(57)【要約】  本発明は、自己免疫性障害もしくは疾患を治療し、または移植もしくは遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶を治療するための、それぞれインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼを誘導する、少なくとも２つの化合物を含んでなる組成物の使用に関し、前記誘導物質は異なる作用機序を有し、組成物はＩＤＯレベルに対して相乗効果を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫性障害もしくは疾患、または臓器、組織、正常細胞または遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶による苦痛を治療するための、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を誘導し、少なくとも２つの化合物を含んでなる組成物であって、前記ＩＤＯ誘導物質が異なる作用機構を有してＩＤＯレベルに対する相乗効果を引き起こすことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記誘導物質が、シチジン類似体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ビタミンＤ３類似体、インターフェロンγ類似体、その他のインターフェロン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン、プロスタグランジンＥ２類似体、ＩＤＯ安定剤、可溶性ＣＴＬＡ４抱合体、およびグリココルチコイドからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記誘導物質が、シチジン類似体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン、インターフェロンγ類似体、その他のインターフェロン、およびＩＤＯ安定剤からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物において、前記誘導物質が、ゼブラリン、バルプロ酸、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インターフェロンγ、インターフェロンＡ、およびＴＧＦ−βからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物において、前記組成物が、薬学的に許容可能な緩衝液、賦形剤、希釈剤、溶媒または担体を含んでなることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物において、前記組成物が、無酸症，急性出血性白質脳炎，アジソン病、円形脱毛症、貧血、悪性抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性難聴、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性リンパ球増殖性、自己免疫心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー、多腺性自己免疫性症候群２型、ベーチェット症候群、セリアック病、シャーガス病、硬化性胆管炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性リンパ球性甲状腺炎、チャーグ・ストラウス症候群、大腸炎、潰瘍性、クローン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病（インシュリン依存性）、シルダー汎発性脳硬化症、脳脊髄炎、実験的自己免疫、（ＥＡＥ）、後天性表皮水疱症、エリテマトーデス、フェルティ症候群、糸球体腎炎（ＩＧＡ）、膜性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、ハンマン−リッチ症候群、自己免疫性肝炎、慢性活性肝炎、特発性血小板減少症、炎症性腸疾患、Ｂ型インスリン抵抗性、ランバート・イートン症候群、水晶体原性ブドウ膜炎、硬化性萎縮性苔癬、円板状紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡性肝炎、狼瘡性腎炎、リンパ球減少症、メニエール病、混合性結合組織疾患、モーレン潰瘍、粘膜皮膚リンパ節症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、横断性脊髄炎、心筋炎、ナルコレプシー、実験的自己免疫性神経炎、視神経脊髄炎、眼前庭聴覚症候群、交感性眼炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、膵臓炎、水疱性類天疱瘡、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、結節性多発動脈炎、再発性多発性軟骨炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、リウマチ性多発性筋痛、多発神経根筋障害、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、特発性血小板減少性紫斑病、レイノー病、ライター病、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、スティッフパーソン症候群、成人発症型スティル病、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺薬中毒症、Ｂインスリン抵抗性、ぶどう膜髄膜脳炎症候群、ウェゲネル肉芽腫、および白斑からなる群から選択される、疾患治療のために使用されることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物において、前記組成物が、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症、クローン病、動脈硬化症、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化）または認知症の治療のために使用されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物において、前記組成物が、臓器、組織、正常細胞または遺伝子治療的改変細胞の移植で使用されて、免疫拒絶を阻止することを特徴とする組成物。
【請求項９】
ａ）適切な培地中の単離細胞を提供するステップと、
ｂ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物を添加するステップと、
ｃ）前記単離細胞を前記組成物と共に培養するステップと、
ｄ）細胞培養であって、中でＩＤＯが誘導される細胞培養を得るステップ
とを含んでなることを特徴とする、細胞培養中でＩＤＯを誘導する方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与するステップを含んでなる、自己免疫性障害もしくは疾患、または臓器、組織、正常細胞または遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶による苦痛を有する哺乳類を治療する方法であって、前記治療がＩＤＯを誘導することを特徴とする方法。
【請求項１１】
最初に、治療される哺乳類、または別の哺乳類に由来する細胞を請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の治療的有効量で、治療される病状と関連する１つまたは複数の抗原存在下で、生体外治療するステップと、それに続いて治療された前記細胞を前記治療される哺乳類へ移入するステップを含んでなる、自己免疫性障害もしくは疾患、または臓器、組織、正常細胞または遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶による苦痛を有する哺乳類を治療する方法において、前記治療がＩＤＯを誘導することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性障害もしくは疾患を治療し、または移植もしくは遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶を治療するための、それぞれインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼを誘導する、少なくとも２つの化合物を含んでなる組成物の使用に関し、前記誘導物質は異なる作用機序を有し、組成物はＩＤＯレベルに対する相乗効果を生じる。
【背景技術】
【０００２】
インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、トリプトファンのインドール部分を分解し、集合的にキヌレニンとして知られる神経刺激性および免疫調節性代謝産物の生成を開始する。樹状細胞によるＩＤＯの機能的発現は、末梢性免疫寛容の主要機序であることが、近年明らかになっている。ＩＤＯは、妊娠中の母親免疫寛容、同種移植片拒絶の制御、および自己免疫、炎症性病変とアレルギーからの保護に寄与する。ＩＤＯ発現はまた、悪性腫瘍が免疫寛容を誘導する生理学的機序の助けとなる（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｍｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。その中でＩＤＯが機能しているようである幅広い生理病理学的状態は、この抑制系が、Ｔ細胞応答の生理学的下方制御と、結果として起きる炎症性応答に頻繁に関与することを示唆する。ＩＤＯを誘導する既知の物質がいくつかあり、前記化合物は異なる作用機構を有する。異なる作用機序を有する、このようなＩＤＯ誘導物質のクラスの例は、特に、シチジン類似体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ビタミンＤ３類似体、インターフェロン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン、プロスタグランジンＥ２類似体、ＩＤＯ安定剤、可溶性ＣＴＬＡ４抱合体、およびグリココルチコイドである。
【０００３】
しかしこれらの物質の多くは、医薬組成物に適するには低すぎるレベルにＩＤＯ量を増大させ、したがって効果的なＩＤＯレベルを誘導するには高用量を要し、それは毒物学、服薬遵守またはコストの理由から適切でない。したがって適切な投与レベルで、異なる自己免疫障害の治療において、および移植拒絶反応の予防において、十分であり治療的に有用なレベルにＩＤＯを増大し得る、新しい医薬組成物を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、単独使用では、ＩＤＯを治療計画に関して十分でないレベルに誘導する化合物を、ＩＤＯを誘導する化合物の混合物または組み合わせ中で使用し得て、異なる作用機序を有する異なるＩＤＯ誘導物質を混合することで、ＩＤＯの増大が、各ＩＤＯ誘導物質が単独で達成するものの合計を上回り、場合によっては相加効果よりも最高で１００倍大きくなったという発見に関する。このような組み合わせを作ることで、その中でＩＤＯ誘導が治療的に有用であるいくつかの疾患と障害のために、それを必要とする哺乳類を治療するために使用し得る医薬組成物を製造することが、初めて可能になるであろう。
【０００５】
第１の態様では、本発明は、自己免疫性障害もしくは疾患、または移植もしくは遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶を治療するための、ＩＤＯを誘導する少なくとも２つの化合物を含んでなる組成物に関し、前記誘導物質は異なる作用機構を有して、ＩＤＯレベルに相乗効果を引き起こす。
【０００６】
第２の態様では、本発明は、自己免疫性障害もしくは疾患を有し、または移植もしくは遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶を有する哺乳類を治療する方法に関し、治療はＩＤＯを誘導し、上で定義される組成物の治療的有効量を患者に投与するステップを含んでなる。
【０００７】
本発明の第３の態様では、例えば、患者または別の個人からの末梢血または骨髄からの樹状細胞またはその他の抗原提示細胞が、適切な培地中で生体外培養される。ＩＤＯ産生を誘導して、ＩＤＯ産生上昇がある細胞の分化を誘導する目的で、発明の組成物をこれらの細胞に添加する。同時にまたはその直後に、治療される病状と関連する１つまたは複数の抗原（例えば自己免疫疾患の原因である自己抗原）を細胞に投与して、その後細胞を患者に移入する。科学文献で養子細胞移入とも称されることもある、この生体外治療は、移入される細胞の臓器または組織への移動をもたらし、そこでそれらはＴ細胞が抑制性Ｔ細胞になり、または抗原特異的調節Ｔ細胞になるように活性化し得る。移入細胞はまた、炎症部位にも移動し得て、そこでそれらは既存の調節Ｔ細胞を局所的に永続化させ得る。
【０００８】
第４の態様では、本発明は、適切な培地中で単離細胞を提供するステップと、上で定義される組成物を添加するステップと、前記単離細胞を組成物と共に培養して、その中でＩＤＯが誘導される細胞培養を得るステップとを含んでなる、細胞培養中でＩＤＯを誘導する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ゼブラリンおよびインターフェロンγによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。目盛りは対数（ｌｏｇａｒｉｔｍｉｃ）であり、各バーについて相対値を提示する。
【図２Ａ】図２Ａは、インターフェロンγおよびバルプロ酸による、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。１ｍＭのバルプロ酸である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、インターフェロンγおよびバルプロ酸による、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。０．５ｍＭのバルプロ酸である。
【図３】図３は、ゼブラリン、インターフェロンγ、およびバルプロ酸による、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。結果は、ＴＨＰ−１細胞によるＩＤＯ１発現に対する、全ての３物質の相乗的効果を明確に実証する。
【図４Ａ】図４Ａは、ｈＣＧとゼブラリンによる、およびｈＣＧとインターフェロンγによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、ゼブラリン（１００μＭ）のみに、ｈＣＧ（０，１単位／ｍｌ）のみに、または組み合わせに曝露された。組み合わせに曝露されたＴＨＰ−１細胞の結果は、相乗効果を実証する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｈＣＧとゼブラリンによる、およびｈＣＧとインターフェロンγによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。細胞が非曝露（培地対照）である場合、ｈＣＧ（０，０１単位／ｍｌ）のみに、インターフェロンγ（２００ＩＵ／ｍｌ）のみに、または組み合わせに曝露された場合に、得られた結果である。組み合わせに曝露されたＴＨＰ−１細胞は、相乗効果を実証する。
【図５】図５は、開始から２４時間にわたるインターフェロンγへの曝露、およびゼブラリンへの連続的曝露後における、ＩＤＯ１発現の動態である。本試験の目的は、ゼブラリンと組み合わされたインターフェロンの動態を調べることであった。インターフェロンγ単独によるＩＤＯ１誘導は、２４時間後に強力であったが、効果は持続せず迅速に低下した。対照的に、期間全体にわたって維持されたゼブラリンと組み合わせた場合、レベルは低下したものの効果は２日目および３日目にも維持された。
【図６】図６は、ゼブラリンへの異なる予備曝露時間後における、２４時間にわたるインターフェロンγへの曝露後における、ＩＤＯ１発現の動態である。ゼブラリンとインターフェロンγによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果の動態である。パネルＡでは、４日後における、ゼブラリンの低い効果が実証される。収集の２４時間前、３日後に単独投与されたインターフェロンγは、強力なバンドを与え、ゼブラリン曝露ＴＨＰ−１細胞の収集の２４時間前、３日後にインターフェロンγを添加した場合は、それはより強力な効果を与え、ゼブラリンがインターフェロンに３日間先行する場合にも、相乗効果が実証される。パネルＢでは、ＴＨＰ−１細胞にゼブラリンのみが５日間にわたり単独投与され、淡いバンドが検出された。インターフェロンγが３日後に単独投与され、２４時間後に洗浄されて、インターフェロン除去の２４時間後に試験すると、淡いバンドが示された。これは、図５で提示される結果に合致する。開始からのゼブラリンと、３日後に２４時間にわたり投与されたインターフェロンγとの組み合わせは、持続性の高度発現レベルをもたらした。パネルＣでは、ＴＨＰ−１細胞がゼブラリンに６日間曝露されて、インターフェロンγが４日後に２４時間にわたり投与され、合計６日後に細胞を収集した。この場合も、インターフェロンγ単独では、検出されたＩＤＯ１誘導はほとんど皆無であったが、組み合わせると強力なＩＤＯ１発現が観察された。パネルＤおよびＥでは、ＴＨＰ−１細胞が、ゼブラリンに７日間曝露され、３日後（パネルＤ）または４日後（パネルＥ）のいずれかに、インターフェロンγに２４時間にわたり曝露された。組み合わせによる持続性の強力なＩＤＯ１発現が、パネルＤおよびＥの双方で図示される。
【図７】図７は、ゼブラリンと、それぞれ２．５および２５ｎｇ／ｍｌの２つの濃度のインターフェロンＡとによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。
【図８】図８は、ゼブラリン、インターフェロンγ、およびインターフェロンＡによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。
【図９】図９は、ゼブラリン、インターフェロンγ、およびＴＧＦ−ｂ１による、ＩＤＯ発現に対する相乗効果である。
【図１０】図１０は、ゼブラリンと、２４時間のインターフェロンγとへの曝露による、ＩＤＯ発現に対する持続的相乗効果である。
【図１１】図１１は、ゼブラリン、インターフェロンγ、およびインターフェロンＡによる、ＩＤＯ発現に対する持続的相乗効果である。
【図１２】図１２は、ゼブラリン、インターフェロンγ、インターフェロンＡ、およびＴＧＦ−βによる、ＩＤＯ発現に対する持続的相乗効果である。
【図１３】図１３は、生体外における５０μＭゼブラリンへの５日間の曝露後における、ラット骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）中のｒＩｄｏ１の発現増強、および生体外における混合脾臓リンパ球のポリクローナル活性化を抑制する抑制機能の改善である。
【図１４】図１４は、成体ウィスター系ラットに７日間にわたり毎日腹腔内接種されたゼブラリン（Ｚｅｂｕｂｕｌａｒｉｎｅ）は、脾臓中でｒＩｄｏ１の発現増強を誘導し、生体外のポリクローナル刺激に対するＴ細胞反応性を抑制する。
【図１５】図１５は、未処置対照と比較した、１４日間にわたるゼブラリンの毎日の腹腔内接種による、腎臓被膜の真下に同種移植された膵島の免疫学的拒絶の抑制である。対照ラット上における、拒絶徴候としての血糖経過観察。図は、対照動物の結果を示す。
【図１６】図１６は、未処置対照と比較した、１４日間にわたるゼブラリンの毎日の腹腔内接種による、腎臓被膜の真下に同種移植された膵島の免疫学的拒絶の抑制である。ゼブラリン処置ラット上における、拒絶徴候としての血糖経過観察。図は、処置動物の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本出願および発明の文脈では、以下の定義が適用される。
【００１１】
「相乗効果」という用語は、通常「相加効果」と称される、ＩＤＯ誘導物質がそれぞれ単独使用される場合に達成されるＩＤＯレベルの合計よりも顕著に高い、ＩＤＯ誘導物質組み合わせの使用後のＩＤＯレベルの増大を意味することが意図される。
【００１２】
「異なる作用機序」という用語は、分子レベルで、および／またはそのいくつかが免疫学的経路を含んでもよい、より複雑な生物学的経路によって、ＩＤＯを誘導する異なる様式と定義される。特に下の表１に示される異なるクラスのＩＤＯ誘導物質は、それらのＩＤＯ誘導に関して、完全にまたは部分的に異なる作用様式を有することが、文献から知られている。これらの異なるクラスは、シチジン類似体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ビタミンＤ３類似体、インターフェロンγ類似体、インターフェロンαなどのその他のインターフェロン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン、プロスタグランジンＥ２類似体、ＩＤＯ安定剤、可溶性ＣＴＬＡ４抱合体、ＴＧＦ−β、およびグリココルチコイドである。
【００１３】
「免疫抑制」という用語は、本明細書で、免疫学的障害を低下させ、停止させ、または改善する効果と定義され、免疫細胞または炎症からの細胞毒性障害を被った罹患組織を保護し、蘇生させまたは回復させる。
【００１４】
「免疫抑制剤」という用語は、本明細書で、免疫障害を低下させ、予防、抑止、または改善するのに効果的な免疫障害治療用量の活性成分を含有し、免疫媒介障害を被った、またはそのリスクがある罹患組織に、保護、蘇生または復活を提供する、活性成分または組成物と定義される。
【００１５】
「インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）」という用語は、トリプトファンを異化し得る、２つの異なるタンパク質である、ＩＤＯ−１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ、ＥＣ１．１３．１１．５２）、またはＩＤＯ−２（インドールアミン−ピロール２，３ジオキシゲナーゼ様１、ＥＣ１．１３．１１．−）を意味することが意図される。ＩＤＯ−１はまた、セロトニンおよびメラトニンも異化し得るが、ＩＤＯ−２の基質特異性は、それほど詳しく研究されていない。トリプトファン経路からの異化産物は、免疫抑制ＩＤＯ活性を高める、トリプトファン、Ｎ−ホルミル−キヌレニン、ホルミルアントラニル酸、アントラニル酸、Ｌ−キヌレニン、４−（２−アミノフェニル）−２，４−ジオキシブタン酸、キヌレン酸、３−ヒドロキシ−Ｌ−キヌレニン、３−ヒドロキシ−アントラニル酸、３−メトキシ（Ｍｅｔｏｘｙ）−アントラニル酸、４−（２−アミノ−３−ヒドロキシ−フェニル）−２，４−ジオキソブタン酸、キサンツレン酸、８−メトキシ（Ｍｅｔｏｘｙ）−キヌレン酸（ｋｕｒｅｎａｔｅ）、２−アミノ−３−カルボキシ−ムコン酸セミアルデヒド、２−アミノムコン酸セミアルデヒド、キノリン酸（Ｑｕｉｍｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、シンナバリニン酸、トリプタミン、Ｎ−メチルトリプタミン、インドール酢酸、２−ホルムアミノベンゾイル酢酸、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン、５−ヒドロキシ−Ｎ−ホルミルキヌレニン（ｆｏｒｍｙｌｋｕｎｅｒｉｎｅ）、５−ヒドロキシ−キヌレニン（ｋｕｎｅｒｉｎｅ）、５−ヒドロキシ−キヌレンアミン（ｋｕｎｅｒｅｎａｍｉｎ）、４，６−ジヒドロキシ−キノリン、セロトニン、Ｎ−アセチル−セロトニン、メラトニン、６−ヒドロキシ−メラトニン、ホルミル−Ｎ−アセチル−５−メトキシキヌレンアミン、Ｎ−メチルセロトニン、ホルミル−５−ヒドロキシ−キヌレンアミン、５−メトキシトリプタミン（Ｍｅｔｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）、５−ヒドロキシインドール−アセトアルデヒド、５−ヒドロキシインドール酢酸、５−メトキシインドール酢酸（Ｍｅｔｏｘｙｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｔｅ）、または５−ヒドロキシインドール−アセチルグリシンである。例は、キヌレニン、３−ヒドロキシ−キヌレニン、アントラニル酸、３−ヒドロキシ−アントラニル酸、キノリン酸、およびピコリン酸である。
【００１６】
ＩＤＯによって媒介される免疫抑制は、トリプトファン飢餓、リンパ球中のアポトーシス誘導、および調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導によって媒介される。アポトーシス誘導およびＴｒｅｇ誘導は異化産物によって媒介され、これが、本発明の組成物によるＩＤＯ誘導と組み合わされた、このような異化産物の添加が、臨床効果を高め得る理由である。ＩＤＯからの免疫抑制作用は、以下によって説明されてもよい。１）トリプトファン飢餓、２）特にＬ−キヌレニン、アントラニル酸、３−ヒドロキシ−アントラニル酸、および３−ヒドロキシ−Ｌ−キヌレニンである、前述の代謝産物のいくつかからの、免疫細胞アポトーシスを誘導する直接毒性効果、および／または３）代謝産物のいくつかは、耐性にとって重要な免疫抑制性調節Ｔ細胞へのヘルパーＴ細胞の分化を刺激する。
【００１７】
類似体は、例えば相同体（アルキル鎖の長さの差などの化学構造中の増分が異なる）、分子断片、１つまたは複数の異なる官能基やイオン化変化がある構造体など、親化合物と化学構造が異なる分子である。構造的類似体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５），ｃｈａｐｔｅｒ２８）で開示されるような技術と共に、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）を使用して、見つかることが多い。
【００１８】
ＩＤＯ遺伝子発現は、抗原提示細胞中で誘導されることが知られている。樹状細胞またはマクロファージの異なるＩＤＯ産生亜集団は、トリプトファン経路中でその他の酵素の変動する発現を有し、したがって代謝産物の異なるサブセットもたらすことが予期され得る。樹状細胞（ＤＣ）および特に形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、ＩＤＯ依存性Ｔｃｅｌｌ抑制の最強の媒介物である（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ８：２０９−１６，２００７）。
【００１９】
ＩＤＯ発現は、一連のシグナルによって複雑な調節を受け、したがってＩＤＯレベルは、異なる作用機構によって誘導または維持されてもよい。例えばＩＤＯは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはヒストンデアセチラーゼの阻害によって誘導されてもよく、それはさもなければ発現抑制されたＩＤＯのサイレンシングプロモーターを活性化する。ＩＤＯはまた、ＩＤＯ遺伝子発現をもたらすＮＦｋＢ活性化によって誘導されてもよく、前記ＮＦｋＢ活性化は、インターフェロンγ  Ｒ１／γＲ２シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体活性化などの様々な要素によって誘導される。さらに反応性酸化種（ＲＯＳ）の阻害剤が、ＩＤＯの安定化に寄与してもよく、既存のＩＤＯレベルを安定化し、または既存のＩＤＯの効果を高め、またはＩＤＯを分解または不活性化する経路を阻害するその他の機構もＩＤＯの安定化に寄与し得る。さらに所望のＩＤＯレベルを増大させまたは維持する方法は、その他のＩＤＯ誘導物質の下流であるが、ＩＤＯ誘導をもたらさない経路の阻害であり、前記阻害はＩＤＯ誘導に有利に働く。さらに別の機序はインターフェロンγの活性化によるものであり、および／またはＩＤＯの自己分泌誘導を活性化するその他の方法によるものである。ＩＤＯを誘導するためのこれらのおよびその他の作用様式を表１に記載する。
【００２０】
本発明は、自己免疫性障害もしくは疾患、または移植もしくは遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶を治療するための、ＩＤＯを誘導する少なくとも２つの化合物を含んでなる組成物に関し、前記誘導物質は異なる作用機構を有して、ＩＤＯレベルに相乗効果（「相乗効果」については上で定義される）を引き起こす。好ましくはこのような相乗効果は、例えば少なくとも３倍高いなど、相加効果（「相加効果」については上で定義される）よりも顕著に高くあるべきである。しかし相乗効果は、好ましくは３倍以上高く、例えば１０、２０、３０、４０、５０または１００倍高く、または下に提示される生体外実施例で示されるように、なおもより高い。前記誘導物質は、シチジン類似体、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ビタミンＤ３類似体、インターフェロンγ類似体、その他のインターフェロン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、ゴナドトロピン受容体シグナル伝達ホルモン、プロスタグランジンＥ２類似体、ＩＤＯ安定剤、可溶性ＣＴＬＡ４抱合体、およびグリココルチコイドからなる群から選択される。異なる誘導物質の例は、ゼブラリン、バルプロ酸、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、およびインターフェロンγである。その他の実施例は、下の表１で言及されるものである。
【００２１】
発明の組成物を使用して、無酸症、急性出血性白質脳炎（ｌｅｕｋｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ），アジソン病、円形脱毛症、貧血、悪性抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性難聴、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性リンパ球増殖性、自己免疫心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー、多腺性自己免疫性症候群２型、ベーチェット症候群、セリアック病、シャーガス病、硬化性胆管炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性リンパ球性甲状腺炎、チャーグ・ストラウス症候群、大腸炎、潰瘍性、クローン病、クリオグロブリン血症、クッシング症候群、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病（インシュリン依存性）、シルダー汎発性脳硬化症、脳脊髄炎、実験的自己免疫、（ＥＡＥ）、後天性表皮水疱症、エリテマトーデス（Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、フェルティ症候群、糸球体腎炎（ＩＧＡ）、膜性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、ハンマン−リッチ症候群、自己免疫性肝炎、慢性活性肝炎、特発性血小板減少症、炎症性腸疾患、Ｂ型インスリン抵抗性、ランバート・イートン症候群、水晶体原性ブドウ膜炎、硬化性萎縮性苔癬、円板状紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡性肝炎、狼瘡性腎炎、リンパ球減少症、メニエール病、混合性結合組織疾患、モーレン潰瘍、粘膜皮膚リンパ節症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、横断性脊髄炎、心筋炎、ナルコレプシー、実験的自己免疫性神経炎、視神経脊髄炎、眼前庭聴覚症候群、交感性眼炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、膵臓炎、水疱性類天疱瘡、落葉状天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｆｏｌｉａｃｅｏｕｓ）、尋常性天疱瘡、結節性多発動脈炎、再発性多発性軟骨炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、リウマチ性多発性筋痛、多発神経根筋障害、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、特発性血小板減少性紫斑病、レイノー病（Ｒａｙｎａｕｄｓ）、ライター病、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、スティッフパーソン症候群、成人発症型スティル病、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺薬中毒症、Ｂインスリン抵抗性、ぶどう膜髄膜脳炎症候群、ウェゲネル肉芽腫、および白斑からなる群から選択される疾患を治療してもよい。疾患（ｄｉｓｅａｒｅｓｅ）の特定例としては、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症、クローン病、動脈硬化症、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化）および認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａｈｅ）組成物、または移植では、臓器、組織、正常なまたは遺伝子治療的改変細胞の免疫拒絶の阻害が挙げられる。
【００２２】
特に発明の組成物を関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬、シェーグレン症候群、多発性硬化症、クローン病、動脈硬化症、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化）または認知症の治療のために使用してもよい。
【００２３】
発明の組成物は、薬学的に許容可能な緩衝液、賦形剤、溶媒または担体をさらに含んでなってもよい。
【００２４】
「薬学的に許容可能な」は、活性成分の生物学的活性の有効性を低下させない、無毒物質を意味する。このような薬学的に許容可能な緩衝液、担体または賦形剤については当該技術分野で周知である。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）、およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい。
【００２５】
「緩衝液」という用語は、ｐＨの安定化の目的で、酸塩基混合物を含有する水溶液を意味することが意図される。緩衝液の例は、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸、炭酸、酢酸、クエン酸、グリコール酸、乳酸、ホウ酸、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、およびＴＥＳである。
【００２６】
「溶媒」という用語は、組成物を提示、希釈および／または溶解する目的がある、水性または非水性液を意味することが意図される。溶媒は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（紅花油、コーンオイル、落花生油、綿実油またはゴマ油など）の１つまたは複数であってもよい。
【００２７】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、およびミネラルの１つまたは複数であってもよい。炭水化物の例としては、例えば凍結乾燥を容易にするために、組成物に添加される、乳糖、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、例えば粘度制御のために、生物接着を達成するために、希釈のために、脂質を化学物質およびタンパク質分解から保護するために、組成物に添加される、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラゲナン、ヒアルロン酸とその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシド共重合体、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル、および全て異なる分子量のポリビニルピロリドンである。脂質の例は、ポリマーと同様の理由で組成物に添加される、全て異なるアシル鎖長と飽和度の、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、および糖脂質、そして卵レシチン、ダイズレシチン、水素化卵およびダイズレシチンである。ミネラルの例は、液体蓄積の低下または有利な顔料特性などの恩恵を得るために組成物に添加される、滑石、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、および酸化チタンである。
【００２８】
組成物は、前記少なくとも２つの誘導物質が生体外で強力なＩＤＯ活性を誘導する濃度に対応する効果を達成するのに適切な量で、それを必要とする哺乳類に投与されてもよい。
【００２９】
適切な用量による治療、免疫系に直接影響を及ぼすことで、内皮細胞中でＩＤＯ発現を誘導し、結果として宿主に対するそれらの免疫原性をより低くし、移植細胞の拒絶リスクを低下させることによって、移植片（臓器、組織または細胞）の前処理のために組成物を使用することが可能である。生体内免疫抑制を提供する用量の組成物による、移植受容者の引き続く治療によって、さらなる免疫抑制治療法なしに、または最小のこのような治療法で、移植片の恒久的な生存が達成され得る。
【００３０】
患者を治療するために、発明の組成物は、作用部位または位置において、５μＭ〜１０ｍＭになる生体内濃度を達成する用量レベルで、または治療される疾患または障害、およびいずれのＩＤＯ誘導物質に言及されるかに応じて、効果的なその他のより低いまたは高いレベルで投与されてもよい。濃度が、通常、モル濃度（Ｍ）として表されないＩＤＯ誘導物質では、例えば０．００１ＩＵ／ｍＬ〜１００ＭＩＵ／ｍＬ、または１〜１０００ＩＵ／ｍＬなどのより狭い範囲またはその他の適切なレベルなどの別の数値が適用される。同様に、得られたレベルが、ｎｇ／ｍＬ、ｍｇ／ｍＬ、ｍｇ／ｋｇ体重などとして表される場合にも、その他の数値が適用される。最初により高い用量が使用され、より低い維持用量がそれに続いてもよい。生体外治療（養子細胞移入）のためには、上で概説されたのと同様の濃度が達成されるべきであるが、これらは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）／生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）濃度であり、生体内濃度ではない。各ＩＤＯ誘導物質で目標とされる用量もまた、使用されるその他の相乗的に作用するＩＤＯ誘導物質に左右される。さらに発明の相乗的に作用する組成物中のＩＤＯ誘導物質の数は、２、３、４以上であり得るので、非常に多数の実行可能な用量レベルが規定され得ることが明らかである。
【００３１】
発明の組成物は、経口、舌下、バッカル、経鼻、吸入、（腹腔内、臓器内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、（中心、肝臓または末梢）静脈、リンパ管、心臓、選択的または超選択的脳動脈アプローチをはじめとする動脈、脳実質または脳室内へのカテーテルを介した脳静脈系を通じた逆行性灌流をはじめとする）非経口；脳または脊髄組織またはいずれかの脳脊髄液脳室上の、またはそれを通じた直接曝露または加圧；脳槽または腰椎穿刺を介した、クモ膜下、脳槽内、硬膜下または硬膜外空隙への注射；眼周囲、眼球、その構造および層内への注入による施用をはじめとする眼球内および眼周囲の点眼；エウスタキオ管、乳突蜂巣、外および内耳道、鼓膜、中耳、蝸牛らせん神経節および内耳性器官をはじめとする内耳をはじめとする耳；ならびに腸内、腸、直腸、膣、尿道または膀胱槽経由をはじめとする、あらゆる適切な手段によって投与されてもよい。また子宮および周産期適応では、母親血管系への、または子宮、子宮頸部、および膣をはじめとする母親臓器を通じた、またはその中への、および胚、胎児、新生児と、羊膜腔などの空隙、臍帯、臍帯動脈または静脈および胎盤などの関連組織中への注射を使用してもよい。好ましい手段は、いずれの場合にも患者の状態と使用される組成物に応じて変動してもよい。
【００３２】
発明の組成物の効果を免疫抑制剤と組み合わせて、耐性誘導の最中または前に、エフェクター免疫細胞の発生頻度を低下させてもよい。
【００３３】
本発明は、発明の組成物の送達のタイミングと順序を使用して、最適な方法で耐性を誘導する可能性を含む。それは、発明の組成物を含んでなる、個々のＩＤＯ誘導物質の送達のタイミングと順序を使用して、最適な方法で耐性を誘導する可能性を含む。例えば発明の組成物が、２つのＩＤＯ誘導物質（「Ａ」および「Ｂ」）を含んでなる場合、最初にＡを一定の投与手段と投薬計画（用量、濃度、頻度など）によって投与してもよい。その後、Ｂを別の経路、用量、および投薬計画で投与する。最終的に、ＡまたはＢの１つは、他方の前に停止し得る。発明の様々な組み合わせについて、それぞれが各ＩＤＯ誘導物質のＩＤＯ誘導有効性、遺伝子発現動態、薬物動態学などを勘案する、多数のこのような異なる相乗的治療計画が想定され得る。
【００３４】
組成物は、メトトレキサート、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリンをはじめとする代謝拮抗剤、（ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、レフルノミド、ＦＫ７７８をはじめとする）ヌクレオチド合成阻害剤、ＦＴＹ７２０、（リンパ球に対するポリクローナル抗体、胸腺細胞、Ｔ細胞、ムロモナブＣＤ３、リツキシマブ、アレムツズマブ、ＣＡＭＰＡＴＨ−１をはじめとする）リンパ球枯渇抗体、非枯渇抗体（ダクリズマブなど、ＬＦＡ３−Ｉｇ融合タンパク質）、（インフリキシマブ、アダリムマブをはじめとする）抗ＴＮＦ抗体、ナタリズマブ（抗ＶＬＡ−４）、抗ＣＤ１５４抗体ＢＧ９５８８およびＩＤＥＣ  １３１）、（レネルセプトおよびエタネルセプト（可溶性ＴＮＦｐ５５およびＴＮＦｐ７５受容体）をはじめとする可溶性サイトカイン受容体、およびアナキンラ（可溶性ＩＬ−１ＲＡ）などの追加的な活性成分を含んでなってもよい。上述の免疫抑制薬剤を本発明の組成物と組み合わせて使用して、免疫エフェクター細胞数を低下させ得る。
【００３５】
組成物は、カプセルおよびアンプルなどの便利な単位用量形態で流通させて、入手可能にしてもよく、製薬技術分野で既知の方法のいずれかによって、製造流通されてもよい。活性成分に加えて、組成物は、製造される組成物タイプに関する技術分野のその他の通常の作用物質もまた含有し得る。これは、例えば脂質、非水性または水性希釈剤、溶剤、溶解剤、乳化剤、シロップ、顆粒または粉末、またはこれらの混合物中の活性成分の懸濁液、溶液、およびエマルション構造の形態を取ってもよい。組成物は、着色剤、保存料、香料、着香剤添加、および甘味剤もまた含有し得る。活性成分に加えて、組成物は、別の薬理的活性薬剤もまた含有し得る。組成物の製造および流通は、液体または微細固体またはその双方を用いて活性成分を均等に密接にまとめ、次に必要とされる場合は、組成物を投与単位形態に形成するなどの、技術分野で公知の技術によって行われる。組成物を構成する個別の用量、部分、および担体ビヒクルは、医療投与のための形状または包装のおかげで、概して適応されて、この目的のために流通される。
【００３６】
錠剤は、場合により１つまたは複数の追加的な薬理的に活性の化合物が添加された活性成分から、圧搾または成型によって製造して流通させ得る。圧縮錠剤は、技術分野で典型的な機械内における、場合によりバインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、および分散剤をはじめとするその他の作用物質と混合された、粉末または顆粒などの分散形状活性成分の既知量の圧搾を通じて製造して流通させ得る。成型錠剤は、技術分野において典型的な機械内で、液体希釈剤で湿らせた薬理的活性化合物とその他の添加剤の既知の活性成分添加量の混合物を成型することで、製造して流通させ得る。錠剤は、場合により、乳白剤または甘味料を含有し得て、遅延または放出制御され、または含有活性成分を消化系の一定の部分内でもまた放出するように調合し得る、保護マトリックスを含む物質で塗布され、包まれまたは被覆されてもよい。カプセルは、ゼラチンまたはその他の水溶性物質の２つの被膜に分かれるまたは密封されたカプセル内に、既知量の活性成分、追加的な薬理的活性化合物、および添加剤を入れることで、製造して流通させ得る。活性成分はまた、マイクロカプセル、ミクロソーム、ミセル、および微小エマルション形態中の組成物として、製造して流通させ得る。
【００３７】
経口局所投与のために許容される活性成分を含有する組成物は、活性成分、その他の薬理的活性化合物、およびアカシアやトラガカントなどの風味添加基礎原料中の添加剤を含有するロゼンジとして；その他の薬理的活性化合物、およびゼラチンやスクロースなどの不活性基剤中の添加剤と共に、活性成分を含有する香錠として；許容される液体中にその他の薬理的活性化合物、および添加剤と共に活性成分を含有する口内洗浄液または洗口液として、製造して流通させ得る。
【００３８】
活性成分、その他の薬理的活性化合物、添加剤、および許容される分散媒を含有する、軟膏、油、クリーム、ローション、ゲル、ペーストとして、および経皮パッチとして、皮膚局所投与のために許容される活性成分を含有する組成物を製造して流通させ得る。
【００３９】
経鼻投与のために許容される活性成分を含有する組成物は、その他の薬理的活性化合物および添加剤と共に、吸入粉末として、または鼻内噴霧または点鼻剤のための油性、水性または非水性液として、製造して流通させ得る。
【００４０】
直腸投与のために許容される活性成分を含有する組成物は、その他の薬理的活性化合物、通常の水溶性希釈剤の適切な基剤、脂肪、および当業者に知られている添加剤との坐薬、クリーム、フォーム、潅注液または浣腸として製造して流通させ得る。
【００４１】
膣内投与のために許容される活性成分を含有する組成物は、その他の薬理的活性化合物、適切な基剤、および当業者に知られている添加剤とのペッサリー、坐薬、クリーム、ゲル、フォーム、潅注液またはスプレーとして製造して流通させ得る。
【００４２】
非経口投与のために許容される活性成分を含有する組成物は、水性および非水性無菌注射液、その他の薬理的活性化合物、抗酸化剤、静菌剤、および組成注射液物を受容者の血液に対して等張、低張または高張にする溶質およびマンニトールなどの糖類をはじめとする添加剤；および懸濁化剤および増粘剤もまた含み得る水性および非水性無菌懸濁液から、製造して流通させ得る。組成物は、液体として密封ガラスまたはプラスチックアンプル、バイアル、ボトル、およびバッグなどの単位用量または多回用量容器で、および使用直前に、例えば水、生理食塩水またはデキストロース溶液などの無菌の液体の添加のみを要する乾燥状態で、製造して流通させ得る。注射のための即席溶液および懸濁液は、上述のような粉末および錠剤から調製し得る。
【００４３】
脳および関連構造、脊髄および関連構造、脳室系、および脳脊髄液腔内への投与のために許容される活性成分を含有する組成物は、その他の薬理的活性化合物、抗酸化剤をはじめとする添加剤、静菌剤、および組成物を脳脊髄液に対して等張、低張または高張にする溶質およびマンニトールなどの糖類；および懸濁化剤および増粘剤もまた含み得る水性および非水性無菌懸濁液を含有する、水性および非水性無菌注射溶液として製造して流通させ得る。組成物は、液体として密封ガラスまたはプラスチックアンプル、バイアル、ボトル、およびバッグなどの単位用量または多回用量容器で、および使用直前に、例えば水、生理食塩水またはデキストロース溶液などの無菌の液体の添加のみを要する乾燥状態で、製造して流通させ得る。注射のための即席溶液および懸濁液は、上述のような粉末および錠剤から調製し得る。
【００４４】
組成物の所望の単位用量は、投与活性成分の１日量、または免疫障害治療用量またはその適切な画分を含有するものである。本発明の単位用量形態はまた、二連シリンジ、その１つが活性成分を含有してもよい連続コンパートメント付きシリンジ、およびその他のあらゆる必要な希釈剤またはビヒクルなどのより複雑なシステムを含んでもよい。シリンジ内の作用物質は、逐次放出され、またはシリンジプランジャーの始動後に、２つの混合物または組み合わせとして放出される。このようなシステムについては、当該技術分野で公知である。
【００４５】
組成物は、上述されたような疾患または障害の治療のために使用してもよい。
2014500312.tif 000002
2014500312.tif 000003
2014500312.tif 000004
【００４６】
以下の実施例は、例証を意図するが、本発明をいかなる任意の様式、形状、または形態でも、明示的または暗黙的に限定することは意図されない。
【実施例】
【００４７】
実施例１．ゼブラリンおよびインターフェロンγによるＩＤＯ発現に対する相乗効果
材料と方法
ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２０２）は、急性単球性白血病に由来する、ヒト単核球細胞系である。それは単球の表現型を有するが、分化させて、より樹状細胞的な表現型にし得る。現行の試験では、ＴＨＰ−１細胞を５％または１０％ＦＣＳ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのナトリウムピルビン酸、および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンが添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地（それぞれＲ５またはＲ１０培地）中で、生体外継代した。細胞密度を１ｍｌあたり２０００００個の細胞に調節し、培養物を加湿インキュベーター内で、１０％ＣＯ２と共に３７℃で４〜７日間培養した。試験される物質、または物質の組み合わせを指定された時点で培地に添加し、ＩＦＮ−γの場合は、示されるように培地から除去した。処置開始の開始９６〜１６８時間後、ＰＣＲによってまたは定量的ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）によって、ＩＤＯ発現を評価した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してフラスコまたは６ウェルプレート内で培養した細胞から、ＲＮＡを抽出した。Ｒｎａｓｅ遊離デオキシリボヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）処理を通じて、残留ＤＮＡを除去した。分光光度計とゲル電気泳動によって、単離ＲＮＡの質と量を測定した。
【００４８】
使用説明に従ってキット（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ付きＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用し、遺伝子発現を実証した。分析されたヒトＩＤＯ−１遺伝子の順方向プライマーおよび逆方向プライマーおよびハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴの配列は、それぞれ以下の通りであった。ＩＤＯ−１順方向：５’−ＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧ−３’、逆方向：５’−ＣＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＧＣＧＡＡＧＡＡＣ；ＨＰＲＴ順方向：５’−ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡ−３’、ＨＰＲＴ逆方向：５’−ＡＣＴＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡ−３’。ＰＣＲ条件は、以下の通りに設定された。９４℃で２分間の１回の変性サイクルと、それに続く９４℃で１５秒間、５３℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクル（ＩＤＯ−１の場合）または３０サイクル（ＨＰＲＴの場合）、７２℃で５分間の最終伸長反応。
【００４９】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ付き、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ二段階ｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ分析（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。ｐｏｌｙｄＴとランダム六量体プライマーとの混合物を使用した２０μｌのＲＴ反応中で、合計１００〜５００ｎｇの全ＲＮＡを使用した。得られたｃＤＮＡを８０μｌの全容積に希釈して、−２０℃で保存した。Ｇｅｎｅ  Ｆｉｓｈｅｒソフトウェアサポートを使用して、異なる遺伝子のプライマー配列をデザインした。（Ｇ．Ｇｉｅｇｅｒｉｃｈ，Ｆ．Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｌｅｉｅｒｍａｃｈｅｒ，ＩＳＭＢ−９６）。ＩＤＯ遺伝子増幅で使用したプライマーは、以下の通りであった。順方向：５’−ＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＡＡ−３’、プライマー配列、逆方向：ＴＴＴＣＡＣＡ−ＣＡＧＧＣＧＴＣＡＴＡＡＧＣＴ−３’。
【００５０】
ｃＤＮＡ配列に従って、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）ＨＰＲＴ順方向：５’−ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡ−３’、ＨＰＲＴ逆方向：５’−ＡＣＴＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡ−３’を使用した。２μｌの希釈ｃＤＮＡ（１２．５ｎｇ）、０．３μＭの各プライマー、１μｌのウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍｌ）、および１０μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧからなる２０μｌの反応中で、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。以下の熱プロファイルによって、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）内でＩＤＯの増幅を実施した。５０℃で２分間のＵＤＧインキュベーション、次に９５℃で５分間での変性と、それに続く９４℃で２秒間、５８℃で１０秒間、および７２℃で１４秒間の４５サイクル。ＨＰＲＴ増幅は、以下の通りに実施した。５０℃で２分間のＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧインキュベーション、９５℃で５分間での変性と、それに続く９４℃で２秒間、５５℃で１０秒間、および７２℃で１４秒間の４５サイクル。増幅後、融解曲線分析を実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲ実験は、常時三連で実施した。
【００５１】
結果と考察
ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、またはゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または異なる濃度のインターフェロンγ  ＩＦＮｇ；Ｓｉｇｍａ）のみに曝露された（図１）。細胞はまた、様々な濃度のインターフェロンγと組み合わされた、１００μＭのゼブラリンにも曝露された。目盛りは対数（ｌｏｇａｒｉｔｍｉｃ）であり、各バーについて相対値を提示する。例えば１００μＭのゼブラリンが単独で９の値を与え、２００ＩＵ／ｍｌのインターフェロン（ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ）γが８０の値を与えたことが顕著である。これらの値の合計が８９であるのに対し、双方が一緒に与えられた場合は、ＩＤＯ１発現は３７０００を上回る値に達する。これは２つの物質による、ＴＨＰ−１細胞中のＩＤＯ１発現の相乗的誘導を実証する。
【００５２】
実施例２．インターフェロンγおよびバルプロ酸によるＩＤＯ発現に対する相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、インターフェロンγ（２００ＩＵ／ｍｌ）のみに、バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ）（１ｍＭ）のみに、または組み合わせに曝露された（図２Ａ）。組み合わせに対するＴＨＰ−１細胞曝露の結果は、相乗効果を実証する。同様であるが、バルプロ酸濃度を０．５ｍＭに低下させた実験もまた実施した（図２Ｂ）。この組み合わせでもまた、ＩＤＯ１発現に対する相乗効果が実証された。
【００５３】
実施例３．ゼブラリン、インターフェロンγ、およびバルプロ酸による、ＩＤＯ発現に対する相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、ゼブラリン（１００μＭ）のみに、インターフェロンγ（２００ＩＵ／ｍｌ）のみに、またはバルプロ酸（１ｍＭ）のみに曝露された（図３）。ＴＨＰ−１細胞は、３つの物質にペアワイズに、および全ての３つの物質の組み合わせにも曝露された。目盛りは対数（ｌｏｇａｒｉｔｍｉｃ）であり、各バーについて相対値を提示する。結果は、ＴＨＰ−１細胞中のＩＤＯ１発現に対する、全ての３つの物質の相乗効果を明確に実証する。
【００５４】
実施例４．ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とゼブラリンによる、およびｈＣＧとインターフェロンγによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、ゼブラリン（１００μＭ）のみに、ｈＣＧ（Ｐｒｅｇｎｙｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）（０，１単位／ｍｌ）のみに、または組み合わせに曝露された（図４Ａ）。組み合わせに対するＴＨＰ−１細胞曝露の結果は、相乗効果を実証する。図４Ｂは、非曝露（培地対照）であり、ｈＣＧ（０，０１単位／ｍｌ）のみ、インターフェロンγ（２００ＩＵ／ｍｌ）のみに、または組み合わせに曝露された場合に、得られた結果を示す。組み合わせは、ＴＨＰ−１細胞中のＩＤＯ１発現に対する相乗効果を実証する。
【００５５】
実施例５．開始から２４時間にわたるインターフェロンγへの曝露、およびゼブラリンへの連続的曝露後のＩＤＯ１発現の動態
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、ゼブラリン（１００μＭ）のみ、インターフェロンγ（２００ＩＵ／ｍｌ）のみ、または２物質の組み合わせに曝露された（図５）。本試験の目的は、ゼブラリンと組み合わされたインターフェロンの動態を調べることであった。ＴＨＰ−１細胞を４群に分割し、第１群を２４時間にわたりインターフェロンγのみ、第２群を培養期間全体にわたってゼブラリンのみに曝露させ、第３群は培養期間全体にわたるゼブラリンと組み合わせて、最初の２４時間インターフェロンγに曝露させた。ＴＨＰ−１細胞を２４時間後に洗浄し、ゼブラリンを置き換えた。２４、４８、７２または９６時間後、ＲＮＡ単離のためにＴＨＰ−１細胞の４群を収集した。ゼブラリンのみへの２４時間曝露は、ＩＤＯ１誘導をもたらさなかった。９６時間後、ゼブラリンによるＩＤＯ１誘導の小さな増大が検出された。インターフェロンγ単独によるＩＤＯ１誘導は、２４時間後に強力であったが、効果は持続せず迅速に低下した。対照的に、期間全体にわたって維持されたゼブラリンと組み合わせた場合、レベルは低かったものの効果は２日目および３日目にも維持された。
【００５６】
実施例６．ゼブラリンへの異なる予備曝露時間後の２４時間にわたるインターフェロンγへの曝露後のＩＤＯ１発現の動態
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。図６は、ゼブラリンおよびインターフェロンγによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果の動態を実証する。パネルＡでは、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、４日後のゼブラリンの低い効果が実証される。収集の２４時間前、３日後に単独投与されたインターフェロンγは、強力なバンドを与え、ゼブラリン曝露ＴＨＰ−１細胞の収集の２４時間前、３日後にインターフェロンγを添加した場合は、それはより強力な効果を与え、ゼブラリンがインターフェロンに３日間先行する場合にも、相乗効果が実証される。パネルＢでは、ＴＨＰ−１細胞にゼブラリンが５日間にわたり単独投与され、淡いバンドが検出された。インターフェロンγが３日後に単独投与され、２４時間後に洗浄されて、インターフェロン除去の２４時間後に試験すると淡いバンドが示された。これは、図５で提示される結果に合致する。開始からのゼブラリンと、３日後に２４時間にわたり投与されたインターフェロンγとの組み合わせは、持続性の高度発現レベルをもたらした。パネルＣでは、ＴＨＰ−１細胞がゼブラリンに６日間曝露されて、インターフェロンγが４日後に２４時間にわたり投与されて、合計６日後に細胞を収集した。この場合も、インターフェロンγ単独では、ほとんど皆無のＩＤＯ１誘導が検出されたが、組み合わせると強力なＩＤＯ１発現が観察された。パネルＤおよびＥでは、ＴＨＰ−１細胞が、ゼブラリンに７日間曝露され、３日後（パネルＤ）または４日後（パネルＥ）のいずれかに、インターフェロンγに２４時間にわたり曝露された。組み合わせによる持続性の強力なＩＤＯ１発現が、パネルＤおよびＥの双方で図示される。ＲＮＡ対照としては、ＨＰＲＴが使用された。
【００５７】
実施例７．ゼブラリンおよびインターフェロンＡによるＩＤＯ発現に対する相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、１００μＭゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または２．５および２５ｎｇ／ｍｌの異なる濃度でインターフェロンＡ（インターフェロンα、「ＩＦＮ−Ａ」；Ｓｉｇｍａ）のみに曝露された（図７）。細胞はまた、同じ２つの濃度のＩＦＮ−Ａと組み合わされた、１００μＭのゼブラリンにも曝露された。ゼブラリンが培養期間全体を通じて存在したのに対し、ＩＦＮ−Ａは９６時間後に添加され、ＲＮＡは１２０時間後に単離された。より低いおよびより高い用量のＩＦＮ−ａについて、ゼブラリンのみおよびＩＦＮ−Ａのみによって誘導されるＩＤＯ１発現の合計は、それぞれ３．１および４．７であったが、併用処置では、２つのＩＦＮ−Ａ用量レベルで、６．０および１６．１であった。これは、２つの物質によるＩＤＯ１発現の相乗的誘導を実証する。
【００５８】
実施例８．ゼブラリン、インターフェロンγ、およびインターフェロンＡによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、１００μＭゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または２．５ｎｇ／ｍｌのインターフェロンα（ＩＦＮ−Ａ，Ｓｉｇｍａ）のみに、または５０ｉｕ／ｍｌのインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）のみに、およびＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａの双方に、または最後に全ての３物質の組み合わせに曝露された（図８）。ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａによる併用処置は、０時間目にＩＦＮ−ｇを培地に添加し、７２時間目にこの培地をＩＦＮ−Ａ含有培地で置換して、９６時間目にこの培地を添加剤なしの培地で置換することで実施された。０〜７２時間の区間で、ゼブラリンおよびＩＦＮ−ｇを培地に含め、次にそれをＩＦＮ−Ａとゼブラリンとを含有する培地で置換し、さらに２４時間後この培地をゼブラリンのみを含有する培地で置換することで、３つの全物質の組み合わせによる処置を実施した。同じ区間で個々の物質による処置を実施して、間隔の終わりに培地を添加剤なしの培地で置換した。３つの全物質の組み合わせは、ＩＤＯ１発現に対して強力な相乗効果を誘導する。ＩＦＮ−ｇ除去の４８時間後、およびＩＦＮ−Ａ除去の２４時間後に強力な相乗効果が観察され、ＩＤＯ１発現に対する持続性の相乗効果が示唆される。
【００５９】
実施例９．ゼブラリン、インターフェロンγ、およびＴＧＦ−βによる、ＩＤＯ発現に対する相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、１００μＭのゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または２０ｎｇ／ｍｌの腫瘍成長因子β１（ＴＧＦ−ｂ１）（Ｓｉｇｍａ）のみに、または１００ｉｕ／ｍｌのインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）に、またはＩＦＮ−ｇとＴＧＦ−ｂ１の組み合わせに、またはゼブラリンとＩＦＮ−ｇの組み合わせに、またはゼブラリン、ＩＦＮ−ｇ、およびＴＧＦ−ｂ１の３物質全ての組み合わせに曝露された。培養開始の７２時間後、ＩＦＮ−ｇを培地に添加して、ＩＦＮ−ｇおよびＴＧＦ−ｂ１による併用処置を実施して、２４時間後に、培地をＴＧＦ−ｂ１を含有する培地で置換した。培養開始時からゼブラリンを培地に含めて、７２時間後にＩＦＮ−ｇを添加し、２４時間後に培地をゼブラリン含有培地で置換することで、ゼブラリンおよびＩＦＮ−ｇによる併用処置を実施した。培養開始時からゼブラリンを添加して、７２時間後にＩＦＮ−ｇを添加し、さらに２４時間後に培地をゼブラリンとＴＧＦ−ｂ１とを含有する培地で置換することで、３物質全てによる併用処置を実施した。同じ区間で個々の物質による処置を実施して、間隔の終わりに培地を添加剤なしの培地で置換した。３物質全ての組み合わせは、ＩＤＯ１発現に対して、合わせたまたはそれぞれ単独のゼブラリンおよびＩＦＮ−ｇよりも顕著により強力である、強力な相乗効果を誘導する（図９）。対照的にゼブラリン不在下では、ＴＧＦ−ｂ１は、ＩＦＮ−ｇの効果を低下させる。ＩＦＮ−ｇ除去の２４時間後に強力な相乗効果が観察され、ＩＤＯ１発現に対する持続性の相乗効果が示唆される。
【００６０】
実施例１０．ゼブラリンおよび２４時間のインターフェロンγへの曝露による、ＩＤＯ発現に対する持続的相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（媒体対照）であり、培養期間全体にわたり１００μＭのゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または（培養４日目）２４時間にわたり２００ｉｕ／ｍｌのインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ；Ｓｉｇｍａ）のみに曝露されて、その後培養液が添加剤なしの培地で置換され、または培養期間全体にわたる１００μＭのゼブラリンと、培養４日目の２４時間にわたるＩＦＮ−ｇとの組み合わせに曝露されて、その後培養液がゼブラリンのみを含有する培地で置換された（図１０）。ＲＮＡを１０、１２または１４日間の培養後に単離して、ＩＤＯ１発現を分析した。２４時間のインターフェロンγ曝露のみによって誘導される発現は、最初は強力であるが、それは試験時点では最小である。対照的に、ゼブラリンを組み合わせた場合の相乗効果は、インターフェロンγ除去の少なくとも１０日後に持続性であり、１４日目にも依然として実証できた。これは、インターフェロンγ曝露が比較的短時間であり、インターフェロンγ?それ自身の効果が消失してから時間がたった場合でさえ、相乗的に誘導されたＩＤＯ１が長期間維持されたことを実証する。
【００６１】
実施例１１．ゼブラリン、インターフェロンγ、およびインターフェロンＡによる、ＩＤＯ発現に対する持続的相乗効果
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、培養期間全体にわたり１００μＭのゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または（培養４日目）２４時間にわたり１００ｉｕ／ｍｌのインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ；Ｓｉｇｍａ）のみに、またはインターフェロンＡ（ＩＦＮ−Ａ；Ｓｉｇｍａ）のみに曝露され、その後培養液が添加剤なしの培地で置換された。その他の細胞サンプルは、１６８時間の培養期間全体にわたる１００μＭのゼブラリンと、培養４日目の２４時間にわたるＩＦＮ−ｇ、およびＩＦＮ−Ａの組み合わせに曝露され、その後、培養液がゼブラリンのみを含有する培地で置換された（図１１）。ＲＮＡを培養の１６８時間後に単離して、ＩＤＯ１発現を分析した。２４時間のＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮ−Ａ曝露のみによって誘導される発現は、最初は強力であるが、それは試験時点では最小である。対照的に、ゼブラリンと組み合わされた場合の相乗効果は、ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａ除去の７２日後に持続性であった。これは、ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａへの曝露が比較的短時間であり、ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａ自身の効果が消失してから時間がたった場合でさえ、相乗的に誘導された強力なＩＤＯ１発現が長期間維持されたことを実証する。
【００６２】
実施例１２．ゼブラリン、インターフェロンγ、インターフェロンＡ、およびＴＧＦ−βを用いた併用処置による持続性の相乗的ＩＤＯ発現
使用された材料と方法は、上の実施例１に記載されるのと同一であった。ヒト単核球細胞系ＴＨＰ−１の細胞は、非曝露（培地対照）であり、培養期間全体にわたり１００μＭゼブラリン（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）のみに、または（培養４日目）２４時間にわたり１００ｉｕ／ｍｌインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ；Ｓｉｇｍａ）のみに、または２５ｎｇ７ｍｌのインターフェロンＡのみに、または２０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β（ＴＧＧ−ｂ；Ｓｉｇｍａ）のみに曝露され、その後培養液が添加剤なしの培地で置換された。その他の細胞サンプルは、１６８時間の培養期間全体にわたる１００μＭのゼブラリンと、培養４日目の２４時間にわたるＩＦＮ−ｇ、ＩＦＮ−Ａ、およびＴＧＦ−ｂの組み合わせに曝露され、その後、培養液がゼブラリンのみを含有する培地で置換された（図１２）。ＲＮＡを培養の１６８時間後に単離して、ＩＤＯ１発現を分析した。２４時間のＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮ−Ａ曝露のみによって誘導される発現は、最初は強力であるが、それは試験時点では最小である。対照的に、ゼブラリンと組み合わされた場合の４物質の相乗効果は、ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａ除去の７２日後に持続性であった。これは、ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−ＡおよびＴＧＦ−ｂへの曝露が比較的短時間であり、ＩＦＮ−ｇおよびＩＦＮ−Ａ自身の効果が消失してから時間がたった場合でさえ、相乗的に誘導された強力なＩＤＯ１発現が長期間維持されたことを実証する。
【００６３】
実施例１３．生体外でのゼブラリン曝露後における、ラット骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）中のＩＤＯ発現増強、および混合脾臓リンパ球の免疫反応性を抑制する抑制機能の改善
ラットの大腿骨から骨髄細胞を採取して、サイトカインＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、確立された生体外技術によって培養し、樹状細胞（ＢＭＤＣ）への分化を支援した。培養７日目に、ＧＭ−ＣＳＦのみを含有する培地で、培地を置換した。ＢＭＤＣのいくつかは、培養５〜１０日目の間にゼブラリン５０μＭに曝露され、対照細胞はこのさらなる処置なしのままにされた。対照およびゼブラリン治療細胞による、ＩＤＯ１の発現を分析した（図１３ａ）。結果は、ゼブラリン曝露が、未成熟対照ＢＭＤＣによって発現されるレベルを超えて、ＩＤＯ１の発現を高めることを実証する。同じ２種類の細胞はまた、培養ウェルの底に付着する強力な刺激性抗ＣＤ３による刺激時の、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラットの同一同系交配株の脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖性免疫応答をそれぞれ抑制する能力についても試験された。ＣＦＳＥ技術、およびＣＤ４およびＣＤ８マーカー（ｍａｋｅｒｓ）を認識するモノクローナル抗体を用いて、ＦＡＣＳ内で増殖を分析した。脾臓細胞培養物に対して１：３０の比率のゼブラリン処置ＢＭＤＣ混和材料は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方について、並行して試験された対照ＢＭＤＣよりも、顕著により強力な増殖性応答の抑制効果を実証した（図１３ｂ）。これは、生体外ゼブラリンへのＢＭＤＣの曝露が、ＩＤＯ１のより強力な発現を誘導し、これらのＢＭＤＣがまた、ゼブラリン未曝露ＢＭＤＣよりも、Ｔ細胞応答性に対してより強力な抑制効果を有することを実証する。
【００６４】
実施例１４．成体ラットに７日間にわたり毎日腹腔内接種されたゼブラリン（Ｚｅｂｕｂｕｌａｒｉｎｅ）は脾臓中でＩＤＯの発現増強を誘導し、生体外の免疫刺激に対する脾臓Ｔ細胞反応性を抑制する
１群のウィスター系ラットに、７日間にわたって、毎日ゼブラリン（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）接種を腹腔内投与し、平行対照群には毎日ＰＢＳ接種を腹腔内投与した。ＲＮＡを脾臓から単離して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術によりＩＤＯ１発現を分析した。結果は、生体内におけるゼブラリンによる全身性の処置が、脾臓細胞中のＩＤＯ１の発現増強を誘導することを実証する（図１４ａ）。またゼブラリンの最後の投与後に双方の群からの脾臓細胞を収集して、抗ＣＤ３抗体によるポリクローナル刺激に対する、それらのＴ細胞増殖反応性について試験した。ＣＦＳＥ技術、およびモノクローナル抗ラットＣＤ４およびＣＤ８抗体を用いて、ＦＡＣＳ内で増殖を分析した（図１４ｂ）。計算された増殖性応答は、ゼブラリン処置ラットからの細胞では、ＰＢＳ．対照処置ラットからの細胞と比較して、およそ３倍低かった。これは、ゼブラリン処置が脾臓中のＩＤＯ１の発現増強を誘導し、脾臓Ｔリンパ球の免疫応答性を阻害することを実証する。
【００６５】
実施例１５．１４日間にわたる毎日のゼブラリン腹腔内接種による同種移植された膵島の免疫学的拒絶の抑制
膵島は、確立された技術によってＬｅｗｉｓラットの膵臓から単離された。３７℃で一晩の培養後、膵島中に存在するインシュリン産生β細胞に対して選択的に毒性である、３５〜４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを腹腔内単回投与された後に、高血糖（血糖≧２０ｍＭｏｌ／Ｌ）が確認された成体（１１〜１４週齢）Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラットの腎臓被膜の真下に、５００〜１２００個の膵島を移植した。インシュリン産生膵島の成功裏の移植の徴候として、血糖は即座に正常レベルに低下した。これらのラットの１群を対照としてさらなる処置なしのままにした一方で、別の群はラットが１１．１ｍＭｏｌ／Ｌ未満の正常な血糖を有した時点での移植の６〜８日後に開始して、１４日間にわたるゼブラリン（２２５ｍｇ／ｋｇ）の毎日の腹腔内接種によって処置した。同種移植された膵島は、６／８の対照ラットで９〜１４日以内に免疫学的に拒絶された（図１５）。移植の４０および４３日後に、正常血糖を維持した２匹の例外的なラットに腎摘出を施して、それらの正常血糖が、移植膵島の意外な持続性の生存の結果かどうか（その場合はそれらの血糖は、移植片の除去後に即座に増大すべきである）、またはストレプトゾトシンによって損傷を受けた膵島の一部の回復のためかどうか（その場合はそれらの血糖は、移植片の除去にもかかわらず正常なままであるべきである）をチェックした。２匹の対照ラットの腎摘出後、血糖は≧７日間にわたって正常なままであったので、ストレプトゾトシンによって引き起こされた最初の損傷後、これらの２匹のラットでは、一部の膵島が回復して、正常な血糖レベルを維持するのに十分な量のインシュリンを産生したと結論付けられた。移植の２０〜２２日後の処置完了時の１匹を除く全ラットにおける、およびゼブラリン処置を停止した≧１週間後に分析された７匹の全てにおける、正常な血糖によって示されるように、移植の２２日後、ゼブラリン処置ラットの１／１０のみが移植片を拒絶した（図１６）。これはＩＤＯ１誘導物質ゼブラリンの免疫抑制、または耐性誘導能力を実証する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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