(57)【要約】本開示は、概して、ループ1B領域に対する改変を有する、抗病原体活性を有する改変ディフェンシン分子を含む抗病原体剤の分野に関する。改変ディフェンシンを発現または含有する遺伝子組換え植物およびその子孫または一部、ならびに園芸および農業において使用するための、ならびに動物用およびヒト用の医薬として使用するための抗病原体組成物も提供される。ニコチアナ・スアベオレンス（Nicotiana suavolens）に由来するディフェンシンも提供される。2014506461.tif 000030
2014506461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:57に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンであって、該改変がナス科クラスIIディフェンシンのループ1B領域に対するものである、人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシン。
【請求項２】
最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％のアミノ酸配列類似性を含む、請求項1記載の改変ディフェンシン。
【請求項３】
ループ1Bアミノ酸配列が、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、および38からなるリストより選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載の改変ディフェンシン。
【請求項４】
ループ1Bアミノ酸配列が、SEQ ID NO:67〜79からなるリストより選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載の改変ディフェンシン。
【請求項５】
ループ1Bアミノ酸配列がSEQ ID NO:29を含む、請求項3記載の改変ディフェンシン。
【請求項６】
SEQ ID NO:39に対して少なくとも90％のアミノ酸配列類似性を有する、請求項1または2または3または4または5記載の改変ディフェンシン。
【請求項７】
SEQ ID NO:39に対して少なくとも95％のアミノ酸配列類似性を有する、請求項6記載の改変ディフェンシン。
【請求項８】
改変前において、ディフェンシンが、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、TpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549より選択される、請求項1記載の改変ディフェンシン。
【請求項９】
改変前において、ディフェンシンがNaD1である、請求項8記載の改変ディフェンシン。
【請求項１０】
改変前において、ディフェンシンがNsD1およびNsD2からなるリストより選択される、請求項8記載の改変ディフェンシン。
【請求項１１】
抗病原体活性が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比べて、より広域の抗病原体活性、より高い抗病原体活性、より高い安定性、および/またはより高い透過性である、請求項1〜10のいずれか一項記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１２】
抗病原体活性が真菌に対する活性のレベルである、請求項11記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１３】
真菌が植物真菌病原体である、請求項12記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１４】
真菌が哺乳動物真菌病原体である、請求項13記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１５】
真菌がヒト真菌病原体である、請求項14記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１６】
真菌が、コレトトリカム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、ディプロディア・メイディス（Diplodia maydis）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、およびフザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticilloides）からなるリストより選択される、請求項13記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１７】
真菌が、フザリウム・ビルグルリフォルメ（Fusarium virgululiforme）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Sclerotinia sclerotiorum）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、およびフザリウム・ツクマニアエ（Fusarium tucumaniae）からなるリストより選択される、請求項13記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１８】
真菌がサビ菌である、請求項13記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項１９】
真菌が、アルテルネリア属の種（Alternaeria spp）、アスペルギルス属の種（Aspergillus spp）、カンジダ属の種（Candida spp）、フザリウム属の種（Fusarium spp）、トリコフィトン属の種（Trychophyton spp）、クリプトコッカス属の種（Cryptococcus spp）、ミクロスポルム属の種（Microsporum spp）、ペニシリウム属の種（Penicillium spp）、トリコスポロン属の種（Trichosporon spp）、セドスポリウム属の種（Scedosporium spp）、ペシロマイセス属の種（Paeciliomyces spp）、アクレモニウム属の種（Acremonium spp）、およびデマチウム科の糸状菌からなるリストより選択される、請求項14記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項２０】
抗病原体活性が殺虫活性である、請求項1記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項２１】
昆虫が、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、オストリニア・ヌビアリス（Ostrinia nubialis）、ロパロシファム属の種（Rhopalosiphum spp）、ヘリコベルパ属の種（Helicoverpa spp）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）、およびライガス属の種（Lygus spp）より選択される、請求項20記載の単離された改変ディフェンシン。
【請求項２２】
請求項1〜10のいずれか一項記載の単離された改変ディフェンシンを含む、組成物。
【請求項２３】
化学殺病原体剤、タンパク質性殺病原体剤、および/またはプロテイナーゼ阻害剤もしくはその前駆体をさらに含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
請求項1〜10のいずれか一項記載の単離された改変ディフェンシンをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項24記載の単離された核酸分子を含む、遺伝子構築物。
【請求項２６】
プロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体をコードする核酸分子をさらに含む、請求項25記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
請求項1〜10のいずれか一項記載のディフェンシンを産生する遺伝子組換え植物、または該ディフェンシンを産生する該植物の子孫。
【請求項２８】
請求項24記載の核酸分子または請求項25記載の遺伝子構築物を含む、請求項27記載の遺伝子組換え植物またはその子孫。
【請求項２９】
コーン、ダイズ、ワタ、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、キャノーラ、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、イチジク、アマ、ブドウ、ラッカセイ、アサ、ラベンダー、キノコ、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナッツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、アブラナ、ライグラス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タロイモ、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフ、およびヤムイモより選択される、請求項27または28記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３０】
増強された抗病原体活性を示す遺伝子組換え植物またはその子孫を作製する方法であって、請求項1〜10のいずれか一項記載の改変クラスIIナス科ディフェンシンをコードする核酸を発現する細胞を含む植物を作り出す工程を含み、該植物またはその子孫における該発現のレベルが、該改変ディフェンシンが植物病原体に対して保護効果を示すのに十分である、方法。
【請求項３１】
植物における病原体侵入を防除する方法であって、請求項22記載の組成物を、該植物、その根、または該植物の周囲にある土壌に局所適用する工程を含む、方法。
【請求項３２】
動物対象における病原体侵入を防除する方法であって、請求項22記載の組成物を、病原体が侵入している可能性のある該動物の表面に局所適用する工程を含む、方法。
【請求項３３】
動物が哺乳動物である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物がヒトである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
抗病原体医薬の製造における、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を有するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンの使用であって、該ループ領域が1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加によって改変されている、使用。
【請求項３６】
病原体が真菌である、請求項35記載の使用。
【請求項３７】
SEQ ID NO:49[NsD1]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:49[NsD1]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンス（Nicotiana suaveolens）に由来する単離されたディフェンシン。
【請求項３８】
SEQ ID NO:51[NsD2]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:51[NsD2]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシン。
【請求項３９】
請求項37または38記載のディフェンシンをコードするヌクレオチドの配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４０】
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、中程度のストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:48または50とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、および最適アラインメント後にSEQ ID NO:46または48に対して少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項37記載の単離された核酸分子。
【請求項４１】
改変ループ1B領域を含みかつ抗病原体活性を示す人工ディフェンシンの製造における、SEQ ID NO:52に対して少なくとも約70％の類似性を有する、クラスIIナス科ディフェンシン成熟ドメインC末端領域を含むクラスIIナス科ディフェンシンの使用。
【請求項４２】
クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ領域を有するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含むディフェンシンを作製する方法であって、抗病原体活性を有するディフェンシンを作製するようにアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって該ループ領域を改変する工程を含む、方法。
【請求項４３】
前記ループ領域がループ1Bである、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を生じるように改変され、式中、Xがアミノ酸残基であり、
X1が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を生じるように改変され、式中、Xがアミノ酸残基であり;
X1が、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2が、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3が、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4が、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5が、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6が、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり;
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記ループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を含み、式中:
X1が、N、H、Q、D、K、もしくはEであり;
X2が、R、H、T、K、もしくはGであり;
X3が、F、H、Y、もしくはWであり;
X4が、P、K、S、もしくはRであり;
X5が、GもしくはFであり;かつ/または
X6が、P、V、I、もしくはNである、
請求項45記載の方法。
【請求項４７】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、アミノ酸配列HRFKGP（NaD2）、QHHSFP（Zea2）、DTYRGV（PsD1）、DKYRGP（MsDef1）、KTFKGI（SoD2）、およびKTWSGN（DmAMP1）に改変されている、請求項44または45または46記載の方法。
【請求項４８】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、SEQ ID NO:67〜79より選択されるアミノ酸配列に改変されている、請求項44または45または46記載の方法。
【請求項４９】
クラスIIナス科ディフェンシンが、最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有するC末端領域を含む、請求項42〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
クラスIIナス科ディフェンシンが、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
クラスIIナス科ディフェンシンがNaD1である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
クラスIIナス科ディフェンシンが、NsD1およびNsD2より選択されるニコチアナ・スアベオレンスに由来するディフェンシンである、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、図2に列挙された非クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1Bに置き換えられる、請求項43記載の方法。
【請求項５４】
ループ1Bが、NaD1に由来するNTFPGIの改変型であり、改変が、以下:
Nが、A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Tが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Fが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Pが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Gが、A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;ならびに/あるいは
Iが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される
の1つあるいは複数を含み、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、請求項47記載の方法。
【請求項５５】
ループ1Bが、NaD1に由来するNTFPGIの改変型であり、
改変が、以下:
Nが、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、およびRより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Tが、K、R、G、H、L、N、F、I、S、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Fが、W、Y、H、L、G、およびPより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Pが、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Gが、S、K、Y、F、およびHより選択されるアミノ酸残基で置換される;ならびに/または
Iが、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される
の1つあるいは複数を含み、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
バックボーンクラスIIナス科ディフェンシンが、前記ループ領域外において、該バックボーンにおけるアミノ酸の置換、付加、および/または欠失をさらに含む、請求項42〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
抗病原体活性が、バックボーンクラスIIナス科ディフェンシンと比べて、より広域の抗病原体活性またはより高い抗病原体活性を含む、請求項32〜56のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願データ
本願は、2011年2月7日に出願された米国特許仮出願第61/440,309号、発明の名称「抗病原体剤(Anti-pathogenic agents)」からの優先権に関連し、かつこの優先権を主張する。本仮出願の全開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本開示は、概して、抗病原体活性を有する改変ディフェンシン分子を含む抗病原体剤の分野に関する。改変ディフェンシンを発現または含有する遺伝子組換え植物およびその子孫または一部、ならびに園芸および農業において使用するための、ならびに動物用およびヒト用の医薬として使用するための抗病原体組成物も提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書において著者によって言及された刊行物の文献目録の細目を本明細書の最後にアルファベット順に集めた。
【０００４】
本明細書におけるいかなる先行技術に対する言及も、この先行技術があらゆる国におけるありふれた一般知識の一部をなすことを認識するものでも、いかなる形で示唆するものでもなく、またそのように解釈されるべきではない。
【０００５】
園芸産業および農業産業の前に立ちはだかっている大きな困難の1つは、真菌病原体などの病原体による侵入および結果として生じる損害の防止である。植物病原体は年に何百万トンもの廃棄生産物の原因となる。殺真菌剤および他の抗病原体化学薬品が首尾良く用いられてきたが、植物の有害生物を防除するための化学薬品の継続使用に関する環境上および規制上の広範囲の懸念がある。さらに、化学殺虫薬の使用の増加は、有害生物集団内での耐性発生の選択圧となっている。病原体、例えば、真菌、昆虫、微生物、線虫、クモ類、原生動物、およびウイルスに対する耐性を植物において誘導する代替機構を開発することが明らかに必要とされている。
【０００６】
植物自然免疫系は、構成成分または予め形成された成分と誘導成分の両方からなる。予め形成された免疫には、様々な物理的障壁、例えば、葉の表面にあるろう層および強固な細胞壁ならびに様々な抗菌タンパク質の発現が含まれる(Nurnberger et al. (2004) Immunol Rev 198:249-266（非特許文献1）)。誘導性応答には、細胞壁の強化(Showalter (1993) Plant Cell 5(1):9-23（非特許文献2）)ならびに様々な生物刺激および非生物刺激に応答して起こる、二次代謝産物のアップレギュレーション(Metlen et al.(2009) Plant Cell Environ 32(6):641-653（非特許文献3）)および抗菌タンパク質のアップレギュレーション(Berrocal-Lobo et al. (2002) Plant Physiol 128(3):951-961（非特許文献4）; Li and Asiegbu (2004) J Plant Res 117(2):155-162（非特許文献5）)が含まれ得る。これらの応答は局所的に感染部位において、または全身応答を生じるように植物の遠く離れた非感染部分において起こり得る。誘導性免疫はまた遺伝子対遺伝子(gene-for-gene)応答を介して起こり得る。遺伝子対遺伝子応答では、病原体関連分子パターン(PAMPS)が特異的なパターン認識受容体(PRR)によって認識されて、病原体のさらなる蔓延を防ぐ過敏感応答を生じる(Jones and Dangl(2006) Nature 444(7117):323-329（非特許文献6）を参照されたい)。
【０００７】
小さなジスルフィドリッチタンパク質が植物免疫の構成的局面および誘導的局面において大きな役割を果たす。これらはシステイン配置に基づいてファミリーに分類することができ、チオニン、スナキン(snakin)、タウマチン様タンパク質、ハベイン(havein)型タンパク質およびノッティン(knottin)型タンパク質、脂質輸送タンパク質およびサイクロチド、ならびにディフェンシンを含む。
【０００８】
植物ディフェンシンは、4〜5個のジスルフィド結合を有する小さな(45〜54アミノ酸)の塩基性タンパク質である(Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):214-8222（非特許文献7）)。これらは、共通のジスルフィド結合パターンおよび共通の構造折り畳みを有し、3つのジスルフィド結合によって3本の逆平行βシートがαヘリックスに繋ぎ止められて、システイン安定化αβモチーフ(CSαβ[図1を参照されたい])を形成する。4番目のジスルフィド結合もまたN末端とC末端を接続して、極めて安定な構造を形成する。抗菌活性、タンパク質合成阻害、ならびにα-アミラーゼ阻害およびプロテアーゼ阻害を含む様々な機能がディフェンシンによるものだと考えられている(Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194（非特許文献8）; Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104（非特許文献9）)。植物ディフェンシンはトランスジェニック植物において発現され、その結果、標的病原体に対する耐性が高まった。例えば、アルファルファディフェンシン(MsDef1、以前はalfAFPとして知られていた)を発現するジャガイモは、非形質転換対照と比較して真菌病原体である半身萎凋病菌(Verticillium dahliae)に対して著しい耐性を示した(Gao et al. (2000) Nat Biotechnol 18(2):1307-1310（非特許文献10）)。イネにおけるダリアディフェンシン(DmAMP1)の発現は、2種類の主要なイネ病原体であるイネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)およびリゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)に対する保護を提供するのに十分であった(Jha et al. (2009) Transgenic Res 18(1):59-69（非特許文献11）)。
【０００９】
植物ディフェンシンはその保存された構造にもかかわらず、配列同一性がほとんどなく、8つのシステイン残基しか完全に保存されていない。これらのシステイン残基は存在および位置がディフェンシン間で保存されているので、通称、「インバリアントシステイン残基」と呼ばれる。植物ディフェンシンは配列類似性に基づいて異なるグループに分類することができる(図2を参照されたい)。各グループの中での配列相同性は比較的高いが、グループ間のアミノ酸類似性は低い。異なるグループからの抗真菌ディフェンシンは異なる機構を介して作用するように思われる。
【００１０】
植物ディフェンシンは2つの主なクラスに分類することができる。クラスIディフェンシンは、小胞体(ER)シグナル配列とその後に続く成熟ディフェンシンドメインからなる。クラスIIディフェンシンは、約33アミノ酸のC末端プロドメインまたはプロペプチド(CTPP)を有するより大きな前駆体として産生される。今までに特定されたクラスIIディフェンシンの大部分はナス科植物種において発見されている。クラスIIナス科ディフェンシンのアラインメントを図3に示した。図3において言及されたNsD1およびNsD2は、本発明の開示に従って特定された新規ディフェンシンである。図3におけるNsD1およびNsD2の記載は、これらが先行技術の一部をなすことを意味するものではない。
【００１１】
クラスIIナス科ディフェンシンは抗真菌活性を示し、花組織において発現する。クラスIIナス科ディフェンシンには、観賞用タバコであるニコチアナ・アラタ(Nicotiana alata)の花において高濃度で発現するNaD1が含まれる(Lay et al. (2003) Plant Physiol 131(3):1283-1293（非特許文献12）)。NaD1は、抗真菌活性機構が調べられている唯一のクラスIIナス科ディフェンシンである。このペプチドの活性は、細胞壁との結合、原形質膜の透過性、および菌糸細胞質へのペプチドの進入を伴う(van der Weerden et al. (2008) J Biol Chem 283(21):14445-14452（非特許文献13）)。他の多くのディフェンシンとは異なり、NaD1は糸状菌に特異的であるようにみられ、酵母、細菌、または哺乳動物細胞の増殖に影響を及ぼさない。
【００１２】
ワタにおいてNaD1を発現させると、真菌病原体であるフザリウム・オキシスポラムf.sp.バシンフェクタム(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)および半身萎凋病菌に対する耐性が上昇する。NaD1を発現する植物が野外条件下で生き残る可能性は非形質転換対照植物の2倍であり、1ヘクタールあたりのリント収率は2倍であった。これにもかかわらず、NaD1発現植物には有意な水準の病気が依然としてあった。
【００１３】
ディフェンシンの構造は、システイン残基間の領域と定義される7本の「ループ」からなる。ループ1は、1番目のβ鎖(1A)、ならびに最初の2つのインバリアントシステイン残基間にある、このβ鎖とαヘリックスをつなぐ可動性領域の大部分(1B)を含む。図5は、保存システイン残基を含むNaD1のループ構造を示す。ループ2、3、および4の最初の部分(4A)はαヘリックスを構成するのに対して、残りのループ(4B〜7)はβ鎖2および3、ならびにこれらをつなぐ可動性領域(βヘアピン領域)を構成する。植物ディフェンシンのこのヘアピン領域は、多様なクラスの多くの抗菌ペプチドにおいて見られるγコアモチーフを形成する(Yount and Yeaman (2005) Protein Pept Lett 12(1):49-67（非特許文献14）)。
【００１４】
このβヘアピン領域は、植物ディフェンシンの生物学的活性に絶対必要であるように思われる。ラディッシュディフェンシンRsAFP2(図2を参照されたい)のこの領域における変異は、一般的に、その抗真菌活性に悪影響を及ぼす。実際に、抗真菌活性に絶対必要だと特定された12個の残基のうち8個がこの領域に位置する(De Samblanx et al. (1997) J Biol Chem 272(2):1171-1179（非特許文献15）)。さらに、分子のこの領域に対応する化学合成ペプチドもそれ自体で抗真菌活性を有する(Schaaper et al. (2001) J. Pept. Res. 57(5):409-418（非特許文献16）)。別の研究では、ヴィグナ・ラジアタ（Vigna radiata）に由来するディフェンシンであるVrD2のループ5に位置する6個の残基は、そのαアミラーゼ阻害活性に絶対必要であることが示された(Lin et al. (2007) Proteins 68(2):530-540（非特許文献17）)。3番目の研究では、抗真菌活性を有するディフェンシン(MsDef1)に由来する領域、および抗真菌活性を有さないディフェンシン(MtDef2)に由来する領域を含有するキメラタンパク質の活性が調べられた。MsDef1のβ2-β3ヘアピン領域を含有するキメラディフェンシンは、完全なMsDef1タンパク質、および活性のないMtDef2に由来するこの領域を含有するキメラディフェンシンとほぼ同じ活性を有した(Spelbrink et al. (2004) Plant Physiol 135(4):2055-2067（非特許文献18）)。
【００１５】
2番目のインバリアントシステイン残基に隣接し、そのN末端側に位置する、1番目のβ鎖とαヘリックスをつなぐ可動性ループ(ループ1B)は、ループ5に由来する残基とのパッチとして結合されたときに、一部のディフェンシンにおける抗真菌活性において軽微な役割を果たすと報告されている。RsAFP2の変異誘発研究から、この領域に位置する、活性に重要な2個のアミノ酸が特定された(De Samblanx et al, 1997 前記（非特許文献15）)。しかしながら、抗真菌ディフェンシンMsDef1のこの領域が、非抗真菌ディフェンシンに由来する対応する領域と交換されたとき、抗真菌活性はほんの少ししか変化しなかった(Spelbrink et al, 2004 前記（非特許文献18）)。
【００１６】
クラスIIナス科ディフェンシンは真菌に対して様々な程度の活性を有する。クラスIディフェンシンの中には非常に低い抗真菌活性を示すものもある。これらの抗病原体活性を改善し、かつ広げるためにディフェンシンを改変する試みは今までに大半が不首尾に終わった。一部のディフェンシンに対する耐性の発生もまた潜在的な問題である。ディフェンシンの抗病原体活性のレベルおよび範囲を操作するプロトコールを開発する必要がある。抗病原体活性を有する広範囲の新規ディフェンシンの作製は耐性発生との闘いも容易にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Nurnberger et al. (2004) Immunol Rev 198:249-266
【非特許文献２】Showalter (1993) Plant Cell 5(1):9-23
【非特許文献３】Metlen et al.(2009) Plant Cell Environ 32(6):641-653
【非特許文献４】Berrocal-Lobo et al. (2002) Plant Physiol 128(3):951-961
【非特許文献５】Li and Asiegbu (2004) J Plant Res 117(2):155-162
【非特許文献６】Jones and Dangl(2006) Nature 444(7117):323-329
【非特許文献７】Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):214-8222
【非特許文献８】Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194
【非特許文献９】Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104
【非特許文献１０】Gao et al. (2000) Nat Biotechnol 18(2):1307-1310
【非特許文献１１】Jha et al. (2009) Transgenic Res 18(1):59-69
【非特許文献１２】Lay et al. (2003) Plant Physiol 131(3):1283-1293
【非特許文献１３】van der Weerden et al. (2008) J Biol Chem 283(21):14445-14452
【非特許文献１４】Yount and Yeaman (2005) Protein Pept Lett 12(1):49-67
【非特許文献１５】De Samblanx et al. (1997) J Biol Chem 272(2):1171-1179
【非特許文献１６】Schaaper et al. (2001) J. Pept. Res. 57(5):409-418
【非特許文献１７】Lin et al. (2007) Proteins 68(2):530-540
【非特許文献１８】Spelbrink et al. (2004) Plant Physiol 135(4):2055-2067
【発明の概要】
【００１８】
概要
本明細書全体を通じて、文脈によって特に必要とされない限り、単語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの語尾変化は、述べられた要素もしくは整数もしくは方法の工程、または要素もしくは整数もしくは方法の工程の集まりを含むことを意味するが、他の任意の要素もしくは整数もしくは方法の工程、または要素もしくは整数もしくは方法の工程の集まりを排除することを意味しないことが理解されるだろう。
【００１９】
本明細書において使用するように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り複数の局面を含む。従って、例えば、本明細書において開示するように、「1つのディフェンシン」についての言及は、1種類のディフェンシンならびに2種類以上のディフェンシンを含み、「1つのアミノ酸の置換、付加、および/または欠失」についての言及は、1つのアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、ならびに2つ以上のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を含み、「その局面」についての言及は1つの局面ならびに2つ以上の局面を含む。
【００２０】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は配列番号(SEQ ID NO)によって表される。SEQ ID NOは数が配列識別子<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)などに対応する。配列識別子をまとめたものを表1に示した。特許請求の範囲の後に配列表を示す。
【００２１】
本開示は、抗病原体活性を有するディフェンシンの新たなファミリーを構成する、人工的に改変されたクラスIIナス科ディフェンシンを開示する。1つの態様において、改変されたクラスIIナス科ディフェンシンにおける抗病原体活性、特に、活性、安定性、および/または膜透過能力のレベルおよび/または範囲の1つまたは複数に関する抗病原体活性は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比較して高い。改変ディフェンシンは、病原体の侵入および増殖を防止するために園芸および農業において、ならびに動物用およびヒト用の医薬の製造において有用なことが本明細書において開示される。これらは単独で用いられてもよく、化学殺病原体剤(pathogenicide)、抗病原体タンパク質、および/またはプロテイナーゼ阻害剤もしくはその前駆型と併用されてもよい。ディフェンシンの新たなファミリーが利用できることは、ある特定のディフェンシンに対する病原体の耐性と闘うのにも役立つ。
【００２２】
クラスIIナス科ディフェンシンはバックボーンとして用いられる。ここで、ディフェンシンN末端部分の1番目のβ鎖(β鎖1)とαヘリックスとの間にあるループ領域(1番目の可動性ループとも記載される)は、アミノ酸の置換、付加、および/もしくは欠失によって改変される、ならびに/または、このループ領域の全てもしくは一部を交換するように、別のディフェンシンに由来するループ領域もしくはその改変型がクラスIIナス科ディフェンシンに接ぎ合わされる。バックボーンディフェンシンはまた、任意で、このループ領域外にさらなる変異を含んでもよい。1〜約50個のさらなる変異がアミノ酸の置換、付加、および/または欠失の形で存在するとき、ループ1B領域外の1つまたは複数の領域になされてもよい。
【００２３】
以下を含む、人工的に作り出されたディフェンシンが提供される:
(i)N末端領域内にループドメインを有するクラスIIナス科ディフェンシンに由来する、またはこれに対応するアミノ酸バックボーン;
(ii)(a)アミノ酸の置換、付加、および/もしくは欠失;ならびに/または(b)1番目のループドメインの全てもしくは一部と、別のディフェンシンに由来するループもしくはその改変型との交換の1つまたは複数に供された、バックボーン上にあるループドメイン。ここで、人工的に作り出されたディフェンシンは抗病原体活性を示す。本開示は、クラスIIナス科ディフェンシンの1番目のループドメイン、特に、ループ1Bを、クラスIディフェンシンのループドメインに対応するアミノ酸配列に変換する工程を含む、1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を開示する。または、クラスIIディフェンシンのループ1Bを交換するために別のクラスIIディフェンシンループ1B領域が用いられる。改変クラスIIナス科ディフェンシンはまた、このループ領域の外側に1つまたは複数のさらなるアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を含有してもよい。存在するのであれば、ループ領域の外側に1〜約50個のさらなる変異が位置してもよい。
【００２４】
1つの態様において、抗病原体活性は、改変前のクラスIIディフェンシンと比較して高い。「高い」とは、非改変クラスIIディフェンシンと比較した活性、安定性、および/または膜透過能力のレベルおよび/または範囲の1つまたは複数の改善を意味する。
【００２５】
バックボーンとして使用するためのクラスIIナス科ディフェンシンには、最もC末端側のインバリアントシステイン(C)残基を含む、NaD1成熟ドメインのC末端にある約20個の連続したアミノ酸残基配列(SEQ ID NO:52)にわたって少なくとも70％のアミノ酸配列類似性を有するディフェンシンが含まれる。クラスIIナス科ディフェンシンの例には、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、およびCc-gthが含まれる。他のバックボーンディフェンシンには、トウガラシ属(Capsicum)に由来するC20およびタバコ属(Nicotiana)に由来するSL549が含まれる。NsD1およびNsD2はニコチアナ・スアベオレンス(Nicotiana suaveolens)に由来し、アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:49および51に示される。
【００２６】
クラスIIナス科ディフェンシンのN末端領域にある「ループドメイン」についての言及は、最初の2つの(インバリアント)システイン(C)アミノ酸残基が隣接することによって規定されるループ領域全体を含む。これは、ディフェンシンのN末端領域にある最初の可動性ループである。しかしながら、1つの態様では、この「ループドメイン」は、1番目のβ鎖の末端から開始し、2番目のインバリアントシステインアミノ酸残基のN末端側で終わるループ領域を指す。この領域は、図5において「L1B」[ループ1B]と呼ばれる。クラスIIナス科ディフェンシンの一例であるNaD1において、この領域またはドメインは一文字表記ではアミノ酸配列NTFPGIを含む(図5を参照されたい)。他のクラスIIナス科ディフェンシンの最初のループ領域を図3に示した。図4は、8個の保存システイン残基を示す異なるクラスのディフェンシンのアミノ酸配列アラインメントの図である。
【００２７】
従って、X1X2X3X4X5X6のループ1Bアミノ酸配列を生じるように、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンのループ1B領域が変異されてもよく、別のディフェンシン、例えば、クラスIディフェンシンまたは別のクラスIIディフェンシンに由来するループ1B領域が所定の位置に接ぎ合わされてもよい。一文字アミノ酸命名法を用いると、式中、
X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、
変異クラスIIナス科ディフェンシンの中のアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のバックボーンを形成するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００２８】
1つの態様において、X1X2X3X4X5X6のアミノ酸配列を生じるように、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンのループ1B領域は変異されるか、または別のディフェンシン、例えば、クラスIディフェンシンに由来するループ1B領域が所定の位置に接ぎ合わされる。一文字アミノ酸命名法を用いると、式中、
X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3は、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5は、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のバックボーンを形成するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００２９】
別の態様において、X1X2X3X4X5X6のアミノ酸配列を生じるように、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンのループ1B領域は変異されるか、または別のディフェンシン、例えば、クラスIディフェンシンに由来するループ1B領域が所定の位置に接ぎ合わされる。一文字アミノ酸命名法を用いると、式中、
X1は、N、H、Q、D、K、もしくはEであり;
X2は、R、H、T、K、もしくはGであり;
X3は、F、H、Y、もしくはWであり;
X4は、P、K、S、もしくはRであり;
X5は、GもしくはFであり;かつ/または
X6は、P、V、I、Nであり
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００３０】
1つの態様において、人工的に作り出された、または改変されたディフェンシンは、SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列を含む。この配列において、ループ1B領域はX1X2X3X4X5X6と定義され、式中、
X1は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;かつ
X6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【００３１】
1つの態様において、人工的に作り出された、または改変されたディフェンシンは、SEQ ID NO:84に示されたアミノ酸配列を含む。この配列において、ループ1B領域はX1X2X3X4X5X6と定義され、式中、
X1は、N、H、Q、D、K、Eからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2は、R、H、T、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3は、F、H、Y、Wからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4は、P、K、S、Rからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5は、G、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;かつ
X6は、P、V、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【００３２】
1つの態様において、SEQ ID NO:39に示されたアミノ酸配列またはSEQ ID NO:39に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する単離されたナス科クラスIIディフェンシンが本明細書において開示される。改変は、クラスIIナス科ディフェンシンの中のループ1Bアミノ酸配列に対するアミノ酸の置換、付加、または欠失である。SEQ ID NO:39は、HXP4を作り出すための、NaD1バックボーンの中にあるNaD2ループ1B配列(HRFKGP)のアミノ酸配列である。本開示はNaD1に及ばないが、そのループ1B配列が変えられている改変NaD1に及ぶ。さらに、本開示は、FST、NeThio1、NeThio2、C20、SL549、PhD1、PhD2、TPP3、Na-gth、またはCc-gthに及ばないが、そのループ1B配列が変えられている、FST、NeThio1、NeThio2、C20、SL549、PhD1、PhD2、TPP3、Na-gth、またはCc-gthの改変型に及ぶ。
【００３３】
前記で示したように、これらの局面は、NaD1成熟ドメインのC末端領域にある約20個の連続したアミノ酸残基配列と70％以上のアミノ酸配列類似性を有するディフェンシンを含む、任意のクラスIIナス科ディフェンシンに適用される。20個の連続したアミノ酸配列はSEQ ID NO:52によって規定される。
【００３４】
1つの態様において、バックボーンアミノ酸配列上にあるループ1B領域は、
2014506461.tif 000003
、またはSEQ ID NO:67〜79のいずれか1つ、
2014506461.tif 000004
に改変される[一文字アミノ酸命名法を使用する]。都合よく、これは、
2014506461.tif 000005
に由来するループ1B領域、またはSEQ ID NO:67〜79によって規定されるループ1BをクラスIIナス科ディフェンシンバックボーンのループ1Bアミノ酸配列の部位に接ぎ合わせることによって、あるいは
2014506461.tif 000006
より選択されるループ1Bアミノ酸配列を生じるように既存のループ1B領域を改変することによって達成される。クラスIIナス科ディフェンシンは、改変ループ領域を単独で、またはループ領域外のディフェンシンバックボーンに対するアミノ酸の置換、付加、および/または欠失との組み合わせを含んでもよい。前記で示したように、SEQ ID NO:67〜79において規定されるループ1Bも用いられてもよく、クラスIIナス科ループ1Bが別のクラスIIナス科ディフェンシンバックボーンに置換されてもよい。
【００３５】
従って、ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ループ領域はアミノ酸の置換、欠失、および/または付加によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンが提供される。
【００３６】
1つの態様において、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にあるループ1B領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンが提供される。
【００３７】
別の態様は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にあるループ1B領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比較して高い抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、クラスIIナス科ディフェンシンは、最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約70％の類似性を有する成熟ドメインC末端部分を含む、人工的に作り出されたディフェンシンを提供する。「アミノ酸の置換、付加、および/または欠失」についての言及は1つまたは複数の置換、付加、および/または欠失を意味する。
【００３８】
1つの態様において、SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:57に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシン。改変は、ナス科クラスIIディフェンシンループ1B領域に対するものである。
【００３９】
1つの態様において、SEQ ID NO:84に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:84に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシン。改変は、ナス科クラスIIディフェンシンループ1B領域に対するものである。
【００４０】
1つの態様において、抗病原体活性は、特に、活性、安定性、および/または膜透過のレベルおよび/または範囲の1つまたは複数に関して、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比較して高い。1つの態様において、抗病原体活性は抗真菌活性である。1つの態様において、抗病原体活性は抗殺虫活性である。
【００４１】
さらなる態様において、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含むループ領域を生じるように、ループ領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、それによって、抗病原体活性を有するディフェンシンが作製され、式中、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいはX6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンが提供される。1つの態様において、ループ領域は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側に位置するループ1Bである。
【００４２】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含むループ領域を生じるように、ループ領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、それによって、抗病原体活性を有するディフェンシンが作製され、式中、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、またはRであり;X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、またはYであり;X3は、W、Y、H、L、G、F、またはPであり;X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、またはGであり;X5は、S、K、Y、F、G、またはHであり;X6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、T、またはYであり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンが提供される。1つの態様において、ループ領域は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側に位置するループ1Bである。
【００４３】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ディフェンシンバックボーン上にあるループ領域は、
2014506461.tif 000007
からなるリストより選択されるディフェンシンに由来するループ領域もしくはその改変型、またはSEQ ID NO:67〜79より選択されるループ1B配列と交換される、人工的に作り出されたディフェンシンが提供される。
【００４４】
1つの態様において、ループ領域は、1個または2個または3個または4個または5個または6個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変される。1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンは、改変ループ領域、ならびにループ領域外のバックボーン領域においてアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を両方とも含む。1〜約50個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失が存在するとき、ループ領域外になされてもよい。
【００４５】
病原体は、真菌(繊維状または非繊維状)、微生物、昆虫、クモ類、線虫、原生動物、またはウイルスでもよい。1つの態様において、病原体は真菌である。別の態様において、病原体は昆虫である。「増強された抗病原体活性」という用語は、より広域の作用、より高レベルの活性、より高い安定性、および/または増強された膜透過活性を含む。
【００４６】
1つの態様において、病原体は、植物真菌および動物真菌を含む真菌である。「動物真菌」には、ヒトを含む哺乳動物に感染する真菌、例えば、担子菌および子嚢菌が含まれる。
【００４７】
人工的に作り出されたディフェンシン分子ならびに人工的に作り出されたディフェンシン分子をコードする核酸分子を含む組成物も本明細書において提供される。組成物は、植物の中で、もしくは植物の表面に使用するためのものでもよく、ヒトを含む哺乳動物などの動物の中に、もしくは動物の表面に使用するためのものでもよい。組成物は、さらなる薬剤、例えば、化学殺病原体剤、タンパク質性殺病原体剤、および/あるいはセリンプロテイナーゼ阻害剤もしくはシステインプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体を含有してもよい。
【００４８】
病原体耐性植物を作製するためのプロトコール、ならびに病原体の侵入、増殖、および/または維持を治療または阻止するために、植物、およびヒトなどの哺乳動物を含む動物を治療するためのプロトコールがさらに提供される。さらに、本開示は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ループ領域は、抗病原体医薬の製造において、アミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンの使用を開示する。1つの局面において、化学殺病原体剤もしくはタンパク質性殺病原体剤および/またはプロテイナーゼ阻害剤もしくはその前駆体が用いられるか、改変ディフェンシンと併用される。1つの局面において、単一の遺伝子構築物は、変化したループ1B領域を含む改変ディフェンシン、およびプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型、例えば、NaPin1A(ニコチアナ・アラタに由来する)、ウシ膵臓トリプシン阻害剤(BPTI)、トマトシスタチン、阻害剤、S1Cys9、またはオオムギシスタチン、HvCPI6をコードする。別の態様において、複数の構築物が用いられ、それぞれが別々に、改変ディフェンシンおよびプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型の1つまたは複数をコードする。
【００４９】
1つの態様において、ループ領域はループ1Bである。
【００５０】
1つの態様において、オーストラリア原産のニコチアナ・スアベオレンス(Nicotiana suaveolens)に由来する単離されたディフェンシン、およびバックボーンディフェンシン分子としてのその使用が提供される。N.スアベオレンスディフェンシンにはNsD1およびNsD2が含まれる。NsD1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:48および49に示される。NsD2のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:49および51に示される。改変ループ1Bを単独で、またはバックボーンに対する1〜約50個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失と組み合わせて有するN.スアベオレンスディフェンシンもまた本明細書において意図される。N.スアベオレンスディフェンシンをコードする単離された核酸分子、例えば、異種プロモーターおよび/またはベクター核酸分子に機能的に連結された、N.スアベオレンスディフェンシンをコードする単離された核酸分子も提供される。
【００５１】
従って、本明細書において開示される別の局面は、SEQ ID NO:49[NsD1]に示されたアミノ酸配列または最適アラインメント後にSEQ ID NO:49[NsD1]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有するニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシンである。本明細書において開示される別の局面は、SEQ ID NO:51[NsD2]に示されたアミノ酸配列または最適アラインメント後にSEQ ID NO:51[NsD2]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有するニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシンに関する。
【００５２】
これらの局面によれば、N.スアベオレンスディフェンシンは、ディフェンシンならびに希釈剤、担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、および/または固体添加物もしくは液体添加物を含む製剤もしくは組成物の単離された、精製された形をとってもよく、製剤または組成物の一部として存在してもよい。
【００５３】
例えば、異種プロモーターおよび/またはベクター核酸分子に機能的に連結された、NsD1をコードする単離された核酸分子(SEQ ID NO:48)およびNsD2をコードする単離された核酸分子(SEQ ID NO:50)、ならびに最適アラインメント後にSEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:50に対して少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいは中程度のストリンジェントな条件下でSEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:50またはその相補型にハイブリダイズする核酸分子が本明細書において提供される。
【００５４】
改変ディフェンシンが別の薬剤、例えば、プロテイナーゼ阻害剤またはシスタチンと併用されたときに、植物細胞を形質転換するために、全てのタンパク質をコードする単一の遺伝子構築物が用いられてもよく、それぞれがタンパク質をコードする複数の構築物が用いられてもよい。または、ディフェンシンを発現するように改変された植物がプロテイナーゼ阻害剤または化学殺病原体剤の局所適用に供されてもよい。
【００５５】
本明細書全体にわたって用いられる配列識別子のまとめを表1に示す。
【００５６】
（表1）配列識別子のまとめ
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【００５７】
表2は、例示された改変ディフェンシンについて説明するために用いられた名称のまとめを示す。
【００５８】
（表2）改変ディフェンシンの名称のまとめ
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【００５９】
表3は、本明細書において用いられたアミノ酸残基の一文字表記および三文字表記のリストである。
【００６０】
（表3）アミノ酸残基の一文字略語および三文字略語のリスト
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
（図１）共通のジスルフィド結合パターンおよび共通の構造折り畳みを示し、3つのジスルフィド結合によって3本の逆平行βシートがαヘリックスに繋ぎ止められて、システイン安定化αβモチーフ(CSαβ)を形成する、ディフェンシン、NaD1、RsAFP1、VrD2、およびブラゼインの模式図である。4番目のジスルフィド結合もN末端とC末端を接続して、安定構造を形成する。
（図２）配列類似性に基づいてディフェンシンを16のグループに分類した模式図である。
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（図３）図3AおよびBは、クラスIIナス科ディフェンシンNaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、Na-gth、NpThio1、およびCc-gthの配列アラインメントの図である。図3Aの中の陰影は配列間の高度の保存を示す。
（図４）保存されている8個のシステイン残基の他に、位置7および10にあるアミノ酸しか高度に保存されていないことを明らかにした、異なるクラスのディフェンシンの配列アラインメントの図である。ナンバリングはNaD1との比較に基づく。
（図５）β鎖1とαヘリックスをつなぐループ1Bの位置を示す、NaD1ループ構造の模式図である。
（図６Ａ）組換えNaD1(rNaD1)の発現および精製を示すイムノブロットの図である。48時間で収集されたP.パストリス(P.pastoris)発現培地(30μL)ならびに非結合画分を含む様々な段階のSP sepharose精製からの試料(30μL)、洗浄液画分(30μL)、および最初の5つの1.5mL溶出画分(各30μL)をSDS-PAGEによって分離し、αNaD1抗体を用いてイムノブロッティングによって調べた。花(200ng)からのNaD1を正の対照として使用した。48時間発現培地中ならびにSP sepharose溶出画分中にrNaD1を検出することができた。
（図６Ｂ）SP sepharoseを用いてP.パストリスから精製されたrNaD1の純度を図示した逆相HPLCトレースの図である。rNaD1を含有するSP sepharose溶出画分を分析用C8 RP-HPLCカラムにロードし、40分の直線勾配(0〜100％緩衝液B)を用いて溶出した。タンパク質を215nmでの吸光度によって検出した。1つの主要なタンパク質を検出した。このことから、タンパク質は高純度であったことが分かる。
（図６Ｃ）花から精製された天然NaD1に対するrNaD1の構造の図である。rNaD1(白四角)および天然NaD1(黒ダイアモンド)の遠紫外線円二色スペクトルを比較した。これらは有意差を示さなかった。このことから、rNaD1は正確に折り畳まれたことが分かる。
（図６Ｄ）花から精製された天然NaD1に対するrNaD1の抗真菌活性の図である。rNaD1(白四角)または天然NaD1(黒ダイアモンド)の存在下でのフザリウム・オキシスポラムf.sp.バシンフェクタムの菌糸増殖を、同じ期間にわたって、タンパク質の無い対照の増殖と比べてプロットした。グラフは、四通り実施された3回の別個の実験からのデータを示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
（図７）NaD1およびNsD1と比較した、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)に対する、ループスワップ(swap)に用いられたクラスIディフェンシンの抗真菌活性のグラフ表示である。
（図８）NaD1と比較した、フザリウム・グラミネアラム(Fgr)に対する、ループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35の相対抗真菌活性のグラフ表示である。
（図９）NaD1と比較した、F.バーティシリオイデス(F.verticilloides)(Fve)に対するループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35の相対抗真菌活性のグラフ表示である。
（図１０）NaD1と比較したコレトトリカム・グラミニコラ(C.graminicola)(Cgr)に対するループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35の相対抗真菌活性のグラフ表示である。
（図１１）pHEX138構築物の模式図である。DNAを、pBIN19(Bevan (1984) Nucleic Acids Research 12:8711-8721)のレフトボーダーとライトボーダーとの間に挿入した。NaD1遺伝子を改変することによってDNAを作製した。略語は時計回りの順番で以下の通りである。
oriV:栄養複製起点(origin of vegetative replication)
ColE1 orl:コリシンE1から得られた複製起点;
TDNA RB:アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)TDNAのライトボーダー;
Nosプロモーター:ノパリン合成酵素Nos遺伝子プロモーター;
NPTII:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIをコードする遺伝子配列;
Nosターミネーター:Nos遺伝子ターミネーター配列;
破壊されたlacZ:βガラクトシダーゼの部分配列をコードするDNAセグメント;
CaMV 35Sプロモーター:カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sタンパク質プロモーター;
HXP4:NaD1の中のNaD2ループ1B[NaD2L1B]+CTPPをコードするDNA;
CaMV 35Sターミネーター:CaMV 35Sタンパク質をコードする遺伝子のターミネーター配列;
M13 ori:M13ウイルス複製起点;
TDNA LB:TDNAレフトボーダー;
全ての矢印が転写方向を示す。
（図１２）NaD1と比較した、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)に対するループ変種HXP4の相対抗真菌活性のグラフ表示である。
（図１３）図13A〜Cは、NaD1と比較した、クリプトコッカス属(Cryptococcus)の種に対するHXP4の相対抗真菌活性のグラフ表示である。
（図１４）図14A〜Cは、NaD1と比較した、アジアダイズサビ菌(ファコプソラ・パキルヒジ(Phakopsora pachyrhizi))に対する、発芽(24時間、A)、付着器(24時間、B)、および付着器後構造(48時間、C)に対するHXP4の効果のグラフ表示である。
（図１５）コーンにおいて使用するためのHvCPI6(オオムギシスタチン)をコードするヌクレオチド配列を含む構築物のヌクレオチド配列の図である。HvCPI6のアミノ酸配列も示す。
（図１６）コーンにおいて使用するためのHvCPI6(オオムギシスタチン)および改変ディフェンシンHXP4をコードするヌクレオチド配列を含む構築物のヌクレオチド配列の図である。HvCPI6およびHXP4のアミノ酸配列も示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
抗病原体活性を有する改変ディフェンシン分子が提供される。「改変ディフェンシン」、「変種ディフェンシン」、「変異ディフェンシン」、および「キメラディフェンシン」という用語は全て、本明細書において説明される改変クラスIIナス科ディフェンシンについて説明するために使用することができる。1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンは、ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖(β鎖1)とαヘリックスとの間にあるループ領域において改変される。1つの態様において、ループ領域は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にある6個のアミノ酸またはその等価物を含む。この領域は「ループ1B」と定義される(図5を参照されたい)。クラスIIナス科ディフェンシンは、成熟ドメインの比較的保存されたC末端部分によって他のディフェンシンと区別される。「クラスIIナス科ディフェンシン」についての言及は、NaD1成熟ドメインのC末端部分に対して少なくとも70％のアミノ酸配列類似性を有する任意のディフェンシンを含む。NaD1のC末端部分は、NaD1成熟ドメインの中にある最もC末端側のインバリアントシステインを末端として含む約20個の連続したアミノ酸残基(例えば、SEQ ID NO:52)を含む。「少なくとも70％」とは、少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％を意味する。表4は、NaD1のC末端アミノ酸配列と多数のクラスIIナス科ディフェンシン成熟ドメインとのパーセント同一性を示す。
【００６３】
クラスIIナス科ディフェンシンの中にあるループ1Bアミノ酸配列は配列X1X2X3X4X5X6に改変され、式中、一文字アミノ酸命名法を用いると、
X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはVであり;
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００６４】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンの中にあるループ1B配列は配列X1X2X3X4X5X6に改変され、式中、
X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3は、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5は、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００６５】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンの中にあるループ1B配列は配列X1X2X3X4X5X6に改変され、式中、
X1は、N、H、Q、D、K、またはEであり;
X2は、R、H、T、K、またはGであり;
X3は、F、H、Y、またはWであり;
X4は、P、K、S、またはRであり;
X5は、GまたはFであり;
X6は、P、V、I、またはNであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００６６】
「X1X2X3X4X5X6」についての言及は、ループ1B領域に対応する6個の連続したアミノ酸残基を意味する。
【００６７】
1つの態様において、人工的に作り出された、または改変されたディフェンシンは、SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列を含む。この配列において、ループ1B領域はX1X2X3X4X5X6と定義され、式中、
X1は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【００６８】
1つの態様において、人工的に作り出された、または改変されたディフェンシンは、SEQ ID NO:84に示されたアミノ酸配列を含む。この配列において、ループ1B領域はX1X2X3X4X5X6と定義され、式中、
X1は、N、H、Q、d、K、Eからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2は、R、H、T、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3は、F、H、Y、Wからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4は、P、K、S、Rからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5は、G、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X6は、P、V、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【００６９】
クラスIIナス科ディフェンシンであるNaD1の場合、ループ1Bアミノ酸配列はNTFPGI(SEQ ID NO:12)である。結果として、NTFPGIは、Nが、A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であるX1の1つと交換され;Tが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であるX2と交換され;Fが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であるX3と交換され;Pが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であるX4と交換され;Gが、A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であるX5と交換され;および/あるいはIが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはVであるX6と交換されるように改変され、但し、ループ1Bアミノ酸配列は、NaD1に由来するループ1Bと一致しない。1つの態様において、ループ1B領域はX1X2X3X4X5X6と定義され、式中、X1は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。ループ1B配列は、1個のアミノ酸変化を有してもよく、2個または3個または4個または5個または6個全てのアミノ酸が変えられてもよい。これは、「1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失」という表現に包含される。
【００７０】
クラスIIナス科ディフェンシンは、ループ1B領域に対する任意の数のアミノ酸変化のみによって改変されてもよく、他の変異と組み合わせて改変されてもよい。他の変異には、アミノ酸の置換、付加、および/または欠失が含まれる。ループ1B領域外の変異は1〜約50の数でよい。「変化」は、あるディフェンシンに由来するループ1B領域を、クラスIIナス科ディフェンシンループ1B領域に接ぎ合わせることを含む。供給源はクラスIディフェンシンループ1Bでもよく、別のクラスIIディフェンシンに由来するループ1Bでもよい。これらの局面は、少なくとも1つの植物病原体または動物病原体に対する改変ディフェンシンの抗病原体活性が維持されるという条件に基づく。1つの態様において、抗病原体活性は、活性、安定性、および/または透過性のレベルまたは範囲に関して、改変前のクラスIIディフェンシンと比べて増強されている。
【００７１】
改変クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンを含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、抗病原体活性を有する変種ディフェンシンを生じるように、N末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にあるループ領域は1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンが本明細書において提供される。1つの態様において、ループ領域は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にある6個のアミノ酸残基によって規定されるループ1Bである。図3〜図5を参照することができる。任意のディフェンシンにあるその等価な領域が本明細書において意図される。ループ1B領域に対して1〜約6個のアミノ酸変化がなされてもよい。1つの態様において、抗病原体活性は抗真菌活性または抗昆虫活性である。1つの態様において、改変クラスIIナス科ディフェンシンの抗病原体活性は、特に、活性、安定性、および/または膜透過能力のレベルおよび/または範囲の1つまたは複数に関して、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比較して増強されている。
【００７２】
本明細書において開示される別の局面は、2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にあるループ1B領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンを提供する。
【００７３】
「1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失」は、「アミノ酸の置換、付加、および/または欠失」という表現に包含される。人工的に作り出されたディフェンシンはディフェンシンの新たなファミリーに相当する。改変ディフェンシンは、病原体の侵入および増殖を防止するために園芸および/または農業において、ならびに動物またはヒトにおいて使用するための医薬として用いられることが本明細書において開示される。改変ディフェンシンは単独で用いられてもよく、化学殺病原体剤、タンパク質抗病原体薬剤、および/あるいはセリンプロテイナーゼ阻害剤もしくはシステインプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型と併用されてもよい。ディフェンシンのパネルから選択できることは、ディフェンシンに対する病原体の耐性の発生と闘うのに役立つ。
【００７４】
プロテイナーゼ阻害剤または抗病原体薬剤と併用されたとき、これらは別々に局所に適用されてもよく、一方が遺伝子組換え植物の中で発現され、他方が局所に適用されてもよく、改変ディフェンシンならびにプロテイナーゼ阻害剤および/または抗病原体薬剤の全てが1種類または複数の種類の遺伝子構築物上で発現されてもよい。
【００７５】
「ループ1B」とは、図5に図示された2番目のインバリアントシステイン残基のN末端側にある6個のアミノ酸残基またはその等価物を意味する。VrD1およびNeThio1などのディフェンシンの中には5個のアミノ酸残基しかないものもある。しかしながら、この場合、ループ1B領域は5個の残基を含む。これはまた、β鎖1とαヘリックスとの間にある1番目の可動性ループ領域とも説明される。ループ1A(図5を参照されたい)はβ鎖である。
【００７６】
前記で示したように、「アミノ酸の置換、付加、および/または欠失」についての言及は、ループ1Bと、別のディフェンシンに由来するループ1Bとの交換を包含する1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を含む。このような交換は、本明細書において、ドメインスワップ、ループスワップ、グラフティング(grafting)、または他の類似表現と呼ばれる。「別のディフェンシン」についての言及は、クラスIディフェンシンであろうとクラスIIディフェンシンであろうと任意のディフェンシンを含む(図2も参照されたい)。クラスIIディフェンシンバックボーンは、任意で、C末端テール(すなわち、CTPP)の除去によって、もしくは既存のCTPPと別のテールとの交換によってさらに改変される、および/またはバックボーンは、前記で言及されたループ領域外の、バックボーンループ上の位置にある1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有してもよい。「クラスIIナス科ディフェンシン」は、最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有する任意のディフェンシンを含む。SEQ ID NO:52は、NaD1成熟ドメインの中の最もC末端側のシステイン残基で終わり、かつこれを含む20個の連続したアミノ酸残基である。SEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有する、このようなクラスIIナス科ディフェンシンの例を表4に列挙した。
【００７７】
従って、抗病原体活性を有する改変ディフェンシンを生じるように、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1B領域に対してアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有する、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンを含む改変ディフェンシンが本明細書において開示される。1つの態様において、抗病原体活性は、改変前のクラスIIディフェンシンと比べて増強されている。
【００７８】
1つの態様において、抗病原体活性を有する改変ディフェンシンを生じるように、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1B領域に対してアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有する、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンを含む改変ディフェンシンであって、クラスIIナス科ディフェンシンは、成熟ドメインのC末端領域において、最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、改変ディフェンシンが提供される。
【００７９】
1つの態様において、SEQ ID NO:39に示されたアミノ酸配列またはSEQ ID NO:39に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する単離されたナス科クラスIIディフェンシンであって、改変が、クラスIIナス科ディフェンシンの中のループ1Bアミノ酸配列に対するアミノ酸の置換、付加、または欠失である、抗病原体活性を有する単離されたナス科クラスIIディフェンシンが本明細書において開示される。1つの態様において、抗病原体活性は抗真菌活性である。
【００８０】
SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列または最適アラインメント後にSEQ ID NO:57に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンであって、改変は、ナス科クラスIIディフェンシンループ1B領域に対するものである、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンも本明細書において開示される。
【００８１】
1つの態様において、SEQ ID NO:84に示されたアミノ酸配列または最適アラインメント後にSEQ ID NO:84に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンであって、改変は、ナス科クラスIIディフェンシンループ1B領域に対するものである、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンが本明細書において開示される。
【００８２】
「少なくとも70％の類似性」についての言及は、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、および100％の類似性を含む。1つの態様において、これは同一性と呼ばれることがある。
【００８３】
さらに、本開示は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖(β鎖1)とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、それによって、抗病原体活性を有するディフェンシンが作製され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいはX6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンを提供する。1つの態様において、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、N、またはそれらの天然改変型からなるリストより選択されるアミノ酸であり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００８４】
さらに、本開示は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖(β鎖1)とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、それによって、抗病原体活性を有するディフェンシンが作製され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、またはRであり;X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、またはYであり;X3は、W、Y、H、L、G、F、またはPであり;X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、またはGであり;X5は、S、K、Y、F、G、またはHであり;X6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、またはYであり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンを提供する。
【００８５】
1つの態様において、X1は、N、H、Q、D、K、もしくはEであり;X2は、R、H、T、K、もしくはGであり;X3は、F、H、Y、もしくはWであり;X4は、P、K、S、もしくはRであり;X5は、GもしくはFであり;かつ/またはX6は、P、V、I、もしくはNであり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B配列の例には、NaD1(N.アラタ)、NsD1(N.スアベオレンス)、NsD2(N.スアベオレンス)、NeThio2(N.エクセルシオル)、およびFST(N.タバカム(N.tabacum))に由来するNTFPGI;PhD1(P.ハイブリダ)に由来するPTWDSV;PhD2(P.ハイブリダ)に由来するPTWEGI;TPP3(S.リコペルシカム(S.lycopersicum))に由来するQTFPGL;Na-gth(N.アテヌアタ)に由来するNTFEGF;Np-Thio1(N.パニクラタ)に由来するNTFPGL;NeThio1(N.エクセルシオル)に由来するIFTGL、およびCc-gth(C.チャイネンセ(C.chinense))に由来するKHFKGLが含まれる。別のループ1B配列はKYFKGL(SEQ ID NO:60)である。
【００８６】
本明細書において開示されるさらに別の局面は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、およびCc-gthからなるリストより選択され、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ディフェンシンバックボーン上にあるループ領域は、
2014506461.tif 000015
からなるリストより選択されるディフェンシンに由来するループ領域もしくはその改変型、またはSEQ ID NO:67〜79より選択されるループ1B配列と交換される、人工的に作り出されたディフェンシンに関する。
【００８７】
1つの態様において、抗病原体活性は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比較して増強されている。増強された活性を求めるためのパラメータには、活性のレベルおよび/もしくは範囲、安定性の程度、ならびに/または透過活性のレベルが含まれる。1つの態様において、ループ領域は、本明細書において定義されたループ1Bである。これは、ディフェンシンの中の1番目の可動性ループである。
【００８８】
前記で示したように、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1B領域はアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含み、それぞれのXは前記で定義された通りであり、全般的に（しかし非限定的に）、少なくとも1つのアミノ酸残基、または1つの局面では6個全ての(もしくは対応する5個の)アミノ酸残基を含む複数のアミノ酸残基は、別のディフェンシン（例えば、クラスIディフェンシンもしくは別のクラスIIディフェンシン）に由来するループ1Bまたはその誘導体に対応する配列に交換される。
【００８９】
以下を含む、抗病原体活性を有する改変ディフェンシンも提供される:
(i)ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を含むクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列;
(ii)別のディフェンシンループ1Bに類似する、または別のディフェンシンループ1Bに相同な、または別のディフェンシンループ1Bと他の点で機能上類似するループ1B領域を生じるように、アミノ酸の置換、付加、欠失、またはスワップによって改変された、ディフェンシン上のループ1B領域;
(iii)結果として生じたループ1Bがアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含み、式中、一文字アミノ酸命名法を用いると、
X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV;またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００９０】
以下を含む、抗病原体活性を有する改変ディフェンシンも提供される:
(i)ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を含むクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列;
(ii)別のディフェンシンループ1Bに類似する、または別のディフェンシンループ1Bに相同な、または別のディフェンシンループ1Bと他の点で機能上類似するループ1B領域を生じるように、アミノ酸の置換、付加、欠失、またはスワップによって改変された、ディフェンシン上のループ1B領域;
(iii)結果として生じたループ1Bがアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含み、式中、
X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3は、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5は、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００９１】
さらに、バックボーンアミノ酸配列は、ループ1B領域外の領域に対するアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を含んでもよい。約1〜約50個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失が存在するのであれば、ループ1B領域外のバックボーンアミノ酸配列に対してなされてもよい。「1〜50」とは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50を意味する。1つの態様において、さらなる変異は、II型ナス科ディフェンシンのC末端テール(CTPP)の中にある。
【００９２】
X1X2X3X4X5X6を含むループ1B配列を導入するようにアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されたループ1B領域またはその等価物を有する、ニコチアナ・スアベオレンス(オーストラリア原産)に由来するバックボーンディフェンシン分子を含み、抗病原体活性を有する、改変ディフェンシンであって、式中、一文字アミノ酸命名法を用いると、
X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、改変ディフェンシンも提供される。1つの態様において、N.スアベオレンスディフェンシンはNsD1およびNsD2より選択される。
【００９３】
本明細書において提供される別の態様は、X1X2X3X4X5X6を含むループ1B配列を導入するように1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されたループ1B領域またはその等価物を有する、ニコチアナ・スアベオレンス(オーストラリア原産)に由来するバックボーンディフェンシン分子を含み、抗病原体活性を有する、改変ディフェンシンであって、式中、
X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3は、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5は、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、改変ディフェンシンを含む。1つの態様において、N.スアベオレンスディフェンシンはNsD1およびNsD2より選択される。
【００９４】
1つの態様において、X1X2X3X4X5X6は、以下より選択されるアミノ酸残基を含む。
X1は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【００９５】
この点に関して、さらに、本開示は、SEQ ID NO:49[NsD1]に示されたアミノ酸配列または最適アラインメント後にSEQ ID NO:49[NsD1]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシンを提供する。本開示の別の局面は、SEQ ID NO:51[NsD2]に示されたアミノ酸配列または最適アラインメント後にSEQ ID NO:51[NsD2]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有するニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシンに関する。NsD1およびNsD2をコードするヌクレオチド配列、例えば、それぞれ、SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:50、あるいは最適アラインメント後にSEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:50に対して少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは中程度のストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:50またはSEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:50の相補型とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も本明細書において意図される。「少なくとも70％の同一性」とは、少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、988％、99％、または100％を意味する。1つの局面において、活性の範囲もしくはレベル、安定性のレベル、および/または透過性を誘導する能力に基づいて、抗病原体活性は改変前のNsD1またはNsD2と比較して増強されている。
【００９６】
1つの態様において、クラスIIディフェンシンのループ領域はX1X2X3X4X5X6によって置換され、式中、
X1は、N、H、Q、D、K、もしくはEであり;
X2は、R、H、T、K、もしくはGであり;
X3は、F、H、Y、もしくはWであり;
X4は、P、K、S、もしくはRであり;
X5は、GもしくはFであり;かつ/または
X6は、P、V、I、もしくはNであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない。
【００９７】
バックボーンディフェンシンがNaD1である限り、ループ1Bは改変されてもよく、改変は、以下:
Nは、A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、およびVより選択されるアミノ酸残基、もしくはそれらの天然改変型で置換され;
Tは、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、およびVより選択されるアミノ酸残基、もしくはそれらの天然改変型で置換され;
Fは、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y、およびVより選択されるアミノ酸残基、もしくはそれらの天然改変型で置換され;
Pは、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、およびVより選択されるアミノ酸残基、もしくはそれらの天然改変型で置換され;
Gは、A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、およびVより選択されるアミノ酸残基、もしくはそれらの天然改変型で置換され;ならびに/または
Iは、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、およびVより選択されるアミノ酸残基、もしくはそれらの天然改変型で置換され、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、NaD1に由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない
を含む。
【００９８】
バックボーンディフェンシンがNaD1である限り、ループ1Bは改変されてもよく、改変は、以下:
Nは、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、T、およびRより選択されるアミノ酸残基で置換され;
Tは、K、R、G、H、L、N、F、I、S、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換され;
Fは、W、Y、H、L、G、およびPより選択されるアミノ酸残基で置換され;
Pは、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、またはGより選択されるアミノ酸残基で置換され;
Gは、S、K、Y、F、およびHより選択されるアミノ酸残基で置換され;ならびに/または
Iは、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される
の1つまたは複数を含む。
【００９９】
1つの態様において、X1X2X3X4X5X6は、以下より選択されるアミノ酸残基を含む。
X1は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【０１００】
X1からX6の「1つまたは複数」とは、1個または2個または3個または4個または5個または6個全てのアミノ酸残基が改変されることを意味する。ループ1B領域外の変異が存在するのであれば、1〜約50個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を含む。
【０１０１】
「病原体」についての言及は、真菌、細菌を含む微生物、昆虫、クモ類、ウイルス、および線虫、ならびに原生動物を含む。1つの態様において、病原体は真菌または昆虫である。
【０１０２】
「真菌」についての言及は、植物または動物に感染する、他の状況では植物または動物の病原体である真菌を含む。動物真菌病原体には、ヒトを含む哺乳動物の真菌病原体が含まれる。特定の真菌病原体には、コレトトリカム・グラミニコラ(Colletotrichum graminicola)、ディプロディア・メイディス(Diplodia maydis)、フザリウム・グラミネアラムおよびフザリウム・バーティシリオイデス(Fusarium verticilloides)が含まれる。主要な農作物の特定の病原体には、コーン:ジベレラ・ゼアエ(Gibberella zeae) (フザリウム・グラミネアラム)、コレトトリカム・グラミニコラ、ステノカルペラ・メイディ(Stenocarpella maydi) (ディプロディア・メイディス)、フザリウム・モニリフォルメ var.サブグルチナンス(Fusarium moniliforme var. subglutinans)、フザリウム・バーティシリオイデス、ビポラリス・メイディス O, T.(Bipolaris maydis O, T.)(コクリオボリス・ヘテロストロファス(Cochliobolis heterostrophus))、エキセロヒラム・ツルシカム(Exserohilum turcicum) I、II、およびIII、セルコスポラ・ゼアエメイディス(Cercospora zeae-maydis)、フィチウム・イレグラレ(Pythium irregulare)、フィチウム・デバリアナム(Pythium debaryanum)、フィチウム・グラミニコラ(Pythium graminicola)、フィチウム・スプレンデンス(Pythium splendens)、フィチウム・ウルチマム(Pythium ultimum)、フィチウム・アファニデルマタム(Pythium aphanidermatum)、アスペルギルス属の種、黄色アスペルギルス(Aspergillus flavus)、ヘルミトスポリウム・カルボナム(Helminthosporium carbonum) I、II、およびIII (コクリオボラス・カルボナム(Cochliobolus carbonum))、ヘルミトスポリウム・ペディセラタム(Helminthosporium pedicellatum)、フィソデルマ・メイディス(Physoderma maydis)、フィロスチクタ・メイディス(Phyllosticta maydis)、カバチエラ・メイディス(Kabatiella maydis)、セルコスポラ・ソルギ(Cercospora sorghi)、ウスティラゴ・メイディス(Ustilago maydis)、ウスティラゴ・ゼアエ(Ustilago zeae)、パシニア・ソルギ(Puccinia sorghi)、パシニア・ポリソラ(Puccinia polysora)、マクロホミナ・ファセオリナ(Macrophomina phaseolina)、ペニシリウム・オキサリカム(Penicillium oxalicum)、ニグロスポラ・オリザエ(Nigrospora oryzae)、クラドスポリウム・ヘルバリウム(Cladosporium herbarium)、クルブラリア・ルナタ(Curvularia lunata)、クルブラリア・イナエキアリス(Curvularia inaequalis)、クルブラリア・パレセンス(Curvularia pallescens)、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)、クラビセプス・ソルギ(Claviceps sorghi)、ディプロディア・マクロスポラ(Diplodia macrospora)、スクレロフトラ・マクロスポラ(Sclerophthora macrospora)、ペロノスクレロスポラ・ソルギ(Peronosclerospora sorghi)、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス(Peronosclerospora philippinensis)、ペロノスクレロスポラ・メイディス(Peronosclerospora maydis)、ペロノスクレロスポラ・サカリ(Peronosclerospora sacchari)、スファセロテカ・レイリアナ(Sphacelotheca reiliana)、フィソペラ・ゼアエ(Physopella zeae)、セファロスポラム・メイディス(Cephalosporum maydis)、セファロスポラム・アクレモニウム(Cephalosporum acremonium); ダイズ:フザリウム・ビルグルリフォルメ(Fusarium virgululiforme)、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)、スクレロチニア・スクレロチオルム(Sclerotinia sclerotiorum)、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ(Fusarium tucumaniae)、ファコプソラ・パキルヒジ、フィトフトラ・メガスペルマ f.sp.グリシネア(Phytophthora megasperma f.sp. glycinea)、フィトフトラ・ソジャエ(Phytophthora sojae)、マクロホミナ・ファセオリナ、リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)、スクレロチニア・スクレロチオルム、ディアポルテ・ファセオロラム var.ソジャエ(Diaporthe phaseolorum var. sojae) (フォモプシス・ソジャエ(Phomopsis sojae))、ディアポルテ・ファセオロラムvar.カウリボラ(Diaporthe phaseolorum var. caulivora)、スクレロチウム・ロルフシ(Sclerotium rolfsii)、セルコスポラ・キクチ(Cercospora kikuchii)、セルコスポラ・ソジナ(Cercospora sojina)、ペロノスポラ・マンシュリカ(Peronospora manshurica)、コレトトリカム・デマチウム(Colletotrichum dematium) (コレトトリカム・トランカタム(Colletotrichum truncatum))、コリネスポラ・カシイコラ(Corynespora cassiicola)、セプトリア・グリシネス(Septoria glycines)、フィロスティクタ・ソジコラ(Phyllosticta sojicola)、アルテルナリア・アルテナタ(Alternaria altenata)、マイクロスファエラ・ディフサ(Microsphaera diffusa)、フザリウム・セミテクタム(Fusarium semitectum)、フィアロホラ・グレガタ(Phialophora gregata)、グロメレラ・グリシネス(Glomerella glycines)、フィチウム・アファニデルマタム、フィチウム・ウルチマム、フィチウム・デバリアナム; キャノーラ:アルブゴ・カンジダ(Albugo candida)、アルテルナリア・ブラシカエ(Alternaria brassicae)、レプトスファエリア・マクランス(Leptosphaeria maculans)、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオルム、マイコスファエレラ・ブラシシコラ(Mycosphaerella brassicicola)、フィチウム・ウルチマム、ペロノスポラ・パラシチカ(Peronospora parasitica)、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・アベナセウム(Fusarium avenaceum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、アルテナリア・アルテルナタ(Alternaria alternata); ワタ:フザリウム・オキシスポラムf.sp.バシンフェクタム、半身萎凋病菌、チエラビオプシス・バシコラ(Thielaviopsis basicola)、アルテナリア・マクロスポラ(Alternaria macrospora)、セルコスポラ・ゴシピナ(Cercospora gossypina)、フォマ・エキシグア(Phoma exigua) (アスコチタ・ゴシピ(Ascochyta gossypii))、フィチウム属の種、リゾクトニア・ソラニ、プチニア・スケダルディ(Puccinia scheddardii)、プチニア・カカバタ(Puccinia cacabata)、ファマトトリコプシス・オムニボレ(Phymatotrichopsis omnivore); キャノーラ:レプトスファエリア・マクランス、スクレロチニア・スクレロチオルム、アルテルナリア・ブラシカエ、アルテナリア・ブラシシコラ(Alternaria brasicicola)、プラスモディフォラ・ブラシカエ(Plasmodiophora brassicae)、リゾクトニア・ソラニ、フザリウム属の種、フィチウム属の種、フィトフトラ属(Phytophthora)の種、アルテルナリア属の種、ペロノスポラ・パラシチカ、マイコスファエレラ・カプセラエ(Mycosphaerella capsellae) (シュードセルコスポレラ・カプセラエ(Pseudocercosporella capsellae))、アルブゴ・カンジダ、ファイトフトホラ・メガスペルマvar.メガスペルマ(Phytophtohora megasperma var. megasperma)、ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea)、エリシフェ・クルシフェララム(Erysiphe cruciferarum); コムギ:コクリオボルス・サチバス(Cochliobolus sativus)、ドレクスレラ・ウィレガネンシス(Drechslera wirreganensis)、マイコスファエレラ・グラミニコラ(Mycosphaerella graminicola)、ファエオスファエリア・アベナリアf.sp.トリチセア(Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticea)、ファエオスファエリア・ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)��ブルメリア・グラミニスf.sp.トリシチ(Blumeria graminis f.sp. tritici)、ウロシスティス・アグロピリ(Urocystis agropyri)、アルテナリア・アルテルナタ、クラドスポリウム・ヘルバラム(Cladosporium herbarum)、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・アベナセウム、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・シュードグラミネアラム(Fusarium pseudograminearum)、ウスチラゴ・トリチシ(Ustilago tritici)、アスコチタ・トリチシ(Ascochyta tritici)、セファロスポリウム・グラミネウ(Cephalosporium gramineum) 、コレトトリカム・グラミニコラ、エリシフェ・グラミニスf.sp.トリチシ(Erysiphe graminis f.sp. tritici)、プチニア・グラミニスf.sp.トリチシ(Puccinia graminis f.sp. tritici)、プチニア・レコンディタf.sp.トリチシ(Puccinia recondita f.sp. tritici)、プチニア・ストリフォルミス(Puccinia striiformis)、プチニア・トリチシナ(Puccinia triticina)、スクレロフトラ・マクロスポラ、ウロシスティス・アグロピリ、ピレノフォラ・トリチシ-レペンティス(Pyrenophora tritici-repentis)、ピレノフォラ・セメニペルダ(Pyrenophora semeniperda)、ファエオスファエリア・ノドラム、セプトリア・ノドラム(Septoria nodorum)、セプトリア・トリチシ(Septoria tritici)、セプトリア・アベナエ(Septoria avenae)、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス(Pseudocercosporella herpotrichoides)、リゾクトニア・ソラニ、リゾクトニア・セレアリス(Rhizoctonia cerealis)、ガエウマンノマイセス・グラミニスvar.トリチシ(Gaeumannomyces graminis var. tritici)、フィチウム属の種、フィチウム・アファニデルマタム、フィチウム・アルヘノマンネス(Pythium arrhenomannes)、フィチウム・グラミコラ(Pythium gramicola)、フィチウム・ウルチマム、ビポラリス・ソロキニアナ(Bipolaris sorokiniana)、クラビセプス・プルプレア(Claviceps purpurea)、タペシア・ヤルンダエ(Tapesia yallundae)、チレチア・トリチシ(Tilletia tritici)、チレチア・ラエビス(Tilletia laevis)、チレチア・カリエス(Tilletia caries)、チレチア・インディカ(Tilletia indica)、ウスチラゴ・トリチシ、ウォジノウィシア・グラミニス(Wojnowicia graminis)、コクリオボルス・サチバス;ソルガム:エキセロヒラム・ツルシカム、コレトトリカム・サブリネオラム(Colletotrichum sublineolum)、セルコスポラ・ソルギ、グロエオセルスポラ・ソルギ(Gloeocercospora sorghi)、アスコシタ・ソルギナ(Ascochyta sorghina)、プチニア・プルプレア(Puccinia purpurea)、マクロホミナ・ファセオリナ、ペルコニア・シルシナタ(Perconia circinata)、フザリウム・モニリフォルメ(Fusarium moniliforme)、アルテナリア・アルテルナタ、ビポラリス・ソルギコラ(Bipolaris sorghicola)、ヘルミントスポリウム・ソルギコラ(Helminthosporium sorghicola)、クルブラリア・ルナタ、フォマ・イシディオサ(Phoma insidiosa)、ラムリスポラ・ソルギ(Ramulispora sorghi)、ラムリスポラ・ソルギコラ(Ramulispora sorghicola)、フィラカラ・サカリ(Phyllachara saccari)、スポリソリウム・レイリアナム(Sporisorium reilianum) (スファセロテカ・レイリアナ)、スファセロテカ・クルエンタ(Sphacelotheca cruenta)、スポリソリウム・ソルギ(Sporisorium sorghi)、クラビセプス・ソルギ、リゾクトニア・ソラニ、アクレモニウム・ストリクタム(Acremonium strictum)、スクレロフトナ・マクロスポラ(Sclerophthona macrospora)、ペロノスクレロスポラ・ソルギ、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、スクレロスポラ・グラミニコラ(Sclerospora graminicola)、フザリ���ム・グラミネアラム、フザリウム・オキシスポラム、フィチウム・アルヘノマネス(Pythium arrhenomanes)、フィチウム・グラミニコラ; ヒマワリ:プラスモパラ・ハルステジ(Plasmopara halstedii)、スクレロチニア・スクレロチオルム、セプトリア・ヘリアンチ(Septoria helianthi)、フォモプシス・ヘリアンチ(Phomopsis helianthi)、アルテナリア・ヘリアンチ(Alternaria helianthi)、アルテナリア・ジニアエ(Alternaria zinniae)、ボトリティス・シネレア、フォマ・マクドナルジ(Phoma macdonaldii)、マクロホミナ・ファセオリナ、エリシフェ・シコラセアラム(Erysiphe cichoracearum)、リゾパス・オリザエ(Rhizopus oryzae)、リゾプス・アリザス(Rhizopus arrhizus)、リゾプス・ストロニフェル(Rhizopus stolonifer)、プチニア・ヘリアンテ(Puccinia helianthe)、半身萎凋病菌、セファロスポラム・アクレモニウム、フィトフトラ・クリプトゲア(Phytophthora cryptogea)、アルブゴ・トラゴポゴニス(Albugo tragopogonis); アル
ファルファ:フィチウム・ウルチマム、フィチウム・イレグラレ、フィチウム・スプレンデンス、フィチウム・デバリアナム、フィチウム・アファニデルマタム、フィトフトラ・メガスペルマ(Phytophthora megasperma)、ペルノスポラ・トリフォリオラム(Peronospora trifoliorum)、フォマ・メディカジニスvar.メディカジニス(Phoma medicaginis var. medicaginis)、セルコスポラ・メディカジニス(Cercospora medicaginis)、シュードペジザ・メディカジニス(Pseudopeziza medicaginis)、レプトトロチラ・メディカジニス(Leptotrochila medicaginis)、フザリウム・オキシスポラム、ベルチシリウム・アルボ-アトラム(Verticillium albo-atrum)、アファノマイセス・エウテイシェス(Aphanomyces euteiches)、ステムフィリウム・ヘルバラム(Stemphylium herbarum)、ステムフィリウム・アルファルファエ(Stemphylium alfalfae)、コレトトリカム・トリフォリ(Colletotrichum trifolii)、レプトスファエルリナ・ブリオシアナ(Leptosphaerulina briosiana)、ウロマイセス・ストリアタス(Uromyces striatus)、スクレロチニア・トリフォリオラム(Sclerotinia trifoliorum)、スタゴノスポラ・メリロチ(Stagonospora meliloti)、ステムフィリウム・ボトリオサム(Stemphylium botryosum)、およびレプトリチラ・メディカジニス(Leptotrichila medicaginis)が含まれる。
【０１０３】
1つの態様において、コーンにおける真菌病原体には、フザリウム・グラミネアラム、コレトトリカム・グラミニコラ、ステノカルペラ・メイディス(Stenocarpella maydis)、フザリウム・バーティシリオイデス、コクリオボリス・ヘテロストロファス、エキセロヒラム・ツルシカム、セルコスポラ・ゼアエメイディスが含まれる。
【０１０４】
1つの態様において、ダイズにおける真菌病原体には、フザリウム・ビルグリフォルメ(Fusarium virguliforme)、フザリウム・ソラナイ(Fusarium solanai)、スクレロチニア・スクレロチオルム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ、ファコプソラ・パキルヒジ(Phakopsora pachirhizi)が含まれる。
【０１０５】
哺乳動物（特に、ヒト）を含む動物の真菌病原体には、アルテルネリア属(Alternaeria)の種（spp）、アスペルギルス属の種、カンジダ属(Candida)の種、フザリウム属の種、トリコフィトン属(Trychophyton)の種、クリプトコッカス属の種、ミクロスポルム属(Microsporum)の種、ペニシリウム属(Penicillium)の種、トリコスポロン属(Trichosporon)の種、セドスポリウム属(Scedosporium)の種、ペシロマイセス属(Paeciliomyces)の種、アクレモニウム属(Acremonium)の種、およびデマチウム科(Dermatiaceous)の糸状菌のうちの種が含まれる。哺乳動物、特にヒトを含む特定の動物の病原体には、アルテナリア・アルテルナタ、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニガー、黄色アスペルギルス、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・パラシチカス(Aspergillus paraciticus)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、カンジダ・ファマタ(Candida famata)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・グイリエルモンジ(Candida guilliermondii)、カンジダ・ハエムロニ(Candida haemulonii)、カンジダ・ケフイル(Candida kefyr)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ルシタニアエ(Candida lusitaniae)、カンジダ・ノルベゲンシス(Candida norvegensis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・ビスワナチ(Candida viswanathii)、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ソラニ、フザリウム・モノリフォルメ(Fusarium monoliforme)、トリコフィトン・ルブラム(Trycophyton rubrum)、トリコフィトン・メンタグロフィテス(Trycophyton mentagrophytes)、トリコフィトン・インターディジタレス(Trycophyton interdigitales)、トリコフィトン・トンスランス(Trycophyton tonsurans)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、クリプトコッカス・ガチ(Cryptococcus gattii)、クリプトコッカス・グルビ(Cryptococcus grubii)、ミクロスポルム・カニス(Microsporum canis)、ミクロスポルム・ジプセム(Microsporum gypseum)、ペニシリウム・マルネフェイ(Penicillium marneffei)、トリコスポロン・ベイゲリ(Tricosporon beigelii)、トリコスポロン・アサヒ(Trichosporon asahii)、トリコスポロン・インキン(Trichosporon inkin)、トリコスポロン・アステロイデス(Trichosporon asteroides)、トリコスポロン・クタネウム(Trichosporon cutaneum)、トリコスポロン・ドメスチカム(Trichosporon domesticum)、トリコスポロン・ムコイデス(Trichosporon mucoides)、トリコスポロン・オボイデス(Trichosporon ovoides)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulans)、トリコスポロン・ロウビエリ(Trichosporon loubieri)、トリコスポロン・ジャポニカム(Trichosporon japonicum)、スケドスポリウム・アピオスペルマム(Scedosporium apiospermum)、スケドスポリウム・プロリフィカンス(Scedosporium prolificans)、パエシロマイセス・バリオチ(Paecilomyces variotii)、パエシロマイセス・リラシナス(Paecilomyces lilacinus)、アクレモニウム・ストリクタム、クラドフィアロフォラ・バンチアナ(Cladophialophora bantiana)、ウァンジエラ・デルマチチディス(Wangiella dermatitidis)、ラミクロリジウム・オボボイデウム(Ramichloridium obovoideum)、カエトミウム・アトロブルンネウム(Chaetomium atrobrunneum)、ダクトラリア・ガロパバム(Dactlaria gallopavum)、ビポラリス属(Bipolaris)の種、エクセロヒルム・ロストラタム(Exserohilum rostratum)��らびにアブシジア・コリムビフェラ(Absidia corymbifera)、アポフィソマイセス・エレガンス(Apophysomyces elegans)、ムコル・インディカス(Mucor indicus)、リゾムコル・プシラス(Rhizomucor pusillus)、リゾパス・オリザエ、カンニングハメラ・ベルトレチアエ(Cunninghamella bertholletiae)、コケロマイセス・レカルバタス(Cokeromyces recurvatus)、サクセナエア・バシフォルミス(Saksenaea vasiformis)、シンセファラストラム・ラセモサム(Syncephalastrum racemosum)、バシジオボラス・ラナラム(Basidiobolus ranarum)、コニジオボラス・コロナタス(Conidiobolus coronatus)、コニジオボラス・インコングラウス(Conidiobolus incongruus)、ブラストマイセス・デルマティディス(Blastomyces dermatitidis)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、コクシジオイデス・ポサダシ(Coccidioides posadasii)、ヒストプラズマ・カプスラタム(Histoplasma capsulatum)、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、シュードアレシェリア・ボイジ(Pseudallescheria boydii)およびソポロトリクス・シェンキ(Sporothrix schenckii)が含まれる。
【０１０６】
「真菌」についての言及はまた、卵菌類、例えば、フィチウム属(Pythium)の種およびフィトフトラ属の種も含む。「真菌」という用語はサビ菌も包含する。
【０１０７】
細菌病原体には、キサントモナス属(Xanthomonas)の種およびシュードモナス属(Pseudomonas)の種が含まれる。他の微生物には、フィトプラズマ属(Phytoplasma)の種およびスピロプラズマ属(Spiroplasma)の種が含まれる。他の病原体には、ウイルス、線虫、および原生動物が含まれる。昆虫病原体には、ジアトラエア・グランジオセラ(Diatraea grandiosella)、オストリニア・ヌビアリス(Ostrinia nubialis)、ロパロシファム属(Rhopalosiphum)の種、ヘリコベルパ属(Helicoverpa)の種、プルテラ・キシロステラ(Plutella xylostella)、およびライガス属(Lygus)の種が含まれる。
【０１０８】
改変クラスIIナス科ディフェンシンをコードする単離された核酸分子も本明細書において提供される。1つの態様において、核酸は、SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。1つの態様において、核酸は、SEQ ID NO:84に示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
従って、以下:
(i)クラスIIナス科ディフェンシンから得られた、またはクラスIIナス科ディフェンシンに対応するアミノ酸バックボーン;
(ii)(a)アミノ酸の置換、付加、および/もしくは欠失;ならびに/または(b)別のディフェンシンに由来するループ1Bもしくはその改変型による全てもしくは一部の交換;ならびに任意で(c)バックボーン上のループ1B領域外での別のアミノ酸の置換、付加、および/もしくは欠失の1つまたは複数に供された、バックボーン上のループ1Bまたはその等価物
を含み、抗病原体活性ループ1Bを示す人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子が提供される。
【０１１０】
本明細書において開示される別の局面は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む人工的に作り出されたディフェンシンであって、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ループ領域はアミノ酸の置換、欠失、および/または付加によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする単離された核酸分子である。
【０１１１】
1つの局面において、ループ領域はループ1Bである。別の局面は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子であって、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、それによって、抗病原体活性を有するディフェンシンが人工的に作製され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;X3は、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;X5は、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/またはX6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、もしくはYであり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子に関する。1つの態様において、X1X2X3X4X5X6は、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gより選択されるアミノ酸残基を含み、X2は、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X3は、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X4は、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;X5は、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;およびX6は、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である。
【０１１２】
別の局面は、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ディフェンシンは、SEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有する成熟ドメインC末端アミノ酸配列を有し、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域はアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、それによって、抗病原体活性を有するディフェンシンが人工的に作製され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、またはVであり;X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいはX6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子に関する。
【０１１３】
別の局面は、ニコチアナ・スアベオレンスディフェンシンから得られたバックボーンアミノ酸配列を有する、人工的に作り出されたディフェンシンであって、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域またはその等価物は1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されて、抗病原体活性を有するディフェンシンが人工的に作製され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X2は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X3は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X4は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;X5は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいはX6は、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子に関する。N.スアベオレンスのディフェンシンの例にはNsD1およびNsD2が含まれる。
【０１１４】
さらに別の局面は、ニコチアナ・スアベオレンスディフェンシンから得られたバックボーンアミノ酸配列を有する人工的に作り出されたディフェンシンであって、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6を含む領域を生じるように、ループ1B領域またはその等価物が1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されて、抗病原体活性を有するディフェンシンが人工的に作製され、X1からX6はそれぞれアミノ酸残基であり、X1は、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;X2は、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;X3は、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;X4は、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;X5は、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/またはX6は、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり、アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子を提供する。N.スアベオレンスのディフェンシンの例にはNsD1およびNsD2が含まれる。
【０１１５】
さらに別の態様において、単離された核酸分子は、ナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、前記ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549からなるリストより選択され、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーン上にあるループ1B領域は、
2014506461.tif 000016
からなるリストより選択されるディフェンシンに由来するループ1B領域、またはSEQ ID NO:67〜79より選択されるループ1B配列と交換される、人工的に作り出されたディフェンシンをコードする。
【０１１６】
本明細書で使用する「類似性」という用語は、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの比較配列間の正確な同一性を含む。ヌクレオチドレベルで非同一性がある場合、「類似性」は、非同一であるが、構造レベル、機能レベル、生化学レベル、および/またはコンホメーションレベルにおいて互いに関連する、異なるアミノ酸を生じる配列間の違いを含む。アミノ酸レベルで非同一性がある場合、「類似性」は、非同一であるが、構造レベル、機能レベル、生化学レベル、および/またはコンホメーションレベルにおいて互いに関連するアミノ酸を含む。特に好ましい態様では、類似性ではなく同一性のレベルでヌクレオチド比較および配列比較がなされる。
【０１１７】
2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の関係性を説明するために用いられる用語は、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性パーセント」、「配列同一性パーセント」、「実質的に類似する」および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、長さが少なくとも12個、しばしば、15〜18個、多くの場合、少なくとも25個以上、例えば、30個の、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含むモノマー単位である。2つのポリヌクレオチドがそれぞれ、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似する配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)、および(2)2つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含むことがあるので、2つ(またはそれより多い)ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性のある局所領域を特定および比較する「比較ウィンドウ」にわたって2つのポリヌクレオチドの配列を比較するとによって行われる。「比較ウィンドウ」は、参照配列と比較される、典型的には12個の連続した残基からなる概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウは、2つの配列を最適にアラインメントするために、(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して約20％以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適アラインメントは、アルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAの中にあるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)をコンピュータにより実行することによって、または検査、および選択された様々な方法のいずれかによって作成された最良のアラインメント(すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高いパーセント同一性をもたらす)によって行うことができる。例えば、Altschul et al.(1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389)に開示されるように、プログラムのBLASTファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な考察は、Ausubel et al.(1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. 1994-1998のユニット19.3において見られる。
【０１１８】
本明細書で使用する「配列類似性」および「配列同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウにわたってヌクレオチド単位またはアミノ酸単位で同一であるか、または機能的もしくは構造的に類似する程度を指す。従って、例えば、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウにわたって2つの任意にアライメントされた配列を比較し、両配列において同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)または同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet)が生じる位置の数を求めて、マッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を、比較ウィンドウの中の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて配列同一性パーセントを出すことによって計算される。本開示の目的のために、「配列同一性」は、DNASISコンピュータプログラム(Version 2.5 for windows; Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USAから入手可能)によって、このソフトウェアに付属する参考マニュアルにおいて用いられたように標準的なデフォルトを用いて計算された「マッチパーセント」を意味すると理解されるだろう。同様のコメントが配列類似性に関して当てはまる。「少なくとも70％」とは、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、および100％を意味する。
【０１１９】
本開示は、低ストリンジェンシー条件下で、改変ディフェンシンをコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子に及ぶ。
【０１２０】
ストリンジェンシー条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当技術分野において周知である。例えば、下記で詳述するように、塩濃度を下げる、ホルムアミド濃度を上げる、またはハイブリダイゼーション温度を上げる、ハイブリダイゼーション時間を変えることによってストリンジェンシーを高めることができる。別の局面では、本発明の核酸は、様々なストリンジェンシー条件(例えば、高、中、および低)下でハイブリダイズする能力によって定義される。
【０１２１】
本明細書において「低ストリンジェンシー」についての言及は、ハイブリダイゼーションの場合、少なくとも約0〜少なくとも約15％v/vのホルムアミドおよび少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩、ならびに洗浄条件の場合には少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩を含み、かつ包含する。一般的に、低ストリンジェンシーは約25〜30℃〜約42℃で行われる。温度を変えてもよく、ホルムアミドを交換するために、および/または別のストリンジェンシー条件にするために、さらに高い温度を使用してもよい。必要に応じて、ハイブリダイゼーションの場合、少なくとも約16％v/v〜少なくとも約30％v/vのホルムアミドおよびなくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩、ならびに洗浄条件の場合には少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩を含み、かつ包含する、「中ストリンジェンシー」、またはハイブリダイゼーションの場合、少なくとも約31％v/v〜少なくとも約50％v/vのホルムアミドおよび少なくとも約0.01 M〜少なくとも約0.15Mの塩、ならびに洗浄条件の場合には少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩を含み、かつ包含する、「高ストリンジェンシー」などの別のストリンジェンシー条件が適用されてもよい。一般的に、洗浄が行われる。Tm=69.3+0.41(G+C)％(Marmur and Doty (1962) J Mol Biol 5:109-118)。しかしながら、二重鎖核酸分子のTmは、ミスマッチ塩基対の数が1％増加するごとに1℃減少する(Bonner and Laskey (1974) Eur J Biochem 46:83-88)。ホルムアミドは、これらのハイブリダイゼーション条件では任意である。従って、ストリンジェンシーの特に好ましいレベルは以下の通り定義される。低ストリンジェンシーは、25〜42℃で6xSSC緩衝液、0.1％w/v SDSである。中ストリンジェンシーは、20℃〜65℃の範囲の温度で2xSSC緩衝液、0.1％w/v SDSである。高ストリンジェンシーは、少なくとも65℃の温度で0.1xSSC緩衝液、0.1％w/v SDSである。
【０１２２】
本明細書で使用する「配列類似性」および「配列同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウにわたってヌクレオチド単位またはアミノ酸単位で同一であるか、または機能的もしくは構造的に類似する程度を指す。従って、例えば、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウにわたって2つの任意にアライメントされた配列を比較し、両配列において同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)または同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet)が生じる位置の数を求めて、マッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を、比較ウィンドウの中の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて配列同一性パーセントを出すことによって計算される。本開示の目的のために、「配列同一性」は、DNASISコンピュータプログラム(Version 2.5 for windows; Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USAから入手可能)によって、このソフトウェアに付属する参考マニュアルにおいて用いられたように標準的なデフォルトを用いて計算された「マッチパーセント」を意味すると理解されるだろう。同様のコメントが配列類似性に関して当てはまる。
【０１２３】
本明細書において開示される核酸分子は他の遺伝分子ともハイブリダイズすることができる。本明細書において「ハイブリダイズする」についての言及は、塩基対合によって核酸鎖が相補鎖と結合するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション反応は、関心対象のある特定の配列が低濃度で存在する試料の中でも、関心対象のある特定の配列を特定できるように高感度かつ選択的にすることができる。ストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当技術分野において周知である。例えば、下記で詳述するように、塩濃度を下げる、ホルムアミド濃度を上げる、またはハイブリダイゼーション温度を上げる、ハイブリダイゼーション時間を変えることによって、ストリンジェンシーを高めることができる。別の局面では、本発明の核酸は、様々なストリンジェンシー条件(例えば、高、中、および低)下でハイブリダイズする能力によって規定される。
【０１２４】
単離された核酸分子はまた、植物細胞、微生物細胞、および非ヒト動物細胞において使用するのに適した、発現ベクターまたはトランスファーベクターを含むベクターの中にあってもよい。「ベクター」についての言及は、多遺伝子発現ベクター(MGEV)、例えば、PCT/AU02/00123に記載の多遺伝子発現ベクター(MGEV)を含む。
【０１２５】
後者の局面によれば、2〜8個のドメインセグメントを有するポリヌクレオチドを含む多遺伝子発現ビヒクル(MGEV)が提供される。各ドメインは機能タンパク質をコードし、リンカーセグメントによって直鎖配列内で次のドメインと連結され、ドメインおよびセグメントは全て同じ読み枠にあり、ドメインの少なくとも1つは本明細書に記載の改変クラスIIナス科ディフェンシンである。1つの態様において、少なくとも1つの他のドメインはプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体である。さらに別の態様において、少なくとも1つのドメインは本明細書において意図される改変クラスIIナス科ディフェンシンであり、少なくとも1つのドメインはプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型である。「プロテイナーゼ阻害剤」とは、セリンプロテイナーゼ阻害剤およびシステインプロテイナーゼ阻害剤を含む。
【０１２６】
改変ディフェンシンをコードする核酸配列は、適切な調節配列(プロモーター、ターミネーター、輸送ペプチドなど)と組み合わされてDNA構築物またはベクターに組み込まれてもよい。核酸はまた異種プロモーターに機能的に連結されてもよい。一部の用途では、改変ディフェンシンをコードする核酸配列は、ディフェンシン融合タンパク質を形成するように別のタンパク質を発現するコード領域内に挿入されてもよく、タンパク質のドメインを交換して、そのタンパク質に抗病原体活性を付与するために用いられてもよい。核酸配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター(例えば、環境条件、病原体の存在、化学薬品の存在によって刺激される)でもよい、同種プロモーターまたは異種プロモーターの制御下に配置されてもよい。輸送ペプチドは改変ディフェンシンに対して同種または異種でもよく、望ましい細胞小器官または細胞外空間に分泌されるように選択される。輸送ペプチドは、天然では、ある特定のディフェンシンと結合していることがある。このようなDNA構築物はクローニングされてもよく、コードされている改変ディフェンシンまたはディフェンシンの活性部分の発現を可能にする生物系に形質転換によって導入されてもよい。適切な生物系には、微生物(例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現系、大腸菌、シュードモナス属、内生植物、例えば、クラビバクター・キシリsubsp.シノドンティス(Clavibacter xyli subsp. cynodontis)(Cxc);酵母;ウイルス;バクテリオファージなど)、培養細胞(例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞)、および植物が含まれる。場合によっては、発現されたディフェンシンは、使用のために後で抽出および単離される。
【０１２７】
本明細書において開示される改変ディフェンシンは、植物およびヒトなどの哺乳動物を含む動物において病原体の病気と闘うのに有用である。従って、改変クラスIIナス科ディフェンシンには、園芸学的および農学的な用途ならびにヒトなどの哺乳動物を含む動物用の医薬としての用途がある。さらに、病原体が本明細書に記載の改変ディフェンシンに曝露される、病原体と闘うプロセスが提供される。改変ディフェンシンは組成物の形で用いられてもよい。改変ディフェンシンは単独で用いられてもよく、化学殺病原体剤、抗病原体タンパク質、および/あるいはII型セリンプロテイナーゼ阻害剤もしくはシステインプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型と併用されてもよい。
【０１２８】
本明細書に記載の改変ディフェンシンは、病原体の侵入、増殖、維持、または蔓延から植物を保護するのに有用であるが、非植物、例えば、ヒトなどの哺乳動物を含む動物用の局所医薬を含む医薬としての用途もある。
【０１２９】
従って、本明細書において開示される別の局面は、本明細書に記載の改変ディフェンシンと、1種類または複数の種類の薬学的または獣医学的または園芸学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤、および/あるいは1種類または複数の種類の他の抗病原体薬剤、例えば、化学殺病原体剤、タンパク質抗病原体薬剤、および/またはプロテイナーゼ阻害剤もしくはその前駆型を含む組成物である。1つの態様において、組成物は、スプレー、ミスト、マイクロ粒子またはナノ粒子、水溶液、散剤、クリーム、軟膏、ゲル、含浸処理した包帯、液体、製剤、塗料、または経口型の組成物を含む他の適切な分配媒体の形をとる。
【０１３０】
薬学的用途の場合、改変ディフェンシン(これから得られた任意の産物を含む)は、哺乳動物感染症を治療するための(例えば、カンジダ属などの酵母と闘うための)殺病原体剤または静病原体剤(pathogenostat)として使用することができる。
【０１３１】
本開示による改変ディフェンシン(これから得られた任意の産物を含む)はまた、防腐剤として(例えば、食品添加物として)、または土壌もしくは成長培地調製プログラムの一部として用いられてもよい。
【０１３２】
農学的用途の場合、改変ディフェンシンは、植物の一生の間に農作物の病気耐性もしくは病気抵抗性を改善するために、または収穫後の農作物保護のために使用することができる。ペプチドに曝露された病原体は阻害される。改変ディフェンシンは植物の表面に既に定着している病原体を根絶やしにすることができる、または将来の病原体攻撃から植物を保護することができる。ペプチドの根絶効果は特に有利である。「植物」についての言及には、農作物植物、例えば、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ワタ、イネ、キャノーラ、コーン、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、イチジク、アマ、ブドウ、ラッカセイ(groundnut)、アサ、ラベンダー、キノコ、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナッツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、アブラナ、ライグラス、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タロイモ、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフ、およびヤムイモが含まれる。
【０１３３】
様々なやり方で、例えば、以下ように植物病原体を改変ディフェンシンに曝露することができる。
(a)改変ディフェンシンは、植物部分、または植物の根の周囲にある土壌もしくは他の成長培地、または標準的な農学的技法(例えば、噴霧)を用いてまかれる前に植物の種子に適用されてもよい。ディフェンシンは化学合成されてもよく、タンパク質を発現するように遺伝子組換えされた微生物または植物から抽出されてもよい。タンパク質は、固体希釈剤または液体希釈剤、任意で様々な補助薬、例えば、界面活性剤と混合したディフェンシンを含む組成物の形で植物または植物成長培地に適用されてもよい。固体組成物は分散可能な粉末、顆粒、または粒の形をとってもよい。
(b)抗病原体ディフェンシンを発現するように遺伝子組換えされた微生物を含む組成物が、植物または植物が成長している土壌に適用されてもよい。
(c)抗病原体ディフェンシンを発現するように遺伝子組換えされた内生植物が植物組織(例えば、種子処理プロセスを介して)に導入されてもよい。内生植物は、植物宿主と非病原性の内共生関係になる能力を有する微生物と定義される。内生植物によって強化される植物保護方法は、Crop Genetics International Corporationによる一連の特許出願(例えば、国際出願公開番号W090/13224、欧州特許公開番号EP-125468-B1、国際出願公開番号W091/10363、国際出願公開番号WO87/03303)において説明されている。内生植物は農薬を産生するように遺伝子組換えされてもよい。国際出願公開番号W094/16076(ZENECA Limited)は、植物由来抗真菌ペプチドを発現するように遺伝子組換えされた内生植物の使用について説明している。
(d)ペプチドが植物体の中で発現されるように、抗病原体ディフェンシンをコードするDNAが植物ゲノムに導入されてもよい(DNAは、cDNA、ゲノムDNA、または標準的な核酸合成機を用いて製造されたDNAでもよい)。
【０１３４】
本明細書に記載の改変ディフェンシンを含む組成物は、一般的に、担体、賦形剤、希釈剤、防腐剤、安定剤、および/または固体添加物もしくは液体添加物を含む。任意で、別の抗病原体剤も含まれる。
【０１３５】
組成物は、意図された投与方法に応じて多種多様な形をとることができる。一般的に、植物および動物には局所組成物が用いられるが、これに限定されない。組成物の調製において、通常の培地、例えば、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、および/または着色剤が用いられてもよい。組成物は、液体調製物、例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液の形をとってもよい。担体、例えば、デンプン、糖、結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤なども使用することができる。組成物はまた散剤、カプセル、および錠剤の形をとってもよい。
【０１３６】
本明細書における改変ディフェンシンは、植物もしくは植物の一部、または根系、または根系の周囲にある土壌もしくは培地、またはヒトなどの哺乳動物を含む動物の皮膚、髪、もしくは毛に直接投与されてもよい。
【０１３７】
エアロゾルまたはスプレーによって投与されるとき、組成物は、農学的製剤および薬学的製剤の分野において周知の技法に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを向上させる吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて食塩水に溶解した溶液として調製されてもよい。
【０１３８】
改変ディフェンシンの有効量は、使用される特定のディフェンシン、投与方法、治療されている病原体、および病原体侵入の重篤度に応じて変化してもよい。従って、改変ディフェンシンを用いた投与計画は、植物または対象のタイプ、種、年齢、体重、性別、および医学的状態;治療されている状態の重篤度;投与経路;ならびに使用されるその特定のディフェンシンを含む様々な要因に従って選択される。通常の知識を持つ園芸家、医師、臨床家、または獣医師は、病原体侵入の進行を阻止する、逆らう、または止めるのに必要なディフェンシンの有効量を容易に決定および処方することができる。徐放性製剤も本明細書において意図される。
【０１３９】
糖衣錠コアには適切なコーティングが施される。この目的のために、任意で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい濃縮糖液が用いられてもよい。活性化合物用量の異なる組み合わせを特定するために、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤コーティングまたは糖衣錠コーティングに染料または色素が添加されてもよい。
【０１４０】
ディフェンシン調製物には、ゼラチンから作られたプッシュフィット(push-fit)カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールから作られた軟らかい密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、増量剤、例えば、ラクトース、結合剤、例えば、デンプン、および/または潤滑剤、例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム、任意で、安定剤と混合した活性成分を含有してもよい。軟カプセルにおいて、活性成分は、適切な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤が添加されてもよい。
【０１４１】
改変ディフェンシン組成物またはこれをコードする発現ベクターはまた、別の抗病原体物質、例えば、別のディフェンシンまたは抗病原体タンパク質もしくはペプチド、あるいは化学殺病原体剤またはプロテイナーゼ阻害剤もしくはその前駆体を含んでもよい。
【０１４２】
本明細書において開示される別の局面は、病原体が蔓延した植物を治療または予防するためのプロトコールまたは方法であって、植物もしくはその一部、または植物の周りにある土壌もしくは成長支持媒体に、本明細書に記載の改変ディフェンシンを単独で、または別の抗病原体薬剤と一緒に含む抗病原体有効量の組成物を適用する工程を含むプロトコールまたは方法を含む。
【０１４３】
別の局面は、病原体に感染した、または病原体が蔓延した哺乳動物、例えば、ヒト対象を含む動物を治療または予防するためのプロトコールまたは方法であって、本明細書に記載の改変ディフェンシンを含む抗病原体有効量の組成物を対象に適用する工程を含むプロトコールまたは方法を提供する。
【０１４４】
「適用する」という用語は接触および曝露を含む。改変ディフェンシンは単独で用いられてもよく、他の抗病原体薬剤または改変ディフェンシンが病原体に接近するのを促進する薬剤と併用されてもよい。
【０１４５】
さらなる態様において、植物細胞は、様々な公知の方法(アグロバクテリウムTiプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃など)に従って組換えDNA構築物で形質転換されてもよい。形質転換細胞は、適切な場合、新たな核材料がゲノムに安定に組み込まれている植物全体に再生することができる。このように、形質転換単子葉植物および形質転換双子葉植物を得ることができるが、通常、後者の方が容易に再生される。これらの一次形質転換体の子孫の一部は、抗病原体ディフェンシンをコードする組換えDNAを受け継いでいる。
【０１４６】
さらに、本開示は、病原体に対する改善した耐性を有し、改変クラスIIナス科ディフェンシンを発現する組換えDNAを含有する植物を提供する。このような植物は、真菌耐性を含む病原体を有する雑種および株を開発するための標準的な植物育種交配において親として使用することができる。
【０１４７】
組換えDNAは、形質転換によって植物またはその祖先に導入されている、DNA、一般的に、異種DNAである。組換えDNAは、病原体攻撃部位(例えば、葉)に送達するために発現される改変クラスIIナス科ディフェンシンをコードする。
【０１４８】
本発明の改変ディフェンシンがトランスジェニック植物またはその子孫の中で発現される場合、病原体は、病原体が植物を攻撃している部位、または病原体が植物を攻撃している部位から離れた部位においてディフェンシンに曝露される。特に、適切な遺伝子調節配列を使用することによって、ディフェンシンは最も効き目がある時および場所においてインビボで産生することができる。例えば、ディフェンシンを、通常、大量に発現されないが、病気耐性が重要になる植物部分(例えば、葉)の中で産生することができる。
【０１４９】
作製することができる遺伝子組換え植物の例には、農作物、穀類、果実、および野菜、例えば、コーン、ダイズ、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ワタ、キャノーラ、イネ、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、キャノーラ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、イチジク、アマ、ブドウ、ラッカセイ、アサ、ラベンダー、キノコ、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナッツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、アブラナ、ライグラス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タロイモ、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフ、およびヤムイモが含まれる。
【０１５０】
病原体は、植物の表面に、植物の中に、または植物の近くで増殖する任意の病原体でよい。この文脈では、耐性は、野生型植物と比較したときに病原体に対する増強された抵抗性を含む。耐性は、抵抗性のわずかな増加から、病原体の影響(この場合、病原体は部分的に阻害される)、植物が病原体の存在の影響を受けないように完全耐性(この場合、病原体は著しく阻害されるか、死滅する)でまでわたってもよい。ある特定の病原体に対する高度の耐性またはさらに広範囲の病原体に対する高度の耐性はいずれも耐性の改善を構成することができる。植物形質転換またはその後の交雑後に、耐性が改善したトランスジェニック植物(またはそれに由来する植物)が選択される。
【０１５１】
本開示は、抗病原体活性を示す遺伝子組換え植物またはその子孫を作製する方法であって、本明細書において開示されたように、改変ディフェンシンをコードする核酸を発現する細胞を含む植物を作り出す工程であって、発現レベルが、改変ディフェンシンが植物病原体に対して保護効果を示すのに十分な発現レベルである工程を含む、方法を提供する。
【０１５２】
本発明の改変ディフェンシンは単独で用いられてもよく、ディフェンシンの任意のグループに由来する1種類または複数の種類の他のディフェンシンと併用されてもよい。従って、抗病原体特性を示す植物を作製するための方法であって、本明細書において開示された改変クラスIIナス科ディフェンシンと別のディフェンシンとの組み合わせを発現する細胞を含む遺伝子組換え植物またはその子孫を作り出す工程を含む、方法が本明細書において提供される。このような植物は、病原体による耐性を促進する危険性が低い。「相乗作用」についての言及は、2種類以上のディフェンシンを使用することによって1種類のディフェンシンに対する耐性と闘うことを含む。
【０１５３】
本発明の改変ディフェンシンは、そのアミノ酸配列に基づいて、例えば、ペプチド合成機またはタンパク質合成機を用いた1つまたは複数のアミノ酸残基の標準的な段階的付加を用いて製造されてもよい。または、改変ディフェンシンは組換え手段によって作られてもよい。細胞によって、もしくは局所に提供されるか、または全身に適用されるかに関係なく、改変ディフェンシンは単独で用いられてもよく、他の抗病原体薬剤と併用されてもよい。
【０１５４】
前記で示したように、本発明の改変ディフェンシンは、改善した、または増強された抗病原体活性を示す。ある特定の態様において、病原体は真菌病原体である。
【０１５５】
従って、ある特定の態様において、クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンを含む、人工的に作り出されたクラスIIナス科ディフェンシンであって、抗真菌活性を有するディフェンシンを生じるように、バックボーン上にあるループ1B領域は1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変され、バックボーンは、任意で、C末端CTPPなどのバックボーン上の他の場所に1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を含んでもよい、人工的に作り出されたクラスIIナス科ディフェンシンが提供される。さらに、本開示は、抗病原体医薬の製造における、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間にループ1B領域またはその等価物を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ループ1B領域は1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンの使用を意図する。
【０１５６】
さらに、別の局面は、改変ループ1B領域を含み、抗病原体活性を示す人工ディフェンシンの製造における、SEQ ID NO:52に対して少なくとも約70％の類似性を有するC末端領域を含むクラスIIナス科ディフェンシンの使用である。
【０１５７】
植物の表面への、もしくは植物の中への病原体侵入、または植物もしくはその根の周囲にある土壌中への病原体侵入を低減または防除するための方法であって、本開示の改変ディフェンシンを植物もしくは植物の根または土壌に局所適用する工程を含む方法が本明細書においてさらに提供される。または、前記方法は、改変ディフェンシンを発現する遺伝子組換え植物ならびに改変ディフェンシンを含有する改変植物の子孫を作製する工程を含む。
【０１５８】
さらに別の局面は、動物の表面へのまたは動物の中への病原体侵入を低減または防除するための方法であって、本発明の改変クラスIIナス科ディフェンシンを、感染した可能性のある動物表面領域に局所適用する工程を含む、方法を提供する。1つの態様において、動物は、ヒトを含む哺乳動物である。従って、動物、特に、ヒトなどの哺乳動物用の抗病原体医薬が本明細書において意図される。1つの態様において、医薬は、散剤、スプレー、アトマイザー、ナノ粒子、ゲル、パスタ剤、含浸処理した包帯、塗料、エアロゾル、水薬、または他の液体の形をとる。抗病原体製剤はまた徐放性組成物でもよい。製剤は、感染した対象を治療するために、または予防薬として用いられてもよい。
【０１５９】
本明細書で使用する「を含む(comprising)」は、「を含む(including)」、「を含有する」、または「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的(inclusive)またはオープンエンドであり、さらなる引用されなかった要素も方法工程も排除しない。本明細書で使用する、「からなる」は、クレームエレメントにおいて特定されていない全ての要素、工程、成分を排除する。本明細書で使用する「から本質的になる」は、クレームの基本的なかつ新規の特徴に物質的に影響を及ぼさない材料も工程も排除しない。「を含む(comprising)」という用語の本明細書における全ての記載は、特に、組成物の成分の説明または装置の要素の説明において、引用された成分または要素から本質的になる組成物および方法ならびに引用された成分または要素からからなる組成物および方法を包含すると理解される。本明細書において適切に例示的に説明された本開示は、本明細書において具体的に開示されていない、いかなる要素、限定がなくても実施することができる。
【０１６０】
置換基のグループが本明細書において開示されたときに、グループメンバーの任意の異性体および鏡像異性体を含む、これらのグループおよび全てのサブグループの全ての個々のメンバー、ならびに置換基を用いて形成することができる化合物のクラスは別々に開示されることが理解される。化合物が請求されるとき、本明細書において開示された参考文献に開示される化合物を含む、当技術分野において公知の化合物は含まれると意図されないことが理解されるはずである。マーカッシュグループまたは他のグループ分けが本明細書において用いられた場合、グループの全ての個々のメンバーならびにグループの可能性のある全ての組み合わせおよび部分的組み合わせが本開示において個々に含まれることが意図される。
【０１６１】
範囲が本明細書において引用されたとき、述べられた範囲内の全ての部分範囲、および述べられた範囲内の全ての整数値は、それぞれの部分範囲および整数値が引用されたように意図されることが意図される。
【０１６２】
様々な局面が本明細書に包含される。これらの局面は以下を含む。
1.クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、抗病原体活性を有するディフェンシンを生じるように、ループ領域がアミノ酸の置換、欠失、および/または付加によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシン。
2.ループ領域がループ1Bである、局面1の人工的に作り出されたディフェンシン。
3.クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を生じるように改変され、Xがアミノ酸残基であり、式中、
X1が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、局面2の人工的に作り出されたディフェンシン。
4.クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を生じるように改変され、Xがアミノ酸残基であり、式中、
X1が、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2が、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3が、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4が、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5が、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6が、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、局面3の人工的に作り出されたディフェンシン。
5.ループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を含み、式中、
X1が、N、H、Q、D、K、もしくはEであり;
X2が、R、H、T、K、もしくはGであり;
X3が、F、H、Y、もしくはWであり;
X4が、P、K、S、もしくはRであり;
X5が、GもしくはFであり;かつ/または
X6が、P、V、I、もしくはNである、局面4の人工的に作り出されたディフェンシン。
6.X1が、L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X2が、S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H、Gからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X3が、A、F、W、N、I、S、Y、P、L、Hからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X4が、K、G、E、R、A、P、F、Q、V、Sからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X5が、M、G、K、D、S、Y、P、E、N、Fからなるリストより選択されるアミノ酸であり;
X6が、V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I、Nからなるリストより選択されるアミノ酸である、局面3の人工的に作り出されたディフェンシン。
7.クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、アミノ酸配列
2014506461.tif 000017
またはSEQ ID NO:67〜SEQ ID NO:79によって規定されるループ1Bに改変されている、局面3または4または5または6の人工的に作り出されたディフェンシン。
8.クラスIIナス科ディフェンシンが、最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有する成熟ドメインC末端領域を含む、局面1〜7のいずれか1つの人工的に作り出されたディフェンシン。
9.クラスIIナス科ディフェンシンが、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、またはSL549より選択される、局面8の人工的に作り出されたディフェンシン。
10.クラスIIナス科ディフェンシンがNaD1である、局面9の人工的に作り出されたディフェンシン。
11.クラスIIナス科ディフェンシンが、NsD1およびNsD2より選択される、ニコチアナ・スアベオレンスに由来するディフェンシンである、局面9の人工的に作り出されたディフェンシン。
12.クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、図2に列挙された非クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1Bに置き換えられる、局面2の人工的に作り出されたディフェンシン。
13.ループ1Bが、NaD1に由来するNTFPGIの改変型であり、
改変が、以下:
Nが、A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Tが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Fが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Pが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Gが、A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;および/あるいは
Iが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される、
の1つまたは複数を含み、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、局面7の人工的に作り出されたディフェンシン。
14.ループ1Bが、NaD1に由来するNTFPGIの改変型であり、改変が、以下:
Nが、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、およびRより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Tが、K、R、G、H、L、N、F、I、S、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Fが、W、Y、H、L、G、およびPより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Pが、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、またはGより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Gが、S、K、Y、F、およびHより選択されるアミノ酸残基で置換される;および/または
Iが、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される、
の1つまたは複数を含み、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、局面13の人工的に作り出されたディフェンシン。
15.バックボーンクラスIIナス科ディフェンシンが、前記ループ領域外のバックボーン上にアミノ酸の置換、付加、および/または欠失をさらに含む、局面1〜14のいずれか1つの人工的に作り出されたディフェンシン。
16.さらなるアミノ酸の置換、付加、および/または欠失が、C末端テールにある1つまたは複数のアミノ酸の置換である、局面15の人工的に作り出されたディフェンシン。
17.バックボーンクラスIIナス科ディフェンシンと比べて、より広域の抗病原体活性、より高い抗病原体活性、より高い安定性、および/またはより高い透過能力より選択される増強された抗病原体活性を有する、局面1〜16いずれか1つの人工的に作り出されたディフェンシン。
18.抗病原体活性が真菌に対する活性のレベルである、局面17の人工的に作り出されたディフェンシン。
19.抗病原体活性が昆虫に対する活性のレベルである、局面17の人工的に作り出されたディフェンシン。
20.真菌が植物真菌病原体である、局面18の人工的に作り出されたディフェンシン。
21.真菌が哺乳動物真菌病原体である、局面20の人工的に作り出されたディフェンシン。
22.真菌がヒト真菌病原体である、局面21の人工的に作り出されたディフェンシン。
23.真菌が、コレトトリカム・グラミニコラ、ディプロディア・メイディス、フザリウム・グラミネアラムおよびフザリウム・バーティシリオイデスより選択される、局面20の人工的に作り出されたディフェンシン。
24.真菌が、コーン:ジベレラ・ゼアエ(フザリウム・グラミネアラム)、コレトトリカム・グラミニコラ、ステノカルペラ・メイディ(ディプロディア・メイディス)、フザリウム・モニリフォルメvar.サブグルチナンス、フザリウム・バーティシリオイデス、ビポラリス・メイディスO,T.(コクリオボリス・ヘテロストロファス)、エキセロヒラム・ツルシカムI、II、およびIII、セルコスポラ・ゼアエメイディス、フィチウム・イレグラレ、フィチウム・デバリアナム、フィチウム・グラミニコラ、フィチウム・スプレンデンス、フィチウム・ウルチマム、フィチウム・アファニデルマタム、アスペルギルス属の種、黄色アスペルギルス、ヘルミトスポリウム・カルボナムI、II、およびIII(コクリオボラス・カルボナム)、ヘルミトスポリウム・ペディセラタム、フィソデルマ・メイディス、フィロスチクタ・メイディス、カバチエラ・メイディス、セルコスポラ・ソルギ、ウスティラゴ・メイディス、ウスティラゴ・ゼアエ、パシニア・ソルギ、パシニア・ポリソラ、マクロホミナ・ファセオリナ、ペニシリウム・オキサリカム、ニグロスポラ・オリザエ、クラドスポリウム・ヘルバリウム、クルブラリア・ルナタ、ルブラリア・イナエキアリス、クルブラリア・パレセンス、トリコデルマ・ビリデ、クラビセプス・ソルギ、ディプロディア・マクロスポラ、スクレロフトラ・マクロスポラ、ペロノスクレロスポラ・ソルギ、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、ペロノスクレロスポラ・メイディス、ペロノスクレロスポラ・サカリ、スファセロテカ・レイリアナ、フィソペラ・ゼアエ、セファロスポラム・メイディス、セファロスポラム・アクレモニウム;ダイズ:フザリウム・ビルグルリフォルメ、フザリウム・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオルム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ、ファコプソラ・パキルヒジ、フィトフトラ・メガスペルマf.sp.グリシネア、フィトフトラ・ソジャエ、マクロホミナ・ファセオリナ、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオルム、ディアポルテ・ファセオロラムvar.ソジャエ(フォモプシス・ソジャエ)、ディアポルテ・ファセオロラムvar.カウリボラ、スクレロチウム・ロフシ、セルコスポラ・キクチ、セルコスポラ・ソジナ、ペロノスポラ・マンシュリカ、コレトトリカム・デマチウム(コレトトリカム・トランカタム)、コリネスポラ・カシイコラ、セプトリア・グリシネス、フィロスティクタ・ソジコラ、アルテナリア・アルテルナタ、マイクロスファエラ・ディフサ、フザリウム・セミテクタム、フィアロホラ・グレガタ、グロメレラ・グリシネス、フィチウム・アファニデルマタム、フィチウム・ウルチマム、フィチウム・デバリアナム;キャノーラ:アルブゴ・カンジダ、アルテルナリア・ブラシカエ、レプトスファエリア・マクランス、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオルム、マイコスファエレラ・ブラシシコラ、フィチウム・ウルチマム、ペロノスポラ・パラシチカ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・アベナセウム、フザリウム・ロゼウム、アルテナリア・アルテルナタ;ワタ:フザリウム・オキシスポラムf.sp.バシンフェクタム、半身萎凋病菌、チエラビオプシス・バシコラ、アルテナリア・マクロスポラ、セルコスポラ・ゴシピナ、フォマ・エキシグア(アスコチタ・ゴシピ)、フィチウム属の種、リゾクトニア・ソラニ、プチニア・スケダルディ、プチニア・カカバタ、ファマトトリコプシス・オムニボレ;キャノーラ:レプトスファエリア・マクランス、スクレロチニア・スクレロチオルム、アルテルナリア・ブラシカエ、アルテナリア・ブラシシコラ、プラスモディフォラ・ブラシカエ、リゾクトニア・ソラニ、フザリウム属の種、フィチウム属の種、フィトフトラ属の種、アルテルナリア属の種、ペロノスポラ・パラシチカ、マイコスファエレラ・カプセラエ(シュードセルコスポレラ・カプセラエ、アルブゴ・カンジダ、ファイトフトホラ・メガスペルマvar.メガスペルマ、ボトリティス・シネレア、エリシフェ・クルシフェララム;コムギ:コクリオボルス・サチバス、ドレクスレラ・ウィレガネンシス、マイコスファエレラ・グラミニコラ、ファエオスファエリア・アベナリアf.sp.トリチセア、ファエオスファエリア・ノドラム、ブルメリア・グラミニスf.sp.トリシチ、ウロシスティス・アグロピリ、アルテナリア・アルテルナタ、クラドスポリウム・ヘルバラム、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・アベナセウム、フザリウム・カルモラム、フザリウム・シュードグラミネアラム、ウスチラゴ・トリチシ、アスコチタ・トリチシ、セファロスポリウム・グラミネウム、コレトトリカム・グラミニコラ、エリシフェ・グラミニスf.sp.トリチシ、プチニア・グラミニスf.sp.トリチシ、プチニア・レコンディタf.sp.トリチシ、プチニア・ストリフォルミス、プチニア・トリチシナ、スクレロフトラ・マクロスポラ、ウロシスティス・アグロピリ、ピレノフォラ・トチチシ-レペンティス、ピレノフォラ・セメニペルダ、ファエオスファエリア・ノドラム、セプトリア・ノドラム、セプトリア・トリチシ、セプトリア・アベナエ、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス、リゾクトニア・ソラニ、リゾクトニア・セレアリス、ガエウマンノマイセス・グラミニスvar.トリチシ、フィチウム属の種、フィチウム・アファニデルマタム、フィチウム・アルヘノマンネス、フィチウム・グラミコラ、フィチウム・ウルチマム、ビポラリス・ソロキニアナ、クラビセプス・プルプレア、タペシア・ヤルンダエ、チレチア・トリチシ、チレチア・ラエビス、チレチア・カリエス、チレチア・インディカ、ウスチラゴ・トリチシ、ウォジノウィシア・グラミニス、コクリオボルス・サチバス;ソルガム:エキセロヒラム・ツルシカム、コレトトリカム・サブリネオラム、セルコスポラ・ソルギ、グロエオセルスポラ・ソルギ、アスコシタ・ソルギナ、プチニア・プルプレア、マクロホミナ・ファセオリナ、ペルコニア・シルシナタ、フザリウム・モニリフォルメ、アルテナリア・アルテルナタ、ビポラリス・ソルギコラ、ヘルミントスポリウム・ソルギコラ、クルブラリア・ルナタ、フォマ・イシディオサ、ラムリスポラ・ソルギ、ラムリスポラ・ソルギコラ、フィラカラ・サカリ、スポリソリウム・レイリアナム(スファセロテカ・レイリアナ)、スファセロテカ・クルエンタ、スポリソリウム・ソルギ、クラビセプス・ソルギ、リゾクトニア・ソラニ、アクレモニウム・ストリカム、スクレロフトナ・マクロスポラ、ペロノスクレロスポラ・ソルギ、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、スクレロスポラ・グラミニコラ、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・オキシスポラム、フィチウム・アルヘノマネス、フィチウム・グラミニコラ;ヒマワリ:プラスモパラ・ハルステジ、スクレロチニア・スクレロチオルム、セプトリア・ヘリアンチ、フォモプシス・ヘリアンチ、アルテナリア・ヘリアンチ、アルテナリア・ジニアエ、ボトリティス・シネレア、フォマ・マクドナルジ、マクロホミナ・ファセオリナ、エリシフェ・シコラセアラム、リゾパス・オリザエ、リゾプス・アリザス、リゾプス・ストロニフェル、プチニア・ヘリアンテ、半身萎凋病菌、セファロスポラム・アクレモニウム、フィトフトラ・クリプトゲア、アルブゴ・トラゴポゴニス;アルファルファ:フィチウム・ウルチマム、フィチウム・イレグラレ、フィチウム・スプレンデンス、フィチウム・デバリアナム、フィチウム・アファニデルマタム、フィトフトラ・メガスペルマ、ペルノスポラ・トリフォリオラム、フォマ・メディカジニスvar.メディカジニス、セルコスポラ・メディカジニス、シュードペジザ・メディカジニス、レプトトロチラ・メディカジニス、フザリウム・オキシスポラム、ベルチシリウム・アルボ-アトラム、アファノマイセス・エウテイシェス、ステムフィリウム・ヘルバラム、ステムフィリウム・アルファルファエ、コレトトリカム・トリフォリ、レプトスファエルリナ・ブリオシアナ、ウロマイセス・ストリアタス、スクレロチニア・トリフォリオラム、スタゴノスポラ・メリロチ、ステムフィリウム・ボトリオサム、およびレプトリチラ・メディカジニスより選択される、局面20の人工的に作り出されたディフェンシン。
25.真菌が、フザリウム・グラミネアラム、コレトトリカム・グラミニコラ、ステノカルペラ・メイディス、フザリウム・バーティシリオイデス、コクリオボリス・ヘテロストロファス、エキセロヒラム・ツルシカム、セルコスポラ・ゼアエメイディス、フザリウム・ビルグリフォルメ、フザリウム・ソラナイ、スクレロチニア・スクレロチオルム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ、ファコプソラ・パキルヒジより選択される、局面24の人工的に作り出されたディフェンシン。
26.真菌が、フザリウム・ビルグルリフォルメ、フザリウム・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオルム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエより選択される、局面24の人工的に作り出されたディフェンシン。
27.真菌がサビ菌である、局面20の人工的に作り出されたディフェンシン。
28.真菌が、アルテルネリア属の種、アスペルギルス属の種、カンジダ属の種、フザリウム属の種、トリコフィトンの種、クリプトコッカス属の種、ミクロスポルム属の種、ペニシリウム属の種、トリコスポロン属の種、セドスポリウム属の種、ペシロマイセス属の種、アクレモニウム属の種、およびデマチウム科の糸状菌より選択される、局面21の人工的に作り出されたディフェンシン。
29.真菌が、アルテナリア・アルテルナタ、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニガー、黄色アスペルギルス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・パラシチカス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・デュブリニエンシス、カンジダ・ファマタ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・グイリエルモジ、カンジダ・ハエムロニ、カンジダ・ケフイル、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニアエ、カンジダ・ノルベゲンシス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ビスワナチ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ソラニ、フザリウム・モノリフォルメ、トリコフィトン・ルブラム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・インターディジタレス、トリコフィトン・トンスランス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガチ、クリプトコッカス・グルビ、ミクロスポルム・カニス、ミクロスポルム・ジプセム、ペニシリウム・マルネフェイ、トリコスポロン・ベイゲリ、トリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・インキン、トリコスポロン・アステロイデス、トリコスポロン・クタネウム、トリコスポロン・ドメスチカム、トリコスポロン・ムコイデス、トリコスポロン・オボイデス、トリコスポロン・プルランス、トリコスポロン・ロウビエリ、トリコスポロン・ジャポニカム、スケドスポリウム・アピオスペルマム、スケドスポリウム・プロリフィカンス、パエシロマイセス・バリオチ、パエシロマイセス・リラシナス、アクレモニウム・ストリクタム、クラドフィアロフォラ・バンチアナ、ウァンジエラ・デルマチチディス、ラミクロリジウム・オボボイデウム、カエトミウム・アトロブルンネウム、ダクトラリア・ガロパバム、ビポラリス属の種、エクセロヒルム・ロストラタムならびにアブシジア・コリムビフェラ、アポフィソマイセス・エレガンス、ムコル・インディカス、リゾムコル・プシラス、リゾパス・オリザエ、カンニングハメラ・ベルトレチアエ、コケロマイセス・レカルバタス、サクセナエア・バシフォルミス、シンセファラストラム・ラセモサム、バシジオボラス・ラナラム、コニジオボラス・コロナタス、コニジオボラス・インコングラウス、ブラストマイセス・デルマティディス、コクシジオイデス・イミティス、コクシジオイデス・ポサダシ、ヒストプラズマ・カプスラタム、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス、シュードアレシェリア・ボイジ、およびソポロトリクス・シェンキより選択される、局面24の人工的に作り出されたディフェンシン。
30.昆虫が、ジアトラエア・グランジオセラ、オストリニア・ヌビアリス、ロパロシファム属の種、ヘリコベルパ属の種、プルテラ・キシロステラ、およびライガス属の種より選択される、局面19の人工的に作り出されたディフェンシン。
31.局面1〜30のいずれか一つの人工的に作り出されたディフェンシンを含み、任意で、化学殺病原体剤もしくはタンパク質性殺病原体剤および/あるいはセリンプロテイナーゼ阻害剤もしくはシステインプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型をさらに含む、組成物。
32.局面1〜30のいずれか一つの人工的に作り出されたディフェンシンをコードする、単離された核酸分子。
33.局面32の単離された核酸分子を含む、遺伝子構築物。
34.局面1〜30のいずれか一つの人工的に作り出されたディフェンシンを産生する遺伝子組換え植物、または前記植物の子孫。
35.局面32の核酸分子または局面33の遺伝子構築物を含む局面34の遺伝子組換え植物、あるいはその子孫もしくは増殖材料。
36.コーン、ダイズ、ワタ、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、キャノーラ、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、イチジク、アマ、ブドウ、ラッカセイ、アサ、ラベンダー、キノコ、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナッツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、アブラナ、ライグラス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タロイモ、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフ、およびヤムイモより選択される、局面34または35の遺伝子組換え植物。
37.増強された抗病原体活性を示す遺伝子組換え植物またはその子孫を作製するための方法であって、局面1〜30のいずれか一つに記載の改変クラスIIナス科ディフェンシンをコードする核酸を発現する細胞を含む植物を作り出す工程であって、植物またはその子孫における発現レベルが、改変ディフェンシンが植物病原体に対して保護効果を示すのに十分な発現レベルである、工程を含む、方法。
38.植物における病原体侵入を防除する方法であって、局面31の組成物を、植物、その根、または植物の周囲にある土壌に局所適用する工程を含む、方法。
39.動物対象における病原体侵入を防除する方法であって、局面31の組成物を、病原体が侵入している可能性のある動物の表面に局所適用する工程を含む、方法。
40.化学殺病原体剤、タンパク質性殺病原体剤、あるいはセリンプロテイナーゼ阻害剤もしくはシステインプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型を適用する工程をさらに含む、局面37または38記載の方法。
41.動物が哺乳動物である、局面39記載の方法。
42.哺乳動物がヒトである、局面31記載の方法。
43.抗病原体医薬の製造における、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ領域を有する、クラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンであって、ループ領域が1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加によって改変されている、人工的に作り出されたディフェンシンの使用。
44.ループ領域がループ1Bである、局面43の使用。
45.病原体が真菌である、局面43または44の使用。
46.化学殺病原体剤、タンパク質性殺病原体剤、あるいはセリンプロテイナーゼ阻害剤もしくはシステインプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆型の使用をさらに含む、局面43または44または45の使用。
47.SEQ ID NO:49[NsD1]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:49[NsD1]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシン。
48.SEQ ID NO:51[NsD2]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:51[NsD2]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有するニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシン。
49.局面47または48のディフェンシンをコードするヌクレオチドの配列を含む、単離された核酸分子。
50.SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、中程度のストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:48または50とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、および最適アラインメント後にSEQ ID NO:46または48に対して少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、局面49の単離された核酸分子。
51.改変ループ1B領域を含み、抗病原体活性を示す人工ディフェンシンの製造における、SEQ ID NO:52に対して少なくとも約70％の類似性を有するクラスIIナス科ディフェンシン成熟ドメインC末端領域を含むクラスIIナス科ディフェンシンの使用。
52.局面32の核酸およびプロテイナーゼ阻害剤をコードする核酸を含む、遺伝子構築物。
【実施例】
【０１６３】
以下の非限定的な例によって局面がさらに説明される。これらの実施例において用いられる方法を以下で説明する。
【０１６４】
ナス科花からのディフェンシンの精製
天然供給源からクラスIIディフェンシンを単離するために、以前に述べられたように(Lay et al. 2003 前記)、花発達の花弁着色段階までのN.アラタ(NaD1、NaD2)またはN.スアベオレンス(NsD1、NsD2)の花全体をすりつぶして細粉にし、希硫酸に溶解して抽出した。簡単に述べると、花(760g湿重量)を液体窒素に入れて凍結し、乳鉢および乳棒ですりつぶして細粉にし、50mM硫酸(新鮮重量1gあたり3mL)に溶解して、UltraTurraxホモジナイザーを用いて5分間ホモジナイズした。4℃で1時間、攪拌した後に、細胞破片を、Miracloth(Calbiochem, San Diego, CA)に通して濾過および遠心分離(25,000xg、15分、4℃)によって取り除いた。次いで、10M NaOHを添加することによってpHを7.0に調整した。抽出物を、4℃で1時間、攪拌した後に、遠心分離(25,000xg、15分、4℃)して沈澱タンパク質を取り除いた。上清(1.8L)を、10mMリン酸ナトリウム緩衝液で予め平衡にしたSP Sepharose(商標) Fast Flow(GE Healthcare Bio-Sciences)カラム(2.5x2.5cm)に適用した。20カラム体積の10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で洗浄することによって非結合タンパク質を取り除き、500mM NaClを含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を用いて、結合タンパク質を3x10mL画分中に溶出した。SP Sepharoseカラムからの画分を逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)に供した。
【０１６５】
ピキア・パストリスからのNaD1の精製
ピキア・パストリス発現系は周知であり、Invitrogenから市販されている(Carlsbad, CA;pPIC9発現ベクターの配列を開示しているサプライヤーのPichia Expression Manualを参照されたい)から市販されている。
【０１６６】
pPIC9-NaD1 P.パストリスGS115のシングルコロニーを用いて、100mLフラスコに入っているBMG培地(Invitrogen Pichia Expression Manualに記載)10mLに接種し、30℃振盪インキュベーター(140rpm)に入れて一晩インキュベートした。培養物を用いて、2Lバッフル付フラスコに入っているBMG 500mLに接種し、30℃振盪インキュベーター(140rpm)に入れた。OD600が2.0に達したら(約18時間)、細胞を遠心分離(2,500xg、10分)によって収集し、5Lバッフル付フラスコに入っているBMM培地1Lに再懸濁し(OD600=1.0)、28℃振盪インキュベーターに入れて3日間インキュベートした。発現培地を遠心分離(4750rpm、20分)によって細胞から分離し、等量の20mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で希釈した。培地をNaOHでpH6.0に調整した後に、10mMリン酸カリウム緩衝液、pH6.0で予め平衡にしたSP Sepharoseカラム(1cmx1cm, Amersham Biosciences)に適用した。次いで、カラムを、10mMリン酸カリウム緩衝液、pH6.0 100mLで洗浄し、結合タンパク質を、500mM NaClを含有する10mMリン酸カリウム緩衝液10mLで溶出した。溶出タンパク質を、本明細書の下記のように40分の直線勾配を用いてRP-HPLCに供した。タンパク質ピークを収集し、SDS-PAGEおよび抗NaD1抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。NaD1含有画分を凍結乾燥し、滅菌milliQ超純水に再懸濁した。Pichia発現NaD1のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ(Pierce Chemical Co.)とタンパク質標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いて求めた。
【０１６７】
逆相高速液体クロマトグラフィー
逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を、検出器(モデル166, Beckman)と接続したSystem Gold HPLC(Beckman)において、ガードカラムが取り付けられた調製用C8カラム(22x250mm, Vydac)を用いて行った。タンパク質試料を緩衝液A(0.1％[v/v]トリフルオロ酢酸)にロードし、0〜100％[v/v]緩衝液B(0.089％[v/v]トリフルオロ酢酸に溶解した60％[v/v]アセトニトリル)の直線勾配で40分にわたり10mL/分の流速で溶出した。タンパク質は、215nmでの吸光度をモニタリングすることによって検出した。タンパク質ピークを収集し、SDS-PAGEによって分析した。
【０１６８】
各段階のNaD1精製からの試料(30μL)をNuPAGE(登録商標)LDS試料ローディング緩衝液(10μL, Invitrogen)に添加し、70℃で10分間加熱した。次いで、試料をNuPAGE(登録商標)プレキャスト4〜12％[w/v]Bis-Trisポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)にロードし、タンパク質を、XCell-Surelock電気泳動装置(Invitrogen)を用いて200Vで流して分離した。タンパク質をクマシーブルー染色によって視覚化するか、または抗NaD1抗体を用いたイムノブロッティングのためにニトロセルロースに転写した。
【０１６９】
rNaD1の円二色スペクトル
P.パストリスから精製されたNaD1(rNaD1)が正確に折り畳まれているかどうかどうかを調べるために、遠紫外線円二色(CD)スペクトルを記録し、天然NaD1と比較した。2つのスペクトルが類似していることから、rNaD1構造は天然NaD1と比較してあまり変化しなかったことが分かる。
【０１７０】
NaD1のPCR変異誘発
NaD1の部位特異的変異誘発を、Phusion(登録商標)部位特異的変異誘発キット(Finnzymes)を用いて行った。望ましい変異を組み込むように、5'末端リン酸化オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。テンプレートプラスミド(pPIC9-NaD1)全体を、以下の温度プロファイル;98℃、30秒;55℃、20秒;72℃、4分を用いた30サイクルと72℃10分の最終延長サイクルのPCR反応において増幅した。次いで、直鎖PCR産物を、T4 DNA Quick Ligaseを用いてRTで5分間、環状化し、製造業者の説明書に従って化学コンピテントTOP10細胞に形質転換によって導入した。変異が正確に組み込まれていることを確実にするために、AOX3'プライマーを用いて構築物を配列決定した。
【０１７１】
エレクトロコンピテントP.パストリスの調製
Chang et al.(2005) Mol Biol Cell 16(10):4941-4953に記載のように、エレクトロコンピテントP.パストリスGS115細胞(Invitrogen)を調製した。簡単に述べると、YPD(1％w/v Bacto酵母抽出物、2％w/v Bactoペプトン抽出物、および2％w/vデキストロース)の中で一晩増殖させた細胞を収集し、振盪しながら、10mM DTT、25mM HEPES, pH8を含有するYPDで30℃で15分間、処理した。細胞を水で2回、氷冷1Mソルビトールで1回、洗浄した後に、1Mソルビトールに再懸濁し、-80℃で保管するために80μLアリコートに分けた。
【０１７２】
pPIC9構築物によるP.パストリスGS115の形質転換
それぞれのpPIC9構築物で形質転換されたシングル大腸菌TOP10コロニーを用いて、100μg/mLアンピシリンを含有するLB 10mLに接種し、振盪インキュベーターに入れて37℃で一晩インキュベートした。プラスミドDNAを、Qiaprep(登録商標)miniprepキット(Qiagen)を用いて単離し、制限酵素SalIを用いて一晩、直線化した。コンピテントP.パストリスGS115細胞(80μL)を氷上で解凍し、直線化DNA 1μgを、0.2cmギャップのある氷冷Gene Pulser(登録商標)エレクトロポレーションキュベットに添加した。DNAを、1.5kV、25μF、400Ω(Gene Pulser, Bio-Rad Laboratories)でのエレクトロポレーションによって導入した。氷冷1Mソルビトール(1mL)を細胞に添加した後に、MDプレート(アミノ酸を含有せず、硫酸アンモニウムを含有する、1.34％w/vイーストニトロジェンベース[US Biological, YNB]、4x10-5％w/vビオチン、2％w/vデキストロース)にプレートし、30℃で5日間インキュベートした。次いで、陽性コロニーを選択し、新鮮なMDプレートに再プレートした。
【０１７３】
rNaD1の特徴付け
図6A〜Dは、花から単離されたrNaD1のイムノブロット、逆相HPLCトレース、構造、および菌糸増殖に対するrNaD1の活性を示す。
【０１７４】
アミノ酸配列比較
図3Aおよび3Bは、NaD1を含む様々なクラスIIナス科ディフェンシンのアミノ酸配列の図を示す。図4は、クラスIディフェンシンおよびクラスIIディフェンシンを示す。これらのアラインメントにおけるループ1B領域は、図3のアミノ酸10-15および図4のアミノ酸9〜14からなる。本開示は、NaD1のアミノ酸32〜51(図3)に対して少なくとも70％の類似性を有する20個の連続したC末端アミノ酸残基(SEQ ID NO:52)を有するディフェンシンに及ぶ。例を表4に示した。
【０１７５】
ベクター地図
図11は、pHEX138のベクター地図を示す。
【０１７６】
植物研究におけるバイオアッセイ法:
コレトトリカム・グラミニコラ接種材料の調製:
コレトトリカム・グラミニコラ(US分離株Carroll-1A-99)をゼア・メイズ(Zea maize)(Pioneer Hi-Bred International, Inc. Johnston, Iowa, USA)から単離した。V8寒天上で約2〜3週間、増殖させた胞子形成中の培養物から胞子を単離した。滅菌水でプレート表面をこそぎ落とし、ティッシュに通した濾過によって菌糸物体から胞子を分離することによって、コレトトリカム・グラミニコラの胞子を収集した。濾液中の胞子濃度を血球計算器を用いて測定した。
【０１７７】
F.グラミネアラム接種材料の調製:
フザリウム・グラミネアラム分離株(73B1A)をゼア・メイズ(Pioneer Hi-Bred International, Inc. Johnston, Iowa, USA)から単離した。SNP寒天上で約2〜3週間、増殖させた胞子形成中の培養物から胞子を単離した。滅菌水でプレート表面をこそぎ落とすことによって、フザリウム・グラミネアラムの胞子を収集した。胞子濃度を血球計算器を用いて測定した。
【０１７８】
トウモロコシ植物への接種:
フラスコから出した後に、バイオアッセイ用の植物を温室内で約9〜10週間、生育した。
【０１７９】
C.グラミニコラの接種
トウモロコシ葉鞘の反対側に長さ2.0mmの傷を2つつけ、次いで、1x106個のコレトトリカム・グラミニコラ胞子/mLをかぶせた。次いで、傷をGlad Pressn'Sealで3日間シールした。接種して10日後にデジタル写真によって感染面積を測定した。
【０１８０】
F.グラミネアラムの接種
トウモロコシ葉鞘の反対側に長さ2.0mmの傷を2つつけた。1x106個のフザリウム・グラミネアラム胞子/mLに浸した直径6mmのペーパーディスクを傷にかぶせた。次いで、傷をGlad Pressn'Sealで3日間シールした。接種して10日後にデジタル写真によって感染面積を測定した。
【０１８１】
ELISA法
タンパク質抽出物:
温室内で生育した植物から葉鞘を切り出した。組織(50mg)を液体窒素に入れて凍結し、ミキサーミル(Retsch MM300)で振動数30s-1で2x15秒間すりつぶした。2％不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％Tween20 450μLを添加し、20秒間ボルテックスすることによって、タンパク質抽出物を作った。試料を10分間遠心分離し、上清を収集した。
【０１８２】
ELISAプレート(Nunc Maxisorp #442404)を、PBSに溶解した100μL/ウェルの一次抗体(100ng/ウェルの抗NaD1(ポリクローナル抗体は、ニコチアナ・アラタの花に由来する精製NaD1に対する標準的な方法によって作られた))とインキュベートした。プレートを、湿度の高い箱の中で4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、PBS/0.05％v/v Tween20で2分間x4洗浄した。プレートを、PBSに溶解した200μL/ウェルの3％w/v BSA(Sigma A-7030:98％ELISAグレード)でブロックし、25℃で2時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS/0.05％v/v Tween20で2分間x4洗浄した。
【０１８３】
次いで、トウモロコシ鞘タンパク質抽出物(PBS/0.05％v/v Tween20で希釈した100μL/ウェル)をプレートに加え、次いで、プレートを25℃で2時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS/0.05％v/v Tween20で2分間x4洗浄し、次いで、PBSに溶解した100μL/ウェルの二次抗体(75ng/ウェルのビオチン標識NaD1抗体)を加えた。ビオチン標識抗体は、EZ-link Sulfo-NHS-LC-ビオチン化キット(Pierce)を用いて調製した。2mLのプロテインA精製抗体および2mgのビオチン試薬を使用した。プレートを25℃で1時間インキュベートし、次いで、PBS/0.05％v/v Tween20で2分間x4洗浄した。PBSに溶解した100μL/ウェルのNeutriAvidin HRP結合体(Pierce #31001;1:1000希釈;0.1μL/ウェル)を加えた。プレートを25℃で1時間インキュベートし、次いで、PBS/0.05％v/v Tween20で2分間x2洗浄した後に、H2Oで2分間x2洗浄した。使用直前に、1個のImmunoPure OPD錠剤(Pierce #34006)を9mLのH2Oに溶解し、次いで、1mLの安定ペルオキシド緩衝液(10X, Pierce #34062)を添加することによって、基質を調製した。基質を100μL/ウェルで加え、発色するまでプレートを25℃でインキュベートした。50μLの2.5M硫酸を加えることによって、反応を止めた。490nmでの吸光度をプレートリーダー(Molecular Devices)において測定した。
【０１８４】
イムノブロット分析
温室内で生育した植物から葉鞘を切り出した。葉鞘組織(50mg)を液体窒素に入れて凍結し、ミキサーミル(Retsch MM300)で振動数30s-1で2x15秒間すりつぶして細粉にした。2％w/v不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％v/v Tween20(75μL)を添加し、ボルテックスすることによって、試料を抽出した。次いで、試料を14,000rpmで10分間、遠心分離し、上清を保管した。上清(21μL)に、Novex NuPAGE 4X LDS試料緩衝液(7.5μL)およびβ-メルカプトエタノール(1.5μL)を添加し、70℃で10分間加熱した。
【０１８５】
抽出された葉鞘タンパク質を、Novex X Cell II mini-cell電気泳動装置において、予め形成された4〜12％w/vポリアクリルアミド勾配ゲル(Novex, NuPAGE bis-tris, MES緩衝液)上でのSDS-PAGEによって200Vで35分間、分離した。予め染色された分子量マーカー(Novex SeeBlue Plus 2)を標準として含めた。タンパク質を、10％v/vメタノールを含むNuPAGEトランスファー緩衝液が入っているNovex X Cell mini-cell電気泳動装置を用いてニトロセルロース膜(Osmonics 0.22ミクロンNitroBind)に60分間、30Vで転写した。転写後に、膜をイソプロパノールに入れて1分間インキュベートした後に、TBSで5分間、洗浄した。
【０１８６】
膜を3％w/v BSAで室温で1時間ブロックした後に、一次抗体と室温で一晩インキュベートした(1mg/mlストックの成熟NaD1またはHvCPI6抗体をTBS/1％w/vBSAで1:1000に希釈した)。膜をTBSTで5x10分間、洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(Pierce, TBSで1:50,000に希釈)とRTで60分間インキュベートした。さらに5X10分間、TBST洗浄を行った後に、膜を、製造業者の説明書に従ってSuperSignal West Pico Chemiluminescent基質(Pierce)とインキュベートした。膜をECL Hyperfilm(Amersham)に曝露した。
【０１８７】
（表4）
2014506461.tif 000018
【０１８８】
実施例1
クラスIディフェンシンの抗真菌活性
方法に記載のように、3種類のクラスIディフェンシンを、これらの天然供給源(NaD2)から精製した、またはP.パストリス発現系(γ-ゼアチオニン2、γ-ホルドチオニン)を用いて発現させた。フザリウム・グラミネアラムに対するペプチドの抗真菌活性を、本質的にBroekaert et al.(1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-60, 1990に記載のように評価し、2種類のナス科クラスIIディフェンシン(NaD1、NsD1)の抗真菌活性と比較した。滅菌モスリンに通した濾過によって、半強度(half-strength)ジャガイモデキストロースブロス(PDB)中で増殖している胞子形成中の培養物から胞子を単離した。胞子濃度を血球計を用いて求め、1/2xPDBに溶解して5x104胞子/mLまで調整した。最終タンパク質濃度が0〜10μMとなるように20μLのフィルター濾過(0.22μm注射器フィルター;Millipore)タンパク質または水と一緒に、胞子懸濁液(80μL)を滅菌96ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。プレートを短時間、振盪し、振盪することなく25℃で28時間、暗所に置いた。菌糸増殖を、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax Pro M5e; Molecular Devices)を用いて595nmでの光学密度を測定することによって評価した。それぞれの試験を三通り行った。結果(図7)から、試験されたクラスIディフェンシンは低い抗真菌活性を示すことが分かった。
【０１８９】
実施例2
クラスIIナス科ディフェンシン上にあるNaD1ループ1B領域に対する改変
本実施例の第1の局面は、クラスIIナス科ディフェンシンの選択である。SEQ ID NO:52に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含むC末端部分を有するディフェンシンを特定するために、ディフェンシンをスクリーニングする（表4）。図3はアラインメントのタイプを示す。SEQ ID NO:50は、最もC末端側のインバリアントシステイン残基を含む、20個の連続した末端アミノ酸を示す。NaD1、NsD1、PhD2、NeThio1、およびNeThio2は、SEQ ID NO:52と100％の類似性を有するディフェンシンの例である。
【０１９０】
クラスIIナス化ディフェンシンバックボーンとしてNaD1を選択する。このディフェンシンは、アミノ酸配列:NTFPGI(SEQ ID NO:12)を有するループ1Bを含む。
【０１９１】
アミノ酸残基NTFPGIの1つまたは複数を別のアミノ酸残基によって置換する。6個全ての残基が変えられてもよく、残基のうち1個または2個または3個または4個または5個が変えられてもよい。これには1個のアミノ酸置換またはループ1Bスワップが含まれる。なされる変化の例には、以下の配列:
2014506461.tif 000019
(と括弧内の供給源)が含まれる。
【０１９２】
他の例には、SEQ ID NO:67〜79より選択されるアミノ酸配列の選択が含まれる。
【０１９３】
実施例3
NaD1ループ変種の存在下でのフザリウム・グラミネアラムの増殖の阻害
組換えNaD1ならびにループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製した。フザリウム・グラミネアラムに対するペプチドの抗真菌活性を、本質的にBroekaert et al(1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-60に記載のように評価した。滅菌モスリンに通した濾過によって、半強度ジャガイモデキストロースブロス(PDB)中で増殖している胞子形成中の培養物から胞子を単離した。胞子濃度を血球計を用いて求め、1/2xPDBに溶解して5x104胞子/mLまで調整した。最終タンパク質濃度が0〜10μMとなるように20μLのフィルター濾過(0.22μm注射器フィルター;Millipore)タンパク質または水と一緒に、胞子懸濁液(80μL)を滅菌96ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。プレートを短時間、振盪し、振盪することなく25℃で28時間、暗所に置いた。菌糸増殖を、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax Pro M5e; Molecular Devices)を用いて595nmでの光学密度を測定することによって評価した。それぞれの試験を三通り行った。
【０１９４】
結果
図8は、NaD1と比較した、フザリウム・グラミネアラム(Fgr)に対するループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35の相対抗真菌活性を示す。0.825ppmでは、HXP4、HXP34、およびHXP35はそれぞれ、フザリウム・グラミネアラムの増殖をNaD1より41.7％大きく、14.6％大きく、または34.5％大きく阻害した。1.65ppmでは、3種類全てのループ変種がフザリウム・グラミネアラムの増殖をNaD1より約70％大きく阻害した。
【０１９５】
実施例4
NaD1ループ変種の存在下でのフザリウム・バーティシリオイデスの増殖の阻害
組換えNaD1ならびにループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製した。フザリウム・バーティシリオイデスに対するペプチドの抗真菌活性を実施例1に記載のように評価した。
【０１９６】
結果
図9は、ループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35の、NaD1と比べて相対的な、F.バーティシリオイデス(Fve)に対する抗真菌活性を示す。3.25ppmでは、HXP4、HXP34、およびHXP35はそれぞれ、F.バーティシリオイデスの増殖をNaD1より40.9％大きく、29.4％大きく、および5.1％大きく阻害した。6.5ppmでは、3種類全てのループ変種がF.バーティシリオイデスの増殖をNaD1より少なくとも67％大きく阻害した。
【０１９７】
実施例5
NaD1ループ変種の存在下でのコレトトリカム・グラミニコラの増殖の阻害
組換えNaD1ならびにループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製した。コレトトリカム・グラミニコラに対するペプチドの抗真菌活性を実施例1に記載のように評価した。
【０１９８】
結果
図10は、NaD1と比較した、コレトトリカム・グラミニコラ(Cgr)に対するループ変種HXP4、HXP34、およびHXP35の相対抗真菌活性を示す。13ppmでは、HXP4、HXP34、およびHXP35はそれぞれ、コレトトリカム・グラミニコラの増殖をNaD1より61.3％、21.8％、または83.2％大きく阻害した。
【０１９９】
実施例6
トランスジェニック植物の作製
HXP4を発現するトランスジェニックキャノーラ(Brassica napus, cv RI64)を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換によって作製した。形質転換に使用したDNAバイナリベクター(pHEX138)を図11に記載した。バイナリベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入し、プラスミドの存在をゲル電気泳動によって確認した。アグロバクテリウム培養物を用いてキャノーラ胚軸切片に感染させた。トランスジェニックシュートを25mg/Lの抗生物質カナマイシン上で選択した。葉から抽出された可溶性タンパク質を検出するためにELISAを用いて、HXP4を発現するトランスジェニック植物を選択した。
【０２００】
3回の形質転換実験(CAT93、CAT94、およびCAT96)から、7つの植物(6回の事象)には検出可能なレベルのHXP4があった（表5）。HXP4タンパク質のレベルは0.3〜2.1ppm(ng HXP4/mg葉組織の新鮮重量)であった。
【０２０１】
（表5）
2014506461.tif 000020
【０２０２】
レプトスファエリア・マクランスを用いた温室バイオアッセイ
病原体レプトスファエリア・マクランスを10％(v/v)V8寒天プレート上で室温で1〜2週間、増殖させる。プレートを滅菌水(5mL)で覆い、寒天表面をこそぎ落として胞子を取り出すことによって粉胞子を単離する。ティッシュに通した濾過によって菌糸物体から胞子を分離する。濾液中の胞子濃度を血球計を用いて求め、水で1x106〜1x107粉胞子/mLまで最終濃度を調整する。
【０２０３】
実生を小さな種まき用トレーに入れて温室内で22℃で生育する。種をまいて約10日後に、それぞれの実生の2枚の子葉に、26ゲージ針を用いて2回、穴を開け(2つの裂片にそれぞれ1回)、傷をつけた領域に一滴の胞子(5μL)を接種する。対照には水を接種する。胞子発芽を容易にするために、植物を高湿度条件下で3日間、維持する。
【０２０４】
接種後20日まで病気症状を評価する。デジタル画像のコンピュータソフトウェア解析(ImageJ)によって、病変サイズをmm2で定量する。ノンパラメトリック法を用いて、病変サイズの平均を統計解析する。
【０２０５】
実施例7
HXP4を発現するトランスジェニックコーン植物の作製
トランスジェニックコーン植物を、標準的なプロトコール、例えば、米国特許第5,981,840号;米国特許第7,528,293号;米国特許第7,589,176号;米国特許第7,785,828号; Frame et al. (2002) Plant Physiology 129:13-22に記載のプロトコールを用いて、アグロバクテリウムを介した形質転換またはパーティクルボンバードメントによって作製する。選択マーカーとしてGAT、構成的発現用のユビキチンプロモーター、ならびに構成的ユビキチンプロモーターの制御下でHXP4またはNaD1をコードするコドン最適化配列、ならびに選択マーカーとしてGATをコードする配列を含有するバイナリベクターを、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス株に導入した。アグロバクテリウム懸濁液に浸漬した後に、固体培地上である期間にわたって共培養することによって、未熟コーン胚に感染させた。次いで、任意に胚を「休止(rest)させた」。この間に、胚を、アグロバクテリウムの増殖を阻害する少なくとも1種類の抗生物質の存在下でインキュベートした。次に、感染胚を、非形質転換細胞の増殖を阻害するグリホセートを含有する固体培地上で培養することによって、形質転換カルスを得た。次いで、形質転換カルスを標準的な方法を用いて植物に再生することができた。
【０２０６】
PCR陽性植物におけるHXP4発現レベルおよびNaD1発現レベルを、例えば、ELISAスクリーニングによって確かめた。>10ppmでHXP4またはNaD1を発現する植物のコレトトリカム・グラミニコラに対する耐性の増大を、方法に記載のバイオアッセイを用いて評価した。
【０２０７】
結果
>10ppmでHXP4を発現する植物は、空のベクターで形質転換された植物と比較して病変部の26％の縮小を示した。>10ppmでNaD1を発現する植物は、空のベクター対照と比較して病変部の縮小を示さなかった（表8）。
【０２０８】
実施例8
HXP4を発現するトランスジェニックダイズ植物の作製
HXP4を発現するトランスジェニックダイズ植物を、アグロバクテリウムを介した形質転換、またはパーティクルボンバードメント、または他のプロトコール、例えば、米国特許第7,589,176号;米国特許第7,528,293号;米国特許第7,785,828号に記載のプロトコールによって作製する。
【０２０９】
HXP4がPCR陽性の再生ダイズ植物を、例えば、ELISAスクリーニングによってHXP4発現レベルについて評価する。稔性トランスジェニック植物の遺伝子コピー数を評価することができる。選択された株のダイズ真菌病原体耐性を温室バイオアッセイにおいて試験する。
【０２１０】
次いで、ダイズ真菌およびサビ菌および昆虫病原体に対して高耐性を示す株を、感染土壌における圃場試験において、およびダイズ植物に標的真菌、昆虫、またはサビ菌病原体を人工的に感染させる試験において評価する。
【０２１１】
実施例9
HXP4を発現するトランスジェニックコムギの作製
アグロバクテリウムを介した形質転換、またはパーティクルボンバードメント、または他の標準的なプロトコール、例えば、米国特許第7,785,828号に記載のプロトコールによって、HXP4を発現するトランスジェニックコムギを作製する。HXP4がPCR陽性の再生コムギ植物を、例えば、ELISAスクリーニングによってHXP4発現レベルについて評価する。稔性トランスジェニック植物の遺伝子コピー数を評価することができる。選択された株のコムギ真菌病原体耐性を温室バイオアッセイにおいて試験する。
【０２１２】
次いで、コムギ真菌病原体に対して高耐性を示す株を、感染土壌における圃場試験において、およびコムギ植物に標的真菌病原体を人工的に感染させる試験において評価する。
【０２１３】
実施例10
ヒト真菌病原体アスペルギルス・ニガーに対する改変NaD1の活性
組換えNaD1およびループ変種HXP4をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製した。アスペルギルス・ニガーに対するペプチドの抗真菌活性を前記のように評価した。
【０２１４】
結果
図12は、NaD1と比較した、A.ニガーに対するループ変種HXP4の相対抗真菌活性を示す。13ppmでは、HXP4は、A.ニガーの増殖をNaD1より20.6％大きく阻害した。これは、HXP4がNaD1の112％超を有すると表すことができる。26ppmおよび53ppmでは、HXP4は増殖をNaD1より少なくとも10％大きく阻害した。
【０２１５】
実施例11
クリプトコッカス属の種に対する改変NaD1の活性
組換えNaD1およびループ変種HXP4をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製した。クリプトコッカス・ネオフォルマンスの2つの株およびC.ガチの1つの株に対するペプチドの抗真菌活性を前記のように評価した。
【０２１６】
結果
図13Aは、NaD1と比較した、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(C1065)に対するループ変種HXP4の相対抗真菌活性を示す。13ppmでは、HXP4は酵母の増殖を完全に阻害したのに対して、NaD1は約16.7％しか阻害しなかった。従って、HXP4はNaD1の活性の596％超を有した。どちらのタンパク質も6.5ppmでは有意な活性を示さなかった。図13Bは、C.ネオフォルマンスの第2の株(C2067)に対するNaD1およびHXP4の相対抗真菌活性を示す。6.5ppmでは、HXP4は増殖を80％超阻害したのに対して、NaD1は増殖を4％未満しか阻害しなかった。C.ガチに対しては(図13C)、HXP4は13ppmではNaD1より10％大きく、6.5ppmではNaD1より38％大きく増殖を阻害した。
【０２１７】
実施例12
バックボーンとしてのクラスIIナス科ディフェンシンTPP3のループ1B領域に対する改変
クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンとしてTPP3(SEQ ID NO:5)を選択する。このディフェンシンは、アミノ酸配列:QTFPGL(SEQ ID NO:15)を有するループ1Bを含む。ループ1B配列をNaD2のループ1B配列(HRFKGP)[SEQ ID NO:29]に変える。キメラタンパク質(HXP107)をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製する。フザリウム・グラミネアラムに対するペプチドの抗真菌活性ならびにその抗昆虫活性を実施例1に記載のように評価する。HXP107のアミノ酸配列をSEQ ID NO:85に示す。
【０２１８】
結果:
HXP107タンパク質は、IC500.5μMでフザリウム・グラミネアラム(Fgr)に対する抗真菌活性を保持する。これは、IC500.2μMの親タンパク質TPP3の活性に比べて勝っている。
【０２１９】
実施例13
クラスIIナス科ディフェンシンNsD1、C20、およびSL549のループ1B領域に対する改変
クラスIIナス科ディフェンシンバックボーンとして、NsD1(SEQ ID NO:49)、C20(トウガラシ属から単離した)(SEQ ID NO:58)、およびSL549(タバコ属から単離した)(SEQ ID NO:59)を選択する。これらのディフェンシンは、それぞれ、以下のアミノ酸配列:
2014506461.tif 000021
を有するループ1Bを含む。ループ1Bにあるアミノ酸残基の1つまたは複数を別のアミノ酸残基によって置換する。6個全ての残基が変えられてもよく、残基のうち1個または2個または3個または4個または5個が変えられてもよい。これには1個のアミノ酸置換またはループ1Bスワップが含まれる。変化の例には、以下の配列:
2014506461.tif 000022
(と括弧内の供給源)が含まれる。
【０２２０】
別の態様では、ループ1Bを、SEQ ID NO:67〜79より選択される配列によって置換する。
【０２２１】
組換えループ変種をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製する。真菌病原体、例えば、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・オキシスポラム、コレトトリカム・グラミニコラ、およびフザリウム・バーティシリオイデスに対するペプチドの抗真菌活性を実施例1に記載のように評価する。
【０２２２】
実施例14
フザリウム・グラミネアラムおよびコレトトリカム・グラミニコラに対するHXP4とプロテアーゼ阻害剤との相乗作用
オオムギI型阻害剤CI-1Bの成熟ドメインをコードするDNA(SEQ ID NO:63)、ニコチアナ・アラタI型阻害剤NaPin1AをコードするDNA、トマトシスタチンSlCys9をコードするDNA(SEQ ID NO:64)、イネシスタチンOslaをコードするDNA(SEQ ID NO:65)、およびオオムギシスタチンHvCPI6をコードするDNA(SEQ ID NO:66)をGenscriptから入手した。SacIIおよびSacIを用いてpUC57ベクターからインサートを切り出し、Perfectprepキット(Eppendorf)を用いてアガロースゲルから抽出し、pHUEに連結し、次いで、これを用いてTOP10大腸菌細胞を形質転換した。プラスミドDNAを単離し、次いで、これを用いて大腸菌Rosetta-GamiB細胞を形質転換した。
【０２２３】
大腸菌Rosetta-GamiBのシングルコロニーを用いて、アンピシリン(0.1mg/mL)、クロラムフェニコール(0.34mg/mL)、テトラサイクリン(0.1mg/mL)、およびカナマイシン(0.05mg/mL)を含有する2YT培地(10mL、16g/Lトリプトン、10g/L酵母抽出物、5g/L NaCl)に接種し、振盪しながら37℃で一晩増殖させた。この培養物を用いて、アンピシリン(0.1mg/mL)、クロラムフェニコール(0.34mg/mL)、テトラサイクリン(0.1mg/mL)、およびカナマイシン(0.05mg/mL)を含有する2YT培地(500mL)に接種し、次いで、約1.0の光学密度(600nm)まで4時間増殖させた。次いで、IPTGを添加し(0.5mM最終濃度)、培養物を16℃でさらに16時間増殖させた。細胞を遠心分離(4,000g、4℃で20分間)によって収集し、ネイティブライシス(native lysis)緩衝液(20mL/L細胞培養物、50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0)に再懸濁し、-80℃で凍結した。次いで、細胞を解凍し、リゾチーム(5mg/25mL再懸濁細胞)で4℃で20分間、処理した。次いで、DNアーゼI(125uL、20％v/vグリセロール、75mM NaClに溶解して2mg/mL)およびMgCl2(125uL、1M)を添加し、試料をロッキングプラットフォーム上で室温で40分間インキュベートした。次いで、試料を氷上で2x30秒間、超音波処理し(80％w/v出力、Branson sonifier 450)、遠心分離した(20,000g、4℃で30分間)。次いで、ヘキサヒスチジンタグ化ユビキチン融合タンパク質(His6-Ub-NaCys1,2,3)を、製造業者の説明書に従って、未変性条件下で、Ni-NTA樹脂を用いた固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)によってタンパク質抽出物(1.5mL〜約25mLの未変性タンパク質抽出物,Qiagen)から精製した。組換えタンパク質を、溶出緩衝液(250mMイミダゾール、200mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH8.0)を用いて溶出した。50mM Tris.Cl、100mM NaCl、pH8.0で平衡にした予め詰められたSephadex G50ゲル濾過カラム(PD-10, Amersham)に溶出タンパク質を適用することによってイミダゾールを除去した。
【０２２４】
脱ユビキチン化酵素6H.Usp2-cc(Catanzariti et al. (2004), Protein Science 13:1331-1339)を用いて、ヘキサヒスチジンタグ化ユビキチンを組換えタンパク質から切断した。非結合タンパク質として、脱ユビキチン化プロテアーゼ阻害剤を用いて、もう1回IMACすることによって、切断されたタグを除去した。次いで、これを逆相HPLCによってさらに精製した。
【０２２５】
組換えCI-1B、SlCys9、およびOslaをH2Oに溶解して原液(20μM)として調製した。ウシ膵臓由来トリプシン阻害剤I-P型(Anderson and Kingston(1983), Proc. Natl. Acad. USA 80:6838-6842)をSigma(T0256)から購入し、H2Oで20μMの濃度まで希釈した。
【０２２６】
フザリウム・グラミネアラムまたはコレトトリカム・グラミニコラ(Colletotrichum gramincola)の増殖に対する、HXP4およびNaD1とセリンプロテイナーゼ阻害剤またはシステインプロテイナーゼ阻害剤との組み合わせの阻害効果を、本質的にBroekaert et al, 前記1990に記載のように測定した。合成貧栄養寒天(SNPB、フザリウム・グラミネアラム)またはV8寒天(コレトトリカム・グラミニコラ)上で増殖している胞子形成中の培養物から胞子を単離し、血球計を用いて計数した。
【０２２７】
本質的に実施例1に記載のように、抗真菌アッセイを96ウェルマイクロタイタートレーの中で行った。ウェルに、10μLのフィルター滅菌(0.22μm注射器フィルター、Millipore)NaD1(2.5μM)、HXP4(2.5μM)または水と、10μLのフィルター滅菌(0.22μm注射器フィルター, Millipore)プロテイナーゼ阻害剤または水、および1/2強度のPDBに溶解した5x104胞子/mL 80μLを充填した。プレートを25℃でインキュベートした。菌糸増殖を、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax Pro M2; Molecular Devices)を用いて595nmでの光学密度(A595)を測定することによってアッセイした。それぞれの試験を四通り行った。
【０２２８】
結果
同濃度で試験したときに、フザリウム・グラミネアラムに対するHXP4とプロテアーゼ阻害剤との相乗効果はNaD1より大きかった。HXP4はコレトトリカム・グラミニコラに対してもプロテアーゼ阻害剤と相乗作用した。相乗作用の計算を表6および表7に示した。Eeは、パーセント阻害として表された、Limpelの式(Richer et al. Pestic Sci 19:309-315)に従う相加応答からの予想された効果である。loは、観察されたパーセント阻害である。4種類全てのプロテアーゼ阻害剤を用いて、Ee値より大きな相乗作用、すなわちlo値が得られた。
【０２２９】
実施例15
植物におけるフザリウム・グラミネアラムに対するHXP4とHvCPI6の相乗作用
実施例7に記載の方法を用いて、HXP4、HvCPI6、またはHXP4+HvCPI6を発現するトランスジェニックコーン植物を作り出し、方法に記載のバイオアッセイを用いてフザリウム・グラミネアラムに対する耐性の増大について評価した。
【０２３０】
図15は、コーン発現用のHvCPI6構築物を示す。図16は、コーン発現用のHXP4+HvCPI6構築物を示す。
【０２３１】
結果
HXP4のみまたはHvCPI6のみを発現する植物は、空のベクターで形質転換された植物と比較して病変部の縮小を示さない。HXP4+HvCPI6を発現する植物の病変部は空のベクター対照と比較して45％縮小した（表9）。
【０２３２】
実施例16
アジアダイズサビ菌に対するHXP4の効果
NaD1をニコチアナ・アラタの花から単離し、ループ変種HXP4をP.パストリス発現系において発現させ、方法に記載のように精製した。アジアダイズサビ菌(ファコプソラ・パキルヒジ)に対するHXP4の効果を試験し、NaD1と比較した。水に溶解した100ppm、10ppm、1ppm、および0.1ppmのペプチドの存在下または非存在下で寒天滴の上に置いたセロハンの上で、ファコプソラ・パキルヒジ夏胞子を生育させた。24時間および48時間で、顕微鏡を用いて、発芽、付着器の形成、および付着器後構造の形成を評価した。処理1回につき3枚の膜を調べ、膜1枚につき50個の単離された胞子発芽体(germling)を評価した。
【０２３３】
結果
発芽(24時間;図14A)、付着器の形成(24時間;図14B)、および付着器後構造の形成(48時間;図14C)に対する効果を全て調べた。10ppmでは、HXP4は、発芽をNaD1より62％大きく効果的に阻害したが、付着器の形成および付着器後構造の形成は、それぞれ、NaD1より65％および59％大きく阻害された。
【０２３４】
実施例17
新規のループ1B配列を特定するためのハイスループットスクリーニング
NaD1の部位特異的変異誘発を、Phusion(登録商標)部位特異的変異誘発キット(Finnzymes)を用いて行った。ループ1Bのランダムな6個のアミノ酸変異を組み込むように5'末端リン酸化縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
【０２３５】
ループ1B変種のライブラリーを発現させるためにpHUE系を使用した。48ウェルプレートにおいて発現させ、96ウェルフィルタープレートにおいて精製するために、発現および精製には実施例14に記載の方法から若干の変更を加えた。テンプレートプラスミド(pHUE-NaD1)全体を、66℃、30秒のアニーリング温度を用いた35サイクルのPCR反応において増幅した。次いで、直鎖PCR産物を、T4 DNAリガーゼを用いて16℃で一晩、環状化し、製造業者の説明書に従って、エレクトロコンピテントRosetta-GamiB(DE3)細胞に形質転換によって導入した。回収された細胞を、アンピシリン(0.1mg/mL)、クロラムフェニコール(0.34mg/mL)、テトラサイクリン(0.1mg/mL)、およびカナマイシン(0.015mg/mL)を含有する2YT寒天上にプレートし、37℃で一晩インキュベートした。
【０２３６】
シングルコロニーを用いて、96ウェルプレートに入っている、アンピシリン(0.1mg/mL)、クロラムフェニコール(0.34mg/mL)、テトラサイクリン(0.1mg/mL)およびカナマイシン(0.015mg/mL)を含有する2YT 150μLに接種した。pHUE-NaD1で形質転換されたRosetta-GamiB(DE3)を正の対照として含めた。70％湿度で一定に振盪しながら、プレートを37℃で一晩インキュベートした。各ウェルの50マイクロリットルを2.5mLの2YT抗生物質に移し、発現および精製を実施例13に記載のように行った。
【０２３７】
コレトトリカム・グラミニコラに対するタンパク質の活性を試験した。0.5mM CaCl2、25mM KClを含有する1/2xジャガイモデキストロースブロスに溶解して最終濃度が2x104胞子/mLとなるように、15マイクロリットルのタンパク質溶液を105μLの胞子溶液に添加した。プレートを25℃でインキュベートし、菌糸増殖を、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax Pro M5e; Molecular Devices)を用いて595nmでの光学密度を測定することによって40時間後にアッセイした。NaD1対照と同等に、またはNaD1対照より大きく真菌増殖を阻害したタンパク質を、発現に使用した細菌コロニーのプラスミドDNAを配列決定することによって特定した。スクリーニングにおいて特定されたシングルコロニーは、NaD1のループ1B配列と同一のループ1B配列を有することが見出された。大規模精製および試験のために、いくつかのコロニーを選択した。タンパク質を実施例14に記載のように発現させ、実施例1に記載のようにフザリウム・グラミコラ(Fusarium graminicola)およびコレトトリカム・グラミニコラに対する活性について試験した。ループ1Bの配列識別子を表10に列挙した。
【０２３８】
（表6）Fgrに対する、プロテイナーゼ阻害剤と組み合わせたHXP4対NaD1の相乗効果
2014506461.tif 000023
【０２３９】
（表7）Cgrに対する、プロテイナーゼ阻害剤と組み合わせたHXP4の相乗効果
2014506461.tif 000024
【０２４０】
（表8）Cgrに対する、HXP4またはNaD1を発現するトランスジェニックコーン植物の保護
2014506461.tif 000025
【０２４１】
（表9）Fgrに対する、HvCPI6と組み合わせてHXP4を発現するトランスジェニックコーンの保護
2014506461.tif 000026
【０２４２】
（表10）コレトトリカム・グラミニコラの増殖を阻害するタンパク質に由来するループ1B配列
2014506461.tif 000027
【０２４３】
当業者であれば、本明細書に記載の開示は、具体的に説明された変化および変更以外の変化および変更を受け入れることができることを理解するであろう。本開示は、このような全ての変化および変更を含むことが理解されるはずである。本開示はまた、本明細書において言及された、または示された工程、特徴、組成物、および化合物の全てを個々に、または一括して含み、これらの工程もしくは特徴の任意の2つ以上からなる任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを含む。
【０２４４】
文献目録
2014506461.tif 000028
2014506461.tif 000029
【図１】
2014506461.tif 000031
【図２】
2014506461.tif 000032
【図３Ａ】
2014506461.tif 000033
【図３Ｂ】
2014506461.tif 000034
【図４】
2014506461.tif 000035
【図５】
2014506461.tif 000036
【図６Ａ】
2014506461.tif 000037
【図６Ｂ】
2014506461.tif 000038
【図６Ｃ】
2014506461.tif 000039
【図６Ｄ】
2014506461.tif 000040
【図７】
2014506461.tif 000041
【図８】
2014506461.tif 000042
【図９】
2014506461.tif 000043
【図１０】
2014506461.tif 000044
【図１１】
2014506461.tif 000045
【図１２】
2014506461.tif 000046
【図１３Ａ】
2014506461.tif 000047
【図１３Ｂ】
2014506461.tif 000048
【図１３Ｃ】
2014506461.tif 000049
【図１４Ａ】
2014506461.tif 000050
【図１４Ｂ】
2014506461.tif 000051
【図１４Ｃ】
2014506461.tif 000052
【図１５】
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【図１６】
2014506461.tif 000054
【配列表】
2014506461000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月8日(2013.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有し、外因性のループ1Bのアミノ酸配列に置き換えられているループ領域（ループ1B）をN末端部分の1番目のβ鎖とαヘリックスとの間に有し、かつ抗真菌活性を有する、単離された人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンポリペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:57に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:29〜38からなるリストより選択されるループ1Bを含む、請求項1または2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
SEQ ID NO:67〜79からなるリストより選択されるループ1Bを含む、請求項1または2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
ループ1Bアミノ酸配列がSEQ ID NO:29を含む、請求項1または2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
HXP4（SEQ ID NO:39）、HXP34（SEQ ID NO:40）、およびHXP35（SEQ ID NO:41）より選択されるポリペプチドに対して少なくとも90％のアミノ酸配列類似性を有する、請求項1または2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
HXP4（SEQ ID NO:39）、HXP34（SEQ ID NO:40）、およびHXP35（SEQ ID NO:41）より選択される、請求項6記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
真菌病原体が植物真菌病原体、哺乳動物真菌病原体、およびサビ菌より選択される、請求項1または2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
真菌が、コレトトリカム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、ディプロディア・メイディス（Diplodia maydis）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticilloides）、フザリウム・ビルグルリフォルメ（Fusarium virgululiforme）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Sclerotinia sclerotiorum）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、およびフザリウム・ツクマニアエ（Fusarium tucumaniae）からなるリストより選択される、請求項8記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
真菌が、アルテルネリア属の種（Alternaeria spp）、アスペルギルス属の種（Aspergillus spp）、カンジダ属の種（Candida spp）、フザリウム属の種（Fusarium spp）、トリコフィトン属の種（Trychophyton spp）、クリプトコッカス属の種（Cryptococcus spp）、ミクロスポルム属の種（Microsporum spp）、ペニシリウム属の種（Penicillium spp）、トリコスポロン属の種（Trichosporon spp）、セドスポリウム属の種（Scedosporium spp）、ペシロマイセス属の種（Paeciliomyces spp）、アクレモニウム属の種（Acremonium spp）、およびデマチウム科の糸状菌からなるリストより選択される、請求項8記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載のポリペプチドを産生する遺伝子組換え植物、または該ポリペプチドを産生する該植物の子孫。
【請求項１３】
コーン、ダイズ、ワタ、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、キャノーラ、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、イチジク、アマ、ブドウ、ラッカセイ、アサ、ラベンダー、キノコ、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナッツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、アブラナ、ライグラス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タロイモ、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフ、およびヤムイモからなるリストより選択される、請求項12記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１４】
遺伝子組換えの結果として抗真菌活性を示す遺伝子組換え植物またはその子孫を作製する方法であって、請求項1〜10のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を含む植物を作り出す工程を含み、該植物またはその子孫における該発現のレベルが、改変ディフェンシンが植物真菌病原体に対して保護効果を示すのに十分である、方法。
【請求項１５】
クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を有するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含むディフェンシンを作製する方法であって、該ループ1B領域全体の、外因性ループ1B配列へのアミノ酸置換によって該ループ1B領域を改変して、抗真菌活性を有するディフェンシンポリペプチドを作製する工程を含む、方法。
【請求項１６】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、SEQ ID NO:29〜38より選択されるアミノ酸配列に改変されている、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、SEQ ID NO:67〜79より選択されるアミノ酸配列に改変されている、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
SEQ ID NO:49[NsD1]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:49[NsD1]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンス（Nicotiana suaveolens）に由来する単離されたディフェンシン。
【請求項１９】
SEQ ID NO:51[NsD2]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:51[NsD2]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシン。
【請求項２０】
請求項18または19記載のディフェンシンをコードするヌクレオチドの配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２１】
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、中程度のストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:48または50とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、および最適アラインメント後にSEQ ID NO:46または48に対して少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項18記載の単離された核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
[本発明1001]
SEQ ID NO:57に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:57に対して少なくとも70％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、抗病原体活性を有する人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシンであって、該改変がナス科クラスIIディフェンシンのループ1B領域に対するものである、人工的に改変されたナス科クラスIIディフェンシン。
[本発明1002]
最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％のアミノ酸配列類似性を含む、本発明1001の改変ディフェンシン。
[本発明1003]
ループ1Bアミノ酸配列が、SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、および38からなるリストより選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または1002の改変ディフェンシン。
[本発明1004]
ループ1Bアミノ酸配列が、SEQ ID NO:67〜79からなるリストより選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または1002の改変ディフェンシン。
[本発明1005]
ループ1Bアミノ酸配列がSEQ ID NO:29を含む、本発明1003の改変ディフェンシン。
[本発明1006]
SEQ ID NO:39に対して少なくとも90％のアミノ酸配列類似性を有する、本発明1001または1002または1003または1004または1005の改変ディフェンシン。
[本発明1007]
SEQ ID NO:39に対して少なくとも95％のアミノ酸配列類似性を有する、本発明1006の改変ディフェンシン。
[本発明1008]
改変前において、ディフェンシンが、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、TpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549より選択される、本発明1001の改変ディフェンシン。
[本発明1009]
改変前において、ディフェンシンがNaD1である、本発明1008の改変ディフェンシン。
[本発明1010]
改変前において、ディフェンシンがNsD1およびNsD2からなるリストより選択される、本発明1008の改変ディフェンシン。
[本発明1011]
抗病原体活性が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンと比べて、より広域の抗病原体活性、より高い抗病原体活性、より高い安定性、および/またはより高い透過性である、本発明1001〜1010のいずれかの単離された改変ディフェンシン。
[本発明1012]
抗病原体活性が真菌に対する活性のレベルである、本発明1011の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1013]
真菌が植物真菌病原体である、本発明1012の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1014]
真菌が哺乳動物真菌病原体である、本発明1013の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1015]
真菌がヒト真菌病原体である、本発明1014の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1016]
真菌が、コレトトリカム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、ディプロディア・メイディス（Diplodia maydis）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、およびフザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticilloides）からなるリストより選択される、本発明1013の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1017]
真菌が、フザリウム・ビルグルリフォルメ（Fusarium virgululiforme）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Sclerotinia sclerotiorum）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、およびフザリウム・ツクマニアエ（Fusarium tucumaniae）からなるリストより選択される、本発明1013の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1018]
真菌がサビ菌である、本発明1013の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1019]
真菌が、アルテルネリア属の種（Alternaeria spp）、アスペルギルス属の種（Aspergillus spp）、カンジダ属の種（Candida spp）、フザリウム属の種（Fusarium spp）、トリコフィトン属の種（Trychophyton spp）、クリプトコッカス属の種（Cryptococcus spp）、ミクロスポルム属の種（Microsporum spp）、ペニシリウム属の種（Penicillium spp）、トリコスポロン属の種（Trichosporon spp）、セドスポリウム属の種（Scedosporium spp）、ペシロマイセス属の種（Paeciliomyces spp）、アクレモニウム属の種（Acremonium spp）、およびデマチウム科の糸状菌からなるリストより選択される、本発明1014の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1020]
抗病原体活性が殺虫活性である、本発明1001の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1021]
昆虫が、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、オストリニア・ヌビアリス（Ostrinia nubialis）、ロパロシファム属の種（Rhopalosiphum spp）、ヘリコベルパ属の種（Helicoverpa spp）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）、およびライガス属の種（Lygus spp）より選択される、本発明1020の単離された改変ディフェンシン。
[本発明1022]
本発明1001〜1010のいずれかの単離された改変ディフェンシンを含む、組成物。
[本発明1023]
化学殺病原体剤、タンパク質性殺病原体剤、および/またはプロテイナーゼ阻害剤もしくはその前駆体をさらに含む、本発明1022の組成物。
[本発明1024]
本発明1001〜1010のいずれかの単離された改変ディフェンシンをコードする、単離された核酸分子。
[本発明1025]
本発明1024の単離された核酸分子を含む、遺伝子構築物。
[本発明1026]
プロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体をコードする核酸分子をさらに含む、本発明1025の遺伝子構築物。
[本発明1027]
本発明1001〜1010のいずれかのディフェンシンを産生する遺伝子組換え植物、または該ディフェンシンを産生する該植物の子孫。
[本発明1028]
本発明1024の核酸分子または本発明1025の遺伝子構築物を含む、本発明1027の遺伝子組換え植物またはその子孫。
[本発明1029]
コーン、ダイズ、ワタ、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、キャノーラ、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、イチジク、アマ、ブドウ、ラッカセイ、アサ、ラベンダー、キノコ、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナッツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、アブラナ、ライグラス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、タロイモ、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフ、およびヤムイモより選択される、本発明1027または1028の遺伝子組換え植物。
[本発明1030]
増強された抗病原体活性を示す遺伝子組換え植物またはその子孫を作製する方法であって、本発明1001〜1010のいずれかの改変クラスIIナス科ディフェンシンをコードする核酸を発現する細胞を含む植物を作り出す工程を含み、該植物またはその子孫における該発現のレベルが、該改変ディフェンシンが植物病原体に対して保護効果を示すのに十分である、方法。
[本発明1031]
植物における病原体侵入を防除する方法であって、本発明1022の組成物を、該植物、その根、または該植物の周囲にある土壌に局所適用する工程を含む、方法。
[本発明1032]
動物対象における病原体侵入を防除する方法であって、本発明1022の組成物を、病原体が侵入している可能性のある該動物の表面に局所適用する工程を含む、方法。
[本発明1033]
動物が哺乳動物である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
哺乳動物がヒトである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
抗病原体医薬の製造における、クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ1B領域を有するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含む、人工的に作り出されたディフェンシンの使用であって、該ループ領域が1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加によって改変されている、使用。
[本発明1036]
病原体が真菌である、本発明1035の使用。
[本発明1037]
SEQ ID NO:49[NsD1]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:49[NsD1]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンス（Nicotiana suaveolens）に由来する単離されたディフェンシン。
[本発明1038]
SEQ ID NO:51[NsD2]に示されたアミノ酸配列、または最適アラインメント後にSEQ ID NO:51[NsD2]に対して少なくとも70％を有するアミノ酸配列を有する、ニコチアナ・スアベオレンスに由来する単離されたディフェンシン。
[本発明1039]
本発明1037または1038のディフェンシンをコードするヌクレオチドの配列を含む、単離された核酸分子。
[本発明1040]
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、中程度のストリンジェンシー条件下でSEQ ID NO:48または50とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、および最適アラインメント後にSEQ ID NO:46または48に対して少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、本発明1037の単離された核酸分子。
[本発明1041]
改変ループ1B領域を含みかつ抗病原体活性を示す人工ディフェンシンの製造における、SEQ ID NO:52に対して少なくとも約70％の類似性を有する、クラスIIナス科ディフェンシン成熟ドメインC末端領域を含むクラスIIナス科ディフェンシンの使用。
[本発明1042]
クラスIIナス科ディフェンシンのN末端部分のβ鎖1とαヘリックスとの間にループ領域を有するクラスIIナス科ディフェンシンに由来するバックボーンアミノ酸配列を含むディフェンシンを作製する方法であって、抗病原体活性を有するディフェンシンを作製するようにアミノ酸の置換、付加、および/または欠失によって該ループ領域を改変する工程を含む、方法。
[本発明1043]
前記ループ領域がループ1Bである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を生じるように改変され、式中、Xがアミノ酸残基であり、
X1が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X2が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X3が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X4が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;
X5が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり;かつ/あるいは
X6が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型であり、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、本発明1043の方法。
[本発明1045]
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を生じるように改変され、式中、Xがアミノ酸残基であり;
X1が、N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、もしくはRであり;
X2が、K、R、G、H、L、N、F、I、S、T、もしくはYであり;
X3が、W、Y、H、L、G、F、もしくはPであり;
X4が、P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGであり;
X5が、S、K、Y、F、G、もしくはHであり;かつ/または
X6が、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I、もしくはYであり;
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記ループ1Bが配列X1X2X3X4X5X6を含み、式中:
X1が、N、H、Q、D、K、もしくはEであり;
X2が、R、H、T、K、もしくはGであり;
X3が、F、H、Y、もしくはWであり;
X4が、P、K、S、もしくはRであり;
X5が、GもしくはFであり;かつ/または
X6が、P、V、I、もしくはNである、
本発明1045の方法。
[本発明1047]
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、アミノ酸配列HRFKGP（NaD2）、QHHSFP（Zea2）、DTYRGV（PsD1）、DKYRGP（MsDef1）、KTFKGI（SoD2）、およびKTWSGN（DmAMP1）に改変されている、本発明1044または1045または1046の方法。
[本発明1048]
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、SEQ ID NO:67〜79より選択されるアミノ酸配列に改変されている、本発明1044または1045または1046の方法。
[本発明1049]
クラスIIナス科ディフェンシンが、最適アラインメント後にSEQ ID NO:52に対して少なくとも70％の類似性を有するC末端領域を含む、本発明1042〜1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
クラスIIナス科ディフェンシンが、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1、PhD2、TPP3、FST、NeThio1、NeThio2、NpThio1、Na-gth、Cc-gth、C20、およびSL549より選択される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
クラスIIナス科ディフェンシンがNaD1である、本発明1050の方法。
[本発明1052]
クラスIIナス科ディフェンシンが、NsD1およびNsD2より選択されるニコチアナ・スアベオレンスに由来するディフェンシンである、本発明1050の方法。
[本発明1053]
クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bが、図2に列挙された非クラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1Bに置き換えられる、本発明1043の方法。
[本発明1054]
ループ1Bが、NaD1に由来するNTFPGIの改変型であり、改変が、以下:
Nが、A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Tが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Fが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Pが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;
Gが、A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される;ならびに/あるいは
Iが、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、もしくはV、またはそれらの天然改変型より選択されるアミノ酸残基で置換される
の1つあるいは複数を含み、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、本発明1047の方法。
[本発明1055]
ループ1Bが、NaD1に由来するNTFPGIの改変型であり、
改変が、以下:
Nが、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S、およびRより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Tが、K、R、G、H、L、N、F、I、S、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Fが、W、Y、H、L、G、およびPより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Pが、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D、もしくはGより選択されるアミノ酸残基で置換される;
Gが、S、K、Y、F、およびHより選択されるアミノ酸残基で置換される;ならびに/または
Iが、P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、およびYより選択されるアミノ酸残基で置換される
の1つあるいは複数を含み、
アミノ酸配列X1X2X3X4X5X6が、改変前のクラスIIナス科ディフェンシンに由来するループ1B領域のアミノ酸配列と一致しない、本発明1054の方法。
[本発明1056]
バックボーンクラスIIナス科ディフェンシンが、前記ループ領域外において、該バックボーンにおけるアミノ酸の置換、付加、および/または欠失をさらに含む、本発明1042〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
抗病原体活性が、バックボーンクラスIIナス科ディフェンシンと比べて、より広域の抗病原体活性またはより高い抗病原体活性を含む、本発明1032〜1056のいずれかの方法。
本明細書全体にわたって用いられる配列識別子のまとめを表1に示す。
【国際調査報告】
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