(57)【要約】  シトルリン化タンパク質抗原（ＡＣＰＡ）に対する抗体は、関節炎において診断及び恐らくは病原に関連する。本発明は、関節炎に罹患した又は罹患するリスクがある個体の分類のためのホモシトルリン含有タンパク質又はカルバミル化タンパク質／ペプチドに対する抗体（抗ＣａｒＰ）を決定する手段及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある形態の関節炎に罹患した、又は罹患するリスクのある、個体を分類する方法であって、前記方法が、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体、好ましくは抗カルバミル化フィブリノーゲン（抗Ｃａ−Ｆｉｂ）抗体を含むかどうかを判定することを含む、方法。
【請求項２】
関節炎の発症の予後を前記関節炎に罹患した個体に提供する方法であって、前記方法が、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体、好ましくは抗カルバミル化フィブリノーゲン（抗Ｃａ−Ｆｉｂ）抗体を含むかどうかを判定すること、及び前記試料中の前記抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出に基づいて前記関節炎の今後の重症度を推定することを含む、方法。
【請求項３】
前記体液が血清試料又は滑液試料である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体がＩｇサブタイプＩｇＡ又はＩｇサブタイプＩｇＧである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、さらに、前記個体の体液を含む試料が抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）を含むかどうかを判定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記個体が関節炎に罹患するリスクがあるかどうかを判定する、請求項１、３から５のいずれか一項に記載の方法であって、前記体液試料が得られた時点で前記個体が関節炎に罹患していない、方法。
【請求項７】
前記関節炎が、リウマチ様関節炎、若年性関節炎、乾せん性関節炎、骨関節炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、自己免疫性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、線維筋痛、ライム病、未分化関節炎、非リウマチ性関節炎又は脊椎関節症を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記関節炎がリウマチ様関節炎、若年性関節炎又は未分化関節炎である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
個体の体液中の抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出キットであって、カルバミル化タンパク質又はペプチド、好ましくはそれから誘導されるカルバミル化フィブリノーゲン又はペプチドを含む、キット。
【請求項１０】
抗ヒトＩｇＧ抗体及び／又は抗ヒトＩｇＡ抗体を更に含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記抗ヒトＩｇ抗体が抗ヒトＩｇＡ抗体を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
シトルリン化タンパク質又はペプチドを更に含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
前記抗Ｃａｒｐ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体が、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び又はその改善された等価物から誘導されるカルバミル化タンパク質又はペプチドに特異的である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項９から１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
さらに、前記個体の関節炎分類指標として更なる因子を決定することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記更なる因子が、ＡＣＰＡ、リウマチ因子、Ｃ反応性タンパク質及び／又は赤血球沈降速度を決定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳後修飾及び関節炎の分野に関する。本発明は、特に、個体の体液を含む試料における翻訳後修飾タンパク質若しくはペプチド又は翻訳後修飾タンパク質若しくはペプチドに特異的な抗体の検出に基づいて個体の試料を分類する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎には１００を超える異なる形態がある。最も一般的な形態は骨関節炎（変形性関節症）である。骨関節炎は、最も一般的には、関節の外傷又は感染の結果であるが、容易に確認できない原因もある。後者は、加齢性骨関節炎と総称されることが多い。別の関節炎形態は、例えば、リウマチ様関節炎、乾せん性関節炎、及び関連した自己免疫疾患である。
【０００３】
関節炎患者の主要な愁訴は関節痛である。とう痛は、定常性であることが多く、患部関節に限局することがある。関節炎のとう痛は、関節に引き起こされた損傷の結果、又は関節周囲に生じた炎症の結果であることが多い。別の愁訴は、堅く痛い関節に対する強引な動き及び疲労に起因する筋挫傷の結果としてのとう痛である。
【０００４】
関節関連とう痛患者の診断は、愁訴が一般に明確でなく、一部は関節炎ではない種々の原因に帰し得るので、容易ではない。実際、初めて来院した関節痛関連の愁訴を有する多数の患者は寛解して、慢性関節炎を発症せず、かなり少数しかリウマチ様関節炎（ＲＡ）を発症しない。自然に寛解する個体が治療を受ける必要はないが、発症する個体が早期治療によりかなりの恩恵を得ることは明らかである。それぞれの群を識別するために、現場は、関節炎の診断をより確実に行うことができる一連の試験を開発した。かかる試験は、現在、関節炎を示すものがその中に存在しないかどうか組織試料及び／又は体液試料をスクリーニングする必要がある。かかる指標は、とりわけ、例えば、ある種のケモカイン、サイトカイン、他の免疫細胞シグナル伝達因子などの「慢性」炎症指標の測定、関節における活性免疫細胞「の蓄積」の測定、及び／又は血中のある種の因子、最も注目すべきはリウマチ因子の存在である。最近、シトルリン化タンパク質若しくはペプチド又はかかるシトルリン化タンパク質若しくはペプチドに特異的な抗体の検出を対象とした試験が、かかる試験の有用なツールとして開発された。かかる試験を利用できることによって、ある形態の関節炎を有する疑いのある個体の診断が大幅に改善された。これらの試験は、今後の発症についてより正確な予後を関節炎に罹患した個体に与えるのに臨床医の助けにもなっている。しかし、これらの開発にもかかわらず、関節炎又はそのリスクのある個体の診断にはまだ多くの要望がある。
【０００５】
例えば、オランダにおいては、ＲＡ診断の推奨は、ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ２０１０基準によって作成された確率スコアに基づく。この基準は、関節のタイプ及び数の関与、血清学的因子リウマチ因子及び抗ＣＣＰ抗体の有無、ＣＲＰなどの急性期タンパク質の有無、愁訴期間などの臨床的特徴を組み合わせたものである。このプロトコルに従ってＲＡと診断された患者は、６を超えるポイントを有する必要がある。臨床的関与及び愁訴期間のみで陽性診断に十分であるということは、関節炎集団が極めて異質であることを示しており、実際、誤診が多い。
【０００６】
オランダ及び他国においては、関節炎のタイプ分け又は関節炎発症リスクのある個体の診断の試験は、現在、かかる患者の体液試料中のシトルリン化タンパク質又はペプチドに特異的な抗体の検出試験を含む。これらの試験は、関節炎患者が、シトルリン化タンパク質に対する抗体（ＡＣＰＡ）の陽性に基づいて分類できるという見通しを与える。ＡＣＰＡの同定は、ＲＡの理解に重大な影響を及ぼした［１］。遺伝及び環境の危険因子［２］、進行［３］寛解［４］及び治療に対する応答［５］に関してＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者とＡＣＰＡ陰性ＲＡ患者を比較すると、主要な相違が認められた。近年、ＡＣＰＡ陽性ＲＡの出現率及び原因病理学に対するより多くの洞察が得られた。しかし、ＡＣＰＡ陰性ＲＡに対してははるかに少ない情報しか利用できない。ひとつには、これは、良好なアッセイが現在ないので、これらの個体を特定すること、又はサブグループ化することさえ、比較的困難だからである。興味深いことに、リツキシマブ治療は、ＲＦ及びＡＣＰＡが陰性な患者にも有益であることが報告された［６、７］。
【０００７】
ＰＡＤ酵素によるアルギニン残基からシトルリン残基への翻訳後修飾は、ＡＣＰＡ抗原を生成する必須ステップである［１］。生理環境下では、このシトルリン化は、毛及び皮膚のような組織において十分に結合していない組織層を生成するのに重要である［８］。核においても、シトルリン化は、後成的調節［９］、及び翻訳［８］と病原体に対する宿主防御［１０］の両方に重要であるクロマチン凝縮においてある役割を果たす。細胞死がどん食能を圧倒し得る病的状況下では、壊死性細胞死によってＰＡＤが細胞外空間に放出されることがあり、そこのより高いカルシウム濃度のために別の宿主分子もシトルリン化される［８］。これらの分子の多くが免疫系に非自己として提示されるので、一部の個体においては抗体応答を誘発することがある。シトルリンは、ホモシトルリンと称する別の翻訳後修飾アミノ酸に極めて類似している（図１）［１１］。ホモシトルリンは、わずか１炭素長いが、構造が似ている［１１］。ホモシトルリンは、体内に尿素と平衡状態で存在するシアナートによる攻撃を受けて、リジン残基から生成される。生理的条件下では、尿素濃度が低すぎて大規模なカルバミル化（リジンをホモシトルリンに変えるプロセス）が起こらないこともある。腎不全の状態では、尿素濃度が増加し、カルバミル化を容易に検出することができる。しかし、大部分のカルバミル化は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）が好中球から放出される炎症中に起こる［１２］。この酵素は、尿素の平衡をシアナート側に大きくシフトさせ、カルバミル化を起こりやすくする［１３］。最近、ホモシトルリンを含むタンパク質がＲＡ関節中に存在し、これが動物モデルにおいてＴ細胞誘発及び自己抗体形成に影響を及ぼし得ることが判明した［１１、１４］。極めて類似してはいるが、カルバミル化は、その構造上の相違とは別に、アルギニンではなくリジンが修飾されるので、シトルリン化とは異なる。したがって、ホモシトルリンは、定義上、タンパク質次いでシトルリン中で別の位置にある。本発明においては、カルバミル化タンパク質に対する自己抗体が関節炎時に存在することが判明し、本発明者らはかかる抗体の測定が早期関節炎及びＲＡの診断、予後及び管理に有用であると判断した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ある形態の関節炎に罹患した、又は罹患するリスクのある、個体を分類する方法であって、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体を含むかどうかを判定することを含む、方法を提供する。
【０００９】
関節炎に罹患した個体は、抗ＣａｒＰ抗体に基づいて、より重篤な形態の関節炎を発症するリスクが低い又は高い個体に分類することができる。抗ＣａｒＰに陽性である関節炎を有する個体は、関節炎を有する抗ＣａｒＰ陰性個体よりも、少なくとも任意の所与の期間内により重篤な形態の関節炎を発症する傾向がある。抗ＣａｒＰ陽性個体は、抗ＣａｒＰ陰性個体と比較して、より重篤な形態により急速に進行する傾向もある。前記方法は、したがって、好ましくは、ある形態の関節炎に罹患した個体を、より重篤又は慢性形態の関節炎に進行する平均よりも低い又は高いリスクの群に割り当てるのに使用される。好ましい一実施形態においては、個体は、受診時に未分化関節炎に罹患している。この実施形態の好ましい一態様においては、前記のより重篤又は慢性形態はＲＡである。この実施形態の別の好ましい一態様においては、前記のより重篤又は慢性形態は、若年性関節炎、好ましくは若年性特発性関節炎である。好ましい一実施形態においては、平均よりも低いリスクの前記群は、関節炎疾患の自然寛解の発生率が平均より高い群である。
【００１０】
リスク集団は、健康な個体、未分化関節炎又は関節痛の患者、関節疾患を有する自己抗体陽性個体、自己抗体陽性個体、関節炎患者の家族であり得る。若年性特発性関節炎は、一過性及び自己限定性又は慢性であり得る、小児期に見られる関節炎のサブセットに使用される用語である。若年性特発性関節炎の小児は、リスク集団と見なされ、これらの患者の一部は、慢性形態の関節炎を発症し得る。
【００１１】
本発明によれば、抗ＣａｒＰ抗体の検出は、未分化関節炎、関節痛及び別の関節疾患を呈する、及び／又は若年性関節炎を呈する個体に有用である。抗ＣａｒＰ抗体の有無は、後年のＲＡ又は持続性関節炎の発症を予示する。この予知力は、ＡＣＰＡ陰性とＡＣＰＡ陽性対象の両方で認められる。
【００１２】
前述の方法は、したがって、好ましくは、個体が後年のＲＡ又は持続性関節炎の発症リスクがあるかどうかを予測するのに使用される。
【００１３】
例えば、ヒトカルバミル化フィブリノーゲンを抗ＣａｒＰ抗体の標的として使用することができる。カルバミル化フィブリノーゲンは、ＩｇＧとＩｇＡの両方の抗ＣａｒＰ抗体によって認識される。完全なフィブリノーゲン、又はカルバミル化フィブリノーゲンから誘導されるペプチドのいずれかを、抗ＣａｒＰ抗体を検出するアッセイにおいて標的として使用することができる。完全なタンパク質、又はフィブリノーゲンから誘導されるペプチドのいずれかを、アッセイに直接使用することができ、又はストレプトアビジン被覆表面に結合する付着ビオチン基を介して固定化することができ、又は抗ＣａｒＰ抗体を検出する任意の他の方法に使用することができる。好ましい一実施形態においては、抗ＣａｒＰ抗体がカルバミル化フィブリノーゲンに特異的に結合する能力がある本発明による方法が提供される。本明細書を通して、抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体という略語は、カルバミル化フィブリノーゲンに特異的に結合する能力がある抗体を指すのに使用される。
【００１４】
関節炎における疾患、例えば、進行性とう痛疾患又は進行性関節損傷の進行は、一定ではない。進行は、ある期間、速いことも遅いこともあり得る。本発明においてより低い又はより高い進行リスクに言及するときには、これは、典型的には、調査される個体群内の平均進行リスクと比較される。
【００１５】
疾患の進行は、毎年確立される群レベルにあり、追跡データは、反復測定分析によって分析することができる。それでも、個体レベルでは、抗ＣａｒＰ、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ陽性は、今後の進行を予示する。現在、ＭＲＩ、超音波及び他の技術を含めて幾つかの方法が、短期の疾患の進行を測定するのに利用可能である。
【００１６】
試料が抗ＣａｒＰ、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を含むかどうか評価するために、抗体の存在試験が実施される。かかる試験は、それだけに限定されないが、１種類／又は数種類のカルバミル化タンパク質及び／又はペプチドを使用する、ＥＬＩＳＡ及び／又はウエスタンブロットを含むことができる。必ずではないが、一般には、試料に対して得られた結果は基準と比較される。基準は、典型的には、１人又は数人の健康な個体（すなわち、関節炎に罹患していないと考えられ、関節炎を発症する差し迫ったリスクがないと考えられる個体）に対して実施される類似の、好ましくは同じ試験の結果である。試料の結果を基準の結果と直接比較することができ、又は基準を使用してしきい値を決定することができる。しきい値以下では、試料は、抗ＣａｒＰ、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体に対して陰性と判断され、しきい値以上では陽性と判断される。
【００１７】
本発明は、さらに、関節炎の発症の予後を前記関節炎に罹患した個体に提供する方法であって、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体を含むかどうかを判定すること、及び前記試料中の前記抗ＣａｒＰ抗体の検出に基づいて前記関節炎の今後の重症度を推定することを含む、方法を提供する。好ましい一実施形態においては、前記抗ＣａｒＰ抗体は、カルバミル化フィブリノーゲンに特異的に結合する能力がある（抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体）。この推定は、典型的には、ある時間間隔を伴い、その間により重篤な形態又は進行が明白になる又はならない（上記参照）。
【００１８】
上記分類のひとつの利点は、個体の群が、他の方法よりも各群内でより均一な遺伝子プロファイルを有することである。別の利点は、個体の群は（予防的）治療に対する応答がより均一であることである。早期の積極的な治療が有益であることが判明したので［１８、１９］、本発明は、関節炎に罹患した又は罹患するリスクがある個体の関節炎治療方法であって、前記個体の関節炎診断を含み、前記診断が、前記個体の体液を含む試料中の抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を測定する方法を含む、方法を提供する。好ましくは、前記試料は、抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を含むと判定された。前記抗ＣａｒＰ又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ陽性個体のより厳密な治療は、患者に有益である。治療は、典型的には、前記治療を受ける前に関節炎と診断された患者になされる治療処置である。本発明は、さらに、関節炎に罹患した個体を関節炎薬物療法及び／又は治療によって治療する方法であって、前記個体が、前記治療前に本発明の方法によって診断されたことを特徴とする、方法を提供する。好ましくは、前記個体は、前記関節炎薬物療法及び／又は治療を受ける前に、本発明の関節炎に罹患した個体を分類する方法によって前記関節炎に罹患したと診断された。本発明は、さらに、関節炎を発症するリスクのある個体の関節炎薬物療法及び／又は治療による予防的治療であって、前記個体が、前記関節炎薬物療法及び／又は治療を受ける前に、本発明の個体を分類する方法によって前記関節炎を発症するリスクがあると診断されたことを特徴とする、方法を提供する。治療、この場合には予防的治療は、近い将来、典型的には分類の１年以内に発症するリスクがあると分類された個体にも施すことができる。かかる予防的治療は、少なくとも疾患の発症を遅らせる、及び／又は疾患の重症度を軽減することができる。
【００１９】
関節炎患者又は関節炎を発症するリスクのある個体を分類する方法は、典型的には、幾つかの異なる試験を含む。かかる試験を本発明の方法と組み合わせて、より正確な分類評価を得ることもできる。このために、本発明は、さらに、関節炎に罹患した個体、又は関節炎の疑い／リスクのある個体を更に分類する手段及び方法を提供する。好ましい一実施形態においては、本発明の方法を抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）試験と組み合わせる。
【００２０】
ＡＣＰＡ試験は、かなりの間使用されてきた（とりわけ、ベンルージ（Ｖｅｎｒｏｏｉｊ）他（２００２）：抗シトルリン化タンパク質／ペプチド抗体並びに初期リウマチ様関節炎の診断及び予後におけるその役割（Ａｎｔｉｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）：ザ  ネザーランズ  ジャーナル  オブ  メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｖｏｌ  ６０：ｐｐ３８３−３８８及びクラレスコグ（Ｋｌａｒｅｓｋｏｇ）Ｌ，ロネリド（Ｒｏｎｎｅｌｉｄ）Ｊ，ランドバーグ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）Ｋ），パデュコフ（Ｐａｄｙｕｋｏｖ）Ｌ，アルフレッドソン（Ａｌｆｒｅｄｓｓｏｎ）Ｌ．リウマチ様関節炎におけるシトルリン化タンパク質に対する免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アニュアル  レビュー  オブ  イミュノロジー（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）２００８；２６：６５１−７５に概説されている）。
【００２１】
多数の異なるシトルリン化タンパク質又はペプチドを試験に使用して、抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）を検出することができる。シトルリン化フィラグリンを使用して、いわゆる抗フィラグリン抗体（ＡＦＡ）が検出された。ＲＡ自己抗体の適切な基質を見つける最初の試みにおいては、１個のシトルリン残基を含む幾つかの線状ペプチドが開発された。これらのシトルリン化ペプチドは、ＲＡ自己抗体によって特異的に認識され、より重要なことには、そのアルギニン含有対応物は認識されなかった。しかし、大部分のペプチドはＲＡ血清のわずか３０％から４５％としか反応しなかったが、７５％を超えるＲＡ血清は合計９種類の試験ペプチドのうち少なくとも１種類と反応した。（シェレケンス（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ）他（１９９８）．ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）Ｖｏｌ  １０１：ｐｐ２７１−２８１）。線状ペプチドを使用することができるが、環式ペプチドは試験をより高感度にすることが見いだされた。環式シトルリン化タンパク質／ペプチドを含む試験は、典型的には、ＣＣＰ試験と称される。ＣＣＰ１試験は既に高感度であるが、免疫認識性が改善された環式シトルリン化タンパク質／ペプチドの新規選択によってＣＣＰ試験の感度が少なくとも８０％に増加することが見いだされた。この後者の試験は、典型的には、ＣＣＰ２試験と称される。したがって、本発明のこの態様の一実施形態においては、ＡＣＰＡを検出する方法は、前記試料中の抗環式シトルリン化タンパク質／ペプチドを検出することを含む。好ましくは、ＡＣＰＡを検出する前記方法は、リウマチ様関節炎の診断のためのシトルリン化ペプチド及びタンパク質の使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）プルイジン（Ｐｒｕｉｊｎ）ＧＪ，ウィーク（Ｗｉｉｋ）Ａ，ファン  ベンルージ（ｖａｎ  Ｖｅｎｒｏｏｉｊ）ＷＪ．アースリシス  リサーチ  アンド  セラピー（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．）２０１０；１２（１）：２０３．電子出版２０１０  Ｆｅｂ  １５．レビュー及び「リウマチ様関節炎に対する第１と第２の抗環式シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ１とＣＣＰ２）自己抗体試験の診断精度及び予後値の比較（Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｃ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＣＰ１  ａｎｄ  ＣＣＰ２）ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）」ファン  ガーレン（ｖａｎ  Ｇａａｌｅｎ）ＦＡ，ヴィセル（Ｖｉｓｓｅｒ）Ｈ，ホイジンガ（Ｈｕｉｚｉｎｇａ）ＴＷ．アナルズ  オブ  ザ  リウマチック  ディジーズ（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．）２００５  Ｏｃｔ；６４（１０）：１５１０−２に記載のようにＣＣＰ２試験である。
【００２２】
ＡＣＰＡの場合と同様に、抗ＣａｒＰ抗体の場合も、原則的には、多数の異なるカルバミル化タンパク質又はペプチドを試験に使用して、抗カルバミル化タンパク質抗体を検出することができる。好ましい一実施形態においては、前記カルバミル化タンパク質又はペプチドは環式ペプチドである。良好なカルバミル化タンパク質はカルバミル化ウシ胎仔血清である。しかし、別の種由来の血清タンパク質も適切である。最適化後にはヒトタンパク質を使用することもできる。不可避的な背景のために、Ｉｇの大規模な欠乏なしにはヒト血清をカルバミル化型で使用することはできない。好ましい一実施形態においては、前記カルバミル化タンパク質は、フィブリノーゲン、好ましくはヒトフィブリノーゲンである。
【００２３】
本発明の方法に使用されるペプチドは、ＡＣＰＡ全般の検出であれ、抗ＣａｒＰ抗体の検出であれ、抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出であれ、典型的には６〜５０アミノ酸のペプチドである。好ましくは、前記ペプチドは、１２から３０アミノ酸、より好ましくは１８から２２アミノ酸、最も好ましくは約２１アミノ酸のペプチドである。上記範囲は、示した数値を含む。すなわち、１２から３０アミノ酸の範囲は、それぞれ１２及び３０アミノ酸のペプチドを含む。ペプチドは、感度及び／又は特異性に応じて、類似の線状ペプチドよりも、環式ペプチドとすることができ、又は環式ペプチドでなくともよい。環状ペプチドは、環式の性質を生じる任意の分子組成で生成され得る。任意の方法を使用して、カルバミル化、シトルリン化又は未変性型のペプチド及び又はタンパク質をプレート及び又はビーズに連結することができる。直接コーティング又はビオチン−ストレプトアビジン若しくは任意の他の利用可能なコーティング方法を使用することができる。
【００２４】
好ましい一実施形態においては、本発明の方法に使用されるかかるペプチドは、ヒトフィブリノーゲンから誘導されるペプチドである。前記ペプチドは、好ましくは、フィブリノーゲンアルファ（図１４）、フィブリノーゲンベータ（図１５）又はフィブリノーゲンベータ（図１６）のいずれか１種類のアミノ酸配列中に存在する１２から３０アミノ酸、より好ましくは１８から２２アミノ酸、最も好ましくは約２１アミノ酸の連続アミノ酸を含む。より好ましい一実施形態においては、ペプチドは、表Ｉ、表ＩＩ又は表ＩＩＩに示されたペプチドのいずれか１種類である。
【００２５】
本発明は、さらに、上で示したように、ある形態の関節炎に罹患した、又は罹患するリスクのある、個体を分類する方法であって、前記個体の体液を含む試料が抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を含むかどうかを判定すること、及び前記試料が抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）を含むかどうかを判定すること、及び前記抗ＣａｒＰ抗体及び／又は前記ＡＣＰＡの検出に基づいて前記個体を分類することを含む、方法を提供する。
【００２６】
抗ＣａｒＰ抗体、抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体及びＡＣＰＡは、任意の免疫グロブリンアイソタイプとすることができる。この技術は、典型的には、１つ以上のＩｇＧサブクラスに焦点を合わせる。本発明においては、前記個体の体液を含む試料中のＩｇサブタイプＡ（ＩｇＡ）とＩｇサブタイプＧ（ＩｇＧ）の両方の抗ＣａｒＰ抗体、抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体及び／又はＡＣＰＡのレベルが、関節破壊などの臨床成績測定を予示することが見いだされた。試料は、抗ＣａｒＰ又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ  ＩｇＧに対して陰性であり得るが、抗ＣａｒＰ又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ  ＩｇＡに対しては陽性であり得、その逆も同様であることも見いだされた。したがって、本発明の方法の好ましい一実施形態においては、前記方法は、前記個体の体液を含む試料が、ＩｇサブタイプＩｇＡの抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体、又はＩｇサブタイプＩｇＧの抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体、又はその両方を含むかどうかを判定することを含み、前記ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出は、前記個体が関節炎に罹患した又は罹患するリスクがあることを示す。好ましい一実施形態においては、前記方法は、さらに、前記個体の体液を含む試料がＡＣＰＡを含むかどうかを判定することを含む。上述したように、本発明の方法は、ＡＣＰＡ陰性個体の不均一な群を更に分割するのに特に有用である。本発明の方法を使用すると、このＡＣＰＡ陰性群を、抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体陽性であり、関節炎に罹患した又は罹患するリスクがあると分類することができる群と、関節炎に罹患していない又は関節炎に罹患するリスクがないと分類される抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体陰性群の群に分割することができる。この判定を個体ごとに行うこともできる。したがって、本発明の方法は、好ましくは、さらに、前記個体の体液を含む試料が抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）を含むかどうかを判定することを含み、前記試料の前記ＡＣＰＡレベルは検出限界及び又は陽性のカットオフ未満である。
【００２７】
抗ＣａｒＰ抗体、好ましくはアイソタイプＩｇＡ若しくはアイソタイプＩｇＧ、又はその両方及びＡＣＰＡの存在について試験された個体の試料を、結果に基づいて以下のように分類することができる。
ａ）抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体＋、ＡＣＰＡ−試料、
ｂ）抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体＋、ＡＣＰＡ＋試料、
ｃ）抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体−、ＡＣＰＡ＋、及び
ｄ）抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体−、ＡＣＰＡ−試料
【００２８】
結果ａ）、ｂ）及びｃ）は、関節炎に現在罹患しているリスクが高い又は関節炎を発症するリスクがある個体の試料として、試料を分類するものである。結果ｄ）は、関節炎に現在罹患している又は発症するリスクが低い個体の試料として、試料を分類するものである。前記個体が、前記試料を群ｄ）に分類するよりも未分化関節炎を呈する場合、前記個体は自然寛解の可能性が高いことを示す。かかる個体は、長期的に抗関節炎治療の利点がないと予想される。本発明は、さらに、未分化関節炎に罹患した個体の体液を含む試料をタイプ分けする方法であって、前記試料が抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を含むかどうかを判定すること、及び前記試料が前記抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは前記抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体に対して陰性であると判定されたときに、前記試料を前記関節炎の自然寛解の可能性が平均よりも高い個体に由来するとタイプ分けすること、及び前記試料が前記抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは前記抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体に対して陽性であると判定されたときに、前記試料をＲＡを有する又はＲＡに進行する可能性が平均よりも高い個体に由来するとタイプ分けすることを含む、方法を提供する。前記平均より高い可能性は、典型的には、未分化関節炎を呈する幾人かの選択されていない個体の平均可能性と前記可能性を比較することによって達せられる。
【００２９】
別の一態様においては、本発明は、ある形態の関節炎に罹患し、前記関節炎のより重篤な形態を発症するリスクが高い個体の関節炎の重症度を推定する方法であって、前記選択された個体の体液を含む試料が抗ホモシトルリン含有タンパク質抗体（抗ＣａｒＰ抗体）、好ましくは抗ホモシトルリン含有フィブリノーゲン抗体（抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体）を含むかどうかを判定すること、及び前記試料中の前記抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは前記抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出に基づいて前記関節炎の重症度を推定することを含む、方法を提供する。
【００３０】
更に別の一態様においては、本発明は、関節炎の発症の予後を前記関節炎に罹患した個体に提供する方法であって、前記個体の体液を含む試料が抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を含むかどうかを判定すること、及び前記試料中の前記抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出に基づいて前記関節炎の今後の重症度を推定することを含む、方法を提供する。前記方法は、好ましくは、ＡＣＰＡを決定する方法と組み合わせられ、前記試料であり、前記抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体試験と前記ＡＣＰＡ試験の組合せ結果を使用して、前記個体の前記関節炎の今後の重症度を推定する。
【００３１】
抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体、及び／又はＡＣＰＡの存在について試験される試料は、原則的には、個体の体液を含む限り、任意のタイプの試料とすることができる。しかし、典型的には、試料は体液の試料である。好ましい一実施形態においては、体液を含む前記試料は、血清試料又は滑液試料である。
【００３２】
関節炎は、上述したように、複合疾患であり、多数の異なる形態の関節炎が現在特定されている。個体が罹患した又は罹患するリスクがある関節炎は、好ましくは、リウマチ様関節炎、若年性関節炎、乾せん性関節炎、骨関節炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、自己免疫性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、線維筋痛、ライム病、未分化関節炎、非リウマチ性関節炎又は脊椎関節症から選択される関節炎である。より好ましくは、個体が罹患した又は罹患するリスクがある関節炎は、リウマチ様関節炎、乾せん性関節炎、骨関節炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、自己免疫性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、線維筋痛、ライム病、未分化関節炎、非リウマチ性関節炎又は脊椎関節症から選択される関節炎である。好ましくは、前記関節炎は、リウマチ様関節炎、若年性関節炎、より好ましくは若年性特発性関節炎、又は未分化関節炎から選択される。より好ましくは、前記関節炎は、リウマチ様関節炎又は未分化関節炎から選択される。
【００３３】
本発明は、さらに、ある形態の関節炎に罹患した個体の関節炎をタイプ分けする方法であって、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体、好ましくは抗カルバミル化フィブリノーゲン（抗Ｃａ−Ｆｉｂ）抗体を含むかどうかを判定することを含む、方法を提供する。関節炎は、前記抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出有無に基づいてタイプ分けすることができる。前記抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは前記抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体が検出される試料は、リウマチ様関節炎の個体に由来する可能性がより高い。したがって、この方法は、単独で、又は前記個体がＲＡに罹患した可能性を評価する別のＲＡ試験と組み合わせて、使用することができる。好ましい一実施形態においては、前記更なる試験は、ＡＣＰＡの存在試験、好ましくはＣＣＰ２試験及び又はリウマチ因子試験を含む。
【００３４】
本発明によれば、抗ＣａｒＰ抗体は、ＲＡ発症前の無症候の健康な個体において検出することができる。したがって、健康な集団においても、抗ＣａｒＰ抗体の検出は、後年のＲＡ又は持続性関節炎の発症リスクがある患者の早期発見に有用である。さらに、抗ＣａｒＰ抗体の検出は、好ましくは現行のＲＡ分類を行う前に、早期治療の利点がある人を特定するのに有用である。
【００３５】
更に別の一態様においては、本発明は、個体がある形態の関節炎を発症するリスクがある又は罹患したかどうかを判定する方法であって、前記個体は、罹患していないと考えられ、又は好ましくは体液を含む試料が収集された時点で関節炎に罹患しておらず、前記方法が、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体を含むかどうかを判定することを含む、方法を提供する。好ましい一実施形態においては、前記抗ＣａｒＰ抗体が抗カルバミル化フィブリノーゲン（抗Ｃａ−Ｆｉｂ）抗体である、本発明による方法が提供される。前記抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは前記抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体が検出される試料は、関節炎、特にＲＡに近い将来、特に試料収集日から５年以内に、特に３年以内に、より具体的には試料収集日から１．５年以内に、罹患又は発症するリスクがある個体に由来する可能性がある。この方法は、単独で、又は前記リスクを評価する別のＲＡ試験と組み合わせて使用することができる。好ましい一実施形態においては、前記更なる試験は、ＡＣＰＡの存在試験、好ましくはＣＣＰ２試験及び又はリウマチ因子試験を含む。
【００３６】
別の一態様においては、本発明は、個体の体液中の抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体の検出キットであって、カルバミル化タンパク質又はペプチドを含む、キットを提供する。好ましくは、前記カルバミル化タンパク質又はペプチドは、カルバミル化フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン由来のペプチドである。好ましい一実施形態においては、前記タンパク質又はペプチドは、上記カルバミル化タンパク質又はペプチドである。特に、前記キットは、フィブリノーゲンアルファ（図１４）、フィブリノーゲンベータ（図１５）又はフィブリノーゲンベータ（図１６）のいずれか１種類のアミノ酸配列中に存在する１２から３０アミノ酸、より好ましくは１８から２２アミノ酸、最も好ましくは約２１アミノ酸の連続アミノ酸を含む少なくとも１種類のペプチドを含む。より好ましい一実施形態においては、前記キットは、表Ｉ、表ＩＩ又は表ＩＩＩに示されたペプチドの少なくとも１種類を含む。
【００３７】
やはり上述したように。好ましい一実施形態においては、前記キットは、さらに、抗ヒトＩｇＧ抗体及び／又は抗ヒトＩｇＡ抗体を含む。好ましくは、前記抗ヒトＩｇ抗体は、検出することができる標識を含む。かかる標識の非限定的例は、ＨＲＰ又はＡＰによる直接標識化である。あるいは、前記キットは、好ましくは、さらに、使用した抗ヒトＩｇ抗体に特異的である別の抗体を含む。この実施形態においては、前記別の抗体は、ビオチン、ＤＩＧなどの検出可能な標識を含む。この入れ子（ｎｅｓｔｉｎｇ）が連続できることは言うまでもなく、標識は、最後及び／又は１個以上（前）の抗体上に存在する。好ましい一実施形態においては、前記抗ヒトＩｇ抗体は抗ヒトＩｇＡ抗体を含む。より好ましい一実施形態においては、前記キットは、抗ヒトＩｇＡ抗体及び抗ヒトＩｇＧ抗体を含む。上記抗ヒトＩｇ抗体は、典型的には、完全抗体であるが、抗原結合部位を含む断片も抗体という用語の使用の範囲内である。同様に、現在、ヒトＩｇに特異的に結合するように作製することができる多種多様な結合タンパク質又はペプチドが利用可能である。かかるヒトＩｇ特異的結合タンパク質又はペプチドは、本明細書に定義された抗ヒトＩｇ抗体の等価物である。同様に、入れ子設定における１個以上の更なる抗体は、入れ子ツリーの前方の抗体及び／又は結合タンパク質／ペプチドに特異的に結合する結合タンパク質及び／又はペプチドで置換することができる。
【００３８】
特に好ましい一実施形態においては、前記キットは、更にシトルリン化タンパク質又はペプチドを含む。好ましい一実施形態においては、前記タンパク質又はペプチドは、上記シトルリン化タンパク質又はペプチドである。やはり上述したように、前記シトルリン化タンパク質又はペプチドは、好ましくは、タンパク質又は環式ペプチドである。好ましくは、前記キットは、ＣＣＰ１又はＣＣＰ２試験の環式シトルリン化ペプチドを含む。好ましくは、前記キットは、ＣＣＰ試験、好ましくはＣＣＰ２試験のすべての環式ペプチドを含む。
【００３９】
本発明の方法は、上述したように、好ましくは、別の関節炎分類指標試験と組み合わせられる。したがって、本発明の方法の好ましい一実施形態においては、前記方法は、さらに、更なる因子を前記個体の関節炎分類指標として決定することを含む。好ましくは、前記更なる因子は、ＡＣＰＡ、リウマチ因子、Ｃ反応性タンパク質、及び／又は赤血球沈降速度を決定することを含む。
【００４０】
カルバミル化は、タンパク質又はペプチドにホモシトルリン残基を生成する修飾を施すプロセスと本明細書では定義される。本明細書においては、カルバミル化タンパク質若しくはペプチド又はその集まりを参照する場合、ホモシトルリン修飾を有する前記タンパク質若しくはペプチド、又はホモシトルリン修飾を有するタンパク質若しくはペプチドの集まりを参照されたい。
【００４１】
本発明は、さらに、個体がある形態の関節炎に罹患した、又は罹患するリスクがあるかどうかを判定するのに使用される抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体、及びＡＣＰＡを提供する。本発明は、さらに、関節炎の分類に使用される抗ＣａｒＰ抗体、好ましくは抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体、及びＡＣＰＡを提供する。前記決定及び／又は分類は、上記決定又は分類である。
【００４２】
本発明は、さらに、ある形態の関節炎に罹患した個体が、前記関節炎のより重篤な形態を発症するリスクが高いかどうかを判定する方法であって、関節炎に罹患したが、最も重篤な形態の関節炎ではない個体を選択すること、及び前記選択された個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質抗体（抗ＣａｒＰ抗体）を含むかどうかを判定することを含み、前記抗ＣａｒＰの検出が、前記個体が前記関節炎のより重篤な形態を発症するリスクが高いことを示す、方法を提供する。好ましい一実施形態においては、前記抗ＣａｒＰ抗体が抗カルバミル化フィブリノーゲン抗体（抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体）である、本発明による方法が提供される。
【００４３】
本明細書においては、抗ＣａｒＰ抗体、抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体又はＡＣＰＡの検出、測定又は評価を参照する場合、前記参照は、１種類を超える抗ＣａｒＰ抗体、抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体及び／又は１種類を超えるＡＣＰＡが検出、測定又は評価されることを含む。抗ＣａｒＰ又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体は、ホモシトルリン修飾それ自体を認識することができ、より典型的には、ホモシトルリン修飾のすぐ近くのタンパク質又はペプチドのアミノ酸の１個以上に関連した前記修飾を認識することができる。本発明の方法又はキットは、１を超える特異性の抗ＣａｒＰ抗体及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体が検出、測定又は評価されるときにより正確である。本発明の方法は、したがって、好ましくは、前記試料中の２種類以上、好ましくは３種類以上、より好ましくは５種類以上、より好ましくは少なくとも７種類の抗ＣａｒＰ及び／又は抗Ｃａ−Ｆｉｂ抗体を測定することを含む。同様に、本発明のキットは、好ましくは、２種類以上、好ましくは３種類以上、より好ましくは５種類以上、より好ましくは少なくとも７種類のカルバミル化タンパク質及び／又はペプチド、好ましくはフィブリノーゲン及び／又はフィブリノーゲン由来のペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】抗ＣａｒＰ抗体を検出する新規特異的アッセイの開発。（Ａ）ＥＬＩＳＡにおけるカルバミル化ＦＣＳ及び未変性ＦＣＳに対する抗ＣａｒＰ抗体陽性標準の用量反応曲線。
【図１Ｂ】抗ＣａｒＰ抗体を検出する新規特異的アッセイの開発。Ｃａ−ＦＣＳで被覆されたＥＬＩＳＡプレートに結合した抗ＣａｒＰ抗体が、示した液相阻害剤を用いたプレインキュベーションによって阻害された阻害研究。Ｃａ−ＦＣＳのみが抗ＣａｒＰ抗体の結合を阻害した。
【図１Ｃ】抗ＣａｒＰ抗体を検出する新規特異的アッセイの開発。Ｃａ−ＦＣＳとＦＣＳの等しい添加量を示すクーマシー染色、及び陰性試料ではなく抗ＣａｒＰ陽性試料の血清試料によるＦＣＳ添加レーンではなくＣａ−ＦＣＳ添加レーンの陽性染色を示すウエスタンブロット。
【図２】抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体はＲＡ血清中に存在する。健康な対照とＲＡ患者の血清のセットにおいて抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡを検出するためにＥＬＩＳＡを実施した。カットオフは、健康な対照の平均＋標準偏差×２によって設定された。検量線に基づく計算に従って任意単位／ｍｌとして表される力価を示す。グラフの下には試験試料数と陽性割合の両方を示す。
【図３】抗ＣａｒＰ抗体及びＡＣＰＡは、２つの別々の自己抗体系である。ＡＣＰＡ及び又は抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性及び陰性のＲＡ患者の割合を示した円グラフ。
【図４】抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ抗体は、未分化関節炎（ＵＡ）からＲＡへの転換に関連する。ベースラインでＵＡを呈する患者の血清を、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体について測定し、１年の経過観察でＲＡに転換するかどうか分析した。示したデータはＡＣＰＡ陽性に基づいても分割される。ＩｇＡ抗ＣａｒＰ抗体は、ＵＡ集団からのＲＡの発症と強く関連する。
【図５】抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ抗体は、ＲＡにおけるより重篤な放射線学的進行に関連する。関節破壊の程度及び割合を、ＡＣＰＡ及び抗ＣａｒＰ抗体に対する陽性に基づいて分割されたＲＡ患者において分析した。抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ抗体陽性は、ＡＣＰＡ陰性とＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者の両方においてより重篤な放射線学的損傷に関連する。
【図６Ａ】シトルリン化及びカルバミル化の説明。シトルリン化及びカルバミル化は、異なるアミノ酸上で異なる機序によって起こるが、類似の最終生成物を生成する。
【図６Ｂ】シトルリン化及びカルバミル化の説明。シトルリン化及びカルバミル化は、異なるアミノ酸上で異なる機序によって起こるが、類似の最終生成物を生成する。
【図７】カルバミル化タンパク質に対する抗体は、ＲＡ患者の血清中に存在する。健康な対照（ＮＨＳ）又はＲＡ患者（ＲＡ）の血清由来のＩｇＧ（Ａ、Ｂ）及びＩｇＡ（Ｄ、Ｅ）と、非修飾ＦＣＳ（ＦＣＳ）又はカルバミル化ＦＣＳ（Ｃａ−ＦＣＳ）で被覆された壁との反応性を示す。４１５ｎｍにおける吸光度として表されたデータ。（Ｃ、Ｆ）ＦＣＳの吸光度単位は、Ｃａ−ＦＣＳの吸光度単位から減算され、特異的抗カルバミル化タンパク質反応を示す。
【図８】抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡは、２つの別々の自己抗体系である。（Ａ）幾つかの形態のＦｉｂペプチドに対するＲＡ患者由来の７６種類の血清のＩｇＧ反応性を示す。（Ｂ、Ｃ）Ｃａ−ＦＣＳ又はＣｉ−ＦＣＳに結合した抗体は液相阻害剤を用いたプレインキュベーションによって阻害され、示される。（Ｄ）ＦＣＳ、Ｃａ−ＦＣＳ及びＣｉ−ＦＣＳは、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルによって分離され、ブロットされた。ブロット上のタンパク質に対して反応性である抗体の存在は、これらのブロットを抗ＣａｒＰ陽性ＡＣＰＡ陰性及び抗ＣａｒＰ陰性ＡＣＰＡ陽性血清と一緒にインキュベートすることによって分析された。
【図９】抗ＣａｒＰ抗体は、可変ドメインを介してＣａ−Ｆｉｂに結合する。（Ａ）５４名の健康な対照及び２１４名のＲＡ患者のＦｉｂ、Ｃｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂに対するＩｇＧ反応性をＥＬＩＳＡによって分析した。（Ｂ）抗Ｃａ−Ｆｉｂ反応性の特異性を阻害研究によって確認した。１個の試料を示す。データは、ＰＢＳによる阻害に関して表される。（Ｃ）精製ＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）２の分子的性質は、クーマシー染色ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルによって確認された。（Ｄ）Ｆ（ａｂ’）２断片は、２名の抗ＣａｒＰ陽性患者及び２名の負の対照の精製ＩｇＧから生成された。患者由来のＦ（ａｂ’）２のみＣｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂと反応した。（Ｅ）阻害実験によれば、Ｆ（ａｂ’）２も必ずしもＣｉ−ＦｉｂとＣａ−Ｆｉｂの交差反応性ではないことが確認された。
【図１０】抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体はＲＡ血清中に存在する。（Ａ、Ｂ）ＥＬＩＳＡにおけるＣａ−ＦＣＳ及びＦＣＳに対する抗ＣａｒＰ抗体陽性標準（ＩｇＧ及びＩｇＡ）の用量反応曲線（Ｃ、Ｄ）健康な対照（ＮＨＳ）及びＲＡ患者の血清において抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡを検出するためにＥＬＩＳＡを実施した。上記方法に記載のように、カットオフは、健康な対照の平均＋標準偏差×２によって設定された。反応性は、任意単位／ｍＬとして表される。試験試料数及び陽性％をグラフの下に示す。（Ｅ、Ｆ）抗ＣＣＰ２及び／又は抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性及び陰性のＲＡ患者％を示す円グラフ。（Ｇ、Ｈ）抗ＣＣＰ２に対して陰性な抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ又はＩｇＡ陽性患者％を示す円グラフ。
【図１１】抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ抗体は、ＡＣＰＡ陰性ＲＡにおいてより重篤な放射線学的進行に関連する。関節破壊の程度及び割合は、含まれるすべてのＲＡ患者で分析され、ＡＣＰＡ陰性又はＡＣＰＡ陽性サブグループに対して別々に分析された（図１３）。関節破壊の重症度を中央値シャープ／ファン  デル  ハイデ（Ｓｈａｒｐ／ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅ）スコア（ＳＨＳ）としてＹ軸上に、経過観察年数をＸ軸上に示す。Ｘ軸の下には各時点の患者数を示す。抗ＣＣＰ２陰性ＲＡ患者の放射線学的進行を示す。Ｐ値は、方法のセクションに記載のように分析モデルから誘導される。
【図１２Ａ】抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ抗体は、疾患前（ｐｒｅ−ｄｉｓｅａｓｅ）からＲＡへの転換に関連する。（Ａ）ベースラインで未分化関節炎（ＵＡ）を呈する患者の血清を、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ抗体について測定し、１年の経過観察でＲＡに転換するかどうか分析した。示したデータはＡＣＰＡ陽性に基づいても分割される。抗ＣａｒＰ抗体は、ＵＡ集団からのＲＡの発症と強く関連する。
【図１２Ｂ】（Ｂ）ベースラインで関節痛を呈する患者の血清においても、抗ＣａｒＰ抗体はＲＡの発症を予示する。
【図１２Ｃ】（Ｃ）ＲＡを発症しない、又は後年ＲＡを発症する、健康な人の血清を抗ＣａｒＰ陽性について比較する。抗Ｃａｒｐの存在は、今後のＲＡの発症に関連する。
【図１３】抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ抗体は、ＲＡにおけるより重篤な放射線学的進行に関連する。関節破壊の程度及び割合を、ＡＣＰＡ及び抗ＣａｒＰ抗体に対する陽性に基づいて分割されたＲＡ患者において分析した。抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ抗体に対する陽性は、ＡＣＰＡ陰性ＲＡ患者においてより重篤な放射線学的損傷に関連する。
【図１４】フィブリノーゲンアルファのアミノ酸配列。
【図１５】フィブリノーゲンベータのアミノ酸配列。
【図１６】フィブリノーゲンガンマのアミノ酸配列。
【図１７】抗ＣａｒＰ抗体は、若年性関節炎に罹患した患者の血清中に存在する。健康な小児（Ｃｔｒ）の血清及び若年性関節炎に罹患した患者の血清中の抗ＣａｒＰ  ＩｇＧを検出するためにＥＬＩＳＡを実施した。上記方法に記載のように、カットオフは、健康な対照の平均＋標準偏差×２によって設定された。反応性は、任意単位／ｍＬとして表される。試験試料数及び陽性％をグラフの下に示す。
【００４５】
[実施例]
[実施例１]
材料及び方法
抗原の生成
抗原源として、本発明者らはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を使用した（Ｂｏｄｉｎｃｏ、バッチＮｏ．２１２−１９２９０９）。これをカルバミル化し、シトルリン化し、又は無修飾源として使用した。
【００４６】
カルバミル化ＦＣＳ（Ｃａ−ＦＣＳ）は、ＦＣＳを再蒸留水に４ｍｇ／ｍｌまで希釈することによって生成された。シアン酸カリウム（ｓｉｇｍａ、ｃａｔ  Ｎｏ．２１５０７４）を８０ｍｇ／ｍｌで添加した。３７℃で１２時間インキュベーション後、試料を再蒸留水で徹底的に透析した。
【００４７】
対照として、本発明者らは、シトルリン化ＦＣＳ（Ｃｉ−ＦＣＳ）も作製した。この目的のために、本発明者らは、ＦＣＳ（２４ｍｇ／ｍｌ）５０ｕｌを０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６  ２４ｕｌ＋０．１２５Ｍ  ＣａＣｌ２  １５ｕｌ＋ＰＡＤ４（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１５８４）３１ｕｌと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。
【００４８】
ＥＬＩＳＡによる抗ＣａｒＰ抗体の検出
非修飾ＦＣＳ及びＣａ−ＦＣＳを１０ｕｇ／ｍｌ（ｐＨ９．６  ０．１Ｍ炭酸塩−炭酸水素塩緩衝剤で希釈）で５０ｕｌをＮｕｎｃイムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ、ｃａｔ  Ｎｏ．４３０３４１）に４℃で終夜塗布した。０．０５％ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ  Ｎｏ．２７，４３４−８）（ＰＴ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄後、ＰＢＳ／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｓｉｇｍａ、ｃａｔ  Ｎｏ．Ａ２１５３）１００ｕｌを３７℃で１時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、血清を５０ｕｌ中で１／５０（ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡ緩衝剤（ＰＴＢ）中）でＦＣＳとＣａ−ＦＣＳの両方の被覆ウェルにインキュベートし、３７℃で１時間インキュベートした。標準血清の（ＰＴＢ希釈）段階希釈物をＣａ−ＦＣＳ被覆ウェル上でインキュベートした。洗浄後、５０ｕｌの１／５０００（ＰＴＢ）希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ、ｃａｔ  Ｎｏ．Ａ０４２３）又は１／１０００（ＰＴＢ）希釈ウサギ抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｄａｋｏ、ｃａｔ  Ｎｏ．Ａ０２６２）と一緒にウェルを３７℃で１時間インキュベートすることによって結合ヒトＩｇＧ又はＩｇＡを検出した。洗浄後、ウェルを５０ｕｌの１／２０００（ＰＴＢ）希釈ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（Ｄａｋｏ、ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ０４４８）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。最後の洗浄後、５０ｕｌの２，２’アジノ−ビス−（３−エチルベンゾ−チアゾール−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及びＨ２Ｏ２をインキュベートし、４１５ｎｍにおける吸光度を標準ＥＬＩＳＡリーダーによって測定して、ＨＲＰ酵素活性を可視化した。
【００４９】
ウエスタンブロットによる抗ＣａｒＰ抗体の検出
ＦＣＳとＣａ−ＦＣＳの両方を通常の１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルに載せ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｅｘｔｒａ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｄｉｅｇｅｍ、ベルギー）に移した。次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ブロットをブロッキング緩衝剤（３％ＥＬＫ  Ｍｉｌｋ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中で室温で１時間インキュベートした。続いて、ブロットをブロッキング緩衝剤で１：５００希釈された血清５ｍｌと一緒に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、ブロッキング緩衝剤で１：５００００希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ、Ｈｅｖｅｒｌｅｅ、ベルギー）３ｍｌと一緒にブロットを室温で１時間インキュベートした。次に、ブロットを洗浄し、結合した抗体を増感化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化した。等しいタンパク質添加は、クーマシーブリリアントブルー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、オランダ）によって確認された。
【００５０】
血清及び滑液
分析された血清は、ライデン早期関節炎（Ｌｅｉｄｅｎ  Ｅａｒｌｙ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）クリニック（ＥＡＣ）コホートに参加した患者に由来した。ライデンＥＡＣは、ライデン大学医療センターのリウマチ学研究部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）で１９９３年に開始された関節炎を最近発症した患者の初期コホート（症候持続時間＜２年）である［１５］。すべてのＲＡ患者は、１年の経過観察（ＥＡＣコホート）内に米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（以前は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９８７年改訂のＲＡ分類基準［１６］を満たした。合計１００７名の患者を分析し、そのうち５８２名はＲＡと診断され、４２５名はＵＡと診断され、そのうち１５１名は経過観察時にＲＡを発症した。これらの患者試料をやはりライデン地区由来の２８０名の健康な対照の試料と比較した。ＲＡ患者の血清／滑液ペアの追加セットを分析した。プロトコルは、関連する現地の倫理委員会によって認可され、全参加者はインフォームドコンセントを与えた。
【００５１】
ＡＣＰＡ検出のためのＥＬＩＳＡ
ベースラインで酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ  ＲＡ  Ｍａｒｋ  ２；Ｅｕｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ａｒｎｈｅｍ、オランダ）によって収集された血清中の全ＩｇＧ抗ＣＣＰ２をＡＣＰＡの尺度として測定した。２５単位／ｍｌを超える値の試料を製造者の指示に従って陽性とみなした。ＣＣＰ２に対する抗体を有する個体をＡＣＰＡ陽性とみなした。
【００５２】
抗ＣａＦｉｂ抗体検出のためのＥＬＩＳＡ
非修飾Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂを２０μｇ／ｍｌで５０μｌ（ｐＨ９．０  ＰＢＳ希釈）をＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに終夜塗布した。ＰＢＳＴｗｅｅｎで洗浄後、ｐＨ９．０  ＰＢＳ／２％ＢＳＡ  ２００μｌを４℃で２時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、ＲＩＡ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６；３５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％ＴｒｉｔｏｎＸ；０．５％デオキシコール酸Ｎａ；０．１％ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ）で１／５０希釈された血清５０μｌと一緒にウェルを氷上で３時間インキュベートした。それに続くインキュベーションはすべてＲＩＡ緩衝剤中で実施される。標準として、陽性血清プールの段階希釈を使用した。氷上で２時間インキュベートされたＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）を使用してヒトＩｇＧを検出した。最後の洗浄後、ＨＲＰ酵素活性をＡＢＴＳを使用して可視化した。本発明者らは、Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂの吸光度をａＵ／ｍＬに変換した。本発明者らは、陽性応答のカットオフを健康な対照の特異的抗ＣａｒＰ反応性の平均＋２×標準偏差として設定した。
【００５３】
本発明者らは、健康な小児の６７個の血清及び若年性関節炎に罹患した患者の１１０個の血清を分析した。
【００５４】
統計
ロジスティック回帰を用いた社会科学用統計パッケージ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＳＰＳＳ）１７．０を使用してデータを解析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
[実施例２]
【００５５】
材料及び方法
患者及び対照血清
分析された血清は、ライデン早期関節炎クリニック（ＥＡＣ）コホートに参加した患者に由来した。ライデンＥＡＣは、ライデン大学医療センターのリウマチ学研究部門で１９９３年に開始された関節炎を最近発症した患者の初期コホート（症候持続時間＜２年）である（４２）。すべてのＲＡ患者は、１年の経過観察内に米国リウマチ学会（以前は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９８７年改訂のＲＡ分類基準（４３）を満たした。合計５７１名のＲＡ患者が分析に含まれた。患者試料をやはりライデン地区に住んでいる３０５名の健康な対照の試料と比較した。プロトコルは現地の倫理委員会によって認可され、インフォームドコンセントが得られた。
【００５６】
ＥＬＩＳＡによる抗ＣａｒＰ抗体の検出
手短に述べると、非修飾ＦＣＳ及び修飾ＦＣＳをＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に終夜塗布した。洗浄及びブロッキング後、ウェルを血清と一緒にインキュベートした。結合ヒトＩｇＧ又はＩｇＡをウサギ抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＡ抗体（ＤＡＫＯ）を使用して検出した。続いて、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ）。最後の洗浄後、ＨＲＰ酵素活性をＡＢＴＳを使用して可視化した（４４）。Ｆ（ａｂ）２を含めて、ＦＣＳ及びＦｉｂに基づくタンパク質修飾及びＥＬＩＳＡアッセイのより詳細な説明は、オンライン（ＳＩ−材料及び方法（ＳＩ−ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））で利用可能である。本発明者らは、陽性応答のカットオフを健康な対照の特異的抗ＣａｒＰ反応性の平均＋２×標準偏差として設定した。ＡＣＰＡの検出及びウェスタンブロッティングの方法はオンライン（ＳＩ−材料及び方法）で利用可能である。
【００５７】
ＦｉｂペプチドのためのＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２μｇ／ｍｌで１００μｌをＮｕｎｃプレート上に４℃で終夜塗布した。洗浄後、アルギニン、シトルリン、ホモシトルリン又はリジンを含むＦｉｂペプチド（図８Ａ）（４５）を１０μｇ／ｍｌでＰＴＢ１００μｌ中で室温で１時間インキュベートした。次に、これらの抗原に対して反応性である抗体の反応性を上述したように検出した。
【００５８】
阻害研究
抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡが交差反応性抗体であるかどうか判定するために、本発明者らは阻害研究を実施した。ＡＣＰＡと抗ＣａｒＰ抗体の両方に陽性である自己抗体陽性血清試料を、漸増濃度の非修飾ＦＣＳ、Ｃａ−ＦＣＳ、Ｃｉ−ＦＣＳ又はＣＣＰ１ペプチドのシトルリン若しくはアルギニン含有形態（４６）と一緒にプレインキュベートした。室温（ＲＴ）でプレインキュベーション後、上述したように、Ｃａ−ＦＣＳ及びＣｉ−ＦＣＳに対する反応性について試料を試験した。Ｃｉ−ＦｉｂとＣａ−Ｆｉｂの両方に陽性である血清及びＦ（ａｂ’）２試料をＦｉｂ、Ｃｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂと一緒に４℃で終夜プレインキュベートし、続いてＦｉｂ  ＥＬＩＳＡで分析した（ＳＩ−材料及び方法）。
【００５９】
放射線学的進行
ＥＡＣコホートにおいては、長軸方向で得られた手足のＸ線像を、シャープ／ファン  デル  ハイデ法に従って採点した（４７）。採点及び分析は依然に詳述されている（２４）。データを直接、又は反復測定分析を使用して各患者に対して得られた長軸方向のデータを最適に利用して、分析する（２４）。より詳細な情報がオンライン（ＳＩ−材料及び方法）で利用可能である。
【００６０】
抗原の生成
本発明者らはカルバミル化タンパク質に対する抗体がＲＡ患者の血清中に存在するかどうか、又はどのタンパク質をそれらが認識するか知らなかったので、本発明者らは多様なセットのカルバミル化タンパク質の試験を開始して、できるだけ多くの抗ＣａｒＰ反応性を検出する可能性を最大にした。この目的のために、本発明者らは、カルバミル化された、シトルリン化された、又は未処理のままのウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｂｏｄｉｎｃｏ）を使用した。カルバミル化ＦＣＳ（Ｃａ−ＦＣＳ）を生成するために、ＦＣＳをＨ２Ｏで４ｍｇ／ｍｌに希釈し、シアン酸カリウム（Ｓｉｇｍａ）を濃度１Ｍまで添加した。３７℃で１２時間インキュベーション後、試料をＨ２Ｏで徹底的に透析した。５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン（Ｆｉｂ）を０．５Ｍシアン酸カリウムと一緒に４℃で３日間インキュベートし、続いてＰＢＳで徹底的に透析することによって、カルバミル化フィブリノーゲン（Ｃａ−Ｆｉｂ）を作製した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、０．０１５Ｍ  ＣａＣｌ２及び４０Ｕ  ＰＡＤ４（Ｓｉｇｍａ）を含む体積１ｍＬ中でＦＣＳ又はＦｉｂ  １０ｍｇを３７℃で２４時間インキュベートすることによって、シトルリン化ＦＣＳ（Ｃｉ−ＦＣＳ）及びシトルリン化フィブリノーゲン（Ｃｉ−Ｆｉｂ）を作製した。本発明者らは、質量分析によってシトルリン及びホモシトルリン残基の存在を確認した。Ｆｉｂの場合、本発明者らは、本発明者らが分析したタンパク質セグメント中に、広範なシトルリン化及び完全なカルバミル化を認めた。
【００６１】
ＥＬＩＳＡによる抗ＣａｒＰ抗体の検出
非修飾ＦＣＳ及び修飾ＦＣＳを１０μｇ／ｍｌで５０μｌ（ｐＨ９．６  ０．１Ｍ炭酸塩−炭酸水素塩緩衝剤希釈）（ＣＢ）をＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に終夜（ＯＮ）塗布した。０．０５％ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ）（ＰＴ）を含むＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳ／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを４℃で６時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡ緩衝剤（ＰＴＢ）で１／５０希釈された血清５０μｌと一緒にウェルを氷上で終夜インキュベートした。それに続くインキュベーションはすべてＰＴＢ中で実施される。標準として、陽性血清プールの段階希釈を使用した。氷上で３．５時間インキュベートされたウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）又はウサギ抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｄａｋｏ）を使用してヒトＩｇＧ又はＩｇＡを検出した。洗浄後、ウェルを氷上でＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ）と一緒に３．５時間インキュベートした。最後の洗浄後、ＨＲＰ酵素活性を依然に記述されたようにＡＢＴＳを使用して可視化した（２５）。健康な対象（ｎ＝３０５）の血清を対照として使用した。本発明者らは、Ｃａ−ＦＣＳとＦＣＳの両方の吸光度をａＵ／ｍＬに変換し、ＦＣＳのバックグラウンド信号（ａＵ／ｍＬ）をＣａ−ＦＣＳの信号（ａＵ／ｍＬ）から減算して、特異的抗ＣａｒＰ反応性を分析した（図７）。本発明者らは、陽性応答のカットオフを健康な対照の特異的抗ＣａｒＰ反応性の平均＋２×標準偏差として設定した。
【００６２】
フィブリノーゲンのＥＬＩＳＡ
非修飾Ｆｉｂ  Ｃｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂを２０μｇ／ｍｌで５０μｌ（ｐＨ９．０  ＰＢＳ希釈）をＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに終夜塗布した。ＰＴで洗浄後、ｐＨ９．０  ＰＢＳ／２％ＢＳＡ  ２００μｌを４℃で２時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、ＲＩＡ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６；３５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％ＴｒｉｔｏｎＸ；０．５％デオキシコール酸Ｎａ；０．１％ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ）で１／５０希釈された血清５０μｌと一緒にウェルを氷上で３時間インキュベートした。それに続くインキュベーションはすべてＲＩＡ緩衝剤中で実施される。標準として、陽性血清プールの段階希釈を使用した。氷上で２時間インキュベートされたＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）を使用してヒトＩｇＧを検出した。最後の洗浄後、ＨＲＰ酵素活性をＡＢＴＳを使用して可視化した。本発明者らは、２１４名のＲＡ患者の血清及び５４名の健康な対象の血清を対照として分析した。本発明者らは、Ｆｉｂ  Ｃｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂの吸光度をａＵ／ｍＬに変換した。本発明者らは、陽性反応のカットオフを健康な対照の特異的抗ＣａｒＰ反応性の平均＋２×標準偏差として設定した。これらのアッセイを３回繰り返すと、同じデータを示した。
【００６３】
Ｆ（ａｂ’）２調製物
２つの抗ＣａｒＰ陽性及び２つの対照血清由来の全ＩｇＧをＨｉＴｒａｐ（商標）タンパク質Ａ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって製造者によって提供されたカラムのプロトコルに従って単離した。Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆ（ａｂ’）２調製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造者によって提供されたプロトコルに従って精製ＩｇＧ試料から作製された。本発明者らは、完全ＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）２の分子的性質をクーマシー染色ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを使用して確認した。これらのＦ（ａｂ’）２を上述したようにＥＬＩＳＡに使用した。今回は、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭカッパ、ラムダ抗体（抗軽鎖）（Ｄａｋｏ）又はＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄａｋｏ）を使用した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡによるＡＣＰＡの検出
ＡＣＰＡをＣＣＰ２  ＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ  ＲＡ  Ｍａｒｋ  ２；Ｅｕｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ａｒｎｈｅｍ、オランダ）によって測定した。２５単位／ｍｌを超える値の試料を製造者の指示に従って陽性とみなした。少数のＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者は抗ＣＣＰ２反応性の範囲外にあることもあり、したがって、両方の用語を使用して、本発明者らの分析に使用されたものを明示することになる。
【００６５】
Ｃｉ−ＦＣＳに対するＡＣＰＡ反応性を、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉｓｏｒｐプレートにおいてＣＢで希釈されたＣｉ−ＦＣＳ（５０μｌ／ウェル  １０μｇ／ｍｌ）で４℃で終夜被覆されたＥＬＩＳＡプレートを使用して検出した。プレートをＰＴで洗浄し、続いてＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液１００μｌを使用して３７℃で１時間ブロッキングした。洗浄後、血清をＰＴＢ５０μｌで１／５０希釈でインキュベートし、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ヒトＩｇＡ及びＩｇＧを上述したように検出した。
【００６６】
ウエスタンブロットによる抗ＣａｒＰ抗体の検出
ＦＣＳ、Ｃａ−ＦＣＳ及びＣｉ−ＦＣＳを１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルに載せ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｅｘｔｒａ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ＰＴで洗浄後、ブロットをブロッキング緩衝剤（３％ＥＬＫ  Ｍｉｌｋ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中で室温で１時間インキュベートした。続いて、ブロットをブロッキング緩衝剤で１：５００希釈された血清２．５ｍｌと一緒に室温で１．５時間インキュベートした。血清は、ＥＬＩＳＡで測定して、ＡＣＰＡ陽性抗ＣａｒＰ陰性又はＡＣＰＡ陰性抗ＣａｒＰ陽性であった。ＰＴで３回洗浄後、ブロッキング緩衝剤で希釈されたＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ５ｍＬと一緒にブロットを室温で１時間インキュベートした。次に、ブロットを洗浄し、結合した抗体を増感化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化した。
【００６７】
放射線学的進行の統計
抗ＣａｒＰ抗体陽性とＸ線写真的進行の関連を前記社会科学用統計パッケージ（ＳＰＳＳ）１７．０を使用して分析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。長軸方向のデータの多変量正規回帰分析を、放射線学的スコアを応答変数として用いて使用した。この方法は、反復測定を即座に分析し、これらの測定間の相関を利用して、より正確な標準誤差をもたらす。放射線学的スコアを対数変換して、正規分布を得た。経時的関節破壊率を、時間と抗ＣａｒＰの相互作用によって試験した。時間の効果は、相互作用期間において線形であると想定した。時間の効果は、モデルにおける因子としても入力され、経時的平均応答プロファイルを与えた。処理の代理（ｐｒｏｘｙ）として年齢、性別及び算入期間がすべての分析において補正変数として含まれた。別の分析においては、抗ＣａｒＰ抗体の効果を、抗ＣＣＰ及びＲＦの効果に対して補正した。
【００６８】
[実施例1]
結果
抗ＣａｒＰ抗体の検出
本発明者らは、インビトロで生成されたカルバミル化ＦＣＳで被覆されたプレートを使用して血清及び滑液から抗ＣａｒＰ抗体を検出する新規ＥＬＩＳＡを作成した。本発明者らは、カルバミル化ＦＣＳ（Ｃａ−ＦＣＳ）に対してＩｇＧとＩｇＡの両方の用量依存的結合を示し、未変性ＦＣＳに対して結合しない陽性血清のプールから標準を作製した（図１Ａ）。ホモシトルリンとシトルリンは極めて類似した残基であるが互いに１原子異なるので、本発明者らは、抗ＣａｒＰ抗体が実際にＡＣＰＡである可能性を除外したいと思った。これを除外する第１の試験として、本発明者らは、Ｃａ−ＦＣＳに結合した抗ＣａｒＰ抗体がＣａ−ＦＣＳ自体によってのみ阻害され得るが、シトルリン化ＦＣＳ（Ｃｉ−ＦＣＳ）、未変性ＦＣＳによっても、ＡＣＰＡを検出するのに使用されるペプチドによっても阻害されず（図１Ｂ）、抗ＣａｒＰが真に異なる反応性であることを示す阻害研究を実施した。ＡＣＰＡとＣＣＰ２プレートの結合もＣａ−ＦＣＳの添加によって阻害されなかった（データ示さず）。
【００６９】
これらの方法はＥＬＩＳＡに依拠するので、本発明者らは本発明者らの知見をウエスタンブロット法を使用して確認したいとも思った。本発明者らは、非還元性ゲル上でＦＣＳ及びＣａ−ＦＣＳを泳動させ、ウェスタンブロッティング後、ＥＬＩＳＡで検出された、抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性又は陰性である患者の血清を使用してブロットを染色した。抗ＣａｒＰ抗体陽性患者の血清は、Ｃａ−ＦＣＳを載せたレーンで陽性であったが、ＦＣＳを載せたレーンでは反応性は見られなかった（図１Ｃ）。抗ＣａｒＰ抗体陰性患者由来の血清は、かかる染色を示さなかった。添加されたゲル上のクーマシー染色によって、本発明者らは、ＦＣＳ添加レーンが類似のタンパク質量を含むことを確認する。まとめると、これらのデータは、本発明者らが、ＩｇＧとＩｇＡの両方の抗ＣａｒＰ抗体を特異的に検出することができる新規アッセイを作成したことを示している。
【００７０】
抗ＣａｒＰ抗体はＲＡ中に存在する。
ライデン早期関節炎クリニック（ＥＡＣ）から、本発明者らは、１９８７年選択基準に従ってＵＡ又はＲＡに罹患した患者を使用した。さらに、本発明者らは、やはりライデン地域の健康な対照を使用した。本発明者らは、患者と対照における抗ＣａｒＰ抗体の存在を同時に測定した。ＯＤ値は、標準を使用して任意の単位／ｍＬに計算された。本発明者らは、健康な人を使用して、健康な対照の平均＋２×標準偏差で定義される陽性のカットオフを計算した。本発明者らは、試料がカットオフより高い力価を有し、ＦＣＳに比べてＣａ−ＦＣＳ上で少なくとも０．１単位高い吸光度を有するときに、試料が陽性であるとみなした［１７］。この手法を用いて、本発明者らは、ＲＡ患者の４２％がＩｇＧ抗ＣａｒＰ抗体陽性であるのに対して、試験したＲＡ患者由来の血清の５４％がＩｇＡ抗ＣａｒＰ抗体陽性であることを確認した（図２）。対になった血清／滑液試料の分析によれば、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡは、血清中のこれらの自己抗体に陽性である患者の滑液中にも見ることができる（データ示さず）。
【００７１】
抗ＣａｒＰ抗体は、かなりの割合のＲＡ患者における血清及び滑液中に存在する。
【００７２】
抗ＣａｒＰ抗体は、ＡＣＰＡとは無関係である。
次に、本発明者らは、抗ＣａｒＰ抗体がＡＣＰＡとは無関係に生じるかどうか分析したいと思った。このために、本発明者らは、３７３名のＲＡ患者のセットにおいて、ＡＣＰＡと抗ＣａｒＰ抗体の関係を分析した。本発明者らのデータによれば、ＲＡ患者の１４％及び２３％はＡＣＰＡを示さないが、それぞれ抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡを有する。同様に、ＲＡ患者の２２％及び１９％はＡＣＰＡに対して陽性であるが、それぞれ抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ及びＩｇＡに対して陰性であった（図３）。ＡＣＰＡ陰性個体に注目して、本発明者らは、すべてのＡＣＰＡ陰性ＲＡ患者の約５０％が抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性であることを認めた。したがって、抗ＣａｒＰ抗体は、ＡＣＰＡとは無関係に生じる。
【００７３】
抗ＣａｒＰ抗体はＲＡの発症を予示する。
ベースラインで未分化関節炎の診断を呈する患者は、寛解することがあり、別の形態の関節炎を発症することがあり、又はＲＡを発症することがある。臨床的に、それは、治療を必要とする患者と自然に寛解する患者を識別できることに関連する。したがって、本発明者らは、ベースラインでＵＡを有する４２５名の患者を抗ＣａｒＰ抗体の存在及びＲＡの発症について分析した（ｎ＝１５１）。本発明者らは、ＩｇＧ抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性であることが１９８７年基準によるＲＡの発症と統計学的に有意に関連しないことを認めた（ｐ＝０．１１）。それに対して、ＩｇＡ抗ＣａｒＰ抗体は、全体としてＵＡ群における今後のＲＡ発症と強く関連した（ｐ＝０．００２）（図４）。この効果は、ＡＣＰＡ陰性個体において特に顕著であった（図４）。
【００７４】
未分化関節炎に罹患した患者における抗ＣａｒＰ抗体の測定は、ＲＡを発症するリスクがある人を特定するのに有用である。
【００７５】
抗ＣａｒＰ抗体は、より重篤な放射線学的損傷に関連する。
最後に、本発明者らは、ベースラインで抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性であるＲＡ患者がその疾患の異なる臨床経過を有するかどうかを分析した。したがって、本発明者らは、関節損傷の程度を経時的に比較した。この分析においても、ＩｇＧ抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性であることは、放射線学的損傷と統計学的に有意に関連しなかった（ｐ＝０．４３）。しかし、ＩｇＡ抗ＣａｒＰ抗体は、関節のより重篤な損傷と強く関連し（ｐ＝０．００２）（図５）、リウマチ因子（ＲＦ）又はＡＣＰＡとは無関係な効果である。全体として、これらのデータは、抗ＣａｒＰ抗体がＲＡ及び又はＡＣＰＡの存在とは無関係により重篤な疾患経過と関連することを示している。
【００７６】
考察
ここで、カルバミル化タンパク質を認識する自己抗体（抗ＣａｒＰ）の新規ファミリーについて記述する。これらの抗ＣａｒＰ抗体は、ＩｇＧとＩｇＡの両方のアイソタイプで検出することができる。阻害研究とコホート研究の両方によれば、抗ＣａｒＰ抗体はＡＣＰＡとは異なる。興味深いことに、抗ＣａｒＰ、特にＩｇＡに対して陽性であることは、抗ＣａｒＰ  ＩｇＡに対して陽性の個体はＵＡからＲＡに進行するリスクが高く、抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ陽性ＲＡ患者は抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ陰性ＲＡ患者よりも悪い成績を有するという臨床的意味を有する。
【００７７】
本発明者らは、複合タンパク質混合物を初期カルバミル化タンパク質抗原源として使用することに決め、したがって本発明者らはＣａ−ＦＣＳを作製した。本発明者らは、ＥＬＩＳＡとウエスタンブロットシステムの両方で未変性ＦＣＳにもシトルリン化ＦＣＳにも結合しないＦＣＳのカルバミル化体に特異的な抗体が存在することを認めた。これらの抗体は、ＩｇＧとＩｇＡの両方のアイソタイプであり、クラス転換されたＢ細胞に由来することを示し、Ｔ細胞の助けを必要とするプロセスである。実際、データは、ホモシトルリンに対するＴ細胞がカルバミル化モデル抗原を用いた免疫化によって誘導され得ることを示している［１１］。
【００７８】
本発明者らは、ここで、早期関節炎におけるこれらの抗体の検出が、今後のＲＡの発症を予測でき、より重篤な疾患経過を予測できることを示す。早期の積極的な治療が有益であることが判明したので［１８、１９］、本発明は、関節炎に罹患した又は罹患するリスクがある個体の関節炎治療方法であって、前記個体の関節炎診断を含み、前記診断が、前記個体の体液を含む試料中の抗ＣａｒＰ抗体を測定する方法を含む、方法を提供する。好ましくは、試料は、抗ＣａｒＰ抗体を含むと判定された。前記抗ＣａｒＰ陽性個体のより厳密な治療は、患者に有益である。
【００７９】
要するに、シトルリン化タンパク質を認識する自己抗体系（ＡＣＰＡ）に次いで、カルバミル化タンパク質に対する自己抗体系（抗ＣａｒＰ）も存在する。かかる抗体の検出は、その存在が、ＡＣＰＡとは無関係に、ＵＡからＲＡへの進行に関連し、より重篤な疾患経過に関連するので、有用である。
【００８０】
[実施例２]
結果
抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡは異なる抗体ファミリーである。
カルバミル化タンパク質に対する抗体（抗ＣａｒＰ抗体）を検出するために、本発明者らは、カルバミル化ＦＣＳ（Ｃａ−ＦＣＳ）及び非修飾ＦＣＳを抗原として用いるＥＬＩＳＡを開発した。４０名のＲＡ患者及び４０名の対照の血清を分析して、本発明者らは、ＲＡ患者の血清が、ＩｇＧ（図７Ａ、Ｂ）とＩｇＡ（図７Ｃ、Ｄ）の両方の反応性を有する健康な対象から得られる血清に比べて、Ｃａ−ＦＣＳと反応することを認めた。Ｃａ−ＦＣＳに対するＲＡ血清の高い反応性は、無修飾ＦＣＳに対する反応性を減算後に更に強調される（図７Ｃ、Ｅ）。シトルリン及びホモシトルリンは、２種類のかなり類似したアミノ酸であるので（図６）、本発明者らは、次に、ＡＣＰＡが、ペプチド中でシトルリンと同じ位置にあるときのホモシトルリンも認識するかどうか判定したいと思った。この目的のために、本発明者らは、ＡＣＰＡによって認識されることが知られているシトルリン化Ｆｉｂペプチドを使用したＥＬＩＳＡを実施した（２３）。このペプチド骨格内で、シトルリン、アルギニン、ホモシトルリン又はリジン残基が更なる分析のために導入された。７６個のＲＡ血清のセットを分析して、本発明者らは、ＡＣＰＡがシトルリン化ペプチドのみを認識し、アルギニン含有又はホモシトルリン含有ペプチドを認識しないことを認めた（図８Ａ）。これらのデータは、ＡＣＰＡが、同じペプチド骨格内に存在するシトルリンとホモシトルリンを識別できることを示す。次に、本発明者らは、翻訳後修飾タンパク質に結合する抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡの交差反応性があるかどうか分析したいと思った。したがって、本発明者らは、シトルリン化とカルバミル化の両方の抗原に対して反応性である血清を使用して阻害研究を実施した。本発明者らは、Ｃａ−ＦＣＳ、シトルリン化ＦＣＳ（Ｃｉ−ＦＣＳ）、未変性ＦＣＳと一緒の、又はＡＣＰＡを検出するのに使用されるシトルリン化ペプチド（ＣＣＰ１）によって、プレインキュベーション後のＣａ−ＦＣＳ被覆プレートに対する抗ＣａｒＰ抗体の結合を分析した。プレインキュベーション後、本発明者らは、Ｃａ−ＦＣＳに結合した抗ＣａｒＰ抗体がＣａ−ＦＣＳによってのみ阻害され得るが、シトルリン化ＦＣＳ（Ｃｉ−ＦＣＳ）、未変性ＦＣＳによっても、ＡＣＰＡを検出するのに使用されるペプチドによっても阻害されないことを認めた（図８Ｂ）。本発明者らは、逆阻害実験も実施して、同じプレインキュベーション手順に従ってＣｉ−ＦＣＳで被覆されたプレートに対するＡＣＰＡの結合を分析した。本発明者らは、Ｃｉ−ＦＣＳに結合したＡＣＰＡが、Ｃｉ−ＦＣＳ及びシトルリン化ペプチドによってのみ阻害され得るが、Ｃａ−ＦＣＳでも、非修飾ＦＣＳでも、アルギニン形態のペプチドでも阻害されないことを認めた（図８Ｃ）。全体として、これらのデータは、抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡが交差反応性ではなく、又は有限の交差反応性にすぎず、ホモシトルリン、それぞれシトルリン含有抗原に対して特異的であることを示す。上記観察はすべてＥＬＩＳＡを使用してなされたので、本発明者らは、異なる技術を使用して本発明者らの知見を確認したいとも思った。このため、本発明者らは、還元ゲル上でＦＣＳ、Ｃａ−ＦＣＳ及びＣｉ−ＦＣＳを使用してウエスタンブロット分析を実施し、続いてウエスタンブロット法を実施した。異なるブロットを、抗ＣａｒＰ陽性及びＡＣＰＡ陰性又は抗ＣａｒＰ陰性及びＡＣＰＡ陽性である個体の血清と一緒にインキュベートした。本発明者らは、抗ＣａｒＰ陽性試料の陽性染色をＣｉ−ＦＣＳでもＦＣＳでもなくＣａ−ＦＣＳのみで認めた（図８Ｄ）。それに対して、抗ＣａｒＰ陰性、ＡＣＰＡ陽性試料は、Ｃａ−ＦＣＳ及びＦＣＳではなく、Ｃｉ−ＦＣＳと反応した（図８Ｄ）。抗ＣａｒＰ抗体の存在を確認するために、本発明者らは、これらの実験をより明確なタンパク質ヒトＦｉｂを標的抗原として使用して繰り返した。Ｆｉｂは、ＰＡＤによってシトルリン化され（Ｃｉ−Ｆｉｂ）、又はシアナートによってカルバミル化された（Ｃａ−Ｆｉｂ）。非修飾形態（Ｆｉｂ）、Ｃｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−ＦｉｂをＥＬＩＳＡにおける抗原として使用した。ＦＣＳの観察と同様に、本発明者らは、抗体とＣｉ−Ｆｉｂ及びＣａ−Ｆｉｂの有意な結合を認めたが、Ｆｉｂ被覆ウェルでは認められなかった（図９Ａ）。これは、主として、ＲＡ血清に限定され、対照には限定されなかった（ｐ＝＜０．０００１）。交差反応性を分析するために、本発明者らは、上述したように阻害研究も実施した。ＥＬＩＳＡ分析によって、ＡＣＰＡ及び抗ＣａｒＰ抗体はほぼ非交差反応性であることが確認された。カルバミル化タンパク質に対する反応性が抗体の抗原結合部によって確実に媒介されるようにするために、本発明者らはＦ（ａｂ’）２を作製した。予想どおりに、Ｆ（ａｂ’）２は、陰性試料ではなく抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ陽性試料から生成され、抗ＣａｒＰ反応性を示す（図９Ｃ、Ｄ）。完全抗体を使用して観察されるように、Ｃａ−Ｆｉｂに対するＦ（ａｂ’）２反応性もＣａ−Ｆｉｂによって特異的に阻害され得るが、Ｃｉ−Ｆｉｂに対するＦ（ａｂ’）２反応性はＣｉ−Ｆｉｂによってのみ特異的に阻害され得る（図９Ｅ）。
【００８１】
まとめると、これらのデータは、抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡが異なる抗原を認識し、一方がシトルリン化タンパク質を認識し（ＡＣＰＡ）、他方がカルバミル化タンパク質を認識する（抗ＣａｒＰ）ことを示す。同様に、これらのデータは、抗原認識が、Ｆ（ａｂ’）２断片中に存在する可変ドメインによって媒介される可能性が最も高いことを示す。
【００８２】
抗ＣａｒＰ抗体はＲＡ中に存在する。
ＡＣＰＡとは別個の自己抗体ファミリーとして抗ＣａｒＰ抗体の同定後、本発明者らは、ＲＡ患者及び対照の大集団においてこれらの抗ＣａｒＰ抗体の存在を定量化したいと思った。このため、本発明者らは、まず、抗ＣａｒＰ抗体陽性血清のプールを含む標準を作製した。この標準は、ＩｇＧとＩｇＡの両方とカルバミル化ＦＣＳ（Ｃａ−ＦＣＳ）の特異的用量依存的結合を示したが、無修飾ＦＣＳには結合しなかった（図１０Ａ、Ｂ）。この分析では、本発明者らは、できるだけ多くの抗ＣａｒＰ反応性を捕らえようとしてＦＣＳに基づくアッセイを再度使用した。本発明者らは、方法のセクションに記載のように、３０５名の健康な個体の血清を使用して陽性のカットオフを設定した。この手法を使用して、本発明者らは、分析されたＲＡ患者の血清の４５％がＩｇＧ抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性であることを認めた（図１０Ｃ）。同様に、試験されたＲＡ患者の血清の４３％はＩｇＡ抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性である（図１０Ｄ）。
【００８３】
抗ＣａｒＰ抗体は、抗ＣＣＰ２陰性ＲＡ患者の血清中にも存在する。
この研究で分析されたＲＡ患者の群は、ＣＣＰ２アッセイによって測定して、ＡＣＰＡ陽性とＡＣＰＡ陰性の両方の個体からなった。したがって、本発明者らは、次に、抗ＣａｒＰ抗体と抗ＣＣＰ２抗体の関連性を分析した。抗ＣａｒＰ抗体及び抗ＣＣＰ２抗体の存在は、ＲＡ集団全体を分析したときに限定された相関を示した（抗ＣａｒＰ  ＩｇＧの場合、ｒ２＝０．２７、ｐ＜０．００１、又はＩｇＡの場合、ｒ２＝０．１５、ｐ＜０．００１）。しかし、本発明者らは、抗ＣＣＰ２抗体に対してのみ陽性であるかなりの数のＲＡ患者、並びに抗ＣａｒＰ抗体に対してのみ陽性である患者群も特定した（図１０Ｅ、Ｆ）。本発明者らは、抗ＣＣＰ２陰性ＲＡ患者の約１６％が抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ抗体を示し、抗ＣＣＰ２陰性ＲＡ患者の３０％が抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ陽性を示すことを認めた（図１０Ｇ、Ｈ）。これらのデータは、抗ＣａｒＰ抗体の存在が抗ＣＣＰ２抗体の出現率と重なるが、３０％を超える抗ＣＣＰ２陰性患者が抗ＣａｒＰ抗体を有するので、この重なりは絶対的なものではないことを示している。全体では、全抗ＣＣＰ２陰性患者の３５％超が抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ又はＩｇＡ抗体を有する。
【００８４】
抗ＣａｒＰ抗体は、より重篤な放射線学的損傷に関連する。
ＡＣＰＡの存在は、放射線学的損傷によって測定して、より重篤な臨床的疾患経過に関連する。抗ＣａｒＰ抗体の存在がより重篤な疾患経過も予示するかどうか分析するために、本発明者らは、ライデンＥＡＣコホートに参加した抗ＣａｒＰ陽性と陰性患者の経時的関節損傷度を比較した。このコホートは、関節炎を最近発症した患者の初期コホートであり、手足のＸ線がすべてのＲＡ患者で毎年撮影されて、シャープ−ファン  デル  ハイデ法によって放射線学的損傷が評価される（２４）。本発明者らは、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧの存在がより重篤な疾患進行と強く関連することを認めた。抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ陽性患者は、ＩｇＧ陰性患者よりも７年間にわたって関節破壊が多く、ＡＣＰＡ及びＲＦの補正なしで（β＝２．０１、９５％ＣＩ  １．６８〜２．４０、ｐ＝８．６８×１０−１４）又は補正ありで（β＝１．４１、９５％ＣＩ  １．１３〜１．７６、ｐ＝０．００２）である（図１３）。抗ＣａｒＰ  ＩｇＡは、ＡＣＰＡ及びＲＦの補正なしで（β＝１．２１、９５％ＣＩ  １．０１〜１．４５、ｐ＝０．０４１）抗ＣａｒＰ  ＩｇＡ陰性患者よりも７年間にわたりより多くの関節破壊に関連するが、補正後は関連がない（ｐ＝０．８５５）（図１３）。上記分析は、抗ＣａｒＰ抗体が抗ＣＣＰ２陰性、抗ＣＣＰ２陽性又は両方のＲＡサブグループにおいて放射線学的進行を予測するかどうか示さないので、本発明者らは、次に、層別解析を実施した。重要なことには、この解析によって、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧの存在が抗ＣＣＰ２陰性サブグループにおいてより重篤な関節損傷に関連することが判明した（β＝１．８６、９５％ＣＩ  １．４１〜２．６６、ｐ＝１．８・１０−５）（図１１）。同様に、より多くの経時的関節損傷に対する類似の傾向が、ＩｇＡ抗ＣａｒＰ抗体に対して陽性を示した抗ＣＣＰ２陰性患者でも認められた（β＝１．２５、９５％ＣＩ  ０．９８〜１．５８、ｐ＝０．０７１）（図１３）。それに対して、重篤な関節破壊によって既に特徴づけられた抗ＣＣＰ２陽性サブグループにおいては、更なる増加は抗ＣａｒＰ抗体も有する個体において認められなかった（図１３）。全体として、これらのデータは、ベースラインにおける抗ＣａｒＰ抗体の検出が、シャープ／ファン  デル  ハイデ法によって測定して、抗ＣＣＰ２陰性ＲＡにおけるより破壊的な疾患経過を予示することを示している。
【００８５】
考察
カルバミル化タンパク質を認識する自己抗体である抗ＣａｒＰ抗体のファミリーは、ＲＡ患者の血清中に検出することができる。阻害研究とコホート研究の両方によれば、抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡは、２つの異なる独立した自己抗体ファミリーであり、一方はカルバミル化タンパク質を認識し、他方はシトルリン化タンパク質を認識する。本発明者らのデータによれば、抗ＣａｒＰ抗体とＡＣＰＡは、概して非交差反応性ではあるが、カルバミル化タンパク質接種後のウサギにおいて得られた最近のデータでも示されるように、本発明者らは、幾らかの交差反応性が集団レベルで存在することを排除しない（１４）。興味深いことに、抗ＣａｒＰ抗体陽性は、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ陽性個体としての臨床成績に関係するが、抗ＣＣＰ２抗体陰性は、抗ＣａｒＰ  ＩｇＧ陰性ＲＡ患者に比べてより破壊的な疾患経過を有する。
【００８６】
現在、カルバミル化のような翻訳後修飾を起こすタンパク質は不明である。カルバミル化は、尿素と平衡にあるシアナートによって媒介される。高い尿素濃度、喫煙及び炎症は、この平衡をシアナート側にシフトさせ、したがってカルバミル化を促進することが報告された（１３）。現在、抗ＣａｒＰ抗体に生体内で関連する標的は不明であるので、本発明者らは、抗ＣａｒＰ抗体の検出のための初期カルバミル化タンパク質抗原源として複合タンパク質混合物を使用した。ウエスタンブロット分析は、（高尿素濃度を表す）シアナートを使用したカルバミル化後のＦＣＳ中に存在する少なくとも１種類の主要なタンパク質の抗ＣａｒＰ抗体による認識を示す（図８Ｄ）。しかし、これらのデータは、カルバミル化がより漸進的ではあるが常に生じているプロセスである生体内の状況を表していない可能性がある（２５）。この点に関して、カルバミル化はほぼ不可逆的であり、したがって半減期の長いタンパク質上にホモシトルリン残基が蓄積するので、特に長寿命のタンパク質は、次第にホモシトルリン残基を得る可能性がある。興味深いことに、関節は、コラーゲン、他の軟骨で発現されるタンパク質などの長寿命タンパク質の存在が知られている。したがって、かかる基質タンパク質は、生存中に、特に炎症条件下で、ホモシトルリン残基を蓄積すると考えられる。実際、ホモシトルリンは関節に存在することが判明し（１１）、恐らくは多数の関節由来のタンパク質の長寿命の性質を示す。これらのタンパク質の識別情報、及びこれらが抗ＣａｒＰ抗体の標的として役立ち得るかどうかを知ることは興味深い。
【００８７】
ＡＣＰＡによって認識される抗原の分子的性質は、１５年以上前に確認され、シトルリンは、これらのＲＡ特異抗体によって認識される抗原の必須成分であると記述された（２６、２７）。この知見は、関連する新たな洞察をＲＡ診断及び病因論に与える道筋をつけたので、かなりの衝撃を与えた（１）。例えば、ＡＣＰＡは、現在、ＲＡの新しいＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準の一部であり（２８）、動物モデル（２９、３０、３１）と生体外ヒト研究（３２、３３、３４、３５）の両方においてＲＡ病原に関係している。重要なことには、ＡＣＰＡの記述は、多数の臨床的特徴を共有するが、遺伝的背景、素因になるような環境要因、及び臨床的進行／寛解に関して異なる少なくとも２つの臨床症候群をＲＡが構成するという認識をもたらした（３６、３、４、３７、３８）。確固たる結論を出すには尚早であることは明白であるが、認識された抗原の類似の性質、及びＡＣＰＡ陰性疾患におけるその存在を考慮に入れると、抗ＣａｒＰ抗体も病因の一因になり、及び／又は診断上の価値を有すると推測したくなる。
【００８８】
抗ＣＣＰ２陰性疾患における抗ＣａｒＰ抗体の存在は、潜在的にＲＡのこの徴候の少なくとも一部を積極的に確認する新規バイオマーカーであり得るので極めて興味深い。この可能性の更なる洞察を得るために、抗ＣａｒＰ抗体の存在がＲＡに特異的であるかどうか、又は別のリウマチ性疾患においても見られるかどうか、並びにその存在が早期の未分類ＲＡ及び／又は関節痛などの関節疾患に罹患した患者における（ＡＣＰＡ陰性）ＲＡの発症を予測するかどうか確かめることは重要である。
【００８９】
陽性試料を規定するカットオフを設定するために、本発明者らは、健康な対照の血清におけるＣａ−ＦＣＳ及びＦＣＳに対するＩｇＧ及びＩｇＡの存在を分析した。全試料のＣａ−ＦＣＳ及びＦＣＳに対する反応性を試験して、同じプレート上に存在する抗ＣａｒＰ抗体陽性標準を使用して吸光度値をａＵ／ｍＬに変換した。幾つかの個体対象由来の血清は非修飾ＦＣＳに対しても反応性を示したので、本発明者らは、検量線によって定義されたａＵ／ｍＬを使用して、Ｃａ−ＦＣＳに対する反応性から「ＦＣＳ反応性」を減算した。本発明者らは、続いて、カットオフを平均＋２×標準偏差として計算し、類似の戦略に従ってＲＡ患者のデータにカットオフを適用した。この方法の欠点は、別の抗原性実体であるＦＣＳに対するａＵ／ｍＬを測定するために標準をＣａ−ＦＣＳに対して使用することである。しかし、この方法は、翻訳後修飾に対する特異的応答の計算を可能にした。
【００９０】
カットオフを設定するどの方法も利点と限界を有する。したがって、本発明者らは、続いて、カットオフを対照における抗Ｃａ−ＦＣＳ応答の平均＋２×標準偏差として計算することによって、別の戦略も使用して本発明者らの観察を確認した。このカットオフを、以前にも使用されたように、ＲＡ患者のデータに適用した（３９）。ＡＣＰＡ陰性ＲＡにおけるＩｇＧの放射線学的進行との関連は、低有意水準（ｐ＝０．００１）ではあるが、依然有意である。
【００９１】
臨床的観点からは、早期関節炎における抗ＣａｒＰ抗体の検出は、より重篤な疾患経過を予測するので、極めて価値のある可能性がある。早期の積極的なＲＡ治療は今後の損傷を防止することが判明したので（４０、４１）、抗ＣａｒＰ抗体の検出は、重篤な疾患を発症するリスクのある抗ＣＣＰ２陰性患者を特定するのに有益かもしれない。かかる患者の特定は、特に分類が困難である早期関節炎患者において、発症後早期の治療法決定を導くのに重要かもしれない。
【００９２】
要するに、シトルリン化タンパク質を認識する自己抗体系（ＡＣＰＡ）に加えて、カルバミル化タンパク質に対する自己抗体系（抗ＣａｒＰ）もＲＡ患者の血清中に存在する。抗ＣａｒＰ抗体の検出は、重篤な疾患経過のリスクがある患者を特定する新しい可能性を提供することができる。
【００９３】
参考文献
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９  ワン（Ｗａｎｇ）Ｙ，ウィソツカ（Ｗｙｓｏｃｋａ）Ｊ，サイグ（Ｓａｙｅｇｈ）Ｊ，リー（Ｌｅｅ）ＹＨ，ペリン（Ｐｅｒｌｉｎ）ＪＲ，レオネリ（Ｌｅｏｎｅｌｌｉ）Ｌ他  ヒトＰＡＤ４は、脱メチルイミノ化によってヒストンアルギニンメチル化レベルを調節する（Ｈｕｍａｎ  ＰＡＤ４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｖｉａ  ｄｅｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）．サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００４；３０６（５６９４）：２７９−８３．
１０  リー（Ｌｉ）Ｐ，リー（Ｌｉ）Ｍ，リンドベルグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）ＭＲ，ケネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ）ＭＪ，シュン（Ｘｉｏｎｇ）Ｎ，ワン（Ｗａｎｇ）Ｙ．ＰＡＤ４は、好中球細胞外トラップによって媒介される抗菌性自然免疫に不可欠である（ＰＡＤ４  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ）．ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディスン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）２０１０；２０７（９）：１８５３−６２．
１１  ミデル（Ｍｙｄｅｌ）Ｐ，ワン（Ｗａｎｇ）Ｚ，ブリスラート（Ｂｒｉｓｓｌｅｒｔ）Ｍ，ヘルバード（Ｈｅｌｌｖａｒｄ）Ａ，ダルバーグ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）ＬＥ，ハゼン（Ｈａｚｅｎ）ＳＬ他  Ｔ細胞のカルバミル化依存活性化：自己免疫性関節炎の病原における新規機序（Ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．ジャーナル  オブ  イミュノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）２０１０；１８４（１２）：６８８２−９０．
１２  シルパル（Ｓｉｒｐａｌ）Ｓ．アテローム硬化型血管疾患の機構経路としてのミエロペルオキシダーゼ媒介性リポタンパク質カルバミル化（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）．クリニカル  サイエンス（Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ）（ロンドン）２００９；１１６（９）：６８１−９５．
１３  ワン（Ｗａｎｇ）Ｚ，ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ）ＳＪ，ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ＥＲ，クム（Ｋｕｍｍｕ）Ｏ，ホルコ（Ｈｏｒｋｋｏ）Ｓ，バーナード（Ｂａｒｎａｒｄ）Ｊ他  タンパク質カルバミル化は、炎症、喫煙、尿毒及びアテローム発生を関連させる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ｓｍｏｋｉｎｇ，  ｕｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）．ネイチャー  メディスン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ）２００７；１３（１０）：１１７６−８４．
１４  ツルネン（Ｔｕｒｕｎｅｎ）Ｓ，コイブラ（Ｋｏｉｖｕｌａ）ＭＫ，リステリ（Ｒｉｓｔｅｌｉ）Ｌ），リステリ（Ｒｉｓｔｅｌｉ）Ｊ．抗シトルリン抗体は、ウサギにおけるホモシトルリン含有タンパク質に起因し得る（Ａｎｔｉｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｈｏｍｏｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）２０１０；６２（１１）：３３４５−５２．
１５  ファン  アクネン（ｖａｎ  Ａｋｅｎ）Ｊ．，ファン  ビルセン（ｖａｎ  Ｂｉｌｓｅｎ）ＪＨ，アラート（Ａｌｌａａｒｔ）ＣＦ，フイジンガ（Ｈｕｉｚｉｎｇａ）ＴＷ，ブリードベルド（Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ）ＦＣ．ライデン早期関節炎クリニック（Ｔｈｅ  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｅａｒｌｙ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃ）．クリニカル  アンド  エクスペリメンタル  リューマトロジー（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）２００３；２１（５  Ｓｕｐｐｌ  ３１）：Ｓ１００−Ｓ１０５．
１６  アーネット（Ａｒｎｅｔｔ）ＦＣ，エドワーシー（Ｅｄｗｏｒｔｈｙ）ＳＭ，ブロッホ（Ｂｌｏｃｈ）ＤＡ，マクシェン（ＭｃＳｈａｎｅ）ＤＪ，フリーズ（Ｆｒｉｅｓ）ＪＦ，クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）ＮＳ他  米国リウマチ学会１９８７年リウマチ様関節炎分類改訂基準（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９８７  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）１９８８；３１（３）：３１５−２４．
１７  フェアプールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔ）ＫＮ，チェウン（Ｃｈｅｕｎｇ）Ｋ，イオアン−ファシネイ（Ｉｏａｎ−Ｆａｃｓｉｎａｙ）Ａ，ファン  デル  ヘルム−バン  ミル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｌｍ−ｖａｎ  Ｍｉｌ）ＡＨ，デ  ブリース−ボウストラ（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ−Ｂｏｕｗｓｔｒａ）ＪＫ，アラート（Ａｌｌａａｒｔ）ＣＦ他  抗シトルリン化タンパク質抗体応答の繊細な特異性は、共有エピトープ対立遺伝子によって影響される（Ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｌｌｅｌｅｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）２００７；５６（１２）：３９４９−５２．
１８  ファン  デル  ヘルム−バン  ミル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｌｍ−ｖａｎ  Ｍｉｌ）ＡＨ，レ（ｌｅ）ＣＳ，ファン（ｖａｎ）ＤＨ，ブリードベルド（Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ）ＦＣ，トウズ（Ｔｏｅｓ）ＲＥ，ホイジンガ（Ｈｕｉｚｉｎｇａ）ＴＷ、最近発症した未分化関節炎の患者における疾患結果の予測基準：個体治療法決定指針（Ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｒｕｌｅ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｅｎｔ−ｏｎｓｅｔ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ｈｏｗ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）２００７；５６（２）：４３３−４０．
１９  ファン  ドンジェン（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）Ｈ，ファン  アクネン（ｖａｎ  Ａｋｅｎ）Ｊ，ラード（Ｌａｒｄ）ＬＲ，ヴィセル（Ｖｉｓｓｅｒ）Ｋ，ロンデイ（Ｒｏｎｄａｙ）ＨＫ，ハルスマンス（Ｈｕｌｓｍａｎｓ）ＨＭ他  推定リウマチ様関節炎患者におけるメトトレキサート治療の有効性：二重盲検無作為化プラセボ対照試験（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）２００７；５６（５）：１４２４−３２．
２３．ウイレムゼ（Ｗｉｌｌｅｍｚｅ）Ａ他（２０１１）ＨＬＡ共有エピトープ対立遺伝子と喫煙の相互作用、及び幾つかのシトルリン化抗原に対する自己免疫へのその寄与（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＨＬＡ  ｓｈａｒｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）６３：１８２３−１８３２．
２４．ファン  デル  リンデン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ）ＭＰ他（２００９）ＣＤ４０における単一ヌクレオチド多形とリウマチ様関節炎における関節破壊速度の関連性（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ＣＤ４０  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｊｏｉｎｔ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）６０：２２４２−２２４７．
２５．ベルリン（Ｂｅｒｌｙｎｅ）ＧＭ（１９９８）健康及び尿毒症におけるカルバミル化タンパク質及びペプチド（Ｃａｒｂａｍｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｉｎ  ｕｒｅｍｉａ）．ネフロン（Ｎｅｐｈｒｏｎ）７９：１２５−１３０．
２６．マッソン−ベシエール（Ｍａｓｓｏｎ−Ｂｅｓｓｉｅｒｅ）Ｃ他（２００１）リウマチ様関節炎特異的抗フィラグリン自己抗体の主要滑液標的は、フィブリンのアルファ及びベータ鎖の脱イミノ化形態である（Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｆｉｌａｇｇｒｉｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｄｅｉｍｉｎａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ）．ジャーナル  オブ  イミュノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）１６６：４１７７−４１８４．
２７．シェレケンス（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ）ＧＡ他（１９９８）シトルリンは、リウマチ様関節炎特異的自己抗体によって認識される抗原決定基の必須成分である（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）．ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲイション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）１０１：２７３−２８１．
２８．アレタハ（Ａｌｅｔａｈａ）Ｄ他（２０１０）リウマチ様関節炎の２０１０米国リウマチ学会／リウマチに対するヨーロッパ連盟分類基準（Ｔｈｅ  ２０１０  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ／  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）
２９．ヒル（Ｈｉｌｌ）ＪＡ他（２００８）ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウスにおける翻訳後修飾（シトルリン化）フィブリノーゲンによって誘発される関節炎（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  （ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ）  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｉｎ  ＤＲ４−ＩＥ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）．ザ  ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディスン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）２０５：９６７−９７９．
３０．クーン（Ｋｕｈｎ）ＫＡ他（２００６）シトルリン化タンパク質に対する抗体は、実験的自己免疫性関節炎において組織傷害を増強する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲイション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）１１６：９６１−９７３．
３１．ウイサル（Ｕｙｓａｌ）Ｈ他（２００９）実験的関節炎におけるシトルリン化コラーゲンタイプＩＩに特異的な抗体の構造及び病原性（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディスン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）
３２．クラベル（Ｃｌａｖｅｌ）Ｃ他（２００８）フィブリノーゲンと複合化されたシトルリン化タンパク質に対するリウマチ様関節炎特異的自己抗体によるＦｃガンマ受容体ＩＩａの結合を介した腫よう壊死因子アルファのマクロファージ分泌の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩａ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）５８：６７８−６８８．
３３．ルー（Ｌｕ）ＭＣ他（２０１０）抗シトルリン化タンパク質抗体は、単球／マクロファージ上の表面発現シトルリン化Ｇｒｐ７８に結合し、腫よう壊死因子アルファ産生を刺激する（Ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｉｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  Ｇｒｐ７８  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）６２：１２１３−１２２３．
３４．シュエルウエー（Ｓｃｈｕｅｒｗｅｇｈ）ＡＪＭ他（２０１０）リウマチ様関節炎におけるＩｇＥ抗シトルリン化タンパク質抗体の機能的役割の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩｇＥ  ａｎｔｉｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．米国科学アカデミー予稿集（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１０７：２５８６−２５９１．
３５．トロウ（Ｔｒｏｕｗ）ＬＡ他（２００９）リウマチ様関節炎患者由来の抗環式シトルリン化ペプチド抗体は、古典的経路と別経路の両方によって補体を活性化する（Ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｃ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｖｉａ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）６０：１９２３−１９３１．
３６．リン−ラスカー（Ｌｉｎｎ−Ｒａｓｋｅｒ）ＳＰ他（２００６）喫煙は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１共有エピトープ対立遺伝子を有するリウマチ様関節炎患者においてのみ抗ＣＣＰ抗体の危険因子である（Ｓｍｏｋｉｎｇ  ｉｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＣＣＰ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎｌｙ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｈｏ  ｃａｒｒｙ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１  ｓｈａｒｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｌｌｅｌｅｓ）．アナルズ  オブ  ザ  リウマチック  ディジーズ（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ）６５：３６６−３７１．
３７．ファン  ガーレン（ｖａｎ  Ｇａａｌｅｎ）ＦＡ他（２００４）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子と環式シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）に対する自己抗体の関連性は、リウマチ様関節炎の重症度に影響を及ぼす（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  （ＣＣＰｓ）  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）５０：２１１３−２１２１．
３８．フェアプールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔ）ＫＮ他（２００５）ＨＬＡ−ＤＲ３と抗環式シトルリン化ペプチド抗体陰性リウマチ様関節炎の関連性（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ３  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｃ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）５２：３０５８−３０６２．
３９．フェアプールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔ）ＫＮ他（２００７）抗シトルリン化タンパク質抗体応答の繊細な特異性は、共有エピトープ対立遺伝子によって影響される（Ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｌｌｅｌｅｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）５６：３９４９−３９５２．
４０．ファン  デル  ヘルム−バン  ミル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｌｍ−ｖａｎ  Ｍｉｌ）ＡＨ他（２００７）最近発症した未分化関節炎の患者における疾患結果の予測基準：個体治療法決定指針（Ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｒｕｌｅ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｅｎｔ−ｏｎｓｅｔ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ｈｏｗ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）５６：４３３−４４０．
４１．ファン  ドンジェン（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）Ｈ他（２００７）推定リウマチ様関節炎患者におけるメトトレキサート治療の有効性：二重盲検無作為化プラセボ対照試験（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）５６：１４２４−１４３２．
４２．デ  ルーイ（ｄｅ  Ｒｏｏｙ）ＤＰＣ他（２０１１）関節炎結果を予測するＧＣｏｅライデン早期関節炎クリニックから何を学ぶことができるか？（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｏｕｔｃｏｍｅｓＧＣｏｅｗｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｅａｒｌｙ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃ？）．リウマトロジー（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）５０：９３−１００．
４３．アーネット（Ａｒｎｅｔｔ）ＦＣ他（１９８８）米国リウマチ学会１９８７年リウマチ様関節炎分類改訂基準（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９８７  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ）３１：３１５−３２４．
４４．スワンナライ（Ｓｕｗａｎｎａｌａｉ）Ｐ他（２０１１）抗シトルリン化タンパク質抗体は、リコール抗原に対する抗体よりも低い結合活性を有する（Ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｈａｖｅ  ａ  ｌｏｗ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｃａｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）．アナルズ  オブ  ザ  リウマチック  ディジーズ（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）７０：３７３−３７９．
４５．フェアプールト（Ｖｅｒｐｏｏｒｔ）ＫＮ他（２００７）抗シトルリン化タンパク質抗体応答の繊細な特異性は、共有エピトープ対立遺伝子によって影響される（Ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｌｌｅｌｅｓ）．アースリシス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）５６：３９４９−３９５２．
４６．シェレケンス（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ）ＧＡ他（１９９８）シトルリンは、リウマチ様関節炎特異的自己抗体によって認識される抗原決定基の必須成分である（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）．ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲイション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）１０１：２７３−２８１．
４７．ファン  デル  ハイデ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅ）Ｄ（２０００）シャープ／ファン  デル  ハイデ法によるＸ線像の読み取り方（Ｈｏｗ  ｔｏ  ｒｅａｄ  ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｈａｒｐ／ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅ  ｍｅｔｈｏｄ）．ジャーナル  オブ  リウマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）２７：２６１−２６３．
【００９４】
[表１]
表Ｉ  フィブリノーゲンアルファのリジン含有ペプチド及びそのホモシトルリン含有対応物のリスト
フィブリノーゲンアルファのリジン   フィブリノーゲンアルファのホモシトルリン含有ペプチド
含有ペプチド
1RVVERHQSACKDSDWPFCSDE   1RVVERHQSAChomocitDSDWPFCSDE
2PFCSDEDWNYKCPSGCRMKGL   2PFCSDEDWNYhomocitCPSGCRMhomocitGL
3NYKCPSGCRMKGLIDEVNQDF   3NYhomocitCPSGCRMhomocitGLIDEVNQDF
4VNQDFTNRINKLKNSLFEYQK   4VNQDFTNRINhomocitLhomocitNSLFEYQhomocit
5QDFTNRINKLKNSLFEYQKNN   5QDFTNRINhomocitLhomocitNSLFEYQhomocitNN
6KLKNSLFEYQKNNKDSHSLTT   6homocitLhomocitNSLFEYQhomocitNNhomocitDSHSLTT
7NSLFEYQKNNKDSHSLTTNIM   7NSLFEYQhomocitNNhomocitDSHSLTTNIM
8EDLRSRIEVLKRKVIEKVQHI   8EDLRSRIEVLhomocitRhomocitVIEhomocitVQHI
9LRSRIEVLKRKVIEKVQHIQL   9LRSRIEVLhomocitRhomocitVIEhomocitVQHIQL
10IEVLKRKVIEKVQHIQLLQKN  10IEVLhomocitRhomocitVIEhomocitVQHIQLLQhomocitN
11EKVQHIQLLQKNVRAQLVDMK  11EhomocitVQHIQLLQhomocitNVRAQLVDMhomocit
12KNVRAQLVDMKRLEVDIDIKI  12homocitNVRAQLVDMhomocitRLEVDIDIhomocitI
13MKRLEVDIDIKIRSCRGSCSR   13MhomocitRLEVDIDIhomocitIRSCRGSCSR 
14SRALAREVDLKDYEDQQKQLE  14SRALAREVDLhomocitDYEDQQhomocitQLE
15VDLKDYEDQQKQLEQVIAKDL  15VDLhomocitDYEDQQhomocitQLEQVIAhomocitDL
16QQKQLEQVIAKDLLPSRDRQH  16QQhomocitQLEQVIAhomocitDLLPSRDRQH
17SRDRQHLPLIKMKPVPDLVPG  17SRDRQHLPLIhomocitMhomocitPVPDLVPG
18DRQHLPLIKMKPVPDLVPGNF  18DRQHLPLIhomocitMhomocitPVPDLVPGNF
19PVPDLVPGNFKSQLQKVPPEW  19PVPDLVPGNFhomocitSQLQhomocitVPPEW
20VPGNFKSQLQKVPPEWKALTD  20VPGNFhomocitSQLQhomocitVPPEWhomocitALTD
21SQLQKVPPEWKALTDMPQMRM  21SQLQhomocitVPPEWhomocitALTDMPQMRM
22SSGTGGTATWKPGSSGPGSTG  22SSGTGGTATWhomocitPGSSGPGSTG
23PGTRREYHTEKLVTSKGDKEL  23PGTRREYHTEhomocitLVTShomocitGDhomocitEL
24EYHTEKLVTSKGDKELRTGKE  24EYHTEhomocitLVTShomocitGDhomocitELRTGhomocitE
25TEKLVTSKGDKELRTGKEKVT  25TEhomocitLVTShomocitGDhomocitELRTGhomocitEhomocitVT
26SKGDKELRTGKEKVTSGSTTT  26ShomocitGDhomocitELRTGhomocitEhomocitVTSGSTTT
27GDKELRTGKEKVTSGSTTTTR  27GDhomocitELRTGhomocitEhomocitVTSGSTTTTR
28STTTTRRSCSKTVTKTVIGPD  28STTTTRRSCShomocitTVThomocitTVIGPD
29TRRSCSKTVTKTVIGPDGHKE  29TRRSCShomocitTVThomocitTVIGPDGHhomocitE
30TKTVIGPDGHKEVTKEVVTSE  30ThomocitTVIGPDGHhomocitEVThomocitEVVTSE
31IGPDGHKEVTKEVVTSEDGSD  31IGPDGHhomocitEVThomocitEVVTSEDGSD
32AAFFDTASTGKTFPGFFSPML  32AAFFDTASTGhomocitTFPGFFSPML
33GSESGIFTNTKESSSHHPGIA  33GSESGIFTNThomocitESSSHHPGIA
34PGIAEFPSRGKSSSYSKQFTS  34PGIAEFPSRGhomocitSSSYShomocitQFTS
35PSRGKSSSYSKQFTSSTSYNR  35PSRGhomocitSSSYShomocitQFTSSTSYNR
36YNRGDSTFESKSYKMADEAGS  36YNRGDSTFEShomocitSYhomocitMADEAGS
37GDSTFESKSYKMADEAGSEAD  37GDSTFEShomocitSYhomocitMADEAGSEAD
38EADHEGTHSTKRGHAKSRPVR  38EADHEGTHSThomocitRGHAhomocitSRPVR
39GTHSTKRGHAKSRPVRDCDDV  39GTHSThomocitRGHAhomocitSRPVRDCDDV
40SGTQSGIFNIKLPGSSKIFSV  40SGTQSGIFNIhomocitLPGSShomocitIFSV
41IFNIKLPGSSKIFSVYCDQET  41IFNIhomocitLPGSShomocitIFSVYCDQET
42LNFNRTWQDYKRGFGSLNDEG  42LNFNRTWQDYhomocitRGFGSLNDEG
43VRGIHTSPLGKPSLSP       43VRGIHTSPLGhomocitPSLSP
【００９５】
[表２]
表ＩＩ  フィブリノーゲンベータのリジン含有ペプチド及びそのホモシトルリン含有対応物のリスト
フィブリノーゲンベータのリジン含有 フィブリノーゲンベータのホモシトルリン含有ペプチド
ペプチド
1MKRMVSWSFHKL                 1MhomocitRMVSWSFHhomocitL
2MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLL        2MhomocitRMVSWSFHhomocitLhomocitTMhomocitHLLLL
3RMVSWSFHKLKTMKHLLLLLL        3RMVSWSFHhomocitLhomocitTMhomocitHLLLLLL
4SWSFHKLKTMKHLLLLLLCVF        4SWSFHhomocitLhomocitTMhomocitHLLLLLLCVF
5LLLLLCVFLVKSQGVNDNEEG        5LLLLLCVFLVhomocitSQGVNDNEEG
6FSARGHRPLDKKREEAPSLRP        6FSARGHRPLDhomocithomocitREEAPSLRP
7SARGHRPLDKKREEAPSLRPA        7SARGHRPLDhomocithomocitREEAPSLRPA
8SGGGYRARPAKAAATQKKVER        8SGGGYRARPAhomocitAAATQhomocithomocitVER
9ARPAKAAATQKKVERKAPDAG        9ARPAhomocitAAATQhomocithomocitVERhomocitAPDAG
10RPAKAAATQKKVERKAPDAGG       10RPAhomocitAAATQhomocithomocitVERhomocitAPDAGG
11AAATQKKVERKAPDAGGCLHA       11AAATQhomocithomocitVERhomocitAPDAGGCLHA
12SSSFQYMYLLKDLWQKRQKQV       12SSSFQYMYLLhomocitDLWQhomocitRQhomocitQV
13YMYLLKDLWQKRQKQVKDNEN       13YMYLLhomocitDLWQhomocitRQhomocitQVhomocitDNEN
14LLKDLWQKRQKQVKDNENVVN       14LLhomocitDLWQhomocitRQhomocitQVhomocitDNENVVN
15DLWQKRQKQVKDNENVVNEYS       15DLWQhomocitRQhomocitQVhomocitDNENVVNEYS
20PVVSCEEIIRKGGETSEMYLI       20PVVSCEEIIRhomocitGGETSEMYLI
21MYLIQPDSSVKPYRVYCDMNT       21MYLIQPDSSVhomocitPYRVYCDMNT
22VDFGRKWDPYKQGFGNVATNT       22VDFGRhomocitWDPYhomocitQGFGNVATNT
23FGNVATNTDGKNYCGLPGEYW       23FGNVATNTDGhomocitNYCGLPGEYW
24LPGEYWLGNDKISQLTRMGPT       24LPGEYWLGNDhomocitISQLTRMGPT
25TELLIEMEDWKGDKVKAHYGG       25TELLIEMEDWhomocitGDhomocitVhomocitAHYGG
26LIEMEDWKGDKVKAHYGGFTV       26LIEMEDWhomocitGDhomocitVhomocitAHYGGFTV
27EMEDWKGDKVKAHYGGFTVQN       27EMEDWhomocitGDhomocitVhomocitAHYGGFTVQN
28GGFTVQNEANKYQISVNKYRG       28GGFTVQNEANhomocitYQISVNhomocitYRG
29EANKYQISVNKYRGTAGNALM       29EANhomocitYQISVNhomocitYRGTAGNALM
30NDGWLTSDPRKQCSKEDGGGW       30NDGWLTSDPRhomocitQCShomocitEDGGGW 
31LTSDPRKQCSKEDGGGWWYNR       31LTSDPRhomocitQCShomocitEDGGGWWYNR 
32WGGQYTWDMAKHGTDDGVVWM       32WGGQYTWDMAhomocitHGTDDGVVWM
33TDDGVVWMNWKGSWYSMRKMS       33TDDGVVWMNWhomocitGSWYSMRhomocitMS
34NWKGSWYSMRKMSMKIRPFFQ       34NWhomocitGSWYSMRhomocitMSMhomocitIRPFFQ
35SWYSMRKMSMKIRPFFPQQ         35SWYSMRhomocitMSMhomocitIRPFFPQQ 
【００９６】
[表３]
表ＩＩＩ  フィブリノーゲンガンマのリジン含有ペプチド及びそのホモシトルリン含有対応物のリスト
フィブリノーゲンガンマのリジン含有フィブリノーゲンガンマのホモシトルリン含有ペプチド
ペプチド
1IADFLSTYQTKVDKDLQSLED       1IADFLSTYQThomocitVDhomocitDLQSLED
2FLSTYQTKVDKDLQSLEDILH       2FLSTYQThomocitVDhomocitDLQSLEDILH
3LEDILHQVENKTSEVKQLIKA       3LEDILHQVENhomocitTSEVhomocitQLIhomocitA
4HQVENKTSEVKQLIKAIQLTY       4HQVENhomocitTSEVhomocitQLIhomocitAIQLTY
5NKTSEVKQLIKAIQLTYNPDE       5NhomocitTSEVhomocitQLIhomocitAIQLTYNPDE
6QLTYNPDESSKPNMIDAATLK       6QLTYNPDESShomocitPNMIDAATLhomocit
7KPNMIDAATLKSRKMLEEIMK       7homocitPNMIDAATLhomocitSRhomocitMLEEIMhomocit
8MIDAATLKSRKMLEEIMKYEA       8MIDAATLhomocitSRhomocitMLEEIMhomocitYEA
9KSRKMLEEIMKYEASILTHDS       9homocitSRhomocitMLEEIMhomocitYEASILTHDS
10LQEIYNSNNQKIVNLKEKVAQ      10LQEIYNSNNQhomocitIVNLhomocitEhomocitVAQ
11NSNNQKIVNLKEKVAQLEAQC      11NSNNQhomocitIVNLhomocitEhomocitVAQLEAQC
12NNQKIVNLKEKVAQLEAQCQE      12NNQhomocitIVNLhomocitEhomocitVAQLEAQCQE
13QLEAQCQEPCKDTVQIHDITG      13QLEAQCQEPChomocitDTVQIHDITG
14DTVQIHDITGKDCQDIANKGA      14DTVQIHDITGhomocitDCQDIANhomocitGA
15TGKDCQDIANKGAKQSGLYFI      15TGhomocitDCQDIANhomocitGAhomocitQSGLYFI
16DCQDIANKGAKQSGLYFIKPL      16DCQDIANhomocitGAhomocitQSGLYFIhomocitPL
17GAKQSGLYFIKPLKANQQFLV      17GAhomocitQSGLYFIhomocitPLhomocitANQQFLV
18GSGNGWTVFQKRLDGSVDFKK      18GSGNGWTVFQhomocitRLDGSVDFhomocithomocit
19QKRLDGSVDFKKNWIQYKEGF      19QhomocitRLDGSVDFhomocithomocitNWIQYhomocitEGF
20KRLDGSVDFKKNWIQYKEGFG      20homocitRLDGSVDFhomocithomocitNWIQYhomocitEGFG
21VDFKKNWIQYKEGFGHLSPTG      21VDFhomocithomocitNWIQYhomocitEGFGHLSPTG
22GTTEFWLGNEKIHLISTQSAI      22GTTEFWLGNEhomocitIHLISTQSAI
23RTSTADYAMFKVGPEADKYRL      23RTSTADYAMFhomocitVGPEADhomocitYRL
24AMFKVGPEADKYRLTYAYFAG      24AMFhomocitVGPEADhomocitYRLTYAYFAG
25GFDFGDDPSDKFFTSHNGMQF      25GFDFGDDPSDhomocitFFTSHNGMQF
26QFSTWDNDNDKFEGNCAEQDG      26QFSTWDNDNDhomocitFEGNCAEQDG
27EQDGSGWWMNKCHAGHLNGVY      27EQDGSGWWMNhomocitCHAGHLNGVY
28GVYYQGGTYSKASTPNGYDNG      28GVYYQGGTYShomocitASTPNGYDNG
29YDNGIIWATWKTRWYSMKKTT      29YDNGIIWATWhomocitTRWYSMhomocithomocitTT
30ATWKTRWYSMKKTTMKIIPFN      30ATWhomocitTRWYSMhomocithomocitTTMhomocitIIPFN
31TWKTRWYSMKKTTMKIIPFNR      31TWhomocitTRWYSMhomocithomocitTTMhomocitIIPFNR
32RWYSMKKTTMKIIPFNRLTIG      32RWYSMhomocithomocitTTMhomocitIIPFNRLTIG
【図１Ａ】
2014505884.tif 000002
【図１Ｂ】
2014505884.tif 000003
【図１Ｃ】
2014505884.tif 000004
【図２】
2014505884.tif 000005
【図３】
2014505884.tif 000006
【図４】
2014505884.tif 000007
【図５】
2014505884.tif 000008
【図６Ａ】
2014505884.tif 000009
【図６Ｂ】
2014505884.tif 000010
【図７】
2014505884.tif 000011
【図８】
2014505884.tif 000012
【図９】
2014505884.tif 000013
【図１０】
2014505884.tif 000014
【図１１】
2014505884.tif 000015
【図１２Ａ】
2014505884.tif 000016
【図１２Ｂ】
2014505884.tif 000017
【図１２Ｃ】
2014505884.tif 000018
【図１３】
2014505884.tif 000019
【図１４】
2014505884.tif 000020
【図１５】
2014505884.tif 000021
【図１６】
2014505884.tif 000022
【図１７】
2014505884.tif 000023
【国際調査報告】
2014505884.tif 000024
2014505884.tif 000025
2014505884.tif 000026