(57)【要約】本発明は、骨形成性および／または骨誘導性および／または骨伝導性等の、骨形成特性を有するポリマーコンポジットを提供するための方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって提供されるポリマーコンポジットおよび骨インプラントまたは移植片のためのその使用、具体的には、眼窩底再構築のためのその使用に関する。  本発明は特に、以下の工程：ａ）１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液体のまたは液化されたポリマー組成物を提供し；ｂ）該液体または液化されたポリマー組成物に、骨形成および骨誘導特性を有する１以上の薬剤を添加し、それにより該液体のまたは液化されたポリマー組成物中の該薬剤の分散物を提供し；ｃ）得られた生成物を架橋させ、それにより骨形成特性を有するコンポジットが提供される、を含んでなる、骨形成特性を有するコンポジットを提供する方法に関する。
2014534015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液体のまたは液化されたポリマー組成物を提供し；
ｂ）該ホモポリマーまたはコポリマーの液体または液化されたポリマー組成物に、骨形成特性を有する１以上の薬剤を添加し、それにより該液体のまたは液化されたポリマー組成物中の該薬剤の分散物を提供し；
ｃ）得られた生成物を架橋させ、それにより骨形成特性を有するコンポジットが提供される
を含んでなる、骨形成特性を有するコンポジットを提供するための方法。
【請求項２】
骨形成特性を有する１以上の薬剤が、塩、セラミック、ガラス、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、バイオガラス、硫酸カルシウム、リン酸オクタカルシウムおよび二相性リン酸カルシウムからなる群から選択される１以上の化合物であり、好ましくは二相性リン酸カルシウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）の液体のまたは液化されたポリマー組成物中の該薬剤の分散物が、分散物中のポリマーの全重量に対して５重量％〜９５重量％の１以上の薬剤を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液化された組成物が５０，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ホモポリマーまたはコポリマーが溶媒中に溶解することによって液化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の後で且つ工程（ｃ）の前に、該分散物を、好ましくは沈殿によりまたは１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーのガラス転移温度を下回る温度で、固化させ、次いで固化した該分散物を型に入れて所望の形に成形する工程を含んでなる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）で照射線量１０〜１００ｋＧｙ、好ましくは１０〜５０ｋＧｙ、のガンマ線を使用して前記生成物を架橋させ、それにより骨形成特性を有するエラストマーコンポジットが提供される、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液体のポリマー組成物が、５０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）の後で且つ工程（ｃ）の前に、少なくとも１つの二重結合または三重結合と架橋ラジカル開始剤を含んでなる架橋剤を添加し、工程（ｃ）で、光重合、熱重合またはレドックス重合を用いて前記分散物を架橋させ、それにより、注射可能なまたはパテの骨形成特性を有する前記コンポジットが提供される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のコポリマーが、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ポリマーと、ラクトン環状エステル、環状カーボネート、環状エーテル、環状無水物および環状デプシペプチドモルホリン２，５−ジオン誘導体からなる群から選択されるものとのコポリマーである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のコポリマーが、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ポリマーと、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびε−カプロラクトン（ＣＬ）からなる群から選択されるものとのコポリマーである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）とのコポリマーが、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ポリマーと、５−バレロラクトン、１，５−ジオキセパン−２−オンおよびｅ−カプロラクトンからなる群から選択されるものとのコポリマーである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋剤が、アクリレート官能化ポリ（トリメチレンカーボネート）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（トリメチレンカーボネート）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（トリメチレンカーボネート）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（ε−カプロラクトン）系オリゴマー、メタクリル酸官能化ポリ（ε−カプロラクトン）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（ε−カプロラクトン）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（エチレングリコール）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（エチレングリコール）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（エチレングリコール）系オリゴマーからなる群から選択される、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記架橋剤が、液体のポリマー組成物の全重量に対して０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜８重量％、より好ましくは１重量％〜５重量％である、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記溶媒が、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルスルホキシド、トルエン、ベンゼン、テトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサンからなる群から選択される、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られる、骨形成特性を有するコンポジット。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）の架橋したホモポリマーまたはコポリマーのポリマーマトリックス中に埋め込まれた請求項１〜１５のいずれかに記載の骨形成特性を有する１以上の薬剤からなる、骨形成特性を有するコンポジット。
【請求項１８】
成形品、注射剤またはパテの形態である、請求項１６または１７記載のコンポジット。
【請求項１９】
骨再生インプラントを提供するための、請求項１６〜１８のいずれかに記載のコンポジットの使用。
【請求項２０】
眼窩底再建のためのインプラントを提供するための、請求項１６〜１８のいずれかに記載のコンポジットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成性（osteogenic）および／または骨誘導性（osteoinductive）および／または骨伝導性（osteoconductive）等の骨形成特性を有するポリマーコンポジットを提供するための方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって提供されるポリマーコンポジット、および骨インプラントまたは移植片のためのそれらの使用、具体的には、眼窩再構築のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、骨欠損または骨折（眼窩底骨折等）の治療において再生されるのが理想的である。骨の再建又は骨欠損のために現在用いられている材料は、自家骨を除き、骨を再生しないので、一般的に骨代用材料として考えられている。
【０００３】
骨折は一般的には外傷の結果であるが、とりわけ骨欠損の場合には、疾患、栄養失調や遺伝性疾患等の他の原因を特定することができる。骨欠損、または骨折は、一般的には骨折した箇所や欠陥部分の再構成によって治療される。骨の欠損を再構築する際に、特に眼窩の欠損においては、脂肪の脱出（herniation of fat）および／または筋肉や結合組織等の組織の取り込みをできるだけ回避しなければならない。
【０００４】
現在、自己移植の、即ち「自己由来」の骨移植片の使用が、骨欠損の修復と再建のための「絶対基準」（golden standard）と考えられている。
【０００５】
しかしながら、自家骨移植の使用には、付加的な外科手術、ドナーサイトモービィディティ（donor site morbidity）や自家骨吸収の予測の難しさ等の欠点が伴う。
【０００６】
これらの問題を回避するため、チタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、シリコーンゴムのような、いくつかの非吸収性材料が、骨欠損または骨折の治療に適用されている。しかしながら、これらの材料は身体には吸収されず、合併症の生涯リスクが伴う。
【０００７】
また、ポリラクチドとポリグリコリドのポリマーマトリックス等の、生分解性および生体吸収性のインプラント材料や移植片を用いる取り組みもなされてきた。ポリラクチドとポリグリコリドの使用は、非吸収性材料に特徴的な合併症の生涯リスクが回避できるので有利である。
【０００８】
ポリラクチドとポリグリコリドの欠点は、それらの分解生成物が周囲の組織、骨や骨形成に対して悪影響を有することが知られているということである。骨欠損の再構成に用いられる現在の生分解性製品のもう一つ欠点は、生分解性材料の分解後に残る線維被膜（fibrous capsules）または瘢痕組織の過剰な発達である。
【０００９】
骨は骨欠損が治癒する間に再生され、再生された骨が周囲の骨とつながることが最適である。しかしながら、現在入手可能な材料を考えると、これが当てはまるのは、主にその骨形成特性（例えば骨形成（osteogenic）および／または骨誘導（osteoinductive）特性等）に起因して自己骨を用いられる場合だけ（少なくとも部分的には）である。
【００１０】
骨形成特性（骨形成性および／または骨誘導性等）を有する薬剤は知られており、リン酸カルシウムなどのセラミックリン酸塩が材料として有望である。いくつかのリン酸カルシウムは、種々の動物モデルにおいて、軟組織および硬組織における骨誘導性等の骨形成特性を発揮することが示されている。しかしながら、構造が脆く、特に、機械的強度が不十分であり、これらのセラミック材料を、骨インプラントまたは骨移植片等として用いる能力としてはまだ問題が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、当分野において、骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有し、骨の再生だけでなく、周囲の骨の構造と付着し、あるいは連結するような、生分解性の人工インプラント材料または人工骨移植片が求められている。
後者は、当分野では、骨の一体化（osseous integration）あるいはオッセオインテグレィション（osseointegration）と呼ばれている。
【００１２】
本発明の目的は、特に、骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有し、骨の再生だけでなく、周囲の骨構造に付着し周囲の骨構造とつながる、生分解性ポリマーマトリックスまたは人工インプラント材料に基づく人工骨移植片を提供することにより、上記の必要性に対処することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の、特に具体的な目的は、添付する特許請求の範囲に記載する本発明によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
具体的には、上記の目的は、特に、本発明の第一の態様に従い、骨形成性特性を有するコンポジットを提供するための方法によって達成され、この方法は下記工程を含んでなる：
ａ）１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液体のまたは液化されたポリマー組成物を提供し；
ｂ）該液体または液化されたポリマー組成物に、骨形成および骨誘導特性を有する１以上の薬剤を添加し、それにより該液体のまたは液化されたポリマー組成物中の該薬剤の分散物を提供し；
ｃ）得られた生成物を架橋させ、それにより骨形成特性を有するコンポジットが提供される。
【００１５】
酸性のポリマーおよび／または多層構造内に酸性の分解生成物を生じるポリマーから構成されるポリマーの層に本コンポジットをラミネートすることは、本願発明の方法の工程の一部ではないが、他の材料またはポリマーのラミネートは本発明の文脈において考えられる。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、上記の方法によって、骨形成だけでなく、新たに形成された骨の周囲の宿主骨との統合を可能にする、生分解性の、言い換えれば、移植後時間とともに完全に分解する、コンポジットが提供されることを発見した。
【００１７】
従って、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）（コ）ポリマーの、ポリマーマトリックスに埋め込まれた、本願の骨形成または骨促進（骨形成性および／または骨誘導性等）剤は、有用な骨移植片である。
【００１８】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、骨形成性および骨誘導性のような骨形成特性を有する本願の１以上の薬剤は、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウム、バイオガラス、硫酸カルシウム、および二相性リン酸カルシウムからなる群から選択されるセラミックである。
【００１９】
ヒドロキシアパタイトやリン酸三カルシウム等のリン酸カルシウム、バイオガラス、および硫酸カルシウムなどのセラミックは、生理学的環境における溶解度に大きく依存して程度が異なる、生物学的に活性な骨形成促進剤である。これらセラミックの骨形成促進活性は、これら材料に成長因子、ストロンチウム等のイオンを添加するか、または骨髄穿刺液と混合することにより、増大させることができる。
【００２０】
特に好ましい実施形態によれば、本セラミックスリン酸塩は、生理的環境において比較的溶解度の低い二相性リン酸カルシウム、即ち、２０±５％β−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）と８０±５％のハイドロキシアパタイト（ＨＡ）の混合物、である。
【００２１】
β−リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）（ＴＣＰ）は、ヒトの体内に存在する生体適合性のリン酸カルシウムであり、ヒトの骨の６０％〜７０％を構成する骨の無機相に相当する化学組成を有する。これは、骨充填材や骨代用材として使用されている。ハイドロキシアパタイトまたはヒドロキシルアパタイトは、カルシウムアパタイトの天然に存在する鉱物形態であり、式Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）で示される。骨の５０％ほどは、この無機物のハイドロキシアパタイトの修飾された形態で構成されている。
【００２２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、本願の、液体のまたは液化されたポリマーおよび１以上の骨形成促進剤の分散物は、５重量％〜９５重量％、好ましくは、１０重量％〜９０重量％、より好ましくは３０重量％〜７０重量％、例えば３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％または６５重量％の骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有する本願の１以上の薬剤を含有する。
【００２３】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、本発明の１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液化されたポリマー組成物は、５０，０００ｇ／ｍｏｌを超える、例えば、１００，０００、５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００または５００，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する。
【００２４】
工程（ａ）において、高分子量ポリマー、即ち通常５００モノマー以上を含んでなるポリマー、を提供することによって、骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成促進特性を有する本発明のコンポジットの物理特性が影響を受け得る。高分子量のポリマーによって、骨形成の間の十分な支持または機械的強度を提供しながら、眼窩底骨折のような比較的大きな骨欠損をカバーするのに特に好適なエラストマー材料が得られるであろう。
【００２５】
高分子量ポリマーを使用する場合の本発明の方法の特に好ましい実施形態によれば、本発明のホモポリマーまたはコポリマーは、溶媒、好ましくは、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルスルホキシド、トルエン、ベンゼン、テトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサンからなる群から選択される溶媒に溶解することにより液化される。
【００２６】
さらに、高分子量ポリマーを使用する場合の本方法の別の特に好ましい実施形態によれば、本方法は、工程（ｂ）の後で且つ工程（ｃ）の前に、該分散物を、好ましくは沈殿によりまたは１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーのガラス転移温度を下回る温度で、固化させ、次いで固化した該分散物を型に入れて所望の形に成形する工程を含んでなる。
【００２７】
従って、高分子量ポリマーを使用する場合、本発明の方法のさらに別の特に好ましい実施形態によれば、本発明は、骨形成性および骨誘導性等の骨形成または骨促進特性を有するコンポジットを提供するための方法に関し、その方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）５０，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーのポリマー組成物を提供し；
ｂ）該ポリマー組成物を溶解し、それにより溶解したポリマーの組成物を提供し；
ｃ）該溶解したポリマーの組成物に、骨形成特性を有する１以上の薬剤を添加し、それにより該溶解したポリマーの組成物中の該薬剤の分散物を提供し；
ｄ）該分散物を析出させ、それによりコンポジットプレシピテートを提供し；
ｅ）該コンポジットプレシピテートを型に入れて所望の形に成形し；そして
ｆ）成形したコンポジットプレシピテートを架橋させ、それにより骨形成特性を有するコンポジットが提供される。
【００２８】
前記工程（ｃ）、または工程（ｆ）の、本発明に係る比較的高分子量のポリマーの架橋は、好ましくは、照射線量１０〜１００ｋＧｙ、好ましくは１０〜５０ｋＧｙ、のガンマ線照射により行ない、それにより骨形成特性を有するエラストマーコンポジットを提供する。
【００２９】
本発明の方法のさらに別の好ましい実施形態によれば、本発明の１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のホモポリマーまたはコポリマーの液体のポリマー組成物は、５０，０００ｇ／ｍｏｌ未満（即ち、通常５００モノマー未満からなるポリマー）、例えば、４５，０００、４０，０００、３５，０００、３０，０００、２５，０００または２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。
【００３０】
工程（a）において、当分野でオリゴマーとも呼ばれる、比較的低分子量のポリマーを提供することにより、本発明の、骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有するコンポジットの物理特性は影響を受ける。低分子量のポリマー、即ちオリゴマー、では粘性のあるコンポジット材料が得られ、それにより比較的モノマー数が小さいオリゴマーを使用した場合には注射可能な半流動性の材料が得られ、比較的モノマー数が大きいオリゴマーを使用した場合はパテ状の特性を有する材料が得られる。
【００３１】
本発明に係る注射可能な半流動性のおよびパテ状のコンポジットは、骨再生能を有する、骨折や欠損のための充填材料として特に適している。
【００３２】
低分子量ポリマー、即ちオリゴマー、を用いる場合、本発明の方法の特に好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの二重結合または三重結合と架橋ラジカル開始剤を含んでなる架橋剤を、工程（a）の後で且つ工程（c）の前に添加し、工程（ｃ）で光重合、熱重合またはレドックス重合を用いて架橋を行い、それにより、注射可能なまたはパテ状の骨形成特性を有する前記コンポジットが提供される。
【００３３】
本発明に係る１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のコポリマーは、好ましくは、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ポリマーと、ラクトン環状エステル、環状カーボネート、環状エーテル、環状無水物および環状デプシペプチドモルホリン２，５−ジオン誘導体からなる群から選択されるものとのコポリマーである。これらのコポリマーはいずれも本発明に係る生分解性のコンポジットを提供する。
【００３４】
特に好ましい実施形態によれば、本発明に係る１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）のコポリマーは、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ポリマーと、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびε−カプロラクトン（ＣＬ）からなる群から選択されるものとのコポリマー、より好ましくは、１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ポリマーと、５−バレロラクトン、１，５−ジオキセパン−２−オンおよびε−カプロラクトンからなる群から選択されるものとのコポリマーである。
【００３５】
本発明に係る方法において使用される場合、本架橋剤は、好ましくは、アクリレート官能化ポリ（トリメチレンカーボネート）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（トリメチレンカーボネート）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（トリメチレンカーボネート）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（Ｌ−ラクチド）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（ε−カプロラクトン）系オリゴマー、メタクリル酸官能化ポリ（ε−カプロラクトン）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（ε−カプロラクトン）系オリゴマー、アクリレート官能化ポリ（エチレングリコール）系オリゴマー、メタクリレート官能化ポリ（エチレングリコール）系オリゴマー、フマル酸官能化ポリ（エチレングリコール）系オリゴマーからなる群から選択される。
【００３６】
存在する場合、本発明の架橋剤は、液体のポリマー組成物の全重量に対して、０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜８重量％、より好ましくは１重量％〜５重量％含有される。
【００３７】
上記のとおり、本方法は、骨形成だけでなく、再生した骨の周囲の骨構造への付着をもたらす、骨形成性および／または骨誘導性等の有用な骨形成または骨促進特性を有する、骨移植片またはコンポジットを提供する。
【００３８】
従って、第二の態様によれば、本発明は、上記の方法によって得られる、骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有するコンポジットに関する。
【００３９】
示したように、酸性のポリマーおよび／または多層構造内に酸性の分解生成物を生じるポリマーから構成されるポリマーの層に本コンポジットをラミネートすることは、本願発明の方法の工程の一部ではなく、したがって、そのようなラミネート体は本発明の方法により得られるものではない。
【００４０】
本発明に係るポリマーマトリックス中に埋め込まれた、本願の骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成または促進剤は、骨の形成だけでなく、周囲の骨構造への付着または結合ももたらす。
【００４１】
したがって、第三の態様によれば、本発明は、上記で定義した１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）の架橋されたホモポリマーまたはコポリマーのポリマーマトリックスに埋め込まれた、上記で定義した骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有する１以上の薬剤からなる、骨形成性および／または骨誘導性等の骨形成特性を有するコンポジットに関する。
【００４２】
上記で示したとおり、最初に提供された液体のまたは液化されたポリマーの分子量に応じて、本願のコンポジットの特性に影響を与えることができる。
【００４３】
従って、本願の第二または第三の態様の好ましい実施形態によれば、本願のコンポジットは、成形品（molded article）、注射剤（injectable）またはパテである。
【００４４】
本願のコンポジット、即ち骨移植片、の有利な特性は、特に、骨折または骨欠損の再構成において本願のコンポジットを用いたときに明白である。
【００４５】
したがって、第四の態様によれば、本発明は、骨再生インプラントを提供するための本願のコンポジットの使用、特に、眼窩底再建のためのインプラントを提供するための本願のコンポジットの使用に関する。
【００４６】
本発明について、以下の実施例でさらに詳細に説明し、好適な実施形態において本願のコンポジットの有利な特性を示す。実施例では図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】３ヶ月後の筋肉内移植部位の光顕微鏡写真を示す。Ａ〜Ｄはそれぞれ、ＢＣＰ、本発明のコンポジット、ラミネートコンポジット、ＰＴＭＣの筋肉内移植部位の全体像を示す。Ｅ〜Ｆはその拡大図（４倍）である。Ａ〜Ｃとその拡大図では、骨（ｂ）がはっきりと見え、ＢＣＰ顆粒（ｐ）に密着している。ＰＴＭＣ（●）マトリックスは広範囲に吸収され、貪食されたポリマー粒子（矢印）が観察される。（▲）は分解したＢＣＰ粒子の残存物が認められる領域を示している。（■）ＰＤＬＬＡポリマー。
【図２】それぞれ、純粋なＢＣＰ粒子（Ａ、Ｂ）、本発明のコンポジット（Ｃ、Ｄ）、ラミネートコンポジット（Ｅ、Ｆ）の筋肉内移植３ヶ月後の光顕微鏡写真（倍率２０倍−４０倍）を示す。ＢＣＰ粒子は、食細胞によって取り囲まれている。粒子の表面の星印は分解を示唆している。残ったＰＴＭＣ粒子（矢印）が容易に識別される。（Ａ、Ｃ及びＥは、倍率２０倍、Ｂ、Ｄ及びＦは４０倍）
【図３】眼窩移植の３ヶ月後（Ａ〜Ｆ）と９ヶ月後（Ｇ〜Ｌ）の光顕微鏡写真を示す。Ａ、Ｄ、Ｇ及びＪは、ＰＴＭＣシートによる再建を示す。線維性被膜形成（Capsule formation）が見え；骨形成の兆候は認められない。新しい骨の形成がはっきり見え、本願のコンポジットシートでは３ヶ月後（Ｂ、Ｅ）ＢＣＰ粒子と密着しており、９ヶ月後（Ｈ、Ｋ）進展がみられる。骨形成のほか、ＰＴＭＣの再吸収とＢＣＰ粒子の分解が示されている。ラミネートコンポジットシートでも、３ヶ月後（Ｃ、Ｆ）ＢＣＰ粒子の周囲に骨形成を示した。９カ月後、限られた量の骨形成が認められた（Ｉ、Ｌ）。（Ｄ〜Ｆ、Ｊ〜Ｌは、それぞれＡ〜Ｃ、Ｇ〜Ｉの４倍の倍率である）（●）ＰＴＭＣ、（＊）上顎洞、（ｂ）骨、（■）ＰＤＬＬＡポリマー、（矢印）残存ＰＴＭＣポリマー粒子、（ｃｔ）結合組織、及び（▲）は分解したＢＣＰ粒子の残存物が認められた領域を示す）
【図４】ヒツジの眼窩における、本コンポジット（Ａ、Ｂ）、ラミネートコンポジット（Ｃ、Ｄ）インプラント（および新たに形成された骨）の宿主骨への移行領域を示す光顕微鏡写真（２．５倍）を示す。ＡおよびＢは、それぞれ３ヶ月後と９ヶ月後の、新たに形成した骨の宿主の骨との優れた骨の統合を示す。Ｃは、３ヶ月後にラミネートコンポジットのＰＤＬＬＡ層が骨統合を妨げていることを明らかに示している。Ｄは、９ヶ月後にＰＤＬＬＡ層が分解しているものの、新たに形成した骨の宿主骨との統合が未だ起きていないことを示している。これは、新たに形成された骨と宿主骨との間に存在する線維性被膜が原因である可能性がある。
【図５】眼窩内移植３ヶ月後と９ヶ月後の、ＢＣＰ粒子の分解を示す光顕微鏡写真（２０倍）を示す。Ａ〜Ｂは本願のコンポジットインプラント、Ｃ〜Ｄはラミネートコンポジットインプラントを表す。ＢＣＰ粒子は、食細胞に取り囲まれている。粒子の星印は分解を示唆している。ＰＴＭＣ粒子の残存物（矢印）が容易に識別される。本願のコンポジットおよびラミネートコンポジットにおけるＢＣＰ粒子の分解は、ＢＣＰ粒子のみを含む筋肉内移植における分解に比べてより広範な傾向にあった。（＊）ＢＣＰが分解している領域を示し、（矢印）貪食されたＰＴＭＣを示す。
【図６】筋肉内移植されたＢＣＰ（Ａ〜Ｂ）と本願のコンポジット（Ｃ〜Ｄ）の落射蛍光共焦点顕微鏡写真を示す。Ｅ〜ＦおよびＧ〜Ｈは、それぞれ、眼窩内移植３ヶ月後と９ヶ月後の本願のコンポジットの画像である。Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧは、明視野像であり、Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＨは、落射蛍光画像である。カルセイン＝緑、キシレノールオレンジ＝赤、オキシテトラサイクリン＝青。３週間後、ポリマーＰＴＭＣマトリックスが再吸収されたエッジの近くで、筋肉内移植された量のＢＣＰと筋肉内移植されたコンポジットの周囲で骨形成が始まっていたことが認められる。眼窩内移植は同様の結果を示した。３ヵ月の群で、骨形成は３週間後に始まっていた（Ｅ〜Ｆ）。Ｇ〜Ｈは、骨形成のプロセスが９ヵ月の時点でもまだ活性であることを示している。
【図７】眼窩底位置の評価を示す。Ａは、ヒツジの術後ＣＢＣＴスキャンの側面図を示す。本願のコンポジットインプラント（矢印）は放射線不透過性を有しており、上顎洞（＊）の上部にはっきり識別することができる。Ｂは、術前のスキャン画像に術後のスキャン画像を重ね合わせたものである。目的の領域をハイライト表示している。術前の状況と比較した場合、インプラントの中央にわずかな「ネガティブ」な変形がある。インプラントが欠損の境界上に位置するとき（すなわちもとの眼窩底の境界線上に置いたとき）眼窩底の術前の状況と比較すると、変形はやや「ポジティブ」である。
【実施例】
【００４８】
前書き
材料および方法
材料
重合グレードの１，３−トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）は、Boehringer Ingelheim（ドイツ）から入手した。オクタン酸第一錫（SnOct\2、Sigma、米国）は入手したものをそのまま用いた。高分子量のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ＰＤＬＬＡ（Ｌ対Ｄ−ラクチドのモル比：５０／５０）は、Purac Biochem（オランダ）から入手し、そのまま使用した。１１５０℃にて焼結、粒径４５〜１５０μｍに篩過された二相性リン酸カルシウムセラミック（ＴＣＰ：２０±５％、ＨＡ：８０±５％）は、Xpand Biotechnology（オランダ）から入手した。使用した溶媒は工業グレードのものでBiosolve（オランダ）から購入した。
【００４９】
コンポジットおよびラミネートの作製 
ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）は、トリメチレンカーボネートを１３０℃にて３日間開環重合することにより調製した。オクタン酸第一錫は、モノマー１モル当たり２×１０−４モルの濃度で触媒として使用した。標準化された手順に従って、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、合成したポリマーの分析を行ったところ、高分子量ポリマーが合成されたことを示した。
【００５０】
ＧＰＣ測定により、分子量＝４１４，０００、Ｍｎ＝３１６，０００グラム／モルであり、ＮＭＲは、モノマー転化率が９８％以上であることを示した。熱分析では、この非晶質ポリマーのガラス転移温度が約−１７℃であることが示された。
【００５１】
ＰＴＭＣポリマーは、クロロホルムに溶解し、過剰のエタノール中で析出させて精製した。同様に、ＢＣＰ粒子とＰＴＭＣのコンポジットは、ＰＴＭＣを５ｇ／１００ｍＬの濃度でクロロホルムに溶解した後、ＢＣＰを溶液中に添加し、均一に分散させることにより調製した。次いで、分散液を、５倍過剰量の１００％エタノール中で析出させた。コンポジットを回収し、一定の重量に達するまで室温で真空下に乾燥させた。ＣＰの３０体積％に相当する５０重量％を含有するＰＴＭＣ／ＢＣＰコンポジットを調製した。
【００５２】
乾燥後、精製したＰＴＭＣとコンポジットの沈殿物を、Carver model 3851-0 laboratory press (Carver, USA)を用いて、１４０℃、３．０ＭＰａの圧力（３１ｋｇ／ｃｍ２）にて厚さ１．５ｍｍのシート状に圧縮成形した。高分子量もであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）は、Ｍｗ＝２３４０００ｇ／ｍｏｌで、Ｍｎ＝１７８０００ｇ／ｍｏｌであった。ＮＭＲは、残存モノマー含有量が１％未満であったことを示した。ガラス状ポリマーはまた非晶質であり、ガラス転移温度は約５２℃であった。このポリマーは、１４０℃で厚さ０．３ｍｍのシートに圧縮成形した。
【００５３】
ＰＴＭＣ／ＢＣＰコンポジットおよびＰＤＬＬＡのラミネートは、コンポジット材料のシート上にＰＤＬＬＡシートを１４０℃にて圧縮成形することにより調製した。コンポジット層は厚さ１．２ｍｍでありＰＤＬＬＡ層は厚さ０．３ｍｍであった。
【００５４】
次いで、調製したシートを真空下に密封し、６０Ｃｏ源（ISOTRON BV, Ede,オランダ）からの２５ｋＧｙのガンマ線照射に曝露し架橋させた。
【００５５】
動物実験の実験計画 
動物に対して実行されたすべての手順は、動物保護に関する国際基準、並びにフローニンゲン大学医療センターの動物実験委員会に準拠して行った。
【００５６】
完全に成長した雌性のオランダテクセルヒツジに施術し、（均等に）２つの群に分けた。第１のグループは、追跡期間を３カ月とし、第二のグループの追跡期間を９ヶ月とした。不規則な形の、臨界サイズ２．５〜３．０ｃｍ２の円形の欠損を両側の眼窩底に作り、下記により再構築した：
１）ＰＴＭＣシート、
２）コンポジット（ＰＴＭＣ／ＢＣＰ）シート
３）ラミネートコンポジット（ＰＴＭＣ／ＢＣＰ−ＰＤＬＬＡ）シート
【００５７】
骨誘導を実証するため、上記のＰＴＭＣ、コンポジットおよびラミネートコンポジットシートのサンプル（１．５ｍｍ×１０ｍｍφ）、並びに１ｍＬの量のＢＣＰ粒子を、ヒツジの背中に筋肉内移植した。以下の表１に概要を示す。
【表１】
2014534015.tif 000003
【００５８】
さらに、再構築された眼窩底の位置を評価するために、すべてのヒツジを、手術の１週間前および１週間後にコーンビームコンピュータ断層撮影（ＣＢＣＴ）で評価した。骨形成を経時的にモニターするため、３ヶ月および９ヶ月の実験終了の６週間前と３週間前に蛍光色素マーカーを投与した。骨形成は、落射蛍光共焦点顕微鏡及び慣用の光学顕微鏡を用い、非脱灰切片の組織学及び組織形態計測によって評価した。
【００５９】
外科処置および蛍光色素標識 
１０匹の完全に成長したメスのオランダテクセルヒツジ（２４〜３６ヶ月齢）を入手し２週間かけて順応させた。外科的処置は全身麻酔下で実施した。睫毛下部を剃毛し消毒した後、両方の眼窩底を経眼窩法（infraorbital approach）を用いて露出させた。骨膜を持ち上げ、眼窩底を穿子および／またはノミを用いて砕いた。骨片は、欠損部位から除去した。作製した骨欠損のサイズは２．５〜３．ｃｍ2であった。
【００６０】
次いで、眼窩底をインプラント材料（ＰＴＭＣ、コンポジットまたはラミネートコンポジットシート）のいずれかを使用して再構築した。欠損部全体を確実にカバーするよう注意を払った。このため、インプラントをハサミでサイズに合わせて調整した。脱落を防ぐため、インプラントをチタン製ネジ（１．５×３．５ｍｍ、KLS-Martin、ドイツ）で固定した。
【００６１】
再建後、外傷の状況を模倣するため眼窩骨膜を切開した（この切開により、実際の外傷の状況と同様に、眼窩脂肪と筋肉が眼窩内へ脱出して再建材料へ力が加わる）。傷口を重ねて吸収性縫合糸（ポリグラクチン９１０、Ethicon、米国）で閉じた。
【００６２】
同時に、サンプルの筋肉内移植を傍脊柱筋に行った。背中の異なる移植部位をマークするため、筋膜を非吸収性の縫合糸（ポリプロピレン、Ethicon、米国）で閉じた。その他の層は吸収性の縫合糸を用いた。
【００６３】
手術の前にアモキシリンを投与し、術後６日間投与を継続した。ブプレノルフィンを周術期および術後の疼痛緩和のため投与した。
【００６４】
終了の前に蛍光色素マーカーを投与した。カルセイングリーン（１０ｍｇ／ｋｇ静注、Sigma、オランダ）を終了の９週間前に投与し、キシレノールオレンジ（１００ｍｇ／ｋｇ静注、Sigma、オランダ）を終了の６週間前、オキシテトラサイクリン（Engemycine32 mg/kg筋肉内、Mycofarm、オランダ）を終了の３週間前に投与した。３ヶ月および９ヶ月の追跡の後、動物をペントバルビタール（オルガノン、オランダ）の過剰投与によって屠殺し、回収した移植部位を４％リン酸緩衝ホルマリン溶液中で固定した。
【００６５】
組織プレパラート
固定したサンプルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でリンスし、エタノール溶液（７０％、８０％、９０％、９６％、１００％×２）で段階的に脱水し、メチルメタクリレート（ＬＴＩ、オランダ）中に包埋した。ダイヤモンド鋸（ライカSP1600、Leica Microsystems、ドイツ）を用いて、組織切片（厚さ１０〜２０μｍ）を作製した（前者は眼窩底に対して垂直面に沿って、後者はインプラントの長軸に平行に）。光学顕微鏡（ニコンエクリプスＥ２００、日本）観察用に、切片を１％メチレンブルー（Sigma Aldrich）および０．３％塩基性フクシン（Sigma-Aldrich社）溶液で染色し、未染色の切片を、落射蛍光共焦点顕微鏡（ライカ TCS SP2, Leica, ドイツ）観察用に作製した。
【００６６】
落射蛍光データは、透過光検出を含む２０倍の油浸対物レンズを用いて得た。それぞれの吸収（abs.）および発光（em.）波長ピークは以下のとおりである：351/364 nm abs.、560 nm em.（テトラサイクリン）、543 nm abs.、580nm em.（キシレノールオレンジ）、488 nm abs.、517 nm em.（カルセイン）。
【００６７】
組織形態計測と統計 
組織形態計測分析用の染色切片の画像は、スライドスキャナ（Dimage Scan Elite 5400 II、コニカミノルタフォトイメージング株式会社、日本）を用いて作成した。
【００６８】
組織形態計測は、Adobe Photoshop Elements 4.0ソフトウェアを用いて行った。要するに、インプラントの面積を、目的の領域（ＲＯＩ）として選択し、対応する画素数を登録した。次いで、ＢＣＰ粒子と石灰化した骨の両方を、擬似着色し、得られた画素数を利用可能な空間における骨形成の百分率を計算するために用いた（利用可能な空間は、ポリマーが吸収されたＢＣＰ粒子間の空間として定義される）。
【数１】
2014534015.tif 000004
【００６９】
利用可能な領域における骨形成の百分率について平均値および標準偏差を計算した。フィッシャーの正確確率検定は、３ヶ月と９ヶ月の群について比較した、異なる材料間、並びに個々の材料間の骨形成の差を評価するために用いた。データのセットを、SPSS 17（社会学のための統計パッケージ、SPSS Inc.、米国）を用いて統計的に評価した。帰無仮説（各セットの平均が等しい）は、信頼水準95％（α=0.05）と評価された。
【００７０】
放射線検査 
術前および術後（再構成された）の眼窩底の位置を評価するため、コーンビームコンピュータ断層撮影（ＣＢＣＴ）を実施し、終了時にも行った。ＣＢＣＴスキャンはプロポフォールによる全身麻酔下で行った。ＣＢＣＴ画像は、Ｉ−ＣＡＴスキャナ（ボクセルサイズ０．３ｍｍ、視野１７０ｍｍ）を用いて取得し、さらなる分析のために保存した。各スキャンは、基準としてスキャナのレーザガイドを使用して、動物の頭を同じ再現可能な位置にして行った。
【００７１】
模倣ソフトウェア（Materialise Dental、ベルギー）を用い、各データセットに各々のデータセットについて骨が示される最適な閾値を用いて、すべての個々のスキャンの３次元（３Ｄ）復元を作成した。
【００７２】
次に、術前（インタクトな）の眼窩底と術後の再構築された眼窩底（即ち眼窩底インプラント）、並びに終了時の再構築された眼窩底を、目的の領域（ＲＯＩ）として選択した。
【００７３】
Geomagic Studioソフトウェア（Geomagic Gmbh、シュトゥットガルト、ドイツ）を使用して、この３Ｄ復元スキャン画像の位置を整え、ＩＣＰ（Iterative Closest Point）登録アルゴリズムを用いて術前の３Ｄ復元スキャン画像とともに登録した。術前のスキャン画像はこのようにリファレンスとして保存した。術前と術後（または終了時）の眼窩底をハイライト表示した。
【００７４】
データセット間の偏差は、眼窩底の表面の間の距離を表示するスライド式のカラースケールで測定した（図６）。
【００７５】
各インプラントについての負の平均偏差（すなわち、欠損のレベルで）を以下の表２に示した。
【００７６】
【表２】
2014534015.tif 000005
【００７７】
このようにして、異なる再構成材料について、異なる時点での変形を測定した。次に、異なるインプラントについて（全体の）平均の負の変形を計算し、これを用いて次式：
【数２】
2014534015.tif 000006
式中：
Ｖ増加＝  再構築材料の変形に起因して増加した眼窩腔の体積（ｍ３）
ｈ＝  ディスク型インプラントの変形（ｍ）
ｒ＝  ０．００９８（ｍ）；これは眼窩底欠損の測定値（３．０ｃｍ２）の半径
により、眼窩底体積の増加量を決定した。
【００７８】
眼窩体積の変化を用いて、ヒツジの眼窩底欠損の再構築についての、異なるインプラントの適合性を評価した。＋０．７ｃｍ３の眼窩体積の増加が、最大限許容し得る体積増加と考えられた。＞０．７ｃｍ３の眼窩体積の増加は眼球陥入につながり得るので、避けるべきである。
【００７９】
結果 
インビボ実験中、いずれのヒツジも、感染または有害な組織反応の徴候は示さなかった。９頭のヒツジは健康で、１頭（他の点では健康な）は術後６ヶ月に予想外に死亡した。検死を行ったがはっきりとした死因は分からなかった。この研究から除外した動物はなかった。早期に死亡した動物は、別途、６ヶ月時の群として評価した。
【００８０】
筋肉内移植の顕微鏡観察の説明
３ヶ月後および９ヵ月後にすべての筋肉内インプラントを追跡し、移植部位を採取した。以下の表３に、異なるインプラントについての骨の発生率の一覧を示す。
【表３】
2014534015.tif 000007
【００８１】
染色した切片の光学顕微鏡評価は、ＢＣＰ粒子を含有する移植のほとんどに骨形成が認められたことを示した。ＰＴＭＣ単独での移植（即ち、ＢＣＰを含有するコンポジットでない）は、いずれのヒツジにおいても骨の形成に至らなかった。
【００８２】
図１は、３ヶ月後の筋肉内移植の概要である。光顕微鏡観察は、骨がＢＣＰ粒子の周囲に形成されており、粒子の表面と密接に接触していたことを示した。骨形成に加えて、結合組織の内部成長が観察された。さらに、移植したコンポジットについては、ＰＴＭＣのポリマーマトリックスの吸収が大きかったことが示された。認められたＰＴＭＣはごく少量に過ぎなかった。ラミネートコンポジットのＰＤＬＬＡ層が依然としてみられた。ＰＴＭＣ移植は骨形成を示さなかった。ＰＴＭＣポリマーは依然として認められ、密性結合組織の線維性被膜に囲まれていた。
【００８３】
ポリマーの分解の兆候に加えて、ＢＣＰ粒子の分解も観察された。図２（高倍率）では、ＰＴＭＣポリマーマトリックスの分解とＢＣＰ粒子の分解が示されている。より詳しく観察すると、食細胞および多核巨細胞の動員が起こっていることが示された。これらの細胞は、ＰＴＭＣポリマーマトリックスの残骸に囲まれて付着しており、またＢＣＰ粒子の表面に付着していた。
【００８４】
９ヶ月後のマウスでは、純粋なＢＣＰ粒子の移植により骨形成が進行していることが示されたのに対し、筋肉内移植した（ラミネート）コンポジットではいずれも骨形成は示されなかった。コンポジットのポリマーＰＴＭＣマトリックスは、ほぼ完全に吸収され、貪食されたＰＴＭＣ粒子がわずかに観察された。ＢＣＰ粒子を含有するすべての移植について９カ月後に、ＢＣＰ粒子の分解の兆候も観察された。
【００８５】
分解の兆候は進んでいたものの、ＰＴＭＣの筋肉内移植のサンプルは依然として確認された。インプラントは依然として密な結合組織からなる線維性被膜に囲まれていた。
【００８６】
眼窩インプラント顕微鏡観察の説明
眼窩移植の結果ついては表３と図３に示す。３ヶ月後、コンポジットおよびラミネートコンポジットのインプラントは骨形成を明かに示した。ＰＴＭＣポリマーマトリックスの大部分は吸収され、ＰＴＭＣのわずかな残存物が観察された。新たに形成された骨は、ＢＣＰ粒子と密に接触していた。さらに、コンポジットインプラントにおける新たに形成された骨は、コンポジットインプラントが宿主骨と接する場所（すなわち眼窩底欠損の境界）で宿主の骨（即ちその動物の骨）と骨統合を示した（図４）。
【００８７】
複合インプラントは、コンポジットインプラントがその結果として宿主骨と接触しなかった欠損のレベルでは、密な結合組織のいくつかの層がインプラントを覆っていた。対照的に、ラミネートコンポジットは、宿主の骨と新たに形成した骨とのこの統合を示さず、密な結合組織からなる線維性被膜に完全に囲まれていた（図４）。
【００８８】
９カ月後、コンポジットインプラントについて骨形成が進行しているように思われた。コンポジットインプラントとラミネートコンポジットインプラントの両方で、ＰＴＭＣポリマーマトリックスのほぼ完全な吸収が示された。貪食されたＰＴＭＣポリマーのみが観察された。この時点ではＰＤＬＬＡ層は完全に吸収されたように見えた。コンポジットインプラントにおいて新たに形成された骨の宿主骨との統合を依然として示したのに対し、ラミネートコンポジットは線維性被膜に囲まれたままであり、その後も統合は示さなかった。
【００８９】
ＢＣＰ粒子の分解の兆候も眼窩インプラントにおいて発見された。図５は、３ヶ月および９ヶ月後のコンポジットインプラントとラミネートコンポジットインプラントを高倍率で示したものである。ここでは貪食細胞の動員も観察された。これらの細胞は、ＢＣＰ粒子並びにＰＴＭＣの残存物にも付着していた。
【００９０】
６カ月後に死亡した動物の組織学的所見は、９ヶ月後の、他の動物での観察と同程度であった。この動物において、眼窩コンポジットインプラントは、宿主骨と一体化した新しい骨形成を示した。他の眼窩に移植されたラミネートコンポジットインプラントは骨形成を示したものの、新たに形成された骨は、（再び）宿主骨と統合されなかった。線維性被膜が、ラミネートコンポジットを囲んでいた。純粋なＢＣＰ粒子の量が移植された場合を除き、骨形成を示した筋肉内移植はなかった（表３）。
【００９１】
ポリマーマトリックスとＰＤＬＬＡ層の分解と吸収は、３ヶ月後の標本と比べて進行していることを示したが、９ヶ月群のように進んではいなかった。ＰＤＬＬＡ層の残残物は依然として確認された。ＢＣＰ粒子の分解もまた、ＢＣＰ粒子を含有する全てのインプラントにおいて観察された。
【００９２】
蛍光顕微鏡検査
シーケンシャル蛍光色素ラベルの落射蛍光共焦点顕微鏡は、移植後３週間で純粋なＢＣＰ粒子と（ラミネート）コンポジットの筋肉内移植において骨の形成が始まったことを示した。同様の結果が、眼窩移植においてコンポジットインプラントとラミネートコンポジットインプラントについて観察された（図６）。
【００９３】
蛍光色素標識の分析は、骨形成がＢＣＰ粒子の表面で開始し、周辺に向かって進行していることを示した。９ヶ月後の蛍光色素標識は、骨形成およびリモデリングのプロセスが、眼窩底インプラントにおいて依然として活性であることを示した。筋肉内に移植された（ラミネート）コンポジットサンプルで９ヶ月後に蛍光標識を示したものはなかった。
【００９４】
組織形態計測
筋肉内および眼窩移植についての組織形態計測分析の結果を表３に示す。利用可能な領域（ポリマーが吸収されたＢＣＰ粒子間の空間として定義される）における骨形成について、平均のパーセンテージおよび標準偏差を示す。各移植においてすべての動物が骨形成を示したわけではないという事実に加えて、個々の動物においておよび個々の動物間で、形成した骨の量に大きな変動がみられた。
【００９５】
３ヶ月後の測定では、眼窩底コンポジット移植において７．７±８．１％（平均±ＳＤ）の骨の形成を示した。９カ月後では、骨の割合は１５．５±１２．０％まで増加した。ラミネートコンポジット眼窩底インプラントは、３ヶ月と９ヶ月後に、それぞれ、５．３±４．０％、１．７±２．４％の骨形成を示した。筋肉内移植で示された骨形成は限定的なものであった。
【００９６】
３ヶ月後、筋肉内に移植されたコンポジットサンプルは、０．３±０．６％の骨形成を示しラミネートコンポジットは２．０±１．９％の骨形成を示した。純粋なＢＣＰ粒子の筋肉内移植は２．９±５．９％の骨形成を示し、９ヶ月後、６．４±６．９％まで進んだ。
【００９７】
途中で死亡した動物は、ラミネートコンポジットとコンポジットインプラントについて、それぞれ１３．９％および１４．９％の骨形成を示した。純粋ＢＣＰ粒子の筋肉内移植は、１２．８％の骨形成が測定された。
【００９８】
ＣＢＣＴによる評価
図７は、眼窩底の再構成の評価プロセスを図で示し、インプラントの性能を示す。放射線不透過性のコンポジットとラミネートコンポジットのシートが容易に確認できることが分かる。上述したように、カラーマッピングは、術前の無傷の眼窩底と比較して、再構成された眼窩底の偏りの変化を示している。
【００９９】
異なる期間について、インプラントの変形および計算されたインプラントの変形による眼窩体積の最大の変化の結果を表２にまとめる。
【０１００】
ＰＴＭＣインプラントで治療した動物における眼窩体積の増加は３ヶ月と９ヶ月後でそれぞれ、＋０．１６〜＋０．２３ｃｍ３であったことがわかる。コンポジットインプラントで処置した動物は＋０．１４〜＋０．１９ｃｍ３の範囲の眼窩体積の増加を示したのに対し、ラミネートコンポジットインプラントで処置した動物は＋０．１１〜＋０．１５ｃｍ３の体積増加を示した。
【０１０１】
考察
本実施例では、ＰＴＭＣと微細構造のＢＣＰからなるコンポジット材料の骨誘導特性の評価について説明する。コンポジット材料は、ヒツジにおいて、同所移植（眼窩）だけでなく、異所移植（筋肉）の部位の両方で評価した。コンポジット材料の骨誘導特性の評価と同時に、耐荷重材料としてのコンポジット材料の適合性を評価した。
【０１０２】
ＰＴＭＣ／ＢＣＰコンポジット材料およびＰＤＬＬＡラミネートＰＴＭＣ／ＢＣＰコンポジット材料は骨誘導特性を有することが示された。また、蛍光色素標識はコンポジット材料の骨誘導能力が９ヶ月後も活性であることを示した。
【０１０３】
外科的処置中、成形能力（shape-ability）に関して、コンポジットおよびラミネートコンポジット、並びにＰＴＭＣインプラントは所望の形状に容易にカットすることができることが明らかとなった。最も重要なことに、今回の結果は、コンポジット並びにラミネートコンポジットが骨誘導特性を発揮することを示した。さらに、コンポジットインプラントは、ラミネートコンポジットとは対照的に、新たに形成した骨と宿主骨との優れた骨統合を示した。
【０１０４】
骨の形成を同時に伴うＰＴＭＣポリマーマトリックスの分解の組織学的観察は、吸収性のポリマーマトリックスが、リン酸カルシウム粒子の骨誘導特性に悪い影響を与えることなく、リン酸カルシウムセラミックの機械的特性を高めることができるという仮説を支持した。
【０１０５】
しかしながら、ラミネートコンポジットについては、骨の形成、並びに新たに形成した骨と宿主の骨の統合において悪影響が観察された。
【０１０６】
本願のコンポジットはまた、正常／局所組織の再生に支障を来さない（優れた骨統合）ことに加え、分解プロセスが露出されたＢＣＰ粒子に沿って継続し、それにより表面積対体積比が増大するので、より好ましい表面積対体積比を有すると期待される。
【０１０７】
個々の動物においておよび個々の動物の間で観察された骨の誘起量の比較的大きな変動は、骨誘導物質に関する研究では珍しいことではない。動物特有の要因が誘導された骨の量に影響を与えることに加えて、移植部位特有の要因も関係することが知られている。
【０１０８】
同所移植は、異所移植と比べて誘導される骨の量が多くなる傾向がある。また、外因性の細胞に対して異なる応答（例えば、外因性の骨形成タンパク質（ＢＭＰ））や骨誘導のプロセスに関与する内因性の細胞の異なる作用につながるような遺伝的な要因により、骨促進環境で新しい骨を形成する個々の動物の固有の能力は変わり得る。
【０１０９】
ＣＢＣＴによる評価は、再構築された眼窩底がいずれも、術前の解剖学的状況と比較して、適切に配置されたことを示した。インプラントの変形による上記の臨界値（０．７ｃｍ３）を超える眼窩体積の計算された増加は認められなかった（表２）。
【０１１０】
結論
本実施例は、ＰＴＭＣと微細構造のＢＣＰ粒子からなる骨誘導コンポジット材料の作製と評価について説明するものである。結果から、本願のコンポジット材料は、成形可能で、骨誘導および骨形成特性を発揮し、周囲の宿主骨との統合または付着を示すと結論することができる。
【図１】
2014534015.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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