(57)【要約】  新規な合成前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）−ターゲット捕捉剤が開示され、これはＰＳＡに特異的に結合する。ある実施態様では、これらの捕捉剤は、バイリガンド又はトリリガンド捕捉剤であり、それぞれ２又は３のターゲット結合部分を持つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチリガンド前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ターゲット捕捉剤を含む合成検出剤であり、前記捕捉剤が血清中で特異的にＰＳＡに結合する検出剤。
【請求項２】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、タンパク質分解に抵抗性の環状トリリガンドであり、前記環状トリリガンドが、アンカーリガンド、第２リガンド及び第３リガンドを含む、検出剤。
【請求項３】
請求項１の検出剤であり、前記捕捉剤が、凍結乾燥粉末として保存に安定である、検出剤。
【請求項４】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、約−８０℃から４０℃の温度で保存に安定である、検出剤。
【請求項５】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、室温で保存に安定である、検出剤。
【請求項６】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、ヒト血清中で少なくとも２４時間安定である、検出剤。
【請求項７】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、ｐＨが３．０から８．０の範囲で安定である、検出剤。
【請求項８】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、銅−ＤＯＴＡでラベル化されている、検出剤。
【請求項９】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、ビオチンでラベル化されている、検出剤。
【請求項１０】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、タンパク質の非正規のエピトープへ結合する、検出剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、免疫療法剤である、検出剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の検出剤であり、前記捕捉剤が、診断剤である、検出剤。
【請求項１３】
請求項１に記載の検出剤であり、前記アンカーリガンド、第２リガンド及び第３リガンドの１つ又は複数の間の結合が、以下の、１、５−置換−１、２、３−トリアゾール残基（Ｔｚ５）又は１、４−置換−１、２、３−トリアゾール残基（Ｔｚ４）を含む、検出剤。
【化７】
2014506883.tif 000008
Ｔｚ４
【化８】
2014506883.tif 000009
Ｔｚ５
【請求項１４】
請求項２に記載の検出剤であり、前記アンカーリガンドが、環状Ｌ−ペプチドであり、前記第２リガンドがＤ−ペプチドであり、及び前記第３のリガンドがＤ−ペプチドである、検出剤。
【請求項１５】
請求項２に記載の検出剤であり、前記アンカーリガンドと前記第２リガンドとの結合、及び前記第２リガンドと前記第３リガンドとの結合が、Ｔｚ５である、検出剤。
【請求項１６】
請求項２に記載の検出剤であり、以下の、Ｔｚ４−トリリガンド及びＴｚ５−トリリガンドからなる群から選択される構造を含む、検出剤。
【化９】
2014506883.tif 000010
Ｔｚ５−トリリガンド
【化１０】
2014506883.tif 000011
Ｔｚ４−トリリガンド
【請求項１７】
請求項１６に記載の前記Ｔｚ５−トリリガンドの製造方法であり、前記方法は：
（ａ）側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５−ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ（側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５アンカー合成ブロック（Ｉ））、
側鎖−保護Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ（側鎖−保護第２合成ブロック（Ｉ））、及び
側鎖−保護Ｔｚ５−ｒｒｉｖｋ（側鎖−保護第３合成ブロック（Ｉ））の合成を含み、これらはそれぞれ以下の構造
【化１１】
2014506883.tif 000012
【化１２】
2014506883.tif 000013
【化１３】
2014506883.tif 000014
を持ち：
（ｂ）前記側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５アンカー合成ブロック（Ｉ）と前記側鎖−保護第２合成ブロック（Ｉ）とをカップリングさせて、以下の構造を持つ、側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５−ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ−Ｔｚ５−Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ（側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５−ＰＳＡＴｚ５−バイリガンド合成ブロック（Ｉ））
【化１４】
2014506883.tif 000015
を形成し：
（ｃ）前記側鎖−保護−ビオチン−ＰＥＧ５−Ｔｚ５−バイリガンド合成ブロック（Ｉ）を、前記側鎖−保護第３合成ブロック（Ｉ）とカップリングさせて、次の構造の、側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５−ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ−Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ−Ｔｚ５−ｒｒｉｖｋ（側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５−ＰＳＡＴｚ５−トリリガンド合成ブロック（Ｉ））
【化１５】
2014506883.tif 000016
を形成し：
（ｄ）前記側鎖−保護ビオチン−ＰＥＧ５−ＰＳＡＴｚ５−トリリガンド合成ブロック（Ｉ）を脱保護基して、ビオチン−ＰＥＧ５−ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ−Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ−Ｔｚ５−ｒｒｉｖｋを形成し：及び
（ｅ）ジスルフィド結合を形成して、次の構造：
【化１６】
2014506883.tif 000017
を持つ、ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ−Ｔｚ５−ｒｒｉｖｋ（ビオチン−ＰＥＧ５−ＰＳＡＴｚ５−トリリガンド（Ｉ））を与えることを含む、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のＰＳＡ−ターゲット捕捉剤を開発する方法であり、前記方法は：
（ａ）ＰＳＡをビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ａｚ４（「アジド−変性ＰＳＡ−ＰＣＣアンカー選択ブロック（Ｉ）」）と接触させてＰＳＡ−アンカー複合体を与えるステップ；
（ｂ）前記アンカー複合体を第１の複数の候補ペプチドと接触させて、ＰＳＡ−ＰＣＣ第２リガンドを選択するステップを含み、前記ペプチドがＤ−プロパルギルグリシンとそのＮ末端で結合されており；
（ｃ）前記ＰＳＡ−ＰＣＣアンカー選択ブロックと前記ＰＳＡＰＣＣ第２リガンドとの間に１、２、３−トリアゾール結合を形成することでＰＳＡ−ＰＣＣバイリガンドを与えるステップを含み、前記アンカー選択ブロックと前記第２リガンドのアジド基とアルキン基が、前記ターゲットタンパク質と結合することで緊密位置にもたらされて、前記ＰＳＡ−ＰＣＣバイリガンドで変性されたビーズを与え；
（ｄ）前記ＰＳＡ−ＰＣＣバイリガンドで変性された前記ビーズを選択するステップ；
前記ＰＳＡ−ＰＣＣバイリガンドを、前記ＰＳＡ−ＰＣＣバイリガンドで変性された前記ビースから除去するステップ；
（ｅ）前記ＰＳＡ−ＰＣＣバイリガンドの前記ＰＳＡ−ＰＣＣ第２リガンドの配列決定するステップ；
（ｆ）ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−ＰＳＡ第２リガンド−Ａｚ４（「アジド変性ＰＣＣバイリガンド選択ブロック（Ｉ）」）を製造するステップ；及び望ましい抗体−様性質がスクリーニングされるまでステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップ、を含む方法であり、ここで
ＰＥＧ５は−（ＮＨ−（ＣＨ２Ｈ４−Ｏ−）５−Ｃ（Ｏ））−であり、Ａｚ４はＬ−アジドリジンである。
【請求項１９】
免疫アッセイにおいて請求項１に記載の前記ＰＳＡ捕捉剤を用いてＰＳＡを検出する方法であり、前記ＰＳＡ捕捉剤が、前記免疫アッセイにおいて抗体又はその等価物と交換される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であり、前記免疫アッセイが、ウェスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロット及びＥＬＩＳＡからなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＳＡ捕捉剤、組成物、方法及びその製造に関する。本出願は、米国仮特許出願第６１／４３９３６２号（２０１１年２月３日出願）に基づく優先権を主張するものであり、この全内容は参照されて本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は通常男性で診断される癌であり、癌死亡の原因となる。初期段階で検出されると、前立腺癌は治癒され得る。残念ながら、多くの場合原発腫瘍の転移が既に発生した最終段階で診断される。前立腺癌スクリーニングで陽性と診断される全ての個人が必ずしも癌を発症するものではない、ということから、早期診断はいまだに議論の余地がある。
【０００３】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、腺カリクレイン遺伝子ファミリーの血清糖タンパク質成分である。ＰＳＡは、制限キモトリプシン様酵素活性を持ち、ＰＳＡの天然基質であるセメノゲリンＩのＣ−末端をチロシン及びロイシン残基に切断する。ＰＳＡの前記組織特異性は、能動的免疫治療のための診断ターゲット及び可能な治療ターゲットの両方として有用なものとする。前立腺特異抗原は、前立腺癌の臨床的証拠がなくても健康な男性の血清中で低レベルで検出され得る。腫瘍状態となると、しかしながら、ＰＳＡの循環濃度は飛躍的に増加する。この増加はしばしばこの疾患の臨床段階と関連付けられている。従って、ＰＳＡは、前立腺癌のスクリーニング及び階層化の両方のためのマーカーとして広く使用され、４ｎｇ／ｍＬよりも多い濃度で、前立腺癌の信頼出来る指標と考えられている（Ｊｅｏｎｇ  ２００７）。血清中で、２つのＰＳＡの異なる形が免疫学的に検出可能であり：遊離型（ＭＷ＝３０ｋＤａ）、及びα１−アンチキモトリプシンとの結合型（ＡＣＴ−ＰＳＡ、ＭＷ＝１００ｋＤａ）である。当モル合計ＰＳＡ測定（遊離ＰＳＡ＋ＡＣＴ−ＰＳＡ）、合計ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡ間の比率、デジタル直腸診（ＤＲＥ）、及び生検が、多重前立腺癌診断アルゴリズムに含まれる。合計ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡの比率はまた、癌と、通常の誤診である前立腺肥大症（ＢＰＨ）間の識別情報を与える。診断又は、フォローアップ目的のための合計ＰＳＡ測定は、広い範囲の濃度を検出するアッセイを必要とする（Ａｃｅｖｅｄｏ  ２００２）。
【０００４】
現在のＰＳＡスクリーニング試験は、血液サンプル中のＰＳＡを検出するために、捕捉剤としてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を利用する。これらの試験は、モノクローナル抗体技術に本来的に伴われるいくつかの制限を持つ。第一に、モノクローナル抗体の不安定性により、費用が高くなり、配送、取扱い及び保存が制限されるという結果となる。第２に、モノクローナル抗体とは、厳密な化学構造ではなく、これらは組成物について製造バッチ間での大きな変動を示し得る、ということである。これは、バッチ間で捕捉親和性と選択制に変化を生じさせ、タンパク質アッセイの定量性において問題を生じさせる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｃｅｖｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ  ３１７：５５−６３（２００２）
【非特許文献２】Ａｇｎｅｗ  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４８：４９４４−１９４８（２００９）
【非特許文献３】Ｂｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：８９２３−８９３０（２００８）
【非特許文献４】Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｎｏｂｌｅ、  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：１６１−２１４（１９９０）
【非特許文献５】Ｊｅｏｎｇ  ＆  Ｌｅｅ、  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １  ７：８４０−８４６（２００７）
【非特許文献６】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  １０：８０７（２００８）
【非特許文献７】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８２：６７２−６７９（２０１  ０）
【非特許文献８】Ｐａｋｋａｌａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  １３：３４８−３５３（２００７）
【非特許文献９】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７：６２１２−６２２０（２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、前立腺癌のスクリーニング及び治療の両方のための、モノクローナル抗体を置き換える改善されたＰＳＡ捕捉剤の技術への要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここである実施態様で、ＰＳＡの特異的に結合する合成ＰＳＡ捕捉剤が提供される。ある実施態様では、これらの捕捉剤は、１つ又は複数のターゲット−結合部分を含み、さらにこれらのある実施態様では、ターゲット結合部分がペプチドである。ある実施態様では、前記捕捉剤は、バイリガンド（ｂｉｌｉｇａｎｄ）又はトリリガンド（ｔｒｉｌｉｇａｎｄ）捕捉剤であり、これは２又は３のターゲット−結合部分を含むことを意味する。これらのある実施態様では、前記捕捉剤は環状バイリガンド又はトリリガンドである。ある実施態様では、捕捉剤の前記ターゲット−結合部分は、お互いに共有結合、例えばアミド結合又は１、４−又は１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール結合（リンケージ）を介して結合され（リンクされ）、及びある実施態様では前記ターゲット−結合部分が共にＴｚ５又はＴｚ４結合（リンケージ）で結合されて（リンクされて）いる。ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、広い範囲の温度、ｐＨ、保存期間、保存状態及び反応条件において安定であり、及びある実施態様では、前記捕捉剤は、同等の抗体よりもこれらの１つ又は複数の条件下でより安定である。
【０００８】
ある実施態様では、ここで提供されるＰＳＡ捕捉剤は、配列表の配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列を含むアンカーリガンド、第２リガンド及び第３リガンドを含む、Ｔｚ５−トリリガンドであり、次の構造を持つ。
【０００９】
【化１】
2014506883.tif 000002
ある実施態様では、ここで提供されるＰＳＡ捕捉剤は、配列表の配列番号１、２、４で示されるアミノ酸配列を含むアンカーリガンド、第２リガンド及び第３リガンドを含む、Ｔｚ４−トリリガンドであり、次の構造を持つ。
【００１０】
【化２】
2014506883.tif 000003
ここである実施態様では、ここで提供される捕捉剤を用いる、サンプル中のＰＳＡを検出又は定量する方法が提供される。ある実施態様では、これらの方法は、免疫アッセイを含み、前記捕捉剤は抗体の代替物であり、これらのある実施態様では前記免疫アッセイはウェスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロット又はＥＬＩＳＡである。
【００１１】
ここである実施態様において、ここで提供される捕捉剤において使用のための、ターゲット−結合部分のスクリーニング方法が提供される。
【００１２】
ここである実施態様では、ここで提供される捕捉剤の合成方法が提供される。
【００１３】
ここである実施態様では、ここで提供される捕捉剤をスクリーニングする方法が提供される。
【００１４】
ここである実施態様では、ここで提供される捕捉剤を用いる、対象体の増加ＰＳＡ濃度に伴う前立腺癌又はある症状の診断及び／又は階層化の方法が提供される。
【００１５】
ここである実施態様では、ここで提供される捕捉剤を用いる、対象体の増加ＰＳＡ濃度に伴う前立腺癌又は症状を治療する方法が提供される。これらのある実施態様では、前記捕捉剤はここで、免疫療法としての機能が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、一般的な捕捉剤選択スキームを示す。
【図２】図２は、タンパク質捕捉剤ターゲットＰＳＡの選択スキームを示す。
【図３ａ】図３ａは、タンパク質捕捉剤ターゲットＰＳＡの化学構造を示し、ＰＳＡアンカーリガンド（配列番号１）選択ブロックを示す。
【図３ｂ】図３ｂは、タンパク質捕捉剤ターゲットＰＳＡの化学構造を示し、ＰＳＡＴｚ５−バイリガンド（配列番号１及び２）選択ブロックを示す。
【図３ｃ】図３ｃは、タンパク質捕捉剤ターゲットＰＳＡの化学構造を示し、ＰＳＡＴｚ５−トリリガンド（配列番号１、２、及び３）選択ブロックを示す。
【図３ｄ】図３ｄは、タンパク質捕捉剤ターゲットＰＳＡの化学構造を示し、ＰＳＡＴｚ４−バイリガンド（配列番号１及び２）選択ブロックを示す。
【図３ｅ】図３ｅは、タンパク質捕捉剤ターゲットＰＳＡの化学構造を示し、ＰＳＡＴｚ４−トリリガンド（配列番号１、２及び４）を示す。
【図４】図４は、配列番号１を含むＰＳＡアンカーリガンド（ＰＳＡ−アンカー）、配列番号２を含むＰＳＡＴｚ５−第２リガンド（１、５−Ｔｚ−第２リガンド）、配列番号３を含むＰＳＡＴｚ５−第３リガンド（１、５−Ｔｚ−第３リガンド）、配列番号２を含むＰＳＡＴｚ４−第２リガンド（１、４−Ｔｚ−第２リガンド）、配列番号４を含むＰＳＡＴｚ４−第３リガンド（１、４−Ｔｚ−第３リガンド）、の化学構造を示し、それぞれのリガンドは、ＡＡＰＰＴＥＣ  Ｔｉｔａｎ  ３５７合成装置上で、Ｆｍｏｃ系固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の側鎖保護生成物である。
【図５】図５は、配列番号１及び２を含むＰＳＡＴｚ５−バイリガンドの、ＰＳＡアンカーをＰＳＡＴｚ５−第２リガンドと結合させることによる合成を示す。それぞれの側鎖は保護されている。
【図６】図６は、配列番号１、２及び３を含むＰＳＡＴｚ５−トリリガンドの、ＰＳＡＴｚ５−バイリガンドをＰＳＡＴｚ５−第３リガンドと結合させることによる合成を示す。それぞれの側鎖は保護されている。
【図７】図７は、配列番号１、２及び３を含むＰＳＡＴｚ５−トリリガンドの合成を示す。
【図８】図８は、開示のひとつとの実施態様による、完全に保護されたアルキン含有アミノ酸の合成を示す。
【図９】図９は、開示のひとつとの実施態様による、完全に保護されたアジド含有アミノ酸の合成を示す。
【図１０】図１０は、開示のひとつの実施態様による保護１、５−トリアゾール結合ジペプチドを提供するために、完全に保護されたアルキン含有アミノ酸と完全に保護されたアジド含有アミノ酸との間のルテニウム触媒アジド／アルキン環化付加（ＲＵＡＡＣ）反応を示す。
【図１１】図１１は、開示のひとつの実施態様による保護された１、５−トリアゾール結合ジペプチドのベンジルエステル保護基を選択的に脱保護基する反応を示す。
【図１２】図１２は、開示のひとつの実施態様による、保護１、４−トリアゾール結合ジペプトドを与えるために、完全に保護されたアルキン含有アミノ酸と完全に保護されたアジド含有アミノ酸との間の、銅触媒アジド／アルキン環化付加（ＣＵＡＡＣ）反応を示す。
【図１３】図１３は、開示のひとつの実施態様による、ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドＴｚ５−ｒｒｉｖｋ、ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドＴｚ５及び市販のモノクローナル抗体抗−ヒトＰＳＡ（ＰＳ１ｍＡｂ）のサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１４】図１４は、開示のひとつの実施態様により、ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドＴｚ５−ｒｒｉｖｋ、及び市販のモノクローナル抗体抗−ヒトＰＳＡ（ＰＳ１ｍＡｂ）のサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示し、これは４ｎｇ／ｍＬの遊離ＰＳＡのカットオフ濃度の範囲での定量化限界を示す。
【図１５】図１５は、ＰＳＡ捕捉剤（アンカーリガンド、バイリガンド、トリリガンド）及び市販ＰＳＡ抗体（抗−ＰＳＡｍＡｂ、ＰＳ１、ＰＳ２及びＰＳ６、ＩｇＧ１）のドッｔブロットアッセイを示す。
【図１６】図１６は、開示のひとつの実施態様による、ビオチン化ＰＳＡ捕捉剤トリリガンド及びビオチン化市販ＰＳＡ抗体（ＰＳ２ｍＡｂ）のプルダウンアッセイの結果を示し：（ａ）銀染色でＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化したプルダウンアッセイの結果；及び（ｂ）ＰＳＡのウェスタンブロットを示す。
【図１７】図１７は、ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドの血清安定性アッセイを示し、ヒト血清とインキュベートしたＰＳＡ捕捉剤トリリガンドのＨＰＬＣ分析により示される。
【図１８】図１８は、ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドの長期安定性アッセイを示し、室温（ＲＴ）又は−８０℃でそれぞれ３週間及び６週間、凍結乾燥粉末として保存された。
【図１９】図１９は、ＰＳＡ捕捉剤により強化されたＰＳＡの酵素活性アッセイを示し；（ａ）ＰＳＡアンカーリガンド；（ｂ）ＰＳＡ捕捉剤バイリガンド；及び（ｃ）ネガティブコントロール塩化亜鉛を示す。
【図２０】図２０は、ビオチン化ＰＳＡ捕捉剤のスキャッチャードプロットを示；（ａ）ＰＳＡ捕捉剤リガンド；及び（ｂ）解離定数（ＫＤ）の決定を示す。
【図２１】図２１は、ＰＳＡ捕捉剤の位置異性体のドットブロットアッセイを示す。ＰＳＡ捕捉剤１、４Ｔｚ−バイリガンド及び１、５Ｔｚ−バイリガンドはトリアゾール位置異性体でのみ異なる。ＰＳＡ捕捉剤１、５Ｔｚ−バイリガンドは、１、４Ｔｚ−バイリガンドよりもより低い検出限界を与える（それぞれ、０．１４μｇＰＳＡ及び０．２８μｇＰＳＡ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ここで、高親和性、特異性で１つ又は複数のターゲットタンパク質を特異的に結合する、タンパク質−触媒捕捉（ＰＣＣ）剤（「捕捉剤」）が提供され、同様に、これらの捕捉剤を製造し、スクリーニングする方法、ターゲットタンパク質の識別、検出及び／又は分離においてこれらの捕捉剤の使用の方法、これらの捕捉剤の、種々の症状の診断、分類及び／又は治療において使用する方法が提供される。ある実施態様では、前記ターゲットタンパク質は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。
【００１８】
ここで使用される用語「捕捉剤」とは、１つ又は複数のターゲット−結合部分を含み、これはそれらのターゲット−結合部分を介してターゲット−タンパク質と特異的に結合する組成物を意味する。それぞれのターゲット−結合部分は、前記ターゲットタンパク質に対して結合親和性を、個々に、又は他のターゲット−結合部分と組み合わせたいずれかで示す。ある実施態様では、それぞれのターゲット−結合部分は、ターゲットタンパク質に、１つ又は複数の非−共有相互作用を介して結合し、例えば水素結合、疎水性相互作用及びファンデルワールス相互作用などである。捕捉剤は、１つ又は複数の有機分子を含み、これは例えばポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド及びその他の非−ポリマー性分子を含む。
【００１９】
ある実施態様では、ターゲット−結合部分は１つ又は複数のポリペプチド又はペプチドを含む。これらの実施態様では、ターゲット−結合部分は、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸及び／又は、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アジド、置換及び非置換アルキニル、置換及び非置換ビオチニル、置換及び非置換アジドアルキル、置換及び非置換ポリエチレングリコールイル及び置換及び非置換二置換−１、２、３−トリアゾールからなる群から選択される官能基で置換されるアミノ酸を含む１つ又は複数のペプチドを含む。
【００２０】
ここで使用される用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、ここで交互に、アミノ酸残基のポリマーを含むアミノ酸配列を意味する。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然由来アミノ酸の人工的化学合成物であるアミノ酸ポリマーにも適用され、同じく天然由来のアミノ酸ポリマー及び非天然由来のアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００２１】
用語「アミノ酸」とは、天然由来及び合成アミノ酸、同じくアミノ酸類似物及びアミノ酸模倣物であって天然由来アミノ酸と類似の方法で機能するもの、およびそれらの異性体を意味する。天然由来のアミノ酸は、遺伝子コードで暗号化され、同様に、例えばヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリンなどの後に変化したもの及びそれらの異性体である。用語「アミノ酸類似体」とは、天然由来のアミノ酸と同じ基本化学構造を持つ化合物を意味し、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基を持つ炭素を持つ化合物であり、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどである。かかる類似体は、変性されたＲ基（例えばノルロイシン）又は変性ペプチド鎖を持つが、なお天然由来のアミノ酸と同じ基本的化学構造を維持する。用語「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を持つが、機能的には天然由来のアミノ酸と類似する、化合物を意味する。アミノ酸は、ここでは、共通して知られている３文字記号で、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会による１文字記号のいずれかで参照される。
【００２２】
２つのターゲット−結合部分を持つ捕捉剤は、ここでは捕捉剤バイリガンドとして参照される。前記捕捉剤が捕捉剤バイリガンドであるこれらの実施態様では、前記第１のターゲット−結合部分は、アンカーリガンドと参照され、前記第２のターゲット−結合部分は第２リガンドとして参照される。ある実施態様では、前記アンカーリガンド及び第２リガンドは共有結合で結合され、これには例えば以下示されるようにアミド結合又は１、４−又は１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール結合が含まれる：
【００２３】
【化３】
2014506883.tif 000004
１、４−二置換−１、２、３−トリアゾール結合
【００２４】
【化４】
2014506883.tif 000005
１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール結合
前記アンカーリガンド及び第２リガンドが、他と、１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール結合を介して結合される場合には、前記１、５−二置換−１、２、３−トリアゾールは、ルテニウム触媒を用いて単一化学反応で合成され得る。例えば、前記１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール結合は、ルテニウム−触媒アジド／アルキン環化付加反応（ＲｕＡＡＣ）を用いて形成され得る（図１１に示される）。前記アンカーリガンド及び第２リガンドが、他と、１、４−二置換−１、２、３−トリアゾール結合を介して結合される場合には、前記１、４−二置換−１、２、３−トリアゾールは、Ｃｕ−触媒アジド／アルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）を用いて形成され得る。１、４−及び１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール位置異性体を導き及び／又は選択的生成のために複数の化学反応を要する他のプロセスも使用され得る。
【００２５】
ある実施態様では、前記アンカー及び第２リガンドは、お互いに、以下の構造を持つＴｚ５又はＴｚ４結合により結合される。
【００２６】
【化５】
2014506883.tif 000006
Ｔｚ４
【００２７】
【化６】
2014506883.tif 000007
Ｔｚ５
３つのターゲット−結合部分を持つ捕捉剤は、捕捉剤トリリガンドとしてここで参照される。ここで提供される捕捉剤トリリガンドのある実施態様では、捕捉剤トリリガンドは、第３のターゲット−結合部分に結合される捕捉剤バイリガンドを含み、好ましくは前記捕捉剤バイリガンドの前記第２リガンドで結合される。この実施態様では、前記第３のターゲット−結合部分は、第３リガンドと参照される。ある実施態様では、前記第３リガンドが、前記バイリガンドと共有結合で結合され、これらのある実施態様では、前記第３リガンドと前記捕捉剤バイリガンドはお互いにＴｚ４又はＴｚ５結合で結合される。
【００２８】
１又は複数の前記アンカーリガンド、第２及び第３リガンドがお互いにアミド結合で結合される実施態様では、前記アミド結合は、結合剤（例えば、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、又はＤＭＦ中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ））の存在下でカルボキシル基とアミン基により形成され得る。
【００２９】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、ある範囲の反応条件及び／又は保存期間若しくは条件にわたり安定である。ここで使用される「安定」な捕捉剤は、特異的にターゲットタンパク質へ結合する能力を維持するものである。ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、１又は複数の反応及び／又は保存条件下で、同じターゲットタンパク質へ結合する抗体よりもより安定である。例えば、ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、同じターゲットタンパク質に結合する抗体よりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。
【００３０】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、６ヶ月以上の保存期間を持ち、これは６ヶ月よりも長い保存に対して安定であることを意味する。これらの実施態様のある実施態様では、前記捕捉剤は、１年以上、２年以上又は３年よりも長い保存期間を持つ。これらの実施態様のある実施態様では、前記捕捉剤は凍結乾燥粉末として保存される。ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、同じターゲットタンパク質へ結合する抗体よりも長い保存期間を持つ。
【００３１】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、−８０℃から約１２０℃の範囲の温度で安定である。ある実施態様では、前記捕捉剤は、−８０℃から−４０℃；−４０℃から−２０℃；−２０℃から０℃；０℃から２０℃；２０℃から４０℃；４０℃から６０℃；６０℃から８０℃；及び／又は８０℃から１２０℃で安定である。ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、同じターゲットタンパク質に結合する抗体よりも広い範囲の温度にわたり安定であり、及び／又は前記同じターゲットタンパク質に結合する抗体よりも特定の温度でより長い時間安定である。
【００３２】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、ｐＨが約３．０から約８．０で安定である。ある実施態様では、範囲は約７．０から約８．０である。
【００３３】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、１２時間を超えてヒト血清中で安定である。このある実施態様では、前記捕捉剤は、ヒト血清中で、１８時間、２４時間、３６時間又は４８時間を超えて安定である。ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、同じターゲットタンパク質に結合する抗体よりもヒト血清中でより長い時間安定である。
【００３４】
ここで使用される用語「抗体」とは、抗原刺激後の活性化されたＢ細胞により産生され、前記抗原に特異的に結合でき生物系での免疫応答を促進するタンパク質の種類を意味する。完全抗体は通常、４つのサブユニットからなり、２つの重鎖と２つの軽鎖を持つ。前記抗体は天然及び合成抗体を含み、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はそれらの断片を含む。例示抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭなどを含む。断片の例は、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２などである。モノクローナル抗体は、「エピトープ」と用語される他の生体分子の単一の特異的空間的及び極性組織に結合する抗体であり、それにより相補的であるとされる。ある形では、モノクローナル抗体はまた、同じ構造を持ち得る。ポリクローナル抗体は、異なるモノクローナル抗体の混合物を意味する。ある形では、ポリクローナル抗体は、異なる抗原性エピトープに結合するモノクローナル抗体の少なくとも２つのモノクローナル抗体の混合物であり得る。異なる抗原性エピトープは、同じターゲット上、異なるターゲット上又は組み合わせたものの上にあり得る。抗体は、当該技術でよく知られた技術で調製され、例えばホストへの免疫化及び血清回収により又は連続的なハイブリドーマ細胞株調製と分泌タンパク質（モノクローナル抗体）回収による。
【００３５】
ここで提供される捕捉剤のある実施態様では、ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ（「ＰＳＡ−Ｔｚ５ＢＬ１」、図３（ｂ）；ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（配列番号１）−Ｔｚ５−（配列番号２）及びビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ｔｚ４−Ｇｌｌｆｆｋ「ＰＳＡ−Ｔｚ４ＢＬ１」、図３（ｄ）；ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（配列番号１）−Ｔｚ４−（配列番号１）からなる群から選択されるＰＳＡ捕捉剤バイリガンドであり、ここでＰＥＧ５は、−（ＮＨ−（Ｃ２Ｈ４−Ｏ−）５−Ｃ（Ｏ））−を表す。
【００３６】
ここで提供される捕捉剤のある実施態様では、ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ｔｚ５−Ｇｌｌｆｆｋ−ｒｒｉｖｋ（「ＰＳＡ−Ｔｚ５ＴＬ１」、図３（ｃ）；ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（配列番号１）−Ｔｚ５−（配列番号２）−Ｔｚ５−（配列番号３）及びビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ｔｚ４−Ｇｌｌｆｆｋ−Ｔｚ４−ｆｗｗｇｇ「ＰＳＡ−Ｔｚ４ＴＬ１」、図３（ｅ）；ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（配列番号１）−Ｔｚ４−（配列番号２）−Ｔｚ４−（配列番号４）からなる群から選択されるＰＳＡ捕捉剤バイリガンドである。
【００３７】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤の合成方法が提供される。ある実施態様では、これらの方法は：
（ａ）ターゲット−結合部分の合成ブロックを製造し、前記合成ブロックがターゲット−結合部分を持ち、及び他の合成ブロックと望ましい結合を形成し得る少なくとも１つの反応性基を持ち、ここで：（ｉ）前記結合は、アミド結合、１、４−二置換１、２、３−トリアゾール結合及び１、５−二置換１、２、４−トリアゾール結合からなる群から選択され；及び（ｉｉ）前記ターゲット−結合部分の他の全ての官能基が、望ましくない反応を防止するために保護され；及び
（ｂ）前記ターゲット−結合部分の合成ブロックを結合させて前記捕捉剤を与えることを含む。
【００３８】
ある実施態様では、前記捕捉剤は１又は複数のＴｚ４及び／又はＴｚ５結合を含む。Ｔｚ４及びＴｚ５結合は、アミド結合及び二置換１、２、３−トリアゾール結合を含むことから、前記Ｔｚ４又はＴｚ５結合捕捉剤の合成ブロックは、アミド結合の形成又は触媒アジド／アルキン環化付加反応により結合され得る。
【００３９】
ある実施態様では、捕捉剤はさらに望ましい化学的又は生物的活性を得るために変性され得る。望ましい化学的又は生物的活性の例は、限定されるものではないが、改善された溶解性、安定性、生物学的利用可能性、検出可能性又は反応性を含む。捕捉剤に導入され得る具体的な変性の例は、限定されるものではないが、ジスルフィド結合形成による捕捉剤の環化；他の官能基又は分子による前記捕捉剤の変性である。同様に捕捉剤は、標準的でないか生物的でないタンパク質のエピトープに結合するように合成することができ、従って、その利用性を向上させることとなる。ある実施態様では、前記捕捉剤は、前記結合反応の前に前記ターゲット−結合部分の合成ブロックを変性することで変性させ得る。
【００４０】
ここでまた、ターゲット−結合部分のためのスクリーニング方法及び／又はこれらのターゲット−結合部分を含む捕捉剤の製造方法が提供される。これらのある実施態様では、前記スクリーニング／製造方法は、次のステップ：
（ａ）前記ターゲットタンパク質のためのアンカーリガンドを選択するための、第１の複数の候補ペプチドを製造するステップ；
（ｂ）前記ターゲットタンパク質を前記第１の複数の候補ペプチドと接触させるステップ；
（ｃ）前記アンカーリガンドとして、前記ターゲットタンパク質に対する親和性を持つ候補ペプチドを選択するステップ；
（ｄ）前記アンカーリガンドを配列決定するステップ；
（ｅ）前記アンカーリガンドとアジド基又はアルキン基を含むアンカーリガンド選択ブロックを製造するステップ；
（ｆ）前記ターゲットタンパク質のための第２リガンドを選択するために第２の複数の候補ペプチドを製造するステップを含み、ここで前記第２の複数のペプチドは、前記アンカーリガンド選択ブロックがアルキン基及びアジド基をそれぞれ持つ場合には、アジド基又はアルキン基を含み；
（ｇ）前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第２の複数のペプチドを前記ターゲットタンパク質と接触させるステップ；
（ｈ）前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第２リガンドとの間に二置換１、２、３−トリアゾール結合を形成することで捕捉剤バイリガンドを与えるステップを含み、ここで前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第２リガンドの前記アジド基及びアルキン基は、前記ターゲットタンパク質への結合により緊密位置とされ；
（ｉ）前記ターゲットとの親和性を持つ前記捕捉剤バイリガンドを選択するステップ；
（ｊ）前記第２リガンドの配列を決定するステップ；及び
（ｋ）アジド基又はアルキン基を含むバイリガンド選択ブロックを製造するステップ；及びステップ（ｆ）から（ｋ）を、前記ターゲットタンパク質への望ましい結合親和性を持つ捕捉剤がスクリーニングされるまで繰り返すステップ、を含む。
【００４１】
前記スクリーニング工程の１また複数のステップは、１又は複数のリガンドが知られている場合には省略され得る。
【００４２】
ある実施態様では、前記第１及び／又は第２の選択のための複数の候補ペプチドは「１ビーズ１化合物」（ＯＢＯＣ）ペプチドライブラリーであり、前記ペプチドは、５から７のＤ−アミノ酸残基を持ち、そのＮ末端でＤ−プロパルギルグリシンと結合されている。
【００４３】
ここで提供されるスクリーニング及び製造方法において、前記方法は知られるアンカーリガンドを利用することができる。この実施態様では、アンカーリガンドスクリーニングのステップが省略され得る。例えば、前記スクリーニングプロセスで使用されるアンカーリガンドは、ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）（ビオチン−ＰＥＧ−シクロ（配列番号１））である。
この実施態様では、アジド−変性アンカーリガンド選択ブロックは、ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ａｚを意味し、ここでＡｚは、アジド基を含む変性アミノ酸を表す（例えば、Ａｚ４とは、Ｌ−アジドリジンを表す）。これらの実施態様では、前記スクリーニング／製造方法は、次のステップ：
（ａ）ＰＳＡを、ビオチン−ＰＥＧ５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ａｚ４（「アジド−変性ＰＳＡ捕捉剤アンカーリガンド選択ブロック（Ｉ））と接触させてＰＳＡ−アンカー複合体を与えるステップ；
（ｂ）前記ＰＳＡ−アンカー複合体を、第２リガンドを選択するための第１の複数の候補ペプチドと接触させるステップであり、前記ペプチドはそのＮ末端でＤ−プロパルギルグリシンと結合されている；
（ｃ）前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第２リガンドとの間に１、５−二置換−１、２、３−トリアゾール結合を形成することでＰＳＡ捕捉剤バイリガンドを与えるステップであり、ここで、前記アンカーリガンド選択ブロックと前記第２リガンドを前記アジド及びアルキン基が、前記ターゲットタンパク質に結合することで緊密位置にもたらされ、前記ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドで変性されたビーズを与え；
（ｄ）前記ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドで変性された前記ビースを選択するステップ；
（ｅ）前記ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドで変性された前記ビーズから前記ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドを除去するステップ；
（ｆ）前記ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドの前記ＰＳＡ捕捉剤第２リガンドの配列決定するステップ；
（ｇ）ビオチン−ＰＥＧ５−サイクル（（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−ＰＳＡ第リガンド−Ａｚ４（「アジド−変性捕捉剤バイリガンド選択ブロック（Ｉ）」）を製造するステップ；及び
（ｈ）上のステップを、前記性質を持つＰＳＡ捕捉剤が識別されるまで、繰り返すステップ、を含む。
【００４４】
さらにここで、ここで適用される捕捉剤を用いてＰＳＡ濃度の変化に伴う前立腺癌又は他の疾患を診断及び／又は段階化する方法が適用される。これらの実施態様では、前記方法は、
（ａ）対象体から生体サンプルを得るステップ；
（ｂ）前記ＰＳＡ捕捉剤で、前記サンプル中のＰＳＡの存在又は不存在を測定するステップ；
（ｃ）前記ＰＳＡ濃度を、ＰＳＡの既定のコントロール範囲と比較するステップ；及び
（ｄ）前記生体サンプル及び前記既定のコントロールとの間の差に基づいて、前立腺癌又は前立腺障害を診断するステップ、を含む。
【００４５】
ある実施態様では、ここで提供される捕捉剤は、１つ又は複数の検出ラベルを含み、例えばビオチン、銅−１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７、１０−四酢酸（銅−ＤＯＴＡ）、又は、ガンマ線、プロトン、中性子、陽電子、トリチウム放射を含む放射活性生成物、又はとりわけ他の方法で検出され得るカバータグ（即ちガドリニウム）を含む。
【００４６】
捕捉剤系タンパク質アッセイは、捕捉剤の合成において非常に高い再現性を持つ。
【００４７】
ここで提供される方法で使用される生体サンプルは、器官、組織、体液及び細胞からなる群から選択され得る。他の側面では、前記体液は、血液、血清、血漿、尿、痰、唾液、便、髄液、脳脊髄液、リンパ液、皮膚の分泌物、気道分泌物、腸分泌物、尿生殖路分泌物、涙、およびミルクからなる群から選択される。他の側面では、前記生体サンプルは血液サンプルである。
【００４８】
ここでまた、ここで開示される捕捉剤の１つ又は複数を投与することでＰＳＡ濃度の増加に伴う前立腺癌又は症状の治療のための方法が提供される。これらのある実施態様では、捕捉剤は、１つ又は複数の追加の治療剤であって、例えば化学療法剤に結合され得る。
【００４９】
ある実施態様では、ここで開示された１つ又は複数の捕捉剤を含むキットが提供される。ある実施態様では、これらのキットは、ＰＳＡ検出及び／又は定量のために使用され、これらのある実施態様では、前記キットは、ＰＳＡ濃度の変化に伴う前立腺癌又は他の障害を診断及び／又は段階化するために使用され得る。ある実施態様では、ここで提供されるキットは：（ａ）吸着材を含む基材を含み、前記吸着材はＰＳＡを結合するために好適であり、及び（ｂ）洗浄液又は洗浄液を作るための装置を含み、前記吸着材と洗浄液の組み合わせでＰＳＡ検出を可能にする。他の実施態様では、ここで提供されるキットは、増加ＰＳＡ濃度に伴う前立腺癌又は症状の治療の際に使用される。
【００５０】
ある実施態様では、ここで提供されるキットはさらに、ラベル又は別の挿入物の形で、好適な走査パラメータについての指示を含み得る。例えば、前記キットは、消費者／キット使用者に、血清のサンプル又は他の組織サンプルを前記プローブに接触させた後の洗浄方法について情報を与える標準指示を含み得る。
【００５１】
他の実施態様では、ここで提供されるキットは（ａ）特異的にＰＳＡに結合するＰＳＡ捕捉剤；及び（ｂ）検出試薬を含む。かかるキットは、ここで記載された材料で製造され得る。
【００５２】
ここで提供されるキットは場合により、標準又はコントロール情報及び／又は材料のコントロール量を含み、試験サンプルが、前記コントロール情報標準及び／又はコントロール量と比較して、サンプル中で検出されたＰＳＡの試験量が、前立腺癌又はその他の前立腺症状と整合する診断量であるかどうかを決定することを可能にする。
【００５３】
以下実施例は、特許請求された発明をよりよく説明するために与えられたものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。具体的な材料の記載は、これは発明を説明するものであり、限定するものではない。当業者であれば、本発明の内容を実施することなく本発明に範囲から離れることなく均等な手段又は試薬を開発することが可能である。
【００５４】
実施例
実施例１：ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドのスクリーニング及び製造：
試薬。
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｘ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）（Ｃ＝Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ、ペンタメチルジヒドロネンゾフラン−５−スルホニル）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）（Ｔｒｔ、トリチル）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（ｔＢｕ、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、ＯＬｅ。Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ）（Ａｎａｓｐｅｃ；  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。アミノ酸カップリング反応は、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、９９％）中で、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−フォスフェート（ＡＡＰＰＴＥＣ）及びＮ、Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）で実施した。Ｎα−Ｆｍｏｃ保護基の除去のためには、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン溶液を使用した。前記ペプチドライブラリーの最終脱保護基には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、最小９８％、滴定）及びトリエチルシラン（ＴＥＳ）を使用した。全ての溶媒及び試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）から入手した。
【００５５】
ペプチドライブラリーの構築
ペンタ−からヘプタペプチド（５〜７）の無作為ＯＢＯＣライブラリーは、自動合成装置、Ｔｉｔａｎ３５７（ＡＡＰＰＴＥＣ）を用いて、ポリエチレングリコール−グラフトポリスチレンビーズ（ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ２、９０μｍ、０．２９ｍｍｏｌ／ｇ、２．８６ｘ１０６ビーズ／ｇ）に標準スプリット−ミックス方法により合成した。通常のライブライリー構築で、非天然−Ｄ−立体異性体を前記ペプチド配列でのそれぞれの位置に使用した。前記カップリングステップでは、Ｆｍｏｃ化学を標準固相ペプチド合成方法に適用した。樹脂は、収集容器（ＣＶ）内でＮＭＰで２時間膨潤させた。Ｆｍｏｃ−メチオニンのカップリングは、０．１７当量のＨＡＴＵ（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロフォスフェート；ＣｈｅｍＰｅｐ）と２当量のＤＩＥＡの添加により開始させた。前記カップリング反応は３０分間行った。カップリング反応に次いで、前記ビーズを完全に洗浄（４ｘＮＭＰ）し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンで処理した（１５分間、その後新しい脱イオン水で洗浄）。樹脂を完全に洗浄（４ｘＮＭＰ、４ｘＤＣＭ）し、次のカップリングサイクルのためにいくつかの等量区分に分けて反応容器（ＲＶ）へ入れた。前記カップリング及びＦｍｏｃ脱保護基反応が完了して、前記樹脂は収集容器内で一緒にされた。前記手順は、望ましい長さのペプチドが得られるまで繰り返された。前記アミノ酸側鎖保護基は次に、トリフルオロ酢酸（９４％）、水（３％）及びトリイソプロピルシラン（３％）で２時間インキュベートすることで除去された。前記ライブラリー樹脂は、ジクロロメタン（ＤＣＭ；５ｘ）、メタノール（ＭｅＯＨ；５ｘ）、水（５ｘ）、ＭｅＯＨ（５ｘ）、ＤＣＭ（５ｘ）及びジエチルエーテル（５ｘ）で完全に洗浄した。得られた樹脂は、真空乾燥し、４℃で保存した。
【００５６】
選択はインシチュクリック化学技術で行い、前記ターゲットタンパク質がアジドをアルキン候補リガンドに共役させる触媒として作用する。スクリーニングのために、Ｎ末端にＤ−プロパルギルグリシンで結合されたＯＢＯＣライブラリーの２００ｍｇ部分を、８−ｍＬ容量Ａｌｌｔｅｃｈ容器内に移動し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．０５％ＮａＮ３、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡからなるブロッキング溶液で、１時間、２５℃で３６０°回転装置上でプレインキュベーションした。別に、ブロッキング溶液中に希釈した５０ｎＭのヒトＰＳＡ（遊離ＰＳＡ、Ｓｃｒｉｐｓ研究所＃Ｐ０７２５）の３ｍＬを、Ｌ−アジドリジン−変性アンカーリガンドビオチン−（ＰＥＧ）５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ａｚ４（ビオチン−（ＰＥＧ）５−シクロ（配列番号１）−Ａｚ４；ＰＥＧ＝５ｘポリエチレングリコール、Ａｚ４＝Ｌ−アジドリジン）（Ｗｕ  ２０００）と、２時間、２５℃で３６０°回転装置上でプレインキュベーションした。前記アンカーリガンドを、前記タンパク質の２０００倍過剰量で供給した。前記ＯＢＯＣライブラリーから前記ブロッキング溶液を捨てた後、前記５０ｎＭ遊離ＰＳＡ及びアンカーリガンドのプレインキュベーション溶液を前記ライブラリーに添加し、４時間２５℃で３６０°回転装置上でインキュベーションした（図１）。スクリーニング物を３ｘ５ｍＬのブロッキング溶液で洗浄し、及び３ｍＬの０．１μｇ／ｍＬの抗−ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体（ＰＳ６、Ａｂｅａｍ）を添加した。２５℃での１時間インキュベーション後、前記スクリーニング物を５ｘ３ｍＬのブロッキング溶液で洗浄した。次に、ＰＳＡの検出のためのＰＳ６モノクローナル抗体とペアを作る捕捉剤バイリガンド選択のために、３ｍＬの１：２５０００抗−マウスＩｇＧ  ＡＰ−結合抗体（＃７０５６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を前記スクリーニング物に提示して１時間２５℃でインキュベーションした。非特異的結合タンパク質を除去するために、前記スクリーニング物を５ｘ３ｍＬのブロッキング溶液、５ｘ３ｍＬの洗浄１緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、続いて５ｘ３ｍＬの洗浄２緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、真空で吸引除去した。ＢＣＩＰ：ＮＢＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｓ３７７１）、新たに調製したアルカリフォスファターゼ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）が、前記スクリーニング物を現像するために使用した。最も強く着色した紫色ビーズ（「イニシャルヒット」）を手動で選択した。選択されたビーズを、７．５Ｍグアニン塩酸（ｐＨ２．０）で脱色して、結合タンパク質及び抗体を除去し、続いてＮＭＰで処理した。
【００５７】
次に、選択されたビーズとブロッキング溶液でプレインキュベートしてスクリーニングの第２段階のために準備した。前記選択されたビーズからブロッキング溶液を捨ててから、３ｍＬの１：１００００ＡＰ−結合ストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と４５分間２５℃でインキュベートした。ＡＰ−結合ストレプトアビジンはビオチンラベルを含むビーズを識別し、それによりＰＳＡ−テンプレートインシチュクリックバイリガンド共役の生成物を識別した。非特異的結合タンパク質を除去するために、前記スクリーニング物を５ｘ３ｍＬブロッキング溶液、５ｘ３ｍＬ洗浄１緩衝液、次いで５ｘ３ｍＬ洗浄２緩衝液で洗浄し、真空吸引除去した。アルカリフォスファターゼ緩衝液中で新たに調製したＢＣＩＰ：ＮＢＴを前記スクリーニング物を現像するために使用した。最も強く着色したビーズ（「プロダクトヒット」）を手動で選択した。選択されたビーズは、７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ２．０）で脱色して結合タンパク質を除去した。脱色の後ＮＭＰで処理した。イニシアルスクリーニング及びプロダクトスクリーニング両方の後、抗−スクリーニングを別に実施して、スクリーニング物を可視化するために使用される試薬への非特異的結合を示したビーズを除去した。この際調節に続いて、オーセンティックヒットの配列決定を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ及び半自動アルゴリズムを用いて行った（Ｌｅｅ  ２０１０）。
【００５８】
前記インシチュクリック化学スクリーニングの際に形成されるバイリガンドのトリアゾールの異性体（１、４−対１、５−）を決定するために、１、４−及び１、５−置換−１、２、３−トリアゾールを含むバイリガンドをそれぞれ合成した（実施例２）。生物アッセイを、より高い親和性及び選択性を持つバイリガンドを決定するために実施した（実施例３から９）。質量スペクトル分析（例えば、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ／ＴＯＦ、ＬＣ／ＭＳなど）をさらに、好ましいトリアゾール置換体を確認するために行った。
【００５９】
インシチュクリックスクリーニングによる捕捉剤トリリガンドの選択
スクリーニングのために、Ｎ末端にＤ−プロパルギルグリシンで結合されたＯＢＯＣライブラリーの２００ｍｇ部分を、８−ｍＬ容量Ａｌｌｔｅｃｈ容器内に移動し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．０５％ＮａＮ３、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡからなるブロッキング溶液で、１時間、２５℃で３６０°回転装置上でプレインキュベーションした。別に、ブロッキング溶液で希釈された１０ｎＭ遊離ＰＳＡの３ｍＬを、Ｌ−アジドリジン−変性捕捉剤バイリガンドビオチン−（ＰＥＧ）５−シクロＴｚ（１、５）−Ｇｌｌｆｆｋ−Ａｚ４［ビオチン−（ＰＥＧ）５−シクロ（配列１）−Ｔｚ（１、５）−配列２−Ａｚ４；Ｔｚ（１、５）＝二置換１、２、３−トリアゾール］と、２時間２５℃で、３６０°回転装置上でプレインキュベートした。捕捉剤バイリガンドは、タンパク質の５０００倍過剰で供給された。ＯＢＯＣライブラリーからブロッキング溶液を除去した後、前記１０ｎＭ遊離ＰＳＡと捕捉剤バイリガンドとのプレインキュベート溶液をライブラリー樹脂へ添加して、４時間２５°で３６０°回転装置上でインキュベートした。抗−ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体（ＰＳ６）と抗−マウスＩｇＧＡＰ−抗体でプロービングして、記載されたようにイニシアルヒットが選択された。記載差されたように、ＡＰ−結合ストレプトアビジンで第２回スクリーニングが実施された。抗−スクリーニングもまた別に実施された。これらの調節に続いて、オーセンティックヒットの配列決定を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ／ＴＯＦ及び半自動アルゴリズムを用いて行った（Ｌｅｅ  ２０００）。
【００６０】
インシチュクリック化学で形成されるトリアゾールの異性体（１、４−対１、５−）の決定のために、１、４−置換−１、２、３−トリアゾールを含むトリリガンドをそれぞれ合成した（実施例２参照）。生物アッセイを実施して、より高い親和性と選択性を持つトリリガンドを決定した（実施例３から９）。質量スペクトル分析（例えば、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ／ＴＯＦ、ＬＣ／ＭＳなど）がさらに、好ましいトリアゾール置換を確認するために実施された。
【００６１】
アンカーリガンド、バイリガンド及びトリリガンド、ビオチン−（ＰＥＧ）５−シクロ（ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ）−Ｔｚ（１、５）−Ｇｌｌｆｆｋ−Ｔｚ（１、５）−ｒｒｉｖｋ、（ビオチン−（ＰＥＧ）５−シクロ（配列１）−Ｔｚ（１、５）−配列２−Ｔｚ（１、５）−配列３、の構造は図３に示される。
【００６２】
単一ビーズからペプチドのＣＮＢｒ開裂
単一ビーズを純粋を含むミクロ遠心チューブに移した（１０μｌ）。ＣＮＢｒ（０．２ＮのＨＣｌ溶液中の０．５０Ｍ、１０μＬ）添加後、反応容器をアルゴンで１５分間パージして、１分間電子レンジ内に置く（Ｌｅｅ  ２０００）。さらに２５分間アルゴンでパージして、得られる溶液を、１０分間４５℃、次いで６０℃で５０分間遠心真空下して濃縮した。
【００６３】
単一ビーズから開裂したペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析
それぞれのチューブに、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸ＣＨＣＡを添加した（１０μＬ、アセトニトリル／水（７０：３０）中の０．５％マトリクス溶液）、及びアセトニトリル／水（１０μＬ、０．１％トリフルオロ酢酸（体積／体積）含有７０：３０）。前記混合溶液の２μＬを取り出して、３８４ウェルＭＡＬＤＩプレート上にスポットし、これを自然乾燥させるために約１５分間放置した。
【００６４】
実施例２：ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドの大量合成：
前記インシチュクリック化学手順から前記ＰＳＡトリリガンドを選択した後、さらなる生体評価のために材料の大量合成が必要である。まとめると、前記それぞれのペプチドリガンド（図４）は、ＡＡＰＰＴＥＣ  Ｔｉｔａｎ３５７合成装置で、Ｆｍｏｃ系固相ペプチド合成を用いて２−クロロトリチル塩化物（ＣＴＣ）樹脂上で製造された。それぞれのアミノ酸カップリング反応は、４当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、３．９当量のＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾチトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフロロ−フォソフェート）及び１０当量のＤＩＥＡを取り込んだ。Ｆｍｏｃ基の脱保護基には２０％ピペリジン／ＮＭＰを要した。ビオチン、ＰＥＧ−鎖（ｎ＝５）及び１、５−トリアゾールリンカーは、樹枝上の前記ペプチド断片の手動でカップリングさせた。前記ペプチドは、側鎖保護基は変化させることなく、樹脂から開裂させ［ジクロロメタン／トリフロロエタノール／酢酸（７：３：１）］、望ましくない副反応や副生成物がなく、続くバイリガンド及びトリリガンドの効果的な合成を保証した。
【００６５】
図５に示されるように、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ条件下で前記ビオチン−ＰＥＧ−ＰＳＡアンカーのＣ末端カルボン酸の活性化は、第２リガンド（１、５−Ｔｚ−Ｇｌｌｆｆｋ）のＮ末端へカップリングさせることを可能にした。この反応からの粗生成物は図６に示される次のステップに移された。再び、ＰＳＡバイリガンドのＣ末端のＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ活性化が、第３リガンド（１、５−Ｔｚ−ｒｒｉｖｋ）とのカップリングのために適用された。全体の側鎖脱保護基、ジスルフィド形成及び精製（図７）により、最終ＰＳＡトリリガンドが得られ、さらなる評価し使用される。
【００６６】
１、５−トリアゾールリンカーの製造は図８から１１に記載される。
【００６７】
１、４−トリアゾールリンカーの製造は図１２に示される。
【００６８】
ＰＳＡトリリガンド合成の実験手順
ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いた標準固相メリフィールドペプチド合成により合成された。Ｆｍｏｃ−Ｌ−アジゾリジンｔ−ブチルエステル及びＢｏｃ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨを含む二置換１、２、３−トリアゾールリンカーが、上で説明したように、Ｒｕ−触媒アジド−アルキン環化付加反応（ＲｕＡＡＣ）で合成された。
【００６９】
ＰＳＡ捕捉剤トリアゾール断片の合成。
【００７０】
側鎖保護アンカーリガンド、第２リガンド及び第３リガンド（図３）は、ＡＡＰＰＴＥＣ  Ｔｉｔａｎ３５７合成装置で、Ｆｍｏｃ系固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて合成された。それぞれのカップリング反応では、４当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、３．９当量のＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−フォスフェート）、及び１０当量のＤＩＥＡが取り込まれた。ビオチン、ＰＥＧ−鎖（ｎ＝５）及び１、５−トリアゾールリンカーは、前記ペプチド断片に手動でカップリングさせた。
【００７１】
試薬（略語）
Ｆｍｏｃ＝フルオレン−９−イルメトキシカルボニル、Ｐｂｆ＝ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル、Ｔｒｔ＝トリチル、ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル、Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、Ｂｎ＝ベンジル、ＨＡＴＵ＝（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルアンモニウムヘキサフロロフォスフェート（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、  ＣＡ）、ＨＯＡｔ＝（７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、  ＣＡ）、ＤＭＦ＝ジメチルホルミアミド、ＤＩＥＡ＝Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、ＴＥＳ＝トリエチルシラン。全ての溶媒及び試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）から購入した。
【００７２】
側鎖保護ＰＳＡＴｚ５−バイリガンドの合成（図５）：
０℃の氷冷浴中で冷却されたＤＭＦ中のビオチン−ＰＲＧ５−（保護）ＰＳＡアンカーの２０ｍＭ溶液中に、１当量のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフロロフォスフェート（ＨＡＴＵ）をＤＭＦ中の０．４Ｍ溶液として添加し、続いて１当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）をＤＭＦ中０．４Ｍ溶液として添加した。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ保護第２リガンドの２０ｍＭ溶液を調製し、これを前記反応混合物中に滴下した。反応物を室温で１６時間撹拌した。カップリングしたバイリガンドをＨ２Ｏでチューブ内に沈殿させ、遠心分離した。上澄みを除去し、残る白色固体を乾燥し、そのまま次にステップで使用した。
【００７３】
側鎖保護ＰＳＡＴｚ５−トリリガンドの合成（図６）：
０℃の氷冷浴で冷却されたＤＭＦ中のビオチン−ＰＥＧ５−（保護）ＰＳＡバイリガンドの２０ｍＭ溶液に、１当量のＨＡＴＵをＤＭＦ中の０．４Ｍ溶液として添加し、次に１当量のＨＯＡｔをＤＭＦ中の０．４Ｍ溶液として添加し、次いで１当量のＤＩＥＡをＤＭＦ中０．４Ｍの溶液として添加した。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ保護第３リガンドの２０ｍＭ溶液を調整し、これを前記反応混合物中に滴下した。反応物を１６時間室温で撹拌した。カップリングしたトリリガンドはチューブ内でＨ２Ｏで沈殿させ、遠心分離した。上澄を捨てて残る白色固体を乾燥しそのまま次にステップで使用した。
【００７４】
側鎖脱保護及びＰＳＡＴｚ５−トリリガンドへのジスルフィド環化反応（図７）。
【００７５】
側鎖保護トリリガンドの粗生成物を、トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ／トリエチルシラン（９４：３：３）中に溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を真空で除去した。脱保護基されたトリリガンドはエーテルを添加して沈殿させた。遠心分離して上澄みを除去後、残る白色固体を乾燥し、次のステップに使用した。
【００７６】
脱保護基トリリガンドを最小量のＤＭＳＯに溶解し、これに、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（４：１）中の銅（ＩＩ）フェナンスロリン［Ｃｕ（ｐｈｅｎ）３］を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで、Ｃ１８カラムを用いて、１２０分で２５から４０％へのＢの直線勾配（ここでＡはＨ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡでＢはＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）を用いて半−分取ＨＰＬＣ精製を行った。
【００７７】
１、５−トリアゾールリンカーの合成
Ｂｏｃ−（Ｄ）−プロパリギルグリシンベンジルエステルの合成（図８）。
【００７８】
ジクロロメタン（２８．０ｍＬ）中のＢｏｃ−（Ｄ）−プロパルギルグリシン（２．１３ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）溶液を氷冷浴で０℃の冷却した。この溶液に、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸［ＥＤＡＣ］（２．２５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、ベンジルアルコール（２．９ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ）、次にジメチルアミノピリジン（１２５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を撹拌し、氷冷浴を室温まで戻した。３時間後、ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ、ニンヒドリン染色）にて、Ｂｏｃ−（Ｄ）−プロパルギルグリシン出発物質がないことが示された。反応物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）及びジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し（２ｘ１０ｍＬ）その後塩水で洗浄した（１０ｍＬ）。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後濃縮した。フラッシュクロマトグラフ（９：１後３：１のＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ）で望ましいベンジルエステル生成物１．９ｇ（６．３ｍｍｏｌ、６３％収率）を油状物として得た。
【００７９】
Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−アジドリジン  ｔ−ブチルエステルの合成（図９）。
【００８０】
Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−アジドリジン（２．２３ｍｇ、５．６５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２８ｍＬ）に溶解した。この溶液に、４Ａモレキュラーシーブを添加し、次にｔ−ブチル−２、２、２−トリクロロアセトイミダート（１．５２ｍＬ、８．４９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃に加熱し、２０分間撹拌し、次に追加の１．５２ｍＬ（８．４９ｍｍｏｌ）のｔ−ブチル−２、２、２−トリクロロアセトイミデートを添加した。反応物を５０℃で１６時間撹拌した。不均一溶液を０℃に冷却し、次にろ過して前記シーブと白色沈殿を除いた。冷却ジクロロメタンを用いて前記固体を洗浄した。得られた溶液を飽和炭酸水素ナトリウム及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。フラッシュクロマトグラフ（２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により、望ましいｔ−ブチルエステル誘導体１．２１ｇ（２．６９ｍｍｏｌ）を油状物として得た。
【００８１】
１、５−Ｔｚリンカーのためのルテニウム−触媒−アジド／アルキン環化付加反応（ＲｕＡＡＣ）手順（図１０）。
【００８２】
Ｂｏｃ−（Ｄ）−プロパルギルグリシンベンジルエステル（５９６ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を無水１、４−ジオキサン（３ｍＬ）にアルゴン雰囲気下で溶解した。この溶液に、クロロ（１、５−シクロオクタジエン）（ペンタメチル−シクロペンタジエニル）ルテニウム（ＩＩ）［６５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ］を添加し、反応混合物が暗赤褐色に変化した。無水１、４−ジオキサン（３ｍＬ＋２ｍＬ洗浄）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−Ｏｔ−Ｂｕ（７９８ｍｇ．１．７７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を密閉した。前記赤褐色混合物を６５℃のオイルバスで加熱し、１６時間撹拌した。（密閉容器中の溶液に加熱には注意する）。ＴＬＣ（１：１Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）では、１、５−トリアゾールを示したが、アジド出発物はなかった。反応混合物を室温に冷却し、濃縮することで暗褐色粗生成物を得、これをすぐにフラッシュクロマトグラフ（１：１、Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）で精製して、灰色がかった白色固体（１．０２ｇ、１．４ｍｍｏｌ、６８収率）を得た。
【００８３】
ベンジルエスエル脱保護基（図１１）。
【００８４】
エタノール（６．９ｍＬ）中に１、５−トリアゾールベンジルエステル（４４２ｍｇ、０．５８６ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％パラジウム／炭素（５８０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を添加し、次に１、４−シクロヘキサジエン（０．５ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１６時間撹拌し、次にセライトパッドを用いてろ過した。濾液を濃縮し、得られた粗生成油状物をフラッシュクロマトグラフ（ＤＣＭ中５％−１０％ＭｅＯＨ）で精製して灰色がかった白色固体（３５０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、９０％収率）を得た。
【００８５】
１、４−Ｔｚリンカーのための銅触媒アジド／アルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）手順（図１２）：
Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−Ｏｔ−Ｂｕ（９５０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−（Ｄ）−プロパルギルグリシン（４５１ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を９：１のＤＭＧ／Ｈ２Ｏ混合物（７ｍＬ）に溶解した。ヨウ化銅（Ｉ）（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、次にジイソプロピルエチルアミン（３６μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。アスコルビン酸ナトリウム（８７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）に溶解し、この水溶液を反応混合物に添加した。反応物を１６時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）で、１、４−トリアゾール生成物を確認し、プロパルギルグリシン出発物は残っていないことが示された。反応混合物をＥｔＯＡｃ（３５ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で希釈した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した（３ｘ１０ｍＬ）。有機層をまとめて、０．１Ｍクエン酸アンモニウム（２０ｍＬ）で洗浄し、次に塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥して濃縮し、油状固体を得た。フラッシュクロマトグラフによる精製（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ５％−１０％）で、白色残渣を得た（１．３ｇ、１．９ｍｍｏｌ、９３％収率）。
【００８６】
実施例３：合成ＰＳＡ捕捉剤と、市販ＰＳＡ抗体との比較（ＥＬＩＳＡ）：
材料と方法。
ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）マイクロタイタープレートを、ｐＨ７．４でＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬでの抗−ヒトＰＳＡ（ＰＳ６、Ａｂｅａｍ）で２時間コーティングした。それぞれのマイクロウェルをＰＢＳで洗浄後（３ｘ）、ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２５）中５％脱脂乾燥乳でで前記プレートを充填し、２時間室温でブロッキングした。ＴＢＳ中１％ＢＳＡで連続希釈した遊離ＰＳＡ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃Ｐ０７２５）を、室温で２時間、前記マイクロタイタープレート全体でインキュベートした。前記プレートをＴＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄し（５ｘ）、次にＴＢＳ中１％ＢＳＡ＋０．１％ＤＭＳＯ（体積／体積）中の２μＭビオチン化捕捉剤で室温１時間インキュベートした。全てのマイクロウェルをＴＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄（５ｘ）した後、ＴＢＳ中１％ＢＳＡの０．１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンＰｏｌｙ−ＨＲＰ共役（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）でインキュベートした。前記プレートをＴＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄（１０ｘ）後、さらにＴＢＳで洗浄し（２ｘ）、次いで、ＱｕａｎｔａＲｅｄ（商標）強化化学発光ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）を添加することで発色させた。励起波長５３５ｎｍを用いて、５９５ｎｍでの蛍光発光を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０分光光度計（Ｂｒｅａ、  ＣＡ）で、ターゲット濃度の関数として記録した。滴定曲線を、４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム  （Ｏｒｉｇｉｎ  ８．５、  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、  ＭＡ）を用いてフィッティングした。アッセイは３回繰り返した。
【００８７】
結果と議論
この結果は、合成ＰＳＡ捕捉剤は、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる市販の抗体と比較する際に検出抗体として使用され得ることを示す。好適な捕捉抗体（例えば抗−ヒトＰＳＡ（ＰＳ６））とのペアの場合、前記アッセイは、１０から２００ｎｇ／ｍＬの範囲にわたり直線性を持つ（図１３）。前記ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドは、４ｎｇ／ｍＬ遊離ＰＳＡのカットオフ濃度の範囲で定量限界（ＬＯＱ）を示したが、これは研究用モノクローナル抗体（抗−ヒトＰＳＡ（ＰＳ１）、Ａｂｅａｍ）と類似する（図１４）。ＬＯＱ又は最小の統計的に信頼性のある定量的測定は、前記アッセイシステムの感度、精度（変動）及びノイズレベルに依存する（〜２．５ｎｇ／ｍＬ）。捕捉剤トリリガンドとバイリガンドについてアッセイ間変動（％ＣＶ）は、前記研究用モノクローナル抗体と類似しており、これは遊離ＰＳＡの３ｎｇ／ｍＬの濃度に下がる。前記ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドは、前記ＰＳＡ捕捉剤バイリガンドよりも感度が強化（２倍を超える）されているが；このことは、前記タンパク質ターゲットが触媒であるインシチュクリック選択プロセスにおいてより高い特異性から予測されることである。このＰＳＡ捕捉剤ＥＬＩＳＡの分析性能特性は、この合成ＰＳＡ捕捉剤が、ヒト血清中のＰＳＡ検出において臨床的に有用である、ということを示唆した。
【００８８】
実施例４：合成ＰＳＡ捕捉剤と市販ＰＳＡ抗体との比較（ドットブロット）：
材料と方法。
ｐＨ７．４ＰＢＳ中で連続希釈された遊離ＰＳＡ（Ｓｃｒｉｏｐｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃Ｐ０７２５）をミクロピペットによりニトロセルロース膜へ適用された。前記膜を、ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２５）中の５％脱脂乾燥乳で４℃２時間ブロッキングした。前記膜をＴＢＳで洗浄した（３ｘ）。ビオチン化ＰＳＡ捕捉剤を、ＴＢＳ＋０．０３％ＤＭＳＯ（体積／体積）中０．５％乳の０．１μＬで調製して、前記膜上で４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳで洗浄（３ｘ）後、前記膜をさらに、０．０２％Ｔｗｅｎｎ２０（体積／体積）を含むＴＢＳ中の０．１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ−共役ストレプトアビジン（Ａｂｅａｍ）で４℃で３０分間処理した。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（体積／体積）を含むＴＢＳで洗浄（５ｘ）後、ＴＢＳで洗浄（２ｘ）して、前記膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏの化学発光強化及び基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、  ＩＬ）で発色させ、次いで直にＨｙＢｌｏｔ  ＣＬ  ＡＲフィルムに暴露した。
【００８９】
結果と議論
ＰＳＡ捕捉剤は、遊離ＰＳＡの２．２μｇから０．１４μｇの範囲で検出された。ＰＳＡ捕捉剤は、アンカーリガンドから、バイリガンド、トリリガンドへと親和性増加を示し、ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドについては、０．１４μｍｇの遊離ＰＳＡの検出下限であった。前記ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドは、抗−ヒトＰＳＡモノクローナル抗体（ＰＳ１）よりも優れた性能を示し、市販ＰＳＡモノクローナル抗体（ＰＳ２、ＰＳ６）よりも低感度であった。前記ＰＳＡ捕捉剤とモノクローナル抗体アッセイとの間の強度の差は、ビオチン化（１ビオチン／捕捉剤対１０ビオチン／モノクローナル抗体（平均して））での差によると考えられる。
【００９０】
ＰＳＡ捕捉剤の位置異性体（ＰＳＡ捕捉剤１、４Ｔｚ−バイリガンド及びＰＳＡ捕捉剤１、５Ｔｚ−バイリガンド）は、ＰＳＡ捕捉剤１、５Ｔｚ−バイリガンドが、ＰＳＡ捕捉剤１、４Ｔｚ−バイリガンドに比較して、改善された検出限界を持つことを示した。
【００９１】
実施例５：プルダウンアッセイ及びウェスタンブロット：
概要
プルダウンアッセイは、緩衝液又はヒト血清溶液中の前記タンパク質に結合した複合媒体から１つのタンパク質を精製する能力を測定することでＰＳＡ捕捉剤の特異性を評価した。前記ＰＳＡ捕捉剤複合体は次いで、固相親和性樹脂で前記サンプルから物理的に分離された。前記捕捉されたサンプルを、ウェスタンブロット分析にためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００９２】
材料と方法
ＰＳＡのプルダウン検出は、抗体の代わりにＰＳＡ捕捉剤を取り込んだ免疫沈降技術を修正したものを用いた。最初に、ビオチン化ＰＳＡ捕捉剤（０．３−０．５μｇ／ｍＬ）を、ＴＢＳ中の２５％ヒトＡＢ雄血清（＃ＨＳ−２０、Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ｔａｒｚａｎａ、  ＣＡ）の２ｍＬと４℃でインキュベートとした。別に、ビオチン化ＰＳＡ捕捉剤（０．３−０．５μｇ／ｍＬ）を、遊離ＰＳＡ１μｇ含むＴＢＳ中の２５％ヒトＡＢ雄血清（＃ＨＳ−２０、Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ｔａｒｚａｎａ、  ＣＡ）の２ｍＬと４℃でインキュベートとした。ビオチン化ＰＳＡ捕捉剤（０．３−０．５μｇ／ｍＬ）と２ｍＬＴＢＳ中に１μｇの遊離ＰＳＡを含む第３のサンプルを同様に４℃で一晩インキュベートした。
【００９３】
タンパク質は、ＢＳＡ−ブロック化ダイナビーズ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１２−０５Ｄ）により、４℃４時間回転させて捕捉させた（プルダウン条件ごとに５０μＬの５０％スラリー）。タンパク質をビーズから  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液により溶出させ、ビーズをＤｙｎａＭａｇ（商標）−Ｓｐｉｎ  ｍａｇｎｅｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１２３−２０Ｄ）により血清又は緩衝液から分離した。サンプルを、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離で処理し、１００Ｖで４５分間電気泳動的に、２０％（体積／体積）メタノールを含む、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．３中のニトロセルロース膜に移動させた。移動の後、ニトロセルロース膜を、ＴＢＳ中５％脱脂乾燥乳中での４℃で２時間ブロッキングした。前記膜をＴＢＳ（３ｘ）で洗浄し、ＴＢＳ中０．５％脱脂乾燥乳の０．４μｇ／ｍＬビオチン化ヤギ抗−ヒトカリクレイン３／ＰＳＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  ＭＮ）と４℃で一晩インキュベートする。ＴＢＳ含有０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（体積／体積）で洗浄後（５ｘ）、ＴＢＳ中０．５％脱脂乾燥乳中のヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａｂｅａｍ）への、０．２μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ−共役ロバポリクローナル第２抗体を前記膜に添加する（４℃で１時間インキュベート）。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（体積／体積）を含むＴＢＳで洗浄（５ｘ）後、ＴＢＳで洗浄し（２ｘ）、前記膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  化学発光強化及び基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、  ＩＬ）で発色させ、次いで直にＨｙＢｌｏｔ  ＣＬ  ＡＲフィルムに暴露した。
【００９４】
別に、二重の４−２０％ゲルを、全タンパク質含有量のために銀染色で可視化（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、  ＣＡ）して、ウェスタンブロット結果との比較においてＰＳＡ捕捉剤の特異性を評価した。
【００９５】
結果と議論
ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドは緩衝液中に遊離ＰＳＡを検出した（図１６）。前記ＰＳＡ捕捉剤配列／構造への追加の変性は、ヒト血清からの高い特異的なプルダウンに寄与するものと予想される。
【００９６】
実施例６：血清安定性：
概要
タンパク質文化への安定性は、インビボ用途でのペプチドの使用及び血清タンパク質診断の重要な要素のひとつである。大抵の天然ペプチドは酵素分解を防止するために変性される必要がある。Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸及び環化の使用を含むいくつかの研究が捕捉剤安定性を完全するために使用されている。
【００９７】
材料と方法
安定性は、８００μＬの全体積中の２５％（体積／体積）ヒトＡＢ血清（ＨＳ−２０、  Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ｔａｒｚａｎａ、  ＣＡ）を含むＴＢＳ中の２００μｇ捕捉剤を混合することで研究された（例えばＰａｋｋａｌａ  ２００７参照）。ペプチドは、３７℃でインキュベートされ、及び１００μＬ部分が時間＝０分、３０分後、及びその後は最大４時間までの１時間毎に取り出された。最終部は２４時間後であった。前記ペプチドは、血清タンパク質から、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過フィルタ装置（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０、ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ冷却ミクロ遠心（Ｂｒｅａ、  ＣＡ）により１２０００ｒｐｍで２０分間遠心して分離された。ろ過物を分析用ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラムで、０から５０％Ｂの勾配で３０分間溶出。Ａ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）で試験され、次いで、Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ質量分析スペクトル装置で分析された。
【００９８】
２つのコントロールアッセイが並行して実施され、上と同じ条件で行われた：（１）ＴＢＳ中及び（２）２５％（体積／体積）ヒトＡＢ雄血清を含むＴＢＳでの捕捉剤。
【００９９】
結果と議論
ヒト血清と４時間３７℃でのインキュベーション後、前記ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドは変化なしであった。２４時間後、ＨＰＬＣではなんらの断片も観察されなかった（図１７）。このデータは、前記ＰＳＡ捕捉剤トリリガンドは、ヒト血清中では生理的温度及び緩衝液では２４時間を超えてタンパク質分解に対して安定である、ことを示唆する。この結果は、環化は、（天然）−Ｌ−アミノ酸を含む配列部分にタンパク質分解に対して抵抗性を改善する方法であり、及びＤ−アミノ酸及び非天然アミノ酸は本来的に安定な要素であることを示す。配列を変化させることのない、この方法はインビボ研究のためのペプチド設計のために有用となり得る。
【０１００】
実施例７：合成ＰＳＡ捕捉剤の長期安定性：
合成ＰＳＡ捕捉剤の長期安定性は、凍結乾燥粉末として捕捉剤を、空気中で室温と−８０℃で、３ヶ月間保存することで評価された。一部分を周期的に取り出し、分析用ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラムで、０から５０％Ｂの勾配を用いた。ここでＡ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡである）で分析し、次いで、Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ質量分析スペクトルで分析した。ＨＰＬＣ分析は、捕捉剤トリリガンドは、保存温度によらず凍結乾燥粉末として６週間を超えて安定であることを示した（図１８）。
【０１０１】
実施例８：活性アッセイ：
材料と方法
遊離ＰＳＡの酵素安定性は、捕捉剤とキモトリプシン基質Ｓｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ（ＡｎａＳｐｅｃ、  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、  ＣＡ）  （例えば、Ｗｕ  ２０００参照）の存在下研究された。ＰＳＡ（３３３ｎＭ）を、１−１００倍過剰モルのＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）緩衝液中捕捉剤と、ｐＨ７．８で１時間２３℃でインキュベートした。別に、ＰＳＡの酵素活性へのＺｎ２＋の阻害効果が、コントロールとして前記反応緩衝液中に１−２００μＭＺｎＣｌ２を含ませることで研究された。最終濃度０．ｌ４ｍＭとなる基質の添加後、吸光度をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０  分光光度計（Ｂｒｅａ、  ＣＡ）で、５分間隔で８０分間４０５ｎｍでモニターした。ＰＳＡの酵素活性は、本来の活性を測定するためにＺｎ及び捕捉剤の不存在下で試験された。全てのアッセイは３回繰り返した。
【０１０２】
結果と議論
ＰＳＡの酵素活性は、ＰＳＡ捕捉剤により強化され、発色基質に対して約３倍のＰＳＡ活性を刺激した。この効果は、捕捉剤の濃度に依存し、及び半最大刺激はミクロモルの濃度範囲で検出された。活性に影響を与える最小ペプチド濃度は、アンカーリガンドで０．２５０μＭ（図１９Ａ）、及び捕捉剤バイリガンドで０．１５９μＭ（図１９Ｂ）の間を変動した。示唆されたことは、アンカーリガンドは活性サイトの近くで結合し、前記活性サイトの立体構造を変化させて、前記合成基質よりもより近づきやすい触媒ポケットを形成し得る、ということである（Ｗｕ  ２０００）。本発明で識別された捕捉剤が、また、天然基質に対してＰＳＡの活性を増加する場合、これらは、前立腺病理学及び生理学においてＰＳＡの生体内役割を研究するために有用であり得るものである。興味あることに、これらのいずれのペプチドも酵素活性を阻害しなかったことである。Ｚｎ２＋は、これに比べてＰＳＡの酵素活性の阻害を示し、比較のために図１９Ｃに示される挙動に寄与する。
【０１０３】
実施例９：スキャッチャードプロット：
概要
スキャッチャード分析は、捕捉剤について平衡解離定数（ｋＤ）を決定するために実施された。
【０１０４】
材料と方法
ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）マイクロタイタープレートを、ＰＢＳｐＨ７．４中の２μｇ／ｍＬ遊離ＰＳＡ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃Ｐ０７２５）で室温で２時コーティングした。それぞれのウェルをＰＢＳで洗浄（ｘ３）後、プレートを、ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中５％の脱脂乾燥乳で充填し、１時間室温でブロッキングした。前記プレートをＴＢＳ中の１％ＢＳＡで洗浄し（５ｘ）、ＴＢＳ＋０．１％ＤＭＳＯ（体積／体積）中１％ＢＳＡ内で連続希釈されたビオチン化捕捉剤を室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳ中１％ＢＳＡで全てのミクロウェルを洗浄後、ＴＢＳ中１％ＢＳＡ内の０．１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンＰｏｌｙ−ＨＲＰ共役（Ｐｉｅｒｃｅ、  ＩＬ）でインキュベートした。前記プレートを吸引して、ＴＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄され（１０ｘ）、次にＴＢＳで洗浄し（２ｘ）、及びその後ＱｕａｎｔａＲｅｄ（商標）強化化学発光ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、  ＩＬ）で発色させた。励起波長５３５ｎｍを用いて、５９５ｎｍの蛍光発光を、捕捉剤濃度の関数として、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０分光光度計（Ｂｒｅａ、  ＣＡ）で記録した。アッセイは３回繰り返した。
【０１０５】
飽和結合データは、スキャッチャード方法により、ＫＤを決定するために可視化された。結合ビオチン化捕捉剤は、１：１ビオチン：ストレプトアビジンを仮定して、ストレプトアビジンＰｏｌｙ−ＨＲＰ共役の一連の滴定から評価された。
【０１０６】
実施例１０：ミクロＰＥＴ／ＣＴイメージング及び生体内分布分析：
ＤＯＴＡ−ラベル化１、５−Ｔｚ−バイリガンドは、６４Ｃｕでラベル化され、マウスに１００μｇＩ．Ｖ．尾部注射により投与される。全身イメージングが、２時間の動的スキャンを用いてミクロＰＥＴ、続いてミクロＣＴイメージングで実施される。１０分間のミウロＰＥＴスキャンはまた、４及び６時間で実施され得る。種々の器官（例えば腎臓、胆嚢、肝臓、脳及び血液）の間のラベル化捕捉剤の生体内分布が、クリアランス及び蓄積を評価するために分析され得る。
【０１０７】
実施例１１：ＭＲＭアッセイ：
多重反応モニター（ＭＲＭ）は、質量スペクトル系アッセイであり、急速に開発されてきた高多重アッセイを可能にする。アッセイパラメータと質量スペクトル装置に依存して最大１００のタンパク質アッセイが、単一のＭＲＭサンプル分析で多重でなされ得る。数百のタンパク質アッセイが、サンプルの一部を取り出すことで単一の血液で実施され得る。
【０１０８】
ＰＳＡのためのＭＲＭアッセが開発され得る。ＰＳＡ捕捉剤は、特定のＰＳＡペプチドを富化するために使用される１００ナノリットルナノアフィニティカラムに、同じ配列の安定−同位体スパイクされたラベル化内部標準と共に固定化される。前記抗−ペプチドＰＳＡ捕捉剤支持体からの溶出の際に、質量スペクトルが、前記ペプチド（天然及びラベル化）を定量化するために使用される。
【０１０９】
通常は、アッセイごとに、４つのデータ点を与えるそれぞれのタンパク質について、２つのペプチドとペプチドごとの２つの遷移がモニターされる。合成ペプチドは、ＭＲＭのアッセイを開発し、それによりペプチドの保持時間をと遷移質量を決定するために使用され得る。タンパク質の数により（１００を超える）、タンパク質アッセイは、別のＭＲＭ試験について２か３のバッチにグループ化され得る。
【０１１０】
ＭＲＭアッセイに含まれるＰＳＡに加えて、他の癌又は前立腺疾患が、タンパク質パネルの一部分としてＭＲＭアッセイに含まれ得る。これらのマーカーは、文献又は専用のデータベースから得られる。
【０１１１】
サンプル試験
それぞれのサンプルは、ＭＲＭ試行のために２又は３の区分に分けられ得る。サンプルは、サンプル試験にわたり定量を標準化するためのペプチド標準物でスパイクされ得る。それぞれの集団からのサンプルは、臨床データ（性、年齢、収集位置など）に基づきマッチングされ、及びマッチングされたサンプルは、分析バイアスを最小化するためにＭＲＭアッセイを連続的に実施する。タンパク質アッセイ測定は、それぞれのサンプル中のそれぞれのタンパク質について得られる。
【０１１２】
評価
それぞれのタンパク質について、統計学的試験（偽発見率調整片側検定ペアｔ−テストなど）が、あるスポットサイズ（例えば１０ｍｍ）を超える癌性サンプルと非癌性サンプルとを識別するかどうかを決定するために使用される。統計的試験でのサンプルのペアリングは、上で記載されたサンプルのマッチングにより決定され得る。タンパク質ごとに４つのデータが存在することから、４つの点の少なくとも３つは、有意な統計的差を示す必要がある。
【０１１３】
タンパク質の具体的なパネルが、集合的に、あるスポットサイズ（例えば１０ｍｍ）を超える癌性サンプルと非癌性サンプルとを識別する診断用パネルであることを検証するために、次に分析が実施され得る。前記パネルのタンパク質の全てのデータ点は、単一のタンパク質からのデータ点であり、ペア統計テストで試験されるものとして扱われる。このテストの僞発見率調整ｐ−値が有意（例えば５％未満）であれば前記パネルは診断的として検証される。僞発見率は、全ての集団からのサンプルが反復的に無作為化されて僞発見率の評価を与える場合には順列テストを含む多くの方法を用いて評価され得る。
【０１１４】
上で説明したように、これまでの記載は本発明の種々の実施態様を説明するためのものである。従って、上で説明された具体的な変更などは本発明の範囲を限定するものではない。当業者に明らかなことは、種々の均等、変更、修正は、本発明の範囲から離れることなくなされるものであり、理解されるべきことは、かかる均等な実施態様もここで本発明に含まれる、ということである。ここで参照される全ての参照文献は、その全体が参照されてここに援用される。
【０１１５】
参照文献
１．  Ａｃｅｖｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ  ３１７：５５−６３  （２００２）、
２．  Ａｇｎｅｗ  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４８：４９４４＾１９４８  （２００９）、
３．  Ｂｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：８９２３−８９３０  （２００８）
４．  Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｎｏｂｌｅ、  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：１６１  −２１４  （１９９０
５．  Ｊｅｏｎｇ  ＆  Ｌｅｅ、  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １  ７：８４０−８４６  （２００７）
６．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  １０：８０７  （２００８）
７．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８２：６７２−６７９  （２０１  ０）
８．  Ｐａｋｋａｌａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  １３：３４８−３５３  （２００７）
９．  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７：６２１２−６２２０  （２０００
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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