(57)【要約】  本発明は免疫学および分子生物学の分野に関連し、B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子に基づくDNAワクチンおよびその使用に係るものである。特に、該ＤＮＡワクチンは、組み換え発現ベクターを含んでおり、該ベクターは、pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、およびアデノウイルスのような、選択された真核生物発現ベクターに有効に結合した外毒素融合遺伝子B7-1-PE40KDELを含んでいる。本発明は、また、外毒素融合遺伝子B7-1-PE40KDEL、コードされる外毒素融合蛋白、該外毒素融合蛋白遺伝子を含む組み換え発現ベクター、および該組み換え発現ベクターを含む組成物、に係るものである。本発明の該DNAワクチンは、同種異系組織／臓器の移植の拒絶反応、およびGVHDのような造血幹細胞移植の拒絶反応の治療または予防に非常に有効である。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
外毒素融合蛋白B7-1-PE40KDELをコードする遺伝子であって、該遺伝子のヌクレオチド配列が以下の配列である遺伝子。
(1)配列番号：1または配列番号：2に示される配列、
(2)配列番号：1または配列番号：2に示される配列によりコードされる蛋白と同一の蛋白をコードする配列であって、そのヌクレオチド配列は、配列番号：1または配列番号：2に示される配列とは、コドンの縮重により相違している配列、
(3)配列番号：1または配列番号：2に示される配列と厳格なハイブリダイズ条件下でハイブリダイズする配列であって、該配列によりコードされる蛋白が配列番号：1または配列番号：2によりコードされる蛋白と同一または類似の機能を有する配列、または
(4)配列番号：1または配列番号：2に示される配列と、75%を超える、または好ましくは85%を超える同一性を有する配列。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子によりコードされる外毒素融合蛋白。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子に機能的に結合された組み換え発現ベクターであって、該発現ベクターは真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターから選択され、好ましくは、該遺伝子は、pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLおよびアデノウイルスから選択される発現ベクターのいずれかに機能的に結合している組み換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組み換え発現ベクターであって、請求項１記載の遺伝子およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターとからなる組み換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子、請求項２記載の外毒素融合蛋白、あるいは請求項３または４記載の組み換え発現ベクターを含む組成物。
【請求項６】
請求項１記載の遺伝子、請求項２記載の外毒素融合蛋白、あるいは請求項３または４記載の組み換え発現ベクター、および医薬的に許容可能なアジュバントを含むワクチン。
【請求項７】
請求項３または４記載の組み換え発現ベクター、および医薬的に許容可能な免疫アジュバントを含むDNAワクチン。
【請求項８】
請求項５記載の組成物、請求項６記載のワクチン、または請求項７記載のDNAワクチンの配合物であって、静脈注射、動脈注射、筋肉内注射、皮下注射、臓器注射、胸膜腔内注射および腹腔内注射による投与に適した形態で製造される配合物。
【請求項９】
請求項５記載の組成物、請求項６記載のワクチン、または請求項７記載のDNAワクチンであって、水溶液または水で戻す凍結乾燥粉末の形態で配合され、注射または粘膜を介した投与法により使用可能なもの。
【請求項１０】
同種異系組織および／または臓器の移植の拒絶反応を治療または予防する方法であって、請求項５記載の組成物、請求項６記載のワクチン、または請求項７記載のDNAワクチンを、それを必要とする患者に有効量投与することを含む方法。
【請求項１１】
請求項５記載の組成物、請求項６記載のワクチン、または請求項７記載のDNAワクチンの使用であって、同種異系組織及び／または臓器の移植の拒絶反応を治療または予防するための医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は免疫学および分子生物学の分野に関連し、B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子に基づくDNAワクチンおよびその使用に係るものである。本発明は、また、B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子、該融合遺伝子によりコードされる外毒素融合蛋白、該融合遺伝子を含む組み換え発現ベクター、および該組み換え発現ベクターを含む組成物に係るものである。
【発明の背景】
【０００２】
同種異系の造血幹細胞移植(allo-HSCT)および実質臓器移植は、血液系腫瘍、ある種の遺伝病、急性重症放射線宿酔、および様々な実質臓器の不全および悪性腫瘍の治療に広く用いられてきた。ドナーとレシピエントとの間の主要組織適合性抗原(MHC)の相違により、マイナー組織適合性抗原(mHA)、組織特異的抗原、および非免疫学的因子のような多くの他の既知または未知の因子ともに、宿主対移植片病(HVGDs)および移植片対宿主病(GVHDsまたはGVHRs)が避けられず、それらが、同種異系組織移植の失敗および慢性移植片機能不全(GCD)の最も重要かつ根本的な原因の一つである。臓器移植が緊急に必要である患者の数の増加に伴い、ドナーの不足がますます顕著となりつつある。現在および将来において、MHCsが完全には一致していない、またはなかば適合しているにすぎない移植のケースが主流となり、造血幹細胞移植および臓器移植の新たな方向性を示すことになるだろう。GVHDおよびHVGDに対する予防および治療の伝統的な方法は、移植レシピエントにおける全免疫機能の破壊に基づくものであり、移植片対白血病(GVL)効果および抗炎症機能の喪失という代償を払いつつも、種々の高用量の免疫抑制薬の使用または移植片からのすべてのＴ細胞の除去により実施されている。GVHDおよびHVGDの発生および進展を防止する新たな戦略の背後にある基本的な方法が、特異的な免疫寛容によりT細胞の活性化の当初のステップが効果的に妨げられるか、誘導が妨げられ、それにより「サイトカイン・ストーム」の発生および進行を根本的に抑制するかどうかに掛っていることは疑いがないところである。したがって、理想的かつ効率的なallo-HSCTおよび臓器移植では、レシピエントの体内やドナーの移植片からすべてのT細胞を除くより、T細胞の同種異系抗原への当初の反応を修正又は変更すべきである。すなわち、レシピエントおよびドナーに特異的な免疫寛容の誘導は、レシピエントまたはドナーのT細胞の同種異系抗原への反応の除去または阻害をターゲットとするが、T細胞の他の抗原への通常の反応は依然として保持しているというものであるべきである。
【０００３】
レシピエントおよびドナーのT細胞が造血幹細胞移植または臓器移植において２つの役割を演じていることは証明されている。造血幹細胞または臓器の生着、条件付感染（conditional infections）の抑制および抗白血病効果への寄与に加え、それはGVHDまたはHVGDの根本的な原因にもなり得る。この免疫応答は、T細胞による認識と活性化を通じて達成される。T細胞活性化には２つのシグナル、すなわちT細胞受容体シグナルおよび分化抗原群28(CD28)の同時刺激シグナルが必要である。最初のシグナルは第２のシグナルによって制御され、T細胞の活性化、部分的活性化またはアネルギーがもたらされる。したがって、T細胞受容体シグナルまたはCD28により仲介される同時刺激シグナルのいずれかをブロックすることによるT細胞活性化の阻害が、HVGDおよび急性GVHD(aGVHD)の予防のために重要な戦略である。細胞障害性Tリンパ球抗原4-Ig(CTLA4-Ig)またはB7抗体誘導特異的免疫寛容は、HVGDおよびaGVHDの予防という目的を達成するために主に用いられており、多くのin vivoおよびin vitroでの動物実験において有効であることが実証されている。しかし、この方法の欠点は、誘導された免疫寛容の期間が短く、誘導された無力なT細胞が他のシグナル伝達経路によって再活性化されうることから、治療が失敗に至ることである。加えて、ブロックのために用いられるモノクローナル抗体はほとんどマウスのものであり、その免疫原性が治療の有効性に影響する。
【０００４】
したがって、良好な免疫寛容を有し、GVHDのような同種異系組織／臓器移植の拒絶反応の治療または予防において有効なDNAワクチンが、この分野では緊急に求められている。
【発明の概要】
【０００５】
多くの実験および創造的な研究の後、発明者は、B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子を見出し、驚くべきことに真核生物細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDELが、転写され、翻訳され、翻訳後に修飾され、およびそれから細胞外空間に分泌されることを発見した。該ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDELは、効率的に真核生物細胞中で発現でき、その発現産物は、好適な標的となる免疫抑制活性を有する。発明者は、またpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子に基づくDNAワクチンが、マウスaGVHDモデルにおける予防および治療において、有効であることを発見した。したがって、以下の発明が提供される。
【０００６】
本発明の１つの側面は、B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子およびそのヌクレオチド配列に関するものであり、該配列は、配列番号：1または配列番号：2に示されるとおりである。
【０００７】
B7-1-PE40KDELの配列およびオープンリーディングフレームの決定は、以下のように解析された：
【化１】
2014505473.tif 000002
【０００８】
上記配列において、下線部はKpnI制限酵素認識部位であり、枠で囲まれた部分はスタートコドンおよびストップコドンである。上記の配列配列番号：1のオープンリーディングフレームは、配列番号：2(1827bp)である。
【０００９】
本発明の他の側面は、外毒素融合遺伝子(配列番号：1または配列番号：2)によりコードされる外毒素融合蛋白(配列番号：3)に関するものである。
【００１０】
配列番号：3のアミノ酸配列は、以下に示すとおりである（608アミノ酸、下線部はシグナルペプチドの配列である。）。
【００１１】
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
1               5                   10                  15      
Gly Ser Thr Gly Asp Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val 
20                  25                  30          
Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln 
35                  40                  45              
Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met 
50                  55                  60                  
Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe 
65                  70                  75                  80  
Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser 
85                  90                  95      
Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala 
100                 105                 110         
Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp 
115                 120                 125             
Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile 
130                 135                 140                 
Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu 
145                 150                 155                 160 
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val 
165                 170                 175     
Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp 
180                 185                 190         
Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly 
195                 200                 205             
His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu 
210                 215                 220               
His Phe Pro Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
225                 230                 235                 240 
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr 
245                 250                 255     
Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg 
260                 265                 270         
Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln 
275                 280                 285             
Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val 
290                 295                 300                 
Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp 
305                 310                 315                 320 
Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu 
325                 330                 335     
Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly 
340                 345                 350         
Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys 
355                 360                 365             
Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala 
370                 375                 380                 
Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly 
385                 390                 395                 400 
Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu 
405                 410                 415     
Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe 
420                 425                 430         
Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe 
435                 440                 445             
Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly 
450                 455                 460                 
Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp 
465                 470                 475                 480 
Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg 
485                 490                 495     
Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu 
500                 505                 510         
Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly 
515                 520                 525             
His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu 
530                 535                 540                 
Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 
545                 550                 555                 560 
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Ile Gly Gly 
565                 570                 575     
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala 
580                 585                 590         
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu 
595                 600                 605            
【００１２】
本発明の他の側面は、pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLおよびアデノウイルスのような真核生物の発現ベクターに効率的に融合できる、細胞B7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子を含む組み換え発現ベクターに関する。
【００１３】
本発明の１つの側面では、組み換え発現ベクターは、B7-1-PE40KDEL遺伝子およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターからなる。
【００１４】
本発明の他の側面は、本発明の組み換え発現ベクターのいずれかを含む組成物に関する。
【００１５】
本発明はまた、GVHDの治療または予防のための、本発明の組み換え発現ベクターのいずれかを含むDNAワクチンに関するものである。
【００１６】
本発明の１つの側面において、ここに記載されたDNAワクチンは医薬的に許容可能な免疫アジュバントも含む。
【００１７】
本発明の他の側面において、ここに記載されたDNAワクチンは、注射または粘膜を経由する免疫化、あるいは遺伝子銃によるトランスフェクトのために用いられる。特に、DNAワクチンは、以下の方法、すなわち、静脈注射、動脈注射、筋肉内注射、皮下注射、臓器注射、胸腔内注射および腹腔内注射の少なくとも１つによる免疫化のために用いられる。
【００１８】
本発明の他の側面において、ここに記載されるDNAワクチンは、水溶液または水に戻した凍結乾燥粉末のいずれかの形態であって、注射または粘膜経由の投与に用いうる。
【００１９】
本発明の他の側面は、DNAワクチンを製造する方法であって、配列番号：1または２のヌクレオチド配列およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターを含むB7-1-PE40外毒素融合遺伝子を効率的に融合させる方法に関するものである。
【００２０】
本発明に関してここに記載されるDNAワクチンを製造する方法は、以下の工程を含む：
1)シグナルペプチドおよびKpnI制限酵素認識部位を含む上流プライマー(P1)、およびXbaI制限酵素認識部位を含む下流プライマー(P2)が設計される。記載された該プライマー配列は、配列番号：4および配列番号：5として示されている。
【００２１】
2)真核生物発現ベクターpGEMT-B7-1-PE40KDELは、高正確性Pfu DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いられる。
【００２２】
3)PCR産物は回収される。回収されたPCR産物およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターは、KpnI+XbaI制限酵素の両方で同時に消化（double-digested）され、消化された産物は電気泳動の後に回収される。
【００２３】
4)消化された産物は回収される。
【００２４】
5)二重消化されたPCR産物およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターはライゲートされる。
【００２５】
6)アンピシリン-耐性細菌クローンが選択され、プラスミドが抽出され、制限酵素による二重消化により同定される。正しい細菌クローンは冷凍保存される。
【００２６】
7)細菌クローンは培養され、DNAワクチンのためのプラスミドが抽出され、精製される。
【００２７】
8)得られたプラスミドは、薬学的に許容可能な免疫アジュバントと混合される。
【００２８】
本発明の他の側面は、外毒素融合遺伝子、またはGVHDの治療または予防のためのDNAワクチンの製造における組み換え発現ベクターの使用に関する。
【００２９】
本発明の更なる側面は、GVHDの治療または予防のための方法であって、治療または予防のために有効な量のDNAワクチンを患者に投与する工程を含む方法に関する。
【００３０】
１日の用量は、患者に１度に投与してもよいし、または１日の間に２、３、４回またはそれ以上に分けて適切な間隔で低用量で投与してもよい。ここで記載する低用量は、単位用量として、たとえば、各単位用量が適切な用量の数値により分けられた１日の総用量に相当する用量を含んでいるように製造されることもできる。さらに、DNAワクチンは、１日1回、２日ごとに１回、週に１回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、6ヶ月に１回、年１回、または２年に１回のような特定の間隔で投与されることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELの構築の略図。ここでSはシグナルペプチド配列を示す。
【図２】B7-1-PE40KDELのPCR産物のアガロースゲル電気泳動による解析。レーン1はDNAマーカー、レーン2はB7-1-PE40KDELのPCR産物。
【図３】KpnI+XbaI制限酵素により二重消化された組み換えプラスミドpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELのアガロースゲル電気泳動による解析。レーン1はDNAマーカー、レーン2はXbaIで消化された組み換えプラスミド、レーン3はKpnI+XbaIにより二重消化された組み換えプラスミド。
【図４】トランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞の逆転写PCR(RT-PCR)産物のアガロースゲル電気泳動による解析。レーン1はDNAマーカー、レーン2はpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELによりトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞におけるB7-1-PE40KDEL増幅産物、レーン3はβ-アクチンのPCR産物、レーン4はpcDNA3.1空ベクターによりトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞におけるB7-1-PE40KDELの増幅産物、レーン5はトランスフェクトされていないCHO-K1-RPE.40細胞におけるB7-1-PE40KDEL増幅産物。
【図５】トランスフェクトされた真核生物細胞から分泌されたB7-1-PE40KDEL融合蛋白のウェスタンプロット解析。レーン1はpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDELによりトランスフェクトされたもの、レーン2はpcDNA3.1/Zeo(+)空ベクターでトランスフェクトされたもの。
【図６Ａ】Zeoでスクリーニングされた安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40におけるシュードモナス（Pseudomonas）外毒素A(PEA)の発現の比較定量の結果。Aはリアルタイム定量PCR、Bは増幅曲線、Cは溶解度曲線。
【図６Ｂ】Zeoでスクリーニングされた安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40におけるシュードモナス（Pseudomonas）外毒素A(PEA)の発現の比較定量の結果。Aはリアルタイム定量PCR、Bは増幅曲線、Cは溶解度曲線。
【図６Ｃ】Zeoでスクリーニングされた安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40におけるシュードモナス（Pseudomonas）外毒素A(PEA)の発現の比較定量の結果。Aはリアルタイム定量PCR、Bは増幅曲線、Cは溶解度曲線。
【図７】PEA濃度測定の標準曲線。
【図８】真核生物細胞の発現産物B7-1-PE40KDELの選択的阻害活性の比較。
【図９】筋肉内注射後のpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELプラスミドの血清における発現レベルのアガロースゲル電気泳動による解析。
【図１０】血中のPE40KDELmRNAの比較定量。
【図１１Ａ】抹消血中のCD3+CD28+T数のフローサイトメトリー解析の代表写真。
【図１１Ｂ】抹消血中のCD3+CD28+T数のフローサイトメトリー解析の代表写真。
【図１２】B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射後の抹消血CD28+T細胞の減少。
【図１３】血清抗-PEA IgG抗体濃度測定の標準曲線。
【図１４】レシピエントマウスにおける典型的なGVHDの症状。典型的な円背(A)および脱毛(B)。
【図１５】移植後のすべてのグループにおけるマウスの体重の変化。AはaGVHDモデルグループ；Bは骨髄移植グループ；Cは脾臓細胞注入グループ；Dは放射線のみのグループ。
【図１６】移植後のキメリズム解析：性決定領域Y(Y染色体におけるsry遺伝子)のPCR産物の電気泳動。レーン1はDNAマーカー；レーン2はaGVHDモデルグループにおけるsry遺伝子増幅；レーン3は骨髄移植グループにおけるsry遺伝子増幅；レーン4は脾臓細胞注入グループにおけるsry遺伝子増幅；レーン5は放射線のみのグループにおけるsry遺伝子増幅。
【図１７】aGVHDマウスの病理組織学的検査(ヘマトキシリンおよびエオシン[HE]染色×100)。Aは小腸；Bは肝臓；Cは脾臓；Dは皮膚。
【図１８】移植後のすべてのグループにおけるGVHDマウスの生存率。
【図１９】移植後のすべてのグループにおけるGVHDマウスの体重変化。
【図２０】移植後のすべてのグループにおけるaGVHDマウスの白血球細胞(WBC)数の変化。
【図２１】B7-1-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンによる治療後のすべてのグループにおけるaGVHDマウスの小腸における病理組織学的変化(HE染色、40×)：Aグループ(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン)、Bグループ(B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、Cグループ(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、Dグループ(空のベクター)、Eグループ(シクロスポリンA[CsA]+メトトレキセート[MTX])およびFグループ(未治療aGVHDグループ)。
【図２２】B7-1-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンによる治療後のすべてのグループにおけるaGVHDマウスの皮膚における病理組織学的変化(HE染色、40×)：Aグループ(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン)、Bグループ(B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、Cグループ(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、Dグループ(空のベクター)、Eグループ(CsA+MTX)およびFグループ(未治療aGVHDグループ)。
【図２３】B7-1-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンによる治療後のすべてのグループにおけるaGVHDマウスの肝臓における病理組織学的変化(HE染色、40×)：Aグループ(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン)、Bグループ(B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、Cグループ(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、Dグループ(空のベクター)、Eグループ(CsA+MTX)およびFグループ(未治療aGVHDグループ)。
【図２４】B7-1-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンによる治療後のすべてのグループにおけるaGVHDマウスの生存曲線および生存時間の中央値。
【図２５】移植後のすべてのグループにおけるキメリズム解析：sry遺伝子(Y染色体)のPCR産物の電気泳動。レーン1はDNAマーカー；レーン2はB7-1-PE40KDEL DNAワクチングループにおけるsry遺伝子増幅；レーン3はB7-2-PE40KDEL DNAワクチングループにおけるsry遺伝子増幅；レーン4はB7-1-PE40KDEL DNAワクチン+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループにおけるsry遺伝子増幅；レーン5はpcDNA3.1注入グループにおけるsry遺伝子増幅；レーン６はCsA+MTXグループにおけるsry遺伝子増幅；レーン７はaGVHDモデルグループ。
【図２６】aGVHDマウス末梢血のCD4+/CD8+率に関するDNAワクチンの効果。
【図２７Ａ】すべてのグループにおける末梢血のCD3+CD4+T/CD3+CD8+T率のフローサイトメトリー解析の代表写真。
【図２７Ｂ】すべてのグループにおける末梢血のCD3+CD4+T/CD3+CD8+T率のフローサイトメトリー解析の代表写真。
【図２８】すべてのグループにおける末梢血のCD4+CD25+Treg/CD4+T率に関するDNAワクチンの効果。
【図２９】すべてのグループにおける末梢血のCD4+CD25+Treg率のフローサイトメトリー解析の代表写真。
【図３０】すべてのグループにおける末梢血のCD8+CD28-Ts率に関するDNAワクチンの効果。
【図３１】すべてのグループにおける末梢血のCD8+CD28-Ts率のフローサイトメトリー解析の代表写真。
【本発明の詳細な説明】
【００３２】
本発明の実施形態は、以下に例を用いて詳細に説明されている。当業者は、以下の例が本発明を説明するためにのみ用いられるものであり、発明の範囲の限定とみなされるべきではないことに留意すべきである。特定の手法又は条件について言及されていない例に対しては、その手法および条件は、本分野の文献(たとえば、J. Sambrook et al., [Peitang Huang et al.による翻訳], Laboratory Manual of Molecular Cloning, Third Edition, Science Press)または製品マニュアルに記載された事項に基づくものである。試薬または器具の製造者の言及がない場合には、その試薬または器具は、すべての従来の生産物であって商業的に購入しうるものである。
【００３３】
例1：真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELの構築
1. 材料および方法
1.1 プラスミド、細胞および主要な試薬
原核生物発現ベクターpGEMT-B7-1-PE40KDEL(2003.3.3)はわれわれのグループによって構築された。該ベクターを含む株はEschericiah coli DHA5α-pGEMT-B7-PE40KDELと命名され、中国微生物菌株保存管理委員会普通微生物センター（China General Microbiological Culture Collection Center、No 1 Building, No.3, Beichen west Road, Chaoyang district Beijing, China）に受託番号CGMCC NO.4987として2011年6月27日に寄託された。前記発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)は我々の部門に保存されている。ZeocinTM、TRIzolおよびLipofectamineTM2000はInvitrogen Corpから購入された。DMEM/F12培地はGibco Incから購入された。Jurkat細胞およびRaji細胞系は我々の部門に保存されていたものである。CHO-K1-RPE.40細胞系はJM MoehringおよびTJ Moehringにより樹立されたものであり、好意によりSucic Joseph博士から提供された。抗シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Aウサギポリクローナル抗体は、Sigma Incから購入された。CD80モノクローナル抗体は、R&D Incから購入された。PVDF膜(ポリフッ化ビニリデン)およびアミコンウルトラ−４（Amicon Ultra-4）はMillipore Incから購入した。超増感化学発光検出試薬はPierce Incから購入された。MTS(CellTiter 96 AQueous One Solution細胞増殖アッセイ)およびPureYieldTMプラスミドミディプレップシステム（midiprep system）はPromega Co. Ltd.から購入された。逆転写キットSYBR(R) Premix Ex TaqTM、KpnI、XbaI、およびT4リガーゼはTaKaRa Bio. Incから購入された。TMB(3,3,5,5'-テトラメチルベンジジン)発色基質溶液および2×Pfu PCR MasterMixはTiangen Biotech(北京)Co., Ltdから購入された。QIAquickゲル抽出キットはQIAGEN Incから購入された。
【００３４】
1.2 主な機器
使用された主な機器には、9700 PCR装置(PerkinElmer)、Du(R)640紫外線検出器(Beckman)、Mini II蛋白電気泳動装置およびセミドライ式蛋白導入装置(Bio-Rad)、Gel-Pro3.1ゲルイメージングシステム(Media Cybernetics)、550 自動マイクロプレートリーダーおよびリアルタイム定量PCR装置(Stratagene、 Mx3005P)が含まれる。
【００３５】
1.3 真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELの構築
シグナルペプチド配列およびKpnI制限酵素認識部位を含む上流プライマー(P1)と、XbaI制限酵素認識部位を含む下流プライマー(P2)が設計された。シグナルペプチド配列は、Invitrogen Inc.のpSecTag2-Bベクターの配列、すなわちマウスIgのk鎖V-J2-Cのシグナルペプチドに基づくものであって、細胞外空間に大量に分泌されることができるものであった。プライマーの配列は以下のとおりであった：
上流プライマーP1：
【化２】
2014505473.tif 000003
【００３６】
下流プライマーP2：
P2： 5’TCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGG 3’(配列番号：5、下線部はXbaI制限酵素認識部位である。)
シグナルペプチド配列が付加されたP1配列は長すぎるため、スプライスオーバーラップエクステンション（SOE）PCR法が、P1をオーバーラッピング増幅のための２つのプライマーに分割するために用いられた。
【００３７】
P1-A：
5’CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG 3’ (配列番号：6)
P1-B：
5’GGTACCTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA 3’ (配列番号：7)
【００３８】
原核生物発現ベクターであるGEMT-B7-1-PE40KDELプラスミドが、テンプレートとして用いられ、高忠実度Pfu DNAポリメラーゼがPCR増幅のために用いられた。反応系は以下のとおりであった：
2×PfuPCRマスターミックス        12.5μl
P1(20μM)                          0.5μl
P2(20μM)                          0.5μl
pGEMT-B7-1-PE40KDEL(1：50)         3μl
ddH2O                              8.5μl
全容積                              25μl
【００３９】
PCR反応条件は以下のとおりであった：96℃で5分間のプレ変性、96℃で1分間の変性、63℃で1分間のアニーリング、および72℃で2分間の30サイクルの伸長、それに続く72℃で10分間の伸長。生産物は、1%アガロースゲル電気泳動を用いて分離された。
【００４０】
PCR産物は回収され、回収されたPCR産物およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターは、KpnI+XbaIにより同時に消化され、消化された産物は電気泳動の後に回収された。消化系は以下のとおりであった：
10×バッファM                                    2μl
XbaI                                              1μl
KpnI                                              1μl
0.1%BSA                                          2μl
回収PCR産物およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクター      14μl
全容積                                            20μl
【００４１】
混合物は、37℃で3時間水槽に置かれた。
【００４２】
消化産物は以下の工程で回収された：
1)アガロースゲルからの標的バンドは、清潔な刃で切り出され1.5ml EPチューブ内に置かれた。
【００４３】
2)ゲルは計量され、バッファQGに対応する容積が、100mgゲル：300μlバッファQG.の比率で添加された。
【００４４】
3)ゲルは50℃で10分間、水槽中で完全に溶解するまでインキュベートされ、チューブは十分に攪拌するために2−3分ごとに上下をひっくり返した。
【００４５】
4)１容積のイソプロパノールが添加され十分に攪拌された。
【００４６】
5)試料はQIAquickカラムにロードされ、１分間遠心処理された。液体を廃棄後、0.5mlのバッファQGが添加され、試料はさらに１分間遠心処理された。
【００４７】
6)廃液を廃棄後、75mlのバッファPEが添加され、カラムは２−５分間放置され、１分間遠心処理された。
【００４８】
7)廃液の廃棄後、カラムは１分間遠心処理され、清潔な1.5ml EPチューブ内に置かれた。
【００４９】
8)30マイクロリットルの注射グレードのH2Oがカラムメンブレンの中心に添加され、１分間放置後、チューブは１分間遠心処理された。それから溶離液が収集された。
【００５０】
9)二重消化されたPCR産物およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターはライゲーションされた。ライゲーション反応は、以下のように組み合わせられた：
2×T4リガーゼバッファ                  5μl
T4リガーゼ                            1μl
二重消化されたPCR産物                3μl
二重消化されたpcDNA3.1/Zeo(+)ベクター  1μl
全容積                                  10μl
【００５１】
ライゲーション反応液で満たされたチューブは4℃の氷水中に一晩置かれた。
【００５２】
以下の方法が、ライゲーション産物をDH5aコンピテント細菌にトランスフェクトするために用いられた：
1)5ミリリットルのライゲーション産物および20μlの試薬は滅菌水で100μlに希釈され；それから反応液は後に使用するために氷上に置かれた。
【００５３】
2)DH5aコンピテント細菌は氷上で解凍され(5分間)、上記の希釈されたプラスミドが添加された。
【００５４】
3)混合液は氷上に20分間置かれ、室温で10分間放置された。前記細菌は培養皿の上に置かれ、37℃で一晩インキュベートされた。
【００５５】
アンピシリン耐性細菌クローンが選択され、プラスミドが抽出され、それから制限酵素による二重消化により選別された(上記と同様の条件)。陽性クローンは、配列決定のためにTaKaRa Bio., Inc.に送付された。
【００５６】
正しい配列を有する前記細菌クローンは凍結保存され、培養され、および寄託され、Escherichia coli DHA5α-pcDNA3.1/B7-1-PE40KDELという名称で、2011年6月27日に中国微生物菌株保存管理委員会普通微生物センター（China General Microbiological Culture Collection Center、No 1 Building, No.3, Beichen west Road, Chaoyang district Beijing, China，寄託番号はCGMCC NO.4986)に寄託された。PureYieldTMプラスミド抽出キットが、多量のプラスミドを抽出し精製するために使用された。精製されたプラスミドは、OD 260/280の比が1.8-2.0で濃度が>0.5μg/μlの食塩水中で溶解された。
【００５７】
1.4 組み換えプラスミドpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELのCHO-K1-RPE.40細胞中での一過性の発現
0.5×105-2×105のCHO-K1-RPE.40細胞が6ウェルプレート(2mlの培地：DMEM/F12、7.5%FBS、1×非必須アミノ酸)中に接種された後、リポソームトランスフェクション法が適用された：4μlのプラスミドおよび10μlのLipofectamineTM2000がそれぞれ250μlのOPTI-MEM I培地で希釈され、それから混合され、20分間インキュベートされた。混合液は、ゆっくりと6ウェルプレートに加えられ、それから37℃、5%CO2で6時間インキュベートされた。それから培地は、完全DMEM培地に置き換えられた。48時間後、細胞および上澄み液が集められ、RT-PCRおよびウェスタンプロット解析を用いて選別された。
【００５８】
1.5 トランスフェクトされた細胞におけるB7-1-PE40KDEL mRNAのRT-PCR解析
トランスフェクションから48時間後、増殖相にあるCHO-K1-RPE.40細胞は、PBSで2回洗浄された。TRIzolキットの指示書にしたがって全RNAが抽出され、それから前述のP1およびP2プライマーを用いたPCR増幅のために、cDNAに逆転写された。β-アクチンが対照コントロールとして使用された。
【００５９】
逆転写反応は以下のように組み合わせられた：
MgCl2                    2μl
10×RNA PCRバッファ    1μl
dNTP混合液              1μl
RNaseインヒビター        0.25μl
AMV                      0.5μl
オリゴdT                  0.5μl
RNA                      4.75μl
全容積                    10μl
【００６０】
反応条件は、42℃で30分間、99℃で5分間、それから5℃で5分間であった。
【００６１】
PCR反応系は以下のとおりであった：
MgCl2                      3μl
10×LAバッファ            4μl
ddH2O                      31.75μl
LA Taq                      0.25μl
P1(20μm)                    0.5μl
P2(20μm)                    0.5μl
第一鎖（First-Strand）cDNA  10μl
全容積                        50μl
【００６２】
反応条件は、以下のとおりである：96℃で5分間の前変性、96℃で1分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、および、72℃で3分間、30サイクルの伸長、それに続く72℃で10分間の伸長。PCR産物は1%アガロースゲル電気泳動で同定された。
【００６３】
β-アクチンプライマーの配列は以下のとおりである：
上流プライマーP1： 5’CTG TGG CAT CCA CGA AAC TA 3’(配列番号：8)
下流プライマーP2： 5’ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC 3’(配列番号：9)
【００６４】
1.6 トランスフェクト細胞におけるB7-1-PE40KDEL蛋白発現のウェスタンブロット解析
1)蛋白電気泳動：トランスフェクション後48時間で、CHO-K1-RPE.40細胞培養物の上澄みが収集され、濃縮された。続いて、15μlの試料および15μlの2×SDSローディングバッファが組み合わせられ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のために5分間煮沸された。蛋白電気泳動は、80Vで蛋白のバンドが濃縮ゲルから泳動するまで行われ、その後、150Vで、蛋白のバンドが分離ゲルの底に到達するまで電気泳動され、その時点で電源が切られた。蛋白電気泳動の配合は以下のとおりである：
10%分離ゲル(5ml)              5%濃縮ゲル(2ml)
ddH2O                        1.90ml                        1.40ml
30%アクリルアミド            1.70ml                        0.33ml
1.5M Tris-HCl(pH 8.8)          1.30ml                        ―――
1.0M Tris-HCl(pH 6.8)          ―――                        0.25ml
10%SDS                        0.05ml                        0.02ml
10%過硫酸アンモニウム        0.05ml                        0.02ml
TEMED                      0.002ml                        0.002ml
【００６５】
2)メンブレンへの転写：蛋白は、フッ化ポリビニリデン(PVDF)メンブレンに電気的に転写された。PVDFメンブレンとして、Immobilon-Pが選択され、メタノール中に15秒間、その後水中に2分間、それから電気的転写バッファ中に20分間、浸された。その間、フィルター紙およびゲルは、電気的転写バッファ中で15分間洗浄された。転写系は、+(白色)/3層フィルター紙/メンブレン/ゲル/3層フィルター紙/黒色として準備された。転写は、60mAで40分間行われた。
【００６６】
3)メンブレンは、室温で2時間ブロックされた。
【００６７】
4)ブロッキング溶液とともに適切に希釈された一次抗体、ウサギ抗PEA抗血清、またはCD80モノクローナル抗体が添加され、メンブレンは、4℃で一晩インキュベートされた。
【００６８】
5)メンブレンは、TBSTで3回、各5分間洗浄された。
【００６９】
6)ブロッキング溶液とともに希釈されたHRP-抗ウサギまたはHRP-抗ヤギIgG二次抗体が添加され、メンブレンは室温で１時間インキュベートされた。
【００７０】
7)メンブレンは、TBSTで3回、各10分間洗浄された。
【００７１】
8)ECL法がゲルの像を現像するために用いられた。
【００７２】
1.7 組み換えプラスミドpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELによるCHO-K1-RPE.40細胞の安定的トランスフェクション
リポソームトランスフェクションが、1.4.節で概略が示されたと同様の手順で行われた。トランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされた細胞は、1：20の割合で希釈され、ZeocinTMが800μg/mlの濃度まで添加された。培地は4日ごとに交換され、Zeo(+)クローンのサイズが徐々に増大しているときに、細胞は24ウェルのプレートに接種された。細胞がコンフルエントな状態に達したとき、細胞は、複数プレートでの継続的培養のために、6ウェルのプレートに接種された。細胞は、リアルタイム定量RT-PCR法により確認され、陽性細胞クローンは凍結保存され後の使用のために保存された。
【００７３】
1.8 酵素標識イムノソルベント検定法(ELISA)によるトランスフェクトされた細胞におけるB7-1-PE40KDEL蛋白発現の分析
1)トランスフェクションの48時間後、安定的にトランスフェクトされた細胞の培養物の上澄みが採集され濃縮された。
【００７４】
2)一晩のうちに、10マイクロリットルの濃縮液は1：10の割合で希釈され、96ウェルのプレートに加えられた。各ウェルの容積は100μlであり、各試料につき3つのウェルが準備された。
【００７５】
3)試料は、ブロッキング溶液で1時間ブロックされた。
【００７６】
4)抗PEAポリクローナル抗体が添加され、37℃で1時間インキュベートされた。
【００７７】
5)プレートはPBSTで３回洗浄された。
【００７８】
6)HRP-抗ウサギIgG抗体が添加され、37℃で1時間インキュベートされた。
【００７９】
7)プレートはPBSTで3回洗浄された。
【００８０】
8)発色TMB溶液が添加され、15分後に、反応は2mol/LのH2SO4により反応が停止された。450nmにおいて光吸収値が測定され、対応する濃度が計算された。
【００８１】
9)トランスフェクトされていない細胞が、ブランクコントロールとして使用され、PEAが標準曲線を描く場合の標準として使用された(Kirman JR, Seder RA. DNA vaccination: the answer to stable, protective T-cell memory? Curr Opin Immunol, 2003, 15: 471-476)。
【００８２】
1.9 真核生物で発現したB7-1-PE40KDELの選択的細胞障害性の解析
CD28を高発現するヒトリンパ腫細胞系のJurkat細胞とpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELで安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40陽性細胞は、96ウェルプレートで濃度1×105/ml、37℃、5%CO2で48時間、共培養された。それから20μlのMTSが添加され；1時間後、490nmでの吸光度値が測定され、細胞障害活性が算出された。CD28を低発現するヒトBurkitt'sリンパ腫細胞系Rajiがネガティブコントロールとして使用された。細胞死率は以下のように算出された：
細胞死率=(1−安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞と標的細胞との共培養ウェル中での生存細胞数／トランスフェクトされていないCHO-K1-RPE.40細胞と標的細胞との共培養ウェル中での生存細胞数)×100%
【００８３】
2. 結果
2.1 真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELの構築
B7-1-PE40KDEL融合遺伝子を真核生物細胞中で発現させるために、B7-1-PE40KDELおよびZeo(+)遺伝子を含む真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELが、図１に示すように構築された。設計されたPCRプライマーが、ヒトB7-1-PE40KDELを増幅するために使用され、アガロースゲル電気泳動により分析された。予測される1,850bpの明確なバンドが観察された(図2)。回収された二重消化産物は、真核生物発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)のKpnIおよびXbaI制限酵素認識部位にクローニングされ、組み換えプラスミドpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELが構築され、要請クローンを得るために、その後、抽出され、電気泳動され(図3)、配列決定によりスクリーニングされた(図4.配列は別添１に示されている)。配列決定の結果、シグナルペプチド配列に続く配列中には、いかなる点突然変異もフレームシフトも存在しないことが明らかとなり、原核生物発現プラスミドpRSETA-B7-1-PE40KDELの配列と一致していた。B7-1-PE40KDEL、ヒトB7-1およびPE40間の蛋白の一次構造および二次構造の比較結果は表1に示されている。
【表１】
2014505473.tif 000004
【００８４】
2.2 真核生物細胞からのB7-1-PE40KDEL外毒素融合遺伝子の発現解析
正しい配列を有する真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELは、CHO-K1-RPE.40細胞に一過性のトランスフェクトをされ、発現されたB7-1-PE40KDEL融合蛋白を検出するために、以下の方法が用いられた：第一にRT-PCRがトランスフェクトされた細胞中のB7-1-PE40KDEL mRNAの発現を検出するために用いられた。pcDNA3.1/B7-1-PE40KDELでトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞には、1,850bpの明確なバンドが見られ、該明確なバンドは空のベクターでトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞には見られなかった。β-アクチンのPCR産物が内部参照として用いられた(図4)。ウェスタンプロット解析が、細胞培養物の上澄み中のB7-1-PE40KDEL融合蛋白の抗原性と分泌発現を検出するために行われた。結果は、ウサギ抗PEA抗血清またはCD80モノクローナル抗体を用いて62-83kDaの陽性バンドが見られたが、空のベクターでトランスフェクトされた細胞ではバンドは見られなかった(図5)。
【００８５】
2.3 安定的にトランスフェクトされた細胞のスクリーニングとB7-1-PE40KDEL融合蛋白の発現解析
スクリーニングされた40クローンのリアルタイム半定量解析により、16クローンが陽性である事が示された。これらの陽性クローンは、その後、培養されバッチで凍結保存された(図6)。安定的にトランスフェクトされた細胞におけるB7-1-PE40KDELの分泌発現量を検出するために、いくつかの陽性クローンの細胞培養物の上澄みをサンプルとして、ELISAおよび既知の濃度のPEAを標準として用いて、蛋白濃度の標準曲線のグラフを描いた(表2、図7)。これらのサンプルからの各上澄みのOD値は、それぞれの安定的にトランスフェクトされたクローンにおける分泌量を得るために標準曲線と比較された。結果は表3に示されている。結果によると、トランスフェクション後24時間で、約287pg/mlのPEA蛋白が1×106の安定的にトランスフェクトされた細胞で発現していることが示されている。
【表２】
2014505473.tif 000005
【００８６】
OD450を縦座標としPEA濃度を横座標として、Curve Expert 1.3ソフトウェアを用いて標準曲線を描いた。多項近似式の標準曲線(図7)は、安定的にトランスフェクトされた細胞株の細胞培養物の上澄みからPEA濃度を算出するために用いられた。
【表３】
2014505473.tif 000006
【００８７】
2.4 真核生物で発現したB7-1-PE40KDELの選択的細胞障害活性
CD28を高発現するヒトリンパ腫細胞系Jurkatが、真核生物で発現したB7-1-PE40KDELの選択的細胞障害活性を検出するために用いられた。CD28を低発現するヒトBurkitt'sリンパ腫細胞系Rajiが、ネガティブコントロールとして使用された。MTTの結果によれば、安定的にトランスフェクトされた細胞とJurkat細胞を一緒にインキュベーションしてから48時間後のOD値は0.782であり、トランスフェクトされていない細胞ではOD値は1.466、Jurkat細胞単独では1.29、安定的にトランスフェクトされた細胞とRaji細胞を共培養した場合は1.296、トランスフェクトされていない細胞単独では1.564であった。前記式によれば、安定的にトランスフェクトされた細胞によるJurkat細胞とRaji細胞の細胞死の率は、92.87%と15%であり、特に、この結果により、真核生物で発現されたB7-1-PE40KDELが、CD28陽性細胞に対して、in vitroで良好な選択的阻害効果を有することが確認された(図8)。
【００８８】
例2：B7-1-PE40KDELのDNAワクチン(1)によるaGVHDに対する保護
1. 材料および方法
1.1 プラスミド、細胞および主な試薬
真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELが、我々のグループにより構築された。この真核生物現ベクターは、以前にDr. Hong Xueにより構築され保存されていたものである。ウサギ抗シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Aポリクローナル抗体は、Sigma Incから購入された。FITC-抗マウスCD3抗体、PE-抗マウスCD28抗体およびPharmlyseTMは、BD Incから購入された。SYBR(R)Premix Ex TaqTM（perfect real-time)は、TaKaRa Bio. Incから購入された。注射用のMTXは、Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.から購入され、シクロスポリンAは、Novartis Pharma Schweiz AGから購入された。マウスリンパ球分離溶液Tianjin Hao Yang Biological Products Co. Ltdから購入された。
【００８９】
ドナー雄マウスC57BL/6(H2b)およびレシピエント雌マウスBalb/c(H2d)は、特別の病原体フリーの環境に収容され、実験の当初の体重は16-18gおよび18-22gであった。すべての実験動物は、Animal Center of the Academy of Military Medical Sciencesにより提供され、飼育条件は、特定の病原体フリー(SPF)レベルであった。Department of Pathology at the Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciencesが、病理学的サンプルの準備および観察を補助した。フローサイトメトリー解析は、Institute of Radiation Medicine of the Academy of Military Medical Sciencesにより行われた。リアルタイム定量PCR解析は、Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciencesの血液センターで行われた。
【００９０】
1.2 主要な機器
in vivo遺伝子導入器具WJ2002(Scientz Biotechnology Co. Ltd.)および自動マイクロプレート読取り機550(Bio-Rad Laboratories, Inc.)が我々の研究で使用された。
【００９１】
1.3 aGVHDマウスモデルの樹立
レシピエントマウスには、感染を防ぐために、移植の一週間前にゲンタマイシン(32×104U/L)およびエリスロマイシン(250mg/L)を含む飲料水が与えられ、滅菌されたクリーンベンチ（laminar airflow cabinet）内で飼育された。60Coの全身照射(TBI)(8.0Gy、線量率は1.8Gy/分)が、移植の4時間前に施された。
【００９２】
ドナー骨髄細胞および脾臓細胞の調製は以下のように行われた：C57BL/6ドナーマウスは、頚椎脱臼により屠殺され、その後、75%エタノールに数分間漬けられた。大腿骨は、無菌的に外科用鋏により得られ、RPMI-1640培養培地が骨髄を骨髄腔から流し出すために使用され、その後、200メッシュの細胞篩を通して移動された。次に、0.83%塩化アンモニウム溶液が赤血球を洗浄するために用いられ、続けて、RPMI-1640培養培地で2回洗浄した(1000rpm、10分間)。これにより骨髄細胞の単一細胞の懸濁液が得られた。それから細胞濃度が1×108/mlに調整された。加えて、脾臓が無菌的に取り除かれ、200メッシュの細胞篩の上に置かれた。細胞が遠心処理により収集された後、0.83%NH4Cl溶液が赤血球を洗浄するために用いられ、その後、RPMI-1640培養培地で2回洗浄された(1000rpm、10分間)。得られた脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、その後、細胞濃度1×108/mlに調整された。
【００９３】
調製された脾臓細胞および骨髄細胞は、尾部静脈注射により、全グループのレシピエントマウスに注入された。注入された細胞の数は、2×107脾臓細胞/マウスおよび1×107骨髄細胞/マウスであった。安定的なaGVHDマウスモデルの樹立は、移植後の、身体的な徴候、造血再生の評価、病理学的解析およびキメリズム解析により確認された。
【００９４】
1.4 aGVHDマウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンによるaGVHDに対する保護のプロトコール
60匹のaGVHDマウスが、ランダムに、各グループがマウス10匹からなる6グループに分けられた：(1)B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループ；(2)B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ；(3)B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ；(4)空のベクターグループ；(5)CsA+MTXポジティブコントロールグループ；および(6)非処置aGVHDグループ。空のベクターおよびDNAワクチンベクターの双方は、生理食塩水に溶解された。プラスミドベクターのRNAのコンタミネーションはなかった。内毒素が除去された。超螺旋性DNAがDNAの70%-80%を占めていた。OD260/OD280率は1.8-2.0の範囲であった。濃度は0.5μg/μlを下回らなかった。予備実験によれば、75μgのB7-1-PE40KDEL DNAワクチンが注入されたとき、aGVHDに対する保護は副作用がほとんどなく良好であった。移植後ただちに、75μgの空のベクターまたはDNAワクチンベクターが、マウスの四頭筋に注射され、遺伝子を効率よく体に送達するために、注射部位に電気パルス仲介刺激が与えられた。パルスのパラメーターは以下のとおりである：電圧、200V/cm；パルス幅、10ms；パルス数、6；周波数、1Hz(Mir LM, Bureau MF, Gehl J, et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96: 4262-4267)。「金基準」であるCsA+MTX養生法は、臨床診療ではよく用いられているが、コントロール薬物として採用された。CsAは、腹腔内注射により1日1回1.5mg/kg.dの用量で投与された。MTXは、腹腔内注射により、1、3、6および11日に0.4mg/kg.dの用量で投与された (Xu K, Li C, Pan X, et al. Study of Relieving Graft-versus-Host Disease by Blocking CD137-CD137 Ligand Costimulatory Pathway in Vitro. Int J Hematol, 2007, 86:84-90.)。
【００９５】
1.5 標準マウスにおけるB7-1-PE40 KDEL DNAワクチンの発現
電気パルス仲介筋肉内注射が、75μgの精製されたB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの、標準Balb/Cマウスの四頭筋への注射に使用され、電気刺激が与えられた(200V/cm、10ms、1Hz、6パルス)。1、7、14、21、28、および35日目に、注射後、血液を採集するために眼球が除去され、ヘパリンで処理された。トリゾール（TRIzol）キットが、RNAを抽出するために使用され、RT-PCRが、B7-1-PE40KDEL mRNAの発現を定性的に検出するために使用された。リアルタイム定量PCRが、さらにPE40 mRNAの血液発現レベルを比較するために使用された。β-アクチンが、内部参照として使用された。
【００９６】
RNA抽出は以下のように行われた：マウスリンパ球分離溶液がマウスの末梢血(約1ml)から白血球細胞を単離するために使用され、1mlのトリゾールが添加される前にPBSで2回洗浄された。単離された細胞は、室温で5分間放置され、その後200μlのクロロフォルムが添加され、振とうにより十分に混合された。層別化の後、混合物は4℃および12,000gで15分間遠心処理された。上層の水性層は、他のチューブに移され、500μlのイソプロパノールが添加され、十分に混合された。室温で10分間放置後、混合物は4°Cおよび12,000gで10分間、遠心処理された。上澄みは廃棄され、RNAはチューブの底にあり、75%エタノールで洗浄後、4℃および8000gで5分間遠心処理された。その後、上澄みは廃棄された。エタノールを完全に蒸発させた後、RNAは適切な量のDEPC処理水に溶解され、UV分光光度計で定量的に測定された。
【００９７】
逆転写の反応条件は、以下のとおりである：
MgCl2                      2μl
10×RNA PCRバッファ      1μl
dNTP                      1μl
RNase阻害因子              0.25μl
AMV                      0.5μl
オリゴdT                  0.5μl
RNA                      0.5μg
全容積                      10μl
【００９８】
反応条件は、42℃で30分間、99℃で5分間および5℃で5分間である。
【００９９】
マウスβ-アクチンプライマーの配列は：
上流プライマーP1： 5’AGG CAT CCT GAC CCT GAA GTA C 3’(配列番号：10)
下流プライマーP2： 5’TCT TCA TGA GGT AGT CTG TCA G 3’(配列番号：11)
【０１００】
PCR反応は以下のように組み立てられた：
SYBR(R)Premix Ex TaqTM(2×)    12.5μl
ddH2O                          10.5μl
P1(20μM)                        0.5μl
P2(20μM)                        0.5μl
cDNA                            1μl
全容積                            25μl
リアルタイムPCR反応：
第1部：前変性
反復：1サイクル
95℃で5分間
第2部：PCR反応
反復：35サイクル
94℃で30秒
59℃で30秒
72℃で60秒
第3部：解離
【０１０１】
1.6 標準マウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンのIn vivo活性
75μgの精製されたB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの注射後、1、7、14、21、28および35日に、マウス眼球が除去され、血液が採集されヘパリンで処理された。FITC-抗マウスCD3抗体およびPE-抗マウスCD28抗体の双方を1マイクロリットル、100μlの抗凝固性の血液に添加し、その後、室温で、暗所で30分間インキュベートした。次に、2mlのPharmlyseTM赤血球溶解素バッファが添加され、その後、室温で、暗所で15分間インキュベートされた。混合液は、それから1500rpmで5分間遠心処理された。上澄みの廃棄後、ペレットはPBSに再懸濁され、その後、1500rpmで5分間遠心処理された。上澄みの廃棄後、0.5mlの2%パラホルムアルデヒド-PBSが検出のために添加された。
【０１０２】
1.7 B7-1-PE40KDEL DNAワクチンで処置された標準マウスにおける抗PEA抗体の検出(Chen SY, Yang AG, Chen JD, et al. Potent antitumor activity of a new class of tumor-specific killer cells. Nature, 1997, 385:78-80.)
B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射から21日後、マウス眼球が除去され、血液が採集され遠心処理され、後に使用するために血清が-20℃で保存された。ELISAは以下のように実施された：PEA(1mg/mL)がコーティングバッファに溶解され、各ウェルは200ng/100μlでコートされ、その後、4℃で一晩インキュベートされた。翌日、ウェルはPBSTで2-3回洗浄され、それからウシ血清ブロッキング溶液中で、室温で2時間ブロックされた。血清サンプルおよび標準サンプル(100μl/well)は、37℃で1時間インキュベートされ、PBSTで3回洗浄された。次に、1：50,000の割合で希釈された100μlのHRP-抗マウスIgG抗体が各ウェルに添加され、37℃で1時間インキュベートされた。PBSTで4回洗浄した後、100μlのTMB色素溶液が各ウェルに添加され、37℃で15分間インキュベートされた。反応は、50μlの2M H2SO4を各ウェルに添加することで終了され、吸光度値が450nmで測定された。ウサギ抗PEAポリクローナル抗体が、ポジティブコントロールとして用いられ、pcDNA3.1の空のベクターを注射したマウスの血清がネガティブコンとロールとして使用された。
【０１０３】
1.8 B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの毒性および副作用
75μgのB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射後、身体的な徴候およびマウスの行動が観察された。加えて、7、14および21日目に、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンがマウスにおいて毒性または副作用があるかに関する予備的観察を行うために、心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓が病理組織学的検査のために採取された。
【０１０４】
1.9 GVHDマウスの身体的徴候に関するB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの効果
全グループのマウスの体重が毎日測定され、毛、精神および下痢などが観察された。
【０１０５】
1.10 GVHDマウスにおける造血再生に関するB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの効果
事前調整の後に、20μlの血液が尾の静脈から採集され、通常の間隔で血球計によりカウントするために380μlの白血球細胞希釈液で希釈され、全グループのマウスにおける血液および造血再生の変化を理解するために使用された。
【０１０６】
1.11 GVHDマウスにおけるキメリズムに関するB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの効果
異なる性のマウスが、骨髄移植におけるドナーおよびレシピエントとして使用された。したがって、ゲノムDNAは、雌レシピエントマウスの末梢血から抽出することができ、Y染色体特異的遺伝子sryのプライマーは、移植の生着の検出のために雄ドナーマウスのY染色体をPCR増幅するために設計することができた。
【０１０７】
sryプライマー1： 5’-TGTGGTCCCGTGGTGAGA-3’(配列番号12)；
プライマー2： 5’-ATCAACAGGCTGCCAATAAA-3’(配列番号13).
【０１０８】
1.12 GVHDマウスの組織病理学に関するB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの効果
移植後21日目に、全グループのマウスの肝臓、脾臓、小腸および皮膚が除去され、10%ホルマリン溶液で固定され、その後、組織病理学的変化を観察するために、パラフィン切片が作成されHE染色が行われた。
【０１０９】
1.13 統計的解析
SPSS 13.0ソフトウェアが、統計的解析のために使用された。t検定が、2つのグループ間の平均測定データにおける相違の統計的有意性を検定するために用いられた。ノンパラメトリック検定(Mann-Whitney検定)が、2つのグループ間の整列されたデータの比較に用いられた。P<0.05の場合に統計的に有意と考えた。SPSS 13.0ソフトウァアは、Kaplan-Meier生存カーブを描くためにも使用された。
【０１１０】
2. 結果
2.1 標準マウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの発現
RT-PCRの結果(図9)は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの注射後、1、7、14、21、28および35日目にB7-1-PE40KDELのmRNAが検出可能であることを示している。我々は、β-アクチンを内部標準として使用した。
【０１１１】
リアルタイム定量PCR(図10)は、PE40KDEL mRNAの発現が、1および7日目に比較的高く、それから発現レベルは時間経過とともに、28および35日目の最低レベルまで徐々に減少したことを示している。
【０１１２】
2.2 標準マウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンのin vivo活性
B7-1-PE40KDELは、CD28を高レベルで発現している細胞を特異的に殺傷することができるので、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンを注射したマウスの末梢血からのCD28+T細胞の除去を分析するために、フローサイトメトリー解析が行われ、幾何平均蛍光強度(Geo mean)として示された(図11)。結果は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射から7日後に、CD28＋T除去効果が現れ始め、血液CD28＋T細胞の幾何平均蛍光強度がコントロールの標準マウスのそれと比較して低いことを示した。注射後21日目には、CD28＋Tの数は最低のレベルに低下した。注射後28および35日目には、CD28＋Tの数は徐々に回復したが、CD28＋T細胞の幾何平均蛍光強度は、依然として標準マウスより低いままであった。この結果は、B7-1-PE40KDELの発現レベルの低下に伴い、CD3+CD28+T細胞が通常レベルに回復する傾向をみせているということを示唆している(図12)。
【０１１３】
2.3 B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射後のマウスにおける抗PEA抗体血清の検出
ELISAを使用して抗PEA抗体のレベルが検出された。市販の抗PEA抗体が、標準曲線を描くための標準として使用された。OD450が横座標として使用され、抗PEA抗体濃度が縦座標として使用され、CurveExpert 1.3ソフトウェアを使用して標準曲線が描かれた(図13)。二次近似式が抗PEA抗体血清の濃度を産出するために用いられた(表4)。B7-1-PE40KDEL DNAワクチンを筋肉内注射したグループの抗PEA抗体レベルは、ポジティブコントロールグループのそれと比較して有意に低く(p<0.05)、ネガティブコントロールグループ（すなわち空のベクター注射グループ）のそれと比較して差異は見られなかった。
【表４】
2014505473.tif 000007
【０１１４】
2.4 標準マウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの毒性および副作用
75μgのB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射後、マウスは毎日観察されたが、身体的徴候や行動における異常は見られなかった。注射後7、14およぴ21日目に除去された心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓の病理組織学的検査は、いかなる病理学的変化も示さなかった。
【０１１５】
2.5 aGVHDマウスモデルの樹立
移植の1週間後、レシピエントマウスは、毛色の変化、気力低下、食欲の減少、腹部および頭部における重篤な脱毛、下痢、黒糞、潰瘍および円背のような、典型的なGVHD症状を示し始める(図14)。その平均体重は、ほぼ1g/dayの割合で徐々に減少し、10日目には約14.77±1.66gの低点に到達する。その後、体重は増加し始め、それから14日目以降に再び徐々に減少し始め、死に至る。全体重損失は死亡時に約8gであった(図15)。末梢血中でカウントされる白血球細胞数は、1日目から低下し始め、3〜4日目に最低(0.69±0.18×109/L)となった。カウント数は6日目に回復し始め、14日目にピークに達し、その後低下し続けた。白血球細胞数は、死亡時には1.54±0.14×109/Lであった。移植後35日目には、雄ドナーマウスの特異的Y-染色体sry遺伝子配列を、図16に示すように371-bpの断片として、すべてのレシピエントマウスの末梢血において検出することができ、移植が成功したことを示唆した。病理学的検査により典型的なGVHDの病理学的所見が以下のように示された：(i)腸粘膜における腺上皮細胞の壊死が小腸組織において見られ、上皮細胞および腺腔において壊死細胞の残骸が存在した；腺上皮細胞sは扁平であり、腺は嚢胞性であり、腺の数は減少し、腺は消滅し、および粘膜上皮細胞は脱落した(図17-A)；(ii)肝臓組織において、病巣の肝臓細胞の縮退および壊死が起き、リンパ球および好酸球の浸潤が観察された(図17-B)。肝臓細胞は膨化し変質した；(iii)脾臓において、我々は、大量の出血、脾性の繊維症、脾臓洞の拡張および出血、ならびに脾臓細胞の散在を観察した(図17-C)；(iv)皮下領域において繊維組織の増殖が観察され、真皮においてリンパ球の浸潤が起こった(図17-D)。GVHDモデルグループのすべてのマウスが放射線照射後24日以内に死亡し、生存時間の中央値は22.7日であった。骨髄移植グループの平均生存時間は60日を越えており、長期生存と考えられる。脾臓細胞注入グループの生存時間の中央値は9.6日であった。放射線照射単独のグループの生存時間の中央値は12.3日であった。すべてのグループのマウスの生存率はKaplan-Meier生存曲線において描かれた(図18)。上に列挙した典型的なGVHD症状のすべてにおいて、我々は安定した急性GVHDマウスモデルが樹立されたことを確認し、成功率は100%近かった。
【０１１６】
2.6 aGVHDマウスの身体的徴候に関するB7-1-PE40KDELおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンの効果
B7-1-PE40KDEL DNAワクチン(B7-1と呼ぶ。)、B7-2-PE40KDEL DNAワクチン(B7-2と呼ぶ。)、およびB7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン(B7-1+B7-2と呼ぶ)による治療の後、円背および脱毛の症状は他のグループと比較してかなり改善した。組み合わせ治療グループにおける脱毛の始まる時期は、他のグループにおけるより3-6日遅かった。便中の出血や肛門周囲の膨化は見られなかった。マウスの体重減少は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループにおいて最も少なく、続いてCsA+MTXグループ、B7-1-PE40KDEL +B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ、およびB7-2-PE40KDEL DNAワクチングループであった。空のベクターグループおよび未処置のGVHDグループ(NSグループ)のマウスは、最大の体重減少を示した。すべてのグループのGVHDマウスの処置後の体重変化を図19に示す。
【０１１７】
2.7 aGVHDマウスの造血再生に関するB7-1-PE40KDELおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンの効果
すべてのグループのaGVHDマウスの末梢血におけるWBC（白血球）の数は、1日目から減少し始め、3〜4日目の約0.6×109/Lの低値に至る。WBC数は、6日目に回復し始め、回復のレベルは、B7-1-PE40KDEL DNAワクチン、B7-2-PE40KDEL DNAワクチン、B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン、およびCsA+MTXのグループにおける方が、空のベクターグループおよび未処置グループよりも高かった。すべてのグループのうち、WBCの回復レベルは、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループにおいて最大であった。続いて、すべてのグループにおいて、WBC数は、再び>1.0×109/Lまで減少した(図20)。
【０１１８】
2.8 aGVHDマウスの組織病理学に関するB7-1-PE40KDELおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンの効果
すべてのグループのマウスの小腸組織に関して、処置後21日目に病理学的解析が行われた(図21)。結果によれば、グループC(B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)およびグループE(CsA+MTX)において、良好な腺上皮細胞の完全性と比較的少ない壊死細胞がみられることが明らかとなった。グループF(未処置のaGVHDグループ)においては、大量の粘液腺上皮細胞の壊死が見られ、粘膜上皮の脱落が最も重篤であった。皮膚の病理学的解析(図22)は、グループD(空のベクターグループ)およびグループF(未処置のaGVHDグループ)における、真皮領域における重篤な繊維組織の増殖を明らかにした。グループA(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン)、グループB(B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、グループC(B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、およびグループE(CsA+MTX)においては、病変はより軽度であり、リンパ球浸潤の程度もグループDおよびFにおけるよりも低かった。肝臓の病理学的解析(図23)は、グループAのみにおいて、肝臓細胞の膨化および水腫変性の程度が比較的低いことを明らかにした。他のグループにおいては、病巣の肝臓細胞変性および壊死、リンパ球および好酸球の浸潤、ならびに重篤な肝臓細胞の膨化および変性が見られた。
【０１１９】
2.9 aGVHDマウスの生存時間に関するB7-1-PE40KDELおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンの効果
7-1-PE40KDEL DNAワクチングループのマウスの生存時間は最長であり、生存時間の中央値は、51日であった。B7-2-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ、空のベクターグループ、CsA+MTXグループ、および未処置グループの生存時間の中央値は、それぞれ41、47、22.5、39.7、および21.5日であった。すべてのグループのマウスの生存率は、Kaplan-Meier生存曲線において描かれた(図24)。
【０１２０】
2.10 B7-1-PE40KDELおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチンによる処置後のすべてのグループのaGVHDマウスのキメリズム評価
移植後21日目に、雄ドナーマウスの特異的Y-染色体sry遺伝子が、すべての処置グループのマウスの末梢血から検出可能であり(図25)、すべてのグループにおいて移植が成功したことを示唆した。
【０１２１】
例3：B7-1-PE40KDEL DNAワクチンによるaGVHDに対する保護(2)
1. 材料および方法
1.1 実験動物
ドナー雄マウスC57BL/6(H2b)およびレシピエント雌マウスBalb/c(H2d)は、特定の病原体フリーの環境に収容され、実験開始時には体重は16-18gおよび18-22gであった。すべての実験動物は、Animal Center of the Academy of Military Medical Sciencesから提供され、飼育条件は特定の病原体フリー(SPF)のレベルであった。
【０１２２】
1.2 医薬および試薬
真核生物発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDELが、我々の部門において構築され保存された。真核生物発現ベクターは、第1部で述べたとおりに構築され保存された。注射用のMTXはJiangsu Hengrui Medicine Co., Ltdから購入された。シクロスポリンAはNovartis Pharma Schweiz AG.から購入された。FITC-抗マウスCD3抗体、PE-抗マウスCD28抗体、PE-Cy5-抗マウスCD8抗体、PE-Cy5-抗マウスCD4抗体、PE-抗マウスCD4抗体、およびPE-抗マウスCD25抗体は、すべてBD Incから購入された。Fluorokine MAPマウスインターフェロン(IFN)γ、インターロイキン(IL)-2、IL-4、IL-10、IL-12、腫瘍壊死因子(TNF)αキット、およびサイトカイン検出のためのLuminex液体チップ（liquid chips）は、R＆D Incにより提供された。腫瘍成長因子(TGF)βおよびIL-2 ELISAキットは、R&D Incにより提供された。
【０１２３】
1.3 aGVHDマウスモデルの樹立
レシピエントマウスには、感染を防ぐために、移植の一週間前にゲンタマイシン(32×104U/L)およびエリスロマイシン(250mg/L)を含む飲料水が与えられ、滅菌されたクリーンベンチ（laminar airflow cabinet）内で飼育された。60Coの全身照射(TBI)(8.0Gy、線量率は1.8Gy/分)が、移植の4時間前に施された。
【０１２４】
ドナー骨髄細胞および脾臓細胞の調製は以下のように行われた：C57BL/6ドナーマウスは、頚椎脱臼により屠殺され、その後、75%エタノールに数分間漬けられた。大腿骨は、無菌的に外科用鋏により得られ、RPMI-1640培養培地が骨髄を骨髄腔から流し出すために使用され、その後、200メッシュの細胞篩を通して移動された。次に、0.83%塩化アンモニウム溶液が赤血球を洗浄するために用いられ、続けて、RPMI-1640培養培地で2回洗浄した(1000rpm、10分間)。結果として、骨髄細胞の単一細胞の懸濁液が得られた。それから細胞濃度が1×108/mlに調整された。加えて、脾臓が無菌的に取り除かれ、200メッシュの細胞篩の上に置かれた。細胞が遠心処理により収集された後、0.83%NH4Cl溶液が赤血球を洗浄するために用いられ、その後、RPMI-1640培養培地で2回洗浄された(1000rpm、10分間)。結果として、脾臓細胞の単一細胞懸濁液が得られ、その後、細胞濃度は1×108/mlに調整された。
【０１２５】
調製された脾臓細胞および骨髄細胞は、尾部静脈注射により、全グループのレシピエントマウスに注入された。注入された細胞の数は、2×107脾臓細胞/マウスおよび1×107骨髄細胞/マウスであった。安定的なaGVHDマウスモデルの樹立は、移植後の、身体的な徴候、造血再生の評価、病理学的解析およびキメリズム分析により確認された。
【０１２６】
1.4 aGVHDマウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンによるaGVHDに対する保護プロトコール
B7-PE40KDEL DNAワクチンおよび他の処置処置の保護プロトコルは以下のとおりであった：薬剤は、すべてのグループのマウスに、移植後1日目に投与された。各グループがマウス5匹からなる6グループは以下のとおりであった：(1)B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループ；(2)B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ；(3)B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ；(4)空のベクターグループ；(5)CsA+MTXコントロールグループ；(6)未処置のaGVHDグループ；および(7)標準コントロールグループ。空のベクターおよびDNAワクチンベクターの双方は、生理食塩水に溶解された。プラスミドベクターのRNAのコンタミネーションはなかった。内毒素が除去された。超螺旋性DNAがDNAの70%-80%を占めていた。OD260/OD280率は1.8-2.0の範囲であった。濃度は0.5μg/μlを下回らなかった。移植後ただちに、75μgの空のベクターまたはDNAワクチンベクターが、マウスの四頭筋に注射され、注射部位に電気パルス仲介刺激が与えられた。パルスのパラメーターは以下のとおりである：電圧、200V/cm；パルス幅、10ms；パルス数、6；周波数、1Hz。「金基準」であるCsA+MTX養生法は、臨床診療ではよく用いられているが、コントロール薬物として採用された。CsAは、腹腔内注射により1日1回1.5mg/kg.dの用量で投与された。MTXは、腹腔内注射により、1、3、6および11日に0.4mg/kg.dの用量で投与された。
【０１２７】
1.5 Luminex液体チップ（liquid chip）によるaGVHDマウスにおける血清サイトカインの検出
移植後、7、14および21日後に、マウスの眼窩下の静脈叢から血液が吸引された。血清が遠心処理により分離された後、以下の工程が実施された。各サンプルは繰り返し検査された。
【０１２８】
1)実験前の以下を含む調製：
20ミリリットルの洗浄バッファ濃縮駅は500mlの洗浄バッファに希釈された；
サンプルは4倍に希釈された：37.5μlのRD6-40+12.5μlのサンプル；
標準サンプルの希釈：標準サンプルは0.9mlのRD6-40により標準カクテルに希釈され、さらに種々の濃度に希釈された；
ミクロスフィアの希釈：50μlのミクロスフィア濃縮液→5mlのミクロスフェア希釈液；
ビオチン抗体の希釈：50μlのビオチン抗体濃縮液→5mlのビオチン抗体希釈液；
スレプトアビジンPEの希釈：55μlのストレプトアビジン濃縮液→5.5mlの洗浄バッファ。
【０１２９】
2)すべての試薬、標準およびサンプルは、室温で調製された。
【０１３０】
3)100マイクロリットルの洗浄バッファが、マイクロプレート上のメンブレンを予め湿らせるために使用され、液体は真空洗浄機により除去された。
【０１３１】
4)希釈されたミクロスフィアは、シェイカーの穏やかな振とうにより再懸濁され、50μlのミクロスフィアが各ウェルに添加された。
【０１３２】
5)各ウェルに50μlの標準サンプルが添加された後、ウェルは密閉され、続いて、室温、暗所で(アルミフォイルでカバーして)3時間インキュベーションした。
【０１３３】
6)液体は真空洗浄機により除去され、プレートは3回100μlの洗浄バッファで洗浄された。
【０１３４】
7)50μlのビオチン抗体の希釈混合液の添加後、ウェルはメンブレンで密閉され、続けて、500±50rpmで振とうしつつ、室温、暗所で(アルミフォイルでカバーして)1時間インキュベーションした。
【０１３５】
8)プレートは、6)に記載されているように3回洗浄された。
【０１３６】
9)50μlのストレプトアビジンPEが各ウェルに添加された後、ウェルはメンブレンで密閉され、続いて、500±50rpmで振とうしつつ、室温、暗所で(アルミフォイルでカバーして)0.5時間インキュベートされた。
【０１３７】
10)プレートは6)に記載されたように3回洗浄された。
【０１３８】
11)100μlの洗浄バッファが、細胞を際懸濁するために各ウェルに添加された後、プレートは室温で2時間、500±50rpmで振とうされた。
【０１３９】
12)解析はLuminexTM100装置により90分間行われた。
【０１４０】
1.6 ELISAキットによるaGVHDマウス中の血清サイトカインの検出
適合するマウスTGFβLuminexキットおよびELISAキットが存在しないため、我々は、ヒトTGF-βとマウスTGF-βが高い相同性を有するという事実を考慮して、ヒトTGF-βELISAキットを代替試薬として用いた。血清IL-2濃度を決定することは困難である。しかし、T細胞が活性化するとIL-2はその受容体に(α、β、およびγサブユニットに)結合し、αサブユニットは細胞表面から脱落し、血清中で検出可能となり、可溶性IL-2受容体(sIL-2R)と呼ばれる。したがって、ELISAキットはマウスにおけるsIL-2Rの再検出に使用できる。
【０１４１】
マウスにおける血清sIL-2RおよびヒトTGFβの検出方法は以下のとおりである：
1)室温に予備的に平衡させた後、必要とされるプレートは密閉バッグから取り出された。
【０１４２】
2)1つのウェルは空のまま残しておき、サンプル(1：1希釈)および異なる濃度の標準サンプル(100μl/well)が他のウェルに添加された。ウェルはその後プレートカバーで密閉され、インキュベーターで37°Cで90分間インキュベートされた。
【０１４３】
3)プレートは4回洗浄された。空のウェルを除き、ビオチン抗体使用溶液(100μl/well)が各ウェルに添加された。ウェルはその後プレートカバーで密閉され、インキュベーターで37°Cで60分間インキュベートされた。
【０１４４】
4)プレートは4回洗浄された。空のウェルを除いて酵素結合（enzyme-conjugating）使用溶液(100μl/well)が添加された。ウェルはその後プレートカバーで密閉され、インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートされた。
【０１４５】
5)プレートは4回洗浄された。色素物質（chromogenic agent）(100μl/well)が添加され、プレートはインキュベーターで37°C、暗所で10-15分間インキュベートされた。
【０１４６】
6)停止溶液(100μl/well)が添加され、ウェルはよく混合され、OD450値はすぐに（5分以内）測定された。
【０１４７】
結果の解釈；
CurveExpert 1.3ソフトウェアが、標準曲線を描くために用いられた。標準曲線のグラフを描く際に、標準サンプルの濃度が横座標として用いられ、OD値が縦座標として用いられた。サンプルの濃度はそのOD値を用い標準曲線上で決定することができる。サンプルのOD値が標準曲線の上限よりも高いときは、サンプルは再測定のために適切に希釈される。希釈倍率はその後サンプル濃度を算出する間に増大される。
【０１４８】
1.7 aGVHDマウスにおける末梢血中T細胞亜集団の解析
移植から2週間後、末梢血が吸引されヘパリンナトリウムで処理された。その後、FITC-抗マウスCD3抗体、PE-抗マウスCD28抗体、PE-Cy5-抗マウスCD8抗体、PE-Cy5-抗マウスCD4抗体、PE-抗マウスCD4抗体、およびPE-抗マウスCD25モノクローナル抗体が添加された。CD4+/CD8+およびCD3+CD8+C28-抑制性T細胞亜集団(Ts細胞)およびCD4+CD25+制御性T細胞亜集団(Treg細胞)における変化を検出するために、フローサイトメトリー解析が行われた。方法は以下のとおりであった：
1)1μgの対応する蛍光ラベル抗体が100μlの抗凝固性の血液に添加された後、サンプルは室温、暗所で30分間インキュベートされた。
【０１４９】
2)2ミリリットルのPharmlyseTM赤血球溶解素バッファが添加され、続いて室温、暗所で15分間インキュベートされた。
【０１５０】
3)サンプルは1500rpmで6分間遠心処理され、上澄みの廃棄後、PBSで再懸濁され、その後1500rpmで5分間再度遠心処理された。
【０１５１】
4)上澄みは廃棄され、0.5mlの2%パラホルムアルデヒド/PBSが検出のために添加された。
【０１５２】
1.8 統計的解析
データはχ+sとして表現され、SPSS 13.0ソフトウェアが統計的解析に用いられた。ANOVAおよびDunnettのt-検定が、グループ間に等分散性がみられた場合の比較に用いられた。P<0.05のときに統計的に有意であると考えられる。ノンパラメトリック解析が、分散の不均一性が見られた場合に用いられた。
【０１５３】
2. 結果
2.1 B7-1-PE40KDEL DNAワクチンによる処置後のaGVHDマウスにおける血清サイトカインの変化
移植後7、14および21日目に、Luminex液体チップおよびELISA法が、すべての実験グループのマウスにおける血清サイトカインの変化を検出するために用いられた。結果は、表1に示されている。結果は、aGVHDマウスの中では、標準コントロールグループと比較して、Th1サイトカインの中で、IFNγ、IL-2およびTNFαが有意に高く(P<0.01)、特に発病の開始の初期の段階から移植後7日の期間に高いことが明らかとなった。移植後14日までに、IFNγレベルは徐々に減少し、21日までには、IFNγは通常のレベルに復帰した。対照的にIL-2およびTNFα、すなわちTh1サイトカインのうちの2つ、のレベルは、通常よりも高いまま維持された。IL-4(Th2サイトカイン)およびTGF-β(Th3サイトカイン)のレベルの変化については、実験グループと標準コントロールグループとの間で統計的な相違は見られなかった。驚くべきことに、7および14日目のaGVHDマウスおけるIL-10(Th2サイトカイン)のレベルが、標準コントロールグループと比較して有意に高かった。利用可能な検出方法の感度のため、IL-12を検出することは困難であった。
【０１５４】
表5に示すように、移植後7日間は、IFNγのようなTh1サイトカインの減少は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループ、B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループおよびB7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループのマウスにおいて最も有意であった(P<0.01)。IFNγレベルは、CsA+MTXグループにおいては、7日目においても依然として高く、aGVHDグループと比較したときにその相違は有意であった(P<0.01)。しかし、14および21日目には、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループと同様に、IFNγレベルはCsA+MTXグループにおける標準に復帰した。加えて、IL-2レベルは、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループおよびCsA+MTXグループの双方において、効果的に減少し、aGVHDコントロールグループと比較したときその相違は有意であった(P<0.05)。対照的に、Th1サイトカインに対する効果では、TNF-αはB7-1-PE40KDEL DNAワクチングループまたはCsA+MTXグループにおいては有意でなかった。
【０１５５】
表5に示すように、IL-4およびIL-10のようなTh2サイトカイン、およびTh3サイトカインであるTGF-β（これらは炎症の抑制に関わっている）に対し、Th2サイトカインIL-4に関する効果において、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループおよびCsA+MTXグループに統計的な相違はなかった。Th2サイトカインIL-10のレベルはB7-1-PE40KDEL DNAワクチングループおよびCsA+MTXグループの双方において、効果的に増加し、aGVHDコントロールグループのレベルと比較したときに、その相違は統計的に有意であった。Th3サイトカインTGF-βに対しては、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンのみがそのレベルを効果的に増加させ、B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループは有意な効果を示さなかった。対照的に、CsA+MTXグループはTh3サイトカインTGF-βの発現レベルがわずかに減少した。.
【表５】
2014505473.tif 000008
【０１５６】
2.2 B7-1-PE40KDEL DNAワクチンによる処置後のaGVHDマウス中の末梢血T細胞亜集団の変化
移植の2週間後、3種のT細胞亜集団(すなわちCD4+/CD8+、CD4+CD25+TregおよびCD8+C28-Ts亜集団)を検出するために、フローサイトメトリー解析が行われた。結果および代表写真が図26-31および表6に示されている。
【０１５７】
結果は、標準グループにおいては、CD4/CD8率は約3.2であり、放射線照射および移植後のaGVHDマウスにおける場合と大きく逆転していた。放射線照射および移植後のaGVHDマウスを標準グループと比較すると、CD3+CD8+T細胞の割合が有意に増加し、その一方でCD3+CD4+の割合は有意に減少していた。B7-1-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-2-PE40KDEL DNAワクチン、B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン、ならびにCsA+MTX処置は、CD4/CD8の割合を有意に逆転させるものではなかった(図26-27および表6)。
【０１５８】
特定のT細胞亜集団がB7-1-PE40KDEL DNAワクチングループおよびCsA+MTXグループにおける免疫調節に関わっているか否かを決定するために、我々は、各グループおよびコントロールグループにおけるCD4+リンパ球間のCD4+CD25+Treg集団の変化を比較した(図28-29および表5)。結果は、CD4+CD25+Treg集団は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループおよびB7-1-PE40KDEL+B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループにおいて、空のベクターグループおよびNSコントロールグループにおけると比較して、有意に高いことを示したP<0.01およびP<0.05)。CD4+CD25+Treg集団は、B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループにおいても、空のベクターグループおよびNSコントロールグループにおけると比較して高かった(P<0.05)が、B7-2-PE40KDEL DNAワクチンの効果はB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの効果よりも弱かった。対照的に、CsA+MTXグループのCD4+CD25+Treg集団においては有意な差はなかった。
【０１５９】
加えて、我々は、他の調節性T細胞による免疫ネットワークの調節における変化を比較した(すなわち、すべてのグループにおけるCD8+CD28-Ts集団における変化)。結果は図30-31および表6に示されている。CD8+CD28-Ts集団は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチン、B7-2-PE40KDEL DNAワクチン、B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチンおよびCsA+MTXグループにおいて、空のベクターグループおよびNSコントロールグループにおけると比較して高く、その差は有意である(P<0.01)ことが理解できる。
【表６】
2014505473.tif 000009
【０１６０】
本発明の実施形態は詳細に記載されており、当業者により理解可能である。発行された文献にしたがって、詳細は変更または置換可能である。これらの変更は本発明の保護の範囲内である。本発明の全範囲は、添付したクレームおよびその均等物によって与えられる。
【図１】
2014505473.tif 000010
【図２】
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【図３】
2014505473.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2014505473.tif 000015
【図６Ｂ】
2014505473.tif 000016
【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014505473.tif 000020
【図１０】
2014505473.tif 000021
【図１１Ａ】
2014505473.tif 000022
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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