(57)【要約】  本発明は、特にヒトおよび動物のヘリコバクターピロリ感染の治療および予防のための医薬組成物および／または食品組成物用の噴霧乾燥ラクトバチルス株および／またはラクトバチルス細胞（乳酸菌）並びにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、ヒトまたは動物におけるヘリコバクターピロリ感染症の治療および予防用の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を含んでなる、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を含み、本質的に単量体および／または二量体の形態で存在することを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物において、ａ）ラクトバチルス細胞は噴霧乾燥され、ｂ）取得された噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は生理適合性の担体に導入されることを特徴とする、組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物において、胃媒体に投与した後、インサイチューでヘリコバクターピロリとの間に共凝集体を形成することを特徴とする、組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物において、前記共凝集体は５０μｍ以上であり、特に５００μｍ超であることを特徴とする、組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物において、前記ラクトバチルス細胞は、乳酸桿菌、ラクトバチルスヘルヴェティクス、イエンセン乳酸桿菌、好酸性乳酸桿菌、ブルガリア乳酸桿菌、ラクトバチルスアミロボラス、デルブリュック乳酸桿菌、ラクトバチルスカゼイ、ラクトバチルスクリスパタス、ガセリ菌、ラクトバチルスジョンソニー、ラクトバチルスパラカゼイ、プロテクト乳酸菌、ラクトバチルスラムノサス、ラクトバチルスカルバタスおよびラクトバチラスプランタルム、ラクトバチラスブレビス、ブーフナー乳酸桿菌、ラクトバチルスフルクティヴォランス、ラクトバチルスヒルガルディー、発酵乳酸桿菌、ラクトバチルスロイテリ、ラクトバチルスヴィリデセンス、ＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５０、ＤＳＭ１７６５１、ＤＳＭ１７６５２、ＤＳＭ１７６５３からなる群から選択され、特に発酵乳酸桿菌、ラクトバチラスブレビス、ラクトバチルスロイテリ、ブーフナー乳酸桿菌およびプロテクト乳酸菌であることを特徴とする、組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物において、医薬組成物または食品組成物は、特に食品または食糧および／またはペットおよび／または家畜用の飼料および／または食品補助剤の形態で存在し、任意に補助剤および添加剤を含んでなることを特徴とする、組成物。
【請求項８】
任意に抗生物質などの更に適切な活性成分と組み合わせた、ヘリコバクターピロリの除菌療法用の、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ヒトまたは動物においてヘリコバクターピロリ感染症に使用するための、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞または請求項１に記載の組成物を含んでなる、医薬製品。
【請求項１０】
ヒトまたは動物においてヘリコバクターピロリ感染症に使用するための、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞または請求項１に記載の組成物を含んでなる、食品補助剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物を生産するための方法であって、前記噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を生理適合性の担体と混合する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組成物を生産するための方法であって、前記ラクトバチルス細胞はまず（ｉ）任意に播種し濃縮され、（ｉｉ）発酵され、そして（ｉｉｉ）噴霧乾燥される、方法。
【請求項１３】
医薬組成物および／または食品組成物を生産するための噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の使用であって、特にヘリコバクターピロリ感染症により引き起こされる疾患、特に消化系疾患、例えば胃炎、胃潰瘍および胃癌、腹部不快感、特に上腹部の不快感、胃重感、胃痙攣、胃痛、上腹部の疼痛または圧迫、上腹部の灼熱感、慢性反復性腹痛、永続的満腹感、食欲不振、空腹時疼痛、膨満感、胸焼け、下痢、異常な便通、吐き気、疾患および嘔吐、食物不耐性、吸収不良、胃不調（機能性消化不良）、胃炎、粘膜損傷または胃十二指腸潰瘍の予防および／または治療のための、使用。
【請求項１４】
任意に抗生物質などの更に適切な活性成分と組み合わせた、ヘリコバクターピロリの除菌療法のための、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の使用。
【請求項１５】
医薬製品または食品補助剤であって、ヘリコバクターピロリ感染症により引き起こされる疾患、特に消化系疾患、例えば胃炎、胃潰瘍および胃癌、腹部不快感、特に上腹部の不快感、胃重感、胃痙攣、胃痛、上腹部の疼痛または圧迫、上腹部の灼熱感、慢性反復性腹痛、永続的満腹感、食欲不振、空腹時疼痛、膨満感、胸焼け、下痢、異常な便通、吐き気、疾患および嘔吐、食物不耐性、吸収不良、胃不調（機能性消化不良）、胃炎、粘膜損傷または胃十二指腸潰瘍に使用するための、特にその予防および治療のため並びに任意に抗生物質などの更に適切な活性成分と組み合わせたヘリコバクターピロリの除菌療法に使用するための、医薬製品または食品補助剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にヒトおよび動物のヘリコバクターピロリ感染の治療および予防のための医薬組成物および／または食品組成物（医薬製品または食品補助剤を含む）用の噴霧乾燥ラクトバチルス株および／またはラクトバチルス細胞（乳酸菌）並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティック微生物には、ヒトまたは動物の体内で有益な効果を示す細胞も含まれる。プロバイオティック組成物は、かかる微生物も含む。有益な効果には、特に消化管の微生物相の改善も含まれる。特に、好ましくない他の微生物は、プロバイオティック微生物とその好ましくない微生物との間の直接の相互作用によって、あるいはプロバイオティック微生物の発現産物または生来の免疫組織の強化により好ましくない微生物の代謝を阻害するという直接の相互作用によって、微生物相内で阻害できる。一般的に、必須の有効要因の主なメカニズムは、消化管の競合的コロニー形成により、好ましくない微生物がもはや正常な機能を妨害するほど粘膜にコロニーを形成できなくなる、あるいは置き換えられてしまうことであると考えられる。
【０００３】
プロバイオティック微生物の一つのグループは、例えばラクトバチルス株によって形成される。かかる微生物は典型的なグラム陽性の微好気性または嫌気性の細菌であり、糖を発酵し、酸、特に乳酸を形成する。
【０００４】
ラクトバチルスを含む医薬組成物は、特に特許文献１によって知られている。当該組成物の用途の一つは、消化管の病気の治療である。
【０００５】
ラクトバチルス株は特許文献２によって知られており、ヘリコバクターピロリによる消化管の感染を治療するための医薬組成物または食品組成物の生産に適している。
【０００６】
ラクトバチルスとヘリコバクターピロリとの相互関係は、特に、非特許文献１から４に記載されている。
【０００７】
ヘリコバクターピロリは胃にコロニーを形成する螺旋状の細菌で、ウレアーゼの生産により胃のｐＨ値が上昇するので、当該細菌は胃酸から守られる。該細菌は粘膜を貫通し、上皮細胞に定着する。かかる感染は体の免疫組織を活性化するが、免疫反応は感染を排除できるほど十分には有効でないので、免疫反応の増強が生じ、その結果、慢性炎症および慢性疾患、例えば胃炎または胃潰瘍が生じ、ひいては癌が発症することになる。
【０００８】
細胞が互いに集まり塊を形成する場合、このプロセスは凝集と呼ばれる。一種類の細胞だけがこの凝集形成に関与する場合、これは自動凝集または自己凝集と呼ばれる。少なくとも二種類の細胞がこの凝集形成に関与する場合、このプロセスは共凝集と呼ばれる。本出願人による特許文献３は、ラクトバチルスとヘリコバクターピロリとの共凝集について記載しているが、これは、ヘリコバクターピロリ感染症の予防、治療および／または除菌療法に利用可能であり、特にヘリコバクターピロリの減少が達成できる。更に、本発明の目的に適したラクトバチルス株は特許文献３に記載されているが、かかるラクトバチルス株（特にＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５０、ＤＳＭ１７６５１、ＤＳＭ１７６５２およびＤＳＭ１７６５３）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），  Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  Ｄ−３９１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙに提出された。
【０００９】
適切なラクトバチルス細胞は、ヘリコバクターピロリに接触すると共凝集を形成する。共凝集の形成により、ヘリコバクターピロリは胃壁を貫通できなくなる。ヘリコバクターピロリ細胞、特にその細胞表面がラクトバチルス細胞によって覆われるので、ヘリコバクターピロリ細胞はもはや胃の上皮細胞に結合できなくなる。ヘリコバクターピロリ細胞が胃の上皮細胞に結合できなくなる結果、炎症反応が回避される。覆われ不活性化されたヘリコバクターピロリ細胞は共凝集体の形態で消化管を運ばれ、排泄される。従って、適切なラクトバチルス細胞を投与することにより、胃の中のヘリコバクターピロリ細胞を削減または排除できる。ラクトバチルス細胞は、予防的または治療的に使用できる。しかし、この治療方法には改善が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，７１６，６１５号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／０８７８９１号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００７／０７３７０９号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎａｔｕｒ．  ８０：７３７−４１（２００４）
【非特許文献２】Ｆｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １７（５）：７８５−７９１（２００３）
【非特許文献３】Ｃａｚｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ４８（１）：２６−３１（２００４）
【非特許文献４】Ｓｇｏｕｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７０（１）：５１８−５２６（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、ヘリコバクターピロリ感染症に関して改善された予防および治療方法を提供することである。特に、改善された共凝集体形成を可能にする方法が提供され、この方法によれば、胃壁におけるヘリコバクターピロリのコロニー形成が、共凝集の形成により大幅に阻害／削減される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
噴霧乾燥ラクトバチルスの使用および生産は、従来技術、例えばＧａｒｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ａｎｄ  Ｌ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｈｅａｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６（６）：２６０５−２６１２（２０００）、Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓｐ．  Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ，  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ７８：１０２５−１０３１（１９９５）およびＴｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ，  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｉｎｇ，  ｏｒ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌ．，  Ｉｎｃ．（ＵＳ）により公知である。
【００１４】
しかし、ヘリコバクターピロリと共凝集体を形成させるための噴霧乾燥ラクトバチルスの使用、特に医薬組成物または食品組成物の形態でのその適合性については、記載されていない。
【００１５】
驚いたことに、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を共凝集に使用すれば、ヘリコバクターピロリ感染症の改善された予防が達成できる。
【００１６】
特に有利な点であるが、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞はヘリコバクターピロリと大きい共凝集体を形成し、ヘリコバクターピロリの微生物負荷を効果的に削減できる。ラクトバチルス細胞の噴霧乾燥により、ラクトバチルス細胞のサイズが特に有益に減少し、細胞の単体化および分離が生じる。他の乾燥方法または乾燥なしに実行される方法とは違って、２〜１０の細胞からなる連鎖（図２Ａ）は全く生じず、噴霧乾燥の特徴である個別の細胞（単量体）または二つの細胞（二量体）が生じる（図２Ｂ）。かかる噴霧乾燥された「細菌細胞」は、胃媒体への投与後、共凝集体のインサイチュー形成に非常に適しており、ラクトバチルス細胞とヘリコバクターピロリ（細胞）からなる、有益で密度の濃い、コンパクトで効率のよい共凝集体が得られ、しかも該共凝集体の形成段階で立体障害が少なくて済む。本発明によるこのような噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は、ヘリコバクターピロリに対して、例えば国際公開ＷＯ２００７／０７３７０９号パンフレットに記載の技術教示に従って達成できるものよりも高い結合親和性を有している。結合親和性が高いので、より少ない数のラクトバチルス細胞で、より多くのヘリコバクターピロリ細胞を覆ったりそれに結合したりできる。更に、高い結合親和性は、形成される共凝集体の安定性を高める効果もある。
【００１７】
更に有利な点であるが、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は、死んだラクトバチルス細胞および／またはラクトバチルス細胞の断片も高比率で含み、それは同様に、共凝集体の自発形成をサポートしている。死んだラクトバチルス細胞および／またはラクトバチルス細胞の断片の割合は、８０％超、９０％超、あるいは１００％でもよい。
【００１８】
本発明の共凝集体は、消化管を通過して自然に体外へ排泄される。既に感染していたとしても、追加のヘリコバクターピロリ菌による更なる感染が予防され、既存の感染は既存のヘリコバクターピロリ菌の不活性化／排泄によって容易に対処できるので、本発明による噴霧乾燥ラクトバチルス株の作用機構は有益である。加えて、本発明のラクトバチルス株はヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性も阻害できるので、共凝集体中のヘリコバクターピロリ菌は胃酸の攻撃から自らを守ることが出来なくなる。その限りにおいて、相乗効果も達成される。
【００１９】
噴霧乾燥ラクトバチルス株またはラクトバチルス細胞は、ヘリコバクターピロリへの結合親和性が上昇（前出）するという特長を有している。ヘリコバクターピロリの表面はラクトバチルス細胞によって覆われるので、ヘリコバクターピロリ細胞は粘膜を貫通することが出来なくなり、その結果、慢性炎症プロセスを含むヘリコバクターピロリ感染症が起きなくなり、胃炎、胃潰瘍、更には胃癌などの二次疾患も効果的に予防される。
【００２０】
更に、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞とヘリコバクターピロリ細胞を含む本発明の共凝集体は安定性が向上するので、更に多くのヘリコバクターピロリを共凝集体に取り入れることができ、加えて、例えば胃の運動などにより、拘束されたヘリコバクターピロリ細胞が新たに解き放たれるということが全く生じない。これは、従来技術で公知の共凝集体と比較して、投与量が少なくて済むという特長につながる。本発明の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は水に溶けやすいという特長を有しているので、噴霧乾燥ラクトバチルスおよび得られた共凝集体の改善された分配が胃腔内で達成される。
【００２１】
ラクトバチルス細胞の噴霧乾燥は、ラクトバチルス自身が野放しに凝集形成（自動凝集）されるのを妨げる、あるいは少なくとも噴霧乾燥していない新鮮なラクトバチルスと比較して、それを劇的に減少させることを、本発明者達は見出した。ヘリコバクターピロリを覆うための結合部位は、ラクトバチルス細胞が自動凝集することによりお互いに占領されてしまう。従って、このように自動凝集を削減または防止することにより、従来技術と比べて、使用されるラクトバチルスの投与量を削減できる。
【００２２】
本発明の噴霧方法はラクトバチルスの形態を変化させ、ヘリコバクターピロリの結合親和性を増大させ、その結果、改善された共凝集形成を達成する。
【００２３】
従って、本発明は、ヒトおよび動物、特にヒトにおけるヘリコバクターピロリ感染症の予防および治療に使用される、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を含む医薬組成物または食品組成物に関する。
【００２４】
本発明の更なる実施態様では、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は、実質的に単量体および／または二量体の形態で存在するのが好ましい（前出、図２Ｂ）。
【００２５】
更に本発明は、ａ）ラクトバチルス細胞が噴霧乾燥され、ｂ）取得された噴霧乾燥ラクトバチルス細胞が生理適合性の担体（生理適合性担体の例示的な実施態様は以下に記載される）に導入される、本発明の組成物に関する。
【００２６】
更に本発明は、ヒトまたは動物に投与後、ヘリコバクターピロリとの共凝集体が胃媒体においてインサイチューで形成されるような組成物に関し、その場合、共凝集体は５０μｍ以上であるのが好ましく、特に１００μｍ以上、１５０μｍ、特に５００μｍ超、特に１，０００μｍ超または１，１００μｍであるのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは、模擬胃環境において、新たに培養され噴霧乾燥されていないラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞とヘリコバクターピロリとを含む共凝集体（共凝集体のサイズは４０μｍ以上）を示す。図１Ｂは、模擬胃環境において、噴霧乾燥ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞とヘリコバクターピロリとを含む非常に大きい共凝集体（共凝集体のサイズは１５０μｍ以上）を示す。図１Ｃから図１Ｅは本実験の対照である。図１Ｃは、模擬胃環境における新たに培養したラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞を示す。自動共凝集は検出できない。図１Ｄは、模擬胃環境における噴霧乾燥ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞を示す。自動共凝集は検出できない。図１Ｅは、模擬胃環境における新たに培養されたヘリコバクターピロリ細胞を示す。自動共凝集は検出できない（図１Ａ−Ｅの倍率は１０００倍）。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂはラクトバチルス細胞の形態を示す。図２Ａは噴霧乾燥されていないラクトバチルス細胞を示す。２から１０の細胞が連鎖状に存在している。図２Ｂは噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を示す。細胞は単量体および二量体で存在し（１または２の細胞）、噴霧乾燥されていないラクトバチルス細胞よりも有意に小さい。
【図３】図３は、ヘリコバクターピロリとの関係で、ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８の新たに培養した細胞と噴霧乾燥した細胞とを共凝集の程度について比較したものである。本試験では、それぞれ１．４ｘ１０８のラクトバチルス細胞を使用した。同一の細胞計数において、ヘリコバクターピロリに対する噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の共凝集活性は、新たに培養した細胞のそれの二倍超である。０％はラクトバチルス細胞の添加がない場合の、（上清中の）ヘリコバクターピロリのＯＤ６００を表す（共凝集なし、または共凝集による沈殿なし）。凝集１００％は最大の共凝集、つまりゼロＯＤ６００または細胞なしの培地のＯＤ６００（全てのヘリコバクターピロリが共凝集により沈殿し、ＯＤ測定によっては上清中にヘリコバクターピロリ細胞は全く検出されない状態）を表す。
【図４】図４は、ヘリコバクターピロリとの関係で、ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８の新たに培養した細胞と噴霧乾燥した細胞とを共凝集の程度について比較したものである。本試験では、それぞれ異なる数のラクトバチルス細胞を使用した。ヘリコバクターピロリに対する噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の共凝集活性は、新たに培養した細胞のそれの二倍である。０％はラクトバチルス細胞の添加がない場合の、（上清中の）ヘリコバクターピロリのＯＤ６００を表す（共凝集なし、または共凝集による沈殿なし）。凝集１００％は最大の共凝集、つまりゼロＯＤ６００または細胞なしの培地のＯＤ６００（全てのヘリコバクターピロリが共凝集により沈殿し、ＯＤ測定によっては上清中にヘリコバクターピロリ細胞は全く検出されない状態）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の意味する範囲内で、「ラクトバチルス細胞」という用語（広い意味で乳酸菌またはラクトバチルス）は、乳酸の発酵に炭水化物、特にグルコースおよびラクトースを必要とし、生合成にエムデン・マイヤーホフ経路を主に使う微生物を含む。分類学上、ラクトバチルス細胞は乳酸菌科に属する。グラム陽性で、胞子を形成せず、一般的に不動性である。ラクトバチルス細胞は嫌気性であるが、ヘミン（チトクローム、カタラーゼ）を含まないにも拘らず耐気性である（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．：１８，４６１−４６７（１９９５）またはＬｕｄｗｉｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．１５：４８７−５０１（１９９２））。ラクトバチルス細胞またはその種は、炭水化物発酵パターンに基づいて、特にＡＰＩ試験（ビオメリュー社製）によって決定できる。本発明によれば、同種発酵性乳酸発酵または異種発酵性乳酸発酵に適した種がその中に特に含まれる。更に好ましいのは、乳酸桿菌、ラクトバチルスヘルヴェティクス、イエンセン乳酸桿菌、好酸性乳酸桿菌、ブルガリア乳酸桿菌、ラクトバチルスアミロボラス、デルブリュック乳酸桿菌、ラクトバチルスカゼイ、ラクトバチルスクリスパタス、ガセリ菌、ラクトバチルスジョンソニー、ラクトバチルスパラカゼイ、プロテクト乳酸菌、ラクトバチルスラムノサス、ラクトバチルスカルバタスおよびラクトバチラスプランタルム（以上は全て同種発酵性）、更にラクトバチラスブレビス、ブーフナー乳酸桿菌、ラクトバチルスフルクティヴォランス、ラクトバチルスヒルガルディー、発酵乳酸桿菌、ラクトバチルスロイテリ、ラクトバチルスヴィリデセンスおよびビフィドバクテリウムビフィドゥム（以上は全て異種発酵性）からなる群から選択されるラクトバチルス細胞である。本出願者が提出した適切なラクトバチルス細胞は、例えば、ＤＳＭ１７６４６、ＤＳＭ１７６４７、ＤＳＭ１７６４８、ＤＳＭ１７６４９、ＤＳＭ１７６５０、ＤＳＭ１７６５１、ＤＳＭ１７６５２およびＤＳＭ１７６５３（前出）である。本発明によれば、発酵乳酸桿菌、ラクトバチラスブレビス、ラクトバチルスロイテリ、ブーフナー乳酸桿菌およびプロテクト乳酸菌が好ましい。
【００２９】
更に本発明に含まれるのは、共凝集に適する範囲で不活性化された、生きているまたは死んでいる「ラクトバチルス細胞」、あるいはラクトバチルス細胞の一部または断片、例えば酵素的分解産物または機械的分解産物（例えばフレンチプレス等）、その「誘導体」、「類似体」または「突然変異体」である。
【００３０】
本発明によれば、「誘導体」、「類似体」、「突然変異体」または「不活性化された」という用語は、細胞または発酵上清、ライセート、「ラクトバチルス細胞」の分画または抽出物等も含み、その場合、かかる細胞または発酵上清、ライセート、分画または抽出物は、本発明のラクトバチルス細胞／株／微生物の特性を有しているのが好ましい。この目的のために、「ライセート」並びに「抽出」という用語は、本発明の微生物細胞の水媒体中の溶液または懸濁物を意味し、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、炭水化物、特に細胞破壊片等の高分子化合物を含む。ライセートは、細胞壁または細胞壁構成物も含むのが好ましい。ライセートを作製する方法は当業者には十分公知であり、例えば「フレンチプレス」、酵素溶解、あるいはガラスビーズまたは鉄球を使ったボールミルの使用が含まれる。細胞は、酵素的に、物理的に、あるいは化学的に崩壊できる。酵素的な細胞溶解の例には、個々の酵素並びにプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、リパーゼ、グリコシダーゼなどの酵素カクテルが含まれ、化学的溶解は、イオンフォア、ＳＤＳなどの洗剤、酸または塩基で達成できるし、物理的方法は、フレンチプレスなどの高圧、浸透圧、温度または高温条件と低温条件の交替によって達成できる。更に、勿論、化学的方法、物理的方法並びに酵素的方法を組み合わせることも可能である。
【００３１】
本発明のラクトバチルス細胞／株／微生物の「誘導体」、「類似体」、「突然変異体」または「不活性化された」ものは、引用された株と同じ特性を有しているのが好ましい。この目的のために、「不活性化された（形態）」、「誘導体」または「類似体」には、代謝活性はもはや存在していないのが好ましい。
【００３２】
本発明のラクトバチルス細胞／株／微生物の「類似体」は、ライセートまたは断片の形態を構成する。本発明のラクトバチルス細胞／株／微生物の「断片」は、細胞の一部、例えば細胞膜、高分子化合物、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、炭水化物並びに細胞破壊片等で構成される。当業者は、「類似体」、「断片」、「誘導体」または「突然変異体」という用語に適切な内容を割り当て、本発明の意味する範囲内でそれらを解釈することができる。当業者は、好ましいラクトバチルス細胞／株／微生物の突然変異体、誘導体、断片または類似体を提供するため、突然変異体、誘導体、断片または類似体の生産に利用可能な技術を開示した公知の標準文献の力を借りることができる。
【００３３】
突然変異体、遺伝子組み換え変種または誘導体は、例えばＤＮＡ組み換え技術（クローニング、シーケンス処理、組み換え核酸の形質転換等）並びに紫外線照射などの物理的突然変異誘発によって、あるいはメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等の化学薬剤によっても、遺伝子的に組み換えられる。当該目的で、有利な特性変化が、標的方法によって、あるいは結果的に得られる複数の突然変異体を評価することにより選択できる。遺伝子組み換え突然変異体は本発明の微生物細胞も含み、細菌の染色体および／またはプラスミドの中に組み換えられた核酸を納めている。直接の遺伝子操作のない自然突然変異同様、点突然変異による組み換えも、発現／転写／翻訳に追加的に影響を及ぼし得る（例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ／Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１））。
【００３４】
かかる微生物の全てが、上記または以下において「ラクトバチルス細胞」と呼ばれる。
【００３５】
ヒト消化管の重要な培養条件には、１．８から４．５までのｐＨ値およびペプシン並びにＮａＣｌの存在が含まれる。かかる培養条件を特徴とする参照培地には、水、５ｇ／ＬのＮａＣｌおよび３ｇ／Ｌのペプシンが含まれ、空腹時または満腹時の胃をシミュレーションするため、ｐＨ値は塩酸で２．０または４．０に調整される。
【００３６】
本発明の意味する範囲内で、「共凝集」という用語は、例えば以下の実施例に従い、特に上述の参照培地において、懸濁液中に本発明の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞およびヘリコバクターピロリ細胞を含む、少なくとも５０μｍまたは１００μｍのサイズの細胞凝集体の形成を意味する。
【００３７】
本発明の意味する範囲内で、「噴霧乾燥ラクトバチルス細胞」という用語は、ラクトバチルス細胞が噴霧乾燥法または噴霧法（同義語）を使って乾燥されることを意味し、この場合、ラクトバチルス細胞の懸濁液は例えば微細な霧状の液滴に分散され、その結果、粉末が得られる。
【００３８】
本発明の噴霧乾燥中、ラクトバチルス細胞を含む溶液または懸濁液が高温の乾燥媒体に噴霧され、乾燥される。噴霧される混合物は、溶液、乳濁液、懸濁液または分散液の形態で存在し得る。ノズルまたはホイール型噴霧器の助けを借りて数百万の液滴に微細化され、その結果、表面が大幅に増大する。水分などの溶媒は熱風によって即座に蒸発し除去される。更に、ラクトバチルス細胞だけが噴霧乾燥される。
【００３９】
噴霧乾燥法または噴霧法は、単項ノズル、ホローコーンノズル、プレッシャーノズル、外部混合型二流体ノズル、空気ノズル、内部混合型二流体ノズル、アトマイジングディスク、超音波アトマイザなどのノズルまたは類似の作用手段が要求されるので、他の乾燥方法とは区別できる。
【００４０】
噴霧乾燥法は従来技術に記載されており、当業者には周知である（Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（前出）またはＥＰ７４０５０およびＥＰ２８５６８２を参照）。Ｂｕｅｃｈｉ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ（ドイツ）製のミニスプレードライヤーＢ−１９１またはＢ−２９０あるいはＧＥＡ  Ｎｉｒｏ（デンマーク）製のＳＤ−６．３−Ｒ等の装置が関連装置として知られ記載されている。
【００４１】
更に本発明は、生理学的に有効量の本発明による噴霧乾燥ラクトバチルス細胞および生理適合性の担体を含む医薬組成物および／または食品組成物に関する。医薬組成物は治療または予防目的のみの組成物であり、ラクトバチルス細胞の他に、薬剤学で一般的に使用される補助剤および／または賦形剤のみが存在する。本発明の意味する範囲内で、食品組成物とは、本発明の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の他に、食品または食糧（例えば、限定されないが２００２年６月１０日のＥＵ指令２００２／４６／ＥＣを参照）および／またはペットおよび／または家畜用の飼料および／または任意に補助剤および添加剤を含む食品補助剤を含んでなる組成物である。
【００４２】
更に本発明は、特にヘリコバクターピロリ感染症、例えば消化器系状態によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のために、医薬組成物または食品組成物、あるいは噴霧乾燥ラクトバチルス細胞または医薬組成物または食品組成物を含む医薬製品または食品補助剤を生産するための、本発明の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の使用または適用に関する。かかる疾患には、特に、胃炎、胃潰瘍および胃癌が含まれる。更に、かかる疾患および症状には、腹部不快感、特に上腹部の不快感、胃重感、胃痙攣、胃痛、上腹部の疼痛または圧迫、上腹部の灼熱感、慢性反復性腹痛、永続的満腹感、食欲不振、空腹時疼痛、膨満感、胸焼け、下痢、異常な便通、吐き気、悪心および嘔吐、食物不耐性、吸収不良、胃不調（機能性消化不良）、胃炎、粘膜損傷または胃十二指腸潰瘍も含まれる。
【００４３】
更に本発明は、任意に抗生物質などの更に適切な活性成分と組み合わせた、ヘリコバクターピロリの除菌または除菌療法のための、本発明の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞あるいは噴霧乾燥ラクトバチルス細胞または医薬組成物または食品組成物を含む医薬製品または食品補助剤の使用または適用に関する。
【００４４】
本発明の医薬組成物または食品組成物、特に食品補助剤または医薬製品（医薬品）は、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を１０２から１０５、好ましくは１０４または１０８から１０１２、特に１０８から１０１０含むことを特徴としてもよい。ここで、上記参照量は投与単位、例えば錠剤の量である。上記組成物は経口投与用として調整するのが好ましい。
【００４５】
本発明の医薬組成物または食品組成物、特に食品補助剤または医薬製品（医薬品）の医薬調製は、業界で一般的に行われている方法で実施できる。薬剤の適切な固形形態または液体形態には、例えば顆粒、粉末、糖衣錠、錠剤、(マイクロ)カプセル剤、硬カプセル剤、座薬、シロップ剤、ジュース剤、懸濁液または乳濁液が含まれ、その生産には従来の補助剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、塗布剤、膨潤剤、滑剤、潤滑剤、風味添加剤、甘味剤および溶解補助剤が使用される。言及しておくべき補助剤には、ステアリン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖類、タルク、粉ミルク、ゼラチン、澱粉、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、例えば肝油、ひまわり油、落花生油または胡麻油、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば滅菌水、一価アルコールまたは多価アルコール、例えばグリセリン等が含まれる。本発明の医薬組成物は、本発明に従って使用される少なくとも一つのラクトバチルス株の規定投与量と、医薬的に適切な生理適合性担体および任意に規定投与量の適切な活性成分、添加剤または補助剤とを混合し、好ましい投与形態を調製することにより生産できる。可能性のある担体には、特に、マルトデキストリン、微結晶セルロース、澱粉、特にコーンスターチ、レブロース、ラクトース、ブドウ糖およびそれらの混合物から選択される物質が含まれる。組成物は、細胞および担体の全量に基づいて、０．１重量%から９５重量％の担体および５重量％から９９．９重量％の噴霧乾燥ラクトバチルス細胞からなってもよいし、あるいはそれらを含有しもよい。
【００４６】
食品組成物および／または食品補助剤の場合、組成物は１０２から１０５、好ましくは１０４から１０１２、より好ましくは１０８から１０１０のラクトバチルス細胞を含むように規定してもよい。上記参照量は投与単位、例えば消費者へ販売するための食糧の包装単位である。生理適合性担体は一般的に食品、特に乳製品、発酵乳製品、ミルク、ヨーグルト、チーズ、穀物、グラノーラバー、焼き食品、飲料水および乳幼児用食物調合品からなる群から選択される食品である。水を含む本発明の適切な食品または食糧は、例えば、限定しないが、２００２年１月２８日の（ＥＣ）規則第１７８／２００２に規定されている。
【００４７】
更に本発明は、本発明の医薬組成物および／または食品組成物、特に食品補助剤または医薬製品（医薬品）を製造するための方法に関し、その場合、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は生理適合性担体と混合され、好ましくは経口投与用に調整される。
【００４８】
更に本発明は、本発明の組成物を製造する方法に関し、その場合、ラクトバチルス細胞は（ｉ）任意に播種し濃縮され、（ｉｉ）発酵され、そして（ｉｉｉ）噴霧乾燥され、その後、生理適合性担体と混合され、好ましくは経口投与用に調整される。
【００４９】
最後に、本発明はヒトまたは動物、特にヘリコバクターピロリ感染症、特に胃炎または胃癌による症状を患っている、あるいはその危険性のある患者または試験対象者の予防または治療方法に関し、その場合、その人は生理学的に有効量の本発明の医薬組成物または食品組成物を一日に一回から五回投与される。投与は限定期間、例えば１週間から３０週間行われてもよいし、あるいは無期限で行われてもよい。特に後者は、永続的予防および再発予防に適している。
【００５０】
本発明を以下の実施例に基づいてより詳細に説明するが、かかる実施例は単に実施態様を示しているにすぎず、本発明はかかる実施例によって特に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：使用される菌株の貯蔵
ラクトバチルス株は冷凍状態で保存した。ＭＲＳ培地（５５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５、Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）の固定相（４−８  ＯＤ６００／ｍＬ）で培養した培養物１ｍＬを５０％（ｖ／ｖ）滅菌グリセリン溶液５００μＬと混合し、その混合物を−８０℃で冷凍した。
【００５２】
ヘリコバクターピロリは冷凍状態で保存した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を追加したブルセラ・ブロス（２８ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、ＢＤ、ＵＳＡ）の固定相で培養した培養物１ｍＬを５０％（ｖ／ｖ）滅菌グリセリン溶液５００μＬと混合し、その混合物を−８０℃で冷凍した。
【００５３】
実施例２：噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の製造プロセス
ヒトの消化管、特に胃の培養条件下でヘリコバクターピロリと共凝集できる噴霧乾燥ラクトバチルスは、以下に記載の方法で製造した。
【００５４】
種培養１は、１５ｍＬの反応容器中の１０ｍＬのＭＲＳ培地で行った。新たに培養し凍結保存した、ラクトバチルス株の凍結乾燥または噴霧乾燥細胞を上記培地に播種した。この種培養物１を嫌気条件下、３７℃で２４時間インキュベートした。全種培養物１を種培養物２のインキュベーションに使った。種培養物２は２４０ｍＬのＭＲＳ培地と１０ｍＬの種培養物１で構成された。種培養物２を嫌気条件下、３７℃で１９時間インキュベートした。各種培養の終わりに、光学密度、ｐＨ値およびｃｆｕを測定した。
【００５５】
ラクトバチルスの発酵に５リットルのＭＲＳを用いた。全必須構成成分を含む発酵槽をオートクレーブにかけた。望ましい温度および撹拌速度はそれぞれ３７℃と１５０ｒｐｍであった。播種濃度は５％であった。発酵プロセスの終わりに、細胞数、コロニー形成単位、ｐＨ、６００ｎｍでの光学密度およびブドウ糖と乳酸塩の濃度を測定した。その後、発酵ブロスを１０倍から２０倍に濃縮した。それから該濃縮物を冷凍した。
【００５６】
乾燥前に２０倍濃縮物を解凍し、４３００ｘｇで１５分遠心分離した。次に、細胞を０．９％ＮａＣｌで洗浄し、再び４３００ｘｇで１５分遠心分離した。その後、細胞を１０％ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。
【００５７】
噴霧乾燥プロセスはＢｕｅｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−１９１で行った。入口温度は１４０℃であった。出口温度は８６℃であった。熱風の流速は５００Ｌ／ｈであった。アスピレーター力は７５％で、ポンプ流量は５％であった。細胞懸濁物は上記パラメーターを使って乾燥し、その後、噴霧乾燥ラクトバチルス粉末を除去した。
【００５８】
噴霧乾燥粉末１ｇあたりのラクトバチルス株の全細胞数並びに生細胞数を測定した。噴霧乾燥粉末の顕微鏡検査（図２Ｂ）により、該ラクトバチルス細胞は噴霧乾燥していないラクトバチルス細胞（図２Ａ）よりも小さいこと、並びに噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は単量体および二量体の形態で存在しているが、噴霧乾燥していないラクトバチルス細胞は長い鎖状であることが示された。噴霧乾燥ラクトバチルス細胞は使用するまで４℃で貯蔵した。
【００５９】
実施例３：胃環境下における噴霧乾燥されていないラクトバチルス株またはラクトバチルス細胞および噴霧乾燥ラクトバチルス株またはラクトバチルス細胞によるヘリコバクターピロリの共凝集比較
密閉した１５ｍＬチューブ中のＭＲＳ培地を使って、ラクトバチルス細胞を３７℃で２４時間培養した。噴霧乾燥ラクトバチルスを検査するため、噴霧乾燥粉末を濃度１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。ヘリコバクターピロリは、微好気性条件下の三角フラスコ中で、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を加えたブルセラ・ブロス（２８ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、ＢＤ、ＵＳＡ）によって３７℃で約２日培養した。培養後、ヘリコバクターピロリ細胞の形態を顕微鏡下で分析した。Ｓ状形態を有する細胞または球状形態を有する細胞についてアッセイを行った。混合形態を有する培養物も検査した。
【００６０】
それぞれの細胞を３２００ｇで１０分遠心分離して回収し、上清は捨てた。ラクトバチルス細胞は５ｍＬのバッファーで１度洗浄し、５ｍＬのＰＢＳバッファー（１．５ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４*２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および８．８ｇ／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳバッファー）に再懸濁した。ヘリコバクターピロリ細胞は、５ｍＬのＰＢＳバッファーで１度洗浄し、５ｍＬの人工胃液（５ｇ／ＬのＮａＣｌおよび３ｇ／Ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ）を含む）に再懸濁した。それぞれの細胞についてＯＤ６００値を測定し、それぞれ人工胃液およびＰＢＳバッファーを添加してヘリコバクターピロリを値２に、ラクトバチルスを値４に調整した。
【００６１】
このようにして得られた細胞懸濁物を２．５ｍＬずつ（ヘリコバクターピロリ／ラクトバチルス）混合し、その混合物を１０秒から１０分振盪した。その結果は、ヘリコバクターピロリとラクトバチルスを含んだサンプルがかなり凝集していたので光学的に鮮明であった。顕微鏡下による分析も行った。
【００６２】
図１Ａは、ヘリコバクターピロリと噴霧乾燥していないラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞とを含む共凝集体の顕微鏡画像を示す。図１Ｂは、ヘリコバクターピロリと噴霧乾燥ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞とを含む共凝集体の顕微鏡画像を示す。この共凝集体は、噴霧乾燥していないラクトバチルス細胞を含む共凝集体よりもかなり大きい。ラクトバチルスのみ並びにヘリコバクターピロリのみを含む各培養物を別々に分析することにより、自己凝集に関する対照実験を行った。図１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅにおいて、共凝集も自動凝集も明白ではない。図１Ｃは、人工胃環境における新たに培養したラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞の顕微鏡画像を示す。図１Ｄは、人工胃環境における噴霧乾燥ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８細胞の顕微鏡画像を示す。図１Ｅは、人工胃環境における新たに培養されたヘリコバクターピロリ細胞の顕微鏡画像を示す。
【００６３】
実施例４：噴霧乾燥ラクトバチルス細胞とヘリコバクターピロリ細胞との共凝集の安定性試験  
生体内条件下に於ける共凝集体の安定性を試験するため、実施例３の実験を行った。５分間の振盪後形成されたラクトバチルス細胞とヘリコバクターピロリ細胞との共凝集体の懸濁物を、１分間ピペッティングすることにより、あるいは高速で２分間振盪することにより、強力な剪断力の下に置いた。その後、該共凝集体を顕微鏡的および巨視的に分析した。噴霧乾燥ラクトバチルス細胞とヘリコバクターピロリを含む共凝集体のサイズは減少しながったが、噴霧乾燥していないラクトバチルス細胞とヘリコバクターピロリの共凝集体のサイズは減少した。
【００６４】
実施例５：本発明のラクトバチルス株を含む医薬組成物の製造  
本発明の一種類のラクトバチルス株または複数種類のラクトバチルス株の細胞を実施例１および２に従って取得し、噴霧乾燥する。次に、噴霧乾燥した粉末を直径約１ｍｍ未満の粒子サイズになるまですり潰す。その結果得られた微粒子を以下の割合（重量パーセント）で賦形剤および／または補助剤と混合する：２０％の微粒子、２％の二酸化珪素（Ｓｙｌｏｉｄ  ＡＬ−ＩＦＰ、ＧＲＡＣＥ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、１％のステアリン酸マグネシウム（ＭＦ−２−Ｖ、Ａｃｋｒｏｓ）、７７％の微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １１２、ＦＭＣ）。
【００６５】
混合はＱｕｉｎｔｅｃｈ  Ｍｉｘｒｏｍｉｘｅｒ  ａｔ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７０  Ｌｅｖｅｌ  ＩＩで行う。混合は約１２０秒行う。その後、得られた混合物を通常の条件下で、商業的に入手可能な打錠機を用いて圧搾するが、約５００ｍｇの重さの錠剤を作るため、弱い圧搾力（１０ｋＮ未満）を用いる。各錠剤には、噴霧乾燥ラクトバチルス細胞が約１０８から１０１０含まれる。
【００６６】
実施例６：種々のラクトバチルス細胞数を用いた、噴霧乾燥されていないラクトバチルス株またはラクトバチルス細胞および噴霧乾燥ラクトバチルス株またはラクトバチルス細胞によるヘリコバクターピロリの共凝集比較
密閉した１５ｍＬチューブ中のＭＲＳ培地を使って、ラクトバチルス細胞を３７℃で２４時間培養した。噴霧乾燥ラクトバチルス細胞を検査するため、噴霧乾燥粉末を濃度１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。ヘリコバクターピロリは、微好気性条件下の三角フラスコ中で、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を加えたブルセラ・ブロス（２８ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、ＢＤ、ＵＳＡ）によって３７℃で約２日培養した。培養後、ヘリコバクターピロリ細胞の形態を顕微鏡下で分析した。Ｓ状形態を有する細胞または球状形態を有する細胞についてアッセイを行った。混合形態を有する培養物も検査した。
【００６７】
それぞれの細胞を３２００ｇで１０分遠心分離して回収し、上清は捨てた。ラクトバチルス細胞は５ｍＬのバッファーで１度洗浄し、５ｍＬのＰＢＳバッファー（１．５ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４*２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および８．８ｇ／ＬのＮａＣｌを含むＰＢＳバッファー）に再懸濁した。ヘリコバクターピロリ細胞は、５ｍＬのＰＢＳバッファーで１度洗浄し、５ｍＬの人工胃液（５ｇ／ＬのＮａＣｌおよび３ｇ／Ｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ）を含む）に再懸濁した。それぞれの細胞についてＯＤ６００値を測定し、それぞれ人工胃液およびＰＢＳバッファーを添加してヘリコバクターピロリを値２に、ラクトバチルスを値４に調整した。
【００６８】
ラクトバチルス懸濁液についてトーマ型血球計算板を用いて細胞数の測定を行い、細胞数の異なる懸濁液を得るため希釈を行った。その結果得られた細胞懸濁液を２．５ｍＬずつ（ヘリコバクターピロリ／ラクトバチルス）混合し、その混合物を５分間振盪した。２分の滞留時間の後、結果は、ヘリコバクターピロリとラクトバチルスを含んだサンプルがかなり凝集していたので光学的に鮮明であったし、顕微鏡的にも鮮明であった（図示しない）。共凝集を定量化するため共凝集していない相（上清、沈殿物は共凝集体）から１ｍＬ回収し、ＯＤ６００を測定した。以下の式を用いて：
【００６９】
【数１】
2014518897.tif 000002
【００７０】
共凝集の程度（％）を測定した。図３および図４は、ヘリコバクターピロリとの関係で、ラクトバチルスＤＳＭ１７６４８の新たに培養した細胞と噴霧乾燥した細胞とを共凝集の程度について示したものである。０％はラクトバチルス細胞の添加がない場合の、（上清中の）ヘリコバクターピロリのＯＤ６００を表す（共凝集なし、または共凝集による沈殿なし）。凝集１００％は最大の共凝集、つまりゼロＯＤ６００または細胞なしの培地のＯＤ６００（全てのヘリコバクターピロリが共凝集により沈殿し、ＯＤ測定によっては上清中にヘリコバクターピロリ細胞は全く検出されない状態）を表す。
【００７１】
同一の細胞計数において、ヘリコバクターピロリに対する噴霧乾燥ラクトバチルス細胞の共凝集は、新たに培養した細胞のそれの二倍超である（図３および図４）。
【図１】
2014518897.tif 000003
【図２】
2014518897.tif 000004
【図３】
2014518897.tif 000005
【図４】
2014518897.tif 000006
【国際調査報告】
2014518897.tif 000007
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2014518897.tif 000009
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