(57)【要約】  本発明は、抗ＭＣＳＰ抗体及びそれを使用する方法を提供する。
2014534806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体は、Ｆｃ領域中のオリゴ糖を改変するために糖鎖が操作され、非糖鎖操作抗体と比較して、抗体はＡＤＣＣエフェクター機能が増加している、ＣＳＰＧリピート含有ドメインを含むヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープに結合する単離された抗体。
【請求項２】
ＣＳＰＧリピート含有ドメインがＣＳＰＧリピート１４（配列番号３）を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｆｃ領域は、非糖鎖操作抗体と比較してフコース残基の数が減少している、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体は、非糖鎖操作抗体と比較して、Ｆｃ領域においてＧｌｃＮＡｃ残基のフコース残基に対する割合が増加している、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
Ｆｃ領域は、非糖鎖操作抗体と比較して、二分されたオリゴ糖の割合が増加している、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が完全長ＩｇＧクラスの抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体が、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号２７のＶＨ配列を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
配列番号２６のＶＬ配列を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号２７のＶＨ配列及び配列番号２６のＶＬ配列を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１９】
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号３２のＶＨ配列を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号３１のＶＬ配列を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号３２のＶＨ配列及び配列番号３１のＶＬ配列を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２５】
抗体が産生されるように請求項２４に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項２６】
請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項２８】
医薬として使用のための請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体又は請求項２６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２９】
癌を治療するための請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体又は請求項２６に記載のイムノコンジュゲートの使用。
【請求項３０】
癌がＭＣＳＰを発現する癌である、請求項２９の使用。
【請求項３１】
癌が、皮膚癌（メラノーマ及び基底細胞癌を含む）、神経膠腫（神経膠芽腫を含む）、骨癌（骨肉腫など）、及び白血病（ＡＬＬ及びＡＭＬを含む）からなる群から選択される、請求項３０の使用。
【請求項３２】
細胞溶解を誘導するための、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３３】
医薬の製造のための請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体又は請求項２６に記載のイムノコンジュゲートの使用。
【請求項３４】
医薬が癌の治療用である、請求項３３の使用。
【請求項３５】
医薬が細胞溶解の誘導用である、請求項３３の使用。
【請求項３６】
請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体又は請求項２６に記載のイムノコンジュゲートの治療的有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
【請求項３７】
癌がＭＣＳＰを発現する癌である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
癌が、皮膚癌（メラノーマ及び基底細胞癌を含む）、神経膠腫（神経膠芽腫を含む）、骨癌（骨肉腫など）、及び白血病（ＡＬＬ及びＡＭＬを含む）からなる群から選択される、請求項３７の方法。
【請求項３９】
細胞溶解を誘導するために、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体又は請求項２６に記載のイムノコンジュゲートの治療的有効量を個体に投与することを含む、個体において細胞溶解を誘導する方法。
【請求項４０】
サンプル中に存在する抗体とＭＣＳＰとの間の抗体−ＭＣＳＰ複合体の形成を許容する条件下で、請求項１から２２の何れか一項に記載される抗体とサンプルを接触させ、そして免疫検出法により複合体の有無を検出することを含む、ＭＣＳＰの免疫組織化学的アッセイ。
【請求項４１】
サンプルが、新鮮な組織サンプル、凍結組織サンプル、又はホルマリン固定、パラフィン包埋組織サンプルである、請求項４０に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年８月２３日に出願された欧州特許出願番号ＥＰ１１１７８３９３．２号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗ＭＣＳＰ抗体、及び疾患の治療のために同じものを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＭＣＳＰ
メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）は、メラノーマ癌の大部分において発現される大きな膜貫通型プロテオグリカンである。ＭＣＳＰはまた、神経膠芽細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ＡＬＬ及びＡＭＬの幾つかの型を含む他の癌で、及び基底細胞癌で発現される。これは、初期の細胞表面メラノーマの進行のマーカーとして役立ち、そして腫瘍細胞の増殖、転移、遊走、浸潤、及び血管新生の刺激に関与している。Staube, E. et al., FEBS Letters, 527:114-118 (2002); Campoli, M. et al., Crit.Rev. Immun.24:267-296 (2004); Vergilis, I. J., J Invest Dermatol, 125:526-531 (2005); Yang, J., JCB, 165:881-891 (2004); Luo, W., J. Immuno., 176:6046-6054 (2006)。
【０００４】
抗体のグリコシル化
オリゴ糖成分が、物理的安定性、プロテアーゼの攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特定の生物学的活性を含む、治療的糖タンパク質の有効性に関連する特性に有意に影響を与えることができる。そうした特性は、オリゴ糖の有無だけでなく、その特定の構造に依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質の機能との間において幾つかの一般化を行うことができる。例えば、特定のオリゴ糖構造は、特定の糖鎖結合タンパク質との相互作用を介して血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介し、一方他は、抗体に結合されて。望ましくない免疫反応を引き起こす(Jenkins et al., Nat Biotechnol 14, 975-81 (1996))。
【０００５】
ＩｇＧ１型抗体は、癌の免疫療法の中で最も一般的に使用される抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で保存されたＮ−結合型糖鎖付加部位を持つ糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋葬され、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、そしてそれらの存在は、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために抗体にとって必須である(Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997))。
【０００６】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) 及び米国特許第６，６０２，６８４号（国際公開第９９／５４３４２号）において説明したように、それらのオリゴ糖成分を操作することによって高めることができるＵｍａｎａらは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）において、二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の過剰発現は、それらの細胞中に産生される抗体のインビトロでのＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示した。Ａｓｎ２９７の糖の組成における変化又はその消失はまた、抗体のＦｃドメインの、ＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑタンパク質への結合にも影響を及ぼす(Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Davies et al., Biotechnol Bioeng 74, 288-294 (2001); Mimura et al., J Biol Chem 276, 45539-45547 (2001); Radaev et al., J Biol Chem 276, 16478-16483 (2001); Shields et al., J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001); Shields et al., J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002); Simmons et al., J Immunol Methods 263, 133-147 (2002))。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、抗ＭＣＳＰ抗体及びそれを使用する方法を提供する。本発明の一態様は、ヒトＭＣＳＰの膜基部のエピトープに結合する単離された抗体を提供し、ここで抗体は、Ｆｃ領域中のオリゴ糖を改変するために糖鎖が操作され、非糖鎖操作抗体と比較して、抗体はＡＤＣＣエフェクター機能が増加していることを特徴とする。一実施態様において、ヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープは、ＣＳＰＧリピート含有ドメインを含むことを含む。一実施態様において、ＣＳＰＧのリピート含有ドメインはＣＳＰＧリピート１４（配列番号３）を含む。一実施態様において、抗体のＦｃ領域は、非糖鎖操作抗体と比較してフコース残基の数が減少している。一実施態様において、抗体は、非糖鎖操作抗体と比較して、Ｆｃ領域においてＧｌｃＮＡｃ残基のフコース残基に対する割合が増加している。一実施態様において、抗体のＦｃ領域は、非糖鎖操作抗体と比較して、二分されたオリゴ糖の割合が増加している。ある実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。ある実施態様では、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。ある実施態様では、抗体は、完全長ＩｇＧクラスの抗体である。
【０００８】
一実施態様において、抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０００９】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１０】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；又は配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列及び配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
【００１１】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のＶＨ配列；配列番号２８のＶＬ配列を含む。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列を含む。
【００１２】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列；配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列；又は配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＨ配列及び配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
【００１３】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のＶＨ配列；配列番号２８のＶＬ配列を含む。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列を含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される抗ＭＣＳＰ抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明の別の態様は、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明の別の態様は、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む抗体の製造方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体を含むイムノコンジュゲート、及び細胞傷害性薬物を提供する。本発明の別の態様は、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体を含むイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、医薬として使用のための、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。本発明の別の態様は、皮膚癌（メラノーマ及び基底細胞癌を含む）、神経膠腫（神経膠芽腫を含む）、骨癌（例えば骨肉腫など）、及び白血病（ＡＬＬ及びＡＭＬを含む）を含む癌、特にＭＣＳＰを発現する癌を治療するための、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体又はそのイムノコンジュゲートを提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、細胞溶解を誘導するための、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体の使用を提供する。本発明の別の態様は、癌の治療のための又は細胞溶解を誘導するための医薬などの医薬の製造における、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体又はそのイムノコンジュゲートの使用を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様は、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体又はそのイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。癌は、例えば、ＭＣＳＰを発現する癌、例えば皮膚癌（メラノーマ及び基底細胞癌を含む）、神経膠腫（神経膠芽腫を含む）、骨癌（例えば骨肉腫など）、及び白血病（ＡＬＬ及びＡＭＬを含む）である。
【００１９】
本発明の別の態様は、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体又はそのイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、個体における細胞溶解を誘導する方法を提供する。  
【００２０】
本発明の別の態様は、サンプル中に存在する抗体とＭＣＳＰとの間の抗体−ＭＣＳＰ複合体の形成を許容する条件下で、上に記載される抗ＭＣＳＰ抗体とサンプルを接触させ、そして免疫検出法により複合体の有無を検出することを含む、ＭＣＳＰの免疫組織化学的アッセイを提供する。一実施態様では、サンプルは、新鮮な組織サンプルである。一実施態様において、サンプルは凍結又はホルマリン固定、パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ｃｏｌｏ３８細胞において表面ＭＣＳＰに対するキメラ抗体のＬＣ００７の結合親和性を示すＦＡＣＳアッセイの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、Ａ２０５８及びＡ３７５癌細胞において、表面ＭＣＳＰに対するキメラ抗体のＬＣ００７の結合親和性を示すＦＡＣＳアッセイの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＣＳＰのＣＳＰＧリピートを含有する構造の概略図である。
【図４】図４は、ＭＣＳＰのＣＳＰＧリピート構築物についてＬＣ００７の結合特異性を示すグラフである。
【図５】図５は、抗体ＬＣ００７は、カニクイザル構築物に対して対応するヒト発現構築物に対するのと類似の親和性で結合することを示すＦＡＣＳアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、非糖鎖操作及び糖鎖操作ＬＣ００７抗体の両方のＡＤＣＣの効果を示すグラフである。
【図７】図７は、糖鎖操作ＬＣ００７抗体のＡＤＣＣ効果が、ヒトＵ８６ＭＧ神経膠芽腫細胞株において観察されることを示すグラフである。
【図８】図８は、ＬＣ００７抗体の複数のヒト化変異体の結合特性を示すグラフである。
【図９】図９は、ＬＣ００７のヒト化変異体は、親ＬＣ００７糖鎖操作抗体のＡＤＣＣ活性を保持することを示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＬＣ００７のヒト化変異体は、親ＬＣ００７糖鎖操作抗体のＡＤＣＣ活性を保持することを示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒト化糖鎖操作抗ＭＣＳＰ抗体は、ビヒクル対照と比較してＭＶ３腫瘍細胞株を保有するトランスジェニックＦＣＧＲ３Ａ ＳＣＩＤマウスにおいて有意に生存期間を増加させることを示す生存曲線を示す。
【図１２】図１２は、キメラ糖鎖操作抗ＭＣＳＰ抗体は、ビヒクル対照と比較してＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞株を保有するトランスジェニックＦＣＧＲ３Ａ ＳＣＩＤマウスにおいて有意に生存期間を増加させることを示す生存曲線を示す。
【図１３】図１３は、キメラ糖鎖操作抗ＭＣＳＰ抗体及びそのヒト化変異体であるＭ４−３ ＭＬ２、の両方が、ビヒクル対照と比較してＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞株を保有するトランスジェニックＦＣＧＲ３Ａ ＳＣＩＤマウスにおいて有意に生存期間を増加させることを示す生存曲線を示す。
【００２２】
本発明の実施態様の詳細な記述
１．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００２３】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００２４】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００２５】
「血管新生障害」は、非腫瘍性状態及び腫瘍性状態の両方を含む、血管新生の任意の調節不全を指す。腫瘍性状態としては、限定されないが、以下に記載のものを含む。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬の斑、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム動脈硬化性斑、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、虹彩(angle)（ルベオーシス）の血管新生、眼性新生血管疾患、脈管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成（グレーブズ病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫（例えば、急性脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関連している）、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化、高親和性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣の疾患、子宮内膜症、液体性疾患の第３の間隔(3rd spacing)（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮類線維腫、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長（癌以外）、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の抑制、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群、化膿性肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、脈管粘着力、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液（例えば心外膜炎と関連しているもの）および胸水が含まれる。
【００２６】
用語「抗ＭＣＳＰ抗体」及び「ＭＣＳＰに結合する抗体」は、抗体が、ＭＣＳＰを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＭＣＳＰに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体の、無関係な、非ＭＣＳＰタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＭＣＳＰへの結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＭＣＳＰへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、異なる種由来のＭＣＳＰ間で保存されているＭＣＳＰのエピトープに結合する。
【００２７】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００２８】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００２９】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００３０】
用語「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長／細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、骨癌（例えば骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫）、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫を含む、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、皮膚癌（例えば、メラノーマ及び基底細胞癌）、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。
【００３１】
用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性疾患」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を言う。一実施態様において、細胞増殖性疾患は癌である。
【００３２】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００３３】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３４】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００３５】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００３６】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００３７】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
【００３８】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００３９】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００４１】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００４２】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００４３】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００４４】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００４５】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００４６】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００４７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００４８】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００４９】
「抗ＭＣＳＰ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００５０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００５１】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００５２】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００５３】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００５４】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００５５】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００５６】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００５７】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００５８】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＭＣＳＰ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意のＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）を指す。その用語は、「完全長」、未処理のＭＣＳＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＭＣＳＰを含む。その用語はまた、天然に存在するＭＣＳＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。ＭＣＳＰはまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンＮＧ２、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、及びメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしても知られる。典型的なヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。Pluschke G., et al., Molecular cloning of a human melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:9710-9715(1996), Staub E., et al., A novel repeat in the melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan defines a new protein family, FEBS Lett. 527:114-118(2002)；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１８８８も参照。
【００５９】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」または「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００６０】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００６１】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００６２】
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、癌などの細胞増殖性疾患の治療及び／又は診断における使用を見出す抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。ある実施態様において、ＭＣＳＰの膜基部のエピトープに特異的に結合する抗体が提供される。所定の実施態様において、ＭＣＳＰに結合し強化されたエフェクター機能を有する抗体が提供される。
【００６３】
Ａ．典型的な抗ＭＣＳＰ抗体
一態様において、本発明は、ＭＣＳＰに結合する単離された抗体を提供する。特に、本発明において提供される抗ＭＣＳＰ抗体は、ヒトＭＣＳＰの膜基部のエピトープに特異的に結合する。Staub E., et al., FEBS Lett. 527:114-118(2002)に議論されるように、ＭＣＳＰの膜基部領域は、ＣＳＰＧリピートドメインとも呼ばれる複数の新規な繰り返しドメインから構成されている。図３本発明の抗ＭＣＳＰ抗体は、ＣＳＰＧリピート含有ドメインを含むヒトＭＣＳＰの膜基部ドメインに存在するエピトープに結合する。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、ヒトＭＣＳＰの１９３７−２０４３のアミノ酸に対応しているＣＳＰＧリピート１４を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート１４ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、ＣＳＰＧリピート１４を含み、そしてＣＳＰＧリピート１５の少なくとも一部を含む。ＣＳＰＧリピート１５ドメインはヒトＭＣＳＰのアミノ酸２０４４−２２４６に対応している。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート１５ドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、天然の膜貫通ドメインを持たない配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧのリピート含有ドメインはＣＳＰＧリピート１３−１５を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、天然の膜貫通ドメインを持たない配列番号６のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧのリピート含有ドメインはＣＳＰＧリピート１２−１５を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＣＳＰＧリピート含有ドメインは、天然の膜貫通ドメインを持たない配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、天然膜貫通ドメインは、ＶＩＩＰＭＣ ＬＶＬＬＬＬＡＬＩＬ ＰＬＬＦＹ（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＱ６ＵＶＫ１）（配列番号４４）である。
【００６４】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰを発現する細胞の溶解を誘導する。溶解は、エフェクター機能、例えば、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞レセプター）の下方制御；及びＢ細胞活性化などを媒介することにより、又は細胞のアポトーシスを直接誘導することによりなど任意のメカニズムによって誘導することができる。
【００６５】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、非糖鎖操作型親抗ＭＣＳＰ抗体と比較してエフェクター機能の少なくとも一つの増加を有するように糖鎖操作されている。エフェクター機能の増加は、Ｆｃ受容体への結合親和性の増加、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加；ＮＫ細胞への結合の増加；マクロファージへの結合の増加；多形核細胞への結合の増加；単球への結合の増加；アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達；樹状細胞成熟の増加；又はＴ細胞プライミングの増加である。糖鎖操作抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰの同じエピトープに向けられる非糖鎖操作抗体に比べて、ＭＣＳＰを発現する癌に罹患している被験者における生存利益を提供する。
【００６６】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００６７】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００６８】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００６９】
その他の態様において、本発明の抗ＭＣＳＰ抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【００７０】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００７１】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００７２】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００７３】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７４】
別の態様において、本発明の抗ＭＣＳＰ抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【００７５】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００７６】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００７７】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００７８】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。
【００７９】
一態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２７のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００８０】
その他の態様において、配列番号２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２６において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２６のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００８１】
その他の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００８２】
別の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３２のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００８３】
別の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３１において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３１のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００８４】
その他の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００８５】
別の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２９のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００８６】
別の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２８において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号２８のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一、二、又は三のＨＶＲを含む。
【００８７】
その他の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００８８】
別の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３５において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３５の重鎖配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
【００８９】
その他の態様において、配列番号３４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む、抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３４の軽鎖配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００９０】
その他の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにある重鎖、及び上記に与えられた実施態様の何れかにある軽鎖を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００９１】
別の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３７において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３７の重鎖配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
【００９２】
その他の態様において、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む、抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＭＣＳＰ抗体は、ＭＣＳＰへ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３６において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３６の軽鎖配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００９３】
その他の態様において、抗ＭＣＳＰ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにある重鎖、及び上記に与えられた実施態様の何れかにある軽鎖を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗ＭＣＳＰ抗体と同一エピトープ（単数又は複数）に結合する抗体を提供する。
【００９４】
一実施態様において、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗ＭＣＳＰ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。別の実施態様において、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗ＭＣＳＰ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
【００９５】
他の実施態様において、本明細書に記載の抗ＭＣＳＰ抗体と同じエピトープへの結合について競合する抗体が提供される。
【００９６】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体と同じエピトープに結合し及び／又は抗ＭＣＳＰ抗体と同じエピトープへの結合について競合する抗体は、例えば、ＡＤＣＣ活性を含む、Ｆｃ媒介性細胞傷害などのエフェクター機能活性を示す。
【００９７】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、ヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープに結合する。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、ＣＳＰＧリピート含有ドメインを含むヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープに結合する。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号５のアミノ酸配列に由来する、該配列中にある、又は該配列と重複するヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープに結合する。
【００９８】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に由来する、該配列中にある、又は該配列と重複するヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープに結合する。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号３のアミノ酸配列に由来する、該配列中にある、又は該配列と重複するヒトＭＣＳＰの膜基部エピトープに結合する。
【００９９】
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＭＣＳＰ抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【０１００】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体はマウスモノクローナル抗体ＬＣ００７である。この抗体の重鎖及び軽鎖の核酸配列は、それぞれ配列番号３７及び３６に示される。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体はマウスモノクローナル抗体ＬＣ００７に由来するキメラ抗体である。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体はマウスモノクローナル抗体ＬＣ００７に由来するヒト化抗体である。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体はマウスモノクローナル抗体ＬＣ００７に由来するヒト抗体である。
【０１０１】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＭＣＳＰ抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
【０１０２】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【０１０３】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Packard）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【０１０４】
他の実施態様によると、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５， BIACORE Inc.）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１０５】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１０６】
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１０７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。
【０１０８】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【０１０９】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１１０】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１１１】
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５，８２１，３３７号，第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号，及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を記述）；Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１１２】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993))；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１１３】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１１４】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１１５】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１１６】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１１７】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１１８】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１１９】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
【０１２０】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＭＣＳＰに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＭＣＳＰの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＭＣＳＰを発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１２１】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１２２】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。  
【０１２３】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＭＣＳＰ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用(Dual Acting) ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１２４】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１２５】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【０１２６】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１２７】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１２８】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１２９】
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１３０】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１３１】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１３２】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１３３】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０１３４】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号 (Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号， Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１３５】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分されたオリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１３６】
従って、本発明は、宿主細胞によって産生される本発明の抗ＭＣＳＰ抗体のグリコシル化プロファイルを修飾するための方法を対象としており、前記宿主細胞中で、本発明の抗ＭＣＳＰ抗体をコードする核酸、又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、又はそうしたポリヌクレオチドを含むベクターを発現させることを含む。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩ）を含む。一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子の組み合わせは、宿主細胞中で発現される（例えば、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎ ＩＩ）。同様に、この方法はまた、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されたか又はそうでなければ非活性化された宿主細胞内（例えば、α１−６フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の活性がノックアウトされた宿主細胞）で抗ＭＣＳＰ抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現を網羅する。別の実施態様において、本発明の抗ＭＣＳＰ抗体は、前記抗体のグリコシル化パターンを修飾するためにＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に発現する宿主細胞で生産することができる。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内の部位にポリペプチドを固定することに関与するゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に、局在化ドメインは酵素のアミノ末端「尾部」を含む。別の好ましい実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明の抗ＭＣＳＰ抗体の発現は、増加したＦｃ受容体結合親和性及び増加したエフェクター機能を有する抗ＭＣＳＰ抗体をもたらす。従って、一実施態様において、本発明は、（ａ）ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸；及び（ｂ）ヒトのＭＣＳＰに結合するキメラ、霊長類化又はヒト化抗体など本発明の抗ＭＣＳＰ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を対象とする。好ましい実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドであり、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを生成し、増加したエフェクター機能を有する抗体を産生するためにそれらを使用するための方法は、米国仮特許出願第６０／４９５，１４２号及び米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号に開示され、その内容全体が参照により本明細書に援用される。特定の実施態様において、宿主細胞によって生産された修飾された抗ＭＣＳＰ抗体は、ＩｇＧ定常領��又はＦｃ領域を含むその断片を有する。別の特定の実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体は、ヒト化又はヒト抗体又はＦｃ領域を含むそれらの断片である。
【０１３７】
本発明の宿主細胞により産生されたグリコシル化が改変された抗ＭＣＳＰ抗体は、典型的には、宿主細胞の修飾の結果（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現により）、Ｆｃ受容体結合親和性の増加及び／又はエフェクター機能の増加を示す。好ましくは、Ｆｃ受容体結合の増加は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体などＦｃγ活性化受容体への結合の増加である。エフェクター機能の増加は、好ましくは以下の一つ又は複数における増加である：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、Ｆｃ媒介性細胞傷害の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞（ＰＭＮＣ）への結合の増加、単球への結合の増加、標的結合抗体の架橋の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。
【０１３８】
一態様において、本発明は、糖鎖操作されていない抗ＭＣＳＰ抗体と比較した場合、抗体依存性細胞傷害性を含むエフェクター機能が増加した抗ＭＣＳＰ抗体（例えば、変異体抗体）のグリコフォームを提供する。抗体のグリコシル化工学は以前に記載されている。例えば、米国特許第６，６０２，６８４号を参照し、参照によりその全体が援用される。グリコシル化に関与する遺伝子の活性を変化させた宿主細胞からの抗ＭＣＳＰ抗体の生産の方法もまた本明細書に詳細が記述される（例えば下の「発現ベクター及び宿主細胞」と題された節を参照）。本発明の抗ＭＣＳＰ抗体のＡＤＣＣの増加もまた、例えば親和性成熟または親和性を向上させる他の方法によって、ＭＣＳＰに対する抗体の親和性を増加させることによって、達成される（Tang et al., J. Immunol. 2007, 179:2815-2823を参照）。これらのアプローチの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【０１３９】
いくつかのタイプの癌の治療のための非コンジュゲート化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験で、最近、有望な結果が得られている。Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997)。キメラ非コンジュゲート化ＩｇＧ１は、低悪性度又は濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫のために承認されている。Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997)、別の非コンジュゲート化モノクローナル抗体であるが、固形乳腫瘍を対象としたヒト化ＩｇＧ１もまた、第ＩＩＩ相臨床試験で有望な結果を示した。Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997)。これら二つのｍＡｂの抗原はそれぞれの腫瘍細胞において高度に発現され、抗体は、インビトロ及びインビボでエフェクター細胞によって強力な腫瘍破壊を媒介する。これに対して、細かな腫瘍特異性を有する他の多くの非コンジュゲート化ｍＡｂは、臨床的に有用であるのに十分な効力のエフェクター機能を引き起こすことはできない。Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996)。これらの弱いｍＡｂのいくつかのために、補助的サイトカイン療法が現在試験されている。サイトカインの添加は、循環リンパ球の活性及び数を増加させることによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激することができる。Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996)。ＡＤＣＣ、標的細胞上の溶解性攻撃は、抗体の定常領域（Ｆｃ）への白血球受容体の結合の際に引き起こされる。Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997)。
【０１４０】
非コンジュゲート化ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増大させるために異なるが、しかし相補的なアプローチは、抗体のＦｃ領域を操作することである。タンパク質工学研究では、ＦｃγＲはＩｇＧのＣＨ２ドメインの下側のヒンジ領域と相互作用することが示されている。Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996)。しかしながら、ＦｃγＲ結合はまた、ＣＨ２領域において保存されたアスパラギン２９７で共有結合したオリゴ糖の存在を必要とする。Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997)は、オリゴ糖とポリペプチドの両方が相互作用部位に直接寄与するか、又はオリゴ糖が活性なＣＨ２ポリペプチドのコンフォメーションを維持するために必要であるかの何れかを示唆している。オリゴ糖構造の改変は、従って、相互作用の親和性を増加させる手段として検討することができる。
【０１４１】
ＩｇＧ分子は、そのＦｃ領域内の２つのＮ−結合型オリゴ糖、各重鎖上に１つ、を運ぶ。任意の糖タンパク質として、抗体は、同じポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に付着された異なる糖鎖を持つグリコフォームの集団として生成される。血清ＩｇＧのＦｃ領域に通常見られるオリゴ糖は、低レベルの末端シアル酸及び二分したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、及び様々な程度の末端のガラクトシル化とコアフコシル化を持つ複雑な二分岐型である(Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997)。幾つかの研究では、ＦｃγＲ結合のために必要な最小限の炭水化物構造はオリゴ糖コア内にあることを示唆している。Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996)。
【０１４２】
非コンジュゲート化治療用モノクローナル抗体の産生のために産業界及びアカデミアで使用されるマウス又はハムスター由来の細胞株は、要求されるオリゴ糖決定因子をＦｃ部位に対して通常付着させる。これらの細胞株で発現されるＩｇＧは、しかしながら、血清中のＩｇＧの低い量で見いだされる分岐したＧｌｃＮＡｃを欠いている。Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995)。対照的に、ラット骨髄腫が産生するヒト化ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）は、そのグリコフォームの一部に分岐したＧｌｃＮＡｃを保有することが最近観察された。Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995)。ラット細胞由来抗体は、有意に低い抗体濃度で、標準的な細胞株で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体とインビトロのＡＤＣＣ活性において同様の最大に達した。
【０１４３】
ＣＡＭＰＡＴＨ抗原は、リンパ腫細胞上に高レベルで通常存在し、このキメラｍＡｂは、分岐したＧｌｃＮＡｃの非存在下で高いＡＤＣＣ活性を有する。Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995)。Ｎ−結合型グリコシル化経路では、分岐したＧｌｃＮＡｃがＧｎＴＩＩＩによって付加される。Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986)。
【０１４４】
以前の研究では、クローン化されたＧｎＴＩＩＩ酵素遺伝子の異なるレベルを外部制御される様式で発現するように以前に操作された、単一の抗体産生ＣＨＯ細胞株を使用した(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999))。このアプローチでは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）の発現及び修飾された抗体のＡＤＣＣ活性間の厳密な相関関係を初めて確立した。従って、本発明は、抗体産生宿主細胞内での糖転移酵素遺伝子の発現レベルを変化させたことによる、グリコシル化を変化させたＦｃ領域又はＦｃ領域に等価な領域を含む、抗ＭＣＳＰ抗体を意図する。特定の実施態様において、遺伝子発現レベルの変化はＧｎＴＩＩＩ活性の増加である。ＧｎＴＩＩＩ活性の増加は、抗体のＦｃ領域において、二分されたオリゴ糖の割合の増加、並びにフコース残基の割合の減少をもたらす。この抗体又はその断片は、Ｆｃ受容体結合親和性を増加させ、かつエフェクター機能を増加させている。
【０１４５】
本発明はまた、修飾されたオリゴ糖を有する本発明の抗ＭＣＳＰ抗体を産生するための方法を対象とし、（ａ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を、本発明に係る抗ＦＡＰ抗体の産生を可能にする条件下で発現させるように操作された宿主細胞を培養し、ここで、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、前記宿主細胞により産生される前記抗ＭＣＳＰ抗体のＦｃ領域においてオリゴ糖を修飾するために十分な量で発現され；及び（ｂ）前記抗ＭＣＳＰ抗体を単離することを含む。一実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドはＧｎＴＩＩＩである。その他の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドがある。特定の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドはＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎＩＩである。その他の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。より特定の実施態様において、融合ポリペプチドはさらに、ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。好ましくは、前記ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩ又はＧｎＴＩＩのゴルジ局在化ドメインである。あるいは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１−６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。本発明の方法によって産生された抗ＭＣＳＰ抗体は、Ｆｃ受容体結合親和性が増加し及び／又はエフェクター機能が増加している。一般に、エフェクター機能の増加は、以下の一つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害の増加を含む）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。Ｆｃ受容体結合親和性の増加は、好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩａなどのＦｃ活性化受容体への結合の増加である。特定の好ましい実施態様において、ＡＢＭはヒト化抗体又はその断片である。
【０１４６】
一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体のＦｃ領域における二分されたＮ−結合型オリゴ糖の割合は、全オリゴ糖のうち少なくとも約１００％から約１０％、具体的には少なくとも約５０％、より具体的には少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０−９５％である。更に別の実施態様において、本発明の方法により産生される抗体は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Ｆｃ領域に非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。一実施態様において、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％から約１００％、具体的には少なくとも約５０％、少なくとも約６０％から少なくとも約７０％、及びより具体的には少なくとも約７５％である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体型のものであり得る。更に別の実施態様において、本発明の方法により産生される抗体は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Ｆｃ領域に二分されたオリゴ糖の割合が増加している。一実施態様において、二分されたオリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％から約１００％、具体的には少なくとも約５０％、少なくとも約６０％から少なくとも約７０％、及びより具体的には少なくとも約７５％である。特定の好ましい実施態様において、宿主細胞及び本発明の方法によって産生された抗ＭＣＳＰ抗体は、Ｆｃ領域における二分された非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。二分された非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体の何れかであり得る。具体的には、本発明の方法は、抗体のＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的には少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２０％から約５０％、より具体的には少なくとも約２０％から約２５％、及びより具体的には少なくとも約３０％から約３５％が二分され、非フコシル化型である抗体を産生するために使用することができる。本発明の抗ＭＣＳＰ抗体は、抗ＭＣＳＰ抗体のＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的には少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２０％から約２５％、及びより具体的には少なくとも約３０％から約３５％が二分され、ハイブリッドで、非フコシル化型であるＦｃ領域をも含み得る。
【０１４７】
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法により産生される、エフェクター機能を増大させ、及び／又はＦｃ受容体結合親和性が増加するように操作された抗ＭＣＳＰ抗体を対象とする。エフェクター機能の増加は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞傷害の増加を含む）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。好ましい実施態様において、Ｆｃ受容体結合親和性の増加は、Ｆｃ活性化受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。一実施態様において、抗体は、インタクトな抗体である。一実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域を含む抗体断片、又は免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域を含む融合タンパク質である。
【０１４８】
本発明は、Ｆｃ受容体結合親和性が増加し、好ましくはＦｃ活性化受容体への結合の増加し、及び／又は抗体依存性細胞傷害を含むエフェクター機能が増加した本発明の抗体のグリコフォームの産生のための宿主細胞系の作製及び使用のための方法を更に提供する。本発明の抗体を用いて使用することができる糖鎖工学の方法論は、米国特許第６６０２６８４号、米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７ Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８８４ Ａ１号、米国仮特許出願第６０／４４１３０７号及び国際公開第２００４／０６５５４０号により詳細に説明されており、それらの各々の内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の抗体は、あるいは、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（ジェネンテック）、又は欧州特許第１１７６１９５ Ａ１号、国際公開第０３／０８４５７０号、国際公開第０３／０８５１１９号及び米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００４／０９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／１３２１４０号(Kyowa)に開示された技術に従って、Ｆｃ領域にフコース残基を減少させるように糖鎖を操作することができる。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。本発明の糖鎖操作抗体はまた、米国特許出願公開第６０／３４４，１６９号及び国際公開第０３／０５６９１４号(GlycoFi, Inc.)又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第２００４／０２４９２７号(Greenovation)（それらの各々の内容が、その全体が本明細書中に参考として援用される）に教授されるものなど、修飾された糖タンパク質を産生する発現系において生産することができる。
【０１４９】
別の態様において、本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する本発明の抗体の生成のための宿主細胞発現系を提供する。特に、本発明は、改良された治療的価値を有する本発明の抗体のグリコフォームの生成のための宿主細胞系を提供する。従って、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するために選択または操作された宿主細胞発現系を提供する。具体的な実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ活性は、ＧｎＴＩＩＩを活性である。一実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。具体的には、宿主細胞発現系は、構成的又は制御されたプロモーター系に作動可能に連結されたＧｎＴＩＩＩを有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むように操作されてもよい。
【０１５０】
一の特定の実施態様において、本発明は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、及び異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドコードする少なくとも一の核酸を発現するように操作された宿主細胞を提供する。一態様において、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、及び異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドコードする少なくとも一の遺伝子を含む核酸により操作される。
【０１５１】
一般に、上述した細胞株を含む培養細胞株の任意のタイプが、本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグラウンドとして使用することができる。好ましい実施態様では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、本発明の操作された宿主細胞を生成するためのバックグラウンド細胞株として使用される。
【０１５２】
本発明は、本明細書で定義される異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを含む、グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えば、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドを発現する任意の操作された宿主細胞を包含することが意図される。
【０１５３】
グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えば、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする一又は複数の核酸が、構成的プロモーターの制御の下、又は代わりに、制御された発現系の下で発現させることができる。このようなシステムは、当技術分野でよく知られており、上述したシステムが含まれている。グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩを活性を有し、異種ゴルジ常在ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする幾つかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、それらの幾つかは、構成的プロモーターの制御下で発現させることができ、一方で他は調節されるプロモーターの制御下で発現される。グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えば、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドの発現レベルは、例えば、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、レポーター遺伝子発現分析又はグリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩを活性の測定を含む、一般的に当技術分野で公知の方法によって決定される。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物に結合するレクチン、例えば、Ｅ４−ＰＨＡレクチンを用いてもよい。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えばＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペ王チドをコードする核酸により操作された細胞により産生される抗体によって媒介されるＦｃ受容体結合の増加又はエフェクター機能の増加を測定する機能的アッセイを使用することができる。
【０１５４】
本発明の抗体のコード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的なアプローチ；（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞内でのそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現により測定されるように転写のレベルを評価すること；；及び（ｄ）イムノアッセイによって、又はその生物学的活性によって測定されるような遺伝子産物の検出により同定され得る。
【０１５５】
第一のアプローチでは、抗ＭＣＳＰ抗体のコード配列、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列の存在は、それぞれ個々のコード配列又はその一部若しくは誘導体に相同的であるヌクレオチド配列を含むプローブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。
【０１５６】
第二のアプローチでは、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスなどにおける包埋体形成）の有無に基づいて、組換え発現ベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、本発明の抗体のコード配列、又はその断片、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）活性を有すｒるコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、それぞれのコード配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の欠如によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために使用される同一又は異なるプロモーターの制御下でコード配列とタンデムに配置することができる。誘導又は選択に応答するマーカーの発現は、本発明の抗体のコード配列、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列の発現を示す。
【０１５７】
第三のアプローチでは、本発明の抗体又はその断片のコード領域、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチドのコード配列の転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価することができる。例えば、ＲＮＡは、本発明の抗体又はその断片のコード配列、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩＩ）活性を有するポリペプチド又はその特定部分のコード配列に相同なプローブを用いたノーザンブロットによって単離し、分析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブへのハイブリダイゼーションについてアッセイすることができる。
【０１５８】
第四のアプローチにおいて、タンパク質産物の発現は、例えばウェスタンブロット、放射免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ等のイムノアッセイによって免疫学的に評価することができる。発現系の成功の最終的な試験は、しかしながら、生物学的に活性な遺伝子産物の検出を含む。
【０１５９】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１６０】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりとして、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０１６１】
１つの受容されるインビトロＡＤＣＣアッセイは以下の通りである。
１）このアッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する；
２）このアッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）このアッセイは以下のプロトコールに従って使用される。
ｉ）ＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離手順を使用して単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中、５×１０６細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）標的細胞を、標準的な培養方法によって増殖させ、９０％よりも高い生存度を有する指数増殖期から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、そして１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に再懸濁する；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終的な標的細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、細胞培養培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで段階希釈し、得られる抗体溶液の５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に加えて、上記の全体の濃度範囲を網羅する種々な抗体濃度を３通りで試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルは、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルの２％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤(Nonidet,Sigma,St.Louis)の水溶液を受容する；
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルに、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を受容する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心分離し、そして１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記の要点ｉ）を各ウェルに加えて２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、そしてプレートをインキュベーター中、５％のＣＯ２大気、３７℃下に４時間配置する；
ｉｘ）各ウェルからの無細胞上清を収集し、実験的に放出された放射能（ＥＲ）をガンマカウンターを使用して定量する；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、計算式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００に従って各抗体濃度について計算し、ここで、ＥＲは抗体濃度について定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記の要点ｖを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、そしてＳＲはＳＲコントロール（上記の要点ｖｉを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）である；
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増加、及び／又は上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、上記のアッセイを用いて測定される、当業者に公知である同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生される、同じ型の抗体によって媒介されるＡＤＣＣに比例するが、これは、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞によって産生されなかった。
【０１６２】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１６３】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０１６４】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１６５】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【０１６６】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号 (Hinton et al.)に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１６７】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１６８】
ｄ）システイン改変抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１６９】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１７０】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＭＣＳＰ抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＭＣＳＰ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１７１】
抗ＭＣＳＰ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１７２】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-25４も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１７３】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１７４】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１７５】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１７６】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【０１７７】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＭＣＳＰ抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０１７８】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１７９】
別の態様において、競合アッセイを、ＭＣＳＰに対する結合について本明細書に記載される抗ＭＣＳＰ抗体と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、本明細書に記載される抗ＭＣＳＰ抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【０１８０】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＭＣＳＰは、ＭＣＳＰに結合する第一の標識された抗体、及びＭＣＳＰへ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された未標識の第二の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＭＣＳＰが、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＭＣＳＰへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたＭＣＳＰに結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＭＣＳＰに結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＭＣＳＰへの結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１８１】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＭＣＳＰ抗体を同定するために与えられる。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１８２】
所定の実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【０１８３】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＭＣＳＰ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１８４】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１８５】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin）、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin)、エノマイシン(enomycin）及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０１８６】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性コンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１８７】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート  （ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第  ５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０１８８】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０１８９】
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＭＣＳＰ抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＭＣＳＰの存在を検出するのに有用である。特に、ＬＣ００７抗体はウエスタンブロット並びに新鮮凍結し、固定された組織上でＭＣＳＰを認識することが決定され、この抗体及びＬＣ００７と同じエピトープを認識するその変異体は、ＭＣＳＰの存在を検出するための種々の技術に適した抗体であることを示している。本明細書で使用する「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。
【０１９０】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＭＣＳＰの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＭＣＳＰ抗体のＭＣＳＰへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＭＣＳＰ抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＭＣＳＰ抗体とＭＣＳＰとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、本方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づくアッセイである。ＭＣＳＰのＩＨＣアッセイは、一般に、抗ＭＣＳＰ抗体のＭＣＳＰへの結合を許容する条件下で、抗ＭＣＳＰ抗体と組織サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＭＣＳＰ抗体とＭＣＳＰとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。ＭＣＳＰ抗体−抗原複合体の有無は、蛍光、イムノゴールド、又は酵素媒介染色法を含む当技術分野で公知の任意の免疫検出法により、検出することができる。分析は、新鮮な組織サンプル、又は凍結若しくは固定された（例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）サンプルについて実施することができる。例えば、Miller et al., Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl. Immunohistochem. Mol.Morphol. (2000) 8(3): 228-235を参照。
【０１９１】
一実施態様において、例えばＭＣＳＰが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＭＣＳＰ抗体が抗ＭＣＳＰ抗体による治療に好適な被検体を選択するために使用される。
本発明の抗体を用いて診断することができる例示的な疾患は、細胞増殖性疾患又は血管新生障害を含む、ＭＣＳＰの発現によって特徴付けられる障害を含む。一実施態様において、障害は、例えば皮膚癌（メラノーマ及び基底細胞癌を含む）、神経膠腫（神経膠芽腫を含む）、骨癌（骨肉腫など）、及び白血病（ＡＬＬ及びＡＭＬを含む）などの癌である。
【０１９２】
ある実施態様において、標識された抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０１９３】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＭＣＳＰ抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１９４】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１９５】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０１９６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート(methylmethacylate)）マイクロカプセル）により、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０１９７】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０１９８】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０１９９】
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＭＣＳＰ抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。  
【０２００】
一態様では、医薬として使用するための抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。更なる態様では、癌の治療に使用するための抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。ある実施態様において、治療の方法に使用される抗ＭＣＳＰ抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に抗ＭＣＳＰ抗体の有効量を投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法における使用のための抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、メラノーマの治療に使用するための抗ＭＣＳＰ抗体を提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２０１】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＭＣＳＰ抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は癌の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、癌を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、癌を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２０２】
更なる態様にて、本発明は、癌を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、そうした癌を有する個体に、抗ＭＣＳＰ抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２０３】
一実施態様において、上記態様において、癌は、その構成細胞の表面上にＭＣＳＰを発現する。一実施態様において、上記の態様の癌は、例えば皮膚癌（メラノーマ及び基底細胞癌を含む）、神経膠腫（神経膠芽腫を含む）、骨癌（骨肉腫など）、及び白血病（ＡＬＬ及びＡＭＬを含む）の中から選択される。一実施態様において、上記の態様にある癌はメラノーマである。
【０２０４】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗ＭＣＳＰ抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＭＣＳＰ抗体のいずれか、及び薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＭＣＳＰ抗体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２０５】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。  
【０２０６】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２０７】
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定するものではないが、単回又は様々な時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。
【０２０８】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２０９】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２１０】
上記の製剤または治療方法のいずれかが、抗ＭＣＳＰ抗体の代わりか又は抗ＭＣＳＰ抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２１１】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
【０２１２】
上記の製造品のいずれかは、抗Ａｘｌ抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０２１３】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２１４】
例１−抗ＭＣＳＰ抗体の産生
免疫化及びハイブリドーマの生成
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＫＬＨ（ＳＶＰＥ ＡＡＲＴＥＡＧＫＰＥ ＳＳＴＰＴＧＥＰＧＰＭＡＳＳＰＥＰＡＶＡ ＫＧＧＦＬＳＦＬＥＡＮ（配列番号２））に結合したヒトのＭＣＳＰ配列の２１７７−２２２１に対応する合成ペプチドで、４回、４週間毎に腹腔内に免疫し、続いてＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ３８細胞(Giacomini P, Natali P, Ferrone S J Immunol. 1985 Jul;135(1):696-702)で２回の免疫化を行った。初回免疫は完全アジュバント中で行い、全て不完全アジュバント中での追加免疫が続いた。
【０２１５】
血清試験採血を採取し、ビオチンに結合されたＭＣＳＰペプチドａａ２１７７−２２２１を使用して最大半量の血清力価を測定し、ストレプトアビジンＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上にコーティングした。最大半量の力価が１：５０，０００であるマウスが静脈内追加免疫のために選択された。融合前に第４日で静脈内追加免疫がＭＣＳＰペプチド２０μｇ及びＣｏｌｏ３８細胞を用いて実施された。静脈内追加免疫後３日間、脾臓細胞を回収し、Ａｇ８ミエローマ細胞と融合させた。
【０２１６】
スクリーニング及びハイブリドーマの特性評価
ＭＣＳＰ特異的抗体のスクリーニングは、ストレプトアビジンマイクロタイタープレート上にコーティングしたＭＣＳＰ−ビオチンペプチドのアミノ酸２１７７から２２２１（配列番号２）に結合する抗体を同定することによって開始された。ＭＣＳＰ固定化ペプチドに結合する陽性クローンを、無血清培地中で増殖させた（Hyclone ADCF-Mab -Thermo Scientific、カタログ番号ＳＨ３０３４９．０２）。
【０２１７】
ＭＣＳＰの天然型への結合は、ヒトのＭＣＳＰを高レベルで過剰発現するＣｏｌｏ３８細胞上でＦＡＣＳ分析により行った。ＭＣＳＰの検出可能なレベルを発現しない前立腺癌ＰＣ３系列を陰性対照として使用した。リード抗体の特異性を更に特徴付けるために、二重免疫細胞化学分析を、キメラリード抗体（ヒトＦｃを発現する）と組み合わせた二重染色のために市販の樹立された抗ＭＣＳＰ抗体（インビトロジェン、カタログ番号４１−２０００、クローンＬＨＭ２）を用いてＣｏｌｏ３８細胞で行った。免疫蛍光標識によって示されるように、一抗体、ＬＣ００７は、Ｃｏｌｏ３８細胞の表面ＭＣＳＰを強く染色したが、ＰＣ３細胞上では陰性であった。
【０２１８】
実施例２：キメラ化
ｍＲＮＡは、抗体クローンＬＣ００７を発現するハイブリドーマ細胞株から単離され、商業的に入手可能なキットを用いてｃＤＮＡに変換した。重鎖（配列番号３９）及び軽鎖（配列番号３８）のｃＤＮＡの単離体を配列決定し、各セグメントは、ヒトＩｇＧ１およびκの定常領域に融合させた。
【０２１９】
配列は、ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞において、ヒト免疫グロブリンのシグナルペプチドを用いて発現させ、従来のプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製した。
【０２２０】
結合活性は以下の方法により決定した。標的細胞を、細胞解離緩衝液を用いて培養フラスコから剥離し、計数して生存能力をチェックした。細胞を再懸濁させ、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中で１．１１１ｘ１０６（生存）細胞／ｍｌに調整した。この懸濁液の１８０μｌを丸底９６ウェルプレート中の各ウェルに移し（２００，０００細胞／ウェル）、４００ｇで、４分間遠心分離し、再懸濁した。ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌから０．００２μｇ／ｍｌ）中の抗体希釈液２０μｌを各ウェルに加えた。試料は、４００ｇで、４分間遠心分離し、再懸濁した。二次抗体は、ＦＩＴＣ−コンジュゲート結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ＃１０９−０９６−０９８））を加え、サンプルは４００ｇで、４分間遠心分離し、再懸濁した。蛍光は、フローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳカントＩＩ）で測定した。滴定の結果を図１及び２に示す。Morgan AC Jr, Galloway DR, Reisfeld RA. Hybridoma. 1981;1(1):27-36に記載の抗体９．２．２７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＧＩ：２０７９７１９３及びＧＩ：２０７９７１８９（ぞれぞれ軽鎖と重鎖）を参照として使用した（図２）。ヒトメラノーマ細胞株Ｃｏｌｏ３８、Ａ２０５８、及びＡ３７５を使用した。Giacomini et al. 1985 (Ｃｏｌｏ３８について)。 Marquardt H, Todaro GJ. J Biol Chem. 1982 May 10;257(9):5220-5 （Ａ２０５８について）。Geiser M, Schultz D, Le Cardinal A, Voshol H, Garcia-Echeverria C. Cancer Res. 1999 Feb 15;59(4):905-10（Ａ３７５について）。
【０２２１】
実施例３：ＭＣＳＰ抗原上ＬＣ００７抗体の結合エピトープの決定
ＬＣ００７抗体はメラノーマ細胞に良好な結合を示したが、元の免疫原には弱い結合であった。従って、抗体ＬＣ００７のエピトープマッピングを、抗原上の正確な結合部位を決定するために行った。このため、様々な数のＣＳＰＧリピートと呼ばれるヒトＭＣＳＰの膜基部リピート領域を各々が含む、ＭＣＳＰ抗原の複数の切断型バージョンが生成された。Staub E., et al., FEBS Lett. 527:114-118(2002)。
【０２２２】
構築物１は、ＣＳＰＧリピート１５を含み（配列番号４）、構築物２は、ＣＳＰＧリピート１４−１５を含み（配列番号５）、構築物３は、ＣＳＰＧリピート１３−１５を含み（配列番号６）、及び構築物４は、ＣＳＰＧリピート１２−１５を含んでいた（配列番号７）。図３は、ＭＣＳＰのＣＳＰＧリピートを含有する構造の概略図を提供する。これらの構築物は、元の膜貫通領域を含有しており、ＦＡＣＳによるＬＣ００７結合の検出のためＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞上に発現された。図４は、この実験の結果を示す。ＭＣＳＰリピート１５と天然膜貫通ドメインのみを含む構築物は、任意の有意な結合を示さなかった。対照的に、ドメイン１４及び１５を含む全ての構築物は、有意な結合を示した。このことは、結合エピトープは反復１４の範囲内であるか又はリピート１４が存在する場合にのみ再構成されるかの何れかであり、リピート１５の一部又はＣＳＰＧリピートと膜貫通ドメイン間の構造をとらない領域も潜在的に含まれていることを示している。
【０２２３】
また、ＬＣ００７は、ウェスタンブロット上で（変性型、線状エピトープ）並びに新鮮な凍結及び固定化組織上でＭＣＳＰを認識すると決定された。ウェスタンブロット分析はまた、ＬＣ００７は、ＭＣＳＰ断片及びグリコシル化変異体を認識するがＭＣＳＰ陰性細胞株上のタンパク質は認識しないことを示した。このように、ＬＣ００７抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づく分析、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）ＩＨＣ分析を含む、ＭＣＳＰの存在を検出するための様々な技術に適した抗体である。
【０２２４】
実施例４：ヒト及びカニクイザル抗原との交差反応性の決定
発現構築物は、カニクイザル抗原に対する交差反応性を試験するため、カニクイザルＭＣＳＰタンパク質のＣ末端部分、分泌のためのシグナルペプチド及びＮ末端ＦＬＡＧ−タグ（配列番号８）を含んで生成した。このドメインは、ドメインＤ３と称した。Tillet, F. et. Al, J. Biol. Chem. 272: 10769-10776 (1997)。類似の構築物はヒトの対応物（配列番号９）において行われた。これら二つの構築物をコードする発現プラスミドを、ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞中に電気穿孔しし、そして発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて確認した。ＬＣ００７抗体の結合は、フローサイトメトリーによって試験した。図５は、抗体ＬＣ００７は、カニクイザル構築物に対して対応するヒト発現構築物に対するのと類似の親和性で結合することを示す。
【０２２５】
実施例５：糖鎖操作ＬＣ００７抗体
ＬＣ００７抗体の糖鎖操作変異体は、ＧｎＴ−ＩＩＩ糖転移酵素発現ベクターと共に又はＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター＋ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクターと共に抗体発現ベクターの同時トランスフェクションによって産生された。
【０２２６】
例６  糖鎖操作ＬＣ００７抗体のＡＤＣＣ
ＡＤＣＣアッセイ
標的：エフェクター比が１：１９で、ＬＣ００７糖鎖操作抗体および対照抗体サンプルの異なる濃度の存在下での、３７℃で１６時間のインキュベーションの間の、ヒトリンパ球（エフェクター）によるＣｏｌｏ３８ヒト悪性メラノーマ細胞（標的）の溶解を蛍光色素の保持を介して測定した。Kolber et al, 1988, J. Immunol. Methods 108: 255-264。ＩＭＲ−３２細胞を、２０分間蛍光色素カルセインＡＭで標識した（最終濃度３．３μＭ）。標識された細胞（８万細胞／ウェル）を糖鎖操作ＬＣ００７抗体及び対照抗体サンプルの異なる濃度で１時間インキュベートした。次いで、単球が枯渇した単核細胞を添加し（１，５００，０００細胞／ウェル）、細胞混合物を５％ＣＯ２大気中３７℃で１６時間インキュベートした。上清を捨て、細胞をＨＢＳＳで一度洗浄し、トリトンＸ−１００（０．１％）中で溶解した。Ｃｏｌｏ３８細胞中の蛍光色素の保持を蛍光光度計を用いて測定し（Perkin Elmer, Luminscence Spectrometer LS 50B（カリフォルニア州フォスターシティー）、特定的溶解を、標的の抗体への曝露の代わりに界面活性剤への曝露から生じる、全溶解対照と比較して算出した。抗体の非存在下でのシグナルを細胞毒性０％に設定した。各抗体濃度を三つ組で分析し、アッセイは別々に３回繰り返した。図６に示すように、非糖鎖操作ＬＣ００７抗体（ＬＣ００７ｗｔ）はＡＤＣＣ作用を示した。ＬＣ００７糖鎖操作抗体（ＬＣ００７ｇ２）は非糖鎖操作ＬＣ００７と比較してＡＤＣＣの増加を示した。従って、非糖鎖操作ＬＣ００７抗体それ自体は、糖鎖工学によって更に増強することができる一部のＡＤＣＣ活性を示す。これに対して、Buraggi G, et al. Int J Biol Markers. 1986 Jan-Apr;1(1):47-54)に記載の抗体２２５．２８Ｓのヒト化バージョンである抗ＭＣＳＰ抗体ＭＨＬＧ ＫＶ９ Ｇ２は、このアッセイにおいて有意なＡＤＣＣの誘導を示さなかった。２２５．２８抗体の結合エピトープは、ＭＣＳＰ抗原のＮ末端部分、又は膜遠位部分内にあると決定された。Ｃｏｌｏ３８細胞上に存在しない、ＥＧＦ受容体に結合する糖鎖操作ＧＡ２０１抗体を、対照として含めた。この抗体によるＡＤＣＣの欠如は、ＮＫ細胞の活性化は、腫瘍細胞上の標的の存在を介して生じなければならないことを示している。
【０２２７】
図７は、糖鎖操作ＬＣ００７抗体のＡＤＣＣが、ヒトＵ８６ＭＧ神経膠芽腫細胞株においても観察されることを示す。
【０２２８】
例７  糖鎖操作ＬＣ００７抗体のヒト化
ヒト化の手順は古典的なループグラフティングの手順に従って行った(Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS, Winter G. Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5。P. Carter et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Vol. 89, pp. 4285-4289, May 1992)。簡潔には、マウス抗体のＣＤＲ（配列番号１０、１１、１２、１４、１５、及び１６）をヒトフレームワーク配列：軽鎖についてＩＭＧＴ受託番号ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１とＩＧＫＪ１、及び重鎖についてＩＭＧＴ受託番号：ＩＧＨＶ４−３１＊０２とＩＧＨＪ４に移植し、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体を生じた。
【０２２９】
抗体構築物は、標的ＭＣＳＰ抗原への結合親和性を保持するために最適化した。図８は、異なるヒト化変異体の結合特性を示す。ヒト残基を有する抗体構築物は抗原への結合の低下を示すことが確定したため、ヒトの残基Ｖａｌ７１およびＡｒｇ９４は、それらの対応するマウスのカウンターパートであるアルギニン、アスパラギン酸によってそれぞれ置換された。図８に示すように、重鎖の位置９４にＡｒｇを有する構築物Ｍ４−２ ＭＬ１（カバット番号付け）（配列番号３０（この配列でＤ９８Ｒに相当する））、及び重鎖の位置７４でＶａｌを有するＭ４−６ ＭＬ１（カバット番号付け）（配列番号３３（この配列でＲ７２Ｖに相当する））は、ＭＣＳＰ抗原への結合の減少を示し、抗体の結合特異性に対するこれらの残基の関連性を示している。対応するマウスのカウンターパートであるアルギニンおよびアスパラギン酸をそれぞれを持つそれらの構築物は、結合活性を保持し、例えばそれらの抗体はＭ４−１（配列番号２９）及びＭ４−３（配列番号３２）の重鎖構築物を有する。
【０２３０】
ＣＤＲ−Ｈ１残基Ａｓｎ３５は、対応するヒト生殖系列のセリン残基に対して置換した。図８に示すように、この置換を含む構築物Ｍ４−７ ＭＬ１（配列番号２５）は、標的ＭＣＳＰ抗原への結合の減少を示し、この残基は、抗原結合力の保持に関与していることを示している。
【０２３１】
さらなる構築物は、抗ＭＣＳＰ抗体の結合特性における他の残基の関連性を示した。ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号２１）における位置７でアルギニン残基をセリンと置換すると、ＭＣＳＰ抗原に対する結合活性の減少をもたらした。ＨＶＲ−Ｌ２ 配列番号２１の位置１でアスパラギン酸チロシンのアスパラギン酸との置換、及び位置２でアラニンのスレオニンとの置換もまたＭＣＳＰ抗原に対する結合活性の減少をもたらした。
【０２３２】
キメラＬＣ００７及びヒト化変異体Ｍ４−３ ＭＬ２に対する一価結合親和性はビアコアアッセイを用いて決定した。簡潔には、抗体はアミンカップリングを介して化学的にＣＭ５チップ（ビアコア）上に固定化した（ＥＤＣ−ＮＨＳにより活性化、各抗体について５０００ ＲＵの結合、エタノールアミンで失活）。ＭＣＳＰ Ｄ３の組換えドメインを分析物として用いた。実験は、ビアコアＴ１００でＨＢＳ−ＥＰ＋のランニングバッファー中、２５℃、３７℃で実施した。ＭＣＳＰ Ｄ３の１：２希釈系列（５０ｎＭから１．５６ｎＭに至るまで）を、２４０秒間チップ表面上に注入し（会合）、その後３００秒間ランニングバッファを注入した（解離）。表面は、注射の間に、３０秒間、１０ｍＭのグリシンｐＨ２により再生し、センサーグラムは１：１結合モデル（ＲＩ＝０及びＲ最大＝局所）を用いて適合させ、Ｋｄを決定した。
【０２３３】
ＬＣ００７キメラ抗体のＫｄは、２５℃で９．８ｎＭ及び３７℃で１０．８ｎＭであると決定された。Ｍ４−３ ＭＬ２抗体のＫｄは、２５℃で１１．４ｎＭ及び３７℃で１６．６ｎＭであると決定された。
【０２３４】
実施例８  糖鎖操作ＬＣ００７抗体のヒト化変異体のＡＤＣＣ
糖鎖操作ＬＣ００７抗体のためのヒト化変異体のＡＤＣＣ活性を、標的細胞としてＣｏｌｏ３８細胞を用いて乳酸デヒドロゲナーゼにより測定した。ヒト末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、本質的に製造業者の説明書に従ってHistopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, Mo. 63178 USA)を用いて調製した。簡単には、静脈血を健常なボランティアからヘパリン化シリンジで採取した。血液は、（Ｃａ＋＋又はＭｇ＋＋を含まない）ＰＢＳで１：０．７５−１．３希釈してHistopaque-1077に重層した。勾配は中断することなく室温（ＲＴ）で３０分間、４００×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する界面相を回収し、ＰＢＳ（二つの勾配由来の細胞あたり５０ｍｌ）で洗浄し、ＲＴで１０分間３００倍のｇで遠心分離によって回収した。ＰＢＳでのペレットの再懸濁後、ＰＢＭＣを計数し、ＲＴで１０分間、２００×ｇでの遠心分離によって再度洗浄した。次いで、細胞を、その後の手順に適切な培地中に再懸濁した。
【０２３５】
ＡＤＣＣアッセイのために使用したエフェクタ−対標的の比率は、それぞれ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞について２５：１及び１０：１であった。エフェクター細胞は、丸底９６ウェルプレートのウェル当たり５０μｌを追加するために適切な濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中で調製した。標的細胞はＣｏｌｏ３０細胞であった。標的細胞を計数し、ＰＢＳ中で洗浄し、そしてマイクロウェルあたり１００μｌで３０，０００細胞を追加するためにミリリットルあたり０．３×百万でＡＩＭ−Ｖに再懸濁した。抗体は、ＡＩＭ−Ｖで希釈し、事前に蒔かれた標的細胞に５０μｌ添加され、ＲＴで１０分間標的に結合させた。次いで、エフェクター細胞を加え、プレートを５％ＣＯ２を含む加湿大気中で３７℃で４時間インキュベートした。標的細胞の死滅は、細胞傷害性検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）を用いて、損傷した細胞からの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出の測定によって評価した。４時間のインキュベーション後、プレートを８００×ｇで遠心分離した。各ウェルからの１００μｌの上清を、新しい透明な平底９６ウェルプレートに移した。キットから１００μｌの呈色基質緩衝液を各ウェルに添加した。呈色反応のＶｍａｘの値は、ＳＯＦＴＭＡＸ ＰＲＯソフトウェア（モレキュラーデバイス、サニーベール、カリフォルニア州９４０８９、米国）を用いて、少なくとも１０分間、４９０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで測定した。自発的なＬＤＨ放出を、抗体ではなく標的とエフェクター細胞のみを含有するウェルから測定した。最大放出は標的細胞のみ及び１％トリトンＸ−１００を含有するウェルから決定した。特異的抗体媒介性死滅の割合は以下のように計算した：（（Ｘ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００、ここで、特異的抗体濃度でのＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自発的放出のＶｍａｘの平均であり、そしてＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である。
【０２３６】
図９は、このアッセイの結果を示し、ヒト化変異体は、親の糖鎖操作ＬＣ００７抗体のＡＤＣＣ活性を保持していることを確認する。
【０２３７】
生存している標的細胞を洗浄し、実施例６に記載のアッセイを用いて０．１％トリトンＸ−１００を含有する５ｍＭのホウ酸塩緩衝液を用いた細胞溶解後に、カルセイン測定(Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter)により定量した。このアッセイの結果を図１０に示す。
【０２３８】
実施例９  マウス異種移植アッセイ
９．１  ＦｃｇＲ３トランスジェニックＳＣＩＤマウスにおけるＭＶ３細胞
（チャールズリバー、リヨン、フランスから購入した）２０ ＦｃｇＲ３Ａ ｔｇ ＳＣＩＤマウスは、徹底したガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明るく／１２時間暗いの日々のサイクルを伴ったＩＶＣ（Isolated Ventilated Cages）条件下で維持された。実験研究プロトコールは見直され、地方政府によって承認された（Ｐ２００５０８６）。到着後、動物は、観察のため新しい環境に慣れるために一週間維持された。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。
【０２３９】
ＭＶ３腫瘍細胞株（van Muijen GN, et al., Int J Cancer. 48(1):85-91 (1991)）は５％ＣＯ２で水飽和大気中で３７℃で１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン、スイス）を補充したＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、スイス）中で日常的に培養した。培養継代は、３日ごとにトリプシン／ＥＤＴＡ１×（ＧＩＢＣＯ、スイス）継代(splitting)により行った。注射の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）からトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、スイス）を用いて回収し、び５０ｍｌの培地に移し、１回洗浄し、ＡＩＭ Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、スイス）に再懸濁した。ＡＩＭ Ｖで更に洗浄後、細胞濃度を、細胞計数器を用いて測定した。ＡＩＭ Ｖ培地２００μｌの中０．２×１０６細胞を各ＦｃｇＲ３Ａ ｔｇ ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射した。
【０２４０】
治療法
異種移植マウスを、各群は９匹のマウスからなる処置群またはビヒクル対照群のいずれかに割り当てた。処置群は、静脈内に、ヒト化糖鎖操作抗ＭＣＳＰモノクローナル抗体Ｍ４−３ ＭＬ２の２５ｍｇ／ｋｇを投与した。ビヒクル（溶媒）対照群は、ビヒクルのみを静脈内投与した。両群は、７日目、１４日目、および２１日目に３回の投与を受けた。  
【０２４１】
統計分析は、ログランク(Mantel-Cox)検定：ｐ＝０．００３３、及びGehan-Breslow-Wilcoxon検定：ｐ＝０．００３９を用いて治療法から得られたデータについて行った。
【０２４２】
結果
図１１に示されるように、ヒト化糖鎖操作抗ＭＣＳＰ抗体は、ビヒクル対照群と比較して、このモデルにおいて生存時間を著しく増加させる。
【０２４３】
９．２  ＦｃｇＲ３トランスジェニックＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞
ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞は元々ＡＴＣＣから入手し、増殖後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。ＭＤＡ−ＭＢ４３５腫瘍細胞株は、５％ＣＯ２で水飽和大気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン、スイス）及び１％のＧｌｕｔａｍａｘを補充したＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ、スイス）中で日常的に培養した。培養継代は、３日ごとにトリプシン／ＥＤＴＡ１×（ＧＩＢＣＯ、スイス）継代(splitting)により行った。
【０２４４】
（チャールズリバー、リヨン、フランスから購入した）ＦｃｇＲ３Ａ ｔｇ ＳＣＩＤマウスは、徹底したガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明るく／１２時間暗いの日々のサイクルを伴ったＩＶＣ（Isolated Ventilated Cages）条件下で維持された。実験研究プロトコールは見直され、地方政府によって承認された（Ｐ２００５０８６）。到着後、動物は、観察のため新しい環境に慣れるために一週間維持された。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。
【０２４５】
注射の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）からトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、スイス）を用いて回収し、び５０ｍｌの培地に移し、１回洗浄し、ＡＩＭ Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、スイス）に再懸濁した。ＡＩＭ Ｖで更に洗浄後、細胞濃度を、細胞計数器を用いて測定した。ＡＩＭ Ｖ培地２００μｌの中０．２×１０６細胞を各ＦｃｇＲ３Ａ ｔｇ ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射した。
【０２４６】
治療法
異種移植マウスを、処置群またはビヒクル対照群のいずれかに割り当てた。処置群は、キメラ糖鎖操作抗ＭＣＳＰモノクローナル抗体を静脈内に投与した。ビヒクル（溶媒）対照群は、ビヒクルのみを静脈内投与した。両群は、７日目、１４日目、および２１日目に３回の投与を受けた。
【０２４７】
結果
図１２に示されるように、キメラ糖鎖操作抗ＭＣＳＰ抗体は、ビヒクル対照群と比較して、このモデルにおいて生存時間を著しく増加させる。
【０２４８】
９．３  ＦｃｇＲ３トランスジェニックＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞
ヒト化抗体Ｍ４−３ ＭＬ２（配列番号３２のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む）が親のキメラ抗体ＬＣ００７と比較されたことを除き、実施例９．２と同じプロトコルに従った、これらの抗体の両方が糖を操作されている。
【０２４９】
結果
図１３に示されるように、親のキメラ抗体ＬＣ００７及びそのヒト化糖鎖操作変異体の両方とも、ビヒクル対照群と比較して、このモデルにおいて生存時間を著しく増加させる。
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【０２５０】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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