(57)【要約】  本発明は、エレクトロポレーションによって好酸性化学合成無機栄養細菌を操作する方法に関する。その方法は、細菌内で自己複製する能力をベクターに与えることができる無性複製起点を含む、ｐＡＦベクターと呼ばれる形質転換ベクターを用いて、細菌の自然の生理学的条件の変化を伴わずに、細菌系統を操作することができ、その方法は、限定されるものではないが、銅、金、ウラン、ニッケル、亜鉛、コバルトの硫酸化である、鉱石のバイオリーチングプロセスにおいて、本発明によって操作されたそのような細菌の使用を可能にすることができる。
2014505483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸性細菌の遺伝子操作方法であって、（１）コンピテントアシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞の獲得工程と、（２）アシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞に挿入された際に自己複製可能であるベクターの構築工程と、（３）エレクトロポレーション技術を用いて一時的なコンピテンス状態に事前に誘導されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞の形質転換工程とを包含することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記細菌の生理学的特性の変化を伴わないことを特徴とする、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項３】
（ａ）接種物増殖期の標準化工程と、（ｂ）細胞の濾過工程と、（ｃ）細菌細胞壁を透過性化または脆弱化して、エレクトロコンピテント細胞を得る工程とからなる、コンピテント細胞の獲得工程を特徴とする、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項４】
前記接種物増殖期の標準化が、接種物が培地中のＦｅ２＋の５０〜８０％の酸化を達成する時期であることを特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項５】
前記接種物増殖期の標準化が、培地中のＦｅ２＋酸化が６０〜７０％であることを特徴とする、請求項４に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項６】
０．４５μｍメンブレンで行われる濾過工程および生理食塩水での連続洗浄を行うこと特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項７】
生理食塩水が０．９質量／体積％のＮａＣｌ水溶液であり、ｐＨ範囲が５．８〜７．５であることを特徴とする、請求項６に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項８】
（ａ）細胞透過性化剤の溶液で事前に洗浄された細胞のインキュベーション工程と、（ｂ）洗浄バッファーを用いた細胞の連続洗浄工程と、（ｃ）エレクトロポレーションバッファー中への細胞の再懸濁工程とを包含する細胞壁透過性化工程を特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項９】
透過性化剤がグリシンであることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１０】
生理食塩水中のグリシン希釈液が約０．５〜３．０質量／体積％のグリシンを含んでなることを特徴とする、請求項９に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１１】
グリシン溶液がおよそ０．５〜３．０質量／体積％のグリシンを含んでなり、グリシンの最適濃度が１．０〜２．０質量／体積％であることを特徴とする、請求項１０に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１２】
透過性化剤との細胞のインキュベーションが２０〜３５℃の間の温度で１０分〜２時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１３】
透過性化剤との細胞のインキュベーションが２０分〜４０分間行われることを特徴とする、請求項１２に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１４】
洗浄バッファーが、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび５ｍＭのリン酸ナトリウムを含有するｐＨ５．８〜７．４の溶液からなることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１５】
エレクトロポレーションバッファーが、１ｍＭのスクロース、３ｍＭの塩化マグネシウムを含有するｐＨ５．８〜７．４の溶液からなることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１６】
（ａ）エレクトロコンピテント細胞と構築されたベクターとの混合工程と、（ｂ）電気パルスの適用工程（エレクトロポレーション）と、（ｃ）操作された細胞の選択工程とをさらに含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１７】
電気パルスが、キャパシタンス２５μＦ、抵抗２００Ω、電圧およそ１．０〜２．０ｋＶ、２．４〜５．０ミリ秒間、の条件で適用されることを特徴とする、請求項１６に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１８】
電気パルスが１．０〜１．５ｋＶの間の電圧に適用されることを特徴とする、請求項１７に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１９】
培養培地中のエレクトロポレーション処理された細胞の回復および操作された細胞のさらなる選択を特徴とする、請求項１６に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項２０】
構築方法が、（１）ｐＢＲ３２２ベクターをバックボーンとして使用する工程と、（２）市販のトランスポゾンから得られる無性複製起点（Ｏｒｉｖ）を含める工程と、（３）サブクローニングベクターへＯｒｉｖを挿入する工程と、（４）決定された制限部位からＯｒｉＶを取り出す工程と、（５）同じ制限部位でベクターｐＢＲ３２２へＯｒｉＶをクローニングし、ｐＢＲ３２２Ｏｒｉｖベクターを作製する工程と、（６）カナマイシン耐性遺伝子を挿入するためにｐＢＲ３２２ＯｒｉＶを消化する工程と、（７）目的のベクターを形成する工程とからなる、形質転換ベクター。
【請求項２１】
市販のトランスポゾンＥＺ−Ｔｎ５（商標）の使用を特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項２２】
市販のサブクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔの使用を特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項２３】
好酸性細菌への遺伝子内容物の転移プロセスに適用されることを特徴とする、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の形質転換ベクターの使用。
【請求項２４】
バイオリーチングプロセスに適用されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作された細菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の生理学的特性の変化を伴わずに、好酸性化学合成無機栄養細菌を遺伝子操作する方法に関するものであり、従って、新規遺伝子操作菌株はその自然の生息地で生存および増殖可能である。
【０００２】
本発明はまた、好酸性化学合成無機栄養細菌の細胞を処理する方法にも関し、その方法は、細菌細胞膜が外来性の遺伝物質の侵入に対して許容状態になるように、該膜を一時的に透過性とすることが可能である。加えて、本発明の目的は、好酸性化学合成無機栄養細菌の菌株に目的の遺伝物質を挿入方法、および好酸性化学合成無機栄養細菌細胞に挿入された際に自己複製可能であるベクターを構築する方法である。
【背景技術】
【０００３】
アシディチオバチルス(Acidithiobacillus)属の細菌は、好酸性で、独立栄養性かつ化学合成無機栄養性である、つまり、これらの細菌は０〜４の酸性ｐＨ条件で生存し、それらの炭素源はＣＯ２であり、それらのエネルギー源は無機化合物である。この属のうち、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)およびアシディチオバチルス・チオオキシダンス(Acidithiobacillus thiooxidans)の２種類は重要であり、バイオマイニングに一般的に用いられている。
【０００４】
アシディチオバチルス・フェロオキシダンス種は、最適増殖がおよそ３０℃およびｐＨおよそ２．０であるグラム陰性の非病原性細菌であり、バイオリーチングプロセス研究の標準微生物として使用されている(Holmes et al., 2008、BMC Genomics 9:597)。
【０００５】
上述の通り、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスは、細菌による金属浸出、すなわち、バイオリーチングとして知られているプロセスに最も使用されている微生物の１つである。バイオリーチングプロセスの間に、微生物の代謝によって、組成中に還元型硫黄および還元型鉄を含む鉱石の可溶化が起こる。この可溶化は、直接的には酵素の作用によって、または間接的には細菌代謝によるＨ２ＳＯ４およびＦｅ３＋の産生によって起こり得る。
【０００６】
バイオリーチングは、冶金鉱業における確立された技術であり、難処理金鉱石の処理への応用と、わずかな鉱石や尾鉱中の銅の回収への応用に成功している。バイオリーチングは、微生物の直接的または間接的作用を用いて、複合基質の金属を酸性媒質へ可溶化する方法と定義される(Rawlings 2005, Microb. Cell. Fact. 4(1): 13)。微生物が金属にまたはその対イオンに作用する場合、バイオリーチングは直接的であり、どちらの場合も目的の金属のイオンがその溶液中に放出される。一方、微生物が金属の可溶化を加速し促進する化学的条件をもたらす場合、バイオリーチングは間接的である。
【０００７】
バイオリーチングは、銅の世界生産量のおよそ１０％を占め、低含有量の鉱石からの金属の回収に特に重要であり、それは、乾式冶金のような標準的なプロセスによる採取が経済的に実行不可能であると思われるためである。それに従って、低含有量の鉱石からの金属の回収へのバイオリーチングの適用は、高電力消費を必要とせず、乾式冶金と比べて、低汚染の戦略であると考えられることから、経済的かつ環境的に実行可能な代案であると示された(Jonhson & Rawlings, 2007, Microbiology 153: 315-24)。
【０００８】
アシディチオバチルス属の種はバイオリーチングプロセスに使用されており、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス種は、酸素を電子の受容体として使用して、Ｆｅ２＋のＦｅ３＋への酸化に有利に働く。生成されたＦｅ３＋は、より高い酸化能を有する作用因子であり、硫化物および酸化に必要な任意の化合物を酸化することができる。バイオリーチングプロセスにおいてアシディチオバチルス・フェロオキシダンスを大量使用するにもかかわらず、塩化物イオン、ならびにＡｓ３＋、Ｈｇ２＋およびＡｇ＋のような重金属に対する感受性と関連してその増殖が遅いことからこの技術の適用拡大が制限されている。
【０００９】
バイオリーチングプロセスでのアシディチオバチルス・フェロオキシダンスの重要性を考えると、この機構を遺伝子操作し得ることは極めて重要になる。細菌細胞を形質転換する有効な方法を使用することにより、酸化活性を向上させ、毒性化合物に対する耐性を高め、増殖を加速させ、目的の特性を組み込むことができる。
【００１０】
アシディチオバチルス種の遺伝子操作は非常に複雑であることが示されている。しかしながら、バイオリーチングプロセスにおけるアシディチオバチルス・フェロオキシダンスの関連性から、この種の遺伝子操作、その増殖条件および酸化条件の改善、ならびに毒性化合物に対する耐性のような、興味深い特性の組み込みを可能にする方法の標準化は極めて重要である。
【００１１】
アシディチオバチルス・フェロオキシダンスの分子遺伝学についての基本情報は長年収集されている。異なるアプローチ、例えば、好酸性菌株と大腸菌(E. coli)を接合させるためのシステムの使用などを用い、主としてエレクトロポレーション技術を用いて、アシディチオバチルス種への遺伝物質の転移を促進する試みについての記載はいくつかある。
【００１２】
アシディチオバチルス細菌の培養は複雑であり、それは、これらの細菌を極酸性ｐＨ条件下で維持しなければならないためである。この特徴からこれらの微生物の操作方法は困難になる。
【００１３】
アシディチオバチルス・フェロオキシダンスについて、およびバイオリーチングプロセスにおいて使用される他の好酸性化学合成無機栄養微生物、例えば、アシディチオバチルス・チオオキシダンス、アシディチオバチルス・カルダス(Acidithiobacillus caldus)、アシディチオバチルス・プロスペルス(Acidithiobacillus prosperus)、レプトスピリルム・フェロオキシダンス(Leptospirillum ferrooxidans)、スルフォバチルス・サーモスルフィドオキシダンス(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)、スルフォロブス・メタリクス(Sulfolobus metallicus)、スルフォロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)、アシディアヌス・ブリーエリイ(Acidianus brierleyi)およびアシディアヌス・インフェルヌス(Acidianus infernus)などについての再現性のある遺伝子操作方法の標準化は困難であったし、また、それほど見込みがあるものではない場合もある。
【００１４】
Roberto and Bruhn (Roberto and Bruhn; 1992, Geomicrobiology Journal (10(3-4), 249-55)は、好酸性細菌の操作ではエレクトロポレーションの使用が制限され、接合技術がより適切であると思われると記載している。
【００１５】
Kusanoら(Kusano et al., 1992, J Bacteriol. 174: 6617-6623)は、水銀耐性遺伝子（オペロン  ｍｅｒ）を担持するベクターとして、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス３０菌株のエレクトロポレーションを記載している。これらの菌株のうち操作されたのは１菌株だけであり、その技術の再現性は非常に低く、これらの著者らが記載した方法を再現できたグループはない。
【００１６】
１９９５年に、Englishら(English et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61: 3256-3260)は、チオバチルス・ネアポリタヌス(Thiobacillus neapolitanus)と、チオバチルス・インターメディウス(Thiobacillus intermedius)のカルボキシソームレプリコンを担持するベクターを用いた電気的形質転換試験を記載した。エレクトロポレーション結果は良かったにもかかわらず、著者らはタンパク質発現を示すことができなかった。このことによって、そのベクターに機能性がないことが示された。
【００１７】
好酸性化学合成無機栄養微生物の遺伝因子の操作および／または同定に関心を示した、バイオリーチングにおけるこれらの微生物の活性を向上させる意図での研究も確認されている(Bruscella et al; 2007, Microbiology 153 (1): 102-10; Farah et al; 2005, Appl. and Environ. Microbiol. 71(11): 7033-7040)。
【００１８】
接合システムに基づく研究によって、大腸菌(Escherichia coli)とアシディチオバチルス種の菌株との間での遺伝的転移に関して４つの発表がなされた(Yankofsky et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 652-657; Jin et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58: 429-430; Liu et al., 2000, J. Bacteriol. 182: 2269-2276およびvan Zyl et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74: 5686-5694)。しかし、アシディチオバチルス・カルダス菌株からのヌル変異体の生成が効率的に可能な技術であることを示したのはvan Zylらの研究だけであり、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス系統ではこの種のアプローチはまだ記載されていない。
【００１９】
最近になって、米国特許出願第２００９／００３５８６４号に、細菌増殖条件の変更に基づくアシディチオバチルス種の操作方法が記載された。このグループは、ｐＨ条件５〜７の範囲内に合わせられたアシディチオバチルス種の培養物は、任意の公知の方法によって、特に、エレクトロポレーションによって操作しやすいことを報告している。しかしながら、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスの最適増殖ｐＨが１．５〜２．５の範囲内であることを考慮すると、この生物の高ｐＨ（ｐＨ５〜７の範囲内）への適合は細菌の生理機能の激しい変化となる。変更された生理学的条件下で操作されたいずれの菌株も代謝が特定の条件に合わせられた状態になるため、この新規微生物は自然条件下で増殖する能力を失うことがある。Suzuki (Suzuki, 2001, Biotechnology Advances 19: 119-132)によれば、鉱石のバイオリーチング／生物酸化のプロセスで作用する微生物には、拡大された温度（３０〜７０℃）範囲、酸性ｐＨ範囲（１．８〜２．２）およびＦｅ２＋イオンに対するＦｅ３＋イオンの高割合の下での作用の実現性など、良好な性能を有するように特有の特性が必要である。よって、土着細菌は、気候条件、鉱物学的特徴、および処理対象の鉱石の化学組成にすでに適応しており、コレクション菌株に比べていくつかの利点を有する。
【００２０】
要約すれば、今日まで、生理学的特性の変化を伴わずに、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞を操作することが可能な、公知で再現性のある方法は存在していない。バイオリーチングプロセスにおいて使用される他の好酸性化学合成無機栄養微生物についても同じことが言え、そのため、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス細菌に限定されない。
【００２１】
加えて、この領域について発表された論文はほとんどなく、それらの大部分は結論に達しないかまたは再現性のない結果を示しており、それは、これらの微生物の遺伝学的取扱いが難しいためである。増殖が遅く、細胞数が少ないことに加え、固体培地でのそのような微生物の培養は難しく、そのため、いくつかの試験の遂行は実現不可能とされた。
【００２２】
それゆえに、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスがバイオリーチングプロセスにおいて最も一般的に使用される微生物であることから、自然の生理機能の変化を伴わない、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスについての遺伝子操作方法の開発は、バイオリーチング分野で最も重要である。バイオリーチングの改善のために操作されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞を得ることを目的とし、細菌内で自己複製可能である機能性ベクターを使用することによって、自然種の生理機能の変化を伴わずにアシディチオバチルス・フェロオキシダンス許容系統を操作する方法を開発した。
【発明の概要】
【００２３】
本発明は、自然の細菌の生理学的特性の変化を伴わずに、好酸性化学合成無機栄養細菌を操作する方法に関するものであり、従って、新規操作菌株はその自然の生息地で生存および増殖可能であり得る。
【００２４】
本発明によれば、前記操作方法は、（ａ）細胞膜の透過性を変えることによる、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスコンピテント細胞の獲得工程と、（ｂ）アシディチオバチルス・フェロオキシダンスに挿入された際に自己複製可能であるベクターの構築工程と、（ｃ）エレクトロポレーション技術を用いて一時的なコンピテンス状態に事前に誘導された、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞の形質転換工程とからなる。
【００２５】
本発明の第２の特徴は、自己複製ベクター、すなわち、該ベクターを機能し得るものにするＤＮＡ配列を含むベクターの構築に関する。
【００２６】
加えて、本発明はまた、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞の処理方法も含み、その方法は、該細菌細胞の細胞膜が許容状態になり、外来性の遺伝物質、例えば、ベクターの侵入を可能にするように、細胞膜を一時的に透過性とすることが可能である。
【００２７】
本発明の別の態様は、複製起点が前記ベクターに挿入されるという重要性からなる。この起点は、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞内でのプラスミドの複製を可能にするはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はｐＡＦベクターの図を示し、アシディチオバチルス種内で該ベクターを機能し得るものにする必須特性を強調表示している。ＯｒｉＥ‐大腸菌内でのプラスミドの複製を可能にするものであり、サブクローニングに必要である；Ｔｃ‐テトラサイクリン耐性遺伝子；Ｋａｎ‐カナマイシン耐性遺伝子；ＯｒｉＶ‐アシディチオバチルス種内でのプラスミドの複製を可能にするものである。
【図２】図２は、ｒＬＲｐＡＦからのｐＡＦベクターの回収についての１％アガロースゲルを示す：（１）分子量マーカー１ｋｇ  ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））；（２）ｒＬＲｐＡＦからの単離プラスミドＤＮＡ；（３）アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ非組換え体の培養物からのＤＮＡ；および（４）１μｇのｐＡＦ由来ＤＮＡ（陽性対照）。
【図３】図３はｒＬＲｐＡＦからのＯｒｉＶの増幅を示す：（１）分子量マーカー１００ｐｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））；（２）アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲの培養物からのＰＣＲ；（３）ｒＬＲｐＡＦの培養物からのＰＣＲ；（４）ｐＡＦ  ＤＮＡの培養物からのＰＣＲ；（５）サンプルなしでのＰＣＲ（陰性対照）および（６）分子量マーカー１００ｐｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））。
【図４】図４は操作（ｒＬＲｐＡＦ）および非操作アシディチオバチルス・フェロオキシダンスのＦｅ２＋酸化曲線のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、好酸性化学合成無機栄養細菌、すなわち、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ系統の操作方法に関する。このような操作方法では、操作細胞内での自己複製能をベクターに付与する無性（vegetative）複製起点を含むことを特徴とするベクターを使用する。
【００３０】
注目すべきことに、本発明は、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ系統に限定されず、アシディチオバチルス細菌にも限定されない。本発明はまた、他の好酸性化学合成無機栄養微生物、熱耐性があるかどうかに関係なく、例えば、限定されるものではないが、アシディチオバチルス・チオオキシダンス、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・プロスペルス、レプトスピリルム・フェロオキシダンス、スルフォバチルス・サーモスルフィドオキシダンス、スルフォロブス・メタリクス、スルフォロブス・アシドカルダリウス、アシディアヌス・ブリーエリイおよびアシディアヌス・インフェルヌスなどの操作にも使用し得る。
【００３１】
細菌の操作とは、目的の遺伝物質を導入するために、プラスミドＤＮＡ（ベクター）が一時的に透過性の細菌細胞に導入されるプロセスである。
【００３２】
本発明によれば、細菌の操作方法は、操作された菌株がその自然環境で生存および増殖可能であり得るように、細菌の自然の生理学的特性の変化を伴わずに行われる。
【００３３】
本発明によれば、前記操作方法は、（ａ）細胞膜の透過性を変えることによる、好酸性化学合成無機栄養細菌のコンピテント細胞の獲得工程と、（ｂ）好酸性化学合成無機栄養細菌の細胞に挿入された際に自己複製可能であるベクターの構築工程と、（ｃ）エレクトロポレーション技術を用いて一時的なコンピテンス状態に事前に誘導された、好酸性化学合成無機栄養細菌細胞の形質転換工程とからなる。
【００３４】
本発明によれば、「コンピテント細胞」という用語は、外来性の物質の侵入に対して許容状態である細胞を包含する。
【００３５】
本発明によれば、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、ならびに他の好酸性化学合成無機栄養微生物の操作方法について成功した必要条件の１つは、細菌細胞内で自己複製可能なベクターの開発である。
【００３６】
機能性ベクターを得るために、いくつかの特徴が探求された。広宿主域プラスミドであることが知られているいくつかのプラスミドは、数種の細菌内で自己複製可能であり、無差別(promiscuous)プラスミドとして知られている。広宿主域プラスミド、特に、グラム陰性菌の不和合群に関するもの（ＩｎｃＱプラスミドおよびＩｎｃＰプラスミド）は、最も研究されたものであり、自然のプラスミドをもたないかまたはまだ記載されたプラスミドがない細菌の系統に対する宿主−ベクター系の開発に適した特徴を示す。
【００３７】
本発明によれば、共通の重要なベクター特性は、無性複製起点（ＯｒｉＶ）と呼ばれるＤＮＡ配列、つまり、数種類のグラム陰性菌に挿入される物質への自己複製能の付与に関与する配列が存在することである。
【００３８】
Rawlingsら(Rawlings et al., 1989, J. Bacteriol. 171; 2735-2739)によって、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスの広宿主域プラスミド（ｐＴＦ−ＦＣ２）から複製領域が単離された。この領域は大腸菌のＩｎｃＱプラスミドのＯｒｉＶとよく似ている。アシディチオバチルス・フェロオキシダンス由来のこのＤＮＡ配列のクローニングにより、ベクターは大腸菌のＧＷ１２５ａ系統（ＤＮＡポリメラーゼ欠損系統）で複製可能になり、類似配列を含むプラスミドは、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスを含むグラム陰性の細菌系統内で自己複製可能であろうことが示唆される。
【００３９】
本発明において、市販のトランスポゾン（ＥＺ−Ｔｎ５（商標））から増幅された２００ｐｂ  ＯｒｉＶは、Rawlingsらにより記載されたＰＴＦ−ＦＣ２プラスミドに見られる配列(Rawlings et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 2735:2739)に対して４４．０５％の類似性を示し、大腸菌由来のＩｎｃＰプラスミドおよび無差別プラスミドＲ１８、Ｒ６８、ＲＫ２、ＲＰ１およびＲＰ４(Peng et al., 1994, J. Bacteriol. 176:2892-2897)に対して１００％の類似性を示すことを記載しておく。従って、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾンから取り込まれるこのＯｒｉＶの挿入により、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス内で複製する可能性が非常に高いベクターの構築は可能になる。従って、図２および図３で分かるように、ｐＡＦベクターはアシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞で複製可能であったことから、本発明で使用されるアプローチは有効であることが示された。また、操作対象の系統が自然のプラスミドをもたない場合には、市販の無差別複製起点により、アシディチオバチルスおよび他の好酸性化学合成無機栄養微生物の系統を遺伝子操作するためのベクターの構築が可能になる。
【００４０】
機能性ベクターの構築にはいくつかの基本エレメントを包含することが必要である：（１）大腸菌系統でのサブクローニングの遂行を可能にする、大腸菌由来の複製起点（Ｏｒｉ  Ｅ）；（２）適当なプロモーター、好ましくは、ｌａｃ  Ｐ（β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子のプロモーター）；（３）操作された細胞の選択を促進するための、抗生物質耐性遺伝子、好ましくは、アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリン；（４）目的の遺伝子または断片の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）；最後に、（５）例えば、β−ガラクトシダーゼのような酵素をコードするリポーター遺伝子、または二次マーカーとしての緑色蛍光タンパク質。
【００４１】
本発明によれば、前記ベクターは、例１に記載の通り、分子生物学技術を用いて構築された(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual)。
【００４２】
ベクターが構築されたら、次の工程は、本発明によれば、例として用いられたアシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ系統の操作工程からなる。
【００４３】
アシディチオバチルス属由来の種およびバイオリーチングプロセスにおいて使用される、他の好酸性化学合成無機栄養細菌の遺伝子操作は特に困難であった。困難であることの一因となる大きな問題の１つは、該細菌が培養される培養基である。該培養基が極低ｐＨ範囲に調整された無機塩混合物であるということによって、これらの微生物の遺伝学的取扱いに必要である工程が妨げられる。遺伝子操作によって該細菌の生理機能が変化を受けず、その結果として、それらの増殖および生理学的再適応ならびにプラスミドＤＮＡの安定性のような問題が回避されるように、遺伝子操作が行われることが最善である。
【００４４】
よって、現在の問題を解決するために、本発明は、エレクトロポレーションによって、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスのような好酸性化学合成無機栄養細菌の操作を可能にする遺伝子操作方法に関し、該操作方法に従えば、該細菌の培養物は自然の生息地と同じ条件、つまり、同じｐＨ条件および温度条件で維持され、それゆえに、該細菌の自然の生理学的状態は変化を受けない。
【００４５】
前記遺伝子操作方法は、６つの重要な工程：（１）前記細菌の細胞膜透過性化を起きやすくするための、接種物増殖期の標準化工程；（２）コンピテント細胞の獲得をもたらす、細菌細胞壁の透過性化または脆弱化工程；（３）電気パルスの適用工程；（４）適当なベクターを使用した、目的の遺伝子を有するプラスミドＤＮＡの組込み工程；（５）接種および回復工程；ならびに（６）操作された細胞の選択工程からなる。
【００４６】
本発明によれば、最適増殖期は、細胞培養が培地中のＦｅ２＋の５０〜８０％の範囲、好ましくは、６０〜７０％の間の酸化を達成する時期であり、この範囲内の細胞は以下のプロセス工程に対してより許容しやすい状態であることが示された。
【００４７】
培養細胞が最適増殖期に達したら、細胞を生理食塩水で洗浄し、次の工程で使用する試薬およびＤＮＡの安定性の維持に適当なｐＨ条件の溶液にそれらの細胞を順応させる。このような培養基の変更は極めて重要であり、それによって、操作工程に使用されるベクターと選択工程に使用される抗生物質は培地の低ｐＨ条件による変性または分解を受けない。生理食塩水での洗浄に続いて、培養細胞を細胞透過性化剤とともにインキュベートし、好酸性化学合成無機栄養細菌のエレクトロコンピテント細胞が生成される。最も一般的なエレクトロポレーション法では、細胞透過性化剤としてグリセロールまたはグリシンが使用される。しかしながら、試験中に、グリセロールはアシディチオバチルス・フェロオキシダンス細胞に対して毒性があり、低濃度（０．５％）でも細胞崩壊を促すことが分かった。しかし、０．５〜３．０質量／体積％のグリシン、好ましくは、１．０〜２．０質量／体積％、最適濃度１．０〜１．５質量／体積％のグリシンを含有する溶液中での細胞のインキュベーションは、細胞壁の透過性化に有効であることが示され、細胞崩壊も引き起こさず、ＤＮＡの組込みに対して許容状態のエレクトロコンピテント細胞が生成された。
【００４８】
次のプロセス工程では、１〜５μｇのＤＮＡ（ベクターｐＡＦ）とともに、エレクトロコンピテント細胞のインキュベーションを行い（グリシンで事前に処理された、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ細胞）、それに続いて、細胞膜への一時的な孔の形成促進を担う装置BioRad社製Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｐｕｌｓｅｒから発生されるパルスの適用を行う。数回の試みの結果として決定された最適条件下で電気パルス中に一時的な孔が開けられ、これらの一時的な孔を通ってベクターは細胞に侵入する。本発明によれば、最適電気パルス条件は：キャパシタンス２５μＦ；抵抗２００Ω；電圧１．０〜２．０ｋＶの間（好ましい最適電圧は１．０〜１．５ｋＶである）；パルス幅２〜５ミリ秒である。
【００４９】
電気パルス後に細胞膜を回復させ、安定させることを目的とし、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスの細胞を、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを添加した、ｐＨ１．５〜２．５の範囲内、好ましくは、ｐＨ１．８の、Ｔ＆Ｋなどの適当な培養培地中で１時間インキュベートした。この工程により、エレクトロポレーション処理された細胞は最適培養培地中で回復され、それらの自然の生理学的条件を取り戻す。
【００５０】
Tuovinen & Kelly (1973)によって開発されたＴ＆Ｋ培養培地を若干の変更を加えて使用した。この培地はアシディチオバチルス・フェロオキシダンス種に特有の培養培地の１つである。Ｔ＆Ｋ培地は、２種の溶液、それぞれ、ＡおよびＢの４：１比での混合物により形成される。溶液Ａは、０．４ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４からなり、溶液Ｂは、３３．４ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏのみからなる。
【００５１】
安定させた後、操作された細胞に選択工程を行った。この工程の目的は、組み込まれたプラスミドＤＮＡを維持した細胞、つまり、操作された（組換え）細胞の選択である。選択は選択剤の存在下で行われ、特にこの場合には、選択剤は抗生物質であり、操作された細胞はこの抗生物質に対して耐性がある。本発明の場合、操作された細胞は、抗生物質であるカナマイシンに対して耐性がある。
【００５２】
回復期間の後、接種物を再度生理食塩水で数回洗浄し、抗生物質処理に適した培養基中で細胞の平衡を保たせるが、それは、公知の抗生物質の大部分が４．０より低いｐＨ範囲で分解されるためである。その後、細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する生理食塩水中で少なくとも２時間、かつ、８時間以内の期間で（好ましいインキュベーション期間は４時間である）インキュベートした。４時間の好ましいインキュベーション期間は、事前に標準化されたものであり、この選択に対して生存する総ての細胞がカナマイシン耐性遺伝子を含むこと、つまり、それらの細胞が、ｐＡＦベクターが組み込まれた組換え／操作細胞である（それゆえに、ｒＬＲｐＡＦ細胞とされた）ことを保証するものである。選択剤がカナマイシンに限定されないことに留意することが重要である。
【００５３】
選択後、ｐＡＦベクターの存在を確認する実験に必要な細胞塊を得るために、ｒＬＲｐＡＦ細胞を、培養培地、具体的に言えば、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏが添加された、ｐＨ１．５から２．５まで、好ましくは、ｐＨ１．８のＴ＆Ｋ培地に接種する。所望により、組換え／形質転換細胞は、ｐＨ１．５〜２．５の間、好ましくは、ｐＨ１．８の固体Ｔ＆Ｋ培地にプレーティングし、３０℃で１０〜２０日間維持してもよく、発生するコロニーはｒＬＲｐＡＦ細胞に相当する。
【００５４】
本発明において行われる手順の例を下に記載するが、それらは本発明の限定としてではなく、むしろ例示として考えるべきである。実験系統としてアシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ系統が使用されたこと、提案する方法はこの系統だけの形質転換に限定されず、任意の好酸性化学合成無機栄養微生物系統、熱耐性があるかどうかに関係なく、例えば、限定されるものではないが：アシディチオバチルス・チオオキシダンス、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・プロスペルス、レプトスピリルム・フェロオキシダンス、スルフォバチルス・サーモスルフィドオキシダンス、スルフォロブス・メタリクス、スルフォロブス・アシドカルダリウス、アシディアヌス・ブリエリエイ(Acidianus brierieyi)およびアシディアヌス・インフェムス(Acidianus infemus)などにも適用し得ることを強調しておく。
【００５５】
本発明の説明で記述された総ての単位は国際単位系に準拠したものであることも強調しておく。
【実施例】
【００５６】
例１：ｐＡＦベクターの構築
市販のｐＢＲ３２２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を、ｐＡＦベクターの構築のための骨格として使用した。無性複製起点（ＯｒｉＶ）を、市販のトランスポゾン（ＥＺ−Ｔｎ５（商標））によって事前に増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔサブクローニングベクターへ挿入した。続いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＯｒｉＶからＣｌａ  Ｉ制限部位およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位でＯｒｉＶ断片を取り出し、この断片をｐＢＲ３２２の同じ制限部位にクローニングした。Ｎｏｖａｇｅｎ社が販売しているｐＥＴ２８ａベクターからカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）を取り出し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位とＳａｌ  Ｉ制限部位との間のＭＣＳ部位（多重クローニング部位）にサブクローニングした。次いで、カナマイシン耐性遺伝子の挿入のために、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ酵素およびＳａｌ  Ｉ酵素でｐＢＲ３２２ＯｒｉＶを消化し、ｐＢＲ３２２ＯｒｉＶ−Ｋａｎベクターを作製した。この構築によって得られたベクターをｐＡＦと呼び、このベクターはおよそ６３０１ｐｂを示し、そのマップを図１に示している。
【００５７】
この例を裏付けるために、大腸菌ＤＨ５ａ系統を、ＣａＣｌ２法を用いて、ｐＡＦベクターで形質転換した。５０ｐｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する固体ＬＢ培養培地中で形質転換コロニーを選択した。細菌増殖および維持に広く用いられるＬＢ培地は、１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム、固体培養培地の場合には１５ｇ／ｌの寒天からなる。
【００５８】
ミニプレップによる次のプラスミド抽出のために、５０μｇ／ｌのカナマイシンを含有する液体培地にカナマイシン耐性コロニーを接種した。その後、ＰＣＲ技術を用いて、プラスミドの異なる領域（ＯｒｉＶおよびカナマイシン遺伝子）の増幅を行った。結果から、単離プラスミドが本発明に従って構築されたｐＡＦベクターであることが確認された。
【００５９】
例２：コンピテントアシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ細胞の獲得
アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ細胞を、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（３３．４ｇ／ｌ）を添加した液体Ｔ＆Ｋ培地（Ｋ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４ｇ／ｌ）、ｐＨ１．８（硫酸で調整）中で増殖させ、３０℃で（２５０ｒｐｍで撹拌）１８時間インキュベートした。培養物が培地中のＦｅ２＋の５０％〜８０％の酸化を達成した（重クロム酸カリウム−Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７で滴定）時点で細胞増殖を中断した。
【００６０】
０．４５μｍの膜濾過での濾過により細胞を集め、生理食塩水（ＮａＣｌ  ０．９質量／体積％、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水使用、ｐＨ５．８〜７．４）で数回洗浄した。アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲのエレクトロコンピテント細胞を得るために、５００ｍＬ培養物のバイオマスを、グリシン１〜２質量／体積％を含有する（グリシンの最適濃度は１〜１．５質量／体積％である）生理食塩水１ｍＬ中で、３０℃、撹拌（２５０ｒｐｍ）下で３０分間インキュベートした。次に、それらの細胞を集め、氷中で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、それらの細胞を洗浄バッファー（リン酸ナトリウム５ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、ｐＨ５．８〜７．４）で２回洗浄し、最後に、２００μｌのエレクトロポレーションバッファー（１Ｍのスクロース、３ｍＭの塩化マグネシウム、ｐｈ５．８〜７．４）中に再懸濁した。
【００６１】
例３：アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲの電気的形質転換
エレクトロコンピテントアシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲ細胞は、例２に記載の通りに得た。各４５μｌのエレクトロコンピテント細胞に対し、１μｇのプラスミドＤＮＡを加えた（本発明により構築されたｐＡＦベクター）。この混合物を０．２ｍｍキュベットに入れてエレクトロポレーションに付し、キュベットはパルス放出まで氷中で保存した。エレクトロポレーション条件は、１．０〜２．０ｋＶ、２００Ω、２．４〜５ミリ秒間であった。その直後に、それらの細胞を、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを添加したＴ＆Ｋ培地（ｐｈ１．８）１ｍＬ中で回復させ、３０℃、撹拌（２５０ｒｐｍ）下で１時間インキュベートした。抗生物質耐性をコードする遺伝子の発現を誘導することを目的として、回復させた細胞を集め、生理食塩水で２回洗浄し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する生理食塩水２ｍＬ中に（３０℃、２５０ｒｐｍ撹拌下で）４時間接種した。そのような選択後に、細胞を集め、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを含有するＴ＆Ｋ培地（ｐＨ１．８）１０ｍＬ中に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍ撹拌下でインキュベートした。
【００６２】
ｐＡＦベクターを含むアシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲの電気的形質転換（組換え）細胞をｒＬＲｐＡＦと名付けた。注目すべきは、ＬＲ系統組換え細胞はｐＨ１．８のＴ＆Ｋ培地中で培養可能であるということであり、本発明の方法は、該細菌の生理学的状態の変化を伴わずに該細菌を操作するのに適していることを意味する。
【００６３】
例４：ｒＬＲｐＡＦ培養物からのｐＡＦベクターの回収
プラスミドＤＮＡの抽出に十分な細胞を得ることを目的として、カナマイシンを用いて４時間選択した、ｐＡＦベクターを含む操作されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス細菌細胞を、培養物が培地中のＦｅ２＋の９０％の酸化を達成するまで、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを添加したＴ＆Ｋ培地（ｐＨ１．８）５００ｍｌに接種した。
【００６４】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）社製Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡを単離し、１％アガロースゲル電気泳動に付した。図２は、１ｋｂ  ｐｌｕｓ分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、ｒＬＲｐＡＦから単離されたプラスミドＤＮＡ、アシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲの一培養物から単離されたプラスミドＤＮＡおよびｐＡＦベクターのＤＮＡ  １μｇ（陽性対照）を含む１％アガロースゲルの写真を示している。バンドの存在（矢印で示す）によって、組換えＬＲ系統がｐＡＦベクター中に存在するプラスミドＤＮＡを有することが示される。
【００６５】
ｒＬＲｐＡＦ中にｐＡＦベクターが存在することを検証するための代替手段は、プラスミドＯｒｉＶを含む領域についてのＰＣＲ手法であった。増幅断片の推定サイズはおよそ３５０ｐｂであった。ＰＣＲ反応は、ｒＬＲｐＡＦおよびＬＲの培養物から得られた細胞塊で行われた。ＰＣＲ陽性対照としてｐＡＦベクターＤＮＡの増幅を行い、陰性対照としてブランク反応を実施した。図３に結果を示し、その図によりｒＬＲｐＡＦ  ＯｒｉＶの増幅が分かる。
【００６６】
例５：操作および非操作アシディチオバチルス・フェロオキシダンスによるＦｅ２＋酸化曲線
ｐＡＦベクターを含む操作されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンスＬＲと、操作されていない該細菌とによるＦｅ２＋の酸化を比較することを目的として、操作細菌と非操作細菌の両方を、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを添加したＴ＆Ｋ培地（ｐＨ１．８）に接種し、３０℃、撹拌（２５０ｒｐｍ）下でインキュベートした。図４に示されるように、ｒＬＲｐＡＦは、非操作系統と比べてＦｅ２＋酸化の遅延を示し、これは、該細菌が操作プロセスからの回復に時間がかかるためである。このアッセイにより、操作された系統はＦｅ２＋を酸化可能であることが示される。
【図１】
2014505483.tif 000003
【図２】
2014505483.tif 000004
【図３】
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【図４】
2014505483.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月10日(2013.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸性細菌の遺伝子操作方法であって、（１）コンピテント好酸性化学合成無機栄養細胞の獲得工程と、（２）好酸性化学合成無機栄養細胞に挿入された際に自己複製可能であるベクターの構築工程と、（３）エレクトロポレーション技術を用いて一時的なコンピテンス状態に事前に誘導された好酸性化学合成無機栄養細胞の形質転換工程とを包含することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記細菌の生理学的特性の変化を伴わないことを特徴とする、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項３】
（ａ）接種物増殖期の標準化工程と、（ｂ）細胞の濾過工程と、（ｃ）細菌細胞壁を透過性化または脆弱化して、エレクトロコンピテント細胞を得る工程とからなる、コンピテント細胞の獲得を特徴とする、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項４】
最適増殖期が、細胞培養が培地中のＦｅ２＋の５０〜８０％の酸化を達成する時期であることを特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項５】
前記接種物増殖期の標準化が、培地中のＦｅ２＋酸化が６０〜７０％であることを特徴とする、請求項４に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項６】
前記濾過工程が０．４５μｍメンブレンで行われ、連続洗浄が生理食塩水で行われること特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項７】
前記生理食塩水が０．９質量／体積％のＮａＣｌ水溶液であり、ｐＨ範囲が５．８〜７．５であることを特徴とする、請求項６に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項８】
前記細胞壁透過性化工程が、（ａ）細胞壁の透過性化に効果的な化学物質を含む溶液で事前に洗浄された細胞のインキュベーション工程と、（ｂ）洗浄バッファーを用いた細胞の連続洗浄工程と、（ｃ）エレクトロポレーションバッファー中への細胞の再懸濁工程とを包含することを特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項９】
前記透過性化剤がグリシンであることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１０】
生理食塩水中に希釈されたグリシンが、約０．５〜３．０質量／体積％のグリシンを含んでなることを特徴とする、請求項９に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１１】
グリシン溶液が、１．０〜２．０質量／体積％のグリシンを含む最適濃度であることを特徴とする、請求項１０に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１２】
前記透過性化剤との細胞のインキュベーションが、２０〜３５℃の間の温度で１０分〜２時間行われることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１３】
前記透過性化剤との細胞のインキュベーションが２０分〜４０分間行われることを特徴とする、請求項１２に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１４】
前記洗浄バッファーが、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび５ｍＭのリン酸ナトリウムを含有するｐＨ５．８〜７．４の溶液からなることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１５】
前記エレクトロポレーションバッファーが、１ｍＭのスクロース、３ｍＭの塩化マグネシウムを含有するｐＨ５．８〜７．４の溶液からなることを特徴とする、請求項８に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１６】
（ａ）エレクトロコンピテント細胞と構築されたベクターとの混合工程と、（ｂ）電気パルスの適用工程（エレクトロポレーション）と、（ｃ）操作された細胞の選択工程とをさらに含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１７】
前記電気パルスが、キャパシタンス２５μＦ、抵抗２００Ω、電圧およそ１．０〜２．０ｋＶ、２．４〜５．０ミリ秒間、の条件で適用されることを特徴とする、請求項１６に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１８】
前記電気パルスが１．０〜１．５ｋＶの間の電圧に適用されることを特徴とする、請求項１７に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項１９】
培養培地中のエレクトロポレーション処理された細胞の回復および操作された細胞のさらなる選択を特徴とする、請求項１６に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項２０】
（１）大腸菌由来の複製起点（Ｏｒｉ  Ｅ）と、（２）適当なプロモーターと、（３）抗生物質耐性遺伝子と、（４）多重クローニング部位（ＭＣＳ）と、（５）コードするリポーター遺伝子とを含む構築の技術的特徴を有する、形質転換ベクター。
【請求項２１】
市販のトランスポゾンＥＺ−Ｔｎ５（商標）の使用を特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項２２】
好酸性細菌への遺伝物質内容物の転移プロセスに適用されることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の形質転換ベクターの使用。
【請求項２３】
バイオリーチングプロセスに適用されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の操作された細菌の使用。
【請求項２４】
好酸性化学合成無機栄養細菌が、アシディチオバチルス型の微生物、ならびにレプトスピリルム・フェロオキシダンス、スルフォバチルス・サーモスルフィドオキシダンス、メタリクス・スルフォロブス、スルフォロブス・アシドカルダリウス、アシディアヌス・ブリーエリイおよびヘルス・アシディアヌスを含む他の型も含んでなる、請求項１に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項２５】
前記コンピテント細胞が、外来性の遺伝物質の侵入を可能にする細胞を含むことを特徴とする、請求項３に記載の好酸性細菌の遺伝子操作方法。
【請求項２６】
（４）自己複製能に関与するＯｒｉＶの挿入を特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項２７】
抗生物質であるカナマイシンに耐性があることを特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項２８】
前記適当なプロモーターがｌａｃ  Ｐであることを特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項２９】
前記多重クローニング部位（ＭＣＳ）が無性複製起点（ＯｒｉＶ）であることを特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【請求項３０】
前記リポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の形質転換ベクター。
【国際調査報告】
2014505483.tif 000007
2014505483.tif 000008
2014505483.tif 000009
2014505483.tif 000010
2014505483.tif 000011
2014505483.tif 000012
2014505483.tif 000013
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2014505483.tif 000015
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