(57)【要約】  本明細書に記述するのは、アルギナートに懸濁させた細胞を凍結保存する方法、並びに、アルギナートに懸濁させた凍結保存された細胞をカプセル封入するための方法である。本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記述した方法に従って処理された細胞を含む細胞性組成物である。【選択図】図1
2014514245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、
(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;
(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;
(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;
(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞をカプセル封入することと
を含む前記方法。
【請求項２】
対象への投与に適した細胞の集団を調製するための方法であって、
(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;
(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと
を含み、該凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞が、解凍後、直ちに対象に投与することができる、前記方法。
【請求項３】
カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、
(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;
(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;
(iii)前記凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;
(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;
(v)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与することと
を含み、前記投与が、ステップ(iv)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される、前記方法。
【請求項４】
細胞の集団を対象に投与するための方法であって、
(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;
(ii)該細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;
(iii)該細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;
(iv)該細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与することと
を含み、前記投与が、ステップ(iii)の解凍後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される、前記方法。
【請求項５】
前記細胞が、幹細胞である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が、胎盤組織から単離される又は該組織に由来する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が、胎盤幹細胞又はAMDACである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記凍結保存溶液が、DMSO、ヒト血清アルブミン、デキストラン、又はHypoThermosol(登録商標)のうちの1種以上をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
カプセル封入された細胞の集団を含む、細胞性組成物であって、前記細胞が、以下の方法:
(i)細胞と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること；に従って作成される、前記細胞性組成物。
【請求項１０】
カプセル封入された細胞の集団を含む、細胞性組成物であって、前記細胞が、以下の方法:
(i)細胞を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(ii)該凍結保存された細胞を解凍することと;(iii)該解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること；に従って作成される、前記細胞性組成物。
【請求項１１】
細胞の集団を含む、細胞性組成物であって、前記細胞が、以下の方法:
(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存すること；に従って作成され、ここで、該凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞は、解凍後、いかなる追加的培養も行うことなく使用することができる、前記細胞性組成物。
【請求項１２】
前記細胞が、幹細胞である、請求項9〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、胎盤組織から単離される又は該組織に由来する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が、胎盤幹細胞又はAMDACである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、HypoThermosol(登録商標)に懸濁される、請求項9〜11のいずれか1項記載の細胞性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2010年12月30日に出願された米国仮出願第61/428,427号(その開示全体を参照によって本明細書に組み込む)の優先権を主張する。
【０００２】
(1.分野)
本明細書に記述するのは、アルギナートに懸濁させた細胞を凍結保存する方法、並びに、アルギナートに懸濁させた凍結保存された細胞をカプセル封入するための方法である。本明細書でさらに提供するのは、本明細書に記述する方法に従って処理された細胞を含む細胞性組成物である。
【背景技術】
【０００３】
(2.背景)
凍結保存は、細胞を低温に冷却することによって保存することができるプロセスである。このような低温では、通常条件下では細胞死をもたらすであろう、生化学的反応を含めた生物活性が、効率的に停止する。したがって、凍結保存は、細胞を将来的使用のために保管するための価値ある手段を提供する。しかし、細胞を凍結保存することに関しては、凍結及び/又は解凍プロセス中に細胞に生じるダメージや、適切に回復させることを確実にするために解凍後に細胞を培養する必要性を含めた、ある種の欠点が存在する。こうした欠点は、特に、凍結保存された細胞を、解凍後直ちに又は短時間のうちに使用することが望ましい場合に、凍結保存された細胞の価値を制限する。
【発明の概要】
【０００４】
(3.概要)
上述の問題を解決する、細胞を凍結保存する方法、及び、凍結保存されている細胞を使用する方法を提供することが、本開示の一目的である。こうした方法は、細胞の凍結保存の前に液体アルギナートが細胞に添加された場合に、細胞を、(i)解凍後にカプセル封入し、次いで、凍結保存された細胞を解凍後に培養する必要なく所望の目的のために使用することができる;又は(ii)凍結保存された細胞を解凍後に培養する必要なく、解凍後にカプセル封入されていない形で使用することができる、という発見に、一部分基づいている。これらの方法はさらに、解凍し、アルギナートに直ちに懸濁し、続いてカプセル封入した、凍結保存された細胞が、生存したままであり、カプセル封入後に直ちに使用することができるという発見に、一部分基づいている。
【０００５】
したがって、一実施態様では、本明細書に記述する方法は、細胞/液体アルギナート溶液を形成するための、細胞への液体アルギナートの添加を含む。いくつかの実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液が作製され、細胞/液体アルギナート溶液中の細胞が、凍結保存され、解凍され、解凍後に直ちにカプセル封入され、その後、該細胞が、例えば細胞が直ちに使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、所望の目的、例えば対象への投与のために使用される。いくつかの実施態様では、凍結保存された細胞の解凍の直後に細胞/液体アルギナート溶液が作製され、続いてこの溶液がカプセル封入され、その後、例えば細胞が直ちに使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、所望の目的、例えば対象への投与のために使用される。いくつかの実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液が作製され、該細胞が凍結保存され、解凍されるが、解凍後にカプセル封入されず、例えば細胞が直ちに使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、細胞が使用される。
【０００６】
一態様では、本明細書で提供されるのは、凍結保存された細胞が解凍されかつアルギナートにカプセル封入された直後の対象への投与に適した、凍結保存されカプセル封入された細胞を調製するための方法である。この態様によれば、凍結保存されカプセル封入された細胞は、その凍結保存の前に液体アルギナートに懸濁され、解凍された直後にカプセル封入される。或いは、凍結保存された細胞が、解凍された直後に液体アルギナートに懸濁され、続いてカプセル封入される。いずれの場合にも、カプセル封入された細胞は、その後、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、対象に投与することができる。
【０００７】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば、細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。
【０００８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。
【０００９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iv)前記凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(vi)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(v)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。
【００１０】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)前記凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(v)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iv)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。
【００１１】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)前記細胞を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(iii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iv)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。
【００１２】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(ii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iii)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。
【００１３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)前記細胞を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(iii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iv)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(vi)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(v)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。
【００１４】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(ii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iii)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(v)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iv)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。
【００１５】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、凍結保存された細胞が解凍された直後の、対象への投与に適した、凍結保存された細胞を調製するための方法である。この態様によれば、凍結保存された細胞は、その凍結保存の前に液体アルギナートに懸濁され、カプセル封入された細胞を投与の前に培養する必要性無しで、解凍の直後に対象に投与することができる。
【００１６】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存すること。ここでは、凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞は、解凍後、直ちに対象に投与することができる。
【００１７】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存すること。ここでは、凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞は、解凍後、直ちに対象に投与することができる。
【００１８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iv)細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(v)細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iv)の解凍後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。
【００１９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iii)の解凍後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。
【００２０】
(4.定義)
用語「約」又は「およそ」は、値が測定又は決定される方法に、ある程度依存する、当業者によって決定される通りの特定の値に対する許容し得る誤差を意味する。ある実施態様では、用語「約」又は「およそ」は、1、2、3、又は4標準偏差以内を意味する。ある実施態様では、用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、又は0.05%の範囲内を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「直ちに」は、本明細書に述べる細胞の使用に関する場合、中間的培養ステップ無しでの細胞の使用を意味する。いくつかの実施態様では、「直ちに」とは、1週間を超える時間の長さをいう。いくつかの実施態様では、「直ちに」とは、6日を超える、5日を超える、4日を超える、3日を超える、2日を超える、又は1日を超える、時間の長さをいう。いくつかの実施態様では、用語「直ちに」とは、約1日、約22時間、約20時間、約18時間、約16時間、約14時間、約12時間、約10時間、約8時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約30分、約20分、又は約10分であるような時間の長さをいう。本明細書で使用される場合、用語「直ちに」は、細胞の使用の前に所望される又は必要とされ得るある種のステップ、例えば、細胞の希釈、細胞の洗浄、及び/又は細胞の保管(例えば、HypoThermosol(登録商標)(BioLife Solutions社、Bothell、WA)などの適切な媒体中での細胞の冷蔵保管)を排除する意図は無い。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「アルギナート」とは、褐藻類の細胞壁に広く分布するアニオン性の多糖をいう。アルギナートは、アルカリ金属、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウムカチオン(メチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンなどの低級アミンから誘導される)と共に水溶性の塩を形成する。用語「アルギナート」は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコール、及びアルギン酸カリウムを含めた、当業者に公知のすべての形のアルギナートを包含する。さらに、用語「アルギナート」は、本明細書で使用される場合、アルギナートを記述するために当業者によって使用されるすべての用語、例えばアルギン酸及びアルギンを包含する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「凍結保護物質」とは、凍結中に起こる損傷、例えば、氷形成に起因する損傷から生物組織(例えば細胞)を保護するために使用される全ての物質をいう。例示的な凍結保護物質としては、限定はされないが、グリコール(少なくとも2個のヒドロキシル基を含有するアルコール)、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、及びグリセロールなど;ジメチルスルホキシド(DMSO);トレハロース;並びにスクロースが挙げられる。用語「凍結保護物質」には、本明細書で使用される場合、アルギナートが含まれることを意図しない。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「カプセル封入」及び「カプセル封入する」とは、液体アルギナートに懸濁されている細胞が、細胞/液体アルギナート懸濁液の二価カチオン(例えば、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化銅、及び塩化ストロンチウム)への曝露後に半透膜に封入されるプロセスをいう。本明細書に記述するカプセル封入された細胞は、インビトロ条件下でもインビボ条件下でも生存したままであり、かつ、該細胞の機能及び代謝特性をも保持する。本明細書で使用される場合、用語「カプセル封入」及び「カプセル封入する」は、細胞がアルギナート中で単に凍結されるだけのプロセスを包含することを意図しない。すなわち、「カプセル封入」は、本明細書で使用される場合、アルギナートが二価カチオンに曝露された場合に起こるアルギナートポリマーの架橋を必要とする。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「凍結保存溶液」とは、細胞をその中で凍結保存することができる溶液をいう。凍結保存溶液は、限定はされないが、アルギナート、凍結保護物質、ヒト血清アルブミン(HSA)、水、タンパク質、塩、緩衝液、HypoThermosol(登録商標)(BioLife Solutions社、Bothell、WA)、及び/又はデキストランを含むことができる。具体的実施態様では、凍結保存溶液は、凍結保護物質を含まない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、必ずしも無限とは限らないが何度も増殖(例えば最大約40倍の集団まで増加)することができ、かつ、多数の細胞型に分化できる(例えばインビトロで分化できる)ような、任意の所与の細胞集団の機能特性を定義する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「由来する」は、単離される又は別途精製されることを意味する。細胞においては、用語「由来する」は、最初の単離物から培養又は展開された組織及び細胞から、直接的に単離された細胞から培養される細胞を包含する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「免疫局在性」は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取、磁気細胞選別、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおける、免疫性タンパク質(例えば抗体又はそのフラグメント)を使用する化合物、例えば細胞性マーカーの検出を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「単離された細胞」は、その細胞が由来する組織の他の細胞から実質的に分離された細胞を意味する。その細胞と天然に関連する少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は少なくとも約99%の細胞が、例えば細胞の収集及び/又は培養中に、細胞から取り出される場合に、細胞は「単離される」。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「細胞の単離された集団」は、その細胞の集団が由来する組織の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。その細胞の集団又はその細胞の集団が由来する細胞と天然に関連する約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は少なくとも約99%の細胞が、細胞から取り出される場合に、細胞の集団は「単離される」。
【００３１】
本明細書で使用される場合、細胞は、ある特定のマーカーについて、そのマーカーが、例えば免疫局在性によって又はRT-PCRによって、バックグラウンドより上に検出可能である場合に、「陽性」である。逆に、同じ文脈における「陰性」は、特定のマーカーが、例えば免疫局在性によって又はRT-PCRによって、バックグラウンドと比較して、であることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「対象」又は「患者」は、動物(例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳類)を指すために互換的に使用される。具体的実施態様では、対象は、鳥類(例えば、ニワトリ又はカモ)である。別の実施態様では、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)、並びに霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含めた哺乳類である。ある実施態様では、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施態様では、対象は、家畜(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど)又は愛玩動物(例えば、イヌ、ネコなど)である。別の実施態様では、対象は、ヒトである。別の実施態様では、対象は、ヒト乳児である。別の実施態様では、対象は、ヒト小児である。別の実施態様では、対象は、ヒト成人である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
(5.図面の簡単な説明)
【図１】4℃及び37℃で7日間HypoThermosol(登録商標)(HT)溶液に懸濁させた、カプセル封入された胎盤幹細胞の生存率を示す。「1×細胞」は、5×105の細胞濃度に相当し;「4×細胞」は、2×106の細胞濃度に相当する。
【００３４】
【図２】凍結保存され、解凍され、アルギナートに懸濁され、カプセル封入され、中間的培養ステップ無しでHypoThermosol(登録商標)中に保管された、胎盤幹細胞の生存率を示す。生存率を、カプセル封入の4時間及び24時間後に評価した。「1×」は、3.75×106細胞/mlを表し;「0.5×」は、1.88×106細胞/mlを表し;「.25×」は、0.94×106細胞/mlを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
(6.詳細な説明)
本明細書で提供されるのは、アルギナート中で細胞を凍結保存するための方法、並びに、記述した方法に従って凍結保存されている細胞を投与する方法である。ある実施態様では、アルギナート中で凍結保存されている細胞が、解凍後にカプセル封入される。本明細書に記述する方法は、凍結保存された細胞の即時使用を可能にするので、凍結保存された細胞を培養する又は解凍後に別途処理する必要が無いという事実によって、凍結保存の公知の方法よりも好都合である。
【００３６】
本明細書で提供されるのはまた、記述した方法に従って凍結保存されている細胞を含む細胞性組成物である。
【００３７】
(6.1凍結保存の方法)
一態様では、本明細書で提供されるのは、凍結保存された細胞が解凍されかつアルギナートにカプセル封入された直後の対象への投与に適した、凍結保存されたカプセル封入された細胞を調製するための方法である。この態様によれば、凍結保存されたカプセル封入された細胞は、該細胞の凍結保存の前に液体アルギナートに懸濁され、解凍された直後にカプセル封入される。或いは、凍結保存された細胞が、解凍された直後に液体アルギナートに懸濁され、続いてカプセル封入される。いずれの場合にも、カプセル封入された細胞は、その後、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、対象に投与することができる。こうした方法で使用される細胞は、下のセクション6.1.2に記述する任意の細胞を含むことができる。
【００３８】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００３９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４０】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iv)前記凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(vi)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(v)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４１】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)前記凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(v)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iv)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４２】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)前記細胞を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(iii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iv)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した、カプセル封入された細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(ii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iii)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。ある実施態様では、これらの細胞は、例えば細胞がカプセル封入の直後に使用されるというように、いかなる追加的培養も行うことなく、解凍及びそれに続くカプセル封入後に使用される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４４】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)前記細胞を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(iii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iv)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(v)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(vi)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(v)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４５】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(ii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iii)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入することと;(v)カプセル封入された細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iv)のカプセル封入後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４６】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、凍結保存された細胞が解凍された直後の、対象への投与に適した、凍結保存された細胞を調製するための方法である。この態様によれば、凍結保存された細胞は、該細胞の凍結保存の前に液体アルギナートに懸濁され、カプセル封入された細胞を投与の前に培養する必要性無しで、解凍の直後に対象に投与することができる。例えば、これらの細胞は、解凍された直後に使用することができる。こうした方法で使用される細胞は、下のセクション6.1.2に記述する任意の細胞を含むことができる。
【００４７】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存すること。ここでは、凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞は、解凍後に、いかなる追加的培養も行うことなく使用することができる。例えば、これらの細胞は、解凍された直後に使用することができる。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象への投与に適した細胞の集団を調製するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存すること。ここでは、凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞は、解凍後に、いかなる追加的培養も行うことなく使用することができる。例えば、これらの細胞は、解凍された直後に使用することができる。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００４９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iii)の解凍後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００５０】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団を対象に投与するための方法であって、以下を含む前記方法である:(i)細胞の集団を得ることと;(ii)細胞の前記集団に液体アルギナートを含む凍結保存溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iii)細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iv)細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(v)細胞/液体アルギナート組成物を対象に投与すること。ここでは、前記投与は、ステップ(iv)の解凍後に前記細胞/液体アルギナート組成物中の細胞を培養することなく実施される。具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、この方法で使用される細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００５１】
(6.1.1カプセル封入された細胞集団)
本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記述した方法に従って作製された、カプセル封入された細胞の集団である。こうしたカプセル封入された細胞は、任意の所望の目的のために、例えば治療目的のために使用することができる。具体的実施態様では、カプセル封入された細胞は、セクション6.3で説明する通りに使用される。
【００５２】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団である。ここでは、前記細胞は、以下の方法に従って作製される:(i)細胞と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存することと;(iii)前記細胞/液体アルギナート組成物を解凍することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。具体的実施態様では、細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００５３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、カプセル封入された細胞の集団である。ここでは、前記細胞は、以下の方法に従って作製される:(i)細胞を凍結保存溶液中で凍結保存することと;(ii)凍結保存された細胞を解凍することと;(iii)解凍された細胞に液体アルギナートを含む溶液を添加して、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(iv)前記細胞/液体アルギナート組成物をカプセル封入すること。具体的実施態様では、細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００５４】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、細胞の集団である。ここでは、前記細胞は、以下の方法に従って作製される:(i)細胞の集団と液体アルギナートを含む凍結保存溶液とを組み合わせて、細胞/液体アルギナート組成物を生成することと;(ii)前記細胞/液体アルギナート組成物を凍結保存すること。ここでは、凍結保存された細胞/液体アルギナート組成物中の細胞は、解凍後に、いかなる追加的培養も行うことなく使用することができる。例えば、これらの細胞は、解凍された直後に使用することができる。具体的実施態様では、細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、細胞は、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞である。
【００５５】
(6.1.2細胞)
当業者に公知の対象及び細胞株から直接単離された初代細胞を含めて、本明細書に記述する方法に従ういかなる細胞型も使用することができる。すなわち、記述した方法に使用される細胞は、結合組織、上皮組織、筋組織、及び/又は神経組織を含めた任意の公知の組織から単離することができる又は該組織に由来し得る。本明細書に記述する方法に従って使用することができる細胞の供給源としては、それだけには限らないが、胎盤(臍帯を含めて)、骨髄、間質、間葉、皮膚、骨、血液、肺、肝臓、脳、腎臓、胆嚢、膀胱、心臓、脾臓、胃、膵臓、精巣、卵巣、結腸、小腸、及び大腸が挙げられる。
【００５６】
ある実施態様では、本明細書に記述する方法で使用される細胞は、幹細胞、例えば、胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞、及び間葉系幹細胞(例えば骨髄由来の間葉系幹細胞)である。胎盤組織(臍帯を含めて)から単離された又は該組織に由来する幹細胞を得るための例示的な方法は、米国特許第7,468,276号、米国特許出願公開第2007/0275362号、及び米国特許出願公開第2010/0124569号に記載されており、これらの開示の全体を参照によって本明細書に組み込む。
【００５７】
具体的実施態様では、本明細書に記述する方法で使用される細胞又は細胞集団は、胎盤から単離された胎盤幹細胞である。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団は、例えば、米国特許第7,468,276号に、また米国特許出願公開第2007/0275362号に詳細に記載されており、これらの開示の全体を参照によって本明細書に組み込む。
【００５８】
胎盤幹細胞は、CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盤幹細胞である。別の具体的実施態様では、前記胎盤幹細胞は、CD200を発現し、かつHLA-Gを発現しない;又はCD73、CD105、及びCD200を発現する;又はCD200及びOCT-4を発現する;又はCD73及びCD105を発現し、かつHLA-Gを発現しない;又はCD73及びCD105を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体(embryoid-like body)の形成を可能にするような条件下で培養される場合に、前記集団における1種以上の胚様体の形成を促進する;又はOCT-4を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にするような条件下で培養される場合に、前記集団における1種以上の胚様体の形成を促進する。さらに他の実施態様では、前記胎盤幹細胞は、CD44、CD90、HLA-ABC、又はHLA-Pの1以上を発現する;かつ/又はCD45、CD119、CD133、KDR、CD80、CD86、HLA-DR、SSEA3、SSEA4、又はCD38の1以上を発現しない。
【００５９】
別の具体的実施態様では、本明細書に記述する方法で使用される細胞又は細胞集団は、「羊膜由来接着細胞」又は「AMDAC」と呼ばれる、胎盤から単離された幹細胞である。こうした細胞及び細胞集団は、例えば、米国特許出願公開第2010/0124569号に詳細に記載されており、その開示の全体を参照によって本明細書に組み込む。
【００６０】
AMDACは、様々な組み合わせの細胞性マーカー及び遺伝子マーカーによって同定することができる。具体的実施態様では、例えば、AMDACは、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって判定可能であるOCT-4-である。別の実施態様では、AMDACは、フローサイトメトリーによって判定可能であるCD49f+である。さらに別の実施態様では、AMDACは、それぞれRT-PCR及びフローサイトメトリーによって判定可能であるOCT-4-及びCD49f+である。さらに別の実施態様では、AMDACは、免疫局在性、例えばフローサイトメトリーによって判定可能であるCD49f+、CD105+、及びCD200+である。別の実施態様では、AMDACは、RT-PCRによって判定可能であるOCT-4-、並びに、免疫局在性、例えばフローサイトメトリーによって判定可能であるCD49f+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様では、AMDACは、免疫局在性、例えばフローサイトメトリーによって判定可能であるVEGFR1/Flt-1(血管内皮増殖因子受容体1)及び/又はCD309(血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)/KDRとしても公知である)について陽性である。別の具体的実施態様では、AMDACは、フローサイトメトリーによって判定可能であるCD90+及び/又はCD117-、及び/又は、RT-PCRによって判定可能であるHLA-G-である。別の具体的実施態様では、前記AMDACは、RT-PCRによって判定可能であるOCT-4-及びHLA-G-、並びにフローサイトメトリーによって判定可能であるCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様では、上のAMDACのいずれかは、さらに、免疫局在性、例えばフローサイトメトリーによって判定可能である、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍血管内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)のうちの1以上である。別の具体的実施態様では、上のAMDACのいずれかは、さらに、免疫局在性、例えばフローサイトメトリーによって判定可能である、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別の具体的実施態様では、AMDACは、短期の神経分化分析によって判定可能であるGFAP+である。別の具体的実施態様では、AMDACは、短期の神経分化分析によって判定可能であるベータ-チューブリンIII(Tuj1)+である。
【００６１】
別の具体的実施態様では、本明細書に記述する方法で使用される細胞は、間葉系幹細胞又は「間葉様(mesenchymal-like)」幹細胞である。具体的実施態様では、間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞である。
【００６２】
(6.1.3カプセル封入)
例えば、細胞/液体アルギナート懸濁液を二価カチオンに曝露することによって、液体アルギナートに懸濁させた細胞をカプセル封入するための、当技術分野で公知の任意の方法を、本明細書に記述する方法に従って使用することができる。概して、本明細書に包含される、細胞をアルギナートにカプセル封入するための方法は、細胞を液体アルギナートに懸濁させて、細胞/液体アルギナート懸濁液を形成することと;細胞/液体アルギナート懸濁液を、例えば滴状様式で(例えばシリンジを介して)液滴として分散させることと;分散させた懸濁液、例えば、細胞/液体アルギナート懸濁液の液滴を、二価カチオン(例えば、カルシウム、バリウム、銅、亜鉛、又はストロンチウム)を含む溶液に曝露する(これは、細胞/液体アルギナート懸濁液中でのアルギナートポリマーの架橋、それによるカプセル封入された細胞の形成をもたらす)こととを含む。本明細書に包含されるカプセル封入方法には、細胞/液体アルギナート懸濁液がアルギナート中で単に凍結されるだけの方法は含まれない。
【００６３】
ある実施態様では、細胞がアルギナートにカプセル封入された場合に、ビーズが形成される。具体的実施態様では、細胞がアルギナートにカプセル封入された場合に形成されるビーズは、ヒドロゲル構造を成す。細胞がアルギナートにカプセル封入された場合に形成されるビーズは、ビーズのサイズが所望の必要性を満たすように形成することができる。ある実施態様では、細胞がアルギナートにカプセル封入された場合に形成されるビーズは、サイズが約100μm、約200μm、約300μm、約400μm、約500μm、約600μm、又は約700μmである。他の実施態様では、細胞がアルギナートにカプセル封入された場合に形成されるビーズは、サイズが約100〜200μm、約100〜300μm、約200〜400μm、約200〜500μm、約300〜500μm、約300〜600μm、約400〜600μm、又は約500〜600μm、約500〜700μmである。具体的実施態様では、細胞がアルギナートにカプセル封入された場合に形成されるビーズは、サイズが500μm未満である。
【００６４】
細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、所望される結果、例えば、アルギナート溶液の所望の粘度に基づいて決定することができる。ある実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、0.5%未満である。他の実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.75%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%である。他の実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、1.5%超である。他の実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、約0.5%から約1.0%、約0.75%から約1.5%、又は約1.0%から約1.5%である。具体的実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、0.75%である。具体的実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中のアルギナートの量は、≧0.009Pa.sの粘度をもたらすのに十分である。
【００６５】
細胞/液体アルギナート溶液の分散は、限定はされないが、水浸(immersion)、沈水(submersion)、噴霧、液滴としての(例えばシリンジを介する)分散、静電気発生、又は霧化を含めて、当業者に公知の任意の手段によって実現することができる。
【００６６】
アルギナートを架橋させ、それによって細胞をカプセル封入するために使用される二価カチオンは、当技術分野で公知の、この技術を実現するための任意の二価カチオンであり得る。ある実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中でアルギナートを架橋させるために使用される二価カチオンは、塩化カルシウム(CaCl2)、塩化バリウム(BaCl2)、塩化ストロミウム(stromium)(SrCl2)、塩化銅(CuCl2)、又は塩化亜鉛(ZnCl2)である。具体的実施態様では、細胞/液体アルギナート溶液中でアルギナートを架橋させるために使用される二価カチオンは、塩化カルシウム(CaCl2)である。ある実施態様では、二価カチオンの溶液は、約0.5%、約0.75%、約1.0%、約1.25%、約1.5%、約1.75%、又は約2.0%の二価カチオンを含む。具体的実施態様では、二価カチオンの溶液は、1.5%の二価カチオン、例えばCaCl2を含む。
【００６７】
(6.1.4凍結保存)
細胞を凍結保存するための当技術分野で公知の任意の方法を、本明細書に記述する方法に従って使用することができる。細胞は、小さな容器(例えばアンプル)に入れた;凍結保存に適した袋に入れた;又は凍結保存のための任意の他の適切な容器に入れた、本明細書に記述する凍結保存溶液中で凍結保存することができる。いくつかの実施態様では、細胞は、市販品として入手可能な凍結保存培地、例えば市販品として入手可能な細胞凍結培地、例えば、Sigma Aldrichカタログ番号C2695、C2639(細胞凍結培地-血清不含1×、DMSOを含有しない)、又はC6039(最小必須培地、グリセロール、仔ウシ血清及びウシ血清を含有する、細胞凍結培地-グリセロール1×)によって特定される細胞凍結培地、Lonza PROFREEZE(商標)2×培地、又はプラズマライト(Plasmalyte)中で凍結保存される。
【００６８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記述する方法に従って処理される細胞は、カプセル封入された形であろうとカプセル封入されていない形であろうと、ヒト血清アルブミン(HSA)などの1種以上の成分を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。ある実施態様では、該凍結保存溶液は、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、又は約60%のHSAを含む。他の実施態様では、該凍結保存溶液は、約5%から約25%、約10%から約30%、約20%から約40%、約30%から約50%、約40%から約60%、又は約50%から約60%のHSAを含む。具体的実施態様では、該凍結保存溶液は、40%のHSAを含む。
【００６９】
他の実施態様では、本明細書に記述する方法に従って処理される細胞は、カプセル封入された形であろうとカプセル封入されていない形であろうと、1種以上の凍結保護物質(例えばDMSO)を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。ある実施態様では、該凍結保存溶液は、約1%、約1.5%、約2%、約2.5%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、又は約10%のDMSOを含む。他の実施態様では、該凍結保存溶液は、約1%から約3%、約2%から約4%、約3%から約5%、約4%から約6%、約5%から約7%、約6%から約8%、約7%から約9%、又は約8%から約10%のDMSOを含む。具体的実施態様では、該凍結保存溶液は、2.5%のDMSOを含む。別の具体的実施態様では、該溶液は、5%のDMSOを含む。
【００７０】
他の実施態様では、本明細書に記述する方法に従って処理される細胞は、カプセル封入された形であろうとカプセル封入されていない形であろうと、HypoThermosol(登録商標)(BioLife Solutions社、Bothell、WA)などの、細胞を保管するのに使用するための1種以上の溶液を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。ある実施態様では、該凍結保存溶液は、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、又は約70%のHypoThermosol(登録商標)を含む。他の実施態様では、該凍結保存溶液は、約25%から約50%、約40%から約60%、約50%から約60%、約50%から約70%、又は約60%から約70%のHypoThermosol(登録商標)を含む。具体的実施態様では、該凍結保存溶液は、55%のHypoThermosol(登録商標)を含む。別の具体的実施態様では、該凍結保存溶液は、57.5%のHypoThermosol(登録商標)を含む。
【００７１】
他の実施態様では、本明細書に記述する方法に従って処理される細胞は、カプセル封入された形であろうとカプセル封入されていない形であろうと、デキストラン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、シリカゲル、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレン、及び/又はグリコールなどの1種以上の賦形剤を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。さらに、本明細書に記述する方法に従って処理される細胞は、カプセル封入された形であろうとカプセル封入されていない形であろうと、ある種の培地(例えばPBS又はDMEM)を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。
【００７２】
具体的実施態様では、本明細書に記述する方法に従って処理される細胞は、40% HSA、5% DMSO、及び55% HypoThermosol(登録商標)を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。具体的実施態様では、該凍結保存溶液中の細胞は、カプセル封入され、該凍結保存溶液中で凍結保存される。別の具体的実施態様では、該凍結保存溶液中の細胞は、カプセル封入されずに、該凍結保存溶液中で凍結保存される。
【００７３】
細胞は、凍結保存中、例えば約1℃/分で冷却することができる。いくつかの実施態様では、凍結保存温度は、約-80℃から約-180℃、又は約-125℃から約-140℃である。凍結保存された細胞を、使用のための解凍の前に、液体窒素の気相に移動させることができる。いくつかの実施態様では、例えば、細胞は、いったん約-80℃に到達すると、液体窒素保管領域に移される。凍結保存は、速度制御型冷凍庫を使用して行うこともできる。凍結保存された細胞は、例えば、約25℃から約40℃の温度で、一般的に約37℃の温度で解凍することができる。
【００７４】
(6.2医薬組成物)
本明細書で提供されるのは、上のセクション6.1.1に記述した細胞性組成物中の細胞を含めた、本明細書で提供される方法に従って処理された細胞を含む医薬組成物である。具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物中の細胞は、上のセクション6.1.2に記述した細胞型である。
【００７５】
本明細書で提供される医薬組成物は、インビボ投与のために製剤化される、細胞/液体アルギナート溶液中のカプセル封入された細胞の集団又はカプセル封入されていない細胞の集団を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞は、許容し得る医薬組成物に相当する凍結保存溶液中で凍結保存され、それによって、細胞が解凍後に対象に直接投与できるようになる。例えば、細胞は、セクション6.1.4に記述した1種以上の成分を含む凍結保存溶液中で凍結保存される。他の実施態様では、細胞は、許容し得る医薬組成物に相当する凍結保存溶液中で凍結保存され、ここでは、該凍結保存溶液はアルギナートを含み、かつ、細胞は、解凍の直後にカプセル封入され、それに続いて、カプセル封入された細胞が対象に投与される。
【００７６】
一実施態様では、本明細書で提供される組成物中の細胞は、容器に入れた、細胞を含む組成物の形で対象に投与される。具体的実施態様では、容器は、袋、フラスコ、バイアル、又は広口ビンである。細胞は、容器から取り出し、当技術分野で公知の又は下のセクション6.3.1に記述した任意の適切な手段、例えば注射を使用して、対象に投与することができる。ある実施態様では、容器は、少なくとも又は多くとも、約1×102細胞、1×103細胞、1×104細胞、1×105細胞、1×106細胞、5×106細胞、1×107細胞、5×107細胞、1×108細胞、5×108細胞、1×109細胞、5×109細胞、1×1010細胞、又は1×1011細胞を含む。具体的実施態様では、医薬組成物中の細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、医薬組成物中の細胞は、胎盤幹細胞である。別の具体的実施態様では、医薬組成物中の細胞は、AMDACである。
【００７７】
ある実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも95%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも90%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも80%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも75%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも50%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。具体的実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、少なくとも40%の生存細胞を含む細胞の集団を含む。
【００７８】
(6.3使用)
本明細書に記述する方法に従って処理される細胞、及びその医薬組成物は、それだけには限らないが治療的使用を含めた、多くの目的のために有用である。これらの細胞及びその医薬組成物は、(i)解凍され、続いてカプセル封入された後に、又は(ii)解凍された後に、それに続くカプセル封入ステップ無しで、対象に投与することができるという事実により、特に有用である。いずれの場合にも、これらの細胞及びその医薬組成物は、解凍後かつ投与前のいかなる中間的培養ステップも必要とせずに対象に投与することができる、例えば、これらの細胞を直ちに投与することができるという点で有用である。さらに、本明細書に記述する方法に従って処理された細胞、及びその医薬組成物は、対象に局所的に投与することができるという点で有用である。したがって、本明細書で提供されるのは、本明細書に記述する方法に従って処理された細胞、又はその医薬組成物を対象に投与する(例えば局所的に投与する)方法である。
【００７９】
(6.3.1投与量及び投与経路)
本明細書に記述した方法に従って処理した細胞(例えばAMDAC又は胎盤幹細胞)、又はその医薬組成物の対象への投与は、該細胞の投与に適した、任意の医学的に許容し得る経路によるものであり得る。具体的実施態様では、該細胞は、局所的に、例えば、投与の目的に関わる、対象の身体における特定の部位に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、ボーラス注入によって投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、頭蓋内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、筋肉内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、腹腔内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、皮内に、又は皮下に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、皮下に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、胸骨内に(intrasternally)投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、関節滑液嚢内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、眼内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、硝子体内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、脳内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、脳室内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、くも膜下腔内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、骨内注入によって投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、膀胱内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、経皮的に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、大槽内に投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、硬膜外に投与される。
【００８０】
別の具体的実施態様では、該細胞は、対象に1回投与される。別の具体的実施態様では、該細胞は、2回以上の別々の投与で対象に投与される。具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×102から1×103細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×103から1×104細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×104から1×105細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×105から1×106細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×106から1×107細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×107から1×108細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×108から1×109細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×109から1×1010細胞を投与することを含む。別の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×1010から1×1011細胞を投与することを含む。他の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×104から約2×104細胞;対象1キログラムあたり約2×104から約3×104細胞;対象1キログラムあたり約3×104から約4×104細胞;対象1キログラムあたり約4×104から約5×104細胞;対象1キログラムあたり約5×104から約6×104細胞;対象1キログラムあたり約6×104から約7×104細胞;対象1キログラムあたり約7×104から約8×104細胞;対象1キログラムあたり約8×104から約9×104細胞;又は対象1キログラムあたり約9×104から約1×105細胞を投与することを含む。他の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×105から約2×105細胞;対象1キログラムあたり約2×105から約3×105細胞;対象1キログラムあたり約3×105から約4×105細胞;対象1キログラムあたり約4×105から約5×105細胞;対象1キログラムあたり約5×105から約6×105細胞;対象1キログラムあたり約6×105から約7×105細胞;対象1キログラムあたり約7×105から約8×105細胞;対象1キログラムあたり約8×105から約9×105細胞;又は対象1キログラムあたり約9×105から約1×106細胞を投与することを含む。他の具体的実施態様では、該投与は、対象1キログラムあたり約1×106から約2×106細胞;対象1キログラムあたり約2×106から約3×106細胞;対象1キログラムあたり約3×106から約4×106細胞;対象1キログラムあたり約4×106から約5×106細胞;対象1キログラムあたり約5×106から約6×106細胞;対象1キログラムあたり約6×106から約7×106細胞;対象1キログラムあたり約7×106から約8×106細胞;対象1キログラムあたり約8×106から約9×106細胞;又は対象1キログラムあたり約9×106から約1×107細胞を投与することを含む。具体的実施態様では、投与される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、投与される細胞は、胎盤幹細胞である。別の具体的実施態様では、投与される細胞は、AMDACである。
【００８１】
別の具体的実施態様では、細胞は、単回単位投与として対象に投与される。具体的実施態様では、細胞の単回単位投与は、種々の実施態様において、少なくとも又は多くとも、約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、又はそれ以上の細胞を含むことができる。具体的実施態様では、単回単位投与として投与される細胞は、幹細胞である。別の具体的実施態様では、単回単位投与として投与される細胞は、胎盤幹細胞である。別の具体的実施態様では、単回単位投与として投与される細胞は、AMDACである。
【実施例】
【００８２】
(7.実施例)
(7.1実施例1:カプセル封入された胎盤幹細胞の生存率
この実施例は、胎盤幹細胞が、アルギナート中にカプセル封入された場合に生存していることを実証する。
【００８３】
(7.1.1 25℃及び37℃での保管)
胎盤幹細胞(5×105細胞/ml)を、0.75%アルギナート溶液に懸濁させ、この細胞/液体アルギナート溶液をCaCl2の溶液(1.5% w/v)に滴下することによってカプセル封入した。カプセル封入された細胞を、25℃又は37℃で7日間保管し、死細胞をヨウ化プロピジウムで標識することによって、また生細胞をカルセイン・アセトメトキシ(AM)で標識することによって、様々な時点で細胞生存率を測定した。
【００８４】
カプセル封入された胎盤幹細胞は、37℃で7日間、また25℃で2日間、生存したままであった。
【００８５】
(7.1.2冷蔵保管)
胎盤幹細胞(5×105細胞/ml及び2×106細胞/ml)を、0.75%アルギナート溶液に懸濁させ、この細胞/液体アルギナート溶液をCaCl2の溶液(1.5% w/v)に滴下することによってカプセル封入した。このカプセル封入された胎盤幹細胞に、HypoThermosol(登録商標)(BioLife Solutions社、Bothell、WA)保管溶液を添加し、細胞を、4℃又は37℃で7日間保管した(すなわち、細胞を100% HypoThermosol(登録商標)中で保管した)。死細胞をヨウ化プロピジウムで標識することによって、また生細胞をカルセインAMで標識することによって、又は、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega社、Madison、WI)(これは、代謝的に活性な細胞の存在を示す、存在するATPの定量化に基づいて、培養中の生存細胞の数の測定を可能にする)を使用してATPのレベルを測定することによって、様々な時点で細胞生存率を測定した。
【００８６】
37℃で培養された、HypoThermosol(登録商標)中のカプセル封入された胎盤幹細胞は、予想通りに、3日後に死滅した。しかし、4℃で培養された、HypoThermosol(登録商標)中のカプセル封入された胎盤幹細胞は、最大7日間生存していた。図1を参照のこと。
【００８７】
(7.2実施例2:凍結保存された胎盤幹細胞のカプセル封入)
この実施例は、凍結保存された胎盤幹細胞を、解凍された後にカプセル封入することができ、かつ、解凍後に細胞を培養することを必要とせずに生存したままであることを実証する。
【００８８】
(7.2.1解凍後のアルギナートの添加及び解凍後のカプセル封入)
40% HSA、55%デキストラン40、及び5% DMSOを含む凍結保存溶液中で凍結保存されている胎盤幹細胞(7.5×106細胞/ml)を解凍し、いかなる中間的培養ステップも無しで、1.5%アルギナート(PBS中)と1:1の割合で混合した。次いで、この細胞を、実施例1に記述した通りにカプセル封入した。カプセル封入後、いかなる中間的培養ステップも無しで、カプセル封入された胎盤幹細胞に、HypoThermosol(登録商標)(BioLife Solutions社、Bothell、WA)保管溶液を添加し、この細胞をシリンジ内で4℃で7日間保管した(すなわち、細胞を100% HypoThermosol(登録商標)中で保管した)。このカプセル封入された胎盤幹細胞の生存率を、製造者の指示書に従ってVi-CELL(登録商標)Cell Viability Analyzer(Beckman Coulter社、Brea、CA)を使用して分析した。カプセル封入の直後には、胎盤幹細胞は、およそ80%生存していた。冷蔵保管における7日後、胎盤幹細胞のおよそ45%が生存していた。
【００８９】
別の実験では、40% HSA、55%デキストラン40、及び5% DMSOを含む凍結保存溶液中で凍結保存されている胎盤幹細胞(7.5×106細胞/ml)を解凍し、いかなる中間的培養ステップも無しで、1.5%アルギナート(PBS中)と1:1の割合で混合した。次いで、この細胞を、実施例1に記述した通りにカプセル封入した。カプセル封入後、いかなる中間的培養ステップも無しで、カプセル封入された胎盤幹細胞を、増殖培地で、3つの別々の希釈率(1×、0.5×、及び.25×)で希釈し、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega社、Madison、WI)を使用して、カプセル封入の4時間及び24時間後に生存率を評価した。カプセル封入された胎盤幹細胞は、どちらの時点でも生存しており、生存率は、カプセル封入の4時間後と24時間後で比較的変わらないままであった。図2を参照のこと。
【００９０】
これらの実験は共に、凍結保存された胎盤幹細胞を、アルギナートに懸濁させ、それに続いて、培養することを必要とせずに、解凍後の該細胞の生存率を保持しながら、解凍後にカプセル封入することができることを実証している。第1の実験は、アルギナートに懸濁させ、それに続いて解凍の直後にカプセル封入された胎盤幹細胞を、生存率を保持しながら、短期間、冷蔵保管することができることをさらに実証している。
【００９１】
(7.2.2凍結保存前のアルギナートの添加及び解凍後のカプセル封入)
胎盤幹細胞(7.5×106細胞/ml)を、5% DMSO、40%ヒト血清アルブミン(HSA)、及び55%アルギナート(濃度1.5%)を含む凍結保存溶液中で凍結保存した。続いて、この凍結保存された胎盤幹細胞を解凍し、それに続いて、この胎盤幹細胞を実施例1に記述した通りにカプセル封入した。このカプセル封入された胎盤幹細胞の生存率を、上述の通りにViCellによって評価した。このカプセル封入された胎盤幹細胞は、カプセル封入後に最大7時間、95%超の生存率、かつ、25℃でのカプセル封入の24時間後におよそ90%の生存率を保持していた。
【００９２】
この実験は、液体アルギナート中で凍結保存された胎盤幹細胞を、解凍後にカプセル封入することができること、また、解凍されたカプセル封入された細胞は、培養することを必要とせずに、生存率を保持することを実証している。
【００９３】
(等価物)
本発明は、本明細書に記述した具体的実施態様によって、範囲が限定されるべきではない。実際、記述したものに加えて、本発明の様々な改変も、前述の説明及び添付の図面から、当業者には明らかとなるであろう。こうした改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であるものとする。
【００９４】
様々な刊行物、特許、及び特許出願が、本明細書に引用されており、それらの開示の全体を、参照によって本明細書に組み込む。
【図１】
2014514245.tif 000003
【図２】
2014514245.tif 000004
【国際調査報告】
2014514245.tif 000005