(57)【要約】重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とするＩＬ３３Ｒに結合する抗体、またはそのキメラ、ヒト化もしくはＴ細胞エピトープの除去された抗体変異体は、炎症疾病の処置のための有利な特性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＩＬ３３Ｒに結合する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが配列番号７を含むことを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが配列番号７を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号８を含むことを特徴とする、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
キメラ、ヒト化またはＴ細胞エピトープの除去された抗体変異体であることを特徴とする、請求項３記載の抗体。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが配列番号２４のＣＤＲ３領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域および配列番号２２のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含む、ヒト化変異体であることを特徴とする、ヒトＩＬ３３Ｒに結合する抗体。
【請求項６】
重鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２７のＣＤＲ２領域および配列番号２６のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含む、ヒト化変異体であることを特徴とする、ヒトＩＬ３３Ｒに結合する抗体。
【請求項７】
重鎖可変ドメインが配列番号２１を含むことを特徴とする、請求項５記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変ドメインが配列番号２１を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３０を含むことを特徴とする、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
重鎖可変ドメインが配列番号２５を含むことを特徴とする、請求項６記載の抗体。
【請求項１０】
重鎖可変ドメインが配列番号２５を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３０を含むことを特徴とする、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
アミノ酸２１６〜２４０位のヒンジ領域においておよび／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプであることによって特徴付けられる、請求項１〜１０記載の抗体。
【請求項１２】
請求項３記載の抗体が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合し、アミノ酸２１６〜２４０位のヒンジ領域においておよび／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４アイソタイプであることによって特徴付けられる、ヒトＩＬ３３Ｒに結合する抗体。
【請求項１３】
アミノ酸２３４位においてロイシンの代わりにアラニンを、そしてアミノ酸２３５位においてロイシンの代わりにアラニンの突然変異を含むことによって特徴付けられる、請求項１１または１２記載の抗体。
【請求項１４】
アミノ酸２３５位においてロイシンの代わりにグルタミン酸を、そしてアミノ酸２２８位においてセリンの代わりにプロリンの突然変異を含むことによって特徴付けられる、請求項１１または１２記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１４記載の抗体を含むことによって特徴付けられる薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項３記載の抗体が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合する抗体を含むことによって特徴付けられる、薬学的組成物。
【請求項１７】
薬学的組成物の製造のための請求項１〜１４記載の抗体の使用。
【請求項１８】
薬学的組成物の製造のための請求項３記載の抗体が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合することによって特徴付けられる抗体の使用。
【請求項１９】
関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息の処置のための請求項１〜１４記載の抗体の使用。
【請求項２０】
関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息の処置のための請求項３記載の抗体が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合することによって特徴付けられる抗体の使用。
【請求項２１】
ＩＬ３３Ｒに結合する抗体が配列番号１の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ３領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記抗体の重鎖をコードする核酸。
【請求項２２】
ＩＬ３３Ｒに結合する抗体が配列番号２４のＣＤＲ３領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域および配列番号２２のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記抗体の重鎖をコードする核酸。
【請求項２３】
ＩＬ３３Ｒに結合する抗体が配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２７のＣＤＲ２領域および配列番号２６のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記抗体の重鎖をコードする核酸。
【請求項２４】
原核または真核宿主細胞におけるＩＬ３３Ｒに結合する抗体の発現のための、請求項２１、２２または２３記載の核酸を含むことによって特徴付けられる発現ベクター。
【請求項２５】
原核または真核宿主細胞において請求項２１、２２または２３記載の核酸を発現させ、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、ＩＬ３３Ｒに結合する組換え抗体の産生のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩＬ３３Ｒに対する抗体（ＩＬ３３Ｒ抗体）、その産生のための方法、前記抗体を含む薬学的組成物、およびその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトＩＬ３３は、ＩＬ−１レセプターに関連したＩＬ３３レセプター（前記レセプターの同義語：ＩＬ１ＲＬ１、Ｔ１／ＳＴ２）を介してシグナルを伝達しそして２型ヘルパーＴ細胞に関連したサイトカインを誘導する、ＩＬ−１ファミリーのインターロイキン−１様サイトカインである。ＩＬ３３（スイスプロットアクセッションナンバーＯ９５７６０）の同義語は、インターロイキン−１ファミリーメンバー１１（ＩＬ−１Ｆ１１）および高内皮細静脈由来の核内因子（ＮＦ−ＨＥＶ）である。ＮＦ−ＨＥＶは、Baekkevold, E.S., et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 69-79に記載されている。ＩＬ３３は、Schmitz, J., et al., Immunity 23 (2005) 479-490によって記載されている。
【０００３】
ヒトＩＬ３３レセプター、すなわちＩＬ３３Ｒ（ＩＬＲＬ１の同義語；スイスプロットアクセッションナンバーＱ０１６３８、他の名称はＳＴ２、Ｔ１／ＳＴ２、Ｆｉｔ−１およびＤＥＲ４である）は、線維芽細胞において増殖の刺激によって誘導され、そしてまたＴｈ２細胞においては抗原の刺激によっても誘導され得る。本発明によるとＩＬ３３ＲおよびＳＴ２はヒトＩＬ３３Ｒを示す。Tominaga, S., et al., (FEBS Lett. 258 (1989) 301-304; Biochim. Biophys. Acta. 1171 (1992) 215-218)およびYanagisawa, K., (FEBS Lett. 318 (1993) 83-87)は、ヒトＳＴ２（分泌型）、ＳＴ２Ｌ（膜貫通レセプター型）およびＳＴ２Ｖ（Ｇｌｕ−７８変異体）を同定した。ヒトＳＴ２は、増殖の刺激されたＢＡＬＢ／ｃ−３Ｔ３細胞においてのみ発現され、そして増殖因子によって誘導される一次応答遺伝子ファミリーのメンバーである。ＳＴ２は、１型および２型の両方のヒトインターロイキン１レセプターの細胞外部分に配列が類似したタンパク質をコードする。ＩＬ３３Ｒノックアウトマウスを用いての研究は、ＩＬ３３ＲがＴＨ２応答の初期事象に関与していることを示唆する（Kropf, P., et al., Infect. Immunity 70 (2002) 5512-5520; Hoshino, K., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 1541-1548; Senn, et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 1929-1938; Townsend, M.J., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 1069-1076）。ＳＴ２は、ＴＨ２免疫のマーカー、アクチベーターおよびレギュレーターであると推定される（Kumar, R.K., et al., Clin. Exp. Allergy 32 (2002) 1394-1396）。
【０００４】
抗ＩＬ３３Ｒ抗体および免疫機能におけるその役割は、多くの刊行物に記載された。抗ヒトＳＴ２抗体Ｍａｂ５２３およびポリクローナル抗体ＡＦ５２３は、R&D Systems (http://www.rndsystems.com)から市販されている。抗ヒトＳＴ２抗体ＨＢ１２は、antibodies-online GmbH, GermanyおよびMBL Int. Corp. (www.mblintl.com)から市販されている。抗ＩＬ３３Ｒ抗体により、ＴＨ２型免疫応答は減少した。前記抗体は、好酸球の浸潤、ＩＬ−５の産生およびＩｇＥの産生を阻害した。喘息の動物モデルにおけるＳＴ２の役割の評価の結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのマウスＩＬ３３Ｒの増加した発現が認められ、このことは、アレルギー性応答または喘息応答におけるＩＬ３３Ｒの役割を示す（Lohning, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 6930-6935およびXu, D., et al., J. Exp. Med. 187 (1998) 787-794; Coyle, A.J., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 895-902）。Meisel, C., et al., J. Immunol. 166 (2001) 3143-3150は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＴ１／ＳＴ２発現の調節および機能、並びにＴ１／ＳＴ２架橋による２型サイトカイン産生の誘導を調べる。Lohning, M., et al.はラットにおいて抗マウスＳＴ２抗体を生成する。アレルゲンにより誘発する１時間前においての２０μg（約０．８mg/kg）のこのような抗体を用いての前処理は、マウスの気道における好酸球の数を７０％減少させた。Kumar, S., et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. 235 (1997) 474-478およびJ. Biol. Chem. 270 (1995) 27905-27913)は、ショウジョウバエにおいて発現された精製された可溶性のＳＴ２レセプターに対して生成されたウサギポリクローナル抗体を使用した免疫沈降によって検出されたＳＴ２タンパク質の発現を記載する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いての研究は、抗ＩＬ３３抗体を用いての処理が、より高度なＴＨ１型応答を誘導したことを明らかとした。患者の血清中のヒトＳＴ２タンパク質を定量するためのＥＬＩＳＡシステムが、Kuroiwa, K., et al., Hybridoma 19 (2000) 151-159によって記載された。抗ＩＬ３３Ｒ抗体はまた、ＲＳＶによる感染に起因する作用も減少させる（Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792）。抗ＩＬ３３Ｒ抗体はまた、関節炎の動物モデルにおいても調査された（Leung, B.P., et al., J. Immunol. 173 (2004) 145-150; Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792）。Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030は、抗ｈｕＳＴ２抗体の存在下でＮＫ細胞におけるインターフェロンγのレベルを調べた。ＩＬ３３Ｒおよび／またはＩＬ３３Ｒに対する抗体は、WO 2005/079844、US 7,087,396、WO 2001/021641、WO 2002/038794、WO 2003/094856に記載されている。Oboki, K., et al., Allergology Int. 59 (2010) 143-160は、宿主の防御および疾病におけるＩＬ−３３およびＩＬ−３３レセプターの役割、並びに、マウス気道炎症に対する抗ＳＴ２抗体、可溶性ＳＴ２抗体および抗ＩＬ−３３抗体の効果を概説する。
【０００５】
発明の要約
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体を含む。好ましくは、前記抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号７を含むことを特徴とする。好ましくは、前記抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号７を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号８を含むことを特徴とする。好ましくは、ＩＬ３３Ｒに結合しそして前記のアミノ酸配列およびアミノ酸フラグメントによって特徴付けられる抗体は、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０〜２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは前記抗体は突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位においてロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む。突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む好ましい重鎖定常領域を配列番号９に示す。好ましくは、ＩＬ３３Ｒに結合しそして前記のアミノ酸配列およびアミノ酸配列フラグメントによって特徴付けられる抗体は、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０〜２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ４アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は突然変異Ｌ２３５Ｅ（アミノ酸２３５位においてロイシンの代わりにグルタミン酸）およびＳ２２８Ｐ（アミノ酸２２８位においてセリンの代わりにプロリン）を含む。
【０００６】
抗体ｒａ１７０（Ｍａｂ ｒａ１７０）は、本発明の好ましい態様である。本発明のさらなる態様は、抗体ｒａ１７０のキメラ、ヒト化またはＴ細胞エピトープの除去された抗体変異体である。
【０００７】
抗体ｒａ１７０の好ましいヒト化抗体変異体は、重鎖可変ドメインが配列番号２４のＣＤＲ３領域、配列番号２３のＣＤＲ２領域および配列番号２２のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とするか、または、重鎖可変ドメインが配列番号２８のＣＤＲ３領域、配列番号２７のＣＤＲ２領域および配列番号２６のＣＤＲ１領域を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号３３のＣＤＲ３領域、配列番号３２のＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする。好ましくは、ヒト化抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号２１または２５を含むことを特徴とする。好ましくは、ヒト化抗体は、軽鎖可変ドメインが配列番号３０を含むことを特徴とする。
【０００８】
前記抗体は、ＩＬ３３Ｒに、１０−１０Ｍ以下の親和性で特異的に結合する。
【０００９】
本発明はさらに、ＩＬ３３Ｒに結合し、そしてモノクローナル抗体ｒａ１７０が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体に関する。前記抗体は少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ３３Ｒに結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０〜２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１アイソタイプ、または突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
【００１０】
好ましくは、前記抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。好ましくは、本発明による前記抗体は、ヒトＩＬ３３／ＩＬ３３Ｒについては０．３２nM、そしてカニクイザルＩＬ３３／ＩＬ３３Ｒについては０．１３nMのＩＣ５０値で、ＩＬ３３Ｒに対するＩＬ３３の結合を阻害する。
【００１１】
本発明による抗体は、好ましくは、好酸球アッセイ、肥満細胞アッセイ、Ｔｈ２アッセイ、好塩基球アッセイ（ＩＬ−５）において５nM以下のＩＣ５０値を示す。このような抗体は、関節リウマチ、喘息または潰瘍性大腸炎の処置において特に有用である。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体ｒａ１７０が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ３３Ｒに結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０から２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位のアミノ酸の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位においてロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１アイソタイプであるか、または突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、薬学的組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。好ましくは、前記薬学的組成物は、モノクローナル抗体ｒａ１７０が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、前記薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ３３Ｒに結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０〜２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変された好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位においてロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１アイソタイプであるか、または突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、潰瘍性大腸炎または喘息の処置のための本発明による抗体の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物の製造のための方法である。好ましくは、前記薬学的組成物は、モノクローナル抗体ｒａ１７０が結合するのと同じＩＬ３３Ｒエピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、前記薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ３３Ｒに結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０〜２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変された好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位においてロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１アイソタイプであるか、またはＬ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体の重鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ３領域、並びに好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体の軽鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号７の重鎖可変ドメインおよび配列番号８の軽鎖可変ドメイン、並びに好ましくは重鎖ヒトＩｇＧ１定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａまたは重鎖ヒトＩｇＧ４定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むことによって特徴付けられる、本発明による抗体をコードする核酸である。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体の重鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号２２のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３領域、並びに好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体の軽鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体は、さらに、配列番号２の軽鎖ＣＤＲ３２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号２１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３０の軽鎖可変ドメイン、並びに好ましくは重鎖ヒトＩｇＧ１定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａまたは重鎖ヒトＩｇＧ４定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むことによって特徴付けられる、本発明による抗体をコードする核酸である。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体の重鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号２６のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３領域、並びに好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、ＩＬ３３Ｒに結合する抗体の軽鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２の軽鎖ＣＤＲ２領域および配列番号３１のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号２５の重鎖可変ドメインおよび配列番号３０の軽鎖可変ドメイン、並びに好ましくは重鎖ヒトＩｇＧ１定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａまたは重鎖ヒトＩｇＧ４定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むことによって特徴付けられる、本発明による抗体をコードする核酸である。
【００１８】
本発明による抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の最新技術において周知であり、そして例えばKabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)、並びにJohnson, G.およびWu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号９のアミノ酸配列（突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１）または配列番号２９のアミノ酸配列（突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４）を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２または３４のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。前記抗体はマウス起源であり、そしてKabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991);およびJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)によるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい。
【００１９】
本発明による抗体は、ＩＬ３３ＲへのＩＬ３３の結合を阻害し、そしてそれ故、ＩＬ−３３Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰシグナル伝達複合体を介したシグナル伝達を阻害することによって特に特徴付けられる。
【００２０】
本発明による抗体は、好ましくは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１である。好ましいγ１重鎖定常領域を配列番号１０または２９および配列番号１１（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含まない）に示す。好ましいκ軽鎖定常領域を配列番号１２または３４に示す。
【００２１】
本発明による抗体は、好ましくは、ヒトの補体因子Ｃ１ｑには結合しないことによって特徴付けられ、それ故、ＣＤＣエフェクター機能は回避される。
【００２２】
本発明による抗体は、好ましくは、ＣＨ１とＣＨ２との間の、アミノ酸２１６〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０〜２４０位のヒンジ領域、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のアミノ酸３２７〜３３１位の第２のドメイン間領域において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。本発明による抗体は、好ましくは、Ｌ２３４（アミノ酸２３４位のロイシン）、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって特徴付けられる。好ましくは、前記抗体は突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位においてロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１アイソタイプであるか、または突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
【００２３】
本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現することのできる前記核酸を含む発現ベクター、およびこのような抗体の組換え産生のためのこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明によるベクターを含む原核または真核宿主細胞を含む。本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現させ、そして前記抗体を前記細胞または細胞培養上清から回収することによって特徴付けられる、本発明による組換えヒトまたはヒト化抗体の産生のための方法を含む。本発明はさらに、このような組換え法によって得ることのできる抗体を含む。
【００２４】
本発明による抗体は、ＩＬ３３Ｒターゲティング療法の必要性がある患者に対して利点を示す。本発明による抗体は、このような免疫学的疾病を患う、特に関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者に対して特に利点をもたらす新規かつ発明的な特性を有する。本発明による抗体は、処置患者のブドウ球菌感染および腸内細菌感染に対する感受性を引き起こさない。本発明はさらに、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者を処置するための方法を提供し、これは、このような疾病を有すると診断された（それ故、このような療法が必要である）患者に、本発明によるＩＬ３３Ｒに結合する抗体の有効量を投与することを含む。前記抗体は、好ましくは薬学的組成物で投与される。本発明のさらなる態様は、患者に本発明による抗体を投与することによって特徴付けられる、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者の処置のための方法である。本発明はさらに、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者の処置のための、および本発明による薬学的組成物の製造のための、本発明による抗体の使用を含む。さらに、本発明は、本発明による薬学的組成物の製造のための方法を含む。
【００２５】
本発明はさらに、薬学的目的のための抗体の製剤化に有用なバッファーおよび／またはアジュバントを場合により一緒に含む、本発明による抗体を含む薬学的組成物を含む。本発明はさらに、薬学的に許容され得る担体に本発明による抗体を含む薬学的組成物を提供する。１つの態様において、薬学的組成物は、製造品またはキットに含まれ得る。
【００２６】
発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、完全な抗体および抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない種々の形態の抗体構造を包含する。本発明による抗体は、好ましくは、ヒト化抗体、キメラ抗体、または本発明による特徴的な特性が保持されている限りさらに遺伝子工学された抗体である。「抗体フラグメント」は、完全長の抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例としては、ディアボディ、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。さらに、抗体フラグメントは、ＶＨドメインの特徴を有する、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位に会合することのできる、またはＩＬ３３Ｒに結合するＶＬドメインの特徴を有する、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位に会合することができ、これにより本発明による抗体の特性を与える、一本鎖ポリペプチドを含む。本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が親免疫グロブリンと比較して異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された抗体を指す。好ましい態様において、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植することにより、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270参照。
【００２７】
本明細書において使用する「ＩＬ３３Ｒに結合する」という用語は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて固定されたヒトＩＬ３３Ｒへの抗体の結合を意味する。抗体が、１２ng/mlを超える抗体濃度で、抗体を含まない対照の平均＋標準偏差の３倍を超えるシグナルを引き起こす場合に結合が見られる。
【００２８】
「親和性」という用語は、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の強度総計を指す。特記しない限り、本明細書において使用する「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）との間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって示され得る。親和性は、本明細書に記載された方法を含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための特定の例証的および例示的な態様を以下に記載する。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することのできるタンパク質決定基を示す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常、エピトープは、特異的な３次元構造特徴、並びに特異的な荷電特徴を有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は変性溶媒の存在下で失われない点で識別される。好ましくは、本発明による抗体は、天然のＩＬ３３Ｒには特異的に結合するが、変性したＩＬ３３Ｒには結合しない。本発明のＩＬ３３Ｒ抗体は、抗体Ｍａｂ ｒａ１７０が結合するのと同じＩＬ３３Ｒ上のエピトープに結合する。本発明のＩＬ３３Ｒ抗体のエピトープ結合特性は、当技術分野において公知の技術を使用して決定され得る。ＩＬ３３Ｒ抗体は、in vitroにおける交差遮断結合アッセイによって試験されることにより、ＩＬ３３Ｒへの抗体Ｍａｂ ｒａ１７０の結合を妨害する試験抗体の能力が決定される。試験抗体が抗体Ｍａｂ ｒａ１７０によって少なくとも１５％置換されていれば、エピトープはほぼ近似している。
【００３０】
本明細書において使用する「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与している軽鎖ドメインと重鎖ドメインの各対を示す。可変軽鎖および重鎖ドメインは同じ一般的な構造を有し、そして各ドメインは、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβ−シートコンフォメーションをとり、そしてＣＤＲは、β−シート構造を接続するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によってその３次元構造が保持され、そして他の鎖のＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００３１】
本明細書において使用する場合の「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原との結合に関与している抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原との結合に最も貢献する領域であり、そして抗体の特性を規定する。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域および／または「超可変ループ」からの残基は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
【００３２】
本出願に使用する「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の基を示す。
【００３３】
本明細書において使用する「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意味する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、しかし好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸と機能的な関係に配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されている場合、ポリペプチドに対するＤＮＡと作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列に作動可能に連結されており；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合にコード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が同一線上にあり、そして分泌リーダーの場合には、連続し、そしてリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって連結が達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」および「細胞培養液」という表現は同義語として使用され、そして全てのこのような名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代の対象細胞、および継代数に関係なくそれから誘導された培養液を含む。また、全ての子孫は、計画的または偶発的な突然変異により、ＤＮＡ内容物が正確に同一ではない場合もあることが理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫も含まれる。
【００３４】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者には周知の用語であり、そして抗体のパパインによる切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、そしてこれらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類され得る。重鎖定常領域により異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合およびＦｃレセプターへの結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。補体活性化（ＣＤＣ）は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は当技術分野の最新技術において公知であり、そして例えばBoackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R.およびCebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434によって記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は、通常、補体の活性化およびＣ１ｑへの結合を示し、一方、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑに結合しない。
【００３５】
本発明による抗体は、サブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分であるヒト起源のＦｃ部分を含む。本発明による抗体のＦｃ部分について、好ましくは以下に定義したようなＣ１ｑへの結合を検出することができない。
【００３６】
それ故、本発明は、本発明による抗体がＩＬ３３Ｒに結合し、ヒト起源のＦｃ部分を含み、そしてヒト補体因子Ｃ１ｑに結合せず、それ故、ＣＤＣエフェクター機能を回避することを特徴とする、前記抗体を含む。
【００３７】
好ましくは本発明による抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／またはＤ２６５に突然変異を有するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスのＦｃγレセプターへの結合に関し、そして／または、ＰＶＡ２３６突然変異を含む。好ましいのは突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である（ＰＶＡ２３６は、ＩｇＧ１のアミノ酸２３３〜２３６位のアミノ酸配列ＥＬＬＧ（１文字アミノ酸コードで示される）またはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡによって置換されていることを意味する）。従って、本発明は、本発明による抗体が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９において少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であることを特徴とする、前記抗体を提供する。１つの態様において、前記抗体はヒト抗体である。別の態様において前記抗体はヒト化抗体である。１つの態様において、本発明は、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含み、そして本発明による抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１において少なくとも１つの突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であることを特徴とし、そして前記抗体は、ビアコアアッセイにおいて１０−８Ｍ未満のＫＤ値でＩＬ３３Ｒに結合する、前記抗体を提供する。別の態様において、ＫＤ範囲は１０−１１から１０−９Ｍである。
【００３８】
Ｃ１ｑへの結合は、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に従って測定され得る。本発明によるＣ１ｑへの結合皆無は、ＥＬＩＳＡプレートを種々の濃度の抗体でコーティングしたこのようなアッセイにおいて、ヒトＣ１ｑを加えることにより特徴付けられる。Ｃ１ｑへの結合は、ヒトＣ１ｑに対して作られた抗体、続いてペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳ（登録商標）（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］）を用いてペルオキシダーゼにより標識されたコンジュゲートを検出することによって検出される。本発明によるＣ１ｑへの結合皆無は、試験抗体の４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）が、１０μg/mlの抗体濃度において、０．０５未満であるならば認められる。
【００３９】
本発明による抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の最新技術において周知であり、そして例えばKabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991);およびJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は配列番号１０、１１または２９を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２または３４のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸である。
【００４１】
本発明は、患者に治療有効量の本発明による抗体を投与することによって特徴付けられる、療法の必要な患者の処置のための方法を含む。本発明は、療法のための本発明による抗体の使用を含む。本発明は、特に炎症疾患の予防および処置のための医薬品の調製のための本発明による抗体の使用を含む。本発明は、炎症疾病の処置のための、好ましくは関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および喘息の処置のための本発明による抗体の使用を含む。
【００４２】
本発明による抗体は、さらに、「保存的な配列の改変」（変異抗体）、すなわち本発明による抗体の前記の特徴に影響を及ぼさないかまたは改変させないヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変を有するこのような抗体を含む。改変は、当技術分野において公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲにより媒介される突然変異誘発によって導入され得る。保存的なアミノ酸の置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、ヒト抗ＩＬ３３Ｒ抗体中の予測される非必須アミノ酸残基を、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基を用いて置換することができる。それ故、「変異体」抗ＩＬ３３Ｒ抗体は、親抗体の１つ以上の可変領域においての１０個まで、好ましくは約２から約５個までの付加、欠失および／または置換によって、「親」抗ＩＬ３３Ｒ抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。
【００４３】
アミノ酸の置換は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載されたような分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって実施され得る。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ３３Ｒに結合するヒトＩｇＧ１型抗体の重鎖をコードする核酸の配列が、前記の改変された抗体がＣ１ｑおよび／またはＦｃγレセプターに結合しないように改変されており、前記の改変された核酸および前記の抗体の軽鎖をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、前記ベクターを真核宿主細胞に挿入し、コードされたタンパク質を発現させ、そして宿主細胞または上清から回収することを特徴とする、Ｆｃγレセプターおよび／またはＣ１ｑに結合しないＩＬ３３Ｒに対する抗体の産生のための方法である。
【００４５】
配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列をアラインさせ、そして必要であればギャップを導入して、配列最大同一率を達成した後、親配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすとは捉えない。変異体はヒトＩＬ３３Ｒに結合する能力を保持し、そして好ましくは、親抗体よりも優れた特性を有する。例えば、変異体は、処置中に低減された副作用を有し得る。
【００４６】
「親」抗体は、抗体ｒａ１７０のＣＤＲ領域を含み、そして好ましくは変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有し、そして存在する場合には、ヒト抗体定常領域またはヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。
【００４７】
本発明による抗体は、好ましくは、組換え手段によって産生される。このような方法は当技術分野の最新技術において広く知られており、そして原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現、その後の抗体ポリペプチドの単離、および通常、薬学的に許容され得る純度までの精製を含む。タンパク質の発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母細胞またはE.coli細胞などの適切な原核または真核宿主細胞において行なわれ、そして抗体を細胞から（上清からまたは細胞溶解後に）回収する。抗体の組換え産生は当技術分野の最新技術において周知であり、そして例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の概説論文に記載されている。抗体は、完全細胞中に、細胞溶解液中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。精製は、カラムクロマトグラフィーおよび当技術分野において周知のその他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質を排除するために行なわれる。Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K., 、Cytotechnology 30 (1999) 71-83によって、およびSchlaeger, E.-J.,、J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの慣用的な免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは容易に単離され、そして慣用的な手順を使用してシークエンスされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ源およびＲＮＡ源として作用し得る。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し得、これをその後、別様に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションさせて、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成がもたらされる。
【００４８】
ヒトＩＬ３３Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。しかしながら、このような改変は、例えば前記したように、非常に限られた範囲でしか実施することができない。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプおよびエピトープとの結合などの前記した抗体特徴を変化させることはないが、組換え産生の収率、タンパク質の安定性を改善し得るか、または精製を容易にし得る。また、抗ＩＬ３３Ｒ抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般的にセリンを用いて置換することにより、分子の酸化に対する安定性を改善しそして異常な架橋を防ぎ得る。逆に、システイン結合（群）を抗体に加えて、その安定性を改善してもよい（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元来のグリコシル化パターンを変化させる。「変化」によって、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を除去すること、および／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素的に付着するための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作る。抗体へのグリコシル化部位の付加は、１つ以上の前記のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって簡便には達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。
【００４９】
抗ＩＬ３３Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の種々の方法によって調製される。これらの方法は、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、またはヒト化抗ＩＬ３３Ｒ抗体の初期に調製された変異体または非変異体形のオリゴヌクレオチドにより媒介される（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製を含むがそれらに限定されない。
【００５０】
抗体の別のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号;第4,179,337号に示されたように、抗体を、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つに連結させることを含む。
【００５１】
本発明による重鎖および軽鎖可変ドメインを、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配列と合わせて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物を単一のベクター中に合わせ、宿主細胞に同時トランスフェクションするか、連続的にトランスフェクションするか、または別々にトランスフェクションし、これをその後、融合させて、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成する。
【００５２】
別の局面において、本発明は、薬学的に許容され得る担体と一緒に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の１つまたは組合せを含む、例えば薬学的組成物などの組成物を提供する。本明細書において使用する「薬学的に許容され得る担体」は、生理学的に適合性である、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収／再吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は注射または点滴に適している。本発明の組成物は、当技術分野において公知の種々の方法によって投与され得る。当業者によって認識されているように、投与の経路および／または形態は、所望の結果に応じて変更される。薬学的に許容され得る担体は、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。水の他に、担体は、例えば、等張緩衝食塩水溶液であり得る。選択した投与経路に関係なく、適切な水和形で使用され得る本発明の化合物、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の慣用的な方法によって薬学的に許容され得る剤形に製剤化される。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性を及ぼすことなく、特定の患者、組成物、および投与形態に対して所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量（有効量）が得られるように変更され得る。選択された投与量レベルは、使用した本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時刻、使用する特定の化合物の排泄速度、使用する特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および病歴、および医学分野において周知の同様な因子を含む、種々の薬物動態因子に依存する。
【００５３】
本発明は、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者の処置のための本発明による抗体の使用を含む。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、関節リウマチを患う患者の処置のための、抗ＩＬ３３Ｒ抗体、好ましくは本発明による抗体の使用であり、前記患者は、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中等度に応答するかまたは応答しない。本発明のさらなる態様は、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者の処置のための医薬品の製造のための、抗ＩＬ３３Ｒ抗体、好ましくは本発明による抗体の使用である。
【００５５】
本発明はさらに、薬学的に許容され得る担体と一緒に本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造のための方法、およびこのような方法のための本発明による抗体の使用を提供する。本発明はさらに、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容され得る担体と一緒に、薬剤を製造するための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。本発明はまた、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または喘息を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容され得る担体と一緒に、薬剤を製造するための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。
【００５６】
配列の記載
配列番号１    Ｍａｂ ｒａ１７０の重鎖ＣＤＲ３
配列番号２    Ｍａｂ ｒａ１７０の重鎖ＣＤＲ２
配列番号３    Ｍａｂ ｒａ１７０の重鎖ＣＤＲ１
配列番号４    Ｍａｂ ｒａ１７０の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５    Ｍａｂ ｒａ１７０の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号６    Ｍａｂ ｒａ１７０の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号７    Ｍａｂ ｒａ１７０の重鎖可変ドメイン
配列番号８    Ｍａｂ ｒａ１７０の軽鎖可変ドメイン
配列番号９    突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトγ１重鎖定常領域（コーカサス人種アロタイプ）
配列番号１０  ヒトγ１重鎖定常領域（コーカサス人種アロタイプ）
配列番号１１  ヒトγ１重鎖定常領域（アフリカ系アメリカ人アロタイプ）
配列番号１２  ヒトκ軽鎖定常領域
配列番号１３  ｍｕｔ１についての置換されたＳＴ２配列フラグメント１
配列番号１４  ｍｕｔ１についての置換されたＳＴ２配列フラグメント２
配列番号１５  ｍｕｔ１についての置換されたＳＴ２配列フラグメント３
配列番号１６  ｍｕｔ１についての置換されたＳＴ２配列フラグメント４
配列番号１７  配列番号１３のＳＴ２フラグメントを置換している、ＩＬ−１Ｒフラグメント１ｍｕｔ１
配列番号１８  配列番号１４のＳＴ２フラグメントを置換している、ＩＬ−１Ｒフラグメント２ｍｕｔ２
配列番号１９  配列番号１５のＳＴ２フラグメントを置換している、ＩＬ−１Ｒフラグメント３ｍｕｔ３
配列番号２０  配列番号１６のＳＴ２フラグメントを置換している、ＩＬ−１Ｒフラグメント４ｍｕｔ４
配列番号２１  ヒト化ｒａ１７０ １１．１２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１１）
配列番号２２  Ｍａｂ ｒａ１７０ １１．１２の重鎖ＣＤＲ１
配列番号２３  Ｍａｂ ｒａ１７０ １１．１２の重鎖ＣＤＲ２
配列番号２４  Ｍａｂ ｒａ１７０ １１．１２の重鎖ＣＤＲ３
配列番号２５  ヒト化ｒａ１７０ １０．１２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１０）
配列番号２６  Ｍａｂ ｒａ１７０ １０．１２の重鎖ＣＤＲ１
配列番号２７  Ｍａｂ ｒａ１７０ １０．１２の重鎖ＣＤＲ２
配列番号２８  Ｍａｂ ｒａ１７０ １０．１２の重鎖ＣＤＲ３
配列番号２９  ヒトＩｇＧ４ ＳＰＬＥ骨格（突然変異Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐを有するヒトγ４重鎖定常領域）
配列番号３０  ヒト化ｒａ１７０の軽鎖可変ドメイン（１１．１２および１０．１２）
配列番号３１  Ｍａｂ ｒａ１７０ １０．１２および１１．１２の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３２  Ｍａｂ ｒａ１７０ １０．１２および１１．１２の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３３  Ｍａｂ ｒａ１７０ １０．１２および１１．１２の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３４  ヒトκ骨格
【００５７】
実施例
実施例１
免疫化
Charles River Laboratories International, Inc.からの野生型ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ（Oryctolagus cuniculus）を免疫化のために使用した。それらを、施設内動物管理使用委員会ガイドラインおよび実験動物管理評価認定協会（ドイツ、ヨーロッパ）に従って、収容しそして維持した。
【００５８】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合させた精製されＮＳ０に由来する分泌可溶形のヒトＩＬ−３３Ｒを、１mg/mlの濃度で、ＮａＣｌ−ヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．１）に溶かし、そして安定なエマルションが生成されるまで完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合（１：１）した。３匹のウサギが、２mlのエマルションの皮内（i.d.）注射、続いて、１週間間隔で各々１mlの２回目の筋肉内（i.m.）および３回目の皮下（s.c.）注射を受けた。1mlの４回目の筋肉内注射を２週間後に実施し、続いて、４週間間隔で１mlの２回のさらなる皮下注射を実施した。各動物の１０mlの末梢全血試料を、３、４、５および６回目の注射の４〜６日後に回収し、そしてＦＡＣＳにおける単一細胞選別のために使用した。各動物のさらなる０．５mlの血清を同時に回収し、そしてＩＬ３３Ｒ特異的抗体応答の特徴付けのために使用した。
【００５９】
抗体応答
免疫化に対する抗体応答を、ＩＬ３３Ｒ特異的ＥＬＩＳＡを使用した血清の連続希釈によって決定し、９６ウェルMaxiSorpマイクロタイタープレートを、３７℃で１時間かけて炭酸バッファー中０．３μg/mlのｒｈＩＬ３３Ｒタンパク質を用いてコーティングした。その後、ウェルを、４℃で一晩かけて１％Crotein C（Roche Diagnostics GmbH, DE）で補充されたＰＢＳを用いて遮断した。検出のために、セイヨウワサビペルオキシダーゼに連結させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（The Jackson Laboratory）を１：１６０００の希釈率で使用した。Roche Diagnostics GmbH, DEのＢＭブルーＰＯＤ基質、沈殿性テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ready-to-use溶液を可視化のために使用した。反応を１Ｎ ＨＣｌを介して停止し、そして４５０／６９０nmによってTecan Infiniteで測定した。
【００６０】
抗体選択の記載
無菌６ウェル細胞培養プレートを、４℃で一晩かけて、炭酸バッファー（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、３４mM炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中２μg/mlのＩＬ３３Ｒタンパク質を用いてコーティングした。プレートを、使用前に３回、無菌ＰＢＳで洗浄した。ＥＤＴＡを含むウサギ全血を、ウサギＰＢＭＣを単離するために実施されたlympholyte mammal（Cedarlane Laboratories）での密度遠心分離前に１×ＰＢＳで２倍に希釈した。ＰＢＭＣを、抗体で染色する前に２回洗浄した。
【００６１】
ＥＬ−４ Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT, USA）、２mMグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、２mMピルビン酸ナトリウム、１０mM ＨＥＰＥＳおよび０．０５mM β−メルカプトエタノールで補充されたＲＰＭＩ １６４０。
【００６２】
マクロファージ／単球の除去
無菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用して、非特異的接着を通してマクロファージおよび単球を除去した。各ウェルに、最大で４mlの培地および免疫化ウサギからの最大６×１０６個の末梢血単核細胞を満たし、そしてインキュベーター中で３７℃で１時間かけて結合させた。上清中の細胞の５０％をパニング工程に使用し；細胞の残りの５０％を、免疫蛍光染色を行なうまで氷上で保持した。
【００６３】
ＩＬ３３Ｒタンパク質上でのＢ細胞の濃縮
ＩＬ３３Ｒタンパク質でコーティングされた６ウェル組織培養プレートに、４mlの培地あたり最大６×１０６個の細胞を播種し、そしてインキュベーター中で３７℃で１時間かけて結合させた。ＩＬ３３Ｒタンパク質上での濃縮工程の後、非接着細胞を、ウェルを１×ＰＢＳを用いて１〜２回注意深く洗浄することによって除去した。残りの粘着性細胞をインキュベーター中で３７℃で１０分間かけてトリプシンによって脱着させ、そしてその後、培地中で２回洗浄した。細胞を、免疫蛍光染色を行なうまで氷上で保持した。
【００６４】
免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー
単一細胞選別のために使用された抗ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣは、AbD Serotec (STAR121F, Duesseldorf, Germany)製であった。表面染色のために、除去工程およびパニング工程からの細胞を、暗闇の中で４℃の低温室中で３０分間回転させながらＰＢＳ中で最適に希釈された抗ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベーションした。遠心分離後、上清を吸引によって除去した。ＰＢＭＣを２サイクルの遠心分離および氷冷ＰＢＳでの洗浄にかけた。最後にＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ分析に直ちにかけた。５μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）をＦＡＣＳ分析の前に加えて、死滅細胞と生細胞とを識別した。コンピューターおよびFACSDiva（商標）ソフトウェア（BD Biosciences, USA）を備えたBecton Dickinson FACSAria（商標）を使用してデータを収集および分析した。
【００６５】
Ｂ細胞培養液
Ｂ細胞培養液を、Zubler, et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363, Zubler, et al., J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183によって記載されたのと類似した方法によって調製した。簡潔に言うと、単一の選別されたＢ細胞を、９６ウェルプレート中で、Pansorbin（登録商標）細胞（１：２００００）（Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland）、５％ウサギ胸腺細胞上清（チャージ２００８０９１０、production Irmgard Thorey）およびγ照射ＥＬ−４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞（２×１０４個／ウェル）を含む２１０μl/ウェルの培地と共に、インキュベーター中５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃で７日間かけて培養した。Ｂ細胞培養上清をスクリーニングのために取り出し、そして細胞を直ちに可変領域遺伝子の回収のために収集するか、または１００μlのＲＬＴバッファー（Qiagen, Hilden, Germany）中で−８０℃で凍結させた。
【００６６】
リボ核酸（ＲＮＡ）の単離
ＲＮＡを単離しなければならない細胞をまず、遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを、１０μl/mlのβ−メルカプトエタノールを含む１００μlのＲＬＴバッファーの添加によって溶解した。細胞をピペットを用いて何回か混合することによって再懸濁し、そしてマルチウェルプレートに移した。プレートを直ちに２００×ｇで遠心分離にかけ、そして−２０℃で凍結させた。ＲＮＡの単離を、製造業者の指示に従ってNucleoSpin（登録商標）９６ＲＮＡキット（Macherey & Nagel）を用いて実施した。
【００６７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
逆転写を、製造業者の指示に従って、SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen)を用いて実施した。
【００６８】
ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応を、製造業者の指示に従ってAccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen)を用いて実施した。軽鎖および重鎖可変領域を別々の反応で増幅した。抗体発現ベクターを標的化するために２５ｂｐのオーバーラップを有するＰＣＲプライマーを使用した。ＰＣＲ産物を、NucleoSpin（登録商標）96 Extract II kit (Macherey & Nagel)によって精製した。
【００６９】
シークエンスおよびＳＬＩＣクローニング
ＰＣＲ産物をシークエンスして、重鎖および軽鎖の可変領域のＤＮＡ配列を決定した。ＰＣＲ産物をいわゆるＳＬＩＣクローニング法によって発現ベクターにクローニングし、これは、Haun, R.S., et al.,、BioTechniques 13 (1992) pp. 515-518およびLi, M.Z., et al., 、Nature Methods 4 (2007) pp. 251-256によって記載されている。抗体発現のためのプラスミドを、制限酵素による消化によって鎖状化した。鎖状化プラスミドを分取アガロース電気泳動によって精製し、そしてゲルから抽出した（Qiaquick Gel Extraction Kit / Qiagen）。精製されたプラスミドを、クローニングしようとするＰＣＲ産物のための重複プライマー（ｂａｙ ２５ｂｐ）を使用してＰＣＲプロトコールに加えた。ベクターおよび挿入断片の両方をｄＮＴＰの非存在下においてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Applied Sciences）を用いて処理してオーバーハングを生成し、その後、ベクターおよび挿入断片をＲｅｃＡ（New England Biolabs）タンパク質およびＡＴＰと共にインキュベーションして、組換えを促進させた。産物をE.coli中に形質転換させた。軽鎖および重鎖のためのプラスミドＤＮＡを単離し、そして各対を一過性トランスフェクションのために合わせた。
【００７０】
ＨＥＫ２９３細胞における抗体の発現のための一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞（Invitrogen）を、Ｆ１７培地（Gibco）中で１×１０６個の細胞／mlとなるまで増殖させた。２×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、293-free（Novagen）およびOptiMEM（登録商標）（Gibco）に懸濁した１μgのＨＣ＋ＬＣプラスミドを用いてトランスフェクションした。７日間のインキュベーション後、上清を収集しそして分析した。
【００７１】
本発明による抗体は、ヒトＵＴ−７細胞におけるＩＬ３３により誘導されるＮＦκＢ活性化の阻害に基づいて高い品質を示す。好ましくは本発明による抗体は、０．０５nM以下、より好ましくは０．０３nM以下のＩＣ５０値を示す。さらに本発明による抗体は、好酸球アッセイ、肥満細胞アッセイ、好塩基球アッセイ（ＫＵ８１２）およびＴＨ２アッセイのアッセイ組合せにおいて価値ある特性を示す。ヒトＵＴ−７細胞において０．０５nM以下、より好ましくは０．０３nM以下のＩＣ５０値のＩＬ３３により誘導されるＮＦκＢ活性化の阻害を示す抗体は、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および喘息の処置において特に有用な特性を有することが判明した。さらに好ましいのは、好酸球アッセイ、肥満細胞アッセイ、Ｔｈ２アッセイ、好塩基球アッセイ（ＩＬ−５）において５nM以下のＩＣ５０値を示す抗体である。
【００７２】
実施例２
ＳＴ２へのＩＬ３３の結合の阻害（ＥＬＩＳＡ）
試験を室温で３８４ウェルのMaxiSorp（商標）マイクロタイタープレート（Sigma-Aldrich, Nunc. DE、カタログ番号４６４７１８）で実施した。各インキュベーション工程後、プレートを３回ＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて洗浄した。最初に、プレートを、少なくとも２時間かけて、１μg/mlのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメント（Jackson Imm. Res., US、カタログ番号１０９−００６−１７０）を用いてコーティングした。その後、ウェルを、１時間かけて、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および２％ＢＳＡ（Roche Diagnostics GmbH, DE）で補充されたＰＢＳを用いて遮断した。６０ng/mlの組換えヒトＳＴ２／ＩＬ−１Ｒ４ Ｆｃキメラ（R&D Systems、UK、カタログ番号５２３−ＳＴ）または組換えカニクイザルＳＴ２ Ｆｃキメラを１時間かけてキャプチャ−した。精製された抗体の希釈液または０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中のハイブリドーマ／Ｂ細胞からの上清を、１時間かけてレセプタータンパク質と共にインキュベーションした。ビオチニル化ヒトＩＬ３３（PeproTech, US、カタログ番号５００−Ｐ２６１）をさらに１時間かけて加えて、複合体を構築した。ＩＬ３３は製造業者のプロトコールに従ってスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Thermo Scientific Pierce、US、カタログ番号２１３２７）を用いてビオチニル化され、そしてＺｅｂａ（商標）の脱塩スピンカラム（Thermo Scientific Pierce、US、カタログ番号８９８８９）を使用して精製された。複合体へのビオチニル化ＩＬ３３の結合を、１：４０００に希釈されたストレプトアビジンＨＲＰ（Roche Diagnostics GmbH、DE、カタログ番号１１０８９１５３００１）を用いて検出した。１時間後、プレートを６回ＰＢＳＴを用いて洗浄し、そして新たに調製したＢＭブルーＰＯＤ基質溶液（ＢＭブルー：３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、Roche Diagnostics GmbH、DE、カタログ番号１１４８４２８１００１）を用いて室温で１２分間かけて展開した。３７０nmにおける吸光度を測定した。陰性対照は、ＳＴ２／ＩＬ−１Ｒ４タンパク質を添加せずに定められ、そして陽性対照は、抗体を除く全ての成分を含めて定められた。
【００７３】
抗体ｒａ１７０は、ヒトＳＴ２への結合の阻害について０．３２nMのＩＣ５０値、そしてカニクイザルＳＴ２については０．１３nMのＩＣ５０値を示す。
【００７４】
実施例３
ヒトＳＴ２細胞外ドメインに対する抗ｈＳＴ２抗体の親和性の決定（Ｈｉｓ−Ａｖｉタグモノマー）
機器：BIACORE（登録商標）Ｔ１００
チップ：ＣＭ４（GE Healthcare BR-1005-34）
カップリング：アミンカップリング
バッファー：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）、ｐＨ７．４、３７℃
【００７５】
親和性の測定のために１０μg/mlのヤギ抗ヒトＦｃｇ抗体（Jackson Imm.  Res.、US、カタログ番号１１５−００５−０９８）を、ＳＴ２に結合する抗体をキャプチャーするためにチップ表面にカップリングさせた。6His Avitag（商標）（Avidity, LLC, US）を含むモノマーヒトＳＴ２細胞外ドメインを種々の濃度で溶液中に加えた。会合を、３７℃で１２０秒間の接触時間かけてＳＴ２細胞外ドメインの注入によって測定し（シングルサイクルカイネティク）；解離を、３７℃で１８００秒間かけてバッファーでチップ表面を洗浄することによって測定した。見かけのＫＤおよび他の動態パラメーターの計算のためにラングミュア１：１モデルを使用した。結果（２回の測定の平均）を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2014508520.tif 000002
【００７７】
実施例４
ヒトＵＴ−７細胞におけるＩＬ３３により誘導されるＮＦκＢ活性化の阻害
ａ）試薬：
ＵＴ−７細胞株（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ１３７）
培養培地：２mM Ｌ−グルタミン（Gibco番号２５０３０）、１．０mMピルビン酸ナトリウム（Gibco番号１１３６０−０３９）、０．１mM ＮＥＡＡ（Gibco番号１１１４０−０３５）、１０％ＦＣＳ（Gibco番号１０５０９−２４）、１０単位/mL ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Roche番号１１１１５１３８）で補充されたＲＰＭＩ １６４０（Gibco番号１０５０９−２４）。
組換えヒトＩＬ−３３（PeproTech番号２００−３３）
PathScan（登録商標）Phospho-NFkB p65 (Ser536)サンドイッチＥＬＩＳＡ抗体対（Cell Signaling番号７８３４）
PathScan（登録商標）サンドイッチＥＬＩＳＡ溶解バッファー（Cell Signaling番号７０１８）
ｒｈＴＮＦα（Roche Applied Sci番号１１３７１８４３）
【００７８】
ｂ）手順：
ＵＴ−７細胞を、２mM Ｌ−グルタミン、１．０mMピルビン酸ナトリウム、０．１mM ＮＥＡＡ、１０％ＦＣＳおよび１０単位/mlのＧＭ−ＣＳＦで補充されたＲＰＭＩ １６４０中で、７％ＣＯ２/９５％空気の混合物中で３７℃で増殖させた。細胞を約１×１０６個の細胞/mlの密度に達した場合に継代し、そして２×１０５個の細胞/mlの密度となるまで希釈した。細胞を継代から２日後にＮＦκＢアッセイのために使用した。ＩＬ３３のための効果的な濃度を決定するために、ＵＴ−７細胞を９６ウェルのポリプロピレン細胞培養プレート中に播種し（２２０μlの全容量の増殖培地において８．０×１０５個の細胞/ウェル）、そして種々の濃度の組換えヒトＩＬ−３３（０．１〜１０ng/ml）を用いて１５分間かけて３７℃で刺激した。その後、プレートを遠心分離にかけ、氷冷ＰＢＳで洗浄し、そして再度遠心分離にかけた。ＰＢＳを除去し、そして１ウェルあたり６０μlのPathScan（登録商標）サンドイッチＥＬＩＳＡ溶解バッファーを加えた。細胞を溶解バッファーと共に１５分間かけて氷上でインキュベーションした。溶解液を遠心分離によって清澄化し、そして上清を収集した。溶解液を、PathScan（登録商標）ホスホＮＦ−κＢ ｐ６５ＥＬＩＳＡを使用したＮＦκＢ活性化の決定まで−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡを製造業者の指示に従って実施した。データは、ＮＦκＢ活性化の刺激は１ng/mlのＩＬ３３で最適であることを実証した。抗体の試験のために、ＵＴ７細胞を９６ウェルのポリプロピレン細胞培養プレート（８．０×１０５個の細胞/ウェル）に播種し、そして全容量２２０μlの増殖培地中の種々の濃度の抗体（０．１５ng/mlから３００ng/mlの最終濃度）と共にインキュベーションした。細胞を抗体と共に１時間かけて氷上でインキュベーションした。続いて、細胞をｒｈＩＬ−３３（１ng/mlの最終濃度）を用いて１５分間かけて３７℃で刺激した。対照として、ＵＴ７細胞の最大ＮＦκＢ活性化を、３７℃で１５分間かけてＴＮＦ−α（３０ng/ml）と共にＵＴ７細胞をインキュベーションすることによって決定した。溶解液の調製およびＮＦκＢの分析を前記したように実施した。結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2014508520.tif 000003
【００８０】
実施例５
クローンｒａ１７０についての結合部位の決定
抗体結合部位の決定のために、ヒトＩＬ−３３レセプターＳＴ２をクローニングし、そして発現させた。ＳＴ２は、３つのドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３からなる。それについてＤ１Ｄ２変異体を作成し、そしてｒａ１７０の残存結合（residual binding）を試験した。Ｒａ１７０はＳＴ２および切断短縮変異体Ｄ１Ｄ２に結合する。
【００８１】
ＳＴ２変異体への結合は、２５℃でBIAcore（登録商標）T100機器（GE Healthcare）を使用して表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。BIAcore（登録商標）システムは、分子の相互作用の研究について十分に確立されている。ＳＰＲ技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定されたリガンドと、溶液中に注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面上の質量の変化を示す。分子が表面上に固定されたリガンドに結合すれば、質量は増加し、解離の場合には質量は減少し、複合体の解離を反映する。ＳＰＲは、リガンド／分析物の結合の連続的でリアルタイムなモニタリングを可能とし、従って、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および平衡定数（ＫＤ）の決定を可能とする。単一の濃度値の投入は、分析物の結合能に関する明瞭な記述を与えるが、結合値についての大まかな示唆をも与える。
【００８２】
キャプチャリングシステムの約８０００共鳴単位（ＲＵ）のアミンカップリング（キャプチャリング用ＳＴ２−Ｈｉｓ特異的Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ、Qiagen、カタログ番号３４６６０）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用してｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で実施した。
【００８３】
分析のためにＨｉｓタグ化ＳＴ２変異体を、３０μl/分の流速で１分間かけて３００nMの溶液を注入することによってキャプチャーした。その後、試験しようとする抗体を、３０μl/分の流速で２分間かけて１００nMの濃度で注入した。解離相を１分間までモニタリングし、そして試料溶液からランニングバッファーへの切り替えによってトリガーした。表面を、３０μl/分の流速でグリシン（ｐＨ２．０）溶液を用いて３０秒間洗浄することによって再生させた。
【００８４】
ブランクに結合させた表面から得られた応答を差し引くことによって、バルク屈折率の差を修正した。また、ブランク注入も差し引く（＝二重参照）。
【００８５】
ＳＴ２変異体は、ＳＴ２野生型と同等に本発明による抗体に結合し、それ故、結合部位はＤ１Ｄ２ドメイン上に位置すると結論付けられる。
【００８６】
実施例６
種々のＳＴ２変異体に対する抗ＩＬ３３Ｒ抗体の結合の決定
種々のＳＴ２変異体への本発明による抗体の結合を、BIAcore（登録商標）A100機器（GE Healthcare）を使用して３７℃で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。BIAcore（登録商標）システムは、分子の相互作用の研究のために十分に確立されている。ＳＰＲ技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、溶液中に注入された分析物と固定されたリガンドとの相互作用によって引き起こされる表面上の質量の変化を示す。分子が表面上に固定されたリガンドに結合すれば、質量は増加し、解離の場合には質量は減少し、複合体の解離を反映する。ＳＰＲは、リガンド／分析物の結合の連続的でリアルタイムなモニタリングを可能とし、従って、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および平衡定数（ＫＤ）の決定を可能とする。
【００８７】
キャプチャリングシステムの約８００共鳴単位（ＲＵ）のアミンカップリング（キャプチャリング用ｍＦｃγ特異的抗マウスＦｃγ、Jackson Imm. Res.、カタログ番号ＪＩＲ１１５−００５−０７１およびｒｂＦｃｇ特異的抗ウサギＦｃｇ、Jackson Imm. Res.、カタログ番号ＪＩＲ１１１−００５−０４６）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用してｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で実施した。
【００８８】
分析のために、１０nMのウサギ抗体および約３０nMのマウス抗体溶液を２分間かけて１０μl/分の流速で注入することによって種々の抗体をキャプチャーした。その後、試験しようとするＨｉｓタグ化ＳＴ２変異体を、１５０nMの最大濃度を有する希釈シリーズで、２．５分間かけて３０μl/分の流速で注入した。解離相を１０分間までモニタリングし、そして試料溶液からランニングバッファーへの切り替えによってトリガーした。抗マウスキャプチャー抗体の表面は、役立つプロトコールを使用して、グリシンｐＨ１．５溶液を用いての６０秒間の洗浄、次いでグリシンｐＨ２．０を用いての６０秒間の洗浄によって再生させた。抗ウサギキャプチャー抗体の表面は、グリシンｐＨ１．７溶液を用いての２回の６０秒間の洗浄工程によって再生させた。
【００８９】
バルク屈折率の差を、ブランクに結合させた表面から得られた応答を差し引くことによって修正した。また、ブランク注入も差し引く（＝二重参照）。
【００９０】
ＳＴ２変異体が、ＳＴ２野生型と同等に調査した抗体に結合するならば、前記変異は、ＳＴ２への抗体の結合に影響を及ぼさず、それ故、結合部位は、突然変異させたＳＴ領域の外に位置すると結論付けられる。
【００９１】
ＳＴ変異体がＳＴ２変異体と同等に調査した抗体に結合しないならば、前記変異は、ＳＴ２への抗体の結合に影響を及ぼし、それ故、結合部位は突然変異させたＳＴ２領域内に位置すると結論付けられる。
【００９２】
抗体の結合特性を表３に示す。Ｒａ１７０の結合はＭｕｔ２およびＭｕｔ３によって影響を受け、このことは、その結合部位が突然変異させた配列ストレッチと重複していることを示す。Ｍａｂ５２３の結合はＭｕｔ２およびＭｕｔ３によって影響を受けるがＭｕｔ４によっても影響を受け、このことはより広い結合領域を示す。
【００９３】
【表３】
2014508520.tif 000004
【００９４】
【表４】
2014508520.tif 000005
【００９５】
実施例７
ＮＫ−アッセイ
ＩＬ３３は、種々の白血球およびまたＮＫ細胞を活性化することによって、ＴＨ１応答およびＴＨ２応答の両方を増幅する（Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030）。以下のアッセイにおいて、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌は、ＩＬ１２およびＩＬ３３の共培養によって誘導され、そしてその阻害は、抗ＩＬ３３Ｒ抗体の特徴付けの際の読み出し情報として役立った。
【００９６】
健康な血液からの白血球（リンパ球）の単離後に、ＮＫ細胞を、陰性ＮＫ細胞単離キット（Miltenyi、番号１３０−０９２−６５７）を使用してＰＢＭＣから精製した。平均純度は９６％超であった。
【００９７】
試薬
−  ヒトＩＬ−１２（Sigma、番号Ｉ２２７６、最終濃度［f.c.］＝１ng/ml）
−  ヒトＩＬ−３３（Peprotech、番号２００−３３、f.c.＝１０ng/ml）
−  ＩＦＮ−γＣＢＡ flexセット（BD、番号５５８２６９）
−  ＮＫ細胞培地：１０％ＦＣＳ（InvitrogenまたはPAA）、１％ピルビン酸ナトリウム（Gibco Invitrogen、番号１１３６０）およびＬ−グルタミン（Gibco Invitrogen、番号２５０３０−０２４）並びに０．１％β−メルカプトエタノール（Gibco Invitrogen、番号３１３５０−０１０）で補充された、ＲＰＭＩ １６４０（PAN、番号Ｐ０４−１７５００）。
【００９８】
１×１０５個のＮＫ細胞／ウェルを、場合により種々の濃度の試料またはアイソタイプ対照抗体で前処理された、９６ウェル平底プレートに播種し、そして３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ＮＫ細胞を１０ng/mlのＩＬ−３３および１ng/mlのＩＬ−１２を用いて刺激し、そして２０時間かけてインキュベーションした。この後、上清を収集し、遠心分離にかけ、そしてＩＦＮ−γの産生について試験した。ＩＦＮ−γの定量のために、ＣＢＡ flexセットプラットフォーム（BD（商標）、FACS Canto IIを使用して）を使用した。ＩＣ５０値は、ｒａ１７０については０．２７nMであり、ｒａ１７０ １０．１２については１．３nMであり、ｒａ１７０ １１．１２については１．８nMであり、ＰＡＢ ＡＦ５２３については２．３nMであり、Ｍａｂ５２３については阻害なしと決定された。
【００９９】
実施例８
好酸球生存率アッセイ
好酸球の生存期間の延長におけるＩＬ−３３の影響を記載するために、Chow, J.Y., et al., Cellular & Molecular Immunology 7 (2010) 26-34に基づいたアッセイを、新たに単離された好酸球を使用して確立した。ヒト好酸球の生存率はＩＬ−３３の添加に依存するので、種々の濃度の抗ヒトＩＬ−３３Ｒ［ＳＴ２］ｍＡｂとのプレインキュベーションはこの効果を阻害した。顆粒球を、Ficoll-Paque（商標）PLUS勾配遠心分離（GE Healthcare、番号１７−１４４０−０３）によって全血から単離した。赤血球の溶解後、沈降した赤血球／顆粒球ペレットを採取して、陰性好酸球細胞単離キット（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、番号１３０−０９２−０１０）を介して好酸球を精製した。
【０１００】
試薬
−  ヒトＩＬ−３３（２０ng/ml）
−  Cell Titer Glo（登録商標）、発光細胞生存率アッセイ（Promega、番号７５７１）
−  好酸球細胞培地：ＦＣＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよび０．１％β−メルカプトエタノールで補充されたＲＰＭＩ １６４０。
【０１０１】
１ウェルあたり１×１０５個の好酸球を９６ウェル平底プレートに移し、その後、試料抗体を含む培地を加え［５μg/mlの最終濃度］、そして３７℃で１時間かけてインキュベーションした。その後、ＩＬ３３を２０ng/mlの最終濃度で加え、そして好酸球を加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベーションした。４０時間後、好酸球の生存率を決定した。ｒａ１７０については１．３nMのＩＣ５０値が見られた。
【０１０２】
実施例９
初代肥満細胞アッセイ
肥満細胞は、自然免疫応答および獲得免疫応答の両方の増幅によるアレルギー反応の発生および維持において中心的である。肥満細胞は組織に局在しており、循環中血液には局在していない。従って、血液からヒト肥満細胞を得るために、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、５〜６週間の間にヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３およびＩＬ−６の存在下で肥満細胞へと分化させた。以下のプロトコールは、Saito, H., et al., Nature Protocols 1 (2006), 2178-2183による刊行物に基づく。
【０１０３】
白血球の単離後（実施例１０参照）、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、ＣＤ３４ MicroBeadキット（Miltenyi Biotec、番号１３０−０４６−７０２）を使用してＰＢＭＣから精製した。平均収量は、１つのドナーあたり合計で１〜２×１０５個の細胞であり；通常、５０％のＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞が得られた。
【０１０４】
試薬および分化プロトコール：
・  Methocult（登録商標）（Stem Cell Tech、番号Ｈ４２３６）
・  インシュリン−トランスフェリン−セレニウム補助剤（Invitrogen、番号５１３００−０４４）
・  ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン
・  ヒトＳＣＦ
・  ヒトＩＬ３およびＩＬ６
・  肥満細胞基礎培地（ｂＭＣ）；０．１％β−メルカプトエタノールおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）。
【０１０５】
精製後、１．５×１０５個の精製されたＣＤ３４＋細胞を、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦ、ＢＳＡ、Methocult（登録商標）およびインシュリン−トランスフェリンーセレニウム補助剤で補充されたｂＭＣ培地に再懸濁し、そして２４ウェルプレートの１０〜１２個のウェルに播種し、そして５〜６週間かけて培養した。
【０１０６】
機能的肥満細胞アッセイ
増殖相および分化相の後、肥満細胞を、抗ＩＬ−３３Ｒ抗体のアンタゴニスト影響を分析する機能的アッセイにおいて使用した。
【０１０７】
試薬および培地
・  ２０ng/mlのヒトＩＬ−３３
・  ヒトＩＬ−５
・  ヒトＩＬ−１３
・  肥満細胞基礎培地
【０１０８】
１ウェルあたり１０５個の肥満細胞を、平底９６ウェルプレートに播種した。まず、肥満細胞を、３７℃で１時間かけて試料またはアイソタイプ対照抗体で前処理した。ＩＣ５０の決定のために、抗体を種々の濃度で使用し、通常、５μg/mlの最終濃度で開始し、そして１：３の工程で希釈した。その後、２０ng/mlのＩＬ−３３を加え、そして細胞を３７℃で約４０から４８時間かけてインキュベーションし、その後、ＴＨ２サイトカインレベル（の阻害）を定量した。指定されたインキュベーション時間の後、細胞懸濁液をＶ底プレートに移し、そして沈降させた（４００×ｇ、室温で１０分間）。その後、上清を使用してサイトカインレベル（ＩＬ−５およびＩＬ−１３）を決定した。ｒａ１７０については０．４nM（ＩＬ−１３）および０．２（ＩＬ−５）までのＩＣ５０値が見られた。
【０１０９】
実施例１０
ヒトＴｈ２アッセイ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコールハイパック密度勾配によって健康ボランティアから単離した。細胞を、２mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて洗浄した後、細胞を、１回、０．５％ＢＳＡおよび２mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて洗浄した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec）および磁気分離を使用してＰＢＭＣから単離した。濃縮されたＴ細胞を、３回、完全ＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＣＳ、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、およびペニシリン／ストレプトマイシンで補充された）を使用して洗浄し、６ウェル平底プレートに０．５×１０６個の細胞/mlで、１：１比のDynabeadsＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Invitrogen）、１０ng/mlのＩＬ−２、１０ng/mlのＩＬ−４、５μg/mlの抗ＩＬ−１２（R&D System）および５μg/mlの抗ＩＦＮγ（R&D System）と共に再懸濁および蒔き、そして３７℃で４日間かけてインキュベーションした。細胞を分割し、その後、同じ培養条件でさらに４日間保持した。細胞を完全ＲＰＭＩを用いて２回洗浄し、その後、２ng/mlのＩＬ２を含む完全ＲＰＭＩ中で３日間１×１０６個の細胞/mlで休止させた。アッセイの１日前に、高結合の９６ウェル平底プレート（Costar）を、５μg/mlの可溶性抗ＣＤ３ｅ（BD Bioscience）を用いてコーティングした。アッセイ日に、細胞を２回完全ＲＰＭＩを用いて洗浄し、そしてＩＬ−２の非存在下でさらに４時間休止させた。プレートをＰＢＳを用いて３回洗浄した。１×１０５個の細胞/ウェルを、１μg/mlの抗ＣＤ２８（BD Bioscience）で補充された完全ＲＰＭＩ中に蒔いた。続いて、細胞を、抗ＳＴ２ Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂ（０〜１０μg/ml）の連続希釈液を用いて３０分間かけて処理し、その後、全容量２００μl中の１０ng/mlのＩＬ３３（Peprotech）を用いて再刺激し、その後、５％ＣＯ２下で３７℃で６４時間かけて培養した。上清を、ＩＬ−５／ＩＬ−１３ ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）のために収集した。ｒａ１７０についてのＩＣ５０値はＩＬ−５については２．７７±２．５８nM（平均±ＳＤ、ｎ＝６）、ＩＬ−１３については１．１０±１．０５（平均±ＳＤ、ｎ＝５）であると決定された。
【０１１０】
実施例１１
カニクイザルＮＫ細胞アッセイ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコールハイパック密度勾配によってカニクイザルから単離した。細胞を、２mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて洗浄した後、細胞を、１回、０．５％ＢＳＡおよび２mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて洗浄した。ＮＫ細胞は、非ヒト霊長類ＣＤ５６マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）による単球の除去後の非ヒト霊長類ＣＤ１６マイクロビーズによるポジティブセレクション、およびAutoMACS（商標）セパレータ−による磁気分離に従って、ＰＢＭＣから単離された。濃縮されたＮＫ細胞を、３回、完全ＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＣＳ、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、およびペニシリン／ストレプトマイシンで補充された）を使用して洗浄し、９６ウェル丸底プレートの完全ＲＰＭＩ中に２．５×１０４個の細胞／ウェルで再懸濁および蒔いた。続いて、細胞を３０分間かけて、抗ＳＴ２Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂ（０〜１０μg/ml）の連続希釈液を用いて処理し、全容量２００μl中の２０ng/mlのヒトＩＬ−３３と１０ng/mlの組換えカニクイザルＩＬ−１２を用いて再刺激し、その後、５％ＣＯ２下で３７℃で２４時間かけて培養した。上清をカニクイザルＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ（MabTech）のために収集した。ＩＣ５０値は、ｒａ１７０について０．１０９±０．０７３nM（平均±ＳＤ、ｎ＝３）であると決定された。
【０１１１】
実施例１２
好塩基球細胞株（ＫＵ８１２）アッセイ
ヒト好塩基球細胞株ＫＵ８１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ２０９９）を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。細胞を１週間に２回、細胞密度が５０万個の細胞/mlを超えないように分割した。品質の制御は、ｃ−ｋｉｔおよびＦｃｅＲＩの細胞表面発現のＦＡＣＳ分析によって慣用的に行なわれた。アッセイ日に、ＫＵ８１２細胞（２０万個の細胞/ウェル）を、新たな完全培地を含む９６ウェル丸底培養プレートに播種した。細胞を、３７℃で１時間かけて抗体または対照アイソタイプの連続希釈液を用いて処理した。処理後、細胞を、３７℃のインキュベーター中で一晩かけて１０ng/mlのＩＬ−３３（Peprotech）を用いて刺激した。細胞を遠心沈殿させ、そして上清をサイトカイン分析のために収集した。サイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ）を、ＭＳＤ製造手順に従って分析した。ｒａ１７０についての３回の独立した実験からのＩＣ５０値は、３．４９±３．４３nM（平均±ＳＤ、ＩＬ−１３）、１．４８±０．７５nM（平均±ＳＤ、ＩＬ−５）、および１．３１±１．２２nM（平均±ＳＤ、ＧＭ−ＣＳＦ）であると決定された。ｒａ１７０についてのＩＣ９０値は、７．５１±０．９９nM（平均±ＳＤ、ＩＬ−１３）、４．６０±１．６５nM（平均±ＳＤ、ＩＬ−５）、および９．１０±４．７４nM（平均±ＳＤ、ＧＭ−ＣＳＦ）であると決定された。
【配列表】
2014508520000001.app
【国際調査報告】
2014508520.tif 000006
2014508520.tif 000007
2014508520.tif 000008
2014508520.tif 000009