(57)【要約】本発明は、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）を含む医薬組成物、及びその生成方法に関し、特にグリコシダーゼ酵素を実質的に含まないＭＡＦ組成物に関する。本発明の組成物及びそれを含む医薬組成物は、特に、静脈内投与に適している。従って、一態様によると、本発明は、Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含み、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含む組成物であって、
前記組成物は、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない、組成物。
【請求項２】
前記組成物のタンパク質総含有量のうちグリコシダーゼ酵素を３％未満含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物のタンパク質総含有量のうちグリコシダーゼ酵素を１％未満含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧｃＭＡＦは、アミノ酸残基と連結するＮ−アセチルガラクトサミン基を有する、ビタミンＤ結合タンパク質（Ｇｃタンパク質）またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧｃＭＡＦは、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｎ−アセチルガラクトサミン基は、４１８位及び４２０位からなる群より選択される位置で、アミノ酸  スレオニンと連結する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｇｃタンパク質断片は、Ｇｃタンパク質のアミノ酸４００〜４３５に対応するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｇｃ断片は、配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｎ−アセチルガラクトサミン基は、４４位および４６位からなる群より選択される位置で、アミノ酸  スレオニンと連結する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｇｃタンパク質またはその断片は、血液血清から精製される、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｇｃタンパク質及びその断片は、クローン化されたポリヌクレオチドから生成される、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
実質的にグリコシダーゼ酵素を含まないＧｃＭＡＦ組成物を生成する工程であって、
前記工程は、
（ａ）Ｇｃタンパク質またはその活性化断片を、グリコシダーゼ酵素  β−ガラクトシダーゼと、または少なくとも１つの別のグリコシターゼ酵素と組み合わせたβ−ガラクトシダーゼと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて接触させ（ここで、グリコシダーゼ酵素はそれぞれ、前記酵素基質を含まない固相に固定される）、Ｇｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を得ること、及び
（ｂ）前記固定酵素を、ＧｃＭＡＦから除去し、その結果、グリコシターゼ酵素を実質的に含まないＧｃＭＡＦ組成物を得ることを含む、工程。
【請求項１３】
前記別のグリコシダーゼ酵素は、マンノシダーゼ及びシアリダーゼからなる群より選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１４】
前記ＧｃＭＡＦは、アミノ酸残基と連結するＮ−アセチルガラクトサミンを有するＧｃタンパク質、またはその断片を含む、請求項１２に記載の工程。
【請求項１５】
前記Ｇｃタンパク質は、配列番号１〜３のうずれか１つで示されるアミノ酸配列、またはその断片を含む、請求項１２に記載の工程。
【請求項１６】
前記Ｎ−アセチルガラクトサミン基は、４１８位及び４２０位からなる群より選択される位置でアミノ酸  スレオニンと連結する、請求項１５に記載の工程。
【請求項１７】
前記Ｇｃタンパク質断片は、前記Ｇｃタンパク質のアミノ酸４００〜４３５に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の工程。
【請求項１８】
前記Ｇｃタンパク質断片は、配列番号４または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含有する、請求項１７に記載の工程。
【請求項１９】
前記Ｎ−アセチルガラクトサミン基は、４４位及び４６位からなる群から選択される位置で、アミノ酸  スレオニンと連結する、請求項１８に記載の工程。
【請求項２０】
前記Ｇｃタンパク質またはその断片は、血液血清から精製される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の工程。
【請求項２１】
前記Ｇｃタンパク質またはその断片は、クローン化したポリヌクレオチドから生成される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の工程。
【請求項２２】
組成物を含有する前記ＧｃＭＡＦにイオン交換クロマトグラフィーを施すことをさらに含む、請求項１２に記載の工程。
【請求項２３】
組成物を含有する前記ＧｃＭＡＦにアニオン交換クロマトグラフィーを施すことを含む、請求項２２に記載の工程。
【請求項２４】
組成物を含有する前記ＧｃＭＡＦに疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すことをさらに含む、請求項１２に記載の工程。
【請求項２５】
組成物を含有する前記ＧｃＭＡＦにイオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを組み合わせて施すことをさらに含む、請求項１２に記載の工程。
【請求項２６】
前記β−ガラクトシダーゼは、アクリルビーズを含む固相で固定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１２〜２６のいずれか１項に記載の方法により、生成されるＧｃＭＡＦを含む組成物であって、
前記組成物は、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない、組成物。
【請求項２８】
前記組成物の組成物タンパク質総含有量のうちグリコシダーゼ酵素を３％未満含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物のタンパク質総含有量のうちグリコシダーゼ酵素を１％未満含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１に記載のマクロファージ活性化因子を含む治療有効量の組成物を含み、
治療上許容可能な希釈剤または担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２７に記載のマクロファージ活性化因子を含む治療有効量の組成物を含み、
治療上許容可能な希釈剤または担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項３２】
静脈内投与用に製剤化される、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の前記医薬組成物を個体に投与することを含む、マクロファージの活性化を前記個体の必要に応じて、誘導する方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の治療上有効量の医薬組成物を、患者の必要に応じて、前記患者に投与することを含む、癌治療方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の治療上有効量の医薬組成物を、患者の必要に応じて、前記患者に投与することを含む、ＨＩＶ感染患者治療方法。
【請求項３６】
前記癌または前記ＨＩＶは、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ナガラーゼ）の段階の上昇に関連する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、頭部／頸部癌、脳癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、線維肉腫、中皮腫、白血病及び黒色腫からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含む医薬組成物及びその生成方法、特に、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まないＧｃＭＡＦ組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症により、免疫反応工程が進行し、マクロファージの活性化が生じる。炎症由来のマクロファージの活性化には、Ｂリンパ球およびＴリンパ球並びに血清ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）の関与が必要となる。
【０００３】
ヒトビタミンＤ結合タンパク質は、「グループスペシフィックコンポーネント」または「Ｇｃタンパク質」とも称し、遺伝子多型を示す進化的に保存された糖タンパク質である。ヒトビタミンＤ結合タンパク質は、約５２，０００の相対分子量を有し、通常、ヒト血漿タンパク質の約０．５％を占める血漿タンパク質である。Ｇｃタンパク質の多型は、主要な２つの表現型Ｇｃ１およびＧｃ２を明らかにする、ゲル電気泳動分析により実証することができる（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄら、１９６０．  Ｎａｔｕｒｅ  １８５：９３１）。Ｇｃ１遺伝子及びＧｃ２遺伝子のヌクレオチド全体をコードする配列、及び予測されるアミノ酸配列は、報告されている（Ｃｏｏｋｅら、１９８５．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７６：２４２０；  Ｙａｎｇら、１９８５．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：７９９４）。Ｇｃ１は、Ｇｃ１ｆ及びＧｃ１ｓサブタイプに分けることができ、それらは、１つのアミノ酸残基の種類により、電気泳動で、２つのバンド（「ｆａｓｔ」及び「ｓｌｏｗ」）となる。
【０００４】
Ｇｃ１タンパク質は、ヒトＧｃタンパク質の主要なサブタイプである。Ｇｃ１タンパク質は、ガラクトース末端及びシアル酸末端（Ｇｃ１ｆの場合）、またはガラクトース末端及びマンノース末端（Ｇｃ１ｓの場合）で、コアタンパク質に結合しているＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含有する分岐型三糖類を運ぶ。Ｇｃ２は、末端ガラクトース分子に連結するコアＧａｌＮＡｃの単純なグリコシル化パターンを有する。Ｇｃ１ｆオリゴ糖を、炎症刺激Ｂ細胞の膜性β−ガラクトシダーゼで加水分解し、マクロファージ活性化前駆因子を得、続いて、Ｔ細胞のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼとも称する）で加水分解しマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）を得る（Ｙａｍａｍｏｔｏら１９９１．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｉｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８５３９−８５４３；  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ  １９９３．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５１：２７９４−２９０２；  Ｎａｒａｐａｒａｊｕ  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ  １９９４．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｓ  ４３：１４３−１４８）。マウスＤＢＰは、ガラクトース末端を有するＮ−アセチルガラクトサミンを含有する二糖類を運ぶ。該二糖類のＢ細胞のβ−ガラクトシダーゼのみによる加水分解は、有用なＭＡＦを産する。そのため、マウスＤＢＰ及びヒトＧｃタンパク質は、ＭＡＦの前駆体である。
【０００５】
本発明の発明者による米国特許第５，１７７，００２号は、グリコシダーゼを有するグリコシル化ビタミンＤ結合タンパク質を処理することにより、有用なマクロファージ活性化因子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成する工程を開示する。Ｇｃタンパク質  Ｇｃ１及びＧｃ２、並びにＧｃ１サブタイプ  Ｇｃ１ｆ及びＧｃ１ｓの表現型は、特にＧｃ分子のポリペプチド部位に結合するオリゴ糖の相違で表現される。マクロファージ活性化因子は、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼ（ノイラミニダーゼとも称する）との組み合わせ、またはβ−ガラクトシダーゼとα−マンノシダーゼとの組み合わせを用いてインキュベートすることにより、Ｇｃ１ｆタンパク質またはＧｃ１ｓタンパク質より効率的に生成される。Ｇｃ１ｓが、α−マンノースの代わりに、シアル酸（Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）を含有するＧｃ１ｓ変異体、Ｇｃ１ｓ＊を少なくとも部分的に含む場合、Ｇｃ１ｓ／Ｇｃ１ｓ＊混合物を処理するために利用する酵素の混合物は、シアリダーゼも含む。β−ガラクトシダーゼのみでのＧｃ２タンパク質の処理は、マクロファージ活性化因子を効率的に得る。従って、特許第５，１７７，００２号は、無処置のＢ細胞及びＴ細胞なしで、Ｇｃタンパク質をマクロファージ活性化因子へｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて効率的に変換させ、ＧｃＭＡＦと称するかなり有用な因子を得ることを開示する。
【０００６】
従来の治療様式に耐性のある制御不能な転移の進行は、癌による死の主な原因である。転移は、初期腫瘍に既に存在する悪性細胞の無作為な蔓延から生じる。それら転移は、その発端のクローンであり得り、異なる転移は、異なる前駆細胞に由来し得る。さらに、転移細胞は、良性の非転移細胞と比較して、突然変異率の増加を示し得り、これにより、複数の転移が、同一の治療様式に対し異なる感受性を示し得るという臨床所見が説明される。よって、播種性転移の好結果な療法は、腫瘍性異質と抵抗性の発展の問題を回避する必要がある。
【０００７】
適切に活性化されたマクロファージは、これらの厳しい基準を満たすことができる。マクロファージは、免疫調節剤を含有するリン脂質小胞（リポソーム）との相互作用によって殺腫瘍性となるように活性化され得る。殺腫瘍性マクロファージは、無傷の非腫瘍細胞を残して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで新生物細胞を認識して破壊することができる。マクロファージが腫瘍形成細胞と正常細胞とを区別する正確な機構（複数可）は不明であるが、そのような免疫原性、転移能、および細胞毒性薬に対する感受性などの腫瘍細胞の特徴とは無関係である。さらに、腫瘍細胞のマクロファージの破壊は、明らかに腫瘍細胞の抵抗性の発達に関連していない。免疫反応を細菌およびウイルスの侵入に基づき形成するため、活性化されたマクロファージが不可欠である。活性化の機構が３つの反応（殺腫瘍性、殺菌性、殺ウイルス）に同一であるため、マクロファージの活性化は、腫瘍、細菌およびウイルス攻撃に対する、宿主の免疫反応にまたがる用途を有する。
【０００８】
研究により、ＧｃＭＡＦは、マウスモデルでのエールリッヒ腹水腫瘍の治療の殺腫瘍の役割を有することが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：２１８７−２１９２；  Ｋｏｇａら、１９９９．  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  ２２０：２０−２６）。マウスモデルの扁平上皮癌において、免疫療法のアジュバンドとしてのＧｃＭＡＦの光線力学療法への投与は、マウスにおいて、腫瘍治癒も対する相乗効果を示した（Ｋｏｒｂｅｌｉｋら、１９９７．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７５：２０２−２０７）。両腫瘍モデルにおいて、ＧｃＭＡＦは、マクロファージを活性化させ、腫瘍細胞を直接攻撃することによってその効果を誘発したと仮定された。さらに、その事実は、ＧｃＭＡＦが、抗血管新生メカニズムを介して部分的には抗腫瘍形成的であることが示唆された（Ｋｉｓｋｅｒら、２００３．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ５（１）：３２−４０）。全てのモデルにおいて、抗腫瘍形成療法としてＧｃＭＡＦの高い効力が観察された。
【０００９】
米国特許出願第２０１１／０１２３５９１号は、体外のシステムを使用して、マクロファージの活性化により、哺乳動物での殺腫瘍、殺菌または殺ウイルス応答を誘導する方法を開示する。システムは、ＧｃＭＡＦと、またはＧｃのタンパク質前駆体からの内因性ＧｃＭＡＦを生じさせる１つまたは複数の酵素と、哺乳動物の血液の白血球画分を接触させるための手段を含む。あるいは、システムは、哺乳動物の血漿と接触した不活性媒体に固定されるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ナガラーゼ）結合リガンドを含み、そのため、ナガラーゼのレベルを低下させる。
【００１０】
ＭＡＦの前駆体、グリコシル化Ｇｃタンパク質は、血液源から精製することができる。あるいは、マクロファージの活性化に関与するＧｃタンパク質またはその小ドメインは、例えば、本発明の発明者による、米国特許第６，４１０，２６９号に記載される組換え法を採用して生成され得る。それは、Ｇｃタンパク質ソースとは無関係に、上述のマクロファージ活性化因子を得るため、部分的に脱グリコキシル化されるべきである。米国特許第５，１７７，００２号は、グリコシダーゼを有する最終調製物の汚染を避けるため、固定化酵素の使用、及びカットオフフィルターに反応混合物を追加させることを開示する。特に、好ましい実施形態である、活性化アガロースビーズを用いた固定化手段を選択するための特定のガイドラインを提供しない。
【００１１】
今日、ＧｃＭＡＦの使用は、上述の手順に従って生成された組成物のタンパク質汚染に明らかに起因している有害な副作用を避けるため、ｅｘ  ｖｉｖｏでの治療または筋肉内投与に限定されている。
【００１２】
免疫不全疾患（ＡＩＤＳなど）、様々な種類の癌、ウイルス感染症、大理石骨病の有用な療法としてのＧｃＭＡＦの能力は確立されており、静脈内投与に適したタンパク質汚染のないＧｃＭＡＦ組成物を有する点で非常に有利であろう。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、マクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）組成物由来の治療用Ｇｃ−タンパク質、及びその生成方法に関する。
【００１４】
本発明の教示は、Ｇｃタンパク質のマクロファージ活性化因子への変換に使用されるグリコシダーゼ酵素の残基を含有することが発見され、そのため、医薬的に投与される際、特に静脈内に投与される際、悪影響を及ぼし得るといった、以前に開示されたＧｃＭＡＦ組成物の欠点を解消する。
【００１５】
本発明の一部は、Ｇｃタンパク質ソースと、ポリガラクトース系樹脂（例えば、セファロースビーズ）に固定されたβ−ガラクトシダーゼとを接触させ、有害量のβ−ガラクトシダーゼを含有したことにより、ＧｃＭＡＦ調整物を得たという予期せぬ発見に基づく。特定の理論または作用機構に拘束されることを望むものではないが、ＧｃＭＡＦ組成物に存在するグリコシダーゼ残渣の存在は、ＧｃＭＡＦ組成物に結合するグリコシダーゼ酵素による固体担体の分解現象に起因し得る。
【００１６】
したがって、一態様によると、本発明は、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない、Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含む組成物を提供する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない」は、組成物のタンパク質総含有量に対し、グリコシダーゼ酵素を３％未満、一般的には、該組成物のタンパク質総含有量に対し、２％または１％未満、より一般的には、０．５％または０．２％未満含有する組成物に関する。
【００１８】
特定の実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、アミノ酸残基に連結するＮ−アセチルガラクトサミンを有する、ビタミンＤ結合タンパク質（Ｇｃタンパク質）またはその活性化断片を含む。
【００１９】
用語「ビタミンＤ結合タンパク質」及び「Ｇｃタンパク質」は、本明細書中では同じ意味で使用され、Ｇｃ２、Ｇｃ１、並びにＧｃ１ｆ、Ｇｃ１ｓ及びＧｃ１ｓ＊のサブタイプを含む、糖タンパク質及びその遺伝的変異体の多様な形態のすべてに関する。本明細書で使用される場合、用語「その活性断片」は、Ｎ−マクロファージの活性化が可能な、アミノ酸残基に連結するアセチルガラクトサミン基末端を有するＧｃタンパク質のいずれかの部分に関する。
【００２０】
特定の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質断片は、成熟Ｇｃタンパク質の多様な形態すべてのアミノ酸４００〜４３５に対応するアミノ酸配列を含む。他の実施形態によれば、Ｇｃ断片は、成熟タンパク質のアミノ酸３７５〜４５８に対応するＧｃタンパク質ドメインＩＩＩである。
【００２１】
特定の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質は、配列番号１〜３（それぞれ、Ｇｃ１ｆ、Ｇｃ１ｓ及びＧｃ２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。それら実施形態によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミン基は、成熟Ｇｃタンパク質の４１８位のアミノ酸  スレオニン、または４２０位のアミノ酸  スレオニンに連結する。
【００２２】
他の実施形態によれば、成熟Ｇｃタンパク質のアミノ酸３７５〜４５８に対応する、Ｇｃ断片ドメインＩＩＩは、配列番号４または配列番号５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含有する。本実施形態によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミンは、４４位にあるアミノ酸  スレオニン、または４６位にあるアミノ酸  スレオニンに連結する。
【００２３】
特定の実施形態によれば、単離されたビタミンＤ結合タンパク質またはその任意の部分は、ヒト血液血清から精製される。他の実施形態によれば、単離されたビタミンＤ結合タンパク質またはそのマクロファージの活性化に関与する小ドメインを、組換えシステムを採用するクローン化ポリヌクレオチドから生成することができる。
【００２４】
組成物媒体からの、Ｇｃタンパク質をマクロファージ活性化因子に変換するグリコシダーゼ酵素の除去は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲル濾過を含むがこれらに限定されない、当業者にとって既知の方法により行われ得る。特定の一般的な実施形態によれば、酵素は、固相、特に酵素基質を含まない固相に固定される。
【００２５】
固体担体に酵素を固定することは、所望のタンパク質（複数可）からの酵素の単純な分離を含み、複数の利点を有する。本発明は、今回、酵素基質を含まない固相の使用により、反応媒体への可溶性酵素の拡散を防ぎ、最終組成物からの不要な酵素の除去を容易にすることを開示する。
【００２６】
従って、別の態様によると、本発明は、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まないＧｃＭＡＦ組成物を生成する工程であって、（ａ）Ｇｃタンパク質またはその活性化断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、グリコシダーゼ酵素  β−ガラクトシダーゼと、または少なくとも１つの別のグリコシダーゼ酵素と組み合わせてβ−ガラクトシダーゼと接触させ（ここで、グリコシダーゼ酵素はそれぞれ、該酵素基質を含まない固相に固定される）、Ｇｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を得ることと、（ｂ）ＧｃＭＡＦ組成物から固定された酵素を除去し、その結果、グリコシダーゼ酵素を実質的に腹満しＧｃＭＡＦ組成物を得ることと、を含む工程を提供する。
【００２７】
特定の実施形態によれば、別のグリコシダーゼ酵素は、マンノシダーゼ及びシアリダーゼからなる群より選択される。
【００２８】
複数の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質は、Ｇｃ１ｆであり、β−ガラクトシダーゼ及びシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）と接触する。
【００２９】
特定の実施形態によれば、工程は、組成物を含有するＧｃＭＡＦにイオン交換クロマトグラフィーを施すことをさらに含む。一般的な実施形態によれば、クロマトグラフィーは、例えば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーである。別の実施形態によれば、工程は、ＧｃＭＡＦ組成物に、例えば、ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すことをさらに含む。他の実施形態によれば、工程は、イオン交換クロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーとの組み合わせをさらに含む。
【００３０】
特定の実施形態によれば、β−ガラクトシダーゼは、アクリルビーズを含む固相に固定される。特定の実施形態によれば、固相は、親水性アクリルビーズである。
【００３１】
特定の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質の表現型Ｇｃ１、サブタイプＧｃ１ｆは、固定されたβ−ガラクトシダーゼ及び固定されたシアリダーゼと接触し、マクロファージ活性化因子を提供する。他の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質の表現型Ｇｃ１、サブタイプＧｃ１ｓは、固定されたβ−ガラクトシダーゼ及び少なくとも１つの固定された別のグリコシダーゼと適宜接触する。特定の一般的な実施形態によれば、Ｇｃタンパク質の表現型Ｇｃ１、サブタイプＧｃ１ｓは、それぞれ酵素基質を含まない固相に固定されたβ−ガラクトシダーゼと、マンノシダーゼと、シアリダーゼとの組み合わせと接触し、α−マンノースの代わりにシアル酸を含有するＧｃ１ｓ変異体（ｈ  Ｇｃ１ｓ＊）の変換を保証する。別の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質の表現型Ｇｃ２は、固定されたβ−ガラクトシダーゼのみと接触し、マクロファージ活性化因子を形成する。
【００３２】
別の態様によると、本発明は、本明細書において前述した工程に従い調製されるマクロファージ活性化因子を提供する。特定の実施形態において、マクロファージ活性化因子は、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない。
【００３３】
別の態様によると、本発明は、本発明の治療上有効量のマクロファージ活性化因子を含み、さらに、医薬的に許容可能な希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態としては、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【００３４】
また別の態様によると、本発明は、本発明のマクロファージ活性化因子を含む医薬組成物を個体に投与することを含む、個体の必要に応じて、個体のマクロファージ活性化を誘導する方法を提供する。
【００３５】
また別の態様によると、本発明は、本発明のＧｃＭＡＦを含む治療上有効量の医薬組成物を患者の必要に応じて患者に投与することを含む、癌またはＨＩＶ感染患者を治療する方法を提供する。
【００３６】
特定の実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、用量  １００〜５００ｎｇ／注入で投与される。
【００３７】
特定の実施形態によれば、癌は、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ナガラーゼ）の増加に関連する。他の実施形態によれば、癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、頭部／頸部癌、脳癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、線維肉腫、中皮腫、白血病及び黒色腫からなる群より選択される。
【００３８】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の記載及び図面から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子を含む治療用組成物を提供する。本発明の組成物は、酵素を汚染することなく、静脈内投与に適しているという点で従来既知の組成物を越える利点を有する。
【００４０】
Ｇｃタンパク質（ビタミンＤ結合タンパク質とも称する）は、ポリヌクレオチドに結合する特定のオリゴ糖を有するポリペプチドを含む血清因子である。特定のグリコシダーゼ酵素を有する特定のオリゴ糖の段階的除去により、Ｇｃタンパク質は、より有用なマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）に変換され、この内容は、本発明の発明者による、米国特許第５，１７７，００２号に記載され、その全体は参考として本明細書に組み込まれる。
【００４１】
ヒトＧｃタンパク質は、当業者にとって既知である任意の方法により、血液血清から精製することができる。特定の実施形態によれば、本発明の工程で使用する高純度なＧｃタンパク質は、Ｌｉｎｋらの手順（１９８６．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５７：２６２）に従い、２５−ヒドロキシビタミン  Ｄ３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーを使用して、血液血清から単離される。Ｇｃタンパク質は、またアクチンへのＧｃタンパク質の結合特異性の利点がある、Ｈａｄｄａｄらの手順（１９８４．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２１８：８０５）に従い、アクチン−アガロースアフィニティークロマトグラフィーでも生成され得る。
【００４２】
あるいは、Ｇｃタンパク質は、ヒトＧｃタンパク質またはＧｃタンパク質小ドメイン（ドメインＩＩＩ）をコードするクローン化ｃＤＮＡから得ることができる。Ｇｃタンパク質及びＧｃドメインＩＩＩのクローニング及び発現は、本発明の発明者による、米国特許第６，４１０，２６９号に記載され、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。該明細書に記載される方法は、ヒトＧｃタンパク質をコードする完全な長さのｃＤＮＡを単離するための、バクテリオファージλｇｔ１１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）のヒト肝臓  ｃＤＮＡライブラリー、及びタンパク質発現のための昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現システムの使用を採用する。しかし、当分野で既知な任意の方法／システムは、細菌細胞システム、昆虫細胞システム、及び哺乳動物細胞システムを含む、Ｇｃタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはその活性部位の発現に使用することができるということは、明示的に理解されるべきである。特定の実施形態によれば、発現は、真核生物細胞において行われ、Ｇｃタンパク質またはその活性ドメインは、適正にグリコシル化される。当分野で既知な任意のこのような細胞システムは、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に使用され得る。従って、ｐＣＩ−ＮＥＯ、ｐＷＥ３、ｐｃＤＮＡ３．１及びｐＣＭ１８２を含む任意の真核生物の発現ベクターを使用することができるが、これに限定されるものではない。選択した細胞システムへのベクターの注入は、増幅の有無に関わらず、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションなどの脂質、または当業者に既知な化学的方法によって行うことができる。トランスフェクションは、一時的または安定した発現を生じ得り、両形態は、所望のＧｃタンパク質またはその一部を得るのに十分である。その後、本発明の教示に係る活性ＭＡＦの前駆体である発現タンパク質は、細胞から抽出、または当分野において既知な任意の方法で増殖培地から収集され得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「Ｇｃタンパク質」または「ビタミンＤ結合タンパク質」は、ＴＧｃ２、Ｇｃ１、及びサブタイプＧｃ１ｆ、Ｇｃ１ｓ、及びＧｃ１ｓ＊を含むすべての遺伝子型、並びに活性変異体及びその断片に関する。本明細書で使用される場合、「活性」Ｇｃタンパク質またはその断片は、マクロファージを活性化させることが可能なＧｃタンパク質、特に、アミノ酸残基と連結するＮ−アセチルガラクトサミン基を有するＧｃタンパク質またはその断片に関する。
【００４４】
特定の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質は、配列番号１〜３（それぞれＧｃ１ｆ、Ｇｃ１ｓ及びＧｃ２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。該実施形態によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミン基は、成熟Ｇｃタンパク質の４１８位のアミノ酸  スレオニン、または４２０位のアミノ酸  スレオニンに連結する。
【００４５】
特定の実施形態によれば、Ｇｃタンパク質断片は、全ての成熟Ｇｃタンパク質の多様型のアミノ酸４００〜４３５に対応するアミノ酸配列を含む。他の実施形態によれば、Ｇｃ断片は、成熟タンパク質のアミノ酸３７５〜４５８に対応するＧｃタンパク質  ドメインＩＩＩである。
【００４６】
他の実施形態によれば、成熟Ｇｃタンパク質のアミノ酸３７５〜４５８に対応するＧｃ断片ドメインＩＩＩは、配列番号４または５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含有する。該実施形態によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミンは、４４位のアミノ酸  スレオニン、または４６位のアミノ酸  スレオニンに連結する。
【００４７】
マクロファージは、活性化されると、癌細胞及びＨＩＶ感染細胞を除去する能力を有する。酵素  α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ナガラーゼ）によるＧｃＭＡＦの脱グリコシル化は、マクロファージの活性化を妨げ、そのため、細胞免疫反応を抑制する。ＨＩＶ感染患者においては、抗原掲示欠損が免疫不全の因子であることが示唆されている。ＨＩＶ患者の血漿におけるナガラーゼの上昇は、その患者において、マクロファージの活性化が阻害され得ることを示唆する。さらに、ナガラーゼは、感染の初期の融合を促進するエンベロープタンパク質の固有成分であることが示されている。全身性エリテマトーデスを有する患者におけるナガラーゼの血漿濃度も上昇することが分かった。狼瘡において、自己抗体は、病原性免疫複合体を形成し、組織に蓄積されている。マクロファージの活性化が中断された場合、マクロファージによるそれら複合体の排除は阻害される。癌細胞は、ナガラーゼを生成することが示されており、血清中の濃度が上昇することは、黒色腫、前立腺癌、結腸直腸癌、及び転移性乳癌に罹患している多くの癌患者で報告されている。従って、そのような患者へ外因性ＧｃＭＡＦを投与することは、ナガラーゼ濃度の上昇による活性マクロファージの不足を解消し得る。実際、ＧｃＭＡＦは、マクロファージ、または癌の破骨細胞、ＨＩＶ感染患者及び骨粗鬆症患者に直接作用し、活性化させることが示されており、予備臨床試験は、様々な種類のヒトの癌で治療効果を示した（例えば、  Ｐａｃｉｎｉ  Ｓ．ら、２０１２．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；３２（１）：４５−５２；  Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＫＪら、２０１０．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０  ５（１０）：ｅ１３４２８）。
【００４８】
医薬的な使用に適するよう、特に、静脈内投与用に製剤化する際、ＧｃＭＡＦ組成物は、ヒトにとって毒性がなく、高い許容性を有するといった細やかな要求を満たすべきである。
【００４９】
従って、Ｇｃタンパク質またはそのドメインＩＩＩを活性ＭＡＦに変換するために必要なグリコシダーゼ酵素、同様に他の潜在的な汚染物質は、ＭＡＦ組成物から除去されるべきである。
【００５０】
一態様によると、本発明は、Ｇｃタンパク質由来のマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を含む組成物であって、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まない組成物を提供する。
【００５１】
別の態様によると、本発明は、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まないＧｃＭＡＦ組成物を生成する工程であって、工程は、（ａ）Ｇｃタンパク質またはその活性断片を、グリコシダーゼ酵素  β−ガラクトシダーゼと、または少なくとも１つの別のグリコシダーゼ酵素と組み合わせたβ−ガラクトシダーゼとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ（ここで、グリコシダーゼ酵素は、それぞれ該酵素基質を含まない固相で固定される）、Ｇｃマクロファージ活性化因子（ＧｃＭＡＦ）を得ることと、（ｂ）ＧｃＭＡＦ組成物から固定した酵素を除去し、その結果、グリコシダーゼ酵素を実質的に含まないＧｃＭＡＦ組成物を得ること、とを含む工程を提供する。
【００５２】
グリコシダーゼ酵素の除去は、当分野で既知な任意の方法により行われ得る。本発明の特定の一般的な実施形態によれば、Ｇｃタンパク質またはその一部は、酵素基質を含まない固相に固定される酵素と接触する。ガラクトースを含まない固相でβ−ガラクトシダーゼを固定することは特に重要である。本発明は、今回、Ｇｃタンパク質をＭＡＦに活性化するために必要なインキュベーションの間、β−ガラクトシダーゼをｓｅｐｈａｒｏｓｅ固相から放出することを開示する。従って、以下に開示される工程において、固定したβ−ガラクトシダーゼは組成物から除去するが、可溶性酵素またはその残渣はまだ、組成物を汚染する可能性がある。
【００５３】
特定の実施形態によれば、ＧｃＭＡＦを含む本発明の組成物は、該組成物のタンパク質総含有量のうちグリコシダーゼ酵素を３％未満含む。他の実施形態によれば、組成物は、該組成物のタンパク質総含有量は、２％未満、一般的には１％未満、より一般的には０．５％または０．２％未満である。それぞれの能力を本発明の個々の実施形態に示す。本明細書で使用される場合、用語「総タンパク質含有の総タンパク質の割合（％）」は、タンパク質総含有量のうちグリコシダーゼ酵素の重量／重量パーセントに関する。
【００５４】
特定の実施形態によれば、本発明の教示に従い、ガラクトシダーゼ基質を含まないβ−ガラクトシダーゼの固定固相は、酵素を抱合することが可能なアクリルビーズで構成される。複数の市販されている樹脂は、ガラクトシダーゼ酵素を固定するために使用され得り、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅｐｏｘｉｄｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）エポキシ（Ｍｅｒｃｋ）、及びＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）（ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ，Ｓｉｇｍａ）を含むがこれらに限定されるものではない。
【００５５】
β−ガラクトシダーゼに加え、Ｇｃタンパク質の表現型に応じて、少なくとも１つの別のグリコシダーゼ酵素が使用され得る。Ｇｃ１ｆタンパク質の活性化には、β−ガラクトシダーゼ及びシアリダーゼが、Ｇｃ１ｆをＧｃＭＡＦに変換するために使用される。Ｇｃ１ｓタンパク質の活性化には、β−ガラクトシダーゼ及びマンノシダーゼが、Ｇｃ１ｓをＧｃＭＡＦに変換するために使用される。β−ガラクトシダーゼに関しては、使用される別の酵素は、それぞれ、固相に固定され得る。本発明の教示に係る最終組成物中にマンノシダーゼ及び／またはシアリダーゼが存在することを避けるため、酵素  マンノシダーゼ及びシアリダーゼは、それぞれ、酵素基質を含まない基質に固定される。
【００５６】
特定の実施形態によれば、マンノシダーゼまたはシアリダーゼは、アガロースを主としたビーズに固定される。
【００５７】
あるいはさらに、溶解しているかまたは固定されているかいずれかのグリコシダーゼ酵素は、複数のクロマトグラフィー技術及び／または濾過及び／または沈殿及び／または遠心分離によりＧｃＭＡＦ組成物から除去され、所望のＧｃＭＡＦタンパク質から酵素を分離する。
【００５８】
一般的なクロマトグラフィー技術は、大きさ（サイズ排除、また、ゲルろ過とも称する）による、交換（イオン交換クロマトグラフィー）による、疎水性（疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー）による、及び生体認識（アフィニティークロマトグラフィー）による分離を含む。
【００５９】
特定の実施形態によれば、工程は、組成物を含有するＧｃＭＡＦにイオン交換クロマトグラフィーを施すことをさらに含む。一般的な実施形態によれば、クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、及びＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどを含む様々な種類のアニオン交換クロマト樹脂を使用することができる。
【００６０】
本発明は、今回、ＧｃＭＡＦ組成物をアニオン交換カラムにかけることによりさらに、非活性体から活性ＧｃＭＡＦを分離することができることを開示する。従って、本発明は、様々なソースからの活性ＧｃＭＡＦの高収量での単離及び精製を成し遂げる手段を提供する。
【００６１】
特定の実施形態によれば、アニオン交換樹脂は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。様々な状態が該特定のステップで使用され得る。特定の実施形態によれば、アニオン交換樹脂は、まず、ｐＨ４．５〜９．５、及び１２．０ｍＳ／ｃｍ未満の導電性を有するバッファ溶液で平衡化される。樹脂の平衡化後、ＧｃＭＡＦを含有する分画を、希釈により、１２ｍＳ／ｃｍ未満のイオン強度に調整し、アニオン交換樹脂上に載せる。これらｐＨ及び導電性の条件は、アニオン交換媒体を洗浄しても、ＧｃＭＡＦがカラム上に保持されることを可能にする。洗浄バッファの導電性（ｐＨ範囲４．５〜９．５における）は、洗浄する間上昇する。この上昇により、適切な状態が提供され、ＧｃＭＡＦが通過画分に処分されることがなく、ＧｃＭＡＦを最大の収量で得る。
【００６２】
その後、ＧｃＭＡＦは、カラムから溶出される。特定の実施形態によれば、溶出は、ｐＨ４．５〜９．５及び３ｍＳ／ｃｍ超の導電性を有するバッファ溶液で行われる。
【００６３】
他の実施形態によれば、工程は、ＧｃＭＡＦ組成物に、例えば、ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すことをさらに含む。
【００６４】
特定の実施形態によれば、疎水性相互作用樹脂は、ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。様々な状態が、該特定のステップで使用され得る。特定の実施形態によれば、疎水性相互作用樹脂は、まず、ｐＨ４．５〜９．５及び１５．０ｍＳ／ｃｍ超の導電性を有するバッファ溶液で平衡化される。樹脂の平衡化後、ＧｃＭＡＦを含有する分画は、希釈により、１５．０ｍＳ／ｃｍ超のイオン強度に調整され、疎水性相互作用樹脂上に載せられる。ｐＨ及び導電性のそれら条件により、疎水性相互作用媒体を洗浄しても、ＧｃＭＡＦをカラム上に保持することが可能となる。洗浄バッファの導電性（ｐＨ４．５〜９．５における）は、洗浄の間、減少する。この現象により、適切な状態が提供され、通過分画にＧｃＭＡＦが処分されることなく、最大収量のＧｃＭＡＦを得る。
【００６５】
その後、ＧｃＭＡＦは、カラムから溶出される。特定の実施形態によれば、溶出は、ｐＨ４．５〜９．５及び２５ｍＳ／ｃｍ未満の導電性を有するバッファ溶液で行われる。
【００６６】
生成物は、治療目的で、特に静脈内投与によりヒトに投与されるべきであり、本発明の組成物の無菌性は、大きな懸念事項である。血清ソース物質は、一般的に、ウイルスの混入の有無を検査され、混入したドナー分画の除去に最大の注意が払われるが、さらに、工程の最終生成物がウイルスに完成していないことを保証する必要がある。
【００６７】
従って、本発明の工程は、ウイルス除去及び／またはウイルス不活性化ステップをさらに含み得る。ウイルスの低減は、ナノ濾過、溶媒／界面活性剤処理、例えば、ヨウ化ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ（ＰＣＴ出願国際公開９７／４８４２２号及び国際公開第９７／４８４８２号に開示される）などのヨウ化イオン交換マトリックス物質を用いた処理のようなヨウ素不活性化、病原体不活性化化合物を用いた処理、熱不活性化、ガンマ線放射、または他の適切で任意な殺ウイルス工程を含む様々な工程によって成し遂げることができる。
【００６８】
脂質コーティングされたウイルスは、非イオン性生体適合溶媒及び洗浄剤を用いて処理されることにより、効果的に不活性化される。溶媒−洗浄剤を適用することによるウイルス不活性化の方法は、例えば、欧州特許第０１３１７４０号に記載される。しかし、非脂質コーディングウイルスは、溶媒−洗浄剤処理により不活性化することができない。従って、例えば、サイズ排除（ナノ濾過）によるウイルスの除去のような非常に小さな大きさの孔のフィルターを通す組成物の濾過のような物理的な手段による排除を含む、他の不活性化方法論がそれら不活性化に使用されるべきである。
【００６９】
グリコシダーゼ酵素の活性ＧｃＭＡＦからの分離及びウイルス除去に続いて、溶液には、透析濾過、限外濾過、凍結乾燥など、またはその組み合わせなどのような従来の手段により、その水含有量を減らし、イオン性組成物を交換する処理をし得る。
【００７０】
特定の実施形態によれば、精製されたＧｃＭＡＦを含む組成物は、５〜５０ｋＤａのＭＷＣＯを用いる限外濾過によりＰＢＳバッファで透析される。その後、ＧｃＭＡＦタンパク質は、ＰＢＳでその最終濃度まで希釈され、０．１または０．２μｍの膜を通し濾過され、無菌ＧｃＭＡＦ組成物を得る。
【００７１】
別の態様によると、本発明は、本発明の治療上有効量のマクロファージ活性化因子を含み、医薬的に許容可能な希釈剤または担体をさらに含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「治療上有効量」は、一定の時間投与されることにより、生体の病状を治療する点で効果的なタンパク質またはタンパク質製剤、または組成物の量に関する。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、粉砕、粉砕、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによる当分野で周知の工程により製造され得る。医薬組成物は、化合物の生体への投与を容易にすることを目的とする。
【００７４】
従って、本発明に係る使用のための医薬組成物は、医薬的に使用することのできる活性化合物の組成物への処理を容易にする、賦形剤及び補助剤を含む１つまたは複数の許容可能な希釈剤または担体を使用する従来の手段で製剤化され得る。適切な製剤化は、選択される投与経路に依存する。一般的な実施形態において、本発明の医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【００７５】
静脈内投与のために、本発明の化合物物は、水溶液で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水バッファのような生理学的に適合するバッファで製剤化され得る。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有し得る。任意に、懸濁液は、化合物の安定性及び溶解性を増大させ、組成物を高濃度溶液にすることが可能な適切な安定剤及び薬剤をも含み得る。
【００７６】
あるいは、活性成分は、使用前に、例えば、滅菌水、パイロジェンフリー水などの適切なビヒクルで再構成する粉末形態であり得る。
【００７７】
本発明の内容での使用に適した医薬組成物は、意図した目的を達成するのに有効な量の活性成分を含有する組成物を含む。より詳細には、治療上有効な量は、被験者の疾患の症状を予防、軽減、または改善するのに有効な化合物の量を意味する。
【００７８】
治療上有効な量の決定は、当業者であれば十分に行うことができる。特定の実施形態によれば、ＧｃＭＡＦは、用量１００〜−５００ｎｇ／注入で投与される。当業者は、治療される個体の特徴（年齢、体重、大きさなど）も含め、治療される特定の疾患及び段階に関連したパラメータに応じて投与の体制を決定することができる。
【００７９】
本明細書に記載の化合物の毒性及び治療効果は、例えば、ＩＣ５０（５０％のマクロファージの活性化を提供するための濃度）及びＬＤ５０（試験動物の５０％が死に至る致死量）を本発明に係るＧｃＭＡＦ化合物用に決定することにより、細胞培養または実験動物で標準的な医薬的手段により決定され得る。それら細胞培養アッセイ及び動物の研究から得られたデータは、ヒトで使用する場合の用量範囲の算出に使用され得る。用量は、採用される剤形及び利用する投与経路に大きく依存し得る。正確な製剤化、投与経路及び用量は、患者の状態を鑑みて、医師個人により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、″Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ″の１ページ、チャプター１参照）。
【００８０】
治療すべき症状の重症度及び応答性に応じて、投薬を決定することができる。特定の実施形態において、本発明のＧｃＭＡＦを含む医薬組成物は、１週間に１度、数週間静脈内投与により投与される。投薬は、また、数日から数週間かけての治療工程で、または治療の効果が出る、または疾患の状態の軽減が達成されるまで、徐放性組成物の単回投与でもあり得る。
【００８１】
投与される組成物の量は、もちろん、被験者、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存するであろう。
【００８２】
以下の実施例を、より完全に、本発明の複数の実施形態を説明するために提示する。しかし、決して、これらを本発明の広い範囲を限定するものとして解釈するべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく多くの変更および本明細書に開示された原理の変形例を考案することができる。
【００８３】
実施例
実施例１：ＧｃＭＡＦ生成
ステップ１：硫酸アンモニウムを用いた濃縮−生成
健康なドナーから血液を得た。各血液試料のＧｃタンパク質型をＰＣＲ反応の特定のプライマーを使用して、さらに質量分析により決定した。型の決定は、ＢｉｏＧｌｏｂｅ  ＧｍｂＨ（ドイツ、ハンブルグ）により、Ａｂｂａｓら、２００８（Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  １７：１３３９−１３４３）に記載される方法に基づき、行った。Ｇｃ１ｆ対立遺伝子のホモ接合性ドナーの試料をさらなる処理のため採取した。２００９年に調査した５０の試料のうち１つ、及び２０１０年に調査した１０５の試料のうち７つがＧｃ１ｆのホモ接合性であると同定された。
【００８４】
血清分画を血液試料から単離して、Ｇｃタンパク質を血清から７０％硫酸アンモニウム（ＡＳ）により沈殿させた。遠心分離後、沈殿したタンパク質をＰＢＳで溶解し、ｐＨ約７．０〜７．６の同一のバッファに透析した。
【００８５】
ステップ２：捕捉−ビタミンＤ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーカラム
タンパク質をＴＥＳＴバッファ（トリス、ＥＤＴＡ、生理食塩水、トリトン、ｐＨ  ７．４）で予め平衡化した２５−ＯＨ−ビタミンＤアフィニティーカラムに載せた。ＴＥＳＴバッファで洗浄後、タンパク質を６Ｍ  ＧｕＨＣｌにより溶出した。２８０ｎｍでのピーク吸光度を有する分画を溜め、ｐＨ７．０のリン酸バッファで透析した。
【００８６】
ステップ３：精製−ヒドロキシアパタイトカラム  タンパク質を、ｐＨ７．０を有するリン酸バッファで予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに載せた。同一のバッファで洗浄後、タンパク質を１０〜２００ｍＭのリン酸で線上段階的に溶出した。タンパク質を含有する分画を溜めた。
【００８７】
ステップ４：Ｇｃ活性化（ＧｃＭＡＦの調整）
Ｇｃ１ｆ型のみを含む溜めたタンパク質分画をアクリルビーズ（Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  Ｅｐｏｘｉｄｅ，ＢｉｏＲａｄ）に抱合されるβ−ガラクトシダーゼで、穏やかに混合しながら３７℃でｐＨ７．４のＰＢＳで１時間処理した。アクリルビーズに抱合される酵素を、遠心分離により除去し、タンパク質分画を収集した。次に、タンパク質分画を、穏やかに混合しながら、３７℃、ｐＨ５．０の０．１Ｍ  ＮａＡｃ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２で、アガロースを包含するノイラミニダーゼで処理し、抱合した酵素は、遠心分離により除去した。現在ＧｃＭＡＦを含有するタンパク質分画を収集し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、４℃で保存した。タンパク質型は、ＥＬＩＳＡ及びＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによるその量により確認した。
【００８８】
ステップ５：最終精製
ＧｃＭＡＦをイオン交換（ＩＥＸ）カラム（Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅなど）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅなど）上で処理し、残留汚染酵素及び非活性Ｇｃ酵素を除去した。その後、組成物は、グリコシダーゼ活性及び／または特定の抗体を使用してグリコシダーゼの有無を計測することにより、実質的にグリコシダーゼ酵素を含まないことを検査した。
【００８９】
ステップ６：製剤化
精製されたタンパク質を、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａのＭＷＣＯでの限外濾過によりＰＢＳに対して透析した。その後、タンパク質をＰＢＳでその最終濃度まで希釈し、滅菌のため、０．２μｍミリポアフィルターを通して濾過した。
【００９０】
特定の実施形態の上述の記載は、過度な実験をすることなく、一般的な概念から逸脱することなく、現在の知識を適用することにより、このような特定の実施形態を他の人が容易に、改変及び／または様々な用途に適用させることができる本発明の一般的な性質を完全に明らかにするであろう。従って、そのような適用及び改変は、開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内に包含されるべきであり、包含されることが意図されている。本明細書で採用される表現及び用語が、説明を目的としており、これらに限定されないことを理解すべきである。様々に開示される機能を実行する手段、物質、及びステップは、本発明から逸脱することなく、別の様々な形態をとることができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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