(57)【要約】  本発明は、ウシの種のメンバーにおいて非抗原特異的免疫応答を誘起するのに有効な免疫活性化方法に関する。この方法は、ウシの種のメンバーを感染性疾患から保護するのに、そして、感染性疾患に罹患した動物を処置するのに、特に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．陽イオン性リポソーム送達媒体；および
ｂ．核酸分子
を含む、畜牛のウシ呼吸器病を処置するための免疫調節性組成物。
【請求項２】
リポソーム送達媒体が、多層状小胞脂質および突出した脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
リポソーム送達媒体が、ＤＴＭＡおよびコレステロール；ＤＯＴＡＰおよびコレステロール；ＤＯＴＩＭおよびコレステロール並びにＤＤＡＢおよびコレステロールからなる群から選択される脂質の対を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
核酸分子が、遺伝子挿入のない単離された細菌由来の核酸ベクターまたはその断片である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレー／エアロゾル、経口、眼内、気管内および鼻腔内からなる群から選択される投与のための、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
生物学的物質が、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ウシ呼吸器病が、ウイルス感染および／または細菌感染に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
免疫調節性組成物を含み、該免疫調節性組成物が、
ａ．ＤＯＴＩＭおよびコレステロール脂質の組合せ；および、
ｂ．遺伝子挿入のない単離された細菌由来の核酸ベクターまたはその断片である核酸分子
を含む、畜牛におけるマンヘミア・ヘモリチカに起因する臨床徴候を低減するための、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
生物学的物質をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
免疫調節性組成物を含み、免疫調節性組成物が、
ａ．ＤＯＴＩＭおよびコレステロール脂質の組合せ；および、
ｂ．遺伝子挿入のない単離された細菌由来の核酸ベクターまたはその断片である核酸分子
を含む、ワクチンを投与されている動物の獲得免疫応答を改善するための、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
免疫調節性組成物が、ワクチンと共投与されるか、ワクチンの後または前に投与されるか、または、ワクチンと混合されている、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウシの種のメンバーにおける免疫活性化方法に関する。特に、本発明は、全身的、非特異的および抗原特異的免疫応答を誘起する方法を含み、それは、動物の投与および感染性疾患に対する保護に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
畜牛は、多くのタイプのウイルス、細菌および寄生生物の感染の第一の標的である。離乳、畜牛の出荷、過酷な天候および牛肉および乳製品における栄養学的な要望などの現代的な生産実務も、疾患の発生率を高めるリスク要因となり得る。ウシ呼吸器病（ＢＲＤ）、または、しばしば呼ばれるように、ウシ呼吸器病症候群は、乳牛および肉牛の両方で起こり、世界中で、畜牛の産業における経済的損失の主原因の一つである。これらの損失は、罹病率、死亡率、体重増加の減少、処置および予防の費用、乳生産の損失および屠体の特徴に対する負の影響が含まれる。
【０００３】
ＢＲＤの病因は、上記の多数の環境的および生理学的ストレス要因と、感染性物質との組み合わせから生じると考えられる。マンヘミア（パスツレラ）・ヘモリチカ（Mannheimia (Pasteurella) haemolytica）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）およびヒストフィラス・ソムニ（Histophilus somni）(以前は、ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus））は、ウシの上気道の正常な菌叢の一部であると考えられる。逆に、下気道は、微生物の侵入の防止を目的とする多数の免疫学的経路により維持される、比較的無菌な環境である。畜牛が環境的および生理学的ストレス要因にさらされると、動物の自然および獲得免疫機能が損なわれ、それにより、上述の生物が増殖し、その後、下気道でコロニー形成することが可能になる。感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ、ＩＢＲまたはＢＨＶ１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器多核体ウイルス（ＢＲＳＶ）およびパラインフルエンザ３型ウイルス（ＰＩ３）などの様々なウシウイルスが、肺における免疫抑制作用を有することが知られている。しかしながら、マンヘミア・ヘモリチカは、ＢＲＤの症例において、断然最も蔓延している細菌の病原体である。
【０００４】
現在のＢＲＤの予防および処置は、肥育場へ到着した際の畜牛集団への抗生物質の投与（即ち、メタ予防（metaphylaxis））、病気の畜牛への抗生物質治療、および、Ｍ.ヘモリチカを含むＢＲＤウイルスおよび細菌に対する予防接種からなる。
【０００５】
現在の予防接種のプログラムおよび医薬的治療が、今日の畜牛におけるＢＲＤの制御に最適ではない様々な理由がある。第一に、畜牛における感染性疾患との闘病において、宿主の防御系が主要な役割を果たす。従来の処置は、細菌感染を処置または制御するのに、抗生物質の投与を含む。しかしながら、ウイルス感染に利用できる承認された医薬的処置はない。ＢＲＤでは、ほとんどの場合、細菌感染があるだけではなく、ウイルス感染もある。第二に、予防接種の時期は、しばしば、最適には及ばない。呼吸器ワクチンが最適に有効であるためには、製品は、ストレスまたは出荷の２−４週間前に投与されるべきであり、これは、典型的には、商業的な畜牛の生産において実行可能ではない。ワクチンの投与は、最適に有効であるには、早すぎるか、または、遅すぎる。
【発明の概要】
【０００６】
従って、疾患を引き起こす生物を減らすか、または排除するために、免疫系を刺激し、攻撃的応答を打ち立てる方法に対する要望が存在する。この方法は、投与が容易であり、単独で、もしくはワクチンと組み合わせて効くか、または、そのようなワクチンをより効果的にするのを助け、より長い作用時間を有するか、または、免疫を最大にするための追加の注射を必要としないことが重要である。本発明は、ウシの種において、非抗原特異的免疫応答を誘起する方法を提供し、それは、投与が容易であり、単独で、もしくはワクチンと組み合わせて効き、１種またはそれ以上の感染性物質に対して、保護的応答を誘導する。
【０００７】
図面の簡単な説明
図１.１は、実施例１に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量による、平均直腸温度のデータをグラフで示す。
図１.２は、実施例１に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量による、毎日の体重増加の平均のデータをグラフで示す。
図１.３は、実施例１に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量に関して、モデルに適合させた肺病変スコアをグラフで示す。
図２.１は、実施例２に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量による、平均直腸温度のデータをグラフで示す。
図２.２は、実施例２に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量による、毎日の体重増加の平均のデータをグラフで示す。
図２.３は、実施例２に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量に関して、モデルに適合させた肺病変スコアをグラフで示す。
図３.１は、実施例３に記載の通り、投与された免疫調節剤の用量に関して、モデルに適合させた肺病変スコアをグラフで示す。
図３.２は、実施例３に記載の通り、免疫調節剤の投与日に関して、モデルに適合させた肺病変スコアをグラフで示す。
図４.１は、実施例４に記載の通り、処置群により保護された動物の％をグラフで示す。
図４.２は、実施例４に記載の通り、処置群により保護された動物（＜１％肺病変および肺病変なし）のパーセントをグラフで示す。
図５.１は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＨＶ−１に感染した細胞におけるＣＤ２５ＥＩ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.２は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＲＳＶに感染した細胞におけるＣＤ２５ＥＩ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.３は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ１型に感染した細胞におけるＣＤ２５ＥＩ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.４は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ２型に感染した細胞におけるＣＤ２５ＥＩ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.５は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＨＶ−１に感染した細胞におけるＩＦＮγ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.６は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＲＳＶに感染した細胞におけるＩＦＮγ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.７は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ１型に感染した細胞におけるＩＦＮγ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.８は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ２型に感染した細胞におけるＩＦＮγ発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.９は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＨＶ−１に感染した細胞におけるＩＬ−４発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.１０は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＲＳＶに感染した細胞におけるＩＬ−４発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.１１は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ１型に感染した細胞におけるＩＬ−４発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.１２は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ２型に感染した細胞におけるＩＬ−４発現指数（ｙ軸）の測定をグラフで示す。
図５.１３は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ１型に感染した細胞における、モデルに適合させた血清抗体力価の評価（ｙ軸）をグラフで示す。
図５.１４は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＶＤＶ２型に感染した細胞における、モデルに適合させた血清抗体力価の評価（ｙ軸）をグラフで示す。
図５.１５は、実施例５に記載の通り、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＢＨＶ−１に感染した細胞における、モデルに適合させた血清抗体力価の評価（ｙ軸）をグラフで示す。
図５.１６は、実施例５に記載の通り、モデルに適合させた毎日の体重増加の平均の結果をグラフで示す。
図６.１は、実施例６に記載の通り、処置群について、ＢＨＶ１ ＳＮＴ力価をグラフで示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明のウシの種のメンバーにおける免疫応答を誘起する方法は、有効量の免疫調節性組成物をウシの種のメンバーに投与し、免疫応答を誘起することを含む。免疫調節性組成物は、リポソーム送達媒体および少なくとも１種の核酸分子を含む。加えて、免疫調節剤は、単独で有効である非抗原特異的免疫応答を誘起するか、または、ワクチンなどの少なくとも１種の生物学的物質の作用を、そのようなワクチンに先だって投与されるか、そのようなワクチンと共に投与されるか、ワクチン接種後に投与されるか、または、ワクチンと混合されると、増強する。
【０００９】
本方法は、ウシの種を感染症から保護し、感染性疾患を有する集団を処置するために、新しい処置戦略を提供する。最後に、本発明の方法は、この免疫調節剤がワクチンと組み合わせて使用されるときに、より迅速、長期かつ良好な、疾患に対する保護を提供する。
【００１０】
１．組成物
ａ．免疫調節剤
本発明のある実施態様では、免疫調節性組成物は、リポソーム送達媒体および少なくとも１種の核酸分子を含む（出典明示により本明細書の一部とする米国特許第６,６９３,０８６号に記載の通り）。
【００１１】
適するリポソーム送達媒体は、核酸分子を処置対象の組織に送達できる脂質組成物を含む。リポソーム送達媒体は、好ましくは、核酸分子および／または生物学的物質を送達するのに十分な時間にわたり、対象において安定に留まることができる。ある実施態様では、リポソーム送達媒体は、受容対象において、少なくとも約５分間安定である。他の実施態様では、リポソーム送達媒体は、受容対象において、少なくとも約１時間安定である。また他の実施態様では、リポソーム送達媒体は、受容対象において、少なくとも約２４時間安定である。
【００１２】
本発明のリポソーム送達媒体は、核酸分子を細胞内に送達するために、細胞の細胞膜と融合できる脂質組成物を含む。ある実施態様では、本発明の核酸：リポソーム複合体は、送達されると、少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）の発現されたタンパク質／総組織タンパク質１ミリグラム（ｍｇ）／送達された核酸１マイクログラム（μｇ）である。他の実施態様では、核酸：リポソーム複合体の形質移入効率は、少なくとも約１０ｐｇの発現されたタンパク質／総組織タンパク質１ｍｇ／送達された核酸１μｇであり；また他の実施態様では、少なくとも約５０ｐｇの発現されたタンパク質／総組織タンパク質１ｍｇ／送達された核酸１μｇである。複合体の形質移入効率は、１フェムトグラム（ｆｇ）の発現されたタンパク質／総組織タンパク質１ｍｇ／送達された核酸１μｇの程度に低くてもよいが、上記の量がより好ましい。
【００１３】
本発明の好ましいリポソーム送達媒体は、直径で約１００ないし５００ナノメートル（ｎｍ）、他の実施態様では、約１５０ないし４５０ｎｍ、また他の実施態様では、約２００ないし４００ｎｍである。
【００１４】
適するリポソームには、一般的に使用されるものなどの任意のリポソーム、例えば、超業者に知られている遺伝子送達方法が含まれる。好ましいリポソーム送達媒体は、多層状小胞（multilamellar vesicle）（ＭＬＶ）脂質および突出した脂質（extruded lipid）を含む。ＭＬＶの製造方法は、当分野で周知である。より好ましいリポソーム送達媒体は、ポリカチオン性脂質組成物（即ち、陽イオン性リポソーム）を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールに結合したコレステロール骨格を有するリポソームを含む。例示的な陽イオン性リポソーム組成物には、Ｎ−［１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール、Ｎ−［１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）およびコレステロール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。送達媒体として使用するのに最も好ましいリポソーム組成物には、ＤＯＴＩＭおよびコレステロールが含まれる。
【００１５】
適する核酸分子には、コードまたは非コード配列およびＤＮＡまたはＲＮＡなどの任意の核酸配列が含まれる。コード核酸配列は、タンパク質またはペプチドの少なくとも一部をコードし、一方、非コード配列は、タンパク質またはペプチドのどの部分もコードしない。本発明によると、「非コード」核酸は、プロモーター領域などの、転写ユニットの調節領域を含み得る。用語「空ベクター」は、用語「非コード」と互換的に使用でき、特に、遺伝子挿入のないプラスミドベクターなどの、タンパク質コード部分のない核酸配列を表す。核酸分子にコードされるタンパク質の発現は、非抗原特異的免疫応答の誘起に必要とされない；従って、核酸分子は、転写制御配列に、必ずしも作動可能に連結している必要は無い。しかしながら、免疫原および／またはサイトカインをコードする核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を組成物に含めることにより、さらなる利点を獲得し得る（即ち、抗原特異的かつ増強された免疫）。
【００１６】
リポソームを核酸分子と複合体化することは、当分野で標準的な方法を使用して、または、出典明示により本明細書の一部とする米国特許第６,６９３,０８６号に記載の通り、達成し得る。リポソームに添加するのに適する核酸分子の濃度には、全身の免疫応答が誘起されるように、十分な量の核酸分子を対象に送達するのに有効な濃度が含まれる。ある実施態様では、約０.１μｇないし約１０μｇの核酸分子を、約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせ、他の実施態様では、約０.５μｇないし約５μｇの核酸分子を、約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせ、また他の実施態様では、約１.０μｇの核酸分子を約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせる。ある実施態様では、組成物中の核酸の脂質に対する比（μｇ核酸：ｎｍｏｌ脂質）は、重量で少なくとも約１：１核酸：脂質（即ち、１μｇ核酸：１ｎｍｏｌ脂質）、他の実施態様では、少なくとも約１：５、また他の実施態様では、少なくとも約１：１０、さらなる実施態様では、少なくとも約１：２０である。ここで表される比は、組成物中の脂質の総量ではなく、組成物中の陽イオン性脂質の量に基づく。他の実施態様では、本発明の組成物中の核酸の脂質に対する比は、重量で約１：１ないし約１：８０核酸：脂質であり；他の実施態様では、重量で約１：２ないし約１：４０核酸：脂質であり；さらなる実施態様では、重量で約１：３ないし約１：３０核酸：脂質であり；また他の実施態様では、重量で約１：６ないし約１：１５核酸：脂質である。
【００１７】
ｂ．生物学的物質
本発明の他の実施態様では、免疫調節剤には、リポソーム送達媒体、核酸分子および少なくとも１種の生物学的物質が含まれる。
【００１８】
適する生物学的物質は、ウシの疾患の予防または処置に有効な物質である。そのような生物学的物質には、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。適する免疫増強タンパク質は、免疫を増強すると知られているタンパク質である。非限定的に例示すると、タンパク質のファミリーを含むサイトカインは、既知の免疫増強タンパク質ファミリーである。適する免疫原は、対象への免疫原の投与が、対象の組織内で遭遇する同一または類似のタンパク質に対して、免疫原に特異的な免疫応答を開始するように、体液性および／または細胞性免疫応答を誘起するタンパク質である。免疫原は、細菌、ウイルス、寄生生物または菌類により発現される病原性抗原を含み得る。好ましい抗原には、対象において感染性疾患を引き起こす抗原が含まれる。本発明によると、免疫原は、体液性および／または細胞性免疫応答を誘起する、天然に産生されるかまたは合成的に誘導されるタンパク質の任意の部分であり得る。そのようなものとして、抗原または免疫原のサイズは、約５−１２アミノ酸の程度に小さくてもよく、全長タンパク質の程度に大きくてもよく、その間のサイズを含む。抗原は、多量体タンパク質または融合タンパク質であり得る。抗原は、天然または組み換え細胞から誘導される精製ペプチド抗原であり得る。免疫増強タンパク質および免疫原の核酸配列は、免疫原が対象の組織で発現され、それにより対象において非特異的免疫応答に加えて免疫原特異的免疫応答を誘起するように、転写制御配列に作動可能に結合している。
【００１９】
本発明の他の実施態様では、生物学的物質はワクチンである。ワクチンは、生の、感染性の、ウイルス、細菌または寄生生物のワクチン、または、死滅した、不活化された、ウイルス、細菌または寄生生物のワクチンを含み得る。ある実施態様では、１種またはそれ以上のワクチン（生または死滅ウイルスワクチン）を、本発明の免疫調節性組成物と組み合わせて使用し得る。適するワクチンには、畜牛の種のために当分野で知られているものが含まれる。例示的なワクチンには、限定されないが、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）（１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ１））、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ３）、ウシ呼吸器多核体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１型および２型）、ヒストフィラス・ソムニ、マイコプラズマ・ボビス（Mycoplasma bovis）および当分野で知られている他の疾患に対する保護のために当分野で使用されるものが含まれる。例示的な実施態様では、マンヘミア・ヘモリチカに対する保護のためのワクチンを、本発明の免疫調節性組成物と組み合わせて使用し得る。
【００２０】
本発明のまた他の実施態様では、生物学的物質は抗菌剤である。適する抗菌剤には、キノロン類、好ましくはフルオロキノロン類、β−ラクタム類およびマクロライド−ストレプトグラミン−リンコサミド（ＭＬＳ）系抗生物質が含まれる。
【００２１】
適するキノロン類には、ベノフロキサシン（benofloxacin）、ビンフロキサシン（binfloxacin）、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン（danofloxacin）、ジフロキサシン（difloxacin）、エノキサシン、エンロフロキサシン（enrofloxacin）、フレロキサシン、ゲミフロキサシン、イバフロキサシン（ibafloxacin）、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン（marbofloxacin）、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン（orbifloxacin）、パズフロキサシン、プラドフロキサシン（pradofloxacin）、ペルフロキサシン（perfloxacin）、テマフロキサシン、トスフロキサシン、サラフロキサシン（sarafloxacin）、ゲミフロキサシンおよびスパルフロキサシンが含まれる。好ましいフルオロキノロン類には、シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、モキシフロキサシン、ダノフロキサシンおよびプラドフロキサシンが含まれる。適するナフチリドン（naphthyridone）類には、ナリジクス酸が含まれる。
【００２２】
適するβ−ラクタム類には、ペニシリン類、例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、テモシリン、アモキシシリン、アンピシリン、コ−アモキシクラブ（co-amoxiclav）(アモキシシリンおよびクラブラン酸)、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン；セファロスポリン類、例えば、セファロニウム（cefalonium）、セファレキシン、セファゾリン、セファプリリン（cefapririn）、セフキノム（cefquinome）、セフチオフル、セファロチン、セファクロル、セフロキシム、セファマンドール、デフォテタン（defotetan）、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフィキシム、セフタジジム、セフェピム、セフピロム；カルバペネム類およびペネム類、例えば、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム、ドリペネム、モノバクタム類、例えば、アズトレオナム（アザクタム）、チゲモナム（tigemonam）、ノカルディシンＡ、タブトキシニン（tabtoxinine）−β−ラクタム；およびβ−ラクタマーゼ阻害剤、例えば、クラブラン酸、タゾバクタムおよびスルバクタムが含まれる。好ましいβ−ラクタム類には、セファロスポリン類、特に、セファゾリンが含まれる。
【００２３】
適するＭＬＳ抗生物質には、任意のマクロライド、リンコマイシン、クリンダマイシン、ピルリマイシンが含まれる。好ましいリンコサミドは、ピルリマイシンである。
【００２４】
他の抗菌剤には、２−ピリドン類、テトラサイクリン類、スルホンアミド類、アミノグリコシド類、トリメトプリム、ジメトリダゾール類、エリスロマイシン、フラマイセチン、フラゾリドン、様々なプレウロムチリン類、例えば、チアムリン（tiamulin）、バルネムリン（valnemulin）、様々な、ストレプトマイシン、クロピドール、サリノマイシン（salinomycin）、モネンシン、ハロフジノン、ナラシン（narasin）、ロベニジンなどが含まれる。
【００２５】
２．方法
ａ．免疫刺激の方法
本発明のある実施態様では、免疫応答は、ウシの種のメンバーにおいて、有効量の免疫調節性組成物をウシの種のメンバーに投与することにより誘起される。有効量は、ウシの種のメンバーにおいて免疫応答を誘起するのに十分である。免疫調節剤は、リポソーム送達媒体および核酸分子を含む。
【００２６】
ある実施態様では、免疫調節剤の有効量は、約１マイクログラムないし約１０００マイクログラム／動物である。他の実施態様では、免疫調節剤の有効量は、約５マイクログラムないし約５００マイクログラム／動物である。また他の実施態様では、免疫調節剤の有効量は、約１０マイクログラムないし約１００マイクログラム／動物である。さらなる実施態様では、免疫調節剤の有効量は、約１０マイクログラムないし約５０マイクログラム／動物である。
【００２７】
本発明の他の実施態様では、免疫応答は、ウシの種のメンバーにおいて、リポソーム送達媒体、単離された核酸分子および生物学的物質を含む有効量の免疫調節剤を投与することにより誘起される。生物学的物質は、免疫調節剤と混合されていても、共に投与されてもよく、または、それから独立していると意図されている。独立した投与は、免疫調節剤の投与の前でも後でもよい。増強された免疫を延長するために、１回より多い免疫調節剤または生物学的物質の投与を使用し得ることも意図されている。さらに、１種より多い生物学的物質を、免疫調節剤と共に投与し得るか、免疫調節剤に先だって投与し得るか、免疫調節剤の投与の後に投与し得るか、または、同時に投与し得る。
【００２８】
ｂ．疾患
本発明の方法は、対象が免疫応答の誘起に影響を受けやすい疾患から保護されるように、対象において免疫応答を誘起する。本明細書で使用するとき、語句「疾患から保護される」は、疾患の症状を低減すること；疾患の発症を低減すること、および、疾患の臨床的または病理的重篤度を低減すること、または、疾患を引き起こす病原体の排出を低減することを表す。対象を保護することは、対象に投与されたとき、疾患の発症を防止する、疾患の症状、臨床徴候、病態または原因を治癒、および／または軽減もしくは低減する、本発明の治療的組成物の能力を表し得る。ＢＲＤの臨床徴候の例には、肺の病変、体温の上昇、鬱病（例えば、摂食障害、外部刺激への反応の低下、垂れ耳）、鼻汁および呼吸器の特徴（例えば、呼吸数、呼吸努力）が含まれる。そのようなものとして、ウシの種のメンバーを疾患から保護することには、疾患の発症を防止すること（予防的処置）および疾患（治療的処置）を有するウシの種のメンバーを処置することの両方が含まれる。特に、対象を疾患から保護することは、有益または保護的な免疫応答を誘導することによってウシの種のメンバーにおいて免疫応答を誘起することにより達成され、それは、いくつかの例では、過活性または有害な免疫応答をさらに抑制、低減、阻害または遮断し得る。用語「疾患」は、ウシの種のメンバーの正常な健康からのいかなる逸脱も表し、疾患症状が存在するときの状態、ならびに、逸脱（例えば、感染、遺伝子の突然変異、遺伝子の異常など）が起こったが、症状はまだ現れていない状態を含む。
【００２９】
本発明の方法は、疾患の予防、疾患に対するエフェクター細胞の免疫の刺激、疾患の除去、疾患の軽減および一次的疾患の発症に起因する二次的疾患の予防に使用し得る。
【００３０】
本発明は、また、ワクチンと共に投与されると、ワクチン単独での投与に対して、動物の獲得免疫応答を改善し得る。一般的に、一度投与されたワクチンは、獲得免疫を刺激するのに時間がかかるので、動物をすぐには保護しない。用語「改善する」は、本発明では、ワクチンが動物を保護し始めるまで動物の自然免疫応答を誘起すること、および／または、獲得免疫を介してワクチンにより与えられる保護の期間を延長することを表す。
【００３１】
本発明の方法には、幅広い様々な病原体の感染に対して保護するために組成物を投与することが含まれる。投与される組成物は、特異的応答を誘起する特異的抗原を含んでも含まなくてもよい。本発明の方法は、ウイルス、細菌、菌類および寄生生物を非限定的に含む感染性微生物の物質に起因する疾患から、受容対象を保護することが意図されている。例示的なウイルス感染症には、非限定的に、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）（１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ１））、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ３）、ウシ呼吸器多核体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１型および２型）、ウシアデノウイルス、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ウシカリシウイルス、ウシパルボウイルス、ＢＨＶ４、ウシレオウイルス、ウシエンテロウイルス、ウシライノウイルス、悪性カタル熱ウイルス、ウシ白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ブルータングウイルス（オルビウイルス）、これらの組み換え体、および、当分野で知られている他のウイルスによる感染に起因するものが含まれる。例示的な細菌感染には、非限定的に、グラム陽性または陰性菌およびマイコバクテリア、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・コリナム（Clostridium colinum）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クウロストリジウム・ノビイ（Clostridium novyi）、気腫疽菌（Clostridium chauveoi）、クロストリジウム・セプティカム（Clostridium septicum）、クロストリジウム・ヘモリチカム（Clostridium hemolyticum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、マンヘミア・ヘモリチカ、ウレアプラズマ・ジベルサム（ureaplasma diversum）、マイコプラズマ・ディスパー（Mycoplasma dispar）、マイコプラズマ・ボビス（Mycoplasma bovis）、マイコプラズマ・ボビルヒニス（Mycoplasma bovirhinis）、ヒストフィラス・ソムニ、カンピロバクター・フィタス（Campylobacter fetus）、レプトスピラ属（Leptospira spp.）、アルカノバクテリウム・ピオゲネス（Arcanobacterium pyogenes）、バチルス・アントラックス（Bacillus anthrax）、フソバクテリウム・ネクロホラム（Fusobacterium necrophorum）、フソバクテリウム属（Fusobacterium spp.）、トレポネーマ属（Treponema spp.）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、パラ結核菌（Mycobacterium paratuberculosis）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、ヒストフィラス属（Histophilus spp.）、モラクセラ属（Moraxella spp.）、ムエレリウス属（Muellerius spp.）、マイコプラズマ属（Mycoplasma spp.）、サルモネラ属（Salmonella spp.）、炭疽菌（Bacillus anthracis）および当分野で知られている他の細菌による感染に起因するものが含まれる。例示的な菌類またはカビの感染には、非限定的に、アルカノバクテリウム属（Actinobacterim spp.）、アスペルギルス属（Aspergillus spp.）およびヒストモナス属（Histomonas spp.）および当分野で知られている他の感染性の菌類またはカビによる感染に起因するものが含まれる。例示的な寄生生物には、非限定的に、ネオスポラ属（Neospora spp.）、毛様線虫属（Trichostrongylus）、クーペリア属（Cooperia）、アナプラズマ属（Anaplasma spp）、バベシア��（Babesia spp）、コリオプテス属（Chorioptes spp）、嚢虫属（Cysticercus spp）、ダーマトフィルス属（Dermatophilus spp）、ダマリニア・ボビス（Damalinia bovis）、ディクチロカウラス（Dictylocaulus spp）、エイメリア属（Eimeria spp）、エペリスロゾーン属（Eperythrozoon spp）、ヘモンクス属（Haemonchus spp）、メロファガス属（Melophagus spp）、ムエレリウス属（Muellerius spp）、ネマトジルス属（Nematodirus spp）、オエストラス属（Oestrus spp）、オステルタギア属（Ostertagia spp）、ソロプテス属（Psoroptes spp）、サルコプテス属（Sarcoptes spp）、セルペンス属（Serpens spp）、糞線虫属（Strongyloides spp）、トキソプラズマ属（Toxoplasma spp）、鞭虫属（Trichuris spp）、白癬菌属（Trichophyton spp）およびトリトリコモナス属（Tritrichomas spp）、ファスシオロイデス属（Fascioloides spp）、アナプラズマ・マジナーレ（Anaplasma marginale）および当分野で知られている他の寄生生物が含まれる。
【００３２】
ｃ．対象
本発明の方法は、家畜でも野生でも、任意の対象またはウシの種のメンバーに適用し得る。特に、それは、繁殖、食肉または乳の生産のために商業的に飼育されている対象に適用し得る。適するウシ対象には、非限定的に、アンテロープ、スイギュウ、ヤク、畜牛およびバイソンが含まれる。ある実施態様では、ウシの種のメンバーは、畜牛である。畜牛の種には、非限定的に、雌牛、雄牛、雌の去勢牛、未経産牛、雄の去勢牛、肉牛または乳牛が含まれる。当業者は、特に感染性物質への環境的暴露を受けやすいので、本発明の方法が、繁殖、食肉または乳の生産のために飼育されている畜牛に大いに有益であることを理解するであろう。
【００３３】
ｄ．投与
様々な投与経路を利用できる。選択される特定の様式は、当然、選択される特定の生物学的物質、対象の齢および全般的健康状態、処置される特定の症状および治療効力に必要とされる用量によって決まるであろう。本発明の方法は、臨床的に許容されない有害作用を引き起こさずに、有効なレベルの免疫応答をもたらす任意の投与様式を使用して実施し得る。組成物は、便利に単位用量形で与えられてもよく、当分野で周知のいかなる方法によって製造されてもよい。
【００３４】
ウシの種の予防接種は、いかなる齢でも実施できる。ワクチンは、静脈内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、皮下に、スプレー／エアロゾルで、経口で、眼内に、気管内に、鼻腔内に、または、当分野で知られている他の方法により、投与し得る。さらに、本発明の方法は、通例の予防接種のスケジュールに基づいて使用し得ると意図されている。免疫調節剤も、静脈内に、筋肉内に、皮下に、スプレーにより、経口で、眼内に、気管内に、経鼻的に、または、当分野で知られている他の方法により、投与し得る。ある実施態様では、免疫調節剤を皮下に投与する。他の実施態様では、免疫調節剤を筋肉内に投与する。また他の実施態様では、免疫調節剤をスプレーとして投与する。さらなる実施態様では、免疫調節剤を経口で投与する。
【００３５】
ある実施態様では、免疫調節剤を攻撃（または感染）に先立ち動物に単独で投与する。他の実施態様では、免疫調節剤を攻撃（または感染）後に動物に単独で投与する。また他の実施態様では、免疫調節剤を攻撃（または感染）と同時に動物に単独で投与する。さらなる実施態様では、免疫調節性組成物を、攻撃に先立つ予防接種として、同時に共に投与する。またさらなる実施態様では、免疫調節性組成物を、攻撃（または感染）と同時に、予防接種と同時に共に投与する。共に投与することには、ワクチンおよび免疫調節剤を、動物の同じ概略的位置に、隣り合う２つの異なる場所で（即ち、動物の首での隣り合う注射）、動物の同じ概略的位置の反対側で（即ち、首の各側に）、または、同じ動物の異なる位置で、投与することが含まれ得る。他の実施態様では、免疫調節性組成物を、予防接種および攻撃に先立ち投与する。さらなる実施態様では、免疫調節性組成物を予防接種後に、しかし攻撃に先立ち、投与する。さらなる実施態様では、免疫調節性組成物を、攻撃（または感染）に先立ち予防接種された動物への攻撃の後に投与する。
【００３６】
ある実施態様では、免疫調節剤を、攻撃の約１日ないし約１４日前または攻撃の約１日ないし約１４日後に投与する。他の実施態様では、免疫調節剤を、攻撃の約１日ないし約７日前または攻撃の約１日ないし約７日後に投与する。または他の実施態様では、免疫調節剤を、攻撃の１、２、３、４、５、６、７日前または攻撃の１、２、３、４、５、６、７日後に投与する。
【００３７】
他の送達システムには、持続放出、遅延放出または徐放の送達システムが含まれ得る。そのようなシステムは、組成物の反復投与を回避でき、従って利便性を高め得る。多くのタイプの放出の送達システムが利用でき、当業者に知られている。ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート類、ポリカプロラクトン類、ポリエステルアミド類、ポリオルトエステル類、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ酸無水物などのポリマーをベースとするシステムが含まれる。薬物を含有する上記のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５,０７５,１０９号に記載されている。送達システムは、また、ステロール類、例えば、コレステロール、コレステロールエステル、および、脂肪酸または中性脂肪、例えば、モノ、ジおよびトリ−グリセリド類などを含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティック（sylastic）のシステム；ペプチドをベースとするシステム；ワックスコーティング；常套の結合剤および添加物を使用する圧縮錠；部分的に融合したインプラントなどである、非ポリマーのシステムを含み得る。特別な例には、本発明の物質がマトリックス内の形態で含有される浸食システム、例えば、米国特許第４,４５２,７７５号、第４,６７５,１８９号および第５,７３６,１５２号に記載のもの、および、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散システム、例えば、米国特許第３,８５４,４８０号、第５,１３３,９７４号および第５,４０７,６８６号に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。加えて、ポンプをベースとする機器の送達システムを使用でき、その中には移植に適応したものもある。
【００３８】
本発明の範囲から離れずに上記の組成物、製品および方法に様々な変更を成し得るので、上記の説明および下記の実施例に含まれる全事項は、限定的な意味ではなく、例示と解釈されることが意図されている。
【００３９】
定義
用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要または十分な量を表す。例えば、感染性疾患を処置または予防するための免疫調節剤の有効量は、微生物に暴露された際に免疫応答の展開を引き起こし、かくして、対象内の微生物の量の減少を、好ましくは微生物の撲滅まで、引き起こすのに必要な量である。特定の適用についての有効量は、処置されている疾患または状態、対象の大きさまたは疾患もしくは状態の重篤度などの要因に応じて変動し得る。当業者は、免疫調節剤の有効量を、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定できる。
【００４０】
用語「サイトカイン」は、免疫を増強するタンパク質のファミリーを表す。サイトカインファミリーは、造血性増殖因子、インターロイキン類、インターフェロン類、免疫グロブリンスーパーファミリーの分子、腫瘍壊死因子ファミリーの分子およびケモカイン類（即ち、細胞、特に貪食細胞の遊走と活性化を調節するタンパク質）を含む。例示的なサイトカイン類には、非限定的に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−α（ＩＦＮα）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）が含まれる。
【００４１】
用語「誘起する」は、活性化する、刺激する、生成する、または、上方調節するという用語と、互換的に使用できる。
【００４２】
用語「免疫応答を誘起すること」は、対象において、免疫応答の活性を特異的に制御するか、またはそれに影響を与えることを表し、免疫応答を活性化すること、免疫応答を上方調節すること、免疫応答を増強すること、および／または、免疫応答を変更すること（例えば、ある種の免疫応答を誘起することにより、今度はそれが、対象において優勢な種類の免疫応答を、有害または無効なものから、有益または保護的なものに変更する）を含み得る。
【００４３】
用語「作動可能に連結」は、核酸分子を転写制御配列に、宿主細胞に形質移入（即ち、形質転換、形質導入または形質移入）されたときにその分子が発現され得るような方法で連結することを表す。転写制御配列は、転写の開始、伸長および停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列などの、転写開始を制御するものである。様々なそのような転写制御配列が当業者に知られている。好ましい転写制御配列には、鳥類、魚類、哺乳動物、細菌、植物および昆虫細胞で機能するものが含まれる。いかなる転写制御配列も本発明で使用し得るが、それらの配列は、免疫原または免疫を刺激するタンパク質をコードする配列と天然に付随する天然産生の転写制御配列を含み得る。
【００４４】
用語「核酸分子」および「核酸配列」は、互換的に使用でき、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体を含む。これらの用語は、オリゴヌクレオチド、並びに、タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸分子、および、調節領域、イントロンまたは他の非コードＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸分子の両方を含む、より大きい配列も含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、約１ないし約５００ヌクレオチドの核酸配列を有し、より典型的には、少なくとも約５ヌクレオチドの長さである。核酸分子は、哺乳動物、魚類、細菌、昆虫、ウイルス、植物または合成の供給源を含む、いかなる供給源に由来してもよい。核酸分子は、組み換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）または化学合成などの、当分野で一般的に知られている方法により産生できる。核酸分子には、天然の核酸分子およびそれらのホモログが含まれ、それには、天然の対立遺伝子多型、および、改変された核酸分子が含まれるがこれらに限定されず、そこでは、そのような改変が、核酸分子が本発明の方法に有用な免疫原または免疫を刺激するタンパク質をコードする能力を実質的に妨害しない方法で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換または逆転している。核酸ホモログは、当分野で知られている数々の方法を使用して産生し得る（例えば、出典明示により本明細書の一部とする、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 参照）。病原体抗原の免疫原性またはサイトカイン活性などの免疫原性をスクリーニングする技法は、当業者に知られており、様々なインビトロおよびインビボアッセイを含む。
【００４５】
実施例
以下の実施例は、本発明の様々な実施態様を例示説明する。
【００４６】
実施例１．自然のウシ呼吸器病を発症する前または後にＤＮＡ免疫調節剤を受容する畜牛の評価
この研究の目的は、ＢＲＤの自然症例を発症する前および後に子牛に投与されたＤＮＡ免疫調節剤の効力を測定することであった。
【００４７】
免疫調節剤
この研究で使用した免疫調節剤は、陽イオン性脂質および非コードＤＮＡを含む組成物であった。合成免疫調節剤脂質成分［１−［２−［９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ］］−２−［８］（Ｚ）−ヘプタデセニル］−３−［ヒドロキシエチル］イミダゾリニウムクロライド（ＤＯＴＩＭ）および合成中性脂質コレステロールを製剤化し、直径約２００ｎｍのリポソームを産生した（米国特許第６,６９３,０８６号参照）。ＤＮＡ成分は、負に荷電されており、正に荷電した（陽イオン性）リポソームと結合する、大腸菌で産生した４２４２塩基対の非コードＤＮＡプラスミドであった（米国特許第６,６９３,０８６号参照）。
【００４８】
研究の動物
呼吸器疾患の現病歴がない、８４頭の離乳期のホルスタインの雄の去勢牛を群れから選択した。個々の子牛を最初に評価し、良好な健康状態にあると判定した。８４頭の子牛を、各々１２頭の子牛からなる７個の処置群に分けた。マンヘミア・ヘモリチカについて予防接種されていない動物のみを研究に含めた。動物は、いずれも、ＤＮＡ免疫調節剤の投与前、３０日以内に抗菌剤を受容していなかった。
【００４９】
処置群に、様々な用量の上記のＤＮＡ免疫調節剤を、処置日に、下記の表１.１に示す通りに投与した。ＤＮＡ免疫調節剤の希釈スキームを、表１.２に提供する。ＤＮＡ免疫調節剤を、筋肉内に、子牛の頭蓋から左肩へ、腹部から項靱帯へ、そして尾背部（caudo-dorsal）から頸溝へ、投与した。
【００５０】
後述の通り、処置−１日目は、子牛を評価し、研究に適すると判定した最初の選択後の、研究の開始日を表す。処置０日目は、−１日目の１日後である、など。
【００５１】
表１.１.免疫調節剤の投与スケジュール
【表１】
2014500292.tif 000002
【００５２】
子牛の大部分が、０日目の朝に様々なレベルのＢＲＤを経験していると観察された。５日目までに、研究集団にいるすべての子牛は、ＢＲＤ罹病の症例の定義に合致すると観察された。重篤なＢＲＤのために安楽死が指示された場合のみ、畜牛を研究集団からはずした。他の感染症／非感染症は観察されず、それによりこの研究から除くことを必要としなかった。
【００５３】
評価
研究の１−５日目に、子牛を様々な健康の指標について評価した。例えば、各子牛について、研究期間中１日ごとに、直腸温度および平均の毎日の体重を測定した。動物を各日ほぼ同じ時刻に（＋／−３時間）、１日目から５日目まで評価した。図１.１および１.２は、投与した免疫調節剤の用量に従って、直腸温度の平均および毎日の体重増加の平均を示す。
【００５４】
研究の５日目に、すべての子牛を安楽死させ、剖検した。個々の子牛について、剖検時に肺病変スコアを決定した（目視検査および手による触診により評価した肺硬化の程度に基づく）。
【００５５】
図１.３は、投与した免疫調節剤の用量に関して、肺病変スコアを示す。投与各日の全体的な肺病変スコアは、−１日目および０日目で、各々約１１％おおび１４％であった。肺病変スコア１１.２％、９.０％、１０.８％および１９.９％が、５００、２００、５０および負の対照群について各々示された。対照群と処置群（２００μｇ）の最大の差異は、約１１％の減少であった。
【００５６】
図１.３のモデルに適合させた評価は、すべての統計モデル共変数（即ち、用量、日および用量ｘ日）に、そして研究中に子牛を飼育した囲いに適合させた、未処理の平均値を反映する。従って、モデルに適合させた評価は、未加工の平均値と比較した差異を表し得る。
【００５７】
続いて、細菌学（肺培養）およびウイルス学（鼻の拭き取り検体）も実施した。５日目に安楽死させた、残っていた子牛（６９）のうち、１１.６％がウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）を鼻の分泌液中に排出していると判明した。研究した動物のすべての肺培養に関して、４１％がＭｈ陽性であり、３１.３％がパスツレラ・マルトシダ（Ｐｍ）に培養陽性であり、１０.８％がＭｈおよびＰｍの両方に培養陽性であり、研究集団中にヒストフィラス・ソムニは単離されなかった。マイコプラズマ・ボビスの培養は、この研究では実施しなかった。
【００５８】
結果
この研究では、ＤＮＡ免疫調節剤の用量（即ち５００μｇ、２００μｇおよび５０μｇ）は、負の対照と比較して、肺病変スコアの有意な低下に近づいた（Ｐ＝０.１２８４；図１.３参照）。しかしながら、ＤＮＡ免疫調節剤投与の日（即ち、−１または０日目）は、肺病変スコアと有意に関連しなかった。ＤＮＡ免疫調節剤の用量のグループ内では、肺病変スコアの統計的差異は観察されなかった。直腸温度は、ＤＮＡ免疫調節剤の用量に有意に関連する傾向があったが（Ｐ＝０.１１９０）、投与の日とは関連しなかった。毎日の体重増加の平均に関して、ＤＮＡ免疫調節剤の用量と負の対照の間に明白な差異は観察されなかった。
【００５９】
ＤＮＡ免疫調節剤が負の対照と比較して肺病変を減少させる強い傾向があったので、この製品がＢＲＤの大流行中に肺組織を保護する可能性を有する証拠が提供された。この研究では、処置投与の日は肺病変と関連しなかったので、畜牛がＤＮＡ免疫調節剤をＢＲＤに伴う臨床徴候の開始の１日前に受容しても同日に受容しても、問題ではないことが示された。ＢＲＤ病原体への暴露のタイミングは典型的な生産システムにおいて一般的には不明であり、畜牛が一連の生産工程で経験する様々なストレス要因の影響によりさらに複雑であるので、この結果は重要である。従って、ＢＲＤの開始に対する投与のタイミングの柔軟性を与える製品を生産者に提供することは、牛肉および乳製品の産業において、極めて価値がある。
【００６０】
実施例２．マンヘミア・ヘモリチカによる実験的攻撃と同時または１日後にＤＮＡ免疫調節剤を受容する畜牛の評価
この研究の目的は、マンヘミア・ヘモリチカによる実験的攻撃と同時または１日後に子牛に投与されたＤＮＡ免疫調節剤の効力を決定することであった。
【００６１】
免疫調節剤
この研究で使用した免疫調節剤は、上記の実施例１の組成物であった。
研究の動物
呼吸器疾患の現病歴がない、８４頭の離乳期の平均約３００ｌｂｓ（１３６ｋｇ）の体重のホルスタインの雌の去勢牛を群れから選択した。個々の子牛を最初に評価し、良好な健康状態にあると判定した。８４頭の子牛を、各々１２頭の子牛からなる７個の処置群に分けた。マンヘミア・ヘモリチカについて予防接種されていない動物のみを研究に含めた。動物は、いずれも、ＤＮＡ免疫調節剤の投与前、３０日以内に抗菌剤を受容していなかった。処置群に、様々な用量のＤＮＡ免疫調節剤を、処置日に、下記の表２.１に示す通りに投与した。ＤＮＡ免疫調節剤の希釈スキームを、表２.２に提供する。ＤＮＡ免疫調節剤を、筋肉内に、子牛の頭蓋から左肩へ、腹部から項靱帯へ、そして尾背部から頸溝へ、投与した。
【００６２】
後述の通り、処置０日目は、子牛を評価し、良好な健康状態にあると判定した最初の選択後の、研究の開始日を表す。処置１日目は、０日目の１日後である、など。
【００６３】
表２.１.免疫調節剤およびＭｈ攻撃の投与スケジュール
【表２】
2014500292.tif 000003
【００６４】
実験的攻撃
０日目に、全部で３.１２ｘ１０７のコロニー形成率（ＣＦＵ）のマンヘミア・ヘモリチカで子牛を攻撃した。呼吸管を通して接種菌液を投与した。３日目までに、研究集団のすべての子牛は、ＢＲＤ罹病の症例の定義に合致すると観察された。発症日の中央値は、１日であった。
【００６５】
評価
先の実施例と同様に、研究の１−５日目に、子牛を様々な健康の指標について評価した。各子牛について、研究期間中１日ごとに、直腸温度および平均の毎日の体重を測定した。動物を各日ほぼ同じ時刻に評価した。図２.１および２.２は、投与した免疫調節剤の用量に関して、直腸温度の平均および毎日の体重増加の平均を示す。
【００６６】
研究の５日目に、すべての子牛を安楽死させ、剖検した。個々の子牛について、剖検時に、実施例１に記載の形式に従って肺病変スコアを決定した。
図２.３は、投与した免疫調節剤の用量に関して、モデルに適合させた肺病変スコアを示す。
【００６７】
結果
この研究では、ＤＮＡ免疫調節剤の用量（即ち５００μｇ、２００μｇおよび５０μｇ）は、負の対照と比較して、肺病変スコアを有意に低下させた。しかしながら、低用量（２００μｇおよび５０μｇ）は、肺病変の減少において、５００μｇの用量を凌いだ。ＤＮＡ免疫調節剤投与の日（即ち、０または１日目）は、肺病変スコアと有意に関連しなかった。ＤＮＡ免疫調節剤の用量のグループ内では、肺病変スコアの統計的差異は観察されなかった。直腸温度は、負の対照群と比較して、ＤＮＡ免疫調節剤を投与された子牛で有意に低かったが、用量とは関連しなかった。毎日の体重増加の平均に関して、ＤＮＡ免疫調節剤の用量と負の対照の間に明白な差異は観察されなかった。
【００６８】
ＤＮＡ免疫調節剤が負の対照と比較して肺病変を減少させる強い傾向があったので、この製品がＢＲＤの大流行中に肺組織を保護する可能性を有する証拠が提供された。この研究では、処置投与の日は肺病変と関連しなかったので、畜牛がＤＮＡ免疫調節剤をＢＲＤに伴う臨床徴候の開始の１日前に受容しても同日に受容しても、問題ではないことが示された。ＢＲＤ病原体への暴露のタイミングは典型的な生産システムにおいて一般的には不明であり、畜牛が一連の生産工程で経験する様々なストレス要因の影響によりさらに複雑であるで、この結果は重要である。従って、ＢＲＤの開始に対する投与のタイミングの柔軟性を与える製品を生産者に提供することは、牛肉および乳製品の産業において、極めて価値がある。
【００６９】
実施例３．マンヘミア・ヘモリチカによる実験的攻撃の２日前または同時にＤＮＡ免疫調節剤を受容する畜牛の評価
この研究の目的は、マンヘミア・ヘモリチカによる実験的攻撃の２日前または同時に子牛に投与されたＤＮＡ免疫調節剤の効力を測定することであった。
【００７０】
免疫調節剤
この研究で使用した免疫調節剤は、上記の実施例１の組成物であった。
研究の動物
呼吸器疾患の現病歴がない、９６頭の平均約８００−１０００ｌｂｓ（３６３−４５４ｋｇ）の体重のホルスタインの雌の去勢牛を群れから選択した。個々の子牛を最初に評価し、良好な健康状態にあると判定した。９６頭の子牛を、各々１２頭の子牛からなる８個の処置群に分けた。マンヘミア・ヘモリチカについて予防接種されていない動物のみを研究に含めた。動物は、いずれも、ＤＮＡ免疫調節剤の投与前、３０日以内に抗菌剤を受容していなかった。処置群に、様々な用量のＤＮＡ免疫調節剤を、処置日に、下記の表３.１に示す通りに投与した。ＤＮＡ免疫調節剤の希釈スキームを、表３.２に提供する。ＤＮＡ免疫調節剤を、筋肉内に、子牛の頭蓋から左肩へ、腹部から項靱帯へ、そして尾背部から頸溝へ、投与した。
【００７１】
後述の通り、処置−２日目は、処置群１−３が免疫調節剤を投与された研究の開始日を表す。処置０日目は、−２日目の２日後である、など。
【００７２】
表３.１.免疫調節剤およびＭｈ攻撃の投与スケジュール
【表３】
2014500292.tif 000004
【００７３】
実験的攻撃
０日目に、全部で１.９ｘ１０１０ＣＦＵで子牛を攻撃した。呼吸管を通して接種菌液を投与した。
【００７４】
評価
先の実施例と同様に、研究の１−５日目に、子牛を様々な健康の指標について評価した。研究の５日目に、すべての子牛を安楽死させ、剖検した。個々の子牛について、剖検時に肺病変スコアを決定した。
【００７５】
図３.１は、投与した免疫調節剤の用量に関して、モデルに適合させた肺病変スコアを示す。図３.２は、免疫調節剤投与の日に関して、モデルに適合させた肺病変スコアを示す。
【００７６】
結果
この研究では、ＤＮＡ免疫調節剤の用量（即ち、２００μｇ、５０μｇおよび２５μｇ）は、負の対照と比較して、肺病変スコアを有意に低下させた。しかしながら、ＤＮＡ免疫調節剤の用量の群の間では、肺病変スコアの統計的差異は観察されなかった。ＤＮＡ免疫調節剤投与の日（即ち、−２日目および０日目）は、肺病変スコアと有意に関連した。免疫調節剤が０日目に投与されると、−２日目と比較して、有意な肺病変の減少が観察された。
【００７７】
実施例４．免疫調節剤と死滅ＭｈワクチンのＭｈ攻撃共投与
この研究の目的は、マンヘミア・ヘモリチカによる実験的攻撃に付された子牛に死滅Ｍｈワクチンと共に投与されるＤＮＡ免疫調節剤の効力を測定することであった。
【００７８】
免疫調節剤
この研究で使用した免疫調節剤は、上記の実施例１の組成物であった。
研究の動物
呼吸器疾患の現病歴がない、８１頭の１２週齢のホルスタインの雄の子牛を群れから選択した。個々の子牛を評価し、良好な健康状態にあると判定した。マンヘミア・ヘモリチカについて予防接種されていない動物のみを研究に含めた。動物は、いずれも、接種菌液の投与前、３０日以内に抗菌剤を受容していなかった。
【００７９】
実験的感染および攻撃
攻撃、または実験的感染は、マンヘミア・ヘモリチカの接種菌液への暴露を含んだ。この生物を、最初の接種では１.７Ｘ１０８／動物、２回目の接種では２.４Ｘ１０１０／動物の濃度で使用した。また、別の呼吸器経路で動物をスプレーで攻撃した。スプレー接種菌液中の生物の濃度は、１.９Ｘ１０１０／動物であった。
【００８０】
マンヘミア・ヘモリチカへの暴露に続いて子牛に投与された上記の免疫調節剤の効力を、表３に詳述する１２個の処置群により測定した。
表４.３.研究の処置群
【表４】
2014500292.tif 000005
油性ＭＨ＝マンヘミア・ヘモリチカワクチン（Pulmo-Guard（登録商標） PHM)
水性ＭＨ＝マンヘミア・ヘモリチカワクチン（One Shot（登録商標）)
ＮＣ＝混合されず、スプレーで攻撃されない（バックグラウンドの肉眼所見のために）
ＣＣ＝接触およびスプレーで攻撃された
ＳＥ＝シーダー（Seeder）攻撃として使用した（気管内で攻撃された）
ＳＥおよびＮＣを除くすべての動物は、スプレーで攻撃された
ＳＣ＝注射の皮下経路
ＩＭ＝注射の筋肉内経路
ＮＡ＝適用不能
＊群Ｔ８の動物は、鼻腔内攻撃後に処置される
【００８１】
研究の０日目に、群Ｔ１、Ｔ２およびＴ１２のすべての動物に、免疫調節剤を皮下投与した。免疫調節剤を、７日目に群Ｔ３、Ｔ４およびＴ５に皮下投与した。免疫調節剤を、１３日目に、群Ｔ６に皮下投与し、Ｔ７に筋肉内投与した。免疫調節剤を１５日目に群Ｔ８に皮下投与した。
【００８２】
ワクチンを受容するすべての動物を、標識の指示に従って予防接種した。免疫調節剤およびワクチンを、リンパ節（首）近くで接近して投与した−２本の注射（１本はワクチン、他方は免疫調節剤）。皮下経路の注射を受容するすべての動物は、肩甲下領域のリンパ節近くに注射された。
【００８３】
研究１０日目に、すべてのＴ１１の子牛をその場から離して家畜トレーラー内で約２４時間輸送し、子牛にストレスを与えた。研究１１日目に、マンヘミア・ヘモリチカを含有する接種菌液２０ｍＬをＴ１１の全動物に経気管投与し、続いて、４時間後に接種菌液２５ｍＬを経気管投与した。研究１４日目に、Ｔ９を除く全群を混合し、その場から離して家畜トレーラー内で約２４時間輸送し、子牛にストレスを与えた。群ＮＣのものを除く全動物を、研究１４日目に大きい囲いの中で１２ないし１６時間混合し、次いで、別々の囲いに戻した（各動物は別個の囲いを有した）。研究１５日目に、マンヘミア・ヘモリチカ２０ｍＬを、もう１つの呼吸器経路により、Ｔ９およびＴ１１を除く全群に投与した。動物を研究期間中毎日、臨床的異常と死亡率について観察した。全動物は、動物の購入前のスクリーニングで、陰性または低力価であった。動物は処置前に高い力価を有し、それは、処置を受ける前に、動物が血清学的にマンヘミア・ヘモリチカに転換したことを示す。
【００８４】
結果
群Ｔ８の動物は、有意に少ない肺病変を有した。
この研究は、ワクチンの有無に拘わらず、早期保護（７日）の開始があることを示唆する（群Ｔ３と比較したＴ４およびＴ５）。図４.１および４.２参照。
【００８５】
実施例５．ＤＮＡ免疫調節剤と共投与されたときの、市販の生ワクチンで予防接種された畜牛の獲得免疫の評価
この研究の目的は、ＤＮＡ免疫調節剤の共投与が、修正生ウイルス（ＭＬＶ）ワクチンにより与えられる獲得免疫を増大するか否かを判定することであった。
【００８６】
免疫調節剤
この研究で使用した免疫調節剤は、上記の実施例１の組成物であった。
研究の動物
呼吸器疾患の現病歴がない、７２頭の離乳期のホルスタインの雌の去勢牛を群れから選択した。７２頭の子牛を、各々１２頭の子牛からなる６個の処置群に分けた。個々の子牛を評価し、良好な健康状態にあると判定した。全子牛は、ＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ１型および２型並びにＢＲＳＶに対する血清抗体を持たなかった。加えて、全子牛は、ＰＩ−３に対して血清抗体陰性であると判明した。続いて、免疫組織化学により、子牛をウシウイルス性下痢ウイルスの永続性感染について陰性であると判定した。
【００８７】
下記表５.１に示す処置日に、処置群にワクチンおよび様々な用量のＤＮＡ免疫調節剤を筋肉内投与した。ＤＮＡ免疫調節剤の希釈スキームを表５.２に提供する。研究の０日目に、群Ｔ１−Ｔ４の全動物に免疫調節剤を投与した。ワクチンを受容するすべての動物に、標識の指示に従って予防接種した。免疫調節剤およびワクチンを、頭側から肩の前で接近して投与した−２本の注射（１本はワクチン、他方は免疫調節剤）。
【００８８】
表５.１.免疫調節剤およびワクチンの投与スケジュール
【表５】
2014500292.tif 000006
ＭＬＶ＝マンヘミア・ヘモリチカワクチン（Bovi-shield（登録商標）)−修正生４方向（4-way）ウイルス性呼吸器ワクチン
ＩＭ＝注射の筋肉内経路
【００８９】
評価
０、１３、２８、２７、３４および４１日目に子牛から回収した適当な血液学的試料からのサンプルに、免疫学的試験を実施した。各試料について細胞性免疫（ＣＭＩ）の測定を行った。この研究の標的病原体は、ＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ１および２、並びにＢＲＳＶであった。実験室は、過去に特定された標的病原体にふさわしい標準的な手法および方法を使用した。
【００９０】
結果
全処置群で、サンプル回収の各日のＣＭＩの結果について、モデルに適合させたデータを決定した。すべての処置群、細胞のタイプおよび抗原にわたり、ＤＮＡ免疫調節剤処置群−ＭＬＶワクチンの組み合わせを、ＭＬＶワクチンのみを受容した畜牛と比較すると、統計的差異は検出されなかった（Ｐ＞０.１０）（図５.１−５.１２参照）。特に、図５.１−５.４は、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＣＤ２５ＥＩ発現指数（ｙ軸）の測定を示す。図５.５−５.８は、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＩＦＮγ発現指数（ｙ軸）の測定を示す。図５.９−５.１２は、６個の処置群（ｘ軸）の各々について、全５種類の細胞タイプにわたり、ＩＬ−４発現指数（ｙ軸）の測定を示す。各グラフに示される４種のＢＲＤウイルス性病原体の各々について、評価を行った。これらの統計的評価について、すべての比較は「ＭＬＶのみ」の処置群に対して行った。
【００９１】
統計的に有意な（Ｐ＜０.１０）処置ｘ日の相互作用は、ＢＶＤＶ１（２８および３５日目）およびＢＶＤＶ２（４２日目）に検出された。列挙した時点のいずれでも、ＢＨＶ−１には有意な知見（Ｐ＞０.１０）は検出されなかった。これらの知見のグラフ的表示を、図.５.１３−５.１５に表示する。負の対照処置群内に抗体陽転が観察されたため、ＢＲＳＶのデータは分析から除いた。すべての統計的評価について、すべての比較は「ＭＬＶのみ」の処置群に対して行ったことに留意されたい。
【００９２】
研究中に、個々の動物の体重も集めた。モデルに適合させた毎日の体重増加の平均の結果のグラフ表示を、図５.１６に示す。ＭＬＶのみの群と比較して、処置群にわたり、有意な知見（Ｐ＞０.１０）は検出されなかった。
【００９３】
要約すると、ＤＮＡ免疫調節剤は、ＭＬＶワクチンと共に投与されたとき、ＭＬＶワクチンの単独投与と比較して、ＣＭＩを増強しなかった。しかしながら、ＤＮＡ免疫調節剤５００μｇは、ＭＬＶワクチン（特にＢＶＤＶ）と共に投与されたとき、体液性免疫を増強し得る。にもかかわらず、獲得免疫に一貫した改善がなくても、用量５００μｇ、２００μｇ、１００μｇおよび５０μｇでのＤＮＡ免疫調節剤の共投与は、ＭＬＶワクチンにより誘導される正の免疫的効果を損なわなかったことに留意すべきである。加えて、性能（例えばＡＤＧ）は、ＤＮＡ免疫調節剤の投与により負の影響を受けなかった。
【００９４】
実施例６．ＤＮＡ免疫調節剤と共に投与されたときの、市販のワクチンで予防接種された畜牛の獲得免疫の評価
この研究の目的は、ＤＮＡ免疫調節剤の共投与が、不活化抗原を含有するワクチンにより与えられる獲得免疫を増大するか否かを判定することであった。
【００９５】
免疫調節剤
この研究で使用した免疫調節剤は、上記の実施例１の組成物であった。
研究の動物
呼吸器疾患の現病歴がない、４８頭の３−５ヶ月齢のホルスタインの雌の畜牛を群れから選択した。４８頭の畜牛を、各々８頭の動物からなる６個の処置群に分けた。個々の動物を評価し、良好な健康状態にあると判定した。全動物は、ＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ１型および２型に対する血清抗体を持たなかった。また、動物をウシウイルス性下痢ウイルスの永続性感染について陰性であるとＰＣＲにより判定した。動物は、ＢＲＳウイルスおよびＰＩ３ウイルスに対するＳＮＴ力価によって選択されなかった。
【００９６】
下記表５.１に示す処置日に、処置群にワクチンおよび様々な用量のＤＮＡ免疫調節剤を筋肉内投与した。ワクチンは、ＢＨＶ１およびＢＶＤＶ１型および２型を不活化抗原として、そして、修正された生ＰＩ３ウイルスおよびＢＲＳウイルスを含有した。免疫調節剤およびワクチンは、動物の同じ側で、頭側から肩の前で別々に与えられるか、または、同じ領域で動物の反対側に別々に与えられるか、または、１本のシリンジ中で混合されていた。ＤＮＡ免疫調節剤の希釈スキームを表５.２に提供する。
【００９７】
表６.１.免疫調節剤およびワクチンの投与スケジュール
【表６】
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ワクチン＝複合（不活化および修正生）４方向ウイルス性呼吸器ワクチン（Rispoval（登録商標）)
ＩＭ＝注射の筋肉内経路
【００９８】
評価
０、３、５、７、９、１１、１４、１７、２０、２３および２７日目に畜牛から回収した適当な血液学的試料からのサンプルに、免疫学的試験を実施した。この研究の標的病原体は、ＢＨＶ−１、ＢＶＤＶ１および２であった。参考のために、ＢＲＳウイルスおよびＰＩ３ウイルスに対する抗体力価も測定した。実験室は、過去に特定された標的病原体のための手法として、血清中和試験（ＳＮＴ）を使用した。
【００９９】
結果
統計的に有意な（Ｐ＜０.０１０）処置ｘ日の相互作用は、ＢＨＶ１（２７日目）に検出された。列挙した時点のいずれでも、ＢＨＶ１並びにＢＶＤＶ１型および２型には、すべての他の時点について有意な知見（Ｐ＞０.１０）は検出されなかった。動物が研究開始時に血清学的に陰性ではなかったので、ＢＲＳＶおよびＰＩ３の力価の結果はさらに評価しなかった。従って、処置の効果は証明できなかった。これらの知見のグラフ的表示を図６.１に示す。すべての統計的評価について、すべての比較は「ワクチンおよびデキストロース５％」の処置群に対して行ったことに留意されたい。
【国際調査報告】
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