(57)【要約】  運動性細胞を選別するための方法は、運動性細胞の初期集団を、マイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップであって、当該運動性細胞の初期集団が第１の平均運動性を有する、ステップ；当該運動性細胞の集団をマイクロ流体チャネルにおいてインキュベーションするステップ；及び、選別された運動性細胞の集団をマイクロ流体チャネルの出口ポートにおいて収集するステップを含む。選別された運動性細胞の集団は、第１の平均運動性より高い第２の平均運動性を有する。
2014518627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動性細胞の初期集団を、マイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップであって、該運動性細胞の初期集団が第１の平均運動性を有する、ステップ；
運動性細胞の該集団を該マイクロ流体チャネルにおいてインキュベーションするステップ；及び、
選別された運動性細胞の集団を該マイクロ流体チャネルの出口ポートにおいて収集するステップであって、選別された運動性細胞の該集団が、該第１の平均運動性より高い第２の平均運動性を有する、ステップ
を含む、運動性細胞を選別する方法。
【請求項２】
前記マイクロ流体チャネルを水平又は垂直に向けるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップが、流動媒体の非存在下においてインキュベーションするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップが、運動性細胞の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って移動することができる十分な時間、例えば、約２０〜６０分間又は約３０分間、該運動性細胞の集団をインキュベーションするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マイクロ流体チャネルの高さが、運動性細胞の寸法の約２０倍未満、例えば、運動性細胞の寸法の約３〜１０倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
出口ポート付近において、選別された運動性細胞の集団を含む収集可能な運動性細胞の集団の複数の画像、例えば影像を得るステップ；及び
該複数の画像を分析するステップ
を含む第２の平均運動性を特定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
運動性細胞の初期集団を導入するステップが、少なくとも精子約１０３個／μＬ、例えば、少なくとも精子約１０４個／μＬの濃度で媒体に精子の初期集団を懸濁させるステップを含み、
媒体中の選別された運動性細胞の集団の濃度が、精子約１．６×１０３個／μＬ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
運動性細胞の初期集団をマイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップ；
該マイクロ流体チャネルにおいて該運動性細胞の集団をインキュベーションするステップ；
該マイクロ流体チャネル内の該運動性細胞の集団の少なくとも一部の複数の画像を取得するステップ；及び
該複数の画像に基づいて該運動性細胞の集団の少なくとも一部の特性を特定するステップ
を含む、運動性細胞の集団を分析する方法。
【請求項９】
特定された特性が、運動性、平均経路速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、又は直線性のうちの少なくとも１つを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特定される特性が、
（１）マイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性、及び
（２）該マイクロ流体チャネルの長さに沿った該運動性細胞の集団の分布
のうちの少なくとも一方を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
特性を特定するステップが、マイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性を、
（１）運動性細胞の初期集団の特性、及び
（２）インキュベーション後に入口ポート付近に位置している残留運動性細胞の集団の特性
のどちらか又は両方と比較するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
特定された特性に基づいて、運動性細胞の初期集団の健康を特定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップが、精子の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って移動することができる十分な時間、例えば、約２０〜６０分間又は約３０分間、流動媒体の非存在下でインキュベーションするステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
マイクロ流体チャネルの高さが、運動性細胞の寸法の約２０倍未満、例えば、運動性細胞の寸法の約３〜１０倍である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
マイクロ流体チャネルの高さが運動性細胞の寸法の約２０倍未満となるように選択されたマイクロチャネルと、
該マイクロ流体チャネルの第１の端部に接続された入口ポートであって、第１の平均運動性を有する運動性細胞の初期集団を受け入れるように構成された入口ポートと、
該マイクロ流体チャネルの第２の端部に接続された出口ポートと
を備え、
該マイクロ流体チャネルが、該マイクロチャネル中において流体の流れを必要とせずに、該第２の端部において、選別された運動性細胞の集団を提供するように構成され、該選別された運動性細胞の集団が、該第１の平均運動性より高い第２の平均運動性を有する、運動性細胞を選別するための装置。
【請求項１６】
マイクロ流体チャネルの高さが、運動性細胞の寸法の約３から１０倍、例えば、約２００μｍ未満、例えば、約６０μｍ未満、例えば、約３〜２０μｍとなるように選択される、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
マイクロ流体チャネルの長さが、少なくとも部分的に、チャネルでの運動性細胞のインキュベーション時間及び運動性細胞の速度のうちの少なくとも一方に基づいて選択され、例えば、該長さが、約２０ｍｍ未満、例えば、約１２〜１５ｍｍである、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
マイクロ流体チャネルが、四角形断面、台形断面、三角形断面、円形若しくは楕円形断面、マイクロチャネルの長さに沿って変わる断面、又はリッジを有する断面を有する、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
マイクロ流体チャネルが、直線状であるか又は湾曲している、請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】
マイクロ流体チャネルの少なくとも一部の複数の画像をキャプチャするように構成された撮像システムをさらに含み、該撮像システムが、
該マイクロ流体チャネルの少なくとも一部を照らすように構成された光源と、
該マイクロ流体チャネルにおける光が照らされた部分の運動性細胞の画像、例えば影像を検出するように構成された検出器と
を含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項２１】
キャプチャされた画像に基づいて、マイクロ流体チャネルにおける撮像された部分での運動性細胞の特性を特定するように構成された分析モジュールをさらに含む、請求項２０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２０日に出願された米国特許出願第６１／４８８，３００号の恩典を主張するものである。上記の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された認可番号Ｒ０１  ＡＩ０８１５３４、Ｒ２１  ＡＩ０８７１０７、及びＲ２１  ＥＢ００７７０７；米軍医学研究調達機関協力協定（U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement）に基づく医学及び革新的技術統合センター（Integration of Medicine and Innovative Technology）（ＣＩＭＩＴ）の認可（ＤＡＭＤ１７−０２−２−０００６）；米国陸軍医学研究司令部（U.S. Army Medical Research & Materiel Command）（ＵＳＡＭＲＭＣ）及び遠隔医療応用研究センター（Telemedicine & Advanced Technology Research Center）（ＴＡＴＲＣ）により付与された認可（Ｗ８１ＸＷＨ−１０−１−１０５０）に基づき、政府の支援により達成された。政府は、本発明においてある特定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、運動性細胞、例えば、哺乳動物の精子細胞などの分析及び選別のためのシステム及び方法に関する。
【０００４】
発明の背景
生殖年齢の５３０万人のアメリカ人夫婦（９％）が不妊症を患っており、そのうち、男性側の要因は症例の５０％を占めている。細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）の有無にかかわらず、体外受精（ＩＶＦ）は、男性不妊症の問題を克服するために、現代の臨床診療において最も広く使用される生殖補助医療技術となっている。ＩＶＦ及びＩＣＳＩの障害の１つは、低精子数（乏精子症（oligozoospermia））及び／又は低精子運動性（精子無力症（oligospermaesthenia））を有し得る精液サンプルから、最も運動性が高く、おそらく最も健康である精子を特定し、単離することである。
【０００５】
発明の概要
本明細書において説明される運動性細胞の選別及び分析システムは、運動性細胞、例えば精子などの集団を、空間制約のあるマイクロ流体チャネル内において、インサイチューでリアルタイムに撮像し、追跡し、選別することができる。当該運動性細胞の選別及び分析システムは、迅速でハイスループットの細胞分析及び選別が可能な、化学薬品不含の無流システムである。運動性細胞の特性、例えば、細胞の数、平均運動性、及び特定の細胞の運動性などを特定することができる。そのような特性の分析は、受胎能に影響を及ぼし得る様々な状態、例えば低精子数（乏精子症）及び低精子運動性（精子無力症）などの診断において重要である。さらに、最も運動性の高い細胞は、ポンプ又は他の周辺機器を必要とせずに、当該選別及び分析システムによって受動的に選別される。主に非常に運動性の高い精子で構成されるサンプルは、例えば、生殖補助医療技術での使用にとって望ましい。
【０００６】
一般的態様において、運動性細胞を選別する方法は、運動性細胞の初期集団を、マイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップであって、当該運動性細胞の初期集団が第１の平均運動性を有する、ステップ；当該運動性細胞の集団をマイクロ流体チャネルにおいてインキュベーションするステップ；及び、選別された運動性細胞の集団をマイクロ流体チャネルの出口ポートにおいて収集するステップを含む。選別された運動性細胞の集団は、第１の平均運動性より高い第２の平均運動性を有する。
【０００７】
実施形態は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る。
【０００８】
運動性細胞は、精子細胞、例えば、動物の、例えば、哺乳動物の精子細胞を含む。
【０００９】
当該方法は、マイクロ流体チャネルを水平又は垂直に向けるステップをさらに含む。
【００１０】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップは、流動媒体の非存在下においてインキュベーションするステップを含む。
【００１１】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップは、マイクロ流体チャネルを約３７℃に加熱するステップを含む。
【００１２】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップは、運動性細胞の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って移動することができる十分な時間、例えば、約２０〜６０分間又は約３０分間、当該運動性細胞の集団をインキュベーションするステップを含む。
【００１３】
マイクロ流体チャネルの高さは、運動性細胞の寸法の約２０倍未満、例えば、運動性細胞の寸法の約３〜１０倍である。
【００１４】
当該方法は、出口ポート付近において、選別された運動性細胞の集団を含む収集可能な運動性細胞の集団の複数の画像、例えば影像を得るステップ；並びに当該複数の画像を分析するステップを含む第２の平均運動性を特定するステップをさらに含む。
【００１５】
当該方法は、運動性細胞の初期集団の平均経路速度（average path velocity）（ＶＡＰ）、直線速度（straight line velocity）（ＶＳＬ）、又は直線性（linearity）のうちの少なくとも１つに基づいて、第１の平均運動性を特定するステップをさらに含む。
【００１６】
当該方法は、選別された運動性細胞の集団の平均経路速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、又は直線性のうちの少なくとも１つに基づいて、第２の平均運動性を特定するステップをさらに含む。
【００１７】
運動性細胞の初期集団を導入するステップは、少なくとも精子約１０３個／μＬ、例えば、少なくとも精子約１０４個／μＬの濃度で媒体に精子の初期集団を懸濁させるステップを含む。媒体中の選別された運動性細胞の集団の濃度は、精子約１．６×１０３個／μＬ以下である。
【００１８】
別の一般的態様において、運動性細胞の集団を分析する方法は、運動性細胞の初期集団をマイクロ流体チャネルの入口ポートに導入するステップ；マイクロ流体チャネルにおいて運動性細胞の集団をインキュベーションするステップ；マイクロ流体チャネル内の運動性細胞の集団の少なくとも一部の複数の画像を取得するステップ；並びに当該複数の画像に基づいて運動性細胞の集団の少なくとも一部の特性を特定するステップを含む。
【００１９】
実施形態は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る。
【００２０】
運動性細胞は、精子細胞、例えば動物の、例えば哺乳動物の精子細胞を含む。
【００２１】
複数の画像を取得するステップは、マイクロ流体チャネル内の運動性細胞の集団の少なくとも一部の複数の影像を取得するステップを含む。
【００２２】
特定された特性は、運動性、平均経路速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、又は直線性のうちの少なくとも１つを含む。
【００２３】
特定される特性は、（１）マイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性、及び（２）マイクロ流体チャネルの長さに沿った運動性細胞の集団の分布のうちの少なくとも一方を含む。
【００２４】
特性を特定するステップは、マイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性を、（１）運動性細胞の初期集団の特性、及び（２）インキュベーション後に入口ポート付近に位置している残留運動性細胞の集団の特性のどちらか又は両方と比較するステップを含む。
【００２５】
当該方法は、当該比較の結果に基づいて、マイクロ流体チャネルの選別能力を特定するステップをさらに含む。
【００２６】
特性を特定するステップは、インキュベーション後に入口ポート付近に位置している残留運動性細胞の集団の特性を、インキュベーション後にマイクロ流体チャネルの出口ポート付近に位置している選別された運動性細胞の集団の特性と比較するステップを含む。
【００２７】
当該方法は、特定された特性に基づいて、運動性細胞の初期集団の健康を特定するステップをさらに含む。
【００２８】
当該方法は、マイクロ流体チャネルの出口ポートにおいて、選別された運動性細胞の集団を収集するステップをさらに含む。
【００２９】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップは、精子の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って移動することができる十分な時間、例えば、約２０〜６０分間又は約３０分間、流動媒体の非存在下でインキュベーションするステップを含む。
【００３０】
運動性細胞の集団をインキュベーションするステップは、精子の初期集団の一部がマイクロ流体チャネルに沿って泳ぐことができる十分な時間、精子の集団をインキュベーションするステップを含む。
【００３１】
マイクロ流体チャネルの高さは、運動性細胞の寸法の約２０倍未満、例えば、運動性細胞の寸法の約３〜１０倍である。
【００３２】
別の一般的態様において、運動性細胞を選別する装置は、マイクロチャネルを備える。マイクロ流体チャネルの高さは、運動性細胞の寸法の約２０倍未満となるように選択される。当該装置は、マイクロ流体チャネルの第１の端部に接続された入口ポートであって、第１の平均運動性を有する運動性細胞の初期集団を受け入れるように構成された入口ポートと、マイクロ流体チャネルの第２の端部に接続された出口ポートとをさらに備える。当該マイクロ流体チャネルは、マイクロチャネル中において流体の流れを必要とせずに、第２の端部において、選別された運動性細胞の集団を提供するように構成される。選別された運動性細胞の集団は、第１の平均運動性より高い第２の平均運動性を有する。
【００３３】
実施形態は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る。
【００３４】
運動性細胞は、精子細胞、例えば、動物の、例えば、哺乳動物の精子細胞を含む。運動性細胞の寸法は、精子細胞の頭部の直径である。
【００３５】
運動性細胞の寸法は、運動性細胞の直径である。
【００３６】
マイクロ流体チャネルの高さは、運動性細胞の寸法の約３から１０倍、例えば、約２００μｍ未満、例えば、約６０μｍ未満、例えば、約３〜２０μｍなどとなるように選択される。
【００３７】
マイクロ流体チャネルの長さは、少なくとも部分的に、チャネルでの運動性細胞のインキュベーション時間及び運動性細胞の速度のうちの少なくとも一方に基づいて選択され、例えば、当該長さは、約２０ｍｍ未満、例えば、約１２〜１５ｍｍである。
【００３８】
マイクロチャネルの長さは、少なくとも部分的に、チャネルでの運動性細胞のインキュベーション時間及び運動性細胞の泳ぐ速度のうちの少なくとも一方に基づいて選択される。
【００３９】
マイクロチャネルは、インキュベーション時間後に、選別された運動性細胞の集団を提供するように構成される。
【００４０】
マイクロ流体チャネルは、四角形断面、台形断面、三角形断面、円形若しくは楕円形断面、マイクロチャネルの長さに沿って変わる断面、又はリッジを有する断面を有する。
【００４１】
マイクロ流体チャネルは、直線状であるか又は湾曲している。
【００４２】
当該装置は、マイクロ流体チャネルの少なくとも一部の複数の画像をキャプチャするように構成された撮像システムをさらに含む。当該撮像システムは、マイクロ流体チャネルの少なくとも一部を照らすように構成された光源と、マイクロ流体チャネルにおける光が照らされた部分の運動性細胞の画像、例えば影像などを検出するように構成された検出器とを含む。
【００４３】
当該装置は、キャプチャされた画像に基づいて、マイクロ流体チャネルにおける撮像された部分での運動性細胞の特性を特定するように構成された分析モジュールをさらに含む。
【００４４】
「運動性細胞」は、例えば、鞭毛及び／又は繊毛の動きなどにより、自発的かつ活動的に移動することができる細胞である。本出願の目的にとっての例示的運動性細胞としては、精子細胞、例えば、哺乳動物の精子細胞など、好中球、マクロファージ、白血球、及びある特定の細菌が挙げられる。
【００４５】
本明細書において説明されるシステム及び方法は、いくつかの利点を有する。例えば、当該運動性細胞の選別及び分析システムは、高い運動性を有する細胞、例えば精子細胞など、の識別及び選択を容易にする。低細胞数又は低細胞運動性を有する出発サンプルに対しても、細胞に有害な作用を及ぼすことなく、運動性細胞の高収率が実現される。当該システムは、簡素で、小型で、安価であり、複雑な機器設備又は周辺機器、例えば、チューブ又はポンプなどの使用を必要としない。結果はオペレータに依存しない。当該運動性細胞の選別及び分析システムは、生殖補助医療技術における使用のために高い運動性の精子を選択することを望んでいる不妊治療院にとって、並びに自宅でそれらの受胎能を確認することを望んでいる個人にとって、有用であり得る。
【００４６】
特に明記されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料について下記において説明する。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み入れられる。それらの内容が本明細書の内容と矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００４７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】例示的な運動性細胞の選別及び分析システムの模式図である。
【図２Ａ】本明細書において説明される、運動性細胞の選別及び分析システムの例示的マイクロ流体チップの模式図である。
【図２Ｂ】図２Ａの例示的マイクロ流体チップの分解立体図である。
【図３】例示的マイクロチャネルの幾何学的構造の模式図である。
【図４】選別されたマウス精子及び選別されていないマウス精子の平均経路速度（ＶＡＰ）及び直線速度（ＶＳＬ）のプロットである。
【図５Ａ】水平に向けられたマイクロチャネルでのマウス精子運動性ベクトルのブルズアイプロットである。
【図５Ｂ】垂直に向けられたマイクロチャネルでのマウス精子運動性ベクトルのブルズアイプロットである。
【図６Ａ】水平及び垂直に向けられたマイクロチャネルにおける、マウス精子の速度のプロットである。
【図６Ｂ】水平及び垂直に向けられたマイクロチャネルにおける、マウス精子の直線性のプロットである。
【図６Ｃ】水平及び垂直に向けられたマイクロチャネルにおける、マウス精子の加速度のプロットである。
【図７】１時間のインキュベーション後の、例示的マイクロ流体チップのマイクロチャネル内での、マウス精子の実験による分布及びシミュレーションによる分布のプロットである。
【図８】インキュベーション時間の関数としての、例示的マイクロ流体チップのマイクロチャネル内での、マウス精子の実験による分布及びシミュレーションによる分布のプロットである。
【図９Ａ】チャネル長及びインキュベーション時間の関数としての、マウス精子のＶＡＰのプロットである。
【図９Ｂ】チャネル長及びインキュベーション時間の関数としての、マウス精子のＶＳＬのプロットである。
【図９Ｃ】チャネル長及びインキュベーション時間の関数としての、マウス精子の直線性のプロットである。
【図９Ｄ】チャネル長及びインキュベーション時間の関数としての、運動性マウス精子の割合のプロットである。
【図１０】チャネル長の関数としての、選別された精子におけるマウス精子のＶＡＰ及びＶＳＬ及び収集可能な精子の割合のプロットである。
【図１１Ａ】マイクロ流体チップで選別された精子、スイムアップ手法によって選別された精子、及び非選別精子における、マウス精子のＶＡＰのプロットである。
【図１１Ｂ】マイクロ流体チップで選別された精子、スイムアップ手法によって選別された精子、及び非選別精子における、マウス精子のＶＳＬのプロットである。
【図１１Ｃ】マイクロ流体チップで選別された精子、スイムアップ手法によって選別された精子、及び非選別精子における、マウス精子の直線性のプロットである。
【図１１Ｄ】マイクロ流体チップで選別された精子、スイムアップ手法によって選別された精子、及び非選別精子に対する、マウス精子の運動性精子の割合のプロットである。
【図１２】精子の軌跡を示す画像である。
【図１３】持続的ランダムウォーク（persistent random walk）（ＰＲＷ）モデルで近似された図１２の精子の軌跡に対する平均二乗変位のプロットである。
【図１４】持続的ランダムウォーク（ＰＲＷ）を実行する精子の軌道の模式図である。
【図１５】チャネル長の関数としての、精子の分布のプロットである。
【００４９】
詳細な説明
図１を参照すると、運動性細胞の選別及び分析システム１００は、運動性細胞、例えば精子などの集団を、空間制約のあるマイクロ流体チャネル内において、インサイチューでかつリアルタイムに撮像し、追跡し、及び／又は選別する。当該運動性細胞の選別及び分析システム１００は、迅速でハイスループットの細胞分析及び選別が可能な、化学薬品不含の無流システムである。運動性細胞の特性、例えば、細胞の数、平均運動性、及び特定の細胞の運動性などを特定することができる。そのような特性の分析は、受胎能に影響を及ぼし得る様々な状態、例えば低精子数（乏精子症）及び低精子運動性（精子無力症）などの診断において重要である。さらに、最も運動性の高い細胞は、ポンプ又は他の周辺機器の必要性なしに、当該選別及び分析システムによって受動的に選別される。主に運動性の高い精子で構成されたサンプルは、例えば、生殖補助医療技術での使用にとって望ましい。
【００５０】
例示的な選別及び分析システム１００は、マイクロ流体チップ１０２を含み、これは、１つ又は複数のマイクロ流体チャネル２００を含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体チップ１０２は、撮像システム１０６と統合されており、当該撮像システムは、マイクロ流体チップの１つ又は複数のマイクロ流体チャネル内において精子の画像をキャプチャする。当該画像を分析することにより、マイクロ流体チャネルでの精子の特性、例えば、数、運動性、速度、加速度、及び／又は指向性を特定することができる。さらに、マイクロ流体チャネル内の精子は、それらが、チャネルに沿って（例えば、泳いだり、又は他のタイプの自走的な動きによって）移動する際に選別され、高品質の運動性精子の選別サンプルは、チャネルの出口において抜き取ることができる。
【００５１】
以下の説明において、当該運動性細胞の選別及び分析システムを、精子を参考にしながら説明する。しかしながら、当該システムにおいて他の運動性細胞、例えば、好中球、マクロファージ、白血球、及びある特定の細菌、例えば、大腸菌（bacterium E. coli）も使用することができることを理解されたい。
【００５２】
マイクロ流体チップの構造及び製作
図２Ａ及び２Ｂを参照すると、マイクロ流体チップ１０２は、１つ又は複数のマイクロ流体チャネル２００ａ、２００ｂ、２００ｃ、２００ｄを有する。選別及び／又は分析のために、例えば、ピペット２０４による注入などによって、入口ポート２０６ａ、２０６ｂ、２０６ｃ、２０６ｄに、精子２０２が導入される。十分なインキュベーション期間の後、下記において説明されるように、選別された精子のサンプルが、出口ポート２０８ａ、２０８ｂ、２０８ｃ、２０８ｄから抜き取られる。
【００５３】
マイクロ流体チップ１０２は、ベース層２１０、中間層２１２、及びカバー層２１４で形成された多層構造である。チャネル２００は中間層２１２に形成され、入口ポート２０６及び出口ポート２０８は、ベース層２１０に形成される。各チャネル２００の第１の端部は、対応する入口ポート２０６に揃えられ、各チャネル２００の第２の端部は、対応する出口ポート２０８に揃えられ、その結果、入口ポート２０６からチャネル２００を介して対応する出口ポート２０８への流路が形成される。いくつかの実施形態において、チャネル２００は、それらのそれぞれの入口ポート２０６及び出口ポート２０８をわずかに超えて延びている。チャネルは、例えば、分析及び／又は選別される精子を含有するマイクロリットル又はミリリットル体積の溶液を受け入れるサイズである。当該チャネルはさらに、下記において説明されるように、効率的な選別を果たすサイズ及び形状でもあり得る。
【００５４】
マイクロ流体チップは、水平構成（すなわち、チャネルが水平を向いている）又は垂直構成（すなわち、チャネルが垂直を向いている）のどちらかにおいて、選別及び分析のために操作可能である。
【００５５】
ベース層２１０は、マイクロ流体チップ１０２に構造的支持を提供し、並びに好適な厚さ、例えば、約１．５ｍｍ（例えば、約１ｍｍから４ｍｍ）などで、十分な剛性の材料、例えば、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ；ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒｒ、アトランタ、ＧＡ）などで形成される。大きな１枚のＰＭＭＡをマイクロ流体チップのための所望のサイズ（例えば、２４ｍｍ×４０ｍｍ）に切断して入口ポート２０６及び出口ポート２０８のための穴を開ける必要がある場合には、レーザー切断機（ＶｅｒｓａＬａｓｅｒ（商標）、スコッツデール、ＡＺ）が使用される。いくつかの例において、チャネル２００の出口端部に到達した精子の収集を容易にするために、出口ポート２０８は、入口ポート２０６より大きい。例えば、いくつかの例では、入口ポート２０６は、約０．３７５ｍｍ又は約０．６５ｍｍ（例えば、約０．３ｍｍから１．２ｍｍ）の直径を有し、出口ポートは、約０．３７５ｍｍ又は約２ｍｍ（例えば、約０．３ｍｍから３．４ｍｍ）の直径を有する。
【００５６】
中間層２１２は、ベース層２１０に接着する材料、例えば、両面接着剤（ＤＳＡ）フィルム（ｉＴａｐｅｓｔｏｒｅ、スコッチプレインズ、ＮＪ）などで形成される。チャネル２００は、それ自体が所望のサイズ（例えば、ベース層２１０のサイズ）にレーザー切断されている中間層２１２中に、ポリゴン、例えば四角形断面などをレーザー切断することによって形成される。チャネル２００の高さは、中間層２１２の厚さによって決定され、これについては、下記においてより詳細に説明する。チャネル２００の長さ及び幅は、それぞれ、中間層２１２中へと切断されたポリゴンの長さ及び幅によって決定される。例えば、下記においてより詳細に説明されるように、チャネルは、約１〜１０ｍｍ幅（例えば、約４ｍｍ幅）及び約１〜２０ｍｍ長（例えば、約３ｍｍ、７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、又は２０ｍｍ長）であり得る。場合によって、様々な長さ及び／又は幅の複数のチャネルが中間層に形成される。
【００５７】
チャネル２００を中間層２１２に切断した後、当該中間層は、各チャネル２００の第１の及び第２の端部が、対応する入口ポート２０６及び出口ポート２１０に揃うか又はそれらをわずかに超えて延びるように、ベース層２１０に接着される。例えばベース層２１０及び中間層２１２と同じ横寸法のスライドガラスなどのカバー層２１４が、中間層の露出している側に接着され、これにより、チャネル２００が封入される。図２に表された実施形態では、マイクロ流体チップ１０２は、カバー層２１４が下になるように向けられている。他の実施形態では、マイクロ流体チップ１０２は、カバー層２１４が上になるように、又はチャネル２００の上部が開放されるように向けられ得る。
【００５８】
概して、本明細書において説明するマイクロ流体チップ１０２は受動的であり、すなわち、能動的な流れシステムに連結されていない。すなわち、運動性細胞は、マイクロ流体チップ１０２内のマイクロチャネル２００に沿って、外部的に駆動される流体流れ（例えば、運動性細胞が懸濁されている媒体の流れ）によって押し流されたり又は別の方法で移動させられたりすることなく、自ら移動する（例えば、泳ぐ）。
【００５９】
撮像システムの操作
再び図１を参照すると、いくつかの実施形態において、精子の選別及び分析システム１００は、マイクロ流体チップ１０２を含み、その構造は、上記において説明されており、任意により撮像システム１０６と統合されている。マイクロ流体チップ１０２と撮像システム１０６とを統合することにより、１つ又は複数のマイクロ流体チャネル２００における精子の集団又は個々の精子を追跡及び分析することが可能となる。いくつかの実施形態において、当該撮像システム１０６は、マイクロ流体チップ１０２の１つ又は複数のチャネル２００に対して自動での広視野撮像を実施するレンズレス撮像システムである。他の実施形態において、撮像システム１０４は、例えば１０×対物レンズを備える光学顕微鏡である。
【００６０】
撮像システム１０６は、光源１０８、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）又は他の光源などを含む。当該光源１０８は、マイクロ流体チップ１０２の１つ又は複数のチャネル２００を照らす。画像センサー１１０が、光源１０８に対してマイクロ流体チップ１０２の反対側に位置されている。光がチャネル２００に入射すると、照らされたチャネルの精子が、光を回折し透過させる。精子による光の回折によって生じた影が、画像センサー１１０によって撮像され、チャネル２００内の精子の集団の影像（すなわち、チャネル２００内の各精子が影として撮像された画像）が生成される。画像センサーは、任意の適切なセンサー、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサー（Ｉｍｐｅｒｘ、ボカラトン、ＦＬ）又は相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）チップベースのセンサーなどであり得る。
【００６１】
当該レンズレス撮像システム１０６は、チャネル内の精子の影像を、即座に（例えば、約１秒で）、広い視野（ＦＯＶ）において生成する。例えば、撮像システム１０６のＦＯＶは、数ミリメートル×数ミリメートル（例えば、４ｍｍ×５．３ｍｍ）から数センチメートル×数センチメートル（例えば、３．７２５ｃｍ×２．５７０ｃｍ）まで大きくあり得、或いは１つ又は複数のチャネル２００の一部又は全体（例えば、１０まで並列に並んだチャネル）を撮像するのに適切な別のサイズであり得る。
【００６２】
場合によって、何十万もの個々の精子が、撮像システム１０６のＦＯＶに捉えられ得る。さらに、撮像システム１０６の広いＦＯＶのために、各個々の精子を、比較的長い時間、撮像システムのＦＯＶ内に捉えることができる。したがって、多くの精子に対して、精子の動き及び活動性を、全体的に又は個別に、長い時間にわたって追跡及び分析することができ、それにより、正確な統計量を取得することが可能となる。いくつかの実施形態において、当該撮像システム１０６は、個別に検出し及びカウントするのに十分なコントラスト及び信号対雑音比においてＦＯＶ内の精子を撮像するように設計され、これは、場合によって、結果として空間分解能が犠牲になり得る。
【００６３】
当該画像は、撮像されたチャネル（複数可）内における個々の精子（例えば、運動性精子）又は精子の集団をカウントし、識別し、追跡し、及びその活動を分析するために、画像解析ソフトウェア（例えば、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ＭＤ）を使用して手動及び／又は自動により加工される。例えば、特定のチャネル内での精子分布のために取得された画像を分析するため、各画像における精子の自動カウント及び識別が実施される。カウントの結果は、回折理論と比較され、これは、臨界パラメータとして、画像センサー１１０の有効領域（例えば、ＣＣＤセンサーの有効面）と撮像された顕微鏡対象（例えば、精子細胞）の位置との間の距離を含む。検出された信号強度に対する、細胞の影の直径の影響を量的に調べるために、キャプチャされた精子細胞の回折シグネチャをモデルで近似する。レンズレス撮像システムの例において、当該システムの操作は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄ回折方程式を数値的に解くことによってモデル化することができる。
【００６４】
大きな領域のＣＣＤを使用し、適切なソフトウェア処理、例えば、ビデオベースの粒子追跡コードなどを組み込むことにより、かなりの程度の拡張性が可能となり、それにより、例えば、数百万もの精子を同時にモニターしかつ分析することができる。
【００６５】
精子の選別及び分析システムの使用
生体適合性媒体、例えば、ヒト卵管液（Human Tubal Fluid）（ＨＴＦ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などに懸濁された精子が、例えばピペットなどを使用して、チャネルの入口ポート２０６からマイクロ流体チップ１０２のマイクロ流体チャネル２００内に導入される。当該チャネルは、既に生体適合性媒体を含み得る。マイクロ流体チップ１０２は、３７℃で、運動性精子がチャネルに沿ってチャネルの出口ポート２０８へと移動するのに十分な時間、インキュベーションされる。例えば、インキュベーション期間は、約２０〜４０分間、例えば、約３０分間、又は約１若しくは２時間未満、或いは、結果として出口ポートにおいて精子の疲弊をもたらす時間量未満などであり得る。インキュベーション期間後、精子は、例えば、微細な先端を有する抜き取り器具又はピペットを使用することによって、又はチップ入口に媒体をポンプ送流することによって、出口２０８から抜き取られる。運動性精子のみがチャネルの長さに沿って移動することができるので、出口から抜き取られた精子は運動性精子であり、すなわち、インキュベーション期間は、（例えば、所定の時間内に出口に到達する精子を選択することによって）高い運動性を有する精子のみを得るために最適化することができる。入口付近に残っている精子は、チャネルの全長を移動することができなかった低運動性精子であるか、又はランダムな動きによってのみ移動する非運動性精子である。このようにして、マイクロ流体チップ１０２は、簡単で、受動的で、無流の精子選別を達成し、並びに高運動性の精子のサンプルを抜き出すことができる。
【００６６】
選別に加えて、当該精子の選別及び分析システム１００は、様々なタイプの分析、例えば、平均精子運動性の分析、並びに個々の精子の経路及び運動性の追跡及び分析などの実施を可能にする。例えば、高品質の精子サンプルを識別するため、又は精子サンプルに関する問題を診断する（例えば、サンプルを乏精子症又は精子無力症サンプルとして診断する）などのために、全精子サンプル若しくは抽出された選別精子サンプルの速度、加速度、指向性、又は運動性を定量化することができる。
【００６７】
当該精子の選別システム１００は、水平構成（すなわち、チャネル２０６を通る流れが水平である）又は垂直構成（すなわち、チャネル２０６を通る流れが垂直であり、精子の選別において追加の識別要因として重力が使用される）のいずれかにおいて、操作可能である。インビボにおいて卵子を受精させるために、精子は、女性生殖器系の解剖学的構造及び／又は位置により、重力に逆らって卵子に向かって移動することが必要とされ得る。したがって、垂直方向において精子の分析及び／又は選別を実施することは、水平方向において分析及び／又は選別を実施するよりも、より現実的に精子を特徴付け又は選択するための能力を提供し得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、精子のカウントのためにレンズレスＣＣＤ撮像システムを使用する場合の誤差を減らすために、当該撮像システムによって分解可能な最大精子濃度は、モデル（例えば、Ozcan及びDemirci、Lab Chip、2008、8、98-106に記載されているようなモデル、なお、当該文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる）に基づいて評価され得る。例えば、４ｍｍ×５．３ｍｍのＣＣＤ領域では、モデルにより、精子１．６×１０３個／μＬの分解可能な最大精子濃度が予測される。精子サンプルが、選別のためにマイクロ流体チャネル、とりわけ長いチャネルに位置されると、運動性精子が見つけられるチャネルの出口端部に向けて精子のモニタリングが実施され得る。この領域では、精子の濃度は、入口付近の精子の濃度よりも低い。したがって、分解可能な最大精子濃度より高い精子濃度、例えば、臨床的に観察される濃度と同じくらい高い精子濃度などをチャネルの出口付近での撮像システムの分解能を落とすことなく、チャネルの入口に導入することができる。下記の実施例において示されるように、分解可能な最大精子濃度より高い精子濃度を導入する能力が実験的に実証され、すなわち、入口において精子２×１０４個／μＬの濃度の精子を導入したにもかかわらず、チャネルの出口付近での選別精子の影の重なりは認められなかった。
【００６９】
選別能力に影響を及ぼすパラメータ
再び図２を参照すると、精子が入口ポート２０６からマイクロ流体チャネル２００に導入されると、運動性精子は当該マイクロ流体チャネル内を移動する。マイクロ流体チャネル２００は、運動性精子をマイクロ流体チャネルの長さに沿って出口ポート２０８に向かって移動するように仕向ける、空間制約のある環境を精子に提示する。結果として、十分なインキュベーション期間の後、高運動性精子の集団は出口ポート付近に到達するが、低運動性精子又は非運動性精子の集団は入口ポート２０６付近のそれらが元居た場所か又はその付近に残っている。したがって、マイクロ流体チャネル内での精子の空間制約により、結果として、チャネル内での精子の運動性による受動的選別が生じる。
【００７０】
マイクロ流体チャネルの幾何学的構造は、チャネル内での精子選別の効率に影響を及ぼし得る。例えば、マイクロ流体チャネルの寸法及び形状は、チャネル内の流体抵抗に影響を及ぼす。さらに、精子の動きは、精子間の相互作用によって影響され、この相互作用は、チャネル内の利用可能な空間によって部分的に影響される。
【００７１】
マイクロ流体チャネル内での精子の空間制約を達成するために、チャネルの高さ及び／又は幅（すなわち、中間層２１２の厚さ、及び中間層中に切断されるポリゴンの幅）は、チャネル内において選別される精子の寸法に基づいて選択され得る。例えば、図３を参照すると、チャネル２００の高さｈは、選別される精子３００のタイプの頭部３０２の寸法ｄの数倍となるように（又は、より一般的には、選別される運動性細胞の寸法、例えば直径など、に基づいて）選択され得る。いくつかの例において、当該高さは、精子の頭部の寸法の３〜１０倍、又は精子の頭部の寸法ｄの２０倍未満である。他の例では、チャネル２００の幅ｗは、精子の頭部の寸法ｄ又は運動性細胞の寸法に基づいて選択され得る。図３に示されるように、寸法ｄは、卵形の精子の頭部３０２の短い直径である。他の実施形態において、寸法ｄは、卵形の精子の頭部３０２の長い直径ｄ’か、又は精子の頭部の長い直径と短い直径の平均であり得る。
【００７２】
より詳細には、約２〜３μｍの頭部寸法ｄを有するヒト精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、６〜３０μｍ、又は６０μｍ未満であり得る。約１０μｍの頭部寸法ｄを有する齧歯動物（例えば、マウス）の精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、３０〜１００μｍ、又は５０μｍ、又は２００μｍ未満であり得る。約４〜５μｍの頭部寸法ｄを有するウシの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１０〜５０μｍ、又は１００μｍ未満であり得る。約３〜４μｍの頭部寸法ｄを有するウマの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１０〜４０μｍ、又は８０μｍ未満であり得る。約４μｍの頭部寸法ｄを有するヒツジの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１０〜４０μｍ、又は８０μｍ未満であり得る。約４〜５μｍの頭部寸法ｄを有するウサギの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１０〜５０μｍ、又は１００μｍ未満であり得る。約３μｍの頭部寸法ｄを有するネコの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１０〜３０μｍ、又は６０μｍ未満であり得る。約３〜４μｍの頭部寸法ｄを有するイヌの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１０〜４０μｍ、又は８０μｍ未満であり得る。約５μｍの頭部寸法ｄを有するブタの精子の場合、チャネル２００の高さｈは、およそ、例えば、１５〜５０μｍ、又は１００μｍ未満であり得る。他の種の精子の場合、チャネルはそれに応じたサイズであり得る。いくつかの実施形態において、チャネルの寸法は、下記においてより詳細に説明されるような、空間制約のある環境内での精子の動きのシミュレーションにより特定された無次元量に基づいて決定される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネルの形状も、チャネル内での精子のより効率的な選別を達成するために適合され得る。例えば、非直線的チャネル（例えば、湾曲したチャネル、Ｓ字形状のチャネル、正弦曲線状のチャネル、正方形のチャネル、又は角度のあるチャネルなど）を使用してもよい。マイクロ流体チャネルの幅は、チャネルの入口ポート側からチャネルの出口ポート側へと変化していてもよい（例えば、狭くなっていくチャネル又は広くなっていくチャネルなど）。マイクロ流体チャネルの側壁は、例えば、広い底部及び狭い上部を有するチャネル（例えば、台形断面を有するチャネル）、或いは別の断面、例えば、三角形断面、円形若しくは楕円形断面、又は別の形状の断面などを有するチャネルなどを形成するように、傾いていてもよい。断面も、リッジ、例えば、ヘリングボーン構造で形成されたリッジ又は四角形のフィンで形成されたリッジなどを有していてもよい。チャネルの深さは、チャネルの長さに沿って変わってもよい。他の形状のチャネル又は他の幾何学的特徴を有するチャネルも使用することができる。
【００７４】
マイクロ流体チャネル２００の長さも、チャネル内での精子の効率的な選別を達成するために選択される。所定のインキュベーション時間に対して、チャネルの長さは、運動性精子がインキュベーション時間内にチャネルの出口端部に到達できるように十分に短いが、チャネルの出口端部の運動性精子とチャネルの入口端部の低運動性精子及び非運動性精子との間が十分離れるように十分に長くあるように選択される。例えば、３０分間のインキュベーション期間及び８０〜１２０μｍ／ｓの速度を有するマウス精子の場合、１２〜１５ｍｍのチャネル長が選択され得る。同じ３０分間のインキュベーション期間でも、約５０μｍ／ｓの速度を有するヒト精子の場合には、８〜１２ｍｍのチャネル長が選択され得る。
【００７５】
他の設計パラメータも、マイクロ流体チャネルの選別能力を最適化するために変えることができる。例えば、チャネルにおける運動性細胞のインキュベーション時間を変えることができる。化学的、生物学的、又は温度における勾配を、チャネルに沿って適用することができる。固定された媒体若しくは動的媒体及び表面パラメータ、例えば、栄養物及び酸素の拡散輸送などを、例えば、卵丘細胞などの他の細胞の存在などによって変えることができる。精子が懸濁されている選別媒体の特性、例えば、密度、表面張力、間隙率、及び／又は媒体の粘度を変えることができる。他の設計パラメータも、マイクロ流体チャネルの選別能力に影響を及ぼすように変えることができる。
【００７６】
場合によって、マイクロ流体チップ１０２のための設計パラメータの一部又は全てが、マイクロチャネルでの精子の運動性のモデルの仕様に従って選択される。当該モデルは、例えば、精子間の相互作用及び精子とマイクロチャネルの表面との間の相互作用などを含めて、空間制約のある環境下での個々の精子及び／又は精子の集団の挙動をシミュレートし得る。当該モデルは、例えば、集合的流体力学効果、精子の疲弊、精子の凝集若しくは他の相互作用、精子の間の流体力学的相互作用の結果としての協同作用、精子とチャネル壁との間の流体力学的相互作用の結果としての協同作用、及び／又は精子の鞭毛の波形などの因子を組み入れることができる。さらに、当該モデルは、長さ、幅、高さ、及び形状など、チャネルの幾何学的構造のパラメータを組み入れることができる。
【００７７】
実施例
本発明について、以下の実施例においてさらに説明するが、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００７８】
概して、以下の実施例は、精子などの運動性細胞を選別するためのマイクロ流体チップの能力を実証するものである。低運動性細胞又は非運動性細胞は当該チャネルに残しつつ、高運動性細胞を当該チップのマイクロ流体チャネル（複数可）の出口端部から回収することができる。当該マイクロ流体チップの選別能力は、チャネル寸法及びインキュベーション時間などのいくつかのパラメータに依存する。運動性細胞の特性、例えば、運動性の様々な運動パラメータなどを、当該マイクロ流体チャネルにおける運動性細胞の画像の分析から特定することができる。
【実施例１】
【００７９】
精子サンプルの調製
精液サンプルは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バーハーバー、ＭＥ）からの７〜１２週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスから採取した。動きが止まるまでマウスをＣＯ２に曝露し、次いで頸椎脱臼によって安楽死させた。胴体の中央部を小さく切開し、皮膚をめくり、鋭的に切開して腹膜を開いて内臓を露出させた。両方の脂肪体を引き下げて、精巣及び精巣上体を露出させた。精巣上体尾及び輸精管部分を摘出して、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を補ったヒト卵管液（ＨＴＦ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンタアナ、ＣＡ）３００μＬの入った中央ウェル皿に入れた。解剖顕微鏡下において、一対の鉗子で精巣上体を適所に保持し、精巣上体の遠位末端を切開して、精子を流出させた。インスリン針で臓器を固定して、一対の鉗子を一方の端から他方の端へとゆっくりと移動させて、精子を輸精管から押し出した。当該皿をインキュベータ（３７℃、５％のＣＯ２）に１０分間入れて、全ての精子を精巣上体から泳ぎ出させた。精巣上体、輸精管、及びより大きな壊死組織片を手作業で取り出して破棄した。
【００８０】
当該精子懸濁液を、０．５ｍＬのエッペンドルフ管に入れ、気体の移動を可能にしつつ蒸発を防ぐために、無菌胚試験済み鉱油の薄層（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を上に位置した。次いで、受精能獲得のため、当該開放管を３７℃のインキュベータに３０分間入れた。受精能獲得の後、当該管をそっと叩いて、当該精子懸濁液を混ぜた。
【００８１】
受精能を獲得した精子のサンプル１０μＬをピペットで取り出し、新しいエッペンドルフ管に入れ、それを６０℃の湯浴に入れ、Ｍａｋｌｅｒ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｓｅｆｉ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ハイファ、イスラエル）を使用してカウントするための死んだ精子のサンプルを得た。残った精子懸濁液を、ＨＴＦ−ＢＳＡ媒体中において精子５０００個／μＬ未満の濃度に調整して、下記の実施例において説明される実験に使用した。特に、マイクロ流体チップに導入される精子の濃度は、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ＭＤ）を使用した画像解析により確認したところ、精子１５００〜４０００個／μＬの範囲であった。
【００８２】
下記のいくつかの実施例において、精子をマイクロ流体チップに導入する前に、スイムアップ法を用いて予備選別した。精子を取り出した後、新鮮なＨＴＦ／ＢＳＡ媒体４０μＬを、０．５ｍＬのエッペンドルフ管中の精子懸濁液の上に加えて、無菌胚試験済み鉱油の薄層を媒体の上に位置した。当該管を３７℃のインキュベータに１．５時間入れて、精子を分離させた。エッペンドルフ管の上部から回収した精子をマイクロ流体チップに導入した。
【実施例２】
【００８３】
高運動性精子の選別
運動性に基づいて精子を選別するマイクロ流体チップの能力を実証するために、入口ポート及び出口ポートでの精子の運動性を、光学顕微鏡を使用して得られた連続する画像に基づいて、非選別精子の運動性と比較した。この選別試験では、７ｍｍのチャネル長、４ｍｍのチャネル幅、５０μｍのチャネル高さ、０．６５ｍｍの入口ポート直径、及び２ｍｍの出口ポート直径を有するマイクロ流体チップを使用した。大きな出口ポート直径は、チャネルからの精子の容易な取り出しのために設計した。
【００８４】
当該チャネルを、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する新鮮なＨＴＦ媒体で満たした。出口ポートを、２μＬのＨＴＦ／ＢＳＡ媒体で満たし、蒸発を防ぐために、上に鉱油の薄層を位置した。受精能獲得後、受精能を獲得した精子１μＬを取り出し、入口ポートに入れた。マイクロ流体チップを、３７℃のインキュベータに３０分間入れた。インキュベーション期間の終了時に、１０×の対物レンズを備えた顕微鏡（ＴＥ  ２０００；ニコン（Ｎｉｋｏｎ）、日本）を使用し、Ｓｐｏｔソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、バージョン４．６、スターリングハイツ、ＭＩ）を使用して０．４〜１秒あたり１フレームの割合において、入口ポート及び出口ポートの両方において１．２ｍｍ×０．９ｍｍの領域に対して２０枚の連続画像を取得した。検証のために、多数のチャネル位置における顕微鏡分析を、チャネルのＣＣＤ分析と比較した。
【００８５】
連続する顕微鏡画像に基づいて、入口ポート及び出口ポートでの精子カウント及び無作為に選択された精子の運動性を、お互いに、及び予備選別された対照サンプルと、並びに非選別精子と比較した。平均経路速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、及び直線性（ＶＳＬ／ＶＡＰ）などの、精子の運動性を定義する運動パラメータを定量した。ＶＡＰは、観察時間の間に精子がその動きの平均的な方向において移動する距離に沿った速度として定義され、ＶＳＬは、精子の軌跡の最初の位置と最後の位置の間の直線距離に沿った速度として定義される。非運動性精子も観察したが、運動性を示す精子のみを追跡した。
【００８６】
図４を参照すると、出口ポートでの精子の運動性（すなわち、ＶＡＰ及びＶＳＬ）は、非選別精子及び選別後に入口ポートにいる精子の運動性よりも著しく高かった（ｐ＜０．０１；ｎ＝３３〜６６；カッコは、群間でのｐ＜０．０１の統計的有意を示している）。
【００８７】
選別試験の結果は、マイクロ流体チップが最も運動性の高い精子を首尾よく選別することができ、それらの精子は、選別プロセスが完了した後に、例えば、抜き取り器具チップにより、又は入口ポートから媒体をポンプ送流することにより、出口ポートにおいて収集することができるということを示している。さらに、選別後でさえの精子速度の幅広い範囲を前提として、単一チップベースの処理及びモニタリングは、水平構成又は垂直構成のどちらかを用いることにより、最も高品質の運動性精子の分離が可能であり得る。
【実施例３】
【００８８】
精子選別に対するチャネルの向きの効果
精子運動性に対するチャネルの向きの効果を特定するために、水平チャネル方向及び垂直チャネル方向における精子の動きを記録した。チャネルは、７ｍｍの長さ、４ｍｍの幅、及び５０μｍの高さを有していた。当該チャネルを、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを補った新鮮なＨＴＦ媒体で満たした。１μＬの精子サンプルを、上記において説明したように、スイムアップカラムの最上部から採取し、ピペットでチャネルの入口ポートに入れた。レンズレスＣＣＤセンサーを使用して、１秒間あたり１フレームの割合で１５枚の連続する影像を記録した。ＣＣＤセンサーは、チャネル全体を網羅しており、そのため、チャネル内の全ての精子を記録した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ、サンノゼ、ＣＡ）を使用して、運動性精子を識別し追跡した。
【００８９】
垂直構成において精子を撮像するために、マイクロ流体チップをＣＣＤセンサーに固定して、システム全体を９０度回転させた。一度、マイクロ流体チップを垂直に位置すると、撮像の間、システムを垂直方向に維持したまま、同じ雄のドナーマウスからの精子を使用して、上記の調製及び撮像プロセスを繰り返した。
【００９０】
各構成から無作為に選択された１０個の精子に対して運動性分析を実施した。特に、水平方向及び垂直方向の両方での精子の動きを記録し、結果を、それぞれ図５Ａ及び５Ｂに示されているように、運動性ベクトルとしてブルズアイプロットに示した。隣接する同心円の間の距離は１００μｍである。両方の構成において、精子は、動き及び方向のそれらのパターンにおいて著しい多様性を示した。
【００９１】
水平方向及び垂直方向の両方における精子の動きをさらに特徴付けるために、精子の動きの経路を追跡し、移動した距離をＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ＭＤ）を使用して測定した。平均経路速度（ＶＡＰ）、直線速度（ＶＳＬ）、及び直線性（ＶＳＬ／ＶＡＰ）などの、精子の運動性を定義する運動パラメータを定量した。非運動性精子も観察したが、運動性を示す精子のみを追跡した。
【００９２】
表１を参照すると、選択された水平構成からの１０個の精子及び垂直構成からの１０個の精子のそれぞれに対して、ＶＡＰ、ＶＳＬ、及び直線性が定量化されている。表から分かるように、水平構成では、精子細胞Ｈ２及びＨ９が最も高い運動性を示し、垂直構成では、精子細胞Ｖ１及びＶ２が最も高い運動性を示した。
【００９３】
表1.選択された精子の精子運動性パラメータ
【表１】
2014518627.tif 000003
【００９４】
図６Ａ〜６Ｃを参照すると、水平構成及び垂直構成の両方において撮像された精子を、ＶＡＰ、ＶＳＬ（図６Ａ）、直線性（図６Ｂ）、及び加速度（図６Ｃ）について、統計的に分析している。短期間においてモニターされた、受精能を獲得した運動性精子の小さなセットに対して、水平構成及び垂直構成における撮像では、統計的に有意な差（ｐ＞０．０５）は得られず、したがって、どちらの構成においても、実質的に互換的にマイクロ流体チップを使用することができるということが実証された。対照的に、精子の加速度は、水平構成（−５０〜３０μｓ−２）よりも垂直構成（−７５〜９０μｓ−２）の方が幅広い範囲の値に広がる。
【００９５】
この実施例及び下記において説明されるさらなる実施例に対し、ＶＡＰ、ＶＳＬ、及び直線性を、０．０５に設定された統計的有意性（ｐ＜０．０５）による２サンプルのパラメトリックスチューデントのｔ検定を用いて、以下の群の間の差の有意性について統計的に分析した：（ｉ）選別後の入口の精子と出口の精子；（２）３０分間のインキュベーション時間によりマイクロ流体チップによって選別された精子とスイムアップ技術によって選別された精子；及び（３）３０分間のインキュベーション時間によりマイクロ流体チップによって選別された精子と非選別精子。統計的有意性の閾値は、全ての試験に対して０．０５（ｐ＜０．０５）に設定し、データは平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。マイクロ流体チップの選別能力をさらに評価するために、非選別条件（ｎ＝３３）、入口（ｎ＝５９）、及び出口（ｎ＝６６）計測に対して、統計的有意性の閾値を０．０１（ｐ＜０．０１）に設定したＴｕｋｅｙのポストホック多重比較検定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、ＶＡＰ及びＶＳＬも分析した。収集されたデータの正規性について、アンダーソン−ダーリング検定により分析した。
【実施例４】
【００９６】
精子選別に対するインキュベーション時間の効果
マイクロ流体チップを使用した精子選別のためのインキュベーション時間を最適化するために、様々なインキュベーション時間に対して、２０ｍｍ長、４ｍｍ幅、及び５０μｍ高のチャネル全体の精子分布を撮像し分析した。
【００９７】
チャネルを、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する新鮮なＨＴＦ媒体で満たした。出口ポートを、２μＬのＨＴＦ／ＢＳＡ媒体で満たし、蒸発を防ぐために、上に鉱油の薄層を位置した。精子１５００〜４０００個／μＬの密度に希釈された精子サンプル１μＬを、入口ポートからチャネルに導入し、蒸発を防ぐために、無菌胚試験済み鉱油の薄層で当該入口ポートを覆った。当該マイクロ流体チップを、５分間、１５分間、３０分間、及び１時間などの様々なインキュベーション時間において、３７℃のインキュベータに入れた。
【００９８】
インキュベーション後、チャネル内の精子分布を、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ）によって制御された自動ステージによる顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，ＬＬＣ、ソーンウッド、ＮＹ）を使用して撮像した。自動分析及び手動分析を使用して、精子分布を分析した。精子濃度が比較的高い入口付近の領域に対しては、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを使用して精子を自動カウントした。より低い精子濃度の領域（例えば、出口付近など）に対しては、手動によるカウントを使用した。
【００９９】
熱で殺した（６０℃で２０分）精子を用い、５分間及び１時間のインキュベーションの後にチャネル内の精子分布を測定する、対照分布実験も実施した。
【０１００】
チャネル内の観察される精子分布に対する、精子の疲弊時間の影響及び死亡した精子の初期割合の役割を調査するために、各インキュベーション時間に対する実験での精子分布を、対照精子分布及びチャネルにおける精子運動性のおおざっぱなモデルによる予測と比較した。精子の活動的な運動性は、持続性ランダムウォーク（ＰＲＷ）としてモデル化し、死亡した精子は、（上記において説明したように）等方性ランダムウォーク（isotropic random walk）によって模倣したブラウン力によってのみ動くとしてモデル化した。
【０１０１】
図７は、１時間のインキュベーション後の、チャネルに沿った様々な位置での実験での精子分布を示している。実験結果を、以下の様々なパラメータのＰＲＷモデル：（１）ＰＲＷモデル；（２）２５％の精子が初期に死亡したＰＲＷ；（３）３０分の平均インキュベーション時間（±１５分）を含むＰＲＷ；及び（４）インキュベーション時間が３０分でありかつ２５％の精子が初期に死亡したＰＲＷと比較する。誤差バーは、平均±標準誤差を意味する。実験結果は、精子が３０分の平均疲弊時間（インキュベーション時間）を有しかつ精子の２５％が初期に死亡したＰＲＷモデルに最も良く一致している。これらの結果は、実験計測と一致しており、所定の精子サンプルにおいて、当該サンプルは入口ポートに注入する直前に既に精子の２０％が死亡したことを示している。
【０１０２】
図８は、５分間、１５分間、３０分間、及び１時間のインキュベーション期間後のチャネル内における実験での精子分布を示している。各インキュベーション時間に対する、実験での分布を、同じインキュベーション時間でありかつ精子の２５％が初期に死亡したＰＲＷモデルと比較した。誤差バーは、平均±標準誤差を意味する。入口ポートから出口ポートへ向かっての精子分布のシフトが、３０分のインキュベーション内において観察され、これは、インキュベーションの間に精子の一部が入口ポートから出口ポートへ向かって泳いで移動したことを示している。この分布のシフトは、３０分のインキュベーション期間の終了時にピークとなった。より詳細には、チャネル位置７〜２０ｍｍにおける精子の割合は、３０分のインキュベーション期間までは増加し、より長いインキュベーション時間では減少した。チャネル位置１〜３ｍｍにおける精子の分布では、同様であるが逆の傾向が観察された。これらの結果は、精子の疲弊に起因し得る。
【０１０３】
３０分のインキュベーション期間（標準偏差±１５分）に対するシミュレーション結果は、実験結果に対し、最高の一致を示す。
【実施例５】
【０１０４】
精子選別に対するチャネル長の効果
様々な長さのチャネルでの入口ポート及び出口ポートにおける精子の特性を比較することによって、精子選別能力に対するチャネル長の効果を特定した。
【０１０５】
上記の実施例４において説明したように、精子サンプルを調製して、チャネルを満たした。７ｍｍ、１０ｍｍ、１０ｍｍ、及び２０ｍｍのチャネル長を使用した。各チャネル長に対して、３０分及び１時間のインキュベーション時間を適用した。
【０１０６】
図９Ａ〜Ｄ及び表２を参照すると、ＶＡＰ、ＶＳＬ、直線性、並びに３０分又は１時間のインキュベーション時間の後の入口及び出口での運動性精子の割合が、各チャネル長に対して示されている。下記においてより詳細に説明されるように、調査した全てのチャネル長は、選別能力を示したが、精子の運動性（ＶＡＰ、ＶＳＬ、及び直線性）及び運動性精子の割合は、チャネル長の間で変わった。チャネル長の間での統計的有意には、＊のマークが付けられており、入口と出口との間での統計的有意には＃のマークが付けられている。データは、平均±標準誤差（Ｎ＝２２〜１０９）として提示されている。
【０１０７】
表2.異なるチャネル長及びインキュベーション時間に対する、平均経路速度(VAP)、直線速度(VSL)、直線性、及び精子の運動性の割合における、SCMSシステムの入口と出口の間の変化の倍率
【表２】
2014518627.tif 000004
【０１０８】
図９Ａ〜９Ｂ及び表２を詳細に参照すると、３０分のインキュベーション期間において、出口における精子のＶＡＰ及びＶＳＬは、７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ長のチャネルの入口における精子のＶＡＰ及びＶＳＬより、それぞれ、１．９、２．１、３．０、及び２．６倍；並びに１．９、２．３、３．８、及び２．８倍高かった。インキュベーション期間が１時間まで増加すると、出口での精子のＶＡＰ及びＶＳＬは、７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ長のチャネルの入口における精子のＶＡＰ及びＶＳＬより、それぞれ、１．４、１．７、２．０、及び２．１倍；並びに１．３、１．８、２．１、及び２．１倍まで減少した。
【０１０９】
図９Ｃ及び表２を参照すると、３０分のインキュベーション期間の場合の全てのチャネル長に対して、入口及び出口における精子の直線性において有意差が観察された。しかしながら、１時間のインキュベーション期間では、入口及び出口での精子の直線性における有意差は、１５ｍｍのチャネル長の場合にのみ観察され；７ｍｍ、１０ｍｍ、及び２０ｍｍのチャネルでは有意差は認められなかった。これらの結果は、インキュベーション時間が最適のインキュベーション時間（この場合は３０分）を超えて増加した場合、運動性及び直線性の低い精子が短いチャネルの出口に到達する機会がより高くなることを示している。２０ｍｍチャネルの出口での精子の直線性の低下は、疲弊に起因し得る。
【０１１０】
図９Ｄ及び表２を参照すると、３０分のインキュベーション期間及び１時間のインキュベーション期間の両方に対し、全てのチャネル長において、入口及び出口における運動性精子の割合において有意差が認められ、この場合、運動性精子の割合は、総精子数に対する運動性精子の割合として定義した。３０分のインキュベーション期間の場合、出口における運動性精子の割合は、入口における運動性精子の割合より、７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ長のチャネルに対して、それぞれ、１．３、１．６、１．７、及び２．０倍高かった。インキュベーション期間が１時間まで増加すると、出口での運動性精子の割合は、入口での運動性精子の割合より、７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ長のチャネルに対して、それぞれ、１．６、３．１、２．２、及び２．３倍高かった。３０分のインキュベーション期間と比較したときの１時間のインキュベーション期間の場合の出口での運動性精子の割合における増加は、より長いインキュベーション期間の間に、いっそう多くの運動性精子が入口から移動することに起因し得る。
【０１１１】
この実施例及びチャネル長の効果に関連する他の実施例において、疲弊及び精子選別結果に対するチャネル長、幾何学的構造、及び表面パターンの有意性を、Ｔｕｋｅｙのポストホック比較によるノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により検定した。
【実施例６】
【０１１２】
精子選別効率に対するチャネル長の効果
様々なチャネル長を使用して選別した後に精子の運動性及び運動性精子の割合を比較することによって、精子選別効率に対するチャネル長の効果を調査した。
【０１１３】
再び図９Ａ及び９Ｂを参照すると、３０分のインキュベーション期間の場合、１５ｍｍ長のチャネルで選別された精子は、７ｍｍ長のチャネルによって選別された精子（ＶＡＰ：１０７．９±２８．１μｍ／ｓ；ＶＳＬ：９８．３±３０．３μｍ／ｓ）及び１０ｍｍ長のチャネルで選別された精子（ＶＡＰ：１０９．８±２６．９μｍ／ｓ；ＶＳＬ：１００．０±３０．３μｍ／ｓ）より著しく高いＶＡＰ（１３０．０±３１．１μｍ／ｓ）及びＶＳＬ（１２０．６±３１．６μｍ／ｓ）を示した。しかしながら、チャネル長を２０ｍｍまで伸ばしても、精子選別（ＶＡＰ：１２７．２±４１．３μｍ／ｓ；ＶＳＬ：１１３．７±３８．０μｍ／ｓ）において、１５ｍｍ長チャネルによる選別を超えるさらなる向上は見られなかった。これらのデータは、１５ｍｍまでチャネル長を延ばすことによって、運動性精子がチャネル内を、精子速度の差により低運動性精子又は非運動性精子よりも遠くまで移動することができ、その結果として、精子選別が向上することを示した。
【０１１４】
１時間のインキュベーション期間の場合、１５ｍｍ長のチャネル（ＶＳＬ：１０８．５±２７．８μｍ／ｓ）はやはり、７ｍｍ長のチャネル（ＶＳＬ：６７．７±２５．２μｍ／ｓ）又は１０ｍｍ長のチャネル（ＶＳＬ：８８．６±２７．８μｍ／ｓ）よりも良好な選別能力を示した。しかしながら、２０ｍｍ長チャネルによって選別された精子は、７ｍｍ長のチャネルによって選別された精子（ＶＡＰ：７９．６±２３．６μｍ／ｓ）及び１０ｍｍ長のチャネルによって選別された精子（ＶＡＰ：９８．４±２７．１μｍ／ｓ）よりも著しく高いＶＡＰ（ＶＡＰ：１２７．３±２４．１μｍ／ｓ）を示した。
【０１１５】
３０分のインキュベーション期間と１時間のインキュベーション期間との間に、精子速度において有意な向上は認められなかった。
【０１１６】
図９Ｃを参照すると、精子の直線性に対し、３０分のインキュベーション期間では異なるチャネル長の間に有意差は認められなかった。しかしながら、インキュベーション時間が１時間まで長くなると、３０分のインキュベーション時間と比較した場合、短いチャネルで選別された精子（７ｍｍ；ｐ＜０．０５）に対して、直線性において有意な減少が認められたが、より長いチャネル（１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ）で選別された精子に対しては認められなかった。この結果は、十分なインキュベーション時間では運動性の低い精子が短いチャネルの出口に到達することに起因し得る。
【０１１７】
図９Ｄを参照すると、各チャネルの入口及び出口における運動性精子の割合を特定するために、統計的分析を実施している。３０分のインキュベーション期間の場合、異なるチャネル長を用いて選別された精子は、チャネルの入口及び出口における運動性精子の割合において、統計的な差を示さなかった。インキュベーション時間が１時間まで長くなると、７ｍｍ長のチャネルでは、より長いチャネルと比較して、入口及び出口における運動性精子の割合において有意な減少が認められた。１時間のインキュベーション期間の７ｍｍ長のチャネルでは、３０ｍｍのインキュベーション期間での同じチャネルと比較した場合に、運動性精子の割合における減少が認められた。しかしながら、インキュベーション時間を１時間まで延ばしても、より長いチャネルでは、運動性精子の割合に有意な影響は生じなかった。これらの結果は、十分なインキュベーション時間では、非常に低い運動性の精子が、７ｍｍ長のチャネルの出口に到達することに起因し得る。しかしながら、１時間のインキュベーション時間でも、低い運動性の精子がより長いチャネル（例えば、１５ｍｍ又は２０ｍｍチャネル）の出口に到達する可能性は低かった。
【０１１８】
さらに、チャネルに導入された総精子に対する、マイクロ流体チップから収集することができる選別された精子の割合（「収集可能な精子の割合」と呼ぶ）を、３０分のインキュベーション期間において、各チャネル長に対して評価した。特に、チャネルにおける収集可能な精子の割合を、３０分のインキュベーション期間でのチャネル内の精子分布に基づいて算出した。７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ長のチャネルから収集される選別された精子の体積は、出口での媒体（３μＬ）に加え、それぞれ、０．２μＬ、０．６μＬ、１μＬ、及び１μＬであった（これは、チャネルの最後の１ｍｍ、３ｍｍ、５ｍｍ、及び５ｍｍにおける精子サンプルの体積に等しい）。所定の体積において、チャネルに導入された総精子数を、チャネルから収集されるであろう選別された精子で割ることにより、収集可能な精子の割合を算出した。
【０１１９】
図１０に示されているように、出口付近の収集可能な範囲内の精子の割合は、７ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、及び２０ｍｍ長のチャネルに対し、それぞれ、２５．６％、１９．７％、９．４％、及び３．３％であった。これらの結果は、高い運動性を有する精子に加えて、短いチャネルから収集される低い運動性の精子に起因し得る効果として、出口付近の収集可能な範囲内の精子の数は、チャネル長が長くなるに従って減少するということを示していた。データは、Ｎ＝３により平均±標準誤差として提示した。
【０１２０】
上記の結果に基づき、効率的な精子選別を達成するために最適なチャネル長及びインキュベーション時間は、それぞれ、１５ｍｍ及び３０分であると結論付けることができる。
【実施例７】
【０１２１】
マイクロ流体チップ選別と従来のスイムアップ選別との比較
１５ｍｍ長、４ｍｍ幅、及び５０μｍ高さのチャネルを有するマイクロ流体チップにより３０分のインキュベーション期間において選別された精子の特性を、３０分のインキュベーション期間において従来のスイムアップ技術によって選別された精子及び非選別精子のサンプルの特性と比較した。
【０１２２】
１５ｍｍ長のチャネルを使用した精子選別を、上記において説明したのと同様に実施した。
【０１２３】
精子に受精能を獲得させるために精子サンプルを３０分間インキュベーションすることによって、スイムアップ選別用に精子サンプルを調製し、続いて、９０μＬの精子サンプルをピペットでエッペンドルフ管に移し、当該サンプルを精子５０００個／μＬ未満の濃度まで希釈した。懐死組織片不含の上乗せ媒体を作成するために、６０μＬの新鮮なＨＴＦ−ＢＳＡ媒体を精子懸濁液の上に加えた。蒸発を防ぐために、無菌鉱油の薄層を当該ＨＴＦ−ＢＳＡ媒体の上に加えた。エッペンドルフ管を３７℃のインキュベータに入れて、３０分又は１時間インキュベーションした。インキュベーション後、運動性分析のために、当該媒体の最上部から５μＬの精子サンプルを採取した。
【０１２４】
スイムアップ技術を使用して選別された精子を分析するために、精子サンプルを、撮像のためにＰＭＭＡスライド（２４ｍｍ×６０ｍｍ）の上に置き、それによって、スイムアップ技術とマイクロ流体チップ技術との間での精子の運動計測に対する基質の影響を排除した。具体的には、５μＬの精子サンプルを、ＰＭＭＡ基材上に位置された１０μＬのＨＴＦ−ＢＳＡ媒体の小滴に加えた。２枚のＤＳＡフィルム片（３ｍｍ×２５ｍｍ）を、当該ＰＭＭＡ上に置いた。当該精子媒体の小滴にスライドガラス（２５ｍｍ×２５ｍｍ）を被せ、それにより、スライドガラスとＰＭＭＡ基材との間に位置されたＤＳＡフィルムが、精子が自由に動くための空間を作り出した。
【０１２５】
ＰＭＭＡ上の精子サンプルを、顕微鏡下において撮像し、精子の運動性及び運動性精子の割合を特定するために分析した。２５枚の連続する顕微鏡画像（ＴＥ  ２０００；ニコン（Ｎｉｋｏｎ）、日本）を、１０×の対物レンズを使用し、Ｓｐｏｔソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、バージョン４．６）を使用して平均して０．６秒に１フレームの割合で、取得した。
【０１２６】
非選別精子の対照サンプルを調製するためにも、これらのサンプルの調製及び撮像技術を使用した。
【０１２７】
図１１Ａ〜１１Ｄを参照すると、１５ｍｍ長のチャネルでは、結果として、スイムアップ技術によって選別された精子及び非選別精子よりも有意に高い運動性（ＶＳＬ、ＶＳＬ、及び直線性）及び運動性精子の割合を有する選別された精子が得られ、当該マイクロ流体チップが高運動性精子を選別するための効果的な方法であることが実証された。データは、Ｎ＝４〜７での平均±標準誤差として提示した。
【実施例８】
【０１２８】
精子の行路の理論的分析
個々の精子を追跡した後、各精子の平均二乗変位（ＭＳＤ）を計算した。図１２は、ＭＴｒａｃｋＪ  Ｐｌｕｇｉｎを組み込んだＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して得たサンプル精子の軌跡を示している（Meijering、Dzyubachyk、Smal. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology、504巻、第9章、2012年2月、183-200ページ）。
【０１２９】
ｘ−ｙ面における精子の動きのみを考慮し、
〈ｄ２（ｔ）〉＝〈（ｘ（ｔ）−ｘ０）２＋（ｙ（ｔ）−ｙ０）２〉
によりＭＳＤを得、この場合、ｘ（ｔ）及びｙ（ｔ）は座標に対応しており、ｘ０及びｙ０は、各精子の行路の最初の位置である。カッコは、異なる精子の行路の平均を意味する。２０のデータセットに対して平均した時間の関数として、結果として得られるＭＳＤを図１３に示す。短時間では、個々の精子の動きは、弾道的（およそｔ２）であり、長時間では拡散的（およそｔ）である。そのような運動性は、持続的ランダムウォーク（ＰＲＷ）モデルによって説明される。ＰＲＷにおいて、ＭＳＤは、
〈ｄ２（ｔ）〉＝２Ｓ２Ｐ［ｔ−Ｐ（１−ｅ−ｔ／Ｐ）］
によって得られ、この場合、Ｓは、ランダムウォーク対象の速度を意味し、Ｐは持続時間に対応する。短時間の極限、ｔ≪Ｐでは、ＰＲＷモデルにおけるＭＳＤは、
〈ｄ２（ｔ）〉≒Ｓ２ｔ２
となる。長時間の極限、すなわち、ｔ≫Ｐでは、ＭＳＤは、
〈ｄ２（ｔ）〉≒２Ｓ２Ｐｔ
によって得られる。
【０１３０】
拡散係数と同様に、ランダム運動性係数は、
【０１３１】
【数１】
2014518627.tif 000005
によって得られる。
【０１３２】
図１３に示されたＭＳＤデータは、ＰＲＷモデルにおけるＭＳＤのための上記の式で首尾よく近似することができ、速度に対してはＳ≒４２μｍ／ｓ、持続時間に対してはＰ≒１３ｓが得られる。次いで、ランダム運動性係数は、μ≒０．０１１ｍｍ２／ｓが得られる。
【実施例９】
【０１３３】
精子の運動性のシミュレーション
マイクロチャネル中における活動的なマウス精子の動きを、上記において説明したように、持続的ランダムウォーク（ＰＲＷ）としてモデル化した。当該シミュレーションは、二次元に制限し、これはチャネルの厚さ５０μｍに相応する。チャネルの寸法は、実験の設定を模倣して、２０ｍｍ×４ｍｍにした。精子の初期分布を図１２に示す。
【０１３４】
当該モデルにおいて、活動的な精子は、
方向を変えるまで、平均所要時間Ｐにおいて、速度：
【０１３５】
【数２】
2014518627.tif 000006
において所定のランダム方向θ（ｔ）（図１４）に動く。θ（ｔ）は、間隔（０、２π］における一様な分布から選択する。シミュレーション時間ステップが、Δｔ（１ｓを選択）で指示される場合、各時間ステップにおいて精子が新しいθ（ｔ）方向を選択する確率は、Δｔ／Ｐである。これは、方向を変えるまで精子は、平均してＰ／Δｔの時間ステップの間、一定のθ（ｔ）を維持することを意味する。
【０１３６】
当該シミュレーションにおいて、実験での追跡データに対する近似から得られるＳ及びＰ値を使用した（実施例８を参照のこと）。結果として得られる、精子の位置（ｘ，ｙ）に対する運動の式は、
ｘ（ｔ＋Δｔ）＝ｘ（ｔ）＋Ｓｃｏｓθ（ｔ）Δｔ
ｙ（ｔ＋Δｔ）＝ｙ（ｔ）＋Ｓｓｉｎθ（ｔ）Δｔ
である。
【０１３７】
チャネルへの初期注入後に精子が死亡又は疲弊してしまったことによって精子が活動的でない場合、それらの精子は、持続的ランダムウォークを行わない。代わりに、当該精子は、等方性ランダムウォーク（ＲＷ）を行う。これは、持続時間Ｐが時間ステップΔｔに等しいＰＲＷと同等である。換言すれば、当該精子は、時間ステップごとに、新たなランダム方向に固定された距離ｒ０を移動し、これは、周囲の媒体からのブラウン力を模倣している。この場合の拡散係数は、Ｄ＝ｒ０２／（４Δｔ）によって与えられる。この拡散係数は、アインシュタイン−スモルコフスキー式［３９］、すなわち、Ｄ＝ｋＢＴ／ζを用いて評価することができ、この場合、ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔは温度であり、並びにζは摩擦係数である。ζを特定するため、長さ１００μｍ及び半径０．５μｍの硬質円筒体としてマウスの精子をモデル化し、これは、先のモデル及び実験による観察に矛盾しなかった。表面から距離ｈにおける長さＬの円筒体の場合、長軸に沿った摩擦係数は、［４１］：
【０１３８】
【数３】
2014518627.tif 000007
によって与えられ、この場合、ηは、媒体の粘度であり、ｒは円筒体の半径である。チャネル内のＰＢＳ緩衝液を模倣するため、η＝１０−３Ｐａ・ｓを使用し、上記の式においてｈ＝２５μｍを用いて、室温においてζ≒１．４×１０−７ｋｇ／ｓという結果を得た。アインシュタイン−スモルコフスキー式を使用することにより、精子に対する拡散係数Ｄ≒０．０３μｍ２／ｓを得る。このことは、所定の時間ステップにおいて、非活動的な精子は、その方向を変えるまでに約０．３μｍ移動するであろうことを意味している。
【０１３９】
チャネル厚（５０μｍ）は、チャネルの幅及び長さに対して十分に小さいため、当該モデルを二次元に制限した。チャネルの壁に対しては、反射的境界条件を使用しており、すなわち、精子が壁に衝突した場合、精子はそこで止まって新たなランダム方向へと反射する。
【０１４０】
実験では、注入の直後に精子がチャネルの最初の５ｍｍを占領するのが観察された。この効果をシミュレーションにおいて模倣するため、図１５に示され、以下の式：
【０１４１】
【数４】
2014518627.tif 000008
によって与えられるフェミ様分布により、最初に精子をランダムに分布させ、この場合、μは界面の平均位置を意味し、βは初期の精子分布の前部の鋭さを調整するパラメータであり、ＮＴはチャネル内の精子の総数である。これは、
【０１４２】
【数５】
2014518627.tif 000009
と表すことができる。シミュレーションでは、以下の値：μ＝５ｍｍ、β＝１０ｍｍ−１、ＮＴ＝１０５を使用した。
【０１４３】
他の実施形態
本発明をそれらの詳細な説明に関連して説明してきたが、上記の説明は例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることは理解されるべきである。他の態様、利点、及び変更も、以下の特許請求の範囲内である。
【符号の説明】
【０１４４】
１００  運動性細胞の選別及び分析システム
１０２  マイクロ流体チップ
１０６  撮像システム
１０８  光源
１１０  画像センサー
２００  マイクロ流体チャネル
２０２  精子
２０４  ピペット
２０６  入口ポート
２０８  出口ポート
２１０  ベース層
２１２  中間層
２１４  カバー層
３００  精子
３０２  頭部
【図１】
2014518627.tif 000010
【図２Ａ】
2014518627.tif 000011
【図２Ｂ】
2014518627.tif 000012
【図３】
2014518627.tif 000013
【図４】
2014518627.tif 000014
【図５Ａ】
2014518627.tif 000015
【図５Ｂ】
2014518627.tif 000016
【図６Ａ】
2014518627.tif 000017
【図６Ｂ】
2014518627.tif 000018
【図６Ｃ】
2014518627.tif 000019
【図７】
2014518627.tif 000020
【図８】
2014518627.tif 000021
【図９Ａ】
2014518627.tif 000022
【図９Ｂ】
2014518627.tif 000023
【図９Ｃ】
2014518627.tif 000024
【図９Ｄ】
2014518627.tif 000025
【図１０】
2014518627.tif 000026
【図１１Ａ】
2014518627.tif 000027
【図１１Ｂ】
2014518627.tif 000028
【図１１Ｃ】
2014518627.tif 000029
【図１１Ｄ】
2014518627.tif 000030
【図１２】
2014518627.tif 000031
【図１３】
2014518627.tif 000032
【図１４】
2014518627.tif 000033
【図１５】
2014518627.tif 000034
【国際調査報告】
2014518627.tif 000035
2014518627.tif 000036