(57)【要約】本発明は、回転式モータと、モータを制御するための手段と、回転式モータに連結され、少なくとも１つの粒子洗浄構造および洗浄された粒子を受容するための１つの粒子受容構造を提供するように適合される、プラットフォームと、プラットフォームが回転する間、粒子受容構造内の試料の粒子を検出するための検出ゾーンとを備える、生物学的試料を処理するための微小流体システムに関する。本発明は、自動化され、かつ手動処理より誤差を生じにくい、試料処理システムを提供する。これは、高品質のビーズベースの免疫蛍光アッセイを行うために、未加工の生物学的試料（例えば、血液、痰、尿）を処理することができる、遠心分離微小流体プラットフォームを使用して達成される。本発明は、単純回転式モータおよびカスタム設計されたプラスチックディスクを使用して、前述に概略された試料調製ステップを行う。
2014518374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料を処理するための微小流体システムであって、該システムは、
回転式モータと、
該モータを制御するための手段と、
該回転式モータに連結されたプラットフォームであって、該プラットフォームは、少なくとも１つの粒子洗浄構造および該粒子洗浄構造の中で洗浄された粒子を受容するように適合される粒子受容構造を提供するように適合される、プラットフォームと、
該プラットフォームが回転する間、該粒子受容構造の中で洗浄された粒子を検出するための検出ゾーンと
を備える、システム。
【請求項２】
前記粒子は、前記生物学的試料の特性を表す免疫修飾されたビーズおよび／または蛍光標識された免疫修飾されたビーズである、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項３】
前記検出ゾーンは、前記プラットフォームが回転する間、光学系と協働するように適合される、請求項１または２に記載の微小流体システム。
【請求項４】
前記粒子受容構造は、ペレット化チャンバを備える、請求項１〜３のいずれかに記載の微小流体システム。
【請求項５】
前記ペレット化チャンバは、その最外点における前記検出ゾーンが画定されるように、１つの端部における一点にテーパ状にされる、請求項４に記載の微小流体システム。
【請求項６】
前記テーパ状端部は、１つの端部が閉鎖された細長薄型チャネル部分をさらに備え、それにより、遠心分離力の下で、ビーズを該チャネルの中で沈殿させる、請求項５に記載の微小流体システム。
【請求項７】
前記検出ゾーンは、前記粒子が、遠心分離によるペレット化に応じて、小領域へと凝縮されるように成形される、請求項１〜６のいずれかに記載の微小流体システム。
【請求項８】
前記粒子は、リザーバの中で洗浄され、該リザーバは、遠心分離力の影響下において、回転中心から遠位の壁に対して、前記ビーズが沈殿するように適合される、請求項１〜７のいずれかに記載の微小流体システム。
【請求項９】
前記粒子受容構造は、流動チャネルを備える、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項１０】
前記流動チャネルは、さらなるチャネル分岐点／合流点を伴わずに、前記洗浄構造から廃棄物リザーバまで直接通じている、請求項９に記載の微小流体システム。
【請求項１１】
前記洗浄構造は、分岐された出口チャネルを備え、該分岐された出口チャネルは、廃棄物リザーバおよび前記粒子受容構造の両方に通じている、請求項１〜１０のいずれかに記載の微小流体システム。
【請求項１２】
ポートまたは他のチャネルによって終端されるポートまたはチャネルは、前記粒子受容構造を通って流動する流体によって、前記廃棄物リザーバから置換される空気を排出するように適合される、請求項１１に記載の微小流体システム。
【請求項１３】
前記出口チャネルの分岐点内の毛細管規模の幾何学的狭窄および拡張は、前記洗浄構造が流体を含有するとき、前記プラットフォームの第１の回転速度において流動に抵抗するように作用するが、第２のより高い回転速度においては、流体を流動させるように構成されている、請求項１１または１２に記載の微小流体システム。
【請求項１４】
前記出口チャネルは、前記洗浄構造の半径方向遠位壁の最大半径方向位置未満である半径において、該洗浄構造から出現し、それにより、画定された体積が、遠心分離力に応答して前記廃棄物リザーバの中へ流れ込むとき、該洗浄構造内に滞留させられる、請求項１１〜１３に記載の微小流体システム。
【請求項１５】
前記滞留させられた流体は、粒子を含む、請求項１４に記載の微小流体システム。
【請求項１６】
前記廃棄物リザーバは、所望の試料体積にほぼ等しい画定された廃棄物体積を備える、請求項１４または１５に記載の微小流体システム。
【請求項１７】
チャネルが、前記廃棄物リザーバから置換される空気を搬送するために提供される、請求項１６に記載の微小流体システム。
【請求項１８】
前記チャネルは、前記廃棄物リザーバから半径方向内側に方向付けられ、該チャネルは、前記プラットフォームが回転中であり、前記洗浄チャンバが動作流体の最大体積によって充填されている間、前記洗浄構造内で達成されるべき最内液体レベルの内側の半径方向位置において、ポートまたは他のチャネルで終端する、請求項１７に記載の微小流体システム。
【請求項１９】
前記リザーバの内部体積は、動作流体の最大設計体積のそれよりも大きく、それにより、回転加速および減速の下にある間、該流体を混合する際に、該リザーバ内の空気の使用を可能にする、請求項１７または１８に記載の微小流体システム。
【請求項２０】
生物学的試料を処理するための方法であって、該方法は、
プラットフォームを回転式モータに連結することと、
該プラットフォームを少なくとも１つの粒子洗浄構造および粒子受容構造とともに構成することと、
該粒子洗浄構造の中で洗浄された粒子を該粒子受容構造の中に受容することと、
該プラットフォームが回転する間、該粒子受容構造の中で洗浄された粒子を検出することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫アッセイ診断またはポータブル診断分析器において使用するための微小流体ディスク、装置、システム、および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
フローサイトメトリーは、種々のタイプの試料、特に、生体細胞を含有する試料の細胞／生物学的内容物を決定するための強力な分析方法である。臨床用途では、フローサイトメーターは、リンパ球計数および分類、白血病およびリンパ腫の免疫学的特性評価、白血球計数および分類、ならびにビーズベースの免疫アッセイ診断を含む、多数の用途のために有用である。
【０００３】
大部分のフローサイトメトリー技法では、流体溶液中の細胞は、通常、レーザ光源または単色でフィルタリングされたＬＥＤ源によって産生される、光ビームを通して、個々に流動させられる。光が、各細胞に衝打するにつれて、光は、散乱され、結果として生じる散乱光が、細胞のタイプを決定するために分析される。細胞はまた、随意に、蛍光分子に関連付けられたマーカーで標識され得、光がそれに衝打すると、蛍光を発し、それによって、細胞上のマーカーの存在を露呈させる。この方式では、細胞の表面成分に関する情報が、取得され得る。
【０００４】
蛍光ビーズは、多重化された免疫アッセイを行うための便宜的かつ強力な方法を提供する。例えば、多重化は、別の異種色で均一に染色される検体と連結された異なる色のビーズを使用することによって達成され得る（散乱または蛍光放出のいずれか）。このように、アッセイ同定は、ビーズ色／蛍光から読み取られ得る一方、分析結果は、ビーズに結合された蛍光染料の量から読み取られ得る。ビーズはまた、免疫アッセイの固相が、バルクで製造され得る形式を提供し、アッセイのロバスト性を向上させる。典型的には、フローサイトメーターは、粒子から蛍光を検出および定量化するその能力を用いて、多重化されたビーズベースの免疫アッセイを行うために使用される。
【０００５】
現在実装されている免疫蛍光ビーズアッセイに関する有意な問題の１つは、広範囲な手動またはロボット試料処理を要求することである。サンドイッチ式免疫アッセイの場合、この試料処理は、以下のステップの一部または全部から成り得る：
・全血からの血漿の分離
・既知の体積の開始試料を提供するための血漿の計測
・血漿の希釈
・検体の結合を助長するための希釈試料と免疫蛍光ビーズの混合
・十分な時間および結合に適切な温度における培養
・ビーズの洗浄
・結合を促進するための洗浄されたビーズと標識された二次抗体との混合
・十分な時間および結合に適切な温度における培養
・未結合二次抗体の洗浄
・フローサイトメトリー流動チャネル内へのビーズの注入。
【０００６】
手動処理は、多くの用途において、コストが非常にかかり、また、誤差を生じやすい。自動化もまた、多くの用途において、コストが非常にかかり、ポイント・オブ・ケアまたは医師の診療室分析等の用途の場合、例えば、液体操作ロボットを使用して現在実践されているように、不適切である。その結果、現在の自動化または手動処理より安価かつ誤差を生じにくい、多重化されたビーズベースの免疫アッセイのための試料処理を提供するという満たされていない必要性が存在する。
【０００７】
ポイント・オブ・ケア診断アッセイシステムの短所は、典型的には、種々のアッセイタイプの多重化が不可能であることである。これらのシステムは、側方流動アッセイまたは電気化学反応アッセイ等の種々の類似アッセイタイプを行う際は非常に良好であるが、免疫アッセイ対比色血液化学反応等の異なる種類のアッセイが要求されるアッセイ条件は、これらの異なるアッセイタイプを多重化するためには不適切となる。この場合もやはり、中心研究所は、試料を分割し、異なるデバイスにおいて、アッセイを行うことによって、そのような統合を達成し得る。光学検出を伴う遠心分離微小流体プラットフォームは、種々のアッセイ技術が、単一計器および消耗品を使用して、並行して実装されることを可能にする。
【０００８】
現在実装されている免疫蛍光ビーズアッセイのさらに有意な問題は、それらが、血液学的フローサイトメトリーのために開発された計器上で稼働されるということである。これらの計器は、これらのアッセイを行うことが可能であるが、高価かつ複雑であって、有意な保守および較正を要求する。その結果、そのようなアッセイを行うための低コストかつ低保守計器類の必要性が存在する。
【０００９】
さらに、免疫蛍光ビーズアッセイは、典型的には、シース流動を使用して実装され、ビーズは、希釈され、ビーズ液体流の周囲の緩衝液の集束流動と整合される。これは、計器の検出体積内に同時に存在しないように、粒子を相互から分離し、かつ光学系内のほぼ同一の場所に位置付けるという二重効果を有する。これは、血液学的アッセイのために非常に有用であるが、蛍光ビーズ等の多数の本質的に同じ物体の検出に対して、いかなる利点ももたらさず、システムの機能を大幅に複雑化する。ビーズ試料が、例えば、その蛍光標識の放出スペクトルによって区別化された２つ以上の明確に規定された母集団から成る場合、同様のことが該当する。
【００１０】
シース流動が所望され得る場合（免疫アッセイシステムと同一のシステム上で稼働される非常に高度に多重化された免疫アッセイまたは血液学的アッセイ）、遠心分離形式は、従来のポンプベースのシステムに勝る有利な利点を提供する。後者の場合、典型的には、複数のポンプが、試料およびシース流体流動のために使用され、ポンプの拍動性を最小にし、規定された平滑流動および試料とシース流動との間の比率を維持するために、多大な注意が払われなければならない。遠心分離力による圧送は、無拍動であるため、そのような変動は、本質的に、システム内に存在しない。
【００１１】
いくつかの方法およびデバイスが、ビーズベースの免疫アッセイを行うために存在する。
【００１２】
特許文献１（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）は、「洗浄された」捕捉ビーズを伴うシステムについて説明しているが、本米国特許公開に関する弱点の１つは、ある点から別の点にビーズを移動させるための手段を提供せず、単一ビーズ検出を不可能にすることである。さらなる弱点は、固相を形成する捕捉されたビーズを伴うシステムが、要求が厳しい製造技法を要求することである。例えば、検体分子および蛍光標識の高度に再現性のある結合を提供するために、充填されたビーズの「層」が、再現可能に構築されなければならない。すなわち、ビーズの充填不良は、ビーズ層内のチャネルにつながり、結合のための十分な時間がなく、検体を高速で通過させ、低結合効率をもたらし得る。
【００１３】
ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００６／１１００９８号（Ｇｙｒｏｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ＡＢ）は、微小チャネル構造を備える、遠心分離ベースの微小流体デバイスを開示しており、その中に、上流方向に、検出微小空洞への液体の輸送のための入口微小導管（輸送微小導管）に取着され、検出微小空洞または検出微小空洞の上流に位置付けられた反応微小空洞内で生じた反応の結果を検出するために使用される、検出微小空洞が存在する。本願は、主に、流体「栓」流を生成させ、気泡または閉塞を伴わずに、流体を合流させるための手段の提供を対象とし、弁のための疎水性表面処理を要求する。そのような構造の特徴サイズは、コンパクトディスク圧縮／射出成形技術のための延伸を使用して実現されており、臨床的に関連のあるより大きな体積（例えば、数１０〜数１００μＬ）を保持することができる構造を生産することは不可能である。Ｇｙｒｏｓによって製造されたディスクは、典型的には、深さ≦０．５ｍｍの特徴を有し、少量または微量体積の場合、動作しない。
【００１４】
特許文献２（Ｇａｍｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ）では、微小流体ディスク上における競合免疫アッセイの実施のためのデバイスが、開示される。これらは、ディスク上のチャンバ内で乾燥された定常固相、例えば、抗体を使用して行われる。さらに、検出は、結合に特異的基質による色形成を介する。
【００１５】
ディスク材料への抗体の直接結合は、製造上の難点を呈するが、これは、代わりに、抗体をビーズ等の「移動」固相に結合することによって回避され得る。ディスク構造をコーティングし、有意な反応時間の間、それらを湿潤状態に維持する必要はない。ビーズはまた、捕捉抗体とのその共役の間、反応動態を向上させるための激しい撹拌を含め、最適条件下、何十万もの消耗品のために十分なバルク量で処理され得る。
【００１６】
比色基質を介した検出は、色の蓄積を生じさせる酵素反応を通したシグナルの増幅を可能にするという点において魅力的であるが、単純蛍光結合アッセイよりはるかに温度変動に敏感である。この温度敏感性はまた、長期間（長期保存期間）の酵素ベースの試薬の保管を困難にする。
【００１７】
特許文献３（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ）では、全血中の糖化ヘモグロビン、総ヘモグロビン、およびグルコースの評価のための微小流体ディスクが開示される。微小流体ディスクの一部分は、溶解された希釈血液の流路内のフリット間に滞留させられるアガロースビーズから成る、親和性母材を使用する。糖化画分は、流動するにつれて、ビーズに結合され、非糖化画分は、キュベット内で光度的に測定される。別のキュベット内での総ヘモグロビンの測定と組み合わせて、これは、糖化ヘモグロビン画分を提供する。この形式の親和法には、いくつかの問題が存在する。第１に、ビーズの滞留は、ａ）フリット等の挿入要素、またはｂ）固相ビーズを滞留させるための１次元（「堰」、ビーズの通過には狭過ぎる）または２次元におけるチャネル狭窄のいずれかを要求する。いずれの場合も、製造要件は、有意であって、数ミクロンから１０ミクロン程度の特徴の生産のために、特殊な方法を要求する。射出成形ツールの機械加工後の射出成形等、より従来の方法を使用して、デバイスを製造することが好ましい。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、前述の問題のうちの少なくとも１つを克服する、免疫アッセイ診断デバイス、システム、および／または方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０９６８６７号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／５３３１１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００８９６１６号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明によると、添付の請求項に記載のように、生物学的試料を処理するための微小流体システムであって、
回転式モータと、
該モータを制御するための手段と、
回転式モータに連結され、少なくとも１つの粒子洗浄構造および粒子洗浄構造内で洗浄された粒子を受容するために適合される粒子受容構造を提供するように適合される、プラットフォームと、
プラットフォームが回転する間、粒子受容構造内で洗浄された粒子を検出するための検出ゾーンと
を備える、システムが提供される。
【００２１】
本発明は、シース流動の複雑性を除去する、免疫アッセイのために適切なシースレス流動方法を提供する。
【００２２】
本発明は、自動化され、かつ手動処理より誤差が生じにくい、試料処理システムを提供する。ロボットシステムと比較して、費用効果的である。これは、高品質ビーズベースの免疫蛍光アッセイを行うために、未加工の生物学的試料（例えば、血液、痰、尿）を処理することができる、遠心分離微小流体プラットフォームを使用して達成される。本発明は、単純回転式モータおよびカスタム設計されたプラスチックディスクを使用して、単一プラットフォーム上で新規粒子洗浄構造および粒子受容構造の組み合わせを使用して、プロセスを行う。
【００２３】
本発明はまた、回転を受けている間、微小流体ディスク上の流動チャネル内におけるビーズの検出のための手段を提供する。一実施形態では、ビーズ（または、粒子）が、シース、磁力、慣性力、または他の集束手段による付加的流動集束の使用を伴わずに、流動チャネル内に注入される。これは、アッセイを行うために要求されるデバイスアーキテクチャを大いに単純化する。
【００２４】
一実施形態では、粒子は、該生物学的試料の特性を表す、免疫修飾されたビーズおよび／または蛍光標識された免疫修飾されたビーズである。
【００２５】
一実施形態では、検出ゾーンは、プラットフォームが回転する間、光学系と協働するように適合される。
【００２６】
一実施形態では、粒子受容構造は、ペレット化チャンバを備える。一実施形態では、ペレット化チャンバは、検出ゾーンが、その最外点に画定されるように、１つの端部における一点にテーパ状にされる。
【００２７】
一実施形態では、テーパ状端部はさらに、１つの端部が閉鎖された細長薄型チャネル部分を備え、遠心分離力下、チャネル内にビーズを沈殿させる。
【００２８】
一実施形態では、検出ゾーンは、粒子が、遠心分離によるペレット化に応じて、小領域に凝縮されるように成形される。
【００２９】
一実施形態では、粒子は、遠心分離力の影響下において、回転中心から遠位の壁に対して、ビーズを沈殿させるように適合されるリザーバ内で洗浄される。
【００３０】
一実施形態では、粒子受容構造は、流動チャネルを備える。
【００３１】
他の実施形態では、シース流動が採用される。これらの場合、単純な１次元シースが、遠心分離力および容易に作成される微小流体ディスクトポロジを使用して作成され得、複数の計数の確率を大いに低下させる。
【００３２】
他の実施形態では、多重化アッセイタイプが行われる。例えば、ビーズのフローサイトメトリー検出を使用した免疫アッセイが、反射またはバルク光学密度（ＯＤ）測定を使用して行われる酵素アッセイの比色検出と組み合わせられ得る。
【００３３】
別の実施形態では、生物学的試料を処理するための微小流体システムであって、
回転式モータと、
該モータを制御するための手段と、
回転式モータに連結され、粒子を受容するために適合される、プラットフォームと、
プラットフォームが回転する間、流動チャネル内の試料の粒子を検出するための手段と
を備える、システムが提供される。
【００３４】
一実施形態では、粒子は、免疫修飾されたビーズである。
【００３５】
一実施形態では、粒子は、遠心分離力の影響下、回転中心から遠位の壁に対して、ビーズの沈殿物のために適合される、リザーバ内で洗浄される。
【００３６】
一実施形態では、洗浄リザーバは、廃棄物リザーバおよび流動チャネルの両方に通じる、分岐された出口チャネルを有する。
【００３７】
一実施形態では、出口チャネルの分岐点内の毛細管規模の幾何学的狭窄および拡張は、洗浄リザーバが流体を含有するとき、プラットフォームの第１の回転速度において、流動に抵抗するように作用するが、第２のより高い回転速度では、流体を流動させることができる。
【００３８】
一実施形態では、流動チャネルに通じる分岐点に対する狭窄の半径方向位置および狭窄の直径の割合は、廃棄物リザーバに通じる分岐点に対する狭窄の半径方向位置および狭窄の直径の割合より小さい。
【００３９】
一実施形態では、出口チャネルは、遠心分離力に応答して、廃棄物リザーバに流れ込むとき、画定された体積が、洗浄リザーバ内に滞留させられるように、洗浄リザーバの半径方向遠位壁の最大半径方向位置未満である半径において、洗浄リザーバから出現する。
【００４０】
一実施形態では、滞留させられた流体は、粒子を含有する。
【００４１】
一実施形態では、廃棄物リザーバは、所望の試料体積から滞留させられた体積を引いたものに等しい画定された体積を有する。
【００４２】
一実施形態では、チャネルは、廃棄物リザーバから置換される空気を搬送するために提供される。
【００４３】
一実施形態では、チャネルは、廃棄物リザーバから半径方向内側に方向付けられ、プラットフォームが回転下にあって、洗浄チャンバが、動作流体の最大体積で充填される間、洗浄構造内で達成されるべき最内液体レベルの内部の半径方向位置において、ポートまたは他のチャネルで終端する。
【００４４】
一実施形態では、リザーバの内部体積は動作流体の最大設計体積より大きく、回転加速および減速下にある間、流体を混合する際、リザーバ内の空気の使用を可能にする。
【００４５】
一実施形態では、流動チャネルは、直接、さらなるチャネル分岐点／合流点を伴わずに、洗浄リザーバから廃棄物リザーバに通じる。
【００４６】
一実施形態では、流動チャネルは、分岐点または合流点を伴わずに、第２の廃棄物リザーバに通じる。
【００４７】
一実施形態では、ポートまたは他のチャネルによって終端されるポートまたはチャネルを使用して、流動チャネルを通して流動する流体によって、廃棄物リザーバから置換される空気を排出する。
【００４８】
一実施形態では、流動チャネルは、プラットフォーム上において、実質的に方位角配向に構成される。
【００４９】
一実施形態では、流動チャネル長さおよび直径は、チャネルの中心における流体流線の速度が、プラットフォームの回転周期によって乗算され、チャネルの長さによって除算され、各粒子が、回転あたり少なくとも１回、検出されることが確実になるように保証されるように選定される。
【００５０】
一実施形態では、粒子を洗浄するための方法であって、
少なくとも１つの粒子洗浄リザーバおよび洗浄された粒子を受容するための１つの流動チャネルを提供するように適合される、請求項１に説明されるプラットフォームを構成するステップと、
画定された体積において、洗浄リザーバ内に粒子および溶液の混合物を提供するステップと、
緩衝液リザーバ内に第１の溶液を上回る体積の第２の溶液を提供するステップと、
洗浄リザーバの遠位壁に対して、粒子を沈殿させるために十分な時間の間、第１の回転速度においてプラットフォームを回転させるステップと、
圧力が、廃棄物チャネルを通して、第１の廃棄物リザーバに流体を送達するために要求される毛細管圧を超えるように、回転速度を増加させ、それによって、沈殿された粒子を含有する画定された量を除き、全流体を廃棄物リザーバ中に排水させるステップと、
第２の溶液によって付与される圧力が、リザーバから混合チャンバに溶液を送達するために要求される毛細管圧を克服するように、回転速度を一時的に増加させるステップと、
回転速度が規定された値を超えないことを確実にしながら、沈殿された粒子を第２の流体中に再懸濁させるために、プラットフォームを周期的に加速および減速させ、それによって、元の流体が実質的にない粒子の懸濁液をもたらすステップと
のうちの１つ以上を含む、方法が提供される。
【００５１】
一実施形態では、回転プラットフォーム上で粒子を検出するための方法であって、
回転周期で乗算され、チャネルの長さで除算される、中心流線の速度が、１未満であるような速度でプラットフォームを回転させることによって、粒子を含有する流体を実質的に方位角的に配向された流動チャネルを通して流動させるステップと、
流動チャネルの半径方向位置に照明を提供するステップと、
照明点のサイズが、方位角方向において、１００μｍ未満であって、横断方向において、流動チャネルの幅以上であるように画定するステップと、
照明点を通過する、流動チャネル内の粒子によって放出される散乱または蛍光照射のいずれかを検出するステップと
のうちの１つ以上を含む、方法が提供される。
【００５２】
一実施形態では、粒子を洗浄し、次いで、検出するための方法であって、
少なくとも１つの粒子洗浄リザーバおよび洗浄された粒子を受容するための１つの流動チャネルを提供するように適合される、プラットフォームを構成するステップと、
画定された体積において、洗浄リザーバ内に粒子および溶液の混合物を提供するステップと、
洗浄リザーバの遠位壁に対して、粒子を沈殿させるために十分な時間の間、第１の回転速度において、プラットフォームを回転させるステップと、
圧力が、廃棄物チャネルを通して、第１の廃棄物リザーバに流体を送達するように要求される毛細管圧を超えるように、回転速度を増加させ、それによって、沈殿された粒子を含有する画定された量を除き、全流体を廃棄物リザーバ中に排水するステップと、
溶液中の粒子の初期体積を上回る第２の体積の流体を添加するステップと、
回転速度が、規定された値を超えないことを確実にしながら、沈殿された粒子を第２の流体中に再懸濁させるために、プラットフォームを周期的に加速および減速させ、それによって、元の流体が実質的にない粒子の懸濁液をもたらすステップと、
圧力が、流動チャネルを通して、第２の廃棄物リザーバに流体を送達するために要求される毛細管圧を超えるような第１の規定された値を上回る速度において、プラットフォームを回転させるステップと、
中心流線の速度が、回転周期で乗算され、チャネルの長さによって除算されるように、回転速度を調節するステップと、
流動チャネルの半径方向位置に照明を提供するステップと、
照明点のサイズが、方位角方向において、１００μｍ未満であって、横断方向において、流動チャネルの幅以上であるように規定するステップと、
照明点を通過する、流動チャネル内の粒子によって放出される散乱または蛍光照射のいずれかを検出するステップと
のうちの１つ以上を含む、方法が提供される。
【００５３】
一実施形態では、回転式モータに連結されるように適合される、プラットフォームであって、
少なくとも１つの粒子洗浄構造および粒子洗浄構造内で洗浄された粒子を受容するために適合される粒子受容構造と、
プラットフォームが回転する間、粒子受容構造内で洗浄された粒子を検出するための検出ゾーンと
を備える、プラットフォームが提供される。
【００５４】
さらなる実施形態では、生物学的試料を処理するための方法であって、
プラットフォームを回転式モータに連結するステップと、
プラットフォームを少なくとも１つの粒子洗浄構造および粒子受容構造とともに構成するステップと、
粒子洗浄構造内で洗浄された粒子を粒子受容構造内に受容するステップと、
プラットフォームが回転する間、粒子受容構造内で洗浄された粒子を検出するステップであって、粒子は、該生物学的試料の特性を表す、免疫修飾されたビーズおよび／または蛍光標識された免疫修飾されたビーズである、ステップと
を含む、方法が提供される。
【００５５】
本発明は、付随の図面を参照して、単なる一例として与えられる、その実施形態の以下の説明からより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、遠心分離微小流体ディスク上において、免疫アッセイおよび臨床化学反応アッセイを行うデバイスの例示的プロセスフローを図示する。
【図２】図２は、希釈または洗浄プロセス後、流動チャネル内へのビーズの注入を提供する、ディスク構造を図式的に図示する。
【図３ａ】図３ａ〜３ｂは、図２の洗浄の流体プロセスを図示する。
【図３ｂ】図３ａ〜３ｂは、図２の洗浄の流体プロセスを図示する。
【図４】図４は、代替希釈または洗浄プロセス後、流動チャネル内へのビーズの注入を提供する、ディスク構造を図式的に図示する。
【図５ａ】図５ａ〜５ｃは、図４の洗浄の流体プロセスを図示する。
【図５ｂ】図５ａ〜５ｃは、図４の洗浄の流体プロセスを図示する。
【図５ｃ】図５ａ〜５ｃは、図４の洗浄の流体プロセスを図示する。
【図６】図６は、粒子を洗浄するためのフィルタを使用する、ディスクベースの構造を図示する。
【図７ａ】図７ａ〜７ｂは、図６のこの洗浄および流動チャネル内への注入の流体プロセスを図示する。
【図７ｂ】図７ａ〜７ｂは、図６のこの洗浄および流動チャネル内への注入の流体プロセスを図示する。
【図８】図８は、堰またはダムを提供するための正確な幾何学形状とともに形成される、本発明の層を図示する。
【図９】図９は、１次元シース流動に好適なチャネル構成を図示する。
【図１０】図１０は、代替１次元シース流動に好適なチャネル構成を図示する。
【図１１】図１１は、液体回転を使用する集束方法を図示する。
【図１２】図１２は、慣性集束を図示する。
【図１３ａ】図１３ａ〜１３ｃは、本発明の好ましい実施形態による、ビーズが、体積中に沈殿され、次いで、検出される、代替検出方式を図示する。
【図１３ｂ】図１３ａ〜１３ｃは、本発明の好ましい実施形態による、ビーズが、体積中に沈殿され、次いで、検出される、代替検出方式を図示する。
【図１３ｃ】図１３ａ〜１３ｃは、本発明の好ましい実施形態による、ビーズが、体積中に沈殿され、次いで、検出される、代替検出方式を図示する。
【図１４】図１４は、比色（「臨床」）化学反応アッセイのための乾燥した化学反応用多孔性パッドの構造および使用を図示する。
【図１５】図１５は、一実施形態による、微小流体ディスクの可能性として考えられる構造を図示する。
【図１６】図１６は、一実施形態による、本発明のディスクを図示する。
【図１７】図１７は、一実施形態による、ある試料処理アッセイ構造の詳細な構造を図示する。
【図１８−１】図１８は、微小流体アッセイ構造の機能を図示する。
【図１８−２】図１８は、微小流体アッセイ構造の機能を図示する。
【図１８−３】図１８は、微小流体アッセイ構造の機能を図示する。
【図１９】図１９は、図５の関連するシース流動の作成に適切な微小流体ディスクを図示する。
【図２０】図２０は、流動チャネル、次いで、廃棄物リザーバへの試料およびシース流体の流動を図示する。
【図２１】図２１は、そのような１０：１シース流動を提供するようにレイアウトされたディスクを示す。
【図２２】図２２は、流体が、図９にも図示されるチャネルの「床」を通して、第２の層から第１の層内に流入する、本発明の具体的実施形態を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
遠心分離微小流体ディスク上で免疫アッセイおよび臨床化学反応アッセイを行うデバイスのための例示的プロセスフローが、図１に図示される。これらのプロセスはユーザによって行われるものと、消耗品、試薬、および計器システムによって行われるものとに分けられる。ユーザプロセスは、
・全血をデバイスに適用する。これは、ヘパリン添加試料採取デバイスから、または直接指に針を刺すことによって、抗凝血剤を含有するポート内に行われてもよい；
・微小流体デバイスを計器内に設置する。ユーザはまた、入口ポートを密閉し、エアロゾル等の生成を防止してもよい；
・試験プロセスを開始する；
である。
【００５８】
システムによって実施されるプロセスは、次いで、完全に自動化され、
・全血を計測する；
・血漿を分離する；
・免疫アッセイ処理チャネルおよび臨床化学反応処理チャネルのための血漿分割量を分割および計測する；
から構成される。
【００５９】
単一免疫アッセイおよび単一臨床化学反応処理チャネルが図示されるが、より多くのアッセイが存在してもよく、試料のサイズおよび微小流体ディスクのサイズによってのみ限定されることを認識されたい。
【００６０】
臨床化学反応チャネルにおけるプロセスは、
・臨床化学反応のための血漿体積をさらに画定するために、必要に応じて、付加的計測ステップを行う；
・微小流体ディスク内に埋め込まれた乾燥した試薬パッドデバイスに血漿を送達する；
・パッド上で血漿を培養し、蛍光生成物の色生成をもたらす；
・検出する；
から構成される。
【００６１】
免疫アッセイチャネルにおけるプロセスは、
・臨床化学反応のための血漿体積をさらに画定するために、必要に応じて、付加的計測ステップを行う；
・血漿の混合チャンバへの送達。この混合チャンバは、競合またはサンドイッチアッセイにおいて、検体およびビーズ基質と係合する、免疫修飾されたビーズおよび蛍光標識された抗体等の乾燥した試薬を含有してもよい。試薬はまた、液体状態で保管され、混合チャンバに送達されてもよいことを認識されたい；
・試料および試薬の混合。これは、ａ）撹拌、ｂ）往復運動、ｃ）同時注入を含む、以下に詳述されるいくつかの方法で生じ得る；
・完全免疫化学反応を確実にするために十分な温度において、および十分な時間の間、混合物を培養する；
・ビーズを洗浄し、非結合蛍光標識を除去する。ある場合には、洗浄は、ビーズの沈殿、上清の除去、および緩衝液によるビーズ（および、残りの取り込まれない標識）の再懸濁および希釈と置換され得る；
・検出のために、流動チャネル内にビーズを注入する；
から構成される。
【００６２】
（遠心分離プラットフォーム上での流体プロセ）
３つの基礎機能によって、大部分のディスクベースのプロセスが可能となる：
・事前に規定された回転速度での具体的設計のディスクの回転によって、チャネルを通して、流体をポンプ圧送する。
【００６３】
・受動的手段を使用して、弁調整を行う。
【００６４】
・密度差および遠心分離力に基づいて、分離を行う（例えば、血漿分離、ビーズの沈殿）。
【００６５】
これらのプロセスの詳細な説明は、以下に提供される。具体的な設計考慮点（微小流体ディスクの幾何学的設計および回転プロファイルの両方）が説明されることによって、上で詳述された全体的な試料処理ステップの実装を可能にする。
【００６６】
（圧送）
流動の生成（シース流体の使用の有無にかかわらず）は、遠心分離形式において容易に達成され得る。実質的に直線のチャネルの場合、層流域（レイノルズ数＜〜２２００）において、流量Ｑを幾何学的、流体、および動作パラメータと関連付ける基礎式は、
【００６７】
【数１】
2014518374.tif 000003
である。
【００６８】
この式において、Ｑは流量である。幾何学的パラメータは、Ａ＝チャネルの断面積＝ｈ×ｗ（ｈおよびｗは、長方形チャネルの深さおよび幅である）であり、ｄＨは、水力直径（断面積の４倍をチャネルの周縁によって除算したものとして規定される）であり、ΔＲは、流体の「水頭」（Ｒ０における流体の内側メニスカスとＲ１における外側メニスカスとの間の半径方向位置の差ΔＲ＝Ｒ１−Ｒ０として規定される）であり、
【００６９】
【化１】
2014518374.tif 000004
は、液体の平均位置であって、
【００７０】
【化２】
2014518374.tif 000005
であり、Ｌは、チャネルの長さである。流体パラメータは、ρ＝流体の密度およびη＝流体の動粘性係数である。最後に、動作パラメータは、角速度ωＲ＝２πｆＲであって、式中、ｆＲは毎秒の回転数であり、それ自体、要求される回転プロファイルに対する時間の関数となるであろう。この表現は、レイノルズ数＜２２００（層流）を有する流量に対して正確である。
式１から、平均速度
【００７１】
【化３】
2014518374.tif 000006
は、
【００７２】
【数２】
2014518374.tif 000007
である。
【００７３】
最大速度（チャネルの中心に生じる）は、
【００７４】
【化４】
2014518374.tif 000008
である。いくつかの用途において、この速度は、重要なパラメータであり、すなわち、流動チャネル内の各粒子が、回転毎に少なくとも１回だけ検出されることを確実にするという観点から重要である。
【００７５】
（弁調整）
遠心分離流体プラットフォームの中の液体を制流または弁調整するための種々の手段が存在し、それらは、サイフォン機構、表面張力効果に基づく受動的単回使用弁（毛細管弁、疎水性弁）、固相／液相転移あるいは接触ヒータまたは光源によって印加される熱による「栓」の融解に基づく単回使用弁、および同一の原理に基づく複数回使用弁の使用を含むが、それらに限定されない。
【００７６】
サイフォン等、これらの弁調整機構のうちのいくつかは、当技術分野において公知であって、パブリックドメインに属する。
【００７７】
受動的「毛細管」弁機構は、特に、有用であって、試験されるほぼ全流体に有効であることが示されている。毛細管弁機構では、表面または毛細管力が、チャネルの断面変化において、流体を滞留させるよう作用する。０度を上回る液体／固体接触角度の場合、特に、断続を伴う合流点を横断しての狭いチャネルからより大きいチャネル内への出現は、界面をわたる圧力差の印加を介して、液体側により高い圧力を伴う正の曲率半径の液体−蒸気界面の作成を要求する。この圧力は、微小流体ディスクの回転を介して生成され得る。一般に、親水性表面に対して界面にわたって流動を生成するために要求される圧力は、流体の表面張力および接触角度のコサインに正比例し、毛細管の直径に反比例する。毛細管弁の有用なおよび容易に加工される寸法は、５０−５００μｍの幅×５０−５００μｍの深さのチャネルセグメントであって、典型的には、より深いチャネルまたはポケットと交差する。
【００７８】
流体は、回転による静水圧が、この毛細管圧未満である場合、毛細管合流点に滞留させられる。回転プラットフォーム上では、この静水圧は、流体の平均位置（前縁と後縁メニスカスとの間または液体体積の半径方向外側と内側メニスカスとの間で測定される）、メニスカスの位置の差、および回転数の２乗に正比例する。
【００７９】
液体特性（表面張力、密度）、材料特性（接触角度）、ディスク上の流体の毛細管規模および構成等の幾何学的パラメータの操作が、毛細管圧が「打破」され、液体が受動的弁を通して「突破」する、明確に規定された回転速度をもたらすことは、当技術分野において認識されている。これらの関係を使用して、広範囲の関連生物学的流体および試薬が、数１００ＲＰＭ（回転数毎分）から５０００ＲＰＭ超の回転速度で制流され得る。これらの関係は、以下の式
【００８０】
【数３】
2014518374.tif 000009
に要約され得る。
式中、ＲＰＭｃは、限界ＲＰＭであって、それを下回ると、流体は、毛細管弁を通って流動せず、それを上回ると流動し、γは、液体表面張力であり、θＣは、ディスクの材料上の液体の接触角度であり、
【００８１】
【化５】
2014518374.tif 000010
、DＲ、ｄＨ、およびρは、上記のように規定される。
【００８２】
（密度差および遠心分離力に基づく分離）
遠心分離プラットフォームに固有であるのは、遠心分離力の印加状態において、成分間の密度差に基づいて、流体を分離する能力である。球状粒子の場合、粒子が「沈殿」する速度の有用な式は、
【００８３】
【数４】
2014518374.tif 000011
である。式中、ＶＳは、ｃｍ／秒単位の粒子速度であり、ρｐは、粒子密度であり、ρＬは、液体密度であり、ηＷは、水の動粘性係数であり、ηＬは、液体の動粘性係数であり、ｄは、ミクロン単位の粒子直径であり、ａｃｃは、重力単位の加速である（９８２ｃｍ／秒２＝９．８２ｍ／秒２＝１重力）。
【００８４】
（混合）
種々の方法が、遠心分離ディスク上で流体を混合するために可能である。第１に、撹拌が採用され得、混合されるべき液体または可溶化されるべき液体および固体が、空気が含まれるチャンバ内に定置される。交互する加速および減速が、混合作用を提供する。本方法は、以下の実施形態および実施例において採用される。
【００８５】
さらなる混合手段は、捕捉された空気に対する流体の往復運動である。本方法では、流体混合チャンバは、狭小チャネルによって、通気ポートを有していない、捕捉された空気体積「バラスト」に接続される。その結果、低回転速度では、流体は、捕捉された空気によって停止される。回転速度が増加されるにつれて、流体は、捕捉された空気体積の中へ侵入し、流体に起因する遠心分離で生成された圧力に応答して、空気を圧縮する。回転速度の低下は、バラストチャンバからの流体の後退につながる。このように、交互する高回転速度／低回転速度サイクルは、「ピペット」混合に類似する往復運動を提供する。
【００８６】
最後に、混合は、例えば、流体をチャネルの両側の毛細管弁にもたらすことによって、混合されるべき２つの流体をリザーバからチャネルの中に注入することによって行われてもよい。流体は、次いで、受容リザーバの中に堆積される。２つの同時に流動する溶液が、チャネルの中に存在する時間量が十分である場合は、流体の拡散混合が生じる。そうでない場合、乱流運動が、受容リザーバの中への流入に応じて、流体を効果的に混合させる。
【００８７】
（検出要件−免疫アッセイ検出：回転流動チャネル）
従来のフローサイトメーターでは、シース流が、測定されるべき粒子を希釈し、それらをチャネルの中心に「１列」に定置するために使用され、ここで、粒子は、計器の光源によって調べられる。これは、流動方向に狭い、典型的には、１０μｍであるが、横断方向におけるシース流の「コア」流よりもはるかに広い光学検出体積を用いて行われる。シース流は、粒子を光源からの実質的に均質照射野内に定置し、それによって、光源による検出された照射内での変動を最小にし、および一度に単一の粒子のみが、光源によって照明されるように粒子を希釈する二重機能を有する。
【００８８】
免疫アッセイ用途の場合、ビーズ濃度は、さらなる希釈が要求されないように確立され得る。例えば、チャネル２５０μｍ２を通って流動する１０μＬ中の２００個の粒子の濃度（典型的免疫アッセイ濃度）は、平均粒子間間隔８００μｍをもたらす。その結果、２つ以上の粒子を一度に計数する確率は、ほとんどゼロに等しい。流動チャネル全体を横断し、実質的に均一であるビームを使用することによって、全粒子が、同時に検出されることなく、かつ光源によって誘発される有意な変動を伴わずに計数され得る。これは、シース流の必要性を回避する。
【００８９】
固定検出器を使用しながら、回転ディスク上の移動粒子を検出する際、検出システムの試料採取速度が、粒子を検出するために適正であることが重要である。速度は、流動チャネルの半径である、半径ＲＦ時のディスク速度によって左右されるため、試料の総数は、単純に、ディスクの方位角（回転）方向における検出体積の幅（ここでは、ｗｌ）、速度＝ωＲ、およびＨｚ単位の試料採取速度ｆＳに比例する：
【００９０】
【数５】
2014518374.tif 000012
ｆＳ＝１０６、ｗｌ＝８０ｕｍ、ならびに回転速度５００ＲＰＭおよび半径方向位置ＲＦ５０ｍｍを使用して、Ｎｓ〜３１が、良好な統計的試料採取のための適正な数であると判断する。
【００９１】
（実施形態：）
検出ステップとして、流動ビーズを用いた遠心分離形式のための多くの形態の免疫アッセイが、本発明を組み込んで実装され得る。例えば、一実施形態では、以下となる：
１．５０μＬの官能化ビーズ（〜６０００個のビーズ）を５０μＬの試料および５０μＬの標識試薬（フィコエリトリン、ＰＥ）（ＶＳ＝１５０μＬ）と混合する
２．３時間培養する
３．１０００μＬの洗浄緩衝液（ＶＷ）を添加する
４．遠心分離し、ビーズをペレット化する
５．上清を廃棄する
６．３００μＬの緩衝液（ＶＥ）中に再懸濁させる
７．フローサイトメトリーを行う。
【００９２】
基本的に、ビーズ洗浄は、ビーズ蛍光性の検出に干渉しないレベルまで、過剰な取り込まれなかった染料（ＰＥ）を除去することである（すなわち、背景は、ビーズ蛍光性にほとんど関係しない）。
【００９３】
（洗浄の実施形態）
洗浄の好ましい実施形態は、以下を含む：
・ペレット化＋傾瀉＋希釈：遠心分離を行い、ビーズをペレット化する；上清を除去（傾瀉）し、溶液の残留量を残す；および緩衝液中にビーズを再懸濁させ、残留材料の濃度の十分な低下を達成する
・ペレット化による洗浄：前述のように、但し、ビーズの第２のペレット化および上清の除去後、緩衝液中にビーズを再懸濁させる。これは、繰り返されてもよい
・フィルタを用いた濾過：ビーズを含有する溶液が、濾過要素に対して駆動され、ビーズが、洗浄される
・トラップを用いた濾過：ビーズを含有する溶液が、ビーズまたは堰より小さい寸法のチャネル（１次元に閉じ込められるが、横断寸法がより大きいチャネル）等、ディスクの基質内に形成されたトラップに対して駆動される。これは、ビーズを捕捉し、洗浄をもたらす。
【００９４】
全ての場合において、廃棄物は、以下により詳細に説明されるように、流動チャネルまたはペレット化チャンバ等、再懸濁および検出構造へのビーズの注入に先立って、１つ以上のリザーバに方向付けられなければならない。
【００９５】
ペレット化＋傾瀉＋希釈。このプロセスは、本質的に、前述のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）によるプロトコルに説明される実験室規模のプロセスを小型化する。ＢＤプロセスでは、試料は、最初に、洗浄によって希釈され、次いで、過剰洗浄液が除去される。緩衝液中の再懸濁は、第１の溶液の可溶性成分の全体的濃度低下をもたらす一方、ビーズの数は、保存される。
【００９６】
代替として、本発明は、ビーズを最初に沈殿させ、上清を傾瀉後、ある体積の緩衝液中に再研削させる。
【００９７】
ディスクベースのプロセスは、以下によって実装され得る：
１．試料体積ＶＳから開始する
２．遠心分離を通して、ビーズを沈殿させる
３．上清の体積ＶＳ−ＶＲＲを廃棄する
４．体積ＶＥ＞ＶＳの溶出／洗浄緩衝液を添加し、緩速撹拌を通して、ビーズを再懸濁させる
５．フローサイトメトリーを行う。
【００９８】
これは、元の試薬の希釈計数ＤＦＣをもたらし、したがって、以下となる：
【００９９】
【数６】
2014518374.tif 000013
ＶＲＲ、ＶＥの適切な選択は、この希釈係数が、残留汚染材料の背景に対して、ビーズの検出のために要求されるもの以下であることを確実にする。
【０１００】
図２は、この希釈または洗浄プロセス後の流動チャネル内へのビーズの注入を提供するディスク構造を図式的に図示する。図示されない他のディスク構造も、試料の調製（例えば、血漿分離）および混合チャンバ（図示される）への液体試薬および試料の送達のために使用されることを理解されたい。混合チャンバ内において、ビーズ、試料、および試薬が培養され、洗浄プロセスの開始時に溶液中に存在する。２つの廃棄物チャンバが、これに接続される。廃棄物１は、混合チャンバに適用される溶液の体積にほぼ等しい体積を有し、毛細管弁Ｖ１を介して、混合チャンバに接続される。廃棄物２は、流動チャネル内で検出される、ビーズ含有「注入液」を受容し、毛細管弁Ｖ３によって接続される。加えて、溶離液チャンバが、毛細管弁Ｖ２によって、混合チャンバに接続される。
【０１０１】
図３ａ−３ｂは、この洗浄の流体プロセスを図示する：
ａ．試料体積ＶＳが、混合チャンバに添加される。溶液は、ビーズを含有してもよく、または混合チャンバ内に存在するビーズおよび試薬を再水和する試料であってもよい。必要に応じて、システムは、次いで、加速および減速によって撹拌され、ビーズおよび液体を混合させる；
ｂ．周波数Ｗ１での高速スピンを使用して、ビーズを沈殿させる；
ｃ．回転速度は、Ｗ２＞Ｗ１まで増加される。これは、混合チャンバの出力における毛細管弁Ｖ１を打破し、チャネルが混合チャンバを第１の廃棄物リザーバに合流する点の半径方向内側にある溶液を傾瀉する。本実施形態では、設計体積ＶＳに対する内側メニスカスの半径方向位置は、弁Ｖ３の位置の半径方向外側にある。その結果、弁Ｖ３は、任意の回転速度において、初期試料によって打破され得ない。速度は、弁Ｖ１が打破された後、Ｗ２を下回る値まで低減され得る。滞留させられた流体ＶＲＲは、チャネルから半径方向外側にあるものとして規定される。この流体流動は、ゆっくりであって、外側壁近傍の流体を有意に妨害しないため、以前のステップで沈殿されたビーズは、混合チャンバの最外表面に残留する。第１の廃棄物チャンバは、混合チャンバから除去された液体の体積ＶＳ−ＶＲＲにほぼ等しいサイズを有すると規定される。さらに、第１の廃棄物チャンバからの空気排気チャネルは、均一回転速度下、任意の想定される流体メニスカス位置の半径方向内側のポートで終端する、またはチャネルに合流する；
ｄ．回転は、Ｗ３＞Ｗ２に急増され、毛細管弁Ｖ２を打破することによって、ある体積の溶出緩衝液を混合チャンバに送達する。全体積が送達される前に回転を減速させることによって、毛細管弁Ｖ３を打破するために十分な静水圧が付与されないように確実にする；
ｅ．溶出流体は、低ＲＰＭにおける緩速撹拌を通して、ビーズを再懸濁させる；
ｆ．回転は、Ｗ４まで急増され、流動チャネルに通じる毛細管弁Ｖ３を打破し、ビーズの沈殿を防止するために、急減速される。これは、廃棄物１が、流体で充填されており、加えて、廃棄物１からの通気チャネルが、廃棄物流体で充填され、流動チャネル内に流動するにつれて、溶出緩衝液によって生成されるものに逆圧を提供し、ビーズ含有注入液が、廃棄物１に流入しないよう確実にし得るため、ビーズ含有溶液を流動チャネルを通して廃棄物２に搬送する。必要に応じて、混合チャンバ内のビーズの濃度が、均質のままであることを確実にするために、試料が流動するにつれて、付加的撹拌ステップが存在してもよい。
【０１０２】
ペレット化による洗浄：好ましい方法は、以下のステップを使用して、真の多段階洗浄を行うことである：
１．試料体積ＶＳから開始する；
２．遠心分離を通して、ビーズを沈殿させる；
３．上清の体積ＶＳ−ＶＲＲ１を廃棄し（ＶＲＲ１は、合理的に大きい（例えば、０．２ＶＳ））、ＶＲＲ１を残す；
４．体積ＶＷの洗浄緩衝液を添加し、総体積ＶＷ＋ＶＲＲ１を作成し、緩速撹拌を通して、ビーズを再懸濁させる；
５．遠心分離を通して、ビーズを沈殿させる；
６．体積ＶＷ＋ＶＲＲ１−ＶＲＲ２の希釈溶液を廃棄し、ＶＲＲ２を残す；
７．体積ＶＥの溶出／洗浄緩衝液を添加し、総体積ＶＥ＋ＶＲＲ２を作成し、ビーズ緩速撹拌を通して、再懸濁させる；
８．フローサイトメトリーを行う、またはビーズを検出する。
【０１０３】
希釈係数は、この場合、
【０１０４】
【数７】
2014518374.tif 000014
である。
【０１０５】
図４は、この希釈または洗浄プロセス後に、流動チャネルの中へのビーズの注入を提供するディスク構造を図式的に図示する。培養および洗浄されるべきビーズが、溶液中に定置される混合チャンバから構成される。２つの直列廃棄物チャンバが、これに接続される。廃棄物１ａは、混合チャンバに適用されるべき溶液の体積にほぼ等しい体積を有し、毛細管弁Ｖ１を介して、混合チャンバに接続される。第２の直列に接続された廃棄物チャンバ廃棄物１ｂは、毛細管弁Ｖ３を介して、第１のものの出口に接続され、初期試料体積（廃棄物１ａ＋洗浄緩衝液体積）に幾分満たない体積を有する（洗浄緩衝液は、最初、洗浄チャンバ内に保持される）。この洗浄チャンバは、弁Ｖ２によって、混合チャンバに接続される。第３の廃棄物チャンバである廃棄物２は、流動チャネル内で検出されるビーズ含有「注入液」を受容し、毛細管弁Ｖ５によって、廃棄物チャンバに接続される。加えて、溶離液チャンバは、毛細管弁Ｖ４によって、混合チャンバに接続される。
【０１０６】
図５ａ−５ｄは、この洗浄の流体プロセスを図示する：
ａ．試料体積ＶＳが、混合チャンバに添加される。溶液は、ビーズを含有してもよく、または混合チャンバ内に存在するビーズおよび試薬を再水和する試料であってもよい。必要に応じて、システムは、次いで、加速および減速によって撹拌され、ビーズおよび液体を混合させる；
ｂ．周波数Ｗ１における高速スピンを使用して、ビーズを沈殿させる；
ｃ．回転速度は、Ｗ２＞Ｗ１まで増加される。これは、混合チャンバの出力における毛細管弁Ｖ１を打破し、溶液を廃棄物リザーバである廃棄物１ａ内に傾瀉させる。溶液は、廃棄物１の出力における弁Ｖ３によって停止されるまで流動し、体積ＶＲＲ１を残す。試料のメニスカスの半径方向位置は、Ｖ４の外側であって、弁Ｖ４が、このプロセスの間に、試料体積ＶＳによって打破されないことを確実にする；
ｄ．回転は、Ｗ３＞Ｗ２に急増され、毛細管弁Ｖ２を打破することによって、ある体積の洗浄緩衝液を混合チャンバに送達する；
ｅ．洗浄緩衝液流体は、低ＲＰＭにおける緩速撹拌を通して、ビーズを再懸濁させる；
ｆ．示されるように、ビーズは、再懸濁される；
ｇ．回転は、Ｗ１まで増加され、再度、この混合溶液中に粒子を沈殿させる；
ｈ．回転は、Ｗ４まで急増され、廃棄物１ａと廃棄物１ｂを接続する毛細管弁Ｖ３を打破する。混合された洗浄および残留初期試料溶液は、傾瀉され、最初に、廃棄物１ａを通って、次いで、廃棄物２ａ内へと通過する。体積ＶＲＲ２＝ＶＲＲ１＋ＶＷＡＳＨ−ＶＷＡＳＴＥ１ｂが、混合チャンバ内に滞留させられる；
ｉ．回転は、Ｗ５まで急増され、毛細管弁Ｖ４を打破し、溶出緩衝液を混合チャンバに接続し、溶出緩衝液が、送達される；
ｊ．緩速撹拌によって、粒子を再懸濁させる；
ｋ−ｌ．回転は、Ｗ６まで急増され、毛細管弁Ｖ６を打破し、混合チャンバを流動チャネルに接続し、ビーズの沈殿を防止するために急減速される。これは、廃棄物１が、流体で充填されているため、ビーズ含有溶液を流動チャネルを通して廃棄物２に搬送する。必要に応じて、混合チャンバ内のビーズの濃度が均質のままであることを確実にするために、試料が流動するにつれて、付加的撹拌ステップが存在してもよい。
【０１０７】
これらの２つの実施例は、洗浄をもたらすための毛細管弁、サイフォン、およびペレット化の使用を組み合わせる、いかなる概念の限定でもない。
【０１０８】
埋込フィルタが、微小流体デバイス内に容易に組み込まれ得、典型的には、同一の材料が、より従来の製品において使用されるのと同一の方法で使用される。いくつかの用途として、微粒子を除去される濾過製品、さらなる使用のために、粒子を捕捉するためのフィルタ、疎水性通気フィルタ、またはＳＰＥを支援する固相結合が挙げられる。多くのフィルタ材料が、利用可能であって、材料選択は、用途に依存する。挿入のための結合方法として、締まり嵌め、Ｏリング、接着剤、および熱結合（熱溶解結合）が挙げられる。方法は、フィルタ選択に依存する。すなわち、シリカ膜は、脆弱であって、多くの場合、締まり嵌め部材による圧縮を使用して、デバイス内に保持される。ポリプロピレンフィルタは、結合のために１３８℃まで加熱されなければならない、熱的に結合される環状オレフィン（環状オレフィンポリマー［ＣＯＰ］または環状オレフィンコポリマー［ＣＯＰ］）部分には不適切であろう。「マクロ」の世界における実施例として、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＰａｌｌ製のフィルタベースの製品が挙げられる。フリットは、着目媒体を濾過するための機械的支援を提供するために使用され得る。
【０１０９】
フィルタは、付加的な製造上の複雑性を呈するが、これらは、克服できないわけではない。フィルタは、形成（例えば、ダイカット）され、定置され（例えば、自動化された機械によって）、潜在的に、最終結合に先立って、適所に鋲留めされなければならない。プロトタイプ段階では、これは、比較的に単純である。すなわち、大規模製造では、フィルタは、典型的には、ピック＆プレース自動化操作を使用して切断され、次いで、定置されるであろう。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは、フィルタユニットの大規模「ホットプレート」溶接を行う。
【０１１０】
適切な細孔サイズの小型フィルタ、例えば、０．４μｍ等のＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルタが、一般に、実験室での濾過のために使用される（混合チャンバと廃棄物チャンバに通じるチャネルとの間に結合される）。その結果、流体は、ディスクのある構成要素から、別の構造化された構成要素（漏出防止結合のために要求される中間層を用いて、「底部」に「蓋」をする）に通過しなければならない。このアプローチの利点は、洗浄ステップの間、試料の濃縮を容易に可能にすることである。すなわち、適用される試料の体積は、溶出緩衝液の体積より大きくあり得る。また、粒子の沈殿が要求されないので、回転速度および幾何学形状の観点から、要件を緩和させる。
【０１１１】
図６は、粒子の洗浄のためのフィルタを使用する、ディスクベースの構造を図示する。ディスクは、２または３層から構成される。構造の大部分は、黒色で示される主要層上にある。フィルタは、この層と単一チャネルから成る第２の層との間に結合される。加えて、時として、上側および下側層が接続する貫通孔から成る中間層を使用することが有用である。すなわち、フィルタ領域内の貫通孔は、漏出防止「リング」が、フィルタの周囲に形成されることを確実にする。このディスク上の特徴は、培養および洗浄されるべきビーズが、溶液中に定置される、第１の層内に混合チャンバを含む。廃棄物チャンバである廃棄物１は、廃棄物１で終端し、埋込フィルタの真下に位置付けられる、第２の層内のチャネルによって、混合チャンバに接続される。毛細管弁Ｖ１は、低回転速度における、このチャネルおよび廃棄物１内への流動に抵抗するために使用される。廃棄物１は、適用される試料とほぼ同一の体積であるように定寸される。また、弁Ｖ２によって、混合チャンバに接続される溶離液／緩衝液リザーバも存在する。第２の廃棄物チャンバである廃棄物２は、流動チャネル内で検出される、ビーズ含有「注入液」を受容し、毛細管弁Ｖ３によって、廃棄物チャンバに接続される。
【０１１２】
図７ａ−７ｂは、この洗浄および流動チャネル内への注入の流体プロセスを図示する：
ａ．試料体積ＶＳが、混合チャンバに添加される。溶液は、ビーズを含有してもよく、または混合チャンバ内に存在するビーズおよび試薬を再水和する試料であってもよい。必要に応じて、システムは、次いで、加速および減速によって撹拌され、ビーズおよび液体を混合させる；
ｂ．周波数Ｗ１における高速スピンは、弁Ｖ１を打破し、試料液体が、埋込フィルタを通して、廃棄物１内に駆動される；
ｃ．全上清は、廃棄物１に輸送される。全粒子は、混合チャンバに暴露されるフィルタの表面上に捕捉される；
ｄ．回転速度は、一時的に、Ｗ２＞Ｗ１まで増加される。これは、毛細管弁Ｖ２を打破し、溶出緩衝液が、混合チャンバに流入することを可能にする；
ｅ．低ＲＰＭにおける緩速撹拌を使用して、溶液中に粒子を再懸濁させる；
ｆ．再懸濁された粒子は、ここで、流動チャネル内の検出に備える；
ｇ．回転は、Ｗ３＞Ｗ２まで急増され、弁Ｖ３を打破し、粒子含有溶液を流動チャネルに送達する。回転は、急減速され、ビーズの沈殿を防止する。これは、ビーズ含有溶液を流動チャネルを通して廃棄物２に搬送する。必要に応じて、混合チャンバ内のビーズの濃度が均質のままであることを確実にするために、試料が流動するにつれて、付加的撹拌ステップが存在してもよい。
【０１１３】
チャネル狭窄；堰およびダム。粒子は、狭窄チャネルによって捕捉され得る。すなわち、チャネル寸法が、粒子直径未満である。
【０１１４】
粒子は、狭窄に対して凝縮されると、粒子間の空間によって形成される非常に小さい平均「チャネル直径」を伴う、凝縮された粒子層を形成する。狭窄チャネルに接近するように「円錐」状に粒子を凝縮することは、凝縮された層を通してチャネルに通じる長い蛇行性流体路によって形成される流動に非常に大きなインピーダンスをもたらすであろう。
【０１１５】
好ましいアプローチは、１次元における狭窄である堰またはダムを使用することである。典型的には、これは、微小流体ディスクの平面に、例えば、チャンバの端部に、垂直に形成される。ディスクの２つの構成要素間に形成される５μｍの間隙は、そのような堰を作成し、５μｍを上回る直径の粒子を捕捉するために使用される。これは、凝縮された層の長さ、ひいては、蛇行性チャネルの長さおよび結果として生じる圧力降下（流動を減少させるように作用する）が、最小にされるように、比較的に広いことが好ましい。
【０１１６】
微小加工法を使用して、そのようなシステムを作成することができる。典型的には、２つの構成要素（例えば、一方の層内のチャンバおよび別の層内の「扇形状」のチャネル入口およびチャネル）を合流することによって作成される。正確な幾何学形状を伴って形成された層の結合は、堰を提供する。これは、図８に示される。
【０１１７】
（粒子受容構造の実施形態）
粒子受容構造の好ましい実施形態は、前述のように設計されたシースレス流チャネルを含み、粒子の濃度は、横断方向（流動チャネルを横断する）に実質的に均一である励起ビームを用いて、有意な同時検出を防止するようなレベルに維持される。チャネルの長さおよび直径は、比較的に低回転速度を使用することができる一方、適正な試料採取時間を伴って、流動チャネル内にある間、少なくとも１回、各粒子を検出することを確実にするように選定される。
【０１１８】
（流動集束システム）
血液学用途等のいくつかの用途では、前述の議論は、流動集束が望ましくあり得ることを示す。そのような流動集束が提供され得る２つの方法は、シース流（従来の方法の拡張）および慣性集束を通したものである。
【０１１９】
（シース流）
種々のシース流実装が、採用され得る。好ましい方法として、以下が挙げられる：
・非同軸シース流
・１次元シース
・チャネル壁内の特徴による液体回転
それぞれが、以下においてより詳細に記載される。
【０１２０】
非同軸シース流。非同軸シース流では、試料流が、チャネル床からシース流体内に注入される。その結果、試料流は、チャネル床に「くっつき」、チャネル内の中心にはない。しかしながら、有意な集束が生じる。流量の比率は、集束の程度を決定する。これは、図１２に示されるように、図示される。ディスク構造は、好ましくは、３つの部分となるであろう。すなわち、流体およびシースチャネルを担持するベース部分と、小開口または貫通孔を伴う密閉中間層と、貫通孔を通して注入されるべき試料を搬送する下側層である。開口の寸法が小さい場合は、毛細管弁として作用するであろう。
【０１２１】
動作時、試料流体は、初期回転速度Ｗ１において、毛細管力によって滞留させられるので、開口に対して駆動されるが、それを通って主要流動チャネルの中へ流動しない。Ｗ２までの付加的加速（潜在的に、回転速度の減速を伴う）は、上流リザーバからシース流体を解放する。シース流体が、空気を置換させるにつれて、流動チャネルを通過し、そのメニスカスは、最終的に、貫通孔における滞留させられた試料流体のメニスカスに合流する。この時点では、シースおよび試料流体の両方が流動する。下流プロファイルに示されるように、シース流体内の試料プルームのサイズは、貫通孔および流動チャネル幅の相対的サイズならびに流量の比率に依存して、非常に小さくあり得る。
【０１２２】
シースおよび試料流量の比率は、３つの要因によって決定され得る。すなわち、流動チャネルにおけるその合流に先立ったそのリザーバ内のシースおよび試料メニスカスの半径方向位置による駆動「圧力」と、シースおよび試料リザーバの断面積と、これらのリザーバからシースおよび試料流体が合流される合流点に通じるチャネルのインピーダンスである。インピーダンスは、シースチャネルと試料チャネルのインピーダンスの比率が、試料流とシース流の所望の比率に等しいように、チャネルの長さおよび直径を変動させることによって、選定され得る。これは、所与の回転速度において、シースリザーバおよび試料リザーバによって生成される圧力水頭が、同一であるであろうということを意味する。所望の流動比は、次いで、
【０１２３】
【数８】
2014518374.tif 000015
を確実にすることによって達成される。
【０１２４】
所望の流動比を前提として、試料のメニスカスが降下する（半径方向位置において外側に移動する）各ｄｒに対して、体積Ａｓａｍｐｌｅ＊ｄｒが流動し、同様に、体積Ａｓｈｅａｔｈ＊ｄｒが流動する。その結果、２つの流体がともにチャネル内に注入されるであろう全てのｒに対して、Ａｓｈｅａｔｈ／Ａｓａｍｐｌｅ＝所望のシース／試料流比となるはずである。
【０１２５】
図に示されるように、試料流は、半径に沿った内側に連続流を伴って、１つのチャネルを通して、貫通孔に通じ得る。これは、捕捉された空気を送給チャネルから追い出すという所望の目的を達成する。
【０１２６】
側方および垂直方向の両方における更なる集束は、図に示されるように、下流の断面を減少させることによって達成され得ることに留意されたい。
【０１２７】
１次元シース。１次元シース流は、試料流を２つの対称シース流と接触させ、試料流に対して、シースの流量を操作することによって作成され得る。流動チャネル内の結果として生じる試料流は、流動チャネルの床から天井に延在するが、流動比によって、側方方向に閉じ込められる。例えば、シース流体の総流量が、２つのシース間で均一であるＱｓｈｅａｔｈであって、試料流が、Ｑｓａｍａｐｌｅである場合、シース化された試料流の側方サイズは、
【０１２８】
【数９】
2014518374.tif 000016
であり、式中、ｗは、チャネル幅である。２５０μｍ幅の流動チャネルの使用は、２５μｍ幅の１次元シースをもたらし得る。
【０１２９】
遠心分離形式における実装は、図１０に示されるように、単純である。シース１および２は、単一シース流体リザーバから送給され、シースチャネルを流動チャネルに接続する２つの毛細管弁で停止し得る。試料は、次いで、上流位置から、流動チャネルを下方に駆動され、メニスカスがシースの暴露されたメニスカスを通過すると、全３つの流体が流動する。相対的インピーダンスは、容易に操作され得る。例えば、試料チャネルの上流部分は、合流点近傍より寸法がはるかに小さく、シースチャネルより高いインピーダンスを作成し得る、または蛇行し、そのより長い長さのため、はるかに大きいインピーダンスを有し得る。
【０１３０】
チャネル壁内の特徴（ストライプ）による液体回転。本方法では、試料およびシース流は、標準的「Ｔ」合流点において合流され、試料流の流量は、シースより有意に低い。そのような場合、試料は、最初、薄型リボン形状内の一方の壁に優先的にくっつく。チャネルの床および天井に定置された流動に対して４５度に角度付けられた「ストライプ」の定置は、循環運動を生じさせるよう作用する。これは、試料流を壁から引き離し、チャネルの中心に向かわせる。ほぼ楕円形のコア流動は、その位置および面積が、相対的流量およびストライプの数の関数であるように形成される。ストライプの幅、深さ、および間隔は、チャネルの深さとほぼ同一の大きさである。典型的には、チャネルはまた、その幅より浅い。
【０１３１】
遠心分離形式における実装は、図１１に示されるように、単純である。シースおよび試料流体が、毛細管弁に提示される。十分なＲＰＭまでの加速に応じて、両弁は、屈服し、液体は、ともにもたらされる。シースおよび試料流を組み合わせる他の場合におけるように、上流インピーダンスおよび圧力は、所望の流動比を作成するように容易に操作され得る。
【０１３２】
完全２次元シース流。また、完全２次元シース流を導入することも可能であるはずである。本方法では、１次元シース流が、最初に、生成される。下方および上方からのシース流の導入が、次いで、試料流を垂直方向に圧縮するように作用し、真の２次元シースを作成する。
【０１３３】
（慣性集束）
「慣性」と称される多数の方法が存在する。これらは、集束を作成するために、単に、前述のような液体の流線内で生成される流路にではなく、様々な程度において粒子自体の離散性に依拠する。いくつかの慣性方法はまた、同様に、集束流線の作成による集束成分を有する。これらの方法はほぼ全て、超低流量で動作し、明らかに、迅速な分析のために要求される範囲（例えば、数１００μＬの液体の流動を１分未満以内に）に拡張することはできない。これらの流動方法の大部分の二次的問題は、構造のサイズが、ほぼ集束されるべき粒子のサイズであるため、加工要求が、短中期的に見て、大量製造において合理的に見込まれるものを超えることである。
【０１３４】
微小流体ディスク内に実装され得る慣性集束方法は、図１５に図示される。本方法は、流動流における拡張および収縮を使用して、渦を誘発し、試料流を集束させる効果を有する。総流量≦５．５ｍＬ／時間および試料：シース比１：１０の場合、チャネル５０μｍＷ×５３μｍＤおよび３００μｍ長によって接続される複数の収縮／拡張を伴う構造３５０μｍ２および５３μｍ深さは、試料をほぼ円筒形のコア（直径〜１８−２０μｍ）に集束させる効果を有する。
【０１３５】
これは、加工および実装の観点から非常に魅力的である。すなわち、全特徴が、１つの部分内にあって、蓋で密閉され得る。シースおよび試料流体は、毛細管弁を使用して、典型的「Ｔ」合流点にもたらされ得る。
【０１３６】
（検出実施形態）
ビーズベースの免疫アッセイ等のいくつかの用途では、フローサイトメトリー検出によって与えられる各粒子に関する詳細な情報は、必要ない。一重免疫アッセイの場合、単一パラメータのみ、重要である。すなわち、直接、ビーズ表面への蛍光標識の結合に依存し、検体濃度を定量的に反映する、蛍光強度である。これらの場合、全ビーズは、原則として、同じであって（当然ながら、その間に統計的変動は存在する）、個々に測定される必要はない。ビーズが、全体として測定され得る場合、いくつかのパラメータは、全体的システム設計において緩和される。すなわち、デバイスは、検出の間、もはや回転する必要はなく、濃度およびビーズ／検出体積サイズは、複数の計数を最小にするために調整される必要はなく、検出器の試料採取速度は、もはや高速である必要はない。これらの制約の除去に加え、バルク検出は、シグナル対ノイズ比の増加をもたらす。すなわち、多くのビーズをディスクの小領域内で同時に検出することによって、全体的蛍光シグナルが、増加され、蛍光シグナル対背景比は、流動内の単一粒子検出を用いたものよりはるかに大きい。
【０１３７】
ビーズをバルクで測定する際に、ビーズは、ディスクの内部表面に対して固定化され得る。これは、いくつかの方法で行われ得る：
１．遠心分離を通したペレット化
２．チャネルの狭窄における捕捉
３．フィルタ上での捕捉
４．磁力。
【０１３８】
図１３ａは、バルクでのビーズの検出に先立った、遠心分離を通したペレット化の実装を示す。
【０１３９】
前述の免疫アッセイプロトコルのパラメータを使用して、アッセイは、サイズ７．５μｍの１０００個のビーズを提供し得る。球状粒子の凝縮層によって占有される最小面積は、
【０１４０】
【数１０】
2014518374.tif 000017
である。
【０１４１】
サイズｄ＝７．５μｍのＮＰ＝１０００個の粒子の場合、この体積は、〜３Ｅ５μｍ３である。これらの粒子が、小体積６０μｍの深さへとペレット化される場合、ビーズによって占有される面積（約７−８個のビーズの深さ）は、〜５ｅ３μｍ２または１辺が〜７１μｍである。これは、低コスト光学を使用して容易に調べることができる。
【０１４２】
図１３ａでは、アッセイが、図５の洗浄システムを使用して行われる。洗浄されたビーズを流動チャネル内に注入するのではなく、ビーズは、第２のペレット化チャンバまたは粒子受容構造に輸送される。ペレット化チャンバは、その最外点に小さく浅い検出ゾーンが存在するように成形される。このように、蛍光ビーズは、遠心分離によるペレット化に応じて、小領域中に凝縮され、単一ビーズと比較して、１０００倍の蛍光シグナルの得られた増幅を伴って、全体として、光学系によって調べられ得る。本発明は、はるかに大きなサイズのビーズを伴う用途において使用され得ることが想定される。１０の増幅（１０個のビーズ）さえ、シグナル／ノイズ改良が、より大きなビーズ／より多くのビーズに伴って改善するように有意となるであろう。
【０１４３】
ビーズの損失に対する制御は、その最外５０％等、ある体積の画分を調べることによって行われ得る。
【０１４４】
多重化されたアッセイは、明確に分離される放出ピークを伴う異なる染色を通して対応され得る。例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）およびＦＩＴＣは両方とも、４８８ｎｍ時の吸収によって活性化され得る。ＰＥ放出ピークは、５７５ｎｍであって、ＦＩＴＣ放出ピークは、５２０ｎｍである。これらは、当業者に公知の光学フィルタリング方法を使用して、スペクトル的に分解され得る。
【０１４５】
フィルタの使用は、前述同様に単純であって、ビーズは、フィルタ上に凝集され、次いで、光学系を使用して、バルクで調べられる。磁石もまた、ビーズを単一検出点に引き付けるために使用され得ることを理解されるであろう。
【０１４６】
図１３ｂおよび１３ｃは、図１３のバルクペレット化および検出チャンバの平面図および横断面図をより詳細に示す。構造は、リザーバ５０２の本体に流入するチャネル５０１を介して充填される。すなわち、置換される空気は、チャネルおよび通気口５０３を通して通気される。リザーバの本体から下方（半径方向外側）には、ビーズを流し込むように設計された円錐形構造があって、ビーズを高回転速度においてディスク上の外側に沈殿させる。これは、可変寸法のいくつかの「円錐」から構成され得る。例えば、「急峻」円錐５０４は、バルク厚から数１００ミクロンの厚さに体積がテーパ状になり得、その後、はるかに緩やかな勾配５０５が続く。この急峻と浅部の組み合わせは、可変ビーズ数が、ディスクの上方（「平面」図）から見て、ほぼ同一の面積を占有することを確実にする。蛍光シグナルは、ビーズの視認される面積に比例する。すなわち、入射照射は、ビーズの最初の数層を下方に浸透するにつれて、ビーズによって大幅に散乱されるため、表面の下方のビーズ層のバルクは、測定可能な蛍光シグナルを提供しない。
【０１４７】
この特徴（凝縮されたビーズによる強力な光散乱）のため、示される検出構造はまた、さらなる超薄型最終沈殿「フィンガ」５０６を有する。これは、典型的には、５０であって、６０μｍに満たない深さおよび〜１００μｍ幅×〜３００μｍ長である。精密な寸法は、重要であるが、平滑縁は、空気（チャンバ内に最初に存在する）が、領域５０６内に気泡として捕捉されないように防止する際、有用である。
【０１４８】
（臨床化学反応用途）
標準的臨床化学反応アッセイは、デバイスに適用されるような全血または全血試料から分離された血漿のいずれかに関して行われ得る。
【０１４９】
着目検体の存在または不在のいずれかにおいて、酵素系を利用して、基質から着色または蛍光生成物を生成する発色または蛍光発生化学反応を含む、種々のアッセイ化学反応が、採用され得る。これらのアッセイシステムは、バルク蛍光測定、微小流体ディスク上の光学キュベットを通した、または反射媒体の存在下における、透過の光学密度または吸収測定あるいは試薬に含浸され、検出に適切な生成物を放出する、母材からの反射測定を含む、種々の方法で使用され得る。
【０１５０】
本発明による母材の調製では、有利には、生物学的流体試料の成分を検出し、より好ましくは、その量を定量化するために使用される、試薬は、母材中に含浸される。非限定的実施例として、クレアチニンが、一連の結合反応を使用して、本発明に従って検出され、そこでは、クレアチニンは、最初に、クレアチニンイミノ加水分解によって、Ｎ−メチルヒダントインおよびアンモニアに変換される。カスケード反応の最終ステップは、水素ペルオキシダーゼと、例えば、テトラメチルブルーを基質として使用しての生成された過酸化水素の検出可能生成物への変換である。反射母材の加工は、微小流体ディスク内への挿入に先立って、複数の浸漬および乾燥ステップを伴う。
【０１５１】
該母材を調製するために使用される材料として、限定されないが、誘導体化されたナイロン、ニトロセルロース、ガラス繊維、およびポリエステルが挙げられ、最も好ましくは、細孔サイズ０．２−２．０μｍを有し、典型的には、細孔サイズ約０．８μｍを有する正の電荷を帯びたナイロン母材を含む。母材の細孔サイズの上限は、血液細胞が、母材に流入するのを阻害または防止するように選定される。母材は、試料計測チャンバから通じるチャネルと流体接触する、アッセイチャンバ内に位置付けられる。母材はさらに、血液試料中の検体の量に比例して検出可能生成物を産生する、固定化試薬で含浸される。最も好ましくは、検出可能生成物は、着色生成物、すなわち、検出可能波長、最も好ましくは、可視波長における光を吸収する生成物である。
【０１５２】
試薬パッドは、図１４におけるように設置され得る。ディスクの流体表面内に形成される陥凹は、試料を搬送するチャネルならびに試料によって置換される空気の除去のための１つ以上の空気置換チャネルとともに形成される。パッド担体は、陥凹内に圧入されると、液密締まり嵌めが得られるように、この陥凹と実質的に、同一の側方寸法を有して形成される。ディスクのチャネルおよび空気置換チャネルは、パッド担体の下面の対応するチャネルおよび空気置換チャネルとシールを形成する。パッド担体の下面はまた、その上面に連通する大きな貫通孔とともに、試料のための「ボウル」を含有する。この上面に対して、試薬含浸反射パッドが接着される。
【０１５３】
（実施例）
本発明による微小流体ディスクの可能性として考えられる構造が、図１５に示される。この微小流体ディスクは、３つの主要構成要素から成る。すなわち、リザーバ、チャネル、受動弁、および液体試薬または乾燥した試薬の形態における試薬等の流体構造の大部分を含有する、流体層１００と、主に、貫通孔を含有する、薄型中間層２００と、下側またはチャネル層３００である。１００と３００との間の連通は、２００における貫通孔を介する。そのような構造は、チャネルが相互にわたって通過しなければならない液体「交差路」を要求する、３次元アーキテクチャを作製するときに有用である。
【０１５４】
この構造は、いかようにも限定するものではないことを認識されたい。微小流体ディスクは、付加的チャネルまたは貫通孔を伴わずに、本質的に、無特徴層または薄型フィルムを用いて、流体層を密閉することによって形成され得る。ある構造では、無特徴密閉フィルムおよびディスクが提供される。
【０１５５】
（免疫アッセイおよび臨床化学反応デバイス）
本発明のディスクは、図１６に示されており、ここでは、流体層１００のみ、図示される。このディスク構造は、構造化された基質および無特徴密閉フィルムから成る。このディスクは、２つのタイプのアッセイを行うように設計される。すなわち、１つは、多色ビーズまたは多色標識の使用を通して多重化され得る、免疫アッセイであって、もう１つは、反射検出のために開発された臨床化学反応アッセイである。ディスクは、ディスクを回転式モータのハブに確動的に係止するように設計された孔または他の特徴であり得る、中心搭載特徴１０１を有する。このディスクは、３つの独立試料において、アッセイを行うように設計される。ある試料は、アッセイ構造１０２のセット内で測定される。
【０１５６】
中心特徴１０１は、ディスクが回転式モータに取着され得る１つの方法にすぎないことに留意されたい。他の半径における取着特徴が、使用されてもよく、例えば、回転子上に対称的に定置されたピンが、微小流体ディスク上の孔と噛合してもよい。
【０１５７】
このディスクは、手動でピペットで取られた緩衝液および液体試薬ならびに全血試料と併用するために設計されるが、ブリスターパウチまたはバッグあるいは他の液体試薬手段の使用が、採用されてもよく、全血の適用は、血液採取および適用デバイスを使用して、または指を刺し、得られた血液液滴をディスクのポートに適用することによって、行われてもよいことを認識されたい。
【０１５８】
図１７は、ある試料処理アッセイ構造の詳細構造を図示する。指定される特徴は、その機能に関連して説明されるであろう。図１８は、微小流体アッセイ構造の機能を図示する。
【０１５９】
ディスクは、リザーバ１３８内に存在する再懸濁緩衝液と、リザーバ１４５内の溶出緩衝液とを含有する。プロトタイプでは、これらの緩衝液は、ディスク上にピペットで取られ得る。生産時、これらの緩衝液は、ブリスターパウチ内に存在してもよい。ブリスターパウチは、種々の方法で開放され得る：
・回転によって開放される脆弱シール。試薬容器内に生成された圧力が、パウチ内の脆弱シールを開放するように作用する；
・計器による破裂。ディスクは、計器の回転式ハブ上の構造が、ブリスターを穿刺可能となる機構とともに設計され得る；
・埋込ピン／鋭利表面による破裂。埋込ピン（製造時に追加されるか、または直接プラスチック内に成形されるかのいずれか）が、リザーバの外側縁内に存在してもよい。十分な速度におけるスピンに応じて、これらのピンに対するパウチの力が、パウチを破裂させる。
【０１６０】
血液は、ユーザによって、血液が、回転に先立って、さらなるチャネルおよび構造内に偶発的に流動しないよう防止するように設計されたテクスチャ表面を有し得る、血液流入構造１０３のポート１０４に適用される。これらの構造は、所望の流路に垂直な狭小「溝」を含んでもよく、回転に先立って、表面の偶発的湿潤を防止するように作用する。空気排気ポートが、流入構造内に存在してもよく、または代替として、置換される空気は、さらなる流体チャネルを通して通気される。
【０１６１】
ディスクは、回転式モータ上に設置され、スピンプロファイルが、開始される。
【０１６２】
初期回転速度Ｗ１（典型的には、２００−４００ＲＰＭ）では、血液は、遠心分離力によって駆動され、流入構造を充填し、次いで、（パネルｄ）チャネル１０５に流入する。随意に、チャネル１０５は、１０３内に残留する内側メニスカスが、半径に垂直な形状に安定するまで、血液のさらなる流動を停止するために、その中に配置される毛細管弁１０６を有してもよい。Ｗ２＞Ｗ１への回転速度の増加は、弁１０６を打破する。すなわち、回転速度は、再び、低下し得る。
【０１６３】
ここで、血液は、チャネル１０８を介して、溢流チャンバ１０９に接続される、分離カラム１０７内に遠心分離で圧送される。チャンバ１０９は、置換される空気を通気するための手段を有し、ディスクの中心近位の分離構造１０７の領域もまた、通気手段を有してもよい。（パネルｅ−ｆ）。同時に、１３８内に存在する再懸濁緩衝液は、毛細管弁１３９を通して、チャネル１４０および１４１内に解放される。チャネル１４１内の毛細管弁１４２は、そのチャネルを通したさらなる流動を妨害する。すなわち、１４０を通る流動は、溢流リザーバ１４３内に続く。これは、リザーバ１３８内の緩衝液の残りの体積を精密に決定するために有用である。これは、パネルｅ−ｆに図示される。
【０１６４】
回転速度は、血漿および凝縮された細胞画分への血液の分離を行うために、Ｗ３＞（Ｗ１、Ｗ２）まで増加される（典型的には、１０００−３０００ＲＰＭの範囲内）。分離構造内のいかなる過剰血液も、溢流体積１０９内に完全に駆動される。パネルｇは、分離プロセスの開始を図示し、血液細胞は、１０７の外側表面に向かって凝縮する。
【０１６５】
血漿分離プロセスの間、毛細管弁１４２は、再懸濁緩衝液を解放し、これは、チャネル１４４を通して、混合チャンバ１２６に送達される。混合チャンバ内に存在するのは、乾燥した試薬、例えば、乾燥した免疫修飾されたビーズ１２７および乾燥した蛍光染料１２８であり得る。
【０１６６】
血漿分離は、継続する。この分離の間、血液および血漿は、分離体積１０７に接続されたサイドアームチャネル１１０内に存在するが、毛細管弁１１１によって滞留させられる。
【０１６７】
また、分離の間、溶出緩衝液のための毛細管弁１４６は、遠心分離によって開始された圧力によって打破され、再懸濁緩衝液と同様に、チャネル１４７を通して、過剰緩衝液の溢流をリザーバ１４８内につなげる。
【０１６８】
パネルｊでは、回転速度は、一時的に、Ｗ４＞Ｗ３まで増加され、典型的には、より適度なレベルまで減速される。これは、毛細管弁１１１を打破し、血漿が、１０７の内側部分から、チャネル１１０がチャンバに合流するレベルまで傾瀉されることを可能にする（その時点で、空気は、１１０内に引き込まれ、血漿分割量を滞留させられた凝縮された血液細胞から分離する）。血漿は、最初に、計測リザーバ１１４内に流動し、通路１１５を通して、第２の計測リザーバ１２１および溢流体積１２２内に溢流する。リザーバ１１４は、反射ベースのアッセイの性能に適切な血漿を計測する一方、リザーバ１２１は、免疫アッセイに適切な体積を計測する。各計測された体積は、毛細管弁（それぞれ、１１７および１２４）によって滞留させられる。
【０１６９】
パネルｌでは、回転速度は、Ｗ５まで急増され、次いで、減速され、毛細管弁１１７および１２４を打破する。
【０１７０】
弁１１７を通過する血漿は、チャネル１１８を介して、血漿内の検体に基づいて、蛍光または着色生成物を生成するために適切な試薬が埋め込まれた反射構造１１９へと移動する。置換される空気は、通気口１２０を通して通気される。
【０１７１】
弁１２４を通過する血漿は、チャネル１２５を介して、混合チャンバ１２６に流入する。
【０１７２】
回転は、減速される。緩速撹拌が、パネルｎに示されるように、ディスクを減速および加速することによって（典型的には、加速１０００−１０，０００ＲＰＭ／秒であるが、全体的減速速度では、１００−５００ＲＰＭ）行われる。この撹拌は、「一方向性」であってもよく、すなわち、ディスクは、停止するために、その５００ＲＰＭから停止まで急減速され、次いで、ゆっくりと５００ＲＰＭに逆加速され、次いで、再び停止され、このようにして、循環されてもよい。または、撹拌は、双方向であってもよく、ディスクは、半サイクル毎に、回転方向を変更する。一方向性撹拌は、チャネル１２９および１３１がチャンバから出射する反対の接線方向に高加速または減速を適用することによって、チャネル１２９および１３１によって混合チャンバの出口（底部）に取着された毛細管弁上の圧力過渡を最小にするために、特に有用である。
【０１７３】
パネルｏでは、試薬は、完全に可溶化され、試料および再懸濁緩衝液と混合され、ビーズは、ここで、溶液中に均質に分散されている。反射構造では、検出可能生成物につながる化学反応が継続する。ディスクは、免疫アッセイが、混合チャンバ内で培養されるため、継続的に撹拌され得る。
【０１７４】
回転速度は、パネルｐに示されるように、混合チャンバ内のビーズをペレット化するために、Ｗ５（典型的には、５００−２５００ＲＰＭ）まで増加される。
【０１７５】
パネルｑでは、反射パッド内で検出可能反応生成物を産生する化学反応が、完了している。検出は、ディスクが低速で回転している間、１〜複数の波長における反射の測定によって生じ得る。
【０１７６】
Ｗ６までの回転速度の急増は、回転速度の後続減速とともに、毛細管弁１３０を打破し、混合チャンバ内の沈殿されたビーズの上清が、チャネル１３３を通して、狭小チャネル１３５およびポート１３６によって通気される、廃棄物リザーバ１３４に進行することを可能にする。パネルｒに示されるように、リザーバ１３４は、上清の小体積が、混合チャンバ内に滞留させられるように定寸され得る。すなわち、１３４が充填するにつれて、最終的に、液体は、チャネル１３５内に上昇し、この液体のメニスカスが、１２６内の滞留させられた流体のメニスカスと同一の半径方向位置になると、流体運動が停止する。
【０１７７】
パネルｒでは、回転速度は、速度Ｗ７まで急増され、溶出緩衝液が、毛細管弁１５０を通して、チャネル１５１内、次いで、混合チャンバ内に解放される。廃棄物チャンバは、満杯であって、空気排気チャネル１３５が、狭小直径であって、混合チャンバの半径方向内側に延在するため、流体は、チャネル１３３を通して、廃棄チャンバに進行せず、初期試料＋再懸濁体積を上回る溶出体積が、収容され得る。これは、パネルｔに示される。
【０１７８】
緩速撹拌は、ビーズを再懸濁させ、ビーズが、パネルｕにおける混合チャンバ内に溶出緩衝液が均質に分散された最終状態につながる。
【０１７９】
最後に、回転速度は、速度Ｗ７まで急増され、次いで、減速され、毛細管弁１３２を打破し、ビーズ搬送流体をチャネル１５２内にもたらす。１５２のあるセクションは、検出システムによる検査のために、固定半径に接線方向に配列された流動チャネル領域１５３である。この流体はさらに、通気ポートを伴う、廃棄物リザーバ１５４内に駆動される。検出は、流体が、１５３を通して流動するにつれて生じる。必要に応じて、さらに撹拌ステップが使用され、混合チャンバ内の残留溶液内のビーズの過度の沈下を防止してもよい。また、回転速度は、このステップの間、変動してもよく、低速から開始し、実質的に、一定流量を維持するために、増加することを認識されたい。
【０１８０】
その廃棄物チャンバを伴う流動チャネルと、統合されたバルクペレット化チャンバ（その独自の廃棄物チャンバとして作用する）の置換は、単純であって、検出ステップは、高速遠心分離（例えば、７２００ＲＰＭで３０秒間）後に、検出を伴うことを理解されるであろう。
【０１８１】
（シース流）
図１９は、シース流の作成に適切な微小流体ディスクを図示する。ここでは、図５の洗浄方法と併せて図示される。既に論じられた混合チャンバ、溶離液チャンバ、廃棄物チャンバ、ならびに毛細管弁およびチャネルに加え、シース流体を含有するリザーバが、存在し、毛細管弁Ｖ４によって、流動チャネルおよび混合チャンバから分離される。シース流体は、統合されたディスクの動作の早期段階における、このシース流体リザーバへの駆動に先立って、大型の試薬パウチまたはブリスター内に存在してもよいことを理解されたい。
【０１８２】
洗浄ステップは、前述の実施例におけるように行われる。回転速度は、急増され、弁Ｖ３を通して、ビーズ含有溶液を混合チャンバから流動チャネル内に解放する。同時に、シース流体は、弁Ｖ４を越えて、駆動され、流動チャネル内の試料溶液に合流する。これは、図２０に図示される。シース流のための流体合流点の構造の詳細は、以下に与えられる。
【０１８３】
前述のように、シース流に対する所望の流動比は、
【０１８４】
【数１１】
2014518374.tif 000018
によって決定される。
【０１８５】
図２０は、そのような１０：１シース流を提供するためにレイアウトされたディスクを示す。シースリザーバは、混合チャンバの深さの２倍である。これは、混合チャンバが狭小化するのと同様に、半径方向位置の増加に伴って、狭小化する（断面積が減少する）ように成形され、したがって、流動比を維持する。
【０１８６】
微小流体ディスク上におけるシース流の実装は、前述の方法を使用することができ、シースと試料溶液との間の合流点の詳細は、シースのタイプを決定する。例えば、図２に示される全体的構造と、図１２の非同軸シースの組み合わせは、図１５におけるように、３つの部分から成るディスクを作成することによって行われ得る。これは、図２１に示される。分析されるべき溶液は、混合チャネルから、中間層内の貫通孔を通して、主要流動チャネルに合流する点まで、下側チャネル層内を進行する。この貫通孔は、図２２における弁Ｖ３として作用することができる。弁Ｖ４を通して、シース流体を解放する、速度急増は、試料の流動を引き起こすために使用され、集束されたシース流が生じる。
【０１８７】
これらの基本概念に関して、多くの変形例が存在することを認識されたい。例えば、サイフォンの使用は、毛細管弁を補完してもよい。サイフォンはまた、毛細管弁と併用されてもよい。毛細管弁は、望ましくない低回転速度におけるサイフォンの「呼水を差す」ステップを防止することができる。弁の突破は、ディスク上の別のステップの一部であってもよい。ディスクの後続減速は、サイフォンの呼水を差すステップ後、流動につながる。
【０１８８】
図面を参照して説明される本発明における実施形態は、コンピュータ装置および／またはコンピュータ装置内で行われるプロセスを備える。しかしながら、本発明はまた、コンピュータプログラム、特に、本発明を実践させるように適合された担体上または内に記憶されたコンピュータプログラムにも拡張する。プログラムは、ソースコード、オブジェクトコード、またはコード中間ソースおよびオブジェクトコードの形態、例えば、部分的にコンパイルされた形態または本発明による方法の実装に使用するために好適な任意の他の形態であってもよい。担体は、ＲＯＭ、例えば、ＣＤ  ＲＯＭ、または磁気記録媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクまたはハードディスク等の記憶媒体を備えてもよい。担体は、電気または光学ケーブルを介して、あるいは無線または他の手段によって伝送され得る、電気または光学シグナルであってもよい。
【０１８９】
本明細書では、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ、およびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）またはその任意の変動および用号「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｅｄ、およびｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）またはその任意の変動は、完全に互換可能であると見なされ、全て、最も広範な可能性として考えられる解釈が与えられるべきであって、その逆も然りである。
【０１９０】
本発明は、前述の実施形態に限定されず、構造および詳細の両方において変更され得る。
【図１】
2014518374.tif 000019
【図２】
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【図３ａ】
2014518374.tif 000021
【図３ｂ】
2014518374.tif 000022
【図４】
2014518374.tif 000023
【図５ａ】
2014518374.tif 000024
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
2014518374.tif 000027
【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
2014518374.tif 000035
【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2014518374.tif 000040
【図１７】
2014518374.tif 000041
【図１８ａ】
2014518374.tif 000042
【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
2014518374.tif 000044
【図１８ｄ】
2014518374.tif 000045
【図１８ｅ】
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【図１８ｆ】
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【図１９】
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【図２０】
2014518374.tif 000049
【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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