(57)【要約】  本発明によって、抗結核性ターゲットをスクリーニングするための新規のターゲット、および抗結核治療のための潜在的薬剤をスクリーニングするためのこれらのターゲットを使用する方法に取り組まれる。ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片との間の結合に作用する抗結核性化合物をスクリーニングする方法、および、単離されたｇｒｏＥＬ２タンパク質と、Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓと、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（ＡＴＣＣ３５７４５）、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣ６０７）を含む培養物培地とを有する、抗結核性薬剤候補をスクリーニングするためのキットが開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片との間の結合に作用する抗結核性化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物と三官能性架橋剤との複合体を準備すること；
ｂ）スフェロプラスト溶液培地を有する培養物中にて、前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片と前記複合体とを接触させること；および
ｃ）前記試験化合物の存在下における前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片との間の結合と、前記試験化合物の非存在下における前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片との間の結合（対照）との差異を測定することにより、前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片の結合に対する前記試験化合物の効果を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記三官能性架橋剤は、Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓである請求項１に記載の抗結核性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３】
前記試験化合物は、
【化１】
2014511994.tif 000004
から選択される、プロパルギル化１，２，４トリアゾール化合物から選択される請求項１に記載の抗結核性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４】
前記培養物は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．Ｂｏｖｉｓから選択される請求項１に記載の抗結核性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項５】
前記複合体は、試験化合物とＭｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓとの複合体である請求項１に記載の抗結核性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項６】
前記複合体は、ＨＰＬＣ技術を使用して精製される請求項１に記載の抗結核性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項７】
前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質は、配列番号１により表される請求項１に記載の抗結核性化合物をスクリーニングする方法。
【請求項８】
単離されたｇｒｏＥＬ２タンパク質と、Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓと、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（ＡＴＣＣ３５７４５）、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣ６０７）を含む培養物培地とを含む、抗結核性薬剤候補をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗結核性化合物をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、本発明は、抗結核性物質のスクリーニングのための新規のターゲットを提供する。特に、本発明は、抗結核性活性を有する薬剤のスクリーニングのための抗結核性ターゲットとしてＧｒｏＥＬ２を開示する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリアのゲノム配列の理解のために莫大な研究が行われているにもかかわらず、過去４０年間、新規の抗結核性薬剤は発見されていない。それゆえ、長期にわたる治療を短くするために、マイコバクテリア種における耐性問題を最小化するために、および／または潜在的なＴＢ感染の治療を促進するために、新規の化学療法剤を開発し、現在の薬剤計画を変更する差し迫った必要性が存在する。抗結核活性のためにイミダゾール、テトラゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、キノキサリンおよびキナゾリンといった大きな系統の化合物を構築する基礎として、初期の試みでは様々なヘテロ環が使用された。トリアゾール誘導体の合成は、その潜在的な抗マイコバクテリア活性およびステロール合成の既知のターゲットのために、近年特に注目されている。フルコナゾールおよびヘキサコナゾールといった市販される重要な抗真菌性誘導体は、Ｎ１置換された１，２，４−トリアゾール化合物であり、これはエルゴステロール生合成阻害剤であり、一方、抗結核性活性は、Ｎ４が置換された１，２，４−トリアゾールチオールの誘導体と関連付けられる。
【０００３】
Ｊｕｎｇｂｌｕｔらの「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｔｏｗａｒｄｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｍｉｃｏｂｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３３，  Ｉｓｓｕｅ  ６，  ｐａｇｅｓ  １１０３−１１１７，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９）が参照されてよく、この文献によると、同定された２５個のタンパク質スポットは推定上のヒートショックタンパク質であり、それには、Ｈｓｐ６０（ｇｒｏＥＬ２；Ｒｖ０４４０）、Ｈｓｐ７０（ＤｎａＫ；Ｒｖ０３５０）、Ｈｓｐ１０（ＧｒｏＥＳ；Ｒｖ３４１８）およびＣｌｐＢ（Ｒｖ０３８４ｃ）が含まれていた。
【０００４】
Ｄａｈｌらの「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲｅｌＭｔｂ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １００２６−１００３１＿ＰＮＡＳ＿Ａｕｇｕｓｔ  １９，  ２００３＿ｖｏｌ．１００＿ｎｏ．１７）というタイトルの記事が参照されてよく、この記事は、ｇｒｏＥＬ２およびｇｒｏＥＳのように、２つの種の間で異なって発現される既知のマイコバクテリア抗原の大きなセットも存在することを開示している。
【０００５】
Ｏｊｈａらの「ＧｒｏＥＬ１：  Ａ  Ｄｅｄｉｃａｔｅｄ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ」（Ｃｅｌｌ  １２３，  ８６１−８７３，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２，  ２００５）が参照されてよく、これは、マイコバクテリアは、２つのＧｒｏＥＬパラログ、ＧｒｏＥＬ１およびＧｒｏＥＬ２のコード化において独特であると述べている。ＧｒｏＥＬ２は必須であり、おそらく、ハウスキーピングシャペロン機能を提供する。しかし、抗結核性物質のスクリーニングのためのｇｒｏＥＬ２といった新規のターゲットを同定する先行技術は、現在まで存在しない。
【発明の目的】
【０００６】
したがって、本発明の主要な目的は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける新規の薬剤ターゲットを同定および単離する方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、結核の治療のための新規の薬剤候補をスクリーニングする方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、核構造に１，２，４−トリアゾール−３−チオールを有し（抗マイクロバクテリア活性）、およびＮ１またはＮ２窒素に置換（ステロール生合成阻害のため）を有する分子を提供する。これらのプロパルギル化トリアゾール誘導体のインビトロ抗マイクロバクテリア活性が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａの活発な複製相並びに非複製休止相に対して試験された。これらの１，２，４−トリアゾール誘導体由来の３つの分子が、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して最も有効であり、それぞれＭＩＣ値が２、０．２および２μｇ／ｍｌであることがわかった。ＭＩＣ濃度において、これらの化合物は、非複製のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して、ＣＦＵ／ｍｌについて０．８２、１．４３２および０．８８ｌｏｇの減少であった。Ｍ．ｓｅｇｍａｔｉｓの増殖に対するこれらの阻害剤の顕著な効果において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＴＨＰ−１マクロファージは、それらの選択性および非毒性の特徴を示した。最も顕著なことに、ＴＨＰ−１マクロファージにおける細胞内バチルスの効果的な致死から、更なる調査のための潜在的な抗結核性のリードとして、これらのトリアゾレチオール誘導体が同定された。１４−デメチラーゼが、タンパク質のシトクロムＰ−４５０クラスに属すことが周知である。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧには、これらの遺伝子が約２３コピー存在するが、興味深いことに、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓでは、５１コピー存在する。このことは、我々のスクリーニング計画から同定されたこれらのトリアゾレチオールが有効でないＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおける、このクラスのタンパク質の役割の重要性を示している。このことは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけるこれらの新規阻害剤の潜在的な新たなターゲットの研究をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ビオチンリンカーと１，２，４トリアゾール化合物との間における結合反応。
【図２】ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析による質量の確認。ＭＡＬＤＩマススペクトルは、阻害剤のみ（ａ）、ビオチンリンカーのみ（ｂ）およびビオチン−阻害剤複合体（ｃ）について、ｄｒｉｅｄ−ｄｒｏｐ法またはｓｌｏｗ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｉｏｎ法を使用して得た。スペクトルは、４ＨＣＣＡ−水／アセトニトリル（２：１  ｖ／ｖ）から成るマトリクス溶液から得た。
【図３】生成物（ビオチン−阻害剤複合体）のＨＰＬＣプロファイル。溶媒（Ａ）、ビオチン１ｍｇ／ｍｌ（Ｂ）、ＭＩＣにおける２ｄ（Ｃ）および反応混合物（Ｄ）を、分取ＨＰＬＣにて分析した。クロマトグラムは、それぞれの実験の３つの同一のセットから得られた結果の代表である。クロマトグラフィーについての詳細の残りは「材料および方法」の欄に示される。
【図４】分子量に基づくＳＤＳ  ＰＡＧＥによる同定されたタンパク質のセパレーション。ストレプトアビジンビーズから単離されたタンパク質のラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ゲルの写真は、阻害剤であらかじめ処理された全細胞抽出物（レーン２）および阻害剤で処理されていない全細胞抽出物（レーン１）を表し、レーン３は高分子量タンパク質マーカーを表す。
【図５】ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のＰＬＧＳソフトウェアによる絵図。このデータは、〜６０ｋＤａの分子量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのシングルバンドを取り出したものを用いて分析した。
【図６】ｇｒｏＥＬ１およびｇｒｏＥＬ２の配列、ならびにＣＬＵＳＴＡＬ２．１によるそれらのマルチプルシーケンスアライメント。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本出願は、２０１２年３月１６日付のインド特許出願第０７３／ＤＥＬ／２０１１号の優先権を主張し、この出願は、その全体が本願に援用される。
【００１１】
上記の目的に関し、本発明は、抗結核性物質のスクリーニングのための新規のターゲットを記載する。本発明は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ内におけるプロパルギル化トリアゾール誘導体のヒットの１つのターゲットの同定を開示する。より具体的には、本発明は、薬剤候補のスクリーニングのための抗結核性ターゲットとしてのＧｒｏＥＬ２を開示する。
【００１２】
本発明の目的のために、薬剤候補を、プロパルギル化１，２，４トリアゾール化合物として選択した。リード阻害剤の細胞内ターゲットの同定は、リード最適化プログラムにおけるスキャフォールドを達成するための必須の基準である。新規の阻害剤のターゲットを同定するために知られている種々のアプローチの中で、親和性貯蔵（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌｉｎｇ）は、ターゲットタンパク質に的中するための端的で単純な方法でありうる。このスキャフォールドのファーマコフォアは未だ未知であるため、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｖｉｅｎｔｉｆｉｃから供給される、阻害剤の標識のためのＭｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｓｎｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓを、本発明の目的のために選択した。
【００１３】
したがって、好ましい実施態様において、本発明はＭｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｓｎｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓを利用する。これらの試薬は、後の共有結合のためのスルフヒドリル部位において、精製された試験タンパク質を標識することを可能とし、関心のあるタンパク質に対してビオチン化を転移させる架橋剤である。ビオチン、スルフヒドリル反応性メタンチオスルホネート（Ｍｔｓ）部分および効率的な光活性化可能テトラフルオロフェニルアジド（Ａｔｆ）部分を含む三官能性架橋剤である、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｓｎｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒ）を使用し、ＵＶ光下で、ヒット化合物／阻害剤（１，２，４トリアゾール）にリンカーを結合させた。生成物の形成の確認は、ＭＡＬＤＩ分析にて行った。分取ＨＰＬＣにより、試薬の残りから生成物を精製した。全細胞抽出物の作製のために、１００ｍｌのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ培養物をｌｏｇ相で取得し、そこへ５ｍｌのスフェロプラスト溶液（０．０００６％）を添加した。その後、培養物を２４時間インキュベートした。ヒット化合物で修飾したビオチンリンカーおよび修飾していないビオチンリンカーを培養物に添加し、３０分インキュベートした。そして、培養物を超音波処理し、細胞内タンパク質を培地中に放出させた。懸濁物全体を１４，０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、ターゲットタンパク質が存在し、阻害剤分子と結合していることが期待される上清を得た。この段階において、上清をＰＢＳに対して透析し、過剰のビオチンリンカーまたは阻害剤分子を除去した。さらに、ＭａｇｎａＢｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓを上清に添加し、外部の地場を使用して、ビオチン標識された分子に既に結合したターゲットタンパク質をプルダウンした。この段階で、ビーズをＰＢＳで２、３度洗浄し、不要なタンパク質を除去した。ビオチンリンカー−阻害剤複合体と結合したターゲット分子を放出させるために、過剰の遊離型ビオチン分子を添加し、その後、水に対して透析した。透析したサンプルを回収し、クロロフォルム−メタノール沈降法を用いて沈降させた。その後、サンプル中の個々のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行することにより分離させた。ゲル中に見つかるタンパク質バンドをトリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩ−ＥＳＩ−ＭＳ分析に用いた。本発明の方法により同定されたタンパク質は、６０ｋＤａのシャペロニン２ＯＳ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＧＮ  ｇｒｏＬ２  ＰＥ１  ＳＶ２である。
【００１４】
したがって、この好ましい実施態様における発明は、ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片の間における結合に作用する抗結核性化合物をスクリーニングする方法であって、
試験化合物と三官能性架橋剤との複合体を準備すること；スフェロプラスト溶液培地を含む培養物において、前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片と前記複合体とを接触させること；
前記試験化合物の存在下における前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片との間の結合と、前記試験化合物の非存在下における前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片との間の結合（対照）との差異を測定することにより、前記ＧｒｏＥＬ２タンパク質またはその断片の結合に対する前記試験化合物の効果を決定すること
を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明による三官能性架橋剤は、Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓである。
【００１６】
本発明の目的のために選択される試験化合物は、
【化１】
2014511994.tif 000002
【００１７】
といったプロパルギル化１，２，４トリアゾール化合物である。
【００１８】
本発明の目的のために選択される培養物は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．Ｂｏｖｉｓである。
【００１９】
本発明の目的のための前記複合体は、試験化合物とＭｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓとの複合体である。
【００２０】
本発明の複合体は、ＨＰＬＣ技術を使用して精製される。
【００２１】
以下の例は、好ましい実施態様を含み、本発明の実施を例示する役割を果たすと考えられ、詳細は、例として、本発明の好ましい実施態様の例示的議論の目的で示される。
【００２２】
別の好ましい実施態様において、本発明は、配列番号１を有する、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の単離されたＧｒｏＥＬ２タンパク質を開示する。
【００２３】
別の好ましい実施態様において、本発明は、単離されたｇｒｏＥＬ２タンパク質と、Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓと、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（ＡＴＣＣ３５７４５）、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣ６０７）を含む培養物培地とを含む、薬剤候補をスクリーニングするためのキットを提供する。
【００２４】
細菌種、培地および接種材料の準備
Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（ＡＴＣＣ３５７４５）、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣ６０７）は、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ（インド、バンガロール）から取得し、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ２５１７７）は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（インド、チャンディーガル）から取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒａｇａｎｉｓｍｓ（ＮＣＩＭ）（インド、プネー）から取得した。全てのマイコバクテリア株のサブ培養は、Ｄｕｂｏｓアルブミンアガースラントまたはプレートにて日常的に行った。液体接種材料は、Ｄｕｂｏｓツイーンアルブミンブロスにて作製し、１５０ｒｐｍの速度で回転するシェイカーインキュベーターにて３７度でインキュベートした。６２０ｎｍにて１．０Ｏ．Ｄの培養物の１％を、全ての実験について標準的な接種サイズとして使用し、約１０５ＣＦＵ／ｍｌの最終接種材料を得た。Ｔｈｐ−１ヒト単球およびＨＬ−６０細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＮＣＣＳ）（インド、プネー）から取得した。細胞は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地にて日常的に維持した。
【実施例】
【００２５】
以下の例は例示として示され、それゆえ、本発明の範囲を限定するとして理解すべきでない。
【００２６】
例１
Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ内におけるトリアゾレチオールの細胞内ターゲット同定
リード阻害剤の細胞内ターゲットの同定は、リード最適化プログラムにおけるスキャフォールドを達成するための必須の基準である。新規の阻害剤のターゲットの同定について既知の種々のアプローチの中で、親和性貯蔵は、ターゲットタンパク質に的中するための端的で単純な方法でありうる。このスキャフォールドのファーマコフォアは未だ未知であるため、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｖｉｅｎｔｉｆｉｃから供給されるＭｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｓｎｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓを、阻害剤の標識のために選択した。Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｓｎｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓは、ビオチン、スルフヒドリル反応性メタンチオスルホネート（Ｍｔｓ）部分および、関心のある化学成分との共有結合を作るための効率的な光活性化可能テトラフルオロフェニルアジド（Ａｔｆ）部分を含む三官能性架橋剤である。このビオチン架橋剤は、阻害剤（２ｄ）と反応でき、その後、複合体の合成の分析を可能とした。
【００２７】
例２
分取ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析による、生成物（阻害剤−ビオチンリンカー）の精製
まず、ＵＶ光の下で、室温で７２時間、リンカーをヒット化合物（２ｄ）に結合させた。その後、反応混合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に供した。この分析において、反応混合物中における、阻害剤、ビオチン−リンカー、およびビオチンリンカー−阻害剤複合体と考えられる生成物の１つの質量は、それぞれ２６１．０９、８４０．７９および１１０１．３ｋｄを示していた。生成物の質量（１１０１ｋｄ、図４）は、明らかに、ビオチンリンカー−阻害剤複合体の形成を示していた。
【００２８】
その後、分取ＨＰＬＣを実行して、残った試薬から生成物を精製した。溶媒、ビオチン−リンカーおよび阻害剤の保持時間は、それぞれ２．４６、６．０１および１１．６分であった。
【００２９】
同一条件にて、ＨＰＬＣカラムに反応混合物を通した場合、保持時間１０．２９２分の位置に、１つの外的なピークが同定された。この新たなピークを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に供したところ、１１０１ｋｄの分子量を有することがわかり、混合物からのビオチンリンカー−阻害剤複合体の分離が確認された。その後、生成物を回収し、更なる実験のために保存した。
【００３０】
例３
ビオチンリンカー−阻害剤複合体を用いた、Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのターゲットタンパク質の同定
残った阻害剤の、ターゲットタンパク質に対するより高い親和性のために、ビオチンリンカー−阻害剤複合体の添加により、全細胞抽出物中のタンパク質に結合することが推定される。その後、この一体となった複合体を、ＭａｇｎａＢｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎビーズを使用して、磁場を適用して底部に沈殿させた。この段階で、ビーズを２、３度洗浄し、不要なタンパク質を除去した。ストレプトアビジンビーズにより回収したターゲットタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、〜６２ｋｄに主要なタンパク質のバンドの存在が示された。このバンドは、抽出物を阻害剤のみで前処理した対照サンプル中において、非有意に存在した（図４）。
【００３１】
ゲルにおいて見られたタンパク質バンドをトリプシンで消化し、質量の決定のために使用した。タンパク質の質量は６０ｋＤａであることがわかり、これによってさらに、ＰＬＧＳスコアから、シャペロニン２ＯＳ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＧＮ  ｇｒｏＬ２  ＰＥ１  ＳＶ２であると同定された。
【００３２】
例４
ターゲットとしてのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｇｒｏＥＬ２を阻害するトリアゾレチオールの検証
ＧｒｏＥＬ１および２は、ともに、シャペロニンの６０ＫｄのＨＳＰファミリーを表すタンパク質のクラスに属すため、機能的に非常に類似している。これらの２つのタンパク質はともに、ＡＴＰアーゼ活性を有することが報告されており、ヒートショックの際に、クエン酸合成凝集を保護することがわかっている。３つの選択された阻害剤（２ｄ、８ｆ、１１ｄ）のｇｒｏＥＬ２に対する特異的作用を検証するために、ｇｒｏＥＬ１も対照として実験に使用した。その結果、これらの精製したｇｒｏＥＬ２に適用した場合、３つすべての化合物が、それぞれのＭＩＣにおいて〜８６％までＡＴＰアーゼ活性を阻害するが、ｇｒｏＥＬ１に対する有意な効果は全く示さないことが明らかとなった（表４．３）。クエン酸合成凝集に対するこれらの阻害剤の更なる調査を実行し、何ら効果がないことがわかった。
【表１】
2014511994.tif 000003
【００３３】
例５
Ｍｔｓ−Ａｔｆ−ビオチンリンカーと阻害剤との複合体
Ｍｔｓ−Ａｔｆ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３３０９３）から入手される、ビオチン、スルフヒドリル反応性メタンチオスルホネート（Ｍｔｓ）部分および効率的な光活性化可能テトラフルオロフェニルアジド（Ａｔｆ）部分を含む三官能性架橋剤である。１０μｌのビオチンリンカー（５ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のトリアゾール阻害剤（２ｄ）と混合し、紫外線（ＵＶ）を７２時間照射した。その後、反応混合物を生成物形成について分析した。
【００３４】
例６
ビオチン阻害剤複合体のマトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）分析
マトリックス溶液の用意
すべてのマトリックス溶液は、４ＨＣＣＡで飽和させ、有機溶媒に対して４ＨＣＣＡ（固体）を添加して、続いて、水および酸（必要に応じて）を添加することにより作製した。それぞれの混合物を徹底的にボルテックスし、遠心分離し、透明なワーキングマトリックス溶液を残した。４ＨＣＣＡの溶解度は、溶媒組成に依存しており、低い値として５ｍＭ（水／メタノール、２：１  ｖ／ｖ）から、中間的な値として２９ｍＭ（ギ酸／水／２−プロパノール、１：３：２  ｖ／ｖ／ｖ）、高い値として７４ｍＭ（水／アセトニトリル、１：１  ｖ／ｖ）である［５３］。
【００３５】
サンプル−マトリックス結晶化法
サンプル−マトリックス溶液を作製するために、一定分量（０．５μｌ）のサンプルを、小さなマイクロ遠心チューブ（Ｔａｒｓｏｎ、インド）にて、１５μｌのマトリックス溶液と合わせた。サンプル−マトリックスの共結晶は、以下の技術により得た。
【００３６】
Ｄｒｉｅｄ−Ｄｒｏｐ法
一定分量（０．５−１μｌ）のサンプル−マトリックス溶液を、アルミニウム製１０サンプルＭＡＬＤＩプローブチップに置き、室温で風乾させ（数分間）、微細な粒状のマトリックス結晶の均一の層を得た。冷水を結晶に１０秒間かけ、揮発性の塩の除去を促進させた。その後、真空吸引により水を除去した。
【００３７】
例７
ビオチン−阻害剤複合体の分取ＨＰＬＣ精製
生成物および反応のそれぞれの成分のクロマトグラフィー分離および分析は、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＳＣＬ−１０ｖｐ−ＳＨＵＭＡＤＺＵシステムコントローラー）の逆相ＸブリッジＣ１８（５μｍ、４６×２５０ｍｍ）カラムにより行った。使用した移動相の組成は、「Ａ」溶液は水（６０、６０、４５、４０）％とし、「Ｂ」溶液はアセトニトリル（４０、４０、５５、６０）％とした。カラム流出物を波長２５４ｎｍでモニターしながら、流速１ｍｌ／分で勾配モードにて分析を行った。
【００３８】
例８
ビオチン−阻害剤複合体と、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの粗製全細胞抽出物との結合
ビオチン−阻害剤複合体をスピードバックにて３０分間溶媒を蒸発させ、その後、１００μｌのＤＭＳＯに溶解させ、その後、全細胞抽出物に添加した。全細胞抽出物の用意のために、５ｍｌのスフェロプラスト溶液（０．０００６％）を、１００ｍｌのｌｏｇ相Ｍｔｂ培養物に添加し、２４時間インキュベートした。このビオチンリンカー−阻害剤複合体を、さらに、２ｄ阻害剤にて既に処理した対照培養に添加し、対照サンプルおよび試験サンプルの両方を、３７℃のインキュベーターシェイカーにて３０分保持し、ターゲットタンパク質に結合させた。両培養物を、プロテアーゼカクテルの存在下で超音波処理し、１４，０００ｒｐｍで１時間細胞抽出物を遠心分離し、細胞内タンパク質を放出させた。上清は、ターゲットタンパク質とビオチン−阻害剤複合体とを含んだ。上清を取得し、ＰＢＳに対して透析し、過剰のビオチン−阻害剤複合体および阻害剤分子を除去した。
【００３９】
例９
ＭａｇｎａＢｉｎｄ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓによる、ビオチン−インヒビター複合体が付与されたターゲットタンパク質の精製
ＭａｇｎａＢｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓは、ビオチン標識分子に関する親和性精製または分離方法に都合がよく、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手される（Ｃａｔ ｎｏ ２１３４４）。ＭａｇｎａＢｉｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓを上清に添加し、外部磁場を利用して、ビオチン−阻害剤複合体に既に結合したターゲットタンパク質を沈降させ、ビーズをＰＢＳで２、３度洗浄して、不要なタンパク質を除去した。ビオチン−阻害剤複合体に付着したターゲットタンパク質を放出するために、過剰の遊離ビオチン分子を添加し、その後、水に対して透析した。透析したサンプルを回収し、タンパク質沈殿物のために処理した。
【００４０】
例１０
ターゲットタンパク質のクロロホルム−メタノール沈降
塩および洗浄剤の除去のために、クロロホルム−メタノール法を行った。１００μｌのサンプルを４００μｌのメタノールに添加し、十分ボルテックスし、その後、１００μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。３００μｌのｍｉｌｉＱ水を添加し、再度２分間、１４，０００ｇの比率で１分間ボルテックスした。上部の水層（タンパク質は層の間に存在）を除去した後、４００μｌのメタノールを添加し、１４，０００ｇで２分間ボルテックスし、ペレットを乱さないようにＭｅＯＨを除去した。サンプルをスピードバックで乾燥させた。１×サンプルバッファーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加した。
【００４１】
例１１
補足したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびプロテオーム解析
サンプル中の個々のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。端的には、まず、タンパク質サンプルと５％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む１×ローディング（サンプル）バッファーとを混合した。そして、サンプルを８０℃で１０分間インキュベートした。次に、３０μｌのサンプルを１２．５％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲルにロードし、ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。電気泳動後、ゲルを一晩クマシー染色に供した。ゲル内に見られるタンパク質のバンドを適切に切り出し、トリプシン消化に供し、その後、ペプチドを抽出し、ＭＡＬＤＩ−ＥＳＩ−ＭＳにてプロテオーム解析した。図４に示されるように、ゲルの画像には、阻害剤で予め処理された全細胞抽出物（レーン２）および処理されていない全細胞抽出物（レーン１）から得られたタンパク質サンプルが示され、レーン３は、高分子量タンパク質マーカーが示されている。分子量〜６０ｋｄの際立ったバンドが、サンプルを阻害剤で予め処理していないレーン（レーン１）中に見られた。
【００４２】
例１２
ＬＣ−ＭＳＥ分析
終濃度１００ｎｇ／μｌの２マイクロリッターの消化したペプチドを、流速３００ｎｌ／分のナノロックスプレーイオンソース（外的ロックマス：Ｇｌｕ−フェブリノペプチド）を装着したＳＹＮＡＰＴ  ＨＤＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）と組み合わせたナノＡＣＱＵＩＴＹオンラインを使用したナノＬＣ−ＭＳＥにより分析した。ペプチドサンプルを、５μｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ  ＣＩ８トラッピングカラム（１８０μｍ×２ｃｍ長）に流速１５μｌ／分でオンラインで注入した。図２ａおよび２ｂに示されるように、３５分間にわたる５から４０％のＢのリニア勾配を用いて（Ａ．０．１％のギ酸を含む水、Ｂ．０．１％のギ酸を含むアセトニトリル）、流速３００ｎｌ／分にて、ＢＥＨ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｅｔｈｙｌ  Ｈｙｂｒｉｄ）１３０  Ｃ１８  １．７μＭ×７５μＭ×１５０ｍｍナノＡＣＱＵＩＴＹ分析カラムにおけるインライン勾配溶出により、ペプチドを分離した。補足は、低い（５ｅＶ）および高い（１５−４０ｅＶ）衝突エネルギーを交互に用いて、スキャン時間１秒で、５０−１９９０ｍ／ｚの質量レンジにおいて、ポジティブＶモードにて行った。ＭＳＥデータは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳバージョン２．４.  Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）にて処理した。処理したデータについて、タンパク質同定のための全４４，９８７のタンパク質エントリーを含むＵｎｉＰｒｏｔデータベースのヒトサブセットに対してサーチした。
【００４３】
例１３
ＡＴＰアーゼ活性アッセイ
精製されたＧｒｏＥＬ１およびｇｒｏＥＬ２のＡＴＰアーゼ活性は、以前に記述されたように実施された比色分析アッセイにて定量した。端的には、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ＭｍのＫＣｌ、１０ＭｍのＭｇＣｌ２および各々２．５μＭのＧｒｏＥＬを含む２５μｌの反応バッファーを、１ｍＭのＡＴＰとともに３７℃で２０分間インキュベートした。マラカイトグリーンの酸性溶液を１００μｌ添加することにより、酵素反応を停止させた。遊離した無機リン酸の量を６５５ｎｍで測定した。対照として、ＡＴＰおよびＧｒｏＥＬタンパク質を含まない状態で反応を行った。それぞれの実験においてリン酸二水素カリウムを使用して作成した標準曲線から、遊離リン酸の概算を行った。ｇｒｏＥＬ２のＡＴＰアーゼ活性に対するこれらのリードの阻害活性は、最終的に、これらのトリアゾレチオールの潜在的な抗結核活性はシャペロニン２タンパク質との結合を介して達成されることを証明した。
【００４４】
例１４
シャペロニンによるクエン酸合成の凝集の予防
ブタの心臓のクエン酸合成凝集を以前に報告されたように行った。端的には、０．１５μｇ／ｍｌのクエン酸合成酵素を、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５）中において、等モル量のオリゴマー比率の異なるＧｒｏＥＬバリアントの存在下または非存在下で４３℃にてインキュベートした。前記シャペロンの、クエン酸合成の凝集を予防する能力を、ＬＳ５５分光光度計にて、４６５ｎｍの放射波長および励起波長の設定並びに３．０ｎｍの対応バンドパスにて、２０分間モニターした。サンプルの温度をＪｕｌａｂｏ循環ウォーターバスで維持し、ＰｈｙｓｉｔｅｍｐタイプＴマイクロカップルを用いてモニターした。我々は、クエン酸合成の凝集に対する阻害剤の効果を全く観察しなかった。
【００４５】
配列番号１＝ｇｒｏＥＬ−２のアミノ酸配列
MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVTLGPRGRHVVLAKAFGGPTVTNDGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDVAGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVNPIALGVGIGKAADAVSEALLASATPVSGKTGIAQVATVSSRDEQIGDLVGEAMSKVGHDGVVSVEESSTLGTELEFTEGIGFDKGFLSAYFVTDFDNQQAVLEDALILLHQDKISSLPDLLPLLEKVAGTGKPLLIVAEDVEGEALATLVVNAIRKTLKAVAVKGPYFGDRRKAFLEDLAVVTGGQVVNPDAGMVLREVGLEVLGSARRVVVSKDDTVIVDGGGTAEAVANRAKHLRAEIDKSDSDWDREKLGERLAKLAGGVAVIKVGAATETALKERKESVEDAVAAAKAAVEEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASLTGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGLDGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAADGVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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