(57)【要約】本明細書中に記載しているのは、組換え野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。本明細書中において更に提供するのは、組換え野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。本明細書中に更に記載しているのは、次の位置：３１６、３１７、３２１および１４５の一つ以上にアミノ酸変異を有することができる変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。該変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を製造する方法、並びにリソソーム蓄積症を有する患者を処置する方法も記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３】
生理的条件が、in vivo である、請求項２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で約３時間にわたって観測される、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６】
増加した安定性が、細胞培養培地中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７】
増加した安定性が、細胞内でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８】
細胞内が、リソソーム内である、請求項７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９】
リソソーム内部が、約ｐＨ５および約３７℃の条件にある、請求項８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０】
増加した安定性が、減少したタンパク質分解を特徴とする、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１】
減少したタンパク質分解が、細胞中で生じる、請求項１０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２】
細胞中が、リソソーム中である、請求項１１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３】
増加した安定性が、非生理的条件におけるものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４】
増加した安定性が、タンパク質精製の際の緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５】
増加した安定性が、タンパク質精製の際の約７より高いｐＨを有する緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１６】
増加した安定性が、タンパク質精製の際の約３未満のｐＨを有する緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１７】
増加した安定性が、有機溶媒を含む緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１８】
増加した安定性が、カオトロピック塩を含む緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１９】
増加した安定性が、約２℃〜約３７℃の範囲の温度における緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０】
増加した安定性が、約２℃〜約８℃の範囲の温度における緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２１】
増加した安定性が、約２０℃の温度における緩衝溶液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２２】
増加した安定性が、凍結融解サイクル後のものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２３】
増加した安定性が、凍結乾燥後の再構成におけるものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２４】
増加した安定性が、薬物配合緩衝液中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２５】
増加した安定性が、生理食塩水中でのものである、請求項１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２６】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２７】
より高い触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２８】
生理的条件が、in vivo である、請求項２７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２９】
より高い触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３０】
保持されている触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で２時間または３時間の時間経過にわたって観測される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３１】
より高い触媒活性が、細胞培養培地中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３２】
より高い触媒活性が、細胞内で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３３】
細胞内が、リソソーム内である、請求項３２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３４】
リソソーム内部が、約ｐＨ５および約３７℃の条件にある、請求項３３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３５】
保持されている触媒活性が、減少したタンパク質分解によって特徴づけられる、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３６】
減少したタンパク質分解が、細胞中で生じる、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３７】
細胞中が、リソソーム中である、請求項３６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３８】
保持されている触媒活性が、非生理的条件におけるものである、請求項２６記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項３９】
より高い触媒活性が、タンパク質精製の際の緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４０】
より高い触媒活性が、タンパク質精製の際の約７より高いかまたはそれに等しいｐＨを有する緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４１】
より高い触媒活性が、タンパク質精製の際の約３未満またはそれに等しいｐＨを有する緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４２】
より高い触媒活性が、有機溶媒を含む緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４３】
より高い触媒活性が、カオトロピック塩を含む緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４４】
より高い触媒活性が、約２℃〜約３７℃の範囲の温度における緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４５】
より高い触媒活性が、約２℃〜約８℃の範囲の温度における緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４６】
より高い触媒活性が、約２０℃の温度において緩衝溶液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４７】
より高い触媒活性が、凍結融解サイクル後に保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４８】
より高い触媒活性が、凍結乾燥後の再構成後に保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項４９】
より高い触媒活性が、薬物配合緩衝液中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５０】
より高い触媒活性が、生理食塩水中で保持される、請求項２６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５１】
次の位置：３１６、３１７、３２１および１４５の一つ以上にアミノ酸変異を含む、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５２】
アミノ酸変異Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５３】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項５２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５４】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項５３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５５】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項５３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５６】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項５２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５７】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項５６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５８】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項５２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項５９】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項５８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６０】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項５８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６１】
アミノ酸変異Ｋ３２１Ｎを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６２】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項６１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６３】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項６２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６４】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項６２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６５】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項６１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６６】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項６５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６７】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項６１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６８】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項６７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項６９】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項６７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７０】
アミノ酸変異Ｋ３２１Ａを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７１】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項７０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７２】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項７１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７３】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項７１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７４】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項７０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７５】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項７４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７６】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項７０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７７】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項７６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７８】
増加した触媒活性を、生理的条件で保持される、請求項７７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項７９】
アミノ酸変異Ｋ３２１Ｖを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８０】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項７９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８１】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項８０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８２】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項８０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８３】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約１．４倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項７９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８４】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項８３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８５】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項７９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８６】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項８５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８７】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項８５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８８】
アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項８９】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項８８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９０】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項８９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９１】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項８９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９２】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項８８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９３】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項９２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９４】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項８８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９５】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項９４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９６】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項９４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９７】
アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９８】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項９７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項９９】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項９８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１００】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項９８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０１】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項９７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０２】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１０１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０３】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項９７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０４】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０５】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０６】
アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ａを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０７】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項１０６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０８】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１０７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１０９】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１０７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１０】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項１０６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１１】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１１０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１２】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項１０６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１３】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１１２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１４】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１１２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１５】
アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｖを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１６】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項１１５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１７】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１１６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１８】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１１６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１１９】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約１．４倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項１１５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２０】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１１９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２１】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項１１５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２２】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１２１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２３】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１２１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２４】
アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２５】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項１２４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２６】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１２５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２７】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１２５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２８】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項１２４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１２９】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１２８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３０】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項１２４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３１】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１３０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３２】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１３０に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３３】
アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ａを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３４】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項１３３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３５】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１３４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３６】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１３４に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３７】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項１３３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３８】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１３７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１３９】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項１３３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４０】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１３９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４１】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１３９に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４２】
アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｖを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４３】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項１４２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４４】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１４３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４５】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１４３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４６】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約１．４倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項１４２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４７】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１４６に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４８】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項１４２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１４９】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１４８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５０】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１４８に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５１】
アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを更に含む、請求項５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５２】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項１５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５３】
増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項１５２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５４】
増加した安定性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件におけるものである、請求項１５２に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５５】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項１５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５６】
延長した見掛け半減期が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１５５に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５７】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項１５１に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５８】
増加した触媒活性が、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件での約３時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項１５７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１５９】
増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項１５７に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項１６０】
野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を発現させること、および
（ｂ）変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を精製すること
を含む方法。
【請求項１６１】
請求項５１、請求項５２、請求項６１、請求項７０、請求項７９、請求項８８、請求項９７、請求項１０６、請求項１１５、請求項１２４、請求項１３３、請求項１４２または請求項１５１のいずれか１項に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項１６２】
請求項５１、請求項５２、請求項６１、請求項７０、請求項７９、請求項８８、請求項９７、請求項１０６、請求項１１５、請求項１２４、請求項１３３、請求項１４２または請求項１５１のいずれか１項に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる緩衝剤を含む組成物。
【請求項１６３】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該タンパク質のループ１領域中に一つ以上の置換アミノ酸を含み、該一つ以上の置換アミノ酸は、該タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とする、タンパク質。
【請求項１６４】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でより安定であることを特徴とする、請求項１６３に記載のタンパク質。
【請求項１６５】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでより安定であることを特徴とする、請求項１６４に記載のタンパク質。
【請求項１６６】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲で巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする、請求項１６３に記載のタンパク質。
【請求項１６７】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨで巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする、請求項１６６に記載のタンパク質。
【請求項１６８】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該タンパク質の活性部位付近のαヘリックス（α６）中に一つ以上の置換アミノ酸を含み、該一つ以上の置換アミノ酸側部は、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ１を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有する側鎖コンホメーションを有することを特徴とする、タンパク質。
【請求項１６９】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする、請求項１６８に記載のタンパク質。
【請求項１７０】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする、請求項１６９に記載のタンパク質。
【請求項１７１】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でより活性なコンホメーションを有することを特徴とする、請求項１６８に記載のタンパク質。
【請求項１７２】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでより活性なコンホメーションを有することを特徴とする、請求項１７１に記載のタンパク質。
【請求項１７３】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中に一つ以上の置換アミノ酸を含み、該一つ以上の置換アミノ酸側鎖は、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションを有することを特徴とする、タンパク質。
【請求項１７４】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でより安定であることを特徴とする、請求項１７３に記載のタンパク質。
【請求項１７５】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでより安定であることを特徴とする、請求項１７４に記載のタンパク質。
【請求項１７６】
タンパク質が、野生型β−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲で異なった残基および二次構造の間により良い相互作用を有することを特徴とする、請求項１７３に記載のタンパク質。
【請求項１７７】
タンパク質が、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨで異なった残基および二次構造の間により良い相互作用を有することを特徴とする、請求項１７６に記載のタンパク質。
【請求項１７８】
リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１７９】
リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１８０】
リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した比活性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１８１】
リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、次の位置：３１６、３１７、３２１および１４５の一つ以上にアミノ酸変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１８２】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８３】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｋ３２１Ｎを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８４】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｋ３２１Ａを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８５】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｋ３２１Ｖを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８６】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８７】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｆを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８８】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１８９】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ａを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９０】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｖを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９１】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９２】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９３】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ａを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９４】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｖを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９５】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９６】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ａを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９７】
変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｖを更に含む、請求項１８１に記載のリソソーム蓄積症を処置する方法。
【請求項１９８】
リソソーム蓄積症が、ゴーシェ病（Gaucher disease）である、請求項１７８、請求項１７９、請求項１８０、請求項１８１、請求項１８２、請求項１８３、請求項１８４、請求項１８５、請求項１８６、請求項１８７、請求項１８８、請求項１８９、請求項１９０、請求項１９１、請求項１９２、請求項１９３、請求項１９４、請求項１９５、請求項１９６または請求項１９７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９９】
投与が、静脈内注入である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
投与が、腹腔内注射である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０１】
次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物。
【請求項２０２】
次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む組成物。
【請求項２０３】
野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した発現が可能であることを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０４】
発現が、野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約１０％増加している、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０５】
発現が、野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約２５％増加している、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０６】
発現が、野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約５０％増加している、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０７】
発現が、野生型β−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約８０％増加している、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０８】
変異型β−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、哺乳動物細胞中で発現可能である、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２０９】
変異型β−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、酵母細胞中で発現可能である、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２１０】
変異型β−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、トランスジェニック動物中で発現可能である、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２１１】
変異型β−グルコセレブロシダーゼタンパク質が、挿入された遺伝子から発現可能である、請求項２０３に記載の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質。
【請求項２１２】
次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物を製造する方法。
【請求項２１３】
次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードしている核酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
[0001]米国法典３５編１１９（ｅ）条の下で、双方とも本明細書中にそのまま援用される２０１０年１１月８日出願の米国仮出願第６１／４１１，３３１号および２０１０年１１月１０日出願の米国仮出願第６１／４１２，１８０号に優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
[0002]本発明の分野は、いろいろなリソソーム蓄積症のための酵素置換療法に有用であるタンパク質を包含する。これらリソソーム蓄積症には、ゴーシェ病（Gaucher disease）が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
[0003]β−グルコセレブロシダーゼは、管腔膜表面においてサポシンＣ（Saposin C）および陰イオンリン脂質との相互作用によって機能して、糖脂質グルコシルセラミドを加水分解する可溶性リソソーム酵素である。β−グルコセレブロシダーゼは、組織マクロファージにおいて、貪食された損傷細胞および病原体を分解し且つそれらから膜を再循環するのに特に重要である。グルコシルセラミドは、極めて多数の重要な細胞経路およびシグナリングカスケードに関与する３００を超える糖脂質およびガングリオシドの一次前駆体分子であるので、これらいろいろな脂質分子の複雑な平衡を維持することが不可欠である。
【０００４】
[0004]ゴーシェ病は、β−グルコセレブロシダーゼの欠損によって引き起こされ、グルコシルセラミドの蓄積を生じる。ゴーシェ病は、貧血、血小板減少症、肝脾腫および骨格異常を含めたいろいろな臨床症状によって現れる。ゴーシェ病は、神経学的合併症に基づいて三つのカテゴリーに分類される：１型（非神経障害性）；２型（急性神経障害性）；および３型（慢性神経障害性）。ゴーシェ病について知られている治療は存在しないが、欠乏したβ−グルコセレブロシダーゼを補充する酵素置換療法（enzyme replacement therapy）（ＥＲＴ）、およびグルコシルセラミドの合成を阻害する基質減少療法は、この疾患のために承認された処置である。低分子薬理学的シャペロンおよびタンパク質フォールディングモジュレーターなどの他の治療的アプローチも、この疾患の可能性ある処置として評価されている。これら処置アプローチの内、ＥＲＴは、ゴーシェ病の内臓症状について最も確立された有効な臨床処置である。イミグルセラーゼ（Imiglucerase）（組換えβ−グルコセレブロシダーゼ；CerezymeＴＭ，Genzyme Corp.ＴＭ）は、ゴーシェ病の処置用に開発されて１９９４年にＦＤＡによって承認され、現在のところ、この疾患の治療の基準である。
【０００５】
[0005]CerezymeＴＭＥＲＴは、最も有効な処置であると広く考えられているが、このリソソーム酵素は、中性ｐＨおよび３７℃で安定ではない。実際に、薬物の大部分は、静脈内注入直後に血中で不可逆的に失活する。触媒活性を保持し且つ標的マクロファージ中に取り込まれるごく一部だけが、全体の治療的効果を与える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、タンパク質生産段階からそれを必要としているヒト対象中への導入時に遭遇すると考えられる生理的条件を通して、酵素失活にそれほど感受性ではない、より安定なβ−グルコセレブロシダーゼ酵素を開発することは、好都合であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
[0006]本明細書中で提供するのは、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。本明細書中において更に提供するのは、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。本明細書中に更に記載しているのは、次の一つ以上の位置：３１６、３１７、３２１および１４５にアミノ酸変異を有することができる変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。
【０００８】
[0007]本明細書中に記載しているのは、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を製造する方法である。本明細書中に更に記載しているのは、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる担体を含む組成物である。本明細書中において更に提供するのは、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる緩衝剤を含む組成物である。
【０００９】
[0008]本明細書中に記載しているのは、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質であり、該一つ以上の置換アミノ酸は、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とする。本明細書中に更に記載しているのは、タンパク質の活性部位付近のαヘリックス（α６）中の一つ以上の置換アミノ酸を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該一つ以上の置換アミノ酸の側鎖は、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ１を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有する側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とする。本明細書中において更に提供するのは、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該一つ以上の置換アミノ酸の側鎖は、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にするという側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とする。
【００１０】
[0009]本明細書中において提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した比活性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、次の一つ以上の位置：３１６、３１７、３２１および１４５にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、ゴーシェ病を処置する方法であって、それを必要としている対象に、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。
【００１１】
[0010]本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物である。
【００１２】
[0011]本明細書中において更に提供するのは、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した発現が可能であることを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質である。
【００１３】
[0012]本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物を製造する方法である。本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードしている核酸を製造する方法である。
【００１４】
図面の簡単な説明
[0013]前述のおよび他の本発明の側面は、添付の図面に関連して考えた場合、以下の本発明の詳細な説明から明らかである。本発明を説明するために、現在のところ好適である態様を図面に示しているが、しかしながら、本発明は、開示されている特定の手段に制限されないということは理解される。図面は、必ずしも、一定尺度で描かれていない。図面においては、以下である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0014]図１（Ａ）は、典型的な一過性トランスフェクション実験から４８時間後に細胞培養培地中に分泌された野生型酵素に対する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の相対発現を比較する酵素活性測定値を示す；（Ｂ）は、一過性トランスフェクション後に細胞培養培地中に分泌された変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および野生型 GlcCerase タンパク質の相対量を比較するウェスタンブロット分析を示す。
【図２】[0015]図２は、Ｈ１４５Ｌ改変、Ｈ１４５Ｆ改変、Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ改変、Ｋ３２１Ｎ改変、Ｋ３２１Ａ改変、Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎ改変およびＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ改変を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の、ｐＨ７．５および３７℃において野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較した安定性を示す；そして
【図３】[0016]図３は、Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ改変を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の、ｐＨ８および３７℃において野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較した安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0017]本内容は、本開示の一部分を成している添付の図面および実施例に関連して与えられる以下の詳細な説明を参照することにより一層容易に理解することができる。本発明は、本明細書中に記載のおよび／または示されている特定の装置、方法、用途、条件またはパラメーターに制限されないということ、および本明細書中で用いられる専門用語は、単に例として特定の態様を記載する目的のためにあり、特許請求の範囲に記載の発明を制限することを意図するものではないということは理解されるはずである。
【００１７】
[0018]更に、添付の特許請求の範囲を含めた明細書中に用いられる場合、「ある（a，an）」および「その（the）」という単数形は、複数形を包含し、そして特定の数値への言及は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、少なくともその特定の値を包含する。「複数」という用語は、本明細書中で用いられる場合、一つより多いことを意味する。値の範囲が表されている場合、別の態様は、一つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを包含する。同様に、近似値として値が表されている場合、「約」という先行詞の使用により、その特定の値が別の態様を成すと理解される。範囲は全て、包括的で且つ組み合わせ可能である。
【００１８】
[0019]本発明の更なる理解を助けるために例を与える。用いられる特定の材料、プロトコルおよび条件は、本発明を更に説明することを意図するものであり、妥当な発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００１９】
[0020]特に断らない限り、変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質特性は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質特性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に相対して述べられている。本明細書中において、「GlcCerase」は、β−グルコセレブロシダーゼについて用いられる略語である。アミノ酸番号は全て、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に相対している。したがって、１４５位は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１中に存在する１４５番目のアミノ酸であると考えられる。更に、本明細書中に開示の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質には、それらの機能性フラグメントまたは誘導体も含まれる。
【００２０】
[0021]本明細書中において、「ほぼ中性ｐＨ」は、通常は生理的ｐＨ（すなわち、３７℃で約７．５のｐＨ）と考えられるｐＨを包含する意味である。
[0022]適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、細胞培養およびタンパク質生産の際に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質に相対して、細胞培養培地中への同様のまたは増加したタンパク質発現および分泌を有することを特徴とすることができる。適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質に相対して増加した安定性を有することを特徴とすることができる。これらのタンパク質は、生理的条件で増加した安定性を有し、そしてそれら生理的条件は、in vivo でありうる。更に、これらのタンパク質は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で増加した安定性を有することを特徴とすることもできる。この増加した安定性は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で約３時間にわたって観測されうる。増加した安定性は、細胞培養培地中で保持され、しかも細胞内で保持されうる。これらのタンパク質は、リソソーム内で増加した安定性を有することもでき、そしてリソソーム内での条件は、約ｐＨ５および約３７℃でありうる。これらのタンパク質は、減少したタンパク質分解により特徴づけられる増加した安定性を有することもでき、そして減少したタンパク質分解は、細胞中で起こりうる。更に、減少したタンパク質分解は、細胞中のリソソーム中でありうる。これらのタンパク質は、タンパク質精製の際の緩衝溶液中などの非生理的条件で増加した安定性を有することもできる。これらの緩衝溶液は、タンパク質精製の際に約７より高いｐＨまたは約３未満のｐＨを有することができる。これらの緩衝溶液は、有機溶媒またはカオトロピック塩を含有することもできる。これらのタンパク質は、緩衝溶液中において約２℃〜約３７℃の範囲の温度で増加した安定性を有することもできる。更に、これらのタンパク質は、緩衝溶液中において約２℃〜約８℃の範囲の温度で増加した安定性を有することもできる。更に、これらのタンパク質は、緩衝溶液中において約２０℃の温度で増加した安定性を有することができる。これらのタンパク質は、凍結融解サイクル後にまたは凍結乾燥後の再構成後に増加した安定性を有することもできる。これらのタンパク質は、生理食塩水などの薬物配合緩衝液（drug-formulation buffer）中で増加した安定性を有することもできる。
【００２１】
[0023]適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とすることができる。これらのタンパク質は、生理的条件でより高い触媒活性を保持しており、そのより高い保持されている触媒活性は、in vivo でありうる。更に、これらのタンパク質は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件でより高い触媒活性を保持していることを特徴とすることもできる。このより高い保持されている触媒活性は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で約２時間にわたって観測されうる。これらのタンパク質は、細胞培養培地中でより高い触媒活性を保持しており、そのより高い保持されている触媒活性は、細胞内でありうる。更に、これらのタンパク質は、リソソーム内でより高い触媒活性を保持していることができ、そしてリソソーム内での条件は、約ｐＨ５および約３７℃でありうる。これらのタンパク質は、減少したタンパク質分解により特徴づけられるより高い触媒活性を保持していることもでき、そして減少したタンパク質分解は、細胞中で起こりうる。更に、減少したタンパク質分解は、細胞中のリソソーム中でありうる。これらのタンパク質は、タンパク質精製の際の緩衝溶液中などの非生理的条件でより高い触媒活性を保持していることもできる。これらの緩衝溶液は、タンパク質精製の際に約７より高いｐＨまたは約３未満のｐＨを有することができる。これらの緩衝溶液は、有機溶媒またはカオトロピック塩を含有することもできる。これらのタンパク質は、約２℃〜約３７℃の範囲の温度でより高い触媒活性を保持していることもできる。更に、これらのタンパク質は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でより高い触媒活性を保持していることもできる。更に、これらのタンパク質は、約２０℃の温度でより高い触媒活性を保持していることができる。これらのタンパク質は、凍結融解サイクル後にまたは凍結乾燥後の再構成後により高い触媒活性を保持していることもできる。これらのタンパク質は、生理食塩水などの薬物配合緩衝液中でより高い触媒活性を保持していることもできる。
【００２２】
[0024]変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、次の一つ以上の位置：３１６、３１７、３２１および１４５にアミノ酸変異を有することもできる。これらのタンパク質は、一つまたは複数のアミノ酸変異：（１）Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆ；または（２）Ｋ３２１Ｎ；または（３）Ｈ１４５Ｌ；または（４）Ｈ１４５Ｆ；または（５）Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎ；または（６）Ｋ３２１Ａ；または（７）Ｋ３２１Ｖ；（８）Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ａ；または（９）Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｖ；または（１０）Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆ；または（１１）Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎ；または（１２）Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ａ；または（１３）Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｖを有することができる。これらのタンパク質のいくつかは、細胞培養およびタンパク質生産の際に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質に相対して、細胞培養培地中への同様のまたは増加したタンパク質発現および分泌を有することを特徴とすることもできる。これらのタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とすることもできる。これらのタンパク質は、生理的条件で増加した安定性を有することを特徴とすることもでき、そしてこれら条件は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃である。これらのタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とすることもできる。その触媒活性は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で約２時間にわたってインキュベーションした後に測定することができる。これらのタンパク質は、生理的条件でより高い触媒活性を保持することを特徴とすることもできる。アミノ酸変異Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｋ３２１Ｎを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｋ３２１Ａを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｋ３２１Ｖを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約１．４倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｈ１４５Ｆを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約２倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼより少なくとも約３倍長い延長した見掛け半減期を有する。この延長した見掛け半減期は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃の条件で約２時間にわたってインキュベーションした後に測定することができる。
【実施例】
【００２３】
実施例１
試薬
[0025]４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（４ＭＵＧ）蛍光発生基質は、Research Products International（Mt. Prospect, IL）より購入した。ＤＮＡ Gel Extraction キットおよび Miniprep ＤＮＡ（登録商標）キットは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）（Valencia, CA）製であった。PureYield Maxiprep ＤＮＡkitＴＭは、PromegaＴＭ（Madison, WI）製であった。特に断らない限り、化学薬品は、SigmaＴＭ（St. Louis, MO）製であった。Fugene−ＨＤＴＭトランスフェクション試薬は、RocheＴＭ（Indianapolis, IN）製であった。ｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡＴＭ哺乳動物発現ベクター、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle medium）（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および他の組織培養試薬は、InvitrogenＴＭ（Carlsbad, CA）製であった。野生型ヒト野生型β−グルコセレブロシダーゼｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００１５７．３）は、OrigeneＴＭ（Rockville, MD）より購入した。制限エンドヌクレアーゼ、Phusion−ＨＦＴＭＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Antarctic ホスファターゼ、化学的コンピテント大腸菌（E. coli）（ＤＨ５α細胞）およびエンドグリコシダーゼＰＮＧアーゼＦおよびＥｎｄｏＨは全て、New England BiolabsＴＭ（Ipswich, MA）より購入した。ヒト胚性腎細胞（Ｔ抗原で形質転換済み；ＨＥＫ２９３Ｔ）は、ＡＴＣＣＴＭからであった。
【００２４】
検定
[0026]変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は全て、ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）における一過性発現によって試験し、タンパク質発現を評価した。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質または野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の触媒活性を試験するためのレポーターシステムは、４−ＭＵ−β−グルコース蛍光発生基質を約ｐＨ５．２および約３７℃で加水分解する性能であった。これらの変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の安定性は、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で約３時間にわたってインキュベーションした後の各々のタンパク質の触媒活性の保持を観測することによって試験した。これら実験における条件は、患者へのβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質酵素置換療法の静脈内注入の際に存在すると考えられる環境に似ているように設計した。
【００２５】
[0027]より具体的には、決して制限すると解釈されるものではないが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを補充した１ｍｌのＤＭＥＭ培地を含む１２ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、そして３７℃において５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、８０〜９０％密集に達した時に、消費された培地を、１ｍｌの新鮮ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地と交換し、そして各々のウェルを、個々のβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質のための１μｇのプラスミドＤＮＡまたはＰＢＳ（モックトランスフェクション陰性対照のため）で、３μｌの Fugene−ＨＤトランスフェクション試薬を製造者のプロトコルにしたがって用いて、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、２４〜７２時間インキュベートし、そして（培地中に分泌される）組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の発現について酵素活性検定によって毎日検査した。
【００２６】
[0028]β−グルコセレブロシダーゼタンパク質発現（および細胞培養培地中への分泌）は、酵素活性検定により、一過性トランスフェクション実験からの２４時間、４８時間または７２時間後の馴化培地および４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（４−ＭＵＧ）蛍光発生基質を用いて評価した。簡単にいうと、各々の試料からの２０μｌの馴化培地を、指定の時点で採取し、そして０．５ｍｌミクロ遠心管中において８０μｌの McIlvane 緩衝液（ＭＩ緩衝液：５０ｍＭクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム（ｐＨ５．２）／０．２５％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００／０．２５％（ｗ／ｖ）タウロコール酸ナトリウム）で希釈した。各２５μｌの希釈試料を、９６ウェル黒色透明底プレートの個々のウェル中に小分けし（三連で行った）、そして５０μｌの６ｍＭ  ４−ＭＵＧ基質（ＭＩ緩衝液中で調製）を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらのプレートを、カバーテープで密封し、３７℃で１時間インキュベートした。酵素反応は、１２５μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることによって止め、そして遊離した４−ＭＵ蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて３５５ｎｍ励起波長および４６０ｎｍ発光波長をそれぞれ用いて読み取った。モックトランスフェクションした試料からの４−ＭＵ蛍光は、「バックグラウンド」対照として役立ち、全てのβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質試料から差し引いた。
【００２７】
[0029]細胞培養培地中に存在する野生型および変異型酸性β−グルコセレブロシダーゼタンパク質の量を推定するために、一過性トランスフェクション実験からの馴化細胞培養培地を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、そして標準的な技法を用いてニトロセルロースメンブランに移した。次に、そのメンブランを、ブロッキング緩衝液（Blocking Buffer）：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）／０．１％（ｖ／ｖ）Tween−２０（ＴＢＳＴ）中の４％（ｗ／ｖ）脱脂乳と一緒に室温で振とうしながら１時間インキュベートした。次に、メンブランを、ブロッキング緩衝液中で１：２５００に希釈したウサギ抗ヒトβ−グルコセレブロシダーゼポリクローナル一次抗体（ヒト酸性β−グルコセレブロシダーゼのＣ末端に相当する１９アミノ酸ペプチドに対して産生させた；Sigma Ｇ−４１７１）と一緒に室温で１時間または４℃で一晩振とうしながらインキュベートした。次に、そのブロットを、ＴＢＳＴで、室温において振とうしながら１時間にわたって少なくとも３回の緩衝液交換で洗浄した。次に、ブロットを、ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００に希釈した酵素結合二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体）と一緒に室温で振とうしながら１時間インキュベートした。そのブロットを、ＴＢＳＴで、室温において振とうしながら１時間にわたって少なくとも３回緩衝液交換して洗浄した。次に、ブロットを、化学発光基質（例えば、Pierce’s Supersignal West-Dura Extended Duration SubstrateＴＭ）と一緒に室温で５分間インキュベートし、そして画像化システムによってまたはフィルムによって可視化して、野生型および変異型酸性β−グルコセレブロシダーゼ酵素についてのタンパク質発現レベルを評価した。
【００２８】
[0030]β−グルコセレブロシダーゼタンパク質安定性を評価するために、一過性発現した変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質および精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（すなわち、CerezymeＴＭ）を、中性ｐＨ緩衝液中において３７℃でインキュベートし、酵素活性について検定して、触媒活性喪失の程度を約３時間にわたって決定した。簡単にいうと、６０μｌの馴化培地（個々の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含有）を、トランスフェクション後２４時間または４８時間後に採取し、そして０．５ｍｌミクロ遠心管中の４２０μｌの０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５）／０．２％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００／０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡに加えた。同様に、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を、ＤＭＥＭ培地／１０％ＦＢＳ中で１：１２，５００に段階希釈し、そして６０μｌのこの希釈した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質試料を、４２０μｌの０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ  ７．５）／０．２％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００／０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡに加えて、１：１００，０００の最終希釈物を得た。（野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質のこの量は、経験的に、一過性発現した組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と同様の量の酵素活性を含有すると決定した）。試料は全て、３７℃水浴中でインキュベートし、そして７０μｌの各試料を、指定の時点（０分、３０分、６０分、９０分、１２０分または１８０分）で取り出し、２０μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）が入っている新しい０．５ｍｌミクロ遠心管に加えた。それらの試料を十分に混合し、そして２５μｌの各希釈試料を用いて、残留する組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質酵素活性（三連）を上記のように測定した。（ｔ＝０分での）初期酵素活性を、各々の組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質について１００％としたが、それ以後の全ての時点の酵素活性を、初期活性に対して正規化して、残留する酵素活性を時間経過全体にわたって決定した。多重実験（少なくとも２回の別々の実験）からのデータを用いて、個々の時点について残留する組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質活性の平均値を得、そして示されるインキュベーション時間に相対してグラフに示した。
【００２９】
実施例２
[0031]特定のアミノ酸置換を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質の発現を、上記の一過性トランスフェクション実験を用いて野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した（図１）。図１Ａで理解されうるように、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ」）、Ｋ３２１Ｎ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｋ３２１Ｎ」）、Ｈ１４５Ｌ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ」）、Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎ」）、Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ」）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中において野生型GlcCerase と共に一過性発現させた。馴化細胞培養培地を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、そしてβ−グルコセレブロシダーゼ酵素活性について、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（４−ＭＵＧ）蛍光発生基質を用いて検定して、野生型 GlcCerase と比較してこれらの変異型 GlcCerase 酵素の相対発現レベルを評価した。これら結果は、異なった変異型 GlcCerase 酵素が、細胞培養培地中のより高い実測酵素活性によって示されるように、野生型 GlcCerase と同様にまたはより良く発現したということを示している。GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎを含めた他の変異型GlcCerase 酵素も、野生型 GlcCerase より良く発現した（データは示さない）。GlcCerase−Ｋ３２１Ａおよび GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎは、野生型 GlcCerase とおよそ同レベルで発現したが、GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、野生型 GlcCerase ほど効率よく発現しなかった（データは示さない）。
【００３０】
馴化細胞培養培地中に存在する変異型 GlcCerase タンパク質および野生型 GlcCerase タンパク質の量は、上記のようにウェスタンブロッティングを用いて評価した。図１Ｂで理解されうるように、馴化細胞培養培地中には、野生型 GlcCerase より多量の GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆおよび GlcCerase−Ｋ３２１Ｎタンパク質が存在した。これらのウェスタンブロッティングデータは、GlcCerase 酵素活性結果と一致し、しかも特定の変異型 GlcCerase 酵素を野生型 GlcCerase より良く発現し且つ分泌するということを確認する。同様の結果を、他の変異型 GlcCerase タンパク質について認めた（データは示さない）。
【００３１】
実施例３
[0032]Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ」）を、上記の in vitro 安定性検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図２で理解されうるように、GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で２時間または３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の８５％を保持した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の７３％を保持した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の５０％を保持した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の３４％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００３２】
[0033]GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１２０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、約ｐＨ８および約３７℃でも試験したが、同様の傾向を示した（図３）。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆおよび野生型 GlcCerase は双方とも、約ｐＨ８および約３７℃でより安定性が低かったが、これらの結果は、GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆが、より高いｐＨにおいて野生型GlcCerase より安定であるということを確認する。
【００３３】
実施例４
[0034]Ｋ３２１Ｎ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｋ３２１Ｎ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図２で理解されうるように、GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の１０４％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の９１％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の７６％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の５４％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００３４】
[0035]GlcCerase−Ｋ３２１Ｎの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１８０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００３５】
実施例５
[0036]Ｈ１４５Ｌ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図２で理解されうるように、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の９２％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の８７％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の６２％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の４２％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００３６】
[0037]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１６０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００３７】
実施例６
[0038]Ｈ１４５Ｆ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図１で理解されうるように、GlcCerase−Ｈ１４５Ｆは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｈ１４５Ｆは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の９４％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｆは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の８０％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｆは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の３７％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｆは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の１７％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００３８】
[0039]GlcCerase−Ｈ１４５Ｆの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１００分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００３９】
実施例７
[0040]Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図２で理解されうるように、GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の１０１％を保持した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の９１％を保持した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の７５％を保持した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の５２％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００４０】
[0041]GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１８０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００４１】
実施例８
[0042]Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の７７％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の８０％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の５６％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の３９％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００４２】
[0043]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１３５分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００４３】
実施例９
[0044]Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図２で理解されうるように、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の８９％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の８６％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の７６％を保持した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の６２％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００４４】
[0045]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１８０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００４５】
実施例１０
[0046]Ｋ３２１Ａ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｋ３２１Ａ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図２で理解されうるように、GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の９０％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の８９％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の４９％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００４６】
[0047]GlcCerase−Ｋ３２１Ａの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ１７０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００４７】
実施例１１
[0048]Ｋ３２１Ａ変異を含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「GlcCerase−Ｋ３２１Ｖ」）を、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質（「野生型 GlcCerase」）と比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、ほぼ中性ｐＨおよび約３７℃で３時間の時間経過にわたって野生型 GlcCerase より有意に安定である。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、３０分のインキュベーション後にその初期活性の７４％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、６０分のインキュベーション後にその初期活性の５５％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２９％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の１５％を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型 GlcCerase は、３０分のインキュベーション後にその初期活性の６８％を保持した。野生型 GlcCerase は、６０分のインキュベーション後にその初期活性の４６％を保持した。野生型 GlcCerase は、１２０分のインキュベーション後にその初期活性の２０％を保持した。野生型 GlcCerase は、１８０分のインキュベーション後にその初期活性の８％を保持した。
【００４８】
[0049]GlcCerase−Ｋ３２１Ｖの推定半減期（この研究において、操作上、初期酵素活性の５０％損失を引き起こした約ｐＨ７．５および約３７℃でのインキュベーション時間として定義される）は、およそ７０分であるが、野生型 GlcCerase の推定半減期は、これら実験条件下においておよそ５０分である。
【００４９】
[0050]上の結果を、表１に要約する。
【００５０】
【表１】
2014500722.tif 000003
【００５１】
[0051]残留活性は、３時間インキュベーション後に残っている酵素活性の量であり、安定性検定において各々の変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質について（ｔ＝０分での）初期酵素活性の百分率として表されている。各々の組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を、少なくとも２回の別々の実験（表１にｎで示される）で試験して、１回しか試験しなかった GlcCerase−Ｋ３２１Ｖおよび GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆを除いて、３時間の時間経過中の平均残留活性を決定した。倍改善（fold-improvement）は、精製した野生型組換え GlcCerase タンパク質に相対する変異型組換え GlcCerase タンパク質の見掛け半減期の増加を意味する。
【００５２】
[0052]１４５位、３１６位、３１７位または３２１位にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質、または GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ、GlcCerase−Ｋ３２１Ｎ、GlcCerase−Ｋ３２１Ａ、GlcCerase−Ｋ３２１Ｖ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ、または GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎまたは GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａまたは GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｖまたは GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆまたは GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持していると特徴づけることができ、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはトランスジェニック動物中において、当業者に知られている分子生物学技法およびタンパク質精製技法を用いて製造しうると考えられる。
【００５３】
[0053]１４５位、３１６位、３１７位または３２１位にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質、または GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ、GlcCerase−Ｋ３２１Ｎ、GlcCerase−Ｋ３２１Ａ、GlcCerase−Ｋ３２１Ｖ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ、または GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎまたは GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａまたは GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｖまたは GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆまたは GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物は、当業者に知られている薬学的に許容しうる担体を用いて製造しうると考えられる。
【００５４】
[0054]１４５位、３１６位、３１７位または３２１位にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質、または GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ、GlcCerase−Ｋ３２１Ｎ、GlcCerase−Ｋ３２１Ａ、GlcCerase−Ｋ３２１Ｖ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ、GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ、または GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎまたは GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａまたは GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｖまたは GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆまたは GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎおよび薬学的に許容しうる緩衝剤を含む組成物は、当業者に知られている薬学的に許容しうる緩衝剤を用いて製造しうると考えられる。
【００５５】
実施例１２
[0055]GlcCerase タンパク質は、酸性ｐＨで安定であり且つリソソーム内の蓄積したグルコシルセラミド基質を浄化する効率が極めてよいことから、改善された効力のために一層多量の活性薬物をリソソームに送達するように、好ましくない（中性ｐＨ）環境により良く耐えてその触媒活性を保持することができるより安定な GlcCerase ＥＲＴを開発することができる。その GlcCerase 酵素は、活性部位酵素阻害剤イソファゴミン（isofagomine）（ＩＦＧ）によって結合された（そして阻害された）場合に、ほぼ中性ｐＨで安定化することができる。ほぼ中性ｐＨでの組換え GlcCerase のタンパク質安定性は、熱融解温度（Ｔｍ）の１５℃までの増加によって示されるように、ＩＦＧで有意に改善する。ＩＦＧで誘発される GlcCerase 安定化の作用機構は、ＩＦＧと６個の GlcCerase 活性部位残基との間の広範囲の水素結合ネットワークによって生じて、活性部位および周囲領域の変性を制限して、より安定な GlcCerase コンホメーションを維持すると考えられる。活性部位および周囲領域において適当な GlcCerase 構造を維持することは、触媒活性および全体の GlcCerase 安定性を助ける。GlcCerase への多数の異なった改変は、ほぼ中性ｐＨで触媒活性を保持し且つより安定なタンパク質構造を維持するのを助けることができる。本明細書中において、ほぼ中性ｐＨで巻戻される傾向がより少ない、活性部位付近のより秩序化された領域を形成するのを助けるように、活性部位付近のループ構造内の戦略的場所に特定のアミノ酸置換を含む、一連の異なった GlcCerase 酵素の構築を提供する。更に、本明細書中において、活性部位付近のαヘリックスへの改変であって、このヘリックスおよび隣接したループを触媒部位から引き離して、オープンで活性なコンホメーションを維持するのを助けることができる改変を提供する。
【００５６】
[0056]野生型 GlcCerase より優れたタンパク質安定性を有すると予測された一連の改変GlcCerase 酵素を作成するアプローチを利用した。主として、次の二つの異なるが相補的な戦略を用いた：（１）酵素を実際に阻害することなく好適な活性 GlcCerase コンホメーションを模倣する、触媒部位付近の特定のループおよびヘリックスの改変；および（２）改善されたタンパク質安定性のために異なった残基および二次構造の間の相互作用を増強することができるランダムコイル領域の改変。
【００５７】
[0057]一つの例において、いくつかの残基を、ループ１領域内（３１１位〜３１９位）で改変して、ほぼ中性ｐＨで巻戻される傾向がより少ないと考えられる活性部位付近のより秩序化された領域を形成するのを助けた。ループ１内に改変を含むこの変異型（GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ）は、約ｐＨ７．５および３７℃でGlcCerase より有意に安定であることが示された。
【００５８】
[0058]第二の例において、活性部位付近のαヘリックス（α６）を改変したが、それは、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ（ループ１）を触媒部位から引き離して、オープンで活性なコンホメーションを維持するのを助けるためであった。したがって、ヘリックスα６内で荷電したリシン残基を非荷電の残基と交換するアミノ酸置換を３２１位に含有した改変GlcCerase 酵素を作成して、隣接したαヘリックスおよびβ構造とのより疎水性の相互作用を促してタンパク質を安定化した。タンパク質アラインメントを、いろいろな種の GlcCerase 酵素について分析し（表II）、そしてＢ．タウルス（B. taurus）の GlcCerase ホモログ（雄牛 GlcCerase；アクセッションコードＤＡＡ３１８０６．１）が、３２１位にアスパラギン（３２１Ａｓｎ）を含有することに注目した。これは、GlcCerase 触媒活性を無効にすることなく、３２１位のリシン（３２１Ｌｙｓ）を異なったアミノ酸残基と交換できる可能性があるということを示唆している。GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、約ｐＨ７．５および３７℃で２時間および３時間後に、それぞれ、その元の触媒活性のおよそ７５％および５４％を保持した。対照的に、野生型 GlcCerase は、同じ条件下においてその初期活性の僅か２１％および８％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｎの推定半減期は、野生型 GlcCerase よりおよそ３．５倍長かった。同様に、GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、約ｐＨ７および３７℃で２時間および３時間後に、それぞれ、その元の触媒活性のおよそ６８％および４９％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ａの推定半減期は、野生型 GlcCerase よりおよそ３倍長かった。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、約ｐＨ７および３７℃で２時間および３時間後に、それぞれ、その元の触媒活性のおよそ２９％および１５％を保持した。GlcCerase−Ｋ３２１Ｖの推定半減期は、野生型 GlcCerase よりおよそ１．４倍長かった。これらのデータは、ヘリックスα６内の正電荷リシン残基を除去することが、この領域をより秩序化し、この領域の巻戻しを制限し、より高い GlcCerase タンパク質安定性を与えたということを示している。
【００５９】
[0059]第三の例において、ランダムコイル領域を、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間で改変したが、それは、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にすることができる。いろいろな種からの GlcCerase 酵素（表２）のタンパク質アラインメント分析は、このランダムコイル内の１４５位が、異なった種の間で異なることを明らかにした。Ｂ．taurus ホモログおよびＳ．スクロファ（S. scrofa）（ブタ）は双方とも、この位置にロイシンを含有するが、マウス GlcCerase は、セリンを含有する。したがって、本発明者は、１４５位のヒスチジン（１４５Ｈｉｓ）をＬｅｕ（Ｈ１４５Ｌ）またはＰｈｅ（Ｈ１４５Ｆ）で置換して、これら改変が GlcCerase 安定性を改善するかどうか決定した。GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ GlcCerase は、野生型 GlcCerase より安定であることが示され、野生型 GlcCerase よりおよそ３倍長い推定半減期（１６０分対５０分）で、２時間後にその初期活性の６２％、そして３時間後に４２％を保持した。同様に、GlcCerase Ｈ１４５Ｆは、野生型 GlcCerase に相対しておよそ２倍長い半減期で、２時間後にその初期活性のおよそ３７％、そして３時間後に１７％を保持した。現在のところ、これら改変が GlcCerase 構造にどのように影響を及ぼすかは知られていないが、部分的に荷電した残基（１４５Ｈｉｓ）をロイシンかまたはフェニルアラニン疎水性残基と交換することは、この領域をより秩序化し、この領域の巻戻しを制限する可能性がある。或いは、これら改変はターンを作り出し、二次構造（例えば、βシートβ２およびヘリックスα２）の間の相互作用を増強することができる。
【００６０】
[0060]タンパク質アラインメントデータを、表２に要約する。
【００６１】
【表２】
2014500722.tif 000004
【００６２】
[0061]適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸を有することができる。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、その一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲で巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、その一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨで巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする。
【００６３】
[0062]適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、タンパク質の活性部位付近のαヘリックス（α６）中の一つ以上の置換アミノ酸であって、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ１を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有するという側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸側部を有することができる。これらのタンパク質は、更に、タンパク質の活性部位付近のαヘリックス（α６）中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ１を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有するという側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側部は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とすることができる。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、その一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ１領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸を有することができる。
【００６４】
[0063]適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。これらのタンパク質は、更に、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖は、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲でより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでの改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。これらのタンパク質は、更に、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約ｐＨ３〜約ｐＨ８の範囲での改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。これらのタンパク質は、更に、βシート（β２）とαヘリックス（α２）との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性ｐＨでの改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーション（confirmation）を有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。
【００６５】
[0064]リソソーム蓄積症を処置するのに適する方法は、更に、それを必要としている対象に、与えられている野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼと比較して増加した比活性を有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。
【００６６】
[0065]リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、次の位置：３１６、３１７、３２１および１４５の一つ以上にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｋ３２１Ｎを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｋ３２１Ａを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｋ３２１Ｖを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｆを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｎを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ａを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｆ３１６Ａ、Ｌ３１７ＦおよびＫ３２１Ｖを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｈ１４５Ｌ、Ｆ３１６ＡおよびＬ３１７Ｆを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｎを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ａを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異Ｈ１４５ＬおよびＫ３２１Ｖを含む変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処��する方法は、更に、ゴーシェ病を処置する方法を含むことができる。処置方法は、静脈内注入による、筋肉内注射による、または当業者に知られている他の投与経路によることができる。
【００６７】
[0066]適切な化合物は、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を有することができる。適切な化合物は、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を有することができる。
【００６８】
[0067]適切な変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して増加した発現が可能であることを特徴とすることができる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約１０％増加されうる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約２５％増加されうる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約５０％増加されうる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ−グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約８０％増加されうる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物または酵母細胞中で発現可能でありうる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、ヒトにおいて発現することができる。変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、挿入された遺伝子から発現することができる。
【００６９】
実施例１３
[0068]変異型組換え GlcCerase タンパク質および野生型 GlcCerase を、前述の方法にしたがって細胞培養物中で発現させて、野生型 GlcCerase と比較したこれらの変異型 GlcCerase 酵素の相対発現を評価した。多数の異なった変異型 GlcCerase 酵素が、一過性トランスフェクション実験において、トランスフェクション後約４８時間後の馴化培地からの酵素活性によって測定されるように（図１）、野生型 GlcCerase より良く発現した。GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ａは、野生型 GlcCerase より良く発現し（約２８２％）、GlcCerase−Ｋ３２１Ｎは、野生型 GlcCerase より良く発現し（約２７２％）、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌは、野生型 GlcCerase より良く発現し（約１５７％）、GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ａ／Ｋ３２１Ｎは、野生型 GlcCerase より良く発現し（約２７２％）、GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎは、野生型 GlcCerase より良く発現した（約３１７％）。GlcCerase−Ｋ３２１Ａは、野生型 GlcCerase と同等に発現したが、GlcCerase−Ｋ３２１Ｖは、野生型より低レベルで発現した（約６１％）（データは示さない）。
【００７０】
[0069]本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物を製造する方法である。本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードしている核酸を製造する方法である。
【００７１】
実施例１４
野生型および改変GlcCerase 酵素のためのプラスミド構築
[0070]野生型および改変GlcCerase 酵素の発現のためのＤＮＡプラスミドは、オリゴヌクレオチドプライマー（表３に挙げられている）、または特定のアミノ酸置換を含む GlcCerase のフラグメントをコードしている合成ＤＮＡミニジーン（＞４００ｂｐ）を用いて作成した。プライマーおよび合成ＤＮＡミニジーンは全て、Integrated DNA TechnologiesＴＭ（Coralville, IA）より購入した。野生型ヒト GlcCerase（ｐＨＤ１０１と称する）は、GlcCerase ｃＤＮＡをＰＣＲによって作成し、そして哺乳動物発現ベクター中に連結することによって構築した。簡単にいうと、野生型ヒト GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、その天然 Kozak 配列および停止コドンを含めて、Phusion−ＨＦ高忠実ＤＮＡポリメラーゼＴＭ（ＮＥＢＴＭ）および２００μＭ  ｄＮＴＰによる二つの同一の５０μｌ反応液中において、プライマーＡおよびＢならびにヒト GlcCerase ｃＤＮＡクローン（OrigeneＴＭ）鋳型ＤＮＡを用いて増幅させた。プライマーＡは、５’ＢｇｌＩＩおよび Kozak 配列の直前にある内部ＥｃｏＲＩ制限部位を含有するように構築した、一方プライマーＢは、発現ベクター中へのＰＣＲ産物のクローニングを可能にするように停止コドンに続く３’ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含有した。それらのＰＣＲ反応物をプールし、得られた約１．６キロベース（ｋｂ）のＰＣＲ産物を分離し、そして１％（ｗ／ｖ）アガロース分取用ゲルから切り取り、そしてＱＩＡＧＥＮ’ｓＴＭGel Extraction キットを用いて単離した。次に、そのＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで３７℃において一晩消化し、そしてＱＩＡＧＥＮ’ｓＴＭＰＣＲクリーンアップキットを製造者の取扱説明書によって用いて再精製した。その哺乳動物発現ベクターｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡＴＭを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、Antarctic ホスファターゼＴＭを用いて脱リン酸し、そしてＱＩＡＧＥＮ’ｓＴＭＰＣＲクリーンアップキットを用いて単離した。ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩで消化したＰＣＲ産物（２μｌ）を、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡＴＭベクター（１μｌ）中に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢＴＭ）を製造者の取扱説明書にしたがって用いて連結した。化学的コンピテントＥ．coli 細胞を、１μｌの連結反応物で形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する Luria-Bertani（ＬＢ）寒天プレート上にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートして、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡで形質転換された明瞭な細菌コロニーを形成させた。個々のアンピシリン耐性細菌コロニーを選びとり、４ｍｌのＬＢブロス（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）中において３７℃で一晩増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを、MiniprepＴＭ（ＱＩＡＧＥＮＴＭ）によって製造者の取扱説明書にしたがって翌日に単離した。単離されたプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ＆ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ用いる二つの異なった制限消化反応により確認した。クローン４からの正しいプラスミドＤＮＡ（ｐＨＤ１０１．４と称する）を選択し、使用して、プラスミドＤＮＡの高レベル複製について上記のように、コンピテントＥ．coli 細胞を再度形質転換した。次に、ＬＢ寒天−アンピシリ���プレートからコロニーを選択し、そして２００ｍｌのＬＢブロス中において３７℃で一晩増殖させ、そしてプラスミドｐＨＤ１０１．４を、MaxiprepＴＭ（PromegaＴＭ）によって単離した。プラスミドｐＨＤ１０１．４（野生型ヒト GlcCerase ｃＤＮＡをコードしている）を、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして他の GlcCerase 酵素の構築および一過性トランスフェクション実験に用いた。
【００７２】
[0071] ＢｇｌＩＩ制限部位をプライマー１中に包含させたため、ＢｇｌＩＩで消化した GlcCerase ＰＣＲ産物の、ｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡＴＭベクターの適合するＢａｍＨＩ部位中への連結が、マルチプルクローニングサイト内のＢａｍＨＩ制限部位を除去したが、この改変発現ベクターを、以下、ｐＥＦ６’と称する。ｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＡＴＭ内のこのＢａｍＨＩ部位の除去は、GlcCerase ｃＤＮＡ内の唯一のＢａｍＨＩ部位を、特定のヌクレオチド置換を含むＤＮＡフラグメントを挿入するのに利用して、改変GlcCerase 酵素を作成することができるために必要であった。
【００７３】
[0072]GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ（ｐＨＤ１０５と称する）を作成するために、これらアミノ酸置換を含有する GlcCerase ミニジーンを、Integrated DNA TechnologiesＴＭによって、天然の隣接する５’ＢｓｒＧＩおよび３’ＢａｍＨＩ制限部位の間に合成した。その合成改変GlcCerase ＤＮＡフラグメント（約０．５ｋｂ）を、ｐＩＤＴＳＭＡＲＴＴＭプラスミドから、ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ制限消化によって遊離させた後、分取用１％アガロースゲルによって単離し、そしてＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩで予め消化し且つ脱リン酸したｐＨＤ１０１．４中にインフレームで連結した。１マイクロリットルのこの連結反応液を用いて、コンピテントＥ．coli 細胞を形質転換し、そしてその試料を、ｐＨＤ１０１について上記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン５（ｐＨＤ１０５．５と称する）を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。
【００７４】
[0073]GlcCerase−Ｋ３２１Ｎ（ｐＨＤ１０９と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップＰＣＲによって導入した。簡単にいうと、Ｎ末端フラグメント（約１．１ｋｂ）は、プライマーＡおよびＤならびに鋳型ＤＮＡとしてのｐＨＤ１０１．４をＰＣＲ反応１において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約０．５ｋｂ）は、プライマーＢおよびＣならびにｐＨＤ１０１．４鋳型をＰＣＲ反応２において用いて作成した。次に、Ｋ３２１Ｎ GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、ＰＣＲ反応３において、ＰＣＲ反応ＡおよびＢからの１μｌならびにプライマー１および２を加えることによって合成した。得られたＰＣＲ産物３（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物３を、再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に連結し、上記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン３（ｐＨＤ１０９．３と称する）を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。
【００７５】
[0074]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ（ｐＨＤ１１０と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップＰＣＲによって導入した。Ｎ末端フラグメント（約０．５５ｋｂ）は、プライマーＡおよびＦならびにｐＨＤ１０１．４鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応４において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約１ｋｂ）は、プライマーＢおよびＥならびにｐＨＤ１０１．４鋳型をＰＣＲ反応５において用いて作成した。Ｈ１４５Ｌ GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、ＰＣＲ反応６において、ＰＣＲ反応４および５からの１μｌならびにプライマーＡおよびＢを加えることによって作成した。得られたＰＣＲ産物６（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物６を、再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に連結し、前記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン２（ｐＨＤ１１０．２と称する）を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。
【００７６】
[0075]GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ（ｐＨＤ１１１と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップＰＣＲによって導入した。Ｎ末端フラグメント（約０．５５ｋｂ）は、プライマーＡおよびＨならびにｐＨＤ１０１．４鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応７において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約１ｋｂ）は、プライマーＢおよびＧならびにｐＨＤ１０１．４鋳型をＰＣＲ反応８において用いて作成した。Ｈ１４５Ｌ GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、ＰＣＲ反応９において、ＰＣＲ反応７および８からの１μｌならびにプライマーＡおよびＢを加えることによって作成した。得られたＰＣＲ産物９（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物９を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に連結し、前記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン１（ｐＨＤ１１１．１と称する）を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。
【００７７】
[0076]GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎ（ｐＨＤ１１２と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、ｐＨＤ１０５．５中にオーバーラップＰＣＲによって導入した。Ｎ末端フラグメント（約１．１ｋｂ）は、プライマーＡおよびＤならびにｐＨＤ１０５．５鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応１０において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約０．５ｋｂ）は、プライマーＢおよびＣならびにｐＨＤ１０５．５鋳型をＰＣＲ反応１１において用いて作成した。Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎ GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、ＰＣＲ反応１２において、ＰＣＲ反応１０および１１からの１μｌならびにプライマーＡおよびＢを加えることによって作成した。得られたＰＣＲ産物１２（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物１２を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に上記のように連結した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いた制限消化によって試験した。クローン７（ｐＨＤ１１２．７と称する）を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。
【００７８】
[0077]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ（ｐＨＤ１１３と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、ｐＨＤ１０５．５中にオーバーラップＰＣＲによって導入した。Ｎ末端フラグメント（約０．５５ｋｂ）は、プライマーＡおよびＦならびにｐＨＤ１０５．５鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応１３において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約１ｋｂ）は、プライマーＢおよびＥならびにｐＨＤ１０５．５鋳型をＰＣＲ反応１４において用いて作成した。Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、ＰＣＲ反応１５において、ＰＣＲ反応１３および１４からの１μｌならびにプライマーＡおよびＢを加えることによって作成した。得られたＰＣＲ産物１５（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物１５を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に前記のように連結した。
【００７９】
[0078]GlcCerase−Ｈ１４５Ｆ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ（ｐＨＤ１１４と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、ｐＨＤ１０５．５中にオーバーラップＰＣＲによって導入した。Ｎ末端フラグメント（約０．５５ｋｂ）は、プライマーＡおよびＨならびにｐＨＤ１０５．５鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応１６において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約１ｋｂ）は、プライマーＢおよびＧならびにｐＨＤ１０５．５鋳型をＰＣＲ反応１７において用いて作成した。Ｈ１４５Ｆ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ GlcCerase ｃＤＮＡ全体を、ＰＣＲ反応１８において、ＰＣＲ反応１６および１７からの１μｌならびにプライマーＡおよびＢを加えることによって作成した。得られたＰＣＲ産物１８（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物１８を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に前記のように連結した。
【００８０】
[0079]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ（ｐＨＤ１１５と称する）を作成するために、ｐＨＤ１０９．３およびｐＨＤ１１０．２双方を、ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、そしてｐＨＤ１０９．３からの約０．５ｋｂフラグメントおよびｐＨＤ１１０．２からの約６．９ｋｂフラグメント（Antarctic ホスファターゼでの処理後）を、分取用１％アガロースゲルによって単離した。次に、ｐＨＤ１０９．３からの約０．５ｋｂフラグメント（Ｋ３２１Ｎアミノ酸置換を含有）を、（Ｈ１４５Ｌ改変を含有する）プラスミドｐＨＤ１１０．２中にインフレームで連結し、前記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン５を選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。
【００８１】
[0080]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎ（ｐＨＤ１１６と称する）を作成するために、ｐＨＤ１１２．７およびｐＨＤ１１０．２双方を、ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、ｐＨＤ１１２．７からの約０．５ｋｂフラグメントおよびｐＨＤ１１０．２からの約６．９ｋｂフラグメント（Antarctic phosphataseＴＭで処理後）を、分取用１％アガロースゲルによって単離した。ｐＨＤ１１２．７からの約０．５ｋｂフラグメント（Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｎアミノ酸置換を含有）を、（Ｈ１４５Ｌ改変を含有する）プラスミドｐＨＤ１１０．２中にインフレームで連結し、前記のように処理する。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験して、正しい GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａ  ｃＤＮＡを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたＤＮＡコンストラクトを、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。
【００８２】
[0081]GlcCerase−Ｋ３２１Ａ（ｐＨＤ１１７と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップＰＣＲによって導入した。簡単にいうと、Ｎ末端フラグメント（約１．１ｋｂ）は、プライマーＡおよびＪならびに鋳型ＤＮＡとしてのｐＨＤ１０１．４をＰＣＲ反応１９において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約０．５ｋｂ）は、プライマーＢおよびＩならびにｐＨＤ１０１．４鋳型をＰＣＲ反応２０において用いて作成した。ＰＣＲ産物１９および２０を、分取用１％アガロースゲルによって単離し、鋳型ＤＮＡとして用いて、Ｋ３２１Ａ GlcCerase ｃＤＮＡフラグメント全体を、ＰＣＲ反応２１においてプライマーＡおよびＢを用いて合成した。得られたＰＣＲ産物２１（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物２１を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に連結し、上記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン１（ｐＨＤ１１７．１と称する）を選択し、更なる特性決定に用いた。
【００８３】
[0082]GlcCerase−Ｋ３２１Ｖ（ｐＨＤ１１８と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップＰＣＲによって導入した。簡単にいうと、Ｎ末端フラグメント（約１．１ｋｂ）は、プライマーＡおよびＬならびに鋳型ＤＮＡとしてのｐＨＤ１０１．４をＰＣＲ反応２２において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約０．５ｋｂ）は、プライマーＢおよびＫならびにｐＨＤ１０１．４鋳型をＰＣＲ反応２３において用いて作成した。ＰＣＲ産物２２および２３を、分取用１％アガロースゲルによって単離し、鋳型ＤＮＡとして用いて、Ｋ３２１Ａ GlcCerase ｃＤＮＡフラグメント全体を、ＰＣＲ反応２４においてプライマーＡおよびＢを用いて合成した。得られたＰＣＲ産物２４（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲ産物２４を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に連結し、上記のように処理した。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験した。クローン７（ｐＨＤ１１８．７と称する）を選択し、更なる特性決定に用いた。
【００８４】
[0083]GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａ（ｐＨＤ１１９と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、ｐＨＤ１０５．５中にオーバーラップＰＣＲによって導入する。Ｎ末端フラグメント（約１．１ｋｂ）は、プライマーＡおよびＪならびにｐＨＤ１０５．５鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応２５において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約０．５ｋｂ）は、プライマーＢおよびＩならびにｐＨＤ１０５．５鋳型をＰＣＲ反応２６において用いて作成する。ＰＣＲ産物２５および２６を、分取用１％アガロースゲルによって単離し、鋳型ＤＮＡとして用いて、Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａ／Ｋ３２１Ａ GlcCerase ｃＤＮＡフラグメント全体を、ＰＣＲ反応２７においてプライマーＡおよびＢを用いて合成する。得られたＰＣＲ産物２７（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化する。ＰＣＲ産物２７を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に上記のように連結する。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いた制限消化によって試験して、正しい GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａ  ｃＤＮＡを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたＤＮＡコンストラクトを、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。
【００８５】
[0084]GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｖ（ｐＨＤ１２０と称する）を作成するために、アミノ酸置換を、ｐＨＤ１０５．５中にオーバーラップＰＣＲによって導入する。Ｎ末端フラグメント（約１．１ｋｂ）は、プライマーＡおよびＬならびにｐＨＤ１０５．５鋳型ＤＮＡをＰＣＲ反応２８において用いることによって作成し、一方Ｃ末端フラグメント（約０．５ｋｂ）は、プライマーＢおよびＫならびにｐＨＤ１０５．５鋳型をＰＣＲ反応２９において用いて作成する。ＰＣＲ産物２８および２９を、分取用１％アガロースゲルによって単離し、鋳型ＤＮＡとして用いて、Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ａ／Ｋ３２１Ｖ GlcCerase ｃＤＮＡフラグメント全体を、ＰＣＲ反応３０においてプライマーＡおよびＢを用いて合成する。得られたＰＣＲ産物３０（約１．６ｋｂ）を、分取用１％アガロースゲルから前記のように単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化する。ＰＣＲ産物３０を再精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し且つ脱リン酸したｐＥＦ６’ベクター中に上記のように連結する。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いた制限消化によって試験して、正しい GlcCerase−Ｆ３１６Ａ／Ｌ３１７Ｆ／Ｋ３２１Ｖ  ｃＤＮＡを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたＤＮＡコンストラクトを、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。
【００８６】
[0085]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ａ（ｐＨＤ１２１と称する）を作成するために、ｐＨＤ１１７．１およびｐＨＤ１１０．２双方を、ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、そしてｐＨＤ１１７．１からの約０．５ｋｂフラグメントおよびｐＨＤ１１０．２からの約６．９ｋｂフラグメント（Antarctic phosphataseＴＭで処理後）を、分取用１％アガロースゲルによって単離する。ｐＨＤ１１７．１からの約０．５ｋｂフラグメント（Ｋ３２１Ａアミノ酸置換を含有）を、（Ｈ１４５Ｌ改変を含有する）プラスミドｐＨＤ１１０．２中にインフレームで連結し、前記のように処理する。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験して、正しい GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ａ  ｃＤＮＡを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたＤＮＡコンストラクトを、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。
【００８７】
[0086]GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｖ（ｐＨＤ１２２と称する）を作成するために、ｐＨＤ１１８．７およびｐＨＤ１１０．２双方を、ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、そしてｐＨＤ１１８．７からの約０．５ｋｂフラグメントおよびｐＨＤ１１０．２からの約６．９ｋｂフラグメント（Antarctic ホスファターゼで処理後）を、分取用１％アガロースゲルによって単離する。ｐＨＤ１１８．７からの約０．５ｋｂフラグメント（Ｋ３２１Ｖアミノ酸置換を含有）を、（Ｈ１４５Ｌ改変を含有する）プラスミドｐＨＤ１１０．２中にインフレームで連結し、前記のように処理する。Miniprep ＤＮＡを、個々のクローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの制限消化によって試験して、正しい GlcCerase−Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｖ  ｃＤＮＡを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたＤＮＡコンストラクトを、ＤＮＡ塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。
【００８８】
[0087]表３は、改変GlcCerase 酵素を構築することについて上に挙げたプライマー配列を要約する。
【００８９】
【表３】
2014500722.tif 000005
【００９０】
[0088]本発明を、その具体的な態様に関して記載してきたが、多くの他の変異および改変ならびに他の使用は、当業者に明らかである。したがって、本発明は、本明細書中の具体的な開示によってではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ説明されることが好適である。
【００９１】
配列
【００９２】
【化１】
2014500722.tif 000006
【００９３】
【化２】
2014500722.tif 000007
【００９４】
【化３】
2014500722.tif 000008
【００９５】
【化４】
2014500722.tif 000009
【００９６】
【化５】
2014500722.tif 000010
【００９７】
【化６】
2014500722.tif 000011
【００９８】
【化７】
2014500722.tif 000012
【００９９】
【化８】
2014500722.tif 000013
【図１】
2014500722.tif 000014
【図２】
2014500722.tif 000015
【図３】
2014500722.tif 000016
【配列表】
2014500722000001.app
【国際調査報告】
2014500722.tif 000017
2014500722.tif 000018
2014500722.tif 000019
2014500722.tif 000020
2014500722.tif 000021