(57)【要約】  本明細書で具体的に開示されるものは、融解温度の分析のための方法及びシステム、特に二重鎖核酸の分析に関する。
2014534811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、二重鎖核酸分子の融解温度を決定する方法：
二本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程であって、前記勾配が、前記二本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子への少なくとも1つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む、前記工程、及び
前記矩形波温度勾配の過程にわたって前記少なくとも1つの遷移を検出する工程。
【請求項２】
矩形波温度勾配が一連の温度パルスを含み、各パルスが、
a）高い第一の温度への前記溶液の温度の上昇、
b）低い第二の温度への前記溶液の温度の下降、
を含み、前記高い第一の温度が前記低い第二の温度より高く、さらに
次のパルスでは、前記高い第一の温度及び前記低い第二の温度が前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
温度パルスの少なくとも1つが、二本鎖核酸分子と一本鎖核酸分子との間で検出可能な遷移が生じる温度範囲を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
検出が、温度パルスの各々の高い第一の温度及び低い第二の温度で生じる、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
さらに、二本鎖核酸から一本鎖核酸分子への最大の検出可能遷移を有する温度パルスを同定する工程を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
同定する工程が検出可能シグナルの差異を計算する工程を含み、前記検出可能シグナルが、一温度パルス内の高い第一の温度及び低い第二の温度で測定される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
溶液が複数の二本鎖核酸種を含み、前記核酸種の各々が異なる配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
複数の二本鎖核酸種の各々が異なる融解温度を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
検出工程が、二重鎖核酸の存在下でシグネチャー検出可能シグナルを有するレポーター成分の検出を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
シグネチャー検出可能シグナルが可逆的である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
レポーター成分が蛍光色素を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
レポーター成分が、臭化エチジウム、YO-PRO-1、ヘキスト33258、ピコグリーン及びSYBRグリーンから成る群から選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
検出する工程が紫外線（UV）吸収をモニターする工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
矩形波温度勾配がプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて作製される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
二重鎖核酸分子の融解温度を決定するシステムであって、プログラム可能なサーマルサイクリング装置、検出装置及び矩形波サーマルサイクリングのためのプログラムを含み、前記プログラムが以下の工程のための命令群を含む、前記システム：
二本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程であって、前記勾配が、前記二本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む、前記工程、及び
前記矩形波温度勾配の過程にわたって前記少なくとも1つの遷移を検出する工程。
【請求項１６】
矩形波温度勾配が一連の温度パルスを含み、各パルスが、
a）高い第一の温度への前記溶液の温度の上昇、
b）低い第二の温度への前記溶液の温度の下降、
を含み、
前記高い第一の温度が前記低い第二の温度より高く、さらに
次のパルスでは、前記高い第一の温度及び前記低い第二の温度が前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される、請求項15に記載のシステム。
【請求項１７】
温度パルスの少なくとも1つが、前記二本鎖核酸分子と前記一本鎖核酸分子との間で検出可能な遷移が生じる温度範囲を含む、請求項16に記載のシステム。
【請求項１８】
検出が、温度パルスの各々の高い第一の温度及び低い第二の温度で生じる、請求項16に記載のシステム。
【請求項１９】
プログラムがさらに、二本鎖核酸から一本鎖核酸分子への最大の検出可能遷移を有する温度パルスを同定するための命令を含む、請求項16に記載のシステム。
【請求項２０】
同する定工程が、検出可能シグナルの差異を計算する工程を含み、前記検出可能シグナルが、一温度パルス内の高い第一の温度及び低い第二の温度で測定される、請求項19に記載のシステム。
【請求項２１】
検出する工程が紫外線（UV）吸収をモニターする工程を含む、請求項15に記載のシステム。
【請求項２２】
矩形波温度勾配がプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて作製される、請求項15に記載のシステム。
【請求項２３】
以下の工程を含む、二本鎖核酸分子の融解温度を決定する方法：
二本鎖核酸分子及び二重鎖核酸存在下でシグネチャー検出可能なシグナルを有するレポーター成分を含むサンプルを提供する工程、
前記サンプルを一連の温度パルスに付す工程であって、少なくとも複数の前記パルスが前記二本鎖核酸分子の一本鎖分子への遷移及び二本鎖分子への復帰を引き起こす、前記工程、及び
前記レポーター成分によって生成されるシグナルを用いて前記二本鎖核酸分子の融解温度を検出する工程。
【請求項２４】
温度パルスの各々が、
a）高い第一の温度への溶液の温度の上昇、
b）低い第二の温度への前記溶液の温度の下降、
を含み、
前記高い第一の温度が前記低い第二の温度より高く、さらに
次のパルスでは、前記高い第一の温度及び前記低い第二の温度が前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
温度パルスの少なくとも1つが、前記二本鎖核酸分子と前記一本鎖核酸分子との間で検出可能な遷移が生じる温度範囲を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
検出が、温度パルスの各々の高い第一の温度及び低い第二の温度で生じる、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
二本鎖核酸から一本鎖核酸分子への最大の検出可能遷移を有する温度パルスを同定する工程を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
同定する工程が検出可能シグナルの差異を計算する工程を含み、前記検出可能シグナルが、一温度パルス内の高い第一の温度及び低い第二の温度で測定される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
溶液が複数の二本鎖核酸種を含み、前記核酸種の各々が異なる配列を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３０】
複数の二本鎖核酸種の各々が異なる融解温度を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
レポーター成分が、一本鎖核酸と比較して二本鎖核酸の存在下で種々のシグナルを生成する、請求項23に記載の方法。
【請求項３２】
種々のシグナルが可逆的である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
レポーター成分が蛍光色素を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
レポーター成分が、臭化エチジウム、YO-PRO-1、ヘキスト33258、ピコグリーン及びSYBRグリーンから成る群から選択される、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
検出する工程が紫外線（UV）吸収をモニターする工程を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３６】
温度パルスがプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて作製される、請求項23に記載の方法。
【請求項３７】
以下の工程を含む、核酸の二本鎖から一本鎖への遷移についての動力学的情報を決定する方法：
二本鎖核酸分子及び二重鎖核酸存在下でシグネチャー検出可能なシグナルを有するレポーター成分を含むサンプルを提供する工程、
前記サンプルを一連の温度パルスに付す工程であって、前記パルスが前記二本鎖核酸分子の一本鎖分子への遷移及び二本鎖分子への復帰を引き起こす、前記工程、及び
前記レポーター成分によって生成されるシグナルを用いて一本鎖状態と二本鎖状態との間の遷移速度を検出し、それによって前記状態間の前記遷移速度が前記遷移についての動力学的情報を提供する工程。
【請求項３８】
以下の工程を含む、二重鎖核酸分子の融解温度を決定する方法：
複数の一本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程であって、前記勾配が、前記一本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む前記工程、及び
前記矩形波温度勾配の過程にわたって前記少なくとも1つの遷移を検出する工程。
【請求項３９】
矩形波温度勾配が一連の温度パルスを含み、各パルスが、
a）高い第一の温度への溶液の温度の上昇、
b）低い第二の温度への前記溶液の温度の下降、
を含み、
前記高い第一の温度が前記低い第二の温度より高く、さらに
次のパルスでは、前記高い第一の温度及び前記低い第二の温度が前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ低くあるように各々調節される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
温度パルスの少なくとも1つが、前記二本鎖核酸分子と前記一本鎖核酸分子との間で検出可能な遷移が生じる温度範囲を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
以下の工程を含む、二重鎖核酸分子の融解温度を決定する方法：
一本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程であって、前記勾配が、前記一本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む前記工程、及び
矩形波温度勾配の過程にわたって前記少なくとも1つの遷移を検出する工程。
【請求項４２】
矩形波温度勾配が一連の温度パルスを含み、各パルスが、
a）高い第一の温度への溶液の温度の上昇、
b）低い第二の温度への前記溶液の温度の下降、
を含み、
前記高い第一の温度が前記低い第二の温度より高く、さらに
次のパルスでは、前記高い第一の温度及び前記低い第二の温度が前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ低くあるように各々調節される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
温度パルスの少なくとも1つが、前記一本鎖核酸分子と前記二本鎖核酸分子との間で検出可能な遷移が生じる温度範囲を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
検出が、前記温度パルスの各々の高い第一の温度及び低い第二の温度で生じる、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
一本鎖核酸から二本鎖核酸分子への最大の検出可能遷移を有する温度パルスを同定する工程を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
同定する工程が検出可能シグナルの差異を計算する工程を含み、前記検出可能シグナルが、一温度パルス内の高い第一の温度及び低い第二の温度で測定される、請求項45に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で具体的に開示されるものは、融解温度の分析のための方法及びシステム、特に二重鎖核酸の分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
融解曲線の分析を利用して、二重鎖核酸の長さ、配列、GC含量及び相補性についての情報を推論できる。したがって、融解曲線の分析は、生成された解離パターンによって、多様な応用、例えば一ヌクレオチド多形性（SNP）の検出並びに、ホモ接合野生型、ヘテロ接合及びホモ接合変異体の対立遺伝子間を識別することに広く利用される。さらにまた、融解曲線の分析を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）後の偽似増幅生成物を検出することができる。
しかしながら、従来の利用可能な溶解曲線分析技術には限界があり、特にサンプル間及び反復分析間における一律性の維持に関して限界がある。したがって、核酸の融解曲線の分析の速度及び精密さが改善された方法及びシステムが希求される。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、核酸融解曲線、特に二重鎖核酸分子に関する分析のための方法及びシステムに関する。本発明のいくつかの実施態様では、そのような方法及びシステムは、速度及び精密さが改善された融解温度の分析を可能にする。
本明細書に提供する発明のいくつかの実施態様では、核酸融解曲線分析の速度及び精密さの改善を可能にする二重鎖核酸分子の融解温度を決定する方法が提供される。本方法は、二本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程（該勾配は、該二本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子への少なくとも1つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む）、及び該矩形波温度勾配の過程にわたって該少なくとも1つの遷移を検出する工程を含む。
いくつかの実施態様では、該矩形波温度勾配は一連の温度パルスを含むことができ、各パルスは、高い第一の温度への該溶液の温度の上昇、低い第二の温度への該溶液の温度の下降を含み、ここで前記高い第一の温度は前記低い第二の温度より高く、さらに次のパルスでは、高い第一の温度及び低い第二の温度は前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される。
【０００４】
また本明細書で提供されるものは、二重鎖核酸分子の融解温度を決定する方法であり、該方法は、複数の一本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程（該勾配は、該一本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む）、及び該矩形波温度勾配の過程にわたって該少なくとも1つの遷移を検出する工程を含む。
いくつかの実施態様では、該矩形波温度勾配は一連の温度パルスを含むことができ、各パルスは、高い第一の温度への該溶液の温度の上昇、低い第二の温度への該溶液の温度の下降を含み、ここで前記高い第一の温度は前記低い第二の温度より高く、さらに次のパルスでは、高い第一の温度及び低い第二の温度は前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ低くあるように各々調節される。
また本明細書で提供されるものは、二重鎖核酸分子の融解温度を決定するシステムであり、該システムは、プログラム可能なサーマルサイクリング装置、検出装置、及び矩形波サーマルサイクリングのためのプログラムを含み、該プログラムは、二重鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程（該勾配は、該二本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む）、及び該矩形波温度勾配の過程にわたって該少なくとも1つの遷移を検出する工程のための命令を含む。
【０００５】
上記システムのいくつかの実施態様では、該矩形波温度勾配は一連の温度パルスを含み、各パルスは、該溶液の温度の高い第一の温度への上昇、該溶液の温度の低い第二の温度への下降を含み、ここで前記高い第一の温度は前記低い第二の温度より高く、さらに次のパルスでは、高い第一の温度及び低い第二の温度は前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される。
また本明細書で提供されるものは、二本鎖核酸分子の融解温度を決定する方法であり、該方法は、二本鎖核酸分子及び二重鎖核酸存在下でシグネチャー検出可能なシグナルを有するレポーター成分を含むサンプルを提供する工程、該サンプルを一連の温度パルスに付す工程（ここで少なくとも複数のパルスが二本鎖核酸分子の一本鎖分子への遷移及び二本鎖分子への復帰を引き起こす）、及びレポーター成分によって生成されるシグナルを用いて該二本鎖核酸分子の融解温度を検出する工程を含む。
いくつかの実施態様では、該温度パルスの各々は、高い第一の温度への該溶液の温度の上昇、低い第二の温度への該溶液の温度の下降を含み、ここで前記高い第一の温度は前記低い第二の温度より高く、さらに次のパルスでは、高い第一の温度及び低い第二の温度は前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される。
【０００６】
また本明細書で提供されるものは、核酸の二本鎖から一本鎖への遷移についての動力学的情報を決定する方法であり、該方法は、二本鎖核酸分子及び二重鎖核酸存在下でシグネチャー検出可能なシグナルを有するレポーター成分を含むサンプルを提供する工程、該サンプルを一連の温度パルスに付す工程（ここで該パルスは二本鎖核酸分子の一本鎖分子への遷移及び二本鎖分子への復帰を引き起こす）、及びレポーター成分によって生成されるシグナルを用いて一本鎖状態と二本鎖状態との間の遷移速度を検出し、それによって当該状態間の遷移速度が該遷移についての動力学的情報を提供する工程を含む。
また本明細書で提供されるものは、二重鎖核酸分子の融解温度を決定する方法であり、該方法は、一本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程（該勾配は、該一本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む）、及び該矩形波温度勾配の過程にわたって該少なくとも1つの遷移を検出する工程を含む。
いくつかの実施態様では、該矩形波温度勾配は一連の温度パルスを含むことができ、各パルスは、高い第一の温度への該溶液の温度の上昇、低い第二の温度への該溶液の温度の下降を含み、ここで高い第一の温度は低い第二の温度より高く、さらに次のパルスでは、高い第一の温度及び低い第二の温度は前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ低くあるように各々調節される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】矩形波温度プロファイルの一例を示すグラフである。温度はY軸で示され、時間はX軸で示される。星印は、該プロファイルでシグナルの検出が実施される時間を示す。
【図２】矩形波温度プロファイルの一例を示すグラフで、温度はY軸で示され、時間はX軸で示される。
【図３】伝統的な融解曲線分析を示すグラフである。二本鎖核酸の指標である蛍光シグナルはY軸に示される。温度はX軸に示される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に提供されるものは、一本鎖形及び二本鎖形の間の解離温度（融解温度としても知られている）に基づいて核酸構造を解明する方法及びシステムである。本方法及びシステムは、複数の階段状のステップを有する矩形波サーマルプロファイルを利用し、それぞれのステップの高温点及び低温点での蛍光の測定を含む。
伝統的な融解曲線分析は、レポート剤を含む溶液全量から頻繁な光学サンプルの採取を必要とする（前記レポート剤は温度の上昇に応答して二本鎖DNAが解離するときにそのレポート特性（例えば強度）を変化させる）。しかしながら、高精度融解方法は、いくつかの問題のために融解温度を精密にかつ再現性をもって報告する能力に制約がある。例えば、標準的な融解曲線分析では、温度管理の均一性を得ることが困難であり、さらに溶液の各々について精密さを再現することは困難である。さらにまた、融解は歯切れのよい現象ではなく、二本鎖形と一本鎖形との間の遷移は、それが熱力学的及び動力学的特徴の混合を含むのでいくらかの幅を有する。さらにまた、伝統的な融解方法は、オーバーラップする融解シグネチャーを解きほぐすために蛍光対温度トレースの導関数に依存する。しかしながら、導関数のピークの解明は蛍光の読みに存在するノイズによってしばしば制限を受ける。
【０００９】
同様な融解温度を有する核酸の構造の良好な解明を達成するために、伝統的な融解曲線は、通常はサーマルサイクリングユニットの非常に遅速でかつ厳密な管理により収集される。伝統的分析で用いられるサーマルプロファイルは、増幅反応で用いられるスロープと比較して極めて浅いスロープを有する直線状である。しかしながら、多くの事例で、このスロープは厳密に管理するのが困難であり、このことは、適用される温度の不確実性のために融解温度の結果の多様性として表れる。結果として、温度の遅速な遷移を可能とし、光学系のノイズ限界を克服するために温度変域で頻繁に光学的測定を実施することを可能にするために、測定時間は長くなる。
さらにまた、いくつかの装置のための光学スキャナーは伝統的な融解曲線の分析にはあまり適していない。なぜならば要求される読み取りの頻度は、全サンプルを読み取るにはスキャナーの性能をしばしば大きく超えているからである。したがって、伝統的なスキャン装置による選択肢には以下のどちらかが含まれる：1）光学スキャンヘッドに適合させるために温度変化速度を落とす（しかしながら、これによって操作時間は増加し、温度管理系により大きな制限を加える）；又は2）一度に1つのサンプルで融解曲線を作成する（これもまた操作時間の全体的長さを増加させる）。
【００１０】
伝統的な融解曲線分析の上記の限界を考慮して、驚くべきことに、融解曲線分析は走査ボルタメトリーと類似の様式で実施できることが見出された。特に、走査ボルタメトリーを用いる混合溶液の電気化学の分析で遭遇する問題は、伝統的融解曲線分析で遭遇する問題とある種の局面で類似する。サーマルプロファイルについての類似性は電極に適用される電圧量のスキャンである。電気化学による混合物の解明は、直線傾斜上に重ね合わせた矩形波プロファイルを使用することである。
したがって、本明細書に提供するものは、融解曲線分析のための新規な様式の驚くべき発見であって、前記は、二重鎖核酸分子又は種々の二重鎖核酸分子の混合物の融解温度の迅速な決定を可能にする。ある種の実施態様では、本方法は、二本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程（該勾配は、該二本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子への少なくとも1つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む）、及び該矩形波温度勾配の過程にわたって該少なくとも1つの遷移を検出する工程を含む。
【００１１】
本明細書で用いられるように、矩形波という用語は、階段様プロファイルによって一般的に定義される振動パターンを指す。サーマルプロファイルの関係では、矩形波パターンは高温と低温を瞬時又は準瞬時に行ったり来たりする。しかしながら、典型的には、理想的な矩形波は波形を生じるシステムの物理的限界のために実際には達成されない。シグナルが低レベルから高レベルに上昇しさらに再び元に戻るために要する時間は、しばしば上昇時間及び下降時間とそれぞれ称される。使用されるサーマルサイクリングシステムに応じて、この上昇時間及び下降時間は準瞬時からいくらかの有限時間まで変動するであろう。したがって、高レベルと低レベルの間及び低レベルと高レベルの間の遷移は、垂直遷移を示すサーマルプロファイルをもたらすことはできないことは理解されよう。したがって、矩形波という用語は、時間に対する温度の関数としてプロットしたとき温度遷移のスロープがいくらかの正の又は負のスロープを有するパターンを含むことができる。
【００１２】
さらにまた、本明細書に提供する矩形波プロファイルは、高温及び低温の各々で保持時間を含むことができる。保持時間の長さは必要に応じて変動することができ、二本鎖核酸と一本鎖核酸との間の遷移の検出を可能にする。したがって、検出が瞬時である実施態様では、保持時間は0であるか又は0近くであり得る。他の実施態様では、検出はいくらかの有限時間を含むことができ、したがって高温又は低温は、核酸が一本鎖形であるか二本鎖形であるかを検出するために必要な時間の間維持され得る。いくつかの実施態様では、保持時間は必要に応じて調節され、核酸分子が平衡に達するのを可能にすることができる。いくつかの実施態様では、保持時間は、約0秒、約1ナノ秒未満、約10ナノ秒未満、約100ナノ秒未満、約1マイクロ秒未満、約10マイクロ秒未満、約100マイクロ秒未満、約1ミリ秒未満、約10ミリ秒未満、約100ミリ秒未満、約1秒未満、約2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10秒未満、又は10秒以上であり得る。
【００１３】
典型的に本明細書で提供される矩形波温度プロファイルは、温度勾配上に重ね合わされる。本明細書で用いられるように、温度勾配は時間に対する温度の変化を指す。伝統的な融解曲線分析では、温度勾配は直線状であり、綿密に温度を管理するために浅いスロープを有する。本明細書で提供される温度プロファイルでは、温度勾配は全体的に正の又は全体的に負のスロープを有することができる。したがって、矩形波パターンが正のスロープの温度勾配上に又は負のスロープの温度勾配上に重ね合わされる時、得られるパターンは、図1及び2に示すように上り階段又は下り階段に類似する。
【００１４】
したがって、ある種の実施態様では、矩形波温度勾配は一連の温度パルスを含み、各パルスは、高い第一の温度への溶液の温度の上昇、低い第二の温度への溶液の温度の下降を含み、ここで高い第一の温度は低い第二の温度より高い。該温度勾配が全体的に正のスロープを有する実施態様では、次のパルスにおいて、高い第一の温度及び低い第二の温度は、典型的には前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ高くあるように各々調節される。該温度勾配が全体的に負のスロープを有する実施態様では、次のパルスにおいて、高い第一の温度及び低い第二の温度は、典型的には前のパルスの第一及び第二の温度よりそれぞれ低くあるように各々調節される。いくつかの実施態様では、高温及び低温は1つ以上のパルスの間で同じ温度を維持することができ、なお全体的に正の又は負のスロープを有する温度プロファイルを生じることは理解されよう。同様に、いくつかの実施態様では、1つ以上のパルスで高温及び低温は前のパルスより低くてもよく、それでもなお全体的に正のスロープを有する温度プロファイルを生じる。同様に、いくつかの実施態様では、1つ以上のパルスで高温及び低温は前のパルスより高くてもよく、それでもなお全体的に負のスロープを有する温度プロファイルを生じる。
【００１５】
ある種の実施態様では、該温度パルスの少なくとも1つは、検出可能な遷移が二本鎖核酸分子と一本鎖核酸分子との間で生じるある範囲の温度を含むことができる。例えば、全体的に正のスロープを有するプロファイルは、典型的にはそれぞれが二重鎖核酸の融解点より下の高温及び低温を含むパルスで開始する。同様に、全体的に負のスロープを有するプロファイルは、典型的にはそれぞれが二重鎖核酸の融解点より上の高温及び低温を含むパルスで開始する。そのような実施態様では、次の1つ以上のパルスは該二重鎖核酸の融解温度を通り過ぎ、二本鎖から一本鎖核酸への遷移、又は一本鎖から二本鎖核酸への遷移が検出される。
本明細書で用いられるように、検出可能な遷移は、二重鎖核酸の有無を指し示すシグナルの変化を指す。検出可能な遷移を同定するために、本方法は、温度パルスの1つ以上の点でのシグナルの検出を利用する。ある種の実施態様では、検出は温度パルスの各々で行われる。また別の実施態様では、各温度パルスの検出要求は存在しないことは理解されよう。例えば、単一検出装置が多数のサンプルの同時検出のためには構成されていない検出システムでは、該検出装置は第一のサンプルのための第一のパルスでシグナルを検出し、続いて第二のサンプルのための第二のパルスでシグナルを検出できよう。
【００１６】
1つ以上の検出可能遷移を同定するために、検出は該温度プロファイルの間の多数の点で行われる。ある種の実施態様では、検出が1つのパルスの別個の点で行われるように時間が設定される。例えば、いくつかの実施態様では、検出は、温度パルスの各々の高温及び低温で行われる。いくつかの実施態様では、検出は温度プロファイル全体を通して行われ、持続的又は準持続的であり得る。
【００１７】
本明細書で提供される方法及びシステムはさらに、二本鎖核酸から一本鎖核酸分子への最大検出可能遷移を有する温度パルスの同定を含むことができる。伝統的融解曲線と類似して、融解温度は典型的にはシグナル対温度曲線の導関数を得ることによって同定される。この導関数は、サンプル中の個々の核酸種の融解曲線の指標となる1つ以上の屈曲点の同定に役立つ。核酸種の融解曲線は一般的には解離温度と称され、この温度で当該種の50％が二重鎖形で、さらに50％が一本鎖形である。核酸の2つの鎖の間の塩基-塩基水素結合を破壊するために必要なエネルギー（したがって融解温度）は、それらの長さ、GC含量及びそれらの相補性に左右される。融解温度に影響を及ぼし得る他の因子には、溶液の塩濃度（例えば以下を参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)、前記は参照により本明細書に含まれる)、溶液のpH、並びに洗剤、対イオン、溶媒及び当業者に公知の他の因子の存在が含まれる。本明細書で提供される方法では、最大の検出可能遷移を有する温度パルスの同定は融解温度をピンポイントで示すために役立ち、前記は伝統的な融解曲線では典型的には要求される追加の微分解析の実施を必要としない。したがって、ある種の実施態様では、最大の検出可能遷移を同定する工程は、一温度パルス内の高温及び低温で測定された検出可能シグナルの差異を計算する工程を含む。続いて、パルスの各々についての検出可能シグナルの差異を比較して、高温と低温との間のシグナルで最大の差異を有するパルスを同定する。
【００１８】
個々の溶液中の核酸分子は完全に均質であってもよく、ここでは各二本鎖核酸種は同じ一次配列及び相補性配列を有し、したがって同じ融解温度を有する。他の実施態様では、溶液は、複数の核酸種を含み不均質であってもよく、ここでは溶液中の2つ以上の二本鎖種は、他の二本鎖種の一次配列及び相補性配列と比較して、各々異なる一次配列及び相補性配列を有する。したがって、わずかに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又はわずかに20以上の塩基対の相違を有する核酸種でさえも、各々の種の固有の融解温度を基準に区別することができる。
【００１９】
本明細書で提供される方法及びシステムでは核酸種は、検出可能な融解温度を有する任意の核酸種であり得る。本明細書の核酸又はオリゴヌクレオチド（又はそれらの文法的等価物）という用語は、共有結合で一緒に連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般的にはホスホジエステル結合を含むが、ただしいくつかの事例では下記に概略するように、また別の骨格を有する核酸アナローグを含む。前記は、例えばホスホロアミド（Beaucage et al., Tetrahedron 49(10): 1925 (1993)及びその中の引用文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)；Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977)；Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986)；Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984)；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；及びPauwels et al., Chemica Scripta 26:141, 1986）、ホスホロチオエート（Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991)；及びU.S. Pat. No. 5,644,048）、ホスホロジチオエート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989）、O-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press）、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)；Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992)；Nielsen, Nature, 365:566 (1993)；Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)、前記文献のいずれも参照により本明細書に含まれる）を含む。他のアナローグ核酸には、陽性荷電骨格を有するもの（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097, 1995）、非イオン性骨格を有するもの（U.S. Pat. Nos. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141及び4,469,863；Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991)；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)；Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994)；Tetrahedron Lett. 37:743, 1996）、及び非リボース骨格を有するもの（以下に記載されたものを含む（U.S. Pat. Nos. 5,235,033 and 5,034,506, and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook））が含まれる。1つ以上の炭素環糖類を含む核酸もまた本核酸の定義に含まれる（Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp. 69-176）。いくつかの核酸アナローグが以下の文献に記載されている（Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 p. 35、前記文献のいずれも参照により本明細書に含まれる）。リボース-リン酸骨格の改変を実施して、標識の付加を容易にするか、又はそのような分子の例えば生理学的環境下における安定性及び半減期を増強させることができる。ヌクレオシドという用語には、ヌクレオチドとともにヌクレオシド及びヌクレオチドアナローグ、並びに改変ヌクレオシド（例えばアミノ改変ヌクレオシド）が含まれる。さらにまた、ヌクレオシドには天然に存在しないアナローグ構造も含まれる。したがって例えばペプチド核酸の個々のユニット（各々は塩基を含む）は本明細書ではヌクレオシドと称される。
【００２０】
したがって、核酸種は、DNA、RNAの任意の形態又はアナローグとともにその人工的及び合成変種であり得る。核酸種は、天然に存在するアナローグ及び非天然アナローグの任意の組合せを含むことができる。核酸種は、ヌクレオチドのペントース糖類又はヌクレオチド塩基又は１つ以上のリン酸エステルがその対応するアナローグで置き換えられた1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。ある種の実施態様では、例示的なリン酸エステルのアナローグには、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどが含まれ（ただしこれらに限定されない）、さらに関連する対イオンが含まれ得る。上記に列挙した改変又は核酸種への任意の他の改変は、その未改変の対応物と比較して、当該種のTmに影響を与え得ることは理解されよう。
【００２１】
核酸分子は以下を含むことができる（ただしこれらに限定されない）：ゲノムDNA、cDNA、hmRNA、mRNA、rRNA、tRNA、小RNA分子（miRNA及びmiRNA前駆体、siRNA、snoRNA、他の非コードRNA（ncRNA）を含むが、ただしこれらに限定されない）、フラグメント化核酸；核、細胞質、細胞内小器官（例えばミトコンドリア又は葉緑体）から得られる核酸；及び微生物又は生物学的サンプルに存在し得るDNA若しくはRNAウイルスから得られる核酸。前記核酸分子は、例えば線状、環状、ヘアピン、又は核酸分子の少なくとも一部分が別の分子との相互作用で若しくはそれ自体で二本鎖を形成することを可能にする任意の他の構造であり得る。
【００２２】
核酸分子は1つ以上のユニバーサル塩基を含むことができる。ユニバーサル塩基という用語は、天然に存在するヌクレオチド（すなわちアデノシン、グアニン、チミン及びシトシン）間の場合よりも少ない水素結合を天然に存在するヌクレオチドと形成するヌクレオチドアナローグを指すことを意図する。ユニバーサル塩基は、水素結合基を欠きながらも二重鎖DNAに効率的に詰め込まれ得る疎水性塩基アナローグであり得、さらに天然の塩基とのペア形成でほとんど選択性を示すことができない（Millican, T.A., et al. (1984) Nuc. Acids Res. 12:7435-7453；Schweitzer, B.A., et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:1863-1872；Matray, T.J., et al. (1999) Nature 399: 704-708；Ogawa, A.K., et al. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274-3287、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。天然の塩基の各々と非選択的にハイブリダイズできるヌクレオ塩基アナローグは以下に記載されている（Van Aerschot, A., et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 4363-4370；Zhang, P. et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26: 2208-2215；Seela, F. et al. (1999), Nucleosides Nucletodies 18:425-441；Bergstrom, D.E., et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 1935-1942；Asomova, O., et al.  (1997) Nucl. Acids Res.  25: 1930-1934；Bergstrom, D.E., et al., (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 1201-1209；Loakes, D. et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 2361-2366；Loakes, D. et al. (1995) Nucl. Acids Res. 22: 4039-4043；Nichols, R., et al., (1994) Nature 369: 492-493）。当業者には理解されるところであるが、全ての公知の核酸アナローグは本発明で有用であり得る。本明細書に記載する方法及び組成物で有用なユニバーサル塩基の非限定的な例には以下が含まれる：デオキシイノシン、3-ニトロピロール(1,2)、又は4-、5-、又は6-ニトロ-インドールのデオキシリボヌクレオチド、1-(2’-デオキシ-β-Dリボフラノシル)-4-ニトロピラゾール、及び1-(2’-デオキシ-β-Dリボフラノシル)-4-ニトロイミダゾール。
【００２３】
いくつかの実施態様では、核酸はペプチド核酸（PNA）である（前記にはペプチド核酸アナローグが含まれる）。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高荷電ホスホジエステル骨格とは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。このことは2つの利点をもたらす。第一に、PNA骨格はハイブリダイゼーション動力学の改善を示す。PNAは、ミスマッチ対完全マッチ塩基対で融解温度（Tm）の変化がより大きい。DNA及びRNAは、典型的には1つの内部ミスマッチについて2−4℃のTmの降下を示す。非イオン性PNA骨格に関しては、この降下は7−9℃に近く、したがってより良好なミスマッチの検出を可能にする。同様に、それらの非イオン性の性質のために、これらの骨格に結合した塩基のハイブリダイゼーションは塩濃度に対し比較的非感受性である。
デオキシイノシン（“dI”）はユニバーサル塩基の好ましい例である。イノシンは、A、C、T又はGと2つの水素結合を形成することができる（以下を参照されたい：Barker, R., Organic Chemistry of Biological Molecules, Prentice-Hall, N.J. (1971)；さらに以下を参照されたい：Martin et al. (1985), Nucl. Acids Res. 13(24): 8927-8938）。他の好ましいユニバーサル塩基の例には以下が含まれる：1-(2’-デオキシ-β-Dリボフラノシル)-3-ニトロピロール、1-(2’-デオキシ-β-Dリボフラノシル)-4-ニトロピラゾール、1-(2’-デオキシ-β-Dリボフラノシル)-4-ニトロイミダゾール、及び1-(2’-デオキシ-β-Dリボフラノシル)-4-ニトロインドール。
【００２４】
二本鎖核酸分子、二重鎖核酸という用語及び同様な用語は、水素結合を有するらせん状配置として存在する、典型的にはDNAと会合した、核酸分子又は前記分子の部分の対を指す。二本鎖核酸分子、二重鎖核酸という用語及び同様な用語はまた本質的に二本鎖対を形成した分子を指し、第一の核酸鎖のオリゴヌクレオチドプライミング部位の化学合成又は第二の核酸鎖の酵素的合成における設計又はエラーから生じる短いミスマッチ領域（例えばモノ、ジ、トリヌクレオチド）を含むものを意味する。二本鎖核酸分子は、二本鎖DNA若しくはRNA、RNA/DNAヘテロ二重鎖、又はRNA/DNAコポリマーとして存在し得るが、ここで“コポリマー”という用語はリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方を含む一核酸鎖を指す。典型的な実施態様では、二本鎖核酸は、二本鎖核酸分子の検出のために当業者に公知の多数の方法論のいずれか（例えばインターカレート色素由来の蛍光の検出）を用いて検出できるものである。一本鎖核酸分子という用語は、二本鎖形として存在していない核酸分子又はその部分を指す。
【００２５】
二本鎖核酸種は、典型的には、相補性であるか又は1つ以上の領域で実質的に相補性である2つの鎖を含むであろう。本明細書で用いられるように、相補性及び実質的に相補性という用語は、ヌクレオチド又は核酸の間、例えば二本鎖DNA分子の2つの鎖の間、又はオリゴヌクレオチドプライマーと配列形成若しくは増幅されるべき一本鎖核酸のプライマー結合部位との間のハイブリダイゼーション又は塩基対形成を指す。したがって、実質的に相補性である配列は、参照配列と比較して、パーセント同一性が100から99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75若しくは前記未満、又はその間の任意の数値の範囲である配列を指すことができる。
相補性ヌクレオチドは、一般的にはAとT（又はAとU）又はCとGである。2つの一本鎖RNA又はDNA分子は、最適にアラインメントされ比較され適切なヌクレオチドの挿入又は欠失が行われた一方の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80％と、通常は少なくとも約90％から95％、より典型的には約98％から100％とペアを形成するとき実質的に相補性であると称される。
【００２６】
利点
本発明は、伝統的な融解曲線分析を超える多数の驚くべき利点を提供する。第一に、矩形波サーマルサイクリングは、サーマルサイクリングユニットの設計趣旨を利用する。換言すれば、当該設計趣旨に反するような態様でサーマルサイクリングユニットを管理しようとするのではなく温度を迅速に変化させるサーマルサイクリングユニットの能力を利用する。スキャンは、遅速なサーマルグラディエントの代わりに急速な温度変化を用いて迅速に実施される。
第二に、本矩形波方法は本質的に微分解析的方法であり、したがって融解温度の決定に追加のデータ処理を必要としない。最適化波形が同定されると推定するならば、この波形形式は、少数の総測定値を用いてオーバーラップする遷移のより精密な解明が可能となる。
第三に、階段関数サーマルプロファイルはより感度が高い。なぜならば、レポーターは、スキャンの過程で何度も状態（すなわち融解状態とアニール状態）間を迅速移動する機会を有するからである。
第四に、本方法はバックグラウンドレベルがもたらす分析シグナルとの干渉が極めて少ない減算的技術である。
矩形波サーマルプロファイルは、レポーターが状態間を繰り返し迅速移動するので動力学的情報を提供する。動力学が一方向に限定される場合、応答形はシフトするであろう。
本明細書で提供される方法は、適切なプログラミングを備えた任意のサーマルサイクラーユニットで容易に実施できるというさらに別の利点を有する。
【００２７】
矩形波は低温から高温へ又はその逆に階段状に変化することができることは理解されよう。各矩形波パルスのパルス高を調節して種々の温度スパンをカーバーすることができる。いくつかの典型的な実施態様は、伝統的融解曲線を用いて測定された遷移幅の半分に等しい矩形波高を用いることができる。与えられた平均温度で測定されるパルスの数を全体的な測定時間を犠牲にして変動させて、ノイズを減少させ厳密性を高めることができる。
本明細書で提供される方法は、電気化学的システムに応用される矩形波電圧電流法といくらかの類似性を有する。電気化学では、温度の代わりに電圧が階段状に変化する。
【００２８】
図1は矩形波サーマルプロファイルの一実施態様を示す。図1に示すように、矩形波階段プロファイルは、直線的変化に重ね合わされた矩形波を含む。全体としてこの変化は時間に対して下降する温度勾配である。当該プロファイルは変化の過程を通して多数のパルスを含む。各パルスで、溶液は広い温度範囲に付され、シグナルは2点で検出される。
図2は、時間に対して全体として温度が上昇する別のサーマルプロファイルを示す。図2に示すように、温度プロファイルは一連のパルスを通過する。各パルスは遷移ジャンプを含む。本明細書で用いられるように、遷移ジャンプは、低温（TL）から高温（TH）への温度の上昇である。図2に示す実施態様では、次の各パルスのTLが前のパルスのTLより高くなるように、次の各パルスでTLを上昇させる。同様に、次の各パルスのTHが前のパルスのTHより高くなるように、THを上昇させる。各パルス内で、平均温度TiはTLとTHの合計の半分と定義される。
いくつかの実施態様では、二重鎖核酸は、二重鎖核酸の存在下でシグネチャーを検出可能なシグナルを有するレポーター成分により検出される。図2に示すサーマルプロファイルでは、二重鎖核酸は、二重鎖核酸の存在下で蛍光シグナルを有するレポーター成分により検出される。蛍光の読み取りは各パルス内のTL及びTHで実施され、各パルスについて低温の読み（FLH）及び高温の読み（FLH）を得る。各パルスの蛍光の変化（ΔFL）は、当該パルスのFLHとFLHとの差である。
【００２９】
パルス間の温度ステップ
本明細書で用いられるように、各パルスの低温に関する温度ステップ（ΔTstepL）は、あるパルスのTLと前のパルスのTLとの間の差と言うことができる。同様に、各パルスの高温に関する温度ステップ（ΔTstepH）は、あるパルスのTHと前のパルスのTHとの間の差と言うことができる。ΔTstepL又はΔTstepHは、時間に対する温度の全体的に正のスロープ又は負のスロープを生じる温度の任意の変化であり得ることは理解されよう。したがって、正のΔTstepL及び／又はΔTstepHを有する一連のパルスは全体的に正のスロープを生じるであろう。同様に、負のΔTstepL及び／又はΔTstepHを有する一連のパルスは全体的に負のスロープを生じるであろう。
本明細書で用いられるように、全体的に正のスロープとは、平均ΔTstepL及び／又はΔTstepHが正であるプロファイルを指す。典型的には、全体的に正のスロープを有するプロファイルは、二重鎖DNAの融解点より下のTL及びTH温度で開始する。典型的には、全体的に正のスロープを有するプロファイルは、二重鎖DNAの融解点より上のTL及びTH温度で終わる。
【００３０】
したがって、いくつかの実施態様では、全体的なスロープは正である。いくつかの実施態様では、各ΔTstepは全プロファイルについて正であろう。例えば、典型的な実施態様では、次の各TLは先行するTL値の各々よりも高いであろう。しかしながら、サーマルプロファイルが正のスロープを有するある種の実施態様では、1つ以上のTL値が先行するTL値よりも低く、それでもなお時間に対して全体的に正の温度スロープを有するプロファイルを生じ得ることは理解されよう。同様に、全体的に正のスロープを有するいくつかの実施態様では、次の各TH値は先行するTH値の各々よりも高いであろう。しかしながら、サーマルプロファイルが正のスロープを有するある種の実施態様では、1つ以上のTH値が先行するTH値よりも低く、それでもなお時間に対して全体的に正の温度スロープを有するプロファイルを生じ得ることは理解されよう。
【００３１】
本明細書で用いられるように、全体的に負のスロープとは、平均ΔTstepL及び／又はΔTstepHが負であるプロファイルを指す。典型的には、全体的に負のスロープを有するプロファイルは、二重鎖DNAの融解点より上のTL及びTH温度で開始する。典型的には、全体的に負のスロープを有するプロファイルは、二重鎖DNAの融解点より下のTL及びTH温度で終わる。
したがって、ある種の実施態様では、全体的なスロープは負である。いくつかの実施態様では、各ΔTstepは全プロファイルについて負であろう。例えば、典型的な実施態様では、次の各TLは先行するTL値の各々よりも低いであろう。しかしながら、サーマルプロファイルが負のスロープを有するある種の実施態様では、1つ以上のTL値が先行するTL値よりも高く、それでもなお時間に対して全体的に負の温度スロープを有するプロファイルを生じ得ることは理解されよう。同様に、全体的に負のスロープを有する典型的なサーマルプロファイルでは、次の各TH値は先行するTH値の各々よりも低いであろう。しかしながら、サーマルプロファイルが負のスロープを有するある種の実施態様では、1つ以上のTH値が先行するTH値よりも高く、それでもなお時間に対して全体的に正の温度スロープを有するプロファイルを生じ得ることは理解されよう。
【００３２】
したがって、いくつかの実施態様では、ΔTstepLの絶対値は、例えば約0.001℃未満、又は約0.001℃、0.01℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃、1.0℃、1.1℃、1.2℃、1.3℃、1.4℃、1.5℃、1.6℃、1.7℃、1.8℃、1.9℃、2.0℃、2.1℃、2.2℃、2.3℃、2.4℃、2.5℃、2.6℃、2.7℃、2.8℃、2.9℃、3.0℃、3.1℃、3.2℃、3.3℃、3.4℃、3.5℃、3.6℃、3.7℃、3.8℃、3.9℃、4.0℃、4.1℃、4.2℃、4.3℃、4.4℃、4.5℃、4.6℃、4.7℃、4.8℃、4.9℃、5.0℃、5.1℃、5.2℃、5.3℃、5.4℃、5.5℃、5.6℃、5.7℃、5.8℃、5.9℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、約20℃、又は前記より高い温度とともにその間の任意の温度値であり得る。典型的な実施態様では、ΔTstepLの絶対値は約1.0℃から約5.0℃の範囲である。いくつかの実施態様では、ΔTstepLは該プロファイルの各パルスについて同じである。例えば図2に示すように、ΔTstepLは各パルスについて同じである。他の実施態様では、ΔTstepLは該プロファイルの1つ以上のパルス間で異なり得ることは理解されよう。
【００３３】
同様に、いくつかの実施態様では、ΔTstepHの絶対値は、例えば約0.001℃未満、又は約0.001℃、0.01℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃、1.0℃、1.1℃、1.2℃、1.3℃、1.4℃、1.5℃、1.6℃、1.7℃、1.8℃、1.9℃、2.0℃、2.1℃、2.2℃、2.3℃、2.4℃、2.5℃、2.6℃、2.7℃、2.8℃、2.9℃、3.0℃、3.1℃、3.2℃、3.3℃、3.4℃、3.5℃、3.6℃、3.7℃、3.8℃、3.9℃、4.0℃、4.1℃、4.2℃、4.3℃、4.4℃、4.5℃、4.6℃、4.7℃、4.8℃、4.9℃、5.0℃、5.1℃、5.2℃、5.3℃、5.4℃、5.5℃、5.6℃、5.7℃、5.8℃、5.9℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、約20℃、又は前記より高い温度とともにその間の任意の温度値であり得る。典型的な実施態様では、ΔTstepHの絶対値は約1.0℃から約5.0℃の範囲である。いくつかの実施態様では、ΔTstepHは該プロファイルの各パルスについて同じである。例えば図2に示すように、ΔTstepHは各パルスについて同じである。他の実施態様では、ΔTstepHは該プロファイルの1つ以上のパルス間で異なり得ることは理解されよう。
【００３４】
パルス内の温度の遷移
本明細書で用いられるように、温度遷移ジャンプ高（ΔTtrans）は、1つのパルス内の高温THと低温TLとの間の差を指す。ΔTtransは任意の適切な温度範囲であり得ることは理解されよう。例えばいくつかの実施態様では、例えば1つのパルスのΔTtransは、約0.001℃未満、又は約0.001℃、0.01℃、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃、1.0℃、1.1℃、1.2℃、1.3℃、1.4℃、1.5℃、1.6℃、1.7℃、1.8℃、1.9℃、2.0℃、2.1℃、2.2℃、2.3℃、2.4℃、2.5℃、2.6℃、2.7℃、2.8℃、2.9℃、3.0℃、3.1℃、3.2℃、3.3℃、3.4℃、3.5℃、3.6℃、3.7℃、3.8℃、3.9℃、4.0℃、4.1℃、4.2℃、4.3℃、4.4℃、4.5℃、4.6℃、4.7℃、4.8℃、4.9℃、5.0℃、5.1℃、5.2℃、5.3℃、5.4℃、5.5℃、5.6℃、5.7℃、5.8℃、5.9℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、約20℃、又は前記より高い温度とともにその間の任意の温度値であり得る。典型的な実施態様では、ΔTtransは約5℃から約10℃の範囲である。いくつかの実施態様では、ΔTtransは該プロファイルの各パルスについて同じである。例えば図2に示すように、ΔTtransは各パルスについて同じである。他の実施態様では、ΔTtransは該プロファイルの1つ以上のパルス間で異なり得ることは理解されよう。
【００３５】
ΔTtransは任意の適切な温度範囲であり得るが、矩形波サーマルプロファイルに有用なΔTtransを決定するある方法は、伝統的な融解曲線のパルス幅の半分に一致する温度範囲を測定することである。特に、図3に示すように、伝統的融解曲線は、低温から高温の温度範囲にわたってインターカレート色素の蛍光を測定する。この伝統的融解曲線は典型的には3つの温度範囲に分割できる：1）蛍光が比較的強く一定である低温の領域；2）温度が上昇するにつれ蛍光レベルが低下する遷移領域；及び3）蛍光が比較的弱く一定である高温領域。融解温度は一般的には、蛍光の低下が屈曲点に達する点に当たる。したがって、例えば伝統的な融解曲線の遷移領域は、50℃から70℃の範囲の20℃領域にスパンし得る。そのような例では、遷移幅の半分は10℃スパンであろう。したがって、本明細書に提供するサーマルプロファイルを用いて同じ二重鎖核酸を分析するとしたら、有用な遷移ジャンプ高ΔTtransは10℃又は伝統的融解曲線の遷移幅の半分であろう。
【００３６】
システム及び装置
さらにまた本明細書で提供されるものは、二重鎖核酸分子の融解温度を決定するシステムである。本システムは、プログラム可能なサーマルサイクリング装置、検出装置、矩形波サイクリングのためのプログラムを含み、前記プログラムは以下の工程のための命令を含む：二本鎖核酸分子を含む溶液を矩形波温度勾配に付す工程（該勾配は、該二本鎖核酸分子の一本鎖核酸分子への少なくとも１つの遷移を引き起こすある範囲の温度を含む）、及び該矩形波温度勾配の過程にわたって前記少なくとも1つの遷移を検出する工程。
プログラム可能なサーマルサイクリング装置は、1つ以上の核酸サンプルで遷移を検出するために検出装置のアクセスを可能にする任意の適切な装置であり得る。プログラム可能なサーマルサイクリング装置は当業者には公知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる装置は温度間を迅速にサイクルさせることができる。
検出装置は、一本鎖核酸と二本鎖核酸との間の遷移を検出できる任意の適切な検出装置であり得る。レポーター成分（例えばインターカレート色素）の蛍光を検出する検出装置は当業界で良く知られている。同様に、UV吸収を検出する検出装置も当業界で良く知られている。いくつかの実施態様では、本システムはさらに光源を含む。前記光源は、吸収又は蛍光が二重鎖核酸の存在下でシグネチャー検出可能シグナルとして用いられる場合に使用できる。UV吸収のための光源は、蛍光のために励起光を提供する光源と同様に当業界では良く知られている。
【００３７】
本明細書で用いられるように、プログラムという用語は、タスク又はプロセスを実施するための命令群又はコマンド群を指す。プログラムという用語はモジュールという用語と互換的に用いることができる。ある種の実施態様では、プログラムは、同じコマンドセット下で実行される多様な命令をコンパイルしたものであり得る。他の実施態様では、プログラムは別個のバッチ又はファイルを指すことができる。
プログラムは、検出装置により入手されたシグナルデータと同様に任意の適切な保存機能上に保存できる。本明細書で用いられるように、記憶装置、保存装置、保存機能などという用語は、情報保存の任意の媒体、装置又は手段を指すことができる。記憶装置には、ディスクドライブ装置、例えばハードドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク、光学若しくは磁性-光学ディスク、RAM若しくはROMチップのようなメモリー、及びデータの記録若しくは保存に用いられる任意の他の媒体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、保存機能はプロセッサーに連結される（プロセッサーは、保存機能に記録されるべき情報を、それを入手した後で送り出す）。具体的な実施態様では、シグナルデータはシステムによって入手され、保存機能に記録される。他の実施態様では、シグナルデータはシステムによって入手され、情報はまず初めに処理されて処理データが保存機能に記録される。
【００３８】
二重鎖核酸の検出
本明細書で提供される方法では、一本鎖核酸と二本鎖核酸との間の遷移は二重鎖核酸レベルの指標となるシグナルを検出することによってモニターされる。二重鎖核酸レベルの検出は、当業界で公知の任意の適切な方法論によって実施できる。例えば、二重鎖核酸レベルは、二重鎖核酸の存在下でシグネチャー検出が可能なシグナルを有するレポーター成分を用いて検出できる。二重鎖核酸の存在下でシグネチャー検出が可能なシグナルを有するレポーター成分は当業者には良く知られ、任意の検出可能シグナルを生成できる。典型的には、該シグナルは、光学的シグナル、例えば蛍光、比色、化学冷光又は混濁度である。いくつかの実施態様では、シグナルは電気的、例えば電圧の変化、抵抗又は電流変化である。
典型的な実施態様では、レポーター成分はインターカレート色素である。インターカレート色素は、それらの二本鎖又は一本鎖DNAとの結合にしたがって種々の蛍光発光を示す。具体的には、それらは二本鎖DNAと特異的に結合し、結合時にそれらは強く蛍光を発する。二本鎖DNAが存在しないとき、それらは結合するものをもたず、低レベルの蛍光を発するだけである。市場で入手可能な適切な蛍光色素には、SYBRグリーン、LCグリーン、LCグリーンプラス、レゾライト（ResoLight）、エバグリーン（EvaGreen）、クロモフィー（Chromofy）、SYTO 9、臭化エチジウム、YO-PRO-1、ヘキスト33258及びピコグリーン（Pico Green）が含まれる。二重鎖核酸の存在下でシグネチャー検出可能シグナルを示すいずれの適切なインターカレート色素も用いることができることは理解されよう。
【００３９】
典型的な実施態様では、シグネチャー検出可能シグナルは可逆的である。したがって、該シグネチャー検出可能シグナルは、温度プロファイルが多数のパルス下で二重鎖核酸の融解温度を繰り返し通過する度に、効率的に“on”及び“off”に繰り返し切り替えられ得る。したがって、インターカレート色素は、それらが優先的に二重鎖核酸に結合し、さらに温度上昇が二重鎖の融解を引き起こしたときに、もう一度アニーリングが生じ得るレベルに温度が到達するまでシグナルが減少するので、レポーター成分として極めて適切である。可逆的シグナルを生成するいずれの適切なレポーター成分も本明細書に提供する方法で利用できることは理解されよう。
いくつかの実施態様では、検出はレポーター成分を必要としないが、二本鎖又は一本鎖核酸の固有の特性をモニターする工程を含むことができる。該固有の特性は、一本鎖と二本鎖核酸間の遷移のモニターを可能にする二本鎖核酸又は一本鎖核酸の適切な任意の特性であり得る。いくつかの実施態様では、該固有の特性はUV吸収である。例えば、一本鎖DNAは、260nmの紫外線を二本鎖DNAよりも強く吸収する。したがって、260nm又は任意の他の適切な波長における吸収の変化を、一本鎖核酸と比較する二本鎖核酸レベルに対するツールとして用いることができる。
【００４０】
動力学的情報
二重鎖核酸の融解は、熱力学的及び動力学的局面の混合を含む現象である。伝統的な融解曲線の分析では、動力学的データ（しばしば融解曲線の非対称性として認められる）はノイズのために不明瞭であり得る。有益なことに、本方法は、核酸分子が状態の間を繰り返し迅速移動するので、遷移の動力学に関して重要な情報を提供できる。遷移が一つの方向で他の方向と比べて速く生じる傾向が存在するならば、該プロファイルが遷移温度を繰り返し通過するとき前記を同定することができる。
したがって、本明細書で提供されるものは、複数の核酸の二本鎖から一本鎖への遷移に関する動力学的情報を決定する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：二本鎖核酸分子及び二重鎖核酸存在下でシグネチャー検出可能シグナルを有するレポーター成分を含むサンプルを提供する工程、前記サンプルを一連の温度パルスに付す工程（ここで前記パルスは該二本鎖核酸分子の一本鎖分子への遷移及び二本鎖分子への復帰を引き起こす）、及び該レポーター成分によって生成されるシグナルを用いて一本鎖状態と二本鎖状態との間の遷移速度を検出し、それによって前記状態間の遷移速度が前記遷移についての動力学的情報を提供する工程。
これまで本発明を一般的に記載してきたが、更なる理解はある種の具体的な実施例を参照することによって得ることができるであろう。前記具体的な実施例は、本明細書では例証の目的のためにのみ提供され、限定が意図されない。
【実施例１】
【００４１】
患者集団における多形のヘテロ接合性を検出するための矩形波サーマルプロファイルの使用
以下の予測的実施例は、上記に記載した矩形波の一応用を説明する。ある患者集団における多形性の存在を検出するために、ゲノムDNAサンプルを当該集団内の一枠の患者から収集する。あり得る多形性にフランキングするプライマーを用いて、問題の領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。具体的には、当該多形性を含む領域を増幅するプライマーを設計する。当該プライマー設計の結果として、どの特有の対立遺伝子が増幅されたかに応じて、当該多形性の領域内の個々の配列を有する増幅生成物が生成される。したがって、どの対立遺伝子が増幅されたかに応じて、生成物はまた少なくとも1.5℃異なる融解温度を有するであろう。前記PCR生成物を各々融解曲線分析に付す。SYBRグリーンを各サンプルに添加し、続いて前記をサーマルサイクリング/検出装置に配置する。融解曲線温度プロファイルは45℃で開始し、各パルスにつき5℃の遷移で低温及び高温のための段差が2℃の矩形波パターンにしたがう。プロファイルは、最終温度が76℃に達するまで前記パルスパターンにしたがう。
データ分析により蛍光値におけるパルスの最大遷移が同定される。サンプルのいくつかでは、1.5℃から2.0℃異なる温度で2つのTm点が同定される。他のサンプルでは、2つの温度のどちらかでただ1つのTm点のみが同定される。これらの発見に基づいて、患者サンプルは、当該多形性についてヘテロ接合又はホモ接合陽性若しくは陰性と分類される。
【００４２】
上記は本発明のいくつかの方法及びシステムを開示する。本発明は、方法及び材料における改変とともに方法及び装置の構成における変更を受けることがある。そのような改変は、本開示を考察するか又は本明細書に開示した発明を実施すれば当業者には明白であろう。したがって、本発明を本明細書に開示した特有の実施態様に限定することは意図されず、前記が本発明の真の範囲内から生じる全ての改変及び変更をカバーしているということも意図されない。
本明細書に引用した全ての参考文献（公開及び未公開出願、特許並びに参考文献を含むが、ただしこれらに限定されない）は参照によりその全体が本明細書に含まれ、本明細書の部分を構成する。参照により本明細書に含まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、そのような矛盾するいずれの事柄も本明細書によって破棄されるか及び／又は本明細書が優先する。
本明細書で用いられる“含む（comprising）”という用語は、“含む（including）”、“含む（containing）”又は“特徴とする（characterized by）”と同義語であり、かつ包括的又はその両端を含み、付加的な未列挙成分又は方法の工程を排除しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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