(57)【要約】本発明は、トランスジーンまたは治療用核酸のヒト被験体への送達のためのウイルスベクター処方物およびその使用方法を提供する。処方物は、ベクターおよび適切な量の空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を含み、その空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質は、任意で、化学的に、または構造的に改変され、かつ中和抗ＡＡＶ抗体に結合し、それにより、ベクターの抗体媒介性クリアランスを低下させるか、または防止するが、ゲノム含有（治療用）ベクターが標的細胞を形質導入して、治療用遺伝子移入を達成することをなお可能にする。
2014534245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ決められた比率のウイルスベクターと、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質のいずれかとを含む、被験体への投与のためのウイルスベクター処方物であって、前記ウイルスベクターがトランスジーンを含み、かつ前記空キャプシド、前記ウイルスゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、患者における前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制する、ウイルスベクター処方物。
【請求項２】
あらかじめ決められた比率のウイルスベクターと、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質のいずれかとを含む処方物であって、前記ウイルスベクターがトランスジーンを含み、かつ前記空キャプシド、前記ウイルスゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、前記ウイルスベクターに対する望まれない免疫応答を抑制するように、被験体由来の生物学的試料中に測定される、前記ウイルスベクターに結合するか、または前記ウイルスベクターと反応するだろう抗体の量に従って調整される量である、処方物。
【請求項３】
前記トランスジーンが、前記ウイルスベクターに関して外来のものである、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項４】
前記空キャプシド、前記ウイルスゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、細胞取り込みを低下させるか、または抑制するように化学的に改変される、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項５】
前記空キャプシド、前記ウイルスゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、架橋剤で処理されるか、または細胞上に発現するＡＡＶ受容体への結合の低下もしくは減少を示す変異型キャプシドを含む、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項６】
前記変異型キャプシドが、非荷電または疎水性残基と置換されている、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの結合に寄与する１または複数のアルギニン残基を含む、請求項５に記載の処方物。
【請求項７】
前記変異型キャプシドが、１つ以上のアルギニン残基が位置４５１、４４８、５３０、５８５、または５８８のいずれかで置換されているＡＡＶ２を含む、請求項６に記載の処方物。
【請求項８】
前記変異型キャプシドが、１つ以上のアルギニン残基が位置４５１でシステインと、位置４４８でシステインと、位置５３０でアラニンと、位置５８５でアラニンと、または位置５８８でアラニンとのいずれかで置換されているＡＡＶ２を含む、請求項６に記載の処方物。
【請求項９】
前記ウイルスベクター、および前記空キャプシド、前記ウイルスゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶベクター、およびＡＡＶ空キャプシド、ＡＡＶウイルスゲノム含有キャプシド、またはＡＡＶキャプシドタンパク質である、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項１０】
前記トランスジーン配列がタンパク質またはペプチドをコードする、請求項３に記載の処方物。
【請求項１１】
前記タンパク質または前記ペプチドが、嚢胞性線維症膜貫通制御因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、ユートロフィン、血液凝固因子（凝固因子）（例えば、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、または凝固因子の高活性もしくは長時間半減期改変体、または凝固因子の活性形態もしくは不活性形態）、モノクローナル抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポイエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１または２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子αおよびβ、サイトカイン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンフォトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤抵抗性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）、ＳＥＲＣＡ２ａ、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ））、ＶＥＧＦ、マイクロジストロフィン、リソソーム酸リパーゼ、アリルスルファターゼＡおよびＢ、ＡＴＰ７ＡおよびＢ、免疫調節性を有するペプチド、免疫寛容誘発または免疫原性ペプチドまたはタンパク質ＴｒｅｇｉｔｏｐｅまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ  ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ：網膜色素変性症のＡＲ形態）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６聴覚消失）、ＡＣＨＭ  ２、３、および４（全色盲）、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症に関与する遺伝子産物（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、またはゲノム編集のための１つもしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集のための修復鋳型として用いられるドナー配列からなる群か��選択される、請求項１０に記載の処方物。
【請求項１２】
前記トランスジーンが、発現によりゲノムＤＮＡの転写、同族ｍＲＮＡの発現、またはＲＮＡの安定性もしくは半減期を調節する核酸をコードする、請求項３に記載の処方物。
【請求項１３】
前記核酸が抑制性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の処方物。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８からなる群から選択される血清型を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるか、またはＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８  ｖｐ１、ｖｐ２、および／もしくはｖｐ３キャプシド配列に少なくとも９５％同一のキャプシド配列を含む、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項１５】
前記空キャプシドまたは前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８からなる群から選択される血清型であるか、またはＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８  ｖｐ１、ｖｐ２、および／もしくはｖｐ３キャプシド配列に少なくとも９５％同一のキャプシド配列を含む、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項１６】
前記空キャプシドもしくは前記ウイルスゲノム含有キャプシドが、前記ウイルスベクターと比較して、インビボもしくはインビトロで細胞を形質導入する能力が低下しているか、または前記ウイルスベクターが、前記空キャプシドもしくは前記ウイルスゲノム含有キャプシドと比較して、インビボまたはインビトロで細胞を形質導入する能力がより高い、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項１７】
前記細胞が、肝臓、膵臓、肺、中枢神経系もしくは末梢神経系の細胞、脳もしくは脊椎（ｓｐｉｎｅ）細胞、腎臓、眼、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓の）、筋肉もしくは腰筋、または腸細胞、脂肪組織、筋肉、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、または唾液腺細胞、内耳神経細胞、または造血系細胞；または肝臓細胞、膵臓、肺、中枢神経系もしくは末梢神経系の細胞、脳もしくは脊椎細胞、腎臓、眼、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓の）、筋肉もしくは腰筋、もしくは腸細胞、脂肪組織、筋肉、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、もしくは唾液腺細胞、内耳神経細胞、もしくは造血系細胞へ発生もしくは分化する多能性前駆細胞もしくは複能性前駆細胞などの幹細胞を含む、請求項１６に記載の処方物。
【請求項１８】
前記細胞が、肝臓の肝実質細胞もしくは類洞内皮細胞、β島細胞、神経細胞、グリア細胞、もしくは上衣細胞、網膜細胞、内分泌細胞、白色、褐色、もしくはベージュ脂肪組織細胞、線維芽細胞、血球もしくはリンパ球；または肝実質細胞もしくは類洞内皮細胞、β島細胞、神経細胞、グリア細胞、もしくは上衣細胞、網膜細胞、内分泌細胞、白色、褐色、もしくはベージュ脂肪組織細胞、線維芽細胞、血球もしくはリンパ球へ発生もしくは分化する幹細胞、多能性前駆細胞もしくは複能性前駆細胞を含む、請求項１６に記載の処方物。
【請求項１９】
ウイルスベクターと空キャプシドの前記あらかじめ決められた比率（ウイルスベクター：空キャプシド）が、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１８、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、またはそれを超えるウイルスベクター  対  空キャプシドの比率である、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項２０】
ウイルスベクターと空キャプシドの前記あらかじめ決められた比率（ウイルスベクター：空キャプシド）が、約１：１０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１０００、１：１０００〜１：５，０００、１：５，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：２５，０００、１：２５，０００〜１：５０，０００、１：５０，０００〜１：１００，０００またはそれを超えるウイルスベクター  対  空キャプシドの比率である、請求項１または２に記載の処方物。
【請求項２１】
薬学的に許容され得る担体中に請求項１に記載の処方物を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
架橋されたＡＡＶ空キャプシドまたは架橋されたＡＡＶゲノム含有キャプシドを含むか、またはそれらからなる組成物。
【請求項２３】
架橋されたＡＡＶ空キャプシドまたは架橋されたＡＡＶゲノム含有キャプシドを含むか、またはそれらからなる薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ＡＡＶ空キャプシド、前記ＡＡＶゲノム含有キャプシド、またはＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８からなる群から選択される血清型を含むか、またはＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８  ｖｐ１、ｖｐ２、および／もしくはｖｐ３キャプシド配列に少なくとも９５％同一のキャプシド配列を含む、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
トランスジーンの細胞への形質導入を増大させるか、または改善するための方法であって、前記トランスジーンがウイルス遺伝子治療の目的で送達され、以下：
ａ）前記トランスジーンを含むウイルスベクターを細胞に投与するステップ；および
ｂ）空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を被験体に、前記トランスジーンの前記細胞への形質導入を増大させるか、または改善するのに有効な量で、投与するステップ、
を含む、方法。
【請求項２６】
トランスジーンを含むウイルスベクターに対する免疫応答を低下させるか、または抑制するための方法であって、以下：
ａ）前記トランスジーンを含むウイルスベクターを被験体に投与するステップ；および
ｂ）空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を前記被験体に、前記トランスジーンを含む前記ウイルスベクターに対する免疫応答を低下させるか、または抑制するのに有効な量で、投与するステップ、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記細胞が被験体内にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
トランスジーンを被験体の細胞に送達するための方法であって、有効量の請求項１または２に記載の処方物の、それを必要とする前記被験体への投与を含む、方法。
【請求項２９】
前記被験体が、前記ウイルスベクターに対する先在する免疫応答を有するか、または前記ウイルスベクターに対する免疫応答を発生する可能性が高い、請求項２６、２７、または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が、凝固障害を有し、かつ前記トランスジーンが凝固因子をコードする、請求項２６、２７、または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記凝固因子が、ヒトプロテインＣ、第ＶＩＩ因子、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはそれらの活性化形態である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２５、２６、または２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８からなる群から選択される血清型を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるか、またはＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、もしくはＡＡＶ−２ｉ８  ｖｐ１、ｖｐ２、および／もしくはｖｐ３キャプシド配列に少なくとも９５％同一のキャプシド配列を含む、請求項２５、２６、または２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記空キャプシドまたは前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来であるか、またはＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、もしくはＡＡＶ−２ｉ８  ｖｐ１、ｖｐ２、および／もしくはｖｐ３キャプシド配列に少なくとも９５％同一のキャプシド配列を含む、請求項２５、２６、または２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞がインビトロまたはインビボにあるものである、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、請求項２６、２７、または２８に記載の方法。
【請求項３７】
トランスジーン発現から利益を受けるだろう、またはトランスジーン発現を必要とする被験体にトランスジーンを送達するための方法であって、以下：
ａ）被験体由来の生物学的試料を測定して、ウイルスベクターに結合するか、またはウイルスベクターと反応するだろう抗体の存在および／または量を決定するステップ：
ｂ）前記ウイルスベクターに結合するか、または前記ウイルスベクターと反応する抗体を有する被験体を選択するステップ；
ｃ）選択された前記被験体に、トランスジーンを含むウイルスベクターを投与するステップであって、前記ウイルスベクターが前記被験体における前記抗体に結合するか、または前記抗体と反応する、ステップ；ならびに
ｄ）前記ウイルスベクターに結合するか、または前記ウイルスベクターと反応する前記生物学的試料中で測定される抗体の量に従って調整され、かつ前記ウイルスベクターに対する望まれない免疫応答を抑制するか、または低下させるように計算される量で、空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を、選択された前記被験体に投与するステップ、
を含む、方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターを含む、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記空キャプシド、前記ウイルスゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を含む、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記空キャプシド、前記ゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、前記ウイルスベクターの前に、またはそれと実質的に同時に、前記被験体に投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記空キャプシド、前記ゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、前記ウイルスベクターと混合され、そして前記被験体に投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４２】
投与される前記ウイルスベクター  対  前記空キャプシドまたは前記ゲノム含有キャプシドの比率が、約１：１０〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：１０００、１：１０００〜１：５，０００、１：５，０００〜１：１０，０００、１：１０，０００〜１：２５，０００、１：２５，０００〜１：５０，０００、１：５０，０００〜１：１００，０００の間またはそれを超えるウイルスベクター  対  空キャプシドまたはゲノム含有キャプシドの比率にある、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記トランスジーン配列がタンパク質またはペプチドをコードする、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記タンパク質または前記ペプチドが、嚢胞性線維症膜貫通制御因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、ユートロフィン、血液凝固因子（凝固因子）（例えば、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、または凝固因子の高活性もしくは長時間半減期改変体、または凝固因子の活性形態もしくは不活性形態）、モノクローナル抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポイエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１または２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子αおよびβ、サイトカイン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンフォトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤抵抗性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）、ＳＥＲＣＡ２ａ、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ））、ＶＥＧＦ、マイクロジストロフィン、リソソーム酸リパーゼ、アリルスルファターゼＡおよびＢ、ＡＴＰ７ＡおよびＢ、免疫調節性を有するペプチド、免疫寛容誘発または免疫原性ペプチドまたはタンパク質ＴｒｅｇｉｔｏｐｅまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ  ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ：網膜色素変性症のＡＲ形態）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６聴覚消失）、ＡＣＨＭ  ２、３、および４（全色盲）、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症に関与する遺伝子産物（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、またはゲノム編集のための１つもしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集のための修復鋳型として用いられるドナー配列からなる群か��選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記トランスジーンが、発現によりゲノムＤＮＡの転写、同族ｍＲＮＡの発現、またはＲＮＡの安定性もしくは半減期を調節する核酸をコードする、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸が抑制性ポリヌクレオチドを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体が、約５×１０１０のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約４．５×１０１１の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約５×１０１１  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体が、約５×１０１０のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約５×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約５．０５×１０１２  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が、約１×１０１１のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約９×１０１１の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１０×１０１１  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体が、約１×１０１１のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約１×１０１３の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１．０１×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が、約５×１０１１のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約２×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約２．５×１０１２  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が、約５×１０１１のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約４．５×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約５×１０１２  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体が、約５×１０１１のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約１×１０１３の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１．０５×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験体が、約１×１０１２のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約４×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約５×１０１２  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体が、約１×１０１２のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約９×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記被験体が、約２×１０１２のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約８×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記被験体が、約５×１０１２のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約５×１０１２の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験体が、約１×１０１３のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約１×１０１３の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約２×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項５９】
前記被験体が、約１×１０１３のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約４×１０１３の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約５×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験体が、約２×１０１３のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約４×１０１３の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約６×１０１３  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体が、約５×１０１３のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約５×１０１３の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約１×１０１４  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項６２】
前記被験体が、約１×１０１４のウイルスベクターゲノム／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）および／または約１×１０１４の空キャプシド／キログラム（ｃｐ／ｋｇ）、合計として、約２×１０１４  ｖｇ＋ｃｐ／ｋｇのウイルスベクター／キャプシド用量を投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスベクター、前記空キャプシド、前記ゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、全身性に、領域性に、もしくは局所性に、および／または注射を介して、注入を介して、もしくはカテーテルを介して投与される、請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項６４】
前記ウイルスベクター、前記空キャプシド、前記ゲノム含有キャプシド、または前記ウイルスキャプシドタンパク質が、静脈内に、動脈内に、眼内に、脳室内に、くも膜下腔内に、槽内に、腹腔内に、関節内に、筋肉内に、皮下に、頭蓋内に、局所的に、経皮的に、皮内に、光学的に、非経口的に（例えば、経粘膜）、経口的に（例えば、経口摂取または鼻腔内または吸入）、投与される請求項２５、２６、２８、または３７に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ  ｖｐ１、ｖｐ２、もしくはｖｐ３キャプシドタンパク質のいずれか、またはＡＡＶ  ｖｐ１、ｖｐ２、もしくはｖｐ３キャプシドタンパク質のいずれかの組み合わせを含む、請求項１もしくは２に記載の処方物、または請求項２５、２６、２８、もしくは３６に記載の方法。
【請求項６６】
ウイルスベクターに対する被験体の望ましくない免疫応答を低下させるか、または抑制するための処方物を調製するための方法であって、前記組成物は、以下：
ａ）ウイルスベクターに結合するか、またはウイルスベクターと反応するだろう、前記被験体由来の生物学的試料中に測定される抗体の量を伝達する情報を得るステップ；
ｂ）得られた前記情報に基づいて、前記被験体に投与された場合、前記ウイルスベクターに対する望まれない免疫応答を抑制するか、または低下させるように計算される空キャプシドの量を決定するステップ；および
ｃ）空キャプシドまたはゲノム含有キャプシドを含む処方物を調製するステップであって、前記処方物中の空キャプシドまたはゲノム含有キャプシドの量が、前記ウイルスベクターに結合するか、または前記ウイルスベクターと反応するだろう、前記生物学的試料中に測定される抗体の量に従って調整され、かつ前記被験体に投与された場合、前記ウイルスベクターに対する望まれない免疫応答を抑制するか、または低下させるように計算される、ステップ、
に従って調製される、方法。
【請求項６７】
トランスジーンを含むウイルスベクターに対する被験体の望ましくない免疫応答を低下させるか、または抑制するための処方物を調製するための方法であって、前記組成物は、以下：
ａ）前記被験体由来の生物学的試料を測定して、ウイルスベクターに結合するか、またはウイルスベクターと反応するだろう抗体の量を定量化するステップ；および
ｂ）空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を含む処方物を調製するステップであって、前記処方物中の空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質の量が、前記ウイルスベクターに結合するか、または前記ウイルスベクターと反応するだろう、前記生物学的試料中に測定される抗体の量に従って調整され、かつ前記被験体に投与された場合、前記ウイルスベクターに対する望まれない免疫応答を抑制するか、または低下させるように計算される、ステップ、
に従って調製される、方法。
【請求項６８】
トランスジーンから利益を受けるだろう、またはトランスジーンを必要としている被験体にトランスジーンを導入するための組成物を調製するための方法であって、前記組成物は、以下：
ａ）前記被験体由来の生物学的試料を測定して、ウイルスに結合するか、またはウイルスと反応する抗体の量を定量化するステップ；
ｂ）トランスジーンを含むウイルスベクターを提供するステップであって、前記ウイルスに結合するか、または前記ウイルスと反応する少なくとも１つの抗体がまた前記ウイルスベクターにも結合し、または前記ウイルスベクターと反応するように、前記ウイルスベクターが、少なくとも１つの抗原決定基を前記ウイルスと共有する、ステップ；および
ｃ）空キャプシドまたはウイルスゲノム含有キャプシドを含む処方物を調製するステップであって、前記処方物中の空キャプシドまたはウイルスゲノム含有キャプシドの量が、前記ウイルスベクターに結合するか、または前記ウイルスベクターと反応する抗体の量に従って調整され、かつ前記被験体に投与された場合、前記ウイルスベクターに対する望まれない免疫応答を抑制するか、または低下させるように計算される、ステップ、
に従って調製される、方法。
【請求項６９】
抗体の量が、１：１〜１：５、１：５〜１：１０、１：１０〜１：２５、１：２５〜１：５０、１：５０〜１：１００、１：１００〜１：２００、またはそれより高い範囲内の力価である、請求項２に記載の処方物、または請求項３７もしくは６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
抗体力価の量が、前記生物学的試料の希釈、ならびに、レポーターＡＡＶベクター、および前記レポーターＡＡＶベクターが形質導入して、レポーターを発現させることができる細胞との希釈された前記試料のインキュベーションによって決定される値であり、レポーターＡＡＶベクターとインキュベートされていない対照血清と比較して、前記レポーターのシグナルの５０％未満の抑制が起こる希釈度が前記値である、請求項２に記載の処方物。
【請求項７１】
抗体力価の量が、前記生物学的試料の希釈、ならびに、レポーターＡＡＶベクター、および前記レポーターＡＡＶベクターが形質導入して、レポーターを発現させることができる細胞との希釈された前記試料のインキュベーションによって決定される値であり、レポーターＡＡＶベクターとインキュベートされていない対照血清と比較して、前記レポーターのシグナルの５０％未満の抑制が起こる希釈度が前記値である、請求項３７または６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
試料中の抗体（力価）の量を決定する方法であって、以下：
ａ）試料を提供するステップ；
ｂ）前記試料を希釈するステップ；
ｃ）レポーターＡＡＶベクター、および前記レポーターＡＡＶベクターが形質導入して、レポーターを発現させることができる細胞と希釈された前記試料をインキュベートするステップ；
ｄ）血清とインキュベートされていない対照レポーターＡＡＶベクターと比較して、前記レポーターのシグナルを測定するステップ、
を含み、ここで、
レポーターＡＡＶとインキュベートされていない対照血清と比較して、前記レポーターのシグナルの５０％未満の抑制が起こる希釈度が、前記試料中の抗体（力価）の量を示す、方法。
【請求項７３】
試料が血清または血漿を含む、請求項２、６９、もしくは７０に記載の処方物、または請求項３７、６６〜６８、もしくは７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
レポーターＡＡＶウイルスで形質導入された前記細胞が、真核細胞を含む、請求項２、６９、もしくは７０に記載の処方物、または請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１２年８月１０日に出願された出願第６１／６８２，０１９号、２０１２年８月２６日に出願された出願第６１／６３９，０２５号および２０１１年１１月２２日に出願された出願第６１／５６２，７９５号（これら出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に明示的に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈおよびＨｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって付与された助成金第ＨＬ０７８８１０号の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に権利を有する。
【０００３】
本出願は、遺伝子治療および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ウイルス中和を緩和し、かつ望ましくない抗ＡＡＶ免疫応答を回避し、それにしたがって、治療用ポリヌクレオチドの効率的な血管内送達およびより予想可能な発現、ならびに存在する抗ベクター免疫の存在下における再投与の能力を提供するように処方されているアデノ随伴ウイルスベクターの組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
導入
アデノ随伴ウイルスは、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ亜科、ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属、ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ種のヘルパー依存性ウイルスである。それは、複製のためにヘルパーウイルスを必要とし、それゆえに、自然感染は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスの感染の状況において起こる。アデノ随伴ウイルスの感染が引き起こす病態は知られていない。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、主に遺伝的疾患の処置のために用いられる、スケーラブルで、効率的な非細胞変性遺伝子送達媒体である（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０１１；１２：３４１−３５５）。非分裂細胞を形質導入し、かつエピソーム的に持続するそれらの能力は、動物において長期のトランスジーン発現をもたらす。広範囲のヒト疾患の動物モデルが、ＡＡＶベクターによる処置に成功しており、その疾患には、脳、心臓、肺、眼、および肝臓の疾患が挙げられる（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０１１；１２：３４１−３５５）。血友病Ｂは、遺伝子移入ベクターの使用のアプローチしやすい標的であり、低くも第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）の野生型レベルの１〜２％の発現により治療効果が実現され得るからである（Ｈｉｇｈ  ＫＡ．、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００１；９５３：６４−７４）。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、インビボの遺伝子移入のための最も有望なウイルスベクターの一つである。近年、実験動物モデルおよびヒトにおけるいくつかの研究が、この治療プラットフォームの可能性を示した。特に、ＲＰＥ６５欠損症および血友病Ｂに冒されたヒトにおいて有効性データの確信が得られている。いくつかのＡＡＶに基づいた遺伝子移入製造物が、今、多くの適応症について臨床試験中であり、いくつかの場合では、臨床開発は、後期およびライセンス供与に向かいつつある。
【０００６】
様々な障害の処置へのＡＡＶに基づいた遺伝子治療アプローチの有望さにもかかわらず、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはＡＡＶベクターへの曝露後、免疫応答が起き、これらの防御応答は、ＡＡＶベクターの治療効力を限定する可能性がある。体液性応答（抗ＡＡＶ中和抗体またはＮＡｂ）は、ウイルス中和を生じる場合が多く、標的細胞のウイルス形質導入の有意な低下を引き起こし、それにより、送達される治療用ポリペプチドの量を制限する。抗ＡＡＶ中和抗体は、ＡＡＶベクターを効率的に中和する；これは、ヒト（Ｍａｎｎｏ  Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６；１２：３４２−３４７）、マウス（Ｓｃａｌｌａｎ  Ｃ．Ｄ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７：１８１０−１８１７）、および非ヒト霊長類（Ｊｉａｎｇ  Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８：３３２１−３３２８）において報告されている。ＡＡＶベクターに曝露された被験体は、全ての４つのＩｇＧサブクラスのＡＡＶキャプシドに対するＩｇＭおよびＩｇＧ応答を含む、体液性免疫応答を示した。臨床試験被験体におけるＡＡＶキャプシドに対するＩｇＧ応答は、先在する抗ＡＡＶ抗体のレベルに反比例し、ベクター用量とは無関係であった。ヒトはまた、天然で、野生型ＡＡＶに曝され、したがって、彼らは、全てのＡＡＶ血清型と交差反応する抗体を生じる。複雑にさせるさらなる要因は、ＮＡｂをスクリーニングするために現在、実施されているアッセイの感度があまり高くなく、それゆえに、これらのアッセイで陰性または低力価と判定される被験体でさえ、実際、ＡＡＶ形質導入をブロックするのに十分である低レベルの抗ＡＡＶ抗体を有する場合がある。
【０００７】
抗体応答に加えて、ＡＡＶベクターに曝露された個体はまた、ＡＡＶベクターキャプシドに対して特異的に向けられる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生じる（Ｌｉ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．４７５、２１７−２２１（２０１１）；Ａｒｒｕｄａ  Ｖ．Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１１５、４６７８−４６８８（２０１０）；Ｃｈｅｎ  Ｙ．Ｈら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５、１２１５−１２１８（２００９）；Ｂｏｕｔｉｎ  Ｓ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２１、７０４−７１２（２０１０）；Ｃａｌｃｅｄｏ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９、３８１−３９０（２００９））。これらのＣＴＬ応答は、ＡＡＶベクターを形質導入された細胞のクリアランスの原因であり、結果として、治療効力の制限が生じる。ＣＴＬ応答は、ベクター用量依存的な様式で引き起こされ（Ｌｉ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．４７５、２１７−２２１（２０１１）；Ｃｈｅｎ  Ｙ．Ｈら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５、１２１５−１２１８（２００９）；Ｃａｌｃｅｄｏ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９、３８１−３９０（２００９））、それゆえに、より低いベクター用量で高レベルの形質導入効率を達成することの重要性の根拠となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１１）１２：３４１〜３５５
【非特許文献２】Ｈｉｇｈ  ＫＡ．、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００１）９５３：６４〜７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
遺伝子治療専門家にとって難しいこととは、細胞形質導入を増加させるためにより高い力価のベクターを用いるという、第１の障壁への明らかな解決法が、抗ベクター応答の誘発および形質導入された細胞の破壊を回避するために全体的なベクター用量ができる限り低いことを必要とするという、第２の障壁の回避の成功を侵害する傾向があることである。したがって、前述の難点を改善または回避するＡＡＶベクターの処方の向上が大いに望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に従って、遺伝子治療を目的とする投与および遺伝子形質導入のためのウイルスベクター処方物が提供される。一実施形態において、処方物は、あらかじめ決められた比率のウイルスベクターと空キャプシドを含み、そのウイルスベクターが、トランスジーンを含み、かつ空キャプシドのあらかじめ決められる量が、前記患者において前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制するように計算される。別の実施形態において、処方物は、あらかじめ決められた比率のウイルスベクターとウイルスゲノム含有キャプシドを含み、そのウイルスベクターが、トランスジーンを含み、かつウイルスゲノム含有キャプシドのあらかじめ決められる量が、前記患者において前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制するように計算される。さらに別の実施形態において、処方物は、あらかじめ決められた比率のウイルスベクターとキャプシドタンパク質を含み、そのウイルスベクターがトランスジーンを含み、かつキャプシドタンパク質のあらかじめ決められる量が、前記患者において前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制するように計算される。
【００１１】
本発明に従って、ウイルスベクター処方物を用いることにより提供される、患者への遺伝子治療を目的とする遺伝子形質導入を増加または向上させる方法もまた、提供される。一実施形態において、方法は、トランスジーンを含むウイルスベクターを細胞に投与するステップ；および空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を、トランスジーンの細胞への形質導入を増加または向上させるのに有効な量で被験体に投与するステップを含む。別の実施形態において、方法は、あらかじめ決められた比率のウイルスベクターの投与と空キャプシドの投与を含み、そのウイルスベクターが、トランスジーンを含み、かつ空キャプシドのあらかじめ決められる量が、前記患者において前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制するように計算される。さらなる実施形態において、方法は、あらかじめ決められた比率のウイルスベクターとウイルスゲノム含有キャプシドの投与を含み、そのウイルスベクターが、トランスジーンを含み、かつウイルスゲノム含有キャプシドのあらかじめ決められる量が、前記患者において前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制するように計算される。さらに別の実施形態において、方法は、あらかじめ決められた比率のウイルスベクターとキャプシドタンパク質の投与を含み、そのウイルスベクターがトランスジーンを含み、かつキャプシドタンパク質のあらかじめ決められる量が、前記患者において前記処方物に対する望まれない免疫応答を抑制するように計算される。
【００１２】
本発明に従って、トランスジーンを含むウイルスベクターに対する免疫応答を低下させるか、または抑制するための方法がさらに提供される。一実施形態において、方法は、トランスジーンを含むウイルスベクターを被験体に投与するステップ；および空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質を、トランスジーンを含むウイルスベクターに対する免疫応答を低下させるか、または抑制するのに有効な量で被験体に投与するステップを含む。
【００１３】
そのような方法において、ウイルスベクターおよび空キャプシドは、別々に（例えば、逐次的に）投与することができ、ウイルスベクターおよびウイルスゲノム含有キャプシドは、別々に（例えば、逐次的に）投与することができ、ならびにウイルスベクターおよびキャプシドタンパク質は、別々に（例えば、逐次的に）投与することができる。そのような方法において、ウイルスベクターおよび空キャプシドは、同時に、または組み合わせとして投与することができ、ウイルスベクターおよびウイルスゲノム含有キャプシドは、同時に、または組み合わせとして投与することができ、ならびにウイルスベクターおよびキャプシドタンパク質は、同時に、または組み合わせとして投与することができる。
【００１４】
本明細書に開示された本発明の処方物、組成物、方法、および使用の特定の実施形態において、ウイルスベクターおよびキャプシド（空またはゲノム含有）またはキャプシドタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶキャプシドである。そのようなＡＡＶベクター、キャプシド（空またはゲノム含有）またはキャプシドタンパク質は、同一の、または異なる血清型であり得、任意の天然の、および非天然のＡＡＶ血清型であり得る。そのような非限定的血清型には、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８が挙げられる。
【００１５】
一態様において、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質は、改変されていない。別の態様において、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質は、細胞取り込みを低下させるか、または抑制するように改変されている。特別の態様において、キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質は、（例えば、化学的に）架橋され得、または改変され得る（受容体結合を低下させるためにアミノ酸残基が置換される）。さらなる特別の態様において、ウイルスエンベロープ（例えば、キャプシド）は、細胞受容体への結合（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合）を低下させるように改変される（例えば、変異している）。様々なそのような態様において、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質の改変されていない、または改変されたタンパク質（例えば、キャプシドタンパク質）は、トランスジーンを含有するウイルスベクターと比較して、受容体に結合する（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する）能力または（インビトロ、エクスビボ、またはインビボで）細胞を形質導入する能力が低下している。他のそのような態様において、トランスジーンを含有するウイルスベクターは、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質の改変されていない、または改変されたタンパク質（例えば、キャプシドタンパク質）と比較して、受容体に結合する（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する）能力または（インビトロ、エクスビボ、またはインビボで）細胞を形質導入する能力がより高い。
【００１６】
追加の態様において、ベクターおよびキャプシド（空またはゲノム含有）またはキャプシドタンパク質は、投与に適した生物学的に許容され得る担体中に存在する。様々な態様において、処方物の全身性、領域性、または局所性投与が用いられる。
【００１７】
トランスジーンを細胞へ送達するための方法であって、処方物の投与を必要とする患者への有効量の処方物の投与を含む方法もまた提供される。一実施形態において、患者は、代謝性または遺伝的障害を有し、トランスジーンは、その障害の１つ以上の症状を矯正し、または寛解させる治療用分子をコードする。
【００１８】
ＡＡＶの任意の血清型が、本発明の処方物および方法および使用に用いられてもよい。一つのアプローチにおいて、キャプシド（空またはゲノム含有）またはキャプシドタンパク質およびウイルスベクターは、同じ血清型由来である。別のアプローチにおいて、キャプシド（空またはゲノム含有）またはキャプシドタンパク質およびウイルスベクターは、ＡＡＶの異なる血清型から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、インビボでマウスおよび非ヒト霊長類において、ＡＡＶ空キャプシドが、抗ＡＡＶ  ＮＡｂによるベクター中和を防止することを示唆するデータを示す。（ａ）ＰＢＳのみを腹腔内（ＩＰ）に注射されたナイーブのマウス、または０．５ｍｇ、５ｍｇ、１５ｍｇ、もしくは５０ｍｇのＩＶＩｇをＩＰに受動免疫されたマウスにおける抗ＡＡＶ８抗体分析（群あたりｎ＝５）。免疫化から２４時間後、分析を実施した。中和抗体（Ｎａｂ）力価は、ＮＡｂアッセイにおいてレポーターベクターシグナルの＜５０％抑制が測定された逆数の血清希釈度を表す。積分強度は、バックグラウンド引き算後のドットブロットアッセイにおける平均ピクセル強度を表す；§、範囲；＃、最大シグナル強度に占めるパーセント。（ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）を、０．５ｍｇのＩＶＩｇで免疫し（結果として、１〜３のＮＡｂ力価を生じた）、またはＰＢＳを注射した（−）。２４時間後、動物は、単独での（０×）、または１０×過剰量のＡＡＶ８空キャプシド（１×１０１０ｃｐ（キャプシド粒子）（灰色棒）または５×１０１０ｃｐ（黒色棒））と共に処方された、１×１０９ｖｇ（ベクターゲノム）（灰色棒）または５×１０９ｖｇ（黒色棒）のＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクターのいずれかを受けた。ベクター送達後８週間目における血漿中のヒトＦ．ＩＸトランスジーンレベルは、平均として示されている；エラーバー、平均値の標準偏差。％残留発現は、ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターを受けたナイーブの動物におけるＦ．ＩＸトランスジーン血漿中レベルに対して計算される。＊、ナイーブマウスに対してｐ＜０．０５。（ｃ）動物あたり５×１０９ｖｇのベクター用量でのＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸ遺伝子移入後の１２週間目に収集されたマウス肝臓におけるベクター遺伝子コピー数。結果は、５つの肝臓の平均コピー数として示されている。エラーバー、平均値の標準偏差。実験群は、パネルｂにおいて示されたのと同じである。（ｄ）１×１０１２ｖｇ／ｋｇ（灰色棒）または２×１０１２ｖｇ／ｋｇ（黒色棒）の用量でＡＡＶ８−ｈＦ．ＩＸベクターを受けた雄アカゲザルにおける血漿中ヒトＦ．ＩＸレベル。動物は、ＰＢＳ中の（０×）、または過剰量の空ＡＡＶ８キャプシド（９×）中に処方された、ＡＡＶ８−ｈＦ．ＩＸベクターを受けた。結果は、４〜８週間目（週１回の測定）における血漿中のｈＦ．ＩＸレベルの平均として示されている。エラーバー、平均値の標準偏差。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、処置前のＮＡｂ力価に基づいた規定量での空キャプシドの添加が、抗ＡＡＶ抗体によりもたらされる遺伝子形質導入障壁を克服することができることを示唆するデータを示す。（ａ〜ｄ）０．５ｍｇ（ａ）、５．０ｍｇ（ｂ）、１５ｍｇ（ｃ）、または５０ｍｇ（ｄ）のＩＶＩｇで免疫され、かつ２４時間後に、５×１０９ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクターのみ（用量）、またはｙ軸に示されているような過剰の空キャプシド中に処方されたベクターを注射されたマウスにおける、％残留Ｆ．ＩＸトランスジーン発現。％残留発現は、ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターのみを受けたナイーブの動物におけるＦ．ＩＸトランスジーン産物の血漿中レベルに対して計算される。結果は、残留発現の平均として示されている（群あたりｎ＝５匹の動物）；エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、架橋された空ＡＡＶキャプシドが、インビトロおよびインビボでＮＡｂをブロックする能力を保持することを示唆するデータを示す。（ａ）ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ルシフェラーゼ、ＭＯＩ  １×１０３）を、ＩＶＩｇの３．２倍希釈溶液と、単独で（０×）、または過剰の、未処理（黒色線）の、もしくは架橋された（赤色線）空ＡＡＶ８キャプシド（１０×、１００×、または１０００×  ＭＯＩ）の存在下で、インキュベートした。％抑制を、バックグラウンド引き算後の、ＩＶＩｇとインキュベートされていないＡＡＶ８−ルシフェラーゼベクターについてのレポーターシグナルの強度に対して決定した。（ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）を、０．５ｍｇのＩＶＩｇで受動免疫し（結果として、１〜３のＮＡｂ力価を生じた）、またはＰＢＳを注射した（−）。２４時間後、動物は、単独での（０×）、または１０×過剰量の未処理の（黒色棒、１０×）、もしくは架橋された（赤色棒、１０×  架橋）ＡＡＶ８空キャプシドと共に処方された、５×１０９ｖｇのＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクターを受けた。結果は平均として示され、エラーバーは平均値の標準偏差を表す。％残留発現は、ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターのみを受けたナイーブの動物におけるＦ．ＩＸトランスジーン産物のレベルに対して計算される。＊、ナイーブの動物におけるベクター単独に対してｐ＜０．０５。（ｃ、ｄ）Ｑ−ＰＣＲにより決定された遺伝子移入から２週間後のマウスの肝臓におけるベクターゲノムのコピー数（ｎ＝５／群）。（ｃ）二倍体ゲノムあたりのＡＡＶ−ＧＦＰベクターゲノムコピー数。（ｄ）二倍体ゲノムあたりのＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターゲノムコピー数。全ての動物は、５×１０９ｖｇのＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクターを単独で（白色棒、ＧＦＰなし）か、または５×１０１０ｖｇの未処理のＡＡＶ８−ＧＦＰベクターと共に（黒色棒、ＧＦＰ）か、または５×１０１０ｖｇの架橋されたＡＡＶ８−ＧＦＰベクターと共に（赤色棒、架橋  ＧＦＰ）かのいずれかで、受けた。結果は平均として表現されており、エラーバーは平均値の標準偏差を表す。＊、未処理のＧＦＰベクターに対してｐ＜０．０５。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、ＡＡＶベクターの架橋が、結果として、細胞侵入の障害、ならびにヒト樹状細胞による結合および取り込みの低下を生じることを示唆するデータを示す。（ａ）ＨＨＬ５ヒト肝実質細胞における未処理のＡＡＶベクターおよび架橋されたＡＡＶベクターの内部移行。細胞を、ＡＡＶ２ベクターで１×１０５のＭＯＩで１時間、処理し、その後、抗ＡＡＶ２モノクローナル抗体Ａ２０で細胞内染色した。ゲートおよび％は、細胞内に局在したＡＡＶシグナルの量を示す。（ｂ）ＨＨＬ５ヒト肝実質細胞でのＣＴＬアッセイ。標的細胞を、未処理の、または架橋されたＡＡＶベクターの増加性ＭＯＩにおいて、一晩、形質導入し、１０：１のエフェクター：標的比でＡＡＶ特異的エフェクター細胞とインキュベートした。％細胞傷害性は、バックグラウンド引き算後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘで標的を処理することにより得られた最大細胞溶解に対して計算される。（ｃ、ｄ）ヒト単球由来ＤＣに、未処理の、または架橋されたＡＡＶ２ベクターを１×１０５のＭＯＩで形質導入し、その後、抗ＡＡＶ２抗体Ａ２０およびＤＲＡＱ５（ｃ）または抗ＣＤ７１抗体（ｄ）で細胞内染色した。（ｃ）ベクター内部移行。上方パネル、ベクターは緑色で示され、赤色での核染色。どちらのベクターについても、収集された少なくとも５０００個のうちの１個の代表的な細胞が示されている。ＣＨ１、明視野；ＣＨ２  ベクター；ＣＨ５  核；ＣＨ２／５  オーバーレイ。ヒストグラムプロットは、未処理のＡＡＶおよび架橋されたＡＡＶについての１時間後（上部パネル）および４時間後（下部パネル）の内部移行したＡＡＶのパーセントを示す。（ｄ）形質導入から４時間後の初期エンドソームにおけるベクターの共局在。上方パネル、ベクターは緑色で示され、紫色でのエンドソーム染色。どちらのベクターについても、収集された少なくとも５０００個のうちの１個の代表的な細胞が示されている。ＣＨ１、明視野；ＣＨ２  ベクター；ＣＨ３  エンドソーム；ＣＨ２／３  オーバーレイ。ドットプロット：ゲートおよびパーセント値は、エンドソーム染色およびベクター染色についてダブルポジティブな細胞を示す。ヒストグラム：ゲートおよびパーセント値は、ベクターおよびエンドソームについての染色が共局在しているドットプロットにおいてゲーティングされた細胞を示す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｄは、ＡＡＶベクターの架橋が、結果として、細胞侵入の障害、ならびにヒト樹状細胞による結合および取り込みの低下を生じることを示唆するデータを示す。（ａ）ＨＨＬ５ヒト肝実質細胞における未処理のＡＡＶベクターおよび架橋されたＡＡＶベクターの内部移行。細胞を、ＡＡＶ２ベクターで１×１０５のＭＯＩで１時間、処理し、その後、抗ＡＡＶ２モノクローナル抗体Ａ２０で細胞内染色した。ゲートおよび％は、細胞内に局在したＡＡＶシグナルの量を示す。（ｂ）ＨＨＬ５ヒト肝実質細胞でのＣＴＬアッセイ。標的細胞を、未処理の、または架橋されたＡＡＶベクターの増加性ＭＯＩにおいて、一晩、形質導入し、１０：１のエフェクター：標的比でＡＡＶ特異的エフェクター細胞とインキュベートした。％細胞傷害性は、バックグラウンド引き算後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘで標的を処理することにより得られた最大細胞溶解に対して計算される。（ｃ、ｄ）ヒト単球由来ＤＣに、未処理の、または架橋されたＡＡＶ２ベクターを１×１０５のＭＯＩで形質導入し、その後、抗ＡＡＶ２抗体Ａ２０およびＤＲＡＱ５（ｃ）または抗ＣＤ７１抗体（ｄ）で細胞内染色した。（ｃ）ベクター内部移行。上方パネル、ベクターは緑色で示され、赤色での核染色。どちらのベクターについても、収集された少なくとも５０００個のうちの１個の代表的な細胞が示されている。ＣＨ１、明視野；ＣＨ２  ベクター；ＣＨ５  核；ＣＨ２／５  オーバーレイ。ヒストグラムプロットは、未処理のＡＡＶおよび架橋されたＡＡＶについての１時間後（上部パネル）および４時間後（下部パネル）の内部移行したＡＡＶのパーセントを示す。（ｄ）形質導入から４時間後の初期エンドソームにおけるベクターの共局在。上方パネル、ベクターは緑色で示され、紫色でのエンドソーム染色。どちらのベクターについても、収集された少なくとも５０００個のうちの１個の代表的な細胞が示されている。ＣＨ１、明視野；ＣＨ２  ベクター；ＣＨ３  エンドソーム；ＣＨ２／３  オーバーレイ。ドットプロット：ゲートおよびパーセント値は、エンドソーム染色およびベクター染色についてダブルポジティブな細胞を示す。ヒストグラム：ゲートおよびパーセント値は、ベクターおよびエンドソームについての染色が共局在しているドットプロットにおいてゲーティングされた細胞を示す。
【図４−３】図４Ａ〜４Ｄは、ＡＡＶベクターの架橋が、結果として、細胞侵入の障害、ならびにヒト樹状細胞による結合および取り込みの低下を生じることを示唆するデータを示す。（ａ）ＨＨＬ５ヒト肝実質細胞における未処理のＡＡＶベクターおよび架橋されたＡＡＶベクターの内部移行。細胞を、ＡＡＶ２ベクターで１×１０５のＭＯＩで１時間、処理し、その後、抗ＡＡＶ２モノクローナル抗体Ａ２０で細胞内染色した。ゲートおよび％は、細胞内に局在したＡＡＶシグナルの量を示す。（ｂ）ＨＨＬ５ヒト肝実質細胞でのＣＴＬアッセイ。標的細胞を、未処理の、または架橋されたＡＡＶベクターの増加性ＭＯＩにおいて、一晩、形質導入し、１０：１のエフェクター：標的比でＡＡＶ特異的エフェクター細胞とインキュベートした。％細胞傷害性は、バックグラウンド引き算後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘで標的を処理することにより得られた最大細胞溶解に対して計算される。（ｃ、ｄ）ヒト単球由来ＤＣに、未処理の、または架橋されたＡＡＶ２ベクターを１×１０５のＭＯＩで形質導入し、その後、抗ＡＡＶ２抗体Ａ２０およびＤＲＡＱ５（ｃ）または抗ＣＤ７１抗体（ｄ）で細胞内染色した。（ｃ）ベクター内部移行。上方パネル、ベクターは緑色で示され、赤色での核染色。どちらのベクターについても、収集された少なくとも５０００個のうちの１個の代表的な細胞が示されている。ＣＨ１、明視野；ＣＨ２  ベクター；ＣＨ５  核；ＣＨ２／５  オーバーレイ。ヒストグラムプロットは、未処理のＡＡＶおよび架橋されたＡＡＶについての１時間後（上部パネル）および４時間後（下部パネル）の内部移行したＡＡＶのパーセントを示す。（ｄ）形質導入から４時間後の初期エンドソームにおけるベクターの共局在。上方パネル、ベクターは緑色で示され、紫色でのエンドソーム染色。どちらのベクターについても、収集された少なくとも５０００個のうちの１個の代表的な細胞が示されている。ＣＨ１、明視野；ＣＨ２  ベクター；ＣＨ３  エンドソーム；ＣＨ２／３  オーバーレイ。ドットプロット：ゲートおよびパーセント値は、エンドソーム染色およびベクター染色についてダブルポジティブな細胞を示す。ヒストグラム：ゲートおよびパーセント値は、ベクターおよびエンドソームについての染色が共局在しているドットプロットにおいてゲーティングされた細胞を示す。
【図５】図５は、ＡＡＶ５８５／８変異体（ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａの二重変異体）が、野生型ＡＡＶ２（ＡＡＶ２）と比較して、インビトロで細胞を形質導入する能力の障害を示したことを示唆するデータを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＡＡＶベクターで、０（０Ｋ、ウイルスなし対照）、１００００（１０Ｋ）、５００００（５０Ｋ）、または１０００００（１００Ｋ）の感染の多重度（ＭＯＩ）において一晩、形質導入した。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメーターを用いてＧＦＰについて分析した。各条件についての％ＧＦＰ陽性細胞は、ヒストグラムプロット内に示されている。ＡＡＶ２−ＧＦＰ対照と比較して、ＡＡＶ５８５／８−ＧＦＰベクター変異体は、インビトロでの形質導入効率の著しい減少を示した。
【図６】図６は、大過剰量のＡＡＶ５８５／８空キャプシドが、インビトロでのＡＡＶ８ベクターの形質導入を抑制しないことを示唆するデータを示す。ＨＥＫ２９５細胞を、ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ８ベクターで形質導入した。ベクターを、以下の可変量のＡＡＶ５８５／８空キャプシドと混合した：ＡＡＶ８−ルシフェラーゼベクターの量の０倍（０×、空キャプシドなしの対照）、１０倍（１０×）、１００倍（１００×）、および１０００倍（１０００×）。ルシフェラーゼ活性を、ルミノメーターを用いて、形質導入から２４時間後、測定した。結果は、相対的光単位（ＲＬＵ）として表現され、棒は、三連の試験の平均および標準偏差を表す。研究された条件のいずれにおいても、形質導入の有意な抑制は観察されなかった。
【図７】図７は、ＡＡＶ５８５／８空キャプシドが、インビトロで、ＡＡＶベクターを抗ＡＡＶ抗体媒介性中和から保護することを示唆するデータを示す。ルシフェラーゼを発現するレポーターＡＡＶ８ベクターを、単独での（０×）、または増加性量のＡＡＶ５８５／８空キャプシド（１０×、１００×、１０００×ＡＡＶ８−ルシフェラーゼベクターの量）の存在下での、プールされた正常血漿（ＦＡＣＴ血漿、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ）の増加性希釈溶液と、インキュベートした。３７℃での１時間のインキュベーション後、ベクターを用いて、インビトロでＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。パーセント抑制は、レポーターベクターが、プールされた血漿の代わりに培地のみとインキュベートされた対照に対して測定された。増加性量のＡＡＶ５８５／８空キャプシドの添加が、ＡＡＶ８−ルシフェラーゼベクターを抗体媒介性中和から保護している。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ＡＡＶ５８５／８空キャプシドが、インビボで、ＡＡＶベクターを抗ＡＡＶ抗体媒介性中和から保護するが、それらが、肝臓を効率的には形質導入しないことを示唆するデータを示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝４／５）は、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）を発現するＡＡＶ８−ＦＩＸ１６ベクターを５Ｅ９ｖｇ／マウスの用量で受けた。１つの群（ＩＶＩＧ「−」）を除き、全ての実験群は、ベクター注射の２４時間前に、精製されたヒトＩｇＧ（ＩＶＩＧ）を腹腔内に受けた（ＩＶＩＧ「＋」）。ＡＡＶ８−ＦＩＸ１６ベクターを、単独で（空「−」）、１０００倍過剰量のＡＡＶ８空キャプシドと混合して（空「ＡＡＶ８  １０００×」）、または１０００倍過剰量のＡＡＶ５８５／８空キャプシドと混合して（空「ＡＡＶ５８５／８  １０００×」）、または１０倍過剰量のＡＡＶ５８５／８空キャプシドと混合して（空「ＡＡＶ５８５／８  １０×」）、与えた。ＡＡＶ８−ＦＩＸ１６ベクターは、単独で与えられた場合、ＩＶＩＧによって効率的に中和された。ＡＡＶ５８５／８空キャプシドは、１０×および１０００×の過剰量において、ＡＡＶ８−ＦＩＸ１６ベクターを、形質導入効率を抑制することなく、抗体媒介性中和から保護した。逆に、１０００×過剰量のＡＡＶ８空キャプシドは、おそらく受容体結合競合のために、ＡＡＶ８−ＦＩＸ１６形質導入の抑制を生じた。（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝４）は、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）を発現するＡＡＶ８−ＦＩＸ１９ベクターを１Ｅ１１ｖｇ／マウスの用量で受けた。一方の群は、ＡＡＶ２−ＦＩＸ１９ベクターを受け、他方の群は、変異体ＡＡＶ５８５／８−ＦＩＸ１９ベクターを受けた。変異体ベクターはマウス肝臓を形質導入しない。
【図９】図９は、ＡＡＶ５８５／８キャプシド抗原がＭＨＣクラスＩ上に効率的には提示されないことを示唆するデータを示す。増加性ＭＯＩのＡＡＶ２ベクター対照またはＡＡＶ５８５／８ベクターで形質導入されたヒト肝実質細胞標的細胞を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイにおける標的として用いた。ＨＬＡ適合ＣＴＬを、インビトロでＡＡＶ抗原に対して増殖させ、アッセイにおいてエフェクター細胞として用いた。ＡＡＶ５８５／８変異体に関して、高域のＭＯＩにわたって殺害は観察されなかった。アッセイにおける水平線は、細胞培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＣＴＬ媒介性細胞溶解の尺度としてアッセイにおいて用いられた）のバックグラウンド放出を表す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、抗ＡＡＶ  ＩｇＧの検出について、ドットブロットアッセイのＥＬＩＳＡアッセイとの比較を示す。両方のアッセイにおいて、抗ＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体を用いた。ＥＬＩＳＡについて、ウェルを、１ｍｇ／ｍｌのＡＡＶキャプシドでコーティング緩衝液において、一晩、コーティングした。ブロッキング後、ＦＡＣＴ血漿の段階希釈溶液を、各ウェルに加え、４℃で一晩、インキュベートした。結合したＩｇＧの検出を、１：１，０００の希釈度で用いられるＨＲＰコンジュゲート化抗体で行った。（ａ、ｃ）抗ＡＡＶ２  ＩｇＧ（ａ）および抗ＡＡＶ８  ＩｇＧ（ｃ）の検出のためのドットブロットアッセイ。プロットは、デンシトメトリーによって測定される平均強度を表す；各ＦＡＣＴ希釈度におけるドットブロットの代表的な写真も示されている。（ｂ、ｄ）抗ＡＡＶ２抗体（ｂ）および抗ＡＡＶ８抗体（ｄ）ＥＬＩＳＡアッセイ。プロットは、各所定のＦＡＣＴ希釈度における光学密度（ＯＤ）を表す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＡＡＶ空キャプシドが、抗ＡＡＶ  ＮＡｂによるベクター中和を防止するが、莫大な過剰である場合だけ、インビトロでの形質導入を抑制しないことを示唆するデータを示す。（ａ）ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ルシフェラーゼ、ＭＯＩ  １×１０３）を単独で（緑色の線）、または過剰の空ＡＡＶ８キャプシド（１０×、１００×、または１０００×そのＭＯＩ）の存在下で、ＩＶＩｇの３．２倍希釈溶液とインキュベートした。％抑制は、ＩＶＩｇとインキュベートされていないＡＡＶ８−ルシフェラーゼベクターについてのレポーターシグナルの強度と比較して決定された。（ｂ）ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターのインビトロでの形質導入の効率への空キャプシドの効果。ＭＯＩ  １×１０３；過剰の空キャプシドの量は、そのＭＯＩに対する倍数としてｘ軸に示されている。ＲＬＵ、相対的光単位。（ｃ）血友病Ｂを有するヒト被験体由来の血清の中和活性への、過剰量（５×、１０×、５０×、１００×）の空ＡＡＶ８キャプシドの添加の効果；アッセイは、パネルＡにおいてＩＶＩｇについて記載されているように、実施された。
【図１２】図１２は、代わりの（非同一の）ＡＡＶ血清型由来の空キャプシドが、ＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸをＮＡｂ中和から保護することを示す。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）を、０．５ｍｇのＩＶＩｇ（１：１）で受動免疫し、またはＰＢＳを腹腔内に注射した（−）。２４時間後、動物は、単独での（−）、または１０×過剰量のＡＡＶ８、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ５の空キャプシドと共に処方された、５×１０９ｖｇのＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクターを受けた。結果は、平均として示され、エラーバーは平均値の標準偏差を表す。％残留発現は、ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターのみを受けたナイーブの動物におけるＦ．ＩＸトランスジーン産物レベルに対して計算されている。＊、ナイーブの動物におけるベクターのみに対してｐ＜０．０５。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｃは、架橋されたＡＡＶキャプシド調製物の特徴づけを示す。（ａ）未処理の（ｕ）、またはホルムアルデヒドで架橋された（ｘ）ＡＡＶベクターの変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて銀染色により、キャプシド構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２、およびＶＰ−３が示されている。２つのベクター調製物が示され、どちらの場合も、未処理のベクターは、架橋溶液中のホルムアルデヒドの添加を除けば、架橋されたベクターと同じ正確な架橋段階を受けた。各調製物について、約１×１０１０ｃｐをウェル上に負荷した。（ｂ）未処理の、または架橋されたＡＡＶ２−ＧＦＰベクターで１×１０４のＭＯＩにおいて２４時間、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現。フローサイトメトリーによって分析されたＧＦＰ＋細胞の％が示されている。（ｃ）架橋キャプシドの抗ＡＡＶ２  Ａ２０抗体による認識。架橋されたＡＡＶ２キャプシドがモノクローナル抗体Ａ２０によって認識されるかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液中の抗体の１：５００希釈溶液でコーティングした。ブロッキング後、様々な量（ｘ軸）の未処理のＡＡＶ２、架橋されたＡＡＶ２、またはＡＡＶ８（陰性対照）をプレート上に負荷した。ウイルスの結合を、ＩＶＩｇの１：５００希釈溶液を加え、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ鎖抗体（１：１０００、Ｃａｌｔａｇ）を加えることにより検証した。結果は、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）読み取り（ｙ軸）として報告されている。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｃは、架橋されたＡＡＶキャプシド調製物の特徴づけを示す。（ａ）未処理の（ｕ）、またはホルムアルデヒドで架橋された（ｘ）ＡＡＶベクターの変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて銀染色により、キャプシド構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２、およびＶＰ−３が示されている。２つのベクター調製物が示され、どちらの場合も、未処理のベクターは、架橋溶液中のホルムアルデヒドの添加を除けば、架橋されたベクターと同じ正確な架橋段階を受けた。各調製物について、約１×１０１０ｃｐをウェル上に負荷した。（ｂ）未処理の、または架橋されたＡＡＶ２−ＧＦＰベクターで１×１０４のＭＯＩにおいて２４時間、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現。フローサイトメトリーによって分析されたＧＦＰ＋細胞の％が示されている。（ｃ）架橋キャプシドの抗ＡＡＶ２  Ａ２０抗体による認識。架橋されたＡＡＶ２キャプシドがモノクローナル抗体Ａ２０によって認識されるかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液中の抗体の１：５００希釈溶液でコーティングした。ブロッキング後、様々な量（ｘ軸）の未処理のＡＡＶ２、架橋されたＡＡＶ２、またはＡＡＶ８（陰性対照）をプレート上に負荷した。ウイルスの結合を、ＩＶＩｇの１：５００希釈溶液を加え、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ鎖抗体（１：１０００、Ｃａｌｔａｇ）を加えることにより検証した。結果は、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）読み取り（ｙ軸）として報告されている。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡＡＶ空キャプシドの推定の作用機構を示す。ＩＶＩｇで受動免疫されたマウスは、単独での、または増加性量の空ＡＡＶキャプシドと共に処方されたＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクターを受けた（ａ）。血漿中のＩｇＧ：キャプシド複合体をアッセイした。アッセイにおける標準曲線として、ＩＶＩｇとインキュベートされた既知量のＡＡＶ８キャプシドを用いた（ｂ）。ベクター投与後、ＩＶＩｇで予備免疫されなかったマウスの血漿において、免疫複合体は検出できなかった（ｃ、列１）。ベクターのみ、またはベクターと空キャプシドを受けた、ＩＶＩｇ注射された動物において、ＩｇＧ：キャプシド複合体が、増加性量で検出可能であった（ｃ、列２〜６）。抗キャプシド抗体の空ＡＡＶキャプシドによる吸収は、結果として、マウスにおいて抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価の用量依存性降下を生じ（ａ）、さらに、増加性レベルのｈＦ．ＩＸトランスジーン発現を生じた（ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に開示された本発明は、ＡＡＶベクター（トランスジーンを有する活性ＡＡＶベクター）の処方物における、ＡＡＶ空キャプシド（ゲノムを有さず、および／または細胞に侵入できないように改変もしくは架橋され得る不活性ＡＡＶ）または（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシドの処方物、方法、および使用を含む。この様式で用いられるＡＡＶ空キャプシドまたは（ウイルス）ゲノム含有キャプシドは、中和抗体（ＮＡｂ）によって結合されるベクターデコイとして働き、それにしたがって、中和抗体が（トランスジーンを含有する）ＡＡＶベクターを中和することを妨げ、その結果として、ＡＡＶベクターが、例えば血流を通して、細胞に送達される場合、優れた遺伝子導入効率を生じる。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子治療」は、疾患、一般的には遺伝性疾患を処置するための、核酸配列（例えば、遺伝子）の個体の細胞および／または組織への挿入であり、欠陥のある変異対立遺伝子が、機能性遺伝子と置き換えられ、またはそれで補われる。血液凝固障害、うっ血性心不全などの後天性疾患は、遺伝子治療に適している。遺伝子治療にはまた、天然において抑制性である核酸、すなわち、望ましくないまたは異常な（例えば、病原性）遺伝子またはタンパク質などの内因性遺伝子またはタンパク質の発現、活性、または機能を抑制し、減少させるか、または低下させるポリヌクレオチドの挿入が挙げられる。
【００２２】
パルボウイルス科由来の「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡのゲノムを有する小さいウイルスである。これらのウイルスは、それらが、細胞に貫入し、核酸／遺伝子材料を、例えば、１９番染色体上の特定の部位に、導入することができるため、遺伝子治療ベクターとして有用である。ＡＡＶはヒトにおいて病原性疾患と関連していないため、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶ病変形成を引き起こすことなく、ヒト患者へ治療用タンパク質および作用物質を送達することができる。
【００２３】
「ＡＡＶベクター」または単に「ベクター」は、野生型ＡＡＶゲノムを除去して、治療用遺伝子発現カセットなどの本来ではない核酸と置き換える分子的方法を用いることにより、野生型ＡＡＶから導かれる。典型的には、野生型ＡＡＶゲノムの末端逆位配列は、ＡＡＶベクター内に保持される。ＡＡＶベクターは、そのウイルスゲノムの全部または一部がトランスジーンと置き換えられており、そのトランスジーンが、ＡＡＶ核酸配列に関して本来ではない核酸であるため、ＡＡＶと区別される。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「空ウイルス」または「空キャプシド」は、ゲノムを含有しない（ゆえに、用語「空」）。対照的に、「（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシド」は、ゲノム、典型的にはウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）を含有する。空キャプシドは、それらが、無傷（ゲノム含有ウイルスベクター）ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、ＡＡＶ）と反応する１つ以上の抗体と反応するという点で、ウイルス様粒子である。例えば、空ＡＡＶ８キャプシドは、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ８ベクター、または別のＡＡＶ血清型などのＡＡＶに結合する１つ以上の抗体と反応する能力を保持する。例えば、空ＡＡＶ２キャプシドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ８ベクターに結合する１つ以上の抗体と反応する能力を保持する。
【００２５】
空（またはゲノム含有）キャプシドは、細胞に侵入する能力を保持する可能性があるが、細胞に侵入することは必要とされず、例えば、空（またはゲノム含有）キャプシドのキャプシドタンパク質配列を改変または架橋することは、その改変された、または架橋されたキャプシドの細胞に侵入する能力を低下させる。それゆえに、そのような空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質は、トランスジーンを含むウイルスベクターと比較して、細胞への結合が低下している可能性がある。したがって、空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質は、改変されなくてもよいし、改変されて、トランスジーンを含むウイルスベクターと比較して、細胞への結合が低下していてもよい。特別の実施形態において、空キャプシド、ウイルスゲノム含有キャプシド、またはウイルスキャプシドタンパク質は、架橋剤で処理されるか、またはＡＡＶ受容体への結合の低下もしくは減少を示す変異型キャプシドを含む。特別の態様において、変異型キャプシドは、非荷電もしくは疎水性残基で置換されている、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合に寄与する１つもしくは複数のアルギニン（Ｒ）残基を含むか、または１つもしくは複数のアルギニン（Ｒ）残基が以下の位置のいずれかにおいて置換されている、ＡＡＶ２などの任意のＡＡＶを含む：４５１、４４８、５３０、５８５、または５８８（例えば、以下の位置のいずれかで置換されている１つ以上のアルギニン（Ｒ）残基：４５１でシステインと、４４８でシステインと、５３０でアラニンと、５８５でアラニンと、または５８８でアラニンと）。位置５８５および５８８に示されたＲ置換なしおよび有りの、置換される可能性がある代表的な位置（４５１、４４８、５３０、５８５、および５８８）を示す代表的なＡＡＶ（ＡＡＶ２）キャプシド配列は以下の通りである：
【００２６】
【化１】
2014534245.tif 000003
【００２７】
空ＡＡＶまたは空キャプシドは、ＡＡＶベクター調製物において時々自然に見出される。そのような自然な混合物は、本発明に従って用いることができ、または必要に応じて、空キャプシドおよび／もしくはベクターの量を増加または減少させるように操作することができる。例えば、空キャプシドの量は、被験体においてベクター媒介性遺伝子導入に用いられることを意図されるＡＡＶベクターと反応する抗体の抑制効果を低下させることが予想される量に調整することができる。
【００２８】
空キャプシドはまた、ＡＡＶベクター調製物とは無関係に産生することができ、必要に応じて、ＡＡＶベクター調製物に加え、または被験体に別々に投与することができる。空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質を、決められた品質および量で作製および精製することができ、任意で、例えば、被験体におけるＡＡＶ抗体力価または血清型に従って調整し、それらの意図された目的に従って、用い、または投与することができる。
【００２９】
空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質は、ウイルスベクターに対する抗体に結合するか、またはそれと反応し、それにより、ウイルスベクターに対する免疫応答を低下させるようにデコイとして機能すると考えられている。そのようなデコイは、ウイルスベクターに対して向けられた抗体を吸収するように働き、それにより、そのような抗体との関連において、細胞のウイルスベクタートランスジーンの形質導入（トランスジーンの導入）を増加または向上させ、次に、遺伝子転写物および／またはコードされたタンパク質の細胞発現を増加させる。
【００３０】
用語「結合する」、「結合すること」、または「と反応する」とは、抗体、または空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、もしくはキャプシドタンパク質が分子レベルで相互作用することを意味する。したがって、抗体に結合するか、またはそれと反応する空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質は、その抗体と分子レベルで相互作用する。
【００３１】
本明細書で開示されているように、異なる血清型の空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質は、特別の血清型に対する抗体と交差反応性である。それゆえに、例えば、ＡＡＶ２などの所定のＡＡＶ血清型に対する抗体はまた、１つ以上の他のＡＡＶ血清型にも結合する可能性がある。したがって、ＡＡＶ２空キャプシド、（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質などの所定のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ−１、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８などの異なる天然の、または非天然のＡＡＶ血清型と組み合わせて、本発明の処方物または方法または使用に用いることができる。同様に、ＡＡＶ８空キャプシド、（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシド、またはキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ−１、２、−３、−４、−５、−６、−７、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、またはＡＡＶ−２ｉ８などの異なる天然の、または非天然のＡＡＶ血清型と組み合わせて、本発明の処方物または方法または使用に用いることができる。
【００３２】
「血清型」は、伝統的には、別のウイルスと比較しての、１つのウイルスに対する抗体の間での交差反応性の欠如に基づいて定義される。そのような交差反応性の差は、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基の差による（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の差による）。伝統的な定義によれば、血清型は、目的のウイルスが、中和活性について、全ての存在し、かつ特徴づけられた血清型に特異的な血清に対して試験されており、かつ目的のウイルスを中和する抗体が見出されていないことを意味する。より多くの天然のウイルス分離株が発見され、キャプシド変異体が生じているため、現在存在する血清型のいずれかと血清学的差がない場合もあるし、いずれとも差がある場合もある。したがって、新しいＡＡＶが血清学的差を有しない場合、この新しいＡＡＶは、対応する血清型の亜群または改変体である。多くの場合、中和活性についての血清学試験はなお、キャプシド配列改変を有する変異ウイルスに対して、それらが、血清型の伝統的な定義に従って別の血清型であるかどうかを決定するために実施されなければならない。したがって、便宜上、かつ繰り返しを避けるために、用語「血清型」は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）と、加えて、所定の血清型の亜群または改変体内にあり得る、血清学的に異ならないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を幅広く指す。
【００３３】
例として、ＡＡＶは、様々な天然および非天然の血清型を含む。そのような非限定的血清型には、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、およびＡＡＶ−２ｉ８が挙げられる。この場合もやはり、便宜上、血清型は、異なる血清型であると完全には特徴づけられておらず、実際、現に、既知の血清型の亜群または改変体を構成する可能性がある、キャプシド配列改変を有するＡＡＶを含む。
【００３４】
本明細書に示されているようなＡＡＶのベクター、空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、またはＡＡＶ−２ｉ８  ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３キャプシド配列のいずれかと少なくとも８０％またはそれ以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）同一の配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれらの部分配列を有するものを含む。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、またはＡＡＶ−２ｉ８についてのそのようなキャプシド配列は、当技術分野において知られている。
【００３５】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、またはＡＡＶ−２ｉ８を含むＡＡＶのベクター、空キャプシド、ゲノム含有キャプシド、および配列関連ＡＡＶベクターは、機能性ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接された１つ以上の異種性ポリヌクレオチド配列（トランスジーン）を含むように、当業者に知られている組換え技術を用いて構築することができる。異種性ポリヌクレオチドの組み入れは、そのＡＡＶを組換えベクターと定義し、それは、「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。そのようなベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つまたは複数、例えば、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を全部または一部、欠失し得るが、ＡＡＶベクター粒子のレスキュー、複製、およびパッケージングのために必要に応じて、少なくとも１つの機能性隣接ＩＴＲ配列を保持し得る。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルス複製およびパッケージングのためにシスに必要とされる配列（例えば、機能性ＩＴＲ）を含む。
【００３６】
「架橋」は、タンパク質鎖間に共有結合を確立するために用いられる化学的、物理学的、または生物学的手順であって、そうでない場合は分離する。非限定的例には、ホルムアルデヒド処理、および二官能性物質での誘導体化が挙げられる。一般的に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、５ｍＭ  ３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。本発明による空キャプシド、（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシド、およびキャプシドタンパク質は、架橋することができ、架橋されたキャプシドまたはキャプシドタンパク質は、ベクター処方物の構成要素であり得る。
【００３７】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む全ての型の核酸、オリゴヌクレオチドを指すように、本明細書で交換可能に用いられる。ポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡ、ならびにスプライスされた、またはスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ならびに抑制性ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小分子または低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子または低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドには、天然の、合成の、および意図的に変更または改変されたポリヌクレオチド、加えて、類似体および誘導体が挙げられる。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、直鎖状または環状であり得、任意の長さであり得る。
【００３８】
「異種性」ポリヌクレオチドは単に、細胞へのポリヌクレオチドのＡＡＶ媒介性移入／送達を目的とした、ＡＡＶに挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種性ポリヌクレオチドは、典型的には、ＡＡＶ核酸とは異なり、すなわち、ＡＡＶ核酸に関して「外来のものである」。いったん細胞へ移入／送達されると、ｒＡＡＶビリオン内に含有された異種性ポリヌクレオチドは、発現することができる（例えば、転写され、適切な場合には、翻訳され得る）。あるいは、ｒＡＡＶビリオン内に含有された、細胞中の移入／送達される異種性ポリヌクレオチドは、発現する必要はない。用語「異種性」は、本明細書で、常にポリヌクレオチドに関連して用いられるとは限らないが、修飾成句「異種性」がない場合でさえも、ポリヌクレオチドへの言及は、その省略にもかかわらず、異種性ポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
「ポリヌクレオチド配列」によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、天然のタンパク質と同様に、完全長未変性配列、加えて、機能性部分配列、改変型、または配列バリアント（ただし、その部分配列、改変型、またはバリアントが、未変性の完全長タンパク質のある程度の機能を保持する限り）を含む。本発明の方法および使用において、ポリヌクレオチド配列によってコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質、およびペプチドは、処置される哺乳動物において欠陥があり、または発現が不十分もしくは欠損している内因性タンパク質と同一であり得るが、同一であることを必要とはされない。
【００４０】
ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞およびその子孫へ安定的に、または一過性に導入／送達するために用いることができる。用語「トランスジーン」は、ウイルスベクターを経由して、細胞または生物体へ導入することができるそのような異種性ポリヌクレオチドを便宜上、指すように用いられる。トランスジーンは、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子、抑制性ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）へ転写されるポリヌクレオチド、または転写されないポリヌクレオチド（例えば、転写を駆動するプロモーターなどの発現調節エレメントを欠く）などの任意のポリヌクレオチドを幅広く含む。例えば、トランスジーンを有する細胞において、そのトランスジーンは、細胞のベクター（例えば、ＡＡＶ）媒介性「形質転換」によって導入／移入されている。トランスジーンが導入されている細胞またはその子孫は、「形質転換細胞」または「形質転換体」と呼ばれる。典型的には、トランスジーンは、形質転換体の子孫に含まれ、または細胞から発生する生物体の一部になる。したがって、（例えば、細胞または組織または器官細胞などの哺乳動物における）「形質転換された」または「トランスフェクションされた」細胞は、外因性分子、例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク質（例えば、トランスジーン）の細胞への組み入れ後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「トランスフェクションされた」または「形質転換された」細胞は、例えば、外因性分子が導入されている細胞、またはその子孫である。その細胞（複数可）は、増殖することができ、導入されたタンパク質が発現することができ、または核酸が転写され得る。
【００４１】
形質転換され得る細胞には、任意の起源（例えば、中胚葉、外胚葉、または内胚葉）の、任意の組織または器官型の細胞を含む。細胞の非限定的例には、肝臓（例えば、肝実質細胞、類洞内皮細胞（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ））、膵臓（例えば、β島細胞）、肺、脳（例えば、神経系細胞、グリア細胞、または上衣細胞）もしくは脊椎などの中枢もしくは末梢神経系、腎臓、眼（例えば、網膜、細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓の）、筋肉もしくは腰筋、または腸（例えば、内分泌）、脂肪組織（白色、褐色、またはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、または造血系（例えば、血液またはリンパ）の細胞が挙げられる。追加の例として、肝臓（例えば、肝実質細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、β島細胞）、肺、脳（例えば、神経系細胞、グリア細胞、または上衣細胞）もしくは脊椎などの中枢もしくは末梢神経系、腎臓、眼（網膜、細胞成分）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心臓の）、筋肉もしくは腰筋、または腸（例えば、内分泌）、脂肪組織（白色、褐色、またはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、または造血系（例えば、血液またはリンパ）の細胞へ発生または分化する多能性または複能性前駆細胞などの幹細胞が挙げられる。
【００４２】
一実施形態における「治療用分子」は、細胞または被験体におけるタンパク質の欠如または欠陥に起因する症状を軽減し得、または低下させ得るペプチドまたはタンパク質である。あるいは、トランスジーンによってコードされる「治療用」ペプチドまたはタンパク質は、被験体に利益、例えば、遺伝的欠陥を矯正すること、遺伝子（発現または機能）欠損を補正すること、または抗癌効果を与えるものである。治療用ペプチドおよびタンパク質には、嚢胞性線維症膜貫通制御因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、ユートロフィン、血液凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎまたはｃｌｏｔｔｉｎｇ）因子（例えば、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、Ｂドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、または凝固因子の高活性もしくは長時間半減期改変体、または凝固因子の活性形態もしくは不活性形態）、モノクローナル抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポイエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１または２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子αおよびβ、サイトカイン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンフォトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤抵抗性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）、ＳＥＲＣＡ２ａ、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ））、ＶＥＧＦ、マイクロジストロフィン、リソソーム酸リパーゼ、アリルスルファターゼＡおよびＢ、ＡＴＰ７ＡおよびＢ、免疫調節性を有するペプチド、免疫寛容誘発または免疫原性ペプチドまたはタンパク質ＴｒｅｇｉｔｏｐｅまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ  ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ：網膜色素変性症のＡＲ形態）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６聴覚消失）、ＡＣＨＭ  ２、３、および４（全色盲）��ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症に関与する遺伝子産物（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、またはゲノム編集のための１つもしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集のための修復鋳型として用いられるドナー配列、ならびに治療効果を必要とする被験体において治療効果を生じる任意の他のペプチドまたはタンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４３】
トランスジーンによってコードされるさらなる例示的な治療用ペプチドまたはタンパク質には、疾患または障害の処置に用いられ得るものが挙げられ、その疾患または障害には、嚢胞性線維症（および肺の他の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、地中海貧血症、貧血および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかんおよび他の神経学的障害、癌、糖尿病、筋肥大（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、糖原貯蔵障害および他の代謝性欠陥、網膜変性疾患（および眼の他の疾患）、ならびに実質臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４４】
本明細書に示されているように、ポリヌクレオチド配列（トランスジーン）は、抑制性およびアンチセンス核酸配列を含む。抑制性、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を調節することができる。そのような分子には、疾患過程の媒介に関与する標的遺伝子の発現を抑制し、それにより、疾患の１つ以上の症状を低下させ、抑制し、または軽減することができるものが挙げられる。
【００４５】
アンチセンスには、ＲＮＡ転写物またはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を結合する、一本鎖、二本鎖、または三本鎖ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。標的遺伝子の転写開始部位由来の、例えば、開始点から−１０の位置と＋１０の位置の間の、オリゴヌクレオチドは、もう一つの特別な例である。三重鎖形成アンチセンスは、二本鎖ＤＮＡに結合し、それにより、その遺伝子の転写を抑制することができる。「ＲＮＡｉ」は、遺伝子発現を抑制するための、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ配列の使用である（例えば、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７（１９９８）；およびＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６（１９９８））。したがって、標的遺伝子をコードする領域由来の二本鎖ＲＮＡ配列を、本発明の方法および使用に従って遺伝子発現／転写を抑制または阻止するために用いてもよい。アンチセンスおよびＲＮＡｉは、哺乳動物およびヒトのＨＴＴをコードする核酸などの標的遺伝子配列（例えば、ＨＴＴ）をコードする核酸に基づいて作製することができる。例えば、一本鎖または二本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ＨＴＴ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を標的にすることができる。
【００４６】
「ｓｉＲＮＡ」は、配列特異的な、転写後の遺伝子サイレンシングまたは遺伝子ノックダウンについてのＲＮＡ干渉過程に関与する治療用分子を指す。ｓｉＲＮＡは、標的にされる遺伝子の同族ｍＲＮＡの配列との相同性を有する。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インビトロで合成することができ、またはより長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって作製することができ、配列特異的ｍＲＮＡ分解の介在物質である。ｓｉＲＮＡまたは本発明の他のそのような核酸は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成することができる。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的供給業者には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）が挙げられる。標的遺伝子のｍＲＮＡを抑制するための特異的なｓｉＲＮＡ構築物は、１５〜５０ヌクレオチド長の間であり得、より典型的には、約２０〜３０ヌクレオチド長である。そのような核酸分子は、当業者に知られた通常の方法を用いて本明細書に開示されたウイルスベクターへ容易に組み入れることができる。
【００４７】
本発明に従って抑制性核酸配列で標的にされ得る遺伝子（例えば、ゲノムＤＮＡ）または病原性遺伝子の転写物（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の特別の非限定的例には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子などのポリヌクレオチド反復疾患に関連した病原性遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症に関連した遺伝子（例えば、アトロフィン１、ＡＴＮ１）；球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン−１、−２、−３、および−７、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によってコードされるＣａｖ２．１  Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アタキシン８逆ストランド（ＡＴＸＮ８ＯＳとも呼ばれる）、脊髄小脳失調症（１型、２型、３型、６型、７型、８型、１２型、１７型）におけるセリン／トレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ  ５５ｋＤａ制御サブユニットＢβアイソフォーム、脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋緊張性ジストロフィーにおけるミオトニンプロテインキナーゼ（ＭＴ−ＰＫ）；フリードライヒ失調症におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の発病に関与する遺伝子；アポリポプロテインＢ（ＡＰＯＢ）およびプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｏｌｏｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶ  Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶ  ＴＡＲ、ＨＩＶ  ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染におけるＣ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ＲＳＶ感染におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオキャプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的ミクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）；腎臓移植におけるｐ５３、急性腎損傷、もしくは臓器移植後臓器機能障害、または急性腎不全における腎損傷；進行型再発性または転移性固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、ＬＭＰ２別名プロテアソームサブユニットβ９型（ＰＳＭＢ  ９）、転移性黒色腫；ＬＭＰ７、別名プロテアソームサブユニットβ８型（ＰＳＭＢ  ８）、転移性黒色腫；ＭＥＣＬ１、別名プロテアソームサブユニットβ１０型（ＰＳＭＢ  １０）、転移性黒色腫；固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシンスピンドルタンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制因子Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝臓腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性大腸腺腫性ポリポーシスにおけるβ−カテニン；β２アドレナリン受容体��緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢性黄斑変性症におけるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１、別名ＤＡＮ損傷誘発性転写物４タンパク質；加齢性黄斑変性症または脈絡膜新生血管における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ  Ｎ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器多核体ウイルス感染における呼吸器多核体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおける遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）様トーシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）、移植におけるｐａｎ−ｃｌａｓｓ  ＩおよびＨＬＡ対立遺伝子特異的；または常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、組換えＡＡＶベクターなどのウイルスベクターの修飾成句としての、加えて、組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドなどの配列の修飾成句としての用語「組換え」は、一般的に天然では生じない様式で、組成物がマニピュレートされている（すなわち、操作されている）ことを意味する。組換えＡＡＶの特別の例は、正常には野生型ＡＡＶに存在しないポリヌクレオチドがＡＡＶ粒子および／またはゲノム内にある場合である。例えば、組換えポリヌクレオチドの特別の例は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、トランスジーン）が、正常にはその遺伝子がＡＡＶゲノム内で付随している５’領域、３’領域、および／またはイントロン領域の有り、または無しで、ベクターへクローニングされる場合である。用語「組換え」は、本明細書で常にＡＡＶベクター、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチドなどの配列に関して用いられるとは限らないが、いかなるそのような省略にもかかわらず、ＡＡＶおよびＡＡＶベクター、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む配列の組換え型が明確に含まれる。
【００４９】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳調節配列を有し得る核酸セグメントを指し、それは、宿主細胞または生物体においてポリペプチドコード配列の発現を促進する。
【００５０】
発現調節は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルにおいてもたらされ得る。用語「発現調節エレメント」は、それが作動可能に連結されている核酸配列の発現を制御または影響する１つ以上の核酸配列エレメントを指す。発現調節エレメントは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、遺伝子サイレンサー、タンパク質コード遺伝子の直前の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）などを含むことができる。典型的には、転写を調節する発現調節エレメントは、転写されるトランスジーンの５’末端の近く（すなわち、「上流」）に並置している。発現調節エレメントはまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）に、または転写物内に（例えば、イントロン中に）位置することができる。発現調節エレメントは、転写されるトランスジーンからある距離（例えば、そのポリヌクレオチドから１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、５０００〜１０，０００またはそれ以上のヌクレオチド）を隔てて、さらにかなりの距離を隔ててでも、位置することができる。とは言え、ＡＡＶベクターについてのポリヌクレオチドの長さの制限により、そのような発現調節エレメントは、典型的には、トランスジーンから１〜１０００ヌクレオチド内である。
【００５１】
核酸配列に作動可能に連結された発現調節エレメントは、その核酸配列の転写、および必要に応じて、翻訳を調節する。用語「作動可能に連結された」とは、言及される構成要素が、それらがそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。典型的には、発現調節エレメントは、遺伝子の５’末端または３’末端に並置しているが、イントロン的でもあり得る。
【００５２】
発現調節エレメントおよびプロモーターには、本明細書で「組織特異的発現調節エレメント／プロモーター」と呼ばれる、特別の組織型または細胞型において活性があるものが挙げられる。組織特異的発現調節エレメントは、典型的には、特定の細胞または組織（例えば、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜、または肺）において活性がある。発現調節エレメントは、典型的には、これらの細胞、組織、または器官において活性があり、特定の細胞型、組織型、または器官型に固有である転写アクチベータータンパク質または転写の他の制御因子によってそれらが認識されるからである。
【００５３】
発現調節エレメントはまた、制御可能である様式での発現を与えることができ、すなわち、シグナルまたは刺激が、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を増加または減少させる。シグナルまたは刺激に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を増加させる制御可能なエレメントはまた、「誘導性エレメント」（すなわち、シグナルによって誘導される）とも呼ばれる。特別な例として、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。シグナルまたは刺激に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を減少させる制御可能なエレメントは、「抑圧性エレメント」（すなわち、シグナルが発現を減少させ、それゆえに、シグナルが除去されるか、または存在しない場合、発現は増加する）と呼ばれる。典型的には、そのようなエレメントによって与えられる増加または減少の量は、存在するシグナルまたは刺激の量に比例する；シグナルまたは刺激の量が多ければ多いほど、発現の増加または減少は大きくなる。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語「（複数の）プロモーター」または「プロモーター」は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことができる。プロモーターは、好ましくは、隣接するＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合の発現した組換え産物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現した組換え産物の量を増加させる。１つの生物体由来のプロモーターは、別の生物体に由来するＤＮＡ配列からの組換え産物発現を増強するために利用することができる。例えば、脊椎動物プロモーターは、脊椎動物においてクラゲＧＦＰの発現のために用いられてもよい。加えて、１つのプロモーターエレメントは、直列に付着した複数のＤＮＡ配列について発現した組換え産物の量を増加させることができる。それゆえに、１つのプロモーターエレメントは、１つ以上の組換え産物の発現を増強することができる。複数のプロモーターエレメントが、当業者によく知られている。
【００５５】
一実施形態において、高レベルの構成的発現が望まれる。そのような発現調節エレメントには、多くの異なる細胞型においてトランスジーンの発現を駆動する能力がある遍在性の、または乱交雑性のプロモーター／エンハンサーが挙げられる。そのようなエレメントには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、および様々な哺乳動物細胞型において活性のある他のウイルスプロモーター／エンハンサー、または天然には存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
別の実施形態において、誘導性プロモーターが望まれる場合がある。誘導性プロモーターは、シスかまたはトランスのいずれかで、外因的に供給された化合物によって制御されるものであり、それには、非限定的に、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；テトラサイクリン抑圧性系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導性系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８（１９９８）も参照））；ＲＵ４８６誘導性系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）］；およびラパマイシン誘導性系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８−１０３２（１９９６））が挙げられる。この関連において有用であり得る他の型の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期により、または複製細胞においてのみ、制御されるものである。
【００５７】
別の実施形態において、目的のトランスジーンまたは核酸配列についての本来のプロモーターが用いられる。トランスジーンまたは核酸配列の発現が本来の発現を模倣するべきであることが望まれる場合、本来のプロモーターが好ましくあり得る。トランスジーンまたは他の核酸配列の発現が、時間的に、もしくは発生的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して、制御されなければならない場合、本来のプロモーターが用いられ得る。さらなる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の本来の発現調節エレメントもまた、本来の発現を模倣するために用いられ得る。
【００５８】
一実施形態において、組換えウイルスゲノムは、組織特異的プロモーター（例えば、肝臓、骨、筋肉、網膜細胞、脳または神経系組織、膵臓、心臓、腎臓などの細胞または組織において活性があるプロモーター）に作動可能に連結されたトランスジーンを含む。例えば、骨格筋における発現が望まれる場合には、筋肉において活性のあるプロモーターが用いられ得る。これらには、骨格α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、加えて、天然のプロモーターより高い活性を有する合成の筋肉プロモーターが挙げられる。Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４１−２４５（１９９９）参照。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６）；骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７）］；骨シアロタンパク質、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１：６５４−６４（１９９６））；リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α（ａ）鎖）；ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３）；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１）；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５）］について知られている。異なるプロモーター由来のエレメントの組み合わせによって、または合成ＤＮＡ配列の開発によって得られる合成プロモーターもまた用いることができる。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、用語「（複数の）エンハンサー」または「エンハンサー」は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置し、またはコードＤＮＡ配列（例えば、組換え産物（複数可）へ転写または翻訳されるＤＮＡ配列）の下流に、もしくはその内部に位置することができる。したがって、エンハンサーエレメントは、組換え産物をコードするＤＮＡ配列の１００塩基対、２００塩基対、または３００塩基対またはそれ以上、上流または下流に位置することができる。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントにより提供される発現の増加より上に、ＤＮＡ配列から発現する組換え産物の量を増加させることができる。複数のエンハンサーエレメントが、当業者にとって容易に入手可能である。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「核酸」または「核酸分子」は、直鎖かまたは環状のいずれかの形をとる、一本鎖かまたは二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、および一本鎖である場合には、その相補的配列の分子を指す。核酸分子を論じることにおいて、特別の核酸分子の配列または構造は、配列を５’から３’の方向に提供する通常の慣習に従って本明細書で記載されてもよい。本発明の核酸に関連して、用語「単離された核酸」が時々、用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物体の天然のゲノムにおいてそれが直接、近接している配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターへ挿入されるか、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物体のゲノムＤＮＡへ組み込まれるＤＮＡ分子を含んでもよい。
【００６１】
「ベクター」は、別の遺伝的配列またはエレメント（ＤＮＡかまたはＲＮＡのいずれか）が付着して、その結果、その付着した配列またはエレメントの複製をもたらす、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）などのレプリコンである。
【００６２】
用語「形質転換する」、「トランスフェクションする」、「形質導入する」は、核酸（トランスジーン）が細胞または宿主生物体へ導入される任意の方法または手段を指し、同じ意味を伝えるために交換可能に用いられてもよい。遺伝子治療の使用および方法について、形質転換される細胞は被験体内にあり得る。被験体内の細胞は、インビボで、本明細書に示されているようなトランスジーンで形質転換することができる。あるいは、細胞は、インビトロで、トランスジーンで形質転換することができ、その後、処置をもたらすために被験体の組織へ移植することができる。あるいは、初代細胞単離物または樹立細胞株がトランスジーンで形質転換することができ、その後、任意で、被験体の組織へ移植されてもよい。そのような方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、ＰＥＧ融合などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
導入される核酸は、レシピエント細胞または生物体の核酸へ組み込まれて（共有結合性に連結されて）もよいし、組み込まれなくてもよい。例えば、細菌、酵母、植物、および哺乳動物の細胞において、導入された核酸は、エピソームエレメントとして、またはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持されてもよい。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物体の核酸（ゲノムＤＮＡ）へ組み込まれた状態になって、その細胞または生物体において安定的に維持され、さらに、レシピエント細胞または生物体の子孫細胞または子孫生物体へ伝えられ、または遺伝してもよい。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物体において一過性でのみ、存在してもよい。
【００６４】
用語「選択可能なマーカー遺伝子」は、発現した場合、抗生物質抵抗性などの選択可能な表現型を、形質転換された細胞または植物へ与える遺伝子を指す。「レポーター」遺伝子は、検出可能なシグナルを提供する遺伝子である。レポーター遺伝子の非限定的例は、ルシフェラーゼ遺伝子である。
【００６５】
用語「作動可能に連結された」とは、コード配列の発現に必要な制御配列が、ＤＮＡ分子において、トランスジーン（例えば、タンパク質コード配列または抑制性核酸）に対して、トランスジーン配列の発現をもたらすように、適切な位置に置かれることを意味する。この同じ定義が、発現ベクターにおける転写ユニットおよび他の転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に時々、適用される。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明の配列、プライマー、およびプローブを指し、２つ以上のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子として定義され、好ましくは３つより多い。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な因子に、ならびにオリゴヌクレオチドの特別な適用および使用に依存する。
【００６７】
句「特異的にハイブリダイズする」とは、当技術分野において一般的に用いられるあらかじめ決められた条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な（時々、「実質的に相補的な」と呼ばれる）配列の２つの一本鎖核酸分子の間での会合を指す。特に、その用語は、オリゴヌクレオチドの非相補的な配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを実質的に除外した、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、用語「プライマー」は、適切な環境に置かれた場合、鋳型依存性核酸合成のイニシエーターとして機能的に働くことができる、制限酵素消化によって生成される生物学的系に由来するか、または合成的に作製されるかのいずれかの、一本鎖かまたは二本鎖のいずれかの、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。適当な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、ならびに適切な温度およびｐＨなどの条件と共に提供された場合、プライマーは、ポリメラーゼまたは同様の活性の作用によるヌクレオチドの付加によってその３’末端で伸長され、プライマー伸長産物を生じ得る。プライマーは、その適用の特別な条件および要求に依存して長さが変わり得る。例えば、診断適用において、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５ヌクレオチド長またはそれ以上である。プライマーは、所望の伸長産物の合成をプライムするために所望の鋳型への十分な相補性をもたなければならず、すなわち、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に用いられる、適当に並置した、プライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な様式で、所望の鋳型鎖とアニールすることができる。プライマー配列が、所望の鋳型の正確な相補体を表すことは必要とはされない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、別の相補的なプライマーの５’末端に付着してもよい。あるいは、伸長産物の合成のために鋳型−プライマー複合体を機能的に提供するのに所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有する条件で、非相補的塩基が、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在してもよい。
【００６９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、および第４，９６５，１８８号に記載されており、その特許の全開示は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００７０】
用語「単離された」は、天然で付随しているだろう他の化合物から十分、分離されている、化合物または複合体を指し得る。「単離された」とは、他の化合物もしくは材料との人工的もしくは合成的混合物、または基本的な活性もしくは次のアッセイに干渉せず、および、例えば、不完全な精製もしくは安定剤の添加により、存在する可能性がある、不純物の存在を排除することを意図するものではない。
【００７１】
用語「免疫応答」は、脊椎動物被験体の免疫系による、抗原または抗原決定基に対する任意の応答を指すことを意図される。例示的な免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）および細胞性免疫応答（例えば、リンパ球の活性化または増殖）が挙げられる。
【００７２】
本発明の方法は、分裂細胞および非分裂細胞の両方を含む幅広い範囲の宿主細胞へ異種性核酸配列（トランスジーン）を送達する（形質導入する）ための手段を提供する。本発明のベクターおよび他の試薬、方法、ならびに薬学的処方物は、さらに、処置の方法として、タンパク質、ペプチド、または治療用核酸を、それを必要とする被験体に投与する方法において有用である。したがって、この様式において、タンパク質、ペプチド、または核酸は、インビボで被験体において産生され得る。被験体はそのタンパク質もしくはペプチドが欠損しているという理由により、または被験体におけるそのタンパク質もしくはペプチドの産生が、処置の方法もしくは別の方法として、いくらかの治療効果を与え得るという理由により、被験体は、そのタンパク質もしくはペプチドから利益を得る可能性があり、またはそれを必要としている場合がある。あるいは、例えば、癌またはアテローム性動脈硬化または神経変性疾患の処置について、例えば、治療効果を達成するために、疾患過程に関与する標的遺伝子の発現または産生を抑制するか、または低下させることが望ましい場合がある。
【００７３】
一般的に、発明の処方物、方法、および使用は、遺伝子発現に関係した任意の障害に関連した症状を処置し、または寛解させるために、生物学的効果を有する任意の核酸（トランスジーン）を送達するのに用いられてもよい。実例となる疾患状態には以下が挙げられるが、それらに限定されない：嚢胞性線維症（および肺の他の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、地中海貧血症、貧血および他の血液凝固障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかんおよび他の神経学的障害、癌、糖尿病、筋肥大（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、糖原貯蔵障害および他の代謝性欠陥、ポンペ病、うっ血性心不全、網膜変性疾患（および眼の他の疾患）、ならびに実質臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患など。
【００７４】
加えて、発明の処方物、方法、および使用は、癌、感染性疾患、および関節リウマチなどの自己免疫疾患に関連した症状を処置し、または寛解させる有益な生物学的効果を与えることが知られているモノクローナル抗体またはその断片をコードする核酸を送達するために用いられてもよい。
【００７５】
遺伝子移入は、様々な疾患状態について治療を提供するために用いられる。欠陥遺伝子が知られており、かつクローニングされている多くの遺伝性疾患がある。場合によっては、これらのクローニングされた遺伝子の機能が知られている。一般的に、上記の疾患状態は、２つのクラス：一般的に劣性様式で遺伝する、通常、酵素の、欠損状態、および優性様式で遺伝する、少なくとも時々、制御タンパク質または構造タンパク質に関わる不均衡状態に分類される。欠損状態の疾患について、遺伝子移入は、補充療法として正常な遺伝子を冒された組織へ運ぶために、加えて、アンチセンス変異を用いてその疾患についての動物モデルを作製するために、用いることができる。不均衡な疾患状態について、遺伝子移入は、モデル系において疾患状態を引き起こすために用いることができ、その後、そのモデル系は、その疾患状態に対抗しようとする試みに用いることができる。このように、発明の処方物、方法、および使用は、遺伝的疾患の処置を可能にする。本明細書で用いられる場合、疾患状態は、その疾患を引き起こし、またはそれをより重症にさせる欠損または不均衡を部分的に、または全体的に治すことにより処置される。変異を引き起こすための、または欠陥を矯正するための核酸配列の部位特異的組込みの使用もまた可能である。
【００７６】
本発明は、ヒトおよび獣医学の両方の医学的適用において有用である。適切な被験体には、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。本明細書で用いられる場合、用語「哺乳動物」には、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、それらに限定されない。ヒト被験体が最も好ましい。ヒト被験体には、胎児、新生児、乳児、若年、および成人の被験体が挙げられる。
【００７７】
特別の実施形態において、本発明は、薬学的に許容され得る担体中のベクターおよび／または空キャプシドもしくは（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシド、または他の医学的作用物質、薬学的作用物質、担体、補助剤、希釈剤などを含む薬学的組成物を提供する。注射について、担体は、典型的には液体である。他の投与方法について、担体は、無菌の、発熱物質を含まない水、または無菌の、発熱物質を含まないリン酸緩衝食塩水などの固体または液体のいずれでもよい。吸入投与について、担体は、呼吸用であり、好ましくは、固体または液体の粒子状の形をとる。注射用媒体として、安定化剤、塩もしくは食塩水、および／または緩衝剤などの、注射用溶液についての通常の添加物を含有する水が挙げられ得る。
【００７８】
他の実施形態において、本発明は、薬学的に許容され得る担体中のＡＡＶプロウイルスがゲノムへ組み込まれている細胞、または他の医学的作用物質、薬学的作用物質、担体、補助剤、希釈剤などを含む薬学的組成物を提供する。そのような細胞は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで作製することができる。
【００７９】
「薬学的に許容され得る」とは、生物学的に、または別なふうに望ましくないということがない材料を意味し、例えば、その材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、被験体に投与され得る。したがって、そのような薬学的組成物は、例えば、ウイルス粒子または細胞を直接被験体に、典型的には静脈内投与によって投与することにおいて、用いられてもよい。
【００８０】
本明細書で用いられる場合、「治療的有効な」量は、疾患状態に関連した症状の少なくとも１つを軽減する（例えば、緩和する、減少させる、低下させる）のに十分である量である。代わりの言い方をすれば、「治療的有効な」量は、被験体の状態においていくらかの改善を与えるのに十分である量である。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載された発明の処方物を用いての、インビボでの投与方法または被験体を処置する方法である。ベクターの、空キャプシドまたは（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシドまたはキャプシドタンパク質と別々での、または組み合わせての、それを必要とする被験体（例えば、ヒト）または動物への投与は、ウイルスベクターを投与するための、当技術分野において知られた任意の手段によることができる。
【００８２】
例示的な投与様式には、経口的（例えば、経口摂取、頬、または舌下）、直腸、経粘膜的、局所的、経皮的（局所的）、吸入、非経口的（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および関節内）、腔内、頭蓋内、脊髄内の投与など、加えて、直接的な組織または器官への注射（腺内、器官内、リンパ管内、肺内）、あるいは、くも膜下腔内、直接的筋肉内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、心内膜心筋、眼内の注射、または血管内送達が挙げられる。あるいは、例えば、全身性様式よりむしろ、局所性様式でウイルスを投与してもよい。
【００８３】
本発明の特別の実施形態において、トランスジーンは、被験体の肝臓に送達される。肝臓への投与は、当技術分野において知られた任意の方法により達成されてもよく、その方法には、静脈内投与、門脈内投与、胆管内（ｉｎｔｒａｂｉｌａｒｙ）投与、動脈内投与、および肝実質（ｐａｒａｅｎｃｈｙｍａ）への直接的注射が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８４】
細胞（例えば、肝実質細胞などの肝臓細胞）が、ペプチド、タンパク質、または治療用核酸をコードする組換えパルボウイルスベクターに感染し、細胞は、コードされたペプチド、タンパク質、または治療用核酸を発現し、循環器系へ治療的有効量でそれを分泌する。あるいは、ベクターは、別の細胞または組織に送達されて、それによって発現し、その別の細胞または組織には、脳、膵臓、脾臓、または筋肉が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
治療効果を達成するためのベクター用量、例えば、１キログラムの体重あたりのベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）または形質導入単位における用量は、いくつかの因子に基づいて変わり、その因子には、投与経路、治療効果を達成するのに必要とされるトランスジーン発現のレベル、処置される特定の疾患、ベクター（例えば、ＡＡＶ）に対する任意の宿主免疫応答、トランスジーンまたは発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、および発現するタンパク質の安定性が挙げられるが、それらに限定されない。当業者は、前述の因子および他の因子に基づいて、特別な疾患または障害を有する患者を処置するためのＡＡＶベクター用量範囲を容易に決定することができる。一般的に、用量は、治療効果を達成し得る、被験体の１キログラムの体重あたり、少なくとも１×１０６、１×１０７、１×１０８またはそれ以上からの範囲、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、または１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６またはそれ以上のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）である。
【００８６】
本発明の特別の実施形態において、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上の投与）が、トランスジーン発現の治療レベルを達成するために用いられてもよい。この実施形態に従い、かつ本明細書に記載されているように、本発明のパルボウイルス処方物は、処置されることになっている被験体において中和抗体を回避するように投与される。
【００８７】
ＡＡＶベクターに特異的な中和抗体（ＮＡｂ）の力価は、インビトロアッセイで測定することができ、そのインビトロアッセイにおいて、試験血清が、レポータートランスジーンを有し、かつ細胞を形質導入するために用いられるＡＡＶベクターとインキュベートされる。インビトロでの残留のレポーター遺伝子活性が、ＡＡＶベクター特異的ＮＡｂの中和の程度を決定するために用いられる。高力価ＮＡｂを有する被験体は、大過剰（ＡＡＶベクター用量を超過する１０〜１０，０００倍のキャプシド粒子濃度）のＡＡＶ空キャプシドと共に投与されてもよい；低〜陰性の力価ＮＡｂを有する被験体は、より低量（ＡＡＶベクター用量を超過する１〜１０倍のキャプシド粒子濃度）の空キャプシドを受けることができる。
【００８８】
本明細書で開示されているように、空キャプシドまたは（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシドまたはキャプシドタンパク質は、未処理であることもできるし、または細胞内取り込みを低下させるように改変され、受容体結合（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合）を低下させるように架橋され、もしくは（例えば、キャプシドタンパク質の）１つもしくは複数のアミノ酸残基を変異することにより改変することもできる。ＡＡＶベクターは、空キャプシドまたは（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシドまたはキャプシドタンパク質と共に処方され、組み合わせとして被験体に投与されてもよいし、またはＡＡＶベクターおよび空キャプシドまたは（例えば、ウイルスの）ゲノム含有キャプシドまたはキャプシドタンパク質は、お互いに別々に被験体へ投与されてもよい。
【００８９】
要約すれば、本発明のパルボウイルスベクター、試薬、ならびに方法および使用は、トランスジーンを分裂細胞または非分裂細胞のいずれにも方向づけるために、およびそこでその核酸を安定的に発現させるために用いることができる。したがって、本発明のベクターは、疾患状態についての遺伝子治療において、または細胞生理学の実験的改変のために、有用であり得る。
【００９０】
他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似した、または等価の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料は本明細書に記載されている。
【００９１】
本明細書に引用された全ての出願、刊行物、特許、ならびに他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用およびＡＴＣＣ引用は、全体として参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するものとする。
【００９２】
本明細書に開示された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示された各特徴は、同じ、等価の、または類似した目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、他に明確な記述がない限り、開示された特徴（例えば、化合物構造）は、等価の、または類似した特徴の類の例である。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ（ａｎｄ））」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つのポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数の遺伝子などの複数のそのようなポリヌクレオチドを含む。
【００９４】
本明細書で用いられる場合、全ての数値または数の範囲は、文脈が明らかに他に示さない限り、そのような範囲内の整数、およびその値または範囲内の整数の小数部を含む。したがって、実例を示すと、少なくとも９０％同一性への言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％など、加えて９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などその他を含む。
【００９５】
「より多い（より大きい）」または「未満」を伴う数への言及は、それぞれ、その指示の数より大きい、または未満の任意の数を含む。したがって、例えば、「１，０００未満」への言及は、９９９、９９８、９９７など、数の１までずっと、含む；「１００未満」は、９９、９８、９７など、数の１までずっと、含む。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、全ての数値または範囲は、文脈が明らかに他に示さない限り、その値の小数部、およびそのような範囲内の整数、およびそのような範囲内の整数の小数部を含む。したがって、実例を示すと、パーセンテージ範囲、９０〜１００％などの数の範囲は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、加えて９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などその他を含む。したがって、１〜５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など、加えて１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などその他を含む。
【００９７】
一連の範囲への言及は、その一連の範囲内の異なる範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。したがって、実例を示すと、２〜７２時間、２〜４８時間、４〜２４時間、４〜１８時間、および６〜１２時間の一連の範囲への言及は、２〜６時間、２、１２時間、２〜１８時間、２〜２４時間など、および４〜２７時間、４〜４８時間、４〜６時間などの範囲を含む。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、指数部は、様々な方式で表現することができる。例えば、４．５×１０１１はまた、４．５ｅ１１と表現することができ、５．０×１０１１は５ｅ１１と表現することができる。
【００９９】
本発明は、一般的に、多数の実施形態および態様を記載するために肯定的言語を用いて本明細書に開示される。本発明はまた、具体的には、物質または材料、方法ステップおよび条件、プロトコール、または手順などの特別な内容が、全部または一部分、排除される実施形態を含む。例えば、本発明の特定の実施形態または態様において、材料および／または方法ステップが排除される。したがって、本発明は、一般的に、本発明が含まないことに関して本明細書で表されていないとしても、本発明において明確には排除されていない態様は、それでもなお、本明細書に開示される。
【０１００】
本発明の多くの実施形態が記載されている。とは言え、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それを様々な利用および条件に適応させるために、本発明を様々に変化および改変することができる。したがって、以下の実施例は、主張される本発明の範囲を例証することを意図されるが、それを限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
この実施例は、様々な材料および方法の記載を含む。
【０１０２】
ＡＡＶベクターおよび空キャプシド：ＡＡＶベクターを、以前に記載されているように調製した（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．５、９３８−９４５（１９９８））。ゲノム含有ベクターおよび空ＡＡＶキャプシド粒子を、塩化セシウム勾配遠心分離により精製した（Ａｙｕｓｏ  Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１７、５０３−５１０（２０１０））。インビボ実験に用いられるＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーターの調節下でヒトＦ．ＩＸを発現した（Ｍａｎｎｏ  Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２、３４２−３４７（２００６））。
【０１０３】
適切な精製ステップのフローチャートは下に提供される。
回収
↓
接線流濾過による濃縮／ダイアフィルトレーション
↓
微少溶液操作による細胞溶解
↓
濾過による清澄化
↓
イオン交換カラムクロマトグラフィーによるＡＡＶ粒子の精製
↓
接線流濾過によるカラム溶出液の濃縮（任意）
↓
１×ＣｓＣｌ勾配遠心分離
↓
接線流濾過による濃縮および緩衝液交換
↓
界面活性剤および濾過（０．２μｍ）での最終処方
↓
最終滅菌濾過（０．２μｍ）、バイアル充填および完了
（最終産物）  。
【０１０４】
架橋：ＡＡＶキャプシドを、２つの異なるプロトコールで架橋した。１つのプロトコールにおいて、１ミリリットルあたり１×１０１３個のＡＡＶ粒子を、３７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）の１：２００希釈溶液と回転ホイール上、４℃で３週間、インキュベートした。その後、試料中のホルムアルデヒドを、３．７５％（ｗ／ｖ）メタ重亜硫酸ナトリウムを加えることにより（１：１００）、中和した。ベクターを、１×  ＰＢＳ中で透析し、濾過し、−８０℃で保存した。未処理のベクターを、同様に、ただしホルムアルデヒドの非存在下で、処理した。第２のプロトコールにおいて、ベクターを５ｍＭ  ３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。ＤＴＳＳＰでの架橋を、氷上で２時間、行った。架橋後、ベクターを１×  ＰＢＳ中で透析し、−８０℃で保存した。架橋は、抗ＡＡＶ２モノクローナル抗体Ａ２０によるキャプシド認識に影響しなかった（図１３）。
【０１０５】
ヒト血清および細胞試料：研究に用いられる全てのヒト試料を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓ（ＩＲＢ）によって承認されたプロトコールにより収集した。小児科被験体由来の試料を、商業的供給源（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）から取得した。樹状細胞（ＤＣ）の調製に用いられる匿名化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３，４１９−４２２（２００７））を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにおけるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。
【０１０６】
動物研究：動物研究は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ＳｅｒｖｉｃｅｓにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。週齢８〜１０週間の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。総体積２００μｌの１×  ＰＢＳ中の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ、Ｇａｍｕｎｅｘ）を、腹腔内に注射した。非ヒト霊長類研究について、ベクターを、以前に記載されているように（Ｎａｔｈｗａｎｉ  Ａ．Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１０９、１４１４−１４２１（２００７））、末梢静脈注入により送達した。
【０１０７】
抗体アッセイ：インビトロ抗ＡＡＶ中和抗体アッセイは、アッセイの感度を増加させるためにレポーター遺伝子ルシフェラーゼを発現するＡＡＶベクターを用いることにより改変された、以前に記載されたプロトコール（Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、３４２−３４７（２００６））に基づいた。アッセイにおいて、ＮＡｂ力価は、「ウイルスのみ」対照のシグナルと比較してルシフェラーゼシグナルの５０％抑制が観察される試験血清の逆数の希釈度に対応する。試験血清の１：１希釈におけるレポーターシグナルのパーセント抑制は、希釈されていない試験試料の抑制活性を表す。
【０１０８】
抗ＡＡＶ抗体を検出するためのドットブロットアッセイについて、１μｇのＡＡＶ２またはＡＡＶ８キャプシドを、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてニトロセルロース膜上へスポットした。その後、膜を、ＴＢＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）で一晩、ブロッキングし、試験血清の１：５００希釈溶液と室温で１時間、インキュベートした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳで条片を洗浄し、ＩＲＤｙｅ  ８００  ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、結合したＩｇＧを検出した。ブロットを、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて１６９μｍの分解能で取得した。画像デンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア  バージョン１．４５ｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて実施し、生じた平均強度を、バックグラウンドの引き算後、陽性対照（ＦＡＣＴプールされたヒト血漿、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ）に占める割合として表した。ドットブロットアッセイは、以下の通り、より詳細に記載されている：
キャプシド変異体の作製：ＡＡＶ２野生型キャプシドタンパク質を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて変異を誘発した。２つの変異を挿入し、結果として、２個のアミノ酸変化：Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを生じた（その変異体キャプシドは、この明細書においてＡＡＶ５８５／８と示されている）。そのキャプシドを用いて、以下の材料を調製した：インビトロ形質導入効率研究のためのＡＡＶ５８５／８−ＧＦＰベクター；マウスにおいて、その変異体キャプシドの肝臓を形質導入し、かつヒト第ＩＸ因子を発現する能力を研究するためのＡＡＶ５８５／８−ＦＩＸ１９ベクター；およびこの変異体の、抗ＡＡＶ抗体についてのデコイとして働く能力を研究するためのＡＡＶ５８５／８空キャプシド。
【０１０９】
試薬および装置：
Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、ＴＢＳ、１０×、Ｓｉｇｍａ  Ｔ５９１２または同等物
ウェスタンブロットブロッキング試薬、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１９２１６７３００１または同等物
Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  １７０−６５３１または同等物
ニトロセルロース膜、ポアサイズ０．２μｍ、Ｐｒｏｔｒａｎ  ＢＡ８３−１０４０２４８８
ゲルブロットペーパーＧＢ００３（１５×１５ｃｍ）Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）
密度勾配精製されたＡＡＶ空キャプシド
精製された抗ヒトＩｇＧ（ＵＮＬＢ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０４０−０１
９２８−３８０４０  ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷタンパク質標識キット−高分子量
対照ＦＡＣＴ血漿、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌカタログ＃００２０−１、ロット番号Ｄ９ｄ１（入手可能ならば）
プール小児科血清
フタ付きの無処理の４ウェルのディッシュ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃２６７０６１または同等物
血清学的ピペット、５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ
５０ｍＬ遠心機／コニカルチューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ４３０２９０
試薬リザーバ、Ｃｏｓｔａｒ  ４８７０
１２チャネルのマルチチャネルピペッター２０〜２００μＬ
Ｐ−２０、Ｐ−２００、およびＰ−１０００  Ｒａｉｎｉｎ  Ｐｉｐｅｔｍａｎ
ピペットチップ
Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）チューブＭｉｎｉＳｏｒｐ  ４ｍｌ、ポリエチレン、４６６９８２
１２チャネルのリザーバ、Ｃｏｓｔａｒ  ４８７７
ボルテックスミキサー
ピンセット
アルミ箔
Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェア（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＩｍａｇｅＪソフトウェア
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  。
【０１１０】
装置
生物学的安全キャビネット
フリーザー、−８０℃
冷蔵庫、２〜８℃
真空源
Ｏｄｉｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
オービタルシェーカー  。
【０１１１】
試薬の調製
≧１×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度でのＡＡＶ空キャプシド
−８０℃における保存１００μＬアリコート
ブロッキング緩衝液：ブロッキング緩衝液を１×  ＴＢＳ中に１：１０希釈する。プレートあたり７０ｍＬのブロッキング緩衝液を調製し、最高４ヶ月間、−２０℃で保存する。
希釈緩衝液：ブロッキング緩衝液を１×  ＴＢＳ中に１：１希釈する。
洗浄緩衝液：１×  ＴＢＳ、０，１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０の溶液を調製する。最高１ヶ月間、２〜８℃で保存する。
対照血漿ＦＡＣＴ：対照血漿を５６℃で３０分間、熱失活させ、５０μＬアリコートを−８０℃で保存する。製造日から３年間の有効期限を割り当てる。解凍されたアリコートを再凍結してはならない。
試験試料：試験血清または血漿試料を５６℃で３０分間、熱失活させ、アリコートを−８０℃で保存する。
標識された抗ヒトＩｇＧ  ＣＷ８００：製造会社の使用説明書に従って、抗体を標識する。最終の抗体濃度は、２ｍｇ／ｍｌであり、色素／タンパク質比率は１．５〜２の間にあるべきである。
【０１１２】
手順
試薬の調製：アッセイの１日目
ＡＡＶ空キャプシドを、プレートあたり５ｍｌのＭｉｎｉＳｏｒｐチューブにおいて、ＴＢＳ  １×中、１０μｇ／ｍｌの最終濃度へ希釈する。
ブロッキング緩衝液を、プレートあたり５ｍｌのＭｉｎｉＳｏｒｐチューブにおいてＴＢＳ  １×中、１／１０００に希釈する。
容器内にニトロセルロース膜およびゲルブロットペーパーを置いて、それらを１×  ＴＢＳ中、５分間、浸漬させる。
Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉを真空源に接続し、真空プレナムの上にフィルターサポートプレートを置き、登録ピンを一直線に並べる。フィルターサポートプレート上にペーパーを置き、切断の角を登録ピンと合わせ、この手順を繰り返して、ゲルブロットペーパーの上にニトロセルロース膜を置く。
減圧を与え、１００μｌ／ウェルをニトロセルロース膜上に、以下のテンプレートに従って、マルチチャネルピペットでスポットする（ＢＢ、ブロッキング緩衝液；ＡＡＶ、空キャプシド）：
【０１１３】
【化２】
2014534245.tif 000004
【０１１４】
なお減圧を続け、クランプを外すことによりマニホールドを取り外し、鉗子を用いて、注意深く膜を取り出す。膜を乾燥させ、５０ｍｌのブロッキング緩衝液でシェーカー（２００ｒｐｍ）上、４℃で一晩、ブロッキングする。
【０１１５】
試料調製およびインキュベーション：２日目
希釈緩衝液を用いて、試験試料および対照（陽性としてのＦＡＣＴ血漿および陰性小児科試料）の２ｍＬの１：５００希釈溶液を調製する。
鉗子とはさみを用いて膜を長方形に、各片が２つのＡＡＶスポットと２つのＢＢスポットを有するように切断する。
シェーカー上で、膜を試料および対照と室温で１時間、インキュベートする。
洗浄緩衝液（１回の洗浄あたり１０ｍｌ、５分間）で３回、洗浄する。
希釈剤として希釈緩衝液（試料あたり２ｍｌ、プレートあたり５０ｍｌ）を用いて、抗ヒトＩｇＧ  ８００ＣＷの１／１００００希釈溶液を調製する。
アルミ箔で膜を覆いながら、試料を室温で１時間、インキュベートする。
暗闇中、洗浄緩衝液（１回の洗浄あたり１０ｍｌ、５分間）で３回、洗浄する。
ピンセットを用いて、２枚のゲルブロットペーパーの間に各膜を置く。それを乾燥させ、アルミ箔で包む。
画像取得：Ｏｄｙｓｓｅｙ（Ｏｄｉｓｓｅｙ）ソフトウェアを開き、新しいプロジェクトを開く。
Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナ上に乾燥膜を、表を下にして置く。
スキャナ表面上のルーラーを用いて取得領域を決定し、ダイアログパネル上に以下のパラメーターを設定する：
（１）分解能：１６９μｍ
（２）焦点：膜
（３）チャネル：８００
（４）強度：５
取得を保存し、カラー化ＴＩＦＦとして画像をエクスポートする。
【０１１６】
Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析
Ｔｉｆｆ画像をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで開き、カラーチャネルを分割する（Ｉｍａｇｅ＞Ｃｏｌｏｒ＞Ｓｐｌｉｔ  Ｃｈａｎｎｅｌ）。
Ｓｐｅｃｉｆｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ（Ｅｄｉｔ＞Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ＞Ｓｐｅｃｉｆｙ）を用いて、２５×２５楕円形選択を描く。
ＦＡＣＴおよび陰性対照を含む、各ＡＡＶおよびＢＢスポットについて平均強度を測定する。
各２連の読み取りの平均をとる。
結果をアッセイレポート形式へコピーし、レポート形式の下部にある式を用いて、最大平均強度に占めるパーセントを計算する。
【０１１７】
最大平均強度に占める％の式：
［（未知試料の平均強度）−（陰性の平均強度）］
［（陽性の平均強度）−（陰性の平均強度）］      。
【０１１８】
第ＩＸ因子および抗ヒトＦ．ＩＸ抗体の決定：マウス血漿中のヒトＦ．ＩＸトランスジーン産物のレベルを、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて検出した。アカゲザル血漿中のヒトＦ．ＩＸおよび抗ヒトＦ．ＩＸ抗体を、以前に記載されているように（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１１０、２３３４−２３４１（２００７））、決定した。
【０１１９】
ＡＡＶベクターゲノムコピーの決定：リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）プライマーおよびプローブは以下の通りであった：ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターゲノムの検出について、フォワードプライマー５’−ＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＴ−３’、リバースプライマー５’−ＣＡＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＣＴＧＣＡＴＡ−３’、プローブ５’−ＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧ−３’。ＡＡＶ−ＧＦＰベクターゲノムの検出について、フォワードプライマー５’−ＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’、リバースプライマー５’−ＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧ−３’、プローブ５’−ＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＮＣＧＣＣＧＴＡＧＧＴＡ−３’。アッセイを、以前に記載されているように（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１１０、２３３４−２３４１（２００７））、実施した。
【０１２０】
細胞内画像化および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ：画像取得を、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施した。画像化を、４０×倍率で実施した。各条件について少なくとも５０００個の細胞を取得した。細胞を、無血清培地中、未処理の、または架橋されたＡＡＶ２ウイルスとインキュベートした。１時間または４時間後、細胞を１×  ＰＢＳで２回、洗浄し、染色した。細胞内染色について、５×１０５個の細胞を固定し、４℃で２０分間、透過処理し、その後、１×  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄した。その後、細胞を、ウサギ抗ＣＤ７１抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）またはＤＲＡＱ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に抗ＡＡＶ抗体Ａ２０（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で染色した。室温での３０分後、細胞を洗浄し、二次抗体で染色した。ＣＴＬアッセイは、以前に記載されていた（Ｐｉｅｎ  Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９、１６８８−１６９５（２００９）；Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１１０、２３３４−２３４１（２００７））。
【０１２１】
統計解析：統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ｂ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて実施した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０１２２】
実施例２
この実施例は、第ＩＸ遺伝子治療で処置された患者の観察および解析の記載、ならびに低いＡＡＶ抗体力価に基づいた被験体の選択にもかかわらず、抗ＡＡＶ抗体力価において実質的な差異があったという発見を含む。
【０１２３】
ＡＡＶ２−Ｆ．ＩＸ肝臓研究（Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、３４２−３４７（２００６））およびＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸ肝臓研究（Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３６５、２３５７−２３６５（２０１１））に登録された被験体は、検出可能なレベルの抗ＡＡＶ抗体を有した（表１；Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、３４２−３４７（２００６）；およびＮａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３６５、２３５７−２３６５（２０１１））。両方の研究における被験体は、類似したベクター用量を受けた；しかしながら、ＡＡＶ２研究において、低用量（８×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ）および中位の用量（４×１０１１ｖｇ／ｋｇ）のコホートにおける被験体のいずれも、検出可能なレベルのトランスジーン発現を示さなかったが（Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、３４２−３４７（２００６））、ＡＡＶ８試験における被験体は、低用量（２×１０１１ｖｇ／ｋｇ）および中位の用量（６×１０１１ｖｇ／ｋｇ）の両方のコホートにおいて、検出可能なレベルの凝固因子（＞１％）を有した（Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．３６５、２３５７−２３６５（２０１１））。これらの研究の異なる成績についての可能な説明は、ＡＡＶ２ベクターと比較して、ＡＡＶ８ベクターの肝実質細胞に対するより高いトロピズムであり得（Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９、１１８５４−１１８５９（２００２））、またはＡＡＶ８が、より高いトランスジーン発現レベルを駆動させることが知られた自己相補的ゲノムを有するという事実であり得た。非ヒト霊長類における発表された研究は、同じトランスジーン発現カセットを有するＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ２ベクターの送達後のおおよそ等価のレベルのＦ．ＩＸトランスジーン発現を示した（Ｊｉａｎｇ，Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０８、３３２１−３３２８（２００６）；Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １１０、２３３４−２３４１（２００７））。ＡＡＶ２およびＡＡＶ８の両方の試験において、最高のベクター用量（２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）で注射された被験体は、類似したピークＦ．ＩＸトランスジーン産物の血漿中レベルを有した（Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、３４２−３４７（２００６）；Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３６５、２３５７−２３６５（２０１１））。
【０１２４】
個体をより厳密に評価するために、以前に記載されたインビトロＮＡｂアッセイを用いて、血友病被験体由来の一連の血清をスクリーニングした（Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、３４２−３４７（２００６））。低ＮＡｂ力価（１〜３）を有するそれらの試料の間で、非希釈血清中の幅広い範囲の中和活性が測定された（表１）。その後、試料を、総抗ＡＡＶ８抗体についての高感度の血清型特異的ドットブロットアッセイ（図１０）を用いて分析した（表１）。
【０１２５】
【表１】
2014534245.tif 000005
【０１２６】
低ＮＡｂ力価を有する被験体の事前選択にもかかわらず、ドットブロット分析は、検出された総抗ＡＡＶ抗体（中和および非中和の両方）の量における顕著な差異を示し、成人被験体の大部分が、陰性であった小児科被験体と比較して、陽性の結果を示した（表１）。
【０１２７】
これらの結果は、ＡＡＶに対する低力価中和抗体（ＮＡｂ）を有するように思われる成人ヒト被験体が、ＮＡｂについての日常的アッセイによっては確実には検出されない有意な量の抗ＡＡＶ  ＩｇＧを有することを示している。
【０１２８】
実施例３
この実施例は、高力価のＡＡＶ  Ｎａｂを有する動物においてさえも、ＡＡＶベクターを過剰量のＡＡＶ空キャプシドと共に処方または送達することが、結果として、抗ＡＡＶ抗体の存在下でさえも、ＡＡＶベクター送達後にインビボでの形質導入のレスキューを生じたことを実証する動物研究の記載を含む。
【０１２９】
インビボでＡＡＶベクターの形質導入の効率への空キャプシドの効果を研究するために、空キャプシドをＡＡＶベクターと処方した。まず、インビトロ研究により、ＡＡＶベクター調製物における空キャプシドの包含が、インビトロでヒト血清の中和活性を大いに低下させることが明らかにされた（図１１）。
【０１３０】
第２に、インビボでＡＡＶベクターの形質導入の効率への空キャプシドの効果を研究するために、抗ＡＡＶ抗体応答のマウスモデル（Ｓｃａｌｌａｎ  Ｃ．Ｄ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１０７、１８１０−１８１７（２００６））（図１ａ）を作製した。ナイーブのマウスまたは低用量のＩＶＩｇ（０．５ｍｇ／マウス）で免疫されたマウスへ、ヒトＦ．ＩＸを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８−ｈＦ．ＩＸ）を、１から３までの範囲の抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価を生じるのに十分に、注射した（図１ａ、ｂ）。１×１０９および５×１０９ｖｇ／マウスのベクター用量、または１０倍（１０×）過剰量のＡＡＶ８空キャプシド中に処方された同じベクター用量は、ナイーブの動物において血漿中、類似したレベルのｈＦ．ＩＸを生じた。ＩＶＩｇ免疫化は、ＰＢＳ中に処方されたベクターによるほとんどの肝臓形質導入を効果的にブロックしたが、１０×  空キャプシド中のベクターの処方物は、トランスジーン発現をレスキューした（図１ｂ）。５×１０９ｖｇのＡＡＶ８−ｈＦ．ＩＸを受けた動物から収集された肝臓において測定されたベクター遺伝子コピー数は、これらの所見を確認した（図１ｃ）。
【０１３１】
その所見を確認するために、ＡＡＶ８についての天然の宿主であるアカゲザル（Ｇａｏ  Ｇ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９、１１８５４−１１８５９（２００２））における類似した研究を実施した。３０匹の動物をスクリーニングして、１のＮＡｂ力価を有する合計７匹のサルを同定した。ヒトと同様に、低ＮＡｂ力価にもかかわらず、選択された動物のベースラインの非希釈血清は、１０％から８０％までのインビトロでの中和活性、およびドットブロットアッセイにおける様々な量の抗ＡＡＶ８  ＩｇＧを有した（表２）。ＡＡＶ８−ｈＦ．ＩＸの１×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量において、ベクターのみを受けた２匹の動物のうち、１匹（１００１）は、抗ｈＦ．ＩＸ抗体の発生のため、ｈＦ．ＩＸトランスジーンを一過性のみ、発現し、そのことは、アカゲザルにおいて以前に報告された所見である（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１１０、２３３４−２３４１（２００７）；Ｎａｔｈｗａｎｉ  Ａ．Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１０７、２６５３−２６６１（２００６）；Ｎａｔｈｗａｎｉ  Ａ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９、８７６−８８５（２０１１））；他方の動物、１００２は、６７ｎｇ／ｍｌのプラトーｈＦ．ＩＸ血漿中レベルに達した。対照的に、９×  空ＡＡＶ８キャプシド中に処方されたベクターを注射された動物、２００１は、ほとんど６倍高い、トランスジーン発現のプラトーレベルに達した（図１ｄおよび表２）。１００２および２００１の動物は、ベースラインにおいて類似した抗ＡＡＶ８中和活性を示した（約３０％、表２）。
【０１３２】
【表２】
2014534245.tif 000006
【０１３３】
動物は、抗ヒトＦ．ＩＸ抑制性抗体を発生した。２×１０１２ｖｇ／ｋｇへの用量増大は、類似した結果をもたらした。ベクターのみを投与された２匹の動物のうちの１匹の３００１は、循環ｈＦ．ＩＸトランスジーン産物の検出可能なレベルを達成しなかった。その動物は、抗ｈＦ．ＩＸ抗体を発生せず、肝臓におけるＡＡＶベクターゲノムコピー数（表３）は、ベースラインにおける非希釈血清の５７％中和活性が、ベクター形質導入を完全にブロックしたことを示唆している。ベクターのみを投与された他方の動物の３００２は、約１６９ｎｇ／ｍｌの循環ｈＦ．ＩＸのプラトーレベルに達した。９×  空キャプシド中に処方されたベクターを投与された２匹の動物のうち、４００１（８０％のベースライン中和活性）は、血漿中、約４１５ｎｇ／ｍｌのｈＦ．ＩＸトランスジーン産物を示した。３００１とほとんど同一の５５％の血清ベースライン中和活性を有する４００２は、９１５ｎｇ／ｍｌのプラトーｈＦ．ＩＸ発現を有した（図１ｄおよび表２）。処方物における空キャプシドの包含は、ＡＡＶベクター体内分布に影響しなかった（表３）。
【０１３４】
【表３】
2014534245.tif 000007
【０１３５】
これらの結果は、血管内腔を通しての遺伝子移入後のＡＡＶベクター形質導入効率への、空キャプシドが有する増強効果に関する、インビトロおよびマウスにおけるインビボでの所見を、大型動物モデルにおいて確認している。ＡＡＶベクターのＡＡＶ空キャプシドと共の投与または同時処方は、抗ＡＡＶ  ＮＡｂの存在下でさえも、標的細胞の効率的なトランスジーン形質導入および発現を可能にする。
【０１３６】
次の研究において、低力価および高力価のＡＡＶ抗体を産生する、ＩＶＩｇで免疫されたマウス（図１ａ）を、増加性量の空キャプシドと組み合わせてのＡＡＶベクター遺伝子形質導入について分析した。簡単に述べると、マウスは、単独での、または増加性量の空ＡＡＶ８キャプシド中に処方された、５×１０９ｖｇ／マウスのベクターを受けた（図２ａ〜ｄ）。低力価の抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価の存在下において（図２ａ）、１０倍過剰量の空キャプシド中でのベクターの処方は、ＡＡＶベクター形質導入を完全にレスキューした。ＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸ用量の最高１００×までの空キャプシド過剰量は、ＡＡＶベクター形質導入を抑制しなかった。１０００倍過剰量の空キャプシドは、トランスジーン発現の約４０％損失を生じた。
【０１３７】
同様に、肝臓形質導入の完全なレスキューは、１０および１００のＮＡｂ力価の存在下において、それぞれ、５０×および１００×の過剰量の空キャプシドで得られた（図２ｂ、ｃ）。しかしながら、１０００×過剰量の空キャプシドを加えることによってさえも（図２ｄ）、極めて高いＮＡｂ力価（＞３０００）の存在下における肝臓遺伝子形質導入の完全なレスキューは検出されなかった。
【０１３８】
抗ＡＡＶ  ＮＡｂの明らかな交差反応性により（Ｂｏｕｔｉｎ  Ｓ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２１、７０４−７１２（２０１０）；Ｃａｌｃｅｄｏ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９、３８１−３９０（２００９））、抗ＡＡＶ８  ＮＡｂの存在下におけるＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸベクター形質導入は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２空キャプシドにより等しくレスキューされたが、ＡＡＶ５空キャプシドは、それほど効果的ではなかった（図１２）。したがって、交差反応性により、１つのＡＡＶ血清型由来の空キャプシドが、１つ以上の異なるＡＡＶベクター血清型に対する中和抗体の効果（ａｆｆｅｃｔ）を抑制または低下するために用いることができることは明らかである（例えば、ＡＡＶ２空キャプシドと組み合わせたＡＡＶ８ベクター、および逆の場合も同じ）。
【０１３９】
これらの所見は、ＡＡＶ空キャプシドが、全身性ベクター送達後の肝臓形質導入を、抗ＡＡＶ  Ｎａｂの存在下で、かつ用量依存性様式で、増強することを実証している。過剰な空キャプシドを用いることは、より高いＮＡｂ力価動物においてＡＡＶベクター中和を克服して、インビボで効率的なトランスジーン形質導入をもたらすであろう。これらの結果はまた、交差反応性空キャプシド血清型を、異なるＡＡＶベクター血清型と組み合わせて用いて、ＡＡＶベクター中和を抑制するか、または低下させることができることも実証している。
【０１４０】
実施例４
この実施例は、架橋された空キャプシドが、ＡＡＶ抗体によるＡＡＶベクター中和の機能的抑制を維持しながら、キャプシド免疫原性を低下させることを実証する動物研究の記載を含む。
【０１４１】
空キャプシドの標的細胞への侵入は、キャプシドエピトープのＭＨＣクラスＩ提示のレベルを増加させる可能性が高い（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１、３２１−３３０（２０１１）；Ｆｉｎｎ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８、１３５−１４２（２０１０）；Ｐｉｅｎ  Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９、１６８８−１６９５（２００９）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３、２６３２−２６４４（２００９））。先在する抗ＡＡＶ抗体に結合するか、またはそれらと反応する能力を実質的に損なうことなく、細胞に侵入するそれらの能力を低下させるために、空ＡＡＶキャプシドを、それらをＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクター処方物へ加える前に架橋した。ホルムアルデヒド架橋方法を用いた結果が表されている；キャプシド架橋のためのＤＴＳＳＰ方法は同様の結果を示した。
【０１４２】
ＡＡＶベクターの架橋を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびインビトロで形質導入効率を試験することにより、検証した（図１３）。架橋された空ＡＡＶキャプシドは、インビトロで（図３ａ）、およびマウスにおいてインビボで（図３ｂ）、抗ＡＡＶ  ＮＡｂを吸着するそれらの能力を保持した。
【０１４３】
架橋された空キャプシドの肝臓トロピズムをインビボで分析するために、単独での、または１０×過剰量の未処理の、もしくは架橋されたＡＡＶ−ＧＦＰベクターと混合されたＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターをマウスに投与した。架橋は、ＡＡＶ−ＧＦＰベクターの標的を肝臓から有意に外し（図３ｃ）、一方、ＡＡＶ−Ｆ．ＩＸベクターゲノムは、全ての実験群からの動物において、類似したレベルで検出可能であった（図３ｄ）。架橋は、脾臓または他のリンパ器官におけるＡＡＶベクター体内分布を検出可能には変化させなかった。
【０１４４】
未処理の、または架橋された空ＡＡＶ２キャプシドで、インビトロで形質導入されたヒト肝実質細胞のフロー画像化により、架橋が、空ＡＡＶキャプシドの細胞への侵入をブロックすることが示された（図４ａ）。架橋はまた、架橋されたＡＡＶキャプシドが、インビトロでのＣＴＬアッセイにおいて標的ヒト肝実質細胞の殺害を引き起こすことができないことにも関連していた（図４ｂ）（Ｆｉｎｎ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８、１３５−１４２（２０１０）；Ｐｉｅｎ  Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９、１６８８−１６９５（２００９））。最後に、ＡＡＶキャプシドの架橋は、インビトロでの単球由来ヒトＤＣにおけるキャプシドの内部移行（図４ｃ）およびエンドソーム局在化（図４ｄ）の両方を減少させた。
【０１４５】
これらの結果は、架橋されたＡＡＶキャプシドが、抗ＡＡＶ  ＮＡｂの存在下でベクター形質導入を増強する能力を保持することを示している。さらに、その研究は、架橋が、ＡＡＶベクターの細胞取り込みを有意に減少させ、免疫媒介性破壊としての、形質導入された肝実質細胞（および他のＡＡＶベクターが形質導入された細胞）の衰えのリスクを低下させる可能性があることを示している。
【０１４６】
実施例５
この実施例は、疾患または障害を処置するためにＡＡＶベクターおよび／または空キャプシドＡＡＶを用いる患者処置研究の記載を含む。
【０１４７】
ＡＡＶベクターの投与を必要とする代謝性または遺伝的疾患に冒された患者において、先在するＮＡｂ力価を、インビトロの中和アッセイを用いて決定する。患者由来の血清の段階希釈溶液を、ルシフェラーゼレポーターを発現するＡＡＶベクターと３７℃でインキュベートする。増加性量のＡＡＶ空キャプシドを、１×から１００００×まで、その反応へ加える。＜１：１のＮＡｂ力価を生じるだろう過剰量の空ＡＡＶキャプシドは、トランスジーン移入のためのＡＡＶベクターとの処方物を作製するために用いることができる。したがって、ＡＡＶベクターでの遺伝子治療についての候補患者由来の血清または血漿試料などの試料を、ＡＡＶ抗体（例えば、中和抗体または「ＮＡｂ」）アッセイを用いて、抗ＡＡＶ中和抗体について分析する。
【０１４８】
簡単には、患者由来の試料を、レポータートランスジーン（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＣＡＴなど）を発現するＡＡＶベクターとインキュベートすることによりアッセイを実施する。患者の血清または血漿におけるＡＡＶベクターの中和後にインビトロで測定される残留するレポーター遺伝子は、抗体力価を示し、通常、形質導入の５０％抑制が観察される血清／血漿希釈度として表される。例えば、血清の１：１０の希釈溶液が、ＡＡＶレポーター遺伝子ウイルスの活性を抑制するならば、抗ＡＡＶ  ＮＡｂ量（力価）は、１：１０である。
【０１４９】
ＡＡＶ抗体量（力価）を提供するアッセイ結果に基づいて、被験体を、任意で、以下と同様の様式で分類することができる：
−  低力価（検出不可能から１：３まで）：これらの個体は、ＡＡＶベクターと共に１〜１０×過剰量の空ＡＡＶキャプシドを受ける。
−  中位の力価（１：３から１：１００まで）：これらの個体は、ＡＡＶベクターと共に５〜１０００×過剰量の空ＡＡＶキャプシドを受ける。
−  高力価（１：１００より上）：これらの個体は、ＡＡＶベクターと共に１０〜１００００×過剰量の空ＡＡＶキャプシドを受ける。
【０１５０】
調製物に含まれる空キャプシドの量を、増加性量の空ＡＡＶキャプシドの存在下で、本明細書に記載されたインビトロのＡＡＶ抗体アッセイを実施することにより決定する。例えば、患者が、１：１０のＮＡｂ力価を有する場合には、血清／血漿は、１×、５×、１０×、５０×、１００×、５００×、１０００×（およびまた、より精密な過剰量）の空キャプシドとインキュベートして、ＡＡＶベクターの薬理学的処方物に用いられる空ＡＡＶキャプシドの最小量を決定する。
【０１５１】
遺伝子治療の特定の例において、血友病Ｂ患者が、ＡＡＶ−ＦＩＸベクターでの遺伝子移入に予定される。患者は、ＮＡｂアッセイにより決定された場合、１：１０の抗ＡＡＶ中和抗体力価を有する。しかしながら、５×  空キャプシドを加えることにより、力価は＜１：１に下がる。
【０１５２】
この患者について、ＡＡＶ−ＦＩＸベクターは、薬学的に許容され得る担体中に、５×  架橋された空キャプシドと共に処方される。患者が、１×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ−ＦＩＸ用量を受けることが予定されると仮定すると、彼は、５×１０１２ｃｐ／ｋｇの（任意で、架橋された）ＡＡＶ空キャプシド中に処方されたこの用量を受ける。ＡＡＶ−ＦＩＸベクターおよびＡＡＶ空キャプシドを、最新の優良医薬品製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）を用いて製造し、製造物の純度、効力、安全性、および安定性を保証するために適切な品質管理試験に供する（Ｗｒｉｇｈｔ  Ｊ．Ｆ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８；１５：８４０−８４８）。最終の処方された製造物におけるＡＡＶベクターとの正確かつ再現性のある混合比を可能にするための精製された空キャプシドの濃度の測定は、ＡＡＶキャプシドタンパク質の消衰係数（Ｓｏｍｍｅｒ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３；７：１２２−１２８）、または他の公知の方法に基づく。
【０１５３】
空キャプシドまたはウイルスゲノム含有キャプシドは、典型的には、本発明に従って処置されることになっている被験体において産生される抗体と反応する血清型を有する。例えば、ＡＡＶ８と反応し、またはそれを中和する抗体を産生する被験体は、ＡＡＶ８空キャプシドまたはＡＡＶ８ウイルスゲノム含有キャプシドを投与することができる。ベクター調製物に加えられる空キャプシドまたはウイルスゲノム含有キャプシドはまた、１つより多い血清型と反応する抗体の交差反応性により、別の血清型でもあり得る。例えば、ＡＡＶ２空キャプシドまたはＡＡＶ２ウイルスゲノム含有キャプシドが、抗ＡＡＶ８抗体のＡＡＶ２との交差反応性により、トランスジーンを発現するＡＡＶ８ベクターに特定の量で加えられる。
【０１５４】
空キャプシドまたはウイルスゲノム含有キャプシドまたはキャプシドタンパク質はまた、被験体において産生される抗体と反応する２つ以上の血清型の混合物を含むことができる。例えば、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８と反応し、またはそれらを中和する抗体を産生する被験体は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８の空キャプシドを投与することができる。
【０１５５】
実施例６
この実施例は、ＡＡＶ５８５／８変異体キャプシドが、抗ＡＡＶ抗体を吸着することができたが、細胞を実質的に形質導入しなかったという研究の記載を含む。
【０１５６】
その研究を、図５〜９についての説明に記載されているように、実施した。その研究により、ＡＡＶ５８５／８変異体キャプシドが、インビトロおよびインビボで、ＡＡＶ８ベクターの抗体媒介性中和を抑制またはブロックすることが示されている。その研究によりまた、ＡＡＶ５８５／８キャプシドが受容体結合において競合しないため、ＡＡＶ５８５／８キャプシドが、大過剰量の治療用ＡＡＶベクターにおいて、ベクター形質導入の効率に干渉することなく、用いることができることが示されている。
【０１５７】
さらに、ＡＡＶ５８５／８変異体キャプシドは、ＡＡＶ２に由来し、そのＡＡＶ２は、ヒトにおいて最もよく見られるＡＡＶの血清型である。したがって、ＡＡＶ２は、循環抗体の大部分を吸着し、事実上全てのＡＡＶ血清型の中和からの保護を提供するはずである。
【０１５８】
ＡＡＶ２変異体キャプシドは、抗ＡＡＶ抗体の問題に対する普遍的な解決法として働く可能性がある。変異体キャプシドは、インビトロおよびインビボで細胞に実質的に感染せず、標的細胞の全体的な抗原負荷に寄与しないように思われ、それゆえに、ＡＡＶ２変異体は、ＡＡＶベクターが形質導入された標的細胞のＣＴＬ媒介性溶解の程度を増加させない。
【０１５９】
実施例７
この実施例は、ＡＡＶ空キャプシドの推定の作用機構を示す研究の記載を含む。
【０１６０】
ＮＡｂ力価＞１０にＩＶＩｇで受動免疫されたマウスは、単独での、または増加性量のＡＡＶ空キャプシドと共に処方された、ＡＡＶ８−Ｆ．ＩＸ（第ＩＸ因子）ベクターを受けた（図１４ａ）。ベクター送達の１日後、血漿を収集し、ＩｇＧ：キャプシド複合体についてアッセイした。アッセイにおける標準曲線として、ＩＶＩｇとインキュベートされた既知量のＡＡＶ８キャプシドを用いた（図１４ｂ）。ベクター投与後、ＩＶＩｇで予備免疫されなかったマウスの血漿において、免疫複合体は検出できなかった（図１４ｃ、列１）。対照的に、ベクターのみ、またはベクターと空キャプシドを受けたＩＶＩｇ注射された動物においてＩｇＧ：キャプシド複合体が、増加性量で検出可能であった（図１４ｃ、列２〜６）。抗ＡＡＶキャプシド抗体の空ＡＡＶキャプシドによる吸収は、結果として、ベクター送達の１日後、マウスにおいて抗ＡＡＶ８  ＮＡｂ力価の用量依存性降下を生じ（図１４ａ）、最終的に、増加性レベルのｈＦ．ＩＸトランスジーン発現を生じた（図１４ｄ）。前述の研究は、空ＡＡＶキャプシドが、デコイとして働き、抗ＡＡＶ抗体に結合し、それにより、ＡＡＶベクターを抗体媒介性中和から保護することを実証している。
【０１６１】
【化３】
2014534245.tif 000008
【図１】
2014534245.tif 000009
【図２】
2014534245.tif 000010
【図３】
2014534245.tif 000011
【図４−１】
2014534245.tif 000012
【図４−２】
2014534245.tif 000013
【図４−３】
2014534245.tif 000014
【図５】
2014534245.tif 000015
【図６】
2014534245.tif 000016
【図７】
2014534245.tif 000017
【図８】
2014534245.tif 000018
【図９】
2014534245.tif 000019
【図１０】
2014534245.tif 000020
【図１１】
2014534245.tif 000021
【図１２】
2014534245.tif 000022
【図１３−１】
2014534245.tif 000023
【図１３−２】
2014534245.tif 000024
【図１４】
2014534245.tif 000025
【配列表】
2014534245000001.app
【国際調査報告】
2014534245.tif 000026
2014534245.tif 000027