(57)【要約】  粒子分離微小構造体が、本体と、入口と出口とを有し本体を貫通して延びる流路であって、該流路を流通数る粒子の流れを受容する流路とを具備する。流路は間隔を開けて対向配置された第１と第２の壁を具備する。第１の壁から流路内に突出する少なくとも１つの突出部が流路の長手方向に延在している。第１と第２の壁の一方の少なくとも一部が第１と第２の位置の間で可逆的に駆動され、第２の位置において第１と第２の壁は実質的に平行となっている。第１の位置では、流路は開いており粒子の流れを受け入れる。第２の位置では、少なくとも１つの突出部が第２の壁に当接し、流路が制限されることによって、粒子の流れから粒子が分離される。
2014505590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子分離微小構造体において、
本体と、
入口と出口とを有し前記本体を貫通して延びる流路であって、該流路を流通数る粒子の流れを受容する流路とを具備し、
前記流路は
間隔を開けて対向配置された第１と第２の壁と、
前記第１の壁から流路内に突出すると共に前記流路の長手方向に延在する少なくとも１つの突出部とを具備しており、
前記第１と第２の壁の一方の少なくとも一部が第１と第２の位置の間で可逆的に駆動され、かつ、前記第２の位置において前記第１と第２の壁は実質的に平行となっており、前記第１の位置において、前記流路は開いており粒子の流れを受け入れるようになっており、前記第２の位置において、前記少なくとも１つの突出部が前記第２の壁に当接し、前記流路が制限されることによって前記粒子の流れから粒子が分離されるようになっている粒子分離微小構造体。
【請求項２】
前記可逆的に駆動される壁は圧力を印加することによって駆動される柔軟な膜である請求項１に記載の微小構造体。
【請求項３】
加圧された流体を受け入れる開口部を有し前記本体を貫通して延びる制御通路であって、
前記制御通路は、前記駆動可能な第１の壁または第２の壁の少なくとも一部と、間隔を開けて対向配置された第３の壁とを具備し、
前記流路が前記第２の位置にあるとき、前記制御通路が、前記駆動可能な第１の壁または第２の壁の一部に圧力を印加するようした請求項１に記載の微小構造体。
【請求項４】
複数の制御通路を具備し、該複数の制御通路の各々が、独立して、前記流路の一部を開放位置と制限位置との間で変形させるようにした請求項３に記載の微小構造体。
【請求項５】
前記複数の通路の各々が、順次に前記流路を開放位置と制限位置との間で変形させるようにした請求項４に記載の微小構造体。
【請求項６】
前記本体を貫通する複数の流路を互いに隣り合わせに配設した請求項１〜５の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項７】
前記駆動可能な第１の壁または第２の壁が柔軟材料を具備する請求項１〜６の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項８】
前記第１と第２の壁の一方に形成され、前記流路が前記第２の位置にあるときに、粒子の流れから粒子を分離する少なくとも１つの凹所を前記流路が更に具備する請求項１〜７の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項９】
横断方向に配設された少なくとも２つのリブが前記少なくとも１つの突出部から前記流路内へ突出しており、前記流路が第２の位置にあるとき、粒子の流れから粒子を分離する前記少なくとも１つの凹所が前記流路内に形成される請求項１〜７の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１０】
前記流路の長手の中心軸線に対する前記少なくとも２つのリブの角度は約３０°〜約９０°となっている請求項９に記載の微小構造体。
【請求項１１】
前記第１と第２の壁の一方の少なくとも一部分が信号に応じて可逆的に駆動可能となっている請求項１〜１０の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１２】
１つの突出部が前記流路の中心線に概ね沿って延在している請求項１〜１１の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１３】
１つの突出部が前記流路の中心線に概ね沿って延在し、１つの突出部が前記流路の各縁部に概ね沿って延在している請求項１〜１１の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１４】
前記粒子は流体中に懸濁している請求項１〜１３の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１５】
前記粒子は、ビーズ、細胞、ミネラル、微粒子、微生物またはこれらの組み合わせである請求項１〜１４の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１６】
前記細胞は真核細胞である請求項１５に記載の微小構造体。
【請求項１７】
前記粒子の流れの中の少なくとも１つの粒子が標識化される請求項１〜１６の何れか１項に記載の微小構造体。
【請求項１８】
粒子分離装置において、
請求項１〜１７の何れか１項に記載の微小構造体と、
前記流路の入口に連結された試料管路およびバッファー管路と、
前記流路の出口に連結されたされた第１の粒子管路および第２の粒子管路と、
前記試料管路とバッファー管路の各々と前記流路の入口との間に配設され、前記粒子の流れおよび前記流路によって受け入れるバッファーの流れを調節するための複数の流れ制御弁と、
前記流路の出口と、前記第１と第２の粒子管路の各々との間に配設され、前記粒子の流れから分離された粒子を流出させる複数の流れ制御弁とを具備し、
前記制御弁は、前記流路が粒子の流れから粒子を分離するために前記第１と第２の位置との間で作動することに対応して開閉する粒子分離装置。
【請求項１９】
複数の粒子分離装置を直列に連結して、粒子の流れから粒子を連続的に分離するようにした請求項１８に記載の粒子分離装置。
【請求項２０】
粒子分離方法において、
流路を具備した微小構造体であって、前記流路が可逆的に駆動可能で対向する一対の流路内面を有している微小構造体に粒子の流れを供給し、
前記対向する一対の流路内面の一部を第１の位置と、該一対の対向する流路内面が実質的に平行となる第２の位置との間で変形させ、
粒子の流れから粒子を分離することを含み、
前記流路が第２の位置にあり制限されているときに分離された粒子の流動が阻害され、そして、流路が制限されているときおよび第１の位置において流路が開いているときに粒子の流れは流路を流通するようにした粒子分離方法。
【請求項２１】
前記流路が、該流路を流通する粒子の流れを調節するための複数の流れ制御弁を具備しており、
前記制御弁は、前記流路が粒子の流れから粒子を分離するために前記第１と第２の位置との間で作動することに対応して開閉する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記流路入口において前記複数の流れ制御弁が粒子の流れを維持しているとき、バッファーの流れを供給するようにした請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
特定のタイプの粒子の速度を選択的に低減する方法において、
流路を具備した微小構造体であって、前記流路が可逆的に駆動可能で対向する一対の流路内面を有している微小構造体に粒子の流れを供給し、
前記対向する一対の流路内面の一部を前記流路が開いた第１の位置と、該一対の対向する流路内面が実質的に平行となり前記流路が制限され第１の粒子集団の流れが阻害される第２の位置との間で変形させ、
第１と第２の粒子集団の速度を低減することを含み、
制限位置において、前記第１の粒子集団は、流路を流通する第２の粒子集団よりも低速で流動し、前記対向する一対の流路内面を第１と第２の位置の間で繰り返し動作させることによって、粒子の流れが前記流路を流通する間、第１の粒子集団が第２の粒子集団に対して濃縮されるようにした方法。
【請求項２４】
複数の流路部分を調節することを更に含み、
前記流路部分の各々が独立して第１と第２の位置の間で動作し、かつ、流路の全容量が一定であるようにした請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は粒子の分離方法および装置に関し、特に、本発明は、粒子の１または複数の物理的特性を利用して異成分から成る粒子混合物を分離する方法および装置に関する。
【０００２】
なお、本願は、米国仮出願61/434,344号の優先権を主張し、該仮出願の開示内容を本願と一体をなすものとして参照する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の物理的な違いに基づいて分離することは医学研究や臨床実務の多くの分野で重要である。物理的な分離に関する従来技術には、細胞をサイズによってのみ分離する流体力学クロマトグラフィーや、細胞のサイズおよび剛性に基づいて分離するろ過が含まれる。サイズと剛性とに基づいく分離は概ね一層有用であると考えられている。と言うのは、種々の細胞型を区別するためにはサイズのみでは不十分であるからである(Hochmuth RM (2000) Journal of Biomechanics 33(1): 15-22; Jones WR、et al. (1999) Journal of Biomechanics 32(2): 119-127; Rosenbluth MJ、et al (2006) Biophysical Journal 90(8):2994-3003)。
【０００４】
細胞のろ過には、一般的に、小さなサイズまたは低い剛性或いはその双方を有した細胞を流出させながら、大きなサイズまたは高い剛性或いはその双方を有した細胞を補足する微小構造体が用いられる(VanDelinder et al.、2007 Analytical Chemistry 79(5):2023-2030; Vona G、et al. 2000 American Journal of Pathology 156(1):57-63 Murthy S et al. 2006 Biomedical Microdevices 8(3):231-237; Mohamed H et al.、2009 Journal of Chromatography A 1216(47):8289-8295; Tan S et al.、2009 Biomedical Microdevices 11 (4): 883-892)。繰り返し生じる制約は、詰まり、すなわち、微小構造体に粒子が蓄積されることである。詰まりによって、フィルタの流体力学的な抵抗が変化し、選択性、収量、処理量が低下する。更に、細胞膜が常にフィルタ壁に接触するので、フィルタ壁に細胞が吸着されることが多くなり、分離後に細胞を回収することが妨げられる。
【０００５】
米国特許出願公開2008/0264863号にはマイクロ流体シーブ弁が開示されている。マイクロ流体シーブ弁は、所定の圧力下で、特定の粒子を補足し懸濁流体を通過させる篩となる柔軟な膜を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開2008/0264863号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、粒子を分離する装置および方法を改良することが望まれる。
本発明は、従来技術の少なくとも一つの欠点を回避または軽減することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
出願人は、開放形態と半閉鎖形態または制限形態との間で移動可能な流路を準備し、該流路を流通する流れを選択的に制御することによって、粒子の流れから特定の粒子を選択的に分離可能となることを認識している。
【０００９】
以下、粒子分離微小構造体、粒子分離装置および粒子分離方法が説明される。粒子分離微小構造体は、本体と、入口と出口とを有し前記本体を貫通して延びる流路であって、該流路を流通数る粒子の流れを受容する流路とを具備する。前記流路は、間隔を開けて対向配置された第１と第２の壁と、前記第１の壁から流路内に突出すると共に前記流路の長手方向に延在する少なくとも１つの突出部とを具備する。前記第１と第２の壁の一方の少なくとも一部が第１と第２の位置の間で可逆的に駆動され、かつ、前記第２の位置において前記第１と第２の壁は実質的に平行となっており、前記第１の位置において、前記流路は開いており粒子の流れを受け入れるようになっており、前記第２の位置において、前記少なくとも１つの突出部が前記第２の壁に当接し、前記流路が制限されることによって前記粒子の流れから粒子が分離される。
【００１０】
１つの実施形態では、前記本体を貫通して延び加圧された流体を受け入れる制御通路が設けられている。制御通路は、前記駆動可能な第１の壁または第２の壁の少なくとも一部と、間隔を開けて対向配置された第３の壁とを具備する。前記流路が前記第２の位置にあるとき、前記制御通路が、前記駆動可能な第１の壁または第２の壁の一部に圧力を印加する。
【００１１】
更なる特徴によれば、粒子分離装置が提供される。この装置は、上記微小構造体と、前記流路の入口に連結された試料管路およびバッファー管路と、前記流路の出口に連結されたされた第１の粒子管路および第２の粒子管路と、複数の流れ制御弁とを具備する。複数の流れ制御弁が、前記試料管路とバッファー管路の各々と前記流路の入口との間に配設される。複数の流れ制御弁は、前記粒子の流れおよび前記流路によって受け入れるバッファーの流れを調節する。前記粒子の流れから分離された粒子を流出させる複数の流れ制御弁が、前記流路の出口と、前記第１と第２の粒子管路の各々との間に配設される。前記制御弁は、前記流路が粒子の流れから粒子を分離するために前記第１と第２の位置との間で作動することに対応して開閉する。
【００１２】
更なる実施形態では、流路を具備した微小構造体であって、前記流路が可逆的に駆動可能で対向する一対の流路内面を有している微小構造体に粒子の流れを供給し、前記対向する一対の流路内面の一部を第１の位置と、該一対の対向する流路内面が実質的に平行となる第２の位置との間で変形させ、粒子の流れから粒子を分離することを含む粒子分離方法であって、前記流路が第２の位置にあり制限されているときに分離された粒子の流動が阻害され、そして、流路が制限されているときおよび第１の位置において流路が開いているときに、子の流れが路を流通するようにした粒子分離方法が提供される。
【００１３】
本発明の更なる特徴によれば、本発明は、特定のタイプの粒子の速度を選択的に低減する方法に関し、該本発明は、流路を具備した微小構造体であって、前記流路が可逆的に駆動可能で対向する一対の流路内面を有している微小構造体に粒子の流れを供給し、前記対向する一対の流路内面の一部を第１の位置と、該一対の対向する流路内面が実質的に平行となる第２の位置との間で変形させ、第１と第２の粒子集団の速度を低減することを含み、流路が制限位置にあるとき、第１の粒子集団の流れが阻害され、前記第１の粒子集団は、流路を流通する第２の粒子集団よりも低速で流動し、前記対向する一対の流路内面を第１と第２の位置の間で繰り返し動作させることによって、粒子の流れが前記流路を流通する間、第１の粒子集団が第２の粒子集団に対して濃縮される。
【００１４】
本発明の他の特徴は、以下に説明する添付図面に関連して特定の実施形態から当業者には明らかであろう。
【００１５】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態を説明するが、該実施形態は単なる一例である。また、添付図面において同様の構成要素には同様の参照番号が付されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】開放位置にある粒子分離装置の実施形態の断面図である。
【図１Ｂ】流れを制限する位置にある図１Ａの粒子分離装置の断面図である。
【図２Ａ】開放位置にある粒子分離装置の実施形態の断面図である。
【図２Ｂ】図２Ａの粒子分離装置のＺＹ軸で定義される平面のＸ軸に沿う断面図である。
【図３Ａ】流れを制限する位置にある図２Ａの粒子分離装置の断面図である。
【図３Ｂ】図３Ａの粒子分離装置のＺＹ軸で定義される平面のＸ軸に沿う断面図である。
【図４】図２Ａの粒子分離装置のＺ軸に沿う平断面である。
【図５】１つの実施形態による粒子分離装置の平断面である。
【図６】１つの実施形態による粒子分離装置の応用例のグラフであって、相対圧力と捕捉した粒子サイズとの関連性を示す図である。
【図７】１つの実施形態による粒子分離装置の断面図であって、装置の一部が開放位置にあり、装置の一部が制限位置にあるずである。
【図８Ａ】１つの実施形態による微小構造体を具備する粒子分離装置および該粒子分離装置を用いて粒子の混合物から種々のサイズの粒子を分離する方法を示す図である。
【図８Ｂ】１つの実施形態による微小構造体を具備する粒子分離装置および該粒子分離装置を用いて粒子の混合物から種々のサイズの粒子を分離する方法を示す図である。
【図８Ｃ】１つの実施形態による微小構造体を具備する粒子分離装置および該粒子分離装置を用いて粒子の混合物から種々のサイズの粒子を分離する方法を示す図である。
【図９】複数の粒子分離装置を直列に連結して対象粒子を多段階で分離するようにした装置を示す図である。
【図１０】50％のデューティサイクルより低い条件で１つの実施形態による粒子分離装置内を流通する流れ中の赤血球、マウスリンパ腫細胞、および末梢血単核球の変位を示すグラフである。
【図１１Ａ】１つの実施形態による粒子分離装置を横断する末梢血単核細胞のビデオからの一連の画像であり、時刻t =10.5秒において装置の流路が開放位置から半閉鎖開位置から移動している。
【図１１Ｂ】１つの実施形態による粒子分離装置を横断するマウスリンパ腫細胞のビデオからの一連の画像であり、時刻t =10.5秒において装置の流路が開放位置から半閉鎖開位置から移動している。
【図１２】異なるデューティ・サイクル下で１つの実施形態による粒子分離装置を流通する流れにおける異なる種類の細胞の平均前進速度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
粒子を分離するための新規な方法、微小構造体および装置が開示される。より詳細には、サイズまたは剛性もしくはサイズおよび剛性のような物理的な特性に基づいて粒子を分離する方法、微小構造体および装置が開示される。少なくとも１つの粒子を分離する微小構造体を備えた粒子分離装置が記載される。また、粒子の速度を選択的に弱め、そして粒子分離装置の詰まりを処理または防止するようにした粒子分離方法が提供される。
【００１８】
粒子を物理的に分離するためのマイクロ流体装置、例えばサイズのみに基づいて粒子を分離するサイズ排除クロマトグラフィー装置や、サイズと剛性に基づいて粒子を分離するろ過装置は公知である。サイズ排除クロマトグラフィーは、粒子が細胞である場合には、通常、効果的に粒子を分離できない。と言うのは、望ましい細胞画分、細胞表現型或いは細胞形態学は、サイズのみに基づいて区別できないからである。
【００１９】
出願人は、例えば細胞のような粒子がフィルタに詰まるろ過装置で繰り返し生じる問題を認識している。細胞が詰まると、流入するサンプルの注入速度が低下し、フィルタの流体力学的な抵抗の予期できない変化を招く。出願人は、また、別個の細胞表現型に対して十分にはっきりと異なる流速を与え効果的な分離を可能とするコラム材料または構造がないことから、細胞を分離するためにサイズ排除クロマトグラフィーを用いることが不適切であることを認識している。更に、従来のろ過装置を用いた場合に生じる不動の接触が持続することによって、フィルタ壁に吸着される粒子、例えば細胞が増加する。これはフィルタを詰まらせるのみならず、分離後の粒子の回収を妨げる。
【００２０】
出願人は、捕獲された粒子をフィルター微小構造体から定期的に除去して、フィルタの特性をリセットし、選択性、歩留まり、スループットを高める必要性を認識している。特に、出願人は、捕捉した粒子の放出を容易にするために、濾過処理中にフィルタ微小構造体を変える必要性を認識している。更に、出願人は、正確に粒子と液体の微小体積の流れを制御することができ、また、その物理特性、より具体的にはサイズや変形性に基づいて粒子を分離することができる微小構造体を提供する必要性を認識している。
【００２１】
出願人は、開放形態と半閉鎖形態または絞り形態との間で流路を動的に変化させ、流路を流通する流れを選択的に制御し、異なるタイプの粒子を含む混合物から成る粒子の流れから特定タイプの粒子を選択的に分離可能とすることを認識している。
【００２２】
更に、出願人は、流路内を粒子の流れが流通する際に、半閉鎖形態では流路の対向する長手方向の内面が実質的に平行となるように、流路の形態を開放形態と半閉鎖形態または絞り形態との間で動的に変化させることによって、一層大きく変形し難い粒子を周期的に捕捉することが容易になり、こうして、サイズと変形性に基づいて粒子を容易に分離可能となることを見出した。
【００２３】
更に、出願人は、流路内を粒子の流れが流通する際に、半閉鎖形態では流路の対向する長手方向の内面が実質的に平行となるように、流路の形態を開放形態と半閉鎖形態または絞り形態との間で動的に変化させることによって、流れの中の異なるタイプの粒子に、粒子の明確に異なる物理的特性によって、異なる流速を与えることできることを発見した。こうした流路形態によって、細胞の物理的特性に基づいて細胞をサイズ排除法によって分離可能な新規な粒子分離装置が提供される。
【００２４】
粒子の剛性または変形性を粒子の耐変形性と称する。粒子の耐変形性は、マイクロピペット吸引法、分子間力顕微鏡法、光ピンセット法を含む公知の種々の方法を用いて測定可能である。
【００２５】
本発明による粒子分離微小構造体は、本体と、入口と出口とを有し前記本体を貫通して延びる流路であって、該流路を流通数る粒子の流れを受容する流路とを具備する。前記流路は間隔を開けて対向配置された第１と第２の壁を具備する。前記第１の壁から流路内に突出する少なくとも１つの突出部が前記流路の長手方向に延在している。前記第１と第２の壁の一方の少なくとも一部が第１と第２の位置の間で可逆的に駆動され、前記第２の位置において前記第１と第２の壁は実質的に平行となっている。前記第１の位置では、前記流路は開いており粒子の流れを受け入れるようになっている。前記第２の位置では、前記少なくとも１つの突出部が前記第２の壁に当接し、前記流路が制限されることによって、前記粒子の流れから粒子が分離される。
【００２６】
前記可逆的に駆動される壁は柔軟材料を具備することができる。前記可逆的に駆動される壁は、圧力を印加することによって駆動される柔軟な膜とすることができる。
【００２７】
微小構造体は、加圧された流体を受け入れる開口部を有し前記本体を貫通して延びる制御通路を備えることができる。該制御通路は、前記駆動可能な第１の壁または第２の壁の少なくとも一部と、間隔を開けて対向配置された第３の壁とを具備する。前記流路が前記第２の位置にあるとき、前記制御通路は、前記駆動可能な第１の壁または第２の壁の一部に圧力を印加する。
【００２８】
微小構造体は、複数の制御通路を具備することができる。該複数の制御通路の各々が、独立して、前記流路の一部を開放位置と制限位置との間で変形させるようになっている。前記複数の通路の各々が、順次に前記流路を開放位置と制限位置との間で変形させるようにしてもよい。ある実施形態では、前記第１と第２の壁の一方の少なくとも一部分が信号に応じて可逆的に駆動可能となっている。
【００２９】
前記本体を貫通する複数の流路を平行に互いに隣り合わせに配設するようにできる。
【００３０】
微小構造体の流路は、前記流路が前記第２の位置にあるときに、粒子の流れから粒子を分離する少なくとも１つの凹所を前記第１と第２の壁の一方に形成するようにできる。ある実施形態では、前記凹所を形成するために、横断方向に配設された少なくとも２つのリブを前記少なくとも１つの突出部から前記流路内へ突出させるようにできる。前記少なくとも２つのリブの角度は、前記流路の長手の中心軸線に対して約３０°〜約９０°とすることができよう。
【００３１】
ある実施形態では、前記流路の中心線に概ね沿って１つの突出部を延在させることができる。ある実施形態では、１つの突出部が前記流路の中心線に概ね沿って延在し、１つの突出部が前記流路の各縁部に概ね沿って延在するようにできる。
【００３２】
ある実施形態では、粒子は流体中に懸濁している。粒子は、ビーズ、細胞、ミネラル、微粒子、微生物またはこれらの組み合わせとすることができよう。ある実施形態では、細胞は真核細胞である。前記粒子の流れの中の少なくとも１つの粒子に標識を付すことができる。
【００３３】
１つの形態によれば、粒子分離装置は、上記の微小構造体と、前記流路の入口に連結された試料管路およびバッファー管路と、前記流路の出口に連結されたされた第１の粒子管路および第２の粒子管路と、複数の流れ制御弁とを具備する。複数の流れ制御弁は、前記試料管路とバッファー管路の各々と前記流路の入口との間に配設され、前記粒子の流れおよび前記流路によって受け入れるバッファーの流れを調節する。複数の流れ制御弁は、また、前記流路の出口と、前記第１と第２の粒子管路の各々との間に配設され、前記粒子の流れから分離された粒子を流出させる。前記制御弁は、前記流路が粒子の流れから粒子を分離するために前記第１と第２の位置との間で作動することに対応して開閉する。
【００３４】
複数の粒子分離装置を直列に連結することによって、粒子の流れから粒子が連続的に分離される。
【００３５】
本発明によれば、流路を具備した微小構造体であって、前記流路が可逆的に駆動可能で対向する一対の流路内面を有している微小構造体に粒子の流れを供給し、前記対向する一対の流路内面の一部を第１の位置と、該一対の対向する流路内面が実質的に平行となる第２の位置との間で変形させ、粒子の流れから粒子を分離することを含む粒子分離方法が提供される。前記流路が第２の位置にあり制限されているときに分離された粒子の流動が阻害され、そして、流路が制限されているときおよび第１の位置において流路が開いているときに粒子の流れは流路を流通する。この方法は、更に、前記流路が、該流路を流通する粒子の流れを調節するための複数の流れ制御弁を設け、前記流路が粒子の流れから粒子を分離するために前記第１と第２の位置との間で作動することに対応して前記制御弁を開閉することを含むことができる。該方法は、更に、前記流路入口において前記複数の流れ制御弁が粒子の流れを維持しているとき、バッファーの流れを供給するようにできる。
【００３６】
本発明によれば、更に、流路が可逆的に駆動可能で対向する一対の流路内面を有している微小構造体に粒子の流れを供給し、  前記対向する一対の流路内面の一部を前記流路が開いた第１の位置と、該一対の対向する流路内面が実質的に平行となり前記流路が制限され第１の粒子集団の流れが阻害される第２の位置との間で変形させ、第１と第２の粒子集団の速度を低減することを含む特定のタイプの粒子の速度を選択的に低減する方法が提供される。制限位置では、前記第１の粒子集団は、流路を流通する第２の粒子集団よりも低速で流動する。前記対向する一対の流路内面を第１と第２の位置の間で繰り返し動作させることによって、粒子の流れが前記流路を流通する間、第１の粒子集団が第２の粒子集団に対して濃縮される。この方法は、複数の流路部分を調節して、前記流路部分の各々が独立して第１と第２の位置の間で動作し、かつ、流路の全容量が一定であるようにするようにしてもよい。
【００３７】
粒子分離微小構造体
図１Ａ、１Ｂは、開位置および絞られた流量制限位置にある本発明の１つの実施形態による粒子分離微小構造体１０を夫々示している。微小構造体１０は、異なるタイプの粒子を含む懸濁流体から選択的分離を容易にする。微小構造体１０は本体１２を具備する。本体１２は流路１４を有し、該流路は本体１２を貫通している。流路１４は、対向する一対の第１と第２の壁１６、１８と、一対の側壁２１、２２と、粒子を含む流れを流通させる入口と出口とから形成されている。第１の壁の第１の表面１５および第２の壁の第２の表面は離間配置されている。第１の壁１６は少なくとも１つの突出部２０を有しており、該第１の突出部は、第１の表面１５から流路１４内に突出すると共に、流路１４の長手方向に延設されている。好ましくは、少なくとも１つの突出部２０は、図１に示すように、流路１４の長手の中心軸線、中心線に実質的に沿って配置されている。第１と第２の壁１５、１８の一方は、図１Ａに示す第１の位置と図２Ｂに示す第２の位置との間で可逆的に駆動される。図１では、第１の壁１６が可逆的に駆動される壁となっている。第１の位置において、流路１４は開いており、粒子を含む流れを自由に受け入れる。第２の位置では、第１と第２の壁１６、１８の一方が流路１４内に偏倚し、突出部２０が第２の壁１８の第２の表面１７に接触する。第２の位置では、流路１４は半閉鎖位置または制限位置にあり、粒子を含む流れを選択的に制限するようになっている。
【００３８】
微小構造体は手動やコンピュータプログラムその他の適当な手段によって制御することができよう。可逆的に駆動される第１の壁１６または第２の壁１８は、例えば電気信号、機械的信号、磁気信号、電磁気信号、光信号、音響信号またはそれらを組合わせた信号に応答して駆動することができよう。微小構造体１０は、信号を受信すると、第１の壁１６または第２の壁１８に力を印加して、流路１４を第１の位置または開位置から第２の位置または制限位置へ移動させ、或いは、力Ｆを除去して、流路１４を第２の位置または制限位置から第１の位置または開位置へ移動させる。該力は、第１の壁または第２の壁を第１と第２の位置の間で可逆的に移動させる如何なる作用力であってもよい。上記力は、可逆的に駆動される第１の壁または第２の壁に印加される圧力とすることができる。
【００３９】
図１Ａ、１Ｂに示すように、開位置にある流路１４の高さ３８は、制限位置にある流路１４の高さ３８よりも高くなっている。高さ３８の違いは、突出部２０の第１の壁１６から流路１４内への突出量によって決定される。流路１４内に突出する突出部２０の長さによって、第２の壁１８の第２の表面１７が突出部２０に当接したときの第２の位置にある流路１４の高さが決定される。第２の壁１８の第２の表面１７が突出部２０に当接する第２の位置では、偏倚した壁が、当初の幅の約半分の幅を有した２つの個別の壁に分割されたように作用する。半分になった壁は、当初の壁と比較して堅く或いは一層高剛性の特性を示し、こうして、撓みや変形に対して一層効果的に抵抗する。突出部２０は、偏倚した第１の壁１６または第２の壁１８が、静止している第１の壁１６または第２の壁１８に対して実質的に平行となることを可能ならしめる。少なくとも１つの突出部２０は、流路が制限位置にあるとき、対向する第１と第２の壁の第１と第２の表面が実質的に平行となるように機械的に拘束する。第１と第２の壁の第１と第２の表面は、流路が開位置にあるとき実質的に平行とすることができよう。流路１４の対向する第１と第２の壁１６、１８の間の距離、つまり流路１４の高さはを選択的に制御可能とすることによって、流路１４が第２の位置にあるとき流路１４の入口において、例えば、より変形しにくく、かつ／または、より大きな粒子を分離、補足することによって、微小構造体１０により粒子を含む流れから粒子を分離可能となる。同様に、流路１４の高さはを選択的に制御することによって、流路１４の第１と第２の位置の双方において、微小構造体１０は、例えば、より変形しやすく、かつ／または、より小さな粒子を含む流れおよび粒子を含まない流れを流路１４内を減衰することなく流通できるようにする。流路を通して１つのタイプの粒子を減衰させることなく流通させ、同時に他のタイプの粒子を補足、制限することによって、これら二種類の粒子を分離可能となる。
【００４０】
微小構造体１０は、本体１２を貫通して延びる１または複数の流路１４を含むことができる。複数の流路は平行に延設される。平行な複数の流路１４を設けることによって、微小構造体１０は。１つの流路を有する微小構造体よりも、一層大量の流体を受け入れ、かつ／または、粒子を含む流れから粒子を一層迅速に分離する。複数の微小構造体を並列に連結することによって、平行な複数の流路を有した同様の構成の微小構造体を構成することもできよう。更に、粒子分離微小構造体１０を適当な手段によって直列（図７を参照して詳細に後述する）或いは並列に連結することができる。
【００４１】
幅広い種類の粒子を分離するために微小構造体を用いることができることは理解されよう。微小構造体の寸法は、分離すべき粒子のタイプに基づいて選択される。流路の高さの最小値は、流路の開位置と制限位置の双方において、第１のタイプの粒子が流路を流通可能で、かつ、分離される粒子である第２のタイプの粒子は、流路が開位置にあるときにのみ流通できるように選択される。例えば、十分に硬い粒子の場合、粒子の有効直径は粒子の実際の直径に略等しくなるが、変形する粒子の有効直径は、流路に入るときに、圧縮され変形するので粒子の実際の直径よりも小さくなる。粒子の有効直径は、流路に粒子を押し込むために使われる差圧に依存している。粒子の有効直径は、流路の高さおよび流路の入口と出口における差圧の双方が既知である流路に対象粒子を押し込むことによっって実験的に決定することができよう。
【００４２】
微小構造体によって、少なくとも１つの対象粒子を選択的に捕獲し、第２のタイプの粒子を溶出させ、次の収集のために捕獲または補足した対象粒子を解放することが可能となる。流路の横方向の寸法、つまり流路の幅は、開位置でも半閉鎖位置であっても、粒子の流路内の流通を阻害してはならないことは理解されよう。
【００４３】
第２の位置では、流路の第１と第２の壁の略平行な表面１５、１７は略均一な流路高さ３８を提供し、そして、粒子の流路内における横位置とは無関係に、特定のサイズまたは剛性若しくは特性のサイズおよび剛性の粒子を選択的に排除する能力を促進する。流路が制限位置にあるときに、既知のサイズの微小粒子を溶出させて、流路出口から流出する粒子サイズを測定して、特定サイズが排除されていることを確認し、そして、特定サイズの粒子の選択性が流路内の粒子の横位置に依存していないことを評価することによっって、第２の位置で流路の前記表面が略平行となっていることが確認される。
【００４４】
他の実施形態による粒子分離微小構造体１１０を図２〜図４に示す。微小構造体１１０は本体１１２を有しており、該本体を貫通して流路１１４と制御通路１４０とが延設されている。
【００４５】
図２、３の実施形態では、第２の壁１１８が可逆的に駆動される壁となっている。制御通路１４０は、第１の壁１１６が可逆的に駆動される壁である部分に形成してもよい。制御通路１４０は、可逆的に駆動される第１の壁１１６または第２の壁１１８の少なくとも一部と、対設された第３の壁１４２とによって画成される。図２、３に示すように、制御通路１４０は可逆的に駆動される第２の壁の一部と、第３の壁１４２と、対向する一対の側壁１４４、１４６と、加圧された流体を受け入れるための開口部とを有している。第２の壁１１８の第１の表面１４８と、第３の壁１４２の第１の表面４３は、互いに対向、離間するように配置される。
【００４６】
制御通路１４０は力Ｆを可逆的に駆動される第１の壁１１６または第２の壁１１８に印加する。ここでは、力Ｆは圧力として与えられる。図２、３に示すように、力Ｆは可逆的に駆動される第２の壁１１８に印加される。制御通路１４０は、上述のように力Ｆを印加するのに適していれば、どのような形状、寸法であってもよい。例えば、流路１１４に圧力を印加するために用いられる制御通路１４０は、該流路の下側に配置される矩形流路とすることができる。１つの実施形態では、制御通路１４０は、適当な位置決め誤差内で、流路１１４に重なり合うように配置される。制御通路１４０は、流路１１４とは異なる寸法にて形成してもよい。流路１１４は、制御通路１４０の両端を超えて長手方向に延在するようにできる。或いは、制御通路１４０は、流路１１４の側壁を超えて側方へ突出していてもよい。
【００４７】
制御通路１４０から流路１１４へ力、例えば、正の差圧を印加することによって、第１の壁１１６または第２の壁１１８が偏倚して突出部１２０に接触し、図３Ａ、３Ｂに示すように、流路１１４が第２の位置にあるとき、流路１１４の対向する第１と第２の壁１１６、１１８の距離が変化する。
【００４８】
制御通路１４０に１つの開口部を設け、該開口部を通じて流体を流入、流出させるようにできる。或いは、流体を制御通路１４０に流入、流出させるための独立の入口と出口とを制御通路に設けてもよい。制御通路１４０が単一のポートを有し、制御通路１４０が「行き止まりの」室または通路となっている場合には、制御通路はデッドエンドフィル法によって加圧流体で充満し、前記室内に取り込まれた空気が除去される。「デッドエンドフィル法」は、行き止まりの室または通路を圧力下で流体により満たす周知の方法である。例えば、先ず、流体を制御通路に注入すると、流体は抵抗の最も地位な経路を流れ、そして、制御通路に充填されていない或いは部分的に充填された領域が形成される。マイクロ流体からの柔軟な膜の製造で用いられるエラストマー材料の通気性を用いて、行き止まりの室を充填することができよう。制御通路の流体には、約100mbarから約4barの圧力とすることができよう。制御通路の流体は空気、水その他加圧することのできる適当な流体とすることができる。
【００４９】
可逆的に駆動される第１の壁１１６または第２の壁１１８は、第１と第２の位置の間で移動可能な柔軟な材料を具備する。１つの実施形態では、可逆的に駆動される第１の壁１１６または第２の壁１１８は、流路１１４と制御通路１４０との間に形成された柔軟な膜を備えており、該膜は駆動される流路１１４内へ偏倚する。該膜は実質的に一定の厚さ、例えば約10μm〜約50μmの厚さとすることができる。マイクロ流体デバイスの柔軟な膜は、流路を部分的に或いは完全に閉塞する弁として用いられることが知られている。
【００５０】
図２Ａ、３Ａに示すように、流路１１４に複数の突出部２０を設けることができる。１つの突出部１２０は、流路１１４の断面の中央に配置され、中心突出部が流路１１４の長手の中心軸線に沿って延在し、対向する側壁１２１、１２２の各々の近傍に１つの突出部を設け、該突出部が流路の側壁１２１、１２２に隣接させて各縁部に沿って延在するようにできる。流路が第２の位置にあるとき、第１と第２の表面１１５、１１７が実質的に平行ならしめる突出部は、流路１１４にいくつ設けもよいことは理解されよう。
【００５１】
流路１１４は、更に、少なくとも１つの凹所１５０を具備している。該凹所は、第１の壁１１６の第１の表面と、第２の壁１１８の第２の表面１１７の少なくとも一方に形成され、流路が第２の位置にあるとき、粒子を含む流れから一層大きな変形しない粒子を捕獲する。凹所１５０は、流路が開位置から制限位置に移動した時に、流路内の大きく変形しない粒子を一時的に捕獲し、そして、流路１１４の閉塞を防止する。
【００５２】
流路１１４は、更に、少なくとも２つのリブ１３０を具備している。該２つのリブは、夫々流路１１４を横断して配設されており、少なくとも１つの突出部１２０から側壁１２１、１２２の一方へ延在し、図５に示すように、流路１１４内に少なくとも１つの凹所１５０を形成する。リブ１３０は、流路の長手の中心軸線に対して約９０°の角度で突出部１２０から延設させることができる。或いは、リブ１３０は、図５に示すように、流路の長手の中心軸線に対して約３０°〜約９０°の角度で突出部１２０から延設させることができる。突出部１２０から延びるリブ１３０は、側壁１２１、１２２に当接させたり、或いは、図２Ａ、３Ａに示すように、第２の突出部１２０に当接させるようにできる。
【００５３】
第１の壁または第２の壁に印加する力を調節することによって、流路１１４の対向する第１と第２の壁１１６、１１８の間の距離、つまり流路１１４の高さ１３８を変更することができる。対向する第１と第２の壁の間の距離を変更し、流路の高さ１３８を変更することによって、特定のタイプの粒子の分離が図６に示すように選択される。流路の第１の壁の第１の表面から突出する少なくとも１つの突出部は、対向する第１と第２の壁が、第２の位置で実質的に平行とするのに適した如何なる形状、寸法であってもよい。流路に既知のサイズの微小球体の補足を促進するため、流路を第１の位置から第２の位置に移動させるために必要な圧力を図６に示す。
【００５４】
作動中に微小構造体は、圧力を印加することによって流路を通して駆動される粒子を含む流れを受け入れる。好ましくは、該圧力は、約10mbarよりも高く200mbarよりも低くすることができる。然しながら、該圧力は、流路通じて流れを駆動するのに適した如何なる圧力であってもよい。流路が開位置にあるとき、粒子の不均一混合物の流れは、流体の流れ方向に流路を通じて自由に流れる。半閉鎖位置または制限位置では、粒子の不均一混合物の流れの中の小さな或いは変形可能なタイプの粒子のみが流路内を流通することができる。粒子の不均一混合物の流れの中の大きな或いは剛性の高いタイプの粒子は流路入口および／または流路内の粒子トラップとして作用する凹所に保持される。流路が開位置に復帰すると、保持されている粒子は流路内に開放され、該流路を通じて下流へ移動する。流路が制限位置にあるときに粒子を含む流れを流路内に流通させた後、流路を開位置に移動させる前に、バッファー溶液を流路内に導入して、流路内に残留する小さい粒子および／または変形する粒子を溶出させる。次いで、流路を開位置に移動させた後に、バッファー溶液を流路内に再び導入して、流路に捕獲された大きな粒子および／または剛性の高い粒子を溶出させる。こうした独立の溶出工程によって、更なる粒子分離が可能となる。
【００５５】
図７に他の実施形態による微小構造体２１０を示す。該微小構造体は、図７に示すように、流路２１４内の粒子を含む流れを選択的に減衰するための複数の制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄを具備している。複数の制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄの各々は、流路の長手の中心軸線に対して実質的に垂直となっている。複数の制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄの各々は、流路内の対応部分を流通する流れを調節する。ここで、対応部分は、可逆的に駆動される第２の壁２１８の対応部分によって示されている。制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄは流体によって充満されており、異なるタイミングで加圧することによって、流路２１４全体の容積を変更することなく、各制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄの流路高さ３２８が独立に調節される。例えば、制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄは、互い違いに配置されるように、２組に分割され、各組の制御通路が、第１と第２の位置の間で流路の異なる部分を調節するようになっている。先ず、粒子分離微小構造体２１０の第１組の制御通路２４０ａ、２４０ｃが、第２の壁の部分２１８ａ、２１８ｃを流路２１４内に偏倚させ、流路の該部分を制限位置に移動させながら、第２組の制御通路２４０ｂ、２４０ｄは第２の壁の部分２１８ｂ、２１８ｄを偏倚させず、流路２１４の対応部分は開位置に保持される。第２の状態では、制御通路２４０ａ、２４０ｂ、２４０ｃ、２４０ｄの第２の壁２１８ａ、２１８ｂ、２１８ｃ、２１８ｄは、第１組の制御通路２４０ａ、２４０ｃが第２の壁の部分２１８ａ、２１８ｃが偏倚し、第２組の制御通路２４０ｂ、２４０ｄが第２の壁の部分２１８ｂ、２１８ｄを偏倚させ、流路の該部分を制限位置に移動させる。粒子分離微小構造体２１０の該動的調整は、流路の開位置と制限位置との間で迅速に移動させ、流路全体の容積を変更することなく、流路の形態を変更することによって操作される。複数の微小構造体を直列に連結することによって、制御通路の同様の構成が得られることは理解されよう。
【００５６】
粒子分離装置および方法
図８に粒子分離装置を示す。装置７０は少なくとも１つの微小構造体１０を具備している。然しながら、後述するように、複数の微小構造体１０を並列または直列に排泄するようにしてもよいことは理解されよう。つまり、代替実施形態では事実上並列化を採用することができる。装置７０は、複数の弁７２ａ、７２ｂ、７２ｃ、７２ｄと複数の管路７３、７５、７７、７８とを具備する。該複数の管路は、流路入口７４または流路出口７に接続され、複数の異なる流れを受け入れ排出するようになっている。管路７３、７５、７７、７８は、適当な手段によって流路入口７４および流路出口７６に接続され、微小構造体１０の流路を通して複数の流れが流通するようになっている。制御弁７２ａ、７２ｂ、７２ｃ、７２ｄの開閉状態は、粒子を含む流れから粒子を分離する流路の開位置および制限位置に対応しており、粒子のタイプによる選択的分離および選択されたタイプの粒子を別々の管路に導くことが容易になる。
【００５７】
１つの実施形態では、装置７０は、流路入口７４に接続されたサンプル管路７３およびバッファー管路７５と、流路出口７６に接続された第１の粒子管路７７および第２の粒子管路７８とを具備している。複数の弁７２ａ、７２ｂ、７２ｃ、７２ｄ、例えば、通常のマイクロ流体制御弁によって、流路に流入し同流路から流出する流れの方向が制御される。流入側制御弁７２ａ、７２ｂは、それぞれ微小構造体のサンプル管路７３と流路入口７４との間、および、バッファー管路７５と流路入口との間に配設され、流路に流入する流れを調節する。流出側制御弁７２ｃ、７２ｄは、該微小構造体の流路出口７６と第１と第２の粒子管路７７、７８との間に配設され、分離された粒子の個々の収集を容易にする。分離された粒子は、収集、貯蔵および抽出されよう。
【００５８】
粒子分離装置７０は、粒子を含む流れから２以上のタイプの粒子を分離するために、複数の流れを受け入れそして排出する複数の管路を含むことができることは理解されよう。
【００５９】
図８に示すように、装置７０は３つの段階（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）から成る作動サイクルで作動する。サンプル入口７３とバッファー入口７５は第１と第２の粒子出口における圧力よりも高い圧力下に保持され、好ましくは約20mbarよりも高く約500mbarよりも低い圧力下で流路を通じで流れが駆動される。第１と第２の粒子出口７７、７８の各々は、概ね大気圧に維持される。
【００６０】
作動サイクルの第１の段階では、図８Ａに示すように、対象粒子９０と、バックグラウンド粒子９２から成る不均一混合物が、サンプル管路７３によって流路入口７４に供給される。流入側制御弁７２ｂは閉じられており、バッファーが微小構造体の流路内に流入することが防止される。流出側制御弁７２ｄは閉じられており、第２の粒子管路７８を粒子が流通しないようになっている。流入側制御弁７２ａは開いており、対象粒子９０と、バックグラウンド粒子９２から成る不均一混合物が微小構造体１０の流路内を流通可能となっている。流入側制御弁７２ａと流出側制御弁７２ｃが開いた状態では、微小構造体１０の流路内に粒子を含む流れが流通する。微小構造体１０は、所定圧力、好ましくは約20mbar以上でサンプル入口圧力よりも高い圧力下で半閉鎖位置または制限位置に保持される。対象粒子９０は、バックグラウンド粒子９２よりも大きくまたは剛性が高く若しくは大きくかつ剛性が高い、対象粒子９０は、微小構造体１０の流路の入口７４に保持される。一方、バックグラウンド粒子９２は流路を流通して流出側制御弁７２から第１の粒子管路７７へ流入し、そこでバックグラウンド粒子９２は収集される。
【００６１】
作動サイクルの第２の段階では、図８Ｂに示すように、流入側制御弁７２ａが閉じられ、流入側制御弁７２ｂが開いている。これによって、粒子を含まないバッファー溶液がバッファー管路７５から微小構造体１０の流路入口７４に供給され、流路内に残留するバックグラウンド粒子９２がパージされる。微小構造体１０は所定圧力、好ましくは20mbar以上でバッファー入口圧力以下の圧力下で半閉鎖位置に保持される。こうして、流路を通して溶液が流れ続け、対象粒子１４が捕獲され続ける。バックグラウンド粒子９２は流路内を流通し続け、流出側制御弁７２ｃから第１の粒子管路７７へ流入し、そこでバックグラウンド粒子９２は収集される。
【００６２】
作動サイクルの第３の段階では、図８Ｃに示すように流出側制御弁７２ｃが閉じられ、流出側制御弁７２ｄが開いており、そして流路の被駆動壁に印加される圧力が除去され、微小構造体１０の流路は開位置に移動する。バッファーと解放された対象粒子が流路内を流通し、流出側制御弁７２ｄから第２の粒子管路７８内に流入して、そこで対象粒子９０が収集される。
【００６３】
この３つの段階から成る作動サイクルによって、バックグラウンド粒子９２からの対象粒子９０の分離が容易になる。作動サイクルの格段はユーザによって制御することができる。粒子分離装置の操作は、手動、コンピュータプログラム、または他の適当な手段によって制御することができよう。作動サイクルの各段階の長さはユーザによって変更したり選択したりすることができる。バックグラウンド粒子からの対象粒子の分離効率は、第２の粒子管路７８におけるバックグラウンド粒子に対する対象粒子の比率で定義される純度、或いは、サンプル管路７３におけるバックグラウンド粒子に対する第２の粒子管路７８における対象粒子の比率で定義される捕獲効率によって測定することができる。分離効率は、３つの段階の各々で費やす時間を調節することによって変化する。第２の粒子管路７８で収集された粒子をサンプル管路７３へ再循環させて、プロセスを繰り返すことによって、分離の全体効率を改善するようにしてもよい。更に、バッファー溶液には粒子は含まれておらず、かつ、微小構造体および粒子を含む流れとは非反応性であることは理解されよう。
【００６４】
例えば、対象粒子の初期の濃度、体積流量、並列化した龍の数が既知であるとすると、各並列に接続された装置で望ましい数の対象粒子を捕獲するために必要な時間を決定することができる。この予測時間は、粒子分離操作の第１段階のための時間に適している。体積流量を知ることによって、バックグラウンド粒子の流路パージに要する時間を見積もることができる。このパージ時間は操作の第２の段階のための時間に適している。対象粒子を第２の粒子出口へパージするために、通常、上記パージ時間と同様の時間が必要となり、この時間は、操作の第３の段階のための時間に適している。
【００６５】
直列に接続された複数の粒子分離装置１７０を具備する多段装置１００を図９に示す。該粒子分離装置は、サンプル管路１７３、バッファー管路１７５、第１の粒子管路１７７、第２の粒子管路１７８を具備する。第１の装置１７０ａの粒子出口１７７、１７８がコネクタ１７９、例えば蛇行形状の管路によって第２の装置１７０のサンプル入口１７３ａに接続することによって、直列に接続された複数の粒子分離装置１７０は相互接続されている。多段装置１００は、単一サンプルの繰り返し濃縮を容易にする。直列の多段精製は、この技術分野で周知のプロセスであって、一層高い純度、例えば、９９．９％の純度を得るために、例えば９０％の純度を得る濃縮プロセスが多段階に順次実行される。
【００６６】
多段装置１００を用いて、既述した分離方法によって、第２の粒子管路１７８ａにおいて、高濃度の対象粒子９０と低濃度のバックグラウンド粒子９２を含む第１の混合物の流れが得られる。第２の粒子管路１７８ａにおける混合物流れ中の対象粒子の濃度は、サンプル管路１７３に提供される対象粒子の濃度よりも高いが、許容純度レベルである必要はない。第１の混合物流れは、サンプル管路１７３ｂにおいて第２の装置１７０ｂに流入し、分離プロセスが繰り返され、第２の粒子管路１７８ｂにおいて第２の混合物流れが得られる。第２の混合物流れは、次いで、サンプル管路１７３ｃにおいて第３の装置１７０ｃに流入し、分離プロセスが繰り返され、第３の粒子管路１７８ｃにおいて第２の混合物流れが得られる。このプロセスは、対象粒子の所望純度レベルが得られるまで、多数回繰り返される。
【００６７】
１つの実施形態では、微小構造体１０の流路の全流体力学的な抵抗を増加するため、かつ／または、装置の使用中に流路の第１と第２の壁が偏倚することによって生じる流体力学的な抵抗の変動を低減するため、かつ／または、先行する段階から分離した粒子を一時的に貯蔵するため、蛇行形状の管路（図９参照）を先行する流入側制御弁７２ａ、７２ｂに直列に設けることができる。
【００６８】
粒子速度を選択的に調節する方法
１つの実施形態では、粒子分離微小構造体１０の流路を流通する特定タイプの粒子速度を選択的に減衰させる方法が開示される。
【００６９】
所定のデューティサイクルで、制御通路４０を周期的に加圧、減圧して、流路を開位置と制限位置との間で移動させる間、不均一混合物の粒子流れが微小構造体１０の流路１４を流通する。デューティサイクルは、流路が開位置にある（自由流れ形態）時間と、流路が１つのサイクルを完結するための時間との間の比率で定義される。１つのサイクルは、流路が開位置から半閉鎖位置または制限位置に移動し、そして開位置に戻るために要する時間で定義される。デューティサイクルによって、自由に流れる粒子速度に対する捕獲された粒子の速度の率が制御される。従って、対象粒子が流路１内で凹所５０に留まる時間を決定することによって、流路内を流通する粒子の平均速度は容易に調整される。異なるタイプの粒子の個々の時的な流動特性によって、流路の長さにわたって粒子分離を可能にする異なる正味の速度が得られる。流路内の各粒子タイプの正味速度は、図１０に示す変位データ・グラフの線形近似を用いて推定することができる。流路形態が動的に変化する本明細書に記載の微小構造体は、選択的にその物理的性質に基づいて、異なる種類の粒子の流量を減衰させる方法を提供する。
【００７０】
開位置と制限位置との間で流路の動作を制御することによって、サイズ、変形性、または、サイズと変形性の双方のようなその物理的特性に基づいて、例えば細胞のような粒子のクロマトグラフィーによる分離が可能となる。液体クロマトグラフィーでは、複数の異なる成分を有する混合物が、異なる成分に異なる流動速度を付与する構造体またはコラムを介して注入される。異なる成分間での流動速度の差によって、混合物が構造体を通って移動する間に、混合物の１つの成分を他の成分に対して相対的に濃縮可能となる。本明細書に記載の微小構造体は、サイズ、変形性またはサイズと変形性の双方のような物理的特性に基づいて、異なる粒子に異なる流動速度を付与することができ、半閉鎖位置で流路に捕獲される粒子は、半閉鎖位置で捕獲されない粒子より低速度で流動する。従って、半閉鎖位置で特定の粒子を選択的に捕獲する微小構造体の能力によって、微小構造体は、これらの粒子のクロマトグラフ分離を可能とする。
【００７１】
開位置の時間（T0PEN）および半閉鎖位置の時間（TSC）、流れの初期の圧力、および、開位置における流路の圧力（POPEN）と半閉鎖位置における流路の圧力（PSC）は、計算または実験によって決定することができよう。例えば、T0PENは、約０．５から約２０秒またはその間の任意の時間、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９秒、またはその間の任意の時間とすることができる。一例として、TSCは、約0.5から約20秒またはその間の任意の時間、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９秒、またはその間の任意の時間とすることができる。一例として、POPENは、約２０mbar〜約５００mbarまたはその間の任意の圧力、例えば約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、またはその間の任意の圧力とすることができる。一例として、PSCは、約２０mbar〜約５００mbarまたはその間の任意の圧力、例えば約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、またはその間の任意の圧力とすることができる。デューティサイクルは、上述したように、これらの値から決定することができ、約０．１〜１．０の範囲またはその間の任意の量、例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９、またはその間の任意の量とすることができる。
【００７２】
流路の形態を連続的に変化させることによって、粒子と流路の微小構造体との間の接触が阻害され、従来の濾過系粒子分離法の問題である粒子吸着および目詰まりを生じる可能性が低減される。粒子分離装置の動作デューティ・サイクルを変化させることによって、流路内面への粒子の吸着および流路の閉塞を低減または防止可能となる。流路のデューティ・サイクルを調節することによって、ユーザが動的流路内に捕獲される粒子密度を容易に制御可能となり、それによって、標的粒子集団の入力フローを変化させることがリアルタイムで可能となる。
【００７３】
流路に印加される流体の圧力（流れ圧力）は０（零）ゼロ以外の、約５mbar〜約５０mbarまたはその間の任意の値、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５mbarまたはその間の任意の値とすることができる。
【００７４】
装置の作製
多層ソフトリソグラフィー（MSL）は、数百から数千の微小反応室、バルブ、ポンプ、流体論理素子その他の構成要素を有したマイクロ流体素子を容易にかつ堅牢に製造する周知の製造技術である。Xia & Whitesides、1998（Chemie社Angewandte-lnternationalの版37:551 -575、本願と一体をなすものとして参照する）には、MSL含むソフトリソグラフィのための手順、材料および技術が記載、総括されている。
【００７５】
多層ソフトリソグラフィの概念（MSL）は、ポリマー、例えばポリジメチルシロキサン（PDMS）の層を厚さを変化させて互いの上に繰り返し積層することである。１０：１よりも低い化学量論比のベースと硬化剤を有したPDMSの薄い層と、１０：１よりも高い化学量論比のベースと硬化剤を有したPDMSの厚い層が別々のウェハ上に形成される。例えば、２０：１のベースと硬化剤を用いて基体上にスピン延伸することによって薄い層を得ることができよう。厚い層は5:1のベースと硬化剤を用いて得ることができよう。予めウェーハ上に形成したフォトレジストパターンによって、装置のマイクロ流体通路、例えば、前記流路および制御流路が画成される。次いで、厚い層がウエハから剥離され、薄いウェハの上面に載置される。焼成後、各層中の余剰成分が結合して、二層通路のPDMS「チップ」が形成される。マイクロ流体用途にエラストマーを適用する方法は、当該技術分野において知られており、米国特許第6929030号、Scherer et al.（シェーラー等）の論文Science 2000, 290, 1536-1539、Unger et al.（アンガー等）の論文Science 2000, 288, 113- 116、McDonald et al.（マクドナルド等）の論文Ace. Chem. Res. 2002, 35, 491-499、Thorsen, T. et al,.（トーセン等）の論文Science 2002, 298, 580-584、Liu, J. et al.（劉等）の論文Anal. Chem. 2003, 75, 4718-4723、Rolland et al.（ロラン等）の論文2004 JACS 126:2322- 2323、WO 02/43615およびWO 01/01025参照。
【００７６】
限定する趣旨ではないが、軟質ポリマーを含む種々のポリマーが、マイクロ流体素子およびシステムで使用することができる。本発明の種々の態様によるマイクロ流体装置の全てまたは一部の製造において有用であり得るポリマーの例としてエラストマーが挙げられる。エラストマーは、一般に、広範な熱安定性、高い潤滑性、撥水性および生理学的不活性によって特徴付けることができる。エラストマーの他の望ましい特徴は用途によって異なる。所望の目的のために好適なエラストマーまたはエラストマーまたは組み合わせを選択することは当業者の能力の範囲内である。エラストマーとしては、シリコーン、PDMS、光硬化性パーフルオロポリエーテル（PFPE）、フルオロシリコーン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリウレタン、ポリ（スチレン-ブタジエン-スチレン）、ビニルシラン架橋シリコーン類などが挙げられる。エラストマーは、光学的に透明または不透明、或いは、透明度が変化してもよい。本開示の実施形態では、生体適合性エラストマーを使用することが望ましいであろう。PDMSは、ソフトリソグラフィ用途における最初の発達、より広く使われているエラストマーの一つである。PDMSは、本発明の様々な実施形態で使用されるエラストマーとして記載されている場合、それは例示目的のみのためであり、代替のエラストマーの選択は当業者の知識の範囲内である。マイクロ流体用途における使用に適したエラストマー、およびそれらの様々な特性および応用例は米国特許第6929030号に記載されている。
【００７７】
製造中に他の構成要素を粒子分離装置に組み込むことができよう。つまり、MSLの間に微小なのバルブ、ポンプ、通路、流体マルチプレクサ、灌流室等を統合することができよう。このような構成要素を作り統合する手法は、例えば、米国特許第7144616号、米国特許第7113910号、米国特許第7040338号、米国特許第6929030号、米国特許第6899137号、米国特許第6408878号、米国特許第6793753号、米国特許第6540895号、米国特許出願公開第2004/0224380号、米国特許出願公開第2004/0112442号およびWO2006/060748に記載されている。
【００７８】
製造後、微小構造体の流路の１または複数の壁、小孔または他の空間を表面処理剤によって処理または被覆してもよい。例えば、通路、小孔または他の空間をウシ血清アルブミン（BSA）またはポリマーを含む流体で一時的に満たし、粒子、特に細胞の非特異的な付着を防止または低減するようにできよう。このようなポリマーの例は、当該技術分野で利用可能であるような様々なポリマー分子量のポリエチレングリコールを含む。処理を準備する際に、装置内を処理し流体の流れを可能にするために適切な粘度を維持しながら、表面上に十分なポリマーまたはタンパク質を堆積させるために適切なポリマーのサイズ及び濃度を当業者は選択することができる。表面処理の後、通路、小孔または他の空間は、残留するアルブミンまたはポリマーを除去するために、第二の流体（例えば、緩衝液、溶剤、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等）でフラッシュするようにしてもよい。
【００７９】
また、微小構造体は、１または複数の寸法が約1mm小さい構造を備えていることは理解されよう。
【００８０】
粒子の流れの不均一混合物は、複数の粒子タイプ、種、特性を含むことができよう。粒子のタイプ、種、特性は、サイズ、剛性またはサイズと剛性の双方が異なっていよう。また、粒子の1つ以上が選択マーカーまたは識別可能なマーカーであってもよい。
【００８１】
粒子は、マイクロシステム内を流通可能な不連続材料であろう。例えば、粒子は、ビーズ、細胞などを含むことができる。例えば、ポリマービーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ナイロンおよび多くの他のポリマー）、シリカまたはシリコンビーズ、粘土や粘土ビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、磁性ビーズ、金属ビーズ、無機化合物ビーズ、および有機化合物のビーズ使用することができる。例えば一般的にクロマトグラフィーに用いられる粒子（例えば、1999年シグマ「生命科学研究のための生化学および試薬」ミズーリ州セントルイス所在のシグマ社のカタログ1921-2007ページ(the 1999 Sigma "Biochemicals and Reagents for Life Sciences Research" Catalog from Sigma (Saint Louis, Mo.), e.g., pp. 1921-2007)参照）や、一般的なアフィニティ精製に使用されるもの（例えば、ダイナル社製のダイナビーズ(Dynabeads TM)はもとより、バクスター免疫療法グループであるプロメガ社および他の多くの供給源から供給される多くの誘導体化ビーズ、例えば、種々の誘導体化ダイナビーズ(Dynabeads TM)（例えば、一般的に結合された試薬を含む様々な磁気ダイナビーズ(Dynabeads TM)）のような種々の粒子が市販されている。
【００８２】
粒子は、緩衝液、生理食塩水、水、培養液、血液、血漿、血清、細胞または組織抽出物、尿など、またはそれらの組み合わせを含む任意の適切な液体中に懸濁させることができる。
【００８３】
細胞は、例えば、細胞培養、環境試料、被験者の体液または組織サンプルから得られ或いは細胞培養、環境試料、被験者の体液または組織サンプル内に発見することができる。細胞は、植物細胞を含む真核細胞であってもよい。細胞培養は、１または複数の特定の細胞型または細胞種を分離するプロセス、濃縮するプロセスまたはその双方のプロセスに含まれてもよい。組織サンプルは、例えば、掻爬、剥離、組織削りまたは組織拭き取り、針吸引生検または針（コア）生検、組織サンプリングのための切開生検、または、切除生検により得ることができ、そしてそれは関心組織の完全な除去を伴うかもしれない。体液としては、例えば、血液、骨髄、血漿、血清、脂肪組織、痰、尿、精液、羊水、臍帯血、脳脊髄液などが挙げられる。
【００８４】
環境試料は、流体と１または複数種の粒子を含むことができる。例えば、環境試料は、真水または塩水（例えば海水、湖沼水、処理施設からの水、下水管からの流出水、或いは、ある場所や環境を監視する際に取得することができる他の水のサンプル）を含むことができよう。環境試料は、土壌、植物、或いは、ある場所や環境を監視する際に見出すことができる他の物質を含むことができる。環境試料は、真核細胞、および/または、原核細胞、および/または、ミネラル、微粒子等を含むような本明細書に例示のような粒子を含んでいてもよい。
【００８５】
対象は、哺乳類、爬虫類、鳥や魚などのような動物とすることができよう。哺乳動物としては、齧歯類、ネコ、イヌ、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマまたはフェレットが挙げられ、げっ歯類の例としては、マウス、ラット、モルモットまたはハムスターを含み、霊長類の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、アカゲザル、ミドリザルが含まれよう。
【００８６】
細胞としては、例えば、赤血球、白血球、末梢血単核球（PBMC）、幹細胞、腫瘍細胞、癌細胞（初代または不死化）、動物またはヒト細胞株（初代細胞株または不死化細胞株）が挙げられる。幹細胞の例としては、成体幹細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹を含む細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞が挙げられる。癌細胞は、どのような癌または腫瘍であってもよい。癌および腫瘍の異なるタイプの非限定的な例としては、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣と脈絡叢腫瘍、松果体腫瘍、神経腫瘍、髄芽腫、神経鞘腫、髄膜腫を含むこのような中枢神経系の新生物として癌腫、髄膜肉腫、下垂体腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎皮質の腫瘍の腫瘍など、内分泌腺の腫瘍、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、および網膜芽細胞腫など、目の腫瘍、神経内分泌システム、胃腸の内分泌系の腫瘍、および生殖腺の腫瘍、頭頸部癌、口腔、咽頭、喉頭の腫瘍、および歯原性腫瘍を含む頭頸部の腫瘍、大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性中皮腫、胸腺腫、および胸郭の一次胚細胞腫瘍含む胸郭の腫瘍、食道、胃の腫瘍を含む消化管の腫瘍、肝臓、胆嚢、膵臓外分泌腺、小腸、虫垂、腹膜、結腸と直腸の腺癌、そして肛門の腫瘍、尿生殖路の腫瘍、腎細胞癌、腎盂腫瘍、尿管を含む、膀胱、尿道、前立腺、陰茎、精巣、および外陰部の腫瘍や膣、子宮頸部、子宮の腺癌、卵巣癌、婦人科肉腫、および乳房の腫瘍を含む、女性の生殖器官、皮膚の腫瘍など基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、悪性黒色腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、プリミティブを含む、骨および軟部組織の腫瘍、神経外胚葉性腫瘍、および血管肉腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、HTLV-IおよびT細胞白血病/リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、ホジキン病を含む造血系の腫瘍、非ホジキンリンパ腫、および肥満細胞性白血病、および急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎腫瘍などを含む子供の腫瘍を含む。
【００８７】
粒子が細胞の場合、媒体、血液または他の流体中で１または複数の細胞型または細胞種を他から分離することには複数の用途がある。限定されないが、このような用途は、白血球除去、血液銀行処理、培養中の非同期細胞の分離、選択された細胞型の濃縮（例えば、臍帯血や骨髄または脂肪組織から幹細胞）、稀な細胞型の同定および/または列挙を含むことができる（例えば血液中の循環腫瘍細胞）などを含むことができよう。このような循環腫瘍細胞は、癌および/または転移の進行や広がりのマーカーとして特定の診断上の、予後における或いは臨床的な関心細胞であろう。循環腫瘍細胞（CTC）は他の血液細胞とは物理的特性、つまりサイズと剛性が相違している。これらの物理的特性の相違は、白血球(WBCs)、心筋細胞、間葉系幹細胞（MSC）および多能性幹細胞のような他の細胞型に利用できるであろう。更に、血液試料中の他の細胞から赤血球を分離して、その後の分析を容易にすることは有益であろう。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および相当な努力が、この反応を縮小するために費やされてきた。赤血球中のヘモグロビンはPCR反応の阻害剤であり、従って、赤血球の存在はPCR反応において有害である。この現象は、白血球濃縮に関する1997年のカールソン等の研究およびワイル等の1998年の研究を刺激した。
【実施例１】
【００８８】
微細加工
図２に示す動的に調整可能な流路高さを有した本発明の粒子分離用の微小構造体の実施例は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）シリコーンの多層ソフトリソグラフィーを用いて作製された二層微小構造体である。多層ソフトリソグラフィー（MSL）は、数百から数千の微小反応室、バルブ、ポンプ、流体論理素子および他の構成要素を有したマイクロ流体素子の容易にかつ堅牢に製造可能とする周知の製造技術である。Xia & Whitesides、1998（Chemie社Angewandte-lnternationalの版37:551 -575、本願と一体をなすものとして参照する）には、MSL含むソフトリソグラフィのための手順、材料および技術が記載、総括されている。
【００８９】
流路微小構造体を含む流路層および制御通路微小構造体を含む制御層を含む成形部品は別々にシリコンウェハ上に製作した。流路層は、流路層に求められる形状を容易にするために４つのフォトリソグラフィ工程で製作した。制御層は、単一のフォトリソグラフィ工程で製作した。５つのマスクパターンは、SolidWorksのDWGエディタを用いて描写した。
【００９０】
成形部品の流路層のSU-8部分を洗浄した100mmシリコンウェハ上に製作した。200℃のホットプレート上で５分間加熱脱水した後、SU-8 3010を500rpmで10秒間前記ウェハ上に広げた後、2250rpmで30秒間スピン延伸した。マスクアライナ内で90秒間紫外線露光する前に、前記ウェハをホットプレート上で95℃で5分間ソフトベークした。次いで、露光したウェハに65℃で1分間、95℃で5分間、そして65℃で1分間のシーケンスで露光後焼成を行った。該ウェハは、その後、SU-8現像液(MicroChem)を用いて現像された。SU-8 3005の第2の層を500rpmで10秒間前記ウェハ上に広げ、次いで3000rpmで30秒間スピン延伸させた。マスクアライナ内で90秒間紫外線露光する前に、前記ウェハをホットプレート上で95℃で5分間ソフトベークした。次いで、露光したウェハに65℃で1分間、95℃で3分間、そして65℃で1分間のシーケンスで露光後焼成を行った。次いで、SU-8現像液(MicroChem)を用いて該ウェハを現像した。SU-8 3025の第三層を500rpmで10秒間前記ウェハ上に広げ、次いで4000rpmで30秒間スピン延伸させた。マスクアライナ内で60秒間紫外線露光する前に、前記ウェハをホットプレート上で95℃で5分間ソフトベークした。次いで、露光したウェハに65℃で1分間、95℃で5分間、そして65℃で1分間のシーケンスで露光後焼成を行った。次いで、SU-8現像液(MicroChem)を用いて該ウェハを現像した。SU-8微小構造体を含むシリコンウェハに流路層のSPR部分が加えられた。SPR 220-7.0フォトレジストを550rpmで50秒間前記ウェハ上に回転塗布した。エッジビードは手操作で除去した。塗布の後、前記ウェハをホットプレート上で65℃で1分間、95℃で3分間、そして65℃で1分間ソフトベークした。次いで、SPRパターンのため設計されたマスクをSU-8のパターンで位置決めし、バースト間隔30秒で5 30バーストで露光した。約30分間待った後、MF-319現像液(MicroChem)を用いてウェハを現像した。最後に、現像したウェハを95℃のホットプレートで10分間アニールし、通路輪郭を丸くした。み通路プロファイルを作成するためのCホットプレート。制御層は、SU-8 3025から作られ、流路層の第2のSU-8層と同じ方法で製造した。
【００９１】
流路と制御通路を含むシリコンウェハは、プラスチック成形技術を用いて複製した(SPデサイ、DMフリーマンおよびJ. Voldman、ラボオンチップ、2009年、9月、1631-1637(S. P. Desai, D. M. Freeman and J. Voldman, Lab Chip, 2009, 9, 1631-1637))。微小構造体は、多層RTV 615ソフトリソグラフィーシリコーン(モメンティブ・パフォーマンス・マテリアル(Momentive Performance Materials))を用いたPDMSプラスチック成形で製作した。制御通路は、シリコンウェハのプラスチック複製品上に1800rpmでスピン延伸させた。流路は、プラスチックのマスターから鋳造成形され、65℃のオーブンで1時間、制御層に拡散接合した。接合した素子は、直径0.5ｍｍのパンチ(米国テキサス州アングルトン所在のTechnical Innovations社(Technical Innovations, Angleton, TX, USA))を用いて切断、打ち抜き流体ポートを形成した。ボンディングの準備のために、PDMS素子と清浄なガラススライドの双方を空気プラズマ(米国ニューヨーク州イサカ所在のハリックプラズマ社(Harrick Plasma, Ithaca, NY, USA))の40sを用いて活性化した。完成した微小構造体は、先ず、200mbarの圧力を用いて、脱イオン水で制御通路を充填することにより実験のために調製された。続いて、5％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水を流路に注入し、PDMSの表面上の細胞の非特異的吸着を防止するために30分間インキュベートした。
【実施例２】
【００９２】
粒子分離分析
分離通路内に既知の大きさの剛性ポリスチレン製マイクロスフェア懸濁液(バングスラボラトリーズ社(Bangs Labs))を流通させた。流路は、当初開放位置にあり、全ての微小球は妨げられることなく通路内を流通する。制御通路により流路に印加される圧力は、微小球が通路を通って流れ続けるにつれ徐々に高くなる。印加される圧力が増加するので柔軟な膜が流路内に偏倚し、流路は第２の位置または制限位置となり、流路の長手方向に沿って流路高さが低減される。流路を第２の位置とするために必要な圧力、そして、懸濁液から単一の微小球を捕獲するのに必要な圧力、懸濁液から微小球の約半分の微小球を捕獲するのに必要な圧力、および、懸濁液から略全ての微小球を捕獲するのに必要な圧力記録した。懸濁液からほぼすべての微小球が捕獲される圧力は、流路が第２の位置に到達し、流路の対向する第１と第２の表面が実質的に平行となるときを示している。これら３つの測定値をボトムエラーバウンド、データポイントおよびトップエラーバウンドで図７に示す。異なる３つの懸濁液でこの実験を繰り返し行った。異なる３つの懸濁液の各々の微小球は、6.47μm、7.27μm、9.45μm、10.14μmの直径を有している。図７に示す結果は、明らかに、開位置から半閉鎖位置に流路を移動するために必要な圧力を示している。メーカーは、微小球の直径につき、微小球直径の形状エラーバウンドの標準偏差を引用している。
【００９３】
結果は、より大きな粒子を入口または流路内に補足または捕獲するためには、小さな粒子よりも実質的に低い圧力が必要であることを示している。流路に印加する圧力の大きさを制御することにより流路を第１と第２の位置の間で移動することによって、サイズと変形性に基づく粒子の選択性が容易にすることを示している。
【実施例３】
【００９４】
粒子速度解析
L1210マウスリンパ腫細胞をRPMI 1640(インビトロジェン社(Invitrogen))を用いて、37℃、5％のCO2を含有する100％加湿雰囲気において、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む懸濁培養で増殖させた。細胞懸濁液を、5％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて希釈した。細胞生存率を、製造業者の指示に従ってL3224 LIVE / DEAD生存率/細胞毒性キット(インビトロジェン社(Invitrogen))を用いて評価した。末梢血単核細胞を、インフォームドコンセントの下、健康な志願者から採取した全血から調製した。全血は、チューブを含む6 mLのヘパリンナトリウム中に吸引した。末梢血単核細胞を、製造者の指示に従ってHISTOPAQUE 1077（Sigma-Aldrich社）を用いて得られた。その後、AIM 5メディア(インビトロジェン社(Invitrogen))で1mLあたり10×106の濃度で再懸濁した。赤血球は全血から精製し、献血から48時間以内に使用した。試験前に、３つの細胞型の各々は、1mL当たり7×108細胞の濃度に再懸濁した。微小構造体に注入される流体は、15 mLのコニカルチューブ(フィッシャーサイエンティフィック社(Fisher Scientific))から供給した。コニカルチューブは、該チューブが加圧された容器として機能できるようにした専用設計のキャップで密封した。容器と微小構造体間の液体の接続は、内径0.5 mmの柔軟タイゴンチューブ(コール・パーマー社(Cole-Parmer))を用いて作成した。微小構造体とチューブとの間のインターフェイスは、PDMS素子とタイゴンチューブとの間に延伸シールを形成する、長さ19ｍｍの23ゲージステンレススチールチューブ(米国ニューハンプシャー州リッチフィールド所在のニューイングランドスモールチューブ社(New England Small Tube, Litchfield, NH, USA))を用いて作成した。マルチチャンネル圧力制御システム(フランス国所在のFluigent社製MFCS-4C(Fluigent MFCS-4C, France))を用いて流路に接続された容器を加圧した。制御通路に接続された容器を加圧し、可撓性膜を偏倚させて流路を制限位置にするために専用設計の圧力制御システムを使用した。制御通路に印加される圧力は、MSP430マイクロプロセッサ(テキサス・インスツルメンツ社(Texas Instruments))と専用に開発されたPCソフトウェアによって自動制御されるソレノイドバルブを用いてオン、オフすることができる。
【００９５】
ニコンのTi-U倒立顕微鏡とニコンDS-2MBW CCDカメラを用いて微小通路内部の細胞の運動のビデオを得た。撮像動画のフレーム単位のトラッキングを用いて個々の細胞の変位を測定した。各セルの正味の速度は、変位データを線形近似した傾きを用いて決定した。気泡径は、CCDカメラに付属しているニコンNIS-要素画像キャプチャソフトウェアを用いて懸濁液中で測定した。
【００９６】
結果からは、赤血球細胞(RBCs)は、高い変形性を有した直径8mm、厚さ2mmの円盤状細胞であることがわかる。赤血球の寸法が微小構造体の長さスケールに比べて小さいので、これらの細胞は本質的に、バルク液体の流れに従う。PBMCは、主としてリンパ球からなり、測定平均直径7.2mm標準偏差0.6mmを有する。マルチレベルセル(MLCs)は不死化細胞株から成長させ、通過後４−６日の間実験に使用した。この期間中、これらの細胞は、10.0mm標準偏差1.4mmの平均直径を有していた。MLCsを選択した理由は、そのサイズと形状はPBMCをにやや似ているが、その核が大きいため、剛性が非常に高くなる可能性が高いためである。
【００９７】
微小通路の2500mmの所定の長さ部分に亘って個々の細胞の変位を観察することによって、動的微小通路内の３つの細胞型の各々の流動特性を追跡した。図１０、１１に代表的な細胞の変位データのグラフおよびビデオ画像を示す。20mbarの圧力でサンプル流体を微小通路に注入し、膜の膨張圧は、流路の開位置のための100mbarと半閉鎖位置のための230mbarとの間で変化させた。膜が第１の位置から第２の位置へそして最初の位置に戻る1つのサイクルが完了するまでの時間は、6秒、50％のデューティサイクルであった。各データグラフのタイミングは図９の膜サイクルの位相に一致するように調整した。L3224 LIVE / DEAD生死判別試験(インビトロジェン社(Invitrogen))により生じる蛍光信号を用いて、細胞生存率を微小通路の長さに沿って繰り返し確認した。細胞生存率の変化は観察されず、これはPDMS膜マイクロバルブによって圧縮した真核細胞に関する以前の観察と一致している。
【００９８】
図１２に３つの細胞型の各々の平均速度のデューティサイクル依存性を示す。これらの測定は、流路圧力100mbarおよび230mbarにおける開位置および半閉鎖位置で採取した。マルチレベル細胞の平均速度は、デューティサイクルが100％から減少するにつれ減少傾向を示し、これに対して、末梢血単核球（PBMC）と赤血球細胞(RBC)の正味流速は互いにほぼ同一であり、またデューティ・サイクルにほとんど依存性がないことを示している。末梢血単核球（PBMC）と赤血球細胞(RBC)の平均速度は、低い周波数で増加する一般的な傾向を示している。この傾向は、これらの細胞と動的微小通路の表面との間の相互作用が減少することに起因する。デューティ・サイクルが40％よりも低くなると、マルチレベルセルの平均速度は、また、デューティサイクルの減少に伴って増加し始める。この特性は、流路が過剰に加圧される場合と同様に、より大きなマルチレベルセルの一部を排除する膜の動きによって引き起こされる。と言うのは、これらの細胞が微小通路に流入には流路が開位置にある時間が不十分であるためである。
【００９９】
既述の説明では、説明目的から、実施形態の完全な理解を提供するために多くの詳細部分を説明した。然しながら、これらの特定の詳細は必ずしも必要とされないことは当業者には明らかであろう。他の例において、理解を不明瞭にしないために、周知の構造および電気回路はブロック図形式で示される。例えば、本明細書に記載の実施形態がソフトウェアルーチン、ハードウェア回路、ファームウェア或いはそれらの組み合わせとして実現されるか否かについては特定の詳細は記載されていない。
【０１００】
上述した実施形態は、単なる例であり、当業者は、特許請求の範囲によって定義される範囲から逸脱することなく、特定の形態において変更、修正および変形を行うことができる。
【０１０１】
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【０１６２】
62.ボリンジャーA、ブッティP、バラスJ-、トラシェルダーH、シーゲンターラーW「テレビ顕微鏡法により測定されたヒトの爪床毛細血管における赤血球速度」微小血管研究、1974年1月; 7(1): 61-72 (Bollinger A, Butti P, Barras J-, Trachsler H, Siegenthaler W. Red blood cell velocity in nailfold capillaries of man measured by a television microscopy technique. Microvasc Res. 1974 1; 7(1):61-72)
【０１６３】
63.ブッティP、インタグリータM、ライマンH、ホリガーC、ボリンジャーA、アンリッカーM「ビデオデンシトメトリー法によるヒトの爪床毛細血管中の赤血球速度測定」微小血管研究、1975年9月、10(2): 220-7 (Butti P, Intaglietta M, Reimann H, Holliger C, Bollinger A, Anliker M. Capillary red blood cell velocity measurements in human nailfold by videodensitometric method. Microvasc Res. 1975 9;10(2):220-7)
【０１６４】
64.バザルガンV「熱応答性のポリマー溶液を用いたマイクロフロー制御」2008年:1-152 (Bazargan V. Micro flow control using thermally responsive polymer solutions. 2008:1-152)
【０１６５】
65.デサイSP、フリーマンDM、ヴォルドマンJ「ソフトリソグラフィ用プラスチックマスターリジッドテンプレート」ラボチップ、2009年9月: 1631-7 (Desai SP, Freeman DM, Voldman J. Plastic masters- rigid templates for soft lithography. Lab Chip. 2009(9):1631-7)
【０１６６】
66.ダフィーDC、マクドナルドJC、シュエーラー王者、ホワイトサイズGM「ポリ(ジメチルシロキサン)におけるマイクロ流体システムのラピッドプロトタイピング」分析化学、1998年12/01、70(23): 4974-84 (Duffy DC, McDonald JC, Schueller OJA, Whitesides GM. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 1998 12/01 ; 70(23) :4974-84)
上記全ての文献を本願と一体をなすものとして参照する。
【符号の説明】
【０１６７】
１０    粒子分離微小構造体
１２    本体
１４    流路
１６    第１の壁
１８    第２の壁
２０    突出部
２１    側壁
２２    側壁
４０    制御通路
５０    凹所
７０    粒子分離装置
７２    流出側制御弁
７２ａ    流入側制御弁
７２ｃ    流出側制御弁
７２ｄ    流出側制御弁
７３    サンプル管路
７４    流路入口
７５    バッファー管路
７６    流路出口
７７    第１の粒子管路
７８    第２の粒子管路
９０    対象粒子
９２    バックグラウンド粒子
１００    多段装置
１１０    粒子分離微小構造体
１１２    本体
１１４    流路
１１６    第１の壁
１１８    第２の壁
１２０    突出部
１３０    リブ
１４０    制御通路
１４２    第３の壁
１５０    凹所
１７０    粒子分離装置
１７０ａ    第１の装置
１７０ｂ    第２の装置
１７０ｃ    第３の装置
１７３    サンプル管路
１７３ａ    サンプル入口
１７３ｂ    サンプル管路
１７３ｃ    サンプル管路
１７５    バッファー管路
１７７    第１の粒子管路
１７８    第２の粒子管路
１７８ａ    第２の粒子管路
１７８ｂ    第２の粒子管路
１７８ｃ    第３の粒子管路
１７９    コネクタ
２１０    粒子分離微小構造体
２１４    流路
２１８    第２の壁
【図１Ａ】
2014505590.tif 000003
【図１Ｂ】
2014505590.tif 000004
【図２Ａ】
2014505590.tif 000005
【図２Ｂ】
2014505590.tif 000006
【図３Ａ】
2014505590.tif 000007
【図３Ｂ】
2014505590.tif 000008
【図４】
2014505590.tif 000009
【図５】
2014505590.tif 000010
【図６】
2014505590.tif 000011
【図７】
2014505590.tif 000012
【図８（Ａ）】
2014505590.tif 000013
【図８（Ｂ）】
2014505590.tif 000014
【図８（Ｃ）】
2014505590.tif 000015
【図９】
2014505590.tif 000016
【図１０】
2014505590.tif 000017
【図１１Ａ】
2014505590.tif 000018
【図１１Ｂ】
2014505590.tif 000019
【図１２】
2014505590.tif 000020
【国際調査報告】
2014505590.tif 000021
2014505590.tif 000022