(57)【要約】  １つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を有する量子ドット（ＱＤ）を有するＱＤペプチドコンジュゲート体を使用することによって、対象の分子を、細胞壁を有する植物細胞中に導入するための方法が提供される。遺伝的にまたは別の形で植物を改変するためのおよび細胞壁を含む植物細胞における病害を処置するまたは予防するための方法が提供される。
2014511678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の分子を、細胞壁を有する植物細胞中に導入して、植物および種子の安定な形質転換を実施する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、
量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
１つまたは複数の対象の分子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
細胞壁を有する細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、互いに接触させるステップと、
細胞壁を有する細胞中へのＱＤ−ペプチドコンジュゲート体および対象の分子の取り込みを可能にするステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＱＤを１つまたは複数のＣＰＰと相互作用させるステップが、ＱＤの表面上への１つまたは複数のＣＰＰの構築を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の対象の分子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させるステップが、対象の分子の負に荷電した基を、ＣＰＰの末端で荷電アミノ基と相互作用させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の細胞壁を含む植物細胞の区画中への取り込みを可能にすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
区画が、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞壁を含む植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、ワタ、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、オリザ属種（Oryza sp.）、シロイヌナズナ属種（Arabidopsis sp.）、トウゴマ属種（Ricinus sp.）、およびサトウキビの細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやおよび茎から成る群から選択される組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数のＣＰＰが、Ｒ９、ＭＰＧ、ＴＡＴ、γ−ゼイン、およびＭＰＧペプチドから選択される群からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象の分子が、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、遺伝子、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ポリペプチド、酵素、ホルモン、グリコペプチド、糖、脂肪、シグナルペプチド、抗体、ビタミン、メッセンジャー、二次メッセンジャー、アミノ酸、ｃＡＭＰ、薬物、除草剤、殺菌剤、抗生物質、およびそれらの組合せから成る群から選択される成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象の分子が、遺伝子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子が、外来性タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象の分子を安定に組み込んだ細胞を選択することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
選択された細胞が、再生可能な細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
再生可能な細胞から植物を再生することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子を安定に発現させる方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、
量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
１つまたは複数の遺伝子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
細胞壁を有する細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、互いに接触させるステップと、
細胞壁を有する細胞中へのＱＤ−ペプチドコンジュゲート体および１つまたは複数の遺伝子の取り込みを可能にするステップと、
前記植物細胞を有する植物の子孫において、遺伝子を発現させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
遺伝子を葉緑体において発現させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子を安定に発現する細胞を選択することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
植物細胞中に分子性物質を移入するための方法であって、
量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、プラスミドＤＮＡと相互作用させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート構造体を形成するステップと、
活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート構造体を、植物細胞中への１つまたは複数のＣＰＰおよびプラスミドＤＮＡ由来の１つまたは複数の遺伝子の取り込みを可能にする条件下で、無傷の壁を有する植物細胞と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１９】
植物細胞を有する植物の子孫において、遺伝子を安定に発現させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
植物形質転換をスクリーニングするおよび同定する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供するステップと、
量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
１つまたは複数の対象の分子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成するステップと、
細胞壁を有する細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を互いに接触させるステップと、
細胞壁を有する細胞中へのＱＤ−ペプチドコンジュゲート体および対象の分子の取り込みを可能にするステップと、
細胞壁を有する植物細胞をイメージングするステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１１年３月２３日出願の米国仮特許出願第６１／４６６，８０４号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は一般に、１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を有する量子ドット（ＱＤ）を有するＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を使用することによって、対象の分子を、細胞壁を有する植物細胞中に導入するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナノ粒子は、ＤＮＡの細胞への送達における使用に活用されてきたユニークな特性を有する。金（Ａｕ）ナノ粒子などの金属ナノ粒子は、細胞毒性が低く、生物学的意義のある様々なリガンドによる機能化が容易であるので、ＤＮＡ送達に使用されてきた。金属ナノ粒子に加えて、３〜５ｎｍのサイズ範囲内の半導体ナノ粒子（例えば、量子ドット）（「ＱＤ」）も、分子を細胞中に送達するための担体として使用されてきた。ＤＮＡおよびタンパク質は、ＱＤ表面に結合しているリガンドに連結することができる（例えばF. Patolsky et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)を参照されたい）。
【０００４】
ナノ粒子は、プラスミドＤＮＡを種々の動物細胞に送達するために使用されてきた。ＤＮＡで被覆されたナノ粒子を細胞壁を有さない細胞とインキュベートした場合、細胞はナノ粒子を取り込み、ＤＮＡにコードされた任意の遺伝子を発現し始めることが発見された。しかしながら、現在の植物遺伝子送達は、植物細胞壁が存在するため困難であり、したがって、植物の遺伝的形質転換のための侵入型の送達手段を一般に利用している。細胞壁を通常は有する細胞へのナノ粒子媒介送達が望まれる場合には、細胞の壁は、粒子の植物のプロトプラストへの追加の前に、剥奪される（F. Torney et al, Nature Nanotechnol. 2, (2007)を参照されたい）。植物細胞において、細胞壁は、外因的に適用した分子の送達に対する障壁として存在する。遺伝子銃（微粒子銃）、微量注入、エレクトロポレーション、およびアグロバクテリウムのような、多くの侵入型方法が、これらの壁のある植物細胞中への遺伝子および小分子の送達を達成するために用いられてきたが、タンパク質の送達は、微量注入によってのみ達成された。植物細胞壁の存在下での小分子およびタンパク質の送達は、探求されていないままであり、無傷の植物細胞／組織または器官において展開される、インビトロおよびインビボ操作のための実現技術を開発するために有利であろう。
【０００５】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、タンパク質およびＤＮＡを含めた広範なカーゴ複合体が哺乳類およびヒト細胞系における生体膜を通過して移行する上で重要な役割を果たすことが知られている、短いペプチドの新規で急成長しているクラスである。J. Schwartz and S. Zhang (2000), Peptide-Mediated Cellular Delivery, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162-167； U. Langel (2002), Preface in Cell Penetrating Peptides； Processes and Applications, U. Langel, editor, CRC Press, Boca Raton； E. Vives and B. Lebleu (2002), The Tat-Derived Cell-Penetrating Peptide in Cell-Penetrating Peptides； Processes and Applications, U. Langel, editor, CRC Press, Boca Raton, pp. 3-22。ＣＰＰが、哺乳類細胞においてカーゴ送達を促進することが示された一方で、トランスフェクション研究のための植物細胞におけるＣＰＰの使用は、いくつかの要因によって限定されてきた。この技術を植物に適合させることに対する主要な障害は、動物細胞とは違い、植物細胞は、ＣＰＰおよびそのカーゴの内部移行に対して二重の障壁系（細胞壁および細胞膜）を示すことである。したがって、ＣＰＰは、効率的な移行のために、これら２つの障壁を乗り越えなければならない。ＣＰＰは、植物細胞において使用されてきたが、植物細胞へのカーゴ送達の送達を実現するために、ＣＰＰの使用とともに、透過処理剤および技法の使用に典型的に頼っている。ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、最もよく研究された移行ペプチドの１つである。最近の報告は、哺乳類細胞における負に荷電したＤＮＡとの複合体を形成することによる、プラスミド送達のためのＴＡＴ−ＰＴＤおよびそのオリゴマーの可能性を示した。I. Ignatovich, E. Dizhe, A. Pavlotskaya, B. Akifiev, S. Burov, S. Orlov and A. Perevozchikov (2003), Complexes of Plasmid DNA with Basic Domain 47-57 of the HIV-1 Tat Protein Are Transferred to Mammalian Cells by Endocytosis-mediated Pathways, J. Biol. Chem. 278:42625-42636； C. Rudolph, C. Plank, J. Lausier, U. Schillinger, R.H. Muller and J. Rosenecker (2003), Oligomers of the Arginine-Rich Motif of the HIV-1 TAT Protein are Capable of Transferring Plasmid DNA into Cells, J. Biol. Chem. 278:11411-11418； Z. Siprashvili, F. Scholl, S. Oliver, A. Adams, C. Contag, P. Wender and P. Khavari (2003), Gene Transfer via Reversible Plasmid Condensation with Cysteine-Flanked, Internally Spaced Arginine-Rich Peptides, Hum. Gene. Ther. 14 (13):1225-33； I. Hellgren, J. Gorman and C. Sylven (2004), Factors Controlling the Efficiency of Tat-mediated Plasmid DNA Transfer, J. Drug. Target. 12 (1):39-47。移行特性を有することが示された他のペプチドは、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ペネトラチン、ｐｅｐ−１ペプチドおよびそれらの断片を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＱＤをペプチドで被覆することは、様々な生物工学的プロセスのためのナノ粒子表面操作において一般的になった１つの手法である。例えば、ＱＤ表面へのポリアルギニンおよびＴＡＴ由来ペプチドなどの細胞透過性ペプチドをＱＤ表面に付着させることにより、動物細胞中にＱＤを移行することが可能となった。最近、ＣＰＰは、基礎および応用生物医学的研究における分子の細胞送達のためのビヒクルとして幅広く使用されるようになった。それらの助けで、現在、哺乳類細胞中に消化性核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはナノ粒子などの膜不透過性物質を導入することが可能である。植物生物学者にとっては、細胞中への生体分子の送達およびその一過性の発現にＣＰＰを使用することにますます魅力が増している。したがって、ナノ粒子に基づく送達の使用を通した植物における遺伝子および他の対象の分子の安定な組込みの方法への必要性が今なおある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施形態をシステム、ツールおよび方法と組み合わせて記載するが、これらは、典型的および例示的であるものとし、範囲を限定するものではない。
【０００８】
本発明の一実施形態は、対象の分子を、細胞壁を有する植物細胞中に導入して、植物および種子の安定な形質転換を実施する方法を含む。方法は、細胞壁を有する植物細胞を提供することおよび量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成すること、および１つまたは複数の対象の分子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成することを含む。細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、細胞壁を有する細胞中へのその取り込みを可能にする条件下で、互いに接触させる。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、遺伝子を安定に発現させる方法を含む。方法は、細胞壁を有する植物細胞を提供すること、量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成すること、および１つまたは複数の遺伝子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成することを含む。細胞壁を有する植物細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を互いに接触させ、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体および１つまたは複数の遺伝子を、細胞壁を有する植物細胞中へのその取り込みを可能にする条件下に置く。次いで、その植物細胞を有する植物の子孫において遺伝子を発現させる。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態は、植物細胞中に分子性物質を移入するための方法を含む。方法は、量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成すること、およびＱＤ−ペプチドコンジュゲート体をプラスミドＤＮＡと相互作用させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート構造体を形成することを含む。活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート構造体を、植物細胞中への１つまたは複数のＣＰＰおよびプラスミドＤＮＡ由来の１つまたは複数の遺伝子の取り込みを可能にする条件下で、無傷の壁を有する植物細胞と接触させる。
【００１１】
本発明の別の特定の実施形態は、植物形質転換をスクリーニングするおよび同定する方法を含む。方法は、細胞壁を有する植物細胞を提供すること、量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成すること、および１つまたは複数の対象の分子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成することを含む。細胞壁を有する細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、互いに接触させ、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体および対象の分子を、細胞壁を有する植物細胞中へのその取り込みを可能にする条件下に置く。次いで、細胞壁を有する植物細胞を、イメージングする。
【００１２】
上述の典型的な態様および実施形態に加えて、別の態様および実施形態が、以下の記述を考慮して明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】量子ドット／ペプチドコンジュゲート体の実施形態を例示する図である。
【図２】ｐＤＡＢ３８３１のプラスミドマップを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の記述および表において、いくつかの用語を使用する。かかる用語が与えられる範囲を含めた、明細書および特許請求の範囲の明白かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００１５】
戻し交配。戻し交配は、栽培者が、ハイブリッド子孫を親の１つに戻って、例えば、第１世代ハイブリッドＦ１をＦ１ハイブリッドの親の遺伝型の１つと繰り返して交配させるプロセスとすることができる。
【００１６】
胚。胚は、成熟種子内に含有される小さい植物とすることができる。
【００１７】
除草剤に対して抵抗性がある。ある用量の除草剤に対する抵抗性は、その用量の除草剤によって植物が生存する能力（すなわち、植物を死滅させることができない）を表す。いくつかの場合において、耐性がある植物は、一時的に黄色になるかまたはそうでなければある除草剤誘発障害（例えば、過剰な分げつおよび／または成長阻害）を示し得るが、回復する。
【００１８】
安定化。安定化は、同じ品種の自殖の植物の１つの世代から次の世代へ再現可能に伝わる植物の特徴を表す。
【００１９】
取り込み。取り込みは、量子ドット、担体ペプチド、細胞透過性ペプチド、およびホーミングペプチドなどの粒子の細胞壁または細胞膜を通過する移行を表し、ここで、移行は、粒子が取り込まれている細胞以外の何かによって粒子に与えられる運動量の結果だけでは起こらない。粒子に与えられる運動量の結果だけで粒子の細胞壁または細胞膜を通過する移行を引き起こすデバイスまたは方法の非限定的な例は、微粒子銃、遺伝子銃、マイクロインジェクション、および／またはインペールフェクション（impalefection）テクノロジーである。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態において、「付加」または「ゲスト」分子の複数の付着部位または充填は、１つまたは複数のペプチドの様々なおよび／または複数の部位に対して操作することができる。この特性を、例えば、形質および病害抵抗性オプションのための種々の樹木または野菜作物における、バイオミメティクスなどの領域のための細胞内の分子の部位の特異的なターゲティングおよびエディティング、非遺伝的に改変された生物オプションのための標的送達、および一過性の形質転換オプションにおいて、用いることができる。本発明の実施形態を用いて、適したバイオセンサーを開発することもできる。さらに、人工染色体（ＡＣＥＳ）を、正確なターゲティングおよび相同組換えオプションのために、現在の真核生物ベクターの代替物として、本発明の方法とともに用いることができる。
【００２１】
本発明の特定の実施形態は一般に、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡなどの負に荷電した分子の送達に適した多機能の蛍光ナノ粒子の使用に関する。Ｒ９、ＴＡＴ、ＭＰＧおよびγ−ゼインなどの、担体および細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）／ホーミングペプチド（ＨＰ）（本明細書で集合的に「ＣＰＰ」と称する）を、発光量子ドット（ＱＤ）の表面上で組み込んだ。ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、シロイヌナズナ（Arabidopsis）インプランタ経路中への効率的なＤＮＡ送達に使用した。ＱＤ−ペプチドバイオコンジュゲート体は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）花軸成長および結実に関して毒性効果を示さなかった。いくつかの安定なＴ１形質転換体を同定し、実生を分析した。ＱＤを使用した、ＤＮＡの担体に基づく送達および安定な形質転換の樹立が、植物において示された。複合体ペイロードを、高性能のオプションで操作して、生体分子を送達しかつ細胞および細胞区画中に正確にターゲティングすることができる。特定の実施形態において、かかる自己発光ＱＤの使用を、植物におけるイメージングオプションに使用することができる。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態に従って、対象の分子を、細胞壁を有する植物細胞中に導入して、植物および種子の安定な形質転換を実施する方法が提供され得る。方法は、細胞壁を有する植物細胞を提供することおよび量子ドット（ＱＤ）を１つまたは複数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と相互作用させて、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成すること、および１つまたは複数の対象の分子を１つまたは複数のＣＰＰに付着させて、活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を形成することを含む。細胞および活性化ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、細胞壁を有する細胞中へのその取り込みを可能にする条件下で、互いに接触させる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、いくつかのペプチドを、ＱＤナノ粒子に共有結合的に結合させ、植物細胞中に送達した。Ｒ９、γ−ゼインおよびＭＰＧ  ＣＰＰを有するナノ粒子を、植物中に成功的に送達して、植物の安定な形質転換を達成した。他の実施形態において、標識した生体分子を使用して、細胞質におけるカーゴの運命を追跡した。これらのＱＤ−ペプチド−ＤＮＡコンジュゲート体の効果的な取り込みを達成し、ＤＮＡおよびＱＤ−ペプチドコンジュゲート体間の複合体は、種子および回復した抵抗性Ｔ１実生を通して伝達される安定な形質転換によって実証されるように、安定であった。
【００２４】
他の態様において、本発明は、生物機能化された（biofunctionalized）生体分子の高性能の送達（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡおよび酵素送達）、イメージングのための、および様々な生物工学的診断およびセンサー機能のための多機能化オプションのためのペイロードとしてのＱＤ「担体」ペプチド−コンジュゲート体の適用に関する。本戦略は、かなり適応可能である表面およびカプセル化化学的手法を提供することができ、したがって、異なる機能性を有する広範囲の分子の合成を促進する。生体分子におけるこれらの材料の潜在的な使用および遺伝子送達の観点での重要な特性は、かかる系において入手可能である高密度の末端基によって規定される。これらは、分子表面特徴に寄与し、（例えば、シグナルまたはターゲティング部位のコンジュゲーションのための）複数の付着部位を提供し、分子容を決定するが、これは、他の分子をこの複合体に隔離するための能力に重要である。コンジュゲートした担体ペプチドは、ＱＤおよび付着したカーゴの両方の送達のために同時に機能する。さらに、カーゴを直接的に担体ペプチドに複合体化することによって、ＱＤ表面上で付着した種の数におけるトレードオフを、除去することができる。負に荷電したオリゴヌクレオチドは、それらだけで細胞壁／膜障壁および細胞膜を移行することができないので、本発明は、とりわけ、ＤＮＡ組込み、遺伝子制御、およびエディティング戦略のための効果的な送達系を提供する。
【００２５】
本発明の実施形態に従って、細胞壁を有する植物細胞は、無傷の細胞壁全体を含む任意の植物細胞とすることができる。細胞壁を有する細胞の例は、藻類、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、ワタ、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、サトウキビ、オリザ属種（Oryza sp.）、シロイヌナズナ属種（Arabidopsis sp.）、およびトウゴマ属種（Ricinus sp.）、好ましくはタバコ、ニンジン、トウモロコシ、ワタ、キャノーラ、ダイズおよびサトウキビ；より好ましくはタバコおよびニンジンを含むがこれらに限定されない。本発明の実施形態は、胚、分裂組織の細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎および組織培養物を含むがこれらに限定されない、任意の組織由来の、またはそれらがどこにおいて発見されても、細胞壁を含む細胞を含むことができる。
【００２６】
本発明の実施形態において、対象の分子は、本発明に従って植物細胞に送達することができる任意の分子とすることができる。対象の分子、または対象の分子の成分は、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、遺伝子、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、植物人工染色体、植物ミニ染色体、植物改変形質遺伝子座ＤＮＡ（Plant Engineered Trait Loci DNA）；ポリペプチド、酵素、ホルモン、グリコペプチド、糖、脂肪、シグナル伝達ペプチド、抗体、ビタミン、メッセンジャー、二次メッセンジャー、アミノ酸、ｃＡＭＰ、薬物、除草剤、殺菌剤、抗生物質、および／またはそれらの組合せを含むことができるがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明の実施形態は、病害の予防または治療のための方法を含む。非限定的な例である実施形態は、本発明の方法を使用しての、殺菌剤、抗生物質、および／または他の薬物のそれらを必要としている細胞への送達を含む。
【００２８】
本発明の態様において、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体は、細胞の様々な部分中に取り込まれ得る。ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を取り込むことができる位置の例は、サイトゾル、核、トノプラスト、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔を含むがこれらに限定されない。本発明の他の実施形態において、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の細胞壁を含む細胞中への取り込みは、シンプラストまたはアポプラスト経路経由で起こることができる。
【００２９】
本発明の追加の実施形態は、遺伝的に改変された植物細胞およびそれらを生み出すための方法を含み、ここで、植物細胞は、本発明の方法を通してそこに導入された１つまたは複数の核酸を有する。実施形態の１つの例において、対象の遺伝子および選択マーカーを含むプラスミドは、本発明によるＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を通して細胞壁を有する植物細胞中に導入することができる。別の実施形態において、安定な形質転換体は、対象の遺伝子および／または選択マーカーを安定に組み込んだものから選択することができる。代替の実施形態において、現在対象の遺伝子を含む植物細胞を、増殖し、対象の分子を含む他の細胞を作製することができる。他の実施形態において、現在対象の分子を含む植物細胞は、対象の分子を含む植物全体を再生するために使用することができる再生可能な細胞とすることができる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、組織培養物において使用するための、対象の分子を含む再生可能な植物細胞を作り出す方法を提供する。組織培養物は、好ましくは、再生可能な細胞と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生する能力があろう。かかる組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織の細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやまたは茎とすることができる。まださらに、本発明の実施形態は、本発明の組織培養物から再生した植物を提供する。
【００３１】
代わりに、本発明は、所望の形質を細胞壁を有する植物細胞中に導入する方法であって、植物細胞に所望の形質を提供する能力があるＱＤ−ペプチドコンジュゲート体および対象の分子を、植物細胞と接触させ、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の細胞壁を通過する取り込みを可能にすることを含む方法を提供する。所望の形質の例は、雄性不稔、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、ならびに細菌性病害、真菌性病害、および／またはウイルス性病害に対する抵抗性から選択される形質を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
本発明の別の態様は、所望の形質または対象の分子を含む安定化した植物系統を生み出す方法であって、所望の形質または対象の分子を、植物細胞壁を通過するＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の取り込みによって最初に導入することができる方法を提供する。安定化した植物系統を生み出す方法は、当業者によく知られており、自殖、戻し交配、ハイブリッド作製、個体群への交配などの技法を含むことができるがこれらに限定されない。細胞壁を通過するＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の取り込みによって植物細胞（またはその祖先）中に最初に導入された、所望の形質または対象の分子を含むすべての植物および植物細胞は、本発明の範囲内である。有利にも、細胞壁を通過するＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の取り込みによって植物または細胞（またはその祖先）中に最初に導入された所望の形質または対象の分子を含む植物細胞を、他の、異なる、植物細胞との交配において使用し、優位な特徴を有する第１世代（Ｆ１）ハイブリッド細胞、種子、および／または植物を作製することができる。
【００３３】
対象の分子が１つまたは複数の遺伝子を含む実施形態において、遺伝子（１つまたは複数）は、優性または劣性対立遺伝子とすることができる。例として、遺伝子（１つまたは複数）は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌抵抗性のための抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス性病害抵抗性、雄性稔性、雄性不稔、強化された栄養価、および工業利用のような形質を付与するであろう。
【００３４】
特異的なタンパク質またはＲＮＡ産物（例えばＲＮＡｉ）をコードする遺伝子の単離および特徴づけを可能にした分子生物学的技法の出現で、植物生物学の分野の科学者は、特異的な様式で細胞の形質を改変するために、外来性遺伝子、または天然もしくは内在性遺伝子の追加もしくは改変バージョン（おそらく異なるプロモーターによって駆動される）を含有し発現するように細胞のゲノムを操作することへの強い興味をもつようになった。かかる外来性、追加および／または改変遺伝子は、本明細書で、集団的に「導入遺伝子」と呼ぶ。この１５から２０年にわたり、トランスジェニック細胞を作製するためのいくつかの方法が開発され、特定の実施形態において、本発明は、細胞の形質転換のバージョン、ならびにＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の細胞壁を通過する取り込みを通して導入遺伝子を細胞壁を有する細胞中に導入することを通して、それらを作製する方法に関する。本発明の実施形態において、導入遺伝子は、発現ベクター中に含有されていてもよい。
【００３５】
細胞形質転換は、特定の細胞において機能するであろう発現ベクターの構築を伴うことができる。かかるベクターは、制御エレメント（例えば、プロモーター）の調節下にある、または制御エレメントに作動可能に連結している遺伝子を含むＤＮＡを含むことができる。発現ベクターは、１つまたは複数のかかる作動可能に連結している遺伝子／制御エレメント組合せを含有することができる。ベクター（１つまたは複数）は、プラスミドの形であってよく、導入遺伝子（１つまたは複数）を細胞壁を含む植物細胞の遺伝子材料中へ組み込むための本明細書で記載したような形質転換方法を使用して、単独または他のプラスミドと組み合わせて使用し、形質転換細胞を提供することができる。
【００３６】
本発明の方法によるＱＤ−ペプチドコンジュゲート体の使用は、安定に形質転換された植物を作製し、高い除草剤耐性がトランスジェニックＴ１植物中に与えられた表現型を有する安定に形質転換された除草剤遺伝子の発現を実証した。この植物は、それが、Ｔ２種子を作製したので、稔性であることが示された。
【００３７】
ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を介した取り込みのための発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、マーカーを含有する形質転換細胞が、ネガティブ選択（すなわち、選択マーカー遺伝子を含有しない細胞の増殖を阻害すること）によってまたはポジティブ選択（すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物をスクリーニングすること）によって回収されることを可能にする、制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結している少なくとも１つの遺伝子マーカーを含むことができる。形質転換のための多くの選択マーカー遺伝子は、形質転換技術においてよく知られており、例えば、抗生物質もしくは除草剤、または阻害剤に対して非感受性であることができる改変標的をコードする遺伝子とすることができる、選択的な化学薬品を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかのポジティブ選択方法も、当技術分野で知られている。
【００３８】
植物形質転換に適した１つの一般的に使用される選択マーカー遺伝子は、植物制御シグナルの調節下にある、カナマイシンに対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔｌｌ）遺伝子を含むことができる。例えば、Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983)を参照されたい。別の一般的に使用される選択マーカー遺伝子は、抗生物質のハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とすることができる。例えば、Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol, 5:299 (1985)を参照されたい。
【００３９】
抗生物質に対する抵抗性を付与する、細菌起源の追加の選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマイシン抵抗性決定要因を含む。Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988)；Jones et al, Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987)；Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990)；Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986)を参照されたい。他の選択マーカー遺伝子は、グリフォセート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する抵抗性を付与する。Comai et al, Nature 317:741-744 (1985)；Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)；およびStalker et al., Science 242:419-423 (1988)を参照されたい。
【００４０】
植物形質転換に適した他の選択マーカー遺伝子は、細菌起源のものではない。これらの遺伝子は、例えば、マウスジヒドロ葉酸還元酵素、植物５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼおよび植物アセト乳酸シンターゼを含む。Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987)；Shah et al, Science 233:478 (1986)；Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990)を参照されたい。
【００４１】
植物形質転換に適したマーカー遺伝子の別の群は、抗生物質などの毒性物質に対する抵抗性に関する形質転換細胞の直接的な遺伝子選択よりはむしろ仮定的に形質転換された植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特異的な組織における遺伝子の発現の空間パターンを定量化または可視化するために特に有用であり、しばしばレポーター遺伝子と呼ばれる。なぜならそれらは、遺伝子発現の調査のための遺伝子または遺伝子制御配列に融合することができるからである。形質転換細胞をスクリーニングするための一般的に使用される遺伝子は、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む。R. A. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987)；Teeri et al, EMBO J. 8:343 (1989)；Koncz et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84: 131 (1987)、DeBlock et al, EMBO J. 3: 1681 (1984)を参照されたい。
【００４２】
最近、植物組織の破壊を必要としない、ＧＵＳ活性を可視化するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が利用可能になった。Molecular Probes publication 2908, Imagene Green(商標), p. 1-4(1993)およびNaleway et al., J. Cell Biol. 115: 151a (1991)。しかしながら、ＧＵＳ活性を可視化するためのこれらのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法は、低感受性、高い蛍光バックグラウンド、および選択マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連する制限のために、形質転換細胞の回収に有用であると判明していない。
【００４３】
つい最近になって、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（例えばＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、およびＹＦＰ）をコードする遺伝子が、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現に関するマーカーとして利用された。Chalfie et al., Science 263:802 (1994)を参照されたい。蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の変異体は、スクリーニング可能なマーカーとして使用することができる。
【００４４】
ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を介した取り込みのための発現ベクター：プロモーター
発現ベクターに含まれる遺伝子は、制御エレメント、例えば、プロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。プロモーターのいくつかの型が、単独またはプロモーターと組み合わせて使用することができる他の制御エレメントのように、形質転換技術において現在よく知られている。
【００４５】
本明細書では、「プロモーター」は、転写の開始から上流であってもよく、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始するための他のタンパク質の認識および結合に関与することができるＤＮＡの領域への参照を含む。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始する能力があるプロモーターとすることができる。発生調節下にあるプロモーターの例は、葉、根、種子、繊維、木部導管、仮導管、または厚壁組織などのいくつかの組織において、優先的に転写を開始するプロモーターを含む。かかるプロモーターは、「組織優先」と呼ばれる。いくつかの組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、１つまたは複数の器官におけるいくつかの細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞における発現を主に駆動する。「誘導性」プロモーターは、環境的調節下にあることができるプロモーターとすることができる。誘導性プロモーターによって転写をもたらすことができる環境条件の例は、嫌気性条件または光の存在を含む。組織特異的、組織優先、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターの群を構成する。「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であることができるプロモーターとすることができる。
【００４６】
Ａ．誘導性プロモーター
誘導性プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい。任意選択で、誘導性プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。誘導性プロモーターでは、誘導剤に応答して転写の速度が上昇する。
【００４７】
任意の誘導性プロモーターを、本発明において使用することができる。Ward et al, Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993) を参照にされたい。典型的な誘導性プロモーターは、銅に応答する、ＡＣＥＩ系由来のもの（Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)）；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に応答する、トウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Hershey et al, Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)；およびGatz et al, Mol. Gen. Genetics 243 :32-38 (1994)）；ならびにＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)）を含むがこれらに限定されない。特に有用な誘導性プロモーターは、植物が通常は応答しない誘導剤に応答するプロモーターとすることができる。典型的な誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターとすることができ、その転写活性は、糖質コルチコイドホルモンによって誘導することができる。Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991)。
【００４８】
Ｂ．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよいか、または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。
【００４９】
異なる構成的プロモーターを、本発明において利用することができる。典型的な構成的プロモーターは、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター（Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)）などの、植物ウイルス由来のプロモーター；イネアクチン遺伝子由来のプロモーター（McElroy et al, Plant Cell 2: 163-171 (1990)）；ユビキチン（Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989)およびChristensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)）；ｐＥＭＵ（Last et al., Theor. Appl. Genet. 81 :581-588 (1991)）；ＭＡＳ（Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)）；およびトウモロコシＨ３ヒストン（Lepetit et al, Mol. Gen. Genetics 231 :276-285 (1992)およびAtanassova et al., Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992)）を含むがこれらに限定されない。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’側にあるＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（または該Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片に類似したヌクレオチド配列）であるＡＬＳプロモーターは、特に有用な構成的プロモーターを代表する。ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５３０を参照されたい。
【００５０】
Ｃ．組織特異的または組織優先プロモーター
組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい。任意選択で、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結していてもよい、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。組織特異的プロモーターに作動可能に連結している対象の遺伝子で形質転換した植物は、排他的、または優先的に、特異的な組織において、導入遺伝子のタンパク質産物を産生することができる。
【００５１】
任意の組織特異的または組織優先プロモーターを、本発明において利用することができる。典型的な組織特異的または組織優先プロモーターは、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根に好ましいプロモーター（Murai et al., Science 23:476-482 (1983)およびＳengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)）；ｃａｂまたはリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ由来のものなどの葉特異的および光誘導プロモーター（Simpson et al, EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985)およびTimko et al., Nature 318:579-582 (1985)）；ＬＡＴ５２由来のものなどの葯特異的プロモーター（Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)）；Ｚｍｌ３由来のものなどの花粉特異的プロモーター（Guerrero et al, Mol. Gen. Genetics 244: 161-168 (1993)）またはａｐｇ由来のものなどの小胞子に好ましいプロモーター（Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)）を含むがこれらに限定されない。
【００５２】
導入遺伝子によって産生されたタンパク質の、葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁またはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送またはアポプラスト中への分泌のための輸送は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、対象のタンパク質をコードする遺伝子の５’および／または３’領域に作動可能に連結することによって達成することができる。構造遺伝子の５’および／または３’末端にある標的配列は、タンパク質合成およびプロセシングの間、コードされたタンパク質が最終的にどこに区画化されることができるかを決定することができる。代わりに、かかる細胞内区画ターゲティングタンパク質を、ＱＤ−ペプチドコンジュゲート体に直接的に結合して、対象の分子で被覆されたＱＤ−ペプチドコンジュゲート体を、所望の細胞内区画に方向づけることができる。
【００５３】
シグナル配列の存在は、ポリペプチドを細胞内オルガネラもしくは細胞内区画に、またはアポプラストへの分泌に向ける。多くのシグナル配列は、当技術分野で知られている。例えば、Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992)；Close, P.S. Close, Master's Thesis, Iowa State University (1993)；C. Knox et al., "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley," Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987)；Lerner et al, Plant Physiol. 91 : 124-129 (1989)；Fontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991)；Matsuoka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991)；Gould et al., J. Cell. Biol. 108: 1657 (1989)；Creissen et al, Plant J. 2: 129 (1991)；Kalderon et al, A short amino acid sequence able to specify nuclear location, Cell 39:499-509 (1984)；Steifel et al., Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation, Plant Cell 2:785-793 (1990)を参照されたい。
【００５４】
外来性タンパク質遺伝子および農学的遺伝子
本発明によるトランスジェニック植物では、外来性タンパク質を、商業的量で産生することができる。したがって、当技術分野でよく理解されている、形質転換植物の選択および繁殖のための技法により、多数のトランスジェニック植物をもたらし、それらを従来の様式で回収し、次いで、外来性タンパク質を、対象の組織からまたは総バイオマスから抽出することができる。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)によって考察されている、既知の方法によって達成することができる。
【００５５】
本発明の態様において、外来性タンパク質の商業的産生のために提供されるトランスジェニック植物は、細胞または植物とすることができる。他の態様において、対象のバイオマスは、種子とすることができる。より高い発現レベルを示す、比較的少数のトランスジェニック植物に関して、主に従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲおよびＳＳＲ分析を通して、組み込まれたＤＮＡ分子の近似の染色体位置を同定する遺伝子地図を作製することができる。これに関する典型的な方法について、Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993)を参照されたい。染色体位置に関する地図情報は、対象のトランスジェニック植物の専売保護に有用であってよい。権限のない繁殖を企てることができ、他の生殖質との交配が行われた場合、組み込み領域の地図を、疑わしい植物に関する類似の地図と比較し、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうか決定することができる。地図の比較は、すべて従来の技法である、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲおよび配列決定を伴うであろう。
【００５６】
同様に、農学的遺伝子は、形質転換細胞またはそれらの子孫において発現させることができる。より詳細には、植物を、本発明の方法を通して遺伝的に操作し、農学的に興味のある様々な表現型を発現させることができる。この点に関して使用することができる典型的な遺伝子は、以下に分類したものを含むがこれらに限定されない。
【００５７】
１．有害生物または病害に対する抵抗性を付与し、以下のものをコードする遺伝子：
Ａ）植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、植物における病害抵抗性遺伝子（Ｒ）の産物と病原体における対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物との間の特異的な相互作用によってしばしば活性化される。植物変種を、クローン化された抵抗性遺伝子で形質転換し、特異的な病原体株に対する抵抗性がある植物を遺伝子工学で作ることができる。例えば、Jones et al., Science 266:789 (1994)（クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性に関するトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）；Martin et al., Science 262: 1432 (1993)（プロテインキナーゼをコードするトマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）に対する抵抗性のためのトマトＰｔｏ遺伝子）；Mindrinos et al, Cell 78: 1089 (1994)（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のためのシロイヌナズナ（Arabidopsis）ＲＳＰ２遺伝子）を参照されたい。
Ｂ）ダイズシストセンチュウ（soybean cyst nematode）などの有害生物に対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５１７；ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１９１８１を参照されたい。
Ｃ）バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルとして作られた合成ポリペプチド。例えば、Ｂｔδ内毒素遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を開示している、Geiser et al, Gene 48: 109 (1986)を参照されたい。さらに、δ内毒素遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．から購入することができる。
Ｄ）レクチン。例えば、いくつかのクリビア・ミニアタ（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)による開示を参照されたい。
Ｅ）アビジンなどの、ビタミン結合タンパク質。ＰＣＴ出願ＵＳ９３／０６４８７を参照されたい。その出願は、害虫に対する幼虫駆除剤としてのアビジンおよびアビジン相同体の使用を教示している。
Ｆ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。例えば、Abe et al, J. Biol. Chem. 262: 16793 (1987)（イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）、Huub et al., Plant Molec. Biol. 21 :985 (1993)（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、Sumitani et al, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243 (1993)（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）アルファ−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）および米国特許第５，４９４，８１３号（Hepher and Atkinson，１９９６年２月２７日に発行された）を参照されたい。
Ｇ）エクジステロイドもしくは幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモンもしくはフェロモン、それらの変異体、それに基づく模倣体、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニスト。例えば、Hammock et al, Nature 344:458 (1990)による、幼若ホルモンの失活剤、クローン化された幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現の開示を参照されたい。
Ｈ）発現するとすぐに、影響される有害生物の生理機能を乱す、昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994)（発現クローニングは、昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡをもたらす）およびPratt et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989)（アロスタチン（allostatin）は、ジプロプテラ・プンタータ（Diploptera puntata）において同定することができる）の開示を参照されたい。昆虫特異的、麻痺性神経毒をコードする遺伝子を開示している、Ｔｏｍａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，２６６，３１７号も参照されたい。
Ｉ）ヘビ、スズメバチ、または任意の他の生物によって天然において産生される昆虫特異的毒液。例えば、サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示に関して、Pang et al, Gene 116: 165 (1992)を参照されたい。
Ｊ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積を司る酵素。
Ｋ）翻訳後修飾を含めた、生物学的に活性のある分子の修飾に関与する酵素：例えば、天然であろうと合成であろうと、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。ｃａｌｌａｓｅ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の名前でのＰＣＴ出願ＷＯ９３／０２１９７を参照されたい。キチナーゼコード配列を含有するＤＮＡ分子は、例えば、受託番号３９６３７および６７１５２の下で、ＡＴＣＣから得ることができる。タバコスズメガのキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を教示している、Kramer et al, Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)、およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供している、Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21 :673 (1993)も参照されたい。
Ｌ）シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)による、リョクトウのカルモジュリンｃＤＮＡクローンに関するヌクレオチド配列の開示、およびトウモロコシのカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提供している、Griess et al, Plant Physiol. 104: 1467 (1994)を参照されたい。
Ｍ）疎水性モーメントペプチド（moment peptide）。ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６７７６（真菌植物病原体を阻害するＴａｃｈｙｐｌｅｓｉｎのペプチド誘導体の開示）およびＰＣＴ出願ＷＯ９５／１８８５５（病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチドを教示している）を参照されたい。
Ｎ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断薬。例えば、Jaynes et al, Plant Sci. 89:43 (1993)の、遺伝子導入タバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にするための、セクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発現の開示を参照されたい。
Ｏ）ウイルス侵入型タンパク質またはそこ由来の複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、コートタンパク質遺伝子が由来してもよいウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされる、ウイルス感染および／または病害の発症に対する抵抗性を与える。Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990)を参照されたい。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチ病ウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介抵抗性は、形質転換植物に付与されてきた。同文献。
Ｐ）昆虫特異的抗体またはそこ由来の免疫毒素。したがって、昆虫の腸における重大な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を失活させ、昆虫を殺すであろう。Taylor et al, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)（単鎖抗体断片の作製を通しての遺伝子導入タバコにおける酵素失活）を参照されたい。
Ｑ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウイルス攻撃から保護されることを示す、Tavladoraki et al, Nature 366:469 (1993)を参照されたい。
Ｒ）病原体または寄生虫によって天然に産生される、発育停止タンパク質。例えば、真菌エンドα−ｌ，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−ｌ，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌のコロニー形成および植物栄養分放出を促進する。Lamb et al., Bio/Technology 10: 1436 (1992)を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴づけは、Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)によって報告され得る。
Ｓ）植物によって天然に産生される、発育停止タンパク質。例えば、Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992)は、オオムギリボソーム失活遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌病害に対する抵抗性の増加を有することを示した。
【００５８】
２．以下の除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子：
Ａ）イミダゾリノン、スルホンアミドまたはスルホニル尿素などの、成長点または分裂組織を阻害する除草剤。このカテゴリーの典型的な遺伝子は、例えば、それぞれ、Lee et al, EMBO J. 7: 1241 (1988)、Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)によって報告されているような、変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。
Ｂ）グリフォセート（例えば、それぞれ、変異５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子（組換え核酸の導入および／または天然のＥＰＳＰ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏでの突然変異誘発の様々な形を通して）、ａｒｏＡ遺伝子およびグリフォセートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によって付与される抵抗性）、グルホシネート（ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリジクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含めた、ストレプトマイセス属（Streptomyces）種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）などの他のホスホノ化合物、ならびにピリジノキシ（pyridinoxy）またはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）。例えば、植物にグリフォセート抵抗性を付与することができる、ＥＰＳＰの形のヌクレオチド配列を開示している、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，９４０，８３５号、およびＢａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌへの米国特許第６，２４８，８７６号を参照されたい。変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉへの米国特許第４，７６９，０６１号において開示され得る。Ｋｕｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．への欧州特許出願第０３３３０３３号、およびＧｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与する、グルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．への欧州出願第０２４２２４６号において提供されることができ、DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)は、ＰＡＴ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製を報告している。セトキシジムおよびハロキシホップなどの、フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノンに対する抵抗性を付与する典型的な遺伝子は、Marshall et al, Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)によって報告されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子を含む。グリフォセート抵抗性を付与する能力があるＧＡＴ遺伝子は、Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．へのＷＯ２００５０１２５１５において報告されている。２，４−Ｄ，フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子は、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣに付与されたＷＯ２００５１０７４３７において報告されている。
Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）などの、光合成を阻害する除草剤。Przibila et al, Plant Cell 3: 169 (1991)は、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドを用いたクラミドモナスの形質転換を報告している。ニトリラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒへの米国特許第４，８１０，６４８号において開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１、および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現は、Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992)において報告されている。
【００５９】
３．以下のものなどの、価値が追加された形質を付与するまたはこれに寄与する遺伝子：
Ａ）例えば、植物をステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で形質転換し、その植物のステアリン酸含量を増加させることによる、修飾脂肪酸代謝。Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992)を参照にされたい。
Ｂ）減少したフィチン酸含量１）フィターゼコード遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を強化し、形質転換植物に遊離のリン酸をさらに追加するであろう。クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示に関して、例えば、Van Hartingsveldt et al., Gene 127:87 (1993)を参照されたい。２）遺伝子は、減少したフィチン酸含量を達成するために導入することができよう。例えばトウモロコシにおいて、これを、フィチン酸の低いレベルによって特徴付けられるトウモロコシ変異体を司ることができる、単一の対立遺伝子と関連するＤＮＡをクローニングし、次いでこれを再導入することによって、達成することができよう。Raboy et al., Maydica 35:383 (1990)を参照にされたい。
Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分枝パターンを修飾する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによってもたらされる、修飾炭水化物組成物。Shiroza et al., J. Bacteol. 170:810 (1988)（連鎖球菌変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Steinmetz et al, Mol. Gen. Genet. 20:220 (1985)（レバンスクラーゼ遺伝子とすることができる、枯草菌（Bacillus subtilis）のヌクレオチド配列）、Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992)（αアミラーゼとすることができる、バチルス・リケニフォン（Bacillus lichenifonn）を発現するトランスジェニック植物の作製）、Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21 :515 (1993)（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Sogaard et al, J. Biol. Chem.268:22480 (1993)（オオムギαアミラーゼ遺伝子のものとすることができる、部位特異的突然変異誘発）、およびFisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993)（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい。
（実施例）
【００６０】
本発明を、例示のために提供し、いかなる様式においても本発明を限定することを意図しない、以下の実施例においてさらに記載する。
【実施例１】
【００６１】
ペプチドの合成
以下の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列；Ｒ９（Futaki et al., 2001, Suzuki et al., 2002）、ＭＰＧ（Morris, 1997 and Morris, 1999）、およびγ−ゼイン（Kogan et al., 2001 and 2002）を、表１において一覧にする。これらのペプチドを、Ｃ末端アミドとしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって、合成した。試料の完全性を、技術で認められたプロトコールを使用して、質量分光光度計を使用して、試験した。
【００６２】
【表１】
2014511678.tif 000003
【００６３】
量子ドット−ペプチドコンジュゲート体の調製
量子ドット（ＱＤ）およびＣＰＰコンジュゲート体を作製した。
ＥｖｉｄｅｎｔＴｅｃｈ（Ｔｒｏｙ、ＮＹ）から購入したアミン官能化量子ドットを、約１ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを、２００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４中の２００μｌのアミン量子ドット（ＱＤ５１４；ｎ＝２．３ｎｍｏｌ）に加えることによって、活性化した。ＣＰＰを、コンジュゲーション緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）においてマレイミド活性化量子ドットと独立的に混合し、４℃で終夜インキュベートした。コンジュゲーション後、ＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体を９０，０００ｒｐｍで３時間、遠心分離し、ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液に溶解した。１：１００から１：３００までのＱＤ対ＣＰＰモル比でＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体を調製した。
【００６４】
ＱＤカーゴ上での細胞透過性ペプチド媒介ＤＮＡ送達
プラスミドＤＮＡ、ｐＤＡＢ３８３１（図１）を、ＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体と複合体化した。ＤＮＡをＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体と複合体化するのに先立って、プラスミドＤＮＡを、変性させ、再アニールさせた。これは、ＤＮＡを希釈してデオキシリボヌクレアーゼを含まない水において１０μｌの最終体積にすることによって完了した。溶液を、溶液を７０℃に５分間加熱し、次いで溶液を室温にゆっくり冷却させることによって変性させた。次いでＤＮＡを、１：１００のＣＰＰ−ＤＮＡ対ＱＤの最終濃度でＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体と複合体化した。ＱＤ−ＣＰＰ−ＤＮＡ複合体形成を３７℃で１時間、行った。最後に、無菌の３％スクロースを、１０ｍｌの最終体積が達成されるまで加えた。ＱＤ−ＣＰＰ−ＤＮＡ複合体溶液を使用して、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の花芽を形質転換した。
【００６５】
ＱＤ−ＣＰＰ−ＤＮＡ複合体でのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換
インプランタ形質転換のための植物材料
種子の同期化した発芽は、Ｔ０植物における花の発生の均一性を保証するために重要である。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana cv. Columbia）由来の種子を０．１％寒天溶液に懸濁し、４℃で４８時間インキュベートして、層積処理（stratification）を完了した。６０ｍｇの種子を秤量し、１５ｍｌ管に移した。１３ｍｌの０．１％寒天溶液を加え、種子が均等に分散されるまでボルテックスした。これは、４．６ｍｇ種子／１ｍｌ溶液（または約２３０種子／ｍｌ）の濃度を作製する。６つの管（７２ｍｌ溶液）を調製して、各トレーにおいて１８の（３−１／２インチ；８．８９−ｃｍ）鉢を含有する４つの平箱に播種した。種子を４℃で４８時間インキュベートして、層積処理を完了した。各鉢に、鉢あたり１．０ｍｌの層積処理した種子で個々に播種した。すべての鉢に播種した時、繁殖ドーム（propagation dome）をトレー上に置いて、土壌を多湿に維持した。ドームを、播種日後５日で除去した。種子を発芽させ、植物を、一定温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下での１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓｅｃの光強度で、長日条件（明所１６時間／暗所８時間）下でＣｏｎｖｉｒｏｎ（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）において栽培した。植物の播種後１０から１４日に、植物に、Ｈｏａｇｌａｎｄ液およびその後脱イオン水を与えて、土壌を多湿に維持したが、ぬらさなかった。播種日の４週間後、花を切って、第２の花のより均等な成長を作製した。植物の播種後第５週において、植物を、形質転換プロセスのために準備した。
【００６６】
インプランタ形質転換およびＴ１抵抗性植物のスクリーニング：
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana cv. Columbia）の形質転換を、ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ（S.J. Clough and A.F. Bent, 1998, Plant J. 16:735 43）からの修正プロトコールを使用して完了した。１０ｍｌ懸濁液を、ＱＤ−ＣＰＰ−ＤＮＡ溶液で作製し、シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物（いくつかの受精した長角果を有する主に未成熟な花房）の処置に使用した。植物を漬ける前に、Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を、０．０５％（２５０ｕｌ／５００ｍｌ）〜０．００５％の濃度まで、ＱＤ−ＣＰＰ−ＤＮＡ溶液に加え、よく混合した。植物の地上部を、穏やかに撹拌しながら２から３０秒間、ＱＤ−ＣＰＰ−ＤＮＡ溶液に漬けた。処置した植物を、２２〜２４℃で１６から２４時間、プラスチックドームカバー下に維持した。植物を、Ｃｏｎｖｉｒｏｎに移し、成熟まで成長させ、種子を回収した。選択トレー（１０．５”×２１”×１”トレー）を使用して、Ｔ０植物からの大量収穫種子（bulk harvest seed）、各トレー上で約１０，０００種子をスクリーニングした。２つの対照、Ｃｏｌ−０負の形質転換対照および正の形質転換対照としてＰＡＴ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）選択マーカーのためのＣｏｌｕｍｂｉａホモ接合種子を使用して、選択噴霧（selection spraying）が正確に行われたことを確実にした。同期化を達成するために、播種に先立って、種子を、０．１％寒天溶液において４８時間、層積処理した。選択トレーあたり１０，０００種子を提供するために、２００ｍｇの種子を、０．１％寒天溶液に加え、種子が、均等に分布するまでボルテックスした。次いで層積処理した種子を、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘ  ＬＰ５を満たした選択トレー上に播種し、Ｈｏａｇｌａｎｄ液で地下灌漑した。選択噴霧を効果的にするために、４０ｍｌの懸濁した種子が選択トレー上に均等に播種されることが重要である。播種後、繁殖ドームを各選択トレー上に置き、植物を選択のために成長させた。繁殖ドームを播種の約５日後に除去した。
【００６７】
さらに、対照実験を完了した。この実験において、ＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体に複合体化していないＤＮＡのみを含有する溶液を使用して、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を形質転換した。上記のプロトコールを、対照として、ＤＮＡ単独の形質転換に使用した。
【００６８】
形質転換植物の選択
新鮮に収穫したＴ１種子を室温で７日間、乾燥させた。Ｔ１種子を２６．５×５１ｃｍ発芽トレーに播種した。各トレーには、４０ｍｌの０．１％アガロース溶液に前もって懸濁し、４℃で２日間保管して、休眠要求を完了し、同期の種子発芽を確実にした２００ｍｇアリコートの層積処理したＴ１種子（約１０，０００種子）が入っている。
【００６９】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５を、微細なバーミキュライトで被覆し、ぬれるまでＨｏａｇｌａｎｄ液で地下灌漑し、次いで重力排水した。各４０ｍｌアリコートの層積処理した種子を、バーミキュライト上にピペットで均等に播種し、４〜５日間、湿気ドーム（humidity dome）で被覆した。ドームを、出芽噴霧後グルホシネートを使用した、最初の形質転換体選択１日前に除去した。
【００７０】
定植の７日後（ＤＡＰ）、Ｔ１植物（それぞれ、子葉および２−４−ｌｆ段階）に、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ  ａｅ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．２％溶液を、１回の適用あたり効果的な割合の２８０ｇ  ａｅ／ｈａのグルホシネートを届けるためにＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧チップ（compressed air spray tip）を使用して、１０ｍｌ／トレー（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、５日以内に５回噴霧した。生存したもの（活発に成長している植物）を、最後の噴霧後４〜７日で同定し、鉢用培地（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０）で調製した３インチ（７．６２ｃｍ）鉢中に、個々に移植した。移植した植物を、湿気ドームで３〜４日間被覆し、元の通り２２℃グロースチャンバーに置くかまたは直接的に温室に移動した。その後、ドームを、除去し、植物を温室（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、明所１４時間：暗所１０時間、最小５００μＥ／ｍ２ｓ１自然＋補光）で栽培した。
【００７１】
分子分析
シロイヌナズナ（Arabidopsis）トランスジェニック植物由来のゲノムＤＮＡを、製造業者の指示に従って、植物ＤＮＡＺＯＬキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、６週齢の植物のすべての葉材料から抽出した。ＰＣＲプライマーを、ｙｆｐおよびｐａｔ導入遺伝子の検出のために設計した。ｙｆｐプライマーを、配列番号４および配列番号５として示す。ｐａｔプライマーを、配列番号６および配列番号７として示す。
配列番号４  ５’−ＴＧＴＴＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＧ−３’
配列番号５  ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡ−３’
配列番号６  ５’−ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧ−３’
配列番号７  ５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧ−３’
【００７２】
ｐａｔおよびｙｆｐに関するＰＣＲ増幅反応を、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑキット（Ｔａｋａｒａ、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して完了した。遺伝子産物を、５０μｌの総反応体積において増幅した。ＰＣＲ反応は、１００ｎｇゲノムＤＮＡ鋳型、１×ＥｘＴａｑ反応緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｐＭｏｌの各プライマー、および０．０２５単位／μＬ  ＥｘＴａｑを含有した。以下のＰＣＲ条件を使用した：９６℃で５分間の１サイクルおよび以下の条件９４℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間の３１サイクルおよび７２℃で７分間の最終伸長。ＰＣＲ増幅産物を、０．８％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウム染色によって可視化した。表２は、これらの反応から得られた増幅産物の結果を示す。
【００７３】
【表２】
2014511678.tif 000004
【実施例２】
【００７４】
量子ドット細胞透過性ペプチドコンジュゲート体を通してのインプランタでのライブイメージング
ＤＨＬＡがキャッピングされたＱＤおよびＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体を通してのライブイメージング
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）からなる融合タンパク質を、Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６１／３１９７６４およびChen et al., 2007においてすでに報告されているように作製し、単離した。様々な細胞透過性ペプチドを、ｐＥＴ２８０細菌発現ベクター内のユニークＮｃｏＩ−ＳｐｅＩ制限部位で、ＹＦＰコード配列の上流にサブクローニングした。タンパク質の発現を誘発し、Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６１／３１９７６４およびChen et al., 2007において報告されているようにそれらを単離し、精製した。ＣＰＰ−ＹＦＰ融合物の配列を、表３において一覧にする。
【００７５】
【表３−１】
2014511678.tif 000005
【表３−２】
2014511678.tif 000006
【００７６】
６２０ｎｍに中心がある、発光最大を有するＤＨＬＡがキャッピングされたＱＤを、すでに報告された手順に従って、熱い配位性溶媒混合物において有機金属前駆体の段階反応を使用して、合成した。Aron et al., 2006；Lu et al., 2007；Doyon et al., 2006；Collins et al., 2003；およびLanio et al., 2000を参照されたい。ナノ結晶を、トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）およびトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）で主に構成された、天然のキャッピングシェルを、すでに報告された二官能リガンドと交換することによって、親水性にした。Lie et al., 2002； Mani et al., 2006； Desjarlais and Berg, 1993を参照されたい。親水性のＱＤの２つのセット、（１）ジヒドロリポ酸でキャッピングされたナノ結晶、および（２）リガンドの９：１モル比で、ポリエチレングリコール（Ｍｗ約６００）が付加されたジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ−ＰＥＧ）およびビオチンで終結したＤＨＬＡポリエチレングリコール（Ｍｗ約４００）（ＤＨＬＡ−ＰＥＧ−ビオチン）の混合物でキャッピングされたナノ結晶を使用した。生じたＱＤを、それぞれ、ＤＨＬＡ−ＱＤおよびＤＨＬＡ−ＰＥＧ−ビオチン−ＱＤと称した。
【００７７】
上記のＣＰＰ分子（γ−ゼイン、ＭＰＧ、およびＲ９）に加えて、２つの追加の分子、ＰＥＰ１およびＴＡＴ（表４）を、すでに報告されたプロトコール（Aron et al., 2006）を使用して、ＤＨＬＡがキャッピングされたＱＤで構築した。上記の適切なモル比のＱＤ−ＣＰＰコンジュゲート体を、１０ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８．０緩衝液において０．３μＭの５１０〜６２０ｎｍ発光ＤＨＬＡがキャッピングされたＱＤに加え、室温で３０分間インキュベートした。コンジュゲート体を、ゲル電気泳動を使用して特徴付け、ここでＣＰＰで構築されたＱＤの電気泳動移動度における変化が観察された。試料を、１×ＴＢＥ緩衝液（０．０９Ｍトリス、０．００２Ｍ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．０９Ｍホウ酸、ｐＨ８．３）において希釈し、１％または２％アガロースゲル上で移動させた。ＱＤあたりのＣＰＰ分子の数を変えることの効果を、複合体の蛍光を観察することによって、モニターした。ゲルイメージを、ＱＤおよび／またはタンパク質を励起し、ゲル内の分離された蛍光バンドに関するイメージを観察することによって作製した。さらに、コンジュゲート体形成を、自己集合におけるＱＤとＣＰＰとの間のエネルギー移動における変化をモニターすることによって確認した。
【００７８】
【表４】
2014511678.tif 000007
【００７９】
植物細胞内での量子ドット−ＣＰＰコンジュゲート体の取り込みおよび細胞内局在化
ＱＤバイオコンジュゲート体を、完全培養培地で希釈し、無傷の壁を有するシロイヌナズナ（Arabidopsis）クラスター細胞培養物、ＪＴＮＴ１タバコおよびニンジン（米国仮特許出願第６１／３１９７６４号）単一細胞培養物に加えた。溶液を、４０〜１５０μｇ／ｍｌで３７℃で１〜４時間、インキュベートした。ＱＤあたり５０ＣＰＰ分子で１：５または１：１０ＱＤ／ＣＰＰ比からなる混合したＱＤコンジュゲート体を、細胞培養物でインキュベートした。過剰な非結合のＱＤコンジュゲート体を、培養物を１×ＰＢＳまたは細胞培養培地で少なくとも３回洗浄することによって除去した。次いで細胞を、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００８０】
落射蛍光イメージ回収を、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡を使用して、行った。隣り合った分裂した蛍光イメージを回収し、５６５ｎｍ二色性フィルターを備えたデュアルビューシステム（dual view system）を使用して、定量化した。６２０ｎｍ  ＱＤに関して、ＱＤ−ＣＰＰ複合体を、イメージングした。細胞イメージング、試料を、４８８ｎｍで励起し、発光を、５６５ｎｍ二色性フィルターで回収／分離し、逆重畳した。ＣＰＰ融合タグが、ＱＤなしで単独で使用されている場合、ＱＤ蛍光を、λ＜６２０ｎｍで回収し、ＹＦＰ蛍光テイル（YFP fluorescent tail）を、λ＞５３７ｎｍで回収した。ＱＤウィンドウ中へのＹＦＰ漏れを、逆重畳の部分として引き算する。６２０ｎｍ  ＱＤ単独を、４８８ｎｍで励起し、それらのそれぞれの発光を、５６５ｎｍ二色性フィルターで分離し、逆重畳する。ＤＡＰＩおよびＣａｌｃｕｏｆｌｕｏｒ蛍光を、キセノン（Ｘｅ）ランプを使用して、励起し、発光を、ＤＡＰＩキューブ（励起に関してＤ３５０／５０Ｘ、二色性４００ＤＣＬＰ、検出に関してＤ４６０／５０ｍ）を使用して、回収する。ＡＦ６４７−ＴＦを、Ｘｅランプを使用して励起し、蛍光を、Ｃｙ５キューブ（励起ＨＱ６２０／６０Ｘ、二色性Ｑ６６０ＬＰ、発光ＨＱ７００／７５ｍ）を使用して、検出する。励起／検出キューブの両方は、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）によって提供される。微分干渉（ＤＩＣ）イメージを、明るい光供給源（bright light source）を使用して、回収する。
【００８１】
したがって、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ニンジンおよびＪＴＮＴ１タバコ細胞の単一の壁で囲われた細胞における局在化を追跡するための種々の細胞透過性ペプチドを含有する官能化ＱＤを、ＬＳＭ７１０  Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡イメージングで観察した。ＱＤは、代謝退化に対するより高い抵抗性および光退色に対するより高い抵抗性を有する。Ｒ９、ＭＰＧ、γ−ゼイン、ＰＥＰ１およびＴＡＴなどのＣＰＰと複合体化したＱＤアミンを、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ニンジンおよびＪＴＮＴ１の単一細胞と、３０分間インキュベートし、細胞を、培地で洗浄し、ＬＳＭ７１０  Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を使用して、イメージングした。Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立顕微鏡を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点スキャナーを、３時間取り込み実験のための励起波長で使用し、５６１ｎｍの励起波長を、５時間取り込み実験のために使用した。
【００８２】
結果は、無傷の壁を有する生きたシロイヌナズナ（Arabidopsis）、ＪＴＮＴ１タバコおよびニンジン懸濁細胞が、λ＝６２０ｎｍで蛍光を示さなかったことを示した。しかしながら、ＱＤ６２０を細胞中に導入した場合、植物細胞中へのＱＤの内部移行が観察された。カルコフロールに関する青色および赤色発光において取り込まれたチャネルのイメージ、細胞壁染色およびＱＤ６２０蛍光範囲は、それぞれ、細胞壁の存在を示す青色蛍光または核の存在を示す赤色蛍光を示し、ここでＱＤ６２０は、核におけるターゲティングのために局在化している。すべてのイメージの上敷きは、内部移行したＱＤが、細胞質および核において集中していたことを例示した。
【００８３】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ＪＴＮＴ１、およびニンジン懸濁細胞の核中へのＣＰＰがコンジュゲートしたＱＤ６２０のターゲティングを実証した。核のターゲティングは、核染色、ＤＡＰＩで核を対比染色することによって、確認された。ＤＡＰＩは、生きた植物細胞において非常に一般的に使用される、重要な核染色である。この染色は、紫外線によって励起される蛍光染色であり、核におけるＤＮＡに結合した場合、青色蛍光を示す。カルコフロール発光範囲は、青色においてであるが、それは、壁に対してのみ特異的である。ＱＤ６２０ＣＰＰコンジュゲート体のイメージおよびＤＡＰＩ染色イメージの上敷きは、核におけるＱＤ−ＭＰＧコンジュゲート体の共局在化を示した。
【００８４】
ＭＰＧ、Ｒ９、γ−ゼイン、ＰＥＰ１およびＴＡＴ  ＣＰＰとコンジュゲートした内部移行したＱＤ６２０は、特徴付けられた表面電荷値を有し、それらのゼータ電位値を、９．５４６６〜１０．１５８６ｍｖの範囲内で測定した。コンジュゲート体サイズの水力学的値は、１２２〜３４２ｎｍの範囲内にあった。これらの粒子コンジュゲート体を、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ＪＴＮＴ１タバコおよびニンジン懸濁細胞とインキュベートした場合、コンジュゲート体は、無傷の細胞中に内部移行し、核において局在化し、これは、粒子が、主に細胞質においておよび時折核において見られるＱＤ６２０アミンコンジュゲート体単独での処置だけとは対照的に、生細胞におけるＱＤコンジュゲート体の核ターゲティングを示している。シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ＪＴＮＴ１タバコおよびニンジン細胞の核中への移行は、細胞透過性ペプチド（ＭＰＧ、ＴＡＴ、ＰＥＰ１、Ｒ９、およびγ−ゼイン）に複合体化した量子ドットで観察された。
【００８５】
この例は、生細胞追跡研究のための蛍光粒子担体としての細胞透過性ペプチドでタグをつけられたＱＤの使用を例証している。ＱＤは、安定な指針として機能する。
【実施例３】
【００８６】
ポリスチレン細胞透過性ペプチドコンジュゲート体を通してのインプランタでのライブイメージング
ＣＰＰと融合したポリスチレンナノ粒子の送達および細胞局在化を、完了した。複合体化したポリスチレン／ＣＰＰナノ粒子を、生きた植物細胞中に移行し、特異的な細胞区画にターゲティングした。
【００８７】
ポリスチレンナノ粒子の内部移行を、ＪＴＮＴ１タバコ単一細胞において、細胞透過性ペプチド、ＴＡＴで標識した。
【００８８】
カルボキシル化したＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅへのＴａｔペプチドのコンジュゲーション
壁で囲まれたＪＴＮＴ１タバコ単一細胞中へのＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ蛍光ポリスチレンナノ粒子（２０ｎｍ直径）の取り込みの評価を、部分的なＴＡＴ細胞透過性ペプチドありおよびなしで試験した。
【００８９】
ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、４℃貯蔵から取得し、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣＬ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加えることによって調製した。生じたカクテルを、１時間インキュベートして、ＥＤＣＬをＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅと反応させた。（ｔｅｒ−ｔｅｒｔブタノール保護カルボキシ末端を有する）ＴＡＴ細胞透過性ペプチドをＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅと複合体化した。ＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体を、室温で終夜インキュベートして、複合体を形成した。複合体を、５０，０００分画分子量限界を有するＡｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔを使用して、精製した。保持されたＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体を、きれいなバイアルに移した。ＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体を、実験に必要になるまで４℃で保管した。
【００９０】
ＪＴＮＴ１タバコ懸濁細胞におけるＴＡＴ−ＦｌｕｏｓｐｈｅｒｅおよびコンジュゲートしていないＦｌｕｏｓｐｈｅｒｅでの細胞取り込み研究
ＪＴＮＴ１単一細胞懸濁液を、３％グリセロールを含有するように調整した、ＮＴ１Ｂ培地において調製した。２０μｌの新たに超音波処理しボルテックスしたＴａｔ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅおよび複合体化していないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅを、ＪＴＮＴ１細胞に加え、３０、６０、または１２０分間、インキュベートした。ＪＴＮＴ１単一細胞を、管を７００ｒｐｍで５分間、遠心分離することによって、単離した。上清を除去し、細胞を、２ｍＬ部のＮＴ１Ｂを使用して、２回すすいだ。洗浄したＪＴＮＴ１細胞を、１ｍＬのグリセロール含有ＮＴ１Ｂ培地に再懸濁し、細胞のいくつかを、別々のスライドガラス上にピペットで移し、５８０ｎｍでの蛍光発光を記録するためのフィルターキューブセットを含有する正立蛍光顕微鏡を明視野モードにおいて使用して、可視化した。顕微鏡を使用して、ＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体で処置したＪＴＮＴ１細胞のイメージを捕えた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、ＪＴＮＴ１タバコ細胞内のＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅの位置の決定を容易にするために、明視野および蛍光イメージを表示および上敷き（積み重ね）した。
【００９１】
ＪＴＮＴ１タバコ細胞のＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体１２０分処置は、ＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体の内部移行および細胞の核中へのターゲティングをもたらした。３０分処置は、ＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体の著しい細胞取り込みをもたらさなかった。あるＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体は、ＪＴＮＴ１グリセロール単一細胞壁と結合していたことが注目された。ＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体の６０分処置は、ＪＴＮＴ１単一細胞内での複合体のいくつかの内部移行をもたらした。観察されたＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体の多数は、細胞の周辺近くで観察されたが、しかしながら、少数の複合体は、ＪＴＮＴ１タバコ細胞の核の非常に近くにおいて現れた。処置の１２０分後、著しい数のＴＡＴ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体が、ＪＴＮＴ１タバコ細胞内に取り込まれ、これらの細胞の核にターゲティングされた。
【００９２】
ポリスチレンナノ粒子の内部移行を、シロイヌナズナ（Arabidopsis）懸濁細胞において、ＴＡＴ、ＭＰＧ、およびγ−ゼイン細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）で標識した。
【００９３】
カルボキシル化したＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅへの細胞透過性ペプチドのコンジュゲーションおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）懸濁細胞中への細胞取り込み
種々の型のＣＰＰを標識して、生きたシロイヌナズナ（Arabidopsis）懸濁細胞の細胞質および核中への細胞壁および細胞膜を通過してのナノ粒子取り込みを、共焦点顕微鏡法を使用して、評価した。ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅを、上記の細胞透過性ペプチド（ＴＡＴ、ＭＰＧ、およびλゼイン）と複合体化した。生じたＣＰＰ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体を、０．１ｍＬのシロイヌナズナ（Arabidopsis）凝集細胞懸濁液と混合し、暗所、室温で３時間（最初の実験）または５時間（第２の実験）、インキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。細胞を、新鮮な培養培地に再懸濁した。再懸濁した細胞懸濁液の液滴を、ガラスカバーガラス上にピペットで移し、真空グリースを使用して、細胞懸濁液滴の周りに周囲長を形成し、その後、第２のガラスカバーガラスを細胞懸濁液の上に置いて、２つのカバーガラスの間に細胞のサンドイッチ状のものを形成した。共焦点顕微鏡（３時間の取り込み実験に関して５１４ｎｍ、および５時間の取り込み実験に関して５６１ｎｍの励起波長で、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立顕微鏡を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点スキャナー）を使用して、ＣＰＰ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体への曝露後、３時間および５時間で、シロイヌナズナ（Arabidopsis）凝集細胞をイメージングした。
【００９４】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）凝集細胞は、共焦点顕微鏡上でレーザーによって５６１ｎｍおよび５１４ｎｍで励起した場合、明白な自己蛍光を示さなかった。しかしながら、シロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストは、この波長でいくらかの自己蛍光を示した。細胞のバックグラウンド自己蛍光は、ＣＰＰ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体取り込み実験のイメージングを妨げなかった。
【００９５】
ＣＰＰ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅコンジュゲート体での曝露後５時間で、シロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストを、イメージングし、次いで、カルコフロール色素で対比染色した。プロトプラストは、細胞壁材料を再生していたけれども、ＣＰＰ−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅコンジュゲート体は、プロトプラストによって内部移行された。細胞は、共焦点顕微鏡法下で観察した場合、活性のあるプロトプラスト鎖によって明らかなように、生きていると判定された。さらに、単一細胞が、細胞の核においてＴＡＴ細胞透過性ペプチドＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ複合体を取り込むことが観察された。示されたγ−ゼイン細胞透過性ペプチドＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅコンジュゲート体での曝露後５時間後、シロイヌナズナ（Arabidopsis）凝集細胞は、細胞核内にＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅを含有することが観察された。これらのイメージは、γ−ゼイン細胞透過性ペプチドが、細胞核中へのＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅの輸送を媒介したことを示した。
【００９６】
修飾されていないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅへの曝露後６時間で観察した、カルコフロールで対非染色したシロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラスト中に内部移行せず、細胞核に輸送されなかった。観察は、修飾されていないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅとの崩壊したおよび死んだプロトプラスト結合を示した。したがって、修飾されていないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅは、生きたシロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストの細胞中に移行されなかったことが実証された。しかしながら、崩壊した細胞または死細胞は、修飾されていないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅを内部移行した。この観察は、細胞の膜完全性が損なわれている場合、修飾されていないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅは内部移行されるが、修飾されていないＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅは、無傷の細胞壁および細胞膜を有する生細胞中に内部移行されないことを示す。
【００９７】
これらの例は、ＣＰＰ融合タグが、細胞中への効率的な送達およびターゲティングを提供することを示す。さらに、使用するＣＰＰの型次第で、核を特異的にターゲティングすることができる。これらのＣＰＰ−Ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅコンジュガントの使用は、細胞不透過性巨大分子の取り込みを促進することができる。この手法の使用は、より少ないＱＤまたはポリスチレンＮＰを使用した細胞標識を可能にするが、それは、標識が、４℃でインキュベートされたまたはワートマニンなどの阻害剤でインキュベートされた細胞において抑止されたので、細胞のエンドサイトーシス能力になお依存している。
【００９８】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物細胞における細胞内区画のインビボイメージングのための新規なプローブとして使用されるＰＡＭＡＭ−ＴＲＩＴＣ標識デンドリマーコンジュゲート体。
無傷の、壁に囲まれた生細胞におけるエンドサイトーシスを定量化するために使用することができるナノ粒子に基づく指標は、植物エンドサイトーシスに関与する細胞小器官のイメージングをインビボで可能にすることができる。さらに、このイメージングは、色素が薄れるまたは退色することなしに達成される。最終的に、生きた植物細胞における粒子またはカーゴ送達の追跡を、かかるナノ粒子に基づく指標で、達成することができる。
【００９９】
この例は、ＰＡＭＡＭデンドリマーＴＲＩＴＣ標識粒子を有する生きた植物細胞におけるエンドサイトーシス区画のイメージングを提示する。植物空胞輸送およびエンドサイトーシス研究において使用されることが知られている、ＦＭ４−６４などのスチリル色素の代わりのライブイメージングのためのこれらの粒子の使用。それらは、時が経つにつれて１つの区画から別の区画へ移動することが知られており、したがって、生きた植物細胞内でエンドサイトーシス区画をイメージングする効果的な手段を提供する。しかしながら、蛍光的に標識したＰＡＭＡＭデンドリマー粒子を使用して、エンドサイトーシス挙動を示すことが可能であり、生きた植物細胞における輸送を研究するために、生体分子に、デンドリマー上のカーゴとしてタグをつけるまたは繋ぎ止めることができる（小胞のみを染色するスチリル色素とは異なって）。ワートマニン処置は、この研究においてエンドサイトーシスを阻害し、ＰＡＭＡＭデンドリマー粒子は、エンドソーム小胞を被覆し、小胞追跡研究における指標として使用することができることを実証した。エンドサイトーシスを追跡するためのＰＡＭＡＭデンドリマーＴＲＩＴＣ標識粒子使用が、実証され、エンドサイトーシスの阻害は、ワートマニンの使用で生じた。したがって、植物細胞における小胞追跡研究に関する生細胞イメージングにおける指標としての粒子に関する新規な役割の例を提供する。
【０１００】
ＴＲＩＴＣ標識およびＰＡＭＡＭデンドリマー
ＴＲＩＴＣ標識ＰＡＭＡＭデンドリマーを、Pasupathy et al., 2008に従って、標識した。ＴＲＩＴＣ標識ＰＡＭＡＭデンドリマーを、０．５ｍｌアリコートの７日齢培養物由来のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）懸濁細胞に加えた。さらに、カルコフロール染料を、イメージングの５分前に、混合物に加えた。植物培養物を、ＴＲＩＴＣデンドリマー複合体で３０分間、インキュベートし、次いで、それらを、共焦点顕微鏡下で直ちに調べた。いくつかの対照試料に関して、２５μＬの１０μＭワートマニン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）を、ＴＲＩＴＣデンドリマー複合体を加える３０分前に、培養物に加えた。次いで、試料を、３０分間再びインキュベートした。生細胞およびクラスターを、上記のプロトコールに従って、ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用して、イメージングした。デンドリマーでインキュベートされていない対照細胞は、共焦点顕微鏡法を通して見た場合、バックグラウンドを作製しなかった。
【０１０１】
共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）
処置した処置した細胞におけるＴＲＩＴＣ−ＰＡＭＡＭ複合体の細胞結合を観察するためおよびそれぞれのインキュベーション持続時間を有する処置されていない対照を見るために、細胞を、培養培地またはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で２回すすぎ、カルコフロールを加えて細胞壁を５分間染色し、次いで直ちに共焦点顕微鏡下で調べた。細胞を、６００〜６２０ｎｍのアルゴンレーザーでＣＬＳＭ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって観察して、生細胞をイメージングした。ここで、ＴＲＩＴＣ−ＰＡＭＡＭの細胞内分布を、単一平面においておよびｚセクションとしても観察した。
【０１０２】
Ｗｏｒｔｍａｎｉｎを処置していない細胞からの結果は、細胞の膜およびエンドソームが、ＴＲＩＴＣ標識ＰＡＭＡＭデンドリマーで染色されたことを示した。ＴＲＩＴＣ標識ＰＡＭＡＭデンドリマーは、エンドソーム中に輸送された。無傷の細胞壁を通過して移行された細胞のエンドソーム内のＰＡＭＡＭデンドリマーを、共焦点レーザー走査型顕微鏡を通して追跡することが可能であった。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、エンドサイトーシスのプロセスを通って、細胞中に移行された。ワートマニンの存在下で、ＴＲＩＴＣ標識ＰＡＭＡＭデンドリマーは、細胞の膜に局在化した。エンドサイトーシスプロセスが阻害されたので、ＰＡＭＡＭデンドリマー−ＣＰＰ複合体は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）細胞のサイトゾル中に移行しなかった。
【０１０３】
本発明をいくつかの実施形態において記載したが、本発明を本開示の精神および範囲内でさらに修正することができる。したがって、本出願は、その一般原則を使用して、本発明のあらゆる変形形態、使用、または適応を包含することが意図されている。さらに、本出願は、本発明が属するかつ添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の制限内にある当技術分野で既知のまたは習慣的な慣行内に入る本開示からのかかる逸脱を包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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