(57)【要約】  本発明は、ビフィドバクテリウム属ＣＥＣＴ  ７７６５株、その菌株の細胞成分、代謝産物および分泌分子、ならびにその菌株と他の微生物との組合せ、ならびに上述の産物を含んでなる組成物に関し、また、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム種の菌株の使用、すなわち、肥満、過体重、高血糖および糖尿病、好ましくは、２型糖尿病、肝脂肪症または脂肪肝、脂質異常症、代謝症候群、肥満および過体重に関連する免疫系機能不全;ならびに肥満および過体重に関連する腸管微生物叢構成不均衡の予防および／または治療のためのＣＥＣＴ  ７７６５株の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＣＥＣＴ  ７７６５であるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)株。
【請求項２】
請求項１に記載の菌株に由来する、菌株。
【請求項３】
遺伝子組換え変異体である、請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
生存細胞の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項５】
非生存細胞の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株を含んでなる、微生物組合せ。
【請求項７】
少なくとももう１種の微生物をさらに含んでなる、請求項６に記載の微生物組合せ。
【請求項８】
他の微生物が腸内細菌または乳酸菌である、請求項７に記載の微生物組合せ。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株から、あるいは請求項６〜８のいずれか一項に記載の微生物組合せから得られる、細胞成分、代謝産物、分泌分子、またはそれらの任意の組合せ。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株、あるいは請求項６〜８のいずれか一項に記載の微生物組合せ；あるいは請求項９に記載の、細胞成分、代謝産物、分泌分子、またはそれらの任意の組合せを含んでなる、組成物。
【請求項１１】
医薬組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでなる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
別の活性物質をさらに含んでなる、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
経口投与、舌下投与、鼻腔投与、くも膜下腔内投与、気管支投与、リンパ系投与、直腸投与、経皮投与、吸入投与、または非経口投与に好適な形態で存在する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
経口投与に好適な形態で存在する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
栄養組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
食品、機能性食品、栄養補助食品、プロバイオティクスまたはシンバイオティクスである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記食品が、乳製品、植物性製品、肉製品、スナック、チョコレート、飲料またはベビーフードを含んでなる一覧から選択される、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記菌株の濃度が、１グラムまたは１ミリリットルの最終組成物当たり、１０３〜１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）である、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬組成物、医薬品、または栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株の使用。
【請求項２１】
医薬組成物、医薬品、または栄養組成物の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株の、あるいは請求項６〜８のいずれか一項に記載の微生物組合せの、あるいは請求項９に記載の細胞成分、代謝産物、分泌分子、またはそれらの任意の組合せの、あるいは請求項１０に記載の組成物の、使用。
【請求項２２】
前記医薬品または前記栄養組成物が、過体重および／または肥満の予防および／または治療のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬品または前記栄養組成物が、高血糖および／または糖尿病の予防および／または治療のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬品または前記栄養組成物が、２型糖尿病の予防および／または治療のために使用される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬品または前記栄養組成物が、肝脂肪症または脂肪肝の治療および／または予防のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２６】
前記医薬品または医薬組成物が、脂質異常症の治療および／または予防のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２７】
脂質異常症が高トリグリセリド血症である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
脂質異常症が高コレステロール血症である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記医薬品または医薬組成物が、代謝症候群の治療および／または予防のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬品または前記栄養組成物が、未処置の対象に対して、過体重対象または肥満対象の免疫系の機能を改善するために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項３１】
前記医薬品または前記栄養組成物が、肥満または過体重の対象における感染症の予防および／または治療のために使用される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記医薬品または前記栄養組成物が、脂肪細胞肥大の予防および／または治療のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬品または前記栄養組成物が、未処置の対照対象に対する、非肥満対象における摂取量の減少およびエネルギー消費の増加のために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項３４】
前記医薬品または前記栄養組成物が、過体重、肥満、および関連病変の発生に関連する末梢および中枢のレベルでの炎症誘発性タンパク質の合成を減少させるために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項３５】
前記医薬品または前記栄養組成物が、未処置の対照に対して、腸管内容物中の腸内細菌濃度を減少させるために使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項３６】
腸管内容物中の腸内細菌濃度の減少が過体重または肥満の対象において行われる、請求項３５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、医薬組成物または製剤の治療活性の分野に含まれ、また食品の分野にも含まれる。具体的には、本発明は、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)ＣＥＣＴ  ７７６５株、その菌株の細胞成分、代謝産物および分泌分子、ならびにその菌株と他の微生物との組合せ、ならびに上述の産物を含んでなる組成物に関し、また、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株の使用、すなわち、肥満、過体重、高血糖および糖尿病、好ましくは、２型糖尿病、肝脂肪症または脂肪肝、脂質異常症(dyslipidemia)、代謝症候群、肥満および過体重に関連する免疫系機能不全、ならびに肥満および過体重に関連する腸管微生物叢構成不均衡の予防および／または治療のためのＣＥＣＴ  ７７６５株の使用にも関する。
【０００２】
背景技術
過体重および肥満は、現在、罹患率が上昇していることや共存症(co-morbilities)から、主要な公衆衛生問題の１つである。これらには、例えば、代謝症候群、高血圧、脂質異常症、糖尿病、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肝脂肪症または脂肪肝および一部の種類の癌が含まれる。
【０００３】
肥満は、食物摂取と、エネルギー消費との間の長期にわたる正の不均衡の結果として起こり、その不均衡によって体脂肪の過剰な増加が引き起こされる。神経内分泌系によって合成されるペプチドおよびホルモンは、種々の末梢の組織および器官と中枢神経系との間の伝達を可能にし、概して、体重調節に寄与し、エネルギーバランス制御に関与している。脂肪組織（レプチン）および膵臓（インスリン）からのシグナルは、長期にわたる食物摂取制御において基礎となる（Konturek et al., 2004. J Physiol Pharmacol., 55: 137-154）。インスリンは、脂肪組織の正常な働きと脂肪組織でのトリグリセリド蓄積の調節や、グルコースの取込みにおいて最も重要なホルモンである。脂肪は、インスリン、および他のホルモン（レプチン）に対する応答として、リポタンパク質リパーゼの刺激と脂肪分解の阻害によって、正常インスリン感受性脂肪組織に蓄えられる。しかしながら、肥満に伴う脂肪組織での脂肪酸の過剰な蓄積によりインスリン感受性が低下し、これにより、トリグリセリドの形での遊離脂肪酸の蓄積がいくつかの器官および組織（肝臓、筋肉、心臓など）に移り、レプチン生産または感受性に変化がもたらされ、炎症誘発性サイトカイン合成が増加し、その結果として、関連疾患（代謝症候群、心血管疾患など）を発症する危険性が高くなる。インスリンのシグナル伝達は、中枢神経系において、エネルギーバランス制御およびグルコースホメオスタシスのためにも必須であり、食欲抑制因子としてともに作用し食物摂取を減少させる、レプチンなどの他の調節因子とのその相互作用に依存する（Gerozissis K., 2004. Eur J Pharmacol., 490(1-3): 59-70）。レプチンは、主に脂肪組織によって合成されるホルモン／アディポカインであるが、胃などの他の組織でもはるかに少ないが合成されている。レプチンの分泌はインスリンによって刺激される。中枢神経系レベルでは、レプチンは、食欲を抑制し、エネルギー消費を増大させ、膵β細胞機能などの生命プロセスに関与し、インスリン分泌に有利に働く（La Cava A, Matarese G. The weight of leptin in immunity. Nat Rev Immunol. 2004 May;4(5):371-9）。末梢レベルでは、レプチンは、脂肪酸およびトリグリセリドの合成を減少させることにより、また、脂質酸化を増加させることにより作用する。しかしながら、肥満対象では、このアディポカインの末梢濃度が異常に高く、アディポカイン抵抗性が生じている。肥満対象における高レプチン濃度は、代謝障害のマーカーであることに加え、免疫応答を修飾し、肥満関連炎症状態の一因ともなり得る。
【０００４】
また、肥満は、永久的に患う可能性がある２型糖尿病などの代謝障害の一因となる、脂肪組織中および全身レベルでのサイトカイン、アディポカインおよび他の炎症誘発性タンパク質の高生産を特徴とする軽度慢性炎症状態とも考えられる（Tilg and Moschen, 2006. Nat Rev Immunol., 6: 772-783）。肥満および代謝障害に関連する炎症性因子としては、特に、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ６、ならびにマクロファージ走化性タンパク質ＭＣＰ１が挙げられる。特に、ＴＮＦ−αは、インスリンの作用に関与する遺伝子の発現（例えば、その受容体遺伝子の発現）を減少させ、インスリンシグナル伝達を減弱させ、インスリン刺激性リポタンパク質リパーゼの作用を阻害する。ＭＣＰ１は、体重増加に関連する脂肪組織へのマクロファージ浸潤に有利に働き、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α）の生産増加、ならびにインスリン抵抗性および肝脂肪症の発現に寄与する。この工程における炎症誘発性サイトカインの機能も、脂肪症、インスリン抵抗性および２型糖尿病などの病変の改善のために抗ＴＮＦ−α抗体に基づいた薬物を使用することによって示されている（Tilg and Moschen, 2006. Nat Rev Immunol., 6: 772-783）。
【０００５】
肥満は、さらに、病原体および他の抗原に対する防御の欠如ならびに術後感染症および合併症の危険性がより高いことに関連する、マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞などの種々の免疫系細胞の機能の変化も特徴とする。脂肪組織マクロファージは、貪食能がより低く、呼吸バーストが少なく、これらは感染性病原体に対する自然免疫系の応答に関与する工程である（Zhou et al., 2009. Proc Natl Acad Sci U S A, 106(26):10740-5.）。さらに、樹状細胞は、破壊能力を有し、Ｔ細胞を刺激する。Ｔ細胞は、例えば、ワクチン接種における抗体産生や、感染症の場合の記憶Ｔ細胞応答を担う適応免疫応答に関与している（Karlsson et al., 2010. J Immunol., 184:3127-33）。
【０００６】
高エネルギー負荷食の習慣的摂取増加と、低身体活動を伴う社会的変化とが世界的な肥満罹患率上昇の主な原因であると考えられている。しかしながら、低カロリー食と、身体活動増加とに基づいた従来の治療は、肥満制御における有効性の低下を示し、一般的には、限定された一時的な体重減少にしかつながらない。薬理学的戦略の使用は副作用を必然的に伴うことから、それも満足できるものではなかった。従って、治療を改善し、これらの病変の予防を可能にする新規介入戦略が未だ求められている。
【０００７】
ヒト腸にコロニーを形成している微生物叢は、個体の代謝機能および免疫学的機能を調節する能力から、肥満および関連疾患に関与する新たな因子と考えられている（Sanz et al., 2010. Proc Nutr Soc., 14: 1-8.）。肥満に関連する微生物叢構成変化が検出されたことから、肥満制御の代替法としての腸管生態系の意図的操作の提唱にもつながった（Ley et al., 2006. Nature, 444: 1022-1023; Nadal et al., 2008. Int J Obes., 33(7): 758-67）。この意味で、肥満または関連疾患を治療するための乳酸菌およびビフィズス菌群由来の微生物の使用が種々の刊行物または特許公報で提唱された。国際特許出願ＷＯ２００７／０４３９３３号には、ラクトバチルス属(Lactobacillus)Ｆ１９株およびＮＣＦＢ  １７４８株ならびにビフィドバクテリウム・ラクティス(B. lactis)Ｂｂ１２株を、発酵乳の形で、体重を制御し、食欲を減退させるために使用することができることが提唱されている。しかしながら、該菌株よりもむしろ発酵乳に含まれる乳タンパク質およびカルシウムが、該効果に関連している可能性があり、該効果は、小腸での代謝に関係している遺伝子の発現改変に基づいたものでしかない。しかしながら、肥満は他の多くの器官および組織に関わっている。特許出願ＵＳ２０１０００６１９６７Ａ１号にも、胃腸管内でのみ満腹を調節するペプチドの発現をモジュレートする細菌の使用が提唱されている。別の特許出願（ＷＯ２００９１５３６６２号）には、糖尿病におけるビフィズス菌およびラクトバチルス菌の使用が提唱されているが、この使用は、末梢組織の炎症を軽減するこれらの微生物の能力にのみ基づいており、中枢神経系レベルでの効果またはこの病変の起源および進行に関与する他の工程が考慮されていない。特許出願ＵＳ２０１００１５０８９０号には、交感神経系の機能を刺激することによって代謝およびエネルギー消費を加速させるためのプロバイオティクス菌の使用が提唱されている。しかしながら、一部の肥満患者でも交感神経系の緊張は高まる。特許出願ＵＳ２０１００１１１９１５号には、ビフィズス菌特異的な効果（腸内ビフィズス菌総量の増加）に基づいて肥満を予防するための小児期におけるプロバイオティクス菌の一般的使用が提唱されている。ビフィズス菌の特性が各菌株に特有であることは考慮されているが、ビフィズス菌の単純な一般増加によって、肥満発生へとつながる特定の工程が改変される方法に関して、原理が示されていない。さらに、上述の特許文献に関して行われた研究は、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)菌株を使用せず、ラクトバチルス属菌株またはそれらとＢ．ラクティスＢｂ１２との組合せおよび食事の改善を使用して行われたため、それらの結果がビフィズス菌によるものと考えることはできず（ＵＳ２０１００１１１９１５号、Luoto et al., 2010. Br J Nutr., 103(12): 1792-9、Luoto et al. 2010. Int J Obes (Lond). Mar 16）、いずれにせよ、それらは本発明の菌株とは異なる菌株である。別の特許出願ＵＳ２００５０１１２１１２号には、単糖類および二糖類からポリマーを生成する微生物の使用が提唱されており、キトサンなどの物質をビフィズス菌と組み合わせて使用してコレステロール吸収を特異的に減少させる（ＪＰ１０３０６０２８号）ことにより個体によるこれらの化合物のどちらの特定吸収も減少させるが、これらは総て、特定の食物成分に関連する肥満問題を軽減するための不完全な方法である。
【０００８】
従って、例えば、免疫系の機能低下との関連性と、末梢および中枢のレベルでのグルコース代謝およびインスリン抵抗性とのつながり、ならびに種々の慢性病変に関与する血液および末梢組織における脂質の蓄積の変化とのつながりとに同時に影響を及ぼして、過体重、肥満および関連病変（糖尿病、脂質異常症、肝脂肪症および代謝症候群など）などの疾患を予防および／または治療するより好適な戦略を見つけるという課題が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株、該菌株の細胞成分、代謝産物、分泌分子、ならびに該菌株と他の微生物との組合せ、ならびに上述の産物を含んでなる組成物に関し、また、過体重および／または肥満、ならびに糖尿病、脂質異常症、肝脂肪症、代謝症候群または感染症などの他の病変に対して影響を及ぼす免疫系の機能不全などの関連変化の予防および／または治療のための該菌株の使用にも関する。本発明はまた、過体重および／または肥満の問題とは関連のないこれらの変化の予防および／または治療のための該菌株の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、食作用に関与するマクロファージの呼吸バーストに対する効果を示す。ＮＤ、標準食を与えた対照動物；ＨＦＤ、高脂肪食；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図２】図２は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、種々の刺激（リポ多糖［ＬＰＳ］および糞便）に関するサイトカイン合成（ＴＮＦ−α）におけるマクロファージの機能に対する効果を示す。ＮＤ、標準食を与えた対照動物；ＨＦＤ、高脂肪食；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。黒色バー：対照；薄灰色：ＬＰＳ；濃灰色：糞便。
【図３】図３は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、樹状細胞とＴ細胞との相互作用およびそれらの増殖能力に対する効果を示す。  該菌株（１０８ｃｆｕ／日）を７週間投与した肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウスの異なる実験群（ｎ＝６／群）の成熟樹状細胞（ＤＣ）とともに、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｌ）をインキュベートした。混合物の細胞比（Ｌ／ＤＣ）は１：１、１：２および１：４であった。ＮＤ、標準食を与えた対照動物；ＨＦＤ、高脂肪食；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図４】図４は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、種々の刺激（ＬＰＳおよび糞便）に関するサイトカイン合成における樹状細胞の機能に対する効果を示す。ＮＤ、標準食を与えた対照動物；ＨＦＤ、高脂肪食；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図５】図５は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、サイズ範囲により分類される脂肪細胞発達に対する効果を示す。ＮＤ、標準食を与えた対照動物；ＨＦＤ、高脂肪食；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図６】図６は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、脂肪症（肝臓脂質蓄積）の発現に対する効果を示す。  細胞での脂肪蓄積程度に応じた脂肪肝細胞数が、ヘマトキシリン・エオシンで染色した肝組織切片において示される。ＮＤ、標準食を与えた対照動物；ＨＦＤ、高脂肪食；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図７】図７は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）における７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、ヘマトキシリン・エオシンで染色した組織切片の、腸細胞で形成されたカイロミクロン数に対する効果を示す。ＨＦＤ、高脂肪食を与えた動物；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図８】図８は、肥満Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）および対照マウスにおける７週間のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株（１０８ｃｆｕ／日）の投与についての、末梢血レプチン濃度に対する効果を示す。Ｌ、レプチン（ｐｇ／ｍｌで表す）；ＨＦＤ、高脂肪食を与えた動物；ＨＦＤ＋Ｐ、高脂肪食＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５；ＳＤ、標準食を与えた動物；ＳＤ＋Ｐ  標準食を与えた動物＋Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５。
【図９】図９は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）での電気泳動による本発明の菌株の種の同定を示す。  Ｍ１列は、下に示す参照微生物のＤＮＡ断片と対応する種々のバンドＢｘを示す：Ｂ１はＢ．アドレッセンティス(B. adolescentis)ＬＭＧ  １１０３７Ｔであり；Ｂ２はＢ．アンギュラタム(B. angulatum)ＬＭＧ  １１０３９Ｔであり；Ｂ３：Ｂ．ロングム亜種インファンティスＣＥＣＴ４５５１Ｔ；Ｂ４：Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ５７７６；Ｂ５：Ｂ．アニマリス亜種ラクティス(B. animalis subsp. Lactis)ＤＳＭ  １０１４０Ｔ。  Ｍ２列では、Ｂ６はＢ．ビフィダム(B. bifidum)ＬＭＧ  １１０４１Ｔであり；Ｂ７はＢ．ロングム亜種ロングムＣＥＣＴ  ４５０３Ｔであり；Ｂ８はＢ．カテニュレイタムＬＭＧ  １１０４３Ｔであり；Ｂ９はＢ．デンティウム(B. dentium)ＣＥＣＴ  ６８７であり；Ｂ１０はＢ．アニマリス亜種アニマリス(B. animalis subsp. animalis)ＬＭＧ  １０５０８Ｔである。  Ｉ１列のバンドは本発明の菌株ＣＥＣＴ  ７７６５を示している。
【発明の具体的説明】
【００１１】
Ｂ．シュードカテニュレイタム種に属するＣＥＣＴ  ７７６５株は、同種、他のビフィドバクテリウム属種および他の乳酸菌属の他の菌株と比べて比較的有利な免疫学的特性を有する。ＣＥＣＴ  ７７６５株によって誘導されるマクロファージにおけるＴＮＦ−α炎症誘発性サイトカイン産生が他種および同種の菌株と比べて少ないことは意味深く（およそ２．５〜１２．６倍の間で少なくなっている；表１）；さらに、ＣＥＣＴ  ７７６５株によって誘導されるＭＣＰ１産生も少ない（およそ１．２〜３８．２倍の間で少なくなっている；表１）。技術の現状についてのセクションで論述した通り、マクロファージによるこれらのサイトカインおよびケモカインの合成は、例えば、肥満、糖尿病、脂質異常症および他の関連代謝障害と直接関係していた。加えて、ＣＥＣＴ  ７７６５株は、ＩＬ１０などの抗炎症性サイトカインの合成を誘導し、この合成は他のビフィドバクテリウム属菌株よりも高い割合でこれらの病変と逆相関する（１．９〜４．８倍の間で高くなっている；表２）。選択した細菌の免疫学的特性は、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の総ての細菌株で共通しておらず、それらの総ての共通する特徴が軽度慢性炎症状態と関連していることであるため、その特徴が過体重および／または肥満、ならびに肥満および過体重と一緒にまたは肥満および過体重とは関係なく現れる関連病変の治療および予防における適用に特に好適なものとなる。
【００１２】
技術の現状とは違って、本発明は、多元的な観点で肥満の治療に取り組み、さらに、任意の公知のビフィドバクテリウム属菌株に関して記載されていないこの病変または関連病変の予防および／または治療のための新しい重要な標的に影響を及ぼす。最も興味深い事実は、この属または種の公知の菌株には、本発明を通じて示される総ての状態の同時かつ有効な治療に有用であることが証明されているものがないということである。
【００１３】
よって、本発明は、技術の現状に、過体重および／または肥満、ならびに特定関連病変（例えば、限定されるものではないが、糖尿病、肝脂肪症、脂質異常症または代謝症候群など）の治療のための高価値のＢ．シュードカテニュレイタム種菌株を提供する。
【００１４】
本質的に、本発明のＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株を使用することによってもたらされる利点は以下である：
・Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の投与により、肥満対象および非肥満対象において脂肪細胞のサイズが縮小される（実施例４参照）。特に、肥満動物へのＣＥＣＴ  ７７６５株の投与では小型脂肪細胞（１０００〜２０００μｍ２）の増加がもたらされるが、一方、該菌株の投与を受けていない肥満動物では、大型脂肪細胞（４０００〜６０００μｍ２）の増加が起こる（実施例４、図５）。
【００１５】
ＣＥＣＴ  ７７６５株により脂肪細胞のサイズが縮小されるという事実から、経時的に維持され、かつ多数の脂肪細胞で起こったならば、過体重および肥満を引き起こし得る脂肪細胞（異常）肥大の治療に該株が有用であることが示される。これは、大型脂肪細胞が、前脂肪細胞の分化によって脂肪生成を誘発する増殖因子をより高濃度で分泌し、フィードバックプロセスを生み出すためである。異常肥大の脂肪細胞はさらに、異常に高濃度の炎症性サイトカインおよびケモカイン（ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、レジスチンなど）を産生し、それらが肝細胞におけるインスリンシグナル伝達を阻害し、インスリン抵抗性および他の合併症をもたらす。脂肪細胞のサイズ増大は、肝臓への脂肪酸供給の増加とも関連し、その増加は肝脂肪症およびその合併症へとつながる。よって、該菌株はさらにこれらの関連病変の予防または改善にも寄与することができる。
【００１６】
・本発明の菌株対象の投与により、肥満対象および非肥満対象において肝臓に蓄積される脂肪の減少がもたらされる（実施例４、図６）。具体的には、該菌株によりグレード４の最大脂肪含量の肝細胞（＞６６％）の数が減少され、グレード３の肝細胞（脂肪含量３４〜６６％）の数が増加される。しかしながら、該菌株の投与を受けていない肥満動物では、肝細胞の種類の割合は逆であり、最大脂肪含量の肝細胞が圧倒的に多い。対照動物では、該菌株の投与により、グレード２の肝細胞（脂肪含量＜３３％）が増加され、グレード３の肝細胞（脂肪含量３４〜６６％）が減少される。これは該菌株を受けていない動物で起こったことの逆である。従って、該菌株の投与により、食物により誘導されたまたは誘導されない肝臓脂肪の蓄積総量が減少されることが示される。
【００１７】
よって、肝脂肪症の予防および／または治療のために、ＣＥＣＴ  ７７６５株を使用することができる。この病変は、高エネルギー負荷食および肥満に関連する病変と考えられる（肥満対象の６０〜９０％に存在する）が、過体重および／または肥満が原因ではない、限定されない例として、感染症および栄養障害または遺伝性代謝障害に起因するケースもある。
【００１８】
・Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株により腸細胞内のカイロミクロンの数が減少される、つまり、吸収され、カイロミクロンの形でリンパおよび血液に入った後、末梢組織へ送られる食物中の脂肪の量が該株により減少される（実施例６、図７）。この特性は、末梢血トリグリセリド濃度の減少にも反映される（実施例５）。過体重および／または肥満の原因であり得るだけでなく、脂肪組織で脂肪蓄積増加を引き起こすことから、食物脂肪の吸収増加は、過体重または肥満の原因ではない他の病変、例えば、本発明の範囲を限定するものではないが、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、代謝症候群、心血管病変および脂質代謝とグルコース代謝との関連により生じる他の障害などの原因となり得る。脂質異常症は、食物から吸収される脂肪だけでなく、脂肪細胞のインスリン抵抗性などの他の代謝障害の結果としても起こり得る。脂肪細胞のインスリン抵抗性は、必ずしも肥満に関連していないが、脂肪細胞から脂肪酸を放出させ、その脂肪酸が肝臓で使用され、トリグリセリド合成および分泌が増加し、末梢血トリグリセリドが増加する。脂質異常症は、この代謝障害、必ずしも肥満に関連していないが、インスリン抵抗性、または食物脂肪の吸収増加に対して遺伝的に疾病素質のある対象にも存在し得る。よって、ＣＥＣＴ  ７７６５株は、食物脂肪の過剰吸収に関連する疾患の予防および／または治療において、ならびに脂質異常症（例えば、高トリグリセリド血症および高コレステロール血症）の予防および／または治療のために効果的であり得る。
【００１９】
・ＣＥＣＴ  ７７６５株により、グルコース代謝障害が調節され、インスリンの合成および機能に関連する末梢血グルコース濃度が増加される（高血糖）（実施例５）。グルコースの増加は、数ある原因の中でも特に、必ずしも肥満に関連していないが、インスリン抵抗性またはインスリン合成の欠如によって起こり得る。
【００２０】
・ＣＥＣＴ  ７７６５株により、自然免疫系および適応免疫系細胞の働きが改善され、肥満対象および非肥満対象において、感染性病原体、抗原またはアレルゲンに対するそれらの応答能力が高められる。特に、高脂肪食により誘導された肥満動物モデルへの該菌株の投与により、とりわけ、食作用およびサイトカイン合成におけるマクロファージの機能が改善される（実施例３、図２および図３）。本発明の菌株対象により、適応免疫系樹状細胞およびＴ細胞の機能も改善される（実施例３、図４）。
【００２１】
よって、ＣＥＣＴ  ７７６５株は、感染症の予防および治療にだけでなく、例えば、ワクチン接種工程および免疫工程における、防御応答の改善にも有用であり得ることから、ＣＥＣＴ  ７７６５株はさらなるプラスの効果を有する。これは、過体重および肥満対象では免疫系のこれらの機能が変更されていることによる。さらに、本発明の菌株は、肥満および過体重に関連するまたは関連していない（基本的にはマクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞の）免疫抑制を呈する他の疾患（例えば、糖尿病）の治療または予防にも有用であり得る。
【００２２】
・ＣＥＣＴ  ７７６５株により、該菌株で処置された肥満および標準体重の対象において末梢および中枢のレベルで誘導され得る炎症誘発性タンパク質が、該菌株で処置されていない場合よりも少量となる。よって、本発明の菌株対象により、末梢系および中枢神経系におけるＴＮＦ−α合成も減少される。ＴＮＦ−α合成は、肥満および他の病変では増加しており、インスリンおよびレプチンの抵抗性の発現に寄与し、インスリンおよびレプチンの食欲抑制作用（空腹感の減少）ならびに体重およびグルコース代謝の調節におけるそれらの機能が抑制される（実施例３）。該菌株により、末梢血レプチン濃度が増加している肥満対象において末梢血レプチン濃度も減少される。標準体重の対象では、該菌株は炎症に有利に働き、末梢血レプチン濃度は増加され、それが食欲および食物摂取の減少、ならびにエネルギー消費および脂質酸化の増大に逆に寄与し、その結果、体重の減少に逆に寄与する（実施例３、図８）。
【００２３】
よって、ＣＥＣＴ  ７７６５株により、タンパク質およびホルモン（サイトカイン、ケモカインおよびアディポカイン）の産生が調節される。肥満、ならびに末梢血および中枢神経系の両方に関する肥満関連特定疾患（限定されない例として、糖尿病、脂質異常症、代謝症候群、心血管疾患および脂肪症など）、ならびに必ずしも過体重および／または肥満に関連していなくてよい他の疾患ではそれらの合成は変更されている。よって、これらの病変の治療および予防のために、該株を使用することができる。
【００２４】
・さらに、ＣＥＣＴ  ７７６５株により、過体重および肥満に関連する変化、ならびにこれらの変化によって起こる炎症作用の正常化によって腸管微生物叢の構成が回復され、該株は、体重増加、インスリン抵抗性、代謝性内毒素血症、肝脂肪症および腸管バリア機能変化と関連していた（実施例３）。本発明の菌株は、他の基礎病変に一次的にまたは二次的に関連し得るあるいはそれらを誘発する危険性がある病原性または日和見性の腸管腸内細菌の過剰増殖を減少させるためにも使用することができる。よって、さらに、感染症および腸管微生物叢の変化に関連する疾患の予防および治療においても、ＣＥＣＴ  ７７６５株を使用することができる。
【００２５】
本発明の１つの側面は、受託番号ＣＥＣＴ  ７７６５であるＢ．シュードカテニュレイタム株に関する。該菌株は２０１０年７月２１日にthe Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (Spanish Type Culture Collection)（ＣＥＣＴ）に寄託され、該菌株には受託番号ＣＥＣＴ  ７７６５が付与された。該国際寄託機関の住所は：Universidad de Valencia / Edificio de Investigacion / Campus de Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia)である。
【００２６】
本発明のＣＥＣＴ  ７７６５株の科学的分類は：界：細菌界(Bacterium)／門：放線菌門(Actinobacteria)／目：ビフィドバクテリウム目(Bifidobacteriales)／科：ビフィドバクテリウム科(Bifidobacteriaceae)／属：ビフィドバクテリウム属／種：シュードカテニュレイタム種である。
【００２７】
前記菌株の特徴は以下に示される：
・ＣＥＣＴ  ７７６５菌が酸化するまたは発酵させる基質は以下に示される：Ｄ−アラビノース、リボース、Ｂ−メチル−Ｄ−キシロシド、ガラクトース、Ｄ−グルコース、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、メレジトースおよびキシリトール。
・ＣＥＣＴ  ７７６５株は以下の酵素活性を有する：オルトニトロフェニル−βＤ−ガラクトピラノシダーゼおよびアルギニンジヒドロラーゼ。
・該菌株は３１〜４２℃の間に含まれる温度範囲で増殖し、最適な増殖は３７℃で行われる。
・該菌株は５〜８の間に含まれるｐＨ範囲で増殖し、最適な増殖はｐＨ７で行われる。
【００２８】
さらに、前記菌株は胃腸のストレス条件（酸性ｐＨおよび高胆汁濃度）で安定している。胃の条件（ｐＨ３およびｐＨ２．５でペプシン３ｇ／ｌ）で平均胃内容排出時間（２時間）のインキュベーション後のその生存可能性は６４〜９５％であり、胆汁酸塩（０．５％および１％）の存在下でのその増殖は８０〜９０％の間で維持される。前記菌株は、技術的保存処理条件（冷凍、凍結乾燥など）および食品調製条件（冷蔵、凍結乾燥、発酵など）に対して抵抗性も示し、種々の工業規模微生物生産培地で増殖する。例えば、前記菌株は、乳汁中で、ＭＲＳ市販実験培地で得られるのと実質的に等しい増殖を示し、ＧＥＭ工業生産培地中ではより大きな対数単位を示す。in vivoでは、前記菌株は、経口投与後の腸管輸送に耐えることが可能であり、対象や、分析サンプルの種類および投与からの経過時間によって、初期投与用量に対して１〜２対数単位の減少を示すだけである。これら総ての特性により腸内でのその生存可能性、存続および有効性が保証される。
【００２９】
本発明の別の好ましい態様は、本発明を通じて記載される能力が維持されたまたは改善された、Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の誘導株に関する。該誘導微生物は、自然に産生され得るし、あるいは技術の現状において公知の突然変異誘発法によって（例えば、限定されるものではないが、突然変異誘発物質またはストレスを引き起こす物質の存在下での起源微生物の増殖など）または特定の遺伝子の改変を目的とする遺伝子工学によって意図的にも産生され得る。より好ましい態様によれば、Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の誘導株は遺伝子組換え変異体である。変異菌株または誘導株という用語は、区別せずに使用することができる。
【００３０】
Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株またはその任意の変異体もしくは誘導体は、例えば、本発明の好ましい態様によるような、記載される影響を及ぼす任意の形態で使用することができ、Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株は（培養可能または培養不能な）生存細胞の形態であり、あるいは本発明の別の好ましい態様によれば、該菌株は非生存細胞の形態（技術の現状において公知の任意の技術、例えば、限定されるものではないが、熱、冷凍または紫外線放射などによって不活性化された「死」細胞）である。
【００３１】
以下、前述の好ましい態様および側面に記載したＢ．シュードカテニュレイタム種の細菌株を総て「本発明の菌株」と表される。
【００３２】
本発明の別の側面は、本発明の菌株を含んでなる微生物組合せに関する。該微生物組合せは、本発明の菌株の細胞セットまたは本発明の菌株の少なくとも１種の細胞と、同種もしくは異種の別の菌株または別の微生物分類群の細胞セットとが一緒になっている。該微生物組合せの細胞は、非生存細胞または生存細胞であってよく、それらの形態に関係なく発生または増殖の状況のいずれの段階（潜伏期、対数期、定常期など）のものであってもよい。
【００３３】
本発明の好ましい態様は、本発明の菌株以外の少なくとももう１種の微生物を含んでなる微生物組合せに関し、例えば、限定されるものではないが、該組合せの一部となり得る微生物は以下である：
・少なくとももう１種のビフィドバクテリウム属菌株、限定されない例として、Ｂ．ロングム(B. longum)ＣＥＣＴ  ７３４７株あるいは他のＢ．シュードカテニュレイタム、Ｂ．カテニュレイタム(B. catenulatum)、Ｂ．ブレーベ(B. breve)、Ｂ．ロングム亜種ロングム(B. longum subsp. longum)、Ｂ．ロングム亜種インファンティス(B. longum subsp. infantis)、Ｂ．ラクティス亜種ラクティス(B. lactis subsp. lactis)、Ｂ．ラクティス亜種アニマリス(B. lactis subsp. animalis)またはＢ．アドレッセンティス(B. adolescentes)種の菌株。
【００３４】
・腸管由来、食品由来または環境由来の少なくとも１種の乳酸菌。該乳酸菌は、限定されるものではないが、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属(Lactococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、ワイセラ属(Weissella)、ペディオコッカス属(Pediococcus)またはストレプトコッカス属(Streptococcus)の細菌を含んでなる一覧から選択される。
【００３５】
・腸管由来、食品由来または環境由来の他の原核生物系統発生群、属または種の少なくとも１種の菌株、例えば、限定されるものではないが、古細菌(Archaea)、フィルミクテス門(Firmicutes)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、プロテオバクテリア門(Proteobacteria)、放線菌門、ヴェルコミクロビウム門(Verrucomicrobia)、フソバクテリウム門(Fusobacteria)、メタノバクテリウム綱(Methanobacteria)、スピロヘータ綱(Spirochaetes)、フィブロバクター門(Fibrobacteres)、デフェリバクター門(Deferribacteres)、デイノコッカス属(Deinococcus)、サーマス属(Thermus)、シアノバクテリア門(Cyanobacteria)、メタノブレビバクテリウム(Methanobrevibacterium)、ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、コプロコッカス属(Coprococcus)、サブドリグラヌルム(Subdoligranulum)、ドレア(Dorea)、ブレイジア(Bulleidia)、アナエロフスティス(Anaerofustis)、ゲメラ属(Gemella)、ロゼブリア(Roseburia)、カテニバクテリウム(Catenibacterium)、ジアリスター(Dialister)、アナエロツルンカス(Anaerotruncus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ミクロコッカス属(Micrococcus)、プロピオニバクテリウム属、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、バクテロイデス属(Bacteroides)、パラバクテロイデス属(Parabacteroides)、プレボテーラ属(Prevotella)、ユウバクテリウム属(Eubacterium)、アッケルマンシア(Akkermansia)、バチルス属(Bacillus)、ブチリビブリオ属(Butyrivibrio)またはクロストリジウム属(Clostridium)など;
・少なくとも１種の真菌株または酵母株、例えば、限定されるものではないが、サッカロミセス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、デバリオミセス属(Debaryomyces)、トルロプシス属(Torulopsis)、アスペルギルス属(Aspergillus)、クモノスカビ属(Rhizopus）、ケカビ属(Mucor）またはアオカビ属(Penicillium）に属するものなど。
【００３６】
以下、前述のパラグラフに記載した微生物組合せを総て「本発明の微生物組合せ」と表される。
【００３７】
本発明の別の側面は、本発明の菌株から、あるいは本発明の微生物組合せから得られる、細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せに関する。本発明はまた、ＣＥＣＴ  ７７６５株から、あるいは本発明の微生物組合せから得られる、細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せと、他の食品成分、植物性製品成分および薬物成分との組合せも意図する。
【００３８】
細菌の細胞成分としては、細胞壁成分（例えば、限定されるものではないが、ペプチドグリカンなど）、核酸、膜成分、または他のもの、例えば、タンパク質、脂質および炭水化物ならびにそれらの組合せ（リポタンパク質、糖脂質または糖タンパク質など）などが挙げられ得る。代謝産物としては、増殖中、技術工程（例えば、限定されるものではないが、食品または薬物の調製工程）における使用中、製品保存中または胃腸管通過中にその代謝活性の結果として細菌によって産生されたまたは改変された任意の分子が挙げられる。これらの代謝産物の例は、限定されるものではないが、有機酸および無機酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、脂質、炭水化物、リポタンパク質、糖脂質、糖タンパク質、ビタミン、塩、金属または核酸である。分泌分子としては、増殖、（例えば、食品または薬物の調製のための）技術工程におけるその使用、製品保存または胃腸管通過の間に細菌によって排出されたまたは放出された任意の分子が挙げられる。これらの分子の例としては、限定されるものではないが、有機酸および無機酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、脂質、炭水化物、リポタンパク質、糖脂質、糖タンパク質、ビタミン、塩、金属、または核酸が挙げられる。
【００３９】
本発明の別の側面は、本発明の菌株、あるいは本発明の微生物組合せ、あるいは本発明の菌株の細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せを含んでなる組成物に関する。
【００４０】
一般的に定義される組成物は、任意の濃度の本発明の菌株から少なくともなる、あるいは本発明の菌株の細胞成分、代謝産物、分泌分子、またはそれらの任意の組合せから少なくともなる、成分セットである。
【００４１】
医薬組成物は、対象の全体的な健康状態の改善を含む、対象の肉体的または精神的に満足のいく状態の改善における少なくとも１つの用途を有する、任意の濃度の本発明の菌株から少なくともなる、あるいは本発明の菌株の細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せから少なくともなる、成分セットである。
【００４２】
医薬品という用語は、医薬品が対象に対して、予防効果または治療効果、すなわち、生理学的効果を必ず与えることから、本発明において定義される「医薬組成物」の意味に比べて意味が限定される。「医薬品」という用語は以下に十分に定義される。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様は、医薬組成物である組成物に関する。一層より好ましい態様では、該医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでなる。
【００４４】
「賦形剤」という用語は、本発明の組成物の成分のいずれもの吸収を助け、該成分を安定させ、あるいは硬度を与えまたは味を良くする香味を与えるという意味で医薬組成物の調製を助ける物質を指す。従って、賦形剤は、成分が相互に結合した状態に保つ機能（例えば、デンプン、糖またはセルロースなど）、甘味機能、着色機能、医薬品の保護機能（例えば、空気および／または水分から医薬品を分離するなど）、錠剤、カプセル剤または任意の他の提供形態での増量剤機能（例えば、リン酸水素カルシウムなど）、成分の溶解およびそれらの腸管吸収を促進する崩壊機能を有することがあるが、このパラグラフで記述されていない別の種類の賦形剤も排除されない。よって、用語「賦形剤」は、ガレヌス製剤に含まれている、それらの調製および安定を可能にするため、それらの官能特性を改変するためまたは医薬組成物の物理化学的特性およびそのバイオアベイラビリティを決定するために、有効成分またはそれらの群に追加される材料と定義される。「薬学的に許容可能な」賦形剤は、医薬組成物の化合物の活性を可能にするものでなければならない、つまり、前記成分と適合するものでなければならない。
【００４５】
「ガレヌス製剤(galenic form)または投与形」は、医薬品を構成するように有効成分および賦形剤を適合させた提供物である。「ガレヌス製剤または投与形」は、医薬組成物が製造業者によって提供される形態と、それが投与される形態との組合せによって定義される。
【００４６】
「担体」またはビヒクルは、好ましくは、不活性物質である。担体の機能は、他の化合物の組込みを容易にすること、より良い調剤および投与を可能にすることまたは医薬組成物に硬度および形状を与えることである。従って、担体は、医薬品において、本発明の医薬組成物の成分のいずれもを特定の容量または重量に希釈するために使用される物質であり；あるいは該成分の希釈を行わない場合でも、より良い調剤および投与を可能にすることができまたは医薬品に硬度および形状を与えることができる物質である。提供形態が液体である場合、薬学的に許容可能な担体は希釈液である。
【００４７】
さらに、賦形剤および担体は薬理学上許容されるものでなければならない、つまり、賦形剤および担体は、それらがそれらの投与を受ける生物に害を及ぼさないように認可および評価を受ける。
【００４８】
別の一層より好ましい態様では、前記医薬組成物は、別の活性物質をさらに含んでなる。治療効力要件に加え、前記医薬組成物に他の治療薬を使用する必要がある場合には、本発明の化合物と別の治療薬との組合せの使用を大いに必要としまたは望ましいとする基本的な理由がさらにある可能性がある。「有効成分」という用語は、それがヒト起源、動物起源、植物起源または化学的起源のものであるか、あるいは別の種類のものであるかには関係なく、医薬品の構成に好適な活性を有すると考えられる任意の材料である。
【００４９】
いずれの場合においても、医薬品の提供形態は、使用する投与の種類に適合させるため、本発明の組成物は、溶液または任意の他の臨床上許容される投与形の形で、治療上有効な量で与えることができる。本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア剤またはエアゾール剤などの、固体、半固体、液体または気体の形態で処方することができる。本発明の一層より好ましい態様によれば、該医薬組成物は経口投与に好適な形態で存在する。
【００５０】
経口投与に好適な形態とは、経口投与を可能にすることができる物理的状態を指す。経口投与に好適な形態は、限定されるものではないが、ドロップ剤、シロップ剤、煎じ薬、エリキシル剤、懸濁液、即席懸濁液、飲用バイアル剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、カシェ剤、丸剤、ペレット剤、口中剤、トローチ剤または凍結乾燥物を含んでなる一覧から選択される。
【００５１】
別の可能性は、前記医薬組成物が舌下投与、鼻腔投与、くも膜下腔内投与、気管支投与、リンパ系投与、直腸投与、経皮投与または吸入投与に好適な形態で存在することである。本発明の菌株、本発明の微生物組合せ、本発明の菌株から、あるいは本発明の微生物組合せから得られる、細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せは、例えば、限定されるものではないが、リポソームまたはミセルと一緒にすることができる。
【００５２】
本明細書において使用される意味において、「治療上有効な量」という表現は、哺乳類、好ましくは、ヒトに投与される場合、哺乳類、好ましくは、ヒトにおいて対象となる疾患または病状の、以下に定義されるような、予防および／または治療をもたらすのに十分である、医薬組成物の成分の量を指す。治療上有効な量は、例えば、任意の提供形態における、本発明の菌株の活性、本発明の微生物組合せの活性、細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの活性によって変化し、また治療上有効な量は、化合物の作用の代謝安定性および持続時間、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、投与の方法および時間、排出速度、薬物の組合せ、特定の障害または病状の重篤度、ならびに療法を受ける対象によっても変化するが、当業者ならば自身の知識と本明細書に従ってその量を決定することができる。
【００５３】
本発明の別の好ましい態様は、栄養組成物である組成物に関する。本発明のより好ましい態様は、食品、機能性食品（nutraceutical）、栄養補助食品(supplement)、プロバイオティクス（probiotic）、またはシンバイオティクス(symbiotic)である栄養組成物に関する。
【００５４】
本発明の「栄養組成物」という用語は、それを摂取する対象に供給される栄養素に関係なく、その生物の１つまたはいくつかの機能に対して有益に作用し、その結果、健康で満足のいく、より良い状態をもたらす食品を指す。従って、該栄養組成物は、疾患または疾患の原因となる因子の予防および／または治療を目的とすることができる。よって、本発明の「栄養組成物」という用語は、機能性食品または特定栄養目的の食品または薬用食品の同義語として使用することができる。
【００５５】
本明細書において使用されるように、「機能性食品」という用語は、健康上有益な作用を有する添加方法で使用される、食物の単離された物質を指す。
【００５６】
本明細書において使用されるように、「プロバイオティクス」という用語は、好適な量で供給される場合に宿主生物の健康に有益である生存微生物を指す。
【００５７】
本明細書において使用されるように、「シンバイオティクス(symbiotic)」という用語は、プレバイオティクスとプロバイオティクスの混合物を含有する食品を指す。それらの食品は、一般的に、増殖および／または代謝活性に有利に働くプレバイオティクス成分を含み、要するに、それと組み合わせたプロバイオティクスの効果、限定されない例として、フラクトオリゴ糖またはガラクトオリゴ糖とビフィズス菌との関連づけなどを含む。
【００５８】
「栄養補助食品」という用語は、用語「栄養補助食品」、「栄養補給剤」、または「補助食品」のいずれとも同義語であり、食事を補うことを目的とする「食品成分」である。栄養補助食品の一部の例としては、限定されるものではないが、ビタミン、無機質、植物性産物、アミノ酸、および食品成分（酵素および腺エキスなど）が挙げられる。それらは、従来の食品の代わりとしてあるいは１回の食事または日常の食事の単一成分としては提供されないが、食事の補完物として提供される。
【００５９】
一層より好ましい態様によれば、前記食品は、乳製品、植物性製品、肉製品、スナック、チョコレート、飲料またはベビーフードを含んでなる一覧から選択される。乳製品は、限定されるものではないが、発酵乳製品（例えば、限定されるものではないが、ヨーグルトまたはチーズ）または非発酵乳製品（例えば、限定されるものではないが、アイスクリーム、バター、マーガリン、乳清）を含んでなる一覧から選択される。植物性製品は、例えば、限定されるものではないが、任意の提供形態の発酵または非発酵の穀物食品である。飲料としては、限定されるものではないが、あらゆるフルーツジュースまたは非発酵乳が挙げられ得る。
【００６０】
本発明の別のより好ましい態様は、前記菌株の濃度が、１グラムまたは１ミリリットルの最終組成物当たり、１０３〜１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）である、本発明において記載される組成物のいずれもに関する。前記菌株の濃度は、必要に応じて、治療上有効なまたは栄養上有効な濃度である。栄養組成物および医薬組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、ペースト剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア剤、またはエアゾール剤などの、固体、半固体、液体、または気体の形態で処方することができる。
【００６１】
以下、前述のパラグラフにおいて定義した、組成物、一般組成物、医薬組成物、または栄養組成物を、総て「本発明の組成物」という用語を用いて表される。
【００６２】
本発明の別の側面は、医薬組成物、医薬品または栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種のＣＥＣＴ  ７７６５株の使用に関する。本発明の別の側面は、栄養組成物、医薬品または栄養組成物の製造のための、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。前述のパラグラフにおいて定義した任意の医薬組成物は、医薬品の製造のために使用することができる。
【００６３】
本発明が関連している医薬品は、ヒト用または動物用であり得る。「ヒト用医薬品」は、ヒトにおける疾患の治療または予防に向けた特性を有するか、あるいは薬理学的、免疫学的または代謝的な作用を働かせることにより生理学的機能を回復させ、補正しまたは改変する目的で、あるいは医療診断を確定する目的でヒトにおいて使用することができまたはヒトに投与することができる、任意の物質または物質組合せである。「動物用医薬品」は、動物疾患に対して治療または予防特性を有するか、あるいは薬理学的、免疫学的または代謝的な作用を働かせることにより生理学的機能を回復させ、補正しまたは改変する目的であるいは獣医診断を確定する目的で動物に投与することができる、任意の物質または物質組合せである。飼料に混ぜるために準備される「薬用飼料用プレミックス」もまた「獣医用医薬品」と考えられるであろう。
【００６４】
本発明の別の好ましい態様は、過体重、肥満の予防および／または治療のためあるいはそれらに関連する任意の病変または機能不全（例えば、免疫系の機能不全）の予防および／または治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株ＣＥＣＴ  ７７６５の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。
【００６５】
本明細書において解釈されるように、「治療」という用語は、対象（好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒト）において対象となる疾患または病状の結果としてもたらされる影響を制御することを指し、以下のことが含まれる：
（ｉ）疾患または病状を抑制すること、つまり、その進行を止めること；
（ｉｉ）疾患または病状を軽減すること、つまり、疾患または病状もしくはその症状の後退をもたらすこと；
（ｉｉｉ）疾患または病状を安定させること。
【００６６】
本明細書において解釈されるように、「予防」という用語は、疾患の発生を防ぐことからなり、つまり、特に、対象が病状の素因を有する場合には、対象（好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒト）において疾患または病状が起こらないようにすることからなる。
【００６７】
本明細書において使用されるように、「過体重」という用語は、対象の肥満度指数（ＢＭＩ）が２５以上であることを特徴とする病変を指す。ＢＭＩは、個体の体重と身長との間の関連性の尺度である。ＢＭＩの計算は下記式で示される：体重（Ｋｇ）／身長２（ｍ）。過体重は、２５≦ＢＭＩ＜３０を特徴とする。
【００６８】
ＢＭＩが３０以上である場合、その対象は「肥満」に罹患している。ＢＭＩ＞４０の対象は病的肥満に罹患していることを考慮して、肥満は異なるレベルに分類される。肥満は、ヒトおよび他の哺乳類の脂肪組織に蓄えられたエネルギー貯蔵量が健康限界を超えている臨床症状である。脂質蓄積により、種々の組織への脂肪沈着、過体重、肥満が生じ、該過体重または肥満に関連する一連の病変、例えば、限定されるものではないが、２型糖尿病および妊娠糖尿病、脂質異常症（好ましくは、高脂血症および高コレステロール血症）、心血管疾患、高血圧、脂肪肝（好ましくは、非アルコール性脂肪肝もしくは肝脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎、硬変または肝炎）、代謝症候群、癌、感染症、他などが生じる。該病変と、過体重または肥満とのそれらの関連性との関係は技術の現状において周知である（例えば、ＷＯ／２０１００８６４５４号またはＷＯ／２００８１１９１１０号など）。従って、該関連性が広く証明されていることから、過体重および／または肥満に関連する病変の予防および／または治療における前記医薬品、前記医薬組成物または前記栄養組成物の使用は正当なものである。よって、当業者ならば考えるように、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の使用により、過体重および／または肥満が原因の疾患の発生を防ぐことができる。
【００６９】
ＢＭＩは、対象が肥満に罹患しているかどうかを判定するためによく用いられるが、その目的のための他のパラメーターもある。絶対胴囲（男性で＞１０２ｃｍ［中心性肥満］、女性で＞８８ｃｍの場合、その対象は肥満に罹患している）または胴囲と殿囲（waist-hip ratio）の比（男性で＞０．９、女性で＞０．８５の場合、その対象は肥満に罹患している）は中心性肥満の尺度として用いられる。肥満判定の別の方法は体脂肪率の測定である（男性で体脂肪がおよそ＞２５％、女性で体脂肪がおよそ＞３０％の場合、その対象は肥満に罹患している）。中心性肥満（男性型肥満または腹部肥満(waist obesity)、主に、高胴囲−殿囲範囲(a high waist-hip radius)を特徴とする）は代謝症候群の重要な危険因子であり、対象を、１つに限らず、心血管疾患および２型糖尿病に罹患させる強い素因となる一連の変化および危険因子である。
【００７０】
健康上の肥満の影響は、種々の細胞および組織で脂肪塊の増加が起こることと考えられ、さらにその影響により、代謝障害を伴って慢性炎症状態および免疫系の機能不全も起こり、それらが上述の種々の病変の原因となる。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様は、肥満または過体重の対象および過体重または肥満の前段階において脂肪組織の増殖および分化を減少させるための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。よって、それは脂肪細胞肥大の予防および／または治療のために使用される。実施例４および図５で示されるように、本発明の菌株対象により脂肪細胞のサイズが縮小される。人生の特定段階（とりわけ、小児期および青年期の間）での脂肪細胞の増加（肥大）は、とりわけ、成人年齢での過体重および肥満ならびに他の関連合併症の発生に有利に働く。特に、肥満動物へのＣＥＣＴ  ７７６５株の投与により、小型脂肪細胞の数の増加がもたらされ、大型脂肪細胞の数の減少がもたらされる（実施例４、図５）。
【００７２】
本発明の別の好ましい態様は、肝脂肪症または脂肪肝の治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。本発明の実施例４で示されるように、肥満動物モデルおよび対照動物（非肥満）の両方へのＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の投与により、脂肪蓄積量が多い肝細胞の数が減少される。全般的に言えば、これは、本発明の菌株により肝臓での脂肪蓄積が減少されることを意味する。
【００７３】
前述のパラグラフにおいて過体重および／または肥満に関連する疾患と定義した、肝脂肪症または脂肪肝の治療または予防のために、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株を使用することができる。本発明はまた、肝脂肪症の悪化と関連する病変、例えば、限定されるものではないが、非アルコール性肝炎、脂肪性肝炎、繊維症、硬変、末期肝疾患または肝臓癌などの予防および／または治療にも関する。さらに、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株は、必ずしも肥満または過体重の対象で現れないが他の障害によってもたらされる、肝臓脂質蓄積と炎症を呈するこれらまたは他の病変に使用することができる。そのような障害としては、例えば、限定されるものではないが、栄養障害（例えば、限定されるものではないが、吸収不良、タンパク質カロリー栄養失調症または非経口栄養）、遺伝性または非遺伝性代謝障害（例えば、限定されるものではないが、２型糖尿病、無βリポタンパク質血症または全身性カルニチン欠乏症）、薬物（例えば、限定されるものではないが、コルチコイドまたはイブプロフェン）もしくは毒素（例えば、限定されるものではないが、アルコール）への暴露に起因する疾患、感染症、硬変、繊維症、末期肝疾患、肝臓癌もしくは下垂体障害による慢性または急性肝炎が挙げられる。特に、２型糖尿病患者のおよそ５０％は脂肪症に冒されている。
【００７４】
本発明の別の好ましい態様は、対照に対する、血液脂質濃度（例えば、脂質異常症）、好ましくは、血液トリグリセリド濃度の変化に起因する疾患の予防および／または治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。よって、それはその血中濃度を正常化するために使用される。該医薬品または該栄養組成物は、好ましくは、脂質異常症（脂質異常症と同義）の治療のために使用される。脂質異常症は、好ましくは、高トリグリセリド血症または高コレステロール血症である。脂質異常症は、脂質代謝障害を唯一の共有要素とする病状であり、それに続く血中の脂質濃度およびリポタンパク質濃度の変化を伴う。脂質異常症は、肥満と関連している場合も関連していない場合もあるが、高脂肪食の摂取とは関連しており、脂肪吸収の増加とも関連している。また、これらの変化は、数ある病変の中でも特に、心血管疾患および糖尿病の危険性がより高いことと関連している。本発明の菌株により、正常対象および肥満対象の両方において、脂質吸収および血液トリグリセリドレベルが減少され、実施例５で示されるように、記載した用途に有効であることがわかる。
【００７５】
本発明の別の好ましい態様は、未処置の対照に対して、食物から吸収される脂質の量を減少させるための、医薬品の製造のための、または栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。
【００７６】
実施例６で示されるように、本発明の菌株により、腸管腸細胞内のカイロミクロンの数が減少される、つまり、該菌株により、吸収される食物脂肪の量が５０％より大きく減少される（実施例６；図７）。カイロミクロンは、食物由来の脂質がパッケージングされ、腸からリンパへ、さらに血液へと輸送され、末梢組織で使用される形であり、この機構を通じて、投与された菌株が生物におけるそれらの吸収および蓄積を制限すると思われる。食物中の脂肪の吸収は、脂肪組織で脂肪蓄積増加をもたらすことにより過体重および／または肥満の原因となり得る他、肥満を生じさせない他の病変、例えば、本発明の範囲を限定するものではないが：脂肪が蓄積したプラークを有する動脈内膜の肥厚を特徴とするアテローム性動脈硬化症、および血漿脂質濃度（トリグリセリドおよび／またはコレステロールならびに関連リポタンパク質）の変化を特徴とする脂質異常症、高心血管系リスクに関連する病変、または脂質代謝とグルコース代謝との関係に由来する他の変化（例えば、限定されるものではないが、インスリン抵抗性または糖尿病）などの原因にもなり得る。
【００７７】
本発明の好ましい態様は、対照に対する高血糖レベルに起因する疾患の予防および／または治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。よって、それは、未処置の対象に対して、血糖濃度（高血糖）を減少させ、その正常な生理学的レベルを維持し、食後血糖応答を調節するために使用される。
【００７８】
空腹時血糖の増加（高血糖）および食後血糖応答の変化は、インスリン抵抗性（十分なインスリンを生成するが体が正常に応答しない対象）によっても起こり得るし、あるいは肥満を伴うまたは伴わない、他の代謝障害または薬物との相互作用によるインスリン合成の欠如によっても起こり得る。本発明の実施例５でこの好ましい態様の実験的確証を提供する。「高血糖レベルに起因する疾患」という用語は、正常グルコース値、つまり、空腹時に血中およそ７２〜１１０ｍｇ／ｄｌの間または４〜７ｍｍｏｌ／ｌ、あるい食後１時間半後に測定した場合におよそ＜１８０ｍｇ／ｄｌ（または１０ｍｍｏｌ／ｌ）を有する健常者に予想される濃度よりも高い血糖濃度によって起こる健康変化に関するものである。該値は近似平均値であるが、これは各対象に特徴的な状態によって起こる変動を考慮する必要があるためである。高血糖レベルに起因する疾患は、限定されるものではないが、神経障害（四肢および／または器官の神経の損傷）、網膜症（眼の網膜の損傷）、腎症（腎不全を引き起こし得る腎臓の損傷）、心血管疾患（例えば、高血圧または心筋梗塞）、脳血管疾患（例えば、脳血栓症）を含んでなる一覧から選択される。
【００７９】
本発明の別の好ましい態様は、糖尿病特有の予防および／または治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。より好ましい態様は、２型糖尿病、過体重および／または肥満に関連する病変の予防および／または治療に関するものであるが、必ずしもそうではない。
【００８０】
２型糖尿病は、組織のインスリン産生およびインスリン感受性の相対的欠乏を特徴とし、それゆえに、末梢でのグルコースの使用不足も特徴とする。２型糖尿病は全糖尿病患者の８０％〜９０％に相当する。２型糖尿病は、成体期に発症することが多く、肥満に関連していることが非常に一般的である。しかしながら、このタイプの糖尿病はいくつかの薬物や他の原因によって引き起こされる場合がある。例えば、糖尿病は、コルチコイドの長期投与に関連していることがよくあり、未処置のヘモクロマトーシスに関連していることもよくあるが、妊娠糖尿病は必ずしも肥満に関連しているとは限らない。
【００８１】
本発明の別の好ましい態様は、肥満または過体重の対象および過体重または肥満の前段階において脂肪組織の増殖および分化を減少させるための、医薬品の製造のため、または栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。よって、それは、代謝症候群の予防および／または治療のために使用される。代謝症候群とは、肥満、脂質異常症（例えば、高トリグリセリド血症(triglyceridemia)および高コレステロール血症）および高血糖の組合せを含む状態で、糖尿病および心血管疾患の危険性をともに高める一連の代謝障害を指す。前述の例で示されるように、本発明の菌株は、これらの障害の予防および同時治療のために有用であり、それゆえに、代謝症候群の予防および同時治療のために有用である。
【００８２】
本発明の別の好ましい態様は、対照対象に対する自然免疫応答および適応免疫応答の変化に関連する疾患の予防および／または治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。よって、それは未処置の対象に対して自然免疫系および適応免疫系の機能を改善するために使用される。この病変は、好ましくは、これらの免疫機能の変化をもたらす、過体重、肥満および関連障害である。これに関して、実施例３に実験データを示す。
【００８３】
「自然免疫応答および適応免疫応答の低下に関連する疾患」という用語は、自然免疫系および適応免疫系の機能の免疫抑制を呈する疾患を指す。
【００８４】
本発明の別の好ましい態様は、対照に対する炎症誘発性タンパク質の高産生に関連する疾患の予防および／または治療のための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。これに関して、実施例２および実施例３に実験データを示す。
【００８５】
炎症誘発性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカインおよびアディポカインが挙げられる。炎症誘発性タンパク質は、好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＴＮＦ−α、もしくはＭＣＰ１およびレプチン、またはそれらの任意の組合せを含んでなる一覧から選択される。炎症誘発性タンパク質は、より好ましくは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＣＰ１、およびレプチン、またはそれらの任意の組合せを含んでなる一覧から選択される。
【００８６】
「炎症誘発性タンパク質の高産生に関連する疾患」という用語は、少なくとも、異なる種類の組織の炎症に関与する（炎症誘発性）タンパク質の産生によって起こる疾患を指す。炎症誘発性タンパク質の高産生に関連する疾患の一部は、過体重および／または肥満にも関連しており、例えば、限定されるものではないが、２型糖尿病、妊娠糖尿病、代謝症候群、脂肪肝、非アルコール性肝炎、高血圧、脂質異常症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂肪性肝炎または癌などである。炎症誘発性タンパク質の高産生に関連する他の疾患は、過体重および／または肥満に関連していないかあるいは肥満が存在しなくても現れることがあり、例えば、限定されるものではないが、上述の疾患（例えば、糖尿病）および他の疾患（アレルギー性炎症など）などである。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様は、未処置の対照に対して、肥満対象のレプチン濃度を減少させるためおよび／または非肥満対象の該ホルモン濃度を増加させるための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。非肥満対象では、レプチンの増加が、食物摂取の減少をもたらし、エネルギー消費および脂質酸化の増加をもたらす。それに対して、肥満対象では、レプチン濃度の減少が代謝障害の正常化および炎症の軽減に寄与する。
【００８８】
本発明の別の好ましい態様は、腸管微生物叢の構成を回復させるためまたは腸管内容物中の腸内細菌濃度を減少させるための、医薬品の製造のためまたは栄養組成物の製造のための、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の菌株、すなわち、本発明の菌株の、あるいは本発明の微生物組合せの、あるいは細胞成分、代謝産物、分泌分子またはそれらの任意の組合せの、あるいは本発明の組成物の使用に関する。一層より好ましい態様では、腸管微生物叢の構成の回復または腸管内容物中の腸内細菌濃度の減少は、過体重対象、肥満対象においてまたはそれらに関連する任意の病変を有する対象において行われる。
【００８９】
腸管微生物叢の回復は、限定されない例として、未処置の対照に対する、腸管内容物中の腸内細菌濃度の減少、ならびにビフィズス菌および／またはラクトバチルス菌の増加に基づいてよい。実施例３．６で見られるように、本発明の菌株の投与により、結腸中の総ビフィズス菌濃度の少なくとも１対数単位の増加がもたらされ、腸内細菌などの潜在的炎症性細菌の濃度の少なくとも０．５対数単位の減少がもたらされる。これはまた、種々の病変によって肥満対象または非肥満対象が影響を受ける末梢組織（例えば、肝臓）へと腸から伝達される炎症誘発性シグナルの減少も引き起こす。
【００９０】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含んでなる」という語およびその変形は、他の技術的特徴、添加物、成分、または工程を排除することを目的としていない。当業者ならば、本発明の他の目的、利点および特徴は、１つには本明細書から、１つには本発明を実施することから推測されるであろう。以下の図面および実施例は、例示として示しており、本発明を限定することを目的としていない。
【実施例】
【００９１】
本発明者らが行ったアッセイを用いて本発明を下に示す。本特許文献に記載する以下の具体的な実施例は本発明の性質を例示するものである。これらの実施例は、単に例示することを目的とするものであり、特許を請求する本明細書の発明を限定するものと解釈してはならない。よって、記載する実施例はその応用分野を限定することを目的としていない。
【００９２】
実施例１．Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の単離および同定
解析前の少なくとも１ヶ月間ビフィズス菌を含有する食品を摂取せず、抗生物質を用いた治療を受けていない母乳栄養の健常マウスの糞便からビフィドバクテリウム属菌株を単離した。サンプルを４℃に保ち、採取後２時間以内に解析した。各サンプルの２ｇを、濃度１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢＳ）で希釈し、それらをＬａｂ−Ｂｌｅｎｄｅｒ  ４００  ｓｔｏｍａｃｈｅｒ(Seward Medical, London, UK)で３分間ホモジナイズし、ペプトン水で希釈した。異なる１０進希釈液の０．１ｍｌアリコートを、０．０５％のシステイン(Sigma, St. Louis, MO; MRS-C)および８０μｇ／ｍｌのムピロシンを含有するＭＲＳ寒天(Man Rogose and Sharpe; Scharlau, Barcelona)に接種した。嫌気性条件(AnaeroGen, Oxoid, UK)により３７℃での４８時間のインキュベーションの後、単離コロニーを選び出し、それらの識別を、グラム染色下の形態の調査によって行った。分離株の識別は、トータルＤＮＡの１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の配列決定によって行った。配列決定された断片を、プライマー２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’：配列番号２）および１４０１ｒ（５’−ＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’：配列番号３）を用いて増幅し、それを、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ市販システム(Amershan, Bioscience, UK)を使用して精製した。他の著者によって記載されている方法による配列決定のために、プライマー５３０ｆ（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’：配列番号４）およびＵ−９６８ｆ（５’−ＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣ−３’：配列番号５）をさらに用いた（Gerhard et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol., 67: 504-513; Satokari et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al., 2002. Appl. Environ. Microbiol., 68: 219-22）。配列決定は、ＡＢＩ  ３７００自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Bi
osystem, Foster City, CA）を使用して行った。
【００９３】
ＣＥＣＴ  ７７６５株の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の１．２８ｋｂ配列は、配列番号１である。ＧｅｎＢａｎｋデータベース内でＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., 1990. J. Mol Biol., 215: 403-410）を用いて、より密接に関係している配列の検索を行った。
【００９４】
配列番号１と最も類似した配列との比較によれば、Ｂ．シュードカテニュレイタム種の他の細菌について（例えば、Ｂ．シュードカテニュレイタムＢ１２７９株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０３７１１７．１）について９９％の同一性を得た。これらの結果は、本発明の菌株が前記種に属している可能性が非常に高いことを示している。
【００９５】
種の同定も、先行研究（Satokari et al., 2001. Applied and Environmental Microbiology, 67, 504-513）に記載されているＤＧＧＥにより確認した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列（５２０ｐｂｂ）を、プライマーＢｉｆ１６４およびＢｉｆ６６２−ＧＣ用いて増幅し、増幅された断片を、ユニバーサルミューテーション検出システム(Universal Mutation Detection System)電気泳動装置(Bio-Rad, Richmond, CA)で分離した。ゲル中で４５〜５５％変性剤濃度勾配を設けた（１００％変性剤は７Ｍ濃度の尿素・４０％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に相当する）。電気泳動移動度を、各種の参照として用いられるコレクション菌株と比較した。
【００９６】
図９で示されるように、本発明の菌株のバンド（ゲルレーンＩ１：Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５）の電気泳動移動度は、参照として用いた同種の別の菌株（Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ５７７６）の電気泳動移動度と一致する。
【００９７】
本発明の菌株を、プライマーＭ１３（５’−ＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴ−３’：配列番号６）およびＤｅｌ（５’−ＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’：配列番号７）を用い、上記の方法によるＲＡＰＤ解析を用いて分子的に型分類した（Hoffmann et al., 1998. Zentralbl Bakteriol. 288, 351-60; Svec et al. 2010. Antonie Van Leeuwenhoek. 98: 85-92）。ランダムに増幅されたＤＮＡ断片のプロフィールにより、本発明の菌株対象（Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５）は同種の他の菌株とは異なることが示された。
【００９８】
実施例２．in vitroでの軽度慢性炎症に関与するマクロファージの応答をモジュレートする能力によるＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の選択
２．１．腸内細菌培養物および上清の調製
菌株を、０．０５％の１％システイン（ＭＲＳ−Ｃ）を含有する１０ｍｌのＭＲＳ培養液（Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spain）に接種し、２４時間培養を行い、それらを嫌気性条件（AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK）により３７℃で２２時間インキュベートした。細胞を遠心分離（６，０００ｇ、１５分）により集め、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、２０％グリセロールを含有するＰＢＳ中に再懸濁した。これらの懸濁液のアリコートを液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。凍結融解サイクル後の生存細胞数を、４８時間インキュベートした後のＭＲＳＣ寒天板の計数により決定した。生存可能性は総ての場合において９０％を超えていた。各アリコートを１回のアッセイのみに使用した。死細菌の効果を評価するために、アリコートの一部を低温不活性化し（３  −２０℃凍結融解サイクル）、加熱不活性化した（８０℃で３０分）。得られた上清のｐＨ値をＮａＯＨで７．２に調整し、濾過滅菌（０．２２−μｍ孔径、Millipore, Bedford, MA）を行い、生存細胞が存在する可能性をなくした。無細胞上清のアリコートを、使用するまで−８０℃で保存した。
【００９９】
２．２．マクロファージの培養および刺激
Ｒａｗ  ２６４．７ネズミマクロファージ細胞株の細胞を、１０％ウシ胎児血清（Gibco, Barcelona, Spain）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Sigma）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Sigma）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Sigma, USA）で増殖させた。刺激実験を行うために、２４ウェル平底ポリスチレンプレート（Corning, Madrid, Spain）において１０６細胞／ｍｌの濃度で３７℃、５％ＣＯ２で細胞をインキュベートした。生存細胞および死細菌１ｘ１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌおよび上清量１５０μｌの懸濁液を刺激として用いた。１μｇ／ｍｌの濃度の、大腸菌(E. coli)Ｏ１１１：Ｂ４（Sigma, St. Louis, MO）から精製されたリポ多糖（ＬＰＳ）を陽性対照として用いた。非刺激ＰＢＭＣでのサイトカイン産生を陰性対照としてアッセイした。各実験において各種の刺激を二反復でアッセイした。培養上清を遠心分離により集め、細分し、サイトカインおよびケモカインの検出までアリコートで−２０℃で保存した。
【０１００】
２．３．サイトカインおよびケモカインの検出
上清のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ１０、およびＭＣＰ１）の濃度を、製造業者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences, San Diego, CA）を用いて測定した。
【０１０１】
本発明の菌株対象は、とりわけ、マクロファージの脂肪組織への遊走や、インスリンおよびレプチンの作用に対する抵抗性を引き起こす肥満関連慢性炎症状態に関与する炎症誘発性分子（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）および走化性分子（ＭＣＰ１）の低濃度をもたらす能力から、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属から選択された（表１）。ＣＥＣＴ  ７７６５株は、低濃度のＴＮＦ−α、ＩＬ−６の産生をもたらしたものであり、ＭＣＰ１の低産生をもたらした２つの菌株のうちの１つであった（表１）。本発明の菌株は、マクロファージによる高濃度の抗炎症性・調節性サイトカイン（ＩＬ−１０、表２）の合成を誘導し、それにより、肥満に関連する炎症の軽減に寄与することができることからも選択された（表２）。選択された細菌の免疫学的特性は、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の総ての腸内細菌に共通するものではなく、また、同種の他の菌株のものに共通するものでもないため、過体重、肥満および関連変化、ならびに前述のセクションで論じた他の疾患の治療および予防におけるその応用に特に好適なものとなる。
【０１０２】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＭＣＰ１の産生の増加は、過体重、肥満および関連病変と関係しているが、該病変だけではなく、本明細書の前述のパラグラフに記載したような、対照に対するＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＭＣＰ１の増加によって起こる任意の病変とも関係している。
【０１０３】
【表１】
2014505467.tif 000002
【０１０４】
【表２】
2014505467.tif 000003
【０１０５】
実施例３．免疫系細胞の機能、末梢血および中枢神経系における免疫学的・内分泌パラメーター、ならびに腸管微生物叢の構成およびその炎症特性に対する、Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の投与の効果
３．１．本発明の菌株対象の培養物の調製
ＣＥＣＴ  ７７６５株を、０．０５％（ｗ／ｖ）システインを補給したＭＲＳ培養液（Scharlab, SL- Barcelona, Spain）で、嫌気性条件（AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK）により３７℃で２２時間増殖させた。細胞を遠心分離（６，０００ｇ、１５分）により集め、リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で洗浄し、１０％脱脂乳中に再懸濁した。これらの懸濁液のアリコートを液体窒素で凍結させ、使用するまで−８０℃で保存した。細菌の生存可能性を、４８時間のインキュベーション後の０．０５％システイン含有ＭＲＳ寒天板の計数により調べたところ、およそ９０％であった。各アリコートの融解は１回のみとした。
【０１０６】
３．２．肥満動物モデルおよびサンプリング
Ｃ５７ＢＬ−６成体雄マウス（６〜８週間；Harlan Laboratories）を使用した。それらのマウスは、４０〜５０％相対湿度の雰囲気中、１２時間明／暗サイクルを用い、制御された温度（２３℃）で飼育した。Ｃ５７ＢＬＡＣＫ６マウスは、Ｃ５７ＢＬ−６またはｂｌａｃｋ  ６と略され、ヒト疾患の研究での遺伝子操作に最も広く使用されている同系交配株の実験マウスである。
【０１０７】
６０％のエネルギーを脂質として供給する高脂肪食（ＨＦＤ）（６０／脂肪、Harlan Laboratories）を７週間与えることによって肥満動物群を作製したが、一方、非肥満動物には通常食を施与した。マウスによる水および食物の摂取は自由とした。体重を週に１回モニタリングした。実験は動物倫理委員会の基準に従って行った。
【０１０８】
動物を４群にランダムに分けた（ｎ＝６／群）：通常食を与えた群（対照）、本発明の菌株対象を投与した対照群（対照−菌株）、高脂肪食を与えた群（肥満）およびＣＥＣＴ  ７７６５株を投与した肥満群（肥満−菌株）。該菌株は、胃管から１日用量１０８ｃｆｕ／日で７週間投与した。対照群および肥満群に、プラセボとして水を同じように投与した。
【０１０９】
この後、動物に麻酔をかけ、頸椎脱臼により犠牲にし、種々の生体サンプルを採取した。末梢血の免疫学的パラメーター（サイトカイン、アディポカインおよびケモカイン）を、ＥＬＩＳＡを用いることによって決定した。炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）の濃度も、前述のセクションで記載したように、ポリトロンを用いて事前にホモジナイズした脳サンプルの上清で、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。微生物叢構成に対する該菌株の投与の効果、ならびに以下に記載するように得られるマクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞のin vitro培養物に対するその免疫応答刺激効果を判定するために、糞便サンプルも採取した。
【０１１０】
３．３．マクロファージに対する効果の評価
自然免疫系細胞の応答の改善に対するＣＥＣＴ  ７７６５株の投与の効果を示すために、腹膜内経路により、５６℃で３０分間不活性化した１０％ウシ胎児血清（Gibco, Barcelona, Spain）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Sigma Chemical Co．）を補給した、ダルベッコ改変イーグル培地液（ＤＭＥＭ）（SigmaTM- St. Louis, MO/USA）を無菌注射することによりマクロファージを得た。各マウス実験群から得られたマクロファージを、ＤＭＥＭ培地中１ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度に調整し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で１時間のインキュベーション後、ウェルを無血清ＤＭＥＭで洗浄し、非接着細胞を除去した。接着細胞を２４時間インキュベートし、この期間の後、各マウス実験群の糞便（希釈、ＰＢＳで１／９）を用いて刺激し、陽性対照として１μｇ／ｍｌのサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)由来ＬＰＳ(Sigma Chemical Co, Madrid, Spain)を用いて刺激した。同時に、基礎サイトカイン産生量を知るために、非刺激マクロファージも評価した。刺激後、上清を集め、上清における以下のサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡ（Ready SET Go! Kit, BD Bioscience, San Diego, CA, USA）により決定した：ＴＮＦ−α、ＩＬ６およびＩＬ−１０。
【０１１１】
３．４．樹状細胞およびＴ細胞に対する効果の評価
Ｔ細胞応答を刺激し、それゆえに、適応免疫応答を刺激する樹状細胞の能力の改善に対する本発明の菌株対象の投与の効果を示すために、混合リンパ球反応でのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を誘導する成熟樹状細胞の能力を判定した。アッセイは、上記のように本発明の菌株対象を投与したまたは投与しなかった肥満マウスおよび対照マウスから抽出した細胞の応答を比較することによって行った。
【０１１２】
マウスの脛骨および大腿骨の骨髄から樹状細胞を生成した。各マウスの脛骨および大腿骨を摘出し、周囲組織を無菌採取した。末端切断後、骨髄を、ＰＢＳで洗い流し、シリンジと０．４５ｍｍ径の注射針を使用して、抽出した。得られた細胞をＰＢＳで１回洗浄し、抗生物質（ペニシリン  １００ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン  １００μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ−ＣＳＦを補給したＲＰＭＩで希釈した１０６細胞のアリコートを１００ｍｍフラスコに播種した。３日目に、１０ｍｌの培養培地を加え、７日目に、その培地を新鮮培地と交換した。８日目に、静かにピペット操作を行うことによって非接着細胞を回収した。それらの細胞をＰＢＳで洗浄し、マウスＧＭ−ＣＳＦ不含培養培地中に再懸濁した。
【０１１３】
混合リンパ球反応を行う前に２４時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加することにより樹状細胞（ＤＣ）を活性化した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために、成熟ＤＣを使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離した。摘出後、脾臓をＦＢＳ含有ＰＢＳ中に懸濁し、それをナイロンメッシュに通し、得られた細胞懸濁液を１回洗浄し、溶解バッファー中に５分間再懸濁した。ＰＢＳで２回洗浄後、製造業者の使用説明書に従ってＬ３Ｔ４−ＣＤ４＋マイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）を用いた陽性選択によりＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＴ）を免疫遺伝学的に分離した。
【０１１４】
混合リンパ球反応を行うために、ＤＣのアリコートを９６ウェルプレートに三反復で分注し、いずれの場合においても、１００μｌの培養培地中で１ｘ１０５ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｌ）を以下の比（Ｌ／ＤＣ）：１：１、１：２、１：４で刺激し、それらを５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で７２時間インキュベートした。マイトジェンとして使用されるＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ；Sigma）を含むまたは含まない、ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を対照として使用した。リンパ球増殖をＥＬＩＳＡキット（ＢｒｄＵ−比色分析；Roche, Diagnostic, Germany）を用いて判定し、４４０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量した。
【０１１５】
食物により誘導された肥満対象にin vivo投与した場合、本発明の菌株により、自然免疫系および適応免疫系細胞の働きが改善され、感染性病原体、抗原またはアレルゲンに対するそれらの応答能力が高められる。特に、高脂肪食により誘導された肥満動物モデルへの該菌株の投与により、とりわけ、食作用およびサイトカイン合成におけるマクロファージの機能が改善される（図１および図２）。該菌株の投与により、貪食能が改善され、それゆえに、免疫学的防御が改善され、外来アレルゲンまたは刺激（酵母／病原体）に応答して腹腔マクロファージの呼吸バーストが増加している（図１）。この能力は、肥満動物では、非肥満対照と比べて有意に低下している（図１）。以前の研究でも、病原体除去に関与する食細胞の呼吸バーストが糖尿病を有する対象でも変化していることが示されている（Marhoffer et al., 1992. Diabetes Care, 15(2): 256-60）。さらに、肥満動物および対照動物から抽出された腹腔マクロファージの培養物と、病原体のリポ多糖（ＬＰＳ）によるそれらのin vitro刺激により、起こり得る感染の阻止に関与するＴＮＦ−αなどのサイトカインの合成が本発明の菌株対象の投与によって改善されることが示されている（図２）。in vivo投与した場合、本発明の菌株対象により樹状細胞およびＴ細胞の機能も改善される。異なる比（１：１、１：２および１：４）でのＴ細胞の存在下でインキュベートした該菌株を投与した肥満マウスから抽出された樹状細胞により、それらの増殖・活性化能力は高められるが、該菌株を投与しなかった肥満動物ではそれらの特性は低下している（図３）。該菌株を投与した肥満動物において樹状細胞の働きが最良であることは、ＬＰＳによるそれらのin vitro刺激後にそれらが病原体に対する応答に関与するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の高分泌を誘導することができることからも示される（図４）。樹状細胞およびＴ細胞の機能性が肥満、および糖尿病などの関連疾患において変化していることから、本特許の菌株対象のこれらの特性は好適なものとなる。特に、樹状細胞は、抗原提示および同種異系Ｔ細胞刺激の能力低下を特徴とする、体重増加に関連する機能的変化を受ける（Macia et al., 2006. J Immunol., 177(9): 5997-6006; Verwaerde et al., 2006. Scand J Immunol., 64(5): 457-66）。刺激（マイトジェンまたは抗原）に対するナイーブＴ細胞の炎症誘発特性が高まり、肥満に関連する軽度慢性炎症状態の一因となり得る。それに対して、すでに抗原に曝されたＴ細胞は増殖欠損を示し、好ましくは、Ｔｈ２型サイトカインを分泌する。この総てが、肥満対象での感染症の高罹患率と、ワクチン接種および感染症に対する記憶Ｔ細胞性応答の欠如を説明している（Karlsson et al., 2010. J Immunol., 184: 3127-33）。Ｔ細胞の機能は糖尿病患者でも欠陥があり、刺激に応答した増殖およびＩＬ２合成の能力低下を示す（Chang and Shaio. 1995. Diabetes Res Clin Pract., 28(2): 137-46）。
【０１１６】
in vivo投与された本発明の菌株により、サイトカイン、ケモカインおよびアディポカインの産生が調節される。肥満および末梢血に関する関連疾患ではその合成は変更されている。肥満および対照の動物モデルで誘導される変化には、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの濃度の減少が含まれる。肥満では増加しておりそれが炎症工程の一因となり得るアディポカインであるレプチンは、肥満動物では減少される。しかしながら、対照動物では、該菌株により、レプチン合成が誘導され、それが食物摂取の減少、エネルギー消費および脂質酸化の増大、ならびに過体重および肥満の予防に寄与する。
【０１１７】
３．５．脳内の炎症性サイトカイン濃度に対する効果の発展
本発明の菌株対象により、中枢神経系におけるＴＮＦ−α合成も著しく減少される。ＴＮＦ−α合成は、肥満では増加しており、インスリンおよびレプチンの食欲抑制作用（空腹感の減少）と体重およびグルコース代謝の調節における機能を抑制するインスリンおよびレプチンの抵抗性の発現に寄与する（De Souza et al., 2005. Endocrinology., 146: 4192-9）。
【０１１８】
３．６．腸管微生物叢の構成およびその炎症特性に対する効果の評価
ＣＥＣＴ  ７７６５株により、過体重および／または肥満に関連する変化、ならびにこれらの変化によって起こる炎症作用、ならびに過体重および／または肥満だけに関連していない他の病状に関連する変化が正常化され、腸管微生物叢の構成が回復される。本発明の菌株の投与により、ラクトバチルス菌およびビフィズス菌の数が増加され、腸管内容物中の腸内細菌の数が少なくとも０．５対数単位減少される。微生物叢構成のこれらの変化はさらに、炎症誘発特性の低下につながり、その抗炎症特性の増強につながる。マクロファージおよび樹状細胞の両方において、該菌株を投与した肥満動物の微生物叢によって誘導された炎症誘発性サイトカイン合成（ＴＮＦ−α合成など）は、該菌株の投与を受けていない肥満動物のものと比べて少なく、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０合成は多い（実施例３；図２および図４）。腸管微生物叢の変化は、体重増加、インスリン抵抗性、肥満および糖尿病の原因と考えられる炎症性刺激の１つと見られており（Cani and Delzenne 2009. Curr Opin Pharmacol., 9(6): 737-43）、該変化はさらに、別のタイプの病状も引き起こす。
【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
実施例４．肝臓および脂肪組織に対するＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の投与の効果
実施例３に記載した同じマウスおよび同じ実験群（実験群のうちの２群には同じ投与計画に従って本発明の菌株対象を投与した）を使用した。処置期間の後に、動物に麻酔をかけ、頸椎脱臼により犠牲にし、脂肪組織（精巣上体）および肝組織のサンプルを採取し、それらを生理食塩水で洗浄し、１０％ホルマリン含有バッファーで固定し、パラフィンで包埋し、４〜５μｍ切片とし、それらをヘマトキシリン・エオシンで染色した。脂肪症（肝臓脂質蓄積）の重篤度を、明視野光学顕微鏡（Olympus）を用いて各固定切片の１０視野を解析することによって、以下の基準に従って判定した：グレード１（脂肪症なし）；グレード２、肝細胞の脂肪の細胞占有率が３３％未満である場合；グレード３、肝細胞の脂肪の細胞占有率が３４〜６６％の間である場合；グレード４、肝細胞の脂肪の細胞占有率が６６％を超える場合。脂肪細胞のサイズは、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢＲ  ２．３ソフトウェアを使用する画像解析によって、各実験群および組織型につき少なくとも１００個の細胞を評価して測定した。
【０１２１】
本発明の菌株対象により、精巣上体組織の脂肪細胞のサイズが縮小される。人生の特定段階（小児期および青年期）での脂肪細胞の増加（肥大）は、成人年齢での過体重および肥満の発生に有利に働き、食物摂取とエネルギー消費との間の正の不均衡と関係がある（Macia et al., 2006. Genes Nutr., 1: 189-212）。それに対して、脂肪細胞のサイズの縮小は、インスリン抵抗性やグルコース濃度の減少と関連している（Varady et al., 2009. Metabolism 58: 1096-101）。特に、肥満動物モデルへの本発明の菌株対象のin vivo投与により、小型脂肪細胞の、１，０００〜２０００μｍ２の間の範囲での増加がもたらされるが、一方、該菌株を投与しなかった肥満動物では、大型脂肪細胞が４０００〜６０００μｍ２の間の範囲で増加される（図５）。非肥満動物でも同様の効果が観察される。
【０１２２】
脂肪細胞のサイズ増大は、肝臓への脂肪酸供給の増加とも関連し、その増加は肝脂肪症およびその合併症へとつながる。よって、前記菌株はこれらの変化の予防または改善にも寄与することができる。従って、Ｂ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株により、脂肪細胞のサイズが縮小する。つまり、経時的に維持され、過体重および肥満、ならびに必ずしも肥満に関連していない他の病変を引き起こし得る細胞肥大へとつながるこの種の細胞の発達における変化の治療に該株が有用である。
【０１２３】
本発明の菌株対象により、高脂肪食の摂取、肥満、および非アルコール性肝炎などの種々の病変に関連する肝臓脂肪蓄積（脂肪症）が減少される（Musso et al., 2010. Hepatology 52: 79-104）。特に、肥満動物モデルへの本発明の菌株対象のin vivo投与により、高脂肪蓄積のグレード４肝細胞（細胞占有率が６６％を超える）の減少がもたらされ、低脂肪含量のグレード３肝細胞（細胞占有率が３４〜６６％）の増加がもたらされるが、一方、該菌株を投与しなかった肥満動物では、その効果は逆である。対照動物では、該菌株の投与により、グレード３が犠牲となりグレード２肝細胞（肝細胞の脂肪の細胞占有率が３３％未満である）が増加され、該菌株を受けなかった動物ではその逆のことが起こる（図６）。
【０１２４】
実施例５．グルコース、インスリン、トリグリセリドおよびコレステロールの末梢血濃度に対するＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の投与の効果
実施例３に記載した同じマウスおよび同じ実験群（実験群のうちの２群には同じ投与計画に従って本発明の菌株を投与した）を使用した。処置期間の後に、動物に麻酔をかけ、頸椎脱臼により犠牲にし、グルコース、トリグリセリドおよびコレステロールの濃度を比色法によって決定するために末梢血サンプルを採取し（Quimica Clinica Applicada, SA, Amposta, Spain）、インスリンの濃度をＥＬＩＳＡにより決定した（BD Bioscience, San Diego, CA, USA）。さらに、動物を犠牲にする前に食後の血糖応答または耐糖能を判定した。絶食期間の後に、基礎グルコース濃度を測定し、その後、各マウスに体重１Ｋｇ当たり２ｇのグルコース負荷を行い、１５分または３０分ごとに、反応ストリップ（Ascensia Esyfill, Bayer）を用い、対応するグルコースメーター（Ascensia BRIO, Bayer）を使用し、検出限界３０〜５５０ｍｇ／ｄｌの間でグルコースを測定した。
【０１２５】
in vivo投与された本発明の菌株により、絶食肥満動物においてその末梢血濃度が減少することでグルコース代謝が調節される；例えば、肥満マウスで検出された高血清グルコース濃度４９２．７（ＳＤ  １８．３）ｍｇ／ｄｌは、本発明の菌株対象の投与によって正常化する傾向があり、インスリン濃度の減少に比例して、３１６．５（ＳＤ  ２０．５）ｍｇ／ｄｌの値に達する。さらに、肥満動物への本発明の菌株対象の投与により、食後グルコース最大値が減少され（４１１．７［ＳＤ  ４９．９］と３５２．０［２５．８］）、グルコースの曲線下面積が減少された（５．４２２ｃｍ２と４．７７９ｃｍ２）。経口投与後の血漿グルコース濃度の増加および高濃度の存続は、インスリン合成またはインスリンもしくは他の原因に対する応答の変化を示し、それは本発明の菌株対象によって正に調節され得、インスリン抵抗性および糖尿病を発症する危険性は減少され、治療は改善される。
【０１２６】
in vivo投与された本発明の菌株により、特に、肥満動物においてトリグリセリドおよびコレステロールの末梢血濃度が減少し、脂質代謝が調節される；例えば、肥満マウスで検出された高血清トリグリセリド濃度１９６．０（ＳＤ  １４．３）ｍｇ／ｄｌは、本発明の菌株対象の投与によって著しく減少され、１４７．５（ＳＤ  １２．５）ｍｇ／ｄｌの値に達する。同様に、肥満動物における高血清コレステロール濃度１４６．９（ＳＤ  １２．７）ｍｇ／ｄｌも本発明の菌株対象の投与によって著しく減少され、９４．４（ＳＤ  ５．７）ｍｇ／ｄｌの値に達する。
【０１２７】
実施例６．腸内での食物由来の脂質の吸収に対するＢ．シュードカテニュレイタムＣＥＣＴ  ７７６５株の投与の効果
実施例３に記載した同じ肥満モデルおよび同じ実験群（実験群のうちの２群には同じ投与計画に従って本発明の菌株対象を投与した）を使用した。処置期間の後に、動物に麻酔をかけ、頸椎脱臼により犠牲にし、腸管組織サンプルを採取し、それらを生理食塩水で洗浄し、１０％ホルマリン含有バッファーで固定し、パラフィンで包埋し、４〜５μｍ切片とし、それらをヘマトキシリン・エオシンで染色した。腸細胞当たりのカイロミクロン数を、明視野光学顕微鏡（Olympus）を用いて各固定切片の１０視野を計数することによって決定し、腸細胞当たりのカイロミクロン数で表した。図７で分かるように、本発明の菌株により、腸細胞で形成されるカイロミクロンの数が５０％を超えて減少される。これらの結果は、本発明の菌株により血液トリグリセリド濃度が減少されることを示した実施例５の結果と一致している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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