(57)【要約】  【解決手段】  血小板の生成のための組成物および方法、およびそれらの使用の方法が開示されている。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血小板減少を治療する方法であって、前記方法は、
ａ）ヒト多能性幹細胞におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それにより、ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成するものである、前記減少させる工程と、
ｂ）前記ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞をトロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それにより、自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株（Ｇ１ＭＥ）を生成するものである、前記培養する工程と、
ｃ）前記Ｇ１ＭＥ細胞においてＧＡＴＡ−１を発現させる工程であって、それにより、最終的な赤血球および巨核球に前記細胞を分化させるものである、前記発現させる工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記細胞から巨核球を単離する工程と、
ｅ）前記単離した巨核球を前記対象に投与する工程であって、それにより、前記血小板減少を治療するものである、前記投与する工程と
を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
工程ｅ）の前に、目的タンパク質をコードする核酸分子の前記細胞への送達を有するものである、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、この方法は、さらに、
目的タンパク質をコードする核酸分子の前記Ｇ１ＭＥ細胞への送達を有するものである、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、工程ａ）は、前記ヒト多能性幹細胞における遺伝子ターゲティングによってＧＡＴＡ−１ノックアウトを生成する工程を有するものである、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、工程ａ）は、ＧＡＴＡ−１  ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを前記ヒト多能性幹細胞に送達する工程を有するものである、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、工程ｃ）は、ＧＡＴＡ−１をコードする核酸分子を有するウイルスベクターに前記Ｇ１ＭＥ細胞を接触させる工程を有するものである、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、工程ｃ）はＧＡＴＡ−１発現の抑制の除去を有するものである、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、工程ｃ）は、ＧＡＴＡ−１を天然レベルに発現する工程を有するものである、方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、工程ｂ）はさらに、間質細胞を有するＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を培養する工程を有するものである、方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、工程ｄ）は、少なくとも約５０μｍの直径を有する細胞を単離する工程を有するものである、方法。
【請求項１２】
自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）ヒト多能性幹細胞におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それにより、ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成するものである、前記減少させる工程と、
ｂ）前記ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞をトロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それにより、自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株（Ｇ１ＭＥ）を生成するものである、前記培養する工程と、
を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、この方法は、さらに、
目的タンパク質をコードする核酸分子を前記細胞に送達する工程を有するものである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法によって生成された、単離された自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）のもとに、２０１０年１０月２５日に提出された米国仮特許出願番号第６１／４０６，１５４号に優先権を主張するものである。上述の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
この発明は、国立心肺血液研究所によって与えられた許諾番号Ｕ０１ＨＬ９９６５６のもとに政府の援助によって作られた。政府はこの発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、血液学の分野に関するものであり、疾病および疾患に関するものである。より具体的には、本発明は、生体外で成長した巨核球からの血小板の生成のための組成物および方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００４】
いくつかの刊行物および特許文献は、本発明が関係する最高水準の技術を記載するために、本明細書の全体にわたって参照される。これらの参照の完全な引用は、本明細書の全体にわたって見つかる。完全に記載されるように、これらの引用のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれる。
【０００５】
血小板は止血において重要であり、巨核球から生じた無核細胞断片である（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｋ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１１：９８１−６）。血小板は、血管新生および炎症においても重要な役割を有する（Ｂｒｏｗｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１５２１−４；Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，ｓ５−１０）。血小板の輸血は、例えば化学療法によって誘発された血小板減少（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ：ＣＩＴ）に続発するように、減少した血小板生成を有する個人（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，４２：１６３−７１）および、例えば播種性血管内凝固症候群の患者のように、さらなる血小板破壊を有する個人（Ｄｅｍｐｆｌｅ，  Ｃ．Ｅ．  （２００４）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，９１：２１３−２４）を含む様々な臨床状況において使用される。米国の２００１年において、血小板輸血は総計で１０，１９６，０００ユニットであり、１９９９年から１２．６％の増加である（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４７：３８５−３９４）。単独のドナー血小板アフェレーシスの使用は、７，５８２，０００の濃縮血小板に同時に２６％増加した。
【０００６】
血小板ドナーの数が増えているとはいえ、血小板減少および出血に関する重大な疾患の患者数が増えていることにより、未だにドナーはかなり不足している（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．，  ４７：３８５−３９４）。現時点で、血小板輸血は、その短い貯蔵半減期により制限されており、アフェレーシスは、ドナーが２時間の手順を受けることを必要とし、ユニットは質でも量でも著しく異なる（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．（２００６）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒ．，４９２−６；Ｈｅｄｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４８：１４４７−５８９；  Ｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４８：６７３−８０）。血小板は室温で保存されなければならないので、これらのユニットは細菌汚染の高い発生率を有する（Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４７：１１３４−４２）。白血球汚染を除去するための白血球減少にもかかわらず、複数輸血患者で阻害が生じる高い発生率が依然としてある（Ｓｅｆｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３：３３３−９）。このように、ドナー由来の血小板は以下の懸念：質および量の多様性、病原体の感染の危険性、貯蔵された血小板の短い存続期間、貯蔵期間における細菌汚染、および、複数輸血患者の同種抗体の進展、が挙げられる。これらの課題は、注入療法における血小板を生成するための新規な戦略の必要性を強調する。
【０００７】
血小板産生、巨核球から循環血小板が生じることによる工程は、依然として不完全に理解されている。試験管内での研究は、血小板が血小板前駆体ストランドの先端でノードを形成することを示唆している（Ｉｔａｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７：１２９９−１３１２）。しかしながら、多光子生体内顕微鏡を使用する、生頭蓋冠髄の直接的な視覚化は、巨核球が大きな細胞質断片を血管系内に放出し（Ｊｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１７６７−１７７０）、その後に、血小板内で再組織化を受けなければならないことを示唆している。肺静脈系の巨核球様倍数体の核の形態分析および定量化に基づく研究は、巨核球が肺に血小板を放出することを示唆する（Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５７：６９−７４）。培養における巨核球からの血小板の派生は、報告されたが（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：４０２−４１３）、量的に平均水準以上になることは困難であった。血小板を生体外で発達させるための現在の努力は、非常に制限されているように見受けられ、臨床的に関連した結果ではない。現在まで、試験管内で生成された血小板の注入からの公開された最も良い結果は、低い血小板数（〜１０４／μｌ）を有する放射線処理されたマウスを使用したものである（Ｎｉｓｈｉｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５：１９１７−１９２７）。ドナー血小板が計数するピークパーセントは、依然としてわずか１％〜２％であった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様において、患者における血小板減少を治療、阻害、および／または予防するための方法が提供される。当該方法は、それを必要とする対象に巨核球および／または血小板を送達する工程を有する。特定の実施形態において、当該方法は、ａ）幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞、造血管細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それによって、ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成する前記減少させる工程、ｂ）ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を、任意に間質細胞とともに、トロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それによって、自己複製、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞、いわゆるＧＡＴＡ−１巨核球−赤血球（Ｇ１ＭＥ）細胞を生成する、前記培養する工程、ｃ）前記Ｇ１ＭＥ細胞においてＧＡＴＡ−１を発現させる工程、赤血球および巨核球に最終的な分化を受ける細胞を有する工程、ｄ）工程ｃ）の細胞から巨核球を単離する工程（例えば、大細胞、任意に勾配工程を介す）と、ｅ）単離した巨核球を対象に投与する工程とを有する。その後、これらの巨核球は、臨床的に関連した数の循環機能血小板を放出し、それによって血小板減少を治療する。特定の実施形態において、当該血小板は試験管内で生成され、その後、対象に投与され、それによって血小板減少を治療する。特定の実施形態において、当該方法は、ａ）幹細胞（例えば、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）由来の造血管細胞におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それによって、ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成するものである、前記減少させる工程、ｂ）ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を、任意に間質細胞とともに、トロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それによって、Ｇ１ＭＥ細胞を生成する、前記培養する工程、ｃ）前記Ｇ１ＭＥ細胞においてＧＡＴＡ−１を発現させる工程、ｄ）工程ｃ）の細胞から巨核球を単離する工程、および、ｅ）単離した成熟巨核球を対象に投与する工程を有する。その後、これらの巨核球は、臨床的に関連した数の循環機能血小板を放出し、それによって血小板減少を治療する。特定の実施形態において、上述されたＭＥＰ−様、Ｇ１ＭＥ細胞は不死であり、ＴＰＯ−依存性である。前駆−巨核球細胞株および担体を有する組成物も、同一のものを生成するための方法と同様に本発明によって包含される。特定の実施形態において、巨核球は、成体骨髄または胎児肝臓から得られるものである。例えば、成体骨髄または胎児肝臓細胞は、ＴＰＯと、任意に間質細胞と培養され、大きく成熟した巨核球が単離される。特定の実施形態において、巨核球は赤血球本体を介して幹細胞由来である。当該方法は、特に対象に投与する前に、目的タンパク質を上記方法の細胞にコードする核酸分子の送達の工程を有する。
【０００９】
本発明の他の態様によると、目的タンパク質（例えば治療タンパク質）を対象に送達するための方法が提供される。当該方法は、上記に記載の工程を有する。そこにおいて、細胞は目的タンパク質を発現する。ＥＳ、ｉＰＳまたは造血前駆体細胞によって開始する特定の実施形態において、細胞の核は、特に、通常、巨核球または血小板には見られない目的タンパク質を（異所的に）発現するために標的とされた。そして、前記血小板を凝血／血栓症、線維素溶解、血管新生または炎症で損傷した血管の部位への治療的送達用担体として使用した。これらのタンパク質は、損傷した血管の部位に濃縮された型内で血小板が活性化された後に送達されることができるように血小板の顆粒内に貯蔵される。対象における疾病または疾患を治療、阻害、および／または予防するための方法も提供され、そこにおいて、目的タンパク質は、治療される疾病または疾患のための治療薬である。当該治療方法は、治療される疾病または疾患のための基地の治療方法の一つ以上と組み合わされることができる。
【００１０】
ｉＰＳ細胞を含む特定の実施形態において、派生された巨核球は、繰り返される血小板曝露後の同種免疫に従属的な従来の血小板輸血に抵抗のある患者のために、個別的な看護（自家移植使用）を可能にすることができる。ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、典型的には成体間質細胞から人工的に派生された多能性幹細胞である（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−７６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−７２，Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７；米国特許出願公開第２０１１／０２００５６８号および第２０１１／０１８９１３７号を参照）。ｉＰＳ細胞を含む特定の実施形態において、患者は遺伝性血小板疾患を有し、その派生したｉＰＳ細胞は、血小板疾患を修正し、機能的に正常な血小板を放出する注入巨核球に至る遺伝子組換えを受ける。以下に記載された他の巨核球と同様に、ｉＰＳ細胞由来巨核球は、ＮＳＧマウスにおける血小板を生じるよう決定される（循環血小板の最大２％が観察された）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は胎児肝臓（ＦＬ）および骨髄（ＢＭ）由来巨核球の単離および受容マウスへの注入の概略図である。注入のための３つの異なる生成物：単離された野生型（ＷＴ）血小板、ＴＰＯの存在下で生育したＦＬ細胞から得られた大細胞および小細胞が収集された。これらは、その後、マウスαＩＩｂ（ｍαＩＩｂ）の代わりにヒトαＩＩｂ（ｈαＩＩｂ）をその血小板表面上にマーカーとして有するマウス内に注入された。ドナー細胞の注入後の異なる時点およびその前に、ｈαＩＩｂ＋レシピエントマウスから全血のフローサイメトリー分析が実行された。血液は標識された種−特異的（マウスまたはヒト）抗−αＩＩｂ抗体で染色された。
【図２】図２は、注入された巨核球およびその結果生体内で生成された血小板の特性評価を示す。図２Ａは小細胞および大細胞の代表的なフィールドを提供する。スケールバー：１００μｍ。図２Ｂは、ＦＬ小細胞および大細胞のＤＮＡ含有量の代表的な分析を提供する。図２Ｃおよび２Ｄは、１０８ＷＴ血小板（２Ｃ）または１０６ＦＬ大細胞（２Ｄ）の注入の前後で、レシピエントマウスからのフローサイメトリーを提供するものである。図２Ｅおよび２Ｆは、１０６の注入されたＦＬ大細胞（２Ｅ）および１０６の注入された成体ＢＭ細胞（２Ｆ）のフローサイメトリー割合を提供するものである。ＷＴ血小板においてｎ＝５、ＦＬ細胞においてｎ＝９、ＢＭ研究においてｎ＝５である。図２Ｇは注入後、放射線処理された血小板減少マウスにおける血小板増大の割合を提供する。治療群につきｎ＝５である。平均は±ＳＤが示されている。３つの群における初期血小板数（１０８／ｍｌ）は、ＣＡＴＣＨ緩衝液，１．８±０．２；血小板，１．９±０．３；大細胞，１．０±０．２であった。図２Ｈは、循環するレシピエントおよび注入された血小板の前方対側方散乱によるサイズ決定を提供する。図２Ｉは、Ｐ−セレクチン、ＧＰＩｂαおよびＧＰＩＸの表面発現を比較する注入された血小板およびＦＬ由来血小板の代表的なフローサイメトリー分析を提供するものである。
【図３】図３は血小板が機能的であること、および、レーザー損傷後、動脈血栓内に取り込まれることができることを示している。図３Ａ〜Ｃは、血小板または表示された細胞（細胞の収集物は循環される）の注入後、血栓内に組み込まれる血小板の代表的な画像を提供する。任意で、ＦＬ細胞の注入後、ドナーＷＴ血小板は、標識された抗−マウスαＩＩｂ  Ａｂを使用して検知された。図３Ｄは、小細胞注入後、再循環するマウスαＩＩｂ＋細胞（矢印）を強調する左から右に経時的な静止画を提供する。スケールバー：３０μｍ。図３Ｅは、ＷＴ血小板またはＦＬ細胞のどちらかの注入後、成長する血栓内に組み込まれるドナー血小板のシミュレーションを提供する。２０の動画がグラフにつき評価された。
【図４】図４は注入された巨核球およびそれらが血小板を流す臓器分布研究を示す。図４Ａは生理的食塩水またはＢｒｄＵで成長した小細胞または大細胞と注入されたｈαＩＩｂ＋マウスからの肺の染色を示す（矢印は染色された核を示す）。図４Ｂは肺におけるＢｒｄＵ−標識された大細胞の動態を示す。図４Ｃは生理的食塩水またはＢｒｄＵで成長した小細胞または大細胞と注入されたｈαＩＩｂ＋マウスからの脾臓の染色を示す（矢印は染色された核を示す）。スケールバー：２００μｍ。図４Ｄは、肺に注入してから３０分後の大ＦＬ細胞：ＢｒｄＵ標識された核（左）およびｍαＩＩｂ標識された核（右）を示す。スケールバー：５０μｍ。データは、３つの別々の研究の代表的なものである。
【図５】図５は、生体外で成長した巨核球から生成された血小板を流すためメタロプロテナーゼ損傷がないことを示す。ＷＴ  ＦＬ−細胞は、メタロプロテナーゼ阻害剤ＧＭ６００１（１００μＭ、図５Ａ）またはＴＡＰ−１（１０μＭ、図５Ｂ）のいずれかの存在下において培養で成長し、その後、小細胞および大細胞に単離され、メタロプロテナーゼ阻害剤が非処理由来の血小板で観察された短い半減期が改善されたかどうかを見るためにｈαＩＩｂ＋レシピエントマウスに注入された。Ｎ＝２、複製において実行された。
【図６】図６は、ＦＬ−大細胞の注入における眼窩後と尾部静脈の比較を示す。レシピエント動物に注入された〜１０６ＦＬ−大細胞のフローサイメトリー割合。治療群につきＮ＝５研究、平均±１標準偏差（ＳＤ）が示されている。これらの研究は、血小板を流すことに巨核球の注入部位に影響を及ぼさないことを示している。
【図７】図７は、注入されたヒト生体外成長巨核球がマウス内に注入された後も血小板を流したことを示す。図７Ａは、免疫抑制ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／インターフェロン−ガンマＮＳＧマウス内に注入されたヒト血小板の経時的グラフを示す。図７Ｂは、ＮＳＧマウスへの胎児肝臓巨核球の注入後の、ヒト血小板の割合の経時的グラフを提供する。図７Ｃは、ＮＳＧマウスへのジメチルファスジル（ｄｉＭＦ；５μＭ）、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ１キナーゼ阻害剤、処理されたヒト肝臓巨核球（大細胞）の注入後のヒト血小板の経時的グラフを提供する。図７Ｄは、ＮＳＧマウスへのＣＤ３４＋骨髄細胞からのヒト巨核球の注入後のヒト血小板の経時的グラフを提供する。図７Ｅは、ＮＳＧマウスへのジメチルファスジル（２μＭ）処理されたヒトＣＤ３４＋骨髄巨核球（大細胞）の注入後、ヒト血小板の経時的グラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上述したように、現在の血小板輸血は、その短い貯蔵半減期、質および量の多様性、細菌汚染の高い危険性、および輸血された血小板に阻害を生じる患者の頻度によって制限される。血小板を生体外で発達させるための現在の努力は、非常に制限されているように見受けられ、臨床的に関連した結果ではない。本発明は、十分な血小板（生体外または生体内）、特にレシピエントに注入される生体外で成長した巨核球からの血小板の生成のための組成物および方法を提供する。特定の実施形態において、血小板は哺乳類の造血前駆細胞またはｉＰＳ細胞、特にヒト胚性幹細胞（例えばｈＥＳＣ）由来の巨核球に由来するものである。本明細書において、マウスに生体外で生成したマウス巨核球を注入することによって、レシピエント血小板の数がほぼ１００倍の増加が従来の発表された結果に対して達成され、それによって、ドナー血小板の臨床的に関連した濃度を達成することがわかった。これらの血小板は、注入された血小板よりもわずかに短い半減期を有するが、サイズ、表面マーカーの発現、および機能において正常である。ヒトの生体外で生成された巨核球の同様の研究において、半減期は、ＮＳＧマウス内に注入された人血小板と同程度またはそれよりも良好である。注入された巨核球は、それらの細胞質を流す肺血管床内に捕捉されているように見える。本発明は患者への治療的な送達の方法（例えば血小板または巨核球注入を介する）も提供する。このような方法は、例えば、血管損傷の部位のような治療上の標的とした送達を可能にする。本発明の方法および組成物は、現在の血小板輸血の代わりに使用されることができ、これらは、止血、血栓症、線維素溶解、炎症、血管新生などの治療／阻害／予防のための標的とされた生成物を送達する派生血小板を使用する新しい臨床状況に応用されることができる。本発明の方法は、巨核球および／または血小板の大量生産を可能にするために直ちに拡張可能である。次に、これは、本発明の方法が注入される血小板の標準化を可能にし、それによって、血小板の反応性に対して制御を増加し、および、細菌汚染に関する問題を回避するとともに、血小板輸血への抵抗の発生率を低下させることを意味する。本発明の方法によって生じた血小板は、「新しく」もあり、および、生体内で生成された後、より持続することが可能である。
【００１３】
本発明の特定の実施形態において、巨核球および／または血小板は、例えばヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞のような幹細胞から生成された。本発明の他の実施形態において、巨核球は胎児肝臓または成体骨髄から単離された。
【００１４】
本発明の特定の実施形態において、例えばｈＥＳＣのような造血前駆細胞における造血転写因子ＧＡＴＡ−１（例えば遺伝子番号：２６２３）発現は自己複製不死化巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）細胞株を生成するため、（例えばＲＮＡｉによって）著しく減少または除去される（例えば、Ｓｔａｃｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｌｏｏｄ  １０７：８７−９７を参照）。ＧＡＴＡ−１発現は従来の遺伝子ターゲティングによって減少させられることができる（Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：３９６５−７３）。例えば、ＧＡＴＡ１は遺伝子ターゲティング（例えばノックアウト）によって男性のヒトＥＳ細胞株Ｈ１（ＮＩＨコードＷＡ０１）から除去されることができる。ＧＡＴＡ１がＸ連鎖遺伝子であるため、ターゲティングの１ラウンドのみが必要とされる。ＧＡＴＡ１の発現は、アンチセンスおよび／またはＲＮＡｉを使用して調整されることもできる（例えばノックダウン）（Ｇｒｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ９：３３９−４５）。例えば、ＧＡＴＡ−１アンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ）または同じものを（例えばベクター、特にウイルスベクターを介して）コードする核酸分子は、ＧＡＴＡ−１の発現を減少するために幹細胞に送達されることができる。本明細書で説明したように、自己複製ＭＥＰは巨核球内における最終的な分化に応じて調整されることができ、そのα−顆粒内に目的タンパク質の高濃度を貯蔵する。
【００１５】
ＧＡＴＡ−１発現の再誘導（特に天然レベルに近づけるため）は、多数の巨核球を生成するためにこれらのＭＥＰを生じる。ＧＡＴＡ−１発現は、ＧＡＴＡ−１をコードする核酸分子を細胞に、特に発現ベクター（例えばヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ））またはウイルスベクター（例えばレントウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびエデノウイルスベクター）を介して、特にネイティブプロモーターの制御下で送達することにより、再活性化されることができる（例えばＨｏｈｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：１４３６−４３）。特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡによるＧＡＴＡ−１抑制は、テトラサイクリンに制御された転写活性化システム（テトラサイクリン／Ｄｏｘ−オフシステム）（例えばＧｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：５５４７−５５５１を参照）または、抗−ＧＡＴＡ−１ｓｈＲＮＡがロックス部位により側面に配置され、および、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現がｓｈＲＮＡコンストラクトを除去するために細胞に一時的に再誘導されるＣｒｅ−ロックスシステムを使用することで、その天然レベルまで戻すことができる。
【００１６】
ヒト巨核球は幹細胞、特にｈＥＳＣまたはｉＰＳ細胞から直接的に生成されることができる。特定の実施形態において、ＧＡＴＡ−１欠損幹細胞は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）のようなサイトカインの存在下、間質細胞（例えばＯＰ９間質細胞）上で培養される（Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，４：４３６−４２；Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１１：５２９８−３０６）。ＴＰＯおよびＯＰ９細胞の存在下で培養されると、幹細胞は、ＯＰ９独立／ＴＰＯ依存となり、ＭＥＰ細胞の性質を有する。これらのＧ１ＭＥ細胞の〜６０％は、ＧＡＴＡ−１の再発現で、同定可能な巨核球において成長する。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、幹細胞は、無血清条件において、胚様体（ＥＢ）ベースのプロトコルを介して巨核球内で分化される（Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：６０−７１；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５３：５２４−８）。ＥＢプロトコル（実施例参照）は、原始線条様集団の形成（段階１）、中胚葉の誘導および特異化（段階２）、および巨核球系の拡張（段階３）を有する。この方法を使用すると、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞由来ＥＢは、試験管内で巨核球ポテンシャルを示すＫＤＲｎｅｇ／ＣＤ３１ｐｏｓ／ＣＤ４１ｐｏｓ集団を生成する（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １１０：Ａｂｓｔｒａｃｔ  １２６５）。
【００１８】
本発明の巨核球は、血小板生成を刺激する、または最適化するために一つ以上の薬剤と接触させることができる。例えば、巨核球は、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤（例えばＳＵ６６５６）および／またはプロスタグランジンＪ２のような血小板前駆体形成を促進する少なくとも一つの薬剤と接触させることができる（Ｇａｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，３５：７０−３；Ａｋｂｉｙｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４：１３６１−８）。巨核球は、ニッチ、間質由来因子−１、線維芽細胞成長因子−１、血管細胞接着分子−１などへの巨核細胞遊走に関係するサイトカインと接触／培養されることができる（Ａｖｅｃｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０：６４−７１）。巨核球はジメチルファスジル（ｄｉＭＦ）のようなＲｈｏ／ＲＯＣＫ１キナーゼ阻害剤と接触させることができる。当該細胞は、骨髄血管における細孔径をシミュレーションするための条件下で特殊な培養皿で培養されることもできる。
【００１９】
血小板減少ＮＳＧマウスは、本発明の細胞／血小板を研究するために使用されることができる（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，５：３０５−９）。例えば、血小板減少ＮＳＧマウスは本発明の方法により生成された巨核球を注入されることができる。このモデルにおいて、新しい血小板の質的な（適切に活性化されることができる静止血小板）態様と同様に量的な（血小板数値上昇および半減期）態様の両方が測定されることができる。研究は正常な血小板数を有するＮＳＧマウスにおいても行われることができる。二つの病的血栓モデル：１）ＦｅＣｌ３頸動脈損傷（Ｇｅｗｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６：１１６０−６；Ｓｔａｃｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：８７−９７）および２）光化学脳卒中モデル（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４７：６７−７１））は、例えば、病的血栓を予防および／または溶解できるかどうか決定するために注入された修飾血小板を研究するのに使用されることができる。
【００２０】
本発明によって、血小板減少および／または血小板減少に関連する出血性疾患を治療、阻害および／または予防するための方法が提供される。当該方法は、本発明の巨核球および／または血小板を、それを必要とする対象に投与する工程を有する。血小板減少は、例えば、患者の血液における血小板の濃度が健康な患者において正常であるとみなされるものよりも低い状態（例えば、血液のミリリットルあたり１５０，０００，０００および４００，０００，０００は典型的に正常であるとみなされる）である、機能的血小板が異常な低量である任意の疾患である。個人の血小板数の減少は、例えば、２０％、３０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上での減少であることができる。減少した血小板数は、例えば、血小板生成の減少または血小板破壊の増加によるものである。
【００２１】
血小板減少は、感染症によって誘発された血小板減少、治療によって誘発された血小板減少、その他を含む。血小板減少は、原因不明でもよい。「感染症によって誘発された血小板減少」は、バクテリアまたはウイルスのような感染性因子によって生じる血小板減少である。「治療によって誘発された血小板減少」は化学療法（血小板減少を誘発する化学療法）、放射線治療（例えば、ガンマ照射、放射線への治療的な曝露）、および、これに限定されないが、細胞障害性薬、ベンゼンまたはアントラセンを含む化学製品、クロラムフェニコール、チオウラシル、およびバルビツール酸塩睡眠薬のような特定の薬への曝露によって生じる血小板減少である。血小板減少の他のタイプは、これに限定されないが、骨髄不全（例えば、先天性無巨核性低形成、および橈骨欠損（ＴＡＲ症候群）による血小板減少、骨髄移植、骨髄癌および再生不良性貧血）、脾腫（例えば門脈圧亢進症）、肝臓疾患（肝硬変）、ゴーシェ病のようなマクロファージ貯蔵疾患、特発性または免疫性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）のような自己免疫疾患、血管炎、容血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少紫斑病（ＴＴＰ）、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）および人工心臓弁膜によって生じる血小板減少である。
【００２２】
本明細書で述べられたように、巨核球内に目的タンパク質（ポリペプチドおよびペプチドを含む）の少なくとも一つの発現は、様々な臨床用途において使用されることができる。例えば、修飾された巨核球／血小板は、止血、線維素溶解、血管新生の目的で使用されることができる。目的タンパク質を巨核球またはＭＥＰ細胞または幹細胞のような前駆体にコードする核酸分子を送達することにより、目的タンパク質は巨核球内に発現されることができる。核酸分子は、発現ベクター、特にレントウイルスベクターのようなウイルスベクター内に含まれることができる。対象の核酸分子は巨核球に特異な方法（例えば、ＧＰＩｂアルファ遺伝子のような巨核球特異プロモーターによって運ばれた目的タンパク質のコード領域を有するｐＢＳＫベースプラスミドを使用する）で発現されることができる。特定の実施形態において、対象の核酸分子は、グリコプロテイン（ＧＰ）Ｉｂαプロモーターに使用可能な状態で結合される。対象の核酸分子を有するベクターは、任意の方法（例えば、トランスフェクション、インフェクション、エレクトロポレーションなど）を介して細胞（ＥＳまたはｉＰＳ細胞、ＭＥＰ細胞または巨核球）に送達されることができる。特定の実施形態において、最終的な巨核球につき高濃度で目的タンパク質を発現するクローンが選択される。
【００２３】
巨核球内で発現されることができる目的タンパク質の例は、これに限られることはないが、以下が含まれる。
【００２４】
１）線維素溶解薬、血栓溶解薬または抗血栓薬は血栓（生体内）を溶解するのに使用されることができる。特定の実施形態において、抗−血栓症血小板は、フィブリノーゲン・レベルの減少またはフィブリン分解生成物の生成のような組織的変化を生じずに生体内で有効に血栓を溶解する。線維素溶解薬は、これに限定されないが、ウロキナーゼ（例えばウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子、ｕＰＡ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）（例えば、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、プロウロキナーゼおよびストレプトキナーゼを含む。
【００２５】
２）凝血原タンパク質は（例えば血管損傷による）出血、出血性疾患または出血体質を治療、阻害、および／または予防するのに使用されることができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血友病Ａの治療のために本発明の細胞を介して送達されることができる。凝血原タンパク質の例は、これに限定されないが、ＦＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子を含む。治療される出血性疾患は、これに限定されないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、凝固因子欠乏（例えばＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＶ、ＦＸＩＩ、ＦＩＩ、ｖＷＦ）、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠乏症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠乏症および例えば、外傷、負傷、血小板減少および抗凝血剤による過剰処置に関連した出血を含む。
【００２６】
３）抗−血管新生薬または化学療法薬は癌（例えば、白血病、リンパ腫のような血液癌）を治療、阻害、および／または予防するのに使用されることができる。特定の実施形態において、抗−血管新生薬または化学療法薬はＣＩＴにおける転移のような転移を治療、阻害、および／または予防するのに使用されることができる。血管新生薬の例は、これに限定されないが、溶解性血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体（セルフ）、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）、アンジポイエチン２、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子−４、軟骨由来の血管新生阻害剤、組織メタプロテイナーゼ阻害（ＴＩＭＰ）、インターフェロン（α、βまたはγ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）、プロトロンビン、プロラクチン、アンチトロンビンＩＩＩフラグメント、および血管内皮細胞増殖阻害（ＶＥＧＩ）を含む。
【００２７】
４）抗−炎症性は血管炎を治療、阻害、および／または予防するのに使用されることができる。本明細書で使用されるように、抗−炎症性は炎症性疾患またはそれらに関連した症状の治療のための化合物に関する。特定の実施形態において、抗−炎症性は抗−炎症性ペプチド１のようなペプチドである。
【００２８】
Ｉ．定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【００２９】
本明細書に用いられる「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二重鎖、および一本鎖の場合、直鎖または環状形態のその相補的配列の分子である任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。核酸分子を論ずる場合、特定の核酸分子の配列または構造は、３’から５’方向にシーケンスを提供する通常の慣例に準じ、本明細書に記述される可能性がある。本発明の核酸に関して、「単離した核酸」という用語が、時折用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物に天然に存在するゲノムにおいてすぐ隣接する配列から単離されるＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離した核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターに挿入される、または原核生物または真核生物細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡにインテグレートするＤＮＡ分子を有する可能性がある。
【００３０】
ＲＮＡに適用される場合、「単離した核酸」という用語は上に定義したように単離したＤＮＡ分子によりコード化されたＲＮＡ分子を指す可能性がある。あるいは、前記用語は、その天然の状態で（すなわち、細胞または組織で）関連する他の核酸から、十分に単離されたＲＮＡ分子を指す可能性がある。単離した核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）はさらに、生物学的または合成的な方法で直接産生され、その産生の間、存在する他の構成要素から単離された分子を意味する可能性がある。
【００３１】
「発現オペロン」はプロモーター、エンハンサー、翻訳開始点（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化信号、ターミネータ、などのような転写および翻訳制御配列を有する可能性があり、宿主細胞または生物においてポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸部位を指す。
【００３２】
プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスのような「ベクター」はレプリコンであり、それに組み込まれた配列または因子の発現および／または複製を生じさせるよう、別の遺伝子配列または因子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が組み込まれる可能性がある。
【００３３】
「遺伝子」という用語は、エクソンおよび（選択的に）イントロン配列を含むポリペプチドをコードしているオープンリーディングフレームを有する核酸を指す。核酸はまたプロモーターまたはエンハンサー配列のような非コード配列を選択的に含む可能性がある。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されず、エクソンの間で認められる任意の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
【００３４】
アンチセンス分子は、特定の遺伝子またはそのような遺伝子のｍＲＮＡ転写に生理的状況下でハイブリダイズし、これにより、そのような遺伝子の転写および／またはそのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドである。アンチセンス分子は標的遺伝子またはそのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションで標的遺伝子の転写または翻訳に干渉するように設計される。アンチセンス分子は一般的に約１５〜約３０のヌクレオチドであるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの的確な長さおよびその標的との相補性のその程度は選択する特定の標的に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは生理的状況下において選択的に標的核酸と結合するよう望ましくは構成される。アンチセンス分子はｍＲＮＡ分子の翻訳出発点に及ぶ可能性がある。逆方向の全遺伝子配列を含むアンチセンスコンストラクトはまた作られる可能性がある。任意の既知のヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは標準的な方法に従いオリゴヌクレオチド合成により調製することが可能である。
【００３５】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導するもののような低分子干渉ＲＮＡ二量体を指す。ｓｉＲＮＡは様々な長さで異なる可能性があるが、１２−３０であり、より一般的には約２１ヌクレオチドの長さである（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）。ｓｉＲＮＡはセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に不対突出塩基を有する可能性がある。本明細書に用いられるように、「ｓｉＲＮＡ」という用語は２つの別々の鎖の二量体および二量体領域を有するヘアピン構造を形成することが可能な一本鎖分子の二量体（ｓｈＲＮＡ）を含む。
【００３６】
本明細書に用いられる「使用可能な関連する」という語句は、別の核酸配列との機能的な関係に置かれる核酸配列を指す可能性がある。使用可能な関連する可能性のある核酸配列の例は、これに限定されるものではないが、プロモーター、切断部位、精製タグ、転写ターミネータ、エンハンサーまたは活性化因子および異種遺伝子を含み、転写され、もし適していれば、翻訳される場合、タンパク質、リボザイムまたはＲＮＡ分子のような機能的な産物を産生する。「使用可能な関連する」という語句はまた、例えば、タンパク様形態のＵｂｌのカルボキシ末端領域の触媒的開裂活性が目的タンパク質の放出を誘導するようなＵｂｌのカルボキシ末端領域をコードしている核酸との機能的な関係に置かれる目的タンパク質をコードしている核酸配列を指す可能性がある。
【００３７】
「単離した」という用語は、それが自然に関連する（例えば、「かなり純粋な」に存在するものとなるように）環境から十分に隔離されたタンパク質、核酸、化合物または細胞を指す可能性がある。「単離した」は、他の化合物または材料との人工または合成混合物の除去、または、例えば、不完全な精製に起因し、存在する可能性がある基本的な活性の阻害をしない不純物の存在を必ずしも意味するものではない。
【００３８】
「かなり純粋である」という用語は、任意の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、細胞など）の少なくとも５０−６０重量％を有する調製物を指す。より望ましくは、調製物は任意の化合物の少なくとも７５重量％を、最も望ましくは９０−９５重量％を有する。純度は任意の化合物に適切な方法により測定される。
【００３９】
「薬理学的に許容される」は、動物およびより具体的にはヒトにおける使用において、連邦政府または州政府または米国薬局方にリストされているまたは薬局方に公認されたその他の監督機関による承認を意味する。
【００４０】
「担体」は、本発明の活性薬剤を投与する、例えば希釈剤、補助剤、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝液（例えばトリスＨＣｌ、アセテート、リン酸塩）、水、水溶液、油、充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤または基剤を指す。適当な医薬担体は"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．ＹおよびＫｉｂｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎにおいて記述される。
【００４１】
本明細書に用いられる「治療する」という用語は、（例えば１若しくはそれ以上の症状を持つ）患者の症状の改善、症状の進行の遅延などを含む、病気または疾患に苦しむ患者に利益を与える任意の種類の治療を指す。
【００４２】
化合物または医薬品組成物の「治療的有効量」は、特定の疾患または病気の症状を防止、阻害、治療、または軽減するための有効量を指す。本明細書において病気または疾患の治療は、病気または疾患、それの症状、またはそれの傾向を治療すること、軽減すること、阻害すること、および／または防止することを指す可能性がある。
【００４３】
「培養する」という用語は、培養液において適当な条件下で細胞集団を増殖または維持することを指す。
【００４４】
ＩＩ．投与
本発明の少なくとも１つの巨核球および／または血小板および少なくとも１つの薬理学的に許容される担体を有する組成物はまた、本発明に包含される。
【００４５】
本発明は、その患者の必要とする、少なくとも本発明の１つの巨核球および／または血小板、および少なくとも１つの薬理学的に許容される担体を有する組成物の投与を有する血小板減少症および／または他の病気または疾患を治療する方法を包含する。本明細書に用いられる「患者」という用語は、ヒトまたは動物（特に哺乳類）の対象を指す。例えば、本発明の血小板は、本発明の巨核球から試験管内で生成し、それから対象に投与される可能性がある。別の実施形態において、本発明の巨核球は直接その対象に送達され、血小板は生体内でその後産生される。
【００４６】
本発明の巨核球および／または血小板は、任意の薬理学的に許容される担体と共に投与のために都合の良いように製剤される可能性がある。例えば、ウイルスベクターは、水、緩衝食塩水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、洗浄剤、懸濁化剤、または適当なそれらの混合物のような許容できる培養液と共に製剤される可能性がある。選択した培養液中の本発明の巨核球および／または血小板の濃度は多様である可能性があり、培養液は医薬品の望ましい投与経路に基づいて選択される可能性がある。任意の従来の培養液または薬剤が投与される巨核球および／または血小板と不適合である場合以外は、その医薬品の使用が検討される。
【００４７】
特定の患者への投与にふさわしい本発明による組成物の量および投与計画は、患者の年齢、性別、体重、全身病状、および本発明の巨核球および／または血小板が投与されている特定の条件およびその重症度を考慮し、医者／獣医／専門医により決定される可能性がある。医者／獣医／専門医はまた、投薬の経路、医薬担体、および巨核球および／または血小板の生物活性を考慮する可能性がある。
【００４８】
適当な医薬品の選択はまた、選択される投与の方法に依存する。望ましくは培養液中で分散する本発明の巨核球および／または血小板を有する医薬品は注射部位と適合する。
【００４９】
本発明の巨核球および／または血小板は、任意の方法により投与される可能性がある。特定の実施形態において、本発明の巨核球および／または血小板は、直接注射、特に血流への静脈注射により投与される。注射のための医薬品は、当該分野で周知である。巨核球および／または血小板を投与する方法として注射が選択される場合、生物学的効果を及ぼすために十分な量の巨核球および／または血小板が彼らの標的細胞に到達することを確実にするための処置を講ずるべきである。
【００５０】
薬理学的に許容される担体に密接な混合物中の活性成分としての本発明の巨核球および／または血小板を含む医薬品組成物は、従来の製薬技術により調製することが可能である。投与、例えば静脈注射、のために求められる調製物の形態に従い、担体は多種多様な形態をとる可能性がある。
【００５１】
本発明の医薬品は、投与の簡便性および投薬量の均一性のために投与単位の形態で製剤される可能性がある。本明細書に用いられるような投与単位の形態は、治療を受けている患者に適切な医薬品の物理的に個別である単位を指す。各々の投薬量は、選択した医薬担体に関連性のある望ましい影響を生じることを意図した活性成分の量を含むべきである。適切な投与単位を同定する手順は、当該分野の当業者に周知である。投与単位は患者の体重に基づき比例して増加または減少される可能性がある。当該分野で周知のように、特定の病状の緩和のための適切な濃度は投薬量濃度曲線計算により決定される可能性がある。
【００５２】
本発明に従って、本発明の巨核球および／または血小板の投与のための適切な投与単位は、動物モデルで細胞の毒性を評価することにより決定される可能性がある。医薬品中の巨核球および／または血小板の様々な濃度は、マウスまたは他の動物に投与される可能性があり、治療の結果として観察される有益な結果および副作用に基づき、最小および最大投与量が決定される可能性がある。適切な投与単位はまた、他の標準的な薬剤と組み合わせて巨核球および／または血小板治療の有効性を評価することで測定される可能性がある。巨核球および／または血小板の投与単位は、個別に、または各々の治療と組み合わせて検出された影響により決定される可能性がある。
【００５３】
以下の実施例は、本発明の様々な実施例を図示するため提供される。実施例は実例となり、任意の方法により本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５４】
材料および方法
研究に用いたマウスの特性評価
ドナー細胞および血小板はＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウス（ジャクソン研究所）またはｍＵＫ−トランスジェニックマウスに由来し、巨核球内でマウスウロキナーゼを異所性に発現する（Ｋｕｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９２６−９３３）。レシピエントマウスはホモ接合的にｈαＩＩｂが遺伝子組換えされ、血小板マウスαＩＩｂの発現がヌル（ｍαＩＩ−／−）で（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００：３５８８−３５９６）、ｈαＩＩｂ＋マウスと呼ばれ、ヒト血小板において見られるＣＤ４１のレベルの２０％を発現する（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：９０７−９１４）。すべての動物実験は、フィラデルフィア小児病院における治験動物利用委員会の承認のもと行った。
血小板および巨核球の生体外単離
ホモジナイズしたＥ１４のＦＬ細胞から得た胎児の肝臓（ＦＬ）巨核球は、これまでに報告のあるとおり培養した（Ｌｅｃｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７５７２−７５７８）。成熟ＢＭ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から得た（Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２２：Ｕｎｉｔ  ２２Ｆ．６）。成熟巨核球は、二段階密度勾配（例えば、１．５％および３％のＢＳＡ段階勾配）を用い単離した（Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２２：Ｕｎｉｔ  ２２Ｆ．６）。クエン酸デキストロースで洗浄したＣ５７ＢＬ／６マウスの下大静脈に由来する血小板はこれまでの報告にあるとおり調製した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：６１０−６１７）。血小板数はＨｅｍａＶｅｔ（登録商標）カウンター（Ｔｒｉａｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）を用い測定した。血小板および／または巨核球は眼窩後部または尾静脈によりレシピエントマウスに注入し、その２つの手段は、類似した結果を示した（図６）。
【００５５】
巨核球の特性評価
血小板前駆体に対する巨核球数は、血球計算器で視覚的に決定した。ＤＮＡ倍数性はこれまでに記述されているようにヨウ化プロピジウムで染色後、ＦＡＣＳｃａｎＴＭ（ＢＤ社）を用いてフローサイトメトリーにより評価された（Ｋａｎａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０４：３１６１−３１６８）。
注入したｈαＩＩｂ＋マウスにおけるフローサイトメトリー解析
モノクローナルＦＩＴＣ−コンジュゲートマウス抗−ヒトＣＤ４１  Ａｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびモノクローナルフィコエリトリン−コンジュゲート（ＰＥ−コンジュゲート）ラット抗−マウスＣＤ４１  Ａｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で３０分間染色し、フローサイトメトリーにより解析したところ、レシピエントマウスからの眼窩後部血液サンプルは二倍に染色された。注入した血小板の活性化は、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ４１（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＰＥ−ラット抗マウスＣＤ４１、およびモノクローナルＦＩＴＣ−ラット抗−マウスＰ−セレクチン抗体（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い３色全血フローサイトメトリーにより評価した。レシピエントに対するドナーの血小板における膜レセプターの相対的な発現を分析するため、全血をマウス抗−ヒトＣＤ４１（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＰＥ−ラット抗−マウスＣＤ４１、およびモノクローナルＦＩＴＣ標識ラット抗−マウスＧＰＩｂαまたはラット抗−マウスＧＰＩＸ  Ａｂ（Ｅｍｆｒｅｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社）により染色した。
【００５６】
血小板減少症ｈαＩＩｂ＋マウスにおける注入解析
マウスを高線量の照射に曝した（合計１，０００センチグレイ、２セッション、２４時間間隔）。経時的な血小板プロファイルを決定するため血小板数を最初に毎日モニターした。これらの研究に含まれる動物は、照射後７日目および２００μｌ  ＣＡＴＣＨ緩衝液中の細胞注入の直前で１×１０８〜２×１０８／ｍｌの血小板数を持った。さらなる数の測定は、注入後４、２４、および４８時間において行った。
【００５７】
挙睾筋レーザー損傷の機能的研究
細胞注入の１時間後に、レシピエントｈαＩＩｂ＋雄マウスを用い挙睾筋レーザー損傷モデルの研究を行った（Ｎｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１２：１１０１−１１０８）。アレクサフルオ４８８（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で標識した抗マウスＣＤ４１Ｆａｂフラグメントを、損傷の５分前に静脈内に注射した。データは毎秒５コマで２．５分間集積した。
【００５８】
ＦｅＣｌ３頸動脈損傷の機能的研究
注入の１時間後にＦｅＣｌ３誘導の動脈損傷をｈαＩＩｂ＋マウスで誘発させた。これまでに報告のあるとおり研究を行った（Ｙａｒｏｖｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：４００６−４０１３）が、２０％のＦｅＣｌ３の損傷は３分間とした。総流量を３０分間記録した。
【００５９】
注入した巨核球運命の研究
ＦＬ由来の細胞を５日間培養し、それから注入前に４８時間１０μＭ  ＢｒｄＵ（シグマアルドリッチ社）に暴露した。注入後、レシピエントマウスを屠殺し、それから単離した臓器を任意の時点でホルマリンで固定した。ＢｒｄＵ標識した核の検出は、２次Ａｂ（Ａｂｃａｍ社）としてラットポリクローナル抗ＢｒｄＵ  Ａｂおよびビオチン化ウサギポリクローナル抗ラットＩｇＧで行い、続いてＤＡＫＯ検出キット（ＥｎＶｉｓｉｏｎ社）で行った。肺における巨核球細胞質は、マウスαＩＩｂ（サンタクルーズバイオテクノロジー社）および２次ビオチン化ウサギポリクローナル抗ヤギＩｇＧ  Ａｂ（Ａｂｃａｍ社）に対するヤギポリクローナルＡｂを用い同様に解析した。
【００６０】
統計
グループ間の違いは、２−テイルドスチューデントのｔ検定を用い比較した。統計解析はマイクロソフトエクセルを用い行った。Ｐ値が０．０５以下であった場合、差は有意であると考えた。
【００６１】
結果
注入した巨核球が循環血小板を生じるかどうかに対処するため、胎児肝臓−（ＦＬ−）およびＢＭ−由来の巨核球を発生させた（図１）（Ｌｅｃｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７５７２−７５７８）。半分以上が５０μｍより大きな直径を有し、約２．５：１の血小板前駆体／細胞のみである、「大細胞」を生成するために２段階密度勾配を用い、他の細胞および血小板前駆体から成熟巨核球を単離した（図２Ａ）。残りの「小細胞」は、約１０：１の血小板前駆体／細胞（図２Ａ）であった。倍数性解析は、ＦＬ大細胞と比較して、ＦＬ小細胞は低いＤＮＡ倍数性を持つことを示した（図２Ｂ）。
【００６２】
種特異的な抗−αＩＩｂ（ＣＤ４１）抗体を用い注入した血小板のフローサイトメトリー検出をさせるため、陽性コントロールＷＴ血小板を単離し、それらの血小板表面にヒトαＩＩｂのみを持つｈαＩＩｂ＋レシピエントマウスに注入した（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００：３５８８−３５９６）。注入の後、全体的な半減期約３６時間であるが、ＷＴ血小板は即座に（すなわち、５分の時点で）ｈαＩＩｂ＋レシピエントマウスにおいて検出された（図２Ｃ、２Ｅ、および２Ｆ）。対照的に、注入したＦＬ大細胞は、約９０分においてピークを持ち、血小板が遅くなるという結果となった（図２Ｄおよび２Ｅ）。これらの血小板は、全体的により短い約２０時間の半減期を有した。注入した細胞の数、血小板数のピークの増加、および約２ｍｌのレシピエントマウス血液量に基づき、各々の大細胞由来の血小板は１００−２００個であると計算され、全細胞が血小板を生じさせるものと仮定される。血小板前駆体を増加させ注入したＦＬ小細胞は、注入したＷＴ血小板と類似した即座のピークを生じたが、これらの血小板は約２時間の切り詰められた半減期を有した（図２Ｅ）。成熟ＢＭ巨核球の注入は、２４時間のわずかにより長い半減期であったが、ＦＬ−由来の巨核球と同様に血小板の出現が遅れる結果となった（図２Ｆ）。臨床血小板減少症を模倣するため、マウスに照射させ、誘導した血小板最下点近くでＣＡＴＣＨ緩衝液（１×ＰＢＳ、１．５％のＢＳＡ、１ｍＭアデノシン、２ｍＭテオフィリン、および０．３８％クエン酸ナトリウム）、ＷＴ血小板またはＦＬ大細胞を注入した。血小板および巨核球が２４時間以上の時間的経過を超え、ＣＡＴＣＨ緩衝液と比較して血小板数を有意に増加することが認められた（図２Ｇ）。
【００６３】
注入した大細胞から誘導される血小板の半減期の短縮を理解するために、それらのサイズ分布を解析し、注入したＷＴ血小板と微粒子を比較したが、差は認められなかった（図２Ｈ）。血小板活性化の別の指標は表面のＰ−セレクチンの発現である（Ｈｓｕ−Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：９１２１−９１２６）。表面のＰ−セレクチン濃度が、注入したＦＬ細胞由来の血小板と注入したＷＴ血小板において同程度であることをフローサイトメトリー解析法により示した（図２Ｉ）。ＡＤＡＭ１７は、血小板半減期を短縮させる培養中で検出されるメタロプロテナーゼであり（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９５：６７７−６８３）、レセプター密度を変えることなくＧＰＩｂ／ＩＸレセプターを不活性化し、ＧＰＩｂαのグリコカリシン細胞外部分を開裂する（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：４２２９−４２３５）。注入したＦＬ細胞由来の血小板および注入したＷＴ血小板は同程度のＧＰＩＸに対する細胞外ＧＰＩｂの比率を示した（図２Ｉ）。このように、注入した大細胞から誘導される血小板のわずかに短くなった半減期は、ＡＤＡＭ１７活性に依存するようではない。
【００６４】
臨床的に、血小板数を増加させず、血小板減少症による出血性素因を食い止めるまたは防ぐために、血小板は典型的に輸注される。レーザーにより誘発させた挙睾筋細動脈損傷モデルにおいて、注入したＷＴ血小板および注入したＦＬ細胞由来の血小板の増大する凝血塊への取り込みを分析した。すべての設定において、血小板は成長する血栓に即座に取り込まれた。ＷＴ血小板およびＦＬ大細胞由来の血小板は、同様に取り込まれた（図３Ａおよび３Ｂ）。再循環し、めったに凝血塊に取り込まれなかったＣＤ４１＋細胞の異なる細胞集団で、ＦＬ小細胞由来の血小板はより少ない程度で取り込まれた（図３Ｃおよび３Ｄ）。この現象は、ＦＬ大細胞の注入の後はめったに認められず（図３Ｂ）、決して注入したＷＴ血小板では認められなかった（図３Ａ）。
【００６５】
ＣＡＴＣＨ緩衝液またはＦＬ大細胞を、低いＣＤ４１表面密度に起因するものと思われる軽度の出血性素因を有するｈαＩＩｂ＋レシピエントマウスに注入した後に、ＦｅＣｌ３頸動脈損傷モデルを用い血小板機能はまた分析された（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：９０７−９１４）。ＦＬ大細胞の注入は、安定した閉塞の発生時間を有意に短縮した（表１）。ｍＵＫマウス由来のＦＬ大細胞はまた、注入され、それらのα−顆粒において異所性にウロキナーゼを発現および貯蔵し（Ｋａｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２５７−２６５）、ＦｅＣｌ３頸動脈損傷モデルにおける血栓症に抵抗性である。ＷＴマウスへのｍＵＫ血小板の輸注は凝血塊の発生を阻害した（Ｋｕｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９２６−９３３）。注入したＦＬ大細胞由来のｍＵＫ血小板が機能的である場合、それらはｈαＩＩｂ＋レシピエントマウスにおいて凝固を阻害するものと結論づけられた。実際、注入したｍＵＫ大細胞は、安定した閉塞を形成することが不可能であった（表１）。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
まず、注入した巨核球がどこで血小板を発生したかに対処するために、巨核球核をＢｒｄＵ標識した。様々な臓器を注入の最高３６時間後に単離した。実質的にＢｒｄＵで染色した全ての核は肺であった（図４Ａ）。染色された核は、最高２４時間確認できた（図４Ｂ）。数個の核は、脾赤色髄において確認できた（図４Ｃ）。肝臓、心臓、脳、またはＢＭには一つも存在しなかった。ＢｒｄＵ標識した大細胞は肺微小血管において注入後最高３０分間、それらの細胞質に保持されるように見え（図４Ｂおよび４Ｄ）、ＦＬ大細胞注入後の血小板数のピークの遅延と一致する。この観察を追認するため、組織を抗−マウスＣＤ４１  Ａｂで染色し、最大３０分間まで陽性に染色された細胞質を検出した（図４Ｄ）。本研究および過去の組織学的研究（Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５７：６９−７４）は、血小板が血管床内で直接循環巨核球、成熟巨核球、高い倍数性巨核球から放出されることが可能であることを示す。髄における血管ニッチで巨核球が大細胞質断片を発生していることを示す最近の研究（Ｊｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１７６７−１７７０）を考慮すれば、試験管内の研究（Ｉｔａｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７：１２９９−１３１２）により明らかにされたそれらと合致するメカニズムを用い、大細胞質断片および全巨核球は血管系に逃れ、肺床の中で血小板を発生する可能性があるが、同様に並流および局所血管因子が含まれる（Ｄｕｎｏｉｓ−Ｌａｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４：１８７５−１８８３）。
【００６８】
ある人は、肺に詰まっている巨核球が心血管の難問を引き起こす可能性があると想定する。しかしながら、表２で示す計算に基づいて、全肺胞毛細血管床のわずか０．４％−１．７％が閉塞した。巨核球の流入を処理する肺血管系の能力に加えて、別の問題は、この床が血小板放出のために特殊化されるかどうかということである。右から左への重篤な心血管シャントをもつ人は少ない血小板数を有することが知られており、他は、循環巨核球よる肺バイパスに由来することが提案された（Ｌｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，９８：２５４−２５８）。しかしながら、肺床を自然に迂回する胎児循環においては、血小板は存在する（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１６２：７３５−７３９）。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
注入した巨核球由来の血小板が表面レセプターのサイズおよび発現において正常であり、増殖する血栓に取り込まれることが可能なことを本明細書において示した。これまでにＡＤＡＭ１７が培養液に存在し、生体外で産生される血小板の半減期が短くなることが示唆されている（Ｎｉｓｈｉｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５：１９１７−１９２７）。本研究では、巨核球をＡＤＡＭ１７の２つの阻害剤、ＧＭ６００１およびＴＡＰ−１の存在下で増殖後、由来する血小板の半減期において変化を示さなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。半減期の短縮に対する他の説明は、大部分の研究がＦＬ巨核球を用い行われたということであり、胎児の血小板は成熟血小板と比較し、より短い半減期を有する（Ｊｉｌｍａ−Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１１２：４６６−４６８）。しかしながら、培養した注入した成熟ＢＭ巨核球は、見かけ上、同様の遅延および少しより長い半減期のみを生じた（図２Ｆ）。
【００７１】
生物学的に反応性を持つ多くの血小板の試験管内における生成は、依然として問題を含む。本研究はヒト細胞株を樹立させ、増加させることが可能あり、巨核球に分化させることが可能であり、血小板のドナー非依存的なソースとなることを示す。そのような細胞株、ＧＡＴＡ−１を欠くＥＳ細胞に由来し、ＧＡＴＡ−１の再発現後約５０％の巨核球を形成するＧ１ＭＥ細胞、がマウス由来で存在する（Ｓｔａｃｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：８７−９７）。巨核球形成の間、目的タンパク質を異所性に発現させるような細胞株の修飾は、その後の損傷部位への異所性タンパク質の標的となる送達に有用である（Ｙａｒｏｖｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：４００６−４０１３）。生体内で注入した修飾された巨核球から修飾された血小板を産生するこのさらなる利点は、ｍＵＫマウス巨核球に由来する血小板により有効な、標的とされたウロキナーゼの送達を示す研究により支持される（表１）。
【００７２】
注入した巨核球は肺床中に血小板を放出することが可能であり、生体内において正常血小板のそれらに類似した特性を持つ生物活性血小板を形成することが可能である。その過程は積極的であり、血小板数を増加させることが可能で、止血を異所性タンパク質の標的とされた送達により改善および修飾することが可能となるよう十分な血小板が形成される。注入した巨核球につき発生する１００−２００個の血小板の推定値に基づき、平均的な７０ｋｇの患者において１０％の血小板数の上昇もたらすため、１０９個の成熟巨核球が発生する可能性がある。
【実施例２】
【００７３】
自己再生するマウスＭＥＰ細胞の樹立
ＧＡＴＡ−１ヌルのマウスＥＳ細胞を作成し、ＧＡＴＡ−１転写制御因子が赤血球および巨核球両方の発生に重要であることを示すのに用いた（Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：３９６５−７３）。ＯＰ９間質フィーダー細胞およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）の存在下における２週間のこれらの細胞の増殖は、自己再生する細胞株Ｇ１ＭＥを誘導した。そのような自己再生する細胞株は同じ系統の野生型（ＷＴ）ＥＳ細胞を用いては認められなかった（Ｓｔａｃｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：８７−９７）。ＧＡＴＡ−１および緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現を誘導するレトロウイルスによりトランスフェクトする場合、〜６０％のＧ１ＭＥ細胞が巨核球（成熟巨核球のＧＰＩｂα発現）に分化した。
【実施例３】
【００７４】
ｈＥＳＣ由来の巨核球の生成
ｈＥＳＣ細胞株を巨核球に分化させる無血清状態での３段階の胚様体（ＥＢ）ベースのプロトコルが用いられた（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １１０：Ａｂｓｔｒａｃｔ  １２６５）。ｈＥＳＣ細胞株の増殖、維持および分化のためのプロトコルは記述されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：２６７９−８７）。巨核球系への分化には、以下のサイトカインが用いられた。ＢＭＰ−４、ｂＦＧＦ、およびＶＥＧＦ（全て１０ｎｇ／ｍｌで）。アクチビンＡ（０．５−３．０ｎｇ／ｍｌ）。ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ｈ１Ｌ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｈ１Ｌ−３（４０ｎｇ／ｍｌ）、およびｈ１Ｌ−１１（５ｎｇ／ｍｌ）。血液生成を同定する初期マーカーとしてＣＤ４１および巨核球に特異的マーカーとしてＣＤ４２（ＧＰｌｂ）を用い、１１日目のＥＢが〜１０％ＣＤ４１ＨｉＣＤ４２＋および〜２０％ＣＤ４１ＬｏＣＤ４２±細胞集団を産生することを見出した。細胞をソートし、ＴＰＯを含有する培養液において培養後、両方の細胞集団は、増加したＣＤ４１およびＣＤ４２の発現および形態（メイ−グリュンワルド−ギムザ染色）により示されるように、さらに分化した。遺伝子発現プロファイル、および前駆細胞および機能的解析を用い、細胞のＣＤ４１ＨｉＣＤ４２＋細胞集団が巨核球系に関与することを明らかにした。
【実施例４】
【００７５】
注入した巨核球からの血小板の放出
ヒトＣＤ４１のみを発現するマウスへ注入したＷＴ血小板（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００：３５８８−９６；Ｍａｓｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２：１１８０−８）は、輸注された血小板の数およびレシピエントマウスの最初の血小板数と一致し、血小板の増大をもたらした。これらの血小板は〜３０時間の半減期であった。培養した胎児肝臓由来のＷＴ巨核球（ＴＰＯ培養液における８日間の増殖後（Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６２：８６３−７４））を注入した場合、１つのマウス巨核球が１０３の血小板の増加を引き起こすと仮定すると、同じレシピエントマウスでの血小板の増加は期待される増加の〜７０％であった。しかしながら、血小板出現の遅れが５分間あり、半減期は注入した血小板においてよりも短い可能性がある。血小板数上昇の遅れは、肺で血小板を放出する必要のある巨核球と一致する。より短い半減期は、ＧＭ６００１の含有により阻害可能な培養基中に存在する最近報告されたメタロプロテナーゼによるものである可能性がある（Ｎｉｓｈｉｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５：１９１７−２７）。注目すべきは、いずれの動物においても注入した巨核球によって呼吸器または血管の明らかな異常を生じず、注入している巨核球が臨床的に適したものであることを示している。
【実施例５】
【００７６】
目的タンパク質の発現
異所性タンパク質は巨核球を発生させる際に発現させることが可能で、血小板α−顆粒に貯蔵させることが可能である。例えば、ＦＶＩＩＩを巨核球形成の間発現させる場合、ＦＶＩＩＩｎｕｌｌマウスの血漿において検出可能なＦＶＩＩＩは認められず、それは循環血小板に貯蔵される（Ｇｅｗｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６：１１６０−６）。ＦＶＩＩＩ放出血小板（ｐＦＶＩＩＩ）は、循環阻害剤の存在下においても効果的である。ｐＦＶＩＩＩを発現するマウス由来の輸注した血小板は、ＦＶＩＩＩｎｕｌｌマウスにおける出血性素因を補正することが可能である（Ｙａｒｏｖｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：４００６−１３；Ｙａｒｏｖｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：４６７４−６）。
【００７７】
同様に、巨核球形成の間、異所性に発現したｕＰＡは循環血小板のα−顆粒に貯蔵されるが、全身性の線維素溶解を引き起こさなかった（Ｋｕｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９２６−３３）が、顕著に血栓溶解が増進した。ＷＴマウスへ輸注したｕＰＡを含有する血小板はまた、レシピエントマウスにおいて線維素溶解を増進した（Ｋｕｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：９２６−３３）。
【実施例６】
【００７８】
ＮＳＧマウス（Ｓｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：１１８−１３０；Ｓｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：６４７７−８９）にヒト血小板を注入した。図７Ａにおいて見られるように、ヒト血小板の半減期は約１０時間であった。ヒト胎児肝臓（ＦＬ）巨核球をＮＳＧマウスに注入した場合、血小板のスパイクが注入の１０時間以内で観察された（図７Ｂ）。注入した２００万個の大細胞は、巨核球につき約１３個の血小板を産生した。ヒト巨核球はまた、成長する血栓に取り込まれた。
【００７９】
血小板産生を増加させるため、ジメチルファスジル（ｄｉＭＦ）、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ１キナーゼ阻害剤のヒトＦＬ巨核球成熟を促進するその能力の試験を行った。ＦＬ−巨核球（大）をＤｉＭＦ（５μｍ）で処理し、ＮＳＧマウスに注入した場合、血小板のスパイクは注入の約１時間以内で観察された（図７Ｃ）。さらに、２００万個の大細胞の注入は、巨核球につき約６個の血小板のみを産生した。次に、骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４＋細胞由来のヒトＭｅｇｓ（大）をＮＳＧマウスに注入した。図７Ｄの中で見られるように、血小板は注入の数時間以内でピークに達した。さらに、２００万個の大細胞の注入は、巨核球につき約７０個の血小板を産生した。ＢＭ  ＣＤ３４＋Ｍｅｇｓ（大）をＤｉＭＦ（２μｍ）で処理し、ＮＳＧマウスに注入した場合、血小板のスパイクは即座に観察された（図７Ｅ）。さらに、２００万個の大細胞の注入は、巨核球につき約４個の血小板のみを産生した。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態のいくつかを記述し、特に上記を例示したが、本発明がそのような実施形態に限定されることを意図しない。以下の請求項に記載したように、様々な修正が本発明の範囲および趣旨を逸脱することなくそれになされる可能性がある。
【図１】
2014511118.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【国際調査報告】
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