(57)【要約】  本発明は、種々の小麦過敏症の分野、特に、種々の形態のこれらの疾患の識別用の抗原およびペプチドに関する。本発明は、新規な小麦アレルゲンの同定、およびセリアック病、疱疹状皮膚炎およびＩｇＥ媒介アレルギーの治療および診断におけるその使用に関する。さらに、本発明は、治療および診断における公知のペプチドおよびタンパク質の使用を提供する。また、本発明は、セリアック病、疱疹状皮膚炎およびＩｇＥ媒介アレルギーの診断および治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６〜５０、６２〜８６および８９〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
小麦から単離されるか、または組換え生成される請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１〜２５のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する請求項３記載の単離核酸分子。
【請求項５】
治療または診断に用いるための請求項１もしくは２記載のポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体。
【請求項６】
セリアック病、疱疹状皮膚炎もしくはＩｇＥ媒介アレルギーの治療または診断に用いるための請求項１もしくは２記載のポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体。
【請求項７】
治療または診断に用いるための配列番号５１〜６１、８７および８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体。
【請求項８】
セリアック病、疱疹状皮膚炎もしくはＩｇＥ媒介アレルギーの治療または診断に用いるための配列番号５１〜６１、８７および８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体。
【請求項９】
治療における使用が、寛容誘導または予防的処置を含む請求項８記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのＴ細胞−、ＩｇＡ−またはＩｇＥ−結合応答を抑制または減弱するように改変された該ポリペプチドの低アレルギー性形態、および所望による医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
該ポリペプチドの低アレルギー性形態が、分子の断片化、トランケーションまたはタンデム化、内部セグメントの欠失、ドメイン再構成、アミノ酸残基の置換、 ジスルフィド架橋の崩壊により改変される請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有する断片もしくは変異体を、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に添加する工程を含むアレルゲン組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法で得られるアレルゲン組成物。
【請求項１４】
−セリアック病を有することが疑われる哺乳動物からの体液または組織試料と、配列番号６２〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体とを接触させ；次いで
−リンパ球増殖アッセイ、細胞活性化のＦＡＣＳ分析の使用によって、またはサイトカイン放出を測定することによってのように試料中で活性化Ｔ細胞の存在を測定することを含み；
ここに、活性化Ｔ細胞の存在は、セリアック病を示すことを特徴とするセリアック病のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項１５】
−培地中で、セリアック病を有することが疑われる哺乳動物からの白血球と、配列番号６２〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体とを接触させ；次いで
−該哺乳動物からの細胞試料と培地とを接触させ；次いで
−細胞試料中でインターフェロンγまたは他の細胞傷害物質の存在を測定することを含み；
ここに、インターフェロンγまたは他の細胞傷害物質の存在は、セリアック病を示すことを特徴とするセリアック病のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項１６】
細胞試料が腸上皮細胞を含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
−セリアック病、疱疹状皮膚炎またはＩｇＥ媒介アレルギーを有することが疑われる哺乳動物からの体液または組織試料と、配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体とを接触させ；次いで
−該ポリペプチドまたはポリペプチド群に特異的に結合しているＩｇＡまたはＩｇＥ抗体の試料中の存在を検出することを含み；
ここに、該ポリペプチドまたはポリペプチド群に特異的に結合するかかる抗体の存在は、セリアック病、疱疹状皮膚炎またはＩｇＥ媒介アレルギーを示すことを特徴とするセリアック病、疱疹状皮膚炎またはＩｇＥ媒介アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項１８】
ＩｇＥ媒介アレルギーが小麦食物アレルギーであることを特徴とする、請求項６または８記載のポリペプチドまたは請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有する断片もしくは変異体または請求項１０もしくは１１に記載の組成物を含む請求項１４〜１８のいずれか１記載の方法を行なうための診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の形態の小麦過敏症の分野、特に、種々の形態のこれらの疾患の識別用の抗原およびペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧｅｌｌおよびＣｏｏｍｂｓの分類（組織傷害の免疫機構の分類である）によれば、以下の４つの型の過敏症が存在する：Ｉ型、ＩｇＥ抗体および抗原の相互作用ならびにヒスタミンおよび他のメディエーターの放出によって媒介された即時型過敏反応；ＩＩ型、細胞表面上の抗体−抗原相互作用による抗体媒介過敏症反応；ＩＩＩ型、循環免疫複合体の形成および組織中でのそれらの沈着による、免疫複合体、局所または全身の炎症反応；ならびにＩＶ型、リンホカインの放出またはＴ細胞媒介細胞毒性のいずれかにより感作されたＴリンパ球により惹起される細胞媒介性過敏症反応が存在する。
【０００３】
小麦（トリーティクム・アエスティウム：Triticum aestivum）は、種々の形態の過敏症を引き起こしかねない。それは３つの区別されるＩｇＥ媒介アレルギー、小麦花粉アレルギー、パン屋喘息および小麦食物アレルギーを引き起こしかねない。小麦花粉アレルギーは、花粉アレルギーの群に属する。パン屋喘息は小麦粉により引き起こされる呼吸アレルギーであり；これは、パン類製造業者、製粉業者または糖菓製造者に発症する重要な職業病である。小麦誘発食物アレルギーは非常に一般的であり、小麦含有食物の摂取後に生じ、湿疹、蕁麻疹、胃腸症状、結膜炎および他の多数の症状を含めた多種多様な臨床症状に導く（１）。ＩｇＥ媒介小麦アレルギーに加えて、小麦に対する過敏症のセリアック病が存在し、これは、小麦タンパク質に対するＩｇＡ抗体およびＴ細胞反応性、ならびにいくつかの腸タンパク質に対する自己反応性のＩｇＡ抗体の発生により特徴付けられる（２、３）。それは、小腸において絨毛萎縮を引き起こし、慢性下痢または便秘、栄養失調、貧血、疲労、成長遅延および片頭痛（４）のような症状に導く小麦に対する炎症性過敏症である（４）。
【０００４】
小麦（トリーティクム・アエスティウム）および小麦製品は栄養における主要要素であるので、小麦製品の回避は、小麦誘発過敏症に苦しむ患者についての現在唯一の治療法である。抗原特異的なアプローチは、過敏症を引き起こすタンパク質の詳細な知識および有効性を必要とするであろう。現在までに、小麦に対する種々の形態の過敏症を識別する診断ツールとして用いられる、明確化されたタンパク質およびペプチドの欠如が存在する。したがって、正確な診断は、小麦粉に対する呼吸アレルギーの場合には特定の吸入負荷、食物アレルギーが疑わしい場合には二重盲検プラセボ対照食物負荷（ＤＢＰＣＦＣ）、ならびにセリアック病についての規定食（diet）に続いて再負荷および／または腸生検に依拠する。Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎら（５）は、小麦食物アレルギー患者ではなくパン屋喘息患者によって認識される特定の組換え小麦粉アレルゲンを同定した。彼らは、天然抽出物とは対照的にマクロ配列した組換えアレルゲンの有用性を示した。しかしながら、アレルゲンのパネルは不完全であり、したがって、小麦食物アレルギーまたはセリアック病に関与する、より多くの抗原およびペプチドを同定し、かつ種々の形態の小麦過敏症に苦しむ患者を区別する方法および診断テストを確立する必要性が存在している。加えて、小麦媒介過敏症の治療のためのかかる小麦抗原およびペプチドを用いる必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、種々の形態の小麦過敏症の分野、特に、種々の形態のこれらの疾患の識別用の抗原およびペプチドに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、前記の先行技術に関係する課題を克服することである。本発明は、種々の形態の小麦過敏症に関与し、種々の形態の小麦過敏症の治療および診断に用い得るポリペプチドおよび核酸配列を提供する。
【０００７】
本発明の１つの態様により、配列番号２６〜５０、６２〜８６および８９〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【０００８】
１つの具体例において、ポリペプチドは、それが小麦から単離されるか、または組換え生成されるという点で特徴付けられる。別法として、ポリペプチドは化学合成によって生成し得る。
【０００９】
本発明のさらなる具体例は、前記のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。例えば、核酸は配列番号１〜２５のいずれか１つのヌクレオチド配列を有し得る。
【００１０】
本発明のもう一つの態様により、前記のポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体は、治療または診断における使用のためのものである。
【００１１】
より詳細には、ポリペプチドまたは前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体は、セリアック病、疱疹状皮膚炎もしくはＩｇＥ媒介アレルギーの治療または診断における使用のためのものである。疱疹状皮膚炎は、セリアック病と関係する皮膚病である。
【００１２】
さらに、本発明は、治療または診断における使用のための、配列番号５１〜６１、８７および８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体を提供する。
【００１３】
より詳細には、配列番号５１〜６１、８７および８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかかる単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体は、セリアック病、疱疹状皮膚炎もしくはＩｇＥ媒介アレルギーの治療または診断における使用のためのものである。さらに、一の具体例により、治療における使用は寛容誘導または予防的処置を含む。
【００１４】
さらにもう一つの態様により、本発明は、配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのＴ細胞、ＩｇＡもしくはＩｇＥ結合反応を抑制もしくは減弱させるために改変された前記ポリペプチドの低アレルギー性形態、および所望により、医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
１つの具体例において、医薬組成物に含まれるポリペプチドの低アレルギー性形態は、分子の断片化、トランケーションまたはタンデム化、内部セグメントの欠失、ドメイン再構成、アミノ酸残基の置換、ジスルフィド架橋の崩壊により改変される。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体を、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製アレルゲン成分を含む組成物に添加する工程を含む、アレルゲン組成物の製造方法を提供する。
【００１７】
さらに、前記方法で得られるアレルゲン組成物が提供される。
【００１８】
また、本発明は、セリアック病のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
−セリアック病を有することが疑われる哺乳動物からの体液または組織試料と、配列番号６２〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体とを接触させ；次いで
−リンパ球増殖アッセイ、細胞活性化のＦＡＣＳ分析の使用によって、またはサイトカイン放出の測定によってのように試料中で活性化Ｔ細胞を測定することを含み；
ここに、活性化Ｔ細胞の存在は、セリアック病を示すことを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
例えば、Ｔ細胞数および機能は、サイトカイン産生、増殖または細胞毒性のごとき活性によってＴ細胞を検出するアッセイによってモニターされ得る（９、１０）。
【００２０】
腹腔粘膜からのあるＴ細胞がＴｈｌまたはＴｈ０プロフィールを持つサイトカイン、特に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を生成することは従前に記載されている。このサイトカインは、特にＴＮＦアルファと組み合わせて、腹腔病変のいくつかの病理学的特徴に関与し得た（１０）。
【００２１】
同様のシナリオにおいて、Ｔ細胞に由来するＩＦＮ−γが、呼吸上皮細胞を介するアレルゲン侵入を促進し、それにより、アレルギー性炎症を増大させることが示されている（１１）。さらに、ある自己抗原によって刺激された末梢血単核細胞からのＩＦＮ−γ含有培地上清は、呼吸上皮細胞層の崩壊および皮膚角化細胞のアポトーシスを引き起こすことが示されている。この損傷は、中和抗ＩＦＮ−γ抗体で抑制できた（１２）。
【００２２】
また、結果的には、本発明は、セリアック病のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
−培地中で、セリアック病を有することが疑われる哺乳動物からの白血球と、配列番号６２〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体とを接触させ；
−前記哺乳動物からの細胞試料と培地とを接触させ；次いで
−細胞試料中でインターフェロンγまたは他の細胞傷害物質（群）（cell-damaging substance）の存在を測定することを含み；
ここに、インターフェロンγまたは他の細胞傷害物質（群）の存在は、セリアック病を示すことを特徴とする該方法を提供する。
【００２３】
ある具体例において、細胞傷害物質を産生する白血球は、種々のタイプのＴ細胞のごときリンパ球である。
【００２４】
ある具体例において、白血球にポリペプチド（群）との接触をもたらす培地は、体液または組織試料であり、細胞試料に体液または組織試料との接触をもたらす前に、上清が、その体液または組織試料から調製され、細胞試料をその上清と接触させる。次いで、細胞試料中のインターフェロンγまたは他の細胞傷害物質（群）の存在を測定する。
【００２５】
この方法の好ましい具体例において、細胞試料は腸上皮細胞を含む。
【００２６】
細胞傷害物質（群）の効果に起因する細胞傷害は、細胞層の崩壊およびアポトーシスを含み得る。
【００２７】
さらに、本発明は、セリアック病、疱疹状皮膚炎またはＩｇＥ媒介アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
−セリアック病またはＩｇＥ媒介アレルギーを有することが疑われる哺乳動物からの体液または組織試料と、配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体とを接触させ；次いで
−前記ポリペプチドまたはポリペプチド群に特異的に結合するＩｇＡまたはＩｇＥの抗体の試料中での存在を検出することを含み；
ここに、前記ポリペプチドまたはポリペプチド群に特異的に結合するかかる抗体の存在は、セリアック病、疱疹状皮膚炎またはＩｇＥ媒介アレルギーを示すことを特徴とする該方法を提供する。
【００２８】
本発明の好ましい具体例により、ＩｇＥ媒介アレルギーは小麦食物アレルギーである。
【００２９】
さらなる態様により、診断用キットは、本発明の方法を行うために提供され、配列番号２６〜１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するその断片もしくは変異体、または前記のごとき医薬組成物を含む。
【００３０】
定義
本明細書に用いた語彙および用語のすべては、関連技術分野においてそれらに通常与えられる意味を有することが意図される。しかしながら、明瞭さのために、少数の用語が特に以下に明確化される。
【００３１】
「前記ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するポリペプチドの断片もしくは変異体」なる表現は、ＷＯ２００８／０７９０９５の定義に同じ意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＬＭＷグルテニンＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５のｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列。太字体で示されるＣ末端部分は、クローン１７５配列である。
【図２】ＩｇＥ反応性クローン４３のアミノ酸配列と整列させたＧｌｕ−Ｂ１のヌクレオチド配列。
【図３】ＩｇＥ反応性クローン８２のアミノ酸配列と整列させたＧｌｕ−Ｂ１のヌクレオチド配列。
【図４】クローン８４由来アレルゲンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。
【図５】小麦アレルゲンをコードするＩｇＥ反応性ｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列。
【図６】ＩｇＥ反応性小麦エピトープのアミノ酸配列。
【図７ａ】天然ＧｌｕＢ３−２３、組換えＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５のドメイン構造。
【図７ｂ】精製Ｃ１７５およびＧｌｕＢ３−２３の質量分析（ＭＳ）。質量／電荷比をＸ軸に示し、強度をＹ軸に表示し、任意の単位で示す。
【図７ｃ】精製Ｃ１７５およびＧｌｕＢ３−２３の質量分析（ＭＳ）。質量／電荷比をＸ軸に示し、強度をＹ軸に表示し、任意の単位で示す。
【図８ａ】天然Ｇｌｕ−Ｂ１および組換えタンパク質のドメイン構造。
【図８ｂ】精製ｍａｌ４３（クローン４３）の質量分析（ＭＳ）。質量／電荷比をＸ軸に示し、強度をＹ軸に表示し、任意の単位で示す。
【図８ｃ】精製ｍａｌ８２（クローン８２）の質量分析（ＭＳ）。質量／電荷比をＸ軸に示し、強度をＹ軸に表示し、任意の単位で示す。
【図９ａ】Ｃ末端の酸伸長ドメイン、およびチオニンドメインの一部は、ＩｇＥエピトープ含有部分と同定される。
【図９ｂ】組換えアレルゲンα−ピューロチオニンの質量分析。質量／電荷比をＸ軸に示し、強度を調べた質量範囲において得た最も強いシグナルのパーセンテージとしてＹ軸に表す。
【図１０】小麦食物アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥ反応性。ドットブロットした精製組換えタンパク質（ＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５）、水性小麦種子（ＷＳＥ）抽出物、およびヒトヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を小麦食物アレルギーに苦しむ患者からの血清とインキュベートした。結合したＩｇＥ Ａｂは、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂで検出し、オートラジオグラフィにより視覚化した。
【図１１】小麦食物アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥ反応性。ドットブロットした精製組換えタンパク質（ＧｌｕＢ３−２３、Ｃ１７５、ｍａｌ４３およびｍａｌ８２）、水性小麦種子（ＷＳＥ）抽出物、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を小麦食物アレルギーに苦しむ患者からの血清とインキュベートした。結合したＩｇＥ Ａｂは、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂで検出し、オートラジオグラフィにより視覚化した。認識頻度を右側余白に表す。
【図１２】小麦食物アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥ反応性。小麦種子抽出物、ＨＳＡ、        精製α−ピューロチオニンをニトロセルロース膜片上にドットし、小麦食物アレルギー患者からの血清とインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体は、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、オートラジオグラフィにより視覚化した。
【図１３】ライ麦、大麦、オート麦、スペルト小麦およびコメ中の関連タンパク質とのＧｌｕＢ３−２３の配列アラインメント。点は同一性を示し、ダッシュはギャップを表す。アラインメントの終わりに、ＧｌｕＢ２−２３に対する同一性をパーセンテージで示す。
【図１４】他の植物における相同タンパク質とのクローン８４由来アレルゲンのα−ピューロチオニンの多重配列アラインメント。小麦α−ピューロチオニンのアミノ酸配列（単一文字コード）は、小麦（ｇｉ｜４００７８５０）、ライ麦（ｇｉ｜４００７７４５）、大麦（ｇｉ｜２４６２１５）、オート麦（ｇｉ｜２１０６９０４５）、ゴートグラス（ｇｉ｜１０５２５５１）、コメ（ｇｉ｜２１５７６８９９３）、セージ（ｇｉ｜７７５４３３９３）、シロイヌナズナ（thale cress）（ｇｉ｜２１５５３５８８）、カラシ（ｇｉ｜１２０５６４５５６）、ダイオウ（pieplant）（ｇｉ｜１９７３１２８８１）中のピューロチオニンと整列させた。認識頻度を右側余白に表す。
【図１５】精製小麦タンパク質に対するセリアック病患者のＩｇＡ反応性。ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした小麦タンパク質に対するセリアック病患者血清およびおよび対照患者血清のＩｇＡ反応性のＥＬＩＳＡ測定。患者血清とのインキュベーション後、結合したＩｇＡを一次抗体としてマウス抗ヒトＩｇＡ１／Ａ２および検出抗体としてＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧを用いて検出した。発色反応を４０５ｎｍにて測定した。小麦および対照タンパク質をＸ軸に示し、右コーナーの説明文は患者を示す。用いた略語：ＨＳＡ−ヒト血清アルブミン、ＧＧ１−γグリアジン１、ＧＧ２−γグリアジン２、Ｐ−患者、ＣＤ−セリアック病陽性、ＧＦＤ−グルテンを含まない規定食。
【図１６】合成γグリアジン１ペプチドに対するセリアック病患者のＩｇＡ反応性。
【図１７】合成γグリアジン１ペプチドに対するセリアック病患者のＩｇＧ反応性。
【図１８】組換えγグリアジンに対する疱疹状皮膚炎患者のＩｇＡ反応性。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
現在まで、種々の形態の小麦誘発過敏症を識別する診断用ツールとして用いる、限定された組の抗原およびペプチドだけが存在する。これは、よく特徴付けされた患者血清を用いて、小麦ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、古典的な免疫化学的アプローチおよびイオン交換クロマトグラフィー生成のグルテン画分の使用により、種々の小麦過敏症の診断に用いることができる新規で十分に規定された小麦抗原を探すように本発明者らを導いた。小麦抗原およびペプチドの同定、組換えタンパク質の生成および特徴付けは、診断（チップ開発）用、およびかかる小麦誘発過敏症の治療用のツールを創製することを可能にする。
【００３４】
以下の実施例は、本発明の核酸配列およびペプチドの単離ならびに使用を含む本発明を示す。その実施例は単に例示的であり、添付された特許請求の範囲により規定される本発明の限定と考えられるべきではない。
【００３５】
実施例１
小麦種子からのλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング 
新しい小麦アレルゲンを見出すために、従前に記載されたごとく、小麦種子からの全ＲＮＡを抽出し、λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを構築した（５）。大腸菌Ｙ１０９０を７×１０５ＰＦＵの組換えファージに感染させ、小麦食物アレルギーに苦しむ３名の患者の血清ＩｇＥで免疫スクリーニングした。λｇｔ１１ファージを含有するニトロセルロースフィルターでの前吸着後に、１：１０血清希釈液を既に力価測定したファージクローンから調製したフィルターに添加した。結合ＩｇＥ抗体は１：１０希釈した１２５Ｉ標識α−ヒトＩｇＥで検出し、オートラジオグラフィによって視覚化した。ＩｇＥ反応性ファージクローンは、さらなる再クローニングにつき選択し、それらのＤＮＡは、λｇｔ１１プライマーでＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Invitrogen）を用いてＰＣＲ増幅し、配列決定した（VBC-Biotech）。得られた配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）でのＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出された配列と比較して、相同タンパク質を見出した。いくつかの場合には、発明者らは対応するタンパク質を同定せずに、ＩｇＥ反応性エピトープだけを得た。すべてのＩｇＥ反応性クローンのリストを表１に示す。
【００３６】
実施例２
発現および精製
クローン１７５およびＧｌｕｂ３−２３
５３７個のヌクレオチドを含むクローン１７５配列（配列番号１）および１１０７個のヌクレオチドを含むＧｌｕＢ３−２３（配列番号５１）および６個のＨｉｓコドンをｐＥＴ１７ｂ大腸菌発現ベクターにクローニングした。ｐＥＴ １７ｂ−Ｃ１７５およびｐＥＴ １７ｂ−ＧｌｕＢ３−２３構築物は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換細胞は、３７℃にて１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する１リットルのルリアブロス培地中で増殖させた。細胞は０．４〜０．６のＯＤ６００まで増殖させ、次いで、過剰発現を０.５ｍＭの終末濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。その後、細菌をさらに４時間増殖させ；細胞を遠心分離によって収集し、−２０℃で一晩凍結した。透明な細胞溶解物を調製し、ＮｉＮＴＡクロマトグラフィーをＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（QIAGEN, Hilden, Germany）によって行った。タンパク質含有画分をプールし、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４で透析した。タンパク濃度はＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Novagen）で決定した。
【００３７】
クローン４３および８２
８２８個のヌクレオチドを含むクローン４３配列（配列番号２）、および５８８個のヌクレオチドを含むクローン８２配列（配列番号３）＋６個のＨｉｓコドンをｐＭａｌ−ｃ４ｘ大腸菌発現ベクター（GeneScript USA Inc.）にクローニングした。ｐＭＡＬ−ｃ４ｘ−４３およびｐＭＡＬ−ｃ４ｘ−８２構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、３７℃で１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む１リットルのルリアブロス＋ブドウ糖培地中で増殖させた。細胞は０．４〜０．６のＯＤ６００まで増殖させ、次いで、過剰発現を０.５ｍＭの終末濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。その後、細菌をさらに４時間増殖させ；細胞を遠心分離によって回収し、−２０℃にて一晩凍結した。透明な細胞溶解物を調製し、ＮｉＮＴＡクロマトグラフィーをＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（QIAGEN, Hilden, Germany）によって行った。タンパク質含有画分をプールし、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４で透析した。そのタンパク濃度はＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Novagen）で決定した。
【００３８】
α−ピューロチオニン
クローン８４由来アレルゲンは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のＣ末端ヘキサヒスチジンタグを持つ組換えタンパク質として発現させた。ｐＥＴ １７ｂ−α−ピューロチオニン構築物をＢｌ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌細胞は、０．６の光学密度（６００ｎｍ）まで３７℃の２５０μｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）アンピシリンを含む２５０ｍｌ ＬＢ培地中で増殖させ、タンパク質発現を１２５μｌ（１Ｍ）イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。大腸菌細胞は４℃で１５分間３５００ｒｐｍでの遠心分離によって４時間後に収集した。タンパク質は、ニッケル・アフィニティークロマトグラフィーによって可溶性画分から精製した(Quiagen, Hilden, Germany）。アレルゲンを１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ４．０中に溶解させ、−２０℃にて貯蔵した。精製したアレルゲン濃度をＢＣＡアッセイ（Pierce, Rockford, IL）により決定した。
【００３９】
実施例３
組換えタンパク質の特徴付け
Ｃ１７５およびＧｌｕＢ３−２３
配列解析は、ＧｌｕＢ３−２３が、安定性のための分子内ジスルフィド結合、およびマクロポリマーを形成するための他のＬＭＷおよびＨＭＷのグルテニンサブユニットとの分子内ジスルフィド結合を構築する８個のシステイン残基を含む、ｓ−ＬＭＷグルテニンであることを示した。天然タンパク質は、シグナルペプチド、Ｎ末端領域、反復ドメインおよび３つのＣ末端領域よりなる。組換えＣ１７５タンパク質は、３つのＣ末端領域およびヘキサ・ヒスチジンタグ（図１）によって構成される。組換えＧｌｕｂ３−２３は、シグナルペプチドがない天然Ｇｌｕｂ３−２３のすべての領域＋ヘキサ−ヒスチジン−タグを含有する（図７ａ）。組換えＣ１７５タンパク質については、２０．８ｋＤａの分子量および８．８１の理論的ｐＩが計算され、組換えＧｌｕＢ３−２３については、分子量は４０．３３ｋＤａおよび８．７３の理論的ｐＩと評価された。純度および分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色（Fling, Bradford）によってコントロールした。Ｃ１７５は約２１ｋＤａ、ＧｌｕＢ３−２３は４０ｋＤａの明確なバンドを提供した。タンパク質の重合挙動についての情報を達成するために、ＳＤＳ ＰＡＧＥ銀染色法を還元または非還元条件下でＢＩＯ  ＲＡＤ銀染色プラスハンドブックによって行った。還元条件について、β−メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液を９５℃にて５分間沸騰させ；非還元条件について、β−メルカプトエタノールを含まない試料緩衝液を用いた。非還元条件下で、Ｃ１７５は、約２０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび２５０ｋＤａのバンドを提供し、これは、Ｃ１７５がジスルフィド結合によるジ−、トリ−およびポリマーを形成することを示す。また、Ｇｌｕｂ３−２３は、非還元条件下の約４０ｋＤａおよび２５０ｋＤａのバンドによって示されたポリマーを形成する。
【００４０】
質量分析は、従前に記載したごとく行った（６）。図７ｂおよび図７ｃにおいて、精製したＣ１７５およびＧｌｕＢ３−２３の質量分析（ＭＳ）を示す。最も高い強度を持つピークは、タンパク質サイズを示す。Ｃ１７５は２１０２１．４３０Ｄａ、およびＧｌｕＢ３−２３は４０３２１．０９４Ｄａのピークを示し、これは計算された質量と相関する。
【００４１】
ｍａｌ４３およびｍａｌ８２
クローン４３および８２に対応する組換えタンパク質は、図８ａに示すＮ末端マルトース結合タンパク質タグ（ＭＢＰタグ）を特色とし、これはｐＭＡＬ−ｃ４ｘベクターに起因する。ｍａｌ４３については、７３．３ｋＤａの分子量および５．８１の理論的ｐＩ、およびｍａｌ８２については６４．６ｋＤａの分子量および５．９９の理論的ｐＩを計算した。全長ＨＭＷ Ｇｌｕ−Ｂ１（配列番号５２に対応する）の配列解析は、タンパク質がジスルフィド結合形成用の４つのシステイン残基を持つｘ−タイプＨＭＷタンパク質であることを示した。天然Ｇｌｕ−Ｂ１はシグナルペプチド、Ｎ末端非反復ドメイン、大きな反復ドメインおよびＣ末端非反復ドメインを含む。組換えｍａｌ４３は、ＭＢＰ、反復ドメインの一部およびヘキサ−ヒスチジンタグよりなる。組換えｍａｌ８２は、ＭＢＰ、反復領域の一部、Ｃ末端非反復領域およびヘキサ−ヒスチジンタグから構成される（図８ａ）。図２において、Ｇｌｕ−Ｂ１のヌクレオチド配列は、クローン４３の推定アミノ酸配列と整列させ、図３において、Ｇｌｕ−Ｂ１のヌクレオチド配列はクローン８２の推定アミノ酸配列と整列させている。
【００４２】
純度および分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色（Fling, Bradford）によってコントロールした。Ｍａｌ４３は約７３ｋＤａにて、ｍａｌ８２は６４ｋＤａにてクリアバンドを提供した。従前に記載（６）のごとく、質量分析を行った。図８ｂおよび図８ｃにおいて、精製ｍａｌ４３およびｍａｌ８２の質量分析（ＭＳ）を示す。７３６９５．５２５Ｄａのピークは、ｍａｌ４３のサイズを示す。図８ｃにおいて、６５２２０．８７２のピークは、ｍａｌ８２の分子量を示す。これらの結果は計算された分子量と相関する。
【００４３】
α−ピューロチオニン
ＩｇＥ反応性ファージクローン８４の推定アミノ酸配列と公表された配列との比較は、それが小麦α−ピューロチオニンであることを示した。α−ピューロチオニンの構造遺伝子は、典型的なシグナルペプチド、チオニンドメイン（５ｋＤａ）およびＣ末端の酸伸長をコードする領域を含む。クローン８４由来アレルゲンの単離ヌクレオチド配列（図４）は、ＩｇＥ反応性を示し、このＩｇＥエピトープは、Ｃ末端の酸伸長ドメインおよび一部のチオニンドメインと関係した（図９ａ）。クローン８４由来アレルゲンについての推定アミノ酸配列は、１２．７ｋＤａの計算分子量および６．２７の等電点（ｐＩ）を有する。精製組換えタンパク質の質量分析分析の結果は、１２７４２Ｄａの推定分子量に一致した（図９ｂ）。タンパク質の純度は、１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色（Fling, Bradford）によりチェックし、それらの同一性をモノクローナル抗−Ｈｉｓタグ抗体（Novagen）を用いるウェスタンブロッティングにより確認した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色した１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１８ｋＤａでの組換えアレルゲンα−ピューロチオニンの純度および移動を示した。
【００４４】
実施例４
組換えタンパク質のＩｇＥ反応性
ＧｌｕＢ３−２３は、小麦依存性食物アレルギーにおける主要アレルゲンである。
ＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５に対する小麦食物アレルギー患者のＩｇＥ反応性をドットブロット分析によりテストし、図１０および図１１に示した。０．５μｇの精製組換えタンパク質（ＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５）、２μｇの水性小麦種子（ＷＳＥ）抽出物および０．５μｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をニトロセルロース（Whatman Protran ニトロセルロース膜, Sigma Aldrich）片にドットし、緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、４、０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．５％ｖ／ｖツイーン−２０、０．０５％ｗ／ｖ ＮａＮ３）でブロックした後、小麦食物アレルギーに苦しむ患者からの１：１０希釈血清とインキュベートした。結合ＩｇＥ Ａｂは１：１０希釈１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂで検出し、オートラジオグラフィにより視覚化した。
【００４５】
血清は、小麦食物アレルギーに苦しむ患者の集団から得た。患者は、小麦に対する陽性の病歴、陽性皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）、二重盲検またはオープン食物負荷またはCAPテスト（Phadia, Uppsala, Sweden）により選択した。
【００４６】
図１０において、２７．３％の患者がＣ１７５に対するＩｇＥ反応性を示し、これらの集団の５４．５％が全長タンパク質ＧｌｕＢ３−２３に対するＩｇＥ反応性を示すことが示されている。図１１において、患者のもう一つの集団の７３．１％がＣ１７５に対してＩｇＥ反応性を示し、８０．８％が全長アレルゲンＧｌｕＢ３−２３に対するＩｇＥ反応性を示すことが示されている。ＷＨＯ／ＩＵＩＳアレルゲン標準化委員会定義（www.allergen.org）により、主要アレルゲンが５０％の患者により認識されなければならない。
【００４７】
したがって、ＬＭＷ ＧｌｕＢ３−２３は、小麦食物アレルギーにおける主要アレルゲンであり、診断および恐らく治療用の有望なアレルゲンである。
【００４８】
さらに、発明者らは、ＩｇＥ認識用の大部分のエピトープがＧｌｕＢ３−２３のＮ末端部分に局在することを示した。阻害ドットブロットを患者血清で行った。血清は、１０μｇの組換えＧｌｕＢ３−２３、Ｃ１７５またはＢｅｔ ｖ１と予めインキュベートした。結合ＩｇＥ Ａｂは１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂで検出し、オートラジオグラフィにより視覚化し、ドット強度はガンマ・カウンターによって測定した。表２は、パーセンテージでの計算された阻害を示し、これは、ＧｌｕＢ３−２３のＣ末端部分のＣ１７５が、ＧｌｕＢ３−２３結合に対するＩｇＥ結合を防止するのに低い可能性を有することを示す。
【００４９】
Ｇｌｕ−Ｂ１は小麦依存性食物アレルギーにおける少なくともマイナーなアレルゲンである。
Ｇｌｕ−Ｂ１の部分的タンパク質を表わす組換え高分子量タンパク質ｍａｌ４３およびｍａｌ８２は、図１１に示される集団からの患者からの血清を用いてドットブロットにおいてテストした。血清は小麦食物アレルギーに苦しむ患者から得た。患者は、小麦に対する陽性の病歴、および陽性の皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）またはＣＡＰテスト（Phadia, Uppsala, Sweden）により選択した。０．５μｇの精製組換えタンパク質（ｍａｌ４３およびｍａｌ８２）の、２μｇの水性小麦種子（ＷＳＥ）抽出物および０．５μｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をニトロセルロース（Whatman Protran nitrocellulose membrane, Sigma Aldrich）片にドットし、緩衝液Ａでブロック後に、１：１０希釈の患者血清とインキュベートした。結合ＩｇＥ Ａｂは１：１０希釈の１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂで検出し、オートラジオグラフィによって視覚化した。３０．８％の小麦食品アレルギー患者は、これらのアレルゲンに対するＩｇＥ反応性を示した（図１１）。ＷＨＯ／ＩＵＩＳアレルゲン標準化委員会定義（www.allergen.org）に基づいて、１０％の患者によって認識されたアレルゲンは、マイナーなアレルゲンである。
【００５０】
α−ピューロチオニン
ドットブロットされた組換え小麦α−ピューロチオニンのＩｇＥ反応性は、小麦食物アレルギーに苦しむ患者からの血清ＩｇＥ抗体でテストした（表３）。α−ピューロチオニンに対するＩｇＥ反応性を示すこれらの各患者は、ドットブロットされた小麦種子抽出物に対するＩｇＥ反応性を示した。１つの集団（ｎ＝１３）からの患者の２３％、およびもう一つの集団（ｎ＝２４）からの患者の２９％が、組換えα−ピューロチオニンに反応した（図１２）。
【００５１】
実施例５
配列アラインメントおよび種々の作物抽出物
ＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５
ＧｌｕＢ３−２３小麦アレルゲンが他の作物種に相同体を有するかどうかを見出すために、ライ麦（Secale sylvestre）、大麦（Hordeum brevisubulatum）、オート麦（Avena sativa）、スペルト小麦（spelt）（Triticum aestivum subsp. Spelta）、およびコメ（Oryza sativa）とのアミノ酸配列整列を行い、図１３に示す。ライ麦は、小麦（Triticum aestivum）においてＧｌｕＢ３−２３に７６％の同一性、大麦は６４％、オート麦は４８％、スペルト小麦は４６％およびコメは４０％の同一性を示す。最も保存されたドメインはシグナルペプチドおよびＣ末端領域であった。引き続いて、種々の作物の水性抽出物を調製した。１５グラムの作物をホモジナイズし、３２ｍｌのＨ２Ｏおよび３２μｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加し、４℃で４時間撹拌した。抽出物を遠心して、未溶解粒子状物質を除去した。水性抽出物を調製用１２．５％ ＳＤＳ ＰＡＧＥに負荷し、タンパク質分子量マーカー（PageRuler Plus; Prestained Protein Ladder, Fermentas）を標準として用い、タンパク質をニトロセルロース膜（Whatman Protran nitrocellulose membrane, Sigma Aldrich）にブロットし、膜を緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、０．５％ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．５％ｖ／ｖツイーン−２０、０．０５％ｗ／ｖ ＮａＮ３）でブロックし、その後、それらをウサギ免疫前血清または緩衝液Ａで１：１００００で希釈したＣ１７５またはＧｌｕＢ３−２３に対して生起されたウサギＡｂと一晩インキュベートした。次いで、血清を処分し、膜を緩衝液Ａで３回洗浄した。結合した一次抗体を１：１０００で希釈した１２５Ｉ標識ウサギＩｇＧ Ａｂ（BSM diagnosic, Vienna, Austria）で検出し、増感紙（Kodak, Heidelberg, Germany）を含むコダックＸＯＭＡＴフィルムにより視覚化した。アレルゲンの交差反応部分を同定するために、膜は、Ｃ１７５およびＧｌｕＢ３−２３に対する２つの種々のウサギ抗体とインキュベートした。結合Ｃ１７５ ＡｂおよびＧｌｕＢ３−２３ Ａｂを各々１２５Ｉ標識抗ウサギＩｇＧ Ａｂにより検出し、オートラジオグラフィによって視覚化した。すべての抽出物においてＧｌｕＢ３−２３相同体を検出できたが、Ｃ１７５抗体は、オート麦において相同体を検出できなく、他のすべての抽出物において、その反応はＧｌｕＢ３−２３抗体を用いるものよりも弱かった。
【００５２】
α−ピューロチオニン
クローン８４由来アレルゲンの交差反応性を研究するために、他の植物における相同性タンパク質とのクローン８４由来アレルゲンα−ピューロチオニンの多重配列アラインメントは、タンパク質も他の植物種に非常に共通していることを示した。クローン８４由来α−ピューロチオニンのアミノ酸配列（単一文字コード）を、小麦（ｇｉ｜４００７８５０）、ライ麦（ｇｉ｜４００７７４５）、大麦（ｇｉ｜２４６２１５）、オート麦（ｇｉ｜２１０６９０４５）、ゴートグラス（ｇｉ｜１０５２５５１）、コメ（ｇｉ｜２１５７６８９９３）、セージ（ｇｉ｜７７５４３３９３）、シロイヌナズナ（ｇｉ｜２１５５３５８８）、カラシ（ｇｉ｜１２０５６４５５６）、ダイオウ（ｇｉ｜１９７３１２８８１）におけるピューロチオニンと整列させた（図１４）。クローン８４由来アレルゲンα−ピューロチオニンは、ライ麦（８５％）、大麦（４９％）からのα−ピューロチオニンと最高の度合いの配列同一性を共有し、また、他のいくつかの植物源からのα−ピューロチオニンと３０％を超える配列同一性を示す（例えば、オート麦４９％、ゴートグラス４４％、コメ４０％、セージ３７％）。ニトロセルロースブロットした抽出物をアルファピューロチオニンに特異的なウサギ抗体で調べ、対照目的のために、対応する免疫前血清を用いた。ライ麦および大麦のような前記の他の植物種からのＳＤＳタンパク質抽出物中のアレルゲンを検出するためのα−ピューロチオニン特異抗体を示した。
【００５３】
実施例６
小麦種子成熟中のタンパク質発現
ＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５
小麦（Triticum aestivum）種子ＳＤＳ抽出物を受粉７、１０、１５、２０、２５、３０、３５日後に、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎら（５）に従い成熟小麦種子から調製した。抽出物はゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜へブロットした。膜をＧｌｕＢ３−２３に対して生起したウサギ抗体とインキュベートした。結合抗ＧｌｕＢ３−２３抗体は、１２５Ｉ標識抗ウサギＩｇＧ抗体で検出し、オートラジオグラフィによって視覚化した。ＧｌｕＢ３−２３が成熟中に小麦種子に蓄積することが明確に示された。
【００５４】
実施例７
ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化アッセイ
ＧｌｕＢ３−２３およびＣ１７５
消化アッセイにおけるアレルゲンの安定性は、その一部分が全く消化されず、タンパク質特異抗体によって検知できるタンパク質が食物アレルゲンに属することを示す（７）。胃および十二指腸のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化は、従前に記載された水性小麦種子抽出物で行った（７）；十二指腸消化については、市販酵素錠Pankreoflat-Dragee（Solvay Pharma, Hannover, Germany）を用いる修飾を含む。消化されたタンパク質をＣ１７５およびＧｌｕＢ３−２３に対して生起したウサギ抗体で検出した。
【００５５】
胃ならびに十二指腸消化アッセイにおいて、抗ＧｌｕＢ３−２３抗体のみが消化後にバンドを検出できることが示された。ＧｌｕＢ３−２３のＣ１７５部分は５分後に胃消化アッセイにおいて消化されたが、ＧｌｕＢ３−２３のＮ末端部分は、１２０分消化後に検出できた。十二指腸消化アッセイは同様のパターンを生じた。Ｃ１７５断片は、２分間の消化後に検出できなかったが、ＧｌｕＢ３−２３部分は、４５分間の十二指腸消化後に検出できた。結果的に、ＧｌｕＢ３−２３のＮ末端部分が安定な消化しにくい断片であることが示された。
【００５６】
実施例８
グリアジンは、Weissらの手順後に７０％エタノールで小麦粒から抽出した（８）。次いで、抽出したグリアジンは、５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ４．０および４Ｍ尿素を含有する緩衝液Ａに対して透析することにより、可溶化した。可溶化したグリアジンを、ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）装置に接続した、緩衝液Ａで平衡したスルホプロピル（ＳＰ）セファロースを通過させた。フロースルー画分を集め、ＦＴ ＳＰと分類した。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、ＳＰカラム中の結合タンパク質を５０ｍＭトリスｐＨ４．０、４Ｍ尿素を含有し、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配を持つ緩衝液Ｂを用いて溶出し、これらの画分をＥｌｕ  ＳＰと分類した。ＦＴ ＳＰ画分の一部を５０ｍＭトリスｐＨ１０．０および４Ｍ尿素を含有する緩衝液Ｃ中で透析し、同じ緩衝液で平衡させたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロースカラムに通過させた。フロースルー画分を集め、ＦＴ ＤＥＡＥと分類した。カラムを緩衝液Ｃで洗浄し、結合タンパク質を０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの勾配を含む緩衝液Ｃで溶出させた。溶出画分はＥｌｕ ＤＥＡＥと分類した。
【００５７】
実施例９
セリアック病特異的小麦タンパク質およびペプチド抗原の同定
全小麦抽出物、全グリアジンおよび前記の実施例８に記載のように得た４つの画分、ＦＴ ＳＰ、Ｅｌｕ ＳＰ、ＦＴ ＤＥＡＥおよびＥｌｕ ＤＥＡＥを、単一次元低減ＳＤＳ−ゲル電気泳動（single dimension reducing SDS gel electrophoresis）により分離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、よく特徴付けられたセリアックおよび非セリアック患者からの血清ＩｇＡで調査した。非セリアック患者および小麦を含まない規定食の患者が、ＦＴ ＳＰおよびＦＴ ＤＥＡＥ画分中のタンパク質により少ない反応性を示したが、他の画分により反応性であり、一般的に、全小麦抽出物および全グリアジン抽出物に対してより反応性であるため、ＦＴ ＳＰおよびＦＴ ＤＥＡＥ画分中のタンパク質は、その疾患に高度に特異的であるようであった（データを示さず）。
【００５８】
実施例１０
セリアック病に対する特異性
全小麦抽出物、グリアジン、グリアジンのその４つの画分、水性可溶小麦タンパク質およびＳＤＳ可溶性グルテニンを電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、小麦アレルギーに関与すると同定されたクローンに対するウサギにおいて生成された抗体で調べた。ＦＴ画分（ＦＴ ＳＰおよびＦＴ ＤＥＡＥ）はセリアック病につきかなりより良好な特異性を有し、すなわち、この画分中の大部分のタンパク質は、ＣＤ患者の血清のみに陽性のＩｇＡ反応性を示し、グルテンを含まない規定食のＣＤ患者および健康対照の血清では反応性を示さなかったが、Ｅｌｕ画分（Ｅｌｕ ＳＰおよびＥｌｕ ＤＥＡＥ）は、健康対照者または規定食のセリアック患者からの血清とのＩｇＡ反応性も示す物質を含有した（データは示さず）。
【００５９】
実施例１１
質量分析によるペプチドおよびタンパク質の同定
その４つの画分を標準プロトコールに従い、ペプシン／トリプシン酵素混合物で消化し、得られたペプチドをＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ質量分析（HCT ULTRA from Bruker Daltonics）により同定した。ＦＴ ＳＰ画分およびＦＴ ＤＥＡＥ画分中でγグリアジンが富化されることが判明した。得られたすべてのペプチドを表４ａ（配列番号：６２〜８６および１０８〜１１０）に示す。
【００６０】
実施例１２
組換えγグリアジン１およびγグリアジン２の発現および精製
γグリアジン１配列（配列番号８７）およびγグリアジン２（配列番号８８）（表４ｂ）をそのＣ終端にてさらなる６×ヒスチジン残基を含む組換えタンパク質として発現されるｐＥＴ２７ｂ大腸菌発現ベクターにクローニングした。ｐＥＴ ２７ｂ−ＧＧ１、およびｐＥＴ ２７ｂ−ＧＧ２構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。その形質転換細胞は、３７℃で５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する１リットルのルリアブロス培地中で増殖させた。細胞は０．６のＯＤ６００まで増殖させ、タンパク質発現を０．５ｍＭの最終濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加および３０℃での１２時間のインキュベーションにより誘導した。細胞は遠心分離によって収集し、溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中で再懸濁し、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリドを溶解直前に添加した。次いで、細胞はＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（ＩＫＡ）ディスペンサーを用いて溶解し、懸濁液を高速にて遠心して、封入体（inclusion body）を抽出した。封入体として組換えタンパク質を含有するペレットを８Ｍ尿素緩衝液中で可溶化し、６×ヒスチジンタグしたＧＧ１およびＧＧ２をＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ ｈａｎｄｂｏｏｋ（QIAGEN, Hilden, Germany）に従って行うＮｉ−Ｎｔａクロマトグラフィーを用いて変性条件下で精製した。精製タンパク質を含む画分は、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール緩衝液に対して階段的に透析して、尿素を除去し、−２０℃でアリコートとして貯蔵した。タンパク濃度はＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Novagen）で決定した。
【００６１】
実施例１３
小麦食物抗原に対するＩｇＡ反応性
１００μｌの小麦タンパク質ＧＧ１（γグリアジン１）、ＧＧ２（γグリアジン２）、５μｇ／ｍｌの濃度のα−ピューロチオニン、ＧｌｕＢ３−２３、Ｃ−１７５、Ｍａｌ８２およびＭａｌ４３をＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｅｌｉｓａプレート上に４℃にて一晩コーティングした。残る自由な結合部位を室温にて２時間ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡでブロックした。セリアック病患者、規定食のセリアック患者および陰性対照からの１００μｌの血清をＰＢＳＴ緩衝液の０．５％ＢＳＡに１：１００希釈にて添加し、４℃にて１２時間インキュベートした。プレートは、ＰＢＳＴ緩衝液中で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ緩衝液中に１：１０００まで希釈したマウス抗ヒトＩｇＡ１／Ａ２（BD Biosciences）の１００μｌを添加し、室温にて５時間インキュベートした。次いで、プレートは、ＰＢＳＴで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Amersham）で標識したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体の１００μｌを添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄し、抗体をＨＲＰ−ＡＢＴＳ（２,２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）検出系を用いて検出し、発色反応はＥＬＳＡプレートリーダー中で４０５ｎｍにて測定した。生成した値は、グラフとしてプロットする。図１５参照。組換えＧＧ１およびＧＧ２は、高いＩｇＡ反応性を示し、α−ピューロチオニンは陰性ＩｇＡ反応性を示し、ＬＭＷグルテニンＧｌｕＢ３−２３およびＣ−１７５ならびにＨＭＷグルテニン（Ｍａｌ８２およびＭａｌ４３）は、中程度のＩｇＡ反応性を示す。この結果は、組換えタンパク質ＧＧ１およびＧＧ２がＩｇＡ反応性に高度に特異的であることを示す。α−ピューロチオニンに対するＩｇＡ反応性の不存在は、ＩｇＥ結合アレルゲンとしてその特異性を示す。従って、それはＩｇＥ反応性につき非常に特異的な候補タンパク質である。
【００６２】
実施例１４
Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープをマッピングするためのオーバーラップγグリアジンペプチドの合成
全長のＧＧ１タンパク質にわたり、５個のアミノ酸残基により相互にオーバーラップし、各ペプチドの長さが１８〜２６個のアミノ酸残基である１９個のＧＧ１ペプチドをＦＭＯＣ技術により合成した（表５、配列番号８９〜１０７）。合成後、ペプチドは０．１％ＴＦＡを含む０〜１００％アセトニトリルの勾配を用いてＨＰＬＣにより精製した。精製ペプチドは、正確な分子量につきＭＡＬＤＩにより分析し、精製画分を凍結乾燥させ、さらなる使用まで−２０℃にて貯蔵した。
【００６３】
実施例１５
合成ＧＧ１ペプチドに対するセリアック病患者のＩｇＡ反応性
ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの５μｇ／ｍｌのその１９個のオーバーラップするペプチド、ｒＧＧ１、アルファ−グリアジンペプチドｐ５６〜７５でコーティングし、アルファ−グリアジンペプチドｐ５６〜７５（Ｑ６５Ｅ）を脱アミド化し、ＣＤ患者、グルテンを含まない規定食のＣＤ患者および健康対照からの血清ＩｇＡで調べ、マウス抗ヒトＩｇＡ１／Ａ２およびヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体を用いて検出した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を対照として用いた（ｎ＝８  ＣＤ患者、グルテンを含まない規定食の２名のＣＤ患者および３名の健康対照）。セリアック病患者からの血清ＩｇＡ反応性は、プロリンとグルタミンにおいて豊富なＮ末端領域が、プロリンおよびグルタミンにおいて貧弱であるそのタンパク質のＣ末端領域よりも高いＩｇＡ反応性を有することを示した（図１６）。合成ＧＧ１ペプチド２〜７、９、１３および１８（すなわち、各々、配列番号９０〜９５、９７、１０１および１０６）の各々は、特異的ＩｇＡ反応性を示した。公知の免疫優勢エピトープのアルファグリアジンＰ５６〜７５とのＧＧ１ペプチドのＩｇＡ反応性の比較および、脱アミド化アルファグリアジンＰ５６〜７５（Ｑ６５Ｅ）は、ペプチド７（配列番号９５）およびペプチド９（配列番号９７）と同様にペプチド４（配列番号９２）およびペプチド６（配列番号９４）が、より良好な感度を有することを示した。
【００６４】
実施例１６
合成ＧＧ１ペプチドに対するセリアック病患者のＩｇＧ（合計）反応性
ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの５μｇ／ｍｌのその１９個のオーバーラップするペプチドおよびｒＧＧ１でコーティングし、ＣＤ患者、グルテンを含まない規定食のＣＤ患者および健康対照からの血清で調べ、マウス抗ヒトＩｇＧ（合計）およびヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体を用いて検出した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、対照として用いた（ｎ＝８  ＣＤ患者、２名のグルテンを含まない規定食のＣＤ患者および３名の健康対照）。Ｎ末端領域におけるペプチドに対する反応性はＣ末端領域より高かった。ＩｇＧを用いるアッセイの感度および特異性は低かった（図１７）。
【００６５】
上記の実施例１４〜１６に示されたセリアック病特異的タンパク質およびペプチドは、抗体に基づいた診断、ＩｇＡおよびＩｇＧテストの双方、好ましくは、ＩｇＡに基づくテストに有用である。
【００６６】
実施例１７
組換えγグリアジンに対する疱疹状皮膚炎患者血清ＩｇＡ反応性
ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの５μｇ／ｍｌのｒガンマグリアジン１、ｒガンマグリアジン２、α−グリアジンペプチドｐ５６〜７５（α−グリ（gli）ペプチド）、脱アミド化α−グリアジンペプチド（Ｄ）およびヒト血清アルブミンでコーティングした。結合タンパク質は、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）患者および健康対照からの血清で調べた。そのタンパク質に対するＩｇＡ反応性は、マウス抗ヒトＩｇＡ１／Ａ２およびヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体を用いて検出した。（ｎ＝１２名のＤＨ患者および２名の健康対照）。組換えＧＧ１およびＧＧ２は、健康対照に対してよりも、ＤＨ患者からの血清に対してより高いＩｇＡ反応性を示した（図１８）。この結果は、組換えタンパク質ＧＧ１およびＧＧ２が疱疹状皮膚炎の診断に用いることができることを示唆する。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
【表２】
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【００６９】
【表３】
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kU/L: リットル当たりのキロ単位, A: アナフィラキシー, AD: アトピー性皮膚炎, AS: 気道症状, AST: 喘息, D: 呼吸困難, GE: 胃腸症状, U: 蕁麻疹, b: カバノキ, c: ネコ, e: 卵, ew: 卵白, ey: 卵黄, gp: 花粉, hdm: チリダニ, n: ナッツ, r: ライ麦, w: 小麦
【００７０】
【表４】
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【００７１】
【表５】
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【００７２】
参考文献
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月4日(2013.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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