(57)【要約】本明細書の実施形態は、懸濁培養物から標的化合物を抽出するための組成物、方法及び使用に関係する。特定の実施形態では、懸濁培養物は藻類培養物を含み得る。一部の実施形態では、組成物及び方法は、懸濁培養物由来の粉砕して乾燥させたバイオマスを集塊化させた後に培養物から標的化合物を抽出することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスからの標的化合物の抽出方法であって、
バイオマスを乾燥させるステップ；
前記乾燥させたバイオマスを磨砕して微粉を作るステップ；
前記微粉を集塊化させるステップであって、それにより集塊粒子を作るステップ；及び
前記集塊粒子を通じて溶媒をパーコレートさせるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記集塊粒子を通じて前記溶媒をパーコレートさせるステップが、向流浸出抽出に基づき前記溶媒を適用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマスを乾燥させるステップが、前記微生物バイオマスを８５℃以上１４８．５℃以下の温度で乾燥させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマスの脱水を進めるため、前記微粉を集塊化させる間に周囲圧力を調整するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記集塊粒子を不燃性溶媒に曝露して不燃性混合物を作るステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記集塊粒子を大気圧下、摂氏２９．４度（華氏８５度）から最高摂氏６５．６度（華氏１５０度）までの範囲の温度で乾燥させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記集塊粒子を大気圧未満の圧力下で乾燥させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法であって、前記集塊粒子を前記大気圧未満の圧力下で乾燥させるステップが、前記集塊粒子の温度を下げることを含む、方法。
【請求項８】
前記バイオマスが、藻類、細菌、酵母、真菌、及び他の微生物の微生物バイオマス、水中の懸濁固形物及び廃水中の微粒子のうちの１つ以上を含む懸濁培養物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記集塊粒子を、５：１以上〜３０：１の高い長さ対直径比の分離カラムに適用するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒が第１の標的化合物を抽出する第１の溶媒であり、前記方法が、前記カラムに少なくとも第２の溶媒を導入して第２の標的化合物を抽出するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微粉を集塊化させるステップであって、それにより集塊粒子を作るステップが、不溶性結合剤を加えながら前記微粉を回転させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子を集塊化させるステップが、粗い水滴のみを加えて前記粒子を集塊化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶媒をパーコレートさせるステップが３５℃以下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
微生物バイオマスから形成されるプリル組成物であって、
各々がその表面積の大部分を維持していて、且つ３００ミクロン未満である、複数の集
塊化した微粉；及び
中性基材
を含む、プリル組成物。
【請求項１５】
前記集塊化した微粉が不溶性結合剤を含む、請求項１４に記載のプリル組成物。
【請求項１６】
前記複数の集塊化した微粉が、各３００ミクロン以上の集塊粒子を形成し、且つ前記集塊粒子が前記プリルの５０パーセント以上を含む、請求項１４に記載のプリル組成物。
【請求項１７】
前記複数の集塊化した微粉が、各３００ミクロン以上の集塊粒子を形成し、且つ前記集塊粒子が前記プリルの８０パーセント以上を含む、請求項１４に記載のプリル組成物。
【請求項１８】
プリルの生成方法であって、
懸濁培養物から微生物バイオマスを得るステップ；
前記バイオマスが少なくとも９０乾燥質量％になるまで前記微生物バイオマスを乾燥させるステップ；
前記乾燥した微生物バイオマスを磨砕して粒子を作るステップ；及び
前記粒子を集塊化させるステップであって、それにより前記粒子の表面積の大部分を維持しながら３００ミクロン以上の集塊粒子を生成して微生物プリルを形成するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記粒子を集塊化させる前記ステップが準大気圧下で行われる、請求項１８に記載のプリル。
【請求項２０】
前記粒子を集塊化させる前記ステップが、高分子結合剤を使用することを含む、請求項８に記載のプリル。
【請求項２１】
乾燥させて粉砕したバイオマスを懸濁培養物から集塊化させる方法であって、少なくとも部分的に乾燥させたバイオマスを、中性基材を含む器具において回転させるステップであって、場合により、前記中性基材が前記バイオマスに滴下して投入されるステップと、バイオマス粒子の凝固塊又は凝集塊を形成するステップであって、そのようにして前記バイオマスを集塊化させて集塊粒子を形成するステップとを含む方法。
【請求項２２】
前記少なくとも部分的に乾燥させて粉砕したバイオマスを、集塊化前、その最中又はその後に、以下の供給源、即ち熱、空気、光、マイクロ波、可視光、赤外線、他の電磁放射線又は他のエネルギー源のうちの少なくとも１つに曝露するステップを更に含む、請求項２１に記載の方法であって、前記少なくとも部分的に乾燥させて粉砕したバイオマスが、前記少なくとも１つの供給源によって更に脱水される、方法。
【請求項２３】
前記バイオマスの脱水を進めるため、前記乾燥させて粉砕したバイオマスを集塊化させる間に周囲圧力を調整するステップを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養物がガスに曝露され、場合により前記ガスが不燃性ガスであり；及び前記集塊粒子が前記ガスと不燃性混合物を形成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記集塊粒子が溶媒に更に曝露されて前記集塊粒子の生成物が抽出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記生成物が脂質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生成物が燃料又は燃料を生産するための供給原料である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
圧力が大気圧であり、及び温度が摂氏２９．４度（華氏８５度）以上摂氏６５．６度（華氏１５０度）未満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養物が噴霧乾燥される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記懸濁培養物が、藻類、細菌、酵母、真菌、水中の懸濁固形物又は廃水中の微粒子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
結合剤を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記結合剤が、コーンスターチ、アルギン酸塩、グルコース、スクロース、フルクトース又は他の糖類、リグニン及び炭水化物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記集塊粒子が、高い長さ対直径比の分離カラムに適用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
懸濁培養物由来のバイオマスから１つ以上の標的化合物を抽出する方法であって、集塊粒子を分離装置に適用するステップと、前記集塊化した懸濁培養物から標的化合物を抽出するステップとを含む方法。
【請求項３５】
第１の薬剤又は溶媒が前記カラムに導入されることにより標的化合物が抽出され、そのしばらく後に少なくとも第２の薬剤又は溶媒が前記カラムに導入されることにより第２の標的化合物が抽出される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤が、ヘキサン、エタノール、クロロホルム又は他の溶媒又は極性薬剤を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
水又は他の薬剤を受け入れることが可能な容器であって、少なくとも１つの方向に動かすことが可能な容器と、ある場所から別の場所に移動させることを可能にする、前記容器に取り付けられる支持体又は格納装置とを含む、懸濁培養物の集塊化用器具。
【請求項３８】
少なくとも１つの保持スクリーン層とドレンとを有する集塊物試験装置であって、藻類プリルの圧縮強度を評価することが可能な装置を含む、藻類プリルの圧縮強度の評価装置。
【請求項３９】
微生物バイオマスの複数の集塊粒子であって、そのうちの５０パーセント以上が３００ミクロン以上である集塊粒子と、
中性基材と
を含む前記微生物バイオマスのプリル組成物
を含むキット。
【請求項４０】
１つ以上の溶媒を更に含む、請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、概して、微生物培養物から採収されるバイオマスの浸出を向上させるための方法及び組成物を報告する。特定の実施形態では、組成物及び方法は、本明細書に報告される方法及び装置を用いて懸濁微生物由来の本質的に乾燥したバイオマスを集塊化させることに関係する。他の実施形態は、微生物によって生成される標的化合物の処理又は抽出の準備として、採収して本質的に乾燥させた微生物を集塊化させる方法に関係する。更に他の実施形態は、微生物からのバイオマス又は標的化合物の回収を増加させるための、集塊培養物を浸出させ又は抽出するシステム及び方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、限定はされないが、燃料、バイオ燃料、医薬品、ニュートラシューティカルズ、小分子、化学品、栄養補助剤、飼料、供給原料及び食品としての潜在的な有用性をもつ多くの副産物及び生成物の生成に用いることができる。そのような生成物を生成及び単離するため、望ましい化合物を回収する処理を行う前に、培養物は高細胞密度に濃縮され得る。更に、そのような生成物の単離又は濃縮に抽出プロセスが用いられ得る。
【０００３】
生成物の生成に微生物を効率的に利用することは、難題であり得る。例えば、藻類バイオ燃料の生成に関して、藻類からの化合物の抽出に利用可能な費用対効果の高い且つ効率的な分離技術はほとんどない。効率的な分離技術の不足を引き起こす要因はいくつかある。例えば、粉砕された藻類を含め、乾燥又は半乾燥固形材料のハンドリングでは、材料が山積みにされると認められるとおり分離が生じ得る；材料のうちより大きい粒子はその山を転がり落ち、一方、より細かい径の材料は頂上付近に留まる。加えて、固結していない細かく粗い材料が存在するために、空気圧で又は機械的にハンドリングする間に粒子の分離が生じ得る。灌流した場合、固結していない範囲の粒子のなかの細粒がその塊のなかで移動して分離し、パーコレーションの問題が起こり得る。細粒の存在は、限局化された選択的な流れ（チャネリング）、流体の流れに至る範囲の目詰まり（ブラインディング又はプラギング）、及び液体の貯留（フラッディング）を引き起こし得る。この粒子分離は抽出及び／又は処理時の問題を助長し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の実施形態は、概して、懸濁培養物から得られるバイオマスのための方法及び組成物を報告する。特定の実施形態では、組成物及び方法は、改良された浸出方法に関係する。他の実施形態は、微生物から生成物及び／又はバイオマスを抽出するための組成物、方法及び使用に関係する。一部の実施形態は、限定はされないが、藻類、細菌、酵母、真菌などの微生物、並びに水中の懸濁固形物及び廃水中の微粒子を含む懸濁組成物に関係する。更に他の実施形態は、集塊化技術を用いて効率的に液体からバイオマスを分離する、又はバイオマス（例えば藻類）から標的化合物を分離するシステム及び方法に関係し得る。
【０００５】
本発明の一部の実施形態は、微生物バイオマスなどのバイオマスからバイオ燃料などの標的化合物を抽出することに関する。これらの実施形態においては、懸濁された培養物（例えば藻類）を乾燥させて摩砕し、微粉及び他の小粒子を作る。それらの小粒子を用いて集塊粒子を作る。一部の実施形態では、小粒子はその個々の表面積のほとんどを維持する。次に、浸出技術によって集塊粒子から標的化合物を抽出する。
【０００６】
他の実施形態では、懸濁培養物由来の、乾燥させ粉砕したバイオマスの集塊化は、少な
くとも部分的に乾燥させた懸濁培養物を器具内で液体と共に回転させ（場合によりこの液体は培養物に滴下して加えられる）、バイオマス粒子の凝固塊又は凝集塊を形成し、そのようにしてバイオマスを集塊化させることにより行われる。バイオマス又は懸濁培養物を更に脱水するため、少なくとも部分的に乾燥させた懸濁培養物を、空気、光、マイクロ波、可視光、赤外線、他の電磁放射線又は他のエネルギー源を介して熱に曝露してもよい。
【０００７】
一部の実施形態では、バイオマスの脱水を進めるため、集塊化後の乾燥時における周囲圧力が調整される。
更に他の実施形態は、処理に用いられる培養物であって、集塊化していない培養物と比較して反応性又は非反応性の薬剤に曝露したときの透過性が向上した培養物を報告する。
【０００８】
他の実施形態は、場合によりガスに曝露される培養物を報告し、ここでガスは不燃性ガスであり、集塊培養物はガスとの不燃性混合物を形成する。
特定の例示的方法では、集塊培養物が溶媒に更に曝露され、集塊培養物の生成物が抽出される。そのような実施形態では、集塊化していない培養物からの生成物の抽出と比較して、集塊培養物の生成物の抽出率が向上する。
【０００９】
一部の実施形態では、集塊化後の大気圧下での乾燥温度は、華氏３２度（摂氏０度）〜摂氏６５．６度（華氏１５０度）の範囲であるが、抽出する標的化合物が分解される温度未満の選択温度である。温度は、圧力が大気圧であるとき摂氏２１．１度（華氏７０度）以上摂氏６５．６度（華氏１５０度）未満の範囲にあることもある。
【００１０】
特定の実施形態では、培養物の標的生成物が分解するリスクを低減するため、圧力は大気圧未満であり、且つ温度は大気圧下での温度未満である。
他の実施形態では、培養物は噴霧乾燥される。
【００１１】
更に他の実施形態において、懸濁組成物には、限定はされないが、藻類、細菌、酵母、真菌、及び水中の懸濁固形物、又は廃水中の微粒子が含まれる。
一部の実施形態では、粒子の集塊化に結合剤が用いられる。結合剤としては、コーンスターチ、アルギン酸塩、グルコース、スクロース、フルクトース又は他の糖類、リグニン、高分子結合剤、又は炭水化物を挙げることができる。一部の実施形態は不溶性結合剤を使用する。他の実施形態では、粒子を集塊化させるときに水又は培養物の水性懸濁液が用いられ得る。
【００１２】
特定の例では、液体と培養物との比は所定の比であってよい。
本明細書に開示されるとおりの集塊培養物は、５０パーセント又は６０パーセント、又は７０パーセント又は８０パーセント又は９０パーセント以上が直径３００ミクロンより大きい粒子を含み得る。
【００１３】
一部の実施形態では、集塊化条件は、集塊粒子の強度及び安定性により選択される。
他の実施形態は、懸濁培養物由来のバイオマスから１つ以上の標的化合物を抽出する方法を含み、これは、集塊化した懸濁培養物を分離装置にかけるステップと、集塊化した懸濁培養物から標的化合物を抽出するステップとを含む。分離装置は、高アスペクト比、場合により１より大きい高さ対幅比のカラムであってもよく、ここで比を大きくすると、溶媒対溶質効率が増加する。
【００１４】
特定の実施形態は、水又は他の薬剤を受け入れることが可能な容器であって、少なくとも１つの方向に動かすことが可能な容器と、その容器に取り付けられる、ある場所から別の場所に移動させることが可能な支持体とを含む、懸濁培養物の集塊化用器具を利用する。
【００１５】
一部の実施形態は、例えば、図６Ａ〜図６Ｅに示されるとおりの、少なくとも１つの保持スクリーン層とドレンとを有する集塊物試験装置であって、藻類プリルの圧縮強度を評価することが可能な装置を含む、藻類プリルの圧縮強度の評価装置を含む。加えて、本明細書で企図される試験は、藻類材料中の１つ以上の標的分子を抽出するための１つ以上の溶媒の存在下で行われ得る。
【００１６】
他の実施形態では、バイオマスから標的化合物が抽出される。バイオマスは乾燥させ、次に磨砕して、微粉を作ることができる。この微粉を集塊化させて集塊粒子を作ることができる。次に集塊粒子を通じて溶媒をパーコレートさせて、１つ以上の標的化合物を抽出することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、向流浸出抽出技法が用いられる。
特定の実施形態では、バイオマスは９５℃〜１２０℃の温度で乾燥することができる。
他の実施形態では、バイオマスの脱水を進めるため、微粉を集塊化する間の周囲圧力が調整される。
【００１８】
一部の実施形態では、集塊粒子は、摂氏２９．４度（華氏８５度）から最高摂氏６５．６度（華氏１５０度）までの範囲の温度に曝露される。
特定の実施形態では、第１の溶媒を用いて第１の標的化合物が抽出され、及び第２の溶媒を用いて第２の標的化合物が抽出される。
【００１９】
他の実施形態では、微粉を集塊化して集塊粒子を作ることには、湿潤溶液（又は不溶性結合剤）を加えながら微粉を回転させることが含まれ得る。
更に他の実施形態では、溶媒は約３５℃乃至正確に３５℃で集塊粒子に加えることができる。
【００２０】
特定の実施形態では、集塊粒子は中性基材に付着させる。中性基材の例としては、限定はされないが、プラスチック、石、金属又は他の好適な材料の粒子を挙げることができる。
【００２１】
特定の実施形態では、粉砕後であって集塊化前の粒子は、直径１５００ミクロン以下、又は直径８５０ミクロン以下、又は直径３００ミクロン以下であってよい。
一部の実施形態では、集塊化前に３００ミクロン未満の微粉が除去され得る。他の実施形態では、３００ミクロン以下の集塊粒子が、標的生成物の抽出のため更に処理され得る。
【００２２】
本明細書における他の実施形態は、５０パーセント、又は６０パーセント、又は７０パーセント、又は８０パーセント、又は９０パーセント、又はそれ以上が直径３００ミクロンより大きい集塊培養物を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、集塊粒子は準大気圧下で作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】時間の関数としての、様々な条件の乾燥温度及び粉砕粒径における乾燥藻類からの脂質の浸出回収率のプロットを示すグラフ。
【図２】粒径の関数としての、乾燥藻類からのヘキサン浸出回収率のプロットを示すグラフ。
【図３】例示的な集塊化器具の実例を示す写真。
【図４Ａ】他の例示的な集塊化器具の実例を示す写真。
【図４Ｂ】他の例示的な集塊化器具の実例を示す写真。
【図５】藻類の乾燥質量に対する液体の質量の割合として表される液体の添加を増加させた後に形成される集塊物の実例を示す写真。
【図６Ａ】本明細書に報告される特定の実施形態の例示的な装置を示す立面図および上面図。
【図６Ｂ】本明細書に報告される特定の実施形態の例示的な装置を示す写真。
【図６Ｃ】本明細書に報告される特定の実施形態の例示的な装置を示す写真。
【図６Ｄ】本明細書に報告される特定の実施形態の例示的な装置を示す写真。
【図６Ｅ】本明細書に報告される特定の実施形態の例示的な装置を示す写真。
【図７】ガラスカラム中で溶媒により湿潤し、集塊化した藻類を示す写真。
【図８】様々な浸出剤適用速度を用いた、様々なベッド高さの集塊粒子のカラムのヘキサン浸出による脂質質量収率の例示的プロットを示すグラフ。
【図９】様々な条件下における乾燥させて集塊化した藻類の溶媒浸出による抽出物からの脂肪酸の例示的ガスクロマトグラフィー分析を示すグラフ。
【図１０】高い溶媒適用速度で短期間、続いて低い適用速度での、背の高いカラムにおける浸出抽出を示すグラフ。
【図１１】図１０のデータの溶出開始から４．５時間までを示すグラフ。
【図１２】時間の関数としての複合のヘキサン浸出抽出物のガスクロマトグラフィー分析を示すグラフ。
【図１３】高流量適用速度の継続時間を変化させたときの背の高いカラム試験における浸出抽出を示すグラフ。
【図１４】背の高いカラム試験における浸出抽出の最初の１２時間の詳細図を表示する図１３のデータを示し、重量収率に対する溶媒適用速度の低下の効果を示すグラフ。
【図１５】カラム浸出試験からの総ヘキサン浸出抽出物の例示的ガスクロマトグラフィー分析を示すグラフ。
【図１６】様々なカラム高さ及び灌流速度における、乾燥させて集塊化した藻類の一次浸出及び二次浸出の例示的なプロットを示すグラフ。
【図１７】極性溶媒及び非極性溶媒による藻類浸出抽出物からの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートの写真。
【図１８】溶媒（例えばヘキサン）による乾燥藻類の撹拌浸出に対する液体対固体比の何らかの効果を示すグラフ。
【図１９】ベッド高さ及び極性溶媒適用速度を変化させて乾燥藻類を二次浸出する間の重量収率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
様々な実施形態を詳説するため、以下の節に様々な例示的組成物及び方法を記載する。当業者には、様々な実施形態の実施に、本明細書に概説される具体的な詳細の全てを、又は更には一部さえも用いる必要はなく、むしろ濃度、時間及び他の具体的な詳細をルーチンの実験を通じて改良し得ることは明らかであろう。場合により、周知の方法又は構成要素は記載に含めていない。
【００２６】
本明細書で使用されるとき「懸濁培養物」は、採収する時点までの培養物を指し得る。
本明細書で使用されるとき「バイオマス」は、培養物から培地が本質的に取り除かれている懸濁培養物（例えば、乾燥させた培養物）を指す。バイオマスは、任意の方法で任意の期間保存することができ、又は例えば標的化合物の抽出のために、直ちに使用することもできる。
【００２７】
本明細書で使用されるとき「流体」は、液体又は気体を意味し得る。例えば、溶媒流体は液体であってよく、乾燥流体は気体であってよい。
本明細書で使用されるとき「集塊化」は、本明細書に記載される特定の実施形態による
懸濁培養物由来の乾燥させて粉砕したバイオマスの凝集塊化を意味し得る。加えて、「集塊化」は、本明細書で使用されるとき、懸濁培養物由来の乾燥させて粉砕したバイオマスの微粉がより大きい粒子に付着すること、小さい粒子から大きい粒子を作ること、又は粒子を中性基材などの他の物質に付着させることに関係し得る。
【００２８】
本発明の一部の実施形態は、細胞の培養物から採収されたバイオマスを通る抽出溶媒の流量を増加させる集塊化及び／又は浸出技術を用いた、バイオマスからの標的化合物の抽出に関する。これらの実施形態においては、集塊化したバイオマスを撹拌式、液体充満式、又は充填床式浸出装置で使用することにより、低コスト且つ高生産量で標的化合物の抽出を増加させることができる。標的化合物としては、限定はされないが、生成物、化学的複合物、バイオ燃料、小分子、栄養補助剤及び供給原料を挙げることができる。例示的バイオマス材料としては、限定はされないが、藻類、細菌、酵母、真菌、水中の懸濁固形物及び廃水中の微粒子を挙げることができる。懸濁培養物に由来するバイオマスがいくつかの実施形態で用いられるが、マット又は固結したマスとして成長させる採収バイオマスなどの、他のバイオマス供給源もまた用いられ得る。
【００２９】
一部の実施形態では、懸濁培養物は藻類培養物であってよい。これらの実施形態で用いられる藻類には、静止している種、浮遊している移動性のある種、又は組み合わせが含まれ得る。藻類種の例としては、限定はされないが、ナンノクロロプシス・エスピーピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）を挙げることができる一方、他の種としては、限定はされないが、ケルプ、例えばサッカリナ・エスピーピー（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  ｓｐｐ．）が挙げられる。任意の微生物培養物が本明細書において企図される。例えば、藻類は、いくつかの工業で用いられる脂質化合物を含めた様々な化合物を生成することができる。脂質は、藻類の生活環の様々な段階で生成され得る。様々な藻類種がその脂質含有分のために成長及び採収されており、脂質含有分は細胞によって生成されるもので、特に貯蔵産物として細胞壁及び細胞内部に主に位置する。目的の化合物又は生成物を有する培養藻類は収集し、濃縮するか、又は「水を取り除く」ことで、標的化合物を回収できる。
【００３０】
標的とされる化合物は、浸出抽出技法を用いて培養生物（例えば藻類、細菌等）から抽出することができる。浸出抽出では、溶媒を用いて生物から標的分子を遊離させ得る。例えば、藻類培養物から採収される非極性成分としては、限定はされないが、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及び当該技術分野における他の公知の分子を挙げることができる。例えば藻類培養物からの、採収することができる極性成分としては、限定はされないが、リン脂質、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（アドレン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（アラキドン酸又はＡＲＡ）、及び当該技術分野で藻類によって生成されることが知られる他の極性分子を挙げることができる。或いは、又はこれらの抽出と共に、一部の実施形態は極性又は非極性標的分子の１つ以上（例えばＰＵＦＡ）の非存在下で機能する。これらの実施形態においては、低い又は付随的な量のＰＵＦＡ（例えばＣ２０：４及びＣ２０：５）を含む環境におけるＣ１６及びＣ１８範囲の標的飽和脂肪酸を、本明細書に開示される方法により生成及び単離することができる。
【００３１】
特定の実施形態では、藻類は水溶液中で処理されても、又は部分的若しくは実質的に水の存在なしに処理するために乾燥させてもよい。脂質を回収するための藻類の乾燥は、脂質成分の回収が良好となる特定の温度で改善できることが実証されている。これらの実施形態において、藻類は、８５℃〜１００℃の範囲の温度、又は更には１００℃より高い温度（例えば約１１２℃）で乾燥させてもよい。一例では、藻類を別個の試験において摂氏６５度、７５度、８５度、及び１００度（℃）に維持した温度で乾燥させ、次に固化した
マスを破砕及び粉砕した。次に、選択された粒径画分（１ｍｍ篩は通過するが、８５０ミクロン篩によっては残留するもの、即ち−１ｍｍ  ＋８５０μｍ）を、これらの乾燥用温度に維持しなかった培養物との比較のためにヘキサンで撹拌浸出し、選択した温度間で比較した。１００℃で乾燥した、更に全てが３００ミクロン径より小さい粒子分布を含む一つの藻類試料もまた含めた。例えば図１を参照のこと。
【００３２】
特定の実施形態では、乾燥は、集塊材料に通す、又はその上への、入射光若しくは他のエネルギー（例えばマイクロ波）の適用によるか、熱の適用によるか、又は周囲空気若しくは加熱空気の通過により達成することができる。乾燥を用いることにより、続く浸出抽出を増加させることができる。これは、細胞膜から液体が除去されることにより希釈が低下して溶媒の浸透が増加し、そのため目的の化合物に対するより良好な溶媒接触が可能となり、ひいては溶媒適用を用いた浸出抽出が増加することで達成され得る。維持する又は最高値に到達させる具体的な乾燥温度は、化合物の浸出抽出が向上するように最適化され得る。８５℃を上回る温度、特に１００℃〜１１２℃の温度域で乾燥させた藻類が、続く浸出における例えばナンノクロロプシス・エスピーピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）からの脂質抽出の向上をもたらすことが見出された。例えば図１を参照のこと。バイオマスに含まれる成分が崩壊し始める温度を上回る乾燥温度は準最適であり、例えばナンノクロロプシス・エスピーピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）は約１４８℃で乾燥させると黒変して焼け焦げた臭いを呈し、黒に近い色のヘキサン浸出抽出物が生成された（データは図示せず）。
【００３３】
一部の実施形態によれば、約１％〜９９％の範囲の乾燥物質含量を有するバイオマスケーキは、ケーキの乾燥物質含量が約９０％〜１００％の範囲になるまで乾燥させる。一部の実施形態によれば、バイオマスは、約８５℃若しくはそれを上回る温度、又は約１００℃若しくはそれを上回る温度又はそれ以上の温度で乾燥させてもよい。これらの実施形態において、バイオマスは低温殺菌温度を上回る温度で乾燥させてもよく、従ってバイオマスは低温殺菌なしに処理され得る。一部の実施形態によれば、バイオマスの処理には細胞破壊及び／又は透過が必要となり得る。このような実施形態では、細胞透過は乾燥させることにより提供されてもよく、乾燥させると膜が収縮して疎油性挙動が取り除かれ、非極性溶媒の浸透が可能となる。加えて、乾燥プロセス（及び／又は最初のハンドリングプロセス）において極めて小さい粒子（例えば「微粉」）を生じさせてもよく、これは、以下に記載するとおり、続く磨砕プロセスを促進し得る。
【００３４】
一部の実施形態によれば、培養物（例えば藻類）は、目的の化合物が効率的に抽出されるように特定の方式で処理される。例えば、乾燥した微生物（例えば藻類）が粉砕されてより小径の粒子が形成され、これによって後の溶媒（例えば浸出用薬剤）とのより良好な流体接触が可能とされる。加えて、バイオマスを高度に乾燥させる場合、小粒子（例えば、粉塵、剥片、又は微粉）は、既に十分に細かい所望の径であり、バイオマスの磨砕を促進し得る。こうしたより小さい粒子は、以下に更に詳細に記載するとおり、次に複合の（例えば集塊化した）粒子を形成することができる。同時に、より小さい粒子をより大きい粒子に集塊化する場合であっても、それらのより小さい粒子は集塊粒子中においてなお容易に特定（例えば、目視で特定）することができ、より小さい粒子の表面積がより良好な溶媒接触に利用され得ることを実証している。例えば図２０を参照のこと。従って、より小さい粒子の複合物である集塊粒子は、例えば円柱形の、例えば押出し法によって形成された粒子と比べてより大きい表面積を有する。
【００３５】
この処理に対する一態様は、「微粉」とも称される細粒径画分を、集塊化と称されるプロセスでより大きい粒子に付着させることである。このように形成された粒子は、「集塊物」又は「プリル」として知られる。集塊物は、細粒がより大きい粒子に及び／又は互いに固着した粒子集合体である。この固着は半永久的な付着であってよく、弱い引力の影響
下にある水性懸濁培養液中の藻類細胞のフロック形成又は凝集とは異なる。このようなフロック形成物（「フロック」）、即ち大きい細胞凝集塊は、水性懸濁液中で形成され、弱い引力は水を除去すると存在しなくなるため、藻類の乾燥処理にはほとんど有用でない。同様に、乾燥細粒は静電気的に帯電した状態となり、一時的に互いを引き付け得るが、抽出溶媒に濡れるとこの効果は持続しない。藻類の抽出処理に有用であるためには、粒子対粒子の付着が広く行き渡って有効なまま保たれ、細粒の脱離及び移動が阻止されなければならない。
【００３６】
特定の実施形態では、微生物の集塊化には、容器内で回転により撹拌される、乾燥させて破砕又は粉砕したバイオマスを用いることが含まれ得る。本明細書で使用が企図される容器としては、限定はされないが、管、バレル、ドラム、又は回転円板を挙げることができる。特定の実施形態では、懸濁培養物に液体が滴下又は別の方式で加えられ得る。一部の実施形態は、不連続な液滴を用いて粒子を局所的に湿潤させ、後にそれらの粒子が、他の粒子が付着する核となる。
【００３７】
一部の実施形態では、集塊化は、水と組み合わせたときに粒子を付着及び結合することが可能な、藻類の天然に存在する又は内因性の構成成分を使用して達成することができる。従ってこのような実施形態では、集塊粒子を作る際に、藻類には水のみが添加される。他の実施形態では、細胞の水中懸濁培養物を液体として添加して、他の乾燥バイオマスの集塊化を生じさせることで、懸濁された細胞を水から分離する必要をなくしてもよい。乾燥させて粉砕したバイオマスに液体が添加されると、添加された水分により細粒の付着が実現され、その追加の水分は、浸出前の乾燥で取り除くことができる。他の実施形態は結合剤を利用し、結合剤は、集塊物の形成を意図して充填床抽出向けの材料に添加することができ、ここでは結合剤が集塊化を生じさせ、又は集塊化速度を増加させるなどする。本明細書で使用が企図される一部の結合剤としては、限定はされないが、糖類、デンプン、コーンスターチ、糖蜜、アルギン酸塩、グルコース、スクロース、フルクトース又は他の糖類、リグニン、高分子結合剤など、又は他の公知の結合剤が挙げられる。これらの実施形態において、結合剤は、集塊化を実現するために浸出用薬剤に対して不溶性であるか、又は条件及び求められる標的化合物によっては可溶性でなければならない。
【００３８】
一部の実施形態では、粉砕後であって集塊化前の粒子は直径４０００ミクロン以下、又は直径８５０ミクロン以下、又は直径３００ミクロン以下等であってもよい。集塊化後の粒子は直径３００ミクロン以上、又は直径５００ミクロン以上、又は直径２０００〜５０００ミクロン以上であってもよい。本明細書における他の実施形態には、５０パーセント、又は６０パーセント、又は７０パーセント、又は８０パーセント、又は９０パーセント、又はそれ以上が３００ミクロンより大きい集塊培養物が含まれる。従って、微生物は、磨砕し、剥片化し、粉末状にする等により、溶媒とより多く接触することが可能な小さいサイズにされてもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、集塊培養物が更なる処理に供される。例えば、熱又は空気（又は両方）を集塊培養物に適用することにより集塊培養物を乾燥（又は更に乾燥）させてもよく、これにより物理的及び化学的接触に対する集塊粒子（集塊物）のロバスト性を向上させて、続く標的化合物の浸出回収を向上させることができる。集塊化後の乾燥温度は、最初のバイオマス乾燥時と同じであってよい：大気圧下でこの温度は、華氏３２度（摂氏０度）から、藻類中の望ましい化合物が分解される温度に至るまでの範囲であってよい。これらの実施形態において、何らかの藻類種を大気圧下で乾燥する場合、一つの乾燥温度は、摂氏２９．４度（華氏８５度）より高く摂氏６５．６度（華氏１５０度）未満であってもよい。周囲大気圧より下げると、乾燥を行う温度は低下し得る。必要であれば、これを用いて、易分解性化合物が分解を受けることなく本質的に乾燥乃至完全に乾燥した集塊物を実現することができる。
【００４０】
一部の実施形態は、藻類を含有する溶液の噴霧乾燥によって大部分が乾燥した藻類の粒子を生成し、それによりそれらの粒子を、本明細書に記載されるとおりの最適化された固定床式浸出用に調製することに関係する。噴霧乾燥による集塊物の調製は、藻類を予備乾燥及び粉砕する必要性を低下させる。続いて噴霧乾燥した粒子を集塊化して、同時に充填床内に置かれたときの細孔径がより大きくなるようにしながら望ましい粒径を生じさせるためには、更なる噴霧乾燥又は他の集塊化処理、例えば回転作用の付与が必要となり得る。他の実施形態では、藻類の集塊化は、藻類溶液の噴霧乾燥及び培養物の集塊化を、続く最適化された充填床式浸出のための水分除去と同時に行うことにより、実現することができる。これらの実施形態で有用な噴霧乾燥技法には、噴霧乾燥用の空気流中での又はその空気流を外れたところでの温度制御式乾燥が含まれる。他の実施形態では、藻類の乾燥に利用される温度の変動を用いて続く浸出抽出を最適化してもよい。微粉の所望の付着が実現された後、集塊化の間に用いられた水は、例えば続いて乾燥させることにより、除去することができる。
【００４１】
従って、一部の実施形態では、湿潤した濃縮細胞を、上記に記載したとおり目的の懸濁培養物に適切な所定の温度で乾燥させることができる。乾燥後、それらの培養物を所定の粒子分布サイズに粉砕し、本明細書に記載されるとおり集塊化させることができる。場合により特定の実施形態は、必要に応じて、集塊化後における最初に決定した温度と同様の温度範囲での再乾燥を提供する。本明細書では、懸濁培養物の標的化合物の抽出に適切な本質的に乾燥した集塊物を実現するため、１つ以上の乾燥工程が用いられ得ることが企図される。
【００４２】
特定の実施形態では、集塊粒子は、溶媒の上向流又は下向流による浸出のためベッドに置かれる。細粒を他の細粒並びにより大きい粒子と付着させて有効平均粒径を増加させると、流体の流れによって浸出床から運び出されることに対する微細材料の抵抗性が高まり得る。従って、一部の実施形態は、粒子の半永久的な集合及び集塊化により、より大きい粒子の形成、並びに充填床を通る流体の流れを維持するのに十分としながら充填床内でのより細かい粒子の可動化及び移行の阻止を実現する集塊化技術を用いる。このようにして、これらの実施形態はより均一で透過性の高い粒子ベッドを維持するとともに、ある範囲への溶媒の選択的な流れ（即ち「チャネリング」）及び他の範囲への流れの低下（例えば「プラギング」）を引き起こし得る浸出中の前記粒子の分離及び移動を防止する。加えて、材料ベッド（「充填床」、「固定床」、又は単に「ベッド」とも称される）の全体にわたり粒子間に介在する空間（「細孔」と称される）が比較的開放して保たれることにより、溶媒を充填床の全体に均等に適用することができ、それにより抽出可能な化合物の回収が増加し得る。一部の実施形態では、バイオマス粒子（例えば微粉）は、中性基材などの非反応性の固体と共に集塊化させてもよい。非反応性の固体は、続く浸出プロセスの間に充填床構造を維持するための構造として働く。
【００４３】
一部の実施形態は、固定床式浸出の使用に関係する。固定床式浸出構成を用いることにより、十分に区別された逐次的浸出が可能となる。ある化合物を抽出する第１の溶媒を用いた抽出の後、必要であればカラムをガス流で乾燥させてもよく、次に第２の溶媒を適用することができ、これにより大部分が第１の溶媒と異なる化合物が抽出される。これらのプロセスは、標的化合物の処理に影響が及び得る、ある浸出剤への別の浸出剤の混入、又は浸出剤の混合を回避することができる。特定の実施形態では、固定床式浸出における集塊化した藻類が、ある溶媒を異なる溶媒に容易に切り換えることを可能にする。これらの実施形態において、ヘキサンの後にエタノールが続いてもよく（非極性溶媒又は極性溶媒が用いられ得る）、これにより化合物の分離を単純化することが可能となり得る。この溶媒の分離により、他の場合には混合されている溶媒及び浸出化合物の高コストな後処理の分離を回避し得る。一部の実施形態では、複数の溶媒は、それらを共に混合して同時に適
用することができるように選択される。
【００４４】
第２（又は第３、第４等）の溶媒の最後の適用後、ベッドから溶媒をパージし、場合により取り出し前に再び乾燥させることができる。本明細書では、溶媒は混合されてもよく、例えば２つ以上の溶媒（例えば、ヘキサン及びエタノール、メタノール、クロロホルム等）を混合して、本明細書に記載される任意の抽出プロセスで使用し得ることが企図される。従って、透過性の充填床における処理により、例えば極性及び非極性など、好ましい化学的性質の様々な溶媒を逐次的に適用して、「チャージ」としても知られる試料マスから種々の目的の化合物を抽出することができる。このように溶媒諸種を逐次的に適用することにより、抽出された生成物の個別の回収及び分離が可能となる。この分離は、後に精製して、且つある化合物を別の化合物と選別するコストを削減するのに望ましいものであり得る。逐次的な浸出はまた、より高純度の生成物、標的化合物、又はバイオ燃料抽出物を生成する機会も提供し得る。特定の実施形態では、標的化合物の浸出前に、集塊培養物から望ましくない化合物を溶離又は除去することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、溶媒は、バイオマス粒子を覆うために溶媒が用いられるシステムではなく、溶媒が粒子集合体にしみ込むパーコレーションシステムで用いられる。パーコレーションシステムを用いると、溶媒が粒子集合体を（例えば、粒子集合体を構成するより小さい粒子の周囲を）通過するに従い溶媒で溶質を溶解させることが可能である。粒子集合体は、溶媒が粒子集合体の最上部に導入される状態で直立した位置に置かれてもよく、従って重力により溶媒が粒子集合体の中を通って引き込まれ、その基部（例えば底面）から抜け出る。これらの実施形態では、溶媒は１回のみ（例えば再循環させる必要なしに）使用されてもよく、これにより時間及び溶媒の所要量が減少する。他の実施形態では、溶媒をベッドを通して循環させることにより、抽出化合物の濃度を増加させ、それにより例えば所望の溶質濃度を達成し、又は選別のために処理する溶媒−溶質量を低減してもよい。一部の実施形態では、浸出時間は約２４時間以下であってよい。
【００４６】
一部の実施形態において、集塊化により、溶媒及び他の流体の双方の、充填床を通る流体の流れを改善することができる。集塊粒子ベッド内の流体の流れの改善により、溶媒抽出（浸出回収）が向上し、収率が増加し、及び充填床の材料からの望ましい成分の回収効率が増加し得る。集塊粒子の充填床を通る流体の流れの改善により、浸出作業からの抽出程度及び抽出率が増加し得る。集塊化がパーコレーション及びベッド空隙率を改善することにより、浸出の間及びその他の、例えば浸出後の試料のパージ又は乾燥による、潜在的に可燃性の溶媒をハンドリングする間の安全性が上昇し得る。また、安全性は、固定床の細孔をガスで充満させて可燃性溶媒との不燃性混合物を作り出す能力によっても向上し得る。本明細書で使用が企図される不燃性流体としては、限定はされないが、窒素又は二酸化炭素が挙げられる。本明細書で企図される有用な可燃性溶媒としては、限定はされないが、ヘキサン及びエタノールが挙げられる。
【００４７】
撹拌式浸出構成での集塊化した藻類粒子の使用は、浸出後の粒子のろ過性を改善し得る。ろ過性の改善により、より多くの浸出用薬剤及び標的化合物を回収することができる。更に、集塊化によってパーコレーション及びドレン特性の改善がもたらされることにより、ろ過材料又は充填床のいずれにおいても、固形物中に残る浸出剤及び／又はリンス剤の量が減少する。加えて、藻類を浸出抽出の前及びその最中の双方において処置することにより、前記の標的化合物の回収を改善してもよい。このような処置には、藻類を乾燥させる間の温度を維持すること、浸出に供される藻類固形物の粒径を維持すること、浸出中の液体対固体（「Ｌ／Ｓ」）質量比を維持すること、及び溶媒、即ち「浸出剤」の温度を維持することが含まれる。これらの処置のうちのいくつかを、以下に更に詳細に記載する。
【００４８】
他の実施形態は、バイオマスからの生成物の抽出を最適化するため、溶媒の対固体質量
比を変化させることに関係する。一部の実施形態では、１つ又は複数の液体対固体（Ｌ／Ｓ）比の最適な組み合わせ又は範囲は、様々なＬ／Ｓ比による浸出試験によって決定することができる。最適なＬ／Ｓ比条件の使用により、浸出物中の抽出化合物から過剰な溶媒をエネルギー集約的に蒸留することが最小限となり、しかし浸出の間に望ましい化合物の十分な回収を実現するだけの溶媒は、充填床式又は撹拌式のいずれの浸出構成においても、確実に存在し得る。
【００４９】
本明細書に提示される一部の実施形態は、高い長さ対直径比を用いる固定床式構成で浸出させることに関係する。高アスペクト比は、１より大きい長さ対直径、又は５、又は１０、又はそれ以上であってよい。これにより、浸出剤の量が最小限に抑えられる一方で、出てくる浸出物中の溶質の量が最適化され、且つ向流接触によって溶媒及び基質中の平衡濃度の溶質からの溶質抽出の抵抗が最小限に抑えられることで、浸出が最適化され得る。他の実施形態では、本明細書に開示されるとおりの浸出は、高アスペクトの封入容器で実現することができ、及び潜在的に、一次浸出剤及び二次浸出剤の両方による浸出、即ち一方の浸出用薬剤による望ましい化合物の抽出と、続く第２の薬剤による浸出抽出を含む。一次及び二次浸出用薬剤は、例えば極性溶媒及び非極性溶媒など、一般的な化学的分類が異なってもよく、又は例えばエタノール及びクロロホルムなど、特異性若しくは強度が異なってもよい。
【００５０】
特定の実施形態は、望ましい化合物の抽出を向上させるために浸出中の温度を変化させることに関係する。室温、周囲温度又は空気温度と比べて高い温度は（例えば、屋外又は加温されていない場所での作業時）、溶媒及び抽出可能な化合物の流動性を改善し、且つ溶質の溶解における溶媒の化学的活性を増加させることができ、及びバイオマスからの化合物の浸出改善に用いることができる。一部の実施形態では、浸出プロセス（及び他のプロセス）の間に用いられる温度は約３５℃であってよく、又は３５℃未満であってもよい。その温度は一定に保たれても、又は変化してもよい。一部の実施形態では、浸出中に望ましい温度を維持することを用いて、他の温度では可溶性がより高いあまり望ましくない特定の構成成分の抽出を阻害又は低減してもよい。更に他の実施形態では、浸出サイクルのある部分についてある温度範囲を維持し、浸出サイクルの別の部分については異なる温度範囲に変えてもよい。
【００５１】
他の実施形態は、撹拌、パーコレーション又は充満床の構成で行われる集塊粒子の浸出に関係する。これらの実施形態において、パーコレーション式浸出は、バイオマスを溶媒中に機械的に懸濁するエネルギー消費のない、向流浸出条件の環境を提供することができる。撹拌浸出は、容易且つ急速に浸出する化合物を短時間で抽出することが可能である。充満式浸出は、浸出システムへの連続的なエネルギー投入が不要であり、しかしながら向流接触を実現するには複数の工程が必要となり得る。従って、様々な現場又は方法の制約から、これらの浸出構成の１つ、又はそれらの組み合わせの適用が他と比べて好ましいとされ得るが、種々の条件下では、これらの方法のいずれかが、集塊化バイオマスを使用して浸出を実施するのにより望ましいものであり得る。
【００５２】
特定の実施形態は、集塊物の相対的な強度及び安定性を決定して集塊化条件を最適化することに関係する。関連性のある溶媒中のプリルを使用する浸漬試験で、溶媒が飽和したときの集塊物の耐久性を実証することができる。溶媒の存在下又は非存在下に、圧縮装置に置かれた乾燥集塊物を使用する強度試験を用いて、ハンドリング及び浸出中の機械的完全性及び耐久性を実証してもよい。例えば、図３は、プリル（例えば、藻類プリル）の圧縮強度及び他のパラメータを評価する、又はカラム中の集塊物の重量をシミュレートする例示的装置を示す。圧縮質量がフォロワープレートに置かれ、フォロワープレートは、試験カラムの円筒形の壁内で集塊物を圧縮する働きをする。示される圧縮質量の質量値は、通常重力に起因してカラム又は他の容器の底に向かって圧力上昇を生じ得る懸濁培養物（
例えば藻類）及び／又は他の成分の特定の質量に相当するように選択されてもよい。カラムの底で圧力及び他の特性を試験する背の高いカラムを組み立てる代わりに、より短い試験カラムを圧縮質量と共に使用することにより、通常はより背の高いカラムの深さが増すことで生じ得るカラムの底に向かう圧力の力を再現してもよい。異なる圧縮質量値を用いて、異なる深さ又は高さのカラムを再現してもよい。加えて、こうした装置は、図示されるとおりのドレンを備えることができ、溶媒使用に適し得る。一部の装置は、集塊物を支持する多層保持スクリーン（例えばアルミニウム）を含む。この装置を用いて集塊物の弾性を試験することができる。
【００５３】
特定の実施形態では、本明細書においてキットが企図される。例えば、キットは、限定はされないが、後の標的生成物抽出に有用な収容器に格納されたプリル組成物を含み得る。キットのプリルは集塊粒子を含むことができ、ここでプリルの大部分、５０パーセント超が３００ミクロン以上の集塊粒子を含む。他の実施形態では、キットは、用いられる微生物バイオマスに応じてプリルの有効期間を最適化するため、様々な温度で保存され得る。特定の実施形態では、キットは室温で保管されてもよい。他の実施形態では、キットは冷蔵庫又は冷凍庫に保管されても、又は更には液体窒素中に保存されてもよい。
【００５４】
本明細書では、キットの構成要素を最適に収容するのに有用な任意の収容器が企図される。
以下に、本明細書に開示される様々な実施形態、及び実施形態の組み合わせを示すいくつかの例を提供する。当業者は、特定のパラメータが例示的なパラメータであり、それらのパラメータは条件及び他の要因に応じて変化し得ることを理解する。
（実施例）
実施例１
図１は、乾燥温度及び粒径の関数としての、乾燥させた藻類からの脂質の浸出回収の実証を示す。図１に示されるとおり、同等の撹拌環境で浸出させたとき、１００℃で乾燥させた−１ｍｍ  ＋８５０ミクロンの粒径画分試料が、他の同じ粒径画分と比較して質量基準で顕著に高い脂質抽出を実現し、及び大幅に小さい粒子の分布を含む３００ミクロン試料が最も高い抽出を達成した。高温がある時点で藻類の脂質成分の分解をもたらし得ることが実証されているが、乾燥時にこれが起こるレベルは完全には確定されなかった。藻類脂質の組成が変化し得る温度は特定されているが、この温度は１１２℃より高いことが示されている。藻類マス、例えばろ過又は遠心固形物、即ち「ケーキ」としての藻類マスは、１００℃で完全に、且つ合理的な迅速さで乾燥し、これが、藻類脂質を変性させるリスクなしに抽出を行うことのできるパラメータを提供する。１１２℃の維持温度で乾燥し、次に撹拌ボトルロール及びカラム試験で浸出させるナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ）藻類を用いる続く試験から、最高１１２℃で乾燥させても回収は減少せず、又は含まれる脂質にいかなる害も現れなかったことが実証された。
【００５５】
水を取り除いた藻類、例えば藻類培養物ろ過ケーキ又は遠心で収集した固形物を完全に乾燥させると、藻類物質を含む２〜１０ミクロンサイズの細胞が固化及び硬化したマスを形成し、このマスは脆い。固結マスとしての乾燥藻類を浸出させると、一部には、溶媒が細胞内区画に達し、目的の抽出化合物が固結マスから出て藻類マスを離れ、バルク溶媒溶液中へと拡散するまでの拡散流路が長くなることに起因して、目的の化合物の抽出回収が低くなり得る。加えて、固結マスの表面積は、例えばｃｍ２／ｇの単位基準で、極めて小さい。抽出時間を最小限に抑え、且つ浸出回収を向上させるため、乾燥藻類は、破壊、破砕及び粉砕による粒径低減に供することができる。特定の乾燥藻類粒径で、続く浸出回収が向上し得ることが実証された。例えば、より小さい粒子の乾燥藻類は、概して大きい粒子と比べて浸出が速い。
【００５６】
実施例２
一つの例示的方法において、藻類培養物を摂氏１００度で乾燥させ、固結マスを細かく破砕した。次に試料をスクリーニング、即ち「篩別」して、藻類粒子をいくつかの粒径等級に分けた。次に、質量基準で浸出回収率及びその程度を決定する並行試験において、粒径範囲毎の部分試料をヘキサンでの撹拌式浸出に供した。狭い粒径等級の試料と並行して浸出した一つの試料は、篩別しなかった細かく破砕した材料からなり、「粉砕混合物」に相当した。この例における浸出条件は、室温で５対１のＬ／Ｓ質量比であった。これらの浸出試験の結果の一部を図２に示す。
【００５７】
図２は、粒径の関数としての乾燥藻類からのヘキサン浸出回収のプロットを示す。より大きい粒径画分（例えば−１ｍｍ  ＋８５０μｍ）に存在する粒子は、より小さい粒径画分（例えば−３００  ＋１４７μｍ）と比較して脂質のヘキサン抽出に利用されにくかったことが実証された。更に、−３００  ＋１４７ミクロンより細かく破砕した次に続く粒径画分であっても、これらの試験の浸出回収が著しく向上することはなかった。従って、本明細書に示されるとおり、より小さい粒子の乾燥藻類は、同様の条件下で浸出させたとき、より大きい粒子と比べてより効率的に浸出し、望ましい化合物のより高い浸出回収程度を実現する。特定の実施形態では、撹拌式のプロセス環境で実施されるとき、これらの微粉は浸出中に最小限のセットバックしか呈しないが、しかしながらより細かい粒径では、浸出後の液体−固体分離の問題が次第に大きくなる。
【００５８】
他の例示的方法では、細かく破砕した材料の沈降床又は充填床に流体を通過させようと試みるときに頻繁に生じる難題があることが実証されている。こうした方法では、微粉の存在により、微粉の移動又は充填床における抽出用の流体流路に相当する細孔の極小化が起こり得る。流体の流れは、このような微粉の悪影響を受ける。微粉によって流路径が著しく減少し、目的の化合物の回収が減少し得る。充填床において微粉が移動し、又は細孔径が減少すると、ある範囲に至る選択的な溶媒の流れ「チャネリング」、他の範囲に至る流れの減少「ブラインディング」、又は本質的に全ての流れの遮断「プラギング」が起こり得る。これらの流れの問題は液体−固体接触を阻害するもので、溶媒が溜まり込むようになり、充填床の各範囲に留まり続け得る点で、成分抽出、ベッドのリンス、又は乾燥を低下させ、又は更には妨害し得る。乾燥させた固形物を集塊化せずに浸出する一例では（実施例１を参照）、３００ミクロン未満を約２０質量％を含む破砕及び粉砕した藻類チャージを、生成されたままの形態で直径３インチ（７６ｍｍ）×高さ２０インチ（５１０ｍｍ）のカラムに入れた。カラムの最上部に溶媒を加えると、カラムは間もなく溶媒を有効量でベッドに通過させることができなくなり、カラムは事実上詰まった状態となった。続いて１０ｐｓｉｇ（２２ｐｓｉａ又は１５２ｋＰａ）の加圧窒素ガスをカラムの最上部に加えても、充填床に有効量の溶媒を押し通すことはできず、この試験は終了した。続いて、破砕及び粉砕した藻類チャージをスクリーニングして３００ミクロン径未満の粒子を実質的に全て取り除くと、脂質のヘキサン抽出用の透過性固定床を生じさせることができたが、処理コストが増すと同時に、試料質量の約２０％のプロセス損失があった。
【００５９】
特定の例示的方法では、より大きい粒子を作り、それにより３００ミクロン未満の微粉を減少させ、又は除去することで、ベッドに粒子間の空間（細孔）を作り出し、又はそれを維持して、小粒子及び微粉の有害な流れ効果を低減し、又は消失させることが可能である。特定の方法では集塊化を用いることができ、ここではより小さい粒子をより大きい粒子に、又は互いに付着させて、より大きい複合粒子を生成する。微粉が付着すると、微粉はもはや移行又は移動には利用できず、有効平均粒径が増加し、充填床内の細孔径も同様に増加する。細孔が大きくなり、且つ細孔数が増加することにより、流体の流れに対する抵抗の低下がもたらされ得る。集塊材料を浸出に供したとき、溶媒がベッド全体により均等に、より高い流量で適用され、抽出可能な化合物のより高速且つ多量の回収につながり得る。
【００６０】
特定の方法では、集塊化は、例えば、「結合剤」と称される、粒子を互いに粘着させる補助化合物の存在下における粒子間接触によって実現することができる。結合剤は添加剤であっても、或いはチャージの予備的構成成分であってもよい。多くの場合、結合剤は液体の添加によって活性化されるが、他の反応性物質が用いられてもよい。一部の実施形態では、集塊化は、粒子に回転動を生じさせて粒子を互いに接触させることにより達成される。一例において、懸濁培養物の集塊化は、乾燥させて破砕した培養物を有する容器において、粒子が容器内で互いを通り越えてカスケード状の流れ及び回転を生じるような方法で容器を回転させることにより、実現することができる。特定の方法は、より細かい粒子がより大きい粒子と、及び互いと集塊化するのを促進する結合剤を含み得る。特定の方法では液体を、ミストに対比されるものとしての粗い又は大きい液滴として添加することができる。粗い液滴は、粒子の集塊化を促進する湿潤した表面積を有する核をもたらし得る。液体は、十分な粒子の付着が実現されるまで、間欠的に、又は連続的に添加することができる。特定の乾燥した懸濁培養物には、外因的な結合剤を添加しなくても、水の添加で集塊化を生じさせるのに十分な天然材料が存在することが示されている。これによりコストが低減されると同時に、このような培養物からの生産が増加し得る。従って、例えば、粗い（ｃｏｕｒｓｅ）水の適用のみを用いて自己集塊化を（例えば特定の藻類種で）促進することは、大幅なコスト削減になり得るとともに、生成される生成物の純度に対する寄与因子にもなり得る。これらの例示的プロセスにおいて、懸濁培養物から採収される化合物又は生成物から添加した結合剤を除去する必要はないものと思われる。
【００６１】
実施例３
一方法では、１Ｌ容器にスペーサー（シム）を設置してジャーの一端を持ち上げることにより、ジャーが小さく揺動するタンブラー上において水平位置で回転するときに、乾燥させて粉砕した藻類が中に留まるようにした。ジャーを回転させながら、藻類がカスケード状に流れるに従い噴霧ボトルで水を添加した。図３は、このセットアップで藻類が集塊化されているところを示す。図３は、１リットル容器で振動タンブラー技術を用いた、乾燥させて粉砕した藻類の集塊化を示す。
【００６２】
より大量の試料の集塊化には、１．２５立方フィート（４２Ｌ）容量の電動セメントミキサを使用した。図４Ａ及び図４Ｂは、より大型のセットアップを示す。図４Ａ及び図４Ｂは、より大容積の藻類培養物の集塊化に用いられる大型ミキサ（例えばセメント用サイズのもの）を示す。図４Ａは電動ミキサを示し、図４Ｂは大型ミキサ内の藻類を示し、ミキサ内で藻類粒子がカスケード状に流れる作用が認められる。加えて、より大量の試料には、他のミキサを使用してもよい（例えば０．３８立方メートル（２分の１立方ヤード）；データは図示せず）。
【００６３】
実施例４
特定の方法では、外因的な液体の添加に伴い、標的とする培養物集塊化を実現するために更なる乾燥が必要であり得る。培養物を再乾燥させると、培養物における浸出反応の向上がもたらされ得る。集塊物が形成された後、熱、空気、化学的又は組み合わせによる乾燥を適用することにより、物理的及び化学的接触に対する集塊粒子（集塊物）のロバスト性又は抵抗性を向上させることができる。再乾燥はまた、試料を含むバイオマス細胞の、細胞中の成分との溶媒相互作用に対する抵抗性も除去し得る。例えば、集塊材料を乾燥オーブンに所定時間入れて、集塊物から流体を低減又は除去することができる。本明細書で実施した乾燥及び浸出試験から、試験した好ましい範囲内で温度を連続的に上昇させると、浸出効率が改善されたことが示されているが、しかしながらバイオマス化合物が分解し始める温度を上回ることは避けなければならない。結果的に、集塊化なしに乾燥する最初の試料乾燥時に用いたのと同じ最適温度で、集塊化したチャージの再乾燥を行った。図５は、乾燥質量藻類に対する添加した水の百分率（例えば１００ｇの水を４００ｇの乾燥藻
類に添加＝２５％）で注記される、様々なレベルの水を集塊化時に使用した、乾燥させて粉砕した藻類から形成された集塊物を示す。一つの観察は、集塊化プロセスの間により多くの水を提供するほど、集塊粒子の粒径が増加したことであった。図５は、本明細書に記載される集塊化プロセスにおいて水の添加量を増加させることの効果を表す。
【００６４】
再乾燥後、浸漬試験を用いて、選択された溶媒中でバイオマス集塊物の安定性及び強度を試験することができる。再乾燥後の試験材料の集塊化したチャージから、プリルをいくつか選択することができ、それらのプリルは、例えば大き過ぎたり又は小さ過ぎたりする、極端なものを代表するのでなく、集塊物の大多数を代表するようにされる。選択したプリルは、プリルを被覆するのに十分な溶媒が入った密封可能容器に入れ、機械的な破断又は微粉の離脱について静止状態で経時的に観察することができる。一部の実施形態では、プリルは顕著な変質なしに数日間浸漬に耐える能力を有する。例示的な試験では、集塊化した藻類粒子は、浸漬７日後も集塊化した形態のままであった。
【００６５】
試験装置は、集塊物の試料を収容し、且つ既知の単位面積当たりの力を及ぼすことにより、加えられる圧力に集塊物が耐える能力を決定するように組み立てることができる。この試験を用いてプリルの性能を評価し、浸出条件下で良好に形成されたプリルが抽出条件によって生じる重量下に圧潰しにくい又は圧潰しそうにないという確信を得ることができる。本発明の一実施形態では、直径６インチ（１５０ｍｍ）の鋼製通風管、高さ６インチ（１５０ｍｍ）の部品を使用して、目的の試料を入れる装置を組み立て、これはシール溶接された隔壁フロアを備え、一端が閉鎖されて他端が開放されている円筒を形成した。隔壁は、ドレン排出が促進されるようにやや皿形で、プレートの中心に穴を開けてねじ立てし、排液の流れを制御するためのボール弁を設置した。吐出し弁の下に置かれるビーカーにまたがるのに十分な架台を加えた。例えば図６Ｄを参照のこと。
【００６６】
隔壁の上面にエキスパンドメッシュを置いてドレン排出を促進し、集塊化したチャージを入れる保持スクリーンを支持した。保持スクリーンは、４層のアルミニウムウィンドウスクリーンから組み立てた。この例ではアルミニウムを選択したが、当業者に周知されているとおりの、ヘキサン又は他の所望の藻類脂質溶媒と適合性を有する任意の材料を用いることができる。図６Ｅを参照のこと。上面のフォロワープレートは鋼製プレートから作製し、円筒形セクションの内径に対してあらゆる側面で１／８インチ（３ｍｍ）の遊びを提供する直径に切断した。フォロワープレート上にウエイトを置いて、試験装置内に入れた集塊物に力を及ぼすことができる。利用される試験装置及び試料マスの物理的均衡に応じて、更なるスペーサー又はライザーをフォロワープレートに加えてもよい。このスペーサーは、加えるウエイトとフォロワープレートとの間に位置させることができ、それにより例えば、ウエイトが設計どおりにフォロワープレートを押圧せず、試料が入った円筒に直接載ることが防止される。例として上面プレートは、ウエイト用のスペーサー及び支持体としての、フォロワープレートと同心状にタック溶接された、例えば直径４インチ（１００ｍｍ）×長さ４インチ（１００ｍｍ）の軽量鋼管のセクションを利用することができる。この器具のいずれの構成部品も、必要性及び用いられる溶媒／抽出媒体に応じて、当該技術分野において公知の任意の化学的に適合性を有する材料を用いて作り上げることができる。図６Ａはユニットの概略図を示し、ウエイトを担持するためのスペーサーが不要な構成である。図を簡単且つ明確にするため、ユニットの支持脚は図示しない。図６Ａは、集塊物破砕強度試験装置を示す。
【００６７】
上記に記載する器具の動作において、集塊化プリルのチャージは試験装置の円筒形セクションに装入される。特定の方法では、スペーサーセクション上に載るウエイトが円筒形セクションの上面と接触しないように、チャージがユニットを十分に満たさなければならず、例えば上記に記載したとおり組み立てた装置での集塊化した藻類の試験では、各４００グラムを超える量の試料を使用した。チャージはおおよそ平らに均され、上面隔壁がチ
ャージ上に置かれる。スペーサー部品の側面に、装置の低い方の円筒形セクションの上面の高さの位置の印を付け、必要であれば直定規を使用して印の適切な位置決めを補助した。次にウエイトをスペーサー上に置き、浸出床が受ける条件をシミュレートする。例えば、円柱状の浸出容器の側面に摩擦がないと仮定して、境界条件として一番底にあるプリルにかかる圧力を選択することができ、例えば０．５ｋｇ／Ｌのかさ密度における高さ１０ｆｔ（３ｍ）の集塊化した藻類のベッドをシミュレートするには、約６２ｌｂｓ（２８ｋｇ）が加えられ得る。実際には、浸出カラム容器の側面はカラムチャージの支持を補助するが、「摩擦のない側面」シナリオは、最悪の場合の境界条件の例である極限条件と解釈することができる。乾燥したチャージ上のスペーサーにウエイトが加えられた後、スペーサーに第２の印を加え、乾燥圧縮レベルを記録する。図６Ｂを参照のこと。次にウエイトを取り除き、「戻り（ｓｐｒｉｎｇ−ｂａｃｋ）」の印を加えて、プリルの弾性を実証してもよい。図６Ｃを参照のこと。ウエイト及びフォロワープレートを一時的に取り除き、藻類脂質溶媒、例えばヘキサンを、液体がチャージの表面全体にわたって見えるようになるまで、チャージに注ぎかけることができる。この例では、この時点で加えられた液体の量が、藻類粒子に吸収されたヘキサンと、圧縮乾燥時の試験チャージの細孔容積とを足した合計に相当する。チャージ毎にフォロワープレート／スペーサー部品を交換し、スペーサー上にウエイトを置き直す。次にスペーサーの側面に、円筒形セクションの上面の高さで「湿潤した」圧縮レベルの印を付ける。器具を所望の長さにわたりこの状態のままとして、集塊物が例えばカラムで受けるものと思われる条件をシミュレートすることができる。記載した装置による一つの試験では、１時間後、ヘキサンで湿潤した圧縮レベルに変化は生じなかった。所望の時間が経った後、ウエイトは取り除くことができる。ドレン弁を開放してベッドから溶媒を取り除く。必要であれば、圧縮されたベッドの上面が露出するまで溶媒レベルを下げ、溶媒を受ける容器を空にした後、残りの溶媒を排出させて回収することができる。このとき２回目の完全なドレン排出の容積が、圧縮されたベッドの細孔容積に相当する。集塊化した藻類の一つの試験では、計測された細孔容積は、圧縮されたベッド容積（当初ヘキサンを加えた状態）を基準として５１％であった。
【００６８】
抽出例：
集塊化及び再乾燥後、チャージは抽出装置に装入する準備が整い、収容器に加えられて固定床を形成する。かかる収容器の形状は、プロセスにおける浸出抽出の程度に影響を及ぼし得る。溶媒がベッドを覆って静止浴を作り出すまで、藻類チャージを含む収容器に浸出剤が添加される場合、溶質の浸出は、粒子における溶質の濃度と溶液における溶質の濃度との間に平衡が確立されるまで進行し得る。次に、まとめて「浸出物」として知られる、チャージから溶解した構成成分を含む溶媒を、ベッドから排出させて交換することができ、後になって新しい溶媒も平衡溶質濃度に達し、このプロセスが繰り返される。かかるプロセスシナリオでは、チャージ収容器の形状は浸出の程度に影響を及ぼさない。しかしながら、浸出チャージ収容器が縦に細長く、溶媒を最上部に適用してベッドにパーコレートさせ、チャージから自由に排出させる場合、その効果は、溶媒がチャージを通じてパーコレートすることに伴う浸出物中の溶質の差濃度の増加である。例えば、チャージの最上部に適用される新しい浸出剤は、チャージの溶質濃度と比較した濃度差が最大であり、抽出が進む。浸出剤が長い流路の藻類チャージを通ってパーコレートする場合、浸出剤中に溶解した溶質濃度が連続的に増加し、カラムを出る前にチャージと平衡に達し得る。これは、適用された浸出剤の各増加分が最大限利用されることを示す。最小の溶質濃度の溶媒が最小の溶質濃度の固形物に接触し、且つより高い溶質濃度の溶媒がより高い溶質濃度の固形物に接触するかかるプロセススキームは、向流接触として知られている。向流接触は、より高濃度の抽出物及び固形物からの可溶性構成成分のより高い回収をもたらす。向流浸出条件を作り出すことによって浸出剤プロセスを改善するには、これらの条件のためアスペクト比の増加、例えば大きい長さ対直径比を考えなければならない。従って、藻類培養物浸出抽出などの懸濁培養物用の円柱状収容器は、高効率の充填床構成であり得る。
【００６９】
別の方法では、培養物浸出チャージを容器に装入することに伴い、容器を機械的に振動させ、又は手で叩いて、装入材料が所定位置に沈降するのを促進してもよい。かかる沈降は、細孔、ひいてはベッドを通る流路を制限するため、集塊化が存在しない場合には望ましくないこともあるが、集塊粒子によって、装入時にこれを用いて浸出用に均一に充填されたベッドを形成することができる。浸出容器に装入した後は、チャージの容積及び質量を記録して、沈降したかさ密度を、例えばポンド／立方フィート又はキログラム／立方メートルとして計算することができる。必要であれば、挿入時に均一なかさ密度となるよう同様の性質のチャージを沈降させることができ、特にプロセス開発の間に有益な、均一なベッド条件を作り出すのに役立ち得る。培養物チャージを浸出容器に装入した後には、チャージに、標的化合物の抽出に好適な溶媒、例えばチャージに含まれる極性化合物の回収には極性溶媒を、又はチャージ中の主に非極性の化合物の回収には非極性溶媒を、灌流させることができる。特定の方法では、浸出剤は、特定の適用速度範囲内で適用して、「フラッディング」として知られる、チャージが溶液を受け入れて通過させる能力を超えることを回避し、又は不必要に低い溶液適用速度で適用直後にチャージとの平衡に達し、比較的低い溶質の浸出回収率しか実現されず、且つ不必要に浸出時間が延びることを回避しなければならない。図７は、ガラスカラムに装入され溶媒による浸出中の集塊藻類を示す。図７は、ガラス製の直径２インチ（５０ｍｍ）のカラム内にある溶媒で湿潤した集塊藻類を表す。
【００７０】
新しい試料チャージでカラム浸出が開始されるとき、溶媒が溶解及び抽出し得る量より多い残りの溶質が存在し得る。抽出プロセスのこの段階で、チャージに比較的高い適用速度を適用して高率の溶質抽出を実現することができる。溶媒からの可溶性成分の、例えば蒸留による分離は、エネルギー集約的なプロセスであり、従って過剰な溶媒による可溶性成分の不必要な希釈は最小限に抑えることが望ましい。後に浸出プロセスにおいて、例えば、浸出カラムを出る浸出物が平衡濃度未満の溶質を含む場合、溶液適用速度を低下させて、カラムに適用される新鮮な又は再利用のヘキサンが必要以上に用いられることを回避し得る。従って、浸出剤適用速度は、浸出の段階又は他の理由、例えば浸出物中の溶質の望ましいと見なされる特定の濃度に合わせて最適化することができる。
【００７１】
実施例５
乾燥藻類からの藻類脂質の浸出では、最初に藻類を湿潤させる溶媒が少量であると、極めて粘性が高くなり得る濃度で脂質がマスから浸出することが観察されている。様々な流速及び浸出経路長さで実施した浸出試験から、粒子の諸部分が溶媒から遮断されて浸出回収が低下する可能性が確認されている。この効果に対し、「ターリング」という表現が生み出された。以下の試験研究は、この効果を実証する。
【００７２】
６つのガラスカラムを直立させて浸出試験を実施した。全て、直径２インチ（５０ｍｍ）×高さ２２インチ（５５０ｍｍ）であった。２つのカラムは、一方の排出が他方のカラム内へと直接滴下されることで、カラム１と称される、高さ４４インチ（１．１ｍ）の固定床に相当するものが生じるように配置した。カラム２〜５は、互いに独立して動作させる、「シングル」高さのカラムであった。乾燥させ、細かく破砕し、及び６０％の水分添加で先述のとおり集塊化させ、当初の乾燥温度での再乾燥工程を伴った複合物試料の一部を用いて、全てのカラムに藻類を装入した。以下の表１は、これらのカラムの様々な試験条件を示す。
【００７３】
表１．直径２インチ（５０ｍｍ）の浸出カラムの試験条件
【００７４】
【表１】
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【００７５】
表１に記載されるとおり、浸出方式はＨｅｘ−Ｅｔｈ又はＥｔｈ−Ｈｅｘと記載され、これは試験カラムに浸出剤が添加された順番を示し、例えばＨｅｘ−Ｅｔｈは、ヘキサンを使用して抽出浸出を実施し、その後に乾燥が続き、次にエタノールを二次浸出剤として使用してカラムチャージの抽出浸出が行われたことを示す。表１から分かるとおり、カラム４への溶媒の流量は他と比較して比較的低かった。試験全体を通して、溶媒は特定の速度の定速で各カラムに適用した。カラム４からの最初の流出物は極めて粘性が高く、その液滴は、実際上、ガラス製の受入れ容器に落ちてから完全に広がるまでに数秒間を要した。比較すると、カラム２からの流出物は著しく粘性が低かった。ベッド高さが他のカラムの２倍あるカラム１でさえ、流出物の粘性はカラム４と比較して低かった。図８は、表１のカラムからの重量収率を示す。カラム４における累積重量回収率は、図８に示すデータにより明らかなとおり、最初は時間に応じて増加した。しかしながら、カラム４のプロットはまた、所定時間の後に重量回収速度が衰え、総回収率が他のカラムより低い最終的な大きさに近づいたことも示している。溶媒を継続的に適用しても、例えば８０時間後にはカラム４から残りの化合物が抽出されないことは、溶媒適用速度が低いと重量回収率が最終的に限定的となる可能性があるという証拠になる。これは、少なくとも短期的に、例えば試験した期間について、ターリングが抽出回収の損失をもたらす可能性があることを示している。図８は、比較カラム試験における乾燥藻類のヘキサン抽出を表す。後に考察する、図１１，１３，１４に示す例が、「ターリング」効果に起因する結果を更に示す。
【００７６】
試料からの重量収率に加え、種々の浸出剤適用速度での回収される化合物の化学構造及び抽出物中におけるその相対的割合が、興味深い。従って、幅広く異なる適用速度を用いた直径２インチ（５０ｍｍ）のカラム試験からの抽出物の試料を、エステル交換及びガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析に供した。図９はＧＣ分析結果を示し、カラム名は表１のとおりである。これらの実験から、図８の考察で指摘したとおりターリングの証拠を示したカラム４からの抽出物を含め、ヘキサン浸出したカラムからの抽出物組成に有意な差はなかったことが実証された。図９は、表１に記載されるカラム試験の４つからのヘキサン抽出物のガスクロマトグラフィー分析を示す。
【００７７】
実施例６
１０ｆｔ（３ｍ高さ）の直径１インチ（２５ｍｍ）鋼管を使用して、続くカラム試験を実施した。このカラムに、乾燥させ、破砕し、及び集塊化させた藻類を、高さ２２インチ（５５０ｍｍ）カラムと同じようにして装入した。最終的に装入したチャージは９９８ｇ及び高さ９．７９ｆｔ（２．９８ｍ）であった。この、より背の高いカラムを、２１５０Ｌ／ｍ２／時（３５．８Ｌ／ｍ２／分）及び１．２Ｌ／ｋｇ／時に相当する２０ｍＬ／分
の高い初期溶媒流速で浸出させ、それにより乾燥藻類ベッドの飽和を促進し、且つ直径２インチ（５０ｍｍ）カラムにおいて低流量で認められたターリング効果を低減又は防止した。「ブレイクスルー」として知られる最初の流出物の出現は、溶媒が流れ始めて１６分後に起こった。ブレイクスルー後３０分で溶液適用速度を、１９４Ｌ／ｍ２／時（３．２Ｌ／ｍ２／分）及び０．１１Ｌ／ｋｇ／時の特定の適用速度である１．８ｍＬ／分に下げた。藻類マスからの可溶性化合物の抽出尺度として用いられる重量収率のプロットから、溶媒適用速度を遅くすると、重量収率の対時間プロットの傾きの急激な減少により明らかなとおり、浸出回収速度が著しく遅くなったことが示された。実際、このカラムの浸出速度がその以前の抽出速度に戻ることは決してなく、このカラムが実現した重量収率の程度は、同じ複合供給試料を使用した以前の浸出試験と比べて低かった。図１０及び図１１を参照のこと。この試験に基づけば、背の高い固定床式の浸出構成には、例えばターリング効果を回避するため、比較的高い溶媒流速をより長く適用することが必要であり得ると判断された。一部には、パーコレーション溶媒浸出剤における平衡溶質濃度の達成に対し、背の高い浸出容器内にある集塊物の連続層の寄与分が増すことに起因して、背の高いカラムほど、低いカラムと比較してより高い初期溶媒適用速度、又は高い初期速度のより長い適用が必要となり得る。当業者は、適切な高い初期適用速度、並びにその継続時間を決定するには、試験及び観察が必要となり得ることを理解し得る。
【００７８】
図１０は、背の高いカラムにおける高い適用速度で短時間の浸出抽出を示す。図１１は、図１０のデータの溶出開始から４．５時間までを示す。
別の方法では、浸出が経過する間に実施例６の直径１インチ（２５ｍｍ）カラムから収集された浸出物の試料に対してＧＣ分析を実施した。これは、ＦＡＭＥ鎖長の抽出物組成が時間に伴い変化したかどうかを決定するために実施した。時間をかけて化合物を選択的に浸出させることにより、化合物の選択的な分離が可能となり得るが、また、必要であれば、一貫した浸出物組成を維持するための余分な手段も必然的に伴い得る。図１２に示されるとおり、ＦＡＭＥ鎖長及び結合位置に関して、本質的に浸出の継続時間に対する組成のばらつきは認められなかった。図１２は、種々の浸出時間におけるヘキサン浸出抽出物のガスクロマトグラフィー分析を示す。
【００７９】
実施例７
別の例において、直径３／４インチ（２０ｍｍ）及び高さ１０ｆｔ（３ｍ）の第２の背の高いカラムを、乾燥させて集塊化した藻類の同じ複合供給試料を使用してセットアップした。装入したチャージは５３１ｇ及び高さ８．５４ｆｔ（２．６０ｍ）であった。この試験では、２１６０Ｌ／ｍ２／時及び１．４Ｌ／ｋｇ／時に相当する１２．４ｍＬ／分の高い初期適用速度を４時間継続することにより、実施例６の直径１インチ（５０ｍｍ）カラム試験で認められたターリング効果を回避した。より長い時間にわたる高い初期速度の適用を用いると、その時間にわたり流出物の流動性は極めて高いままであった。高い適用速度の時間を通して、流出物は色が不透明色から濃い深緑色に変わり、４時間目の終わりに受け収容器内の浸出物は明るい光線を透過可能であることが認められた。このように不透明度、従っておそらくは濃度が変化したため、４時間目に適用流量を、１９１Ｌ／ｍ２／時及び０．１２４Ｌ／ｋｇ／時に相当する１．１ｍＬ／分に低下させた。図１３及び図１４に示す重量収率データは、初期の高流量期間がより高速の化合物抽出において成功したこと、及び時間の関数としての抽出のプロットが、流量を低下させたときに最小限の抽出速度変化しか示さないことを実証している。このプロットはまた、最終的に実現された回収率が直径１インチ（２５ｍｍ）のカラムより高かったことも実証し、比較的低い適用速度が１インチ（２５ｍｍ）カラムでの浸出の阻害をもたらしたとともに、持続的なより高い適用速度が直径３／４インチ（２０ｍｍ）カラムでのより高い最終回収率に寄与したという主張を更に裏付けている。加えて、持続的なより高い適用速度のカラムの回収がより速いことは、それ自体が、商業的な操業において望ましい成分のより速い回収の実現により操業コストを最小限に抑え得る点で利益に相当する。図１３は、２つの背の高いカラ
ム試験における、高流量適用での時間の関数としての浸出抽出を示す。図１４は、背の高いカラム試験における浸出抽出の最初の１２時間の詳細図を示す。直径３／４インチ（２０ｍｍ）カラム試験から収集されたヘキサン浸出物は、計測及びサンプリング後、固結して蒸留することにより、抽出物中の藻類化合物から揮発性の高いヘキサンを除去した。最終的な抽出物の試料を分析した。結果は図１５に示す。図１５は、直径３／４インチ（２０ｍｍ）カラム浸出からの抽出物のガスクロマトグラフィー分析のヒストグラムプロットを示す。
【００８０】
乾燥させて集塊化した藻類のカラム浸出試験では、試料チャージからの初期の高い成分回収速度の後、回収率が最終レベルへと漸近するに従い徐々に速度が遅くなる。チャージからの有効な溶質浸出完了は、チャージからの溶質の相対的な枯渇に基づき、又は浸出物における最小溶質濃度から選択することができる。
【００８１】
有効な浸出完了の後、カラムチャージに対して、適合性を有する流体の「プッシュ」を適用して、カラムからの浸出物の最終的なドレン排出を促進することができる。例えば、このカラムから浸出物を排出させるプッシュ流体には、例えば可燃性溶媒用の窒素又は二酸化炭素など、溶媒蒸気と組み合わせるときに不燃性又は他の形で非反応性であるガスを利用してもよい。このプッシュ流体は、ベッドからの溶媒及び潜在的にいずれか残っている目的の化合物の最終的な回収及び除去を促進する。プッシュ流体は、典型的にはガスであり、溶媒蒸気は適切な回収及び／又は通気システムに送られる。かかるシステムは溶媒を回収する凝縮器からなり、又は最小限でも、浸出器具において溶媒ヒュームが健康及び安全上の問題を引き起こすことがないように通気システムからなり得る。
【００８２】
液体溶媒の回収が完了した後、初期浸出物の受け器を浸出チャージ収容器から切り離すことができる。プッシュ流体の適用後、カラムに更なる不活性ガスを適用してチャージを乾燥させてもよい。最初の浸出剤に適合すると見なされる次に続く浸出剤が適用され、且つそれらの２つの浸出用薬剤の混合が、例えば分離困難などの望ましくない結果を生じないと思われる場合には、この段階は省略されてもよい。プッシュ流体はカラムチャージからの溶媒を運んでいるため、乾燥用流体を凝縮器に送り込んで溶媒を回収するとともに、環境へのその放出を防止することが望ましい可能性もある。プッシュ流体及び乾燥用流体の予熱、並びにカラム及びカラムチャージそれ自体の加熱により、乾燥時間が短縮され、乾燥程度が向上し得る。
【００８３】
望ましい場合、例えば、最初の浸出中に抽出されたものと異なる化合物を回収するため、続く浸出段階を異なる溶媒で開始してもよい。これには、最初に藻類から主に非極性の脂質を浸出回収するためのヘキサンなどの非極性溶媒の適用と、続く極性化合物を回収するための極性溶媒の適用、又はその逆が含まれ得る。この抽出スキームは、記載される固定床式浸出プロセスを用いることで単純化され、これにより、集塊化チャージを通じた高いパーコレーション速度、チャージの徹底的な向流浸出、含まれる浸出剤の効率的なドレン排出、及び初期浸出後に比較的高い流速のプッシュ流体を低い差圧で適用する能力がもたらされる。初期浸出剤と同様に、続く溶媒の灌流にも様々な適用速度を利用して、適用する溶液の量、溶質抽出速度及び浸出物の濃度を最適化することができる。充填床の構成、特に結果的に長い流路を提供する高アスペクト比を有するものにより、より実際的で容易に達成される二次浸出が可能となる。この単純化されたプロセスは、撹拌浸出プロセスにおける二次浸出の適用と対比することができ、撹拌浸出プロセスでは、撹拌容器から固形物を取り出し、ろ過して、場合により乾燥させ、次に撹拌容器に戻して二次浸出剤で再懸濁する。二次浸出が完了すると、又は実際的である限りまで続行されたところで、撹拌浸出容器から固形物を再び取り出し、ろ過して、場合により続いて乾燥させる。当業者は理解し得るとおり、二次撹拌浸出に必要な追加的な方法ステップ、機器、ハンドリング及び複雑さにより、充填床構成と比較したときの労力及びコストが増加する。
【００８４】
実施例８
一例において、表１に記載される２インチ（５０ｍｍ）カラム試験のヘキサン浸出後、エタノール浸出を実施した。図１６は、乾燥させて集塊化した藻類のエタノールによる二次浸出のプロットを示す。図１６は、カラムにおける重量回収率を示し、ここで３つのカラムについてはヘキサンが最初の浸出剤で、エタノールが二次浸出剤であり、一方、別のカラムについてはエタノールが最初の浸出剤で、ヘキサンが二次浸出剤であった。シングル／高流量／エタノール試験の一次エタノールカラム浸出では、エタノール浸出は早く終了し、不活性ガスプッシュ及び乾燥期間後、ヘキサンによる二次浸出を開始した。
【００８５】
一次及び二次浸出溶媒を用いて浸出試験を実施する間、抽出に用いる溶媒の順序に応じて抽出率に差があり得ることが見出された。回収される化合物の一般的な性質を分析するため、浸出溶液に対して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて組成の差を見出した。図１７は、藻類浸出溶液のＴＬＣプレートの写真である。プレートは、同じ藻類カラム試料からそれぞれ一次及び二次の順序で浸出した、非極性溶媒のヘキサン（左側）及び極性溶媒のエタノール（中央）によって抽出された化合物を示す。２つの浸出溶液を、プレートの右側の標準溶液に対して評価する。抽出毎に、１〜３と表示される３つのレーンを評価し、ここでレーンの数字が大きくなるほど、プレートにスポッティングした浸出物の量が増加し、例えばレーン３のヘキサン浸出物はレーン２のヘキサンより多量に加えた等である。極性溶媒は、理論上は非極性化合物を抽出しないはずであるが、一部の非極性化合物はエタノール浸出抽出物からのＴＬＣ中央線の上側に確かに現れる。対照的に、図の左側にある非極性浸出抽出物中に極性化合物はほとんど見出されなかった。図１７は、逐次的な極性及び非極性浸出溶液の薄層クロマトグラフィーを示す。
【００８６】
１つ又は複数の二次溶質の回収が実現した後、最初のプッシュ流体と同様の、但し同一である必要はないプッシュ流体をチャージに適用して、最終的な浸出物の回収及びカラムのドレン排出を促進することができる。プッシュ後、二次溶媒受け器を取り外してから乾燥用流体を適用する。次に、所望の乾燥程度に達するまで、乾燥用流体を適用する。乾燥後、カラムチャージを取り出すことができる。これは、カラムの底を、例えばボルト止めフランジ又はヒンジ付きエンドキャップ又は分流シュートによって開放し、チャージを重力の力でカラムから受入れ容器の中に吐き出させることにより達成されてもよく、受入れ容器は、可搬式の移送容器又は最終的な収容器、例えば車輪付きトレイ又はバレルであってもよい。処理されるバイオマスの性質及び最後に利用される溶媒に応じて、安全上の目的から、容器を取り外す間の静電気を散逸又は最小化する手段の利用が望ましいこともある。不活性ガスのブランケッティングもまた、潜在的に存在し得る残留溶媒蒸気が静電発火する可能性を低減するのに利用し得る。そこから、浸出させた基体としても知られる浸出残渣を、続く他の望ましい化合物の回収のため、又は保管、続く処理又は廃棄のため、パッケージすることができる。回収された浸出物は、チャージから浸出した望ましい成分、例えば藻類脂質と合わせて、適用された１つ又は複数の溶媒を含んでいる。一次及び二次浸出物は、望ましい化合物から溶媒を除去するために別個に処理される可能性が最も高い。一つのかかる回収方法は、真空の存在下における蒸留、例えば回転蒸発式の蒸留、又は真空を加えない蒸留によるものである。溶媒の除去後、残留する液体又は半固体材料は、抽出物又はバイオ粗製物としても知られる抽出残渣に相当する。抽出残渣には、限定はされないが、藻類油、ＥＰＡ、ＤＨＡなどが含まれ得る。非極性及び極性浸出物の蒸留からの残渣は、存在する脂質化合物及びそれらの化合物の最終用途に応じて、必要であれば組み合わせても、又は別個のままにしておいてもよい。
【００８７】
実施例９
別の例示的な方法では、２つのステンレス鋼製の直径３０．４８ｃｍ（１２インチ）×高さ３．３５ｍ（１１フィート）〜１０．１６ｃｍ（４インチ）のカラムを組み立てた。
カラムを絶縁材で被覆された電気素子でヒートトレースし、及び各々に適用する溶液は、蒸気加熱グリコール浴を通過する配管で送り、浸出カラムにおける温度制御を確実にした。最初のコミッショニングカラム浸出の藻類は１００℃で乾燥させた。この藻類を、２ｍｍ穴径の吐出スクリーンを使用するハンマーミルにおいて粉砕した。藻類を１８ｋｇバッチで、質量基準で４４％〜４８％の添加水分で（水のみ）、大型の１／３立方ヤード（０．２５立方メートル）のガラス繊維で内張りされたセメントミキサにおいて集塊化させた。集塊化した藻類を約４８時間乾燥させた。カラムに１４４ｋｇの再度乾燥させた藻類を装入した。溶媒適用速度は、直径２．５４ｃｍ（１インチ）及び１．９１ｃｍ（３／４インチ）×高さ３．０５ｍ（１０フィート）のカラムからのカラム断面積に比例させ、及び３時間の初期高流量期間の間は３．３Ｌ／分又は２５２８Ｌ／ｍ２／時で、次に浸出サイクルの残りは２９０ｍＬ／分又は２２４Ｌ／ｍ２／時であった。このコミッションラン中の周囲温度は−１９°Ｆ（−２８℃）もの低さで、抽出プロセスに影響はなかったことが注記され得る。合計３６．８Ｌ又は３３．３ｋｇの最終抽出物が回収され、２３．１質量％の抽出回収率であった。同月中の後日に実施した第２のコミッショニング浸出は、３１．２質量％の抽出回収率を達成した。
【００８８】
実施例１０
微粉を含む材料を使用する代替的な固定床式処理方法は、微粉をより粗い粒子と分離し、それらの２つの径等級を別個に処理することである。一例は、チャージ材料のスクリーニングにより２つの粒径等級、微粉と粗粒とを確立し、及び固定床で粗粒子を浸出させる一方で、微粉は廃棄するか、或いは微粉を撹拌浸出させることであり得る。
【００８９】
微粉を付着させる一つの代替的な方法は、乾燥時に達成することができる。この方法には、藻類ブロスの噴霧乾燥が含まれる。噴霧乾燥により、水分除去と同時に多孔質の集塊粒子を作り出すことができ、また乾燥したバイオマスに成長培地の成分、例えば海草培養物の場合には例えば塩及び／又は金属を取り込むことができる。ある場合には、徹底的な浸出抽出のために更なる乾燥が必要であり得る。或いは、より最適な条件のため、最初の噴霧乾燥後に集塊化及び再乾燥を用いることで、例えばより大きい粒子を、固定床に溶媒を通過させ得るより大きい細孔と同時に作り出すことができる。微粉の付着をもたらすことにより集塊化すると、微粉の最高７０、８０、９０又は更には１００パーセントに至る大多数が、浸出が完了するまで充填床から抜け出ず留まることができる。従って、例えば撹拌浸出後のろ過など、別の処理を介する代わりに、集塊化により、浸出プロセスの間に液体−固体分離を実現することが可能である。浸出中に微粉を共に保持しておくことで、資本コスト及び操業コストの双方の成分の処理コストを低減することができる。固定床において様々な溶媒で集塊粒子の逐次的な個別の浸出を実施できるこの実証された能力は、作業効率の向上及び供給材料の望ましい成分の抽出増加をもたらし得る。
【００９０】
プロセス実施例Ａ−細かく粉砕された藻類を、集塊化なしに固定床で浸出させる。
この例示的方法では、パーコレーション及び乾燥藻類の溶媒浸出を実施する能力に対する影響について粒径を分析した。破砕及び粉砕した藻類を直径３インチ（７６ｍｍ）ガラスカラムに装入した。藻類チャージの最上部にヘキサン溶媒を添加した。ベッドが溶媒で飽和した状態になった直後に、パーコレーションは有効な停止に達した。カラムの最上部に窒素を１０ｐｓｉｇ（６９ｋＰａ）で適用したが、充填床に有効量の溶媒を押し通すことはできず、試験を終了した。
【００９１】
プロセス実施例Ｂ−浸出前のより大きい粒子からの微粉の分離
この例示的方法では、粗粒子の充填床式浸出による、より大きい粒子から微粉を分離する、例えば材料のスクリーニングにより３００マイクロメートル径未満の粒子を実質的に全て除去する代替的な浸出スキームを分析した。ここで更なる処理が必要であったことで、試料質量の約２０％のプロセス損失が観察された。微粉は廃棄することができ、又は撹
拌浸出してもよいが、撹拌及びろ過コストに起因して、固定床式浸出と比較してコストが上昇する。更に、固定床と同等に浸出するよう向流接触を実現するために、この手法では、向流デカンテーション（又は藻類をろ過及び再パルプ化（再懸濁）する逐次的ステップのいずれかのための更なる機器が必要となり、固定床式の集塊化浸出と比較してコスト及び労力が増加する。
【００９２】
プロセス実施例Ｃ−抽出可能な化合物の溶媒浸出回収に影響を及ぼす液体対固体比（「Ｌ／Ｓ比」）の例
図１８は、撹拌式ヘキサン浸出における乾燥藻類からの重量収率に対するＬ／Ｓ比の効果を示す。浸出時に用いる溶媒が不十分であると、早期に溶質による溶媒飽和及び溶質回収の阻害又は浸出の長時間化が起こり得る。過剰な溶媒の使用は、プロセス経済学、例えば機器のサイズ決定、消耗品のコスト、可燃性液体の保管、追加蒸留容量のコスト、及び蒸留操業コスト（エネルギー入力）に特に影響を及ぼす。この試験では、１０：１及び２０：１のＬ／Ｓ比と比較したとき、５：１のＬ／Ｓ比の使用が、あったとしても最小限の有害効果であることが示された。
【００９３】
プロセス実施例Ｄ−乾燥させて破砕した藻類を使用した、細粒の付着を生じさせる集塊化試験
ナンノクロロプシス・エスピーピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）藻類のチャージを摂氏１００度で乾燥し、破砕して粒径を減少させて、７６重量％が２０メッシュ／８５０ミクロン未満で、４８メッシュ／３００ミクロン未満が２３重量％含まれる粒子を得た。このチャージを、回転する収容器内でカスケード状に流れる藻類チャージ上に噴霧される粗い液滴としての逐次的な水分添加を用いて集塊化した。集塊化の間に添加した水分は、試料の乾燥重量と比べて３６％の水であった。集塊化後、チャージを対流式オーブンで１９時間を少し超えるだけ乾燥させた。「プリル」としても知られるいくつかの個々の集塊物を、ほぼ平均径の集塊粒子に相当するものとして選択し、プリルの安定性試験としてヘキサンの収容器内に沈めた。数時間、次に数日の期間にわたりプリルを観察し、それらの複合粒子が普遍的な溶媒の存在下でどのように一体に保持されているかに関して状態を書き出した。この安定性試験では、プリルから脱離する微粉は認められなかった。
【００９４】
プロセス実施例Ｅ
増加した細孔容積の抽出及びパーコレーションに対する集塊化の有益性を実証する、藻類を使用したカラム浸出試験。
【００９５】
実施例Ｄで集塊化した材料の試料を浸出用カラムに装入した。カラム及びチャージは、直径１／２インチ（１２．７）ｍｍ及び深さ１２インチ（３０５）ｍｍの充填床を形成した。２０．５グラムの重さの沈降した集塊物は、水と比べたかさ密度が０．５３であった。前のカラム試験は、同じ種の乾燥して破砕した藻類のチャージ（例えばスクリーニングして４８メッシュ（３００ミクロン）径未満の粒子を除去したチャージ）を使用した。この集塊化していない充填床はかさ密度が０．６５で、著しく高密度であり、集塊粒子がより低いかさ密度を生じさせたことが実証された。より小さいカラムの流れ特性が改善されたことから、この集塊化したベッドが単位質量基準でより大きい細孔容積を有したことも示される。カラム内のチャージの上側に、適用される溶液を分配するために置いた薄いグラスウールパッドの上に、ヘキサンを弁付き供給容器から滴下して、集塊化したカラムを浸出させた。試験の大部分について、溶媒の流れは、４７４Ｌ／ｍ２／時に相当する約１ミリリットル毎分（ｍＬ／分）に維持した。浸出物が重力流によってチャージを抜けてカラムの底から出て、それを受け収容器に収集した。ヘキサン浸出後、窒素ガスのプッシュを下降流構成でカラムに送り込み、それにより浸出剤の最終的な排出を促進した。次にカラムチャージを窒素流で乾燥させると、１分以内にカラム全体が淡色になった。窒素流は
約３分間継続し、次に停止させた。
【００９６】
ヘキサン浸出に関する藻類残渣について更に情報を得るため、チャージを秤量用にカラム浸出器具から取り出した。このステップは、スケールアップ等に価値があり得る。次にチャージを元のカラムに再度装入し、叩いて沈降させた。前述のハンドリング及び再装入に起因するいくらかの分離が認められ、より細かいがなお集塊化している材料の特定の領域が、円柱状ベッドの中央３分の１に蓄積した。小さいグラスウールパッドを再びチャージに被せて置いた。次に極性溶媒の１００％エタノールを、ヘキサンを当初適用したのと同じ方法及び流速で適用した。浸出は、カラム流出物の色が淡黄色に見えるまで継続した。最終的なフラッシュ容量を適用し、次にカラムをドレン排出させた。ここでも、窒素をプッシュ流体として下降流構成で適用し、その後継続して乾燥を促進した。
【００９７】
２つの浸出物溶液の蒸留を別個に行い、抽出された構成成分から溶媒を除去した。残渣又は抽出物から、ヘキサン浸出中にチャージから２９．３％重量／重量（ｗ／ｗ）が浸出し、エタノール浸出中に７．３％ｗ／ｗが取り出され、合計３６．６％ｗ／ｗの抽出物となったことが示された。このレベルの回収率は撹拌浸出回収試験とは対照的で、撹拌浸出回収試験では、集塊化させる固定床式浸出の非極性ヘキサン浸出回収とほぼ同程度の、３１％の抽出をヘキサン浸出で実現するために、１００％が４８メッシュ（３００ミクロン）粒径より小さくなるまで粉砕する必要があることが示されたが、粉砕する労力がはるかに大きく、且つ撹拌浸出の複雑性及びコストが増した。生産規模では、粒径の低減は費用の増加につながり得る。粒径の低減及び細かく粉砕して浸出させた材料のＬ／Ｓ分離は、いずれも集塊化させる固定床式浸出では回避することができる。
プロセス実施例Ｆ
予め濃縮して凍結した藻類固形物を１１２℃で乾燥し、次に実験室用ハンマーミルを使用して破砕及び粉砕した。このハンマーミルは０．０７９インチ（２ｍｍ）径の丸穴吐出スクリーンを備え、これにより１６メッシュ（１．７ｍｍ）を通過する９０％ｗ／ｗ及び４８メッシュ（３００ミクロン）を通過する１７％を含む粒径分布が生じた。この微細材料を集塊化試験に供し、そのなかで６０％の水添加で好ましい集塊物が生成されることが決定された。好ましいという判断は、微粉が完全に付着していること、及び個々の粒子間にかなりの空間をもつ、良好に固結した粒子の中程度のサイズの集合体であることによった。続いて集塊材料を対流式オーブンにおいて１１２〜１１３℃で乾燥させた。カラムを浸出のため直立させ、カラムは直径２インチ（５０ｍｍ）×長さ２ｆｔ（０．６ｍ）のガラスカラム（例えばリーブス・グラス・インコーポレイティッド（Ｒｅｅｖｅｓ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｃ．）、フロリダ州トレントン（Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＦＬ）、モデルＲＧ３４４３−０５）からなった。各カラムはテフロン（登録商標）製吐出コックを備えた。浸出パラメータに関するプロセス開発調査のため、カラムを並列で動作させ、直列で動作する２つのカラムを含めた。表２は、各試験に選択された動作パラメータの概要を示す。
【００９８】
表２．並列及び直列カラムの動作パラメータ
【００９９】
【表２】
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【０１００】
表中のベッド高さの表記は、Ｌｏｗが１カラム高さ、約２ｆｔ（０．６ｍ）であることを指し、一方Ｈｉｇｈは、上下に積み重ねて直列で浸出させる２つのカラムであって、上のカラムの流出物が下のカラムに送られるもので、総有効ベッド高さが約４ｆｔ（１．２ｍ）のカラムを指す。浸出方式は溶媒適用順序を指し、Ｈｅｘ−Ｅｔｈはヘキサンの後にエタノールが続くことを示し、Ｅｔｈ−Ｈｅｘは逆の順序を示す。浸出灌流速度は、表３に示されるとおり、想定される時間に対して計算したＬ／Ｓ質量比に基づき選択した。
【０１０１】
表３．２インチ／５０ｍｍ径カラムにおけるベッド高さ、Ｌ／Ｓ比及び浸出時間毎の灌流速度
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
図１９は、プロセス実施例Ｆのカラムのエタノールによる乾燥藻類の二次浸出における重量収率を示す。
プロセス実施例Ｇ
プロセス実施例Ｆの付属試験として、一般的な浸出が完了した後にカラムのフラッシュを行い、それまでに可溶化した化合物を全て取り除いた。従って、ヘキサンのビーカーを直径２インチ（５０）ｍｍの大きさのガラスカラムにあけ、ガラスカラムには集塊化した藻類のベッドが入っていた。ビーカーは３００ｍｌのヘキサンを保持し、藻類上に３秒未満で注ぎ込んで、７３ｇａｌ／ｆｔ２／分（２９６０Ｌ／ｍ２／分）の特定の適用速度とした。緻密な観察下に、溶液は表面に貯留せず、例えばカラムのフラッディングは認められなかった。代わりに溶媒は、当初は湿潤した前線として見られ、その前線が固定床中に移行し、カラムを通るパーコレーションの流れの中に急速に分散した。
【０１０４】
プロセス実施例Ｈ
一部の例示的方法では、垂直型の噴霧乾燥器を使用して集塊培養物を生じさせることができる。
【０１０５】
工業乾燥ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｄｒｙｉｎｇ）の図１０．１３は、５００℃の差温（空気対粒子）で最大１ｍｍ径までの粒子が可能であることを示唆しているように思われる。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
実施例１１
噴霧乾燥時に藻類成分の酸化が増加する可能性に関して、（スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）におけるβカロチン試験、剥片（約２０メッシュ超）では元のβカロチンレベルの５２％が維持されたが、噴霧乾燥した細粉（１００メッシュ未満）では元のレベルの３４％しか維持されなかった。これは、活性反応に利用可能な表面積が剥片より粉末のほうが大きいという観点で説明することができる。このことから、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）の乾燥に噴霧乾燥を用いることが適切であるのか、疑問視される。活性反応に利用可能な表面積は、剥片と比べて粉末でより大きい。
【０１０８】
実施例１２
噴霧乾燥した藻類の例：
極めて細かい粒子を始めて、藻類の噴霧乾燥を用いることができる。このとき藻類スラリーをパイプでタンク、例えば７６．２ｃｍ（３０インチ）のボーエン・タワー（ＢＯＷＥＮ  ＴＯＷＥＲ）噴霧乾燥器、Ｓ／Ｓ（ステンレス鋼製）に運ぶことができる。噴霧器乾燥器は４１．１℃（１０６°Ｆ）に予熱することができる。藻類スラリーを、噴霧乾燥器で約２分間、毎時約４５３．５９ｋｇ（１０００ｌｂｓ）の速度で乾燥させると、平均含水率が約８％の粉末状組成物を生成することができる。この粉末状組成物の粒径は、約８０ミクロン〜３００ミクロンの範囲であった。
【０１０９】
本明細書で企図される器具は、セメントミキサと同様の装置、又は電動式の、若しくは部分的に電動式の、若しくは人力で動く他の同様の装置を含み得る。器具の内側には、表面への微生物及び溶媒の付着を低減するためのコーティングが塗布されてもよい。
【０１１０】
本明細書において開示及び特許請求される組成物及び／又は方法及び／又は装置は全て、本開示をふまえれば、必要以上に実験を行うことなく作製及び実行することができる。この発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点で記載されているが、当業者には、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法及び／又は装置に対して、及び本明細書に記載される方法のステップ又はステップの順序において変形例が適用され得ることは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連性のある特定の薬剤が、本明細書に記載される薬剤に代用されてもよく、一方で同じ又
は同様の結果が得られ得ることは明らかであろう。当業者に明らかなそのような同様の代替例及び改良例は全て、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内にあると見なされる。
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図６Ａ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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