(57)【要約】  本発明はＡｐｏE（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）フラグメントに優先的に結合する抗体を提供する。これらの抗体は、このフラグメントの毒性を低減するのに役立ち、種々の神経疾患の治療および予防に用途を有する。【選択図】図3
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｐｏＥ（１〜２９９）への結合に比べて、ＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）の残基２７２を含むエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）の位置２７２の遊離カルボキシル基を含むエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）のＥ４アイソフォームに結合する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
３つの軽鎖カバトＣＤＲおよび３つの重鎖カバトＣＤＲを含み、各軽鎖ＣＤＲが、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４と呼ばれる対応するＣＤＲに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、各重鎖ＣＤＲが、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１と呼ばれる対応するＣＤＲに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
３つの軽鎖カバトＣＤＲおよび３つの重鎖カバトＣＤＲを含み、各ＣＤＲが、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲとは６つ以下の置換、削除または挿入で配列が異なり、１５Ｇ８が、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられるマウス抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
各ＣＤＲが、１つ以下の置換、削除または挿入で配列が異なる、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
各軽鎖ＣＤＲは、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲに対して１００％の配列同一性を有し、重鎖ＣＤＲは、６つを超える置換、削除または挿入で配列が異なることはない、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖ＣＤＲ Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３ならびにＣＤＲ Ｈ１およびＣＤＲ Ｈ３の各々が、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲに対して１００％の配列同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２が、６つ以下の置換、削除または挿入で配列が異なる、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８の、カバトによって規定された３つの軽鎖ＣＤＲ、およびカバトによって規定された３つの重鎖ＣＤＲを有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
配列番号９の前記３つのカバトＣＤＲを含み、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および、配列番号１０の前記３つのカバトＣＤＲを含み、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項１２】
ＡｐｏＥへの特異的結合について１５Ｇ８と競合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
１５Ｇ８と同一のＡｐｏＥ上のエピトープに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
成熟重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含み、成熟軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト化、キメラ、張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、またはヒト抗体である、請求項１，２，３または４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖまたは単一ドメイン抗体である、請求項１，２，３または４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
アイソタイプがＩｇＧ１である、請求項１，２，３または４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記アイソタイプがヒトＩｇＧ１である、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
定常領域に少なくとも１つの変異を有する、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
前記アイソタイプがヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
ヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型のモノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８であって、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８が、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられるマウス抗体である、抗体。
【請求項２２】
配列番号１８の３つの軽鎖カバトＣＤＲを含む軽鎖可変領域、および配列番号１７の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
軽鎖可変領域フレームワークが、ＡＡＴ８６０３５（配列番号８）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
軽鎖可変領域フレームワークが、ＡＡＴ８６０３５（配列番号８）に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２５】
重鎖可変領域フレームワークが、ＡＡＸ８２４９４（配列番号７）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２６】
重鎖可変領域フレームワークが、ＡＡＸ８２４９４（配列番号７）に対して少なくとも９３％の配列同一性を有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む、抗体。
【請求項２８】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１７の３つのカバトＣＤＲを含み、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１８の３つのカバトＣＤＲを含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号１７に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３０】
前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３２】
前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３３】
前記成熟重鎖可変領域が、配列番号１７に対して少なくとも９８％の配列同一性を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３４】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３５】
位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３６】
位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３７】
位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３８】
位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３９】
位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項４０】
位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項４１】
位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、請求項２７に記載の抗体。
【請求項４２】
前記成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であり、前記成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１８であり、ただし、位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶまたはＬによって占められてもよく、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦまたはＹによって占められてもよく、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲまたはＬによって占められてもよく、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱまたはＥによって占められてもよく、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱまたはＫによって占められてもよく、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱまたはＶによって占められてもよく、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤまたはＥによって占められてもよく、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫまたはＲによって占められ得る、請求項２７に記載の抗体。
【請求項４３】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められている、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲによって占められている、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４５】
位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４６】
位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫによって占められている、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４７】
（ｉ）配列番号１７の３つのカバトＣＤＲ、および、配列番号１７の対応する重鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟重鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化重鎖；ならびに
（ｉｉ）配列番号１８の３つのカバトＣＤＲ、および、配列番号１８の対応する軽鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟軽鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化軽鎖を含み、
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、抗体。
【請求項４８】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
（ｉ）配列番号１７の３つのカバトＣＤＲ、および、配列番号１７の対応する重鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟重鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化重鎖；ならびに
（ｉｉ）配列番号１８の３つのカバトＣＤＲ、および、配列番号１８の対応する軽鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟軽鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化軽鎖を含み、
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）がQによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫによって占められている、抗体。
【請求項５０】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫによって占められている、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
（ｉ）配列番号１７の３つのカバトＣＤＲ、および、配列番号１７の対応する重鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟重鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化重鎖；ならびに
（ｉｉ）配列番号１８の３つのＣＤＲ、および、配列番号１８の対応する軽鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟軽鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化軽鎖を含み、
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫによって占められている、抗体。
【請求項５２】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫによって占められている、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５３】
（ｉ）配列番号１７の３つのカバトＣＤＲ、および、配列番号１７の対応する重鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟重鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化重鎖；ならびに
（ｉｉ）配列番号１８の３つのＣＤＲ、および、配列番号１８の対応する軽鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する成熟軽鎖可変フレームワーク領域を含むヒト化軽鎖を含み、
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、抗体。
【請求項５４】
位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項５６】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１８のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項５７】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１８のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項５８】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項５９】
前記成熟重鎖可変領域のＣＤＲならびに配列番号１７および配列番号１８由来の成熟軽鎖可変領域における差異が、それぞれ、位置Ｈ６０〜Ｈ６５（カバト番号付け）に存在する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項６０】
成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合し、成熟軽鎖定常領域が軽鎖定常領域に融合している、請求項１〜５９のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項６１】
重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜６０のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項６２】
重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１ｍ３アロタイプである、請求項１〜６１のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項６３】
前記重鎖定常領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有し、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよい、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６４】
前記重鎖定常領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の抗体。
【請求項６５】
前記重鎖定常領域が配列番号３８のアミノ酸配列を有し、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよい、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６６】
前記重鎖定常領域が配列番号３７のアミノ酸配列を有し、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよい、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６７】
前記重鎖定常領域が配列番号４０のアミノ酸配列を有し、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよい、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６８】
前記軽鎖定常領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６９】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域に融合しており、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよく、前記成熟軽鎖定常領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域に融合している、請求項５５に記載の抗体。
【請求項７０】
配列番号１６のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖、および配列番号１３のアミノ酸配列を有する成熟重鎖を含む、抗体。
【請求項７１】
配列番号１１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、配列番号１４のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域、および配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項７２】
重鎖定常領域が、天然ヒト定常領域の変異体型であって、前記天然ヒト定常領域に比べてＦｃγ受容体への結合が弱い変異体型である、請求項１〜７１のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項７３】
請求項１〜７２のいずれか1項で定義される成熟重鎖可変領域および／または成熟軽鎖可変領域をエンコードする、核酸。
【請求項７４】
配列番号１２および配列番号１５のいずれかを含む配列を有する、請求項７３に記載の核酸。
【請求項７５】
請求項７３に記載の核酸またはＨ４２を含むベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７６】
抗体をヒト化する方法であって、
マウス抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を決定する工程と、
マウス重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をエンコードする核酸、およびマウス軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をエンコードする核酸を合成する工程と、および
前記核酸を宿主細胞において発現させて、ヒト化抗体を産生する工程とを含み、
前記マウス抗体が、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられる１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８である、方法。
【請求項７７】
ヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を産生する方法であって、
前記抗体の重鎖および軽鎖をエンコードする核酸で細胞を培養して、前記細胞から前記抗体を分泌させる工程と、および
細胞培養培地から前記抗体を精製する工程とを含み、
前記抗体が、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８のヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型であり、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８が、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられるマウス抗体である、方法。
【請求項７８】
ヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を産生する細胞株を生成する方法であって、
抗体の重鎖および軽鎖をエンコードするベクターならびに選択可能なマーカーを細胞に導入する工程と、
前記ベクターのコピー数が増加した細胞を選択するための条件で、前記細胞を増殖させる工程と、
前記選択した細胞から単一細胞を単離する工程と、および
抗体の収率に基づいて選択した単一細胞からクローン化した細胞をバンクする工程とを含み、
前記抗体が、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８のヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型であり、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８がは、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられるマウス抗体である、方法。
【請求項７９】
前記細胞を選択的条件で増殖させ、自然に発現し少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４ｈを分泌する細胞株についてスクリーニングする工程をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体が請求項１〜７２のいずれか１項で定義される抗体である、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
残基２７２および２７３を含むエピトープにてＡｐｏＥ（１〜２９９）に特異的に結合する、抗体。
【請求項８２】
請求項１〜８１のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項８３】
ＡｐｏＥの３〜１０個の連続残基を含み、残基２７２にＣ末端を有する、ＡｐｏＥの単離フラグメント。
【請求項８４】
当該フラグメントに対する抗体の誘起を支援するスペーサーを随意的に介して、キャリア分子に連結されている、請求項８３に記載の単離フラグメント。
【請求項８５】
本質的に配列番号４１から成る、請求項８４に記載の単離フラグメント。
【請求項８６】
請求項８４に記載のフラグメントおよびヒトへの投与に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項８７】
アルツハイマー病の治療または予防の方法であって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤の有効な投与計画を、アルツハイマー病を有するまたはアルツハイマー病の危険性のある患者に実施し、これにより前記疾患の治療または予防をする工程を含む、方法。
【請求項８８】
前記抗体が請求項１〜１０のいずれか１項で定義される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記薬剤が残基２７２にＣ末端が位置するＡｐｏEの３〜１０個の連続アミノ酸のフラグメントである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記薬剤が前記フラグメントのN末端上のキャリアに連結された配列番号４１から成るＡｐｏEのフラグメントである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
患者がＡｐｏＥ４保有者である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
ＡｐｏＥ４に関連する疾患の治療または予防の方法であって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤の有効な投与計画を、前記疾患を有するまたは前記疾患の危険性のある患者に実施し、これにより前記疾患の治療または予防をする工程を含む、方法。
【請求項９３】
神経疾患の治療または予防の方法であって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤の有効な投与計画を、ＡｐｏＥ４保有者である患者に実施し、これにより前記疾患の治療または予防をする工程を含む、方法。
【請求項９４】
前記抗体が請求項１〜７２のいずれか１項で定義される抗体である、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗体が、配列番号９の３つのカバトＣＤＲを含み、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および、配列番号１０の３つのカバトＣＤＲを含み、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
前記抗体が、ＡＡＴ８６０３５（配列番号８）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域フレームワークを含むヒト化１５Ｇ８抗体である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗体が、ＡＡＸ８２４９４（配列番号７）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域フレームワークを含むヒト化１５Ｇ８抗体である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９８】
前記抗体が、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９９】
前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含み、ただし、位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶまたはＬによって占められ得、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦまたはＹによって占められ得、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲまたはＬによって占められ得、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱまたはＥによって占められ得、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱまたはＫによって占められ得、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱまたはＶによって占められ得、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤまたはＥによって占められ得、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫまたはＲによって占められ得る、請求項８７に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含み、ただし、位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められている、請求項８７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含み、ただし、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている、請求項８７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１０３】
前記抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、配列番号１４のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域、および配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１０４】
アルツハイマー病に対する活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、ＡｐｏＥおよびＡＰＰ導入遺伝子を発現する遺伝子導入動物に前記薬剤を投与する工程と、前記薬剤がアルツハイマー病の少なくとも１つの兆候または症状を阻止するかまたは遅延させるかを判断する工程とを含み、前記薬剤が、ＡｐｏE（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体またはそのような抗体を誘導する薬剤である、方法。
【請求項１０５】
ＡｐｏＥのフラグメントであって、前記フラグメントのＮ末端上のキャリアに連結した配列番号４１から成るフラグメントを含む免疫原で動物を免疫する工程を含む、ＡｐｏＥ（１〜２９９）への結合に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体を生成する方法。
【請求項１０６】
前記免疫原が配列番号５を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記免疫原が、コンジュゲートを形成するために［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステルを用いて、ヒツジ抗マウスＩｇＧにコンジュゲートされる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記コンジュゲートおよびアジュバントでマウスを免疫する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
６０日の期間にわたる全４回の免疫化でマウスを免疫化する、請求項１０８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）は、１９ｑ１３．２に位置し、脂質輸送およびコレステロール処理において役割を有するタンパクをエンコードする。このタンパクは、低比重リポタンパク受容体結合部位を含むＮ末端ドメイン（残基１〜１９１）と、主要脂質結合部位（残基２４０〜２７２）を含むＣ末端ドメイン（残基２１６〜２９９）と、これら２ドメイン間のヒンジ領域とを有する。
【０００２】
ＡｐｏＥ遺伝子は、３つの対立遺伝子変異型：ＡｐｏＥ４，ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ２を有する。ＡｐｏＥ３（ここでは、それぞれＥ４，Ｅ３およびＥ２ともいう）が最も高頻度の型であり、ＡｐｏＥ２が最も低頻度である。異なる集団における遺伝子のＡｐｏＥ４バージョンの頻度は変動するが、常に３０％未満であり、しばしば８％〜１５％である。ＡｐｏＥ４は、アルツハイマー病（ＡＤ）の強力な危険因子として知られている。対立遺伝子の１つのコピーの存在は、この疾患に罹患する可能性を約３倍高め、疾患の発症を平均で５年高める。同一の対立遺伝子の２つのコピーは、ＡＤの危険性を約８倍高め、発症の年齢を平均で１０年低下させる。ＡＤを患った状態で死亡し、ＡｐｏＥ４対立遺伝子を有する個体の検死解剖の解析は、プラークおよび脳血管アミロイドなどのＡβ関連の病変が、その対立遺伝子を有するそれらの個体において概して上昇することを示している。リポタンパクとしてのＡｐｏＥは、脂質粒子と相互作用し、したがって、血漿中の脂質輸送、特にコレステロールに関与している。ＡｐｏＥは、ニューロンの維持および修復に役割を有すると報告されている。ＡｐｏＥ４とアルツハイマー病との関連は、Ａβ依存および非依存の双方の複数の機構によって媒介されるかもしれない。ＡｐｏＥ４は、Ａβの産生および沈着の亢進に関連し、それ自体が毒性のある凝集体およびタンパク分解フラグメントを形成する、と報告されている（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４ ６０２７−６０３１ （２００９）； Ｍａｈｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０３， ５６４４−５６５１ （２００６））。
【０００３】
Ｅ２，Ｅ３およびＥ４アイソフォームは各々、脂質を輸送する能力が異なり、ＡＤに対する作用が異なり、Ｅ４はＡＤの全体的危険性を増大させ、Ｅ２は減少させる。３つの対立遺伝子は各々、ヒトにおいて位置１１２および１５８の２つの残基でのみ互いに異なる。ＡｐｏＥ２は両部位にＣｙｓを有する。Ｅ３は１１２にＣｙｓ、１５８にＡｒｇを有し、Ｅ４は両部位にＡｒｇを有する。これらの変化は、３つすべてのアイソフォームに、ＡＤ病誘発傾向の主要因であると思われる全体的な構造の差異をもたらす。
【０００４】
関連出願情報
本出願は、２０１１年２月７日出願の米国特許仮出願第６１／４４０，２８４号に基づく優先権を主張しており、その内容は参照によって全て本明細書に組み込まれる。
【０００５】
配列表の参照
０５７４５０−４１０７０８．ｔｘｔのための配列表のファイルに記されている配列表は、４１，９７１バイトであり、２０１２年２月７日に作成された。このファイルに含まれている情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＡｐｏＥ（１〜２９９）への結合に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、たとえばモノクローナル抗体を提供する。この抗体はＡｐｏＥ（１〜２７２）の残基２７２を含むエピトープに結合してもよい。この抗体はＡｐｏＥ（１〜２７２）の位置２７２の遊離カルボキシル基を含むエピトープに結合してもよい。この抗体はＡｐｏＥ（１〜２７２）のＥ４アイソフォームに結合してもよい。このモノクローナル抗体は、ヒト化、キメラ、張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、またはヒト抗体であり得る。このモノクローナル抗体は、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖまたは単一ドメイン抗体であり得る。アイソタイプは、ヒトＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，またはＩｇＧ４であり得る。少なくとも１つの変異が定常領域に存在してもよい。
【０００７】
本発明は、さらに、モノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８の、カバトによって規定された３つの軽鎖ＣＤＲ、およびカバトによって規定された３つの重鎖ＣＤＲを有するモノクローナル抗体を提供する。１２Ｃ１２，１５Ｅ１０および１５Ｇ８は、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられるマウス抗体である。
【０００８】
本発明は、さらに、３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲを含み、各軽鎖ＣＤＲが、配列番号２２（ＣＤＲ Ｌ１）、配列番号２３（ＣＤＲ Ｌ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ Ｌ３）と呼ばれる対応するＣＤＲに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、各重鎖ＣＤＲが、配列番号１９（ＣＤＲ Ｈ１）、配列番号２０（ＣＤＲ Ｈ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ Ｈ３）と呼ばれる対応するＣＤＲに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、３つの軽鎖カバトＣＤＲおよび３つの重鎖カバトＣＤＲを含み、各ＣＤＲが、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲとは６つ以下の置換、削除または挿入で配列が異なり、１５Ｇ８は、配列番号１０の軽鎖可変領域および配列番号９の重鎖可変領域によって特徴付けられるマウス抗体であるモノクローナル抗体を提供する。ある抗体において、各ＣＤＲは、１つ以下の置換、削除または挿入で配列が異なる。ある抗体において、各軽鎖ＣＤＲは、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲに対して１００％の配列同一性を有し、重鎖ＣＤＲは、６つを超える置換、削除または挿入で配列が異なることはない。ある抗体において、軽鎖ＣＤＲ Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３ならびにＣＤＲ Ｈ１およびＣＤＲ Ｈ３の各々は、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲに対して１００％の配列同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２が、６つ以下の置換、削除または挿入で配列が異なる。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含み、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥへの特異的結合について１５Ｇ８と競合するモノクローナル抗体、または、１５Ｇ８と同一のＡｐｏＥ上のエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００１１】
本発明は、さらに、モノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８のヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型を提供する。上記の抗体は、配列番号１８の３つの軽鎖カバトＣＤＲを含む軽鎖可変領域および配列番号１７の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよい。ある抗体において、上記の軽鎖可変領域フレームワークは、ＡＡＴ８６０３５（配列番号８）に対して、少なくとも８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を有する。ある抗体において、上記の重鎖可変領域フレームワークは、ＡＡＸ８２４９４（配列番号７）に対して、少なくとも８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００１２】
本発明は、さらに、配列番号１７に対して少なくとも８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および／または、配列番号１８に対して少なくとも８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。このような抗体の中には、それぞれ配列番号５２および６０由来の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける差異は、位置Ｈ６０〜Ｈ６５に存在するものがある。このような抗体の中には、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号１７の３つのカバトＣＤＲを含み、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１８の３つのカバトＣＤＲを含むものがある。このような抗体の中には、上記の成熟重鎖可変領域は、配列番号１７に対して少なくとも８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を有するものがある。このような抗体の中には、上記の成熟軽鎖可変領域は、配列番号１８に対して少なくとも８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を有するものがある。ある抗体において、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＬによって占められている。ある抗体において、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＹによって占められている。ある抗体において、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＬによって占められている。ある抗体において、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＥによって占められている。ある抗体において、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＫによって占められている。ある抗体において、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＶによって占められている。ある抗体において、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＥによって占められている。ある抗体において、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＲによって占められている。ある抗体において、前記成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７であり、上記の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ただし、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＶまたはＬによって占められることがあり、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＦまたはＹによって占められることがあり、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＲまたはＬによって占められることがあり、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＱまたはＥによって占められることがあり、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＱまたはＫによって占められることがあり、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＱまたはＶによって占められることがあり、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＤまたはＥによって占められることがあり、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＫまたはＲによって占められ得る。このような抗体の中には、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＬによって占められているものがある。このような抗体の中には、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＶによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＦによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＲによって占められているものがある。このような抗体の中には、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＲによって占められているものがある。このような抗体の中には、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＤによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＫによって占められているものがある。
【００１３】
本発明は、さらに、配列番号１７の３つのカバトＣＤＲを含むヒト化重鎖、および配列番号１８の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む抗体を提供する。ある抗体において、成熟重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１７の対応する重鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有し、成熟軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１８の対応する軽鎖可変領域フレームワークに対して６５〜８５％の同一性を有する。位置Ｌ３（カバト番号付け）はＬによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＹによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＬによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）はＥによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）はＫによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）はＶによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＥによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＲによって占められていてもよい。 位置Ｌ３（カバト番号付け）はＶによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＦによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＲによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）はＱによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）はＱによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）はＱによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＤによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＫによって占められていてもよい。 位置Ｌ３（カバト番号付け）はＬによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＹによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＬによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）はＱによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）はＱによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）はＱによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＤによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＫによって占められていてもよい。位置Ｌ３（カバト番号付け）はＶによって占められ、および／または位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＦによって占められ、および／または位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＲによって占められ、および／または位置Ｈ１（カバト番号付け）はＥによって占められ、および／または位置Ｈ３（カバト番号付け）はＫによって占められ、および／または位置Ｈ５（カバト番号付け）はＶによって占められ、および／または位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＥによって占められ、および／または位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＲによって占められていてもよい。ある抗体において、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＬによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバ���番号付け）はＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＲによって占められている。ある抗体において、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＶによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＦによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＲによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＤによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＫによって占められている。ある抗体において、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＬによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＱによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＤによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＫによって占められている。ある抗体において、位置Ｌ３（カバト番号付け）はＶによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）はＦによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）はＲによって占められ、位置Ｈ１（カバト番号付け）はＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）はＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）はＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）はＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）はＲによって占められている。
【００１４】
本発明は、さらに、配列番号１１または配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１４のアミノ酸配列を有する。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号１７のアミノ酸配列を有し、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１８のアミノ酸配列を有する。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１８のアミノ酸配列を有する。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号１７のアミノ酸配列を有し、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
上記抗体のいずれにおいても、上記の成熟重鎖可変領域は重鎖定常領域に融合することができ、上記の成熟軽鎖定常領域は軽鎖定常領域に融合し得る。
【００１６】
上記抗体のいずれにおいても、上記の重鎖定常領域は、天然ヒト定常領域の変異体型であって、上記の天然ヒト定常領域に比べてＦｃγ受容体への結合が弱い変異体型であり得る。
【００１７】
上記抗体のいずれにおいても、上記の重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプであり得る。ある抗体において、アロタイプはＧ１ｍ３である。ある抗体において、アロタイプはＧ１ｍ１である。
【００１８】
ある抗体において、上記の重鎖定常領域は配列番号３７，３８，３９または４０と呼ばれるアミノ酸配列を有し、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよい。ある抗体において、上記の軽鎖定常領域は、配列番号３５と呼ばれるアミノ酸配列を有する。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号３９と呼ばれるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域に融合し、ただし、Ｃ末端リジン残基は省略されてもよく、上記の成熟軽鎖定常領域は配列番号３５と呼ばれるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域に融合している。ある抗体において、上記の成熟軽鎖は配列番号１６を含み、上記の成熟重鎖は配列番号１３を含む。ある抗体において、上記の成熟重鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、上記の重鎖定常領域は配列番号３９のアミノ酸配列を有し、上記の成熟軽鎖可変領域は配列番号１４のアミノ酸配列を有し、上記の軽鎖定常領域は配列番号３５のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
本発明は、さらに、上記成熟重鎖可変領域のいずれか、および／または上記成熟軽鎖可変領域のいずれか、たとえば配列番号１２または配列番号１５をエンコードする核酸を提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、上述の核酸のいずれかを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、上記抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、抗体をヒト化する方法であって、マウス抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を決定すること、マウス重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をエンコードする核酸、およびマウス軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をエンコードする核酸を合成すること、および、上記の核酸を宿主細胞において発現させて、ヒト化抗体を産生することを含み、上記のマウス抗体が１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８である方法を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに、ヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を産生する方法であって、上記の抗体の重鎖および軽鎖をエンコードする核酸で形質転換した細胞を培養して、上記の細胞から上記の抗体を分泌させること、および、細胞培養培地から上記の抗体を精製することを含み、上記の抗体が、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８のヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型である方法を提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、ヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体を産生する細胞株を生成する方法であって、抗体の重鎖および軽鎖をエンコードするベクターならびに選択可能なマーカーを細胞に導入する工程と、上記のベクターのコピー数が増加した細胞を選択するための条件で、上記の細胞を増殖させる工程と、上記の選択した細胞から単一細胞を単離する工程と、および、抗体の収率に基づいて選択した単一細胞からクローン化した細胞をバンクする工程とを含み、上記の抗体が、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８のヒト化、キメラ、または張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型である方法を提供する。上記方法は、さらに、選択的条件で細胞を増殖させ、自然に発現し少なくとも１００ｐｇ／Ｌ／ｄａｙで分泌する細胞株についてスクリーニングする工程とを含んでもよい。
【００２５】
本発明は、さらに、残基２７２および２７３を含むエピトープにてＡｐｏＥ（１〜２９９）に特異的に結合する単離抗体を提供する。
【００２６】
本発明は、さらに、上記抗体のいずれかおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥの３〜１０個の連続残基を含み且つ残基２７２にＣ末端を有するＡｐｏＥの単離フラグメントを提供する。このフラグメントは、当該フラグメントに対する抗体の誘起を支援するスペーサーを随意的に介して、キャリア分子に連結されていてもよい。このフラグメントは、ヒトへの投与のために薬学的に許容されるアジュバントと組み合わされて医薬組成物を形成し得る。
【００２８】
本発明は、さらに、アルツハイマー病の治療または予防の方法であって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤の有効な投与計画を、アルツハイマー病を有するまたはアルツハイマー病の危険性のある患者に実施し、これにより前記疾患の治療または予防をする工程を含む方法を提供する。上述の抗体のいずれも、そのような方法に使用可能である。
【００２９】
ある方法において、上記の抗体は、配列番号９の３つのカバトＣＤＲを含み、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および、配列番号１０の３つのカバトＣＤＲを含み、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む。ある方法において、上記の抗体は、ＡＡＴ８６０３５（配列番号８）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域フレームワークを含むヒト化１５Ｇ８抗体である。ある方法において、上記の抗体は、ＡＡＸ８２４９４（配列番号７）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域フレームワークを含むヒト化１５Ｇ８抗体である。ある方法において、上記の抗体は、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟重鎖可変領域、および、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する成熟軽鎖可変領域を含む。ある方法において、上記の抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含み、ただし、位置Ｌ３（カバト番号付け）がＶまたはＬによって占められることがあり、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＦまたはＹによって占められることがあり、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＲまたはＬによって占められることがあり、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＱまたはＥによって占められることがあり、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＱまたはＫによって占められることがあり、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＱまたはＶによって占められることがあり、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＤまたはＥによって占められることがあり、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＫまたはＲによって占められ得る。ある方法において、上記の抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含み、ただし、位置Ｌ３（カバト番号付け）がＬによって占められ、位置Ｌ３６（カバト番号付け）がＹによって占められ、位置Ｌ４６（カバト番号付け）がＬによって占められている。ある方法において、上記の抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含み、ただし、位置Ｈ１（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ３（カバト番号付け）がＫによって占められ、位置Ｈ５（カバト番号付け）がＶによって占められ、位置Ｈ４２（カバト番号付け）がＥによって占められ、位置Ｈ８３（カバト番号付け）がＲによって占められている。ある方法において、上記の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、および配列番号１４のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む。ある方法において、上記の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、配列番号１４のアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域、および配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。上記に代えて、Ｃ末端が残基２７２に位置する、ＡｐｏＥの３〜１０個の連続アミノ酸のフラグメントを使用することが可能である。このような方法は、ＡｐｏＥ４保有者である患者に実施されてもよい。
【００３０】
本発明は、さらに、ＡｐｏＥ４に関連する疾患の治療または予防の方法であって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤の有効な投与計画を、前記疾患を有するまたは前記疾患の危険性のある患者に実施し、これにより前記疾患の治療または予防をする工程を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明は、さらに、神経疾患の治療または予防の方法であって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体、またはそのような抗体を誘導する薬剤の有効な投与計画を、ＡｐｏＥ４保有者である患者に実施し、これにより前記疾患の治療または予防をする工程を含む方法を提供する。
【００３２】
本発明は、さらに、アルツハイマー病に対する活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、ＡｐｏＥおよびアミロイドベータ前駆体（ＡＰＰ）導入遺伝子を発現する遺伝子導入動物に上記の薬剤を投与する工程と、および上記の薬剤がアルツハイマー病の少なくとも１つの兆候または症状を阻止するかまたは遅延させるかを判断する工程とを含み、上記の薬剤が、ＡｐｏE（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体またはそのような抗体を誘導する薬剤である方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】マウス１５Ｇ８のアミノ酸配列とヒト化１５Ｇ８重鎖成熟可変領域との位置整合を示す図である。ヒトアクセプターＶＨ配列として、ＡＡＸ８２４９４（ＧＩ：６２４２１４６１）（配列番号７）由来のヒトアクセプターＶＨ配列を使用している。
【００３４】
【図２】マウス１５Ｇ８のアミノ酸配列とヒト化１５Ｇ８軽鎖成熟可変領域との位置整合を示す図である。ヒトアクセプターＶＬ配列として、ＡＡＴ８６０３５（配列番号８）由来のヒトアクセプターＶＬ配列を使用している。
【００３５】
【図３】完全長ＡｐｏＥ３、完全長ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３（１〜２７２）およびＡｐｏＥ４（１〜２７２）の免疫沈降ブロットを示す図である。
【００３６】
【図４】モノクローナル抗体１２Ｃ１２（左パネル）、１５Ｅ１０（中央パネル）および１５Ｇ８（右パネル）を使用した、野生型マウス（“ｗｔ”）、ａｐｏＥノックアウトマウス（“ＫＯ”）、ならびにヒトＡｐｏＥノックイン（Ｅ２，Ｅ３およびＥ４型）およびヒトアミロイドベータを発現する遺伝子導入マウス由来の組織溶解物のウエスタンブロットを示す図である。
【００３７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＡｐｏＥ３アミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２は、ＡｐｏＥ４アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号３は、ＡｐｏＥ３（１〜２７２）アミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号４は、ＡｐｏＥ４（１〜２７２）アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号５は、カップリングを容易にするためにリンカーとして人工ＣＧＧを加えたＡｐｏＥ ２６８〜２７２である。
【００４２】
配列番号６は、ＡｐｏＥ４（２６６〜２７６）のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号７は、ＡＡＸ８２４９４由来のヒトアクセプターＶＨ配列である。
【００４４】
配列番号８は、ＡＡＴ８６０３５由来のヒトアクセプターＶＬ配列である。
【００４５】
配列番号９は、ｍ１５Ｇ８ＶＨ可変領域（ｍ１２Ｃ１２ＶＨまたはｍ１５Ｅ１０ＶＨと同一）のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１０は、ｍ１５Ｇ８ＶＬ可変領域（ｍ１２Ｃ１２ＶＬまたはｍ１５Ｅ１０ＶＬと同一）である。
【００４７】
配列番号１１は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＨｖ１可変領域のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号１２は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＨｖ１可変領域の核酸配列である。
【００４９】
配列番号１３は、ＩｇＧ１ヒトＧ１ｍ３アロタイプ定常領域に融合したＨｕ１５Ｇ８ＶＨｖ１のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１４は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＬｖ１可変領域のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号１５は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＬｖ１可変領域の核酸配列である。
【００５２】
配列番号１６は、（定常領域のＮ末端にアルギニンが位置する）ヒト軽鎖カッパ定常領域に融合したＨｕ１５Ｇ８ＶＬｖ１のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号１７は、可変フレームワーク領域に復帰変異を有しないＨｕ１５Ｇ８ＶＨｖ２可変領域のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号１８は、可変フレームワーク領域に復帰変異を有しないＨｕ１５Ｇ８ＶＬｖ２可変領域のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号１９は、重鎖カバトＣＤＲ1のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号２０は、重鎖カバトＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号２１は、重鎖カバトＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号２２は、軽鎖カバトＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号２３は、軽鎖カバトＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号２４は、軽鎖カバトＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号２５は、ｍ１５Ｇ８ＶＨシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号２６は、ｍ１２Ｃ１２ＶＨシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号２７は、ｍ１５Ｅ１０ＶＨシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号２８は、ｍ１５Ｇ８ＶＬシグナルペプチド（ｍ１２Ｃ１２ＶＬまたはｍ１５Ｅ１０ＶＬシグナルペプチドと同一）のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号２９は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＨシグナルペプチドｖ１の核酸配列である。
【００６６】
配列番号３０は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＨシグナルペプチドｖ１のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号３１は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＨシグナルペプチドｖ２の核酸配列である。
【００６８】
配列番号３２は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＨシグナルペプチドｖ２のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号３３は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＬシグナルペプチドの核酸配列である。
【００７０】
配列番号３４は、Ｈｕ１５Ｇ８ＶＬシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号３５は、Ｎ末端にアルギニンが位置するヒト軽鎖カッパ定常領域のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号３６は、Ｎ末端にアルギニンが位置しないヒト軽鎖カッパ定常領域のアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号３７は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号３８は、ヒトＩｇＧ１ Ｇ１ｍ１アロタイプ重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号３９は、ヒトＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプ重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００７６】
配列番号４０は、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号４１は、ＡｐｏＥ ２６８〜２７２である。
【００７８】
定義
モノクローナル抗体および他の治療剤は、一般に単離した形態で提供される。これは、その薬剤が一般に、干渉タンパクおよびその薬剤の製造または精製に由来して生じる他の混入物から少なくとも５０％ｗ／ｗの純度にされたものであるが、その薬剤が、薬学的に許容されるキャリアまたはその薬剤の使用を容易にすることを目的とした他の媒体の過剰量と併用される可能性を排除するものではないことを意味する。モノクローナル抗体は、干渉タンパクおよび製造または精製由来の混入物から、少なくとも６０％，７０％，８０％，９０％，９５％または９９％ｗ／ｗの純度にされたものである。
【００７９】
本発明の抗体は、一般に、少なくとも１０６，１０７，１０８，１０９または１０１０Ｍ−１の会合定数で指定の標的に結合する。このような結合は、強度が検知可能なほど高く、少なくとも１つの無関係な標的に対して生じる非特異的結合から識別可能である点で特異的結合である。特異的結合は、特定の官能基間の結合の形成または特定の空間的一致（たとえば、錠と鍵タイプ）の結果であり得る。一方、非特異的結合は、通常、ファン・デル・ワールス力の結果である。しかし、特異的結合は、モノクローナル抗体が１つのかつただ１つの標的に結合することを必ずしも意味しない。
【００８０】
基本的な抗体構造ユニットは、サブユニットの四量体である。各四量体には、ポリペプチド鎖の同一の対が２つ含まれており、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部位には、抗原認識に主として関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域、たとえば、可変軽鎖領域（ＶＬ）および可変重鎖領域（ＶＨ）が含まれている。この可変領域は、当初、開裂可能なシグナルペプチドに連結されて発現される。このシグナルペプチドを持たない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることがある。したがって、たとえば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを持たない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部位は、エフェクター機能に主として関与する定常領域を規定する。
【００８１】
軽鎖はカッパまたはラムダのどちらかに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプを、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥと、それぞれ規定する。軽鎖および重鎖の内部において、可変領域および定常領域は、１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖にも約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域が含まれる（概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）， Ｃｈ． ７を参照）（すべての目的のために参照によって全体が組み込まれる）。
【００８２】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、無傷抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性の抗体を除いて、上記の２つの結合部位は同一である。鎖はすべて、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された、相対的に保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）という同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域によって位置整合されて、特異的エピトープへの結合が可能になっている。Ｎ末端からＣ末端までに、軽鎖および重鎖の双方はドメインＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバト（Ｋａｂａｔ），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９８７ ａｎｄ １９９１），またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７ （１９８７）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３ （１９８９）の定義に従う。カバトはまた、広く使用されており、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基が同一の番号を割り当てられる番号付け体系（カバト番号付け）を提供している。
【００８３】
「抗体」の用語には、無傷抗体およびその結合フラグメントが含まれる。一般に、フラグメントは、標的への特異的結合について、そのフラグメントが由来する無傷抗体と競合する。フラグメントには、分離した重鎖、軽鎖Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ，Ｆｖおよび単一ドメイン抗体が含まれる。単一（可変）ドメイン抗体には、従来の抗体におけるそのＶＬパートナーから分離したＶＨ領域（または、逆も同様）が含まれ（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６）,ラクダまたは軟骨魚類（たとえば、テンジクザメ）などの種に由来する、ＶＨ領域がＶＬ領域と会合していない（たとえばＷＯ ９４０４６７８を参照）ＶＨ領域（ＶＨＨとしても知られる）も含まれる。抗体の前者のタイプはＤａｂとしても知られ、後者はナノボディとしても知られる。定常領域または定常領域の一部分は、単一ドメイン抗体に存在してもしなくてもよい。たとえば、ラクダ由来の天然単一可変ドメイン抗体には、ＶＨＨ可変領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域が含まれている。単一ドメイン抗体は、従来の抗体への類似の研究手法によるヒト化の対象であり得る。抗体のＤａｂタイプは、通常、ヒト起原の抗体から得られる。抗体のナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標））タイプは、ラクダまたはサメ起原であり、ヒト化の対象であり得る。フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術、または無傷免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって産生することが可能である。「抗体」の用語には、単一特異性抗体に加えて、二重特異性抗体も含まれる。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５−３２１ （１９９０）； Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：１５４７−５３ （１９９２）を参照）。ある二重特異性抗体において、２つの異なる重鎖／軽鎖対には、モノクローナルまたはヒト化１５Ｇ８重鎖／軽鎖対、および、１５Ｇ８が結合するものとは異なるＡｐｏE上のエピトープに対して特異的な重鎖／軽鎖対が含まれる。
【００８４】
ある二重特異性抗体において、１つの重鎖／軽鎖対は、以下にさらに述べるように、モノクローナルまたはヒト化１５Ｇ８抗体であり、この重鎖／軽鎖対は、インスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、リポタンパク受容体、またはトランスフェリン受容体などの、血液脳関門に発現される受容体に結合する抗体由来である（Ｆｒｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８８：４７７１−４７７５， １９９１； Ｆｒｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３７３−３７７， １９９３）。このような二重特異性抗体は、受容体媒介トランスサイトーシスによって、血液脳関門を超えて輸送され得る。二重特異性抗体の脳への取り込みは、その二重特異性抗体を操作して、血液脳関門受容体へのその親和性を低減することによって、さらに増進され得る。上記の受容体への親和性を低減することは、脳内でのより広い分布をもたらす結果となる（たとえば、Ａｔｗａｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ． ３， ８４ｒａ４３， ２０１１； Ｙｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ． ３， ８４ｒａ４４， ２０１１を参照）。
【００８５】
「エピトープ」の用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸または１つ以上のタンパクの３次折り畳みによって近接する非連続アミノ酸から形成することが可能である。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、変性化溶媒に曝されても維持され、一方、３次折り畳みによって形成されるエピトープは、一般に、変性化溶媒での処理で失われる。エピトープは、一般に、固有の空間コンフォメーションに少なくとも３個以上、より一般には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法には、たとえば、Ｘ線結晶法および２次元核磁気共鳴がある。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６６， Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ． （１９９６）を参照。
【００８６】
同一のまたは重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原への他の抗体の結合に競合する１つの抗体の能力を示す、簡単なイムノアッセイによって特定することが可能である。抗体のエピトープは、抗原に結合した抗体の、接触残基を特定するＸ線結晶法によっても明確にすることが可能である。あるいは、１つの抗体の結合を減弱させまたは除去する、抗原のすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を減弱させまたは除去する場合、２つの抗体は同一のエピトープを有する。１つの抗体の結合を減弱させまたは除去するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を減弱させまたは除去する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【００８７】
抗体間の競合は、試験対象の抗体が共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される（たとえば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０：１４９５， １９９０を参照）。競合結合アッセイでの測定において、過剰の試験抗体（たとえば、少なくとも２ｘ，５ｘ，１０ｘ，２０ｘまたは１００ｘ）が、参照抗体の結合を少なくとも５０％、ただし好ましくは７５％，９０％または９９％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイ（競合する抗体）で特定される抗体には、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および、立体障害が生じることにより、参照抗体が結合するエピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
【００８８】
「患者」の用語には、予防または治療の処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳類が含まれる。
【００８９】
アミノ酸置換を保存的または非保存的と分類する目的で、アミノ酸は以下のようにグループ分けされる：グループＩ（疏水性側鎖）：ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ，ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ；グループＶ（鎖の向きに影響する残基）：ｇｌｙ，ｐｒｏ；および、グループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。保存的置換には、同一分類内のアミノ酸間の置換が含まれる。非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類のメンバーと交換することから成る。
【００９０】
配列同一性割合は、カバト番号付け体系によって最大に位置整合された抗体配列で決定される。位置整合の後、対象抗体領域（たとえば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同一領域と比較される場合、対象抗体領域と参照抗体領域との配列同一性割合は、対象および参照抗体領域の双方において同一のアミノ酸によって占められる位置の数を、ギャップを除外した前記２つの領域の整合位置の総数で割り、１００倍して百分率に変換したものである。
【００９１】
「アジュバント」の用語は、抗原と併せて投与されたときに抗原に対する免疫応答を増大させるおよび／またはその応答に向かわせるが、単独で投与されたときには抗原に対する免疫応答を生じない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、およびマクロファージの刺激などのいくつかの機構によって、免疫応答を増大させ得る。
【００９２】
簡潔化のために、「ＡｐｏＥ４保有者」の用語は、１つまたは２つのＡｐｏＥ４対立遺伝子を有する患者を指すために、また、「ＡｐｏＥ４非保有者」、「ＡｐｏＥ４非・保有者」または「非ＡｐｏＥ４保有者」は、ＡｐｏＥ４対立遺伝子を有しない患者を指すために使用されることがある。
【００９３】
疾患は、ＡｐｏＥ４保有者の集団が、非保有者の集団に比べて統計的に有意なほど、その疾患のより高い頻度での発生、その疾患のより大きな重症度、または、その疾患のより早い発現年齢を有する場合に、ＡｐｏＥ４対立遺伝子と関連付けられる。
【００９４】
個体は、対象が、少なくとも１つの既知の危険因子（たとえば、遺伝子的、生化学的、家族歴、状況的曝露）であって、その危険因子を有しない個体よりも、その危険因子を有する個体を、統計的に有意に大きい疾患発症の危険度に置く危険因子を有する場合、疾患の危険度が上昇する。
【００９５】
「症状」の用語は、患者によって認識される、歩行変調などの、疾患の主観的証拠を指す。「兆候」は、医師によって観察される疾患の証拠を指す。
【００９６】
統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。
【発明の詳細な説明】
【００９７】
Ｉ．概要
通常のヒトＡｐｏＥは、シグナルペプチドを除いて、長さが２９９個のアミノ酸であるが、インビボでのキモトリプシン様セリンプロテアーゼによる開裂によって切断して、Ｃ末端切断体、具体的にはアミノ酸２７２で切断されたフラグメントとすることが可能である。ＡｐｏＥ４は、他のＡｐｏＥアイソフォームよりも容易に、タンパク分解開裂を起こす。ＡｐｏＥ４の１〜２７２フラグメントは、組織培養において、および、１〜２７２フラグメントを発現する遺伝子導入マウスにおいて、神経毒性を有している。
【００９８】
本発明は、ＡｐｏE（１〜２９９）に比べて、あるいは残基２７３以降で終わるＡｐｏＥの他のＣ末端切断型に比べて、ＡｐｏE（１〜２７２）フラグメントに優先的に結合する抗体を提供する。これらの抗体は、このフラグメントの毒性を軽減する働きをする。本発明の実施のためにメカニズムの理解は必要でないが、毒性の軽減は、様々なメカニズムの中でもとりわけ、抗体が、このフラグメントの貪食を誘導する、ＡｐｏＥ（１〜２７２）の遊離濃度を低下させる、フラグメントの分子間もしくは分子内凝集もしくは他の分子への結合を阻害する、または、非毒性コンフォメーションを安定化する結果であるかも知れない。この抗体は完全長ＡｐｏEよりもＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合するので、切断フラグメントの毒性は、完全長ＡｐｏＥ（１〜２９９）の神経保護作用を許容できないほど減弱させることなく、阻止することが可能である。
【００９９】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）フラグメントに優先的に結合する抗体またはそのような抗体を誘導し得る薬剤は、アルツハイマー病およびＡｐｏＥ４の存在に関連する他の疾患を治療または予防する方法に使用することができる。
【０１００】
ＩＩ．ＡｐｏＥおよびそのフラグメント
文脈からそうでないと明らかでない限り、ＡｐｏＥは、ＡｐｏＥの天然ヒト型を、特にそのＡｐｏE２，Ｅ３またはＥ４対立遺伝子を指す。Ｅ３対立遺伝子の例示的配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０２６４９の残基１９〜３１７）を次に示す。
ＫＶＥＱＡＶＥＴＥＰ ＥＰＥＬＲＱＱＴＥＷ ＱＳＧＱＲＷＥＬＡＬ ＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶ ＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥ ＬＬＳＳＱＶＴＱＥＬ ＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥ ＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥ ＱＬＴＰＶＡＥＥＴＲ ＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡ ＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤ ＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧ ＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴ ＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ ＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡ ＶＹＱＡＧＡＲＥＧＡ ＥＲＧＬＳＡＩＲＥＲ ＬＧＰＬＶＥＱＧＲＶ ＲＡＡＴＶＧＳＬＡＧ ＱＰＬＱＥＲＡＱＡＷ ＧＥＲＬＲＡＲＭＥＥ ＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤ ＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲ ＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩ ＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲ ＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥ ＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶ ＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳ ＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号１）
【０１０１】
下線を付した位置１１２のシステインは、ＡｐｏＥ４においてはアルギニンであり、下線を付した位置１５８のアルギニンはＡｐｏＥ２においてはシステインである。したがって、ＡｐｏＥ４は次の配列を有する。
ＫＶＥＱＡＶＥＴＥＰ ＥＰＥＬＲＱＱＴＥＷ ＱＳＧＱＲＷＥＬＡＬ ＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶ ＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥ ＬＬＳＳＱＶＴＱＥＬ ＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥ ＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥ ＱＬＴＰＶＡＥＥＴＲ ＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡ ＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤ ＶＲＧＲＬＶＱＹＲＧ ＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴ ＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ ＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡ ＶＹＱＡＧＡＲＥＧＡ ＥＲＧＬＳＡＩＲＥＲ ＬＧＰＬＶＥＱＧＲＶ ＲＡＡＴＶＧＳＬＡＧ ＱＰＬＱＥＲＡＱＡＷ ＧＥＲＬＲＡＲＭＥＥ ＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤ ＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲ ＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩ ＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲ ＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥ ＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶ ＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳ ＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号２）
【０１０２】
ＡｐｏＥのフラグメントは、たとえばＡｐｏＥ（１〜２７２）のように、最初と最後のアミノ酸の範囲を規定することで示されることがある。完全長ＡｐｏＥタンパクについては、このようなフラグメントはＥ２，Ｅ３またはＥ４対立遺伝子のいずれをも含み得る。好ましいフラグメントはＡｐｏＥ（１〜２７２）である。このフラグメントのＥ３およびＥ４対立遺伝子を、Ｅ３を先にして、以下に示す。
ＫＶＥＱＡＶＥＴＥＰ ＥＰＥＬＲＱＱＴＥＷ ＱＳＧＱＲＷＥＬＡＬ ＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶ ＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥ ＬＬＳＳＱＶＴＱＥＬ ＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥ ＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥ ＱＬＴＰＶＡＥＥＴＲ ＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡ ＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤ ＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧ ＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴ ＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ ＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡ ＶＹＱＡＧＡＲＥＧＡ ＥＲＧＬＳＡＩＲＥＲ ＬＧＰＬＶＥＱＧＲＶ ＲＡＡＴＶＧＳＬＡＧ ＱＰＬＱＥＲＡＱＡＷ ＧＥＲＬＲＡＲＭＥＥ ＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤ ＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲ ＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩ ＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲ ＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥ ＤＭ（配列番号３）
ＫＶＥＱＡＶＥＴＥＰ ＥＰＥＬＲＱＱＴＥＷ ＱＳＧＱＲＷＥＬＡＬ ＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶ ＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥ ＬＬＳＳＱＶＴＱＥＬ ＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥ ＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥ ＱＬＴＰＶＡＥＥＴＲ ＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡ ＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤ ＶＲＧＲＬＶＱＹＲＧ ＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴ ＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨ ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ ＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡ ＶＹＱＡＧＡＲＥＧＡ ＥＲＧＬＳＡＩＲＥＲ ＬＧＰＬＶＥＱＧＲＶ ＲＡＡＴＶＧＳＬＡＧ ＱＰＬＱＥＲＡＱＡＷ ＧＥＲＬＲＡＲＭＥＥ ＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤ ＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲ ＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩ ＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲ ＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥ ＤＭ（配列番号４）
【０１０３】
あらゆる個体に存在する対立遺伝子型は、直接シーケンス法、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイなどの使用、対立遺伝子特異的プローブ、一塩基伸長法、対立遺伝子特異的伸長法などの、従来の多くの技術によって決定することができる。対立遺伝子型は、異なる対立遺伝子発現産物に特異的な抗体を使用するＥＬＩＳＡによって、タンパクレベルで決定することも可能である。遺伝子分析および免疫分析のキットが市販されている（たとえば、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）。対立遺伝子型の決定は、通常インビトロで行われ、つまり、取り出して決して患者に戻されることのない試料について行われる。
【０１０４】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．結合特異性および機能的特性
本発明は、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体を提供する。これらの抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８と呼ばれる抗体は、３つの例示的なＩｇＧ１ｋアイソタイプのマウスモノクローナル抗体である。マウスモノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０および１５Ｇ８は、同一の成熟可変領域を有する。マウスモノクローナル１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８の成熟重鎖可変領域は、配列番号９である。マウスモノクローナル１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８の成熟軽鎖可変領域は、配列番号１０である。
【０１０５】
＞ ｍ１５Ｇ８ＶＨ可変領域（ｍ１２Ｃ１２ＶＨまたはｍ１５Ｅ１０ＶＨと同一）
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＬＳＲＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＦＹＣＡＲＥＧＡＴＡＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号９）
【０１０６】
＞ ｍ１５Ｇ８ＶＬ可変領域（ｍ１２Ｃ１２ＶＬまたはｍ１５Ｅ１０ＶＬと同一）
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＱＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１０）
【０１０７】
優先的な結合とは、抗体が、ＡｐｏE（１〜２９９）に対するよりもＡｐｏＥ（１〜２７２）に対して、検出可能により強く（つまり、より高い会合定数で）結合すること（つまり、実験誤差を超えて結合すること）を意味する。好ましい抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２９９）よりもＡｐｏＥ（１〜２７２）に対して、少なくとも２，５または１０倍高い会合定数を有する。いくつかの抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２７２）に結合し、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に対する有意な結合性を欠く（つまり、ＡｐｏＥ（１〜２９９）と無関係な対照タンパクとの結合を区別できない）。いくつかの抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２９９）よりもＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合し、ＡｐｏＥ（１〜２７２）の遊離Ｃ末端に対して末端特異的である。このような抗体は、遊離型のＡｐｏＥ（１〜２７２）のＣ末端アミノ酸（つまり、ＡｐｏＥ（１〜２９９）で生じているように他のアミノ酸に付着しているのではないカルボキシル基を有する）を含むエピトープを認識する。末端特異的抗体は、たとえば、ＡｐｏＥの残基２６３〜２７２，２６４〜２７２，２６５〜２７２，２６６〜２７２，２６７〜２７２，２６８〜２７２，２６９〜２７２または２７０〜２７２内部のエピトープに結合し得る（内部には範囲を規定する位置が含まれる）。ＡｐｏＥ（１〜２７２）に対する末端特異的抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に対して優先的な結合を示すが、ＡｐｏＥ（１〜２９９）へのあらゆる程度の特異的結合を欠いてもよいし欠かなくてもよい。ＡｐｏＥ（１〜２９９）よりもＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する他の抗体は、末端特異的ではないが、たとえば、ＡｐｏＥ（１〜２７２）とＡｐｏＥ（１〜２９９）との折り畳みパターンの差異によって、ＡｐｏＥ（１〜２９９）には存在しないか、または少なくとも精密に複製されない、ＡｐｏＥ（１〜２７２）に存在するコンフォメーションエピトープを認識するかも知れない。
【０１０８】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）のＣ末端への末端特異的抗体は、このフラグメントのＣ末端アミノ酸を含むペプチドで免疫化することによって、初めから生成することが可能である。通常、このようなペプチドは、Ｃ末端アミノ酸を含むＣ末端由来の３〜１０個の連続アミノ酸を有し、５または６個の連続アミノ酸のペプチドが好ましい。このようなペプチドは、好ましくは、このペプチドへの抗体応答を引き起こすのに役立つ異種のコンジュゲート分子に付着している。付着は、直接でも、スペーサーペプチドまたはアミノ酸を介してでも可能である。システインが、その遊離ＳＨ基がキャリア分子の付着を容易にするので、スペーサーアミノ酸として使用される。ポリグリシンリンカー（たとえば、２〜６個のグリシン）も使用することができ、グリシンとこのペプチドとの間にシステイン残基を有しても有しなくてもよい。キャリア分子は、このペプチドに対する抗体応答を引き起こすのに役立つＴ細胞エピトープを提供する働きをする。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのいくつかのキャリアが使用可能である。ペプチドスペーサーを、固相ペプチド合成の一部として、ペプチド免疫原に付加することができる。ペプチドスペーサーは、固相ペプチド合成の一部として、ペプチド免疫原に付加し得る。キャリアは、一般に、化学架橋によって付加される。使用可能な化学架橋の例には、クロス−Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルまたはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）がある（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． １９８８； Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：７７８−７８０ （１９８８）； Ｃｈｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７８：２７−４７ （１９９３）； Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７４：１９７−２０３ （１９９３）； Ｆａｌｋ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３９：２３０−２４２ （１９９４）； ＷＯ ９８／２３６３５；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６０：３３６３−３３７３（１９９８）を参照）。目的はペプチドの遊離Ｃ末端への抗体を生成することなので、キャリアおよびスペーサーが存在する場合は、一般にペプチドのＮ末端に付着される。他のペプチドに対する末端特異的抗体を生成する例示的な手順は、たとえば、Ｋｏｎｉｇ， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７７：３４４−３５５ （１９９６）， Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１５８ （２）：１２０−１２８ （１９９３）； Ｇｒａｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：（１３）：７０１３−６ （１９９５）に記載されている。
【０１０９】
随意的スペーサーおよびキャリアを有するペプチドは、以下に詳述するように、実験動物またはＢ細胞を免疫化するために使用することができる。ハイブリドーマ上清は、免疫原として使用されるＡｐｏＥペプチドへの結合能力について試験し得る。ペプチドは、スクリーニングアッセイを容易にするために、キャリアまたは他のタグに付着することができる。この場合、キャリアまたはタグは、ＡｐｏＥペプチドではなくスペーサーまたはキャリアに対する特異的な抗体を排除するために、免疫化に使用されるスペーサーおよびキャリア分子の組み合わせとは選択的に異なる。抗体は、ペプチド免疫原の切断部位を架橋するペプチドに対してもスクリーニングすることができる。たとえば、ペプチド免疫原がＡｐｏＥの残基２７２で終わる場合、切断部位を架橋するペプチドには少なくともＡｐｏＥの残基２７２および２７３が含まれる。抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２７２）への結合についても、また、ＡｐｏＥ（１〜２９９）への結合の欠如または少なくとも結合の減少についても、スクリーニングすることができる。このようなアッセイで使用されるＡｐｏＥは、Ｅ２，Ｅ３またはＥ４アイソフォームのいずれでもあり得る。
【０１１０】
本発明の抗体の中には、マウスモノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８と同一のまたは重複するエピトープに結合するものがある。ある抗体は、ＡｐｏＥへの特異的結合について、マウスモノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８と競合する。このような結合エピトープまたは特異性を有する抗体は、ＡｐｏＥまたは所望のエピトープを含むその一部分でマウスを免疫化し、生じる抗体を、ＡｐｏＥ（１〜２９９）よりもＡｐｏＥ（１〜２７２）への優先的な結合について、随意的にマウスモノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８との競合において、スクリーニングすることによって生成することが可能である。
【０１１１】
選択されたマウス抗体（たとえば１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８）の結合特異性を有する抗体は、ファージ提示法の変法を用いて生成することも可能である。Ｗｉｎｔｅｒ， ＷＯ ９２／２０７９１を参照。この方法は、ヒト抗体の生成に特に適している。この方法においては、選択されたマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域のどちらかが、出発物質として使用される。たとえば、軽鎖可変領域が出発物質として選択される場合、メンバーが同一の軽鎖可変領域（つまり、マウス出発物質）および異なる重鎖可変領域を提示するファージライブラリが構成される。この重鎖可変領域は、たとえば、再配列したヒト重鎖可変領域のライブラリから得ることができる。ＡｐｏＥ（１〜２７２）に対して強い特異的結合（たとえば、少なくとも１０８および好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）を示すファージが選択される。このファージ由来の重鎖可変領域が、その後、さらなるファージライブラリを構成する出発物質として働く。このライブラリにおいて、各ファージは、同一の重鎖可変領域（つまり、最初の提示ライブラリから特定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。この軽鎖可変領域は、たとえば、再配列したヒト可変軽鎖領域のライブラリから得ることができる。再び、ＡｐｏＥ（１〜２７２）に対して強い特異的結合を示すファージが選択される。得られる抗体は、通常、マウス出発物質と同一または類似のエピトープ特異性を有する。
【０１１２】
他の抗体は、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８などの、例示的抗体の重鎖および軽鎖をエンコードするｃＤＮＡの変異生成によって得ることが可能である。成熟重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８に対して少なくとも６２．５％，６５％，７５％，８５％，９０％，９５％または９９％同一であり、その機能的特徴を保持する、および／または、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（たとえば、保存的置換）、削除もしくは挿入により、それぞれの抗体から相違するモノクローナル抗体もまた本発明に含まれる。このような抗体の中には、各ＣＤＲは、６つ以下（たとえば、１，２，３，４，５または６つ）の置換、削除または挿入で、１５Ｇ８由来の対応するＣＤＲと配列が異なるものがある。対応する１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８のＣＤＲに対して、少なくとも６２．５％，６５％，７５％，８５％，９０％，９５％，９９％または１００％同一である、カバトによって規定された、少なくとも１つ好ましくは６つすべてのＣＤＲを有するモノクローナル抗体もまた含まれる。ある抗体は、ＣＤＲ Ｈ２以外の１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８の各ＣＤＲに対して、少なくとも８０，９５または１００％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２に対して少なくとも６２．５％の同一性をする。マウスモノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０および１５Ｇ８は、各々、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４の３つのカバト軽鎖ＣＤＲおよび配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１の３つのカバト重鎖ＣＤＲを有する。
【０１１３】
重鎖カバトＣＤＲ1
ＦＹＡＭＳ（配列番号１９）
【０１１４】
重鎖カバトＣＤＲ２
ＳＬＳＲＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）
【０１１５】
重鎖カバトＣＤＲ３
ＥＧＡＴＡＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）
【０１１６】
軽鎖カバトＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＱ（配列番号２２）
【０１１７】
軽鎖カバトＣＤＲ２
ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２３）
【０１１８】
軽鎖ＣＤＲ３カバト
ＦＱＧＳＨＶＰＷＴ（配列番号２４）
【０１１９】
末端特異的ではないが、ＡｐｏＥ（１〜２７２）に存在し、ＡｐｏＥ（１〜２９９）には存在しないか精密に複製されないコンフォメーションエピトープに結合する、ＡｐｏＥ（１〜２７２）とＡｐｏＥ（１〜２９９）とを識別する抗体は、特徴的コンフォメーションを発現するのに十分なより長いペプチド免疫原、たとえばＡｐｏＥ（１〜２７２）自体または少なくともその５０，１００，２００または２５０個の連続残基、で免疫化することによって、生成することが可能である。より長いペプチドは、様々な方法、とりわけ組み換え発現により生成することが可能である。このような方法で生成された抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べて優先的なAｐｏＥ（１〜２７２）への結合についてスクリーニングされる。
【０１２０】
本発明は、好ましくは、ＡｐｏE（１〜２９９）に比べて、より長い切断フラグメント、つまりＡｐｏＥ（１〜２７３）〜ＡｐｏE（１〜２９８）のフラグメント、に結合する抗体、および、そのようなフラグメントのＣ末端に対して末端特異的な抗体も提供する。
【０１２１】
本発明はまた、タンパク分解開裂の部位の両側の２残基を含むエピトープを有する抗体を提供する。ＡｐｏＥ（１〜２７２）を生成する開裂の部位について、それら２残基はＡｐｏＥの残基２７２および２７３である。このような抗体は、開裂部位の両側の２残基を含むペプチドを免疫原として使用して生成することが可能である。末端特異的抗体を生成する場合と同様に、このようなペプチドは、一般に、すべてＡｐｏＥ由来の約３〜１０個の連続アミノ酸を含む。このペプチドは、末端特異的抗体の生成で述べたように、随意的にスペーサーを介して、コンジュゲート分子に連結することができる。
【０１２２】
Ｂ．  非ヒト抗体
免疫原に対するマウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットなどの他の非ヒトモノクローナル抗体の生成は、たとえば、上記の免疫原でその動物を免疫化することによって行うことができる。Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ＣＳＨＰ ＮＹ， １９８８）を参照（すべての目的のために参照によって組み込まれる）。このような免疫原は、天然源から、ペプチド合成によって、または組み換え発現によって得ることが可能である。
【０１２３】
随意的に、上記の免疫原はアジュバントと共に投与することができる。以下に述べるように、いくかの型のアジュバントが使用可能である。完全フロイントアジュバントに続く不完全アジュバントが、実験動物の免疫化に好ましい。ウサギまたはモルモットが、一般に、ポリクローナル抗体の作成に用いられる。マウスは、一般に、モノクローナル抗体の作成に用いられる。抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２７２）またはＡｐｏＥの他の切断型への特異的結合についてスクリーニングされる。抗体はさらに、ＡｐｏＥ（１〜２９９）への、残基２７２〜２７３におよぶ残基を含むＡｐｏＥのペプチドへの、またはＡｐｏＥの切断型を生じる他の開裂部位におよぶペプチドへの、特異的結合の欠如についてスクリーニングされてもよい。このようなスクリーニングは、欠失変異体のコレクションに対する抗体の結合を測定し、どの欠失変異体が抗体に結合するかを決定することによって、達成することが可能である。結合は、たとえば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ（商標）またはＥＬＩＳＡによって評価することができる。
【０１２４】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体（たとえば、１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８）由来のＣＤＲを、ヒト「アクセプター」抗体配列に移植した、遺伝子的改変抗体である（たとえば、Ｑｕｅｅｎ， ＵＳ ５，５３０，１０１ ａｎｄ ５，５８５，０８９； ｉｎｔｅｒ， ＵＳ ５，２２５，５３９； Ｃａｒｔｅｒ， ＵＳ ６，４０７，２１３； Ａｄａｉｒ， ＵＳ ５，８５９，２０５ ａｎｄ ６，８８１，５５７， ａｎｄ Ｆｏｏｔｅ， ＵＳ ６，８８１，５５７を参照）。アクセプター抗体配列は、たとえば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列（たとえば、カバトの軽鎖または重鎖可変領域コンセンサス配列、１９９１、上記）、または生殖細胞系列可変領域配列であり得る。
【０１２５】
重鎖のためのアクセプター配列の例は、ＡＡＸ８２４９４（ＧＩ：６２４２１４６１）のＧｅｎＢａｎｋアクセッションコードを有するヒト成熟重鎖可変領域である。このアクセプター配列のＣＤＲ Ｈ１およびＨ２は、マウス１５Ｇ８重鎖のもののカノニカル型と同一である（１５Ｇ８のＣＤＲ Ｈ３はカノニカルクラスを持たない）。このアクセプター配列は、重鎖可変領域フレームワークにおいて、マウス１５Ｇ８重鎖可変領域フレームワークに対して８２％の配列同一性を有する。異なるアクセプター配列が使用される場合、そのアクセプターは、たとえば、ＡＡＬ５７８３７（ＧＩ：１８０４２１１７；マウス１５Ｇ８重鎖可変領域フレームワークに対して７７％の配列同一性）のＧｅｎＢａｎｋアクセッションコードを有するヒト成熟重鎖可変領域由来の成熟重鎖可変領域、または、そのような配列の１つを組み込んだ成熟重鎖可変領域配列であり得る。
【０１２６】
軽鎖について、アクセプター配列の例は、ＡＡＴ８６０３５（ＧＩ：５０８９８１６３）のＧｅｎＢａｎｋアクセッションコードを有する成熟軽鎖可変領域である。このアクセプター配列は、マウス１５Ｇ８軽鎖と同一のカノニカル型を有する３つのＣＤＲを含み、軽鎖可変領域フレームワークにおいて８１％の配列同一性を有する。異なるアクセプターが使用される場合、そのアクセプターは、たとえば、ＢＡＣ０１７３０（ＧＩ：２１６６９４１１；マウス１５Ｇ８軽鎖可変領域フレームワークに対して８１％の配列同一性）もしくはＡＢＣ６６８６３（ＧＩ：８４７９７８２８；マウス１５Ｇ８軽鎖可変領域フレームワークに対して８０％の配列同一性）のＧｅｎＢａｎｋアクセッションコードを有する成熟軽鎖可変領域由来の他の成熟軽鎖配列、または、そのような配列の１つを組み込んだ成熟軽鎖可変領域配列であり得る。
【０１２７】
ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体由来のいくつかのまたはすべてのＣＤＲ、ならびに、存在する場合、完全にまたは実質的にヒト抗体配列由来の可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも１つ、２つおよび通常３つすべてのＣＤＲ、ならびに、存在する場合、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも１つ、２つおよび通常３つすべてのＣＤＲ、ならびに、存在する場合、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびｄＡｂを除いて、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるＣＤＲは、（カバトによって規定された）対応残基の少なくとも８５％，９０％，９５％または１００％が、それぞれのＣＤＲ間で同一である場合、実質的に非ヒト抗体における対応するＣＤＲ由来である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、カバトによって規定された対応残基の少なくとも８５，９０，９５または１００％が同一の場合、ヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域にそれぞれ由来する。
【０１２８】
ヒト化抗体は、マウス抗体由来の（好ましくはカバト規定の）６つすべてのＣＤＲを組み込んでいることが多いが、すべてのＣＤＲよりも少ない（たとえば、少なくとも３つ、４つまたは５つの）マウス抗体由来のＣＤＲで作成することも可能である（たとえば、Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：３０７６， ２００２； Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３２０： ４１５−４２８， ２００２； Ｉｗａｈａｓｈｉ ｅｔ aｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６：１０７９−１０９１， １９９９； Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６４：１４３２−１４４１， ２０００）。
【０１２９】
いくつかの抗体において、ＣＤＲの一部、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットのみが、ヒト化抗体において結合を維持するために必要である。抗原に接触せずＳＤＲ内に位置しないＣＤＲ残基は、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１， １９８７）の外に存在するカバトＣＤＲの領域から、分子設計でおよび／または実験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４１： ８６３， ２００４に記載されているようにして、以前の研究に基づいて特定することが可能である（たとえば、ＣＤＲ Ｈ２内の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要でないことが多い）。したがって、たとえば、あるヒト化抗体は、６つまでの置換、削除または挿入を有するＣＤＲ Ｈ２、または、ドナー抗体のＣＤＲ Ｈ２に対して少なくとも６２．５％の配列同一性を有することが可能である。このようなヒト化抗体において、１つ以上のドナーＣＤＲ残基が存在しない、またはドナーＣＤＲ全体が欠如している位置では、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列における対応する（カバト番号付けの）位置を占めるアミノ酸であり得る。ＣＤＲにおいてドナーアミノ酸に代わるアクセプターのそのような置換をいくつ含めるかには、競合する考察のバランスが反映される。そのような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減少させ、その結果、潜在的な免疫原性を低下させる点で、潜在的に有益である。しかし、置換によって親和性が変化することもあり得るので、親和性の大きな低下は回避するのが好ましい。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も、実験的に選択することが可能である。
【０１３０】
ヒトアクセプター抗体配列は、随意的に、多くの既知ヒト抗体配列からから選択して、ヒトアクセプター配列可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの高度の配列同一性（６５〜８５％同一性）をもたらすことが可能である。
【０１３１】
ヒト可変領域フレームワーク残基由来のあるアミノ酸は、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または抗原への結合に対するあり得る影響に基づいて、選択して置換することが可能である。可能性のあるそのような影響の調査は、モデリング、特定の位置のアミノ酸の特性の検査、または、特定のアミノ酸の置換もしくは変異原性の影響の実験的観察によってなされる。
【０１３２】
たとえば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基とでアミノ酸が異なる場合、アミノ酸が合理的に以下のように期待できるときは、ヒトフレームワークアミノ酸はマウス抗体由来の等価フレームワークアミノ酸によって置換し得る：
（１）抗原に非共有的に直接結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）そうでなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（たとえば、ＣＤＲ領域から６Å未満）、（たとえば、同種の既知免疫グロブリン鎖の解析済みの構造上で軽鎖または重鎖をモデリングすることによって特定される）、および
（４）ＶＬ−ＶＨ接合部分に参画する残基と相互作用する。
【０１３３】
Ｑｕｅｅｎ， ＵＳ ５，５３０，１０１によって規定されるクラス（１）〜（３）に由来するフレームワーク残基は、交互にカノニカル残基およびバーニア残基と呼ばれることがある。ＣＤＲループのコンフォメーションを決定するドナーＣＤＲループのカノニカルクラスを規定するフレームワーク残基は、カノニカル残基と呼ばれることがある（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６， ９０１−９１７ （１９８７）， Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＆ Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６３， ８００−８１５， １９９６）。抗原結合ループコンフォメーションが抗原への抗体の適合の微調整において役割を有するのを支援するフレームワーク残基の層は、バーニア残基と呼ばれることがある（Ｆｏｏｔｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ， １９９２， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ． ２２４， ４８７−４９９）。置換の他の候補は、潜在的なグリコシル化部位を生成する残基である。置換の他の候補は、その位置のヒト免疫グロブリンには稀な、アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価な位置由来の、または、より一般的なヒト免疫グロブリンの等価な位置由来の、アミノ酸で置換することが可能である。置換の他の候補は、その位置のヒト免疫グロブリンには稀な、アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【０１３４】
本発明の例示的ヒト化抗体には、配列番号１４または配列番号１８（それぞれＬ１およびＬ２と呼ばれる）の成熟軽鎖可変領域および配列番号１１または配列番号１７（それぞれＨ１およびＨ２と呼ばれる）の成熟重鎖可変領域によって特徴付けられる、１５Ｇ８のヒト化型が含まれる。たとえば、ヒト化抗体には、Ｈ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１が含まれる。
【０１３５】
本発明は、Ｈ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１の変異型も提供する。このような変異型において、ヒト化重鎖成熟可変領域は、配列番号１１または配列番号１７に対して、少なくとも６５％，８５％，９０％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を示し、ヒト化軽鎖成熟可変領域は、配列番号１４または配列番号１８に対して、少なくとも６５％，８５％，９０％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の配列同一性を示す。そのようなヒト化抗体の中には、Ｈ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１のカバトＣＤＲ領域と完全にまたは実質的に同一の３つの重鎖および３つの軽鎖カバトＣＤＲが含まれることがあり、これらはマウスドナー抗体のものと同一である。
【０１３６】
ある変異型は、少数（たとえば、一般に１，２，３，５，６，７，８，９または１０個以下）の置換、削除または挿入でＨ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２またはＨ２Ｌ１の配列と相違する。このような差異は、通常フレームワーク内であるが、ＣＤＲ内でも生じ得る。ヒト化ｍＡｂにおいてＣＤＲと接触しないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスｍＡｂまたは他のマウスもしくはヒト抗体の対応位置由来のアミノ酸の置換を収容し、さらに多くの潜在的なＣＤＲ接触残基が置換を受容し、またはさらにＣＤＲ内のアミノ酸が変更されてよい。ＣＤＲ置換の１つの例は、ＣＤＲ内の残基を、可変領域フレームワークを提供するために使用されるヒトアクセプター配列の対応位置を占める残基で、置換することである。
【０１３７】
Ｈ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１の変異型になされる置換は、置換されるアミノ酸に関して保存的なことが多い。ある変異型において、Ｈ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１における（保存的および非保存的の双方の）置換は、ヒト化抗体の結合親和性に実質的な影響を及ぼさない。ある変異型において、成熟変異型軽鎖および重鎖可変領域配列は、それぞれのＨ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１成熟軽鎖および重鎖可変領域に対して、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％同一である。これに代えて、他のヒト抗体アクセプター配列、特にマウス１５Ｇ８の可変領域フレームワーク配列に対して高い配列同一性を有するものも、ヒト化抗体可変領域フレームワーク配列を提供するために適している。
【０１３８】
Ｈ１Ｌ１，Ｈ２Ｌ２，Ｈ１Ｌ２およびＨ２Ｌ１の変異型の中には、例示の抗体に関連して述べたアクセプターからドナーへの置換の位置（すなわち、Ｌ３，Ｌ３６，Ｌ４６，Ｈ１，Ｈ３，Ｈ５，Ｈ４２およびＨ８３）の少なくとも１，２，３，４，５，６，７または８つすべては、それぞれ、残基Ｌ，Ｙ，Ｌ，Ｅ，Ｋ，Ｖ，ＥおよびＲ（マウスドナー抗体重鎖の対応位置を占める残基）によって占められるものがある。重鎖アクセプター配列がＡＡＸ８２４９４以外、または軽鎖アクセプター配列がＡＡＴ８６０３５以外の場合、アクセプターからドナーへの置換は、特定の可変フレームワーク領域位置の指定された占有にとって、その指定位置を占める残基がアクセプターとドナーとで既に同一であるか否かに応じて、必要であることもないこともある。
【０１３９】
Ｄ．  キメラおよび張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体
本発明は、さらに、非ヒト抗体、特に例示の１２Ｃ１２，１５Ｅ１０または１５Ｇ８抗体の、キメラおよび張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）型を提供する。
【０１４０】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（たとえばマウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域が、ヒト軽鎖および重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。このような抗体は、実質的にまたは完全にマウス抗体の結合特異性を保持し、ヒト配列の約３分の２である。
【０１４１】
張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲのいくつかおよび通常すべて、ならびに非ヒト可変領域フレームワーク残基のいくつかを保持するが、ＢまたはＴ細胞エピトープに寄与するかも知れない他の可変領域フレームワーク残基、たとえば、露出残基（Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９， １９９１）を、ヒト抗体配列の対応位置由来の残基で置換した、ヒト化抗体の型である。結果は、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換によって、よりヒト類似とされた抗体である。
【０１４２】
Ｅ．  ヒト抗体
ＡｐｏＥ（１〜２７２）またはＡｐｏＥの他の切断型に対するヒト抗体は、以下に述べる種々の技法によって提供される。ヒト抗体を生成する方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７ （１９８３）； Ｏｅｓｔｂｅｒｇ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，６３４，６６４；およびＥｎｇｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ４，６３４，６６６のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスの使用（たとえば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９３／１２２２７ （１９９３）； ＵＳ ５，８７７，３９７， ＵＳ ５，８７４，２９９， ＵＳ ５，８１４，３１８， ＵＳ ５，７８９，６５０， ＵＳ ５，７７０，４２９， ＵＳ ５，６６１，０１６， ＵＳ ５，６３３，４２５， ＵＳ ５，６２５，１２６， ＵＳ ５，５６９，８２５， ＵＳ ５，５４５，８０６， Ｎａｔｕｒｅ １４８， １５４７−１５５３ （１９９４）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）， Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ， ＷＯ ９１／１０７４１ （１９９１）を参照）、および、ファージ提示法（たとえば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９２／０１０４７， ＵＳ ５，８７７，２１８， ＵＳ ５，８７１，９０７， ＵＳ ５，８５８，６５７， ＵＳ ５，８３７，２４２， ＵＳ ５，７３３，７４３およびＵＳ ５，５６５，３３２を参照）がある。
【０１４３】
F.  定常領域の選択
キメラ、ヒト化（張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）を含む）またはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性補体および／または細胞媒介性細胞毒性が望まれるか否かに依存する。たとえば、ヒトアイソトープＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体媒介性細胞毒性を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有しない。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。
【０１４４】
ヒト軽鎖カッパ定常領域の一例は、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。配列番号３５のＮ末端アルギニンは省略可能であり、その場合、軽鎖カッパ定常領域は配列番号３６のアミノ酸配列を有する。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の一例は、配列番号３７のアミノ酸配列を有する。例示的ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域は、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含むテトラマーとして、分離した重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、または、重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結された一本鎖抗体として発現され得る。
【０１４５】
ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変異型および同型アロタイプ変異型を示し、すなわち、定常領域は、異なる個体において、1つ以上の多形位置にて相違し得る。同型アロタイプを認識する血清が１つ以上の他のアイソタイプの非多形領域に結合する点で、同型アロタイプはアロタイプと異なる。ヒト定常領域と呼ぶものには、以下に述べるように、エフェクター機能を低下または向上させるための、天然アロタイプまたは３，５または１０個までの置換における多型位置を占める残基の、あらゆる天然アロタイプまたはあらゆる置換を有する定常領域が含まれる。たとえば、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１ Ｇ１ｍ１またはＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプであってもよく、それぞれ、配列番号３８または配列番号３９のアミノ酸配列を有する。さらに別の重鎖定常領域は、Ｃ末端リジンを欠くことを除いて、配列番号３８または配列番号３９のアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
重鎖のＣ末端リジンなどの、軽鎖および／または重鎖のアミノまたはカルボキシ末端における1個または数個のアミノ酸は、分子の一部またはすべてにおいて、欠落または誘導体化してよい。置換は、定常領域において行うことができ、補体媒介細胞毒性またはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低下または向上させ（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，６２４，８２１； Ｔｓｏ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８３４，５９７；および、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３：４００５， ２００６を参照）、または、ヒトにおいて半減期を延長させる（たとえば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：６２１３， ２００４を参照）。置換の一例には、抗体の半減期を向上させるための位置２５０のＧｌｎおよび／または位置４２８のＬｅｕが含まれる（この段落においては定常領域についてＥＵ番号付けを使用する）。位置２３４，２３５，２３６および／または２３７のいずれかまたはすべてにおける置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体への親和性を低下させる（たとえば、ＵＳ ６，６２４，８２１を参照）。ヒトＩｇＧ１の位置２３４，２３５および２３７におけるアラニン置換は、エフェクター機能を低下させるために好ましい。ヒトＩｇＧ２における位置２３４，２３６および／または２３７は、アラニンによって置換され、位置２３５はグルタミンによって置換されてもよい（たとえば、ＵＳ ５，６２４，８２１を参照）。
【０１４７】
ある抗体において、軽鎖定常領域は配列番号３５のアミノ酸配列を有する。ある抗体において、重鎖定常領域は配列番号３９のアミノ酸配列を有する。ヒト化軽鎖の一例は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。ヒト化重鎖の一例は配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
【０１４８】
＞ ＩｇＧ１ヒトＧ１ｍ３アロタイプ定常領域に融合したＨｕ１５Ｇ８ＶＨｖ１
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＬＳＲＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＡＴＡＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３）
【０１４９】
＞ （定常領域のＮ末端にアルギニンが位置する）ヒト軽鎖カッパ定常領域に融合したＨｕ１５Ｇ８ＶＬｖ１
ＤＶＬＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＱＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＬＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１６）
【０１５０】
Ｇ．  組み換え抗体の発現
キメラ、ヒト化（張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）を含む）およびヒト抗体は、一般に、組み換え発現によって生成される。この抗体をエンコードする核酸は、所望の細胞型（たとえば、ＣＨＯまたはＳｐ２／０）における発現について、コドン最適化される。組み換えポリヌクレオチドコンストラクトには、一般に、抗体鎖のコード配列に操作可能に連結された発現制御配列が含まれ、これには生来または異種のプロモーター領域が含まれる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を変換すること、または真核生物宿主細胞に導入することが可能なベクターにおける真核生物プロモータシステムである。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高いレベルでの発現、ならびに交差反応抗体の収集および精製に好適な条件下に維持される。抗体鎖をエンコードするベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素などの選択可能な遺伝子も包含することができて、上記の抗体鎖をエンコードする核酸のコピー数の増幅を可能にする。
【０１５１】
Ｅ． Ｃｏｌｉは、抗体、特に抗体フラグメントを発現するために特に好適な原核細胞宿主である。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセスは、好ましい酵母宿主であり、要望どおりに、発現制御配列、複製起点、終結配列などを有する適切なベクターを持つ。一般的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に寄与する酵素が含まれる。
【０１５２】
哺乳類細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをエンコードするヌクレオチドセグメントを発現するために好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ， Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ， （ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＮＹ， １９８７）を参照。無傷の異種タンパクを分泌することが可能な好適な宿主細胞株のいくつかが、この技術分野において開発されており、これには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ヒーラ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびに、Ｓｐ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。好ましくは、これらの細胞は非ヒト細胞である。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９：４９ （１９８６））、ならびに、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列などの、必要な処理情報部位をはじめとする発現制御配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９ （１９９２）を参照。
【０１５３】
抗体重鎖および軽鎖をエンコードするベクターが細胞培養に導入されると、細胞プールを、無血清培地において成長生産性および産生物品質についてスクリーニングすることができる。次いで、最高産生の細胞プールをＦＡＣＳ系単一細胞クローニングに付して、モノクローナル株を生成することが可能である。７．５ｇ／Ｌ培養物を超える産生力化に相当する、１細胞１日当たり５０ｐｇまたは１００ｐｇを超える特定生産性が好ましい。単一細胞クローンによって産生される抗体は、濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ，ＩＥＦ，ＵＶスキャン、ＨＰ−ＳＥＣ、糖質−オリゴ糖マッピング、質量分析、および、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイについて試験することも可能である。その後、選択したクローンを、後の使用のために、多数のバイアルに入れてバンクし、冷凍保存することが可能である。
【０１５４】
一旦発現すると、抗体は、プロテインＡ捕捉、カラムクロマトグラフィー（たとえば、疎水的相互作用またはイオン交換）、ウイルス不活性化のための低ｐＨなど（概して、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ， １９８２）を参照）を含む、この技術分野の標準的処理に従って精製することが可能である。
【０１５５】
抗体の商業生産のための方法には、コドン最適化、プロモーター、転写要素、およびターミネーターの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞バンク、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、無血清単一細胞クローニング、タンパク力価の向上が含まれる（たとえば、ＵＳ ５，７８６，４６４， ＵＳ ５，８８８，８０９， ＵＳ ６，０６３，５９８， ＵＳ ６，１１４，１４８， ＵＳ ７，５６９，３３９， ＷＯ２００４／０５０８８４， ＷＯ２００５／０１９４４２， ＷＯ２００８／０１２１４２， ＷＯ２００８／１０７３８８，およびＷＯ２００９／０２７４７１を参照）。
【０１５６】
Ｈ．  核酸
本発明は、さらに、上述の重鎖および軽鎖のいずれかをエンコードする核酸を提供する。一般に、核酸は、その核酸によってエンコードされる成熟重鎖および軽鎖に融合したシグナルペプチド（たとえば、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３によってエンコードされ得る配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド）をエンコードする。核酸上のコード配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの、そのコード配列の発現を確実にするための調節配列と操作可能に連結し得る。重鎖および軽鎖をエンコードする核酸は、単離した形態で生じることが可能であり、または、１つ以上のベクターにクローン化することが可能である。核酸は、たとえば、固相合成または重複オリゴヌクレオチドのＰＣＲによって、合成することが可能である。重鎖および軽鎖をエンコードする核酸は、たとえば発現ベクター内に、１つの連続核酸として連結すること、または、たとえば各々をそれ自体の発現ベクターにクローン化して、分離することが可能である。
【０１５７】
ＩＶ．  能動免疫原
能動免疫として使用される薬剤は、受動免疫に関して説明した上述の抗体（たとえば、ＡｐｏＥ（１〜２９９）よりもＡｐｏＥ（１〜２７２）またはＡｐｏＥの他の切断型に優先的に結合する抗体）と同一タイプの抗体を患者に誘導するように働く。能動免疫に使用される薬剤は、実験動物にモノクローナル抗体を産生するために使用される免疫原（たとえば、ＡｐｏＥ（１〜２７２）などの所望の切断フラグメントのＣ末端由来の３〜１０個の連続アミノ酸のペプチド）と同一タイプであり得る。使用可能なフラグメントのいくつかの例には、ＡｐｏＥ ２７０〜２７２，２６９〜２７２，２６８〜２７２，２６７〜２７２，２６６〜２７２，２６５〜２７２，２６４〜２７２，および２６３〜２７２が含まれ、２６８〜２７２および２６７〜２７２が好ましい。
【０１５８】
異種キャリアおよびアジュバントは、使用される場合、モノクローナル抗体の産生に使用されるものと同一であってよいが、ヒトにおける使用の医薬的適合性を高めるために選択されてもよい。適するキャリアには、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、または、ジフテリア（たとえばＣＲＭ１９７）、Ｅ．ｃｏｌｉ、コレラもしくはＨ．ｐｙｌｏｒｉなどの他の病原性細菌由来のトキソイド、もしくは弱毒化毒素誘導体が含まれる。Ｔ細胞エピトープは、好適なキャリア分子でもある。いくつかのコンジュゲートは、本発明の薬剤を、免疫賦活ポリマー分子（たとえば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）またはグルカン（β １→２ポリマー））、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−１，ＩＬ−１ αおよびβペプチド，ＩＬ−２，γ−ＩＮＦ，ＩＬ−１０，ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（たとえば、ＭＩＰ１−αおよびβ，ならびにＲＡＮＴＥＳ）に連結することによって形成することが可能である。免疫原は、スペーサーアミノ酸（たとえば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）によってまたはよらずにキャリアに連結してよい。追加のキャリアにはウイルス様粒子が含まれる。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、偽ウイルスまたはウイルス由来粒子とも呼ばれ、ウイルスカプシドの多数の複製および／またはインビボで自己集合して明確な球対称のＶＬＰになり得るエンベロープタンパクから成る、サブユニット構造を表す（Ｐｏｗｉｌｌｅｉｔ， ｅｔ ａｌ．， （２００７） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（５）：ｅ４１５）。これに代えて、ペプチド免疫原は、ｐａｎ ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）などの、ＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分を結合し得る少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープに連結することが可能である。ＰＡＤＲＥは、ＵＳ ５，７３６，１４２， ＷＯ ９５／０７７０７，およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １ ：７５１−７６１ （１９９４）に記載されている。能動免疫原は、免疫原および／またはそのキャリアの多数の複製物が単一の共有結合分子として存在する、多量体型で存在し得る。
【０１５９】
フラグメントは、薬学的に許容されるアジュバントと共に投与されることが多い。アジュバントは、そのペプチドが単独で使用される場合よりも、誘導された抗体の力価および／または誘導された抗体の結合親和性を向上させる。免疫応答を引き起こすために、様々なアジュバントを、ＡｐｏＥの免疫原フラグメントと組み合わせて、使用することができる。好ましいアジュバントは、応答の定性的な形態に影響する免疫原のコンフォメーション変化を起こすことなく、免疫原への固有応答を増大させる。好ましいアジュバントには、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、３ Ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ（ＭＰＬ（商標））が含まれる（ＧＢ ２２２０２１１ （ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｍｏｎｔａｎａ， ｎｏｗ ｐａｒｔ ｏｆ Ｃｏｒｉｘａを参照）。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は、トリテルペン配糖体、つまりＱｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の皮から単離されたサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ｅｄｓ． Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ，１９９５）； ＵＳ ５，０５７，５４０）， （Ａｑｕｉｌａ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ； 現在、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。他のアジュバントは、水乳濁液中のオイルであり（スクアレンまたはピーナッツ油など）、モノホスホリルリピドＡ（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３６， ８６−９１ （１９９７））を参照）、プルロニックポリマー、およびマイコバクテリア死菌などの、免疫刺激剤と併用されてもよい。他のアジュバントは、ＣｐＧである（ＷＯ ９８／４０１００）。アジュバントは、活性薬剤を有する治療組成物の成分として投与することが可能であり、または、治療剤の投与前に、投与と同時に、もしくは投与後に、別個に投与することが可能である。
【０１６０】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）に対する抗体を誘導するＡｐｏＥの天然フラグメントの類似体も、使用することができる。たとえば、そのようなペプチドにおいて、１個以上またはすべてのＬアミノ酸は、Ｄアミノ酸で置換することが可能である。また、アミノ酸の順序も逆にすることができる（レトロペプチド）。ペプチドには、すべて逆順のＤアミノ酸（レトロインベルソペプチド）が含まれてもよい。ＡｐｏＥペプチドとの著しいアミノ酸配列類似性を必ずしも有していないペプチドおよび他の化合物が、それにもかかわらずＡｐｏＥペプチドの模倣体として機能し、同様の免疫応答を誘導する。上述したＡｐｏＥへのモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体も使用可能である。そのような抗Ｉｄ抗体は、抗原を模倣し、それに対する免疫応答を生じる（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｉｔ ｅｄ．， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ６ｔｈ ｅｄ．， ｐ． １８１を参照）。
【０１６１】
ペプチド（および、随意的に、そのペプチドに融合したキャリア）も、そのペプチドをエンコードし、患者において原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で発現される核酸の形態で、投与することが可能である。免疫原をエンコードする核酸セグメントは、一般に、意図する患者の標的細胞におけるＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーなどの調節因子に連結している。血液細胞における発現については、免疫応答の誘導に望ましいことであるが、軽鎖および重鎖免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー因子、またはＣＭＶ主要媒介物初期プロモーターおよびエンハンサーが、直接の発現に好適である。連結した調節因子およびコード配列は、ベクターにクローン化されることが多い。
【０１６２】
前記ＤＮＡは、裸（ｎａｋｅｄ）の（つまり、コロイドまたは封入材料を有しない）形態で供給することが可能である。これに代えて、レトロウイルスシステム（たとえば、Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｕｍｉｎ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． ３， １０２−１０９ （１９９３）を参照）、アデノウイルスベクター（たとえば、Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ５９１ １ （１９９３）を参照）、アデノ随伴ウイルスベクター（たとえば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９， １８６７ （１９９４）を参照）、ワクシニアウイルスおよび鳥ポックスウイルスを含むポックス科由来のウイルスベクター、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＵＳ ５，６４３，５７６を参照）由来のものなどのアルファウイルス属由来のウイルスベクター（たとえば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０， ５０８−５１９ （１９９６）を参照）、ならびに、水疱性口内炎ウイルス（ＷＯ ９６／３４６２５を参照）などのラブドウイルス、ならびに、パピローマウイルス（Ｏｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６， ３２５−３３３ （１９９５）； Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ， ＷＯ ９４／１２６２９およびＸｉａｏ ＆ Ｂｒａｎｄｓｍａ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２４， ２６３０−２６２２ （１９９６））を含む、いくつかのウイルスベクターシステムを使用することが可能である。
【０１６３】
免疫原をエンコードするＤＮＡ、またはこれを含むベクターは、リポソームにまとめることができる。好適な脂質および関連する類似体が、ＵＳ ５，２０８，０３６， ＵＳ ５，２６４，６１８， ＵＳ ５，２７９，８３３，およびＵＳ ５，２８３，１８５に記載されている。免疫原をエンコードするベクターおよびＤＮＡは、粒子状キャリアに吸着させ、または結合させることも可能であり、その例には、ポリメチルメタクリレートポリマーならびにポリラクチドおよびポリ（ラクチド−共−グリコリド）が含まれる（たとえば、ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ． １９９６を参照）。
【０１６４】
Ｖ．スクリーニング法
抗体は、既に述べたように、最初、意図する結合特異性（たとえば、ＡｐｏＥ（１〜２９９）よりもＡｐｏＥ（１〜２７２）への優先的結合）について、スクリーニングすることが可能である。能動免疫原も同様に、そのような結合特異性を有する抗体を誘導する能力についてスクリーニングすることが可能である。この場合、能動免疫原は実験動物を免疫化するのに使用され、その結果得られる血清は適当な結合特異性について試験される。
【０１６５】
所望の結合特異性を有する抗体は、次いで、細胞モデルおよび動物モデルにおいて試験することができる。細胞モデルには、ＡｐｏＥを天然に発現する、または、ＡｐｏＥ（１〜２９９）もしくはその切断フラグメント、特にＡｐｏＥ（１〜２７２）をエンコードするＤＮＡを導入された細胞が含まれる。このようなスクリーニングに用いられる細胞は、優先的には神経細胞である。細胞は、（たとえば、細胞抽出物のウエスタンブロットまたは免疫沈降により）ＡｐｏＥ（１〜２７２）のレベル低下について、または、実施例で説明するように、ＡｐｏＥ（１〜２７２）に起因する毒性低下についてスリーニングすることができる。抗体または能動免疫原は、ＡｐｏＥ４に関連する疾患の遺伝子導入動物モデルにおいてスクリーニングすることも可能である。このような遺伝子導入動物は、とりわけ、タウ、プレセニリンまたはアルファシヌクレインなどの、ヒトＡｐｏＥおよび／またはヒトＡＰＰ導入遺伝子を含み得る。このような遺伝子導入動物は、ＡｐｏＥに関連する疾患の少なくとも１つの兆候または症状を呈するように処置される。ヒトＡｐｏＥ導入遺伝子を有する多くの遺伝子導入マウスが、たとえば、対立遺伝子発現した、内因性対立遺伝子のノックアウト、完全長ＡｐｏＥ導入遺伝子、または切断フラグメント（たとえば、ＡｐｏＥ（１〜２７２））、プロモーターの選択、その他の因子において多様な科学文献に記載されている（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ／ｒｅｓ／ｃｏｍ／ｔｒａを参照）， Ｂｕｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２２， １０５３９−１０５４８ （２００２）， Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９７， ２８９２−２８９７ （２０００）， Ｔｅｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５７， １４９５−１５１０ （２０００） Ｒａｆｆａｉ ｅｔ  ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２： ＩＩ−１５０ （ａｂｓｔｒ．） （２０００）； Ｒａｆｆａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７： １１０６４−１１０６８ （２００２）。これらのモデルにおけるアルツハイマー病の病理の特徴には、シナプス前終末の数の減少、（ＡｐｏＥとＡＰＰの両方を発現するモデルにおける）プラーク沈着の増加、タウのリン酸化の増加、学習および記憶の損傷、ならびに長期増強の変化、水迷路を使用して評価することができる著しい学習障害が含まれる（Ｍａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０３， ５６４４−５６５１ （２００６）を参照）。抗体または活性薬剤の活性は、ＡｐｏＥ切断フラグメント、特にＡｐｏＥ（１〜２７２）の減少、Ａβのアミロイド沈着などの他の病理学的特徴の減少、行動欠陥の阻止または遅延、を含む種々の基準によって評価することができる。能動免疫原は、血清における抗体の誘導について試験することもできる。受動および能動免疫原はともに、遺伝子導入動物の血液脳関門を経由する抗体の脳内への移行について、試験することができる。抗体または活性薬剤についての試験は、通常、その抗体または活性薬剤を欠いた（たとえば、媒体で置換した）並列実験が行われる対照と組み合わせて行われる。とりわけ、以下のＡｐｏＥ４抗体（１５Ｄ２，１２Ｄ３，７Ｃ８およ���２Ｇ３）、ＡｐｏＥ３抗体（１２Ｅ５，１２Ｈ５および６Ｈ６），２Ｃ１１（ＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４の双方を認識する）、ならびに５Ｆ６（ＡｐｏＥを認識するが、他の点では特徴づけられない）は、対照として用いることができる。次いで、試験対象である抗体または活性薬剤に起因する疾患の兆候または症状の軽減、遅延または阻止を、対照と比較して評価することができる。
【０１６６】
ＶＩ．  処置に適する患者
ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在は、多くの神経疾患、ならびに、アルツハイマー病、ダウン症候群、軽度認識障害、血管アミロイド病（たとえば、脳アミロイド血管症）、パーキンソン病および他のレビー小体病、熱外傷、脳卒中、冠動脈バイパス手術の合併症、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、ならびにＣＮＳ虚血（たとえば、Ｍａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０３， ５６４４−５６５１ （２００６）を参照）を含む状態の危険性の増大、重度の増大および／または発症の低年齢化に関連づけられてきた。疾患および状態とＡｐｏＥ４対立遺伝子との広範な関連のため、本投与計画は、何らかの神経疾患を有する、またはいずれかを発症する危険性があると考えられる、ＡｐｏＥ４対立遺伝子のキャリアである対象の治療および予防に使用することが可能である。本投与計画は、上述の疾患またはＡｐｏＥ４対立遺伝子もしくは高レベルのＡｐｏＥ １〜２７２に関連する他の疾患のいずれかにおける治療または予防のために、ＡｐｏＥ４の保有状態にかかわらず、個体に使用することができる。本方法は、アルツハイマー病の治療または予防に、また、ＡｐｏＥ４保有者である患者において、特に適する。
【０１６７】
処置に適する患者には、現在症状を示している患者に加え、疾患の危険がありながら症状を示していない患者が含まれる。疾患の危険がある患者には、疾患の既知の遺伝的危険性を有するものが含まれる。そのような個体には、この疾患を経験したことのある親戚を有する者、および、遺伝学的または生化学的マーカーの分析によって危険性を判断された者が含まれる。危険性の遺伝学的マーカーには、特に、ヘテロ接合型の、さらにはホモ接合型のＡｐｏＥ４対立遺伝子がある。アルツハイマー病の危険性の他のマーカーには、ＡＰＰ遺伝子における変異、特に、それぞれＨａｒｄｙおよびＳｗｅｄｉｓｈ変異と呼ばれる位置７１７ならびに位置６７０および６７１での変異、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２の変異、ならびに、ＡＤ、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の家族歴がある。現在アルツハイマー病を患っている個体は、ＰＥＴイメージングによって、上述の危険因子の存在とともに特徴的認知症から認識することが可能である。加えて、ＡＤを有する個体を特定するために、いくつかの診断試験が利用可能である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ４２のレベルの測定が含まれる。タウレベルの上昇およびＡβ４２レベルの低下は、ＡＤの存在を示す。いくつかの変異はパーキンソン病と関連する。これらは、Ａｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３、またはロイシンリッチリピートキナーゼ、ＰＡＲＫ８などのパーキンソン病に関連する他の遺伝子における変異である。個体は、ＤＳＭ ＩＶ ＴＲの基準によって、上述の神経疾患のいずれかを有すると診断することも可能である。
【０１６８】
無症状の患者においては、どの年齢（たとえば、１０，２０，３０）でも処置を開始することができる。しかし、通常、患者が４０，５０，６０または７０歳という年齢に達するまでは、処置を始める必要がない。治療は、一般に、ある期間にわたる複数回の投与を必要とする。処置は、経時的に抗体を分析することによって観察される。応答が低下した場合、ブースター投与量が指示される。潜在的なダウン症候群の患者の場合、処置は、出生前に、治療剤を母親に投与することによって、または、誕生後短期間投与することによって行うことができる。
【０１６９】
ＶＩＩ．  医薬組成物および処置の方法
予防上の適用においては、抗体または抗体を誘導する薬剤もしくはこれを含有する医薬組成物が、疾患（たとえば、アルツハイマー病）にかかり易いあるいは疾患の危険のある患者に、危険性を低下させ、重度を抑え、または、その疾患の少なくとも１つの兆候もしくは症状の発現を遅らせるために有効な投与計画（用量、頻度、および投与経路）で投与される。特に、投与計画は、好ましくは、脳におけるＡｐｏＥ（１〜２７２）の蓄積を阻止しまたは遅延させるため、および／またはその毒性作用を阻止しまたは遅延させるため、および／または行動欠陥の進行を阻止しまたは遅延させるために有効である。治療的な適用においては、抗体または抗体を誘導する薬剤が、疾患（たとえば、アルツハイマー病）の疑いのある、または既に疾患にかかっている患者に、その疾患の少なくとも１つの兆候または症状を改善し、または少なくともさらなる悪化を阻止するために有効な投与計画（用量、頻度、および投与経路）で投与される。特に、投与計画は、好ましくは、毒性および／または行動欠陥に関連するＡｐｏＥ（１〜２７２）のレベルを低下させ、または少なくともさらなる上昇を阻止する。
【０１７０】
投与計画は、処置を受けた個々の患者が、本発明の方法で処置されない比較患者の対照集団における平均結果よりも好ましい結果を達成する場合、または、比較臨床試験（たとえば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相、または第ＩＩＩ相試験）において、ｐ＜０．０５または０．０１またはさらに０．００１のレベルで、対照患者に対して処置を受けた患者においてより好ましい結果が示される場合に治療的または予防的に有効であると判断される。
【０１７１】
有効用量は、投与の手段、対象部位、患者の生理状態、患者がＡｐｏＥ保有者であるか、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、および処置が予防であるか治療であるかを含む多くの異なる因子によって変わる。
【０１７２】
抗体についての例示的な投与量範囲は、約０．０１〜５ｍｇ／患者体重ｋｇであり、より一般には、０．１〜３ｍｇ／ｋｇまたは０．１５〜２ｍｇ／ｋｇまたは０．１５〜１．５ｍｇ／ｋｇである。抗体は、そのような投与量を、毎日、毎隔日、毎週、毎隔週、毎月、毎四半期、または経験的な分析によって決定される他のスケジュールに従って、投与することができる。例示的な処置は、長期、たとえば少なくとも６カ月にわたる複数の投与回数での投与を必要とする。追加の例示的な投与計画は、２週間に１回、１カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与を必要とする。
【０１７３】
能動投与のための薬剤の量は、ヒトへの投与について、患者当たり０．１〜５００μｇ、より一般には、注射１回当たり１〜１００または１〜１０μｇから変動する。注射のタイミングは、１日１回から１年１回または１０年１回と、大きく変動する。一般的な投与計画は、免疫化に続く６週間または２カ月などの時間隔でのブースター注射から成る。他の投与計画は、免疫化に続く１，２および１２カ月後のブースター注射から成る。他の投与計画は、生涯にわたる２カ月毎の注射を必要とする。上記に代えて、ブースター注射は、免疫応答の観察による指示に応じて、不定期的であり得る。
【０１７４】
抗体または抗体を誘導する薬剤は、好ましくは、末梢経路（つまり、投与されたまたは誘導された抗体が、血液脳関門を通って脳の所望の部位に到達する経路）で投与される。投与の経路には、局所的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内が含まれる。抗体の投与の好ましい経路は、静脈内および皮下である。能動免疫のための好ましい投与は、皮下および筋肉内である。このタイプの注射は、最も一般的に、腕または脚の筋肉になされる。いくつかの方法において、薬剤は、沈着物が堆積した特定の組織に直接注射、たとえば、頭蓋内注射される。
【０１７５】
非経口経路の医薬組成物は、好ましくは、無菌で実質的に等張であり、ＧＭＰ条件に従って製造される。医薬組成物は、単位用量（つまり、単回の投与のための用量）の形態で提供することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて、調製することが可能である。剤形は、選択される投与経路に依存する。注射については、抗体は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンガー液などの生理学的に適合する緩衝剤、または生理食塩水もしくは緩衝酢酸溶液として調製される（注射部位の不快感を軽減するため）。この溶液は、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散化剤などの製剤化剤を含有し得る。これに代えて、抗体は、使用の前に、好適な担体たとえば無菌で発熱物質を含まない水とで構成するために、凍結乾燥の形態であり得る。
【０１７６】
本投与計画は、処置中の疾患の治療または予防に有効な他の薬剤と組み合わせて、実施することが可能である。たとえば、アルツハイマー病の場合、本投与計画は、Ａβに対する免疫療法（ＷＯ／２０００／０７２８８０）、コリンエステラーゼ阻害剤、またはメマンチンと組み合わせることができ、パーキンソン病の場合、アルファシヌクレインに対する免疫療法（ＷＯ／２００８／１０３４７２）、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、ＣＯＭＴ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、アマンタジン、または抗コリン剤と組み合わせることができる。
【０１７７】
実施例
実施例１：  抗体調製
２７２にて終わるＡｐｏＥの新エピトープに特異的な抗体を調製するために、ＣＧＧ−ＬＶＥＤＭ（配列番号５）；リンカーとして、またカップリングを容易にするために人工ＣＧＧを加えたＡｐｏＥ ２６８〜２７２（ＬＶＥＤＭ；配列番号４１）を、ペプチド上のシステインへのヒツジ抗マウス上の遊離アミンの架橋を可能にするＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）を用いて、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）にコンジュゲートさせた。
【０１７８】
５匹のＡ／Ｊマウスを、第０日に、フロイント完全アジュバント中のペプチドコンジュゲート１００μｇで免疫化し、第１４，２８および５６日に、フロイント不完全アジュバント中のペプチド１００μｇで再度免疫化した。第６３日に、マウスから尾静脈切傷経由で採血し、次いで、血清の希釈液を用いて、ＣＧＧ−ＬＶＥＤＭペプチド（配列番号５）に対する抗体力価を決定した。すべての動物において、容認可能なレベルまで力価が上昇した。
【０１７９】
番号５の動物が２１８０００の力価を有していたので、融合に選択した。融合は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法の修正版を用いて行った。融合細胞を選択培地中で一晩インキュベートし、生存可能な細胞を計数し、融合細胞の選択のためのアザセリン、成長促進のためのｍＩＬ６、および、活性化オボアルブミンに結合させ、次いで、陽性クローンを撮像するために蛍光標識したＣＧＧ−ＬＶＥＤＭ（配列番号５）を加えた、ＧｅｎｅｔｉｘからのＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓに、約５０００細胞／ウェルにて再懸濁した。
【０１８０】
最初の選択は、ＣｌｏｎｅＰｉｘ−ＦＬソフトウェアを用いて行った。我々の基準で陽性とみなされるコロニーを９６ウェルプレートに移し、５０〜８０％コンフルエンスまで成長させて、ＣＧＧ−ＬＶＥＤＭ（配列番号５）には結合し、ＡｐｏＥのアミノ酸２６６〜２７６（ＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷ；配列番号６）におよぶペプチドには結合しないことについて、再スクリーニングした。この基準を満たし、良好な安定性を示した抗体をクローニングし増殖させて、組織培養培地から抗体を精製した。
【０１８１】
抗体は、ＡｐｏＥ（１〜２７２）への結合についても試験することができる。ＡｐｏＥ（１〜２７２）フラグメントは、ＡｐｏＥ２，Ｅ３およびＥ４アイソフォームのいずれでもあり得る。このようなフラグメントは、好ましくは、組み換えによって発現される。結合は、免疫沈降および／またはウエスタンブロットによって評価することが可能である。抗体は、所与の抗体が適当なフラグメントに特異的であるかを調べるために、対照と比較して、ＡｐｏＥ２，Ｅ３またはＥ４保有者由来のＡＤ脳組織についての免疫組織化学によって試験することもできる。
【０１８２】
実施例２：  抗体のインビトロ試験
導入されたヒトＡｐｏＥ４を発現するＮｅｕｒｏ ２Ａ細胞（神経芽細胞腫由来のマウス神経芽細胞、ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＣＬ−１３１）は、導入ヒトＡｐｏＥ４を処理して、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイで検出される（たとえば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０２， １８６９４−１８６９９ （２００５）を参照）ように）、いくつかのレベルで神経毒性を示す１〜２７２フラグメントにする。ＭＴＴは、代謝的に活性な細胞において還元されて、不溶の紫色ホルマザン結晶を形成する、黄色テトラゾリウム塩であり、ホルマザン結晶は界面活性剤の添加で可溶になる。次いで、その色を分光手段によって定量する。これらの細胞は、ＡｐｏＥ（１〜２７２）特異的抗ＡｐｏＥ抗体が、この神経細胞株において上記のフラグメントの毒性を阻むか否かを判断するために使用することができる。必要に応じて、微飲作用または飲作用などの機構によって、抗体の取り込みが生じ得る。リードスルー抗体（つまり、切断部位を架橋したエピトープを有する抗体）が、陰性対照として使用可能である。陽性の結果は、抗体処理細胞におけるＭＴＴシグナルが、非処理の対照（陰性対照）に比べて上昇することか、あるいは、導入されなかった細胞（陽性対照）と同様のシグナルであること（つまり、代謝活性の保存）である。
【０１８３】
ＡｐｏＥ（１〜２７２）を導入したＮｅｕｒｏ ２Ａ細胞で、同様のアッセイを行うことができる。これらの細胞は、タンパク分解処理なしで、ＡｐｏＥ １〜２７２の切断フラグメントを直接産生する。
【０１８４】
実施例３：  抗体のインビボ試験
ＡｐｏＥ（１〜２９９）に比べてＡｐｏＥ（１〜２７２）に優先的に結合する抗体またはそのような抗体を誘導する薬剤は、ＡＰＰ導入を背景にして、ヒトＡｐｏＥ４保有マウスに投与することができる。Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２０００ ｖｏｌ． ９７ ｎｏ． ６ ２８９２〜２８９７には、そのようなマウスの例として、内因性Ａｐｏ対立遺伝子がノックアウトされたマウスにヒトＡＰＰ Ｖ７１７ＦおよびヒトＡｐｏＥ４を導入されたマウスが記載されている。遺伝子導入マウスの脳の免疫組織学的染色およびこれらのマウスのウエスタンブロットは、そのような処理がなされず、マウスにおいて行動欠陥を生じる場合に、ＡｐｏＥ（１〜２７２）フラグメントのレベル上昇を示す。ＡｐｏＥ（１〜２７２）のレベルの低下、シナプトフィジンレベルの上昇、または行動欠陥の阻止は、したがって、有効性エンドポイントとして使用することができる。
【０１８５】
実施例４：  免疫沈降ブロット
溶液および試薬：  Ｍｉｌｌｉ−Ｑまたは同等の精製水を用いて以下の溶液を調製した：（１）１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；（２）１Ｘ細胞溶解緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２．５ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，１μｇ／ｍｌロイペプチン。使用の直前に、１ｍＭ ＰＭＳＦを細胞溶解緩衝液に加えた；（３）３Ｘ ＳＤＳ試料緩衝液：１８７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５°ＣにてｐＨ６．８），６％ｗ／ｖ ＳＤＳ，３０％グリセリン，１５０ｍＭ ＤＴＴ，０．０３％ｗ／ｖブロモフェノールブルー。プロテインＧアガロースビーズを免疫沈降に使用した。
【０１８６】
細胞溶解物調製：  培地を吸引した。調節剤を含有する新鮮な培地を加えることによって、細胞を所望の時間処理した。次いで、培地を除去し、非変性条件で細胞を採取するために、細胞を氷冷ＰＢＳですすいだ。ＰＢＳを除去し、０．５ｍｌの氷冷１Ｘ細胞溶解緩衝液を各プレート（１０ｃｍ）に加えた。プレートを氷上で５分間インキュベートした。細胞をプレートからかき取って、微小遠心管に移した。細胞を氷上に保ち、氷上で５秒間ずつ３回超音波処理した。試料を、１４，０００Ｘｇ，４°Ｃにて１０分間微小遠心分離し、上清を新しい管に移した。必要に応じて、分解物を−８０°Ｃにて保存した。
【０１８７】
免疫沈降およびブロッティング：  プロテインＡ／Ｇアガロースビーズへの非特異的結合を低減するために、溶解物プレクリーニング工程を行った。具体的には、２０μｌのアガロースビーズスラリーを２５０μｌの細胞溶解物に加えた。この混合液を４°Ｃにて３０分間インキュベートし、最大速度で２分間回転させた。上清を、次の工程の抗体のために、回収した。
【０１８８】
約２５０μｌの細胞溶解物を、５μｇの１次抗体１５Ｇ８と混合した。この混合物を、緩やかに揺らしながら４°Ｃにて一晩インキュベートした。次いで、プロテインＧアガロースビーズ（５０％ビーズスラリー２０μｌ）を加え、混合物を、緩やかに揺らしながら４°Ｃにて、さらに１〜３時間インキュベートした。試料を４°Ｃにて３０秒間、微小遠心分離した。ペレットを、１Ｘ細胞溶解緩衝液の５００μｌで５回洗浄した。洗浄の間、試料を氷上に保った。
【０１８９】
ペレットを、３Ｘ ＳＤＳ試料緩衝液２０μｌに再懸濁した。再懸濁したペレットをボルテックスし、次いで、３０秒間微小遠心分離した。試料を２〜５分間９５〜１００°Ｃに加熱し、１４，０００Ｘｇにて１分間微小遠心分離した。約１５〜３０μｌの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２〜１５％）に載せた。１５０ボルトにて電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ニトロセルロース膜へ電気的に転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）した。膜を２５ｍｌブロッキングバッファー中で室温にて１時間インキュベートし、それぞれ１５ｍｌのＴＢＳ／Ｔで５分間、３回洗浄した。
【０１９０】
次に、膜を、１０ｍｌ１次抗体希釈緩衝液中で１次抗体抗ＡｐｏＥ４抗体１Ｆ９（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ｍ０６７−３）と共に、穏やかに攪拌しながら４°Ｃにて一晩インキュベートした。次いで、膜を、それぞれ１５ｍｌのＴＢＳ／Ｔで５分間、３回洗浄した。その後、膜を、希釈緩衝液中の１：２００００ヤギ抗マウスＩｇＧ＿ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ抗体（Ｌｉ−ｃｏｒ Ｂｉｏ ＃９２６−３２２１０）１０ｍｌと共に、穏やかに攪拌しながら室温にて１時間インキュベートし、それぞれ１５ｍｌのＴＢＳ／Ｔで５分間、３回洗浄した。Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒを用いて、膜をスキャンした。
【０１９１】
完全長ＡｐｏＥ３、完全長ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３（１〜２７２）、およびＡｐｏＥ４（１〜２７２）の溶解物を、１μｇ／ｍｌ １Ｆ９（Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でのウエスタンブロットを用いて検出した（図３のレーン１〜４）。さらに、完全長ＡｐｏＥ３、完全長ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３（１〜２７２）、およびＡｐｏＥ４（１〜２７２）の溶解物を、ｍ１５Ｇ８抗体で免疫沈降させた。次いで、ｍ１５Ｇ８免疫沈降物を、１μｇ／ｍｌ １Ｆ９でのウエスタンブロットを用いて検出した（図３のレーン５〜８）。１Ｆ９は、ＡｐｏＥ３タンパクには結合しないＡｐｏＥ４特異的抗体である（図３のレーン１，２，５および６）。結果を図３に示す。ここで、レーン１は完全長ＡｐｏＥ３溶解物、レーン２はＡｐｏＥ３（１〜２７２）溶解物、レーン３は完全長ＡｐｏＥ４溶解物、レーン４はＡｐｏＥ４（１〜２７２）溶解物、レーン５はマウス１５Ｇ８で免疫沈降した完全長ＡｐｏＥ３、レーン６はマウス１５Ｇ８で免疫沈降したＡｐｏＥ３ １〜２７２、レーン７はマウス１５Ｇ８で免疫沈降した完全長ＡｐｏＥ４、レーン８はマウス１５Ｇ８で免疫沈降したＡｐｏＥ４ １〜２７２である。
【０１９２】
ＡｐｏＥ４（１〜２７２）のｍ１５Ｇ８免疫沈降は、１Ｆ９で検出された（図３のレーン８）。しかし、１Ｆ９でのブロッティングでは、完全長ＡｐｏＥ４のｍ１５Ｇ８免疫沈降は全く検出されなかった（図３のレーン７）。これらの結果は、１５Ｇ８が１〜２７２に対して特異的であることを示している。
【０１９３】
実施例５：  ウエスタンブロットによる１２Ｃ１２，１５Ｅ１０および１５Ｇ８の特徴付け
野生型マウス、ＡｐｏＥ ＫＯマウス、ならびにヒトＡｐｏＥアイソフォームノックイン（Ｅ２，Ｅ３およびＥ４型）およびヒトアミロイドベータを発現する遺伝子導入マウス由来の皮質組織溶解物を、ウエスタンブロットを用いて分析した。モノクローナル抗体１２Ｃ１２，１５Ｅ１０および１５Ｇ８は、ｍＡｂの陰性対照／背景反応性として働くａｐｏＥ ＫＯマウスを含む、異なる型の組織溶解物の複数のバンドを認識する（図４）。結果を図４に示す。ここで、レーン１はａｐｏＥ ＫＯマウス由来の皮質溶解物のウエスタンブロット、レーン２は組み換え完全長ＡｐｏＥ４、レーン３は組み換え完全長ＡｐｏＥ３、レーン４は組み換え完全長ＡｐｏＥ２、レーン５は野生型マウス由来の皮質溶解物のウエスタンブロット、レーン６は遺伝子導入Ｅ４ノックインマウス由来の皮質溶解物のウエスタンブロット、レーン７は遺伝子導入Ｅ３ノックインマウス由来の皮質溶解物のウエスタンブロット、レーン８は遺伝子導入Ｅ２ノックインマウス由来の皮質溶解物のウエスタンブロットである。
【０１９４】
野生型、Ｅ３またはＥ４ノックインマウスの皮質溶解物において（ただし、Ｅ２またはＡｐｏＥ ＫＯマウスの皮質溶解物においてではない）、３つの抗体はすべて、３０ＫＤａ付近のバンドを認識する（レーン５，６および７）。Ｅ３またはＥ４ノックインマウスの皮質溶解物において（ただし、野生型、Ｅ２ノックインまたはＡｐｏＥ ＫＯマウスの組織溶解物においてではない）、３つの抗体はすべて、６０ＫＤａ付近のバンドを認識する（レーン６および７）。野生型、Ｅ３およびＥ４ノックイン皮質溶解物に特異的なこれらのバンドの分子量は、ＡｐｏＥ（１〜２７２）単量体（３１．５ＫＤａ）および二量体（６３ＫＤａ）と整合している（図４）。
【０１９５】
実施例６：  ヒト化１５Ｇ８抗体の設計
ヒト化のための出発点つまりドナー抗体は、マウス抗体１５Ｇ８である。ｍ１５Ｇ８の可変カッパ（Ｖκ）は、ヒトカバトサブグループ２に対応するマウスカバトサブグループ２に属する。ｍ１５Ｇ８のＶＨは、ヒトカバトサブグループ３に対応するマウスカバトサブグループ３ｄに属する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２， １９９１）。本実施例全体にわたって、カバト番号付けを使用する。
【０１９６】
Ｖｋにおいて、１６残基ＣＤＲ−Ｌ１はカノニカルクラス４に属し、７残基ＣＤＲ−Ｌ２はクラス1に属し、９残基ＣＤＲ−Ｌ３はクラス1に属する（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２６３：８００−１５， １９９６）。５残基ＣＤＲ−Ｈ１はクラス１に属し、１６残基ＣＤＲ−Ｈ２はクラス３に属する（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２６３：８００−１５， １９９６）。ＣＤＲ−Ｈ３は、カノニカルクラスを持たない。ＶκドメインとＶＨドメインとの接合部分の残基は、一般に見られるものである。
【０１９７】
１５Ｇ８の大まかな構造モデルを提供する構造を見い出すべく、ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３： Ｄ２３３−７， ２００５）中のタンパク配列を調査した。二量体抗体４−Ｂ８（８）／Ｅ９の結晶構造（ｐｄｂ ｃｏｄｅ １ＫＦＡ； Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２９３：４８９−４９６， ２００２）が、全体的な配列類似性およびある程度良好な分解能（２．８Å）を有しているので、これをＶｈ構造として選択した。加えて、１ＫＦＡのＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２は、ｍ１５Ｇ８ Ｖｈのものと同一の同じカノニカル構造を有している。１ＫＦＡは、ＣＤＲ−Ｈ３において、１００Ｄ位置に挿入を有している。Ｎｑ１６−１１３．８（ｐｄｂ ｃｏｄｅ ２ＣＪＵ＿Ｌ； Ｓｃｏｔｔｉ ＆ Ｇｈｅｒａｒｄｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３５９：１１６１， ２００６）が、良好な全体的配列類似性およびある程度良好な分解能（２．５Å）を有していたので、これをＶｋ構造として選択した。加えて、ＣＤＲ−Ｌ１，Ｌ２およびＬ３は、ｍ１５Ｇ８ Ｖｋと同一のカノニカル構造を有していた。Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ２０１１（更新公開、２０１２年９月）内のＰＲＩＭＥモデリングワークフロー（ＰＳＰ ３．０１１１）において、１ＫＦＡおよび２ＣＪＵ構造を鋳型として用いて、マウス１５Ｇ8 Ｆｖ領域の構造モデルを構築した。重鎖のＣＤＲ３の構造モデルを、さらに、残基９９〜１０７を含む領域についてのＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒループ探査によって精密化した。拡張ループサンプリングを１０回繰り返すことで、Ｆｖ領域全体の背景において、エネルギー的に好ましい１つのループコンフォメーションが得られた。
【０１９８】
ＮＣＢＩからの非冗長タンパク配列データベースの調査により、マウスＣＤＲを移植するのに適するヒトフレームワークを選択することができた。Ｖｋとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションコードＡＡＴ８６０３５（ＧＩ：５０８９８１６３）を有するヒトカッパ軽鎖を選択した。これは、カバトヒトカッパサブグループ２に属し、ＣＤＲ−Ｌ１，Ｌ２およびＬ３について、ｍ１５Ｇ８のものと同一のカノニカルクラスを有している。Ｖｈとしては、ヒトＩｇ重鎖ＡＡＸ８２４９４（ＧＩ：６２４２１４６１）（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ７４（６）， ３２２２−３２３１， ２００６）を選択した。これは、カバトヒト重鎖サブグループ３に属し、ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２について、ｍ１５Ｇ８のものと同一のカノニカルクラスを有している。１５Ｇ８のＣＤＲ−Ｈ３は、カノニカルクラスを持たない。
【０１９９】
＞ ＡＡＸ８２４９４＿ＶＨ＿ＨｕＦｗｒ
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＬＹＹＧＹＲＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号７）
【０２００】
＞  ＡＡＴ８６０３５＿ＶＬ＿ＨｕＦｗｒ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＮＴＹＬＬＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＬＹＫＶＳＤＲＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＨＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）
【０２０１】
復帰変異の候補としてのいくつかの位置の選択の根拠は、以下の通りである。
【０２０２】
可変軽鎖復帰変異
Ｖ３Ｌ（ここでは他と同様に、フレームワーク復帰変異について、第１に述べる残基はヒトの残基であり、第２に述べる残基はマウスの残基である）：構造モデルにおいて、この位置のロイシンは、ＣＤＲに近接してパッキングされ、この残基が抗原と接触する可能性が高い。よって、これを復帰変異とする。
【０２０３】
Ｆ３６Ｙ：これは接合残基である。構造モデルにおいて、この残基は、重鎖Ｗ１０３接合残基と密接している。よって、これを復帰変異とする。
【０２０４】
Ｒ４６Ｌ：これは接合残基である。構造モデルにおいて、Ｌｅｕは、ＣＤＲ Ｌ２およびＣＤＲ Ｈ３の下方にパッキングされ、Ａｒｇによる置換は、これら２つのＣＤＲのコンフォメーションを歪ませるであろう。
【０２０５】
可変重鎖復帰変異
Ｑ１Ｅ，Ｑ３ＫおよびＱ５Ｖ：構造モデルにおいて、カバト位置Ｈ３のリジンはＣＤＲ Ｈ１と接触している。この構造において、これら３個の残基はまとまってパッキングされ、つまり、カバト位置Ｈ１のＧｌｕおよびカバト位置Ｈ５のＶａｌは、カバト位置Ｈ３のリジンと相互作用する。よって、これら３個の残基はまとまって復帰変異している。
【０２０６】
Ｄ４２Ｅ：カバト位置Ｈ４２のＧｌｕは、ヒトフレームワークにおいて、この位置ではアスパラギン酸よりも頻度の高い残基であり、したがって、これは復帰変異している。
【０２０７】
Ｋ８３Ｒ：Ａｒｇは、ヒトフレームワークにおいて、カバト位置Ｈ８３ではより頻度が高く、したがって、これは復帰変異している。
【０２０８】
２つのヒト化重鎖および２つのヒト化軽鎖に、種々の復帰変異を取り込ませた（図１〜２および表１〜２）。Ｈｕ１５Ｇ８ＶＬｖ１〜ｖ２およびＨｕ１５Ｇ８ＶＨｖ１〜ｖ２におけるＬ３，Ｌ３６，Ｌ４６，Ｈ１，Ｈ３，Ｈ５，Ｈ４２およびＨ８３のアミノ酸を、表３〜４に示す。
（表１）
ＶＨ復帰変異
2014511174.tif 000003
（表２）
ＶＬ復帰変異
2014511174.tif 000004
【０２０９】
＞ １５Ｇ８ｖｈ バージョン１
【０２１０】
アミノ酸配列
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＬＳＲＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＡＴＡＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１１）
【０２１１】
核酸配列
ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣ（配列番号１２）
【０２１２】
＞ １５Ｇ８Ｖκバージョン１
【０２１３】
アミノ酸配列
ＤＶＬＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＱＷＹＬＱＲＰＧＱＳＰＲＬＬＬＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１４）
【０２１４】
核酸配列
ＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号１５）
【０２１５】
＞ １５Ｇ８ｖｈ バージョン２（復帰変異なし）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＤＫＲＬＥＷＶＡＳＬＳＲＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＡＴＡＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１７）
【０２１６】
＞ １５Ｇ８Ｖκバージョン２（復帰変異なし）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＱＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＬＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８）
（表３）
ヒト化１５Ｇ８抗体重鎖における復帰変異に好ましいフレームワーク残基のカバト番号付け
2014511174.tif 000005
（表４）
ヒト化１５Ｇ８抗体軽鎖における復帰変異に好ましいフレームワーク残基のカバト番号付け
2014511174.tif 000006
【０２１７】
引用したすべての文献（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号などを含む）、特許および特許出願は、個々の文献、特許および特許出願が具体的にかつ個別に、すべての目的のためにその全体が参照によって組み込まれると指示されているのと同じ程度に、すべての目的のために、各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＧｅｎｂａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号などに関連する配列において変動がある場合、本出願は、その出願日の引用アクセッション番号に関連する配列を指す。
【図１】
2014511174.tif 000007
【図２】
2014511174.tif 000008
【図３】
2014511174.tif 000009
【図４】
2014511174.tif 000010
【配列表】
2014511174000001.app
【国際調査報告】
2014511174.tif 000011
2014511174.tif 000012
2014511174.tif 000013
2014511174.tif 000014
2014511174.tif 000015
2014511174.tif 000016
2014511174.tif 000017