(57)【要約】  本発明は、低刺激性アレルゲンとして有用な突然変異体ポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、突然変異体のＢｅｔ  ｖ  １タンパク質およびこのようなポリペプチドの、カバノキ花粉アレルギーに対して脱感作するための低刺激性アレルゲンとしての使用を提供する。さらに、本発明は、このようなポリペプチドを含むワクチン処方物、このような処方物の使用、およびカバノキ花粉アレルギーに対するワクチン接種の方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示される野生型アミノ酸配列の鋳型、またはその任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換え低刺激性カバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、天然で、または突然変異の何れかにより、
（１）アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｓ１１７、およびＫ１１９からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第１のアミノ酸置換と、
（２）アミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第２のアミノ酸置換と
を含むポリペプチド。
【請求項２】
野生型アミノ酸配列の前記鋳型が、配列番号３に示される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
野生型アミノ酸配列の前記鋳型が、配列番号４〜３８からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４１〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびにアミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における少なくとも１つの第２のアミノ酸置換、またはこれらのアイソフォームを含む、請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸１０１がＫである配列番号４１、
アミノ酸８０がＹである配列番号４２、
アミノ酸８２がＫである配列番号４３、
アミノ酸８４がＫである配列番号４４、
アミノ酸９９がＫである配列番号４５、
アミノ酸１１７がＫである配列番号４６、および
アミノ酸１１９がＥである配列番号４７
からなる群から選択されるアミノ酸配列；
ならびにアミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における少なくとも１つの第２のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つの第１のアミノ酸置換が、アミノ酸残基Ｅ１０１およびＳ９９からなる群から選択される位置にあり、前記少なくとも１つの第２のアミノ酸置換が、アミノ酸残基Ｎ２８およびＤ２５からなる群から選択される位置にある、請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つの第１のアミノ酸置換が、Ｅ１０１位にあり、前記少なくとも１つの第２のアミノ酸置換が、Ｎ２８位にある、請求項１〜７の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ヒスタミン放出能が、前記野生型Ｂｅｔ  ｖ  １のヒスタミン放出能と比較すると、少なくとも２０分の１に低減されている、請求項１〜９の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ヒスタミン放出能が、前記野生型Ｂｅｔ  ｖ  １のヒスタミン放出能と比較すると、少なくとも１００分の１に低減されている、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
併せて少なくとも２、３、または４つのアミノ酸置換が存在する、先行する請求項の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の少なくとも１つの低刺激性ポリペプチドと、医薬として許容可能な希釈剤またはアジュバントとを含むワクチン組成物。
【請求項１４】
前記ワクチンが、舌下投与用である、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
配列番号３に示される野生型アミノ酸配列の鋳型、またはその任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、天然で、または突然変異の何れかにより、
（１）アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｓ１１７、およびＫ１１９からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第１のアミノ酸置換と、
（２）アミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第２のアミノ酸置換と
を含む、ワクチンとして用いるためのポリペプチド。
【請求項１６】
カバノキ花粉アレルギーに対してワクチン接種する方法であって、カバノキ花粉アレルギーを患う対象に、請求項１〜１４の何れか１項に記載の低刺激性ポリペプチドまたはワクチン組成物を、カバノキ花粉に対して脱感作し、これに対する防御的抗体の産生を誘導するのに有効な量で投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、低刺激性アレルゲンとして有用な突然変異体ポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、特異的突然変異体のＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド、およびカバノキ花粉アレルギーに対して脱感作するための低刺激性アレルゲンとしての、このようなポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、このようなポリペプチドを含むワクチン処方物、ワクチン接種におけるこのような処方物の使用、およびカバノキ花粉アレルギーに対するワクチン接種の方法にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
アレルギーは、一般的には無害なタンパク質であるアレルゲンに対する免疫反応によって引き起こされる。アレルギー性疾患は、全世界で流行性といい得る比率に達しつつある。工業国における人口の２５％超が、Ｉ型アレルギーを患い、その数は、着実に増大しつつある。カバノキ花粉アレルギーは、Ｉ型アレルギーの極めて一般的な形態である。Ｂｅｔ  ｖ  １とは、カバノキ花粉の主要なアレルゲンである。Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲン、そのイソアレルゲン、および変異体についてのより多くの情報は、ＷＨＯのウェブサイトであるｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇにおいて見出される。
【０００３】
Ｉ型アレルギーは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の形成に基づく。アレルゲン分子が、マスト細胞または好塩基球の表面上の受容体に結合した２つのＩｇＥ抗体に結合し、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ複合体の架橋形成を誘導すると、症状が発生する。これは、炎症性の反応および症状、例えば、アレルギー性喘息、鼻炎、食物および皮膚アレルギー、ならびにまたアナフィラキシーを引き起こす生物学的メディエーター、例えば、ヒスタミンおよび脂質メディエーターの脱顆粒を誘発する。
【０００４】
ＩｇＥは、２つの同一な軽鎖および重鎖からなる大型の分子である。ＩｇＥの重鎖には５つのドメイン：ＶＨ、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３、およびＣε４が存在する。完全なＩｇＥ分子のサイズは、約２００ｋＤａである。そのＦｃεＲＩ受容体へと結合したＣε２〜Ｃε４断片およびＣε２〜Ｃε４断片の結晶構造は、決定されている（Ｇａｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００（４０６）：２５９〜２６６；およびＷａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２（３）：６８１〜６８６）。
【０００５】
過去数年間において、多数の異なるアレルゲンの三次元構造が決定されている。これらのアレルゲンは、構造的に大幅にばらつき、アレルゲンがＩｇＥ抗体の産生を引き起こす能力を説明しうる一般的な構造モチーフは同定されていない。しかし、アレルギー誘発性が少数のタンパク質ファミリーだけに制約されていることを示唆する研究がなされており、これにより、タンパク質の構造的特徴もまた、アレルギー誘発性において役割を果たすという証拠が提起されている（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５（１１５）：１６３〜１７０；Ｒａｕｄａｕｅｒら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８（１２１）：８４７〜８５２；Ｒｏｕｖｉｎｅｎら、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ２０１０（５）：ｅ９０３７）。
【０００６】
アレルギー誘発性について研究する場合の本質的な問題は、アレルゲンのＩｇＥ抗体結合部位である、いわゆるＢ細胞エピトープに関与する。しかし、残念なことに、このＢ細胞エピトープは、アレルゲンの三次元構造から直接的に推定することができない。加えて、個別の患者のＩｇＥにより認識される明確なアレルゲンのエピトープには差違がある。したがって、Ｂ細胞エピトープは、多様な技法および多様な原理、例えば、アレルギー性患者に由来するポリクローナルのＩｇＥ血清プールと反応するアレルゲン誘発性の断片またはペプチドの解析、アレルゲンの部位指向突然変異誘発、エピトープ模倣体（ミモトープ）の使用、およびバイオインフォーマティックスによるモデル化研究を用いて探索されてきた。しかし、それでもなお、何れのアレルゲンについても、主要なエピトープの全体的な遺伝子地図は存在しない。
【０００７】
カバノキ花粉に関しては、例えば、Ｈｏｌｍら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００４（１７３）：５２５８〜５２６７）により、「選択領域」における表面トポロジーを操作する目的で、４つおよび９つの点突然変異を含有するＢｅｔ  ｖ  １突然変異体が作製された。論文は、この「選択」がいかにしてなされたのかについては記載していない。４つのアミノ酸置換を伴う突然変異体は、分子表面上における３つの異なる領域に対応し、９つアミノ酸置換を伴う突然変異体は、分子表面上における５つの異なる領域に対応していた。これらのＢｅｔ  ｖ  １突然変異体は、場合によっては、ヒト血清中のＩｇＥに結合し、ヒト好塩基球によるヒスタミン放出を誘発する能力を低減させた。これらのＢｅｔ  ｖ  １突然変異体はまた、突然変異させていないＢｅｔ  ｖ  １に対するＩｇＧ抗体を誘導することも可能であった。
【０００８】
さらなる修飾組換えアレルゲンが報告されている：
国際特許公開ＷＯ０２／４０６７６および同ＷＯ０３／０９６８６９は、カバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １の多くの突然変異体形態を開示している。これらの突然変異体は、ランダム突然変異を、Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドの保存的表面構造の配列解析に基づく推定ＩｇＥ結合部位に導入することにより作製された。ＷＯ０３／０９６８６９は、アレルゲン表面上の異なる「小型基」における４つの主要な突然変異の使用について開示している。
【０００９】
国際特許公開ＷＯ２００７／０７３９０７は、アミノ酸部位５４、１１５、または１２３における３つのアミノ酸の置換または欠失を含むＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドについて開示している。これらの突然変異体により、ヒスタミン放出能が低減されたという証拠はない。
【００１０】
国際特許公開ＷＯ２００９／０２４２０８は、アミノ酸１００〜１２５の領域内に少なくとも４つの突然変異を有するＢｅｔ  ｖ  １突然変異体について開示している。しかし、突然変異のためにポリペプチドの三次元構造は失われており、ヒスタミン放出活性も報告されていない。
【００１１】
国際特許公開ＷＯ２００８／０９２９９２は、不連続のアレルゲン誘発性エピトープ、すなわち、アレルゲン誘発性物質上の６００〜９００Åの領域を伴う平面状の表面におけるアミノ酸残基を修飾することにより、Ｉ型表面におけるアレルゲン誘発性物質の相互作用を遮断する方法について開示し、これにより、低刺激性カバノキ花粉タンパク質を調製しうることを示唆している。
【００１２】
Ｎｉｅｍｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２００７（１５）：１４１３〜２１は、任意のアレルゲンの完全なエピトープを決定するための唯一の合理的な方法は、ＩｇＥ抗体と複合体化したアレルゲンの結晶構造の測定を要すると言明するＬａｖｅｒら、Ｃｅｌｌ  １９９０（６１）：５５３〜５５６による開示に沿って、特異的なアレルゲンのエピトープを求める１つの手法について開示している。Ｎｉｅｍｉらは、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と複合体化したＩｇＥのＦａｂ断片の結晶構造について開示している。Ｎｉｅｍｉらはまた、２つのＩｇＥ／Ｆａｂ分子が、二量体のＢＬＧにいかに結合するのかについても示し、ＩｇＥのエピトープが、βシート領域内に位置する「平坦な」表面である、既知のＩｇＧエピトープ構造と比較すると異なることについても示している。
【００１３】
Ｒｏｕｖｉｎｅｎら、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ２０１０（５）：ｅ９０３７は、未変性型質量分析（エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析：ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）と組み合わせたバイオインフォーマティックス法を用いて、アレルゲンの二量体構造の役割について探索した。アレルゲンの５５の既知の結晶構造のＥＳＩ−ＭＳ測定により、アレルゲンのうちの８０％は、結晶中で対称性の二量体またはオリゴマーで存在し、大半は、高タンパク質濃度で形成される一過性の二量体であることが示された。二量体構造とアレルギー誘発性の間の可能な関係は、ウシのミルクに由来する組換えアレルゲンであって、二量体として生じるβ−ラクトグロブリン（ｒＢｏｓ  ｄ  ５  Ｂ）、およびその突然変異体であって、主に単量体として生じるＨ１４６Ｐにより研究された。単量体のｒＢｏｓ  ｄ  ５  Ｂ突然変異体であるＨ１４６Ｐにより、天然のＢｏｓ  ｄ  ５  Ｂおよび組換えＢｏｓ  ｄ  ５  Ｂと比較すると、ヒスタミン放出能の、ある程度の低減が観察された。著者らは、二量体化が、アレルゲンの極めて一般的かつ本質的な特徴でありうることを結論付け、純粋に単量体のアレルゲン変異体の調製物であれば、特異的免疫療法の新規の可能性を開きうることを概して示唆しているが、アレルギー誘発性における構造上の特徴の根本的な役割については依然として知られていない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結晶解析から、アレルゲン分子がヒト体内で、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいていかに挙動するのかについての直接的な結論を引き出すことはできない。
【００１４】
今日、全てのアレルギー性症状の処置における趨勢は、しばしば不可能であるか、または症状の処置に過ぎないアレルゲンの回避ではなくて、アレルゲン特異的脱感作を用いる、能動的な忍容性の誘導へと向かっている。現行の脱感作療法は、天然の供給源から精製されたアレルゲンであって、バッチ間のばらつきにより、処置の適正な用量および有効性を見出し、これを維持することと関連する問題がもたらされうるアレルゲンに基づく。これらの問題は、アナフィラキシー性の副作用および新たなアレルゲンへの感作の潜在的危険性をもたらしうる。
【００１５】
脱感作のために組換えアレルゲンを用いれば、バッチ間のばらつきと関連する欠点が除去されるであろう。そして、最初の組換えアレルゲンが臨床試験にかけられている（Ｖａｌｅｎｔａら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０（２８）：２１１〜４１）。したがって、臨床におけるこのようなアレルゲンの有効性は、今後の課題である。
【００１６】
アレルギー治療の問題の増大に応じるための、安全で有効なワクチンおよび治療用生成物に対するニーズは、認知されており、大きなものである。現在のところ、アレルギーの安全で有効な療法のための市場は十分に開発されていない。
【発明の簡単な説明】
【００１７】
本発明は、配列番号３に示される野生型アミノ酸配列の鋳型、またはその任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換え低刺激性カバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、天然で、または突然変異の何れかにより、
（１）アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｓ１１７、およびＫ１１９からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第１のアミノ酸置換と、
（２）アミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第２のアミノ酸置換と
を含むポリペプチドに関する。
【００１８】
本発明は、カバノキ花粉に対して脱感作するためのワクチンとして用いるための、上記で規定された低刺激性ポリペプチドにさらに関する。
【００１９】
本発明は、上記で規定された少なくとも１つの低刺激性ポリペプチドと、少なくとも１つの医薬として許容可能なアジュバントとを含むワクチン組成物にさらに関する。本発明の一態様では、前記ワクチンが、舌下投与用である。
【００２０】
本発明は、カバノキ花粉アレルギーに対してワクチン接種する方法であって、カバノキ花粉アレルギーを患う対象に、上記で規定された低刺激性ポリペプチドまたはワクチン組成物を、カバノキ花粉に対して脱感作し、これに対する防御的抗体の産生を誘導するのに有効な量で投与することを含む方法にさらに関する。
【００２１】
本発明による低刺激性ポリペプチドは、ヒスタミン放出能が、Ｂｅｔ  ｖ  １野生型のヒスタミン放出能と比較すると、少なくとも２０分の１に低減されている。一態様では、ポリペプチドは、ヒスタミン放出能が、少なくとも１００分の１に低減されている。
【００２２】
以下では、本発明が、付属の図面を参照しながら、好ましい態様を介して、より詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】例１において導出されるＢｅｔ  ｖ１の推定ＩｇＥエピトープ残基（赤色の残基）およびＢｅｔ  ｖ  １の二量体化に関与する推定残基（紫色の残基）を例示する図。
【図２】組換えアレルゲンを産生するための細菌の発現ユニットであって、Ｐｔａｃがプロモーターであり、ＰｅｌＢが組換えアレルゲンのコード領域へと連結されたシグナル配列であり、星印がアミノ酸置換部位を例示する発現ユニットを概略的に示す図。
【図３】Ｂｅｔ  ｖ  １の３６のアイソフォームのアミノ酸配列アラインメントを示す図。
【図４】例２で用いられるＢｅｔ  ｖ  １野生型ポリペプチド（Ａ、配列番号１）およびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋポリペプチド（Ｂ、配列番号２）の核酸配列を示す図。
【図５】血清中ＩｇＥのＢｅｔ  ｖ  １への結合に対する、組換えＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １  Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋポリペプチドによる競合的阻害を示す図。
【図６】組換えＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １  Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋポリペプチドによるヒスタミン放出実験の結果を示す図。
【図７】濃度３μＭにおける組換えＢｅｔ  ｖ  １野生型および組換えＢｅｔ  ｖ  １突然変異体Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋの未変性型ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ質量スペクトルを示す図。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
以下の記載、例、および特許請求の範囲では、アミノ酸に３文字コードと１文字コードの両方を用いる。例えば、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：９〜３７（１９８４）を参照されたい。
【００２５】
本発明によるポリペプチドにおけるアミノ酸部位の命名法は、以下の通りに例示される：Ｎ２８とは、２８位にアスパラギン残基が存在することを意味するのに対し、Ｎ２８Ｋとは、２８位におけるアスパラギン残基がリシン残基により置きかえられていることを意味する。したがって、Ｅ１０１とは、１０１位にグルタミン酸残基が存在することを意味するのに対し、Ｅ１０１Ｋとは、１０１位におけるグルタミン酸残基がリシン残基により置きかえられていることを意味するなどである。
【００２６】
カバノキ花粉アレルギーとは、アレルギーの極めて一般的な形態であり、シラカバ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）の花粉は、欧州および北米におけるＩ型アレルギー反応の主要な原因の１つである。人口の約１０〜１５％が、カバノキ花粉アレルギーを患っている可能性があることが推測されている。さらに、対象が花粉にさらされない場合であっても、他のアレルゲン、例えば、リンゴアレルゲンが、アレルギー性反応を引き起こすカバノキ花粉に特異的なＩｇＥと交差反応する。
【００２７】
Ｂｅｔ  ｖ  １とは、カバノキ花粉の主要なアレルゲンであり、カバノキ花粉アレルギー性対象のうちの９５％超におけるＩｇＥ結合の一因である。Ｂｅｔ  ｖ  １とは、分子量が１７ｋＤのタンパク質である。野生型Ｂｅｔ  ｖ  １のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。ＷＨＯのアレルゲンについてのウェブサイト（ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇ）は、Ｂｅｔ  ｖ  １の３６のアイソフォームを列挙しており、その配列は図３で対比されている。アラインメントは、Ｂｅｔ  ｖ  １が、高度に保存的であることを示す。本発明において野生型Ｂｅｔ  ｖ  １として用いられるアイソフォームの鋳型は、アイソフォームＢｅｔ  ｖ  １ａ（Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１）に由来するが、これらのイソアレルゲンのうちの何れか１つ適切なものを用いて、本発明による低刺激性ポリペプチド変異体を提供することができる。
【００２８】
合計３６のＢｅｔ  ｖ  １アイソフォームのアミノ酸配列は、それぞれ、配列表で以下の通りに開示される：１．０１０１（配列番号３）、１．０１０２（配列番号４）、１．０１０３（配列番号５）、１．２５０１（配列番号６）、１．１５０１（配列番号７）、１．１５０２（配列番号８）、１．２８０１（配列番号９）、１．３００１（配列番号１０）、１．２９０１（配列番号１１）、１．２３０１（配列番号１２）、１．０５０１（配列番号１３）、１．０６０１（配列番号１４）、１．０６０２（配列番号１５）、１．０８０１（配列番号１６）、１．１７０１（配列番号１７）、１．０４０１（配列番号１８）、１．０４０２（配列番号１９）、１．０７０１（配列番号２０）、１．１００１（配列番号２１）、１．２４０１（配列番号２２）、１．２６０１（配列番号２３）、１．２７０１（配列番号２４）、１．２２０１（配列番号２５）、１．０２０１（配列番号２６）、１．０９０１（配列番号２７）、１．０３０１（配列番号２８）、１．１４０１（配列番号２９）、１．１４０２（配列番号３０）、１．１９０１（配列番号３１）、１．２００１（配列番号３２）、１．１８０１（配列番号３３）、１．１１０１（配列番号３４）、１．１２０１（配列番号３５）、１．１６０１（配列番号３６）、１．２１０１（配列番号３７）、および１．１３０１（配列番号３８）。
【００２９】
Ｂｅｔ  ｖ  １のアイソフォームは、異なるアレルゲン誘発の可能性を有する変異体を包含する。Ｂｅｔ  ｖ  １のアイソフォームは、配列番号３のＢｅｔ  ｖ  １野生型アミノ酸配列と少なくとも９４％同一である。例えば、Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１に対するアミノ酸残基同一性が９６％のアイソフォームであるＢｅｔ  ｖ  １．０４０１と、残基同一性が９４％のＢｅｔ  ｖ  １．１００１は、それらがメディエーター放出の微弱な誘導剤であるために、天然の低刺激性アレルゲンとして同定されている。Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１と比較して、Ｂｅｔ  ｖ  １．１００１は、例えば、Ｎ２８Ｋ突然変異を含有する。これらはまた、優れたワクチン候補物質を表すための基準も満たすと考えられている（Ｗａｇｎｅｒら、Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１２１：７２５〜７３５）。しかし、学術的、実験的、または臨床的データは、入手可能でない。
【００３０】
本発明は、Ｂｅｔ  ｖ  １の突然変異させた低刺激性ポリペプチド変異体であって、それを必要とする対象を免疫化し、これにより、カバノキ花粉に対するアレルギーを防止および／または緩和し、カバノキ花粉に対するアレルギーを患う対象を脱感作するためのワクチンとして有用な低刺激性ポリペプチド変異体を提供する。
【００３１】
本発明による組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドは、野生型アミノ酸配列を有するが、それらがＩｇＥの産生を誘導する能力を低減するかまたは完全に減殺するものの、それらが防御的ＩｇＧ抗体の産生を誘導する能力は保持する突然変異を選択されたアミノ酸位置において含有する、すなわち、低刺激性である。
【００３２】
具体的には、本発明は、配列番号３に示される野生型アミノ酸配列の鋳型、またはその任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換え低刺激性カバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、天然で、または突然変異の何れかにより、
（１）アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｓ１１７、およびＫ１１９からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第１のアミノ酸置換と、
（２）アミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における、少なくとも１つの第２のアミノ酸置換と
を含むポリペプチドに関する。
【００３３】
一態様では、本発明のポリペプチドが、配列番号３に示される野生型アミノ酸配列の鋳型を有する。別の態様では、本発明のポリペプチドが、配列番号４〜３８からなる群から選択される、野生型アミノ酸配列の鋳型を有する。
【００３４】
本発明の一態様では、組換え低刺激性カバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドが、配列番号３９に示されるアミノ酸配列により表される。配列番号３９は、アミノ酸置換についての位置（アミノ酸の２５、２８、４３、４６、４７、８０、８２、８４、９９、１０１、１１７、１１９、１５８位）を伴うＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列を開示しており、また、これらの位置における野生型アミノ酸も開示している。
【００３５】
示される任意の位置における第１の置換と第２の置換の任意の組合せにより、低刺激性ポリペプチドが結果としてもたらされる。本発明の一態様では、ポリペプチドが、配列番号４１〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびにアミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における少なくとも１つの第２のアミノ酸置換、またはこれらのアイソフォームを含む。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号４１〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびにアミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における少なくとも１つの第２のアミノ酸置換、またはこれらのアイソフォームを有する。本発明の別の態様では、ポリペプチドが、アミノ酸１０１がＫである配列番号４１、アミノ酸８０がＹである配列番号４２、アミノ酸８２がＫである配列番号４３、アミノ酸８４がＫである配列番号４４、アミノ酸９９がＫである配列番号４５、アミノ酸１１７がＫである配列番号４６、およびアミノ酸１１９がＥである配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列；ならびにアミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における少なくとも１つの第２のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ポリペプチドは、アミノ酸１０１がＫである配列番号４１、アミノ酸８０がＹである配列番号４２、アミノ酸８２がＫである配列番号４３、アミノ酸８４がＫである配列番号４４、アミノ酸９９がＫである配列番号４５、アミノ酸１１７がＫである配列番号４６、およびアミノ酸１１９がＥである配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列；ならびにアミノ酸残基Ｎ２８、Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８からなる群から選択される位置における少なくとも１つの第２のアミノ酸置換を有する。配列番号４１は、Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列であって、１０１位におけるアミノ酸が置換されており、野生型のアミノ酸ＥではないＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列を開示している。同様に、配列番号４２〜４７は、Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、８０、８２、８４、９９、１１７、および１１９位のそれぞれにおけるアミノ酸が置換されておサり、野生型のアミノ酸ではないＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドを示す。
【００３６】
本発明の一態様では、前記少なくとも１つの第１のアミノ酸置換が、アミノ酸残基Ｅ１０１およびＳ９９からなる群から選択される位置にあり、前記少なくとも１つの第２のアミノ酸置換が、アミノ酸置換Ｎ２８およびＤ２５からなる群から選択される位置にある。
【００３７】
本発明のさらに別の好ましい態様では、前記少なくとも１つの第１のアミノ酸置換が、Ｅ１０１位にあり、前記少なくとも１つの第２のアミノ酸置換が、Ｎ２８位にある。本発明の好ましい一態様では、組換え低刺激性カバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドが、配列番号４０に示されるアミノ酸配列により表される。配列番号４０は、２８および１０１位における置換を伴うＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列であって、これらの位置におけるアミノ酸がリシン（Ｋ）であるＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列を示す。
【００３８】
本発明の低刺激性ポリペプチド変異体はまた、複数の第１および第２の置換を含有する変異体も含む。「少なくとも１つの第１の置換」および「少なくとも１つの第２の置換」という用語は、低刺激性Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドが防御的抗体応答を誘導する能力が保持される限り、前記第１および第２の置換が各々、１つ、２つ、３つ、または４つ以上の置換を含み、第１の置換と第２の置換の任意の組合せが可能であることを意味する。したがって、本発明の好ましい一態様では、第１のアミノ酸置換が、Ｅ１０１位における置換を含み、前記第２のアミノ酸置換が、Ｎ２８位およびＤ２５位、またはＮ２８位、Ｄ２５位およびＹ１５８位にある。本発明の別の好ましい態様では、第１のアミノ酸置換が、Ｅ１０１位およびＳ９９位における置換を含み、前記第２のアミノ酸置換が、Ｎ２８位にある。本発明のまた別の好ましい態様では、前記第１のアミノ酸置換が、Ｅ１０１位およびＳ９９位にあり、前記第２のアミノ酸置換が、Ｎ２８位およびＤ２５位にある。
【００３９】
本発明のさらに好ましい態様では、Ｂｅｔ  ｖ  １の置換が、少なくとも、Ｅ１０１およびＮ２８、Ｅ１０１およびＤ２５、Ｅ１０１およびＮ４３、Ｅ１０１およびＧ４６、Ｅ１０１およびＮ４７、Ｅ１０１およびＹ１５８、Ｋ８０およびＮ２８、Ｋ８０およびＤ２５、Ｋ８０およびＮ４３、Ｋ８０およびＧ４６、Ｋ８０およびＮ４７、Ｋ８０およびＹ１５８、Ｎ８２およびＮ２８、Ｎ８２およびＤ２５、Ｎ８２およびＮ４３、Ｎ８２およびＧ４６、Ｎ８２およびＮ４７、Ｎ８２およびＹ１５８、Ｓ８４およびＮ２８、Ｓ８４およびＤ２５、Ｓ８４およびＮ４３、Ｓ８４およびＧ４６、Ｓ８４およびＮ４７、Ｓ８４およびＹ１５８、Ｓ９９およびＮ２８、Ｓ９９およびＤ２５、Ｓ９９およびＮ４３、Ｓ９９およびＧ４６、Ｓ９９およびＮ４７、Ｓ９９およびＹ１５８、Ｓ１１７およびＮ２８、Ｓ１１７およびＤ２５、Ｓ１１７およびＮ４３、Ｓ１１７およびＧ４６、Ｓ１１７およびＮ４７、Ｓ１１７およびＹ１５８、Ｋ１１９およびＮ２８、Ｋ１１９およびＤ２５、Ｋ１１９およびＮ４３、Ｋ１１９およびＧ４６、Ｋ１１９およびＮ４７、またはＫ１１９およびＹ１５８である。本発明のさらに好ましい態様では、置換が、これらの組合せのうちの１つである。
【００４０】
本発明の好ましい一態様では、併せて少なくとも２、３、または４つのアミノ酸置換が存在する。好ましくは、本発明のポリペプチドが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の置換を有する。より好ましくは、ポリペプチドが、２つ、３つ、または４つの置換を有する。本発明の利点の１つは、少数の（少なくとも２つの）置換だけが、所望の効果のために必要とされることである。
【００４１】
本発明によるポリペプチドは低刺激性であり、対応する突然変異させていないＢｅｔ  ｖ  １野生型のヒスタミン放出能と比較して少なくとも２０分の１、好ましくは１００分の１に低減されたヒスタミン放出能を呈示する。
【００４２】
本発明による低刺激性ポリペプチドは、アレルギー、とりわけ、カバノキ花粉アレルギーに対するワクチンとして有用である。本発明によるポリペプチドを含むワクチンは、当業者に知られている標準的な製薬手順により調合される。本発明によるワクチンは、とりわけ、舌下投与に適する。
【００４３】
本発明による低刺激性変異体は、選択された特異的なアミノ酸残基、例えば、かさ高い側鎖がＢｅｔ  ｖ  １のエピトープ表面に位置する残基を突然変異させることにより得られる。選択されたアミノ酸残基は、それらの側鎖が溶媒の方へと外側を向く残基である。このような残基を突然変異させることによりアレルゲンの基本的な三次元構造に最小限の変化を引き起こす。しかし、好ましくは、変異体の全体的構造が野生型アレルゲンの全体的構造と依然として酷似している一方で、突然変異誘発により、エピトープの表面が、マスト細胞表面におけるＩｇＥ抗体の結合および架橋形成が防止されるかまたは強く低減される程度まで修飾される。このような突然変異は、野生型アレルゲンと突然変異させた変異体アレルゲンの両方に結合する能力を有するＩｇＧおよび他の防御的抗体の誘導に好適である。突然変異の効果は、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の、修飾Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンに対するアフィニティーの低下として決定される。好ましくは、突然変異は、特異的ＩｇＥ抗体のアフィニティーを、少なくとも１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１、より好ましくは２０から１００分の１、最も好ましくは１００分の１未満に減少させる。結果として得られる修飾Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンは、アレルギー性患者におけるカバノキ花粉に対する忍容性を惹起するのに用いることができる。
【００４４】
アレルゲン特異的脱感作において有用な、本発明による低刺激性変異体ポリペプチドは、２つの特徴：１）ＩｇＥを介する反応を強く低減する能力；および２）野生型３Ｄフォールディングの保持であり、したがって、野生型アレルゲンに結合することが可能なＩｇＧ抗体の産生を誘導する能力を保有する。
【００４５】
ＩｇＥ結合エピトープの構造についての知識があれば、上述の低刺激性変異体のデザインが大幅に簡略化されるであろう。しかし、ＩｇＥ抗体と共に複合体化したＢｅｔ  ｖ  １の構造は、残念ながら入手可能でない。個別の患者のＩｇＥにより認識される明確なアレルゲンのエピトープにどのくらい多くの差違が存在するのかは、知られていない。また、エピトープ走査におけるペプチドの使用も信頼できるものではなく、実際に有用なのは直鎖状エピトープを走査する場合に限られる（Ｎｉｅｍｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２００７（１５）：１４１３〜２１）。単一のペプチドの立体配座のほか、物理的特性、例えば、可溶性は、天然のタンパク質構造の一部を形成するポリペプチド鎖の対応する部分の場合とは顕著に異なりうる。したがって、突然変異体Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンのデザインは、突然変異体を調製し、これを調べることにより、エピトープの構造を解明し、潜在的なヒットについて調べるのに分子グラフィックスプログラム、例えば、ＰｙＭＯＬを用いる、分子表面解析に基づいた。加えてデザインでは、Ｂｅｔ  ｖ  １の二量体化能力も考慮に入れた。
【００４６】
Ｂｅｔ  ｖ  １（タンパク質データバンクコード：１ＢＶ１）の結晶構造を用いて、Ｂｅｔ  ｖ  １の四次構造を規定した。ＰＤＢｅＰＩＳＡのインターネットサーバーを、Ｂｅｔ  ｖ  １の対称性の二量体のための座標を創出するのに用いた。マスト細胞表面上のクラスター内のＩｇＥ抗体間の距離は、約５ｎｍであることが推測されている（Ｋｎｏｌ，ＥＦ；Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．５０（２００６）：６２０）。Ｂｅｔ  ｖ  １の分子表面上では、対称軸から２．５ｎｍ以内の距離にある２回対称軸周囲のＢｅｔ  ｖ  １二量体の分子表面を研究することにより、２つの推定エピトープが同定された（図１）。
【００４７】
推定エピトープが、アミノ酸残基Ｖ２〜Ｅ６；Ｒ７０〜Ｄ７５；Ｎ７８〜Ｓ８４；Ｅ９６〜Ｋ１０３；およびＫ１１５〜Ｈ１２１からなるのに対し、Ｂｅｔ  ｖ  １二量体の単量体間界面は、アミノ酸残基Ｋ２０〜Ｋ３２；Ｓ３９〜Ｐ５０；Ｖ７４〜Ｈ７６；およびＤ１５６〜Ｎ１５９からなる。
【００４８】
突然変異点として使用できるアミノ酸残基を同定するために、これらの推定エピトープを注意深く解析した。好ましい突然変異点は、アレルゲンのＩｇＥ抗体への結合を減少させるが、野生型アレルゲンの三次元構造をやはり維持する能力を有するものとする。推定エピトープは、アミノ酸残基Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｅ１０１、Ｓ１１７、およびＫ１１９を包含する。単量体間界面は、残基Ｄ２５、Ｎ２８、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、およびＹ１５８を包含する。残基Ｅ１０１およびＮ２８は、それらが、それぞれ、推定エピトープの中央部および単量体間界面の戦略的な位置に位置するので、最も興味深い突然変異点と考えられた。本発明では、（単数または複数の）第１のアミノ酸置換がエピトープ領域内にあり、（単数または複数の）第２のアミノ酸置換が単量体間界面にある。
【００４９】
これらの２つの残基は、Ｂｅｔ  ｖ  １の３６のアイソフォーム全てにおいて高度に保存的である。残基１０１には天然の変異が存在しない。天然の変異は残基２８に見出され、アスパラギン（３１のアイソフォームにおける）、リシン（２つのアイソフォームにおける）、またはチロシン（３つのアイソフォームにおける）として存在する。図３において示される通り、残基Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、Ｋ８０、Ｓ８４、Ｋ１１９、およびＹ１５８が保存的であるのに対し、残基Ｎ８２、Ｓ９９、およびＳ１１７はわずかに変異する。
【００５０】
次のステップは、各残基に適切な突然変異を選択することであった。例として述べると、Ｓ９９は、小型で親水性および中性のアミノ酸残基である。したがって、ＩｇＥの結合に干渉する突然変異となれば、「反対の」性質、すなわち、大型でかつ／または帯電した残基のもの、例えば、ＳｅｒからＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌへの突然変異となるであろう。同様に、Ｅ１０１およびＮ２８も、反対の電荷を有する残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）または疎水性残基（Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、またはＴｒｐ）で置きかえることができる。したがって、残基Ｄ２５、Ｎ４３、Ｇ４６、Ｎ４７、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ１１７、およびＫ１１９における置換をデザインしうるであろう。表１は、配列番号３９に示される、本発明によるＢｅｔ  ｖ  １低刺激性突然変異体をもたらす潜在的な置換を列挙する。
【表１−１】
2014515752.tif 000002
【００５１】
セグメント：Ｖ２〜Ｅ６；Ｒ７０〜Ｄ７５；Ｎ７８〜Ｓ８４；Ｅ９６〜Ｋ１０３；Ｋ１１５〜Ｈ１２１
【表１−２】
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【００５２】
本発明による修飾Ｂｅｔ  ｖ  １低刺激性アレルゲンは、ワクチンとして有用である。従来のアレルギー用ワクチン接種は、典型的に、長期間、例えば、１年から２年にわたる複数回の皮下免疫化として実行する。アナフィラキシー反応の危険性を最小化するために、免疫化スキームを初期の用量増加相および維持相の２相で適用する。用量増加相は、微量で開始し、次いで、典型的には、維持用量に達するまで１６週間にわたりゆっくりと増加させる。維持相は、典型的に、６週目ごとの注射を含む。このようなワクチン接種のレジメは、患者にとって退屈であり、長期にわたる拘束が要請される。さらにこのようなワクチン接種のレジメは、安全性および再現性の点で、ワクチンの安定性に対して大きな影響を及ぼす。患者は、各注射後に、厳密にモニタリングされ、しばしば、入院することが必要である。
【００５３】
本発明による低刺激性アレルゲンのヒスタミン放出能は実質的に低減されるので、用量増加相は、従来のアレルギー用ワクチン接種の用量増加相よりかなり短いか、または、最良の場合、用量増加スキームは必要とされない可能性があるだろう。本発明による修飾組換え低刺激性アレルゲンは、バッチ間のばらつきを少しも示さない。したがって、用量応答および起こり得る副作用についての緊密なモニタリングは必要とされない。
【００５４】
したがって、本発明は、ワクチンとして上記で詳細に記載した低刺激性Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドの使用、および本発明の少なくとも１つの組換え低刺激性Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドと、少なくとも１つの医薬として許容可能な希釈剤またはアジュバント、例えば、生理食塩液、緩衝液、水酸化アルミニウムなどとを含むワクチン組成物にさらに関する。本発明は、カバノキ花粉アレルギーに対してワクチン接種する方法であって、カバノキ花粉アレルギーを患う対象に、上記で規定した低刺激性ポリペプチドまたはワクチン組成物を、カバノキ花粉に対する防御的抗体の産生を誘導するのに有効な量およびワクチン接種スケジュールを用いて投与することを含む方法にさらに関する。
【００５５】
ワクチン接種の「対象」は、ヒト（成人、小児、または青年）または動物である。好ましくは、動物は、任意の家畜動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタである。
【００５６】
例えば、本発明による低刺激性アレルゲンは、従来のワクチン処方物、例えば、当技術分野でよく知られた方法を用いる水酸化アルミニウム吸着ワクチンとして調合される（Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒら、ＰＮＡＳ、１０１（２）：１４６７７〜８２、２００４年）。しかし、代替的に、本発明による低刺激性アレルゲンは、当技術分野で知られた方法および処方物を用いて、他の適切なワクチン接種の経路およびスキーム、例えば、口腔粘膜または舌下投与により投与されうることも好ましい。例えば、欧州特許公開ＥＰ１８１２０５９を参照されたい。
【００５７】
修飾Ｂｅｔ  ｖ  １低刺激性アレルゲンであれば、例えば、０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌの濃度で用いうるであろう。例示的な用量は、アレルギーの重症度、患者の年齢、および治療履歴に応じて、可能な用量増加相において０．０５μｇ〜２μｇ、維持相において３〜１５μｇ、好ましくは５〜１５μｇ、最も好ましくは約１０μｇで変化させることができる。適切な用量は、アレルギーの処置および防止に精通した医師により容易に決定される。
【００５８】
国際特許公開ＷＯ０４／０４７７９４は、アレルギーワクチンを舌下投与するための固体の急速分散剤形を開示しており、米国特許出願第２００９／０２９７５６４号は、口腔粘膜投与するための液体のワクチン処方物を開示している。
【００５９】
本発明による修飾Ｂｅｔ  ｖ  １低刺激性アレルゲンは、舌下用ドロップを用いて舌下投与するのに特に適切である。この目的で、低刺激性ポリペプチドが生理食塩液中に提供される。ポリペプチドを投与するのに安全かつ有効な用量範囲のほか、所望の免疫応答を誘発することが可能な投与レジメは、当技術分野で知られた方法およびスキームを用いる、本発明によるワクチン候補物質の臨床開発において決定される。
【００６０】
本発明による低刺激性アレルゲンの単回の最大耐量は、増加する舌下投与量に曝露されるアレルギー性の男性および女性対象における研究で決定される。あらかじめ規定された用量の最大耐量に達したら、研究を、毎日の投与を伴う用量決定研究であって、用量レベルの変化が２から４倍である研究へと適合させる。初期用量は、１０〜１００μｇの範囲であり、研究は、最大２０ｍｇでありうる舌下最大耐量をもたらす。
【００６１】
その後、毎日または毎週投与される広範な用量範囲にわたり、用量漸増研究および用量決定研究を行う。ワクチン接種用量範囲の安全性については、複数回の投与を行う前に、皮膚プリックテストで予備的に調べる。これらの研究は、第１に、免疫学的パラメーターをもたらし、第２に、カバノキ花粉による感作後における最終的な有効性をもたらす。
【００６２】
本発明による低刺激性ポリペプチドワクチンは、ＴＨ２型からＴＨ１型へのシフトとして検出可能なＴ細胞応答を誘発するものとする。ＩｇＧ抗体の産生は、アレルゲン誘発性感作試験を開始する前に実証可能であるものとする。
【００６３】
最後に、アレルギー性患者における研究を、３〜６カ月間にわたり多数回の舌下投与に曝露されるアレルギー性男性および女性対象における二重盲検無作為化プラセボ対照脱感作研究として、最初の１２カ月間追跡を伴って実施する。対象は、研究を開始する前のほか、その後６カ月ごとに、二重盲検式でアレルゲンにより感作される。
【００６４】
研究は、天然のアレルゲンへと感作されるときの、プラセボを施される群と、本発明による低刺激性アレルゲンワクチンを施される群の間で、統計学的および臨床的な有意差を示すことになる。
【００６５】
［実施例］
以下の例は、本発明の態様をさらに例示するために示されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者には、技法が高度になるにつれて、発明の概念を多様な形で実施しうることが明らかであろう。したがって、本発明およびその態様は、本明細書で記載される例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変化しうるものである。
【００６６】
例１    Ｂｅｔ  ｖ  １突然変異のデザイン
低刺激性アレルゲンのデザインにおける目標は、マスト細胞表面におけるＩｇＥ−抗体に結合し、これを架橋する能力が強く低減されるが、野生型アレルゲンと酷似する構造を依然として維持する突然変異体アレルゲンを達成することである。これは、野生型アレルゲンと突然変異体アレルゲンの両方に結合する能力を有するＩｇＧおよび他の抗体の誘導に好適であろう。
【００６７】
ＩｇＥ結合エピトープについての知識があれば、デザインが大幅に簡略化されるであろう。しかし、ＩｇＥ抗体と共に複合体化したＢｅｔ  ｖ  １の構造は、入手可能でない。また、エピトープ走査におけるペプチドの使用も信頼できるものではない（Ｎｉｅｍｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１５）：１４１３〜２１、２００７）。エピトープについて示唆する唯一の方法は、突然変異体を調製することにより、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンの分子表面を研究し可能なヒットを調べることである。第１に、本発明者らは、Ｂｅｔ  ｖ  １の分子表面上において推定エピトープを同定した（図１）。第２に、本発明者らは、この推定エピトープ上において、突然変異させると、野生型アレルゲンと類似する三次元構造を維持するが、それにもかかわらずＩｇＥ抗体への結合を減少させる能力を有する残基を選択した。推定エピトープには、アミノ酸残基Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｅ１０１、Ｓ１１７、およびＫ１１９が含まれる。
【００６８】
第３のステップは、各残基について突然変異を選択することである。例として、Ｓ９９は、小型で親水性および中性の残基であるセリンである。したがって、ＩｇＥの結合に干渉する突然変異となれば、「反対の」性質、すなわち、大型でかつ／または帯電した、例えば、Ｓ９９Ｋ（セリンからリシン）、Ｓ９９Ｒ（セリンからアルギニン）、Ｓ９９Ｄ（セリンからアスパラギン酸）、Ｓ９９Ｙ（セリンからチロシン）、およびＳ９９Ｖ（セリンからバリン）となるであろう。Ｅ１０１の場合なら、ＩｇＥの結合に干渉する突然変異が、反対の電荷を伴う残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を用いること、または疎水性残基（Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ）を用いることを包含しうるであろう。
【００６９】
最後に、二量体化を妨げる特徴を、本発明の単量体のポリペプチド変異体へと導入するために、Ｂｅｔ  ｖ  １の結晶構造（ＰＤＢコード：１ＢＶ１）に基づく突然変異のデザインを用いた。ＰＩＳＡサーバーによりＢｅｔ  ｖ  １二量体のモデルを創出した。分子グラフィックスプログラムを用いることにより、単量体間界面を研究した。エピトープの突然変異体において用いられる原則と同じ原則を用いて、この界面上の突然変異体をデザインした。例として、単量体間界面上のＮ２８は、中型の親水性残基である。したがって、二量体の形成に干渉する突然変異であれば、極めて大型の荷電残基（リシン、アルギニン）または疎水性残基（チロシン、イソロイシン、トリプトファン）となろう。
【００７０】
例２    組換えＢｅｔ  ｖ  １分子のクローニング
組換えＢｅｔ  ｖ  １分子（ｒＢｅｔ  ｖ  １）の野生型（ｗｔ）および突然変異体を作製するために、これらの特定のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、細菌性の発現プラスミドへとクローニングした（図２）。まず、例１でデザインされたｒＢｅｔ  ｖ  １のｃＤＮＡであって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる、ベクターｐＵＣ５７における産生（ｗｔおよびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ）のためのコドン最適化を伴うｃＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＵＳＡ）へ注文した。ｃＤＮＡは、５’端におけるＮｃｏＩ制限部位および３’端におけるＨｉｎｄＩＩＩを含有した。ｃＤＮＡを、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、Ｅｒｖｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌＢ）のシグナル配列をコードする細菌性の発現ベクターであるｐＫＫｔａｃ（Ｔａｋｋｉｎｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（４）：８３７〜８４１、１９９１）へとクローニングし、発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株へと形質転換した。ｒＢｅｔ  ｖ  １およびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ  ３１００；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により検証し、本明細書ではこれを配列番号１〜２として示す。
【００７１】
例３    組換えＢｅｔ  ｖ  １分子の産生
細菌性発現のために、野生型ｒＢｅｔ  ｖ  １の発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＤＥ株へと形質転換し、Ｂｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体の発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８株へと形質転換した。ｒＢｅｔ  ｖ  １  ｗｔおよびＢｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体の単独のコロニーを、それぞれ、５ｍｌのＳＢまたはＴＢ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、および１％のブドウ糖へと接種し、２２０ｒｐｍで振とうしながら、＋３７℃で１６時間培養した。培養物は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを伴う３倍濃度のＳＢまたはＴＢ  ３００ｍｌへと１：５０に希釈し、ＯＤ６００が４に達するまで＋３７℃で培養した。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによりタンパク質の発現を誘導し、１７０ｒｐｍで振とうしながら、ＲＴで１６時間細胞を培養した。細胞を、＋４℃、５０００ｇで、１５分間にわたる遠心分離により採取し、細胞のペリプラズム画分を、Ｂｏｅｒら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２００７（５１）：２１６〜２２６）により記載される浸透圧ショック法を介して単離した。９００ｍｌ培養物の細胞ペレット同等物を、３０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０％のスクロース、ｐＨ８．０、および１ｍＭのＥＤＴＡによる３００ｍｌ中に再懸濁させ、氷上における振とう下で２０分間インキュベートした。懸濁液は、４℃、８０００ｇで２０分間にわたり遠心分離した。この後、ペレットを、氷冷させた５ｍＭのＭｇＳＯ4  ７５ｍｌ中で再懸濁させ、氷上において４℃で２０分間振とうし、４℃、８０００ｇで２０分間にわたる遠心分離により浸透圧ショック流体を採取した。
【００７２】
例４    ｒＢｅｔ  ｖ  １分子の精製
野生型ｒＢｅｔ  ｖ  １およびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体のペリプラズム画分に１ＭのＮａＣｌを補充し、発現させるタンパク質の両方について、第１のクロマトグラフィーによる精製ステップを２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０の緩衝液を伴うフェニル−セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、２ｍｌ／分の流速を用いて実行した。溶出は、７．５％のイソプロパノールを伴う２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．３による直線勾配で実施した。組換えＢｅｔ  ｖ  １野生型またはＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体を含有する画分をプールし、濃縮した。野生型Ｂｅｔ  ｖ  １は、４６０ｍｍの層高、および流速を０．３ｍｌ／分とする１倍濃度のＰＢＳ緩衝液を伴うＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ６０サイズ除外クロマトグラフィーカラムによりさらに精製した。ｒＢｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体の場合は、サイズ除外クロマトグラフィーの前に、Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質の夾雑を除去するために、さらなるアミロース樹脂クロマトグラフィーステップが要請された。
【００７３】
プールされるｒＢｅｔ  ｖ  １画分のタンパク質濃度は、２８０ｎｍで決定された。
【００７４】
例５    質量分析によるｒＢｅｔ  ｖ  １およびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体の解析
従来のＥＳＩ供給源（Ａｐｏｌｌｏ−ＩＩＴＭ）を装備した４．７  Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＡＰＥＸ−ＩＩ  ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により、質量分析実験を実施した。未変性型質量スペクトル：１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．９）中３μＭの濃度の脱塩されたアレルゲン試料を、乾燥（２００℃、６ミリバール）および噴霧用ガスとして用いられる乾燥窒素と共に、１．５ｍＬ／分の流速で直接的に注入した。全ての装置パラメーターを、気相における非共有結合的相互作用を維持するように、かつ、ｍ／ｚ２０００〜３０００のイオン透過を最大化するように最適化した。異なる試料間のバイアスを回避するために、同じ装置パラメーターの設定を終始使用した。典型的には、共付加された１２８ｋｗｏｒｄの時間ドメイン過渡信号５００〜１０００を記録し、５１２ｋｗｏｒｄのデータへと処理してから、高速フーリエ変換および大きさの計算を行った。ＥＳ  Ｔｕｎｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）のイオンに関しては、外部から質量較正を行った。変性型スペクトルは、典型的に、アセトニトリル／水／酢酸溶液中で測定した。全てのデータは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＸＭＡＳＳ  ７．０．８ソフトウェアを用いて収集および処理した。未変性型ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ質量スペクトルは、組換えＢｅｔ  ｖ  １突然変異体であるＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋが、組換えＢｅｔ  ｖ  １野生型と同様な形でフォールドすることを示す（図７）。
【００７５】
例６    競合的ＥＬＩＳＡにより解析される、血清中ＩｇＥの、組換えＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋポリペプチドへの結合に対する阻害
カバノキ花粉アレルギー性患者のＩｇＥ血清試料（Ｅ３）の、ストレプトアビジンウェル上に固定化されたビオチニル化ｒＢｅｔ  ｖ  １への結合を、ｒＢｅｔ  ｖ  １およびｒＢｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体の量を増加させることにより阻害した。まず、市販されるｒＢｅｔ  ｖ  １（野生型；Ｂｉｏｍａｙ）を、製造元のプロトコールによりＳｕｌ−ｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチニル化した。ビオチニル化ｒＢｅｔ  ｖ  １（ウェル１つ当たり０．５μｇ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）ウェル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｇｍｂｈ）へと固定化した後、洗浄ステップおよびＥ３血清の添加を行う（１：６の希釈率）。シェーカー内、ＲＴにおいて２時間のインキュベーションおよび洗浄ステップの後に、異なる量（４、１、０．２５、０．０６２５、０．０１５６、および０．００３９μｇ）のｒＢｅｔ  ｖ  １を添加し、シェーカー内で、ＲＴにおいて２時間インキュベートした。洗浄ステップの後に、希釈率１：１０００のＡＦＯＳコンジュゲート抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、シェーカー内で、ＲＴにおいて１時間のインキュベーションにより、結合したＩｇＥ分子の検出を実施した。最後に、基質溶液であるｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した（Ｖａｒｉｏｓｃａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００７６】
競合的ＥＬＩＳＡにより解析した、血清中ＩｇＥの、ｒ  Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドへの結合の結果を図５に示す。ｗｔおよびＮ２８−Ｅ１０１Ｋ突然変異体のｒＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドを、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルギー性患者の血清（Ｅ３）の、固定化されたｒＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ）への結合に対する競合に用いた。何れのｒＢｅｔ  ｖ  １野生型分子（Ｂｉｏｍａｙ製の市販品と本発明者ら独自の生成物）も、ＩｇＥの、固定化されたＢｅｔ  ｖ  １への結合を阻害した。ｒＢｅｔ  ｖ  １対照と比較したところ、Ｂｅｔ  ｖ  １突然変異体Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋが阻害の低減を示したことから、突然変異Ｅ１０１ＫおよびＮ２８Ｋが、ＩｇＥのエピトープとＢｅｔ  ｖ  １の二量体化に影響を及ぼすことが示された。
【００７７】
例７    ヒスタミン放出アッセイ
精製組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドの生物学的活性を、ストリッピング処理された好塩基球に対する受動感作法、およびその後のアレルゲン分子による感作を介して解析した。ヒスタミン放出アッセイは、公認のヒスタミン放出アッセイ法を有する、ＲｅｆＬａｂ  ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋの外注サービスとして実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、好塩基球性の白血球からのヒスタミンの放出の、市販の組換えＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ、Ａｕｓｔｒｉａ）、ならびに２つの組換えＢｅｔ  ｖ  １タンパク質であるｗｔおよびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋによる誘導を測定した。３つのアレルゲンの各々について、濃度範囲２０〜０．０６ｎｇ／ｍｌの用量応答研究としての受動伝達試験において、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルギー性患者の血清（Ｅ３）により２連で調べた。
【００７８】
ヒスタミン放出アッセイの結果を、図６に示す。ｒＢｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋの生物学的活性は、基準物質である市販の組換えＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ）およびｒＢｅｔ  ｖ  １野生型と比較して１００分の１であった。
【００７９】
当業者には、技法が高度になるにつれて、発明の概念を多様な形で実施しうることが明らかであろう。本発明およびその態様は、上記の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変化しうるものである。
【００８０】
例８    皮膚プリックテスト
皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）を、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会による承認後、２例がカバノキ花粉アレルギーと診断され、１例が非アトピー性患者である、３例のボランティア被験者について、組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドおよび関与性の対照により実施した。組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド調製物の内毒素は、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ：型番２０３４４）により除去し、その後、内毒素含量を、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ：型番Ｌ００３５０Ｃ）により解析した。組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド調製物は、Ｃｏｓｔａｒ  ＳＰＩＮ−Ｘ（型番８１６０）により濾過滅菌し、−２０℃のアリコートで保管した。
【００８１】
ＳＰＴは、５０および５μｇ／ｍｌの濃度で組換えＢｅｔ  ｖ  １ａ  ｗｔ（Ｂｉｏｍａｙ）およびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体、ならびに市販のカバノキ花粉抽出物（ＡｌｋＡｂｅｌｌｏ）を用いて実行した。塩化ナトリウム（０．９％）およびヒスタミン二塩酸塩（ＡｌｋＡｂｅｌｌｏ）が、それぞれ、陰性および陽性対照として用いられた。皮膚をプリッキングする前に、ランセット（乱切刃）を、皮膚プリック試薬を含有する試験管内に入れた。１５分後ならびに６および２０時間後に応答を測定した。各被験個体におけるヒスタミン二塩酸塩に対する皮膚応答の直径は、１５分後に５ｍｍであり、この値を陽性（＋）応答として選択した（表２）。濃度が５０μｇ／ｍｌのＢｅｔ  ｖ  １突然変異体Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋにより誘導される即時的皮膚反応は、同じ濃度のＢｅｔ  ｖ  １  ｗｔにより誘導される反応と比較したところ、軽微であった。濃度が５μｇ／ｍｌのＢｅｔ  ｖ  １  ｗｔおよびＮ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体により誘導される皮膚反応は、同等であった。注目すべきことに、何れのアレルギー性患者の場合も、Ｂｅｔ  ｖ  １Ｎ２８Ｋ−Ｅ１０１Ｋ突然変異体により誘導される皮膚反応は、Ｂｅｔ  ｖ  １  ｗｔと比較して著しく短い時間内で消失した。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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