(57)【要約】  式Ｉの高硫酸化二糖および本明細書で開示される他の高硫酸化二糖は、ヒト好中球エラスターゼ不均衡と関連する疾患または病状を治療するために使用される。二糖および／またはそのような化合物を調製するために有用な中間体はヘパリンから調製される。式Ｉの化合物により治療される疾患および病状としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および嚢胞性線維症（ＣＦ）が挙げられる。製剤は、肺にエアロゾル製剤または乾燥粉末手段で、または噴霧を介して送達される。経口剤形もまた好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩を含有するそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤：
【化１】
2014500863.tif 000020
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈから成る群から独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈおよび送達薬剤から選択される）。
【請求項２】
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも３つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項１の製剤。
【請求項３】
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも４つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項１の製剤。
【請求項４】
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも５つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項１の製剤。
【請求項５】
Ｒ１〜Ｒ６がＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項１の製剤。
【請求項６】
（ｉ）式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩を含有する乾燥粉末医薬製剤
【化２】
2014500863.tif 000021
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈからなる群より独立して選択され、ただし、Ｒ１−Ｒ６の少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される）
【請求項７】
（ｉ）化学式ＩＩの化合物
【化３】
2014500863.tif 000022
およびその製薬学的に許容可能な塩と（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈからなる群より独立して選択され；Ｒ４はＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される）、
（ｉｉ）送達剤と、
を含有する噴霧可能医薬製剤。
【請求項８】
前記式Ｉの化合物は下記のとおりのＲ１〜Ｒ６を有する化合物
【化４】
2014500863.tif 000023
【表１】
2014500863.tif 000024
およびその製薬学的に許容可能な塩から選択される、請求項１に記載のエアロゾル、乾燥粉末または噴霧可能製剤。
【請求項９】
エラスターゼ関連状態の治療を必要とする動物のエラスターゼ関連状態を治療または緩和する方法であって、
（ｉ）式Ｉの化合物
【化５】
2014500863.tif 000025
およびその製薬学的に許容可能な塩（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３ＨまたはＨから独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈである）を含有する製剤を製薬学的に有効な量投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記製剤はエアロゾル製剤である、請求項９の方法。
【請求項１１】
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも３つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項９の方法。
【請求項１２】
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも４つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項９の方法。
【請求項１３】
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも５つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、請求項９の方法。
【請求項１４】
Ｒ１〜Ｒ６がＳＯ３Ｈから選択される、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記エラスターゼ関連状態は気管支炎である、請求項９の方法。
【請求項１６】
前記エラスターゼ関連状態は肺気腫である、請求項９の方法。
【請求項１７】
前記エラスターゼ関連状態はＣＯＰＤである、請求項９の方法。
【請求項１８】
前記エラスターゼ関連状態は嚢胞性線維症である、請求項９の方法。
【請求項１９】
前記エラスターゼ関連状態は急性呼吸窮迫症候群であり、前記製剤は静脈内投与により送達される、請求項９の方法。
【請求項２０】
式Ｉの化合物またはその製薬学的に許容可能な塩
【化６】
2014500863.tif 000026
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３ＨまたはＨから独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈである）の肺送達のための送達装置。
【請求項２１】
請求項１に記載の式Ｉの化合物と、抗炎症剤、ロイコトリエン拮抗薬または修飾剤、抗コリン作用薬、マスト細胞安定剤、コルチコステロイド、免疫刺激剤、ベータアドレナリン作動薬（短期作用および長期作用）、メチルキサンチン、ロイコトリエン拮抗薬および抗ヒスタミン薬から選択される少なくとも１つの追加の活性成分と、を含有するエラスターゼ関連障害の治療のための組み合わせ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの追加の活性成分は、モンテルカストナトリウム、アルブテロール、レバルブテロール、サルメテロール、ホルモテロール、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、セチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、テオフィリン、イプラトロピウム、クロモリン、ネドクロミル、ベクロメタゾン、フルニソリド、モメタゾン、トリアミシノロン、プレドニゾリン、プレドニゾン、ザフィルルカスト、ジレウトンまたはオマルジウナブ（ｏｍａｌｚｉｕｎａｂ）から選択される、請求項２１に記載の組み合わせ。
【請求項２３】
高硫酸化二糖を用いたエラスターゼ関連障害の治療方法。
【請求項２４】
前記コア環は、６，６二糖または６，５二糖である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記二糖は６，５二糖部分である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
高硫酸化二糖の経口製剤を投与することを含む、エラスターゼ関連障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血球エラスターゼに関連する疾患または病状の治療における下記でさらに記載される化学式Ｉの高硫酸化二糖化合物および本明細書で開示される他の高硫酸化二糖の使用に関する。特に、本発明は肺機能（気管粘液速度）を改善する、および／または疾患または病状、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を治療／緩和するための化学式Ｉの化合物の製剤に関する。ＣＯＰＤはその遅い進行および疾患の初期過程ではしばしば治療されないという事実のために、「サイレントキラー」として説明されている。肺気腫および慢性気管支炎はＣＯＰＤのサブタイプである。肺気腫では、肺胞の壁が構造的に損傷され、最終的にはガス交換および肺容量のための表面積が減少する。慢性気管支炎は、過剰の粘液産生により特徴づけられ、および気流制限が疾患の進行と共に発症する。ＣＯＰＤ患者は重篤な気流制限を有し、最終的には血液に十分酸素を送り込む能力を失う。ＣＯＰＤは、世界中で主な死因であり、ＣＯＰＤ関連死の割合が上昇している。New England J.
of Med. Sep. 16, 2010。肺機能の進行性喪失は、ＣＯＰＤの特質であり、現在用いられている療法により防止されない。よって、この疾患のための薬物または有効な治療が著しく要求されている。
【０００２】
エラスターゼは典型的には、白血球、例えばマクロファージおよび好中球から放出され、ＣＯＰＤにおいて引き起こされる著しい構造的損傷に関与する。ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）は、結合組織の巨大分子成分、例えばエラスチンを分解することができる非常に強力なプロテアーゼとして知られており、粘液過分泌を誘発し、疾患、例えばＣＯＰＤ、ＣＦおよび他の炎症性疾患、例えば関節リウマチを引き起こす、またはこれと関連する。エラスターゼはまた、接着分子、例えばＭａｃ−１（好中球接着および遊出を調節し、またはこれに関与する）に結合することが知られている。さらに、エラスターゼは、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（Ｍａｃ−１のためのリガンドである）を切断することができる。よって、ＣＯＰＤ患者の肺内でのエラスターゼ負荷の増加（現在使用されている療法、例えばステロイドにより変化させることができない）は、エラスターゼ阻害剤および／またはＣＯＰＤ、ＣＦおよび他のそのような疾患におけるエラスターゼの上昇したレベルの影響を低減させる他の薬物療法を必要とする。ＣＯＰＤでは、疾患は現在吸入抗コリン性気管支拡張薬（臭化イプラトロピウム、チオトロピウム）または吸入β刺激薬（アルブテロール、サルメテロールまたはホルモテロール）またはそのような薬剤とステロイドの組み合わせ（Ａｄｖａｉｒ（登録商標）、Ｓｙｍｂｉｃｏｒｔ（登録商標））またはメチルキサンチン（テオフィリン）により治療される。ＣＦでは、現在の療法はＣＯＰＤに対する上記治療（複数可）と共に、ＤＮＡＳＥ、吸入抗生物質（例えばトブラマイシン）、抗炎症剤（例えば高用量イブプロフェン）を含む。これらの疾患を効果的に治療および／または緩和する、新規療法が著しく必要とされている。
【背景技術】
【０００３】
エラスターゼの強力な損傷効果と関連する重篤な症状を典型的に有する慢性または遺伝性肺障害を効果的に治療するＨＮＥの阻害剤を見いだす試みを開示し、またはこれに関連する多くの特許および科学出版物が存在する。エラスターゼ阻害剤として知られている薬物のクラスの中で、ヘパリンまたはその誘導体は、非常に興味深い的である。ヘパリンはインビトロおよびインビボの両方でＨＮＥに対し非常に強力である。この効能および相対活性は、明らかにヘパリンの分子構造の特定の化学特性によるものである。これらの特性としては、質量、鎖長、硫酸化度、電荷密度、特定の硫酸化およびイズロン酸量が挙げられる。ヘパリンはまた、血管内皮との白血球相互作用に影響することが知られており、これはまた、エラスターゼの阻害剤である他に、エラスターゼの放出に影響する。ヘパリンは抗凝固活性を有することもまた知られており、そのため、本発明者らは、何人かの他の科学者と共に、抗炎症活性を有するが抗凝固特性を有さない、ヘパリン由来の短いオリゴ糖を含むヘパリン類似体またはその誘導体を発見した。
【０００４】
以前の所見は、ヘパリン断片のエラスターゼ阻害活性については、少なくとも１２−１４サッカリドの鎖長が必要とされることを示唆していた。他の論文は、エラスターゼを阻害するには２０００−３０００の最低分子量（Ｍ）のヘパリン部分が必要であることを示唆した。超硫酸化ヘパリン（６．３ｋＤ）が、それらのエラスターゼ阻害活性について調査された。ヘパリンの接着活性についての効果の評価に関連する研究では、４−１４サッカリドのヘパリン画分は、ＩＬ−１βにより刺激される、好中球の内皮細胞への接着には影響しなかいことが見いだされた。ヘパリンオリゴ糖によるエラスターゼ放出の阻害は同様のパターンに従う。４−、６−または８−サッカリドのみを有するヘパリンオリゴ糖は、高濃度で名目上の効果を有し、分子量が減少するにつれ阻害活性が失われた。本発明者らは、驚くべきことに、化学式Ｉの短鎖、低分子量多硫酸化二糖は、ヒト好中球エラスターゼの効果を治療または緩和し、よって上昇したエラスターゼ活性またはエラスターゼ／抗エラスターゼ活性の不均衡に関連する病状または疾患を治療する薬物として有用であることを発見した。
【０００５】
米国特許第７，０５６，８９８号（８９８特許）は、ある高硫酸化二糖、および、ある炎症性障害を治療するための前記高硫酸化二糖の利用方法を開示および請求している。‘８９８特許は、その請求されている化合物を利用して、喘息と、アレルギー反応もしくは炎症性疾患または容態等の喘息に関連する病態とを含む肺炎を治療することを具体的に説明している。その明細書で開示されている化合物は、喘息と喘息に関連する病態との症状、特に、抗原刺激に続く喘息患者の晩期反応を予防、逆行および／または緩和する能力のあるものとして記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
米国特許仮出願第６１／２６６，３６１号は、この未だに処理されていない要求に対処し、意外にも、本明細書で詳述されている高硫酸化二糖と、製薬学的に許容可能な天然ポリマーまたは合成ポリマーから成る群から選択される送達剤、ならびに、嵩高の化合物（例えば、分子量が平均分子量として４，５００ダルトンを超えるそれらの化合物）の送達を向上させるのにこれまで利用されてきた他のビヒクルとを含むある製剤が、請求されている添加剤を用いずに経口で送達される同じ化合物と比べて吸収／バイオアベイラビリティ／効能を増していることを開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、化学式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩と、吸入に好適なビヒクルとを含む医薬製剤に関し、
【化１】
2014500863.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから成る群から独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される。本発明はさらに、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも３つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、化学式Ｉの化合物を有する製剤に関する。本発明はさらに、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも４つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、化学式Ｉの化合物を有する製剤にも関する。本発明はさらに、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも５つがＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される、化学式Ｉの化合物を有する製剤にも関する。好ましくは、本発明は、Ｒ１〜Ｒ６がＳＯ３Ｈから選択される、化学式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩に関する。本発明は、Ｒ１〜Ｒ６がＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択される、化学式Ｉの化合物を有する製剤にも関する。本発明は、プロドラッグ、誘導体、活性代謝物、化学式Ｉの前記化合物の部分的にイオン化された誘導体および完全にイオン化された誘導体、ならびに、それらの立体異性体をさらに含む。本発明の二糖を構成する単量体は、Ｄ異性体またはＬ異性体であり得る。炭素環の周りのヒドロキシ部分またはそれらの硫酸化異形またはリン酸化異形（またはそれらの中間体）は、いずれかの特定の立体中心で、アルファ表記またはベータ表記であり得る。単糖部分の間を繋ぐ酸素原子も、アルファまたはベータであり得る。本発明の化合物の分子量は、通常、１，０００ダルトン未満である。本発明はまた、エラスターゼ関連障害の治療における２つの６員環を有する多硫酸化二糖の使用に関する。
【０００８】
最も好ましい実施形態は、Ｒ１〜Ｒ６がＳＯ３Ｈから選択される化学式Ｉの化合物とその製薬学的に許容可能な塩とを含むエアロゾル/噴霧可能製剤に関する。本発明は、化学式Ｉの化合物の経口製剤にも関し、変数は、エラスターゼ関連障害の治療に対し上記で規定した通りである。
【０００９】
本発明は、生物のエステラーゼ関連状態をその治療の必要に応じて治療する方法であって、化学式Ｉの化合物
【化２】
2014500863.tif 000003
およびその製薬学的に許容可能な塩（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３ＨまたはＨから独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈである）を含む化合物を製薬学的に有効な量投与することを含む方法も含む。
【００１０】
本発明について、以下の図面で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】気管粘液速度（ＴＭＶ）におけるＨＮＥ誘導低減に関する吸入高硫酸化二糖の効果を示す。
【図２】ＨＮＥ誘導効果に対する等価の用量の二糖ナトリウムの効果を示す。
【図３】高硫酸化二糖はＨＮＥの効果を逆行させることもできることを示す。
【図４】ＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減に関するカルボポール製剤中の経口高硫酸化二糖のポジティブな効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、そのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤およびその利用に関し、その製剤は、化学式Ｉの化合物およびその化合物の製薬学的に許容可能な塩
【化３】
2014500863.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから成る群から独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから選択される）を含む。
【００１３】
本発明は、
（ｉ）化学式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩
【化４】
2014500863.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ４、およびＲ５は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択され、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択される）
を含む、そのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤にも関する。
【００１４】
本発明は、
（ｉ）化学式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩、
【化５】
2014500863.tif 000006
（式中、Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択され、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択される）を含むそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤にも関する。
【００１５】
本発明は、
（ｉ）化学式Ｉの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩
【化６】
2014500863.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択され、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択される）を含むそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤にも関する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）化学式ＩＩの化合物
【化７】
2014500863.tif 000008
およびその製薬学的に許容可能な塩（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから成る群から独立して選択される）を含むそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤に関する。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）化学式ＩＩの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩
【化８】
2014500863.tif 000009
（式中、Ｒ１およびＲ４はＳＯ３Ｈであり、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択される）を含むそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤に関する。
【００１８】
追加の好ましい追加の実施形態では、本発明は、（ｉ）化学式ＩＩの化合物およびその製薬学的に許容可能な塩
【化９】
2014500863.tif 000010
（式中、Ｒ１はＳＯ３Ｈであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈから独立して選択される）を含むそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な医薬製剤に関する。
【００１９】
本発明は、上に定義されたようなＲ１〜Ｒ６を有する化学式ＩまたはＩＩの化合物およびそれらの製薬学的に許容可能な塩を含むそのような治療の必要な患者の肺への送達に好適な液体または固体剤形にも関する。
【００２０】
本発明は、エラスターゼに関連するまたはエラスターゼ/抗エラスターゼの不均衡における病状を治療または緩和する方法であって、（ｉ）化学式Ｉの化合物
【化１０】
2014500863.tif 000011
およびその製薬学的に許容可能な塩を含む製薬学的に有効な量の製剤（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３ＨまたはＨから独立して選択され、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つは、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈである）を投与することを含む方法も含む。
【００２１】
本発明は、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、表１に化合物１〜１４として示されている変異体から選択される化学式Ｉの化合物を含む噴霧可能、
乾燥粉末またはエアロゾル医薬製剤に関する。
【化１１】
2014500863.tif 000012
【表１】
2014500863.tif 000013
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明の製剤中の化合物は、上の表１に示されている化学式Ｉの化合物の金属塩から選択される。それらの化合物では、カルボン酸基がイオン化され、二糖の周りの各々の硫酸基がイオン化されて金属塩を形成し、その金属は、例えばナトリウムから選択される。加えて、アミン塩を含む他の塩が、カルボン酸塩または硫酸塩の位置に形成され得る。最も好ましい化合物は、化合物１４のナトリウム塩としての完全イオン化形態である（化合物１４ａ）。
【００２３】
本発明の化合物は、本明細書で実施例において記載されているように、例えば、ヘパリンから得ることができる。用いた具体的なプロセスではブタヘパリンを用いたが、任意の哺乳類のヘパリンを用いて、本発明の化合物を生成してもよい。加えて、本化合物は、合成的に誘導してもよい。記載されている二糖の原料物質として、様々な他の多糖を用いてもよく、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリ硫酸ペントサンならびに、他のグリコサミノグリカンおよびムコ多糖体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の化合物は一般に、以下の工程を含むプロセスにより調製することができる。（１）ヘパリンナトリウムを水に溶解させ、ｐＨを弱酸性（約ｐＨ６）に調節し、（２）この溶液を亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）水溶液で処理して亜硝酸を形成し、ヘパリンを脱重合し（および、例えば、ＩｄｏＡ（２Ｓ）ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）を脱アミノ化して、Ｉｄｏ（２Ｓ）−ａＭａｎを形成する）、（３）脱重合したヘパリン溶液を塩基化して、ｐＨを約７にし、（４）脱重合したヘパリン溶液を希釈し、（５）前記溶液を濾過し、３ｋＤａ（３０００ダルトン）未満のヘパリンオリゴ糖を収集、濃縮し、（６）３ｋＤＡ未満の脱重合したヘパリンを含む濾過溶液を塩基性に変化させ、（７）この塩基化した溶液を水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）で処理し、ヘパリンの酸性化および脱重合後に形成されたアルデヒドカルボニルを還元して、アルコールにし、（８）還元した生成物を濃酸で処理し、次に、ｐＨを約７に調節し、（９）サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、得られた還元オリゴマーをさらに分画して、二糖アンモニウム塩を得て、その二糖アンモニウム塩を陽イオン交換樹脂でさらに処理してナトリウム塩を形成し、そのナトリウム塩をさらに分画して、主成分として、式中のＲ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＳＯ３−であり、Ｒ４がＳＯ３−であり、Ｒ５がＨであり、Ｒ６がＨであり、カルボキシ基（ＣＯ２Ｈ）がＣＯ２−Ｎａ＋である化学式Ｉの化合物がナトリウム塩の形態として得られると共に、主成分として、式中のＲ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＳＯ３−であり、Ｒ４がＳＯ３−であり、Ｒ５がＳＯ３−であり、Ｒ６がＨであり、カルボキシ基（ＣＯ２Ｈ）がＣＯ２−Ｎａ＋である化学式Ｉの化合物が得られ、（１０）その結果得られた二糖を適切な条件下で硫酸塩源（例えば、（ＣＨ３）３ＮＳＯ３）で処理し、本発明の製剤で用いる高硫酸化二糖を形成する。
【００２５】
本明細書に限定することなく、ヘパリンおよび他の炭水化物または複合炭水化物は、ヒドロキシル基ならびに硫酸基またはカルボン酸基が規定の立体化学または絶対立体化学の環上に存在するキラル分子であることが分かる。ヘパリン中の最も一般的な二糖単位は、例えば、２−Ｏ−硫酸化イズロン酸および６−Ｏ−硫酸化グルコースアミンであるＩｄｏＡ（２Ｓ）ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）である。
【化１２】
2014500863.tif 000014
【００２６】
一般には、本発明の製剤で用いられる少糖類および二糖を生成する多糖源は、概して、炭水化物環の周囲にキラル中心の絶対立体化学を定めることが分かる。追加の硫酸基は、上に概要を記載したプロセスによる化学手段により、または、いずれかの既知の手段により付加され、最活性部分（高硫酸化二糖およびそれらの塩）が得られる。この最活性部分をさらに精製して、医薬品グレードの二糖が形成される。この二糖を賦形剤とさらに調合し、治療の必要な患者の肺に送達するのに適した剤形を形成させる。多硫酸化誘導体として上記で示した分子は、エラスターゼ関連障害の治療において活性であろう。そのような多硫酸化誘導体は、上記で示される３つの硫酸基より多くを有するであろう。
【００２７】
核磁気共鳴造影法および／または他の既知の構造識別法を利用して、ヘパリン（いずれかの既知のヘパリン源由来）または他の所定の多糖の脱重合から得られた分子の化学構造を決定し得る。本化合物を合成または半合成で作製する場合、当業者は、標準の有機化学技術を用いて、所望のヒドロキシ部分を当業者に既知の保護基で保護することができる。
【００２８】
上記で記載される化学式Ｉの化合物（またはその混合物）をその後、エアロゾル賦形剤または噴霧可能賦形剤と調合し、本発明の製剤を形成させる。賦形剤は、任意の公知のまたは発見された吸入剤、噴射剤および／または患者の肺に送達するのに好適な他の添加剤からなる群より選択される。そのような製剤および／または本明細書で記載される活性成分はまた、ＣＯＰＤ、その下位疾患、ＣＦまたは他のエラスターゼ関連状態のための公知の治療と共に送達され、またはこれと組み合わされ、またはこれと組み合わせて使用され得る。ＣＯＰＤでは、疾患は現在吸入抗コリン性気管支拡張薬（臭化イプラトロピウム、チオトロピウム）または吸入β刺激薬（アルブテロール、サルメテロールまたはホルモテロール）またはそのような薬剤とステロイドの組み合わせ（Ａｄｖａｉｒ、Ｓｙｍｂｉｃｏｒｔ）またはメチルキサンチン（テオフィリン）により治療される。ＣＦでは、現在の療法はＣＯＰＤに対する上記治療（複数可）と共に、ＤＮＡＳＥ、吸入抗生物質（例えばトブラマイシン）、抗炎症剤（例えば高用量イブプロフェン）を含む。患者およびその内科医の処方によって、本発明および指名された疾患のための上記治療のいずれか一つの組み合わせが、患者を治療するために使用され得る。ステロイドは、ＣＯＰＤ患者には典型的には有効でなく、そのため、特許請求される多硫酸化二糖製剤などの療法が著しく必要とされている。
【００２９】
本発明の製剤は、任意の適切な既知の手段により患者またはその他の生物に送達することができる。活性成分およびその他の賦形剤に対する、製剤に添加される添加剤の比率および添加剤の種類は、所望されている製剤の種類に依存する。例えば、エアロゾル製剤では、好適な噴射剤ならびに水溶液が好適な送達装置、例えば吸入器中で薬物を送達するために使用され得る。
【００３０】
本発明の組成物は、エアロゾル送達手段または噴霧可能手段に好適な製薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。
【００３１】
式ＩおよびＩＩの化合物は、上述のように、製薬学的に許容可能な塩を形成する。金属塩としては、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、ＮｇもしくはＢａ、またはＡｌ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｚｒ、Ｔｉ、Ｂｉ、ＭｎもしくはＯｓを有する塩、あるいは、式ＩまたはＩＩの化合物をアミノ酸等の有機塩基または任意のアミンと反応させることにより形成される塩が挙げられる。好ましい塩はナトリウム塩である。
【００３２】
したがって、本発明の好ましい製剤には、表１に示す化合物が含まれ、それは高硫酸化二糖であり、例えば、噴霧可能水溶液から選択される送達剤をさらに含む。好ましい活性成分は、ナトリウムが化学式Ｉ中のカルボキシル水素原子にとって代わるナトリウム塩の形態である。
【００３３】
これらの製剤は、上昇したまたは異常レベルのヒト好中球エラスターゼと関連するそれらの病状、例えばＣＯＰＤ、嚢胞性線維症などを治療するのに有用である。
【００３４】
嚢胞性線維症は、患者肺での、病原菌による慢性感染に至らしめる異常な粘性粘液の産生により特徴づけられる。細菌コロニーは炎症細胞の流入を開始させ、これはさらに炎症性サイトカイン（ＩＬ−６およびＩＬ−８）の上昇を引き起こす。これにより、ＣＦ患者における感染と炎症の再発サイクルが起こり、罹患および死亡に至る。ＣＦ患者では、粘液溶解薬であり、粘液の肺からの排除を可能にし、抗炎症および抗エラスターゼ活性をも有する薬物がこの疾患を緩和し、または治療するのを助けるであろう。小さな臨床試験（６人の患者）においてＣＦ患者を治療するのにヘパリンが使用され、より薄い痰および他の臨床パラメータに関してはいくらかの成功があったが、ＣＦまたは他のエラスターゼ関連状態、例えば肺気腫またはＣＯＰＤを治療するためにこの医薬を使用することは承認されていない。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「症状の治療または緩和」は、本発明の製剤を投与した個人の症状を、治療を受けていない同じ個人またはとある個人の症状と比較して、軽減、予防および／または逆行させることを意味する。
【００３６】
本発明の製剤は、ヒトならびに他の動物における有用性を予測する動物試験において有効であることが見いだされている。本明細書で記載される特定の動物試験は、製剤が全肺粘液繊毛クリアランス（ＭＣＣ）を改善または刺激するのに有用であることを証明する。気管粘液速度（ＴＭＶ）は、ヒツジにおけるＭＣＣのマーカーとして測定される。ＴＭＶモデルは、様々な相対条件下で例えば障害された個人において観察される応答を模倣する測定値として使用され、障害された個人は薬物で治療される。好中球エラスターゼは、動物モデル（ヒツジ）において、粘液繊毛不全を誘導する薬剤として、およびＭＣＣを、８時間までの間ヒツジにおいて抑制する薬剤として使用される。化学式Ｉの化合物をその後、エラスターゼ処置動物においてＴＭＶを増加させ、ＭＣＣを回復させる医薬として使用した。
【００３７】
研究で使用したヒツジは、人道的な世話を用いて処置した。ヒツジは研究を通して意識があり、動物を局所麻酔薬で処置した後、器具の使用を実施した。化学式Ｉの化合物の効果を研究するために、ヒツジは麻酔薬（鼻孔内２％リドカイン）で局所的に処置した後、気管内チューブ（直径７．５ｃｍ）を経鼻的に挿管させた。チューブのカフを声帯直下に配置し、気管表面積の最大暴露を可能にした。カフを、薬物送達期間中を除き研究を通して収縮させ、チューブによるＴＭＶの障害を最小に抑えた。吸気を温め、加湿した。
【００３８】
ＴＭＶは出版物Chest, Vol 128/5/ November 2005,
pp3742-3749において一般的に記載される方法により、インビボで測定した。ＴＭＶは、Ｘ線撮影技術により、５〜１０の放射線不透過性Ｔｅｆｌｏｎ／三酸化ビスマスディスク、直径１ｍｍ、厚さ０．８ｍｍおよび重量１．８ｍｇを用いてインビボで測定した。ディスクを、連続圧縮空気源（３−４Ｌ／ｍｉｎ）に接続された改造吸引カテーテルを介して気管内に吹き込んだ。カテーテルは気管内チューブ内に残ったままであり、気管表面との接触はない。個々のディスクのセファリッド軸流速度を画像増強器ユニットからビデオテープ上に記録する。個々のディスク速度を各ディスクが１分の観察期間の間進んだ距離を測定することにより計算する。各実行に対し、全ての個々のディスク速度の平均値をその後に計算する。この研究で使用したヒツジは、蛍光透視ユニットに固有の拡大誤差を較正するために標準として公知の長さの放射線不透過性基準マーカーを含むカラーを着用した。
【００３９】
ＨＮＥをＥｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）から入手した。保存液を製造者の仕様に従い調製した。ヒツジに決められた量のＨＮＥを、約１．１μｍのＭＭＡＤを有する液滴を生成させるＲａｉｎｄｒｏｐネブライザ（Ｎｅｌｌｃｏｒ  Ｐｕｒｉｔａｎ−Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）エアロゾル送達システムを使用して投与した。ネブライザを電磁弁と２０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）での圧縮空気源とから構成される薬量計に接続させた。ネブライザの出力をＴ字部品に接続させ、一端をＨａｒｖａｒｄレスピレーター（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ  ＭＡ）に取り付けた。レスピレーターを１：１の吸気／呼気比および２０呼吸／分の速度で設定した。電磁弁をレスピレーターの呼吸サイクルの開始時に１秒間作動させた。５００ｍｌの１回換気量を使用して薬剤を送達させた。本発明では、化学式Ｉの化合物を患者の肺に送達させる任意の好適な手段が使用され得る。エアロゾル送達手段、噴霧可能送達手段および噴射剤および／または吸入剤装置手段が、当技術分野で知られており、本明細書で使用され得る。本明細書で使用される化合物は好ましくは、乾燥粉末として使用され、これらはその後、患者への送達日に、滅菌容器および脱イオン水または他の好適な溶媒／送達システムを使用して溶液として調製される。いくつかの装置では、化学式Ｉの化合物の乾燥粉末は、可溶化剤または溶液の必要なしで、患者に医薬を送達するために使用され得る。
【００４０】
本発明の製剤はまた、他の適切な薬物または活性成分と組み合せて、治療の対象とする特定の疾患または状態に応じて投与することができる。本発明は、本明細書での定義に従うＲ１〜Ｒ６を有する式ＩまたはＩＩの化合物（すなわち、硫酸基を少なくとも２個有する）を、それを必要とする生物に投与することを含む、ＣＯＰＤの治療法に関する。追加の活性成分は、併用療法の形式または少なくとも２つの活性成分を有する単回投与単位の形式で投与することができ、第１の活性成分は、本明細書での定義に従うＲ１〜Ｒ６を有する式ＩまたはＩＩの化合物であり、第２の活性成分は、ＣＦ、ＣＯＰＤまたは任意のエラスターゼ関連状態または障害に続発する任意の状態の治療のために最先端治療として使われるいずれかの薬または薬物から選択される。そのような薬物としては、抗炎症剤、ロイコトリエン拮抗薬または修飾剤、抗コリン作用薬、マスト細胞安定剤、コルチコステロイド、免疫刺激剤、ベータアドレナリン作動薬（短期作用および長期作用）、メチルキサンチン、および以下に制限されないが、モンテルカストナトリウム、アルブテロール、レバルブテロール、サルメテロール、ホルモテロール、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、セチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、テオフィリン、イプラトロピウム、クロモリン、ネドクロミル、ベクロメタゾン、フルニソリド、モメタゾン、トリアミシノロン、プレドニゾリン、プレドニゾン、ザフィルルカスト、ジレウトンまたはオマルジウナブ（omalziunab）を含む、上記のような障害の治療に使用されるその他の一般クラスまたは特定の薬品が挙げられる。
【００４１】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をさらに詳しく説明することを目的としており、非制限的である。
【００４２】
実施例１  高硫酸化二糖の調製
最初にヘパリンナトリウムを脱重合化することによって、本発明の製剤で用いる化合物を調製した。活性薬物物質の調製のための出発物質は、例えば、ブタ腸粘膜ヘパルチン（１〜４個の連結したグルコサミンおよびウロン酸残基から成る多分散硫酸化コポリマー）である。本明細書で記述されている活性薬物物質（ＡＤＳ）、高硫酸化二糖は、ヒツジモデルで抗アレルギー活性を有することが示された。ＡＤＳの生成は一般に、以下の手順であった。
１）ブタヘパリンを制御下で亜硝酸脱重合化
２）ＮａＢＨ４を持つ末端アルデヒド基をアルコールに還元
３）サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって、分離した二糖のアンモニウム塩を生成
４）二糖アンモニウム塩を三酸化硫黄ピリジン錯体と反応させ、高硫酸化二糖を生成
５）ＳＥＣに続いてナトリウム塩への陽イオン交換を行い、最終生成物を得る
この方法で生成される好ましい生成物は、以下に示すナトリウム塩形態の硫酸基を６個有する高硫酸化二糖（化合物１４ａ）であった。
【化１３】
2014500863.tif 000015
化合物１４ａの溶解度は＞０．５ｇ／ｍＬである。以下の手順において、本明細書に記述される化合物を製造するための数多くの可能な方法の１つを説明する。室温で、水３リットルを入れたビーカーに、市販のブタヘパリン−Ｎａ（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ州ＷａｕｎａｋｅｅのＳＰＬ等の市販の供給源から入手）２５０ｇを加え、攪拌してスラリーにし、その時点でさらに水２リットルを加え、ヘパリン塩を完全に溶解した。
【００４３】
次にヘパリン溶液のｐＨをおよそｐＨ６（５．９８）に調節した。この溶液に、ＮａＮＯ２（０．２５ｍｍｏｌ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＡＣＳグレード）を１７．２５ｇ添加し、ヘパリンの制御した亜硝酸脱重合化を達成した。攪拌を１０分間続け、その間に約２３℃の温度で、３７％ＨＣｌを約３５．１ｍｌゆっくりと加え、ｐＨをおよそ３（３．００）にした。溶液の温度およびｐＨを２時間（１２０分）モニタリングし、その間に温度は２０℃に、ｐＨは２．１６に低下した。次に５０％ＮａＯＨを約２３ｍｌゆっくりと加えて、ｐＨを６．７５に調節し、溶液をクエンチし、脱重合化したヘパリン溶液を得た。
【００４４】
上記で得た脱重合化したヘパリン溶液をｄｔＨ２Ｏを使って最終容積８リットルに希釈し、濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｍａｓｓ．、Ｂｅｄｏｆｏｒｄ）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２、面積が０．５ｍ２の３ｋ  ＰＬＢＣ−Ｃ（カセット：Ｃａｔ＃ＰＳ  ＰＬＢＣＣ  ０５）、（分子量３ｋＤａでカットオフ）、サイズが３ｋＤａ（３０００ダルトン）に満たないヘパリンオリゴ糖を採取し、濃縮した（すなわち、透過液は３０００ダルトンに満たないこれらのオリゴ糖から構成されていた）。３０００ダルトンより大きい濃縮物を、２０Ｍ溶液を使って、亜硝酸の脱重合化処理に再びかけ、さらにヘパリンの分解を開始した。同じ種類のフィルター（分子量３０００ダルトンでカットオフ）を使って、この２回処理したオリゴ糖調製物を限外濾過した後、得られた透過液（分子量３ｋＤａ未満）を初回の限外濾過から得た透過液に加え、続いて、バッチ全体を逆浸透圧法で濃縮し、最終容積を２．５リットルに減少させた。続いて、これを凍結乾燥した。
【００４５】
凍結乾燥したオリゴ糖調製物（５０ｇ）を１リットルの純水に溶解した後、２〜１０℃の氷浴で冷却した。冷却したオリゴ糖溶液にＮａＨＣＯ３（２１ｇ）を添加し、完全に溶解するまで調製物を攪拌した。０．０１ＭのＮａＯＨ溶液４００ｍＬ中の０．５Ｍの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）溶液を調製し、６０分かけて、冷却したオリゴ糖／ＮａＨＣＯ３溶液にゆっくりと添加した。ＮａＢＨ４溶液０．５Ｍの処理は、５員環上に形成されたアルデヒド（脱アミノ反応後に形成される）をアルコール成分に還元することが目的だった。この反応調製物を３時間、２〜１０℃で攪拌した後、濃ＨＣｌでクエンチし、ｐＨ４．０にした。その後、溶液のｐＨをＮａＯＨを使って、６．７５に調節し、最終的に逆浸透圧法で最小容量に濃縮し、その後、凍結乾燥して、還元オリゴ糖を得た。サイズが３ｋＤａ未満の還元オリゴ糖調製物を後にＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ６樹脂（０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３による溶出）を使って、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分画してオリゴミックス（oliogmix）を分画し、二糖アンモニウム塩を採取した。採取した画分をカルバゾールアッセイで分析し、Ａｂｓ５３０対画分数のプロットにより、採取した画分のプロファイルを得た。プロファイル上の類似画分をプールし、後で凍結乾燥し、分離した画分をアンモニウム塩として得、ＮＨ４ＨＣＯ３を除去した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ  １２０  Ｐｌｕｓ陽イオン交換樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されている）を使った陽イオン交換によって、アンモニウム塩をナトリウム塩の形態に変えた。これらの画分から２つの二糖を得、化合物Ａ（８５重量％）およびＢ（３〜５重量％）と同定された。
化合物Ａ：
【化１４】
2014500863.tif 000016
化合物Ｂ：
【化１５】
2014500863.tif 000017
【００４６】
上記の化合物ＡおよびＢを含有する画分をさらに処理し、高硫酸化二糖を形成した。２つの非制限的方法を利用した。方法１では、２．５グラムの二糖を含有する上記フラクションを５０ｍＬの水に溶解させた溶液を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されているＤｏｗｅｘ  ５００ＷＸ２００酸性樹脂と、製造メーカーの指示に従って反応させることによって酸性化した。酸性の濾液をテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを使って中和し、その溶液を凍結乾燥し、テトラブチルアンモニウム（Ｂｕ４Ｎ＋）塩を綿状固体として得た。次にアルゴン下で、無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を二糖アンモニウム塩と（ＣＨ３）３ＮＳＯ３（５．２２グラム）との混合物に添加した。この反応混合物を５０℃で４８時間、加熱した。次にこの溶液を室温に冷却した。酢酸ナトリウムのエタノール飽和溶液１００ｍｌを添加し、この混合物を室温で２０分間攪拌し、水２．５Ｌで希釈した後、５００ダルトン（すなわち、０．５ｋＤａ）の膜で濾過した。濃縮物（すなわち、０．５ｋＤａより大きい）を凍結乾燥し、ＮＨ４ＨＣＯ３溶液０．２Ｍに再び懸濁し、製造メーカーの指示に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ６樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）でクロマトグラフィーにかけ、０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で溶出し、高硫酸化二糖のＮＨ４＋塩（３．５グラム）を得た。この塩の一部（２．４グラム）を、製造メーカーの指示に従って、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ  １２０  Ｐｌｕｓ陽イオン交換樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されている）と反応させ、Ｎａ＋塩に変換し、表１に示されており、以下に化合物１４ａとして示されている化合物１４のナトリウム塩を得た：
化合物１４ａ：
【化１６】
2014500863.tif 000018
この化合物は、方法２によっても調製した。方法２では、化合物ＡとＢを含有する画分０．５グラムと（ＣＨ３）３ＮＳＯ３３グラムとのアルゴン下、１５ｍＬのＤＭＦ中の混合物を４８時間、６０℃で加熱した。その後、この反応混合物を室温に冷却し、１０％の酢酸ナトリウム水溶液２０ｍＬで希釈し、室温で２０分間攪拌し、エタノール１００ｍＬを添加し、高真空下でこの反応混合物を濃縮し、固体残渣を得た。この残渣を５００ｍＬの水に溶解し、５００ダルトンの膜で濾過した（Ｈ２Ｏで３回洗浄）。高硫酸化した１４ａ生成物を含有するナトリウム塩濃縮物を凍結乾燥して、オフホワイトの固体を得た。
【００４７】
実施例２
以下に限定されないが、本明細書に列挙された具体的な疾患および状態を含め、エラスターゼに関連する疾患および状態の治療および緩和に対する本発明による製剤の有効性を実証するために、出願者は下記実施例を提供する。
【００４８】
動物準備
この研究で使用される全ての手順は、Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（実験動物の人道的使用を確保する責任を有する）により調査され、承認された。
【００４９】
成体ヒツジをカート内で、特別の体用ハーネスで直立位置にて拘束した。動物の頭部を固定し、鼻孔の局所麻酔を２％リドカインで誘導した後、動物に標準気管内（ＥＴ）チューブ（７．５ｍｍ直径、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を経鼻的に挿管した。気管支ファイバースコープを使用して、ＥＴチューブを案内し、その気管内での位置を確認した。チューブのカフを声帯直下に配置し、気管表面積の最大暴露を可能にした。気管内チューブカフ膨張により引き起こされるＴＭＶの可能性のある障害を最小に抑えるために、我々は化合物の噴霧期間を除き研究を通してカフを収縮させた。さらに、長期挿管の効果を緩和するために、我々はＢｅｎｎｅｔｔ加湿器（Ｐｕｒｉｔａｎ−Ｂｅｎｎｅｔｔ；Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を使用して吸気を温め、加湿した。挿管後、動物は約２０分間の休息が与えられ、その後に試験を開始した。動物は全研究を通して覚醒し、警戒していた。
【００５０】
ＴＭＶ測定
ＴＭＶは、インビボで蛍光透視技術によりＳｉｒｅｍｏｂｉｌｅ２０００フルオロスコープ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いて測定した。５〜７の放射線不透過性Ｔｅｆｌｏｎ／三酸化ビスマスディスク（１ｍｍ直径、厚さ０．８−ｍｍおよび重量１．８ｍｇ）を動物の気管の中央部に吹き込んだ。３〜４Ｌ／分での連続圧縮空気源に接続されたカテーテルを使用して、気管の表面上に、気管内チューブを介してディスクを送達させた。カテーテルはディスクの吹送中のみ気管内チューブ内に留まり、気管表面とは接触しなかった。ディスクが気管上に送達されるとすぐに、各個々のディスクの頭側軸流速度を、フルオロスコープとインラインの携帯用画像増強器ユニットからビデオテープ上に記録した。速度を各ディスクが１分の観察期間の間進んだ距離を測定することにより計算した。各実行に対し、全ての個々のディスク速度の平均値を計算した。公知の長さの放射線不透過性基準マーカーを含むカラーをヒツジの首周りに固定し、蛍光透視ユニットに固有の拡大誤差を較正するために標準として使用した。
【００５１】
エアロゾル送達システム
全ての薬剤は、Ｒａｉｎｄｒｏｐネブライザ（Ｎｅｌｌｃｏｒ  Ｐｕｒｉｔａｎ−Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてエアロゾル化した。これは約１．１μｍのＭＭＡＤを有する液滴を生成させる。ネブライザを電磁弁と２０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）での圧縮空気源とから構成される薬量計システムに接続させた。ネブライザの出力をＴ字部品に接続させ、一端をＨａｒｖａｒｄレスピレーター（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ  ＭＡ）に取り付けた。レスピレーターを１：１の吸気／呼気比および２０呼吸／分の速度で設定した。電磁弁をレスピレーターの吸気サイクルの開始時に１秒間作動させた。５００ｍｌの１回換気量を使用して薬剤を送達させた。
【００５２】
薬剤
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）をＥｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｏｗｅｎｖｉｌｌｅ，ＭＯ）から入手した。保存液を製造者の仕様に従い調製した。１１９０ｍＵの活性酵素を含む６．８μｌのアリコートをストックから調製し、−８０°Ｃで保存した。実験日に、ＨＮＥを３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、ヒツジに上記で記載されるエアロゾル送達システムを用いて総量を投与した。
【００５３】
二糖ナトリウムおよび高硫酸化二糖は、乾燥粉末として提供した。溶液は実験日に新たに調製した。滅菌容器を使用して化合物を秤量し、合計３．０ｍＬの脱イオン水を容器に添加した。化合物が完全に溶解するとすぐに、溶液を動物にエアロゾルにより上記システムを使用して投与した。全ての薬剤を噴霧乾燥させた（約１０−１２分）。
【００５４】
カプセル形態の経口剤形を１：２の活性成分対カルボポール比（１５ｍｇ活性／３０ｍｇカルボポール）を用いて調製した。図４で示されるように使用した用量は、それぞれ１５ｍｇの２つのカプセルであった。カルボポールに類似する他の好適な賦形剤もまた経口製剤において使用され得る。
【００５５】
プロトコル
プロトコル１：ＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減に対する二糖ナトリウムおよび高硫酸化二糖を用いた前処置の効果：初期ベースラインＴＭＶ測定値を得た後、動物を別々に、二糖ナトリウム（１０ｍｇ、３０ｍｇまたは１００ｍｇ）または高硫酸化二糖（１０ｍｇ、３０ｍｇまたは１００ｍｇ）で処置した。３０分後、それから、ヒツジをエアロゾル化ＨＮＥで誘発した。ＴＭＶの測定値をＨＮＥ投与後１５分、３０分および４５分、その後１時間毎に６時間まで、取得した。
【００５６】
プロトコル２：ＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減の逆行に関する高硫酸化二糖の効果：ベースラインＴＭＶ測定値を得た後、ヒツジをエアロゾル化ＨＮＥで誘発した。その後、ＴＭＶ測定値を、ＨＮＥ投与後最初の４時間の間１時間毎に取得した。直ちに、４時間ＴＭＶ測定後、ヒツジを１０ｍｇ、３０ｍｇまたは１００ｍｇの高硫酸化二糖で処置した。連続ＴＭＶ測定値をＨＮＥ後８時間まで１時間毎に取得した。
【００５７】
プロトコル３：ＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減に対する経口高硫酸化二糖の効果：動物を、１２時間毎に投与される、２回の経口高硫酸化二糖（１４ａ）（３０ｍｇのカルボポールを有するそれぞれ、１５ｍｇのカプセル２つ、３０ｍｇに等しい活性総用量）で処置した。最後の用量は、ＨＮＥによるエアロゾル誘発前９０分に投与した。ＴＭＶの測定値を、ベースラインおよびエアロゾル化ＨＮＥによる誘発後１５分に取得し、その後、上記のように誘発後６時間までの間連続して取得した。
【００５８】
結果
図１はＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減に関する吸入高硫酸化二糖（化合物１４ａ）の効果を示す。ＨＮＥは単独でＴＭＶをベースラインの約６０％まで低減させた。吸入高硫酸化二糖により前処置により、このＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減に対し用量依存性保護が得られた。比較して、図２はＨＮＥ誘導効果に対する等用量の２’，６二硫酸二糖ナトリウム（ヘパリンの一酸化窒素による化学脱重合化により生成）の効果を示す。高硫酸化二糖と対照的に、１０ｍｇおよび３０ｍｇ用量の２’，６−二硫酸二糖ナトリウムはどちらも、ＨＮＥ誘導応答に対する保護を提供しなかった。よって、高硫酸化二糖（例えば、２を超える硫酸を有する）は、ＨＮＥ誘導効果に対する保護において増加した効能を示した。この比較例で使用される２’，６−二硫酸二糖ナトリウムは硫酸基の代わりにヒドロキシル基を有する（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６はＨであり、Ｒ３およびＲ４は硫酸であり、カルボン酸アニオンのナトリウム塩を有する）化学式Ｉの化合物として示される同一の化合物である。
【００５９】
図３は、高硫酸化二糖がＨＮＥの効果を逆行させることもできることを示す。この研究では、１０ｍｇ用量の高硫酸化二糖は無効であったが、３０ｍｇおよび１００ｍｇの両方の高硫酸化二糖ではＨＮＥ誘導応答の著しい逆行が見られた。これらの所見は、高硫酸化二糖はＴＭＶにおけるＨＮＥ誘導低減に対抗するように治療的に、ならびに予防的に（図１で示されるように）使用することができることを示す。
【００６０】
図１−３で示される研究では、動物データは明らかに、特許請求する化合物は、ヒト好中球エラスターゼに関連する疾患または病状の有効なモジュレーターであることを示す。好ましい実施形態では、特許請求する化学式Ｉの化合物およびその塩は、多硫酸化塩の形態であり、その治療の必要な患者の肺に送達される。
【００６１】
特許請求する本発明について、その具体的な実施形態に言及しながら詳しく記述してきたが、特許請求する本発明に対して、その精神と範囲から逸脱することなく、各種の変更および改変を加えられることは、当業者には明らかであろう。したがって、例えば、当業者は、単なる日常的な実験を用いることにより、特許請求する本発明の無数の実施形態のうち、明確に記述されていない可能性のある実施形態を認識するであろう。そのような実施形態は本発明の範囲内である。
【００６２】
本発明はさらに、ヘパリン由来のそれらの二糖を含み、６−６員構造を有する任意の多硫酸化二糖を用いて、エラスターゼ関連障害を治療する方法に関し、ただし、少なくとも３つの硫酸基がその部分上に存在することを条件とする。そのような化合物は例えば、ＵＳ特許公開第ＵＳ２００３００８７８７５号；５，６９０，９１０号；６，１９３，９５７号および７０５６８９８号において記載されており、これらは全て参照により組み込まれる。下記で示されるＮ−硫酸化二糖単位およびその立体異性体を含むその多硫酸化バージョンはまた、エラスターゼ関連障害の治療において有効である：
【化１７】
2014500863.tif 000019
「高硫酸化二糖」という用語はこのように、二糖コア分子上に少なくとも２つの硫酸部分を有する任意の二糖部分を意味し、ただし、そのような分子は、化学式Ｉの化合物においてＲ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６をＨとして、Ｒ３およびＲ４を硫酸（ＳＯ３−Ｍ＋）として有するナトリウム二糖を含まない。この用語はまた、ヘパリン由来で、低分子量（例えば、約１，０００ダルトン以下）を有する任意の多硫酸化二糖および任意の多硫酸化誘導体またはその化学的／酵素的に修飾されたバージョンを含み、ただし、前記部分は少なくとも２つの硫酸基を有する。酵素処理により、上記で示される６，６二糖が提供される。ＮＯによる化学脱重合により、６，５環構造が提供される。好ましい修飾物または誘導体は少なくとも３つの硫酸部分を有する。最も好ましい部分は、全てのヒドロキシル基が硫酸基により置換されており、いずれのＮ基もＮ−硫酸化される。
【００６３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2014500863.tif 000031