(57)【要約】  本発明は、アシルドナーグルタミン含有タグおよびアミンドナー物質を含む、操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体−薬剤コンジュゲート、毒素−（生体適合性ポリマー）コンジュゲート、抗体−（生体適合性ポリマー）コンジュゲート、および二重特異的抗体）を提供する。１つの態様において、本発明は、式（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。本発明はまた、トランスグルタミナーゼを用いて、操作されたポリペプチドコンジュゲートを作製する方法を提供する。【図１】2014500866.tif 000022
2014500866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｔが、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミン（Ｑ）を含み、
Ａがアミンドナー物質であり、かつ
アミンドナー物質が、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている、
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２】
アシルドナーグルタミン含有タグが、Ｆｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない、請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３】
アシルドナーグルタミン含有タグが、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号１）を含み、式中、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項４】
アシルドナーグルタミン含有タグが、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）、ＧＬＬＱＧ（配列番号６）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱ（配列番号１０）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、およびＬＬＱＧＲ（配列番号５６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項５】
Ｆｃ含有ポリペプチドが、同一の位置にある野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、カルボキシル末端内の最後のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項６】
Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが、完全長の抗体重鎖および抗体軽鎖を含む、請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
アシルドナーグルタミン含有タグが、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端に位置する、請求項６に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
アシルドナーグルタミン含有タグが、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグが、重鎖のカルボキシル末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグが、Ｆｃ含有ポリペプチド上の別の部位のどこかに位置する、請求項７に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
アシルドナーグルタミン含有タグが、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端にあるＦｃ含有ポリペプチドに位置する、請求項６に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１０】
Ｆｃ含有ポリペプチドが抗体を含み、抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、または抗体断片である、請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
抗体がＩｇＧである、請求項１０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
ＩｇＧのエフェクター機能が、野生型ＩｇＧと比較して最大約２分の１まで低下する、請求項１１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
アミンドナー物質が、式：
Ｘ−Ｙ−Ｚ
を含み、
式中、Ｘがアミンドナー単位であり、Ｙがリンカーであり、Ｚが作用物質部分である、
請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
アミンドナー単位−リンカー（Ｘ−Ｙ）が、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、プトレシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシンからなる群から選択される、請求項１３に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
作用物質部分が細胞傷害物質である、請求項１３に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
細胞傷害物質が、アントラサイクリン、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、ツブリシン、ヘミアステリン、およびその立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体からなる群から選択される、請求項１５に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１７】
アミンドナー物質が、Ａｌｅｘａ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ−ＬｙｓＧｌｙ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、プトレシニル−ゲルダナマイシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンからなる群から選択される、請求項１３に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１８】
アミンドナー物質が、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤまたはアミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤである、請求項１７に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項１９】
アミンドナー単位−リンカー（Ｘ−Ｙ）が分岐鎖状の単位であり、作用物質部分が少なくとも約２つの作用物質部分を含む、請求項１３に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２０】
式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｆｃ含有ポリペプチドが、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、
Ｔが、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または第１のＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、
Ａがアミンドナー物質であり、
アミンドナー物質が、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、かつ
アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンが、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している、
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２１】
式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｆｃ含有ポリペプチドが、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、
Ｔが、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、
Ａがアミンドナー物質であり、
アミンドナー物質が、第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、かつ
アシルドナーグルタミン含有タグが、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している、
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２２】
アシルドナーグルタミン含有タグが、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない、請求項２０または２１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２３】
タグがＧまたはＧＧを含み、タグが、第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接している、請求項２０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２４】
タグが、Ｌｙｓを含むアミンドナータグである、請求項２０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２５】
アミンドナータグが、アミノ酸配列ＫＧを含む、請求項２４に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２６】
アミンドナータグが、ＫＧＧ、ＧＫＧＧ（配列番号１１）、ＧＳＫＧＧ（配列番号１２）、ＧＳＧＫＧＧ（配列番号１３）、およびＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２７】
第１のＦｃ含有ポリペプチドが、同一の位置にある野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、第１のＦｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端内の最後のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾を含む、請求項２０または２１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２８】
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドである、請求項２０または２１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項２９】
アシルドナーグルタミン含有タグが、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端に位置する、請求項２０または２１に記載のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３０】
式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｆｃ含有ポリペプチドが、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、
Ｔが、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含む、アシルドナーグルタミン含有タグであり、
Ａがアミンドナー物質であり、かつ
第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグが、互いに部位特異的に架橋している、
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３１】
第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグが、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓにそれぞれ空間的に隣接していない、請求項３１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３２】
アミンドナー物質が、ジアミンを含む化合物である、請求項３０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３３】
化合物が、プトレシン（ブタン−１，４−ジアミン）、エチレンジアミン、カダベリン（ペンタン−１，５−ジアミン）、スペルミジン、スペルミン、ヒドラジン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、フェニレンジアミン、キシリレンジアミン、ジフェニルエチレンジアミン、１，８−ジアミノナフタレン、およびその立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体からなる群から選択される、請求項３２に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３４】
アミンドナー物質が反応性Ｇｌｎを含まない、請求項３０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３５】
式：（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｔが、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、
Ａがアミンドナー物質であり、
アミンドナー物質が、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、
かつ生体適合性ポリマーが、Ｆａｂ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている、
操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３６】
式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｔが、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または毒素ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、
Ａがアミンドナー物質であり、
アミンドナー物質が、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、
かつ生体適合性ポリマーが、毒素ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている、
操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３７】
式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ｂを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートであって、
式中、Ｔが、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、
Ｂが生体適合性ポリマーであり、
毒素ポリペプチドが、生体適合性ポリマー内のいずれかの部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしている、
操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート、および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４０】
ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置するＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｂ）アミンドナー物質を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、および
ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項４１】
操作されたＦｃ含有ポリペプチドが抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
アシルドナーグルタミン含有タグが、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端で抗体に位置する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アシルドナーグルタミン含有タグが、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグが、重鎖のカルボキシル末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグが、抗体の別の部位のどこかに位置する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第１のアシルドナーグルタミン含有タグが、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含み、第２のアシルドナーグルタミン含有タグが、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
アミンドナー物質が、式：Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｘがアミンドナー単位であり、Ｙがリンカーであり、Ｚが作用物質部分である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｂ）タグに位置する第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグを提供するステップ、
ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子と還元環境において接触させるステップ、および
ｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子にトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項２０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項４８】
ａ）アシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｂ）第２のＦｃ含有ポリペプチドを提供するステップ、
ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドと還元環境において接触させるステップ、および
ｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドにトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項２１に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項４９】
アシルドナーグルタミン含有タグが、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項５０】
アシルドナーグルタミン含有タグが、アミノ酸配列ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）を含み、アミンドナータグが、アミノ酸配列ＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１３）を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項５１】
操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子への操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率が、少なくとも約３０％である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ａ）第１のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｂ）第２のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｃ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子およびアミンドナー物質と還元環境において接触させるステップ、ならびに
ｄ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子にトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項３０に記載の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項５３】
ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置するＦａｂ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｂ）生体適合性ポリマーを操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、および
ｃ）操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔを生体適合性ポリマーに共有結合によって連結させて、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項３５に記載の操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項５４】
ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置する毒素ポリペプチドを含む操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、
ｂ）生体適合性ポリマーを操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、および
ｃ）操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔを生体適合性ポリマーに共有結合によって連結させて、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項３６に記載の操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項５５】
ａ）生体適合性ポリマーに位置するアシルドナーグルタミン含有タグを含む操作されたＴ−Ｂ分子を提供するステップ、
ｂ）毒素ポリペプチドを操作されたＴ−Ｂ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、および
ｃ）操作されたＴ−Ｂ分子を毒素ポリペプチドと共有結合によって反応させて、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップ
を含む、請求項３７に記載の操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法。
【請求項５６】
トランスグルタミナーゼが微生物タンパク質である、請求項４０、４７〜４８、および５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
トランスグルタミナーゼが精製トランスグルタミナーゼである、請求項４０、４７〜４８、および５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲートをアフィニティークロマトグラフィーステップによって精製する精製ステップをさらに含む、請求項４０、４７〜４８、および５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、参照することによって本明細書にその全体が組み込まれる、２０１０年１１月５日に出願された米国仮出願第６１／４１０，８４０号および２０１１年１０月３１日に出願された米国仮出願第６１／５５３，９１７号の利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、全体を通して、アシルドナーグルタミン含有タグおよびアミンドナー物質を含む操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体−薬剤コンジュゲート、毒素−（生体適合性ポリマー）コンジュゲート、抗体−（生体適合性ポリマー）コンジュゲート、および二重特異的抗体）に関する。本発明はまた、トランスグルタミナーゼを用いてこのような操作されたポリペプチドコンジュゲートを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体療法は、癌および免疫疾患などの様々な障害を有する患者における標的化された治療的処置を提供し、したがって、生物学的リサーチにおいて重要な役割を有する。抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）および操作された二重特異的抗体などの、標的化された抗体療法の異なるアプローチが調査されている。例えば、Ｄｏｒｏｎｉａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕａｇｅ  Ｃｈｅｍ．１９：１９６０〜１９６３（２００８）；Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：９２５〜９３２（２００８）、およびＣａｒｔｅｒ，Ｐ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１〜２）：７〜１５（２００１）を参照されたい。
【０００４】
抗体−薬剤コンジュゲート（すなわち、イムノコンジュゲート）のケースでは、細胞傷害性薬剤は通常、腫瘍への薬剤部分の標的化された局所的送達のために抗体に連結またはコンジュゲートされる。化学修飾は、リジン側鎖のアミンを介して、または鎖間ジスルフィド結合を還元することによって活性化されたシステインスルフヒドリル基を介して薬剤を抗体にコンジュゲートするために広く用いられている。しかし、これらのタイプの「残基特異的な」コンジュゲーションによって、抗体に対する薬剤の異なるモル濃度比率、異なり非特異的なコンジュゲーション部位、異なる効率、安全性、および薬物動態学、ならびに抗体−薬剤コンジュゲートの異なるクリアランスを有する、コンジュゲートの異種混合物がもたらされる。Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９：２０９２〜２０９６（２００５）を参照されたい。さらに、封入体または不正確なジスルフィド架橋もまた、システインを導入された抗体において形成され得る。例えば、Ｇｅｎｔｌｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：６５８〜６６３（２００４）を参照されたい。規定された化学量論を有する特異的な薬剤コンジュゲーションのために抗体（例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ）の特異的部位で操作された、反応性システイン残基もまた調査されている。Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６：９２５〜９３２（２００８）を参照されたい。しかし、このようなシステイン操作された抗体および抗体−薬剤コンジュゲートの発現およびコンジュゲーションは、長時間の反応手順（例えば、還元および酸化）を要する複雑なプロセスである。例えば、Ｇｏｍｅｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０５（４）：７４８〜７６０（２００９）を参照されたい。抗体凝集体もまた、システイン操作された抗体および抗体−薬剤コンジュゲートを作製するプロセスの間に生成し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質のコンジュゲーションにトランスグルタミナーゼを用いる酵素的アプローチは、抗体／タンパク質と薬剤との「残基特異的な」コンジュゲーションに代わるものとして最近調査されている。トランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３、タンパク質−グルタミン：ガンマグルタミルトランスフェラーゼ；タンパク質−グルタミン：アミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ、ＣＡＳ８０１４６−８５−６）は、第一級アミンへのアシル付加を触媒する酵素ファミリーに属し、ここで、ペプチド結合したγ−グルタニル残基のガンマカルボキサミド基はアシルドナーであり、第一級アミンはアシルアクセプターおよびアミンドナーである。トランスグルタミナーゼは、例えば、タンパク質へのタンパク質の付着のために用いられている。例えば、Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９：２０９２〜２０９６（２００５）を参照されたい。トランスグルタミナーゼを用いる抗体の酵素的修飾もまた、報告されている。Ｊｏｓｔｅｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４０：４７〜５４（２０００）；Ｔａｋａｚａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８６（４）：３９９〜４０４（２００４）；およびＭｉｎｄｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９：２７１〜２７（２００８）を参照されたい。トランスグルタミナーゼを用いるタンパク質のコンジュゲーションまたは修飾は、高い選択性、単純な反応手順、および穏やかな反応条件という利点をもたらす。しかし、これまで、トランスグルタミナーゼの基質特異性に起因して、トランスグルタミナーゼによって仲介される抗体およびタンパク質の部位特異的なコンジュゲーションは、明確に確立されてはいない。したがって、トランスグルタミナーゼを用いて部位特異的なおよび均質な抗体−薬剤コンジュゲート、抗体コンジュゲート、またはタンパク質コンジュゲートを生成するためのさらに効率的な方法が必要とされている。
【０００６】
本願において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、および特許出願が参照することによってそのように組み込まれることが具体的におよび個別に示されるかのように、同程度に全ての目的で、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。限定はしないが定義された用語、用語の使用、記載された技術などを含む、組み込まれた文献および類似の材料の１つまたは複数が、本願と異なるかまたは矛盾する場合、本願が優先される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、Ｆｃ含有ポリペプチド−薬剤コンジュゲート、二重特異的抗体、Ｆａｂ含有ポリペプチド−生体適合性ポリマーコンジュゲート、および毒素−生体適合性ポリマーコンジュゲート）およびトランスグルタミナーゼを用いてそれを作製する方法を提供する。本発明者らは、アシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、Ｇｌｎ含有ペプチドタグまたはＱタグ）またはポリペプチドの操作（例えば、ポリペプチド上でのアミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異を介する）によって反応性にされた内因性グルタミンで操作されたＦｃ含有ポリペプチドが、トランスグルタミナーゼの存在下でアミンドナー物質（例えば、反応性アミンを含むかまたはそれに付着した低分子）と共有結合によって架橋して、アミンドナー物質がアシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを介してＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートしている、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定なおよび均質な集団を形成し得ることを発見した。アシルドナーグルタミン含有タグ（または反応性の内因性グルタミン）で操作されたＦｃ含有ポリペプチドとアミンドナー物質とのコンジュゲーション効率は、少なくとも約５１％であり、Ｆｃ含有ポリペプチドとアミンドナー物質との間のコンジュゲーション効率は、アシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンの不存在下で、約５％未満である。例えば、Ｇｌｎ含有ペプチドタグに空間的に隣接したＦｃ含有ポリペプチドにおける最後のアミノ酸の欠失またはＬｙｓ（リジン）から別のアミノ酸への突然変異は、Ｆｃ含有ポリペプチドと低分子（例えば、細胞傷害物質またはイメージング剤）とのコンジュゲーション効率を有意に増大させる。本発明者らはさらに、トランスグルタミナーゼの存在下で、安定なおよび均質な二重特異的抗体集団が、還元環境において、あるエピトープに対する第１のＦｃ含有ポリペプチドに対して操作されたＧｌｎ含有ペプチドタグおよび第２のエピトープに対する第２のＦｃ含有ポリペプチドに対して操作された別のペプチドタグ（例えば、Ｌｙｓ含有ポリペプチドタグ）を用いて生成され得ることを発見した。類似の二重特異的抗体はまた、２つのＧｌｎ含有ペプチドタグに対して操作された２つの異なるＦｃ含有ポリペプチドとジアミンとを組み合わせることによって作製され得る。本発明者らはさらに、トランスグルタミナーゼの存在下で、長い半減期を有する安定なおよび均質なＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートまたは毒素ポリペプチドコンジュゲートが、Ｆａｂ含有ポリペプチドまたは毒素ポリペプチドに対して操作されたＧｌｎ含有ペプチドタグと生体適合性ポリマーとを共有結合によって反応させることによって作製され得ることを発見した。さらに、本明細書において記載されるアシルドナーグルタミン含有タグ、Ｆｃ含有ポリペプチド、および／またはアミンドナー物質の選択によって、部位特異的なコンジュゲーションが可能になる。
【０００８】
１つの態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作された（例えば、挿入または１つもしくは複数の野生型アミノ酸の置き換え／置換を介して）アシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性（すなわち、アミンおよびトランスグルタミナーゼの存在下でアシルドナーとして共有結合を形成する能力）にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしている。
【０００９】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない（すなわち、アシルドナーおよびトランスグルタミナーゼの存在下でアミンドナーとして共有結合を形成する能力）。
【００１０】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグの操作またはＦｃ含有ポリペプチドの操作は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異、またはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグの操作またはＦｃ含有ポリペプチドの操作は、ヒトＩｇＧの２９７位でのアスパラギン（Ａｓｎ）からグルタミンへのアミノ酸置換ではない（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）。
【００１１】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、式：Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分である。いくつかの実施形態において、アミンドナー単位−リンカー（Ｙ−Ｚ）は分岐鎖状の単位であり、作用物質部分（Ｚ）は、少なくとも約２つの作用物質部分を含む。いくつかの実施形態において、アミンドナー単位−リンカーは、線状の単位である。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、Ａｌｅｘａ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ（アセチル）−ＬｙｓＧｌｙ−ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤ）、アミノ−ＰＥＧ３（ポリエチレングリコール）−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６  Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ（バリン）−Ｃｉｔ（シトルリン）−ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、プトレシニル−ゲルダナマイシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンからなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、アミンドナー単位−リンカーは、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、プトレシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシンからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、作用物質部分は低分子である。いくつかの実施形態において、低分子は、細胞傷害物質またはイメージング剤である。いくつかの実施形態において、細胞傷害物質は、アントラサイクリン、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、ツブリシン、ヘミアステリンおよびその立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、作用物質部分は、生体適合性ポリマーまたはポリペプチドである。
【００１４】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または第１のＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチド（例えば、二重特異的抗体）である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチド（例えば、二重特異的抗体）である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、タグはＧまたはＧＧを含み、タグは、第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接している。
【００１７】
いくつかの実施形態において、タグは、Ｌｙｓを含むアミンドナータグである。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＫＧを含む。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、ＫＧＧ、ＧＫＧＧ（配列番号１１）、ＧＳＫＧＧ（配列番号１２）、ＧＳＧＫＧＧ（配列番号１３）、およびＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含む、アシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、互いに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、反応性Ｇｌｎを含まない。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓにそれぞれ空間的に隣接していない。
【００１９】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドに架橋したアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アシルドナーグルタミン含有タグは、第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、反応性Ｇｌｎを含まない。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに隣接していない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、ジアミンを含む化合物である。いくつかの実施形態において、化合物は、プトレシン（ブタン−１，４−ジアミン）、エチレンジアミン、カダベリン（ペンタン−１，５−ジアミン）、スペルミジン、スペルミン、ヒドラジン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、フェニレンジアミン、キシリレンジアミン、ジフェニルエチレンジアミン、１，８−ジアミノナフタレン、およびその立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体からなる群から選択される。
【００２１】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、Ｆａｂ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、１つのＧｌｎを含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または毒素ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、毒素ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）および生体適合性ポリマーの両方は、トランスグルタミナーゼの基質である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）と生体適合性ポリマーとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【００２３】
１つの変型において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ｂを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ｂは生体適合性ポリマーであり、毒素ポリペプチドは、生体適合性ポリマー内のいずれかの部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマー内のアシルドナーグルタミン含有タグは、毒素ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接している。いくつかの実施形態において、毒素ポリペプチドは、Ｌｙｓを含むアミンドナータグを含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置するＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）アミンドナー物質を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）タグに位置する第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子と還元環境において接触させるステップ、およびｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子にトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）を含み、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態において、操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子への操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％である。いくつかの実施形態において、アシルドナータグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。
【００２６】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のＦｃ含有ポリペプチドを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドと還元環境において接触させるステップ、およびｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドにトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）を含み、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。
【００２７】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含む、アシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、互いに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）第１のアシルドナーグルタミン含有タグに付着した第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む、第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のアシルドナーグルタミン含有タグに付着した第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む、第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｃ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子およびアミンドナー物質と還元環境において接触させるステップ、ならびにｄ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって反応させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓにそれぞれ空間的に隣接していない。
【００２８】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドに架橋したアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アシルドナーグルタミン含有タグは、第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）第１のアシルドナーグルタミン含有タグに付着した第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のＦｃ含有ポリペプチドを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびアミンドナー物質と還元環境において接触させるステップ、ならびにｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドとトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって反応させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに隣接していない。
【００２９】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、Ｆａｂ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグに位置するＦａｂ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）生体適合性ポリマーを操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔを生体適合性ポリマーに共有結合によって連結させて、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグまたは毒素ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンであり、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、毒素ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置する毒素ポリペプチドを含む操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）生体適合性ポリマーを操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔを生体適合性ポリマーに共有結合によって連結させて、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【００３１】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ｂを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔはアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ｂは生体適合性ポリマーであり、毒素ポリペプチドは、生体適合性ポリマー内の反応性部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）生体適合性ポリマーに位置するアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンを含む操作されたＴ−Ｂ分子を提供するステップ、ｂ）毒素ポリペプチドを操作されたＴ−Ｂ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作されたＴ−Ｂ分子を毒素ポリペプチドに共有結合によって連結させて、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートをアフィニティークロマトグラフィーステップによって精製する精製ステップをさらに含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは微生物タンパク質である。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、精製トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、カルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、少なくとも１つのＧｌｎを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号１）を含み、式中、Ｘは、アミノ酸（例えば、従来のアミノ酸Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、もしくはＴｒｐ、または非従来のアミノ酸）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）、ＧＬＬＱＧ（配列番号６）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱ（配列番号１０）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、およびＬＬＱＧＲ（配列番号５６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、同一の位置にある野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、カルボキシル末端内の最後のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異、またはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、置換は、野生型アミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、別のアミノ酸（１つまたは複数）を挿入すること（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸を挿入すること）を含む。いくつかの実施形態において、別のアミノ酸はＡｒｇである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、完全長抗体重鎖および抗体軽鎖を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端にあるＦｃ含有ポリペプチドまたはＦａｂ含有ポリペプチドに位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖のカルボキシル末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、軽鎖のカルボキシル末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、表７〜９に列挙されるグルタミン含有タグ）は、重鎖のカルボキシル末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、表７〜９に列挙されるグルタミン含有タグ）は、Ｆｃ含有ポリペプチド上の別の部位に位置する。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含み、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端にあるＦｃ含有ポリペプチドまたはＦａｂ含有ポリペプチドに位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖のアミノ末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、軽鎖のアミノ末端または別の部位に位置する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、挿入されるか、または抗体内の別の部位にある１つもしくは複数の野生型アミノ酸を置き換え、別の部位は、アミノ末端またはカルボキシル末端ではない。いくつかの実施形態において、別の部位は、表７、８、および９に列挙される様々な位置を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドまたはＦａｂ含有ポリペプチドは、抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型ＩｇＧと比較して最大約２分の１まで低下する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１に低下する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１未満に低下する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２倍超増大する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、挿入される（付着される）か、または毒素ポリペプチドのカルボキシル末端および／もしくはアミノ末端にある１つもしくは複数の野生型アミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、挿入されるか、または毒素ポリペプチド上の別の部位にある１つもしくは複数の野生型アミノ酸を置き換え、別の部位は、アミノ末端またはカルボキシル末端ではない。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲート）は、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、二重特異的抗体）は、少なくとも約３０％のコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約９５％のコンジュゲーション効率を有し、接触されるアミンドナー物質と接触される操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）との間の濃度比率は約５０：１である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲート）は、少なくとも約２時間のインビボでの曝露の後、少なくとも約２０％で対象（例えば、哺乳動物）内に存在する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲート）を含む組成物を提供する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲート）および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４７】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される方法によって精製された、操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲート）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】重鎖のカルボキシル末端でＨＣＱ０１タグ（ＬＬＱＧＧ（配列番号２））を有するｍＡｂ１−ＨＣＱ０１（ＩｇＧ１サブタイプモノクローナル抗体）と様々なアミン含有フルオロフォア誘導体との間の、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションのコンジュゲーション効率を示す図である。精製されたコンジュゲートの効率値は、各フルオロフォアの励起波長および２８０ｎｍでの相対的ＵＶ−ｖｉｓ吸光度から計算された。対応するフルオロフォア／抗体のロード量は、各バーの上に示されている。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびｐＨ８．０（Ａ）または１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびｐＨ８．８（Ｂ）での、重鎖のカルボキシル末端もしくはアミノ末端（それぞれ、ＨＣＱ０１（配列番号２）およびＨＮＱ０１（ＱＶＱＬＫＥ（配列番号３９）））または軽鎖のカルボキシル末端もしくはアミノ末端（それぞれ、ＬＣＱ０１（ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５））およびＬＮＱ０１（ＧＬＬＱＧ（配列番号６））でＱ−（グルタミン）タグを有するｍＡｂ１（ＩｇＧ１サブタイプ）への、およびタグ付けされていないｍＡｂ１への、２つのフルオロフォアカダベリンの、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を示す。精製されたコンジュゲートの効率値は、各フルオロフォアの励起波長および２８０ｎｍでの相対的ＵＶ−ｖｉｓ吸光度から計算された。対応するフルオロフォア／抗体のロード量は、各バーの上に示されている。
【図３】示されている重鎖または軽鎖のいずれかの末端に組み込まれている様々なＱタグを有するＩｇＧ１  ｍＡｂ１への、およびいずれのタグも有さない野生型ｍＡｂ１への、Ａｌｅｘａ４８８カダベリンの、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を示す図である。精製されたコンジュゲートの効率値は、４９５ｎｍ（Ａｌｅｘａ４８８の励起波長）および２８０ｎｍでの相対的ＵＶ−ｖｉｓ吸光度から計算された。全てのＱタグおよびモノクローナル抗体の一部のアミノ酸配列が下に示されている。記号「−」は、アミノ酸配列の欠失を示す。例えば、ＨＣＱ０１において、ＬＳＬＳＰＧは、最後のアミノ酸が欠失しているモノクローナル抗体配列の一部であり、ＱタグＬＬＱＧＧは、モノクローナル抗体に対して操作されている。
【図４】重鎖のカルボキシル末端でＨＣＱ０１タグを有するＩｇＧ１  ｍＡｂ１−ＨＣＱ０１、軽鎖のＣ末端でＬＣＱ０１タグを有するｍＡｂ１−ＬＣＱ０１、ならびにＨＣＱ０１タグおよびＬＣＱ０１タグの両方を有する二重突然変異体への、Ａｌｅｘａ４８８カダベリンの、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を示す図である。精製されたコンジュゲートの効率値は、４９５ｎｍ（Ａｌｅｘａ４８８の励起波長）および２８０ｎｍでの相対的ＵＶ−ｖｉｓ吸光度から計算された。対応するフルオロフォア／抗体のロード量は、各バーの上に示されている。
【図５】二重特異的抗体（ＩｇＧ４およびＩｇＧ２）の、トランスグルタミナーゼによって触媒される架橋を示す図である。Ｃタグ１〜４は、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（（配列番号７））に対応する。
【図６】異なるトランスグルタミナーゼ濃度での、二重特異的抗体の架橋のための異なるＫタグおよびＱタグの架橋効率を示す図である。Ｋ０４、Ｋ０５、Ｋ０６、Ｋ０７、およびＫ０８は、配列番号２６、２７、２８、２９、および３０にそれぞれ対応する。Ｑ００、Ｑ０１、Ｑ０２、Ｑ０３、Ｑ０４、Ｑ０５、Ｑ０６、Ｑ０７、およびＱ０８は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、２、および３８にそれぞれ対応する。
【図７】異なるトランスグルタミナーゼ濃度での、二重特異的抗体の架橋のための異なるＫタグおよびＱタグの架橋効率を示す図である。Ｋ０４、Ｋ０５、Ｋ０６、Ｋ０７、およびＫ０８は、配列番号２６、２７、２８、２９、および３０にそれぞれ対応する。Ｑ００、Ｑ０１、Ｑ０２、Ｑ０３、Ｑ０４、Ｑ０５、Ｑ０６、およびＱ０７は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、および２にそれぞれ対応する。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、質量分析によって検証される、トランスグルタミナーゼの存在下での抗体−（アシルドナーグルタミン含有タグ）およびアミンドナー物質（カダベリンＡｌｅｘａ−４８８）の部位特異的なコンジュゲーションを示す。
【図９】ＭＤＡ−ＭＢ３６１−ＤＹＴ２モデルにおける、トランスグルタミナーゼでコンジュゲートされた抗体（ヒト化ＩｇＧ１）のインビボでの有効性を示す図である。ＴＧ１（またはＨＣＱ０１）、Ｈ１０、およびＴＧ６は、配列番号２、３、および４８の配列をそれぞれ有するＱタグである。Ｎ２９７Ａは、２９７位での非グリコシル化および２９５位にあるアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンをもたらす、２９７位でのＮからＡへのアミノ酸置換を表す。Ｎ２９７Ｑは、２９７位での非グリコシル化ならびに２９５位および２９７位にあるアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンをもたらす、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を表す。ＰＥＧ６ＭＭＡＤは、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを表し、ｖｃＭＭＡＤは、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤを表す。媒体は、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）溶液のみである。
【図１０】Ｎ８７モデルにおける、トランスグルタミナーゼでコンジュゲートされた抗体（ヒト化ＩｇＧ１）のインビボでの有効性を示す図である。ＴＧ１（またはＨＣＱ０１）は、配列番号２に対応する。Ｎ２９７Ｑは、２９７位での非グリコシル化ならびに２９５位および２９７位にあるアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンをもたらす、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を表す。ＰＥＧ６ＭＭＡＤは、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを表し、ｖｃＭＭＡＤは、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤを表す。媒体は、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）溶液のみである。
【図１１】ＢｘＰＣ３モデルにおける、トランスグルタミナーゼでコンジュゲートされた抗体（キメラＩｇＧ１）のインビボでの有効性を示す図である。Ｎ２９７Ｑは、２９７位での非グリコシル化ならびに２９５位および２９７位にあるアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンをもたらす、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を表す。ＰＥＧ６ＭＭＡＤは、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを表し、ｖｃＭＭＡＤは、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤを表す。媒体は、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）溶液のみである。
【図１２】インビボでの抗体コンジュゲートの安定性の決定を示す図である。Ｑタグ（ＴＧ１（配列番号１））で操作された抗体を、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥまたはアミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤにコンジュゲートさせ、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウス内に注射した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、操作されたポリペプチドコンジュゲートおよびトランスグルタミナーゼを用いてそれを作製する方法を提供する。本発明者らは、アシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、Ｇｌｎ含有ペプチドタグ）またはポリペプチドの操作（例えば、ポリペプチドのアミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異を介する）によって反応性にされた内因性グルタミンで操作されたＦｃ含有ポリペプチドが、トランスグルタミナーゼの存在下でアミンドナー物質（例えば、アミンドナー単位を含むかまたはそれに付着した低分子）と共有結合によって架橋して、アミンドナー物質がアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンを介してＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートしている、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定なおよび均質な集団を形成し得ることを発見した。アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）で操作されたＦｃ含有ポリペプチドとアミンドナー物質とのコンジュゲーション効率は、少なくとも約５１％であり、Ｆｃ含有ポリペプチドとアミンドナー物質との間のコンジュゲーション効率は、アシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンの不存在下で、約５％未満である。例えば、Ｇｌｎ含有ペプチドタグに空間的に隣接したＦｃ含有ポリペプチドにおける最後のアミノ酸の欠失またはＬｙｓ（リジン）から別のアミノ酸への突然変異は、Ｆｃ含有ポリペプチドと低分子（例えば、細胞傷害物質またはイメージング剤）とのコンジュゲーション効率を有意に増大させる。本発明者らはまた、トランスグルタミナーゼの存在下で、安定なおよび均質な二重特異的抗体集団が、還元環境において、あるエピトープに対する第１のＦｃ含有ポリペプチドに対して操作されたＧｌｎ含有ペプチドタグおよび第２のエピトープに対する第２のＦｃ含有ポリペプチドに対して操作された別のペプチドタグ（例えば、Ｌｙｓ含有ポリペプチドタグ）を用いて生成され得ることを発見した。類似の二重特異的抗体はまた、２つのＧｌｎ含有ペプチドタグに対して操作された２つの異なるＦｃ含有ポリペプチドをジアミンと組み合わせることによって作製され得る。本発明者らはさらに、トランスグルタミナーゼの存在下で、長い半減期を有する安定なおよび均質なＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートまたは毒素ポリペプチドコンジュゲートが、Ｆａｂ含有ポリペプチドまたは毒素ポリペプチドに対して操作されたＧｌｎ含有ペプチドタグを生体適合性ポリマーと共有結合によって反応させることによって作製され得ることを発見した。さらに、本明細書において記載されるアシルドナーグルタミン含有タグ、Ｆｃ含有ポリペプチド、および／またはアミンドナー物質の選択によって、部位特異的なコンジュゲーションが可能になる。理論に拘束されることは望まないが、本明細書において記載される方法を用いて生成される抗体−薬剤コンジュゲート、二重特異的抗体、抗体−生体適合性ポリマーコンジュゲート、毒素−生体適合性ポリマーコンジュゲートは、安定であり、インビボ、インビトロ、およびエクスビボでタンパク質分解に耐性であり、ならびに／または長い半減期を有する。
【００５０】
したがって、本発明の１つの態様において、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供され、式中、Ｔは、特異的部位で操作された（例えば、挿入または野生型アミノ酸（１つまたは複数）の置き換え／置換を介して）アシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性（すなわち、アミンおよびトランスグルタミナーゼの存在下でアシルドナーとして共有結合を形成する能力）にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしている。
【００５１】
別の態様において、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供され、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。
【００５２】
別の態様において、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供され、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含む、アシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、互いに部位特異的に架橋している。
【００５３】
いくつかの実施形態において、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供され、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、アミノ酸位置２９５で非グリコシル化されており（例えば、ヒトＩｇＧ１において）、野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較してアミノ酸位置２９７でのアミノ酸修飾を含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のアミノ酸位置２９５にある内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、ヒトＩｇＧの２９７位でのアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）からグルタミンへの置換ではない（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）。
【００５４】
別の態様において、式：（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供され、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、Ｆａｂ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。
【００５５】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または毒素ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、毒素ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。
【００５６】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ｂを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ｂは生体適合性ポリマーであり、毒素ポリペプチドは、生体適合性ポリマーのいずれかの部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしている。
【００５７】
別の態様において、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法が提供され、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置するＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）アミンドナー物質を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【００５８】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎは含まず、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）タグに位置する第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子と還元環境において接触させるステップ、およびｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子にトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成すせるステップを含む。
【００５９】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含む、アシルドナーグルタミン含有タグであり、第１のアシルドナーグルタミン含有および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓにそれぞれ空間的に隣接しておらず、Ａはアミンドナー物質であり、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、互いに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）第１のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｃ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子およびアミンドナー物質と還元環境において接触させるステップ、ならびにｄ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子にトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【００６０】
一般的な技術および定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。全体として、本明細書において記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名、およびその技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる。
【００６１】
本発明の方法および技術は、全体として、別段の指示がない限り、当技術分野において周知の従来の、ならびに本明細書を通して引用および議論される様々な一般的なおよびさらに具体的な参考文献において記載されているような方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書において記載されるように、製造者の説明に従って行われる。本明細書において記載される、分子生物学、生化学、免疫学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して用いられる命名、ならびにその実験手順および実験技術は、当技術分野において周知であり一般的に用いられるものである。本明細書および特許請求の範囲を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含めるがいかなる他の整数または整数群も排除しないことを意味すると理解される。
【００６２】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さの、好ましくは比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸の）アミノ酸鎖を指すために、本明細書において区別せずに用いられる。鎖は、直鎖状または分岐鎖状であり得、これは、修飾されたアミノ酸を含み得、および／または非アミノ酸によって介在され得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されている、アミノ酸鎖を包含する。同様にこの定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つまたは複数の類似体、および当技術分野において知られている他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として生じ得ることが理解される。
【００６３】
本明細書において用いられる用語「Ｆｃ含有ポリペプチド」は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシル末端のポリペプチド配列を含むポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）を指す。Ｆｃ含有ポリペプチドは、天然Ｆｃ領域または変異Ｆｃ領域（すなわち配列）を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は通常、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。Ｆｃ含有ポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部または全てを含み得る（通常、そのアミノ末端で）。Ｆｃ含有ポリペプチドはまた、二量体であり得る。Ｆｃ含有ポリペプチドは、任意の適切な免疫グロブリン、例えば、様々なＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得ることができるか、または誘導することができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｇｌｕ２１６位のアミノ酸残基から、またはＡｌａ２３１から、そのカルボキシル末端まで伸びていると定義される。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指標のものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。
【００６４】
Ｆｃ含有ポリペプチドは、１つまたは複数のポリペプチドがＦｃ含有ポリペプチドに機能可能に連結している、Ｆｃ含有融合ポリペプチドであり得る。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃポリペプチドを通常は任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子であり得る融合パートナーと組み合わせる。事実上任意のタンパク質または低分子が、Ｆｃ領域に連結して、Ｆｃ含有融合ポリペプチドを生成し得る。Ｆｃ含有融合パートナーには、限定はしないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得る。
【００６５】
本明細書において用いられる用語「アシルドナーグルタミン含有タグ」、「グルタミンタグ」、「Ｑ含有タグ」、または「Ｑタグ」は、トランスグルタミナーゼのアミンアクセプターとして作用する１つまたは複数のＧｌｎ残基を含有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「アミンドナー物質」または「アシルアクセプター」は、１つまたは複数の反応性アミン（例えば、第一級アミン）を含有する作用物質を指す。例えば、アミンドナー物質は、アミンドナー単位（例えば、第一級アミンＮＨ２）、リンカー、および作用物質部分（例えば、低分子）を含み得る。アミンドナー物質はまた、反応性Ｌｙｓ（例えば、内因性Ｌｙｓ）を含有するポリペプチド（例えば抗体）または生体適合性ポリマーであり得る。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、用語「生体適合性ポリマー」は、レシピエント（例えばヒト）においていかなる望ましくない局所的または全身的な影響も引き起こすことのない、レシピエントにおける治療または医療的処置に適切なポリマー（例えば、反復している単量体単位または構造単位）を指す。生体適合性ポリマー（合成の、組換えの、または天然の）は、水溶性のまたは水不溶性のポリマーであり得る。生体適合性ポリマーはまた、直鎖状または分岐鎖状のポリマーであり得る。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、用語「部位特異性」、「部位特異的にコンジュゲートしている」、または「部位特異的に架橋している」は、特異的部位（例えば、抗体もしくは毒素ポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端、抗体内のアクセス可能な部位（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖のループ）、または毒素ポリペプチド（例えば、ポリペプチドループ））での、アシルドナーグルタミン含有タグで操作されたポリペプチドへの、アミンドナー物質の特異的なコンジュゲーションまたは架橋を指す。アシルドナーグルタミン含有タグで操作されたポリペプチドは、Ｆｃ含有ポリペプチド、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドであり得る。用語「部位特異性」、「部位特異的にコンジュゲートしている」、または「部位特異的に架橋している」はまた、特異的部位（例えば、生体適合性ポリマー内のアクセス可能な部位）での、アシルドナーグルタミン含有タグで操作された生体適合性ポリマーへの、ポリペプチド（例えば、毒素ポリペプチド）の特異的なコンジュゲーションまたは架橋を指し得る。部位特異性は、限定はしないが、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、タンデム質量分析（ＭＳ）、および飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ））、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、部位特異的突然変異生成、蛍光標識、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＸ線結晶学を含む、様々な技術によって測定することができる。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、用語「に空間的に隣接している」は、所望のトランスグルタミナーゼ反応への干渉を指す。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、文脈によって別段の指示がない限り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、サメおよびラクダ抗体を含む一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体およびドメイン抗体、ならびに、本明細書において記載される、抗体部分、多価抗体、多重特異的抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を示す限りの、二重特異的抗体）、および抗体断片を含む、融合タンパク質、ならびに、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体構造も包含するものである。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、また抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体構造は周知である。１つの態様において、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギの免疫グロブリンである。
【００７１】
本明細書において用いられる用語「Ｆａｂ含有ポリペプチド」は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、または（Ｆａｂ’）２断片を含むポリペプチドを指す。Ｆａｂ含有ポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部または全てを含み得る（通常は、そのカルボキシル末端で）。Ｆａｂ含有ポリペプチドは、任意の適切な免疫グロブリンから、例えば様々なＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得ることができるか、または誘導することができる。Ｆａｂ含有ポリペプチドは、１つまたは複数のポリペプチドがＦａｂ含有ポリペプチドに機能可能に連結している、Ｆａｂ含有融合ポリペプチドであり得る。Ｆａｂ融合体は、免疫グロブリンのＦａｂポリペプチドを通常は任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子であり得る融合パートナーと組み合わせる。事実上任意のタンパク質または低分子が、Ｆａｂポリペプチドに連結して、Ｆａｂ含有融合ポリペプチドを生成し得る。Ｆａｂ含有融合パートナーには、限定はしないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得る。
【００７２】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖およびＣＨ１および１つの重鎖の可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成し得ない。
【００７３】
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１つの重鎖の一部、また、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含有し、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成され得る。
【００７４】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を含有し、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間で形成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、したがって、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって共に結び付けられている２つのＦａｂ’断片からなる。
【００７５】
本明細書において用いられる「抗体断片」は、無傷抗体の一部分のみを含み、前記部分は好ましくは、無傷抗体内に存在する場合に前記部分に通常は関連する機能の、少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたは全てを保持する。
【００７６】
「多重特異的抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープを標的化する抗体である。「二重特異的な（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異的な（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、または「二官能性の」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、多重特異的抗体の種であり、限定はしないがハイブリドーマの融合またはＦａｂ'断片の連結を含む、様々な方法によって生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１；およびＫｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。二重特異的抗体の２つの結合部位は、同一のまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、微量に存在し得る、考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原に対するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。
【００７８】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、一部の実施形態において、所望の生物学的活性を示す限りの、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（１つまたは複数）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を具体的に含み得る（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。
【００７９】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体は、さらに、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインのほぼ全てを含み、超可変ループの全てまたはほぼ全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたはほぼ全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲに対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。また、総説：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）、およびそこで引用される参考文献も参照されたい。
【００８０】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または本明細書において開示されるヒト抗体を作製する技術のいずれかを用いて作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。
【００８１】
本明細書において用いられる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」を免疫グロブリン定常ドメイン（すなわち、Ｆｃドメイン）のエフェクター成分と組み合わせる抗体様分子または免疫グロブリン様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（抗原結合部位）以外の（すなわち「異種の」）、所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、もしくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００８２】
本明細書において用いられる「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、およびその変型は、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ＮＹ）（第４版、１９９９）；Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、６：４０７〜４１５；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２において説明されている、当技術分野において知られている意味を含む。
【００８３】
本明細書において用いられる場合、用語「野生型アミノ酸」、「野生型ＩｇＧ」、「野生型二重特異的抗体」、または「野生型ｍＡｂ」は、ある集団（例えば、ヒト、マウス、ラット、細胞など）内で天然に生じるアミノ酸または核酸の配列を指す。
【００８４】
本明細書において用いられる場合、用語「コンジュゲーション効率」または「架橋効率」は、操作されたポリペプチドコンジュゲートの実験的に測定された量を、操作されたポリペプチドコンジュゲートの最大期待量で割った値の間の比率である。コンジュゲーション効率または架橋効率は、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの当業者に周知の様々な技術によって測定することができる。コンジュゲーション効率はまた、室温または３７℃などの異なる温度で測定することができる。
【００８５】
用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例としては、限定はしないが、抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｆｃ受容体の結合、補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）、食作用、Ｃ１ｑの結合、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節が挙げられる。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照されたい。このようなエフェクター機能は通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを要し、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。エフェクター機能の典型的な測定は、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合を介する。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、「抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を生じさせる、細胞介在性の反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号において記載されているような、インビトロＡＤＣＣアッセイを用いて評価することができる。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【００８７】
「補体依存性の細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体の活性化経路は、同族抗原と複合した分子（例えば抗体）への補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の結合によって開始される。補体の活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）において記載されているような、ＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、対立遺伝子変異体を含むＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩＩサブクラス、およびＦｃｙＲＩＶサブクラスの受容体を含み、あるいは、これらの受容体のスプライシングされた形態を含む。ＦｃｙＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：２〜４において概説されている。「ＦｃＲ」にはまた、胎児への母親ＩｇＧの移入に関与する新生児受容体ＦｃＲｎが含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
【００８９】
本明細書において用いられる用語「還元環境」は、グルタチオン（ＧＳＨ）、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（２−メルカプトエタノール）、およびシステインなどの広範な還元剤によって達成され得る還元条件を指す。還元剤は、典型的には、マイクロミリモル濃度範囲で用いられる。
【００９０】
用語「精製する」およびその文法上の変型は、組成物内のポリペプチドの純度レベルを向上させる（すなわち、組成物内の不純物（１つまたは複数）の量（ｐｐｍ）を減少させることによって）、ポリペプチドおよび１つまたは複数の不純物を含有する混合物からの少なくとも１つの不純物の完全なまたは部分的な除去を意味するために用いられる。
【００９１】
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、それ自体がその値またはパラメータに向けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。
【００９２】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定はしないが、家畜、スポーツ用の動物、ペット、霊長類、ウマ、犬、猫、マウス、およびラットが含まれる。
【００９３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という記載を用いて実施形態が本明細書において記載されている場合は全て、「からなる」および／または「から基本的になる」と言う用語で記載されているそれ以外の類似の実施形態もまた提供される。
【００９４】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは選択肢の他のグループ分けに関して記載されている場合、本発明は、列挙されたグループ全体をまとめて包含するだけではなく、グループの各メンバーを個別におよびメイングループの全ての考えられるサブグループも包含し、しかしまた、グループメンバーの１つまたは複数が欠けているメイングループも包含する。本発明はまた、特許請求の範囲に記載の発明におけるグループメンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に排除することも想定する。
【００９５】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものに類似または同等の方法および材料もまた本発明の実施または試験において用いることができる。本明細書において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる。一致しない場合には、定義を含む本明細書が優先される。多くの文献が本明細書において引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における一般常識の一部を形成することを承認するものではない。本明細書および特許請求の範囲を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含めることを意味するが、いかなる他の整数または整数群も排除するものではない。文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定するためのものではない。
【００９６】
操作されたポリペプチドコンジュゲート
本明細書における操作されたポリペプチドコンジュゲートは、アシルドナーグルタミン含有タグまたはポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンに対して操作されたポリペプチド（例えば、Ｆｃ含有ポリペプチド、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチド）を含み、ポリペプチドは、アシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを介してアミンドナー物質（例えば、低分子または生体適合性ポリマー）に部位特異的にコンジュゲートしている。アシルドナーグルタミン含有タグは、挿入され得るか、またはポリペプチド上の１つもしくは複数の野生型アミノ酸を置き換え／置換し得る。内因性グルタミンは、Ｆｃ含有ポリペプチド、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸を修飾すること（例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異）によって反応性（すなわち、アミンおよびトランスグルタミナーゼの存在下でアシルドナーとして共有結合を形成する能力）にされ得る。操作されたポリペプチドコンジュゲートはまた、アシルドナーグルタミン含有タグを含有するように操作された生体適合性ポリマーに部位特異的にコンジュゲートしているポリペプチド（例えば、毒素ポリペプチド）を含み得る。
【００９７】
１つの態様において、操作されたポリペプチドコンジュゲートは、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであり、式中、Ｔは、特異的部位で操作された（例えば、アシルドナーグルタミン含有タグの挿入、または１つもしくは複数の野生型アミノ酸の置き換え／置換を介する）アシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位のどこかにあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。したがって、アシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性のグルタミン）およびアミンドナー物質の両方は、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性のグルタミン）とアミンドナー物質との間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【００９８】
本明細書において記載される、本発明において用いられるトランスグルタミナーゼは、様々な由来源から得ることができるかまたは作製することができる。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、酵素の立体構造の変化を誘発するためおよび酵素活性を可能にするためにカルシウムを要する、カルシウム依存性のトランスグルタミナーゼである。例えば、トランスグルタミナーゼは、モルモットの肝臓に由来し得、また市販の由来源（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ））を介して得ることができる。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、酵素の立体構造の変化を誘発するためおよび酵素活性を可能にするためにカルシウムを要しない、カルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、ストレプトベルティシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｉｃｅｓ）（例えば、ストレプトマイセス・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）、またはストレプトベルティシリウム・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ））に由来するトランスグルタミナーゼなどの、微生物ゲノムに由来する微生物トランスグルタミナーゼである。ＡＣＴＩＶＡ（商標）（味の素、日本）などの市販されているカルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼは、本発明に適している。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトトランスグルタミナーゼ）、細菌タンパク質、植物タンパク質、真菌タンパク質（例えば、卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）および放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｉｃｅｔｅｓ）のトランスグルタミナーゼ）、または原核生物タンパク質である。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、トルロプシス属（Ｔｕｒｏｌｐｓｉｓ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される、本発明において用いられるトランスグルタミナーゼはまた、当業者に知られている組換え技術を用いて生産された組換えタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される、本発明において用いられるトランスグルタミナーゼは、精製タンパク質であり得る。例えば、精製トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５０％の純度である。本明細書において用いられる場合、「純粋な」または「精製」タンパク質は、他の汚染タンパク質を有さないタンパク質（例えば、トランスグルタミナーゼ）を指す。いくつかの実施形態において、精製トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９８％、または９９％の純度のいずれかである。いくつかの実施形態において、精製トランスグルタミナーゼは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度のいずれかである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのアシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。例えば、アシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、またはカルボキシル末端およびアミノ末端の両方において反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、少なくとも１つのＧｌｎを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、１つのＧｌｎを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号１）を含み、式中、Ｘは、本明細書において記載されるような従来のまたは非従来のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＸはＬ（Ｌｅｕ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、またはＷ（Ｔｒｐ）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）、ＧＬＬＱＧ（配列番号６）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱ（配列番号１０）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、およびＬＬＱＧＲ（配列番号５６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＱＶＱＬＫＥ（配列番号３９）およびＶＱＬＫＥ（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）、ＧＬＬＱＧ（配列番号６）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱ（配列番号１０）、ＱＶＱＬＫＥ（配列番号３９）、ＶＱＬＫＥ（配列番号４０）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、およびＬＬＱＧＲ（配列番号５６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＧＧＱＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＱＧＧＬ（配列番号４２）、ＧＸＧＱＧＧＧ（配列番号４３）、ＧＧＸＱＧＧＧ（配列番号４４）、ＧＧＧＱＸＧＧ（配列番号４５）、およびＧＧＧＱＧＸＧ（配列番号４６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含まず、式中、Ｘは、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、またはＥである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのＦｃ含有ポリペプチドは、同一の位置にある野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、カルボキシル末端内の最後のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異、またはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、置換は、野生型アミノ酸を別のアミノ酸（例えば、非野生型アミノ酸）で置き換えることを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、１つまたは複数のアミノ酸を挿入すること（例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸を挿入すること）を含む。いくつかの実施形態において、別の（例えば、非野生型）アミノ酸または挿入されるアミノ酸は、Ａｒｇである。いくつかの実施形態において、別の（例えば、非野生型）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである。例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端内の最後のアミノ酸はＡｒｇで置換され、Ｆｃ含有ポリペプチドに対して操作されたアシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、またはＬＬＱのアミノ酸配列を含む。Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端内の最後のアミノ酸もまた欠失され得、Ｆｃ含有ポリペプチドに対して操作されたアシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、またはＬＬＱのアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、同一の位置にある野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、アミノ末端内の第１のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異、またはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、置換は、野生型アミノ酸を別の（例えば、非野生型）アミノ酸で置き換えることを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、アミノ酸を挿入することを含む。いくつかの実施形態において、別の（例えば、非野生型のまたは挿入される）アミノ酸は、Ａｒｇである。いくつかの実施形態において、別の（非野生型のまたは挿入される）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである。例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドのアミノ末端内の第１のアミノ酸はＧｌｎであり、Ｆｃ含有ポリペプチドに対して操作されたアシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、またはＬＬＱを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、完全長の抗体重鎖および抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端にあるＦｃ含有ポリペプチドに連結している／位置している。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のアシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、表７〜９において列挙されるＱタグ）および第２のアシルドナーグルタミン含有タグ（例えば、表７〜９において列挙されるＱタグ）を含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖のカルボキシル末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、軽鎖のカルボキシル末端に位置する。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含み、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端にあるＦｃ含有ポリペプチドに位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは重鎖のアミノ末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、軽鎖のアミノ末端に位置する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、または抗体断片である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、挿入またはＦｃ含有ポリペプチド上の別の部位にある１つもしくは複数の野生型アミノ酸の置き換えによって、Ｆｃ含有ポリペプチドに位置し、別の部位は、アミノ末端またはカルボキシル末端ではない。例えば、アシルドナーグルタミン含有タグは、抗体ループの一部である。アシルドナーグルタミン含有タグは、１つまたは複数の重鎖ループに連結し得る。アシルドナーグルタミン含有タグはまた、抗体の１つまたは複数の軽鎖ループに連結し得る。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖ループおよび軽鎖ループの両方に位置する。いくつかの実施形態において、別の部位は、表７、８、および９において列挙されている様々な位置を含む。いくつかの実施形態において、別の部位は、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸位置（１つまたは複数）１０８、１３５、１６０、１６８、１８９〜１９２、１９０〜１９２、２００〜２０２、２２２〜２２３、２５１〜２５４、２５２〜２５３、２２２〜２２３、２９３〜２９７、２９４〜２９７、２９５、２９７、または３８５（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、内因性グルタミンをアミンドナー物質に対して反応性にするために操作される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドの操作は、Ｆｃ含有ポリペプチド上のアミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異、またはその任意の組み合わせである。例えば、２９７位にある野生型アミノ酸Ａｓｎは、アミノ酸Ａで置換されるかまたは置き換えられ、その結果、２９７位での非グリコシル化および２９５位での反応性の内因性グルタミンが生じる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドの操作は、ヒトＩｇＧの２９７位（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）でのアスパラギン（Ａｓｎ）からグルタミンへのアミノ酸置換ではない。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、約１倍以上に増加する、または最大約２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれかまで低下する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートはＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して最大約２分の１まで低下する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１に低下する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１未満に低下する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートはＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１倍以上に増加する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１倍である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれか未満に低下する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、少なくとも約１倍から３０００倍に増大する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのエフェクター機能は、野生型Ｆｃ含有ポリペプチドと比較して、少なくとも約１倍から５倍、６倍から１０倍、１１倍から１５倍、１６倍から２０倍、２１倍から２５倍、２６倍から３０倍、３１倍から３５倍、３６倍から４０倍、４１倍から４５倍、４６倍から５０倍、５１倍から５５倍、５６倍から６０倍、６１倍から６５倍、６６倍から７０倍、７１倍から７５倍、７６倍から８０倍、８１倍から８５倍、８６倍から９０倍、９１倍から９５倍、９６倍から１００倍、１０１倍から２００倍、２０１倍から３００倍、３０１倍から５００倍、５０１倍から１０００倍、１００１倍から１５００倍、１５０１倍から２０００倍、２００１倍から２５００倍、２５０１倍から３０００倍のいずれかに増大する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートはＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して、約１倍から３００倍に増大する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、または３０００倍のいずれかに増大する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、式：Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分である。
【０１１４】
アシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミン）を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートし得るアミンドナー物質の数は、Ｆｃ含有ポリペプチド（１つまたは複数）に連結／挿入されたアシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミン）の数、およびアシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス／曝露された内因性グルタミン）上のＧｌｎの数に応じる。例えば、２つのアミンドナー物質は、２つの重鎖のカルボキシル末端で抗体に部位特異的にコンジュゲートし得、かつ／または２つのアミンドナー物質は、２つの軽鎖のカルボキシル末端で同一の抗体に部位特異的にコンジュゲートし得る。
【０１１５】
本発明のアミンドナー単位は、トランスグルタミナーゼの基質を提供して、アシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを介するＦｃ含有ポリペプチドへの作用物質部分のコンジュゲーションを可能にする、第一級アミン（ＮＨ２）である。したがって、アシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミン）とアミンドナー単位との間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【０１１６】
本発明のリンカーは、切断可能なまたは切断不可能なリンカーであり得る。例えば、リンカー（アミンドナー単位を有する）またはアミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチドから放出され得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、従来のまたは非従来のアミノ酸（１つまたは複数））および／または非ペプチドリンカーであり得る。非ペプチドリンカーの例としては、アルキルリンカーおよびＰＥＧリンカーが挙げられる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、アミンドナー単位−リンカー（例えば、Ｘ−Ｙ）は、作用物質部分を含む直鎖状の単位である。他の実施形態において、アミンドナー単位−リンカーは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の作用物質部分を含む、分岐鎖状の単位である。
【０１１８】
典型的なアミンドナー単位−リンカーには、限定はしないが、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ、アミノ−ＰＥＧ２（ポリエチレングリコール）−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（バリン）−Ｃｉｔ（シトルリン）−ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、プトレシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシンからなる群から選択されるアミンドナー単位−リンカーが含まれる。
【０１１９】
本発明の操作されたＦｃ含有ポリペプチドの作用物質部分には、低分子、タンパク質またはポリペプチド、および生体適合性ポリマーが含まれる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、低分子は、細胞傷害物質、免疫抑制物質、またはイメージング剤（例えば、フルオロフォア）である。いくつかの実施形態において、細胞傷害物質は化学療法物質である。
【０１２１】
細胞傷害物質の例としては、限定はしないが、アントラサイクリン、オーリスタチン、ドラスタチン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、ツブリシン、ヘミアステリン、およびその立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体が挙げられる。
【０１２２】
アントラサイクリンは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓ）の細菌に由来し、広範な癌、例えば白血病、リンパ腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌を治療するために用いられている。典型的なアントラサイクリンには、限定はしないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン（すなわち、アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンが含まれる。
【０１２３】
ドラスタチンおよびそのペプチド類似体ならびに誘導体、オーリスタチンは、抗癌活性および抗真菌活性を有することが示されている、非常に強力な抗有糸分裂物質である。例えば、米国特許第５，６６３，１４９号、およびＰｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１〜２９６５（１９９８）を参照されたい。典型的なドラスタチンおよびオーリスタチンには、限定はしないが、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、および５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）が含まれる。
【０１２４】
デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞傷害性能力を有するＤＮＡアルキル化剤である。ＢｏｇｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＰＮＡＳ  ９２：３６４２〜３６４９（１９９５）を参照されたい。典型的なドラスタチンおよびオーリスタチンには、限定はしないが、（＋）−デュオカルマイシンＡおよび（＋）−デュオカルマイシンＳＡ、ならびに（＋）−ＣＣ−１０６５が含まれる。
【０１２５】
エンジインは、９員環および１０員環、またはコンジュゲートした三重−二重−三重結合の環状系の存在によって特徴付けされる、あるクラスの抗腫瘍細菌生成物である。典型的なエンジインには、限定はしないが、カリケアマイシン、エスペラマイシン、およびダイネミシンが含まれる。
【０１２６】
ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合し、抗腫瘍薬剤として用いられている、ベンゾキノンアンサマイシン抗生物質である。典型的なゲルダナマイシンには、限定はしないが、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）が含まれる。
【０１２７】
メイタンシンまたはその誘導体であるメイタンシノイドは、チューブリンの重合の阻害を介して有糸分裂の間の微小管形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：１００２〜１００５（１９７５）を参照されたい。典型的なメイタンシンおよびメイタンシノイドには、限定はしないが、メルタンシン（ＤＭ１）およびその誘導体、ならびにアンサミトシンが含まれる。
【０１２８】
タキサンは、抗チューブリン物質または有糸分裂阻害物質として作用するジテルペンである。典型的なタキサンには、限定はしないが、パクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））が含まれる。
【０１２９】
ビンカアルカロイド（alkyloid）はまた、抗チューブリン物質である。典型的なビンカアルカロイド（alkyloid）には、限定はしないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、作用物質部分は免疫抑制物質である。免疫抑制物質の例としては、限定はしないが、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレクストレート、ならびに糖質コルチコイドおよびその類似体が挙げられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、作用物質部分は、イメージング剤（例えば、フルオロフォア）、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ランタニド蛍光体、およびその誘導体が含まれる。フルオロフォアの例としては、限定はしないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば、５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば、５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば、５−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えば、ＳＲ１０１）が挙げられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、作用物質部分はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはマウスモノクローナル抗体である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、作用物質部分は、毒素ポリペプチド（または毒素タンパク質）である。毒素ポリペプチドの例としては、限定はしないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えば、セラトトキシン）、およびコノトキシン（例えば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）が挙げられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、治療用放射性同位体または他の標識を、アミンドナー物質へのＦｃ含有ポリペプチドのコンジュゲーションのための作用物質部分内に組み込むことができる。放射性同位体または他の標識の例としては、限定はしないが、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、および１５３Ｐｂが挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、作用物質部分は、生体適合性ポリマーである。Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ含有ポリペプチドの生物学的特徴を向上させるように、例えば、血清の半減期および生物活性を増大させるように、および／またはインビボでの半減期を延長させるように、アシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを介して生体適合性ポリマーにコンジュゲートし得る。生体適合性ポリマーの例としては、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体、および両性イオン含有生体適合性ポリマー（例えば、ホスホリルコリン含有ポリマー）が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質（Ｘ−Ｙ−Ｚ）は、
【０１３７】
【化１】
2014500866.tif 000003
であり、式中、Ｘは、ＮＨ２であり（すなわち、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−としてグルタミンと共有結合を形成する）、ｍは０から２０であり、ｎは１から８であり、ｐは０から３であり、ｑは０または１であり、アミノ酸は、任意の従来のまたは非従来のアミノ酸であり、Ｚは、細胞傷害物質またはイメージング剤である。
【０１３８】
従来のアミノ酸または天然アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいていくつかの群に分けられる：（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性（負に荷電している）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性（正に荷電している）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、および（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。従来のアミノ酸には、ＬまたはＤの立体化学が含まれる。
【０１３９】
非従来のアミノ酸は、非天然アミノ酸である。非従来のアミノ酸の例としては、限定はしないが、アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、シトルリン、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン（ethylaspargine）、ヒドロキシリジン（hyroxylysine）、アロ−ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン（orithine）、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、Ａｌｅｘａ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＦ、プトレシニル−ゲルダナマイシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシン、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、またはアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤである。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）を含み、アミンドナー物質は、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシン、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、またはアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤである。アミンドナー物質の典型的な構造を、表１に列挙する。
【０１４１】
【表１−１】
2014500866.tif 000004
【０１４２】
【表１−２】
2014500866.tif 000005
【０１４３】
【表１−３】
2014500866.tif 000006
【０１４４】
【表１−４】
2014500866.tif 000007
【０１４５】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または第１のＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチド（例えば、二重特異的抗体）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓ（すなわち、アシルドナーおよびトランスグルタミナーゼの存在下でアミンドナーとして共有結合を形成する能力）に空間的に隣接していない。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質内のタグは、ＧまたはＧＧを含み、タグは、第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接している。したがって、アシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミン）および操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓは、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）と第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、タグは、Ｌｙｓを含むアミンドナータグ（すなわち、Ｋタグ）である。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＫＧを含む。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、ＫＧＧ、ＧＫＧＧ（配列番号１１）、ＧＳＫＧＧ（配列番号１２）、ＧＳＧＫＧＧ（配列番号１３）、およびＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、アシルドナーグルタミン含有タグ（またはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミン）および操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのアミンドナータグは、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）とアミンドナータグとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【０１４８】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチド（例えば、二重特異的抗体）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓ（すなわち、内因性の反応性Ｌｙｓ）は、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグと第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。
【０１４９】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含む、アシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、互いに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、反応性Ｇｌｎを含まない。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチド（例えば、二重特異的抗体）である。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓにそれぞれ空間的に隣接していない。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、ジアミンを含む化合物である。ジアミンを含む化合物の例としては、限定はしないが、プトレシン（ブタン−１，４−ジアミン）、エチレンジアミン、カダベリン（ペンタン−１，５−ジアミン）、スペルミジン、スペルミン、ヒドラジン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、フェニレンジアミン（例えば、ｏ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、またはｐ−フェニレンジアミン）、キシリレンジアミン（例えば、ｏ−キシリレンジアミン、ｍ−キシレンジアミン、またはｐ−キシリレンジアミン）、ジフェニルエチレンジアミン、１，８−ジアミノナフタレン、およびその立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、プトレシンまたはカダベリンである。
【０１５１】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドに架橋したアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アシルドナーグルタミン含有タグは、第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋している。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、反応性Ｇｌｎを含まない。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに隣接していない。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的なＦｃ含有ポリペプチド（例えば、二重特異的抗体）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓ（すなわち、内因性の反応性Ｌｙｓ）は、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグと第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、操作された二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型の二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドと比較して、約１倍以上に増加する、または最大約２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれかまで低下する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的ＩｇＧであり、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して最大約２分の１まで低下する。他の実施形態において、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して約２分の１に低下する。他の実施形態において、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して約２分の１未満に低下する。いくつかの実施形態において、操作された二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的ＩｇＧであり、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して約１倍以上に増加する。他の実施形態において、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して約１倍である。いくつかの実施形態において、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して約１分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれか未満に低下する。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型のＦｃ含有ポリペプチドと比較して、少なくとも約１倍から３００倍のいずれかに増大する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、二重特異的ＩｇＧであり、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して、少なくとも約１から５倍、６から１０倍、１１から１５倍、１６から２０倍、２１から２５倍、２６から３０倍、３１から３５倍、３６から４０倍、４１から４５倍、４６から５０倍、５１から５５倍、５６から６０倍、６１から６５倍、６６から７０倍、７１から７５倍、７６から８０倍、８１から８５倍、８６から９０倍、９１から９５倍、９６から１００倍、１０１から２００倍、２０１から３００倍、３０１から５００倍、５０１から１０００倍、１００１から１５００倍、１５０１から２０００倍、２００１から２５００倍、２５０１から３０００倍のいずれかに増大する。いくつかの実施形態において、二重特異的ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型の二重特異的ＩｇＧと比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、または３０００倍のいずれかに増大する。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、操作された二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、二重特異的抗体）は、例えば、別のポリペプチドまたは分子作用物質に連結した本明細書において開示される操作された融合Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製することによって、修飾または誘導体化することができる。例えば、操作された二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドは、当業者によって周知の技術を用いて、限定はしないがＰＥＧ、メチル基またはエチル基、エステル、糖質基などを含む化学基で修飾または誘導体化することができる。これらの化学基（およびインビボでの治療用化合物を安定化させるために用いられている、それらに類似の他のもの）は、操作された二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの生物学的特徴を向上させるため、例えば、血清の半減期および生物活性を増大させるため、またはインビボでの半減期を延長するために有用である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作された二重特異的なＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、当技術分野において知られている多数の方法のいずれかを用いて標識することができる。いくつかの実施形態において、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、またはマークされたアビジン（例えば、光学的方法もしくは比色分析方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。いくつかの実施形態において、標識またはマーカーは、治療的であり得、例えば、本明細書において記載されるような薬剤コンジュゲートまたは毒素であり得る。ポリペプチドの標識の例としては、限定はしないが、放射性同位体または放射性核種、蛍光標識、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ、磁気作用物質、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体、立体異性体、アイソスター、またはホモログが挙げられる。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるように、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【０１５６】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、Ｆａｂ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位のどこかにあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。例えば、Ｆａｂ含有ポリペプチドは、Ｆａｂ含有ポリペプチドの生物学的特徴を向上させるように、例えば、血清の半減期および生物活性を増大させるように、および／またはインビボでの半減期を延長させるように、本明細書において記載されるアシルドナーグルタミン含有タグまたはアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを介して生体適合性ポリマーに部位特異的にコンジュゲートし得る。いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマー、または両性イオン含有生体適合性ポリマーである。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、少なくとも１つのＧｌｎを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号１）を含み、式中、ＸはＬ（Ｌｅｕ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、またはＷ（Ｔｒｐ）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）、ＧＬＬＱＧ（配列番号６）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱ（配列番号１０）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、およびＬＬＱＧＲ（配列番号５６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＱＶＱＬＫＥ（配列番号３９）およびＶＱＬＫＥ（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）および生体適合性ポリマーの両方は、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）と生体適合性ポリマーとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【０１５７】
生体適合性ポリマー内の反応性アミンは、第一級アミンであり得る。いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマー内の第一級アミンは、内因性の第一級アミンまたは外因性の第一級アミンである。本明細書において記載されるＬｙｓを含むアミンドナータグは、生体適合性ポリマーに付加または操作されて外因性の第一級アミンをもたらし得る。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、Ｌｙｓを含む。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＫＧを含む。いくつかの実施形態において、アミンドナータグは、ＫＧＧ、ＧＫＧＧ（配列番号１１）、ＧＳＫＧＧ（配列番号１２）、ＧＳＧＫＧＧ（配列番号１３）、およびＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミン（アクセス可能な／曝露された／反応性の）は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のカルボキシル末端にあるＦａｂ含有ポリペプチドに位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖のカルボキシル末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、軽鎖のカルボキシル末端に位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミン（アクセス可能な／曝露された／反応性の）は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方のアミノ末端にあるＦａｂ含有ポリペプチドに位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖のアミノ末端に位置し、第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、軽鎖のアミノ末端に位置する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆａｂ含有ポリペプチド内の別の部位に位置するかまたは挿入され、別の部位は、アミノ末端またはカルボキシル末端ではない。例えば、アシルドナーグルタミン含有タグは、抗体ループの一部である。アシルドナーグルタミン含有タグは、１つまたは複数の重鎖ループに連結され得る。アシルドナーグルタミン含有タグはまた、抗体の１つまたは複数の軽鎖ループに連結され得る。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖ループおよび軽鎖ループの両方に連結される。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、Ｆａｂ含有ポリペプチドは、抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異的抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである。
【０１６１】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグまたは毒素ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンであり、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、毒素ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位のどこかにあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしている。例えば、毒素ポリペプチドは、毒素ポリペプチドの生物学的特徴を向上させるように、例えば、血清の半減期および生物活性を増大させるように、および／またはインビボでの半減期を延長させるように、本明細書において記載されるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミン（アクセス可能な／曝露された／反応性の）を介して生体適合性ポリマーに部位特異的にコンジュゲートし得る。いくつかの実施形態において、毒素ポリペプチドは、セラトトキシンまたはコノトキシン（例えば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）である。いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマーは、ＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマー、または両性イオン含有生体適合性ポリマーである。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、少なくとも１つのＧｌｎを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号１）を含み、式中、Ｘは、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、またはＷ（Ｔｒｐ）である。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）、ＧＬＬＱＧ（配列番号６）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱ（配列番号１０）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、およびＬＬＱＧＲ（配列番号５６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＱＶＱＬＫＥ（配列番号３９）およびＶＱＬＫＥ（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）および生体適合性ポリマーの両方は、トランスグルタミナーゼの基質であり、アシルドナーグルタミン含有タグ（または内因性グルタミン）と生体適合性ポリマーとの間の連結は、式ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−のものである。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、毒素ポリペプチドのカルボキシル末端に位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、毒素ポリペプチドのアミノ末端に位置する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、毒素ポリペプチドの別の部位のどこかに位置する。
【０１６３】
１つの変型において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ｂを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ｂは生体適合性ポリマーであり、毒素ポリペプチドは、生体適合性ポリマーのいずれかの部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしている。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、生体適合性ポリマー内のアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンは、毒素ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓ（例えば、反応性の内因性Ｌｙｓ）に空間的に隣接している。いくつかの実施形態において、毒素ポリペプチドは、本明細書において記載されるアミンドナータグを含む。例えば、Ｌｙｓを含むアミンドナータグは、毒素ポリペプチドに連結され得る。
【０１６５】
（毒素ポリペプチド）−（アシルドナーグルタミン含有タグ）、生体適合性ポリマー、およびその結果得られる（毒素ポリペプチド）−（アシルドナーグルタミン含有タグ）−（生体適合性ポリマー）の典型的な構造を以下に示す。
【０１６６】
【化２】
2014500866.tif 000008
【０１６７】
セラトトキシンＱタグは、配列番号８１に対応する。
【０１６８】
（毒素ポリペプチド）−（アミンドナータグ）、（アシルドナーグルタミン含有タグ）−（生体適合性ポリマー）、およびその結果得られる（毒素ポリペプチド）−（アミンドナータグ）−（アシルドナーグルタミン含有タグ）−（生体適合性ポリマー）の典型的な構造を以下に示す。
【０１６９】
【化３】
2014500866.tif 000009
【０１７０】
ＳｍＩＩＩＡは、配列番号８２に対応する。
【０１７１】
操作されたポリペプチドコンジュゲートを作製する方法
本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲートを作製する方法もまた、本発明において提供される。１つの態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、Ｆｃ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位のどこかにあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置するＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）アミンドナー物質を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法を用いて調製された操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約５１％〜６０％、６１％〜７０％、７１％〜８０％、８１％〜９０％、または９１％〜１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）、Ｑ、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４７）、ＬＬＱＧ（配列番号３）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５０）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＬＱＧ（配列番号５２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５５）、またはＬＬＱＧＲ（配列番号５６）を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、アミノ酸配列ＬＬＱＧＧ（配列番号２）を含む第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチドの重鎖のカルボキシル末端に位置し、アミノ酸配列ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５）を含む第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチドの軽鎖のカルボキシル末端に位置し、本明細書において記載される方法を用いて調製された操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのコンジュゲーション効率は、少なくとも約６５％である。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含み、アミノ酸配列ＬＬＱＧ（配列番号３）を含む第１のアシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチド（すなわち、ＩｇＧ１）内の野生型アミノ酸位置１９０〜１９２（Ｋａｂａｔナンバリングスキーム）を置き換え、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号４８）を含む第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端にある野生型アミノ酸Ｋを置き換え、本明細書において記載される方法を用いて調製された操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのコンジュゲーション効率は、少なくとも約８０％である。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドのカルボキシル末端内の最後のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、欠失、挿入、置換、または突然変異）を含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのコンジュゲーション効率は、同一の位置でのアミノ酸修飾を有さない同一の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートと比較してコンジュゲーション効率が増大している。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、少なくとも約５％から約９９％増大する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、約５％、１０％、１５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか増大する。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、Ａｒｇでの野生型アミノ酸の置き換えを含む置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、Ａｒｇ）の挿入である。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、アミノ酸の欠失である。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドのアミノ末端内の最初のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、欠失、挿入、置換、または突然変異）を含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのコンジュゲーション効率は、同一の位置でのアミノ酸修飾を有さない同一の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートと比較してコンジュゲーション効率が増大している。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、少なくとも約５％から約９９％増大する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、約５％、１０％、１５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか増大する。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、Ｇｌｎでの野生型アミノ酸の置き換えを含む置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、アミノ酸（例えば、Ｇｌｎ）の挿入である。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、アミノ酸の欠失である。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗体（例えば、１つまたは複数の重鎖ループおよび／または軽鎖ループ）上の別の（例えば、カルボキシル末端またはアミノ末端以外のアクセス可能な／反応性の部位）部位における１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、挿入、置換、または突然変異）を含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのコンジュゲーション効率は、同一の位置でのアミノ酸修飾を有さない同一の操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートと比較してコンジュゲーション効率が増大している。抗体上のアクセス可能な／反応性の部位の例を、表７、８、および９に列挙する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、少なくとも約５％から約９９％増大する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、約５％、１０％、１５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか増大する。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、接触されるアミンドナー物質と接触される操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子との間の濃度比率は、約２：１から約８００：１である。例えば、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーション反応のためにロードされるかまたは用いられる、アミンドナー物質（例えば、細胞傷害性薬剤）とアシルドナーグルタミン含有タグに付着した操作されたＦｃ含有ポリペプチドとの間の濃度比率は、約２０：１であり得る。いくつかの実施形態において、接触されるアミンドナー物質と接触される操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子との間の濃度比率は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、または８００：１のいずれかである。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチド（抗体）が特異的部位（例えば、Ｃ末端）にあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミン（アクセス可能な／曝露された／反応性の）を介してアミンドナー物質とコンジュゲートしている場合、抗体−薬剤コンジュゲートはさらに安定である（例えば、さらに長いインビボでの半減期）。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチド、または毒素ポリペプチドコンジュゲート）は、対象（例えば、哺乳動物）内において、インビボで少なくとも約１日後、少なくとも約５０％で存在する。例えば、操作されたポリペプチドコンジュゲートは、対象において、インビボで少なくとも約２時間後、２〜６時間後、６〜１２時間後、１２〜１８時間後、１８〜２４時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、または２週間後のいずれか、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のいずれかで存在する。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号２）またはＬＬＱＧＡ（配列番号４８）であり、アミンドナー物質は、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤである。
【０１８０】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦｃ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびタグを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグに付着した第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）タグに付着した第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子と還元環境において接触させるステップ、およびｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって反応させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）を含み、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子への操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％である。いくつかの実施形態において、操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子への操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％〜３５％、３５％〜４０％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５６％〜６０％、６１％〜６５％、６６％〜７０％、７１％〜７５％、７６％〜８０％、８１％〜８５％、８６％〜９０％、９１％〜９５％、または９６％〜９９％のいずれかである。いくつかの実施形態において、操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−タグ分子への操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、約３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のいずれかである。
【０１８２】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、反応性Ｇｌｎを含まず、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のＦｃ含有ポリペプチドを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドと還元環境において接触させるステップ、およびｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドにトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７）を含み、アミンドナータグは、アミノ酸配列ＧＳＧＧＫＧＧ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％である。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％〜３５％、３５％〜４０％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５６％〜６０％、６１％〜６５％、６６％〜７０％、７１％〜７５％、７６％〜８０％、８１％〜８５％、８６％〜９０％、９１％〜９５％、または９６％〜９９％のいずれかである。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、約３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のいずれかである。
【０１８３】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドにそれぞれ架橋した第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグを含むアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、第１および第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、互いに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）第１のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第２のＦｃ含有ポリペプチドを含む第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｃ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子およびアミンドナー物質と還元環境において接触させるステップ、ならびにｄ）第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子にトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、第１のアシルドナーグルタミン含有タグおよび第２のアシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓにそれぞれ空間的に隣接していない。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子への第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約５０％である。いくつかの実施形態において、第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子への第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％〜３５％、３５％〜４０％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５６％〜６０％、６１％〜６５％、６６％〜７０％、７１％〜７５％、７６％〜８０％、８１％〜８５％、８６％〜９０％、９１％〜９５％、または９６％〜９９％のいずれかである。いくつかの実施形態において、第２の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子への第１の操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、約３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のいずれかである。
【０１８５】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｆｃ含有ポリペプチドは、第１のＦｃ含有ポリペプチドおよび第２のＦｃ含有ポリペプチドを含み、Ｔは、第１のＦｃ含有ポリペプチドに架橋したアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ａはアミンドナー物質であり、アシルドナーグルタミン含有タグは、第２のＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に架橋しており、前記方法は、ａ）第１のアシルドナーグルタミン含有タグに位置する第１のＦｃ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）第２のＦｃ含有ポリペプチドを提供するステップ、ｃ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とを第２のＦｃ含有ポリペプチドおよびアミンドナー物質と還元環境において接触させるステップ、ならびにｄ）操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を第２のＦｃ含有ポリペプチドにトランスグルタミナーゼの存在下で部位特異的におよび共有結合によって連結させて、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、第１のＦｃ含有ポリペプチド内の反応性Ｌｙｓに隣接していない。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％である。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、少なくとも約３０％〜３５％、３５％〜４０％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５６％〜６０％、６１％〜６５％、６６％〜７０％、７１％〜７５％、７６％〜８０％、８１％〜８５％、８６％〜９０％、９１％〜９５％、または９６％〜９９％のいずれかである。いくつかの実施形態において、第２のＦｃ含有ポリペプチドへの操作された（Ｆｃ含有ポリペプチド）−Ｔ分子の架橋効率は、約３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のいずれかである。
【０１８６】
別の態様において、本発明は、式：（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、またはＦａｂ含有ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、Ｆａｂ含有ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位のどこかにあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグに位置するＦａｂ含有ポリペプチドを含む操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）生体適合性ポリマーを操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（Ｆａｂ含有ポリペプチド）−Ｔを生体適合性ポリマーに共有結合によって連結させて、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートを形成させるステップを含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法を用いて調製された操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約５１％〜６０％、６１％〜７０％、７１％〜８０％、８１％〜９０％、または９１％〜１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲートは、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ａを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであるか、または毒素ポリペプチドの操作によって反応性にされた内因性グルタミンを含み、Ａはアミンドナー物質であり、アミンドナー物質は、反応性アミンを含む生体適合性ポリマーであり、生体適合性ポリマーは、毒素ポリペプチド内のカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位のどこかにあるアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）アシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンに位置する毒素ポリペプチドを含む操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔ分子を提供するステップ、ｂ）生体適合性ポリマーを操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作された（毒素ポリペプチド）−Ｔを生体適合性ポリマーに共有結合によって連結させて、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【０１８９】
別の態様において、本発明は、式：（毒素ポリペプチド）−Ｔ−Ｂを含む操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを調製する方法を提供し、式中、Ｔは、特異的部位で操作されたアシルドナーグルタミン含有タグであり、Ｂは体適合性ポリマーであり、毒素ポリペプチドは、生体適合性ポリマー内のいずれかの部位にあるアシルドナーグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしており、前記方法は、ａ）生体適合性ポリマーに位置するアシルドナーグルタミン含有タグを含む操作されたＴ−Ｂ分子を提供するステップ、ｂ）毒素ポリペプチドを操作されたＴ−Ｂ分子とトランスグルタミナーゼの存在下で接触させるステップ、およびｃ）操作されたＴ−Ｂ分子を毒素ポリペプチドと共有結合によって反応させて、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートを形成するステップを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法を用いて調製された操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも約５１％〜６０％、６１％〜７０％、７１％〜８０％、８１％〜９０％、または９１％〜１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、操作された毒素ポリペプチドコンジュゲートは、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法はさらに、精製ステップを含む。本明細書において記載される操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または毒素ポリペプチドコンジュゲートは、様々な精製方法、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、透析、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（例えば、ＨＩＣでの分画）、硫酸アンモニウム沈殿、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール誘導体沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、および弱分割クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの精製ステップは、アフィニティークロマトグラフィー方法のステップを含む。タンパク質Ａリガンド（合成の、組換えの、または天然の）を、本明細書において記載される操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートをアフィニティー精製するために用いることができる。合成のまたは組換えのタンパク質Ａリガンドは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から商業的に購入することができ、天然タンパク質Ａリガンド（例えば、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）、ＰＲＯＳＥＰ（商標）Ｖａ、およびＰＲＯＳＥＰ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から商業的に購入することができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、精製ステップから生じる、精製された操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、精製された操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または精製された毒素ポリペプチドコンジュゲートは、非常に純度が高く、すなわち、少なくとも約７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９８％、または９９％のいずれかの純度である。例えば、精製された操作されたポリペプチドコンジュゲートは、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかの純度である。
【０１９４】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート）を薬学的に許容できる賦形剤または担体内に含む医薬組成物を提供する。操作されたポリペプチドコンジュゲートは、単独で、または本発明の１つもしくは複数の他の操作されたポリペプチドコンジュゲートと組み合わせて、または１つもしくは複数の他の薬剤と組み合わせて（またはその任意の組み合わせとして）投与することができる。本発明の医薬組成物、方法、および使用は、したがってまた、以下に詳述されるように、他の活性物質との組み合わせ（同時投与）の実施形態を包含する。
【０１９５】
本明細書において用いられる場合、用語「同時投与」、「同時投与された」、または「と組み合わせて」は、（ｉ）本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲートおよび治療物質（１つまたは複数）が、このような成分を治療を必要としている患者にほぼ同時に放出する単回投与形態に共に製剤されている場合の、前記成分の組み合わせの、前記患者への同時投与、（ｉｉ）本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲートおよび治療物質（１つまたは複数）が、治療を必要としている患者によってほぼ同時に接取される（その際、前記成分が前記患者にほぼ同時に放出される）個別の投与形態に、互いに分かれて製剤されている場合の、前記成分のこのような組み合わせの、前記患者へのほぼ同時の投与、（ｉｉｉ）本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲートおよび治療物質（１つまたは複数）が、各投与間の十分な時間間隔を伴って治療を必要としている患者によって連続的な時点で接取される（その際、前記成分が前記患者に実質的に異なる時点で放出される）個別の投与形態に、互いに分かれて製剤されている場合の、前記成分のこのような組み合わせの、前記患者への連続投与、ならびに（ｉｖ）本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲートおよび治療物質（１つまたは複数）が、制御された様式で前記成分を放出する（その際、これらの成分が、治療を必要としている患者に同時におよび／または異なる時点で同時放出、連続放出、および／またはオーバーラップ放出され、ここで、各部分は、同一のまたは異なる経路で投与され得る）単回投与量に、共に製剤されている場合の、前記成分のこのような組み合わせの、前記患者への連続投与を意味するものであり、これを指す。
【０１９６】
全体として、本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート）は、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせた製剤として投与されることに適している。用語「賦形剤」は、本発明の化合物（１つまたは複数）以外の任意の成分を記載するために本明細書において用いられる。賦形剤（１つまたは複数）の選択は、特定の投与態様、溶解度および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに投与形態の性質などの因子に大きく依存する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤のいくつかの例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせがある。いくつかの実施形態において、限定はしないが、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウムを含む等張剤が、医薬組成物内に含まれる。薬学的に許容できる物質のさらなる例としては、限定はしないが、抗体の保存期間または有効性を増強させる、湿潤剤または微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝液が挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート）は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において記載されているような既知の技術を用いて、対象への投与の際に免疫原性を低減させるために脱免疫化することができる。
【０１９８】
本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者に容易に明らかとなる。このような組成物およびその調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００５）において見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、大量に、１つの単一単位用量で、または複数の単一単位用量で、調製、包装、または販売することができる。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む、医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の投与量、またはこのような投与量の都合の良い画分、例えば、このような投与量の２分の１または３分の１に等しい。当技術分野において認められている、ペプチド、タンパク質、または抗体を投与するための任意の方法を、本明細書において開示される操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートに適切に採用することができる。
【０２００】
本発明の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。医薬組成物の非経口投与には、対象組織の物理的破壊および組織内の破壊を介する医薬組成物の投与によって特徴付けされる、したがって通常は、血流内、筋肉内、または内臓内への直接的な投与をもたらす、任意の投与経路が含まれる。例えば、非経口投与には、限定はしないが、組成物の注射、外科的切開を介する組成物の適用、組織を貫通する非外科的な創傷を介する組成物の適用などによる、医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与には、限定はしないが、皮下の、腹腔内の、筋肉内の、胸骨内の、静脈内の、動脈内の、髄腔内の、脳室内の、尿道内の、頭蓋内の、滑液嚢内の注射または注入、および腎臓透析注入技術が含まれると考えられる。いくつかの実施形態において、非経口投与は、静脈内経路または皮下経路である。
【０２０１】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水または無菌の等張生理食塩水などの薬学的に許容できる担体と組み合わされた活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、包装、または販売することができる。注射可能な製剤は、単位投与形態で、例えばアンプル、または防腐剤を含有する多回用量容器で、調製、包装、または販売することができる。非経口投与のための製剤には、限定はしないが、懸濁液、溶液、油性媒体または水性媒体内のエマルジョン、ペーストなどが含まれる。このような製剤はさらに、限定はしないが懸濁剤、安定剤、または分散剤を含む、１つまたは複数のさらなる成分を含み得る。非経口投与のための製剤の１つの実施形態において、活性成分は、適切な媒体（例えば、発熱性物質を有さない滅菌水）で再構成して、その後、再構成された組成物を非経口投与するために、乾燥（すなわち、粉末または粒状）形態で提供される。非経口製剤にはまた、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは３から９のｐＨまで）などの賦形剤を含有し得る水性溶液が含まれるが、一部の適用では、非経口製剤は、無菌の非水性溶液として、または発熱性物質を有さない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、さらに適切に製剤することができる。典型的な非経口投与形態には、無菌の水溶液、例えば水性プロピレングリコール溶液またはデキストロース溶液内の、溶液または懸濁液が含まれる。このような投与形態は、必要に応じて、適切に緩衝することができる。有用な他の非経口投与可能な製剤には、微晶質形態のまたはリポソーム調製物内の活性成分を含むものが含まれる。非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤することができる。調節放出製剤には、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、標的放出製剤、およびプログラム放出製剤が含まれる。例えば、１つの態様において、無菌の注射可能な溶液は、所要の量の操作されたＦｃ含有ポリペプチド、例えば抗体−薬剤コンジュゲートまたは二重特異的抗体を、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒内に組み込み、必要であればその後、濾過滅菌することによって、調製することができる。通常、分散は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙されたもののうち所要の他の成分を含有する無菌媒体内に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、先に滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分とをもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物内に含めることによってもたらされ得る。
【０２０２】
本発明の典型的な非限定的な医薬組成物は、約５．０から約６．５の範囲のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲート、約１ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモル濃度から約４００ミリモル濃度のトレハロース、および約０．０１ミリモル濃度から約１．０ミリモル濃度のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む、無菌水溶液としての製剤である。
【０２０３】
投与レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調節することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができるか、複数の分割用量を経時的に投与することができるか、または用量を、急迫的な治療的状況によって指示されるように比例的に低減もしくは増大させることができる。投与の容易性および投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤することが、特に有利である。投与単位形態は、本明細書において用いられる場合、治療される患者／対象のための単位投与量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、所要の薬学的担体と組み合わされた、所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、通常、（ａ）作用物質部分（例えば、細胞傷害物質などの低分子）の固有の特徴および達成されるべき特定の治療的効果または予防的効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合の当技術分野に特有の限定によって、およびこれらに直接的に応じて、決定される。
【０２０４】
したがって、当業者には、本明細書において提供される開示に基づいて、用量および投与レジメンが治療分野において周知の方法に従って調節されることが理解されよう。すなわち、最大耐用量を容易に確定することができ、検出可能な治療的利益を患者にもたらす有効量もまた、検出可能な治療的利益を患者にもたらすための各作用物質を投与するための時間的要件が可能であるように、確定することができる。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されるが、これらの例は、本発明の実施において患者に提供され得る用量および投与レジメンを限定するものでは全くない。
【０２０５】
投与量値が、軽減されるべき症状のタイプおよび重症度で変化し得、単回用量または複数回用量を含み得ることに留意されたい。さらに、任意の特定の対象について、具体的な投与レジメンが、個体の要求および組成物を投与するかまたは投与を監督する人の専門的な判断に従って経時的に調節されるべきであること、ならびに本明細書において説明される投与量範囲は典型的なものにすぎず、本発明の組成物の範囲または実施を限定することを意図したものではないことも理解されたい。さらに、本発明の組成物を用いる投与レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、症状の重症度、投与経路、および採用される特定の抗体を含む、様々な因子に基づき得る。したがって、投与レジメンは広く変化し得るが、標準的な方法を用いて通常通りに決定することができる。例えば、用量は、毒性効果などの臨床効果および／または実験値を含み得る薬物動態学的または薬力学的なパラメータに基づいて調節することができる。したがって、本発明は、当業者によって決定される、患者内での用量増加を包含する。適切な投与量およびレジメンの決定は、関連する分野において周知であり、本明細書において開示される教示を提供された当業者には、包含されることが理解されよう。
【０２０６】
ヒト対象への投与では、本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート）の毎月用量の全量は、典型的には、当然のことながら投与態様に応じて、患者当たり約０．０１ｍｇから約１２００ｍｇの範囲である。例えば、静脈内の毎月用量は、患者当たり約１から約１０００ｍｇを要し得る。毎月用量の全量は、単回用量または分割用量で投与することができ、医師の指示で、本明細書によって示される典型的な範囲から外れてもよい。
【０２０７】
本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲート、例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、Ｆａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または毒素ポリペプチドコンジュゲートの治療上または予防上有効な量の典型的な非限定的な範囲は、１月で患者当たり約０．０１から約１０００ｍｇである。一部の実施形態において、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、１月で患者当たり約１から約２００または約１から約１５０ｍｇで投与することができる。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。
【０２０８】
キット
本発明はまた、上記の障害の治療において用いるためのキット（または製品）を提供する。本発明のキットは、精製された操作されたポリペプチドコンジュゲート（例えば、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、操作されたＦａｂ含有ポリペプチドコンジュゲート、または操作された毒素ポリペプチドコンジュゲート）および疾患の治療にコンジュゲートを用いるための指示を含む、１つまたは複数の容器を含む。例えば、指示は、癌（例えば、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、または肺癌）などの疾患を治療するための操作されたポリペプチドコンジュゲートの投与についての記載を含む。キットはさらに、個体が疾患および疾患の段階を有しているかの同定に基づく、治療に適切な個体の選択についての記載を含み得る。
【０２０９】
操作されたポリペプチドコンジュゲートの使用に関する指示は、通常、目的の治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（例えば、多用量包装）、または小単位用量であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは包装挿入物（例えば、キット内に含まれる紙片）上に書き込まれた指示であるが、機械で読み取り可能な指示（例えば、磁気ディスクまたは光学式記憶ディスク上に記録された指示）もまた許容できる。
【０２１０】
本発明のキットは、適切な包装内にある。適切な包装には、限定はしないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチック袋）などが含まれる。特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）、またはミニポンプなどの注入装置と組み合わせて用いるための包装もまた検討される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物内の少なくとも１つの活性物質は、本明細書において記載される操作されたポリペプチドである。容器はさらに、第２の薬学的に活性な作用物質を含み得る。
【０２１１】
キットは、緩衝液および説明情報などのさらなる成分を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器と組み合わされたラベルまたは包装挿入物（１つまたは複数）とを含む。
【実施例】
【０２１２】
本明細書において記載される実施例および実施形態は例示的なものにすぎず、これらに照らした様々な修正または変更は当業者に示唆され、本願の趣旨および範囲に含まれる。
【０２１３】
（実施例１）
トランスグルタミナーゼを用いる部位特異的な抗体−薬剤コンジュゲーション
所望のペイロード（薬剤または作用物質部分）への抗体のコンジュゲーションを、重鎖および／または軽鎖のカルボキシル末端でグルタミンタグ（Ｑタグ）を有する抗体と、選択したペイロード（イメージング剤または細胞毒）のアミン含有誘導体との間の、微生物トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミド転移反応を介して行った。
【０２１４】
抗体−薬剤コンジュゲーション
このアミド転移反応において、抗体上のグルタミンはアシルドナーとして作用し、アミン含有化合物はアシルアクセプター（アミンドナー）として作用した。１．６７〜４．０４μＭの濃度の精製抗体を、ｐＨ範囲６．２〜８．８の、１５０〜９００ｍＭのＮａＣｌ、および２５ｍＭのＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸］またはＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液内で、０．２２５〜０．５４５％（ｗ／ｖ）のストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下で、１６７〜４０４μＭの範囲の２０〜１００Ｍ過剰なアシルアクセプターとインキュベートした。反応条件を、個別のアシルアクセプター誘導体のために調整し、最適な効率および特異性は、典型的には、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．８で、２．８７μＭの抗体、２８７μＭの誘導体、および０．３７８％（ｗ／ｖ）のトランスグルタミナーゼで観察された。室温で２．５時間のインキュベーションの後、抗体を、当業者に知られている標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの市販のアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ）で精製した。コンジュゲーション効率を、そのそれぞれの波長でのフルオロフォアおよび抗体による相対的ＵＶ−ｖｉｓ吸光度を用いて抗体−フルオロフォアコンジュゲートについて決定し、疎水性相互作用クロマトグラフィー分析を用いて抗体−薬剤コンジュゲートについて決定した。
【０２１５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
異なる薬剤：抗体化学量論でのコンジュゲーション生成物の相対的な分布を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて決定した。抗体当たり０、１つ、または２つの薬剤を有する抗体−薬剤コンジュゲートは、細胞毒部分の疎水性が高いことに起因するＨＩＣカラム上でのそれらの差次的な保持に基づいて、容易に分解した。コンジュゲーション生成物を、緩衝液Ａ（１．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７）内でＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム、２．５μｍの粒子サイズ、４．６ｍｍ×１０ｃｍ（トーソーバイオサイエンス、日本）上に注射し、０から１００％の線形勾配の緩衝液Ｂ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７）で０．８ｍＬ／分で８５分間にわたり溶出した。Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズクロマトグラフィーシステムおよびＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、コンジュゲートを分離、定量、および分画した。
【０２１６】
抗体−フルオロフォアのコンジュゲーション効率
重鎖のカルボキシル末端でＱ含有タグを有するｍＡｂ１−ＨＣＱ０１（ＩｇＧ１サブタイプ）（ＨＣＱ０１はＬＬＱＧＧ（配列番号２）である）と様々なアミン含有フルオロフォア誘導体との間の、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を試験した。図１。ｍＡｂ１−ＨＣＱ０１とフルオロフォア誘導体Ａｌｅｘａ４８８カダベリンとの間のコンジュゲーションは、７９％の最も高いコンジュゲーション効率を有していた。トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を、２つの異なるコンジュゲーション条件（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびｐＨ８．０；または１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびｐＨ８．８）で、重鎖のカルボキシル末端もしくはアミノ末端（それぞれ、ＨＣＱ０１（ＬＬＱＧＧ（配列番号２）））およびＨＮＱ０１（ＱＶＱＬＫＥ（配列番号３９））または軽鎖のカルボキシル末端もしくはアミノ末端（それぞれ、ＬＣＱ０１（ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号５））およびＬＮＱ０１（ＧＬＬＱＧ（配列番号６））でＱ含有タグを有する２つのフルオロフォアカダベリン（Ａｌｅｘａ４８８カダベリンおよびＳＲ１０１カダベリン）を用いてさらに試験した。フルオロフォアカダベリンおよびｍＡｂ１のコンジュゲーションは、重鎖カルボキシル末端および軽鎖カルボキシル末端でＱタグを有するｍＡｂ１において観察された。図２Ａおよび２Ｂ。重鎖または軽鎖の末端で組み込まれた様々なＱタグを有するＩｇＧ１  ｍＡｂ１、およびいかなるタグも有さない野生型ｍＡｂ１への、Ａｌｅｘａ４８８カダベリンの、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率もまた試験した。図３。図２Ａおよび２Ｂと同様に、ＩｇＧ１  ｍＡｂ１へのＡｌｅｘａ４８８カダベリンのコンジュゲーションは、重鎖および軽鎖のカルボキシル末端において観察された。最後に、重鎖のカルボキシル末端でＨＣＱ０１タグを有するＩｇＧ１  ｍＡｂ１−ＨＣＱ０１、軽鎖のカルボキシル末端でＬＣＱ０１タグを有するｍＡｂ１−ＬＣＱ０１、ならびにＨＣＱ０１タグおよびＬＣＱ０１タグの両方を有する二重突然変異体への、Ａｌｅｘａ４８８カダベリンの、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を試験した。この実施例において、最も高いコンジュゲーション効率は、ＩｇＧ１  ｍＡｂ−ＨＣＱ０１−Ａｌｅｘａ４８８カダベリンで観察された。図４。
【０２１７】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる抗体−薬剤のコンジュゲーション効率の分析
重鎖のカルボキシル末端でＨＣＱ０１タグを有するＩｇＧ１  ｍＡｂ１−ＨＣＱ０１で得られた疎水性相互作用クロマトグラムを、コンジュゲーションの前（Ａ）、アミノカプロイル−ＭＭＡＥへのコンジュゲーションの後（Ｂ）、アミノ−ＰＥＧ２−プロピオニル−ＭＭＡＥへのコンジュゲーションの後（Ｃ）、アミノ−ＰＥＧ３−プロピオニル−ＭＭＡＥへのコンジュゲーションの後（Ｄ）、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤへのコンジュゲーションの後（Ｅ）、アミノカプロイル−ＭＭＡＤへのコンジュゲーションの後（Ｆ）、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭＭＡＤへのコンジュゲーションの後（Ｇ）、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤへのコンジュゲーションの後（Ｈ）、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦへのコンジュゲーションの後（Ｉ）、アミノカプロイル−ＭＭＡＦへのコンジュゲーションの後（Ｊ）、プトレシニル−ゲルダナマイシンへのコンジュゲーションの後（Ｋ）、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンへのコンジュゲーションの後（Ｌ）の薬剤について決定した。コンジュゲーションは、（Ｂ）〜（Ｌ）で観察された。重鎖のアミノ末端でＨＮＱ０１タグを有するｍＡｂ１−ＨＮＱ０１で得られた疎水性相互作用クロマトグラムはまた、コンジュゲーションの前（Ａ）、ＡｃＬｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンへのコンジュゲーションの後（Ｂ）、ＡｃＬｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンにコンジュゲートしていない、軽鎖のカルボキシル末端でＬＣＱ０１タグを有するｍＡｂ１−ＬＣＱ０１（Ｃ）、およびＡｃＬｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンにコンジュゲートした、軽鎖のカルボキシル末端でＬＣＱ０１タグを有するｍＡｂ１−ＬＣＱ０１（Ｄ）、ならびにＡｃＬｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンへのコンジュゲーションの前の、軽鎖のＮ末端でＬＮＱ０１（配列番号９）タグを有するｍＡｂ１−ＬＮＱ０１（Ｅ）、およびＡｃＬｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンへのコンジュゲーションの後の、軽鎖のＮ末端でＬＮＱ０１（配列番号９）タグを有するｍＡｂ１−ＬＮＱ０１（Ｆ）の薬剤についても試験した。さらに、いかなるＱタグも有さない野生型ＩｇＧ１  ｍＡｂ１で得られた疎水性相互作用クロマトグラムを用いる対照実験もまた、コンジュゲーションの前（Ａ）、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲーションの後（Ｂ）、アミノカプロイル−ＭＭＡＦとのコンジュゲーションの後（Ｃ）、プトレシニル−ゲルダナマイシンとのコンジュゲーションの後（Ｄ）、およびＡｃＬｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンとのコンジュゲーションの後（Ｅ）の薬剤について行った。対照実験において、抗体にコンジュゲートする薬剤は観察されなかった。
【０２１８】
抗体−薬剤のコンジュゲーション効率および安定性
異なる化学量論を有する抗体−薬剤コンジュゲートの相対的分布を、疎水性相互作用クロマトグラムを積分することによって得た。ロード量は、薬剤／抗体比率に等しい。
【０２１９】
【表２】
2014500866.tif 000010
【０２２０】
ｍＡｂ１−ＨＣＱ０１へのＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンの、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションをまた、抗体濃度比率当たりの初期薬剤を変化させてモニタリングした。異なる化学量論を有するコンジュゲーション生成物を、ＨＩＣを用いて分析した。
【０２２１】
【表３】
2014500866.tif 000011
【０２２２】
いくつかの抗体−薬剤コンジュゲートの安定性を、４℃で４週間、３７℃で１６時間、および３７℃で１週間のインキュベーションの後にＨＩＣを用いて試験した。
【０２２３】
【表４】
2014500866.tif 000012
【０２２４】
【表５】
2014500866.tif 000013
【０２２５】
部位特異的なコンジュゲーションの質量分析による確認
ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、およびＩｇＧ４アイソタイプのＱタグＱ０１（ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７））を有する抗体を、トランスグルタミナーゼおよびカダベリンＡｌｅｘａ−４８８とコンジュゲートさせた。対照として、導入されたタグ内にグルタミンを有さない抗体および関連のない野生型ＩｇＧ２抗体をまた、他の３つの抗体で行ったものと同一の条件下でコンジュゲートさせた。全ての抗体をペプチドに消化し、逆相クロマトグラフィーによって分離し、その後、質量分析した。消化されたペプチドを、４９０ｎｍでの吸光度（Ａｌｅｘａ４８８染料の最大吸光度）によってモニタリングした。２つの二重ピークをＱタグ含有試料において同定したが、対照抗体において標識は同定されず、このことは、所与の条件下での部位特異的なコンジュゲーションを強く示す。ＩｇＧ１、２、４のＱ０１試料からの２つの二重ピークを質量分析によってさらに分析して、付着の部位を確認した。Ａｌｅｘａ４８８がコンジュゲートした全てのペプチドを、導入されたＱ０１タグとして同定した。（Ａｌｅｘａ４８８を用いて観察された２つのピークは、実験において用いられたＡｌｅｘａ４８８が、５位または６位でカダベリンリンカーが付着した２つの種の混合物であることに起因するものであった。タグペプチドの二重ピークの特徴は、発現の間に起こるＣ末端での少量のタンパク質分解の結果である。）図８Ａおよび８Ｂ。
【０２２６】
（実施例２）
異なるＫタグおよびＱタグを用いる、二重特異的抗体の、トランスグルタミナーゼによって触媒される架橋。
材料および方法
ＩｇＧヘテロ二量体（すなわち、二重特異的抗体）を、１〜２ｍＭのＧＳＨ（グルタチオン）を有するＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）内で、３７℃で２４時間、２つの抗体（野生型ＩｇＧ４またはＩｇＧ１およびＩｇＧ２の二重特異的突然変異体）をインキュベートすることによって調製した。ヘテロ二量体を、形成された二重特異的抗体と微生物トランスグルタミナーゼとのインキュベーションによって架橋した。アミド転移反応において、抗体上の導入されたグルタミンはアシルドナーとして作用し、抗体上のリジン、リジン含有タグ、またはジアミン化合物は、アシルアクセプターとして作用する。典型的には、１．６７〜４．０４μＭの精製抗体を、ｐＨ範囲６．２〜８．８の、１５０〜９００ｍＭのＮａＣｌ、および２５ｍＭのＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリン］エタミンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液内で、０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）のストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ、味の素、日本）とインキュベートする。ジアミン化合物による２つのグルタミンタグの架橋のケースでは、１６７〜４０４μＭの間の範囲の２０モル濃度過剰なアシルアクセプターを用いた。室温でおよそ２時間のインキュベーションの後、抗体を、当業者によって知られている標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ）上で精製する。架橋効率を、還元性ＳＤＳゲル上で抗体をランさせ、重鎖−重鎖架橋のバンドに対して重鎖バンドの強度を比較することによって決定する。
【０２２７】
二重特異的抗体ＩｇＧ４およびＩｇＧ２の、トランスグルタミナーゼによって触媒される架橋
グルタミン（Ｑ００タグ：ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号７））が導入されたＣ末端（カルボキシル末端）タグを有する対照抗体を、増大量のトランスグルタミナーゼとインキュベートし、次に、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した。単量体重鎖および架橋した重鎖−重鎖に対応するバンドを定量し、これは、ＩｇＧ４抗体のおよそ６０％が架橋することを示した。二重特異的なＷＴ（野生型）ＩｇＧ４および突然変異ＩｇＧ２抗体（２分の１はＱタグを有し、残りの半分はＫタグを有する）を、方法の節において記載されているように調製し、トランスグルタミナーゼによって架橋し、上記の対照抗体として分析した。データは、ＷＴ−ＩｇＧ４では抗体のおよそ３０％が架橋したが、突然変異ＩｇＧ２は６７％を示したことを示す。図５。
【０２２８】
二重特異的抗体での異なるＫタグおよびＱタグの最小化および架橋効率
Ｑ０１タグを有する突然変異ＩｇＧ２抗体を、Ｋ０２−Ｋ０８タグを有する突然変異ＩｇＧ２抗体とインキュベートし、二重特異的抗体を上記のように形成させた。架橋の程度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて測定した。Ｋ０８タグを有する突然変異ＩｇＧ２抗体を、Ｑ０１−Ｑ０８タグを有する突然変異ＩｇＧ２抗体とインキュベートし、二重特異的抗体を上記のように形成させた。架橋の程度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて測定した。図６。
【０２２９】
Ｑ０３タグ、Ｑ０６タグ、およびＱ０７タグを有する突然変異ＩｇＧ２抗体を、Ｋ０２タグ、Ｋ０３タグ、およびＫ０６タグを有する突然変異ＩｇＧ２抗体とインキュベートし、二重特異的抗体を上記のように形成した。架橋の程度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥから測定した。図７。
【０２３０】
（実施例３）
インビトロでの細胞傷害アッセイ
インビトロでの細胞傷害アッセイを、様々な抗体、ペイロード（すなわち、作用物質部分）、およびアミンドナー単位を用いて行った。ｍＡｂ２（キメラＩｇＧ１抗体）では、標的を発現する細胞（Ａ４３１、ＯＶＣＡＲ３、ＢｘＰＣ３、およびＨＴ−２９）または発現しない細胞（ＳＷ６２０）を、処理の前に２４時間、壁が白く底が澄明なプレートに２０００個細胞／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートまたは遊離化合物（すなわち、薬剤に抗体がコンジュゲートしていない）で処理し、これを３組行った。細胞の生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって処理の９６時間後に決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって計算した。表６は、様々な抗体−薬剤コンジュゲートおよびコンジュゲートしていない薬剤を用いる、異なる細胞におけるコンジュゲーション比率および抗体のＩＣ５０を示す。
【０２３１】
【表６−１】
2014500866.tif 000014
【０２３２】
【表６−２】
2014500866.tif 000015
【０２３３】
【表６−３】
2014500866.tif 000016
【０２３４】
ｍＡｂ３（ヒト化ＩｇＧ１抗体）では、標的を発現する細胞（ＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１−ＤＹＴ２、Ｎ８７）または発現しない細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を、処理の前に２４時間、９６ウェル細胞培養物プレート内に播種した。細胞を、３倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートまたは遊離化合物（すなわち、薬剤に抗体がコンジュゲートしていない）で処理し、これを１０種の濃度で２組行った。細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＭＴＳ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって処理の９６時間後に決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照のパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０値を、４パラメータロジスティックモデル＃２０３とＸＬｆｉｔ  ｖ４．２（ＩＤＢＳ、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ、Ｓｕｒｒｙ、ＵＫ）とを用いて計算した。表７は、様々なコンジュゲート位置での様々な抗体−薬剤コンジュゲートを用いる、異なる細胞におけるコンジュゲーション比率および抗体のＩＣ５０を示す。
【０２３５】
【表７】
2014500866.tif 000017
【０２３６】
（実施例４）
インビボでのＭＤＡ−３６１  ＤＹＴ２腫瘍異種移植モデル
抗体−薬剤コンジュゲートのインビボでの有効性研究を、ＭＤＡ−３６１  ＤＹＴ２細胞系を用いて、標的を発現する異種移植モデルを用いて行った。ＤＹＴ２の有効性研究では、５０％マトリゲル内の１０００万個の腫瘍細胞を、腫瘍サイズが２５０〜３５０ｍｍ３に達するまで、６〜８週齢の放射線照射したヌードマウスに皮下移植した。平均腫瘍容積がおよそ４００ｍｍ３に達したら処理を開始した。投与は、ボーラス尾静脈注射を介して行った。処理に対する腫瘍の応答に応じて、動物に１〜１０ｍｇ／ｋｇの抗体薬剤コンジュゲート（ｍＡｂ３）を注射し、４日ごとに４回処理した。抗体薬剤コンジュゲートには、ｍＡｂ３−ＴＧ１−アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、ｍＡｂ３−Ｈ１０−ＴＧ６−アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、ｍＡｂ３−Ｎ２９７Ａ−アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、およびｍＡｂ３−Ｎ２９７Ｑ−アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤが含まれる。ＴＧ１（またはＨＣＱ０１）、Ｈ１０、およびＴＧ６は、配列番号２、３、および４８の配列をそれぞれ有するＱタグである。Ｑタグ（すなわち、ＴＧ１、Ｈ１０、およびＴＧ６）で置き換えられたｍＡｂ上の具体的なアミノ酸位置を表９に示す。Ｎ２９７Ａは、２９７位での非グリコシル化および２９５位でのアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンを生じさせる、２９７位でのＮからＡへのアミノ酸置換を示す。Ｎ２９７Ｑは、２９７位での非グリコシル化ならびに２９５位および２９７位でのアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンを生じさせる、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を示す。全ての実験動物は、週に１回、体重の変化をモニタリングした。腫瘍容積を、最初の５０日間は週に２回、およびその後は週に１回、キャリパー装置によって測定し、式：腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２で計算した。動物の腫瘍容積が２５００ｍｍ３に達する前に、動物を安楽死させた。抗体薬剤コンジュゲートで処理した全ての動物において、全てのコンジュゲートで、投与後１週間以内に腫瘍の退行が観察され、少なくとも５週間継続した。図９を参照されたい。逆に、腫瘍容積は、媒体のみを投与された動物において増大した。図９を参照されたい。これらの結果は、本明細書において記載される方法によって調製された抗体薬剤コンジュゲートがマウス異種移植モデルにおける腫瘍サイズの低減において効果的であることを示す。
【０２３７】
（実施例５）
インビボでのＮ８７腫瘍異種移植モデル
抗体−薬剤コンジュゲートのインビボでの有効性研究を、Ｎ８７細胞系を用いて、標的を発現する異種移植モデルを用いて行った。有効性研究では、５０％マトリゲル内の７５００万個の腫瘍細胞を、腫瘍サイズが２５０と３５０ｍｍ３との間に達するまで、６〜８週齢のヌードマウスに皮下移植した。平均腫瘍容積がおよそ４００ｍｍ３に達したら処理を開始した。投与は、ボーラス尾静脈注射を介して行った。処理に対する腫瘍の応答に応じて、動物に１〜１０ｍｇ／ｋｇ（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ、群当たりｎ＝８）の抗体薬剤コンジュゲート（ｍＡｂ３）を注射し、４日ごとに４回処理した。抗体薬剤コンジュゲートには、ｍＡｂ３−ＴＧ１−アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、ｍＡｂ３−ＴＧ１−アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、およびｍＡｂ３−Ｎ２９７Ｑ−アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤが含まれる。ＱタグＴＧ１（またはＨＣＱ０１）は、配列番号１に対応する。ＱタグＴＧ１で置き換えられたｍＡｂ上の具体的なアミノ酸位置を表９に示す。Ｎ２９７Ｑは、２９７位での非グリコシル化ならびに２９５位および２９７位でのアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンを生じさせる、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を示す。全ての実験動物は、週に１回、体重の変化をモニタリングした。腫瘍容積を、最初の５０日間は週に２回、およびその後は週に１回、キャリパー装置によって測定し、式：腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２で計算した。動物の腫瘍容積が２５００ｍｍ３に達する前に、動物を安楽死させた。１０ｍｇ／ｋｇでの全てのコンジュゲートで、および３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ３−ＴＧ１−アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ群で、１週間後に腫瘍の退行が観察された。腫瘍の阻害は、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ用量での残りのコンジュゲートで観察された。図１０。これらの結果はまた、本明細書において記載される方法によって調製された抗体薬剤コンジュゲートがマウス異種移植モデルにおける腫瘍サイズの低減において効果的であることを示す。
【０２３８】
（実施例６）
インビボでのＢｘＰＣ３腫瘍異種移植モデル
抗体−薬剤コンジュゲートのインビボでの有効性研究を、標的を発現するＢｘＰＣ３異種移植片を用いて行った。腫瘍細胞を、腫瘍サイズが少なくとも２００ｍｍ３に達するまで、５〜８週齢のＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスに皮下移植した。平均腫瘍容積が２００〜４００ｍｍ３に達したら処理を開始した。投与は、ボーラス尾静脈注射を介して行った。処理に対する腫瘍の応答に応じて、動物に１〜１０ｍｇ／ｋｇの抗体薬剤コンジュゲート（ｍＡｂ２）を注射し、１回の単回用量で処理した。抗体薬剤コンジュゲートには、ｍＡｂ２−ＴＧ１−アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤおよびｍＡｂ２−Ｎ２９７Ｑ−アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤが含まれる。ＱタグＴＧ１（またはＨＣＱ０１）は、配列番号１に対応する。ＱタグＴＧ１で置き換えられたｍＡｂ上の具体的なアミノ酸位置を表９に示す。Ｎ２９７Ｑは、２９７位での非グリコシル化ならびに２９５位および２９７位でのアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンを生じさせる、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を示す。全ての実験動物は、週に１回、体重の変化をモニタリングした。腫瘍容積を、週に１回、キャリパー装置によって測定し、式：腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２で計算した。動物の腫瘍容積が２０００ｍｍ３に達する前に、動物を安楽死させた。腫瘍が退行したら、動物を、処理が中断した後の腫瘍の再成長について連続的にモニタリングした。腫瘍の退行は、投与の１週間後に観察され、ｍＡｂ２−Ｎ２９７Ｑ−ＰＥＧ６ＭＭＡＤ（左パネル、図１１）では３週間、ｍＡｂ２−ＴＧ１−ｖｃＭＭＡＤ（右パネル、図１１）では６週間超継続した。ＴＧ１（またはＨＣＱ０１）は、配列番号２に対応する。これらの結果はまた、本明細書において記載される方法によって調製された抗体薬剤コンジュゲートがマウス異種移植モデルにおける腫瘍サイズの低減において効果的であることを示す。
【０２３９】
（実施例７）
コンジュゲーション部位のスキャン
ＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ２またはｍＡｂ４）上の様々な部位での、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率を調べた。抗体の曝露されたループ（例えば、１〜５アミノ酸長）の部分を様々な長さのＱタグで置き換えるか、またはＱタグをこれらのループ内に挿入した。ｍＡｂ２突然変異体およびｍＡｂ４突然変異体を、トランスグルタミナーゼを用いて様々なリンカー−ペイロード（アミンドナー物質）にコンジュゲートし、コンジュゲーション収量を、実施例１において記載されているように決定した。試験したアミノ酸位置、Ｑタグの配列、およびコンジュゲーション収量のリストを、表８および９に示す。
【０２４０】
【表８】
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【０２４１】
【表９−１】
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【０２４２】
【表９−２】
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【０２４３】
【表９−３】
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【０２４４】
（実施例８）
インビボでの抗体コンジュゲートの安定性の決定
Ｃ末端（アミノ酸位置４４７）でＱタグ（配列番号２）で操作された抗体（ｍＡｂ２）を、アミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥまたはアミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤにコンジュゲートし、１０ｍｇ／ｋｇでＳＣＩＤマウスに注射した。マウスをその後、３日後に屠殺した。抗体コンジュゲートを、タンパク質Ａを用いてマウス血漿から精製し、ＨＩＣカラムでランして、実施例１において記載されたように残っているコンジュゲートの量を定量した。Ａｂ−ＴＧ１でＣ末端でコンジュゲートされたアミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥは、３日後にインビボでほぼ完全に切断されていることが分かった。Ａｂ−ＴＧ１でＣ末端でコンジュゲートされたアミノカプロイル−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤは、無傷のコンジュゲートのおよそ６０％が３日後にインビボで残っていることが分かった。図１２を参照されたい。
【０２４５】
（実施例９）
トランスグルタミナーゼを用いる、部位特異的なＦａｂコンジュゲーション
生体適合性ポリマーへのＦａｂのコンジュゲーションを、重鎖および／または軽鎖上にグルタミンタグ（Ｑタグ）を有するＦａｂ断片とアミン含有生体適合性ポリマーとの間の、微生物トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミド転移反応を介して行う。このアミド転移反応において、Ｆａｂ断片上のグルタミンはアシルドナーとして作用し、アミン含有ポリマーはアシルアクセプター（アミンドナー）として作用する。精製Ｆａｂを、ストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下で、過剰なアシルアクセプターとインキュベートする。反応条件を、個別のアシルアクセプター誘導体のために調整する。室温または３７℃でのインキュベーションの後、Ｆａｂコンジュゲートを、実施例１において記載されているように、当業者に知られている標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて精製する。コンジュゲーション効率を、質量分析、疎水性クロマトグラフィー、または分光光度法（相対的吸光度）、またはイオン交換クロマトグラフィーによって決定する。Ｆａｂ断片と生体適合性ポリマーとの間の、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率は、５０％よりも高く、均質な部位特異的なコンジュゲーションをもたらす。
【０２４６】
（実施例１０）
トランスグルタミナーゼを用いる、部位特異的な毒素ポリペプチドコンジュゲーション
生体適合性ポリマーへの毒素ポリペプチドのコンジュゲーションを、グルタミンタグ（Ｑタグ）を有する毒素ポリペプチドとアミン含有ポリマーとの間、または第一級アミンを有する毒素ポリペプチドとグルタミンタグを有する生体適合性ポリマーとの間の、微生物トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミド転移反応を介して行う。毒素ポリペプチドは、阻害的なシステインノット（セラトトキシンなど）、コノトキシン（ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａなど）、または任意の他の小さな毒素タンパク質足場であり得る。このアミド転移反応において、グルタミンはアシルドナーとして作用し、アミンはアシルアクセプターとして作用する。精製毒素ポリペプチドを、ストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下で、アシルアクセプターとインキュベートする。反応条件を、個別のアシルアクセプター誘導体のために調整する。室温でのインキュベーションの後、毒素ポリペプチドコンジュゲートを、当業者に知られている標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて精製する。コンジュゲーション効率を、質量分析、疎水性クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーによって決定する。毒素ポリペプチドと生体適合性ポリマーとの間の、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率は、５０％よりも高く、均質な部位特異的なコンジュゲーションをもたらす。
【０２４７】
（実施例１１）
トランスグルタミナーゼを用いる、抗体ループへの部位特異的な薬剤コンジュゲーション
抗体へのそのループ上での異なる薬剤（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＦ、またはゲルダナマイシン）のコンジュゲーションを、重鎖および／または軽鎖上のループ内にグルタミンタグ（Ｑタグ）を有する抗体とアミンドナー単位を含有する薬剤（例えば、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、ＡｃＬｙｓ−プトレシン、ＡｃＬｙｓ−β−Ａｌａ、またはＡｃＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ）との間の、微生物トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミド転移反応を介して行う。このアミド転移反応において、抗体ループにおけるグルタミンはアシルドナーとして作用し、薬剤に連結したアミンドナー単位はアシルアクセプター（アミンドナー）として作用する。精製抗体を、ストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下で、過剰なアシルアクセプターとインキュベートする。反応条件を、個別のアシルアクセプター誘導体のために調整する。室温でのインキュベーションの後、抗体−薬剤コンジュゲートを、実施例１において記載されているように、当業者に知られている標準的なアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて精製する。コンジュゲーション効率を、質量分析、疎水性クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーによって決定する。抗体と薬剤との間の、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーションの効率は、５０％よりも高く、抗体ループの部位での均質な部位特異的なコンジュゲーションをもたらす。
【０２４８】
開示された教示は様々な適用、方法、および組成物に関して記載されているが、本明細書における教示および以下の特許請求の範囲に記載の発明から逸脱することなく、様々な変化および変更を行うことができることが理解されよう。前述の実施例は、開示される教示をより良く説明するために提供されており、本明細書において提示される教示の範囲を限定することを意図したものではない。本教示はこれらの典型的な実施形態に関して記載されているが、当業者には、これらの典型的な実施形態の多くの変型および変更が、不必要な実験を伴わずに可能であることが容易に理解されよう。全てのこのような変型および変更は、本教示の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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