(57)【要約】本発明は、タンパク質の分泌のため、およびリグノセルロース系バイオマスの分解のための細胞を提供する。これらの細胞を使用する方法もまた提供される。詳細には、真菌細胞および酵母細胞におけるタンパク質分泌のための、β−グルコシダーゼおよび異化分解産物レプレッサー遺伝子ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の遺伝的欠失の組合せ利用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項８】
前記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖はセロビオースである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
分泌される前記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異体細胞は、該細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異体細胞は、該細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記不活性化変異が欠失である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がリコンビナント細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がＮＣＵ００８９０である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がＮＣＵ０６６５０である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程；および
（ｂ）上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示す、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す、工程；および
（ｂ）上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記糖はセロビオースである、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
分泌される前記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている、請求項３４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す、請求項３４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示す、請求項３４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子の発現が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されている、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項３４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項３４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がＮＣＵ００８９０である、請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がＮＣＵ０６６５０である、請求項３４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である、請求項３４〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項３４〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項３４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項３４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項６９】
請求項６８に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７０】
請求項６８または６９に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７１】
請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７２】
前記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項７３】
前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項７４】
２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、糖が、上記変異体細胞に対応する、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７５】
請求項７４に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７６】
請求項７４または７５に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７７】
請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項７８】
前記糖は、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項７９】
前記糖はセロビオースである、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８０】
分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項６８〜７９のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８１】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項６８〜８０のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８２】
分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項６８〜８０のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８３】
分泌される前記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項６８〜８０のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８４】
前記不活性化変異が欠失である、請求項６８〜８３のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８５】
前記細胞がリコンビナント細胞である、請求項６８〜８４のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８６】
前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項６８〜８５のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８７】
前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項６８〜８６のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８８】
前記細胞が、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項６８〜８７のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項８９】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項６８〜８８のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９０】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項６８〜８８のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９１】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項６８〜８８のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９２】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項６８〜８８のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９３】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項６８〜８８のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９４】
前記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む、請求項８９〜９３のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９５】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項６８〜９４のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９６】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項６８〜９４のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９７】
前記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がＮＣＵ００８９０である、請求項６８〜９６のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９８】
前記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がＮＣＵ０６６５０である、請求項６８〜９７のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項９９】
リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１００】
請求項９９に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、ｃｒｅ−１遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のリコンビナント細胞であって、
ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０２】
請求項９９〜１０１のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０３】
請求項９９〜１０２のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０４】
前記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１０５】
前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１０６】
リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０７】
請求項１０６に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、ｃｒｅ−１遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０８】
請求項１０７に記載のリコンビナント細胞であって、
ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、
糖が、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１０９】
請求項１０６〜１０８のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１１０】
請求項１０６〜１０９のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。
【請求項１１１】
前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項１０６〜１１０のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１２】
前記糖はセロビオースである、請求項１０６〜１１０のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１３】
分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項９９〜１１２のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１４】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項９９〜１１３のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１５】
分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項９９〜１１３のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１６】
分泌される前記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項９９〜１１３のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１７】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項９９〜１１６のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１８】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項９９〜１１６のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１１９】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項９９〜１１６のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２０】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項９９〜１１６のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２１】
前記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項９９〜１１６のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２２】
前記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む、請求項１１７〜１２１のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２３】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項９９〜１２２のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２４】
少なくとも１つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項９９〜１２２のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２５】
前記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がＮＣＵ００８９０である、請求項９９〜１２４のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２６】
前記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がＮＣＵ０６６５０である、請求項９９〜１２５のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２７】
前記細胞が、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である、請求項９９〜１２６のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２８】
前記細胞が、真菌細胞または酵母細胞である、請求項９９〜１２７のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１２９】
前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項９９〜１２８のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１３０】
前記細胞が、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項９９〜１２９のいずれか１項に記載のリコンビナント細胞。
【請求項１３１】
バイオマスを分解する方法であって、
（ａ）リグノセルロース系バイオマスを提供する工程；
（ｂ）請求項６８〜１３０のいずれか１項に記載の細胞、あるいはｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程；
（ｃ）上記細胞をセルロース系バイオマスと接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程；ならびに
（ｄ）誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程
を包含する、方法。
【請求項１３２】
前記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
バイオマスを分解する方法であって、
（ａ）リグノセルロース系バイオマスを提供する工程；
（ｂ）請求項６８〜１３０のいずれか１項に記載の細胞、あるいはｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程；
（ｃ）上記細胞を糖と接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程；ならびに
（ｄ）誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程
を包含する、方法。
【請求項１３５】
前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記糖はセロビオースである、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項１３１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１３１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項１３１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
分泌される前記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項１３１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願との相互関係〕
本願は、米国特許仮出願番号６１／４５３，０８６（２０１１年３月１５日出願）の利益を主張する。上記仮出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
〔ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する配列表の寄託〕
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する下記の寄託：配列表のコンピュータで読み込み可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：６７７７９２００１６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１２年３月１４日、サイズ：２２ＫＢ）の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
〔技術分野〕
本開示は、タンパク質（例えば、セルラーゼ）を増加させるため、およびリグノセルロース系バイオマスを分解するための変異体細胞に関する。本発明は特に、タンパク質（例えば、セルラーゼ）を増加させるための、変異体細胞および方法を提供する。
【０００４】
〔背景技術〕
リグノセルロース系バイオマスは、バイオ燃料を製造するための、再生可能で豊富な原材料である。しかし、バイオ燃料の製造プロセスにおいて、不溶性のリグノセルロース系バイオマスから、細胞を透過でき、かつ急激に発酵できる糖類への初期変化率が、技術的な課題であり、大きな障害である。それゆえ、用途が多いエネルギー源としてリグノセルロース系バイオマスの可能性を十分に開くために、このような障害を克服するための改善された手段が必要とされている。
【０００５】
バイオマスの自然分解は、リグノセルロース分解酵素（lignocellolytic enzymes）の分泌を通して真菌の微生物によって行われる。例えば、糸状菌であり、研究用モデルの有機体であるNeurospora crassa（N. crassa）は、焼かれた後に近年成長している野生の植物中によく確認される。上記植物では、セルラーゼを分泌し、その結果、植物の細胞壁の分解を開始する。リグノセルロースの分解における自然の役割に基づき、糸状菌およびそのリグノセルロース分解酵素が、生物工学的な製造プロセスにおけるバイオマスの分解の触媒として大きな可能性を有する。
【０００６】
糸状菌におけるセルラーゼの分泌は、不溶性の植物の細胞壁の成分（例えば、セルロース、ヘミセルロースまたはキシラン）によって効果的に誘導されるが、水溶性の誘導因子では効果が小さい。例えば、セルラーゼの主な最終生成物である水溶性のセロビオースは、ハイポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）（Trichoderma reesei；T. reesei）およびアスペルギルス（A. niger、A. nidulans、A. oryzae）を含んでいる糸状菌のいくつかの種類へセルラーゼを誘導するが、セルロース自体よりも非常に低いレベルである。しかし、不溶性の誘導因子が有する１つの問題は、セルラーゼが不溶性の誘導因子に付着し得、その結果、分泌される酵素の活性の効力が低減することである。
【０００７】
不溶性のバイオマス自体を処理することは、不均一なプロセスであり、バイオマス表面へ真菌細胞がアクセスすることが制限されている。それゆえ、真菌が豊富な培養液中では、大きな細胞の母集団が自由に動き、そして誘導している植物の表面との接触が不足するため、高いレベルにて活性のあるセルラーゼ酵素を分泌しない。細胞を懸濁させ、その結果バイオマスの分解を促進させる観点で、セルラーゼ酵素を含んでいるタンパク質の製造を最適化するために、水溶性の小分子（例えば、セロデキストリン）を用いて誘導した後に、高いレベルにて活性のあるタンパク質を分泌する細胞のシステムが必要とされている。
【０００８】
〔概要〕
本明細書中にて、タンパク質の分泌を増加させるため、およびリグノセルロース系バイオマスを分解するための変異体細胞を提供する。また、本明細書中にて、上記変異体細胞を用いる、タンパク質の分泌を増加させる方法およびリグノセルロース系バイオマスを分解する方法を提供する。さらに、本開示は、糸状菌（例えば、Neurospora crassa）中の変異しているβ−グルコシダーゼ遺伝子および異化分解産物レプレッサー遺伝子（ｃｒｅ−１）の少なくとも一方が、セルロース系バイオマス（例えば、セロビオース）によって誘導される場合、結果としてタンパク質の分泌が増加するという驚くべき発見の少なくとも一部に基づく。特定の理論に縛られることを望むものでないが、β−グルコシダーゼ遺伝子およびｃｒｅ−１が、タンパク質の転写制御に関連していると考えられている（図１）。
【０００９】
従って、本開示の一局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および（ｂ）上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および（ｂ）上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
【００１０】
従って、本開示の一局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および（ｂ）上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および（ｂ）上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
【００１１】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形��と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。
【００１２】
本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程；および（ｂ）上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示す。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す、工程；および（ｂ）上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
【００１３】
本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程；および（ｂ）上記リコンビナント細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示す。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、（ａ）リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す、工程；および（ｂ）上記リコンビナント細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
【００１４】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記遺伝子の発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダー��遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
【００１５】
本開示の別の局面は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
【００１６】
本開示の別の局面は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、糖が、上記変異体細胞に対応する、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
【００１７】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile （Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み��わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。
【００１８】
本開示の別の局面は、リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、ｃｒｅ−１遺伝子の上記発現は低減されていない。ある実施形態において、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、セルロース系バイオマスが、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
【００１９】
本開示の別の局面は、リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、ｃｒｅ−１遺伝子の上記発現は低減されていない。ある実施形態において、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、糖が、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記非リコンビナント細胞において、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
【００２０】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形��と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
【００２１】
本開示の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、（ａ）リグノセルロース系バイオマスを提供する工程；（ｂ）上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程；（ｃ）上記細胞をセルロース系バイオマスと接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程；ならびに（ｄ）誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。本発明の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、（ａ）リグノセルロース系バイオマスを提供する工程；（ｂ）上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程；（ｃ）上記細胞を糖と接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程；ならびに（ｄ）誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。
【００２２】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、N.crassaのβ-グルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの転写制御のためのモデルを示している。転写の抑制解除および特異的誘導の両方が、セルラーゼ遺伝子発現の最大転写活性を達成するために求められる。矢印は、セルロース代謝の経路を示している。青線はΔ３βＧおよびΔ３βＧΔｃｒｅ欠失株において最小限と考えられる経路を示し、赤線は３βＧおよびΔ３βＧΔｃｒｅ欠失株において最も活性化されると考えられる経路を示している。
【００２３】
図２は、N.crassaにおけるセルラーゼ酵素に関する遺伝子発現の経時変化を示している。図２Ａは、セロビオヒドロラ−ゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）の経時変化を示している。図２Ｂは、エンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の経時変化を示している。全ての遺伝子の発現レベルは、２％のスクロースを用いて誘導した場合を１に正規化している。株は、２％のスクロースを用いた最小培地において１６時間成長させ、その後、２％のアビセル（登録商標）を用いた最小培地において４時間成長させた。全てのサンプルにおいて、アクチン（ＮＣＵ０４１７３）遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を３通り行い、エラーバーは９５％の信頼区間を示している。
【００２４】
図３は、ＷＴ、Δ３βＧおよびΔ３βＧΔｃｒｅにおいて、０．２％のセロビオースまたは０．１％のアビセル（登録商標）を用いて４時間誘導した後、選択したセルラーゼの遺伝子発現を示している。ｃｂｈ−１、ｇｈ６−２およびｇｈ５−１の遺伝子発現レベルは、１％のスクロースを用いて誘導した場合を１に正規化している。全てのサンプルにおいて、アクチンを内在性のコントロールとして用いた。各株を３回成長させ、エラーバーは１の標準偏差を示している。
【００２５】
図４は、２％のスクロースを用いた最小培地に移して４時間経過したΔｃｒｅ−１における、セルラーゼ セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の遺伝子発現レベルを示している。両方の遺伝子の発現レベルは、２％のスクロースを用いて誘導した野生型を１に正規化している。アクチン（ＮＣＵ０４１７３）の遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を３回行い、エラーバーは９５％の信頼区間を示している。
【００２６】
図５は、野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１における、絶食状況下でのセルラーゼ セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の遺伝子発現レベルを示している。全ての遺伝子の発現レベルは、２％のスクロースを用いた場合を１に正規化している。株は、２％のスクロースを用いた最小培地において１６時間成長させ、その後、炭素源が添加されていない最小培地において４時間成長させた。全てのサンプルにおいて、アクチン（ＮＣＵ０４１７３）遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を３回行い、エラーバーは９５％の信頼区間を示している。
【００２７】
図６は、１０ｍＭまたは１ｍＭのいずれかのセロビオースを用いて４時間誘導した後の、セルラーゼ セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の遺伝子発現レベルを示している。図６Ａは、野生型に関する結果を示している。図６Ｂは、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０欠失変異体に関する結果を示している。図６Ｃは、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１欠失変異体に関する結果を示している。全ての遺伝子に関する発現レベルは、２％のスクロースを用いて誘導した場合を１に正規化している。株は、２％のスクロースを用いた最小培地において１６時間成長させ、その後、１ｍＭのセロビオース、１０ｍＭのセロビオース、または２％のスクロースを用いた最小培地において４時間成長させた。全てのサンプルにおいて、アクチン（ＮＣＵ０４１７３）遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を３回行い、エラーバーは９５％の信頼区間を示している。
【００２８】
図７は、セロビオースおよびアビセル（登録商標）を用いて誘導した後の、ＷＴ、Δ３βＧ、およびΔ３βＧΔｃｒｅ株における、タンパク質生成および酵素活性の概要を示している。図７Ａは、セロビオースを用いて誘導したΔ３βＧを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。図７Ｂは、セロビオースを用いて誘導したΔ３βＧΔｃｒｅを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。図７Ｃは、セロビオースを用いて誘導したＷＴを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。図７Ｄは、アビセル（登録商標）で５日間成長させたＷＴを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。セロビオース誘導株は、０．２％のセロビオースを用いた３６時間の誘導の前に、１％のスクロースを用いた最小培地において２４時間のプレ成長させている。スクロース、グルコース、フルクトースの濃度（グルコース等価物、三角形）、セロビオース（円形）、タンパク質生成物（正方形）、およびバイオマス蓄積（ダイヤモンド）を測定した。図７Ｅは、アビセル（登録商標）に関する、７Ａ，７Ｂ、および７Ｄの２４時間誘導の上清活性を示している。セロビオースを用いて２４時間誘導したΔ３βＧ（正方形）およびΔ３βＧΔｃｒｅ（三角形）の培養上清のセルラーゼ活性を、アビセル（登録商標）で５日間成長させたＷＴ（ダイヤモンド形）の培養上清と比較した。エラーバーは、１の標準偏差である。図７Ｆは、７Ａおよび７Ｂにおける培養上清のバイオリアクターにおけるＡｚｏ-ＣＭＣ（エンドグルカナーゼ）活性の経時変化を示している。Ａｚｏ-ＣＭＣ活性を、２％のアビセル（登録商標）で５日間成長させたＷＴの培養上清中の活性に対する割合として表している。
【００２９】
図８は、野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１の培養濾過液における、ＭｕＬａｃ活性（セロビオヒドロラ−ゼ１）の比較である。図８Ａは、アビセル（登録商標）で４日間経過した後、アビセル（登録商標）での野生型活性の割合として表したＭｕＬａｃ活性を示している。図８Ｂは、精製したリコンビナントＣｂｈ−１等価物μｇとして表したＭｕＬａｃ活性を示している。株は、２％のスクロースにおいて１６時間成長させ、その後、２％のスクロース、２％のセロビオース、または２％のアビセル（登録商標）において４日間成長させており、２日および４日の両方の時点で採取した。培養上清中のエキソグルカナーゼ活性は、４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-セロビオシド（ＭｕＬａｃ）試験を用いて測定した。
【００３０】
図９は、野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ―１の培養濾過液中のＡｚｏ−ＣＭ−セルロース活性の比較である。株は、２％のスクロースにおいて２４時間成長させ、その後、２％のスクロース、１％のアビセル（登録商標）、または２％のセロビオースにおいて４日間成長させた。エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性は、アビセル（登録商標）を用いた活性から４日後の野生型の活性に対する割合として示している。注釈：４つのどの株についてもＡｚｏ−ＣＭ−セルロース活性が検出されなかったため、スクロース培養のデータは示していない。
【００３１】
図１０は、N.crassa野生型およびΔｃｒｅ−１株の表現型の比較である。図１０Ａは、アビセル（登録商標）で７日間成長させたＷＴおよびΔｃｒｅ−１株の培養濾過液中で分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ０４９５２）、セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ―１、ＮＣＵ０７３４０）および２（ｃｂｈ―２、ＮＣＵ０９６８０）、並びに、エンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）を表すタンパク質のバンドに印を付けている。図１０Ｂは、ＷＴおよびｃｒｅ―１株の７日間の培養上清のアビセラーゼ試験によって検出された、Ａｚｏ−ＣＭＣでのエンドグルカナーゼ活性、タンパク質濃度、並びに、グルコースおよびセロビオース濃度の比較である。
【００３２】
図１１は、野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１欠失変異体の培養上清中に分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。株は、１％のスクロースにおいｔ２４時間成長させ、その後、２％のスクロース、２％のセロビオース、１％のスクロースおよび１％のセロビオース、または１％のスクロースおよび１％のアビセル（登録商標）において４日間成長させており、２４時間の時点でサインプルを採取した。１５μｌの濾過液の培養上清を、標準的な１０％のＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ポリアクリルアミドゲルにて泳動させると共に、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色した。注釈：スクロースでのΔｃｒｅ−１およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ―１における７２ｋＤａで泳動したタンパク質を質量分析法によってＮＣＵ０１５１７（グルコアミラーゼ１）として同定した。
【００３３】
図１２は、野生型、N.crassaおよびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０（β−ＧｔＫＯ）の培養上清中に分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。株は、１％のスクロースにおいて２４時間成長させ、その後、２％のスクロース、２％のセロビオース、または２％のアビセル（登録商標において５日間成長させた。セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ―１、ＮＣＵ０７３４０）、セロビオヒドロラーゼ２（ｃｂｈ―２、ＮＣＵ０９６８０）、およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）を表すタンパク質のバンドに印を付けている。さらに、野生型におけるβ−グルコシダーゼ（ＮＣＵ０４９５２）に目印を付け、三重欠失Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０における欠如部分を縁取りしている。
【００３４】
図１３は、近縁関係にある菌類における、オーソロガス遺伝子であるＮＣＵ００１３０（配列番号１）、ＮＣＵ０４９５２（配列番号２）およびＮＣＵ０８７５５（配列番号３）に対する、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示している。全ての配列は、相違するアミノ酸のみを表すオーソロガス遺伝子を用いたN.crassa遺伝子を規定している。“.”は同一の残留物を示し、“−“は挿入または欠失を示している。
【００３５】
図１４は、β−グルコシダーゼＮＣＵ００１３０オーソロガス遺伝子の進化の関係を示している。進化の歴史は近隣結合法（Saitou N. and Nei M., 1987）を用いて推測した。全体の枝長が１．５６１３２５０３である最適な系図を示している。この系図は、同じユニットにおける枝長が系統樹を推測するために用いられる進化の距離となるような比率で描かれている。進化の距離は、ピアソン コレクション法（Zuckerkandl E. and Pauling L., 1965）を用いて算出し、また、サイト当たりのアミノ酸置換の数のユニットにある。この分析は、１１のアミノ酸配列に関している。ギャップおよび欠けている（missing）データを含む全ての位置は削除されている。最終的なデータセットにおいて、全体で４４７の位置が存在する。進化に関する解析は、ＭＥＧＡ５にて行った（Tamura K., Dudley J., Nei M., and Kumar S., 2007）。
【００３６】
図１５は、β−グルコシダーゼＮＣＵ０４９５２オーソロガス遺伝子の進化の関係を示している。全体の枝長が２．８４０１８９６０である最適な系図を示している。この分析は、１１のアミノ酸配列に関している。最終的なデータセットにおいて全体で６９０の位置が存在する。
【００３７】
図１６は、β−グルコシダーゼＮＣＵ０８７５５オーソロガス遺伝子の進化の関係を示している。全体の枝長が２．３７３５３８９６である最適な系図を示している。この分析は、１１のアミノ酸配列に関している。最終的なデータセットにおいて全体で７０９の位置が存在する。
【００３８】
図１７は、セロデキストリンを用いて誘導した後の、ＷＴおよびΔ３βＧにおけるセルラーゼ誘導を示している。図１７Ａは、アビセル（登録商標）、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを用いて４時間誘導した後のＷＴにおけるｃｂｈ―１、ｇｈ５−１、およびｇｈ６−２の発現を示している。図１７Ｂは、アビセル（登録商標）、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを用いて４時間誘導した後のΔ３βＧにおけるｃｂｈ―１、ｇｈ５−１、およびｇｈ６−２の発現を示している。ｃｂｈ―１、ｇｈ５−１、およびｇｈ６−２の遺伝子発現レベルは、１％のスクロースを用いて誘導した場合を１に正規化している。全てのサンプルにおいて、アクチン（ＮＣＵ０４１７３）遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。エラーバーは１の標準偏差を示している。
【００３９】
図１８は、セロビオースまたはアビセル（登録商標）を用いた誘導後のＷＴおよびβグルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの発現レベルを示している。図１８Ａは、ＷＴ、Δ３βＧ、およびΔ３βＧｃｒｅ−１株の培養上清中で分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。３重ノックアウト（triple knockout）における、ＣＢＨ―１、ＧＨ６−２およびＧＨ５−１を表すタンパク質のバンドに印を付けている。グルコアミラーゼＩ（ＮＣＵ０１５１７）の存在は、ｃｒｅ−１遺伝子の欠失と関連している。培養物は、２％のスクロースにおいて２４時間成長させ、その後、２％のスクロースまたは０．２％のセロビオースを添加した。２４時間（ＷＴ、Δ３βＧおよびΔ３βＧΔｃｒｅ）または７２時間（Δ３βＧ）後に、上清を回収した。ＷＴアビセル（登録商標）の培養物は２％のアビセル（登録商標）において５日間成長させた。Δ３βＧは１％のスクロースにおいて２４時間成長させた後、１％のアビセル（登録商標）において４８時間成長させた。Δ３βＧΔｃｒｅは１％のスクロースにおいて２４時間成長させた後、１％のアビセル（登録商標）において２４時間成長させた。図１８Ｂは、アビセル（登録商標）に関する、１８Ａの上清の活性を示している。グルコース（濃いグレー）およびセロビオース（淡いグレー）を、１％のアビセル（登録商標）を用いて２４時間、５０℃で培養した後に測定した。エラーバーは１の標準偏差を示している。
【００４０】
図１９は、ソホロース、ラクトースまたはＤ（＋）−ガラクトースを用いて誘導した後の、ＴＷおよびΔ３βＧにおけるセルラーゼ誘導を示している。図１９Ａは、１ｍＭのソホロース、１ｍＭのラクトースまたは１ｍＭのＤ（＋）−ガラクトースを用いて４時間誘導した後の、ＷＴおよびΔ３βＧにおけるｃｈｂ−１の発現を示している。図１９Ｂは、１ｍＭのソホロース、１ｍＭのラクトースまたは１ｍＭのＤ（＋）−ガラクトースを用いて４時間誘導した後の、ＷＴおよびΔ３βＧにおけるｇｈ６−２の発現を示している。ｃｈｂ−１およびｇｈ６−２の遺伝子発現レベルは、１％のスクロースを用いて誘導した場合を１に正規化している。全てのサンプルにおいて、アクチン（ＮＣＵ０４１７３）遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。エラーバーは１の標準偏差を示している。
【００４１】
図２０は、ＷＴおよびΔ３βＧのｍＲＮＡの配列決定を示している。図２０Ａは、ＷＴN.crassaにおいて異なる誘導を受けた３１８の遺伝子の階層的クラスタ分析を示し、セアビセル（登録商標）による誘導をセロビオースによる誘導と比較している。淡い色は相対的な発現が高いことを示し、また、濃い色は相対的な発現が低いことを示している。図２０Ｂは、セロビオースまたはアビセル（登録商標）を用いて誘導したＷＴを、セロビオースを用いて誘導したΔ３βＧと比較したＦＰＫＭｓ（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）におけるセルラーゼ発現を示している。全ての株は、２％のスクロースで１６時間成長させ、その後、炭素源のない培地（Vogels食塩水のみ）、０．２％のセロビオースまたは１％のアビセル（登録商標）に４時間移した。
【００４２】
図２１は、セロビオースまたはアビセル（登録商標）を用いて誘導した後の、ＷＴ、Δ３βＧ、およびΔ３βＧΔｃｒｅ株における酵素活性を示している。図２１Ａは、アビセル（登録商標）に関する、２４時間の誘導上清活性を示している。セロビースを用いて２４時間誘導したときのΔ３βＧ（正方形）およびΔ３βＧΔｃｒｅ（ダイヤモンド）株の培養上清のセルラーゼの活性を、アビセル（登録商標）で５日間成長させたＷＴの培養上清の活性と比較している。図２１Ｂは、３６時間経過した後のアビセル（登録商標）加水分解試験（Ａに基づく）において生成された、セロビオース（淡いグレー）およびグルコース（濃いグレー）の内訳を示している。エラーバーは１の標準偏差を示している。
【００４３】
図２２は、野生型（アビセル（登録商標））、Δ３βＧ（セロビオース）、およびΔ３βＧΔｃｒｅ（セロビオース）Neurospora crassa株において、質量分析によって同定されたタンパク質の概要を示している。
【００４４】
図２３は、Neurospora crassa株Δ３βＧ、Δ３βＧΔｃｒｅ、Δ３βＧΔ８９０、Δ３βＧΔ６６５０、Δ３βＧΔ６６５０Δ８９０、Δ３βＧΔｃｒｅΔ６６５０、Δ３βＧΔｃｒｅΔ８９０、およびΔ３βＧΔｃｒｅΔ６６５０Δ８９の培養濾過液中のＭｕＬａｃ活性（セルラーゼ活性）を示している。Δ８９０を用いた株は、β−マンノシターゼ遺伝子ＮＣＵ００８９０において欠失があった。Δ６６５０を用いた株は、ホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子ＮＣＵ０６６５０において欠失があった。株は、２％のスクロースで３６時間成長させ、その後、０．２％のセロビオースで２４時間成長させた。培養上清中のエキソグルカナーゼ活性は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−セロビオシド（ＭｕＬａｃ）試験を用いて測定した。結果は、各株における相対的な蛍光発光として示されている。
【００４５】
〔詳細な説明〕
［概要］
本開示は、セルロース系バイオマスによる誘導に応答したセルラーゼ等のタンパク質分泌の増加を示す変異体細胞及びリコンビナント細胞、及びこのような細胞を、タンパク質分泌の増加に利用する方法に関する。分泌されるタンパク質は、リグノセルロース系バイオマスの分解において、使い道を見出してもよい。ここに開示されているように、本開示の変異体細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子、ｃｒｅ−１遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ若しくはホスホリパーゼ様遺伝子等の、少なくとも１つの遺伝子において、不活性化変異を含んでいる。ここに開示されているように、本開示のリコンビナント細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子、ｃｒｅ−１遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ若しくはホスホリパーゼ様遺伝子等の、少なくとも１つの遺伝子について、対応する非リコンビナント細胞における上記少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して低減した発現を示す。
【００４６】
［タンパク質分泌の誘導］
セルロース系バイオマスは、植物、藻類、真菌類、バクテリア等の生命体、並びに、多糖及び多糖構成要素を含む細菌性バイオフィルムから得られるマスである。セルロースは、セルロース系バイオマスにおける支配的な多糖である。セルロースは、アンヒドロセロビオース（線状β−（１，４）−Ｄ−グルカン）のホモポリマーであり、β−１，４グルコシド結合にて結合したグルコース単位を含む。多形全般であるが、セルロースは、まず、並列したグルカン鎖からなる不溶性結晶マトリックスとして、植物組織に見られる。セルロース系バイオマスは、生のバイオマス、未処理のバイオマス、または加工されたバイオマスであってもよい。セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖を含んでいてもよい。
【００４７】
本開示に適したセルロース系バイオマスは、限定されないが、糖、多糖、オリゴ糖、精製したセルロース、及びセルロース誘導体を含んでいてもよい。精製したセルロースは、Solka Flok等のホロセルロース、並びに、Avicel(登録商標）及び Sigmacell（登録商標）等の微結晶性セルロースを含む。セルロース誘導体は、限定されないが、セロデキストリン、β−メチルウンベリフェリル−オリゴ糖、ｐ−ニトロフェノール−オリゴ糖、長鎖セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、及びヒドロキシメチルセルロース（ＨＥＣ）を含む。
【００４８】
本明細書に使用されるとき、「セロデキストリン」は、様々な長さのβ（１→４）グルコースポリマーを指し、限定されないが、セロビオース（２グルコースモノマー）、セロトリオース（３グルコースモノマー）、セロテトロース（４グルコースモノマー）、セロペントース（５グルコースモノマー）、及びセロヘキソース（６グルコースモノマー）を包含する。有利には、セロビオース等の短鎖のセロデキストリンが適している。また、本開示における分泌されるタンパク質は、セロビオース等の短鎖のセロデキストリンに付着しない。
【００４９】
ある局面において、本開示におけるセルロース系バイオマスは、本開示の細胞によって分解される、生のバイオマス原料であってもよい。分解されたバイオマスは、限定されないが、セルロース及び微結晶性セルロース等の多糖、またはセロデキストリン及びセロビオース等のオリゴ糖を含む。他の局面において、本開示におけるセルロース系バイオマスは、セルロース及び微結晶性セルロース等の精製された多糖、またはセロデキストリン及びセロビオース等のオリゴ糖を含んでいてもよい。さらに他の局面において、本開示のバイオマスは、セルロース及び微結晶性セルロース等の多糖と、セロデキストリン及びセロビオース等のオリゴ糖との混合物を含んでいてもよい。
【００５０】
ある局面において、本開示のセルロース系バイオマスは、タンパク質分泌を誘導するために、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞へ直接添加されてもよい。
【００５１】
他の局面において、タンパク質の分泌は、セルロース系バイオマスの分解を介して上記細胞によりインサイチュで生じた、セロデキストリンまたはセロビオース等の１つ以上のセルロース誘導体によって、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞から誘導されてもよい。ある局面において、セルロース系バイオマスは、細胞から分泌を誘導するが、細胞から分泌された１つ以上のタイプのタンパク質に付着しない、あるいは該タンパク質を隔離するセルロース誘導体を生成するのに十分な量である。
【００５２】
さらに、糖は、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞からタンパク質分泌を誘導するのに用いられてもよい。適切な糖は、限定されないが、多糖、オリゴ糖、ソホロース、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。
【００５３】
［分泌されるタンパク質］
ある局面において、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞は、セルロース系バイオマスまたは糖による誘導に応答して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質の分泌を増加させる。
【００５４】
本明細書に使用されるとき、増加した分泌は、本開示のタンパク質の分泌の増加したレベルを指す。分泌は、細胞内から細胞外へのタンパク質の移動を包含している。分泌の増加したレベルは、所望のタンパク質の発現または生成を増加する結果であってもよい。または、分泌の増加したレベルは、所望のタンパク質の細胞からの輸送を増加した結果であってもよい。本開示の方法は、タンパク質の生成及び分泌に関わる経路を改変し結果としてタンパク質の分泌レベル全体を増加させることによって、タンパク質の分泌レベルを増加させてもよい。
【００５５】
分泌され得る本開示のタンパク質のタイプは、限定されないが、内因性タンパク質及び異種タンパク質を包含する。本開示の内因性タンパク質は、本開示の細胞に内在するタンパク質である、あるいは、本開示の細胞によって自然に生成される。本開示の異種タンパク質は、本開示の細胞内で自然に発現されないタンパク質である。異種タンパク質は、当該技術において公知な任意の方法によって、組換えによって細胞内で発現されてもよい。一般的に、異種タンパク質をコードするリコンビナント核酸は、操作できるように、プロモーター等の調節配列に連結されている。当該技術において公知な、適切な調節配列が用いられてもよい。適切なプロモーターは、限定されないが、恒常的プロモーター及び誘導性プロモーターを包含する。さらに、異種タンパク質は、細胞から自身の分泌を導く分泌ペプチドを含んでもよい。本開示の方法における使用に適した、当該技術において公知な任意の分泌ペプチドが使用されてもよい。
【００５６】
ある局面において、分泌されたタンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。本明細書に使用されるとき、「セルロース誘導性タンパク質」は、野生型細胞（例えば非変異体細胞または非リコンビナント細胞）における発現及び分泌がセルロースによって誘導されるタンパク質を指す。例えば、セルロース誘導性タンパク質は、C.M. Phillips et al., 2011 (Phillips, CM et al., Proteome Res. 2011 Sep 2;10(9):4177-85. Epub 2011 Aug 1) に記載されている。
【００５７】
本開示における、分泌されたセルロース誘導性タンパク質は、限定されないが、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及びセルロース結合ドメイン含有タンパク質を含む。
【００５８】
本明細書に使用されるとき、「セルラーゼ」または「セルラーゼペプチド」は、セルロース、リケニン、及び穀物β−Ｄ−グルカンの加水分解を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。例えば、セルラーゼは、セルロースにおける１，４−β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解してもよい。本開示のセルラーゼは、限定されないが、エンドセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅｓ）、β−１,４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ、及びセルデキストリナーゼ、エキソグルカナーゼ等のエキソセルラーゼ、セロビナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ等の酸化セルラーゼ、並びにセルロースホスホリラーゼを包含する。
【００５９】
本明細書に使用されるとき、「ＧＨ６１酵素」は、グルコシドヒドロラーゼファミリー６１酵素を指す。本開示のＧＨ６１酵素は、セルラーゼ活性を促進することができる。ＧＨ６１酵素の例は、限定されないが、多糖モノオキシゲナーゼを包含する。ある局面において、本開示のＧＨ６１ヒドロラーゼは、ＧＨ６１−１遺伝子、ＧＨ６１−２遺伝子、ＧＨ６１−５遺伝子、ＮＣＵ０７８９８遺伝子、ＮＣＵ０８７６０遺伝子、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
【００６０】
セロビオースデヒドロゲナーゼは、酸化還元酵素活性を有する酵素であり、ＥＣ  １．１.９９．１８活性を有する酵素を包含する。ある局面において、セロビオースデヒドロゲナーゼは、ＮＣＵ００２０６、ｃｄｈ−１遺伝子、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
【００６１】
ラクトナーゼは、アシル化ホモセリンラクトンにおけるホモセリンラクトン環のエステル結合を加水分解し得る酵素である。ある局面において、本開示のラクトナーゼは、ＮＣＵ０７１４３、ｌａｃ−２遺伝子、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
【００６２】
カルボヒドレートエステラーゼは、ＥＣ  ３．１．１.−活性及びＥＣ  ３．１．２−活性を有する酵素である。カルボヒドレートエステラーゼの例は、限定されないが、アセチルキシランエステラーゼ、シンナモイルエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、及びＳ−フォルミルグルタチオンヒドロラーゼを包含する。ある局面において、本開示のカルボヒドレートエステラーゼは、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
【００６３】
多糖リアーゼは、ＥＣ  ４．２．２−活性を有する酵素である。ある局面において、本開示の多糖リアーゼは、ＮＣＵ０５５９８、このホモログ、及びこの相同分子種によってコードされる。
【００６４】
本明細書に使用されるとき、「セルロース結合ドメイン含有タンパク質」は、セルロース結合ドメインを含むタンパク質を指す。セルロース結合ドメインは、グルコシドヒドロラーゼ等のセルロース−活性酵素に見られるタンパク質ドメインである。一般的に、セルロース結合ドメインは、カルボヒドレート結合活性を有する。ある局面において、本開示のセルロース結合ドメイン含有タンパク質は、ＮＣＵ０９７６４、このホモログ、及びこの相同分子種によってコードされる。
【００６５】
ある局面において、本開示における分泌されたセルロース誘導性タンパク質は、ＮＣＵ０５１３７、このホモログ、及びこの相同分子種によってコードされるタンパク質である。
【００６６】
［変異体細胞］
本開示の一局面は、セルロース系バイオマスまたは糖に応答したタンパク質の分泌増加を示す変異体細胞及びリコンビナント細胞、並びに、このような細胞を、タンパク質の細胞からの分泌を増加させるため、及びリグノセルロース系バイオマスを分解するために、利用する方法に関する。ここに開示されているように、本開示の変異体細胞は、少なくとも１つの遺伝子にて不活性変異を含む。適切な不活性変異の例は、限定されないが、欠失、点変異、機能欠損変異、切断、重複、転位、及び／または反転を包含し、結果として遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する。所望の遺伝子にて１つ以上の不活性変異を生成する方法は、当該技術において公知であり、特に限定されないが、ＰＣＲ変異誘発、挿入変異誘発、化学変異誘発、及び照射を包含する。
【００６７】
本開示の一局面において、上記変異体細胞は、真菌細胞または酵母細胞である。本開示のもう１つの局面において、上記変異体細胞は、子嚢菌種担子菌種の真菌細胞、Neurospora crassa (N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile (Ｍyceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum 細胞、 Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、またはAcremonium cellulolyticus細胞であってもよい。好ましくは、上記変異体細胞は、N. crassa変異体細胞である。本開示のもう１つの局面において、上記変異体細胞は、リコンビナント細胞である。好ましくは、上記変異体、リコンビナント細胞は、N. crassa変異体、リコンビナント細胞である。
【００６８】
［β−グルコシダーゼ変異体細胞］
β−グルコシダーゼ遺伝子は、β−グルコシダーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるとき、「β−グルコシダーゼ」は、グルコースの遊離とともに末端非還元のβ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒するβ−グルコシドグルコヒドロラーゼを指す。β−グルコシダーゼは、高度に保存された酵素である。
【００６９】
一局面において、本開示の変異体細胞は、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記少なくとも２つの遺伝子によってコードされるβ−グルコシダーゼの機能欠陥を引き起こす。少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の不活性化変異は、特に限定されないが、欠失、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、β−グルコシダーゼ活性を完全になくす、あるいは、β−グルコシダーゼ活性を、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはＲＮＡの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
【００７０】
本開示の不活性変異を含むβ−グルコシダーゼは、細胞内のβ−グルコシダーゼまたは細胞外の（すなわち分泌された）β−グルコシダーゼであってもよい。不活性変異を含む、適したβ−グルコシダーゼの例は、限定されないが、N. crassa遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、ＮＣＵ０８７５５、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされるものを包含する。ＮＣＵ００１３０の相同分子種、ＮＣＵ０４９５２の相同分子種、及びＮＣＵ０８７５５の相同分子種の例は、限定されないが、図１３〜１６にリスト化されたものを包含する。
【００７１】
本開示における特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００７２】
本開示における特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、誘導２日後の少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００７３】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、誘導２日後の全タンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００７４】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、１５ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、３０ｎＭ、少なくとも３５ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、４５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも５５ｎＭ、６０ｎＭ、少なくとも６５ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも７５ｎＭ、８０ｎＭ、少なくとも８５ｎＭ、９０ｎＭ、少なくとも９５ｎＭ、少なくとも100ｎＭ、少なくとも１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、少なくとも１７５ｎＭ、２００ｎＭ、少なくとも２２５ｎＭ、少なくとも２５０ｎＭ、少なくとも２７５ｎＭ、３００ｎＭ、少なくとも３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、少なくとも３７５ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも４２５ｎＭ、少なくとも４５０ｎＭ、少なくとも４７５ｎＭ、５００ｎＭ、少なくとも５２５ｎＭ、少なくとも５５０ｎＭ、少なくとも５７５ｎＭ、６００ｎＭ、少なくとも６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、少なくとも６７５ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも７２５ｎＭ、少なくとも７５０ｎＭ、少なくとも７７５ｎＭ、８００ｎＭ、少なくとも８２５ｎＭ、少なくとも８５０ｎＭ、少なくとも８７５ｎＭ、９００ｎＭ、少なくとも９２５ｎＭ、９５０ｎＭ、少なくとも９７５ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１２５μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも１７５μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２２５μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも２７５μＭ、少なくとも３００μＭ、少なくとも３２５μＭ、少なくとも３５０μＭ、少なくとも３７５μＭ、少なくとも４００μＭ、少なくとも４２５μＭ、少なくとも４５０μＭ、少なくとも４７５μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも５２５μＭ、少なくとも５５０μＭ、少なくとも５７５μＭ、少なくとも６００μＭ、少なくとも６２５μＭ、少なくとも６５０μＭ、少なくとも６７５μＭ、少なくとも７００μＭ、少なくとも７２５μＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも７７５μＭ、少なくとも８００μＭ、少なくとも８２５μＭ、少なくとも８５０μＭ、少なくとも８７５μＭ、少なくとも９００μＭ、少なくとも９２５μＭ、少なくとも９５０μＭ、少なくとも９７５μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１１ｍＭ、少なくとも１２ｍＭ、少なくとも１３ ｍＭ、少なくとも１４ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも１７ｍＭ、少なくとも１８ｍＭ、少なくとも１９ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、または��れ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで転写してもよい。
【００７５】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、１５ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、３０ｎＭ、少なくとも３５ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、４５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも５５ｎＭ、６０ｎＭ、少なくとも６５ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも７５ｎＭ、８０ｎＭ、少なくとも８５ｎＭ、９０ｎＭ、少なくとも９５ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、少なくとも１７５ｎＭ、２００ｎＭ、少なくとも２２５ｎＭ、少なくとも２５０ｎＭ、少なくとも２７５ｎＭ、３００ｎＭ、少なくとも３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、少なくとも３７５ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも４２５ｎＭ、少なくとも４５０ｎＭ、少なくとも４７５ｎＭ、５００ｎＭ、少なくとも５２５ｎＭ、少なくとも５５０ｎＭ、少なくとも５７５ｎＭ、６００ｎＭ、少なくとも６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、少なくとも６７５ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも７２５ｎＭ、少なくとも７５０ｎＭ、少なくとも７７５ｎＭ、８００ｎＭ、少なくとも８２５ｎＭ、少なくとも８５０ｎＭ、少なくとも８７５ｎＭ、９００ｎＭ、少なくとも９２５ｎＭ、９５０ｎＭ、少なくとも９７５ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１２５μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも１７５μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２２５μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも２７５μＭ、少なくとも３００μＭ、少なくとも３２５μＭ、少なくとも３５０μＭ、少なくとも３７５μＭ、少なくとも４００μＭ、少なくとも４２５μＭ、少なくとも４５０μＭ、少なくとも４７５μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも５２５μＭ、少なくとも５５０μＭ、少なくとも５７５μＭ、少なくとも６００μＭ、少なくとも６２５μＭ、少なくとも６５０μＭ、少なくとも６７５μＭ、少なくとも７００μＭ、少なくとも７２５μＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも７７５μＭ、少なくとも８００μＭ、少なくとも８２５μＭ、少なくとも８５０μＭ、少なくとも８７５μＭ、少なくとも９００μＭ、少なくとも９２５μＭ、少なくとも９５０μＭ、少なくとも９７５μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１１ｍＭ、少なくとも１２ｍＭ、少なくとも１３ｍＭ、少なくとも１４ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも１７ｍＭ、少なくとも１８ｍＭ、少なくとも１９ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、または２５６倍高いレベルで分泌してもよい。
【００７６】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、上記少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子は、少なくとも３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも４つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも５つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも６つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも７つのβ−グルコシダーゼ遺伝子またはそれ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。
【００７７】
本開示における１つの好ましい実施形態では、N. crassa細胞において、上記β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、及びＮＣＵ０８７５５は、欠失されている。
【００７８】
本開示におけるもう１つの局面において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼの活性を低減する不活性化変異を含む上記変異体細胞は、さらに、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含み、セルロース系バイオマスまたは糖の誘導によって、ｃｒｅ−１遺伝子において変異を欠く細胞のレベルよりも高いレベルで少なくとも１つのタイプのタンパク質を分泌する。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされるタンパク質若しくはＲＮＡの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び単一または多重の不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
【００７９】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、または１００，０００倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００８０】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００、または１０，０００倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００８１】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、誘導２日後の全タンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００８２】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、１５ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、３０ｎＭ、少なくとも３５ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、４５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも５５ｎＭ、６０ｎＭ、少なくとも６５ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも７５ｎＭ、８０ｎＭ、少なくとも８５ｎＭ、９０ｎＭ、少なくとも９５ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、少なくとも１７５ｎＭ、２００ｎＭ、少なくとも２２５ｎＭ、少なくとも２５０ｎＭ、少なくとも２７５ｎＭ、３００ｎＭ、少なくとも３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、少なくとも３７５ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも４２５ｎＭ、少なくとも４５０ｎＭ、少なくとも４７５ｎＭ、５００ｎＭ、少なくとも５２５ｎＭ、少なくとも５５０ｎＭ、少なくとも５７５ｎＭ、６００ｎＭ、少なくとも６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、少なくとも６７５ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも７２５ｎＭ、少なくとも７５０ｎＭ、少なくとも７７５ｎＭ、８００ｎＭ、少なくとも８２５ｎＭ、少なくとも８５０ｎＭ、少なくとも８７５ｎＭ、９００ｎＭ、少なくとも９２５ｎＭ、９５０ｎＭ、少なくとも９７５ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１２５μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも１７５μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２２５μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも２７５μＭ、少なくとも３００μＭ、少なくとも３２５μＭ、少なくとも３５０μＭ、少なくとも３７５μＭ、少なくとも４００μＭ、少なくとも４２５μＭ、少なくとも４５０μＭ、少なくとも４７５μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも５２５μＭ、少なくとも５５０μＭ、少なくとも５７５μＭ、少なくとも６００μＭ、少なくとも６２５μＭ、少なくとも６５０μＭ、少なくとも６７５μＭ、少なくとも７００μＭ、少なくとも７２５μＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも７７５μＭ、少なくとも８００μＭ、少なくとも８２５μＭ、少なくとも８５０μＭ、少なくとも８７５μＭ、少なくとも９００μＭ、少なくとも９２５μＭ、少なくとも９５０μＭ、少なくとも９７５μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１１ｍＭ、少なくとも１２ｍＭ、少なくとも１３ｍＭ、少なくとも１４ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも１７ｍＭ、少なくとも１８ｍＭ、少なくとも１９ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで転写してもよい。
【００８３】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、１５ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、３０ｎＭ、少なくとも３５ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、４５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも５５ｎＭ、６０ｎＭ、少なくとも６５ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも７５ｎＭ、８０ｎＭ、少なくとも８５ｎＭ、９０ｎＭ、少なくとも９５ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、少なくとも１７５ｎＭ、２００ｎＭ、少なくとも２２５ｎＭ、少なくとも２５０ｎＭ、少なくとも２７５ｎＭ、３００ｎＭ、少なくとも３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、少なくとも３７５ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも４２５ｎＭ、少なくとも４５０ｎＭ、少なくとも４７５ｎＭ、５００ｎＭ、少なくとも５２５ｎＭ、少なくとも５５０ｎＭ、少なくとも５７５ｎＭ、６００ｎＭ、少なくとも６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、少なくとも６７５ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも７２５ｎＭ、少なくとも７５０ｎＭ、少なくとも７７５ｎＭ、８００ｎＭ、少なくとも８２５ｎＭ、少なくとも８５０ｎＭ、少なくとも８７５ｎＭ、９００ｎＭ、少なくとも９２５ｎＭ、９５０ｎＭ、少なくとも９７５ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１２５μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも１７５μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも２２５μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも２７５μＭ、少なくとも３００μＭ、少なくとも３２５μＭ、少なくとも３５０μＭ、少なくとも３７５μＭ、少なくとも４００μＭ、少なくとも４２５μＭ、少なくとも４５０μＭ、少なくとも４７５μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも５２５μＭ、少なくとも５５０μＭ、少なくとも５７５μＭ、少なくとも６００μＭ、少なくとも６２５μＭ、少なくとも６５０μＭ、少なくとも６７５μＭ、少なくとも７００μＭ、少なくとも７２５μＭ、少なくとも７５０μＭ、少なくとも７７５μＭ、少なくとも８００μＭ、少なくとも８２５μＭ、少なくとも８５０μＭ、少なくとも８７５μＭ、少なくとも９００μＭ、少なくとも９２５μＭ、少なくとも９５０μＭ、少なくとも９７５μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１１ｍＭ、少なくとも１２ｍＭ、少なくとも１３ｍＭ、少なくとも１４ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも１６ｍＭ、少なくとも１７ｍＭ、少なくとも１８ｍＭ、少なくとも１９ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、または２５６倍高いレベルで分泌してもよい。
【００８４】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、上記少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子は、少なくとも３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子である。
【００８５】
本開示におけるもう１つの好ましい実施形態では、N. crassa細胞において、上記β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、ＮＣＵ０８７５５、及び上記ｃｒｅ−１遺伝子は、欠失されている。
【００８６】
［ＣｒｅＡ／ｃｒｅ−１変異体細胞］
一局面において、本開示の変異体細胞は、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるＣｒｅＡ／ＣＲＥ−１の機能欠陥を引き起こす。ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１遺伝子の不活性化変異は、特に限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、ＣｒｅＡ／ＣＲＥ−１活性を、完全になくす、あるいは、ＣｒｅＡ／ＣＲＥ−１活性を、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはＲＮＡの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。本明細書に使用されるとき、「ｃｒｅ−１遺伝子」及び「ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１遺伝子」は、置換可能に使用される。
【００８７】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化ｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、または１００，０００倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００８８】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化ｃｒｅ−１変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍高いレベルで分泌するように、不活性化ｃｒｅ−１変異を含む上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００８９】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、上記変異体細胞は、ｃｒｅ−１変異を欠く細胞に対して、Ｃ−化合物／糖代謝、細胞外代謝、結合機能または補因子要求性を有するタンパク質、Ｃ−化合物／糖の輸送、輸送機構、及びタンパク質合成に関わる遺伝子の発現の基底レベルを向上させる。
【００９０】
本開示の好ましい一例では、N. crassa細胞において、上記ｃｒｅ−１遺伝子は、欠失されている。
【００９１】
本開示のもう１つの局面において、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含む上記変異体細胞は、さらに、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子によってコードされる、β−グルコシダーゼ活性をなくす不活性変異を含む。少なくとも２つのβ−グルコシダーゼにおける不活性変異は、欠失、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、β−グルコシダーゼ活性を完全になくす、あるいは、上記活性を、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはＲＮＡの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。上記β−グルコシダーゼは、細胞内のβ−グルコシダーゼ、または細胞外の（すなわち、分泌された）β−グルコシダーゼであってもよい。
【００９２】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、または１００，０００倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００９３】
本開示の特有の一局面において、本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
【００９４】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、上記少なくとも２つのβ−グルコシダーゼは、３つのβ−グルコシダーゼである。
【００９５】
本開示の好ましい一実施形態では、上記変異体細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、及びＮＣＵ０８７５５の欠失、並びにｃｒｅ−１の欠失を含む、N. crassa細胞である。
【００９６】
［β−マンノシダーゼ変異体細胞］
本開示におけるもう１つの局面において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、並びに／または、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異及びｃｒｅ−１遺伝子での不活性化変異を含む変異体細胞は、さらに、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の活性を低減させる変異を含む。
【００９７】
本開示におけるβ−マンノシダーゼ遺伝子は、β−マンノシダーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるとき、「β−マンノシダーゼ」、「マンナンエンド−１，４−β−マンノシダーゼ」、「エンド−１，４−β−マンノシダーゼ」、「エンド−β−１，４−マンナナーゼ」、「β-マンナナーゼＢ」、「β−１,４−マンナン４−マンナノヒドロラーゼ」、「エンド−β−マンナナーゼ」、「β−Ｄ−マンナナーゼ」、及び「１，４−β−Ｄ−マンナンマンナノヒドロラーゼ」は、置換可能に使用され、マンナン、ガラクトマンナン、及びグルコマンナンにおける１，４−β−Ｄ−マンノシド結合をランダムに加水分解できる酵素を指す（ＥＣ３．２.１．７８）。ある局面において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００８９０、T. reeseiタンパク質ＩＤ６２１６６、T. reeseiンパク質ＩＤ５７８５７、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種である。
【００９８】
一局面において、本開示の変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるβ−マンノシダーゼの機能欠陥を引き起こす。上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異は、限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、β−マンノシダーゼ活性を完全になくす、あるいは、β−マンノシダーゼ活性を、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはＲＮＡの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
【００９９】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、または１００，０００倍高いレベルで転写するように、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
【０１００】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、6倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍高いレベルで分泌するように、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
【０１０１】
本開示の好ましい一例では、N. crassa細胞において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子は、欠失されている。
【０１０２】
［ホスホリパーゼ変異体細胞］
本開示におけるもう１つの局面において、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異及びｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１遺伝子での不活性化変異を含む変異体細胞、並びに／または、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１遺伝子での不活性化変異、及び少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞は、さらに、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む。
【０１０３】
本明細書に使用されるとき、「ホスホリパーゼ様遺伝子」は、ホスホリパーゼ遺伝子と相同性がある配列を有する遺伝子、またはホスホリパーゼと相同性があるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、本開示のホスホリパーゼ様遺伝子は、ＮＣＵ０６６５０であってもよい。ＮＣＵ０６６５０は、ホスホリパーゼ活性を示すタンパク質をコードすることが示されていない一方、そのコードされるアミノ酸配列と最も近い関連ホモログは、ホスホリパーゼである。
【０１０４】
本開示のホスホリパーゼ遺伝子は、ホスホリパーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるホスホリパーゼ酵素は、限定されないが、リン脂質を、例えば脂肪酸及び他の脂肪親和性に分子加水分解する任意の酵素を包含する。ホスホリパーゼをコードする遺伝子は、限定されないが、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、またはホスホジエステラーゼをコードする遺伝子を包含する。
【０１０５】
従って、ある局面において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子は、ＮＣＵ０６６５０、T. reeseiタンパク質ＩＤ６７５７９、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種である。
【０１０６】
一局面において、本開示の変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能欠陥を引き起こす。上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異は、限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、ホスホリパーゼ活性を完全になくす、あるいは、ホスホリパーゼ活性を、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはＲＮＡの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
【０１０７】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、または１００，０００倍高いレベルで転写するように、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
【０１０８】
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも１つのタイプのタンパク質を、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍高いレベルで分泌するように、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
【０１０９】
本開示の好ましい一例では、N. crassa細胞において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子は、欠失されている。
【０１１０】
［リコンビナント細胞］
本開示のもう１つの局面は、細胞において、低減した、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子またはｃｒｅ−１遺伝子の発現を示し、セルロース系バイオマス若しくは糖に応答して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタンパク質の分泌の増加を示すコンビナント細胞、並びに、細胞からのタンパク質の分泌を増加させるため、及びグノセルロース系バイオマスを分解するために、このような細胞を利用する方法に関する。本開示のリコンビナント細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞であってもよい。
【０１１１】
本開示における、低減した、所望の遺伝子（例えば、β−グルコシダーゼ遺伝子、ｃｒｅ−１遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ遺伝子若しくはホスホリパーゼ様遺伝子）の発現を示すリコンビナント細胞は、上記所望の遺伝子の発現を低減させる変異を含んでいてもよい。変異を生じさせ特徴付ける方法は、当該技術において公知であり、変異スクリーニング等である。また、本開示のリコンビナント細胞は、上記所望の遺伝子を標的としその発現を低減させる阻害性オリゴヌクレオチド等の、組換えコンストラクトを含むトランスジェニック細胞であってもよい。上記阻害性オリゴヌクレオチド限定されない例は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡを包含する。さらに、所望の遺伝子の発現は、クエリング及び減数分裂性サイレンシング等の、遺伝子サイレンシング技術によって低減されてもよい。遺伝子サイレンシング技術は、所望の遺伝子、所望のＲＮＡ、所望の遺伝子の調節タンパク質を標的とすることができる。
【０１１２】
本開示のリコンビナント細胞によって分泌され得るタンパク質のタイプは、限定されないが、セルロース誘導性タンパク質を包含する。セルロース誘導性タンパク質の限定されない例は、限定されないが、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及びセルロース結合ドメイン含有タンパク質を包含する。ある局面において、本開示における分泌されるタンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４、またはＮＣＵ０５１３７によってコードされる。ある局面において、本開示のリコンビナント細胞は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタンパク質の分泌を増加させている。
【０１１３】
ある局面において、本開示のリコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す。他の実施形態において、本開示のリコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す。
【０１１４】
ここで用いられている「対応する非リコンビナント細胞」は、上記リコンビナント細胞において遺伝子発現が低減した結果となる上記リコンビナント細胞の改変の欠損を除き、上記リコンビナント細胞と同じ種であり、上記リコンビナント細胞と同じ条件下にて培養された細胞をいう。本開示における遺伝子の「低減した発現」は、対応する改変していない細胞中の遺伝子発現レベルと比較して減少した、改変した細胞中の遺伝子発現レベルをいう。
【０１１５】
ある局面において、上記少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。他の局面において、上記ｃｒｅ−１遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。
【０１１６】
本開示の特有の局面において、低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞は、さらに、低減した、遺伝子ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の発現を示す。ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の発現を低減するための手段は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術であってもよい。遺伝子サイレンシング技術は、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１、またはｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の調節タンパク質若しくはＲＮＡを標的としてもよい。ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の発現は、少なくとも１０％0、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。
【０１１７】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞は、上記ＣｒｅＡ／ＣＲＥ−１転写因子の機能活性が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減された細胞であってもよい。上記ＣｒｅＡ／ＣＲＥ−１の機能は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。
【０１１８】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞、並びに／または低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現レベル及び低減した遺伝子ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の発現レベルを示す上記リコンビナント細胞は、さらに、低減した、本開示の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現を示してもよい。上記β−マンノシダーゼ遺伝子の発現を低減するための手段は、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術を包含する。遺伝子サイレンシング技術は、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子、またはβ−マンノシダーゼ遺伝子の調節タンパク質若しくはＲＮＡを標的としてもよい。β−マンノシダーゼ遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。ある局面において、β−マンノシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００８９０の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。
【０１１９】
本開示におけるもう１つの特有の局面において、低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞、低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現及び低減した遺伝子ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の発現を示す上記リコンビナント細胞、並びに／または低減した少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現、低減した遺伝子ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の発現、及び低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞は、さらに、低減した、本開示の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子若しくはホスホリパーゼ様遺伝子の発現を示してもよい。上記ホスホリパーゼの発現を低減するための手段は、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術を包含する。遺伝子サイレンシング技術は、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子若しくはホスホリパーゼ様遺伝子、または遺伝子の調節タンパク質若しくはＲＮＡを標的としてもよい。ホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。ある局面において、遺伝子ＮＣＵ０６６５０の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。
【０１２０】
本開示の好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、及びＮＣＵ０８７５５の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。本開示のもう１つの好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、及びＮＣＵ０８７５５の発現、並びにｃｒｅ−１遺伝子の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。本開示のさらにもう１つの好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、及びＮＣＵ０８７５５の発現、ｃｒｅ−１遺伝子の発現、並びにβ−マンノシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００８９０の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。本開示のさらに好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２、及びＮＣＵ０８７５５の発現、ｃｒｅ−１遺伝子の発現、β−マンノシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００８９０の発現、並びに遺伝子ＮＣＵ０６６５０の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。
【０１２１】
本開示の一局面において、上記リコンビナント細胞は、低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す。ｃｒｅ−１の発現を低減するための手段は、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術を包含する。遺伝子サイレンシング技術は、ｃｒｅ−１、またはｃｒｅ−１の調節タンパク質若しくはＲＮＡを標的としてもよい。ｃｒｅ−１の発現は、リコンビナント細胞において、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。
【０１２２】
本開示のもう１つの局面において、ＣｒｅＡ／ＣＲＥ−１転写因子の機能活性は、リコンビナント細胞において、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている。ＣｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減されていてもよい。
【０１２３】
［バリアント、配列同一性、及び配列類似性］
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術において、公知である。例えば、２つの配列間の配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学的アルゴリズムの限定されない例は、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877において見られるような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムである。
【０１２４】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実行は、配列同一性を決定するための配列比較に利用される。このような実行は、限定されないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを包含する。これらのプログラムを用いたアライメントは、初期パラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、上記のMyers及びMiller (1988) のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル(weight residue table)、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティがＡＬＩＧＮプログラムに用いられ得る。Altschulr et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴプログラムは、上記のKarlin 及びAltschul (1990) のアルゴリズムに基づいている。本開示のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２にて行うことができる。本開示のタンパク質またはポリペプチドと相同性があるアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３にて行うことができる。比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（BLAST 2.0）が利用される。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ (BLAST 2.0)が、分子間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに用いられ得る。上記のAltschul et al. (1997)を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してＢＬＡＳＴＮ、タンパク質に対してＢＬＡＳＴＸ）の初期パラメーターが用いられ得る。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。アライメントは、検査によって手動にて行われてもよい。
【０１２５】
本明細書に使用されるとき、配列同一性、すなわち２つの核酸またはポリペプチドの配列に照らした同一性は、２つの配列において、特有の比較ウィンドウにて最大一致となるように整列したときに同じとなる残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質への参照に用いられる場合、同一でなくかつアミノ酸の同類置換によりしばしば異なる残基位置は、アミノ酸残基が類似した化学特性（例えば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸に置換されている場合、分子の機能特性が変化していないと認識される。配列が同類置換によって異なる場合、配列同一性のパーセンテージは、上記置換の同類の性質を補正するために、上方に調整されてもよい。このような同類置換によって異なる配列は、配列類似性すなわち類似性を有するといわれている。この調整をする手段は、当業者にとって公知である。通常、これは、完全ミスマッチというよりむしろ部分ミスマッチとして同類置換をスコアリングし、これによって配列同一性のパーセンテージを増加させることを包含する。従って、例えば、同一アミノ酸についてスコア１が付与され、非同類置換についてスコアゼロが付与された場合、同類置換については、ゼロと１との間のスコアが付与される。同類置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ(Intelligenetics, Ｍountain View, Calif.)において実行されるように、計算される。
【０１２６】
核酸は、Sambrook, J. et al. 2000. Ｍolecular Cloning: A Laboratory Ｍanual (Third Edition)に記載された技術等の標準的な分子生物学的技術を用いて、合成される、単離される、あるいは、操作されてもよい。技術は、クローニング、ｃＤＮＡライブラリーの発現、及びｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡの増幅を包含する。
【０１２７】
本開示の核酸、またはそのサブ配列は、発現カセットまたはベクターを含むクローニング媒介物に挿入されてもよい。上記クローニング媒介物は、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ、または人工染色体であり得る。上記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターを包含し得る。上記クローニング媒介物は、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来ベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、または哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）を包含し得る。
【０１２８】
上記核酸は、操作できるように、プロモーターに連結されてもよい。上記プロモーターは、ウイルス、バクテリア、哺乳類、または植物のプロモーターであり得る。上記プロモーターは、恒常的なプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または、環境的に調節された、あるいは発生的に調節されたプロモーターであり得る。
【０１２９】
［タンパク質の分泌を増加させる方法］
本開示の他の局面は、セルロース系バイオマスまたは糖に応答して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌することができる本開示の任意の細胞を提供する工程、及び、上記細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させることにより、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法に関する。
【０１３０】
本開示の方法にて用いられてもよいセルロース系バイオマスは、限定されないが、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。ある好ましい実施形態において、セルロース系バイオマスは、セロビオースを含む。
【０１３１】
本開示の方法にて用いられてもよい糖は、限定されないが、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントース、セロヘキソース、及びソホロースを含む。ある好ましい実施形態において、上記糖は、セロビオースを含む。
【０１３２】
本開示のリコンビナント細胞によって分泌されてもよいタンパク質のタイプは、限定されないが、セルロース誘導性タンパク質を包含する。セルロース誘導性タンパク質の限定されない例は、限定されないが、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及び セルロース結合ドメイン含有タンパク質を包含する。ある局面において、本開示における分泌されるタンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４、またはＮＣＵ０５１３７によってコードされる。
【０１３３】
従って、本開示のある局面は、変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、あるいは上記細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる工程、及び上記変異体細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスまたは糖は、タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法を提供する。ある局面において、上記セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する。
【０１３４】
いくつかの局面において、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる上記方法は、β−グルコシダーゼインヒビター存在下にてタンパク質の分泌を誘導するステップを含む。好ましくは、上記β−グルコシダーゼインヒビターは、ノジリマイシンである。
【０１３５】
本開示の他の局面は、リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、あるいは、対応する非リコンビナント細胞中のｃｒｅ−１遺伝子の発現と比較して低減したｃｒｅ−１遺伝子の発現を示す、工程、及び上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスまたは糖は、タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法を提供する。ある局面において、上記セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する。
【０１３６】
［リグノセルロース系バイオマスの分解のための方法］
本開示のさらなる局面は、リグノセルロース系バイオマスを提供する工程、本開示の任意の変異体細胞またはリコンビナント細胞を提供する工程、上記細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させることにより、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程、及び、上記誘導された細胞をリグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、上記分泌された、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質は、リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による、バイオマスの分解のための方法に関する。
【０１３７】
一般的に、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、及びリグニンと強く結合した他のカルボヒドレートポリマーを含む植物バイオマスを指す。適切なリグノセルロース系バイオマスの例は、限定されないが、植物材料、都市ごみ、都市の紙ごみ、木材残渣、製材工場及び製紙工場の廃棄物、並びに農業残渣を包含する。適切な植物材料の例は、限定されないが、ススキ(Miscanthus)、エネルギーグラス、エレファントグラス、スイッチグラス、索草、ライグラス、リードカナリーグラス、葦、麦藁、大麦藁、カノラ藁、オート麦藁、トウモロコシ滓、大豆滓、オート外皮, スペルト麦、モロコシ、もみ殻、サトウキビの搾り殻、トウモロコシ繊維、大麦、麦、アマ、小麦、アマニ、柑橘類の果肉、綿実、ラッカセイ、アブラナ、ヒマワリ、えんどう豆、ルピナス、パーム殻粒、ココナッツ、コンニャク、ローカストビーンガム、グアルガム、大豆、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、青い茎、トウモロコシの穂軸、松、針葉樹軟材、ユーカリ、樺木、柳、ヤマナラシ、ポプラ木、雑種ポプラ、エネルギーカン、短いローテーションの木質農作物、作物残渣、庭ごみ、及びこれらの組合せを包含する。
【０１３８】
本開示の方法にて用いられてもよいセルロース系バイオマスは、限定されないが、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。ある好ましい実施形態において、セルロース系バイオマスは、セロビオースを含む。
【０１３９】
本開示の方法にて用いられてもよい糖は、限定されないが、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントース、セロヘキソース、及びソホロースを含む。ある好ましい実施形態において、上記糖は、セロビオースを含む。
【０１４０】
本開示のリコンビナント細胞によって分泌されてもよいタンパク質のタイプは、限定されないが、セルロース誘導性タンパク質を包含する。セルロース誘導性タンパク質の限定されない例は、限定されないが、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及び セルロース結合ドメイン含有タンパク質を包含する。ある局面において、本開示における分泌されるタンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４、またはＮＣＵ０５１３７によってコードされる。
【０１４１】
本開示の一局面において、リグノセルロース系バイオマスの分解のための上記方法は、β−グルコシダーゼインヒビター存在下にてリグノセルロース系バイオマスを上述した本開示の変異体細胞と接触させるステップを含む。好ましくは、上記β−グルコシダーゼインヒビターは、ノジリマイシンである。
【０１４２】
［用途］
本明細書に記載された方法は、リグノセルロース系バイオマスを分解するのに有用な他の方法と組み合わせて実施され得る。
【０１４３】
例えば、リグノセルロース系バイオマスは、アンモニア繊維拡散（ＡＦＥＸ）、蒸気爆発、アルカリ水溶液、酸性溶液、有機溶媒、イオン液体（ＩＬ）、電解水、リン酸、及びこれらの組合せによる処理を含む前処理がされていてもよい。植物材料からリグニンを除去する前処理では、ヘミセルロースから遊離した糖質の全体的な量を増やしてもよい。
【０１４４】
〔実施例〕
後述する実施例は、単なる例であって、本開示の局面を何ら限定するものではない。
【０１４５】
〔実施例１〕
以下の実施例は、３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassa株内、および、３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とｃｒｅ−１遺伝子とを欠失しているN. crassa株内で誘導される、セルラーゼの転写およびセルロース分解酵素の生産における特徴に関するものである。
【０１４６】
［材料および方法］
（株）
株は、Fungal Genetics Stock Center（ＦＧＳＣ）から入手した。当該株には、Neurospora crassaの、野生型（wild-type：ＷＴ）(FGSC 2489)、ｃｒｅ−１遺伝子の欠失株（Δｃｒｅ−1）（FGSC 10372）、細胞内（intracellular）のβ−グルコシダーゼ  NCU00130の欠失株（FGSC 11822およびFGSC 11823）、細胞外（extracellular）のβ−グルコシダーゼ  NCU08755の欠失株（FGSC 18387およびFGSC 18388）、および、細胞外のβ−グルコシダーゼ  NCU04952の欠失株（FGSC 13731およびFGSC 13732）が含まれる。
【０１４７】
４つの遺伝子の欠失株は、ＦＧＳＣに記載されている方法（http://www.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20make%20a%20cross-2.pdf）にしたがって、１つの遺伝子を欠失している株を順次掛け合せることによって作製した。全ての欠失株の遺伝子型は、遺伝子に特異的なプライマーと、ハイグロマイシン（hygromycin：ｈｐｈ）カセットに対する共通のプライマーと、を用いて確認した。ｈｐｈに対するフォワードプライマーは、以下のとおりである。つまり、
hph Middle FWD：  ５’−CGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAG−３’      （配列番号４）
リバースプライマーは、以下のとおりである。つまり。
【０１４８】
NCU00130：        ５’−TAGTGTACAAACCCCAAGC−３’            （配列番号５）
NCU004953：       ５’−AACACACACACACACACTGG−３’            （配列番号６）
NCU08755：        ５’−ACAGTGGAGGTGAGAAAGG−３’              （配列番号７）
NCU08807：        ５’−GTACTTACGCAGTAGCGTGG−３’            （配列番号８）
（生育と転写研究（Transcriptional Studies Growth））
菌株を、２５０ｍＬの三角フラスコ内に入った、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含む５０ｍＬのフォーゲルの塩（Vogel’s salts）へ、ＯＤ５９５が０．０５になるように植菌した。そして、当該菌株を、照明が点いた状態で、２００ｒｐｍにて１６時間生育させた。次いで、バイオマスに対して４０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離を行うとともに、バイオマスをフォーゲルの塩にて２回洗浄することによって、余分なスクロースを除去した。次いで、当該バイオマスを、新鮮な５０ｍＬの培地へ加えた。なお、当該培地は、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースと、セロビオース（Sigma）またはアビセル（Avicel）（登録商標）  ＰＨ１０１（アビセル（Avicel）（登録商標））と、を含んだものであった。照明が点いた状態にて、培養物に対して、２００ｒｐｍにて４時間の誘導をかけた。次いで、ブフナー漏斗上のワットマン  ガラス  マイクロファイバー  フィルター（ＧＦ／Ｆ）にて濾過するとともに、５０ｍＬのフォーゲルの塩を用いて洗浄することによって、培養したバイオマスを集めた。バイオマスを、液体窒素中で瞬時に冷凍させ、当該バイオマスを、−８０℃にて保存した。
【０１４９】
（ＲＮＡの分離）
ジルコニア／シリカ  ビーズ（０．２ｇ、直径０．５ｍｍ；Biospec)、Mini-Beadbeater-96（Biospec）、および、１ｍＬのTRIzol試薬（Invitrogen）を用い、これらの使用説明書にしたがって、凍結サンプルから全ＲＮＡを精製した。TURBO DNA-free（Ambion）およびRNeasy kit（Qiagen）を用いて消化することによって、全ＲＮＡを更に精製した。ナノドロップ、および、アガロースゲル電気泳動によって、ＲＮＡの品質を確認した。
【０１５０】
（定量的なリアル−タイム  ＲＴ−ＰＣＲ）
EXPRESS One-Step SYBR GreenER Kit（Invitrogen）、および、StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて、定量的なＲＴ−ＰＣＲを行った。全反応容量を１０μＬとし、当該全反応容量中に３００ｎＭのフォワードプライマー、３００ｎＭのリバースプライマー、および、７５ｎｇの鋳型ＲＮＡが含まれている状態にて、３回の反応を行った。データの解析は、Relative Quantitation／Comparative CT（ΔΔＣＴ）を利用したStepOne Software（Applied Biosystems）を用いて行った。データを、対照サンプルとしての、スクロースによって発現した内在性のコントロールであるアクチン、に対して標準化した。エラーバーは、９５％の信頼区間（confidence interval）を示している。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーは、「Tian et al., 2009」内に記載されているように用いた。
【０１５１】
アクチン
５’−TGATCTTACCGACTACCT−３’            （配列番号９）
５’−CAGAGCTTCTCCTTGATG−３’            （配列番号１０）
ＣＢＨＩ（ＮＣＵ０７３４０）
５’−ATCTGGGAAGCGAACAAAG−３’            （配列番号１１）
５’−TAGCGGTCGTCGGAATAG−３’            （配列番号１２）
ＣＢＨＩＩ（ＮＣＵ０９６８０）
５’−CCCATCACCACTACTACC−３’            （配列番号１３）
５’−CCAGCCCTGAACACCAAG−３’            （配列番号１４）
エンドグルカナーゼ  ２（ＮＣＵ００７６２）
５’−GAGTTCACATTCCCTGACA−３’            （配列番号１５）
５’−CGAAGCCAACACGGAAGA−３’            （配列番号１６）
ＧＨ６１（ＮＣＵ０７８９８）
５’−TCAAGCCCGGTTACTATC−３’            （配列番号１７）
５’−AACCTGTCACCTGCAACT−３’            （配列番号１８）
ＣＲＥ−１
５’−CTACTGCCATGTCCTCTC−３’            （配列番号１９）
５’−TATCAGGACCACTTTGGCTTC-３’          （配列番号２０）
β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）
５’−GTTCGGCGTTACCTATGT−３’            （配列番号２１）
５’−AGAGTCAAAGAGCGGCTTC−３’            （配列番号２２）
（タンパク質の分泌／酵素活性に関する試験）
菌株を、２５０ｍＬの三角フラスコ内に入った、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含む１００ｍＬのフォーゲルの塩へ、ＯＤ５９５が０．０５になるように植菌した。そして、当該菌株を、照明が点いた状態で、２００ｒｐｍにて２４時間生育させた。次いで、２％スクロース、２％セロビオース、１％スクロース／１％セロビオース、または、１％スクロース／１％アビセル（登録商標）を用いて、培養物に対して誘導をかけた。照明が点いた状態で２００ｒｐｍにて５日間の培養を続けながら、１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に上清を回収した。全てのサンプルを回収するまで、回収した上清を２μｍのＰＥＳフィルターにて濾過してバイオマスを回収し、当該バイオマスを−２０℃にて保存した。分泌されたタンパク質を可視化するために、濃縮されていない１５μＬの上清を、標準的な１０％のＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ポリアクリルアミドゲルにて泳動させるとともに、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色した。
【０１５２】
Ｅｎｄｏ−１，４−β−グルカナーゼの活性は、Ａｚｏ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Megazyme）を用いて、使用説明書にしたがって測定した。簡潔に言えば、前もって３７℃に加熱しておいた１００μＬのＡｚｏ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ基質溶液と、９６．５μＬの培養上清と、３．５μＬの３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）とを、深い９６ウエルプレート内にて混合した。混合した後で、上記プレートを、３７℃にて１０分間インキュベートした。０．５ｍＬの沈殿剤溶液を加えることによって反応を停止させ、１０００ｇにて１０分間の遠心分離を行った。５０μＬのサンプルを平底の９６ウエルアッセイ用プレートへ移し、Beckman Coulter Paradigm plate readerを用いて、５９０ｎｍの光学濃度にて吸光度を３回測定した。データを、アビセル（登録商標）を用いた時の４日後の野生型の活性に対する割合として示す。
【０１５３】
エキソグルカナーゼ（セロビオハイドロラーゼ−１）の活性は、４−Methylumbelliferyl β−Ｄ−cellobioside（ＭｕＬａｃ）アッセイを用いて測定した。当該アッセイは、主としてＣＢＨ−１の活性を測定するものである。活性は、経時的な蛍光の変化として示され、当該変化は、酵素活性を示すものとして最適な線のスロープ（slope of a best-fit line）になる。当該アッセイを行う前に、培養上清を５０００ダルトンより上の濃縮装置（sartorius stedim Vivaspin 500）にかけることによって、培養上清中の余分な糖を取り除いた。保持されたタンパク質を５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を用いて２回洗浄し、直線の範囲内にてアッセイが行われるように、上記タンパク質を２μｇ／μＬに希釈した。アッセイは、１０μｇの全タンパク質を含む１００μＬの全容量にて行われ、アッセイでは、ＭｕＬａｃの最終濃度が１．０ｍＭであり、酢酸ナトリウム（ｐＨ５）の最終濃度が５０ｍＭであった。４０℃に設定されたBeckman Coulter Paradigm plate reader内にてアッセイを行った。なお、当該アッセイでは、励起／発光波長として３６０／４６５ｎｍを採用し、１０分間にわたって３０秒毎に測定を行った。最適な線のスロープは、個々の培養上清のＭｕＬａｃの活性を示している。希釈されていない活性を示すために、ＭｕＬａｃの活性を、２μｇ／ｍＬの希釈物を得るために必要な最初の希釈物に対して標準化した。セロビオハイドロラーゼ−１の組み換え体の活性をスタンダードとして用い、データを、アビセル（登録商標）を用いた時の４日後の野生型の活性に対する割合として示す。
【０１５４】
アビラーゼ（Avicelase）の活性は、ＷＴ、Δｃｒｅ−1、および、他の欠失株の７日目の培養上清中のグルコースおよびセロビオースの濃度を指標として、Ｔｉａｎ等（Tian et al, 2009）にしたがって決定した。簡潔に言えば、ＷＴおよびΔｃｒｅ−1の７日目の培養上清の１ボリュームと、５ｍｇ／ｍＬのアビセル（登録商標）および５０ｍＭのＮａＡｃバッファー（ｐＨ５．０）を含む基質溶液の１ボリュームとを、３７℃にて混合した。撹拌して５時間の後、共役酵素反応によって、グルコースの濃度とセロビオースの濃度とを測定した。
【０１５５】
［結果］
（３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の欠失株における、セルラーゼの転写の誘導）
N. crassa内にてセルラーゼが誘導される初期の時点を調べるために、まず、培養物をスクロースの存在下にて１６時間培養し、大量のバイオマスを作製した。その後、培養物を、別の炭素源を含む新鮮な培地へ移した。野生株における初期の経時変化では、セロビオハイドロラーゼ  Ｉ遺伝子  ｃｂｈ−１およびエンドグルカナーゼ  ２遺伝子  ｇｈ５−１に関して、４時間の誘導時間において、スクロースにおける遺伝子発現とアビセル（登録商標）における遺伝子発現との差が最も大きかった（図２）。
【０１５６】
３つのβ−グルコシダーゼ（NCU08755、NCU04952、および、NCU00130）は、アビセル（登録商標）またはススキ（Miscanthus）を用いて野生型のN. crassaが生育している間に、転写レベルが著しく増加することが知られている（Tian et al, 2009）。加えて、質量分析法によって、NCU04952が分泌タンパク質として同定された（Tian et al, 2009）。これら３つのβ−グルコシダーゼが、セロビオースを利用したセルラーゼの誘導において役割を果たしているか否かを決定するために、単一のβ−グルコシダーゼを欠失している３種類の菌株を、セロビオースが媒介するセルラーゼの誘導のためのｑＲＴ−ＰＣＴによってスクリーニングした。しかしながら、単一のβ−グルコシダーゼの欠失変異体には、著しい効果を示すものは無かった。余計なβ−グルコシダーゼの活性の問題、および、最小限のグルコース濃度における強力なカタボライト  リプレッションの可能性、を克服するために、３つのβ−グルコシダーゼを欠失した株を作製した。
【０１５７】
アビセル（登録商標）を用いた場合、３つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、試験した３種類のセルラーゼの誘導について、野生株と似た表現型を示した（図３）。しかしながら、２％のセロビオースを用いた場合、野生型の株では、ｃｂｈ−１についてはスクロースを用いたときの２０倍誘導されるのみであり、ｃｂｈ−２またはｅｇ−２についてはスクロースを用いたときと誘導に違いが無かった。一方、２％のセロビオースを用いた場合、３つのβ−グルコシダーゼの変異株では、非常に異なった様相を示し、ｃｂｈ−１についてはスクロースを用いたときの６，５００倍誘導され、ｃｂｈ−２についてはスクロースを用いたときの２，１００倍誘導され、ｅｇ−２についてはスクロースを用いたときの２，２００倍誘導された（図３）。
【０１５８】
（３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子およびｃｒｅ−１遺伝子の欠失株における、セルラーゼの転写の誘導）
３つのβ−グルコシダーゼの欠失株とΔｃｒｅ−１株とを掛け合わせることによって、野生株がアビセル（登録商標）へ応答するのと同様に、セロビオースに対して転写レベルで応答する変異体を作製した。セロビオースまたはアビセル（登録商標）の何れかを用いて当該変異体に誘導をかけると、セロビオースまたはアビセル（登録商標）を用いたときの３つのβ−グルコシダーゼの欠失株、および、アビセル（登録商標）を用いたときの野生株のように、ｃｂｈ−１、ｃｂｈ−２およびｅｇ−２について同様に転写が誘導された（図３）。これらの結果は、ｃｒｅ−１が一般的なセルロース分解レギュロンとして機能していること、および、ｃｒｅ−１の欠失がN. crassaのセルラーゼの永久的な機能低下（depression）を引き起こすこと、を示している。
【０１５９】
ｃｒｅ−１の欠失株では、アビセル（登録商標）を用いた場合に、セルラーゼの転写および分泌が穏やかに増加することが知られている。同様に、Ｃｒｅ−１では、スクロースを用いたときのｃｂｈ−１およびｅｇ−２の転写のベースレベルが、スクロースを用いたときの野生型の略７倍に増加することが知られている（図４）。セロビオースを用いて誘導した場合に、Δｃｒｅ−１は、スクロースを用いて誘導した場合よりも、ｃｂｈ−１の転写が６００倍に増加し、ｅｇ−２の転写が８０倍に増加する（図３）。発現における当該増加は、スクロースを用いたときの発現と比較して顕著ではあるが、アビセル（登録商標）を用いてΔｃｒｅ−１を誘導したときに観察される、ｃｂｈ−１における１１，０００倍の増加、ｅｇ−２におけ８０００倍の増加からすれば、僅かでしかない（図３）。
【０１６０】
セロビオースに対する転写応答が特異的な応答であって、一般的な飢餓による効果ではないことを示すために、炭素源を用いない対照実験を行った。スクロースを用いた最初の１６時間のプレ増殖期（pre-growth phase）の後で、最小培地を用いて穏やかな洗浄を行い、残留するスクロースを残さず除去した。そして、最後に、バイオマスを、炭素源が全く添加されていない最小培地を含む培地へ移した。スクロース、セロビオースまたはアビセル（登録商標）が加えられたときの培養と同じ方法にてこれらの培養を行ったので、ＲＴ−ＰＣＲを介して得られた転写データは、飢餓がセルラーゼの転写に及ぼす一般的な影響を示している。
【０１６１】
図５は、野生株、Δｃｒｅ−１、および、３つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、飢餓によって僅かな誘導（３〜３０倍の増加）を示すのに対し、３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とｃｒｅ−１遺伝子とを欠失した株は、これらの条件下において、ｃｂｈ−１およびｅｇ−２の転写がより大きく増加することを示している。３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とｃｒｅ−１遺伝子とを欠失した株をスクロースにて生育させたときと比較して、当該株の飢餓に対する応答は、ｃｂｈ−１およびｅｇ−２の誘導が、各々３４０倍および２００倍である。これらの影響は、アビセル（登録商標）またはセロビオースを用いたときに観察される１０，０００倍〜２０，０００倍に達するｃｂｈ−１およびｅｇ−２の誘導と比較すれば、僅かでしかない。それ故に、これらの結果は、アビセル（登録商標）およびセロビオースに対するこれらN. crassaのセルラーゼの転写応答は、特異的なものであって、飢餓に対する一般的な応答ではない、ことを示している。
【０１６２】
自然にセルロースが加水分解される場合、著しいグルコース  レプレッションが引き起こされる程に高い濃度のセロビオースおよびグルコースが蓄積されることはない。実験におけるセロビオースの濃度を変化させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて上記現象を再現することができる。図６は、欠失株と比較して、野生型の株ではセルラーゼの誘導が著しく減少している一方で、野生型のセルラーゼの発現は濃度依存性であって、より高い１０ｍＭというセロビオースの濃度よりも、より低い１ｍＭというセロビオースの濃度の方がより良い誘導物質として機能することを示している。主要なβ−グルコシダーゼの活性を取り除くことにより、両方のセロビオース濃度において、野生型の誘導の２５倍の誘導が達成される。更に、カタボライト  リプレッサーであるＣＲＥ−１を欠失させると、セロビオースの濃度を増加させても、もはや酵素の誘導を制限しない（図６）。
【０１６３】
（β−グルコシダーゼ遺伝子の欠損が示す、セロビオースによって誘導される、セルロース分解酵素の生産の増加）
スクロースまたはアビセル（登録商標）を用いて誘導した場合、３つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、野生型と非常に似た結果を示す。スクロースを用いた場合、２日後に、非常に少量の分泌されたタンパク質（１８０μｇ／ｍＬ）が観察される（図７）。そして、当該分泌されたタンパク質は、ＭｕＬａｃに対して全く活性を有していない（図８）。アビセル（登録商標）を用いて誘導した場合、４日目までに、上清中に有意な濃度のタンパク質が観察される（図７）。この培養上清は、同じ時点において、野生型の培養物と同様に、Ａｚｏ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ活性およびＭｕＬａｃ活性を有している（５．５μｇ  ＣＢＨＩ等価物）（図８および９）。スクロースおよびアビセル（登録商標）を用いた培養では、この欠失株は、野生型と似ている。一方、この欠失株は、セロビオースに対して全く異なる応答をする。セロビオースを用いた場合の２日目において、１．４μｇの組み換えＣＢＨＩに等価なＭｕＬａｃ活性が観察され、４日目までに、当該値は、４．８４μｇの組み換えＣＢＨＩ等価物の値にまで有意に増加する（図８Ｂ）。そして、Ａｚｏ−ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ活性は、アビセル（登録商標）を用いたときの野生型に似ている（図９）。この特異的な酵素活性は、炭素のカタボライト  リプレッションの影響を最小限にしたときに、セロビオースが、転写の誘導に加えて、活性のあるセルラーゼの分泌を直接的に刺激し得ることを示している。
【０１６４】
（ｃｒｅ−１の欠失によって増大するセルロース分解酵素の生産）
セルロース分解性の培地（cellulolytic media）におけるN. crassaの生育に対するＣＲＥ−１の機能を調べるために、異なる炭素源において、Δｃｒｅ−１株と野生株との相対的な増殖速度を比較した。唯一の炭素源として２％のアビセル（登録商標）を含む培地を用いて生育させた場合、Δｃｒｅ−１株は、野生株よりも早くアビセル（登録商標）を消費し（例えば、３−４日、対、５−６日）、Δｃｒｅ−１株は、３０％多い細胞外タンパク質を分泌し、Δｃｒｅ−１株は、５０％高いエンドグルカナーゼ活性を示した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。アグリゲート  アビセル  アッセイ（aggregate Avicelase assay）（当該アッセイは、併合されたβ−グルコシダーゼ活性、エンドセルラーゼ活性およびエキソセルラーゼ活性を意図している）は、野生株と比較して、Δｃｒｅ−１株におけるグルコース濃度が２０％高いことを示している（図１０Ｂ）。しかしながら、セロビオースの検出量が少ないことは、Δｃｒｅ−１株においてβ−グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースへ変換する；図１０Ｂ）の分泌が増加していることを示唆している。
【０１６５】
野生株と比較して、Δｃｒｅ−１株は、一般的により多くの分泌タンパク質を生産していると考えられる。このことは、セロビオースおよびアビセル（登録商標）によって誘導された培養物においてのみならず、スクロースを用いた４８時間目（図７および１１）においても明らかである。なお、当該スクロースを用いた４８時間目では、分泌タンパク質の濃度は、野生型における分泌タンパク質の濃度の略２倍である（４８１μｇ／ｍＬ、対、２７０μｇ／ｍＬ）。Δｃｒｅ−１は、スクロースを用いたときにより多くのタンパク質を分泌する一方で、これらのタンパク質は、ＭｕＬａｃに対して何ら活性を示さない（図８）。７０ｋＤａの最も明確なバンドは、ＣＢＨ−１／２と同じ分子量に対応する。活性が無いことは、ＢＮＨ−１／２の不活性型であるか、あるいは、別の非セルロース分解性タンパク質であることを示唆している。転写に関する試験にて観察された事項と同様に、Δｃｒｅ−１株は、セロビオースを用いたときに（６５３μｇ／ｍＬ）、セルラーゼの分泌が少し増加する（図７）。そして、当該増加は、ＭｕＬａｃに対する活性（．８ｕｇ）の穏やかな増加を引き起こす（図８Ｂ）。加えて、アビセル（登録商標）を用いて誘導した場合、４日目のＭｕＬａｃ活性は、野生型の活性よりも低い（２．８ｕｇ  ＣＢＨＩ等価物）（図８Ｂ）。しかしながら、３日目と比較して、４日目における全体的なタンパク質のバンドパターンが概してより薄いことから、この効果は、飢餓に起因する可能性がある（図１２）。
【０１６６】
（β−グルコシダーゼ遺伝子とｃｒｅ−１遺伝子との欠失によって引き起こされる、セロビオースを用いた誘導時のセルロース分解酵素の生産の増加）
野生型よりも多くのタンパク質を恒常的に分泌している点において、３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とｃｒｅ−１遺伝子とを欠失した株は、ｃｒｅ−１を欠失した株と似ている。また、スクロースまたはアビセル（登録商標）にて誘導したときの、タンパク質ゲル（protein gel）にて可視化されたパターンが、これらの２つの株において非常に似ている（図１１）。Δｃｒｅ−１株と、３つのβ−グルコシダーゼおよびｃｒｅ−１を欠失した株と、の間の主要な相違点は、分泌されたタンパク質の活性におけるセロビオースの影響である（図８）。セロビオースを用いたときには４日目までに、当該変異株は、１１μｇのＣＢＨＩ等価物よりも多い量を生産することができる。当該量は、アビセル（登録商標）を用いたときに同じ時点で生産される量よりも多い（図８Ｂ）。加えて、Ａｚｏ−ＣＭＣ活性アッセイは、アビセル（登録商標）またはセロビオースを用いた誘導培養の両方において、この株が、似た量のＥｎｄｏ−１，４−β−グルカナーゼ活性を生産することを示している（図９）。
【０１６７】
〔実施例２〕
後述する実施例は、N. crassaのβ−グルコシダーゼのオーソロガス遺伝子であるNCU00130、NCU04952およびNCU08755の同定に関する。
【０１６８】
［材料および方法］
National Center for Biotechnology Information（NCBI）non-redundant amino acid databaseと、検索要求（queries）としてのNCU00130、NCU04952およびNCU08755のアミノ酸配列と、を用いて、BLASTpサーチを行った。BLASTpサーチにてヒットした配列を、ClustalW2を用いてMEGA5にて整列させた。
【０１６９】
近隣結合法（Saitou N. and Nei M., 1987）を用いて、系統樹を作製した。ピアソン  コレクション法（Zuckerkandl E. and Pauling L., 1965）を用いて進化距離を算出した。なお、当該進化距離は、サイトあたりのアミノ酸置換の数のユニットにある。進化に関する解析は、MEGA5にて行った（Tamura K., Dudley J., Nei M., and Kumar S., 2007）。
【０１７０】
［結果］
図１３に、近縁関係にある菌類における、オーソロガス遺伝子であるNCU00130、NCU04952およびNCU08755に対する、ClustalWアミノ酸配列アラインメントの結果を示す。
【０１７１】
図１４に、β−グルコシダーゼ  NCU00130の系統樹を示す。
【０１７２】
図１５に、β−グルコシダーゼ  NCU04952の系統樹を示す。
【０１７３】
図１６に、β−グルコシダーゼ  NCU08755の系統樹を示す。
【０１７４】
〔実施例３〕
後述する実施例は、３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassa株、および、３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とｃｒｅ−１遺伝子とを欠失しているN. crassa株から高レベルにて分泌されるタンパク質の、同定および特性検討に関する。
【０１７５】
［材料および方法］
（株）
Fungal Genetics Stock Center（FGSC）から入手した株には、野生型（FGSC 2489）、細胞内のβ−グルコシダーゼ  NCU00130の欠失株（FGSC 11822およびFGSC 11823）、細胞外のβ−グルコシダーゼ  NCU08755の欠失株（FGSC 18387およびFGSC 18388）、および、NCU04952の欠失株（FGSC 13731およびFGSC 13732）が含まれる。ホモカリオンであるｃｒｅ−１を欠失している株（NCU08807）は、（４４）内に記載されている。複数の欠失を有する株は、順次掛け合せることによって作製した。複数の欠失を有する各株の遺伝子型は、遺伝子に特異的なプライマーと、ハイグロマイシン（ｈｐｈ）カセット対する共通のプライマーと、を用いて確認した。ｈｐｈに対するフォワードプライマーとして、実施例１の配列番号４に示すものを用いた。NCU00130、NCU004953、NCU08755およびNCU08807のために用いたリバースプライマーは、実施例１にて用いたものと同じであった。具体的に、NCU00130のためのリバースプライマーは配列番号５であり、NCU004953のためのリバースプライマーは配列番号６であり、NCU08755のためのリバースプライマーは配列番号７であり、NCU08807のためのリバースプライマーは配列番号８であった。
【０１７６】
（転写に関する試験）
菌株の分生子を、２５０ｍＬの三角フラスコ内に入った、２％  ｗ／ｖのスクロースを含む５０ｍＬのフォーゲルの塩（４５）へ、ＯＤ５９５が．０５になるように植菌した。そして、当該分生子を、照明が点いた状態で、２００ｒｐｍにて１６時間生育させた。次いで、バイオマスに対して４２００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離を行うとともに、バイオマスをフォーゲルの塩にて２回洗浄することによって、過剰なスクロースを除去した。次いで、当該バイオマスを、５０ｍＬのフォーゲルの塩が入った新しいフラスコへ加えた。なお、当該フォーゲルの塩には、１％  ｗ／ｖのスクロース、０．２％  ｗ／ｖのセロビオース（Sigma）、または、１％  ｗ／ｖのアビセル（登録商標）ＰＨ１０１（Sigma）が追加されていた。照明が点いた状態にて、培養物に対して、２００ｒｐｍにて４時間の誘導をかけた。次いで、ブフナー漏斗上のワットマン  ガラス  マイクロファイバー  フィルター（ＧＦ／Ｆ）にて濾過するとともに、５０ｍＬのフォーゲルの塩を用いて洗浄することによって、培養したバイオマスを集めた。バイオマスを、液体窒素中で瞬時に冷凍させ、そして、当該バイオマスを、−８０℃にて保存した。各時点において、３つの独立した生物学的な複製物（フラスコ）について、試験を行った。
【０１７７】
（ＲＮＡの分離）
ジルコニア／シリカ  ビーズ（直径０．５ｍｍ；Biospec)、Mini-Beadbeater-96（Biospec）、および、１ｍＬのTRIzol試薬（Invitrogen）を用い、これらの使用説明書にしたがって、凍結サンプルから全ＲＮＡを精製した。TURBO DNA-free（Ambion）およびRNeasy kit（Qiagen）を用いて消化することによって全ＲＮＡを更に精製した。ナノドロップ、および、アガロースゲル電気泳動によって、ＲＮＡの濃度および品質を確認した。
【０１７８】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
EXPRESS One-Step SYBR GreenER Kit（Invitrogen）、および、StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて、定量的なＲＴ−ＰＣＲを行った。全反応容量を１０μＬとし、当該全反応容量中に３００ｎＭのフォワードプライマー、３００ｎＭのリバースプライマー、および、７５ｎｇの鋳型ＲＮＡが含まれている状態にて、３回の反応を行った。データの解析は、Relative Quantitation/Comparative CT（ΔΔＣＴ） settingを利用したStepOne Software（Applied Biosystems）を用いて行った。データを、対照サンプルとしての、スクロースによって発現した内在性のコントロールであるアクチン、に対して標準化した。
【０１７９】
アクチン（NCU4173）のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、実施例１の配列番号９および配列番号１０であり、ｃｂｈ−１（NCU07340）のＲＴ−ＰＣＴに用いたプライマーは、実施例１の配列番号１１および配列番号１２であり、ｇｈ６−２（NCU09680）のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、実施例１の配列番号１３および配列番号１４であり、ｇｈ５−１（NCU00762）のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、実施例１の配列番号１５および配列番号１６であった（４６，４７）。
【０１８０】
（ｍＲＮＡの配列決定）
ｍＲＮＡの配列決定は、Illumina kit（RS-100-0801）と、精製したＲＮＡと、を用いて行った。最終的なｃＤＮＡライブラリーを、Agilent bioanalyzer 2000によって定量化するとともに、標準的なIlluminaの操作手順にしたがってIllumina Genome Analyzer-IIを用いて配列を決定した。
【０１８１】
（系統発生学的な解析）
系統発生学的な解析に用いたＢ−Ｇ’ｓのための、GenBank accession numbers（PID）、 Joint Genome Institute protein ID（JGI）、または、Broad Institute Fusarium Comparative Database Genes（FGSG）numberは、以下のとおりである。つまり、NCU08755：Myceliophthora thermophila、JGI 80304：Aspergillus niger、PID 254674400；Phanerochaete chrysosporium、PID 19352194；Trichoderma reesei、JGI 121735；Fusarium graminearum、FGSG_06605；Sclerotinia sclerotiorum、PID 156051478；Botryotinia fuckeliana、PID 154301968；Penicillium chrysogenum、PID 255942539；Schizophyllum commune、JGI 256304；Postia placenta、JGI 107557.  NCU00130：Myceliophthora thermophila、JGI 115968；Aspergillus niger、PID 213437；Phanerochaete chrysosporium、PID 127920；Trichoderma reesei、JGI 120749；Fusarium graminearum、FGSG_07274；Sclerotinia sclerotiorum、PID 156037816；Botryotinia fuckeliana、PID 156037816；Penicillium chrysogenum、PID 255941826；Schizophyllum commune、JGI 57050；Postia placenta、JGI 45922.  NCU04952：Myceliophthora thermophila、JGI 66804；Aspergillus terreus、PID 115401928；Phanerochaete chrysosporium、PID 3320413；Trichoderma reesei、JGI 76672；Sclerotinia sclerotiorum、PID 156050519；Botryotinia fuckeliana、PID 154293970；Penicillium chrysogenum、PID 255945487；Schizophyllum commune、PID 302694815。
【０１８２】
アラインメントに用いた全てのタンパク質は、BLASTpを用いて同定した。相同タンパク質の配列は、ClustalWを用いてMEGA5にて整列させた。距離を見積もるためのポアソンモデルと、５００回のブートストラップ反復（bootstrap replications）を用いた最近隣枝交換（ＮＮＩ）ツリー検索ストラテジー（Nearest-Neighborhood-Interchange（NNI） tree searching strategy）と、を用いて、最大尤度系統（Maximum Likelihood phylogeny）を決定した（４８，４９）。
【０１８３】
（発現差分（Differential Expression）の解析）
生物学的な差異を明確にするために、培地を替えてから４時間目において、セルロースおよびスクロースを用いた野生株に関して、３つの培養物をサンプリングするとともに解析した。全ての別の菌株およびコンディションについては、単一のＲＮＡｓｅｑライブラリーを解析した。
【０１８４】
Tophat（version 1.1.4）（50）を用いて、N. crassa OR74Aのゲノム（version 10）における推測される転写物に対して、配列を決定したライブラリーをマッピングした。FPKMs（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）のCufflinks（version 0.9.2）（５１）を用いて、転写物の量を見積もった。なお、このとき、上から４分の１の順位における正規化（upper quartile normalization）を用い、Broad Instituteに由来するリファレンスのアイソフォームに対してマッピングした。
【０１８５】
（階層的クラスタ分析）
複数の菌株の間において、または、複数の生育条件の間において統計学的に顕著な発現の変化を示す遺伝子を、Cuffdiffを用いて同定した。このとき、上から４分の１の順位における正規化、および、遺伝子座毎にマップされた読み取りの最小値（minimum of mapped reads per locus）を用いた。次いで、これらの遺伝子を選別にかけて、ｉ）菌株／コンディション試験の各々において、全ての生物学的な複製物の間で、見積もられた量が２倍の変化を示す遺伝子、および、ｉｉ）少なくとも１つの菌株／コンディション試験において、常に１０より大きなＦＰＫＭを有する遺伝子、のみを選択した。
【０１８６】
セルロースを用いた野生株、セロビオースを用いた野生株、セロビオースを用いた変異株、および、セルロースを用いた変異株に関して、FPKMにしたがったCluster 3.0 (52)を用いて、階層的クラスタ分析を行った。クラスタリングに先立って、FPKMをlogへ変換し、遺伝子ごとの基準（per-gene basis）に基づいて菌株／生育条件にわたって標準化し、菌株／生育条件にわたる平均値に基づいて中央を決めた。クラスタリング法における、類似関数および平均連鎖（similarity metric and average linkage）として、ピアソンの相関係数（中央が決められていない（uncentered））を用いた。
【０１８７】
（フラスコの振とう試験）
培養物は、１％のスクロース中で２４時間成長させ、その後、２％のスクロースまたは０．２％のセロビオースを加えた。２４時間後（ＷＴ、Δ３βＧ、および、Δ３βＧΔｃｒｅ）または７２時間後（Δ３βＧ）に、上清を回収した。アビセル（登録商標）を用いたＷＴの培養物は、２％のアビセル（登録商標）の存在下で５日間生育させ、Δ３βＧは、１％のスクロースの存在下で２４時間生育させた後で１％のアビセル（登録商標）の存在下で４８時間生育させ、Δ３βＧΔｃｒｅは、１％のスクロースの存在下で２４時間生育させた後で１％のアビセル（登録商標）の存在下で２４時間生育させた。
【０１８８】
（バイオリアクターの試験）
セルラーゼの生産は、１Ｌの操作容積にて、３．７Ｌのバイオリアクター（BioEngineering AG）内で行った。適切に撹拌を行うために、バイオリアクターには、１個の４８ｍｍのＲｕｓｈｔｏｎ型のインペラと、等しく間隔をあけた４個のバッフルと、が備えられていた。インペラのスピードを、８時間の間は、胞子を発芽させるために２００ｒｐｍに制御し、その後の残りの試験では、５００ｒｐｍまでに制御した。温度は２５℃に維持され、培地のｐＨは５．５に制御された。なお、培地のｐＨの制御には、４０％のリン酸、および、１：５に希釈された水酸化アンモニウムを用いた。溶存酸素を、培地の飽和濃度の２０％よりも高い濃度に維持した。当該維持は、溶存酸素圧（dissolved oxygen tension）に基づいて、通気速度を０．５〜３ＶＶＭに変化させることによって行った。唯一の炭素源として１％  ｗ／ｖのスクロースを含む最少培地（他の物でない限り、記載）に、１０９の分生子を植菌した。生育を開始してから２４時間後に、最終濃度が０．２％  ｗ／ｖとなるようにセロビオースまたはアビセル（登録商標）を加えることによって、セルラーゼの生産を誘導した。誘導の０時間または１２時間前、誘導時、誘導してから４、８、１２、２４および３６時間後に、上清のサンプルを回収した。サンプルに対して４０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行うことによって、バイオマスを沈殿させた。そして、全てのサンプルを回収するまで、上清を２μｍのＰＥＳフィルターにて濾過して−２０℃にて保存した。
【０１８９】
（酵素活性のアッセイ）
分泌された全タンパク質は、Bio-Rad Protein Assay kit（Bio-Rad）を用いて測定され、１５μＬの濃縮されていない上清を４−１４％のＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ポリアクリルアミドゲルにて泳動することによって可視化され、かつ、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色された。
【０１９０】
全アビセラーゼの活性は、２００ｒｐｍにてオービタルシェーカーにて撹拌しながら、５０℃にて、２５０ｍＬの培養ボトル内にて処理された。各ボトルには、５０ｍＬの操作容積にて、１％のセルロース（アビセル（登録商標））および５０ｍＭ（ｐＨ５．０）の酢酸ナトリウムが入っていた。微生物の混入を防ぐために、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）が加えられた。加水分解試験を開始するに先立って、あらゆる溶解した糖を除去するために、１０ｋＤａのＭＷＣＯ遠心濾過機を用いて、バイオリアクターの培養液サンプルのバッファー交換を行った。加水分解する混合物を予め５０℃に加熱した後、酵素を加えた（１ｍＬの濾過された培養液）。はじめの１２時間の間は４時間毎にサンプルを採取し、その後の合計４８時間の間は１２時間毎にサンプルを採取した。加水分解試験は、３回行った。
【０１９１】
（糖の解析）
３０℃の条件下にて、CarboPac PA20 Analytical Column（３×１５０ｍｍ）およびCarboPac PA20 guard column（３×３０ｍｍ）を用いて、DIONEX ICS-3000 HPLC（Dionex Corp., Sunnyvale, CA）によって、スクロース、フルクトース、グルコースおよびセロビオースを測定した。２５μＬの希釈されたサンプルを注入し、４ｍＬ／ｍｉｎの条件下にて、１００ｍＭのＫＯＨ（isocratic）を用いて溶出を行った。ＰＡＤを用いて糖を検出し、Chromeleon software packageを用いて、４つの潜在的な糖質の波形（Four-Potential Carbohydrate Waveform）およびピークを解析した。
【０１９２】
（質量分析）
液体クロマトグラフィー−質量分析（liquid chromatography−mass spectrometry）に用いる移動相の溶媒を準備するために、Fisher Scientific（Pittsburgh, PA）から購入したアセトニトリル（Fisher Optima grade, 99.9%）およびギ酸（Pierce, 1 mL ampules, 99＋％）、並びに、Milli−Q Gradient ultrapure water purification system（Millipore, Billerica, MA）を用いて１８．２  ＭΩ・ｃｍ（２５℃）の抵抗率に精製した水、を用いた。
【０１９３】
四重極直交加速飛行時間型（Ｑ−ｔｏｆ）質量分析計（orthogonal acceleration quadrupole time-of-flight (Ｑ−ｔｏｆ) mass spectrometer）を用いて、トリプシンにて消化されたタンパク質を解析した。なお、当該四重極直交加速飛行時間型（Ｑ−ｔｏｆ）質量分析計は、直列にて、ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ultraperformance liquid chromatograph：ＵＰＬＣ）へ連結されていた。Ｃ１８トラップ用カラム（１８０μｍ×２０ｍｍ）、分析用カラム（１００μｍ×１００ｍｍ）、および、１０μＬのサンプルループを備えたnanoAcquity UPLC（Waters, Milford, MA）を用いて、ペプチドを分離した。Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａは、水が９９．９％でありギ酸が０．１％のものであり、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂは、アセトニトリルが９９．９％でありギ酸が０．１％のものであった（ｖ／ｖ）。分析の前に、隔壁キャップにてシールされたポリプロピレン製の０．３ｍＬのスナップ−トップ  バイアル（Wheaton Science, Millville, NJ）に入ったサンプル溶液を、nanoAcquity autosampler compartment内へ装填した。サンプル（１０μＬ）を注入した後、流速が１５μＬ／ｍｉｎの条件下にて、１００％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ａを用いて３分間のトラッピングを行った。サンプル間の二次汚染を防止するために、注入後に、５００μＬのＳｏｌｖｅｎｔ  ＡおよびＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂの各々を用いて、注入用の注射針を洗浄した。溶出プログラムは、３０分間にて８％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂから３５％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂへ変化するリニア・グラディエント（linear gradient）、０．３３分間にて９５％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂへ変化するリニア・グラディエント、３．６７分間にわたる９５％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂによる一定状態、０．３３分間にて１％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂへ変化するリニア・グラディエント、および、１１．６７分間にわたる１％のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂによる一定状態、からなるものであった。なお、当該溶出プログラムでは、流速は、５００ｎＬ／ｍｉｎであった。分析用カラムおよびサンプルコンパートメントは、各々、３５℃および８℃に維持された。
【０１９４】
ＵＰＬＣカラムの出口は、Universal NanoFlow Sprayer nanoelectrospray ionization（nanoESI）エミッターへ連結された。なお、当該エミッターは、質量分析計（Q-tof Premier, Waters, Milford, MA）のナノフローイオン源内に備え付けられたものであった。nanoESIエミッターチップは、サンプリングコーン開口（sampling cone aperture）から略３ｍｍの位置に配置された。nanoESIソースパラメーターは、以下のとおりであった。つまり、nanoESI電圧が２．４ｋＶであり、噴霧ガス（窒素）の圧力が０．１５ミリバール（ｍｂａｒ）であり、サンプルコーン電圧が３５Ｖであり、エクストラクションコーンおよびイオンガイド電圧が４Ｖであり、ソースブロック温度が８０℃であった。コーンガスは、用いなかった。コリジョンセルには、８×１０−３ｍｂａｒの圧力のアルゴンガスが含まれていた。Ｔｏｆ分析器を‘Ｖ’モードにて操作した。これらの条件下では、通常、１．０×１０４（ｍ/ｚ＝７７１にて測定）の質量分解能（５３）が実現された。当該質量分解能は、本試験において測定される、一価にまたは多価に帯電したプレカーサーイオンおよび断片イオンの同位体の分布（isotopic distributions）を解明するのに十分なものであった。それ故に、独立して、イオンの質量および電荷を決定した。つまり、ｍ／ｚスペクトル内で隣接する同位体ピークの間の間隔の逆数から、イオンの電荷を決定した。解析を行う直前に、ギ酸ナトリウムの水溶液を用いて、エクスターナルな質量のキャリブレーションを行った。０．４５ｓのスキャンインテグレーションと０．０５ｓのインタースキャンディレイとを用いた、ｍ／ｚ＝４００−１５００のポジティブイオンモードにて、計測スキャンを行った。データ依存モードでは、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）解析のための各計測スキャンから、２０カウント／秒（ｃｐｍ）の強度閾値よりも大きい最大５つのプレカーサーイオンを選択した。ＭＳ／ＭＳにおいて、２＋、３＋、および、４＋の電荷状態のプレカーサーイオンを選択するために、リアルタイムの脱同位体および電荷状態の識別（Real-time deisotoping and charge state recognition）を行った。任意のプレカーサーイオンの質量および電荷状態に基づいて、自動的に衝突活性化解離の衝突エネルギー（ＣＡＤ）（Collision energies for collisionally activated dissociation（CAD））を選択した。０．２０ｓのスキャンインテグレーションと０．０５ｓのインタースキャンディレイとを用いて、ｍ／ｚ＝１００−２０００の範囲にて、ＭＳ／ＭＳスペクトルを測定した。最大２Ｓの累積ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて３０，０００ｃｐｍの最小全イオン電流（ＴＩＣ）（minimum total ion current（TIC））を達成するために、イオンをフラグメント化させた。不必要なＭＳ／ＭＳ測定が発生することを避けるために、リアルタイムの動的排除（real−time dynamic exclusion）を用いて、３００Ｓの期間にわたって±０．２ｍ／ｚユニットの排除幅にて、既に解析されたプレカーサーイオンが再び選択されることを防いだ。
【０１９５】
トリプシンによって消化されたタンパク質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析にて得られたデータを、ProteinLynx Global Server software（version 2.3, Waters）を用いて処理した。当該ProteinLynx Global Server software（version 2.3, Waters）によって、バックグラウンド除去（３５％の閾値および５次の多項式（fifth order polynomial））、スムージング（Savitzky-Golay、１０回、３チャンネルよりも大）、質量スペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの重心化（centroiding）（４つのチャンネルの半分の高さにおける、上位８０％の各ピークおよび最少ピークの幅）を行った。処理されたデータを、Neurospora crassaのタンパク質のデータベース（Broad Institute, Cambridge, MA）に対して検索した。データベースの検索には、以下の基準を用いた。つまり、プレカーサーイオン質量トレランスが１００ｐｐｍ、フラグメントイオン質量トレランスが０．１５Ｄａ、消化試薬がトリプシン、間違った分解を最大３つまで許容、メチオニンの酸化は変化可能な修飾である。ペプチドをＭＳ／ＭＳスペクトルへ対応付けるために、同じシリーズから少なくとも３つの連続したフラグメントイオン（換言すれば、ｂタイプのフラグメントイオン、または、ｙタイプのフラグメントイオン）を同定する必要があった。ペプチドを同定するフラグメントイオンの存在を確かめるために、ＭＳ／ＭＳスペクトルを検査した。３つの生物学的な複製物（全上清、結合ＰＡＳＣ、非結合ＰＡＳＣ）中の２つにおいて、少なくともペプチドが検出された場合、タンパク質が存在すると決定した。
【０１９６】
［結果］
（３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassaの、セロデキストリンを用いた誘導培養におけるセルラーゼの転写の誘導）
野生型のN. crassa（ＷＴ）を、スクロース、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを単一の炭素源として用いて成長させた場合には、リグノセルロース分解酵素遺伝子は誘導されず、セルロース分解酵素活性も検出されなかった（図１７Ａ）。これは、N. crassaがセロデキストリンによって成長するときに、β−グルコシダーゼ酵素の活性によって産生されたグルコースが、セロデキストリンの誘導能を隠す可能性があると考えられた（図１）。N. crassaのゲノムは、推定β−グルコシダーゼ酵素をコードしている少なくとも７つの遺伝子を有しているが、３つのみ（ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５）が、アビセル（登録商標）またはMiscanthus（２０）による成長の間に、転写が有意に増加する。これらのβ−グルコシダーゼの３つ全てが、他の糸状菌において推定され且つ実験的に証明されたβ−グルコシダーゼ酵素に対して高い相同性を示した。発現データに基づいて、ＧＨ１−１（ＮＣＵ００１３０）、ＧＨ３−３（ＮＣＵ０８７５５）およびＧＨ３−４（ＮＣＵ０４９５２）は、N. crassaが単一の炭素源としてアビセル（登録商標）またはセロデキストリンによって成長するときにセロビオースをグルコースへ変換することにおいて、最も関連がある酵素であると考えた。
【０１９７】
セロビオースがN. crassaにおけるセルラーゼ遺伝子の発現を誘導するかどうかを検証するために、β−グルコシダーゼ遺伝子であるｇｈ１−１、ｇｈ３−３またはｇｈ３−４を欠失している株において、３つの主要なセルラーゼ遺伝子（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０；ｇｈ６−２、ＮＣＵ０９６８０およびｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の発現が誘導されたかどうかを、移行実験によって試験した。β−グルコシダーゼ酵素間の重複の可能性を排除するために、β−グルコシダーゼ遺伝子を異なる組合せで欠失している二重変異体株および三重変異体株も構築し、試験を行った。０．２％セロビオースを用いて４時間に亘って誘導した後に、それぞれのβ−グルコシダーゼ欠失株（Δｇｈ１−１、Δｇｈ３−３またはΔｇｈ３−４）は、ｃｂｈ−１、ｇｈ６−２またはｇｈ５−１の発現の誘導を示さなかった。これに対して、Δｇｈ１−１Δｇｈ３−３二重変異体は、いくつかのセルラーゼ遺伝子の誘導を示した。しかし、ＷＴの培養をアビセル（登録商標）に移したときのように、全ての３つのβ−グルコシダーゼ遺伝子（Δｇｈ１−１、Δｇｈ３−３およびΔｇｈ３−４）を欠失している株（Δ３βＧ）は、０．２％セロビオースに移したときのｃｂｈ−１、ｇｈ５−１およびｇｈ６−２の相対的な発現レベルが類似していた（図１８Ａ）。さらに、Δ３βＧ株は、セロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオースに移したときのｃｂｈ−１、ｇｈ５−１およびｇｈ６−２の相対的な発現レベルが類似していた（図１７Ｂ）。Δ３βＧ変異体における転写応答は、セロビオースに特異的であった。そして、あらゆる炭素源を欠失している培地に移したときのＷＴ株およびΔ３βＧ株におけるｃｂｈ−１およびｇｈ５−１の発現は、転写レベルでのわずかな増加のみを示したので（５０倍未満の誘導）、Δ３βＧ変異体における転写応答は、飢餓が原因ではなかった。ＷＴのN. crassaにおけるアビセル（登録商標）によるｃｂｈ−１およびｇｈ５−１の誘導およびセロビオースに移したΔ３βＧ株におけるアビセル（登録商標）によるｃｂｈ−１およびｇｈ５−１の誘導が、〜２０，０００倍（最小値）であることと比較すると、これらの値は無視してもよい。
【０１９８】
工業用の種であるT. reeseiにおいて、もっとも広く使用されている可溶性のセルラーゼ誘導剤は、ソホロースおよび乳糖である（２５）。それゆえ、ＷＴおよびΔ３βＧ欠失株を用いて、ソホロースまたは乳糖への接触によってN. crassaにおけるセルラーゼ遺伝子の発現が誘導されるかどうかを調べた。他の糸状菌種にみられるように（１５）、ＷＴまたはΔ３βＧ変異体を、ソホロース、乳糖またはＤ−（＋）−ガラクトース（乳糖の分解産物）を含有している培地に移すと、セルラーゼ遺伝子の発現は有意に誘導されなかった（図１９）。
【０１９９】
たとえリグノセルロースが存在していたとしても、炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）は、糸状菌において、グルコースまたはスクロース等の好ましい炭素源の存在下におけるセルラーゼ遺伝子およびヘミセルラーゼ遺伝子の発現を抑制するために機能する（４）。Aspergillus sp.、T. reeseiおよびN. crassaにおいてＣｒｅＡ／ＣＲＥ１／ＣＲＥ−１を欠失している株は、それぞれ、セルロースまたはヘミセルロースによって成長するときにセルラーゼおよびヘミセルラーゼの量を増加させる。このため、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー転写因子であるＣｒｅＡ／ＣＲＥ１／ＣＲＥ−１（２６）は、ＣＣＲにおいて主要な役割を担っている（２１、２７、２８）。N. crassaのｃｒｅ−１欠失株（ΔＮＣＵ０８８０７）から単離されたＲＮＡの定量的なＲＴ−ＰＣＲ解析は、ｃｂｈ−１およびｇｈ５−１の基礎的な発現が、ＷＴ株に対しておよそ１０倍増加したことを示した。スクロースから０．２％セロビオースに４時間に亘って移したときに、Δｃｒｅ−１株は、ｃｂｈ−１、ｇｈ５−１およびｇｈ６−２の誘導の増加を示した（それぞれ、３，０００倍、５００倍および８５倍）。しかし、Δｃｒｅ−１変異体における誘導のレベルは、アビセル（登録商標）に接触したＷＴまたはセロビオースに接触したΔ３βＧ変異体において得られた誘導レベルよりも有意に低かった。特に、ｃｒｅ−１も欠失しているΔ３βＧ株（Δ３βＧΔｃｒｅ）は、アビセル（登録商標）に移したＷＴまたはセロビオースに移したΔ３βＧ変異体よりも、ｃｂｈ−１、ｇｈ５−１およびｇｈ６−２をより強く誘導した（図１８Ａ）。これらのデータは、セロビオースに接触したときのΔ３βＧ変異体におけるセルラーゼ遺伝子の発現の誘導が、セルロースによる誘導と遜色ないこと、およびＣＣＲが解除された結果ではないことを示している。
【０２００】
（セロビオースに接触した三重β−グルコシダーゼ変異体における野生型のN. crassaのセルロース分解反応の再現）
Δ３βＧ株におけるセロビオースに対する全ゲノム応答が、アビセル（登録商標）に接触したＷＴ株と類似しているかまたは異なっているかを評価するために、ハイスループットシークエンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を用いた。遺伝子発現の変化の全ゲノムパターンは、セロビオースに対するΔ３βＧ変異体の応答が、アビセル（登録商標）によって誘導されたＷＴの応答と密接に一致することを示した。そして、セロビオースに対するΔ３βＧ変異体の応答が、セロビオースに対するＷＴの応答または飢餓状態におけるＷＴの応答とは有意に異なっていることを示した。アビセル（登録商標）に対する応答において、ＷＴのN. crassaにおいてどの遺伝子が有意且つ特異的に誘導されたのかを特定するために、アビセル（登録商標）に移したＷＴの発現プロファイルと炭素源を追加していない培地に移したＷＴの発現プロファイルとの間でペアワイズ解析を実施した。これらの解析によって、３２１個の遺伝子（３つの欠失したβ−グルコシダーゼ遺伝子を含む）を同定した。これらの遺伝子は、アビセル（登録商標）に対する応答において、ＷＴ培養において有意且つ特異的に誘導された（セルロースレギュロン）。この遺伝子セットは、１６個の推定セルラーゼ遺伝子と、１２個の推定ヘミセルラーゼ遺伝子とを含んでいた。セルロースレギュロンにおける追加遺伝子は、ＣＡＺｙ（２９）によって炭水化物において活性があると予測されたタンパク質をコードしている４１個の遺伝子と、分泌タンパク質（ｓｉｇｎａｌＰ）（３０）をコードしている１１１個の遺伝子とを含んでいた。セルロースレギュロンにおける３２１個の遺伝子の内、１５６個は未分類のタンパク質として特徴づけられるタンパク質をコードしている（MIPS FunCat database）（３１）。特に興味深いことに、ｘｌｎＲ／ｘｙｒ１の相同体（ＮＣＵ０６９７１）は、Aspergilli（３２）およびT. reesei（３３）におけるセルラーゼの制御において主要な役割を担っており、セルロースレギュロンに分類される。しかし、ＮＣＵ０６９７１は、N. crassa（３４）において、ｘｌｎＲ／ｘｙｒ１相同体として既に同定されたが、植物細胞壁の分解におけるその役割は未知である。
【０２０１】
セロビオースまたはアビセル（登録商標）の炭素源を含有していない培地に移したＷＴの発現データと、セロビオースまたはアビセル（登録商標）を含有している培地に移したΔ３βＧ株の発現データとから、セルロースレギュロンの範囲内において遺伝子の階層的クラスタ分析を行った結果、４つの異なる発現クラスタを同定した（図２０Ａ）。最も大きいクラスタ（クラスタ２）は、２１０個の遺伝子を含み、セロビオースにおけるΔ３βＧ株またはアビセル（登録商標）誘導条件下のΔ３βＧ株と同様に、アビセル（登録商標）におけるＷＴ株において高い発現を示した。２１０個の遺伝子のこのグループは、セルロース分解のためのアクセサリータンパク質であると特定された３つの遺伝子（ＮＣＵ００２０６、ｃｄｈ−１；ＮＣＵ０７１４３、ｌａｃ−２；ＮＣＵ０９７６４、ＣＢＭ１含有タンパク質）と同様に、全ての１６個の推定セルラーゼ遺伝子（ＮＣＵ００７６２、ｇｈ５−１；ＮＣＵ００８３６、ｇｈ６１−７；ＮＣＵ０１０５０、ｇｈ６１−４；ＮＣＵ０２２４０、ｇｈ６１−１；ＮＣＵ０２３４４、ｇｈ６１−１２；ＮＣＵ０２９１６、ｇｈ６１−３；ＮＣＵ０３３２８、ｇｈ６１−６；ＮＣＵ０４８５４、ｇｈ７−２；ＮＣＵ０５０５７、ｇｈ７−１；ＮＣＵ０５１２１、ｇｈ４５−１；ＮＣＵ０７１９０、ｇｈ６−３；ＮＣＵ０７３４０、ｃｂｈ−１；ＮＣＵ０７７６０、ｇｈ６１−２；ＮＣＵ０７８９８、ｇｈ６１−１３；ＮＣＵ０８７６０、ｇｈ６１−５；ＮＣＵ０９６８０、ｇｈ６−２）を含んでいた（２０，３５）。このクラスタは、９個のヘミセルラーゼ遺伝子（ＮＣＵ０２３４３、ｇｈ５１−１；ＮＣＵ０２８５５、ｇｈ１１−１；ＮＣＵ０４９９７、ｇｈ１０−３；ＮＣＵ０５９２４、ｇｈ１０−１；ＮＣＵ０５９５５、ｇｈ７４−１；ＮＣＵ０７２２５、ｇｈ１１−２；ＮＣＵ０７３２６、ｇｈ４３−６；ＮＣＵ０８１８９、ｇｈ１０−２；ＮＣＵ０９７７５、ｇｈ５４−１）も含んでいた。このクラスタにおける残りの１８２個のタンパク質の内、２９個はＣＡＺｙ（２９）によって炭水化物において活性があると予測され、７６個はｓｉｇｎａｌＰによって分泌されると予測されると共に、２５個の遺伝子は両方のカテゴリーに分類される。残る１０２個の遺伝子は、推定された機能的カテゴリー（３１）、すなわち、Ｃ−化合物および炭水化物の代謝に関与すると推定された１０個の遺伝子；タンパク質の折畳み、修飾または輸送に関与する８個の遺伝子；および未分類のタンパク質をコードする６２個の遺伝子に分類された。
【０２０２】
３６個の遺伝子の小さなクラスタ（クラスタ１）は、ＷＴ株またはΔ３βＧ欠失株がアビセル（登録商標）に接触したときに、高い発現レベルを示した（図２０Ａ）。しかし、セロビオースに接触したΔ３βＧ欠失株においては、より低い発現レベルを示した。このグループは、推定β−キシロシダーゼ遺伝子（ＮＣＵ０９６５２、ｇｈ４３−５）およびヘミセルロースにおいて活性があるタンパク質をコードしているいくつかの他の遺伝子（ＮＣＵ００７１０、アセチルキシランエステラーゼ；ＮＣＵ０１９００、キシロシダーゼ／アラビノシダーゼ；ＮＣＵ００８９１、キシリトールデヒドロゲナーゼ；およびＮＣＵ０８３８４、キシロース還元酵素）を含んでいた。これらの結果は、これらの遺伝子は、アビセル（登録商標）において見出されたように、０．５〜１．０％ヘミセルロースによって誘導されたこと（２０）、およびセロビオースによって誘導されたレギュロンの一部ではないことを示している。
【０２０３】
セロビオースにおけるΔ３βＧ株の誘導と、アビセル（登録商標）におけるＷＴの誘導とを比較すると、顕著なパターンが現れる（図２０Ｂ）。アビセル（登録商標）によってＷＴにおいて誘導された遺伝子は、Δ３βＧ変異体において認められた値と非常に近い。例えば、アビセル（登録商標）におけるＷＴにおいて、ｃｂｈ−１のためのＦＰＫＭは１２６，８１６±５３，０１６である。一方、セロビオースにおけるΔ３βＧにおいて、ＦＰＫＭは１３０，８６５である。このパターンは、ＮＣＵ０７７６０（ｇｈ６１−２）のような、わずかに誘導されたセルラーゼにまで及ぶ。アビセル（登録商標）におけるＷＴにおいて、ＮＣＵ０７７６０（ｇｈ６１−２）のためのＦＰＫＭは２３９±６２であり、セロビオースにおけるΔ３βＧ変異体において、ＦＰＫＭは５３８であった。一方で、Δ３βＧ変異体におけるいくつかのヘミセルラーゼ遺伝子が、セロビオースに対する応答において誘導された。しかし、アビセル（登録商標）によって誘導したＷＴ培養またはΔ３βＧ培養における発現レベルよりも低かった。例えば、アビセル（登録商標）を用いて誘導したＷＴにおいて、ＮＣＵ０５９２４（エンドキシラーゼ、ｇｈ１０−１）は、２０，０２３±９，８８８ＦＰＫＭであった。これに対して、セロビオースによって誘導したΔ３βＧ変異体においては、１０，０００ＦＰＫＭの発現レベルが観察された。これらの結果は、全てのセルラーゼ遺伝子が同じレギュロン内にあること、およびヘミセルラーゼ遺伝子は、セルラーゼによって協調的に制御されるものと、完全誘導のためにさらなるシグナルが必要なものとに分類されることを示している。
【０２０４】
（Δ３βＧ変異体における植物細胞壁分解酵素の転写は、セルラーゼ分泌およびセルラーゼ活性と関連している）
セロビオースに対する応答において、Δ３βＧ株およびΔ３βＧΔｃｒｅ株の転写応答が機能的なタンパク質の増加と関連するかどうかを検証するために、セロビオースまたはアビセル（登録商標）による誘導に対する応答において、Δ３βＧ株およびΔ３βＧΔｃｒｅ株の分泌タンパク質およびセルラーゼ活性をＷＴ培養と比較することによって評価した（ＳＩ材料および方法）。予測されたとおり、全てのスクロース成長培養からの上清（Δ３βＧ、Δ３βＧΔｃｒｅおよびＷＴ）は、アビセル（登録商標）加水分解試験において、結晶質セルロースからグルコースまたはセロビオースを産生することができなかった（材料および方法）。一方、アビセル（登録商標）によって誘導した培養からの全ての３つの上清（Δ３βＧ、Δ３βＧΔｃｒｅおよびＷＴ）は、結晶性セルロースをセロビオースおよびグルコースに分解することができた（図１８Ｃ）。セロビオースを用いて成長させたときに、Δ３βＧ株およびΔ３βＧΔｃｒｅ株は、ＷＴのアビセル（登録商標）成長培養と同様の分泌タンパク質のパターンを示した（図１８Ｂ）（２０）。重要なことに、セロビオースによって誘導した、Δ３βＧ欠失株およびΔ３βＧΔｃｒｅ欠失株からの上清は、結晶性セルロースを加水分解した。一方で、ＷＴのセロビオース成長培養からの上清は、結晶性セルロースを加水分解しなかった。Δ３βＧ株およびΔ３βＧΔｃｒｅ株は、３つのβ−グルコシダーゼを欠失しており、大部分はセロビオースを産生した。これらのデータは、ＷＴの培養においてグルコース産生活性の大部分をもたらす点で、３つのβ-グルコシダーゼ酵素の役割と一致している（３７）。
【０２０５】
工業用の糸状菌は、種々の産物を高レベルに産生するために、液内培養において成長させられる（３８）。それゆえ、制御されたバイオリアクター工程において、Δ３βＧ欠失株およびΔ３βＧΔｃｒｅ欠失株におけるセルラーゼの誘導を調べた（図７Ａ〜Ｄ）。スクロースを用いた成長の２４時間後に、ＷＴ、Δ３βＧおよびΔ３βＧΔｃｒｅは、同量のバイオマス（〜３．５ｇ／Ｌ）を産生した（図７Ａ〜Ｃ）。０．２％セロビオースを用いた誘導後に、ＷＴは、大量のタンパク質を分泌しなかった（．０５ｍｇ／ｍＬ；図７Ｃ）。一方、Δ３βＧ培養およびΔ３βＧΔｃｒｅ培養は、上清において、それぞれ、０．１２ｍｇ／ｍＬのタンパク質および０．２４ｍｇ／ｍＬのタンパク質を産生した（図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、セロビオースによって誘導した、Δ３βＧ培養およびΔ３βＧΔｃｒｅ培養は、この誘導の同じ期間に亘って、エンドグルカナーゼ活性が有意に増加した（図７Ｆ）。２４時間の時点の合計のアビセラーゼ活性を調べると、Δ３βＧΔｃｒｅ株は、Δ３βＧ株（０．２９６ｍｇ／ｍＬ）と比較して、さらに６０％のグルコース等価物（０．４２４ｍｇ／ｍＬ）を産生したことがわかった（図７Ｅ）。しかし、タンパク質の全濃度を規準化すると、Δ３βＧΔｃｒｅ株は、ＷＴまたはΔ３βＧの培養上清よりも比活性が低かった（図２１）。
【０２０６】
（分泌タンパク質のプロテオーム解析）
アビセル（登録商標）において成長するＷＴのN. crassaによって分泌されるタンパク質に対する、セロビオースによって誘導したΔ３βＧ株によって分泌されるタンパク質の独自性を比較するために、ショットガンプロテオミクスアプローチを用いてセクレトームを解析した（表１）。ＷＴのアビセル（登録商標）成長培養上清において、３９個のタンパク質が同定された。セロビオース成長培養において、Δ３βＧ培養液において３８個のタンパク質が同定され、Δ３βＧΔｃｒｅ培養液において２４個のタンパク質が同定された（図２２）。定量的な質量分析法によって、アビセル（登録商標）におけるＷＴのN. crassaのセクレトームの７６％は、６個の個別のタンパク質からなると結論付けられた（３５）。これらのタンパク質の全てが、ＷＴ培養液、Δ３βＧ培養液、およびΔ３βＧΔｃｒｅ培養液において同定された（欠失したβ−グルコシダーゼ、ｇｈ３−４を除く）（表１）。セルラーゼに加えて、少量のアクセサリータンパク質を同定した。これらのアクセサリータンパク質は、セクレトームの計６．５％を構成する（３５）。同定したアクセサリータンパク質は、セロビオースデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ−１）、２型ラクトナーゼ（ＬＡＣ−２）、および２つの仮想タンパク質（すなわち、ＮＣＵ０９７６４、機能未知のＣＢＭ１−含有タンパク質、およびＮＣＵ０５１３７、欠失するとセルラーゼ活性の増加をもたらす遺伝子）であった（２０）。これらのデータは、セロビオースに対するΔ３βＧ変異体の転写応答と同様に、セロビオースにおけるΔ３βＧ株において分泌されたタンパク質の独自性と、分泌されたタンパク質の量とが、アビセル（登録商標）に対するＷＴのN. crassaの応答とよく似ていることを示している。
【０２０７】
【表１】
2014508534.tif 000002
【０２０８】
表１において、ＧＨは、グリコシド加水分解酵素を表し、Ｎ／Ａは遺伝子ノックアウトを示す。セクレトームの割合は、アビセル（登録商標）によって誘導されたセクレトームを、ＡＱＵＡ質量分析法（３５）によって同定した。１３個のタンパク質が、全セクレトームの９１％に相当し、全ての他のタンパク質がセクレトームの１％未満に相当した。
【０２０９】
〔実施例４〕
以下の実施例は、N. crassaの遺伝子であるＮＣＵ００８９０およびN. crassaの遺伝子であるＮＣＵ０６６５０の欠失を含むN. crassa株におけるセルラーゼ活性の特定に関する。
【０２１０】
［材料および方法］
N. crassaの三重β−グルコシダーゼ遺伝子欠失株と、N. crassaの三重β−グルコシダーゼ遺伝子およびｃｒｅ−１遺伝子欠失株とを、実施例１において記載したとおり作製した。
【０２１１】
ＮＣＵ０６６５０（ＦＧＳＣ  １１２４６および１１２４７）の欠失株およびＮＣＵ００８９０（ＦＧＳＣ  １６７４９）の欠失株は、真菌遺伝子ストックセンター（Fungal Genetics Stock Center）（ＦＧＳＣ）から取得した。多重欠失株は、連続交雑を行うことによって産生した。それぞれの多重欠失株の遺伝子型は、遺伝子特異的プライマーおよびハイグロマイシン（ｈｐｈ）カセットに対する共通プライマーを用いて確認した。フォワードプライマーは以下であった：
hph Middle FWD:  5’-CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’  ［配列番号４］
リバースプライマーは以下であった：
NCU06650:    5’- CAT CTC ATA CTC CCT CAT CC-3’    ［配列番号２３］
NCU00890:    5’- GGT TGT CTC GGT CGA CAT TG -3’    ［配列番号２４］。
【０２１２】
エキソグルカナーゼ（セロビオヒドラーゼＩ）活性は、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−セロビオシド（ＭｕＬａｃ）試験を用いて測定した。この試験は、主に、ＣＢＨ−１の活性を測定するものである。そして、活性は、蛍光における変化として表され、蛍光における変化は、酵素活性の指標としてのベストフィットラインの傾きを時間とともにもたらす。この試験は、２０μｌの全培養上清と、最終濃度が１．０ｍＭのＭｕＬａｃおよび５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５とを含む、全量１００μｌにおいて実施される。この試験は、４０℃に設定されたベックマンコールターパラダイムプレートリーダー（Beckman Coulter Paradigm plate reader）において、３６０／４６５ｎｍの励起波長／発光波長を用いて、１０分間にわたって３０秒ごとに測定することによって実施した。ベストフィットラインの傾きは、それぞれの培養上清のＭｕＬａｃ活性を表している。
【０２１３】
［結果］
ＮＣＵ００８９０欠失およびＮＣＵ０６６５０欠失の両方が分泌過剰として特徴づけられることを考えると、これらの欠失を、三重β−グルコシダーゼおよびｃｒｅ−１欠失株と組み合わせることによって、セルラーゼ分泌が増加することを確認する必要があった。ＮＣＵ００８９０遺伝子は、β−マンノシダーゼをコードしている。ＮＣＵ０６６５０遺伝子は、ホスホリパーゼに最も近い相同性を有していると特徴付けられたポリペプチドをコードしている。
【０２１４】
図２３において示したように、ＮＣＵ００８９０欠失またはＮＣＵ０６６５０欠失を三重β−グルコシダーゼ欠失株と組み合わせると、セロビオースによる誘導の２４時間後に、セロビオヒドラーゼＩ活性における少量の増加が認められた。さらに、ｃｒｅ−１欠失も含むことによって、六重変異体（三重β−グルコシダーゼ欠失と、ＮＣＵ００８９０欠失およびＮＣＵ０６６５０欠失の両方とを含む）は、セロビオースによる誘導の２４時間後に、さらに高いセロビオヒドラーゼＩ活性を有していた。
【０２１５】
β−マンノシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００８９０の相同体は、Trichoderma reeseiにおいて同定された。T. reesei相同体は、スキャフォールド１０（Scaffold 10）、258215-260779、protein ID 62166；およびスキャフォールド４（Scaffold 4）、877954-880802、protein ID 57857において見出される。
【０２１６】
さらに、遺伝子ＮＣＵ０６６５０の相同体は、T. reeseiにおいて同定された。この相同体は、スキャフォールド２２（Scaffold 22）、490155-490769、protein ID 67579において見出された。
【０２１７】
T. reesei相同体は、DOE Joint Genome Institute T. reesei databaseを用いて、ＮＣＵ００８９０またはＮＣＵ０６６５０のＢＬＡＳＴｐサーチを行うことによって同定された。
【０２１８】
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【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】N.crassaのβ-グルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの転写調節のためのモデルを示す。
【図２】N.crassaにおけるセルラーゼ酵素に関する遺伝子発現の経時変化を示す。
【図３】ＷＴ、Δ３βＧおよびΔ３βＧΔｃｒｅにおいて、０．２％のセロビオースまたは０．１％のアビセル（登録商標）を用いて４時間誘導した後、選択したセルラーゼの遺伝子発現を示す。
【図４】２％のスクロースを用いた最小培地に移して４時間経過したΔｃｒｅ−１における、セルラーゼ  セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の遺伝子発現レベルを示す。
【図５】野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１における、絶食状況下でのセルラーゼ  セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の遺伝子発現レベルを示す。
【図６】１０ｍＭまたは１ｍＭのいずれかのセロビオースを用いて４時間誘導した後の、セルラーゼ  セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ−１、ＮＣＵ０７３４０）およびエンドグルカナーゼ２（ｇｈ５−１、ＮＣＵ００７６２）の遺伝子発現レベルを示す。
【図７】セロビオースおよびアビセル（登録商標）を用いて誘導した後の、ＷＴ、Δ３βＧ、およびΔ３βＧΔｃｒｅ株における、タンパク質生成および酵素活性を示す。
【図８】野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１の培養濾過液における、ＭｕＬａｃ活性（セロビオヒドロラ−ゼ１）の比較を示す。
【図９】野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ―１の培養濾過液中のＡｚｏ−ＣＭ−セルロース活性の比較を示す。
【図１０】N.crassa野生型およびΔｃｒｅ−１株の表現型の比較を示す。
【図１１】野生型（ＷＴ）、Δｃｒｅ−１、Δ４９５２Δ８７５５Δ１３０、およびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０Δｃｒｅ−１欠失変異体の培養上清中に分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１２】野生型、N.crassaおよびΔ４９５２Δ８７５５Δ１３０（β−ＧｔＫＯ）の培養上清中に分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１３】近縁関係にある菌類における、オーソロガス遺伝子であるＮＣＵ００１３０（配列番号１）、ＮＣＵ０４９５２（配列番号２）およびＮＣＵ０８７５５（配列番号３）に対する、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。
【図１４】β−グルコシダーゼＮＣＵ００１３０オーソロガス遺伝子の進化の関係を示す。
【図１５】β−グルコシダーゼＮＣＵ０４９５２オーソロガス遺伝子の進化の関係を示す。
【図１６】β−グルコシダーゼＮＣＵ０８７５５オーソロガス遺伝子の進化の関係を示す。
【図１７】セロデキストリンを用いて誘導した後の、ＷＴおよびΔ３βＧにおけるセルラーゼ誘導を示す。
【図１８】セロビオースまたはアビセル（登録商標）を用いた誘導後のＷＴおよびβグルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの発現レベルを示す。
【図１９】ソホロース、ラクトースまたはＤ（＋）−ガラクトースを用いて誘導した後の、ＴＷおよびΔ３βＧにおけるセルラーゼ誘導を示す。
【図２０】ＷＴおよびΔ３βＧのｍＲＮＡの配列決定を示す。
【図２１】セロビオースまたはアビセル（登録商標）を用いて誘導した後の、ＷＴ、Δ３βＧ、およびΔ３βＧΔｃｒｅ株における酵素活性を示す。
【図２２】野生型（アビセル（登録商標））、Δ３βＧ（セロビオース）、およびΔ３βＧΔｃｒｅ（セロビオース）Neurospora crassa株において、質量分析によって同定されたタンパク質の概要を示す。
【図２３】Neurospora crassa株Δ３βＧ、Δ３βＧΔｃｒｅ、Δ３βＧΔ８９０、Δ３βＧΔ６６５０、Δ３βＧΔ６６５０Δ８９０、Δ３βＧΔｃｒｅΔ６６５０、Δ３βＧΔｃｒｅΔ８９０、およびΔ３βＧΔｃｒｅΔ６６５０Δ８９の培養濾過液中のＭｕＬａｃ活性（セルラーゼ活性）を示す。
【図１】
2014508534.tif 000003
【図２】
2014508534.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2014508534.tif 000007
【図６】
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【図７】
2014508534.tif 000009
【図８】
2014508534.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2014508534.tif 000013
【図１２】
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【図１３−１】
2014508534.tif 000015
【図１３−２】
2014508534.tif 000016
【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４】
2014508534.tif 000020
【図１５】
2014508534.tif 000021
【図１６】
2014508534.tif 000022
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2014508534.tif 000028
【図２３】
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【配列表】
2014508534000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月31日(2013.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
（ａ）変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程；および
（ｂ）上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞がリコンビナント細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、該細胞中のｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項１０】
ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる変異体細胞であって、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、ｃｒｅ−１遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
【請求項１３】
分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項１４】
前記細胞がリコンビナント細胞である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【請求項１５】
前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の変異体細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７からなる群より選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形��と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、ｃｒｅＡ／ｃｒｅ−１の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記遺伝子の発現は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダー��遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile （Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み��わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記２つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記３つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、４つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、５つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、６つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または７つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ０４９５２およびＮＣＵ０８７５５を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも１つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はＮＣＵ００８９０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも１つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はＮＣＵ０６６５０である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形��と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa（N. crassa）細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile（Myceliophthora thermophila）細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本開示の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、（ａ）リグノセルロース系バイオマスを提供する工程；（ｂ）上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程；（ｃ）上記細胞をセルロース系バイオマスと接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程；ならびに（ｄ）誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、１つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。本発明の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、（ａ）リグノセルロース系バイオマスを提供する工程；（ｂ）上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはｃｒｅ−１遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程；（ｃ）上記細胞を糖と接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程；ならびに（ｄ）誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、ＧＨ６１酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、ＮＣＵ０７３４０、ＮＣＵ０９６８０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ００７６２、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ０２２４０、ＮＣＵ０７１９０、ＮＣＵ０７８９８、ＮＣＵ０８７６０、ＮＣＵ００２０６、ＮＣＵ０７１４３、ＮＣＵ０９４９１、ＮＣＵ０９６６４、ＮＣＵ０５５９８、ＮＣＵ０９７６４およびＮＣＵ０５１３７から選択される遺伝子によってコードされる。
【国際調査報告】
2014508534.tif 000030
2014508534.tif 000031
2014508534.tif 000032
2014508534.tif 000033
2014508534.tif 000034
2014508534.tif 000035