(57)【要約】本発明は（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群の中から選択されるアミノ酸残基のみを含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている因子ＶＩＩを含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと、（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されたミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物であって、上記ポリアミノ酸が、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群の中から選択されるアミノ酸残基だけを含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されていることを特徴とする因子ＶＩＩを含む医薬組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）のコポリマーから形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む請求項１に記載の医薬組成物：
【化１】
2014524416.tif 000012
（ここで、
Ｒ１はポリアルキレングリコール鎖を表し、
Ｒ２は（ｉ）５〜１８個の炭素原子を含むアルキル鎖および（ｉｉ）ベンジル基から選択される基であり、
ｘは１０〜１００の整数であり、
ｎは１〜ｘ−１である整数であり、
側鎖に疎水基を有するサブユニットおよび側鎖にカルボン酸基を有するサブユニットは疎水性ポリマーセグメント全体にわたってランダムに分散している）。
【請求項３】
式（Ｉ）のコポリマーにおいてＲ１基がポリエチレングリコール鎖を表す請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
式（Ｉ）のコポリマーにおいてＲ２基が８個の炭素原子を含む未置換アルキル鎖である請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
式（Ｉ）のコポリマーにおいてｘが４０である請求項２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
式（Ｉ）のコポリマーにおいてｎ／ｘの値が少なくとも０．１且つ１．０以下、好ましくは０．９である請求項２〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ポリアルキレングリコール鎖の分子量が８ｋＤａ〜１５ｋＤａ、好ましくは１０ｋＤａ〜１２ｋＤａである請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
因子ＶＩＩとコポリマーとの質量比が１：１００ｗｔ：ｗｔ〜５０：１００ｗｔ：ｗｔ、好ましくは５：１００ｗｔ：ｗｔ〜２０：１００ｗｔ：ｗｔである請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
因子ＶＩＩが（ｉ）血漿から精製した非組み換え因子ＶＩＩおよび（ｉｉ）組換え因子ＶＩＩから選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
因子ＶＩＩが、必要に応じてアミノ酸の置換または欠失を含む組換えヒト因子ＶＩＩである請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
液体または凍結乾燥物の形態をしている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ｐＨを４．５〜６．５、好ましくは５〜６の値に調整するための緩衝液をさらに含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
非経口投与した時に下記の特徴（１）〜（３）の一つまたは複数を有する医薬プロファイルを生じるのに適した、（ｉ）親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物：
（１）AUC（曲線下面積）値が同量のFＶＩＩを封入していない比較組成物で得られるAUC値より１０％以上高い、
（２）MRT（平均滞留時間）値が少なくとも２時間で、且つ
（３）CL（クリアランス）値が最大で２００ｍｌ／ｋｇ／時である。
【請求項１４】
（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群の中から選択されるアミノ酸残基のみを含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている、医薬として用いるための因子ＶＩＩ。
【請求項１５】
（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと、（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基のみを含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている、凝固障害を治療するための因子ＶＩＩ。
【請求項１６】
（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと、（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群の中から選択されるアミノ酸残基のみを含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている因子ＶＩＩの、凝固障害を治療するための医薬製造での使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分として因子ＶＩＩを含む医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）はビタミンＫ依存性のグリコプロテインであり、その活性形（ＦＶＩＩａ）はカルシウムおよび組織因子の存在下で第Ｘ因子および第ＩＸ因子を活性化して凝集プロセスに関与する。ＦＶＩＩは分子量が約５０ｋＤａの４０６個のアミノ酸残基の単一ペプチド鎖の形で分泌される。ＦＶＩＩは４つの異なる構造ドメインすなわちＮ−末端γ−カルボキシル（Gla）ドメインと、２つの上皮成長因子様（EGF様）ドメインと、一つのセリン・プロテアーゼドメインとを含む。ＦＶＩＩの活性化によるＦＶＩＩａの生成は、Arg152-Ile153 (アルギニン 152-イソロイシン 153)結合の切断によって特徴付けられる。従って、ＦＶＩＩａは単一のジスルフィド架橋(システイン135-システイン262)によって互いに結合する分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸の軽鎖と、分子量が約３０ｋＤａである２５４個のアミノ酸の重鎖とから成る。
【０００３】
ＦＶＩＩ／ＶＩＩａは第ＶＩＩＩ（血友病タイプＡ）または第ＩＸ因子（血友病タイプＢ）を欠失している患者やその他の凝固因子を欠失している患者、例えば遺伝性ＦＶＩＩ欠失患者の血友病治療で使われている。また、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａは脳卒中の処置でも推薦されている。
【０００４】
従って、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａは主として非常に長期間にわたる患者の治療に使われ、この治療は最高で週１回の時間間隔での頻回の注射を含む。実際には、因子ＶＩＩで治療した患者の大部分が、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａを週２回から週３回投与され、これは非常に面倒である。
【０００５】
所望の治療効果または予防効果を達成し且つ維持するためにはＦＶＩＩ／ＶＩＩａのかなり高い投与量と頻繁な静脈内投与が必要である。従って、この治療は患者にとって制約が多く且つ非常に高価なものになっている。
【０００６】
さらに、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａは一般に外科手術を受けなければならない患者に投与される。通常、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａの「初回量」とよばれる初回投与、例えば３０〜４０ＩＵ／ｋｇを外科行為の約１時間前に実行し、次いで、一回または複数のその後の投与を外科手術中、必要に応じて、外科手術後の数時間または数日間に実行することで血漿ＦＶＩＩ／ＶＩＩａレベルを許容された基準の範囲内に維持できる。
【０００７】
ＦＶＩＩ／ＶＩＩａはタンパク分解性の切断に弱いタンパクであり、凝集活性（非定型切断）を含まない多数の分解産物の形成を引き起こすことがわかっている。非定型切断は製造プロセスの種々の段階、さらにＦＶＩＩ／ＶＩＩａの貯蔵段階で起こることがある。分解産物は血漿由来のＦＶＩＩ／ＶＩＩａと、遺伝子組み換えによって作られたＦＶＩＩ／ＶＩＩａの両方で観察されている。非定型切断はＦＶＩＩａを生成するＦＶＩＩの活性化の前、例えばＦＶＩＩの産生および精製中、活性化段階自体の間または活性化産物（ＦＶＩＩａ）の精製および／または貯蔵中に起こることがある。
【０００８】
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを用いた予防および治療の質を改良するためには、公知の医薬組成物のＦＶＩＩ／ＶＩＩａバイオアベイラビリティと比較して改良されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａバイオアベイラビリティが得られる医薬組成物を得られるのが有利である。特に、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａが非常に安定で、公知の組成物よりも種々の分解に影響され難い組成物を得るのが有利である。
【０００９】
特に、生物体内で時間をかけてＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの安定性を高めることができ、時間をかけてＦＶＩＩ／ＶＩＩａを徐放して２つの投与の間隔を伸ばすことができ、従って、（ｉ）長期投与される患者の生活の質を高め、且つ、（ｉｉ）例えば外科手術中のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの複数の投与を減らすか、それに頼らないことによって、外科手術時の医師の作業を容易にするＦＶＩＩ／ＶＩＩａ配合物を得るのが有利である。
【００１０】
ＦＶＩＩ／ＶＩＩａのバイオアベイラビリティを改良するための解決策、例えばリポソームへのＦＶＩＩ／ＶＩＩａの封入は既に従来技術で考えられている。
生体適合性親水性ポリマーで誘導体化された約１〜２０モル％の両親媒性脂質を含むコロイド粒子にＦＶＩＩ／ＶＩＩａが非共有結合されている医薬組成物も開示されている。特許文献１（欧州特許第1 633 440号公報）には「ＰＥＧ化された」リポソームから形成されるコロイド粒子に封入されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａを含むこのタイプの医薬組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第1 633 440号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、従来技術のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを含む医薬組成物を代替し、あるいは、公知のものより改良された医薬組成物を提供するというニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと、（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基のみを含み（comprising exclusively）、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている因子ＶＩＩを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
上記ブロックコポリマー分子では親水性ポリマーセグメントが疎水性ポリマーセグメントに共有結合されている。
本明細書でポリアルキレングリコールとは下記の式（Ａ）のものである：
Ｈ−［Ｏ−Ｒ］ｚ−ＯＨ          （Ａ）
（ここで、
Ｒは１〜４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基で、
ｚは１０〜２５００、好ましくは５０〜５００の整数である）
【００１５】
本発明の一つの実施例ではＲはエチル基から成り、ｚは２００〜３００である。
本発明医薬組成物の一つの実施例では、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール、好ましくは分子量が１０ｋＤａ〜１２ｋＤａのポリエチレングリコールから成る。
本発明医薬組成物の一つの実施例では、因子ＶＩＩとコポリマーとの質量比が１：１００ｗｔ：ｗｔ〜５０：１００ｗｔ：ｗｔ、好ましくは５：１００ｗｔ：ｗｔ〜２０：１００ｗｔ：ｗｔである。
本発明医薬組成物の一つの実施例では、因子ＶＩＩが、（ｉ）血漿から精製した非組み換え因子ＶＩＩおよび（ｉｉ）組換え因子ＶＩＩ、特に一つまたは複数のアミノ酸の置換または欠失で変更された組換え因子ＶＩＩから選択される。
【００１６】
本発明の他の対象は、（ｉ）親水性ポリマーセグメントと、（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物であって、この組成物は、それが非経口投与された時に下記の特徴の一つまたは複数を有する医薬プロファイルを生じるのに適した医薬組成物にある：
（１）ＡＵＣ（曲線下面積）値が同量のＦＶＩＩを封入していない比較組成物で得られるＡＵＣ値より１０％以上高い、
（２）ＭＲＴ（平均滞留時間）値が少なくとも２時間で、且つ
（３）ＣＬ（クリアランス）値が最大で２００ｍｌ／ｋｇ／時である。
【００１７】
ＭＲＴおよびＣＬの値は７週齢のウイスター系ラットから得られるもの。
本明細書で、比較組成物のＡＵＣ値より１０％以上高いＡＵＣ値とは、比較組成物のＡＵＣ値より20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%または100%以上高いＡＵＣ値を含む。本発明の医薬組成物の一つの実施例では、ＡＵＣ値が含まれる所定量のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対して同じ所定量のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａで、ミセルが存在しない比較組成物のＡＵＣ値の２倍（１００％以上）であることが分かった。
【００１８】
本発明のさらに他の対象は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群の中から選択されるアミノ酸残基をもっぱら含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている、薬物として用いるための因子ＶＩＩにある。
【００１９】
本発明のさらに他の対象は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基をもっぱら含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている、凝固障害を治療するための因子ＶＩＩにある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】は、組換えヒトＦＶＩＩを含むミセルを含まない組成物およびミセル中に封入されたＦＶＩＩの組成物のそれぞれで各組成物を産生するために初期に導入されたＦＶＩＩの量と比較して検出されたＦＶＩＩの量を測定するための標準曲線を示す図。Ｘ軸：初期に添加されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａの量（ミリリットル当たりのミリ国際単位（mIU/ml）で表示）；Ｙ軸：検出されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの量（１ミリリットル当たりのミリ国際単位（mIU/ml）で表示）。
【図２】は（ｉ）ミセルを含まないFＶＩＩ組成物、（ｉｉ）FＶＩＩ とコポリマーとの比率を10:100にしたＣ８−グラフト化コポリマーのミセル中に導入されたFＶＩＩ組成物、および（ｉｉｉ）FＶＩＩ とコポリマーとの比率を10:100にしたＢｎ−グラフト化コポリマーのミセル中に導入されたFＶＩＩの組成物でそれぞれ得られた、組換えヒトFＶＩＩ血漿濃度プロファイルを示す図。Ｘ軸：組成物の投与後の経過時間（時間で表示）；Ｙ軸：測定された血漿FＶＩＩ/ＶＩＩa濃度（１ミリリットル当たりのミリ国際単位（mIU/ml）で表示）。
【図３】は（ｉ）pH 5のミセルを含まないFＶＩＩ組成物、（ｉｉ）FＶＩＩ とコポリマーとの比率を5:100にしたＢｎ−グラフト化コポリマーのミセル中に導入されたFＶＩＩの組成物、および（ｉｉｉ）FＶＩＩ とコポリマーとの比率を5:100にしたＣ８−グラフト化コポリマーのミセル中に導入されたFＶＩＩ の組成物でそれぞれ得られた、組換えヒトFＶＩＩ血漿濃度プロファイルを示す図。
【図４】は［図２］および［図３］に示したFＶＩＩ溶液およびFＶＩＩ封入ミセルから得られた組換えヒトFＶＩＩ血漿濃度プロファイルを示す図。
【図５】は、各組成物を産生するために初期に導入されたFIXの量と比較した、ヒトFIXを含むミセルを含まない組成物およびミセル中に封入されたFIXの組成物中でそれぞれに検出されたＦＩＸの量を測定するための標準曲線を示す。Ｘ軸：初期に添加されたＦＩＸの量（１ミリリットル当たりのミリ国際単位（mIU/ml）で表示）；Ｙ軸：検出されたＦＩＸの量（１ミリリットル当たりのミリ国際単位（mIU/ml）で表示）。
【図６】は、（ｉ）ミセルを含まないFIX組成物、（ｉｉ）ＦＩＸとコポリマーとの比率を10:100にしたＣ８−グラフト化コポリマーのミセル中に導入されたＦＩＸ  の組成物、および（ｉｉｉ）ＦＩＸとコポリマーとの比率を10:100にしたＢｎ−グラフト化コポリマーのミセル中に導入されたＦＩＸの組成物でそれぞれ得られた（これら３つの溶液は全てｐＨ＝４およびｐＨ＝６でテストする）、ヒトＦＩＸ血漿濃度プロファイルを示す図。Ｘ軸：組成物の投与後の経過時間（時間で表示）；Ｙ軸：測定された血漿ＦＩＸ濃度（１ミリリットル当たりのミリ国際単位（mIU/ml）で表示）。
【図７】は、血友病Aマウス失血に対するFＶＩＩ, NaCl 0.9%, Ｆ７−ＩＲおよびＦ７−ＳＲの効果を示す図。点は個体の失血を表し、線は値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
驚くべきことに、ブロックコポリマー分子中に親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む特定タイプのブロックを含むブロックコポリマーのミセル中にＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａをうまく導入できるということが本発明によって示された。
【００２２】
上記ブロックコポリマー分子では親水性ポリマーセグメントが疎水性ポリマーセグメントに共有結合されていることは明記しておく。
【００２３】
ブロックコポリマー分子内に親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントを含む特定タイプのブロックを含むコポリマーのミセル中にFＶＩＩ/FＶＩＩaを導入することによって、インビボでFＶＩＩ／ＦＶＩＩaのバイオアベイラビリティを大幅に高めることができることが本発明によって示された。
【００２４】
特に、特定タイプのブロックを含むこのコポリマーのミセルを用いることによって、初期に導入されたFＶＩＩ／FＶＩＩaが時間をかけて徐放され、FＶＩＩ／ＶＩＩaが血流中で分解するのを効率的に防ぐことが実施例によって示された。
【００２５】
本発明は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基をもっぱら含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている因子ＶＩＩを含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
本明細書でアミノ酸残基の「一部」とは、上記ポリアミノ酸の一つまたは複数のアミノ酸残基が疎水基で置換された側鎖を有することを意味する。この置換アミノ酸残基の「一部」は上記ポリアミノ酸に含まれるアミノ酸残基の１０％以上から１００％以下の範囲であるのが好ましい。本発明の一つの実施例では置換アミノ酸残基の「一部」は40%から100%以下であり、これは上記ポリアミノ酸に含まれるアミノ酸残基の70% から100%以下を含む。
【００２７】
以下、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性セグメントおよび（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性セグメントの特定の実施例を式（Ｉ）のブロックコポリマーの説明とともに詳細に説明する。
【００２８】
疎水性ポリアミノ酸セグメントは好ましくは例えばＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれらのラセミ混合物の残基から成るポリ−ホモ−アミノ酸鎖から成る。疎水性セグメントはポリ(アスパラギン酸)、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(ヒスチジン)、ポリ(リシン)、ポリ(アスパラギン酸エステル)、ポリ(グルタミン酸エステル)、ポリ(ヒスチジンエステル)、ポリ(リシンエステル)、ポリ(アスパラギン酸エステル)の部分加水分解物、ポリ(グルタミン酸エステル)の部分加水分解物、ポリ(ヒスチジンエステル)の部分加水分解物またはポリ(リシンエステル) の部分加水分解物から選択されるポリアミノ酸鎖で構成できる。ポリ（アミノ酸エステル）の「部分加水分解物」という用語はポリ（アミノ酸）の一部のみがエステル化される、すなわち全てに満たないアミノ酸残基がエステル化されることを意味する。
【００２９】
上記ブロックコポリマーの疎水性セグメントは１０〜１００個のアミノ酸残基、例えば２０〜７５個のアミノ酸残基（これは３０〜５０個のアミノ酸残基を含む）の複数のアミノ酸残基を含むのが好ましい。
【００３０】
上記定義のブロックコポリマーの疎水性セグメントに含むことができるアミノ酸エステル残基において、アミノ酸残基は疎水基でエステル化されているのが好ましい。この疎水基は５〜１２個の炭素原子を含むアルキル鎖およびベンジル基から成る群の中から選択するのが好ましい。このアルキル鎖は未置換または１〜３個の炭素原子を含む一つまたは複数のアルキル鎖で置換されたアルキル鎖から成るのが好ましい。
【００３１】
医薬組成物の製造に使用されるブロックコポリマーの一般的なファミリーは当業者に周知である。しかし、これらのブロックコポリマーはタンパク分子を封入する能力をこれまでテストされたことは本出願人の知る限りない。血液凝固タンパクはなおさらである。
【００３２】
上記定義のブロックコポリマーのミセル中にFＶＩＩ/ＶＩＩaを導入する実施例で、この凝固因子に検出可能な変更が引き起こされることはないということがわかった。本発明の実施例では本発明のブロックコポリマーのミセル中に導入される出発材料として使用されるFＶＩＩ／ＶＩＩaの量は調製される最終医薬組成物中に一体化される。本発明者はさらに、所定量のFＶＩＩ／ＶＩＩａを用いて（ｉ）ＦＶＩＩ／ＶＩＩａが本明細書のブロックコポリマーのミセル中に導入された医薬組成物と、（ｉｉ）上記ブロックコポリマーのミセルを含まない比較組成物とを調製して、２つの組成物のそれぞれで同量のＦＶＩＩ／ＶＩＩａが測定されることを示した。
【００３３】
さらに、本発明実施例では、所定量のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを（ｉ）ミセルの非存在下で組成物中および（ｉｉ）上記定義のブロックコポリマーのミセルを含む組成物中にそれぞれ導入すると、大幅に多い量のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの全インビボバイオアベイラビリティが観察される。これはこれらの２つの組成物のそれぞれのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ血中濃度プロファイルで示される。
【００３４】
さらに、本発明実施例では、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａが導入された上記ブロックコポリマーのミセルを含む組成物によってインビボで放出されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａの量は、投与時期の６時間後にミセルフリー組成物によってインビボで放出されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａの量より投与時期の４８時間後の方が多いことがわかる。
【００３５】
さらに別の観点から、本発明実施例では、上記定義のブロックコポリマーのミセルに導入されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａの組成物は、インビボで、曲線下面積（ＡＵＣ）値が、対応するミセルを含まない組成物で測定されるＡＵＣ値より最大で２倍半大きいことがわかる。
【００３６】
本発明でミセルに導入されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａ組成物のＡＵＣ値は、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａを封入する他の公知の解決策、例えば特許文献１（欧州特許第1 633 44０号公報）（この文献の［表５］および［表６］の結果を参照）に記載の解決策で得られるＡＵＣ値より大きいことは理解できよう。
【００３７】
さらに別の観点から、上記コポリマーのミセル中に導入されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａを含む本発明の医薬組成物は、ミセルを含まない同じ組成物のバイオアベイラビリティ時間と比較して、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを血流中で非常に長い時間の間、バイオアベイラブル（bioavailable）にすることができる。すなわち、本発明医薬組成物では最大で１０倍長い平均滞留時間（MRT）が測定される。
【００３８】
さらに、本発明実施例では、本発明医薬組成物中に存在するＦＶＩＩ／ＶＩＩａは、ミセルを含まない対応する医薬組成物中に存在するＦＶＩＩ／ＶＩＩａよりはるかにゆっくりと血流から除去されることがわかった。すなわち、本発明の医薬組成物の投与後に測定されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａクリアランス（ＣＬ）値はミセルを含まない組成物の約３分の１以下であ。
【００３９】
さらに、本発明医薬組成物で得られた血流中のＦＶＩＩ／ＶＩＩａの終末半減期（terminal half-time）ｔ1/2（β）は、ミセルを含まない対応する組成物で観察されたものよりはるかに長い。
【００４０】
加えて、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａを本明細書に定義の上記のブロックコポリマーのミセル中に導入したときに得られる非常に優れた薬物動態プロファイルは当業者には予測できないことである。すなわち、少なくともこのタイプのミセルの能力：（ｉ）タンパク分子を取り込む、（ｉｉ）タンパク分子の血流への運搬によって引き起こされるタンパク分子の変更を防ぐ、（ｉｉｉ）タンパク分子を分解しない形態で時間をかけて大量に放出するという能力は本明細書で初めて開示されたものである。
【００４１】
さらに、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａのような特定タイプの凝固タンパクが本明細書に記載のタイプのミセル中へ導入するのに成功し、改良されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａ予防的または治療的治療、特に所定時間の間の投与回数を減らす必要のあるＦＶＩＩ／ＶＩＩａ予防的または治療的治療を開発する可能性と両立する薬物動態プロファイルに従ってインビボで放出できるということは当業者に予想できないことである。
【００４２】
本発明のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの医薬組成物で得られるインビボでの結果の驚くべき、予測不可能な性質は、本明細書に定義の上記ブロックコポリマーのミセルは、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａと有意な構造的および機能的類似性を有する別の凝固因子、すなわち因子ＩＸの薬物動態プロファイルを変化させることが全くできないという事実によって証明される。因子ＦＶＩＩ／ＶＩＩａおよび因子ＩＸはいずれもＧＬＡ−ドメインタンパクであることを特に明記しておく。
【００４３】
本発明実施例では、上記ブロックコポリマーのミセルを含む組成物に導入される因子ＩＸの量は、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａと同様に、対応するミセルを含まない組成物に導入される因子ＩＸの量と同等であることがわかった。
【００４４】
しかし、本発明実施例の結果から、上記ミセルを含む組成物に導入される因子ＩＸおよびミセルを含まない対応する組成物に導入される因子ＩＸのそれぞれの血漿濃度の変化のプロファイルは同じであることがわかる。これらの結果は上記ブロックコポリマーのミセルは、因子ＩＸに関して下記の（ｉ）〜（ｖ）のいずれかであることを意味する：（ｉ）因子ＩＸを取り込むことができない、または（ｉｉ）分解されずに因子ＩＸを取り込むことはできない、または（ｉｉｉ）血流中で可能性のある変更から因子ＩＸを守ることができない、または（ｉｖ）取り込んだ因子ＩＸを血流中に放出することができない、または（ｖ）上記の不可能なことを少なくとも２つ合わせたものを示す。
【００４５】
本発明の医薬組成物の実施例では、上記医薬組成物は下記式（Ｉ）のコポリマーから形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む：
【化１】
2014524416.tif 000002
【００４６】
（ここで、
Ｒ1はポリアルキレングリコール鎖を表し、
Ｒ2は（ｉ）５〜１８個の炭素原子を含むアルキル鎖および（ｉｉ）ベンジル基から選択される基であり、
ｘは１０〜１００の整数であり、
ｎは１〜ｘ−１である整数であり、
側鎖に疎水基を有するｎ個のサブユニットおよび側鎖にカルボン酸基を有するｘ−ｎ個のサブユニットは疎水性ポリマーセグメント全体にわたってランダムに分布している）
【００４７】
式（Ｉ）のブロックコポリマーの「Ａｃ」はアセチル基を意味する。
式（Ｉ）のブロックコポリマーの親水性ポリマーセグメントはポリアルキレングリコールから成るＲ1基によって表される。
【００４８】
本明細書でポリアルキレングリコールとは式（Ａ）のものである：
Ｈ−［Ｏ−Ｒ］ｚ−ＯＨ        （Ａ）
（ここで、
Ｒは１〜４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基で、
ｚは１０〜２５００、好ましくは５０〜５００の整数である）
Ｒは未置換の直鎖アルキル基であるのが好ましい。
【００４９】
本発明実施例では、Ｒはエチル基またはブチル基から成り、ｚは２００〜３００である。
ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（すなわち式（Ａ）の基Ｒがエチル基）およびポリブチレングリコール（すなわち式（Ａ）の基Ｒがブチル基）から選択されるのが有利である。
【００５０】
Ｒ１はポリエチレングリコールであるのが好ましい。
Ｒ１は分子量が５ｋＤａ〜５０ｋＤａであるポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールまたはポリブチレングリコール、例えば分子量が８ｋＤａ〜２０ｋＤａのポリアルキレングリコール、さらに分子量が１０ｋＤａ〜１２ｋＤａのポリアルキレングリコールであるのが有利である。
Ｒ１は分子量が５ｋＤａ〜５０ｋＤａのポリエチレングリコール、例えば分子量が８ｋＤａ〜２０ｋＤａのポリエチレングリコール、さらに分子量が１０ｋＤａ〜１２ｋＤａのポリエチレングリコールであるのが好ましい。
【００５１】
ポリエチレングリコールの分子量は４４ｍ＋６２である（ここで、ｍはポリマー中のエチレングリコール単位の数から成る整数）。従って、５ｋＤａのポリエチレングリコールは約１１３個のグリコール単位を含む（すなわちｚ＝約１１３）。従って、８ｋＤａのポリエチレングリコールは約１８０のグリコール単位を含む（すなわちｚ＝約１８０）。従って、１０ｋＤａのポリエチレングリコールは約２２７のグリコール単位を含む。従って、１２ｋＤａのポリエチレングリコールは約２７０のグリコール単位を含む。従って、１５ｋＤａのポリエチレングリコールは約３３８のグリコール単位を含む。従って、２０ｋＤａのポリエチレングリコールは約４５０のグリコール単位を含む。従って、５０ｋＤａのポリエチレングリコールは約１１２６のグリコール単位を含む。「ｘ」の値が工業的に許容される数値を有する基準値として決められることは理解できよう。例えは「ｘ」値が４０の場合、「ｘ」の実測値は３７〜４３の範囲になる。
【００５２】
ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールの分子量は平均分子量である。一般に、ポリアルキレングリコール。実際には、例えばポリエチレングリコールの寸法はポリエチレングリコール分子の個々の寸法がポリマーの分子の集団内でわずかに異なるためその平均分子量に対して定義される。
【００５３】
式（Ｉ）のブロックコポリマーでは疎水性セグメントはポリ（グルタミン酸）から成り、そのグルタミン残基の少なくとも一部は疎水性Ｒ2基でエステル化される。
本発明実施例では、Ｒ2基は５〜１８個の炭素原子を含むアルキルから成り、このアルキルは未置換であるか、または、１〜３個の炭素原子を含む一つまたは複数のアルキルで置換されている。
【００５４】
本発明の好ましい実施例ではＲ2基は８〜１２の炭素原子を含むアルキル鎖から成る。
Ｒ2は８の炭素原子を含む未置換アルキル鎖（オクチル基）で構成できる。
他の実施例では、Ｒ2基はベンジル基から成る。
式（Ｉ）のブロックコポリマーの疎水性セグメントは「ｘ」のグルタミン酸残基を含む。ｘは１０〜１００、例えば２０〜７５、さらに３０〜６０の整数である。実施例はｘが４０に等しい式（Ｉ）のブロックコポリマーの使用を示している。
【００５５】
既に述べたように、疎水性セグメント中のアミノ酸残基の一部はＲ2基で置換される。特に、疎水性セグメントはＲ2基による置換での置換率によって特徴付けられる。Ｒ2基による置換での置換率「ＳＲ」は式（Ａ）：ＳＲ＝ｎ／ｘに従って計算される。Ｒ2基による疎水性セグメントの置換での置換率ＳＲは一般に少なくとも0.1且つ1.0以下、例えば0.4から1.0以下まで、例えば0.7から1.0以下までである。
【００５６】
Ｒ2基による置換での置換率ＳＲは、式（Ｉ）の対応するブロックコポリマーの分子群に対して測定される平均値として求められることは理解できよう。従って、ＳＲ率を０．９として示すときは、実際の測定率は「ｘ」値の数値的許容値により、0.79〜0.98にすることができる。
一般に、本明細書に定義されたブロックコポリマーは特許文献２（欧州特許出願第2042184号公報）に開示された方法に従って合成できる。
【特許文献２】欧州特許出願第2042184号公報
【００５７】
本明細書に定義のブロックコポリマーは水溶液中に存在するときに自己会合性によって自発的にミセルを形成する。上記ブロックコポリマーの特定構造はブロックコポリマーに自己会合特性、特に疎水性コアと親水性クラウンとを有するミセルタイプの安定なナノ粒子を自発的に形成する能力を与える。
【００５８】
特定の理論に縛られるものではないが、上記定義のブロックコポリマーのミセル中に封入されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａは、血流中で所定の滞留時間後にミセルが解離した時に、（ｉ）ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子をミセルを介して拡散させる、および、（ｉｉ）ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子を放出させる、の２つの異なる方法によってそれぞれ血流中に放出されると本発明者は考える。
【００５９】
「因子ＶＩＩ」、「ＦＶＩＩ」および「ＦＶＩＩａ」という用語は血液凝固因子ＶＩＩ、場合によってはその活性化形態（ＦＶＩＩａ）を示すのに区別しないで使用し、哺乳類のゲノムで天然にコードされるＦＶＩＩ／ＶＩＩａに対する変異体および変異株を包む。本明細書で因子ＶＩＩはＦＶＩＩ並びにＦＶＩＩａを包含する。本発明に従ってミセル中に封入されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａはヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａまたはヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａの変異体または変異株であるのが好ましい。
【００６０】
本発明の医薬組成物を調製する際には血漿から精製したＦＶＩＩ／ＶＩＩａまたは組換えＦＶＩＩ／ＶＩＩａを使用できる。ＦＶＩＩ／ＶＩＩａのこれら２つの形態は当業者に周知であり、商業的に容易に入手できる。
【００６１】
血漿から精製したＦＶＩＩ／ＶＩＩａは例えば商品名「因子ＶＩＩ  ＬＦＢ」（フランス医薬品販売許可番号No. 5615752）で市販されている特殊医薬品にすることができる。
組換えヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａは、例えば商品名NovoSeven（登録商標） (NovoNordisk（登録商標）, フランス医薬品販売許可番号No.5730938（非特許文献１に基づく）で市販されている特殊医薬品から成る。
【非特許文献１】２００４年１月２７日に最初に許可された欧州医薬品販売許可（European marketing authorization initially granted on 27 January 2004）
【００６２】
この特殊医薬品ではＦＶＩＩ／ＶＩＩａは凍結乾燥された形態である。
組換えヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａはさらにヒトＦＶＩＩをコードする遺伝子に対してトランスジェニクであるウサギで産生したＦＶＩＩ／ＶＩＩａで構成できる。これは特許文献３（PCT出願第WO2007/138199号公報）の開示に従って産生できる。
【特許文献３】PCT出願第WO2007/138199号公報
【００６３】
組換えヒトFVII/VIIaはさらに、特許文献４（PCT出願第WO2008/015339号公報）または特許文献５（米国特許出願第2004185535号明細書）の開示に従って産生されるＦＶＩＩ／ＶＩＩａで構成できる。
【特許文献４】国際公開第WO2008/015339号公報
【特許文献５】米国特許出願第2004185535号明細書
【００６４】
既に明記したように、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａの変異体または変異株、特にヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａの変異体または変異株から成る因子ＶＩＩを用いることもできる。ヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａの変異株または変異体としては例えば下記の（ｉ）国際出願公開および（ｉｉ）米国特許明細書に記載のものを用いることができる。
【特許文献６】国際出願公開第WO 2008127702号公報
【特許文献７】国際出願公開第WO 2008155509号公報
【特許文献８】国際出願公開第WO 0222776号公報
【特許文献９】国際出願公開第WO 2009126307号公報
【特許文献１０】国際出願公開第WO 02077218号公報
【特許文献１１】国際出願公開第WO 03093465号公報
【特許文献１２】国際出願公開第WO 0183725号公報
【特許文献１３】米国特許第7416860号明細書
【特許文献１４】米国特許第7419803号明細書
【００６５】
従来技術では、対象となるＦＶＩＩ／ＶＩＩａのタイプに従って、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａの活性度はＦＶＩＩ／ＶＩＩａタンパク１ミリグラム当たり５００〜４０００国際単位（ＩＵ）にできることが知られている。実施例で用いるＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａのタイプは約２０００ＩＵ／ｍｇＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの活性度を有する。
【００６６】
本発明実施例では１ミリグラム当たり２０００国際単位の比活性度を有する組換えヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａの使用する。
ＦＶＩＩ／ＶＩＩａが導入または封入されたブロックコポリマーのミセルは、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ：コポリマー質量比が１：１００ｗｔ：ｗｔ〜５０：１００ｗｔ：ｗｔ、好ましくは５：１００ｗｔ：ｗｔ〜２０：１００ｗｔ：ｗｔであるのが有利である。
【００６７】
一般に、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ：コポリマー質量比は、所望の予防的または治療的効果と両立できる量のＦＶＩＩ／ＶＩＩａ活性成分を含む医薬組成物を患者に投与できるように十分に大きな値を有するのがよいことは当業者は理解できよう。
【００６８】
さらに、本明細書に定義のブロックコポリマーのミセルは所定量のＦＶＩＩ／ＶＩＩａを、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ：コポリマー質量比の最大値で取り込む能力を有することも当業者は理解できよう。この最大値を超えると過剰ＦＶＩＩ／ＶＩＩａはもはや十分にミセルに取り込まれず、従って、本発明の医薬組成物内で遊離した形態になる。ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子の一部が遊離した形態である上記ブロックコポリマーに対して大過剰質量のＦＶＩＩ／ＶＩＩａの条件下では対応するＦＶＩＩ組成物の薬物動態プロファイルが変化し、これは本発明が追求する目的を満たすことはできない。
【００６９】
本発明実施例ではＦＶＩＩ／ＶＩＩａ：コポリマー質量比が５：１００ｗｔ：ｗｔおよび１０：１００ｗｔ：ｗである本発明の医薬組成物を例に示す。
ミセル中に導入または封入されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａを含む本発明の医薬組成物は液体形態または凍結乾燥形態にすることができる。
本発明の医薬組成物は凍結乾燥形態で調製できる。この凍結乾燥した組成物に適量の滅菌脱塩水を添加して、液体形態の本発明の医薬組成物を調製する。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、使用前に貯蔵される形態、固体形態または液体形態とは無関係に、上記医薬組成物を液体形態で患者に投与することは当業者には理解できよう。
医薬組成物は特に医薬組成物が液体形態であるときに、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子が導入または封入されたミセルを安定化するようにｐＨ値を調整するために、緩衝液または緩衝液の組合せをさらに含むのが好ましい。
【００７１】
本発明の医薬組成物のｐＨ値の維持は、特にＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子と上記ブロックコポリマーの分子との会合をミセル内で促進するためである。
本発明の医薬組成物の実施例では、この組成物のｐＨを４．５〜６．５のｐＨ値の範囲の所定のｐＨ値に維持できる緩衝液または緩衝液の組合せを使用する。
本発明の好ましい実施例では、この組成物のｐＨを５〜６のｐＨ値の範囲の所定のｐＨ値に維持できる緩衝液または緩衝液の組合せを添加する。
【００７２】
特定の理論に縛られるものではないが、ｐＨ５〜ｐＨ６の範囲である所定のｐＨで、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子と本明細書に定義されたブロックコポリマーの分子との間の相互作用が促進されると本発明者は考える。ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ、特に組換えヒトＦＶＩＩ／ＶＩＩａは６〜７の等電点を有することを明記する。ｐＨがｐＨ５〜ｐＨ６の範囲に維持される本発明の医薬組成物の実施例では、分子は荷電した形態であり、これはブロックコポリマーの疎水性セグメントの構造性アミノ酸残基、例えば式（Ｉ）のブロックコポリマーの構造性グルタミン酸残基と同様である。ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ分子と上記ブロックコポリマーの分子との間の静電相互作用はこの５〜６のｐＨ範囲で全体的に誘引性である。
本発明実施例は、液体形態の本発明の医薬組成物のｐＨをｐＨ５またはｐＨ６に維持できる緩衝液を含む本発明の医薬組成物の実施例を示している。
当業者に周知な任意のタイプの生理学的に許容される緩衝液を使用できる。緩衝液は本発明の医薬組成物中に約２ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度範囲で存在できる。
【００７３】
特に、有機酸または有機酸またはその塩、例えば下記のものから選択される緩衝液または緩衝液の組合せを使用できる：
（１）クエン酸緩衝液、例えばクエン酸一ナトリウムまたはクエン酸二ナトリウム、またはこれらの混合物、クエン酸とクエン酸三ナトリウムとの混合物、クエン酸とクエン酸三ナトリウムとの混合物、
（２）コハク酸緩衝液、例えばコハク酸とコハク酸一ナトリウムとの混合物、コハク酸と水酸化ナトリウムとの混合物、コハク酸とコハク酸一ナトリウムとの混合物、
（３）酒石酸緩衝液、例えば酒石酸と酒石酸ナトリウムとの混合物、酒石酸と酒石酸カリウムとの混合物、酒石酸と水酸化ナトリウムとの混合物、
（４）フマル酸緩衝液、例えばフマル酸とフマル酸一ナトリウムとの混合物、フマル酸とフマル酸二ナトリウムとの混合物、フマル酸一ナトリウムとフマル酸二ナトリウムとの混合物、
（５）グルコン酸緩衝液、例えばグルコン酸とグルコン酸ナトリウムとの混合物、グルコン酸と水酸化ナトリウムとの混合物、グルコン酸とグルコン酸カリウムとの混合物、
【００７４】
（６）シュウ酸緩衝液、例えばシュウ酸とシュウ酸ナトリウムとの混合物、シュウ酸と水酸化ナトリウムとの混合物、シュウ酸とシュウ酸カリウムとの混合物、
（７）乳酸緩衝液、例えば乳酸と乳酸ナトリウムとの混合物、乳酸と水酸化ナトリウムとの混合物、乳酸と乳酸カリウムとの混合物、
（８）酢酸緩衝液、例えば酢酸と酢酸ナトリウムとの混合物、酢酸と水酸化ナトリウムとの混合物、
（９）燐酸緩衝液、例えばクロロホスホン酸二ナトリウムと燐酸一カリウムとの混合物、二塩基性燐酸一水素と一塩基性燐酸二水素との混合物。
【００７５】
本発明実施例は（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸またはＭＥＳ）緩衝液を含む本発明の医薬組成物を例に示す。このＭＥＳ緩衝液は１０ｍＭの最終濃度で使用できる。
さらに、本明細書に定義されたブロックコポリマーから形成されたミセルに封入されたＦＶＩＩ／ＶＩＩａを含む本発明の医薬組成物は、凍結防止剤または凍結防止剤の組合せをさらに含むことができる。
【００７６】
凍結防止剤は当業者に周知の任意のタイプの凍結防止剤にすることができる。特に、糖類タイプの凍結防止剤、例えば単糖類、二糖類または多糖類を使用できる。例えば、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、グリセロール、スクロースまたはトレハロースから選択される凍結防止剤を使用できる。
本発明実施例は、凍結防止剤がスクロースである本発明の医薬組成物を例に示す。
本発明の医薬組成物は一つまたは複数の生理学的に許容可能な追加の賦形剤、特に、現行のヨーロッパ薬局方または米国薬局方によって勧められているものを含むことができる。本発明の医薬組成物は非特許文献２（ヨーロッパ薬局方の第６版、２００７年６月）または非特許文献３（米国薬局方、２０１０年）で勧められている一つまたは複数の追加の賦形剤を含むことができる。
【非特許文献２】ヨーロッパ薬局方の第６版、２００７年６月
【非特許文献３】米国薬局方、２０１０年
【００７７】
本発明医薬組成物が液体形態の場合、特に直ちに使える液体の形態であるときには、この医薬組成物はミセルの形態で本明細書に定義された上記ブロックコポリマーの最終濃度が1mg/ml〜100mg/mlである。
特定の理論に縛られるものではないが、ミセル形態の上記ブロックコポリマーの分子の配列を維持するための臨界最低濃度（ＣＭＣ）が達成されないという事実から、上記ブロックコポリマーの最終低濃度でミセルの完全性が変化すると本発明者は考える。
【００７８】
上記ブロックポリマーの濃度が１００ｍｇ／ｍｌ以上であると、上記医薬組成物の粘度特性によって、この組成物の、注射による患者への投与に対する適合性が低下すると本発明者は考える。
ある好ましい実施例では、本発明医薬組成物が液体形態であるとき、特にすぐに使える液体の形態であるときの上記ブロックコポリマー、例えば式（Ｉ）のブロックコポリマーの最終濃度は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌである。
一般に、本発明医薬組成物は、用量単位当たり５００ＩＵ〜１００００ＩＵの範囲のＦＶＩＩ／ＶＩＩａの活性度を得るのに適した量のＦＶＩＩ／ＶＩＩａを含む。
【００７９】
例として、２０００ＩＵ／ｍｇの比活性度を有するＦＶＩＩ／ＶＩＩａでは、５０００ＩＵでの本発明の医薬組成物の用量単位は、ミセル中に導入または封入された２．５ｍｇのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを含む。さらに、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ：コポリマー質量比が１０：１００である本発明医薬組成物では、上記用量単位は、ミセル形態の上記コポリマー、例えば式（Ｉ）のコポリマーの量であり、２５ｍｇの上記コポリマーである。さらに、上記コポリマーの最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌである医薬組成物の実施例では、上記用量単位は直ちに使える液体の形態であるときに１ｍｌの容積である。
【００８０】
医薬組成物が溶液から成る本発明医薬組成物の実施例では、医薬組成物が０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを含む。これらの実施例の一部では、上記組成物は０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを含む。これらの実施例は、約１ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを含む医薬組成物を包含する。
本発明の医薬組成物のある提示形態では、液体形態の組成物を複数の用量単位に十分な容積の瓶に充填でき、この複数の用量単位を取り出して注射器の容器に連続して充填し、この注射器を続いて、非経口投与による上記組成物の投与に使用することは理解できよう。
【００８１】
一般に、本発明の医薬組成物はその非経口投与、例えば皮下投与、皮内投与および静脈内投与に適している。静脈内投与が好ましい。
本発明の医薬組成物は一般に凝固障害を予防または治療するためのものである。本発明の医薬組成物は任意の周知の医学的徴候およびFＶＩＩ/ＶＩＩa全般で引き続いて認識される任意の医学的徴候に用いられる。
本発明の医薬組成物は例えば、因子ＶＩＩの構造上単独欠失に関係した出血事象の治療に使用できる。
本発明の医薬組成物はさらに、因子ＶＩＩの構造上単独欠失の場合の且つ患者の病歴に関係した出血事象の予防に使用できる。
【００８２】
本発明の医薬組成物は特に、下記の患者群の外科手術中または侵襲的処置中に生じる出血症状の治療および出血の予防に適している：
（１）＞  ５  ベセスダ単位  （ＢＵ）の力価を有する凝固因子ＶＩＩＩに対する阻害剤を有する先天性血友病患者、
（２）因子ＶＩＩＩの投与に対する強い既往反応が予測できる先天性血友病患者。
【００８３】
本発明の医薬組成物は特に、下記の患者群の外科手術中または侵襲的処置中に生じる出血症状の治療、および、出血の予防に適応とされる：
（１）＞５ベセスダ単位（ＢＵ）の力価を有する凝固因子ＩＸに対する阻害剤を有する先天性血友病患者、
（２）因子ＩＸの投与に対する強い既往反応が予測できる先天性血友病患者、
（３）後天性血友病患者、
（４）先天性ＦＶＩＩ欠失患者、および
（５）抗−ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａおよび／または抗−ＨＬＡ抗体を有し、且つ血小板輸血に対する（既往または現）反応の欠如を示すグランツマン血小板無力症患者。
【００８４】
さらに他の観点では、本発明の対象は（ｉ）親水性ポリマーセグメントおよび（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセルに封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物であって、この組成物は、それが非経口投与されるときに、一つまたは複数の下記の特徴を有する薬物動態プロファイルを発生するのに適している医薬組成物にある：
（１）ＡＵＣ（曲線下面積）値が同量のＦＶＩＩを封入していない比較組成物で得られるＡＵＣ値より１０％以上高い、
（２）ＭＲＴ（平均滞留時間）値が少なくとも２時間であり、
（３）ＣＬ（クリアランス）値が最大で２００ｍｌ／ｋｇ／時である。
【００８５】
既に述べたように、ＭＲＴおよびＣＬの値は７週齢のウイスター系ラットから得るのがよい。
以下、上記医薬組成物の具体例を詳細に説明する。
【００８６】
本発明の他の対象は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基をもっぱら含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている、薬物として用いるための因子ＶＩＩにある。
【００８７】
本発明のさらに他の対象は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセル中に封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基をもっぱら含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている、凝固障害を治療するための因子ＶＩＩにある。
【００８８】
本発明のさらに他の対象は、（ｉ）ポリアルキレングリコールから成る親水性ポリマーセグメントと（ｉｉ）ポリアミノ酸から成る疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー分子から形成されるミセルに封入された因子ＶＩＩであって、このポリアミノ酸がヒスチジン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基をもっぱら含み、このアミノ酸残基の一部が疎水基で置換されている因子ＶＩＩの、凝固障害を治療するための薬物の製造での使用にある。
【００８９】
本発明の一実施例では、本発明の医薬組成物を例えば下記（１）および（２）によっての出血事象の治療に使用できる：
（１）中程度の事象において１５〜２０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩ／ＶＩＩａの用量に必要な上記組成物の量の投与、および
（２）重篤な事象において３０〜４０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩ／ＶＩＩａの用量に必要な上記組成物の量の投与、その後に、２０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩ／ＶＩＩａの容量を、間を置いて次々と６〜８時間で投与して、出血事象の消散まで因子ＶＩＩレベルを３５％〜４５％に維持する。
【００９０】
本発明の一実施例では、本発明の医薬組成物を外科手術の治療に使用できる、すなわち、外科手術のときに５０％以上の循環因子ＶＩＩレベルを得るために、３０〜４０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩ／ＶＩＩａの初回量に必要な本発明の医薬組成物の量を、外科手術の１時間前に投与し、手術の直前に因子ＶＩＩレベルをテストする。本発明の医薬組成物のそれに続く用量を６〜８時間ごとに投与し、その後の数日間（１）または（２）のようにする：
（１）簡単な外科的処置の場合は、循環因子ＶＩＩレベルを２０〜３０％に維持し；
（２）大手術の場合は、循環因子ＶＩＩレベルを３５〜４５％に維持する。
【００９１】
因子ＶＩＩレベル補正および生物学的モニタリングの持続時間は、臨床的症状および出血のリスクに適している。
本発明の一実施例では、本発明の医薬組成物を予防的治療に使用できる。すなわち、本発明の医薬組成物は反復性出血事象、例えば、因子ＶＩＩ欠失が＜５％である患者で関節血症の予防に適応ができる。本発明医薬組成物の有効用量は、２０〜３０ＩＵ／ｋｇのＦＶＩＩ／ＶＩＩａの投与量に必要な用量であり、且つ、数週間〜数カ月の間、週に少なくとも２〜３回投与するほうがよい。これは、出血予防に関する結果に従って、調節するほうがよい。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１
式（Ｉ）のブロックコポリマーのミセル中に封入されたＦＶＩＩ／ＶＩＩaを含む医薬組成物を製造するための第１シリーズ
A  医薬組成物の製造方法
A.1.  コポリマー
式（Ｉ）の２つのタイプの自己会合コポリマーを用いた。ここではＲ2基は（ｉ）「PEG-pGlu(OC8)-Ac」で表される未置換のオクチル鎖または（ｉｉ）「PEG-pGlu(OBn)-Ac」で表されベンジル基である。
PEG-pGlu(OC8)-Acコポリマーは下記の式（Ｉ−Ａ）を有する:
【化２】
2014524416.tif 000003
【００９３】
（ここで、Ｒ1基は分子量が１０ｋＤａのポリエチレングリコール鎖であり、この鎖のポリ（グルタミン酸塩）鎖は４０個のグルタミン酸単位（ｘ＝４０）を含み、ポリ（グルタミン酸塩）鎖の４０の構成グルタミン酸単位中３６のグルタミン酸単位が置換され、グルタミン酸残基をオクチル基で置換する置換率は０．９であるる）。
【００９４】
PEG-pGlu(OBn)-Acコポリマーは下記の式（Ｉ−Ｂ）を有する:
【化３】
2014524416.tif 000004
【００９５】
（ここで、Ｒ1基は分子量が１０ｋＤａのポリエチレングリコール鎖であり、この鎖のポリ（グルタミン酸塩）鎖は４０のグルタミン酸単位（ｘ＝４０）を含み、ポリ（グルタミン酸塩）鎖の４０の構成グルタミン酸単位中３６のグルタミン酸単位が置換され、、グルタミン酸残基をベンジル基で置換する置換率は０．９である）。
【００９６】
A.2  因子ＶＩＩ/ＶＩＩa
Laboratoire Fran軆ochais du Fractionnement et des Biotechnologiesによる特許文献３（PCT出願第WO2007/138199号公報）の開示に従ってウサギ乳汁で産生した組換えヒト因子ＶＩＩ/ＶＩＩaを用いた。
精製した組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaの比活性度は2000IU/mgである。
【００９７】
A.3  PEG-pGlu(OC8)-Acコポリマーのミセル中またはPEG-pGlu(OBn)-Acコポリマーのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む医薬組成物の製造 
A.3.1.  PEG-pGlu(OC8)-Ac のミセルを含む組成物
pH 5の10mM MES 緩衝液と10%スクロースを含む最終容積が2.4mlの水溶液に４oＣで (i) 0.36mgの上記組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaおよび(ii) 3.6mgのPEG-pGlu(OC8)-Acを添加する。
混合物中でのFＶＩＩ/ＶＩＩaおよびPEG-pGlu(OC8)-Acは質量比が10:100である。この混合物を４℃で２４時間のインキュベーションした後のPEG-pGlu(OC8)-Ac分子は自己会合し、組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaを封入するミセルを形成した。
【００９８】
A.3.2.  PEG-pGlu(OBn)-Acのミセルを含む組成物
pH 5の10mM MES 緩衝液と10%スクロースを含む最終容積が2.4mlの水溶液に４oＣで(i) 0.36mgの組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaおよび(ii) 3.6mgのPEG-pGlu(OBn)-Acを添加する。
混合物中でのFＶＩＩ/ＶＩＩaおよびPEG-pGlu(OBn)-Acは質量比が10:100である。この混合物を４℃で２４時間のインキュベーションした後のPEG-pGlu(OBn)-Ac分子は自己会合し、組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaを封入するミセルを形成した。
【００９９】
Ｂ．  薬物動態アッセイ
B.1  動物
７週齢のウイスター系ラットを用いた。
B.2.  投与プロトコル
３匹のラットから成るグループを用いた。同じグループのラットには同じ治療を行う。ミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩa溶液を第１グループの３匹のラットに600IU/kgの用量で静脈内投与した。
第２グループの３匹のラットにはPEG-pGlu(OC8)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの溶液を600IU/kgの用量で静脈内投与した。
第３グループの３匹のラットにはPEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの溶液を600IU/kgの用量で尾静脈内投与した。
【０１００】
B.3.  薬物動態プロファイルの測定
Diagnostica Stago社から商品名「Asserachrom（登録商標）ＶＩＩ:Ag」で市販のFＶＩＩ ELISA検出キットによって、３つの配合物のそれぞれに対して薬物動態プロファイルを下記プロトコルを用いて作った：
（１）ラット血漿を、最終濃度が0.1%の界面活性剤溶液によって４℃で１時間、前処理し、ミセルを溶解させて、ミセルにまだ封入されているFＶＩＩaを全て放出する。
（２）既知量のポリマーの干渉可能性を考慮してミセルの存在下で標準曲線を適合させる（「図１」）。
各ラットごとに血漿FＶＩＩ/ＶＩＩa濃度を投与後の下記の経過時間に測定した：5分、0.5時間、1時間、２時間、８時間、24時間および48時間。
結果は［図２］に示す。
［図２］の結果から、PEG-pGlu(OC8)-AcまたはPEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaは時間をかけて連続放出され、相当量のFＶＩＩ/ＶＩＩaは24時間後 (PEG-pGlu(OBn)-Ac)、さらには48時間後(PEG-pGlu(OBn)-Ac)もまだ放出されていることがわかる。
【０１０１】
実施例２
式（Ｉ）のブロックコポリマーのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む医薬組成物を製造するための第２シリーズ
A.  医薬組成物の製造方法
実施例１に記載のプロトコルを用いて下記の５つの配合物を調製した：
（１）pH 5のMES緩衝液中にミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物（以下「FＶＩＩ 溶液(pH 5)」という）；
（２）pH 6の燐酸緩衝液中にミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物（以下「FＶＩＩ 溶液(pH 6)」という）；
（３）FＶＩＩ/:PEG-pGlu(OC8)-Ac質量比がpH 5で0.5:10である、PEG-pGlu(OC8)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物（以下「5% C8ミセル(pH 5)」という）；
（４）FＶＩＩ/:PEG-pGlu(OC8)-Ac質量比がpH 5で1:10である、PEG-pGlu(OC8)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物（以下「10% C8ミセル(pH 5)」という）；
（５）FＶＩＩ/: PEG-pGlu(OBn)-Ac質量比がpH 5で1:10である、PEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物（以下「10% Bnミセル(pH 5)」という）。
【０１０２】
B.  薬物動態アッセイ
実施例１と同じ条件下で薬物動態アッセイを行った。
結果は［図３］に示す。
［図３］の結果から、PEG-pGlu(OC8)-AcまたはPEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaは時間をかけて連続放出され、相当量のFＶＩＩ/ＶＩＩaが24時間後 (PEG-pGlu(OBn)-Ac)、さらには48時間後(PEG-pGlu(OBn)-Ac)にもまだ放出されていることがわかる。
［図３］の結果から、さらに、２つのFＶＩＩ/ＶＩＩa配合物：（ｉ）5% C8 ミセル(pH 5)および（ｉｉ）10% C8ミセル (pH 5)に封入された配合物で、同一の薬物動態プロファイルが得られることがわかる。
テストした配合物の一部の薬物動態プロファイルの各特性値を［表１］に示す。
【表１】
2014524416.tif 000005
【０１０３】
［表１］の結果から、最良の薬物動態プロファイルパラメータは式（I）のコポリマーから形成されたミセル中に封入された組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む医薬組成物の各実施例で得られることがわかる。
式（Ｉ）のコポリマーのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの組成物のAUC値は特に注目できる。この値は、ミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの対応する配合物で測定されたAUCより、それぞれ2.3倍(PEG-pGlu(OBn)-Ac)および2.9倍(PEG-pGlu(OC8)-Ac)大きい。
さらに、［表１］の結果から、血流中のFＶＩＩ/ＶＩＩa に対するMRT滞留時間値はミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの対応する配合物で測定されたMRT値よりそれぞれ3.7倍(PEG-pGlu(OBn)-Ac)および11.9倍(PEG-pGlu(OC8)-Ac)大きいことがわかる。
さらに、［表１］の結果から、PEG-pGlu(OC8)-Acベースの配合物で得られる薬物動態プロファイルはPEG-pGlu(OBn)-Acベースの配合物で得られる薬物動態プロファイルより有利であることがわかる。
【０１０４】
実施例３
式（Ｉ）のブロックコポリマーのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む医薬組成物を製造するための第３シリース
A.  医薬組成物の製造方法
実施例１に記載のプロトコルを用いて下記の３つの配合物を調製した：
（１）pH 5のMES緩衝液中にミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物；
（２）FＶＩＩ/:PEG-pGlu(OC8)-Ac質量比がpH 5で0.5:10である、PEG-pGlu(OC8)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物；
（３）FＶＩＩ/: PEG-pGlu(OBn)-Ac質量比がpH 5で0.5:10である、PEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの配合物（以下「5% Bnミセル(pH 5)」という）
【０１０５】
B.  薬物動態アッセイ
実施例１と同じ条件下で薬物動態アッセイを行った。
結果は［図３］に示す。
［図３］の結果から、PEG-pGlu(OC8)-AcまたはPEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaは時間をかけて連続放出され、相当量のFＶＩＩ/ＶＩＩaは24時間後 (PEG-pGlu(OBn)-Ac)、さらには48時間後(PEG-pGlu(OBn)-Ac)にもまだ放出されていることがわかる。
テストした３つの配合物の薬物動態プロファイルの特性値は［表２］に示す。
【表２】
2014524416.tif 000006
【０１０６】
［表２］の結果は式（I）のコポリマーから形成されたミセル中に封入された組換えヒトFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む医薬組成物の各実施例で得られるより良い薬物動態プロファイルパラメータであることを示す。
式（Ｉ）のコポリマーのミセルに封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaの組成物のAUC値は特に注目できる。この値はミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの対応する配合物で測定されたAUCより、それぞれ3.2倍(PEG-pGlu(OBn)-Ac)および4.0倍(PEG-pGlu(OC8)-Ac)大きい。
さらに、［表２］の結果から、血流中のFＶＩＩ/ＶＩＩa に対するMRT滞留時間値はミセルを含まないFＶＩＩ/ＶＩＩaの対応する配合物で測定されたMRT値より、それぞれ3.0倍(PEG-pGlu(OBn)-Ac)および8倍(PEG-pGlu(OC8)-Ac)大きいことがわかる。
さらに、［表２］の結果から、PEG-pGlu(OC8)-Acベースの配合物で得られる薬物動態プロファイルは、PEG-pGlu(OBn)-Acベースの配合物で得られる薬物動態プロファイルより有利であることがわかる。
【０１０７】
［図４］は実施例２、４でテストした各配合物で得られた薬物動態結果の要約を示している。
［図４］の結果から、一般に、テストした式（Ｉ）のコポリマーのミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む組成物とは無関係に、優れた薬物動態プロファイルが得られることがわかる。
［図５］の結果からさらに、実施例に記載の範囲にあるFＶＩＩ:コポリマー比、すなわち、5:100~10:100とは無関係に、FＶＩＩ/ＶＩＩa のAUC 値が同様に増加することがわかる。
テストしたミセルを含む全ての配合物において、血流中のFＶＩＩ/ＶＩＩaの平均滞留時間(MRT)の大幅な増加が測定された。
［図４］の結果からさらに、PEG-pGlu(OC8)-Acから形成されるミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む配合物で得られる結果の方が、PEG-pGlu(OBn)-Acから形成されるミセル中に封入されたFＶＩＩ/ＶＩＩaを含む配合物で得られるものより良いことがわかる。
【０１０８】
実施例４（比較例）
PEG-pGlu(OC8)-AcまたはPEG-pGlu(OBn)-Acから形成されるミセル中に封入されたＦＩＸの調製物
A.  比較例の調製物の製造方法
実施例１に記載のプロトコルを用いて下記の４つの調製物を作った：
（１）pH ４の燐酸緩衝液中にミセルを含まないFIXの配合物（以下「FIX溶液(pH ４)」という）；
（２）pH ６の燐酸緩衝液中にミセルを含まないFIXの配合物（以下「FIX溶液(pH ６)」という）；
（３）FIX:PEG-pGlu(OC8)-Ac質量比が 1:10である、pH ４の燐酸緩衝液中でPEG-pGlu(OC8)-Acのミセルに封入されたFIXの配合物（以下「10% C8ミセル (pH 4)」という）；
（４）FIX:PEG-pGlu(OC8)-Ac質量比が 1:10である、pH ６の燐酸緩衝液中でPEG-pGlu(OC8)-Acのミセルに封入されたFIXの配合物（以下「10% C8ミセル (pH ６)」という）；
（５）FIX:PEG-pGlu(OBn)-Ac質量比が 1:10である、pH ４の燐酸緩衝液中でPEG-pGlu(OBn)-Acのミセルに封入されたFIXの配合物（以下「10% Bnミセル (pH 4)」という）；
（６）FIX:PEG-pGlu(OBn)-Ac質量比が 1:10である、pH ６の燐酸緩衝液中でPEG-pGlu(OBn)-Acのミセルに封入されたFIXの配合物（以下「10% Bnミセル (pH ６)」という）
LFB社から商品名Betafact（登録商標）で市販の精製ヒトＦＩＸを用いて調製物を製造した。
【０１０９】
C.  薬物動態アッセイ
Diagnostica Stago社から商品名「Asserachrom（登録商標）IX:Ag」で市販のＦＩＸ  ELISA検出キットによって、ＦＩＸを200 IU/kgの用量で用いて、実施例１と同じ条件下で薬物動態アッセイを行った。
結果は［図６］に示す。
［図７］の結果から、PEG-pGlu(OC8)-AcまたはPEG-pGlu(OBn)-Acのミセル中に封入されたＦＩＸは、ミセルを含まない配合物中に存在するＦＩＸの動態学と同じ動態学に従って放出されることがわかる。
従って、［図６］の結果から、式（I）のコポリマーから形成されるミセル中のヒトＦＩＸの配合物はその薬物動態プロファイルを変更しないことがわかる。
これらの結果から、ＦＶＩＩ／ＶＩＩａの改良された医薬組成物を調製するために本発明に従って開発された技術的課題は、別の凝固因子の改良された組成物の調製に置き換えすることは全くできないことがわかる（その別の凝固因子がＦＶＩＩ／ＶＩＩａと共通の多くの構造上および機能上の特性を有するにもかかわらず）。
【０１１０】
実施例５
ブロックコポリマーミセル中のFＶＩＩ封入後のFＶＩＩ活性の維持
Ａ  材料と方法
Ａ．１．生成物
実施例５の目的は、本明細書に記載の式（Ｉ）のブロックコポリマーのミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物中の因子ＶＩＩ活性の維持をテストすることにある。この実施例の医薬組成物はＦＶＩＩａ−ＳＲ（ＦＶＩＩａ徐放維持）ともよばれる。
テストは非封入FＶＩＩ因子を含む比較例の医薬組成物を含めて行った。この実施例ではこの比較例の医薬組成物をＦＶＩＩａ−ＩＲ（ＦＶＩＩａ即時放出)ともよぶ。
FＶＩＩaのソースはLaboratoire Fran軆ochais du Fractionnement et des Biotechnologiesによる特許文献３（国際公開第WO2007/138199号公報）の開示に従ってヒトFＶＩＩに対してトランスジェニクであるウサギの乳汁から精製した組換えヒトFＶＩＩaにした。
FＶＩＩa-SR医薬組成物では、クエン酸ナトリウム1.5g/Lと１０％スクロースを含む水溶液中で、タンパク／ポリマー質量比を10:100にして、pGlu(OC8)-Ac のミセル中にFＶＩＩaを封入した。pH は5.2に調節した。FＶＩＩa濃度は0.4g/L~1.1g/Lにした。
【０１１１】
A.2.  Elisaアッセイ
FＶＩＩ滴定は、FＶＩＩ ELISAキットAsserachrom（登録商標）、すなわちDiagnostica Stago社からのAgで、このメーカーの使用説明書に従って行う。
A.2.   FＶＩＩ凝固時間テスト
BCS XP 機 (Siemens)で実施した時間測定法によるFＶＩＩa滴定では、組換え可溶性組織因子、リン脂質およびカルシウムの存在下で、サンプルを希釈してFＶＩＩaを除く全ての因子が過剰である溶液中の凝固時間を測定する。FＶＩＩa滴定はメーカーの使用説明書に従って行った。
ELISAとFＶＩＩ凝固時間テストの両方でサンプルを前処理する。ラット血漿を、界面活性剤溶液(0.1%の最終濃度でNP-40)によって４℃で１時間、前処理し、ミセルを溶解させて、ミセルに以前に封入されたFＶＩＩaを全て放出させる。
【０１１２】
B.  結果
結果を［表３］に示す。
【表３】
2014524416.tif 000007
【０１１３】
［表３］に示す結果から、FＶＩＩaを本特許出願に記載のブロックコポリマーのミセル中に封入したときに、FＶＩＩa活性が変わらないことがわかる。
【０１１４】
実施例６
ブロックコポリマーのミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物の有効性の試験
Ａ．  目的
実施例６の目的は、本明細書に記載の式（Ｉ）のブロックコポリマーのミセル中に封入された因子ＶＩＩを含む医薬組成物のインビボでの有効性をテストすることであった。この実施例の医薬組成物はＦＶＩＩａ−ＳＲ（ＦＶＩＩａ徐放維持）ともよばれる。
テストは、非封入ＦＶＩＩ因子を含む比較例の医薬組成物を含めて行った。この実施例では比較例の医薬組成物をＦＶＩＩａ−ＩＲ（ＦＶＩＩａ即時放出）ともよぶ。
有効性試験としてテールクリップ（tail-clip）モデルを用いた。このモデルでは因子ＶＩＩI欠失マウスまたは血友病Ａマウスの尾端を切断する。これらのマウスは１％以下の正常の因子ＶＩＩI活性を有し、且つ、同じ株の野生型マウスと比較して、テールクリップモデルにおいて失血の増加が認められる。
失血量を測定して、FＶＩＩa-SR とFＶＩＩa-IRのホメオスタシス効果を比較した。２つの用量のFＶＩＩa-SRおよびFＶＩＩa-IR (4mg/kgおよび8mg/kg)を投与し、注射後の２つの時点（５分および１２０分）を選択して失血を測定した。FＶＩＩa-SRおよびFＶＩＩa-IR有効性を、ネガティブおよびポジティブコントロール、すなわち、それぞれ生理食塩水(NaCl 0.9%)および因子ＶＩＩI投与血友病Aマウスを用いて評価した。
【０１１５】
Ｂ．  材料と方法
Ｂ．１．生成物
B.1.1.  活性成分
FＶＩＩa源はLaboratoire Fran軆ochais du Fractionnement et des Biotechnologiesによる特許文献３（国際公開第WO2007/138199号公報）の開示に従ってヒトFＶＩＩに対してトランスジェニクであるウサギの乳汁から精製した組換えヒトFＶＩＩaにした。
FＶＩＩa-SR医薬組成物では、クエン酸ナトリウム1.5g/Lと１０％スクロースを含む水溶液中で、タンパク／ポリマー質量比を10:100にして、pGlu(OC8)-Ac のミセルにFＶＩＩaを封入した。pH は5.2に調節した。FＶＩＩa濃度を0.4g/L~1.1g/Lにした。
FＶＩＩa-SRのバッチサンプルを0.4g/Lの最終タンパク濃度で調製した。
FＶＩＩa-IRのバッチサンプルを0.4g/Lの最終タンパク濃度で調製した。
全てのバッチサンプルを使用するまで-70ーCで貯蔵した。テストのために、サンプルを室温で解凍し、３時間以内に動物に注射した。
【０１１６】
B.1.2.  ポジティブコントロール
1000 IU/mLの市販のヒト血漿由来因子ＶＩＩI Factane （登録商標） (FAC, LFB, Les Ulis, France)を因子ＶＩＩIとして用いた。各バイアルを使用するまで4ーCに維持した。FＶＩＩIを２０ｍＬの蒸留水で50 IU/mLまで再懸濁し、次いで、ＰＢＳ (PAA laboratories, Les Mureaux, France) で10 IU/mLに希釈し、３時間以内に動物に注射した。
B.1.3.  ネガティブコントロール生成物
血友病Ａのネガティブコントロール生成物として０．９％の塩化ナトリウム溶液を用いた。この生成物を室温で貯蔵した。
【０１１７】
B.2.  動物
B.2.1.  遺伝的背景および飼育
因子ＶＩＩI欠失マウスコロニーを用いた。８~１２週齢の８５匹のマウスを用いた。エクソン１６因子ＶＩＩI欠失マウスまたは血友病ＡマウスのつがいをThe Jackson laboratory (Bar Harbor, ME, USA)から購入した。これらの動物をC57BL/6 WT マウス(Janvier, Le Genest-St-Isle, France)まで８世代にわたって戻し交配した。同様の遺伝的背景を保証するために、コントロールC57BL/6 WTマウスを血友病Ａの最後の戻し交配で産生した。マウスはフランスの法令および欧州連合の実験指針によって推奨されているように飼育した。温度、湿度測定、換気を制御且つ記録した。乾燥した標準的げっ歯類食餌および真水を適宜与えた。
【０１１８】
B.2.2.  処置
この試験では合計で８５匹の血友病Ａマウスを用いた。実験時に、麻酔薬および産物投与量のためにマウスの体重を計った。産物投与の３分前に、尾を３７℃の水浴に漬けた。次いで、マウスをマウス保定器に入れ、マウスの尾静脈に接触して産物投与する間、この動物を的確に拘束する。産物投与直後に、トリブロムエタノールを0.02mL/1.25% 溶液の体重gの投与量で腹腔内注射してマウスに麻酔をかけた。実験中の動物の体温は３７℃に一定に維持した。
B.2.3.  投与計画
テストした生成物を［表４］に開示するように注射した。手短に言えば、FＶＩＩａ−ＩＲまたはＦＶＩＩａ−ＳＲの２つの用量を血友病Ａマウスに投与した。第１の用量は１０匹のマウスに注射した各生成物ごとに4mg/kgにした。コントロールとして、FＶＩＩIをFＶＩＩI:Cが100IU/kgになる用量で１１匹の血友病Ａマウスに注射した。さらに、１９匹の血友病ＡマウスにNaCl 0.9%を注射した。全ての生成物において、注射容積は、注射する生成物の用量および濃度に応じて、200〜250 オlであった。この用量のFＶＩＩa(SR (4mg/kg)で得られる結果に基づいて、別の用量の8mg/kgをテストした。この新規な用量に関して同数の動物（１０匹）を用いた。これらの用量の効果を生成物投与の５分後にテールクリップモデルで評価した（詳細は［表４］参照）。次いで、１５〜１８匹の血友病Ａマウスに8mg/kgのＦＶＩＩａ−ＩＲおよびＦＶＩＩａ−ＳＲをそれぞれ注射した。これらの用量の効果を生成物投与の１２０分後にテールクリップモデルで評価した。
【０１１９】
【表４】
2014524416.tif 000008
【０１２０】
B.2.4.  テールクリップモデル
テールクリップまたはトランザクションテールモデル
マウスの尾出血時間を、トリブロムエタノール麻酔下にテールクリップアッセイを用いて実行した。メスを用いて麻酔をかけたマウスの尾端を３ｍｍ切断した。第１グループの動物では、FＶＩＩa-SR効率の最適な用量を求めるために、尾のトランザクションを生成物投与の５分後に行った。次いで、第２グループの動物では、ＦＶＩＩａ−ＩＲ効率が検出できなくなるが、血友病Ａマウスの失血を治すためにできればＦＶＩＩａ−ＳＲはまだ効率的であってほしい時点（２時間）で、トランザクションを行った。
【０１２１】
試験したパラメータ
切断した尾をトランザクションの直後に、温かい生理食塩水で満たした５０ｍｌ管に浸した。血液を３７℃で３０分間回収した。３０分後、血液と生理食塩水の混合物を１５００ｇで遠心分離した。次いで、赤血球ペレットをH2O中に溶解し、ヘモグロビンの量を416 nmの吸光度の読取りによって得た。各サンプルの失血量を標準曲線から計算した。標準曲線は規定容積(20オl, 40オl, 60オL, 80オlおよび100オl) のマウス血液を H2O中に溶解し、上述のヘモグロビンを抽出することによって得た。実験の最後に、全ての動物に麻酔をかけて頸椎脱臼により安楽死させた。
B.2.5.  統計分析
マンホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U-test）は、KaleidaGraph（登録商標）ソフトウェア (version 1.0, Synergy Software, Reading, PA, USA).を用いて、２つのグループの間の失血に統計的差異を判定した。統計的差異はP<=0.05のときに認められた。
【０１２２】
C. 結果
C.1  注射の５分後のテールクリップモデルにおけるFＶＩＩI およびNaCl 0.9%のテストコントロール
血友病Ａマウスにおけるテールクリップモデルを確証するために、ＦＶＩＩＩを100IU/kgでテストした。ＦＶＩＩＩまたはNaCl 0.9%投与の５分後に失血を測定した。結果を［表５］および［図７］に示す。100 IU/kgでのＦＶＩＩＩの投与は、ネガティブコントロールグループ(NaCl 0.9%)と比較して、失血の有意な減少(P=0.0001, マンホイットニーのＵ検定)を誘発した
【表５】
2014524416.tif 000009
【０１２３】
C.2.  注射の５分後のテールクリップモデルにおけるFＶＩＩａ−ＳＲの投与効果
２つの用量のＦＶＩＩａ−ＳＲ (4および8mg/kg)を血友病Ａマウスに投与した。結果は［表６］および［図７］に示す。生成物投与の５分後に失血を測定した。データの統計学的評価から、4mg/kg のＦＶＩＩａ−ＩＲの投与は、ネガティブコントロールグループと比較して失血の有意な減少(P=0.043)を誘発したことがわかった。それに対して、同じ用量(4mg/kg)のＦＶＩＩａ−ＳＲでは、有意でない減少および失血に全く影響を与えない(P=0.731)ことが観察された。しかし、8mg/kg のＦＶＩＩａ−ＳＲの投与は、ネガティブコントロールグループと比較して失血に有意な減少(P=0.028)を誘発した。これらのデータに基づいて、テールクリップモデルにおける血友病Ａマウスの失血の減少を誘発するＦＶＩＩａ−ＳＲの能力は8mg/kgの用量でさらに評価された。［図７］ではＦＶＩＩａ−ＳＲおよびＦＶＩＩａ−ＩＲを投与したケースがそれぞれＦ７−ＳＲおよびＦ７−ＩＲとして示される。
【表６】
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【０１２４】
C.3.  注射の１２０分後のテールクリップモデルにおけるFＶＩＩａ−ＳＲの持続効果
投与の１２０分後の失血の有意な減少を誘発するＦＶＩＩａ−ＳＲとＦＶＩＩａ−ＩＲの両方の能力を評価および比較するために、両方の分子を8mg/kgで血友病Ａマウスに投与した。結果は［表７］および［図７］に示す。データの統計学的評価から、ＦＶＩＩａ−ＩＲの投与はネガティブコントロールグループと比較して、失血に全く効果がない(P=0.856)ことがわかった。それに対して、同じ用量(8mg/kg)のＦＶＩＩａ−ＳＲでは、ネガティブコントロールグループと比較して、失血に有意な減少 (P=0.005)が観察された。
【表７】
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【０１２５】
C.4.  結果の要約
ＦＶＩＩａ−ＳＲは、血友病Ａマウスのインビボテールクリップモデルにおける失血を補正する有意な能力を示した。8mg/kgでのその投与の１２０分後、および、５分後に、この生成物は失血を有意に減らすことができ、一方、同じ条件下でＦＶＩＩａ−ＩＲではそれができない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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