(57)【要約】  本発明は、腫瘍手術後の早期胃癌を有する対象の術後生存期間を予測するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明はまた、癌において活性化されるシグナル伝達バイオマーカーに合わせた組合せ治療を施すことにより、早期胃癌を有する対象を処置するための方法も提供する。特定の実施形態においては、本発明の方法は、対象から得られた癌細胞中のシグナル伝達因子分析物の特定の組合せの活性化状態又はレベルの検出に依拠する。かくして、本発明の方法は、早期胃癌を有する対象の生存期間又は予後を予測し、単剤療法ではなく組合せ治療から利益を得る対象を同定することにより、術前及び術後の両方の処置決定を指導するのに特に有用である。【選択図】  図１０Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍手術後のステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の生存期間を予測する方法であって、
（ａ）対象から得られた癌細胞中のｃＭＥＴ及びＨＥＲ１を含む少なくとも２種の分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された少なくとも２種の分析物の存在又は活性化のレベルに基づいて、対象の生存期間を予測するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
対象の無病生存期間又は無増悪生存期間を予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対象が、ＨＥＲ１活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間を有すると予測される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
胃癌がびまん型胃癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、癌細胞中における、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３を含む少なくとも１種のさらなる分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されていない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象が、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間を有すると予測される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、及びＨＥＲ３が癌細胞中で同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されていない、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
対象が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間を有すると予測される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｃ）ステップ（ａ）で決定された少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１の存在又は活性化のレベルに基づいて、ｃＭＥＴ阻害剤のみを又はｃＭＥＴ阻害剤をＨＥＲ１阻害剤と組み合わせて対象に投与するステップ
をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されている場合、場合によってＨＥＲ２が癌細胞中で活性化されていない及び／又はＨＥＲ３が癌細胞中で活性化されている場合に、ｃＭＥＴ阻害剤がＨＥＲ１阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）が、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標））を用いて分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象を処置する方法であって、
ｃＭＥＴ阻害剤とＨＥＲ１阻害剤とを含む組合せ治療を対象に施すステップを含み、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１がステージＩ又はＩＩの胃癌において同時活性化される、方法。
【請求項１５】
対象が、ＨＥＲ１活性化の非存在下でｃＭｅｔが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組合せ治療が、一次治療として対象に施される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
組合せ治療が、腫瘍手術後の補助治療として対象に施される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＥＲ２が、ステージＩ又はＩＩの胃癌において活性化されていない、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２活性化の非存在下でｃＭｅｔが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＥＲ３が、ステージＩ又はＩＩの胃癌において活性化されている、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及び／又はＨＥＲ３活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｃＭＥＴ阻害剤が、ＡＭＧ１０２、ＭｅｔＭＡｂ、ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ８８０、ＸＬ１８４、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、ＰＨＡ−６６５７５２、及びその組合せからなる群から選択される、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＥＲ１阻害剤が、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、ＢＩＢＷ−２９９２、及びその組合せからなる群から選択される、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１の存在又は活性化のレベルが、対象から得られた癌細胞中で決定される、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
癌細胞が、一次腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、腹水腫瘍細胞（ＡＴＣ）、及びその組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１の存在又は活性化のレベルが、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標））を用いて決定される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、胃癌患者の生存期間を予測及び改善する方法に関する。
［関連出願の相互参照］[0001]本出願は、２０１１年４月４日に出願された米国特許仮出願第６１／４７１，６７８号及び２０１２年１月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／５９０，７８７号の優先権を主張し、それらの開示はその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
[0002]乳癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、胃の癌（胃癌）及び甲状腺癌などの様々なヒト悪性腫瘍が、持続的なｃ−Ｍｅｔの刺激、過剰発現、又は突然変異を示す。注目すべきことに、ｃ−Ｍｅｔにおける活性化突然変異は、ヒト腫瘍形成においてｃ−Ｍｅｔと直接関連する、特定の遺伝性乳頭状腎細胞癌を有する患者において積極的に同定されてきた。ｃ−Ｍｅｔ受容体の異常調節又はそのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の過剰発現に起因するｃ−Ｍｅｔシグナリング経路の異常なシグナリングは、侵襲的な表現型と関連してきた。ｃ−Ｍｅｔシグナリングがいくつかの癌の進行及び拡散に関与するという豊富な証拠及び疾患におけるその役割の理解の増強は、抗癌剤開発における主要な標的としてｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦにおけるかなりの興味をもたらしてきた。
【０００３】
[0003]この興味は、臨床適用の可能性を有する様々なｃ−Ｍｅｔ経路アンタゴニストの開発をもたらした。経路選択的抗癌剤開発の３つの主な手法は、リガンド／受容体相互作用の拮抗作用、チロシンキナーゼ触媒活性の阻害、及び受容体／エフェクター相互作用の遮断を含んでいた。
【０００４】
[0004]ｃ−Ｍｅｔは、散乱因子としても知られる、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の細胞表面受容体である。ＨＧＦは、プラスミノーゲンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーと高度に関連する多ドメインの糖タンパク質である。それは間葉細胞により一本鎖の不活性ポリペプチドとして分泌され、複数のプロテアーゼによってその活性なヘテロ二量体に切断される。
【０００５】
[0005]ＨＧＦ結合は、ｃ−Ｍｅｔ受容体のホモ二量体化及びキナーゼ活性を調節する触媒部位内の２個のチロシン残基（Ｙ１２３４及びＹ１２３５）のリン酸化を誘導する。そのカルボキシ末端尾部はチロシンＹ１３４９及びＹ１３５６を含み、これらは、リン酸化された場合、細胞内アダプタータンパク質のドッキング部位として働き、下流のシグナリングを引き起こす。ｃ−Ｍｅｔ受容体は、胚発生の間及び成人期に、肝臓、膵臓、前立腺、腎臓、筋肉、及び骨髄などの多くの器官の上皮細胞中で発現される。
【０００６】
[0006]対象となる１つのｃ−Ｍｅｔにより媒介される癌は、胃癌である。胃癌は、世界で癌による死亡の主因であり、その発生件数は１年あたり１８．９／１００，０００である。胃癌の発生件数は、９３４，０００例であり、新しい事例の５６％が東アジアで発生していると見積もられた。胃癌は、２００２年のＣｅｎｔｒａｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙのデータによれば、韓国における全ての癌の２０．８％を占める。胃癌患者においては胃切除術が唯一の根治的処置であるが、根治的手術後の４０〜６０％の高い再発率は依然として、不良な全生存期間の原因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]いくつかのｃ−Ｍｅｔアンタゴニストの予備臨床結果が、現在臨床研究中である。モノクローナル抗体、リガンド／受容体相互作用の破壊剤、及び小分子チロシンキナーゼ阻害剤などのこれらの薬剤は、有望であった。いくつかのマルチターゲット療法も病院で研究中であり、特にチロシンキナーゼ阻害に関して有望であることが示されている。ｃ−Ｍｅｔが様々な癌において果たす役割を考慮すると、個体のための治療の適切な選択及び戦略が必要である。これは、ｃ−Ｍｅｔにより媒介される胃癌については特に当てはまる。本発明は、これらの必要性及び他の必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]本発明は、腫瘍手術後の早期（例えば、ステージＩ若しくはＩＩ又は中間移行期）の胃癌を有する対象の生存期間を予測するためのアッセイ及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、早期胃癌を有する対象における治療効果及び／又は組合せ治療に対する応答を予測するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明は、胃癌において活性化されているシグナル伝達バイオマーカーに合わせた組合せ治療を施すことによって早期胃癌を有する対象を処置するための方法をさらに提供する。特定の実施形態においては、本発明の方法は、早期胃癌を有する対象から得られた癌細胞中のシグナル伝達因子分析物の特定の組合せの活性化状態又はレベルの検出に依拠する。かくして、本明細書に記載の方法は、早期胃癌を有する対象の生存期間又は予後の予測、及び分析物について検出された活性化状態又はレベルを考慮して単剤療法とは対照的に、組合せ治療から利益を得る対象を同定することによる腫瘍手術の前後の両方での処置決定の指導にとって特に有用である。
【０００９】
[0009]以下の実施例３に記載の研究は、新鮮な凍結された胃癌組織における活性化ＲＴＫのレベルを決定するための多重化ＣＥＥＲ（商標）プラットフォームの使用及び胃癌患者の潜在的なサブグループ（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、トランケート型変異体のＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、及びＩＧＦ１Ｒ）への分類を説明する。その経路タンパク質活性化パターンに基づいて、複数のシグナルタンパク質活性化が腫瘍のサブグループにおいて観察され、余剰の経路活性化入力は余剰の下流シグナリングをもたらし、かくして、単一のＲＴＫに対して標的化された単剤療法の抗腫瘍効果を制限した。ｃＭＥＴ−及びＨＥＲ−同時活性化胃癌細胞株におけるｃＭＥＴ阻害剤と組み合わせたＨＥＲ１／２阻害剤の抗腫瘍効果が決定された。腹膜液（腹水）から単離された循環腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞を用いて、治療にわたるＲＴＫ活性化プロフィールのベースライン及び進化する変化を医師がモニターすることができる強力な手段が開発された。総合すれば、この研究は、胃癌ヒト組織における同時的ＲＴＫ活性化の証拠を提供し、癌が処置及び進行の間に進化するにつれてＲＴＫ活性化をモニターするための臨床的手段を確立する。
【００１０】
[0010]そのようなものとして、特定の態様においては、本発明は、腫瘍手術後のステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の生存期間を予測する方法であって、
（ａ）対象から得られた癌細胞中のｃＭＥＴ及びＨＥＲ１を含む少なくとも２種の分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された少なくとも２種の分析物の存在又は活性化のレベルに基づいて対象の生存期間を予測するステップと
を含む前記方法を提供する。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態においては、前記方法は、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の無病生存期間又は無増悪生存期間を予測する。特定の例においては、ステージＩの胃癌は、ステージＩＡ又はステージＩＢの胃癌である。他の特定の例においては、ステージＩＩの胃癌は、ステージＩＩＡ又はステージＩＩＢの胃癌である。
【００１２】
[0012]特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されている。そのような実施形態においては、対象は、ＨＥＲ１活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌は、例えば、腸型、びまん型、又は混合型胃癌などの組織学的サブタイプに対応する。特定の実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌は、びまん型胃癌である。
【００１４】
[0014]他の実施形態においては、ステップ（ａ）は、癌細胞中のＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３を含む少なくとも１種のさらなる分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップをさらに含む。特定の例においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１は癌細胞中で同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されない。そのような例においては、対象は、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。他の特定の例においては、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ３が癌細胞中で同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されていない。そのような例においては、対象は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。
【００１５】
[0015]特定の実施形態においては、前記方法は、
（ｃ）ステップ（ａ）で決定された少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１の存在又は活性化のレベルに基づいて、ｃＭＥＴ阻害剤のみを又はｃＭＥＴ阻害剤をＨＥＲ１阻害剤と組み合わせて対象に投与するステップ
をさらに含む。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されている場合、及び場合によりＨＥＲ２が癌細胞中で活性化されていない及び／又はＨＥＲ３が癌細胞中で活性化されている場合に、ｃＭＥＴ阻害剤はＨＥＲ１阻害剤と組み合わせて投与される。
【００１７】
[0017]シグナル伝達分子の総発現及び活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態を、様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。特定の実施形態においては、癌細胞の細胞抽出物などの試料中のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は、本明細書に記載される単一検出アッセイ又は近接二重検出アッセイ（例えば、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＣＥＥＲ（商標）））などの免疫アッセイを用いて検出される。
【００１８】
[0018]特定の実施形態においては、ステップ（ａ）は、分析物（例えば、少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によってはＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３）の存在又は活性化のレベルを、ＣＥＥＲ（商標）を用いて決定するステップを含む。
【００１９】
[0019]ＣＥＥＲ（商標）技術は、本明細書及びそれぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の特許文献に記載される：ＰＣＴ国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレット、同第２００９／０１２１４０号パンフレット、同第２００９／１０８６３７号パンフレット、同第２０１０／１３２７２３号パンフレット、同第２０１１／００８９９０号パンフレット、及び同第２０１１／０５００６９号パンフレット、並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６６２４。
【００２０】
[0020]さらなる態様においては、本発明は、ステージＩＩ又はＩＩの胃癌を有する対象を処置する方法であって、
ｃＭＥＴ阻害剤とＨＥＲ１阻害剤とを含む組合せ治療を該対象に施すステップを含み、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１がステージＩ又はＩＩの胃癌において同時活性化される、前記方法を提供する。
【００２１】
[0021]いくつかの実施形態においては、前記方法は、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の予後を改善する（例えば、無病生存期間又は無増悪生存期間を増加させる）。特定の例においては、ステージＩの胃癌は、ステージＩＡ又はステージＩＢの胃癌である。他の特定の例においては、ステージＩＩの胃癌は、ステージＩＩＡ又はステージＩＩＢの胃癌である。
【００２２】
[0022]他の実施形態においては、前記対象（例えば、組合せ治療を開始する前）は、ＨＥＲ１活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する。
【００２３】
[0023]さらなる実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌において、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１は同時活性化されるが、ＨＥＲ２は活性化されない。そのような実施形態においては、前記対象（例えば、組合せ治療を開始する前）は、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する。
【００２４】
[0024]さらに他の実施形態においては、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ３はステージＩ又はＩＩの胃癌において同時活性化される。そのような実施形態においては、前記対象（例えば、組合せ治療を開始する前）は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する。
【００２５】
[0025]いくつかの実施形態においては、組合せ治療は一次治療（例えば、胃腫瘍の大きさを収縮させるための術前処置）として対象に施される。他の実施形態においては、組合せ治療は、術後補助治療（例えば、腫瘍手術後）として対象に施される。特定の実施形態においては、組合せ治療は、一次治療として術前及び補助治療として術後の両方に施すことができる。
【００２６】
[0026]特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ阻害剤は、フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ−８８０）、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＭＧ１０２、ＭｅｔＭＡｂ、ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＸＬ１８４、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、及びその組合せからなる群から選択される。他の特定の実施形態においては、ＨＥＲ１阻害剤は、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、ＢＩＢＷ−２９９２、及びその組合せからなる群から選択される。特定の実施形態においては、組合せ治療は、ｃＭＥＴ阻害剤（複数可）であるフォレチニブ及び／又はＰＨＡ−６６５７５２と、ＨＥＲ１阻害剤であるラパチニブとを含む。
【００２７】
[0027]特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によってはＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３（並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）などの分析物の存在又は活性化のレベルは、対象から得られた癌細胞中で決定される。いくつかの例においては、癌細胞は、一次腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、腹水腫瘍細胞（ＡＴＣ）、及びその組合せからなる群から選択される。
【００２８】
[0028]特定の実施形態においては、前記方法は、組合せ治療を施す前の対象から得られた癌細胞中でのｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によってはＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３（並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）などの分析物の存在又は活性化のレベルを決定して、例えば、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１がステージＩ又はＩＩの胃癌において同時活性化されているかどうかを決定するステップをさらに含む。特定の実施形態においては、そのような分析物の存在又は活性化のレベルは、ＣＥＥＲ（商標）を用いて決定される。
【００２９】
[0029]本発明の他の課題、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から当業者には明らかとなるであろう。
２０１０年７月１５日に出願された国際公開第２０１１／００８９９０号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２）及び２０１２年１月１９日に出願された米国特許出願第１３／３５４，２５７号の図面は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、生物試料中の活性化されている（例えば、リン酸化されている）分析物レベル及び総分析物レベルの決定において特に有用である、本発明の近接アッセイ形式（例えば、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＣＥＥＲ（商標）））の一実施形態を示す。
【図２】図２は、ＣＥＥＲ（商標）（上）及びＩＨＣ（左下）によるＲＴＫの発現を示す。各患者におけるシグナルタンパク質のレベルを、「ＨＥＲ２、ＰＩ３Ｋ、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＩＧＦ１Ｒ」の順に順位付けした後、図を作製した。ＧＣＡ患者におけるｐ９５ＨＥＲ２の存在（左下）及びＩＨＣサブタイプを有する各ＨＥＲ２におけるそのレベル（右下）も示される。
【図３】図３は、多次元尺度構成法（Ａ）及びパターン（Ｂ）により作製された例示的な同時活性化相関指数を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜図４Ｇは、実施例２に記載される胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリングの結果を示す。
【図５】図５は、ＣＥＥＲ（商標）アッセイの原理及びアレイのレイアウトを示す例示的略図を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｂは、胃癌におけるＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の発現を示す。（図６Ａ）０．２５μｇの溶解物での患者試料のＨＥＲ２発現に関するＣＵ分布。ｘ軸はＩＨＣ／ＦＩＳＨ状態を表し、ｙ軸はＢＴ４７４標準曲線から決定されたＣＥＥＲ（商標）アッセイに由来するＣＵ値を表す。ＩＨＣ／ＦＩＳＨ陽性集団（５０／４３４）に関する１１の中央値と比較してＩＨＣ／ＦＩＳＨ陰性集団（３８４／４３４）に関する０の中央値を有する２群間の分離が示される。定量の限界を超える１つの飽和試料は示されない。囲みは四分位範囲を表し、上に７５％タイル及び下に２５％タイルを示す。囲みの中央の線は、中央値を表す。髭は四分位範囲の１．５倍以内の最高値及び最低値に伸びる。０．００１未満のＰ値が、ウイルコクソンの符号付き検定により決定された。（図６Ｂ）２０μｇの溶解物での腫瘍試料のサブセット（５８／４３４）におけるｐ９５ＨＥＲ２のＣＵ分布。ｘ軸はＩＨＣ状態を表し、ｙ軸はｐ９５に関するＣＥＥＲ（商標）アッセイに由来するＣＵ値を表す。完全長ＨＥＲ２はアッセイの前に免疫枯渇により除去された。データ点はＩＨＣ及びＦＩＳＨによるＨＥＲ２状態に基づいて着色される。示される通り、２のＩＨＣを有する１つのデータ点が、ＦＩＳＨ分析により陽性であると決定された。下のグラフには、３のＩＨＣを有する試料に関するＣＵ値が示される。ＣＥＥＲ（商標）によりｐ９５について陽性であると決定された３４の試料のうち、２４（７１％）がＩＨＣ／ＦＩＳＨによりＨＥＲ２（＋）であった。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、胃癌におけるＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の発現を示す。（図６Ａ）０．２５μｇの溶解物での患者試料のＨＥＲ２発現に関するＣＵ分布。ｘ軸はＩＨＣ／ＦＩＳＨ状態を表し、ｙ軸はＢＴ４７４標準曲線から決定されたＣＥＥＲ（商標）アッセイに由来するＣＵ値を表す。ＩＨＣ／ＦＩＳＨ陽性集団（５０／４３４）に関する１１の中央値と比較してＩＨＣ／ＦＩＳＨ陰性集団（３８４／４３４）に関する０の中央値を有する２群間の分離が示される。定量の限界を超える１つの飽和試料は示されない。囲みは四分位範囲を表し、上に７５％タイル及び下に２５％タイルを示す。囲みの中央の線は、中央値を表す。髭は四分位範囲の１．５倍以内の最高値及び最低値に伸びる。０．００１未満のＰ値が、ウイルコクソンの符号付き検定により決定された。（図６Ｂ）２０μｇの溶解物での腫瘍試料のサブセット（５８／４３４）におけるｐ９５ＨＥＲ２のＣＵ分布。ｘ軸はＩＨＣ状態を表し、ｙ軸はｐ９５に関するＣＥＥＲ（商標）アッセイに由来するＣＵ値を表す。完全長ＨＥＲ２はアッセイの前に免疫枯渇により除去された。データ点はＩＨＣ及びＦＩＳＨによるＨＥＲ２状態に基づいて着色される。示される通り、２のＩＨＣを有する１つのデータ点が、ＦＩＳＨ分析により陽性であると決定された。下のグラフには、３のＩＨＣを有する試料に関するＣＵ値が示される。ＣＥＥＲ（商標）によりｐ９５について陽性であると決定された３４の試料のうち、２４（７１％）がＩＨＣ／ＦＩＳＨによりＨＥＲ２（＋）であった。
【図７】図７は、ＩＨＣ及びＣＥＥＲ（商標）による乳癌におけるＨＥＲ２発現の比較を示す。乳癌におけるそれぞれのＩＨＣサブグループにおけるＣＥＥＲ（商標）に基づくＨＥＲ２発現の分布は（Ａ）に示される。ＩＨＣとＣＥＥＲ（商標）ＨＥＲ２状態との間には１７％（３８／２２７）の不一致コールが存在した（Ｃ−一致、Ｄ−不一致）。１００の試料（不一致コールと共に全てを含む）のＩＰ−Ｗ分析の結果は（Ｂ）にまとめられる。ＣＥＥＲ（商標）とＩＰＷにより調整されたＨＥＲ状態との間の一致が示される。
【図８】図８は、ＣＥＥＲ（商標）アッセイを用いて完全長及びトランケート型ｐ９５ＨＥＲ２発現を決定するための戦略の非限定例を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｂは、胃癌におけるリン酸化されたマーカーのプロファイリングを示す。（図９Ａ）代表的な免疫アッセイの画像が指示されたシグナル伝達タンパク質の経路プロファイリングについて示される。アレイシグナル強度は、黒色／紺青色（低い）から赤色／白色（高い／飽和）までの範囲である。（図９Ｂ）１０μｇの溶解物濃度で測定された活性化（リン酸化）されたマーカーに関するＣＥＥＲ（商標）アッセイに由来するＣＵ値に基づく４３４の試料のヒートマップ及び階層的クラスタリング。それぞれの列はマーカーを表し、それぞれの行は患者試料を表す。活性化の相対レベルはカラースケールと共に記載され、ここで赤色は最高レベルの活性化を表し、緑色は最低レベルを表す。各マーカーに関するＣＵ値（列）は、十分位数により順位付けられた。０〜０．１のジッターをそれぞれのバイオマーカーＣＵ値に加えて、等しいサイズのビンを作出した。行及び列の系統樹は、階層的クラスタリング計算の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｂは、胃癌におけるリン酸化されたマーカーのプロファイリングを示す。（図９Ａ）代表的な免疫アッセイの画像が指示されたシグナル伝達タンパク質の経路プロファイリングについて示される。アレイシグナル強度は、黒色／紺青色（低い）から赤色／白色（高い／飽和）までの範囲である。（図９Ｂ）１０μｇの溶解物濃度で測定された活性化（リン酸化）されたマーカーに関するＣＥＥＲ（商標）アッセイに由来するＣＵ値に基づく４３４の試料のヒートマップ及び階層的クラスタリング。それぞれの列はマーカーを表し、それぞれの行は患者試料を表す。活性化の相対レベルはカラースケールと共に記載され、ここで赤色は最高レベルの活性化を表し、緑色は最低レベルを表す。各マーカーに関するＣＵ値（列）は、十分位数により順位付けられた。０〜０．１のジッターをそれぞれのバイオマーカーＣＵ値に加えて、等しいサイズのビンを作出した。行及び列の系統樹は、階層的クラスタリング計算の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、活性化されているＲＴＫプロファイリングに基づく胃癌における無病生存期間の差異を示す。（図１０Ａ及び図１０Ｂ）腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌試料における根治手術後の無病生存期間の差異。この分析は、０のＲＴＫ活性化対１以上のＲＴＫ活性化を有するコホート間で、全体の胃癌試料セット（図１０Ａ）又はＨＥＲ２（−）胃癌試料セット（図１０Ｂ）のみを比較した。ステージＩＩ＋ＩＩＩ胃癌を有する全患者における２つのコホートの中央生存期間は、３２．６３ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び７６．５３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）であり、ＨＥＲ２（−）のステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌を有する患者においては３０．１０ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び６８．１３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）である。（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）ＨＥＲ２（−）（図１０Ｃ）又はステージＩのＨＥＲ２（−）（図１０Ｄ）胃癌試料におけるｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−）対ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋）コホートを比較する根治手術後の無病生存期間の差異。ＨＥＲ２（−）患者における２つのコホートの中央生存期間は４６．１７ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋））及び８２．８０ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−））である。ＨＥＲ２（−）のステージＩの胃癌を有する患者における中央生存期間は、両コホートについて定義されていない。各コホート中の試料数、ｐ値及びハザード比が示される。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、活性化されているＲＴＫプロファイリングに基づく胃癌における無病生存期間の差異を示す。（図１０Ａ及び図１０Ｂ）腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌試料における根治手術後の無病生存期間の差異。この分析は、０のＲＴＫ活性化対１以上のＲＴＫ活性化を有するコホート間で、全体の胃癌試料セット（図１０Ａ）又はＨＥＲ２（−）胃癌試料セット（図１０Ｂ）のみを比較した。ステージＩＩ＋ＩＩＩ胃癌を有する全患者における２つのコホートの中央生存期間は、３２．６３ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び７６．５３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）であり、ＨＥＲ２（−）のステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌を有する患者においては３０．１０ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び６８．１３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）である。（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）ＨＥＲ２（−）（図１０Ｃ）又はステージＩのＨＥＲ２（−）（図１０Ｄ）胃癌試料におけるｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−）対ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋）コホートを比較する根治手術後の無病生存期間の差異。ＨＥＲ２（−）患者における２つのコホートの中央生存期間は４６．１７ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋））及び８２．８０ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−））である。ＨＥＲ２（−）のステージＩの胃癌を有する患者における中央生存期間は、両コホートについて定義されていない。各コホート中の試料数、ｐ値及びハザード比が示される。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、活性化されているＲＴＫプロファイリングに基づく胃癌における無病生存期間の差異を示す。（図１０Ａ及び図１０Ｂ）腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌試料における根治手術後の無病生存期間の差異。この分析は、０のＲＴＫ活性化対１以上のＲＴＫ活性化を有するコホート間で、全体の胃癌試料セット（図１０Ａ）又はＨＥＲ２（−）胃癌試料セット（図１０Ｂ）のみを比較した。ステージＩＩ＋ＩＩＩ胃癌を有する全患者における２つのコホートの中央生存期間は、３２．６３ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び７６．５３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）であり、ＨＥＲ２（−）のステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌を有する患者においては３０．１０ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び６８．１３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）である。（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）ＨＥＲ２（−）（図１０Ｃ）又はステージＩのＨＥＲ２（−）（図１０Ｄ）胃癌試料におけるｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−）対ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋）コホートを比較する根治手術後の無病生存期間の差異。ＨＥＲ２（−）患者における２つのコホートの中央生存期間は４６．１７ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋））及び８２．８０ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−））である。ＨＥＲ２（−）のステージＩの胃癌を有する患者における中央生存期間は、両コホートについて定義されていない。各コホート中の試料数、ｐ値及びハザード比が示される。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、活性化されているＲＴＫプロファイリングに基づく胃癌における無病生存期間の差異を示す。（図１０Ａ及び図１０Ｂ）腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌試料における根治手術後の無病生存期間の差異。この分析は、０のＲＴＫ活性化対１以上のＲＴＫ活性化を有するコホート間で、全体の胃癌試料セット（図１０Ａ）又はＨＥＲ２（−）胃癌試料セット（図１０Ｂ）のみを比較した。ステージＩＩ＋ＩＩＩ胃癌を有する全患者における２つのコホートの中央生存期間は、３２．６３ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び７６．５３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）であり、ＨＥＲ２（−）のステージＩＩ＋ＩＩＩの胃癌を有する患者においては３０．１０ヶ月（１以上のＲＴＫ活性化）及び６８．１３ヶ月（０のＲＴＫ活性化）である。（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）ＨＥＲ２（−）（図１０Ｃ）又はステージＩのＨＥＲ２（−）（図１０Ｄ）胃癌試料におけるｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−）対ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋）コホートを比較する根治手術後の無病生存期間の差異。ＨＥＲ２（−）患者における２つのコホートの中央生存期間は４６．１７ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋））及び８２．８０ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−））である。ＨＥＲ２（−）のステージＩの胃癌を有する患者における中央生存期間は、両コホートについて定義されていない。各コホート中の試料数、ｐ値及びハザード比が示される。
【図１１】図１１は、ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−）対ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋）胃癌コホート間の無病生存期間の差異を示す。ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−）対ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋）コホートを比較する全ての（ＨＥＲ２（＋）及びＨＥＲ２（−））胃癌試料における根治手術後の無病生存期間の差異。胃癌患者における２つのコホートの中央生存期間は、４６．１７ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（＋））及び８２．８０ヶ月（ｃ−ＭＥＴ（＋）ＨＥＲ１（−））である。各コホート中の試料数、ｐ値及びハザード比が示される。
【図１２】図１２は、胃癌細胞中での活性化ＨＥＲ１／ＨＥＲ２及びＭＥＴの阻害を示す。ラパチニブ／ｃＭＥＴ阻害剤処置後の経路タンパク質の調節が、それぞれの治療的処置を用いる癌細胞増殖阻害に対する経路阻害の表現型効果と共に示される。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びｃ−ＭＥＴは、それぞれ、赤色、黄色及び緑色の矢印で示される。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｅは、胃癌患者からのＣＴＣ及びＡＴＣにおけるリン酸化マーカーのプロファイリングを示す。（図１３Ａ）胃癌患者から単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及び活性化が示される。ＣＴＣ溶解物中のホスホ−ＨＥＲ１、ホスホ−ＨＥＲ２、総ＨＥＲ１、総ＨＥＲ２及びＣＫを、ＣＥＥＲ（商標）を用いて検出した。（図１３Ｂ）胃癌患者００５〜１１０から得られた腹水から単離された腫瘍細胞を、指示された用量で４時間、薬剤（ラパチニブ及びｃＭＥＴ阻害剤）で処理した。処置後のホスホタンパク質の調節はＣＥＥＲ（商標）により検出される。用量依存的様式での薬剤処置の際に、ｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２及びｐ−ｃＭＥＴのレベルの明確な低下が観察された。標的特異的シグナル低下が観察されたが、非標的化ＲＴＫ、ＩＧＦ１Ｒの活性化の増加も観察された。（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）胃癌患者から採取された腹水から単離された腫瘍細胞を、２μＭの阻害剤カクテル（ラパチニブ及びＰＨＡ−６６５，７５２）若しくはＤＭＳＯを含むか、又は含まない増殖因子のカクテル（ＥＧＦ、ヘレグリン、ＨＧＦ及びＩＧＦ）で、３７℃で４時間処理した。増殖因子／薬剤処理の完了時に、細胞を溶解し、ＣＥＥＲ（商標）を用いてプロファイルした。相対ＣＵを、ベースライン（薬剤処理なし及び増殖因子刺激なし）に対するＣＵの比として定義した。増殖因子処理は、複数のシグナル伝達タンパク質の活性化を誘導した。薬剤処理は、対応する標的タンパク質の活性化を低下させた。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｅは、胃癌患者からのＣＴＣ及びＡＴＣにおけるリン酸化マーカーのプロファイリングを示す。（図１３Ａ）胃癌患者から単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及び活性化が示される。ＣＴＣ溶解物中のホスホ−ＨＥＲ１、ホスホ−ＨＥＲ２、総ＨＥＲ１、総ＨＥＲ２及びＣＫを、ＣＥＥＲ（商標）を用いて検出した。（図１３Ｂ）胃癌患者００５〜１１０から得られた腹水から単離された腫瘍細胞を、指示された用量で４時間、薬剤（ラパチニブ及びｃＭＥＴ阻害剤）で処理した。処置後のホスホタンパク質の調節はＣＥＥＲ（商標）により検出される。用量依存的様式での薬剤処置の際に、ｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２及びｐ−ｃＭＥＴのレベルの明確な低下が観察された。標的特異的シグナル低下が観察されたが、非標的化ＲＴＫ、ＩＧＦ１Ｒの活性化の増加も観察された。（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）胃癌患者から採取された腹水から単離された腫瘍細胞を、２μＭの阻害剤カクテル（ラパチニブ及びＰＨＡ−６６５，７５２）若しくはＤＭＳＯを含むか、又は含まない増殖因子のカクテル（ＥＧＦ、ヘレグリン、ＨＧＦ及びＩＧＦ）で、３７℃で４時間処理した。増殖因子／薬剤処理の完了時に、細胞を溶解し、ＣＥＥＲ（商標）を用いてプロファイルした。相対ＣＵを、ベースライン（薬剤処理なし及び増殖因子刺激なし）に対するＣＵの比として定義した。増殖因子処理は、複数のシグナル伝達タンパク質の活性化を誘導した。薬剤処理は、対応する標的タンパク質の活性化を低下させた。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｅは、胃癌患者からのＣＴＣ及びＡＴＣにおけるリン酸化マーカーのプロファイリングを示す。（図１３Ａ）胃癌患者から単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及び活性化が示される。ＣＴＣ溶解物中のホスホ−ＨＥＲ１、ホスホ−ＨＥＲ２、総ＨＥＲ１、総ＨＥＲ２及びＣＫを、ＣＥＥＲ（商標）を用いて検出した。（図１３Ｂ）胃癌患者００５〜１１０から得られた腹水から単離された腫瘍細胞を、指示された用量で４時間、薬剤（ラパチニブ及びｃＭＥＴ阻害剤）で処理した。処置後のホスホタンパク質の調節はＣＥＥＲ（商標）により検出される。用量依存的様式での薬剤処置の際に、ｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２及びｐ−ｃＭＥＴのレベルの明確な低下が観察された。標的特異的シグナル低下が観察されたが、非標的化ＲＴＫ、ＩＧＦ１Ｒの活性化の増加も観察された。（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）胃癌患者から採取された腹水から単離された腫瘍細胞を、２μＭの阻害剤カクテル（ラパチニブ及びＰＨＡ−６６５，７５２）若しくはＤＭＳＯを含むか、又は含まない増殖因子のカクテル（ＥＧＦ、ヘレグリン、ＨＧＦ及びＩＧＦ）で、３７℃で４時間処理した。増殖因子／薬剤処理の完了時に、細胞を溶解し、ＣＥＥＲ（商標）を用いてプロファイルした。相対ＣＵを、ベースライン（薬剤処理なし及び増殖因子刺激なし）に対するＣＵの比として定義した。増殖因子処理は、複数のシグナル伝達タンパク質の活性化を誘導した。薬剤処理は、対応する標的タンパク質の活性化を低下させた。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｅは、胃癌患者からのＣＴＣ及びＡＴＣにおけるリン酸化マーカーのプロファイリングを示す。（図１３Ａ）胃癌患者から単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及び活性化が示される。ＣＴＣ溶解物中のホスホ−ＨＥＲ１、ホスホ−ＨＥＲ２、総ＨＥＲ１、総ＨＥＲ２及びＣＫを、ＣＥＥＲ（商標）を用いて検出した。（図１３Ｂ）胃癌患者００５〜１１０から得られた腹水から単離された腫瘍細胞を、指示された用量で４時間、薬剤（ラパチニブ及びｃＭＥＴ阻害剤）で処理した。処置後のホスホタンパク質の調節はＣＥＥＲ（商標）により検出される。用量依存的様式での薬剤処置の際に、ｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２及びｐ−ｃＭＥＴのレベルの明確な低下が観察された。標的特異的シグナル低下が観察されたが、非標的化ＲＴＫ、ＩＧＦ１Ｒの活性化の増加も観察された。（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）胃癌患者から採取された腹水から単離された腫瘍細胞を、２μＭの阻害剤カクテル（ラパチニブ及びＰＨＡ−６６５，７５２）若しくはＤＭＳＯを含むか、又は含まない増殖因子のカクテル（ＥＧＦ、ヘレグリン、ＨＧＦ及びＩＧＦ）で、３７℃で４時間処理した。増殖因子／薬剤処理の完了時に、細胞を溶解し、ＣＥＥＲ（商標）を用いてプロファイルした。相対ＣＵを、ベースライン（薬剤処理なし及び増殖因子刺激なし）に対するＣＵの比として定義した。増殖因子処理は、複数のシグナル伝達タンパク質の活性化を誘導した。薬剤処理は、対応する標的タンパク質の活性化を低下させた。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜図１３Ｅは、胃癌患者からのＣＴＣ及びＡＴＣにおけるリン酸化マーカーのプロファイリングを示す。（図１３Ａ）胃癌患者から単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及び活性化が示される。ＣＴＣ溶解物中のホスホ−ＨＥＲ１、ホスホ−ＨＥＲ２、総ＨＥＲ１、総ＨＥＲ２及びＣＫを、ＣＥＥＲ（商標）を用いて検出した。（図１３Ｂ）胃癌患者００５〜１１０から得られた腹水から単離された腫瘍細胞を、指示された用量で４時間、薬剤（ラパチニブ及びｃＭＥＴ阻害剤）で処理した。処置後のホスホタンパク質の調節はＣＥＥＲ（商標）により検出される。用量依存的様式での薬剤処置の際に、ｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２及びｐ−ｃＭＥＴのレベルの明確な低下が観察された。標的特異的シグナル低下が観察されたが、非標的化ＲＴＫ、ＩＧＦ１Ｒの活性化の増加も観察された。（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）胃癌患者から採取された腹水から単離された腫瘍細胞を、２μＭの阻害剤カクテル（ラパチニブ及びＰＨＡ−６６５，７５２）若しくはＤＭＳＯを含むか、又は含まない増殖因子のカクテル（ＥＧＦ、ヘレグリン、ＨＧＦ及びＩＧＦ）で、３７℃で４時間処理した。増殖因子／薬剤処理の完了時に、細胞を溶解し、ＣＥＥＲ（商標）を用いてプロファイルした。相対ＣＵを、ベースライン（薬剤処理なし及び増殖因子刺激なし）に対するＣＵの比として定義した。増殖因子処理は、複数のシグナル伝達タンパク質の活性化を誘導した。薬剤処理は、対応する標的タンパク質の活性化を低下させた。
【図１４】図１４は、総ＨＥＲ２及びリン酸化ＨＥＲ２に関する標準曲線を示す。ＢＴ４７４から調製された連続希釈細胞溶解物の標準曲線を用いて、各試料中のＨＥＲ２発現及びリン酸化の程度を正規化した。それぞれの曲線を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定されたシグナル強度の対数対細胞溶解物の濃度の対数の関数としてプロットし、標準細胞株を参照した。画像は単一のＰＭＴ設定で示したが、複数のＰＭＴ走査は定量のダイナミックレンジを拡張する。
【図１５−１】図１５−１〜図１５−２０は、表２である。この表は、両方とも胃癌（ＧＣＡ）及び乳癌（ＢＣＡ）スコアリング基準に基づくＨＥＲ２（＋）及びＨＥＲ２（−）胃癌試料のＨＥＲ２遺伝子増幅状態（「１」は遺伝子増幅されており、「０」は遺伝子増幅されていない）及びＨＥＲ２  ＩＨＣスコア（「０」、「１」、「２」又は「３」として表される）を示す。胃癌試料の組織学的サブタイプは影付きである：腸型（薄い灰色）、びまん型（中程度の灰色）、及び混合型（濃い灰色）。この表は、各試料中のＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ及びＰＩ３Ｋシグナリング分子のｐ９５ＨＥＲ２発現状態（「１」はｐ９５（＋）であり、「０」はｐ９５（−）であり、「ＮＤ」は決定されていない）及びリン酸化状態（「１」はリン酸化されており、「０」はリン酸化されていない）もまとめる。各マーカーに関するそれぞれのＣＵカットオフが示される。
【図１５−２】表２の続きである。
【図１５−３】表２の続きである。
【図１５−４】表２の続きである。
【図１５−５】表２の続きである。
【図１５−６】表２の続きである。
【図１５−７】表２の続きである。
【図１５−８】表２の続きである。
【図１５−９】表２の続きである。
【図１５−１０】表２の続きである。
【図１５−１１】表２の続きである。
【図１５−１２】表２の続きである。
【図１５−１３】表２の続きである。
【図１５−１４】表２の続きである。
【図１５−１５】表２の続きである。
【図１５−１６】表２の続きである。
【図１５−１７】表２の続きである。
【図１５−１８】表２の続きである。
【図１５−１９】表２の続きである。
【図１５−２０】表２の続きである。
【図１６】図１６は、表３である。この表は、それぞれの活性化ＨＥＲキナーゼ軸受容体メンバー及び他のＨＥＲメンバーとのその同時活性化に関する試料数の分布を示す。試料のＨＥＲ２状態及び組織学的サブタイプが示される。
【図１７】図１７は、表４である。この表は、活性化ｃ−ＭＥＴ受容体及び他のＲＴＫとのその同時活性化パターンに関する試料数の分布を示す。試料のＨＥＲ２状態及び組織学的サブタイプが示される。
【図１８】図１８は、表５である。この表は、活性化ＩＧＦ１受容体及び他のＲＴＫとのその同時活性化パターンに関する試料数の分布を示す。試料のＨＥＲ２状態及び組織学的サブタイプが示される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
Ｉ．序論
[0049]腫瘍学の分野における分子標的療法時代の到来と共に、多くの腫瘍学者は、さもなければ支持療法にあったであろう難治性の転移性癌患者における分子標的化剤に対する予期せぬ劇的な応答を経験してきた。しかしながら、病院では、その標的プロフィールに基づいて選択された患者でさえも、標的化剤に対して応答しないか、又は劇的な初期応答を有した後に耐性を生じることが多い。標的化剤に関する治療的利益の増強を妨害する主な問題としては、（１）患者のサブグループにおける、同時に起こる余剰な経路の活性化、（２）経路の混線によって元の標的タンパク質（複数可）をバイパスする別のシグナリング事象の活性化による耐性の発生、（３）癌が抗癌剤処置の過程を通して転移及び進行する時の分子的及び病理学的特徴の変化、（４）処置中又は処置後の再生検の限定された利用可能性、並びに（５）「進化する」疾患に対処するための潜在的な薬剤耐性機構を同定するための標的化剤に関するコンパニオン診断の制限が挙げられる。
【００３２】
[0050]胃癌は、世界の癌による死亡の主因であり、１年あたりの発生件数は１８．９／１００，０００であり、１年あたりの死亡率は１４．７／１００，０００であり（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１６  Ｓｕｐｐｌ  １、ｉ２２〜２３（２００５）を参照されたい）、韓国においては最も一般的な悪性腫瘍である。転移性胃癌は、予後不良に起因して腫瘍内科医にとって依然として治療的課題である。現在、トラスツズマブが、無作為化第ＩＩＩ相臨床試験において胃癌にとって有効であることが証明されている唯一の活性な標的化剤である（例えば、Ｂａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，３７６：６８７〜６９７（２０１０）を参照されたい）。胃癌における他の公知の活性化経路タンパク質としては、ヒト表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリー、間葉上皮移行因子又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭＥＴ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、及びインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）が挙げられる。
【００３３】
[0051]本発明は、胃癌を、この種類の癌において活性である鍵となる増殖因子受容体シグナリング経路のリン酸化プロフィールに基づいて分離することができることを証明する。特に、本発明は、この種類の癌における標的療法剤の選択及び結果に直接影響するシグナリング経路活性化プロフィールに基づいて胃癌における不均一性のレベルを同定する。特定の態様において、高感度で新規な免疫アッセイであるＣＥＥＲ（商標）を、全型及びリン酸化型のいくつかのタンパク質を特異的に分析するために多重化することができる胃癌臨床試料に対して用いた。実施例３に記載の試験は、胃癌患者の４０％超において、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、及びＩＧＦ１Ｒ分子のうちの少なくとも１つのシグナル伝達キナーゼが活性化されていることを証明する。この研究で分析されたＲＴＫのうち、ＨＥＲファミリーメンバーは最も高頻度で活性化されているチロシンキナーゼであり、ＨＥＲ３は胃癌の２８％において活性化されており、それに次いでＨＥＲ２（２１％）及びＨＥＲ１（１５．７％）が活性化されている。さらに、実施例３に記載の研究は、ＨＥＲ２陽性胃癌は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の活性化を主として示すが、ＨＥＲ２陰性癌は典型的には活性なＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びｃ−ＭＥＴ経路を担持すること、並びにＨＥＲ２活性化胃癌が、ｃ−ＭＥＴ活性化胃癌とは異なるサブグループであることを示す。さらに、実施例３に記載の研究は、大多数の胃癌（７５％を超えるＨＥＲ２陽性及び約８５％のＨＥＲ２陰性）が単一の活性なＲＴＫを有さず、むしろ、それらが、同時活性化ＲＴＫのネットワークによって駆動されることを例示する。
【００３４】
[0052]注目すべきことに、実施例３に記載の研究は、ｐ−ＨＥＲ１：ｐ−ｃＭＥＴを同時発現する胃癌試料における全体的なシグナリング特性が、ＨＥＲ１が活性化されていないｐ−ｃＭＥＴを発現する試料とは異なることを証明する。ｐ−ＨＥＲ１（−）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）対ｐ−ＨＥＲ１（＋）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）試料セットについて、中央生存期間の有意差が観察された。事実、この研究は、ｃＭＥＴとＨＥＲ１との同時活性化が、ＨＥＲ２陰性試料セットにおいてｃＭＥＴだけが活性化されているステージＩの患者と比較して、より少ない無病生存期間を示したことを証明する。そのようなものとして、この試験は、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１（及び場合によってはＨＥＲ３）の同時活性化がＨＥＲ２陰性のびまん型胃癌と密接に関連すること、並びにそのような胃癌患者が有意に少ない生存期間を有することを証明する。かくして、この研究は、ＨＥＲ１とｃＭＥＴの両方の組合せ治療的阻害が、いずれかの標的のみに対する単剤療法とは対照的に、ＨＥＲ１とｃＭＥＴが同時に活性化されている癌細胞における、より有効な抗腫瘍戦略であることを示す。
【００３５】
ＩＩ．定義
[0053]本明細書で用いられる以下の用語は、別途特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
【００３６】
[0054]用語「癌」は、異常な細胞の制御されない増殖を特徴とするあるクラスの疾患の任意のメンバーを含むことが意図される。この用語は、悪性、良性、柔組織、又は固形、及び転移前及び転移後の癌などのあらゆるステージ及び等級の癌として特徴付けられようと、全ての公知の癌及び新生物状態を含む。様々な種類の癌の例としては、限定されるものではないが、胃癌（例えば、胃の癌）、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び食道癌などの消化器癌及び消化管癌、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、虫垂癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、中枢神経系の癌、皮膚癌、リンパ腫、グリオーマ、絨毛癌、頭部及び頸部癌、骨肉腫、並びに血液の癌が挙げられる。本明細書で用いられる「腫瘍」は、１種又は複数の癌性細胞を含む。特定の実施形態においては、胃癌は、例えば、腸型、びまん型、及び／又は混合型などの組織学的サブタイプに対応する。
【００３７】
[0055]用語「分析物」は、対象の任意の分子、典型的には、存在、量（発現レベル）、活性化状態若しくはレベル、及び／又は同一性が決定されるポリペプチドなどの大分子を含む。特定の実施形態においては、分析物は、例えば、ＨＥＲ（ＥＧＦＲ）又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路の構成要素などのシグナル伝達分子である。
【００３８】
[0056]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達因子」は、細胞が細胞外シグナル又は刺激を、典型的には、細胞の内部での整然とした順序での生化学反応を含む応答に変換するプロセスを実行するタンパク質及び他の分子を含む。シグナル伝達分子の例としては、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ〜Ｃ、ｃ−ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、及びＲＴＫ１０６などの受容体チロシンキナーゼ；アミノ末端細胞外ドメインを喪失したトランケート型ＨＥＲ２受容体（例えば、ｐ９５ＥｒｂＢ２（ｐ９５ｍ）、ｐ１１０、ｐ９５ｃ、ｐ９５ｎ、など）などのトランケート型の受容体チロシンキナーゼ；受容体チロシンキナーゼ二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ４など）；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、ＣｓＫ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、及びＬＩＭＫなどの非受容体チロシンキナーゼ；ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼスプライス変異体アルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＧＳＫ−３β、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、及びパキシリンなどのチロシンキナーゼシグナリングカスケード構成要素；エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、糖質コルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受��体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体などの核ホルモン受容体；それぞれ、乳癌において増幅される−１（ＡＩＢ１）及び核受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）などの核受容体コアクチベーター及びリプレッサー；並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００３９】
[0057]用語「ＨＥＲシグナリング経路の構成要素」は、ＨＥＲキナーゼ受容体の任意の１つ若しくは複数の上流のリガンド、ＨＥＲキナーゼ受容体の結合パートナー、及び／又はＨＥＲキナーゼ受容体を介して調節される下流のエフェクター分子を含む。ＨＥＲシグナリング経路構成要素の例としては、限定されるものではないが、ヘレグリン、ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３など）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５）など）、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、スプライス変異体アルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＨＥＲ２量体（例えば、ＨＥＲ１／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１／ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１／ＨＥＲ４、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ４、ＨＥＲ３／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３／ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３／ＨＥＲ４、ＨＥＲ４／ＨＥＲ４、ＨＥＲ４／ｐ９５ＨＥＲ２など）、ＧＳＫ−３β、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００４０】
[0058]用語「ｃ−Ｍｅｔシグナリング経路の構成要素」は、ｃ−Ｍｅｔの任意の１つ若しくは複数の上流のリガンド、ｃ−Ｍｅｔの結合パートナー、及び／又はｃ−Ｍｅｔを介して調節される下流のエフェクター分子を含む。ｃ−Ｍｅｔシグナリング経路構成要素の例としては、限定されるものではないが、肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、プレキシンＢ１、ＣＤ４４ｖ６、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＳＴＡＴ（例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＧＲＢ２、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１、ＳＨＰ２、ＳＲＣ、ＧＲＢ２、ＣＲＫＬ、ＰＬＣγ、ＰＫＣ（例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ）、パキシリン、ＦＡＫ、アデュシン、ＲＢ、ＲＢ１、ＰＹＫ２、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００４１】
[0059]用語「活性化状態」とは、ＨＥＲ又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路構成要素などの特定のシグナル伝達分子が活性化されるかどうかを指す。同様に、用語「活性化レベル」とは、ＨＥＲ又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路構成要素などの特定のシグナル伝達分子がどの程度活性化されるかを指す。活性化状態は、典型的には、１種又は複数のシグナル伝達分子のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体化状態に対応する。活性化状態の非限定例（括弧内に列挙される）としては、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化された（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化された（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＨＥＲ２（トランケートされたＥｒｂＢ２）、ｐ−ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−ＭＥＴ（ｐ−ｃ−ＭＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ：ＨＧＦ複合体）；ＡＫＴ１（ｐ−ＡＫＴ１）；ＡＫＴ２（ｐ−ＡＫＴ２）；ＡＫＴ３（ｐ−ＡＫＴ３）；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ）；ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）；ＥＲＫ１（ｐ−ＥＲＫ１）；ＥＲＫ２（ｐ−ＥＲＫ２）；ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）；ＰＤＫ２（ｐ−ＰＤＫ２）；ＳＧＫ３（ｐ−ＳＧＫ３）；４Ｅ−ＢＰ１（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）；ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ−ＰＩＫ３Ｒ１）；ｃ−ＫＩＴ（ｐ−ｃ−ＫＩＴ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲ１（ｐ−ＨＧＦＲ１）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲＡ（ｐ−ＰＤＧＦＲＡ）；ＰＤＧＦＲＢ（ｐ−ＰＤＧＦＲＢ）；ＶＥＧＦＲ１（ｐ−ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：硫酸ヘパリン、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；ＴＩＥｌ（ｐ−ＴＩＥｌ）；ＴＩＥ２（ｐ−ＴＩＥ２）；ＥＰＨＡ（ｐ−ＥＰＨＡ）；ＥＰＨＢ（ｐ−ＥＰＨＢ）；ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）；ＮＦＫＢ（ｐ−ＮＦＫＢ）、ＩＫＢ（ｐ−ＩＫＢ、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢ）；ＢＡＤ（ｐ−ＢＡＤ、ＢＡＤ：１４−３−３）；ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１）；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ）；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８）；ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）；ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）；ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）；ＲＢ（ｐ−ＲＢ）；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３）；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ）；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）；ｃ−Ｓｒｃ（ｐ−ｃ−Ｓｒｃ）；パキシリン（ｐ−パキシリン）；ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、Ｓｈｃ（ｐ−Ｓｈｃ���、Ｒａｓ（ｐ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１（ｐ−ＧＡＢ１）、ＳＨＰ２（ｐ−ＳＨＰ２）、ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、ＣＲＫＬ（ｐ−ＣＲＫＬ）、ＰＬＣγ（ｐ−ＰＬＣγ）、ＰＫＣ（例えば、ｐ−ＰＫＣα、ｐ−ＰＫＣβ、ｐ−ＰＫＣδ）、アデュシン（ｐ−アデュシン）、ＲＢ１（ｐ−ＲＢ１）、及びＰＹＫ２（ｐ−ＰＹＫ２）が挙げられる。
【００４２】
[0060]本明細書で用いられる用語「試料」は、患者から得られる任意の生物学的標本を含む。試料としては、限定されるものではないが、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核細胞）、管洗浄液、腹水、胸水、乳頭吸引液、リンパ液（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄吸引液、唾液、尿、排泄物（すなわち、糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、細針吸引液（例えば、無作為乳輪周囲穿刺吸引により収穫される）、任意の他の体液、腫瘍の生検（例えば、針生検）又はリンパ節の生検（例えば、センチネルリンパ節生検）などの組織試料（例えば、腫瘍組織）、腫瘍の外科的切除などの組織試料（例えば、腫瘍組織）、及びその細胞抽出物が挙げられる。いくつかの実施形態においては、試料は全血又は血漿、血清、若しくは細胞ペレットなどのその分画成分である。他の実施形態においては、試料は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて全血又はその細胞画分から固形腫瘍の循環細胞を単離することにより得られる。さらに他の実施形態においては、試料は、例えば、胃癌などの固形腫瘍に由来する、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。特定の実施形態においては、試料は、胃癌を有する対象から得られた凍結組織から調製された腫瘍溶解物又は抽出物である。
【００４３】
[0061]「生検」とは、診断又は予後評価のために組織試料を取り出すプロセス、及びその組織標本自体を指す。当技術分野で公知の任意の生検技術を、本発明の方法及び組成物に適用することができる。適用される生検技術は、一般的に、いくつある要因の中で特に、評価しようとする組織型並びに腫瘍のサイズ及び種類（すなわち、固形又は懸濁（すなわち、血液若しくは腹水））に依存する。代表的な生検技術としては、切除生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、細針吸引生検など）、外科的生検、及び骨髄生検が挙げられる。生検技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋａｓｐｅｒら（編）、第１６版、２００５、第７０章に、及びＰａｒｔ  Ｖを通して考察されている。当業者であれば、生検技術を行って所与の組織試料中の癌細胞及び／又は前癌細胞を同定することができることを理解するであろう。
【００４４】
[0062]用語「対象」又は「患者」又は「個体」は、典型的には、ヒトを含むが、例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ヒツジ、ブタなどの他の動物を含んでもよい。
【００４５】
[0063]本明細書で用いられる用語「希釈系列」は、特定の試料（例えば、細胞溶解物）又は試薬（例えば、抗体）の一連の下行濃度を含むことが意図される。希釈系列は、典型的には、測定された量の出発濃度の試料又は試薬を、希釈剤（例えば、希釈バッファー）と混合して、より低濃度の試料又は試薬を作製し、このプロセスを所望の数の連続希釈液を得るのに十分な回数繰り返すプロセスにより製造される。試料又は試薬を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００、又は１０００倍に連続希釈して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０の下行濃度の試料又は試薬を含む希釈系列を製造することができる。例えば、１ｍｇ／ｍｌの出発濃度の捕捉抗体試薬の２倍連続希釈液を含む希釈系列は、一定量の出発濃度の捕捉抗体を、等量の希釈バッファーと混合して、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の捕捉抗体を作製し、このプロセスを繰り返して０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．０３２５ｍｇ／ｍｌなどの捕捉抗体濃度を得ることにより製造することができる。
【００４６】
[0064]本明細書で用いられる用語「優れたダイナミックレンジ」とは、わずか１個の細胞又は数千もの細胞中の特定の分析物を検出するアッセイの能力を指す。例えば、本明細書に記載の免疫アッセイは、それらが捕捉抗体濃度の希釈系列を用いて約１〜１０，０００個の細胞（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、又は１０，０００個の細胞）中の対象の特定のシグナル伝達分子を有利に検出するため、優れたダイナミックレンジを有する。
【００４７】
[0065]「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、例えば、ガラス（例えば、スライドガラス）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズなど）、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は任意の他の好適な基質などの固相支持体上に固定又は拘束された捕捉抗体の異なるセット及び／又は希釈系列を含む。捕捉抗体は、一般的には、共有又は非共有相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力、双極子間結合）により固相支持体上に固定又は拘束される。特定の例においては、捕捉抗体は、固相支持体に結合した捕捉剤と相互作用する捕捉タグを含む。本明細書に記載のアッセイにおいて用いられるアレイは、典型的には、様々な公知の／アドレス可能な位置で固相支持体の表面にカップリングされた複数の異なる捕捉抗体及び／又は捕捉抗体濃度を含む。
【００４８】
[0066]用語「捕捉抗体」は、細胞抽出物などの試料中の１種又は複数の対象の分析物に特異的である（すなわち、それに結合する、それにより結合される、又はそれと複合体を形成する）固定された抗体を含むことが意図される。特定の実施形態においては、捕捉抗体は、アレイ中の固相支持体上に拘束される。固相支持体上に様々なシグナル伝達分子のいずれかを固定するための好適な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。
【００４９】
[0067]本明細書で用いられる用語「検出抗体」は、試料中の対象の１種又は複数の分析物に特異的である（すなわち、それに結合する、それによって結合される、又はそれと複合体を形成する）検出可能な標識を含む抗体を含む。この用語はまた、対象の１種又は複数の分析物に特異的である抗体も包含し、該抗体は検出可能な標識を含む別の種により結合され得る。検出可能な標識の例としては、限定されるものではないが、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）標識、化学反応標識、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、及びその組合せが挙げられる。様々なシグナル伝達分子のいずれかの活性化状態及び／又は総量を検出するための好適な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手可能である。非限定例として、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＫ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ｒａｆ、及びＭＥＫなどの様々なリン酸化形態のシグナル伝達分子に対するホスホ特異的抗体が、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である。
【００５０】
[0068]用語「活性化状態依存的抗体」は、試料中の対象の１種又は複数の分析物の特定の活性化状態に特異的である（すなわち、それに結合する、それにより結合される、又はそれと複合体を形成する）検出抗体を含む。好ましい実施形態においては、活性化状態依存的抗体は、１種又は複数のシグナル伝達分子などの１種又は複数の分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体化状態を検出する。いくつかの実施形態においては、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバー間でのヘテロ二量体複合体の形成を、活性化状態依存的抗体を用いて検出する。特定の実施形態においては、活性化状態依存的抗体は、１種又は複数の以下のシグナル伝達分子における１つ又は複数のリン酸化部位（リン酸化部位はヒトタンパク質配列中のアミノ酸の位置に対応する）を検出するのに有用である：ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１（例えば、チロシン（Ｙ）１０６８）；ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２（例えば、Ｙ１２４８）；ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３（例えば、Ｙ１２８９）；ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４（例えば、Ｙ１２８４）；ｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｙ１００３、Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５、及び／又はＹ１３４９）；ＳＧＫ３（例えば、トレオニン（Ｔ）２５６及び／又はセリン（Ｓ）４２２）；４Ｅ−ＢＰ１（例えば、Ｔ７０）；ＥＲＫ１（例えば、Ｔ１８５、Ｙ１８７、Ｔ２０２、及び／又はＹ２０４）；ＥＲＫ２（例えば、Ｔ１８５、Ｙ１８７、Ｔ２０２、及び／又はＹ２０４）；ＭＥＫ（例えば、Ｓ２１７及び／又はＳ２２１）；ＰＩＫ３Ｒ１（例えば、Ｙ６８８）；ＰＤＫ１（例えば、Ｓ２４１）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔ２２９、Ｔ３８９、及び／又はＳ４２１）；ＰＴＥＮ（例えば、Ｓ３８０）；ＡＫＴ１（例えば、Ｓ４７３及び／又はＴ３０８）；ＡＫＴ２（例えば、Ｓ４７４及び／又はＴ３０９）；ＡＫＴ３（例えば、Ｓ４７２及び／又はＴ３０５）；ＧＳＫ−３β（例えば、Ｓ９）；ＮＦＫＢ（例えば、Ｓ５３６）；ＩＫＢ（例えば、Ｓ３２）；ＢＡＤ（例えば、Ｓ１１２及び／又はＳ１３６）；ｍＴＯＲ（例えば、Ｓ２４４８）；Ｒｓｋ−１（例えば、Ｔ３５７及び／又はＳ３６３）；Ｊｎｋ（例えば、Ｔ１８３及び／又はＹ１８５）；Ｐ３８（例えば、Ｔ１８０及び／又はＹ１８２）；ＳＴＡＴ３（例えば、Ｙ７０５及び／又はＳ７２７）；ＦＡＫ（例えば、Ｙ３９７、Ｙ５７６、Ｓ７２２、Ｙ８６１、及び／又はＳ９１０）；ＲＢ（例えば、Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ６１２、及び／又はＳ７８０）；ＲＢ１（例えば、Ｓ７８０）；アデュシン（例えば、Ｓ６６２及び／又はＳ７２４）；ＰＹＫ２（例えば、Ｙ４０２及び／又はＹ８８１）；ＰＫＣα（例えば、Ｓ６５７）；ＰＫＣα／β（例えば、Ｔ３６８及び／又はＴ６４１）；ＰＫＣδ（例えば、Ｔ５０５）；ｐ５３（例えば、Ｓ３９２及び／又はＳ２０）；ＣＲＥＢ（例えば、Ｓ１３３）；ｃ−Ｊｕｎ（例えば、Ｓ６３）；ｃ−Ｓｒｃ（例えば、Ｙ４１６）；並びにパキシリン（例えば、Ｙ３１及び／又はＹ１１８）。
【００５１】
[0069]用語「活性化状態非依存的抗体」は、その活性化状態とは無関係に試料中の対象の１種又は複数の分析物に特異的である（すなわち、それに結合する、それによって結合される、又はそれと複合体を形成する）検出抗体を含む。例えば、活性化状態非依存的抗体は、１種又は複数のシグナル伝達分子などの１種又は複数の分析物のリン酸化形態と非リン酸化形態の両方を検出することができる。
【００５２】
[0070]用語「インキュベートすること」は、「接触させること」及び「曝露すること」と同義語として用いられ、別途指摘しない限り、任意の特定の時間又は温度要件を含まない。
【００５３】
[0071]「受容体チロシンキナーゼ」又は「ＲＴＫ」は、膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼモチーフを特徴とする５６種のタンパク質のファミリーを含む。ＲＴＫは、増殖、分化、接着、移動、及びアポトーシスを調節する細胞シグナリング及び移行シグナルにおいて機能する。受容体チロシンキナーゼの突然変異活性化及び／又は過剰発現は、細胞を形質転換し、癌の発生及び増殖において重要な役割を果たすことが多い。ＲＴＫは、トラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、イマチニブ、ニロチニブなどの様々な分子標的剤の標的となってきた。１つのよく特徴付けられたシグナル伝達経路は、シグナルを上皮増殖因子（ＥＧＦ）から細胞中での細胞増殖の促進に伝達するのを担うＭＡＰキナーゼ経路である。
【００５４】
[0072]用語「無病生存期間」は、患者が疾患の兆候がなく（例えば、公知の再発がなく）生存する特定の疾患（例えば、癌）の処置後の時間の長さを含む。特定の実施形態においては、無病生存期間は、特定の治療の効果を評価するのに用いられる臨床パラメータであり、通常は１又は５年の単位で測定される。
【００５５】
[0073]用語「無増悪生存期間」は、患者が疾患のさらなる症状がなく疾患と共に生きる特定の疾患（例えば、癌）の処置の間及び後の時間の長さを含む。
【００５６】
[0074]用語「全生存期間」は、癌などの疾患を有すると診断されたか、又は疾患について処置された後の規定の期間にわたって生存する患者を記載する臨床評価項目を含む。
【００５７】
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0075]本発明は、腫瘍手術後に早期（例えば、ステージＩ若しくはＩＩ又は中間ステージへの移行）胃癌を有する対象の生存期間を予測するためのアッセイ及び方法を提供する。特定の態様においては、本発明は、早期胃癌を有する対象における治療効果及び／又は組合せ治療に対する応答を予測するためのアッセイ及び方法を提供する。本発明は、胃癌において活性化されているシグナル伝達バイオマーカーに合わせた組合せ治療を施すことによって早期胃癌を有する対象を処置するための方法をさらに提供する。特定の実施形態においては、本発明の方法は、早期胃癌を有する対象から得られた癌細胞中のシグナル伝達因子分析物の特定の組合せの活性化状態又はレベルの検出に依拠する。かくして、本明細書に記載の方法は、早期胃癌を有する対象の生存期間又は予後の予測、及び分析物について検出された活性化状態又はレベルを考慮して単剤療法とは対照的に、組合せ治療から利益を得る対象を同定することによる腫瘍手術の前後の両方での処置決定の指導にとって特に有用である。
【００５８】
[0076]特定の態様においては、本発明は、腫瘍手術後のステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の生存期間を予測する方法であって、
（ａ）対象から得られた癌細胞中のｃＭＥＴ及びＨＥＲ１を含む少なくとも２種の分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された少なくとも２種の分析物の存在又は活性化のレベルに基づいて対象の生存期間を予測するステップと
を含む前記方法を提供する。
【００５９】
[0077]いくつかの実施形態においては、前記方法は、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の無病生存期間又は無増悪生存期間を予測する。特定の例においては、ステージＩの胃癌は、ステージＩＡ又はステージＩＢの胃癌である。他の特定の例においては、ステージＩＩの胃癌は、ステージＩＩＡ又はステージＩＩＢの胃癌である。１つの代替的な実施形態においては、対象はステージ０の胃癌を有する。別の代替的な実施形態においては、対象は、末期（例えば、ステージＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、若しくはＩＩＩＣなどのステージＩＩＩ、又はステージＩＶ）の胃癌を有する。ＡＪＣＣ胃癌ステージ分類システムの第７版の説明については、例えば、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、１７：３０７７〜９（２０１０）（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６０】
[0078]特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１は、癌細胞中で同時活性化される。そのような実施形態においては、対象は、ＨＥＲ１活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。より少ない生存期間の転帰の非限定例としては、より短い寿命、癌の再発までのより短い時間、癌の症状が生じるまでのより短い時間、より高い再発リスク、及びその組合せが挙げられる。
【００６１】
[0079]いくつかの実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌は、例えば、腸型、びまん型、又は混合型胃癌などの組織学的サブタイプに対応する。特定の実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌は、びまん型胃癌である。他の実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が、びまん型胃癌において同時活性化されている。そのような実施形態においては、対象は、ｃＭＥＴは活性化されているが、ＨＥＲ１は活性化されていない、及び／又はびまん型胃癌を有するステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。
【００６２】
[0080]他の実施形態においては、ステップ（ａ）は、癌細胞中のＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３を含む少なくとも１種のさらなる分析物の存在又は活性化のレベルを決定するステップをさらに含む。特定の例においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されない。そのような例においては、対象は、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。他の特定の例においては、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ３が癌細胞中で同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されていない。そのような例においては、対象は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間（例えば、より不良な予後）を有すると予測される。
【００６３】
[0081]いくつかの実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象に関するより少ない生存期間の転帰としては、対照対象（例えば、ｃＭＥＴは活性化されているが、ＨＥＲ１は活性化されていないステージＩ又はＩＩの胃癌対象）と比較して数日、数週間、数ヶ月、又は数年（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０日、週間、月、又は年）短い寿命、無病生存期間、又は無増悪生存期間が挙げられる。
【００６４】
[0082]特定の実施形態においては、癌細胞は、一次胃腫瘍試料、例えば、ステージＩ又はＩＩの胃腫瘍などの腫瘍組織試料から単離される。いくつかの例においては、癌細胞は、一次腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、腹水腫瘍細胞（ＡＴＣ）、及びその組合せからなる群から選択される。特定の例においては、細胞抽出物を、単離された癌細胞から製造する。
【００６５】
[0083]特定の実施形態においては、前記方法は、
（ｃ）ステップ（ａ）で決定された少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１の存在又は活性化のレベルに基づいて、ｃＭＥＴ阻害剤のみを又はｃＭＥＴ阻害剤をＨＥＲ１阻害剤と組み合わせて対象に投与するステップ
をさらに含む。
【００６６】
[0084]いくつかの実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が癌細胞中で同時活性化されている場合、並びに場合によりＨＥＲ２が癌細胞中で活性化されていない、及び／又はＨＥＲ３が活性化されている場合に、ｃＭＥＴ阻害剤がＨＥＲ１阻害剤と組み合わせて投与される。ｃＭＥＴ阻害剤及びＨＥＲ１阻害剤の非限定例は、本明細書に記載される。特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ阻害剤（複数可）であるフォレチニブ及び／又はＰＨＡ−６６５７５２は、ＨＥＲ１阻害剤であるラパチニブと組み合わせて投与される。さらなる実施形態においては、１種又は複数のさらなる抗癌剤が対象に投与される。好適なさらなる抗癌剤の非限定例は、以下に記載される。
【００６７】
[0085]特定の実施形態においては、ステップ（ａ）は、ＣＥＥＲ（商標）を用いて分析物（例えば、少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）の存在又は活性化のレベルを決定するステップを含む。他の実施形態においては、ステップ（ａ）は、１種又は複数の分析物（例えば、少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）の存在又は発現のレベルを決定するステップをさらに含む。特定の実施形態においては、そのような分析物の存在又は発現のレベルは、ＣＥＥＲ（商標）を用いて決定される。特定の実施形態においては、分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、それぞれの分析物について作製された標準曲線に対して較正される。
【００６８】
[0086]特定の例においては、本発明の方法は、読み取り可能な形式でユーザー（例えば、腫瘍学者又は一般開業医などの臨床医）に、ステップ（ｂ）における予測の結果を提供するステップをさらに含んでもよい。いくつかの例においては、前記方法は、臨床医、例えば、腫瘍学者又は一般開業医に、ステップ（ｂ）における予測の結果を送るか、又は報告するステップをさらに含んでもよい。他の例においては、前記方法は、例えば、研究室の、コンピュータデータベース又は情報を保存するための他の好適な機械若しくは装置に、ステップ（ｂ）における予測の結果を記録又は保存するステップをさらに含んでもよい。
【００６９】
[0087]さらなる態様において、本発明は、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象を治療する方法であって、
ｃＭＥＴ阻害剤及びＨＥＲ１阻害剤を含む組合せ治療を対象に施すことを含み、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１がステージＩ又はＩＩの胃癌において同時活性化されている、前記方法を提供する。
【００７０】
[0088]いくつかの実施形態においては、前記方法は、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の予後を改善する（例えば、無病生存期間又は無増悪生存期間を増加させる）。特定の例においては、ステージＩの胃癌は、ステージＩＡ又はステージＩＢの胃癌である。他の特定の例においては、ステージＩＩの胃癌は、ステージＩＩＡ又はステージＩＩＢの胃癌である。１つの代替的な実施形態においては、対象は、ステージ０の胃癌を有する。別の代替的な実施形態においては、対象は、末期（例えば、ステージＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ若しくはＩＩＩＣなどのステージＩＩＩ、又はステージＩＶ）の胃癌を有する。ＡＪＣＣ胃癌ステージ分類システムの第７版の説明については、例えば、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、１７：３０７７〜９（２０１０）（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００７１】
[0089]特定の実施形態においては、前記方法は、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が同時活性化されており、組合せ治療を受けていないステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対照対象と比較して、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象の生存期間を数日、数週間、数ヶ月、又は数年（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０日、週間、月、又は年）増加させる（例えば、無病生存期間又は無増悪生存期間を増加させる）。
【００７２】
[0090]他の実施形態においては、対象（例えば、組合せ治療を開始する前）は、ＨＥＲ１活性化の非存在下でｃＭｅｔが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する。より少ない生存期間の転帰の非限定例としては、より短い寿命、癌の再発までのより短い時間、癌の症状が生じるまでのより短い時間、より高い再発リスク、及びその組合せが挙げられる。
【００７３】
[0091]さらなる実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌においてｃＭＥＴ及びＨＥＲ１が同時活性化されているが、ＨＥＲ２は活性化されていない。そのような実施形態においては、対象（例えば、組合せ治療を開始する前）は、ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２活性化の非存在下でｃＭｅｔが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する。
【００７４】
[0092]さらに他の実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌において、ｃＭｅｔ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ３が同時活性化されている。そのような実施形態においては、対象（例えば、組合せ治療を開始する前）は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３活性化の非存在下でｃＭＥＴが活性化されているステージＩ又はＩＩの胃癌対象と比較して、より少ない生存期間及び／又はより不良な予後を有する。
【００７５】
[0093]いくつかの実施形態においては、ステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象に関するより少ない生存期間の転帰としては、対照対象（例えば、ｃＭＥＴは活性化されているが、ＨＥＲ１は活性化されていないステージＩ又はＩＩの胃癌対象）と比較して数日、数週間、数ヶ月、又は数年（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０日、週間、月、又は年）短い寿命、無病生存期間、又は無増悪生存期間が挙げられる。
【００７６】
[0094]他の実施形態においては、組合せ治療は、一次治療（例えば、胃腫瘍のサイズを収縮させるための術前処置）として対象に施される。他の実施形態においては、組合せ治療は、術後補助治療（例えば、腫瘍手術の後）として対象に施される。特定の実施形態においては、組合せ治療を、一次治療として術前及び補助治療として術後の両方に施すことができる。特定の例においては、治療上有効量のｃＭＥＴ阻害剤及びＨＥＲ１阻害剤が、対象に投与される。
【００７７】
[0095]特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ阻害剤は、フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９／ＸＬ−８８０）、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＭＧ１０２、ＭｅｔＭＡｂ、ＡＲＱ１９７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＸＬ１８４、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、及びその組合せからなる群から選択される。他の特定の実施形態においては、ＨＥＲ１阻害剤は、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、ＢＩＢＷ−２９９２、及びその組合せからなる群から選択される。特定の実施形態においては、組合せ治療は、ｃＭＥＴ阻害剤（複数可）であるフォレチニブ及び／又はＰＨＡ−６６５７５２並びにＨＥＲ１阻害剤であるラパチニブを含む。
【００７８】
[0096]他の実施形態においては、本発明の方法は、１種又は複数のさらなる抗癌剤を対象に投与するステップをさらに含む。特定の実施形態においては、抗癌剤は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体若しくはチロシンキナーゼ阻害剤などの抗シグナリング剤（すなわち、細胞増殖抑制剤）；抗増殖剤；化学療法剤（すなわち、細胞傷害剤）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌細胞などの異常細胞の制御されない増殖を減少させるか、若しくは無効化する能力を有する任意の他の化合物などの、癌細胞中の活性化されているシグナル伝達経路構成要素の機能を阻害する薬剤を含む。好ましい実施形態においては、１種又は複数のさらなる抗癌剤は、ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、ＨＥＲ３阻害剤、ＨＥＲ１／２阻害剤、ＨＥＲ１／２／４阻害剤、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及びその組合せからなる群から選択される。
【００７９】
[0097]本発明における使用にとって好適な抗シグナリング剤の例としては、限定されるものではないが、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、ゲムツズマブ（マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（商標））、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））、及びトシツモマブ（ベキサール（ＢＥＸＸＡＲ）（登録商標））などのモノクローナル抗体；ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、スニチニブ（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、メシル酸イマチニブ（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクチマ（ＺＡＣＴＩＭＡ）（商標）；ＺＤ６４７４）、ペリチニブ（ＥＫＢ−５６９）、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、ＨＫＩ−２７２、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ−２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７などのチロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００８０】
[0098]抗増殖剤としては、シロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＢＥＺ−２３５、及びＸＬ７６５などのｍＴＯＲ阻害剤；１Ｌ６−ヒドロキシメチル−ｃｈｉｒｏ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカルボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセテート、１，３−ジヒドロ−１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２複合体）、ＡＰＩ−２、癌原遺伝子ＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５マーのペプチド（Ｈｉｒｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９：５３４０７〜５３４１８（２００４））、ＫＰ３７２−１、並びにＫｏｚｉｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５：１１４４〜１１４５（２００３）及びＫａｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、４：４６３〜４７６（２００３）に記載の化合物などのＡＫＴ阻害剤；ＰＸ−８６６、ウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、クエン酸テトロドトキシン、マレイン酸チオペラミド、ＧＤＣ−０９４１（９５７０５４−３０−７）、ＩＣ８７１１４、ＰＩ−１０３、ＰＩＫ９３、ＢＥＺ−２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、ＴＧＸ−１１５、ＺＳＴＫ４７４、（−）−デグエリン、ＮＵ７０２６、ミリセチン、タンズチニブ、ＧＤＣ−０９４１ビスメシレート、ＧＳＫ６９０６９３、ＫＵ−５５９３３、ＭＫ−２２０６、ＯＳＵ−０３０１２、ペリフォシン、トリシリビン、ＸＬ−１４７、ＰＩＫ７５、ＴＧＸ−２２１、ＮＵ７４４１、ＰＩ８２８、ＸＬ−７６５、及びＷＨＩ−Ｐ１５４などのＰＩ３Ｋ阻害剤；ＰＤ９８０５９、ＡＲＲＹ−１６２、ＲＤＥＡ１１９、Ｕ０１２６、ＧＤＣ−０９７３、ＰＤ１８４１６１、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ−０３２５９０１、及びＡＲＲＹ−１４２８８６などのＭＥＫ阻害剤；ＢＭＳ−５３６９２４などのＩＧＦ−１Ｒ阻害剤；並びにその組合せが挙げられる。
【００８１】
[0099]ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤の非限定例としては、ＰＦ−００２９９８０４、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ−５９９６２６）、ＢＭＳ−６９０１５４、ＰＦ−０２３４１０６６、ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＣＩ−１０３３、ＢＩＢＷ−２９９２、及びその組合せが挙げられる。
【００８２】
[0100]化学療法剤の非限定例としては、白金に基づく薬剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレアなど）、代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンシタビン（ゲムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標））、ペメトレキセド（アリムタ（ＡＬＩＭＴＡ）（登録商標））、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標））など）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、その医薬として許容される塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体、並びにその組合せが挙げられる。
【００８３】
[0101]ホルモン療法剤の例としては、限定されるものではないが、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））、レトロゾール（フェマラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））、ボロゾール、エキセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、ホルメスタン（レンタロン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ）（登録商標））など）、選択的エストロゲン受容体調節因子（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラゾフォキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンなど）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、及びゴセレリンなどのゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、その医薬として許容される塩、その立体異性体、その誘導体、その類似体、並びにその組合せが挙げられる。
【００８４】
[0102]本発明において有用な癌ワクチンの非限定例としては、Ａｃｔｉｖｅ  ＢｉｏｔｅｃｈからのＡＮＹＡＲＡ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ＢｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＤＣＶａｘ−ＬＢ、ＩＤＭ  ＰｈａｒｍａからのＥＰ−２１０１、ＰｈａｒｍｅｘａからのＧＶ１００１、Ｉｄｅｒａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＩＯ−２０５５、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからのＩＮＧＮ２２５及びＢｉｏｍｉｒａ／Ｍｅｒｃｋからのスチムバックス（Ｓｔｉｍｕｖａｘ）が挙げられる。
【００８５】
[0103]放射性治療剤の例としては、限定されるものではないが、場合によって腫瘍抗原に対する抗体にコンジュゲートされた４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、及び２１２Ｂｉなどの放射性核種が挙げられる。
【００８６】
[0104]特定の実施形態においては、１種又は複数のさらなる抗癌剤としては、ＨＥＲ１／２のためのラパチニブ、ＨＥＲ１／２／４のためのゲフィチニブ、ＨＥＲ１／２のためのＢＩＢＷ−２９９２、ＩＧＦ−１ＲのためのＢＭＳ−５３６９２４、ＭＥＫのためのＰＤ−３２５９０１、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲのためのＢＥＺ−２３５、並びにその組合せが挙げられる。
【００８７】
[0105]特定の実施形態においては、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３（並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）などの分析物の存在又は活性化のレベルは、対象から得られた癌細胞中で決定される。いくつかの例においては、癌細胞は、一次腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、腹水腫瘍細胞（ＡＴＣ）、及びその組合せからなる群から選択される。
【００８８】
[0106]特定の実施形態においては、前記方法は、対象から得られた癌細胞中のｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３（並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）などの分析物の存在又は活性化のレベルを決定した後、組合せ治療を投与して、例えば、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１がステージＩ又はＩＩの胃癌において同時活性化されているかどうかを決定するステップをさらに含む。特定の実施形態においては、そのような分析物（例えば、少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１、場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３）の存在又は活性化のレベルは、ＣＥＥＲ（商標）を用いて決定される。
【００８９】
[0107]特定の実施形態においては、前記方法は、対象から得られた癌細胞中のｃＭＥＴ及びＨＥＲ１並びに場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３（並びに他のシグナル伝達バイオマーカー）などの分析物の存在又は発現のレベルを決定した後、組合せ治療を投与して、例えば、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１がステージＩ又はＩＩの胃癌において同時発現されるかどうかを決定するステップをさらに含む。特定の実施形態においては、そのような分析物（例えば、少なくともｃＭＥＴ及びＨＥＲ１、場合によりＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３）の存在又は発現のレベルは、ＣＥＥＲ（商標）を用いて決定される。他の特定の実施形態においては、分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、それぞれの分析物について作製された標準曲線に対して較正される。
【００９０】
[0108]いくつかの実施形態においては、対象の特定の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される分析物のシグナル強度に対応する相対蛍光単位（ＲＦＵ）値として表される。他の実施形態においては、対象の特定の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される分析物の増加するシグナル強度に対応する「−」、「±」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」又は「＋＋＋＋」として表される。いくつかの例においては、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の発現及び／又は活性化の検出不可能な、又は最小限に検出可能なレベルを、「−」又は「±」として表すことができる。他の例においては、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の低レベルの発現及び／又は活性化を、「＋」として表すことができる。さらに他の例においては、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の中程度のレベルの発現及び／又は活性化を、「＋＋」として表すことができる。さらなる例においては、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の高レベルの発現及び／又は活性化を、「＋＋＋」として表すことができる。他の例においては、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定される対象の特定の分析物の非常の高レベルの発現及び／又は活性化を、「＋＋＋＋」として表すことができる。
【００９１】
[0109]他の実施形態においては、対象の特定の分析物の発現レベル及び／又は活性化レベルは、分析物について作製された標準曲線に対して、例えば、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイを用いて決定されるＲＦＵ値を較正又は正規化することにより定量される。特定の例においては、計算された単位（ＣＵ）の値を、標準曲線に基づいて算出することができる。他の特定の例においては、ＣＵ値を、対象の特定の分析物のシグナル強度についての上記の説明に従って、「−」、「±」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」、又は「＋＋＋＋」として表すことができる。米国特許出願第１３／３６５，６３８号（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例３は、癌細胞などの細胞中でのシグナル伝達経路タンパク質の定量のためのデータ分析の非限定例を提供する。
【００９２】
[0110]特定の実施形態においては、対象の特定の分析物のＣＵ値を算出し、カットオフ値と比較して、細胞又は試料がその分析物について陽性であるか、又は陰性であるかを決定することができる。特定の例においては、ＣＵ値として表される場合、対象の分析物のカットオフ値は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、１０００００、５０００００以上のＣＵであってよい。特定の実施形態においては、１ＣＵは、約１〜２×１０６のＲＴＫ及び／又は約１〜２×１０５の活性化（例えば、リン酸化）ＲＴＫの発現に相当する（以下の実施例３を参照されたい）。
【００９３】
[0111]特定の実施形態においては、カットオフ値と等しいか、又はそれより大きい対象の分析物のＣＵ値は、細胞又は試料（例えば、細胞抽出物）がその分析物について陽性である、例えば、分析物が細胞又は試料中で過剰発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）されることを示唆する。非限定例として、約５００ＣＵのカットオフ値を用いて、ｐ９５ＨＥＲ２陽性性についてスコア化することができる。別の非限定例として、約６又は７のカットオフ値（例えば、６．７ＣＵ）を用いて、リン酸化されたＨＥＲ１（ｐ−ＨＥＲ１）の存在についてスコア化することができる。さらに別の非限定例として、約４１又は４２のカットオフ値（例えば、４１．６ＣＵ）を用いて、リン酸化されたＨＥＲ２（ｐ−ＨＥＲ２）の存在についてスコア化することができる。別の非限定例として、約１１２４又は１１２５のカットオフ値（例えば、１１２４．３ＣＵ）を用いて、リン酸化されたＨＥＲ３（ｐ−ＨＥＲ３）の存在についてスコア化することができる。別の非限定例として、約６又は７のカットオフ値（例えば、６．１ＣＵ）を用いて、リン酸化されたｃＭＥＴ（ｐ−ｃＭＥＴ）の存在についてスコア化することができる。さらに別の非限定例として、約６９又は７０のカットオフ値（例えば、６９．２ＣＵ）を用いて、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ１Ｒ）の存在についてスコア化することができる。別の非限定例として、約１７５又は１７６のＣＵのカットオフ値（例えば、１７５．３ＣＵ）を用いて、リン酸化されたＰＩ３Ｋ（ｐ−ＰＩ３Ｋ）の存在についてスコア化することができる。図１５−１〜図１５−２０（表２）は、特定の試料がｐ９５ＨＥＲ２発現及び／又はＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ及び／又はＰＩ３Ｋリン酸化について陽性であるかどうかを決定するための本明細書に記載の例示的カットオフ値の使用を示す。
【００９４】
[0112]特定の実施形態においては、カットオフ値は、分析される特定量の試料と関連する、例えば、特定のカットオフ値を、ＣＥＥＲ（商標）などの近接アッセイにより分析される試料の量（例えば、ＣＥＥＲ（商標）により分析される少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００μｇ以上の組織）に基づいて決定することができる。非限定例として、約５００ＣＵのカットオフ値を用いて、分析される組織の特定量（例えば、２０μｇ）あたりのｐ９５ＨＥＲ２の陽性性についてスコア化することができる（以下の実施例３を参照されたい）。
【００９５】
[0113]ｉｎ  ｓｉｔｕでの活性化状態を保存するために、シグナル伝達タンパク質は、典型的には、細胞が、単離された直後に、好ましくは９６、７２、４８、２４、６又は１ｈｒ以内に、より好ましくは、３０、１５、又は５分以内に抽出される。単離された細胞を、通常は約１〜３０分間、ナノモル濃度からマイクロモル濃度の増殖因子と共にインキュベートして、シグナル伝達因子活性化を復活させるか、又は刺激することもできる（例えば、Ｉｒｉｓｈら、Ｃｅｌｌ、１１８：２１７〜２２８（２００４）を参照されたい）。刺激増殖因子としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ＴＧＦ−α、ＰＩＧＦ、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、ＮＲＧ１、ＰＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、サイトカインなどが挙げられる。個々の患者のための抗癌療法の可能性を評価するために、単離された細胞を、増殖因子刺激の前、その間、及び／又は後に変化する用量の１種又は複数の抗癌剤と共にインキュベートすることができる。増殖因子刺激を、数分又は数時間行うことができる（例えば、約１〜５分から約１〜６時間）。単離、抗癌剤による処置、及び／又は増殖因子刺激の後、当技術分野で公知の任意の技術を用いて細胞を溶解して、シグナル伝達タンパク質を抽出する。好ましくは、細胞溶解を、増殖因子刺激後、約１〜３６０分間、より好ましくは、２つの異なる時間間隔：（１）増殖因子刺激後約１〜５分；及び（２）増殖因子刺激後約３０〜１８０分で開始する。或いは、溶解物を使用まで−８０℃で保存することができる。
【００９６】
[0114]特定の実施形態においては、本発明は、癌細胞中での１種又は複数（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５以上）のさらなる分析物の発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性化レベル（例えば、リン酸化若しくは複合体形成のレベル）を決定するステップをさらに含む。
【００９７】
[0115]癌細胞からの細胞抽出物などの試料中で調べることができるシグナル伝達分子などのさらなる分析物の非限定例としては、限定されるものではないが、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナリングカスケード構成要素、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、及びその組合せが挙げられる。特定の例においては、１種又は複数の以下のさらなる分析物の存在又は発現及び／若しくは活性化のレベルを、癌細胞からの細胞抽出物などの試料中で決定することができる：ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、Ｒａｆ、ＳＲＣ、ＭＥＫ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／又はＰＩＫ３Ｒ１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＰＨ−Ａ、ＥＰＨ−Ｂ、ＥＰＨ−Ｃ、ＥＰＨ−Ｄ、ＦＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＦＬＴ−３、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ｃ−ＦＭＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、ＨＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、ＡＫＴ、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、受容体二量体、ＧＳＫ−３β、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７、並びにその組合せ。
【００９８】
[0116]１つの特定の実施形態においては、本発明は、以下の分析物：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｐ９５ＨＥＲ２、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃＫＩＴ、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ及び／若しくはＰＩＫ３Ｒ１）、ＳＨＣ、並びに／又はＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、２及び／若しくは３）などの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上のマーカーの発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性化レベル（例えば、リン酸化若しくは複合体形成のレベル）を決定するステップを含む。
【００９９】
[0117]特定の好ましい実施形態においては、本発明は、（ｉ）ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、及び／若しくはＳＨＣのうちの少なくとも１つ以上の発現レベルを決定するステップ並びに／又は（ｉｉ）ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、及び／若しくはＳＨＣのうちの少なくとも１つ以上の活性化レベルを決定するステップを含む。いくつかの実施形態においては、活性化レベルは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、及び／又はＳＨＣのリン酸化のレベルに対応する。他の特定の実施形態においては、活性化レベルは、ＰＩ３Ｋ複合体のレベルに対応する。ＰＩ３Ｋ複合体の例としては、限定されるものではないが、二量体化された受容体チロシンキナーゼ対、ＰＩ３Ｋ  ｐ８５サブユニット（例えば、ＰＩＫ３Ｒ１）、及びＰＩ３Ｋ  ｐ１１０サブユニット（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ若しくはＰＩＫ３ＣＢなどのα若しくはβサブユニット）を含む１種又は複数の複合体が挙げられる。例えば、２０１１年９月２日に出願された米国特許仮出願第６１／５３０，６２１号（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１００】
[0118]いくつかの実施形態においては、１種又は複数の分析物の発現レベルを決定するステップは、対応する分析物に特異的な１種又は複数の抗体を用いて、細胞抽出物中の１種又は複数の分析物のそれぞれの総量を検出するステップを含む。特定の実施形態においては、前記抗体は、検出しようとする分析物の活性化状態とは無関係に分析物に結合する、すなわち、前記抗体は分析物の非活性化形態と活性化形態の両方を検出する。
【０１０１】
[0119]総発現レベル及び／又は状態を、様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。特定の実施形態においては、細胞株（例えば、胃癌細胞株）又は腫瘍組織（例えば、胃腫瘍組織）からの細胞抽出物などの試料中のシグナル伝達分子などの対象の１種又は複数の分析物の総発現レベル及び／又は状態は、単一検出アッセイ又は本明細書に記載の近接二重検出アッセイ（例えば、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標）））などの免疫アッセイを用いて検出される。
【０１０２】
[0120]特定の実施形態においては、１種又は複数の分析物の発現レベル（例えば、総レベル）を決定するステップは、
（ｉ）細胞から作製された細胞抽出物を、固相支持体上に拘束された、１種又は複数の希釈系列の捕捉抗体（例えば、１種又は複数の分析物に特異的な捕捉抗体）とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の捕捉された分析物を形成させるステップ（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、分析物と捕捉抗体とを含む捕捉された分析物の複合体に変換するため）と、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１種又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存的抗体（例えば、１種又は複数の分析物に特異的な第１及び第２の活性化状態非依存的抗体）を含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成させるステップ（例えば、捕捉された分析物の複合体を、捕捉された分析物と検出抗体とを含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換するため）であり、第１の活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、第２の活性化状態非依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する前記ステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１０３】
[0121]他の特定の実施形態においては、トランケート型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）である１種又は複数の分析物の発現レベル（例えば、総レベル）を決定するステップは、
（ｉ）細胞から製造された細胞抽出物を、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば、接触させる）ステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去することによって、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）を除去して、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を形成させるステップ（例えば、細胞抽出物を、特異的な完全長受容体又は完全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換するため）と、
（ｉｉｉ）完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１種又は複数の捕捉抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップであり、捕捉抗体が固相支持体上に拘束された、前記ステップ（例えば、完全長受容体が枯渇した細胞抽出物中に存在するトランケート型受容体を、トランケート型受容体と捕捉抗体との複合体に変換するため）と、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケート型受容体を、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）のＩＣＤ結合領域に特異的な１種又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存的抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップ（例えば、捕捉されたトランケート型受容体の複合体を、捕捉されたトランケート型受容体と検出抗体とを含む検出可能な捕捉されたトランケート型受容体の複合体に変換するため）であり、第１の活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、第２の活性化状態非依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する、前記ステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）、増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１０４】
[0122]第１の活性化状態非依存的抗体を、容易化部分で直接標識するか、又は例えば、第１の活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと、容易化部分にコンジュゲートされた相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを介して容易化部分で間接的に標識することができる。同様に、第２の活性化状態非依存的抗体を、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接標識するか、又は例えば、第２の活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの結合を介して、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識することができる。特定の例においては、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、結合対の第２のメンバーはストレプトアビジン又はニュートラアビジンなどのアビジンである。
【０１０５】
[0123]いくつかの実施形態においては、容易化部分は、例えば、グルコースオキシダーゼであってよい。特定の例においては、グルコースオキシダーゼと、第１の活性化状態非依存的抗体とを、例えば、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１６〜１７に記載のスルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００又は７５０ｋＤａ）の分子量を有する。他の実施形態においては、酸化剤は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってよい。さらに他の実施形態においては、シグナル増幅対の第１のメンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってよい。さらなる実施形態においては、シグナル増幅対の第２のメンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってよい。好ましくは、増幅されたシグナルは、活性化チラミドを産生するビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化により生成される（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換するため）。活性化チラミドを、直接検出するか、又は例えば、シグナル検出試薬の添加の際に、間接的に検出することができる。シグナル検出試薬の非限定例としては、ストレプトアビジン標識フルオロフォア並びにストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組合せが挙げられる。
【０１０６】
[0124]特定の例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼと、第２の活性化状態非依存的抗体とを、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｋＤａ）の分子量を有する。
【０１０７】
[0125]トランケート型受容体は、典型的には、完全長受容体の断片であり、完全長受容体と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を共有する。特定の実施形態においては、完全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論によっても束縛されるものではないが、トランケート型受容体は、完全長受容体のＥＣＤのタンパク質溶解的プロセッシングを介して、又は膜貫通ドメインの前、中、若しくは後に位置するメチオニン残基からの選択的翻訳開始により生じ、例えば、短縮されたＥＣＤを有するトランケート型受容体又は膜に結合した、若しくは細胞質ＩＣＤ断片を含むトランケート型受容体を作出することができる。
【０１０８】
[0126]特定の好ましい実施形態においては、トランケート型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、対応する完全長受容体はＨＥＲ２である。しかしながら、当業者であれば、トランケートされたタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法を、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ突然変異体（グリア芽腫、結腸直腸癌などに関与する）、他のトランケート型受容体チロシンキナーゼ、キャスパーゼなどのいくつかの異なるタンパク質に適用することができることを理解するであろう。国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１２は、優れたダイナミックレンジを有する多重高効率近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを用いて細胞中のｐ９５ＨＥＲ２などのトランケート型受容体を検出するための本発明のアッセイ方法の例示的実施形態を提供する。
【０１０９】
[0127]いくつかの実施形態においては、ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ストレプトアビジンはビーズに結合し、ビオチンは抗体に結合する。特定の例においては、抗体は、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）のＥＣＤ結合領域に特異的である。
【０１１０】
[0128]いくつかの実施形態においては、捕捉抗体のそれぞれの希釈系列は、一連の下行する捕捉抗体濃度を含む。特定の例においては、捕捉抗体を少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、又は１０００倍）に連続希釈して、アレイ上にスポットされる設定された数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）の下行する捕捉抗体濃度を含む希釈系列を作製する。好ましくは、それぞれの捕捉抗体希釈を少なくとも２、３、４、５又は６回繰り返してアレイ上にスポットする。
【０１１１】
[0129]他の実施形態においては、固相支持体は、ガラス（例えば、スライドガラス）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は他の任意の好適な基質を含む。好ましい実施形態においては、捕捉抗体は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）から市販されているＦＡＳＴ（登録商標）スライドなどのニトロセルロースポリマーで被覆されたスライドガラス上に拘束される（例えば、共有又は非共有相互作用を介して）。本発明における使用にとって好適な抗体アレイを構築するための例示的方法は、例えば、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１１２】
[0130]さらなる実施形態においては、１種又は複数の分析物の活性化レベルを決定するステップは、検出しようとするそれぞれの分析物のリン酸化形態に特異的な抗体を用いて、細胞抽出物中の１種又は複数の分析物のリン酸化レベルを検出するステップを含む。
【０１１３】
[0131]リン酸化レベル及び／又は状態を、様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。例えば、リン酸化されたタンパク質を、リン酸化形態のタンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫アッセイにより検出することができることが当技術分野で周知である（例えば、Ｌｉｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９３：１３７２〜１３８１（２００５）を参照されたい）。免疫アッセイは、一般的には、免疫ブロッティング（例えば、ウェスタンブロッティング）、ＲＩＡ、及びＥＬＩＳＡを含む。より特異的な型の免疫アッセイとしては、抗原捕捉／抗原競合、抗体捕捉／抗原競合、２抗体サンドイッチ、抗体捕捉／抗体過剰、及び抗体捕捉／抗原過剰が挙げられる。抗体を作製する方法は、本明細書並びにＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡに記載されている。ホスホ特異的抗体を、ｄｅ  ｎｏｖｏで作製するか、又は商業的起源若しくは非商業的起源から取得することができる。リン酸化レベル及び／又は状態を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ又は［γ−３３Ｐ］ＡＴＰの形態の放射性リン酸を用いて細胞を代謝標識することにより決定することもできる。リン酸化タンパク質は、放射性になり、従って、シンチレーション計測、ラジオグラフィーなどにより追跡及び定量可能になる（例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３：７６０５〜７６０８（１９７８）を参照されたい）。例えば、代謝標識されたタンパク質を、細胞から抽出し、ゲル電気泳動により分離し、膜に移し、特定の分析物に特異的なプローブを用いて精査し、オートラジオグラフィーにかけて、３２Ｐ又は３３Ｐを検出することができる。或いは、ゲルをオートラジオグラフィーにかけた後、膜に移し、抗体精査を行うことができる。
【０１１４】
[0132]特定の実施形態においては、細胞株（例えば、胃癌細胞株）又は腫瘍組織（例えば、胃腫瘍組織）からの細胞抽出物などの試料中の対象の１種又は複数の分析物の活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態を、単一検出アッセイ又は本明細書に記載の近接二重検出アッセイ（例えば、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標）））などの免疫アッセイを用いて検出する。
【０１１５】
[0133]特定の実施形態においては、１種又は複数の分析物の活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定するステップは、
（ｉ）細胞から製造された細胞抽出物を、捕捉抗体の希釈系列（例えば、１種又は複数の分析物に特異的な捕捉抗体）とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の捕捉された分析物を形成させるステップであり、捕捉抗体が固相支持体上に拘束される前記ステップ（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、分析物と捕捉抗体とを含む捕捉された分析物の複合体に変換するため）と、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な活性化状態非依存的抗体（例えば、１種又は複数の分析物に特異的な活性化状態非依存的抗体）と、対応する分析物に特異的な活性化状態依存的抗体（例えば、１種又は複数の分析物に特異的な活性化状態依存的抗体）とを含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成させるステップ（例えば、捕捉された分析物の複合体を、捕捉された分析物と検出抗体とを含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換するため）であり、活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、活性化状態依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する、前記ステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）、増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１１６】
[0134]他の特定の実施形態においては、トランケート型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）である１種又は複数の分析物の活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定するステップは、
（ｉ）細胞から製造された細胞抽出物を、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば、接触させる）ステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去することによって、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）を除去して、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を形成させるステップ（例えば、細胞抽出物を、特異的完全長受容体又は完全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換するため）と、
（ｉｉｉ）完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な複数の捕捉抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップであり、捕捉抗体が固相支持体上に拘束される前記ステップ（例えば、完全長受容体を枯渇させた細胞抽出物中に存在するトランケート型受容体を、トランケート型受容体と捕捉抗体との複合体に変換するため）と、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケート型受容体を、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）のＩＣＤ結合領域に特異的な活性化状態非依存的抗体及び活性化状態依存的抗体を含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップ（例えば、捕捉されたトランケート型受容体の複合体を、捕捉されたトランケート型受容体と検出抗体とを含む検出可能な捕捉されたトランケート型受容体の複合体に変換するため）であり、活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、活性化状態依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する、ステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）、増幅されたシグナルを生成するステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１１７】
[0135]活性化状態非依存的抗体を、容易化部分で直接標識するか、又は例えば、活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと、容易化部分にコンジュゲートされた相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって容易化部分で間接的に標識することができる。同様に、活性化状態依存的抗体を、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接標識するか、又は例えば、活性化状態依存的抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの結合によってシグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識することができる。特定の例においては、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、結合対の第２のメンバーはストレプトアビジン若しくはニュートラアビジンなどのアビジンである。
【０１１８】
[0136]いくつかの実施形態においては、容易化部分は、例えば、グルコースオキシダーゼであってよい。特定の例においては、グルコースオキシダーゼと活性化状態非依存的抗体とを、例えば、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１６〜１７に記載のようにスルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０ｋＤａ）の分子量を有する。他の実施形態においては、酸化剤は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってよい。さらに他の実施形態においては、シグナル増幅対の第１のメンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってよい。さらなる実施形態においては、シグナル増幅対の第２のメンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってよい。好ましくは、増幅されたシグナルを、ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化により生成させ、活性化チラミドを産生させる（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換するため）。活性化チラミドを、例えば、シグナル検出試薬の添加時に直接検出するか、又は間接的に検出することができる。シグナル検出試薬の非限定例としては、ストレプトアビジン標識フルオロフォア及びストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組合せが挙げられる。
【０１１９】
[0137]特定の例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼと活性化状態依存的抗体とを、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートすることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｋＤａ）の分子量を有する。
【０１２０】
[0138]トランケート型受容体は、典型的には、完全長受容体の断片であり、完全長受容体と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を共有する。特定の実施形態においては、完全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論によっても束縛されるものではないが、トランケート型受容体は、完全長受容体のＥＣＤのタンパク質分解的プロセッシングを介して、又は膜貫通ドメインの前、中、若しくは後に位置するメチオニン残基からの選択的翻訳開始により生じ、例えば、ＥＣＤが短縮されたトランケート型受容体又は膜に結合した、若しくは細胞質ＩＣＤ断片を含むトランケート型受容体を作出することができる。
【０１２１】
[0139]特定の好ましい実施形態においては、トランケート型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、対応する完全長受容体はＨＥＲ２である。しかしながら、当業者であれば、トランケートされたタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法を、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ突然変異体（グリオブラストーマ、結腸直腸癌などに関与する）、他のトランケート型受容体チロシンキナーゼ、キャスパーゼなどのいくつかの異なるタンパク質に適用することができることを理解するであろう。国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１２は、優れたダイナミックレンジを有する多重高効率近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを用いて細胞中のｐ９５ＨＥＲ２などのトランケート型受容体を検出するための本発明のアッセイ方法の例示的実施形態を提供する。
【０１２２】
[0140]いくつかの実施形態においては、ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ストレプトアビジンはビーズに結合し、ビオチンは抗体に結合する。特定の例においては、抗体は、完全長受容体（例えば、完全長ＨＥＲ２）のＥＣＤ結合領域に特異的である。
【０１２３】
[0141]いくつかの実施形態においては、捕捉抗体のそれぞれの希釈系列は、一連の下行する捕捉抗体濃度を含む。特定の例においては、捕捉抗体を少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、又は１０００倍）に連続希釈して、アレイ上にスポットされる設定された数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）の下行する捕捉抗体濃度を含む希釈系列を作製する。好ましくは、それぞれの捕捉抗体希釈を少なくとも２、３、４、５又は６回繰り返してアレイ上にスポットする。
【０１２４】
[0142]他の実施形態においては、固相支持体は、ガラス（例えば、スライドガラス）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は他の任意の好適な基質を含む。好ましい実施形態においては、捕捉抗体は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）から市販されているＦＡＳＴ（登録商標）スライドなどのニトロセルロースポリマーで被覆されたスライドガラス上に拘束される（例えば、共有又は非共有相互作用を介して）。本発明における使用にとって好適な抗体アレイを構築するための例示的方法は、例えば、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１２５】
ＩＶ．単一検出アッセイ
[0143]いくつかの実施形態においては、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物中の対象の１種又は複数の分析物（例えば、ＨＥＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路の１種又は複数の構成要素などの１種又は複数のシグナル伝達分子）の発現及び／若しくは活性化レベル又は状態を検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重高効率２抗体アッセイである。非限定例として、このアッセイで用いられる２種の抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、及び（２）活性化形態の分析物に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存的抗体）を含んでもよい。活性化状態依存的抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体化状態を検出することができる。或いは、検出抗体は、細胞抽出物中の分析物の総量を検出する活性化状態非依存的抗体を含む。活性化状態非依存的抗体は一般に、活性化形態と非活性化形態の両方の分析物を検出することができる。
【０１２６】
[0144]１つの特定の実施形態においては、対象の分析物の発現又は活性化レベルを検出するための２抗体アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、１種又は複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成させるステップであり、検出抗体が分析物の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存的抗体又は分析物の発現レベル（例えば、総量）を検出するための活性化状態非依存的抗体を含む、前記ステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１２７】
[0145]本明細書に記載の２抗体アッセイは、典型的には、異なるアドレス可能な位置で固相支持体の表面にカップリングされた一定範囲の捕捉抗体濃度で複数の異なる捕捉抗体を含む抗体に基づくアレイである。本発明における使用のための好適な固相支持体の例は、上記の通りである。
【０１２８】
[0146]捕捉抗体と検出抗体は、好ましくは、分析物の結合に関してそれらの間の競合を最小化するように選択される（すなわち、捕捉抗体と検出抗体は両方とも、その対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）。
【０１２９】
[0147]一実施形態においては、検出抗体は結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。結合対のメンバーを、当技術分野で周知の方法を用いて、検出抗体又はシグナル増幅対の第１のメンバーに直接的又は間接的にカップリングさせることができる。特定の例においては、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、デヨージナーゼなど）であり、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）である。これらの例においては、増幅されたシグナルをチラミド試薬のペルオキシダーゼ酸化により生成させて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で活性化チラミドを産生させる。
【０１３０】
[0148]活性化チラミドは、直接検出されるか、又は例えば、ストレプトアビジン標識フルオロフォア若しくはストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと発色試薬との組合せなどのシグナル検出試薬の添加時に検出される。本発明における使用にとって好適なフルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられる。ストレプトアビジン標識を、当技術分野で周知の方法を用いて、フルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的にカップリングさせることができる。本発明における使用にとって好適な発色試薬の非限定例としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナプトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノゲンが挙げられる。
【０１３１】
[0149]本明細書に記載の２抗体アッセイを実施するための例示的プロトコルは、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例３に提供されている。
【０１３２】
[0150]２抗体手法の別の実施形態において、本発明は、トランケート型受容体の発現又は活性化レベルを検出するための方法であって、
（ｉ）細胞抽出物を、完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去することによって、完全長受容体を除去して、完全長受容体を含まない細胞抽出物を形成させるステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を含まない細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１種又は複数の捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして、複数の捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケート型受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップであり、検出抗体がトランケート型受容体の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存的抗体又はトランケート型受容体の発現レベル（例えば、総量）を検出するための活性化状態非依存的抗体を含むステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む、方法を提供する。
【０１３３】
[0151]特定の実施形態においては、トランケート型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。他の特定の実施形態においては、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合し、ビオチンは抗体に結合する（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である場合）。
【０１３４】
[0152]国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の図１４Ａは、対象の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体で被覆されたビーズが、アッセイから完全長受容体を除去するためにトランケート型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）ではなく完全長受容体（例えば、ＨＥＲ２）に結合することを示す。国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの図１４Ｂは、トランケート型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）が、一度、捕捉抗体に結合したら、それを完全長受容体（例えば、ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に特異的である検出抗体によって検出することができることを示す。検出抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接コンジュゲートさせることができる。次いで、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を行って、検出しようとするシグナルを生成させることができる。トランケート型受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）の発現レベル又は活性化状態を調べて、例えば、その総濃度又はそのリン酸化状態、ユビキチン化状態、及び／若しくは複合体化状態を決定することができる。
【０１３５】
[0153]別の実施形態においては、本発明は、（ａ）固相支持体上に拘束された１種又は複数の捕捉抗体の希釈系列と、（ｂ）１種又は複数の検出抗体（例えば、活性化状態非依存的抗体及び／又は活性化状態依存的抗体）とを含む、上記の２抗体アッセイを実施するためのキットを提供する。いくつかの例においては、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１種又は複数のシグナル伝達分子の発現レベル及び／又は活性化状態を検出するためのキットを用いる方法に関する説明書をさらに含んでもよい。キットはまた、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、洗浄バッファーなどの本発明の特異的方法の実施に関して上記された任意の追加試薬を含んでもよい。
【０１３６】
Ｖ．近接二重検出アッセイ
[0154]いくつかの実施形態においては、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物中の対象の１種又は複数の分析物（例えば、ＨＥＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路の１種又は複数の構成要素などの１種又は複数のシグナル伝達分子）の発現及び／又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重高効率近接（すなわち、３抗体）アッセイである。非限定例として、近接アッセイにおいて用いられる３抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、（２）活性化形態の分析物に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存的抗体）、及び（３）分析物の総量を検出する検出抗体（すなわち、活性化状態非依存的抗体）を含んでもよい。活性化状態依存的抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体化状態を検出することができるが、活性化状態非依存的抗体は、分析物の総量（すなわち、活性化形態と非活性化形態の両方）を検出することができる。
【０１３７】
[0155]１つの特定の実施形態においては、対象の分析物の活性化レベル又は状態を検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、１種又は複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、１種又は複数の活性化状態非依存的抗体と、対応する分析物に特異的な１種又は複数の活性化状態依存的抗体とを含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成させるステップであり、活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、活性化状態依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する前記ステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１３８】
[0156]別の特定の実施形態においては、トランケート型受容体である対象の分析物の活性化レベル又は状態を検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去することによって、完全長受容体を除去して、完全長受容体を含まない細胞抽出物を形成させるステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を含まない細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１種又は複数の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケート型受容体を、１種又は複数の活性化状態非依存的抗体と、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１種又は複数の活性化状態依存的抗体とを含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップであり、活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、活性化状態依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する前記ステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１３９】
[0157]特定の実施形態においては、トランケート型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。他の特定の実施形態においては、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合し、ビオチンは抗体に結合する（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である場合）。
【０１４０】
[0158]代替的な実施形態においては、活性化状態依存的抗体を容易化部分で標識し、活性化状態非依存的抗体をシグナル増幅対の第１のメンバーで標識することができる。
【０１４１】
[0159]別の非限定例として、近接アッセイにおいて用いられる３種の抗体は、（１）対象の特定の分析物に特異的な捕捉抗体、（２）分析物の総量を検出する第１の検出抗体（すなわち、第１の活性化状態非依存的抗体）、及び（３）分析物の総量を検出する第２の検出抗体（すなわち、第２の活性化状態非依存的抗体）を含んでもよい。好ましい実施形態においては、第１及び第２の活性化状態非依存的抗体は、分析物上の様々な（例えば、異なる）エピトープを認識する。
【０１４２】
[0160]１つの特定の実施形態においては、対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、１種又は複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成させるステップと、
（ｉｉ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１種又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存的抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成させるステップであり、第１の活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、第２の活性化状態非依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成する前記ステップと、
（ｉｉｉ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１４３】
[0161]別の特定の実施形態においては、トランケート型受容体である対象の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、
（ｉ）細胞抽出物を、完全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートするステップと、
（ｉｉ）細胞抽出物から複数のビーズを除去することによって、完全長受容体を除去して、完全長受容体を含まない細胞抽出物を形成させるステップと、
（ｉｉｉ）完全長受容体を含まない細胞抽出物を、完全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１種又は複数の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップと、
（ｉｖ）複数の捕捉されたトランケート型受容体を、完全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１種又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存的抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を形成させるステップであり、第１の活性化状態非依存的抗体が容易化部分で標識され、第２の活性化状態非依存的抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、容易化部分がシグナル増幅対の第１のメンバーに向かい、それと反応する酸化剤を生成するステップと、
（ｖ）複数の検出可能な捕捉されたトランケート型受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成させるステップと、
（ｖｉ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出するステップと
を含む。
【０１４４】
[0162]特定の実施形態においては、トランケート型受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、完全長受容体はＨＥＲ２である。他の特定の実施形態においては、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ビオチンはビーズに結合し、ビオチンは抗体に結合する（例えば、抗体が完全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である場合）。
【０１４５】
[0163]代替的な実施形態においては、第１の活性化状態非依存的抗体をシグナル増幅対の第１のメンバーで標識することができ、第２の活性化状態非依存的抗体を容易化部分で標識することができる。
【０１４６】
[0164]本明細書に記載の近接アッセイは、典型的には、異なるアドレス可能な位置で固相支持体の表面にカップリングされた一定範囲の捕捉抗体濃度で１種又は複数の異なる捕捉抗体を含む抗体に基づくアレイである。本発明における使用のための好適な固相支持体の例は、上記の通りである。
【０１４７】
[0165]捕捉抗体、活性化状態非依存的抗体、及び活性化状態依存的抗体は、好ましくは、分析物結合に関してそれらの間での競合を最小化するように選択される（すなわち、全ての抗体がその対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）。
【０１４８】
[0166]いくつかの実施形態においては、１種若しくは複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体、或いは１種若しくは複数の分析物の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存的抗体は、検出可能な部分をさらに含む。そのような例においては、検出可能な部分の量は、細胞抽出物中の１種又は複数の分析物の量と相関する。検出可能な部分の例としては、限定されるものではないが、蛍光標識、化学反応標識、酵素標識、放射性標識などが挙げられる。好ましくは、検出可能な部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられる。検出可能な部分を、当技術分野で周知の方法を用いて、活性化状態非依存的抗体に直接的又は間接的にカップリングさせることができる。
【０１４９】
[0167]特定の例においては、１種若しくは複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体、或いは１種若しくは複数の分析物の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存的抗体は、容易化部分で直接標識される。容易化部分を、当技術分野で周知の方法を用いて活性化状態非依存的抗体にカップリングさせることができる。本発明における使用のための好適な容易化部分は、容易化部分に近接する（すなわち、空間的に近いか、又は接近する）別の分子に向かい（すなわち、指向する）、それと反応する（すなわち、それに結合する、それにより結合される、又はそれと複合体を形成する）酸化剤を生成することができる任意の分子を含む。容易化部分の例としては、限定されるものではないが、グルコースオキシダーゼなどの酵素又は電子受容体として酸素分子（Ｏ２）を含む酸化／還元反応を触媒する任意の他の酵素、及びメチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアレート染料、フタロシアニンなどの光増感剤が挙げられる。酸化剤の非限定例としては、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応において酸素原子を移動させるか、又は電子を獲得する任意の他の化合物が挙げられる。好ましくは、好適な基質（例えば、グルコース、光など）の存在下で、容易化部分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）は、２つの部分が互いに近接している場合、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基により保護されたハプテン、酵素阻害剤へのチオエーテル結合により不活化された酵素など）に向かい、それと反応する酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素など）を生成する。
【０１５０】
[0168]他の特定の例においては、１種若しくは複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存的抗体、或いは１種若しくは複数の分析物の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存的抗体は、活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカーと、容易化部分にコンジュゲートされた相補的オリゴヌクレオチドリンカーとのハイブリダイゼーションにより容易化部分で間接的に標識される。オリゴヌクレオチドリンカーを、当技術分野で周知の方法を用いて、容易化部分又は活性化状態非依存的抗体にカップリングさせることができる。いくつかの実施形態においては、容易化部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカーに対して１００％の相補性を有する。他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションの際に、少なくとも１、２、３、４、５、６つ以上の不一致領域を含む。当業者であれば、異なる分析物に特異的な活性化状態非依存的抗体を同じオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーのいずれかにコンジュゲートすることができることを理解するであろう。
【０１５１】
[0169]容易化部分又は活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカーの長さは変化してもよい。一般に、リンカー配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチド長であってよい。典型的には、無作為核酸配列がカップリングのために生成される。非限定例としては、オリゴヌクレオチドリンカーのライブラリーを、３つの異なる連続ドメイン：スペーサードメイン、シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ドメイン、及びコンジュゲーションドメインを有するように設計することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドリンカーは、それらがコンジュゲートされる容易化部分又は活性化状態非依存的抗体の機能を破壊することなく効率的なカップリングのために設計される。
【０１５２】
[0170]オリゴヌクレオチドリンカー配列を、様々なアッセイ条件下で任意の二次構造形成を防止又は最小化するように設計することができる。典型的には、アッセイ手順全体において沈降を可能にするリンカー内のそれぞれのセグメントについて、融点を注意深くモニターする。一般的には、リンカー配列のセグメントの融点の範囲は、１〜１０℃である。規定のイオン濃度下での融点、二次構造、及びヘアピン構造を決定するためのコンピュータアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ６．０）を用いて、それぞれのリンカー内の３つの異なるドメインのそれぞれを分析することができる。組み合わせた配列全体を、その構造的特徴及び他のコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカー配列との適合性について、例えば、それらが相補的オリゴヌクレオチドリンカーにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするかどうかを分析することもできる。
【０１５３】
[0171]オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域は、オリゴヌクレオチド架橋部位からのコンジュゲーションドメインの十分な分離を提供する。コンジュゲーションドメインは、相補的オリゴヌクレオチドリンカー配列で標識された分子を、核酸ハイブリダイゼーションによりコンジュゲーションドメインに連結するように機能する。核酸媒介性ハイブリダイゼーションを、抗体−分析物（すなわち、抗原）複合体形成の前又は後のいずれかに実施し、より可撓性のアッセイ形式を提供することができる。多くの直接的抗体コンジュゲーション法と違って、比較的小さいオリゴヌクレオチドの抗体又は他の分子への連結は、その標的分析物に対する抗体の特異的親和性又はコンジュゲートされた分子の機能に対して最小限の影響を有する。
【０１５４】
[0172]いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドリンカーのシグネチャー配列ドメインを、複合体多重化タンパク質アッセイにおいて用いることができる。多重抗体を、異なるシグネチャー配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーとコンジュゲートさせることができる。多重免疫アッセイにおいて、好適なプローブで標識されたレポーターオリゴヌクレオチド配列を用いて、多重アッセイ形式で抗体とその抗原との交叉反応性を検出することができる。
【０１５５】
[0173]オリゴヌクレオチドリンカーを、いくつかの異なる方法を用いて抗体又は他の分子にコンジュゲートすることができる。例えば、５’又は３’末端のいずれかにチオール基を有するオリゴヌクレオチドリンカーを合成することができる。チオール基を、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）を用いて脱保護し、得られたリンカーを、脱塩スピンカラムを用いることにより精製することができる。得られた脱保護されたオリゴヌクレオチドリンカーを、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋リンカーを用いて抗体又は他の種類のタンパク質の第一級アミンにコンジュゲートすることができる。或いは、オリゴヌクレオチド上に５’リン酸基を水溶性カルボジイミドＥＤＣで処理してリン酸エステルを形成させた後、アミン含有分子にカップリングすることができる。特定の例においては、３’リボース残基上のジオールをアルデヒド基に酸化した後、還元的アミノ化を用いて抗体又は他の種類のタンパク質のアミン基にコンジュゲートすることができる。他の特定の例においては、３’又は５’末端のいずれかにビオチン改変を有するオリゴヌクレオチドリンカーを合成し、ストレプトアビジン標識された分子にコンジュゲートすることができる。
【０１５６】
[0174]Ｕｓｍａｎら、Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９：７８４５（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：５４３３（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３：２６７７〜２６８４（１９９５）；及びＷｉｎｃｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、７４：５９（１９９７）に記載のものなどの、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドリンカーを合成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホラミダイトなどの、一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。オリゴヌクレオチド合成のための好適な試薬、核酸脱保護のための方法、及び核酸精製のための方法は、当業者には公知である。
【０１５７】
[0175]特定の例においては、１種若しくは複数の分析物の活性化レベルを検出するための活性化状態依存的抗体、或いは１種若しくは複数の分析物の発現レベルを検出するための第２の活性化状態非依存的抗体を、シグナル増幅対の第１のメンバーで直接標識する。シグナル増幅対メンバーを、当技術分野で周知の方法を用いて、活性化状態依存的抗体にカップリングさせて活性化レベルを検出するか、又は第２の活性化状態非依存的抗体にカップリングさせて発現レベルを検出することができる。他の特定の例においては、活性化状態依存的抗体又は第２の活性化状態非依存的抗体を、活性化状態依存的抗体又は第２の活性化状態非依存的抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの結合により、シグナル増幅対の第１のメンバーで間接的に標識する。結合対メンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を、当技術分野で周知の方法を用いて、シグナル増幅対メンバー又は活性化状態依存的抗体若しくは第２の活性化状態非依存的抗体にカップリングさせることができる。シグナル増幅対メンバーの例としては、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、デヨージナーゼなどのペルオキシダーゼが挙げられる。シグナル増幅対メンバーの他の例としては、保護基によって保護されたハプテン及び酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活化された酵素が挙げられる。
【０１５８】
[0176]近接チャネリングの一例においては、容易化部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯをグルコースなどの基質と接触させた場合、それは酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））を生成する。ＨＲＰがＧＯに近接するチャネリング内にある場合、ＧＯにより生成されたＨ２Ｏ２はＨＲＰに向かい、それと複合体化して、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成し、それはシグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ルミノール若しくはイソルミノールなどの化学発光基質又はチラミド（例えば、ビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、若しくは４−ヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光性基質）の存在下で、増幅されたシグナルを生成する。近接アッセイにおいてＧＯ及びＨＲＰを使用する方法は、例えば、Ｌａｎｇｒｙら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．ＵＣＲＬ−ＩＤ−１３６７９７（１９９９）に記載されている。ビオチン−チラミドをシグナル増幅対の第２のメンバーとして用いる場合、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体はチラミドを酸化して、求核性残基の近くで共有結合する反応性チラミドラジカルを生成する。活性化チラミドは、直接検出されるか、又は例えば、ストレプトアビジン標識フルオロフォア若しくはストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと発色試薬との組合せなどのシグナル検出試薬の添加時に検出される。本発明における使用にとって好適なフルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられる。ストレプトアビジン標識を、当技術分野で周知の方法を用いて、フルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的にカップリングさせることができる。本発明における使用にとって好適な発色試薬の非限定例としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナプトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノゲンが挙げられる。
【０１５９】
[0177]近接チャネリングの別の例においては、容易化部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは特定の結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）へのハプテンの結合を防止する保護基で保護された複数のハプテンで標識された大分子である。例えば、シグナル増幅対メンバーは、保護されたビオチンで標識されたデキストラン分子、クマリン、及び／又はフルオレセイン分子であってよい。好適な保護基としては、限定されるものではないが、フェノキシ−、アナリノ−、オレフィン−、チオエーテル−、及びセレノエーテル−保護基が挙げられる。本発明の近接アッセイにおける使用にとって好適なさらなる光増感剤及び保護されたハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号に記載されている。光増感剤が光で励起された場合、それは酸化剤（すなわち、一重項酸素）を生成する。ハプテン分子が光増感剤の近くのチャネリング内にある場合、光増感剤により生成された一重項酸素はハプテンの保護基上のチオエーテルに向かい、それと反応して、カルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を得て、ハプテンから保護基を遊離する。次いで、未保護のハプテンは、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを生成することができる特異的結合パートナー）に特異的に結合することができる。例えば、ハプテンがビオチンである場合、特異的結合パートナーは、酵素標識されたストレプトアビジンであってよい。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどが挙げられる。洗浄して未結合の試薬を除去した後、酵素の検出可能な（例えば、蛍光、化学発光、発色など）基質を添加することにより検出可能なシグナルを生成させ、当技術分野で公知の好適な方法及び装置を用いて検出することができる。或いは、チラミドシグナル増幅を用いて検出可能なシグナルを増幅し、活性化チラミドを直接検出するか、又は上記のシグナル検出試薬の添加時に検出することができる。
【０１６０】
[0178]近接チャネリングのさらに別の例においては、容易化部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−阻害剤複合体である。酵素と阻害剤（例えば、ホスホン酸標識デキストラン）を、切断可能なリンカー（例えば、チオエーテル）により一緒に連結する。光増感剤が光で励起された場合、それは酸化剤（すなわち、一重項酸素）を生成する。酵素阻害剤複合体が光増感剤に近接するチャネリング内にある場合、光増感剤により生成された一重項酸素は切断可能なリンカーに向かい、それと反応して、酵素から阻害剤を遊離させ、それによって酵素を活性化する。酵素基質を添加して検出可能なシグナルを生成させるか、或いは増幅試薬を添加して増幅されたシグナルを生成させる。
【０１６１】
[0179]近接チャネリングのさらなる例においては、容易化部分はＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは上記の保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体であり、保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２の添加は、保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体に向かい、ｐ−アルコキシフェノール保護基と反応して、露出したハプテン又は反応性酵素をもたらす反応性フェニレンジイミンを生成する。増幅されたシグナルが生成され、上記のように検出される（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号及び第５，４４５，９４４号を参照されたい）。
【０１６２】
[0180]本明細書に記載の近接アッセイを実施するための例示的プロトコルは、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例４に提供されている。
【０１６３】
[0181]別の実施形態においては、本発明は、（ａ）固相支持体上に拘束された１種又は複数の捕捉抗体の希釈系列と、（ｂ）１種又は複数の検出抗体（例えば、活性化状態非依存的抗体と活性化レベルを検出するための活性化状態依存的抗体との組合せ並びに／又は発現レベルを検出するための第１及び第２の活性化状態非依存的抗体の組合せ）とを含む、上記の近接アッセイを実施するためのキットを提供する。いくつかの例においては、キットは、腫瘍細胞などの細胞の１種又は複数のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を検出するためのキットを用いる方法に関する説明書をさらに含んでもよい。キットはまた、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、容易化部分のための基質、洗浄バッファーなどの本発明の特定の方法の実施に関して上記された任意の追加試薬を含有してもよい。
【０１６４】
ＶＩ．抗体の製造
[0182]本発明の免疫アッセイに従って腫瘍細胞中のシグナル伝達分子の発現及び活性化のレベルを分析するためのまだ市販されていない抗体の生成及び選択を、いくつかの方法で達成することができる。例えば、１つの方法は、当技術分野で公知のタンパク質発現及び精製方法を用いて、対象のポリペプチド（すなわち、抗原）を発現及び／又は精製することであるが、別の方法は当技術分野で公知の固相ペプチド合成法を用いて対象のポリペプチドを合成することである。例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．Ｄｅｕｔｃｈｅｒ（編）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．１８２（１９９０）；Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇｒｅｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（編）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．２８９（１９９７）；Ｋｉｓｏら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３８：１１９２〜９９（１９９０）；Ｍｏｓｔａｆａｖｉら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、１：２５５〜６０、（１９９５）；及びＦｕｊｉｗａｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４４：１３２６〜３１（１９９６）を参照されたい。次いで、精製又は合成されたポリペプチドを、例えば、マウス又はウサギに注入して、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成させることができる。当業者であれば、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載のような、抗体の製造のための多くの手順が利用可能であることを認識するであろう。また、当業者であれば、抗体を模倣する（例えば、抗体の機能的結合領域を保持する）結合断片又はＦａｂ断片を、様々な手順により遺伝子情報から調製することもできることを理解するであろう。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５）；及びＨｕｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：３９１４〜３９２０（１９９２）を参照されたい。
【０１６５】
[0183]当業者であれば、抗体又は結合断片を製造し、対象の様々なポリペプチドの親和性及び特異性についてスクリーニング及び選択する際に多くの手法を取ることができるが、これらの手法は本発明の範囲を変化させないことを認識するであろう。
【０１６６】
[0184]ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二特異的抗体、その断片、及び抗体を精製する方法のより詳細な説明は、国際公開第２０１０／１３２７２３号パンフレット（その開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１６７】
[0185]当業者であれば、抗体と類似する機能を有する任意の結合分子、例えば、試料中の対象の１種又は複数の分析物に特異的である結合分子又は結合パートナーを、本発明の方法において用いることができることも理解するであろう。好適な抗体様分子の例としては、限定されるものではないが、ドメイン抗体、ユニボディ、ナノボディ、サメ抗原反応タンパク質、アビマー、アドネクチン、アンチカーム（ａｎｔｉｃａｌｍ）、親和性リガンド、フィロマー、アプタマー、アフィボディ、トリネクチンなどが挙げられる。
【０１６８】
ＶＩＩ．投与方法
[0186]本発明の方法によれば、本明細書に記載の抗癌剤は、当技術分野で公知の任意の都合の良い手段により対象に投与される。本発明の方法を用いて、胃腫瘍を有する対象における抗癌剤又は抗癌剤の組合せの治療効果を予測することができる。本発明の方法を用いて、抗癌剤又は抗癌剤の組合せを用いる処置に対する胃腫瘍の応答を予測することもできる。本発明の方法を用いて、胃腫瘍の処置のための好適な抗癌剤又は抗癌剤の組合せを選択又は同定することもできる。本発明の方法を用いて、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１阻害剤の組合せ治療を対象に施すことによりステージＩ又はＩＩの胃癌を有する対象を処置することもできる。当業者であれば、本明細書に記載の１種又は複数の抗癌剤を、単独で、又は従来の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、及び／若しくは手術との組合せ治療手法の一部として投与することができることを理解するであろう。
【０１６９】
[0187]特定の実施形態においては、抗癌剤は、モノクローナル抗体若しくはチロシンキナーゼ阻害剤などの抗シグナリング剤（すなわち、細胞増殖抑制剤）、抗増殖剤、化学療法剤（すなわち、細胞傷害剤）、ホルモン療法剤、放射線療法剤、ワクチン、及び／又は癌細胞などの異常細胞の制御されない増殖を減少させるか、若しくは無効化する能力を有する任意の他の化合物を含む。いくつかの実施形態においては、対象は、少なくとも１種の化学療法剤と組み合わせて１種又は複数の抗シグナリング剤、抗増殖剤、及び／又はホルモン療法剤で処置される。例示的なモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、及びワクチンは、上記の通りである。
【０１７０】
[0188]いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の抗癌剤を、限定されるものではないが、免疫刺激剤（例えば、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、レバミソール、インターロイキン−２、α−インターフェロンなど）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体−カリケアミシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−シュードモナス外毒素コンジュゲートなど）、及び放射線免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、又は１３１Ｉにコンジュゲートされた抗ＣＤ２０モノクローナル抗体など）などの従来の免疫療法剤と同時投与することができる。
【０１７１】
[0189]抗癌剤を、必要に応じて好適な医薬賦形剤と共に投与し、許容される任意の投与様式により実行することができる。かくして、投与は、例えば、経口、頬、舌下、歯肉、口蓋、静脈内、局所、皮下、経皮、経真皮、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、膀胱内、くも膜下、病変内、鼻内、経直腸、経膣、又は吸入によるものであってよい。「同時投与する」とは、抗癌剤が第２の薬剤（例えば、別の抗癌剤、抗癌剤治療に伴う副作用を軽減するのに有用な薬剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤など）の投与と同時に、その直前に、又は直後に投与されることを意味する。
【０１７２】
[0190]治療上有効量の抗癌剤を、反復的に、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回以上投与するか、又はその用量を連続的注入により投与することができる。用量は、例えば、好ましくは正確な用量の簡単な投与にとって好適な単位剤形中の錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、停留浣腸剤、クリーム剤、軟剤膏、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル剤、フォーム剤などの、固体、半固体、凍結乾燥粉末、又は液体剤形の形態を取ってもよい。
【０１７３】
[0191]本明細書で用いられる用語「単位剤形」とは、それぞれの単位が、好適な医薬賦形剤と共に、所望の開始、許容性、及び／又は治療効果をもたらすように計算された所定量の抗癌剤を含有する、ヒト被験者及び他の哺乳動物のための単一用量として好適な物理的に個別の単位（例えば、アンプル）を指す。さらに、より濃縮された剤形を調製し、その後、より希薄な単位剤形を製造することができる。かくして、より濃縮された剤形は、実質的により多い、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上の量の抗癌剤を含有する。
【０１７４】
[0192]そのような剤形を調製するための方法は、当業者には公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０）を参照されたい）。剤形は、典型的には、従来の医薬担体又は賦形剤を含み、他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織浸透促進剤、可溶化剤などをさらに含んでもよい。好適な賦形剤を、当技術分野で周知の方法により特定の剤形及び投与経路に合わせることができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上掲を参照されたい）。
【０１７５】
[0193]好適な賦形剤の例としては、限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、例えば、カーボポール９４１、カーボポール９８０、カーボポール９８１などのポリアクリル酸が挙げられる。剤形は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、メチル−、エチル−及びプロピル−ヒドロキシ−安息香酸（すなわち、パラベン）などの保存剤、無機及び有機酸及び塩基などのｐＨ調整剤、甘味料、並びに香料をさらに含んでもよい。剤形はまた、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン含有複合体を含んでもよい。
【０１７６】
[0194]経口投与のために、治療上有効量は、錠剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、スプレー剤、ロゼンジ剤、散剤、及び持続放出製剤の形態にあってもよい。経口投与のための好適な賦形剤としては、医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０１７７】
[0195]いくつかの実施形態においては、治療上有効量は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態を取り、かくして、剤形は、抗癌剤と共に、以下のいずれか：ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどの希釈剤、スターチ又はその誘導体などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びにスターチ、アカシアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びその誘導体などの結合剤を含んでもよい。抗癌剤を、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体中に配置された坐剤に製剤化することもできる。
【０１７８】
[0196]液体剤形は、抗癌剤及び場合により１種又は複数の医薬として許容されるアジュバントを、例えば、水性塩水（例えば、０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中に溶解又は分散させて、例えば、経口、局所、又は静脈内投与のための溶液又は懸濁液を形成させることにより調製することができる。抗癌剤を停留浣腸剤に製剤化することもできる。
【０１７９】
[0197]局所投与のために、治療上有効量は乳濁液、ローション散剤、ゲル散剤、フォーム剤、クリーム剤、ゼリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏剤、及び経皮貼付剤の形態にあってもよい。吸入による投与のために、抗癌剤を乾燥粉末として、又はネブライザーを介して液体形態で送達することができる。非経口投与のために、治療上有効量は、滅菌注射可能溶液及び滅菌包装粉末の形態にあってもよい。好ましくは、注射可能溶液は約４．５〜約７．５のｐＨで製剤化される。
【０１８０】
[0198]治療上有効量を、凍結乾燥形態で提供することもできる。そのような剤形は、投与の前に再構成させるための、バッファー、例えば、重炭酸バッファーを含んでもよいか、又はバッファーを、例えば、水を用いる再構成のために凍結乾燥剤形中に含有させることができる。凍結乾燥剤形は、好適な血管収縮剤、例えば、エピネフリンをさらに含んでもよい。凍結乾燥剤形を、場合によって再構成された剤形を対象にすぐに投与することができるように、再構成のためのバッファーと組み合わせて包装されたシリンジ中に提供することができる。
【０１８１】
[0199]対象を定期的な間隔でモニターして、特定の治療レジメンの効果を評価することもできる。例えば、特定のシグナル伝達分子の活性化状態は、本明細書に記載の１種又は複数の抗癌剤を用いる処置の治療効果に基づいて変化してもよい。対象をモニターして、応答を評価し、個別化された手法における特定の薬剤又は処置の効果を理解することができる。さらに、特定の抗癌剤又は抗癌剤の組合せに初期に応答する対象は、その薬剤又は薬剤の組合せに対して不応性になり得るが、これはこれらの対象が獲得薬剤耐性を生じたことを示唆している。これらの対象はその現在の治療を継続することができず、代替処置を本発明の方法に従って処方することができる。
【実施例】
【０１８２】
ＶＩＩＩ．実施例
[0200]以下の実施例は特許請求される発明を限定するためではなく、例示するために提供されるものである。
【０１８３】
[0201]２０１０年７月１５日に出願された国際公開第２０１１／００８９９０号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２１８２）及び２０１２年１月１９日に出願された米国特許出願第１３／３５４，２５７号の実施例は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
実施例１．胃癌患者における複数のシグナル経路タンパク質の機能的プロファイリング
要約
[0202]胃癌（ＧＣＡ）患者においては胃切除術が唯一の根治的処置であるが、根治的手術後の４０〜６０％の高い再発率は依然として、不良な全生存期間の原因である。生存期間をさらに改善するためには、補助化学放射線療法後の生存又は再発に関する信頼できる分子予後マーカーを同定することが緊急に必要であり、これは患者に合わせた処置戦略の開発に進展するであろう。従って、本発明者らは、多重化免疫マイクロアレイプラットフォームを用いてシグナル伝達経路タンパク質の機能的プロファイリングのための多重化免疫アッセイプラットフォームを開発した。ここで、本発明者らは、ＧＣＡにおけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、及びＩＧＦ１Ｒの機能的プロファイリングを報告する。
【０１８５】
序論
[0203]転移性胃癌は、予後不良に起因して腫瘍内科医にとって依然として治療的課題である。多くの胃癌事例においては、ＨＥＲ２の増幅及び／又は過剰発現が存在する。胃癌のための新規治療標的の探求において、トラスツズマブはＨＥＲ２（＋）転移ＧＣＡを有する患者において生存利益を示している。しかし、ＨＥＲ２（＋）患者は、一次耐性又は獲得耐性のため、トラスツズマブに反応しないことが多い。本発明者らの研究において、本発明者らは、阻害剤又は薬剤の組合せの合理的選択のための標的化可能な経路タンパク質の普及を調査するためにシグナル伝達経路におけるタンパク質の発現／活性化レベルを分析した。ここで、本発明者らは、ＧＣＡにおいてＨＥＲ２標的化剤を組み込む将来の臨床試験のための基礎作りをするために、ＨＥＲ２、ｐ９５−ＨＥＲ２並びにＨＥＲ２及び他の平行経路に関するトランス活性化能力を有する他の経路タンパク質の発現／活性化プロファイリングを報告する。
【０１８６】
方法
[0204]協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標））：組織溶解物中に存在する標的タンパク質は、ニトロセルロース表面上に印刷された特異的捕捉抗体に結合し、未結合の非標的タンパク質はスライドから除去される。グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）とコンジュゲートされた捕捉された標的タンパク質上の代替的エピトープに対する一方の検出抗体と、ＨＲＰとコンジュゲートされた標的タンパク質又は別の非重複エピトープ上のリン酸化部位に特異的な他方の検出抗体との酵素的相互作用は、シグナル生成／増幅をもたらす（図１を参照されたい）。
【０１８７】
[0205]スライド印刷：それぞれの特異的標的タンパク質のための捕捉抗体を、連続希釈液中で３回印刷する。それぞれのスライドは、それぞれのスライド実行上の試料の正確な定量のための標準曲線生成のための細胞株対照を含む。
【０１８８】
[0206]臨床試料：急速凍結された胃癌組織は、局在化された、組織学的に確認されたＧＣＡを有する患者に由来するものであった（Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）。急速凍結された組織試料を、１００μＬの溶解バッファー中で溶解し、得られた溶解物を−８０℃で保存した後、分析に用いた。
【０１８９】
結果
[0207]このコホート中の患者の７％がＩＨＣにより高レベルのＨＥＲ２を発現した（３１／４４７）が、約１２％の患者がＣＥＥＲ（商標）アッセイにより有意なレベルのＨＥＲ２の発現を示した。トランケート型ＨＥＲ２（又はｐ９５ＨＥＲ２）は、図２に示されるようにＧＣＡ患者の５．６％（２５／４４７）において検出された。変化するレベルのＨＥＲ３発現が、約４０％の患者において認められた。
【０１９０】
[0208]より低いＨＥＲ２発現を示す試料中ではより高レベルのＨＥＲ１が認められた。ＨＥＲ３−Ｐレベルは、ＨＥＲ３−Ｔ及びＰＩ３Ｋ活性化と高い相関度を示した。このコホートにおけるＩＧＦ１Ｒの発現は多くの試料において相対的に低かった。ｐ９５ＨＥＲ２レベルはより高いＨＥＲ２発現を示す試料において突出していたが、ｐ９５ＨＥＲ２活性化の証拠はより広い分布を有していた。ＨＥＲ１の同時活性化はｃＭＥＴ活性化を示す患者について頻繁に観察された（図３を参照されたい）。
【０１９１】
結論
[0209]再発性又は転移性ＧＣＡの処置を、バイオマーカーの疾患特異的機能的プロファイリングに基づいて最適化し、患者に合わせた処置戦略をもたらすことができる。サブＧＣＡにおける組み合わせた標的化ＨＥＲ１及びｃＭＥＴは、同時活性化パターンを示す患者にとって利益となり得る。ＣＥＥＲ（商標）は限られた量の組織についても実施することができるが、治療レジメンの過程での伝達経路タンパク質の変化の発生は、より良好な処置戦略を考案する際に医師を指導し、進化するか、又は組合せ／連続的標的療法の臨床開発を支援することができる。
【０１９２】
実施例２．胃癌細胞株のパネルにおける経路タンパク質の包括的プロファイリング
要約
[0210]癌治療における分子標的療法の到来と共に、標的化剤に関する経路タンパク質のプロファイリングが最重要になっている。しかしながら、標的化レジメンにおける応答を予測する難しさの原因の１つは、腫瘍のシグナル伝達経路におけるタンパク質の異常な変化に関する限られた知識の結果である可能性がある。経路タンパク質の異常な活性化が腫瘍細胞における新生物表現型を引き起こし、標的化された介入が臨床応答を誘導する機構の深いレベルの理解は、医師及び薬剤開発者にとって共通の目標であった。ここで、本発明者らは、経路タンパク質の発現及び／又は活性化（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｔ、ｃＫＩＴ、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＥＲＫ、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ＰＴＥＮ及び他のシグナルタンパク質）と共に包括的突然変異プロファイル及び標的化薬剤処置に応答するそれらの調節を報告する。様々な阻害剤に対するＧＣＡのサブクラスにおける耐性の機構を、標的化薬剤の選択、組合せ、及び／又は配列決定を用いる合理的な治療選択肢を設計するために利用することができる。
【０１９３】
序論
[0211]腫瘍試料の前臨床細胞応答プロファイリングは、新規癌治療剤の開発における基盤となっている。従って、本発明者らは、その遺伝子変化についてよく特徴付けられた３０種のＧＣＡ細胞株におけるシグナル伝達タンパク質を機能的にプロファイルするために協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標））多重化タンパク質マイクロアレイ系を適用した。これらの細胞株における遺伝子特性と機能的経路特性との組合せは、ＧＣＡの多様で異なる下位分類を可能にし、臨床研究及び薬剤開発のためのロードマップを提供することができる。
【０１９４】
方法
[0212]ＣＥＥＲ（商標）：組織溶解物中に存在する標的タンパク質は、ニトロセルロース表面上に印刷された特異的捕捉抗体に結合し、未結合の非標的タンパク質はスライドから除去される。グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）とコンジュゲートされた捕捉された標的タンパク質上の代替的エピトープに対する一方の検出抗体と、ＨＲＰとコンジュゲートされた標的タンパク質又は別の非重複エピトープ上のリン酸化部位に特異的な他方の検出抗体との酵素的相互作用は、シグナル生成／増幅をもたらす（図１を参照されたい）。
【０１９５】
[0213]多剤効果分析：約１×１０４個の細胞を２４ウェルプレート中に塗布し、好適な増殖培地中で増殖させた。ラパチニブ、ｃＭＥＴ阻害剤又は両薬剤（コンボ）を１μＭの濃度で４ｈ添加し、その後の経路プロファイリングのために溶解した。
【０１９６】
結果
[0214]図４Ａは、３０種のＧＣＡ細胞株の包括的発現／活性化プロフィールを例示する。図４Ｂは、ＳＮＵ５細胞株経路プロフィールの例示的免疫アレイ画像を提供する。図４Ｃ〜Ｇは、細胞株ＳＮＵ５（Ｃ）、ＳＮＵ４８４（Ｄ）、ＳＮＵ１（Ｅ）、ＭＫＮ４５（Ｆ）、及びＫＡＴＯＩＩＩ（Ｇ）のベースライン経路プロフィール及び薬剤治療後のそれらの調節の概要を提供する。異なる強度の活性化の程度を強調して区別する。
【０１９７】
結論
[0215]再発性又は転移性ＧＣＡの処置を、バイオマーカーの疾患特異的機能的プロファイリングに基づいて最適化し、患者に合わせた処置戦略をもたらすことができる。さらに、処置の間の伝達経路タンパク質の変化の発生を、好適な薬剤を組み合わせるか、又は配列決定するように医師をより良好に指導する、限られた量の腫瘍試料（例えば、ＦＮＡ、ＣＴＣなど）を必要とするＣＥＥＲ（商標）プラットフォームにより容易に決定することができる。
【０１９８】
実施例３．チロシンリン酸化プロファイリングは、胃癌において同時活性化されている経路を同定する
[0216]本実施例で提示される研究は、胃癌を、この種類の癌において活性である鍵となる増殖因子受容体シグナリング経路のリン酸化プロフィールに基づいて分離することができることを例示する。
【０１９９】
概要
[0217]現在、トラスツズマブは、約２０％の転移性胃癌において有益な唯一の公知の標的療法である。これらの不均一な癌における活性化ＲＴＫの理解の増進は、標的療法剤開発を有意に進歩させることができる；しかしながら、それは、本発明者らが臨床標本におけるリン酸化ネットワークを調べることができないことによって妨げられる。新しい免疫アッセイであるＣＥＥＲ（商標）を用いて、本発明者らは、進行した胃癌においてトランケート型ＨＥＲ２変異体の存在を初めて証明した。本発明者らはまた、再発胃癌の無病生存期間に影響する、同時活性化ＲＴＫの存在も証明した。活性化ＲＴＫの階層的クラスタリングは、胃癌において活性化ＨＥＲ１：ｃ−ＭＥＴ、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３及びＩＧＦ１Ｒ−ＰＩ３Ｋを発現する試料の同時クラスタリングを示す。細胞及び一次腫瘍細胞中でのインビトロでの研究は、示差的に調節されるＲＴＫパターンが治療標的化を導くことができることを証明する。全体として、本発明者らの研究は、胃癌における薬剤開発及び治療モニタリングに関する強い関連を有する。
【０２００】
有意性
[0218]ＨＥＲ２（＋）癌のサブセットを除いて、有効な処置手法を導くための分子マーカーの欠如に起因して、大多数の進行胃癌について全体的に受け入れられる処置コンセンサスは存在しない。本明細書では、新規臨床診断アッセイを用いて、本発明者らは４３４の進行段階の胃癌試料、稀なＣＴＣ及び腹水由来腫瘍細胞において、同時活性化ＲＴＫが異なるサブセットの胃癌を区別することの証拠を提供する。示差的ＲＴＫ活性化パターンは、術後無病生存期間と相関する。胃癌サブタイプのユニークな分子誘導因子本発明者らの理解の改善、新規予後マーカーの同定の補助、処置パラダイム、及び薬剤投与後の治療応答又は疾患進行の長期的モニタリングなどの、臨床組織に直接対する標的化リン酸化分析の影響は有意である。
【０２０１】
序論
[0219]腫瘍学の分野における分子標的療法時代の到来と共に、多くの腫瘍学者は、さもなければ支持療法にあったであろう難治性の転移性癌患者における分子標的化剤に対する予期せぬ劇的な応答を経験してきた。しかしながら、標的療法剤に関する患者の選択基準は、現在不完全である。その標的プロフィールに基づいて選択された患者でさえも、標的化剤に対して応答しないか、又は劇的な初期応答を有した後に耐性を生じることが多い。標的化剤に関する治療的利益の増強を妨害する主な問題は、（１）患者のサブグループにおける、同時に起こる余剰な経路の活性化、（２）経路の混線によって元の標的タンパク質（複数可）をバイパスする別のシグナリング事象の活性化による耐性の発生、（３）癌が抗癌剤処置の過程を通して転移及び進行する時の分子的及び病理学的特徴の変化、（４）処置中又は処置後の再生検の限定された利用可能性、並びに（５）「進化する」疾患に対処するための潜在的な薬剤耐性機構を同定するための標的化剤に関するコンパニオン診断の制限である。
【０２０２】
[0220]ヒト  カイノーム（ｋｉｎｏｍｅ）のチロシンキナーゼ補体の約半分がヒト癌に関与し、癌処置のための標的並びに患者選択のためのバイオマーカーを提供する（Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ及びＨｕｎｔｅｒ、２００１；Ｈｏｃｈｇｒａｆｅら、２０１０）。さらに、以前の研究により、多形成グリア芽細胞腫（Ｓｔｏｍｍｅｌら、２００７）、乳癌（Ｈｏｃｈｇｒａｆｅら、２０１０；Ｌｉｕら、２０１１；Ｘｕら、２０１１）、肺癌（Ｅｎｇｅｌｍａｎ及びＪａｎｎｅ、２００８；Ｅｎｇｅｌｍａｎ及びＳｅｔｔｌｅｍａｎ、２００８）、頭部及び頸部癌（Ｘｕら、２０１１）並びに胃癌（Ｌｉｕら、２０１１）などのいくつかの癌のサブセットにおける受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の同時活性化が示された。本発明者らは、一度、標的タンパク質がマイクロアレイ上に捕捉されたら、２種の検出酵素コンジュゲート化抗体の同時局在化を要するユニークな免疫複合体の形成を利用する近接性に基づく免疫アッセイ、協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標）、図５に示される）を開発した。このアッセイ形式により、本発明者らは単一細胞レベルに対して非常に高感度（約１００ゼプトモルの感度）の様式でＲＴＫ並びに下流の経路タンパク質の発現及び活性化をプロファイルすることができ、従って、これは同時経路活性化（又は活性化能力）を示す余剰の経路の多重化分析にとって好適である。
【０２０３】
[0221]胃癌は、世界の癌による死亡の主因であり、１年あたりの発生件数は１８．９／１００，０００であり、１年あたりの死亡率は１４．７／１００，０００であり（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００５）、韓国においては最も一般的な悪性腫瘍である（Ｂａｅ及びＰａｒｋ、２００２）。転移性胃癌は、予後不良に起因して腫瘍内科医にとって依然として治療的課題である。現在、トラスツズマブが、無作為化第ＩＩＩ相臨床試験において胃癌にとって有効であることが証明されている唯一の活性な標的化剤である（Ｂａｎｇら、２０１０）。胃癌における他の公知の活性化経路タンパク質としては、ヒト表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリー、間葉上皮移行因子又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭＥＴ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、及びインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）が挙げられる。かくして、本発明者らは、多重化ＣＥＥＲ（商標）プラットフォームを用いて、４３４の新鮮な凍結された胃癌組織中での活性化ＲＴＫのレベルを決定し、胃癌患者を潜在的なサブグループ（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２のトランケート型変異体、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、及びＩＧＦ１Ｒ）に分類しようと試みた。その経路タンパク質活性化パターンに基づいて、本発明者らは、腫瘍のサブグループ中に複数のシグナルタンパク質活性化を観察し、本発明者らは、余剰の経路活性化入力が残りの下流のシグナリングを誘導し、かくして、単一のＲＴＫに対して標的化された単剤療法の抗腫瘍効果を制限すると仮定した。本発明者らは、ｃＭＥＴ及びＨＥＲが同時活性化されている胃癌細胞株においてＨＥＲ１／２阻害剤＋ｃＭＥＴ阻害剤の抗腫瘍効果を調査する原理証明実験を行った。最後に、本発明者らは、循環腫瘍細胞及び腹膜液（腹水）から単離された悪性細胞を用いる処置を通したＲＴＫ活性化プロフィールのベースライン及び進行する変化を医師がモニターすることができる潜在的に強力な手段を開発した。総合すれば、本発明者らの研究は、胃癌ヒト組織における同時的ＲＴＫ活性化の証拠を提供し、本発明者らは処置及び進行の間に癌が進化する時のＲＴＫ活性化をモニターするための臨床手段を確立した。
【０２０４】
結果
患者の特徴
[0222]分析に含まれた４３４人の患者の特徴を、表１に提供する。全ての患者はＤ２リンパ節切除と共に胃切除術を受けた。４３４人の患者のうち、２４２人（５５．８％）の患者はＤ２リンパ節切除と共に胃亜全摘術を受けた。ＡＪＣＣ  ２００２ステージング系によれば、８６人の患者が病理学的なステージＩを有し、１１６人がステージＩＩを有し、１２６人がステージＩＩＩを有し、１０６人がステージＩＶを有していた（３５人の患者は転移性Ｍ１を有していた）。分析の時点で、２２６人の患者が死亡しており、２３７人の患者が再発を記録していた。病状については、７０人の患者が印環細胞癌を有していた。５年全生存率は５２．４％であり、５年無病生存率は５０．０％であった。全ての一次胃癌組織を、手術の時点で調達し、将来の分子分析のためにすぐに簡易凍結した。
【表１】
2014517259.tif 000003
【０２０５】
胃癌はＨＥＲ２及びそのトランケート変異体であるｐ９５ＨＥＲ２を発現する
[0223]化学療法と組み合わせた、ＨＥＲ２標的化抗体、トラスツズマブの優れた効果は、胃癌における分子標的療法への道を開いた。しかしながら、免疫組織化学分析及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションから選択されたＨＥＲ２発現胃癌患者の全てがこの処置に応答したわけでなく、より予測的なバイオマーカーの必要性を強調している。本発明者らは、４３４人の患者から得られた胃癌標本におけるＨＥＲ２の活性化状態を含むその状態の綿密な分析を実施した。
【０２０６】
[0224]本発明者らの胃癌試料コホートのＨＥＲ２状態を、２＋のＩＨＣスコアを有するこれらの組織に関する標準的なＩＨＣ  ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ、次いで、ＦＩＳＨ分析により決定した。本発明者らの研究においては、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２（＋））試料は、ＦＩＳＨにより決定されたＨＥＲ２遺伝子増幅に加えて３＋又は２＋のＨＥＲ２−ＩＨＣスコアを示す試料と定義される。ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２（−））試料は、ＨＥＲ２遺伝子増幅を示さない２＋ＨＥＲ２−ＩＨＣスコアを有する標本又は１＋／０ＨＥＲ２−ＩＨＣスコアを示す試料を含む。胃癌に特異的であるこれらの定義に基づいて（Ｈｏｆｍａｎｎら、２００８）、４３４人のうちの５０人の患者（１１．５％）が、本発明者らの患者コホート中で免疫組織化学分析及び／又はＦＩＳＨによりＨＥＲ２（＋）であると確認された（表２）。他の報告（Ｇｒａｂｓｃｈら、２０１０；Ｈｏｆｍａｎｎら、２００８；Ｔａｎｎｅｒら、２００５）と一致して、ＨＥＲ２発現は、びまん型又は混合型胃癌と比較して腸癌において観察されたより多い数のＨＥＲ２（＋）試料（５０のうちの３６（７２％））を含むＬａｕｒｅｎ組織型について変化した。多数の「ＨＥＲ２陰性」試料が、ＨＥＲ２陽性患者集団よりも明確に少ないレベルではあるが、全ＨＥＲ２を依然として発現することに留意することが重要である（図６Ａ）。乳癌に特異的なＩＨＣ指針ＨＥＲ２−ＩＨＣを用いてＨＥＲ２（＋）胃癌試料をＨＥＲ２発現について再分析した場合、７８％（３９／５０）が３＋又は２＋のままであったが、残りの２２％（１１／５０）が１＋とスコア化された（表２）。
【０２０７】
[0225]免疫組織化学分析及びＦＩＳＨ技術は、ＨＥＲ２の活性化状態の読出しを提供せず、低いＨＥＲ２発現を見逃し得るため、本発明者らは次に、この患者試料セットにおいて免疫マイクロアレイに基づくＣＥＥＲ（商標）アッセイ（Ｋｉｍら、２０１１）（図５）を用いて、総及びリン酸化ＨＥＲ２タンパク質の発現レベルを分析した。本発明者らは、ＣＥＥＲ（商標）アッセイにおいて得られたＲＦＵ値を、公知のＨＥＲ２発現及び活性化を有する細胞株対照に基づく標準的な機能的単位である計算された単位（ＣＵ）に変換するためのアルゴリズムを以前に開発した（Ｋｉｍら、２０１１）。予測された通り、図６Ａに示されるように、ＨＥＲ２（−）腫瘍よりも実質的により高いＨＥＲ２発現レベルが、ＩＨＣ／ＦＩＳＨ  ＨＥＲ２（＋）腫瘍においてＣＥＥＲ（商標）により観察された（７７．９ＣＵ対４．３ＣＵの平均値、ｐ値８．１８Ｅ−１０）。さらに、ＣＥＥＲ（商標）は、ＨＥＲ２（＋）腫瘍集団内でＨＥＲ２発現における有意なレベルの不均一性を示し、これはＨＥＲ２細胞分布パターンの焦点的又は「クローン的」性質に起因して胃癌において報告されることが多い形質である（Ｈｏｆｍａｎｎら、２００８）。これはまた、ＨＥＲ２に関するＩＨＣとＦＩＳＨの読出しとの間の中程度に過ぎない一致度をもたらし（ＴｏＧＡ試験、８７．５％）、胃癌のためのＨＥＲ２診断剤を開発する際に複雑性をもたらす。本発明者らの分析では、６４％（３２／５０）のＩＨＣ／ＦＩＳＨ  ＨＥＲ２（＋）癌も、ＣＥＥＲ（商標）によるＨＥＲ２発現を示した。興味深いことに、約２０％のＨＥＲ２（−）癌も、ＣＥＥＲ（商標）によるＨＥＲ２発現について陽性であった。注目すべきことに、本発明者らは、最初に８３％の一致を示した２９３人の乳癌患者においてＩＨＣ及びＣＥＥＲ（商標）を介してＨＥＲ２発現を以前に比較したが（図７）、ＨＥＲ２ウェスタンブロット（ＷＢ）に基づく発現に関してＩＨＣ読出しを調整する際に、比較はＣＥＥＲ（商標）とＷＢ調整されたＩＨＣとの間で９６％の一致を示した（Ｋｉｍら、２０１１）。
【０２０８】
[0226]本発明者らは、胃癌における選択的ＨＥＲ２変異体の存在を探索した。ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌の７０〜８０％におけるトラスツズマブ耐性の重要な機構の１つは、細胞外トラスツズマブ結合ドメインを欠く、トランケート型のＨＥＲ２受容体、ｐ９５ＨＥＲ２の蓄積である（Ｓｃａｌｔｒｉｔｉら、２００７）。本発明者らは、胃癌における総ｐ９５ＨＥＲ２を特異的に分析するための高感度で特異的なＣＥＥＲ（商標）に基づくアッセイを開発した。これは、完全長ＨＥＲ２の免疫磁気枯渇後にトランケート型ＨＥＲ２変異体について富化された腫瘍組織溶解物中で三重抗体媒介性免疫マイクロアッセイプラットフォームを用いることにより達成された（図８）。総ｐ９５ＨＥＲ２アッセイ読出しは、ＢＴ４７４乳癌細胞株に由来する対照細胞溶解物を用いて生成された標準曲線から生成されたシグナルと関連していた。ＣＥＥＲ（商標）に基づくｐ９５ＨＥＲ２アッセイプラットフォームを用いて、胃癌において、完全長ＨＥＲ２に加えて、トランケート型のＨＥＲ２を初めて特異的に検出した。ＣＥＥＲ（商標）により検出される有意な完全長ＨＥＲ２発現を示すＨＥＲ２（＋）群（３１の試料）及びＨＥＲ２（−）群（２７の試料）に由来する腫瘍試料のサブセットにおいて、ｐ９５ＨＥＲ２発現を分析した。ＨＥＲ２（−）群中の１つの試料は、技術的問題のため正確に分析できなかった。本発明者らの胃癌患者コホートにおけるｐ９５ＨＥＲ２の発生率は、ＨＥＲ２（＋）標本においては約７７％（３１のうちの２４）であった。完全長ＨＥＲ２発現と同様、腸型胃癌において、大部分のトランケート型ＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２（＋）中で発現されたｐ９５ＨＥＲ２の７９％）が観察された。ＩＨＣ／ＦＩＳＨによりＨＥＲ２（−）であったが、有意なＣＥＥＲ（商標）に基づくＨＥＲ２発現を示した腫瘍のごく一部（全体の２．６％又は１０／３８４）においてもｐ９５ＨＥＲ２発現が検出された。これらのものは、ｐ９５ＨＥＲ２について分析されたＨＥＲ２（−）試料のサブセットの約３７％（１０／２７）を占めた。しかしながら、ＨＥＲ２（＋）胃癌試料中でのｐ９５ＨＥＲ２の平均発現は、ＨＥＲ２（−）試料中で観察されたものよりも有意に高かった（ＨＥＲ２（＋）中の５０８３．６ＣＵ対ＨＥＲ２（−）中の４３７．０ＣＵ、ｐ値＝１．２７ｅ−０５）。５００ＣＵのカットオフ値を用いて、分析された組織２０μｇあたりのｐ９５ＨＥＲ２陽性性についてスコア化した（図６Ｂに示される）。総合すれば、本発明者らのデータは、完全長及びトランケート型のＨＥＲ２発現の両方の包括的分析が胃癌におけるＨＥＲ２標的化戦略のさらなる開発に価値をもたらすことを示唆している。
【０２０９】
胃癌における経路活性化プロフィールの不均一性：同時活性化シグナリング経路
[0227]胃癌においてＨＥＲ２及びそのトランケートされたアイソフォームの存在を決定したら、本発明者らは、薬剤標的であるいくつかのシグナリング分子の総形態及びリン酸化（活性化）形態の存在を探索した。これらのものは、ＨＥＲキナーゼ軸（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３）、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ並びにＰＩ３ＫのＲＴＫメンバーを含んでいた。多重化ＣＥＥＲ（商標）経路アレイの代表的な画像を図９Ａに示す。本発明者らの研究パネルでは、２０２人の患者（４６．５％）に由来する腫瘍が、本発明者らの研究パネルにおいて試験されたＲＴＫの検出可能な活性化を有していなかった。逆に、経路クラスタリング分析（図９Ｂ）に示されるように、残りの患者に関する経路活性化パターンは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１／２／３、ＨＥＲ１／３／ｃ−ＭＥＴ又はＨＥＲ３／ｃ−ＭＥＴなどの複数のＲＴＫの同時活性化を示すいくつかの胃癌について広く変化したが、その他は単一のタンパク質上でのみリン酸化されていた。全ての分析した試料の腫瘍含量は、その組織学的検査に基づいて少なくとも７０％であった。しかしながら、パンサイトケラチン発現は明確に可変的であり、これは胃癌の上皮含量における不均一性を示唆している。このプロファイリングに基づいて、本発明者らは、そのＲＴＫ活性化シグネチャー及びＨＥＲ２状態に従って４３４の胃癌試料コホートを分類した。
【０２１０】
[0228]胃癌におけるＨＥＲ軸（表３）：本発明者らが分析した全てのＲＴＫのうち、本発明者らは、ＨＥＲ軸の少なくとも１つの受容体メンバーが、本発明者らのデータセット中の胃癌試料の４１％において活性化されていることを見出した。約６６％のＨＥＲ２（＋）癌及び約３８％のＨＥＲ２（−）癌が、ＨＥＲキナーゼ受容体メンバーの活性化を示した。さらに、ＨＥＲキナーゼ受容体が活性化されている試料の約３６％は、ｃ−ＭＥＴ又はＩＧＦ１Ｒ経路の同時活性化を示さなかった。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３はＨＥＲ２（−）癌と比較して、より高い百分率のＨＥＲ２（＋）胃癌患者（５０％及び３６％）においてリン酸化されており、それらはそれぞれ、約２２％及び約２４％の試料において活性化されていた。リン酸化されたＨＥＲ１は、ＨＥＲ２陽性癌に対するそのような選択性を有するとは考えられず、ＨＥＲ２陽性及び陰性胃癌の両方において同等に活性化されている（ＨＥＲ２（＋）においては２６％及びＨＥＲ２（−）においては２５％）。組織学的には、ＨＥＲ２陽性の腸型胃癌の大部分は、活性化ＨＥＲ２（２２／３６又は約６１％）、それに次いでＨＥＲ３（１３／３６又は約３６％）を発現し、腸型胃癌の全体で３６％が活性化ＨＥＲ２経路を発現していた。一般に、ＨＥＲ２活性化は、びまん型癌（１９．１％）と比較して、腸型（３５．７％）及び混合型の癌（３３．３％）に、より集中していた。対照的に、活性化ＨＥＲ１は、多くは腸型（２４．７％）及びびまん型（２５．８％）胃癌において観察された。活性化ＨＥＲ３は、３つの胃癌組織型の全部の間で同等に発現された。
【０２１１】
[0229]ＨＥＲキナーゼ軸のシグナリング機能は活性化受容体二量体化に依存するため、本発明者らは、活性化ＨＥＲメンバーの様々な対を調べた。ＨＥＲ２とＨＥＲ３との同時活性化は、ＨＥＲ２陽性癌において好ましかったが（１３／５０又は２６％）、７／１３のＨＥＲ２：ＨＥＲ３活性化試料がＨＥＲ１同時活性化を示さなかった。他方、ＨＥＲ２陰性胃癌は、任意の特異的なＨＥＲキナーゼ二量体対に対する選択性を実証せず、３つの可能な活性化二量体対（ＨＥＲ１：ＨＥＲ２、ＨＥＲ１：ＨＥＲ３及びＨＥＲ２：ＨＥＲ３）は全部、それぞれ約１５％のＨＥＲ２（−）試料において発現された。ＨＥＲ１／２／３受容体の三重活性化は、１１．５％の胃癌において観察され、ＨＥＲ２（＋）とＨＥＲ２（−）癌の間で類似する分布を示した。
【０２１２】
[0230]本発明者らはまた、試料中のｐ９５ＨＥＲ２発現に関して活性化されているＨＥＲ軸受容体メンバーの状態も調べた。ｐ９５ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（＋）胃癌は、活性化ＨＥＲ１（ｐ９５ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（＋）の５／２４若しくは約２１％で発現される）又は活性化ＨＥＲ３（ｐ９５ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（＋）の９／２４若しくは約３７％で発現される）と比較して、活性化完全長ＨＥＲ２（ｐ９５ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（＋）の１６／２４若しくは約６７％で発現される）に対する親和性を有していた。しかしながら、ｐ９５ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（−）胃癌は、そのような選択性を有さず、ｐ９５ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（−）試料の５０％（５／１０）が３つ全部のＨＥＲキナーゼ軸受容体メンバーの活性化を示した。
【０２１３】
[0231]ｃ−ＭＥＴ活性化胃癌（表４）：ＨＥＲ１と同様、ｃ−ＭＥＴのリン酸化もＨＥＲ２（＋）（２２％）とＨＥＲ２（−）（２５％）胃癌との間で同等に分布していた。さらに、Ｌａｕｒｅｎの組織型に基づく活性化ｃ−ＭＥＴの分布も、腸型（３１．２％）及びびまん型（２４．４％）胃癌において類似していた。混合型胃癌はいずれも、本発明者らの試料セットでは活性化ｃ−ＭＥＴの存在を示さなかった。
【０２１４】
[0232]大部分のｃ−ＭＥＴ活性化胃癌試料（約７１％又は７７／１０８）が、ＨＥＲキナーゼ受容体メンバーの同時活性化を示した。従って、本発明者らは、胃癌においてｃ−ＭＥＴ経路と混線する好ましいＨＥＲ軸受容体をさらに調査した。活性化ｃ−ＭＥＴ及びｐ９５ＨＥＲ２発現は、それぞれ、ＨＥＲ２（＋）及びＨＥＲ２（−）試料を発現するｐ９５ＨＥＲ２の５／２４及び１／１０に同時に存在していた。全体として、ｃ−ＭＥＴは、ＨＥＲ２（１０．１％）又はＨＥＲ３（９．７％）と比較して、ＨＥＲ１（６６／４３４又は１５．２％）と共に選択的に同時活性化されていた。同じ傾向がＨＥＲ２（−）胃癌において観察され、１５．４％の癌がｃ−ＭＥＴ−ＨＥＲ１同時活性化を示した。事実、ｃ−ＭＥＴ−ＨＥＲ１が同時活性化されている１３／６６の胃癌は、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３の同時活性化を示さなかった。これらの観察は、胃癌におけるｃ−ＭＥＴとＨＥＲ１シグナリング経路との間の混線の可能性を示唆している。ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２も同じ試料中でリン酸化されていない限り、ｃ−ＭＥＴ活性化はＨＥＲ３活性化と共に決して同時に存在しなかった。約７％の胃癌試料が、３つ全部のＨＥＲ軸受容体メンバーとｃ−ＭＥＴとの同時活性化を示した。
【０２１５】
[0233]ＩＧＦ１Ｒ活性化胃癌（表５）：ＨＥＲ３活性化と同様、ＩＧＦ１受容体により駆動されるシグナリング経路は、ＨＥＲ２（−）癌（２４．５％）と比較して高い百分率のＨＥＲ２（＋）癌（３０％）において活性であった。さらに、リン酸化されたＨＥＲ３に関して観察された通り、活性化ＩＧＦ１Ｒは３つの組織学的胃癌サブタイプの間で同等に分布していた、すなわち、腸型胃癌の２６％、びまん型胃癌の２４％及び混合型胃癌の２８％であった。この分布により、本発明者らは、本発明者らの試料セットにおいてＩＧＦ１Ｒ−ＨＥＲ３同時活性化があるかどうかを調査することになった。ＩＧＦ１Ｒは実際、特にＨＥＲ２（＋）癌においてホスホ−ＨＥＲ３と共に最大限に同時活性化されており、２２％又は１１／５０のＨＥＲ２（＋）試料がＩＧＦ１Ｒ−ＨＥＲ３同時活性化を示した。しかしながら、ＨＥＲ２（−）癌においては、ＨＥＲ３とのＩＧＦ１Ｒ同時活性化の百分率（５１／３８４の試料又は１３．８％中）は、ＨＥＲ１とのＩＧＦ１Ｒ同時活性化と類似していた（５３／３８４の試料又は１３．３％中）。ＩＧＦ１Ｒ：ＨＥＲ２同時活性化（４５／３８４の試料又は１１．７％中）はそのすぐ後ろにあった。全体として、３４／４３４の胃癌試料が、ｃ−ＭＥＴ同時活性化も示した２８の試料のＩＧＦ１ＲとのＨＥＲキナーゼ軸の全メンバーの同時活性化を示した。しかしながら、ｃ−ＭＥＴは、ＨＥＲキナーゼ受容体メンバー同時活性化の非存在下でＩＧＦ１Ｒと同時活性化されているのは稀であった。さらに、ｃ−ＭＥＴ：ＩＧＦ１Ｒ同時活性化は、ＨＥＲ２（−）胃癌において主に観察された。わずかのｐ９５ＨＥＲ２（＋）試料が、ＩＧＦ１Ｒ活性化（７／２４のＨＥＲ２（＋）試料及び３／１０のＨＥＲ２（−）試料）を示した。
【０２１６】
[0234]胃癌試料を、本研究における６つの評価されたマーカーの十分位数に基づく活性化プロフィールに基づくヒートマップにクラスター化した。クラスター化分析を行って、胃癌における上記のＲＴＫ活性化相関パターンを確認した（図９Ｂ）。この分析により、ｃ−ＭＥＴ：ｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２：ｐＨＥＲ３及びＩＧＦ１Ｒ：ＰＩ３Ｋ活性化パターンが本発明者らの試料セットにおいては異なるサブセットを形成するｃ−ＭＥＴ−ｐＨＥＲ１クラスターと密接に相関することが示された。これは、本発明者らが以前に観察したＲＴＫ同時活性化パターンと一致していた。ＰＩ３Ｋなどのこれらの分析したＲＴＫの下流にあるシグナリング経路のさらなる分析は、選択されない胃癌集団において、ＰＩ３Ｋ活性がＩＧＦ１Ｒ同時活性化（７７／１０８の試料又は７１．３％）、次いで、ＨＥＲ３同時活性化（７１／１０８の試料又は６５．７％）と共に最大限に観察されることを示した。これは、クラスタリング分析及び報告された研究と一致し、ＣＥＥＲ（商標）アッセイの妥当性を強化する。
【０２１７】
[0235]まとめると、リン酸化されたＨＥＲキナーゼ軸受容体メンバー、ｃ−ＭＥＴ及びＩＧＦ１Ｒの本発明者らの包括的分析により、胃癌が分析されたＲＴＫの活性に関して有意に不均一であり、事実、そのＲＴＫ活性化プロフィールに基づいて異なるサブクラスに分離することができることが示された。さらに、同時シグナリング経路は、いずれか１つのシグナルよりもむしろ胃癌において高度に普及している。そのような分子の分離は、胃癌サブタイプの予後及び治療剤研究の指導を助けることができる。
【０２１８】
ＣＥＥＲ（商標）に基づく経路活性化プロフィールに基づく試料分離は術後無病生存期間と相関する
[0236]本発明者らは、胃癌の臨床予後に対するＣＥＥＲ（商標）に基づくリン酸化プロファイリングの影響を調査した。根治的手術後の無病患者生存期間を、手術の時点で得られたその腫瘍試料のシグナリング経路活性化プロフィールに基づいて患者を群に分離した後に分析した。最初に、本発明者らは、ＨＥＲ２（＋）腫瘍を有する患者とＨＥＲ２（−）腫瘍を有する患者との無病生存期間の差異を分析した。ＨＥＲ２（＋）腫瘍の多くは、抗ＨＥＲ２治療に明確に応答する腸組織型である。従って、本発明者らは、ＨＥＲ２（＋）腫瘍の再発時間がＨＥＲ２（−）胃癌のものと異なり得るどうかを調査した。しかしながら、試料をその腫瘍ステージについて調整した後でも、そのような差異は観察されなかった。直感的に期待された通り、ＨＥＲ２（＋）及びＨＥＲ２（−）の両方の腫瘍を有する胃癌患者の中央無病生存期間は、ステージＩからステージＩＶまで腫瘍ステージが増加すると共に進行的に減少した。
【０２１９】
[0237]ＨＥＲ２（＋）及びＨＥＲ２（−）の両方の胃癌のサブセットのみが本発明者らの研究において分析されたＲＴＫの活性化を示したので、本発明者らは、活性化ＲＴＫがこれらの腫瘍の進行に影響し得ると理由付けた。従って、本発明者らは、ＣＥＥＲ（商標）アッセイにより決定されたように、ＲＴＫが活性化されていない患者と、１以上のＲＴＫが活性化されている患者との生存期間の差異を分析した。腫瘍ステージも考慮に入れるまで、２つの群の間には生存期間の有意差は観察されなかった。ステージＩの疾患を有するＧＣＡ患者は典型的には根治的外科切除から極端な利益を示すが、ステージＩＶの疾患を有する患者は緩和処置の選択肢に限られるため、本発明者らは、ＲＴＫ活性化の程度がステージＩＩ及びＩＩＩの疾患を有する患者の臨床転帰に対して影響を有するかどうかを調査しようとした。一度、試料がその腫瘍ステージに基づいて分離されたら、１以上のＲＴＫ活性化を有するステージＩＩ及びＩＩＩの患者が、分析されたＲＴＫがいずれも活性化されていないものよりも悪化した無増悪生存期間を示すことは明らかであった。腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩ及び１以上のＲＴＫ活性化を有する患者の中央生存期間は、０のＲＴＫ活性化を有するものよりも有意に低かった（図１０Ａ；１以上のＲＴＫ活性化については腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩ：３２．６３ヶ月及び０のＲＴＫ活性化については７６．５３ヶ月（ｐ＝０．０３１８、ハザード比＝０．６９））。中央生存期間の有意差は、ＨＥＲ２（−）のみの試料においても同様に維持された（図１０Ｂ；１以上のＲＴＫ活性化については腫瘍ステージＩＩ＋ＩＩＩ：３０．１０ヶ月及び０のＲＴＫ活性化については６８．１３ヶ月（ｐ＝０．０１９０、ハザード比＝０．６４））。これらのデータは、様々な組合せの、本研究において分析されたＲＴＫが胃癌における無病生存期間に影響することを明確に示している。この分析からの重要な観察は、それが、根治的手術後の患者の無病生存期間に対して寄与する、単に発現状態ではなく、ＲＴＫの活性化状態であることである。図９Ａから明らかであるように、いくつかの胃癌試料は様々なＲＴＫを高レベルで発現するが、多くの試料においては、これらのＲＴＫのサブセットのみがリン酸化されるか、又はこれらのＲＴＫはいずれもリン酸化されない。生存期間分析のために、有意なＲＴＫ活性化を示す試料のみが分析された。
【０２２０】
[0238]無増悪生存期間に対する個々のＲＴＫの寄与を探索する努力において、本発明者らは、ＨＥＲ１及びｃ−ＭＥＴが活性化されている胃癌試料に集中した。これらのＲＴＫに焦点を当てる理由はいくつかあった。ｃ−ＭＥＴは有意な数の胃癌において遺伝子増幅されるが、単一の薬剤である抗ＭＥＴ阻害剤はこれらの癌において臨床利益を示すことができなった（Ｊｈａｗｅｒら、２００８）。他の研究者は、胃癌の前臨床モデルにおけるｃ−ＭＥＴ及びＨＥＲ１の組合せ治療の優れた効果を報告している（Ｃｏｒｓｏら、２０１０）。胃癌臨床標本の本発明者ら自身のＣＥＥＲ（商標）に基づく分析において、本発明者らは、そのような試料の同時クラスタリングを含むｃ−ＭＥＴ及びＨＥＲ１の同時活性化を観察した。これは、ｐ−ＨＥＲ１：ｐ−ｃＭＥＴを同時発現する胃癌試料における全体的なシグナリング特性が、ＨＥＲ１が活性化されていないｐ−ｃＭＥＴを発現する試料とは明確に異なっていてもよいことを示唆する。本発明者らは、ｐ−ＨＥＲ１（−）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）及びｐ−ＨＥＲ１（＋）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）試料セットにおいて無増悪生存期間を比較した。全体の胃癌試料セットにおいてこれらのコホートの中央生存期間には有意差があった（図１１；ｐ−ＨＥＲ１（＋）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）については４６．１７ヶ月及びｐ−ＨＥＲ１（−）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）については８２．８０ヶ月（ｐ＝０．０１８４、ハザード比＝０．５１））。ＨＥＲ２（−）のみの試料においても同様の結果が観察された（図１０Ｃ）。その後、ｐ−ＨＥＲ１（−）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）及びｐ−ＨＥＲ１（＋）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）コホートを、腫瘍段階を調整したＨＥＲ２（−）試料セットにおいて分析した。ステージＩの胃癌は異なるＲＴＫ活性化状態を有する患者について術後の無病生存期間における有意差を示さなかったが、ｐ−ｃＭＥＴ（＋）のステージＩの胃癌はＨＥＲ１同時活性化サブタイプについて有意差を示した。ｃＭＥＴとＨＥＲ１との同時活性化は、ｃＭＥＴのみが活性化されているステージＩの患者と比較した場合、より少ない無病生存期間を示した（図１０Ｄ）。本発明者らのデータは、ｐ−ＨＥＲ１（＋）：ｐ−ｃＭＥＴ（＋）胃癌試料がより不良な予後を有し、そのような患者のための治療選択肢を決定するためにステージ特異的様式でシグナリング経路特性を決定する際に価値があることを強く示唆する。ステージＩの疾患を有する胃癌患者は、術後のより積極的な補助処置選択肢のための候補を同定するために経路活性化状態に基づいてさらに特性評価する必要がある。
【０２２１】
胃癌モデル系におけるＲＴＫプロフィールに基づいて治療標的化を指導することができる
[0239]ＣＥＥＲ（商標）アッセイを用いて、本発明者らはそのＲＴＫ活性化プロフィールに基づいて１６を超える胃癌細胞株を分類し、そのデータは胃癌組織において観察されたものと一致していた（Ｈｏｅら、２０１１）。データをいくつかのそのようなモデルについて提示する。ＭＥＴ増幅された胃癌細胞、ＳＮＵ５及びＳＮＵ４８４は、感知できるレベルのＨＥＲ１及びｃ−ＭＥＴタンパク質を同時発現することが同定された。しかしながら、リン酸化プロファイリングは、胃癌臨床標本のサブセットにおいて以前に注記されたように、これらの細胞中でのｐＭＥＴに加えてｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２の発現を示した。ＨＥＲ２が増幅された胃癌細胞株として周知であるＮＣＩ−８７（Ｎ８７）細胞は、分析されたホスホ−ＲＴＫパネル内でｐＨＥＲ２のみの発現を示した。ＦＧＦＲ２が増幅されたＫＡＴＯＩＩＩ細胞は、図１２に示されるように、低レベルのｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２、ｐＨＥＲ３及びｐＭＥＴタンパク質を示した。
【０２２２】
[0240]不均一なＲＴＫ活性化パターンが、胃癌患者のサブセット中にも認められるように胃癌モデル系中に存在するという観察に基づいて、本発明者らは、この情報を用いて胃癌における治療決定を予測的に指示することができると仮定した。従って、本発明者らは、二重ＨＥＲ１／２チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫ１）であるラパチニブ並びにＭＥＴ阻害剤であるＰＨＡ−６６５，７５２及びフォレチニブを用いる「概念実証」実験を行った。図１２に示される通り、ラパチニブは総ＨＥＲ２レベルを変化させることなくＮＣＩ−８７細胞中でのＨＥＲ２活性化を無効化したが、ＭＥＴが増幅されたＳＮＵ５又はＳＮＵ４８４細胞中ではそうすることができなかった。他方、ＭＥＴ阻害剤は、ＳＮＵ５及びＳＮＵ４８４細胞中でｐＭＥＴを無効化した。興味深いことに、ｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２も、有意なＭＥＴ活性を示さないＮＣＩ−８７細胞中ではなく、ＭＥＴが阻害されたＭＥＴが増幅された細胞中では部分的に遮断された。これは、ＭＥＴ及びＨＥＲ−キナーゼシグナリング経路がＭＥＴ増幅された胃癌において関連していることを示している。さらに、ラパチニブとフォレチニブとの４時間の組合せ処置は、ＭＥＴが増幅されたＳＮＵ５及びＳＮＵ４８４細胞中で、下流のシグナリングエフェクターＰＩ３Ｋ及びＳｈｃのものなどのＨＥＲキナーゼ及びＭＥＴキナーゼ活性を完全に遮断した。これは、組合せ治療手法がそのような胃癌においてより有用であることを示唆している。
【０２２３】
[0241]癌細胞増殖阻害に対する経路阻害の表現型効果を試験するために、本発明者らは、それぞれの治療的処置を用いて細胞傷害アッセイを行った。ＲＴＫプロファイリングデータと一致して、ｃ−ＭＥＴが増幅されたＳＮＵ５細胞中でのラパチニブのＩＣ５０は１．０μＭ／Ｌを超えていたが、それはＰＨＡ６６５，７５２については０．０５８μＭ／Ｌでほぼ２桁の規模でより低いものであった。しかしながら、ラパチニブ＋ＰＨＡ６６５，７５２の組合せのＩＣ５０は０．０１８μＭ／Ｌでさらにより低く、組合せ処置を用いるＨＥＲキナーゼ及びＭＥＴシグナリング経路の最大限の遮断と一致していた（ｐ＝０．０１）。これらの実験は、ＨＥＲ及びＭＥＴキナーゼの組み合わせた阻害は、単剤療法とは対照的に、このクラスの胃癌においてより有益であり得ることを示唆している。対照的に、標的療法剤の存在下でシグナリング経路の不完全な阻害を示したＫＡＴＯＩＩＩ細胞は、単剤処置又は組合せ薬剤処置の両方について最小限の細胞増殖阻害を示した（ＩＣ５０＞１．０μＭ／Ｌ）。総合すれば、前臨床モデルにおけるこれらの研究は、ＣＥＥＲ（商標）プラットフォームが胃癌における複数のＲＴＫ活性化の状態を同時に調査することができ、次いで、これを用いて治療結果を選択及びモニターすることができることを明確に示している。
【０２２４】
胃癌患者においてＲＴＫプロフィールを研究するためのＣＴＣ及びＡＴＣの有用性の調査
[0242]胃癌前臨床モデルにおいて証明されたように、ＣＥＥＲ（商標）技術により決定されたＲＴＫ活性化のパターンを、治療決定を指導し、処置応答をモニターするために用いることができる。しかしながら、分子的変化をモニターするための追跡腫瘍生検は病院では常に利用できるわけではない。従って、本発明者らは、より容易に利用できる循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び腹水腫瘍細胞（ＡＴＣ）を用いてＲＴＫ評価プラットフォームを設定しようとした。患者あたりのＣＴＣの数は、ＣＥＥＲ（商標）アッセイにより認められた変化するレベルのＣＫにより示されるように広く変化し、４人のそのような患者からの結果を図１３Ａに示す。ＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及び活性化だけが示されるが、本発明者らは転移性胃癌患者から単離されたＣＴＣにおける他のＲＴＫ活性化の不均一なパターンを観察した。さらに、本発明者らは、胃癌における非侵襲的癌細胞の別の供給源である腹水から悪性腫瘍細胞を上手く単離した。１００ｍＬの腹水の排水中で、７．５ｍｌの血液中でのＣＴＣの典型的な収量よりも数倍規模でより多い数の腫瘍細胞が認められた（１×１０３〜１×１０４を超える）。胃癌ＣＴＣ中に認められた不均一なＲＴＫ活性化パターンは、胃癌患者から単離されたＡＴＣ中でも認められた。
【０２２５】
[0243]次に、本発明者らは、これらの腫瘍細胞（ＣＴＣ及びＡＴＣ）中のシグナリング経路がリガンド及び／又は薬剤摂動に対して応答するかどうかを決定した。これは、ｉｎ  ｓｉｔｕの癌を示唆し得るＣＴＣ／ＡＴＣ中のシグナリング経路の機能及び薬剤応答性に関する価値ある情報を潜在的に提供することができる。ラパチニブとｃ−ＭＥＴ阻害剤との組合せを用いる処置の際に、胃癌患者から単離されたＣＴＣ中でリン酸化されたＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びｃ−ＭＥＴの用量依存的阻害が認められた。代表例を図１３Ｂに示す。この特定のＣＴＣのセットにおいて、本発明者らは阻害剤処置の際のＩＧＦ１Ｒの同時活性化も観察した。この現象の正確な機構及びこれが胃癌においても起こるかどうかは、この時点では不明である。続いて、ＥｐＣＡＭ陽性ＡＴＣを、３７℃で４ｈ、ラパチニブとＰＨＡ−６６５，７５２のカクテルを含むか、又は含まない増殖因子のカクテル（ＥＧＦ、ＨＲＧ、ＨＧＦ及びＩＧＦ１）で処理した。このプラットフォームを、いくつかの異なるＡＴＣ単離物上で試験した。異なる活性化経路を示した３人の異なる胃癌患者から単離されたＡＴＣの代表例を示す（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）。有意なレベルのｐ−ＨＥＲ１、ｐ−ＨＥＲ２並びにｐ−ｃＭＥＴが、ＡＴＣの３つ全部のセットにおいて観察されたが、これは、ラパチニブとＰＨＡ−６６５，７５２との組合せがこれらの特定の患者に利益を与え得ることを示唆している。実際、標的療法剤のこの組合せは、程度は変化するがこれらの３つの標的のリン酸化を減少させることができた。この薬剤の組合せが実際にそのような患者のための臨床利益になるかどうかは、現時点では不明である。しかしながら、ＡＴＣにおける他の活性化ＲＴＫのプロファイリングは、ＨＥＲ３及びＩＧＦ１Ｒも、阻害剤カクテルにより効率的に阻害することができないいくつかの試料において変化するレベルで活性化されていることを示した。これらの活性化ＲＴＫは試験された治療剤の結果に影響し得る可能性がある。事実、１人の患者（００５−１１６）は、阻害剤処置と共にｐ−ＩＧＦ１Ｒの増加を示した。同様に、活性化ＲＴＫ（ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、Ｅｒｋ及びＡＫＴ）の下流のシグナリング分子の分析により、リガンド及び薬剤処置の際にその活性化及び阻害プロフィールに関して不均一性が示された。本発明者らのデータは、胃癌患者における治療的処置の前後でのシグナリング経路の評価のための非侵襲的プラットフォームを明確に示している。
【０２２６】
考察
[0244]本研究で、本発明者らは、胃癌を、この種類の癌において活性である鍵となる増殖因子受容体シグナリング経路のリン酸化プロフィールに基づいて分離することができることの証拠を提供する。胃癌は、再発及び化学療法に対する応答に関して広範囲の予後を示す非常に不均一な疾患である。この不均一性は、組織病理学的（Ｌａｕｒｅｎ、１９６５）、解剖学的（Ｂｌｏｔら、１９９１；Ｃｒｅｗ及びＮｅｕｇｕｔ、２００６）及び疫学的（Ｃａｒｎｅｉｒｏら、２００４；Ｃｏｒｒｅａら、１９９０；Ｕｅｍｕｒａら、２００１；Ｙｏｕら、１９９３）特徴などのいくつかのレベルで認識される。胃癌をその遺伝子発現シグネチャーに基づいてさらに分類するための最近の努力が始まっている（Ｏｏｉら、２００９；Ｓｈａｈら、２０１１；Ｔａｙら、２００３）。本発明者らの研究は、この種類の癌にける標的療法の選択及び結果に直接影響するシグナリング経路活性化プロフィールに基づいて胃癌におけるさらに別のレベルの不均一性を同定する。
【０２２７】
[0245]臨床試料の標的化リン酸化分析は、限られた量の臨床組織上で機能するにもかかわらず、複数のＲＴＫの活性化パターンをスコア化及び区別するのに十分な感度のある容易に利用できる臨床アッセイが存在しないため、阻まれてきた。本研究で、本発明者らは、いくつかのタンパク質の総形態及びリン酸化形態を特異的に分析するために多重化することができる急速凍結された胃癌臨床試料に直接対する、高感度で新規な免疫アッセイであるＣＥＥＲ（商標）を用いた。本発明者らは、胃癌患者の約５３％において、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴ及びＩＧＦ１Ｒ分子のうちの少なくとも１つのＲＴＫが活性化されていることを証明する。本研究で分析されたＲＴＫのうち、ＨＥＲファミリーメンバーが最も高頻度で活性化されているチロシンキナーゼであった。ＨＥＲファミリーメンバーの発現は胃癌における腫瘍進行及び不良な予後と以前に相関していた（Ａｌｌａｇａｙｅｒら、２０００；Ｇａｒｃｉａら、２００３；Ｈａｙａｓｈｉら、２００８）；しかしながら、本発明者らの研究はその活性化プロフィールの初めての証明である。活性化ＨＥＲキナーゼメンバーを有するいくつかの胃癌は他の分析されたＲＴＫファミリーメンバーの活性化を示さなかったが、ｃ−ＭＥＴが活性化されている癌はほぼ常にＨＥＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒの同時活性化を示した。クラスタリング分析により、ＨＥＲ１及びＩＧＦ１Ｒ活性化胃癌と共に、ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴが活性化されているものに分類されたＨＥＲ２活性化胃癌は、Ｐ１３Ｋ活性化胃癌に最も近いことが示された。ＲＴＫプロフィールは、Ｌａｕｒｅｎの組織型及び腫瘍のＨＥＲ２状態に基づいて分離された。遺伝子発現プロフィールの相違に基づいて、最近の研究（Ｓｈａｈら、２０１１）は、胃癌を「近位非びまん型」、「びまん型」及び「遠位非びまん型」と分類し、これらの区別が胃癌の現在の臨床管理に対する有意な影響を有し得ることを示唆した。その活性キナーゼプロフィールに基づくこれらの胃癌サブタイプの異なる生物学への新しい洞察を提供することとは別に、胃癌の組織病理と一致する特異的ＲＴＫ活性化パターンの同定は、現在では利用可能な薬剤候補の仮説に基づく治療剤試験を可能にすることができる。
【０２２８】
[0246]本発明者らの分析からの印象的な観察は、有意な数の胃癌（ＨＥＲ２陽性の４８％及びＨＥＲ２陰性の約３２％）が単一の活性なＲＴＫを有さず、むしろそれらが同時活性化ＲＴＫのネットワークにより駆動されることである。この知見は、胃癌が個々の標的化処置に対する耐性を示すと共に、標的化剤の組合せが胃癌のそのようなサブセットにおいてより有効であり得ることを示唆するため、薬剤開発に大きな影響がある。実際、非選択的胃癌患者におけるフォレチニブ（ＸＬ−８８０）単剤療法の第ＩＩ相試験は、対象となる応答を証明することができず（Ｊｈａｗｅｒら、２００８）、ＨＥＲ２（＋）胃癌患者のサブセットにおいてはトラスツズマブ活性が観察されるに過ぎない。本発明者らの知識にとって、本発明者らの研究は、胃癌臨床試料中の複数のＲＴＫ経路活性化の初めての証明である。同様の観察がグリア芽腫（Ｓｔｏｍｍｅｌら、２００７）及び乳癌（Ｈｏｃｈｇｒａｆｅら、２０１０）において以前に報告されており、そのＲＴＫ活性化プロフィールにより指導される組合せ処置は単剤処置より優れていた。本発明者らは、ｃＭＥＴ／ＨＥＲ１リン酸化がＨＥＲ２陰性胃癌において密接に関連すること、及びそのような胃癌患者が有意により不良な生存期間を有することを同定した。ｃ−ＭＥＴとＨＥＲ１軸との混線が胃癌及び肺癌細胞株において報告されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎら、２００７；Ｌｉｕら、２０１１）。最近の研究は、ＨＥＲキナーゼシグナリングが胃癌におけるｃＭＥＴ阻害に対する耐性を促進し、２つのシグナリングファミリーの同時的遮断がより有益であり得ると報告する（Ｃｏｒｓｏら、２０１０；Ｌｉｕら、２０１１）。本発明者らの結果は、ＨＥＲ１とｃＭＥＴとの組合せ治療的阻害が、いずれかの標的に対する単剤療法とは対照的に、ＨＥＲ１／ＭＥＴが同時活性化されている細胞中でより有効な抗腫瘍活性であることを証明する。
【０２２９】
[0247]トラスツズマブ活性はＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する乳癌において認められる。この知見は、ここで胃癌にも拡張され、トラスツズマブはＨＥＲ２（＋）の進行胃癌の処置のためにＦＤＡに認可されている（Ｂａｎｇら、２０１０）。事実、トラスツズマブは生存利益を示す胃癌における唯一の標的療法である。しかしながら、それは、トラスツズマブ＋標準的な化学療法がＨＥＲ２（＋）胃癌において４７％の全体応答率にするため、トラスツズマブは全てのＨＥＲ２（＋）胃癌患者に利益を与えないという最近のＴｏＧＡ試験から明らかである。本発明者らの現在のＣＥＥＲ（商標）に基づく分析は、この非応答の少なくとも４つの可能な理由を提供し、その活性化状態などの複数のマーカーのスコアリングが標的療法剤に対する応答を予測する際により有益であり得ることを示す。トラスツズマブの非応答の１つの可能性は、効率的なＨＥＲ２診断の開発における複雑性に寄与するＣＥＥＲ（商標）アッセイにより示される通り、胃癌におけるＨＥＲ２発現の高い不均一度である。改変されたＩＨＣ／ＦＩＳＨ−ＨＥＲ２スコアリング基準が乳癌の指針とは異なる胃癌について規定されたが、それらは依然として全ての胃癌における不均一なＨＥＲ２状態を効率的に捕捉することができず、抗ＨＥＲ２応答者を正確に予測するには不十分であり得る。第２に、ＣＥＥＲ（商標）分析により示される通り、ＨＥＲ２（＋）胃癌の５０％のみがリン酸化されたＨＥＲ２を発現する。活性なＨＥＲ２経路の非存在は、ＨＥＲ２シグナリングが全てのＨＥＲ２（＋）胃癌において腫瘍生存に有意に寄与するわけではないことを示唆する。従って、それをトラスツズマブで阻害することによっては、測定可能な腫瘍阻害が得られない。第３に、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴ及びＩＧＦ１Ｒにより駆動されるものなどのシグナリング経路は、ＨＥＲ２（＋）胃癌の２６％、３６％、２２％及び３０％においてそれぞれ活性であることを本発明者らが証明しているが、トラスツズマブに対する耐性を促進する代替的な腫瘍生存シグナルを提供し得る。乳癌においてはＨＥＲ２：ＨＥＲ３ヘテロ二量体をトラスツズマブにより効率的に遮断することができない（Ａｇｕｓら、２００２；Ｃｈｏら、２００３；Ｇｈｏｓｈら、２０１１）こと、及びＩＧＦ１Ｒシグナリングがトラスツズマブ耐性を促進する（Ｈｕａｎｇら、２０１０；Ｎａｈｔａら、２００５）ことが公知である。さらに、胃癌異種移植モデルにおける最近の前臨床試験の証拠（Ｙａｍａｓｈｉｔａ−Ｋａｓｈｉｍａら、２０１１）は、トラスツズマブとペルツズマブとの組合せ処置が、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ヘテロ二量体シグナリングの効率的阻害に一部起因して、ＨＥＲ２（＋）モデルにおいてトラスツズマブ単独よりも優れていることを示している。最後に、近接性に基づくＣＥＥＲ（商標）免疫アッセイを用いる本発明者らの研究は、胃癌におけるトラスツズマブ耐性にも寄与し得るＨＥＲ２（＋）胃癌の４６％中の、ＨＥＲ２のトランケートされたカルボキシ末端断片であるｐ９５ＨＥＲ２の存在を証明する。乳癌におけるｐ９５ＨＥＲ２は、より悪い予後（Ｓａｅｚら、２００６）及びより高い転移性（Ｍｏｌｉｎａら、２００２）に加えて、トラスツズマブを認識する細胞外エピトープの欠如（Ｓｃａｌｔｒｉｔｉら、２００７）に起因してハーセプチン処置に対する耐性を促進する。しかしながら、ｐ９５ＨＥＲ２発現の大規模な臨床的検証は、パラフィン包埋標本中でのｐ９５ＨＥＲ２の免疫組織化学的検出に伴う技術的困難性に起因して依然としてない。２つのグループがｐ９５ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を生成したが、ＧｅｐａｒＱｕａｔｔｒｏの研究からの最近の矛盾する知見はｐ９５ＨＥＲ２のレベルをトラスツズマブ耐性と相関させることができなかったため（Ｌｏｉｂｌら、２０１１）、その臨床的検証は依然として係属中である（Ｐａｒｒａ−Ｐａｌａｕら、２０１０；Ｓｐｅｒｉｎｄｅら、２０１０）。本発明者らがＣＥＥＲ（商標）アッセイを用いて急速凍結された胃癌臨床標本中でｐ９５ＨＥＲ２を検出することに成功したことに留意すべきである。胃癌におけるｐ９５ＨＥＲ２の発生頻度（ＨＥＲ２（＋）の７７％）は、乳癌において報告されたもの（ＨＥＲ２（＋）の約３０％）よりも高い。いくつかの研究がｐ９５ＨＥＲ２（＋）癌における、抗ＨＥＲ２ＴＫＩであるラパチニブの使用を示しているため（Ａｒｒｉｂａｓら、２０１１；Ｓａｅｚら、２００６）、完全長ＨＥＲ２又はトランケート型ｐ９５ＨＥＲ２のいずれかを発現する胃癌細胞中でのトラスツズマブ対ラパチニブの効果を試験することができる。さらに、胃癌患者における第ＩＩ相ネオアジュバントラパチニブ＋化学療法試験においてｐ９５ＨＥＲ２発現を検証することができる。ＨＥＲ２陰性胃癌は、本発明者らの研究において分析された全胃癌集団の大きい方の割合（約８８％）を形成するが、この集団のために認可された標的療法は存在しない。ＣＥＥＲ（商標）アッセイに基づいて、これらの癌のいくらかはＨＥＲ２タンパク質を依然として発現するが、そのレベルはＨＥＲ２（＋）集団と比較して有意に低い。事実、本発明者らは、有意なレベルのリン酸化されたＨＥＲ２を含む８４の試料を検出したが、これは、これらの癌は腫瘍増殖を促進するために活性なＨＥＲ２受容体シグナリングを利用し、かくして、様々なＨＥＲ２標的化剤に対する潜在的な応答因子であり得ることを示唆している。トラスツズマブは、ＩＨＣにより決定されたように、ＨＥＲ２（−）状態を有する少数の乳癌患者において有益であることが見出された（Ｐａｉｋら、２００８）。活性なＨＥＲ２シグナリングに加えて、本発明者らは、ＨＥＲ２（−）腫瘍増殖を駆動するのにも寄与し得るＨＥＲ２（−）胃癌においてＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴ及びＩＧＦ１Ｒが活性化されている患者のいくつかのサブグループを同定した。本発明者らの研究において見出されたｐＨＥＲ１、ｐＨＥＲ２及びｐＨＥＲ３を発現する試料の割合は乳癌において報告されたものと類似することは注目に値する（Ｆｒｏｇｎｅら、２００９）。ＨＥＲ３タンパク質過剰発現は、胃癌における予後不良と相関し（Ｂｅｇｎａｍｉら、２０１１；Ｈａｙａｓｈｉら、２００８）、潜在的な治療標的と示唆された。本発明者らの分析では、約２４％のＨＥＲ２（−）胃癌が活性なＨＥＲ３シグナリングを発現し、これらの癌の有意な割合はリン酸化されたＨＥＲ２及びＨＥＲ１を同時発現していた。これは、ＨＥＲ３シグナリングが胃癌において有意な役割を果たし得ることを示唆している。
【０２３０】
[0248]分子標的化剤に関する長年の経験後、本発明者らは今では、転移癌が処置中に耐性経路が出現する進化する疾患であると認識している。腫瘍学者は、その後の処置を計画するための再生検の必要性と、再生検の臨床実現性との間のジレンマに遭遇するであろう。従って、本発明者らは、体液（例えば、腹水）から単離されたＣＴＣ及び悪性腫瘍細胞を用いてＲＴＫ活性化プロファイリングプラットフォームを開発した。本発明者らは、ＣＥＥＲ（商標）アッセイがＣＴＣをプロファイルするのに十分な感度を有することを証明した。ＣＴＣを用いて、本発明者らは、処置中及び進行時に標的化されたＲＴＫ状態を長期的にモニターすることができる。全ての転移癌患者が分析に利用可能なＣＴＣを有するわけではないという事実を考慮して、本発明者らは、胃癌患者に由来する悪性腹水などの体液から悪性腫瘍細胞も単離し、ＲＴＫ活性化をこれらの細胞中でプロファイルすることができることを上手く示した。これは胃癌患者におけるホスホ−ＲＴＫアッセイの適用性及び臨床実現性の範囲を明確に拡張するであろう。本発明者らは、増殖因子を用いて悪性腹水及び活性化経路から癌細胞を単離した後、証拠に基づく標的療法剤を適用し、薬剤耐性を克服するための戦略を開発するための患者における特定の経路タンパク質を標的化する薬剤の有効性を試験するための潜在的な代用系として、腫瘍細胞をエクスビボでＴＫＩで処理した。
【０２３１】
[0249]本発明者らは今や、オーダーメイド癌医療及びバイオマーカーに駆動される臨床研究の時代に急速に近づいている。複数のＲＴＫ同時活性化を示す本発明者らの知見は、胃癌における単剤療法の低い応答率の合理的な説明を提供する。将来、本発明者らは複数のシグナリング経路を有する胃癌患者のサブセットにおける前衛的な組合せ標的化処置を考慮することができる。ＣＴＣ及び／又は体液を用いるモニタリング手段を用いて、本発明者らは、選択的シグナリング経路を標的化する疾患進行に対する必要な追跡処置を迅速に指摘することができる。
【０２３２】
実験手順
患者コホート及び組織標本の調達
[0250]全ての患者は根治を目的とする徹底的なリンパ節切除を含む胃切除術を受けた。手術で切除された一次胃腫瘍から採取された４４７の新鮮な凍結組織が、最終的な分析に利用可能であった。全ての新鮮な凍結組織は外科医によって手術野で採取され（３０分以内に）、液体窒素中ですぐに簡易凍結され、後に使用するまで−８０℃の冷凍庫で保存された。
【０２３３】
[0251]腫瘍標本は、病理学者によって７０％を超える腫瘍領域の存在について確認された。分析のために、凍結組織の小片（１０μｍ切片Ｘ３）を、予め冷却したかみそりの刃を用いて調製した後、１００μＬの溶解バッファー中で溶解した。得られた溶解物をその後の分析の前に−８０℃で保存した。
【０２３４】
組織病理学的検査及びＨＥＲ２状態の決定
[0252]全ての利用可能なＨ＆Ｅ染色されたスライドを、２人の病理学者がその中心を検査した。全ての腫瘍標本は、手術で切除された一次胃腫瘍に由来するものであった。ＨＥＲ２状態を免疫組織化学分析（ＩＨＣ）により決定した。ＩＨＣ分析を、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。ＨＥＲ２タンパク質発現レベルを、胃癌に関するＨＥＲ２スコアリングに関するコンセンサスパネル推奨に従って、０〜３＋とスコア化した（Ｈｏｆｍａｎｎら、２００８；Ｒｕｓｃｈｏｆｆら、２０１０）。ＦＩＳＨのために、ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ  ＨＥＲ２  ＤＮＡプローブキット（Ａｂｂｏｔｔ、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）を用いた。Ａｒｉｏｌ画像分析システムを用いて、ハイブリダイゼーションシグナルを計測した（Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）。４０個の侵襲腫瘍細胞が計測された。画像分析により１．８〜２．２のＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比を有する全試料を、６０個を超える非重複細胞を計測することによって手動でスコア化した。２．２を超える、１．８〜２．２、又は１．８未満の比を、それぞれ増幅について陽性、不定、又は陰性と分類した。第１７染色体ポリソミーは細胞１個あたり平均で６を超えるコピー数のＣＥＰ１７シグナルと定義された。４４７の標本のうち、４３４の標本が最終的な分析に含まれていた。
【０２３５】
協調的酵素増強反応免疫アッセイ（ＣＥＥＲ（商標））
[0253]免疫マイクロアレイスライドをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２〜７．４）で２回リンスし、ＲＴで１ｈ、８０μＬのＷｈａｔｍａｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで遮断した後、ＴＢＳＴで２回洗浄した。８０μＬの希釈バッファー（２％ＢＳＡ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＴＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４）中の連続希釈された溶解物対照及び試料を、スライド上の指定されたサブアレイに添加した後、ＲＴで１時間インキュベートした。スライドを４回（それぞれ３ｍｉｎ）洗浄し、検出Ａｂを８０μＬの反応バッファー中に添加し、ＲＴで２時間インキュベートした。ＴＢＳＴでスライドを洗浄して未結合の検出Ａｂを除去した後、エタノール溶液中の４００μｇ／ｍＬ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）から調製された８０μＬのビオチン−チラミド溶液（５０ｍＭグルコース／ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌ）を添加し、暗室中で１５ｍｉｎインキュベートした。グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）／ＨＲＰ媒介性チラミドシグナル増幅プロセスを、ＴＢＳＴで４回、それぞれ３ｍｉｎ洗浄することにより終結させた。２％ＢＳＡ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ／ＴＢＳ中、０．５μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（ＳＡ）−Ａｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４０ｍｉｎインキュベートすることにより、ビオチン−チラミドの局所蓄積を検出した。インキュベーションの完了時に、スライドをＴＢＳＴで４回洗浄し、乾燥させ、マイクロアレイスキャナーにより画像化するまで暗室中で保持した。
【０２３６】
トランケート型ＨＥＲ２の富化
[0254]完全長ｐ１８５−ＥＲＢＢ２受容体を、図８に示されるようなＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的な磁気ビーズに結合した抗体を用いて溶解物から除去した。得られたｐ１８５−ＨＥＲ２を枯渇させた溶解物は、ＥＣＤを欠くトランケート型ＨＥＲ２（ｔ−ＨＥＲ２）受容体タンパク質を含有し、これをその後のｔ−ＨＥＲ２発現及びリン酸化の定量に用いた。
【０２３７】
ＣＥＥＲ（商標）のデータ分析
[0255]スライドを、有効なダイナミックレンジを増加させる４つの光電子増倍管（ＰＭＴ）獲得設定で走査した。バックグラウンド補正されたシグナル強度を、３回印刷されたスポットについて平均化した。スポット足跡上の限界、スポット複製物の変動の係数、及び全体のパッドバックグラウンドなどのいくつかの基準を用いて、さらなる分析のためにデータを濾過した。それぞれのアッセイについて、よく特徴付けられたシグナル伝達タンパク質を含む細胞株から調製された連続希釈された対照細胞溶解物から、標準曲線を作製した。捕捉抗体濃度及びＰＭＴの関数として誘導された５パラメータの式にデータを適合させた。それぞれのマーカーに関する標準曲線を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定されたシグナル強度の対数対細胞溶解物の濃度の対数の関数として適合させ、標準細胞株を参照した。例えば、ＢＴ４７４から調製された連続希釈された細胞溶解物の標準曲線を用いて、それぞれの試料中のＨＥＲ２発現及びリン酸化の程度を正規化した（図１４）。従って、１ＣＵのＨＥＲ２発現を有する試料は、１の標準参照ＢＴ４７４細胞のＲＦＵ値と等しいＲＦＵ値を有する。参照細胞は、細胞１個あたり１〜２×１０６個のＨＥＲ１又はＨＥＲ２受容体を有し、その約１０％がリン酸化された受容体であるため、１ＣＵは１〜２×１０６のＲＴＫ又は１〜２×１０５のリン酸化ＲＴＫの発現に相当する（Ｋｉｍら、２０１１）。ＣＵにより検出限界（ＬＯＤ）値は、ＨＥＲ２の発現及び活性化の両方について１ＣＵ未満であると決定された。それぞれの希釈及び獲得からの個々の予測を、単一の最終的な予測に平均化した。
【０２３８】
ＣＥＥＲ（商標）マーカーの決定及びヒートマップのクラスタリング
[0256]臨床設定における使用のためのバイオマーカーデータの評価における統計的課題は、最適な診断カットオフレベルを決定することである。参照範囲値が存在しない場合、所与のバイオマーカーの陽性性は、本研究の患者集団における個々のバイオマーカーに関する第三四分位よりも大きいものと定義された。所与のマーカーについてＣＥＥＲ（商標）アッセイからのＣＵ値に基づいて患者を順位付けた。第三四分位カットオフよりも大きいこれらの患者を、バイオマーカーレベルが上昇し、従ってシグナル経路が活性化されている可能性がある最も高いリスクにあると考えた。次いで、生存分析を行って、これらのカットオフの予測品質にアクセスした。
【０２３９】
[0257]腫瘍試料のバイオマーカープロフィールを、ヒートマップにより表した。それぞれの細胞を、そのマーカーの活性化の十分位数順位に基づいて着色した。それぞれのマーカーを十分位数により順位付け、色を示すスケールと共に、特徴ある影で表した。行（患者）及び列（マーカー）のクラスタリングを示した。統計的環境のｇｐｌｏｔｓライブラリーＲ：Ａ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）で利用可能なヒートマップ．２関数により呼ばれる、Ｒ中のｈｃｌｕｓｔ関数を用いて最も相関する観察を連続的にグループ化することにより、完全連結アルゴリズムを用いて階層的クラスター（又はデンドログラム）を得た。マーカーのサブグループは、クラスタリングにより定義され、患者のためのマーカープロフィールの比較を可能にする。
【０２４０】
多重化マイクロアレイ印刷
[0258]非接触プリンター（Ｎａｎｏｐｌｏｔｔｅｒ、ＧｅＳｉＭ）を用いて、ニトロセルロース被覆スライドガラス（オンサイト（ＯＮＣＹＴＥ）（登録商標）、Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）上に捕捉抗体を印刷した。スポットの直径は約１７５μｍであり、スライドを４℃の乾燥チャンバ中で保持した。約５００ｐＬの捕捉Ａｂを３回、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、及び０．２５ｍｇ／ｍＬの連続希釈濃度で印刷した。精製マウスＩｇＧを陰性対照として用いた。免疫アレイスライド配置を図５に示す。
【０２４１】
抗体コンジュゲーション及び精製
[0259]標的特異的Ａｂ（ヒトシグナル伝達タンパク質上の異なるエピトープに対するマウスモノクローナル）及び対応する検出酵素グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を二官能性架橋リンカー、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で活性化し、カップリングし、抗体酵素コンジュゲートを作製した（Ｇｉｂｓｏｎら、１９６４；Ｋｌａｐｐｅｒ及びＨａｃｋｅｔｔ、１９６３）。コンジュゲートをＨＰＬＣにより精製した。精製されたコンジュゲート中のＡｂ活性を、競合ＥＬＩＳＡにより決定し、コンジュゲーション後の酵素活性を検出酵素に特異的な機能的アッセイにより検出した。
【０２４２】
細胞培養液及び試薬
[0260]ヒト胃癌細胞株を、Ｋｏｒｅａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から購入した。全ての細胞株を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、抗生物質／抗真菌剤を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ａｕｓｔｒｉａ）中で増殖させた。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートし、培地を週に２回交換した。集密に達した後、実験の終了まで細胞を新しいフラスコにさらに分割した。
【０２４３】
[0261]変化する程度のＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現（Ｄｒａｇｏｗｓｋａら、２００４；Ｆｉｌｍｕｓら、１９８７；Ｉｍａｉら、１９８２）を示す、ＣＥＥＲ（商標）アッセイ対照細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ８２７及びＢＴ４７４細胞を、ＡＴＣＣから取得し、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ダルベッコ最少必須培地、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）、ＢＴ４７４（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）、並びにＨＣＣ８２７及びＴ４７Ｄ（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、０．２Ｕ／ｍｌウシインスリン）について５％ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。細胞を計数し、１×ＰＢＳで洗浄した後、増殖因子刺激を行った。無血清増殖培地中で５又は１５ｍｉｎ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を１００ｎＭ上皮増殖因子（ＥＧＦ）又はトランスフォーミング増殖因子ａ（ＴＧＦａ）で刺激し、Ｔ４７Ｄ細胞を２０ｎＭヘレグリンβ（ＨＲＧβ）又は１００ｎｇ／ｍＬインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）で刺激した。刺激された細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、溶解させ（溶解バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）、氷上で３０ｍｉｎ保持した後、その後のアッセイのために上清を採取するか、又は−８０℃で保持した。
【０２４４】
薬剤処置
[0262]細胞を２×１０５細胞／６ウェルプレート上に播種し、３７℃で２４ｈインキュベートし、１μＭ／ｍｌのラパチニブ、フォレチニブ又は組合せで、３７℃で４ｈ処理した。細胞を薬剤処置後に収穫し、遠心分離によりペレット化した。タンパク質分析のために、細胞ペレットを−８０℃で保存した後、タンパク質を抽出した。
【０２４５】
細胞増殖阻害アッセイ
[0263]製造業者のプロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、細胞増殖阻害を決定した。簡単に述べると、細胞（１００μＬ／ウェル中の３×１０３個）を９６ウェルプレート上に播種し、３７℃で２４ｈインキュベートし、３７℃で３ｄ、薬剤（ラパチニブ又はフォレチニブ又は組合せ）で処理した。薬剤処置後、ＭＴＳ溶液を各ウェルに添加し、インキュベーションを３７℃で４ｈ継続した。各ウェルの吸光度値（ＯＤ）を、４９０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて測定した。全ての実験を３回行った。
【０２４６】
実施例４．胃癌治療のための個別化マウスモデル
[0264]本実施例は、胃癌などの特定の腫瘍に対抗するために患者に投与することができる、最も有効な抗癌剤又は抗癌剤の組合せ（例えば、カクテル）を同定する際に医師を補助するためのマウスモデル（「アバター」）を記載する。
【０２４７】
[0265]「アバター」は、ヒト腫瘍由来組織がある患者の癌の個別化されたモデルを作出するために移植されたマウス又は他の動物を含む。この手法の一例においては、患者の胃癌（例えば、びまん型胃癌などのステージＩ又はＩＩの胃癌）を、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１、並びに場合によってはＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３並びに他のシグナル伝達経路成分などの１種又は複数の分析物の存在又は発現及び／若しくは活性化のレベルについて分析する。次いで、患者の腫瘍の小片を免疫不全マウス上に異種移植することにより、特定の胃癌のものである個別化マウスモデルを作出する。次いで、抗癌剤又は抗癌剤の組合せ（例えば、カクテル）への異種移植片の腫瘍応答を試験することができる。例えば、ｃＭＥＴ及びＨＥＲ１の両方が患者の胃癌において活性化されている場合（例えば、ＣＥＥＲ（商標）技術により決定された場合）、ｃＭＥＴ阻害剤とＨＥＲ１阻害剤との組合せを、アバター上に存在する異種移植腫瘍上で試験して、これがその患者の癌にとって有効な処置であるかどうかを決定することができる。異種移植腫瘍が阻害剤カクテルに応答する場合（例えば、腫瘍の収縮）、その特定の組合せ治療を患者に施すことができる。
【０２４８】
[0266]本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。上記発明は、明確に理解するために例示及び実施例によりいくらか詳細に説明されたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び改変を本発明に対して行うことができることは、本発明の教示に照らせば当業者には容易に明らかとなるであろう。
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【図１】
2014517259.tif 000004
【図２】
2014517259.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６Ａ】
2014517259.tif 000016
【図６Ｂ】
2014517259.tif 000017
【図７】
2014517259.tif 000018
【図８】
2014517259.tif 000019
【図９Ａ】
2014517259.tif 000020
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2014517259.tif 000025
【図１１】
2014517259.tif 000026
【図１２】
2014517259.tif 000027
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１５−１０】
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【図１５−１１】
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【図１５−１２】
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【図１５−１３】
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【図１５−１４】
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【図１５−１５】
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【図１５−１６】
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【図１５−１７】
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【図１５−１８】
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【図１５−１９】
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【図１５−２０】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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