(57)【要約】  本発明は任意で共有結合したポリエチレングリコール部分を有する、Ｄ型またはレトローインベルソシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ピリン・ペプチドを基板に結合する方法および組成物に関する。本明細書に開示される方法および組成物は摩擦抵抗を減少するため、非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルムの形成を抑制するため、物質の炎症反応を抑制するため、金属の腐食割合を減らすため、およびバイオセンサー製品に有用である。【選択図】図３１Ｂ
2014517817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パイプを流れている液体の摩擦抵抗を減らすための処理方法であって、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ.ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含むＤ型レトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドと（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分との複合体を運ぶ液体を、パイプの壁に前記ピリン・ペプチドの付着によりパイプを通って流れる液体の摩擦抵抗を減らすのに効果的な量で、パイプに導入する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ピリン・ペプチド複合体がこのペプチドのＣ−末端またはＮ−末端のいずれかまたは両方に共有結合するポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ピリン・ペプチド複合体中のポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの間の分子量を有する、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記パイプに導入された複合体中のピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を含む、請求項１、２、および３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記パイプに導入された複合体中のピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ピリン・ペプチド複合体が付着されるパイプの内部表面が金属、ポリマー、セラミック、またはシリケート表面から選択される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ピリン・ペプチドが適用されるパイプの内部表面が、ステンレススチール、カーボンスチール、チタニウム、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウム、ならびにこれらの合金からなる群より選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記パイプがステンレススチール内部表面を有し、前記導入によりパイプの内部表面に付着するピリン・ペプチド複合体の量がこの内部表面の腐食を減らすのに十分な量である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記導入する工程によりパイプの内部に付着したピリン・ペプチド複合体の量が、パイプに導入された砂含有スラリーの摩擦抵抗を減らすのに十分な量である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入する工程が、通常の操作の間にパイプへ導入される液体にペプチド複合体を定期的に添加することを含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ―末端またはＣ―末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含むＤ型レトロインベルソ合成ピリン・ペプチドと（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分との複合体を露出表面の摩擦係数を減らすのに十分な量でコーティングした、金属、ポリマー、セラミック、またはシリケート表面を有する物品。
【請求項１２】
前記ピリン・ペプチド複合体がこのペプチドのＣ−末端またはＮ−末端のいずれかまたは両方に共有結合するポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドである、請求項１１の物品。
【請求項１３】
前記複合体中のポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの間の分子量を有する、請求項１１または１２の物品。
【請求項１４】
前記複合体中のピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を含む、請求項１１、１２、および１３のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１５】
前記パイプに導入された複合体中のピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列を含む、請求項１４の物品。
【請求項１６】
前記物品の露出表面が金属表面である、請求項１１乃至１５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１７】
前記物品の露出表面がステンレススチールであり、前記表面をコーティングしているペプチド複合体がこの表面の腐食速度を減らすのに十分な量で存在する、請求項１１乃至１６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１８】
パイプであって、内部壁表面がペプチド複合体でコートされていて、この表面をコーティングしているペプチド複合体がパイプを通って流れている液体の摩擦抵抗を減らすのに十分な量で存在する、請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１９】
１００ミクロン以下の幅寸法を有するマイクロフルイディクスチャンネルであって、その内部壁表面がペプチド複合体でコーティングされていて、この表面をコーティングしているペプチド複合体がこのチャンネルを通って流れている液体の摩擦抵抗を減らすのに十分な量で存在する、請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２０】
パイプを通って流れているコーティング粒子のスラリーの摩擦抵抗を減らすのに十分な量のペプチド複合体で表面を覆われた砂粒子を含む、請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２１】
前記ペプチドでコーティングされた表面が相互に接触している可動部を有する機械である、請求項１１−１７の品物。
【請求項２２】
前記ペプチド複合体で表面をコーティングした露出金属表面を有する電子機器である、請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２３】
ステンレススチールまたはチタンの表面を有する整形外科の移植装置であり、表面を覆うペプチド複合体は、覆う表面上のバイオフィルム生成を抑制するのに十分な量で存在する請求項１１乃至１７の品物。
【請求項２４】
（ｉ）通常の使用の条件下で非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルム形成の基板として提供することができる露出表面を有する要素と、
（ｉｉ）非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリア等によるバイオフィルム形成を抑制するのに有効な量の、この表面に結合する、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含み、任意でこのペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を有するＤ型またはレトロインベルソ合成ピリン・ペプチドとを含む物品。
【請求項２５】
体内にとどまる移植断片である医療機器であり、この医療機器の表面に結合するピリン・ペプチドがポリエチレングリコール部分に共有結合したＤ型ピリン・ペプチドである、請求項２４の物品。
【請求項２６】
前記ペプチド複合体中のポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの分子量を有する、請求項２４または２５の物品。
【請求項２７】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を含む、請求項２４、２５、および２６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２８】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列を含む、請求項２４乃至２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２９】
前記合成ピリン・ペプチドが結合する表面が金属、ポリマー、セラミック、またはシリケート表面から選択される、請求項２４乃至２８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３０】
前記合成ピリン・ペプチドが結合する表面が金属表面であり、ステンレススチール、カーボンスチール、チタニウム、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウム、ならびにこれらの合金からなる群より選択される、請求項２４乃至２９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３１】
前記合成ピリン・ペプチドが結合する表面がステンレススチール表面であり、適用されるピリン・ペプチドがこの表面に共有結合している、請求項２４乃至３０のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３２】
リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）によるバイオフィルム形成を抑制するために使用し、適用されるピリン・ペプチドの量がそれぞれリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）によるフィルム形成を抑制するのに有効な量である、請求項２４乃至３０のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３３】
むき出しの結晶粒界領域を有する表面を有する金属物質を処理して腐食速度を減らす方法において、この物質の結晶粒界領域をＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端結合レセプタータンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかまたは両方に追加的な０−１０個の残基を含み、任意でこのペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を含み、この金属の腐食速度を抑制するのに有効な量で存在する、Ｄ型またはレトロインベルソ合成ピリン・ペプチドに接触させる工程を含む、改善。
【請求項３４】
前記ピリン・ペプチド複合体がペプチドのＣ―末端またはＮ−末端の１つまたは両方に共有結合しているポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドである、請求項３３の改善。
【請求項３５】
前記ポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの間の分子量を有する請求項３３または３４の改善。
【請求項３６】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を含む、請求項３３、３４、および３５のいずれか１項に記載の改善。
【請求項３７】
パイプに導入される共有結合体の前記ピリン・ペプチド複合体がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列を含む、請求項３３乃至３６の改善。
【請求項３８】
前記接触する工程が少なくとも０．３ｅＶ  ＥＦＷ単位まで露出結晶粒界領域の電気仕事係数を変化させるのに効果的で、所与の力を用いて原子力間顕微鏡のチップで金属表面を打撃して生じるナノ押し込みにより測定される露出結晶粒界領域の硬度が少なくとも２０％高められる、請求項３３乃至３７の改善。
【請求項３９】
前記金属が、ステンレススチール、カーボンスチール、チタニウム、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウム、ならびにこれらの合金からなる群より選択される、請求項３３乃至３８のいずれか１項に記載の改善。
【請求項４０】
前記金属物質がステンレススチールであり、接触する工程がこの表面を通る腐食電流により測定される腐食速度を、少なくとも３０％減らす、請求項３３乃至３９のいずれか１項に記載の改善。
【請求項４１】
前記金属物質が細孔性または網状であり、接触する工程によりこの物質の孔または網目により定義される内部表面にピリン・ペプチドを結合して行われる、請求項３３乃至４０のいずれか１項に記載の改善。
【請求項４２】
前記金属物質が露出結晶粒界領域を有し、接触する工程がピリン・ペプチドをこの結晶粒界領域に選択的に結合させるのに効果的であり、したがって、その結晶粒界領域において表面を優先的に保護することにより金属表面の硬度および腐食耐性を高める、請求項３３乃至４０のいずれか１項に記載の改善。
【請求項４３】
患者に移植されるように設計された医療機器に対する炎症反応を抑制する方法であって、
この機器を移植する前に、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループ、
（ｉｉ）このループのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方における追加的な０−１０残基、および
（ｉｉｉ）レトロ−インベルソ（ＲＩ）型のおけるＤ−アミノ酸からなり、任意でこのペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を有する、合成ピリン・ペプチドにこの機器を接触させる工程を含む、方法。
【請求項４４】
前記ピリン・ペプチドがこのペプチドのＣ−末端またはＮ−末端の１つに結合したポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドである、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記ポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの間の分子量を有する、請求項４３または４４の方法。
【請求項４６】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を含む、請求項４３、４４、および４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記パイプに導入される複合体におけるピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列を含む、請求項４３乃至４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
検体を検出するためのバイオセンサー機器であって、
（ａ）（ｉ）バイオセンサー表面と（ｉｉ）基板表面に結合する、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含み、任意でこのペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を有する、Ｄ型（ＲＩ）合成ピリン・ペプチドと、
（ｉｉｉ）このピリン・ペプチドに直接または間接的に共有結合するレセプターとを有する、導電性金属基板、および
（ｂ）表面に結合したレセプターへ検体関連リガンドの結合に反応する基板表面を通る電気性質における変化を検出するための検出器を含む、バイオセンサー機器。
【請求項４９】
バイオセンサー基板がステンレススチールで形成され、そこに結合するピリン・ペプチドがＤ型ピリン・ペプチドである、請求項４８のバイオセンサー機器。
【請求項５０】
レセプターが多重コイルＥ／Ｋコイルペアを通じてピリン・ペプチドに共有結合し、その１つがピリン・ペプチドに共有結合し、他がレセプターに結合する、請求項４８または４９のいずれかに記載のバイオセンサー機器。
【請求項５１】
ステンレススチール、スズ、鉄、またはチタニウムから形成される基板の１つ以上のむき出しの表面に、化合物を共有結合する方法であって、この基板のむき出しの表面をＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端レセプター結合タンパク質由来のジヅルフィドループを含み、かつこのループのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含み、任意でこのペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を有する、Ｄ型合成ピリン・ペプチドに接触させ、それゆえ露出表面にピリン・ペプチドを共有結合させる工程、並びに接触および結合の前後で、化合物を前記ピリン・ペプチドに結共有結合する工程を含む、方法。
【請求項５２】
前記基板表面が露出結晶粒界領域を有し、前記接触が露出結晶粒界領域において化合物の優先的な局在化に有効である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記ピリン・ペプチドがこのペプチドのＣ―末端またはＮ―末端の１つまたは両方に共有結合するポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドである、請求項５１または５２の方法。
【請求項５４】
前記ペプチドに付着するポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの間の分子量を有する、請求項５１、５２、および５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を含む、請求項５１乃至５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記化合物がペプチド、オリゴサッカライド、脂質、核酸、および有機小分子からなる群より選択される、請求項５１乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記物質が細孔性または網状であり、前記接触する工程がこの物質における孔または網目により定義される内部表面にピリン・ペプチドを結合するのに有効である、請求項５１乃至５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ―末端またはＣ−末端のいずれかまたは両方に追加的な０−１０個の残基を含み、任意でこのペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を有するＤ型合成ピリン・ペプチドと
（ｉｉ）このピリン・ペプチドに直接的または間接的に共有結合する化合物とをその表面に結合してなる基板。
【請求項５９】
ステンレススチール、カーボンスチール、チタニウム、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウム、ならびにこれらの合金からなる群より選択される金属で形成され、バイオセンサー電子反応要素として機能し、化合物が共有結合により直接ピリン・ペプチドに結合しているかまたはＫ／Ｅ多重コイルペアを解してピリン・ペプチドに間接的に結合していいて、このコイルの１つがピリン・ペプチドに共有結合し、他のコイルが化合物に共有結合している、請求項５８の基板。
【請求項６０】
ピリン・ペプチドがこのペプチドのＣ―末端またはＮ―末端の１つに共有結合しているポリエチレングリコールを有するＤ型ピリン・ペプチドである、請求項５８または５９の基板。
【請求項６１】
前記ペプチドに付着しているポリエチレングリコール部分が０．２乃至５００ｋＤａｌの分子量を有する、請求項５８、５９、および６０のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６２】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を含む、請求項５８乃至６１のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６３】
前記ピリン・ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列を含む、請求項５８乃至６２のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６４】
ステンレススチールで形成され、その表面に結合するピリン・ペプチドの効果により電気仕事係数を変更する、請求項５８乃至６３のいずれか１項に記載の基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤ型またはレトロ−インベルソＩＶ型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリン・ペプチドを用いて、任意にポリエチレン部分に共益結合している物質の被覆およびその方法および製品についての分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリアＩＶ型線毛（ｐｉｌｉ）は多くのグラム陰性細菌の宿主コロニー形成及び毒性にとって不可欠であり、また、あるグラム陽性細菌の発病の役割も果たすことがある。ＩＶ型線毛は、バクテリアの表面から伸び、生物及び非生物表面への特異的な付着を仲介する。この結合に関与する線毛結合ドメインは、タンパク質のＣ末端領域にある１２−１７のジスルフィド・ループ領域内にコードされ、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＶ型ピリン由来の残基１２８−１４４から構成されるジスルフィド・ループペプチドのような、この領域のみを含む合成ペプチドは生物及び非生物表面へ結合することが示されている。
【０００３】
本願発明者および協力者らはピリン誘導タンパク質ナノチューブ（ＰＮＴ）が高親和性でステンレス鋼に結合することを最近示した。またこの結合は、ＩＶ型ピリン・ペプチド結合ドメインに対応する合成ペプチドによるＰＮＴ結合の拮抗的阻害を受けながら、Ｃ末端先端が関連することを示した。（Ｙｕ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １：７３−８３  （２００７）。さらに、本願発明者および協力者らにより、Ｃ末端レセプター結合ドメインに由来したピリン・ペプチドが、ステンレス鋼、スズ、アルミニウム、チタニウム、クロム、プラスチック、ガラス、シリケート、セラミックス、及びそれらの混合物のような、非生物表面に結合された時、塗布面上のバクテリアのバイオフィルム形成を防止することができることをさらに実証した（Ｕ．Ｓ．  ２００８０２８７３６７）。
【０００４】
近年、発明者らはＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループを含む合成ピリン・ペプチドをいくつかの金属に結合させることが、金属の、表面だけの特性を著しく増強させ（つまりバイオフィルム形成と無関係に）、いくつかの金属の中で、例えば、バイオセンサーの適用に、利用することができるような態様で表面の電子特性を変更させることを発見した（ＵＳＳＮ  １２／８９９，９５８）。
【０００５】
１つ以上の態様において、本発明はパイプを通る液体の摩擦抵抗を減らしてパイプを処理する方法に関する。該方法はパイプに（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端のレセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、このループのＮ−末端あるいはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０の追加的な残基を含むＤ型あるいはレトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドと（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分との複合体を運ぶ液体を、このパイプの壁にピリン・ペプチドを付着させることによりパイプを流れる液体の摩擦抵抗を減らすのに効果的な量で導入することによる。
【０００６】
このピリン・ペプチド複合体はこのペプチドのＣ末端またはＮ末端の両方の１つに共有結合したポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドでよい。このペプチド複合体におけるポリエチレングリコール部分は０．２−５００ｋＤａｌの間の分子量を有していてもよい。このピリン・ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、又は９で定義される例示的な配列を含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義される配列を有していても良い。
【０００７】
ピリン・ペプチド複合体が付着されるパイプの内部表面は、金属、ポリマー、セラミック、又はケイ酸塩表面でよい。例示的な金属としてはステンレススチール、カーボンスチール、チタン、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウムおよびそれらの合金がある。
【０００８】
パイプの内壁に付着したピリン・ペプチド複合体の量または面密度はステンレススチール等の腐食性の金属の腐食の割合を減らすのに十分であり、および／またはパイプへ導入された流体、例えば砂を含むスラリー、の摩擦抵抗を縮小するのに十分であればよい。
【０００９】
ピリン・ペプチド複合体は、通常動作の間にパイプへ導入された流体にペプチド複合体を周期的に加えることにより、パイプへ導入されてもよい。
【００１０】
他の側面において、本発明は（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端のレセプター結合タンパク質に由来のジスルフィド・ループを含み、このループのＮ−末端あるいはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０の追加的な残基を含むＤ型あるいはレトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドと（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分との複合体を、露出表面の摩擦係数を減らすのに十分な量で覆われた、露出金属、ポリマー、セラミック、またはケイ酸塩表面を有する物品を含む。例示的なピリン・ペプチドは上に記載した。
【００１１】
この物品の露出表面はステンレススチール、カーボンスチール、チタン、銅、真鍮、スズ、鉄、銀およびマグネシウムの表面およびその合金等の金属表面であり、表面を覆うペプチド複合体は表面の腐食速度を減らす、および／又はパイプを流れる液体の摩擦係数を減らすのに十分な量で存在する。
【００１２】
１つの態様において、この物品は、幅寸法が１００ミクロン以下のマイクロフルイディクスチャンネルであり、その内壁表面はペプチド複合体で覆われており、およびこの表面を覆っているペプチド複合体が、このチャンネルを通って流れる液体の摩擦抵抗を減らすのに十分な量で存在する。
【００１３】
第二の態様において、この物品は、パイプを通って流れる覆われた粒子のスラリーの摩擦抵抗を減らすのに十分なペプチド複合体の量で外表面を覆われた砂粒を含む。
【００１４】
第三の態様において、この物品は、ペプチドで覆われた表面が互いに接触して動く可動部を有する機械である。
【００１５】
第四の態様において、品物は、ペプチド複合体覆われた露出金属面有する電子装置か構成部品である。
【００１６】
第五の態様において、品物はステンレススチールまたはチタンの表面がある整形外科の移植装置であり、表面を覆うペプチド複合体は、覆う表面上のバイオフィルム形成を抑制するのに十分な量で存在する。
【００１７】
更なる側面において、本発明は、（ｉ）通常の使用環境下において非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）・バクテリアによるバイオフィルム形成の基板となりうることが可能な露出表面を有する構成要素と（ｉｉ）この表面に結合し、非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）・バクテリアによるバイオフィルム形成の抑制に有効な量の、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、このループのＮ−末端あるいはＣ−末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含み、任意で、ペプチドに結合したポリエチレングリコールを含むＤ型あるいはレトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドとからなる物品を含む。例示的な抑制されるバクテリアはリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）またはブドウ球菌（Ｓｔｓｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）である。
【００１８】
更なる他の側面において、本発明は、露出した結晶境界領域を備えた表面がある金属素材を処理して物質の腐食の速度を抑制する方法における改良を含む。この改良は、物質中の露出した結晶粒界領域と、物質の腐食の割合を抑制するのに有効な量の、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端のレセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループを含み、このループのどちらか又は両方のＮ−末端側あるいはＣ−末端側の上の０−１０個の追加の残基を含み、任意でペプチドに共有結合したポリエチレングリコール部分を含むＤ型あるいはレトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドとを接触させる工程を含む。典型的な金属はステンレススチール、カーボンスチール、チタン、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウムおよびそれらの合金を含んでいる。典型的なピリン・ペプチドおよびピリン・ペプチド複合体は上記にある。
【００１９】
金属に結合するペプチドまたはペプチド複合体の量は、少なくとも０．３ｅＶのＥＦＷユニットまで露出した結晶境界領域の電子仕事関数を変更するのに有効であり、所与の力で原子間力顕微鏡のチップにより金属面を打つことにより生じるナノ押込みによって測定された、露出した結晶境界領域の硬度を少なくとも２０％まで高めるために有効な量である。金属はステンレススチールである場合、結合したペプチドあるいはペプチド複合体の量は、表面を横切る腐食電流により測定して、少なくとも約３０％まで覆う表面の腐食の速度を減じるのに有効な量である。
【００２０】
金属素材が多孔性か網状に形作られている場合には、接触工程を行い、ピリン・ペプチドを材料中の多孔か網目によって定義された内表面に結合する。金属素材が露出した結晶境界領域を有する場合には、接触するステップはピリン・ペプチドを前記結晶境界領域に選択的に結び付けるのに有効で、それにより、その結晶境界領域で優先的にその表面を保護することにより、金属面の硬度および耐腐食性を増強してもよい。
【００２１】
さらに、患者に移植されるように設計されている医療機器に対する炎症反応を抑制する方法を開示する。方法は、医療機器を移植する前に、（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端のレセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループ、（ｉｉ）ループのＮ−末端側、あるいはＣ−末端側のどちらかあるいは両方の上の０−１０個の追加の残基および（ｉｉｉ）レトロ−インベルソ（ＲＩ）型の中のＤアミノ酸からできているおよび任意でペプチドに共有結合で付けられたポリエチレングリコール部分を含む、合成ピリン・ペプチドで、露出されている医療機器の表面を覆うことを含む。好ましいペプチドおよびペプチド複合体は上に示された通りである。
【００２２】
別の側面では、発明は検体の検出のためのバイオセンサー装置を含んでいる。この装置は、（ａ）（ｉ）バイオセンサー表面と、（ｉｉ）この基板表面に結合する、ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループを含み、このループの両方またはどちらかのＮ−末端側あるいはＣ−末端側の上の０−１０個の追加の残基を含み、任意でペプチドに共有結合するポリエチレングリコール部分を含むＤ型（ＲＩ）の合成ピリン・ペプチドと、（ｉｉｉ）このピリン・ペプチドに共有結合で直接あるいは間接的に結合するレセプターとを有する伝導性の金属基板、および（ｂ）表面に結合したレセプターへ検体関連リガンドの結合に反応して基板表面を横切る電気的性質の変化を検知するための検知器を含む。
【００２３】
バイオセンサー基板はステンレススチールから作られてもよい。また、そこに結合したピリン・ペプチドは任意にポリエチレングリコール部分に共有結合したＤ型ピリン・ペプチドでもよい。１つの実施形態では、ピリン・ペプチドのコンビネーションも用いてよく、例えば、下記に述べられるように、サンプル化合物との非特異性の相互作用を減じるためにはＰＥＧ−Ｄピリン・ペプチドを用い、バイオセンサー表面への目標配位子の結合のためには、ＲＩピリン・ペプチド（ＰＥＧ部分の有無に関わらず）を用いて、このペプチドに、直接的にあるいは間接的に目的配位子を共有結合させて使用する。
【００２４】
レセプターは、１つがピリン・ペプチドに結合し、他の部分がレセプターに結合する多重コイルＥ／Ｋコイル・ペアにより、ピリン・ペプチドに共有結合される。
【００２５】
更なる他の側面において、本願発明は、ステンレススチール、スズ、鉄、又はチタニウムから作られる基板の露出表面の１つ以上に化合物を共有結合させる方法を含む。方法は、ａ）基板の露出表面をＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ及び前記ループのＮ末端側又はＣ末端側のいずれか又は両方上に０−１０個の追加的残基を含み、任意でこのペプチドに共有結合したポリエチレングリコール部分を有する合成ペプチドと接触させ、ピリン・ペプチドを露出表面に共有結合させる工程、及び（ｂ）ペプチドを前記基板に結合する前又は後に、化合物をＰＥＧ−ピリン・ペプチド複合体のピリン・ペプチドに、またはＰＥＧ−ピリン・ペプチド複合体のＰＥＧ部分に、直接的に又は間接的に共有結合させる工程、を含む。好ましいピリン・ペプチドおよびペプチド複合体は上に記述された通りである。
【００２６】
基板表面が露出結晶境界領域である場合、この接触工程は基板の露出結晶粒界領域に前記化合物を優先的に局在させるのに効果的である。基板が多孔性か網状に形作られる場合には、接触工程を行い、ピリン・ペプチドを材料の孔か網目によって定義された内表面に結合してもよい。
【００２７】
さらに、その表面が、（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端レセプター結合タンパク質のジスルフィド・ループを含み、このループのＮ−末端側あるいはＣ−末端側のどちらか又は両方の上に０−１０個の追加的残基を含み、任意にペプチドに共有結合的に付加するポリエチレングリコール部分を有する、Ｄ型合成ピリン・ペプチド、および（ｉｉ）共有結合で、ピリン・ペプチドあるいはＰＥＧピリン・ペプチド複合体中のＰＥＧ部分に、直接あるいは間接的に付けられる合成物、に結合した基板を開示する。
【００２８】
基板は、ステンレススチール、カーボンスチール、チタン、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウムおよびそれらの合金等の金属でよく、バイオセンサー電気的反応要素として機能してもよい。化合物は共有結合によりピリン・ペプチドに直接結合された、または１つのコイルがピリン・ペプチドに共有結合し、他のコイルが化合物に共有結合した、Ｋ／Ｅコイルド／コイルペアを通じてピリン・ペプチドに間接的に結合された、検体レセプター分子であり、ステンレススチール基板にはその表面へのピリン・ペプチド結合による変更された電子仕事関数を示す。
【００２９】
次の発明の詳細な説明が添付した図面と共に読まれる時、これら及び本発明の他の目的及び特徴はより完全に明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図１Ａ−１Ｄは、いくつかのバクテリアの属／種／株の中のＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合ドメインの配列を示す。
【００３１】
図２Ａと２Ｂは、コーティングがないステンレススチール又はＫ１２２−４（２Ａ）及びＰＡＯ（２Ｂ）ピリン・ペプチドでコーティングしたステンレススチール上でなされた付着力測定を示すプロットである。
【００３２】
図３Ａと３Ｂは、コーティングがないステンレススチール及びＫ１２２−４（３Ａ）及びＰＡＫ（３Ｂ）ピリン・ペプチドでコーティングしたステンレススチールでの電子仕事関数（ＥＷＦ）を示すプロットである。
【００３３】
図４は、２か月の期間にわたって得られた、コーティングした及びコーティングがない、ステンレススチールを用いたＥＷＦ測定を示す。
【００３４】
図５は、８００ｎＭ荷重下にて、ペプチドをコーティングした及びコーティングしていない、ステンレススチールの力‐変位曲線を示す。
【００３５】
図６Ａと６Ｂは、２０μＮ（６Ａ）及び５０μＮ（６Ｂ）荷重で行なわれたナノ押込み試験の結果を示す。
【００３６】
図７Ａと７Ｂは、ペプチドコーティング（７Ａ中のＰＡＯ及び７Ｂ中のＫ１２２−４）及びコーティングがない、ステンレススチールでの荷重を増加させながらの変位測定のプロットである。
【００３７】
図８Ａ及び８Ｂは、コーティングがない（８Ａ）及びＴ４Ｐ１７ピリン・ペプチドでコーティングを施した（８Ｂ）ステンレススチール基板及びＡＦＭチップの間の電流のコンダクタンスＡＦＭ表面マップである。
【００３８】
図９Ａ−９Ｂは、コーティングした及びコーティングがないステンレス表面の腐食特性の測定であり、ピリンをコーティングしたステンレススチールが、コーティングがないステンレススチールより著しく低い腐食電流（Ｉｃｏｒｒ）を有すること（９Ａ）、並びにピリンコーティング及びコーティングがないステンレススチールは、著しく異なる腐食電位（Ｅｃｏｒｒ）（９Ｂ）がないことを示す。
【００３９】
図１０Ａと１０Ｂは、ピリンをコーティングしたステンレススチールがコーティングがないステンレススチールより著しく低い腐食速度（１０Ａ）及びコーティングがないステンレススチールと比較して、分極に対する著しく高い耐性（１０Ｂ）を有することを示すプロットである。
【００４０】
図１１は、ピリン・ペプチドが別のペプチドに、この場合、ロイシンジッパー型Ｅコイル又はＥ／Ｋ多重コイルに接合する場合、金属表面へ結合するピリン・ペプチドの腐食阻害作用を逆にできることを示す。
【００４１】
図１２Ａ−１２Ｃは、コーティングがないか（１２Ａ）、ピリン・ペプチドでコーティングしたか（１２Ｂ）、又はピリンに接合するコイル‐コイル二重螺旋を有するピリン・ペプチドでコーティングしたか、どちらかであるステンレススチールサンプル上の腐食の視覚的な効果を示す写真である。
【００４２】
図１３は、増加する量の外因性ペプチドを使用する競合結合測定法のステンレススチール表面から結合ピリン・ペプチドが置き換えられないことを示す。
【００４３】
図１４はコーティングがない及びＫ−１２２−４ピリン・ペプチドコーティング、ステンレススチールサンプルのＸＰＳプロットである。
【００４４】
図１５Ａと１５Ｂは、Ｌ型とＤ型の両方又はピリン・ペプチドでコーティングした、ステンレススチールサンプル上の付着力測定（１５Ａ）及びピリン・ペプチドの同じＬ型とＤ型でコーティングしたステンレススチールサンプル上のＥＷＦ力測定（１５Ｂ）を示す。
【００４５】
図１６Ａと１６Ｂは、ピリン・ペプチド（Ｄ型）がステンレススチールステント（１６Ａ）及びガラス表面（１６Ｂ）にしっかりと結合する能力を実証する。
【００４６】
図１７Ａと１７Ｂは、ステンレススチールサンプルに結合したＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸ピリンの中でプロテアーゼ消化に対する相対的抵抗性を示す棒グラフである。
【００４７】
図１８Ａと１８Ｂは、本発明の１つの実施態様として構築されたバイオセンサー装置の操作を示す略図である。
【００４８】
図１９は、ピリン・ペプチドを介して、検体を結合する薬剤Ｒがバイオセンサー表面に直接に付けられたバイオセンサーにおける検体を結合する工程を例示する。
【００４９】
図２０は、検体を結合する薬剤Ｒが、ピリン・ペプチド・多重コイル複合体を介して、バイオセンサー表面に付けられたバイオセンサーにおける検体を結合する工程を例示する。
【００５０】
図２１は本発明のバイオセンサーの中で異なる検出構成配置を示す。
【００５１】
図２２Ａと２２Ｂは、レセプターに結合する検体を結合する前に及び後に、バイオセンサー装置に記録されたサイクリックボルタンメトリー・プロットであり、２２Ｂは、図２２Ａの中の長方形パネルの拡大である。
【００５２】
図２３Ａ及び２３のＢは、本発明のより一般的な実施態様によって構築された検体検出装置を示す。
【００５３】
図２４Ａ−２４Ｄは、ステンレススチール（２４Ａ）、冠状動脈のステント（２４Ｂ）、フォーリー（Ｆｏｌｅｙ）（ラテックス）カテーテル（２４Ｃ）及び中心静脈の（シリコン）（２４Ｄ）カテーテルにＴ４Ｐ１７ピリン・ペプチドが結合することを示す棒グラフである。
【００５４】
図２５Ａと２５Ｂは、コーティングがない及びピリンコーティングした、チタニウム又はステンレススチール表面にＰＢＭＣ免疫学的応答について、Ｄピリン・ペプチドコーティングの影響を示すウェスタンブロット（２５Ａ）と棒グラフのプロット（２５Ｂ）である。
【００５５】
図２６Ａ及び２６Ｂは、コーティングがない及びピリンコーティングした、チタニウム又はステンレススチール表面にヒトマクロファージ免疫学的応答について、Ｄピリン・ペプチドコーティングの影響を示すウェスタンブロット（２６Ａ）と棒グラフのプロット（２６Ｂ）を示す。
【００５６】
図２７Ａ−２７Ｄは、Ｋ１２２−４ピリン・ペプチドの各種形態、Ｋ１２２−４のボルグｓＥＷＦ、で覆われたステンレススチールの特徴を示す。ＥＷＦについて（２７Ａおよび２７Ｂ）、ナノ押込み（２７Ｃ）、および腐食速度（２７Ｄ）を示す。
【００５７】
図２８Ａ−２８ＣはコーティングしていないチタンあるいはＤ型、レトロ−インベルソあるいはＤ型−ＰＥＧピリン・ペプチドで覆われたチタンの電子仕事関数（ＥＷＦ）を示すプロットである。
【００５８】
図２９は、コーティングしていないか、Ｄ型、レトロ−インベルソ断片Ｄ型−ＰＥＧピリン・ペプチドで覆われたチタン表面に対する表面ナノ押込み影響を示す。
【００５９】
図３０Ａ−３０Ｄは示した応力レベルのチタン・プレートに対するバルク微小押込みの影響を示す。
【００６０】
図３１Ａと３１Ｂは、コーティングしていないか、ＰＥＧ−Ｄ型ピリン・ペプチドで覆われた両方のステンレススチール板にチタン・プレート上で測定された接着力（図３１Ａ）、および腐食速度（３１Ｂ）を示す。
【００６１】
図３２Ａ−３２Ｅはコーティングしていないチタン（３１Ａ）、ＰＥＧ−Ｄ型ピリン・ペプチドで覆われたチタン（３２Ｂ）、ピリン・ペプチドのレトロ−インベルソ型で覆われたチタン（３２Ｃ）、Ｄ型ピリン・ペプチドで覆われたチタン（３２Ｄ）、およびレトロ−インベルソおよびＤ型ピリン・ペプチドのコンビネーションで覆われたチタン（３２Ｅ）の代表的な摩擦係数のプロフィールである。
【００６２】
図３３Ａ−３３Ｆは、ステンレススチール（３３Ａ、パート１−９および２８Ｂ）、チタン（３３Ｃ、パートＡおよびＢ）、ポリウレタン（３３Ｄ）、ポリスルホン（３３Ｅ、パートＡとＢ）、シリコン（３３Ｆ）を含む様々な材料へのＬ−ピリン・ペプチド、ＲＩ−ピリン・ペプチド、およびＤ型ペプチドの結合を比較するデータを示す。
【００６３】
図３４は、１０分間５ｍＡの電流を適用した時のステンレススチールからの、対照ペプチド（Ｉｇ）、Ｌ型ピリン・ペプチド（Ｌ）、ＲＩピリン・ペプチド（ＲＩ）、およびＤ型ピリン・ペプチドの結合の相対的損失を示す。
【００６４】
図３５Ａ−３５ＤはＤ型ピリン・ペプチド、ＲＩピリン・ペプチド、あるいはＤ＋ＲＩピリン・ペプチド、あるいはコーティングしていない対照のステンレススチール板上におけるリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（３５Ａ）および、ステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の３つの菌株（３５Ｂ−３５Ｄ）のバイオフィルム抑制の範囲を示すプロットである。
【００６５】
図３６Ａ−３６Ｆは、Ｄ型ピリン・ペプチド、ＲＩピリン・ペプチド、あるいはＤ＋ＲＩピリン・ペプチドでコーティングした、あるいはコーティングしていない対照のステンレススチール板上におけるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリアの様々な株のバイオフィルム抑制の範囲を示すプロットである。
【００６６】
図３７Ａ−３７Ｃはが非常に小さなドロップとしてステンレススチールにＰＥＧ−Ｄピリン・ペプチドを適用したときのバクテリアの抑制影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
１．定義
「線毛（ｐｉｌｕｓ）」は多くのバクテリアの表面で見つけられた毛のような付属器官である。
【００６８】
ピリンは線毛のタンパク質サブユニットの一般名である。
【００６９】
「Ｔ４Ｐピリン・ペプチド」の「ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリン」又は「ピリン・ペプチド」は、生物又は非生物表面に線毛の遠位末端を付着させてバクテリアを前へ引くために線毛を収縮することにより、運動性の力を作りだすために緑膿菌バクテリアが使用する線毛構造をいう。すべてのＩＶ型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）線毛は、酸化体の中で、１２−残基ループ又は１７−残基ループのいずれかに分類することができるジスルフィド・ループを含むＣ末端レセプター結合領域を含む。図１は、Ｃ末端ピリン領域が配列されたいくつかのバクテリアの種の中のジスルフィド・ループ領域を示す。
【００７０】
「ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループ」は、そのアミノ酸配列が例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって同定されたＰＡＫ菌株のような公知のバクテリアジスルフィド・ループのアミノ酸配列に相当するか、或いは４つの緑膿菌の菌株ＰＡＫ、ＰＡＯ、ＰＡ８２９３５及びＫ−１２２−４のジスルフィド・ループ配列の複合体として形成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に含まれる配列のうちの１つのような、２つ以上の異なるバクテリアの種及び／又は菌株の間のジスルフィド・ループ配列中に一以上のアミノ酸変異を置換として形成する配列のうちのひとつのような、既知のバクテリアのジスルフィド・ループ・アミノ酸配列にそのアミノ酸配列が相当するジスルフィド・ループをいう。
【００７１】
「合成ペプチド」は、固相又は組み換えのペプチド合成によって形成されるペプチドをいう。
【００７２】
「ステンレススチール、スズ、鉄又はチタニウムから作られた基板」は、ステンレススチール、スズ、鉄又はチタニウム又はこれらの金属の２つ以上の混合物からつくられた金属基板、又は、ステンレススチール、スズ、鉄又はチタニウム又はその混合物でコーティングした金属又は非金属基板を意味する。基板は、他の金属、特にコバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、クロム（ステンレススチールの中にある）、及び水銀を含む周期表の列４−６及び９−１２カラムからの遷移金属、の小さな割合を含んでよい。
【００７３】
「ステンレススチール、スズ、鉄又はチタニウムから作られた金属基板へのＴ４Ｐピリン・ペプチドの共有結合」は、ピリン・ペプチドが、（ｉ）遊離ピリン・ペプチドにより置換に抵抗する、及び（ｉｉ）金属の表面ｅ−軌道の変化を示す改変したエレクトロン仕事関数（ＥＷＦ）を有する結合を通じて金属表面へ付けられていることを意味する。また、そのような金属基板へのピリン・ペプチドの共有結合は、（ｉ）表面の付着力の変化、（ｉｉ）表面硬度の変化、（ｉｉｉ）コンダクタンスの変化、及び／又は（ｉｖ）Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で見られた結合するエネルギーのピークの変化が特徴であってもよい。
【００７４】
「共有結合した化合物を有する金属基板」は、基板表面に共有結合で結合するＴ４Ｐピリン・ペプチド及びピリン・ペプチドに直接に又は間接的に共有結合で結合するピリンタンパク質のもう一つの部分以外の化合物を有するステンレススチール、スズ、鉄又はチタニウム基板を意味する。化合物が多重コイル・ロイシンジッパー・ペア、ビオチン・アビジン・ペアなどのような高親和性結合ペアによってピリン・ペプチドに結合される場合、化合物は間接的にＴ４Ｐピリン・ペプチドに共有結合で結合され、ここで、ペアのメンバーのうちの１つがピリン・ペプチドに共有結合で結合され、及び他方は化合物に共有結合で結合される。
【００７５】
金属基板の「露出した結晶粒界領域」は、結晶粒界が生じる基板の（すなわち基板を形成する金属原子の２つの多結晶の配向の境界で）外面領域をいう。
【００７６】
「露出した結晶粒界領域でのピリン・ペプチドの優先的な局在化」は、ピリン・ペプチド、及びピリン・ペプチドに共有結合する任意の化合物が、結晶粒界間の露出した領域より大きな分子濃度及び／又は結晶粒界領域での表面コーティングの大きな厚さを有することを意味する。
【００７７】
「Ｌ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチド」又は「Ｌ型ピリン・ペプチド」は、Ｌ−対掌体のアミノ酸残基（Ｌ−アミノ酸残基）からできているＴ４Ｐピリン・ペプチドを指す。
【００７８】
「Ｄ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチド」あるいは「Ｄ型ピリン・ペプチド」は、Ｄ対掌体のアミノ酸残基（Ｄアミノ酸残基）から主としてあるいは排他的にできているＴ４Ｐピリン・ペプチドを指す。具体的には、Ｄ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチドは、５０％を超えるＤアミノ酸残基を含み、および好ましくはすべてがＤ−アミノ酸であり、任意の残り残基はＬ−アミノ酸である。Ｄ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチドは耐プロテアーゼ性である。また、それらがこのプロテアーゼ抵抗性を著しく損なわないように、ペプチド中の任意のＬ−対掌体のアミノ酸をピリン・ペプチド配列内に配置するべきである。これらの位置は個々の可能な位置で単一のＬ−アミノ酸置換を有する一連のＤ型ピリン・ペプチドを形成して、おり、様々なプロテアーゼに対する抵抗性に関して単一の置換ペプチドを試験すのにより決定することができる。
【００７９】
レトロ−インベルソＴ４Ｐピリン・ペプチド」あるいは、「レトロ−インベルソ・ピリン・ペプチド」あるいは「ＲＩピリン・ペプチド」は、Ｄ対掌体のアミノ酸残基の逆さまだった配列があるＴ４Ｐピリン・ペプチドを指す。下記に述べられるように、それは正確な相対的地位でのアミノ酸側鎖を配置するだろう。レトロ−インベルソＴ４Ｐピリン・ペプチドは耐プロテアーゼ性である。
【００８０】
「ポリエチレングリコール」あるいは「ＰＥＧ」はエチレングリコールの線形又は枝分かれしたポリマーを意味し、少数として５ユニット体単位および数千ユニットまでを含み、０．２キロダルトンから５００キロダルトン以上の間の分子量の範囲を有する。サイズの特定においてはＰＥＧの平均分子量で表す。「ポリエチレングリコール部分」はポリエチレングリコール部分か、ピリン・ペプチドに「結合している」部分また上に定義されるようなポリエチレングリコールを指す。複合体は、通常、ピリン・ペプチドのＣ−末端および（または）Ｎ末端アミノ酸へポリエチレングリコール部分が共有結合で付けられている共有結合体である。
ＩＩ．ピリン・ペプチド
【００８１】
図１Ａ−１Ｄは、シーケンス情報が利用可能な様々なバクテリアの属／種／株のジスルフィド・ループを含むＣ末端ピリン・ペプチド領域に関する配列を示す。所望の配列はジスルフィド・ループ配列（システイン残基（Ｃ）で始まり及び終了し、いくつかの場合、ループの一方の側に５までもしくはそれ以上の残基を含む）を含む。一文字の英字アミノ酸指示は標準規則によるものである。ペプチドの正常な酸化体では、ペプチドは、システイン残基間のジスルフィド架橋を含んでいる。
【００８２】
本発明の中で用いる合成ペプチドは、図１Ａ−１Ｄの中で示される配列の１つ以上を含むか、これらに由来する。配列が、示された配列のうちの一つを含む場合、配列はそのジスルフィド・ループを単独で含んでよく、又はそのループは、ループのＮ末端又はＣ末端側のどちらか又は両方にて、１０まで、好ましくは５未満の残基をさらに含んでよく、ここで、追加の非ループ残基が、典型的には隣接した非ループ配列の１以上を含むか、またはこれらに由来する。より一般的に、ループ及び非ループ領域両方の配列は、配列、好ましくは、ジスルフィド・ループ中に同じ数又はほとんど同じ数の残基を有する配列、を整列させることによる２つ以上の配列に由来してよい。例えば、図１Ａの中で、緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ（配列番号：３）、ＰＡＫ（配列番号：４）、ＰＡ８２９３５（配列番号：７）及びＫ１２２−４（配列番号：９）に対応する４ペプチドは、１４量体のジスルフィド・ループを含む。図１Ａの中の４つの緑膿菌株からのジスルフィド・ループ配列を整列させることによって、組み合わせた配列Ｋ／Ａ／Ｓ／Ｔ−Ｃ−Ｔ／Ｋ／Ａ−Ｓ／Ｔ−Ｄ／Ｔ／Ｎ−Ｑ／Ｖ／Ａ−Ｄ／Ｅ−Ｅ／ＩＰ／Ａ／Ｎ−Ｑ／Ｍ／Ｋ−Ｆ／Ｙ−Ｉ／Ｔ／Ｒ／Ｌ−Ｐ−Ｋ／Ｎ−Ｇ／Ｔ−−Ｃ−Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｑ／Ｎ−Ｋ／Ｎ／Ｄ／Ｔ（配列番号：１０）が明らかになる。この１７の残基ペプチド（また、総称的にＴ４Ｐ１７と呼ぶ）は１４のジスルフィド・ループ残基、ひとつの上流（Ｎ末端側）非ループ残基及び２つの下流非ループ残基を含む。この配列内の配列の例は、配列番号：１０に由来される実際の４つの異なる配列、つまりＰＡＫ（配列番号：３）、ＰＡＯ（配列番号：４）、ＰＡ８２９３５（配列番号：７）、及びＫ−１２２−４（配列番号：９）に対応する配列を含む。
【００８３】
別の例は、２つの緑膿菌株Ｇ７−０９（配列番号：１）及びＰＡ１１０５９４（配列番号：２）はコンポジットシーケンスＳ／Ｔ−Ｉ−Ｄ−Ｗ−Ｇ／Ａ−Ｃ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｄ／Ａ−Ｓ−Ｎ−Ａ−Ｖ／Ｔ−Ｓ／−−Ｓ−−Ｇ／Ａ−Ｔ−Ｄ／Ａ−Ｒ／Ｑ−Ｎ／Ｇ−Ｍ／Ｆ−Ｐ／Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｌ／Ｍ−Ｔ／Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ／Ｓ−Ｌ／Ｖ−Ｐ−Ａ／Ｑ−Ｒ／Ｅ−Ｆ−Ａ−Ｐ−Ｓ／Ａ−Ｅ／Ｑ−Ｃ−Ｒ（配列番号：２１）を形成する。
【００８４】
いったんピリン・ペプチド配列が選択されると、標準組み換え又は固相合成により合成され得る。例えば、Ｅ−コイルＰＡＫ（１２８−１４４）ｏｘは、ｐＲＬＤ−Ｅプラスミドから組み換え的に発現され、ここで、ＰＡＫ（１２８−１４４）ｏｘＤＮＡ配列が合成オリゴヌクレオチドを利用するＥ−コイルを用いてインフレームでスプライシングされ、既知のテクニック（例えば、Ｇｉｌｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２００６）  ５９（４）：１０８３及び本明細書に引用されるレファレンスを参照願いたい）に従って大腸菌ＢＬ−２１で発現された。発現されたペプチドは、金属親和性クロマトグラフィーにより精製され、純度及びジスルフィド架橋の構成は、質量分析とＮ末端タンパク質シーケンシングによって確認された。
【００８５】
本発明の１つの一般的な態様において、ピリン・ペプチドはＤ−アミノ酸からなり、前述のようにＬアミノ酸がマイナー分画であり（残基の５０％未満）、ペプチドのプロテアーゼ耐性を著しく損なわない限り、１つ以上のＬ−アミノ酸を含んでもよい。ピリン・ペプチド中のＤアミノ酸の包含の目的はペプチドが曝されるであろう１つ以上のプロテアーゼ酵素によるタンパク質分解活性に対するペプチドの耐性を高めることにある。例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアにはエラスターゼ、メタロプロテアーゼおよび典型的なトリプシ様セリン・プロテアーゼ（それはリジンおよび（または）ペプチド分裂中のアルギニン残留物を要求するかターゲットとする）を含むプロテアーゼの集合を有する。したがって、Ｋ１２２−４ピリン・ペプチド中のＫ１３６およびＫ１４０で、例えばＤリジンを含むためにピリン・ペプチドを合成することができるかもしれない。好ましくは、ペプチドをできるだけ多くのプロテアーゼに強くする際に、ピリン・ペプチドは完全にＤアミノ酸から形成されるべきである。すべてＤ−アミノ酸又はＤとＬアミノ酸の混合物から構成されるピリン・ペプチドは、合成において、活性化されたＤ又はＬ型アミノ酸試薬を用いる従来の固相法によって作ることができる。（例えば、Ｇｕｉｃｈａｒｄ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．９７６５−９７６９，１９９４年１０月を参照。）
【００８６】
以下に見られるように、Ｄ型ピリン・ペプチドは、表面のコーティング剤としてＬ型ピリン・ペプチドに対して重要な利点を有している。最初に、Ｌ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチドはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによって引き起こされたバイオフィルム生成を禁じるのに有効であるが、Ｄ型・ピリン・ペプチドはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルム生成に対する優れた抑制効果を示し、およびリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびブドウ球菌（Ｓｔｓｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）等の非シュードモナスバクテリアによるバイオフィルム生成に対するより強い抑制を提供する。第２に、Ｌ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチドは多くの金属、ポリマー、ケイ酸塩およびセラミックスを含む様々な材料への高い親和性で結合するのに有効であるが、一般にＤ型ペプチドは、材料がプロテアーゼに露出される場合、そして、導電性材料の場合には、電流が材料に提供する際、実質的により安定した結合を提供する。
【００８７】
別の一般的な実施形態では、ピリン・ペプチドは、いわゆるレトロ−インベルソ（ＲＩ）ピリン・ペプチドを生産するために逆の配列方向に（すなわちカルボキシ末端からアミの末端方向へ）合成されたＤアミノ酸からできている。レトロ−インベルソ（ＲＩ）型ピリン・ペプチドは、さらにプロテアーゼに対するより大きな抵抗という長所を有し、ピリンで覆う物質がプロテアーゼに（例えば生物学の環境の中で）露出されるか、細菌増殖環境下の場合に、ここに記述された適用に有利である。ＲＩ型ペプチドを合成する方法は、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．Ｍ．，Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ，１９９８，９８：７６３−７９５の中で、例えば詳述される。それは引用によって本明細書に組込まれる。
【００８８】
以下に見られるように、レトロ−インベルソ・ピリン・ペプチドは、さらに表面のコーティング剤としてＬ型ピリン・ペプチドよりも重要な利点を有している。最初に、一般に、Ｄ型ピリン・ペプチドはＲＩペプチドよりもバイオフィルム形成をより強力に抑制するが、ＲＩペプチドはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルム構成に対する優れた抑制を提供し、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）とブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）等のバクテリアのように、非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）・バクテリアによるバイオフィルム構成に対して劇的により強い抑制を提供する。第２に、Ｌ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチドは増加した電子仕事関数（ＥＷＦ）、より大きな硬度および耐腐食性で特徴付けられる共有結合様の結合を通じて、ステンレススチールに高親和性で結合するのに有効であるが、レトロ−インベルソピリン・ペプチドは、Ｌ型ペプチドによって提供されるものよりも有意に高いＥＷＦを示し、Ｌ型ペプチドで見られた硬度よりも高い高度を示し、Ｌ型ペプチドで見られた耐腐食性より大きな耐性を示している。
【００８９】
まだ別の実施形態において、ピリン・ペプチド、および好ましくはピリン・ペプチドのＤ型か、レトロ−インベルソ・フォームでは、従来のペプチド結合方法、（例えばペプチドおよびＰＥＧ部分の間のアミド、エステル、エーテルあるいはジスルフィドリンケージの形成、あるいは活性化グループを含んでいるリンケージ）を使用して、典型的には線形又は枝分かれポリエチレングリコールの端部をペプチドのＮ−末端のアミンおよび（または）Ｃ−末端の酸性のグループへ共有結合で結びつけることにより、線形のあるいは枝分かれポリエチレングリコール・ポリマー鎖を共有結合する。ＰＥＧあるいはタンパク質の共有結合に使用される適切な反応グループを有するＰＥＧは、例えばＰＥＧＴｅｃｈ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｖｅｎｔｕｒａ，  およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（分岐ＰＥＧ）より入手可能であり、活性化基は、例えばマレイミド（典型的には、ペプチドを含む反応のためには、スルフィドリル基、ビニール・スルホン、プロピオンアルデヒド、ピリジルスルホン、ＮＨＳエステル、あるいはヨードアセトアミド）である。典型的にはＰＥＧには、１つの末端に不活発な基、例えば、メトキシがあり、およびもう１つの末端に活性化されたか反応的な基がある。ポリマー試薬は、より小さいかより大きなＰＥＧは適切であるが、１００〜１，０００繰り返し単位に相当する、５ｋＤａから４０ｋＤａの間の選択された寸法範囲の中に平均分子量を有している。活性化されたＰＥＧ試薬によるタンパク質のＰＥＧ化は標準ＰＥＧ結合方法によって実行される。
【００９０】
ＰＥＧ−Ｄピリン・ペプチドかＰＥＧ−ＲＩピリン・ペプチドの利点は、下に見られるだろう。一般に、Ｄ型あるいはＲＩピリン・ペプチド型のＰＥＧ化形態は、前述のようにペプチドのＤ型あるいはＲＩ型の非ＰＥＧ化型に対して利点を備えているが、摩擦の係数の著しい減少および覆う表面上のバイオフィルム生成のより大きな抑制においても更に有利である。
ＩＩＩ．金属表面の処理
【００９１】
ある態様においては、本発明は、材料の腐食の速度を低減するために、露出した結晶粒界領域を有する表面があるステンレススチール、スズ、鉄又はチタニウム金属材料を処理するための改善された方法を含む。方法は、別々に又はパッシベーションのようないくつかの他の耐食方法のうちの１つと組み合わせて使用されてもよい。金属材料は、結晶粒界領域を有する単一の露出面や複数の処理される外部表面を有し得、又は材料の外部表面からアクセス可能な空隙又は内部の網目を有してよい。理解されるように、この方法は、例えば、酸化雰囲気中で、又は塩基性か酸性の液体のような腐食性液体との接触によって、化学腐蝕にさらされるあらゆる、ステンレススチール、スズ、鉄、又はチタニウム金属材料を処理するいずれの場合にも適している。
【００９２】
方法を実行する際に、混入物質を除去するために、金属材料を最初に例えば、エタノール浴の中で１回以上洗浄してよい。その後、材料を、共有結合でピリンを材料の露出面に結合するのに効果的な条件の下にて、ピリンの溶液と接触させる。典型的な処理方法では、材料を、ほぼ中性のｐＨ（例えばｐＨ７）にて、水性の緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）中、２μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬの間、例えば１０μｇ／ｍＬ、のピリン・ペプチド濃度にて、ピリン・ペプチドの溶液中に放置し、ピリン・ペプチドの適切なコーティングが生ずるまで、例えば５−１２０分間、溶液と接触させる。
【００９３】
あるいは、コーティングされる材料をピリン溶液で吹きかけ、所望の接触時間（例えば５−１２０分）にわたって、高湿環境中でスプレーされた溶液と接触させてよい。
【００９４】
別の実施態様では、ピリンコーティングは、例えば、ミクロファブリケーション操作において、又は材料上の露出した結晶粒界領域にペプチドを選択的に塗布するために、選択された金属表面に塗られる。この実施態様では、ペプチドの溶液は、エリアに特異的な方法で（例えばインクジェット・プリンターなどによって）材料の露出面に供給される。
ＩＩＩＡ．処理方法及び金属表面特性の変更
【００９５】
このセクションは、耐腐食性を増強するために金属表面を処理するための典型的な方法、及び、増加した耐腐食性に加えて、次のことを実施する発明をサポートするために行われた試験について記述する。
（ｉ）処理した表面の低減した付着力、
（ｉｉ）処理した表面の改変した電子仕事関数、
（ｉｉｉ）処理した表面の増加した硬度、
（ｉｖ）低減したコンダクタンス、及び
（ｖ）少なくとも２か月の期間にわたるコーティング安定性。
別途規定しない限り、このセクション、およびセクションＩＩＩＢおよびＩＩＩＣの中で報告された試験は、Ｌ型ピリン・ペプチドを用いて行なわれた。セクションＩＩＩＤの中で報告された試験と結果は、Ｄ型およびレトロ−インベルソ・ピリン・ペプチドおよびＤおよびＲＩピリン・ペプチドＰＥＧ複合体で行なわれた。
【００９６】
サンプル調製  厚さ１ｍｍの商用銘柄３０４  ２Ｂフィニッシュプレート（２０ゲージ）ステンレススチール板を１ｃｍｘ１ｃｍの寸法を有するサンプルへカットした。サンプルを空気中１時間１１４０℃で焼き戻し、空気中で冷却した。表面を１２０、２４０、３２０、４００、６００及び８００＃グリットの研磨紙を使用して、磨き、その後、１２００＃グリットの研磨紙で最終磨きを行った。
【００９７】
１ｃｍｘ１ｃｍｘ１ｃｍの寸法を有するアルミニウムとステンレススチールのサンプルは以前に記載された磨き手順に従って磨かれた。これらのサンプルのどちらも、みがきに先立って焼き戻されなかった。
【００９８】
ペプチド又はモノマーの線毛でサンプルをコーティングする工程
ステンレススチールとアルミニウムのサンプルを商業用の皿洗い用石鹸を使用して１分間洗浄し、その後、蒸留水ですすいだ。その後、サンプルを１５分間穏やかな撹拌で９５％のエタノールに浸し、蒸留水ですすぎ、１分間試薬用アセトン中へ浸した。サンプルを蒸留水で５回すすぎ、風乾させた。サンプルをペプチド又はペプチド複合体又はモノマーの線毛の１０μｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に浸し、穏やかな撹拌で１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。溶液を除去し、サンプルを蒸留水で６回洗い、風乾させた。
【００９９】
カーボンスチールサンプルを水にさらされた時に生じる迅速な空気腐食を防ぐために、アセトン洗浄ステップに続き、１００％のメタノールですすぎ、１００％のメタノールの中で直ちに浸した以外は、上記に記述されたプロトコールを使用して、きれいにした。ペプチド又はペプチド複合体を１００％のメタノールに溶解し、最終濃度１０μｇ／ｍＬをカーボンスチールサンプルを浸すために使用した。サンプルを穏やかな撹拌で１時間ＲＴにてインキュベートした。サンプルを１００％メタノールで６回洗浄し、風乾させた。
【０１００】
付着力測定  ５０−７０ｎｍのチップの丸みを有する標準ＡｕコートＡＦＭ窒化ケイ素チップとペプチドコーティング面の間の付着力を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して測定した。ＡＦＭチップとコート面の間の付着力を決定するために、ＡＦＭを「コンタクト」モードで使用した。チップを表面に近付け、接触させ、チップが表面から引き離される時、カンチレバーのデフレクション（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を測定した。デフレクションの全量（それは付着力を反映する）を、レーザー光線によって検知した。カンチレバーのばね定数が知られている場合、付着力は、ビーム偏向から定量的に決定することができる。この試験では、カンチレバーばね定数は０．０６Ｎ／ｍだった。各実験については、２０と５０の間で、付着力測定は１つのサンプル当たり得られた。
【０１０１】
Ｋ１２２−４又はＰＡＯピリン・ペプチドのいずれかでコーティングしたステンレススチールサンプルを用いた付着試験の結果を図２Ａ及び２Ｂそれぞれ中でプロットする。図２Ａで見られるように、付着力が約４０−７５ｎＮの間に属し、平均約６０ｎＮとなった、コーティングがされないサンプルに比較して、コーティングされた金属の付着力は、約５−４０ｎＮ（ナノニュートン（ｎａｎｏＮｅｗｔｏｎ））の間の範囲の中に属し、平均で約２０ｎＮとなった。同様の結果はＰＡＯピリン・コーティングで得られた。付着力が電子の反射活性、例えばファンデワールス相互作用、であるので、ペプチドをコーティングすることが金属表面エレクトロン層を覆う役目をすることが結論付けられる。
【０１０２】
ペプチドをコーティングしたアルミニウム板上で同様に行った付着測定では、コーティングの有無による実質的なプレートの接着力の差を示さなかった。
【０１０３】
仕事関数測定  コーティングした及びコーティングしていない、ステンレススチールサンプルの電子仕事関数（ＥＷＦ）をＳＫＰ３７０  走査型ケルビンプローブ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｋｅｌｖｉｎ  Ｐｒｏｂｅ）で従来通りに測定した。方法は振動するキャパシタンスプローブを使用して操作され、掃引バッキングポテンシャル（ｓｗｅｐｔ  ｂａｃｋｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を通して、仕事関数の差はスキャニングプローブリファレンスチップとサンプル表面の間で測定される。調べられたサンプルは、ＰＡＫでピリン・ペプチドをコーティングしたサンプルも試験された以外は、付着試験の中で使用されるものに似ていた。
【０１０４】
試験の結果はコーティングされないサンプル及びＫ１２２−４ピリン・ペプチドコーティングサンプルについて図３Ａでプロットされ、コーティングされないサンプル及びＰＡＯ−及びＰＡＫピリン・ペプチドコーティングサンプルについて図３Ｂでプロットした。３つのコーティングすべてについては、ピリン・ペプチドコーティングは少なくとも約０．５ｅＶの差で、最終値約５ｅＶまで、表面のＥＷＦを上げた。
【０１０５】
ペプチドコーティングアルミニウム板上の同様のＥＷＦ測定は、実質的にはコーティング及び未コーティングプレート間のＥＷＦの差を示さなかった。
【０１０６】
ペプチドコーティングの安定性  図４は、コーティングの後に２か月の期間にわたって得られたＫ１２２−４ピリン・ペプチドコーティングサンプル上の測定の結果を示す。未コーティングのスライドに対して、コーティングサンプルのより大きなＥＦＷは、２か月の試験期間にわたって観察され、少なくとも２か月のコーティング安定性を示した。
【０１０７】
ナノインデンテーション／硬度  ペプチドコーティングを施したサンプルの機械的性質の変化を検査するために、トリボスコープ（ｔｒｉｂｏｓｃｏｐｅ）（Ｈｙｓｉｔｒｏｎ、ミネアポリス、アメリカ）を使用した。トリボスコープ（ｔｒｉｂｏｓｃｏｐｅ）はナノメカニカルなプローブ及びＡＦＭの組合せである。プローブ（ダイヤモンドのピラミッド形のビッカース（Ｖｉｃｋｅｒｓ）圧子）は、１００ｎＮの荷重感度及び０．２ｎｍの変位分解能を伴う１５０ｎｍの名目上の半径を有する。ナノインデンテーション中、力と変位の曲線は各インデンテーションについて得られ、サンプルの表面へのチップの全深さ変位は、このカーブから得られた。ナノインデンテーションテストは、５０〜８００μＮの荷重を用いて行なわれた。５つの荷重‐変位曲線が各荷重について得られた。
【０１０８】
５０〜８００μＮの間の荷重範囲の下で、ペプチドコーティング（暗い）、及びペプチド未コーティング（明るい）ステンレススチールの荷重‐変位曲線を図５に示す。８００μＮ荷重の全変位はグラフの上に示され、コーティングスライドは範囲４５−５５ｎｍあり、未コーティングスライドは約９０−９５ｎｍの間にある。このテストに基づいて、コーティングスライドは、未コーティングスライドの硬度のほぼ２倍を有する。より一般的に、コーティングはステンレススチール、スズ、鉄、又はチタニウムの金属表面の硬度を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、及び５０％以上まで増加させるのに効果的である。
【０１０９】
図６Ａと６Ｂは、コーティング及び未コーティングスライドについて、２０μＮ（６Ａ）及び５０μＮ（６Ｂ）で作られたナノ押込みについての変位をプロットする。コーティングが、未コーティングスライドより約２０％−１００％大きい硬度を持っていたことは、図５からのデータと一致している。
【０１１０】
ＰＡＯコーティング（７Ａ）及びＫ１２２−４コーティングについて、５０−８００μＮ（７Ａ）及び５０−４００μＮ（７Ｂ）の荷重範囲にわたり、同じタイプの試験を図７Ａ及び７Ｂ中でプロットし、実質的に、同じ結果を伴う。両方の場合では、ピリン・ペプチドコーティングは、金属試料の表面硬度を約２倍にした。
【０１１１】
ペプチドコーティングアルミニウム板の同様のナノインデンテーションテストは、コーティング及び未コーティングのプレート間で実質的には表面硬度の変化を示さなかった。
【０１１２】
増加したコンダクタンス  コンダクタンスは、材料が電流を導く能力を有することの尺度である。表面コンダクタンスを測定するための１つの標準分析法は、指定された低電圧用の電位のバイアスの下で表面上の指定された位置からＡＦＭチップまで流れる電流を測定するために原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用する。ＡＦＭは、それぞれ、未コーティング及びコーティングピリンステンレスプレートについて、図８Ａ及び８Ｂにおいて、異なる濃淡のレベルによって表わされて、特異的な色として表面とチップの間の電流（ｐＡ）を定量的に表示する。一般に、濃色から淡色への色調の変化は大量から小量への電流（２８．０〜２４．５ｐＡ間）の変化を示す。２つの図から、図８Ａ中の未コーティングステンレススチールサンプルの表面領域が、サンプル表面にわたってかなり変化し得ることが観察され、比較的高い電流を示す濃い色調を有し、一方、図８Ｂ中のピリンコーティングサンプル表面領域は著しく低いコンダクタンスで、実質的にコンダクタンス・プロファイルがより均一である。ピリンコーティング材料中で実質的により高い金属仕事関数（表面電子を抽出するために必要な仕事関数の尺度）を示す。この結果は、図３Ａと３ＢからのＥＷＦデータと一致する。
【０１１３】
耐腐食性  材料表面中の腐食に対する耐性又は腐食感受性の調査に利用可能な多くの方法がある。１つの方法は、固定電位で金属板をわたって流れる電流を測定することである。測定された電流は、酸化還元反応に伴い往復する表面電子を反映し、高い電流は腐食の大きなポテンシャルを示す。図９Ａ中のプロットは、Ｋ−１２２−４ピリン・ペプチドでコーティングされ又はコーティングされていないで、上記のように調製された３０４の２Ｂフィニッシュプレート（２０ゲージ）ステンレススチール板について測定した電流（Ｉｃｏｒｒ）を示す。結果は、コーティング板について、著しくより低いＩｃｏｒｒを示した。これはより大きな耐腐食性を示す。
【０１１４】
上記の試験で観察されたＩｃｏｒｒの差が、電流が金属表面を横切って最初に流れ始めるポテンシャル（Ｅｃｏｒｒ）と関係があるかどうかが尋ねられるかもしれない。この質問は、金属中の電流が最初に流れ始めるポテンシャル（Ｅｃｏｒｒ）を見ることにより試験された。図９Ｂの中で示される試験の結果は、図９Ａで見られたＩｃｏｒｒ値の差が２つのサンプル間の電位レスポンスの差によらないことを示して、コーティング又は未コーティング金属試料が同様のＥｃｏｒｒ値を持っていることを示す。
【０１１５】
Ｋ−１２２−４コーティング及び未コーティングサンプルについてミリ（ｍｉｌｌ）（ミリインチ（ｍｉｌｌｉｉｎｃｈ））／年（ｙｅａｒ）（ｍｐｙ）で測定された、腐食速度測定を図１０Ａ中でプロットした。結果は図９Ａで見られたＩｃｏｒｒの差と一致している。特に、平均速度が比較される場合、ピリン・ペプチドコーティングは腐食速度を３倍以上に低減するように見える。
【０１１６】
腐食モニタリングで別の広く用いられる方法は、自由腐食電位にて電位電流密度曲線の傾きとして規定される、分極抵抗であり、既知の数学的関係によって腐食電流と関係がありうる抵抗性値Ｒｐをもたらす。図１０Ｂは、コーティング及び未コーティングステンレススチール値に対するＲｐ値をプロットし、ペプチドコーティングが耐腐食性の尺度としてのＲｐを著しく増大することを示す。
【０１１７】
興味深いことには、ピリン・ペプチドが強い双極子及び／又は高い電荷密度を有する別のペプチドに結合する場合（この場合、ロイシンジッパー型Ｅコイル、又はそれに結合した同じＥコイル、Ｅコイル／Ｋコイルペア中の反対に帯電したＫコイル）、腐食の防止におけるピリン・ペプチドの影響は逆になり得る。図１１で見られるように、未コーティングステンレススチールサンプルでの腐食速度は、ピリンＥ又はＥ／Ｋコイル中に結合ピリンを有するサンプルより実質的に低い。
【０１１８】
上記に議論された様々なステンレススチールサンプルに対する腐食試験法の視覚的な影響は、図１２Ａ−１２Ｃで見られる。この試験では、サンプルはピリン・ペプチド未コーティング（１２Ｂ）又はピリン・ペプチド（１２Ａ）コーティングいずれか又はＥ／Ｋ多重コイル・ペアに結合したピリン・ペプチドであった。各場合では、サンプルは薄い食塩水中ですでに記載された腐食試験法を行った。未コーティングプレートと比較して、ピリンコーティング板は表面の腐食をほとんど示さず、その一方でピリン結合コーティングは、腐食を著しく増強するようだ。
【０１１９】
手短にいえば、ステンレススチール、スズ、鉄、又はチタニウムのような金属を、ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来したジスルフィド・ループを含む、及び前記ループのＮ又はＣ末端側のどちらか又は両方上の０−１０個、好ましくは、０−５個の追加の残基を含む、合成ピリン・ペプチドでコーティングすることは、金属表面の硬度及び耐腐食性両方を増加するのに効果的である。増加した耐腐食性は、例えば、０．２ＥＦＷユニット以上で金属表面の電子仕事関数を増加、並びに上述のように、Ｉｃｏｒｒ、腐食速度及びＲｐ値など、変化によって証拠づけられ、増加した硬度は、一定の力を有する原子間力顕微鏡のチップで金属表面を押し込んで、つくられた、２０％以上低減されたナノインデンテーションにより証拠づけられる。
【０１２０】
方法の中で意図される他の金属は、周期表の列４−６及び９−１２カラム由来の遷移金属であって、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、及び水銀、及びそれらの混合物及び合金、及びメタロイドのシリコン及びゲルマニウム、及びそれらの酸化物を含む。
低められた摩擦係数
【０１２１】
摩擦の係数は既知の方法、例えば、２００７年のＪ．Ｐｈｙｓ．：Ｃｏｎｆ  Ｓｅｒ  ６１  ５１．によって報告されるように原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して、測定される。手短かに言えば、ＡＦＭのカンチレバービームを用いて所与の応力（例えば５００  ｍＮ）を表面に適用し、試験表面を横切って移動させる。その後、ビーム中のたわみの量は、たわみを低下させるより低い摩擦の係数と共に、ビームによって摩擦の力実験値の基準を提供する。
その後、表面上のビーム軌跡のラインを横断するたわみプロフィールは、小さくより一定のたわみでは低い係数を示し、高くより不安定なプロフィールではより高いビーム偏向を摩擦の係数の基準として供給する。
ＩＩＩＢ．処理された金属へピリン・ペプチドの共有結合の追加的証拠
【０１２２】
コーティング金属の改変された電子仕事関数及び増強された耐腐食性は、ピリン・ペプチドがコーティング表面の電子特性を変化させたことを示し、金属の自由電子軌道を変更させるペプチド及び金属の間の共有結合の形成を示唆する。この発見の追加的サポートは、このサブセクションの中で報告されるペプチド置換アッセイ及びＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）試験からもたらされる。
【０１２３】
ペプチド／線毛置換アッセイ  化合物と基板の間の共有結合の相互作用のひとつの指標は、複合体が溶質中の化合物の存在下にてインキュベートされる場合に、化合物が基板から脱離できないことである。ここで、外来性のピリン・ペプチドがステンレススチール表面に結合されたピリン・ペプチドを離脱させる能力を試験した。すでに記載したように、厚さ１ｍｍの商用銘柄３０４  ２Ｂフィニッシュプレート（２０ゲージ）ステンレススチール板をきれいにした。これらの板は焼き戻しされなかったし磨かれなかった。板を９６ウェルのＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  ＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｍａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中へ集めた。ビオチン化ＰＡＫペプチド又はビオチン化精製線毛の１０μｇ／ｍＬを含む５０マイクロリットルの溶液をウェル（５つの複製）に加え、マニホールドを穏やかな撹拌で１時間ＲＴでインキュベートした。ウェルを１ｘＰＢＳで６回洗浄した。ラベル化していないＰＡＫペプチドを、量を増やしながら（０〜１０μｇ／ｍＬ）、複製ウェルに加え、鋼マニホールドを穏やかな撹拌でＲＴにて１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳで６回洗浄した。結合ビオチン化ペプチド又は線毛の置換をストレプトアビジン・ホースラッディシュペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）を使用して評価した。Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（シグマ）を１／５００に希釈し、１００μＬを各ウェルに加え、マニホールドをＲＴで１時間インキュベートした。１５０マイクロリットルのデベロッピング緩衝液（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｍＭ２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）（シグマ）及び０．０３％（ｖ／ｖ）過酸化水素含有０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．２）を各ウェル加えた。マニホールドは穏やかな撹拌で１０分間ＲＴでインキュベートした。反応溶液を９６ウェル平底マイクロタイタープレート（コーニング）に移し、４０５ｎｍの吸光度をＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートレーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して測定した。
【０１２４】
図１３にプロットされたデータから見られるように、可溶性ピリン・ペプチドの比較的高濃度にさえ、金属表面による結合ピリン・ペプチドの消失は測定できず、結合ピリン・ペプチドが非結合ペプチドと釣り合っていることを実証し、ペプチドと金属表面間の共有結合を示す。金属表面へのペプチドの共有結合の詳細な証拠は、耐腐食性試験によって下に提供される。
【０１２５】
ＸＰＳ特性  Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）は、材料内に存在する元素の元素組成及び電子状態を測定する量的分光器の方法である。ＸＰＳスペクトルは、Ｘ線ビームで材料を照らし、一方、分析された物質の頂部１から１０ｎｍまでから放出される電子の運動エネルギー及び数を同時に測定することにより得られる。ＸＰＳは極めて高い真空（ＵＨＶ）条件を必要とする。
【０１２６】
Ａｘｉｓ−１６５１スペクトロメーター（Ｋｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を未コーティングのサンプル及びピリンコーティングされたサンプルから発生した光電子（ｐｈｏｔｏ−ｅｍｉｔｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を試験するために使用した。２つのサンプルから放出された電子についてのスペクトルを図１４に示す。見てわかるように、ピリンコーティングされたサンプルは、未コーティングのサンプルの中には存在しない、約１００及び１５０ｅＶの結合エネルギーを有する２つのユニークなピークを有する。１つの可能性は、２つのピークが、共有電子結合により、実質的に赤にシフトした、硫黄金属結合を表すということである。金属とＮ又はＯ結合形成の証拠はなく、ピリンと金属間との好ましい共有結合の（共有電子）相互作用は、ピリン・ペプチド中の２つの硫黄原子の１つ又は両方とであることを示唆する。
ＩＩＩＣ．  結晶粒界効果
【０１２７】
結晶粒界は、多結晶体中の２つの粒子（又は晶子）間の境界である。粒界は結晶構造の欠陥で、材料の電気的及び熱伝導性を減少させる傾向がある。ほとんどの粒界中の高い界面エネルギー及び比較的弱い結合形成は、しばしばそれらに腐食の発現及び固形物から新しい相の沈殿のための好ましい部位を作る。
【０１２８】
結晶粒界が腐食のための開始部位として役立つことができるので、金属表面へ結合するピリン・ペプチドが粒界部位で優先的に生じたかどうか判断することは興味深かった。この問題を調べるために、ピリン・ペプチドコーティングＡＦＭチップを用いる、上記に説明した付着力試験を、粒子内の及び粒界での付着力効果を調べるためにさらに改良した。試験における「テスト」及び「コントロール」表面は、ＰＡＯピリン・ペプチド又はＰＡＯアミノ酸のスクランブル配列を有するペプチドでコーティングしたステンレススチールプレートだった。各サンプルについては、粒子内の及び粒界での付着力を測定した。
【０１２９】
下記の表１の結果からわかるように、ピリン・ペプチドは、粒界の内側でスクランブル配列を有する同じ材料より約２０ｎＮ低い付着力を有し、粒界で約４３ｎＮ低い付着力を有する。結果は、ピリン・ペプチドが粒界で優先的に局在化している、言い換えると、ピリン・ペプチドが、粒界で大きなコーティング厚さを有するか、又はピリン結合の同じレベルは粒界で大きな付着力効果をもたらすかのいずれかを示す。いずれの場合も、データは、ピリン・ペプチドを金属表面に結合することにより見られる耐食効果の大きさについて説明する。
【表１】
2014517817.tif 000003
【０１３０】
ステンレススチールを含む金属およびポリマーを含む各種材料に結合する、ピリン・ペプチドのＤ形態及びＲＩ形態の能力及びピリンコーティング材料の特性を検討するために、Ｋ１２２−４ピリン・ペプチドのＤ及びＲＩ型を合成し、同じピリン・ペプチドのＬ型に対して試験した。
【０１３１】
１つの試験において、ステンレススチールプレートをＬ型ピリン・ペプチド（３つの異なるバクテリア）、Ｄ型ピリン・ペプチド、又はＲＩピリン・ペプチドでコートし、１つのプレートはコーティングしなかった。プレートは、付着力の変化について（図２Ａと２Ｂに関して上記に報告された試験と同様）最初に試験した。図１５Ａでわかるように、付着力の大幅な低減は、未コーティングプレートと比較して、ピリン・ペプチドの３つの形態すべてに見られた。
【０１３２】
図３Ａ−３Ｂに関して上記に記載されたものとして行なわれた同じ６つのサンプル上のＥＷＦ測定を図１５Ｂの中でプロットした。興味深いことには、Ｄ−アミノ酸形態は未コーティングプレートを含む他の５枚のプレートのうちのどれより実質的に低いＥＷＦを与えた。しかし、ＲＩ形態は同程度又はＬ型ピリン・サンプルより高いＥＷＦ値を与えた。これらの結果はＬ型Ｋ１２２−４ピリン・ペプチド（ｂｏｒｇ−Ｋ１２２ＳＳ）で覆われたか、Ｄ型Ｋ１２２−４ピリン・ペプチド（ｂｏｒｇ−Ｋ１２２ＳＳ−Ｄアミノ）で覆われたか、レトロ−インベルソＫ１２２−４ピリン・ペプチド（指定のｂｏｒｇ−Ｋ１２２ＳＳレトロ−インベルソ）で覆われた、ステンレススチール（ボルグ（等級３０４ステンレススチール））につてのＥＷＦ価値を示す図２７Ａでも見られた。予想されるように、レトロ−インベルソ・ピリン・ペプチドはトリプシン処理（両方の図２７Ｂ）に強くて、鋼（図２７Ｃ）の硬度もさらに著しく増加させた。ＥＷＦは表面の電子のエネルギーレベル、およびそれらの電子が他の材料に反応する能力の指標であるので、高いＥＷＦは一般に増強された耐腐食性を反映する。これは、ｂｏｒｇ−Ｋ１２２ＳＳレトロ−インベルソがコーティングしていないステンレススチールに対して５０％ぐらい腐食耐性を改善することを示す、図２７Ｄの中で示される試験によって確認される。
【０１３３】
この結果はピリン・ペプチドのＤ型とＬ型の両方、およびＬ型ピリン・ペプチドよりも優位に高いＥＷＦを与えているＤ型ピリン・ペプチドよりも高いＥＷＦを示すレトロインベルソ型が、ステンレススチールと金属表権の電子的性質を変更するやり方で、相互作用することができることを示す。
【０１３４】
Ｄ型ピリンがステンレススチールにしっかりと結合する能力を、コーティングしていないか、又はビオチン化対照ペプチド（ピリン配列のスクランブル化又は非結合領域のいずれかの）でコーティングしたもの、又はビオチン化Ｄ型ピリン・ペプチドでコーティングしたもののいずれかの、ステンレススチールステントに結合するペプチドの比較により調べた。個々のステント表面に結合したペプチドの量を３７ｏＣでＳＤＳの３％の溶液の表面を最初に洗い、引き続き、ＰＢＳで数回洗浄することにより測定した。洗浄表面を、ストレプトアビジンＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  （ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））でインキュベートし、次に、ＡＢＴＳ基質にさらし、４０５ｎｍで吸光度を測定した。図１６Ａで見られるように、コントロール・ペプチドのものより、ステンレススチールステントに結合したＤ形態ピリン・ペプチドは約２倍だった。
【０１３５】
金属結合したＬ形態ピリン・ペプチドに比べて、金属結合したＤ型ピリン・ペプチドの酵素タンパク質分解に対する耐性を調査するために、ステンレススチールプレートをＬ型ペプチド、Ｄ型ペプチド及びコントロール（スクランブル化ピリン配列）で、複製して、コーティングした。その後、各複製からの１つのサンプルを、０．２５％、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ７．４の濃度で、６０分間３７ｏＣにてトリプシンでインキュベートした。その後、サンプルを上記に記述したＨＲＴアッセイ方法によって結合タンパク質について分析した。
【０１３６】
図１７Ａは、トリプシンへの暴露前後にＬ型ピリンの結合したペプチド・レベルを示す。図からわかるように、ピリン・ペプチドの半分以上はプロテアーゼ処理によって除かれた。対照的に、結合Ｄ型ピリン・ペプチドの量は、プロテアーゼ消化（図１７Ｂ）に実質的に影響されなかった。結果は、（ｉ）ステンレススチールへのＬ形態ペプチドの共有結合がプロテアーゼ消化からの保護を与えない、及び（ｉｉ）結合Ｄ型ピリン・ペプチドは、酵素タンパク質分解から実質的に防御される、ことを実証した。
【０１３７】
Ｌ型ピリン・ペプチドに対するＤ型およびレトロインベルソピリン・ペプチドにより提供される強結合親和性およびタンパク質分解活性の点における本願発明の有利な効果を示す追加的な実験を行った。ここで見られるように、これらの利点はＤ型ピリン・ペプチドには特に著しい。
【０１３８】
図２８Ａ−２８Ｃは磨いていない（図２８Ａ）および６００グリッドで磨いたチタニウム表面（図２８Ｂおよび２８Ｃ）上のＤおよびＲＩ型ピリン・ペプチドおよびペプチド−ＰＥＧ共有結合対の効果を示す。示されるように、Ｋ１２２ピリン・ペプチドのＤ型とＲＩ型の両方は測定可能な程度に金属表面のＥＷＦを増加させ、Ｄ型は両方のチタン表面で最も高いＥＷＦ増加を示した。ＰＥＧ−Ｄピリン・ペプチド（図２８Ｃ）はＥＷＦを高めたが、ＰＥＧ化されていないＤ型ペプチドよりもその程度が少なかった。
【０１３９】
ＰＥＧ−Ｄピリン・ペプチドを含む各種Ｄ型およびＲＩ型ピリン・ペプチドでコーティングしたチタニウム表面のナノ押込み測定値を図２９に示す。ＰＥＧに共有結合したＤ型ペプチドを含むＲＩ型およびＤ型ペプチドの両方は未コートチタニウムに対して有意に表面を硬くしたことを示した。ＰＡＯ−Ｋ１３０１ペプチドはＰｉｌＡタンパク質の番号付けに従い残基位置１３０にもとのリジン残基がイソロイシン残基で置換されたアミノ酸変異を有するＬ型ピリン・ペプチドである。
【０１４０】
図２９で見られた表面硬化効果が表面に限られる（例えば、バルク金属効果ではない）ということを証明するために、ナノ押込み測定を図２９と同じピリン・ペプチドでコーティングしたステンレススチールで、図３０Ａ−３０Ｅのように、より高い打撃応力で行った。おわかりのように、硬度においてより高い応力でも変化はなかった。
【０１４１】
図３１Ａはチタニウムプレート（図３１Ａ）上の付着力およびスチールプレートの腐食速度（図１３Ｂ）におけるＰＥＧ−Ｄピリン・ペプチドの効果を示す。ＰＥＧ化されたＤ型ペプチドは付着力にあまり効果的ではなかったが、スチールプレートでは腐食速度を有意に低くした。
【０１４２】
ＰＥＧ化したピリン・ペプチドがコーティングされた金属の摩擦係数を有意に減らすことを証明するために、このケースでは、チタニウムプレート、未コートチタニウム表面のＡＦＭ摩擦係数測定値、および各種ピリン・ペプチドでコーティングしたチタニウムを前述と同様に実施し、結果を表３２Ａ−３２Ｅに示した。各図は、各コーティングについて作成された６つの異なるプロファイルから用いる代表的なプロファイルである。図３２Ａプロファイルに示すように、未コートチタニウム表面は、高くて、不安定な変位を示した。最も低い摩擦係数は図３２Ｂプロファイルに示すように、ＰＥＧ−Ｄ−ペプチドでコーティングしたチタニウムプレートで観察された。このプロファイルは表間された表面ラインに対して低くて非常に均一な変位により特徴付けられている。ペプチドの非ＰＥＧ化ＲＩ型（図３２Ｃ）とＤ型（図３２Ｄ）は、摩擦係数を有意に低くするが、どのプロファイルもＰＥＧ−Ｄ型と比較して、低められた摩擦係数を示さなかった。いくつかの改善は金属表面の別の場所にＤ型とＲＩ型が結合している非ＰＥＧ化ペプチドのＤ型とＲＩ型が適用されたとき（図３２Ｅ）に観察された。しかしながら、非ＰＥＧ化ペプチドの組合せはＰＥＧ化Ｄ型ペプチド単独よりも、より高くでより不安定な変位を示した。
【０１４３】
図３３Ａのフレーム２−９はステンレススチールステントの蛍光顕微鏡写真（フレーム１において２０倍で示す）であり、この表面は対照ペプチド（フレーム２および３）、Ｌ−ペプチド（フレーム４および５）、ＲＩ−ペプチド（フレーム６および７）、およびＤ型ピリン・ペプチド（フレーム８および９）である。見てのとおり、Ｄ−ペプチドは全血でインキュベートとした後でも強力な蛍光を保持していた。この事はタンパク質分解活性にもっとも強い耐性を示している。図３３Ｂはストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ビオチン標識されたペプチド／タンパク質に結合している）を用いて検出されたペプチド／プロテインスポットを示す。ステンレススチール上でＤ型およびＲＩ型ピリン・ペプチドだけがプロテイナーゼＫ耐性であった。この２つのピリン・ペプチドはＬ型ピリン・ペプチドよりもステンレススチール基板により効率的に結合するだろう。同様の結果はＬ型、Ｄ型、およびＲＩ型ピリン・ペプチドがチタニウムに結合したとき（３３Ｃ）でも観察され、ここにおいて、右パネルＡはＤ型ペプチドがチタニウム基板に結合したときに、最も高いプロテイナーゼＫ耐性を示した。同様な結果は、図３３Ｄで見られるように、Ｄ型とＲＩ型ピリン・ペプチドのポリウレタン基板への結合についても観察された。ここにおいて、対照ペプチドに対するＤ型とＲＩ型ピリン・ペプチドの基板への結合のレベルが示されている。ここには示していないが、Ｌ型ペプチドは相対的にポリウレタンへの結合が弱かった。
【０１４４】
同様の結果は、３つのピリン・ペプチド型がポリスチレン透析膜に結合して、各種破壊的処理を受けたときにも観察された。図３３ＥのフレームＡを見るとＤ型とＲＩピリン・ペプチドの両方がＬ型ペプチドよりもトリプシンに多いに耐性があることがわかる。図３３ＥのフレームＢはＳＤＳ，プロアテイナーゼＫおよび１０分間の煮沸を行った後の結合ペプチドの相対量を示す。それぞれのケースにおいて、Ｄ型ペプチドは膜に結合したとき、最も安定であり、Ｌ型は安定性が最も少なく、ＲＩペプチドはそれらの中間の安定性を示した。このパターンはシリコン基板に結合した場合にも見られた（図３３Ｆ）。
【０１４５】
３つのピリン・ペプチド型がスチレンスチールに結合して、穏やかな電流を流した場合のこれらのピリン・ペプチド型の相対的安定性を評価することに着目した。１つの実験では図３４に結果を示すが、１８Ｖ、５０ｍＡの電流を１０分間ステンレススチールに流すと、対照ペプチド、Ｌ型ペプチド、およびＲＩペプチドは実際に減少し、Ｄ型ペプチドはわずかにまたはまったく結合の損失がなかった。同様の結果は、より低い電流（３０および４０ｍＡで同じ時間）（データ示さず）でも達成された。これらの結果は、以下で説明するように、リガンド結合レセプター分子がピリン・ペプチドを介して金属基板に結合される各種アッセイフォーマットと特に一致する。基板がマイルドな電流に曝されたときのＤ型ピリン・ペプチドの結合維持能力により、基板に適度な（中程度の）電流を適用することにより、Ｄ型ピリン・ペプチドを介して基板に結合されてレセプターへ検体を結合するために関与するシグナルの有意な損失をせずに、非特異的結合を基板から排除することができる。
【０１４６】
ＩＩＩＥ．関連する適用
また、ピリン・ペプチド結合がコーティングした材料の硬度を増加することができる能力は、本発明の別の態様に従って、板ガラス又は自動車安全ガラスのような、他の硬い材料表面に利用することができる。この適用では、掃除されたガラス表面が、ピリンの層で表面をコーティングするのに効果的な条件の下にてピリン・ペプチドで接触される。基板に結合したタンパク質の量をＨＲＰアッセイを使用して、上記のように測定した。図１６Ｂで見られるように、Ｄ形態ペプチドは、ＳＤＳ処理によってでさえ除去に抵抗して、ガラス表面にしっかりと結合され、コントロール・ペプチドで行ったのより、ステンレススチールステントに結合されたピリン・ペプチドは約２倍であった。
【０１４７】
別の適用では、表面処理は機械中の互いとの可動接触子にあるコーティングした金属表面の潤滑性を増強するために使用される。ここで目的機械部品を、共有結合でピリンコーティングを形成する条件の下で、上記のように、ピリン・ペプチドに部品をさらすことにより、増強された表面潤滑性のために前処理する。あるいは、ピリン・ペプチド溶液を機械操作の間に機械部品のより大きな潤滑性を維持するために、操作又は一時停止の間に機械の接触表面に塗布してよい。
【０１４８】
別の適用では、表面処理を用いて機械中で互いに接触する可動接触子にあるコーティングした金属表面の潤滑性を増強する。ここで目的機械部品を、共有結合でピリン・コーティングを形成する条件の下で、上記のように、ピリン・ペプチドに部品をさらすことにより、増強された表面潤滑性のために前処理する。あるいは、ピリン・ペプチド溶液を機械操作の間に機械部品のより大きな潤滑性を維持するために、操作又は一時停止の間に機械の接触表面に塗布してよい。
ＩＶＡ．共有結合で結合した化合物を有する金属基板
【０１４９】
（ｉ）上記に詳述するように、基板へのピリン・ペプチドの共有結合及びピリンへの直接的又は間接的化合物の共有結合、言い換えると、ピリン化合物複合体を介する、という手段で、本発明の本態様は、例えば、レセプターなどの化合物が基板にて共有結合する金属基板を含む。未結合ピリン・ペプチドについて上記に説明のように、コーティングした基板は、最初に金属表面へ結合していないピリン・ペプチドを付着させること、続いて、結合ピリンへ化合物を共有結合することにより、あるいは最初にピリン化合物複合体を作り、続いて、金属表面へのその複合体を結合することにより、作成される。ピリン・ペプチドに化合物を共有結合で結合する方法は、例えば、アミン又はカルボキシル基を介して直接的な化学結合により、又は二官能基カップリング試薬を使用することによって行うなど、周知である。化合物がそれ自体ペプチドである場合、ピリン化合物複合体は組み換え又は固相合成によって融合タンパク質として形成することができる。コーティングした基板は、金属表面へのピリン結合による改変された表面電子特性を有し、下記に詳述されるように、本発明を実証するために行なわれた試験は、表面結合化合物に検体関連分子が結合することにより、基板表面を流れる電流が調整されることを示し、基板にわたって流れる電流の変化によって、そのような結合態様を記録することを可能にする。以下に見られるように、化合物も、基板に（例えばＥ／Ｋ多重コイル複合体によって）共有結合で間接的に結合してよい。図３３Ａ−図３３Ｆのデータから理解できるように、ピリン・ペプチドのＤ型はこの適用に好適であり、各種金属基板においてより安定に結合する。
ＩＶＢ．結合ピリン基板を有するバイオセンサー装置
【０１５０】
図１８Ａと１８Ｂは、発明の実施態様に従って構築されたバイオセンサー・アッセイ装置３２を示す。装置は、金属検出プレート３４上にピリン・ペプチドコーティングで観察された、改変された電子特性の有益性を有する。すなわち、プレート３４は、ステンレススチール、スズ、鉄、又はチタニウムのような金属から作られ、ピリン・ペプチドによってコーティングされた場合、改変された電子表面性質を有する。上記のように、ピリンコーティングは、プレート表面を上記のピリン・ペプチド３６及び検体を結合する部分３８の複合体にさらすことにより、又は結合した、非複合体ピリン・ペプチドに化合物を付けることにより形成される。プレートはそれ自体、その側面が装置中の壁４０によって形成され、部分的に水性の導電媒体４２で充填される浅いバイオセンサー反応容器４１の下部表面を形成する。このバイオセンサー表面に結合されたピリン・ペプチドはＰＥＧ−ピリン・ペプチド複合体の組み合わせ、例えば板へのサンプルの非特異結合を減らす働きをするＰＥＧ−Ｄ−ピリンと例えばこの表面に化合物を共有結合するＲＩ−化合物複合体である第二の複合体、を含んでいても良い。
【０１５１】
反対の回線接続が検出プレートの下部側面へある場合、装置中のバイオセンサー回線は容器、電圧ソース４６及び電流計４８へ伸びる電極４４を含む。
【０１５２】
図１９と２０は、バイオセンサーの２つの表面の構成を示す。図１９では、レセプター（リガンド結合）分子（Ｒ）は、ピリン・ペプチド（かぎ型部分）に共有結合で結合し、次に、バイオセンサー表面に共有結合で結合される。バイオセンサー基板を横切ったコンダクタンスは、（ｉ）基板表面とピリン・ペプチドの結合相互作用及び（ｉｉ）コンダクタンス上のレセプターＲの影響によって決定される。リガンドＬ（例えば検体）がレセプターに結合する場合、表面での電子特性はさらに変調され、その結果観察されたバイオセンサー電流の変化を引き起こす。図２１に示された電流の変化は、リガンドがレセプターに結合後、高い電流から低い電流となる。
【０１５３】
図２０では、レセプターＲは、基板へのピリン／Ｋコイル複合体の共有結合を通じて基板表面に間接的に結合され、その後、レセプター‐Ｅコイル複合体と多重コイル相互作用する。この実施態様の中で、バイオセンサー表面をコーティングする複合体の形成は、ピリン・ペプチドとレセプターＲに結合するＫコイル、Ｅコイルの及びレセプターＲに結合することができるリガンドＬである、３−構成要素の複合体である。この実施態様では、表面上のコーティング、マスキングＫ−コイル部位に検体を結合するために、最初に、バイオセンサーを検体と反応させる。この反応をＫ−コイルのマスクキングによって引き起こされた電流の変化として直接に読んでもよく、又は検体反応の後にまだマスキングされていないＫ−コイルの量に応じて、Ｅ−コイルに結合するために、Ｅ−コイル試薬が、この段階で添加されてもよい。
【０１５４】
図２２Ａと２２Ｂは、図２０に示した多重コイル構成によってＨｉｓ部分（レセプター）が基板表面に結合されるバイオセンサー相互作用についたボルタメーター・サイクル・カーブである。図２２Ａは、それ自身及びその後Ｈｉｓの部分の特異的抗‐Ｈｉｓ抗体を添加することにより、ピリン構築物を介してステンレススチールに共有結合でリンクされたＥ−コイルに複合体化したＫ−コイルに表示されたＨｉｓの部分について完全な環式のボルタメトリーカーブを示す。図２２Ｂは、正電圧バイアスだけでなくマイナス電圧バイアスの下でＨｉｓ部分に結合する抗体によって電流が変化させられることを実証する、左ねじれ部分の環式のボルタメトリーのカーブの増幅を示す。Ｈｉｓレセプターにａｎｔｉ―Ｈｉｓ抗体を結合することは、最低の電流サイクルを生産し、バイオセンサー表面に結合する「検体」を有する電流の低下を証拠づける。Ｈｉｓレセプターがピリン・ペプチドによってバイオセンサー表面に直接に結合された時、同様の結果は得られ、使用された検体はａｎｔｉ―Ｈｉｓ抗体だった。
【０１５５】
センサーの操作を理解するために、下記の表２からのデータであって、（ｉ）コーティングがないステンレススチール板（修飾されない）（ｉｉ）Ｅ−コイル（負に帯電したロイシンジッパー）ペプチド（Ｅ−ＰＡＫ）に結合したピリン・ペプチドでコーティングしたステンレススチール板、及び（ｉｉｉ）反対に帯電したＫ−コイルペプチドに結合した同じ複合体でコーティングされた第３のステンレススチール板、すなわち、そのペプチドは、Ｅ−コイル／Ｋ−コイルヘテロダイマー（Ｋ−Ｅ−ＰＡＫ）に結合する、ステンレススチール板について、Ｉｃｏｒｒ、Ｅｃｏｒｒ、腐食速度及びＲｐデータを示すデータからの耐腐食性データを考慮することは有用である。Ｉｃｏｒｒカラムを考慮すると、データは、プレートに結合するＥ−ＰＡＫがそのＩｃｏｒｒ値を著しく増加させることを示し、ＰＡＫピリンで単独で見られた効力と反対である。（図９Ａを参照）。複合体が中和される場合（Ｋ−Ｅ−ＰＡＫ）、Ｉｃｏｒｒ値は、未コーティング金属より実質的に低く、未結合ペプチドで観察された効力に同様である。Ｅｃｏｒｒ、腐食速度及びＲｐ値に対する同様の影響は、データから見られ、すなわち、反対に帯電したＫコイルで結合することによるＥ−コイル影響を中和することが、Ｅ−ＰＡＫピリン結合によりもたらされた表面効果を改変させる。
【表２】
2014517817.tif 000004
【０１５６】
バイオセンサーの様々な利点は上記の記載から評価することができる。第一に、検体結合レセプターをバイオセンサー表面に共有結合で結合するピリン・ペプチドが、バイオセンサー表面にて直接に電子活性に影響するので、電流の中で、直接効果（例えば低減）をもたらすリガンド結合により、表面の複合体のサイズ及び電荷を改変させる。第２に、電子活性又は分子と直接に相互に作用する金属の表面の電子の能力が、相互作用の程度及び力を決定するので、金属表面と分子の相互作用はプラスチックとの相互作用とは基本的に異なる。酸化被膜を形成しない金属（金のような）は非常に活性のある表面の電子（結晶のエッジ効果による）を持っており、それらの表面への材料を容易に吸収する。これらの材料は、サンプル・マトリックスからのタンパク質及び他の分子の非特異性の吸着に影響を受けやすく、したがって、バイオセンサー・プラットフォームとして有用ではない。ステンレススチールのような金属は、表面の酸化を受け、不動酸化物層（不動態化された）を形成し、非特異的に結合するイベントを最小化にし、材料をそれらの表面に容易に結合しない（従って医療と食品産業でのそれらの広範囲の使用）４−６。Ｔ４Ｐ１７ペプチドを使用して、特異的なペプチド／タンパク質成分を不動態化されたステンレススチールに容易に結合させる能力は、バイオセンサー適用のリガンド・レセプター相互作用を検出する際に信号対ノイズ比を改善する際に有効な利点を与える。上述したように、ステンレススチールに結合するＴ４Ｐ１７は電子伝達を仲介し、電圧バイアスにさらされた時バイオセンサーとして機能することができる。上記に報告した実験は、金属表面に結合したピリン‐レセプター結合物に結合するリガンドに応答してバイオセンサー表面を横切って電子流を変調する能力を実証する。
【０１５７】
ＲＩ及びＤ型ペプチドはバイオセンンサー製品において競合する利益を提供する。ＲＩペプチドはＥＷＦにおいて強力な電気効果を生じ、このことはより強力な非局在化効果を示しているので、検体または検体関連分子がピリン・ペプチドを通じて基板に付着されているレセプターに結合するときに、ＲＩペプチドは高い電気反応を提供するだろう。一方、Ｄ型ペプチドはレセプターのより安定な付着を提供するようであり、前述のように気質の適度な電流を適用することで、サンプル物質の非特異的を除去することができるだろう。前述のように、センサー表面はＰＥＧ部分を有する１つまたは両方の１つのペプチド組み合わせでコーティングすることもできる。
ＩＶＥ．結合ピリン基板を有する一般的なアッセイ装置
【０１５８】
図２３Ａと２３Ｂは、プレート１８を有する検体探知装置１６を示し、そのプレートの上部の検出表面がピリン・ペプチド２０及び検体‐特異的ターゲット分子２２の複合体でコーティングされる。プレートはピリン・ペプチドが結合する様々な材料から作られてよいが、プレートは、好ましくは、ピリンがそれに共有結合で結合する、ステンレススチール、スズ、鉄、及びチタニウム表面のような金属である。共有結合は、生産、タンパク質安定性、コーティング安定性の容易さの点から多くの利点を与える。また、装置は、２５で示されるように検出表面を照らすために、例えばＵＶ源のような、ビーム源２４及び光検出器２６を含む。ペプチド複合体は、表面への非特異結合を減らすために機能することができるＰＥＧ部分を追加的に含んでいても良い。
【０１５９】
操作では、検出プレートの表面は、可溶性検体分子３０として図１２Ｂの中で示される目的の検体を含む流体サンプルで覆われ、これらは、検出表面上の検体特異的な分子２２と反応することを許される。示された蛍光検出器では、反応混合物は、検出表面に結合した検体と特異的に反応することができる蛍光性の標識抗体又は他の媒体を含んでよい。その後、検出表面は、非結合成分を除去するために洗浄される。ついで、図１２Ｂで示されるように、蛍光２７が放射され、反応表面は結合螢光の存在の有無及び存在するときはその量について分析され、アッセイを完成する。
【０１６０】
従来の螢光アッセイが装置に組み入れられてよいと認識されるだろう。例えば、ピリン・ペプチドは蛍光性部分を含んでよく、検体結合部分は、ピリン蛍光性部分から螢光を消すのに有効な蛍光性の消光物質を含んでよい。この実施態様では、検体を検体結合部分に結合することは、消光物質の効果を覆うのに有効であり、検体結合部分に結合する検体の存在下にて、より大きな螢光を生産する。
【０１６１】
代替的な実施態様においては、ピリン・ペプチド及び検体結合部分は第１と第２の蛍光種をそれぞれ含んでよく、所定の励起波長で励起された時、それは蛍光共鳴エネルギー転移を生産するのに有効である。この構成において、検体結合種への検体の結合はそのようなエネルギー転移を阻害するのに有効であり、観察された螢光を低減させる。
【０１６２】
前述のように、Ｄ型ペプチドはこの適用において２つの有意な利点を有する：表面へのより安定した結合および電流の適用による非特異結合物質を除去する能力。
Ｖ．コーティングした金属表面を有する医療機器
【０１６３】
例えば、ステンレススチール、スズ、鉄、及びチタニウム表面のような、ある金属表面に結合するペプチドついて、上記に記載の試験は、ペプチドと金属の間の共有結合の（電子共有）結合の形成を示して、ピリン・ペプチド結合が金属の表面の電子特性を改変することを実証する。この発見は、ステンレススチール、スズ、鉄、及びチタニウム表面に、例えばペプチド、脂質、核酸、代謝産物、又は薬物分子のような、生物活性の分子を共有結合で結合するための方法及びピリン・ペプチドを介して、露出した機器の金属に共有結合で結合する生物活性化合物を有する新しい医療機器を提供する。
【０１６４】
方法の中で意図する他の金属は、周期表の列４−６及びカラム９−１２からの遷移金属であって、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、オスミウム、白金、金、及び水銀、及びそれらの混合物及び合金を含み、メタロイドのシリコン及びゲルマニウム、及びそれらの酸化物を含む。
【０１６５】
この方法では、金属の表面は、ＩＶタイプ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質から由来するジスルフィド・ループを含む、及びそのループのＮ−又はＣ―末端側上のどちらか又は両方の、０−１０、好ましくは、０−５の追加の残基を含む、合成ピリン・ペプチドで接触される。
【０１６６】
共有結合された生物活性分子を含む前に、ピリン・ペプチドまたは複合体を調製した場合、接触させる工程を単独で行って、金属表面へ生物活性分子を共有結合させる。生物活性分子を有するペプチド（この場合ピリン・ペプチド）の複合体を調製する方法は、周知であり、ペプチドとペプチド生物活性分子の間の融合タンパク質を形成すること、及びペプチドへの生物活性分子の共有結合の反応サイトを提供するための具体的に改良した化学反応の使用を含む。例えば、ピリン・ペプチドの固相合成中の最終工程は、例えばアルデヒドのような、反応基（それは生物活性分子と共有結合の反応に使用することができる）の使用を含んでよい。
【０１６７】
あるいは、金属表面へペプチドをつけた後に、金属表面上の結合ピリンに生物活性分子を共有結合でつなぐために、再度、従来の二価性試薬又は特定の化学反応基の化学反応を利用して、ピリン・ペプチドで生物活性分子を反応させてもよい。
【０１６８】
目的のポリペプチドを得る際に使用する別の適用は、例えば、組み換えのポリペプチド合成によるように、目的のポリペプチドを有する、上記に記載されたタイプのピリン・ペプチドを含む、融合タンパク質を最初に合成することにより実行される。その後、融合タンパク質は、ステンレススチール、スズ、鉄、チタニウム、クロム、プラスチック、ガラス、ケイ酸塩、セラミックス、又はそれらの混合物から作られた基板で接触を受けて、それによって、基板へのピリン・ペプチド部分の結合を介して、基板へ融合タンパク質が結合する。
【０１６９】
非結合材料を除去するために基板を洗った後に、基板は、結合ピリン・ペプチドから目的のポリペプチドを特異的に切断することができる薬剤で処理される。これは融合タンパク質中の規定された配列リンカーを特異的に切断することができるタンパク質分解酵素で基板を処理すること又は融合タンパク質中の前記リンカーの特異的に切断できる化学薬品又は放射エネルギー源で基板を処理することを含んでよい。その後、放出された目的のポリペプチドは、実質的に精製された形態で、基板から溶出される又は洗われる。
【０１７０】
結合方法の別の適用は、所望の表面性質を有するか、又はそれらの表面上の所望の生物活性分子を運ぶ移植可能な装置を調製する際にある。例えば、本発明の骨インプラントはステンレススチール又はチタニウムの移植構造を含み、その一部は骨の領域内に、又はその領域に対して放置するのに適している。移植へのボンド・アタッチメントを促進するために、この部分は、上述の合成ピリン・ペプチド、及びＲＧＤのような、骨形態形成タンパク質因子、又は骨形態形成タンパク質因子ＢＭＰ２−ＢＭＰ７の複合体でコーティングされる。
【０１７１】
関連する適用では、ピリン・ペプチドは、金属又はポリマーのステントの表面に適用され、例えば、血管内の移植組織部位での望まれない凝固又は瘢痕をもたらしうる表面反応が促進することをより少ない傾向にするような、改善された表面性質を有する、本発明によるステントを生産する。あるいは、コーティングは、例えばピリンと薬の間のエステル・リンカーのような、バイオリリーサブル（ｂｉｏｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）リンカーを持つ、ピリン−ｌｉｍｕｓ薬剤複合体のような、ピリン・ペプチド及び生物活性分子の複合体によって形成されてよい。
【０１７２】
下記に見られるように、コーティングした金属表面は、装置に対して、身体におこりうる炎症反応を著しく低減する。
ＶＩ．低減された炎症反応を備えた医療機器
【０１７３】
感染又は細胞の損傷／ストレスによって伝達した炎症に加えて、莫大な量の医原性の炎症は、医療機器類によって引き起こされる。非生物学的適合の医療機器へのヒト組織、細胞、及びタンパク質の露出は、臨床効果が非常に過小評価される、機能障害の宿主レスポンスを引き起こす。実施例は、組織反応、及び血管グラフト、人工関節及び他の移植可能な装置を含む医療用人工装具の挿入に続く機能障害の創傷治癒を含む。同様に、白血球及び凝固系の活性は、心肺バイパスと血液透析のような体外循環血液回路に定期的にさらされる患者に重大な罹患率をもたらす。これらのイベントは、さらに急性及び慢性疾患を持った患者の治癒、再生及びリハビリテーションに影響を与える。
【０１７４】
発明の別の態様によれば、Ｄ−アミノ酸、Ｄ型とＬ型アミノ酸の混合物、及びレトロ−インベルソ（ＲＩ）型でのＤ−アミノ酸、さらにはこれらはすべてＰＥＧに結合した形態でもよい、で作られたピリン・ペプチドで金属表面をコーティングすることにより、例えばチタニウムのような、医療機器の中で使用されるある金属への炎症反応を調査した。
【０１７５】
ある試験では、人間の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）細胞を標準細胞培養状態の下で単独で、又はＤ形態ピリン・ペプチドでコーティングしていないか又はコーティングしたかいずれかである、チタニウム又は鋼板の存在下においてインキュベートした。３７ｏＣにて、ＲＰＭＩ培地中２４時間のインキュベーション後、培養培地をサイトカインＩＬ−１β（それはＰＢＭＣの中の炎症反応のインジケータである）について分析した。チューブリンをハウスキーピング・コントロールとして分析した。図２５Ａは、５つのサンプルの各々について測定されたＩＬ−１β及びチューブリンのウェスタンブロットを示す。結果からわかるように、Ｄ形態ピリン・ペプチドコーティングはステンレススチール及びチタニウムサンプルの両方中の炎症反応を防止するのに効果的だった。この結果は、チタニウムサンプルについて図２５Ｂの中で示される棒グラフで定量的に見ることができる。
【０１７６】
同様の試験が同じサンプルに対するヒトＴＨＰ−１マクロファージ細胞の炎症反応を試験するために行なわれたが、非結合ピリン・ペプチド配列を表わすコントロール・ペプチド１又は２でコーティングした、ステンレススチール又はチタニウムから作られた追加サンプルを含んでいた。その後、コーティングした及びコーティングしていないサンプルを７２時間３７℃にてＲＰＭＩ培地中ＴＨＰ−１マクロファージとインキュベートした。その後、培養培地及び細胞の溶解産物をサイトカインＩＬ−１β及びハウスキーピング・タンパク質チューブリンについて分析した。結果を図２６Ａの中の２つのウェスタンブロット中に示す。結果からわかるように、チタニウム単独が、Ｄ形態ピリンコーティングによって実質的に縮小された強い炎症反応を引き起こした。図２６Ｂの中で与えられたステンレススチールサンプルについての量的図は、コーティングしていないステンレススチールへの炎症反応はやや小さかったが、それにもかかわらず、結果はＤ型ペプチドコーティングによって防止されたことを示す。Ｄ形態ピリンコーティングの影響が、かなり特異的であることは２つのコントロール・ペプチドサンプル（それらは適度に強いレスポンスを示す）から明白である。
【０１７７】
ある態様においては、本発明は、身体に移植された時、炎症反応細胞に露出される表面がある医療機器を含み、ここで、身体中においてこれらの表面は、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ−末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ、
（ｉｉ）前記ループのＮ又はＣ−末端側上のいずれかの０−１０、好ましくは、０−５の、追加的残基、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−アミノ酸、Ｄ、Ｌアミノ酸の混合物、又はレトロ−インベルソ（ＲＩ）型でのＤ−アミノ酸から構成されること
を含む合成ピリン・ペプチドでコーティングされていることを特徴とする。これらのペプチドは任意でＰＥＧ部分に結合されていてもよい。
【０１７８】
図２４Ａ−２４Ｄにおける結合試験は、ステンレススチール（図２４Ａ）、クロム・コバルト・ステント（図２４Ｂ）、ラテックス・カテーテル（図２４Ｃ）及びシリコン静脈カテーテル（図２４Ｄ）を含む様々な医療機器及び機器表面へのＤ形態ピリン・ペプチドの強い結合を実証する。各ケースでは、サンプルはコーティングがない（図２４の中の白い棒グラフ）、コントロールスクランブルＤ形態ピリン・ペプチドでコーティングした（斜線を施した棒グラフ）、又はＤ形態ピリン・ペプチドでコーティングした、のどちらかだった。その後、サンプルを洗浄し、上記に記述されたＨＲＴアッセイによって結合タンパク質について分析した。すべてのサンプルについては、結合ピリン・ペプチドのレベルが、実質的にコントロールのレベル以上であり、ステンレススチールを有するサンプルが、最も高い、結合コーティングを生ずるようだった。本発明は、金属及び非金属ステントの両方、さまざまな弾力性のある材料から作ったカテーテル、カテーテルの末端の支持装置、及び心臓及び他の血管のバルブを含む、対象となる身体に移植されるか一時的に移植される他の医療機器を含み、前記機器が、身体中の炎症反応にさらされる表面を含み、Ｄ型又はＲＩ型ピリン・ペプチドでコーティングされていることを特徴とする。
【０１７９】
関連する態様においては、本発明は、医療機器を移植する前に、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ、
（ｉｉ）ループのＮあるいはＣ末端側のどちらか又は両方上の０−１０、好ましくは、０−５の追加の残基、及び
（ｉｉｉ）Ｄ−アミノ酸、ＤとＬアミノ酸の混合物、又はレトロ−インベルソ（ＲＩ）型でのＤ−アミノ酸の構成
を有する合成ピリン・ペプチドで機器の露出表面をコーティングすることにより、対象内に移植された医療機器に対する炎症反応を防止する方法も含む。
【０１８０】
更なる他の態様において、本発明はＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンに結合しているＣ末端レセプター由来のジスルフィド・ループを含み、かつこのループのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含み、任意でＰＥＧ部分に共有結合し、非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルム形成を抑制するのに有効な量で存在する、Ｄ型またはレトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドを物品の表面に適用することにより、バイオフィルム形成を抑制する方法を含む。好適なピリン・ペプチドはＤ型ペプチドであり、好適なペプチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で定義され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、または９で定義される配列に例示されるような配列を含んでも良い。
【０１８１】
物品は例えば、非医療機器であり、金属パイプまたはポリマー透析膜等があり、これらは通常使用の間にバイオフィルム形成が起こる。あるいは、医療機器としては、ポリマーカテーテル、金属またはポリマーステント、心臓弁あるいは金属またはセラミック偽骨または骨インプラント等がある。より一般的には、物品におけるこれらのコート表面はスチール、スズ、鉄、またはチタニウム等の金属、ポリマー、セラミックス、またはシリケート表面でよい。
【０１８２】
この方法は特定の態様において、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）によるバイオフィルム形成を抑制するために用いられる。ここにおいて、物品表面に適用されるピリン・ペプチドの量はリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）またはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のそれぞれについてバイオフィルム形成を抑制するのに効果的な量である。
【０１８３】
以下で報告する試験において、ステンレスコーティングした非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアのバクテリア結合をブロックするためのＤ型またはＲＩＴ４Ｐピリン・ペプチドの態様を試験した。実験的では、Ｄ型、ＲＩ型＋ＲＩＴ４Ｐピリン・ペプチド（Ｋ−１２２−４）でコーティングしたまたはしなかったスチレンスチールプレートを室温で、１時間、１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１×１０５ＣＦＵ／ｍｌバクテリアの培地中で攪拌しながら培養した。このプレートを１回当たり５ｍｌの１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２で５回洗浄して、１ｍＭの水溶性アクリジルオレンジで室温にて染色し、水で洗浄し、風乾した。このプレートをその後落射蛍光顕微法で試験し、６００  ４０Ｘ視野で顕微鏡写真を撮り、視野あたりの結合バクテリアの数を決定した。これらのコンディションは成熟バイオフィルムを確立するための能力を予測するバイオフィルム成形の初期ステージを調べる。
【０１８４】
図３５Ａはプレートに結合しているリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）についての結果を示し、Ｄ型およびＲＩピリン・ペプチドがリステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）がコーティング表面に結合することを抑制することを示す。Ｄ型ペプチドはこれら３つの結果を有意に抑制したが、ＲＩ型はあまり有意な結合抑制結果を示さなかった。
【０１８５】
図３６Ａ−３６Ｆに示すように、各種ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）株で同様の結果が得られた。ここにおいて、Ｄ型ペプチドは一般的であるが、常に２つのピリン・ペプチドのうちでより広く抑制結果を示した。
【０１８６】
Ｌ型ピリン・ペプチドはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアのコーティングされた表面への結合の抑制において効果的であることは知られているが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｇｅｎｅｓ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を用いた初期の研究は、Ｌ型ピリン・ペプチドでコーティングしたまたはコーティングされていないプレートへのバクテリアの結合において、違いを示すことに失敗した。つまり、この結果はＬ型Ｔ４Ｐピリン・ペプチドは、表面に覆われたときはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルム形成の抑制において、効果的であるが、Ｄ型及び／またはＲＩＴ４Ｐピリン・ペプチドにより非シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリアによるバイオフィルム形成の抑制も達成することができ、Ｄ型ペプチドが一般的により効果的であることを示す。
【０１８７】
図３７Ａ−３７Ｃはステンレススチール表面におけるバイオフィルムの形成についてのＰＥＧ−Ｄ−ピリン・ペプチドの効果を示す。各フレームにおいて、ＰＥＧ−Ｄ−ピリン・ペプチドで覆われたエリアは、金属表面の未コート領域における明らかなバイオフィルム形成とは対照的に、バイオフィルム形成がわずかであるがまたはまったくなかった。この抑制はシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｕ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）バクテリア株（図３４Ａ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）バクテリアの両方にもあてはまる。本願発明のサポートについて行われた試験は他のバクテリア病原体のＰＥＧ−Ｄ−ピリン・ペプチドコーティングによる抑制を示す。これらの観察結果は、バイオフィルム形成の制限についてＰＥＧの添加により表面を修飾することが効果的であるものの、このアプローチの商業的な制限はＰＥＧ表面処理の安定性及び長期間維持のための加工であったことを報告している刊行物と一致する。本願発明ではペプチドコート表面において、バイオフィルム形成を抑制することが本願発明者らにより示されている、ピリン・ペプチドを介して金属表面にＰＥＧを共有結合させることによりこの問題を解決する。
ＶＩＩＩ．覆われたパイプおよび方法
【０１８８】
硬度を高め腐食を抑制するだけでなく、コート表面における摩擦抵抗を減らすためのＰＥＧのＤ型およびＲＩ型ピリン・ペプチド共有結合体の能力は、硬度を高め腐食耐性を維持しつつ、液体が流れるパイプの摩擦抵抗を減らすためのドリルおよびパイプ工業において重要な応用技術である。
【０１８９】
オイル及びガスの調査において、液体を圧力下で岩盤構造に送りこんで、岩層を砕くこと、および取り込んだ天然ガスを放出すること（フラッキングとして知られているプロセス）は一般的である。フラッキングする液体は、水、砂等のプロッパント、及び化学添加剤のスラリーである。このパイプをＰＥＧ−ＤまたはＲＩ型ピリン・ペプチド結合体でコーティングすることにより、パイプ等に送り込まれるスラリーの摩擦抵抗を有意に減らし、コストを減らし、ポンプ操作の効率を高めることができる。同様に、長距離にわたりオイルまたは天然ガス生成物を運んでいるパイプラインについて、輸送コストにおける有意な改善を効率性が内部コーティングを有するパイプでもって達成される。
【０１９０】
パイプを処理してこのパイプを通って流れる液体の摩擦抵抗を減らす方法の実施において、
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジシルフィドループを含み、０−１０個の追加的な残基をこのループのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に含むＤ型またはレトロ−インベルソ合成ピリン・ペプチドと
（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分との複合体を、パイプの壁にピリン・ペプチドを結合してパイプの壁を通って流れる液体の摩擦係数を減らすのに効果的な量でパイプに導入する。例えば、共有結合体を最初のコーティングおよびコーティングの定期的な回復のために、１−１０グラム／キロリットルの最終液体を定期的にフラッキングスラリーに適用することができる。以下で述べるように、パイプ内部表面のコーティングを意図した追加的共有結合体の大部分に粒子が結合しかつ削除されるのを防ぐために、スラリーの中の砂粒子はＰＥＧ−ピリン共有結合体でコーティングされる。
【０１９１】
好適なピリン・ペプチドはペプチドのＣ−末端またはＮ−末端の１つまたは両方に共有結合されたポリエチレングリコール部分を有するＤ型ピリン・ペプチドであり、ペプチド共有結合体のこのポリエチレングリコール部分は０．２乃至５００ｋＤａｌの分子量を有する。
【０１９２】
ピリン・ペプチド複合体が付着するパイプの内部表面は、金属、ポリマー、セラミック、またはシリケート表面でよい。例示的な金属としては、ステンレススチール、カーボンスチール、チタニウム、銅、真鍮、スズ、鉄、銀、およびマグネシウム、ならびにこれらの合金がある。パイプはスチレンスチール内部行面を有する場合、導入によりパイプの内部表面に付着するピリン・ペプチド共有結合体の量は前記内部表面の腐食を減らすのに十分な量である。
【０１９３】
本発明の関連する側面では、金属、ポリマー、セラミック、またはシリケート表面の露出表面の摩擦係数を減らすのに十分な量の
（ｉ）ＩＶ型緑膿菌（Ｔ４Ｐ）ピリンのＣ末端レセプター結合タンパク質由来のジスルフィド・ループとこのループのＮ―末端またはＣ―末端のいずれかまたは両方に０−１０個の追加的な残基を含むＤ型またはレトローインベルソ合成ピリン・ペプチドと
（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分との複合体でコーティングした物品に関する。この覆われた表面は低められた摩擦係数を有し、金属製品の場合には、高められた腐食耐性を示す。例示的なピリン・ペプチドは、例えば、Ｄ型ペプチドとＰＥＧ部分は、上で説明されたとおりである。
【０１９４】
この製品は、コーティングされる製品の表面を非ＰＥＧ化ピリン・ペプチドコーティングで説明したように、ＰＥＧ−ピリン共有結合体の溶液または懸濁液に曝すことにより製造される。
【０１９５】
この製品が内部壁表面をペプチド共有結合体で覆われたパイプである場合、表面を覆っているペプチド共有結合体はパイプを通って流れている液体の摩擦係数を減らすのに十分な量で存在する。
【０１９６】
この製品が１００ミクロン以下の幅寸法を有するミクロフルイディックチャンネルである場合、このチャンネル内部表面は、このチャンネルを通って流れている液体の摩擦抵抗、例えば、細孔パイプを通る砂スラリーの摩擦抵抗を減らすのに十分な量のペプチド共有結合体で覆う。
【０１９７】
別の態様において、機械の稼動部、（相互掌状ギアまたは往復運動する要素等）をペプチド共有結合体でコートして部品の摩擦係数を減らして部品を長持ちさせる。
【０１９８】
また別の態様において、製品は金属導線または電極等の表面を有し、これらをコーティングして導線の初期の組み立てまたは交換の間の腐食または磨耗から導線を保護する。
【０１９９】
更なる別の態様において、コーティングされた製品は砂等のスラリー粒子であり、ＰＥＧ−Ｄ−またはＲＩ型ピリン・ペプチド共有結合体をこの粒子の懸濁液へ添加することにより、あるいは、単に共有結合体をスラリーに添加することによりコートされる。粒子の減じられたパイプを通るスラリーの対流動性をさらに減らす。
【０２００】
本発明は特定の実施態様及び適用に関して記述されたが、様々な修飾が特許請求の範囲を逸脱せずに作ることができることが理解されるだろう。
【図１ＡＢＣＤ】
2014517817.tif 000005
【図２ＡＢ】
2014517817.tif 000006
【図３ＡＢ】
2014517817.tif 000007
【図４】
2014517817.tif 000008
【図５】
2014517817.tif 000009
【図６ＡＢ】
2014517817.tif 000010
【図７ＡＢ】
2014517817.tif 000011
【図８ＡＢ】
2014517817.tif 000012
【図９ＡＢ】
2014517817.tif 000013
【図１０ＡＢ】
2014517817.tif 000014
【図１１】
2014517817.tif 000015
【図１２ＡＢＣ】
2014517817.tif 000016
【図１３】
2014517817.tif 000017
【図１４】
2014517817.tif 000018
【図１５ＡＢ】
2014517817.tif 000019
【図１６ＡＢ】
2014517817.tif 000020
【図１７ＡＢ】
2014517817.tif 000021
【図１８ＡＢ】
2014517817.tif 000022
【図１９】
2014517817.tif 000023
【図２０】
2014517817.tif 000024
【図２１】
2014517817.tif 000025
【図２２ＡＢ】
2014517817.tif 000026
【図２３ＡＢ】
2014517817.tif 000027
【図２４ＡＢＣＤ】
2014517817.tif 000028
【図２５ＡＢ】
2014517817.tif 000029
【図２６ＡＢ】
2014517817.tif 000030
【図２７ＡＢＣＤ】
2014517817.tif 000031
【図２８ＡＢＣ】
2014517817.tif 000032
【図２９】
2014517817.tif 000033
【図３０ＡＢ】
2014517817.tif 000034
【図３０ＣＤＥ】
2014517817.tif 000035
【図３１ＡＢ】
2014517817.tif 000036
【図３２ＡＢＣＤＥ】
2014517817.tif 000037
【図３３Ａ】
2014517817.tif 000038
【図３３ＢＣ】
2014517817.tif 000039
【図３３ＤＥ】
2014517817.tif 000040
【図３３Ｆ】
2014517817.tif 000041
【図３４】
2014517817.tif 000042
【図３５Ａ】
2014517817.tif 000043
【図３５ＢＣＤ】
2014517817.tif 000044
【図３６ＡＢＣ】
2014517817.tif 000045
【図３６ＤＥＦ】
2014517817.tif 000046
【図３７ＡＢＣ】
2014517817.tif 000047
【配列表】
2014517817000001.app
【国際調査報告】
2014517817.tif 000048
2014517817.tif 000049
2014517817.tif 000050
2014517817.tif 000051
2014517817.tif 000052
2014517817.tif 000053