(57)【要約】テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製する方法が記載される。その方法は、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドで構成されている二本鎖鋳型／プライマー基質を標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合する工程、およびその反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加えることにより、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長して、ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを提供する工程を包含する。そのＤＮＡコピーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成された相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含む。二本鎖鋳型／プライマー基質にヌクレオチドを付加する方法も記載される。その方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡ配列の検出、ＰＣＲ増幅、クローニングおよび決定を容易にするために使用することができる。
2014506483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製する方法であって、該方法は：
相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つの二本鎖鋳型／プライマー基質を少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合する工程、および
該反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加えて、該ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長して、該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成される相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡコピーポリヌクレオチドを提供する工程
を包含し、ここで、
該二本鎖鋳型／プライマー基質は、該ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が該相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端と直接整列される平滑末端、または該ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が該相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端を超えて１ヌクレオチド伸長しているオーバーハング端を有する、
方法。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＲＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、ＲＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、ＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記二本鎖鋳型／プライマー基質が、オーバーハング端を有し、２〜４個の異なるヌクレオチドからなるオーバーハング端を有する複数の異なる二本鎖鋳型／プライマー基質が、使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドが、オーバーハング端を有し、前記標的ポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドが、該ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非レトロウイルス逆転写酵素が、前記ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に１〜１５個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加した後、前記標的ポリヌクレオチドを複製することにより、前記ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを合成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記非レトロウイルス逆転写酵素が、ただ１つのさらなる非相補ヌクレオチドを付加する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の３’末端が、ブロッキング剤により終止されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記非レトロウイルス逆転写酵素が、グループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複数のＤＮＡコピーポリヌクレオチドのクローニングライブラリーが、複数の異なる標的ポリヌクレオチドを使用することによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを環状化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製する方法であって、該方法は：
相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つの二本鎖鋳型／プライマー基質を少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合する工程、および
該反応媒体に適当量のグループＩＩイントロン逆転写酵素を加えて、該ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長して、該標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成される相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡコピーポリヌクレオチドを提供する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＲＮＡからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、ＲＮＡからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖が、ＤＮＡからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記二本鎖鋳型／プライマー基質が、前記ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端と直接整列される平滑末端を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記二本鎖鋳型／プライマー基質が、前記ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端を超えて１ヌクレオチド伸長しているオーバーハング端を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
２〜４個の異なるヌクレオチドからなるオーバーハング端を有する複数の異なる二本鎖鋳型／プライマー基質が、使用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的ポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドが、前記ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドに相補的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記逆転写酵素が、前記ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に１〜１５個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加した後、前記標的ポリヌクレオチドを複製することにより、前記ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを合成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記逆転写酵素が、ただ１つのさらなる非相補ヌクレオチドを付加する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の３’末端が、ブロッキング剤により終止されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
複数のＤＮＡコピーポリヌクレオチドのクローニングライブラリーが、複数の異なる標的ポリヌクレオチドを使用することによって調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを環状化する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドにさらなるヌクレオチドを付加する方法であって、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドからなる二本鎖鋳型／プライマー基質を含む反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加える工程を包含し、ここで、該非レトロウイルス逆転写酵素は、該ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に１〜１５個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加する、方法。
【請求項３１】
前記非レトロウイルス逆転写酵素が、グループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１〜６個のさらなる非相補ヌクレオチドが付加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
単一の非相補ヌクレオチドが付加される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
係属中の出願のデータ
この出願は、２０１１年２月２３日に出願された米国仮出願第６１／４４５，７６１号（これは、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の資金供与
この研究は、少なくとも部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓからの助成金番号ＧＭ３７９４７およびＧＭ３７９５１によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、本明細書によってその全体が参考として援用される。２０１２年２月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３１５９４０２４．ｔｘｔという名称であり、３４，１６６バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリーの構築、マイクロアレイ用のプローブの作製、ならびに従来および次世代のＲＮＡシーケンシングをはじめとした種々の用途のためにＲＮＡのｃＤＮＡコピーを合成するバイオテクノロジーにおいて使用されている。長いポリアデニル化ＲＮＡに対応するｃＤＮＡの合成は、ランダムヘキサマープライマーまたはポリ（Ａ）テイルに相補的なオリゴ（ｄＴ）含有プライマーを使用することによって達成され得る。しかしながら、非ポリアデニル化ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質に結合したＲＮＡフラグメント）に対応するｃＤＮＡの鎖特異的なクローニングおよびシーケンシングは、典型的には、ＰＣＲプライマー結合部位を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはキメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプターを、そのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の末端にライゲートすることを必要とする（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。それらのアダプターは、通常、ＲＮＡリガーゼを使用してそのＲＮＡ鋳型に（そのＲＮＡの３’および５’末端に順次（例えば、Ｒｏｃｈ  ４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）シーケンシングおよびＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）次世代シーケンシング）またはＲＮＡの両端に同時に（例えば、ＳＯＬｉＤＴＭ次世代シーケンシング））ライゲートされる（Ｌｉｎｓｅｎら、２００９）。いくつかの用途の場合、第１のアダプターが、逆転写のためにＲＮＡの３’末端にライゲートされ、第２のアダプターが、得られたｃＤＮＡの３’末端にライゲートされる（例えば、タンパク質に結合したＲＮＡフラグメントのｃＤＮＡの架橋および解析（ＣＲＡＣ）；Ｇｒａｎｎｅｍａｎら、２００９）。１つの変法では、そのｃＤＮＡの３’末端にＣ残基を付加する、逆転写酵素の鋳型非依存性（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）ヌクレオチド付加反応（それにより、第２鎖合成のための相補的なＧ残基を含む第２のアダプターのアニーリングが可能になる）を使用することによって、第２のアダプターのライゲーションが回避される（Ｚｈｕら、２００１）。別の変法では、例えば、単一ヌクレオチド分解能でのＵＶ架橋および免疫沈降（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：ｉＣＬＩＰ，Ｋｏｅｎｉｇら、２０１０）またはリボソームプロファイリングを用いたヌクレオチド分解能での翻訳のゲノムワイドインビボ解析（Ｉｎｇｏｌｉａら、２００９）では、ｃＤＮＡを環状化した後の直鎖化、および第１のアダプター中の二方向プライマー結合部位を使用したＰＣＲ増幅によって、第２のアダプターのライゲーションが回避される。
【０００５】
オリゴヌクレオチドアダプターの付着は、非ポリアデニル化ＲＮＡおよびＲＮＡフラグメントに対応するｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングのための容易なＰＣＲ増幅のために必要とされるが、残念なことに、アダプターを付着させるリガーゼの使用は、時間のかかる高価かつ非効率な工程である。さらに、アダプターのライゲーションのために通常使用されるＲＮＡリガーゼは、ライゲートされる末端に対して異なるヌクレオチド優先性を有することから、構築されたライブラリーにおいてｃＤＮＡの偏った提示がもたらされる（Ｌｉｎｓｅｎら、２００９；非特許文献２）。
【０００６】
ＲＴをコードする遺伝的エレメントであるレトロエレメントは、ＬＴＲ含有レトロエレメントおよび非ＬＴＲ含有レトロエレメントという名称の２つの主要なファミリーに分けられる（Ｘｉｏｎｇ  ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  １９９０）。レトロウイルス（そのＲＴがバイオテクノロジーにおいて通常使用される）は、ＬＴＲ含有レトロエレメントの周知の例である。非ＬＴＲレトロエレメントは、ＲＴをコードするエレメント（それらとしては、レトロプラスミド、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、レトロン（ｒｅｔｒｏｎ）および可動性グループＩＩイントロンが挙げられる）の多種多様なファミリーである（Ｘｉｏｎｇ  ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  １９９０）。可動性グループＩＩイントロンは、触媒的に活性なイントロンＲＮＡ（「リボザイム」）およびイントロンによってコードされるＲＴからなり、それらは一体となって、ＲＮＡスプライシングおよびイントロン可動性を促進するように機能する（Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｌｙ  ２０１０）。グループＩＩイントロンＲＴは、典型的には、４つの保存されたドメイン：ＲＴ（レトロウイルスＲＴのフィンガーおよびパーム領域に見られる７つの保存された配列ブロック（ＲＴ１〜７）を含む）；Ｘ（レトロウイルスＲＴのサムドメインに少なくとも部分的に対応するＲＮＡスプライシング活性のために必要とされる領域）；Ｄ（ＤＮＡ標的部位認識に関与するＤＮＡ結合ドメイン）；およびＥｎ（ＤＮＡ標的部位を切断して逆転写用のプライマーを生成するＤＮＡエンドヌクレアーゼドメイン）からなる（Ｂｌｏｃｋｅｒら、２００５；Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｌｙ  ２０１０）。Ｅｎドメインは、いくつかのグループＩＩイントロンＲＴでは欠損しており、その代わりそのＲＴは、ＤＮＡ複製フォークにおける新生鎖を使用して逆転写を開始する（Ｚｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ  ２００３；Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｌｙ  ２０１０）。グループＩＩイントロンＲＴのＲＴおよびＸ／サムドメインは、Ｎ末端の伸長、さらなるＮ末端の保存された配列ブロック（ＲＴ−０）、ならびにそのＲＴおよびＸ／サムドメイン内の保存された配列ブロック間の挿入に起因して、レトロウイルスＲＴのそれよりも大きい（Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｌｙ  ２０１０）。ＲＴ−０、およびＲＴドメイン内の保存された配列ブロック間の挿入のいくつかは、他の非ＬＴＲレトロエレメントＲＴにも見られる（Ｂｌｏｃｋｅｒら、２００５）。レトロウイルスＲＴとは異なり、グループＩＩイントロンおよび非ＬＴＲレトロエレメントＲＴは、ＲＮａｓｅＨドメインを欠いている。
【０００７】
レトロプラスミドおよび非ＬＴＲレトロトランスポゾンによってコードされるＲＴは、最初のＲＮＡ鋳型から、その最初の鋳型から合成されたｃＤＮＡの３’末端とほとんどまたはまったく相補性を有しない新しいＲＮＡ鋳型の３’末端に、直接テンプレートスイッチすることができる点でレトロウイルスＲＴとは異なると見出されている（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ  １９９７；Ｂｉｂｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ２００２，２００４；Ｋｅｎｎｅｌｌら、１９９４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９４：８５８〜６２
【非特許文献２】Ｌｅｖｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）７：７０９〜１５
【非特許文献３】Ｌａｍｍら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）１：１〜１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本明細書中に開示されるように、ある特定のクラスのレトロエレメント、最も著名なものとしては、可動性グループＩＩイントロンによってコードされる逆転写酵素（ＲＴ）が、アダプターライゲーションに関連する困難に対する解決法を提供し、より一般的には、ＲＮＡおよびＤＮＡ配列の検出、ＰＣＲ増幅およびクローニングを容易にする新しい方法を提供する。本発明者らは、非レトロウイルスＲＴでは、最初の鋳型から合成されたｃＤＮＡと新しいＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の３’末端との間にほとんどまたはまったく相補性を有しないテンプレートスイッチが可能であり得、ならびにこの反応が、ライゲーションなしでアダプター配列を標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に直接連結する連続的なｃＤＮＡを合成するために使用され得るという仮説を立てた。次いで、その複合ｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡの３’末端において第２のアダプター分子にライゲートされ得るか、または例えば、一本鎖ＤＮＡを効率的に環状化する酵素であるＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら、２００６）を用いて環状化され得、それにより、第１のアダプターの異なる部分にアニールする二方向プライマーを用いたＰＣＲ増幅が可能になる。いくつかの用途の場合、そのようなプライマーは、次世代／ディープシーケンシング用のバーコードを付加し得る。
【００１０】
ｃＤＮＡを合成するための非レトロウイルス逆転写酵素（ＲＴ）の使用（ここで、目的の配列を含む標的ポリヌクレオチド鎖が、１つ以上のアダプター配列および／またはｃＤＮＡの３’末端に付加される鋳型非依存性ヌクレオチド残基からのテンプレートスイッチによって連結される）が記載される。そのアダプター配列は、ＰＣＲプライマー結合部位を含み得、その付着は、その後の、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の検出、ＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡライブラリー構築およびシーケンシングを容易にする。そのアダプター配列は、他の有用な配列（例えば、その後のｃＤＮＡの精製用の親和性タグ配列）も含み得る。ｃＤＮＡの３’末端への鋳型非依存性ヌクレオチド付加は、例えば、鋳型非依存性ヌクレオチド付加によって付加されたヌクレオチド残基に相補的なヌクレオチド残基を含むＰＣＲプライマーのアニーリングを可能にすることによって、または鋳型非依存性ヌクレオチド付加によって付加されたヌクレオチド残基に相補的なヌクレオチド残基を含むベクターへのｃＤＮＡのクローニングを可能にすることによって、それらのｃＤＮＡのその後の増幅およびクローニングを容易にし得る。逆転写酵素による、特定の３’末端ヌクレオチド残基を有する標的ポリヌクレオチド配列へのテンプレートスイッチを指示するための方法、および逆転写酵素による、種々の３’末端ヌクレオチド残基を有するポリヌクレオチド鎖間のテンプレートスイッチにおける偏りを最小限にするための方法も、記載される。本開示は、逆転写酵素によるＲＮＡからＤＮＡ鋳型へのまたはＤＮＡ鋳型間のテンプレートスイッチのための方法も提供し、それにより、種々のＤＮＡおよびＲＮＡ配列の連結が可能になる。例えば、逆転写酵素がＤＮＡ鋳型間で鋳型を飛び移る能力を用いることにより、第２鎖合成のためまたは一本鎖ゲノムＤＮＡからＤＮＡライブラリーを作製するために一本鎖ＤＮＡにアダプターが付着され得る。非レトロウイルスＲＴを使用して、そのＲＴによって合成されていない他のＤＮＡに鋳型非依存性ヌクレオチド残基を付加することにより、それらの検出、ＰＣＲ増幅、クローニングおよびシーケンシングを容易にするための方法も、記載される。本開示は、鋳型非依存性ヌクレオチド付加が有害であり得る用途（例えば、キャピラリー電気泳動による正確なｃＤＮＡの長さの測定、ＲＮＡ構造マッピングおよびＲＮＡフットプリンティング）のために、非レトロウイルスＲＴによるそのような鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させるための方法も提供する。
【００１１】
前述の大まかな説明と以下の詳細な説明の両方が、単に例示的かつ説明的なものであって、特許請求される本発明を限定しないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴのテンプレートスイッチ活性の比較。５’３２Ｐ標識プライマーＰｃを含むＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型／プライマー基質（５０ｎＭ）を、等モル濃度のｍｉＲＮＡｘと混合し、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴ（２μＭ）またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（ＳＳＩＩＩ）ＲＴ（１０ユニット／μＬ）で逆転写した。それらの反応を、各酵素に対する最適条件下で行った（ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴに対しては、６０℃における、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および１ｍＭ  ｄＮＴＰ、ならびにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴに対しては、５０℃における、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３および１ｍＭ  ｄＮＴＰ）。それらの反応を、上記ＲＴを加えることによって開始し、３０分間インキュベートし、ＥＤＴＡ／ＳＤＳ（０．１２５Ｍ，０．０５％最終）を加えることによって停止した後、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１；フェノール−ＣＩＡ）で抽出した。その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。−ＲＴコントロールレーンは、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴ反応条件下においてＲＴなしでインキュベートされたＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型／プライマー基質を示している。Ｍ，サイズマーカーとして使用された３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）。ＡｍＭＯは、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡの３’末端におけるアミノ修飾因子（ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ）を表しており、＊は、プライマーの５’末端における３２Ｐ標識を表しており、Ｎは、テンプレートスイッチにおける偏りを評価する後の実験で使用されるｍｉＲＮＡｘオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の両方における２つのランダム化されたヌクレオチド残基を表している。
【図２】図２、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチおよびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅによる環状化を介したｃＤＮＡクローニングのための方法。第１の工程では、グループＩＩイントロンＲＴは、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型／プライマーからｍｉＲＮＡｘにテンプレートスイッチすることにより、ＩＡ−Ｐ１アダプター配列をｍｉＲＮＡｘに連結する連続したｃＤＮＡを生成する。その産物を、ＲＮａｓｅＨとともにインキュベートして、ＲＮＡ鋳型を消化し、ゲル精製し、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩまたはＩＩで環状化する。組み込まれていないプライマーをエキソヌクレアーゼＩで消化した後、ｃＤＮＡ産物を、ウラシル−ＤＮＡ切り出し混合物（ＵＤＥ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））を用いて、プライマーに組み込まれていたデオキシウリジン（ＰｃＤＮＡプライマー配列中の下線が付されたＵ）において再度、直鎖化し、次いで、さらなるアダプター配列および次世代シーケンシング用のバーコードを導入するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型−プライマー基質およびＳＯＬｉＤシーケンシング用のＰＣＲプライマーの配列（出現する順序で、それぞれ配列番号５、２４および８〜１０）を下部に示す。ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡは、そのＲＮＡ末端へのテンプレートスイッチを妨害する３’アミノ修飾因子（ＡｍＭＯという名称）を有する。Ｘは、バーコード（ＢＣ）ヌクレオチド残基を表し、＊は、プライマーの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図３】図３、２つの５’−および２つの３’−ヌクレオチド残基がランダム化されたｍｉＲＮＡ（配列番号２６）に対応するｃＤＮＡ（配列番号２８）のクローニングおよびシーケンシング。ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型／プライマー基質（配列番号２７として開示される「ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ」配列）からｍｉＲＮＡｘへのＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴのテンプレートスイッチを介して、図１において当該酵素に対して使用された反応条件下で１５分間、ｃＤＮＡを合成し、ゲル精製し、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩで環状化し、ＳＯＬｉＤ  ５’および３’プライマーとともにＦｌａｓｈ  Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）にＴＡクローニングし、Ｍ１３（−２０）Ｆプライマーを用いてＳａｎｇｅｒ法による配列決定を行った。ｍｉＲＮＡの５’および３’末端におけるランダム化されたヌクレオチドの位置に、それぞれ、下線および灰色の網掛けによるハイライトを付している。産物配列（出現する順序で、それぞれ配列番号２９〜５３）において、変異ヌクレオチド残基を小文字で示し、鋳型非依存性ヌクレオチド残基を太字の小文字で示している。産物配列中のＮは、その配列中で明確に特定できなかったヌクレオチドを表している。
【図４Ａ】図４、Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡの５’末端に対応するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を使用したＬｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加およびテンプレートスイッチ。（Ａ）ゲルアッセイ。Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質；４０ｎＭ）を、２００μＭ  ｄＮＴＰ、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む反応媒体中で、ゲルの右に図示された小さい人工基質とともに、３０℃で３０分間インキュベートした。それらの人工基質は、単独のまたは４０ｎＭ  Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ（６０ｎｔ）にアニールされた４４ｎＭ  ５’３２Ｐ標識ＤＮＡプライマーｃ（Ｐｒｉ  ｃ；４５ｎｔ）＋４０ｎＭエキソン１（Ｅ１；４０ｎｔ）ＤＮＡまたはＲＮＡだった。インキュベートした後、フェノール−ＣＩＡ抽出によってその反応を終結させ、その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭを用いてスキャンされる変性１５％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。レーン（１）および（２）それぞれＬｔｒＡなしおよびありでインキュベートされた３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃ；（３）および（４）それぞれ３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃおよびＥ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートされたＬｔｒＡ；（５）および（６）それぞれＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ／３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃ鋳型／プライマー基質およびＥ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートされたＬｔｒＡ。この概略図において、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、灰色の楕円として示されており、ＤＮＡ合成の向きは、灰色の楕円内の点線の矢印で示されている。ＤＮＡシーケンシングのために切り出されたバンド（ａ〜ｎ）が、ゲル内に示されている。ゲルの右側の数字は、５’３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）のヌクレオチドの位置を示している。（Ｂ）および（Ｃ）ＤＮＡ産物の配列。図４Ｂは、出現する順序で、それぞれ配列番号５４〜６１、６１、６１、６１、６１〜６２、６２〜６３、６１および２５を開示している。図４Ｃは、出現する順序で、それぞれ配列番号６４、５５、５７、６５、５８、６６、５９、６７〜６８、６０〜６１、６９、６２、７０〜７２、７２および７２〜７４を開示している。レーン５および６における示されたゲルバンドから得られた産物は、それぞれ、ＬＩ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマーｃ基質におけるＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの５’末端へのプライマーｃの伸長、およびその後の、エキソン１  ＤＮＡまたはＲＮＡへのテンプレートスイッチから生じた。ＤＮＡ産物配列中の変異ヌクレオチド残基は、小文字で示されており、テンプレートスイッチ接合点またはｃＤＮＡの３’末端に挿入された余分なヌクレオチド残基は、太字の小文字で示されている。この図に示されていないＤＮＡ産物配列の一部が、エキソン１  ＤＮＡ産物に対して１つのＧからＡへの変化、およびエキソン１  ＲＮＡ産物に対して２つのＡからＧへの変化を含んだ。右側の数字は、各配列の頻度を示している。＊は、プライマーｃの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図４Ｂ】図４、Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡの５’末端に対応するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を使用したＬｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加およびテンプレートスイッチ。（Ａ）ゲルアッセイ。Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質；４０ｎＭ）を、２００μＭ  ｄＮＴＰ、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む反応媒体中で、ゲルの右に図示された小さい人工基質とともに、３０℃で３０分間インキュベートした。それらの人工基質は、単独のまたは４０ｎＭ  Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ（６０ｎｔ）にアニールされた４４ｎＭ  ５’３２Ｐ標識ＤＮＡプライマーｃ（Ｐｒｉ  ｃ；４５ｎｔ）＋４０ｎＭエキソン１（Ｅ１；４０ｎｔ）ＤＮＡまたはＲＮＡだった。インキュベートした後、フェノール−ＣＩＡ抽出によってその反応を終結させ、その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭを用いてスキャンされる変性１５％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。レーン（１）および（２）それぞれＬｔｒＡなしおよびありでインキュベートされた３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃ；（３）および（４）それぞれ３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃおよびＥ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートされたＬｔｒＡ；（５）および（６）それぞれＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ／３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃ鋳型／プライマー基質およびＥ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートされたＬｔｒＡ。この概略図において、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、灰色の楕円として示されており、ＤＮＡ合成の向きは、灰色の楕円内の点線の矢印で示されている。ＤＮＡシーケンシングのために切り出されたバンド（ａ〜ｎ）が、ゲル内に示されている。ゲルの右側の数字は、５’３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）のヌクレオチドの位置を示している。（Ｂ）および（Ｃ）ＤＮＡ産物の配列。図４Ｂは、出現する順序で、それぞれ配列番号５４〜６１、６１、６１、６１、６１〜６２、６２〜６３、６１および２５を開示している。図４Ｃは、出現する順序で、それぞれ配列番号６４、５５、５７、６５、５８、６６、５９、６７〜６８、６０〜６１、６９、６２、７０〜７２、７２および７２〜７４を開示している。レーン５および６における示されたゲルバンドから得られた産物は、それぞれ、ＬＩ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマーｃ基質におけるＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの５’末端へのプライマーｃの伸長、およびその後の、エキソン１  ＤＮＡまたはＲＮＡへのテンプレートスイッチから生じた。ＤＮＡ産物配列中の変異ヌクレオチド残基は、小文字で示されており、テンプレートスイッチ接合点またはｃＤＮＡの３’末端に挿入された余分なヌクレオチド残基は、太字の小文字で示されている。この図に示されていないＤＮＡ産物配列の一部が、エキソン１  ＤＮＡ産物に対して１つのＧからＡへの変化、およびエキソン１  ＲＮＡ産物に対して２つのＡからＧへの変化を含んだ。右側の数字は、各配列の頻度を示している。＊は、プライマーｃの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図４Ｃ】図４、Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡの５’末端に対応するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を使用したＬｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加およびテンプレートスイッチ。（Ａ）ゲルアッセイ。Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質；４０ｎＭ）を、２００μＭ  ｄＮＴＰ、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む反応媒体中で、ゲルの右に図示された小さい人工基質とともに、３０℃で３０分間インキュベートした。それらの人工基質は、単独のまたは４０ｎＭ  Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ（６０ｎｔ）にアニールされた４４ｎＭ  ５’３２Ｐ標識ＤＮＡプライマーｃ（Ｐｒｉ  ｃ；４５ｎｔ）＋４０ｎＭエキソン１（Ｅ１；４０ｎｔ）ＤＮＡまたはＲＮＡだった。インキュベートした後、フェノール−ＣＩＡ抽出によってその反応を終結させ、その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭを用いてスキャンされる変性１５％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。レーン（１）および（２）それぞれＬｔｒＡなしおよびありでインキュベートされた３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃ；（３）および（４）それぞれ３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃおよびＥ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートされたＬｔｒＡ；（５）および（６）それぞれＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ／３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｃ鋳型／プライマー基質およびＥ１  ＤＮＡまたはＲＮＡとともにインキュベートされたＬｔｒＡ。この概略図において、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、灰色の楕円として示されており、ＤＮＡ合成の向きは、灰色の楕円内の点線の矢印で示されている。ＤＮＡシーケンシングのために切り出されたバンド（ａ〜ｎ）が、ゲル内に示されている。ゲルの右側の数字は、５’３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）のヌクレオチドの位置を示している。（Ｂ）および（Ｃ）ＤＮＡ産物の配列。図４Ｂは、出現する順序で、それぞれ配列番号５４〜６１、６１、６１、６１、６１〜６２、６２〜６３、６１および２５を開示している。図４Ｃは、出現する順序で、それぞれ配列番号６４、５５、５７、６５、５８、６６、５９、６７〜６８、６０〜６１、６９、６２、７０〜７２、７２および７２〜７４を開示している。レーン５および６における示されたゲルバンドから得られた産物は、それぞれ、ＬＩ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマーｃ基質におけるＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの５’末端へのプライマーｃの伸長、およびその後の、エキソン１  ＤＮＡまたはＲＮＡへのテンプレートスイッチから生じた。ＤＮＡ産物配列中の変異ヌクレオチド残基は、小文字で示されており、テンプレートスイッチ接合点またはｃＤＮＡの３’末端に挿入された余分なヌクレオチド残基は、太字の小文字で示されている。この図に示されていないＤＮＡ産物配列の一部が、エキソン１  ＤＮＡ産物に対して１つのＧからＡへの変化、およびエキソン１  ＲＮＡ産物に対して２つのＡからＧへの変化を含んだ。右側の数字は、各配列の頻度を示している。＊は、プライマーｃの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図５Ａ】図５、３’Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロン−エキソン２組込み接合点に対応するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を使用したＬｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加およびテンプレートスイッチ。（Ａ）ゲルアッセイ。Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質；４０ｎＭ）を、２００μＭ  ｄＮＴＰ、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ジチオトレイトールを含む反応媒体中で、ゲルの右に図示された小さい人工基質とともに、３０℃で３０分間インキュベートした。その人工基質は、単独のまたは４０ｎＭ  Ｅ２  ＲＮＡもしくはＤＮＡ（４０ｎｔ）にアニールされた４４ｎＭ  ５’３２Ｐ標識ＤＮＡプライマーｅ２（Ｐｒｉ  ｅ２；７０ｎｔ）だった。フェノール−ＣＩＡ抽出によってその反応を終了させ、その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭを用いてスキャンされる変性１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。レーン（１）および（２）それぞれＬｔｒＡなしおよびありでインキュベートされた３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｅ２  ＤＮＡ；（３）および（４）それぞれアニールした３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｅ２を有するＥ２  ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型とともにインキュベートされたＬｔｒＡ。この概略図において、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、灰色の楕円として示されており、ＤＮＡ合成の向きは、点線の矢印で示されている。ＩＳは、イントロン挿入部位を示している。ゲルの右側の数字は、５’３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）の位置を示している。（Ｂ）ｃＤＮＡ産物の配列。図５Ｂは、出現する順序で、それぞれ配列番号７５〜７６、７６〜９２、８７〜８８および９３〜１１６を開示している。ゲル中に示されているバンド（ａ〜ｄ）を切り出し、クローニングし、配列決定した。鋳型および予想されるＤＮＡ産物配列（四角内）を、実験的に決定されたＤＮＡ産物配列の各セットの上に示す。ＤＮＡ産物配列中の変異ヌクレオチド残基は、小文字で示されており、テンプレートスイッチ接合点またはｃＤＮＡの３’末端に挿入された余分なヌクレオチド残基は、太字の小文字で示されている。右側の数字は、各配列の頻度を示している。＊は、プライマーの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図５Ｂ】図５、３’Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロン−エキソン２組込み接合点に対応するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を使用したＬｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加およびテンプレートスイッチ。（Ａ）ゲルアッセイ。Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質；４０ｎＭ）を、２００μＭ  ｄＮＴＰ、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ジチオトレイトールを含む反応媒体中で、ゲルの右に図示された小さい人工基質とともに、３０℃で３０分間インキュベートした。その人工基質は、単独のまたは４０ｎＭ  Ｅ２  ＲＮＡもしくはＤＮＡ（４０ｎｔ）にアニールされた４４ｎＭ  ５’３２Ｐ標識ＤＮＡプライマーｅ２（Ｐｒｉ  ｅ２；７０ｎｔ）だった。フェノール−ＣＩＡ抽出によってその反応を終了させ、その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭを用いてスキャンされる変性１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。レーン（１）および（２）それぞれＬｔｒＡなしおよびありでインキュベートされた３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｅ２  ＤＮＡ；（３）および（４）それぞれアニールした３２Ｐ標識Ｐｒｉ  ｅ２を有するＥ２  ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型とともにインキュベートされたＬｔｒＡ。この概略図において、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、灰色の楕円として示されており、ＤＮＡ合成の向きは、点線の矢印で示されている。ＩＳは、イントロン挿入部位を示している。ゲルの右側の数字は、５’３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）の位置を示している。（Ｂ）ｃＤＮＡ産物の配列。図５Ｂは、出現する順序で、それぞれ配列番号７５〜７６、７６〜９２、８７〜８８および９３〜１１６を開示している。ゲル中に示されているバンド（ａ〜ｄ）を切り出し、クローニングし、配列決定した。鋳型および予想されるＤＮＡ産物配列（四角内）を、実験的に決定されたＤＮＡ産物配列の各セットの上に示す。ＤＮＡ産物配列中の変異ヌクレオチド残基は、小文字で示されており、テンプレートスイッチ接合点またはｃＤＮＡの３’末端に挿入された余分なヌクレオチド残基は、太字の小文字で示されている。右側の数字は、各配列の頻度を示している。＊は、プライマーの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図６】図６、平滑末端ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質への鋳型非依存性ヌクレオチド付加のアッセイ。そのＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質は、ＲＮＡ鋳型の５’末端まで完全に伸長されたｃＤＮＡを模倣する平滑末端を有する（４０ｎｔのＲＮＡ鋳型５’−ＧＵＧＣＧＣＣＣＡＧＡＵＡＧＧＧＵＧＵＵＡＡＧＵＣＡＡＧＵＡ−３’（配列番号１）；２０ｎｔのＤＮＡプライマー５’−ＡＡＣＡＣＣＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号２））。ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴ（２μＭ）を、各レーンの上に示されるように、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５または７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１もしくは１００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰもしくはｄＴＴＰ（左側のゲル）または１μＭもしくは１ｍＭの４種すべてのｄＮＴＰおよび３ｍＭ  ＡＴＰ（右側のゲル）を含む反応媒体中で、ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質（１００ｎＭ）とともに、６０℃で１０分間インキュベートした。１２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳを加えた後、フェノール−ＣＩＡ抽出によってその反応を終了させた後、その産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。１０ｂｐラダーマーカー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）の位置をゲルの右側に示す。＊は、プライマーの５’末端における３２Ｐ標識を表している。
【図７】図７、鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させる反応条件下でのグループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチを介してｍｉＲＮＡｘから合成されたｃＤＮＡの次世代ＳＯＬｉＤシーケンシング。ｍｉＲＮＡｘオリゴヌクレオチドを、ランダム化された位置により高い割合のヌクレオチド残基が得られるように手作業で混合されたヌクレオチドを用いて合成し、逆転写反応を、１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中、６０℃で１０分間行ったことを除いては図３のように、ランダム化されたヌクレオチド残基を５’末端および３’末端に有するｍｉＲＮＡｘ鋳型（配列番号７）に対応するｃＤＮＡ（配列番号２８）の合成およびクローニングを行った。そのｃＤＮＡを、図２に記載されているようにＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを使用するＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ手順を介してクローニングし、ＳＯＬｉＤシーケンシングによって解析した。示されているＳＯＬｉＤ配列（出現する順序で、それぞれ配列番号１１７〜１３６）は、２，２３９，０７２個の高品質リードのうち、最も頻度の高い２０個である（右側の数字は、その配列に対するリード数を示している）。すべての配列が、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型−プライマー基質（配列番号２７として開示されている「ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ」配列）からｍｉＲＮＡｘへの単一のテンプレートスイッチに起因する分子に対応する。ランダム化されていたヌクレオチドの位置は、下線および網掛け文字で示されている；変異ヌクレオチド残基は、小文字で示されており、鋳型非依存性ヌクレオチド残基は、太字の小文字で示されている。類似の結果が、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって得られた（図示せず）。
【図８】図８、異なる末端塩基対を有する平滑末端ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質からのテンプレートスイッチ。５’ＲＮＡ／３’ＤＮＡ末端に４種の可能性のある塩基対の各々を有する３２Ｐ標識平滑末端ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質（相補的な４２ｎｔのＤＮＡにアニールされた４２ｎｔのＩＡ／Ｐ１  ＲＮＡ鋳型）を、ｍｉＲＮＡｘ（その３’末端のヌクレオチド残基は、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵだった）にテンプレートスイッチするために使用した。逆転写反応を、１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中、６０℃で１５分間行った。その反応を、ＲＴを加えることによって開始し、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳを加えることによって終了させた。フェノール−ＣＩＡ抽出の後、産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。Ｍ，サイズマーカーとして使用された３２Ｐ標識１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）。＊は、プライマーの５’末端における３２Ｐ標識を表している。各ゲルレーンにおける放射能の量について正規化された、テンプレートスイッチ産物バンドにおける放射能の定量に基づいて、５’Ｇ  ＲＮＡ／３’Ｃ  ＤＮＡ基質から種々の３’末端ヌクレオチド残基を有するＲＮＡへのテンプレートスイッチ事象のパーセンテージは、Ａ，１６％；Ｃ，１５％；Ｇ，１９％およびＵ，５０％だった。他の３つの平滑末端基質は、３’Ｃ残基を有するＲＮＡへのテンプレートスイッチに対する優先性を示している。
【図９】図９、３’オーバーハング基質からのグループＩＩイントロンＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴのテンプレートスイッチ。（Ａ）テンプレートスイッチ反応を、種々の３’ヌクレオチド残基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＵ）を有する標的ｍｉＲＮＡｘ（配列番号１３７）に対して、種々の単一ヌクレオチド３’オーバーハング（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、または４種すべてのヌクレオチドの等モル濃度の混合物（Ｎ））を有する最初の３２Ｐ標識ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質（ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／Ｐｃ３’オーバーハングＤＮＡ）を用いて行った。反応は、ＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させる、高塩反応媒体（４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ）中、２μＭ  ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴを用いる６０℃、１０分間だった。産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。ゲルの左側の数字は、標識されたサイズマーカー（１０ｂｐラダー）の位置を示している。＊，プライマーの５’末端における３２Ｐ標識。（Ｂ）等モルの単一ヌクレオチド３’オーバーハングを有するＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡから、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる脱リン酸化の前および後の３’リン酸化Ｃ残基を有するｍｉＲＮＡｘ（それぞれＰおよびＤＰ）または同一配列のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｍｉＤＮＡｘ）へのテンプレートスイッチ。
【図１０】図１０、３’オーバーハング基質からのグループＩＩイントロンＲＴ  ＧｓＩ−ＩＩＣ−ＭＲＦのテンプレートスイッチ。等モルのＡ、Ｃ、ＧまたはＴの単一ヌクレオチド３’オーバーハングを有するＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡから、３’リン酸化Ｃ残基を有するか（Ｐ）もしくは有しないｍｉＲＮＡｘ（配列番号１３７）または同一配列のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｍｉＤＮＡｘ）へのテンプレートスイッチ。反応は、高塩反応媒体（４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ）中、２μＭ  ＧｓＩ−ＩＩｃ−ＭＲＦを用いる６０℃、１０分間だった。産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。ゲルの左側の数字は、標識されたサイズマーカー（１０ｂｐラダー）の位置を示している。＊，プライマーの５’末端における３２Ｐ標識。
【図１１】図１１、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ鋳型プライマーからのＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴのテンプレートスイッチ。テンプレートスイッチ反応を、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡまたはＤＮＡにアニールされたＡ、Ｃ、ＧまたはＴ単一ヌクレオチド３’オーバーハングの等モル混合物を有する３２Ｐ標識ＤＮＡプライマー基質（ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／Ｐｃ  ３’オーバーハングＤＮＡ）を用いて行った。反応は、高塩反応媒体（４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ）中、２μＭ  ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴを用いる６０℃、１０分間だった。産物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。＊，プライマーの５’末端における３２Ｐ標識。矢印は、テンプレートスイッチ産物を示している。図１１は、「ｍｉＲＮＡｘ」配列を配列番号１３７として開示している。
【図１２】図１２、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチを使用することによるｍｉＲＮＡのクローニングおよびシーケンシング。最初のＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ鋳型／ＰｃＤＮＡプライマー基質（１００ｎＭ）からｍｉＲＮＡ参照セット（９６３個の等モル濃度のｍｉＲＮＡ，１１０ｎＭ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｍｉＲＸｐｌｏｒｅ）へのテンプレートスイッチ反応を、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴ（２μＭ）を用いて行った。後者は、等モル比（ＴＳ１）、または３’ＵもしくはＧ残基を有するｍｉＲＮＡの提示を調整するために２：０．５：１：１（ＴＳ２）で混合された単一のＡ、Ｃ、ＧまたはＴ３’オーバーハングを有した（図９を参照のこと）。反応を、図９のように行い、図２に記載されたようにｃＤＮＡをクローニングした。平行してＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ；ＡＢＩ）または小ＲＮＡサンプルプレップセット３キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）；ＮＥＢ）を使用することによって等しい一定分量の上記ｍｉＲＮＡから調製した。これらのキットは、ＳＯＬｉＤシーケンシング用のアダプターを上記ｍｉＲＮＡの３’および５’末端に同時に（ＡＢＩ）または逐次的に（ＮＥＢ）ライゲートし、その３’アダプターに相補的なＤＮＡプライマーを使用して、ＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩで逆転写する。（Ａ）そのライブラリー調製方法によって導入された分散を比較するために、最も少ないものから最も多いものまでランク付けし、中央値正規化し、ｌｏｇ２変換し、プロットした、ユニークに識別可能なコア配列を有する８９８個のｍｉＲＮＡのサブセットに対するカウントを示しているプロット。（Ｂ）および（Ｃ）異なるＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーにおいて過小提示されたｍｉＲＮＡと過剰提示されたｍｉＲＮＡとの重複を示しているベン図。各ライブラリー中の最も少ないおよび最も多い５％のｍｉＲＮＡを、Ｒを使用して特定し、ＶｅｎｎＤｉａｇｒａｍ  Ｒパッケージ（Ｃｈｅｎ  ＆  Ｂｏｕｔｒｏｓ  ２０１１）を使用してプロットした。
【図１３】図１３、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチおよび２つの市販のキットによって調製されたＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーにおけるｍｉＲＮＡ３’末端ヌクレオチド残基の提示。ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴによるテンプレートスイッチ；Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ）；または小ＲＮＡサンプルプレップセット３キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標））によって、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを調製した。ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴによるテンプレートスイッチ反応を、等モル比（ＴＳ１）、または３’ＵもしくはＧ残基を有するｍｉＲＮＡに対する提示を調整するために２：０．５：１：１の比（ＴＳ２）で混合された単一のＡ、Ｃ、ＧまたはＴ３’オーバーハングを有するＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型／プライマー基質を使用することによって行った。棒グラフは、ｍｉＲＸｐｌｏｒｅ参照セットにおける４種の各塩基で終結しているｍｉＲＮＡのパーセンテージ（黒色）と、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー中のｍｉＲＮＡの３’末端の塩基のパーセンテージ（ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ／ＴＳ１，点々；ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ／ＴＳ２，濃い灰色；ＡＢＩ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｓｅｑ，斜線；ＮＥＢ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ，薄い灰色）とを比較している。パネルＡでは、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー中のｍｉＲＮＡの３’ヌクレオチド残基を、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ａｄａｐｔｏｒの前の塩基として特定した。各サンプル中の末端の塩基を決定するとき、プライマーダイマー、アダプターのみおよび低品質配列を回避するために、各配列の始めから１５ｂｐ以上離れたＩｎｔｅｒｎａｌ  Ａｄａｐｔｏｒの８塩基に対する完全一致を要求した。パネルＢでは、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー中のｍｉＲＮＡの３’ヌクレオチド残基は、ユニークなコア配列を有する８９８個のｍｉＲＮＡのセットに対する３’ヌクレオチド残基の、存在量によって調整された分布から推論した（図１２を参照のこと）。類似の傾向が、ｍｉＲＮＡの３’末端残基を特定する両方の方法に対してみられた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態だけを説明するためのものであって、本発明を限定すると意図されていない。
【００１４】
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに他のことを示していない限り、複数形も含むと意図されている。さらに、終点による数値的な範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数字を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００１５】
「単離された」ポリヌクレオチドは、本明細書中で使用されるとき、その天然の環境から取り出されているか、組換え手法を用いて作製されているか、または化学的にもしくは酵素的に合成されている、ポリヌクレオチドを意味する。また、あるポリヌクレオチドは、他の任意のポリヌクレオチドおよび関連する細胞産生物または他の不純物から精製され得る、すなわち、本質的にそれらを含まない場合がある。
【００１６】
ヌクレオチド（ｎｔ）は、リン酸エステル結合によって、ペントース（ＲＮＡではリボースおよびＤＮＡではデオキシリボース）（そしてそれは有機塩基に連結される）に連結されたリン酸基からなる。核酸のモノマー単位は、ヌクレオチドである。天然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡの各々は、４つの異なるヌクレオチドを含む：アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基を有するヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡに見られ、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル塩基を有するヌクレオチドは、天然に存在するＲＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルは、それぞれＡ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵと省略されることが多い。
【００１７】
相補ヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドで塩基対を容易に形成するヌクレオチドである。アデニンは、チミンまたはウラシルと相補的であり、逆もまた同じであり、グアニンは、シトシンと相補的であり、逆もまた同じである。相補性とは、隣接する鎖内の対向するヌクレオチドが相補的である可能性のことを指し、高い相補性は、相補ヌクレオチドの数が多いことを示唆し、低い相補性は、相補ヌクレオチドの数が少ないことを指す。
【００１８】
ヌクレオチドは、遊離した一、二および三リン酸の形態を含む（すなわち、そのリン酸基は、それぞれ１、２または３個のリン酸部分を有する）。したがって、ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧおよびＧＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）ならびにそれらの誘導体を含む。ヌクレオチドは、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰを含むｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体も含む。
【００１９】
ポリヌクレオチドは、本明細書中で使用されるとき、複数のヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）を含む任意の分子を意味することがある。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも５ヌクレオチドを含み、より好ましくは、１０以上のヌクレオチドを含む。一本鎖の記述は、相補鎖の配列も定義する。したがって、ある核酸は、記述される一本鎖の相補鎖も包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部を含み得る。二本鎖ポリヌクレオチドは、当業者が理解するように、互いに会合したある配列およびその相補的な配列である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、ここで、その核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、化学合成法によって得てもよいし、組換え法によって得てもよい。ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡからなると定義されるとき、それは、それぞれＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖と称され得る。
【００２０】
オリゴヌクレオチドは、本明細書中で使用されるとき、一般にオリゴヌクレオチドがより短い長さであることを除いては、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドのことを指す。オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチドを含み、ゆえに、２ヌクレオチドという最小サイズを有するが、いくつかの実施形態においては最小値は６ヌクレオチドである。その最大サイズに関しては、オリゴヌクレオチドは、一般に、１００ヌクレオチド以下のサイズを有するが、いくつかの実施形態においては、その限界は、７０ヌクレオチド以下である。
【００２１】
「オーバーハング配列」は、その用語が本明細書中で使用されるとき、二本鎖領域から伸びている核酸の一本鎖領域のことを指す。
【００２２】
用語「プライマー」は、本明細書中で使用されるとき、鋳型オリゴヌクレオチドに対して伸長される能力を特徴とする、精製された制限消化物などとして天然に存在するかまたは合成的に生成された、オリゴヌクレオチドのことを指すので、すべてをヌクレオチドの存在下、好適な温度およびｐＨに置くと、あるオリゴヌクレオチド（その配列は、鋳型分子の少なくとも一部の配列に相補的である）は、プライマーに連結される。しかしながら、この様式で使用される単なる能力は、そのプライマーが鋳型に対して完全に伸長されることを要求するのではなく、いくつかの実施形態では、プライマーは、少数の鋳型非依存性ヌクレオチドの付加のための部位としてだけ使用される。少なくとも６ヌクレオチド長の長さを有するプライマー六量体などのプライマーが、使用され得る。好ましいプライマーは、約６〜１００ヌクレオチド、またはいくつかの実施形態では１０〜７０ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。しかしながら、それより長いプライマーも、いくつかの実施形態では使用され得る。これらのより長いプライマーは、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドである。
【００２３】
２つ以上のオリゴヌクレオチドの状況において本明細書中で使用される「同一」または「同一性」は、それらの配列が、比較領域にわたって同じである、特定のパーセンテージの残基を有することを意味することがある。そのパーセンテージは、２つの配列を最適にアラインメントし、特定の領域にわたってその２つの配列を比較し、両方の配列に同一の残基が存在する位置の数を決定することにより、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較領域中の位置の総数で除し、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。「実質的に類似」は、所与の核酸配列が、参照配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおもより好ましくは少なくとも９５％の同一性を共有することを意味する。２つの配列が異なる長さであるか、またはアラインメントによって１つ以上の食い違いのある末端が生成され、かつ比較する特定の領域が単一の配列しか含まない場合、その単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子に含まれないことがある。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とが、等価物であるとみなされる場合がある。同一性の決定は、手作業でまたはコンピュータ配列アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０）を使用することによって行われ得る。
【００２４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングまたは精製なしにＤＮＡ配列の混合物中の標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法のことを指す。例えば、ＰＣＲおよびその発展の概要を提供しているＢａｒｔｌｅｔｔ  ＆  Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（２００３）を参照のこと。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、典型的には、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入した後の、ＤＮＡポリメラーゼの存在下における正確なシーケンスの熱サイクリングからなる。その２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。標的配列を増幅するために、その混合物は、変性され、次いで、プライマーが、標的分子内のそれらの相補配列にアニールする。アニーリングの後、プライマーは、新しい対の相補鎖を形成するようにポリメラーゼによって伸長される。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を何度も繰り返すことにより、所望の標的配列の増幅された高濃度のセグメントを得ることができる。別段述べられない限り、ＰＣＲは、本明細書中で使用されるとき、ＰＣＲの変法（例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、多重化ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲまたは当業者に公知のその他のＰＣＲ変法のいずれか）も含む。
【００２５】
本明細書中で使用されるとき、用語「テンプレートスイッチ」とは、逆転写酵素が最初の核酸配列鋳型から、その最初の鋳型から合成されたｃＤＮＡの３’末端に対してほとんどまたはまったく相補性を有しない新しい核酸配列鋳型の３’末端に切り換わる能力のことを指す。本明細書中のテンプレートスイッチの顕著な例は、逆転写酵素が、最初の核酸配列鋳型／プライマー基質から、そのＤＮＡプライマー鎖の３’末端に対してほとんどまたはまったく相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を有しない新しい核酸配列鋳型の３’末端に切り換わる能力である。
【００２６】
本明細書において使用されるとき、請求項の移行句であっても本文であっても、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、制約のない意味を有すると解釈されるべきである。つまり、それらの用語は、句「少なくとも有する」または「少なくとも含む」と同意語として解釈されるべきである。プロセスの文脈において使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、そのプロセスが、列挙された工程を少なくとも含むが、追加の工程も含む場合があることを意味する。化合物または組成物の文脈において使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、その化合物または組成物が、列挙された特徴または構成要素を少なくとも含むが、追加の特徴または構成要素も含む場合があることを意味する。
【００２７】
１つの態様において、テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製する方法が提供される。テンプレートスイッチは、最初の核酸配列鋳型から、その最初の鋳型から合成されたＤＮＡの３’末端に対してほとんどまたはまったく相補性を有しない新しい核酸配列鋳型の３’末端に切り換わる逆転写酵素を使用してＤＮＡコピーが調製されることを可能にし、それによって、ライゲーションなしでアダプター配列を標的オリゴヌクレオチド配列に直接連結する連続したＤＮＡ産物の合成が可能になる。
【００２８】
標的ポリヌクレオチドは、様々な異なる核酸配列であり得る。標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡから生成され得るか（例えば、ｍｉＲＮＡ）、または標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡから生成され得る。そのポリヌクレオチドのサイズおよび配列は、本明細書中に記載される方法に対して特に限定されないが、標的ポリヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオチドのサイズを有することが好ましい。
【００２９】
標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製する方法は、反応媒体中で二本鎖鋳型／プライマー基質を標的ポリヌクレオチドと混合する工程を包含する。その二本鎖鋳型／プライマー基質は、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドからなる。その二本鎖鋳型／プライマー基質は、典型的には、オリゴヌクレオチドである鎖を含むが、さらなる実施形態では、それらの鎖の一方または両方が、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドであり得る。ＤＮＡプライマーおよび鋳型鎖は、アダプター配列を含み得、標的ポリヌクレオチドに対して有用な機能性を提供する他の配列も含み得る。例えば、プライマーは、標的ポリヌクレオチドの検出、同定、ＰＣＲ増幅および／またはクローニングを容易にする配列を含み得る。プライマー鎖は、容易な精製のための親和性タグまたはプライマーを固体表面に連結することができるタグも含み得る。プライマーおよび相補的な鋳型オリゴヌクレオチドは、それらが複製されるのを妨げる修飾を含み得る。プライマーは、ヘアピン構造を有するポリヌクレオチドでもあり得る。有用なプライマー鎖の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）小型ＲＮＡプライマー、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘシーケンシングプライマー、Ｒｏｃｈｅ（登録商標）４５４プライマー、ＮｅｘＴｅｒａＴＭプライマー、および目的の配列を濃縮するための特注設計のプライマー（例えば、ｏｐｔｉｍｕｓプライマー）が挙げられる。
【００３０】
ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの結合は、適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を反応媒体に加えることによって開始される。適当量は、当業者に公知であり、本明細書中の実施例に提供される。これにより、その逆転写酵素が、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長して、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成された相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを生成するＤＮＡコピー鎖を生成する。
【００３１】
用語「逆転写酵素」（すなわち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）とは、逆転写酵素活性（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する活性）を有する酵素の一群のことを指す。一般に、そのような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素、およびそれらの変異体、バリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。非レトロウイルス逆転写酵素としては、非ＬＴＲレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｉｐｔａｓｅｓ）およびグループＩＩイントロン逆転写酵素が挙げられる。グループＩＩイントロン逆転写酵素の例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロン逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＴｅＩ４ｃイントロン逆転写酵素またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧｓＩ−ＩＩＣイントロン逆転写酵素が挙げられる。さらなる細菌逆転写酵素は、Ｓｉｍｏｎ  ＆  Ｚｉｍｍｅｒｌｙ（２００８）およびＫｏｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｈｉｓａ（２００８）に記載されており、それらは、多くのクラスの非レトロウイルス逆転写酵素（すなわち、とりわけ、レトロン、グループＩＩイントロンおよび多様性発生（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）レトロエレメント）を記載している。逆転写酵素は、主に、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写する（次いでそれは、さらなる操作のためにベクターにクローニングされ得る）ために使用されているか、または様々な増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自動持続配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、多種多様なプライマー伸長反応、５’ＲＡＣＥ、化学修飾の検出、またはＲＮＡ鋳型を用いたＤＮＡの合成を必要とする他の手法）において使用されている。
【００３２】
通常発現された形態に加えて、逆転写酵素の機能的フラグメントも使用され得る。逆転写酵素の機能ドメインは、当業者に周知であり、逆転写酵素の構造を含まない機能的フラグメントが調製され得る。例えば、公知の逆転写酵素をコードする遺伝子のサブクローンが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９９年版およびそれまでの版）に記載されているような、遺伝子フラグメントをサブクローニングするための従来の分子遺伝的操作を使用して生成され得る。次いで、そのサブクローンは、インビトロまたはインビボにおいて細菌細胞内で発現されることにより、それが逆転写酵素の機能的フラグメントであるかを決定する逆転写酵素活性について試験され得るより小さいタンパク質またはポリペプチドが得られる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、非レトロウイルス逆転写酵素は、グループＩＩイントロン逆転写酵素である。多種多様のグループＩＩイントロン由来逆転写酵素が公知である。例えば、１０５個の完全長グループＩＩイントロン由来逆転写酵素を記載しているＺｉｍｍｅｒｌｙ  Ｌａｂ  Ｗｅｂｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｇｒｏｕｐ  ＩＩ  Ｉｎｔｒｏｎｓを参照のこと。このウェブサイトの使用は、Ｄａｉら（２００３）およびＣａｎｄａｌｅｓら（２０１２）に記載されている。さらなる実施形態では、可動性グループＩＩイントロン逆転写酵素または安定化させた逆転写酵素融合タンパク質が使用され得る。安定化させた逆転写酵素融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質などのタンパク質への付着によって安定化させた逆転写酵素である。安定化させた逆転写酵素融合タンパク質を調製するための例示的な方法は、さらに本明細書中の実施例１および２に記載されている。安定化させた逆転写酵素融合タンパク質のより完全な説明は、米国特許出願公開第２０１２／０００９６３０号に見られる。
【００３４】
グループＩＩイントロンは、その自己スプライシング反応について公知のあるクラスのＲＮＡをコードする。ある特定のインビトロ条件下において、グループＩＩイントロンによってコードされたＲＮＡは、タンパク質の助けなしに、それ自身を前駆体ＲＮＡから切り出し、それらの隣接エキソンを一緒にライゲートし得る。そのスプライシングの反応機序は、核ｐｒｅ−ｍＲＮＡイントロンのスプライシングに似ている。いくつかのグループＩＩイントロンは、逆転写酵素（ＲＴ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もコードし、それは、活性な可動性エレメントである。そのＯＲＦは、典型的には、グループＩＩイントロンによってコードされるＲＮＡのドメインＤＩＶに見られる。グループＩＩイントロンＲＴは、触媒的に活性なＲＮＡ構造を安定化させることによってＲＮＡスプライシングを補助し、次いで、「レトロホーミング」と呼ばれるプロセスによってイントロンの可動性を促進するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）において、切り出されたイントロンＲＮＡに結合したままで残る。レトロホーミングは、ＲＮＰにおける切り出されたイントロンＲＮＡがＤＮＡ標的部位に直接挿入し、そのＲＴによって逆転写される機序によって生じる。グループＩＩイントロンが適切なＤＮＡ配列へのそのイントロンの標的化を促進するレトロホーミングにおいて、グループＩＩイントロンＲＴは、そのイントロンＲＮＡの正確なｃＤＮＡコピー（それは、典型的には、２〜２．５ｋｂ長であり、高度に安定したコンパクトな二次および三次構造に折り畳まれる）を生成しなければならない。したがって、グループＩＩイントロンＲＴは、その生物学的機能を果たすために、高い処理能力および忠実度を有しなければならない。また、グループＩＩイントロン由来ＲＴは、ＲＮａｓｅＨ活性を欠く。これは有益である場合がある。なぜなら、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを特異的に分解し、このことは、任意のＲＮＡを一度のみ複製することを許容し、完全長ｃＤＮＡの収量が減少し得るからである。
【００３５】
非レトロウイルス逆転写酵素によるＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドから標的ポリヌクレオチドへのテンプレートスイッチは、反応媒体中で行われる。その反応媒体は、本方法の間、ＤＮＡコピーの生成を可能にする十分量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むかまたは含むように調製され得、非レトロウイルス逆転写酵素の作用に適した温度（例えば、２５℃〜約８１℃）で維持されるべきである。水性媒体中での逆転写酵素の作用に必要な緩衝液および他の材料もまた、当業者に公知の量で含められる。例えば、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ−Ｓｅｒｇｅｒｉｅら、２００７）。
【００３６】
ＤＮＡコピーの形成を容易にするために使用される二本鎖鋳型／プライマー基質は、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドで構成されている。いくつかの実施形態において、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖は、ＲＮＡから作製されることにより、相補的なＲＮＡ鎖が提供され得る。他の実施形態において、相補オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡから作製されることにより、相補的なＤＮＡ鎖が提供され得る。好ましくは、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖は、ＲＮＡから作製される。なぜなら、ＲＮＡが、より効率的に使用されるからであり、最もおそらくは、逆転写酵素の天然の鋳型がＲＮＡであるからである。しかしながら、ＤＮＡも使用され得る。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ鋳型プライマーを使用したテンプレートスイッチを示している図１１を参照のこと。
【００３７】
逆転写酵素によって伸長される二本鎖鋳型／プライマー基質の末端は、平滑末端であり得、それは、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端と相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端とが同じ位置で終結し得ること、すなわち、対になっていないヌクレオチドなしで「直接整列され」得ることを意味する。あるいは、二本鎖鋳型／プライマー基質の同じ末端は、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端を超えて１ヌクレオチド伸長している「オーバーハング」を有し得る。テンプレートスイッチのために、ただ１つのオーバーハングまたは平滑末端を必要とすることは、テンプレートスイッチするためにＤＮＡプライマー鎖の３’末端と新しいＲＮＡ鋳型の３’末端との間に少なくとも２塩基対を必要とするレトロウイルス逆転写酵素に勝る利点を提供する（Ｏｚ−Ｇｌｅｅｎｂｅｒｇら、２０１１）。単一ヌクレオチドのオーバーハングを使用することにより、相補的な３’末端を有する核酸に特異的にテンプレートスイッチすることができるか、または経験的にデザインされた４種すべてのオーバーハングの混合物を使用することにより、テンプレートスイッチにおける偏りを減少させることができる。平滑末端に勝る単一ヌクレオチドのオーバーハングの利点は、オーバーハングを構成するヌクレオチドの比が、単一の標的ポリヌクレオチドの３’ヌクレオチド残基または標的ポリヌクレオチドの混合物の３’ヌクレオチド残基に相補的であるように所望のとおり調整され得る点である。オーバーハングが存在するとき、標的ポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドが、ＤＮＡプライマー鎖の３’末端におけるオーバーハングヌクレオチドに相補的であることが好ましく、それにより、これらの２つのヌクレオチドの塩基対形成による会合が容易になる。
【００３８】
「オーバーハング」は、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態を行いつつ、異なる位置にも提供され得る。これらの実施形態において、非レトロウイルス逆転写酵素は、１〜１５個のさらなる非相補ヌクレオチドをＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に付加した後、相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡコピーポリヌクレオチドを生成する。これらのヌクレオチドは、別の鎖と会合していないので、それらは、付加されたとき非相補的であるが、当然のことながら、適切な配列を有する標的ポリヌクレオチドが利用可能になる場合、それらは相補的になることもあり得る。さらなる実施形態において、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端におけるオーバーハングは、１〜１５ヌクレオチドより短いことがある。例えば、それは、１〜６ヌクレオチド、１〜３ヌクレオチドであり得るか、または単一のヌクレオチドであり得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドを複製する文脈のほかに、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端にオーバーハングを提供することが望ましい場合がある。したがって、本開示は、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドにさらなるヌクレオチドを付加する方法も提供する。この方法は、本明細書中に記載されるような、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドからなる二本鎖鋳型／プライマー基質を含む反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加える工程、および次いで、その非レトロウイルス逆転写酵素がそのＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に１〜１５個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加することを可能にする工程を含む。この方法のいくつかの実施形態において、非レトロウイルス逆転写酵素は、グループＩＩイントロン逆転写酵素である。さらなる実施形態において、たった１〜６個のさらなる非相補ヌクレオチドまたは単一の非相補ヌクレオチドでさえも、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することが好ましい場合がある。
【００４０】
本明細書中に記載される方法のある特定の実施形態は、相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチド鋳型鎖の３’末端に、そのオリゴヌクレオチドを終止しかつ逆転写酵素によるさらなる再複製を妨害するブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。そのブロッキング剤は、上記逆転写酵素がこのオリゴヌクレオチドを標的として使用することを妨害する。好適なブロッキング剤の例としては、３’−アミノ修飾因子Ｃ３および３’−アミノ修飾因子Ｃ７（その両方が、分枝リンカーを含み、そのアミノ基は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で保護されている）が挙げられる。他の潜在的な３’修飾因子は、チオール基；ＤＰＴＡ（３，３’−（ヒドロキシニトロソヒドラジノ］ビス−１−プロパンアミン）（これはオリゴヌクレオチドを金表面に結合体化するためにも使用され得る）；スペーサーホスホアミダイト修飾因子；またはグリセロールであり得る。スペーサー修飾因子は、光切断可能にされ得る。再複製を妨げるブロッキング剤の使用は、当業者に理解されており、ゆえに、本明細書中に記載される方法とともに他のブロッキング剤を使用してもよい。
【００４１】
テンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドにプライマーを結合する利点の１つは、好適なプライマーを多種多様の異なるポリヌクレオチドと同時に会合する能力である。したがって、本明細書中に記載される方法は、複数のＤＮＡコピーポリヌクレオチドを有するクローニングライブラリーを調製するために使用され得る。そのクローニングライブラリーは、本明細書中に記載されるような二本鎖鋳型／プライマー基質を複数の異なる標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合し、その反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加えて、その後の複製および／または同定を容易にする配列（例えば、アダプター配列）を含む標的ポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡポリヌクレオチドのライブラリーを形成することによって、調製される。任意の数のさらなる標的ポリヌクレオチドが含められ得る。例えば、２、５、１０、５０、１００またはそれを上回る異なる標的オリゴヌクレオチドが、本明細書中に記載される方法を用いてアダプター配列と同時に会合され得る。
【００４２】
さらなる実施形態は、ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを環状化するさらなる工程も含み得る。鎖の環状化とは、ＤＮＡコピーポリヌクレオチドの３’末端を５’末端に接続して、直鎖のポリヌクレオチド鎖ではなくＤＮＡ環をもたらすことを指す。環状化は、例えば、ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡを環状化する酵素であるＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ）で処理することによって行われ得る。そのＤＮＡの環状化によって、その鎖が、ＰＣＲおよび二方向プライマーを使用することによって容易に増幅されることが可能になる。
【００４３】
上記逆転写酵素（例えば、グループＩＩイントロン逆転写酵素）および二本鎖鋳型／プライマー基質は、ＤＮＡコピーポリヌクレオチドの調製または鋳型非依存性ヌクレオチド付加にとって有用なキットに組み込まれ得る。その二本鎖鋳型／プライマー基質は、先に記載したように平滑末端またはオーバーハング端を含み得る。そのようなキットは、１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブなど）（その各々が、ＤＮＡコピーポリヌクレオチドを調製するために使用される別個のエレメントの１つを含む）を受け入れるように区画化された運搬デバイスを備え得る。例えば、その内容物が溶液中に上記逆転写酵素を含む第１の容器が提供され得る。さらに、任意の数のさらなる容器が提供され得、それらの内容物は、独立して、二本鎖鋳型／プライマー基質および反応媒体の構成要素（例えば、ＤＮＡ合成用の好適な緩衝液およびヌクレオチド、例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ））を含み得る。そのキットは、１つ以上の標的ポリヌクレオチドも備え得るか、またはそのキットは、別の供給源から提供される標的ポリヌクレオチドとともに使用されるように構成され得る。上記の構成要素の任意の組み合わせが提供され得る。そのキットは、反応媒体に加えられる逆転写酵素が二本鎖鋳型／プライマー基質のＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長することを可能にして、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成された相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡコピーポリヌクレオチドを提供しつつ、その様々な構成要素の安定した貯蔵を提供するように構築され得る。
【００４４】
以下の実施例は、非レトロウイルス逆転写酵素を調製する方法、およびテンプレートスイッチを使用してＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドに連結するためまたは鋳型／プライマー基質にさらなるヌクレオチドを付加するためにその非レトロウイルス逆転写酵素を使用する方法を提供する。これらの実施例は、例証目的のために含められるものであって、本発明の範囲を限定すると意図されていない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦおよびＧｓＩ−ＩＩｃ  ＲＴの調製
発現プラスミドｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃは、Ｘａ因子部位の代わりにＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有する（Ｋｒｉｓｔｅｌｌｙら、２００３）ｐＭａｌ−ｃ２ｘの誘導体であるｐＭａｌ−ｃ２ｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）においてｔａｃプロモーターの後ろにクローニングされた融合されたＮ末端のＭａｌＥタグを有するＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＴｅＩ４ｃグループＩＩイントロンのＲＴ  ＯＲＦを含んでいる。このプラスミドは、ｐＵＣ１９（Ｍｏｈｒら、２０１０）にクローニングされたＴｅＩ４ｃイントロンのＴｅＩ４ｃ  ＲＴ  ＯＲＦを、制限酵素認識部位（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）を付加するプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、次いで、そのＰＣＲ産物をｐＭａｌ−ｃ２ｔの対応する部位にクローニングすることによって、構築された。ＴＥＶプロテアーゼで切断可能なリンカー（ＴＶＤＥＡＬＫＤＡＱＴＮＳ３Ｎ１０ＬＥＮＬＹＦＱＧ）（配列番号３）を、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅポリメラーゼ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ；Ｍａｋａｒｏｖａら、２０００）を使用するＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＰＣＲ手順によって強固なリンカー（ＴＶＤＡＡＬＡＡＡＱＴＮＡＡＡＡＡ）（配列番号４）で置き換えた。
【００４６】
ｐＭａｌＥ−ＧｓＩ−ＩＩＣを、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株１０のゲノムＤＮＡ（Ｇｒｅｇ  Ｄａｖｉｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手したもの）のＲＴ  ＯＲＦを、ＢａｍＨＩ部位を付加するプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、そのＰＣＲ産物をｐＭａｌ−ｃ２ｔの対応する部位の間にクローニングすることによって構築された。ＧｓＩ−ＩＩＣは、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノム内の複数のコピーに見られるグループＩＩＣイントロンである（ＣＰ００１７９４，Ｍｏｒｅｔｚ  ａｎｄ  Ｌａｍｐｓｏｎ  ２０１０）。クローニングされたＧｓＩ−ＩＩＣ  ＲＴ  ＯＲＦは、これらのゲノム配列のうちの１つに対応し、Ｖｅｌｌｏｒｅら（２００４）によってクローニングされたＲＴ  ＯＲＦと比べて３つのアミノ酸配列の変更を有する。
【００４７】
ＭａｌＥ−ＲＦ  ＲＴを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標），ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ  ＮＪ）またはＳｃａｒａｂＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｔ７ｌａｃ（Ｓｃａｒａｂ  ＧｅｎｏｍｉｃｓＴＭ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）においてｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃまたはｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ−ＩＩｃから発現させた。その大腸菌の株を、上記発現プラスミドで形質転換し、ＴＢまたはＬＢ培地において３７℃で対数期の中間（Ｏ．Ｄ．６００＝０．８）まで生育させ、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて１８℃で約２４時間インキュベートすることによって誘導した。次いで、その細胞を遠心分離によりペレットにし、４５ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトールおよび１０％グリセロール）に再懸濁し、−８０℃で凍結した。
【００４８】
ＭａｌＥ−ＲＦ  ＲＴを精製するために、その細胞懸濁液を解凍し、氷上で１５分間、リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）で処理し、ドライアイス上で３回凍結融解し、超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ  ４５０  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ，Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ  ＣＴ；氷上、６０％の強度による３または４回の１０秒間で破裂（ｂｕｒｓｔ）させた（破裂の間は１０秒間空けた））、４℃、１８，５００×ｇで３０分間遠心分離した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を０．２％の最終濃度まで加え、４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、核酸を沈殿させた。得られた上清を、緩衝液Ａで平衡化させておいたアミロースカラム（１０ｍｌのカラム体積；Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｈｉｇｈ−Ｆｌｏｗ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓＴＭ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に適用し、そのカラムを、０．５Ｍ、１．５Ｍおよび０．５Ｍ  ＫＣｌを含む各５カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、次いで、１０ｍＭマルトースを含む緩衝液Ａで溶出した。プールされたタンパク質画分を、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で予め平衡化させておいたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（３つのタンデム型の１ｍｌカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ  Ｃｏｒｐ．）によってさらに精製した。それらのタンパク質を、緩衝液Ａにおいて上記カラムに適用し、上記充填濃度から２Ｍ  ＫＣｌまでの４０カラム体積のグラジエントで溶出した。ピーク画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＫＣ１、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび５０％グリセロールに対して透析し、急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【００４９】
実施例２：ＬＩ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質）の調製
ＬｔｒＡタンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、タンパク質発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ２ｔ（上記を参照のこと）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの間の、ｔａｃプロモーターおよびΦ１０シャイン・ダルガノ配列の下流にクローニングされたＬｔｒＡ  ＯＲＦ（Ｍｉｌｌｓら、１９９６）を含むプラスミドｐＭＡＬ−ＬｔｒＡから発現させた。細胞の開始培養物をＬＢ培地中、３７℃で一晩生育させ、それを使用して０．５ＬのＬＢ培地を含む高収量フラスコ（ｕｌｔｒａ  ｙｉｅｌｄ  ｆｌａｓｋｓ）に接種し、それを３７℃で３時間生育させた後、１８℃で２４時間生育させることによって、自己誘導した（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ２００５）。細胞を遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＬＡ−８．１０００；４，０００×ｇ，１５分，４℃）によって回収し、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０％グリセロールおよび０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に再懸濁した。ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴの調製について上に記載したような３回の凍結融解サイクルおよび超音波処理によって溶解を行った。細胞残屑をペレットにした後（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒＴＭ  ＪＡ−１４ローター，１０，０００ｒｐｍ，３０分，４℃）、０．４％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および４℃で２０分間の一定の撹拌に続く遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒＴＭ  ＪＡ−１４ローター，１４，０００ｒｐｍ，３０分，４℃）を用いて、その上清から核酸を沈殿させた。次いで、４℃で１時間、一定で撹拌しながら、硫酸アンモニウムを５０％飽和まで加えることによって、その上清からタンパク質を沈殿させた。沈殿させたタンパク質をペレットにし（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒＴＭ  ＪＡ−１４ローター，１４，０００ｒｐｍ，３０分，４℃）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％グリセロールに溶解した。そのタンパク質を１０ｍｌアミロースカラム（Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｈｉｇｈ−Ｆｌｏｗ樹脂；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓＴＭ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に適用し、それを５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％グリセロールの３カラム体積で洗浄し、１０ｍＭマルトースを含む５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％グリセロールで溶出した。ＭａｌＥ−ＬｔｒＡを含む画分を、８０μｇ／ｍｌのＴＥＶプロテアーゼとともに４℃で１８時間インキュベートした。これらの画分を、４０ｍＭイミダゾールとともに充填され、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７，５、１０％グリセロール、４０ｍＭイミダゾールの３カラム体積で洗浄され、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％グリセロール、３００ｍＭイミダゾールで溶出される、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに通すＦＰＬＣによってＴＥＶプロテアーゼからさらに精製した。単量体ＬｔｒＡを、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））に通すＦＰＬＣによってさらに精製した。次いで、精製されたタンパク質を３０μＭまで濃縮し、透析によって１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％グリセロールに交換した。
【００５０】
実施例３：グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチを介したｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシング
ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴによる逆転写反応を、上記の精製タンパク質をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された人工オリゴヌクレオチド基質とともにインキュベートすることによって行った。いくつかの実験において、ファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））を製造者のプロトコルに従って使用して、ＤＮＡプライマーを［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（登録商標））で５’末端標識した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で１．１：１のモル比で混合し、ＰＣＲ機器（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ９７００，Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、８２℃に２分間加熱し、次いで、１０分間にわたって室温に冷却することによって、プライマーをＲＮＡ鋳型鎖にアニールした。図の説明文に明記されている条件下で１０〜４０μｌの反応媒体中において逆転写反応を行った。反応を、酵素を加えることによって開始し、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳを加えることによって終了させた後、フェノール−ＣＩＡ抽出した。標識されたプライマーを用いた実験の場合、生成物を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて解析した。
【００５１】
グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチを介したｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングのために、本発明者らは、デオキシウリジンを含む５’標識Ｐｃプライマー（５’−ＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＧＣＣ／ｄＵ／ＧＣＴＧＴＡ３’）（配列番号６）に１：１．１モル比でアニールした３’アミノ修飾因子（ＡｍＭＯ，６〜７個の炭素のリンカーを介して１級アミンに付着される；ＩＤＴ）を有するＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｏｌｇｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（５’−ＣＧＣＣＵＵＧＧＣＣＧＵＡＣＡＧＣＡＧＣＣＵＣＵＣＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＣＧＧＵＧＡＵ−ＡｍＭＯ−３’）（配列番号５）からなる合成ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマーを使用した。逆転写反応のために、その鋳型／プライマー基質（５０または１００ｎＭ）を、図の説明文に記載されている条件下で５０〜１００μｌの反応媒体中において等モル濃度のｍｉＲＮＡｘ（５’Ｐｈｏｓ−ＮＮＣＧＣＵＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＮＮ３’）（配列番号７）およびＲＴ（最終２〜２．５μＭ）とともにインキュベートした。得られたｃＤＮＡを、５５℃で５分間、熱安定性ＲＮａｓｅＨ（ＨｙｂｒｉｄａｓｅＴＭ；２０ユニット；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））で処理した。ゲル切片を破砕し、それらを一晩、０．５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ６．５、０．１％ＳＤＳ中に浸漬することによって、ｃＤＮＡ産物を変性２０％ポリアクリルアミドゲルからバンド単離した。溶出されたｃＤＮＡを、フェノール抽出し、直鎖アクリルアミドキャリア（５８μｇ／ｍｌ）の存在下において０．３Ｍ酢酸ナトリウムを用いて沈殿させ、水に溶解し、場合によっては、ＱｉａｇｅｎＴＭ  ＭｉｎＥｌｕｔｅキットを使用して精製した。次いで、そのｃＤＮＡを、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩまたはＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））を製造者の指示書に従って使用して環状化し、製造者の指示書に従ってエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））で処理することにより、任意の残存する直鎖ｃＤＮＡ分子を除去した。環状化されたｃＤＮＡを、ＰＣＲにとって十分低いＥＤＴＡ濃度を維持するために０．５×濃度の切り出し緩衝液を用いて、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）ウラシルＤＮＡ切り出し（ＵＤＥ）キットを製造者の指示書に従って使用して、再度直鎖化した。その反応産物を、ＳＯＬｉＤ５’および３’プライマー
【００５２】
【化１】
2014506483.tif 000003
を使用し、製造者の指示書に従ってＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘポリメラーゼ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）またはＦｌａｓｈ  Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、９５℃、５５℃および６８℃（各々５秒間）の１５〜３５サイクルにわたって増幅した。そのＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルからバンド単離し（Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｍ１３  Ｆ（−２０）プライマーを用いたＳａｎｇｅｒシーケンシングに向けて、ＴＡクローニングしたか（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）もしくはＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）にクローニングしたか、またはＳＯＬｉＤシーケンシングによって直接、配列決定した。
【００５３】
グループＩＩイントロンＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質）による逆転写反応を、２０μｌの４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および２００μＭ  ｄＮＴＰ中において、上記の精製タンパク質を人工オリゴヌクレオチド基質（下記を参照のこと）とともにインキュベートすることによって行った。その反応構成要素を氷上に集め、基質を最後に加え、３０℃で３０分間インキュベートした。フェノール−ＣＩＡ抽出によって反応を終了させた。その反応産物の一部（３μｌ）を、等体積のゲルローディングバッファーＩＩ（９５％ホルムアミド、１８ｍＭ  ＥＤＴＡ、ならびに各々０．０２５％のＳＤＳ、キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））に加え、９８℃で７分間変性させ、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＴＭでスキャンされる変性１０または１５％ポリアクリルアミドゲルにおいて泳動した。
【００５４】
図４に記載されている反応は、
【００５５】
【化２】
2014506483.tif 000004
を使用した。
【００５６】
図５に記載されている反応は、
【００５７】
【化３】
2014506483.tif 000005
を使用した。
【００５８】
ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手し、ゲル切片をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内において−８０℃で１０分間凍結し、次いで破砕し、それらを一晩、４℃において０．５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ６．５および０．１％ＳＤＳ中に浸漬することによって、変性１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルにおいてゲル精製した。オリゴヌクレオチドを、Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター，０．４５μｍポアサイズ（ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ  Ｉｎｃ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を使用することによってゲルフラグメントから分離し、次いで、直鎖アクリルアミドキャリア（５８μｇ／ｍｌ）の存在下においてエタノール沈殿させ、ヌクレアーゼ不含水に溶解した。ＤＮＡプライマーを、ファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））を製造者のプロトコルに従って使用して［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で５’末端標識した。プライマーのアニーリングのために、オリゴヌクレオチドを、ＲＴアッセイにおいて使用された２０×濃度で混合し、次いで、８２℃に加熱し、１×アニーリング緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において４５分間にわたって２５℃までゆっくり冷却した。アニーリングの効率を、Ｔｒｉｓ−ボラート−ＥＤＴＡ（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ  ホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む非変性１０％ポリアクリルアミドゲルにおける３０℃での電気泳動によって評価した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【００５９】
Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴを用いて合成されたｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングのために、バンドを切り出し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内において−８０℃で１０分間凍結し、そのチューブ内で破砕し、６００μｌの５００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１００μＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ６．５および０．１％ＳＤＳを加え、４℃で一晩インキュベートすることによって、変性１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル切片からｃＤＮＡ産物をゲル精製した。それらのオリゴヌクレオチドを、Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター，０．４５μｍポアサイズ（ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ  Ｉｎｃ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を使用することによってゲルフラグメントから分離し、直鎖アクリルアミドキャリア（５８μｇ／ｍｌ）の存在下においてエタノール沈殿させ、ヌクレアーゼ不含水に溶解した。そのｃＤＮＡを、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩまたはＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））を使用して環状化し、エキソヌクレアーゼＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））で処理し、ＰＣＲにとって十分低いＥＤＴＡ濃度を維持するために０．５×濃度の切り出し緩衝液を用いてウラシル−ＤＮＡ切り出し酵素混合物（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））で直鎖化した（すべて製造者の指示書に従って）。図４の実験の場合、直鎖化された産物を、プライマーＡｎｃｈｏｒ６相補鎖（５’−ＣＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧ）（配列番号１８）およびＡｎｃｈｏｒ５（５’−ＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧ）（配列番号１９）とともに、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓＴＭ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用することによってＰＣＲ増幅した。図５の実験の場合、直鎖化された産物を、プライマーＡｎｃｈｏｒ４相補鎖（５’−ＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＧＣＣＡＧＡＴＧ）（配列番号２０）およびＡｎｃｈｏｒ５（上記を参照のこと）を用いて同様にＰＣＲ増幅した。以下のサイクル条件：９８℃での２分間の最初の変性、９８℃１０秒間、６０℃１０秒間、７２℃５秒間の２５サイクル、および７２℃での７分間の最後の伸長を用いて、５０μｌの反応媒体Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓＴＭ）においてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、２％アガロースにおいて分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いてゲル精製した後、製造者のプロトコルに従ってＴＯＰＯ−ＴＡ  ｐＣＲ２．１ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）にクローニングした。ランダムなコロニーを拾い、クローニングされたＰＣＲ産物を、プライマーＭ１３  Ｆ（−２０）（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）（配列番号２１）およびＭ１３  Ｒ（−２６）（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）（配列番号２２）とともにＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒを使用するコロニーＰＣＲによって増幅し、次いで、Ｍ１３  Ｒ（−２４）（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）（配列番号２３）プライマーを使用して配列決定した。
【００６０】
実施例４：熱安定性ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦグループＩＩイントロンＲＴによるテンプレートスイッチおよび鋳型非依存性ヌクレオチド付加の解析
図１は、熱安定性ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦグループＩＩイントロンＲＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴが、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡという名称のＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質から２１ｎｔのＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｍｉＲＮＡｘという名称）（その配列は、テンプレートスイッチにおける偏りを評価するために、５’末端と３’末端の両方に２つのランダム化されたヌクレオチド残基（Ｎ）を有する、植物ｍｉＲＮＡ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ａｔｈ  ｍｉｒ−１７３；Ｐａｒｋら、２００２）の配列と類似している）の３’末端にテンプレートスイッチする能力を比較している。その鋳型／プライマー基質は、ＳＯＬｉＤ次世代シーケンシング用のＩｎｔｅｒｎａｌ  Ａｄａｐｔｏｒ（ＩＡ）およびＰ１配列を含む４２ｎｔの鋳型ＲＮＡ（ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡという名称）（それは、Ｐ１およびＩＡ配列の一部に相補的なアニールした３１ｎｔのＤＮＡプライマー（Ｐｃという名称）を有する）からなる（図２）。そのＩＡ−Ｐ１鋳型ＲＮＡは、その３’末端へのテンプレートスイッチによる再複製を妨害する３’−アミノ修飾因子（ＡｍＭＯ；ＩＤＴ）を用いて合成され、ＰｃＤＮＡプライマーは、その５’末端において３２Ｐ標識され、環状化されたｃＤＮＡをその後、ウラシルＤＮＡ切り出し混合物（ＵＤＥ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ；図２）を用いて直鎖化するために内部にデオキシウリジンを含む。ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴによる逆転写反応を、各酵素に対する最適条件下で行った（図１の説明文を参照のこと）。
【００６１】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩは、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ鋳型の５’末端へのＰｃプライマーの伸長によって生じる約４２ｎｔの単一の優勢な生成物（ＩＡ−Ｐ１  ｃＤＮＡ）をもたらすが、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴは、同様の生成物に加えて、ＩＡ−Ｐ１アダプター配列に１、２または３コピーの２１ｎｔのｍｉＲＮＡｘを連結するテンプレートスイッチに対して予想される一連のより大きなサイズのバンドをもたらす。ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡの末端でのｃＤＮＡ合成の終止によって生じる主要な約４２ｎｔのバンドは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩよりもＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴの場合のほうがわずかに大きいことから、このグループＩＩイントロンＲＴでは、それがＲＮＡ鋳型の５’末端に達した後、余分なヌクレオチド残基をそのｃＤＮＡの３’末端に付加する傾向がより強いことが示唆される。そのような余分なヌクレオチド付加は、他のＤＮＡポリメラーゼおよびＲＴの特性である（Ｃｌａｒｋら、１９８７；Ｃｌａｒｋ  １９８８，Ｈｕ  １９９３，Ｐａｔｅｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｏｎ  １９９４，Ｐｅｌｉｓｋａ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ  １９９２，Ｇｏｌｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ２００２）。それは、その酵素が鋳型の５’末端に達した後にＤＮＡ産物鎖の３’末端で生じるので、一般に、「鋳型非依存性ヌクレオチド付加」または「ターミナルトランスフェラーゼ」活性と呼ばれる（Ｇｏｌｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ２００２，Ａｎｄｒａｄｅら、２００９）。本明細書中で、本発明者らは、それを鋳型非依存性ヌクレオチド付加活性または余分なヌクレオチドの付加活性と称する。
【００６２】
グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチを介して合成されたｃＤＮＡをクローニングおよび配列決定するために、本発明者らは、図２に概説されている手順を開発した。グループＩＩイントロンＲＴによるｃＤＮＡ合成の後、その産物を、ＲＮａｓｅＨとともにインキュベートしてＲＮＡ鋳型鎖を消化し、変性２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて精製し、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅで環状化し、エキソヌクレアーゼで消化することにより、ライゲートされていないｃＤＮＡを除去する。次いで、環状のｃＤＮＡを、ウラシルＤＮＡ切り出し混合物を用いて、ＰｃＤＮＡプライマー配列（図２，下）に組み込まれていたデオキシウリジン残基において再度直鎖化することにより、ＳＯＬｉＤ  ５’および３’プライマーを使用した容易な増幅が可能になる。
【００６３】
図２の手順におけるｃＤＮＡのゲル精製の工程は、特定のサイズのｃＤＮＡバンドの同定を必要としない用途の場合は省くことができる。そのｃＤＮＡは、第２のアダプターをそのｃＤＮＡの３’末端にライゲートするか、または一続きの相補ホモポリマー（例えば、ポリ（ｄＴ））を含む第２のアダプターのアニーリングを可能にするホモポリマーテイル（例えば、ポリ（ｄＡ））を付加する、上記ＲＴもしくは別の酵素（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）の鋳型非依存性ヌクレオチド付加活性を使用することによって、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを使用せずにクローニングすることもできる。さらに、そのｃＤＮＡが変性ゲルにおいてゲル精製される場合、ＲＮａｓｅＨ処理は自由選択である。環状化されたｃＤＮＡは、ウラシル切り出し直鎖化工程なしにＰＣＲ増幅され得るか、またはいくつかの他の手段（例えば、オリゴヌクレオチドアダプターに組み込まれた制限酵素認識部位における制限酵素消化）によって直鎖化され得る。下に記載される種々の実験では、ｃＤＮＡの増幅から生じたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡベクターにクローニングしたか、もしくはＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）にクローニングしてＳａｎｇｅｒ法によって配列決定したか、または次世代ＳＯＬｉＤシーケンシングによって直接配列決定した。
【００６４】
図３は、図１と同じ条件下でのＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴのテンプレートスイッチによって生成されたｃＤＮＡの配列を示している。ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＤＮＡプライマー基質からｍｉＲＮＡｘへの第１のテンプレートスイッチ、およびｍｉＲＮＡｘの第２の分子への第２のテンプレートスイッチから生じた可能性があるｃＤＮＡを、バンド単離し、図２に示されている手順を用いてクローニングし、Ｍ１３Ｆ（−２０）プライマーを用いてＳａｎｇｅｒ法によって配列決定した。約６５ｎｔの産物のクローニングおよびシーケンシングから、それがＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡアダプター配列からｍｉＲＮＡへのテンプレートスイッチから生じたものであり、それによって、そのアダプターとｍｉＲＮＡ配列とが連結されたことが確かめられた。すべての場合において、そのテンプレートスイッチは、その２つのＲＮＡ配列の接合点に余分なヌクレオチド残基の付加なく継ぎ目なしに生じた。しかしながら、１〜１５個の余分なヌクレオチド残基が、ｍｉＲＮＡ鋳型の５’末端に達した後、ｃＤＮＡの３’末端に付加され、Ａ残基が１番目の余分なヌクレオチドとして優先的に付加された。さらに、そのｃＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ鋳型の３’末端ヌクレオチド残基の向かい側の位置に有意な偏りを示した：Ａ，４６％；Ｃ；３３％；Ｇ，２１％；およびＵ，０％。そのｃＤＮＡ配列におけるこれらの偏りは、鋳型／プライマー基質からのテンプレートスイッチが、３’末端にＵ残基を有するｍｉＲＮＡを好み、３’末端にＡ残基を有するｍｉＲＮＡを強く嫌ったことを示唆する。
【００６５】
約８５ｎｔの産物のクローニングおよびシーケンシングから、その産物が、ｍｉＲＮＡ鋳型への２つの連続したテンプレートスイッチから生じたものであり、それにより、タンデムな２コピーのｍｉＲＮＡ配列に連結されたＩＡ−Ｐ１アダプター配列が生じたことが確かめられた（図示せず）。また、アダプター配列の付着は、解析された１１個のクローンにおいて、余分なヌクレオチド残基が第１または第２のテンプレートスイッチの接合点に組み込まれずに、継ぎ目なしに生じた。しかしながら、完成したｃＤＮＡの３’末端に再度、余分なヌクレオチド残基が付加され（Ａ残基が１番目の余分なヌクレオチドとして優先的に付加された）、最初のテンプレートスイッチは、再度、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡから３’Ａ残基を有するｍｉＲＮＡへのスイッチに反する強力な偏りを示した（ｃＤＮＡ配列において、３’末端のｍｉＲＮＡヌクレオチドの向かい側の位置にＴ残基が欠如していたことによって示唆される（図示せず））。
【００６６】
実施例５：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｌｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質）によるテンプレートスイッチおよび鋳型非依存性ヌクレオチド付加の解析
テンプレートスイッチおよび鋳型非依存性ヌクレオチド付加に対する傾向が、グループＩＩイントロンＲＴの一般的な特性であるか否かを決定するために、本発明者らは、中温性のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｌｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンＲＴを用いて生化学的アッセイを行った。図４Ａに示される実験において、最初の鋳型／プライマー基質は、６０ｎｔのＲＮＡ鋳型（その５’末端は、アニールした４５ｎｔのＤＮＡプライマー（プライマーｃ；その図ではＰｒｉ  ｃという名称）を有するＬｌ．ＬｔｒＢイントロンの末端に対応する）からなるものだった。そのＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、アニールしたＤＮＡプライマーからイントロンＲＮＡ鋳型の逆転写を開始し、それをそのＲＮＡの５’末端まで伸長し、次いでそのＲＴは、ｌｔｒＢエキソン１（Ｅ１  ＲＮＡまたはＤＮＡ）のヌクレオチド配列を有する第２の４０ｎｔのＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型に飛び移り得る。Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの３’末端は、そのＲＴが最初の鋳型の第２の分子に切り換わる能力を妨害するアミノ修飾因子（ＡｍＭＯ）を有する。その反応は、２００μＭ  ｄＮＴＰ、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む反応媒体において行われた（その高い塩濃度は、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴの最適な活性のために必要とされると以前に示されている（Ｓａｌｄａｎｈａら、１９９９））。
【００６７】
図４Ａのレーン５および６は、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴが、プライマーをイントロンＲＮＡ鋳型の末端まで効率的に伸長して、標識された約６０ｎｔの主要な産物（そのサイズは、最初のＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡ鋳型の末端までのＰｒｉ  ｃ  ＤＮＡプライマーの伸長について予想されるサイズである）に加えて、それより少量のそれより大きいサイズの産物（そのサイズは、エキソン１  ＤＮＡもしくはＲＮＡ（１００ｎｔ）、またはアミノ修飾因子にもかかわらずＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの第２の分子（１２０ｎｔ）へのテンプレートスイッチに対して予想されるサイズである）をもたらすことを示している。その約６０ｎｔの産物は、最初のｃＤＮＡの３’末端への鋳型非依存性ヌクレオチド付加をおそらく反映するダブレットとして分離された。コントロールレーン（レーン１〜４）は、そのような標識された産物が、プライマーｃ単独の場合、あるいはＲＴ単独とともに、またはエキソン１  ＲＮＡもしくはＤＮＡの存在下において、インキュベートされたプライマーｃの場合に検出されなかったことを示している（レーン１〜４）。
【００６８】
ｃＤＮＡ産物のクローニングおよびシーケンシングを図４ＢおよびＣに要約する。そのシーケンシングから、主要な約６０ｎｔの産物（レーン５のバンドａおよびｂ、ならびにレーン６のｈおよびｉ）が、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの５’末端までまたは５’末端付近まで伸長しているｃＤＮＡに対応することが確かめられ、そのダブレットは、ＲＮＡ鋳型の末端に到達した際のｃＤＮＡの３’末端への、余分なヌクレオチドであるヌクレオチド残基（主にＡ残基）の付加を反映している（図４ＢおよびＣ）。
【００６９】
より大きなバンド（レーン５のバンドｃ〜ｇおよびレーン６のｈ〜ｎ）は、イントロンの５’末端からエキソン１  ＤＮＡまたはＲＮＡの３’末端へのテンプレートスイッチによって生成された産物（図４ＢおよびＣ）、ならびに内部領域またはアミノ修飾因子にもかかわらずＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡの３’末端へのテンプレートスイッチによって生成された産物を含む（図示せず）。バンドｃ、ｄおよびｅは、エキソン１  ＤＮＡへのテンプレートスイッチによって生成された産物を含む（図４Ｂ）。バンドｊ、ｋおよびｌは、エキソン１  ＲＮＡへのテンプレートスイッチによって生成された産物を含む（図４Ｃ）。エキソン１  ＤＮＡへのテンプレートスイッチのほとんど（７０％）が継ぎ目なしに生じたが、余分なヌクレオチド残基（主にＡ残基）が、テンプレートスイッチ接合点のいくつか（３０％）、ならびにＤＮＡ産物のほとんど（９２％）の３’末端に見られた。本発明者らは、エキソン１  ＲＮＡへのテンプレートスイッチ接合点の６１％が、余分なヌクレオチド残基を有し、ｃＤＮＡの３’末端の４４％が、両方の場合において余分なヌクレオチド残基（主にＡ残基）を有したことを見出した。本発明者らは、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡへのテンプレートスイッチ接合点の４８％が、余分なヌクレオチド残基を有し、ｃＤＮＡの３’末端の５０％が、両方の場合において余分なヌクレオチド残基（主にＡ残基）を有したことを見出した（図示せず）。場合によっては、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、一続きのＡ残基を付加する。バンドｇは、エキソン１  ＤＮＡへの２つの連続したテンプレートスイッチによって生成された産物を含む。バンドｎは、エキソン１  ＲＮＡへの２つの連続したテンプレートスイッチによって生成された産物を含む。バンドｄ、ｆ、ｊ、ｋおよびｍは、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡへのテンプレートスイッチによって生成された産物を含む。バンドｍは、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡへの２つの連続したテンプレートスイッチによって生成された産物も含む。バンドｋは、２つの連続したテンプレートスイッチ（１つ目はエキソン１  ＲＮＡへのテンプレートスイッチであり、続いてＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＮＡへのテンプレートスイッチ）によって生成された産物も含む。複数のテンプレートスイッチによる産物は、テンプレートスイッチ接合点のいくつかおよびほとんどのｃＤＮＡの３’末端に組み込まれる鋳型非依存性ヌクレオチド残基（ほとんどの場合、Ａ残基）を含む単一のテンプレートスイッチによる産物と同様の特徴を有する。テンプレートスイッチの間に余分な鋳型非依存性ヌクレオチド残基を付加する傾向は、これらの実験ではＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴよりもＬｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴが大きいことから、ＲＴまたは実験条件のいずれかの差異が反映される。とりわけ、図４の実験は、第２の鋳型がＲＮＡであるかＤＮＡであるかに関係なく、グループＩＩイントロンＲＴによるテンプレートスイッチが生じ得ることを示している。
【００７０】
図５は、アニールしたＤＮＡプライマー（ｅ２）を有するｌｔｒＢエキソン２（Ｅ２）ＤＮＡまたはＲＮＡに対応する種々の鋳型／プライマー基質を使用する、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴを用いた生化学的アッセイの第２のセットを示している。以前の研究（Ｓｍｉｔｈら、２００５）から予想されるように、Ｌｌ．ＬｔｒＢ  ＲＴは、ＲＮＡ鋳型に対しては高いＲＴ活性を示したが、ＤＮＡ鋳型に対しては低いＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性しか示さなかった（図５Ａ，レーン３および４）。ＲＮＡ鋳型を用いて得られた産物の大部分は、１０ｎｔの５’オーバーハングを超えて伸長し（図５Ａ，レーン４）、これらのｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングから、最大７個のＣ残基の一続きのホモポリマーを含む余分なヌクレオチド残基（ここでは主にＣ残基）が、ｃＤＮＡの３’末端に付加されていることが明らかになった（図５Ｂ）。シーケンシングは、図５Ｂのレーン４におけるより大きな産物が、最初のＥ２  ＲＮＡから、Ｅ２  ＲＮＡの第２のおよび時折、第３の分子（それらは、この実験では、テンプレートスイッチを妨害する３’アミノ修飾因子を有しなかった）へのテンプレートスイッチによって生成されたことを示した（図５Ｂ）。これらの場合、余分なヌクレオチド残基（再度、主にＣ残基）が、テンプレートスイッチ間の接合点およびｃＤＮＡの３’末端に見られた。これらの知見は、グループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加の特異性が、種々の鋳型／プライマー基質およびｃＤＮＡに対して異なり得ることを示している。同様の知見が、他のＲＴおよびＤＮＡポリメラーゼについても得られており、それは、例えば、その他のものよりもいくつかの入来ヌクレオチドを好む塩基スタッキング相互作用に関与し得る、ＤＮＡ産物鎖の末端ヌクレオチド残基の差異が原因となっている（Ｈｕ  １９９３；Ｍａｇｎｕｓｏｎら、１９９６；Ｇｏｌｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ２００２）。グループＩＩイントロンＲＴが一続きのホモポリマーを含む余分なヌクレオチド残基をｃＤＮＡの３’末端に付加する能力は、ｃＤＮＡクローニング（例えば、相補ヌクレオチド残基のオーバーハングを含むベクターへのクローニング、または相補的なホモポリマー配列を有する第２のアダプターのアニーリングを可能にすることによるクローニング）のために、使用され得る。
【００７１】
実施例６：グループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加における反応条件の変更の影響
グループＩＩイントロンＲＴがｃＤＮＡの３’末端に余分なヌクレオチド残基を付加する能力は、潜在的に有用であるが、ｃＤＮＡの正確なサイジングを必要とするいくつかの用途（例えば、キャピラリー電気泳動）にとっては有害である場合があり、ｃＤＮＡの３’末端と新しいＲＮＡ鋳型の３’末端との間に相補性を導入することによってテンプレートスイッチにおける偏りに関与することができた。図３の実験では、例えば、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴによるｃＤＮＡの３’末端への余分なＡ残基の優先的な付加は、その優先的な付加を、相補的な３’Ｕ残基を有するｍｉＲＮＡへのテンプレートスイッチに偏らせることができ、不一致の３’Ａ残基を有するｍｉＲＮＡを嫌うことがあった。グループＩＩイントロンＲＴによるテンプレートスイッチは、ｃＤＮＡと新しいＲＮＡ鋳型との間の塩基対形成なしでも生じ得るが、ｃＤＮＡの３’末端に付加された余分なヌクレオチド残基との塩基対形成または不一致に対する可能性は、その他のものよりもいくかの鋳型へのスイッチを強く好み得る。したがって、ｃＤＮＡの３’末端への鋳型非依存性ヌクレオチド付加の程度が最小限にされ得るかまたは制御され得る条件を見つけ出すために時間を費やした。
【００７２】
そのような条件を見つけ出すために、ＲＮＡ鋳型の５’末端まで完全に伸長されたｃＤＮＡプライマーを模倣する平滑５’ＲＮＡ／３’ＤＮＡ末端を有するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を使用する図６に示されているアッセイを使用した。このＤＮＡ基質を、種々の濃度の４種の各ｄＮＴＰの存在下の種々の反応条件下でＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴとともにインキュベートした。その結果は、（ｉ）この鋳型／プライマー基質ＲＮＡに対するＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴによるＤＮＡ鎖の３’末端への鋳型非依存性ヌクレオチド残基の付加に対する優先性の順序がＡ＞Ｇ＞Ｃ＞Ｔであること；（ｉｉ）鋳型非依存性ヌクレオチド付加が、より高い一価塩濃度およびより低いＭｇ２＋濃度（例えば、４５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  Ｍｇ２＋）と、より低いｄＮＴＰ濃度（例えば、１ｍＭではなく１μＭ）との組み合わせによって減少し得ることを示した。鋳型非依存性ヌクレオチド付加が、ＡＴＰによって減少し得ることも見出された（ＡＴＰは、以前に、ＨＩＶ−１  ＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させると見出されていた（Ｇｏｌｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ２００２））。他の実験において、本発明者らは、グループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加が、ｃＤＮＡ合成と比べて相対的に遅い反応であり、ゆえに、その反応を短時間行うことによって減少し得ることも見出した。低いｐＨは、ＨＩＶ１  ＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させると報告されており（Ｇｏｌｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  ２００２）、同様に、グループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加も減少させ得る。ｄＮＴＰ濃度に対する鋳型非依存性ヌクレオチド付加の強い依存性は、異なる比のｄＮＴＰを使用することによって、特定の１種のｄＮＴＰの付加に有利に働く可能性があり、それにより、ｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングのための、相補ヌクレオチドとのアニーリングを可能にし得る一続きのホモポリマー（例えば、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｃ））がもたらされ得ることを示唆する。グループＩＩイントロンＲＴは、ＤＮＡの３’末端に所望のテイルを付加するために単一のｄＮＴＰを用いる別個の反応工程においても使用され得る。
【００７３】
実施例７：鋳型非依存性ヌクレオチド付加を最小限にする反応条件下でのテンプレートスイッチによるｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシング
グループＩＩイントロンＲＴによる鋳型非依存性ヌクレオチド付加を最小限にする反応条件が同定されたので、ｍｉＲＮＡクローニングおよびシーケンシング実験（ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴが、ＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ／ＰｃＤＮＡ鋳型−プライマー基質から、５’末端と３’末端の両方に２つのランダム化されたヌクレオチドを有する２１ｎｔのｍｉＲＮＡにテンプレートスイッチする）を繰り返したが、ここでは、鋳型非依存性ヌクレオチド付加を減少させることを意図した反応条件下で（４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１０分間）行った。得られたｃＤＮＡを、図２のプロトコルを用いてクローニングし、１ｍＭ  ｄＮＴＰの濃度を使用して、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング（図示せず）と次世代ＳＯＬｉＤシーケンシングの両方によって解析した。
【００７４】
図７は、ＳＯＬｉＤシーケンシングによって得られた２，２３９，０７２個の高品質リードのうち最も豊富な２０個の配列を示している。その２，２３９，０７２個の高品質リードのうち、４９％が、１コピーのｍｉＲＮＡｘを有し、５１％が、別のｍｉＲＮＡｘ鋳型への第２のテンプレートスイッチを反映する２つのタンデム型ｍｉＲＮＡｘ配列を有した。ｍｉＲＮＡｘモノマーリードとダイマーリードとの比は、シーケンシングの前の最初のｃＤＮＡ産物のよりストリンジェントなゲル精製によって高められ得る。それらの配列から、改変された反応条件によって、ｃＤＮＡの３’末端への鋳型非依存性ヌクレオチド付加が減少したことが確かめられた（図７）。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって解析されたｃＤＮＡのうち、３３％しか、余分な３’ヌクレオチド残基（最も頻繁には単一のＡ残基）を有しなかった（図示せず）。ＳＯＬｉＤシーケンシングの場合は、Ｐ２配列に連結されたｍｉＲＮＡｘモノマー配列を有した９７５，０２０個の高品質リードのうち、５０％が、１つ以上の余分な３’ヌクレオチド残基（最も頻繁には単一のＡ残基）を有し（２４４，８７７リード）、ｍｉＲＮＡｘダイマーの１，１３８，６３６個の高品質リードのうち、４８％が、１つ以上の余分な３’ヌクレオチド残基（再度、最も頻繁には単一のＡ残基）を有した（２５５，２５７リード；図示せず）。しかしながら、それらのｃＤＮＡ配列は、なおもｍｉＲＮＡｘ鋳型の３’末端ヌクレオチド残基の向かい側の位置に強い偏りを示した（高品質ｍｉＲＮＡｘモノマーリードの９７４，２７６個（上記を参照のこと）に基づくｃＤＮＡ配列においてＡ，７５％；Ｃ，８％、Ｇ，９％；Ｔ；８％（この位置は明確に解読することができた））が、ＲＮＡ鋳型の末端から２番目のヌクレオチド残基の向かい側のランダム化された位置には、有意な偏りは認められなかった。鋳型の３’末端の位置の向かい側に見られた偏りは、テンプレートスイッチが、ｃＤＮＡの３’末端に優先的に付加された鋳型非依存性Ａ残基と塩基対形成し得る３’Ｕ残基を有するｍｉＲＮＡｘ分子に優先的に生じるモデルと一致する。
【００７５】
実施例８：種々のＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質の使用によるテンプレートスイッチの偏りの最小化
鋳型非依存性ヌクレオチド付加によって引き起こされるテンプレートスイッチの偏りを減少させるための他のアプローチを探索した。１つのアプローチにおいて、本発明者らは、ｃＤＮＡが最初のＲＮＡ鋳型の末端に到達したときの構造を模倣する、種々の末端塩基対を有する平滑末端のＲＮＡ／ＤＮＡ鋳型−プライマー基質からのテンプレートスイッチを試験した。図８は、４つの可能性のある５’ＲＮＡ／３’ＤＮＡ塩基対の各々で終結している平滑末端の基質から、種々の３’末端ヌクレオチドを有するｍｉＲＮＡｘオリゴヌクレオチドへのテンプレートスイッチのゲル解析を示している。テンプレートスイッチ産物のバンド強度を定量し、各レーンにおける放射能の量に対して正規化することによって、４種の各ヌクレオチド残基で終結しているＲＮＡに対して生じたテンプレートスイッチのパーセンテージの推定値を得た。Ｕ／Ａ、Ｃ／ＧまたはＡ／Ｔ塩基対で終結しているＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質のすべてが、３’Ｃ残基を有するｍｉＲＮＡｘへのテンプレートスイッチに対して優先性を示したが、Ｇ／Ｃ塩基対で終結しているＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質は、３’Ｕ残基で終結しているｍｉＲＮＡｘに対していくらかの優先性を示したにもかかわらず、４種すべてのヌクレオチド残基で終結しているｍｉＲＮＡｘに効率的にテンプレートスイッチした（３つの別個の実験において、Ｕ，４３〜５９％；Ｇ，２９〜３０％；Ｃ，１７〜１９％；およびＡ，４〜１２％）。したがって、異なる形状およびヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質（例えば、Ｇ／Ｃ塩基対で終結している平滑末端ＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質）の使用を用いることにより、テンプレートスイッチの偏りが最小限にされ得る。
【００７６】
図９Ａは、ｃＤＮＡの３’末端への１つのヌクレオチド残基の鋳型非依存性付加に対して予想される構造を模倣する、プライミング鎖の種々の３’オーバーハングを含むＩＡ−Ｐ１  ＲＮＡ鋳型／ＰｃＤＮＡプライマー基質のセットを使用する第２のアプローチを示している。その結果は、これらの鋳型／プライマー基質が、予想通り、相補的な３’ヌクレオチド残基を有するＲＮＡ鋳型における開始を好んだが、なおも、他の３’末端ヌクレオチドを有するＲＮＡにある程度テンプレートスイッチし得ることを示した。したがって、３’Ａオーバーハングを有する鋳型／プライマー基質が、相補的な３’Ｕ残基を有するｍｉＲＮＡｘへのテンプレートスイッチに対して強い優先性を示し；３’Ｃオーバーハングを有する鋳型／プライマー基質は、相補的な３’Ｇ残基を有するｍｉＲＮＡｘならびに非相補的３’Ｃ残基を有するｍｉＲＮＡｘに効率的にテンプレートスイッチし；３’Ｇオーバーハングを有する鋳型／プライマー基質は、相補的な３’Ｃ残基を有するｍｉＲＮＡｘならびに非相補的３’Ｇ残基を有するｍｉＲＮＡに効率的にテンプレートスイッチし；３’Ｔオーバーハングを有する鋳型／プライマー基質は、相補的な３’Ａ残基を有するｍｉＲＮＡｘに効率的に、およびおそらくＴＧ塩基対の形成を反映する、３’Ｇ残基を有するｍｉＲＮＡｘにいくらか非効率的にテンプレートスイッチした。場合によっては、非相補的３’ヌクレオチド残基（−１位）を有するＲＮＡへのテンプレートスイッチは、−２または−３位のヌクレオチド残基との塩基対形成を反映し得る（例えば、３’Ｇオーバーハングを有するプライマーは、末端の２つのヌクレオチド残基をスキップして、ｍｉＲＮＡ鋳型の−３位のＣ残基との塩基対形成によって開始し得る）。レトロウイルスＲＴは、そのＲＴによって付加された鋳型非依存性ヌクレオチドと新しいＲＮＡ鋳型の３’末端との間の相補性を用いることによってテンプレートスイッチし得るが、少なくとも２塩基対（そのうちの１つは、比較的安定したＧＣまたはＣＧ対でなければならない）がこの反応に必要である（Ｏｚ−Ｇｌｅｅｎｂｅｒｇら、２０１１）。ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴのテンプレートスイッチ反応は、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴの作用可能な温度である６０℃でさえもテンプレートスイッチを促進するのにただ１つの任意のタイプの塩基対だけで十分であるので、新規である。
【００７７】
重要なことには、種々の３’オーバーハングを有する鋳型／プライマー基質の混合物が、種々の鋳型に対して一層少ない偏りを示した。例えば、３つの別個の実験において、可能性のある４種の３’オーバーハングの各々を有する鋳型／プライマー基質の等モル混合物が、以下のとおり、種々の３’ヌクレオチド残基を有するｍｉＲＮＡに切り換わった（Ａ，１５〜２７％；Ｃ，２８〜３０％；Ｇ，２８〜３０％；およびＵ，１６〜２７％；各ゲルレーンにおける総放射能に対して正規化した後の、テンプレートスイッチの総数に対するパーセンテージとして計算された）。したがって、種々の３’ＤＮＡオーバーハングを有する適切な比のＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質を含む混合物が、未知の配列のＲＮＡのｃＤＮＡ合成およびクローニングのために、テンプレートスイッチの偏りを減少させるために使用され得る。逆に、特定の３’ＤＮＡオーバーハングを有するＲＮＡ鋳型／ＤＮＡプライマー基質が、既知の配列の特定のＲＮＡの増幅に有利に働くように別々に使用され得る。
【００７８】
さらなる特徴付けによって、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチ反応が：（ｉ）従来のＲＮａｓｅ切断またはアルカリ切断から生じ得る３’リン酸によって阻害されるが、３’リン酸の除去によって回復されること；（ｉｉ）ＲＮＡと同様にＤＮＡに対して生じる（それは、３’末端のヌクレオチド上の２’ＯＨ基が必要ないことを示唆する）ことが示された（図９Ｂ）。したがって、ｍｉＲＮＡのクローニングおよびシーケンシングに加えて、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチは、ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ／ＣＲＡＣまたはリボソームプロファイリングなどの手順におけるＲＮａｓｅ消化によって生成される、タンパク質に結合したＲＮＡフラグメントのクローニングおよびシーケンシングにとって（Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら、２００６，Ｈｏｌｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  １９９１，Ｇｒａｎｎｅｍａｎら、２００９，Ｚｈａｎｇ  ＆  Ｄａｒｎｅｌｌ  ２０１１，Ｉｎｇｏｌｉａら、２００９）；ならびにおそらくはＤＮＡｓｅｑライブラリーの構築において有用であるはずである。
【００７９】
実施例９：さらなるグループＩＩイントロンＲＴおよびＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ鋳型／プライマー基質を使用するテンプレートスイッチ
３’オーバーハング基質からのテンプレートスイッチを、図１０に示されるようにＧｓＩ−ＩＩＣ−ＭＲＦグループＩＩイントロンを使用して実証した。この図は、プライマーをｍｉＲＮＡ配列と連結するテンプレートスイッチの使用を実証しており、より広くは、それぞれサブグループＩＩＡおよびＩＩＢに属するＬｌ．ＬｔｒＢおよびＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴと同じテンプレートスイッチ反応を、異なる構造のサブクラス（サブグループＩＩＣ）に属する第３のグループＩＩ  ＲＴであるＧｓＩ−ＩＩＣ−ＭＲＦが行うことを示している。テンプレートスイッチの別の例は、図１１に提供されており、これは、ＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴを使用した、最初のＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ鋳型／プライマー基質からのテンプレートスイッチを示している。この図は、いずれかのタイプの鋳型／プライマー基質が、テンプレートスイッチを行うために適しているが、ＲＮＡ／ＤＮＡ鋳型プライマー基質がより効率的であることを実証している。
【００８０】
実施例１０：ｍｉＲＮＡのクローニングおよびシーケンシングのための、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチの使用
ライブラリー構築に対するその有用性を評価するために、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチおよび従来のＲＮＡライゲーション法を使用する２つの市販のキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭおよびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓＴＭ）を使用することにより、９６３個の等モルのｍｉＲＮＡからなる参照セットのＳＯＬｉＤシーケンシング用ライブラリーを作製した。次いで、本発明者らは、ユニークに識別可能なコア配列を有するｍｉＲＮＡのうちの８９８個のライブラリー存在量を比較した。そのプロットは、異なる比の３’オーバーハングを有する鋳型−プライマー基質（ＴＳ１およびＴＳ２）からのＴｅＩ４ｃ−ＭＲＦ  ＲＴのテンプレートスイッチによって調製された２つのライブラリーが、いずれかの市販のキットによって調製されたものより一様なｍｉＲＮＡ配列の分布（より平らな線）を有することを示している（図１２Ａ）。アウトライヤーの解析から、すべてのライブラリーにおいて過小提示された９つのｍｉＲＮＡが特定されたが、その他においては、異なる方法によって過小または過剰提示されたｍｉＲＮＡの間の重複はほとんどなかった（それぞれ図１２ＢおよびＣ）。図１３は、グループＩＩイントロンＲＴのテンプレートスイッチによって生成されたｃＤＮＡライブラリー中の種々の３’末端ヌクレオチドを有するｍｉＲＮＡの提示が、異なる比のＡ、Ｃ、ＧまたはＴ３’オーバーハングを有する鋳型／プライマー基質を使用することによって調整され得ることを示している。
【００８１】
まとめると、前述の結果は、相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖と会合したＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドからなる二本鎖鋳型／プライマー基質を標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合し、その反応媒体に適当量のグループＩＩイントロン逆転写酵素を加えることにより、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長し、それにより、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成された相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡコピーポリヌクレオチドを提供するテンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製するための一般的な方法を実証する。
【００８２】
その結果は、二本鎖鋳型／プライマー基質を標的ポリヌクレオチドと反応媒体中で混合し、その反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加えることにより、そのＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドをその３’末端から伸長し、それにより、標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して合成された相補的な標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡコピーポリヌクレオチドを提供するテンプレートスイッチを使用して標的ポリヌクレオチドのＤＮＡコピーを調製する方法も実証する。この実施形態において、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドは、そのＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端がその相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端と直接整列される平滑末端、またはそのＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端がその相補オリゴヌクレオチド鋳型鎖の５’末端を超えて１ヌクレオチド伸長しているオーバーハング端を有する。
【００８３】
上記の結果は、二本鎖鋳型／プライマー基質を含む反応媒体に適当量の非レトロウイルス逆転写酵素を加える工程を包含する、さらなるヌクレオチドをＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドに付加する方法も実証しており、この方法では、グループＩＩイントロンが、ＤＮＡプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に１〜１５個のさらなる非相補ヌクレオチドを付加する。
【００８４】
【化４】
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【００８５】
【化５】
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【００８６】
【化６】
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【００８７】
【化７】
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【００８８】
【化８】
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本明細書中に引用されたすべての特許、特許出願および特許公開ならびに電子的に入手可能な資料の完全な開示は、参照により援用される。前述の詳細な説明および実施例は、単に理解を明確にするために与えられた。それらからの不必要な限定が理解されるべきでない。本発明は、示されたおよび記載された厳格な詳細に限定されず、当業者に明らかなバリエーションが、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含められる。
【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月2日(2013.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014506483000001.app
【国際調査報告】
2014506483.tif 000027