(57)【要約】  本発明は、インビトロおよび／またはインビボで抗凝固剤の抗凝固効果を中和する、抗原結合領域、抗体、抗原結合性抗体フラグメントおよび抗体模倣物の同定および使用に関する。本発明の抗体および機能的フラグメントならびに抗体模倣物は、治療（解毒）および／または診断目的で、例えばＦＸａ阻害剤などの抗凝固剤の薬理学的効果を特異的に解消するために使用することができる。本発明は、前記分子をコードする核酸配列、それを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書を伴うキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロおよび／またはインビボで抗凝固剤の抗凝固活性を中和する、単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項２】
抗凝固剤に結合する、単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項３】
抗凝固剤に結合し、かつインビトロおよび／またはインビボで該抗凝固剤の抗凝固活性を中和する、単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項４】
抗凝固剤が５０００Ｄａ未満の分子量を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項５】
抗凝固剤が第Ｘａ因子阻害剤またはトロンビン阻害剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項６】
ＦＸａ阻害剤が、式１の基を含む化合物、アピキサバン、ベトリキサバン、ラザキサバン、エドキサバン、オタミキサバンまたはＹＭ−１５０であるか、トロンビン阻害剤がダビガトランである、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項７】
抗凝固剤がリバーロキサバンである、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項８】
抗体配列が表１の抗体の可変重鎖ＣＤＲ配列および可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
配列番号２６３〜２６５によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２６６〜２６８によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
配列番号２５１〜２５３によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２５４〜２５６によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列、または
配列番号２２１〜２２３によって表される可変重鎖ＣＤＲ配列および配列番号２２４〜２２６によって表される可変軽鎖ＣＤＲ配列
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
抗体配列が表１に示す抗体の可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
配列番号４８９によって表される重鎖フラグメント配列および配列番号４９０によって表される軽鎖配列、または
配列番号２１７によって表される可変重鎖配列および配列番号２１８によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号１１７によって表される可変重鎖配列および配列番号１１８によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号２０７によって表される可変重鎖配列および配列番号２０８によって表される可変軽鎖配列、または
配列番号４９３によって表される重鎖フラグメント配列および配列番号４９４によって表される軽鎖配列
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
抗体または抗体模倣物が、結合に関して、請求項８〜１１に記載の抗体または抗原結合性フラグメントと競合する、前記請求項のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項１３】
抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列が、表１に示す少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一であるか、または表１に示す少なくとも１つのＶＨまたはＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である、請求項１２に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列が、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇの少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一であるか、またはＭ１８−Ｇ０８−ＧのＶＨまたはＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、コンセンサス配列である配列番号４９７もしくは配列番号５０２（ＣＤＲ  Ｈ１）、配列番号２２２もしくは配列番号５０３（ＣＤＲ  Ｈ２）、または配列番号４９８もしくは配列番号５０４（ＣＤＲ  Ｈ３）に合致する重鎖ＣＤＲ配列の少なくとも１つ、および／または配列番号４９９もしくは配列番号５０５（ＣＤＲ  Ｌ１）、配列番号５００もしくは配列番号５０６（ＣＤＲ  Ｌ２）、または配列番号５０１もしくは配列番号５０７（ＣＤＲ  Ｌ３）のコンセンサス配列に合致する軽鎖ＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１６】
ａ．抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号４９７（ＣＤＲ  Ｈ１）、配列番号２２２（ＣＤＲ  Ｈ２）および配列番号４９８（ＣＤＲ  Ｈ３）に合致する重鎖ＣＤＲ配列、ならびに配列番号４９９（ＣＤＲ  Ｌ１）、配列番号５００（ＣＤＲ  Ｌ２）および配列番号５０１（ＣＤＲ  Ｌ３）に合致する軽鎖ＣＤＲ配列を含むか、または
ｂ．抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号５０２（ＣＤＲ  Ｈ１）、配列番号５０３（ＣＤＲ  Ｈ２）および配列番号５０４（ＣＤＲ  Ｈ３）に合致する重鎖ＣＤＲ配列、ならびに配列番号５０５（ＣＤＲ  Ｌ１）、配列番号５０６（ＣＤＲ  Ｌ２）および配列番号５０７（ＣＤＲ  Ｌ３）に合致する軽鎖ＣＤＲ配列を含む、
請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１７】
抗体または抗原結合性フラグメントが、表１に示す少なくとも１つのＣＤＲ配列または少なくとも１つの可変重鎖もしくは軽鎖配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１８】
フラグメントがＦａｂフラグメントである、前記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合性フラグメント。
【請求項１９】
抗体またはフラグメントがモノクローナルである、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項２０】
抗体またはフラグメントが、ヒト、ヒト化またはキメラである、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項２１】
請求項１〜２０に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物をコードする単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載のポリヌクレオチド配列または請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
宿主細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が酵母または大腸菌細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２４に記載の宿主細胞を培養し、抗体もしくはフラグメントまたは抗体模倣物を単離することによって、請求項１〜２０に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を生産する方法。
【請求項２７】
請求項１〜２０に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項７〜２０に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を含む医薬組成物。
【請求項２９】
医薬としての請求項１〜２０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項３０】
該抗凝固剤によって誘導された抗凝固状態を正常化するための医薬としての請求項１〜２０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項３１】
該ＦＸａ阻害剤によって誘導された抗凝固状態を正常化するための医薬としての請求項１〜２０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項３２】
式１の基を含む化合物によって誘導された抗凝固状態を正常化するための医薬としての請求項１〜２０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項３３】
リバーロキサバンによって誘導された抗凝固状態を正常化するための医薬としての請求項７〜２０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【請求項３４】
抗凝固剤によって誘導された抗凝固状態を請求項２７に記載の医薬組成物を使って正常化する処置方法。
【請求項３５】
ＦＸａ阻害剤によって誘導された抗凝固状態を請求項２７に記載の医薬組成物を使って正常化する処置方法。
【請求項３６】
式１の基を含む化合物によって誘導された抗凝固状態を請求項２７に記載の医薬組成物を使って正常化する処置方法。
【請求項３７】
リバーロキサバンによって誘導された抗凝固状態を請求項２８に記載の医薬組成物を使って正常化する処置方法。
【請求項３８】
実施例１Ｋまたは実施例１Ｌの化合物。
【請求項３９】
抗体もしくはその抗原フラグメントまたは抗体模倣物を単離または検出するための請求項３８の化合物の使用。
【請求項４０】
請求項３８の化合物および／または請求項１〜２０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む診断キット。
【請求項４１】
インビトロおよび／またはインビボ診断アッセイにおける抗凝固剤の定性的および／または定量的決定のための診断剤としての請求項１〜２０に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固因子の治療的阻害剤と相互作用しそれを中和する、抗原結合領域、抗体、抗原結合性抗体フラグメントおよび抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃ）の同定および使用に関する。
【０００２】
本発明の抗体模倣物、抗体および機能的フラグメントは、治療（解毒）および／または診断目的で、例えばＦＸａ阻害剤などの薬理学的効果を特異的に解消（ｒｅｖｅｒｓｅ）するために使用することができる。本発明は、前記の分子をコードする核酸配列、それを含有するベクター、医薬組成物、および使用説明書を伴うキットも提供する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
抗凝固薬の一般的な制約は、処置に関連する出血リスクと、緊急的状況に陥った場合にその活性を迅速に解消することが充分にはできないことである。新興の抗凝固剤リバーロキサバンは認容性と安全性が立証されている新薬であるが、その効果の迅速な中和（解毒）を可能にする特異的薬剤を利用することができれば、医学的に有利であるだろう。ここに、本発明者らは、ＦＸａ阻害剤、例えばリバーロキサバンによって誘導される抗凝固の迅速な解消（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を可能にし、それによって選択的解毒剤として作用する、新規な特異的抗体、抗原結合性抗体フラグメントおよび抗体模倣物を記載する。
【０００４】
深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）、脳卒中および心筋梗塞などの血栓塞栓性障害は、心血管関連の罹患および死亡の主要原因である。ビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ、例えばワルファリン）、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）のような抗凝固薬による高リスク患者における血栓塞栓症の処置と防止は、何年も前から、幅広く確立された医療介入になっている。しかし、抗凝固薬の一般的な制約は、処置に関連する出血リスクと、緊急的状況に陥った場合にその活性を迅速に解消することが充分にはできないことである。古典的な抗凝固剤の場合は、硫酸プロタミン（ＵＦＨおよびＬＭＷＨ用）やビタミンＫ（ＶＫＡ用）など、いくつかの解毒剤を利用することができる。加えて、組換え第ＶＩＩａ因子または血液製剤も、非特異的な解消剤（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｇｅｎｔ）として考慮することができる。しかし、新興の経口抗凝固剤（例えばリバーロキサバン）のための特異的解毒剤は、利用できるものがなく、臨床開発中でもない。これらの新しい抗凝固剤は今後ますます重要になるだろうし、それら新しい抗凝固剤の一つに特異的な解毒剤を利用することができれば、緊急的状況における医学的利点になるであろう。
【０００５】
ＵＦＨ、ＬＭＷＨおよびＶＫＡのような従来型の抗凝固薬を利用することができるにもかかわらず、予測可能な薬物動態、より良い治療ウィンドウおよび使い勝手のよい適用性を有する改良された治療薬に対する医療ニーズは高い。リバーロキサバンは、血液凝固第Ｘａ因子（ＦＸａ）を直接阻害する新興の経口利用可能な抗凝血剤である（Ｐｅｒｚｂｏｒｎ  Ｅ．ら，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１１，  １０（１）：６１−７）。ＦＸａは、凝固カスケードのキー酵素に相当し、プロトロンビンからのトロンビンの生成により、血餅形成を触媒する。リバーロキサバン（化学名：５−クロロ−Ｎ−［［（５Ｓ）−２−オキソ−３［４−（３−オキソモルホリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル］メチル］チオフェン−２−カルボキサミド）は、４３６ｇ／ｍｏｌの分子量を有し、ＦＸａを、他の生物学的に関連するセリンプロテアーゼより＞１０，０００高い選択性で、用量依存的に阻害する（０．４ｎＭのＫｉ）。これは迅速な作用発現（１．７×１０／Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ）を有し、可逆的に結合する（５×１０−３ｓ−１のｋｏｆｆ）。リバーロキサバンは、プロトロンビナーゼ結合型ＦＸａ（２．１ｎＭのＩＣ５０）および血餅会合型ＦＸａ（７５ｎＭのＩＣ５０）も阻害し、静脈および動脈血栓症に関するさまざまな動物モデルにおいて、用量依存的に抗血栓活性を示す。臨床研究において、リバーロキサバンは好ましい安全性および認容性プロファイルを示し、待機的股関節または膝関節置換術後の成人患者におけるＶＴＥの防止に有効であった。リバーロキサバンは、待機的股関節または膝関節置換術後の成人患者におけるＶＴＥを防止するために、Ｘａｒｅｌｔｏ（登録商標）という商品名で販売されており、今のところ、この適応に関してエノキサパリンより優れた効力を一貫して示している唯一の新しい経口抗凝固剤である。この化合物は、高リスク心房細動患者における脳卒中の防止などといった慢性適応症のためにも開発されている。
【０００６】
リバーロキサバンだけでなく、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、およびＴＡＫ−４４２など、さまざまな臨床開発段階にある経口利用可能な直接ＦＸａ阻害剤が、他にもいくつかある（Ｇａｒｃｉａ，  Ｄ．ら，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；  １１５（１）：１５−２０）。加えて、間接的（アンチトロンビン依存的）非経口ＦＸａ阻害剤である五糖フォンダパリヌクスが、ＶＴＥの防止および処置に関して承認されている。もう一つの新しいクラスの抗凝固剤は、トロンビンの活性部位に結合することによってそのフィブリン相互作用を遮断する直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）である。しかし、これらの薬物は全て、特異的解毒剤が存在しないので、出血リスクと、緊急手術または血管インターベンションに先だって抗凝固を迅速に解消できないこととが、どの抗凝固剤を投与する場合にも、依然として、重大な懸念である。したがって、抗凝固剤と解毒剤との特異的ペアを提供することは、重要な未充足医療ニーズに対処することになるであろう。
【０００７】
リバーロキサバンは、認容性と安全性が立証された薬物であり、比較的短い半減期を有する化合物でもある。しかし、推定される臨床出血状況の重症度によっては、単に投薬を中止するだけでは、その抗凝固効果を解消するには充分でない場合がありうる。特異的解毒剤を利用することができれば、重症出血事象（例えば外傷によって引き起こされるもの）の結果として、または緊急の侵襲的手技（例えば緊急手術）の必要により、抗凝固効果の迅速な中和が必要になる稀な緊急的状況において、有利であるだろう。現在、生命を脅かす出血が起きた場合は、組換え第ＶＩＩ因子の投与を考慮しうるが、限られた非臨床データおよび臨床データしか利用できない（Ｌｅｖｉ，  Ｍ．ら，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１０；３６３（１９）：１７９１−８００）。考慮されるかもしれない非特異的解毒剤は、血液由来（活性化）プロトロンビン複合体濃縮製剤（ａＰＣＣ、ＰＣＣ）または新鮮凍結血漿である。しかし、これらのどの解消戦略も臨床経験がなく、これらの介入は血栓形成促進リスク、感染のリスク、または遅い作用発現などといった医学的問題を引き続き有している点に注意することが重要である（Ｒｏｍｕａｌｄｉら，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  ２０１０；  １６（３１）：３４７８−８２）。
【０００８】
最近、ＦＸａ阻害剤の非選択的解毒剤であるＰＲＴ０６４４４５に関する前臨床データが報告された。この分子は、ＦＸａタンパク質の変異型組換え体に基づき、その本来の凝固促進活性を欠くが、それでもなお、さまざまなタイプのＦＸａ活性部位阻害剤に結合することができ、それによって、それらの抗凝固効果を中和する（ＷＯ  ２００９／０４２９６２  Ａ２）。この化合物は、全ての現行ＦＸａ阻害剤（低分子阻害剤もアンチトロンビン依存性阻害剤も）の抗凝固を解消することが、前臨床相で報告されている。しかし、そのような非選択的解毒剤の短所は、その使用が全てのＦＸａ阻害剤の有効性の欠如につながるだろうということであり、これは、処置される患者の即時抗凝固が必要になった場合に、問題になりうる。そのうえ、内在性ＦＸａタンパク質に対して交差特異的な抗薬物抗体が発生する可能性も排除することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、上述の課題を克服するために、凝固阻害剤に対する理想的解毒剤、例えば式１の構造要素を含有するＦＸａ阻害剤（例えばリバーロキサバン）に対する理想的解毒剤は、高度に特異的であって、必要ならば異なる阻害剤による、または異なる化合物クラスの他の阻害剤による、さらなる後続の処置を可能にするものであるだろう。未結合阻害剤の効率のよい持続的な低減を可能にするために、薬物に対するそのアフィニティは、μＭ域未満にあるべきである。その上、それは迅速な作用発現を有するべきであり、凝固カスケードに対する固有の影響を欠くべきである。加えて、医薬の素速い再取り込みを可能にするには、短い半減期が有利であるだろう。さらにまた、解毒剤は、血栓形成促進リスクまたは感染のリスクなどといった、他の上述した従来からの医学的問題を欠くべきである。
【００１０】
解決策は、抗凝固剤の抗凝固活性を中和する抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物の提供である。
【００１１】
抗体および抗体模倣物は、１０００Ｄａ未満の分子量を有する低分子、いわゆるハプテンに特異的に結合することができると記述されてきた。静脈内投与された、ヒツジポリクローナル血清由来の抗体フラグメント（Ｆａｂ）による低分子化合物の結合および中和は、例えばジゴキシン中毒の処置（ＤｉｇｉＦａｂ、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ヒツジ））、または抗毒素としての使用（ＣｒｏＦａｂ、ガラガラヘビ科（Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）多価免疫Ｆａｂ（ヒツジ））に関して、確立されている。
【００１２】
最近、組換え抗体技術を使ったハプテン特異的抗体の生成も報告された（Ｓｈｅｅｄｙ，  Ｃ．ら，  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｄｖ  ２００７；  ２５：３３３−５２に総説がある）。約１０１０個を上回る異なる抗体分子を含む高度に多様なファージディスプレイライブラリーに基づいて、ｎＭ未満に至るアフィニティを有するハプテン特異的結合剤を、さまざまなクラスの低分子に対して単離することができた（Ｖａｕｇｈａｎら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １９９６；  １４  （３）：３０９−３１４）。それでもやはり、ハプテンは依然として難易度の高いターゲットであり、抗ハプテン抗体のアフィニティは、タンパク質のような高分子量抗原のものより低いことが多い。その理由は、それらが小さくかつ疎水性であり、抗体結合部位（パラトープ）と相互作用できる官能基をわずかしか提供しないことにある。さらにまた、ディスプレイライブラリーからのハプテン特異的抗体の単離も、「バイオパニング」ステップに際してターゲットを固定化するために分子の化学修飾が必要であることが、妨げになる。
【００１３】
ハプテン特異的結合タンパク質の概念は最近、工学的に操作されたリガンド結合タンパク質（いわゆる「抗体模倣物」）にも及んでいることに触れておくべきである。これについては、ジギタリス中毒時のジゴキシン解毒剤として適切な、ジゴキシゲニン結合性の工学的に操作されたリポカリン（アンチカリン）が記載されている（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ  Ｓ．およびＳｋｅｒｒａ  Ａ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ２００５；  １０  （１）：２３−３３）。
【００１４】
ここでは、構造式１を含むＦＸａ阻害剤に対して高いアフィニティで結合する、抗体、その抗原結合性抗体フラグメント、もしくはその変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、または抗体模倣物を提供する。また、これらの化合物の薬理学的効果の解消を目標とする、抗体、抗原結合性抗体フラグメントおよび抗体模倣物に基づく治療法も提供する。また、診断目的での血液試料中のこれらＦＸａ阻害剤の機能的中和を目標とする、抗体、抗原結合性抗体フラグメントおよび抗体模倣物に基づく方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
［概要］
凝固因子の治療的阻害剤を中和し、それゆえに治療目的および／または診断目的でのそれらの抗凝固活性の解消に役立つ、抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、または抗体模倣物を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
式１に記載の構造要素を含有する凝固第Ｘａ因子（ＦＸａ）の治療的阻害剤（例えばリバーロキサバン）に結合し、それゆえに治療目的および／または診断目的でのそれらの抗凝固活性の解消に役立つ、ヒト抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、または抗体模倣物を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１７】
本発明は、他のＦＸａ阻害剤に結合しない、式１の基を含む化合物に特異的な抗体またはそのフラグメントを、抗体ファージディスプレイの方法によって同定することができたという、驚くべき発見に基づいている。したがって、特異的解毒剤として役立つこれらの抗体では、必要であれば、それら他のＦＸａ阻害剤で処置対象の抗凝固を再開することが可能になる。
【００１８】
本発明の第１の態様によれば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用に基づいてリバーロキサバンを表面に固定化することができるようにする、リバーロキサバンの誘導体を合成することが可能であった。リバーロキサバンおよびその誘導体の固定化は、ファージライブラリーからの抗体の選択（ファージパニング）、ならびにＥＬＩＳＡフォーマットでの特異的抗体のスクリーニングおよび分析にとって、必要条件である。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、ＫＤ＜５００ｎＭのアフィニティと、リバーロキサバンで阻害された生化学的ＦＸａアッセイにおいて、ＥＣ５０＜２μＭの半数効果濃度（ＥＣ５０）とを有する、抗体および抗体フラグメントを同定することが可能であった。  
【００２０】
本発明の第３の態様によれば、アピキサバン、エドキサバンまたはラザキサバンのような他のＦＸａ阻害剤とは交差反応しない、式１に記載する構造要素を含有する化合物に特異的な抗体およびその抗体フラグメントを同定することが可能であった。
【００２１】
本発明は、抗凝固剤治療を受けている対象における凝固阻害剤の効果を、有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物をその対象に投与することによって、選択的に中和する治療方法に関する。
【００２２】
本発明の一実施形態は、表１に示す単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントに向けられる。
【００２３】
もう一つの態様では、抗体もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、または抗体模倣物が、血漿中半減期（または循環半減期）を延長する能力を有する薬剤と共投与される。さらにもう一つの態様では、抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、または抗体模倣物が、その血漿中半減期を延長するために、それ自身に、または他の部分にコンジュゲートされる。
【００２４】
抗体、その抗原結合性フラグメント、または抗体模倣物を含有する医薬組成物も提供する。
【００２５】
もう一つの態様において、本発明は、ＦＸａ阻害剤の抗凝固活性の実質的な中和が必要な場合に使用するための、リバーロキサバンと表１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントとを含むキットを提供する。
【００２６】
さらなる一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された原核宿主細胞または真核宿主細胞が提供される。
【００２７】
本発明のこれらの、そして他の、特徴、態様、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲を参照すれば、より良く理解されることになるであろう
【００２８】
本発明の抗体は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であることができ、一方、抗原結合性抗体フラグメントは、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖであることができる。したがって本発明の抗原結合性抗体フラグメントは、本明細書に記載する１つ以上の挙動を示す抗原結合領域であるか、またはそのような抗原結合領域を含有しうる。
【００２９】
本発明は、単離された核酸配列であって、そのそれぞれが、式１の基を含む化合物に特異的である上述の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードすることができるものにも関係する。本発明の核酸は、抗体または抗原結合性抗体フラグメントの組換え生産に適している。したがって本発明は、本発明の核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞にも関係する。
【００３０】
本発明の組成物は、治療的、予防的または診断的応用に使用しうる。それゆえ、本発明には、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、そのための医薬上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物が包含される。関連する一態様では、本発明は、リバーロキサバンの望ましくない存在に関連する状態においてリバーロキサバンを中和する方法を提供する。好ましい一実施形態では、上述の状態が、患者における抗凝固効果の迅速な解消が（例えば緊急の侵襲的手技が必要であるために）要求される状況である。そのような方法は、有効量の、本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書において考慮される医薬組成物を、その必要がある対象に投与するステップを含む。
【００３１】
本発明の抗体、その抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物は、ＦＸａ阻害剤の存在および／または量を決定するための診断方法に使用することができる。
【００３２】
本発明は、抗体ライブラリーを使って、式１によって記述される構造コンポーネントを含有する化合物に特異的に結合する、かかるライブラリーの１つ以上のメンバーを単離するための指示も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は生化学的ＦＸａアッセイにおけるＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴによるリバーロキサバンの機能的中和の結果を示す（実施例４に記載）。リバーロキサバンの中和に関するＦａｂの機能的力価を評価するために、生化学的ＦＸａアッセイを行った。一連の濃度のＦａｂを蛍光原性ＦＸａ基質と予め混合してから、ＦＸａ（０．０５ｎＭ）とリバーロキサバン（０．６ｎＭ、ＩＣ７５）の予混合溶液に加えた。５０分間記録した反応進行曲線を解析したところ、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴによるリバーロキサバン誘導性ＦＸａ阻害の解消に関して、６ｎＭのＥＣ５０が得られた。ｘ軸：ｔ（分）、ｙ軸：相対蛍光単位；点線：緩衝液；黒塗りの三角：第Ｘａ因子対照；黒塗りの四角：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン；菱形：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋０．４６ｎＭ  Ｆａｂバー：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋１．４ｎＭ  Ｆａｂ十字：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋４．１ｎＭ  Ｆａｂ白抜きの丸：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋１２ｎＭ  Ｆａｂ円：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋３７ｎＭ  Ｆａｂ星印：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋１１０ｎＭ  Ｆａｂ白抜きの三角：第Ｘａ因子＋０．６ｎＭリバーロキサバン＋３３０ｎＭ  Ｆａｂ。
【図２】図２は０．５μＭ  Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴへのさまざまな濃度のリバーロキサバンの結合を記述するローゼンタール−スキャッチャードプロットを示す（実施例７に記載）。限外濾過後にＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの存在下でリバーロキサバンの未結合濃度（未結合率（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｕｎｂｏｕｎｄ）＝ｆｕ）を決定することにより、リバーロキサバンに対するＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのＫＤ値を決定することが可能になる。ローゼンタール−スキャッチャードプロットの傾きから約０．４８ｎＭのＫＤ値が算出された。Ｙ軸：（結合率（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｂｏｕｎｄ））／（未結合率）；Ｘ軸：（結合率）×（リバーロキサバンの濃度［μＭ］）。
【図３】図３は０．１μＭリバーロキサバンの非存在下（図３ａ）または存在下（図３ｂ〜ｄ）、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴありまたはなし（０μＭ（図３ｂ）、０．０９μＭ（図３ｃ）および０．７２μＭ（図３ｄ））での、ヒト乏血小板血漿におけるトロンビン生成アッセイからの結果を示す（実施例８に記載）。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴは、ヒト血漿におけるトロンビン生成に対するリバーロキサバンの効果を、濃度依存的に中和すると結論づけることができる。
【図４】図４は０．１μＭ  ＳＡＴＩの非存在下（図４ａ）または存在下（図４ｂ〜ｄ）、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴありまたはなし（０μＭ（図４ｂ）、０．０９μＭ（図４ｃ）および０．７２μＭ（図４ｄ））での、ヒト乏血小板血漿におけるトロンビン生成アッセイからの結果を示す（図８に記載）。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴは、ヒト血漿におけるトロンビン生成に対するＳＡＴＩの効果を、濃度依存的に中和すると結論づけることができる（Ｘ軸：時間［分］；Ｙ軸：トロンビン［ｎＭ］）。
【図５】図５はあらゆるＦＸａ阻害剤の非存在下、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴありまたはなし（０μＭ（図５ａ）、０．０９μＭ（図５ｂ）および０．７２μＭ（図５ｃ））での、ヒト乏血小板血漿におけるトロンビン生成アッセイからの結果を示す（実施例８に記載）。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴそれ自体はヒト血漿におけるトロンビン生成になんの効果も有さないと結論づけることができる（Ｘ軸：時間［分］；Ｙ軸：トロンビン［ｎＭ］）。
【図６】図６は０．０５μＭリバーロキサバンの存在下、一連の濃度のＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴなしまたはあり（０〜１０００ｎＭ）での、血漿に基づくＦＸａアッセイからの結果を示す（実施例９に記載）。一連の濃度のＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴが、ヒト血漿におけるＦＸａに対するリバーロキサバンの阻害効果を強力に解消することを実証することができた。Ｘ軸：Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ［ｎＭ］；Ｙ軸：ＦＸａ活性［％］；黒いバー：対照（リバーロキサバンなし、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴなし）；灰色のバー：Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴなし；チェック模様のバー：一連の濃度［ｎＭ］のＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ、左から右へ：０．０１−０．１−１−１０−１００−１０００。
【図７】図７はそれぞれ０．１７μＭ（白抜きの記号）および０．３３μＭ（黒塗りの記号）のリバーロキサバンの存在下での、ヒト血漿におけるプロトロンビン（ＰＴ）アッセイからの結果を示す（実施例１０に記載）。一連の濃度のＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴがヒト血漿におけるＰＴに対するリバーロキサバンの阻害効果を強力に解消することを実証することができた。（Ｘ軸：Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの濃度［ｌｏｇＭ］；Ｙ軸：プロトロンビン時間［秒］；データは最終アッセイ濃度を５回の実験の平均±ｓｅｍと共に表している）。
【図８】図８はそれぞれ０．４μＭ（白抜きの記号）および０．８μＭ（黒塗りの記号）のリバーロキサバンの存在下での、ラット血漿におけるプロトロンビン（ＰＴ）アッセイからの結果を示す（実施例１０に記載）。一連の濃度のＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴがヒト血漿におけるＰＴに対するリバーロキサバンの阻害効果を強力に解消することを実証することができた。（Ｘ軸：Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの濃度［ｌｏｇＭ］；Ｙ軸：プロトロンビン時間［秒］；データは、データは最終アッセイ濃度を５回の実験の平均±ｓｅｍと共に表している）。
【図９】図９は精製非還元（−）および還元（＋）ＦａｂフラグメントＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。精製は実施例１６において説明する。ＬＣ＝軽鎖、ＨＣ＝重鎖、Ｆａｂ＝インタクトなＦａｂフラグメント、右端のレーンはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ）である。
【図１０】図１０はリバーロキサバンの経口投与（時点０）および１．５時間から２．５時間までの１時間にわたるＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの注入（チェック模様の四角）後に、ラット血漿におけるＰＴをエクスビボでアッセイした、ラットＰＫ／ＰＤ研究の結果を示す（実施例１７に記載）。迅速かつ持続的なＰＴ値の正常化を実証することができた（Ｘ軸：リバーロキサバンの経口投与後の時間（単位：時間）；Ｙ軸：プロトロンビン時間（単位：秒）；データは５匹の平均±ｓｅｍを表している）。黒塗りの四角：媒体対照；白抜きの四角：リバーロキサバン（１．５ｍｇ／ｋｇ）；黒塗りの三角：リバーロキサバン（１．５ｍｇ／ｋｇ）＋Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ（８５ｍｇ／ｋｇ）。
【図１１】図１１は１．５ｍｇ／ｋｇリバーロキサバンの経口投与と、リバーロキサバン投与の１．５時間後から開始して１時間にわたる８５ｍｇ／ｋｇ  Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの注入後の、ラット血漿における未結合リバーロキサバンの濃度／時間プロファイルを示す（実施例１８に記載）。この研究は、意識下のラット（破線）と麻酔下のラット（点線）の両方で行った。対照ラット（麻酔下）では、リバーロキサバンだけを投与した（実線）。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの注入に続いて起こる未結合リバーロキサバンの血漿濃度の迅速な低下が実証されている。いくつかの試料については、未結合リバーロキサバンの濃度を決定することができなかった、なぜなら、それらの値は定量下限（ＬＬＯＱ；灰色の水平方向の線）未満だったからである。Ｘ軸：時間（単位：時間）；Ｙ軸：未結合リバーロキサバンの濃度（単位：μｇ／Ｌ）。
【図１２】図１２は麻酔下のラットにおける、リバーロキサバン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）によって延長された累積尾出血時間に対するＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの効果を示す（実施例１９に記載）。１０７．５ｍｇ／ｋｇの等モル用量のＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴが、リバーロキサバンによって延長された出血時間を、ほとんど正常値まで有意に短縮することを、実証することができた。水平方向のバーは群中央値を示す。ｐ値は、クラスカル・ウォリス検定後のダンの多重比較による。黒塗りの四角：無処置；黒塗りの丸：リバーロキサバン（１ｍｇ／ｋｇ）；白抜きの丸：リバーロキサバン（１ｍｇ／ｋｇ）＋Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ（１０７．５ｍｇ／ｋｇ）；Ｙ軸：累積出血時間（単位：秒）。
【図１３】図１３はスティックで示されたリバーロキサバンと複合体を形成しているＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの模式図を表す（実施例２１に記載）。
【図１４】図１４はＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴとリバーロキサバンの結合および相互作用を表す（実施例２１に記載）。
【図１５】図１５は競合ＥＬＩＳＡの結果を示す（実施例２２に記載）。固定された量のＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴを、さまざまな濃度のリバーロキサバンと共にプレインキュベートし、コーティングされた実施例１Ｋからの化合物へのＦａｂの残存結合量を決定した。Ｘ軸：リバーロキサバンの濃度（単位：μＭ）；Ｙ軸：ＯＤ４０５シグナル。
【図１６】図１６は３μＭアピキサバンの非存在下（図１６ａ）または存在下（図１６ｂ〜ｄ）、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴありまたはなし（０μＭ（図１６ｂ）、１．４３μＭ（図１６ｃ〜ｄ）および０．１μＭリバーロキサバン（図１６ｄ））での、ヒト乏血小板血漿におけるトロンビン生成アッセイからの結果を示す（実施例２３に記載）。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴはアピキサバンの抗凝固効果に影響を及ぼさないことがわかる（Ｘ軸：時間［分］；Ｙ軸：トロンビン［ｎＭ］）。
【図１７】図１７は０．７５μＭダビガトランの非存在下（図１７ａ）または存在下（図１７ｂ〜ｄ）、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴありまたはなし（０μＭ（図１７ｂ）、０．７２μＭ（図１７ｃ〜ｄ）および０．１μＭリバーロキサバン（図１７ｄ））での、ヒト乏血小板血漿におけるトロンビン生成アッセイからの結果を示す（実施例２３に記載）。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴはダビガトランの抗凝固効果に影響を及ぼさないことを見てとることができる（Ｘ軸：時間［分］；Ｙ軸：トロンビン［ｎＭ］）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［発明の詳細な説明］
本発明は、式１の基を含む化合物を含むＦＸａ阻害剤に特異的であるか、またはそのようなＦＸａ阻害剤に対して高いアフィニティを有し、対象に治療上の利益を与えることができる、抗体および抗体フラグメントの発見に基づいている。本発明の抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラでありうる。以下に例を挙げて本発明をさらに例解するが、これらの例は、決して、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００３５】
Ｉ．定義
「ヒト」抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラではなく（例えば「ヒト化」されておらず）、（全体または一部が）非ヒト種に由来するものでもないものと、ここに定義される。ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトに由来するか、または合成ヒト抗体であることができる。「合成ヒト抗体」は、ここでは、既知のヒト抗体配列の解析に基づく合成配列からインシリコで全体または一部が導き出された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えばヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを解析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成することができる。ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントのもう一つの例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリー（例えばそのようなライブラリーはヒト天然源から採取された抗体に基づくものである）から単離された核酸によってコードされるものである。ヒト抗体の例にはＳｏｅｄｅｒｌｉｎｄら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０００，  １８（８）：８５３−８５６に記載の抗体がある。
【００３６】
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合性フラグメントは、ここでは、（ｉ）非ヒト源（例えば異種免疫系を保持するトランスジェニックマウス）に由来し、その抗体がヒト生殖細胞系配列に基づくもの、（ｉｉ）非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子工学によって部分的にヒトアミノ酸配列に交換されているもの、または（ｉｉｉ）可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源のものであると共に、可変ドメインの１つ以上のフレームワークがヒト起源のものであり、かつ定常ドメインが（もしあるなら）ヒト起源のものであるＣＤＲ移植体と定義される。
【００３７】
「キメラ抗体」またはその抗原結合性フラグメントは、ここでは、可変ドメインが非ヒト起源に由来し、一部または全ての定常ドメインがヒト起源に由来するものと定義される。
【００３８】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量に存在するかもしれない予想されうる変異、例えば自然に生じる変異を除けば、同一である。したがって、「モノクローナル」という用語は、別々の抗体の混合物ではないというその抗体の特徴を示している。典型的には異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。「モノクローナル」という用語が、何らかの特定の方法による抗体の生産を要求していると解釈してはならない。モノクローナル抗体という用語は、特にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を包含する。
【００３９】
本明細書において、目的の抗原、例えば低分子ハプテン（ここでは、構造式１を含むＦＸａ阻害剤、例えばリバーロキサバン）「に特異的に結合する」、または「に／に対して特異的である」、または「を特異的に認識する」抗体とは、血漿試料中のそのターゲットを中和するのに治療剤として役立ち、かつ式１に記載の構造コンポーネントを含有するもの以外の他のＦＸａ阻害剤と有意に交差反応しないような形で、その抗原に充分なアフィニティで結合する抗体である。本明細書において、特定のターゲット「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に／に対して特異的である」という用語は、例えば、抗原に対して約１０−４Ｍ未満、あるいは約１０−５Ｍ未満、あるいは約１０−６Ｍ未満、あるいは約１０−７Ｍ未満、あるいは約１０−８Ｍ未満、あるいは約１０−９Ｍ未満、あるいは約１０−１０Ｍ未満、あるいは約１０−１１Ｍ未満、あるいは約１０−１２Ｍ未満、またはそれ以下の一価ＫＤを有する抗体またはその抗原結合性フラグメントによって示すことができる。抗体は、その抗体が、ある抗原と１つ以上の参照抗原とを識別することができるのであれば、そのような抗原「に特異的に結合する」または「に／に対して特異的である」または「を特異的に認識する」。その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に／に対して特異的である」または「を特異的に認識する」とは、例えば以下の方法の一つに従って決定される、目的の抗原と無関係な抗原とを識別する抗体の能力を指している。そのような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンが含まれるが、これらに限るわけではない。例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコア化は標準的な発色（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼを伴う二次抗体およびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）によって行いうる。一定のウェルにおける反応を、例えば４５０ｎｍなどにおける光学密度によってスコア化する。典型的バックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ＯＤでありうる、また、典型的な陽性反応は１ＯＤでありうる。これは、陽性／陰性の差が５倍、１０倍、５０倍、好ましくは１００倍以上であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、およそ３〜５個の無関係な抗原のセット、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどを使って行われる。
【００４０】
「結合アフィニティ」とは、ある分子の単一の結合部位とその結合パートナーの間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の表示がない限り、本明細書にいう「結合アフィニティ」とは、結合ペアのメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合アフィニティを指す。解離定数「ＫＤ」は、ある分子（例えば抗体）とその結合パートナー（例えば抗原）の間のアフィニティ、すなわちリガンドが特定のタンパク質にどれくらい強固に結合するかを記述するために、よく使用されている。リガンド−タンパク質アフィニティは、２つの分子の間の非共有結合的分子間相互作用によって左右される。アフィニティは、本明細書において記述するものなど、当技術分野において知られている一般的な方法によって測定することができる。一実施形態において、本発明の「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、実施例５に従い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。解離平衡定数（ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使ってセンソグラムを一次１：１結合モデルに当てはめることによって得られる会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）の比に基づいて計算した。他の適切なデバイスは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、またはＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６計器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）である。
【００４１】
もう一つの実施形態では、本発明の「ＫＤ」または「ＫＤ値」が、実施例６に従い、制御および解析ソフトウェアを使った等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）（Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ・フライブルク）を使用することによって測定される。溶解状態で結合反応中に放出される熱を経時的にモニタリングし、解析ソフトウェアを使って熱力学的データを解析することで、ＫＤ値を見積もる。実施例６による、制御および解析ソフトウェアを使った等温滴定熱量測定（Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ・フライブルク）。
【００４２】
さらなる一実施形態では、本発明の「ＫＤ」または「ＫＤ値」が、溶解状態にある固定された量の抗体または抗体フラグメントの存在下で、抗原の未結合濃度を測定することによって決定される。ＫＤ値は、実施例７に従い、ローゼンタール−スキャッチャードプロットを使って計算される。この方法では、Ｘ軸が結合リガンドの濃度であり、Ｙ軸が未結合リガンドの濃度で割った結合リガンドの濃度である。ＫＤは傾きの負の逆数に等しいので、ローゼンタール−スキャッチャードプロットからＫＤを見積もることができる。
【００４３】
本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、好ましくは、典型的にはジスルフィド結合によって互いに連結された４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖から構成されるものを指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）と重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、例えば３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含みうる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、その中に散在していて、フレームワーク領域（ＦＲ）呼ばれる、より保存された領域とに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲと最大４つのＦＲとから構成され、それらがアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、例えば次の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００４４】
本明細書において使用する用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基であって、その存在が抗原結合にとって必要なものを指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔが定義した「相補性決定領域」（例えば、おおよそ、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；（Ｋａｂａｔら「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｌｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ  （１９９１）））からのアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（例えば、おおよそ、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：  ９０１−９１７  （１９８７）））からの残基を含みうる。いくつかの例では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲ領域と超可変ループとの両方からのアミノ酸を含むことができる。
【００４５】
インタクトな抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には５つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分割することができる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、［アルファ］、［デルタ］、［イプシロン］、［ガンマ］、および［ミュー］と呼ばれる。クラスの異なる免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元コンフィギュレーションはよく知られている。本明細書にいう抗体は、従来から知られている抗体およびその機能的フラグメントである。
【００４６】
抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」は、ここに、抗原結合領域を保っている抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えばＩｇＧの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つ以上の超可変領域、例えばＣＤＲ１、２、および／または３領域中に見いだされるが、可変「フレームワーク」領域も、例えばＣＤＲに足場を提供することなどによって、抗原結合に重要な役割を果たしうる。「抗原結合領域」は、好ましくは、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４〜１０３と可変重（ＶＨ）鎖の５〜１０９、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３〜１０７とＶＨの４〜１１１を含み、特に好ましいのは完全なＶＬ鎖とＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１〜１０９およびＶＨの１〜１１３；ＷＯ  ９７／０８３２０によるナンバリング）である。
【００４７】
本発明の「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；単一ドメイン抗体（ＤＡｂ）、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成された多重特異性（例えば二重特異性および三重特異性）抗体を包含する（Ｃ．Ａ．Ｋ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編（１９９５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｒ．ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．Ｄｕｅｂｅｌ編（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ））。「多重特異性」抗体または「多機能」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間に存在する分子間ジスルフィド相互作用が最小になるようにまたは完全に除去されるように、工学的に操作することができる。本発明における使用にとって好ましい抗原結合性フラグメントのクラスはＦａｂフラグメントである。
【００４８】
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、多数の健常ボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーに由来しうる。ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）技術を使って、完全にヒトのＣＤＲを新しい抗体分子に組み換える（Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎｇら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０００，  １８：８５３−８５６）。このユニークな組換えプロセスにより、ライブラリーは、ヒト免疫系によって天然に作り出されうる抗体よりもさらに多様な抗体を含有することが可能になる。
【００４９】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意の構造決定基を包含する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子またはそれらの組み合わせの化学的に活性な表面グループからなり、通常は特異的な三次元構造特徴と、特異的な電荷特徴とを有している。２つの抗体は、当業者に周知の方法のいずれかによって、一方の抗体が競合結合アッセイにおいてもう一つの抗体と競合することが示されるのであれば、「同じエピトープに結合する」という。
【００５０】
「単離された」抗体は、同定され、それを発現する細胞のコンポーネントから分離された抗体である。細胞の夾雑コンポーネントは、抗体の診断的または治療的使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含みうる。好ましい実施形態では、抗体が、（１）例えばローリー法、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法、ＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（例えばＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ、ＧＸ  ９０またはＢｉｏｒａｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒデバイスによるもの）などによる決定で、９５重量％を上回る抗体になるまで、さらに好ましい実施形態では９９重量％を上回るまで精製されるか、（２）少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで精製されるか、または（３）還元条件下もしくは非還元条件下に、クーマシーブルーを使用するか、好ましくは銀染色を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドになるまで精製される。単離された天然抗体には、組換え細胞内にインサイチュで抗体を包含する、というのも、その抗体の天然環境のコンポーネントのうち、少なくとも１つは存在しないであろうからである。しかし通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
【００５１】
参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に関して、それぞれ「パーセント（％）配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性が得られるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、それぞれ参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基と同一である候補配列中のそれぞれ核酸残基またはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。保存的置換は配列同一性の一部とはみなされない。好ましいのはギャップなしのアラインメントである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適当なパラメータを決定することができる。
【００５２】
「構造式１を含むＦＸａ阻害剤」は、式１の基を含む化合物によって定義される
【化１】
2014506448.tif 000002
式１
［式中、＊は、化合物の残りの部分への取り付け部位である］。
【００５３】
「構造式２を含むＦＸａ阻害剤」は、式２の基を含む化合物によって定義される
【化２】
2014506448.tif 000003
式２
［式中、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素であり、かつＲ３は水素であるか、
または、
Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は水素であり、かつＲ３はメチルであるか、
または、
Ｒ１は水素であり、Ｒ２はフルオロであり、かつＲ３は水素であり、
ならびに、
＊は、化合物の残りの部分への取り付け部位である］。
【００５４】
凝固阻害剤の活性を「中和する」（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）、「解消する」（ｒｅｖｅｒｓｅ）、「排除する」（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ）もしくは「正常化する」（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）またはそれに類する語句は、該阻害剤の阻害機能または抗凝固機能を阻害または遮断することを指す。これらの語句は、インビトロおよび／またはインビボでの、該阻害剤の機能の部分的阻害または遮断を指すと共に、該阻害剤の活性の大半または全てを阻害または遮断することも指す。好ましい一実施形態では、凝固阻害剤が実質的に中和され、これは、該凝固阻害剤を直接的または間接的に阻害するその能力が、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、低減されることを意味する。
【００５５】
「抗体模倣物」は、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（Ｇｅｂａｕｅｒ  Ｍ．ら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２００９；  １３：２４５−２５５；Ｎｕｔｔａｌｌ  Ｓ．Ｄ．ら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００８；  ８：６０８−６１７に総説がある）およびアプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）（Ｋｅｅｆｅ  ＡＤ．ら，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１０；９：５３７−５５０に総説がある）である。
【００５６】
本発明の抗体
本発明は、インビトロおよび／またはインビボで凝固の治療的阻害剤の抗凝固活性を中和するのに適した抗体およびその機能的フラグメントまたは抗体模倣物の同定および使用に関する。好ましい一実施形態では、インビトロ阻害が、ＰＴ、ａＰＴＴ、トロンビン生成または生化学的アッセイで決定される。好ましい一実施形態では、インビボ阻害が尾出血実験で決定される。
【００５７】
もう一つの実施形態は、凝固の治療的阻害剤に結合する本発明の抗体およびその機能的フラグメントまたは抗体模倣物である。
【００５８】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体およびその機能的フラグメントまたは抗体模倣物が、インビトロおよび／またはインビボで、抗凝固剤に結合し、該抗凝固剤の抗凝固活性を中和する。
【００５９】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体およびその機能的フラグメントまたは抗体模倣物が、インビトロおよび／またはインビボで、抗凝固剤に結合し、該第１抗凝固剤の抗凝固活性を中和し、かつ該第１抗凝固剤ではない別の抗凝固剤を中和しない。
【００６０】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体およびその機能的フラグメントまたは抗体模倣物が、インビトロおよび／またはインビボで、抗凝固剤に特異的に結合し、該第１抗凝固剤の抗凝固活性を特異的に中和し、かつ該第１抗凝固剤ではない別の抗凝固剤を中和しない。
【００６１】
さらなる好ましい一実施形態では、抗凝固剤が低分子、好ましくは５０００Ｄａ未満、２５００Ｄａ未満、より好ましくは１０００Ｄａ未満の分子量を有する低分子である。好ましい抗凝固剤はＦＸａまたはトロンビンの阻害剤である（ダビガトラン（Ｓｏｒｂｅｒａら，  Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ２００５，  ３０（９）：８７７−８８５およびそこで言及されている文献））。
【００６２】
さらなる好ましい一実施形態では、ＦＸａ阻害剤が、式１の基を含む化合物、アピキサバン（ＷＯ２００３／０２６６５２；実施例１８参照）、ベトリキサバン（米国特許第６，３７６，５１５号および同第６，８３５，７３９号参照）、ラザキサバン（ＷＯ１９９８／０５７９５１；実施例３４参照）、エドキサバン（ＵＳ  ２００５  ００２０６４５；実施例１９２参照）、オタミキサバン（Ｇｕｅｒｔｉｎら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００７，  １４，  ２４７１−２７８１およびそこで言及されている文献）またはＹＭ−１５０である。
【００６３】
さらなる好ましい一実施形態では、式１の基を含む化合物が、式２の基を含む化合物である。さらなる好ましい一実施形態では、式２の基を含む化合物が、リバーロキサバン、ＳＡＴＩ（ＷＯ  ２００８／１５５０３２（実施例３８）参照）および実施例１Ｇの化合物である。より一層好ましい一実施形態では、式２の基を含む化合物がリバーロキサバンである。
【００６４】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が、５００ｎＭ未満、好ましくは２５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはより好ましくは２５ｎＭ未満の結合アフィニティ（ＫＤ）を有する。結合アフィニティは、好ましくは、実施例７に記載の方法によって決定される。
【００６５】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が、各抗凝固剤で阻害された生化学的アッセイにおいて、ＥＣ５０＜２μＭ、＜１μＭ、＜０．５μＭ、または好ましくは＜０．０１μＭの半数効果濃度（ＥＣ５０）で、抗凝固剤を中和する。好ましい一実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が、リバーロキサバンで阻害された生化学的ＦＸａアッセイにおいて、抗凝固剤を、ＥＣ５０＜２μＭ、＜１μＭ、＜０．５μＭ、または好ましくは＜０．０１μＭの半数効果濃度（ＥＣ５０）で中和する。
【００６６】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が、抗凝固剤への結合に関して、表１の抗体、好ましくは抗体Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合する。さらなる一実施形態では、上記の競合抗体またはその抗原結合性フラグメントが、リバーロキサバンへの結合に関して、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合する。
【００６７】
さらなる一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、リバーロキサバンへの結合に関して、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合し、ここでは、抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、ａ）軽鎖の９９番目のアミノ酸残基の、リバーロキサバンのクロロチオフェン部分へのπ−スタッキング、ｂ）重鎖の１０４番目のアミノ酸残基の、リバーロキサバンのクロロチオフェン部分への疎水性スタッキング、ｃ）重鎖の５０番目（水素結合ドナーアミノ酸）および１０２番目（１０２番目の場合はポリペプチド鎖のバックボーンアミドを介して）のアミノ酸残基の、リバーロキサバンの中央アミドへの水素結合、ｄ）重鎖の１０２番目の水素結合アクセプターアミノ酸残基の、リバーロキサバンのオキサゾールのカルボニル酸素への水素結合、およびｅ）重鎖の３３番目のアミノ酸残基の、リバーロキサバンのフェニル環へのπ−スタッキングによって媒介される。
【００６８】
もう一つのさらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、リバーロキサバンへの結合に関して、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合し、ここでは、軽鎖の９９番目のアミノ酸残基が、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒからなる群より選択される。もう一つのさらなる実施形態では、重鎖の１０４番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸であって、好ましくは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＰｈｅからなる群より選択される。もう一つのさらなる実施形態では、５０番目のアミノ酸残基が水素結合ドナーアミノ酸残基であり、好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択される。もう一つのさらなる実施形態では、重鎖の１０２番目のアミノ酸残基が水素結合アクセプターアミノ酸であり、好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択される。もう一つのさらなる実施形態では、重鎖の３３番目のアミノ酸残基が、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒからなる群より選択される。
【００６９】
もう一つのさらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、リバーロキサバンへの結合に関して、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合し、ここでは、
軽鎖の９９番目のアミノ酸残基が、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒからなる群より選択され、
重鎖の１０４番目のアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＰｈｅからなる群より選択される疎水性アミノ酸であり、重鎖の１０２番目のアミノ酸残基が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択される水素結合アクセプターアミノ酸である。
【００７０】
もう一つのさらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、リバーロキサバンへの結合に関して、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合し、ここでは、
軽鎖の９９番目のアミノ酸残基がＴｒｐであり、
重鎖の１０２番目のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＡｓｎであり、かつ
重鎖の１０４番目のアミノ酸残基がＬｅｕである。
【００７１】
もう一つのさらなる実施形態では、上記競合抗体または抗原結合性フラグメントが、リバーロキサバンへの結合に関して、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと競合し、３５番目のＡｓｎ、３７番目のＴｙｒ、９０番目のＧｌｎ、９９番目のＴｒｐ、および１０１番目のＰｈｅ（Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ可変軽鎖のアミノ酸位置によるナンバリング）を含む可変軽鎖配列と、３１番目のＳｅｒ、３３番目のＴｒｐ、３５番目のＳｅｒ、４７番目のＴｒｐ、５０番目のＳｅｒ、９９番目のＶａｌ、１００番目のＴｒｐ、１０１番目のＡｒｇ、１０２番目のＡｓｎ、１０３番目のＴｙｒおよび１０４番目のＬｅｕ（Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ可変重鎖のアミノ酸位置によるナンバリング）を含む可変重鎖とを有する。
【００７２】
さらなる一実施形態では、上述の競合抗体が、それぞれＭ１８−Ｇ０８−ＧのＶｈ配列およびＶｌ配列と、少なくとも９０％同一である。
【００７３】
本発明の抗体、抗原結合性抗体フラグメント、ならびに抗体およびフラグメントの変異体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とから構成される。本発明において考えられる抗体または抗原結合性抗体フラグメントの変異体は、抗原に対する抗体または抗原結合性抗体フラグメントの結合活性が維持されている分子である。
【００７４】
この文書では、全体を通して、以下に挙げる本発明の代表的抗体またはその機能的フラグメントについて述べる：Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧおよびＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ。それぞれの配列（配列番号）を表１に示す。
【００７５】
［表１］抗体および各々の配列
【表１−１】
2014506448.tif 000004
【表１−２】
2014506448.tif 000005
【表１−３】
2014506448.tif 000006
【表１−４】
2014506448.tif 000007
【表１−５】
2014506448.tif 000008
【表１−６】
2014506448.tif 000009
【表１−７】
2014506448.tif 000010
【表１−８】
2014506448.tif 000011
【表１−９】
2014506448.tif 000012
【表１−１０】
2014506448.tif 000013
【表１−１１】
2014506448.tif 000014
【００７６】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１に示す少なくとも１つの（好ましくは対応する）ＣＤＲ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一であるか、またはそれぞれ表１に示すＶＨまたはＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一な可変重鎖または軽鎖配列を構成する、重鎖または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００７７】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、それぞれ抗体Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの少なくとも１つの（好ましくは対応する）ＣＤＲ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００７８】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ抗体Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの（好ましくは対応する）重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００７９】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、抗体Ｍ１４−Ｇ０７の重鎖ＣＤＲ２および３配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である重鎖ＣＤＲ２および３配列、ならびに抗体Ｍ１４−Ｇ０７の軽鎖ＣＤＲ１および３配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である軽鎖ＣＤＲ１および３配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、抗体Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの重鎖ＣＤＲ２および３配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である重鎖ＣＤＲ２および３配列、ならびに抗体Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの軽鎖ＣＤＲ１および３配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である軽鎖ＣＤＲ１および３配列を含む。
【００８０】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１または表３に開示する（好ましくは抗体Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの）ＶＨ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である可変重鎖配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表１または表２に開示する（好ましくは抗体Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの）ＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である可変軽鎖配列を含む。
【００８１】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、抗体Ｍ１４−Ｇ０７、Ｍ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−ＧまたはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのそれぞれＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％または９５％同一である可変重鎖および軽鎖配列を含む。
【００８２】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、表４および５に示すＭ１４−Ｇ０７またはＭ１８−Ｇ０８由来の（好ましくは対応する）ＣＤＲコンセンサス配列に合致する重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。さらなる好ましい一実施形態は、コンセンサス配列、配列番号４９７（ＣＤＲ  Ｈ１）、配列番号２２２（ＣＤＲ  Ｈ２）および配列番号４９８（ＣＤＲ  Ｈ３）によって表される対応する重鎖ＣＤＲ配列に合致する重鎖ＣＤＲ配列と、コンセンサス配列、配列番号４９９（ＣＤＲ  Ｌ１）、配列番号５００（ＣＤＲ  Ｌ２）および配列番号５０１（ＣＤＲ  Ｌ３）によって表される対応する軽鎖ＣＤＲ配列に合致する軽鎖ＣＤＲ配列とを含むか、またはコンセンサス配列、配列番号５０２（ＣＤＲ  Ｈ１）、配列番号５０３（ＣＤＲ  Ｈ２）および配列番号５０４（ＣＤＲ  Ｈ３）によって表される対応する重鎖ＣＤＲ配列に合致する重鎖ＣＤＲ配列と、コンセンサス配列、配列番号５０５（ＣＤＲ  Ｌ１）、配列番号５０６（ＣＤＲ  Ｌ２）および配列番号５０７（ＣＤＲ  Ｌ３）によって表される対応する軽鎖ＣＤＲ配列に合致する軽鎖ＣＤＲ配列とを含む、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００８３】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および３に開示する、または好ましくは表１もしくは表２および３に示す抗体の、少なくとも１つの（好ましくは対応する）重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および表３に開示する、または好ましくは表１もしくは表２および表３に示す抗体の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの（好ましくは対応する）重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、抗体または抗原結合性抗体フラグメントは、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、表１または表２および３に示す抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１およびＣＤＲ２と軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３とを含む。さらなる好ましい一実施形態では、抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列、表または表２および３に示す抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および表３に示す抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００８４】
さらなる一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および表３に開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む。さらなる好ましい一実施形態では、抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表１または表２および表３に示すＶＨおよびＶＬ配列を含む。
【００８５】
さらなる一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントが、表９（Ｍ１４−Ｇ０７の変異体）または表１１（Ｍ１８−Ｇ０８の変異体）（これらの表は、その２列目に従って該分子の重鎖および／または軽鎖に導入された、単一および／または二重アミノ酸置換を示している）に開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む。
【００８６】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントがモノクローナルである。さらなる好ましい一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性抗体フラグメントがヒト、ヒト化、またはキメラである。
【００８７】
この文書では、全体を通して、以下に挙げる本発明の好ましい抗体について述べる：「Ｍ１４−Ｇ０７」、「Ｍ１８−Ｇ０８」、「Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ」または「Ｍ１８−Ｇ０８−ＤＫＴＨＴ」または「Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ」。
【００８８】
Ｍ１４−Ｇ０７は、配列番号４７５（ＤＮＡ）／配列番号２０７（タンパク質）に対応する可変重鎖領域と、配列番号４７６（ＤＮＡ）／配列番号２０８（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域とを含む抗体を表す。
【００８９】
Ｍ１８−Ｇ０８は、配列番号４８５（ＤＮＡ）／配列番号２１７（タンパク質）に対応する可変重鎖領域と、配列番号４８６（ＤＮＡ）／配列番号２１８（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域とを含む抗体を表す。
【００９０】
Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇは、配列番号３８５（ＤＮＡ）／配列番号１１７（タンパク質）に対応する可変重鎖領域と、配列番号３８６（ＤＮＡ）／配列番号１１８（タンパク質）に対応する可変軽鎖領域とを含む抗体を表す。
【００９１】
Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴは、配列番号４９１（ＤＮＡ）／配列番号４８９（タンパク質）に対応する重鎖領域と、配列番号４９２（ＤＮＡ）／配列番号４９０（タンパク質）に対応する軽鎖領域とを含む抗体を表す。
【００９２】
Ｍ１８−Ｇ０８−ＤＫＴＨＴは、配列番号４９５（ＤＮＡ）／配列番号４９３（タンパク質）に対応する重鎖領域と、配列番号４９６（ＤＮＡ）／配列番号４９４（タンパク質）に対応する軽鎖領域とを含む抗体を表す。
【００９３】
Ｍ０１８−Ｇ０８−Ｇ−ＩｇＧ１は、配列番号５０８（タンパク質）に対応する重鎖領域と配列番号５０９（タンパク質）に対応する軽鎖領域とを含むＩｇＧ１抗体を表す。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗体、その抗原結合性フラグメント、もしくはその誘導体、または抗体模倣物、またはそれらをコードする核酸が、単離されている。単離された生物学的コンポーネント（例えば核酸分子または抗体などのタンパク質）は、そのコンポーネントが天然に存在している生物の細胞における他の生物学的コンポーネント、例えば他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞小器官から、実質的に分離または精製されたものである。「単離された」核酸およびタンパク質には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  米国コールドスプリングハーバー）および  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓら  １９９４「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ）に記載の標準的な精製法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。
【００９５】
抗体生成
完全ヒトｎ−ＣｏＤｅＲ抗体ファージディスプレイライブラリーを使用し、特別に開発したツールおよび方法を使って、構造式１を含むＦＸａ阻害剤に特異的な高アフィニティヒトモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメントを単離した。これらのツールおよび方法には、特異的ターゲット分子と、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用に基づく、表面へのそれらの固定化が含まれる。ターゲット分子としての構造式１を含むＦＸａ阻害剤の固定化は、ファージライブラリーからの抗体およびその抗原結合性フラグメントの選択（ファージパニング）、ならびにＥＬＩＳＡフォーマットでの特異的抗体のスクリーニングおよび分析にとって、必要条件である。
【００９６】
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、ファージディスプレイ技術（ＰＤＴ）における３つの非従来型アプローチの組み合わせによって開発された。第１に、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用に基づいて表面に固定化することができる構造式１を含むＦＸａ阻害剤を合成した（実施例１Ｋおよび１Ｌ）。第２に、ストレプトアビジンビーズ上に固定化されたターゲット化合物（実施例１Ｋおよび１Ｌ）を、ストリンジェントな条件下での選択に使用した。ビオチンリンカー部分に特異的な結合物質を枯渇させるために、ＦＩＴＣ−ビオチンによるファージライブラリーの事前吸着を含めた。第３に、さまざまなパニングラウンドにおいて得られたファージアウトプットの逐次スクリーニングを見込んだスクリーニング方法を開発した。これら特別な方法の組み合わせにより、ユニークな抗体「Ｍ１６−Ｄ０５」、「Ｍ１４−Ｇ０７」、「Ｍ１５−Ｂ０７」、「Ｍ２５−Ｅ０５」、「Ｍ１８−Ａ１０」、「Ｍ１６−Ａ０３」および「Ｍ１８−Ｇ０８」の単離が可能になった。
【００９７】
これらのユニークな抗体を、ＥＬＩＳＡ試験およびＳＰＲ解析（ＢＩＡｃｏｒｅ）ならびにＦＸａ阻害剤として例えばリバーロキサバンを使用する機能的中和アッセイにおいて、ターゲット分子への結合アフィニティに関して、さらに特徴づけた。
【００９８】
ユニークな抗体「Ｍ１４−Ｇ０７」および「Ｍ１８−Ｇ０８」の変異体を生成させ、アフィニティおよび／またはＦＸａアッセイにおけるリバーロキサバンの効果を解消する機能について、スクリーニングした。一部の実施例で述べるとおり、その結果得られた変異体「Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ」を再クローニングし、非タグ付きＦａｂ「Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ」として発現させ、詳細に特徴づけた。
【００９９】
本発明の抗体およびその機能的抗体フラグメントまたは抗体模倣物を得るための他の例示的方法
上記と類似する方法で、当業者はライブラリースクリーニングによって抗体模倣物を生成させることができる。
【０１００】
本発明の抗体またはその機能的フラグメントを得るには、ディスプレイライブラリーの使用だけでなく、他の方法も使用することができる。例えば、担体タンパク質にカップリングした実施例１Ｋおよび／または実施例１Ｌからの化合物を、非ヒト動物、例えば齧歯類動物において、抗原として使用することができる。一態様では、非ヒト動物が、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを使って、マウス抗体生産を欠くマウス系統を、工学的に作出することが可能である。ハイブリドーマ技術を使って、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生産し、選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら，  １９９４，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎ．  ７：１３−２１；Ｕ．Ｓ．２００３−００７０１８５、ＷＯ  ９６１３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）、およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴｌＵＳ９６１０５９２８（１９９６年４月２９日出願）を参照されたい。
【０１０１】
もう一つの実施形態では、非ヒト動物からモノクローナル抗体を得て、それを修飾（例えばヒト化または免疫原性除去（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ））する。Ｗｉｎｔｅｒは、ヒト化抗体を調製するために使用しうるＣＤＲ移植法を記述している（英国特許出願ＧＢ  ２  １８８６３８Ａ（１９８７年３月２６日出願）；米国特許第５，２２５，５３９号）。あるヒト抗体のＣＤＲの全てを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えてもよいし、ＣＤＲの一部だけを非ヒトＣＤＲで置き換えてもよい。所定の抗原へのヒト化抗体の結合に必要な数のＣＤＲを置き換えるだけでよい。ヒト化抗体は、抗原結合に直接的には関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域からの等価な配列で置き換えることによって、生成させることができる。ヒト化抗体を生成させるための一般的方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉら，  １９８６，  ２５  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、およびＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号に記載されている。これらの方法には、重鎖または軽鎖の少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離すること、操作すること、および発現させることが含まれる。そのような核酸の供給源は数多く利用することができる。例えば核酸は、上述のように、所定のターゲットに対する抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。次に、ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡを、適当な発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１０２】
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ここに提供する具体的ペプチド配列に限定されない。むしろ本発明はこれらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照して、当業者は、本明細書に開示する抗体およびその抗原結合性フラグメントの機能的変異体を調製し、試験し、利用することができるであろうし、抗凝固剤に結合する能力を有する変異体が本発明の範囲に包含されることも理解するであろう。
【０１０３】
変異体には、例えば、本明細書に開示するペプチド配列と比較して改変された相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を少なくとも１つは有している抗体またはその抗原結合性フラグメントを含めることができる。この概念をより良く例解するために、以下に抗体の構造を簡単に説明する。
【０１０４】
抗体は２本のペプチド鎖で構成され、それぞれが１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインと可変領域（ＶＬ、ＶＨ）とを含有し、このうち後者は、いずれも、４つのＦＲ領域と、その間に配置された３つのＣＤＲから構成されている。抗原結合部位は１つ以上のＣＤＲによって形成されているが、ＦＲ領域はＣＤＲに構造的フレームワークを提供しており、それゆえに、抗原結合において重要な役割を果たしている。ＣＤＲまたはＦＲ領域中のアミノ酸残基を１つ以上改変することによって、当業者は、変異したまたは多様化した抗体配列をルーチンに生成させることができ、それらを、例えば新しい性質または改良された性質を求めて、抗原に対してスクリーニングすることができる。
【０１０５】
表２（ＶＬ）および表３（ＶＨ）では、本発明の一定の抗体についてＣＤＲ領域およびＦＲ領域を詳述し、所与の位置におけるアミノ酸を互いに比較すると共に、対応するコンセンサス配列とも比較している。
【０１０６】
［表２］ＶＬ配列
【表２】
2014506448.tif 000015
［表３］ＶＨ配列
【表３−１】
2014506448.tif 000016
【表３−２】
2014506448.tif 000017
［表４］Ｍ１４−Ｇ０７誘導体のコンセンサスＣＤＲ配列
【表４】
2014506448.tif 000018
［表５］Ｍ１８−Ｇ０８誘導体のコンセンサスＣＤＲ配列
【表５】
2014506448.tif 000019
【０１０７】
本発明のさらなる好ましい一実施形態は、ＣＤＲ配列が表１に示すように選択された抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【０１０８】
本発明のさらなる好ましい一実施形態は、ＶＨおよびＶＬ配列が表１に示すように選択された抗体または抗原結合性フラグメントである。当業者は、表１、２および３のデータを使って、本発明の範囲に含まれるペプチド変異体を設計することができる。変異体は１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変化させることによって構築することが好ましく、変異体は改変されたフレームワーク領域も１つ以上有しているかもしれない。改変は、フレームワーク領域にも加えうる。例えば、ペプチドＦＲドメインが改変されていて、生殖細胞系配列と比較して残基に変動があるかもしれない。
【０１０９】
さらにまた、変異体は、ある抗体を、抗体中の１つ以上のアミノ酸残基（好ましくは１つ以上のＣＤＲ中のアミノ酸残基）を多様化することによる最適化のための出発点として使用し、結果として生じた一群の抗体変異体を、改良された性質を伴う変異体を求めてスクリーニングすることによって取得してもよい。特に好ましいのは、ＶＬおよび／またはＶＨのＣＤＲ３中の１つ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、トリヌクレオチド変異誘発（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＴＲＩＭ）技術（Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ  Ｂ．ら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９４，  ２２：  ５６００）を使って一群のＤＮＡ分子を合成することによって行うことができる。抗体またはその抗原結合性フラグメントには、例えば限定するわけではないが半減期の改変につながる修飾（例えばＦｃ部分の修飾またはＰＥＧなどのさらなる分子の取り付け）などといった修飾／変異を伴う分子が含まれる。
【０１１０】
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載する抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考えれば、当業者には、いくつかの合理的な置換がわかるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
【０１１１】
例えば（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；（ｄ）陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、（ａ）〜（ｄ）のグループ内で行うことができる。加えて、グリシンおよびプロリンは、αヘリックスを破壊するその能力に基づいて、互いに置換することができる。また、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなどといった一定のアミノ酸は、αヘリックス中に見いだされることの方が多く、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、βプリーツシート中に見いだされることの方が多い。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンはターン中によく見いだされる。いくつかの好ましい置換は、次に挙げるグループ内で行うことができる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。既知の遺伝暗号、組換え技法および合成ＤＮＡ技法を考慮すれば、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１１２】
本明細書において、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列相同性」は、同一であるか保存的アミノ酸置換に相当するアミノ酸のパーセンテージを示す。
【０１１３】
本発明のＤＮＡ分子
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡ分子にも関係する。これらの配列には、表１に示すＤＮＡ分子が含まれるが、それらに限るわけではない。
【０１１４】
本発明のＤＮＡ分子は本明細書に開示する配列に限定されるわけではなく、その変異体も包含する。本発明内のＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるその物理的性質に言及することによって記述することができる。ＤＮＡを使用することで、その相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と（ＤＮＡは二本鎖であることから）その等価物またはホモログとを、核酸ハイブリダイゼーション技法を使って同定できることは、当業者にはわかるであろう。ハイブリダイゼーションが１００％未満の相補性で起こりうることもわかるであろう。しかし、条件を適当に選択すれば、ハイブリダイゼーション技法を使用し、特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて、ＤＮＡ配列を区別することができる。そのような条件に関する指針については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９（前掲書）およびＡｕｓｕｂｅｌら，  １９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．，  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．Ｄ．，  Ｓｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ａ．およびＳｔｒｕｈｌ，  Ｋ．編  （１９９５）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ニューヨーク：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
【０１１５】
２つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、それら２つの配列が互いにハイブリダイズするであろう条件の「ストリンジェンシー」の関数として表現することができる。本明細書において使用する用語「ストリンジェンシー」は、その条件がハイブリダイゼーションを嫌う度合を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く嫌い、そのような条件下では、構造的に最も近縁な分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェント条件は、より低度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションにとって有利になる。それゆえに、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。次の関係は、ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに役立つ（式中、Ｔｍは核酸二重鎖の融解温度である）：
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃低下する。
ｃ．（Ｔｍ）μ２  −（Ｔｍ）μ１＝１８．５  ｌｏｇ１０μ２／μ１
式中、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、総ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在などといった数多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階と「洗浄」段階の二段階で行われる。
【０１１７】
まず最初に、結合段階では、ハイブリダイゼーションに有利な条件下で、プローブをターゲットに結合させる。この段階では、通常、温度を変えることによって、ストリンジェンシーが制御される。高ストリンジェンシーの場合、短い（＜２０ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブを使用するのでない限り、温度は通常、６５℃〜７０℃である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１００μｇの非特異的キャリアＤＮＡを含む。Ａｕｓｕｂｅｌら，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．９，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２７  （１９９４）参照。異なるバッファー条件であるが機能的には等価なものも、もちろん、数多く知られている。関連性の程度が低い場合は、低い温度を選びうる。低ストリンジェンシー結合温度は約２５℃〜４０℃である。中ストリンジェンシーは少なくとも約４０℃〜約６５℃未満である。高ストリンジェンシーは少なくとも約６５℃である。
【０１１８】
次に、過剰のプローブを洗浄によって除去する。通常は、この段階において、よりストリンジェントな条件が適用される。したがって、ハイブリダイゼーションによって関連性を決定する際に最も重要なのは、この「洗浄」段階である。洗浄溶液は、典型的には、より低い塩濃度を含有する。例示的な中ストリンジェンシー溶液の一つは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する。高ストリンジェンシー洗浄溶液は、（イオン強度で）約０．２×ＳＳＣ未満に相当するものを含有し、好ましいストリンジェント溶液は約０．１×ＳＳＣを含有する。さまざまなストリンジェンシーに関連する温度は「結合」に関して上に述べたものと同じである。また、洗浄溶液は、典型的には、洗浄中に何度か交換される。例えば、典型的な高ストリンジェンシー洗浄条件は、５５℃で３０分間、２回洗浄すること、および６０℃で１５分間、３回洗浄することを含む。
【０１１９】
本発明の一実施形態は、（ｉ）本発明の抗体または抗原結合性フラグメント、表１に示すＣＤＲ配列をコードするか、または（ｉｉ）表１に示す可変軽鎖および重鎖配列をコードするか、または（ｉｉｉ）本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメント、表１に示すＣＤＲ配列、または表１に示す可変軽鎖および重鎖配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸配列である。
【０１２０】
機能的に等価な変異体
本発明の範囲に含まれるさらにもう一種類のＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物を基準にして記述することができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重ゆえに、それらが表１に見いだされるものと同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
【０１２１】
ここで提供されるＤＮＡ分子の変異体をいくつかの異なる方法で構築できることはわかる。例えば、それらは、完全な合成ＤＮＡとして構築することができる。２０〜約１５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを効率よく合成する方法は、幅広く利用することができる。Ａｕｓｕｂｅｌら，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１１，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１  （１９９３）参照。Ｋｈｏｒａｎａら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７２：２０９−２１７  （１９７１）によって初めて報告された方法で、オーバーラップしたオリゴヌクレオチドを合成し、アセンブルすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲書）のＳｅｃｔｉｏｎ  ８．２も参照されたい。好ましくは、適当なベクターへのクローニングが容易になるように、遺伝子の５’端および３’端に工学的に作出された便利な制限部位を伴う合成ＤＮＡが設計される。
【０１２２】
記載のとおり、変異体を生成させる一方法は、本明細書に開示するＤＮＡの一つから出発し、次に、部位特異的変異誘発を行うことである。Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲書）のｃｈａｐｔｅｒ  ８，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３７  （１９９７）参照。典型的な一方法では、ターゲットＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ媒体中にクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主中に導入する。その結果生じる子孫の一部は所望のミュータントを含有し、そのことは、ＤＮＡ配列決定を使って確認することができるであろう。加えて、子孫ファージが所望のミュータントになる確率を増加させるさまざまな方法を利用することができる。これらの方法は当業者にはよく知られており、そのようなミュータントを生成させるためのキットが市販されている。
【０１２３】
組換えＤＮＡコンストラクトおよび発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の１つ以上を含む組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用され、そこに本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡ分子が挿入される。
【０１２４】
ここで提供される抗体、その抗原結合部分または誘導体は、宿主細胞における軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、その抗原結合部分または誘導体を組換え的に発現させるために、軽鎖および／もしくは重鎖またはその一部をコードするＤＮＡフラグメントを保因する１つ以上の組換え発現ベクターを、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現するように、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。標準的な組換えＤＮＡ法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー  （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９８９）およびＢｏｓｓらによる米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法などを使って、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製かつ／または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクター中に組込み、そのベクターを宿主細胞中に導入する。
【０１２５】
加えて、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、例えば、完全長抗体鎖もしくはＦａｂフラグメントをコードする核酸配列に転換するか、ｓｃＦｖに転換することができる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、もう一つのＤＮＡフラグメント（例えば抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーをコードするもの）に（２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームになるように）作動的に連結することができる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野では知られており（例えばＫａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら  （１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、米国保険社会福祉省、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【０１２６】
ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＬ領域とＶＨ領域とがフレキシブルなリンカーで接合されている連続した単鎖タンパク質としてＶＨ配列およびＶＬ配列を発現させることができるように、ＶＨコード核酸とＶＬコード核酸とを、フレキシブルなリンカーをコードするもう一つのフラグメントと作動的に連結することができる（例えばＢｉｒｄら  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：５５２−５５４参照）。
【０１２７】
抗体、その抗原結合部分または誘導体を発現させるには、標準的な組換えＤＮＡ発現法を使用することができる（例えばＧｏｅｄｄｅｌ「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ  （１９９０）参照）。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次にそれを適切な宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡとを、別々のベクターに挿入する。他の実施形態では、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡとを、同じベクターに挿入する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるか誘導性であるかなどといった因子によって左右されることはいうまでもない。
【０１２８】
細菌発現
細菌用の有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターに対して作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅に備えて、１つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のさまざまな種が含まれる。
【０１２９】
細菌ベクターは、例えばバクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースであることができる。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の要素を含有する市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含有することができる。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを、適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制解除／誘導し、細胞をさらにある期間培養する。細胞を典型的には遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果得られた粗抽出物を、さらなる精製のためにとっておく。
【０１３０】
細菌系では、発現させるタンパク質の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを、有利に選択しうる。例えば、抗体を生成させるために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、そのようなタンパク質を大量に生産しようとする場合は、例えば、精製が容易な融合タンパク質産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましいであろう。本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物には、天然精製産物、化学合成的手法の生成物、ならびに例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌などを含む原核宿主や、シュードモナス属、ストレプトマイセス属およびスタフィロコッカス属のさまざまな種から（好ましくは大腸菌細胞から）組換え技法によって生産された産物が含まれる。
【０１３１】
哺乳類発現および精製
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばＳｔｉｎｓｋｉによるＵ．Ｓ．５，１６８，０６２、ＢｅｌｌらによるＵ．Ｓ．４，５１０，２４５、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによるＵ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる（例えばＡｘｅｌらによるＵ．Ｓ．４，３９９，２１６、４，６３４，６６５およびＵ．Ｓ．５，１７９，０１７を参照されたい）。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与する。
【０１３２】
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクションまたはポリカチオンによるトランスフェクションなどといった標準的技法を使って行うことができる。
【０１３３】
ここで提供される抗体、その抗原結合部分もしくは誘導体、または抗体模倣物を発現させるのに適した哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ  （１９８２）  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質が、宿主細胞を成長させている培養培地中に分泌されるように、発現ベクターが設計される。抗体の一過性トランスフェクション／発現は、例えばＤｕｒｏｃｈｅｒら  （２００２）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ  ３０  ｅ９によるプロトコールに従って達成することができる。抗体の安定トランスフェクション／発現は、例えばＵＣＯＥ系のプロトコール（Ｔ．  Ｂｅｎｔｏｎら  （２００２）  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３８：４３−４６）に従って達成することができる。
【０１３４】
抗体、その抗原結合部分または誘導体は、標準的なタンパク質精製法を使って、培養培地から回収することができる。
【０１３５】
本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物は、例えば限定するわけではないが、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどといった周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用することができる。例えばＣｏｌｌｉｇａｎ「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク）（１９９７−２００１）の例えばＣｈａｐｔｅｒ  １、４、６、８、９、１０を参照されたい（これらは、それぞれ引用により、全て本明細書に組み込まれる）。
【０１３６】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントには、天然精製産物、化学合成的手法の生成物、ならびに例えば酵母（例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ））、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主（好ましくは哺乳動物細胞）から組換え技法によって生産された産物が含まれる。組換え生産手法に使用する宿主に依存して、本発明の抗体はグリコシル化体であることも、非グリコシル化体であることもでき、グリコシル化体は好ましい。そのような方法は、多くの標準的実験マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（前掲書）のＳｅｃｔｉｏｎ  １７．３７〜１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ（前掲書）のＣｈａｐｔｅｒ  １０、１２、１３、１６、１８および２０などに記載されている。
【０１３７】
治療法
治療法は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物の治療有効量を、処置を必要とする対象に投与することを伴う。「治療有効」量とは、ここに、単回投与として、または複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、血漿中の式１の構造を含むＦＸａ阻害剤を中和するのに十分な量であって、有害な状態の軽減につながるが、毒物学的には認容されうるような、抗体または抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物の量と定義される。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物は、既知の医薬と共投与されるかもしれないし、場合によっては、抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物そのものが修飾されるかもしれない。例えば、解毒剤の血漿中半減期を増加させるために、抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、リポソームおよびカプセル化剤、リン脂質膜またはナノ粒子にコンジュゲートまたは付加することができるだろう。
【０１３８】
本発明は、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤による抗凝固剤治療を受けている対象における該抗凝固剤の抗凝固効果を、その対象に有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を投与することによって、選択的に中和する治療方法に関する。本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物は、待機的状況または緊急的状況において、該ＦＸａ阻害剤の抗凝固性を安全かつ特異的に中和してほぼ正常化した凝固状態をもたらすために使用することができると考えられる。そのような待機的状況または緊急的状況は、例えば重症出血事象（例えば外傷によって引き起こされるもの）または緊急の侵襲的手技（例えば緊急手術）の必要など、正常化した凝固が好ましい状況である。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、血行動態パラメータに固有の効果を有さない。好ましい一実施形態では、ＦＸａ阻害剤がリバーロキサバンである。
【０１３９】
対象は、ヒトまたは非ヒト動物（例えばウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類）であることができる。
【０１４０】
一実施形態では、過量の、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の投与後に、本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が投与される。
【０１４１】
もう一つの実施形態では、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤で処置された対象を、増加した出血リスクに曝しうる手術に先だって、本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が投与される。
【０１４２】
さらにもう一つの実施形態では、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤が凝固に及ぼす効果を中和するために本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物で処置された対象を、本解毒剤によって結合されないＦＸａ阻害剤を投与することにより、迅速に再び抗凝固処置することができる。
【０１４３】
有効量の本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を、対象に投与することが考えられる。
【０１４４】
もう一つの実施形態では、本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物が、抗血栓および／または抗線維素溶解活性を有する凝固剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、血液凝固剤が、凝固因子、凝固因子に関連するポリペプチド、組換え凝固因子およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。もう一つの実施形態では、血液凝固剤を、吸着性化学薬品、止血剤、トロンビン、フィブリン糊、デスモプレシン、寒冷沈降物および新鮮凍結血漿、凝固因子濃縮物、活性化または非活性化プロトロンビン複合体濃縮物、ＦＥＩＢＡ、血小板濃縮物およびそれらの組み合わせからなる群より選択しうる。利用可能な血液凝固因子のさらなる例は、引例Ｂｒｏｏｋｅｒ  Ｍ「Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ」第８版，  Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ，  ２００８に見いだすことができる。
【０１４５】
上述の障害はヒトにおいて詳しく特徴づけられているが、哺乳動物を含む他の動物にも、類似する病因と共に存在し、本発明の医薬組成物を投与することによって処置することができる。
【０１４６】
上記の障害のいずれを処置するためにも、本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使って従来の方法で製剤化することができる。本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、任意の適切な手段（これは、処置される障害のタイプに応じてさまざまでありうる）によって、投与することができる。考えうる投与経路には、非経口（例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下）、肺内および鼻腔内が含まれ、局所免疫抑制処置にとって望ましい場合には、病変内投与も含まれる。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば抗体または抗原結合性フラグメントの用量を減らしていく、パルス注入によって投与されるかもしれない。好ましくは、投薬は、一つには、投与が短期間であるか、長期間であるかに依存して、注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。投与すべき量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物が投与されるかどうかなどといったさまざまな因子に依存するであろう。投与の経路が処置すべき障害または状態に依存してさまざまであるだろうことは、当業者にはわかるであろう。
【０１４７】
本発明のポリペプチドもしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物の治療有効量の決定は、主として、特定の患者特性、投与経路、および処置される障害の性質に依存するであろう。一般的指針は、例えば医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の刊行物および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」のｃｈａｐｔｅｒ  ２７および２８，  ４８４〜５２８ページ（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、ペンシルバニア州イーストン：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  １９９０）に見いだすことができる。より具体的には、治療有効量の決定は、その医薬の毒性および効力などといった因子に依存するであろう。毒性は、上記参考文献に見いだされる当技術分野において周知の方法を使って決定することができる。効力は、同じ手引きを、下記の実施例で述べる方法と合わせて利用することによって、決定することができる。
【０１４８】
診断方法
本発明のもう一つの態様は、被験者の変化した凝固状態が、該被験者の血液における式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の存在によるのかどうかを決定するためのインビトロ診断方法であり、この方法では、（ａ）インビトロ凝固試験を本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの存在下で行い、（ｂ）インビトロ凝固試験を本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの非存在下で行い、（ｃ）ステップ（ａ）と（ｂ）で行った試験の結果を比較し、（ｄ）ステップ（ａ）からの結果とステップ（ｂ）からの結果が異なるのであれば、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の存在に起因する変化した凝固状態と診断する。好ましいインビトロ凝固試験はＰＴ、ａＰＴＴまたはトロンビン生成試験である。診断および治療における後続のステップを計画するために、とりわけ緊急的状況においては、この情報を迅速に入手できることが、極めて重要な場合がある。例えばループス抗凝固因子の存在下では、検査室試験において延長された凝固時間（例えばＰＴＴ）を観察することができ、この場合は、リン脂質および細胞膜と会合しているタンパク質に対する自己抗体が、正常な凝固プロセスを妨害している。しかし、インビボのループス抗凝固因子は実際には血栓形成促進剤である、というのも、これは、血小板膜リン脂質と相互作用し、血小板の接着および凝集を増加させることによって、血栓の形成を早めるからである。上述の診断試験は、他のアッセイと組み合わせることで、ループス抗凝固因子を検出するのに役立ちうる。
【０１４９】
本発明のもう一つの態様は、機能的に活性な本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物の量を、該分子で処置された被験者の血液において、捕捉試薬として実施例１Ｋおよび／または１Ｌからの化合物を使って決定するためのインビトロ診断方法である。例えばＥＬＩＳＡアッセイでは、実施例１Ｋおよび／または１Ｌからの化合物をストレプトアビジンコートウェルに固定化し、本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物を含有する試料を加えることができる。洗浄ステップに続いて、捕捉された該分子を検出抗体で検出することができ、結果を、既知量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物による検量線と比較することによって、試料中の物質量を計算することができる。
【０１５０】
本発明のもう一つの態様は、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤で処置された被験者の体液における該阻害剤の量を、実施例１Ｋおよび／または１Ｌからの化合物と、ＥＬＩＳＡ試験用の捕捉試薬としての本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物とを使って決定するためのインビトロ診断方法である。結合している、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の量は、標識抗イディオタイプ抗体（本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物へのその結合が、該阻害剤の存在下ではブロックされるもの）の添加によって生成させることができるシグナルから見積もることができる。
【０１５１】
本発明のもう一つの態様は、式１の構造を含むＦＸａ阻害剤で処置された被験者の体液における該阻害剤の量を、競合結合アッセイにおいて実施例１Ｋおよび／または１Ｌからの化合物と本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物とを使って決定するためのインビトロ診断方法である。さらに詳しく述べると、該阻害剤で処置された被験者からの体液、例えば血漿を、固定された量の本発明の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物と共にプレインキュベートすることができる。次に、固定化した実施例１Ｋおよび／または１Ｌからの化合物への本発明の抗体の残存結合量を、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどで評価することができる。試料中の該阻害剤の量は、結果を、既知量の阻害剤による検量線と比較することによって計算することができる。
【０１５２】
好ましい一実施形態では、体液が、例えば尿、血液、血漿、血清および唾液である。もう一つの好ましい実施形態では、体液が血液である。
【０１５３】
本発明のもう一つの実施形態は、マトリックスに係留された抗凝固剤と、該抗凝固剤に結合する本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントとを含む診断キットである。係留は、リンカー、例えばビオチンリンカーによるものであることができる。マトリックスは固体マトリックス、例えばマイクロタイタープレートであることができる。上記診断キットの好ましい一実施形態では、抗凝固剤がリバーロキサバンである。上記診断キットのさらなる好ましい一実施形態では、係留された抗凝固剤が、実施例１Ｋの化合物または実施例１Ｌの化合物である。さらなる好ましい一実施形態では、抗体がＭ１８−Ｇ０８、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ、もしくはＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨ、またはその抗原結合性フラグメントである。最も好ましいキットは、抗体Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴまたはその抗原結合性フラグメントと、実施例１Ｋの化合物とを含む。さらなる一実施形態では、試料中の抗凝固剤（ここでは抗凝固剤がキットの抗凝固剤に対応する）を定量的および／または定性的に決定するための診断方法であって、（ａ）上記キットの抗体またはその抗原結合性フラグメントの混合物を、抗凝固剤への抗体の結合を可能にする条件下で形成させるステップ、（ｂ）該混合物を、上記キットの係留された抗凝固剤と、抗凝固剤への抗体の結合を可能にする条件下で接触させるステップ、（ｃ）係留された抗凝固剤に結合している抗体または抗原結合性フラグメントの量を決定するステップを含む方法において、上記の診断キットが使用される。試料中の該抗凝固剤の量は、結果を、既知量の該抗凝固剤による検量線と比較することによって計算することができる。好ましい一実施形態では、試料が体液である。より好ましいのは、尿、血液、血漿、血清および唾液からなる液体の群に含まれる体液である。好ましい一実施形態では、上記診断方法がリバーロキサバンを決定するための方法である。好ましくは、本方法では、抗体Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴまたはその抗原結合性フラグメントと、実施例１Ｋの化合物とを含むキットを使用する。そのような診断方法の例は、実施例２２に示す競合ＥＬＩＳＡフォーマット法である。
【０１５４】
医薬組成物および投与
本発明は、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントを単独で、または少なくとも１つの他の薬剤、例えば安定化化合物と組み合わせて含むことができ、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった（ただしこれらに限るわけではない）任意の滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができる医薬組成物にも関係する。これらの分子はいずれも、単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、賦形剤または医薬上許容される担体と混合された医薬組成物の形で、患者に投与することができる。本発明の一実施形態では、医薬上許容される担体が医薬的に不活性である。
【０１５５】
本発明は医薬組成物の投与にも関係する。そのような投与は、経口的または非経口的に行われる。非経口送達の方法には、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。これらの医薬組成物は、活性成分に加えて、活性化合物を医薬的に使用することができる調製物へと加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む適切な医薬上許容される担体を含有しうる。製剤および投与のための技法に関するさらなる詳細は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（編、Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見いだすことができる。
【０１５６】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野において周知の医薬上許容される担体を使って、経口投与に適した投薬量で、製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、製剤化することを可能にする。
【０１５７】
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物を固形賦形剤と混和し、場合によっては、得られた混合物を粉砕し、所望であれば適切な助剤を添加した後に、錠剤または糖衣丸の核が得られるように顆粒の混合物を加工することによって、得ることができる。適切な賦形剤は、糖質またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
【０１５８】
糖衣丸の核には、濃厚糖溶液などの適切なコーティングが施され、このコーティング溶液も、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴づけるために、錠剤または糖衣丸のコーティングには、染料または顔料を加えてもよい。
【０１５９】
経口的に使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィット式（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作られた密封軟カプセル剤が含まれる。プッシュフィット式カプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、そして場合によっては安定化剤と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性化合物を適切な液体、例えば安定化剤を含む、または安定化剤を含まない、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁することができる。
【０１６０】
非経口投与用の医薬製剤には活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の医薬組成物を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理学的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁剤として調製することもできる。適切な親油性の溶剤または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。所望により、懸濁液は、適切な安定化剤、または高濃度溶液の調製が可能になるように化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有してよい。
【０１６１】
局所または経鼻投与のためには、浸透すべき特定の障壁に適した浸透剤を、製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野では広く知られている。
【０１６２】
キット
本発明はさらに、上記の本発明の組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。そのような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒトへの投与用の製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知を、添付することができる。
【０１６３】
もう一つの実施形態において、キットは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含有してもよい。これらの抗体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、宿主細胞へのトランスフェクションと宿主細胞による発現に適したプラスミドに入れて提供される。プラスミドは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を調節するために、プロモーター（多くの場合、誘導性プロモーター）を含有しうる。プラスミドは、プラスミド中に他のＤＮＡ配列を挿入してさまざまな抗体を生産することが容易になるように、適当な制限部位も含有しうる。プラスミドは、コードされているタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするために、数多くの他の要素も含有しうる。そのような要素は、当業者にはよく知られており、例えば選択可能マーカー、開始コドン、終止コドンなどが含まれる。
【０１６４】
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、当技術分野において知られている方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
【０１６５】
医薬組成物は塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの酸（ただしこれらに限るわけではない）を使って形成させることができる。塩は、水性溶媒または他のプロトン性溶媒に、対応する遊離塩基型よりも溶解しやすい傾向を示す。別の例では、好ましい調製物が、使用前にバッファーと混合される、ｐＨ範囲が４．５〜５．５の１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトール中の凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１６６】
許容される担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を調製したら、それらを適当な容器に入れて、適応する状態の処置に関するラベリングをすることができる。本発明の抗体および抗原結合性フラグメントの投与に関して、そのようなラベリングには、投与の量、頻度および方法が含まれるであろう。
【０１６７】
治療有効量
本発明における使用に適した医薬組成物には、活性成分が、意図する目的、すなわち式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の中和を達成するのに有効な量で含有されている組成物が含まれる。有効量の決定は当業者の能力で十分に可能である。
【０１６８】
どの化合物についても、まず最初はインビトロ凝固試験（例えばＰＴ）において、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルを使って望ましい濃度範囲および投与経路も実現される。次に、そのような情報を、ヒトにおける投与にとって有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
【０１６９】
治療有効量は、症状または状態を改善する、抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物の量を指す。そのような化合物の治療効力および毒性は、インビトロで、または実験動物において、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）などといった、標準的な医薬的手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果の間の用量比が治療係数であり、これは比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。大きな治療係数を呈する医薬組成物は好ましい。インビトロアッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用のための投薬量範囲を策定する際に使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み毒性はほとんどまたは全くないような循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形、患者の感度、および投与経路に応じてこの範囲内で変動する。
【０１７０】
本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは抗体模倣物は、対象の血漿中に存在する式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の効果を中和することが必要な時に、１回または数回投与することができる。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、単回投与で投与すれば、充分である。
【０１７１】
厳密な投薬量は、処置すべき患者を考慮して個々の医師が選択する。投薬量および投与は、十分なレベルの活性部分が提供されるように、または所望の効果が維持されるように、調節される。考慮することができる他の因子には、対象に投与された式１の構造を含むＦＸａ阻害剤の実体および／または量、抗体またはその抗原結合性フラグメントの製剤および／または投与様式；患者の年齢、体重および性別；食餌、投与の時間および頻度、併用薬、反応感度、および治療に対する認容性／応答が含まれる。
【０１７２】
通常の投薬量は、投与経路に応じて、合計用量で０．１ミリグラムから１００，０００ミリグラムまで変動しうる。特定の投薬量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；または同第５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は、ポリヌクレオチド用には、タンパク質用またはそれらの阻害剤用とは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的であるだろう。放射標識抗体の場合、好ましい比放射能は、０．１ｍＣｉ／ｍｇタンパク質から１０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質までに及びうる（Ｒｉｖａら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：３２７５−３２８０，  １９９９；Ｕｌａｎｅｒら，  ２００８  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４６（３）：８９５−９０２）。
【０１７３】
以下に実施例を挙げて、本発明を、さらに詳しく説明する。これらの実施例は、具体的な実施形態を参照して本発明を例証するために提供されるにすぎない。これらの実例は、本発明の一定の具体的態様を例解するものではあるが、限定を表すものではなく、ここに開示する発明の範囲を定めようとするものでもない。
【０１７４】
全ての実施例は、別段の説明が詳細になされている部分を除き、当業者にとっては周知かつ定型的な標準的技法使って行われた。下記実施例の定型的な分子生物学技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  コールドスプリングハーバー，  ニューヨーク，  １９８９などの標準的実験マニュアルに記載されているとおりに行うことができる。
【実施例】
【０１７５】
Ａ）実施例
略号：
ａｑ．：水溶液
ｃａｔ．：触媒
ｄ：日
ＤＣＩ：直接化学イオン化（ＭＳにおいて）
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ：Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド・ＨＣｌ
ＥＩ：電子衝撃イオン化（ＭＳにおいて）
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化（ＭＳにおいて）
Ｅｔ：エチル
ＧＣ−ＭＳ：ガスクロマトグラフィー連動質量分析
ｈ：時間
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−オール水和物
ＨＰＬＣ：高圧高性能液体クロマトグラフィー
ｃｏｎｃ．：濃
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー連動質量分析
Ｍｅｔｈ．：方法
ｍｉｎ：分
ＭＳ：質量分析
ＮＭＲ：核磁気共鳴分光法
Ｒｔ：保持時間（ＨＰＬＣにおいて）
ＲＴ：室温
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
【０１７６】
ＬＣ−ＭＳ法：
方法１Ａ：計器：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱｕａｔｔｒｏＰｒｅｍｉｅｒ／Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ａｃｑｕｉｔｙ；カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  １．９μ  ５０ｍｍ×１ｍｍ；移動相Ａ：１リットルの水＋０．５ｍｌの濃度５０％のギ酸、移動相Ｂ：１リットルのアセトニトリル＋０．５ｍｌの濃度５０％のギ酸；勾配：０．０分  ９０％Ａ→０．１分  ９０％Ａ→１．５分  １０％Ａ→２．２分  １０％Ａ；流速：０．３３ｍｌ／分；オーブン：５０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１７７】
方法２Ａ：計器：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ  ＭＳとＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００；カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  ３μ  ２０ｍｍ×４ｍｍ；移動相Ａ：１リットルの水＋０．５ｍｌの濃度５０％のギ酸、移動相Ｂ：１リットルのアセトニトリル＋０．５ｍｌの濃度５０％のギ酸；勾配：０．０分  １００％Ａ→３．０分  １０％Ａ→４．０分  １０％Ａ→４．０１分  １００％Ａ（流速２．５ｍｌ／分）→５．００分  １００％Ａ；オーブン：５０℃；流速：２ｍｌ／分；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１７８】
方法３Ａ：計器：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＳＱＤ  ＵＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μ  ５０ｍｍ×１ｍｍ；移動相Ａ：１リットルの水＋０．２５ｍｌの濃度９９％のギ酸、移動相Ｂ：１リットルのアセトニトリル＋０．２５ｍｌの濃度９９％のギ酸；勾配：０．０分  ９０％Ａ→１．２分  ５％Ａ→２．０分  ５％Ａ；オーブン：５０℃；流速：０．４０ｍｌ／分；ＵＶ検出：２１０〜４００ｎｍ。
【０１７９】
方法４Ａ：計器：Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱとＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００；ＵＶ  ＤＡＤ；カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  ３μ  ２０ｍｍ×４ｍｍ；移動相Ａ：１リットルの水＋０．５ｍｌの濃度５０％のギ酸、移動相Ｂ：１リットルのアセトニトリル＋０．５ｍｌの濃度５０％のギ酸；勾配：０．０分  １００％Ａ→３．０分  １０％Ａ→４．０分  １０％Ａ；オーブン：５５℃；流速：２ｍｌ／分；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１８０】
エナンチオマーの分取のための分離：
方法１Ｂ：相：球状ビニルシリカゲル結合型メタクリル−Ｌ−ロイシン−ｔｅｒｔ−ブチルアミド、６７０ｍｍ×４０ｍｍ；移動相：酢酸エチル；流速：８０ｍｌ／分、ＵＶ検出：２６５ｎｍ。
【０１８１】
方法２Ｂ：相：球状ビニルシリカゲル結合型メタクリル−Ｌ−ロイシン−ジシクロプロピルメチルアミド、６７０ｍｍ×４０ｍｍ；移動相Ａ：酢酸エチル、移動相Ｂ：メタノール；勾配：０．０分  １００％Ａ→１０．１分  １００％Ａ→１３．１分  １００％Ｂ→１３．１１分  １００％Ａ→２１．０分  １００％Ａ；流速：８０ｍｌ／分、ＵＶ検出：２６５ｎｍ。
【０１８２】
エナンチオマーの分析のための分離：
方法１Ｃ：相：球状ビニルシリカゲル結合型メタクリル−Ｌ−ロイシン−ジシクロプロピルメチルアミド、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；移動相：酢酸エチル；流速：２ｍｌ／分、ＵＶ検出：２６５ｎｍ。
【０１８３】
出発物質
実施例１Ａ
Ｎ−（｛（５Ｓ）−３−［４−（２−アリル−３−オキソモルホリン−４−イル）フェニル］−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−５−クロロチオフェン−２−カルボキサミド［ジアステレオマーの混合物］
【化３】
2014506448.tif 000020
１０．９ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）の５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソ−４−モルホリニル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−２−チオフェンカルボキサミド（ＷＯ  ０１／０４７９１９に記載）を２５０ｍｌのＴＨＦに溶解し、６２．５ｍｌ（１０．５ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）の１Ｎリチウムヘキサメチルジシラジド−ＴＨＦ溶液を、−７８℃でゆっくり加えた。３０分後に、２．４ｍｌ（４．４ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）の３−ヨード−２−プロペンを滴下した。反応混合物を室温まで温まらせ、この温度で１６時間撹拌した。次に飽和塩化アンモニウム水溶液と酢酸エチルとを加えた。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（移動相：勾配、酢酸エチル／ジクロロメタン  ２：１→酢酸エチル）により精製した。収量：５．８ｇ（理論値の４９％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．９７分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４７６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１８４】
実施例１Ｂ
Ｎ−（｛（５Ｓ）−３−［４−（２−アリル−３−オキソモルホリン−４−イル）フェニル］−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−５−クロロチオフェン−２−カルボキサミド［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー２］
【化４】
2014506448.tif 000021
実施例１Ａからの化合物５．７ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）の異性体を、方法１Ｂに従って分離することにより、２．５ｇの実施例１Ｂ（２番目に溶出する化合物）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．９５分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４７６［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＨＰＬＣ（方法１Ｃ）：Ｒｔ＝４．１５分。
【０１８５】
実施例１Ｃ
５−クロロ−Ｎ−｛［（５Ｓ）−３−｛４−［２−（３−ヒドロキシプロピル）−３−オキソモルホリン−４−イル］フェニル｝−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル］メチル｝チオフェン−２−カルボキサミド［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー］
【化５】
2014506448.tif 000022
実施例１Ｂからの化合物２．５ｇ（５．２５ｍｍｏｌ）を３５ｍｌのＴＨＦに溶解し、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンの０．５Ｍ  ＴＨＦ溶液２３．１ｍｌ（１．４１ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を１０〜１５℃で加えた。反応混合物を室温まで温まらせ、この温度で１．５時間撹拌した。１３．１ｍｌ（１．０５ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）の２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を０〜５℃で滴下した。次に、過酸化水素の３６％溶液４．６ｍｌを、バス温度が３０℃を超えないように滴下した。３０分後に酢酸エチルと水を加えた。有機相を分離した。水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を亜硫酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を３０〜３５℃で酢酸エチルと混合し、濾過し、酢酸エチルで洗浄した。残渣を減圧下で乾燥し、粗生成物を、これ以上精製することなく、さらに反応させた。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．８２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４９４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１８６】
実施例１Ｄ
４−［３−（４−｛４−［（５Ｓ）−５−（｛［（５−クロロ−２−チエニル）カルボニル］アミノ｝メチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−フェニル｝−３−オキソモルホリン−２−イル）プロポキシ］−４−オキソブタン酸［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー］
【化６】
2014506448.tif 000023
実施例１Ｃからの化合物３００ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）、１８２ｍｇ（１．８２ｍｍｏｌ）の無水コハク酸、０．２３ｍｌ（２２６ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）のピリジンおよび２２３ｍｇ（１．８２ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを、２ｍｌのＤＭＦに加えて溶解した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を分取用ＨＰＬＣで精製した。収量：１３４ｍｇ（理論値の３７％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法１Ａ）：Ｒｔ＝０．９８分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５９４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１８７】
実施例１Ｅ
ｔｅｒｔ−ブチル−（５−｛［６−（｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝−アミノ）ヘキサノイル］アミノ｝ペンチル）カルバメート
【化７】
2014506448.tif 000024
３０ｍｌのＤＭＦに懸濁した５００ｍｇ（１．４０ｍｍｏｌ）のＮ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロン酸、２８３ｍｇ（１．４０ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル−（５−アミノペンチル）カルバメート、３２１ｍｇ（２．１０ｍｍｏｌ）のＨＯＢＴ、０．２４ｍｌ（１８１ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよび３２２ｍｇ（１．６８ｍｍｏｌ）のＥＤＣを室温で１６時間撹拌した。次に、さらに２９１ｍｇ（１．４４ｍｌ）のｔｅｒｔ−ブチル−（５−アミノペンチル）カルバメートを追加し、その混合物を室温でさらに１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水および酢酸エチルならびに少量のジオキサンを加えた。水相を酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を分取用ＨＰＬＣで精製した。収量：１００ｍｇ（理論値の１３％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法４Ａ）：Ｒｔ＝１．７１分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５４２  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１８８】
実施例１Ｆ
Ｎ−（５−アミノペンチル）−６−（｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］−ペンタノイル｝アミノ）ヘキサンアミド塩酸塩
【化８】
2014506448.tif 000025
実施例１Ｅからの化合物１００ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を２ｍｌのメタノールに溶解し、２ｍｌのクロロメタンと２ｍｌ（２．０ｍｍｏｌ）の１Ｎ塩酸−ジエチルエーテル溶液とを加えた。その混合物を室温で１６時間撹拌し、減圧下で濃縮し、乾燥した。収量：９０ｍｇ（理論値の９８％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．４６分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４４２  ［Ｍ＋Ｈ−ＨＣｌ］＋。
【０１８９】
実施例１Ｇ
Ｎ−（｛（５Ｓ）−３−［４−（２−アリル−３−オキソモルホリン−４−イル）−２−フルオロフェニル］−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−５−クロロチオフェン−２−カルボキサミド［ジアステレオマーの混合物］
【化９】
2014506448.tif 000026
１０．０ｇ（２２．０ｍｍｏｌ）の５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−３−［２−フルオロ−４−（３−オキソモルホリン−４−イル）フェニル］−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド（ＷＯ  ２００８／１５５０３４に記載）を２２０ｍｌのＴＨＦに溶解し、２６．４ｍｌ（４．４２ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）の１Ｎリチウムヘキサメチルジシラジド−ＴＨＦ溶を−７８℃でゆっくり加えた。３０分後に、２．１２ｍｌ（３．８９ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）の３−ヨード−２−プロペンを滴下した。反応混合物を室温までゆっくり温まらせ、この温度で１６時間撹拌した。次に、飽和塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルを加えた。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。収量：３．８ｇ（理論値の３５％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．９６分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４９４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１９０】
実施例１Ｈ
Ｎ−（｛（５Ｓ）−３−［４−（２−アリル−３−オキソモルホリン−４−イル）−２−フルオロフェニル］−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−５−クロロチオフェン−２−カルボキサミド［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー１］
【化１０】
2014506448.tif 000027
実施例１Ｇからの化合物２．９０ｇ（５．８７ｍｍｏｌ）の異性体を方法２Ｂに従って分離することにより、１．４０ｇの実施例１Ｈ（最初に溶出する化合物）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法２Ａ）：Ｒｔ＝２．０２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４９４  ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＨＰＬＣ（方法１Ｃ）：Ｒｔ＝２．５４分。
【０１９１】
実施例１Ｉ
５−クロロ−Ｎ−｛［（５Ｓ）−３−｛２−フルオロ−４−［２−（３−ヒドロキシプロピル）−３−オキソモルホリン−４−イル］フェニル｝−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル］メチル｝チオフェン−２−カルボキサミド［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー］
【化１１】
2014506448.tif 000028
実施例１Ｈからの化合物１．４０ｇ（２．８３ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＴＨＦに溶解し、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンの０．５Ｍ  ＴＨＦ溶液１２．５ｍｌ（０．７６ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）を１０〜１５℃で加えた。反応混合物を室温まで温まらせ、この温度で１．５時間撹拌した。７．１ｍｌ（０．５７ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）の２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を０〜５℃で滴下した。次に、過酸化水素の３５％溶液２．５ｍｌを、バス温度が３０℃を超えないように、滴下した。３０分後に、酢酸エチルおよび水を加えた。有機相を分離した。水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を亜硫酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を３０〜３５℃で酢酸エチルと混合し、濾過し、酢酸エチルで洗浄した。残渣を減圧下で乾燥し、粗生成物を、これ以上精製することなく、さらに反応させた。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．８３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５１２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１９２】
実施例１Ｊ
｛４−［（５Ｓ）−５−（｛［（５−クロロ−２−チエニル）カルボニル］アミノ｝メチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−３−フルオロ−フェニル｝−３−オキソモルホリン−２−イル）プロポキシ］−４−オキソブタン酸［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー］
【化１２】
2014506448.tif 000029
実施例１Ｉからの化合物３００ｍｇ（０．５９ｍｍｏｌ）、１７６ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ）の無水コハク酸、２２３μｌ（２１８ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）のピリジンおよび２１５ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−４−ジメチルアミノピリジンを１ｍｌのＤＭＦに加えて溶解させた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を分取用ＨＰＬＣで精製した。収量：１３２ｍｇ（理論値の３７％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法１Ａ）：Ｒｔ＝０．９９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６１２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１９３】
実施例（Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｅｘａｍｐｌｅ）
実施例１Ｋ
３−（４−｛４−［（５Ｓ）−５−（｛［（５−クロロ−２−チエニル）カルボニル］アミノ｝メチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−フェニル｝−３−オキソモルホリン−２−イル）プロピル−４−オキソ−４−［（５−｛［６−（｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝アミノ）ヘキサノイル］アミノ｝ペンチル）アミノ］ブタノエート
［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー］
【化１３】
2014506448.tif 000030
実施例１Ｆからの化合物２４ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）と実施例１Ｄからの化合物３０ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解してから、２６μｌ（１９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよび２９ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵを加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で濃縮し、分取用ＨＰＬＣで精製した。収量：９ｍｇ（理論値の１８％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法３Ａ）：Ｒｔ＝０．８１分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝１０１７［Ｍ＋Ｈ］＋。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝９．０５−８．９０（ｍ，１Ｈ），７．８６−７．７６（ｍ，１Ｈ），７．７２−７．６６（ｍ，３Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．１９（ｄ，１Ｈ），６．４７−６．２８（ｍ，１Ｈ），４．９０−４．７７（ｍ，１Ｈ），４．３６−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．２５−３．９９（ｍ，６Ｈ），３．９５−３．７９（ｍ，３Ｈ），３．６５−３．５２（ｍ，３Ｈ），３．１４−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．０３−２．９６（ｍ，６Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ），２．３９−２．２８（ｍ，２Ｈ），２．０８−１．９８（ｍ，３Ｈ），１．９４−１．８６（ｍ，１Ｈ），１．８２−１．５５（ｍ，４Ｈ），１．５４−１．４２（ｍ，５Ｈ），１．４１−１．１７（ｍ，１５Ｈ）。
【０１９４】
実施例１Ｌ
３−（４−｛４−［（５Ｓ）−５−（｛［（５−クロロ−２−チエニル）カルボニル］アミノ｝メチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−３−フルオロフェニル｝−３−オキソモルホリン−２−イル）プロピル−４−オキソ−４−［（５−｛［６−（｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝アミノ）ヘキサノイル］アミノ｝ペンチル）アミノ］ブタノエート［エナンチオマー的に純粋なジアステレオマー］
【化１４】
2014506448.tif 000031
実施例１Ｆからの化合物２４ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）および実施例１Ｊからの化合物３１ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解してから、２６μｌ（１９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよび２９ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵを加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で濃縮し、分取用ＨＰＬＣで精製した。収量：４０ｍｇ（理論値の７３％）。
ＬＣ−ＭＳ（方法１Ａ）：Ｒｔ＝０．９８分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝１０３５［Ｍ＋Ｈ］＋；
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝９．００−８．９６（ｍ，１Ｈ），７．８１（ｔ，１Ｈ），７．７５−７．６３（ｍ，３Ｈ），７．５８−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｄｄ，１Ｈ），７．２１（ｄ，１Ｈ），６．４６−６．３１（ｍ，２Ｈ），４．９３−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．３６−４．２７（ｍ，１Ｈ），４．２７−４．１８（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．０５（ｍ，３Ｈ），４．０５−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．８４（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｄｄ，１Ｈ），３．６８−３．５５（ｍ，４Ｈ），３．１５−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．０２−２．９９（ｍ，６Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ），２．３８−２．２６（ｍ，２Ｈ），２．１０−１．９８（ｍ，４Ｈ），１．９６−１．５５（ｍ，４Ｈ），１．４９−１．４２（ｍ，４Ｈ），１．４１−１．３０（ｍ，６Ｈ），１．２６−１．１２（ｍ，４Ｈ）。
【０１９５】
構造および名称
リバーロキサバン
５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソ−４−モルホリニル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝−メチル）−２−チオフェンカルボキサミド
ＷＯ  ０１／０４７９１９（実施例４４）に記載されている。
【化１５】
2014506448.tif 000032
【０１９６】
ＳＡＴＩ
５−クロロ−Ｎ−｛［（５Ｓ）−３−｛４−［３−｛２−［（ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシシクロヘキシル）アミノ］エチル｝−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３，５−ジメチルフェニル｝−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−５−イル］メチル｝−チオフェン−２−カルボキサミド
ＷＯ  ２００８／１５５０３２（実施例３８）のＳＡＴＩに記載されている。
【化１６】
2014506448.tif 000033
【０１９７】
実施例２：ｎ−ＣｏＤｅＲライブラリーからの抗体生成
ファージ選択：
式１の基を含むＦＸａ阻害剤に対するヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントの単離は、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（スウェーデン・ルンド）のナイーブＦａｂ抗体ライブラリーｎ−ＣｏＤｅＲ（これは６つのＣＤＲ全てが多様化されているＦａｂライブラリーである）を使用するファージディスプレイ技術（Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎｇら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０００，  １８：８５３−８５６に記載されている）によって行った。
【０１９８】
この実施例において使用した標準的緩衝液は次のとおりである：
１×ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ製（Ｄ５６５２−５０ｌ）
ＰＢＳＴ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７９４９）を補足した１×ＰＢＳ
ＰＢＳＴ−ＭＰ３％：３％粉乳（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９９９９）を補足したＰＢＳＴ。
【０１９９】
簡単に述べると、Ｆａｂ抗体ライブラリーの一部を、まず最初にストレプトアビジンコートＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１２０６Ｄ）と共に６０分間、次に濃度５００ｎＭのＦＩＴＣ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｂ８８８９）と共に１０分間、エンドツーエンド（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）ローテーターで、逐次、プレインキュベートすることにより、望ましくない表面結合物質を枯渇させた。次に、１．５時間のインキュベーションステップにおいて、１５０μｌの新しいストレプトアビジンコートビーズを、選択バッファーＰＢＳＴ中で、５００ｎＭの実施例１Ｋの化合物または５００ｎＭの実施例１Ｌの化合物にプレカップリングしてから、ＰＢＳＴでビーズをよく洗浄した。次に、コートビーズを、ブロッキング緩衝液中、エンドツーエンドローテーターで、３０分間インキュベートすることによってブロッキングした。ブロッキングしたコートビーズを、ブロッキング緩衝液でよく洗浄してから、ブロッキングし枯渇させたＦａｂライブラリーの一部と混合した。エンドツーエンドローテーターで６０分間のインキュベーション後に、試料をブロッキング緩衝液で３回洗浄し、次にＰＢＳＴで３回洗浄し、最後にＰＢＳ中で３回洗浄した。４００μｌのトリプシン溶液（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｔ１４２６）の添加によって、結合しているファージを溶出した。室温で３０分間のインキュベーション後に、４０μｌのアプロチニン（ＰＢＳ中、２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ａ１１５３）を加えることで、トリプシン消化を停止させた。
【０２００】
溶出したファージを増殖させ、ファージ力価を既述のように決定した（Ｃｉｃｏｒｔａｓ  Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎら，  Ｐｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２００４；  １７（３）  ２１３−２２１）。簡単に述べると、溶出溶液の一部をタイトレーション実験のために取り置き、残りを使って指数増殖期の大腸菌ＨＢ１０１’（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔから）を形質転換することにより、新しいファージストックを調製し、そのファージストックを、それぞれ１００ｎＭおよび２０ｎＭのターゲット分子を使用する第２および第３選択ラウンドに使用した。各選択ラウンドについて、インプットファージとアウトプットファージの両方を指数増殖期の大腸菌ＨＢ１０１’でタイトレートし、ファージＥＬＩＳＡで分析するために第２および第３ラウンドからのクローンを拾った。
【０２０１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
ファージＥＬＩＳＡ：
異なる選択ラウンドから選択されたファージを、ファージＥＬＩＳＡを使って、特異性について分析した。簡単に述べると、ファージ発現は、１０μｌの終夜培養物（１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５３５４）および１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ，Ｔ３３８３）を補足したＬＢ培地中）を、１００μｌの新鮮培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび０．１％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ８７６９）を補足したＬＢ培地）に加え、９６ウェルＭＴＰ中、２５０ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００が０．５に達するまで振とうすることによって行った。次に、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４２０３１１）を加え、試料を、３７℃でさらに１５分間、振とうせずにインキュベートした。ＩＰＴＧ（最終濃度０．２５ｍＭ）を加えた後、細胞を、２００ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で終夜インキュベートした。
【０２０２】
ストレプトアビジンがプレコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、１５５００）を、それぞれ実施例１Ｋおよび１Ｌからの化合物１μｇ／ｍｌで、４℃において終夜コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング試薬で処理し、再びＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ファージ発現液から１ウェルあたり５０μｌずつ移し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰにカップリングした抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２７−９４２１−０１；ＰＢＳＴに１：２５００希釈）を加え、室温で１時間インキュベートした。５０μｌのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０２３）の添加によって呈色反応を進行させ、５〜１５分後に、５０μｌのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ、１１２０８０１０００）を加えることによって停止させた。比色反応をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）において４５０ｎＭで記録した。
【０２０３】
ＥＬＩＳＡによるｓＦａｂのスクリーニング：
可溶性Ｆａｂフラグメント（ｓＦａｂ）を生成させるために、第２および第３選択ラウンドからのファージミドＤＮＡを単離し、ｇｅｎｅ  ＩＩＩ産物を除去するために、制限酵素ＥａｇＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＦＤ０３３４）およびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｌ）で、供給者の説明書に従って消化した。得られたフラグメントを再ライゲーションし、コンストラクトを、ケミカリーコンピテント大腸菌Ｔｏｐ１０に、標準的方法を使って形質転換した。単クローンを拾って、ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌ、０．１％グルコース）が入っている９６ウェルプレートに移し、２５０ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００が０．５に達するまで振とうした。その後、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）の添加によって、ｓＦａｂ産生を誘導し、２００ｒｐｍで振とうしながらインキュベーションを３０℃で終夜続けた。翌朝、ＢＥＬ緩衝液（２４．７ｇ／ｌホウ酸；１８．７ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；１．４９ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０；２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｒｏｃｈｅ））を各ウェルに加え、５０μｌの処理済み培養物を、ＥＬＩＳＡにおけるターゲットへのｓＦａｂの結合について、検出をＨＲＰにカップリングした抗ｈＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（Ｓｉｇｍａ；Ａ０２９３）で行った点以外は基本的にはファージについて述べたようにして、分析した。
【０２０４】
実施例３：可溶性Ｆａｂスクリーニングヒットの小規模生産
表面プラズモン共鳴での一次キャラクタリゼーションおよび生化学的ＦＸａ活性アッセイにおけるリバーロキサバンの機能的中和のために、ユニークなスクリーニングヒットを小規模に生産した。５０〜１００ｍｌのＬＢ培地（０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを補足したもの）に、最初のｐＢＩＦベクター中にクローニングされた（ただしｇｅｎｅ  ＩＩＩ配列を欠く）ユニークなＦａｂ配列を含有する各大腸菌Ｔｏｐ１０クローンの前培養物を接種した。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によってｓＦａｂの生産を誘導し、２５０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で終夜、インキュベーションを続けた。
【０２０５】
次に、細胞を遠心分離によって回収し、２０％スクロース（ｗ／ｖ）、３０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ、Ｌ−６８７６）および２．５  Ｕ／ｍｌベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ１０１４）を含有する溶解緩衝液中、４℃で１時間インキュベートすることによって、穏やかに溶解した。次に、清澄化した上清を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔラムダアフィニティマトリックス（ＢＡＣ  ０８４９．０１０）に適用した。そのマトリックスをＰＢＳで洗浄してから、結合したｓＦａｂを１００ｍＭグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３）で溶出させ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で直ちに中和した。次に、試料をＰＢＳに対して透析し、Ｈｉｓ−Ｍｕｌｔｉ−Ｔｒａｐプレート（ＧＥ）での２回目の精製ステップに、製造者の説明に従って付した。溶出したｓＦａｂをＰＢＳに対して透析し、タンパク質含量と純度について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０２０６】
実施例４：生化学的第Ｘａ因子活性アッセイにおけるリバーロキサバンの機能的中和
第Ｘａ因子活性をリバーロキサバンによって残存ＦＸａ活性が２０〜３０％になるまで阻害し、試験化合物（例えばＦａｂフラグメント）によるこの阻害の中和を分析した。
【０２０７】
アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．８、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、１ｍＭグルタチオン、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ウシ血清アルブミン）における試験化合物の段階希釈を行った（典型的濃度は５μＭから０．０００７μＭまでの範囲）。
【０２０８】
２０μＬの希釈試験化合物を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ・フリッケンハウゼン）に入れてから、アッセイ緩衝液中のＦＸａ基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ  Ｘａ（１００ｍＭ、ＤＭＳＯ中、Ｌｏｘｏ、ドイツ・ドッセンハイム）の１：４００希釈液（２５０μＭ）１０μＬを加えた。第Ｘａ因子阻害剤リバーロキサバンを含有するアッセイ緩衝液中の第Ｘａ因子（ＨＴＩ、米国バーモント州エセックスジャンクション）希釈液２０μＬを加えることによって、酵素反応を開始させた。同時に、リバーロキサバンなしの対照反応も開始させた。
【０２０９】
３２℃でのインキュベーション中に、蛍光マイクロタイタープレートリーダー（例えばＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、スイス・メンネドルフ；励起３６０ｎｍ、蛍光４６５ｎｍ）を使って反応進行曲線をモニターした。
【０２１０】
対照反応において、反応速度が線形であり、かつ消費される基質が５０％未満であるようなＦＸａの希釈液を選択した（アッセイにおける典型的な最終ＦＸａ濃度：０．０５ｎＭ）。対照反応と比較してＦＸａ活性が７０〜８０％阻害されるようなリバーロキサバンの濃度を選択した（アッセイにおけるリバーロキサバンの典型的最終濃度：０．６ｎＭ）。結果を図１に示す。
【０２１１】
試験化合物濃度を、５０分間のインキュベーション時間後の第Ｘａ因子活性のパーセンテージに対してプロットすることにより、ＥＣ５０値を決定した。ＥＣ５０値は、リバーロキサバン誘導性ＦＸａ阻害の５０％を解消する試験化合物の濃度と定義される。
【０２１２】
実施例５：表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるアフィニティの決定
Ｆａｂフラグメントの結合アフィニティは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）での表面プラズモン共鳴分析によって決定した。Ｆａｂフラグメントを最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に希釈し、フローセル２、３および４については、それぞれアミンカップリング化学により、３０００〜５０００ＲＵのレベルで、ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）に固定化した。フローセル１は参照として使用した。ＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）中の、さまざまな濃度の分析物、それぞれリバーロキサバン、実施例１Ｇからの化合物、ＳＡＴＩ（ＷＯ  ２００８／１５５０３２（実施例３８）に記載）、アピキサバン（ＷＯ２００３／０２６６５２（実施例１８）に記載）、エドキサバン（ＷＯ２００３／０００６８０（実施例１９２）、ＵＳ  ２００５  ００２０６４５（実施例１９２）に記載）、ラザキサバン（ＷＯ１９９８／０５７９５１（実施例３４）に記載）（２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、および１．５６ｎＭ）を、固定化Ｆａｂフラグメント上に、６０μｌ／分の流速で３分間注入し、１０分間、解離させた。インライン参照セル補正とその後の緩衝液試料差し引き後に、センソグラムを生成させた。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使ってセンソグラムを一次１：１結合モデルに当てはめることによって得られた会合速度定数と解離速度定数の比に基づいて、解離平衡定数（ＫＤ）を計算した。データを表６および表７に要約する。
【０２１３】
［表６］パニング／スクリーニングで得られたいくつかの初回Ｆａｂヒットと最適化変異体Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのキャラクタリゼーション：ＳＰＲ解析（Ｂｉａｃｏｒｅ）から得られたリバーロキサバンに対する固定化Ｆａｂのアフィニティデータ（ＫＤ；単位ｎＭ）およびリバーロキサバン（０．６ｎＭ）の存在下での生化学的ＦＸａアッセイ（０．０５ｎＭ  ＦＸａ）におけるＦａｂの半数効果濃度（ＥＣ５０；単位μＭ）の要約
【表６】
2014506448.tif 000034
［表７］さまざまなＦＸａ阻害剤への結合に関する選ばれたＦａｂのキャラクタリゼーション：ＳＰＲ解析（Ｂｉａｃｏｒｅ）から得られたリバーロキサバンに対する固定化Ｆａｂのアフィニティデータ（ＫＤ；単位ｎＭ）の要約
【表７】
2014506448.tif 000035
【０２１４】
実施例６：等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によるアフィニティの決定
熱力学的パラメータを決定するために、制御および解析ソフトウェアを備えたＶＰ−ＩＴＣ等温滴定熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ・フライブルク）を応用した。ここでは、等温滴定熱量測定を使って、溶解状態でのリバーロキサバンへの試験化合物（例えばＦａｂフラグメント）結合の会合定数のオーダーを決定した。
【０２１５】
ＤＭＳＯ中のリバーロキサバンの１０ｍＭ溶液（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ・ウッパータール）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ、ドイツ・タウフキルヒェン）で１：２０００に希釈した。その溶液を脱気し、試料セル（１．４ｍＬ）に充填した。参照セルは水で満たした。ＰＢＳ緩衝液に試験試料の５０μＭ溶液を調製した。試験化合物溶液のＤＭＳＯ濃度を試料セル中のＤＭＳＯ濃度に調節した。脱気後に、試験化合物溶液を、計器のシリンジに吸い込んだ。
【０２１６】
一定の温度（２５℃）で、継続的に撹拌しながら、計器の制御ソフトウェアを利用して、試験化合物溶液を試料セルに注入した（リファレンスパワー：５μｃａｌ／秒、各１０μＬの１２回注入、各注入の持続時間２０秒、各注入間の待ち時間３００秒）。結合反応中に放出された熱を経時的にモニターし、解析ソフトウェアを使ってデータを解析した。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの場合、リバーロキサバンに対するＫＤは滴定曲線から＜１ｎＭと見積もられた。
【０２１７】
実施例７：ダルベッコＰＢＳにおけるリバーロキサバンに対するＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのＫＤ値の決定
Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの存在下でのリバーロキサバンの未結合濃度の決定は、溶解状態でのリバーロキサバンへのＦａｂのＫＤ値の決定を可能にする。ローゼンタール−スキャッチャードプロットを使ってＫＤ値を計算した（図２）。
【０２１８】
リバーロキサバンを、０．２１４μＭ〜０．５８３μＭの濃度で、０．５μＭ  Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと共に、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）緩衝液中、室温で２０分間インキュベートした。次に、その溶液を、３００００Ｄａの排除サイズを有するメンブレンを含んでいる限外濾過デバイスに加えた。試料を１００ｇで３分間遠心分離した。５０μＬの限外ろ過液および出発溶液に、内部標準を含有する酢酸アンモニウム／アセトニトリル（１／１  ｖ／ｖ）ｐＨ３．０の溶液１５０μＬをスパイクした。ＡＰＩ  ４０００（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使ったＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって試料を分析した。ｆｕ（＝未結合率（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｕｎｂｏｕｎｄ））値は、関係式ｆｕ（％）＝濾液濃度／（出発液濃度＊１００）に従って計算し、以前に記述されているように（Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ  Ｊ．ら，  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ２００４；  ９３（４）：８１６−３０）、限外濾過デバイスへの非特異的結合について補正した。ローゼンタールスキャッチャードプロットの傾きから、ＫＤ値は約０．５ｎＭと計算された（図２）。
【０２１９】
実施例８：Ｆａｂ解毒剤によるトロンビン生成アッセイにおけるリバーロキサバンまたはＳＡＴＩの効果の解消
Ｈｅｍｋｅｒによるトロンビン生成アッセイは、化合物が凝固カスケードの動態に及ぼす効果を調べることを可能にする。組織因子およびＣａ２＋をヒト乏血小板血漿に加えて外因性経路を開始させ、生成したトロンビンの活性を、特異的蛍光標識基質（Ｂａｃｈｅｍ、Ｉ−１１４０（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ））を使って決定する。反応は、２０ｎＭ  Ｈｅｐｅｓ、６０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中、３７℃で行った。反応を開始させるための試薬とトロンビンキャリブレータは、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅから市販されている。測定は、３９０／４６０ｎｍフィルターセットとディスペンサとを装着したＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ蛍光計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）において行う。全ての実験ステップを、製造者の説明（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）に従って行う。阻害剤（リバーロキサバンまたはＳＡＴＩ、０．１μＭ）および解毒剤（存在する場合）を、血漿と共に３７℃で５分間プレインキュベートしてから、トロンビン生成を開始させた。Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴは、リバーロキサバンおよびＳＡＴＩの効果を、それぞれ図３および図４に示すように、濃度依存的に中和する。図５は、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴそのものの濃度を増加させてもトロンボグラムが変化しないことを実証し、このＦａｂが凝固に対して固有の影響を持たないことを強調している。
【０２２０】
実施例９：血漿中でのＦＸａ活性アッセイにおけるリバーロキサバンの効果の解消
リバーロキサバンによる血漿中のＦＸａ活性の阻害およびその阻害効果の解消を調べるために、クエン酸加ヒト血漿（Ｏｃｔａｐｈａｒｍ）を、ヒルジンで希釈したリバーロキサバンと共にインキュベートし、３７℃で３分間インキュベートする。次に、Ｆａｂを加え、３７℃で５分間のインキュベーション後に、０．１ｍＭカルシウムを含有する緩衝液中のラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ−Ｘ、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、最終濃度５ｍＵ／ｍｌ）を添加することによって、ＦＸ活性化を開始する。特異的な蛍光原性標識基質（Ｂａｃｈｅｍ、Ｉ−１１００、濃度５０μＭ）の切断を測定することによってＦＸａ活性を決定し、蛍光は、ＳｐｅｃｔｒａＦｌｏｕｒｐｌｕｓリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使って３６０／４６５ｎｍで連続的にモニターした。
【０２２１】
図６に、血漿中のＦＸａ活性に対するリバーロキサバンの効果と、一連の濃度のＦａｂ  Ｍ０１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴによるその阻害効果の解消を示す。
【０２２２】
実施例１０：インビトロでのプロトロンビン時間（ＰＴ）に対するリバーロキサバンの効果の解消
クエン酸加血液（０．１１Ｍクエン酸Ｎａ／血液、１：９  ｖ／ｖ）をヒト献血者から静脈穿刺によって得るか、麻酔下のウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から大動脈カニューレ挿入によって得て、乏血小板血漿を分離するためにそれを４０００ｇで１５分間遠心分離した。血漿試料をリバーロキサバン（図７および図８に示すとおりの濃度、ＤＭＳＯに溶解、最終ＤＭＳＯ濃度１％）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。その血漿−リバーロキサバン混合物に解毒剤を加え、室温でさらに１０分間インキュベートした。このＰＴアッセイは、組織因子源としてリコンビプラスチン（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して、ＡＭＡＸ  ２００自動凝固計（Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、製造者の説明に従って行った。最終アッセイ体積の組成は血漿が１／３、ＰＴ試薬が２／３である。各リバーロキサバン濃度がもたらすＰＴ延長の最大半量正常化に必要な解毒剤濃度に関して、ＩＣ５０値を計算した。データは５回の実験からの平均±ｓｅｍとして記載し、最終アッセイ濃度を表す（表８ならびに図７および図８）。
【０２２３】
［表８］インビトロでのプロトロンビン時間（ＰＴ）に対するＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの効果
【表８】
2014506448.tif 000036
【０２２４】
実施例１１．抗体変異体のクローニング、発現および発現レベルの定量
２つのリバーロキサバン結合性Ｆａｂ  Ｍ１４−Ｇ０７およびＭ１８−Ｇ０８（どちらも重鎖のＣ末端にｃ−ｍｙｃタグとヘキサヒスチジンタグを有するもの）の重鎖および軽鎖を、ｐＥＴ２８ａ細菌発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．、英国ノッティンガム）にサブクローニングし、Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・カールスルーエ）に形質転換した。標準的なオリゴベースの部位特異的変異誘発法によって変異を導入し、ＤＮＡ配列決定によって変異を確認した。
【０２２５】
Ｆａｂ抗体発現のために、変異体プラスミドをＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｌｙｓＹ／Ｉｑ大腸菌株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃ３０１３）に形質転換し、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中の終夜培養物に接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含む新鮮なＬＢ培地に５％の終夜培養物を移すことによって発現培養物を作った。６時間後に、Ｆａｂ発現を誘導するために１ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｒｏｔｈ、２３１６．５）を加え、培養物を３０℃でさらに１８時間インキュベートした。
【０２２６】
発現レベルの定量にはＥＬＩＳＡアプローチを使用した。簡単に述べると、ＭＴＰプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐブラック、４６０５１８）を、コーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、１２１５００）に希釈したＦａｂ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５２６０）と共に、４℃で終夜インキュベートし、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ  Ｍｅｒｃｋ  １．０６４０４．５０００；２．７ｍＭ  ＫＣｌ  Ｍｅｒｃｋ  １．０４９３６．１０００；１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  Ｍｅｒｃｋ  １．０６５８６．２５００、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  Ｍｅｒｃｋ  １．０４８７１．５０００；０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、２３３３６００１０を含有するもの）で３回洗浄し、１００％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、１１３５００）を使って室温で１時間ブロッキングし、再び洗浄した。培養物をＰＢＳＴ中の１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋに希釈し、ＭＴＰプレートに室温で１時間結合させた。ＰＢＳＴで洗浄した後、捕捉されたＦａｂをＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ａ１９０−１０５Ｐ）と共にインキュベートし、洗浄し、１０μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１２２２２）と共に、暗所、室温で、１０〜３０分間インキュベートしてから、蛍光測定を行った。測定された定量シグナルを、精製Ｆａｂ対照の希釈系列によって決定されたダイナミックレンジに従ってフィルタリングした。
【０２２７】
実施例１２．ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使った抗体変異体の活性の決定
実施例１Ｋからの化合物に対する変異型抗体変異体の活性を決定するために、平衡または解離制限（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｏｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｅｄ）ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを使用した。簡単に述べると、ＭＴＰプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐブラック、４６０５１８）を、コーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、１２１５００）に希釈した４μｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、１８９７３０）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、プレートを、ＰＢＳＴ中、１００％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、１１３５００）を使って、室温で１時間ブロッキングし、洗浄ステップを繰り返した。プレートを、さまざまな濃度（０．３〜２００ｎＭ）の実施例１Ｋからの化合物と共に、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、２５μｌの粗細菌培養物を室温で１時間加えることによって抗体フラグメントを固定化した。ＰＢＳＴで洗浄した後、競合ステップまたは直接検出を行った。競合の場合、ＰＢＳＴ中の１０％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋに希釈した３００ｎＭのリバーロキサバンを加え、室温で１．５〜３時間インキュベートした。まだ結合しているＦａｂを検出するために、ＰＢＳＴ中の１０％Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋに希釈したＨＲＰ結合抗ラムダ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ５１７５）を、室温で１時間加えた。洗浄後に、１０μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１２２２２）を加え、室温で１０〜３０分間インキュベートした後、蛍光シグナルの測定を行った。
【０２２８】
実施例１３．ＦＸａ脱阻害アッセイ（ＦＸａ  ＤＩＡ）における変異体の成績の解析
無修飾リバーロキサバンに対する野生型（ｗｔ）および変異型Ｆａｂ変異体の活性を決定するために、ＦＸａ活性の脱阻害アッセイを行った。簡単に述べると、１０μｌの粗細菌培養物を１μｌの２００ｎＭリバーロキサバンおよび２μｌのＦＸａ基質（Ｆｌｕｏｐｈｅｎ、Ｈｙｐｈｅｎ  ＢｉｏＭｅｄ、３２９０１１）と共に、黒色低容積プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、７８４０７６）中、室温で１時間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、Ｍｅｒｃｋ  １．０８３８２．２５００；１００ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｍｅｒｃｋ  １．０６４０４．５０００；２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｍｅｒｃｋ  １．０２３８２．１０００；０．１％ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ  Ａ４５０３；０．１％ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ  Ｐ２１３９）に希釈した２８ｎＭ  ＦＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＨＣＸＡ−００６０）７μｌを加え、マイクロプレートリーダー、例えばＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００を使って、４４０ｎｍで蛍光シグナルを測定することにより、酵素活性を経時的に記録した。蛍光シグナルを経時的に積分し、野生型に対する変異体の比を比較した。
【０２２９】
実施例１４．単一および多重アミノ酸置換
表９に記載するのは、Ｍ１４−Ｇ０７（ｗｔ）の重鎖および／または軽鎖に導入された単一および／または二重アミノ酸置換のいくつかの例である。変異体の成績は、競合ステップなしのＥＬＩＳＡおよびＦＸａ脱阻害アッセイ（ＦＸａ  ＤＩＡ）で、四つ一組にして分析した。ＥＬＩＳＡでは、平均を計算し、各々の平均発現レベルに対して標準化した。２〜３回の独立した実験から得られる変異体対ｗｔ比を比較することによって、変異体の総合的成績を評価した。ｗｔ＋２×ＳＤ（比の標準偏差）を上回る平均比を有する変異体は改良されたとみなして「＋＋」の印を付け、一方、ｗｔ−２×ＳＤ未満の比を有する変異体は結合アフィニティが低減したとみなして「−」の印を付ける。成績が両方の閾の間にある全ての変異体に「＋／−」の印を付ける。陰性対照（非発現細胞）＋３×ＳＤを下回る平均蛍光カウントを有する変異体は非結合性とみなして「−−」の印を付けたが、この基準を満たす変異体は一つもなかった。ＦＸａ脱阻害アッセイでは、平均を計算し、２〜３回の独立した実験から得られる変異体対ｗｔ比を比較することによって、変異体の総合的成績を評価した。ｗｔ＋２×ＳＤを上回る平均比を有する変異体は改良されたとみなして「＋＋」の印を付け、一方、ｗｔ−２×ＳＤ未満の比を有する変異体は結合アフィニティが低減しているか非結合性であるとみなして「−−」の印を付ける。成績が両方の閾の間にある全ての変異体に「＋／−」の印を付ける。分析しなかった変異体には「ｎｄ」（未決定）の印を付ける。ＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義した。
【０２３０】
［表９］Ｍ１４−Ｇ０７内の単一および二重アミノ酸置換の分析
【表９−１】
2014506448.tif 000037
【表９−２】
2014506448.tif 000038
【表９−３】
2014506448.tif 000039
【表９−４】
2014506448.tif 000040
【表９−５】
2014506448.tif 000041
【表９−６】
2014506448.tif 000042
【０２３１】
表１０に記載されているのは、Ｍ１４−Ｇ０７抗体内での複合的アミノ酸置換の例である。全ての組み合わせが表１０に記載されているわけではないが、抗リバーロキサバン抗体は記載した修飾の任意の組合せを含みうると考えられる。変異体の成績は、競合ステップなしのＥＬＩＳＡで、四つ一組にして解析した。平均を計算し、コーティングに使用した実施例１Ｋからの化合物の濃度が１０ｎＭ未満である場合には、実施例１Ｋからの化合物を含まないストレプトアビジンコートプレートで決定された平均バックグラウンドシグナルを差し引き、シグナルを各々の平均発現レベルに対して標準化した。変異体の総合的成績は、ｗｔと比較して２倍改良された参照変異体を使って、２〜３回の独立した実験から得られる変異体対参照比を比較することによって評価した。参照＋２×ＳＤを上回る平均比を有する変異体に「＋＋＋」の印を付し、一方、参照−２×ＳＤ未満の比を有する変異体には「＋／−」の印を付ける。成績が両方の閾の間にある全ての変異体に「＋＋」の印を付ける。０．５未満の比を有する変異体には「−」の印を付けるが、この基準を満たす変異体は一つもなかった。ＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義した。
【０２３２】
［表１０］Ｍ１４−Ｇ０７内の多重アミノ酸置換の例
【表１０−１】
2014506448.tif 000043
【表１０−２】
2014506448.tif 000044
【０２３３】
表１１に記載するのは、Ｍ１８−Ｇ０８（ｗｔ）の重鎖および／または軽鎖に導入された単一および／または二重アミノ酸置換のいくつかの例である。変異体の成績は、競合ステップありのＥＬＩＳＡおよびＦＸａ脱阻害アッセイ（ＦＸａ  ＤＩＡ）で、四つ一組にして分析した。ＥＬＩＳＡでは、平均を計算し、１〜３回の独立した実験から得られる変異体対ｗｔ比を比較することによって、変異体の総合的成績を評価した。ｗｔ＋２×ＳＤ（比の標準偏差）を上回る平均比を有する変異体は改良されたとみなして「＋＋」の印を付け、一方、ｗｔ−２×ＳＤ未満の比を有する変異体は結合アフィニティが低減したとみなして「−」の印を付ける。成績が両方の閾の間にある全ての変異体に「＋／−」の印を付ける。陰性対照（非発現細胞）＋３×ＳＤを下回る平均蛍光カウントを有する変異体は非結合性とみなして「−−」の印を付けた。ＦＸａ脱阻害アッセイでは、平均を計算し、２〜３回の独立した実験から得られる変異体／ｗｔ比を比較することによって、変異体の総合的成績を評価した。ｗｔ＋２×ＳＤを上回る平均比を有する変異体は改良されたとみなして「＋＋」の印を付け、一方、ｗｔ−２×ＳＤ未満の比を有する変異体は結合アフィニティが低減しているか非結合性であるとみなして「−−」の印を付ける。成績が両方の閾の間にある全ての変異体に「＋／−」の印を付ける。分析しなかった変異体には「ｎｄ」（未決定）の印を付ける。ＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義した。
【０２３４】
［表１１］Ｍ１８−Ｇ０８内の単一および二重アミノ酸置換の分析
【表１１−１】
2014506448.tif 000045
【表１１−２】
2014506448.tif 000046
【表１１−３】
2014506448.tif 000047
【表１１−４】
2014506448.tif 000048
【表１１−５】
2014506448.tif 000049
【表１１−６】
2014506448.tif 000050
【表１１−７】
2014506448.tif 000051
【０２３５】
表１２に記載されているのは、Ｍ１８−Ｇ０８抗体内での複合的アミノ酸置換のいくつかの例である。全ての組み合わせが表１２に記載されているわけではないが、Ｍ１８−Ｇ０８抗リバーロキサバン抗体は記載した修飾の任意の組合せを含みうると考えられる。変異体の成績は、競合ステップありのＥＬＩＳＡで、四つ一組にして解析した。平均を計算し、コーティングに使用した実施例１Ｋからの化合物の濃度が１０ｎＭ未満である場合には、実施例１Ｋからの化合物を含まないストレプトアビジンコートプレートで決定された平均バックグラウンドシグナルを差し引き、シグナルを各々の平均発現レベルに対して標準化した。変異体の総合的成績は、ｗｔと比較して１０倍改良された参照変異体を使って、２〜３回の独立した実験から得られる変異体対参照比を比較することによって評価した。さらなる印が何もない変異体には、参照１（「＊」の印を付ける）を使用し、＃の印を付けた変異体には、参照２（「＊＊」の印を付ける）を使用した。参照＋２×ＳＤを上回る平均比を有する変異体には「＋＋＋」の印を付け、一方、各参照の＜０．１の比を有する変異体には「＋／−」の印を付けるが、この基準を満たす変異体は一つもなかった。成績が両方の閾の間にある全ての変異体に「＋＋」の印を付ける。ＣＤＲはＫａｂａｔに従って定義した。
【０２３６】
［表１２］Ｍ１８−Ｇ０８内の多重アミノ酸置換の例
【表１２−１】
2014506448.tif 000052
【表１２−２】
2014506448.tif 000053
【表１２−３】
2014506448.tif 000054
【０２３７】
実施例１５．Ｈｉｓタグ付きＦａｂフラグメントの精製
細胞を、４℃、９０００ｒｐｍで、３０分間の遠心分離によって回収し、−２０℃で保存した。抗体フラグメントを上清から２段階精製法を使って精製した。最初に、上清を緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に対して再緩衝化し、濃縮し、１００ｍｌを５ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（Ｑｉａｇｅｎ、１０１８１４２）にローディングした。ローディング後に、カラムをまず２０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、次に１５カラム体積の４．３％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄し、１５体積の緩衝液Ｂで溶出させた。フラクションを合わせ、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０８５１−０１）を製造者のプロトコールに従って使用することにより、緩衝液をＰＢＳに交換した。第２の精製ステップでは、Ｎｉ−ＮＴＡ精製抗体をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔラムダアフィニティマトリックス（ＢＡＣ  ０８４９．０１０）と共にインキュベートした。４℃で終夜インキュベートした後、マトリックスをカラムにローディングし、５体積のＰＢＳ、５体積の５００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で洗浄し、再び５体積のＰＢＳで洗浄した。抗体を、６体積の１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）、次に３体積の１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）で、溶出液を中和するための総体積の１／１５の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に溶出させた。最後に溶出液を、４℃で終夜、ＰＢＳに対して透析した。精製抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析した。
【０２３８】
実施例１６：大腸菌およびＨＥＫ２９３における非タグ付きＦａｂフラグメントの生産
発現コンストラクトのクローニング
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」コールドスプリングハーバー、１９８９）に従って定型的なクローニング作業を行った。大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離（ミニプレップ）にはＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。形質転換に使用した宿主生物は大腸菌ＤＨ５α株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの抽出は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを利用して、製造者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従って行った。ＰＣＲおよびシークエンス反応用のオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎから購入し、合成遺伝子（サッカロミセス・セレビシア（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のコドン使用頻度に最適化したもの）はＧｅｎｅａｒｔから購入した。ＰＣＲ実験にはＭｅｒｃｋのＫＯＤポリメラーゼを製造者のプロトコールに従って使用した。全てのベクターコンストラクトを外部機関（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による配列決定で確認した。
【０２３９】
大腸菌発現ベクターｐＭＣ１１およびｐＭＣ１４
Ｍ１８−Ｇ０８−ＤＫＴＨＴとＭ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの両者をｐＥＴ２８ａからｐＵＣ系大腸菌発現ベクター（それぞれｐＭＣ１４およびｐＭＣ１１）のｐＬＡＣプロモーター制御下に再クローニングする操作は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）配列を別個に増幅した後、ｐＵＣ系ベクターのユニーク制限部位を利用することによって行った。
【０２４０】
コード配列の５’側および３’側の追加オリゴヌクレオチドには、ｐＵＣ系大腸菌発現ベクターへのＬＣおよびＨＣのインフレームサブクローニングに使用した制限酵素認識部位が含まれる。
【０２４１】
ＬＣ配列の増幅は、ＮｈｅＩ制限部位を持ちｐｅｌＢリーダーに結合するフォワードプライマーとＬＣ配列の３’端と対合するリバースプライマーとを使って行った。制限消化はＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで行った。続いて、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＵＣ系ベクターへのライゲーションを行った。ライゲートしたＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【０２４２】
ＨＣ配列の増幅は、ＮｃｏＩ制限部位を有しｐｅｌＢリーダーに結合するフォワードプライマーと、ＬＣ配列の３’端に対合し、末端５アミノ酸ＤＫＴＨＴをコードする追加ヌクレオチドとそれに続くＳａｃＩＩ制限部位とを有するリバースプライマーとを使って行った。制限消化はＮｃｏＩ／ＳａｃＩＩで行った。次に、ＮｃｏＩ／ＳａｃＩＩ消化したｐＵＣ系ベクターへのライゲーションを行った。ライゲートしたＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【０２４３】
Ｍ１８−Ｇ０８−ＤＫＴＨＴのＬＣをコードする遺伝子のタンパク質配列は次のとおりである。
【化１７】
2014506448.tif 000055
【０２４４】
Ｍ１８−Ｇ０８−ＤＫＴＨＴのＨＣをコードする遺伝子のタンパク質配列は次のとおりである。
【化１８】
2014506448.tif 000056
【０２４５】
Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのＬＣをコードする遺伝子のタンパク質配列は次のとおりである。
【化１９】
2014506448.tif 000057
【０２４６】
Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴのＨＣをコードする遺伝子のタンパク質配列は次のとおりである。
【化２０】
2014506448.tif 000058
【０２４７】
哺乳類発現ベクターｐＭＣ１９およびｐＭＣ３２
プラスミドｐＭＣ１９（Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴをコードする）およびｐＭＣ３２（Ｍ１８−Ｇ０８−ＤＫＴＨＴをコードする）に関するコード配列はＧｅｎｅａｒｔから合成遺伝子として購入した（哺乳類コドン使用頻度に最適化されたもの）。コード配列の５’側および３’側の追加オリゴヌクレオチドには、各配列を一本鎖哺乳類発現ベクターのｐＣＭＶ５プロモーターの制御下にインフレームサブクローニングするために使用した制限酵素認識部位が含まれる。
【０２４８】
ＨＥＫ２９３  ６Ｅ細胞におけるＦａｂ発現
一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ６Ｅ細胞を使用する哺乳動物細胞培養によって、いくつかのＦａｂフラグメントを生産した。重鎖と軽鎖をどちらも、上述のように、単一ベクター系のＣＭＶ５プロモーターの制御下にクローニングした。発現規模は、トランスフェクションの２４時間後に０．５％トリプトンＴＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、注文番号：１９５５３）と１％ＦＣＳ  ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、注文番号：１６２５０）を補足したＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、注文番号：０５−００９２ＤＫ）を使って、２０Ｌウェーブ（ｗａｖｅ）バッグ（Ｃｕｌｔｉｂａｇ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で１０Ｌとした。５％ＣＯ２、３７℃、角度８°の揺動１８回／分で、細胞を６日間培養した。発現レベルは約１２０ｍｇ／Ｌだった。細胞を遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ１２ＢＰ、３０分、４℃、４０００ｒｐｍ）によって回収した。細胞を捨てた。Ｆａｂフラグメントを含有する上清を０．２μｍ滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２  ＸＬＧ、注文番号：５４４５３０７Ｇ８−−００）で濾過した。
【０２４９】
大腸菌ＢＬ２１におけるＦａｂ発現
Ｆａｂフラグメントは、上記の発現コンストラクトに基づく大腸菌系で発現させることもできる。１０ｇ／Ｌグルコース一水和物（Ｓｉｇｍａ、注文番号：Ｇ５７６７）および１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、注文番号：Ａ１４９１，００１０）を補足した２００ｍｌの２×ＹＴ培地（Ｄｉｆｃｏ  ２×ＹＴ培地：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、注文番号：２４４０２０）に、例えばｐＭＣ１１で形質転換した大腸菌ＢＬ２１の凍結培養物１０００μｌを接種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で、１６時間培養した。このシードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）を、１ｇ／Ｌグルコース一水和物、１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび０．１ｍｌ／ＬポリグリコールＰ２０００（ＢＡＳＦ）を補足した２×ＹＴ培地２０Ｌの接種に使用した。生産培養物は、５０Ｌウェーブバック中、３０℃、揺動３５回／分、角度９°および曝気速度０．５２Ｌ空気／分のＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｕｌｔｉｂａｇでインキュベートした。０．５〜０．６のＯＤ６００において、Ｆａｂフラグメントの発現を、０．７５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。さらに２０時間のインキュベーション後に、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ１２ＢＰ、１時間、４℃、４０００ｒｐｍ）によって培養物を回収した。そのバイオマスを−２０℃で凍結し、上清を０．２μｍ滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２  ＸＬＧ、注文番号：５４４５３０７Ｇ８−−００）で濾過し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−Ｍｉｎｉ−Ｈｏｌｄｅｒと２つのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳｌｉｃｅカセットＨｙｄｒｏｓａｒｔ  １０ｋとを使ったＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｏ  Ｆｌｕｘ  Ｍ１２クロスフロー濾過で濃縮した。使用したパラメータは、入口圧２バール；出口圧１．５バール；圧力差０．５バールであり、これが当初は５０秒間で１００ｍｌの濾液をもたらした。
【０２５０】
１００ｇの大腸菌細胞ペレットを、３２０ｍｌの３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋２００ｇ／Ｌスクロース＋６錠のＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）＋２５Ｕ／ｍｌベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ１０１４）＋１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、４℃で２時間インキュベートした。４０ＫＰＳＩヘッド（使用圧力３６．１ＫＰＳＩ）を装着したＴＳ細胞破砕システム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌｔｄ．）を使って細胞を破砕した（２サイクル、セル温度１０℃；供給溶液およびフロースルーは４℃に維持した）。４℃、３５，０００×ｇで３５分間の遠心分離によって細胞残渣を除去した。清澄化した上清（粗抽出物）を滅菌濾過し、さらなる加工のために−２０℃で保存した。
【０２５１】
非タグ付きＦａｂの精製
本発明のＦａｂフラグメントを滅菌濾過したＨＥＫ２９３  ６Ｅ上清もしくは大腸菌上清から、または滅菌濾過した大腸菌粗抽出物（上述のように生成したもの）から、２段階精製法を使って精製した。捕捉ステップとして「ラムダセレクト（ｌａｍｂｄａ  ｓｅｌｅｃｔ）」アフィニティカラム（ＢＡＣ）を使用した。細胞上清または大腸菌培養物１０Ｌに対して、４０ｍｌのラムダセレクト樹脂を使用した。さらなる精製ステップは全て２０℃で行い、以後のどのステップでも、使用した流速は６ｍｌ／分である。カラムを５カラム体積（＝ＣＶ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した。試料のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ溶液でｐＨ７．４に調節し、カラムに適用した。次に、１０ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。Ｆａｂフラグメントを３ＣＶの５０ｍＭ酢酸Ｎａ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出させた。溶出プールのｐＨを２．５Ｍ  ＴｒｉｓでｐＨ７．０に調節し、滅菌濾過し、限外濾過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔａ  １０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ９０１００８）を使って１７．８ｍｇまで濃縮した。試料を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した３５／５００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。カラムを３ｍｌ／ｍｌの流量で２ＣＶにわたって溶出させ、各６ｍｌのフラクションを集めた。Ｆａｂフラグメントを含有するフラクションをプールし、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（４−１２％ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分析した。図９に示すように、Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの調製物は、＞９８％の純度であり、軽鎖＝ＬＣおよび重鎖＝ＨＣの両方が等量ずつ存在する。
【０２５２】
実施例１７：エクスビボでのプロトロンビン時間（ＰＴ）（ラットＰＤ／ＰＫ）
リバーロキサバンを、経口胃管法によって、ＥｔＯＨ−ＰＥＧ−水（１０−５０−４０％、５ｍｌ／ｋｇ）に溶解した１．５ｍｇ／ｋｇの用量で、雄ウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に投与した。経口投与の約７５分後に、Ｆａｂ解毒剤注入用の静脈（頚静脈）カテーテルと血液試料採取用の動脈（頚動脈）カテーテルとを埋め込むために、イソフルラン麻酔を誘導した。経口リバーロキサバン投与の９０分後に、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの注入を、１時間以内に８５ｍｇ／ｋｇの用量で開始した（ＰＢＳ中、投与体積１５ｍｌ／ｋｇ／時間）。プロトロンビン時間および血漿中濃度を実施例１０で述べたように決定した。リバーロキサバン誘導性ＰＴ延長の正常化を図１０に示す。この実験設定に関する未結合リバーロキサバンの血漿中濃度の時間経過を実施例１８で述べる。
【０２５３】
実施例１８：ラットにおけるＦａｂ解毒剤による未結合リバーロキサバン濃度の低減
リバーロキサバンの薬物動態に対するＦａｂ解毒剤のインビボ効果を調べるために、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴを共投与した後のラットにおけるリバーロキサバンの未結合濃度を、（実施例１７に記載のプロトコールに従って）麻酔下のラットで決定した。薬物の未結合濃度だけが薬理学的効果を駆動するので、未結合濃度は、薬理学的効果の良い予測因子である。未結合濃度を決定するために、血漿試料をＤＰＢＳで希釈し（１／１  ｖ／ｖ）、排除サイズ３０，０００Ｄａのメンブレンを有する限外濾過デバイスに加えた。試料を１２００ｇで２分間遠心分離した。２５μＬの限外ろ過液をＤＰＢＳで希釈し（１／１  ｖ／ｖ）、排除サイズ３００００Ｄａのメンブレンを有する限外濾過デバイスに加えた。試料を１２００ｇで２分間遠心分離した。２５μＬの限外ろ過液を２５μＬのＤＰＢＳで希釈し、内部標準を含有する酢酸アンモニウム／アセトニトリル（１／１  ｖ／ｖ）ｐＨ６．８の溶液１５０μＬをスパイクした。血漿試料に３００μＬのアセトニトリルをスパイクし、４℃、２０００ｇで、１０分間遠心分離した。全ての試料をＡＰＩ  ４０００（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使ったＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ｆｕ値は、関係式ｆｕ（％）＝（濾液濃度／血漿試料濃度）×１００に従って計算し、以前に記述されているように（Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ  Ｊ．ら，  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ２００４；  ９３（４）：８１６−３０）、限外濾過デバイスへの非特異的結合および血漿希釈について補正した。
【０２５４】
図１１に、１．５ｍｇ／ｋｇのリバーロキサバンを経口投与し、リバーロキサバンの投与の１．５時間後から開始して１時間にわたって８５ｍｇ／ｋｇのＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴを注入した後の、ラット血漿における未結合リバーロキサバンの濃度／時間プロファイルを図示する。Ｆａｂの注入後に起こるリバーロキサバンの未結合血漿中濃度の迅速な低減が示されている。いくつかの試料では、リバーロキサバンの未結合濃度が定量下限（ＬＬＯＱ）未満であったため、リバーロキサバンの未結合濃度を決定することができなかった。
【０２５５】
実施例１９：ラットにおける出血時間
リバーロキサバンによって延長された出血を妨害するＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの潜在的能力を、ラット尾横切開モデルで研究した。薬物投与用および血液試料採取用の静脈（頚静脈）および動脈（頚動脈）カテーテルを埋め込むために、動物（雄ウィスターラット、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をイナクチン（１８０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。１ｍｇ／ｋｇリバーロキサバン（ＥｔＯＨ−ＰＥＧ−水、１０−５０−４０％中、３ｍｌ／ｋｇ）のｉｖ．ボーラス投与の５分後に、先端から２〜３ｍｍの距離で尾を横切断することによって、出血を開始させた。出血事象を観察し記録するために出血中の尾を３７℃の０．９％食塩水に浸漬した。出血開始の１分後に、１０７．５ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ中、１．３３ｍｌ／ｋｇ／分）の用量で１０分間にわたるＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの注入を開始した。出血を３０分間記録し、処置に関する知識のない観察者がスコア化した（０＝出血なし、１＝軽微、２＝軽度、３＝中等度、４＝最大出血）。スコアは３０秒間隔で取得し、累積出血時間は、３０分間のスコア４出血の場合に達成される１８００秒を最大値として計算した。各群５匹の中央出血時間は、無処置群、リバーロキサバン群およびリバーロキサバン＋Ｆａｂ解毒剤群において、それぞれ１９５、１４２５および３６８秒だった（図１２）。
【０２５６】
実施例２０：Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ−リバーロキサバン複合体の結晶化およびＸ線構造決定
結晶化
Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴを含むタンパク質を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０中で３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化に先だって、タンパク質溶液を、５０ｍＭ  ＤＭＳＯに溶解した３倍モル過剰のリバーロキサバンと混合し、氷上で１時間インキュベートした。Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴとリバーロキサバンとを含むタンパク質コンストラクトの共結晶を、静置液滴法を使って２０℃で成長させ、等体積のタンパク質溶液と沈殿剤としてのウェル溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、２０％ＰＥＧ４０００、２Ｍ  ＮａＣｌ）とを混合することによって結晶化させた。結晶は１日後に現れ、１４日後にその最終サイズまで成長した。
【０２５７】
データの収集と処理
クライオバッファーを使用せずに結晶を液体窒素中で急速冷凍した。結晶のデータは、ＢＥＳＳＹシンクロトロン（ベルリン）のビームラインＢＬ１４．１において、ＭＡＲ  ＣＣＤ検出器で収集した。データを指数付けし、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，  Ｗ．  （２０１０）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ６６，  １２５−１３２）で積分し、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳでスケーリングに備え、ＳＣＡＬＡ（Ｐ．Ｒ．  Ｅｖａｎｓ，  （２００５）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ６２，  ７２−８２）でスケーリングした。結晶は２．２５Åまで回折し、格子定数ａ＝１２０．４の立方晶空間群Ｐ２３と、非対称ユニット中に１つのＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ−リバーロキサバン複合体とを有している。
【０２５８】
構造の決定と精密化
ＢＡＬＢＥＳ（Ｆ．Ｌｏｎｇ，  Ａ．Ｖａｇｉｎ，  Ｐ．ＹｏｕｎｇおよびＧ．Ｎ．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  （２００８）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ６４，  １２５−１３２）を使用し、ｐｄｂコード１ｒｚｆをサーチモデルとして、リバーロキサバンとモノクローナル抗体Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの共構造を分子置換法で解いた。ＣＯＯＴ（Ｐ．  Ｅｍｓｌｅｙら．  （２０１０）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ６６：４８６−５０１）によるモデル構築と、ＲＥＦＭＡＣ５．５（Ｇ．Ｎ．  Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら．  （１９９７）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ５３，  ２４０−２５５）を使った最尤精密化（ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を繰り返すことでモデルを完成させた。データセットおよび精密化の統計情報を表１３に要約する。
【０２５９】
［表１３］Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴ−リバーロキサバン複合体に関するデータセットおよび精密化の統計情報
【表１３】
2014506448.tif 000059
【０２６０】
実施例２１：Ｘ線構造ベースのエピトープマッピング
Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴとリバーロキサバンの複合体（図１３）は、非対称ユニットあたり１コピーの複合体として結晶化した。リバーロキサバンと接触しているＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの残基（パラトープ）。２つの方法を使って、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴに対するリバーロキサバンの結合エピトープを決定し、表１４ａおよび表１４ｂに列挙する。
【０２６１】
方法１：埋没表面をＣＣＰ４プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（Ｐ．Ｊ．  Ｂｒｉｇｇｓ  （２０００）  ＣＣＰ４  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  Ｎｏ．  ３８）で解析し、リバーロキサバンの結合ありとリバーロキサバンの結合なしとで計算した場合に総面積差を示す残基（表１４ａ）。
【０２６２】
方法２：計算のために、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの全てのアミノ酸とリバーロキサバンに、水素原子を付加した。次に、結晶構造における結合リバーロキサバンの４Å環境にある残基を、プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏバージョン３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、２００５−１１）を使って計算した（表１４ｂ）。
【０２６３】
両方の計算から得られる残基は全てリバーロキサバンに接触しているとみなした。
【０２６４】
［表１４ａ］方法１を使った場合にリバーロキサバンと接触しているＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの残基
【表１４−１】
2014506448.tif 000060
［表１４ｂ］方法２を使って計算されたリバーロキサバンと接触しているＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの残基。全ての距離をÅで列挙する。
【表１４−２】
2014506448.tif 000061
【表１４−３】
2014506448.tif 000062
【表１４−４】
2014506448.tif 000063
【表１４−５】
2014506448.tif 000064
【表１４−６】
2014506448.tif 000065
【０２６５】
要約すると、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴは、次に挙げる残基によって、リバーロキサバンを認識する。
軽鎖：
Ａｓｎ３５［Ｌ−ＣＤＲ１］、Ｔｙｒ３７、Ｇｌｎ９０［Ｌ−ＣＤＲ３］、Ｔｒｐ９９［Ｌ−ＣＤＲ３］、Ｐｈｅ１０１
重鎖： 
Ｓｅｒ３１［Ｈ−ＣＤＲ１］、Ｔｒｐ３３［Ｈ−ＣＤＲ１］、Ｓｅｒ３５［Ｈ−ＣＤＲ１］、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５０［Ｈ−ＣＤＲ２］、Ｖａｌ９９［Ｈ−ＣＤＲ３］、Ｔｒｐ１００［Ｈ−ＣＤＲ３］、Ａｒｇ１０１［Ｈ−ＣＤＲ３］、Ａｓｎ１０２［Ｈ−ＣＤＲ３］、Ｔｙｒ１０３［Ｈ−ＣＤＲ３］、Ｌｅｕ１０４［Ｈ−ＣＤＲ３］。
【０２６６】
リバーロキサバンのクロロチオフェン部分はＴｒｐ９９（Ｌ−ＣＤＲ３）へのπ−スタッキングおよびＬｅｕ１０４（Ｈ−ＣＤＲ３）への疎水性スタッキングによって相互作用する。リバーロキサバンの中央アミドは、Ｓｅｒ５０（Ｈ−ＣＤＲ２）およびＡｓｎ１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）の側鎖に水素結合している。リバーロキサバンのオキサゾールのカルボニル酸素は、Ａｓｎ１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）の主鎖アミドに水素結合している。ここに記載した相互作用は全て式１に移し換えることができる。
【０２６７】
リバーロキサバンのフェニル環は、Ｔｒｐ３３（Ｈ−ＣＤＲ１）へのπ−スタッキングによって相互作用する。これらの相互作用は式２に移し換えることができる。
【０２６８】
図１３に、スティックで示されたリバーロキサバンと複合体を形成しているＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴの模式図を図示する。図１４に、Ｆａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴとリバーロキサバンの結合および相互作用を図示する。
【０２６９】
実施例２２：競合ＥＬＩＳＡによるリバーロキサバン含量の決定および定量
ＰＢＳＴ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７９４９）を補足した１×ＰＢＳ
ＰＢＳＴ−ＭＰ３％：３％粉乳（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９９９９）を補足したＰＢＳＴ
与えられた試料中のリバーロキサバンの含量を決定するために、競合ＥＬＩＳＡを確立した。簡単に述べると、ストレプトアビジンをプレコートしたＭＴＰプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎｏ．６５５９９０）を、実施例１Ｋからの化合物１００ｎＭと共に、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、プレートを室温で１時間、ＰＢＳＴ−ＭＰ３％でブロッキングし、洗浄ステップを繰り返した。競合ステップのために、ＰＢＳ中に段階希釈したさまざまな量のリバーロキサバンを含有する試料を、最終濃度２．５μｇ／ｍｌのＦａｂ  Ｍ１８−Ｇ０８−Ｇ−ＤＫＴＨＴと混合し、室温で１時間インキュベートしてから、前処理したウェルに移した。インキュベーションとＰＢＳＴによる洗浄後に、残留結合Ｆａｂの検出を、ＨＲＰにカップリングされた抗ｈＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（Ｓｉｇｍａ；Ａ０２９３）によって行った。１００μｌのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０２３）の添加によって呈色反応を進行させ、５〜１５分後に、１００μｌのＨ２ＳＯ４（０．２５Ｍ；Ｍｅｒｃｋ、１１２０８０１０００）を添加することによって停止させた。比色反応をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）において４５０ｎＭで記録した。
【０２７０】
図１５に示すように、シグナルの用量依存的現象を検出することができた。
【０２７１】
実施例２３：Ｆａｂ解毒剤の存在下でのトロンビン生成アッセイにおけるアピキサバンおよびダビガトランの活性
トロンビン生成アッセイは本質的に実施例８で述べたように行った。実験は、それぞれ３μＭアピキサバン（図１６）または０．７５μＭダビガトラン（図１７）の存在下で行った。Ｆａｂ解毒剤だけを加えた場合（最終濃度はそれぞれ１．４３μＭおよび０．７２μＭ）も、Ｆａｂ解毒剤をリバーロキサバン（最終濃度０．１μＭ）と組み合わせて加えた場合も、トロンビン生成に対する効果は検出できなかった。
【０２７２】
文献
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Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １９９６；  １４  （３）：３０９−３１４
Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９４，  ２２：  ５６００
ＷＯ  ２００９／０４２９６２  Ａ２
ＷＯ  ９７／０８３２０
【図１】
2014506448.tif 000066
【図２】
2014506448.tif 000067
【図３ａ）】
2014506448.tif 000068
【図３ｂ）】
2014506448.tif 000069
【図３ｃ）】
2014506448.tif 000070
【図３ｄ）】
2014506448.tif 000071
【図４ａ）】
2014506448.tif 000072
【図４ｂ）】
2014506448.tif 000073
【図４ｃ）】
2014506448.tif 000074
【図４ｄ）】
2014506448.tif 000075
【図５ａ）】
2014506448.tif 000076
【図５ｂ）】
2014506448.tif 000077
【図５ｃ）】
2014506448.tif 000078
【図６】
2014506448.tif 000079
【図７】
2014506448.tif 000080
【図８】
2014506448.tif 000081
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ）】
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【図１６ｂ）】
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【図１６ｃ）】
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【図１６ｄ）】
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【図１７ａ）】
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【図１７ｂ）】
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【図１７ｃ）】
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【図１７ｄ）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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