの）、ジアミノアリール誘導体（特に国際公開第２００６／０３２６３１号；国際公開第２００７／１０７５４３号；及び、国際公開第２００７／１０７５４５号に記載のもの）並びにペプチド誘導体（特にＢｏｔｔｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｐｅｒ，７（１１），１９９７，８６０−９に記載のもの）等、従来技術においてＭｄｍ２タンパク質の阻害剤として記載されたものが挙げられる。これらの阻害剤の概要については、「Ｌｕｔｚ  Ｗｅｂｅｒ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，２０１０，２０（２），１７９−１９０」及び「Ｓｈａｎｇａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２００９；４９：２２３−４１」に記載されており、詳細についても上記文献を参照されたい。
【００２５】
より具体的な例として、下記式：
【００２６】
【化１】
2014500008.tif 000002
【００２７】
で表されるＮｕｔｌｉｎ−３（（±）−４−［４，５−ビス（４−クロロフェニル）−２−（２−イソプロポキシ−４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイミダゾール−１−カルボニル］ピペラジン−２−オン）（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４  Ｆｅｂ  ６，３０３（５６５９），８４４−８に記載されるもの、腫瘍学的治験において２つの第Ｉ相試験の対象である）、下記式：
【００２８】
【化２】
2014500008.tif 000003
【００２９】
で表されるＮＳＣ６６８１１分子（２−メチル−７−［フェニル（フェニルアミノ）メチル］−８−キノリノール）、及び、下記式：
【００３０】
【化３】
2014500008.tif 000004
【００３１】
【化４】
2014500008.tif 000005
【００３２】
【化５】
2014500008.tif 000006
【００３３】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、国際公開第２００８／１１９７４１号の記載と同義である）
【００３４】
【化６】
2014500008.tif 000007
【００３５】
【化７】
2014500008.tif 000008
【００３６】
【化８】
2014500008.tif 000009
【００３７】
【化９】
2014500008.tif 000010
【００３８】
で表される各分子が挙げられる。
【００３９】
これらの分子はガン治療の用途で知られているが、インフルエンザウイルスの製造を量的に改善する用途は今まで予見されていなかった。本発明がなす貢献は、Ｍｄｍ２アンタゴニスト、好ましくはＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤をインフルエンザウイルス又はワクチンシードの製造に使用する点にある。その製造にはあらゆる手法を用いることができる。
【００４０】
インフルエンザウイルス又はワクチンシードは、Ｍｄｍ２アンタゴニスト、特にＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤の存在下、細胞システムにおいて製造される。
【００４１】
Ｍｄｍ２アンタゴニスト、特にＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤の効果は、当業者によって調整される複数のパラメータ、すなわち阻害剤の量、阻害剤を添加するタイミング、感染時の初期ウイルス量、製造時間によって影響される。
【００４２】
例えば、Ｍｄｍ２アンタゴニスト、特にＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤は、濃度０．１〜１００μＭで使用される。特に、Ｎｕｔｌｉｎ−３等のイミダゾール誘導体を使用する場合、濃度は１μＭ〜１０μＭ程度であることが好ましく、ＮＳＣ６６８１１等のキノリン誘導体を使用する場合、濃度は０．５μＭ〜５μＭ程度であることが好ましい。
【００４３】
選択した細胞システム（鶏卵又は培養細胞）にインフルエンザウイルス又はインフルエンザワクチンシードを感染させる。Ｍｄｍ２アンタゴニスト、特にＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤は、感染前、感染後又は感染と同時に添加できる。ウイルス、特にワクチンシードは、発育鶏卵の尿膜細胞で、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養により製造できる。使用する細胞の種類は、細胞培養、ウイルスの複製及び製造、並びに、ウイルス抗原の製造に好適なものであれば特に限定されない。上記細胞は、ヒト由来若しくはその他動物由来の哺乳類細胞、鳥類細胞又は昆虫細胞から選択されることが有利である。
【００４４】
哺乳類細胞としては、特にヒト細胞由来、ブタ細胞由来又はイヌ細胞由来の培養細胞が挙げられる。特に、肺上皮細胞由来の細胞（ヒト肺ガン細胞Ａ５４９（ＣＣＬ−１８５）等）や腸管上皮細胞由来の細胞（Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３７））であってもよい。
【００４５】
また、哺乳類細胞としては、以下の細胞等も挙げられる。
・ＳＪＰＬブタ肺上皮細胞（特にＡＴＣＣに寄託されたＰＴＡ−３２５６細胞株（米国特許出願公開第２００４／０１４２４５０号明細書及び国際公開第２００９／０５９４１１号）等）
・イヌ由来ＭＤＣＫ細胞
・ＢＨＫ２１（ＣＣＬ−１０、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ（ハムスター））
・ヒトＨＯＳ細胞（特にＣＲＬ−１５４３細胞株等）
【００４６】
特定の一実施形態において、上記細胞は細胞培養に適合した鳥類細胞であり、例えば以下の細胞等が挙げられる。
・ＣＣＬ−１４１（Ａｎａｓ  ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）
・ＣＲＬ−１２１３５（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｃｏｎ  Ａ−Ｃ１  ＶＩＣＫ）
・ＣＲＬ−１２２０３（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ−１）
・ＣＲＬ−１２３５７（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、ＣｏｎＡ−Ｂ１−ＶＩＣＫ）
・ＣＲＬ−１５９０（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、ＳＬ−２９）
・ＣＲＬ−１７０８（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ、ＱＴ６）
・ＣＲＬ−１９６２（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ、ＱＭ７（Ｑｕａｉｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ７））
・ＣＲＬ−２１１１（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）、ＤＴ４０）
・ＣＲＬ−２１１２（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）、ＤＴ９５）
・ＣＲＬ−８１３５（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏ（シチメンチョウ）、ＭＤＴＣ−ＲＰ１９）
・ＡＴＣＣに寄託されたＱＭ７筋芽細胞株（ＣＲＬ−１６３２、米国特許出願公開第２００５／００８４５０３号に記載されるもの）
【００４７】
他の鳥類細胞株も当業者に公知であり、使用できる。上記細胞は特に鳥類胚細胞であってもよい。国際公開第０３／０７６６０１号及び国際公開第２００８／１２９０５８号には、ＥＢ６６及びＥＢｘ細胞株が記載されている。Ｌｏｈｒらは、ウイルスの増殖用又は複製用のＡＧＥ１．ＣＲ及びＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ鳥類細胞株の樹立を記載している。また、国際公開第２００９／００４０１６号には、ウイルス製造用に不死化させた鳥類細胞及びその作製方法が記載されている。
【００４８】
特定の一実施形態によれば、上記細胞は、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＡ５４９細胞から、通常はインフルエンザウイルス製造に使用される鳥類細胞株から選択される。
【００４９】
ＭＤＣＫ細胞は、例えば米国特許出願公開第２００６／０１８８９７７号明細書及び欧州特許第１８６２５３７号明細書に記載されている。特に、ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−６５０１）、ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−６５０２）、及び、ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３（ＡＴＣＣ：ＰＴＡ−６５０３）といった細胞株が挙げられる。
【００５０】
上記細胞は、例えば以下の細胞から選択される。
・Ｖｅｒｏ細胞、特にＣＣＬ−８１（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、Ｖｅｒｏ細胞株）
・ＣＨＯ細胞、特にＣＲＬ−１２４４４（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター））及びＣＨＯ  ＤＰ−１２（ｃｌｏｎｅ  ＃１９３３  ａＩＬ８．９２  ＮＢ  ２８６０５／１２細胞株）
・ＭＤＣＫ細胞、特にＣＣＬ−３４（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ−２）細胞株）
・ＣＯＳ細胞、特にＣＲＬ−１６５０（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、ＣＯＳ−１細胞株）、ＣＲＬ−１６５１（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、ＣＯＳ−７細胞株）
・ＣＶ１細胞、特にＣＣＬ−７０（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、ＣＶ−１細胞株）
・ＨｅＬａ細胞
・Ｈｅｐ−２細胞
【００５１】
ＣＶ−１、ＣＶ−Ｃ、Ｖｅｒｏ及びＢＳＣ−１細胞株をウイルス製造に使用することは、例えば米国特許第６，３０３，３７１号明細書に記載されている。
【００５２】
有利な実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ、ＣＶ−１、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ２１、ＰＥＲＣ６、Ａ５４９、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＡＧＥ１．ＣＲ、ＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ、ＥＢ６６、ＥＢｘ、及び、Ｈｅｐ−２から選択される。上記細胞は、医療用途での細胞培養によるウイルス製造が規制当局により認可された細胞株から選択されることが有利である。
【００５３】
特定の一実施形態によれば、本発明に係るインフルエンザウイルスの製造方法は、（ａ）発育鶏卵、又は、細胞培地中の細胞株の細胞のいずれかであってもよい細胞システムにインフルエンザウイルス、特にインフルエンザワクチンシードを感染させる工程、（ｂ）上記インフルエンザウイルス、特にインフルエンザワクチンシードを複製できる条件下で、工程（ａ）で選択、感染させた製造用細胞システムを培養する工程、並びに、（ｃ）インフルエンザウイルス全粒子、特にワクチンシード、特に培養上清及び／又は培養細胞中に製造されたインフルエンザウイルス全粒子、特にワクチンシードを回収する工程を有する。鶏卵システムの場合にはｉｎ  ｖｉｖｏで培養し、細胞株の場合にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する。
【００５４】
Ｍｄｍ２アンタゴニスト、特にＭｄｍ２タンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用の阻害剤は、任意のインフルエンザウイルス、特に野生型ウイルス、感染個体から得られた一次ウイルス分離株、組換ウイルス、弱毒化ウイルス、リアソートメントにより得られたウイルス、又は、逆遺伝学的に製造されたウイルスを製造する際に使用できる。
【００５５】
特定の一実施形態によれば、上記製造は細胞システムにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。好ましくは無血清培地、より好ましくは動物由来タンパク質フリー培地（調整済み（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）合成培地）である細胞培地で、選択したインフルエンザウイルスを細胞株の細胞に感染させる。特定の一実施形態によれば、感染細胞は、蛋白質分解酵素の存在下、培地において、ウイルスが上記培地で確実に十分に増殖できる条件下で培養される。上記蛋白質分解酵素は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ、フーリン及びカルボキシペプチダーゼから選択される。該酵素は、組換酵素であること、すなわち動物由来ではないことが有利である。
【００５６】
インフルエンザウイルスの分節性によって、本発明に係る方法はリアソータントインフルエンザウイルスの製造にも適用できる。この場合、選択した細胞システムを少なくとも２種類のインフルエンザウイルス株に感染させるため、２種類のウイルス株に由来するセグメント（分節）の混合物が一つの宿主細胞で製造されることとなる。ウイルスの構築の際、ウイルス断片には理論上あらゆる組み合わせが考えられる。新規な組み合わせはリアソータントと呼ばれる。抗体等を用いて他のウイルスを抑制又は排除することにより、特定のリアソータントを選択することができる。ワクチンシードはこのような方法で生成される。このような手法についての詳細は、「Ｋｉｌｎｏｕｒｎｅ  Ｅ．Ｄ．，Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＳＡ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  Ｅ．Ａ．Ｅｄｓ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９４」を参照されたい。
【００５７】
また、本発明に係る方法は、逆遺伝学的なインフルエンザウイルスの製造にも適用できる。特に、細胞に発現プラスミドをトランスフェクトすることで組換ウイルスを製造できる（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，２０００  Ｄｅｃ；８１（Ｐｔ  １２）：２８４３−７）。また、それほど広くは採用されていないが、精製タンパク質、特に精製ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡタンパク質の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｃＤＮＡコンストラクトから転写したインフルエンザウイルスＲＮＡの修飾転写物を用いる手法もある。得られた合成リボ核粒子は、その後、事前にインフルエンザウイルスを感染させておいた細胞に転写する。この手法についての詳細は、「Ｅｎａｍｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８ｔｈ，１９９０，３８０２−３８０５」、「Ｅｎａｍｉ  ａｎｄ  Ｐａｌｅｓｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，２５１１−２５１３（１９９１）」及び「Ｌｕｙｔｊｅｓ，Ｃｅｌｌ．，１９８９，５９，１１０７−１１１３」を参照されたい。
【００５８】
本発明の文脈において、特定の一実施形態によれば、本発明に係るインフルエンザウイルス、特にワクチンシードの製造方法は、回収したウイルスを不活化する工程を有していてもよい。不活化は任意の公知手法で実施でき、例えば、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−８０等）添加エーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０２、デオキシコール酸ナトリウム、又は、リン酸トリ−Ｎ−ブチルで処理することで実施できる。
【００５９】
本発明に係るウイルス、特にワクチンシードの製造方法は、ワクチンの製造方法に含まれていてもよい。この場合、本発明に係るワクチンの調製方法は、製造したインフルエンザウイルス全粒子から抗原性表面タンパク質（ＨＡ及びＮＡ）を製造する工程を有する。この際、場合によっては、得られたウイルス全粒子を含む培地、特に上清をデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）消化酵素（デオキシリボヌクレアーゼ又は核酸分解酵素等）で処理する必要がある。また、陽イオン界面活性剤（セチルトリメチルアンモニウム又はミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン又はリポフェクトアミン等）を添加してもよい。
【００６０】
多くの場合、ウイルス又は表面タンパク質の回収は、濃縮及び／又は精製を伴い、当業者に周知の手法によって、特に限外濾過又は遠心分離を行って実施される（例えば、Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｗｅｂｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｙ（Ｅｄｓ．），Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２４，ｐｐ．３２４−３３２を参照）。
【００６１】
本発明に係る方法で得られたワクチンは、死滅（不活化とも言う）病原体又は生きた弱毒化病原体に相当するものであってもよい。ワクチンは、例えば、ウイルスの製造後に得られる培養上清に相当するものであるか、又は、本発明に係る方法で製造されたウイルスを用いて得ることができる抗原性表面タンパク質に相当するものであってもよい。
【００６２】
添付の図面を参照しつつ、以下の実施例によって本発明が説明されるが、本発明は以下の実施例に決して限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】非感染Ａ５４９細胞層の写真、及び、Ｎｕｔｌｉｎ−３の存在下又は非存在下における、Ｈ３Ｎ２ウイルスに感染させたＡ５４９細胞層の写真である。
【図２】各種の培養条件及び感染回数において、培養上清中に見られたウイルスゲノムのコピー数（Ｍ／ｍｌ）（Ｍは、ウイルスタンパク質Ｍ１及びＭ２をコードするウイルスゲノムのセグメント）を示す。
【図３】各種の培養条件及び感染回数において、培養上清中に見られたウイルスゲノムのコピー数（Ｍ／ｍｌ）（Ｍは、ウイルスタンパク質Ｍ１及びＭ２をコードするウイルスゲノムのセグメント）を示す。
【図４】各種の培養条件及び感染回数において、培養上清中に見られたウイルスゲノムのコピー数（Ｍ／ｍｌ）（Ｍは、ウイルスタンパク質Ｍ１及びＭ２をコードするウイルスゲノムのセグメント）を示す。
【図５】各種の培養条件及び感染回数において、培養上清中に見られたウイルスゲノムのコピー数（Ｍ／ｍｌ）（Ｍは、ウイルスタンパク質Ｍ１及びＭ２をコードするウイルスゲノムのセグメント）を示す。
【図６】各種の培養条件及び感染回数において、培養上清中に見られたウイルスゲノムのコピー数（Ｍ／ｍｌ）（Ｍは、ウイルスタンパク質Ｍ１及びＭ２をコードするウイルスゲノムのセグメント）を示す。
【図７】各種の培養条件及び感染回数において、培養上清中に見られたウイルスゲノムのコピー数（Ｍ／ｍｌ）（Ｍは、ウイルスタンパク質Ｍ１及びＭ２をコードするウイルスゲノムのセグメント）を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６４】
以下の全実施例において、実験は３７℃の温度で実施した。培地はＤＭＥＭ（Ｒｅｆ．４１９６６、Ｇｉｂｃｏ）を使用し、感染時にトリプシン（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。
【００６５】
（１）インフルエンザによる細胞変性効果に対するＮｕｔｌｉｎ−３の効果：Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染Ａ５４９細胞での試験
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）：ＣＣＬ１８５）は、肺ガン由来細胞である。この細胞は、ＩＩ型肺胞上皮細胞と同様な特徴（ヒト気道由来の極性化上皮細胞）を示す（Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９７６  Ｊａｎ  １５；１７（１）：６２−７０）。感染した親から得た肺組織に対して幾つかのｅｘ−ｖｉｖｏ実験を実施したところ、この種の上皮細胞がインフルエンザウイルスの初期感染部位を構成しているらしいことが分かった（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，２００７  Ｆｅｂ；１３（２）：１４７−９、ｖａｎ  Ｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６  Ａｐｒ  ２１；３１２（５７７２）：３９９）。従って、上記細胞はインフルエンザウイルス研究に適切なものと考えられるため、インフルエンザウイルスの基礎研究の分野において非常に広く用いられている。
【００６６】
一般的には、ウイルスによる細胞変性効果を経時的に観察及びモニタリングすることで、細胞層の感染の程度を一次評価できる。ウイルスによる細胞変性効果は、特に、感染細胞同士が融合して多核細胞構造（合胞体）を形成することを特徴とする。細胞層における上記構造の量及び大きさを光子顕微鏡で観察することで、感染の程度を推測できる。Ｎｕｔｌｉｎ−３（１０μＭ）の存在下及び非存在下、同じ感染条件（ＭＯＩ（感染多重度）＝２×１０−３）で得られた細胞変性効果を比較したところ、図１（非感染（ＭＯＣＫ）細胞を参照として使用）に示される通り、２４ｈｐｉ（ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（感染２４時間後）以降かなりの差異が認められた。Ｎｕｔｌｉｎ−３の非存在下では、Ａ５４９細胞は、感染が進んだ際に特徴的に見られる細胞変性効果を示し、多数の細胞集合体及び合胞体構造を有している。それに比べて、Ｎｕｔｌｉｎ−３で処理した（分子を感染１４時間前に添加した後、感染工程を通じて保持）した細胞は、更に顕著な細胞変性効果を示し、特により大きな合胞体感染構造を有している。
【００６７】
（２）ウイルス製造に対するＮｕｔｌｉｎ−３の効果：Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染Ａ５４９細胞での試験
上清の感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を経時的に測定して、感染工程中に製造、放出されたウイルスを定量したところ、Ｎｕｔｌｉｎ−３の存在下の方が子孫ウイルス量はより多かった（２４ｈｐｉ及びそれ以降、１ｌｏｇ１０の差で増加；図２Ａ）。そして、より正確に理解するため、ウイルスＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲで定量することによって、上清のウイルスゲノムコピー数（Ｍ／ｍｌ）を定量した（図２Ｂ）。４８ｈｐｉ時点では、Ｎｕｔｌｉｎ−３の非存在下で測定されたコピー数は６．６６×１０６Ｍ／ｍｌであったのに対し、Ｎｕｔｌｉｎ−３の存在下ではコピー数は２．４４×１０８Ｍ／ｍｌであった。すなわち、ウイルス製造量について３６倍超の増加が見られた。７２ｈｐｉ時点で同様に算出したところ、Ｎｕｔｌｉｎ−３を使用した条件の方が８８倍の増加が見られた。
【００６８】
（３）各種の初期接種量のウイルスを用いてウイルス複製周期１サイクル以上で製造されたウイルスの力価に対するＮｕｔｌｉｎ−３の効果：前処理の効果、及び、各種濃度のＮｕｔｌｉｎ−３の効果の評価
【００６９】
（ａ）Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染Ａ５４９細胞での試験
Ｎｕｔｌｉｎ−３の存在下又は非存在下、各種の量（ＭＯＩ＝０．０１、０．１及び１）のウイルスをＡ５４９細胞に感染させ、ウイルス周期１サイクル（１０ｈｐｉ）又はウイルス周期複数サイクル（２８ｈｐｉ）後、ＲＴ−ｑＰＣＲで上清中のコピー数（Ｍ／ｍｌ）を測定した。感染１４時間前（Ｔ＝−１４ｈ）又は感染時点ですぐに（Ｔ＝０ｈ）、細胞をＮｕｔｌｉｎ−３と接触させた（図３）。いずれの場合も、Ｎｕｔｌｉｎ−３は一度に添加する。
【００７０】
ウイルス周期１サイクル（１０ｈｐｉ）の時間尺度では、上清中のウイルスゲノムはＭＯＩが０．１又は１という感染条件下でのみ定量できた。細胞がＮｕｔｌｉｎ−３の存在下にある場合、上清中のコピー数（Ｍ／ｍｌ）は多くなった。例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３の存在下、Ｔ＝０で処理を開始した場合、感染細胞の上清におけるゲノムコピー数は、Ｎｕｔｌｉｎ−３を使用しなかったコントロールと比較して、ＭＯＩ＝０．１及びＭＯＩ＝１ではそれぞれ１１〜５０倍多くなった（図３）。
【００７１】
同様の実験を、前処理を行う時間を変更して（感染１０時間前に対して１４時間前）、ＭＯＩ＝１０−３で実施した。４８ｈｐｉ時点では、Ｎｕｔｌｉｎ−３によって、上清中のコピー数（Ｍ／ｍｌ）がコントロールと比較して、濃度０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭではそれぞれ１．５倍、５．７倍及び４０倍多くなる（図４）。
【００７２】
（ｂ）Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染ＭＤＣＫ細胞での試験
ＭＤＣＫ細胞株（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−３４）は、実験室でのインフルエンザウイルス製造に最も広く用いられている細胞株である。この細胞株は登録されたものでもあり、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社及びＳｏｌｖａｙ社がこの細胞株でワクチンバッチを製造している。
【００７３】
図５に示される結果から、初期ＭＯＩ値１０−３において、感染１４時間前に前処理した場合、各種濃度（０．１、１及び１０μＭ）のＮｕｔｌｉｎ−３分子によって、ウイルス周期を複数サイクル連続した後の細胞上清のウイルス力価（ゲノムコピー数（Ｍ／ｍｌ））が大きく増加したことが分かる。２４ｈｐｉ時点では、Ｎｕｔｌｉｎ−３の存在下ではゲノムコピー数（Ｍ／ｍｌ）がコントロールと比較して１９倍にまで多くなっている。これらの追加データによって、Ａ５４９細胞株で得られた結果が裏付けられる。
【００７４】
（４）ウイルス複製に対する別のＭｄｍ２アンタゴニスト分子（ＮＳＣ６６８１１）の効果：Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染Ａ５４９細胞での試験
Ｍｄｍ２と相互作用し、従ってｐ５３／Ｍｄｍ２相互作用をブロックするもの（Ｎｕｔｌｉｎ−３と同様の作用を持つもの）として、下記式：
【００７５】
【化１０】
2014500008.tif 000011
【００７６】
で表されるＮＳＣ６６８１１分子（２−メチル−７−［フェニル（フェニルアミノ）メチル］−８−キノリノール、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が知られている。
【００７７】
この分子は、濃度２μＭ及び２０μＭ、ＭＯＩ＝１０−３で使用した。
【００７８】
図６は、４８ｈｐｉ時点で得られた結果を表し、ＮＳＣ６６８１１分子の場合も、Ｎｕｔｌｉｎ−３分子について上述したのと全く同様の結果が得られることを示している。よって、４８ｈｐｉ時点では、ＮＳＣ６６８１１の濃度が２μＭの場合、上清中のゲノムコピー数（Ｍ）がコントロールと比較して約６倍多くなっている。同様に、７２ｈｐｉ時点では、ＮＳＣ６６８１１の濃度が２０μＭの場合、上清中のゲノムコピー数（Ｍ）がコントロールと比較して約５倍多くなっている。
【００７９】
（５）ウイルス複製に対するＭｄｍ２過剰発現の効果：Ａ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）ウイルス感染Ａ５４９細胞での試験
ウイルス製造に対するＭｄｍ２過剰発現の効果も検討した。図７に示す結果は、初期ＭＯＩ値１０−３の場合の４８ｈｐｉ及び７２ｈｐｉでのコピー数を示しており、Ｍｄｍ２タンパク質が過剰発現すると（ｐｃｄＮＡ−Ｈｄｍ２）、Ｈ３Ｎ２ウイルスの複製効率が低くなることが分かる。この結果から、インフルエンザウイルス製造において試験した分子の効果は、Ｍｄｍ２タンパク質に対するアンタゴニスト作用と実際に関連していることが裏付けられる。
【００８０】
（６）結論
（１）、（２）、（３）、（４）及び（５）に示した全ての実験から、２つの異なる細胞システム（Ａ５４９／ＭＤＣＫ）でのインフルエンザウイルス製造に対して、Ｎｕｔｌｉｎ−３又は別のＭｄｍ２アンタゴニスト分子（ＮＳＣ６６８１１）が明らかに効果を示すことが分かる。Ｍｄｍ２過剰発現条件下で得られた結果から、試験した２種類の分子（ｐ５３−Ｍｄｍ２相互作用の阻害剤）の作用様式と、それらがインフルエンザウイルスの細胞製造を調節する性質とが機能的に関連していることが裏付けられる。
【図２】
2014500008.tif 000021
【図３】
2014500008.tif 000022
【図４】
2014500008.tif 000023
【図５】
2014500008.tif 000024
【図６】
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【図７】
2014500008.tif 000026
【図１】
2014500008.tif 000027
【国際調査報告】
2014500008.tif 000028
2014500008.tif 000029
2014500008.tif 000030
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2014500008.tif 000032
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