(57)【要約】  本発明は、多重化単一チャンバー反応におけるサンプル中の標的核酸を検出及び定量化するための方法を提供する。高性能アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように最適化されたチャンバーを導入する消耗品、及びその使用方法が提供される。本方法を実行するために消耗品を使用するように構成されたデバイス及びシステムは、本発明の特徴である。
2014511178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を検出するための方法であって：
少なくとも１つの表面上に、少なくとも１つの高性能核酸検出アレイを有する検出チャンバーを提供し；
前記検出チャンバーに、検出されるべき１つ以上の前記標的核酸のコピーを含んで成るサンプルを充填し；
増幅プライマー及びプローブを前記１つ以上のコピーにハイブリダイズさせ；
増幅プライマー依存性増幅反応において、１つ以上の前記標的核酸のコピーの少なくとも一部を増幅させ、ここで前記増幅反応が、プローブの開裂及び第一のプローブフラグメントの放出をもたらし；
前記第一のプローブフラグメントを前記高性能アレイにハイブリダイズさせ；そして
前記第一のプローブフラグメントを前記アレイに結合させることにより生み出されるシグナルを検出し、それにより前記標的核酸を検出し、ここで前記検出ステップが、前記アレイに近位のバックグラウンドシグナルを減らす条件下で実施されることを含んで成る、前記方法。
【請求項２】
前記プローブが、標識プローブを含んで成り、且つ前記第一のプローブフラグメントが、標識プローブフラグメントを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識プローブフラグメントが、前記アレイへのハイブリダイズにおいて検出可能シグナルを生み出す標識を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出チャンバーが、前記アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出チャンバーが、前記アレイに近位の少なくとも１つの次元において５００μｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出チャンバーが、前記アレイに近位の少なくとも１つの次元において約１０μｍ〜約２００μｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アレイが、前記第一のプローブフラグメントにハイブリダイズする非比率制限数の捕捉核酸を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のプローブフラグメントが、前記標的核酸と相補的ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アレイの前記捕捉核酸にハイブリダイズする前記第一のプローブフラグメントが、約３０ヌクレオチド長未満である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレイの前記捕捉核酸にハイブリダイズする前記第一のプローブフラグメントが、約２０ヌクレオチド長未満である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記アレイの前記捕捉核酸にハイブリダイズする前記第一のプローブフラグメントが、約１５ヌクレオチド長以下である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、前記チャンバーと動作可能に連結されている少なくとも１つのポートまたは流体チャネルを通って充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸が、前記検出に先立ち、少なくとも５つの増幅サイクルで増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸が、前記検出に先立ち、複数の増幅サイクルにおいて増幅され、ここで前記標的核酸部分が、前記検出後に、前記プローブのさらなるコピーの存在下で増幅され、その結果放出される第一のプローブフラグメントは、その後に前記アレイにハイブリダイズし、そして検出され、ここで検出されるシグナル強度は、前記サンプル中に存在する前記標的核酸の量に相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナルが、１つ以上の光学シグナル波長を検出することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記シグナルを検出することが、複数のシグナルから複数の光学シグナル波長を検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ハイブリダイゼーション温度が、前記増幅反応温度未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一のプローブが、前記標的核酸に相補的でない第一の直交フラップを含んで成り、前記フラップが、前記標識プローブから開裂して、前記標識プローブフラグメントを生み出す、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブが、前記第一のフラップに少なくとも部分的に相補的である第二の直交フラップを含んで成り、前記第一のフラップが前記アレイに結合するために有するＴmよりも、前記第二のフラップが前記第一のフラップに結合するために有するＴmの方が高い、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識プローブが、蛍光または発光標識を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識が、蛍光染料である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブが、標識及び標識クエンチャーを含んで成り、前記プローブの開裂が、前記標識及び前記クエンチャーの分離をもたらすことにより、前記標識を未消光化する、請求項１に記載の方法。 
【請求項２３】
前記プローブが、未消光化標識を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記シグナルが光学シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出されたシグナルが、前記第一のプローブフラグメントの前記高性能アレイへのハイブリダイゼーションを示すインターカレーティング染料からのシグナルを含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アレイの１つ以上の領域のローカルバックグラウンドを検出し、そして前記バックグラウンドを補正することによりシグナル強度測定を正規化することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出ステップにおいて検出されたシグナルが、２．５超のシグナル対バックグラウンドノイズ比率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出ステップにおいて検出されたシグナルが、５超のシグナル対バックグラウンドノイズ比率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性、または前記アレイの一様でない多様な領域の視野を補正することにより、シグナル強度を正規化することをさらに含んで成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、複数の標的核酸を含んで成り、且つ前記アレイが、複数の捕捉核酸タイプを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉核酸タイプが、前記アレイ上で空間的に分離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
それぞれ異なる核酸標的に特異的である複数の増幅プローブを、前記標的核酸と共にインキュベートすることを含んで成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
約５〜約１００個の捕捉核酸タイプ、及び約５〜約１００個の対応する標識プローブタイプが増幅反応において存在し、ここで５〜１００個までの異なるシグナルが前記アレイ中の前記シグナルの位置に基づき検出され得る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記捕捉核酸が、約３５０ｆｍｏｌｅ／ｃｍ2〜約５，０００ｆｍｏｌｅ／ｃｍ2超の密度で配置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記捕捉核酸が、２０００ｆｍｏｌｅ／ｃｍ2超の密度で配置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
それぞれ異なる標的核酸に特異的である複数の標識プローブを、前記標的核酸と共にインキュベートすることを含んで成り、ここで前記増幅プライマー依存性増幅反応において前記標的核酸の少なくとも一部分を増幅することが、複数の標識プローブタイプの開裂をもたらし、そして複数の標識プローブフラグメントタイプの放出をもたらし、ここで前記ハイブリダイズが、前記複数のプローブフラグメントタイプを前記アレイにハイブリダイズさせることを含んで成り、ここでそれぞれの前記異なるプローブフラグメントタイプが、空間的に別々の捕捉核酸タイプにハイブリダイズし、ここで前記標識シグナルを検出することが、前記アレイ上の空間的に別々の捕捉核酸に対応する複数の空間的に別々の領域からの複数の標識シグナルを検出することを含んで成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記標識プローブタイプが、同一の標識部分を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記標識プローブタイプが、複数の異なる標識部分を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記標識プローブタイプが、１つ以上の異なる標識部分を含んで成り、ここで前記異なる部分の数が、前記標識プローブタイプの数よりも少ない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅ステップ、及び前記第一のプローブフラグメントを高性能アレイにハイブリダイズさせるステップが、同一の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
複数の標的核酸配列のサンプルを分析するための方法であって：
前記サンプルを第一の複数の標識プローブと接触させ、
それぞれ前記第一の複数の標識プローブが、標的核酸配列の第一のパネル中の注目の異なる標的配列に相補的な第一の部分、及び高性能プローブアレイ上の異なる捕捉プローブに相補的な第二の部分を含んで成り、ここで前記第二の部分が、そこに結合した標識を有し、且つ前記注目の標的配列に相補的でなく；
増幅プライマー依存性増幅反応において、任意の標的配列を、前記サンプル中に存在する前記標的核酸配列の第一のパネルから増幅し、
ここで前記増幅反応が、前記標的配列にハイブリダイズした標識プローブの開裂、及び前記標識を担持している前記標識プローブの前記第二の部分の放出をもたらし；
前記標識プローブの前記放出された第二の部分を、前記高性能アレイにハイブリダイズさせ；
前記高性能アレイにおける捕捉プローブへの前記標識プローブの前記第二の部分の結合を検出し；そして
前記サンプル中に存在する標的配列を、前記高性能アレイにハイブリダイズする前記標識プローブの前記第二の部分から同定すること、
を含んで成る、前記方法。
【請求項４２】
前記サンプルを、第二の複数の標識プローブと接触させ、
それぞれ前記第二の複数の標識プローブが、前記第二の部分、及び標的核酸配列の第二のパネル中の異なる注目の標的配列に相補的である第三の部分を含んで成り；
増幅プライマー依存性増幅反応において、前記サンプル中に存在する前記標的核酸配列の第二のパネルから、任意の標的配列を増幅し、
ここで前記増幅反応が、前記標的配列にハイブリダイズした標識プローブの開裂、及び前記ラベルを担持している前記標識プローブの前記第二の部分の放出をもたらし；そして
前記ハイブリダイゼーション、検出、及び同定ステップを繰り返すことをさらに含んで成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
核酸検出デバイスであって、
少なくとも１つの表面上に少なくとも１つの高性能核酸検出アレイを含んで成り、前記アレイから検出されるシグナルのシグナルバックグラウンドを減らすように構成された検出チャンバー；
前記デバイスの動作間に前記チャンバー中の温度を調節する、前記検出チャンバーに動作可能に接続された熱調節モジュール；及び
前記デバイスの動作間に前記アレイで生み出されるシグナルを検出する光列を含んで成る、核酸検出デバイス。
【請求項４４】
前記デバイスが、前記アレイに近位の少なくとも１つの次元において、約５００μｍ未満の深さである、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項４５】
前記デバイスが、前記アレイに近位の少なくとも１つの次元において、約１０μｍ〜約２００μｍの深さである、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項４６】
前記表面が、セラミック、ガラス、石英、またはポリマーから構成される、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項４７】
前記捕捉核酸が、前記デバイスの動作間に、非比率制限の密度で前記アレイ中に存在する、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項４８】
前記捕捉核酸が、前記チャンバーの表面上の熱安定性コーティングにつながれた、請求項４７に記載の核酸検出デバイス。
【請求項４９】
前記コーティングが、１つ以上の：化学反応基、求電子基、ＮＨＳエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα，β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含んで成る、請求項４８に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５０】
前記アレイが、多数の捕捉核酸タイプを含んで成り、ここで前記アレイの空間的に固有の領域に異なるタイプが局在化される、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５１】
前記アレイ上に６個以上の異なる捕捉核酸タイプが存在する、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５２】
前記アレイ上に、約５〜約１００個の異なる捕捉核酸タイプが存在する、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５３】
前記捕捉核酸が、２０００ｆｍｏｌｅ／ｃｍ2超の密度で配置される、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５４】
前記熱調節モジュールが、１つ以上の：熱電モジュール、ペルティエ素子、冷却ファン、ヒートシンク、または前記チャンバーの外面の一部分と一緒になるように構成された金属板を含んで成る、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５５】
前記熱調節モジュールが、コンピューターに動作可能に接続された、フィードバックを可能とする制御システムを含んで成る、請求項５４に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５６】
前記光列が、落射蛍光検出システムを含んで成るか、または前記システムと動作可能に接続されている、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５７】
前記光例が、１つ以上の：励起光源、アークランプ、水銀アークランプ、ＬＥＤ、レンズ、光学フィルター、プリズム、カメラ、光検出器、ＣＭＯＳカメラ、またはＣＣＤアレイを含んで成る、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５８】
前記アレイ中のシグナルの位置を検出されるべき核酸と関連付ける、アレイ読み取りモジュールを含んで成る、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項５９】
前記デバイスが、１回以上のシグナル強度の測定と熱調節モジュールにより行われる多くの増幅サイクルを相互に関連付け、前記デバイスにより検出される標的核酸の濃度を決定するコンピューターまたはコンピューター読み取り可能媒体において具現化されるシステム指示を含んで成るか、または前記指示に動作可能に接続される、請求項４３に記載の核酸検出デバイス。
【請求項６０】
コンピューターと動作可能に接続されており、ここで前記コンピューターは、前記熱調節モジュールにより前記熱循環を制御し、そして光列により画像がいつ取得されたか、または見られたかを特定する指示を含んで成り、そして前記コンピューターは、画像情報を時間関数としてシグナル強度曲線に変換し、そして／または前記デバイスにより分析された標的核酸の濃度を決定する指示をさらに含んで成る、請求項４３に記載のデバイスを含んで成るシステム。
【請求項６１】
前記コンピューターが、前記アレイの１つ以上の領域についてのローカルバックグラウンドを検出するための指示、及び前記バックグラウンドを補正することによりシグナル強度測定を正規化するための指示を含んで成る、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
前記コンピューターが、アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性、または一様でない前記アレイの異なる領域の視野を補正することにより、シグナル強度を正規化するための指示を含んで成る、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
核酸検出消耗品であって：約５００μｍ未満の深さの薄いチャンバーを含んで成り、ここで前記チャンバーは透明な窓を含んで成り、ここで前記窓は、前記窓の内面上に配置された高性能捕捉核酸アレイを含んで成り、そして前記チャンバーは、前記チャンバーと流体接続された少なくとも１つの試薬送達ポートをさらに含んで成り、前記チャンバー内の流体の熱循環を可能とするように構成されている、前記核酸検出消耗品。
【請求項６４】
前記核酸アレイが、前記アレイの空間的に固有の領域に位置する複数の異なる捕捉核酸タイプを含んで成る、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項６５】
前記チャンバーが、前記試薬送達ポートを含んで成る第一の上側表面、及び前記窓を含んで成る底部透明表面を含んで成り、前記頂部及び底部表面が、感圧接着剤材料を含んで成る側壁により接合される、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項６６】
前記チャンバーが、前記試薬送達ポートを含んで成る第一の上側表面、及び前記窓を含んで成る底部透明表面を含んで成り、前記頂部及び底部表面が、ガスケットにより、或いは前記上側もしくは下側表面、または両表面上の外形的特徴により一緒に接合され、ここで前記ガスケットまたは特徴が、前記上側もしくは下側表面、または両表面の対応する領域に融合または付着される、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項６７】
前記上側及び下側表面が、超音波により一緒に融合され、前記ガスケットまたは特徴が、融合される領域を区切る、請求項６６に記載の消耗品。
【請求項６８】
前記特徴が、前記上側または下側表面のいずれにおいて透明領域であり、且つ関連した上側または下側表面において対応する陰影領域であり、ここで前記上側及び下側表面が、前記透明領域を通り抜け、且つ前記陰影領域上にレーザー光を向けられることにより一緒にレーザー溶接される、請求項６６に記載の消耗品。
【請求項６９】
前記ガスケットまたは特徴が、ＵＶ硬化性接着剤の流れを導き、ここで前記接着剤は、前記上側及び下側表面の間で流れ、そしてＵＶ光にさらされ、それにより前記上側と下側表面とを接合する、請求項６６に記載の消耗品。
【請求項７０】
前記捕捉核酸アレイが、前記窓上の熱安定性コーティングと接続される、請求項６５に記載の消耗品。
【請求項７１】
前記コーティングが、化学反応基、求電子基、ＮＨＳエステル、テトラまたはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα，β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含んで成る、請求項７０に記載の消耗品。
【請求項７２】
前記捕捉核酸アレイが、２０００ｆｍｏｌｅ／ｃｍ2超の密度で配置される、請求項６５に記載の消耗品。
【請求項７３】
前記捕捉核酸アレイが、２５００ｆｍｏｌｅ／ｃｍ2超の密度で配置される、請求項６５に記載の消耗品。
【請求項７４】
前記窓が、ガラス、石英、セラミック、またはポリマーを含んで成る、請求項７０に記載の消耗品。
【請求項７５】
前記チャンバーが、約１０μｍ〜約２００μｍの深さである、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項７６】
前記チャンバーが、約１４０μｍ以下の深さである、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項７７】
前記チャンバーが、約１００μｍ以下の深さである、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項７８】
前記チャンバーが、約１ｍｍ〜約５０ｍｍの平均直径である、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項７９】
前記チャンバーが、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍの平均直径である、請求項６３に記載の消耗品。
【請求項８０】
包装材料中に包装された請求項６３に記載の消耗品を含んで成り、場合により１つ以上のコントロール試薬を含んで成るキット。
【請求項８１】
サンプル中の標的核酸配列の存在を検出するための方法であって：
第一の標的核酸配列に相補的である第一の部分、及び前記第一の標的核酸配列に相補的でない第二の標識部分を含んで成る第一の標識プローブの存在下で、前記標的核酸配列が増幅される時に前記第二の部分が前記第一の部分から開裂するように、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて、前記サンプルにおいて増幅反応を行い；
前記第二の標識部分を、前記第二の部分に相補的である捕捉プローブを含んで成る基板にハイブリダイズさせ；そして
前記基板上の前記捕捉プローブにハイブリダイズした前記第二の標識部分の存在を検出すること
を含んで成る、前記方法。
【請求項８２】
前記基板が、平面基板を含んで成る、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記基板が、ビーズを含んで成る、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
それぞれ異なる標的核酸配列に相補的である第一の部分、及び任意の前記異なる標的核酸配列に相補的でないそれぞれ異なる配列を含んで成る第二の標識部分を有する多数の標識プローブを、前記異なる標的核酸配列が増幅される時に、前記第二の標識部分が、前記第一の部分から開裂されるように提供すること；
前記増幅反応の間に開裂される前記第二の標識部分を、それぞれ異なる標識された第二の部分に相補的であり、それぞれ前記平面基板上の異なる公知の位置に配置される複数の異なる捕捉プローブにハイブリダイズさせること；そして
前記基板上で標識された第二の部分が前記捕捉プローブにハイブリダイズする位置から、前記サンプル中の標的核酸配列の存在を同定すること
をさらに含んで成る、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
それぞれ異なる標的核酸配列に相補的である第一の部分、及び任意の前記異なる標的核酸配列に相補的でないそれぞれ異なる配列を含んで成る第二の標識部分を有する多数の標識プローブを、前記異なる標的核酸配列が増幅される時に、前記第二の標識部分が、前記第一の部分から開裂されるように提供すること；
前記増幅反応の間に開裂される前記第二の標識部分を、それぞれ異なる標識された第二の部分に相補的であり、それぞれ特有の標識を担持している異なるビーズ上に配置される複数の異なる捕捉プローブにハイブリダイズさせること；そして
所定の標的核酸配列の存在を、それが結合する前記ビーズを同定することにより検出すること
をさらに含んで成る、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援の研究開発の下で成された発明に対する権利に関する陳述
【０００２】
本発明は、米国、国土安全保障省助成、契約番号ＨＳＨＱＤＣ−１０−Ｃ−０００５３の支持により成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年２月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／４６３，５８０号、及び２０１１年１１月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／５６１，１９８号に対する優先権を請求し、その全開示は、全ての目的のためにそれらの全体において、本明細書中に参照により組み込まれている。
【０００４】
本発明は、リアルタイムＤＮＡ増幅、検出及び定量化、並びにアレイを含む関連する消耗品（consumables）、デバイス、及びシステムの分野にある。
【背景技術】
【０００５】
リアルタイムＰＣＲは、生物試料中の注目の核酸を検出するために日常的に使われている。リアルタイムＰＣＲの検討については、例えば、Ｍ ＴｅｖｆｉｋＤｏｒａｋ（編）（２００６）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（改良法) Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，第１編ＩＳＢＮ−１０：０４１５３７７３４Ｘ ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４１５３７７３４８、及びＬｏｇａｎ等（編）（２００９）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第１編ＩＳＢＮ−１０：１９０４４５５３９５，ＩＳＢＮ−１３：９７８〜１９０４４５５３９４を参照する。さらなる詳細については、例えばＧｅｌｆａｎｄ等“Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”米国特許第５，２１０，０１５号；Ｌｅｏｎｅ等（１９９５）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＮＡＳＢＡ ｅｎａｂｌｅ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２６：２１５０〜２１５５；並びにＴｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ（１９９６）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３〜３０８も参照する。伝統的に、単一反応容器（例えばマルチウェルプレートのウェル）中のサンプルごとに２個以上の標的核酸を検出するために使用される単一ウェル多重化は、それぞれの単位複製配列に特異的なＴＡＱＭＡＮ（商標）または分子指標プローブ等の自己消光ＰＣＲプローブを用いて達成される。溶液中の単位複製配列への結合において、またはＰＣＲの間のプローブの分解において、プローブは消光せずに、検出可能なシグナルを生み出す。プローブは、異なる波長の蛍光色素分子により標識され、単一「ワンポット」反応において約５個までの標的の多重化能を可能にする。反応ごとに約６個以上のプローブは、実際のスペクトル範囲及び標識放出限界のために達成するのが困難である。これは単一反応の多重化を厳しく制限し、順にどのくらい多くの標的がサンプルごとにスクリーニングされ得るかを大いに制限し、そして注目の多重の標的の検出において試薬費用及び機器の複雑性をつり上げる。
【０００６】
核酸アレイは、増幅産物の検出を多重化する他の手法を表す。最も典型的には、増幅反応は、サンプル上で行われ、且つ単位複製配列は、核酸アレイ上で単独で検出される。例えば、Ｓｏｒｇｅ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｐｒｏｂｅ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”米国特許第６，３５０，５８０号は、増幅混合物の外のプローブを精製することにより、増幅へと放出され、そしてその後にそれを検出するプローブの捕捉を提案する。単位複製配列を作製し、且つ検出するためのこの多重ステップアプローチは、実現不可能な増幅混合物のリアルタイム分析を作製する。
【０００７】
捕捉核酸の存在中で反応物を増幅させる異なる手法もまた提案されてきた。例えば、Ｋｌｅｉｂｅｒ等“Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”米国特許第６，２７０，９６５号は、蛍光を誘導した消失を介する単位複製配列の検出を提案する。同様にＡｌｅｘａｎｄｒｅ等“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ （Ｍｉｃｒｏ） Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”米国特許第７，８２９，３１３号は、アレイ上の単位複製配列の検出を提案する。他の例では、標的ポリヌクレオチドは、増幅の結果として生み出されるプローブフラグメントを検出すること、例えば電極へ結合し、その後に電気化学的な検出をすることにより検出される。例えばＡｉｖａｚａｃｈｖｉｌｌｉ等“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”米国特許出願公開第２００７／００９９２１１号；Ａｉｖａｚａｃｈｖｉｌｌｉ等“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”米国特許出願公開第２００８／０１９３９４０、及びＳｃａｂｏｏ等“Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”米国特許出願公開第２００８／０２４１８３８を参照する。
【０００８】
これらの方法は、全て多重標的核酸検出のためのそれらの使用を制限する実際的制限に悩まされている。例えばＫｌｅｉｂｅｒ（米国特許第６２７０，９６５号）は、アレイ表面での単位複製配列の蛍光を検出するために、蛍光を誘導した消失に頼り、そして複雑且つ高価な光学及びアレイを要求する。Ａｌｅｘａｎｄｒｅ（７，８２９，３１３）は、アレイ上の単位複製配列の検出を提案し；Ｋｌｅｉｂｅｒによれば、これは、それぞれのアレイが、それぞれの単位複製配列を検出するように特注設計されていなければならないので、有意にアレイのコストが上がる。Ａｌｅｘａｎｄｒｅによれば、実際には、アレイ上、特に単位複製配列が比較的に大きいところの異種単位複製配列について同様のハイブリダイゼーション反応速度論を達成することは、困難であり得る。さらに本技術は、さらに高レベルのシグナルバックグラウンド、またはｉｎ ｓｉｔｕ熱循環を介して安定のままである高レベルのアレイも含んで成る付随の液相が存在する場合に、アレイ上のシグナルをどのように検出するかについて、殆ど助言を提供しない。
【０００９】
本発明は、当業界においてこれら及び他の問題を克服する。本発明のより完全な理解は、以下の完全な検討において得られるだろう。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明は、例えば生物サンプル中のウィルス、細菌、プラスモディウム、真菌、または他の病原体を検出するために、注目の核酸の高度に多重化された検出を可能にする方法、並びに関連するデバイス、システム及び消耗品を提供する。消耗品は、チャンバーの内面上に高性能熱安定核酸検出アレイを有するシグナル最適化チャンバーを含んで成る。アレイは、約１００個以上までの異なる万能標識プローブを検出するために構成される。方法は、チャンバー中で行われている増幅反応により、注目の核酸の一部分の増幅の間に、（“プローブフラグメント”としての）標識万能プローブを作り出す。万能プローブは、数サイクルの増幅後、及びその後の選定された増幅サイクル後にアレイにハイブリダイズし、リアルタイムでのサンプル中の注目の１つ以上の核酸の検出及び定量化の両方を可能にする。
【００１１】
したがって、第一の態様では、標的核酸を検出するための方法が提供される。これは、少なくとも１つのチャンバーの表面上に少なくとも１つの高性能核酸検出アレイを有する検出チャンバーを提供することを含む。高性能アレイは、典型的にチャンバーにおける反応によって生み出される検出可能なプローブフラグメントの増加した捕捉率を可能にする、非比率制限数（non-rate limiting number）の捕捉核酸（capture nucleic acids）を有し、且つ捕捉核酸は、アレイ効率も増加させる比較的に小さなプローブ核酸を捕捉するように構成される。プローブのアレイへの結合の検出は、好適には例えば未結合の遊離プローブから生じるアレイに近位のバックグラウンドシグナルレベルを減らすように選定され、または構成された条件下で実施される。例えば特定の実施形態では、チャンバー自体は、例えばバックグラウンドを減らすようにチャンバーを成形することにより（例えばアレイに近位が比較的に薄いチャンバー、例えば典型的に約５００μｍであるか、またはアレイ上方がより浅いチャンバーを作ることにより）、アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される。またより薄いチャンバーは、厚みのあるチャンバーよりも少ない熱質量を有し、そしてより高速且つより効率的な温度サイクルであり得る。システム及び方法がバックグラウンドシグナルのレベルを減らすように構成されている他の方法は、以下により詳細に記載される。
【００１２】
検出されるべき標的核酸の１つ以上のコピーを有するサンプルは、検出チャンバー中に充填される。増幅プライマー及び標識プローブは、１つ以上の標的核酸のコピーにハイブリダイズする。１つ以上の標的核酸のコピーの少なくとも一部は、増幅プライマー依存性増幅反応において増幅される。増幅反応は、例えば増幅酵素のヌクレアーゼ活性のために、標識プローブの開裂をもたらす。これは、アレイにより検出される標識プローブフラグメントの放出をもたらす。標識プローブフラグメントは、（典型的に数サイクルの増幅で処理され、チャンバー中に放出された量のプローブフラグメントが増幅された後に）高性能アレイにハイブリダイズする。標識プローブフラグメントのアレイへの結合により生み出される標識シグナルがその後に検出されることにより、標的核酸が検出される。
【００１３】
検出チャンバーの正確な構成は、変えられ得る。構成は、アレイに近位のチャンバー中のシグナルバックグラウンドを減らすように選定される。一般に、チャンバー中で少なくとも１％、及びしばしば約５％以上のシグナルは、アレイの領域においてアレイで（例えば約６％、８％、またはさらに１０％以上）濃縮される。９９％以下の総シグナルのバックグラウンドは、より低いレベルがしばしば所望されるにもかかわらず、システムにより正規化（normalize）され得る。本明細書において記載される典型的な実施形態では、９５％以下の総バックグラウンドのレベルは、アレイに近位のチャンバーの構成を最適化することにより達成される。この構成最適化は、例えばアレイの上方のチャンバーの深さを最小限に保つことにより達成される。典型的な実施形態では、チャンバーは、深さにおいて、またはアレイに近位の他の次元において約１ｍｍ未満であり、より典型的にはアレイに近位の少なくとも１つの次元において約５００μｍ以下、好適には約２５０μｍ以下、例えば約１０μｍ〜約２００μｍの間であり、及びいくつかの実施形態では、チャンバーは、アレイに近位の次元において約１５０μｍである。本明細書における一例では、チャンバーは、アレイの上方で約１４２μｍの深さである。本明細書のおける他の例では、チャンバーは、約１００μｍの深さである。関連のあるチャンバー次元は、検出システムのシグナル検出路、（例えば、シグナルがアレイ上に光を通すことにより作り出されるところ、いくつかの光がアレイを通り、そしてアレイ上方の流体中を抜け出すところ）次第であり、関連のある次元は、アレイ上方のチャンバーの深さである。検出されるバックグランドシグナルのレベルを減らすことに加えて、チャンバー厚を減らすこともバックグラウンドノイズ構成要素の寄与、例えば反応流体からのアレイスポットシグナル及びバックグラウンドシグナルの特異的検出とは関連しない検出器応答を減らすことの利益を有する。特に１つの主なノイズ寄与因子は、一般に検出されるシグナルの総量の平方根で増加し、順に反応チャンバーの厚さに対応する、使用される検出器からのショットノイズである。したがって反応チャンバーの減少した厚さを提供することにより、１つではバックグラウンドノイズが減らされ、そして結果としてシステム全体のシグナル対バックグラウンドノイズ比率（signal to background noise ratio）（ＳＮＲ）が増える。他の潜在的ノイズ寄与因子は、過剰の光の検出、例えばフィルターなしの励起光、意図的でない周辺光、散在性蛍光、システム構成成分の自己蛍光等を含む。多くのこれらのノイズ寄与因子は、適切な光学フィルター（例えば過剰な励起光を取り除き、または減少させる）、検出器での周囲光を減少させ、または妨げる封じ込まれた光学系の使用を介し、またアレイスポットサイズの構成を通して、及び検出器でのシグナルクロストークを減らす、または取り除くために間隔を空けること等の従来からの手法を通して軽減され得る。特に好適な態様では、本発明のアッセイ方法及びシステムのためのＳＮＲは、典型的に２．５超、好適には３超、４超、５超、１０超、及びいくつかの場合では２０以上である。
【００１４】
またバックグラウンドシグナルを減らすための本発明のシステム及び方法を構成するための代替または追加の手法は、本発明のデバイス及び方法との結合において採用され得る。例えば本発明のデバイス及びシステムは、全内部反射蛍光顕微鏡検査法（total internal reflection fluorescence microscopy）（“ＴＩＲＦ”）構成を用いて、励起光が内部全体に反射されるように捕捉アレイの下にある基板中に向かう場合に、励起照明を捕捉アレイに提供するように構成され得る（Ｍ.Ｔｏｋｕｎａｇａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ.ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍ.２３５，４７（１９９７）及びＰ.Ａｍｂｒｏｓｅ,Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３６，２４４（１９９９）を参照）。これにもかかわらず、表面から離れて指数関数的に崩壊し、残りの溶液中で、蛍光色素分子を励起させずに、表面に例えば１００ｎｍの深さで隣接して効果的な照明をもたらすアレイの基板−流体境界面部分で、エバネッセント波が作り出される。
【００１５】
また他の代替または追加の手法では、本発明の分析方法において採用される反応物は、実際のプローブ／アレイ結合シグナルと比較して、バックグラウンドシグナルを減らすように構成される。例えば、バックグラウンドシグナルは、捕捉アレイプローブ及び標識フラグメントの両方において、例えばＦＲＥＴ構成物において、協力的な蛍光色素分子の使用を通して減らされ得る。特に第一の励起スペクトル及び第一の発光スペクトルを有する供与体蛍光色素分子は、１つの捕捉プローブまたは標識プローブフラグメントと結合され得る。供与体の発光スペクトルと重複し、且つ供与体の励起スペクトルとは異なる励起スペクトルを有する受容体蛍光色素分子は、他のプローブと結合される。捕捉プローブ及び標識プローブフラグメントがハイブリダイズする場合、供与体及び受容体は、エネルギーを伝達するのに十分な隣接にし、受容体蛍光色素分子の発光スペクトルに相当する固有の蛍光シグナルを産する。供与体の励起スペクトルの内部でのみ励起し、且つ供与体の発光スペクトルをフィルターするために光学システムを構成することにより、供与体からのエネルギー伝達シグナルから生じるシグナルを、ハイブリダイゼーションにおいて選択的に検出することができる。多種多様なＦＲＥＴ標識対は、以前に記載されている（例えば米国特許第６，００８，３７３号、Ｗａｇｇｏｎｅｒ、及び米国特許第７，４４９，２９８号、Ｌｅｅ等を参照する）。十分に理解されているように、本発明において、結合した標識プローブフラグメントから検出されるシグナルと比較して、反応溶液中の未結合の無傷の標識プローブからのシグナルの寄与、またはバックグラウンドシグナルを減らすための多くの方法、例えば検出器の焦点面の中のシグナルを濃縮するために反応チャンバーを構成すること、溶液中で未結合の場合と比べて、アレイに結合している場合には異なる発光スペクトル、または開裂プローブフラグメント中で分離した場合と比べて、同一の無傷のプローブが存在する場合には蛍光を減らす自己消光プローブのいずれかが存在する相互作用的な標識化技術を採用することを含む方法が採用され得る。
【００１６】
上述の通り、アレイは、典型的に標識プローブフラグメントにハイブリダイズする非比率制限数の捕捉核酸を含む。これは、増幅反応が、増幅の間に、反応混合物中にプローブフラグメントを結合させるために利用できるアレイ上の部位の数（例えば接近可能な相補的な捕捉核酸）を満たしていないプローブフラグメント濃度をもたらすいくらかのプローブフラグメントを生み出すことを意味する。言い換えると、アレイ上の結合部位の数は、増幅反応において生み出されるプローブフラグメントの濃度で満たされるものであるように過剰に維持され、且つ好適には、十分に過剰に維持される。アレイ上の部位の数に比率制限がないために、溶液中のバックグラウンドプローブフラグメントに対するアレイ上のプローブフラグメントの比率は、最適化される。典型的なアレイ密度は、約３５０ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上、例えば約２，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上、２，５００ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上、３，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上、４，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上、４，５００ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上、または５，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2以上の間である。いくつかの実施形態では、アレイ上でプローブを結合させる部位の数は、少なくとも１Ｘであり、そのサイトの数は、増幅反応の間に生み出されるプローブフラグメントの濃度により満たされ、且つ場合により５Ｘ、１０Ｘ、５０Ｘ以上である。比率は、増幅サイクルの数、及び生み出されるプローブの量により変わるだろう。アレイの効率は、捕捉されるべきプローブフラグメントの長さの機能でもある。プローブは、ハイブリダイゼーションの間に所定のＴmで結合するために十分に長くなければならないが、より短いフラグメントは、典型的により効率的なハイブリダイゼーションを示す。アレイにより捕捉される典型的なプローブフラグメントは、約５０個以下のヌクレオチド長であり；アレイは、対応する相補的捕捉核酸配列を有する部位を含んで成る（捕捉核酸は、例えば表面上方の相補的部位の間にスペースを置くための追加の配列、例えば表面効果を減らすための追加の配列も場合により含み得る）。より典型的には、プローブ及び捕捉配列は、約４０個以下のヌクレオチド長、例えば約３０個、約２０個、または約１５個以下のヌクレオチド長さである。
【００１７】
いくつかの場合では、所定の分析において使用される捕捉アレイプローブ、及び相補的標識プローブフラグメントは、それらが全てのアレイのメンバーに渡り、狭い範囲のＴmを提供するように選定される。特に最適且つ一貫した捕捉アレイへのハイブリダイゼーションを確実にするために、所定のアレイにおける捕捉プローブは、それぞれアレイの全ての他のメンバーについて約１０℃以内、及び好適にはアレイ中の全ての他のプローブについて約７℃、５℃、または３℃以内のＴmを有するだろう。かかる狭いＴmの範囲は、一貫したハイブリダイゼーションを可能にし、且つアレイの全てのメンバーに渡りシグナル発生をもたらす。
【００１８】
典型的な実施形態では、ハイブリダイゼーション温度は、捕捉核酸のためのプローブフラグメントのＴmがプローブの分子内Ｔm未満であり得るように（例えばプローブがバックグラウンドを減らすためのクエンチャーを含んで成る場合）、及び／または標的核酸のためのプローブのＴm未満であり得るように、増幅反応の温度未満である。すなわち、典型的な熱循環の実施形態では、増幅反応は、ハイブリダイゼーションステップよりも高い温度で行われ；したがってプローブは、典型的にプローブフラグメントがアレイのために有するよりも、標的核酸のためにより高いＴmを有するだろう。標識プローブは、典型的に標的核酸に相補的でない第一の直交フラップ（orthogonal flap）を含んで成り；このフラップは、標識プロ―ブから開裂し、標識プローブフラグメントを生み出す。標識プローブは、場合により例えばクエンチャー部分と結合された、第一のフラップに少なくとも部分的に相補的である（例えば第一のフラップ上の標識の隣接度に基づいた消光を提供するための）第二の直交フラップを含んで成る。バックグラウンドは、第一のフラップがアレイに結合するために有するＴmよりも、第二のフラップが第一のフラップに結合するために有するＴmが高い場合に減らされる。かかる構成では、伸長反応は、第一の温度、すなわち標的核酸のための無傷の（intact）プローブのＴmを下回るが、無傷のプローブの分子内Ｔm、及びアレイ上の捕捉プローブのプローブフラグメントのＴmの両方を上回る温度で生じる。伸長に伴い、反応温度が低くなるので、プローブの分子内Ｔmを下回り、プローブの二次構造の形成を可能にし、そして蛍光色素分子の消光をもたらす。さらに捕捉プローブに対するプローブフラグメントのＴmを下回るまで冷却することは、プローブフラグメントのアレイへのハイブリダイゼーション、及びその関連の蛍光色素分子の検出を可能にする。無傷のプローブは、予めその二次構造に形成されているため、あまり捕捉プローブに結合せず、且つ消光するので、無傷のプローブの意図されない捕捉、及び溶液中の無傷のプローブにおいて存在する蛍光色素分子からのバックグラウンドシグナルの両方を減らし、またはそれは捕捉プローブアレイに結合し得る。特定の態様において、クエンチャーは、本発明の無傷のプローブに作用されるが、特定の実施形態では、驚くべきことに、クエンチャーがプローブ上に必要とされないことが分かった。プローブからクエンチャーを除くことによりバックグラウンドが増加するとしても、最適化されたチャンバー設計及び高性能アレイにより、バックグラウンドからのアレイシグナルの識別が達成できるからである。
【００１９】
他の実施形態では、標識プローブフラグメント及びその相補的な捕捉核酸は、伸長反応の温度よりも高いＴm、例えば１０度以上を有するように設計または選定される。したがって、伸長反応が例えば５５℃〜６０℃の間で行われる場合、標識プローブフラグメント及び捕捉核酸のＴmは、典型的に例えば７１℃であるだろう。かかる場合において、アレイ上の捕捉核酸への標識プローブフラグメントのハイブリダイゼーションは、伸長反応と同一の温度で起こるので、アレイにハイブリダイズし、そして得られるシグナルを検出するために、温度をさらに低くする必要性がなくなる。結果として、３段階の温度プロファイルよりもむしろ２段階のプロファイルが使用され得る。
【００２０】
無傷の標識プローブにおいて、標的配列に結合するプローブ部分に対して直交である標識プローブフラグメントの方向性は、変えられ得る。特に放出標識プローブフラグメントは、プローブの標的特異的部分から開裂した末端が、捕捉プローブがアレイ表面につながれた点に近位または遠位のいずれかである場合の方向性において、アレイ上で捕捉プローブにハイブリダイズし得る。いくつかの場合では、例えば、任意の無傷のプローブは、アレイの表面に向かうプローブの標的特異的部分を提示する方向性において、捕捉プローブに結合するのみであるということを確実にすることにより、結果としてそれが結合することによる潜在的な表面干渉をうまく利用し、さらに無傷のプローブのアレイによる所望されない捕捉の可能性を減らし得る。かかる方法は、特にアレイ上の固体表面の場合、例えばシリカ基板等において有用である。
【００２１】
サンプルは、消耗品の正確な構成に応じて、任意の多様なメカニズムによりチャンバー中に充填され得る。１つの都合のよい適用では、サンプルは、チャンバーと動作可能に連結された（in operable communication with the chamber）少なくとも１つのポートまたは流体チャネルを通して充填される。例えば、ポートは、消耗品の頂部表面において、チャンバーに導くポートと共に組み立てられ得る。これは、例えばピペットまたは他の流体送達デバイスを介する簡易化充填を提供する。或いは、流体またはマイクロ流体チャネル、キャピラリー等は、サンプル送達のために使用され得る。
【００２２】
方法は、例えばリアルタイムでのサンプル中の注目の核酸（a nucleic acid of interest）の検出、及び／または核酸の定量化のために使用され得る。したがって一つの態様では、標的核酸は、シグナルの検出に先立ち、複数の増幅サイクルにおいて、シグナル検出後にさらに増幅される標的核酸部分により、すなわち標識プローブの追加のコピーの存在中で場合により増幅される。得られた放出標識プローブフラグメントは、その後にアレイにハイブリダイズし、そしてサンプル中に存在する標的核酸の存在及び／または量に相関して検出されるシグナル強度により検出される。典型的にサンプルは、増幅により放出されるプローブフラグメントの数を増やすことによりシグナルレベルを増やすために、最初の検出前に２回以上のサイクルで増幅される。例えば標的核酸は、アレイからのシグナルの検出に先立ち、少なくとも例えば２、３、４、５回以上の増幅サイクルで場合により増幅され得る。
【００２３】
標識プローブは、量子ドット等の他の標識も使用され得るが、典型的に蛍光または発光標識を含んで成る。１つの好適な実施形態では、標識は蛍光染料である。プローブフラグメントにより生み出されるシグナルは、典型的に光学シグナルである。標識プローブは、場合により標識及び標識クエンチャー（label quencher）を含んで成り；標識プローブの開裂は、標識とクエンチャーの分離をもたらすので、標識は消光されない。しかしながら上記の通り、クエンチャーは、本発明の実施において要求されない。
【００２４】
シグナルは、典型的にプローブまたはプローブフラグメント上の光学標識に対応する１つ以上の光学シグナル波長を検出することにより検出される。アレイ上のプローブフラグメントの結合位置が、異なるプローブ間を識別するために使用され得るので、多重化増幅反応（２つ以上の標的がサンプル中に存在する場合に、多重標的核酸を増幅するために設計された増幅反応）においてプローブを区別するために、異なるプローブ上で異なる標識を使用することは必要とされない。しかしながら、多重プローブ標識は、多重化能を増強するために使用され得る。多重プローブが使用される場合、シグナルを検出することは、複数の異なる標識（例えば異なるプローブ上の異なる蛍光染料部分）により作り出される複数のシグナルから複数の光学シグナル波長を検出することを含み得る。
【００２５】
アレイに結合するプローブフラグメントに結合した標識基、例えば標識プローブフラグメントに関して一般に記載されているが、予め標識されたプローブの使用を必要としない他の検出スキームがなされ得ることが理解される。例えばいくつかの実施形態では、インターカレーティング染料（intercalating dye）が使用され得る。インターカレーティング染料は通常、二本鎖核酸への取り込まれ時、またはインターカレーティング時に、検出可能なシグナル事象を提供する。本発明において、アレイ上の相補的プローブへの開裂プローブフラグメントのハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料を取り込めるアレイ表面で二重らせんの二本鎖を作り出し、そしてそのハイブリダイゼーションの特有のシグナル指標的なものを提供する。インターカレーティング染料は、当業界において周知であり、且つ例えば、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｕｄｎａｓｏｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）、Ｖｏｌ.３５、Ｎｏ.１９、ｅｌ２７において記載されたものを含む。同様に光学シグナル検出方法は、特に好適であるが、プローブ構成及びアッセイ方法は、一般に非光学標識及び／または検出方法を用いて、例えば電気化学的検出方法（例えばＣｈｅｍＦＥＴＳ、ＩＳＦＥＴＳ、等）を用いて、場合により電気化学的標識基（例えば大きく荷電した基を有する）との結合においても実施されて、検出器表面での、または検出器表面近くでの、アレイプローブへのプローブフラグメントのハイブリダイゼーションの検出を増幅し得る。
【００２６】
ローカルバックグラウンドは、アレイの１つ以上の領域について、前記バックグラウンドを補正することにより正規化されているシグナル強度測定により検出され得る。典型的に、正規化されたシグナル強度は、総シグナルの約１０％未満、例えば総シグナルの約１〜約１０％の間である。実施形態の一例分類では、正規化されたシグナル強度は、総シグナルの約４〜約７％の間である。典型的に、およそ１％以上のシグナルがアレイに局部集中する場合、例えば約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれを上回るシグナルがチャンバーのある領域のアレイに局在化する場合、バックグラウンドからのアレイシグナルを識別することが可能である。バックグラウンドに対してより低いレベルのシグナルでさえ識別することが可能であるが、これは、一般的に好適ではない。方法は、アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性を補正することにより（例えばスポットサイズ、スポット密度、または両方を補正することにより）、またはアレイの異なる領域の一様でない視野を補正することにより、シグナル強度を正規化することをさらに含み得る。
【００２７】
サンプル中の多重標的核酸を同時に検出するための能力は、本発明の好適な態様を表す。サンプルは、サンプルごとに２つ以上の標的を検出することが可能な複数の捕捉核酸タイプを含んで成るアレイと共に１つまたは複数の標的核酸を有し得る。捕捉核酸タイプは、アレイ上で空間的に分離され、（上記の通り、多重標識が使用され得るにもかかわらず）多重標識の使用の必要性を取り除く。多重化手法では、それぞれ多様な核酸標的に特異的である複数の増幅プローブは、１つ以上の標的核酸を含み得るサンプルと共にインキュベートされる。例えば約５〜約１００個以上の捕捉核酸タイプが存在し得る。それぞれ検出されるべき潜在的な標的は、多様なプローブを利用するだろうし、同様に例えばそれぞれ注目の潜在的標的に特異的である約５〜約１００以上の標識プローブタイプが増幅反応において場合により存在する。アレイは、対応する捕捉核酸、例えば約５〜約１００以上の捕捉核酸タイプを含む。これは、検出されるべき対応する多くのシグナルを認め、且つアレイにより処理される。例えば約５〜約１００個以上の異なるシグナルは、プローブフラグメントのアレイへのハイブリダイゼーション後にアレイ上のシグナルの位置付けに基づき検出され得る。理解されているように、アレイ上の捕捉プローブタイプの数は、一般にシグナル反応容積中で多重化され得る固有の増幅反応の数により決定される。しかしながら多くの数の多様な捕捉プローブ、例えば１００個超、１０００個超、１０，０００個超の捕捉プローブタイプを有する捕捉アレイも、状況次第で、例えば増幅反応がアレイによる監視のためにためられる場合等において採用され得る。
【００２８】
本発明の利点は、１つの捕捉アレイ構成が、多重の異なる標的核酸配列パネルに使用され得ることである。特に第一のパネルのプローブセットは、パネル中の標的に特異的である部分に特異的である第一の標的、及び捕捉アレイ上の個々のプローブに相補的である第二の捕捉部分を有するプローブを含むだろう。第二の多様なパネルのためのプローブセットは、（部分的に重複していても、または全く相違していても）そのパネルのための標的特異的部分を含むだろうが、一方で捕捉部分は、第一のパネルのプローブセットのためのものと同一であるだろう。言い換えると、標的の任意のパネルのためのプローブセットは、多くの捕捉アレイに常に相補的であるであろう、そのパネルのために使用されるプローブの半固定された部分を含むだろう。プローブは、標的核酸の特異的パネルに選定される可変部分も含むだろう。例えば分析工程では、第一のプローブセットは、第一のセット中のそれぞれのプローブが、捕捉プローブアレイ上の多様な捕捉プローブに相補的である第一の固定された部分を有する場合に採用される。それぞれのプローブは、第一のパネル中の所定の標的配列に相補的である標的特異的部分も含む。第二のパネルのためのプローブの第二のセットは、セット中のそれぞれのプローブが同一の第一の固定された部分を含むが、そのパネル中の標的に特異的な第二の標的特異的部分を有する場合に採用される。
【００２９】
図１Ａに関して、標識プローブの部分Ａは、可変部分に相当し、一方、部分Ｂは、アレイ上のプローブに相補的であるだろう固定された部分に相当するだろう。万能または一般的な捕捉アレイ及び捕捉プローブセットの使用は、本発明において使用される消耗品のより効率的な製造及びより低い製造コストを可能にする。
【００３０】
したがってサンプルが多重標的核酸を含んで成る一つの実施形態では、方法は、それぞれ異なる標的核酸に特異的な複数の標識プローブを、標的核酸と共にインキュベートすることを含む。増幅プライマー依存性増幅反応において、標的核酸の少なくとも一部分を増幅することは、複数の標識プローブタイプの開裂をもたらし、そして複数の標識プローブフラグメントタイプの放出をもたらす。複数のプローブフラグメントタイプは、アレイにハイブリダイズする。それぞれ多様なプローブフラグメントタイプは、空間的に別々の捕捉核酸タイプにハイブリダイズする。標識シグナルを検出することは、アレイ上の空間的に別々の捕捉核酸に対応する複数の空間的に別々の領域からの複数の標識シグナルを検出することを含む。場合により、且ついくつかの好適な実施形態では、標識プローブタイプは、同一の標識部分を含んで成るが、追加の多重化、及び／または異なるコントロールもしくは登録プローブの使用は、複数の異なる標識部分を使用することを含み得る。典型的に標識プローブタイプは、標識プローブタイプの数よりも少ない数の異なる部分と共に、１つ以上の異なる標識部分を含み得る。
【００３１】
方法を行うためのデバイス及びシステムは、本発明の特徴である。デバイスまたはシステムは、チャンバーの少なくとも１つの表面上に少なくとも１つの高性能核酸検出アレイを含んで成る検出チャンバーを含み得る。方法についての参照により示されたように、チャンバーは、アレイから検出されるシグナルのシグナルバックグラウンドを減らすように構成されている。デバイスまたはシステムは、典型的に検出チャンバーに動作可能に接続された（operably coupled to the detection chamber）熱調節モジュールを含み、それはデバイスの動作間のチャンバー内部の温度を調節する。光列（optical train）は、デバイスの動作間にアレイで生み出されるシグナルを検出する。
【００３２】
方法についての参照により示されたバックグラウンドを減らすためのチャンバーの全ての次元的な特徴は、場合によりデバイスに適用される。例えばデバイスは、アレイに近位の少なくとも１つの次元において約５００μｍ未満の深さ、例えばアレイに近位の少なくとも１つの次元において約１０μｍ〜約２００μｍの間の深さであり得る。アレイが形成されるチャンバー表面は、任意の適した材料、例えばセラミック、ガラス、石英、またはポリマーから構成され得る。いくつかの実施形態では、例えば落射蛍光を利用するものは、表面が少なくとも部分的に透明であるだろう。
【００３３】
方法について参照により示さるようなアレイ上の捕捉核酸は、典型的にデバイスの動作間に非比率制限の密度で存在する。アレイは、場合により、例えばアレイの空間的に固有の領域に局在化するような複数の捕捉核酸タイプを含む。例えば５個以上の多様な捕捉核酸タイプは、例えば約１００個以上の多様なタイプまでアレイ上に存在し得る。捕捉核酸は、場合によりチャンバーの表面上で熱安定性コーティングにつながれ、アレイの熱循環を促進する。コーティングの例は、場合により：化学反応基、求電子基、ＮＨＳエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα,β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含み得る。
【００３４】
熱調節モジュールは、場合により熱電モジュール、ペルティエ素子、冷却ファン、ヒートシンク、チャンバーの外面の一部分と一緒になるように構成された金属板等の熱循環を促進する特徴を含む。典型的に熱調節モジュールは、モジュールの部分を制御し、またはモジュールの部分であるコンピューターに動作可能に接続された、フィードバックを可能とする制御システムを有する。
【００３５】
光列は、落射蛍光検出システムを含み得るか、または落射蛍光検出システムに動作可能に接続され得る。典型的な光列構成要素は、任意の：励起光源、アークランプ、水銀アークランプ、ＬＥＤ、レンズ、光学フィルター、プリズム、カメラ、光検出器、ＣＭＯＳカメラ、及び／またはＣＣＤアレイを含む。さらにデバイスは、アレイ中のシグナル位置を検出されるべき核酸に関連付ける、アレイ読み取りモジュールを含み得るか、またはかかるアレイ読み取りモジュールにつながれ得る。
【００３６】
デバイスまたはシステムは、例えばコンピューターまたはコンピューター読み取り可能媒体において具現化されるようなシステム指示を含み得るか、またはかかるシステム指示に動作可能に接続され得る。指示は、例えば熱調節モジュールにより行われる１つ以上のシグナル強度及び増幅サイクルの数の測定を、デバイスにより検出される標的核酸の濃度を決定することと関連付けるような、デバイスまたはシステムの任意の態様を制御し得る。
【００３７】
システムは、例えばコンピューターと動作可能に接続されたデバイスを含み得る。コンピューターは、例えば熱調節モジュールにより熱循環を制御する指示、及び／またはいつ画像が取得されたか、もしくは光列により見られたかを特定する指示を含むことができ、並びに／或いは画像情報を機能時間としてシグナル強度曲線に変換し、デバイスにより分析される標的核酸の濃度を決定すること等ができる。コンピューターは、バックグラウンドを説明するためのシグナル強度を正規化するための指示、例えばアレイの１つ以上の領域のローカルバックグラウンドを検出するための指示、及び前記バックグラウンドを補正することによりアレイシグナル強度を正規化するための指示を含み得る。同様にコンピューターは、アレイ捕捉核酸スポッティング、アレイの一様でない異なる領域の視野等における変動性を補正することによりシグナル強度を正規化するための指示を含み得る。
【００３８】
本発明は、１つの態様において、例えば本発明のデバイス及びシステムを使用するための、例えば本発明の方法を実行するための核酸検出消耗品を含む。チャンバーが、窓（window）の内面上に処理された高性能捕捉核酸アレイを有する光学的に透明な窓を含む場合に、消耗品は、例えば約５００μｍ未満の深さの薄いチャンバーを含み得る。消耗品は、例えばチャンバーと流体接続された（fluidly coupled to the chamber）少なくとも１つの試薬送達ポートも含み得る。典型的に消耗品は、チャンバー内部での流体の熱循環を可能にするように構成される。
【００３９】
本発明のデバイス、システム及び方法において、アレイ及びチャンバーについて参照により上記に示された特徴の全ては、消耗品にも同様に適用される（逆もまた同様）。例えば核酸アレイは、複数の多様な捕捉核酸タイプを含むことができ、そのタイプは、アレイの空間的に明白に異なる領域に位置する。捕捉核酸の密度は、例えば約２，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2超、２，５００ｆｍｏｌ／ｃｍ2超、３，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2超、４，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2超、４，５００ｆｍｏｌ／ｃｍ2 超、または５，０００ｆｍｏｌ／ｃｍ2超であり得る。
【００４０】
同様にチャンバーは、例えば頂部及び底部表面が、感圧接着剤材料の形を成す側壁により接合される場合に、試薬送達ポートを含んで成る第一の上側表面（a first upper surface）、及び窓を含んで成る底部透明表面(a bottom transparent surface)を含み得る。チャンバーを形成するために頂部及び底部表面を接合するための他の構造も使用され得る。例えば頂部表面（top surface）及び底部表面(bottom surface)は、ガスケット、或いは上側表面もしくは下側表面（lower surface）、または両側の表面上の外形的特徴により一緒に接合され得る。ガスケットまたは特徴は、場合により上側もしくは下側表面、または両方の対応する領域に融合または結合される。いくつかの実施形態では、ガスケットまたは特徴は、ＵＶ硬化性接着剤の流れに関し、接着剤が、上側及び下側表面の間で流れ、そしてＵＶ光にさらされることにより、上側及び下側表面が接合する。他の実施形態では、上側及び下側表面は、ガスケットまたは特徴と超音波的に一緒に融合され、融合された領域を区切り得る。他の例では、特徴は、上側または下側のいずれかの表面上の透明領域、及び関連した上側または下側表面上の対応する陰影領域である。この実施形態では、上側及び下側表面は、透明領域を通して、及び陰影領域上にレーザーを向けられることにより一緒にレーザー溶接され得る。
【００４１】
捕捉核酸アレイは、典型的に窓上の熱安定性コーティングにつながれる。例えば、コーティングは、化学反応基、求電子基、ＮＨＳエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα，β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含み得る。窓自体は、例えばガラス、石英、セラミック、ポリマー、または他の透明な材料を含み得る。
【００４２】
方法、システム及びデバイスに関して上記に示された特徴の全ては、消耗品におけるチャンバーの構成に関して適用される。例えばチャンバーは、約１０μｍ〜約２００μｍの間の深さ、例えば約１４０μｍの深さであり得る。チャンバーは、他の次元において有意に広く、例えば約１ｍｍ〜約５０ｍｍの間の平均直径であり得る。１つの特定の実施形態では、チャンバーは、約１０ｍｍ〜約２０ｍｍの間の平均直径である。
【００４３】
本発明は、例えば本発明の消耗品を含んで成るキットを含む。キットは、包装材料、方法を実行するための指示、コントロール試薬（例えば消耗品のアレイ上のコントロール部位と結合するような例えばコントロール鋳型、プローブ、またはプライマー）も含み得る。
【００４４】
方法、システム、デバイス、消耗品及びキットは、例えば本発明のシステムまたはデバイスにおいて使用するための消耗品を提供するキットとの組み合わせにおいて、例えば本発明の方法を実行するために使用され得る。特に断りのない限り、方法のステップは、場合によりシステム、デバイス、消耗品またはキットにおいて対応する構造的特徴を有し、そして逆もまた同様である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、本発明のＰＣＲプローブの図式の説明である。
【図２】図２は、本発明のＰＣＲチャンバーの概略図である。
【図３】図３は、３つのステップの増幅反応のコピー数滴定に関するアレイに基づくリアルタイムＰＣＲ曲線を示すグラフである。
【図４】図４は、溶液のアリコートから作り出される溶液に基づくリアルタイムＰＣＲ曲線を示すグラフである。
【図５】図５は、未消光プローブにより作り出されるアレイに基づくリアルタイムＰＣＲ曲線を示すグラフである。
【図６】図６は、多重化増幅に関するリアルタイムＰＣＲ曲線を示すグラフである。
【図７】図７は、標的を添加しない１０多重（１０−ｐｌｅｘ）反応に関するアレイに基づくリアルタイムＰＣＲ曲線を示すグラフである。
【図８】図８は、１０多重（１０−ｐｌｅｘ）パネル及びそれぞれ１０4コピーで存在する３個の標的によるアレイに基づくリアルタイムＰＣＲ曲線を示すグラフである。
【図９】図９は、５’フラップ模倣体のハイブリダイゼーションのリアルタイム反応速度論を示すグラフである。
【図１０】図１０は、方法の概略図である。
【図１１】図１１は、図式のシステム説明である。
【図１２】図１２は、２つのステップの増幅反応のコピー数滴定に関するアレイに基づくリアルタイムＰＲ曲線を示すグラフである。
【図１３】図１３は、シグナル対バックグラウンド比率に対する反応チャンバー厚の関連を示すプロットである。
【図１４】図１４は、本発明の可動式基板実施形態に関する全体の検出システムの図式の説明である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
標的核酸の増幅、検出、及びリアルタイム定量化を行うための方法は、本発明の特徴である。方法における標的核酸の増幅は、アレイにハイブリダイズする標的特異的標識プローブフラグメントを放出し；アレイは、増幅が起こるチャンバー中に分散する。シグナルは、アレイから検出され、標的核酸の検出及びリアルタイム定量化の両方を提供する。
【００４７】
本発明は、典型的に、チャンバー中に核酸検出アレイを含んで成る消耗品としてフォーマットされた反応チャンバー、並びに消耗品と相互に作用するデバイス及びシステムも提供する。
【００４８】
方法
本発明は、サンプル中の１つ以上の標的核酸を、リアルタイムで検出及び定量化するための方法を提供する。方法は、多重化に非常に適し、入手可能な溶液に基づくリアルタイム核酸検出方法を用いて達成され得るものよりも多くの数の多様な標的核酸の特異的検出及び定量化を、１つのチャンバー反応及び検出を用いて可能にする。これは、本発明が、液相スペクトル検出よりもむしろ、（検体と接触するアレイを用いる、）アレイに基づく検体の検出を利用するからである。核酸検出アレイは、例えば溶液中の異なる染料標識の識別と比較して、アレイ位置識別を介する有意により大きな検体分解能を有する。比較として、何千もの異なる検体を同時検出するアレイを構成することは可能であるが、溶液中の約６個以上の異なる標識蛍光色素分子を検出することは、典型的に可能ではない。
【００４９】
図１０は、方法の部分的な概観を提供する。示されているように、プライマーは、標識プローブとともに鋳型にハイブリダイズする。プローブは、標識部分と結合された鋳型（“フラップ”）に相補的でない直交配列を含んで成る。プローブは、増幅反応（例えばＰＣＲ増幅サイクル）の間に開裂する。１つの都合のよい手法では、天然のポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を使用して、フラップを開裂する。この手法では、ポリメラーゼによるプライマー伸長は、それがフラップと鋳型間の接合に遭遇するとポリメラーゼのヌクレアーゼ作用によりフラップの開裂をもたらす。これは、その後に例えば特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件に温度を調節することによりアレイにハイブリダイズする標識プローブフラグメントとしてのフラップを放出する。アレイ上の標識の検出は、リアルタイムでの鋳型の検出及び定量化を提供する。
【００５０】
一般に、１つ以上の標的核酸の存在（または不存在）を試験されるサンプルは、増幅反応にかけられる。反応は、単一のチャンバー中で容易に多重化され、約１０〜約１００個以上の異なる核酸を増幅、検出、及び定量化し得る。例えば約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００個以上の核酸は、単一の増幅／検出チャンバー中で検出され得る。反応／検出チャンバーにおける１０個の異なる標的核酸の同時増幅、検出及び定量化を実証する本明細書における実施例は、後に示されている。本実施例、及び本明細書における方法の能力は、典型的なスペクトル的に制限された、溶液に基づく多重検出の能力をしのぐ。
【００５１】
本方法において検出されるべきそれぞれの標的核酸は、少なくとも１個の、そして一般的には２個の増幅プライマー（２個のプライマーの使用は、単一のプライマーと比較して、反応に特異性を加え、且つ産物形成を加速させる）を用いて特異的に増幅される。プライマーは、典型的にサンプル中の標的核酸に特異的にハイブリダイズし、そして例えば標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ポリメラーゼを用いて伸長される。注目の標的核酸を増幅するために使用され得る増幅プライマーの設計及び構造は、公知の方法に従う。ＰＣＲプライマー設計に関する詳細については、例えば後に示されている参考文献、及びＡｎｔｏｎ Ｙｕｒｙｅｖ（編）（２００７）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）［Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ］Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−1０：１５８８２９７２５Ｘ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１５８８２９７２５９を参照のこと。
【００５２】
標的鋳型核酸上でプライマーを用いるＰＣＲ増幅は、標準的な増幅緩衝剤、酵素、温度、及びサイクル時間の使用を含む適切な反応条件を用いて行われ得る。ハイブリダイゼーション条件、緩衝剤、試薬、反応サイクル時間等を含むＰＣＲ技術の説明については、例えばＹｕｒｙｅｖ（上記）、ｖａｎ Ｐｅｌｔ−Ｖｅｒｋｕｉｌ等（２０１０）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編ＩＳＢＮ−１０：９０４８１７５７９８、ＩＳＢＮ−１３：９７８〜９０４８１７５７９６；Ｂｕｓｔｉｎ（編）（２００９）Ｔｈｅ ＰＣＲ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖeｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０：０５２１８８２３１１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０５２１８８２３１６；Ｖｉｌｊｏｅｎ等（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＩＳＢＮ １４０２０３４０３２；Ｋａｕｆｍａｎ等（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第２編 Ｃｅｓｋｅ（編）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（Ｋａｕｆｍａｎ）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｒａｌｐｈ Ｒａｐｌｅｙ（編）（２０００）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）；Ｃｈｅｎ等（編）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第二編（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９２巻）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ等編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ.Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）を参照する。リアルタイムに基づくＰＣＲ方法に適用可能な増幅条件、プライマー設計、及び他の詳細は、例えばＬｏｇａｎ等（編）（２００９）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第１編ＩＳＢＮ−１０：１９０４４５５３９５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１９０４４５５３９４、及びＭ Ｔｅｖｆｉｋ Ｄｏｒａｋ（編）（２００６）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（改良方法）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、第１編ＩＳＢＮ−１０：０４１５３７７３４Ｘ ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４１５３７７３４８を参照のこと。
【００５３】
サンプル中のそれぞれの標的核酸に特異的な標識プローブは、増幅プライマーとともに標的核酸にハイブリダイズする。増幅反応は、鋳型にハイブリダイズした標識プローブを開裂し、標識プローブフラグメントを放出する。その後に本標識フラグメントは、図１０に示されているように、反応チャンバー中のアレイにハイブリダイズする。
【００５４】
図１Ａは、本発明の方法において有用なプローブを概略的に示す。プローブは、標的核酸に相補的である領域Ａを含んで成る。プローブは、標的核酸に相補的でない「フラップ（flap）」Ｂをさらに含んで成る。標識Ｅは、フラップＢに結合する。標識Ｅは、末端の位置に示されているが、標識は、実際にはフラップＢに沿って任意の点でフォーマットされ得る。例えば任意の多様なヌクレオチドは標識され、そして標準または軽度に修飾された核酸合成プロトコルにおいて使用され、プローブ上の任意の所望される部分で標識を提供し得る。
【００５５】
図１Ａにおける標識クエンチャーＤを含んで成る任意の領域Ｃは、フラップＢの部分に相補的である。適切な溶液条件下で、領域Ｃの塩基は、フラップＢと対になり、標識Ｅ及びクエンチャーＤを近づけることにより、標識Ｅを消光させる。これは、反応／検出チャンバー中の液相のシグナルバックグラウンドを減らすが、プローブクエンチャーは、本発明の実行に要求されない。本発明の一つの驚くべき態様は、アレイに近位の溶液中に未消光プローブが存在している場合でも、アレイに結合したプローブフラグメントを特異的に検出することが可能であることである。本実施形態の実施例は、本明細書中に記載されている。一般に液相バックグラウンドを減らすために構成される反応／検出チャンバーにおける高性能アレイの使用は、本発明の方法、消耗品、デバイス及びシステムにおける溶液中のシグナルバックグラウンドからのアレイでのシグナルの識別を可能にする。
【００５６】
アレイの構造に応じて、種々の異なる標識基は、標識プローブを標識化するために使用され得る。上記のように、かかる標識は、典型的に個々の蛍光色素分子または相互作用的な染料対または基、例えばＦＲＥＴ対を含み得る蛍光標識基、並びに供与体／クエンチャー対を含む。核酸プローブを標識化するために適する広範囲の異なる蛍光標識基は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１編（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,Ｉｎｃ.）において記載される。
【００５７】
本明細書における多くの検討はＰＣＲに基づく増幅に関するが、他の増幅反応も代用され得る。例えば切断可能な結合の開裂（例えば米国特許第５，０１１，７６９号；米国特許第５，６６０，９８８号；米国特許第５，４０３，７１１号；米国特許第６，２５１，６００号を参照)、及び分岐核酸構造（米国特許第７，３６１，４６７号；米国特許第５，４２２，２５３号；米国特許第７，１２２，３６４号；米国特許第６，６９２，９１７号）を含むもの等の増幅反応と対になる開裂反応を伴う多酵素系が使用され得る。ＴａｑＭａｎにつながれたヘリカーゼ依存性増幅のような開裂（Ｔｏｎｇ,Ｙ等、２００８ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４５：５４３〜５５７）もまた使用され得る。核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、またはリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）が使用され得る。ＮＡＳＢＡに基づく手法では、プローブは、ＰＣＲにおけるように、増幅プライマーとともに鋳型にハイブリダイズし得る。プローブは、逆転写酵素、または添加されたエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ作用により開裂し、ＰＣＲにおけるポリメラーゼによる放出と類似の方法においてプローブフラグメントを放出し得る。ＮＡＳＢＡの１つの潜在的な利点は、熱循環が必要とされないことである。これは、デバイス及びシステム全体の要求を単純化する。ＮＡＳＢＡの識別については、例えばＣｏｍｐｔｏｎ（１９９１）、“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１〜２を参照のこと。病原性核酸を検出するためのＮＡＳＢＡの使用については、例えばＫｅｉｇｈｔｌｅｙ等（２００５） “Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＮＡＳＢＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（４）：６０２〜８を参照のこと。ＬＣＲ−スタイル反応が使用される場合、プローブは、増幅酵素のヌクレアーゼ活性に頼ることよりもむしろエンドヌクレアーゼを用いて開裂され得る。
【００５８】
本明細書における方法では、チャンバーの少なくとも１つの内面上に、少なくとも１つの高性能核酸検出アレイを有する検出チャンバーが提供される。高性能アレイは、典型的にチャンバーにおける増幅反応により生み出されるプローブフラグメントの効率的な捕捉を可能にする、非比率制限数の捕捉核酸を有する。捕捉核酸は、比較的に小さなプローブ核酸を捕捉するように構成され、それはさらにアレイ効率も上昇させる。チャンバーは、例えばバックグラウンドを減らすようにチャンバーを成形することにより、アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される。例えばバックグラウンドは、アレイに近位（例えば上方または下方）のチャンバー厚（浅い）を作ることにより減らされ；例えば１ｍｍ以上の深さのチャンバーでの検出は可能であるが、典型的にチャンバーは、アレイ上方または下方で約５００μｍ以下の浅さである。反応チャンバー及びアレイに関するさらなる詳細は、本方法において有用な消耗品についての後述の参照により記載されている。
【００５９】
アレイにより捕捉されるシグナルは検出され、そしてシグナル強度が測定される。シグナル強度は、サンプル中の標的核酸の存在及び／または量に相関する。典型的にサンプルは、増幅により放出されるプローブフラグメントの数を増やすことによりシグナルのレベルを増やすために、最初の検出前に２回以上のサイクルで増幅される。例えば標的核酸は、アレイからのシグナルの検出に先立ち、場合により少なくとも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の増幅サイクルで増幅され得る。
【００６０】
１つの典型的な実施形態では、蛍光または他の光学画像は、増幅反応の間に、選定された時間、温度、及び増幅サイクル間隔でアレイから捕捉される。これらの画像は、サンプル中に標的核酸が存在するか否かを決定するために、そしてサンプル中の出発標的核酸濃度の定量化を提供するために分析される。画像は、中間グレイ強度測定、バックグラウンド補正及びベースライン修正の組み合わせを用いて分析される。バックグラウンドは、アレイ上のそれぞれのスポットについて局所的に測定され得る。バックグラウンドは、注目のアレイ領域（例えばアレイスポット）を取り囲む溶液の同心環の画像強度を測定することにより計算される。それぞれの領域からのシグナルは、その後に領域中の局所バックグラウンドを説明するために補正される。補正されたそれぞれの領域からのシグナルは、スポッティングにおける変動性、及び視野における一様でない照明を説明するために、さらに正規化され得る。最初のいくつかのサイクル、典型的に５〜１５サイクルから得られた補正された強度測定の平均値は、ベースラインを調整するために、及びそれぞれの領域からの測定を正規化するために使用される。
【００６１】
増幅後のシグナル強度測定に基づく核酸を定量化するための方法に関するさらなる詳細は、例えば本段落より前に示されている参考文献、並びにＪａｎｇ  Ｂ．Ｒａｍｐａｌ（編）（２０１０）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：第２巻、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第２編ＩＳＢＮ−１０：１６１７３７８５２６、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１６１７３７８５２２；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ. Ｂｕｓｔｉｎ（編）（２００４）Ａ−Ｚ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＩＵＬ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏ.５）（ＩＵＬ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌｉｎｅ；第１編ＩＳＢＮ−１０：０９６３６８１７８８、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０９６３６８１７８２；及びＫａｍｂｅｒｏｖａ及びＳｈａｈ（２００２）ＤＮＡ Ａｒｒａｙ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ（Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ ｓｅｒｉｅｓ）ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ；第２編ＩＳＢＮ−１０：０９６６４０２７５８、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０９６６４０２７５９において見出され得る。
【００６２】
代替的な構成において、捕捉プローブは、静的基板よりもむしろビーズ、樹脂、粒子等（本明細書において、一般に「ビーズ」と交換可能に呼ばれる）等の可動式基板に場合により結合され得る。例えば、本明細書の他の箇所で示されるように、平面基板は、標的核酸配列、またはサンプル材料内部の配列の増幅の間に生み出される開裂プローブフラグメントとハイブリダイズするであろう、配置された捕捉プローブを提供するために使用され得る。所定の標的核酸配列の存在は、プローブフラグメントがハイブリダイズするアレイ上のプローブ位置を捕捉する検出により検出される。それぞれのプローブフラグメントが特定の標的配列に特異的であるので、プローブフラグメントが存在するならば、標的は存在し、そして増幅されることを示す。可動式相基板では、所定の分析においてそれぞれ異なる捕捉プローブタイプは、さらに特有の標識を担持する異なる可動式基板につながれる。その後に可動式基板は、ビーズ、及び含蓄的に捕捉プローブ、並びに標識プローブフラグメントが存在するか否かを同定するために、検出チャネルを通過する。所定のビーズ上で、特定の捕捉プローブに対応する標識プローブが検出されれば、それは、プローブフラグメント（及び相補的捕捉プローブ）に関連する標識配列がサンプル中に存在し、そして増幅されたことを示す。本発明の本態様は、エンドポイント検出において、例えば全ての増幅反応の完了後に行われ得るが、例えば１回以上の増幅サイクル後に増幅混合物からビーズのフラクションを吸い上げ、そしてビーズからの標識プローブフラグメントシグナル強度を測定すること等の定量分析においても行われ得る。
【００６３】
所定のビーズ上の捕捉標識プローブフラグメントの濃度は、反応混合物からのビーズの分離が必要とされないように、検出チャネルにおいて十分に高いシグナル対バックグラウンド比率を提供するだろう。さらにアレイに基づく基板によるような、無傷のプローブ及び／または任意の消光基において二次構造を含むことは、溶液中であっても、または意図されていない可動式基板への結合からでも、プローブフラグメントと無傷のプローブ間のバックグラウンドシグナルを区別するより大きな能力を可能にする。いくつかの場合では、天然の無傷のプローブの二次構造は、可動式基板上の捕捉プローブとの結合において立体障害を生じさせ、いくつかの場合では、無傷のプローブがビーズに結合するという少なくなった可能性をもたらすることも予測されるだろう。 
【００６４】
多様な異なるビーズタイプは、本発明の本態様と組み合わせて使用され得る。例えばポリスチレン、セルロース、アクリル、ビニル、シリカ、常磁性もしくは他の無機粒子、または任意の多様な他のビーズタイプが使用され得る。上記の通りビーズは、典型的に特有の標識サインにより別個に標識される。さらに、多様な異なる標識タイプは、有機蛍光標識、無機蛍光標識（例えば量子ドット）、発光標識、電気化学標識等を含めて使用され得る。かかる標識は、広く商業的に入手可能であり、且つ適切に活性化されたビーズに容易に結合するように構成される。蛍光標識基の場合では、広いスペクトルの励起放射、例えば多重レーザーの使用を必要とせずに広域の特有な標識特徴を提供するように、多くの数の標識サインは、２、３、４個以上のスペクトル的には固有の蛍光標識基の異なる組み合わせ、及びそれぞれの標識の異なるレベルを提供することにより提供され得る。
【００６５】
方法は、典型的に本明細書におけるデバイス、システム、消耗品及びキットを用いて行われる。デバイス、システム及び消耗品の全ての特徴は、本明細書における方法を実行するために提供され、そして本明細書における方法は、デバイス、システム、消耗品及びキットとの組み合わせにおいて実行され得る。
【００６６】
消耗品
本発明のワンポット反応チャンバーは、シグナルバックグラウンドを減らすように構成される。高性能アレイは、チャンバーの少なくとも１つの内面上に形成される。アレイは、典型的に本方法の増幅及びアレイハイブリダイゼーションステップの両方の間、増幅反応物及び産物と接触している。これは、使用者が１つ以上の増幅反応サイクルを行い、リアルタイムでアレイからのシグナルを監視することにより結果物を検出し、そしてその後に１つ以上の追加の増幅サイクルを行い、さらにその後に検出を行うことを可能にする。したがってアレイからのシグナル強度は、注目の核酸をリアルタイムで検出及び定量化するために使用され得る。
【００６７】
本発明の消耗品は、チャンバーの内面上にチャンバー及び高性能アレイを含む。チャンバーは、典型的に薄く（浅く）、例えば約１ｍｍ未満の深さである。一般により薄いチャンバー、アレイ上方のより少ない溶液は、溶液中の標識プローブまたはプローブフラグメントからのシグナルバックグラウンドを減らす。典型的な所望されるチャンバーの深さは、約１μｍ〜約５００μｍの範囲にある。消耗品の組み立て易さのために、チャンバーは、しばしばアレイ上方に約１０μｍ〜約２５０μｍの深さ、例えば約１００μｍ〜約１５０μｍの深さの範囲にある。チャンバーは、例えば手動または自動分注器によるサンプルの送達のための試薬送達ポートを有する表面を含み得る。
【００６８】
図２は、実施例の消耗品の引き伸ばし概略図を提供する。本実施例では、底部表面層１及び上側表面層２は、中間層２により接合される。カットアウト（cutout）４は、層１，２、及び３の集合体上にチャンバーを形成する。ポート５は、集合体上のチャンバーに緩衝剤及び試薬を送達するための都合のよい通路を形成する。高性能アレイは、カットアウトの頂部または底部表面を形成する領域中の頂部または底部層において形成され得る。１つの都合のよい実施形態では、アレイに結合した標識の検出のために落射蛍光検出が使用される場合、アレイは、本発明のデバイス及びシステムにおいて下側表面の下方に置かれた検出光により見られるように構成されている消耗品と共に、下側表面上に組み立てられる。一般に頂部または底部表面のいずれか（または両方）は、窓を含め、その窓を通して検出光がアレイを見ることができるだろう。
【００６９】
中間層３は、使用される消耗品の組み立て方法に応じて、任意の多様な形態をとり得る。１つの都合のよい実施形態では、頂部及び底部表面１及び２は、感圧接着剤材料の形を成す層３により接合される。感圧接着剤の層（例えばテープ）は周知であり、且つ広く入手可能である。例えばＢｅｎｅｄｅｋ及びＦｅｌｄｓｔｅｉｎ（編）（２００８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：第１巻:Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、第２巻:Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第３巻:Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０:１４２００５９３４３、ＩＳＢＮ−１３:９７８−１４２００５９３４２を参照のこと。
【００７０】
チャンバーを形成するために頂部及び底部表面を接合するための他の組み立て方法も使用され得る。例えば頂部及び底部表面は、ガスケット、或いは上側もしくは下側表面、または両表面上の外形的特徴により一緒になって接合され得る。ガスケットまたは特徴は、場合により上側または下側表面の対応する領域に融合または接着される。ケイ素及びポリマーチップの加工方法は、頂部または底部表面における特徴を形成するために適用され得る。マイクロ−特徴加工を含む加工方法を特徴付けるための紹介については、例えばＦｒａｎｓｓｉｌａ（２０１０）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｉｃｒｏ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ；第２編ＩＳＢＮ−１０：０４７０７４９８３０、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７０７４９８３８；Ｓｈｅｎ及びＬｉｎ（２００９）“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｄ ｉｎｓｅｒｔ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ” Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ,Ｉｎｃ. 第４９巻、第１版、１０４（１１）頁；Ａｂｇｒａｌｌ（２００９）Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ＩＳＢＮ−１０：１５９６９３３５０Ｘ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１５９６９３３５０７；Ｋａａｊａｋａｒｉ（２００９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＭＥＭＳ：Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ａｃｃｅｌｅｒｏｍｅｔｅｒｓ、ｇｙｒｏｓｃｏｐｅｓ、ＲＦ ＭＥＭＳ、ｏｐｔｉｃａｌ ＭＥＭＳ、ａｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｍａｌｌ Ｇｅａｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＩＳＢＮ−１０：０９８２２９９１０９、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０９８２２９９１０４；Ｓａｌｉｔｅｒｍａｎ（２００６）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ ＢｉｏＭＥＭＳ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ＳＰＩＥ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＩＳＢＮ−１０：０８１９４５９７７１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８１９４５９７７０；Ｍａｄｏｕ（２００２）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ、第２編ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ−１０：０８４９３０８２６７、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８４９３０８２６０を参照のこと。これらの加工方法は、頂部または底部表面上に所望される本質的に任意の特徴を形成し、中間層の必要性を排除するために使用され得る。例えばくぼみは、頂部または底部表面（または両表面）において形成されてよく、且つ２つの層が接合することによりチャンバーが形成される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ガスケットまたは特徴は、ＵＶまたは放射線硬化性接着剤（radiation curable adhisive）の流れを導く。本接着剤は、上側または下側表面の間で流れ、そしてＵＶ光または放射線（例えば電子ビーム、または「ＥＢ」放射線）に曝されることにより上側及び下側表面を接合する。ＵＶ及び放射線硬化性接着剤を含む入手可能な接着剤の記載については、例えばＥｂｎｅｓａｊｊａｄ（２０１０）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｗｉｌｌｉａｍ Ａｎｄｒｅｗ；第１編ＩＳＢＮ−１０：１４３７７４４６１３、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１４３７７４４６１３；Ｄｒｏｂｎｙ（２０１０）Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、第２編ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；第２編ＩＳＢＮ−１０：１４２００９４０４１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１４２００９４０４６を参照。
【００７２】
他の実施形態では、上側及び下側表面は、ガスケット、或いは融合した領域とチャンバーまたは消耗品において生み出される他の構造的な特徴を区切る表面特徴と一緒になって、超音波的に融合され得る。超音波溶接、及び材料を融合するのに有用な関連技術は、例えばＡｓｔａｓｈｅｖ及びＢａｂｉｔｓｋｙ（２０１０）Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅｓ：Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編ＩＳＢＮ−１０：３６４２０９１２４５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３６４２０９１２４７；及びＬｅａｖｅｒｓｕｃｈ（２００２）“Ｈｏｗ ｔｏ ｕｓｅ ｔｈｏｓｅ ｆａｎｃｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗｅｌｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｓ”、 Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４８（１０）：７０〜７６において教示されている。
【００７３】
他の例では、特徴は、上側または下側表面のいずれかにおける透明領域、及び関連した上側または下側表面における対応の陰影領域である。本実施形態では、上側及び下側表面は、レーザー光が透明領域を通過し、そして陰影領域上に向かうことにより、一緒に溶接され得る。レーザー溶接方法は、例えばＳｔｅｅｎ等（２０１０）Ｌａｓｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第４編ＩＳＢＮ−１０：１８４９９６０６１５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１８４９９６０６１８；Ｋａｎｎａｔｅｙ−Ａｓｉｂｕ（２００９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｓｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）Ｗｉｌｅｙ ＩＳＢＮ−１０：０４７０１７７９８５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７０１７７９８３；及びＤｕｌｅｙ（１９９８）Ｌａｓｅｒ Ｗｅｌｄｉｎｇ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ ＩＳＢＮ−１０：０４７１２４６７９４、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７１２４６７９４において教示されている。
【００７４】
捕捉核酸アレイは、典型的に窓上で熱安定性コーティングにつながれる。窓自体は、例えばガラス、石英、セラミック、ポリマーまたは他の透明な材料を含み得る。窓をコーティングするのに適する多様なコーティングは、入手可能である。一般にコーティングは、（例えばアレイが結合したチャンバー表面が、ガラスであるか、またはポリマーであるかに関わらず）アレイ基板との互換性、アレイ膜を結合するのに適した反応基を含むための誘導化能力または処理能力、及び工程条件（例えば熱安定性、光安定性等）との互換性に基づき選定される。例えばコーティングは、化学反応基、求電子基、ＮＨＳエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα，β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含み得る。生体分子を表面に結合させる際の表面コーティング及びそれらの用途の記載については、例えばＰｌａｃｋｅｔｔ（編）（２０１１）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｆｉｌｍｓ ａｎｄ Ｃｏａｔｉｎｇｓ Ｗｉｌｅｙ ＩＳＢＮ−１０：０４７０６８３４１４、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７０６８３４１５；Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（編）（２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０：１６１７３７３５４０、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１６１７３７３５４１；Ｌａｈａｎｎ（編）（２００９）Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗｉｌｅｙ ＩＳＢＮ−１０：０４７０６９９７０１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７０６９９７０６；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２編Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；第２編ＩＳＢＮ−１０：０１２３７０５０１０、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１２３７０５０１３.Ｗｕｔｓ及びＧｒｅｅｎｅ（２００６）Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；第４編ＩＳＢＮ−１０：０４７１６９７５４０、♯ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７１６９７５４１；Ｗｉｔｔｍａｎｎ（編）（２００６）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ ＣｈｉｐｓII（Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編ＩＳＢＮ−１０：３５４０２８４３６２、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０２８４３６９；Ｌｉｃａｒｉ（２００３）Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ、Ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｍａ��ｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）Ｗｉｌｌｉａｍ Ａｎｄｒｅｗ ＩＳＢＮ−１０：０８１５５１４９２１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８１５５１４９２３；Ｃｏｎｋ（２００２）Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ Ａｒｒａｙｓ Ｓｔｏｒｍｉｎｇ Ｍｅｄｉａ ＩＳＢＮ−１０：１４２３５０９６４１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１４２３５０９６４６、並びにＯｉｌ及びＣｏｌｏｕｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９３）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｏａｔｉｎｇｓ−Ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓａｇｅ.第３編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第３編ＩＳＢＮ−１０：０４１２５５２１０８、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４１２５５２１０６を参照のこと。
【００７５】
核酸アレイを作るための方法は利用可能であり、且つ内側のチャンバー表面上にアレイを形成することにより本発明に適用され得る。内側のチャンバー表面上にアレイを形成するために使用され得る核酸マイクロアレイを形成するための技術は、例えばＲａｍｐａｌ（編）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：第Ｉ巻：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第２編ＩＳＢＮ−１０：１６１７３７６６３９、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１６１７３７６６３４；Ｍｕｌｌｅｒ及びＮｉｃｏｌａｕ（編）（２０１０）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編.ＩＳＢＮ−１０：３６４２０６１８２６、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３６４２０６１８２０；Ｘｉｎｇ及びＣｈｅｎｇ（編）（２０１０）Ｂｉｏｃｈｉｐｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編.ＩＳＢＮ−１０：３６４２０５５８５０、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３６４２０５５８５０；Ｄｉｌｌ等（編）（２０１０）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＩＳＢＮ−１０：１４４１９２４９０６、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１４４１９２４９０２；Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ（２０１０）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ Ｃｈｉｐｓ II（Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編ＩＳＢＮ−１０：３６４２０６６６６６、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３６４２０６６６６５；Ｒａｍｐａｌ（２０１０）ＤＮＡ Ａｒｒａｙｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０：１６１７３７２０４８、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１６１７３７２０４９；Ｓｃｈｅｎａ（著、編）（２００７）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ）Ｓｃｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；第１編、ＩＳＢＮ−１０：１９０４８４２１５１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１９０４８４２１５６；Ａｐｐａｓａｎｉ（編）（２００７）Ｂｉｏａｒｒａｙｓ：Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃｓ ｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０：１５８８２９４７６５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１５８８２９４７６０；及びＵｌｒｉｋｅ Ｎｕｂｅｒ（編）（２００７）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（改良法）Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ ＩＳＢＮ−１０：０４１５３５８６６３、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４１５３５８６６８において記載される。アレイを形成するために表面にＤＮＡを結合させる技術は、化学反応性の表面またはコーティング、光に関連する合成、ＤＮＡプリンティング技術、及び当業界において多くの他の利用可能な方法を使用する、任意の多様なスポッティング方法を含み得る。
【００７６】
アレイ密度を定量化するための方法は、上記の参照において、及びＧｏｎｇ等（２００６）“Ｍｕｌｔｉ−ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ａｍｉｎｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｌｉｄｅｓ”Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.７８：２３４２−２３５１において提供される。
【００７７】
消耗品は、キットを形成するために容器、または容器材料中に包装され得る。キットは、さらに消耗品を使用するのに有用な構成要素、例えばコントロール試薬（例えばコントロール鋳型、コントロールプローブ、コントロールプライマー等）、緩衝剤等も含み得る。
【００７８】
デバイス及びシステム
本発明の消耗品を使用する、及び／または本発明の方法を実行するデバイス及びシステムは、同様に本発明の特徴である。デバイスまたはシステムは、消耗品の特徴、例えば（消耗品としてフォーマットされているか、またはデバイスの専用部分としてフォーマットされているかどうかに関わらず）反応チャンバー及びアレイを含み得る。最も典型的には、デバイスは、典型的にアレイを監視するための検出光、チャンバーを熱循環させるためのモジュール、及び熱循環を制御し、そして後シグナルを処理するシステム指示を有するコンピューターとともに、レシーバー、例えば上記の消耗品を搭載する載物台を有するだろう。
【００７９】
図式のシステムの例は、図１１において説明されている。示されているように、消耗品１０は、載物台２０の上に搭載される。環境制御モジュール（ＥＣＭ）３０（例えばペルティエ素子、冷却ファン等を含んで成る）は、環境制御（例えば熱循環の温度）を提供する。照明光は、光源４０（例えばランプ、アークランプ、ＬＥＤ、レーザー等）により提供される。光列５０は、照明光源４０から消耗品１０へ光を向ける。消耗品１０からのシグナルは、光列により検出され、そしてシグナル情報は、コンピューター６０に送られる。コンピューター６０は、場合によりＥＣＭ３０も制御する。シグナル情報は、コンピューター６０により処理され、そして使用者が見ることができるディスプレイ７０、またはプリンター、或いは両方に出力され得る。ＥＣＭ３０は、消耗品１０の上方か下方に搭載され、そして追加の視覚光８０（載物台２０の上方か下方に設置される）を含み得る。
【００８０】
載物台／レシーバーは、熱循環及び分析の間に消耗品を搭載するように構成される。載物台は、アラインメントアーム、戻り止め、穴、くぎ等の消耗品の対応する特徴と一緒になる登録及びアラインメント特徴を含み得る。載物台は、例えば消耗品が載物台に直接載せられる場合などの多くの実施形態において必要とされないが、消耗品を受け止め、そして正しい位置に置くカセットを含むことができ、他のデバイス要素と動作可能に接続されてそれは設置され得る。デバイス要素は、消耗品と共に動作するように構成され、そして緩衝剤及び試薬を消耗品に送達するための流体送達システム、熱循環もしくは他の温度制御、または環境制御モジュール、検出光等を含み得る。チャンバーが消耗品中に導入されるよりもむしろデバイス中に組み立てられる場合の実施形態では、デバイス要素は、典型的にチャンバー上で、またはチャンバー近位で動作するように構成される。
【００８１】
消耗品への流体送達は、デバイスもしくはシステムにより行われ得るか、またはデバイスもしくはシステム中への消耗品の充填に先立ち行われ得る。流体取扱い要素は、デバイスもしくはシステム中に統合され得るか、または別々のデバイスもしくはシステムから独立した処理位置にフォーマットされ得る。流体取扱い要素は、試薬もしくは緩衝剤を消耗品中のポートに送達する分注器（手動または自動）を含み得るか、またはキャピラリー、微細加工デバイスチャネル等を含み得る。消耗品を充填するために使用され得る手動及び自動分注器及び分注器システムは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（アメリカ）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ドイツ）、Ｌａｂｔｒｏｎｉｃｓ（カナダ）及びその他の多くを含む多様な入手源から得られる。一般的に言えば、多様な流体取扱いシステムは入手可能であり、且つ本発明のデバイス及びシステムに組み込まれ得る。例えばＫｉｒｂｙ（２０１０）Ｍｉｃｒｏ−ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＩＳＢＮ−１０：０５２１１１９０３０、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０５２１１１９０３０；Ｂｒｕｕｓ（２００７）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃｓ）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ ＩＳＢＮ−１０：０１９９２３５０９０、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１９９２３５０９４；Ｎｇｕｙｅｎ（２００６）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、第２編（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ） ＩＳＢＮ−１０：１５８０５３９７２６、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１５８０５３９７２２；Ｗｅｌｌｓ（２００３） Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；第１編ＩＳＢＮ−１０：０４４４５１０２９Ｘ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４４４５１０２９７を参照する。消耗品は、場合により送達システムと一緒になるように構成されるポート、例えばピペットまたはキャピラリー送達デバイスによる充填に適した寸法のポートを含んで成る。
【００８２】
ＥＣＭまたは熱調節モジュールは、熱電モジュール、ペルティエ素子、冷却ファン、ヒートシンク、チャンバーの外面の一部分と一緒になるように構成された金属板、流体槽等の熱循環を促進する特徴を含み得る。多くのかかる熱調節構成要素は、本発明のデバイス及びシステムへの導入のために入手可能である。例えばＫｅｎｎｅｄｙ及びＯｓｗａｌｄ（編）（２０１１）ＰＣＲ Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ−１０：１９０４４５５７２７；ＩＳＢＮ−１３：９７８−１９０４４５５７２１；Ｂｕｓｔｉｎ（２００９） Ｔｈｅ ＰＣＲ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０：０５２１８８２３１１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０５２１８８２３１６；Ｗｉｔｔｗｅｒ等（編）（２００４） Ｒａｐｉｄ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編、ＩＳＢＮ−１０：３５４０２０６２９９、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０２０６２９３；Ｇｏｌｄｓｍｉｄ（２００９）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；第１編、ＩＳＢＮ−１０：３６４２００７１５５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３６４２００７１５６；Ｒｏｗｅ（編）（２００５） Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｍａｃｒｏ ｔｏ Ｎａｎｏ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；第１編、ＩＳＢＮ−１０：０８４９３２２６４２、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８４９３２２６４８を参照する。熱調節モジュールは、例えば消耗品を受け止めるカセット中でフォーマットされ得るか、または消耗品に近位で動作可能に載物台に載せられ得る。
【００８３】
典型的にＥＣＭまたは熱調節モジュールは、モジュールを制御する、またはモジュールの一部であるコンピューターに動作可能に接続された、フィードバックを可能とする制御システムを有する。コンピューター依存性の、フィードバックを可能とする制御は、装置制御への利用可能な手法である。例えばＴｏｏｌｅｙ（２００５）ＰＣ Ｂａｓｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、第３編、ＩＳＢＮ−１０：０７５０６４７１６７、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０７５０６４７１６８；Ｄｉｘ等（２００３）Ｈｕｍａｎ−Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ（第３編）Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、第３編ＩＳＢＮ−１０：０１３０４６１０９１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１３０４６１０９４を参照する。一般にシステム制御は、例えば標的温度及びサイクル時間を作り出すため、並びにいつ検出光により画像が見られたか／取得されたかを特定するために、インプットとしてスクリプトファイルを使用することができるコンピューターにより行われる。写真画像は、典型的に反応の間の異なる時間で取得され、そしてコンピューターにより分析され、機能時間としての強度曲線を作り出すことにより標的物の濃度を導き出す。
【００８４】
光列は、任意の典型的な光列構成要素を含み得るか、またはかかる構成要素に動作可能に接続され得る。光列は、例えば消耗品のアレイ上に、またはアレイ領域に焦点を当てるようにして、消耗品に照明を向ける。光列は、アレイから放出された光（例えば蛍光または発光シグナル）を検出することもできる。入手可能な光学的構成要素の説明については、例えばＫａｓａｐ等（２００９）Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；第１編ＩＳＢＮ−１０：０５２１８１５９６７、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０５２１８１５９６３；Ｂａｓｓ等（２００９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ、第３編、第Ｉ巻：Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ, Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｌｉｇｈｔ、Ｃｏｍｐｏｎｅｔｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ｓｅｔ） ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；第３編、ＩＳＢＮ−１０：００７１４９８８９３、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００７１４９８８９０；Ｂａｓｓ等（２００９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ、第３編、第II巻：Ｄｅｓｉｇｎ、Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ、Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ、Ｒａｄｉｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；第３編ＩＳＢＮ−１０：００７１４９８９０７、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００７１４９８９０６；Ｂａｓｓ等（２００９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ、第３編、第III 巻：Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、ＩＳＢＮ−１０：００７１４９８９１５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００７１４９８９１３；Ｂａｓｓ等（２００９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ、第３編、第IV巻：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ, Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｏｐｔｉｃｓ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、第３編、ＩＳＢＮ−１０：００７１４９８９２３、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００７１４９８９２０；Ｂａｓｓ等（２００９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ、第３編、第Ｖ巻：Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｏｐｔｉｃｓ、Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ、Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ、Ｘ−Ｒａｙ ａｎｄ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；第３編、ＩＳＢＮ−１０：００７１６３３１３８、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００７１６３３１３０；並びにＧｕｐｔａ及びＢａｌｌａｔｏ（２００６）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、第２編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、第２編ＩＳＢＮ−１０：０８４９３３０９５５、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８４９３３０９５７を参照のこと。典型的な光列構成要素は、任意の：励起光源、アークランプ、水銀アークランプ、ＬＥＤ、レンズ、光学フィルター、プリズム、カメラ、光検出器、ＣＭＯＳカメラ、及び／またはＣＣＤアレイを含む。１つの所望される実施形態では、落射蛍光検出システムが使用される。デ��イスは、さらにアレイ中のシグナル位置を検出されるべき核酸に関連づけるアレイ読み取りモジュールを含むか、またはアレイ読み取りモジュールに接続され得る。
【００８５】
本発明の可動式基板実施形態における特定の態様では、反応容器は、例えば統合されたマイクロ流体チャネルシステム中に、または増幅混合物と検出チャネルの間の適切な流体接触面を通して、検出器チャネルに直接接続され得る。或いは従来型のフローサイトメーター中に存在するような流体接触面は、増幅反応混合物をサンプリングするために検出チャネル上に提供され得る。検出チャネルは、典型的に所定の時間で実質的にシグナルビーズだけがチャネルを越えることができる次元を有するように構成される。検出チャネルは、典型的にビーズの励起、及びビーズから発せられる蛍光シグナルの収集を可能にする検出窓を含むだろう。多くの場合では、溶融シリカまたはガラスキャピラリー、或いは他の透明なマイクロ流体チャネルは、検出チャネルとして使用される。
【００８６】
本発明の光検出システムは、典型的に１つ以上の励起波長で励起光を送達することができる、１つ以上の励起光源を含むだろう。さらに含められるのは、検出チャネルから発せられる光を収集し、そして蛍光シグナルからの励起光をフィルターするために構成されている光列であるだろう。光列は、典型的に蛍光シグナルを送り、そしてビーズから発せられる蛍光シグナル構成要素と捕捉プローブフラグメントから発せられるシグナル構成要素を分離するためのさらなる分離要素も含み得る。
【００８７】
図１４は、全体の検出システム１４００の図式説明を提供する。示されているように、システムは、それぞれ多様な波長で励起光を提供するレーザー１４０２及び１４０４等の第一及び第二の励起光源を含む。或いはシグナル広域スペクトル光源または多重狭域スペクトル光源は、適切な波長範囲、または例えばビーズに関連したもの、及び標識プローブフラグメントに関連したもの等のサンプル中の検出可能標識を励起する範囲で、励起光を送達するために使用され得る。
【００８８】
実線矢印として示されるそれぞれのレーザーからの励起ビームは、例えば二色性の１４０６等の方向性の光の使用を通して検出チャネル１４０８に向けられる。検出チャネル１４０８においてビーズ１４１０から発せられる光は、収集光学、例えば対物レンズ１４１２によって収集される。その後に収集された光は、破線として示されているように、放射蛍光を通すように構成されている１４１４を、収集された励起放射線を拒絶しながら、通過する。収集された蛍光は、第一の発光スペクトルで捕捉プローブフラグメント上の標識から放射された蛍光、及びビーズ中で使用される標識の数に応じて、１つ以上の多様な発光スペクトルでのビーズ標識特徴からの蛍光シグナルを含む。その後に収集された蛍光は、第一の検出器１４２０に捕捉プローブフラグメントからの蛍光を反射させる、二色性の１４１６を通過する。その後にビーズからの残りの蛍光特徴は、第二の検出器１４２２に第一のビーズシグナル構成要素を反射させ、そして第二のビーズシグナル構成要素を第三の検出器１４２４に通過させる、第二の二色性１４１８を介してシグナルを通過することによるさらなる分離にかけられる。検出器は、典型的に検出ビーズに関連したシグナルデータを保管するため、及びシグナルデータを分析し、ビーズのアイデンティティ、ひいては捕捉プローブ及び関連の標的核酸配列を決定するために適切なプロセッサまたはコンピューターに接続される。さらにプロセッサまたはコンピューターは、経時的実験が行われる場合、例えば全増幅反応において１回以上の増幅サイクル後にビーズをサンプリングする場合に、シグナルデータを定量化するためにプログラミングし、そして標的配列コピー数を創出することを含み得る。
【００８９】
デバイスまたはシステムは、例えばコンピューター、またはコンピューター読み取り可能媒体中で具現化されるようなシステム指示を含み得るか、またはかかるシステム指示に動作可能に接続され得る。指示は、デバイスまたはシステムの任意の態様、例えば１つ以上のシグナル強度の測定及び熱調節モジュールにより行われる多くの増幅サイクルを相互に関連付け、デバイスにより検出される標的核酸の濃度を決定することを制御し得る。
【００９０】
システムは、他のデバイス構成要素に動作可能に、例えば適切な配線により、または無線接続により接続されたコンピューターを含み得る。コンピューターは、例えば熱調節モジュールにより、例えば上記のようにフィードバック制御を用いて、熱循環を制御し、そして／または光列により画像がいつ取得されたか、または見られたかを特定する指示を含み得る。コンピューターは、画像情報を受信し、または画像情報をデジタル情報及び／または機能時間としてのシグナル強度曲線に変換し、デバイス等により分析される標的核酸の濃度を決定する。コンピューターは、バックグラウンドを説明するためにシグナル強度を正規化するため、例えば１つ以上のアレイ領域の局所的なバックグラウンドを検出するため、及び前記バックグラウンドを補正することによりアレイシグナル強度測定を正規化するための指示を含み得る。同様にコンピューターは、アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性、アレイの一様でない多様な領域の視野等を補正することによりシグナル強度を正規化するための指示を含み得る。
【００９１】
さらなる定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定のデバイスまた生体システムに限定されずに、当然に変化され得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、且つ限定されることを意図しないことも理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば本明細書において検討される消耗品チャンバーの「表面（a surface）」は、場合により２つ以上の表面の組み合わせ等を含む。
【００９２】
他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似する、または同等である任意の方法及び材料は、本発明の試験を実施するのに使用され得るが、好適な材料及び方法は、本明細書において記載される。本発明の記載及び特許請求の範囲では、以下に記載される定義に従い、以下の専門用語が使用される。
【００９３】
「増幅プライマー（amplification primer）」は、鋳型依存性増幅反応において伸長され得る部分（例えば分子）である。最も典型的には、プライマーは、増幅条件下で鋳型に結合する核酸を含むだろうし、または増幅条件下で鋳型に結合する核酸であるだろう。典型的にプライマーは、ポリメラーゼにより（例えばポリメラーゼ連鎖反応における熱安定性ポリメラーゼにより）、またはリガーゼにより（例えばリガーゼ連鎖反応において）伸長され得る末端を含んで成るだろう。
【００９４】
「検出チャンバー（detection chamber）」は、部分的に、または完全に密閉された構造であり、ここにおいてサンプルは分析され、または標的核酸が検出される。チャンバーは、完全に閉鎖され得るか、または例えば試薬または反応物の送達のためにチャンバーと流体連結されたポートまたはチャネルを含み得る。チャンバーの外形は、例えば適用及び使用可能なシステム装置に応じて変えられ得る。例えばアレイ近くに狭い次元（例えばチャンバーの深さ）を含むことにより（それによりアレイに近位の溶液から生み出されるシグナルの量を減らすことにより）、チャンバーがシグナルバックグラウンドを減らすように次元的に形成される場合に、或いは例えばコーティング（例えば光学コーティング）、または構造物（例えばアレイに近位のバッフルまたは他の外形の構造物）の使用により、チャンバーがバックグラウンドを減らすように別に構成される場合に、チャンバーは、「アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される」。典型的にチャンバーは、アレイでシグナルの差異を検出することを可能にするために、溶液中のシグナルが十分に低いように、アレイに近位の次元（例えば深さ）を有するように構成される。例えば１つの実施形態では、チャンバーは、アレイ上方に約１ｍｍの深さ未満であり；望ましくは、チャンバーは、約５００μｍ未満の深さである。典型的にチャンバーは、アレイ上方に約４００μｍ未満、約３００μｍ未満、約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満の深さである。本明細書において提供される１例では、チャンバーは、約１４２μｍの深さである。
【００９５】
「高性能核酸アレイ（high-efficiency nucleic acid array）」は、ハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプローブフラグメントに効率的にハイブリダイズする捕捉核酸のアレイである。典型的な実施形態では、アレイは、反応／検出チャンバーの内面上にフォーマットされる。アレイは、表面上のスポッティングから化学または光化学合成までの任意の従来型のアレイ技術により形成され得る。高性能は、プローブまたはフラグメントを認識する捕捉プローブの領域の長さを制御することにより（より短いプローブは、長いプローブよりも効率的にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション条件のために最小のハイブリダイゼーションの長さに下げる）、そしてそれぞれのアレイ領域における捕捉核酸の数を制御することにより達成される。捕捉部位は、捕捉部位と表面の間に連結配列または構造を含むことにより、ハイブリダイゼーションのためにより効率的／利用可能であるように作製され得る（したがって、ハイブリダイゼーションにおける表面効果を減らし得る選定された表面からの距離で、捕捉部位をフォーマットする）。例えば核酸配列またはポリエチレングリコールリンカー（または両方）は、使用され得る。それぞれのアレイ領域における捕捉核酸の数は、所定のプローブまたは典型的な増幅反応の結果として生み出されるフラグメントのためのハイブリダイゼーションに利用可能なサイトの数が比率制限ではないように、分配される。上記のように、これは、増幅反応の間に生み出される標識プローブフラグメントを結合するために利用可能なサイトの数が過剰にあることを意味し、且つ好適には増幅反応後の反応混合物中のプローブフラグメントの濃度により飽和されるであろう部位の数が実質的に過剰にあることを意味する。
【００９６】
「標識プローブ（labeled probe）」は、増幅条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする分子または化合物であり、そしてそれは、検出可能な部分を含んで成るか、または検出可能に作製され得る。最も典型的には、標識プローブは、蛍光色素分子、染料、発光原子団、量子ドット等の光学標識を含んで成る核酸である。標識は直接検出され得るか、または例えばプローブがクエンチャー部分を含んで成る場合には消光状態にあり得る。本明細書における多くの実施形態では、標識プローブは、標的核酸増幅の間に開裂し、検出可能な標識を含んで成るプローブフラグメントを放出する。例えば標識プローブは、例えば増幅反応がプローブの開裂をもたらし、標識プローブフラグメントを放出する場合の蛍光色素分子及びクエンチャーを含み得る。最も典型的には、プローブは、「フラップ」領域を含むだろう。このフラップ領域は、ハイブリダイゼーションの間に標的と塩基対にならず、そしてヌクレアーゼ（例えばポリメラーゼのヌクレアーゼ活性）により残りのプローブから開裂されることにより、プローブフラグメントを形成する。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は、説明のために示されるものであって、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書において記載されている実施例及び実施形態は、説明を目的とするだけであり、またそれを踏まえた多様な改良または変更は、当業者に提案されるだろうし、且つ本出願の精神及び視野、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【００９８】
実施例  検出システム
本実施例の検出システムは、標的核酸の単一チャンバー、多重化、リアルタイムＰＣＲ検出を可能にする。システムは、伝統的なスペクトル識別からアレイに基づく空間識別に移行することにより、リアルタイムＰＣＲの多重化能を広げ、増幅されるそれぞれの標識に特異的なリアルタイム情報を作り出す。
【００９９】
伝統的に単一ウェル多重化は、それぞれの単位複製配列に特異的であり、且つ異なる波長の蛍光色素分子により標識されるＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ等のＰＣＲプローブを用いて達成される。この手法では、染料発光スペクトル及びスペクトルウィンドウに制限されるために、単一反応多重化能が、最大で約５個の標的までに制限される。
【０１００】
本実施例において記載される手法では、単位複製配列の代わりとしての役割を果たし、処理の間にアレイを固定した表面に増幅の進行についての情報を伝達する、標識ＰＣＲプローブを使用する。増幅の反応速度論についての情報は保存され、サイクル数の閾値化法に基づき、検出及び定量化情報の両方を獲得することを可能にする。
【０１０１】
ＰＣＲサイクルにおける伸長ステップの間に、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲプローブを開裂し、その後に選択的にアレイ表面上の捕捉プローブにハイブリダイズし得るフラップ核酸を放出する。それぞれのフラップ及び対応する捕捉プローブは、試験パネル中で潜在的な標的に特有である。
【０１０２】
反応チャンバーの深さ
実験は、所定のアレイについてのシグナル対バックグラウンドノイズ比率に対するチャンバー厚の関係を評価するために行った。さまざまな深さのチャンバーにより基板を機械加工し、そして官能化ポリマーでコーティングした。チャンバーの実際の深さを測定した。その後に捕捉プローブにより基板をスポット化し、そしてＵＶ硬化エポキシを用いて囲まれた反応チャンバー中に集めた。アレイ上でそれぞれの捕捉プローブに相補的である標識プローブフラグメントの４５ｎＭの合成模倣体、及び２５５ｎＭの対応の無傷のプローブ（模倣体に対し１５％の開裂）を含む溶液を、それぞれの囲まれた反応チャンバーの中にピペットで取り、そしてシグナル対バックグラウンドシグナルを、３０℃での３分のハイブリダイゼーション後に測定した。１つの分析の結果は、図１３に示されている。図１３から明らかなように、６００ミクロン〜２００ミクロンを下回る反応チャンバー厚の減少は、３００ミクロン厚を下回る、及びより好適に２００ミクロン厚を下回る最適な比率により、シグナル対バックグラウンドノイズ比率の劇的な増加を示した。
【０１０３】
ＰＣＲチャンバー及びアレイ
大部分の実験において使用したＰＣＲチャンバーは、図２に示されている。示されているように、チャンバーは、ＰＣＲプローブのフラップ配列に相補的である捕捉オリゴのアレイを含んで成る底部表面から成る。捕捉プローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ.（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ, Ｉｏｗａ）により合成され、且つ結合化学構造とオリゴ配列の間のポリエチレングリコールリンカーとともに、ＰＣＲチャンバーの底部を形成している基板への共有結合のために５’末端アミノ基を有する。配列の長さは、対応するＰＣＲプローブフラップと同一である。ＰＣＲチャンバーの底部は、商業的に入手可能なスライドから形成した。このスライドは、捕捉プローブのその後の結合のために活性ＮＨＳエステルを含むポリマーコーティングを備えた。スライドは、ポリマーコーティングによりコーティングされたガラス及びプラスチック基板の両方を含めた。両タイプのスライドは、類似の実験データをもたらす。捕捉プローブは、標準的なアレイプロトコルに従い、ＳＰＯＴＢＯＴ（商標）（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ））を用いてスポット化される。捕捉プローブスポットは、典型的にスポット間で２００μｍの中心から中心のピッチで、１００μｍの直径であった。
【０１０４】
捕捉プローブのスポッティング及び洗浄後に、図２において示されているように、感圧接着剤（ＰＳＡ）、及び入口及び出口を有するポリカーボネート頂部部品を用いてＰＣＲチャンバーを集めた。チャンバーは、１４２μＭの最終的な深さ／厚さ（または高さ）、及び１５ｍｍの直径を有した。チャンバーは、約４５μＬの容積のＰＣＲ試薬を保持する。
【０１０５】
熱循環装置及び光学ブレッドボード
熱循環及び光検出システムは、（１）励起光源（例えば水銀アークランプまたはＬＥＤ）、（２）Ｃｙ３、Ｃｙ５等の特異的な組み合わせの蛍光色素分子が検出されるように、励起光及び発光のために使用される干渉光学フィルター、並びに（３）ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラである光検出器を含む落射蛍光、単一チャネル検出システムを含めた。
【０１０６】
システムは、さらに封入された消耗品（例えば上記のアレイ及びチャンバー）を所望される温度及び所望される時間で急速に熱循環させるために使用した１対の熱電モジュール、金属板、ヒートシンク及び強力な冷却ファン等の熱循環構成要素も含めた。制御システムへのフィードバックとして消耗品に近位のサーミスタを使用した、フィードバックを可能とする制御システムの使用により、熱電モジュールを特定の期間、特定の温度に制御した。
【０１０７】
システム制御は、標的温度及び期間を作り出し、並びに光検出器により画像がいつ取得されたかを特定するインプットとしてスクリプトファイルを用いたコンピューターにより行った。熱反応の間の異なる時間で取得された画像をコンピューターにより分析し、機能時間としての強度曲線を作り出し、それにより標的の濃度を導き出した。
【０１０８】
単一チャネル蛍光画像は、熱反応が進む間の多様な時間及び温度で消耗品から得た。その後にこれらの蛍光画像を分析し、出発標的核酸濃度の定量化を生み出した。中間グレイ強度測定、バックグラウンド補正及びベースライン修正の組み合わせを用いて、蛍光画像を分析した。バックグラウンドは、アレイ中のそれぞれのスポットについて局所的に測定した。バックグラウンドは、注目のスポットを取り囲む溶液の同心環の蛍光強度を測定することにより計算した。その後に局所バックグラウンドを説明するために、それぞれのスポットからのシグナルを補正した。スポッティングにおける変動性、及び視野における一様でない照明を説明するために、補正したそれぞれのスポットからのシグナルをさらに正規化した。最初のいくつかのサイクル、典型的に５〜１５サイクルから得られた補正された強度測定の平均値は、ベースラインを調整するために、及びそれぞれのスポットからの測定を正規化するために、その後に使用した。
【０１０９】
実施例１：３段階増幅反応
増幅試薬混合は、それぞれ増幅される標的に特異的である２つのＰＣＲ増幅プライマー、及びそれぞれ増幅される標的に特異的であるＰＣＲプローブを含む標準的なＰＣＲ試薬を含んだ。典型的なプローブの構造は、図１Ａに概略的に示されている。示されているように、図１Ａのプローブ領域（Ａ）は、伝統的なリアルタイムＰＣＲプローブに典型的なもの（例えばＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブにおけるようなもの）と同一の法則を用いて設計された標的単位複製配列に相補的であるプローブの核酸領域を表す。プローブ領域（Ｂ）は、標的核酸ではなく、対応する捕捉プローブ（後に検討されている）に相補的である直交核酸「フラップ」配列を表す。説明の目的のための一例では、本配列は、他のプローブ設計が置き換えられ得るが、４０°〜４６℃の間のＴmを有するように設計される。一例では、配列の長さは、約１３または１４塩基である。プローブ領域（Ｃ）は、核酸領域（Ｂ）の配列の一部分に相補的である配列を有する核酸を表す。この配列は、例えば４７〜５１℃のＴmを有する全長プローブの二次構造の形成を促進するように設計される。クエンチャー（Ｄ）は、任意のクエンチャー分子を表す。標識（Ｅ）は、蛍光色素分子または他の光検出標識を表す。蛍光色素分子Ｃｙ３は、以下に提示したデータのために使用した。
【０１１０】
本実施例におけるデータについてのＰＣＲは、以下の試薬製剤：２００ｎＭプライマー、ＩＸ  ＦＡＳＴ  ＳＴＡＲＴ（商標）ＰＣＲ緩衝剤（Ｒｏｃｈｅから入手可能）、２〜６ｍＭのＭｇＣ１2、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．２単位／μＬ ＦＡＳＴ ＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、及び１５０ｎＭのＰＣＲプローブにより行った。
【０１１１】
１００μＬのＰＣＲ反応は、上記の製剤を用いて調製した。本実施例において使用したＰＣＲプローブ配列は：
【０１１２】
【化１】
2014511178.tif 000003
【０１１３】
であった。
【０１１４】
５’及び３’フラップは、下線／二重下線で表示され、そして伝統的なＴａｑＭａｎ配列は、太字で示されている。二重下線の配列は、二次構造を形成するために設計された相同領域を表示する。ｍＦｏｌｄ（ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ）により、ＰＣＲ緩衝剤条件を用いて決定された二次構造の予測される融解温度は、５１℃であった。ＰＣＲプローブは、３’末端で、５’Ｃｙ３蛍光色素分子及びＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｍｏｉｅｔｙにより標識した。
【０１１５】
ＰＣＲチャンバーの底部基板に結合した捕捉プローブ配列は：ＰＣＲ緩衝剤条件を用いて４２℃のＴmを有す、ＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ Ｎ（配列番号：２）であった。
【０１１６】
標的配列を含んで成るＤＮＡプラスミドを、１０6、１０4、及び１０2コピー／μＬの濃度で、それぞれのＰＣＲ反応に添加した。その後に溶液を９５℃に加熱することにより脱気した。脱気後、ポリメラーゼを添加し、そしてピペットを用いて、反応をＰＣＲチャンバー中に充填した。平行分析のために、残された溶液をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００に充填した。
【０１１７】
アレイに基づくＰＣＲのサイクル条件は、以下の通りである：
【０１１８】
【表１】
2014511178.tif 000004
【０１１９】
変性及び伸長は、５サイクルの間に行い、そしてその後の変性／伸長／ フラップハイブリダイゼーション及び光読み取りは、８サイクルの間に繰り返した。
【０１２０】
ＡＢＩ７５００のサイクル条件は、以下の通りである：
【０１２１】
【表２】
2014511178.tif 000005
【０１２２】
変性／伸長及び読み取りは、４０サイクルの間に行った。
【０１２３】
コピー数滴定の結果は、アレイに基づくＰＣＲについては図３、及び液相ＰＣＲについては図４に示されている。図に示されるように、結果は同等なものであり、類似の滴定についての挙動を与える。
【０１２４】
実施例２：２段階増幅反応
上記の実施例１のように、増幅試薬混合は、増幅されるべきそれぞれの標的と相補的である２個のＰＣＲプライマー（２００ｎＭ）、及び増幅されるべきそれぞれの標的に相補的である配列を有するＰＣＲプローブ（３００ｎＭ）を含む標準ＰＣＲ試薬を含んだ。典型的なプローブの構造は、図１Ｂに示されている。示されているように、標識プローブは、さらに伝統的なリアルタイムＰＣＲプローブ（すなわちＴａｑＭａｎ）に典型的なものと同一の法則を用いて設計された標的単位複製配列に相補的である核酸フラグメント（Ａ）を含む。さらに含められるのは、捕捉アレイ上の対応する捕捉プローブに相補的である直交核酸「フラップ」配列（Ｂ）である。プローブは、フラップ部分Ｂにつながれた蛍光標識（Ｃ）、及び標的特異的部分（Ａ）につながれたクエンチャー部分（Ｄ）も含む。
【０１２５】
２段階増幅のための直交フラップ（Ｂ）は、７０℃の捕捉アレイ上でその相補体が持つＴmを有するように設計された配列を含んで成る。典型的に配列の長さは、２５〜２７塩基である。上記の実施例１のように、全体のプローブは、最も安定した二次構造が、ＰＣＲに使用される緩衝剤条件における伸長及び測定温度を下回るわずか１０℃ほどのＴmを有すように設計される。オリゴは、ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｉｄｔｄｎａ［ｄｏｔ］ｃｏｍで入手可能な公表されたソフトウェアを用いて設計した。以下のＰＣＲプローブ配列は、本実施例において使用した。
【０１２６】
【化２】
2014511178.tif 000006
【０１２７】
二重下線の配列は直交フラップを構成し、そして下線がない配列は、単位複製配列と相同である。プローブの最も安定な二次構造は、４５℃の溶融温度を有する。直交フラップのＴmは、７１℃である。ＰＣＲプローブは、３’末端上で内部Ｃｙ３蛍光色素分子Ｃ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪより入手可能）及びＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２  ｍｏｉｅｔｙ  Ｄ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ. Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡより入手可能）により標識した。
【０１２８】
ＰＣＲプローブのフラップ部分と相同であった捕捉プローブをスポット化した。以下のサイクル条件以外は、上記の通りＰＣＲを行った。
【０１２９】
【表３】
2014511178.tif 000007
【０１３０】
４０回のサイクルを実施し、そしてそれぞれの伸長ステップの終了時に蛍光シグナルを測定した。図１２は、１回目が標的ＤＮＡプラスミド１０4個のコピーの着手で存在し、さらに２回目が１０6個のコピーで存在した場合、２つの標的のためのアレイに基づくＰＣＲについてのコピー数滴定を示す。
【０１３１】
実施例３：未消光ＰＣＲプローブを用いるアレイに基づくＰＣＲ曲線
以下の例外を除き、実施例１と同一のプロトコルを用いた。使用されるＰＣＲプローブ配列は、以下の通りである。
【０１３２】
【化３】
2014511178.tif 000008
【０１３３】
本配列を５’Ｃｙ３蛍光色素分子で標識したが、３’クエンチャーを含めなかった。１０6個の標的のコピーを添加し、そしてＰＣＲを処理した。リアルタイムデータは、図５に示されている。
【０１３４】
実施例４：多重化アレイに基づく増幅
本実験は、同一のＰＣＲチャンバー中の多重標的についてのデータ取得能及び増幅能を確立する。ＰＣＲ条件は、以下の例外を除き、実施例１に示されたものと同一である。第一に、それぞれデータを取得されるべき標的に特異的である５セットのプライマー及び５個の別個のＰＣＲプローブを、ＰＣＲ反応に添加する。第二に、５個の特有の捕捉プローブを、それぞれ５個のＰＣＲプローブの５’フラップ配列に対応するＰＣＲチャンバーの底部基板上に付着させる。第三に、１０回目のＰＣＲサイクル後に、実施例１では５サイクルごとであったところ、２サイクルごとに温度を３０℃の表面ハイブリダイゼーション温度まで下げた。これは、ＰＣＲ増幅の間により高頻度の光学的データ取得を可能にする。
【０１３５】
ＰＣＲプローブ及び捕捉プローブ配列を以下に示す。
【０１３６】
【化４】
2014511178.tif 000009
【０１３７】
上記のプライマー及びＰＣＲプローブに特異的な配列を包含する５個の標的プラスミドを、１００μＬのＰＣＲ反応に添加し、そして上記のように溶液を調製及び充填した。得られたリアルタイムアレイに基づくＰＣＲデータは、図６に示されている。
【０１３８】
実施例５：高レベル多重化
本実施例は、本実施例のパネル中に含められる任意の１０個の潜在的な標的であり得る多重標的を検出するための単一チャンバー多重化を実証する。この多重化のレベル−６個以上の潜在的な標的のパネル−は、伝統的な液相ＰＣＲにおいては達成され得ない。
【０１３９】
実験材料及び手順は、以下を除き、上記のものと同一であった。最初の１０個のプライマーセット及びＰＣＲプローブは、上記と同じ濃度でＰＣＲ反応中に導入された。ＰＣＲプローブ及び捕捉プローブの配列を以下に示す。
【０１４０】
【化５】
2014511178.tif 000010
【０１４１】
【化６】
2014511178.tif 000011
【０１４２】
【化７】
2014511178.tif 000012
【０１４３】
図７は、ＰＣＲ反応に添加された標的がない場合（鋳型コントロールなし）に得られたリアルタイムのアレイに基づくＰＣＲ曲線を示す。図に示されるように、標的を除き、全てのＰＣＲ構成要素を含む溶液から得られたシグナルはなかった。図８は、１０，０００個のコピー／μＬで添加された３個のプラスミド標的（ＭＰＶ、ＯＰＣ−１、ＰＩＶ２）による同一の実験を示す。
【０１４４】
実施例６：高速ハイブリダイゼーション反応速度論の実証
上記のようにＰＣＲチャンバーを構成した。以下のアミン、ペグ化捕捉プローブ配列を底部基板上に付着させた：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号：３８）。
【０１４５】
ＰＣＲプローブの５’フラップ部分を模倣し、５’末端でＣｙ３蛍光色素分子により標識され、且つ捕捉プローブに相補的である、以下のオリゴ配列（１００ｎＭ）を含む上記のＰＣＲ緩衝剤を含む溶液を調製した：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ Ｎ（配列番号：３９）。
【０１４６】
溶液をＰＣＲチャンバー中に充填し、そしてチャンバーを６０℃に加熱し（二本鎖のＴmを１５度超える）、そしてその後に３０℃まで冷却した。これは、ＰＣＲプロトコルのハイブリダイゼーションステップ間の条件を模倣する。光読み取りは、２分間で、２０秒ごとに行った。得られたデータは、図９に示されている。
【０１４７】
データの１つの注目の態様は、内部温度が３０℃に達する瞬間に、すでに著しいハイブリダイゼーションが起こっていることを示す。
【０１４８】
本明細書において概説した手法は、これまでの手法では見いだされなかった多重の利点を有する。本発明のシステムは、増幅工程の間にリアルタイムで、液相ＰＣＲからアレイをとどめた表面に情報を効果的に伝達することにより、単一チャンバー、高度に多重化された定量的なＰＣＲを可能にする。これは、液相リアルタイムＰＣＲの効率を維持し、且つ蓄積された膨大な知識体系を活用しながらより高いレベルの多重化を可能にする。これを達成するために、システムの多重の新規の態様が開発される必要があった。
【０１４９】
例えば、本発明の１つの特徴は、液相と固相を橋渡しする代わりに、単位複製配列を使用することである。アレイに基づくリアルタイムＰＣＲのゴールに向かうことを目的としたこれまでの教示は、一般に固相アレイへの単位複製配列自体のハイブリダイゼーションに依存してきた。これは、要求される情報を解明するために、システムを複雑化し、効果を妨げ、そしてより高価な構成要素を要求する、多重の論点を提示する。多重化ＰＣＲ環境では、類似する長さ及びハイブリダイゼーション効率の単位複製配列を設計することは、非常に困難である。開裂可能な５’フラップを有するＰＣＲプローブの使用は、ハイブリダイゼーション反応速度論に理想的な非常に短い配列を採用することにより、それぞれの単位複製配列から表面へ情報を伝達する物質を均質にする。本手法は、さらに検出されるべき単位複製配列の配列から独立したアレイ上の捕捉プローブ配列も作製する。これは、最も好都合な捕捉配列の選定、及び多くの多様な標的パネルに使用され得る万能アレイの実現性を可能にし、設計及び製造手法を簡略化する。
【０１５０】
本明細書において開示されるようなＰＣＲプローブは、さらにプローブに基づく液相リアルタイムＰＣＲのためにすでに開発済みである設計規則も活用する。ハイブリダイゼーションへの非常に短い配列（例えば１３〜１４塩基）の使用は、ハイブリダイゼーションを非常に効率的にし、標準的なＰＣＲ緩衝剤の低い塩環境において、アレイ上に高いシグナルを可能にする。したがってシステムは、表面ハイブリダイゼーションが、最適な液相ＰＣＲとつながれる必要がある場合に、単一チャンバー中で非常によく働くことができる。
【０１５１】
本発明の他の特徴は、液相バックグラウンド蛍光から、表面ハイブリダイズシグナルを識別することある。本発明の本態様は、アレイからの関連情報を抽出するのに重要である。これまでの教示は、この問題を克服するために、表面シグナルを液相バックグラウンドから単離するための全内部反射率または共焦点顕微鏡検査法の使用のような、複雑化された、または高価な光学上の手法を採用する。それに反して、本発明は、識別を達成するために光学的「トリック」がないことを要求する、単純な標準光学装置の使用を提供する。シグナル識別能は、多重源から生じる。アレイにおいて使用される表面化学は、非常に高い捕捉プローブ密度、及び上記のようにハイブリダイズされる標的密度を提供する。表面は、１００％の標的核酸の捕捉効率に近づけることができることが示されている。この高い捕捉密度及び効率は、表面シグナルを濃縮し、表面／液相識別を補助する役割を果たす。短い標的核酸の使用は、この効果を劇的に増強する役割を果たす。
【０１５２】
シグナル識別を補助する本発明の他の態様は、非常に薄いチャンバーの使用である。溶液からのバックグラウンドシグナルは、アレイ上方の溶液の高さに線形的に関連する。薄いチャンバーの使用は、この効果をうまく利用する。
【０１５３】
本発明の他の態様は、液相情報の表面アレイへのリアルタイム伝達を可能にする、高速ハイブリダイゼーション反応速度論の使用である。これらの実施例において記載されるシステムは、極めて高速な固相ハイブリダイゼーションを実証する。この現象は技術を促進し、そして短い５’フラップ標的、最適な固相表面化学構造、薄い消耗品、及び熱循環温度プログラムの間に生み出される温度勾配を含む本発明の多重の態様に起因し得る。
【０１５４】
前記の発明は、明瞭さ及び理解の目的のために多少詳しく記載されているが、形態及び詳細における多様な変化は、本発明の真の範囲から逸脱せずに成され得ることは、本開示を読むことから当業者には明確であるだろう。例えば上記の全ての技術及び器具は、多様な組み合わせにおいて使用され得る。本出願において引用されている全ての刊行物、特許、特許出願、及び／または他の資料は、全ての目的のために、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、及び／または他の資料が参照により組み込まれていることが示されているならば、全ての目的のために、同一の範囲で、参照によりそれらの全体が組み込まれている。
【図１Ａ】
2014511178.tif 000013
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014511178.tif 000019
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月7日(2013.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
ＰＣＲチャンバーの底部基板に結合した捕捉プローブ配列は：ＰＣＲ緩衝剤条件を用いて４２℃のＴmを有す、ＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ Ｎであった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
【化２】
2014511178.tif 000028
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【化４】
2014511178.tif 000029
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
【化５】
2014511178.tif 000030
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
【化６】
2014511178.tif 000031
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
【化７】
2014511178.tif 000032
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
実施例６：高速ハイブリダイゼーション反応速度論の実証
上記のようにＰＣＲチャンバーを構成した。以下のアミン、ペグ化捕捉プローブ配列を底部基板上に付着させた：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
ＰＣＲプローブの５’フラップ部分を模倣し、５’末端でＣｙ３蛍光色素分子により標識され、且つ捕捉プローブに相補的である、以下のオリゴ配列（１００ｎＭ）を含む上記のＰＣＲ緩衝剤を含む溶液を調製した：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ Ｎ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を検出するための方法であって：
少なくとも１つの表面上に、少なくとも１つの核酸検出アレイを有する検出チャンバーを提供し；
前記検出チャンバーに、検出されるべき１つ以上の前記標的核酸のコピーを含んで成るサンプルを充填し；
第一のハイブリダイズステップにおいて、増幅プライマー及びプローブを前記１つ以上のコピーにハイブリダイズさせ；
増幅プライマー依存性増幅反応において、１つ以上の前記標的核酸のコピーの少なくとも一部を増幅させ、ここで前記増幅反応が、プローブの開裂及び第一のプローブフラグメントの放出をもたらし；
第二のハイブリダイズステップにおいて、前記第一のプローブフラグメントを前記アレイにハイブリダイズさせ；そして
前記第一のプローブフラグメントを前記アレイに結合させることにより生み出されるシグナルを検出し、それにより前記標的核酸を検出し、ここで１つ以上の前記検出チャンバー及びプローブが、前記アレイに近位のバックグラウンドシグナルを減らすように構成される、前記方法。
【請求項２】
前記プローブが標識プローブを含んで成り、且つ前記第一のプローブフラグメントが標識プローブフラグメントを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識プローブフラグメントが、前記アレイへのハイブリダイズにおいて検出可能シグナルを生み出す標識を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出チャンバーを提供するステップにおいて、前記検出チャンバーが、前記アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アレイが、前記第一のプローブフラグメントにハイブリダイズする非比率制限数の捕捉核酸プローブを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一のプローブフラグメントが、前記標的核酸と相補的ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、前記チャンバーと動作可能に連結されている少なくとも１つのポートまたは流体チャネルを通って充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸が、前記検出に先立ち、少なくとも５つの増幅サイクルで増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸が、前記検出に先立ち、複数の増幅サイクルにおいて増幅され、ここで前記標的核酸部分が、前記検出後に、前記プローブのさらなるコピーの存在下で増幅され、その結果放出される第一のプローブフラグメントは、その後に前記アレイにハイブリダイズし、そして検出され、ここで検出されるシグナル強度は、前記サンプル中に存在する前記標的核酸の量に相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナルが、１つ以上の光学シグナル波長を検出することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記シグナルを検出することが、複数のシグナルから複数の光学シグナル波長を検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二のハイブリダイズステップが、前記増幅ステップにおける伸長反応と同一の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のプローブが、前記標的核酸に相補的でない第一の直交フラップを含んで成り、前記フラップが、前記標識プローブから開裂して、前記標識プローブフラグメントを生み出す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが、前記第一のフラップに少なくとも部分的に相補的である第二の直交フラップを含んで成り、前記第一のフラップが前記アレイに結合するために有するＴmよりも、前記第二のフラップが前記第一のフラップに結合するために有するＴmの方が高い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識プローブが、蛍光または発光標識を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、標識及び標識クエンチャーを含んで成り、前記プローブの開裂が、前記標識及び前記クエンチャーの分離をもたらすことにより、前記標識を未消光化する、請求項１に記載の方法。 
【請求項１７】
前記プローブが、未消光化標識を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナルが光学シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出されたシグナルが、前記第一のプローブフラグメントの前記高性能アレイへのハイブリダイゼーションを示すインターカレーティング染料からのシグナルを含んで成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アレイの１つ以上の領域のローカルバックグラウンドを検出し、そして前記バックグラウンドを補正することによりシグナル強度測定を正規化することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
アレイ捕捉核酸プローブスポッティングにおける変動性、または前記アレイの一様でない多様な領域の視野を補正することにより、シグナル強度を正規化することをさらに含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、複数の異なる標的核酸を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アレイが、前記アレイ上で空間的に分離された複数の異なる捕捉核酸プローブタイプを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数の増幅プライマーおよび複数の異なるプローブタイプを、前記標的核酸と共にインキュベートすることを含んで成り、ここで各々のプライマーは異なる標的核酸に特異的であり、そして各々のプローブタイプは異なる標的核酸に特異的である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
それぞれ異なる標的核酸に特異的である複数の標識プローブタイプを、前記標的核酸と共にインキュベートし；
前記増幅プライマー依存性増幅反応において前記標的核酸の少なくとも一部分を増幅して、複数の異なる標識プローブタイプを開裂し、複数の異なる標識プローブフラグメントタイプの放出すること、
を含んで成り、ここで前記第二のハイブリダイズステップが、前記複数のプローブフラグメントタイプを前記アレイにハイブリダイズさせることを含んで成り、ここでそれぞれの前記異なるプローブフラグメントタイプが、空間的に別々の異なる捕捉核酸プローブタイプにハイブリダイズし、ここで前記標識シグナルを検出することが、前記アレイ上の空間的に別々の捕捉核酸プローブに対応する複数の空間的に別々の領域からの複数の標識シグナルを検出することを含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識プローブタイプが、同一の標識部分を含んで成る、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識プローブタイプが、複数の異なる標識部分を含んで成る、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識プローブタイプが、１つ以上の異なる標識部分を含んで成り、ここで前記異なる部分の数が、前記標識プローブタイプの数よりも少ない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅ステップ、及び前記第一のプローブフラグメントを高性能アレイにハイブリダイズさせるステップが、同一の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
約５〜約１００個の、空間的に別々の異なる捕捉核酸プローブタイプがアレイ上に存在し、約５〜約１００個の、異なる標識プローブフラグメントタイプが増幅反応中に生み出され、前記アレイ上に存在する空間的に別々の異なる捕捉核酸タイプの各々が、異なる標識プローブフラグメントと相補的である、請求項２５に記載の方法。
【国際調査報告】
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