(57)【要約】  本発明は、混合栄養性方式で増殖することができるオドンテラ（Odontella）属の微細藻類の新規株、及び、従属栄養性又は混合栄養性方式で、多価不飽和脂肪酸、特にＥＰＡ及びＤＨＡの生産を可能にするそのような株を選択し培養するための方法、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０１１年５月２７日にＣＣＡＰにおいて受託番号ＣＣＡＰ１０５４／５で寄託されたオドンテラ（Odontella）株に対応する微細藻類。
【請求項２】
オドンテラ（Odontella）属の微細藻類を培養又は選択するための方法であって、
暗所又は光供給の存在下で、オドンテラ（Odontella）属の１種又は数種の株を培養する工程と、
培地中に少なくとも２０ｍＭの酢酸塩、グルコース、キシロース、アラビノース、乳糖、ショ糖、酢酸塩、又はグリセロールを含む炭素含有基質の存在下で、該培養物を数世代にわたって維持する工程と、
このようにして得られたオドンテラ（Odontella）細胞を採取する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記炭素含有基質が酢酸塩又はショ糖を含む、請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記オドンテラ（Odontella）属の微細藻類株が、請求項１に規定されたとおりである、請求項２又は３に記載の培養方法。
【請求項５】
前記株の培養が光供給を伴う混合栄養性方式で行われ、その強度が５〜３００μＥ、好ましくは１０〜２００μＥ、さらに好ましくは２０〜１５０μＥであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
前記炭素含有基質がアラビノース又はキシロースを含むことを特徴とする、請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
前記株の培養が、経時的に非連続的又は可変的な光の供給をともなって混合栄養性方式行われ、光の強度は、光子のマイクロモルで５０μモル／ｍ2ｓ1超の強度で、少なくとも１時間に１回の割合で変化することを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記光の供給がフラッシュ形式であることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項９】
フラッシュは、５秒〜１０分、好ましくは１０秒〜２分、さらに好ましくは２０秒〜１分を含む持続時間を有する連続照射相からなることを特徴とする、請求項８に記載の培養方法。
【請求項１０】
オドンテラ（Odontella）属の微細藻類においてＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）及び／又はＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）を富化する方法であって、請求項２〜９のいずれか１項に記載の培養方法に従う、従属栄養性又は混合栄養性方式でオドンテラ（Odontella）属の少なくとも１種の株の培養を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
ＥＰＡ及びＤＨＡ含量が、総細胞脂質の４０％超、さらに好ましくは５０％超であることを特徴とする、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、オドンテラ（Odontella）属の微細藻類。
【請求項１２】
ＥＰＡ又はＤＨＡの生産方法であって、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡが、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法に従って得られる微細藻類の脂質含有物から抽出されることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従属栄養や混合栄養条件下で増殖することができるオドンテラ（Odontella）属の新規微細藻類株と、この微細藻類を選択し培養して、従属栄養又は混合栄養方式で多価不飽和脂肪酸、特にＥＰＡ及びＤＨＡの生産を可能にする方法とに関する。
この新規株は、特に、光の供給がフラッシュ形式で行われる混合栄養方式で行われる培養法で、ＥＰＡ及びＤＨＡを生産するのに特に有用である。
【０００２】
序文
微細藻類は独立栄養性を有する光合成微生物であること、すなわちこれらは、光合成によって自律的に増殖する能力を有することは、知られている。
微細藻類は、海水媒体中、新鮮な半塩水中、ならびに様々な土地の生息地で、生長する。
【０００３】
淡水や海で見つかる微細藻類種のほとんどは厳密には独立栄養であり、すなわちこれらは光合成によってのみ増殖することができる。
しかし、非常に多様な群や起源の微細藻類種のうちのいくつかは、厳密には独立栄養性ではないことが見出されている。従って、これらの一部は、従属栄養性であり、光が全く存在しない状態で、発酵により、すなわち有機物を用いて、生長することが可能であると言われている。
【０００４】
その生長のために光合成が必須である他の微細藻類種は、光合成と、それらの環境中に存在する有機物質の両方とから利益を得ることができる。これらの中間の種は、混合栄養であると言われており、光と有機物の両方の存在下で培養することができる。
【０００５】
いわゆる＜混合栄養性＞微細藻類のこの特殊性は、光合成と発酵とを同時に実施することを可能にするその代謝に関係しているようである。両方の種類の代謝は、この微細藻類の増殖への全体的なプラスの効果と共存する［Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6:87-102］。
【０００６】
現在、微細藻類の分類はまだ、形態学的基準と、これらの細胞が含む光合成色素の性質とに広く基づいている。従って、これは藻類の異なる種の栄養要求性、従属栄養性、又は混合栄養性の指標とはあまりなり得ないが、後者が非常に多くの種や形態の多様性をカバーする［Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171］。
【０００７】
微細藻類のいくつかの種は、多量の脂質、特に多価不飽和脂肪酸を蓄積するか又は分泌することができるため、微細藻類は現在多くの工業的プロジェクトの主題である。
【０００８】
これらの多価不飽和脂肪酸の中で、オメガ−３ｓシリーズのいくつかの不飽和酸（ＰＵＦＡ−ω３）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５  ω３）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６  ω３）は、栄養的重要性が認識されており、治療的応用の点で大きな可能性を有する［Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225］。
【０００９】
漁業に由来する魚油は、現在これらの種類の脂肪酸の主要な商業的供給源である。しかし、これらの油は新しい用途（水産養殖における食品補助物質、マーガリンへの取り込み）が見いだされているが、激しい漁業活動のために海の水産資源が減少しつつある。
【００１０】
従って、今後、これらの種類の多価不飽和脂肪酸についての市場の増大する需要に答えるために、ＥＰＡとＤＨＡの新しい供給源を探す必要がある。
【００１１】
脂肪酸を新規に合成できる以外に、微細藻類は、魚油と比較していくつかの利点を有する。特にこれらは、制御された条件下でインビトロで培養することができ、これは比較的一定の生化学的組成を有するバイオマスの生産を可能にする。一方、魚油とは異なり、微細藻類の脂質は、不快な臭いが無く、コレステロールをほとんど又は全く含まない。最後に、微細藻類により生産される脂質は、一般に魚油より単純な脂肪酸プロフィールを有し、これが、目的の脂肪酸を分離するための工程を少なくする。
【００１２】
主要なＥＰＡ及びＤＨＡ生産性微細藻類は、種々の動物門に属する海産種である。しかし、これらの門に含まれる数十万の種のうちで、分類学上のランクが互いに離れたほんの少数の種が、ＥＰＡ及びＤＨＡの高い含有量を有する。多量のＥＰＡ及び／又はＤＨＡを生産することができる種の中で、最もよく言及されるものは、シゾキトリウム属（Schizochytrium sp.）、クリプテコディニウム（Crypthecodinium sp.）（渦鞭毛藻綱（Dinophyceae））、フェオダクチルム属（Phaeodactylum sp.）（珪藻綱 (Bacillariophyceae）、ナビキュラ目（Naviculales)）、及びオドンテラ属（Odontella sp.）（珪藻綱 (Bacillariophyceae）、コアミケイソウ綱（Coscinodiscophyceae））に属するものである。
【００１３】
オドンテラ（Odontella）属の微細藻類は、大きなサイズの単細胞藻類であり、その長さは３５〜５０ミクロンに達することがある。これらは、二つの対称の弁からなる珪殻を持っている。これらは遍在しており、世界各地の沿岸地域の藻類であり、密なプランクトン集団は形成せず、沿岸域における底生藻類の多様な種に関連して見られる。自然状態では、オドンテラ・アウリタ（Odontella aurita）種は、１．６％〜３．４％の合計乾燥重量のＥＰＡを蓄積し、これは微細藻類により生産される総脂肪酸の平均２１％である。
【００１４】
オドンテラ・アウリタ（Odontella aurita）は、一般に動物飼料で使用するために、特に魚や甲殻類の幼虫の餌となるために屋外のプールで栄養要求性方式で培養される［Pulz et Gross (2004) Valuable products from biotechnology of microalgae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65(6):635-648］。
【００１５】
しかし、屋外のプールでの栄養要求方式の微細藻類の培養は、工業的利用にはあまり適していない。実際、微細藻類の集中的利用の観点からは、バイオマス生産は、大量に、閉じた大きな光バイオリアクター中で行わなければならない。しかし、そのような条件下では、特に微細藻類の密度が高くなると、培地中に含まれる全ての細胞に充分な光照射を与えることは困難である。
【００１６】
オドンテラ（Odontella）属の微細藻類の栄養要求性培養の代替法は、光無しで、炭素含有基質の形のエネルギーを供給して従属栄養性培養を実施すること、又は低強度の光と有機基質とを供給して混合栄養性培養を実施することであろう。
【００１７】
しかし現在まで、そのような条件下でオドンテラ（Odontella）属の微細藻類は培養できていない。
従って、本出願人が、従属栄養性方式及び混合栄養性方式で培養され、ＤＨＡとＥＰＡとを満足できる量で生産できるオドンテラ（Odontella）属の微細藻類株を分離できたことは、予想外である。
【００１８】
オドンテラ（Odontella）のこの新規株は、環境から分離され、本発明者により培養され、さらに詳しくは、特にフラッシュ形式の不連続な光照射下で、混合栄養性条件下で微細藻類を培養することからなる、本発明者により開発された方法に従って培養された。
【００１９】
一般に微細藻類にとってストレスとして認識される照射相と暗い相との密接な交代は、驚くべきことに、この株から多価不飽和脂肪酸の多量の生産を得ることを可能にした。本発明のこのような株の適用は、低下した光の供給から利益を得る発酵槽における多価不飽和脂肪酸の工業生産の可能性を開き、従って、既存の独立栄養培養方式と比較して、エネルギー及び表面積の節約を可能にするはずである。
【００２０】
本発明に従って選択されたこれらの株の最初の株であるオドンテラ（Odontella）ＦＣＣ６７５は、ブダペスト条約の規定に従って２０１１年５月２７日にＣＣＡＰ（Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Scotland, United Kingdom）に寄託され、受託番号ＣＣＡＰ１０５４／５を割り当てられた。
本発明の種々の形態と利点は、以下に詳述される。
【００２１】
詳細な説明
従って本発明は、従属栄養性方式又は混合栄養性方式で培養できることを特徴とする、分離されたオドンテラ（Odontella）属の微細藻類（門：珪藻（Bacillariophyta）、綱：コアミケイソウ（Coscinodiscophyceae）、科：ユーポジカシー（Eupodicaceae））に関する。
【００２２】
この微細藻類が従属栄養性方式で培養できるという事実は、暗所で、通常オドンテラ（Odontella）を栄養要求方式で培養するために使用される標準培地、好ましくはミネラル培地（これは、炭素含有基質が加えられている）中で、増殖できるその能力により理解される。ミネラル培地は、無機化合物ならびに任意にビタミンやある種のアミノ酸が溶解されている、しばしば海水に基づく水溶液からなる培地を意味する。オドンテラ（Odontella）の培養に適したミネラル培地は、例えばｆ／２培地である［Guillard, R.R.L. (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA; Guillard, R.R.L. and Ryther, J.H. (1962) Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239］。
【００２３】
この微細藻類が混合栄養性方式で培養できるという事実は、光供給の存在下で、上記培地と類似の培地、すなわち通常オドンテラ（Odontella）を栄養要求方式で培養するために使用される標準培地（しかし、これは、炭素含有基質が加えられていない）中で、増殖できるその能力により理解される。
【００２４】
一般に、光の供給の強度は、５μＥ以上、好ましくは５〜３００μＥ、さらに好ましくは１０〜２００μＥ、さらにより好ましくは２０〜１５０μＥである。
【００２５】
従属栄養又は混合栄養において、炭素含有基質は培地に供給される。炭素含有基質は、純粋な形で又は混合物として、一般に以下の化合物の１個又は数個を含むかこれらからなる：デンプン、グルコース、キシロース、アラビノース、乳糖、乳酸塩、セルロース、及びこれらの誘導体、ショ糖、酢酸塩、及び／又はグリセロール。
【００２６】
デンプン、例えばトウモロコシ、コムギ、又はジャガイモからのデンプンの生体内変換の生成物、特にデンプン加水分解物（これはサイズの小さい分離からなる）は、従属栄養性又は混合栄養性方式で微細藻類を培養するのに使用できる炭素含有基質を形成することができる。
【００２７】
微細藻類の混合栄養性又は従属栄養性方式の培養は好ましくは、少なくとも５ｍＭ、好ましくは少なくとも１０ｍＭ、さらに好ましくは少なくとも２０ｍＭ、さらにより好ましくは５０ｍＭ超の炭素含有基質の存在下で行われる。当業者は、使用される炭素含有基質の最大濃度の決定方法を周知している。一般に、この微細藻類の混合栄養性又は従属栄養性方式の培養は、１０〜２００ｍＭ、好ましくは２０〜５０ｍＭの炭素含有基質の存在下で行われてよい。
【００２８】
細胞が高濃度の脂質を蓄積することを可能にするために、培養中に連続的基質供給が確保される。一定濃度を維持するように、培養法中に追加の基質が培地に加えられる。当業者は、培地中の炭素含有基質の一定濃度を維持するために、培地に加えられる炭素含有基質の濃度の決定方法を周知している。一般に培養は、炭素含有基質の蓄積濃度が、５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０〜８００ｍＭ、より好ましくは７０〜６００ｍＭ、さらにより好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭで行われてよい。
【００２９】
本発明の目的において、アラビノースとキシロースは、本発明の従属栄養性方式でオドンテラ（Odontella）を培養するための好適な炭素含有基質である。
酢酸塩とショ糖は、本発明の混合栄養性方式でオドンテラ（Odontella）を培養するための好適な炭素含有基質である。
【００３０】
従って本発明は、本発明の従属栄養性又は混合栄養性を有するオドンテラ（Odontella）属の微細藻類を培養又は選択するための方法であって、
暗所で又は光供給の存在下で、オドンテラ（Odontella）属の１種又は数種の株を培養する工程と、
上記した上記培地中で炭素含有基質の存在下で、この培養物を数世代にわたって維持する工程と、
このようにして得られたオドンテラ（Odontella）細胞を採取する工程と、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３１】
本発明の培養法は特に、こうして選択されたか又は生産された微細藻類中で蓄積する多価不飽和脂肪酸、さらに詳しくはＥＰＡ及びＤＨＡの生産に関する。
そのような培養法は、可変の又は不連続な光供給が適用される時、すなわち培養された藻類に与えられる光のフラックスが、経時的に可変であるか又は不連続である時、特に有利である。
【００３２】
一般的な考えとは逆に、培養物の可変の又は不連続な光照射、特に混合栄養性方式の培養の時、藻類の生長に対して好ましい影響を有し、特にその脂質生産に関する限り、その生産性の上昇を可能にした。
【００３３】
理論に拘束されるつもりはないが、本発明者は、微細藻類への不連続な又は可変の光供給は、脂質の合成に好ましい＜ストレス＞を引き起こす作用を有すると考えている。この現象は一部は、自然界では、微細藻類はその環境の制約に耐えるために脂質貯蔵物を蓄積する傾向があるという事実により説明することができる。
【００３４】
不連続な照射とは、暗い期間が入る照射を意味する。暗い時期は、藻類が培養される時間の４分の１超、好ましくは２分の１又はそれ以上である。
【００３５】
本発明の好適な形態において、照射は不連続であり、さらに好ましくは短い継続期間にわたってフラッシュ形式である。次に連続照射相は、一般に５秒〜１０分、好ましくは１０秒〜２分、さらに好ましくは２０秒〜１分を含む。
【００３６】
本発明の別の態様において、照射は可変でもよく、これは、照射に暗い時期が入り、かつ光強度が経時的に変化してもよいことを意味する。この光の可変性は、周期的でも、循環的でも、又はランダムでもよい。
【００３７】
本発明において、照射は連続的に変化してもよく、すなわち光強度が一定ではなく、永久に経時的に方向する（ｄμｍｏｌ（光子）／ｄｔ≠０）である。
本発明において、連続的及び不連続的照射相を含む光供給を有することもできる。
【００３８】
本発明は、特に、オドンテラ（Odontella）属の微細藻類を培養するための方法であって、上記藻類は、暗所で経時的に非連続的又は可変的な光の供給をともなって培養され、光の強度は、光子のマイクロモルで、１０μモル／ｍ2ｓ1以上、好ましくは５０μモル／ｍ2ｓ1以上、さらに好ましくは１００μモル／ｍ2ｓ1以上の強度で、１時間当たり１回又は数回の割合、有利には１時間当たり２回以上の割合で変化することを特徴とする、方法に関する。これらの異なる不連続な又は可変の照射方式の共通点は、本発明において、培養中の藻類に照射される光の強度は、１秒当たり１平方メートル当たりの光子のマイクロモル（μモル／ｍ2ｓ1）で表すと、同じ１時間以内に少なくとも１回変化するという事実である。この光強度の変化の大きさは、一般的に１０μモル／ｍ2ｓ1超、好ましくは２０μモル／ｍ2ｓ1以上、さらに好ましくは５０μモル／ｍ2ｓ1以上である。すなわち、毎時間、好ましくは１時間以内に数回、光強度は高値と低値とを達成し、これらの値の差は、記載されたもの以上である。好ましくはこの光強度は、毎時間５０μモル／ｍ2ｓ1と１００μモル／ｍ2ｓ1とを達成し、さらに好ましくは０μモル／ｍ2ｓ1と５０μモル／ｍ2ｓ1、さらにより好ましくは、０μモル／ｍ2ｓ1と１００μモル／ｍ2ｓ1とを達成する。
【００３９】
１μモル／ｍ2ｓ1は、しばしば文献で使用される単位である１μＥ／ｍ2ｓ1（アインシュタイン）に対応することが知られている。
【００４０】
培養物への光供給は、発酵槽の外壁周りに分配されたランプにより得られる。これらのランプの所定の照射期間を、時計が開始させる。発酵槽は好ましくは、昼光から遮蔽されて、温度管理容器中に位置する。
【００４１】
本発明のある態様において、培養物は、培地が規則的に循環して発酵槽の照射部分に到達する発酵槽中で得られる。そのような発酵槽は、例えばその一部が透明であり、外部から照射される円管を備えた装置であってもよい。培地及び懸濁藻類は、そのような装置の照射部分を活発に循環しながら、定期的に光と接触させられる。
【００４２】
本出願人により分離され、選択され、培養されたオドンテラ（Odontella）の特定の株ＦＣＣ６７５は、２０１１年５月２７日にＣＣＡＰに受託番号ＣＣＡＰ１０５４／５で寄託された。進行中の分類学的分析に従うと、後者はオドンテラ・アウリタ（Odontella aurita）種に属する。しかし他のオドンテラ（Odontella）種との関係を考慮すると、本発明は、本明細書に記載のように、混合栄養性を有するオドンテラ（Odontella）属のすべての微細藻類種に関連する。
【００４３】
本出願人が観察できたように、本発明の方法に従って選択される株が、従属栄養性又は混合栄養性方式で良好な増殖能を有するという事実は、これらの株が多価不飽和脂肪酸、特にＥＰＡとＤＨＡの高生産能を有する原因である。
【００４４】
従って本発明の培養法は、本出願人により分離されＣＣＡＰに寄託された株と類似の、多価不飽和脂肪酸の高収率を有する、混合栄養性のオドンテラ（Odontella）株の選択を可能にする。
【００４５】
株をスクリーニングするために、種々のオドンテラ（Odontella）株を平行して、同じ容器中でマイクロタイタープレート上で、種々の培養物の条件と生長を正確にモニタリングして、培養することができる。すなわち、不連続な照射に対する種々の株の応答を測定し、必要であれば、培地に１個又は数個の炭素含有基質を加えることは、容易である。この不連続な照射と炭素含有基質に対して好適に反応する株は、一般に品質（脂質プロフィール中のより豊富な多価不飽和脂肪酸）と量（より高率のＥＰＡとＤＨＡを含む脂質）の点で、脂質の生産のためのより良好な収率を与える。
【００４６】
微細藻類は、発酵槽中で微細藻類の多様なプールから選択することができ、そこから、不連続な又は可変の光と混合栄養性培養条件とを組合せる本発明のこの選択方式により利益を受ける変種を選択することが試みられる。この場合、培養は、培養物中の微細藻類を何世代にもわたって維持し、培養の最後に、培地中に優勢となった成分を分離することにより、培養が行われる。
【００４７】
本発明の培養法は特に、株の培養が数世代にわたって、好ましくは混合栄養性方式で行われることと、及び脂質を有する細胞が採取されることとを特徴とする。
【００４８】
本発明はまた、多価不飽和脂肪酸中のオドンテラ（Odontella）属の微細藻類を増加させる方法であって、混合栄養性又は従属栄養性方式で、さらに詳しくは前記の培養法に従って、オドンテラ（Odontella）属の微細藻類を選択し培養することを含むことを特徴とする、方法に関する。
【００４９】
本発明はまた、従属栄養性又は混合栄養性を有するオドンテラ（Odontella）属の微細藻類の培養による脂質、特に多価不飽和脂肪酸の生産と、脂質含有物、特にＥＰＡ及び／又はＤＨＡを抽出するためのこうして培養された微細藻類の回収と、に関する。これらの微細藻類は、好ましくは前記方法に従って培養されるか又は選択される。
【００５０】
混合栄養性又は従属栄養性方式での本発明のオドンテラ（Odontella）株の培養は、一般に、栄養要求性方式でのオドンテラ（Odontella）の同じ株の培養と比較して、２０％超、しばしば３０％超、さらに時に４０％超の総バイオマスの上昇を可能にする。
【００５１】
さらにこうして培養されたオドンテラ（Odontella）株から抽出される総脂質中の総ＥＰＡとＤＨＡ脂質の含量は、総細胞脂質の乾燥重量の、１０％超、一般に３０％超、しばしば４０％超、さらには５０％超である。
【００５２】
ＥＰＡ及びＤＨＡを選択的に抽出するための方法は、当業者に公知であり、例えばBligh, E.G. and Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J. Biochem. Physiol., 37: 911-917] に記載されている。こうして抽出されるＥＰＡとＤＨＡは、栄養組成物（例えば、調合乳）の、又は化粧品組成物又は治療組成物中の添加剤として使用することができる。
【００５３】
本発明の方法に従って、選択され、培養され、多価不飽和脂肪酸が富化された微細藻類は、水和型又は脱水型で直接、又は、特に漁業の変換後栄養物質補助食品として、又は化粧品又は治療用製品の組成物中に使用される成分として変換後に、使用することができる。
【実施例】
【００５４】
バイオリアクター中のオドンテラ・アウリタ（Odontella aurita）株の培養
培養物を、コンピュータ監視付きの専用の自動機器を備えた２Ｌ使用可能容量の発酵槽（バイオリアクター）中で増殖させる。系のｐＨは、塩基（１Ｎ水酸化ナトリウム溶液）及び／又は酸（１Ｎ硫酸溶液）を加えることにより調整される。培養温度は２３℃に設定される。攪拌は、Rushton配置（下降ポンプ作用を有する３刃羽根プロペラ）に従ってシャフト上に置いた３つの攪拌ローターを使用して行う。攪拌速度と通気流速は、それぞれ、少なくとも１００ｒｐｍで最大２５０ｒｐｍに、及びＱｍｉｎ＝０．５ｖｖｍ／Ｑmzx＝２ｖｖｍに制御される。バイオリアクターは、透明のタンクの周りの外部照明システムを備える。強度と光サイクルは、コンピュータ監視付きの専用の自動機器により制御される。
【００５５】
温度制御容器（２２℃）中の混合テーブル（１４０ｒｐｍ）上で調製され１００μＥ／ｍ2ｓ1で連続的に照射した前培養物が、反応槽に接種される。前培養物と培養物は、バイオリアクター中でｆ／２培地中で調製される。バイオリアクター中の混合栄養性培養物のために使用される有機炭素は、２０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウムである。炭素含有有機基質は、＜フェドバッチ方式＞で培地に加えられる。従属栄養性培養条件は、光の無い場合の混合栄養性のものと同じである。
【００５６】
培養物のモニタリング
総バイオマス濃度は、乾燥重量を測定することによりモニタリングされる（ワットマンＧＦＣフィルターでろ過、次にオーブンで真空下で６５℃及び−０．８バールで、少なくとも２４時間乾燥後、重量測定）。
【００５７】
脂質の総数の定量に関して、１０7細胞／ｍＬが抽出された。脂質を抽出する方法は当業者に公知であり、例えばBligh, E.G. and Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917]により記載されている。
【００５８】
フラッシュイング・ライト
バイオリアクター培養物中の光の供給は、発酵槽の外壁の周りに分配されたＬＥＤランプにより得られた。１０〜１００μＥの照射時間又はパルスについて、時計がこれらのＬＥＤを開始させる。混合栄養性培養で使用されるフラッシュ・システムの光強度は、栄養要求性培養（対照）で使用されるものと同じである。
【表１】
2014515935.tif 000002
【国際調査報告】
2014515935.tif 000003
2014515935.tif 000004
2014515935.tif 000005
2014515935.tif 000006
2014515935.tif 000007
2014515935.tif 000008