(57)【要約】  本発明は、ウイルスタンパク質及びウイルスキャプシド集合に必要なタンパク質などのタンパク質を発現するために、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞系を提供し、並びにウイルスキャプシドに類似した様式で、多タンパク質複合体に組み立てるタンパク質が提供される。更に提供されるものは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞系を使用して、ウイルスタンパク質、キャプシド集合に必要なタンパク質、及び多タンパク質複合体に組み立てるタンパク質などのタンパク質を発現するための方法である。更に提供されるものは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞系において、ウイルスタンパク質、ウイルスキャプシド集合、及びその分解が細菌疾患、寄生体疾患、代謝疾患、腫瘍的疾患、免疫学的疾患、又はＣＮＳ疾患を軽減することができる多タンパク質複合体へのタンパク質の集合を調節する化合物をアッセイするための方法である。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質を発現するための無細胞系であって、前記無細胞系が、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含み、前記目的のタンパク質の発現に必要な成分を更に含む、無細胞系。
【請求項２】
前記目的のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項１に記載の無細胞系。
【請求項３】
前記ウイルスタンパク質が、ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項２に記載の無細胞系。
【請求項４】
前記目的のタンパク質が、キャプシド結合タンパク質である、請求項１に記載の無細胞系。
【請求項５】
前記ウイルスタンパク質が、フラビウイルス科、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、ボルナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、アストロウイルス科、ポリオーマウイルス科、アネロウイルス科、パルボウイルス科、カリシウイルス科からなる群から選択されるウイルスの科のメンバーであるウイルスによって発現される、請求項２に記載の無細胞系。
【請求項６】
前記成分が、緩衝液、アミノ酸、核酸転写物及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーを含む、請求項１に記載の無細胞系。
【請求項７】
前記成分が、検出可能部分、ＡＴＰ、ＧＴＰ、リン酸クレアチン、標識付けアミノ酸、ミリストイルＣｏＡリチウム塩、ＲＮアーゼ阻害剤、クレアチンキナーゼ、ｔＲＮＡ及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーを更に含む、請求項６に記載の無細胞系。
【請求項８】
前記標識付けアミノ酸が、［３５Ｓ］メチオニンである、請求項７に記載の無細胞系。
【請求項９】
前記核酸転写物が、インビトロ転写反応で構築される、請求項６に記載の無細胞系。
【請求項１０】
前記核酸転写物が、ウイルスタンパク質をコード化する、請求項６に記載の無細胞系。
【請求項１１】
前記核酸転写物が、ウイルスキャプシドタンパク質をコード化する、請求項１０に記載の無細胞系。
【請求項１２】
前記核酸転写物が、ウイルスキャプシド結合タンパク質をコード化する、請求項６に記載の無細胞系。
【請求項１３】
前記緩衝液が、酢酸カリウム、スペルミン、ジチオスレイトール及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項６に記載の無細胞系。
【請求項１４】
ウイルスキャプシドを組み立てるための無細胞系であって、前記無細胞系が、約５％以下の小麦胚芽抽出物と、前記ウイルスキャプシドを含む１つ以上のウイルスタンパク質の発現に必要な成分とを含む、無細胞系。
【請求項１５】
前記ウイルスキャプシドが、フラビウイルス科、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、ボルナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、アストロウイルス科、ポリオーマウイルス科、アネロウイルス科、パルボウイルス科、カリシウイルス科から選択されるウイルスの科から得られる、請求項１４に記載の無細胞系。
【請求項１６】
前記成分が、緩衝液、アミノ酸、及び前記ウイルスタンパク質をコード化する核酸転写物を含む、請求項１４に記載の無細胞系。
【請求項１７】
前記成分が、検出可能部分、ＡＴＰ、ＧＴＰ、リン酸クレアチン、標識付けアミノ酸、ミリストイルＣｏＡリチウム塩、ＲＮアーゼ阻害剤、クレアチンキナーゼ、ｔＲＮＡを更に含む、請求項１６に記載の無細胞系。
【請求項１８】
前記標識付けアミノ酸が、［３５Ｓ］メチオニンである、請求項１７に記載の無細胞系。
【請求項１９】
前記核酸転写物が、インビトロ転写反応で構築される、請求項１６に記載の無細胞系。
【請求項２０】
前記核酸転写物が、前記ウイルスキャプシドを含むタンパク質をコード化する、請求項１６に記載の無細胞系。
【請求項２１】
前記緩衝液が、酢酸カリウム、スペルミン、及びジチオスレイトールからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項１６に記載の無細胞系。
【請求項２２】
目的のタンパク質を発現する方法であって、前記目的のタンパク質が、請求項１に記載の前記無細胞系を使用して発現される、方法。
【請求項２３】
前記目的のタンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のタンパク質が、ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的のタンパク質が、ウイルスキャプシド結合タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１４に記載の前記無細胞系を使用して、ウイルスキャプシドを組み立てる方法。
【請求項２７】
化合物が細胞機能を調節するかどうかを試験する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記化合物を請求項１に記載の前記無細胞系に導入することと、
（ｂ）前記細胞機能が調節されるかどうかを判定することと、を含む、方法。
【請求項２８】
前記化合物が、有機小分子及び生物薬剤からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを試験する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記化合物を請求項１４に記載の前記無細胞系に導入することと、
（ｂ）前記ウイルスキャプシド集合が調節されるかどうかを判定することと、を含む方法。
【請求項３０】
前記化合物が、有機小分子及び生物薬剤からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質の無細胞発現のためのキットであって、
（ａ）約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
（ｂ）前記タンパク質の発現に必要な成分と、
（ｃ）前記キットの使用に十分な使用説明書と、を含むキット。
【請求項３２】
ウイルスキャプシドの集合のためのキットであって、
（ａ）約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
（ｂ）ウイルスキャプシド集合に必要なタンパク質の発現に必要とされる成分と、
（ｃ）前記キットの使用に十分な使用説明書と、を含むキット。
【請求項３３】
化合物がタンパク質の発現を調節するかどうかを判定するためのキットであって、
（ａ）約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
（ｂ）前記タンパク質の発現に必要な成分と、
（ｃ）前記化合物が前記タンパク質の発現を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書と、を含むキット。
【請求項３４】
化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを判定するためのキットであって、
（ａ）約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、
（ｂ）ウイルスキャプシド集合に必要なタンパク質の発現に必要とされる成分と、
（ｃ）前記化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書と、を含むキット。
【請求項３５】
化合物が多タンパク質集合を調節するかどうかを判定するためのキットであって、
（ａ）約５％以下の細胞抽出物を含む無細胞混合物と、
（ｂ）非ウイルスタンパク質の発現に必要な成分と、
（ｃ）前記化合物が多タンパク質集合を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書と、を含むキット。
【請求項３６】
前記目的のタンパク質が、多タンパク質複合体を形成する非ウイルスタンパク質である、請求項１に記載の無細胞系。
【請求項３７】
前記多タンパク質複合体が、中枢神経系障害、代謝障害、腫瘍的障害、又は免疫学的障害を含む疾患に関与する、請求項３６に記載の無細胞系。
【請求項３８】
前記目的のタンパク質が、細菌又は寄生体タンパク質である、請求項３６に記載の無細胞系。
【請求項３９】
前記目的のタンパク質が、多タンパク質複合体を形成する非ウイルスタンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記多タンパク質複合体が、中枢神経系障害、代謝障害、腫瘍的障害、又は免疫学的障害を含む疾患に関与する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記目的のタンパク質が、細菌又は寄生体タンパク質である、請求項３９に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年８月３日に出願された米国仮特許出願第６１／５１４，８２５号の利益を主張するものであり、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に明らかに組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究及び開発下で行われる発明に対する権利に関する声明
該当せず。
【０００３】
本発明は、無細胞翻訳のための組成物における使用のための小麦胚芽抽出物、小麦胚芽抽出物を含有する組成物を使用してタンパク質を発現する方法、ウイルスキャプシドを集合させる方法、並びに限定されないがウイルスキャプシドの集合を含めるタンパク質−タンパク質相互作用を調節する化合物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
無細胞翻訳系は、目的のタンパク質を発現するために、細胞抽出物を利用する。このパラダイムでは、インビトロ転写させた又は単離したＲＮＡ鋳型を、追加の成分、すなわちアミノ酸と一緒に細胞抽出物に加え、タンパク質合成を可能にする。
【０００５】
小麦胚芽抽出物は、無細胞翻訳反応に通常使用され、最初に様々な研究者により報告がなされた（例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓ，Ｂ．Ｅ．及びＰａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．著（１９７３年、ＰＮＡＳ  ７０、２３３０頁））。小麦胚芽抽出物は、それが原核細胞、真核細胞、及びウイルスＲＮＡの翻訳をサポートするために望ましい。小麦胚芽抽出物は、ウイルスキャプシドを集合させるよう設計された無細胞系において有用であることが更に示された（Ｌｉｎｇａｐｐａら著、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  １２５：８８−１１１（１９９４年）；Ｌｉｎｇａｐｐａら著、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  １３６：５６７−５８１（１９９７年）；Ｓｉｎｇｈら著、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７９：２５７−２７０（２００１年）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら著、Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：８８−９２（２００２年）；Ｌｉｎｇａｐｐａ及びＴｈｉｅｌｅｎ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８５：１８５−９５（２００９年））。ウイルスキャプシドは、ウイルスゲノムを保護するウイルスのタンパク質の殻であり、その集合は、宿主因子により触媒されるプロセスであり、抗ウイルス剤を開発するために標的化され得る。
【０００６】
適切な小麦胚芽抽出物濃度は、効率的なタンパク質発現に必要とされる。効果的なタンパク質発現のための最適な小麦胚芽抽出物濃度は、全翻訳混合物の約４０〜５０％であることが一般的に示されている（Ｅｒｉｋｓｏｎ及びＢｌｏｂｅｌ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９６：３８−５０（１９８３年））。報告は、適切なキャプシド集合のために、小麦胚芽抽出物が最終反応体積の２０％で最適に使用されることを特定した。（Ｌｉｎｇａｐｐａ及びＴｈｉｅｌｅｎ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８５：１８５−９５（２００９年））。
【０００７】
抗ウイルスモジュレータ類似体が、細胞培養中のウイルスに対するそれらの活性に同程度の相対的比率で無細胞系において有効であることを示すことは、無細胞発現系を利用する抗ウイルス剤開発プロセスの重要な観点である。現在使用される無細胞系は、インビトロでキャプシド集合を崩す治療薬の能力とウイルス複製を妨害するためのこれら治療薬の能力との間の有用な相関を示さない。したがって、無細胞系において薬剤に対する最大の感受性を達成する成分のレベル及び比率を有する無細胞システムを開発し、その後、細胞培養中の生ウイルスに対してその有効性を相関させる必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
全く驚くべきことに、小麦胚芽抽出物の濃度が約５％以下に維持される無細胞系が、１０％又は２０％では明らかな相関性がなく、５％の小麦胚芽抽出物で、薬剤感受性と感染性ウイルス薬剤感受性との間の極めて良好な相関性を提供することをここで発見した。当該技術分野は小麦胚芽抽出物濃度と薬剤感受性との間の関係を現在まで認識することができず、タンパク質合成を最大化するために高濃度の小麦胚芽抽出物の使用を推奨している。したがって、小麦胚芽抽出物が高濃度（例えば、２０％以上）で使用されるべきであるという文献の教示内容は、本発明によって提供されるような、５％以下の小麦胚芽で観察されるような、薬剤スクリーニングのための最適の感受性を提供する無細胞系を結果としてもたらすことができない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、全般的には、約５％以下の小麦胚芽抽出物を使用して、タンパク質を発現するための無細胞系に関する。したがって、主張される主題は、タンパク質を発現するため並びにウイルスタンパク質及びキャプシド集合のモジュレータをアッセイするための組成物及び方法を提供する。
【００１０】
例示的な実施形態では、目的のタンパク質を発現するための無細胞系が提供される。この系は、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含み、目的のタンパク質の発現に必要とされるその他の成分を更に含む。例示的な実施形態では、目的のタンパク質はウイルスタンパク質である。例示的な実施形態では、ウイルスタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質である。選択される実施形態では、目的のタンパク質はキャプシド結合タンパク質である。選択される実施形態では、目的のタンパク質は、キャプシドタンパク質と類似する様式（すなわち、細胞質内のその他のタンパク質による特定の多タンパク質複合体の形成の触媒に起因する可能性が高い）で集合を起こす宿主タンパク質である。
【００１１】
例示的な実施形態では、タンパク質は、多タンパク質複合体を形成する非ウイルスタンパク質である。選択される実施形態では、多タンパク質複合体は、中枢神経系障害、代謝障害、腫瘍的障害、又は免疫学的障害を含む疾患に関与する。例示的な実施形態では、目的のタンパク質は細菌タンパク質又は寄生体タンパク質である。
【００１２】
ウイルスタンパク質は、任意のウイルス又はウイルスの科から得ることができる。例示的な実施形態では、ウイルスタンパク質は、フラビウイルス科、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、ボルナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、アストロウイルス科、ポリオーマウイルス科からなる群から選択されるウイルスの科のメンバーであるウイルスから得る。
【００１３】
約５％以下の小麦胚芽抽出物に加えて、本発明の例示的な組成物は、発現系が所望の量及び／又は形態で所望のタンパク質を発現することを確実にするために必要な又は有用な成分を更に含有する。例示的な実施形態では、組成物の更なる成分は、緩衝液、アミノ酸、及び核酸転写物の１つ以上を含有する。様々な実施形態では、組成物は、検出可能な部分、ＡＴＰ、ＧＴＰ、リン酸クレアチン、標識付けアミノ酸、ミリストイルＣｏＡリチウム塩、ＲＮアーゼ阻害剤、クレアチンキナーゼ、及びｔＲＮＡの１つ以上を含有する。例示的な実施形態では、標識付けアミノ酸は、［３５Ｓ］メチオニンを含む。例示的な実施形態では、核酸転写物は、インビトロ転写反応から得られる。例示的な実施形態では、核酸転写物は、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルスキャプシドタンパク質をコード化する。例示的な実施形態では、核酸転写物は、ウイルスキャプシド結合タンパク質をコード化する。一実施形態では、緩衝液は、酢酸カリウム、スペルミン、及びジチオスレイトール又はその他の還元剤並びにこれらの組み合わせから選択されるメンバーを含む。
【００１４】
別の実施形態では、本明細書に記載するような無細胞系を使用して目的のタンパク質を発現する方法が提供される。例示的な実施形態では、目的のタンパク質はウイルスタンパク質、例えばウイルスキャプシドタンパク質である。例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、ウイルスキャプシド結合タンパク質である。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の無細胞系を使用してウイルスキャプシドを組み立てる方法を提供する。
【００１６】
例示的な実施形態では、本発明は、多タンパク質複合体において非ウイルスタンパク質を組み立てる方法を提供する。選択される実施形態では、方法は、中枢神経系障害、代謝障害、腫瘍的障害、又は免疫学的障害を含む疾患に関与する多タンパク質複合体を集合させる。例示的な実施形態では、方法は、細菌タンパク質又は寄生体タンパク質の多タンパク質複合体を組み立てる。
【００１７】
様々な実施形態では、化合物が細胞機能を調節するかどうかを試験する方法を提供する。例示的な方法は、化合物を本発明の無細胞系に導入することと、細胞機能が調節されるかどうかを判定することとを含む。
【００１８】
本発明はまた、化合物が、宿主タンパク質に及ぼす効果又はウイルスキャプシドタンパク質それ自体に及ぼす効果のためにウイルスキャプシド集合を調節するかどうかをテストする方法も提供する。この方法は、本発明の無細胞系に化合物を導入することと、ウイルスキャプシド（又はその他のタンパク質）集合が調節されるかどうかを判定することとを含む。
【００１９】
別の実施形態では、タンパク質の無細胞発現のためのキットが提供される。例示的なキットは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物、タンパク質の発現に必要とされる成分、及び無細胞発現実験におけるキットの使用に十分な使用説明書を備える。
【００２０】
別の実施形態では、ウイルスキャプシドの組立てのためのキットが提供される。キットは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物、ウイルスキャプシド集合に必要とされるタンパク質の発現に必須となる成分、及び無細胞発現実験におけるキットの使用に十分な使用説明書を備える。
【００２１】
別の実施形態では、化合物がタンパク質の発現を調節するかどうかを判定するためのキットが提供される。キットは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物、タンパク質の発現に必須となる成分、及び化合物がタンパク質の発現を調節するかどうかを判定するための無細胞混合物の使用に十分な使用説明書を備える。
【００２２】
別の実施形態では、化合物がウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを判定するためのキットが提供される。キットは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物、ウイルスキャプシド集合に必要なタンパク質の発現に必須となる成分、及び化合物が無細胞混合物中でウイルスキャプシド集合を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書を備える。
【００２３】
別の実施形態では、化合物が多タンパク質集合を調節するかどうかを判定するためのキットが提供される。キットは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物、非ウイルスタンパク質の発現に必須となる成分、及び化合物が多タンパク質集合を調節するかどうかを判定するために十分な使用説明書を備える。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３部ずつの２μＬの翻訳抽出物をウェスタンブロッティングすることによる２６℃における５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成におけるタンパク質合成の定量、並びにアルカリ性ホスファターゼ接合二次抗体に基づく比色法を使用するバンド強度の定量に、任意の密度単位としてプロットしたものを図示する。無細胞翻訳を、その有効性が細胞培養中の感染性ウイルスに対して評価された化合物の不在下（ＤＭＳＯ対照）、又は存在下で、５％、１０％又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成で、Ｃ型肝炎ウイルスコアポリペプチドをコード化するｍＲＮＡでプログラムされたＷＧ無細胞タンパク質合成システムにおいて実施し、弱いものから強いものまで効力の段階的変化を表すことを見出した。２μＬの翻訳抽出物のウェスタンブロッティング（３部ずつ）による小麦胚芽の各パーセンテージにおけるタンパク質合成の定量は、アルカリ性ホスファターゼ接合二次抗体に基づく比色法を使用して、任意の密度単位としてバンド強度の定量時にプロットした。結論：タンパク質合成のレベルは、小麦胚芽の各パーセンテージでほぼ同様であるが、１０％又は２０％のいずれかよりも５％のＷＧでわずかに低い。
【図２】化合物の不在下（ＤＭＳＯ対照）又は存在下で、５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成において合成された、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する化合物効力の間の感度及び相関性を図示する。（Ａ）化合物の効力は、大変弱い（化合物１３８−８５）から最も強力（化合物１３８−１３６）までの範囲である。結論：細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い（ＥＣ５０＞５０ｕＭ）から強い（ＥＣ５０＝１００ｎＭ）までの範囲であった。（Ｂ）感染性ウイルスに対する薬剤効力への各小麦胚芽のパーセンテージにおけるプレートスクリーン上の薬剤効力の相関性である。結論：薬剤感受性は、１０又は２０％においてほとんど明確ではなく、５％の小麦胚芽抽出物において感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関性を示す。したがって小麦胚芽抽出物が２０％以上で使用されるべきであるという文献内容の教示は、本発明により提供されるような５％以下の小麦胚芽において観察される薬剤スクリーニングに関する最適な感受性のポイントに合わない。
【図３】化合物の不在下（ＤＭＳＯ対照）又は存在下で、５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成物において合成された、インフルエンザウイルス（ＦＬＵＶ）に対する化合物効力の間の感度及び相関性を図示する。（Ａ）化合物の効力は、極めて弱い（化合物１３８−１６５）から最も強力（化合物１５０−１２０）までの範囲である。（Ｂ）ＦＬＵＶに対する薬剤効力への各小麦胚芽のパーセンテージにおけるプレートスクリーン上の薬剤効力の相関性である。前の図のＨＣＶについてと同様に、ＦＬＵＶについて見ることができるように、感染性ウイルスに対する化合物効力とプレートスクリーン上の化合物効力との間の感受性及び相関性は、５％のＷＧで最大であり、１０％のＷＧ濃度で消滅し、２０％である程度まで再び現れたが、これは感染性ウイルスに対する最大効力と完全な相関ではない。したがって、図１でＨＣＶについて明確にされたポイントは、ＦＬＵＶにもかなりの範囲で当てはまる
【図４】化合物の不在下（ＤＭＳＯ対照）又は存在下で、５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成物において合成された、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に対する化合物の効力の間の感度及び相関性を図示する。（Ａ）化合物の効力は、極めて弱い（化合物１５８−８０）から最も強力（化合物１５０−１３３）までの範囲である。（Ｂ）ＶＥＥＶに対する薬剤効力への各小麦胚芽パーセンテージにおけるプレートスクリーンを使用する薬剤効力の相関性である。前の図のＨＣＶについてと同様に、ＶＥＥＶについて見ることができるように、感染性ウイルスに対する化合物の効力とプレートスクリーン上の化合物の効力との間の感度及び相関性は、５％のＷＧで最大であり、１０％で減衰され、２０％のＷＧ濃度で大きく消失する。したがって、図１のＨＣＶについて明確にされたポイントは、ＶＥＥＶに当てはまる。
【図５】化合物の不在下（ＤＭＳＯ対照）又は存在下で、５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成物において合成された、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する化合物の効力の間の感度及び相関性を図示する。（Ａ）化合物の効力は、極めて弱い（化合物６０２７）から最も強力（化合物６０５１）までの範囲である。図１〜４で示した前の３つのウイルスの科についてと同様に、ＨＩＶについて見ることができるように、プレートスクリーンの感度は、５％のＷＧで最大であり、この濃度で感染性ウイルスに対する効力への最大の相関が見られる。この感度及び相関性は、より高いＷＧ濃度において減衰され又は消失される。したがって、図１〜４で示すような４つの場合の４つで、無細胞系は、低いＷＧ濃度において、最大の薬剤感受性及び感染性ウイルスに対する効力への最適な相関性を示す。
【図６】ＨＣＶキャプシドタンパク質でプログラムされた無細胞系において観察されたＥＣ５０を図示する。（Ａ）無細胞翻訳系に基づく抗キャプシド集合薬剤スクリーンの再現性を確立するために、ＨＣＶキャプシドタンパク質でプログラムされた無細胞系において観察されたＥＣ５０を、細胞培養中の感染性ＨＣＶに対するＥＣ５０に対してプロットした。無細胞系における活性が感染性ウイルスに対する活性と相関するならば、観察されるように、構造−活性相関最適化からのデータポイントが、右上四分の一内に突き出なければならない。更に、その他のウイルス科により強力である類似体は、高相関直線から離れて青色で示される。（Ｂ）部分（Ａ）からの最も強力な類似体の拡大図は、より明確に類似体の右上四分の一への突出を示す。
【図７】ＨＩＶキャプシドタンパク質でプログラムされた無細胞系で観察されたＥＣ５０を図示する。図６のＨＣＶについて示したような細胞培養中の感染性ウイルス（ｙ−軸）に対しての無細胞系中のＨＩＶキャプシド集合に対する類似体の効力（ｘ−軸）の相関性である。親化合物は赤色で示し、類似体は紫色で示す。構造−活性相関を、所定のサブファーマコフォアを含む関連化合物に繋がる点線によって示す。
【図８】ＦＬＵＶキャプシドタンパク質でプログラムされた無細胞系において観察されたＥＣ５０を図示する。図６のＨＣＶ及び図７のＨＩＶについて示したような細胞培養中の感染性ウイルス（ｙ−軸）に対しての無細胞系中のＦＬＵＶキャプシド集合に対する類似体の効力（ｘ−軸）の相関性である。親化合物を赤色で示す。構造−活性相関（ＳＡＲ）を、所定のサブファーマコフォアを含む関連化合物に繋がる点線によって示す。ＨＩＶ及びＦＬＵＶに関するように、本物のウイルスの抗ウイルス化合物相関に対して良好な無細胞で予期したように、ＳＡＲはグラフの右上四分の一に向かって突出する。
【図９】供給源中の５％の小麦胚芽調製物の均一性及び調製条件を図示する。１３個の小麦胚芽抽出調製物のサンプルを５０μＬから１ｍＬに希釈し、その２０μＬを採取し、１０％のβＭＥを有する２０μＬのＳＤＳゲルサンプル緩衝液と混合し、１００℃／５分で加熱した。１０μＬをＳＤＳ  ＰＡＧＥ上に充填した。染料の先端が底部に到達した時に、ゲルを１０％の酢酸及び５０％のメタノール中で固定させ、次いで０．１％のクーマシーブリリアントブルーで染色し、完全に脱染した。
【図１０】任意の積分密度単位としてプロットされた図９からのスキャンされたレーンの定量を図示する。この分析は、異なる小麦胚芽調製物の組成の類似性を定量化し、この抽出物が、クーマシー染色可能なタンパク質によって測定されるように、タンパク質内容物中で極めて再現可能であることを示す。
【図１１】５％の小麦胚芽調製物のＡ２６０吸収スペクトルを図示する。吸収スペクトルのスキャンは、５％小麦胚芽抽出物において主なＡ２６０ピークを示す。このピークを、図９の１３個の５％小麦胚芽抽出調製物のそれぞれに関する吸光度値の範囲を規定するために使用する。
【図１２】図９の１３個の５％小麦胚芽調製物のＡ２８０吸収スペクトルを図示する。吸収スペクトルのスキャンは、Ａ２６０吸収スペクトルの影響力の大きさが主な原因で、５％の小麦胚芽抽出調製物におけるＡ２８０の主ピークを示さない。
【図１３】Ａ２６０／Ａ２８０吸収スペクトル比を図示する。様々な小麦胚芽抽出調製物からのＡ２６０ｎｍ及びＡ２８０ｎｍ値の均一性のために、供給源及び一連の緩衝液条件に無関係に、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比を調製物均一性の別の尺度として計算した。
【図１４】ＣＮＳ疾患への薬剤発見に適用されるタンパク質生合成のための無細胞系を図示する。様々なＣＮＳ障害に関係する６つのタンパク質（Ａ〜Ｆ）の生合成を、５％の小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を使用して検討した。初期生成物及び最終生成物のショ糖勾配プロファイル（青色の右側）、合成及び集合を全ての場合で分離して考えた。Ｃを除いて全てで、高分子量構造の形成を成功裏に再構成するように条件を確立した。いくつかの推定ＣＮＳ障害について、小分子阻害剤を同定し、細胞中で検証を行った。
【図１５】新たに合成された炭酸脱水酵素（上部パネル）及びアルファグロビン（下部パネル）、その成熟オリゴマー状態が＞２０Ｓの大型の高分子量構造を伴わない２つのタンパク質のショ糖勾配分析を図示する。左側パネルは、２６℃／１時間における３５Ｓ標識付けメチオニン合成後のＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーから定量化され、続いてタンパク質合成を停止させ、鎖を放出させるためにプロマイシンで処理した勾配プロファイルのパネルである。右側パネルは、３４℃／２時間のインキュベーション後にＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーから定量化された勾配プロファイルである。その成熟型が低分子量オリゴマー型に限定されるこれら新たに合成されたタンパク質の高分子量構造への変換の失敗は、ウイルスキャプシドタンパク質又は既知のオリゴマー非ウイルスタンパク質について観察されるような集合が、非特異的集合の形態ではなく、むしろ基質選択的集合を示すことを示唆する。したがって、この図は、本発明が生物学的に有意義でかつ医学的に重要なタンパク質のサブセットに選択的であるが、無細胞翻訳及び集合条件下のインキュベーション時に大きな多タンパク質複合体を形成しない多くのタンパク質には選択的でないことを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
序論
様々な実施形態において、本発明は、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞系及びこれら系を使用してウイルスタンパク質を発現するための方法を提供する。本発明の無細胞系は、ウイルスキャプシドを組み立てるために有用である。更に提供されるものは、本発明の無細胞系を使用して、化合物が細胞機能を調節するかどうかを試験するための方法である。
【００２６】
無細胞系は、一般的にはその中で様々な操作が可能であるキャプシド集合に有用である。例えば、この系内の反応はタンパク質合成段階及びタンパク質集合段階に分離されることができる。これは、自然発生するキャプシド集合段階を減速し、ウイルスタンパク質合成及びキャプシド集合の最適な調節を判定するために、操作が実施されることを可能にする。無細胞系においてキャプシド集合を減速させる１つの利点は、これが細胞培養中の生ウイルスの既知のモジュレータの効力と無細胞系内の同一のモジュレータの効力との間の相関を可能にすることである。別の利点は、一過性の標的（例えば、キャプシド形成を促進するために触媒的に作用する宿主タンパク質）が特定され得ることである。
【００２７】
本発明は、驚くべきことに、当該技術分野において基準及び必須な濃度として長期間にわたって承認されたものよりも著しく低い小麦胚芽抽出物のこれら濃度が非常に有効であることを立証する。小麦胚芽抽出物は、無細胞発現系において２０％より上の濃度で使用されるべきであることが、当該技術分野において承認されてきた（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎ及びＢｌｏｂｅｌ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚ  ９６：３８−５０（１９８３年）；並びにＬｉｎｇａｐｐａ及びＴｈｉｅｌｅｎ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８５：１８５−９５（２００９年）を参照されたい）。本発明の組成物及び方法によると、キャプシド集合は、２０％の小麦胚芽抽出物である場合と同様に５％の小麦胚芽抽出物で有効である。しかしながら、細胞培養中の生ウイルスに対する抗ウイルス効力と２０％の小麦胚芽抽出物を使用する無細胞系中のキャプシド集合を抑制するための能力との間には相関性がほとんど又は全く存在しない。達成したいことは、合成のレベルと因子の量との間の最適なバランスである。重要な点は、５％の小麦胚芽抽出物濃度を使用して、無細胞系中の抗ウイルス化合物の効力が、細胞培養中のウイルス感受性に最も密接に関わることが、本明細書で示されることである。５％を超えると、薬剤感受性は低下する。
【００２８】
定義
特に注記しない限り、本明細書で使用される技術用語は、当業者により理解されるような通常の使用法に従う。分子生物学における共通の用語の定義は、基準となるテキスト（例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ著、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編集）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編集）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．出版、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８））で見ることができる。
【００２９】
本明細書で使用するとき、フレーズ「無細胞系」とは、生細胞の不在下で、インビトロでタンパク質を合成することが可能である任意のタイプの系を指す。例示的な系は、小麦胚芽抽出物から得た無細胞タンパク質合成系である。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「発現する」及び「発現」とは、タンパク質、ペプチド、又はヌクレオチド配列の産生を指し、ＲＮＡ生成物への転写、転写後修飾及び／又はその生成物をコード化するＤＮＡからのタンパク質生成物又はポリペプチドへの翻訳、並びに可能な翻訳後修飾を含める。
【００３１】
用語「ポリペプチド」又は「ペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、その中で１つ以上のアミノ酸残基が相当する天然型アミノ酸の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然型アミノ酸ポリマー及び非天然型アミノ酸ポリマーに適用する。ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、様々なレベルの構成に関して説明され得る。この構成の一般的説明については（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４年）及びＣａｎｔｏｒ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ著、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＰａｒｔＩ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０年）を参照されたい）。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に整列した三次元構造を指す。これら構造は、ドメイン、例えば酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔ドメイン、及び細胞質尾部ドメインとして一般的に既知である。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトユニットを形成するポリペプチドの部分であり、典型的には１５〜３５０個のアミノ酸長さである。例示的なドメインとしては、酵素活性又はその他の機能的活性を有するドメインが挙げられる。典型的ドメインは、３−シート及びα−へリックスのストレッチなどのより小さい組織のセクションから作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、別個の三次ユニットの非共有結合によって形成される三次元構造を指す。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「目的のタンパク質」、「所望のポリペプチド」、「所望のタンパク質」、又は「標的タンパク質」は互換性であり、限定されないが、ウイルスキャプシドタンパク質、又はその一部、すなわち、細胞質ドメイン又はタンパク質のその他のドメインを含める全タンパク質分子を指す。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「ウイルス」又は「ウイルス性」とは、ある種を例外として、光学顕微鏡によって観察不能であり、独立した代謝を欠如し、生存する宿主細胞内でのみ複製することができる微細な感染物質を指す。一部の例外としては、限定されないが、本明細書に記載の無細胞翻訳系が挙げられる。これら個々の粒子（すなわち、例えばビリオン）は、典型的には、核酸及びタンパク質の殻又は外膜を含み、一部のビリオンはまた、脂質含有膜を有する。用語ウイルスは、動物、植物、ファージ、及びその他のウイルスを含める全てのタイプのウイルスを包含する。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」とは、ウイルス核酸を包囲するタンパク質外膜を指す。ウイルスキャプシドは、内表面及び外表面を有する。ウイルスキャプシドの内表面は、ウイルス核酸に通常曝される表面である。ウイルスキャプシドの外表面は、一般的に環境に曝される表面である。フレーズ「ウイルスキャプシド集合」とは、ウイルスキャプシドを生成するのに十分な様式でウイルスキャプシドタンパク質を配列させるプロセスを指す。
【００３５】
本明細書で使用するとき、用語「キャプシド結合タンパク質」とは、その集合の間、又はその集合の後のいずれかで、ウイルスキャプシドと相互作用するタンパク質を指す。キャプシド結合タンパク質は、ウイルスに対して内因性であってもよく、外因的に付加されてもよく、又は無細胞抽出物と共に存在してもよい。キャプシド結合タンパク質としては、限定されないが、キャプシドシャペロン及びキャプシド形成を導く触媒的作用を有するタンパク質を挙げることができる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、用語「成分」とは、天然型又は非天然型アミノ酸を成長するポリペプチド鎖に組み込むために必要とされる無細胞系の構成要素である。例えば、成分としては、限定されないが、緩衝液、アミノ酸、核酸転写物、ＡＴＰ、ＧＴＰ、リン酸クレアチン、標識付けアミノ酸、ミリストイルＣｏＡリチウム塩、ＲＮアーゼ阻害剤、クレアチンキナーゼ、及びｔＲＮＡを挙げることができる。成分は本明細書で非常に詳細に記載される。
【００３７】
フレーズ「検出可能な部分」又は「接合体」とは、任意の原子、分子又はその一部を指し、その存在、不在又はレベルを、直接的又は間接的に監視可能である。様々な検出可能な部分が当業者に周知であり、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な任意の物質であり得る。このような検出可能な部分としては、限定されないが、磁気ビーズ、蛍光染料、放射標識、酵素、及びコロイド金若しくは着色ガラス又はプラスチックビーズなどの比色分析標識を挙げることができる。
【００３８】
用語「アミノ酸」とは、天然型及び合成アミノ酸、並びに天然型アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然型アミノ酸は、遺伝子コードによってコード化されるものである。アミノ酸は、それらの一般的に知られる３つの文字記号で、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１つの文字記号でのいずれかで本明細書で称される。同様にヌクレオチドは、それらの一般的に認められる単一の文字コードによって称される。個々のアミノ酸又はコード化配列中の少ない割合のアミノ酸への置換、欠失又は付加は、保存的修飾変異体であり、ここでは改変が化学的に類似するアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。このような保存的修飾変異体は加えられ、本発明の多形変異体、異種間相同体、及び対立遺伝子を除外しない。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ著、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照されたい）。
【００３９】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖又は二重鎖型のいずれかでのこれらのポリマー、並びにこれらの補体を指す。他の指示のない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾変異体（例えば、変性コドン置換）及び相補配列、並びに明示的に示される配列を非明示的に包含する。具体的には、変性コドン置換は、その中の１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を編成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら著、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４年））。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。特定のヌクレオチド配列はまた、「スプライス変異体」を非明示的に包含し、これは名前の通り、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後に、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコード化するように、スプライスされ得る。スプライス変異体の生成についてのメカニズムは異なるが、エクソンの選択的スプライシングを含む。読み過し転写による同一の核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義によって包含される。スプライス産物の組換え型を含めるスプライシング反応のいずれの産物も、この定義に含まれる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、フレーズ「インビトロ転写反応」とは、大部分が精製された成分、例えば、精製ＤＮＡ鋳型及び精製ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する無細胞環境において起こる転写反応を指す。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「調節する」又は「調節された」とは、例えば、標的の活性を抑制するため、又は標的の活性を制限する又は低減するためなどの、標的の活性を変更するために、直接的又は間接的のいずれかで標的と相互作用することを意味する。したがって、フレーズ「細胞機能を調節する」とは、限定されないがタンパク質合成の抑制又はウイルスキャプシドなどの分子構造へのタンパク質集合の抑制を含むことができる方法の機能を変更することを意味する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「試験化合物」又は「化合物」又は「薬剤候補」又は「モジュレータ」又は文法的等価物は、腫瘍細胞増殖の直接的又は間接的調節する能力について試験される、天然型又は合成のいずれかの任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド（例えば、長さが約５〜約２５個のアミノ酸、好ましくは、長さが約１０〜２０個又は１２〜１８個のアミノ酸、好ましくは長さが１２、１５、又は１８個のアミノ酸）、有機小分子、多糖類、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を説明する。試験化合物は、多様性の十分な範囲を提供する組み合わせライブラリ又はランダム化ライブラリなどの試験化合物のライブラリの形態であり得る。試験化合物は、必要に応じて融合パートナー、例えば、標的化化合物、レスキュー化合物、二量体化化合物、安定化化合物、アドレス可能な化合物、及びその他の機能的部分に結合される。一般に、有用な特性を有する新しい化学物質は、例えば、活性を抑制する、リード化合物の変異体を生じる、並びにこれら変異体化合物の特性及び活性を評価するなど、いくつかの望ましい特性又は活性を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定することによって生成される。多くは、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）法が、このような分析に使用される。化合物は、例えば、核酸及びポリペプチド配列の阻害剤、活性化剤、又はモジュレータであり得、これらは、核酸及びポリペプチド配列のインビトロ及びインビボアッセイを使用して同定された分子を活性化し、抑制し、又は調節することを指すよう使用される。阻害剤は、例えば、本明細書に記載の無細胞系から得た核酸又はポリペプチドに結合し、これらの活性を部分的に又は完全にブロックし、これらの活性化を低下させ、抑制し、遅延させ、これらの活性又は発現を不活性化し、感受性を低下させ、又はダウンレギュレートする化合物、例えば拮抗剤である。活性化剤は、例えば、本明細書に記載の無細胞系から得た核酸又はポリペプチドを増加させ、開放し、活性化し、促進し、活性を増強し、感度を高め、作動させ、又はアップレギュレートする化合物、例えば作動剤である。阻害剤、活性化剤、又はモジュレータはまた、無細胞系から得たタンパク質の遺伝的に修飾した変形、例えば変化させた活性を有する変形、並びに天然型及び合成リガンド、基質、拮抗剤、作動剤、抗体、ペプチド、環式ペプチド、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、又は小化学分子を含む。
【００４３】
フレーズ「有機小分子」とは、天然型又は合成のいずれかの有機分子を指し、これは、約５０〜約２５００ダルトンの分子量、好ましくは約２０００ダルトン未満の分子量、好ましくは約１００と約１０００ダルトンの間の分子量、より好ましくは約２００と約５００ダルトンの間の分子量を有する。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「生物薬剤」又は「生物薬剤的化合物」とは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体等などの任意の化合物で、これは、遺伝子制御下で生物学的系において外因的に発現されることができ、医薬用途又は治療用途に対して生物学的活性を付与するものを指す。生物薬剤又は生物薬剤的化合物は、構成的に又は誘導的に発現され得る。生物学的系は、インビボ生物学的系及び／又はインビトロ生物学的系であり得る。
【００４５】
無細胞系
小麦胚芽の無細胞抽出物は、翻訳に重要なサイトゾル因子を提供し、広範囲のｍＲＮＡのタンパク質へのインビトロ翻訳をサポートする。翻訳メカニズムは、無細胞系が高効率で原核細胞及び真核細胞のｍＲＮＡの双方を翻訳できるように、十分に保存される。小麦胚芽抽出物の最適濃度は、翻訳されるそれぞれのＲＮＡ配列について決定され得る。
【００４６】
例示的な実施形態では、本発明は、５％の小麦胚芽抽出物を含む、ウイルスタンパク質を含める目的のタンパク質を発現するための無細胞系（組成物）を提供する。様々な実施形態では、本発明は、５％の小麦胚芽抽出物を含む、ウイルスキャプシド集合のための無細胞系を提供する。しかしながら、当業者であれば、約４％、約３％、約２％、又は約１％などの約５％未満の量の小麦胚芽抽出物がウイルスタンパク質を発現するために使用され得ることを認識されるであろう。本発明の組成物はまた、小麦胚芽抽出物の総濃度が組成物の約２０％（体積／体積）未満であるように、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％などの多量の小麦胚芽抽出物を含むこともできる。
【００４７】
本発明で使用する小麦胚芽抽出物を産生するための方法は、鋳型核酸、アミノ酸、及びエネルギー源等が供給される場合に、小麦胚芽抽出物が無細胞タンパク質合成を可能にする限りにおいて、特別に限定されない。例示的なプロセスでは、小麦胚芽を小麦種子中の胚乳から分離し、続いて小麦胚芽からの抽出及び精製によって得た抽出物を、小麦胚芽抽出物として使用する。当業者であれば、小麦胚芽抽出物は小麦種子から調製されることができることが分かるであろう（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎ及びＢｌｏｂｅｌ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚ  ９６：３８−５０（１９８３年）；ＰＮＡＳ  ９７：５５９−５６４（２０００））。当業者であれば、小麦胚芽は商業的に購入できることを理解するであろう（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ等）。
【００４８】
小麦胚芽抽出物を使用する無細胞翻訳系は、効率的な翻訳のために、小麦胚芽抽出物に加えて、多種多様な成分を利用することができる。本明細書に記載されるものは、小麦胚芽抽出物を使用するウイルスタンパク質の効果的な翻訳に有用な基本的成分である。しかしながら、追加の成分は、産生したタンパク質及び／又はキャプシドの所望の特性、所望の産生条件及び他の変数に応じて、翻訳及び／又はキャプシド集合に有用であり得ることを当業者は認識するであろう。本発明の無細胞系のための適切な成分の選択は、当業者の能力範囲内に十分含まれる。キャプシド集合に小麦胚芽抽出物を使用することはまた、当該技術分野では既知であり、例えば、Ｌｉｎｇａｐｐａ及びＴｈｉｅｌｅｎ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８５：１８５−９５（２００９年）、及び米国特許第７，６３８，２６９号でより詳細に記載される。
【００４９】
例示的な実施形態では、本発明の組成物は、緩衝液を更に含む。無細胞翻訳系は、一般的に、適切な補償用緩衝液を必要とする。小麦胚芽翻訳系のカリウム及びマグネシウム濃度は、翻訳の効率に及ぼす劇的な効果を有することができ、補償用緩衝液は、翻訳反応全体のイオン濃度を翻訳される各ｍＲＮＡについて決定される最適に調整するために使用される。緩衝液は、効果的なタンパク質発現のための更なる成分を含むことができ、これは、限定されないが、酢酸カリウム、アミン（例えば、スペルミン）、及びイオウ化合物（例えば、ジチオスレイトール）が挙げられる。
【００５０】
本発明の組成物はまた、必要に応じて、タンパク質又はその一部をコード化する核酸を含む。例示的な実施形態では、翻訳混合物は、１つ以上のウイルスタンパク質をコード化する転写物核酸又はその断片を含有する。この実施形態では、無細胞翻訳系は、２つの連携した反応：インビトロ転写及び無細胞翻訳に関与する。ＲＮＡは、限定されないが、ｍＲＮＡを単離する方法又はインビトロＲＮＡ転写物を、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含有するベクター中にクローンしたＤＮＡから作製することによる方法を含める当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。ＲＮＡ分子はまた、翻訳反応で使用した同一の反応容器内で生成され得る。例示的な実施形態では、ＲＮＡは、例えば、ウイルスタンパク質コード領域又はｃＤＮＡと一緒にＳＰ６ポリメラーゼを反応混合物に添加することによって、その場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で生成される。
【００５１】
例示的な実施形態では、目的のウイルス又は目的のウイルスが感染した個体の体液、若しくは個体から得た感染細胞を含有するサンプルが、ウイルスのタンパク質をコード化するウイルス核酸の供給源として使用される。これは、その後適当なプロモータの背後で（例えば、ＳＰ６ポリメラーゼに関して）操作され、ＰＣＲによって増幅され、転写結合翻訳のために精製される。液体は、限定されないが、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、脳脊髄液等を含める任意の体液であってもよい。
【００５２】
小麦胚芽抽出物中に存在する内因性ｍＲＮＡは、リボゾームに関する外因性ＲＮＡ及び翻訳に必要な因子と競合し得る。したがって、調製された抽出物をヌクレアーゼで処理することによって、内因性ＲＮＡの濃度を低下させることは、場合によっては有益である。このようなヌクレアーゼは、当該技術分野で周知であり、限定されないが、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））から得た小球菌ヌクレアーゼを挙げることができる。
【００５３】
当該技術分野で既知の方法を使用して、タンパク質合成を維持するのに十分なエネルギーレベルを維持する。例示的な実施形態では、追加のヌクレオチドエネルギー源を反応中に加える。様々な実施形態では、リン酸クレアチン／クレアチンホスホキナーゼの添加によって、エネルギーが維持される。例示的な実施形態では、当該技術分野で既知である標準的翻訳混合物中に存在するＡＴＰ及びＧＴＰ濃度が、合成及びキャプシド形成の双方をサポートするのに十分である。
【００５４】
例示的な実施形態では、ウイルスはミリストイル化中間体を有する。このようなウイルスについては、キャプシド集合を可能にするために、許容できる塩の有無で十分なミリストイルコエンザイムＡ（ＭＣｏＡ）を添加することができる。必要とされる濃度は、特定の実験条件により異なってもよく、したがって経験的に決定され得る。
【００５５】
様々な実施形態では、本発明の無細胞翻訳系は、限定されないが、ＲＮアーゼ阻害剤、リボヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ミクロソーム膜、及びｔＲＮＡを含める更なる成分を、単独又は組み合わせて含む。
【００５６】
ウイルスタンパク質発現及びキャプシド集合
本発明はまた、本発明の組成物を使用してタンパク質を発現する方法も提供する。例示的な実施形態では、無細胞系を使用して、キャプシド生合成及び集合を模倣する。無細胞系では、ウイルスキャプシド転写物が、キャプシドタンパク質翻訳及びその後のキャプシド集合に必要とされる可溶性因子を含有する小麦胚芽抽出物の存在下で翻訳される（Ｌｉｎｇａｐｐａら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３６：５６７−５８１（１９９７年））。小麦胚芽抽出物中に存在するサイトゾルタンパク質及び膜タンパク質の双方が、キャプシド集合及び／又はウイルス複製に関与することができる。組込み型膜タンパク質は膜貫通タンパク質を含有することができる。キャプシド集合に膜タンパク質を必要とするウイルスを利用するこれらの実施形態において、適当な膜が無細胞翻訳混合物に添加されることがある。無細胞翻訳混合物を、例えばキャプシド中間体の集合を容易にすることができるシャペロンタンパク質で補足することも更に可能である。無細胞系におけるキャプシドの集合は、キャプシド集合に関与する特定のウイルスタンパク質（複数可）のみの発現を最小限必要とする。一旦発現されると、ポリペプチドはキャプシドを組み立てるように進み、これは宿主因子によって触媒される。
【００５７】
キャプシドを形成するために十分な時間にわたるインキュベーションの後に、無細胞反応の産物が分析され、沈降価、浮遊密度、及び電子顕微鏡外観を決定することができる。同時に、これらはキャプシド構造の一体性についての測定値の高感度セットを形成する。
【００５８】
合成されたウイルスタンパク質は、当該技術分野で既知の任意の方法で検出されることができる。例示的な実施形態では、標識付けアミノ酸を使用する放射標識付けキャプシドポリペプチドが用いられる。このアプローチを使用する一実施形態では、３５Ｓメチオニンが翻訳混合物に添加される。インビトロ発現後に、速度沈降勾配が、負荷緩衝液中に分けられ、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで処理されるフラクションを生成することができる。ゲルは、速度沈降勾配の異なるフラクション中の３５Ｓ標識付けウイルスタンパク質の量を示すオートラジオグラフを作成するフィルムに露光され得る。あるいは、当該技術分野で既知であるように、ホスホイメージャーを使用して放射標識付けウイルスタンパク質を可視化することができる。
【００５９】
様々な実施形態では、抗体、例えば市販の抗体を使用して、有効なタンパク質発現又はキャプシド集合を検出する。あるいは、当該技術分野で周知のように、抗体が目的のタンパク質に対して特異的に発生され得る。
【００６０】
本発明の無細胞系におけるウイルスタンパク質発現及びキャプシド集合は、フラビウイルス科、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘパドナウイルス科、ボルナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、パピローマウイルス科、アデノウイルス科、アストロウイルス科、ポリオーマウイルス科を含めるが、これらに限定されない任意の科からのウイルスに有用である。
【００６１】
非ウイルスタンパク質
本発明はまた、本発明の組成物を使用して、非ウイルスタンパク質を発現する方法も提供する。例示的な実施形態では、無細胞系を使用して、ウイルスキャプシドが類似モデルとして働く多タンパク質複合体への集合の経路を模倣する。図１４は、合成段階及び集合段階へのＤＩＳＣ１遺伝子を含める、様々なＣＮＳ関連タンパク質を分析するための５％の小麦胚芽抽出物の使用を図示する。ウイルスキャプシド集合に関与する宿主タンパク質は、その他の目的で宿主中に存在するに違いないために、これらの内因性集合経路のための基質である非ウイルスタンパク質は、本発明による薬剤スクリーニングに等しく効果的に使用可能であるべきである。したがって、本発明は、ＣＮＳ疾患にのみならず、限定されないが代謝疾患、腫瘍的疾患、及び免疫学的疾患にも適用可能でなければならない。本発明は、分解される場合、多タンパク質複合体を形成し、細菌又は寄生体疾患を軽減する細菌又は寄生体タンパク質を模倣する。本発明の適用可能性に必要とされることは、問題にしている新たに合成されたタンパク質が、この抽出物中でその他のタンパク質を使用するための能力を共有し、別個の多タンパク質複合体へのそれらの集合を補助又は容易にすることである。
【００６２】
モジュレータに関するアッセイ
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質を含めるタンパク質の調節は、本発明の無細胞系（例えば、約５％の小麦胚芽抽出物を有する）における発現、フォールディング、及び集合に及ぼす化合物の効果を判定することによって評価され得る。他の実施形態ではウイルスキャプシド集合の調節は、本発明の無細胞系（例えば、約５％の小麦胚芽抽出物を有する）を使用して、キャプシド集合に及ぼす効果を判定することによって評価され得る。いくつかの実施形態では、限定されないがキャプシド集合シャペロンタンパク質を含めるキャプシド結合タンパク質の調節は、本発明の無細胞系（例えば、５％の小麦胚芽抽出物を使用する）におけるタンパク質の発現に及ぼす効果を判定することによって評価され得る。調節としては、限定されないが、感染、複製、レセプター結合、細胞の侵入、粒子形成等の調節を更に挙げることができる。
【００６３】
本発明の無細胞系を使用する利点は、キャプシド形成のプロセスが減速され、これによって、キャプシド集合のモジュレータのためのキャプシド集合プロセスの標的化が可能になることである。約５％の小麦胚芽抽出物を有するものなどの本発明の無細胞系を使用する利点は、場合によってはより高い小麦胚芽濃度において検出されないであろう化合物を検出するための増大した感度である。
【００６４】
ウイルスタンパク質及び／又はウイルスキャプシド集合の調節の測定は、インビトロ、インビボ、及びエクスビボで様々なアッセイを使用して実施され得る。本明細書に記載のアッセイは、完全長ウイルスタンパク質、変異体、突然変異体又はこれらの断片を使用することができる。活性、例えば、酵素活性、細胞表面マーカー発現、ウイルス複製及び増殖に影響を及ぼす好適な物理的、化学的又は表現型の変更は、発現されるタンパク質に及ぼす試験化合物の影響を評価するために使用され得る。アッセイはまた、タンパク質活性、キャプシド集合、又はウイルスタンパク質とのシャペロンの結合をブロック又は変更するよう設計された１つ以上の薬剤を利用することもできる。アッセイはまた、ウイルスキャプシド集合中間体のモジュレータを同定することもできる。更には、ゲノム核酸がキャプシド中にキャプシド形成されることもでき、これは、キャプシド形成で干渉する、並びにキャプシド形成を抑制する薬剤の作用のメカニズムを検討するアッセイシステムの設計で干渉する薬剤を設計するために使用され得る。
【００６５】
結合アッセイは、固定状態又は可溶性のいずれかであることができる。タンパク質又はウイルスキャプシドは、共有結合的又は非共有結合的のいずれかで、固体支持体上に結合され得る。多くの場合、本発明のインビトロアッセイは、非競合的又は競合的のいずれかの基質又はリガンド結合アッセイ若しくは親和性アッセイである。その他のインビトロアッセイとしては、分光的（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（例えば、形状）、クロマトグラフィー的、又はタンパク質についての溶解特性における変化を測定することが挙げられる。
【００６６】
高処理量結合アッセイを実施することができ、その中で、ウイルスタンパク質は有望なモジュレータに接触され、適当な時間にわたってインキュベートされる。有望なモジュレータは、固体支持体に結合され、タンパク質が添加され得る。あるいは、タンパク質が固体支持体に結合される。限定されないが、有機小分子、タンパク質（例えば抗体又はペプチドなどの）、糖、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイム若しくはｓｉＲＮＡ）、又は脂質などの生物薬剤又は生物学的物質を含める広範囲のモジュレータが使用され得る。標識付けタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動シフト、免疫アッセイ、酵素アッセイ等を含める、広範囲のアッセイを使用して、ウイルスタンパク質−モジュレータ結合を特定することができる。場合によっては、候補モジュレータの結合は、競合的結合アッセイを通して判定され、ここでは、既知のリガンド又は基質の結合の妨害が、有望なモジュレータの存在下で測定される。いずれかのモジュレータ、既知のリガンド、又は基質がまず初めに結合し、次いで競合物質が添加される。タンパク質が洗浄された後に、有望なモジュレータ若しくは既知のリガンド又は基質のいずれかの結合の妨害が判定される。多くの場合、有望なモジュレータ若しくは既知のリガンド又は基質のいずれかが標識付けされる。
【００６７】
可溶性又は固定状態のいずれかの高処理量アッセイでは、数千の異なるモジュレータ又はリガンドを一日のうちに評価することが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された有望なモジュレータに対して別個のアッセイを行うために使用されることができ、又は、濃度又はインキュベーション時間の影響が観察されるべきである場合、５〜１０個のウェル毎に単一のモジュレータを試験することができる。したがって、単一の標準マイクロタイタープレートは、約３５０個（例えば、３８４個）のモジュレータをアッセイすることが可能である。１５３６個のウェルプレートが使用されれば、この場合、単一のプレートは、約１００〜約１５００個の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。一日当たり多数のプレートをアッセイすることが可能であり、アッセイは、約６，０００、２０，０００、５０，０００個までの、又は１００，０００個を超える異なる化合物をスクリーニングすることが、統合システムを使用して可能である。
【００６８】
極めて多数の有望な治療的化合物（有望なモジュレータ又はリガンド化合物）を含有する組み合わせ有機小分子又はペプチドライブラリを提供することを伴う高処理量スクリーニング法が使用され得る。このような「組み合わせ化学ライブラリ」又は「リガンドライブラリ」は、その後１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされ、所望の特徴的な活性を示すこれらライブラリメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を同定する。このように同定された化合物は、通常の「リード化合物」として働くことができ、又はそれ自体が有望な又は実際の治療薬として使用されることができる。
【００６９】
組み合わせ化学ライブラリは、試薬などの多数の化学「結合ブロック」を組み合わせることによって、化学合成、生物合成のいずれかによって生成された多様な化学化合物の集合体である。例えば、ポリペプチドライブラリなどの線形組み合わせ化学ライブラリは、所定の化合物長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）に関して全ての可能な方法で、化学結合ブロック（アミノ酸）のセットを組み合わせることによって形成される。数百万個の化学化合物が、化学結合ブロックのこのような組み合わせ混合を通して合成されることができる。
【００７０】
組み合わせ化学ライブラリの調製及びスクリーニングは、当業者には周知である。かかる組み合わせ化学ライブラリとしては、限定されないが、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１年）及びＨｏｕｇｈｔｏｎら著、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８８（１９９１年）を参照されたい）が挙げられる。種々の化学ライブラリを生成するために、その他の化学物質が使用され得る。このような化学物質としては、限定されないが、ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソマー（Ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３（１９９３年））、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら著、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２年））、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら著、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２年））、小化合物ライブラリの類似有機合成物（Ｃｈｅｎら著、Ｉ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４年））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３年））、及び／又はペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら著、Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４年））、核酸ライブラリ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＳａｍｂｒｏｏｋ著、上記を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Ｖａｕｇｈｎら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４３（３）：３０９−３１４（１９９６年）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、炭水化物ライブラリ（例えば、Ｌｉａｎｇら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０−１５２２（１９９６年）及び米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、有機小分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ  １８、３３頁（１９９３年）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号及び同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、同第５，２８８，５１４号等を参照されたい）が挙げられる。
【００７１】
哺乳動物抽出物
本発明により説明される概念は、タンパク質合成及びタンパク質集合の双方をサポートすることが可能な非小麦胚芽抽出物に等しく適用可能である。したがって、タンパク質のデノボ合成が可能な哺乳動物タンパク質抽出物の最低濃度は、本発明との類似によって、多タンパク質集合のために最も有効な系である可能性が高い。当業者であれば、小麦胚芽抽出物について本明細書で提供された情報を使用して、これを哺乳動物細胞からの抽出物の開発に適用することができるであろう。
【００７２】
キット
例示的な実施形態において、本発明は、タンパク質の無細胞発現のためのキットを提供する。様々な実施形態では、キットは、ウイルスキャプシドを組み立てるための用途のものである。本発明の例示的なキットは、約５％以下の小麦胚芽抽出物を含む無細胞混合物と、タンパク質の発現に必須である成分のそれぞれとを含有する。キット内に含まれる小麦胚芽抽出物及び成分は、本明細書に記載される通りの小麦胚芽抽出物及び成分である。本発明は、化合物がタンパク質の発現を調節するかどうかを判定するためのキットを更に提供する。いくつかの実施形態では、適切な目的のためにウイルスタンパク質の発現又はキャプシドの集合を変更するために、追加の成分が含まれることができる。キットは、典型的には、タンパク質発現及び／又はキャプシド集合の最適化のための使用説明書を含有する。キットは、必要に応じて、本発明のタンパク質の活性及び／又はキャプシド集合に及ぼす影響についてアッセイする高処理量法を実行するための使用説明書、１つ以上の容器又はコンパートメント（例えば、プローブ、標識等を保持するための）、活性の対照モジュレータ、及び／又はキット成分を混合するための自動電機子等を含有する。
【００７３】
以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を説明しようとするものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００７４】
ウイルスキャプシド集合を、その効力が細胞培養中の感染性ウイルスに対して評価されている化合物（又はＤＭＳＯ）対照の存在下で、５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成を有する無細胞タンパク質合成系において検討した。
【００７５】
結果
２μＬの翻訳抽出物をブロッティングすることによって（３部で）、タンパク質合成を、５％、１０％、又は２０％の小麦胚芽抽出物の組成で先ず初めに定量化し、Ｃ型肝炎ウイルスコアポリペプチドを使用するアルカリ性ホスファターゼ接合二次抗体に基づく比色法を用いて、任意の密度単位としてバンド強度の定量にプロットした。タンパク質合成は、小麦胚芽抽出物の各パーセンテージでほぼ同一であった（図１）。これに加えて、タンパク質合成は、小麦胚芽抽出物供給源又は調製条件に関係なく均一であり（図９〜１３）、大きな多タンパク質複合体を形成する生物学的に有意義かつ医学的に重要なタンパク質に選択的であった（図１５）。
【００７６】
細胞培養中でＣ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、及びヒト免疫不全ウイルスに対して有効であることが示された化合物を、次いで、異なる小麦胚芽抽出物濃度で、無細胞タンパク質合成系を使用して、対応のウイルスキャプシドタンパク質に対する効力について相関させた。
【００７７】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、Ｃ型肝炎ウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い（１３８〜８５；ＥＣ５０＞５０μＭ）から強い（１３８〜１３６；ＥＣ５０＝１００ｎＭ）までの範囲であった（図２Ａ及び６）。薬剤感受性は、１０％又は２０％の小麦胚芽抽出物においては明確な相関がほとんどなく、５％の小麦胚芽抽出物で、感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関を示した（図２Ｂ）。
【００７８】
インフルエンザウイルス（ＦＬＵＶ）
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、インフルエンザウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い（１３８〜６５；ＥＣ５０  １〜２０μＭ）から強い（１５０〜１２０；ＥＣ５０＜０．１６〜４ｎＭ）までの範囲であった（図３Ａ及び図８）。薬剤感受性は、５％の小麦胚芽抽出物で、感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関を示した。相関は１０％の小麦胚芽抽出物で消失し、２０％である程度まで再び現れたが、感染性ウイルス細胞培養アッセイに対効力との完全な相関関係ではなかった（図３Ｂ）。
【００７９】
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、ベネズエラウマ脳炎ウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力は、弱い（１５８〜８０；ＥＣ５０＞２０μＭ）から強い（１５０〜１３３；ＥＣ５０＜０．４μＭ）までの範囲であった（図４Ａ）。薬剤感受性は、５％の小麦胚芽抽出物で最大の相関を示し、１０％の小麦胚芽抽出物で大きく低下し、２０％の小麦胚芽抽出物で大部分は失われた（図４Ｂ）。
【００８０】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
最適な小麦胚芽抽出物濃度を、ヒト免疫不全ウイルスに対して有効であることが示された化合物について決定した。細胞培養中の感染性ウイルスに対する化合物の効力を図７に示す。薬剤感受性は、５％の小麦胚芽抽出物で、感染性ウイルス薬剤感受性に最大の相関を示し、より高い小麦胚芽抽出物濃度で大きく低下し、又は失われる（図５）。
【００８１】
方法
目的のタンパク質をコード化するクローン化ｃＤＮＡを、ＳＰ６バクテリオファージプロモータ及び哺乳動物の５’未翻訳化コード領域の背後で操作し、ＰＣＲ生成物を発生させ、ゲル精製し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、無菌水中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬに調整した。この生成物を使用して転写物を生成した。
【００８２】
転写反応を、以下の成分を指示した最終濃度で含有するよう構成させる（Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．９  ４５ｍＭ、ＭｇＡｃ  ６ｍＭ、スペルミジン  ２ｍＭ、ジチオスレイトール  １０ｍＭ、及び４８０μＭのそれぞれＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、５００単位／ｍＬのＳＰ６ポリメラーゼ、２５単位／ｍＬのＲｎａｓｉｎ）、そして２０μｇ／ｍＬのＰＣＲ生成物を４０℃で２時間半にわたってインキュベートし、小分けし、液体窒素中で凍結させて、−８０℃で保管した。
【００８３】
翻訳反応を、転写反応を含む容積の１／５で、３８４のウェルプレートフォーマットにおいて２０μＬの容積で実行する。反応の残部は、最終翻訳反応中、指示した濃度で以下の成分を含有する：ＡＴＰ及びＧＴＰがそれぞれ１ｍＭ、リン酸クレアチン  ４ｍＭ、タンパク質合成に使用される２０個のアミノ酸のそれぞれ４０μＭ、クレアチンキナーゼ  ５０μｇ／ｍＬ、約５％以下の翻訳容積を含む、図１１〜１３に示したＡ２６０／２８０吸光度値を有する小麦胚芽抽出物。
【００８４】
考察
ヒトの疾患を引き起こすことが知られるウイルスの科を表１に示し、これらは推定上のキャプシドが組み立てられたアプローチ、及び試験した全てのウイルス科について特定された特徴的な集合中間体を含む経路に従うことができる。細胞培養中の感染性ウイルスに対するこれらウイルスの科の実証のうちの１３について、無細胞スクリーンで活性な化合物を探索し−並びに多数の活性なファーマコフォアがすべての場合で特定された。ウイルス科のそれぞれが、本発明の無細胞キャプシド集合系においてキャプシドを組み立てた。
【００８５】
結果は、無細胞キャプシド集合系において、小麦胚芽抽出物が２０％以上で使用されるべきであることを示唆する以前の概念は根拠がないことを示す。これは、小麦胚芽抽出物濃度が、１０％又は２０％とは対照的に５％である場合に、細胞培養中のウイルスに対する化合物の効力と無細胞系中のキャプシド集合との間の大きな相関性が観察されるためである。その結果として、標準小麦胚芽抽出物を使用してウイルスモジュレータを発見しようとするこれまでの試みは、有望な抗ウイルス候補薬を見落としている可能性が高い。
【表１】
2014524244.tif 000003
【００８６】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示の目的のためにすぎず、それらに関する様々な修正又は変更が当業者に勧められ、これら修正又は変更は、本出願の精神及び範囲内並びに添付の請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び出願は、全ての目的で、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１】
2014524244.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014524244.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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