(57)【要約】  本発明は、形質転換アルファルファ事象ＫＫ１７９−２を提供する。本発明は、また、その事象に関する細胞、植物部分、種子、植物、日用品およびその事象に特有で、アルファルファ植物のゲノムに形質転換ＤＮＡを挿入することにより作成されたＤＮＡ分子も提供する。本発明は、さらに、試料におけるアルファルファ事象ヌクレオチド配列の存在を検出するための方法、アルファルファ事象の存在の判定に特徴的なヌクレオチド配列の検出に用いられるプローブおよびプライマーを提供する。
2014524742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、特許委託指定ＰＴＡ−１１８３３として代表的な種子が寄託されているＫＫ１７９−２と指定されたアルファルファ植物の種子。
【請求項２】
請求項１に記載の種子を栽培することにより生成されるアルファルファ植物ＫＫ１７９−２またはその一部。
【請求項３】
花粉、胚珠、花、新芽、根または葉を含む、請求項２に記載のアルファルファ植物ＫＫ１７９−２またはその一部。
【請求項４】
アルファルファ事象ＫＫ１７９−２を含む、請求項２に記載のアルファルファ植物ＫＫ１７９−２の子孫植物またはその一部。
【請求項５】
花粉、胚珠、花、新芽、根または葉をさらに含む、請求項４に記載の子孫植物またはその一部。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４から成る群から選択されるＤＮＡ分子を含むアンプリコンを生成するゲノムを有する、請求項４に記載のアルファルファ植物ＫＫ１７９−２もしくは種子またはその一部。
【請求項７】
ａ．配列番号１および配列番号２から成る群から選択されるポリヌクレオチド分子、
ｂ．配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド分子、または
ｃ．ａ）またはｂ）に相補的なポリヌクレオチド分子
を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
種子の代表的な試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１８３３として寄託されている事象ＫＫ１７９−２に由来する、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
事象ＫＫ１７９−２からのＤＮＡに由来するテンプレート分子から生成されたアンプリコンである、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
事象ＫＫ１７９−２ＤＮＡの存在の判定に特徴的なポリヌクレオチドプローブであって、前記ポリヌクレオチドプローブが配列番号１および配列番号２、またはこれらの相補体を含む核酸分子に連結するのに十分な長さを有し、前記ポリヌクレオチドプローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号２、またはそれらの相補体を含むＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２またはこれらの相補体を含まないＤＮＡ分子をハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
ＤＮＡ試料中の事象ＫＫ１７９−２に由来するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、
ａ．前記ＤＮＡ試料を請求項６に記載のポリヌクレオチドプローブと接触させることと、
ｂ．前記ＤＮＡ試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、
ｃ．前記ＤＮＡ試料中の事象ＫＫ１７９−２に由来する前記ＤＮＡ分子への前記ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出することと
を含む方法。
【請求項１２】
第一のＤＮＡ分子および前記第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子から成るＤＮＡ分子の対であって、試料中で事象ＫＫ１７９−２の判定に特徴的なアンプリコンＤＮＡを生成するための増幅反応において、事象ＫＫ１７９−２由来のテンプレートと併用した場合に、前記第一および第二のＤＮＡ分子が、ＤＮＡプライマーとして機能するために十分な長さの配列番号６の連続的ヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補体を有するポリヌクレオチド分子を含んでいる、ＤＮＡ分子の対。
【請求項１３】
事象ＫＫ１７９−２に由来するＤＮＡの存在を検出するために特異的なＤＮＡプライマーまたはポリヌクレオチドプローブとして機能するために十分な長さの配列番号６の連続的ヌクレオチドまたはその相補体の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含み、前記ＤＮＡの検出が試料中の前記ＫＫ１７９−２ＤＮＡの存在の判定に特徴的となる、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１４】
少なくとも１つのポリヌクレオチド分子が配列番号１および配列番号２から成る群から選択される、請求項１３に記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１５】
請求項７に記載のＤＮＡ分子を含む微生物。
【請求項１６】
植物細胞である、請求項１５に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１１年６月３０日出願の米国仮特許出願第６１／５０３，３７３号および２０１２年６月２６日出願の米国仮特許出願第６１／６６４，３５９号の優先権を有し、これら出願の開示内容の全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の援用
電子的に提出され、２０１２年５月１日に作成されたファイル名「５７９７８＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、（ＭＳ−ＷＩＮＤＯＷＳ上での）サイズが１０，５６４バイトである、配列表のファイルを、参照により本明細書に援用する。
【０００３】
本発明は、アルファルファ形質転換事象ＫＫ１７９−２に関する。また、本発明は、当該事象に関する細胞、植物部分、種子、植物および日用品、ならびに当該事象に特有であり、アルファルファ植物のゲノムに形質転換ＤＮＡを挿入することにより作成されたＤＮＡ分子も提供する。さらに、本発明は、試料中のアルファルファ事象ヌクレオチド配列の存在を検出するための方法、アルファルファ事象の存在の判定に特徴的なヌクレオチド配列の検出に用いられるプローブおよびプライマーを提供する。
【背景技術】
【０００４】
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）は、世界で最も栽培されているマメ科植物であり、米国はアルファルファの生産国としては１位である。アルファルファの農業形質および品質を改善するために、アルファルファ作物にバイオテクノロジー手法が適用されている。かかる農業形質の１つとしてリグニン含有量が挙げられる。
【０００５】
リグニンは地上で２番目に多量に存在する生体高分子であり、有機炭素の３０％を占める。リグニンは細胞壁の構造的一体性にとって不可欠であり、茎に硬度および強度を与える。リグニン含有量は、乳牛の飼料消化率に逆相関する。リグニンの低減は、かかる低減をもたらしながら、同時にアルファルファの消化率を増加させることができるＲＮＡ抑制構築体の発現により、形質転換植物で達成され得る。植物における外来遺伝子または抑制分子の発現は、用いられる調節要素、導入遺伝子挿入物の染色体位置、導入遺伝子挿入部位の近くにある任意の内在性調節要素の近接度、および光や温度などの環境的要因など、多くの要因により影響を受けることが知られている。例えば、導入遺伝子抑制の全体的なレベルにおける差異または類似して生成された事象間での導入遺伝子抑制の空間的もしくは時間的な差異が存在し得ることが観察されている。この理由のため、商業的な農業目的に有用な１つの事象を最終的に特定するために、数百もの独立した形質転換事象をスクリーニングすることが必要となることが多々ある。かかる事象は、所望される抑制表現型、分子特性および改善された形質を備えていると特定されると、植物育種方法を使用して、他の遺伝的背景にその改善された形質を遺伝子移入する目的に用いることができる。その結果、得られる子孫は、その形質転換事象を含み、したがって、元の形質転換体のその形質と同一の特性を有することになる。これは改善された形質を含み、特定の局地的な生育条件に好適に適合化したいくつもの異なる作物種を生産する目的に用いることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
有性交配の子孫に、対象とする導入遺伝子／ゲノムＤＮＡが含まれるかを判断するために、特定の植物の導入遺伝子／ゲノムＤＮＡの存在を検出することができれば有益であると考えられる。さらに、特定の植物を検出する方法は、形質転換作物由来の食物の市販前承認およびラベル付与を要求する規制に準拠すれば有用になるであろう。
【０００７】
核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションなどの、周知の核酸検出方法によって、抑制要素の有無を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、プロモーター、ターミネーター、標識遺伝子などの、頻繁に利用される遺伝子要素に着目する。結果として、かかる方法は、挿入されるＤＮＡに隣接する染色体ＤＮＡ（「フランキングＤＮＡ」）の配列が判明している場合を除いては、異なる形質転換事象、とりわけ同一のＤＮＡ構築体を使用して生成した形質転換事象を区別するのに有用ではない可能性がある。事象特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒｓら（Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５３：３０４１−３０５２，２００５年）により記載され、そこでは、形質転換トウモロコシ系Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６およびＧＡ２１、ならびにキャノ−ラ事象ＧＴ７３についての事象特異的な追跡システムが実証されている。この研究において、事象特異的なプライマーおよびプローブが、各事象のゲノム／導入遺伝子連結部の配列に基づいて設計された。また、遺伝子転換植物事象に特異的なＤＮＡ検出方法も、米国特許第７，６３２，９８５号；第７，５６６，８１７号；第７，３６８，２４１号；第７，３０６，９０９号；第７，７１８，３７３号；第７，１８９，５１４号；第７，８０７，３５７号および第７，８２０，３９２号に記載されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、代表的な種子試料が米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、受入番号ＰＴＡ−１１８３３として寄託されている、事象ＫＫ１７９−２と命名されたアルファルファ形質転換事象である。
【０００９】
本発明は、事象ＫＫ１７９−２を含む植物、細胞、植物部分または種子に由来する事象を含む植物、種子、細胞、子孫植物または植物部分を提供する。本発明は、よって、以下に限定されるものではないが、花粉、胚珠、花、新芽、根および葉を含む。
【００１０】
本発明の１つの態様は、アルファルファ事象ＫＫ１７９−２の植物または種子からのＤＮＡ形質転換／ゲノム連結領域の存在を検出するための組成物および方法を提供する。配列番号１、配列番号２およびそれらの相補体から成る群から選択される少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノム連結ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子が提供され、そこで、連結分子は挿入部位に渡る。これらのＤＮＡ分子を含むアルファルファ事象ＫＫ１７９−２および種子が、本発明の一態様である。
【００１１】
アルファルファ事象ＫＫ１７９−２からのＤＮＡ導入遺伝子／ゲノム領域配列番号３またはその相補体である新規ＤＮＡ分子が提供される。そのゲノムに配列番号３を含むアルファルファ植物および種子が、本発明の一態様である。本発明のもう１つの態様において、ＤＮＡ導入遺伝子／ゲノム領域配列番号４またはその相補体であるＤＮＡ分子が提供され、そこで、このＤＮＡ分子は、アルファルファ事象ＫＫ１７９−２において新規である。そのゲノムに配列番号４を含むアルファルファ植物および種子が、本発明の一態様である。
【００１２】
本発明は、事象ＫＫ１７９−２に関連するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子は、事象ＫＫ１７９−２の導入遺伝子挿入部とフランキングゲノムＤＮＡとの連結部、および／または挿入されたＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの領域、および／または挿入部位に隣接する統合された形質転換ＤＮＡの領域、および／または統合された形質転換発現カセットの領域、および／またはこれらの領域のいずれかの近接配列を表すか、またはこれらに由来するヌクレオチド配列を含み得る。また、本発明は、当該事象の判定に特徴的なプライマーおよびプローブとして有用なＤＮＡ分子も提供する。これらの分子を含む植物、細胞、植物部分、商用品、子孫および種子も提供される。
【００１３】
本発明の一態様によれば、ＫＫ１７９−２と指定された新規アルファルファ植物からの導入遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。配列番号１（配列番号６の第１０３８〜１０５７位に対応、図１［Ｆ］）、配列番号２（配列番号６の第３６２０〜３６３９位に対応する、図１［Ｆ］）、およびその相補体から成る群から選択されるＫＫ１７９−２の少なくとも１つの連結配列を含むＤＮＡ配列が提供され、連結配列はゲノムに挿入された異種のＤＮＡにおいて、アルファルファ細胞ゲノムＤＮＡに連結するポイントに渡るヌクレオチド配列であり、アルファルファＤＮＡを含有する生物学的試料におけるこの配列の検出は、その試料中のアルファルファ事象ＫＫ１７９−２  ＤＮＡの存在の判定に特徴的である（図１）。これらのＤＮＡ分子を含むアルファルファ事象ＫＫ１７９−２およびアルファルファ種子が、本発明の一態様である。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ検出方法で用いるための２つのＤＮＡ分子が提供され、第１のＤＮＡ分子は、配列番号３または配列番号５のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の十分な長さの連続するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、ならびに配列番号３の５’フランキングアルファルファゲノムＤＮＡ領域のいずれかの部分の同様の長さの第２のＤＮＡ分子を含み、これらのＤＮＡ分子は、増幅反応で事象ＫＫ１７９−２に由来するテンプレートと併用される場合、ＤＮＡプライマーとして機能し、試料中の事象ＫＫ１７９−２ＤＮＡの判定に特徴的なアンプリコンを生成する。配列番号３および配列番号５のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されたいずれのアンプリコンおよび配列番号１を含むいずれのアンプリコンも、本発明の一態様である。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ検出方法で用いるための２つのＤＮＡ分子が提供され、第１のＤＮＡ分子は、配列番号４または配列番号５のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の十分な長さの連続するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、ならびに配列番号４の３’フランキングアルファルファゲノムＤＮＡのいずれかの部分の同様の長さの第２のＤＮＡ分子を含み、増幅反応で事象ＫＫ１７９−２に由来するテンプレートと併用される場合、このＤＮＡ分子はＤＮＡプライマーとして機能し、試料中の事象ＫＫ１７９−２ＤＮＡの判定に特徴的なアンプリコンを生成する。配列番号４および配列番号５のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されたいずれのアンプリコンおよび配列番号２を含むいずれのアンプリコンも、本発明の態様である。
【００１６】
本発明は、アルファルファ事象ＫＫ１７９−２に由来するＤＮＡの存在を検出するのに有用な方法、組成物およびキットを提供する。ある種の方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、アルファルファ事象ＫＫ１７９−２からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応で用いた場合に、その事象に特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させることと、（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、アンプリコンを生成することと、（ｃ）配列番号１および／または配列番号２を含む、そのアンプリコンを検出することを含む。また、本発明は（ａ）ＤＮＡを含む試料を、事象からのゲノムＤＮＡとハイブリッド形成反応で用いた場合にその事象に特異的なＤＮＡ分子にハイブリダイズするプローブと接触させることと、（ｂ）その試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、（ｃ）ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。事象に由来するＤＮＡの存在を検出するのに有用な本発明の方法および組成物を含むキットも提供される。
【００１７】
さらに、本発明は、（ａ）ＫＫ１７９−２アルファルファ植物を、第２のアルファルファ植物と交配させ、それにより種子を生成することと、（ｂ）この種子を栽培して複数の子孫植物を生成することと、（ｃ）ＫＫ１７９−２を含む子孫植物または低減したリグニン含有量の子孫植物を選択することを含む、アルファルファ植物を生成する方法を提供する。
【００１８】
本発明の前記の態様および他の態様は、以下の詳細な記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アルファルファ事象ＫＫ１７９−２のゲノムにおける形質転換挿入物を示す図である。［Ａ］は、配列番号３と配列番号５との連結を形成する配列番号１の相対位置に対応する。［Ｂ］は、配列番号４と配列番号５との連結を形成する配列番号２の相対位置に対応する。［Ｃ］は、配列番号３の相対位置に対応し、それはアルファルファゲノムフランキング領域および形質転換ＤＮＡ挿入物の任意に割り当てた５’終端の一部を含む。［Ｄ］は、配列番号４の相対位置に対応し、それはアルファルファゲノムフランキング領域および形質転換ＤＮＡ挿入部の任意に割り当てた３’終端の一部を含む。［Ｅ］は、配列番号５を表し、それは事象ＫＫ１７９−２のゲノムに組み込んだＣＣＯＭＴ抑制カセットを含む形質転換ＤＮＡ挿入物の配列である。［Ｆ］は、配列番号６を表し、それは図中、左から右に表されている配列番号３、配列番号５および配列番号４を含む連続する配列である。これらの配列は、事象ＫＫ１７９−２のゲノム中に存在するため、配列番号１および配列番号２は、前記のように組み込まれている。ＬＢ：は、Ｔ−ＤＮＡの左側境界を表す。ＲＢ：は、Ｔ−ＤＮＡの右側境界を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列の簡単な説明
電子的に提出され、２０１２年５月１日に作成されたファイル名「５７９７８＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、（ＭＳ−ＷＩＮＤＯＷＳ上での）サイズが１０，５６４バイトである、配列表のファイルを、参照により本明細書に援用する。
【００２１】
配列番号１は、アルファルファゲノムＤＮＡと組み込まれたＤＮＡ挿入物との間の左側境界連結部を表す２０塩基対のヌクレオチド配列である。この配列は、配列番号６の１０３８〜１０５７位、および配列番号３の１０３８〜１０４７に対応する（図１の［Ｃ］）。加えて、配列番号１は、配列番号５の１〜１０位にある発現カセットの組み込まれた左側境界に対応する（図１の［Ｅ］）。
【００２２】
配列番号２は、組み込まれたＤＮＡ挿入物とアルファルファゲノムＤＮＡとの間の右側境界連結部を表す２０塩基対のヌクレオチド配列である。この配列は、配列番号６の３６２０〜３６３９位および配列番号４の９１〜１１１位に対応する（図１の［Ｄ］）。加えて、配列番号２は、配列番号５の２５７３〜２５８２位に対応する（図１の［Ｅ］）。
【００２３】
配列番号３は、事象ＫＫ１７９−２の挿入されたＤＮＡに隣接する５’アルファルファゲノム配列（１０４７塩基対）および組み込まれたＤＮＡの領域（１００塩基対）を含む１１４７塩基対のヌクレオチド配列である。この配列は、配列番号６の１〜１０４７位に対応する。
【００２４】
配列番号４は、事象ＫＫ１７９−２の挿入されたＤＮＡに隣接する３’アルファルファゲノム配列（１２５６塩基対）および組み込まれたＤＮＡの領域（１００塩基対）を含む１３５６塩基対のヌクレオチド配列である。この配列は、配列番号６の３５２９〜４８８５位に対応する。
【００２５】
配列番号５は、組み込み後の左側および右側の境界配列を含む、組み込まれた発現カセットの配列である。配列番号５は、配列番号６の１０４８〜３６２９のヌクレオチド位置に対応する。
【００２６】
配列番号６は、ＫＫ１７９−２の挿入されたＤＮＡに隣接する５’配列（配列番号３）、組み込まれたＤＮＡ挿入物の配列（配列番号５）およびＫＫ１７９−２の挿入されたＤＮＡに隣接する３’配列（配列番号４）のコンティグを表す４８８５塩基対のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号７は、ＫＫ１７９−２事象を特定するために用いられるプライマーＳＱ２０９０１の配列である。プライマーＳＱ２０９０１とＳＱ２３７２８（配列番号８）との組合せを用いた８１塩基対のＰＣＲアンプリコンの生成は、事象ＫＫ１７９−２の存在に対する陽性の結果である。
【００２８】
配列番号８は、ＫＫ１７９−２事象を特定するために用いられるプライマーＳＱ２２３７２８の配列である。
【００２９】
配列番号９は、ＫＫ１７９−２事象を特定するために用いられるプローブＰＢ１０１６４の配列である。これは、６ＦＡＭ（商標）標識された合成ヌクレオチドである。
【００３０】
配列番号１０は、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおける内部対照として用いられるプライマーＳＱ１５３２の配列である。
【００３１】
配列番号１１は、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおける内部対照として用いられるプライマーＳＱ１５３３の配列である。
【００３２】
配列番号１２は、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおける内部対照として用いられるＶＩＣ（商標）標識された合成オリゴヌクレオチドプローブＰＢ０３５９の配列である。
【００３３】
詳細な説明
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する上での手引きとするために提供される。特段の記載のない限り、用語は、関連技術分野における当業者による通常の使用に従い理解されるものである。また、分子生物学における通常の用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら、Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、第５版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１年）およびＬｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４年）に記載されている。
【００３４】
本発明は、形質転換アルファルファ事象ＫＫ１７９−２を提供する。本明細書中で用いられる場合、「事象」という用語は、染色体上の特定の位置で植物のゲノムに形質転換ＤＮＡを組み込んだ結果として生成される植物、種子、子孫、細胞、その植物部分、およびＤＮＡ分子を指す。事象ＫＫ１７９−２は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａゲノムの特定の染色体位置に、本明細書中で配列番号５として提供される配列を有する形質転換ＤＮＡを挿入した結果として生成される植物、種子、子孫、細胞、それらの植物部分およびＤＮＡ分子を指す。ＫＫ１７９−２を含有する種子試料は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、受入番号ＰＴＡ−１１８３３として寄託されている。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「アルファルファ」という用語は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａを意味し、野生アルファルファ種を含み、アルファルファと育種し得るすべての植物種を含む。また、アルファルファは、関係するクロ−バ−の花と類似の青または黄色の花をつけるウマゴヤシ属の旧世界の草本の任意の植物の名前であるメディック（ｍｅｄｉｃ）とも呼ばれる。トウモロコシや大豆と異なり、アルファルファ植物は同質四倍体である。したがって、各形質は２つではなく、４つの染色体上に存在する遺伝子により決定される。これは遺伝子研究を複雑にし、さらにアルファルファの改善をより困難にする。市販のアルファルファ種子は、選択されたクローン間での無作為の相互授粉に続き、隔離した自然受粉を１〜３世代行うことにより生成される合成栽培品種を構成し得るクローンの混合物から構成されることが多い。さらに、２つ以上のクローンの種子を混合するか、または隔離したクローンを相互授粉することによっても、アルファルファの合成栽培品種を開発することができる。合成栽培品種を形成するときは、コンポ−ネントクローン各々からの等量の種子を混合して、最初の原原種のストックを形成する。
【００３６】
形質転換「事象」は、対象の遺伝子のＲＮＡ抑制を含む核酸構築体など、異種ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、植物のゲノムへの導入遺伝子カセットの挿入に起因する独立して形質転換した形質転換植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への導入遺伝子の挿入など、望ましい分子特性を有する特定の植物の選択により生成される。事象を含有する植物は、植物のゲノム中の特定位置に挿入された導入遺伝子を含む元来の形質転換体を指し得る。また、事象を含有する植物は、植物のゲノムにおける同一の特定位置に導入遺伝子を保持する元来の形質転換体の子孫を指し得る。かかる子孫は、形質転換体またはその子孫と別の植物との間の有性異系交配により生成することができる。かかる別の植物は、同一または異なる導入遺伝子を含有する形質転換植物であってもよく、あるいは、異なる変種からの植物など、非形質転換植物であってもよい。反復親に繰り返し戻し交配した後でも、形質転換された親からの事象ＤＮＡは、同一のゲノム位置での交配の子孫に存在する。
【００３７】
事象ＫＫ１７９−２を含むＤＮＡ分子は、挿入された形質転換ＤＮＡ（配列番号５として規定される）の少なくとも一部および挿入されたＤＮＡのすぐ隣にあるフランキングゲノムＤＮＡの一部を含むＤＮＡ分子を指す。したがって、事象ＫＫ１７９−２を含むＤＮＡ分子は、形質転換ＤＮＡ挿入物の少なくとも一部および形質転換ＤＮＡが挿入された植物のゲノムの特定の領域の少なくとも一部を表すヌクレオチド配列を有する。周囲の植物ゲノムとの関係において、事象ＫＫ１７９−２に挿入したＤＮＡの配列は、事象ＫＫ１７９−２に特異的かつ特有であり、したがって、かかるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、事象ＫＫ１７９−２の判定に特徴的であり、特定に役立つ。かかるＤＮＡ分子の配列の例を、本明細書中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号６として提供する。かかるＤＮＡ分子は、また、事象ＫＫ１７９−２を含む植物の染色体の必須部分であり、植物の子孫に伝わり得る。
【００３８】
本明細書中で用いられる場合、「組換えＤＮＡ分子」は、自然には共に生じないＤＮＡ分子の組合せを含み、人間の介入の結果であるＤＮＡ分子であり、例えば、互いに異種の少なくとも２個のＤＮＡ分子の組合せから成るＤＮＡ分子、および／または人工的に合成され、天然に広く存在するポリヌクレオチド配列から逸脱したポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および／または宿主細胞のゲノムＤＮＡに人工的に組み込まれた導入遺伝子を含むＤＮＡ分子、および宿主細胞のゲノムの対応するフランキングＤＮＡなどである。組換えＤＮＡ分子の例は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ    ｓａｔｉｖａ  ゲノムへの導入遺伝子の挿入に起因する。本明細書中に記述するＤＮＡ分子であり、これは最終的に、その生物における組換えＲＮＡおよび／またはタンパク質分子の抑制に帰結し得る。また、ヌクレオチド配列またはそれに由来する任意のフラグメントも、そのＤＮＡ分子が植物、種子または植物組織からの細胞、組織またはホモジネートから抽出することができる場合、あるいは、植物、種子または植物組織からの細胞、組織またはホモジネートから抽出したＤＮＡまたはＲＮＡからのアンプリコンとして生成可能であり、そのいずれも事象ＫＫ１７９−２に由来する、かかる物質に由来している場合、組換えＤＮＡ分子とみなされることになる。この件については、配列番号１および配列番号２で規定されている連結配列、ならびにこれらの連結配列も含む事象ＫＫ１７９−２に由来するヌクレオチド配列は、事象ＫＫ１７９−２の細胞のゲノム内に存在するのか、それとも事象ＫＫ１７９−２に由来する組織、子孫、生物学的試料または日用品に検出可能な量で存在するかにかかわらず、組換えＤＮＡとみなされる。本明細書中で用いられる場合、「導入遺伝子」という用語は、宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれたポリヌクレオチド分子を指す。かかる導入遺伝子は、宿主細胞に対して異種であってもよい。「形質転換植物」という用語は、かかる導入遺伝子を含む植物を指す。「形質転換植物」は、組換えＤＮＡの安定的な組み込みによりゲノムが改変されている植物、植物部分、植物細胞または種子を含む。形質転換植物は、元来的に形質転換されている植物細胞から再生された植物、および形質転換された植物の後の再生または交配からの子孫形質転換植物を含む。かかるゲノムの改変の結果として、形質転換植物は関係する野生型植物とは明確に異なる。形質転換植物の例は、事象ＫＫ１７９−２を含有するものとして、本明細書中に記載される植物である。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、「異種」という用語は、現在、その配列が存在している遺伝的文脈において、所定の宿主ゲノムには、普通は存在しない配列を指す。この点において、この配列は宿主ゲノムに生来属していてもよいが、宿主配列の中にある他の遺伝子配列に対して、再配置されていてもよい。
【００４０】
本発明は、ＤＮＡ分子およびその対応するヌクレオチド配列を提供する。本明細書中で用いられる場合、「ＤＮＡ配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」という用語は、通常、５’（上流）から３’（下流）の終端へと表される、ＤＮＡ分子のヌクレオチドの配列を指す。本明細書中で用いられる命名法は、連邦規則集第３７章第１条第８２２項によって要求され、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８年）、付録２、表１および３に規定されたものである。本発明は、形質転換事象ＫＫ１７９−２で提供される２本のヌクレオチド配列鎖のうちの一方の鎖のみに関して開示される。したがって、含蓄および誘導により、当業で完全な相補体または逆相補的配列とも称される、相補的配列は、本発明の範囲内であり、したがって、請求の対象となる主題の範囲内であるものとする。
【００４１】
挿入された形質転換ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列および挿入された形質転換ＤＮＡのいずれかの端部に隣接するＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａゲノムＤＮＡのかなりのセグメントに対応するヌクレオチド配列が、本明細書中では、配列番号６として提供される。このサブセクションは、配列番号５として提供される挿入された形質転換ＤＮＡである。挿入された形質転換ＤＮＡの５’終端に隣接するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列および挿入されたＤＮＡの５’終端の一部は、本明細書中では、配列番号３として提供される。挿入された形質転換ＤＮＡの３’終端に隣接するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列および挿入されたＤＮＡの３’終端の一部は、本明細書中では、配列番号４として提供される。形質転換ＤＮＡがゲノムＤＮＡに接続し、連結される位置に渡る領域は、本明細書中では、連結部と称される。「連結配列」または「連結領域」は、挿入された形質転換ＤＮＡおよび隣接するフランキングゲノムＤＮＡに渡るＤＮＡ配列および／または対応するＤＮＡ分子を指す。事象ＫＫ１７９−２の連結配列の例が、本明細書中では、配列番号１および配列番号２として提供される。アルファルファ植物または種子に由来するヌクレオチド分子中のこれらの連結配列の１つの特定は、そのＤＮＡが事象ＫＫ１７９−２から得られ、事象ＫＫ１７９−２からのＤＮＡの存在の判定に特徴的であるという確証である。配列番号１は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの５’終端との連結部に渡る２０塩基対のヌクレオチド配列である。配列番号２は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの３’終端との連結部に渡る２０塩基対のヌクレオチド配列である。配列番号１の連続するヌクレオチドを含む形質転換事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの任意のセグメントは、本発明の範囲内である。配列番号２の連続するヌクレオチドを含む形質転換事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの任意のセグメントは、本発明の範囲内である。加えて、本段落内で記述された配列のいずれかに対する相補的な配列を含むいずれのポリヌクレオチド分子も、本発明の範囲内である。図１は、アルファルファ事象ＫＫ１７９−２のゲノム中の形質転換ＤＮＡ挿入物の図であり、配列ＩＤ番号１〜６の相対位置は５’から３’に配置されている。
【００４２】
さらに、本発明は、試料中の事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの存在を診断するためのプライマーまたはプローブのいずれかとして用いることのできる例となるＤＮＡ分子を提供する。かかるプライマーまたはプローブは、標的核酸配列に対して特異的であり、したがって、本明細書中に記載する本発明の方法による、事象ＫＫ１７９−２核酸配列の特定に有用である。
【００４３】
「プローブ」は、検出可能な標識またはリポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素が付着した単離された核酸である。かかるプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合には、アルファルファ事象ＫＫ１７９−２からのＤＮＡを含むアルファルファ植物からであろうと、試料からであろうと、その事象からのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明に従うプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけではなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に連結するポリアミドおよび他のプローブ物質を含み、かかる連結の検出を用いて、特定の試料におけるその標的ＤＮＡ配列の存在の診断／決定／確定を行うことができる。
【００４４】
「プライマー」は、一般には、特異的なアニーリングまたはハイブリダイゼーション方法で使用するために設計され、相補的なＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、プライマーと標的ＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸張される単離されたポリヌクレオチドである。プライマーの対は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａゲノムＤＮＡの試料などのテンプレートＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのサーマル増幅もしくはアイソサーマル増幅、またはその他の核酸増幅方法などと組み合わせて使用し、アンプリコンを生成することができ、かかる反応から生成されるアンプリコンは、プライマーがテンプレートにハイブリダイズした２つの部分の間に位置するテンプレートＤＮＡの配列に対応する。本明細書中で用いられる場合、「アンプリコン」は、増幅反応の生成物など、増幅技法を用いて合成されたＤＮＡの切片またはフラグメントである。本発明の１つの実施形態において、事象ＫＫ１７９−２の判定に特徴的なアンプリコンは、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａゲノム中に通常は見られない配列を含む。本発明で用いられる場合、プライマー対は、通常、サーマル増幅もしくはアイソサーマル増幅反応またはその他の核酸増幅方法において、プライマーの個々のメンバーによる連結の標的にされる位置と位置の間にあるポリヌクレオチドセグメントを線形的に増幅する目的のために、２本鎖のヌクレオチドセグメントの相対する鎖を連結する２つのプライマーの使用を指すことが意図される。プライマーとして有用な例示的なＤＮＡ分子は、配列番号７〜９として提供され、第１のＤＮＡ分子および第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子として用いることができ、どちらの分子もそれぞれ、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、またはこれらの相補体の十分な長さの連続的なヌクレオチドであり、ＤＮＡプライマーとして機能するため、事象ＫＫ１７９−２由来のテンプレートＤＮＡと一緒に増幅反応で使用すると、形質転換事象ＫＫ１７９−２に特異的かつ特有のアンプリコンが生成される。「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡ増幅反応で形成される可能性のあるプライマーダイマーを明示的に除外する。
【００４５】
本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列に対して完全に配列同一性を有することができるが、その標的配列とは異なり、標的配列に優先的にハイブリダイズする能力を維持するプライマーおよびプローブを従来の方法により設計し得る。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用した特定の溶媒および塩の濃度下で２本鎖構造を形成できる配列において十分に相補性であることだけが必要である。どのような核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法も、試料中の事象ＫＫ１７９−２からの形質転換ＤＮＡの存在を特定する目的に用いることができる。プローブおよびプライマーは、一般に、長さが少なくとも約１１個のヌクレオチド、少なくとも約１８個のヌクレオチド、少なくとも約２４個のヌクレオチド、および約３０個以上のヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。
【００４６】
プローブおよびプライマーを調製および使用するための方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，１〜３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年（以降「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９年」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ    ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２年（定期的に更新される）（以降では、「Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２年」）；およびＩｎｎｉｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０年に記載されている。ＰＣＲ−プライマー対は、既知の配列から、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（バージョン０．５，版権１９９１年，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）など、その用途のためのコンピュ−タプログラムを使うことにより、既知の配列から導き出すことができる。
【００４７】
本明細書中に開示されたフランキングＤＮＡおよび挿入配列に基づくプライマーおよびプローブを用いて、公知の方法、例えば、かかる配列を再度クローニングおよび配列決定することにより、開示された配列を確認することができる。
【００４８】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を使用して、試料中の形質転換事象からのＤＮＡの存在を特定することができる。核酸分子またはそのフラグメントは、一定の条件下では、他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書中で用いられる場合、２個の核酸分子が逆平行の２本鎖核酸構造を形成することができる場合、その２個の分子は互いに特異的にハイブリダイズできると言われる。核酸分子は、完全な相補性を示すとき、もう１個の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書中で用いられる場合、分子の一方のヌクレオチドすべてが他方の分子のヌクレオチドに対して相補的であるとき、分子は「完全な相補性」を示すと言われる。２個の分子は、少なくとも「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニーリングした状態を維持できるのに十分な安定性をもって、互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、分子は「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニーリングした状態を維持できるのに十分な安定性をもって、互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言われる。ストリンジェンシー条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）およびＨａｙｍｅｓらにより、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５年）で記述されている。したがって、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱がその分子が２本鎖構造を形成する能力を完全に排除しない限り、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用した特定の溶媒および塩の濃度下で２本鎖構造を形成できる配列において十分に相補性であることだけが必要である。
【００４９】
本明細書中で用いられる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下でそれが比較の対象とされている核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は、例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続けて、５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に知られているか、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９年），６．３．１〜６．３．６にに記載されている。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃での約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでの範囲から選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から、約６５℃での高ストリンジェンシー条件に増加できる。温度および塩の両方を変更でき、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持し、他方の変数を変化させ得る。１つの実施形態において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下において、配列番号１および配列番号２に記載された１つまたは複数の核酸分子に特異的にハイブリダイズするであろう。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られた多数の方法によって検出できる。これらは、以下に限定されないが、蛍光性タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを含むことができる。
【００５０】
特定の増幅プライマー対を用いる標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）について、「ストリンジェントな条件」は、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが、ＤＮＡ熱増幅反応において連結し、かつ好ましくは、特有の増幅生成物のアンプリコンを生成するであろう標的核酸配列だけに、プライマー対がハイブリダイズすることを可能にする条件である。ＤＮＡ増幅法の例としては、ＰＣＲ、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（例えば、米国特許第７，４８５，４２８号を参照）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４５５，１６６号および第５，４７０，７２３号を参照）、転写増幅法（ＴＭＡ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８７：１８７４−１８７８（１９９０年）を参照）、ロ−リングサ−クル増幅（ＲＣＡ）（例えば、ＦｉｒｅおよびＸｕ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５（１９９５年）；Ｌｕｉら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１８：１５８７−１５９４（１９９６年）；Ｌｉｚａｒｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−２３２（１９９８年）、米国特許第５，７１４，３２０号および第  ６，２３５，５０２号を参照）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔら，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ    ５（８）：７９５−８００（２００４年）；米国特許第７，２８２，３２８号を参照）、および多置換増幅（ＭＤＡ）（例えば、Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ９９：５２６１−５２６６（２００２年）を参照）が挙げられる。
【００５１】
「（標的配列）に特異的」という用語は、プローブまたはプライマーが、標的配列を含む試料中の標的配列にだけ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、「単離された」という用語は、分子がその本来または自然の状態では、それに通常伴う他の分子と少なくとも部分的には分離されていることを指す。１つの実施形態において、「単離された」という用語は、ＤＮＡ分子がその本来または自然な状態では、通常、そのＤＮＡ分子に隣接している核酸から少なくとも部分的に分離されていることを指す。したがって、通常は伴わない制御配列またはコーデング配列に、例えば、組換え技法の結果として融合されているＤＮＡ分子は、本明細書中では、単離されたとみなされる。かかる分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれているか、または他のＤＮＡ分子と一緒に核酸中に存在するときでも、単離されているとみなされる。
【００５３】
本発明で開示されるＤＮＡ分子またはそのフラグメントを単離または操作するのに、当業者によく知られている方法はいくつでも使うことができる。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を使用して、特定の開始ＤＮＡ分子の増幅および／または元来の分子の変種の生成を行うことができる。自動化オリゴヌクレオチド合成機を使うことで、一般に実践されているように、ＤＮＡ分子またはそのフラグメントは、化学的手段によるフラグメントを直接的に合成するなど、他の技法によっても得ることができる。
【００５４】
本明細書中に提供されるＤＮＡ分子および対応するヌクレオチド配列は、したがって、とりわけ事象ＫＫ１７９−２の特定、事象ＫＫ１７９−２を含む植物変種またはハイブリッドの選択、試料における事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの存在の検出、ならびに事象ＫＫ１７９−２または事象ＫＫ１７９−２を含む植物および植物部分の存在および／または欠如についての試料の監視に有用である。
【００５５】
本発明は植物、子孫、種子、植物細胞、花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織、および葉などの植物部分を提供する。これらの植物、子孫、莢、植物細胞、植物部分および日用品は、配列番号１の連続的なヌクレオチドおよび配列番号２の連続的なヌクレオチドとして提供される配列の少なくとも１つを含むポリヌクレオチドなど、本発明のポリヌクレオチドを検出可能な量含む。本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分および日用品は、１つまたは複数の追加の抑制標的も含み得る。
【００５６】
本発明は、事象ＫＫ１７９−２を含む形質転換植物に由来する植物、子孫、種子、植物細胞、および花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織および葉などの植物部分を提供する。事象ＫＫ１７９−２を含む種子の代表的な試料は、本発明を可能にする目的のために、ブダペスト条約に従って寄託されている。寄託を受け取るために選択された貯蔵所は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡ，郵便番号２０１１０に住所を持つ米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）である。ＡＴＣＣ寄託組織は、事象ＫＫ１７９−２の種子に受入番号ＰＴＡ−１１８３３を付与した。
【００５７】
本発明は、配列番号１の連続的ヌクレオチド、配列番号２の連続的ヌクレオチドから成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む微生物を提供する。かかる微生物の例は、形質転換植物細胞である。本発明の植物細胞などの微生物は、多くの工業用途に有用である。これらの用途としては、限定するものではないが、（ｉ）科学的調査または産業調査としての使用；（ｉｉ）二次的科学的調査目的に、または工業製品として用いることのできる内因性もしくは組換えの炭水化物、脂質、核酸、酵素もしくはタンパク質生成物、酵素もしくはタンパク質生成物または小分子を生成するための培養での使用；および（ｉｉｉ）生成後に農業研究または生産に用いることのできる形質転換植物または植物組織培養の生成のための近代的な植物組織培養技法での使用。形質転換植物細胞などの微生物の生成および使用には、人工の特有な微生物を生成するために、近代的な微生物学技術および人間の介入を利用する。この工程では、組換えＤＮＡが植物細胞のゲノムに挿入され、自然界に発生する植物細胞とは別個かつ特有な形質転換植物細胞を作成する。この形質転換植物細胞は、次いで、近代的な微生物学技術を使用して、細菌や酵母細胞と極めて同じように培養することができ、未分化の単細胞状態で存在し得る。新しい植物細胞の遺伝子組成および表現型は、異種ＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むことにより作成される技術的効果である。本発明のもう１つの態様は、本発明の微生物を使用する方法である。形質転換植物細胞など、本発明の微生物を使用する方法は、（ｉ）細胞のゲノムに組換えＤＮＡを組み込んだ後、この細胞を使用して、同一の異種ＤＮＡを有する追加の細胞を誘導することにより形質転換細胞を生成する方法；（ｉｉ）近代的な微生物学技術を使用して組換えＤＮＡを含む細胞を培養する方法；（ｉｉｉ）培養した細胞から内因性または  組換えの炭水化物、脂質、核酸、酵素もしくはタンパク質の生成物を生成および精製する方法；および（ｉｖ）形質転換植物細胞で、近代的な植物細胞培養技術を使用して、形質転換植物または形質転換植物組織培養を生成する方法を含む。
【００５８】
本明細書中で用いられる場合、「子孫」は、配列番号１の連続的ヌクレオチドまたは配列番号２の連続的ヌクレオチドとして提供される配列の少なくとも１つを有する祖先植物および／ポリヌクレオチド由来の事象ＤＮＡを含む任意の植物、種子、植物細胞および／または再生可能な植物部分を含む。植物、子孫および種子は、形質転換配列の存在に対しヘテロ連結であり得る。子孫は、事象ＫＫ１７９−２を含む植物により生成される種子からおよび／または事象ＫＫ１７９−２を含む植物からの花粉で受精する植物により生成される種子から生育され得る。
【００５９】
子孫植物は異型交配することができ、例えば、別の植物と交配して、変種またはハイブリッド種子または植物を産生することができる。他方の植物は、形質転換であっても、非形質転換であってもよい。本発明の変種またはハイブリッド種子または植物は、かくて、事象ＫＫ１７９−２の特異的かつ特有なＤＮＡを有さない第１の親を事象ＫＫ１７９−２を含む第２の親と交雑して、事象ＫＫ１７９−２の特異的かつ特有なＤＮＡを含むハイブリッドを生じさせることにより、誘導し得る。親の各々は、交配または育種の結果、事象ＫＫ１７９−２の特異的かつ特有なＤＮＡおよび／または配列番号１の連続的ヌクレオチドもしくは配列番号２を含む少なくとも１つの対立遺伝子を有する種子など、本発明の植物または種子が得られる限りにおいて、ハイブリッドまたは同系交配／変種とすることができる。親植物への戻し交配および非形質転換植物との異型交配も企図され、栄養繁殖も同様に企図される。異なる形質および作物に一般的に用いられる他の育種方法の記載は、いくつもの参考文献のうちの１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ（１９８７年）に見出される。
【００６０】
他家受粉など、１つの植物を別の植物で有性交配することは、人間の介入により達成または容易化することができ、例えば、１つの植物の花粉を人間の手で採取し、この花粉をもう１つの植物の花柱または柱頭に接触させる、人間の手または行動で、（例えば、手動介入または化学的除雄剤の塗布により）植物の雄しべまたは葯を切除、破壊または防護することで、自然の自家受粉を防止し、受粉が起こるためには、他家受粉が行われなければならないようにし、「誘導された受粉」のための位置に花粉媒介昆虫を人間が配置し（例えば、果樹園または畑にミツバチの巣を配置し、あるいは花粉媒介昆虫と一緒に植物を檻に入れ）、人間が花の部分を開放または切除し、花柱または柱頭に異種の花粉が乗るか、または接触できることができるようにし、植物の選択的な配置（例えば、受粉できる近接距離に意図的に植物を植える）、および／または化学物質を塗布し、花が咲くのを早める、または（花粉の花柱の）受容性を促進するなどの方法が挙げられる。
【００６１】
この方法を実践する際、自家受粉または自系連結など、１つの植物をそれ自身と有性交配させるステップは、人間の介入により達成または容易化することができる。例えば、人間の手で１つの植物の花粉を採取し、この花粉を同じの植物の花柱または柱頭に接触させた後、任意で、その植物のさらなる受粉を防止し、人間の手または行動で、（例えば、雄穂除去または化学的除雄剤の塗布により）近くにある他の植物の雄しべまたは葯を切除、破壊または防護することで、自然の他家受粉を防止し、受粉が起こるためには、自家受粉が行われなければならないようにし、「誘導された受粉」のための位置に花粉媒介昆虫を人間が配置し（例えば、花粉媒介昆虫と一緒に植物を単独で檻に入れる）、人間が花またはその一部を操作し自家受粉できるようにし、植物の選択的な配置（例えば、受粉できる近接距離を越えた位置に意図的に植物を植える）、および／または化学物質を塗布し、花が咲くのを早めるか、または（花粉の花柱の）受容性を促進するなどの方法が挙げられる。
【００６２】
本発明は、事象ＫＫ１７９−２を含む植物に由来する植物部分を提供する。本明細書中で用いられる場合、「植物部分」は、事象ＫＫ１７９−２を含む植物に由来する物質から成る植物の任意の部分を指す。植物部分は、花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織、繊維および葉に限られないが、これらを含む。植物部分は生育可能、生育不能、再生可能および／または再生不能であり得る。
【００６３】
本発明は、事象ＫＫ１７９−２を含む植物に由来する日用品を提供する。本明細書中で用いられる場合、「日用品」は事象ＫＫ１７９−２を含む植物、種子、植物細胞または植物部分に由来する物質から成る任意の組成物または生成物を指す。日用品は消費者に対して販売され、生育可能である場合も、生育不能である場合もある。生育不能日用品としては、限定するものではないが、生育不能種子および穀物、加工された種子、種子部分および植物部分、脱水した植物組織、凍結した植物組織および加工した植物組織、陸生および／または水生動物の消費のための動物の飼料用に加工された種子および植物部分、油、粗びき粉、細粉、フレ−ク、ふすま、繊維および人間が消費するためのその他の任意の食物ならびにバイオマスおよび燃料生成物が挙げられる。加工されたアルファルファは、世界のマメ科牧草の最大の供給源である。事象ＫＫ１７９−２を含む植物は、よって、アルファルファ植物から通常確保される任意の日用品の製造に使うことができる。事象ＫＫ１７９−２を含む植物由来のかかる日用品はいずれも、事象ＫＫ１７９−２に対応する特異的かつ特有なＤＮＡを少なくとも検出可能な量含有し得、具体的には、配列番号１の連続的ヌクレオチドおよび配列番号２の連続的ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを検出可能な量含有し得る。本明細書に開示される検出方法も含め、ポリヌクレオチド分子に対する標準的ないかなる検出方法も使用してよい。日用品に配列番号１の連続的ヌクレオチドまたは配列番号２の連続的ヌクレオチドが検出可能な量存在している場合、その日用品は本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織および葉など）および日用品は、したがって、農業目的の事象ＫＫ１７９−２を含む種子および／または植物部分を産生する目的での植物の栽培、植物育種および研究目的のための事象ＫＫ１７９−２を含む子孫の生産、産業および研究の的のための微生物学技術での利用、および消費者への販売にとりわけ有用である。
【００６５】
本発明は、リグニンの低減した植物および事象ＫＫ１７９−２を含む植物を生成するための方法を提供する。事象ＫＫ１７９−２植物は、米国特許第５，９１４，４５１号に記載されているのと類似したアグロバクテリウム媒介形質転換方法により、同系交配のアルファルファ株を構築体ｐＦＧ１１８と一緒に使うことで生成された。構築体ｐＦＧ１１８は、アルファルファ植物細胞中のＣＣＯＭＴ酵素の下向き調節のための植物抑制カセットを含む。形質転換アルファルファ細胞は、無傷のアルファルファ植物へと再生され、個々の植物は、導入遺伝子カセットの完全性、構築体の骨格配列の欠如、リンクされていないカナマイシン耐性選択カセットの欠失など、望ましい分子特性を示す、独立に形質転換された形質転換植物の集団から選択された。さらに、インバースＰＣＲおよびＤＮＡ配列解析が実施され、５’および３’の挿入物から植物へのゲノム連結部が求められ、挿入物内での要素の編成が確認され（図１）、さらにアルファルファ事象ＫＫ１７９−２における挿入物の完全なＤＮＡ配列（配列番号５）が求められた。さらに、野外条件下で、リグニンの減少について形質転換植物をスクリーニングして、選択した。ｐＦＧ１１８の抑制カセットをそのゲノム中に含むアルファルファは、本発明の態様である。
【００６６】
形質転換事象ＫＫ１７９−２を含む、リグニンの低減した植物を生成するための方法が提供される。これらの方法で用いられる形質転換植物は、導入遺伝子に対してヘテロ連結であってもよい。これらの方法により生成される子孫植物は、変種またはハイブリッド植物であってよく、植物により生成される種子からおよび／または事象ＫＫ１７９−２を含む植物からの花粉によって受粉される植物によって生成される、事象ＫＫ１７９−２を含む種子から生育してよく、導入遺伝子に対してホモ連結であっても、ヘテロ連結であってもよい。子孫植物は、導入遺伝子に対してホモ連結の植物など、真の育種系統の植物を生成するために、後に自家受粉されてもよく、あるいは異型交配、例えば、関係のない別の植物と交配するなどして、変種またはハイブリッドの種子または植物を生成してもよい。本明細書中で用いられる場合、「連結状態」という用語は、植物中の特定の染色体位置（遺伝子座）にあるＤＮＡの類似性を指す。本発明において、ＤＮＡは、具体的には、連結配列（事象ＤＮＡ）と一緒に導入遺伝子を指す。連結配列を有する導入遺伝子挿入物が、染色体対（４つの対立遺伝子）の各染色体上の同一位置に存在する。連結配列を有する導入遺伝子挿入物が、染色体対（１つの対立遺伝子）の１つの染色体上にのみ存在する場合に、ヘテロ連結とみなされる。野生型植物は事象ＤＮＡに対しては欠損している。
【００６７】
これらの方法によりもたらされ、これらの方法を使用して生成される子孫植物および種子は、例えば、子孫植物および種子は組換えであり、したがって人間の介入により作成されており、本発明の形質転換ＤＮＡから成る少なくとも１つの対立遺伝子および／または配列番号１の連続するヌクレオチドまたは配列番号２の連続するヌクレオチドから成る群から選択されるポリヌクレオチド配列の検出可能な量を含んでいるため、他の植物とは異なる。種子は個々の子孫植物から選択されてよく、種子は配列番号１または配列番号２を含んでいる限り、本発明の範囲内にある。
【００６８】
本発明の植物、子孫、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、莢、花、根または茎組織および葉など）および日用品は、ＤＮＡの組成、遺伝子発現および／またはタンパク質発現について評価され得る。かかる評価は、ＰＣＲ、配列決定、ノ−ザンブロット法、サザン解析、ウエスタンブロット法、免疫沈降法およびＥＬＩＳＡなどの種々の方法を使用するか、または本明細書中に規定される検出方法および／または検出キットを用いることにより、実施され得る。
【００６９】
試料における事象ＫＫ１７９−２に特異的な組成物の存在を検出する方法が提供される。１つの方法は、事象ＫＫ１７９−２を含む細胞、組織、種子、植物または植物部分に特異的かつそれらに由来のＤＮＡの存在を検出することから成る。この方法では、増幅に適切な条件に供すると、事象ＫＫ１７９−２  ＤＮＡからのアンプリコン、特に配列番号１および／もしくは配列番号２、またはこれらの相補体を含むアンプリコンを生成することの可能なプライマー対と接触させるためのテンプレートＤＮＡ試料が提供される。テンプレートＤＮＡ分子が配列番号１または配列番号２の特異的かつ特有なヌクレオチド配列を組み込んでいる限り、アンプリコンは事象ＫＫ１７９−２由来のテンプレートＤＮＡ分子から生成される。アンプリコンの生成で使用するために選択されたポリメラーゼに応じて、アンプリコンは１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。この方法は、かかる任意の増幅反応で生成されたアンプリコン分子を検出し、アンプリコンの配列内で、配列番号１もしくは配列番号２に対応するヌクレオチド、またはこれらの相補体の存在を確認できるようにしている。アンプリコンにおいて、配列番号１および／もしくは配列番号２に対応するヌクレオチド、またはアンプリコン中のこれらの相補体の検出は、試料において、事象ＫＫ１７９−２に特異的なＤＮＡ、および事象ＫＫ１７９−２を含む生物学的物質の存在に対して決定決定的および／または判定に特徴的なものである。
【００７０】
植物または植物組織由来の物質から成る試料において、配列番号３または配列番号４に対応するＤＮＡ分子の存在を検出するためのもう１つの方法が提供される。その方法は（ｉ）植物からまたは異なる植物の群からＤＮＡ試料を入手すること、（ｉｉ）ＤＮＡ試料を配列番号１または配列番号２のいずれかとして規定されたヌクレオチドを含むＤＮＡプローブ分子と接触させること、（ｉｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブとＤＮＡ試料がハイブリダイズできるようにすること、および次に（ｉｖ）プローブと標的ＤＮＡ試料とのハイブリダイゼーション事象を検出することから成る。ハイブリッド組成物の検出は、場合によって、ＤＮＡ試料における配列番号３または配列番号４の存在の判定に特徴的である。あるいはハイブリダイゼーションの非存在は、適切な陽性対照が同時に実行されている場合、試料中での形質転換事象の非存在の判定に特徴的である。あるいは、特定の植物が、配列番号１もしくは配列番号２に対応する配列のどちらか一方もしくは両方、またはそれらの相補体を含むと判定することは、その植物が事象ＫＫ１７９−２に対応する少なくとも１つの対立遺伝子を含むことの決定要因である。
【００７１】
よってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、または核酸プローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションのようないずれか周知の核酸検出方法によって、本発明の核酸分子の存在を検出することが可能である。事象特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒｓら（Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５３：３０４１−３０５２，２００５年）によって記載されており、その中で、形質転換トウモロコシ系統Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６、およびＧＡ２１ならびに形質転換事象ＲＴ７３の事象特異的トレーシング系が示されている。この研究においては、事象特異的なプライマーおよびプローブが各事象のゲノム／形質転換遺伝子の連結部の配列に基づいて設計された。また、形質転換植物事象特異的ＤＮＡの検出方法は、米国特許第７，６３２，９８５号；第７，５６６，８１７号；第７，３６８，２４１号；第７，３０６，９０９号；第  ７，７１８，３７３号；第  ７，１８９，５１４号、第  ７，８０７，３５７号および第７，８２０，３９２号にも記述されている。
【００７２】
ＤＮＡ検出キットが提供される。１つの種類のキットは、試料における形質転換事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの存在を検出するための特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号３、配列番号５または配列番号６の連続的ヌクレオチドの少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む。キットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号１に規定される配列の連続的なヌクレオチドを含む。あるいは、キットは、試料における形質転換事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの存在を検出するための特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号４、配列番号５または配列番号６の連続的ヌクレオチドの少なくとも１個のＤＮＡ分子を含み得る。キットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号２に規定される配列の連続的なヌクレオチドを含む。
【００７３】
代替のキットは、標的ＤＮＡ試料を上述のようなプライマー対に接触させた後、配列番号１および配列番号２の連続的ヌクレオチドを含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を実行する方法を使用する。アンプリコンの検出およびアンプリコンの配列内での配列番号１および配列番号２の連続的ヌクレオチド、またはそれらの相補体の検出は、ＤＮＡ試料における事象ＫＫ１７９−２特異的ＤＮＡの存在の判定に特徴的である。
【００７４】
試料中の事象ＫＫ１７９−２ＤＮＡに特異的かつ特有なＤＮＡの存在またはさらには非存在を判定、検出または診断するのに有用なＤＮＡプローブとして使用するのに十分なＤＮＡ分子が提供される。ＤＮＡ分子は、配列番号１の連続的ヌクレオチドまたはその相補体および配列番号２の連続的ヌクレオチドまたはその相補体を含む。
【００７５】
核酸増幅はサーマルおよびアイソサーマル増幅方法を含め、当業で既知の種々の核酸増幅方法のいずれによっても達成することができる（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１８８３として寄託されている事象ＫＫ１７９−２を含む代表的な種子試料を有する）。事象ＫＫ１７９−２からの異種ＤＮＡ挿入物の配列、連結配列またはフランキング配列は、本明細書中に提供される配列に由来するプライマーを用いて、事象からのかかる配列を増幅し、次いで、アンプリコンまたはクローンしたＤＮＡの標準ＤＮＡ配列決定を行うことにより、確認することができる。
【００７６】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出し得る。かかる１つの方法は、隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の双方をオーバーラップさせるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されているＧｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：４１６７−４１７５，１９９４年）である。そのオリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。（挿入された配列における１つのプライマーおよび隣接したフランキングゲノム配列における１つのプライマーを用いた）対象の領域のサーマル増幅後に、１本鎖アンプリコンを固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび期待された次の塩基に特異的な標識されたｄｄＮＴＰを用いて、単一塩基伸長反応のためのテンプレートとして機能できる。読み取りは、蛍光性またはＥＬＩＳＡベースであり得る。蛍光性または他のシグナルの検出は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００７７】
もう一つの方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｔｅｃｈ．  ００：１８−２４，２０００年）によって記載されたピロシーケンス技術である。この方法において、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入物ＤＮＡ連結部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、対象の領域からの１本鎖のアプリコンにハイブリダイズされ（挿入された配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルファートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄＮＴＰが個々に加えられ、その組み込みの結果、光シグナルがもたらされ、それが測定される。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または多重の塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００７８】
Ｃｈｅｎら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ９：４９２−４９８，１９９９年）によって記載された蛍光偏光法は、アンプリコンを検出する目的に用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムのフランキングおよび挿入されたＤＮＡ連結部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは対象の領域からの１本鎖のアンプリコンにハイブリダイズされ（挿入ＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列における１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの組み込みを生じる。組み込みは、蛍光測定器を用いて偏光の変化として測定できる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００７９】
ＴＡＱＭＡＮ（商標登録）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）も、製造者により提供された指示を使用して、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として用いることができる。簡単に言うと、ゲノムフランキングおよび挿入物ＤＮＡ連結部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光部分がＦＲＥＴプローブ上の消光部分から離れて切断および遊離する。蛍光シグナルが、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によるフランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８０】
分子標識は、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６年）に記載されたように、配列検出に用いるために記載されている。簡単に言うと、フランキングゲノムおよび挿入物ＤＮＡ連結部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブの特有な構造の結果、それは蛍光部分および消光部分を隣接に保つ二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。増幅の成功に続いて、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、プローブ二次構造の除去ならびに蛍光部分および消光部分の空間的分離を生じ、それは蛍光シグナルの生成を生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によるフランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８１】
マイクロフルイディクス（米国特許出願公開第２００６０６８３９８号、米国特許第６，５４４，７３４号）など、他の記載された方法は、ＤＮＡ試料を分離および増幅する方法および装置を提供する。特定のＤＮＡ分子を検出および定量するために光学色素が用いられる（国際公開第０５／０１７１８１号）。ナノチューブ装置（国際公開第０６／０２４０２３号）は、特定のＤＮＡ分子を連結した後、検出され得るＤＮＡ分子またはナノビーズの検出のための電子センサーを含む。
【００８２】
ＤＮＡ検出キットを、本明細書に開示された組成物、およびＤＮＡ検出の当該技術分野において周知の方法を用いて開発できる。キットは、試料中の事象ＫＫ１７９−２の特定に有用であり、適切な事象ＤＮＡを含む植物を育種するための方法に適用できる。キットは、配列番号１〜６またはそのフラグメントもしくは相補体に相同性または相補的であるＤＮＡプライマーもしくはプローブを含み得る。
【００８３】
したがって、本発明のキットおよび検出方法は、事象ＫＫ１７９−２の特定、事象ＫＫ１７９−２を含む植物品種またはハイブリッドの選択、試料中の事象ＫＫ１７９−２由来のＤＮＡの存在の検出、ならびに事象ＫＫ１７９−２または事象ＫＫ１７９−２を含む植物、植物部分もしくは日用品の存在および／または非存在についての試料の監視にとりわけ有用である。
【００８４】
以下の実施例は本発明のある種の好ましい実施形態の例を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者が本発明の実施に良好に機能することを見出したアプローチを表すものであり、よって、その実施についての好ましい様式の例を構成し得るとみなせることは、当業者によって理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、本開示に鑑みて、多数の変更を開示された特定の実施形態に加えることが可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果を依然として得ることが可能であることを理解するであろう。
【実施例】
【００８５】
実施例１：インバースＰＣＲを使用したフランキング配列の単離および配列決定によるフランキング配列の特定
この実施例は、事象ＫＫ１７９−２に対して、インバースＰＣＲを用いた、形質転換ＤＮＡ挿入物に隣接する（フランキング）アルファルファゲノムＤＮＡ配列の単離および配列決定によるそのフランキングゲノム配列の特定について記述する。
【００８６】
Ｏｃｈｍａｎらによって、１９９０年に（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：   Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）記述されている要領で、事象ＫＫ１７９−２中のＴ−ＤＮＡ挿入物に隣接する配列を、インバースＰＣＲを用いて決定した。植物ゲノムＤＮＡを野生型Ｒ２３３６と温室条件下で育成された組織からの形質転換系列の両方から単離した。凍結した葉組織を液体窒素中で乳棒と乳鉢を使うか、または機械的研磨によりすり砕き、次いで、当該技術分野で知られている方法を用いてＤＮＡを抽出した。限定されないが、種子を含む任意の組織からのＤＮＡ抽出のために、この方法には、当業者によって改変を加えることができる。
【００８７】
各試料からのＤＮＡのアリコートを、形質転換ＤＮＡの制限解析に基づいて選択された制限エンドヌクレアーゼによって消化した。制限フラグメントの自己連結後、形質転換ＤＮＡの５’終端および３’終端から離れる方向に伸張する配列を増幅するであろう、形質転換配列から設計したプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実行した。多種多様なＴａｑポリメラーゼおよび増幅系を用いることができる。表２に、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５３１ＳまたはＦ５３１Ｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００、ＡＢＩ  ９８００  Ｆａｓｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＣｙｃｌｅｒおよびＭＪ Ｏｐｔｉｃｏｎを使用したフランキング配列単離のためのＰＣＲ増幅の例を示す。
【００８８】
【表１】
2014524742.tif 000003
【００８９】
ＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡＧＥＮゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。標準的な配列決定プロトコルを用いて以降の産物の配列を直接的に決定した。これらの２つの方法を使用して、ＣＣＯＭＴ抑制カセットを含め、組み込みＤＮＡ挿入物の左側境界配列に向かって伸張する５’フランキング配列を特定し、配列番号３として示す（図１の［Ｃ］）。ＣＣＯＭＴ抑制カセットを含め、組み込みＤＮＡ挿入物の右側境界配列に向かって伸張する３’フランキング配列を特定し、配列番号４として示す（図１の［Ｄ］）。Ｒ２３３６ゲノムＤＮＡに組み込まれる形質転換ＤＮＡを配列番号５（図１の［Ｅ］）として示す。
【００９０】
単離した配列をＴ−ＤＮＡ配列と比較して、フランキング配列および同時に単離したＴ−ＤＮＡフラグメントを特定した。発現カセット存在の確認は、推定フランキング配列データおよび公知のＴ−ＤＮＡ配列に基づいて設計したプライマーを用いたＰＣＲによって行った。形質転換系統においてＴ−ＤＮＡが組み込まれた同一の領域に対応するＲ２３３６野生型配列を、ＫＫ１７９−２中のフランキング配列から設計したプライマーを用いて単離した。ＫＫ１７９−２のフランキング配列およびＲ２３３６野生型配を複数のヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対照して解析した。この情報を用いて、植物ゲノムに対する導入遺伝子の関係を調査し、挿入部位整合性を見た。実施例２に記載した要領で、フランキング配列および野性型配列を用いて、その事象を特定するために用いたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）エンドポイントアッセイ用プライマーを設計した。
【００９１】
実施例２
実施例２：事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）
この実施例は、試料中の事象ＫＫ１７９−２ＤＮＡを特定するための事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）サーマル増幅法を記載する。
【００９２】
事象ＫＫ１７９−２に特異的なエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法で有用な条件の例が、表２および表３に記述されている。エンドポイントアッセイに用いるＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ２０９０１（配列番号７）およびＳＱ２３７２８（配列番号８）、ならびに６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０１６４（配列番号９）である。６ＦＡＭ（商標）は、そのＤＮＡプローブに連結したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の蛍光色素製品である。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）プローブについて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性はフルオロフォアと消光剤との間で５’−終端からプローブを切断する。標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズした場合、消光剤およびフルオロフォアは、蛍光シグナルを生成するのに十分に分離する。
【００９３】
プライマーＳＱ２０９０１（配列番号７）およびＳＱ２３７２８（配列番号８）は、プローブＰＢ１０１６４（配列番号９）とともに、記述された要領で用いられると、事象ＫＫ１７９−２  ＤＮＡに特徴的な８１ｎｔのアンプリコンを生成する。この解析は、事象ＫＫ１７９−２  ＤＮＡを含むことが知られているアルファルファからの陽性対照、非形質転換アルファルファからの陰性対照、およびテンプレートＤＮＡを含まない陰性対照を含む。
【００９４】
これらのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ９７００、ＡＢＩ  ９８００  Ｆａｓｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＣｙｃｌｅｒおよびＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２２５での使用に合わせて最適化されている。事象ＫＫ１７９−２  ＤＮＡを特定するアプリコンの生成のために、当業者に既知の他の方法および装置を用いてもよい。
【００９５】
【表２】
2014524742.tif 000004
【００９６】
【表３】
2014524742.tif 000005
【００９７】
上に開示し、特許請求の範囲に列挙する代表的なアルファルファ事象ＫＫ１７９−２種子は、ブタペスト条約に従って、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．  ２０１１０に寄託されている。ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−１１８３３である。寄託は、３０年間、または最後の請求後５年間、または特許権の有効期間のうち、いずれか長い期間、寄託機関に保管され、この期間中、必要に応じて入れ替えられることもある。
【００９８】
本発明の原理を例示または記載してきたが、当業者には、かかる原理から逸脱することなく、本発明の構成や詳細を変更できることは明白であろう。発明者らは、添付した特許請求の範囲の趣旨および範囲にあるすべての変更を特許請求する。
【００９９】
実施例３
実施例３：低減リグニンアルファルファ事象の茎下部におけるＡＤＬの測定
【表４】
2014524742.tif 000006
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％。
ＬＳＤ＝最小有意差。
ＦＤ＝秋眠。
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２低減リグニンアルファルファ誘導事象。
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）。
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）。
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間。
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間。
Ｐ値  ＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１００】
表４の事象陽性植物は、プールされた陰性対照と比較して、茎下部のＡＤＬに１８〜３１％の範囲にわたる有意な（ｐ＜０．０５）減少を示した。ＫＫ１７９−２アルファルファ事象は「スイートスポット」選択法により特定される低減したリグニン表現型を有する。
【０１０１】
【表５】
2014524742.tif 000007
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％。
ＬＳＤ＝最小有意差。
ＦＤ＝秋眠。
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２低減リグニンアルファルファ誘導事象。
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）。
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）。
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間。
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間。
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１０２】
【表６】
2014524742.tif 000008
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％。
ＬＳＤ＝最小有意差。
ＦＤ＝秋眠。
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２低減リグニンアルファルファ誘導事象。
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）。
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）。
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間。
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間。
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１０３】
【表７】
2014524742.tif 000009
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＬＳＤ＝最小有意差
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１０４】
【表８】
2014524742.tif 000010
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＬＳＤ＝最小有意差
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１０５】
表６〜８は、それぞれ４箇所および２箇所での秋眠（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖質での茎下部のＡＤＬについての２００９のデータを示している。６つの事象陽性系列は、プールされた陰性対照と比較して、ＡＤＬに１２〜２６％の範囲にわたる有意な（ｐ＜０．０５）低減を示し、誘導事象ＫＫ１７９はＡＤＬに１８〜２２％の低減を示した。
【０１０６】
実施例４
実施例４：低減したグニンアルファルファ事象の茎下部でのＮＤＦＤ測定
【表９】
2014524742.tif 000011
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））。
ＦＤ＝秋眠。
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象。
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）。
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間。
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間。
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１０７】
３箇所での秋眠（ＦＤ）生殖質の６つの低減リグニン事象に対する茎下部のＮＤＦＤ。事象陽性植物は、プールされた陰性対照と比較して、茎下部のＮＤＦＤに１８〜３５％の範囲にわたる有意な（ｐ＜０．０５）増加を示した。
【０１０８】
【表１０】
2014524742.tif 000012
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））。
ＦＤ＝秋眠。
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象。
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）。
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間。
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間。
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１０９】
【表１１】
2014524742.tif 000013
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））。
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象。
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）。
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）。
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間。
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間。
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１１０】
【表１２】
2014524742.tif 000014
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＦＤ＝秋眠
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１１１】
【表１３】
2014524742.tif 000015
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１１２】
表１１〜１３は、それぞれ４箇所と２箇所での秋眠（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖質における茎下方ＮＤＦＤの２００９年のデータを示している。６つの事象陽性低減リグニンアルファルファ事象は、プールされた陰性対照と比較して、ＮＤＦＤに２２〜３６％の範囲にわたる有意な（ｐ＜０．０５）増加を示し、誘導事象ＫＫ１７９−２はＮＤＦＤに２２〜２８％の増加を示した。
【０１１３】
実施例５
実施例５：低減リグニンアルファルファ事象に対する生長力評価
【表１４】
2014524742.tif 000016
【０１１４】
これらの試験に対して採集されたデータは次の通りである：春季スコアとして前回の収穫の２１日後および５月の第２週に計測した植物生長力（１〜１０で採点、１０が最高）、季節ごとに収穫の１〜５日前に計測した倒伏耐久力（１〜１０で採点、１０  は完璧に直立）。植物を乾燥した後に計測した植物収量（１植物当たりの乾燥物質（ＤＭ）のグラム数）、ＮＤＦＤ（ＲＬアルファルファに対してＣＡＩ  ＮＩＲキャリブレーションを使用）およびＡＤＬ（ＲＬアルファルファに対してＮＩＲ較正を使用）。
【０１１５】
実施例６
実施例６：低減リグニンアルファルファ事象に対する植物全体におけるＡＤＬ測定
【表１５】
2014524742.tif 000017
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＬＳＤ＝最小有意差
ＦＤ＝秋眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１１６】
【表１６】
2014524742.tif 000018
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＬＳＤ＝最小有意差
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１１７】
【表１７】
2014524742.tif 000019
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＬＳＤ＝最小有意差
ＦＤ＝秋眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１１８】
４箇所に渡る、２００９年からの植物全体のＡＤＬデータを表１７および表１９に示す。秋眠生殖質における６つの低減リグニン陽性事象は、プールされた陰性対照と比較して、ＡＤＬに８〜１９％の間で変動する有意な（ｐ＜０．０５）減少を示した。事象ＫＫ１７９−２は、秋眠生殖質において、ＡＤＬにそれぞれ９．８％および９．４５の低減を示した。
【０１１９】
【表１８】
2014524742.tif 000020
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＬＳＤ＝最小有意差
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２０】
２箇所に渡る、２００９年からの植物全体のＡＤＬデータを表１８および表２０に示す。非休眠生殖質における６つの低減リグニン陽性事象は、プールされた陰性対照と比較して、ＡＤＬに１０〜１６％の間で変動する有意な（ｐ＜０．０５）減少を示した。６つの事象の５つは、プールされた陰性対照と比較して、ＡＤＬに１０〜１８％の間で変動する有意な減少を示した。事象ＫＫ１７９−２は、秋眠生殖質において、ＡＤＬにそれぞれ１２．３％および１０．９％の低減を示した。
【０１２１】
【表１９】
2014524742.tif 000021
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＦＤ＝秋眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２２】
【表２０】
2014524742.tif 000022
表中に用いられている略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾燥物資の％
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２３】
表１９および２０は、商用チェックと比較した、低減リグニンアルファルファ事象ＫＫ１７９−２の植物の干草全体のＡＤＬデータを含む。ＫＫ１７９−２事象は、６．８〜１６．７％の範囲にわたる４つの秋眠商用チェックの３つと比較して、ＡＤＬに有意な（ｐ＜０．１））減少を示した（表１９、４箇所からのデータ）。非休眠背景生殖質のＫＫ１７９−２事象（ＮＤ１）は、７．６〜１０．６％の範囲にわたる４つの非休眠商用チェックすべてと比較して、ＡＤＬに減少（ｐ＜０．２）を示した（表２０、２箇所からのデータ）。非休眠背景生殖質（ＮＤ２）のＫＫ１７９−２事象は、４つの非休眠商用チェックと比較して、ＡＤＬに全体的な減少（ｐ＜０．２）を示し、商用事象４（ＮＤ２、２箇所からのデータ）と比較して、有意な（ｐ＜０．１）８．８％の減少を示した。
【０１２４】
実施例７：低減リグニンアルファルファ事象に対する植物全体におけるＮＤＦＤ測定
【表２１】
2014524742.tif 000023
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＦＤ＝秋眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２５】
【表２２】
2014524742.tif 000024
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２６】
【表２３】
2014524742.tif 000025
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））。
ＦＤ＝秋眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２７】
表２３および２５に、４箇所に渡る、２００９年からの植物全体の ＮＤＦＤデータを示す。秋眠生殖質における６つの低減リグニン陽性事象は、プールされた陰性対照と比較して、ＮＤＦＤに７〜１６％の範囲にわたる有意な（ｐ＜０．０５）増加を示した。事象ＫＫ１７９−２は、秋眠生殖質において、それぞれＮＤＦＤに７．５％および９．２％の増加を示した。
【０１２８】
【表２４】
2014524742.tif 000026
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１２９】
表２４および表２６に、２箇所に渡る、２００９年からの植物全体のＮＤＦＤデータを示す。非休眠生殖質における６つの低減リグニン陽性事象は、プールされた陰性対照と比較して、ＮＤＦＤに８〜１５％の範囲にわたる有意な（ｐ＜０．１）増加を示した。事象ＫＫ１７９−２は、非休眠生殖質において、それぞれＮＤＦＤに１４．０％および１１．５％の増加を示した。
【０１３０】
【表２５】
2014524742.tif 000027
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＦＤ＝秋眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１３１】
【表２６】
2014524742.tif 000028
表中に用いられている略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁の不消化成分および難消化成分を表す（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾燥物資の％））
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１３２】
表２５および表２６は、商用チェックと比較した、低減リグニンアルファルファ事象ＫＫ１７９−２の植物全体のＮＤＦＤデータを含む。ＫＫ１７９−２事象は、４つの秋眠商用チェックの３つと比較して、４．２〜１６．８％の範囲にわたるＮＤＦＤに有意な（ｐ＜０．２）増加を示した（表２５、４箇所からのデータ）。ＫＫ１７９−２事象は、４つの非休眠商用チェック（ＮＤ１）すべてと比較して、９．８〜１９．４％の範囲にわたりＮＤＦＤに増加（ｐ＜０．２）を示した（表２６、２箇所からのデータ）。ＫＫ１７９−２事象は、４つの非休眠商用チェック（ＮＤ２）と比較して、８．８〜１６．３％の範囲にわたりＮＤＦＤに増加（ｐ＜０．２）を示した（表２６、２箇所からのデータ）。
【０１３３】
実施例８
実施例８：低減リグニンアルファルファ事象に対する場所横断収量解析
【表２７】
2014524742.tif 000029
表中に用いられている略語：
収量＝植物単位で計算される収量（グラム）
ＦＤ＝秋眠
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１３４】
表２７のデータは、プールした陰性対照と比較して、秋睡（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖細胞質における６つの低減リグニン事象に対する場所横断収量解析を示す。プールされた陰性対照と比較してＫＫ１７９−２について、収量に有意な減少は検出されなかった。
【０１３５】
【表２８】
2014524742.tif 000030
表中に用いられている略語：
収量＝植物単位で計算される収量（グラム）
ＦＤ＝秋眠
ＮＤ＝非休眠
ＫＫ１７９＝ＫＫ１７９−２削減リグニンアルファルファ誘導事象
デルタ＝事象平均と対照平均の差（事象−対照）
％差＝事象と対象とのパーセント差（デルタ／対照×１００）
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の上限信頼区間
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を使用したデルタ値の下限信頼区間
Ｐ値＝帰無仮説下で大きな絶対差が得られる確率（両側有意性検定）。
【０１３６】
秋眠（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖質における低減リグニンアルファルファ誘導事象に対する収量データは、８つの商用チェックと比較して、有意な収量の減少には帰結しなかった。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月18日(2014.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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