(57)【要約】  対象における癌細胞の増殖または転移の予防または阻害のための方法が開示される。１つの方法は、ケモカインＣＣＬ２５および／またはケモカイン受容体ＣＣＲ９に対する抗体の治療的に有効な量を対象に投与することという段階を含む。他の方法は、ケモカインＣＣＬ２５および／またはケモカイン受容体ＣＣＲ９に対する抗体を発現する治療的に有効な量の発現ベクターを対象に投与することという段階を含む。
2014508117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌を治療するための方法であって：
抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を前記対象に投与することを含み、
前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記治療的に有効な量が約０．５と５０ｍｇ／ｋｇの間であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の前記方法であって、前記抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせが癌性組織内に直接投与されることを特徴とする前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の前記方法であって、前記抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせが化学療法剤と共に投与されることを特徴とする前記方法。
【請求項４】
請求項１に記載の前記方法であって、前記癌が癌腫でありかつ前記抗ＣＣＬ２５抗体、または前記抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせがＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される他の抗ケモカインまたは抗ケモカイン受容体抗体と共に投与されることを特徴とする前記方法。
【請求項５】
請求項１に記載の前記方法であって、前記癌が黒色腫でありかつ前記抗ＣＣＬ２５抗体、または前記抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせがＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される他の抗ケモカインまたは抗ケモカイン受容体抗体と共に投与されることを特徴とする前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の前記方法であって：
前記対象に由来する組織中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現のレベルを判定すること、および、ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の上昇レベルが検出される場合、前記抗ＣＣＬ２５抗体、前記抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を前記対象に投与することを含む前記方法。
【請求項７】
対象におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現が上昇した癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法であって：
抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を前記対象に投与することを含み、
前記治療的に有効な量が約０．５と５０ｍｇ／ｋｇの間であることを特徴とする前記方法。
【請求項８】
請求項７に記載の前記方法であって、前記癌細胞が芽腫細胞、癌腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、骨髄腫細胞、肉腫細胞または胚細胞腫瘍細胞であることを特徴とする前記方法。
【請求項９】
化学療法の効果を増強するための方法であって：
抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの有効量を、癌に対する化学療法を受けている対象に投与することを含み、
前記有効量が約０．５と５０ｍｇ／ｋｇの間であることを特徴とする前記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の前記方法であって、前記対象が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍に対する化学療法を受けていることを特徴とする前記方法。
【請求項１１】
医薬組成物であって：
（１）抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの有効量；
（２）抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、またはその組み合わせの有効量；および（３）医薬品として許容できる担体を含む前記医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の前記医薬組成物であって：
抗ＣＸＣＬ１６抗体、または抗ＣＸＣＲ６抗体、またはその組み合わせの有効量をさらに含む前記医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物であって：
（１）抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの有効量；
（２）抗ＣＸＣＬ１６抗体、抗ＣＸＣＲ６抗体、またはその組み合わせの有効量；および（３）医薬品として許容できる担体を含む前記医薬組成物。
【請求項１４】
医薬組成物であって：
（１）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を阻害するか、または（２）ＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害するか、または（３）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する物質を発現することのできる発現ベクター；および（３）医薬品として許容できる担体を含む前記医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の前記医薬組成物であって、前記物質が抗ＣＣＬ２５抗体または抗ＣＣＲ９抗体であることを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１６】
対象における癌を治療するための方法であって：
有効量のＣＣＬ２５免疫原および／またはＣＣＲ９免疫原で前記対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含み、
前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴する前記方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の前記方法であって、前記ＣＣＬ２５免疫原が配列番号１１６〜１３２からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列を含むペプチドであることを特徴とする前記方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の前記方法であって、前記ＣＣＲ９免疫原が配列番号１３３〜１３７からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列を含むペプチドであることを特徴とする前記方法。
【請求項１９】
対象におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現が上昇した癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法であって：
有効量のＣＣＬ２５免疫原および／またはＣＣＲ９免疫原で前記対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含む前記方法。
【請求項２０】
対象における癌を治療するための方法であって：
前記対象に由来する生物学的サンプルにおけるＣＣＬ２５発現および／またはＣＣＲ９発現のレベルを検出すること、および
前記生物学的サンプルにおいてＣＣＬ２５発現および／またはＣＣＲ９発現の上昇レベルが検出される場合、有効量のＣＣＬ２５免疫原および／またはＣＣＲ９免疫原で前記対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含む前記方法。
【請求項２１】
化学療法の効果を増強するための方法であって：
癌に対する化学療法を受けている対象に有効量のＣＣＬ２５免疫原および／またはＣＣＲ９免疫原を投与してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含み、
前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴する前記方法。
【請求項２２】
対象における癌を治療するための方法であって：
（１）１つまたはそれ以上のＣＣＬ２５およびＣＣＲ９免疫原の有効量および（２）１つまたはそれ以上のＣＸＣＬ１３免疫原、ＣＸＣＲ５免疫原、ＣＸＣＬ１６免疫原およびＣＸＣＲ６免疫原の有効量により前記対象を免疫することを含み、
前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１１年９月２９日に出願された米国特許出願第１３／２４８，９０４号、２０１１年９月１５日に出願された米国特許出願第１３／２３３，７６９号、および２０１０年１２月１４日に出願された米国特許出願第１２／９６７，２７３号からの優先権を主張する。前述の全ての出願の全文を参照文献として本願に援用する。
【０００２】
本願は、全般的に抗体の分野に関する。具体的には、本願は癌細胞の増殖および／または遊走の阻害または予防のための抗ケモカイン抗体および／または抗ケモカイン受容体抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
最近の癌研究の進歩にもかかわらず、悪性腫瘍の治療のための細胞特異的治療法の開発は達成することが難しい。悪性腫瘍細胞が変異を受け、免疫防御を回避し、かつ血管新生を促進して急速に増殖する細胞に栄養素を送達することを可能とする数多くの複雑な因子が、標的化治療様式の開発を複雑にする。現行の治療法は多数の想定外の副作用を有する。たとえば、化学療法は苦痛を与えかつ時に致死的となる多くの副作用をもたらす。バイオテクノロジーの進歩により、より副作用の少ない標的化生物学的治療法の開発が促進されている。
【０００４】
宿主細胞は、シグナルを送りかつ宿主細胞の活性を引き起こすリガンドと関連する表面受容体を有する。上皮成長因子受容体は細胞の増殖および転移の制御を助ける。多くの腫瘍細胞は、発現する表皮成長因子受容体の数が正常な細胞よりも多い。ＩＭＣ−２２５と命名された新たな治療法は、表皮成長因子受容体を標的とし、かつ遮断することにより細胞の分裂および修復を妨げるよう特に設計されている。最近、ＨＥＲ−２特異性モノクローナル抗体であるトラスツズマブが転移性乳癌の治療に有効であることが立証されている。この抗体は細胞の増殖を阻害する癌細胞上の相互作用を遮断する。しかし、ＨＥＲ−２は乳癌細胞の２５から３０％に認められるにすぎない。
【０００５】
ケモカインは、加水分解抵抗性である小さなサイトカイン様タンパク質のスーパーファミリーであり、血管新生または内皮細胞増殖の阻害を促進し、細胞骨格改変を誘導し、リンパ球を活性化または不活性化し、かつＧタンパク質共役受容体との相互作用により走化性を媒介する。ケモカインは、その受容体を発現する宿主細胞の増殖および遊走を媒介することができる。
【０００６】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２５（ＣＣＬ２５）は胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）とも呼ばれ、ＣＣケモカインファミリーに属する小さなケモカインである。ＣＣＬ２５は胸腺細胞、マクロファージおよび樹状細胞に対して走化性である。ＣＣＬ２５は、ケモカイン受容体ＣＣＲ９と結合することによりその効果を誘発し、かつＴ細胞の発達において１つの役割を果たすと考えられる。ヒトＣＣＬ２５は１５１アミノ酸を含むタンパク質前駆体として生成される。ＣＣＬ２５に対する遺伝子（ｓｃｙａ２５）は第１９染色体上に位置する。
【０００７】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体９（ＣＣＲ９）はＧＰＲ９−６としても知られ、胸腺では（未成熟Ｔ細胞上でも成熟Ｔ細胞上でも）非常に高度に発現しているものの、リンパ節および脾臓では発現が低い。ＣＣＲ９は腸でも豊富であり、その発現は腸のＴ細胞と関連している。ケモカイン結合タンパク質Ｄ６は過去にＣＣＲ９と呼ばれていたが、この分子は真の（シグナリング）ケモカイン受容体でないスカベンジャー受容体であることは、留意すべき点である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願の１つの態様は、対象における芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、または胚細胞腫瘍を治療するための方法に関する。１つの実施形態においては、方法は、抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を対象に投与するこという段階を含み、前記治療的に有効な量が約０．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの間であることを特徴とする。他の実施形態においては、方法は、タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としてのＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９免疫原の有効量により対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することという段階を含む。
【０００９】
本願の他の態様は、対象における癌を治療するための方法であって：抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせを発現する有効量の発現ベクターを前記対象に投与することを含み、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とする方法に関する。
【００１０】
本願の他の態様は、対象における癌を治療または予防するための方法であって：（１）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を阻害するか、（２）ＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害するか、または（３）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する物質を発現する有効量の発現ベクターを対象に投与することを含み、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、または肉腫、または胚細胞腫瘍であることを特徴とする方法に関する。
【００１１】
本願の他の態様は、対象におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現が上昇した癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法に関する。１つの実施形態においては、方法は、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を対象に投与するこという段階を含み、治療的に有効な量が約０．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの間であることを特徴とする。他の実施形態においては、方法は、タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としてのＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９免疫原の有効量により対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することという段階を含む。他の実施形態においては、方法は、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせを発現する発現ベクターを対象に投与することという段階を含む。
【００１２】
本願の他の態様は、化学療法の効果を増強するための方法に関する。１つの実施形態においては、方法は、癌に対する化学療法を受けている対象に、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を対象に投与するこという段階を含み、前記治療的に有効な量が約０．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの間であることを特徴とし、前記癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、または胚細胞腫瘍であることを特徴とする。他の実施形態においては、方法は、タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としてのＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９免疫原の有効量により対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することという段階を含む。他の実施形態においては、方法は、対象において抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせを発現する発現ベクターを前記対象に投与することという段階を含む。
【００１３】
本願の他の態様は、化学療法の効果を増強するための方法に関する。方法は、癌に対する化学療法を受けている対象に、（１）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を阻害するか、または（２）ＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害するか、または（３）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害することのできる物質を発現する治療的に有効な量の発現ベクターを投与することを含み、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、または胚細胞腫瘍であることを特徴とする。
【００１４】
本願の他の態様は、医薬品として許容できる担体および（１）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を阻害するか、または（２）ＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害するか、または（３）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する物質を発現することができる発現ベクターを含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳癌組織によるＣＣＬ２５発現を示す。
【図２】ＣＣＬ２５が乳癌細胞株増殖のシスプラチン誘導性減少を阻害することを示す。
【図３】ＣＣＬ２５が乳癌細胞をシスプラチン誘導性アポトーシスから保護することを示す。
【図４】乳癌細胞株におけるＣＣＬ２５−ＣＣ９相互作用によるＰＩ３ＫおよびＡｋｔの活性化を示す。
【図５】乳癌細胞株のＣＣＬ２５処理後のＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲリン酸化を示す。
【図６−１】卵巣癌組織によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。
【図６−２】卵巣癌組織によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。
【図７Ａ】卵巣癌組織によるＣＣＬ２５発現の分析を示す。
【図７Ｂ】卵巣癌組織によるＣＣＬ２５発現の分析を示す。
【図８Ａ】卵巣癌組織によるＣＣＲ９発現の分析を示す。
【図８Ｂ】卵巣癌組織によるＣＣＲ９発現の分析を示す。
【図９】卵巣癌細胞株によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。
【図１０】卵巣癌細胞による低酸素調節ＣＣＲ９  ｍＲＮＡおよび表面タンパク質発現を示す。
【図１１】ＳＫＯＶ−３細胞の低酸素媒介性およびＣＣＬ２５媒介性遊走および浸潤を示す。
【図１２】ＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性コラゲナーゼ発現を示す。
【図１３】ＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ゼラチナーゼ発現を示す。
【図１４】ＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ストロメライシン発現を示す。
【図１５】前立腺癌細胞によるＣＣＲ９発現を示す。
【図１６】前立腺組織によるＣＣＲ９発現を示す。
【図１７】前立腺癌組織によるＣＣＬ２５発現を示す。
【図１８】健常ドナーまたは前立腺疾患患者における血清ＣＣＬ２５レベルを示す。
【図１９】マウス骨髄細胞によるＣＣＬ２５発現を示す。
【図２０】ＣＣＲ９媒介性前立腺癌細胞遊走および浸潤を示す。
【図２１】前立腺細胞株によるＣＣＬ２５誘導性活性ＭＭＰ発現を示す。
【図２２】ＣＣＲ９ノックダウンによるＰＣ３前立腺癌細胞株の骨転移の阻害を示す。
【図２３】肺癌患者の血清ＣＣＬ２５レベルを示す。
【図２４】非腫瘍性肺組織および肺癌組織によるＣＣＲ９発現を示す。
【図２５】結腸癌組織によるＣＣＲ９−ＣＣＬ２５発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の詳細な説明は、任意の当業者に本発明を作製しかつ使用することを可能とするために提示する。説明を目的として、本願の完全な理解を提供するために具体的な用語が述べられている。しかし、これらの具体的な詳細は本発明を実施する上で必要とされないことが当業者に明らかとなるであろう。具体的な施用の説明は典型的な例としてのみ提供される。本発明は提示した実施例に限定されることを意図しないが、可能な限り最も広い範囲に適合することとする。
【００１７】
別途定義しない限り、本願に関連して用いられる科学的および技術的用語は当業者が共通して理解する意味を有する。さらに、文脈が別途必要としない限り、単数形の語句は複数形を含みかつ複数形の語句は単数形を含む。
【００１８】
（定義）
本願で用いられる以下の用語は以下の意味を有する：
【００１９】
本願で用いられる用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、障害および／またはその随伴症状を緩和するかまたは抑止するための方法を意味する。本願で用いられる用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、対象が障害および／またはその随伴症状を獲得することを妨げる方法を意味する。一定の実施形態においては、用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、障害および／またはその随伴症状を獲得するリスクを低下させる方法を意味する。
【００２０】
本願で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、かつ具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例：二重特異性抗体など）、および抗体フラグメントを包含する。「特異的に結合する」または「免疫反応する」によって、抗体が所望の抗原の１つまたはそれ以上の抗原決定基と反応しかつ他のポリペプチドとは反応（すなわち結合）しないか、または他のポリペプチドとさらにより低い親和性で結合することが意味される。用語「抗体」は、一般的には全長抗体の抗原結合領域または可変領域である、全長抗体の一部を含む抗体フラグメントも含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線形抗体；単鎖抗体（ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントより形成される多重特異性抗体を含む。本発明の一定の実施形態においては、たとえば腫瘍浸透性を高めるために、無傷の抗体よりもむしろ抗体フラグメントを用いることが望ましいこともある。この場合、その血清半減期を延長するために、技術上既知である任意の手段で修飾されている抗体フラグメントを用いることが望ましいこともある。
【００２１】
本願で用いられる用語「モノクローナル抗体」は相当均一な抗体の母集団から得られる抗体を意味し、すなわち母集団を構成する個々の抗体は少量存在しうる天然に発生する可能性のある変異を除いて同一である。本願のモノクローナル抗体は、具体的には、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である一方で、分子鎖の残りの部分が他の種に由来するかまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、および所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントを含む。
【００２２】
非ヒト抗体の「ヒト化」型は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、ほとんどの場合、所望の特異性、親和性および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によってレシピエントの超可変領域に由来する残基が置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化および他のキメラ抗体を作製するための方法は技術上既知である。
【００２３】
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。本例においては、結合特異性のうち一方はＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６に対するものである。第２の結合標的は他の任意の抗原であり、細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットであることが好都合である。二重特異性抗体を作製するための方法は技術上既知である。
【００２４】
「ヘテロ複合体抗体」の使用も本発明の範囲内である。ヘテロ複合体抗体は共有結合で連結される２つの抗体より構成される。このような抗体は、たとえば免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化することが提唱されている（米国特許第Ｎｏ．４，６７６，９８０号）。架橋剤を包含するものを含むタンパク質合成化学における既知の方法を用いて、インビトロで抗体を調製できることが意図されている。
【００２５】
本発明は、毒素（例：細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的活性毒素またはそのフラグメント）などの細胞毒性物質、または放射性同位元素（すなわち放射性複合体）と複合体化した抗体を含む「免疫複合体」の使用も意図する。使用することのできる酵素的活性毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害物質、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害物質、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。放射性複合抗体の生成のために多様な放射性核種を利用することができる。例は２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅを含む。
【００２６】
薬理学的な意味において、本発明の文脈では、抗体の「治療的に有効な量」は、その治療に抗体が有効である障害の予防または治療において有効な量を意味する。「障害」は、癌腫および化学療法抵抗性を含めた、抗体による治療によって利益を得るあらゆる状態である。これは、哺乳類に当該の障害の素因をもたらす病的状態を含めた、慢性および急性の障害または疾患を含む。
【００２７】
本願で用いる用語「腫瘍」は、新生物または細胞の異常増殖によって形成される固形病変を意味する。腫瘍は、良性であることも、前悪性であることも、あるいは悪性であることもある。
【００２８】
用語「癌」は、悪性新生物または悪性腫瘍と定義され、かつ細胞の集団が調節されない細胞増殖、隣接組織に侵入しかつこれを破壊する浸潤、および時に転移、すなわちリンパまたは血液を介した体内の他の位置への拡散を示す疾患の種類である。これら３つの癌の悪性特性は、浸潤または転移しない良性腫瘍から癌を識別する。典型的な癌は：癌腫、黒色腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽腫を含む。
【００２９】
本願で用いられる用語「癌腫」は、形質転換上皮細胞、または組織発生が不明であるがサイトケラチンまたは細胞間橋の生成などの上皮細胞と関連する特異的な分子的または組織学的特性を有する形質転換細胞からなる浸潤性悪性腫瘍を意味する。本発明の典型的な癌腫は卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、インスリノーマ、腺癌、線扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脳癌、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、下垂体癌および骨癌を含む。
【００３０】
本願で用いられる用語「リンパ腫」は、免疫系のリンパ細胞の癌である。リンパ腫は、典型的には固形腫瘍として存在する。典型的なリンパ腫は：小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、鼻型節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球型ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、皮膚原発ＣＤ３０陽性Ｔリンパ球増殖性疾患、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、不特定末梢Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫を含む。典型的な形態の古典的ホジキンリンパ腫は：結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、およびリンパ球減少または非減少型を含む
【００３１】
本願で用いられる用語「肉腫」は、胚体中胚葉から発生した数多くの組織の１つにおける形質転換細胞から発生する癌である。したがって、肉腫は骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、および造血組織の腫瘍を含む。たとえば、骨肉腫は骨から発生し、軟骨肉腫は軟骨から発生し、脂肪肉腫は脂肪から発生し、かつ平滑筋肉腫は平滑筋から発生する。典型的な肉腫は：Ａｓｋｉｎ腫瘍、ボトリオディーズ、軟骨肉腫、ＥｗｉｎｇのＰＮＥＴ、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫を含む。軟部組織肉腫のサブクラスは：胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫類腱腫、線維形成性小円形細胞性腫瘍、類上皮肉腫骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管周皮細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパンジオサルコマル、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫を含む。
【００３２】
本願で用いる用語「白血病」は、白血球の異常な増加を特徴とする血液または骨髄の癌である。白血病は一連の疾患を包含する幅広い用語である。さらには、血液腫瘍と呼ばれるさらにより幅広い群の一部である。白血病は種々の大分類に細分され；第１の分類は急性型白血病と慢性型白血病の分類である。急性白血病は幼若血液細胞数の急速な増加を特徴とする。そのような細胞による密集によって骨髄は健常な血液細胞を産生できなくなる。慢性白血病は、比較的成熟しているがやはり異常な白血球の過剰な蓄積を特徴とする。典型的には進行に数ヶ月から数年かかり、細胞は正常細胞よりもさらに高い率で生成され、血液中の異常な白血球が増加する。白血病は罹患する血液細胞によっても細別される。この分類により白血病はリンパ芽球性またはリンパ球性白血病と骨髄性または骨髄原性白血病に分類される。リンパ芽球性またはリンパ球性白血病では、癌性変化は、通常では続いてリンパ球を形成する種類の骨髄細胞に発生する。骨髄性または骨髄原性白血病では、癌性変化は、通常では続いて赤血球、他の一部の種類の白血球および血小板を形成する種類の骨髄細胞に発生する。これら２種類の分類の複合により、合計４つの主要カテゴリーが提供される。典型的には、これら４つの主要カテゴリーのそれぞれの中に数種類のサブカテゴリーがある。これらの分類スキームから外れた希少種もある。典型的な白血病は：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄原性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄原性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキット白血病、および成人性Ｔ細胞白血病を含む。
【００３３】
本願で用いられる用語「黒色腫」は、メラニン細胞の癌または悪性腫瘍である。メラニン細胞は、皮膚の色をもたらす暗色色素メラニンを産生する細胞である。主として皮膚に発生するが、腸および眼を含む身体の他の部分にも認められる。黒色腫は以下の定型およびサブタイプに分類される：悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節型黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、無色素性黒色腫、軟部組織黒色腫、小母斑様細胞を伴う黒色腫、スピッツ母斑の特性を有する黒色腫、およびぶどう膜黒色腫。
【００３４】
本願で用いられる用語「胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）」は胚細胞に由来する新生物である。胚細胞腫瘍は癌性腫瘍であることも、または非癌性腫瘍であることもある。正常の場合、胚細胞は性腺（卵巣および精巣）の内部に発生する。性腺の外部に由来する胚細胞腫瘍は、胚の発達中の錯誤により発生した先天性欠損でありうる。胚細胞腫瘍は：ジャーミノーマまたはセミノーマ胚細胞腫瘍と非ジャーミノーマまたは非セミノーマ胚細胞腫瘍の２分類に大別される。典型的なジャーミノーマまたはセミノーマ胚細胞腫瘍は：ジャーミノーマ、未分化胚細胞腫およびセミノーマを含む。典型的な非ジャーミノーマ胚細胞腫瘍または非セミノーマ胚細胞腫瘍は：胎児性癌、内胚葉洞腫瘍または卵黄嚢腫瘍（ＥＳＴ、ＹＳＴ）、絨毛癌、成熟型奇形腫、類皮嚢胞、未熟型奇形腫、悪性トランスフォーメーションを伴う奇形腫、多胚腫、性腺芽細胞腫、および混合ＧＣＴを含む。
【００３５】
本願で用いられる用語「転移」は、１つの器官または部分から隣接しない他の器官または部分への癌または癌腫の拡散を意味する。
【００３６】
用語「哺乳類」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの家畜および畜産動物、および動物園、スポーツまたは愛玩用動物を含む、哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００３７】
用語「阻害する」は相対的な用語であり、物質の投与後に反応または状態が定量的に減少する場合、または物質の投与後に参照物質と比較して減少する場合、物質は反応または状態を阻害する。同様に、用語「予防する」は、反応または状態の特性のうち少なくとも１つが除去される限り、必ずしもある物質が完全に反応または状態を除去することを意味しない。したがって、感染または病的反応といった反応を低減または予防する組成物は、そのような感染または反応を除去することができるが、感染または反応が、物質非存在下での感染または反応の、または参照物質と比較して少なくとも約７０％、または約８０％、またはさらに約９０％（すなわち１０％未満に）といった少なくとも約５０％などの測定可能な程度で減少する限り、必ずしも完全に除去しない。
【００３８】
用語「上昇レベル」は、関連技術において習慣的に定義されるかまたは用いられる正常または対照レベルよりも高いレベルを意味する。たとえば、組織の免疫染色の上昇レベルは、当業者であれば対照組織の免疫染色のレベルよりも高いとみなす免疫染色のレベルである。
【００３９】
用語「ＣＸＣＬ１３免疫原」および「ＣＸＣＲ５免疫原」は、（１）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５に由来する免疫原性ペプチドおよび／または（２）ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５に由来する免疫原性ペプチドをコードし、かつ発現することのできる発現ベクターを含む免疫原性組成物を意味する。ＣＸＣＬ１３またはＣＸＣＲ５に由来する免疫原性ペプチドは、他の部分と融合させてその免疫原性を増強しうる。ＣＸＣＬ１３免疫原ペプチドの例は、RSSSTLPVPVFKRKIP (SEQ ID(配列番号) NO:45), PRGNGCPRKEIIVWKK (SEQ ID NO:46), LPRGNGCPRKEIIVWK (SEQ ID NO:47), QILPRGNGCPRKEIIV (SEQ ID NO:48), ILPRGNGCPRKEIIVW (SEQ ID NO:49), RIQILPRGNGCPRKEI (SEQ ID NO:50), RGNGCPRKEIIVWKKN (SEQ ID NO:51), KRSSSTLPVPVFKRKI (SEQ ID NO:52), IQILPRGNGCPRKEII (SEQ ID NO:53), DRIQILPRGNGCPRKE (SEQ ID NO:54), RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:55), RCRCVQESSVFIPRRF (SEQ ID NO:56), GNGCPRKEIIVWKKNK (SEQ ID NO:57), CVQESSVFIPRRFIDR (SEQ ID NO:58), IDRIQILPRGNGCPRK (SEQ ID NO:59), LRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO:60), FIDRIQILPRGNGCPR (SEQ ID NO:61), RCVQESSVFIPRRFID (SEQ ID NO:62), CRCVQESSVFIPRRFI (SEQ ID NO:63), QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ ID NO:64), RFIDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65), VQESSVFIPRRFIDRI (SEQ ID NO:66), ESSVFIPRRFIDRIQI (SEQ ID NO:67), SLRCRCVQESSVFIPR (SEQ ID NO:68), NGCPRKEIIVWKKNKS (SEQ ID NO:69), PQAEWIQRMMEVLRKR (SEQ ID NO:70), RRFIDRIQILPRGNGC (SEQ ID NO:71), LRKRSSSTLPVPVFKR (SEQ ID NO:72), VQESSVFIPRR (SEQ ID NO:73, EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:74), KKNK (SEQ ID NO:75), RKRSSS (SEQ ID NO:76), RGNGCP (SEQ ID NO:77), VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO:78), DRIQILP (SEQ ID NO:79), RKEIIVW (SEQ ID NO:80) and KSIVCVDPQ (SEQ ID NO:81)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。ＣＸＣＲ５免疫原性ペプチドの例はTSLVENHLCPATE (SEQ ID NO:82), EGSVGWVLGTFLCKT (SEQ ID NO:83), LPRCTFS (SEQ ID NO:84), LARLKAVDNT (SEQ ID NO:85) and MASFKAVFVP (SEQ ID NO:86)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。
【００４０】
用語「ＣＸＣＬ１６免疫原」および「ＣＸＣＲ６免疫原」は、（１）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６に由来する免疫原性ペプチドおよび／または（２）ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６に由来する免疫原性ペプチドをコードし、かつ発現することのできる発現ベクターを含む免疫原性組成物を意味する。ＣＸＣＬ１６またはＣＸＣＲ６に由来する免疫原性ペプチドは、融合タンパク質の形態でその免疫原性を増強しうる。ＣＸＣＬ１６免疫原ペプチドの例はAAGPEAGENQKQPEKN (SEQ ID NO:87), SQASEGASSDIHTPAQ (SEQ ID NO:88), STLQSTQRPTLPVGSL (SEQ ID NO:89), SWSVCGGNKDPWVQEL (SEQ ID NO:90), GPTARTSATVPVLCLL (SEQ ID NO:91), SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO:92), RLRKHL (SEQ ID NO:93), LQSTQRP (SEQ ID NO:94), SSDKELTRPNETT (SEQ ID NO:95), AGENQKQPEKNA (SEQ ID NO:96), NEGSVT (SEQ ID NO:97), ISSDSPPSV (SEQ ID NO:98), CGGNKDPW (SEQ ID NO:99), LLPTSPPISQASEGASSDIHT (SEQ ID NO:100), STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT (SEQ ID NO:101), SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA (SEQ ID NO:102), TGSCYCGKR (SEQ ID NO:103), DSPPSVQ (SEQ ID NO:104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG (SEQ ID NO:105), WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ (SEQ ID NO:106), SDIHTPAQMLLSTLQ (SEQ ID NO:107), RPTLPVGSL (SEQ ID NO:108), TAGHSLAAG (SEQ ID NO:109), GKRISSDSPPSVQ (SEQ ID NO:110) and KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH (SEQ ID NO:111)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。ＣＸＣＲ６免疫原性ペプチドの例はHQDFLQFSKV (SEQ ID NO:112), AGIHEWVFGQVMCK (SEQ ID NO:113), PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO:114) and YYAMTSFHYTIMVTEA (SEQ ID NO:115)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。
【００４１】
用語「ＣＣＬ２５免疫原」および「ＣＣＲ９免疫原」は、（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９に由来する免疫原性ペプチドおよび／または（２）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９に由来する免疫原性ペプチドをコードし、かつ発現することのできる発現ベクターを含む免疫原性組成物を意味する。ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９に由来する免疫原性ペプチドは、融合タンパク質の形態でその免疫原性を増強しうる。ＣＣＬ２５免疫原ペプチドの例はLAYHYPIGWAVL (SEQ ID NO:116), KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH (SEQ ID NO:117), FEDCCLAYHYPIGWAVLRRA (SEQ ID NO:118), IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN (SEQ ID NO:119), AMKLLDAR (SEQ ID NO:120), KVFAKLHHN (SEQ ID NO:121), QAGPHAVKKL (SEQ ID NO:122), FYLPKRHRKVCGNP (SEQ ID NO:123) YLPKRHRKVCGNPK  (SEQ ID NO:124), LPKRHRKVCGNPKS (SEQ ID NO:125), PKRHRKVCGNPKSR (SEQ ID NO:126), CGNPKSREVQRAMK (SEQ ID NO:127), GNPKSREVQRAMKL (SEQ ID NO:128), KFSNPISSSKRNVS (SEQ ID NO:129), PKSREV (SEQ ID NO:130), LHHNTQT (SEQ ID NO:131) and SSSKRN (SEQ ID NO:132)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。ＣＣＲ９免疫原ペプチドの例はQFASHFLPP (SEQ ID NO:133), AAADQWKFQ (SEQ ID NO:134), TFMCKVVNSM (SEQ ID NO:135), IAICTMVYPS (SEQ ID NO:136) and VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ (SEQ ID NO:137)からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列からなるか、またはこれを含むペプチドを含むが、これに限定されない。
【００４２】
本願で用いられる用語「生物学的サンプル」は、血液、血漿、尿、唾液、脊髄液、糞便、汗、または息などの体液または身体生成物であってもよい、生物学的由来の材料を意味する。生物学的サンプルは組織サンプルおよび細胞サンプルも含む。
【００４３】
本願において、範囲は「おおよその」１つの特定の数値から、かつ／または「おおよその」他の特定の数値までとして表示することがある。そのような範囲が表示される場合、他の実施形態は１つの特定の数値からかつ／または他の特定の数値までを含む。同様に、先行する「おおよそ」の使用によって数値が近似として表示される場合、当該の特定の数値が他の実施形態を形成することが理解されるであろう。さらに、各範囲の端点は、もう一方の端点に関しても、もう一方の端点と無関係でも重要であることが理解されるであろう。本願には数多くの数値が開示されており、かつ本願において各数値はその具体的な数値自体に付け加えて「おおよその」その数値として開示されることも理解される。たとえば、数値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。ある数値が開示される場合、当業者が適切に理解するように、その数値「よりも小さいかまたはこれと等しい」、「その数値よりも大きいかまたはこれと等しい」、および数値間の可能な範囲も開示されることも理解される。たとえば、数値「１０」が開示される場合、「１０より小さいかまたはこれと等しい」、および「１０より大きいかまたはこれと等しい」も開示される。
（ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９に対して免疫することにより癌を治療または予防すること）
【００４４】
ＣＣＬ２５はＣＣＲ９ケモカイン受容体のリガンドである。ケモカインも受容体も、癌の転移および浸潤の調節において１つの役割を果たすと見られる。ＣＣＬ２５もＣＣＲ９も、卵巣癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、骨癌および膵臓癌を含めた複数の癌腫組織の種類において、正常組織と比較して局所的にアップレギュレートされる。ＣＣＬ２５レベルは、それらの癌を有する患者の血清においても上昇する。さらに、可溶性ＣＣＬ２５ケモカインは、癌細胞のインビボおよびインビトロ増殖および遊走を促進する。
【００４５】
ＣＣＲ９は、推定上化学療法剤に対する保護を支援する、癌細胞生存における多様な役割を有しうる、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のケモカイン受容体ファミリーの構成要素である。ＣＣＲ９のＣＣＬ２５との相互作用はマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）発現をモジュレートし、かつ癌腫細胞の遊走および潜在的浸潤能力を増強する。このことは、ＣＣＲ９−ＣＣＬ２５相互作用が癌腫細胞遊走および浸潤に寄与することを示唆する。従って、この軸を遮断することは癌腫細胞転移を阻害する可能性を有する。
【００４６】
本願の１つの態様は、ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９に対して免疫することによって癌を治療または予防するための方法に関する。方法は、タンパク質、ペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドとしてのＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９免疫原の有効量により対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することという段階を含み、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、または肉腫を含むことを特徴とする。
【００４７】
他の実施形態においては、方法は、（１）タンパク質、ペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドとしての１つまたはそれ以上のＣＣＬ２５およびＣＣＲ９免疫原、および（２）タンパク質、ペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドとしての１つまたはそれ以上のＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５免疫原、および／またはタンパク質、ペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドとしての１つまたはそれ以上のＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６免疫原の有効量で対象を免疫する段階を含む。
（癌を治療または予防するための抗ＣＣＬ２５および抗ＣＣＲ９抗体の使用）
【００４８】
本願の他の態様は、癌を治療または予防するための抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体の使用に関する。使用は、そのような治療を必要とする対象に、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を投与することを含み、癌が芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、または肉腫であることを特徴とする。
【００４９】
他の実施形態においては、対象は癌細胞におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現上昇をもたらす癌と診断される。そのような癌の例は芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫および胚細胞腫瘍を含むが、これに限定されない。１つの実施形態においては、対象は脳癌と診断される。他の実施形態においては、対象は骨癌と診断される。他の実施形態においては、対象は下垂体癌と診断される。さらに他の実施形態においては、対象は卵巣癌と診断される。
【００５０】
他の実施形態においては、方法は、対象に由来する組織中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現のレベルを判定すること、およびＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の上昇レベルが検出される場合、抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を対象に投与することをさらに含む。
【００５１】
他の実施形態においては、方法は、対象に由来する組織中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現のレベルを判定すること、およびＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の上昇レベルが検出される場合、タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としてのＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９免疫原の有効量で対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することをさらに含む。
【００５２】
他の実施形態においては、方法は、対象に由来する組織中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現のレベルを判定すること、およびＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の上昇レベルが検出される場合、（１）タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としての１つまたはそれ以上のＣＣＬ２５およびＣＣＲ９免疫原、および（２）タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としての１つまたはそれ以上のＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５免疫原、および／またはタンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としての１つまたはそれ以上のＣＸＣＬ１６およびＣＸＣＲ６免疫原の有効量で対象を免疫することをさらに含む。
【００５３】
本願の好ましい抗体は、ヒトＣＣＬ２５と結合し、かつ好ましくはＣＣＬ２５がＣＣＲ９を含むがこれに限定されない受容体と結合する能力を（部分的または完全に）遮断するものである。本願の他の好ましい抗体は、ヒトＣＣＲ９と結合し、かつ好ましくは、腫瘍または癌腫細胞などの、ＣＣＲ９ケモカイン受容体をその細胞表面に発現する細胞がＣＣＲ２５を含むがこれに限定されないリガンドと結合する能力を（部分的または完全に）遮断するものである。本願のさらなる他の好ましい抗体は、ヒトＣＣＲ９と結合し、かつ好ましくは可溶性ＣＣＲ９ケモカイン受容体がＣＣＬ２５を含むがこれに限定されないリガンドと結合する能力を（部分的または完全に）遮断するものである。
【００５４】
１つの実施形態においては、抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体はモノクローナル抗体である。他の実施形態においては、抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体はヒト化抗体である。１つの実施形態においては、抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体はヒト化抗体フラグメントである。
【００５５】
本願の具体的な実施形態においては、抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体による対象の治療は、他の抗原に対して特異的である少なくとも１つの他の抗体の治療的に有効な量による事前、同時または事後の対象の治療と併用される。１つの実施形態においては、他の抗原はＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１などの他のケモカインまたはケモカイン受容体である。
【００５６】
他の実施形態においては、他の抗原は癌腫と関連するケモカインまたはケモカイン１受容体でありかつＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＲ２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される。
【００５７】
他の実施形態においては、他の抗原は黒色腫と関連するケモカインまたはケモカイン受容体であり、かつＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＬ１およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される。
【００５８】
他の実施形態においては、他の抗原は白血病に関連するケモカインまたはケモカイン受容体でありかつＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７およびＣＸ３ＣＲ１からなる群から選択される。
【００５９】
他の典型的な抗原は、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；ａ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子などの凝血因子；プロテインＣなどの抗凝血因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲンアクチベータ；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽球成長因子；表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；ＥＧＦ受容体などのＥｒｂＢ受容体ファミリー構成要素；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３４などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；たとえばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９および／またはＩＬ−１０などのインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；解離促進因子；たとえばＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ａｎ  ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどの、そのａまたはｂサブユニットを含むαｖ／β３インテグリン；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＫ２、ＣＡ１２５、ＴＡ９０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；補体活性化第一経路、補体レクチン経路、または補体活性化第��経路に由来するタンパク質のうちいずれか１つ；および上記のポリペプチドのいずれかのフラグメントなどの分子を含む。
【００６０】
抗体は、ボーラスまたはある時間に及ぶ連続注入としての静脈内投与、筋肉内、腹腔内、イントラセロブロスパイナル、皮下、関節内、滑液内、鞘内、口腔内、局所または吸入経路によるなどの既知の方法で対象に投与しうる。一定の実施形態においては、抗体は、侵襲的手技中の腫瘍母地への直接的な投与を含めて、腫瘍または癌組織に直接投与される。抗体は、罹患組織への標的ケモカインに対する投与を目的としてスポンジまたはガーゼなどの固形支持体上に付置される。
【００６１】
本発明の抗体は、通常許容される医薬品として許容できる担体中で投与することができる。許容できる担体は食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖食塩水溶液を含むが、これに限定されない。固形支持体、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフェアまたはマイクロスフェアも、抗体の投与を目的とした担体として用いうる。
【００６２】
抗体の適切な用量（「治療的に有効な量」）は、たとえば治療しようとする状態、状態の重症度および経過、抗体が予防的目的で投与されるかまたは治療的目的で投与されるか、前治療、患者の臨床履歴および抗体に対する応答、使用する抗体の種類、および担当医の裁量などに依存するであろう。抗体は単回、または一連の治療に渡って特許に適切に投与され、かつ診断から先の任意の時点で特許に投与してもよい。抗体は、単独の治療として投与しても、または当該の状態の治療において有用な他の薬剤または治療と共に投与してもよい。
【００６３】
一般的な提案として、投与する抗体の治療的に有効な量は、単回投与であれそれ以上の投与であれ約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内となるであろう。具体的な実施形態においては、投与する抗体の範囲は約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、１μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日および１０ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００６４】
他の実施形態においては、抗体は１ｎｇ〜１０ｎｇ／注射、１０ｎｇから１００ｎｇ／注射、１００ｎｇから１μｇ／注射、１μｇから１０μｇ／注射、１０μｇから１００μｇ／注射、１００μｇから１ｍｇ／注射、１ｍｇから１０ｍｇ／注射、１０ｍｇから１００ｍｇ／注射、および１００ｍｇから１０００ｍｇ／注射の用量範囲で投与される。抗体は連日、または２、３、４、５、６および７日毎、または１、２、３または４週間毎に注射することができる。
【００６５】
他の具体的な実施形態においては、投与する抗体の用量範囲は約１ｎｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇである  さらに他の具体的な実施形態においては、投与する抗体の用量範囲は約１ｎｇ／ｋｇから約１０ｎｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇから約１００ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇから約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１０μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、および約１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇである。
【００６６】
他の具体的な実施形態においては、投与する抗体の量は、またはおおよその量は０．０００６、０．００１、０．００３、０．００６、０．０１、０．０３、０．０６、０．１、０．３、０．６、１、３、６、１０、３０、６０、１００、３００、６００および１０００ｍｇ／日である。予測される様に、用量は患者の状態、サイズ、年齢および状態に依存するであろう。
【００６７】
抗体は、適宜または表示通りに、ボーラスとしてまたは連続注入により単回投与、またはボーラスとしてまたは連続注入により複数回投与で投与することができる。複数回投与は、たとえば１日に複数回、毎日、２、３、４、５、６または７日毎、毎週、２、３、４、５または６週間毎にまたは毎月１回投与することができる。しかし、他の投与法を用いてもよい。この治療の進行は従来の技術によって容易にモニタリングされる。
【００６８】
本願の具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、これを必要とする対象に単独の治療薬として投与しうる。具体的な実施形態においては、腫瘍または癌腫細胞を死滅させるかまたはそのアポトーシスを促進するための治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体。他の具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、腫瘍または癌腫の確立を阻害または予防する。さらに具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、既存の腫瘍または癌腫からの腫瘍または癌腫細胞の遊走または転移を阻害または予防する。さらに他の実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は腫瘍または癌腫細胞の非癌性組織への浸潤を阻害または予防する。
【００６９】
本発明の具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、１つまたはそれ以上の追加的な治療的に有効な抗体と共にこれを必要とする対象に投与しうる。前記の１つまたはそれ以上の追加的な治療的に有効な抗体は、ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９上の追加的な決定基、他のケモカイン、他のケモカイン受容体、腫瘍または癌腫特異抗原、ウイルス、細菌または寄生虫抗原、癌細胞生成物またはアポトーシスのレムナントを含むがこれに限定されない他の可溶性または細胞表面リガンドまたは受容体に向けられてもよい。抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、１つまたはそれ以上の追加的な治療的に有効な抗体の前、同時、および／またはその後に投与しうる。
【００７０】
具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、１つまたはそれ以上の追加的な治療的に有効な抗体の、腫瘍または癌腫細胞を死滅させる際の有効性を増強する。より具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、腫瘍または癌腫細胞を死滅させるために必要とされる１つまたはそれ以上の追加的な治療的に有効な抗体の量を減少させる。
【００７１】
さらに具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、確立した腫瘍または癌腫からの腫瘍または癌腫細胞の遊走または転移を阻害または予防し、１つまたはそれ以上の追加的な治療に有効な抗体の腫瘍または癌腫細胞を死滅させる際の局所的有効性を増強する。さらに他の具体的な実施形態においては、治療的に有効な量の抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体は、腫瘍または癌腫細胞の非癌性組織への浸潤を阻害または予防し、１つまたはそれ以上の追加的な治療的に有効な抗体の腫瘍または癌腫細胞を死滅させる際の局所的有効性を増強する。
【００７２】
１つの実施形態においては、抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体は細胞毒性物質と複合体化した抗体である。他の実施形態においては、抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体は、化学療法剤などの他の抗癌剤と共に投与される。
【００７３】
本願の他の態様は、ケモカインＣＣＬ２５のその受容体を担持する細胞との相互作用を阻害する方法に関する。１つの実施形態においては、方法は、細胞を哺乳類ＣＣＬ２５またはＣＣＬ２５の一部と結合する抗体またはその機能的フラグメントの有効量と接触させることを含む。他の実施形態においては、方法は、タンパク質、ペプチドまたはコード遺伝子としてのＣＣＬ２５免疫原の有効量により対象を免疫してＣＣＬ２５の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することという段階を含む。
【００７４】
本発明の他の態様は、ＣＣＲ９を担持する細胞を哺乳類ＣＣＲ９またはＣＣＲ９の一部と結合する抗体またはその機能的フラグメントの有効量と接触させることを含む、ＣＣＲ９担持細胞のそのリガンドとの相互作用を阻害する方法に関する。
【００７５】
他の実施形態においては、癌を治療する方法は、癌または悪性細胞において抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせを発現する有効量の発現ベクターを、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態においては、癌を治療する方法は、有効量のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９免疫原により対象を免疫してＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する抗体を産生するよう宿主を誘導するという段階を含む。
【００７６】
発現ベクターは、抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体をコードするヌクレオチドの標的細胞内へのヌクレオチド送達が可能で、かつ標的細胞において抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体を発現する任意のベクターとすることができる。他の実施形態においては、発現ベクターはＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９をコードするヌクレオチドを標的細胞に送達して抗ＣＸＣＬ１３および／またはＣＸＣＲ５抗体を産生するよう宿主を誘導することができる。発現ベクターの例はウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む。発現ベクターの例はウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む。
【００７７】
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスなどの他の大容量ウイルスベクターを含むが、これに限定されない。これらのウイルスを発現ベクターとしての使用に適切とするその性質を共有する任意のウイルスファミリーも含まれる。
【００７８】
（レトロウイルスベクター）
レトロウイルスは、任意の種類、サブファミリー、属および親和性を含めた、レトロウイルス科に属する動物ウイルスである。遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを用いるための方法の例は、その教示を参照文献として本願に援用する、米国特許第４，８６８，１１６号および第４，９８０，２８６号；ＰＴＣ国際出願第９０／０２８０６号および第８９／０７１３６号；およびMulligan（Science 260:926-932 (1993)；に記載されている。
【００７９】
（アデノウイルスベクター）
組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および数多くの他の組織部位への直接的インビボ送達後に、高効率ウイルス転移を達成することが示されている。組換えアデノウイルスは特異的な細胞表面受容体と結合することにより遺伝子形質導入を達成し、ウイルスはその後野生種または複製欠損アデノウイルスと同じ様式で受容体を介したエンドサイトーシスにより内部移行する。
【００８０】
ウイルスベクターは、１つまたはそれ以上のウイルス遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものであることが可能であり、かつこれらのビリオンはヒト２９３細胞株などの補体細胞株によって生成される。１つの実施形態においては、Ｅ１遺伝子がアデノウイルスベクターから除去される。他の実施形態においては、Ｅ１およびＥ３遺伝子がともにアドネオウイルスベクターから除去される。他の実施形態においては、Ｅ１およびＥ４遺伝子がともにアドネオウイルスベクターから除去される。他の実施形態においては、アデノウイルスベクターはガットレスアデノウイルスベクターである。
【００８１】
（アデノ随伴ウイルスベクター）
他の種類のウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づいている。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができかつヒトに対して非病原性であるので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは約４から５ｋｂを輸送することが可能であり、かつ野生種ＡＡＶは１９番染色体に安定的に挿入されることが知られている。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この種のベクターの特に好ましい実施形態は、カリフォルニア州サンフランシスコのＡｖｉｇｅｎにより生成されるＰ４．１  Ｃベクターであり、これは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼウイルス遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／または緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含むことができる。
【００８２】
他の種類のＡＡＶウイルスにおいては、ＡＡＶは、異種遺伝子と機能的に関連する細胞特異性発現を誘導するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットの両側にある１対の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。この文脈において、異種はＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスにとって固有でない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を意味する。
【００８３】
典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域は欠失し、安全で非細胞毒性のベクターを生成している。ＡＡＶ  ＩＴＲ、またはその修飾は感染性または部位特異的組み込みを付与するが、細胞毒性は付与せず、かつプロモーターは細胞特異的発現を誘導する。
【００８４】
（大ペイロードウイルスベクター）
大型ヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学実験により、それによってヘルペスウイルスへの感染を許容する細胞に大きな異種ＤＮＡフラグメントをクローニングし、増殖させ、かつ確立することのできる手段が提供されている（Sun他、Nature genetics 8: 33-41, 1994；CotterおよびRobertson, Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999）。これらの大型ＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡフラグメントを特定の細胞に送達する可能性を有する。ＥＢＶ組換え体は、感染Ｂ細胞において大きなＤＮＡ片をエピソームＤＮＡとして維持することができる。ヒトゲノムインサートを３３０ｋｂまで担持する個々のクローンは遺伝学的に安定と見られる。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶ感染中に構成的に発現する特異的なＥＢＶ核タンパク質であるＥＢＮＡ１を必要とする。さらに、これらのベクターは、一時的にインビトロで大量のタンパク質を生成することのできるトランスフェクションを目的として使用することができる。ヘルペスウイルスアンプリコン系も、＞２２０ｋｂのＤＮＡ片をパッケージ化してＤＮＡをエピソームとして安定的に維持できる細胞を感染させるために使用されている。他の有用な系は、たとえば複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターを含む。
【００８５】
非ウイルスベクターはプラスミド発現ベクターを含む。プラスミドベクターは、典型的には、その中に追加的なＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二重鎖ＤＮＡループを含む。
【００８６】
ウイルスおよび非ウイルス発現ベクターの両者において、単数または複数の抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、ｍＲＮＡ合成を誘導するための適切な転写制御配列（プロモーター、および任意に１つまたはそれ以上のエンハンサー）の近傍かつその方向に配置される。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は適切な転移制御配列と機能的に関連する。そのようなプロモーターの例は：ＣＭＶの前初期プロモーターであるＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーターなどのウイルスプロモーター、バキュロウイルスの多面体プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰＬプロモーター、および真核生物細胞またはそのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを含む。プロモーターは組織特異的プロモーターでもよい。
【００８７】
発現ベクターは、典型的には翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネータも含む。ベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養についてのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性などの、またはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００８８】
発現ベクターは、たとえば翻訳の効率を改善するなどの、追加的発現要素も含むことができる。これらのシグナルは、たとえばＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列などを含むことができる。たとえば一部の例では、翻訳開始コドンおよび関連配列要素は目的のポリヌクレオチド配列（例：天然開始コドン）と同時に適切な発現ベクターに挿入される。そのような場合、追加的翻訳調節シグナルは不要である。しかし、ポリペプチドコード配列、またはその一部のみが挿入される場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外因的翻訳調節シグナルが提供される。開始コドンは、目的のポリヌクレオチド配列を確実に翻訳するために、正しいリーディングフレームに配置される。外因性翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の多様な由来とすることができる。所望される場合、発現の効率は使用する細胞系に適したエンハンサーの包含によってさらに上昇させることが出来る。
【００８９】
１つの実施形態においては、発現ベクターは誘導可能なまたは調節可能な発現系を含む。調節可能な発現系を以下に簡潔に記述する：
【００９０】
（エクジソン系）
エクジソン系は、ショウジョウバエに認められる脱皮誘導系に基づいているが、修飾して哺乳類細胞における発現の誘導を可能としている。系は、ショウジョウバエステロイドホルモンエクジソンの類似体ムリステロンＡを用いて、ヘテロ二量体核酸受容体を介した目的の遺伝子の発現を活性化する。発現レベルは、哺乳類細胞の生理学に影響することなく、基礎レベルを２００倍上回ると報告されている。
【００９１】
（プロゲステロン系）
プロゲステロン受容体は、通常は刺激されて特異的なＤＮＡ配列と結合し、かつそのホルモンリガンドとの相互作用を経て転写を活性化する。逆に、プロゲステロン拮抗物質ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、ホルモン誘導性核輸送およびその後のＤＮＡ結合を遮断することができる。刺激されてＲＵ４８６との相互作用を経て結合することのできるプロゲステロン受容体の変異型が生成されている。特異的で調節可能な転写因子を生成するために、プロゲステロン受容体のＲＵ４８６結合ドメインは、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインおよびＨＳＶタンパク質ＶＰ１６のトランス活性化ドメインと融合されている。キメラ因子はＲＵ４８６の非存在下で不活性である。しかし、ホルモンの付加はキメラタンパク質の立体構造変化を誘導し、さらにこの変化はＧＡＬ−４結合部位との結合およびＧＡＬ−４結合部位を含むプロモーターからの転写の活性化を可能とする。
【００９２】
（ラパマイシン系）
ＦＫ５０６およびラパマイシンなどの免疫抑制剤は、特異的細胞タンパク質と結合しかつその二量体化を促進することにより作用する。たとえば、ラパマイシンのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）との結合によりもう１つのラパマイシン結合タンパク質ＦＲＡＰとのヘテロ二量体化がもたらされ、これは薬剤の除去により逆転することができる。薬剤の添加により２つのタンパク質を接合する能力により、転写を含む数多くの生物学的プロセスの調節が増強される。キメラＤＮＡ結合ドメインはＦＫＢＰと融合されており、これにより融合タンパク質の特異的ＤＮＡ結合配列との結合が可能となる。転写活性化ドメインもＦＲＡＰと融合されている。これら２つの融合タンパク質が同じ細胞において共発現する場合、ラパマイシンの添加に媒介されたヘテロ二量体化により完全に機能的な転写因子を形成することができる。二量体化キメラ転写因子は、その後合成ＤＮＡ結合配列のコピーを含む合成プロモーター配列と結合することができる。この系は、アデノウイルスおよびＡＡＶベクターに成功裏に組み込まれている。
【００９３】
（癌を治療または予防するためのＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の発現または活性を阻害する物質の使用）
本願の他の態様は、癌を治療または予防するためのＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の発現または活性を阻害する物質の使用に関する。他の実施形態においては、使用は、（１）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現を阻害するか、または（２）ＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害するか、または（３）ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の生物学的活性を阻害する物質を発現する有効量の発現ベクターを、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。１つの実施形態においては、ＣＣＬ２５およびＣＣＲ９の生物学的活性はＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を含む。
【００９４】
他の実施形態においては、対象は癌細胞におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現上昇をもたらす癌と診断される。そのような癌の例は芽腫、ユーケミア、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、胚細胞腫瘍、および卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、インスリノーマ、腺癌、線扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脳癌、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、下垂体癌および骨癌などの癌腫を含むが、これに限定されない。
【００９５】
他の実施形態においては、方法は、対象に由来する組織中のＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９発現のレベルを判定すること、および組織においてＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の上昇レベルが検出される場合にのみ、対象に対して物質を投与することをさらに含む。
【００９６】
１つの実施形態においては、発現ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態においては、発現ベクターは非ベクターベクターである。他の実施形態においては、発現ベクターは、ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９をコードするヌクレオチドを標的細胞内に送達して抗ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９抗体を産生するよう宿主を誘導することができる。
【００９７】
他の実施形態においては、物質は抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせである。
【００９８】
さらに他の実施形態においては、物質は機能的核酸である。機能的核酸は、標的分子と結合することまたは特異的反応を触媒することなどの特異的機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、標的分子が有する特異的活性の阻害物質として作用することができる。機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチドなどの任意の巨大分子と相互作用することができる。したがって、機能的核酸はＣＣＬ２５またはＣＣＲ９のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと相互作用して発現を阻害したり、あるいはＣＣＬ２５またはＣＣＲ９タンパク質と相互作用して活性を阻害したりすることができる。機能的核酸は、しばしば標的分子と機能的核酸分子の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するよう設計される。他の状況では、機能的核酸分子と標的分子の間の特異性認識は、機能的核酸分子と標的分子の間の配列相同性に基づくのではなく、むしろ特異的認識が発生することを可能とする三次構造の形成に基づく。機能的核酸分子の例はｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列を含む。
【００９９】
ｓｉＲＮＡは、２段階機構：開始段階およびエフェクター段階を包含するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与する。第１の段階では、投入二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が処理されて２１〜２３ヌクレオチドの「ガイド配列」などの小さなフラグメントとなる。ＲＮＡ増幅は全ての動物で発生する。典型的には、その後、ガイドＲＮＡはＲＮＡを分解することのできるタンパク質ＲＮＡ複合体であるヌクレアーゼ複合体に組み込まれることがあり、これはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれている。このＲＩＳＣ複合体は第２のエフェクター段階で作用し、ガイドＲＮＡによって塩基対形成相互作用を経て認識されるｍＲＮＡを破壊する。ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの分解を引き起こす事象の引き金となる、任意の手段による二重鎖ＲＮＡの細胞への導入を包含する。ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシングの１形態である。本願に開示されたｓｉＲＮＡに加えて、ＲＮＡｉにおいて作用することのできるＲＮＡヘアピンも開示される。ＲＮＡｉ分子を作製しかつ使用することの記載については、その全文、および少なくともＲＮＡｉ分子の送達および作製に関する形成材料を本願に参照文献として援用するHammond他、Nature Rev Gen 2: 110-119 (2001)；Sharp, Genes Dev 15: 485-490 (2001), Waterhouse他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23): 13959-13964（1998）を参照されたい。
【０１００】
ＲＮＡｉは、哺乳類細胞を含む多くの種類の細胞で作用することが示されている。哺乳類細胞で作用するには、ＲＩＳＣ複合体内で標的化配列として用いられるＲＮＡ分子がより短いことが好ましい。たとえば、５０または４０または３０または２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長未満またはこれと等しい。これらのＲＮＡ分子は、開裂させようとする標的ＲＮＡに対して３’および５’末端に突出を有することも可能である。これらの突出は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０ヌクレオチド長、またはこれ未満またはこれと等しいことが可能である。
【０１０１】
アンチセンス分子は、正準または非正準塩基対形成を経て標的核酸分子と相互作用するよう設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、たとえばＲＮアーゼＨ媒介性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解などを経た標的分子の破壊を促進するよう設計される。代替的に、アンチセンス分子は、転写または複製などの、標的分子上で通常発生するプロセシング機能を中断するよう設計される。アンチセンス分子は標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子で最もアクセスしやすい領域を発見することによるアンチセンス効率の最適化のための数多くの方法が存在する。典型的な方法は、インビトロ選択実験、およびＤＭＳおよびＤＥＰＣを用いたＤＮＡ修飾試験であろう。アンチセンス分子が１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満かまたはこれと等しい解離定数（ｋｄ）で標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用を支援する方法および技術の典型的な見本は、以下の非制限的な米国特許の一覧に認めることができる：いずれもその全文を本願に参照文献として援用する第５，１３５，９１７号、第５，９９４，３２０号、第６，０４６，３１９号、および第６，０５７，４３７号。
【０１０２】
アプタマーは、好ましくは特異的な様式で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループまたはＧ−四重鎖などの規定の二次および三次構造に折りたたまれる長さの範囲が１５〜５０塩基の小さな核酸である。アプタマーはケモカインと結合しかつその機能を遮断することができる（例：Marro他、Biochem Biophys Res Commun. 2006 Oct 13;349:270-6などを参照）。アプタマーは、標的分子から１０−１２Ｍ未満のｋｄで非常に堅く結合することができる。アプタマーは１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは非常に高度の特異性で標的分子と結合することができる。たとえば、アプタマーは分離され、標的分子と、分子上でただ１つの位置が異なる他の分子の結合親和性は１００００倍以上異なる（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、標的分子との間のｋｄが、バックグラウンド結合分子との間のｋｄより少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００分の１低いことが好ましい。多様な種々の標的分子と結合するアプタマーを作製および使用する方法の典型的な例は、以下の非制限的な米国特許の一覧に認めることができる：いずれもその全文を本願に参照文献として援用する第５，４７６，７６６号、第５，８６１，２５４号、第６，０３０，７７６号、および第６，０５１，６９８号。
【０１０３】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することのできる核酸分子である。したがって、リボザイムは触媒的核酸である。リボザイムが分子間反応を触媒することは好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム（例：米国特許第５，３３４，７１１号および第５，８６１，２８８号、国際公開第９８５８０５８号および第９７１８３１２号などを参照）、ヘアピンリボザイム（例：米国特許第５，６３１，１１５号および第６，０２２，９６２号などを参照）、およびテトラヒメナリボザイム（例：米国特許第５，５９５，８７３号および５，６５２，１０７号などを参照）などの、天然の系に認められるリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する数多くの異なる種類のリボザイムがある。天然の系には認められないが、新規に特異的反応を触媒するよう設計されているリボザイムも数多くある（例：米国特許第５，５８０，９６７号および第５，９１０，４０８号を参照）。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を開裂し、またより好ましくはＲＮＡ基質を開裂する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識およびこれとの結合およびその後の開裂を経て核酸基質を開裂する。この認識は、多くの場合大部分が正準または非正準塩基対相互作用に基づく。標的基質の認識は標的基質の配列に基づくので、この特性により、リボザイムは核酸の標的特異的な開裂にとって特に優れた候補となる。種々の多様な反応を触媒するリボザイムを作製および使用する方法の典型的な例は、いずれもその全文を本願に参照文献として援用する米国特許：第５，６４６，０４２号、第５，８６９，２５３号、第５，９８９，９０６号、および第６，０１７，７５６号に認めることができる。
【０１０４】
三重鎖形成機能性核酸分子は、二重鎖または単鎖核酸のいずれかと相互作用することのできる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、ここで３本のＤＮＡ鎖がワトソン−クリックおよびフーグスティン型塩基対の両者に依存する複合体を形成する。三重鎖分子は標的領域と高い親和性および特異性で結合することができるので好ましい。三重鎖形成分子は１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。種々の多様な標的分子と結合する三重鎖形成分子を作製および使用する方法の典型的な例は、いずれもその全文を本願に参照文献として援用する米国特許：第５，１７６，９９６号、第５，６８３，８７４号、第５，８７４，５６６号、および第５，９６２，４２６号に認めることができる。
【０１０５】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、またこの複合体は標的分子を開裂するＲＮアーゼＰによって認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的標的とするよう設計することができる。ＲＮアーゼＰは、細胞内でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを支援する。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いることにより、細菌ＲＮアーゼＰを補充してほぼあらゆるＲＮＡ配列を開裂することができる（例：Yaleによる国際公開第９２／０３５６６号、およびForsterおよびAltman、Science 238:407-409 (1990)を参照）。 
【０１０６】
同様に、ＲＮＡの真核細胞ＥＧＳ／ＲＮアーゼＰ指向開裂を利用して、真核細胞内で所望の標的を開裂することができる。（Yuan他、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010（1992）；Yaleによる国際公開第９３／２２４３４号；Yaleによる国際公開第９５／２４４８９号；YuanおよびAltman, EMBO J 14:159-168（1995）、およびCarrara他、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2627-2631（1995）を参照）。種々の多様な標的分子の開裂を促進するEＧＳ分子を作製および使用する方法の典型的な例は、以下の非制限的な米国特許の一覧に認めることができる：いずれもその全文を本願に参照文献として援用する第５，１６８，０５３号、第５，６２４，８２４号、第５，６８３，８７３号、第５，７２８，５２１号、第５，８６９，２４８号、および第５，８７７，１６２号。
【０１０７】
（ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現上昇を有する癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法）
本願の他の態様は、対象におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現上昇を有する癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法に関する。
【０１０８】
１つの実施形態においては、方法は、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を対象に投与することという段階を含む。
【０１０９】
他の実施形態においては、方法は、対象において抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせを発現する発現ベクターを前記対象に投与することという段階を含む。
【０１１０】
他の実施形態においては、方法は、ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の発現、またはＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の生物学的活性、またはＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害することのできる物質を発現する発現ベクターを対象に投与することを含む。他の実施形態においては、発現ベクターは、ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９をコードするヌクレオチドを標的細胞内に送達して抗ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９抗体を産生するよう宿主を誘導することができる。
【０１１１】
癌細胞におけるＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９の発現は、免疫染色または定量的ＰＣＲなどの技術上周知の方法を用いて判定することができる。ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９を過剰発現することが知られている癌細胞は、黒色腫細胞および癌腫細胞を含むが、これに限定されない。癌腫の例は卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、インスリノーマ、腺癌、線扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脳癌、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、下垂体癌および骨癌を含むが、これに限定されない。
【０１１２】
１つの実施形態においては、癌細胞は脳癌細胞である。他の実施形態においては、癌細胞は骨癌細胞である。他の実施形態においては、癌細胞は下垂体癌細胞である。さらに他の実施形態においては、癌細胞は卵巣癌細胞である。
（化学療法の効果を増強するための方法）
【０１１３】
本願の他の態様は、化学療法の効果を増強するための方法に関する。１つの実施形態においては、方法は、癌に対する化学療法を受けている対象に、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせの有効量を投与することを含む。
【０１１４】
他の実施形態においては、方法は、癌に対する化学療法を受けている対象に、抗ＣＣＬ２５抗体、または抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせを発現する有効量の発現ベクターを投与することを含む。
【０１１５】
他の実施形態においては、方法は、癌に対する化学療法を受けている対象に、ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の発現、またはＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の生物学的活性、またはＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害することができる物質を発現する発現ベクターを投与することを含む。他の実施形態においては、発現ベクターは、ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９をコードするヌクレオチドを標的細胞に送達して抗ＣＣＬ２５および／またはＣＣＲ９抗体を産生するよう宿主を誘導することができる。
【０１１６】
１つの実施形態においては、対象は芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍に対する化学療法を受けている。他の実施形態においては、対象は脳癌に対する化学療法を受けている。他の実施形態においては、対象は骨癌に対する化学療法を受けている。他の実施形態においては、対象は下垂体癌に対する化学療法を受けている。さらに他の実施形態においては、対象は卵巣癌に対する化学療法を受けている。
【０１１７】
（癌を治療または予防するための組成物およびキット）
本願の他の態様は、癌を治療または予防するための組成物およびキットに関する。１つの実施形態においては、組成物は（１）抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせ、および（２）医薬品として許容できる担体を含む。他の実施形態においては、組成物は（１）抗ＣＣＬ２５抗体、抗ＣＣＲ９抗体、またはその組み合わせについてのコード配列を担持する発現ベクター、および（２）医薬品として許容できる担体を含む。他の実施形態においては、組成物は、（１）ＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の発現、またはＣＣＬ２５またはＣＣＲ９の生物学的活性、またはＣＣＬ２５とＣＣＲ９の相互作用を阻害する物質についてのコード配列を担持する発現ベクター、および（２）医薬品として許容できる担体を含む。
【０１１８】
１つの実施形態においては、前記組成物およびキットは芽腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または胚細胞腫瘍を治療または予防するためのものである。具体的な実施形態においては、前記癌腫は卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、インスリノーマ、腺癌、線扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脳癌、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、下垂体癌および骨癌からなる群から選択される。
【０１１９】
本願の組成物は、抗ＣＣＬ２５または抗ＣＣＲ９抗体単独などの単一の種類の抗体を含むことも、あるいは両種類の抗体を含むこともある。組成物は、治療する具体的な適応症に対する必要に応じ、上述の１つまたはそれ以上の追加的な抗原に特異的な抗体、好ましくは互いに有害に作用しない相補的な活性を有する抗体の治療的に有効な量も含むことがある。たとえば、治療する癌腫が卵巣癌である場合、単一の製剤に、抗ＣＣＬ２５および／または抗ＣＣＲ９抗体を、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ１２５および／または抗ＴＡ９０などの１つまたはそれ以上のさらなる抗癌決定因子抗体と共に含む治療的製剤を調製することが望ましいこともある。本願の一部の実施形態においては、治療的抗体を化学療法剤または細胞毒性剤と組み合わせることもある。本願の他の実施形態においては、治療的抗体は抗炎症剤または血栓溶解剤と組み合わせてもよい。このような薬剤は、意図する目的にとって効果的である量で組み合わせて適切に存在する。
【０１２０】
本願で用いられる文言「医薬品として許容できる担体」は、医薬品としての投与に適合した、任意のかつ全ての溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、放出制御担体、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、分散媒体、コーティング、抗菌または抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含むことを意図する。医薬品として活性である物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は技術上周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効化合物として不適合である範囲を除き、組成物におけるその使用は想定される。補足的な薬剤も組成物に組み入れることができる。一定の実施形態においては、医薬品として許容できる担体は血清アルブミンを含む。
【０１２１】
本願の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するよう製剤化される。投与経路の例は、鞘内、動脈内、静脈内、皮内、皮下、口腔内、経皮（局所）および経粘膜などの非経口投与を含む。一定の実施形態においては、医薬組成物は腫瘍組織中に直接投与される。
【０１２２】
非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用蒸留水、食塩水溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリンなどの無菌希釈剤；プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調節することができる。非経口製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または多人数用バイアルに封入することができる。
【０１２３】
注射用途に適した医薬組成物の例は、無菌水溶液（水溶性の場合）、または分散剤および無菌注射液または分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与用の適切な担体は生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシパニー）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。いずれの場合も、注射用組成物は無菌でなければならず、かつ容易なシリンジ操作性が存在する程度まで流動性でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、かつ細菌または真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体とすることができる。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングなどの使用、分散剤の場合は必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１２４】
微生物の作用の予防は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの多様な抗菌および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、たとえば糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類および塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長期間の吸収は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによって引き起こすことができる。
【０１２５】
無菌注射液は、適切な溶媒中の必要とされる量の活性化合物（例：抗ＣＣＬ２５または抗ＣＣＲ９抗体など）を、必要に応じて、上に列挙された成分のうち１つまたはこれらの組み合わせに組み入れたのち、濾過滅菌することにより調製することができる。分散剤は、一般的に、上に列挙した成分より基本分散媒体および必要とされる他の成分を含有する無菌担体に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過したその溶液から活性、成分＋任意の所望の追加的成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２６】
経口組成物は、一般的に不活性溶媒または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、または圧縮して錠剤とすることができる。経口治療投与を目的として、活性化合物を添加剤と組み合わせかつ錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、液状担体中の化合物が口腔的に施用されかつ素早く動かした後で喀出または嚥下されることを特徴とする、含嗽液としての使用のための液状担体を用いて調製することもできる。医薬品として適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分のうちいずれか、または同様の性質の化合物を含むことができる：微結晶性セルロース、ガムトラガント、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アルギニン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの着香料。
【０１２７】
化合物は、吸入による投与のために、加圧容器からのエアロゾルスプレー、またはたとえば二酸化炭素といったガスなどの適切な噴射剤を収容するディスペンサー、またはネブライザーの形態で送達される。
【０１２８】
全身投与も、経粘膜的手段によるかまたは経皮的手段によることができる。経粘膜的または経皮的投与のために、透過しようとするバリアに適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は技術上周知であり、かつ、たとえば経粘膜投与のために界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻腔内スプレーまたは坐薬の使用によって達成することができる。経皮投与のために、医薬組成物は技術上周知である通りに軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに製剤化する。
【０１２９】
一定の実施形態においては、医薬組成物は、活性成分の持続放出または制御放出のために製剤化される。エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者にとって明らかである。材料は、たとえばＡｌｚａ社やＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社などから商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化したリポソームを含む）も、医薬品として許容できる単体として用いることができる。これらは、たとえば米国特許第４，５２２，８１１に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【０１３０】
投与を容易にし、かつ用量を均一化するために経口または非経口組成物を用量単位形態に製剤化することは特に有益である。本願で用いられる用量単位形態は、治療しようとする対象に単位用量として適合化した物理的に分離した単位を含み；各単位は、必要とされる医薬品担体と共に、所望の治療的効果を生成するよう算出された事前に定められた量の活性化合物を含む。本願の用量単位形態の規格は、活性化合物の特有の性質および達成しようとする具体的な治療効果、および個体の治療のためのそのような活性化合物を調合する技術に固有の制限によって規定されかつこれに直接依存する。
【０１３１】
そのような化合物の毒性および治療的効果は、たとえばＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）を判定するためなどの、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順によって判定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比率は治療係数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表示することができる。大きな治療係数を示す化合物が望ましい。毒性副作用を示す化合物を用いることもあるものの、非罹患細胞に対する潜在的な障害を最小化し、かつこれにより副作用を低下させるために、そのような化合物の標的を罹患組織の部位とする送達システムを設計するよう注意を払うべきである。
【０１３２】
細胞培養測定および動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて用いるための用量範囲の製剤化に用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性をほとんど伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。用量は、使用する剤型および利用する投与経路に依存してこの用量範囲内で変動しうる。本願の方法において用いられる任意の化合物について、治療的に有効な用量は始めに細胞培養分析から推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で判定されるＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう製剤化される。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に判定することができる。一定の実施形態においては、単回用量は０．０１μｇから５０ｍｇの抗ＣＣＬ２５または抗ＣＣＲ９抗体を含有する。医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサーに投与のための指示と共に収容することができる。
【０１３３】
本願は、制限的と解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本願の全体に引用された全ての参照文献、特許および公開特許明細の内容、さらには図面および表は、本願に参照文献として組み入れられる。
【実施例１】
【０１３４】
（多様な癌腫におけるＣＣＬ２５およびＣＣＲ９発現および活性のインビトロ分析）
図１に示すように、ＣＣＬ２５は乳癌組織によって発現される。乳癌組織をアイソタイプ対照または抗ＣＣＬ２５抗体で染色した。マゼンタ色はＣＣＬ２５染色を示す。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳシステムでデジタル画像をキャプチャした。示された乳癌の代表的な症例およびＣＣＬ２５の免疫強度。
【０１３５】
図２は、乳癌細胞株増殖におけるＣＣＬ２５のシスプラチン誘導性減少の阻害が証明されることを証明する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、シスプラチン濃度を上昇させながら、０または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋アイソタイプ対照または抗ＣＣＲ９  Ａｂで２４時間培養した。細胞増殖はＢｒｄＵ取り込みで判定し、測定は３回ずつ実施して３回繰り返した。アスタリクスはＣＣＬ２５処理ＢｒＣａ細胞と未処理ＢｒＣａ細胞の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１３６】
図３Ａ〜Ｂは、ＣＣＬ２５が乳癌細胞をシスプラチン誘導性アポトーシスから保護することを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、５ｍｇ／ｍＬシスプラチン単独または０または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣＣＲ９またはアイソタイプ対照とともに２４時間培養した（Ａ）。細胞を回収し、アネキシンＶおよびポピドンヨウ素（ＰＩ）で染色した。染色細胞のフローサイトメトリーによる分析ではアポトーシス（アネキシンＶ陽性）細胞を生存（非蛍光）および壊死（ＰＩ陽性）細胞と識別した。アスタリクスはＣＣＬ２５処理乳癌細胞と未処理乳癌細胞の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を、５ｍｇ／ｍＬシスプラチンまたは０または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋抗ヒトＣＣＲ９または１ｍｇ／ｍＬ  アイソタイプ対照Ａｂとともに２４時間培養した（Ｂ）。アポトーシス細胞の検出は、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法で遂行した。アポトーシス細胞は、標準的な蛍光フィルターセット（５２０±２０ｎｍ）により核緑色蛍光を示した。アスタリクスはシスプラチンＣＣＬ２５処理乳癌細胞株と未処理乳癌細胞株の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１３７】
図４Ａ〜Ｂは、乳癌細胞株におけるＣＣＬ２５−ＣＣ９相互作用によるＰＩ３Ｋ活性化およびＡｋｔ活性化を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＣＣＬ２５、シスプラチンおよび特異的キナーゼ阻害剤（ワートマニンおよびＰＦ−５７３，２２８）による処理後にＰＩ３ＫおよびＡｋｔを活性化するその能力について試験した。原位置での総ＰＩ３ＫおよびＡｋｔレベルおよびリン酸化ＰＩ３ＫおよびＡｋｔレベルを、シスプラチンおよびキナーゼ阻害剤の存在下でＣＣＬ２５刺激の前（０分）または刺激後（５または１０分）にＦａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣｅｌｌベースのＥＬＩＳＡで定量した。３回ずつ測定した３回の独立した実験から総ＰＩ３ＫまたはＡｋｔに対する活性化ＰＩ３Ｋ（Ａ）またはＡｋｔ（Ｂ）の比率±ＳＥＭを示す。アスタリクスは未処理細胞とＣＣＬ２５処理細胞とＣＣＬ２５＋シスプラチン処理細胞の間の統計的有意差を示す。
【０１３８】
図５Ａ〜Ｂは、乳癌細胞株のＣＣＬ２５処理後のＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲリン酸化を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＣＣＬ２５、シスプラチンおよび特異的キナーゼ阻害剤（ワートマニンおよびＰＦ−５７３，２２８）による処理後にＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲをリン酸化するその能力について試験した。原位置での総ＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲレベルおよびリン酸化ＧＳＫ−３βおよびＦＫＨＲレベルを、シスプラチンおよびキナーゼ阻害剤の存在下でＣＣＬ２５刺激の前（０分）または刺激後（５または１０分）にＦａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣｅｌｌベースのＥＬＩＳＡで定量した。３回ずつ測定した３回の独立した実験から総ＧＳＫ−３βまたはＦＫＨＲに対するリン酸化ＧＳＫ−３β（Ａ）またはＦＫＨＲ（Ｂ）の比率±ＳＥＭを示す。アスタリクスは未処理細胞とＣＣＬ２５処理細胞とＣＣＬ２５＋シスプラチン処理細胞の間の統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１３９】
図６は卵巣癌組織によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。非腫瘍性（ｎ＝８）、漿液性腺癌（ｎ＝９）、漿液性乳頭状嚢腺腫（ｎ＝１）、類子宮内膜腺癌（ｎ＝５）、粘液性腺癌（ｎ＝２）、嚢腺腫（ｎ＝３）、粘液性ボーダーライン腺癌（ｎ＝１）、明細胞癌（ｎ＝５）、顆粒膜細胞腫瘍（ｎ＝３）、未分化胚細胞腫（ｎ＝３）、移行上皮癌（ｎ＝３）、ブレンネル腫瘍（ｎ＝１）、卵黄嚢腫瘍（ｎ＝４）、腺癌（ｎ＝１）および線維腫（ｎ＝２）に由来する卵巣癌組織をアイソタイプ対照または抗ＣＣＲ９およびＣＣＬ２５抗体で染色した。茶色（ＤＡＢ）はＣＣＲ６染色をし、かつマゼンタ色の染色はＣＣＬ２５を示す。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳシステムで各スライドのデジタル画像をキャプチャした。典型的な症例はＣＣＲ９およびＣＣＬ２５の免疫強度を示す。
【０１４０】
図７Ａ〜Ｂは卵巣癌組織によるＣＣＬ２５発現の分析を示す。ＣＣＬ２５発現を分析し、変形ボックスプロットで示した（Ａ）。ボックス内の下、中央および上の線は、それぞれ第１四分位（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）および第３四分位（Ｑ３）を示す。上と下のひげは中央値±１．５（Ｑ３−Ｑ１）を表す。非腫瘍との有意差を下のパネルに示す。表（Ｂ）は、非腫瘍性組織（ＮＮ）と、漿液性腺癌（ＳＡ）、類子宮内膜腺癌（ＥＣ）、粘液性腺癌（ＭＡ）、嚢腺腫（Ｃ）、粘液性ボーダーライン腺癌（ＭＢＡ）、明細胞癌（ＣＣＣ）、顆粒膜細胞腫瘍（ＧＣＴ）、未分化胚細胞腫（Ｄ）、移行上皮癌（ＴＣＣ）、ブレンネル腫瘍（ＢＴ）、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、腺癌（Ａ）および線維腫（Ｆ）とのそれぞれのｐ値または有意差を示す。
【０１４１】
図８Ａ〜Ｂは卵巣癌組織によるＣＣＲ９発現の分析を示す。ＣＣＲ９発現を分析し、変形ボックスプロットで示した（Ａ）。ボックス内の下、中央および上の線は、それぞれ第１四分位（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）および第３四分位（Ｑ３）を示す。上と下のひげは中央値±１．５（Ｑ３−Ｑ１を表し非腫瘍との有意差を下のパネルに示す。表（Ｂ）は、非腫瘍性組織（ＮＮ）と、漿液性腺癌（ＳＡ）、類子宮内膜腺癌（ＥＣ）、粘液性腺癌（ＭＡ）、嚢腺腫（Ｃ）、粘液性ボーダーライン腺癌（ＭＢＡ）、明細胞癌（ＣＣＣ）、顆粒膜細胞腫瘍（ＧＣＴ）、未分化胚細胞腫（Ｄ）、移行上皮癌（ＴＣＣ）、ブレンネル腫瘍（ＢＴ）、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、腺癌（Ａ）および線維腫（Ｆ）とのそれぞれのｐ値または有意差を示す。
【０１４２】
図９Ａ〜Ｂは卵巣癌細胞株によるＣＣＲ９およびＣＣＬ２５発現を示す。卵巣癌細胞をフルオレセイン（ＦＩＴＣ）複合体化抗ＣＣＲ９抗体またはＦＩＴＣ複合体化アイソタイプ対照抗体で染色しさらにＦＡＣＳで分析した（Ａ）。卵巣癌細胞をＦＩＴＣ複合体化抗ＣＣＲ９で染色し、細胞内ＣＣＬ２５をフィコエリスリン（ＰＥ）複合体化ＣＣＬ２５抗体で染色し、核はＤｒａｑ−５で染色した（Ｂ）。融合データは、表面上のＣＣＲ９発現および核内のＣＣＬ２５発現を示す。
【０１４３】
図１０Ａ〜Ｂは卵巣癌細胞による低酸素調節ＣＣＲ９  ｍＲＮＡおよび表面タンパク質発現を示す。正常酸素条件および低酸素条件下のＳＫＯＶ−３細胞株または正常一次卵巣組織から総ＲＮＡを分離した。ＣＣＲ９  ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を３回ずつ実施した。転写物のコピーは、１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーの実数に対して＋ＳＥで表示する（Ａ）。正常酸素下および低酸素下のＳＫＯＶ−３細胞をＰＥ複合体化アイソタイプ対照抗体（Ａｂ）（塗りつぶしたヒストグラム）またはＰＥ複合体化抗ＣＣＲ９モノクローナルＡｂ（白抜きヒストグラム）で染色し、さらにフローサイトメトリーで定量した（Ｂ）。ＰＥ陽性細胞の平均蛍光強度の平均を示す。記号は、正常組織またはアイソタイプ対照とＯｖＣａ細胞の間（＠）または正常酸素と低酸素細胞間（＊）のＣＣＲ９発現の統計的に有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４４】
図１１Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞の低酸素媒介性およびＣＣＬ２５媒介性遊走および浸潤を示す。ＳＫＯＶ−３細胞を、ＣＣＬ２５の走化性勾配に向かって遊走するその能力について試験した（Ａ）。遊走測定中、正常酸素または低酸素条件下で１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５を用いて、１．０μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９抗体（Ａｂ）またはアイソタイプ対照Ａｂと共に細胞を共培養した。またＳＫＯＶ−３細胞は、低酸素条件下または正常酸素条件下で１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５に応答してＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリクスに浸潤するかまたはこれを横切ってトランスロケーションするその能力についても試験した（Ｂ）。浸潤測定中、正常酸素または低酸素条件下で１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５を用いて、ＣＣＲ９に対するモノクローナル抗体１．０μｇ／ｍＬと共に細胞を共培養した。遊走または浸潤した細胞の個数（＋ＳＥ）は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す記号と共に示す。
【０１４５】
図１２Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性コラゲナーゼ発現を示す。細胞を、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−１３）ｍＲＮＡおよび活性タンパク質を発現するその能力について試験した。ＳＫＯＶ−３細胞は、正常酸素または低酸素条件下で、単独、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬアイソタイプ対照抗体（Ａｂ）、またはＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９  Ａｂと共に２４時間培養した。総ＲＮＡを分離し、コラゲナーゼのｍＲＮＡ発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、さらに転写コピーを実際の１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーに対して表示する（Ａ）。調製培地において活性コラゲナーゼをＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｋ測定で定量した（Ｂ）。記号は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４６】
図１３Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ゼラチナーゼ発現を示す。細胞を、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）ｍＲＮＡおよび活性タンパク質を発現するその能力について試験した。ＳＫＯＶ−３細胞は、正常酸素または低酸素条件下で、単独、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬ  アイソタイプ対照抗体（Ａｂ）、またはＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９  Ａｂと共に２４時間培養した。総ＲＮＡを分離し、ゼラチナーゼのｍＲＮＡ発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、さらに転写コピーを実際の１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーに対して表示する（Ａ）。調製培地中の活性ゼラチナーゼをＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｋ測定で定量した（Ｂ）。記号は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４７】
図１４Ａ〜ＢはＳＫＯＶ−３細胞によるＣＣＬ２５誘導性ストロメライシン発現を示す。細胞を、ストロメライシン（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、およびＭＭＰ−１１）ｍＲＮＡおよび活性タンパク質を発現するその能力について試験した。ＳＫＯＶ−３細胞は、正常酸素または低酸素条件下で、単独、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬ  アイソタイプ対照抗体（Ａｂ）、またはＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬマウス抗ＣＣＲ９  Ａｂと共に２４時間培養した。総ＲＮＡを分離し、ストロメライシンのｍＲＮＡ発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、さらに転写コピーを実際の１８Ｓ  ｒＲＮＡコピーに対して表示する（Ａ）。調製培地において活性ストロメライシンをＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｒａｋ測定で定量した（Ｂ）。記号は、ＣＣＬ２５処理正常酸素細胞と未処理正常酸素細胞の間（＃）、ＣＣＬ２５処理低酸素細胞と未処理低酸素細胞の間（＠）、または同様に処理した正常酸素細胞と低酸素細胞の間（＊）の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１４８】
図１５は前立腺癌細胞株によるＣＣＲ９発現を示す。前立腺細胞株（Ｃ４−２Ｂ、ＬＮＣａＰ、およびＰＣ３）および正常前立腺細胞（ＲＷＰＥ−１）をＦＩＴＣ複合体化抗ヒトＣＣＲ９（緑）および７ＡＡＤ（核染色；赤）で染色した。陽性染色細胞をＡｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍで撮像および定量した。右のパネルはＣＣＲ９染色の平均蛍光強度を示す。
【０１４９】
図１６Ａ〜Ｄは前立腺組織によるＣＣＲ９発現を示す。国立衛生研究所（ＮＩＨ）、国立癌研究所（ＮＣＩ）およびアラバマ州立大学（バーミンガム）より組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を入手し、ＣＣＲ９について染色した。４０×対物レンズを搭載したＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅシステムで各スライドのデジタル画像をキャプチャした。前立腺癌（ＣａＰ）（Ａ）、マッチングした良性前立腺組織（ＭＢ）（Ｂ）および陰性対照の典型的な例を示し、スキャンして分析した全ての組織のＣＣＲ９強度をＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（ｖ．６．２５）で定量した。図２７ＤはＭＢと、良性前立腺肥大（ＢＨＰ）、前立腺癌（ＰＣａ）の間のＣＣＲ９免疫強度を示す。アスタリクスは、ＭＢと、ＢＰＨ、ＰＣａ組織間のＣＣＲ９免疫強度の有意な（ｐ＜０．０１）差を示す。
【０１５０】
図１７Ａ〜Ｄは前立腺癌組織によるＣＣＬ２５発現を示す。エンドクリン−パラクリン細胞表現型の神経内分泌分化は、前立腺悪性腫瘍で頻繁に発生し、かつ転帰および治療上の潜在的重大性を有する。パラクリン細胞表現型は、前立腺および前立腺癌におけるアンドロゲン非感受性、分裂終了部分母集団と見なすことができる。図１７Ａは、前立腺上皮間新生物内のパラクリンパターンにおけるＣＣＬ２５の発現を示す。双頭矢印はＣＣＬ２５を産生する複数のパラクリン細胞を指し示し（赤）、茶色の矢印はＣＣＲ９を発現する細胞を指し示す（茶）。図１７ＢはＣＣＬ２５について赤く染色された細胞を示す。茶色の矢印は細胞ＮＳＥを指し示す。図１７ＡおよびＣは、それぞれ図１７ＤおよびＢよりも高い倍率を示す。
【０１５１】
図１８は健常ドナーまたは前立腺疾患患者における血清ＣＣＬ２５レベルを示す。ＥＬＩＳＡを用いて、健常ドナー、前立腺癌（ＰＣａ）、前立腺上皮間新生物（ＰＩＮ）、および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）由来の血清中のＣＣＬ２５を定量した。アスタリクスは、健常対照と比較したＣＣＬ２５レベルの有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１５２】
図１９Ａ〜Ｃはマウス骨髄細胞によるＣＣＬ２５発現を示す。非腫瘍担持（Ａ）および腫瘍担持（Ｂ）マウス由来の骨髄細胞を吸引し、ＦＩＴＣ複合体化抗ＣＣＬ２５抗体で染色した。陽性染色細胞（Ｃ）をＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで定量した。ＩＤＥＡＳソフトウェアを用いて画像ベース分析を実施したところ、前立腺腫瘍細胞攻撃後の骨髄によるＣＣＬ２５発現の１．６倍の増加を示した。
【０１５３】
図２０Ａ〜ＢはＣＣＲ９媒介性前立腺癌細胞遊走（Ａ）および浸潤（Ｂ）を示す。ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＣ４−２ｂ細胞を、無添加（白抜き棒グラフ）、１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５（斜線棒グラフ）、または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５＋１μｇ／ｍＬ抗ＣＣＬ２５（塗りつぶし棒グラフ）に向かって遊走するその能力について試験した。遊走および浸潤チャンバーに播種するために最初に用いた１０４個の細胞からＣＣＬ２５に応答して遊走および浸潤した細胞の個数（±ＳＥＭ）は、遊走がＣＣＬ２５依存的でありかつ抗ＣＣＬ２５抗体遮断によって阻害されることを示す。アスタリクスは、無添加とＣＣＬ２５処理細胞の間の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１５４】
図２１は、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＣ４−２ｂ前立腺細胞株によるＣＣＬ２５誘導性活性マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）発現を示す。細胞は、無添加（白抜き棒グラフ）または１００ｎｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２５添加（塗りつぶし棒グラフ）で２４時間培養した。培養上清中のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、およびＭＭＰ−１１タンパク質レベルをＭＭＰ活性分析により判定した。アスタリスクは、未処理細胞株と比較したＣＣＬ２５処理細胞株のＭＭＰ分泌の有意な（ｐ＜０．０５）上昇または低下を示す。
【０１５５】
図２２Ａ〜ＦはＣＣＲ９ノックダウンによるＰＣ３前立腺癌細胞株の骨転移の阻害を示す。マウスを、ルシフェラーゼおよびドセタキセルの誘導によるＣＣＲ９特異性ｓｈＲＮＡ発現ＰＣ３細胞株で攻撃した（Ａ、Ｄ）。マウスはこの細胞株で腹腔内注射により攻撃した。その後、マウスは２１日間飲用物中に何も添加しないかまたはドキシサイクリン（０．２ｍｇ／ｍＬ）を投与された。Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｘｅｎｏｇｅｎ１００インビボ撮像システムにより転移と腫瘍増殖を毎週モニタリングした。攻撃より２４時間後には変化がなかったが（Ｂ、Ｅ）、攻撃の３週間後には、骨転移としてのＣＣＲ９ノックダウンＰＣ３（Ｆ）細胞の増殖はＣＣＲ陽性ＰＣ３細胞（Ｃ）と比較してより少なかった。
【０１５６】
図２３は肺癌患者の血清ＣＣＬ２５レベルを示す。ＣＣＬ２５  ＥＬＩＳＡを実施して、腺癌（ＡｄｅｎｏＣａ；ｎ＝１４）、扁平上皮癌（ＳＳＣ；ｎ＝１７）と診断された患者、および健常ドナー（ｃｏｎｔｒｏｌ；ｎ＝９）に由来する血清中のＣＣＬ２５レベルを定量した。ＥＬＩＳＡはＣＣＬ２５＞５ｐｇ／ｍＬを検出することができた。塗りつぶした円は個々の血清ＣＣＬ２５レベルを示し、線は各群の濃度の中央値を示す。アスタリクスは、対照群と肺癌群の間の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。
【０１５７】
図２４Ａ〜Ｃは非腫瘍性肺組織および肺癌組織によるＣＣＲ９発現を示す。非腫瘍性（ｎ＝８）（Ａ）、腺癌（ｎ＝２４）（Ｂ）、および扁平上皮癌（ｎ＝５４）（Ｃ）由来の肺組織をアイソタイプ対照または抗ＣＣＲ９抗体で染色した。茶色（ＤＡＢ）はＣＣＲ９染色を示す。
【０１５８】
図２５Ａ〜Ｃは結腸癌組織によるＣＣＲ９−ＣＣＬ２５発現を示す。非腫瘍性（ｎ＝８）および腺癌（ｎ＝１６）由来の結腸組織を（Ａ）アイソタイプ対照、（Ｂ）抗ＣＣＲ９、または（Ｃ）抗ＣＣＬ２５抗体で染色した。茶色（ＤＡＢ）染色はＣＣＲ９陽性を示し、かつマゼンタ色の染色はＣＣＬ２５陽性を示す。
【実施例２】
【０１５９】
（リアルタイムＰＣＲ分析によりケモカイン発現レベルを検出すること）
（プライマー設計）
ＮＩＨ−ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベースよりＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１についてのメッセンジャーＲＮＡ配列を取得した。プライマーはＢｅａｃｏｎＪ  ２．０コンピュータプログラムを用いて設計した。コンピュータプログラム：Ｐｒｉｍｅｒ  ＰｒｅｍｉｅｒＪおよびＭＩＴ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３を用いてプライマーの熱力学分析を実施した。生成したプライマーセットをヒトゲノム全体と比較して特異性を確認した。
【０１６０】
（リアルタイムＰＣＲ分析）
癌細胞株（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックヴィル）を、非必須アミノ酸Ｌ−グルタミン酸、およびピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ−１６４０（完全培地）中で培養した。臨床切除組織より原発性腫瘍および正常ペアマッチング組織（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州フレデリックおよびＵＡＢ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ、アラバマ州バーミンガム）を採取した。メーカーのプロトコルに従ってＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、オハイオ州シンシナティ）を用い、１０６個の細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離した。ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼ（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）１０Ｕ／Ｆｌを用いて３７℃で１５分間処理することで、これらのサンプルより潜在的なゲノムＤＮＡ汚染を除去した。その後、ＲＮＡを沈殿させ、ＲＮＡ  Ｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）に再懸濁した。メーカーのプロトコルにしたがってＴａｑｍａｎ７逆転写試薬（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、総ＲＮＡ約２μｇを逆転写することによりｃＤＮＡを生成した。その後、メーカーのプロトコルにしたがってＳＹＢＲ７  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス試薬（アプライドバイオシステムズ）を用い、ｃＤＮＡをＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に対する特異的ヒトｃＤＮＡプライマーにより増幅した。これらの標的のｍＲＮＡのコピーレベルを、ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃｙｃｌｅｒおよびソフトウェア（カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いたリアルタイムＰＣＲ分析により評価した。
【０１６１】
ＣＸＣＬ１−、ＣＸＣＬ２−、ＣＸＣＬ３−、ＣＸＣＬ４−、ＣＸＣＬ５−、ＣＸＣＬ６−、ＣＸＣＬ７−、ＣＸＣＬ８−、ＣＸＣＬ９−、ＣＸＣＬ１０−、ＣＸＣＬ１１−、ＣＸＣＬ１２−、ＣＸＣＬ１３−、ＣＸＣＬ１４−、ＣＸＣＬ１５−、ＣＸＣＬ１６−、ＣＸＣＲ１−、ＣＸＣＲ２−、ＣＸＣＲ３−、ＣＸＣＲ４−、ＣＸＣＲ５−、ＣＸＣＲ５ａ−、ＣＸＣＲ５ｂ−、ＣＸＣＲ６−、ＣＸＣＲ７−、ＣＣＬ１−、ＣＣＬ２−、ＣＣＬ３−、ＣＣＬ４−、ＣＣＬ５−、ＣＣＬ６−、ＣＣＬ７−、ＣＣＬ８−、ＣＣＬ９−、ＣＣＬ１０−、ＣＣＬ１１−、ＣＣＬ１２−、ＣＣＬ１３−、ＣＣＬ１４−、ＣＣＬ１５−、ＣＣＬ１６−、ＣＣＬ１７−、ＣＣＬ１８−、ＣＣＬ１９−、ＣＣＬ２０−、ＣＣＬ２１−、ＣＣＬ２２−、ＣＣＬ２４−、ＣＣＬ２５−、ＣＣＬ２５−１−、ＣＣＬ２５−２−、ＣＣＬ２７−、ＣＣＬ２８−、ＣＣＲ１−、ＣＣＲ２−、ＣＣＲ３−、ＣＣＲ４−、ＣＣＲ５−、ＣＣＲ６−、ＣＣＲ７−、ＣＣＲ８−、ＣＣＲ９−、ＣＣＲ１０−、ＣＣＲ１１−、ＸＣＬ１−、ＸＣＬ２−、ＸＣＲ１−、ＣＸ３ＣＲ１−、またはＣＸ３ＣＬ１特異性プライマーセットを用いて得られたＲＴ−ＰＣＲ生成物は、宿主配列にアニーリングしたプライマー（ＮＩＨ−ＮＣＢＩ遺伝子バンク）を排除したので、他の遺伝子標的と交差反応しなかった。プライマーは、ＣＸＣＲ５ａ対ＣＸＣＲ５ｂおよびＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１対ＣＣＬ２５−２をもたらす種々のサイズのアンプリコン生成物相対的多型を生成した。この目的に向けて、腺腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、および／または骨髄腫細胞株および腫瘍組織のＲＴ−ＰＣＲ分析により、ケモカインおよびケモカイン受容体は癌細胞により識別的に発現されることが明らかとなった。
【実施例３】
【０１６２】
（抗ケモカインおよび抗ケモカイン受容体抗体はインビトロおよびインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する）
（抗血清の調製）
ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＲ９、ＣＸ３ＣＲ１、およびＣＸ３ＣＬ１（配列番号１−２１）から１５アミノ酸ペプチドを合成し（シグマジェノシス、テキサス州ザ／ウッドランド）、さらにその後の抗血清調製またはモノクローナル抗体生成のための免疫用に、鶏卵リゾチーム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）と複合体化して抗原を生成した。発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物測定（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社、ミシシッピー州ファルマス）によりケモカインペプチド複合体のエンドトキシンレベルを定量したところ＜５ＥＵ／ｍｇであることが示された。初回免疫用に、抗原１００μｇを免疫原としてフロイントの完全アジュバントＲｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔシステム（ＲＡＳ）と共に最終体積１．０ｍＬで用いた。この混合物の１００ｍＬ分取をウサギの背部の２部位に皮下投与し、また各後脚の筋肉に４００ｍＬずつ筋肉内投与した。３から４週間後、ウサギに、フロイントの不完全アジュバントに加えて抗原１００μｇを投与してその後３回免疫した。抗−ＣＸＣＲ１、−ＣＸＣＲ２、−ＣＸＣＬ１、−ＣＸＣＬ２、−ＣＸＣＬ３、−ＣＸＣＬ５、−ＣＸＣＬ６  −ＣＸＣＬ７、−ＣＸＣＬ８、−ＣＸＣＬ１２、−ＣＸＣＲ５ａ、−ＣＸＣＲ５ｂ、−ＣＸＣＬ１３、−ＣＸＣＲ６、−ＣＸＣＬ１６、−ＣＣＬ１６、−ＣＣＬ２５、−ＣＣＬ２５−１、−ＣＣＬ２５−２、−ＣＣＲ９、−ＣＸ３ＣＲ１、および−ＣＸ３ＣＬ１抗体価が１：１，０００，０００に達したときに抗血清を採取した。続いて、正常血清または抗血清を熱不活化しさらにＰＢＳで１：５０希釈した。
【０１６３】
（モノクローナル抗体の調製）
ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＲ９、ＣＸ３ＣＲ１、およびＣＸ３ＣＬ１から１５アミノ酸ペプチドを合成し（シグマジェノシス）、さらにその後の抗血清調製またはモノクローナル抗体生成のための免疫用に、鶏卵リゾチーム（Ｐｉｅｒｃｅ）と複合体化して「抗原」を生成した。発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物測定（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社、ミシシッピー州ファルマス）によりケモカインペプチド複合体のエンドトキシンレベルを定量したところ＜５ＥＵ／ｍｇであることが示された。初回免疫用に、抗原１００μｇを免疫原としてフロイントの完全アジュバントＲｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔシステム（ＲＡＳ）と共に最終体積２００μＬで用いた。その後、この混合物の１００μＬ分取をラット、マウス、または免疫グロブリンヒト化マウスの背部の２部位に投与した。２週間後、動物にはフロイントの不完全アジュバントに加えて抗原１００μｇを投与してその後３回免疫した。血清を採取し、かつ抗−ＣＸＣＲ１、−ＣＸＣＲ２、−ＣＸＣＬ１、−ＣＸＣＬ２、−ＣＸＣＬ３、−ＣＸＣＬ５、−ＣＸＣＬ６  −ＣＸＣＬ７、−ＣＸＣＬ８、−ＣＸＣＬ１２、−ＣＸＣＲ５ａ、−ＣＸＣＲ５ｂ、−ＣＸＣＬ１３、−ＣＸＣＲ６、−ＣＸＣＬ１６、−ＣＣＬ１６、−ＣＣＬ２５、−ＣＣＬ２５−１、−ＣＣＬ２５−２、−ＣＣＲ９、−ＣＸ３ＣＲ１、または−ＣＸ３ＣＬ１抗体価が１：２，０００，０００に達したとき、宿主を屠殺しかつ脾細胞を分離してハイブリドーマを生成した。簡潔に述べると、免疫した宿主の脾臓またはリンパ節に由来するＢ細胞を不死骨髄腫細胞株（例：ＹＢ２／０など）と融合させた。次に、選択培養条件（すなわちＨＡＴ添加培地）およびハイブリドーマクローニングの限定希釈法後にハイブリドーマを分離した。ＥＬＩＳＡを用いて所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を選択した。正常ラットまたはマウスに由来するハイブリドーマを、一般的に用いられる分子生物学的技術を用いてヒト化した。高親和性および増殖性ハイブリドーマをクローニングした後、腹水または培養上清から抗体を分離し、力価１：２，０００，０００に調節しさらにＰＢＳで１：５０希釈した。
【０１６４】
（抗血清またはモノクローナル抗体投与）
Ｔ、Ｂ，およびＮＫ細胞を欠く免疫不全ヌードＮＩＨ−ＩＩＩマウス（週齢８から１２週、チャールズリバーラボラトリー、マサチューセッツ州ウィルミントン）に１×１０６個の癌細胞を皮下に与えて腫瘍を確立した。確立された固形腫瘍は、その後宿主から切除して速やかに移植するか、または後日移植するために液体窒素に保存した。用時切除したかまたは液体窒素で凍結した腫瘍組織（１ｇ）を、腸脂肪組織に外科的に移植して腫瘍を生成した。一旦異種移植腫瘍の増殖がサイズ５ｍｍに達したならば、ＮＩＨ−ＩＩＩマウスに抗血清またはモノクローナル抗体のいずれかの２００μＬ腹腔内注射を３日毎に実施し、さらに腫瘍増殖の進行または退縮についてモニタリングした。
【０１６５】
（データ分析）
ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ２０００（イリノイ州シカゴ）ソフトウェアを用いて、データの統計的有意性を分析および確認した。その後、２因子不対検定を用いたスチューデントのｔ−検定でデータを分析した。この分析においては、投与サンプルを非投与サンプルと比較した。有意水準はｐ＜０．０５に設定した。
【０１６６】
（インビトロ増殖試験）
腺腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、および／または骨髄腫細胞株をＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６  ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に対して特異的な抗体の存在するまたは存在しない完全培地内で増殖させた。ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を発現する癌細胞株の増殖は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、またはＣＸＣＬ８に対する抗体によって阻害された。同様に、ＣＸＣＲ４を発現する癌細胞株の増殖はＣＸＣＲ４またはＣＸＣＬ１２に対する抗体によって阻害された。ＣＸＣＲ５ａまたはＣＸＣＲ５ａを発現する癌細胞株の増殖はＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、またはＣＸＣＬ１３に対する抗体によって阻害された。ＣＸＣＲ６を発現する癌細胞株の増殖はＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６に対する抗体によって阻害された。ＣＣＲ９を発現する癌細胞株の増殖はＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、またはＣＣＬ２５−２に対する抗体によって阻害された。ＣＸ３ＣＲ１を発現する癌細胞株の増殖はＣＸ３ＣＲ１またはＣＸＣ３Ｌ１に対する抗体によって阻害された。興味深いことに、可溶性リガンドＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、またはＣＸ３ＣＬ１に対する抗体は、膜受容体に向けられたものの増殖阻害において、より効果的である。
【０１６７】
（インビトロ血管新生試験）
微小血管内膜細胞（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ワシントン州カークランド）を供給者のプロトコルにしたがって増殖させ、さらにＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に特異的な抗体の存在下または非存在下で、血管新生についてのインビトロ測定（ＢＤ−Ｂｉｏｃｏａｔ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）において微細血管細静脈を形成させた。血管新生は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６に対する抗体によって阻害された。
【０１６８】
（インビボ増殖試験）
癌細胞株または原発性腫瘍組織をＮＩＨ−ＩＩＩマウスに養子移入し、さらに目的の異種移植腫瘍を形成させた。ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２；ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬｌに対する抗体は、腫瘍サイズの進行および退縮に識別的に影響した。一定の場合において、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＬ１６に向けられた抗体は、効果的に腫瘍増殖の退縮にも進行の阻害にもつながる。ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ５ａ、ＣＸＣＲ５ｂ、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ１６、ＣＣＲ９、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＸ３ＣＲ１、またはＣＸ３ＣＬ１に向けられた抗体は、腫瘍サイズの進行の阻害において効果的である。
【０１６９】
本願で用いられるケモカインのタンパク質配列はＮＩＨ−ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに以下のように記録される：(1) CXCR1 (ACCESSION#（受託番号） NP 000625), SEQ ID NO:1, (2) CXCR2(ACCESSION# NP  001548), SEQ ID NO:2, (3) CXCL1 (ACCESSION# NP 001502), SEQ ID NO:3, (4) CXCL2 (ACCESSION# NP 002080), SEQ ID NO:4, (5) CXCL3 (ACCESSION# NP 002081), SEQ ID NO:5, (6) CXCL5 (ACCESSION# NP  002985), SEQ ID NO:6, (7) CXCL6 (ACCESSION# NP 002984), SEQ ID NO:7, (8) CXCL7 (ACCESSION# NP 002695), SEQ ID NO:8, (9) CXCL8 (IL-8, ACCESSION# NP 000575), SEQ ID NO:9, (10) CXCR4 (ACCESSION# NP 003458), SEQ ID NO:10, (11) CXCL12 (ACCESSION# NP  000600), SEQ ID NO:11, (12) CXCR5A (ACCESSION# NP 116743), SEQ ID NO:12, (13) CXCR5B (ACCESSION# NP 001707), SEQ ID NO:13, (14) CXCL13 (ACCESSION# NP 006410), SEQ ID NO:14, (15) CXCR6 (ACCESSION# NP  006555), SEQ ID NO:15, (16) CXCL16 (ACCESSION# NP 071342), SEQ ID NO:16, (17) CCL16 (ACCESSION# NP 004581), SEQ ID NO:17, (18) CCL25 (ACCESSION# NP-005615.2), SEQ ID NO:18, (19) CCL25-1 (ACCESSION# NP  005615), SEQ ID NO:19, (20) CCL25-2 (ACCESSION# NP 683686), SEQ ID NO:20, (21) CX3CR1 (ACCESSION# NP  001328), SEQ ID NO:21, and (22) CX3CL1 (ACCESSION# NP  002987), SEQ ID NO:22. 
【０１７０】
ｃＤＮＡ配列は既知でありかつＮＩＨ−ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにおいて以下の受入番号の下で利用可能である：(23) CXCR1 (ACCESSION# NM 000634), SEQ ID NO:23, (24) CXCR2(ACCESSION# NM  001557), SEQ ID NO:24, (25) CXCL1 (ACCESSION# NM 001511), SEQ ID NO:25, (26) CXCL2 (ACCESSION# NM 002089), SEQ ID NO:26, (27) CXCL3 (ACCESSION# NM 002090), SEQ ID NO:27, (28) CXCL5 (ACCESSION# NM  002994), SEQ ID NO:28, (29) CXCL6 (ACCESSION# NM 002993), SEQ ID NO:29, (30) CXCL7 (ACCESSION# NM 002704), SEQ ID NO:30, (31) CXCL8 (IL-8, ACCESSION# NM 000584), SEQ ID NO:31, (32) CXCR4 (ACCESSION# NM 003467), SEQ ID NO:32, (33) CXCL12 (ACCESSION# NM  000609), SEQ ID NO:33, (34) CXCR5A (ACCESSION# NM 032966), SEQ ID NO:34, (35) CXCR5B (ACCESSION# NM 001716), SEQ ID NO:35, (36) CXCL13 (ACCESSION# NM 006419), SEQ ID NO:36, (37) CXCR6 (ACCESSION# NM  006564), SEQ ID NO:37, (38) CXCL16 (ACCESSION# NM 022059), SEQ ID NO:38, (39) CCL16 (ACCESSION# NM 004590), SEQ ID NO:39, (40) CCL25 (ACCESSION# NM_005624.3), SEQ ID NO:40, (41) CCL25-1 (ACCESSION# NM 005624), SEQ ID NO:41, (42) CCL25-2 (ACCESSION# NM 148888), SEQ ID NO:42, (43) CX3CR1 (ACCESSION# NM 001337), SEQ ID NO:43, and (44) CX3CL1 (ACCESSION# NM 002996), SEQ ID NO:44.
【０１７１】
以下の表に示すように、大半が何らかの腫瘍を発現する個別のケモカインは変動しうる。本願の方法は、個別の患者に対し、患者自身の腫瘍において過剰発現されるケモカインに応じてカスタマイズしうる。本願の方法を用いて、腫瘍において過剰発現される個別のケモカインを同定し、かつその過剰発現されたケモカインに対する抗体を投与することが可能である。癌患者に合わせた治療の調節は新規であり、かつ本願の特に有益な態様である。
【０１７２】
表１は、検討した個別の腫瘍において過剰発現された個別のケモカインの種々の量を示す。
【０１７３】
（表１．ケモカイン、ケモカイン受容体および癌の関連（疾患の病期による））
【表１】
2014508117.tif 000003
【実施例４】
【０１７４】
（ＰＣａ化学療法抵抗性に関与するＣＣＲ９−ＣＣＬ２５誘発性抗アポトーシスおよび／または生存シグナル）
ＬＮＣａＰ（ホルモン反応性、野生型ｐ５３発現）、ＰＣ３（ホルモン抵抗性、ｐ５３完全欠損）、およびＤＵ１４５（ホルモン抵抗性、ｐ５３変異）細胞株を、ＣＣＬ２５を添加または無添加で、かつドキソルビシン（１μＭ／２μＭ／４μＭ）、エトポシド（２０μＭ／４０μＭ）、エストラムスチン（４μＭ／１０μＭ）、またはドセタキセル（１０ｎＭ／２０ｎＭ／４０ｎＭ）を添加または無添加で４、８、１２、および２４時間増殖させる。細胞生存、プロアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル（Ａｋｔ、Ｓｒｃ、ＣａｍＫＩＩ、ＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ  Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、ＢａＫ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＴＰ５３、カスパーゼ−３、−６、−８、−９、サバイビン、ビトロネクチン、β−カテニン）、および薬剤耐性または代謝を担う分子（Ｔｗｉｓｔ−１、Ｓｎａｉｌ−１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−π（ＧＳＴ−π）、ｐ５３、トポイソメラーゼＩ、ＩＩα、ＩＩβ、およびＡＢＣ薬物輸送体）の発現および活性化を、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングで評価する。簡潔に述べると、細胞処理後にリアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子発現の変化を試験する。シグナリング分子の活性化も、リン酸化特異性抗体（すなわちウェスタンブロット分析）によって試験する。活性化シグナリング分子の役割をさらに確認するため、ＣＣＬ２５処理後に、化学的阻害物質またはｓｉＲＮＡを用いて候補分子の発現または活性を阻害し、また標的遺伝子をリアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析で分析する。その後、化学療法剤に対する処理細胞の反応をＶｙｂｒａｎｔアポトーシス測定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）キットで評価する。
【０１７５】
（ＲＮＡ分離およびリアルタイムＰＣＲ）
Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（インビトロジェン）法で総ＲＮＡを分離し、紫外線分光測定によって定量する。電気泳動法によりＲＮＡの品質を分析する。ｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）をメーカーの記載する通りに用いてｃＤＮＡ合成を完遂する。ＩＱ（登録商標）ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ）をメーカーの記載する通りに用い、さらにＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、ＢａＫ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＸＩＡＰ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＴＰ５３、チトクロームＣ、カスパーゼ−３、−６、−８、−９、サバイビン、ラミン、ＣａｍＫＩＩ、ビトロネクチン、β−カテニン、カドヘリン、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｓｎａｉｌ−１、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨに対して設計された特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実施する。結果をΔＣｔ法によって算出し、非処理群に対するｍＲＮＡ変化が何倍かを定量する。
【０１７６】
（ウェスタンブロッティング）
細胞を回収し、溶解緩衝液に再懸濁して総タンパク質を抽出する。溶解緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有し、プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭベンズアミジン、１０μｇ／ｍＬ大豆トリプシン阻害剤、５０μｇ／ｍＬロイペプチン、１μｇ／ｍＬペプスタチンおよび２０μｇ／ｍＬアプロチニンを添加する。細胞溶解液を氷上で３０分間保存し、４℃で２０分間遠心分離し（１４０００×ｇ）、さらに上清をｍＲＮＡレベルの有意なモジュレーションを示す遺伝子のウェスタンブロット分析に用いる。同様に、蛍光体特異性抗体を用いてＡｋｔ１／２／３、ｍＴＯＲ、ＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、およびＧＳＫ−３βのリン酸化のレベルの変化を試験する。さらに、特異抗体を用いて開裂後のカスパーゼおよびＰＡＲＰの活性化を評価する。ＥＣＬプラス試薬（Ｐｈａｒｍｅｃｉａ）によるＸ線フィルム上でのタンパク質バンドの化学発光検出後に得られた結果を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ画像分析ソフトウェア（ＮＩＨ）を用いてβアクチンおよび／またはＧＡＰＤＨに対して正規化する。
【０１７７】
（チトクロームＣ放出の検出）
細胞を採取し、さらにＰＢＳで洗浄し、さらに２２０ｍＭマンニトール、６８ｍＭショ糖、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤を含有する抽出緩衝液に再懸濁する。氷上で３０分間インキュベートした後、Ｇｌａｓｓ−Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザーを用いて細胞をホモジナイズし、さらにホモジネートを１４，０００ｇで１５分間遠心分離する。サイトゾルの抽出物を、抗チトクロームＣモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いたウェスタンブロット分析に用いる。
【０１７８】
（ｓｉＲＮＡトランスフェクション、化学的阻害剤、およびアポトーシス検出）
前立腺癌細胞株を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（インビトロジェン）を用いて遺伝子特異性および非特異性対照ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）によってトランスフェクトする。至適な遺伝子ノックダウン時間およびｓｉＲＮＡ濃度をウェスタンブロット分析で確認し、またＣＣＬ２５、抗ＣＣＬ２５抗体、対照抗体、および／または抗ＣＣＲ９抗体を用いて、または用いずに薬剤処理した後の細胞の生存についてさらに評価する。生存、アポトーシス、および壊死細胞の変化の検出は以下のように評価する：細胞の生存は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、Ｖｙｂｒａｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓによってメーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）の記載通りに試験する。遺伝子ノックダウン後の下流遺伝子発現の変化は、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを用いて試験する。
【０１７９】
ＣＣＬ２５で処理した細胞は細胞生存および薬物輸送体タンパク質の発現の亢進を示し、これはホルモン反応性および非反応性細胞においてその発現パターンの差を示す。抗ＣＣＬ２５  ＡｂはＰＣａ細胞においてＣＣＬ２５の効果を有効に反転させる。ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシドおよびドセタキセルは、ＣＣＬ２５処理（またはＣＣＲ９遮断）していないＰＣａ細胞においてアポトーシスを誘導する。
【実施例５】
【０１８０】
（ＡＢＣ薬物輸送体におけるＣＣＲ９−ＣＣＬ２５誘導性変化）
ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＤＵ１４５細胞を、ＣＣＬ２５、抗ＣＣＬ２５抗体、対照抗体、および／または抗−ＣＣＲ９抗体を添加または無添加で、ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシド、またはドセタキセルと共にまたはこれを加えずに、前述の通りに４、８、１２または１６時間増殖させる。処理後、ＡＢＣ輸送体およびＴｗｉｓｔ−１のｍＲＮＡ発現の変化を、ＡＢＣおよびＴｗｉｓｔ−１  ｃＤＮＡに向けられた特異的プライマーを用いて、上述の通りにリアルタイムＰＣＲで定量する。ｍＲＮＡ発現の有意な変化を示す遺伝子をウェスタンブロット分析でさらに試験する。処理細胞に由来する核抽出物をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）測定によって評価し、ＣＸＣＬ１６結合によって誘導される転写因子がＡＢＣ輸送体およびＴｗｉｓｔ−１のプロモーター領域と結合するか判定する。
【０１８１】
（クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ））
実施例４の結果は、調節される遺伝子、さらにはＣＣＲ９−ＣＣＬ２５相互作用によって活性化される転写因子をモジュレートしうる遺伝子についての情報を提供する。これらの結果に基づき、標的転写因子および遺伝子を選択する。特異的ＰＣＲプライマーを、転写因子の結合部位を含むこれらの遺伝子のプロモーター領域に対して設計する。ＰＣＲプライマーを用いて、転写因子と共に沈殿するＤＮＡを増幅する。２０ｍＭ酪酸塩の存在下で細胞をトリプシン処理により回収する。５０，０００個の細胞をＰＢＳ／酪酸５００μＬに再懸濁する。１％ホルムアルデヒドを用いてタンパク質とＤＮＡを室温で８分間架橋し、さらに１２５ｍＭグリシンを５分間用いて架橋を停止する。細胞をソフト減速条件のスイングアウトローターで４℃、４７０ｇで１０分間遠心分離し、氷冷ＰＢＳ／酪酸０．５ｍＬ中でボルテックス振盪したのち遠心分離して２回洗う。溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０ｍＭ酪酸塩を添加し、ボルテックスで振盪し、またその後遠心分離することにより細胞を溶解する。この手順は、５００ｂｐのクロマチンフラグメントを生成することが知られている。超音波処理した溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２０ｍＭ酪酸塩を含有するＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ  ＣｈＩＰ緩衝液）で８倍希釈する。ＲＩＰＡ  ＣｈＩＰ緩衝液（３３０μＬ）をペレットに添加し、ボルテックスで混合する。ＣｈＩＰ材料の免疫沈降および洗浄は、特異的転写因子に向けられた抗体の使用によって実現される。抗体ビーズ複合体を収容するチューブにクロマチンを分取する。投入サンプルを、フェノール−クロロホルムイソアミルアルコール分離用チューブに入れる。免疫沈降材料を３回洗い、ＴＥ中にある間に新しいチューブに移す。１％ＳＤＳでのＤＮＡ溶離、架橋の逆転およびプロテイナーゼＫ消化は、６８℃で２時間１段階で実施する。アクリルアミド担体（シグマアルドリッチ）の存在下でフェノール−クロロホルムイソアミルアルコール、およびエタノール沈降によりＤＮＡを抽出し、ＴＥに溶解する。３〜４つの独立したＣｈＩＰから免疫沈降したＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで分析する。リアルタイムＰＣＲデータは、３回の独立した再現ＣｈＩＰ分析において、投入ＤＮＡに対する沈殿（抗体結合）ＤＮＡの百分率（±ＳＤ）で表示する。
【０１８２】
ＣＸＣＲ６−ＣＸＣＬ１６シグナリングを介したＣＲＥＢ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、およびＮＦｋＢなどの転写因子のリン酸化および活性化は、その後ＡＢＣ輸送体およびＴｗｉｓｔ−１の発現の増大につながる。同じプロモーターに負の調節要素が存在する場合、遺伝子発現の低下が認められる。ホルモン依存性および抵抗性ＰＣａ細胞はこれらの細胞内シグナリング分子の発現に差があるので、ホルモン依存性および抵抗性条件によってモジュレートされる遺伝子に多様性を示す。遺伝子発現におけるモジュレーションは、ＣＸＣＬ１６の存在下とＣＸＣＬ１６投与の非存在下で薬物投与による差を示す。
【実施例６】
【０１８３】
（ＣＣＬ２５指向的な治療法のインビボ評価）
雄性ヌードマウスを、ルシフェラーゼ発現アンドロゲン反応性（ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ）および非反応性（ＰＣ３−Ｌｕｃ）細胞で皮下攻撃する。インビボ撮像システムを用いて腫瘍の発達を非侵襲的に測定する。測定可能な腫瘍の確立後、マウスを投与群（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）と対照群（Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫ）に分ける。「Ａ」群にはＣＣＬ２５中和抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を１日おきに投与し、また対照（Ｆ群）にはアイソタイプ対照抗体を投与する（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）。「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」および「Ｅ」群にはＣＣＬ２５中和抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を、それぞれドキソルビシン腹腔内注射（１から３日目、その後１５日目から１７日目に５ｍｇ／ｋｇ／日投与）、エトポシド静脈内注射（１０ｍｇ／ｋｇ／日；１、５、９、１４、１９および２４日目）、エストラムスチン静脈内注射（１〜５日目および２６〜３１日目に４ｍｇ／ｋｇ／日投与）、またはドセタキセル腹腔内注射（８ｍｇ／ｋｇ／日で週２回４週間）と共に投与する。これらの投与群の対照（それぞれ「Ｇ」、「Ｈ」、「Ｉ」および「Ｊ」）には、これらの薬剤を同様の濃度および注射プロトコルを用いてアイソタイプ対照抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）と共に投与する。「Ｋ」群にはＰＢＳを投与し、プラセボとなる。投与および対照の腫瘍進行および退縮をインビボ撮像で非侵襲的に評価する。投与群および非投与群から腫瘍を切除し、免疫組織化学検査によって細胞生存および薬剤抵抗性タンパク質の変化について評価する。本願で用いられる文脈においては、用語「ＣＣＬ２５中和抗体」は抗ＣＣＬ２５抗体および／または抗ＣＣＲ９抗体を意味する。
【０１８４】
（統計（有意性）およびサンプルサイズ）
サンプルサイズ（または検定力）の算出は予備試験の設計および提案された実験の要件を判定することにとって重要である。我々の結果を解釈するためには、有意性検定および統計分析も重要である。従来のα値、すなわちｐ＝０．０１を用いて本試験の統計的有意性を評価する。提案された実験は、各群最小１０匹のマウスを必要とするであろう。データは平均±ＳＥＭで表示され、かつ正規分布サンプルについては両側対（または非対）スチューデントｔ−検定を、または正規分布しないサンプルについてはノンパラメトリック検定として非対マンホイットニーＵ検定により比較する。結果は、ＳＹＳＴＡＴ（Ｓｙｓｔａｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社）統計プログラムを用いて分析する。一因子および二因子分散ＡＮＯＶＡ分析を用いて、それぞれ群およびサブグループを評価する。したがって、結果はｐ値が＜０．０５である場合に統計的に有意とみなす。
【０１８５】
（動物）
週齢６から８週間の雄性ヌードマウスにＰＣａ細胞を皮下注射する。簡潔に述べると、５×１０６個のルシフェラーゼ発現ＰＣ３細胞を無菌ＰＢＳ１００μＬに再懸濁し、イソフルラン麻酔下でヌードマウスの側腹部に注射する。ルシフェラーゼ発現ＬＮＣａＰ細胞（５×１０６個）を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ベクトンディッキンソン）と混合し、イソフルラン麻酔下でヌードマウスの側腹部に注射する。
【０１８６】
（インビボ腫瘍増殖の分析）
腫瘍担持ヌードマウスに、撮像の１５分前に２５×５／８”ゲージ針を用いた腹腔内注射によりＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）１５０ｍｇ／ｋｇを投与する。マウスはＩＶＩＳ１００インビボ撮像システムを用いて撮像し、結果を光子／秒／ｃｍ２／ｓｒで表示する。腫瘍体積はノギスを用いて測定し、式（長径）×（短径）２×０．５で算出する。
【０１８７】
（細胞生存、アポトーシスおよび薬剤耐性遺伝子発現分析）
投与プロトコル完了の３日後に全群から腫瘍を切除する。腫瘍を４％ＰＦＡで固定し、さらにパラフィン包埋する。パラフィン切片（厚さ７μｍ）をガラススライドに載置し、脱パラフィンし、さらに再水和する（キシレンで５分、無水エタノール、９５％エタノールおよび７０％エタノールで１分ずつ）。再水和した切片を用いて、薬物輸送体、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＦＡＫ、ＦＫＨＲ、ＦＯＸＯ、Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、ＢａＫ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＸＩＡＰ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、ＴＰ５３、チトクロームＣ、カスパーゼ−３、−６、−８、−９、サバイビン、ラミン、ＣａｍＫＩＩ、ビトロネクチン、β−カテニン、カドヘリン、Ｔｗｉｓｔ−１、ＣＲＥＢ、ＮＦ−κＢ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＣＣＲ９およびＣＣＬ２５について、ペルオキシダーゼベースで免疫組織化学染色する。染色後、スライドをＡｐｅｒｉｏスキャンスコープ（Ａｐｅｒｉｏ）システムによりスキャンおよび分析する。
【０１８８】
ＣＣＬ２５中和は、薬剤に反応した細胞生存の低下による腫瘍体積の減少につながる。しかし、形成される腫瘍の間でも反応はホルモン感受性（ＬＮＣａＰ）およびホルモン抵抗性（ＰＣ３細胞）によって異なる。さらに、化学療法剤は機能的ＣＣＲ９−ＣＣＬ２５軸を有する腫瘍においては効果が低く、これによりこれらの薬剤を細胞外に輸送することが知られているＡＢＣタンパク質の発現が亢進しうる。
【０１８９】
上の記述は、当業者に対して本願を実践する方法を教示することを目的とし、かつ記述を読めば当業者に対してすぐに明らかになるそれら全ての明白な変更およびその変法を詳述することを意図していない。しかし、そうした全ての明白な変更および変法が本願の範囲に含まれることが意図され、それは以下の請求項によって定義される。請求項は、文脈が具体的にそうでないと示さなければ、そこで意図される目的に合致するために効果的な要素および段階を任意の順番で包含することを意図する。本明細書に引用された全ての参照文献は、その全文を本願に参照文献として援用する。
【図２】
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【図５】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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