(57)【要約】本発明は、アクセプターＤＮＡ、例えば二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変のための方法に関する。その方法は、標的（二重鎖）アクセプターＤＮＡに対して少なくとも１つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの使用を含む。ミスマッチは前記オリゴヌクレオチド内の特定の位置に位置する。本発明に係る方法を行うための指示書を含み、好ましい実施形態において、その方法の使用に適したオリゴヌクレオチドを含むキットもまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ＤＮＡ配列および前記第１ＤＮＡ配列の相補体である第２ＤＮＡ配列を含む二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の標的改変のための方法であって、前記方法は、
前記二重鎖アクセプターＤＮＡ配列をドナーオリゴヌクレオチドと併用する工程を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのドメインを含み、前記ドメインは、前記第１ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも１つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチは前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、方法。
【請求項２】
前記ドナーヌクレオチドが、ミスマッチを除いて前記第１ＤＮＡ配列に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、塩基修飾、３’および／または５’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの部分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾ヌクレオチドが、その相補的ヌクレオチドを有する天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧヌクレオチドと比べて高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第１ＤＮＡ配列中の反対の位置におけるヌクレオチドと相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して前記第１ＤＮＡ配列中の反対の位置においてヌクレオチドに強力に結合し、および／または前記修飾ヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドが、ＬＮＡまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ミスマッチが修飾ヌクレオチドではない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する少なくとも１つのミスマッチ由来の少なくとも１つのヌクレオチドであり、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチは前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記二重鎖アクセプターＤＮＡの改変は、好ましくは、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および／または胚細胞からなる群から選択される細胞内におけるものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記二重鎖アクセプターＤＮＡが、原核生物、細菌、真核生物、植物、動物、酵母、真菌、げっ歯類またはヒトから得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変が、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記二重鎖アクセプターＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、哺乳動物人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはエピソームＤＮＡ由来である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の標的改変のため、好ましくは、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するため、ミスマッチ修復のため、遺伝子変異を含む（植物）遺伝物質の標的改変のため、標的遺伝子修復のため、および遺伝子ノックアウトのための、請求項１〜１３のいずれか一項にオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変のための方法を行うための指示書を備える、キット。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法において使用するためのオリゴヌクレオチド、好ましくは、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドをさらに備える、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
第１ＤＮＡ配列および前記第１ＤＮＡ配列の相補体である第２ＤＮＡ配列を含む二重鎖アクセプターＤＮＡ配列と併用されるとき、前記オリゴヌクレオチドが、前記第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるドメインを含み、前記ドメインが、前記第１ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのミスマッチ、好ましくは１つのミスマッチを含み、前記少なくとも１つのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチが前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、請求項１５または１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクセプターＤＮＡ、例えば、二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）のための方法に関する。その方法は、標的（二重鎖）アクセプターＤＮＡに対して少なくとも１つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの使用を含む。ミスマッチは前記オリゴヌクレオチド内の特定の位置に配置される。本発明に係る方法を行うための指示書、および好ましい実施形態ではその方法における使用に適したオリゴヌクレオチドを備えるキットも提供される。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えは、生細胞の遺伝物質を故意に変化させるプロセスである。その目的は、その細胞の、またはその細胞が一部を形成している生物もしくはその細胞が再生し得る生物の遺伝的にコードされている生物学的特性を改変することであることが多い。これらの変更は、遺伝物質の一部の欠失、外来性遺伝物質の付加、または遺伝物質の既存のヌクレオチド配列の変更（例えば、１つのヌクレオチドを別のものに対して置換することによる変更）の形をとることができる。
【０００３】
真核生物の遺伝子組換えの方法は、２０年以上にわたって知られており、農業、人間の健康、食品の品質および環境保護の分野における改良のために、植物、ヒトおよび動物の細胞ならびに微生物において幅広く適用されることが見出されている。
【０００４】
通常の遺伝子組換え法は、細胞のゲノムに外来性ＤＮＡフラグメントを付加することからなり、それにより、すでに既存の遺伝子によってコードされている特性を超えた新しい特性（それによって既存の遺伝子の発現を抑制する用途を含む）がその細胞または生物に付与されることがある。
【０００５】
これらの方法は、標的に所望の特性を提供する際にいくらかの有効性を有し得るが、それにもかかわらず、これらの方法は、まったく正確でない。例えば、外来性ＤＮＡフラグメントが挿入されるゲノムの位置（およびゆえに最終的な発現レベル）を制御できない。さらに、所望の効果は、元のバランスのとれたゲノムによってコードされる天然の特性を超えて表れなければならない。反対に、所定のゲノム遺伝子座においてヌクレオチドの付加、欠失または変換をもたらす遺伝子組換えの方法は、既存の遺伝子の正確かつ制御可能な改変を可能にする。
【０００６】
オリゴヌクレオチド特異的（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）標的ヌクレオチド交換（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ）（ＴＮＥ）は、真核細胞への（合成）オリゴヌクレオチド（短い一続きのヌクレオチド、および／またはそのワトソン−クリック塩基対形成特性がＤＮＡに似ているがＤＮＡとは化学的に異なる場合があるヌクレオチド様部分からなる分子；Ａｌｅｘｅｅｖ  ａｎｄ  Ｙｏｏｎ，１９９８；Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｍｉｅｃ，２００３）の送達に基づく方法である。
【０００７】
オリゴヌクレオチドの相同配列にミスマッチヌクレオチドを計画的にデザインすることによって、そのミスマッチヌクレオチドは、そのヌクレオチドがハイブリダイズし得るゲノムＤＮＡ配列に変更を誘導し得る。この方法は、標的中の１つ以上のヌクレオチドの変換を可能にし、例えば、この方法を適用することにより、既存の遺伝子の中に終止コドンが作製されてその遺伝子の機能が破壊され得るか、またはコドンが変更されてアミノ酸組成が変化したタンパク質をコードする遺伝子が生じ得る（タンパク質工学）。
【０００８】
標的ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）は、植物、動物および酵母細胞をはじめとした多くの生物において報告されており、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（ＯＤＭ）とも称される。
【０００９】
キメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用したＴＮＥの第１の例は、動物細胞によってもたらされた（Ｉｇｏｕｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に概説）。キメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用したＴＮＥは、植物細胞でも実証されている（Ｂｅｅｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｏｃｈｅｖｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，２００３；Ｏｋｕｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｔｏｒｉｙａｍａ，２００４；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。概して、植物と動物の両方の研究において報告された頻度は、選択可能でない染色体遺伝子座にＴＮＥを実際に適用するには低すぎた。キメラオリゴヌクレオチドを使用したＴＮＥは、再現が困難であるとも見出された（Ｒｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）ことから、より信頼できる結果をもたらす代替のオリゴヌクレオチドデザインが捜し求められた。
【００１０】
いくつかの研究室は、ＴＮＥのために一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドを使用することに注目した。これらは、植物細胞と動物細胞の両方においてより再現性のある結果をもたらすと見出された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかしながら、特に植物などの高等生物の細胞においてＴＮＥを適用する際に直面する最も大きな問題のせいで、従来報告されている相対的に低い効率のままである。トウモロコシでは、１×１０−４という変換頻度が報告された（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。その後のタバコ（Ｋｏｃｈｅｖｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，２００３）およびイネ（Ｏｋｕｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｔｏｒｉｙａｍａ，２００４）での研究は、それぞれ１×１０−６および１×１０−４という頻度を報告した。
【００１１】
様々なタイプのオリゴヌクレオチドを使用するＴＮＥが、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文献９を含む様々な特許および特許出願の主題である。
【００１２】
特許文献１では、無修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて得られる遺伝子改変の低効率が、反応混合物または標的細胞に存在するヌクレアーゼによるドナーオリゴヌクレオチドの分解の結果であると企図されている。得られるオリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼに対する（より大きな）抵抗性を付与する修飾ヌクレオチドを組み込むことが提唱されている。これらの修飾は、好ましくはそのオリゴヌクレオチドの末端に配置されると開示されているのに対し、ミスマッチは、各末端から少なくとも８ヌクレオチドに存在する。
【００１３】
特許文献２では、ヌクレアーゼ抵抗性の少なくとも１つの改変された末端領域を有する一本鎖修飾オリゴヌクレオチドを使用した、標的染色体ゲノム改変（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）のための方法も開示されている。一本鎖修飾オリゴヌクレオチドを使用したＴＮＥは、特許文献１０の主題でもある。
【００１４】
現在のＴＮＥの方法が低効率であるせいで、代替および／またはより良いＴＮＥ法が未だ必要とされている。これらは、単独でまたは既存のＴＮＥ法（上でおよび当該分野で開示されたものなど）と組み合わせて使用することにより、効率を改善することができる。したがって、本発明者らは、既存のＴＮＥ技術を改善しようと試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６９３６４６７号明細書
【特許文献２】米国特許第７２２６７８５号明細書
【特許文献３】米国特許第５７９５９７号明細書
【特許文献４】米国特許第６１３６６０１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１６３８４９号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／０２３６２０８号明細書
【特許文献７】国際公開第０３／０１３２２６号
【特許文献８】米国特許第５５９４１２１号明細書
【特許文献９】国際公開第０１／９２５１２号
【特許文献１０】国際公開第０２／２６９６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
当該分野において明確にされている技術的課題は、細胞内において特定のおよび所望の遺伝的変更を導入するために、例えば、植物細胞内に存在するゲノムに特定の遺伝的変更を導入するために現在利用可能な方法が、低効率によって妨害されており、その手法が面倒かつ高価になっている点である。代替のおよびより良いＴＮＥ法を得る必要がある。
【００１７】
ゆえに、解決すべき課題の１つは、細胞に存在するような遺伝情報、特に二重鎖ＤＮＡ配列に遺伝的変更を導入するための、代替のおよび／またはより良いおよび／またはさらなる方法を提供することである。好ましくは、そのような方法は、当該分野において報告されている効率と比較して向上した効率を有する。そのような方法は、遺伝情報が変更された細胞の提供、より詳細には、標的ＤＮＡに改変を導入することによって細胞の機能が変更された細胞の提供を可能にするだろう。そのような機能は、例えば、本発明に係る方法によって変更されたＤＮＡを含むＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の変更された特性に関するものであり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、二重鎖ＤＮＡ配列の標的改変のための新規の方法を見出した。その方法は、標的にハイブリダイズすることができる（当業者に公知であるような、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下において）ドメインを含むドナーオリゴヌクレオチドを使用する。そのドナーヌクレオチドは、標的二重鎖ＤＮＡ配列と比較して少なくとも１つのミスマッチをさらに含み、そのミスマッチは、標的二重鎖ＤＮＡ配列に導入されるものである。
【００１９】
当該分野において、オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、そのオリゴヌクレオチド内に、換言すれば、そのオリゴヌクレオチドの「中央のどこか」に存在すべきであることは、提唱されている通常の知識である（例えば、上で論じた様々な特許出願、特に、米国特許第６９３６４６７号明細書および同第７２２６７８５号明細書を参照のこと）が、現在、驚いたことに、かつ予想外にも、ミスマッチが、そのオリゴヌクレオチドの中央のどこかでなく特定の位置に配置されるとき、ＴＮＥが良好な効率で行われ得ることが見出された。特に、効率的なＴＮＥのためには、ミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに配置されるべきであることが見出された。最も好ましくは、少なくとも１つのミスマッチは、（ｓｓ）オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。
【００２０】
いずれのミスマッチもオリゴヌクレオチドの中央部分に存在すべきであり、例えば、ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの成熟前の分解を防止するためにオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端における修飾が導入されるべきであるという通常の考えとは対照的に（例えば、米国特許第６９３６４６７号明細書を参照のこと）、オリゴヌクレオチドにおいて３’末端から０、１または最大でも２ヌクレオチドにミスマッチを有することによって、標的ヌクレオチド交換の方法、すなわち、二重鎖ＤＮＡ配列の標的改変のための方法において有益に使用できるオリゴヌクレオチドが提供されることが見出された。
【００２１】
さらに、３’末端から０、１または最大でも２ヌクレオチドに少なくとも１つのミスマッチを含むオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、すなわち、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾、ならびに／または前記ヌクレオチドの３’末端および／もしくは５’末端における修飾を有するヌクレオチドを含めることによってさらに改変され得る。これらの修飾には、オリゴヌクレオチドと標的配列との結合／ハイブリダイゼーションを改善する、および／またはいわゆるヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの分解を妨害するかもしくは阻害する、周知の修飾が含まれる。そのような修飾ヌクレオチドの例としては、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸、またはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、実施例３に示されるように、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを組み込むことを必要とされないし、他の任意のタイプの修飾ヌクレオチドが組み込まれることも必要とされない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】終止コドンを含むＧＦＰ  ＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】ＧＦＰ−ＳＴＯＰタンパク質のアミノ酸配列を示し、終止コドンの位置は、アスタリスクで表されている（配列番号２）。
【図３】本研究において使用される構築物の概略図である。
【図４】少なくとも３つの独立した実験において試験した異なるオリゴヌクレオチドによるエピソームＧＦＰの修復を示す。
【図５】ＹＦＰ−ＳＴＯＰ構築物のヌクレオチド配列を示している。１８６位のヌクレオチドが（ＣからＡに）変化されており、それにより、インフレームの終止コドン（配列番号３）が生じている。
【図６】ＹＦＰ−ＳＴＯＰのタンパク質配列を示している。このタンパク質の終止コドンの位置は、アスタリスクで示されている（配列番号４）。
【図７】トマトプロトプラストにおけるエピソームＹＦＰプラスミド上でのＴＮＥを示す。７４６０は単に野生型ＹＦＰ遺伝子を使用した形質転換効率を示す。７４６１＋ＰＢ２１２は、３５Ｓ  ＹＦＰ−ＳＴＯＰ構築物がオリゴヌクレオチドＰＢ２１２と一緒にトマトプロトプラスト内に同時に組み込まれたときの修復効率を示す。
【図８】本発明に係るオリゴヌクレオチドを示し、ＰＳ結合のような修飾がなくてもＴＮＥ効率を増加させる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
以下の説明および実施例では、いくつかの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む明細書および請求項の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書中で別段定義されない限り、使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２４】
本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、上で使用されたような「ａ」ＤＮＡ分子を単離するための方法は、複数の分子（例えば、１０個、１００個、１０００個、１万個、１０万個、１００万個またはそれ以上の分子）を単離することを含む。特に、本明細書中に記載される本発明は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの使用を利用する。
【００２５】
本発明の方法において使用される従来の手法を行う方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定および関連分野における従来の手法の実施は、当業者に周知であり、例えば、以下の参考文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的な最新版；ならびに連続出版物のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏで論じられている。
【００２６】
本発明に係る核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくは、それぞれ、シトシン、チミンおよびウラシルならびにアデニンおよびグアニンの任意のポリマーまたはオリゴマーを含み得る（Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ  ７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．１９８２）（その全体が、すべての目的のために本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分、およびそれらの任意の化学的バリアント（例えば、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化またはグリコシル化された形態など）を企図する。それらのポリマーまたはオリゴマーは、組成が不均一であっても均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）であってもよく、天然に存在する起源から単離されてもよいし、人工的または合成的に生成されてもよい。さらに、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその混合物であり得、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリッド状態を含む一本鎖または二本鎖の形態で永久にまたは一時的に存在し得る。
【００２７】
（合成）オリゴヌクレオチド：化学的に合成することができる好ましくは約５〜約１５０塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドと称される。一般に、これらの合成ＤＮＡ分子は、独特のまたは所望のヌクレオチド配列を有するようにデザインされるが、関連する配列を有しかつそのヌクレオチド配列内の特定の位置に異なるヌクレオチド組成を有する分子のファミリーを合成することが可能である。合成オリゴヌクレオチドという用語は、計画的なまたは所望のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子のことを指すために使用される。
【００２８】
「標的ヌクレオチド交換」または「ＴＮＥ」。標的ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）は、染色体またはエピソームの遺伝子中の部位と少なくとも部分的に相補的な合成オリゴヌクレオチドが、特定の部位のヌクレオチドの変換を指示するプロセスである。多種多様のオリゴヌクレオチドおよび標的を使用したＴＮＥが報告されている。その報告されているオリゴヌクレオチドのいくつかは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラであり、ヌクレアーゼ抵抗性を付与する末端修飾を含む。
【００２９】
実施形態の説明
１つの態様において、本発明は、二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の標的改変のための方法に関する。
【００３０】
その方法は、二重鎖アクセプターＤＮＡ配列をドナーオリゴヌクレオチドと併用する（ｃｏｍｂｉｎｅ）工程を包含する。オリゴヌクレオチドは、（当業者に公知であるようなハイブリダイゼーションを可能にする条件下で）第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるドメインを含む。第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズできるドメインは、第１ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのミスマッチを含む。前記少なくとも１つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する。最も好ましくは、前記少なくとも１つのミスマッチはオリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。
【００３１】
本発明に係る方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドによってアクセプターＤＮＡ配列の特定部位における１つ以上のヌクレオチドの特異的かつ選択的な改変を可能にする。特に、標的改変は、本発明に係る、すなわち第１ＤＮＡ配列と比較して少なくとも１つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの細胞に導入することによって、二重鎖アクセプターＤＮＡ配列を含む標的細胞内で行うことができ、前記少なくとも１つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する。最も好ましくは、前記少なくとも１つのミスマッチはオリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。本方法の結果は、標的ＤＮＡ配列の配列が改変されるような、１つ以上のヌクレオチドの標的改変である。本発明は、好ましくは、インビボで行われ得るが、エキソビボまたはインビトロでも行われ得る。
【００３２】
本発明の文脈において、二重鎖ＤＮＡ配列は、第１ＤＮＡ配列および第２ＤＮＡ配列を含む。第２ＤＮＡ配列は、第１ＤＮＡ配列の相補体であり、第１ＤＮＡ配列と対形成することにより、その二重鎖を形成する。例えば、第１ＤＮＡ配列ＡＴＴＴ（５’から３’方向）の相補体は、ＴＡＡＡ（３’から５’方向）である。この第２ＤＮＡ配列は、第１ＤＮＡ配列と対形成することにより、二重鎖を形成する。二重鎖ＤＮＡ配列が、例えば、遺伝子の一部である場合、第１ＤＮＡ配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖に存在し得る。
【００３３】
二重鎖ＤＮＡ配列のＤＮＡは、任意のタイプのＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラＤＮＡ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、プラスミドＤＮＡ、エピソームＤＮＡ）であってよい。そのＤＮＡ配列は、イントロンまたはエキソンの一部、コーティングまたは非コーティング、発現を制御するかまたはしないものであり得る。
【００３４】
本明細書中に開示される方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、一本鎖であり、第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのドメインを含む。二重鎖ＤＮＡ配列に対する少なくとも１つのミスマッチは改変され、そのミスマッチは、オリゴヌクレオチドの３’末端から０、１または２ヌクレオチドに位置し、ドメインに直接隣接する第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるドメイン内に含まれる。
【００３５】
したがって、少なくとも１つのドメインは、改変される二重鎖ＤＮＡ配列に対する少なくとも１つのミスマッチを含み得るか、またはそのミスマッチのすぐ隣りである／そのミスマッチに直接隣接する。換言すれば、そのオリゴヌクレオチドは、その実験の条件下でその二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の第１ＤＮＡ配列とハイブリダイズでき、かつ前記第１ＤＮＡ配列に対するミスマッチを含む、隣り合ったヌクレオチドからなるドメインを含むか、またはそのミスマッチは、前記ドメインのすぐ隣に位置する（ここで、そのミスマッチは、そのオリゴヌクレオチドの３’末端から０、１または２ヌクレオチドに位置する）。
【００３６】
例えば、上記ドメインが、（５’から３’方向で）３’末端から３ヌクレオチドまで位置する場合、ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの３’末端から２ヌクレオチドのドメインのすぐ隣りであり得る。
【００３７】
例えば、上記ドメインが、（５’から３’方向で）３’末端から１ヌクレオチドまで位置する場合、ミスマッチは、ドメイン内に含められ得る（例えば、３’末端から２ヌクレオチドに配置され得る）か、またはドメインに直接隣接し得る（すなわち、３’末端から０ヌクレオチドに配置され得る、換言すれば、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在し得る）。
【００３８】
本発明の文脈において、およびミスマッチ、または第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるドメインに含まれるミスマッチに対して言及される場合に、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端から２、１または０ヌクレオチドに位置する限り、これらには、そのドメインに含まれるかまたはそのドメインに直接隣接して位置する任意のミスマッチが含まれることが当業者によって理解されるべきである。
【００３９】
ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、好ましくは２つ以上のミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、２つ以上の変異が、同時にまたは連続的に標的ＤＮＡに導入され得る。上記オリゴヌクレオチドは、その内部に２つ以上のミスマッチを隣接してまたはオリゴヌクレオチド上の離れた位置に含み得る。ある特定の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、隣接していてもよいかまたは離れていてもよい（すなわち、隣接していなくてよい）２、３、４個またはそれ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。そのオリゴヌクレオチドは、その内部にミスマッチを含むさらなるドメインを含み得る。それらのミスマッチは、同じドメインに存在してもよいし、異なるドメインに存在してもよい。
【００４０】
本発明に係るオリゴヌクレオチドが、非ハイブリダイズ部分、換言すれば、第１ＤＮＡ配列とハイブリダイズしない隣り合ったヌクレオチドをさらに含み得ることが、当業者によって理解されるだろう（例えば、これらの部分が、第１ＤＮＡ配列中のいずれの配列とも相補的でないとき）。
【００４１】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、かつ変更される二重鎖ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのミスマッチ、好ましくは１つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接する、１つのドメインを含む。そのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは、原則として、第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる２つ以上のドメインを含み得るが、しかしながら、それらのドメインのうちの１つだけが、本明細書中に開示されるような少なくとも１つのミスマッチ（または１つのミスマッチ）を含み得るか、またはそのミスマッチに直接隣接し得る。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡにハイブリダイズできるただ１つのドメインを含む。そのようなドメインは、オリゴヌクレオチドの３’末端付近または３’末端に位置し、ミスマッチを含むか、またはミスマッチに直接隣接する。
【００４２】
本明細書中に開示される方法においてドナーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、様々な長さであり得るが、通常、その長さは、１０〜５００ヌクレオチド、好ましくは、１１〜１００ヌクレオチド、好ましくは、１５〜９０、より好ましくは、２０〜７０の間で変動し得る。
【００４３】
上記ドメインは、ミスマッチを含む少なくとも５ヌクレオチドからなり得るが、ミスマッチを含むそのオリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドからもなり得る。ミスマッチが上記ドメインに直接隣接する場合、そのドメインは、少なくとも５ヌクレオチドからなり得るが、ミスマッチを除いて、そのオリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドからもなり得る。上記オリゴヌクレオチド中のドメインは、通常、ほぼ少なくとも５、１０、好ましくは、１５、２０、２５または３０ヌクレオチドである。
【００４４】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する少なくとも１つのミスマッチを含む。最も好ましくは、前記（少なくとも１つの）ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。当業者は、３’末端という用語が包含するものを理解する。一本鎖非環状ＤＮＡ分子は、２つの末端である３’末端および５’末端（「３プライム末端」および「５プライム末端」とも称される）を有する。
【００４５】
一本鎖核酸の５’末端は、Ｃ−５炭素原子が糖−リン酸骨格の末端の炭素原子を形成している特定のヌクレオチドを明示する。Ｃ−５炭素原子は、ホスホジエステル結合によってリン酸基に連結されていてもよいし、されていなくてもよいが、このリン酸基は、その後、別のヌクレオチドといずれの結合も形成しない。一本鎖核酸の３’末端は、リン酸ジエステル結合を用いるかその他を用いるかを問わず、Ｃ−３炭素原子が他のいずれのヌクレオチドとも連結しない特定のヌクレオチドを明示する。Ｃ−５原子は、フラノース環の酸素と核酸塩基の両方に直接隣接するＣ原子から数え始めて、リボースまたはデオキシリボース分子の５番目の炭素原子であり、フラノース環の一部を形成しない。Ｃ−３原子は、フラノース環の酸素と核酸塩基の両方に直接隣接するＣ原子である１から数え始めて、リボースまたはデオキシリボース分子の３番目の炭素原子であり、フラノース環の一部を形成する。
【００４６】
用語「３’末端から２ヌクレオチドに位置するミスマッチ」は、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドから２ヌクレオチドに存在することを指し示す。用語「３’末端から１ヌクレオチドに位置するミスマッチ」は、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドから１ヌクレオチドに存在することを指し示す。用語「３’末端から０ヌクレオチドに位置するミスマッチ」は、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドであることを指し示す。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明に係る方法に使用されるドナーオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのミスマッチを除いて、例えばオリゴヌクレオチドにおける１つ、２つ、３つもしくは４つのミスマッチを除いて第１ＤＮＡ配列に相補的である。
【００４８】
特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する１つのミスマッチを除いてオリゴヌクレオチドの全長にわたって第１ＤＮＡ配列に相補的であり、最も好ましくは前記ミスマッチはオリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ミスマッチの位置（３’末端から２、１または０ヌクレオチドに配置される）までオリゴヌクレオチドの全長にわたって第１ＤＮＡ配列に（５’から３’方向で）相補的である。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明に係る方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、塩基修飾、３’および／または５’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾を有する少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む少なくとも１つの部分を含む。
【００５０】
塩基修飾、３’および／もしくは５’末端塩基修飾、骨格修飾ならびに／または糖修飾は、オリゴヌクレオチドと標的配列との（結合／ハイブリダイゼーション）親和性を高めるため、および、独立してまたはさらに、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるために、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。しかしながら、実施例３に示されるように、オリゴヌクレオチドは、いずれの修飾ヌクレオチドも組み込む必要はない。
【００５１】
本発明に係る方法における使用に適したオリゴヌクレオチドを提供する（および前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、少なくとも１つのミスマッチを含む）オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの任意の修飾が、有益に使用され得る。修飾は、天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇヌクレオチドのうちのいずれか１つに対するものであることが当業者によって理解されるだろう。
【００５２】
有益なことに、本発明にとって必須ではないが、本発明に係る方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含んでもよく、その修飾オリゴヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める。これらの修飾としては、塩基修飾、骨格修飾および／または糖修飾が挙げられ得る。通常、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるそのような修飾ヌクレオチドは、細胞環境においてオリゴヌクレオチドの安定性を高める場合があり、それにより、標的ヌクレオチド交換が改善される場合がある。好ましくは、本発明の方法に従って使用するためオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも８個の修飾ヌクレオチドを含む。あるいはまたは同時に、本発明の方法に従って使用するためのオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める最大でも２５個、好ましくは最大でも２０個、より好ましくは最大でも１５個、最も好ましくは最大でも１０個の修飾ヌクレオチドを含む。そのような修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意の位置、好ましくは、オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端から、２０ヌクレオチド以内、好ましくは１５ヌクレオチド以内、より好ましくは１０ヌクレオチド以内、なおもより好ましくは８ヌクレオチド以内、なおもより好ましくは６ヌクレオチド以内、最も好ましくは、３’末端の最後のヌクレオチドおよび／または５’末端の最後のヌクレオチドに位置し得る。標的ＤＮＡ配列に組み込まれるミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端から０、１または最大でも２ヌクレオチドに位置するとき、そのような修飾ヌクレオチドが、細胞ヌクレアーゼから３’側を保護するがゆえに、オリゴヌクレオチドの３’末端に（例えば、３’末端から２０、１５、１０、９、８、７、６または４ヌクレオチド以内に）位置することが特に好ましい。しかしながら、先に記載したように、かつ実施例３に示されるように、実際には、オリゴヌクレオチドが、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める修飾ヌクレオチドを含むことは、本発明にとって必須ではない。
【００５３】
天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高め、本発明に係る方法において使用するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る、そのような様々な修飾ヌクレオチドが本明細書中で述べられる。そのような修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドであり得るが、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、または非リン酸のヌクレオチド間結合を有するヌクレオチド（例えば、カーボネート、カルバメート、シロキサン、スルホンアミドおよびポリアミド核酸）でもあり得る。また、国際公開第０２２６９６７号に記載されているような細胞ヌクレアーゼ抵抗性を付与する、ＬＮＡ（ロックト核酸）などの修飾ヌクレオチド、または当業者に公知であるような、オリゴヌクレオチドの細胞ヌクレアーゼ抵抗性を改善する他の任意の修飾ヌクレオチドを使用してもよい。
【００５４】
あるいは、または上に記載されたヌクレアーゼ抵抗性を付与する修飾ヌクレオチドに加えて、本発明に係る方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて、標的ＤＮＡ配列に対してより高い結合親和性を有する修飾ヌクレオチドを含み得る。これらの修飾としては、塩基修飾、骨格修飾および／または糖修飾が挙げられ得る。通常、高い結合親和性を有するそのような修飾ヌクレオチドは、標的配列とのより強い塩基対形成をもたらし、それによって、オリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリッドの安定性が高まる場合があり、これは、標的ヌクレオチド交換を改善すると考えられている。好ましくは、本発明の方法に従って使用するためのオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて、標的ＤＮＡ配列に対してより高い結合親和性を有する、少なくとも１〜１０個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個、なおもより好ましくは１〜４個（例えば、１、２、３または４個）、なおもより好ましくは２個の修飾ヌクレオチドを含む。上で述べたような修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意に位置に、好ましくは、ミスマッチから１ヌクレオチド離れた位置、好ましくは、ミスマッチから最大でも２、３、４、５、６または７ヌクレオチド離れた位置に位置し得る。好ましくは、そのような修飾ヌクレオチドは、ミスマッチの５’側に配置されるが、ミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端の最後のヌクレオチドに位置しない場合、そのような修飾ヌクレオチドをミスマッチの３’側に位置することが選択されてもよい。
【００５５】
天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて標的ＤＮＡ配列に対してより高い結合親和性を有し、本発明に係る方法において使用するためのオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る、そのような修飾ヌクレオチドの様々な例が、本明細書中で述べられ、その修飾ヌクレオチドとしては、２−ＯＭｅ置換、ＬＮＡ（ロックト核酸）、リボヌクレオチド、ｓｕｐｅｒＡ、ｓｕｐｅｒＴ、または天然に存在するＡ、Ｔ、ＣおよびＧヌクレオチドと比べて標的ＤＮＡ配列に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を改善する当業者に公知であるような他の任意のタイプの修飾ヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
修飾ヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃヌクレオチドと比べて細胞ヌクレアーゼに対して高い抵抗性を付与するか否かの判定は、例えば、トマト抽出物、トマト細胞またはＥ．ｃｏｌｉに存在するような、細胞ヌクレアーゼの存在下において、例えば、前記修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの半減期を、前記修飾ヌクレオチドを有しないオリゴヌクレオチドと比較することによって、行われ得る。第１に述べたものの半減期のほうが長い場合、前記修飾ヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対する高い抵抗性を付与する。修飾ヌクレオチドが、天然に存在するＡ、Ｔ、ＣまたはＧヌクレオチドと比べて標的ＤＮＡ配列に対して高い結合親和性を付与するか否かの判定は、例えば、前記修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドとその標的との間で形成される二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を、前記修飾ヌクレオチドを有しないオリゴヌクレオチドとその標的とによって形成される二重鎖と比較することによって、行われ得る。第１に述べたものの融解温度のほうが高い場合、前記修飾ヌクレオチドは、天然に存在するＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃヌクレオチドと比べて、標的ＤＮＡ配列に対してより高い結合親和性を付与する。
【００５７】
本発明に係る部分は、オリゴヌクレオチドの任意の一部であり、少なくとも１ヌクレオチドの長さを有すると理解されるべきである。例えば、ある部分は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４、より好ましくは１〜２ヌクレオチドを含み、ミスマッチの３’側および／または５’側に位置し得る。少なくとも１つの部分は、本発明に係るドメインの一部であり得る；換言すれば、その部分は、第１ＤＮＡ配列とハイブリダイズできるドメイン内に存在し得る。あるいは、その部分は、完全にまたは部分的にドメインと重複し得る。完全に重複する場合、その部分は、同じ長さのドメインを有し得るが、ドメインの長さを超える長さを有する場合もある。部分的に重複する場合、そのドメインとその部分とは、少なくとも１つのヌクレオチドを共有する。
【００５８】
オリゴヌクレオチドにおいて使用される修飾のタイプに応じて、第１ＤＮＡ配列とハイブリダイズできるドメインの一部となる修飾ヌクレオチドに優先度が存在する場合がある（そのドメインは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、少なくとも１つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接する）。これは、特に、天然に存在するＡ、Ｃ、ＴまたはＧヌクレオチドと比べて、その相補的なヌクレオチドに対してより高い結合親和性を有する修飾ヌクレオチドの場合である。
【００５９】
塩基修飾としては、例えば、国際公開第０２２６９６７号に記載されているような修飾（ピリミジンのＣ−５位の修飾（例えば、２’−デオキシウリジン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジンおよび５−メチル−２’−デオキシシチジン）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。他の塩基修飾としては、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような合成および天然の核酸塩基が挙げられる。
【００６０】
末端（３’および／または５’）修飾としては、２’−Ｏ−メチル塩基、３’アミン基、ホスホロチオエート結合、またはヌクレアーゼ抵抗性である他の任意の修飾が挙げられ得る。当業者は、これらの種類の修飾を十分に承知している。ヌクレアーゼに対する抵抗性を提供することによって、標的ヌクレオチド交換がさらに改善されると考えられている。
【００６１】
様々な骨格修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイトおよびメチルホスホネートを含む、国際公開第０２２６９６７号で述べられているもの）、および非リン酸のヌクレオチド間結合を有するもの（例えば、カーボネート、カルバメート、シロキサン、スルホンアミドおよびポリアミド核酸）は、細胞ヌクレアーゼに対する抵抗性を高める。ゆえに、そのような骨格修飾は、本発明に係る方法において使用されるオリゴヌクレオチドにおいて有用である。
【００６２】
さらに、糖修飾（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロまたは２’−メトキシエトキシを含むがこれらに限定されない）は、形成された二重鎖の熱力学的安定性を高めることができ、同時に、ヌクレアーゼ抵抗性を改善することができる。
【００６３】
好適な修飾の他の例は、国際公開第２００７０７３１４９号に記載されている。ドナーオリゴヌクレオチドの修飾は、例えば、ホスホロチオエート結合、２−ＯＭｅ置換、ＬＮＡ（ロックト核酸）の使用、リボヌクレオチド、ならびに標的ＤＮＡに対する親和性結合の改善もしくはヌクレアーゼ活性の阻害またはその両方によってオリゴヌクレオチドとアクセプター鎖とのハイブリッドの安定性を改変するおよび好ましくは増強する他の塩基を含み得る。
【００６４】
これらのすべてのタイプの修飾が、当業者に周知であり、様々な商業的供給源から容易に入手可能である。
【００６５】
ある実施形態において、修飾ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれ、修飾ヌクレオチドが、その相補的なヌクレオチドに対して天然に存在するＡ、Ｃ、ＴまたはＧヌクレオチドよりも高い結合親和性を有し、修飾ヌクレオチドが、第１ＤＮＡ配列中の向かい側の位置のヌクレオチドに相補的な天然に存在するヌクレオチドと比べて第１ＤＮＡ配列中の向かい側の位置のヌクレオチドにより強く結合し、かつ／または修飾ヌクレオチドが、ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドである、本発明に係る方法が提供される。
【００６６】
好ましくは、上記修飾は、塩基修飾、３’末端および／もしくは５’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾である。上で論じられたように、本発明に係るドナーオリゴヌクレオチドは、そのドナーが、標的ＤＮＡ鎖に対して高い親和性を示し、それにより、そのドナーが容易に挿入され得るようにおよび／または形成された二重鎖の熱力学的安定性を高めるように（同じ実験環境下で、そのような修飾を含まない同じオリゴヌクレオチドと比較して）、ハイブリダイゼーション特性を改善する修飾を含み得る。ドナーオリゴヌクレオチドは、独立してまたはさらに、ヌクレアーゼに対してより抵抗性になって二重鎖構造を安定化し得るように改変され得る。
【００６７】
従来技術では、相補的なヌクレオチドに対して天然に存在するＡ、Ｃ、ＴまたはＧヌクレオチドよりも高い結合親和性を有する多種多様の修飾ヌクレオチド（その修飾ヌクレオチドは、第１ＤＮＡ配列中の向かい側の位置のヌクレオチドに相補的な天然に存在するヌクレオチドと比べて第１ＤＮＡ配列中の向かい側の位置のヌクレオチドにより強く結合し、かつ／または修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドである）が報告されている（例えば、国際公開第２００７０７３１５４号および上で論じられた様々な修飾を参照のこと）。
【００６８】
ある特定の実施形態において、修飾は、ミスマッチから１ヌクレオチド離れた位置、好ましくは、ミスマッチから２、３、４、５、６または７ヌクレオチド離れた位置に存在する。ある特定の実施形態において、修飾は、ミスマッチの下流の位置に配置される。ある特定の実施形態において、修飾は、ミスマッチの上流の位置に配置される。
【００６９】
ミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接するドメインと、修飾ヌクレオチドを含む部分とは、重複していることがある。したがって、ある特定の実施形態では、ミスマッチを含むかまたはミスマッチに直接隣接するドメインは、修飾が考慮される部分とは異なるオリゴヌクレオチド上の位置に配置される。ある特定の実施形態では、そのドメインは、１つ以上の部分を組み込んでいる。ある特定の実施形態では、部分が、ドメインを組み込むことができる。ある特定の実施形態では、そのドメインと部分とは、オリゴヌクレオチド上の同じ位置に位置してもよく、同じ長さを有してもよく、すなわち、その部分は、長さおよび位置が一致する。ある特定の実施形態では、１つのドメイン内に２つ以上の部分が存在し得る。
【００７０】
本発明の場合、このことは、ＤＮＡ二重鎖を変更するミスマッチを含むオリゴヌクレオチドの一部が、改変されるオリゴヌクレオチドの部分と異なる位置またはシフトした位置に位置し得ることを意味する。
【００７１】
好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡ、および／またはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドからなる群から選択される。
【００７２】
好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ロックト核酸である。ロックト核酸（ＬＮＡ）は、アンチセンス遺伝子治療で使用する場合に興味深い特性を有するＤＮＡアナログであり、当業者に公知である。
【００７３】
ＬＮＡは、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。ＬＮＡおよび関連アナログの構造上および機能上の基本的な特性は、様々な刊行物および特許（国際公開第９９／１４２２６号、同第００／５６７４８号、同第００／６６６０４号、同第９８／３９３５２号、米国特許第６０４３０６０号および同第６２６８４９０号明細書（これらのすべての全体が参考として援用される）を含む）に開示されている。
【００７４】
ＬＮＡヌクレオシドは、通常の核酸塩基のすべてに対して入手可能であり（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｕ；例えば、Ｅｘｉｑｏｎ（ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ）から）、標準的なワトソン−クリック塩基対形成の法則に従って塩基対を形成することができる。ＬＮＡは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み込まれると、より迅速に相補的なヌクレオチド鎖と対形成し、得られる二重鎖の安定性を高める。換言すれば、ＬＮＡは、正しい標的と不適当な標的とを識別する能力（高特異性）を、非常に高い生体安定性（ｂｉｏ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）（低代謝回転）および前例のない親和性（標的に対する非常に高い結合強度）と同時に備える。実際に、ＬＮＡを用いて記録された親和性の上昇は、以前に報告されたすべてのアナログの低〜中程度の範囲の親和性からかけ離れたものである。
【００７５】
ＬＮＡは、リボースが２’−酸素原子と４’−炭素原子との間のメチレン架橋によって構造的に拘束されているＲＮＡアナログである。この架橋は、リボフラノース環の可撓性を制限し、その構造を堅い二環式の形態に固定する。このいわゆるＮ型（または３’−エンド）コンフォメーションによって、ＬＮＡ含有二重鎖のＴｍ（融解温度）が上昇し、その結果として、より高い結合親和性およびより高い特異性がもたらされる。重要なことには、ＬＮＡの好ましい特性は、核酸アナログを用いたときにしばしば観察されるように他の重要な特性を犠牲にして成り立っているわけではない。
【００７６】
ＬＮＡは、ＤＮＡアナログ分野を構成する他のすべての化学と自由に組み合わせることができる。ＬＮＡ塩基は、すべてがＬＮＡの短い配列またはそれより長いＬＮＡ／ＤＮＡキメラとして、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。ＬＮＡは、内部、３’位または５’位に配置され得る。しかしながら、その堅い二環式のコンフォメーションのせいで、ＬＮＡ残基は、時折、核酸鎖のらせんのひねりを妨害する。それゆえ、２つ以上隣接したＬＮＡ残基を有するオリゴヌクレオチドをデザインすることは、一般にそれほど好ましくない。好ましくは、ＬＮＡ残基は、らせんのひねりを妨害しない少なくとも１つの（修飾）ヌクレオチド（例えば、従来のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ））によって分断される。
【００７７】
最初に開発された好ましいＬＮＡモノマー（［ベータ］−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマー）は、新しいＬＮＡモノマーに改変された。その新規［アルファ］−Ｌ−オキシ−ＬＮＡは、３’エキソヌクレアーゼ活性に対して優れた安定性を示すと示唆されており、強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインする際に、［ベータ］−Ｄ−オキシ−ＬＮＡよりも有力かつ万能でもある。また、国際公開第９９１４２２６号、同第００／５６７４８号、同第００／６６６０４号およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，７５（７），ｐｐ２３４１−２３４９に開示されているようなキシロ−ＬＮＡ、Ｌ−リボＬＮＡおよび他のＬＮＡを使用することもできる。本発明では、上記タイプの任意のＬＮＡが、［ベータ］−Ｄ−ＬＮＡアナログよりも優先して、本発明の目標、すなわちＴＮＥの効率の改善を達成する際に有効である。
【００７８】
上で述べたように、好ましくは、ＬＮＡは、本発明に係る方法において使用されるオリゴヌクレオチド中のミスマッチから少なくとも１ヌクレオチド離れている。ＴＮＥの分野では、ＬＮＡ修飾は、ＴＮＥにおいて使用されるキメラ分子に対する代替物として可能性のあるオリゴヌクレオチド修飾のリストに列挙されているが、本発明に係る方法において使用されるような一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡを含むように改変されるとき、ＴＮＥ効率は、ＬＮＡが、ミスマッチから少なくとも１ヌクレオチド、なおもより好ましくは、ミスマッチから１ヌクレオチド離れて位置するときに現在見出されているＴＮＥ効率に対して有意に高まることが見出されている。そのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約７５％超の（最も近い整数のヌクレオチドに丸められる）ＬＮＡを含まない。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを含む。商業的に入手可能なヌクレオチド修飾の多くは、遺伝子治療のためのアンチセンスの用途で使用するために開発された。アンチセンスの用途で利用可能な最も単純かつ最も広く使用されているヌクレアーゼ抵抗性化学構造（「第１世代」アンチセンス−オリゴヌクレオチド）は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。これらの分子では、硫黄原子が、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格における非架橋酸素に取って代わっており（例えば、国際公開第２００７０７３１５４号の図２を参照のこと）、その結果、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性が生じる。
【００８０】
遺伝子治療の場合、ホスホロチオエート／ホスホジエステルキメラは、一般に、５’末端と３’末端の両方に１〜４個のＰＳ修飾ヌクレオシド間結合を有し、中央のコアには無修飾ＤＮＡを有する。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチド中の任意の所望の位置に組み込むことができる。
【００８１】
好ましくは、修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡ、またはなおもより好ましくは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドであり、より好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、例えば、１、２、３または４つのホスホロチオエートを有する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、本発明に係るオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端付近に（例えば、５’末端から１、２、３、４、５、６、７ヌクレオチド以内に）少なくとも１つのホスホロチオエートを含む。
【００８２】
ある実施形態において、少なくとも２、３、４または５個の修飾ヌクレオチドを含む、本発明に係る方法において使用されるオリゴヌクレオチドが提供される。好ましくは、そのオリゴヌクレオチドは、２、３、４または５個の修飾ヌクレオチドを含む。好ましくは、その修飾は、ＬＮＡおよび／またはホスホロチオエート結合からなる群から選択される。
【００８３】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド中のミスマッチの位置のヌクレオチドを、修飾することができる。そのミスマッチが修飾できるか否かは、ドナー鎖とアクセプター鎖との間の親和性の差異を利用した、標的ヌクレオチド交換またはその細胞のＤＮＡ修復機構の正確な機構に大きく左右される。好ましい実施形態において、ミスマッチの位置のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
【００８４】
ある実施形態において、修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する少なくとも１つのミスマッチから少なくとも１ヌクレオチドに存在し、最も好ましくは、前記少なくとも１つのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、本発明に係る方法が提供される。
【００８５】
先に論じられたように、本発明に係る方法において使用されるような一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡを含むように改変されるとき、修飾ヌクレオチド、好ましくは、ＬＮＡが、ミスマッチから少なくとも１ヌクレオチド離れて、なおもより好ましくは、ミスマッチから１ミスマッチに位置するときに現在見出されている程度まで、ＴＮＥ効率が有意に高まることが見出されている。換言すれば、好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチド、好ましくは、ＬＮＡは、少なくとも１つの他のヌクレオチド（その少なくとも１つの他のヌクレオチドは、ＬＮＡではなく、好ましくは、修飾ヌクレオチドではない）によってミスマッチと分断されている。しかしながら、例えば、ホスホロチオエート結合の場合、そのような結合は、ミスマッチヌクレオチドに直接隣接してもよい。
【００８６】
ある実施形態において、二重鎖アクセプターＤＮＡの改変が、好ましくは、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および／または（非ヒト）胚細胞からなる群から選択される細胞内での改変である方法が提供される。本発明は、その最も広い形態において、一般に、あらゆる生物（例えば、ヒト、動物、植物、魚類、爬虫類、昆虫、真菌、細菌など）に適用可能である。したがって、本発明は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および／または胚細胞からなる群から選択される細胞内で行うことができる。好ましい実施形態において、細胞は、植物細胞である。
【００８７】
二重鎖アクセプターＤＮＡが、原核生物、細菌、真核生物、植物、動物、酵母、真菌、げっ歯類またはヒトから得られる、本明細書中に記載されるような方法も提供される。好ましい実施形態において、二重鎖アクセプターＤＮＡは、植物から得られる（または植物細胞に存在する植物ＤＮＡである）。
【００８８】
本発明の実施形態において、二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入である。好ましくは、二重鎖ＤＮＡ配列の改変は、わずか５ヌクレオチド、好ましくは、わずか４、３、２、１ヌクレオチド、最も好ましくは、１ヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入である。より好ましくは、二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の改変は、わずか５ヌクレオチド、好ましくは、わずか４、３、２、１ヌクレオチド、最も好ましくは、１ヌクレオチドの置換である。
【００８９】
別の実施形態において、二重鎖アクセプターＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、人工染色体、哺乳動物人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラＤＮＡおよび／またはプラスミドを含むエピソームＤＮＡに由来する、本発明に係る方法が提供される。
【００９０】
実際に、本発明は、上に開示されたＤＮＡのような任意のタイプのＤＮＡを改変するために適用可能である。本発明は、例えば、標的ヌクレオチド交換が可能なタンパク質、例えば特に、細胞のミスマッチ修復機構において機能性であるタンパク質の存在下において、上記ＤＮＡをドナーオリゴヌクレオチドによる改変に供することによって、インビボならびにエキソビボまたはインビトロで行うことができる。
【００９１】
細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、エレクトロポレーション、または核もしくは細胞質に送達できる他の従来の手法によって行うことができる。本発明の方法のインビトロ試験は、例えば国際公開第０１／８７９１４号、同第０３／０２７２６５号、同第９９／５８７０２号、同第０１／９２５１２号に記載されているような無細胞系を用いて行うことができる。上記オリゴヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド、メチル化されていないヌクレオチドまたはその両方を含み得る。
【００９２】
本発明は、その最も広い形態において、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するための多くの目的のために適用可能である。
【００９３】
本発明は、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するため、ミスマッチ修復のため、遺伝子変異を含む（植物）遺伝物質の標的改変のため、標的遺伝子修復のため、および遺伝子ノックアウトのための、本明細書の前述に本質的に記載されたようなオリゴヌクレオチドの使用にも関する。好ましくは、本発明に係る方法は、植物から得られるか、植物に存在するか、または植物に提供される、二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変のための方法である。
【００９４】
本発明はさらに、本明細書中で定義されるような、オリゴヌクレオチドの１つ以上を、必要に応じて、ＴＮＥが可能であるタンパク質とともに備えるキットに関する。
【００９５】
特に、上記キットは、二重鎖ＤＮＡの標的改変のための指示書を備える。その指示書は、本明細書中に記載される本発明に係る方法の工程の説明を本質的に含む。
【００９６】
特に、本明細書中に開示される方法に係る二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変のための方法を行うための指示書を備えるキットが提供され、ここで、そのキットは、本発明に係る方法において使用するためオリゴヌクレオチドをさらに備える。好ましくは、オリゴヌクレオチドは本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドである。
【００９７】
したがって、この実施形態において、上記キットは、第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズできる少なくとも１つのドメインを含むオリゴヌクレオチドを備えてもよく、そのドメインは、標的ＤＮＡ配列に対する少なくとも１つのミスマッチを含むかまたは直接隣接し、前記少なくとも１つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに配置され、最も好ましくは、前記少なくとも１つのミスマッチはオリゴヌクレオチドの３’末端に存在し、本発明に係る方法、すなわちＴＮＥを行うための指示書をさらに備え、ここで、標的ＤＮＡに対するミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが使用され、そのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに存在し、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチはオリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。
【００９８】
当業者が理解するように、上記ミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端または３’末端から１ヌクレオチドまたは３’末端から２ヌクレオチドに位置すること、オリゴヌクレオチドが、二重鎖ＤＮＡ配列を改変するために使用され得ることを少なくとも通知する指示書を提供することによって、これらの指示書およびオリゴヌクレオチドを備えるそのようなキットは、上に記載されたキットおよび請求されるキットの範囲内のキットとなる。
【００９９】
上記キットはまた、例えば、本明細書中に記載および開示されるような本発明の方法に従った二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変、ならびに本発明に係る方法において使用するために適したならびに本明細書中に記載および開示されるようなオリゴヌクレオチドの（別個の）供給または提供を行うための指示書または情報を提供するウェブサイトまたは文書の形態をとってもよい。
【０１００】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドが、第１ＤＮＡ配列およびその第１ＤＮＡ配列の相補体である第２ＤＮＡ配列を含む二重鎖アクセプターＤＮＡ配列と併用されるとき、第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズできるドメインを含むオリゴヌクレオチドであり、そのドメインが、第１ＤＮＡ配列に対する少なくとも１つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも１つのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、前記少なくとも１つのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、上に記載したような本発明に係るキットが提供される。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：タバコプロトプラストにおけるＧＦＰエピソームに対するＴＮＥ
ＴＮＥは、オリゴヌクレオチドを細胞に導入することを含み、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、ゲノムの標的遺伝子座に、そのオリゴヌクレオチド中のミスマッチヌクレオチドによってもたらされる変異を誘導する。
【０１０２】
下記の実験において、インフレームの終止コドンを含む非機能性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有するエピソーム（プラスミド）に対してＴＮＥを行うことによって、ＴＮＥの正確さおよび効率を測定した。このプラスミドと、終止コドンを修復するためにデザインしたオリゴヌクレオチドとの同時トランスフェクションによって、ＧＦＰ発現および活性が修復され、その修復は、下記の実験において、プロトプラストトランスフェクションの２４時間後に単一細胞レベルにおいてスコア付けされた。この第１の実施例では、タバコプロトプラストにおいて行われた実験を説明する。
【０１０３】
材料および方法
構築物
機能性のＧＦＰオープンリーディングフレームを合成し、そのコドン使用頻度を、ナス科で使用するために最適化した。図１に示されるように、８２位のヌクレオチドを変化させて（ＧからＴに）ＧＦＰのバリアントを作製した。これによって、インフレームの終止コドンが生じ、得られるタンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。ＧＦＰ  ＯＲＦ（ＧＦＰ  ＷＴ）および終止コドンを有するＧＦＰバリアント（ＧＦＰ−ＳＴＯＰ）を、植物細胞での遺伝子発現用のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むｐＵＣベースのベクターのマルチクローニングサイトにＸｈｏＩ−ＳａｃＩフラグメントとしてクローニングした。これによって、構築物ｐＫＧ７３８１（ＧＦＰ−ＷＴ）およびｐＫＧ７３８４（ＧＦＰ−ＳＴＯＰ）を得た。さらに、ＧＦＰを、翻訳によって６×ＨＩＳタグおよびＮＬＳ（核局在化シグナル配列）に融合することにより、プロトプラスト核へのＧＦＰタンパク質の蓄積が促進され、ゆえに、本発明者らのＧＦＰ陽性細胞のスコア付け能力が改善された。これらの構築物を図３に示す。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド
上記ＧＦＰ遺伝子中の終止コドンを修復するオリゴヌクレオチドを表１に示す。
【０１０５】
【表１】
2014500727.tif 000002
【０１０６】
表１．本研究において使用されたオリゴヌクレオチド。各オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチヌクレオチドに下線が引かれている。アスタリスクは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表している。オリゴヌクレオチドの向きは、センス（ＧＦＰコード配列と同一）またはアンチセンス（ＧＦＰコード配列に相補的）として与えられている。すべてのオリゴヌクレオチドは、５’−３’方向で示されている。ＰＢ２２１はミスマッチに加えてＬＮＡ修飾（Ｌ＝ＬＮＡ  Ｃ）を含む。
【０１０７】
タバコプロトプラストの単離およびトランスフェクション
この実施例の原材料は、２５／２０℃（昼／夜）の温度および８０μＥ．ｍ−２．ｓ−１の光子束密度（１６／２４ｈの明期）でガラスジャー（７５０ｍｌ）内のＭＳ２０培地中で無菌的に生育されたタバコのインビトロシュート培養物だった。ＭＳ２０培地は、２％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．８％Ｄｉｆｃｏ寒天を含むがホルモン無添加の基本的なＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１５：４７３−４９７，１９６２）である。上記シュートを３週間毎に新鮮培地に継代した。
【０１０８】
葉肉プロトプラストを単離するために、３〜６週齢のシュート培養物の完全に展開した葉を採取した。その葉を１ｍｍの薄片にスライスし、次いでそれを、室温にて３０分間の原形質分離前処理（ｐｒｅｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のために、４５ｍｌのＭＤＥ基本培地を含む大きな（１００ｍｍ×１００ｍｍ）ペトリ皿に移した。ＭＤＥ基本培地は、９００ｍｌという総体積中に０．２５ｇのＫＣｌ、１．０ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１３６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのポリビニルピロリドン（ＭＷ１０，０００）、６ｍｇのナフタレン酢酸および２ｍｇの６−ベンジルアミノプリンを含んだ。その溶液の重量オスモル濃度をソルビトールで６００ｍＯｓｍ．ｋｇ−１に調整し、ｐＨを５．７にした。
【０１０９】
原形質分離前処理の後、５ｍｌの酵素原液を各ペトリ皿に加えた。その酵素原液は、１００ｍｌあたり７５０ｍｇのＣｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ１０、５００ｍｇのドリセラーゼおよび２５０ｍｇのマセロザイムＲ１０からなり（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂ．Ｖ．，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、例えば、製品Ｃ８００１およびＭ８００２）、Ｗｈａｔｍａｎ紙で濾過して濾過滅菌した。上記ペトリ皿を密閉し、動かさずに２５℃の暗所において一晩インキュベートすることにより、細胞壁を消化した。
【０１１０】
次いで、プロトプラスト懸濁液を５００μｍおよび１００μｍの篩に通して２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れ、等体積のＫＣｌ洗浄培地と混合し、５０ｍｌチューブにおいて８５×ｇで１０分間遠心分離した。ＫＣｌ洗浄培地は、１リットルあたり２．０ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏおよび重量オスモル濃度を５４０ｍＯｓｍ．ｋｇ−１にするのに十分な量のＫＣｌからなるものだった。
【０１１１】
遠心分離工程を２回繰り返し、１回目は、通常の半分の濃度のＭＳ培地の多量養素（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１５：４７３−４９７，１９６２）、１リットルあたり２．２ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏおよび重量オスモル濃度を５４０ｍＯｓｍ．ｋｇ−１にする量のマンニトールであるＭＬｍ洗浄培地にプロトプラストを再懸濁し、最後は、マンニトールをスクロースで置き換えたＭＬｍ培地であるＭＬｓ培地にプロトプラストを再懸濁した。
【０１１２】
プロトプラストを、スクロース培地中の浮遊相（ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｂａｎｄ）から回収し、等体積のＫＣｌ洗浄培地に再懸濁した。血球計算器を用いて密度を測定した。続いて、プロトプラストを、再度、１０ｍｌガラス管において、８５×ｇで５分間遠心分離し、ペレットを、エレクトロポレーション培地に１×１０５プロトプラストｍｌ−１という密度で再懸濁した。
【０１１３】
プロトプラストのエレクトロポレーション
ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置をエレクトロポレーションのために使用した。エレクトロポレーション培地としてＰＨＢＳ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２；０．２Ｍマンニトール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＣａＣｌ２）およびエレクトロポレーション混合物において約１×１０６／ｍｌのプロトプラスト密度を使用し、エレクトロポレーションの設定は、２５０Ｖ（６２５Ｖｃｍ−１）の電荷および８００μＦのキャパシタンスとし、パルスと培養との間の回復時間は１０分間とした。各エレクトロポレーションにおいて、８００マイクロリットルのエレクトロポレーションにつき、約２μｇの総オリゴヌクレオチドおよび２０μｇのＫＧ７３８１またはＫＧ７３８４を使用した。
【０１１４】
エレクトロポレーション処理後、プロトプラストを３０分間氷上に置いて回復させ、次いで、１×１０５プロトプラストｍｌ−１という密度でＴ０培養液に再懸濁し、２１℃の暗所において一晩インキュベートした。Ｔ０培養液は、９５０ｍｇのＫＮＯ３、８２５ｍｇのＮＨ４ＮＯ３、２２０ｍｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１８５ｍｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、８５ｍｇのＫＨ２ＰＯ４、２７．８５ｍｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３７．２５ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ、Ｈｅｌｌｅｒ培地のとおりの微量養素（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．，Ａｎｎ  Ｓｃｉ  Ｎａｔ  Ｂｏｔ  Ｂｉｏｌ  Ｖｅｇ  １４：１−２２３，１９５３）、Ｍｏｒｅｌ−Ｗｅｔｍｏｒｅ培地（Ｍｏｒｅｌ，Ｇ．ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｗｅｔｍｏｒｅ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ．３８：１３８−４０，１９５１）のとおりのビタミン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、３ｍｇのナフタレン酢酸、１ｍｇの６−ベンジルアミノプリン、および重量オスモル濃度を５４０ｍＯｓｍ．ｋｇ−１にする量のマンニトールを含んだ（１リットルあたり，ｐＨ５．７）。エレクトロポレーションの２０時間後に、核内のＧＦＰシグナルを可視化するＵＶ顕微鏡下でプロトプラストを検鏡した。
【０１１５】
あるいは、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドＤＮＡをタバコプロトプラストに導入するためにＰＥＧ処理を用いることもできる。これを行う方法は、文献において周知である。
【０１１６】
結果
構築物ＫＧ７３８１（ＧＦＰ−ＷＴ）をタバコプロトプラストにエレクトロポレートしたとき、インキュベーションのおよそ２０時間後に、核に位置する強いＧＦＰシグナルが観察された。このシグナルは、ＧＦＰ  ＯＲＦの強い一過性の発現に起因するものである。このシグナルは、おそらく細胞からのプラスミドＤＮＡの分解／排出に起因して、４８時間以内に消失した。代表的な実験では、およそ３０％のプロトプラストが、ＧＦＰシグナルを示し、これが、最大のエレクトロポレーション効率である。ＫＧ７３８４（ＧＦＰ−ＳＴＯＰ）をタバコプロトプラストに導入したときは、ＧＦＰシグナルは観察されなかった。
【０１１７】
いったん実験の設定が実証されたら、ミスマッチヌクレオチドの代替の配置を用いてデザインしたいくつかの異なるオリゴヌクレオチドとともにＫＧ７３８４をタバコプロトプラストに導入する実験を行った。
【０１１８】
ＫＧ７３８４が導入された終止コドンを修復するためにミスマッチを保有するオリゴヌクレオチドと同時導入された場合、我々は実際に修復されたＧＦＰ発現を観察した。ＫＧ７３８４がミスマッチを欠くオリゴヌクレオチドと同時導入される場合、ＧＦＰ発現は観察されなかった。ＴＮＥ細胞機構はＧＦＰ−ＳＴＯＰの配列を変化させるためにオリゴヌクレオチドを使用でき、それ故、細胞においてＧＦＰ活性を修復すると結論付けた。
【０１１９】
試験した各オリゴヌクレオチドの修復効率を図４に示す。各々の独立した実験において、ＫＧ７３８１を使用して最大形質転換効率を決定し、次いでこれを使用してオリゴヌクレオチドの各々の修復効率を補正した。例えば、オリゴヌクレオチドとのＧＦＰ修復事象の数が、ＫＧ７３８４のトランスフェクション後のＧＦＰ陽性細胞の数と等しい場合、ＧＦＰ修復パーセントは１００％である。
【０１２０】
そのデータから、修復は、ミスマッチヌクレオチドがオリゴヌクレオチド上に存在する場合にのみ発生し、ＧＦＰ８を用いた場合、修復は観察されないと結論付けた。修復は、オリゴヌクレオチドが中心（ＧＦＰ７）において単一のミスマッチを含んでいた場合、形質転換細胞の約３０％において観察された。予想外のことに、我々は、ミスマッチがオリゴヌクレオチドの３’末端（ＰＢ１５４）に位置する場合、ＴＮＥ効率が増加することを見出した。この場合、修復効率は現在の実験において最高に観察された。驚くべきことに、５’末端（ＰＢ１５３）においてミスマッチを有するオリゴヌクレオチドは非常に低い修復効率を与えた。ＧＦＰ３はＧＦＰ７、ＰＢ２１８およびＰＢ２２１とほぼ同じ効率であった。
【０１２１】
次にオリゴヌクレオチドの３’末端と比較して−１位、−２位または−３位にそれぞれミスマッチを有する一連のオリゴヌクレオチド（ＰＢ２１８、ＰＢ２１９、ＰＢ２２０）をデザインし、試験した。ミスマッチが−３位に位置する場合、修復効率はＧＦＰ７のもの以下に低下した。ＰＢ２１８（−１位）はＧＦＰ７と同程度の効率であった。ＰＢ２１９（−２位）はＰＢ１５４と効率的に同様の修復を与えた。したがって、３’末端におけるミスマッチは最高の修復効率を与えるのに対して、−１、−２位内におけるミスマッチの配置は、同様に効果的なＴＮＥ効率を与えることができる。
【０１２２】
次に３’ミスマッチとともに−２位においてＬＮＡ修復を有するオリゴヌクレオチド（ＰＢ２２１）を試験した。ＬＮＡヌクレオチドは、その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる。結果を図５に示す。
【０１２３】
実施例２．トマトプロトプラスト内のＹＦＰエピソームにおけるＴＮＥ
実施例１は、３’末端においてミスマッチを有するオリゴヌクレオチドがＴＮＥを行うのに効果的であることを示した。本発明に係る方法の広範囲の使用を示すため、および３’オリゴヌクレオチドとともに観察された高いＴＮＥ効率が実施例１において使用したオリゴヌクレオチドの特異的配列に起因することを排除するために、代替の配列を有するが、本発明に従って配置されるミスマッチ（例えば３’ミスマッチ）も有するオリゴヌクレオチドがＴＮＥアッセイに活性であることを示すことが重要である。さらに、観察された効果がまた、他の植物種でも発生することを実証することは有益であるので、トマトプロトプラストにおいて同様の実験を行うことを決定した。
【０１２４】
構築物
終止コドンを生じる１８６位（Ｃ〜Ｔ）に位置するヌクレオチド変化を有するＹＦＰ−ＷＴおよびＹＦＰ−ＳＴＯＰのバージョンを生成した。ＹＦＰ−ＳＴＯＰ遺伝子のヌクレオチド配列（図５）および翻訳したタンパク質配列（図６）の両方を示す。ＧＦＰおよびＹＦＰ遺伝子の両方は有意な配列相同性を共有しているが、この終止コドンをコード配列における異なる位置にデザインしたので、オリゴヌクレオチドはＧＦＰ実験に使用したものと完全に異なる配列を有する。これらの遺伝子を次いで植物発現ベクター内にクローニングしたので、ＹＦＰ  ＯＲＦをウイルス３５Ｓプロモーターにより発現させた。その３’末端においてミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを、ＹＦＰ−ＳＴＯＰ構築物内の１８６位におけるＴをＣに変換し、それ故、ＹＦＰ活性を修復するようにデザインした。
【０１２５】
ＹＦＰ（ＰＢ２１２）における終止コドンを修復するために使用したオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。ホスホロチオエート結合をアスタリスクにより表す。オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチに下線が引かれている。
ＰＢ２１２  Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＡＡＣＴＴＧＡＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ（配列番号１４）
【０１２６】
トマトプロトプラスト単離および精製
トマト葉プロトプラストの単離および再生は以前に記載されており（Ｓｈａｈｉｎ，１９８５；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７ａ；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７ｂ）、必要な溶液はそれらの刊行物に見出され得る。つまり、０．１％次亜塩素酸塩を用いて滅菌したトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）種を、２５℃および５０〜７０％相対湿度にて２０００ルクスにて１６／８時間の明記において滅菌ＭＳ２０培地においてインビトロで増殖させた。１ｇの新たに採取した葉を５ｍｌのＣＰＷ９Ｍを有するディッシュに入れ、手術用メスの刃を用いてｍｍ毎に主幹に垂直に切断する。それらを、２５ｍｌ酵素溶液（２％セルロースｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ、０．４％マセロザイムｏｎｏｚｕｋａＲ１０、２．４−Ｄ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（２ｍｇ／ｍｌ）ｐＨ５．８を含有するＣＰＷ９Ｍ）の新たなプレートに移し、暗所で２５℃にて一晩、消化を開始した。次いでプロトプラストをオービタルシェーカー（４０〜５０ｒｐｍ）に１時間入れることによって、遊離させた。プロトプラストを５０μｍ篩に通過させることによって細胞残屑から分離し、その篩をＣＰＷ９Ｍで２回洗浄した。プロトプラストを８５ｇにて遠心分離し、上清を捨て、次いでＣＰＷ９Ｍの半分の体積中に取った。プロトプラストを、最終的に３ｍｌのＣＰＷ９Ｍ中に取り、次いで３ｍｌのＣＰＷ１８Ｓを２つの溶液が混合することを回避するように注意深く加えた。プロトプラストを８５ｇにて１０分間回転させ、中間層に浮遊している生存しているプロトプラストを、長いパスツールピペットを用いて回収した。ＣＰＷ９Ｍを加えることによりプロトプラストの体積を１０ｍｌまで増加させ、回収したプロトプラストの数を血球計において決定した。プロトプラスト懸濁液を５℃にて１０分間８５×ｇにて遠心分離する。上清を捨て、プロトプラストペレットを、ＣＰＷ９Ｍ洗浄培地中で１０６．ｍＬ−１の最終濃度に再懸濁する。１０ｍＬ管中で、２５０μＬのプロトプラスト懸濁液＋／−１２．５μｇのｄｓＲＮＡおよび２５０μｌのＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ４０００（Ｆｌｕｋａ＃８１２４０）、０．１ＭのＣａ（ＮＯ３）２、０．４Ｍのマンニトール）を穏やかにだが、完全に混合する。２０分後、室温にてインキュベートし、５ｍＬの冷０．２７５ＭのＣａ（ＮＰ３）２を滴下して加える。プロトプラスト懸濁液を４℃にて８５×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てる。次いでトマトプロトプラストを、４ｍｌのＫ８ｐ培地を含有する４ｃｍのペトリ皿に移し、蛍光顕微鏡を用いてＹＦＰ発現について２４時間後に試験する。
【０１２７】
結果
これらの実験の結果を図７に示す。我々は、３’末端にミスマッチを有する異なる配列のオリゴヌクレオチドが実際にトマトプロトプラストにおいてＹＦＰ発現を修復できることを確認できる。
【０１２８】
実施例３．ＴＮＥ効率に対するＰＳ結合の効果
この実施例では、本発明に係るオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを組み込んでいる必要もないし、本発明に係るオリゴヌクレオチドが、他の任意のタイプの修飾を組み込んでいる必要もないことが示される。
【０１２９】
方法
トマト葉肉プロトプラストをトマトインビトロ植物の幼葉から単離した。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによってその発現が引き起こされるｅＹＦＰ（ｓｔｏｐ）遺伝子を有するレポーター構築物およびオリゴヌクレオチドを、ＰＥＧ媒介性の方法によってトマトプロトプラストにトランスフェクトした。３０℃、暗黒下のグロースチャンバー内で一晩インキュベートした後、ＹＦＰフィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて感染プロトプラストを観察した。黄色蛍光を発するプロトプラストの数をスコア付けし、黄色プロトプラストの数をトランスフェクトされたプロトプラストの数で除することによって、ＴＮＥ効率を算出した。
【０１３０】
試験されたオリゴヌクレオチドの配列：
ＰＢ７２  Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ
（配列番号１５）２５ｍｅｒ，ＰＳ，ナンセンス（＝コントロール）
ＰＢ２４３  Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ＡＡＣＴＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ
（配列番号１６）２５ｍｅｒ，ＰＳ，３’ＭＭ（＝ミスマッチ）アンチセンス
ＴＦ８  ＧＡＴＧＡＡＣＴＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＣＣＧ
（配列番号１７）２５ｍｅｒ，３’ＭＭアンチセンス
＊は、ホスホロチオエート結合を表している。
【０１３１】
ＰＢ２４３、およびＴＦ８によって引き起こされるＴＮＥ反応は、標的配列をＴＡＡからＴＡＣに変換する。ゆえに、オリゴヌクレオチドＰＢ２４３およびＴＦ８は、ＹＦＰ中の終止コドンを修復するようにデザインされており、ここで、ＰＢ７２はＰＳ結合を含み、ＴＦ８は、ＰＳ結合を含まない。図８に示されるように、ＰＢ２４３は、ＹＦＰ発現を２０．１３％の効率で修復できるのに対して、ＴＦ８は、ＹＦＰ発現を５．８３％の効率で修復でき、それ故、ナンセンスオリゴヌクレオチドの１．４３のバックグラウンドレベルと比較してかなり高かった（それぞれほぼ１５倍およびほぼ４倍）。
【０１３２】
このように、この実施例は、ＰＳ結合のような修飾を含むかまたは含まないオリゴヌクレオチドの使用は、ＴＮＥにおいて使用することができることを示す。
【０１３３】
文献
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Ｚｈｕ，Ｔ．，Ｍｅｔｔｅｎｂｕｒｇ，Ｋ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｔａｇｌｉａｎｉ，Ｌ．ａｎｄ  Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｃ．Ｌ．（２０００）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍａｉｚｅ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＲＮＡ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｎｏｔ  １８，５５５−８．
Ｚｈｕ，Ｔ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｔａｇｌｉａｎｉ，Ｌ，Ｓｔ  Ｃｌａｉｒ，Ｇ．，Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂｏｗｅｎ，Ｂ．（１９９９）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＲＮＡ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，８７６８−７３．
【図１】
2014500727.tif 000003
【図２】
2014500727.tif 000004
【図３−１】
2014500727.tif 000005
【図３−２】
2014500727.tif 000006
【図４】
2014500727.tif 000007
【図５】
2014500727.tif 000008
【図６】
2014500727.tif 000009
【図７】
2014500727.tif 000010
【図８】
2014500727.tif 000011
【配列表】
2014500727000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月30日(2013.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ＤＮＡ配列および前記第１ＤＮＡ配列の相補体である第２ＤＮＡ配列を含む二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の標的改変のための方法であって、前記方法は、
前記二重鎖アクセプターＤＮＡ配列をドナーオリゴヌクレオチドと併用する工程を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのドメインを含み、前記ドメインは、前記第１ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも１つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチは前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、方法。
【請求項２】
前記ドナーヌクレオチドが、ミスマッチを除いて前記第１ＤＮＡ配列に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、塩基修飾、３’および／または５’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの部分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾ヌクレオチドが、その相補的ヌクレオチドに対して天然に存在するＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧヌクレオチドと比べて高い結合親和性を有し、前記修飾ヌクレオチドが、前記第１ＤＮＡ配列中の向かい側の位置におけるヌクレオチドと相補的な天然に存在するヌクレオチドと比較して前記第１ＤＮＡ配列中の向かい側の位置におけるヌクレオチドに強力に結合し、および／または前記修飾ヌクレオチドがヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドが、ＬＮＡまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ミスマッチが修飾ヌクレオチドではない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置する少なくとも１つのミスマッチ由来の少なくとも１つのヌクレオチドであり、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチは前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、２、３または４個のミスマッチを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記二重鎖アクセプターＤＮＡの改変は、好ましくは、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および／または胚細胞からなる群から選択される細胞内におけるものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記二重鎖アクセプターＤＮＡが、原核生物、細菌、真核生物、植物、動物、酵母、真菌、げっ歯類またはヒトから得られる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変が、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記二重鎖アクセプターＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、哺乳動物人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体ＤＮＡ、オルガネラＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはエピソームＤＮＡ由来である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
二重鎖アクセプターＤＮＡ配列の標的改変のため、好ましくは、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するため、ミスマッチ修復のため、遺伝子変異を含む（植物）遺伝物質の標的改変のため、標的遺伝子修復のため、および遺伝子ノックアウトのための、請求項１〜１４のいずれか一項にオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重鎖アクセプターＤＮＡの標的改変のための方法を行うための指示書を備える、キット。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法において使用するためのオリゴヌクレオチド、好ましくは、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドをさらに備える、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
第１ＤＮＡ配列および前記第１ＤＮＡ配列の相補体である第２ＤＮＡ配列を含む二重鎖アクセプターＤＮＡ配列と併用されるとき、前記オリゴヌクレオチドが、前記第１ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるドメインを含み、前記ドメインが、前記第１ＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのミスマッチ、好ましくは１つのミスマッチを含み、前記少なくとも１つのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端から最大でも２、好ましくは最大でも１ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは前記少なくとも１つのミスマッチが前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する、請求項１６または１７に記載のキット。
【国際調査報告】
2014500727.tif 000012
2014500727.tif 000013
2014500727.tif 000014