(57)【要約】  本発明は、（ａ）タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列：とタンパク質合成効率向上の活性を有する制御配列を含む機能性核酸分子、および（ｂ）当該機能性核酸分子の利用、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と；
（ｂ）上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、
を含む、機能性核酸分子。
【請求項２】
上記制御配列はＳＩＮＥ（Short Interspersed Element）由来の配列を含んでいる、請求項１に記載の機能性核酸分子。
【請求項３】
上記ＳＩＮＥ由来の配列が、ＳＩＮＥ−Ｂ２由来の配列である、請求項２に記載の機能性核酸分子。
【請求項４】
上記制御配列が以下の（１）〜（５）からなる群より選択される、請求項１に記載の機能性核酸分子。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ
（２）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ
（４）（ｉ）配列番号１、２または３に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡと少なくとも２５％の類似性を有し、かつ、（ｉｉ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸、および
（５）（ｉ）配列番号１、２または３に示される塩基配列において、１以上で２００以下の塩基が欠失、置換、付加、および／または挿入されたＤＮＡによってコードされ、かつ、（ｉｉ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸。
【請求項５】
上記ターゲット決定配列が当該機能性核酸分子における５’末端と制御配列との間に配置されている、請求項１〜４の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
【請求項６】
上記ターゲット決定配列が７塩基以上で２５０塩基以下の長さを有している、請求項１〜５の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
【請求項７】
上記ターゲット決定配列がタンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列、またはタンパク質合成効率を向上させる対象であるタンパク質をコードするＲＮＡにおける始めの開始子コドン付近の配列に対して、少なくとも６０％の類似性を有する、請求項１〜６の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
【請求項８】
上記機能性核酸分子の上記制御配列が翻訳の方向に対して逆向きに配置されている、請求項１〜７の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
【請求項９】
上記ターゲット決定配列がタンパク質をコードするＲＮＡの５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）またはタンパク質をコードするＲＮＡにおける始めの開始子コドン付近の配列にハイブリダイズするように設計された、請求項１〜８の何れか一項に記載の機能性核酸分子。
【請求項１０】
（ａ）タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と；
（ｂ）上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、
を含むＲＮＡ分子を調製する工程を含む、機能性核酸分子の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９の何れか一項に記載の機能性核酸分子をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１２】
請求項１〜９の何れか一項に記載の機能性核酸分子、または請求項１１に記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜９の何れか一項に記載の機能性核酸分子、請求項１１に記載のＤＮＡ分子または請求項１２に記載の発現ベクターを含む、タンパク質合成効率を向上させる組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜９の何れか一項に記載の機能性核酸分子を、タンパク質をコードするＲＮＡの一部が機能性ＲＮＡ分子の標的決定配列と類似性を有する当該タンパク質をコードするＲＮＡと共存させる工程、を含むタンパク質合成効率向上方法。
【請求項１５】
上記工程（ａ）において機能性核酸分子または請求項１１に騎士あのＤＮＡ分子を細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のタンパク質合成効率向上方法によってタンパク質合成効率を向上させる工程を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１７】
タンパク質の量的現象によって引き起こされる疾患の治療方法であって、請求項１４または１５に記載のタンパク質合成効率向上方法によって、当該疾患または当該疾患の疾病素因を持つ被験者においてタンパク質合成効率を向上させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）タンパク質合成効率を向上させる機能性核酸分子と、（ｂ）当該機能核酸分子の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、各種の機能性ＲＮＡ分子群が知られており、代表的な機能性ＲＮＡ分子の一例は、アンチセンスＲＮＡ等の比較的長い機能性ＲＮＡ分子である。代表的な機能性ＲＮＡ分子の他の例は、ｓｈ（short hairpin）ＲＮＡ、ｓｉ(small interfering)ＲＮＡ、ｍｉ(micro interfering)ＲＮＡ等の比較的短い機能性ＲＮＡ分子である。これら機能性ＲＮＡ分子は何れも遺伝子発現のダウンレギュレーションに寄与することが一般的によく知られている（非特許文献１）。
【０００３】
アンチセンスＲＮＡ技術は、ターゲット特異性に優れる。しかし、抗ウイルス応答を活性化するという欠点を有する。一方、ｓｈＲＮＡ等の比較的短い機能性ＲＮＡ分子は、抗ウイルス応答を実質的に活性化しない。その代わりに、対象配列に対する高い特異性を維持することが難しいためオフターゲット効果を生じる可能性を持っている。したがって、比較的短鎖の機能性RNA分子は、アンチセンスRNA手法に比べて低いターゲット特異性を示す傾向がある。
【０００４】
特許文献１では、ターゲット配列の発現抑制のための相補的な配列；Pol IIIタイプIIIプロモーター；と、少なくともｓｒｐ９とｓｒｐ１４タンパク質への結合ドメインを含む７ＳＬ小ＲＮＡ由来配列（特にはＡｌｕ由来配列の断片）：を含む機能性核酸分子（ＤＮＡ分子）が開示されている。ｓｒｐ９とｓｒｐ１４のタンパク質は７ＳＬ複合体からの遺伝子転写において７ＳＬＲＮＡに結合するタンパク質ファミリーの一員である。
特許文献１に開示された機能性核酸分子は、当該機能性核酸分子から転写されたＲＮＡ分子が実質的に抗ウイルス応答活性を引き起こさずに優れたターゲット特異性を持つ遺伝子発現抑制技術として利用されることが述べられている。
【０００５】
Ａｌｕは、ＳＩＮＥｓ (Short Interspersed Elements)の一グループとして分類される。特許文献１において開示されている機能性核酸分子のＡｌｕ由来配列は特定の向きで挿入され、ＲＮＡ安定性に関係があると考えられていることに注意されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００８／１１３７７３  Ａ２（国際公開日２００８年９月２５日）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】He L, Hannon GJ. Nat Rev Genet. 2004 Jul;5(7):522-31. PMID 15211354
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１やその他の文献において広く報告されているように、遺伝子発現を抑制する多くのタイプの機能性核酸分子等が報告されている。転写効率を向上させることで遺伝子発現を向上させる技術はいくつか報告されているが(Nature Chemical Biology 3, 166 - 173 (2007), B . Janowski et al.のケースのように)、転写効率の向上は、プラトー効果のためにタンパク質合成効率を直接的な割合で常に向上させる訳ではない。この点において、翻訳されるタンパク質の合成は、得られたRNAがリボソームとの効率的に接触できるかの能力を含めた、多くの他の因子に依存しているかもしれない。さらに、自然界に存在するｍＲＮＡの転写の上昇は、常に細胞や器官で可能なわけではない。即ち、直接的にタンパク質合成効率を向上させるいかなる機能性核酸分子も報告されていなかった。
【０００９】
本発明者らは、翻訳のみに機能することが求められる多くの場面があると考えた。例えば、細胞核内でのｍＲＮＡ転写リプログラミングは不要であることから、転写に干渉しないで治療目的のための動物のタンパク質の翻訳を増強することが強く望まれるだろう。
【００１０】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものである。本発明の目的は、タンパク質合成効率を向上させる機能性核酸分子と、当該機能性核酸分子の利用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らの現在の知見から、タンパク質の翻訳はｍＲＮＡの翻訳画分の上流に位置するｍＲＮＡの領域の構造を含む因子によって制御されていると考えられる。この領域は、5’UTR(5’ 非翻訳領域)として知られている。本発明の目的のためには、5’UTRは自然界に存在するもの(自然界において発見されたRNA、転写開始点から開始コドン)であっても良く、またはクローニングベクターやその他のリコンビナント配列などの人工物であってもよい。
【００１２】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、ノンコーディングＲＮＡとして知られるＲＮＡ分子の機能の解析を通じて、そのようなＲＮＡ分子のある特定の構造がタンパク質合成効率を向上させる機能を有するという驚くべき事実を本発明者らは見出した。当該機能性核酸分子は、ターゲット配列のアンチセンス配列を通じて特定の標的となるタンパク質に対して効果を示した。当該知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明に係る機能性核酸分子は、
（ａ）タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と；
（ｂ）上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、を備える。
【００１４】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記制御配列はＳＩＮＥ（Short Interspersed Element）由来の配列を含んでいる。具体的には、ＳＩＮＥ由来の配列は、ｔＲＮＡ由来のＳＩＮＥ、例えば、ＳＩＮＥ  Ｂ２、ＩＤエレメント、ＭＥＮ、４．５Ｓ１、ＤＩＰ由来の配列、または、これらの配列もしくは類似の配列の複数個を別々のエレメントとして連結したものを含む配列であってもよい。ＳＩＮＥ由来の配列は、例えば、ＳＩＮＥ配列の一部によって形成された、実質的に可能性のある予測構造を含む配列であってもよい。
【００１５】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記制御配列は以下の（１）〜（５）からなる群より選択されるものであってもよい：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ（ＡＳ  Ｕｃｈｌ１におけるＳＩＮＥ／Ｂ２）
（２）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ（ＡＳ  Ｕｃｈｌ１における、ＳＩＮＥ／Ｂ２、下線で示した３９ｎｔのスペーサー、およびＳＩＮＥ／Ａｌｕ）
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ（ＡＳ  ＵｘｔにおけるＳＩＮＥ／Ｂ２）
（４）（ｉ）配列番号１、２または３に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡと少なくとも２５％の類似性を有し、かつ、（ｉｉ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸
（５）（ｉ）配列番号１、２または３に示される塩基配列において、１以上で２００以下の塩基が欠失、置換、付加、および／または挿入されたＤＮＡによってコードされ、かつ、（ｉｉ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸。
【００１６】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記ターゲット決定配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含む。
【００１７】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記ターゲット決定配列は、当該機能性核酸分子における５’末端と制御配列との間に配置されていてもよい。
【００１８】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、７塩基以上で２５０塩基以下の長さを有していることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対して、または、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるＡＴＧの上流のプラスミド配列に対して、少なくとも６０％の類似性を有することが好ましい。
【００２０】
本発明に係る機能性核酸分子では、制御配列の方向を正とした場合でのＳＩＮＥ由来の配列の方向は、当該方向（上記で定義される正の方向）に対して逆方向に配向されており、ＳＩＮＥ由来の配列は、ＳＩＮＥのコンセンサス配列と同じ方向に配向されている。すなわち、上記機能性核酸分子の制御配列は、翻訳の方向に対して正方向に配向しており、かつ、アンチセンス核酸分子の転写の方向に対して逆方向に配向している。
【００２１】
５’→３’方向を正方向と定義すると、本発明における上記ＳＩＮＥ由来の配列は、その５’→３’方向は上記ＳＩＮＥのコンセンサス配列と一致しているが、本発明における機能性核酸分子の逆方向に埋め込まれている。
【００２２】
本発明に係る機能性核酸分子では、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡの５’−ＵＴＲにおけるターゲット配列とハイブリダイズするように設計されていてもよい。あるいは、上記ターゲット決定配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡのコード領域におけるターゲット配列とハイブリダイズするように設計されていてもよい。さらに、上記ターゲット決定配列は、タンパク質をコードするＲＮＡのターゲット配列における開始コドン上流のプラスミド配列とオーバーラップしていてもよいし、タンパク質をコードするＲＮＡのターゲット配列における開始コドンを含んでいてもよい。本発明に係る機能性核酸分子は、タンパク質をコードするＲＮＡの５’末端における、または、当該分子の他の部分における特定のスプライシング変異体をターゲットとし得る。
【００２３】
本発明に係る機能性核酸分子は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と、タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、を備える限りにおいて、当業者によって、適宜、設計されて製造され得る。合成中または合成後のあらゆる修飾が、ＲＮＡ療法学などの知識／方法に従って、当業者によって機能性核酸分子に適用され得る。
【００２４】
本発明に係るＤＮＡ分子は、上述の機能性核酸分子として、何れか１つの上記ＲＮＡ分子をコードする。
【００２５】
本発明に係る発現ベクターは、上述の機能性核酸分子として、何れか１つの上記ＲＮＡ分子または上記ＤＮＡ分子を含む。
【００２６】
本発明に係るタンパク質合成効率を向上させる組成物は、何れか１つの上述の機能性核酸分子および／または上述の発現ベクターを含む。
【００２７】
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、何れか１つの上述の機能性核酸分子または上述の発現ベクターを、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡと共存させる工程を含む。上記タンパク質をコードするＲＮＡは、上記機能性核酸分子のターゲット決定配列におけるアンチセンスとハイブリダイズ可能である。
【００２８】
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法では、細胞に対して、何れか１つの上述の機能性核酸分子または上述の発現ベクターをトランスフェクトする（または形質導入する）工程を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明に係るタンパク質合成方法は、タンパク質を合成する方法であって、何れか１つの上述のタンパク質合成効率向上方法によってタンパク質合成効率を向上させる工程を含む。
【００３０】
本発明に係る疾患の治療方法は、対象において、何れか１つの上述のタンパク質合成効率向上方法によってタンパク質合成効率を向上させる工程を含み、当該疾患は所定の正常タンパク質の量的減少またはハプロ不全に起因する。
【００３１】
本発明に係る治療方法では、上記対象は、疾患または疾患の素因を有していてもよく、当該疾患は正常タンパク質の量的減少またはハプロ不全に起因する。さらに、上記機能性核酸分子は、所定の正常タンパク質の合成効率を向上させるものであってもよい。
【００３２】
また、上記疾患が所定の正常タンパク質の量的減少またはハプロ不全に起因し、変異タンパク質のような異常タンパク質を包含する別のタンパク質の量的増加に起因する場合、本発明の治療方法は、適宜、従来のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ等による当該別のタンパク質発現を抑制させる方法、および／または、従来の抗体もしくは低分子化合物等を用いたタンパク質機能を不活性化させる方法と併用することができる。
【００３３】
また、本発明に係る治療方法では、上記疾患は、例えば、神経変性疾患または癌であってもよい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、（ａ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する機能性核酸分子、および（ｂ）当該機能性核酸分子の利用を見事に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、実験１に関するものであり、Ｕｃｈｌ１／ＡＳ  Ｕｃｈｌ１のゲノム編成の概略図である。
【図２】図２は、実験２に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１のドメイン編成の概略図である。ＡＳ  Ｕｃｈｌ１のエキソンは灰色で示されており；反復エレメントは赤色（Ａｌｕ／ＳＩＮＥＢ１）および青色（ＳＩＮＥＢ２）で示されている。イントロンは線で表されている。
【図３】図３は、実験３に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１がＵｃｈＬ１タンパク質のレベルを制御することを示す図である。ＡＳ  Ｕｃｈｌ１がトラスフェクトされたＭＮ９Ｄ細胞は、ｍＲＮＡ量が変化することなく、空のベクターのコントロールと比較して、内因性のＵｃｈＬ１タンパク質のレベルの向上を示す。
【図４】図４は、実験４に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１がＵｃｈＬ１タンパク質のレベルを制御することを示す図である。トランスフェクトするＡＳ  Ｕｃｈｌ１の量を増加させると、ＨＥＫ細胞のおけるＵｃｈＬ１タンパク質の量が漸増する。Ｕｃｈｌ１のｍＲＮＡレベルに変化はない。
【図５】図５は、実験５に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１がＵｃｈＬ１タンパク質のレベルを制御することを示す図である。内因性（ＭＮ９Ｄ細胞、左パネル）および過剰発現（ＨＥＫ細胞、右パネル）のＵｃｈＬ１タンパク質のレベルを制御するために、全長（ＦＬ）のＡＳ  Ｕｃｈｌ１が必要である。Δ５’またはΔ３’欠失変異体の構成が示されている。
【図６】図６は、実験６に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１が、埋め込まれたＳＩＮＥＢ２を介して、ＵｃｈＬ１タンパク質のレベルを制御することを示す図である。反転したＳＩＮＥＢ２はＵｃｈＬ１タンパク質のレベルを調節するのに充分である。変異体の構成が示されている。
【図７】図７は、実験７に関するものであり、ＳＩＮＥＢ２が埋め込まれたＡＳ転写物のファミリーを示す図である。タンパク質をコードする遺伝子のＡＳ（アンチセンス）であり、反転した向きに埋め込まれたＳＩＮＥＢ２を含む、ＦＡＮＴＯＭ３ノンコーディングクローンのファミリー。
【図８】図８は、実験８に関するものであり、ＳＩＮＥＢ２が埋め込まれたＡＳ転写物のファミリーを示す図である。Ｕｘｔ／ＡＳ  Ｕｘｔのゲノム編成の概略図。ＡＳ  Ｕｘｔは、トランスフェクトしたＭＮ９Ｄ細胞において、内因性のＵｘｔタンパク質のレベルを向上させる（左）が、その転写に影響を与えない（右）。
【図９】図９は、実験９に関するものであり、ドーパミン作動性ニューロンの核におけるＡＳ  Ｕｃｈｌ１の発現を示す図である。ＡＳ  Ｕｃｈｌ１（赤色）およびＵｃｈｌ１（緑色）の転写物は、黒質のＴＨ陽性ＤＡニューロンの核および細胞質において発現している（青色）。局在の詳細は拡大画像に示す。
【図１０】図１０は、実験１０に関するものであり、ＭＮ９Ｄ細胞においてラパマイシン処理後にＡＳ  Ｕｃｈｌ１が細胞質へ移行することを示す図である。転写物の５’オーバーラップ部または３’末端部に及ぶプライマーを用いて測定したｍＲＮＡレベル。データは平均±標準偏差、ｎ≧３（３）を示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図１１】図１１は、実験１１に関するものであり、ラパマイシン処理がＵｃｈｌ１タンパク質の発現を誘引することを示す図である。Ｕｃｈｌ１タンパク質のレベルは、ラパマイシン処理したＭＮ９Ｄ細胞において向上する。
【図１２】図１２は、実験１２に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１に埋め込まれたＳＩＮＥＢ２が、ラパマイシン処理後にＵｃｈｌ１の翻訳を誘引することを示す図である。ＭＮ９Ｄ細胞におけるＡＳ  Ｕｃｈｌ１の転写のサイレンシング（ｓｈＲＮＡ、ターゲット配列の−１５／＋４の位置を含んでいる）は、ラパマイシンに誘引されたＵｃｈｌ１タンパク質のレベルを抑制した。スクランブル，ｓｈＲＮＡ制御配列。左，ｍＲＮＡレベル；右，タンパク質レベル。
【図１３】図１３は、実験１３に関するものであり、ＡＳ  Ｕｃｈｌ１に埋め込まれたＳＩＮＥＢ２が、ラパマイシン処理後にＵｃｈｌ１の翻訳を誘引することを示す図である。埋め込まれたＳＩＮＥＢ２の欠失（ΔＳＩＮＥＢ２）は、ラパマイシンに誘引されたＵｃｈｌ１タンパク質の上方制御を抑制するのに充分である。
【図１４】図１４は、実験１４に関するものであり、人工的なヒト化強化緑色蛍光タンパク質（Ｇｆｐ）ｍＲＮＡに対応する、ＳＩＮＥＢ２が埋め込まれた人工的なＡＳ転写物（ＡＳ  Ｇｆｐ）が、ＧＦＰタンパク質合成を向上させることを示す図である。図１４の（ａ）は、Ｇｆｐ／ＡＳ  Ｇｆｐ構築物の概略図を示す。図１４の（ｂ）は、スクランブルのオーバーラップする配列または空のプラスミドはトランスフェクトしたＨＥＫ細胞においてＧｆｐタンパク質のレベルを向上させない一方、ＡＳ  ＧｆｐはトランスフェクトしたＨＥＫ細胞においてＧｆｐタンパク質のレベルをどのように向上させるかを示す。オーバーラップは７２ｎｔ長であり、ＡＴＧの中央にある。
【図１５】図１５は、実験１５に関するものであり、ｐＨＹＧＲＯ中の人工的な組換え抗体（ｐＨＹＧＲＯクローン）に対応する、ＳＩＮＥＢ２が埋め込まれた人工的なＡＳ転写物（ＡＳ  Ｆｃ  クローン）が、ｐＨＹＧＲＯにコードされているタンパク質の合成を向上させることを示す図である。ａ，ｐＨＹＧＲＯ／ＡＳ  Ｆｃ構築物の概略図。ｂ，ＳＶ５  ｔａｇを介して検出したところ、ＡＳ  Ｆｃは、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞においてコードされているタンパク質のレベルを向上させ、一方でスクランブルのオーバーラップする配列または空のプラスミドの場合では向上しない。
【図１６】図１６は、実験１６に関するものであり、人工的な緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡに対応する、ＳＩＮＥＢ２が埋め込まれた人工的なＡＳ転写物が、どのようにＥＧＦＰタンパク質合成を向上させるかを示す図である。
【図１７】図１７は、ＳＩＮＥ  Ｂ２由来の配列の、可能性のある予測構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について、より具体的に説明する。
【００３７】
［１．機能性ＲＮＡ分子］
（機能性核酸分子の構成）
本発明に係る機能性核酸分子は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と；上記タンパク質合成効率を向上させる活性を有する制御配列と、を備えるという特徴を有する。本発明に係る機能性核酸分子は、本書の記載に基づいて、適宜、当業者において設計し、製造することができる。
【００３８】
本発明によれば、タンパク質合成効率が向上する。一実施形態において、上記タンパク質合成効率は、翻訳効率における向上の結果として向上し、好ましくは転写効率を実質的に変化させることなく向上する。それゆえ、翻訳効率が向上するにつれて、タンパク質合成効率が向上するものであってもよい。別の実施形態において、転写および翻訳の両方を、別々の方法によって向上させるができ；当然、ＲＮＡがより低い発現レベルとなり、さらにタンパク質がより高い発現レベルとなってもよい。
【００３９】
（タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡ）
本発明に係る機能性核酸分子によりタンパク質合成効率が向上する、タンパク質をコードするＲＮＡは、５’末端の開始コドンおよび３’末端の終止コドンを有している翻訳領域（コード領域）を含んでいるＲＮＡであれば特にその配列、由来等は限定されない。具体的には、本発明に係る機能性核酸分子によりタンパク質合成効率が向上する、タンパク質をコードするＲＮＡ（ターゲットとなるＲＮＡ）は、５’キャップ構造、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）および／または３’非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。これらの領域は、細胞における内因性配列に由来してもよいし、人工的に合成した配列に由来してもよい。発現ベクターに遺伝子のオープンリーディングフレーム（コード配列）が位置しているＯＲＦｅｏｍｅは、その一例である。
【００４０】
また、３’非翻訳領域には、そのさらに３’末端にポリＡ配列が付加され得るための配列（ポリＡ付加シグナル）が含まれていることが好ましい。ポリＡ付加シグナルは、例えば、ＡＡＵＡＡＡからなる塩基配列、２つのＡＡＵＡＡＡ配列を含んでいるSV40 early polyA signal、またはSV40 early polyA シグナルがタンデムに並んでいる配列などであってもよい。ポリＡ付加シグナルはこれらに限定されない。例として、それ以外の様々なポリアデニル化部位が文献に記載されており、いくつかのｍＲＮＡでは従来のポリアデニル化シグナルすら保持していない（Carninci et al, Genome Res. 2003 Jun;13(6B):1273-89. PMID: 12819125）。
【００４１】
本発明に係るタンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡは、その３’末端にポリＡ配列を有していてもよい。３’末端にポリＡ配列を有しているＲＮＡは、翻訳ドメインからのタンパク質合成効率およびＲＮＡ自身の安定性に優れている。そのようなＲＮＡは、例えば、Ｕｃｈｌ１、Ｕｘｔ、ＧＦＰに示される何れかのＲＮＡ、またはこれらの何れかのＲＮＡのホモログであってもよいが、これらに制限されない。
マウス（Mus musculus）ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（Ｕｃｈｌ１）  RefSeq: NM_011670.2
Ｕｃｈｌ１  ＲＮＡをコードするＵｃｈｌ１  ＤＮＡの配列を配列番号４に示す。
マウス（Mus musculus）ubiquitously expressed transcript（Ｕｘｔ）  RefSeq: NM_013840.3
Ｕｘｔ  ＲＮＡをコードするＵｘｔ  ＤＮＡの配列を配列番号５に示す。
ＧＦＰ（ｐＥＧＦＰベクター由来の配列）
ＧＦＰ  ＲＮＡの配列をコードするＧＦＰ  ＤＮＡの配列を配列番号６に示す。
【００４２】
タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡは、生物由来の内因性ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。また、真核生物に由来するｍＲＮＡの範疇には、いわゆるプロセシングを受けた成熟ｍＲＮＡ、およびプロセシングを受ける前の前駆体ｍＲＮＡも含まれる。
【００４３】
（ターゲット決定配列）
上記ターゲット決定配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列に対するアンチセンス配列を含む配列である。ターゲット配列は、本発明においてタンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡの部分配列から任意に選択される。ターゲット配列は、タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入されかつ最初の５’末端の開始コドンを囲むプラスミドＤＮＡから転写されるＲＮＡ配列に由来してもよい。アンチセンス配列の長さは特に限定されない。しかしながら、異なるＲＮＡｓが含まれる系において、ターゲットとなるＲＮＡに対する特異性を向上させる観点では、アンチセンス配列の長さは、７塩基より長いことが好ましく、１０塩基より長いことがより好ましく、１５塩基より長いことがより好ましい場合がある。さらに、アンチセンス配列の長さは、２５０塩基より短いことが好ましく、２００塩基より短いことがより好ましく、１５０塩基より短いことがより好ましく、１００塩基より短いことがより好ましく、９０塩基より短いことがより好ましく、８０塩基より短いことがより好ましく、７７塩基より短いことがより好ましく、７０塩基より短いことがより好ましく、６０塩基より短いことがより好ましく、５０塩基より短いことがより好ましく、４０塩基より短いことがより好ましく、３０塩基より短いことがより好ましい場合がある。
【００４４】
一実施形態において、ターゲット決定配列中に２以上の異なるアンチセンス配列が含まれていてもよい。例えば、複数のタンパク質をターゲットとするために、これらの複数のアンチセンス配列を適用することができる。あるいは、同一のタンパク質をコードするＲＮＡとハイブリダイズ可能である複数のアンチセンス配列を、当該タンパク質をコードするＲＮＡに対する特異性を向上させるために適用することができる。一実施形態において、長い二本鎖ＲＮＡのような長い二本鎖核酸分子の存在により細胞中で起こり得るγインターフェロンの反応を回避するために、本発明のターゲット決定配列は、ターゲットとなるＲＮＡに対してミスマッチを含んでいてもよい。
【００４５】
また、本発明の機能性核酸分子とターゲットとなるＲＮＡとの特異性を向上させる観点では、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡにおけるターゲット配列および／または当該ターゲット配列を含むプラスミド由来ＲＮＡとハイブリダイズが可能な限りにおいて、上記タンパク質をコードするＲＮＡにおける対応ターゲット配列との間で、好ましくは少なくとも６０％の相同性、より好ましくは少なくとも７０％の相同性、より好ましくは少なくとも７５％の相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも８５％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するように設計される。特に好ましくは、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列と、上記ターゲット配列の対応配列とが、完全に一致するように設計することである。
【００４６】
また、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡの５’−ＵＴＲにハイブリダイズするように設計することができる。この設計は、全長がコードされているタンパク質の合成に適用することができる。５’−ＵＴＲは、細胞における内因性の配列に由来してもよいし、人工的な配列に由来してもよい。上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、ターゲットとなるＲＮＡのコード領域等の、上記ターゲットＲＮＡの５’−ＵＴＲ以外の領域にハイブリダイズ可能に設計してもよい。例えば、当該ターゲットとなるＲＮＡのコード領域の所定の部分に、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列がハイブリダイズ可能に設計することができる。この設計は、ＲＮＡがコードするタンパク質が非常に大きく、かつそれ自体で生理活性を示すドメインを有する、ジストロフィン遺伝子等に有効である。
【００４７】
さらに、上記ターゲット決定配列におけるアンチセンス配列は、５’ＵＴＲと、コード配列または上記タンパク質をコードするｍＲＮＡの３’ＵＴＲのような、配列の他の機能性部分の一部との両方にハイブリダイズするように設計することができる。
【００４８】
（制御配列）
本発明に係る機能性核酸分子では、上記制御配列が上記タンパク質合成効率を向上する活性を有している。
【００４９】
本発明の一実施形態において、上記制御配列はＳＩＮＥ由来の配列を含んでいてもよい。具体的には、ＳＩＮＥ由来の配列は、ｔＲＮＡ由来のＳＩＮＥ、例えば、ＳＩＮＥ−Ｂ２、ＩＤエレメント、ＭＥＮ、４．５Ｓ１、ＤＩＰ由来の配列であってもよい。さらに、Ａｌｕ等の７ＳＬ−ＲＮＡ由来の配列が上記制御配列に含まれていてもよい。
【００５０】
一実施形態において、複数のＳＩＮＥ由来の配列が上記制御配列に含まれ得る。これらの複数のＳＩＮＥ由来の配列は、異なる配列と組み合わされていてもよく、例えば、ＳＩＮＥ  Ｂ２由来の配列とＡｌｕ由来の配列との組み合わせ、または、異なるＳＩＮＥ  Ｂ２由来の配列の組み合わせであってもよい。
【００５１】
ＳＩＮＥ由来の配列は、全体的にまたは部分的に各種のＳＩＮＥのコンセンサス配列と同一または類似の配列を指す。例えば、ＳＩＮＥ−Ｂ２由来の配列は、全体的にまたは部分的にＳＩＮＥ  Ｂ２のコンセンサス配列と同一または類似の配列を指す。ＳＩＮＥのコンセンサス配列に対して切り詰めたＳＩＮＥ由来の配列であっても、タンパク質合成効率を向上させる機能を保持する限りにおいて本発明ではＳＩＮＥ由来の配列として使用することができる。ＳＩＮＥ由来の配列は、例えば、ＳＩＮＥ配列の一部によって形成された実質的に可能性のある予測構造を含む配列であってもよい。ＳＩＮＥ−Ｂ２由来の配列の可能性のある予測構造の例は、図１６の（ａ）および（ｂ）に示されるとおりである。
【００５２】
類似の配列とは、ＳＩＮＥのコンセンサス配列に対して、少なくとも２５％の類似性、好ましくは少なくとも５０％の類似性、より好ましくは少なくとも５５％の類似性、より好ましくは少なくとも６０％の類似性、より好ましくは少なくとも６５％の類似性、より好ましくは少なくとも７０％の類似性、より好ましくは少なくとも７５％の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の類似性、より好ましくは少なくとも８５％の類似性、より好ましくは少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する配列を指す。
【００５３】
ＳＩＮＥの配列は、上記のこれら保存されたコンセンサスに由来してもよい。例えば、配列番号１のＳＩＮＥ  Ｂ２断片、配列番号３、および文献（参照：Espinosa et al, http://rnajournal.cshlp.org/content/13/4/583.full）から無作為に取ってきた別のＳＩＮＥ  Ｂ２という３つの配列のみの間でのＳＩＮＥ  Ｂ２間のコンセンサス類似性の分析では、ＳＩＮＥ  Ｂ２断片間のみで３６塩基中少なくとも９塩基、わずか２５％の類似性で共通し得ることを明白に示す。
【００５４】
さらに、分岐しているにもかかわらず、これらはやはり、公知（Bioinformatics. 2000 Nov;16(11):1040-1.MaskerAid: a performance enhancement to RepeatMasker.Bedell JA, Korf I, Gish W.）のRepeatMaskのようなプログラムを用いてＳＩＮＥ  Ｂ２エレメントとして認識可能である。
【００５５】
一実施形態において、上記長さは、タンパク質合成効率の向上を引き起こすことが可能な、ＳＩＮＥエレメントとの類似性を有する最も短い配列に限定することができる。
【００５６】
一実施形態において、本発明で説明されるＳＩＮＥエレメントと部分的な類似性を有し、かつ合成されたタンパク質のレベルを向上するよう作用する、人工的な核酸配列を合成することが可能である。
【００５７】
また、本発明に係る機能性核酸分子は、タンパク質合成効率をさらに助長する目的で、タンデムに並んでいる複数の制御配列を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明の明細書において、「ＳＩＮＥ」とは、非ＬＴＲ（long terminal repeat）型のレトロトランスポゾンのうち、（ａ）逆転写活性およびエンドヌクレアーゼ活性等を有しないタンパク質をコードするものであって、かつ（ｂ）生物のゲノム中に完全なまたは不完全なコピーが大量に存在する、散在性反復配列を広く指す。すなわち、ＳＩＮＥは、ＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写され、ゲノムに組み込まれるＤＮＡ配列であるが、これらのプロセスを他の宿主の因子に依存したＤＮＡ配列である。ＳＩＮＥの長さは特に限定されないが、通常は、２０ｂｐ以上、好ましくは３０ｂｐ以上、より好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは５０ｂｐ以上であり、７００ｂｐ以下、好ましくは６００ｂｐ以下、より好ましくは５００ｂｐ以下、より好ましくは４００ｂｐ以下の範囲内である。また、ＳＩＮＥの由来も限定されないが、通常はｔＲＮＡ由来であってその５’末端側にｔＲＮＡに対応する配列を有する配列である。また、ＳＩＮＥは、Ａｌｕ等の７ＳＬ  ＲＮＡ由来の配列、およびＳＩＮＥ３等の５Ｓ  ｒＲＮＡ由来の配列であってもよい。ＳＩＮＥ３に関しては、Kapitonovらによる文献（Vladimir V. Kapitonov and Jerzy Jurka: Molecular Biology AND Evolution 20(5): p694-702, 2003）等が参照される。
【００５９】
上記制御配列は、例えば、以下の（１）〜（５）から選択されてもよい：
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ
（２）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ
（３）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡ
（４）（ｉ）配列番号１、２または３に示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるＲＮＡと少なくとも２５％の類似性を有し、かつ、（ｉｉ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸
（５）（ｉ）配列番号１、２または３に示される塩基配列において、１以上で２００以下の塩基が欠失、置換、付加、および／または挿入されたＤＮＡによってコードされ、かつ、（ｉｉ）タンパク質合成効率を向上させる機能を有する核酸。
【００６０】
欠失、置換、付加、および／または挿入される塩基の数は、好ましくは１以上で１７５以下であり、より好ましくは１以上で１５０以下であり、より好ましくは１以上で１２５以下であり、より好ましくは１以上で１００以下であり、より好ましくは１以上で７５以下であり、より好ましくは１以上で５０以下であり、より好ましくは１以上で３０以下であり、より好ましくは１以上で２０以下である。
【００６１】
（ターゲット決定配列と制御配列との位置的関係）
本発明では、ターゲットとなるタンパク質が翻訳される方向（センス鎖方向）を「正方向」と定義し、正方向と反対の方向を「逆方向」と定義する。本発明に係る機能性核酸分子では、ターゲット決定配列と制御配列との位置的関係は特に限定されない。しかしながら、上記ターゲット決定配列が、上記制御配列よりも、上記機能性核酸分子における正方向側に近接して配置されるものが好ましい。上記ターゲット決定配列と上記制御配列とは直結してもよい。あるいは、上記ターゲット決定配列と上記制御配列との間に、両者を連結するリンカー配列および／またはそのような配列が挿入されていてもよい。
【００６２】
本発明に係る機能性核酸分子では、制御配列において正方向となるＳＩＮＥ由来の配列の方向が、当該方向（上記定義では正方向）に関して逆方向に向いており、ＳＩＮＥ由来の配列がＳＩＮＥのコンセンサス配列と同じ方向に向いていることが好ましい。すなわち、機能性核酸分子の制御配列は、翻訳の方向に関して正方向に向いている。
【００６３】
５’→３’方向を正方向と定義する場合、本発明におけるＳＩＮＥ由来の配列では、その５’→３’方向がＳＩＮＥのコンセンサス配列に一致しており、本発明における機能性核酸分子に逆方向で埋め込まれている。例えば、ＳＩＮＥ  Ｂ２由来の配列のうちの１つの場合において、ＳＩＮＥ  Ｂ２由来の配列のＡボックス部位は、ＳＩＮＥ  Ｂ２由来の配列のＢボックス部位よりも、機能性核酸分子の３’側に位置している。
【００６４】
（機能性核酸分子の製造）
本発明に係る機能性核酸分子の製造方法は、上述のＲＮＡ分子を調製する工程を含む。機能性核酸分子は、公知の核酸生合成法によって調製されてもよいし、あるいは、例えば、（ｉ）当該機能性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を作成し、（ｉｉ）当該ＤＮＡ分子を当該機能性ＲＮＡ分子へと転写する方法によって調製してもよい。機能性核酸分子のサイズは特に限定されないが、例えば、核酸生合成法で製造するという観点では、２０００塩基以下のサイズが好ましく、２５０塩基以下のサイズがより好ましい。
【００６５】
［２．ＤＮＡ分子、発現ベクター、タンパク質合成効率を向上させる組成物］
本発明に係るＤＮＡ分子は、何れか１つの上述の本発明に係る機能性核酸分子をコードする。また、本発明に係る発現ベクターは、何れか１つの上述の本発明の機能性ＲＮＡ分子を含むＲＮＡベクター、または、本発明に係る上記ＤＮＡ分子を含むＤＮＡベクターである。また、本発明に係るタンパク質合成効率を向上させる組成物は、何れか１つの上述の機能性核酸分子または上述の発現ベクターを含む。
【００６６】
一実施形態において、本発明に係る上記組成物は、例えば、インビトロでタンパク質を製造するための網状赤血球抽出物；または、工業利用、研究目的、もしくはあらゆる他のスクリーニングのためのタンパク質を発現している哺乳動物細胞においてインビボでタンパク質を製造するための網状赤血球抽出物のような、インビトロ系をベースとした翻訳剤を含んでいてもよい。
【００６７】
本発明に係る上記発現ベクターのバックボーンは、特定の種類に特に限定されず、プラスミドベクターから適宜選択すればよい。プラスミドベクターは、用いる宿主細胞の種類および用途に応じて、哺乳動物、酵母、昆虫の発現ベクター、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルス発現ベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター）、ファージベクター、コスミドベクター等であってもよい。例えば、本発明を、ヒトを含む哺乳動物の遺伝子治療に用いる場合には、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ベクター、またはレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを構築して調製すればよい。
【００６８】
あるいは、上記発現ベクターは、最終的に、ターゲットとなる発現細胞または生物のゲノムに組み込まれてもよい。
【００６９】
［３．タンパク質合成効率向上方法］
（タンパク質合成効率向上方法）
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡとを共存させる工程を含む。この工程は、インビボで行うこともできるし、タンパク質無細胞合成系を用いたインビトロで行うこともできる。本発明において、「インビボ」は具体的には細胞培養または動物全体を用いる系を意味し、「インビトロ」は具体的には無細胞アッセイを用いる系を意味する。上記工程をインビボで行う場合は、単離した細胞または組織において、上記機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させる対象である、タンパク質をコードするＲＮＡとを共存させてもよい。あるいは、生体において、上記機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させる対象であるＲＮＡとを共存させてもよい。
【００７０】
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、細胞に対して、上記機能性核酸分子をコードする上述の発現ベクター、または上記機能性核酸分子自体をトランスフェクトする工程を含み、このトランスフェクトする工程によって上記機能性核酸分子と上記タンパク質をコードするＲＮＡとを共存をさせる方法であってもよい。「細胞」とは、単離した細胞のみならず、個体を構成している細胞も指す。上記タンパク質合成効率を向上させる対象であるＲＮＡは、細胞における内因性の配列に由来してもよいし、人工的に合成したタンパク質をコードするＲＮＡに由来してもよい。細胞へ核酸分子をトランスフェクト（遺伝子導入）する方法は、例えば、ベクターによる自律的な感染、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ウイルス導入等、従来の方法で適宜行えばよい。上記ベクターは、宿主のゲノムに永続的に組み込まれてもよいし、組み込まれなくてもよい。
【００７１】
上記細胞は、動物および植物を含むあらゆる生物からの細胞の何れかに由来してもよいし、樹立された細胞株から選択される細胞の何れかに由来してもよい。
【００７２】
本発明において、動物としては脊椎動物が挙げられ、好ましくはヒトを含む動物であるが、これらの例に限定されない。
【００７３】
本発明において、植物としては単子葉植物および双子葉植物の両方が挙げられる。一実施形態において、上記植物は、農作物（例えば、穀物および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、コメ、モロコシ、雑穀類、カッサバ、オオムギ、またはエンドウ）、または他のマメ科植物である。別の実施形態において、上記植物は、野菜または観賞植物であってもよい。本発明の植物は：トウモロコシ（Zea mays）、カノーラ（Brassica napus、Brassica rapa ssp.）、アマ（Linum usitatissimum）、アルファルファ（Medicago sativa）、コメ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cerale）、モロコシ（Sorghum bicolour、Sorghum vulgare）、ヒマワリ（Helianthus annus）、コムギ（Tritium aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Lopmoea batatus）、カッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cofea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Anana comosus）、カンキツ属の木（Citrus spp.）、ココア（Theobroma cacao）、チャ（Camellia senensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifer indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia intergrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、オートムギ、またはオオムギであってもよいが、これらの例に限定されない。
【００７４】
本発明において、上記樹立された細胞株としては、COS-1（ATCC No.CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、ヒト胎児腎細胞株293（ATCC NO.CRL 1573）、PerC6（Crucell）、仔ハムスター腎細胞（BHK）（ATCC CRL.1632）、BHK570（ATCC NO: CRL 10314）、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（例えば、CHO-K1、ATCC NO: CCL 61、DG44等のDHFR minus CHO細胞株、特に懸濁培養に適応したCHO細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ATCC CRL-1587）、HeLa細胞、SH-Y5Y細胞、イヌ腎細胞（ATCC CCL 34）、ヒト肺細胞（ATCC CCL 75）、Hep G2および骨髄腫またはリンパ腫細胞（例えばNSO（US 5,807,715を参照））、Sp2/0、YO、他の動物由来細胞（Sf9細胞、DT40等）が挙げられるが、これらの例に限定されない。さらに、上記樹立された細胞株は、ハイブリドーマ、または遺伝子導入、核移植および／もしくは化合物処理によって特定の特徴を与えられた細胞でもよく、例えば、核移植した胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞（国際公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号、特開２０１０−２７３６８０、特開２０１０−２８４０８８、特開２０１１−５０３７９、特開２０１１−４６７４等）、ニューロン幹細胞もしくはｉＰＳ細胞等から分化したニューロン細胞、または再プログラミングされた線維芽細胞等に由来するニューロン細胞が挙げられるが、これらの例に限定されない。
【００７５】
本発明に係るタンパク質合成効率方法は、ＲＮＡからの翻訳効率の向上を最適にもたらす。タンパク質合成効率の向上とは、本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターをターゲットとなるＲＮＡと系内で共存させない場合と比較して、タンパク質合成効率が向上することを指す。タンパク質合成効率の向上の程度は特に限定されないが、上記タンパク質合成効率方法によって合成されるタンパク質量は、上記機能性ＲＮＡ分子をターゲットとなるＲＮＡと系内で共存させない場合に産生されるタンパク質量と比較して、少なくとも１．５倍になることが好ましく、少なくとも２倍になることがより好ましい。
【００７６】
上記機能性核酸分子または上述の発現ベクターをターゲットとなるＲＮＡと系内で共存させる場合、当該機能性核酸分子（または当該発現ベクター）と、当該ターゲットＲＮＡとの量比は特に限定されないが、例えば、１：１〜１：１０の範囲内にすればよい。
【００７７】
（タンパク質合成方法）
上述の本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、タンパク質合成方法として用いることができる。すなわち、本発明に係るタンパク質の合成方法は、ターゲットとなるタンパク質の製造方法であって、上記何れかのタンパク質合成効率向上方法によってタンパク質合成効率を向上する工程を含む製造方法である。好ましくは、上記ターゲットとなるＲＮＡからのタンパク質翻訳効率の向上によって、上記ターゲットとなるタンパク質を効率的に合成する。
【００７８】
本発明に係るタンパク質合成方法において、合成されるタンパク質の一例は抗体であり、具体的には、抗体の軽鎖もしくは重鎖または両方、または抗体の単鎖組換え体の合成である。抗体の合成は、好ましくは、インビトロ系または単離した細胞系を用いて行い、当該系中に、本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、タンパク質合成効率を向上させるターゲットとなるＲＮＡとを共存させる。
【００７９】
（疾患の治療方法）
本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、例えば、所定の正常タンパク質の量的減少に起因する疾患の治療に利用可能である。当該疾患は特に限定されないが、例えば、筋ジストロフィー等の筋変性疾患；アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、およびタンパク質のコードのレベルにおける三塩基反復性疾患（すなわち、ハンチントン病）またはＤＮＡ／ＲＮＡレベルにおける三塩基反復性疾患（すなわち、脆弱Ｘ）等の神経変性疾患；等が挙げられる。
【００８０】
さらに、本発明は、アポトーシス促進タンパク質の発現または腫瘍の治療における腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３ファミリーメンバー）の発現を向上させることを通じて、腫瘍の治療に適用可能である。
【００８１】
そのような腫瘍としては癌が挙げられ、そのような腫瘍は、癌腫、メラノーマおよび肉腫、膀胱癌腫、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、結腸腫瘍、食道腫瘍、子宮内膜腫瘍、肝細胞癌、胃腸間質性腫瘍、喉頭腫瘍、肺腫瘍、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、腎細胞癌、皮膚腫瘍、または甲状腺腫瘍を含む腫瘍の何れかであってもよいが、これらに限定されない。
【００８２】
上記治療方法は、対象の体内において、本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、ターゲットとなるＲＮＡとを共存させる工程を含む上述のタンパク質合成効率向上方法によって、タンパク質合成効率を向上させる工程を含む。この工程では、上記機能性核酸分子自体、または上述の発現ベクターを、上記対象の細胞に対してトランスフェクトする。上記ターゲットとなるＲＮＡは、上記対象の細胞における内因性のＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）であってもよいし、人工的に合成したＲＮＡであってもよい。あるいは、上記ターゲットとなるＲＮＡまたは当該ＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記対象の細胞に対してトランスフェクトしてもよい。
【００８３】
また、本発明に係るタンパク質合成効率向上方法は、疾患を抑制するタンパク質性の因子（例えば、インターフェロン、またはアポトーシス誘導因子等）を対象の体内で増産させることを通じて、疾患の治療に適用可能である。例えば、本発明を用いて増産したアポトーシス誘導因子を、腫瘍等の治療に効果的に用いることができる。
【００８４】
上記治療方法は、対象の体内において、本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、疾患を改善するタンパク質をコードするターゲットとなるＲＮＡであって、当該機能性核酸分子のターゲット決定配列におけるアンチセンス配列にハイブリダイズするものとを共存させる工程を含んでもよい。この工程では、上記機能性核酸分子自体または上述の発現ベクターを、対象の細胞に対してトランスフェクトする。上記疾患を改善するタンパク質をコードするＲＮＡは、上記対象の細胞における内因性のＲＮＡであってもよい。あるいは、上記疾患を改善するタンパク質をコードするＲＮＡまたは当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を、対象の細胞に対してトランスフェクトしてもよい。
【００８５】
上述の治療方法は何れも、対象の体内に移植されることを前提とした単離細胞に対する前処理として行うこともできる。当該細胞は、治療および移植の前に対象の体内から単離してもよい。上述の治療方法は、（ａ）本発明に係る機能性核酸分子または上述の発現ベクターと、ターゲットとなるＲＮＡとを単離細胞内において共存させる工程と；（ｂ）工程（ａ）後に当該細胞を対象の体内に移植する工程とを含む治療方法であってもよい。単離細胞は、分化能を有する細胞であってもよく、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、体性幹細胞、特に多能性の成人の前駆細胞、幹細胞、造血幹細胞、血管内皮幹細胞、間葉系幹細胞、肝臓幹細胞、神経系幹細胞、内皮幹細胞、膵臓幹細胞、始原生殖細胞、Muse細胞のような多系統に分化する細胞（Kuroda et al., 2010, PNAS）が挙げられる。また、単離細胞は、人工的な未分化細胞であってもよく、例えば、核移植胚性幹細胞、または、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞（国際公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号、特開２０１０−２７３６８０、特開２０１０−２８４０８８、特開２０１１−５０３７９、特開２０１１−４６７４等））のような遺伝子導入および／もしくは化合物処理により多能性を獲得した細胞が挙げられる。また、単離細胞は、線維芽細胞または再プログラミング後に別の体細胞になる能力を獲得した成人体細胞であってもよい。また、（ａ）の後で（ｂ）の前に、上記単離細胞を未分化増殖させてもよい。あるいは、（ａ）の後で（ｂ）の前に、上記単離細胞を分化させて分化細胞または分化細胞群（細胞シート等）を得て、当該分化細胞または分化細胞群を上記体内に移植してもよい。
【００８６】
上記対象とは、ヒトを含む動物を指し、好ましくはヒトを含む哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。また、上記対象とは、概して、（ａ）既に疾患の症状を示している者、および（ｂ）遺伝子上に疾患の素因はあるが疾患の症状をまだ示していない者を含む概念である。この観点から、本発明において、「治療」の概念には、疾患の治療的処置および予防的処置が含まれる。
【実施例】
【００８７】
本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明する。本発明はこれに限定されないことに注意されたい。
【００８８】
実施の態様と具体的な実施例は、本発明の技術的詳細を例示するものであり、それらの実施様態や具体的実施例に限定され狭く解釈されるものではなく、むしろ本発明の精神により多くの変形形態に適用され、それらの変形形態は以下に記載される特許請求項の範囲を超えない。
【００８９】
（合成PARK5/Uchl1遺伝子座におけるアンチセンス転写）
FANNTOM2クローンRik6430596G22は、推定のスプライスされたアンチセンス(AS)ノンコーディングRNA(ユビキチンC末端水素化酵素１(UCHL1)  遺伝子７のncRNA9）として特定された(実験1)。Uchl1は脱ユビキチン化酵素、ユビキチンライゲース、もしくはモノユビキチンスタビライザーとして働く神経特異的タンパク質である(参照１；Liu, Y., Fallon, L., Lashue1, H.A., Liu, Z. & Lansbury, P.T., Jr. The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect a1pha-synuc1ein degradation and Parkinson's disease  susceptibility. Cell 111, 209-218 (2002).、参照２；Osaka, H., et al. Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 12,1945-1958 (2003).)。これは、パーキンソン病(PARK5)の常染色体優位性の変異である(参照３；Leroy, E., et al. The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395, 451-452 (1998))。散発性の死後脳の黒質(SN)においてUchL1の発現は減少しており、aSYN凝集体の形成と相関していることが発見された。またUchl1活性の欠失はレビー小体型認知症(DLB)とアルツハイマー病(AD)とも関連している。Uchl1の異所性発現はマウスモデルにおけるβアミロイドに起因するシナプス機能の損失と文脈依存記憶を回復するため、Uchl1発現の増加はADへの治療戦略として提唱されている（参照１、参照４；Butterfield, D .A., et al. Redox proteomics identification of oxidatively modified hippocampal proteins in mild cognitive impairment: insights in to the development of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis 22, 223-232 (2006).、参照５；Castegna, A., et al. Proteomic identification of oxidatively modified proteins in Alzheimer's disease brain. Part II: dihydropyrimidinase-related protein 2, alpha-enolase and heat shock cognate 71. J Neurochem 82, 1524-1532 (2002).、参照６；Choi, J., et al. Oxidative modifications and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopathic Parkinson's and Alzheimer's diseases. J BioI Chern 279, 13256-13264 (2004).)。
【００９０】
Rik6430596G22は、Uchl1の２番目のイントロン中で開始してAUGコドンを含むセンス(S)mRNAのはじめの72塩基と一致する、典型的な5’末端で直接対応する転写物である。転写物のうち一致していない部分には、Repeatmaskerにより特定された２つの埋め込まれた繰り返し配列、SINEB2とAluが含まれている。FANTOM2 cDNAクローンは70kbのゲノム領域にわたっており、伝統的なGT-AG則に従いイントロンジャンクションする、４つのエクソンからなるスプライスされた転写物である(実験２)。開示の残りの部分においては、Rik6430596G22は、自然界のUchl1のアンチセンス転写物(AS Uchl1)として言及される。
【００９１】
AS Uchl1は、埋め込まれた逆向きSINE2リピートを必要とするメカニズムによりUchL1タンパク質レベルを増加する。
【００９２】
次に、S（センス）とAS（アンチセンス）転写物の相互作用を調べた。5’ rapid amplification of cDNA ends(RACE)法を用いてMN9D細胞からAS Uchl1の完全長cDNAのクローニングを行った後、CMVで動くAS Uchl1をドーパミン作動性MN9D細胞にて一過性で過剰発現し、内在性Uchl1 mRNAとタンパク質レベルをqRT-PCRとウェスタンブロッティングにて測定した。Uchl1 mRNAの内在性レベルには有意な変化は観察されなかったが、UchL1タンパク質産物の強力で再現性のある発現上昇が24時間以内に検出された（実験３）。本発明者らは、いずれの転写物も発現しないHEK細胞に両方のcDNAを共トランスフェクトさせることで、MN9D細胞で観察された結果が再現しうるかの検証を行った。マウスUchl1と共トランスフェクトするAS Uchl1の量を増加させると、外来性のAS Uchl1 mRNAレベルに優位な変化がないままにAS Uchl1の用量依存的にUchL1タンパク質の発現上昇が認められた(実験４)。この特異的な効果は、GFPのような関係のない対照では観察されなかった。UchL1タンパク質に対しての機能性を付与するAS Uchl1 mRNAの配列および／または構造要素を特定するため、欠失変異体を作製し、HEK細胞での共トランスフェクトと同様にとMN9D細胞にて検証した。5’末端側の第一エクソンを欠失したAS Uchl1欠失コンストラクト(AS Uchl1Δ3’)、もしくは最後の３つのエクソンを欠失したコンストラクト(AS Uchl1Δ3’)は、MN9DとHEK細胞のいずれにおいてもUchl1タンパク質レベルを発現させることができず、AS Uchl1の機能において5’末端、3’末端の両方の部分が重要であることが示唆された（実験５）。
【００９３】
次に、埋め込まれた繰り返し配列、AluとSINEB2のUchL1タンパク質の発現上昇における役割を評価するため更なる欠失変異体が合成された。
【００９４】
SINEB2とAluの両方のリピートエレメントを含む領域の標的欠失 (AS Uchl1 ΔSINEB2+ALU)はUchl1タンパク質の発現を阻害した。単一のリピートエレメントの欠失(Δ-SINE B2 (764-934)とΔ-ALU(1000-1045)により、SINEB2がUchL1タンパク質増加に必要な転写物の機能領域であることが明らかにした（実験６）。すべての実験において、野生型AS Uchl1と欠失コンストラクトのトランスフェクションによってUchl1 mRNAレベルの変化が検出されることはなかった。
【００９５】
さらに、Δ-SINEB2変異体は完全長AS Uchl1に対してドミナントネガティブ活性を持っている。
【００９６】
Δ-SINEB2欠失変異体は、AS Uchl1 RNAの二次構造を潜在的に損なうことになる170塩基を欠いているため、764-934塩基の間で反転されたSINEB2配列を持つ変異体を作成した。興味深いことに、反転したSINEB2はUchl1タンパク質レベルを上昇させることができず、AS Uchl1に埋め込まれたSINEB2ドメインは方向依存性で活性を持つことを証明した（実験６）。
【００９７】
AS転写物に埋め込まれた反転したSINEB2繰り返し配列を持つS/AS（センス／アンチセンス）対はノンコーディングRNAの新規機能のクラスが同定された：
ノンコーディングcDNAのFANTOM3コレクションから、正方向でのSINEB2エレメント（B3サブクラスと、タンパク質をコードする遺伝子と５‘末端で直接対応でのオーバーラップを含む、自然界のAS転写産物の他の例を生物情報学的に探索した。これにより、Uchl1/As Uchl1の構造と同様な31のS/AS対を特定した（実験７）。
【００９８】
Uchl1/AS Uchl1での観測が他の例に一般化されるか検証するため、Uxt(ubiquitously-expressed transcript) のASオーバーラップ転写物, As Uxt(Rik4833404H03)をクローニングして強制発現させた。ドーパミン作動性MN9D細胞にAS Uxtをトランスフェクトしたことにより、総mRNA レベルの変化はないままにUxtタンパク質は発現上昇し、より一般的なメカニズムが働いていることを確認した（実験８）。
【００９９】
AS Uchl1はドーパミン作動性神経において発現して、細胞核に拡充する転写物である。：
マウス成体組織パネルと肉眼で切り取った脳領域と神経細胞株におけるマルチプレックスRT-PCTにより、AS Uchl1発現は中脳腹側部、皮質とMN9Dドーパミン作動性細胞に限られ、神経組織でない組織、細胞株では見られないことが分かった。Uchl1のオーバーラップ領域ではない部分を標的としたリボプローブでのダブルインサイチューハイブリダイゼーションにより、mRNAは、脊椎や中脳腹側部と同様に、海馬、皮質、皮質下領域の細胞の細胞質に多く分布していることが示された。抗チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織蛍光染色とダブルインサイチューハイブリダイゼーションの組み合わせにより、Uchl1とASのmRNAはSNの同じDA神経において発現していることが示された。興味深いことに、S/AS対の転写物は、二つの異なる細胞小器官に広く局在化していた。成熟Uchl1 mRNAは主に細胞質で観察されたが、AS RNAは細胞核、特に核内領域に凝集していた（実験９）。近年、50%の細胞の転写物は細胞核内に拡充し、おもに機能の不明なノンコーディングRNAからなることが発見された。細胞核に留まっているRNAは、paraspeckleと呼ばれる領域に凝集する傾向があり、AS Uchl1の局在部位や関連性が埋め込まれたSINEによって制御されている点において、きわめて似通っている。（参照７；Chen, L.L., DeCerbo, J.N. & Carmichael, G.G. Alu element-mediated gene silencing. Embo J 27, 1694-1705 (2008).）
RACEの優位性により、AS Uchl1遺伝子の正確な転写開始点（TSS）をMN9D細胞においてマッピングした。実験２に示すように、TSSはこれまでに注釈付けされた配列の上流250bp、Uchl1の２番目のイントロンの中に位置している。
【０１００】
AS Uchl1はパーキンソン病神経化学モデルやヒト死後脳において発現が抑制されている。:
次に、マウスゲノム網羅的なAS UchL1遺伝子座における70-kb領域を、Genome Vist alignment(http;//genome.lbl.gov/cgi-bin/GenmeVista)を使ってヒトゲノム配列と比較した。CSTピークと対応するヒト配列上にデザインされたプライマーを用いて、1.6kbのノンコーディングRNA転写物、ヒトUCHL1遺伝子に５'末端で直接対応するアンチセンスを、ヒト脳RNAからクローニングした。ヒトAS  UCHL1遺伝子の解剖学的構成は、埋め込まれたリピートエレメントの存在と同様にS/AS対のオーバーラップ領域を含むマウスのそのカウンターパートと酷似していた。ヒトAS UCHL1の発現は、マウスで確認されたように神経組織では高度に制限されていた。
【０１０１】
UCH-L1タンパク質の合成は、ラパマイシン処理により、細胞核-細胞質間輸送、AS Uchl1 RNAとAS依存的なUchl1 mRNAの活性ポリソームへの輸送を通して上昇した。
【０１０２】
いままでのところ、AS ncRNAはS mRNAの量の変化を伴わずS タンパク質レベルを上昇させる。生理学的状態においてS mRNAとAS ncRNAは異なる細胞内器官に局在していると考えられることから、細胞核内のAS ncRNAを、翻訳が行われる場となる細胞質へ再輸送する能力においてPDの病理において関係あるとされているいくつかのストレス因子について試験した。MN9D細胞を、1mM過酸化水素水、血清飢餓状態、1μg/mlラパマイシン、20nMツニカマイシン、20nM TNFαで45分間さらし、細胞質および細胞核のAS Uchl1 mRNA量をqRT-PCRによりそれぞれ測定した。処理のほとんどは効果を示さなかったが、ラパマイシンは細胞質のAS Uchl1 mRNAの量を大幅に発現上昇させた(実験10)。
【０１０３】
ラパマイシンは、mTORCへの効果とその結果起こるS6Kと4E-BP1活性の抑制を通じてのCAP依存型の翻訳阻害剤としてよく知られている。現在、抗がん剤として試験中であり、神経変性疾患での臨床試験も提案されている。ラパマイシンによる翻訳開始の阻害は、LRRK2の優性なパーキンソン病関連の変異の過剰発現の場合と同様に、parkinとpink1をノックアウトされたハエで観察されるドーパミン作動性神経細胞の欠失を回復することができる(参照８；Tain, L.S., et al. Rapamycin  activation of 4E-BP prevents parkinsonian dopaminergic neuron loss. Nat Neurosci 12, 1129-1135 (2009).)。さらに、ラパマイシンはインビトロおよびマウスの実験において哺乳動物ドーパミン作動性神経細胞を神経化学中毒から保護する(参照９；Malagelada, C., Jin, Z.H., Jackson-Lewis, V.,Przedborski, S. & Greene, L.A. Rapamycin protects against neuron death in in vitro and in vivo models of Parkinson's disease. J Neurosci 30, 1166-1175 (2010).,、参照１０；Malagelada,C., Ryu, E.J., Biswas, S.C., Jackson-Lewis, V. & Greene, L.A. RTP801 is elevated in Parkinson brain substan tia nigral neurons and mediates death In cellular models of Parkinson's disease by a mechanism involving mammalian target of rapamycln inactivation. J Neurosci 26, 9996-10005 (2006).).)。近年、ラパマイシンは、パーキンソン病治療の一般的な重篤な運動副作用であるL-DOPA誘導型の運動障害の予防も示されている(参照１１；Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E. & Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal 2, ra36 (2009).)。
【０１０４】
細胞質内アンチセンスUchl1量に対するラパマイシンの効果は、併せて起こる細胞核の定常状態でのレベルの減少と、AS Uchl1のデノボ転写物がないことから確認された(実験10)。これらの転写物の細胞内の総量は一定であった。Uchl1 mRNAの細胞内分布、デノボ転写、または細胞内総量には変化がなかった。
【０１０５】
CAP 依存型の翻訳における阻害にも関わらず、ラパマイシン処理においてUchl1タンパク質レベルは数倍上昇した(実験11)。
【０１０６】
本発明者らは、AS Uchl1がUchL1の発現に必要なのか確認した。RACEにより特定されたTSS周辺のアンチセンスUchl1プロモーター領域-4から+15塩基を標的とした、AS Uchl1に対するshRNAを恒常的に発現するMN9D安定細胞株を構築した(参照１２； Hawkins, P.G., Santoso, S., Adams, C., Anest, V. & Morris, K.V. Promoter targeted small RNAs induce long-term transcriptional gene silencing in human cells. Nucleic Acids Res 37, 2984-2995 (2009))。予想通り、スクランブルの細胞では、MN9D親細胞株と比べてUchL1タンパク質の発現上昇が示されたが、一方でAS Uchl1に対するshRNAを発現する細胞ではUchL1タンパク質レベルは変化していなく、これは、ラパマイシンによるUchl1タンパク質の発現とAS Uchl1 ncRNAに因果関係のある関連性があることを証明している(実験12)。独立した実験モデルとして、AS Uchl1(Δ-SINEB2)のドミナントネガティブ変異を発現する安定細胞株を構築した。空ベクターの対照MN9D安定細胞株をラパマイシン処理したところ、UchL1 タンパク質レベルは上昇した。AS Uchl1 のドミナントネガティブフォームの存在下では、この発現上昇はまったく観察されなかった(実験13)。
【０１０７】
ラパマイシン処理によるS コーディングタンパク質レベルにおけるAS依存性の上昇のためのモデル：
成長中の細胞において、mTORC1シグナルは、増殖と下流の基質である4E-BPとS6Kのリン酸化を介したCAP依存型翻訳機構の制御に必要である。細胞増殖抑制剤であるラパマイシンはmROTC1活性を阻害し、CAP依存型の翻訳の阻害を引き起こす。ここで、本発明者らはこれらの条件でAS 転写物は選択されたmRNAのタンパク質合成において必要であることを示す。ラパマイシン添加において、細胞核に拡充したncRNA AS Uchl1は、Sタンパク質をコードするmRNAを翻訳のためポリソームとパートナーを組ませる場である細胞質に輸送される。
【０１０８】
従って、AS Uchl1は哺乳ゲノム内でのS/AS対に関連し、２つのドメインからなるncRNAの新規な機能を持つクラスのメンバーの代表である。5’でのオーバーラップ領域は、相補鎖から転写されるタンパク質をコードするmRNAパートナーに対して特異性を提供する。3’の反転したSINEB2エレメントは翻訳活性化の為に必要で、細胞質において埋め込まれたSINEB2の新しい機能を示す。
【０１０９】
インビボにおけるUchl1発現の操作は、PDとADを含む神経変性疾患の治療が提案されてきた。埋め込まれたリピートエレメントを持つ自然界のAS 転写物は、選択されたmRNAのタンパク質合成を上昇させる内在性分子ツールを代表しているかもしれず、新しいクラスのRNA医療を示唆している。
【０１１０】
現在、ラパマイシンは神経変性疾患用の神経保護薬として、そして抗がん剤として、集中的に精査が行われている。マウスにおいて、ラパマイシンは、PD治療における一般的な重篤な副作用であるL-DOPA誘導型運動障害を予防する。さらにショウジョウバエ遺伝学モデルにおいてアポトーシスやほ乳類における神経化学中毒からニューロンを保護し、抗パーキンソン治療の魅力的な分子となっている(参照１１；Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E. & Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal 2, ra36 (2009).).)。したがってインビボでの作用機序と、PDでよく知られた症例に関連した経路での相互作用をより理解することが、ここでUchl1で示したように重要である。ラパマイシン誘導型タンパク質合成におけるAS転写物の役割は、予想外の活性化スイッチとなる。
【０１１１】
EGFP発現あるいは抗体発現を増加させる人工合成ASは細胞内における各標的の発現を上昇させる。:
本発明者らは、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）に対する72塩基長のターゲット決定配列アンチセンスをAS Uchl1における適切な配列位置に挿入した合成RNAで、タンパク質合成が達成されるか否かを検証した。実験14の通りに、EGFPを発現上昇させる人工ASの発現を設計した。人工ASをコードする断片をpcDNA3.1ベクター(Invitrogen)にクローニングした。これにより、ターゲット決定配列と制御配列を持つ機能性核酸分子はいかなる目的遺伝子のタンパク質合成効率を向上できることを証明した。本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１１２】
同様にして、実験15に示すように抗体に対しても適用した。組換え抗体を発現上昇させる人工ASは、組換え抗体のリーダー配列を標的にするように設計され(オーバーラップはATG周辺72bp)、ベクター(AS Fc)へ埋め込んだ。対照としてターゲット決定配列がスクランブル配列からなる人工ASも作製した(スクランブル)。抗体のターゲット配列はpHYGROベクター(pHYGRO)に含まれていた。pHYGROおよびAS FCまたは対象をHEK細胞に共トランスフェクトした。HEK細胞での一過性のトランスフェクションにより、細胞抽出液においてAS Fc特異的な組換え抗体の発現上昇が示された。SVタグで検出した結果、AS FcはHEK細胞におけるコードされたタンパク質のレベルを上昇させたが、配列にオーバーラップするスクランブルまたは空ベクターでは示さなかった。本発明について、以下の実施例、及び比較例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１１３】
さらなる検証のため(実験16)、製造元指示書に従いリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてEGFP発現ベクターであるpECFP-C2(Clontech)をHEK細胞株にトランスフェクトした。その後、EGFP発現を弱く発現する形質転換体を選択した。AS GFPはEGFPに対するターゲット決定領域を含み、EGFPタンパク質合成効率を向上させるよう人工的に設計した(図16)。安定形質転換体に、さらにAS GFPをコードするベクターもしくは対照ベクターをトランスフェクトした。アンチセンスGFPもしくは対照ベクターのトランスフェクションから24時間後もしくは48時間後に細胞を回収し溶解した。細胞抽出液中のGFPレベルはウェスタンブロッティングで測定した。形質転換体におけるEGFPの低発現は、AS GFPコンストラクトをトランスフェクションすることで上昇した(図16)。
【０１１４】
さらなる実験において、EGFPのATGコドンまでのプラスミドバックボーン44塩基にオーバーラップする標的決定配列を持つコンストラクトを合成した。このコンストラクト(SINEup005)は標的遺伝子のタンパク質合成を非常に効果的に上昇させた（10倍以上）。
【０１１５】
したがって、これは本発明者らが見出したASの新しいタイプは、タンパク質合成効率を上昇させる対象となるタンパク質をコードするRNA中の標的配列に対するアンチセンス配列を含むターゲット決定配列と、タンパク質合成効率を上昇させる活性を有する制御配列を含む機能性核酸分子として人工的に設計されうることの一つの証拠である。
【０１１６】
（方法）
プラスミド
RACE フラグメント：Uchl1の5’UTRをRACE PCR(GeneRacer, Invitrogen)によりNM9Dの総RNAから増幅し、pGEM（登録商標）-T Easyベクター(Promega)にクローニングした。
完全長AS Uchl1：ASの完全長DNAを、RACEフラグメントとFANTOMクローンRik6430596G22から、以下のプライマーを用いてのプライマーセットを用いてフージョンPCRを行い増幅した。
mAS Uchl1fl 5’- ACAAAGCTCAGCCCACACGT-3’（SEQ ID No:13）およびRev mAS Uchl1 fl 5’- CATAGGGTTCATT-3’(SEQ ID No:14)
Uchl1: マウスUchl1 mRNAを、以下のプライマーセットによりFANTOMクローン2900059022からクローニングした：
mUchl1用5’-TTAAGCTGCTTTGCAGAGAGC-3’(SEQ ID No:15)およびRev mUchl1 5’-TTAAGCTGCTTTGCAGAGAGC-3’(SEQ ID No:16)
AS Uchl1 shRNA：As Uchl1のTSS周辺の -14/＋４の配列を含むオリゴCGCGCAGTGACACAGCACAAA (SEQ ID No:17)をpSUPER.retro.puroベクターにクローニングし、スクランブル配列をコントロールとして使用した。
【０１１７】
欠失変異体：
Δ5’：  mAS Uchl1 flおよびRev Δ用5’AS Uchl1  5’ TACCATTCTGTGCGGTGCA-3’(SEQ ID No:18)
Δ3’  ： mAS Uchl1およびRev mAS Ichl1 fl.用 GACCTCCTCTAGCACTGCACA-3’(SEQW ID No:19) 
明確な欠失変異体のため、PCRフラグメント I をpcDNA3.1-のNheI-EcoRI位置およびPCRフラグメントIIを続くEcoRI-HindII位置にクローニングした。
AS Uchl1 Δ(Alu+SINEB2):
PCRフラグメント  I ： mAS Uchl1 flおよびRev pre-SINE B2 用5’- CAATGGATTCCATGT-3’(SEQ ID No:20). PCRフラグメントII：For post-ALU 用5’-GATATAAGGAGAATCTG-3’(SEQ ID No:21)およびRev mAS fl。
AS Uchl1 Δ(Alu):
PCRフラグメントI: mAS Uchl1 flおよびRev pre-Alu 
5'- TTATAGTATGTGTTGTC-3' (SEQ ID:22)。PCRフラグメントII:  post-ALU用5'-GATATAAGGAGAATCTG-3'(SEQ ID No:23)およびRev mAS flをEcoRI-HindII位置にクローニングした。
AS Uchl1 Δ(SINEB2):
PCRフラグメントI : mAS Uchl1 flおよびRev pre-SINE B2用 5'-CAATGGATTCCATGT-3' (SEQ ID No:24)。PCRフラグメントII:  post-SINE B2用5'- GAATTCCTCCAGTCTCTTA -3'(SEQ ID No:25) およびRev mAS fl。
AS uchl1 (Alu+SINEB2)  フリップ：PCRフラグメントI: SINE B2 内部用 5'-TGCTAGAGGAGG-3' (SEQ ID No:26)およびRev Alu flip 5'- GTCAGGCAATCC -3' (SEQ ID No:27)をAS Uchl1Δ(Alu+SINEB2)の単一のEcoRI位置にクローニングした。
AS uchl1 SINEB2フリップ：PCRフラグメントをSINE B2内部用 5'-TGCTAGAGGAGG-3' (SEQ ID No:28)およびRev SINE フリップ5'-AAAGAGATGGC-3' (SEQ ID No:29)をAS Uchl1Δ(SINEB2)の単一のEcoRI位置へクローニングした。
【０１１８】
細胞
MN9D細胞を10mmペトリ皿に、10% ウシ胎仔血清FBSペニシリン(50 units/ml)および、ペニシリン（50ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（50ユニット／ｍｌ）を含むダルベッコ変法イーグル培地に播種した。処理は、ラパマイシン(R0395, Sigma)を最終濃度1μg/mlにて新鮮な培地に45分添加することにより行った。
MN9D安定細胞株(siRNA -15/+4、スクランブルsiRNA、pcDNA3.1-およびΔSINE B2)を樹立するため、MN9D細胞を100mmペトリ皿に播種し、製造元提供の取扱説明書に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、翌日に細胞を500μMのネオマイシン(#N1142, Sigma)により選択した。
HEK-293T細胞は、10％ウシ胎仔血清(Sigma-Aldrich)、100 ユニット／ｍｌペニシリン、そして100μm／mLストレプトマイシン(Sigma)を含むDMEM(GIBCO)にて37℃で湿式CO2培養器にて増殖させた。
【０１１９】
PCR
PCR分析： 総RNAをTrizol試薬(Invitrogen)を用いて製造元説明書に従い抽出した。DNAseI(Ambion)処理された後、1μgをiScriptcDNA synthesis Kit(BioRad)を用いて逆転写した。リアルタイムqRT-PCRをSybr 緑色蛍光色素(2x iQ5 SYBR Green supermix, BioRad)を用いて行った。アクチンとGAPDHを内部標準として用いた。相対定量は比較Ct法を用いて行った。
アクチン：センス 5'- CACACCCGCCACCAGTTC-3' (SEQ ID No:30)、アンチセンス  5'-CCCATTCCCACCATCACACC-3'（配列番号３１）
Gapdh：センス5'-GCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3'（配列番号３２）、アンチセンス5'-GCAGAAGGGGCGGAGATGAT-3'（配列番号３３）。
AS Uchl1 オーバーラップ：  センス5'-GCACCTGCAGACACAAACC-3'（配列番号３４）、アンチセンス 5'-TCTCTCAGCTGCTGGAATCA-3'（配列番号３５）
AS Uchl1：5'CTGGTGTGTATCTCTTATGC (配列番号３６)、アンチセンス 5'CTCCCGAGTCTCTGTAGC （配列番号３７）
Uchl1：センス 5'- CCCGCCGATAGAGCCAAG （配列番号３８）、アンチセンス 5'-ATGGTTCACTGGAAAGGG-3'（配列番号３９）
AS Uchl1 プレRNA： 5'-CCATGCACCGCACAGAATG-3' (配列番号４０)、アンチセンス 5'-GAAAGCTCCCTCAAATAGGC-3' （配列番号４１）
プレA0ribosomal RNA ：センス  5'-TGTGGTGTCCAAGTGTTCATGC-3' (配列番号４２)、アンチセンス5'-CGGAGCACCACATCGATCTAAG-3 （配列番号４３）
AS_Uxt：センス5'-CAACGTTGGGGATGACTTCT （配列番号４４）、アンチセンス5'-TCGATTCCCATTACCCACAT（配列番号４５）
Uxt：センス5'-TTGAGCGACTCCAGGAAACT-3'（配列番号４６）、アンチセンス（配列番号４７）
マルチプレックスRT-PCTは、Platinum（登録商標） Taq DNAポリメラーゼとSuperScript（登録商標）
III One-Step RT-PCR(Invitrogen)システムを用いて行った。DNAse処理された 500mgの総RNAをGapdh、Uchl1、As Uchl1のリバースプライマーとともにインキュベートした。
反応は、60℃、60分にて行った。
それぞれを３つに分注し、フォワードプライマーを最終濃度200nMになるように加えた。PCR反応は、95℃15秒、続いて60℃45秒、最後に68℃30秒のサイクルを４０サイクル行った。
【０１２０】
ウエスタンブロット
細胞は、SDSサンプルバッファー２x中で溶解した。タンパク質は15%SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜へ転写した。イムノブロッティングは一次抗体:抗Uchl1(#3524  Cell Signaling)１：３００希釈、抗b-actin(A5441、Sigma)１：５０００希釈を用いて行った。
Uchl1の検出は、推奨のホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された二次抗体を用いた改良型の化学発光とECL検出試薬(RPN2105、GE Healthcare)で行った(#WBKLS0500 ImmobilionWestnChemioluminescent HRP 基質)。
【０１２１】
細胞分取
核原形質の分画は、核原形質分離キット（Norgen）を製造元説明書に従って使用して行った。RNAを抽出してDNAseI処理をされた。細胞質分画の純度は、プレリボソーマルRNAでのリアルタイムqRT-PCRによって確認した。
【０１２２】
二色インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）
試薬：抗DIG抗体 D8156(Sigma)；ストレプトアビジン HRP RPN1231-100UL (Amersham Bioscience)；DIG ラベリングミックス#11 277 073 910(Roche)、BIOラベリングミックス#11 685 597 910(Roche)、リボ核酸トランスファーパン酵母由来 R8759(Sigma)、デオキシリボ核酸一本鎖サケ精巣由来 D7656(Sigma)、ブロッキング試薬 #11 096 176 001(Roche)、TSA Cy3システム(Perkin Elmer, Heidelberg, Germany)。
4%ホルムアルデヒドによる灌流の後、マウスの脳を一晩30%スクロースにて凍結保護をした。インサイチューハイブリダイゼーションを凍結切片(16μm)で行った。
センスとアンチセンスプローブは、マウスUchl1 cDNAの末端600bpとマウスAS Uchl1の最後の1000bpをコードするcDNAからインビトロ転写にて作製した。Uchl1のプローブはジゴキシゲニンで標識し、AS Uchl1のプローブはビオチンで標識した。ビオチンとジゴキシゲニンの取り込みは、ノーザンブロットにて確認した。切片は3％過酸化水素水で30分にて前処理した。ハイブリダイゼーションは、1 mg/ml(Uchl1)およびAS Uchl1ための3 mg/mlの濃度でのプローブを用いて、60℃、16時間で行った。ビオチン化RNAの検出の検出には、ストレプトアビジン-HRPを1:250希釈、２時間、TNBバッファー(Tris HCl pH 7.5 100mM, NaCl 150mM, 0.5%ブロッキング試薬)で行い、TNTバッファー(Tris HCl pH 7.5、100mM、NaCl 150mM、0.05% tween）中での洗浄後にTSA Cy3システムを用いて可視化した。
DIG標識プローブでのISHは、TSA反応の後、抗DIGモノクローナル抗体を用いて切片をインキュベートすることで行った。RNA ISHと免疫蛍光染色を組み合わせるため、切片を抗TH(#AB152 Chemicon)１：１０００希釈とともにインキュベートした。シグナルは、次いで蛍光色素が結合されたヤギ抗ウサギ二次抗体405とヤギ抗マウス抗体488を用いて検出した。切片はその後洗浄し、Vectashield (Vector lab)マウント培地でマウントして共焦点顕微鏡(Leica)にて観察した。
【０１２３】
ヒト検死脳サンプル
脳サンプルは、Institute of Neuropathology, BellvitgeHospital（バルセロナ大学、スペイン）の脳バンクより入手した。サンプルは患者もしくはその家族のインフォームドコンセントとバルセロナ大学の倫理委員会の許可のもと、検死時に解剖された。脳は病理学的にPDの症例と確認され、対照群(Navarro et al., 2009)と年齢が一致したコーカサス人から得られた。簡潔に言えば、すべてPD症例は、典型的なPDを煩っており、認知障害をもった症例はなく、神経病理的な診断は確立された基準に従って行われた。健康な対照群は神経、代謝、循環器疾病の症状はなく、神経病理学研究によりアルツハイマー病やその他病理などを含む異常は見られないことが明らかにされている。死亡から組織標本の間は3時間から５時間の範囲である。
【０１２４】
生物情報学的解析
AS Uchl1のヒトホルトログ候補を特定するため、ヒトとマウスのAS UChl1相同領域の保存性をVISTA genome browserを用いて行った。本発明者らは、ヒトとマウスゲノム最小75%同一性をもつCTS（Conserved sequence tags）のパラメータを選択した。それぞれの保存エレメントに対して、ヒト相同領域の上にプライマーを設計した。
追加の翻訳アクチベーター候補の特定のために、本発明者らはノンコーディングRNAであって5’末端コーディング転写物と直接対応でオーバーラップするFANTOM3完全長cDNAから検索した[PMID: 1614072]。Nordstrom et al 2009（Nordstrom, K.J'J et al. Critical evaluation of the FANTOM3 non-coding RNA transcripts. Genomics 94, 169-176 (2009).）に記載された8535のFANTOM3 ncRNA転写物nの選別セットをスタート地点として使用した。これらのncRNA転写物のゲノム上の位置とREFSEQ（Maglott, D.R., Katz, K.S., Sicotte, H. & Pruitt, K.D. NCBI's LocusLink and Ref Seq. Nucleic Acids Res 28, 126-128 (2000)）のコーディング転写物をUCSCのゲノムブラウザー（Kent, W.J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res 12, 996-1006 (2002)）で抽出し、788のコーディングセンス：ノンコーディングアンチセンス対を特定した。その後ncRNAをrepeat maskerを用いて確認し、SINEB2関連の配列を特定した(Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-3.0.1996-2010 <http://www.repeatmasker.org>)。これによりタンパク質コーディング転写物と5’末端のオーバーラップのペアは127まで減少した(うち60はリピートのセンス鎖のバージョンを持ち、53はアンチセンスのバージョンを持ち、14はセンスとアンチセンスの両方のバージョンを持つ)。
その後、SINEB2関連エレメントのアライメントを行った(http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html)。この解析により、Uchl1-ASと同様の方向性を持ったリピートを持つ転写物とオーバーラップするアンチセンスが実験試行(Uxt1-AS)に選択された。
【０１２５】
配列
例として、以下のものがタンパク質コーディングmRNAと相補的な配列のリストである。これらは対象を決定する配列を提供する断片[水色でハイライトしたnow] と制御配列[赤でハイライトhow]の例を含む。この例では自然界のアンチセンスのリスト中の制御配列は89塩基の短さである。アンチセンスRNAの抜粋リスト中の結合配列は44塩基の短さである。
下のそれぞれの配列は、Repeatmaskプログラムにより決定されたレトロトランスポゾンエレメントについてのアライメントの要約である。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明に依れば、ＲＮＡからの翻訳の効率を改善する機能を有する機能性核酸分子、およびそれらの利用を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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