(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞の少なくとも２つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化を測定するステップと、該ＤＮＡメチル化を少なくとも１つの参照細胞の前記少なくとも２つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける前記少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化と比較するステップを含み、前記遺伝子が、異なる染色体上に位置し、嗅覚受容体遺伝子の遺伝子ファミリーに属する、多能性幹細胞の品質を判定する方法に関する。
2014500708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の少なくとも３つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化を測定するステップと、
少なくとも１つの参照細胞の前記少なくとも３つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける前記少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化と比較するステップ
を含み、
前記遺伝子が、異なる染色体上に位置し、嗅覚受容体遺伝子の遺伝子ファミリーに属する、多能性幹細胞の品質を判定する方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照細胞が多能性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記参照細胞が分化した細胞である、請求項１〜３の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも２つの参照細胞が使用される、請求項１〜４の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞の少なくとも４遺伝子または少なくとも５遺伝子のそれぞれにおける少なくとも１つのＣｐＧアイランドのメチル化が測定され、前記参照細胞の遺伝子におけるメチル化とそれぞれ比較される、請求項１〜５の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項７】
前記嗅覚受容体遺伝子がクラスＩまたはクラスＩＩのヒトメンバーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
各遺伝子で複数のＣｐＧアイランドが測定される、請求項１〜７の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞の少なくとも７遺伝子または少なくとも１０遺伝子のそれぞれにおける少なくとも１つのＣｐＧアイランドのメチル化が測定され、前記参照細胞の遺伝子におけるのメチル化とそれぞれ比較される、請求項１〜８の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記嗅覚受容体遺伝子が、ＯＲ６Ｋ６、ＯＲ６Ｎ１、ＯＲ６Ｎ２、ＯＲ５１Ａ７、ＯＲ５１Ｇ２、ＯＲ５１Ｇ１、ＯＲ１Ｍ１、ＯＲ７Ｇ２、ＯＲ７Ｇ１から選択される、請求項１〜９の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡメチル化の測定にメチル化特異的ＰＣＲが用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バイサルファイトを用いてメチル化シトシンがウラシルに変換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標識化マーカーまたは標識化プローブを使用するリアルタイムＰＣＲが用いられる、請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の品質を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療では、細胞補充療法の適用において、変性疾患を患う患者への幹細胞投与を可能とする多種多様なアプローチが精力的に追究されている。現在では既に、軟骨再生に役立つ幹細胞を用いる治療法が多数の病院で行われている。近い将来には、幹細胞の適用は急激に増加するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多能性の誘導により高分化型の内在性細胞をリプログラミングする方法は、この開発に寄与するであろう。これにより、免疫拒絶と倫理的側面の両方の問題が回避される
【０００４】
しかしながら、現存する全てのアプローチにおいて、これにはインビトロでの細胞培養が必要され、この細胞培養には一律の基準が存在しない。ヒトでの適用には、幹細胞の性能または品質の判定が必要とされる。
【０００５】
Chuanying Pan et al., J. Genet. Genomics 37 (2010) 241-248では、線維芽細胞の誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells）でのＮＡＮＯＧプロモーターおよびＯＣＴ４プロモーターの脱メチル化が研究された。
【０００６】
Prashant Mali et al., Stem Cells 28 (2010) 713-720では、HumanMethiylation27 BeadChipを用いた誘導多能性幹細胞の脱メチル化が研究された。
【０００７】
本発明の目的は、性能と品質を判定する簡単な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、
多能性幹細胞の少なくとも３つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化を測定するステップと、
少なくとも１つの参照細胞の前記少なくとも３つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける前記少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化と比較するステップ
を含み、
前記遺伝子が、異なる染色体上に位置し、嗅覚受容体遺伝子の遺伝子ファミリーに属する、多能性幹細胞の品質を判定するための方法によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】線維芽細胞、ＩＰＳ線維芽細胞およびＥＳ細胞（Ｉ３）における３つの異なる染色体上の３つの嗅覚受容体遺伝子それぞれの５′領域のＤＮＡメチル化状態を示す図である。
【図２】線維芽細胞、ＩＰＳ線維芽細胞およびＥＳ細胞（Ｉ３）における１番染色体上の嗅覚受容体遺伝子の５′領域のＤＮＡメチル化状態を示す図である。
【図３】線維芽細胞、ＩＰＳ線維芽細胞およびＥＳ細胞（Ｉ３）における１１番染色体上の嗅覚受容体遺伝子の５′領域のＤＮＡメチル化状態を示す図である。
【図４】線維芽細胞、ＩＰＳ線維芽細胞およびＥＳ細胞（Ｉ３）における１９番染色体上の嗅覚受容体遺伝子の５′領域のＤＮＡメチル化状態を示す図である。
【図５】線維芽細胞、ＩＰＳ線維芽細胞およびＥＳ細胞（Ｉ３）における１７番染色体上の嗅覚受容体遺伝子の５′領域のＤＮＡメチル化状態を示す図である。
【図６】線維芽細胞、ＩＰＳ線維芽細胞およびＥＳ細胞（Ｉ３）における３番染色体上の嗅覚受容体遺伝子の５′領域のＤＮＡメチル化状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特定の細胞型、例えば、幹細胞の出現には、細胞型特異的遺伝子の発現が必要とされる。これには、定性的および定量的に適合した遺伝子制御が必要とされる。
【００１１】
遺伝子制御の本質的なメカニズムの１つは、ＤＮＡメチル化である。ヒトの遺伝子の約６０％が、分化した細胞においてＤＮＡメチル化による影響を受けている。ＤＮＡでは、パリンドローム型ＣｐＧジヌクレオチドの構成中に存在するシトシンが、付加的なメチル基を有する場合がある。このようにメチル化された遺伝子は、発現しないか、発現が非常に少ない。
【００１２】
しかしながら、メチル化は、ゲノム全体にわたって遺伝子に均一に分布するのではなく、遺伝子の５′領域に存在するいわゆるＣｐＧアイランドで増加している。
【００１３】
ＣｐＧアイランドが完全にメチル化されている場合、対応する遺伝子の発現は不可能である。メチル化されていない場合、遺伝子は転写能を有する、すなわち、転写され得る。
【００１４】
しかしながら、メチル化され得るＣｐＧジヌクレオチドは、それらが属する遺伝子の制御に対して同等ではない。転写因子の標的配列と関連して作用する、特定のＣｐＧのメチル化が遺伝子発現に最も大きな影響を与える。メチル化されたＣｐＧは、ＤＮＡのメジャーグルーブにおけるそれらの立体的な位置によって、転写因子の結合に影響を与えると考えられている。したがって、どのＣｐＧがメチル化されるかによって、不完全にメチル化されたＣｐＧアイランドにより転写の阻止または転写の減少がもたらされる可能性があるが、転写への抑制的影響が全くないこともある。
【００１５】
本発明によれば、検査される多能性幹細胞の少なくとも３つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化が分析（すなわち、遺伝子が選択）され、これらの遺伝子の公知のＣｐＧアイランドについて、そのＣｐＧアイランドの少なくとも１つの位置のメチル化が測定される。好ましくは、転写制御と高い関連性のあるＣｐＧアイランド中の位置が測定される。次にこのようなメチル化を参照細胞のメチル化と比較し、参照細胞の同一遺伝子における同一ＣｐＧアイランド、および該ＣｐＧアイランド内の同一位置が比較される。
【００１６】
本発明のある実施形態では、検査される多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞であってもよく、その場合、公知の多能性幹細胞が参照細胞として適切である。
【００１７】
被検幹細胞と参照細胞が同様のメチル化パターンまたは同一のメチル化パターンを有する場合は、リプログラミングの成功を示し、高品質の誘導多能性幹細胞が得られたことを示す。さらに、またはその代わりに、例えば線維芽細胞などの出発細胞を、参照細胞として使用することもできる。ＤＮＡメチル化の変化の程度を用いて、出発細胞からの誘導の成功を判断することもでき、高分化細胞と推定上の誘導幹細胞とが類似するほどその誘導幹細胞の品質は悪くなる。
【００１８】
幹細胞は、長期にわたって培養下で維持されていることが多い。何年間も培養下で維持されている、一部は胚性幹細胞に由来する幹細胞株が存在する。この場合、幹細胞が培養中に損傷を受け、このことに長い間気付かれないままでいた可能性があることを排除することはできない。この場合、本発明の方法を用いて、培養中に２つ以上の遺伝子の１つまたは複数のＣｐＧアイランドのメチル化の程度を観察し、差異の発生から培養細胞の変化を結論づけることができる。すなわち、もとの培養細胞のＤＮＡメチル化パターンから逸脱したＤＮＡメチル化パターンを示す細胞は、品質がより低い。
【００１９】
本発明によれば、３つの遺伝子のＤＮＡメチル化が判定されるだけではなく、差異をより顕著なものとするために、より多くの遺伝子が用いられることが好ましい。本発明によれば、遺伝子の数は、３、または４、または５、または７、または１０、またはそれ以上であってもよい。
【００２０】
メチロームについての代表的な所見を得るためには、異なる染色体上に位置する遺伝子が検査され、これにより細胞状態の全体像が良好になる。
【００２１】
多くの場合、少なくとも一部はある遺伝子ファミリーに属する遺伝子を検査することが適切である。他の実施形態では、例えば、ある遺伝子がある遺伝子ファミリーに属し、別の遺伝子が別の遺伝子ファミリーに属する、１０の遺伝子を検査することもまた適切であり得る。
【００２２】
本発明の方法では、常に、同一遺伝子の同一ＣｐＧアイランドにおける同一位置のみのメチル化の程度が比較可能であることが重要である。
【００２３】
本発明によれば、測定されるＣｐＧアイランドの各々における単一の位置が分析されるだけではなく、複数の位置が分析されることが好ましく、または、複数のＣｐＧアイランドが存在する場合、複数のＣｐＧアイランドの複数の位置が分析されることが好ましい。
【００２４】
本発明で使用される遺伝子ファミリーは、嗅覚受容体遺伝子の遺伝子ファミリーである（The human olfactory receptor gene family, Malnic B, Godfrey PA, Buck LB. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2004 Feb 24; 101(8): 2584-9. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2004 May 4; 101(18): 7205、およびThe mouse olfactory receptor gene family. Godfrey PA, Malnic B, Buck LB. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2004 Feb 17; 101(7): 2156-61. Epub 2004 Feb 9）。嗅覚受容体遺伝子は、ヒトゲノムにおいて最大の遺伝子ファミリーである（約１，０００遺伝子）。これらの遺伝子は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞において、それらの５′領域でＣｐＧアイランドと関連しており、両タイプの幹細胞において、このアイランドは密にメチル化されている。対照的に、線維芽細胞における同じ遺伝子の同じＣｐＧアイランドは、基本的にメチル化されていない。この差異は、各染色体においてもしばしば見られることから、明らかにゲノムのＤＮＡメチル化（「メチローム」）を反映していることを示す。嗅覚受容体遺伝子の遺伝子ファミリーの特別な利点は、それらが多数存在すること、全ての染色体に分布すること、ならびに胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞において密にメチル化されていることにある。したがって、異なってメチル化され得る多数のゲノム部位におけるメチル化を判定することが可能である。好ましくは少なくとも１０の部位、より好ましくは少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１０００の部位が分析されて、評価に用いられる。
【００２５】
前記遺伝子の命名法は「ＯＲｎＸｍ」であり、「ＯＲ」は嗅覚受容体スーパーファミリーを表し、
「ｎ」は、ファミリーを表す整数であり、そのメンバーは、４０％を超える配列同一性を有し、
「Ｘ」は、サブファミリーを表す一文字であり、そのメンバーは、６０％を超える配列同一性を有し、
「ｍ」は、個々のファミリーメンバーを示す整数である。
【００２６】
したがって、例えば、ＯＲ１Ａ１は、嗅覚受容体ファミリー１のサブファミリーＡの第１アイソフォームである。
【００２７】
同一のサブファミリーの受容体は、類似の分子を認識すると考えられている。
【００２８】
ＯＲファミリー５１〜５６を含むクラスＩ（魚類様受容体）、およびＯＲファミリー１〜１３を含むクラスＩＩ（四肢動物）の２つの大きなグループが存在する。
【００２９】
好適に使用される受容体遺伝子は、以下の通りである。
ＯＲ１Ａ１；ＯＲ１Ａ２；ＯＲ１ＡＡ１Ｐ；ＯＲ１ＡＢ１Ｐ；ＯＲ１ＡＣ１Ｐ；ＯＲ１Ｂ１；ＯＲ１Ｃ１；ＯＲ１Ｄ２；ＯＲ１Ｄ３Ｐ；ＯＲ１Ｄ４；ＯＲ１Ｄ５；ＯＲ１Ｅ１；ＯＲ１Ｅ２；ＯＲ１Ｅ３；ＯＲ１Ｆ１；ＯＲ１Ｆ２Ｐ；ＯＲ１Ｆ１２；ＯＲ１Ｇ１；ＯＲ１Ｈ１Ｐ；ＯＲ１Ｉ１；ＯＲ１Ｊ１；ＯＲ１Ｊ２；ＯＲ１Ｊ４；ＯＲ１Ｋ１；ＯＲ１Ｌ１；ＯＲ１Ｌ３；ＯＲ１Ｌ４；ＯＲ１Ｌ６；ＯＲ１Ｌ８；ＯＲ１Ｍ１；ＯＲ１Ｍ４Ｐ；ＯＲ１Ｎ１；ＯＲ１Ｎ２；ＯＲ１Ｐ１；ＯＲ１Ｑ１；ＯＲ１Ｒ１Ｐ；ＯＲ１Ｓ１；ＯＲ１Ｓ２；ＯＲ１Ｘ１Ｐ；ＯＲ１Ｘ５Ｐ；ＯＲ２Ａ１；ＯＲ２Ａ２；ＯＲ２Ａ３Ｐ；ＯＲ２Ａ４；ＯＲ２Ａ５；ＯＲ２Ａ７；ＯＲ２Ａ９Ｐ；ＯＲ２Ａ１２；ＯＲ２Ａ１３Ｐ；ＯＲ２Ａ１４；ＯＲ２Ａ１５Ｐ；ＯＲ２Ａ２０Ｐ；ＯＲ２Ａ２５；ＯＲ２Ａ４１Ｐ；ＯＲ２Ａ４２；ＯＲ２ＡＤ１Ｐ；ＯＲ２ＡＥ１；ＯＲ２ＡＦ１Ｐ；ＯＲ２ＡＧ１；ＯＲ２ＡＧ２；ＯＲ２ＡＨ１Ｐ；ＯＲ２ＡＩ１Ｐ；ＯＲ２ＡＪ１；ＯＲ２ＡＫ２；ＯＲ２ＡＬ１Ｐ；ＯＲ２ＡＭ１Ｐ；ＯＲ２ＡＯ１Ｐ；ＯＲ２ＡＰ１；ＯＲ２ＡＱ１Ｐ；ＯＲ２ＡＳ１Ｐ；ＯＲ２ＡＳ２Ｐ；ＯＲ２ＡＴ１Ｐ；ＯＲ２ＡＴ２Ｐ；ＯＲ２ＡＴ４；ＯＲ２Ｂ２；ＯＲ２Ｂ３；ＯＲ２Ｂ４Ｐ；ＯＲ２Ｂ６；ＯＲ２Ｂ７Ｐ；ＯＲ２Ｂ８Ｐ；ＯＲ２Ｂ１１；ＯＲ２ＢＨ１Ｐ；ＯＲ２Ｃ１；ＯＲ２Ｃ３；ＯＲ２Ｄ２；ＯＲ２Ｄ３；ＯＲ２Ｅ１Ｐ；ＯＲ２Ｆ１；ＯＲ２Ｆ２；ＯＲ２Ｇ１Ｐ；ＯＲ２Ｇ２；ＯＲ２Ｇ３；ＯＲ２Ｇ６；ＯＲ２Ｈ１；ＯＲ２Ｈ２；ＯＲ２Ｈ４Ｐ；ＯＲ２Ｈ５Ｐ；ＯＲ２Ｉ１Ｐ；ＯＲ２Ｊ１；ＯＲ２Ｊ２；ＯＲ２Ｊ３；ＯＲ２Ｊ４Ｐ；ＯＲ２Ｋ２；ＯＲ２Ｌ１Ｐ；ＯＲ２Ｌ２；ＯＲ２Ｌ３；ＯＲ２Ｌ５；ＯＲ２Ｌ６Ｐ；ＯＲ２Ｌ８；ＯＲ２Ｌ９Ｐ；ＯＲ２Ｌ１３；ＯＲ２Ｍ１Ｐ；ＯＲ２Ｍ２；ＯＲ２Ｍ３；ＯＲ２Ｍ４；ＯＲ２Ｍ５；ＯＲ２Ｍ７；ＯＲ２Ｎ１Ｐ；ＯＲ２Ｐ１Ｐ；ＯＲ２Ｑ１Ｐ；ＯＲ２Ｒ１Ｐ；ＯＲ２Ｓ１Ｐ；ＯＲ２Ｓ２；ＯＲ２Ｔ１；ＯＲ２Ｔ２；ＯＲ２Ｔ３；ＯＲ２Ｔ４；ＯＲ２Ｔ５；ＯＲ２Ｔ６；ＯＲ２Ｔ７；ＯＲ２Ｔ８；ＯＲ２Ｔ１０；ＯＲ２Ｔ１１；ＯＲ２Ｔ１２；ＯＲ２Ｔ２７；ＯＲ２Ｔ２９；ＯＲ２Ｔ３２Ｐ；ＯＲ２Ｔ３３；ＯＲ２Ｔ３４；ＯＲ２Ｔ３５；ＯＲ２Ｕ１Ｐ；ＯＲ２Ｕ２Ｐ；ＯＲ２Ｖ１；ＯＲ２Ｖ２；ＯＲ２Ｗ１；ＯＲ２Ｗ２Ｐ；ＯＲ２Ｗ３；ＯＲ２Ｗ４Ｐ；ＯＲ２Ｗ５；ＯＲ２Ｗ６Ｐ；ＯＲ２Ｘ１Ｐ；ＯＲ２Ｙ１；ＯＲ２Ｚ１；ＯＲ３Ａ１；ＯＲ３Ａ２；ＯＲ３Ａ３；ＯＲ３Ａ４Ｐ；ＯＲ３Ｂ１Ｐ；ＯＲ３Ｄ１Ｐ；ＯＲ４Ａ１Ｐ；ＯＲ４Ａ２Ｐ；ＯＲ４Ａ３Ｐ；ＯＲ４Ａ４Ｐ；ＯＲ４Ａ５；ＯＲ４Ａ６Ｐ；ＯＲ４Ａ７Ｐ；ＯＲ４Ａ８Ｐ；ＯＲ４Ａ９Ｐ；ＯＲ４Ａ１０Ｐ；ＯＲ４Ａ１１Ｐ；ＯＲ４Ａ１２Ｐ；ＯＲ４Ａ１３Ｐ；ＯＲ４Ａ１４Ｐ；ＯＲ４Ａ１５；ＯＲ４Ａ１６；ＯＲ４Ａ１７Ｐ；ＯＲ４Ａ１８Ｐ；ＯＲ４Ａ１９Ｐ；ＯＲ４Ａ２１Ｐ；ＯＲ４Ａ４０Ｐ；ＯＲ４Ａ４１Ｐ；ＯＲ４Ａ４２Ｐ；ＯＲ４Ａ４３Ｐ；ＯＲ４Ａ４４Ｐ；ＯＲ４Ａ４５Ｐ；ＯＲ４Ａ４６Ｐ；ＯＲ４Ａ４７；ＯＲ４Ａ４８Ｐ；ＯＲ４Ａ４９Ｐ；ＯＲ４Ａ５０Ｐ；ＯＲ４Ｂ１；ＯＲ４Ｂ２Ｐ；ＯＲ４Ｃ１Ｐ；ＯＲ４Ｃ２Ｐ；ＯＲ４Ｃ３；ＯＲ４Ｃ４Ｐ；ＯＲ４Ｃ５；ＯＲ４Ｃ６；ＯＲ４Ｃ７Ｐ；ＯＲ４Ｃ９Ｐ；ＯＲ４Ｃ１０Ｐ；ＯＲ４Ｃ１１；ＯＲ４Ｃ１２；ＯＲ４Ｃ１３；ＯＲ４Ｃ１４Ｐ；ＯＲ４Ｃ１５；ＯＲ４Ｃ１６；ＯＲ４Ｃ４５；ＯＲ４Ｃ４６；ＯＲ４Ｃ４８Ｐ；ＯＲ４Ｃ４９Ｐ；ＯＲ４Ｃ５０Ｐ；ＯＲ４Ｄ１；ＯＲ４Ｄ２；ＯＲ４Ｄ５；ＯＲ４Ｄ６；ＯＲ４Ｄ７Ｐ；ＯＲ４Ｄ８Ｐ；ＯＲ４Ｄ９；ＯＲ４Ｄ１０；ＯＲ４Ｄ１１；ＯＲ４Ｄ１２Ｐ；ＯＲ４Ｅ１；ＯＲ４Ｅ２；ＯＲ４Ｆ１Ｐ；ＯＲ４Ｆ２Ｐ；ＯＲ４Ｆ３；ＯＲ４Ｆ４；ＯＲ４Ｆ５；ＯＲ４Ｆ６；ＯＲ４Ｆ７Ｐ；ＯＲ４Ｆ８Ｐ；ＯＲ４Ｆ１３Ｐ；ＯＲ４Ｆ１４Ｐ；ＯＲ４Ｆ１５；ＯＲ４Ｆ１６；ＯＲ４Ｆ１７；ＯＲ４Ｆ２１；ＯＲ４Ｆ２８Ｐ；ＯＲ４Ｆ２９；ＯＲ４Ｇ１Ｐ；ＯＲ４Ｇ２Ｐ；ＯＲ４Ｇ３Ｐ；ＯＲ４Ｇ４Ｐ；ＯＲ４Ｇ６Ｐ；ＯＲ４Ｇ１１Ｐ；ＯＲ４Ｈ６Ｐ；ＯＲ４Ｈ１２Ｐ；ＯＲ４Ｋ１；ＯＲ４Ｋ２；ＯＲ４Ｋ３；ＯＲ４Ｋ４Ｐ；ＯＲ４Ｋ５；ＯＲ４Ｋ６Ｐ；ＯＲ４Ｋ７Ｐ；ＯＲ４Ｋ８Ｐ；ＯＲ４Ｋ１１Ｐ；ＯＲ４Ｋ１２Ｐ；ＯＲ４Ｋ１３；ＯＲ４Ｋ１４；ＯＲ４Ｋ１５；ＯＲ４Ｋ１６Ｐ；ＯＲ４Ｋ１７；ＯＲ４Ｌ１；ＯＲ４Ｍ１；ＯＲ４Ｍ２；ＯＲ４Ｎ１Ｐ；ＯＲ４Ｎ２；ＯＲ４Ｎ３Ｐ；ＯＲ４Ｎ４；ＯＲ４Ｎ５；ＯＲ４Ｐ１Ｐ；ＯＲ４Ｐ４；ＯＲ４Ｑ１Ｐ；ＯＲ４Ｑ２；ＯＲ４Ｑ３；ＯＲ４Ｒ１Ｐ；ＯＲ４Ｒ２Ｐ；ＯＲ４Ｒ３Ｐ；ＯＲ４Ｓ１；ＯＲ４Ｓ２；ＯＲ４Ｔ１Ｐ；ＯＲ４Ｕ１Ｐ；ＯＲ４Ｖ１Ｐ；ＯＲ４Ｗ１Ｐ；ＯＲ４Ｘ１；ＯＲ４Ｘ２；ＯＲ４Ｘ７Ｐ；ＯＲ５Ａ１；ＯＲ５Ａ２；ＯＲ５ＡＣ１；ＯＲ５ＡＣ２；ＯＲ５ＡＣ４Ｐ；ＯＲ５ＡＨ１Ｐ；ＯＲ５ＡＫ１Ｐ；ＯＲ５ＡＫ２；ＯＲ５ＡＫ３Ｐ；ＯＲ５ＡＫ４Ｐ；ＯＲ５ＡＬ１；ＯＲ５ＡＬ２Ｐ；ＯＲ５ＡＭ１Ｐ；ＯＲ５ＡＮ１；ＯＲ５ＡＮ２Ｐ；ＯＲ５ＡＯ１Ｐ；ＯＲ５ＡＰ１Ｐ；ＯＲ５ＡＰ２；ＯＲ５ＡＱ１Ｐ；ＯＲ５ＡＲ１；ＯＲ５ＡＳ１；ＯＲ５ＡＵ１；ＯＲ５ＡＷ１Ｐ；ＯＲ５ＡＺ１Ｐ；ＯＲ５Ｂ１Ｐ；ＯＲ５Ｂ２；ＯＲ５Ｂ３；ＯＲ５Ｂ１０Ｐ；ＯＲ５Ｂ１２；ＯＲ５Ｂ１５Ｐ；ＯＲ５Ｂ１７；ＯＲ５Ｂ１９Ｐ；ＯＲ５Ｂ２１；ＯＲ５ＢＡ１Ｐ；ＯＲ５ＢＢ１Ｐ；ＯＲ５ＢＣ１Ｐ；ＯＲ５ＢＤ１Ｐ；ＯＲ５ＢＥ１Ｐ；ＯＲ５ＢＨ１Ｐ；ＯＲ５ＢＪ１Ｐ；ＯＲ５ＢＫ１Ｐ；ＯＲ５ＢＬ１Ｐ；ＯＲ５ＢＭ１Ｐ；ＯＲ５ＢＮ１Ｐ；ＯＲ５ＢＮ２Ｐ；ＯＲ５ＢＰ１Ｐ；ＯＲ５ＢＱ１Ｐ；ＯＲ５ＢＲ１Ｐ；ＯＲ５ＢＳ１Ｐ；ＯＲ５ＢＴ１Ｐ；ＯＲ５Ｃ１；ＯＲ５Ｄ２Ｐ；ＯＲ５Ｄ３Ｐ；ＯＲ５Ｄ１３；ＯＲ５Ｄ１４；ＯＲ５Ｄ１５Ｐ；ＯＲ５Ｄ１６；ＯＲ５Ｄ１７Ｐ；ＯＲ５Ｄ１８；ＯＲ５Ｅ１Ｐ；ＯＲ５Ｆ１；ＯＲ５Ｆ２Ｐ；ＯＲ５Ｇ１Ｐ；ＯＲ５Ｇ３；ＯＲ５Ｇ４Ｐ；ＯＲ５Ｇ５Ｐ；ＯＲ５Ｈ１；ＯＲ５Ｈ２；ＯＲ５Ｈ３Ｐ；ＯＲ５Ｈ４Ｐ；ＯＲ５Ｈ５Ｐ；ＯＲ５Ｈ６；ＯＲ５Ｈ７Ｐ；ＯＲ５Ｈ８Ｐ；ＯＲ５Ｈ１４；ＯＲ５Ｈ１５；ＯＲ５Ｉ１；ＯＲ５Ｊ１Ｐ；ＯＲ５Ｊ２；ＯＲ５Ｊ７Ｐ；ＯＲ５Ｋ１；ＯＲ５Ｋ２；ＯＲ５Ｋ３；ＯＲ５Ｋ４；ＯＲ５Ｌ１；ＯＲ５Ｌ２；ＯＲ５Ｍ１；ＯＲ５Ｍ２Ｐ；ＯＲ５Ｍ３；ＯＲ５Ｍ４Ｐ；ＯＲ５Ｍ５Ｐ；ＯＲ５Ｍ６Ｐ；ＯＲ５Ｍ７Ｐ；ＯＲ５Ｍ８；ＯＲ５Ｍ９；ＯＲ５Ｍ１０；ＯＲ５Ｍ１１；ＯＲ５Ｍ１２Ｐ；ＯＲ５Ｍ１３Ｐ；ＯＲ５Ｍ１４Ｐ；ＯＲ５Ｐ１Ｐ；ＯＲ５Ｐ２；ＯＲ５Ｐ３；ＯＲ５Ｐ４Ｐ；ＯＲ５Ｒ１；ＯＲ５Ｓ１Ｐ；ＯＲ５Ｔ１；ＯＲ５Ｔ２；ＯＲ５Ｔ３；ＯＲ５Ｖ１；ＯＲ５Ｗ１Ｐ；ＯＲ５Ｗ２；ＯＲ６Ａ２；ＯＲ６Ｂ１；ＯＲ６Ｂ２；ＯＲ６Ｂ３；ＯＲ６Ｃ１；ＯＲ６Ｃ２；ＯＲ６Ｃ３；ＯＲ６Ｃ４；ＯＲ６Ｃ５Ｐ；ＯＲ６Ｃ６；ＯＲ６Ｃ７Ｐ；ＯＲ６Ｃ６４Ｐ；ＯＲ６Ｃ６５；ＯＲ６Ｃ６６Ｐ；ＯＲ６Ｃ６８；ＯＲ６Ｃ６９Ｐ；ＯＲ６Ｃ７０；ＯＲ６Ｃ７１Ｐ；ＯＲ６Ｃ７２Ｐ；ＯＲ６Ｃ７３Ｐ；ＯＲ６Ｃ７４；ＯＲ６Ｃ７５；ＯＲ６Ｃ７６；ＯＲ６Ｄ１Ｐ；ＯＲ６Ｅ１Ｐ；ＯＲ６Ｆ１；ＯＲ６Ｊ１；ＯＲ６Ｋ１Ｐ；ＯＲ６Ｋ２；ＯＲ６Ｋ３；ＯＲ６Ｋ４Ｐ；ＯＲ６Ｋ５Ｐ；ＯＲ６Ｋ６；ＯＲ６Ｌ１Ｐ；ＯＲ６Ｌ２Ｐ；ＯＲ６Ｍ１；ＯＲ６Ｍ２Ｐ；ＯＲ６Ｍ３Ｐ；ＯＲ６Ｎ１；ＯＲ６Ｎ２；ＯＲ６Ｐ１；ＯＲ６Ｑ１；ＯＲ６Ｒ１Ｐ；ＯＲ６Ｒ２Ｐ；ＯＲ６Ｓ１；ＯＲ６Ｔ１；ＯＲ６Ｕ２Ｐ；ＯＲ６Ｖ１；ＯＲ６Ｗ１Ｐ；ＯＲ６Ｘ１；ＯＲ６Ｙ１；ＯＲ７Ａ１Ｐ；ＯＲ７Ａ２Ｐ；ＯＲ７Ａ３Ｐ；ＯＲ７Ａ５；ＯＲ７Ａ８Ｐ；ＯＲ７Ａ１０；ＯＲ７Ａ１１Ｐ；ＯＲ７Ａ１５Ｐ；ＯＲ７Ａ１７；ＯＲ７Ａ１８Ｐ；ＯＲ７Ａ１９Ｐ；ＯＲ７Ｃ１；ＯＲ７Ｃ２；ＯＲ７Ｄ１Ｐ；ＯＲ７Ｄ２；ＯＲ７Ｄ４；ＯＲ７Ｄ１１Ｐ；ＯＲ７Ｅ１Ｐ；ＯＲ７Ｅ２Ｐ；ＯＲ７Ｅ４Ｐ；ＯＲ７Ｅ５Ｐ；ＯＲ７Ｅ７Ｐ；ＯＲ７Ｅ８Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０Ｐ；ＯＲ７Ｅ１１Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２Ｐ；ＯＲ７Ｅ１３Ｐ；ＯＲ７Ｅ１４Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５Ｐ；ＯＲ７Ｅ１６Ｐ；ＯＲ７Ｅ１８Ｐ；ＯＲ７Ｅ１９Ｐ；ＯＲ７Ｅ２１Ｐ；ＯＲ７Ｅ２２Ｐ；ＯＲ７Ｅ２３Ｐ；ＯＲ７Ｅ２４；ＯＲ７Ｅ２５Ｐ；ＯＲ７Ｅ２６Ｐ；ＯＲ７Ｅ２８Ｐ；ＯＲ７Ｅ２９Ｐ；ＯＲ７Ｅ３１Ｐ；ＯＲ７Ｅ３３Ｐ；ＯＲ７Ｅ３５Ｐ；ＯＲ７Ｅ３６Ｐ；ＯＲ７Ｅ３７Ｐ；ＯＲ７Ｅ３８Ｐ；ＯＲ７Ｅ３９Ｐ；ＯＲ７Ｅ４１Ｐ；ＯＲ７Ｅ４３Ｐ；ＯＲ７Ｅ４６Ｐ；ＯＲ７Ｅ４７Ｐ；ＯＲ７Ｅ５３Ｐ；ＯＲ７Ｅ５５Ｐ；ＯＲ７Ｅ５９Ｐ；ＯＲ７Ｅ６２Ｐ；ＯＲ７Ｅ６６Ｐ；ＯＲ７Ｅ８３Ｐ；ＯＲ７Ｅ８４Ｐ；ＯＲ７Ｅ８５Ｐ；ＯＲ７Ｅ８６Ｐ；ＯＲ７Ｅ８７Ｐ；ＯＲ７Ｅ８９Ｐ；ＯＲ７Ｅ９０Ｐ；ＯＲ７Ｅ９１Ｐ；ＯＲ７Ｅ９３Ｐ；ＯＲ７Ｅ９４Ｐ；ＯＲ７Ｅ９６Ｐ；ＯＲ７Ｅ９７Ｐ；ＯＲ７Ｅ９９Ｐ；ＯＲ７Ｅ１００Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０１Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０２Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０４Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０５Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０６Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０８Ｐ；ＯＲ７Ｅ１０９Ｐ；ＯＲ７Ｅ１１０Ｐ；ＯＲ７Ｅ１１１Ｐ；ＯＲ７Ｅ１１５Ｐ；ＯＲ７Ｅ１１６Ｐ；ＯＲ７Ｅ１１７Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２１Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２２Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２５Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２６Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２８Ｐ；ＯＲ７Ｅ１２９Ｐ；ＯＲ７Ｅ１３０Ｐ；ＯＲ７Ｅ１３６Ｐ；ＯＲ７Ｅ１４０Ｐ；ＯＲ７Ｅ１４５Ｐ；ＯＲ７Ｅ１４８Ｐ；ＯＲ７Ｅ１４９Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５４Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５５Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５６Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５７Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５８Ｐ；ＯＲ７Ｅ１５９Ｐ；ＯＲ７Ｅ１６０Ｐ；ＯＲ７Ｅ１６１Ｐ；ＯＲ７Ｅ１６２Ｐ；ＯＲ７Ｇ１；ＯＲ７Ｇ２；ＯＲ７Ｇ３；ＯＲ７Ｇ１５Ｐ；ＯＲ７Ｈ１Ｐ；ＯＲ７Ｈ２Ｐ；ＯＲ７Ｋ１Ｐ；ＯＲ７Ｌ１Ｐ；ＯＲ７Ｍ１Ｐ；ＯＲ８Ａ１；ＯＲ８Ａ２Ｐ；ＯＲ８Ａ３Ｐ；ＯＲ８Ｂ１Ｐ；ＯＲ８Ｂ２；ＯＲ８Ｂ３；ＯＲ８Ｂ４；ＯＲ８Ｂ５Ｐ；ＯＲ８Ｂ６Ｐ；ＯＲ８Ｂ７Ｐ；ＯＲ８Ｂ８；ＯＲ８Ｂ９Ｐ；ＯＲ８Ｂ１０Ｐ；ＯＲ８Ｂ１２；ＯＲ８Ｃ１Ｐ；ＯＲ８Ｄ１；ＯＲ８Ｄ２；ＯＲ８Ｄ４；ＯＲ８Ｆ１Ｐ；ＯＲ８Ｇ１；ＯＲ８Ｇ２；ＯＲ８Ｇ３Ｐ；ＯＲ８Ｇ５；ＯＲ８Ｇ７Ｐ；ＯＲ８Ｈ１；ＯＲ８Ｈ２；ＯＲ８Ｈ３；ＯＲ８Ｉ１Ｐ；ＯＲ８Ｉ２；ＯＲ８Ｉ４Ｐ；ＯＲ８Ｊ１；ＯＲ８Ｊ２；ＯＲ８Ｊ３；ＯＲ８Ｋ１；ＯＲ８Ｋ２Ｐ；ＯＲ８Ｋ３；ＯＲ８Ｋ４Ｐ；ＯＲ８Ｋ５；ＯＲ８Ｌ１Ｐ；ＯＲ８Ｑ１Ｐ；ＯＲ８Ｒ１Ｐ；ＯＲ８Ｓ１；ＯＲ８Ｓ２１Ｐ；ＯＲ８Ｔ１Ｐ；ＯＲ８Ｕ１；ＯＲ８Ｕ８；ＯＲ８Ｕ９；ＯＲ８Ｖ１Ｐ；ＯＲ８Ｘ１Ｐ；ＯＲ９Ａ１Ｐ；ＯＲ９Ａ２；ＯＲ９Ａ３Ｐ；ＯＲ９Ａ４；ＯＲ９Ｇ１；ＯＲ９Ｇ２Ｐ；ＯＲ９Ｇ３Ｐ；ＯＲ９Ｇ４；ＯＲ９Ｇ９；ＯＲ９Ｈ１Ｐ；ＯＲ９Ｉ１；ＯＲ９Ｉ２Ｐ；ＯＲ９Ｉ３Ｐ；ＯＲ９Ｋ１Ｐ；ＯＲ９Ｋ２；ＯＲ９Ｌ１Ｐ；ＯＲ９Ｍ１Ｐ；ＯＲ９Ｎ１Ｐ；ＯＲ９Ｐ１Ｐ；ＯＲ９Ｑ１；ＯＲ９Ｑ２；ＯＲ９Ｒ１Ｐ；ＯＲ９Ｓ２４Ｐ；ＯＲ１０Ａ２；ＯＲ１０Ａ３；ＯＲ１０Ａ４；ＯＲ１０Ａ５；ＯＲ１０Ａ６；ＯＲ１０Ａ７；ＯＲ１０ＡＡ１Ｐ；ＯＲ１０ＡＢ１Ｐ；ＯＲ１０ＡＣ１Ｐ；ＯＲ１０ＡＤ１；ＯＲ１０ＡＥ１Ｐ；ＯＲ１０ＡＥ３Ｐ；ＯＲ１０ＡＦ１Ｐ；ＯＲ１０ＡＧ１；ＯＲ１０ＡＨ１Ｐ；ＯＲ１０ＡＫ１Ｐ；ＯＲ１０Ｂ１Ｐ；ＯＲ１０Ｃ１；ＯＲ１０Ｄ１Ｐ；ＯＲ１０Ｄ３；ＯＲ１０Ｄ４Ｐ；ＯＲ１０Ｄ５Ｐ；ＯＲ１０Ｇ１Ｐ；ＯＲ１０Ｇ２；ＯＲ１０Ｇ３；ＯＲ１０Ｇ４；ＯＲ１０Ｇ５Ｐ；ＯＲ１０Ｇ６；ＯＲ１０Ｇ７；ＯＲ１０Ｇ８；ＯＲ１０Ｇ９；ＯＲ１０Ｈ１；ＯＲ１０Ｈ２；ＯＲ１０Ｈ３；ＯＲ１０Ｈ４；ＯＲ１０Ｈ５；ＯＲ１０Ｊ１；ＯＲ１０Ｊ２Ｐ；ＯＲ１０Ｊ３；ＯＲ１０Ｊ４；ＯＲ１０Ｊ５；ＯＲ１０Ｊ６Ｐ；ＯＲ１０Ｊ７Ｐ；ＯＲ１０Ｊ８Ｐ；ＯＲ１０Ｊ９Ｐ；ＯＲ１０Ｋ１；ＯＲ１０Ｋ２；ＯＲ１０Ｎ１Ｐ；ＯＲ１０Ｐ１；ＯＲ１０Ｑ１；ＯＲ１０Ｑ２Ｐ；ＯＲ１０Ｒ１Ｐ；ＯＲ１０Ｒ２；ＯＲ１０Ｒ３Ｐ；ＯＲ１０Ｓ１；ＯＲ１０Ｔ１Ｐ；ＯＲ１０Ｔ２；ＯＲ１０Ｕ１Ｐ；ＯＲ１０Ｖ１；ＯＲ１０Ｖ２Ｐ；ＯＲ１０Ｖ３Ｐ；ＯＲ１０Ｖ７Ｐ；ＯＲ１０Ｗ１；ＯＲ１０Ｘ１；ＯＲ１０Ｙ１Ｐ；ＯＲ１０Ｚ１；ＯＲ１１Ａ１；ＯＲ１１Ｇ１Ｐ；ＯＲ１１Ｇ２；ＯＲ１１Ｈ１；ＯＲ１１Ｈ２；ＯＲ１１Ｈ３Ｐ；ＯＲ１１Ｈ４；ＯＲ１１Ｈ５Ｐ；ＯＲ１１Ｈ６；ＯＲ１１Ｈ７；ＯＲ１１Ｈ１２；ＯＲ１１Ｈ１３Ｐ；ＯＲ１１Ｉ１Ｐ；ＯＲ１１Ｊ１Ｐ；ＯＲ１１Ｊ２Ｐ；ＯＲ１１Ｊ５Ｐ；ＯＲ１１Ｋ１Ｐ；ＯＲ１１Ｋ２Ｐ；ＯＲ１１Ｌ１；ＯＲ１１Ｍ１Ｐ；ＯＲ１１Ｎ１Ｐ；ＯＲ１
１Ｐ１Ｐ；ＯＲ１１Ｑ１Ｐ；ＯＲ１２Ｄ１Ｐ；ＯＲ１２Ｄ２；ＯＲ１２Ｄ３；ＯＲ１３Ａ１；ＯＲ１３Ｃ１Ｐ；ＯＲ１３Ｃ２；ＯＲ１３Ｃ３；ＯＲ１３Ｃ４；ＯＲ１３Ｃ５；ＯＲ１３Ｃ６Ｐ；ＯＲ１３Ｃ７Ｐ；ＯＲ１３Ｃ８；ＯＲ１３Ｃ９；ＯＲ１３Ｄ１；ＯＲ１３Ｄ２Ｐ；ＯＲ１３Ｄ３Ｐ；ＯＲ１３Ｅ１Ｐ；ＯＲ１３Ｆ１；ＯＲ１３Ｇ１；ＯＲ１３Ｈ１；ＯＲ１３Ｉ１Ｐ；ＯＲ１３Ｊ１；ＯＲ１３Ｋ１Ｐ；ＯＲ１３Ｚ１Ｐ；ＯＲ１３Ｚ２Ｐ；ＯＲ１３Ｚ３Ｐ；ＯＲ１４Ａ２；ＯＲ１４Ａ１６；ＯＲ１４Ｃ３６；ＯＲ１４Ｉ１；ＯＲ１４Ｊ１；ＯＲ１４Ｋ１；ＯＲ１４Ｌ１Ｐ；ＯＲ５１Ａ１Ｐ；ＯＲ５１Ａ２；ＯＲ５１Ａ３Ｐ；ＯＲ５１Ａ４；ＯＲ５１Ａ５Ｐ；ＯＲ５１Ａ６Ｐ；ＯＲ５１Ａ７；ＯＲ５１Ａ８Ｐ；ＯＲ５１Ａ９Ｐ；ＯＲ５１Ａ１０Ｐ；ＯＲ５１ＡＢ１Ｐ；ＯＲ５１Ｂ２；ＯＲ５１Ｂ３Ｐ；ＯＲ５１Ｂ４；ＯＲ５１Ｂ５；ＯＲ５１Ｂ６；ＯＲ５１Ｂ８Ｐ；ＯＲ５１Ｃ１Ｐ；ＯＲ５１Ｃ４Ｐ；ＯＲ５１Ｄ１；ＯＲ５１Ｅ１；ＯＲ５１Ｅ２；ＯＲ５１Ｆ１；ＯＲ５１Ｆ２；ＯＲ５１Ｆ３Ｐ；ＯＲ５１Ｆ４Ｐ；ＯＲ５１Ｆ５Ｐ；ＯＲ５１Ｇ１；ＯＲ５１Ｇ２；ＯＲ５１Ｈ１Ｐ；ＯＲ５１Ｈ２Ｐ；ＯＲ５１Ｉ１；ＯＲ５１Ｉ２；ＯＲ５１Ｊ１；ＯＲ５１Ｋ１Ｐ；ＯＲ５１Ｌ１；ＯＲ５１Ｍ１；ＯＲ５１Ｎ１Ｐ；ＯＲ５１Ｐ１Ｐ；ＯＲ５１Ｑ１；ＯＲ５１Ｒ１Ｐ；ＯＲ５１Ｓ１；ＯＲ５１Ｔ１；ＯＲ５１Ｖ１；ＯＲ５２Ａ１；ＯＲ５２Ａ４；ＯＲ５２Ａ５；ＯＲ５２Ｂ１Ｐ；ＯＲ５２Ｂ２；ＯＲ５２Ｂ３Ｐ；ＯＲ５２Ｂ４；ＯＲ５２Ｂ５Ｐ；ＯＲ５２Ｂ６；ＯＲ５２Ｄ１；ＯＲ５２Ｅ１；ＯＲ５２Ｅ２；ＯＲ５２Ｅ３Ｐ；ＯＲ５２Ｅ４；ＯＲ５２Ｅ５；ＯＲ５２Ｅ６；ＯＲ５２Ｅ７Ｐ；ＯＲ５２Ｅ８；ＯＲ５２Ｈ１；ＯＲ５２Ｈ２Ｐ；ＯＲ５２Ｉ１；ＯＲ５２Ｉ２；ＯＲ５２Ｊ１Ｐ；ＯＲ５２Ｊ２Ｐ；ＯＲ５２Ｊ３；ＯＲ５２Ｋ１；ＯＲ５２Ｋ２；ＯＲ５２Ｋ３Ｐ；ＯＲ５２Ｌ１；ＯＲ５２Ｌ２Ｐ；ＯＲ５２Ｍ１；ＯＲ５２Ｍ２Ｐ；ＯＲ５２Ｎ１；ＯＲ５２Ｎ２；ＯＲ５２Ｎ３Ｐ；ＯＲ５２Ｎ４；ＯＲ５２Ｎ５；ＯＲ５２Ｐ１Ｐ；ＯＲ５２Ｐ２Ｐ；ＯＲ５２Ｑ１Ｐ；ＯＲ５２Ｒ１；ＯＲ５２Ｓ１Ｐ；ＯＲ５２Ｔ１Ｐ；ＯＲ５２Ｕ１Ｐ；ＯＲ５２Ｖ１Ｐ；ＯＲ５２Ｗ１；ＯＲ５２Ｘ１Ｐ；ＯＲ５２Ｙ１Ｐ；ＯＲ５２Ｚ１；ＯＲ５５Ｂ１Ｐ；ＯＲ５６Ａ１；ＯＲ５６Ａ３；ＯＲ５６Ａ４；ＯＲ５６Ａ５；ＯＲ５６Ａ７Ｐ；ＯＲ５６Ｂ１；ＯＲ５６Ｂ２Ｐ；ＯＲ５６Ｂ３Ｐ；ＯＲ５６Ｂ４。
【００３０】
ＤＮＡメチル化を判定する方法としては、種々の方法が一般に用いられる。一般的な方法の一つには、メチル化特異的ＰＣＲがある。この方法では、メチル化シトシンがバイサルファイトを用いてウラシルに変換される。特異的なプライマーを用いることによって、検査される部位のメチル化の有無を調べることができる。測定方法は、標識化マーカーまたは標識化プローブが使用されるリアルタイムＰＣＲである。
【００３１】
別の判定方法には、ロシュ社のいわゆるNimble-Gene（登録商標）がある。この方法では、５′メチルシチジン特異的抗体を用いてＤＮＡ断片を沈降、単離して、増幅後にアレイ上で検出する。
【００３２】
例えば、放射性標識、サザンブロッティングなどによる他の方法もまた可能である。
【００３３】
複数のＣｐＧアイランド、または１つのＣｐＧアイランド中の複数の位置、または複数の遺伝子を分析する場合、このためのメチル化特異的ＰＣＲ反応を、多数のプライマーを用いる１回のＰＣＲで行うことも原理的には可能である。ＰＣＲの特異性を高めるためには、各検査を別々に行うことが好ましい。
【００３４】
多くの実施形態において、測定の質を確認するために、対照をさらに取り入れることが役に立つであろう。
【００３５】
測定値間で差異が生じる可能性があるので、参照細胞と幹細胞を同時に２つの反応で確認することもまた、しばしば適切であろう。しかしながら、多くの場合、幹細胞のメチル化について、以前の測定値とそれに対応する保存データを再利用すれば十分である。
【００３６】
本発明はまた、
多能性幹細胞の少なくとも２つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化を測定するステップと、
少なくとも１つの参照細胞の前記少なくとも２つの遺伝子のＣｐＧアイランドにおける前記少なくとも１つのＣｐＧのＤＮＡメチル化と比較するステップ
を含む、多能性幹細胞の品質を判定する方法に関する。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【００３８】
１．ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡを以下のように単離した。Qiagen社のDNeasy blood&tissue DNA isolations kitを用いて細胞からゲノムＤＮＡを単離した。
【００３９】
２．メチル化ＤＮＡの単離
超音波処理により１μｇのゲノムＤＮＡを約３００〜１，０００塩基対のサイズの断片に変換した。メチルシトシン特異的抗体を用いてメチル化ＤＮＡ断片を沈降させた。Methylamp Methylated DNA Capture Kit（ダイアジェノード（Diagenode）社のMeDIP）を使用した。
【００４０】
３．メチル化の分析
Nimble-Gene 385K Ref. Seq. Promoter Array HG18（ロシュ社）に沈降物をハイブリダイズさせた。ＣｐＧジヌクレオチドに富む公知の遺伝子全てのプロモーター領域がこのアレイ上に存在し、５０塩基長のオリゴヌクレオチド試料の形状で共有結合している。
【００４１】
ハイブリダイズしたアレイをマイクロアレイスキャナー（モレキュラー・デバイス（Molecular Devices）社）でスキャンし、アクソン（Axon）社のGenepixソフトウェアでイメージを作製した。Nimble-Scan Version 2.5およびSignal-Map Version 1.9を解析のために使用した。
【００４２】
４．品質の判定
使用した細胞は、（ａ）線維芽細胞、（ｂ）４つの転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４のレトロウイルスによる導入によって線維芽細胞から誘導された多能性幹細胞（Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006 Aug 25; 126(4): 663-76. Epub 2006 Aug 10と同様）、および（ｃ）公知の胚性細胞株Ｉ−３から得られた細胞であった。異なる染色体の嗅覚受容体遺伝子上のＣｐＧメチル化を分析した。分析結果を図１〜６に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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