(57)【要約】本発明は、γδＴ細胞を含む末梢血リンパ球の細胞株、その組成物、及びその製造方法に関し、また、医学的使用、すなわち薬剤に使用するための医学的使用、並びに癌免疫療法に使用するための医学的使用に関する。細胞株は、機能的な天然細胞障害性受容体（ＮＣＲ）を発現させるヒト抹消血のＶδ１＋γδＴ細胞のサンプルを含む。これらのＶδ１＋ＮＣＲ＋Ｔ細胞は、白血病細胞株及び慢性リンパ球白血病患者の腫瘍細胞の滅殺を直接媒介する。本発明は、ヒトＶδ１＋ＮＣＲ＋Ｔ細胞が、体外でγδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−ファミリーサイトカインを用いて、すべてのγδ抹消血リンパ球（γδＰＢＬ）と分化して増殖する。驚くべきことに、このような分画は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６、並びに、リンパ性白血病に対して非常に強化された細胞障害性と関連する高濃度のグランザイムＢを発現させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な天然細胞障害性受容体を発現させるＶδ１＋γδＴ細胞を含むリンパ球の細胞株。
【請求項２】
請求項１記載の細胞株であって、
機能的な天然細胞障害性受容体を発現させるＶδ１＋γδＴ細胞から構成される細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２記載の細胞株であって、
Ｖδ２＋γδＴ細胞をさらに含む細胞株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記天然細胞障害性受容体はＮＫｐ３０を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記リンパ球は末梢血サンプル由来であることを特徴とする細胞株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記天然細胞障害性受容体はＮＫｐ４４を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記天然細胞障害性受容体はＮＫｐ４６を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞株であって、
グランザイムＢを発現させる細胞を含む細胞株。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞株の細胞を含む組成物。
【請求項１０】
請求項９記載の組成物であって、
注射可能な物質であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の組成物であって、
薬剤に使用するための組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物であって、
自己又は異種の養子細胞療法、腫瘍又は癌治療、腫瘍又は癌免疫療法、及び／又は、白血病治療に使用するための組成物。
【請求項１３】
請求項１１記載の組成物であって、
急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、又は、皮膚メラノーマの治療に使用するための組成物。
【請求項１４】
請求項１１記載の組成物であって、
ウィルス感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１５】
請求項１４記載の組成物であって、
前記ウィルスはヘルペスウイルス科又はレトロウイルス科由来であることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１〜８記載の細胞株の製造方法であって、
γδＰＢＬを分離する工程と、
適切な培地に、γδＴＣＲアゴニスト及び少なくとも１つのγｃ−ファミリーサイトカインを添加して、前記細胞を培養する工程とを備える方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−ファミリーサイトカインの添加は、前記細胞の少なくとも４０％が天然細胞障害性受容体を発現させるまで、実行されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加は、前記細胞の少なくとも４０％がＮＫｐ３０を発現させるまで、実行されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニストは、フィトヘムアグルチニン、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、抗γδＴＣＲモノクローナル抗体、又は、これらの混合物であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニストの濃度の範囲が０．０１〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記γｃ−サイトカインは、ＩＬ-２、ＩＬ-４，ＩＬ-９、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２１、又は、これらの混合物であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法であって、
前記γｃ−サイトカインの濃度の範囲が、１〜１００００Ｕ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法であって、
前記γｃ−サイトカインの濃度の範囲が、１００〜１０００Ｕ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加時間の範囲が、２〜６０日であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加時間の範囲が、９〜２５日であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加時間の範囲が、１０〜１５日であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδＴ細胞を含むリンパ球の細胞株、その組成物、及びその製造方法に関し、また、医学的使用、すなわち薬剤に使用するための医学的使用、並びに癌免疫療法に使用するための医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、形質転換細胞を認識し破壊できる様々なリンパ球分画を含む非常に複雑な免疫系を持ったホストにおいて発症する。リンパ球が常に腫瘍形成の監視を繰り返す間、癌細胞は分子戦略を発現し、免疫学的監視を回避し、ホスト免疫系の圧力の下で競合的に選択されることが、現在広く知られている。「癌免疫編整（cancer immunoediting）」と呼ばれる動的プロセスは癌免疫療法への大きな障害を構成すると考えられている。
【０００３】
多数の免疫回避機構の間で、白血病とリンパ腫のプライマリーサンプルがしばしば、非古典的なＭＨＣ（major histocompatibility complex：主要組織適合遺伝子複合体）タンパク質を下方制御し、ＵＬＢＰ１がカウンター受容体ＮＫＧ２Ｄを発現するγδＴ細胞によって血液腫瘍を発現させるのに重要であることが最近示された（非特許文献１）。
【０００４】
γδＴ細胞は、健常者の１〜１０％の抹消血リンパ球（ＰＢＬ：peripheral blood lymphocytes）を構成する生得的なリンパ球であり、実験室で試験される、非常に機能的な血液腫瘍細胞株を標的にすることができる。しかしながら、多くのリンパ性白血病プライマリーサンプルが十分に活性化されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に耐性を示すということ（非特許文献１〜２）、そして、優勢なγδＰＢＬの分画も耐性を示すということが示された。さらに、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の活性化因子の体内投与を含む臨床試験は、血液腫瘍又は固形腫瘍を有する患者の１０〜３３％に限定された客観的反応により、ある程度の成果を示した。さらに、客観的反応は報告されなかったので、活性化した／増殖したＶδ２＋細胞の養子移植を含む実験の結果は少なかった。実際に、自己のＶδ２＋Ｔ細胞のシンプルな体外増殖は、体内でその監視を回避する腫瘍を観察すると、患者への再注射ではほとんど治療効果がなかった可能性があった。
【０００５】
癌免疫療法は、細胞障害性リンパ球によって腫瘍細胞認識に依存する。γδＴ細胞は、様々な動物腫瘍モデルで重要な役割を果たすＭＨＣ非制限キラーリンパ球の集団である。それにも関わらず、ヒト血液腫瘍の大部分は、特定のアゴニストで活性化されたγδ抹消血リンパ球（ＰＢＬ）と、非常によく見られるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：T-cell receptor）に耐性があるということを示した。この点は、現在のγδＴ細胞媒介免疫療法に重要な制約を構成した。
【０００６】
従って、体内に存在する天然コンポーネントに耐える腫瘍を検出するために、γδＴ細胞をさらなる認識メカニズムに与えるストラテジーを授けることが不可欠である。
【０００７】
天然細胞障害性受容体は、１０年以上前にA. Moretta等によって同定され、ＮＫ細胞の抗腫瘍機能において重要な相乗的役割を果たすことが示された。実際、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６は、特定のＮＫ細胞マーカーの２つであることが広く知られている。
【０００８】
非特許文献３は、抹消血γδＴ細胞のＮＫ受容体の発現を開示した。しかしながら、開示されたγδＴ細胞は本発明のγδＴ細胞と異なる。非特許文献３はまた、本発明とは逆に、ＮＫｐ３０がこのようなγδＴ細胞において発現しないということを示した。相違点のいくつかは次の通りである。
・治療法（(IFN-γ, TNF-α + 抗ＣＤ３モノクローナル抗体 ＋ＩＬ−１β ＋ ＩＬ−２ ＋ ＩＬ−１５）；
・γδＴ細胞の表現型（ＮＫｐ３０−及びＮＫｐ４６―；さらに、γδＴ細胞の６２％がＶδ２＋サブタイプに属する）；
・γδＴ細胞の２０％未満がＣＤ５６＋である；
・γδＴ細胞の２０％未満がＣＤ８＋である；
・ＮＫｐ４４の発現レベルが、γδＴＣＲ／ＣＤ３複合体の刺激によって変調しない（従って、異なる分子メカニズムが含まれ、そして、細胞でのＮＫｐ４４発現を誘導する）。
【０００９】
非特許文献３は、ＮＫｐ４４を発現させる抹消血γδＴ細胞を開示した。ＮＫｐ４４は、機能的であり、腫瘍細胞（骨髄腫細胞）の認識及び除去をもたらす。しかしながら、γδＴ細胞の８±７％だけがＮＫｐ４４を発現させ、γδＴ細胞の多く（６２％）がＶδ２＋サブタイプに属する（それらはＶδ１−である）。ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６はγδＴ細胞に発現せず、これらの細胞の２０％未満がＣＤ８＋又はＣＤ５６＋であった。
【００１０】
従って、開示されたγδＴ細胞株は総合的に、本願発明者等が同定したγδＴ細胞株と異なる。本願発明者等の細胞株におけるγδＴ細胞の９５％超は通常、Ｖδ１＋サブタイプに属し、これらのＶδ１＋γδＴ細胞の（通常３０％を超える）高い割合は機能的なＮＫｐ４４を発現させる。重要なことに、ＮＫｐ４４はＮＫｐ３０との相乗効果を示し、顕著に腫瘍細胞を認識して滅殺する能力を強くする（図５Ｂ）。ＮＣＲ間のこのような協同は、所望の効果（癌の除去）を獲得するのに重要であり、事前に同定されたＮＫｐ４４＋γδＴ細胞には見られない。
【００１１】
非特許文献４は、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞でのＮＫＧ２Ｄ受容体の共通の発現を開示した。非特許文献４はまた、γδＴ細胞の増殖及び活性化が抗腫瘍反応を生むことを述べている。しかしながら、本発明は反対に、γδ細胞はＮＫｐ３０−及びＮＫｐ４６−である。
【００１２】
特許文献１は、実質的に精製されたγδＴ細胞の認識に基づいた白血病の治療方法を開示した。本方法は、リンパ球の活性化と、その増殖とを備える。主な相違点は以下の通りである。
・治療法（プレートに結合させた（plate-bound）固定化抗ＴＣＲ抗体＋放射線照射“フィーダ”腫瘍Ｂ細胞）；
・γδＴ細胞（ＮＫｐ３０−、ＮＫｐ４４−、ＮＫｐ４６−、ＣＤ８−）。
【００１３】
特許文献２は、γδＴ細胞のような細胞障害性細胞団を分離する工程と、治療薬及び細胞障害性細胞の認識工程とを備える、患者の癌を減少する方法を開示した。本発明との主な相違点は、γδＴ細胞が遺伝子学的に変更され、化学療法薬に抵抗するということである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第００／４４８９３号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０５３７５０号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Lanca, T. et al., “The MHC class Ib protein ULBP1 is a nonredundant determinant of leukemia/lymphoma susceptibility to gammadelta T-cell cytotoxicity”, Blood115:2407-2411; 2010
【非特許文献２】Gomes, A.Q. et al., “Identification of a panel of ten cell surface protein antigens associated with immunotargeting of leukemias and lymphomas by peripheral blood gammadelta T cells”, Haematologica 95:1397-1404, 2010
【非特許文献３】von Lilienfeld-Toal, M., J. Nattermann, et al. (2006). "Activated gammadelta T cells express the natural cytotoxicity receptor natural killer p 44 and show cytotoxic activity against myeloma cells." Clin Exp Immunol 144(3):528-533
【非特許文献４】Rey, J., C. Veuillen, et al. (2009). "Natural killer and gammadelta T cells in haematological malignancies: enhancing the immune effectors." Trends Mol Med 15(6): 275-284
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、機能的な天然細胞障害性受容体（ＮＣＲ）を発現させるＶδ１＋γδＴ細胞を含む、又は当該Ｖδ１＋γδＴ細胞から構成される抹消血リンパ球の細胞株に関する。より好ましい実施形態において、天然細胞障害性受容体は、ＮＫｐ３０を含む、又は当該ＮＫｐ３０から構成される。
【００１７】
より好ましい実施形態において、開示した細胞株はさらに、Ｖδ２＋γδＴ細胞を含む。
【００１８】
開示した細胞株の他のより好ましい実施形態において、天然細胞障害性受容体はさらに、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、又はその混合物を含む。
【００１９】
開示した細胞株の他の好ましい実施形態において、細胞株は、グランザイムＢを発現させ得る。
【００２０】
開示した主題はさらに、細胞株を備える組成物を含む。より好ましい実施形態において、組成物は注射可能な物質である。好ましい実施形態において、注射可能な組成物は、機能的な天然細胞障害性受容体を発現させる、８０％以上、すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％の機能的Ｖδ１＋γδＴ細胞から構成される細胞集団を含み、より好ましくは、天然細胞障害性受容体はＮＫｐ３０を含み、又はＮＫｐ３０から構成され、そして、機能的な天然細胞障害性受容体を発現させる１億個以上のＶδ１＋γδＴ細胞を含むことを特徴とする。好ましくは、組成物はまた、薬学的に許容可能な物質又はキャリアと、より好ましくは、ヒト血清アルブミンのような安定剤とを含む。細胞は、自己移植、すなわち、同じ生物学的製剤由来（又は同じドナー由来）の自己移植であることが好ましい。より好ましくは、細胞は、開示した主題により説明された方法等の方法によって得られる。
【００２１】
開示した主題の他の態様は、本発明に開示した細胞株の細胞を含む組成物の薬剤における使用である。
【００２２】
より好ましい実施形態において、本発明の開示した組成物は、自己又は異種の養子細胞療法、腫瘍又は癌治療、腫瘍又は癌免疫療法、及び／又は、白血病治療に使用し、あるいは、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、又は、皮膚メラノーマ等の治療のために使用する。
【００２３】
より好ましい実施形態において、本発明で開示した組成物は、ウィルス感染の治療に使用され得る。すなわち、処置されるウィルスは、ヘルペスウイルス科、又はレトロウイルス科等由来である。
【００２４】
開示した主題はさらに、γδＰＢＬを分離する工程を含む、開示した細胞株の製造方法を含む。より好ましい実施形態において、測定サンプル（starting sample）は、抹消血サンプル、又はその画分を含む血液、並びに、バフィーコート細胞、単核細胞及び低密度単核細胞を含む血液であってもよい。細胞は、密度勾配遠心法等の公知技術を用いて、血液の測定サンプルから得てもよい。すべてのγδＰＢＬは、磁性標的された抗ＴＣＲγδ＋抗体を用いたポジティブ選択、又はＴＣＲγδ（−）細胞の枯渇／除去を介して分離される。γδＰＢＬは、ＲＰＭＩ１６４０又はＩＭＤＭ等の任意の適切な哺乳類細胞の培地で維持される。
【００２５】
開示した主題はさらに、γδＴＣＲアゴニストの存在下で、好ましくは可溶性又は固定化された前記アゴニストの添加（より好ましくは連続添加）によって、そして、少なくとも１つのγｃ−サイトカインの存在下で、好ましくは前記サイトカインの添加（より好ましくは連続添加）によって、適切な培地でこのような細胞を培養する方法を含む。前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインは、培養時に、また培養期間を通じて、好ましくは３〜６日毎に細胞の前記培養物に添加され、前記培養物中におけるγδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの濃度が常に一般的に０より大きい。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加は、細胞の少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％が天然障害性受容体を発現させるまで実行され得る。より好ましい実施形態において、前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加は、天然障害性受容体、すなわちＮＫｐ３０を含む又はＮＫｐ３０からなる天然障害性受容体を発現させる、５０００万個、１億個、２億個を超える生存能力があり機能的な細胞が達成されるまで実行され得る。
【００２７】
開示した方法のより好ましい実施形態において、前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加は、少なくとも４０％の細胞、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、１００％の細胞がＮＫｐ３０を発現させるまで実行され得る。
【００２８】
開示した方法のより好ましい実施形態において、γδＴＣＲアゴニストは、植物レクチン（フィトヘムアグルチニン−ＰＨＡを含む）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３ｍＡｂを含む）、抗γδＴＣＲモノクローナル抗体、又は、これらの混合物を含むがこれに限定されるものではない、すべてのＶδ１＋γδＰＢＬ中で発現するγδＴＣＲ／ＣＤ３受容体複合体を活性化し、刺激し、又は誘発し得る可溶性の又は固定化された分子又は化合物であってもよい。他のアゴニストの抗体がＶδ１＋γδＴＣＬに使用されてもよい。用語「抗体（antibodies）」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、一本鎖可変フラグメント、及び組み換え技術によって作られた結合パートナーを含む。より好ましくは、γδＴＣＲアゴニストの濃度の範囲は、０．０１〜１００μｇ／ｍｌであり、さらにより好ましくは１〜５μｇ／ｍｌであってもよい。
【００２９】
開示した方法のより好ましい実施形態において、「γｃ−サイトカインは」、共通サイトカイン受容体γ（ガンマ）鎖ファミリーのサイトカイン、好ましくは、インターロイキン、すなわち、ＩＬ−２、ＩＬ−４，ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、又は、これらの混合物等を意味する。使用されるインターロイキンは、人間由来又は動物由来、好ましくは人間由来であってもよい。また、インターロイキンは、野生型タンパク質、あるいは、任意の生物学的に活性なフラグメント又は変異体であってもよく、すなわち、その受容体を結合可能で、本発明の方法の条件のγδＴ細胞の活性化を含み得る。より好ましくは、サイトカインは、他の分子、例えばペプチド、ポリペプチド、又は生物学的に活性なタンパク質と融合又は複合して水溶性であってもよい。好ましくは、ヒト組み換えγｃ−サイトカインが使用される。より好ましくは、インターロイキンの濃度の範囲は、１〜１００００Ｕ／ｍｌ、さらに好ましくは１００〜１０００Ｕ／ｍｌであってもよい。
【００３０】
開示した方法の他の好ましい実施形態において、前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加は、２〜６０日間実行され、より好ましくは９〜２５日間、さらにより好ましくは１０〜１５日間、すなわち、１１、１２、１３，１４日間実行されてもよい。
【００３１】
本発明は、γδＴ細胞を含む末梢血リンパ球の細胞株、その組成物、及びその製造方法において、好ましくは、薬剤に使用するため、すなわち癌免疫療法に使用するために、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６を発現させることを特徴とする。
【００３２】
本発明は、白血病細胞株及び慢性リンパ性白血病患者の新生細胞の滅殺を直接媒介する、天然障害性受容体（ＮＣＲｓ）を発現させるＶδ２（−）Ｖδ１＋ γδＰＢＬｓの新規な分画を特徴とする。ＮＣＲ＋ Ｖδ１＋ Ｔ細胞が、機能的なＰＩ−３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を要求するプロセスを介して、γｃ−サイトカイン及び汎ＴＣＲアゴニストによる刺激で、全体のγδＰＢＬから分化し、大きくなるということを見出した。驚くべきことに、このような分画は安定して、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６と、リンパ性白血病細胞に対する細胞障害性を増強することを関連する高濃度のグランザイムＢとを発現させる。特別な機能獲得及び機能損失の実験により、ＮＫｐ４６を除く、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４が、ＴＣＲ−非依存性の白血病細胞認識の非冗長性で相乗的な役割を果たすことを証明した。従って、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ Ｔ細胞は、ヒトの癌の養子細胞免疫療法のための、誘導可能で特化したキラーリンパ球集団から構成される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１ａ】汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化された、増強した抗白血病細胞障害性のγδＰＢＬ培養を示す図。
【図１ｂ】汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化された、増強した抗白血病細胞障害性のγδＰＢＬ培養を示す図。
【図１ｃ】汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化された、増強した抗白血病細胞障害性のγδＰＢＬ培養を示す図。
【図２ａ】汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化されたγδＰＢＬ中の天然細胞障害性受容体発現の誘導を示す図。
【図２ｂ】汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化されたγδＰＢＬ中の天然細胞障害性受容体発現の誘導を示す図。
【図２ｃ】汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化されたγδＰＢＬ中の天然細胞障害性受容体発現の誘導を示す図。
【図３ａ】天然細胞障害性受容体が選択的に発現し、Ｖδ１＋Ｔ細胞を急速に増殖させることを示す図。
【図３ｂ】天然細胞障害性受容体が選択的に発現し、Ｖδ１＋Ｔ細胞を急速に増殖させることを示す図。
【図４ａ】ＡＫＴ−依存γｃ−サイトカイン及びＴＣＲシグナル伝達がＶδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０発現を誘導することを示す図。
【図４ｂ】ＡＫＴ−依存γｃ−サイトカイン及びＴＣＲシグナル伝達がＶδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０発現を誘導することを示す図。
【図５】ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４がＮＣＲ＋γδＰＢＬによって滅殺する腫瘍細胞に影響を与えることを示す図。
【図６ａ】ＮＣＲ＋γδＰＢＬが、プライマリーリンパ球性白血病に対して、増大した細胞障害性を与える安定した分画であることを示す図。
【図６ｂ】ＮＣＲ＋γδＰＢＬが、プライマリーリンパ球性白血病に対して、増大した細胞障害性を与える安定した分画であることを示す図。
【図６ｃ】ＮＣＲ＋γδＰＢＬが、プライマリーリンパ球性白血病に対して、増大した細胞障害性を与える安定した分画であることを示す図。
【図７】ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されたγδＰＢＬにおけるＮＫｐ３０に対するアイソタイプコントロール染色を示す図。
【図８】Ｖγ９Ｖδ２ＰＢＬがＰＨＡ−誘導アポトーシスに影響され易くないことが好ましいことを示す図。
【図９】ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されたγδＰＢＬ培養物中のＶδ１＋Ｔ細胞濃縮を示す図。
【図１０】新たに分離されたγδＰＢＬがＮＫｐ３０を発現させないことを示す図。
【図１１】ＴＣＲとＩＬ−２シグナル伝達が増殖性のＶδ１＋Ｔ細胞においてＮＫｐ３０発現を誘導することを示す図。
【図１２】ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ＰＢＬにおけるＣＤ５６の発現増加を示す図。
【図１３】Ｂ７ｈ６が多くのリンパ性白血病サンプルにおいて過剰発現しないことを示す図。
【図１４】ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化された培養物におけるγδＰＢＬの表現型を示す図。
【図１５】ＮＫｐ３０＋γδＰＢＬが、様々な組織起源由来の癌細胞に対して高い細胞障害性があることを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
添付図面は、本発明を説明するために好ましい実施形態を提供し、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
図１ａ、図１ｂ、図１ｃは、汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化された、増強した抗白血病細胞障害性のγδＰＢＬ培養を示す図。（Ａ）：γδ末梢血リンパ球（γδＰＢＬ）は、健常被験者の末梢血からＭＡＣＳ（磁気細胞分離装置）で分離され（左図）、ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２又はＰＨＡ／ＩＬ−２のいずれか一方で４〜１９日間刺激された。活性化は、ＣＤ６９発現増加（中央図；新たに分離したコントロール細胞のレベルは影を付している）、及びＣＦＳＥ希釈（右図；点線は初期ＣＦＳＥレベルを示す）に対するフローサイトメトリー法によって評価された。（Ｂ−Ｃ）：事前活性化（Ａで１４日間）されたγδＰＢＬを、ＤＤＡＯｓｅラベルされた白血病細胞と３時間同時培養した。腫瘍細胞溶解は、アネキシンＶ染色法によって評価され、フローサイトメトリー法を使用した。（Ｂ）：Ｂｖ１７３白血病細胞株に対する異なるドナーの代表的な結果である。割合はアネキシンＶ＋腫瘍細胞に関する。基底腫瘍細胞アポトーシス（γδＰＢＬがない場合）は、＜５％であった。（Ｃ）：４つの白血病標的細胞腫を有する６つの異なるドナーの結果の要約である。エラーバーはＳＤ（ｎ=６，＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）を示す。（Ｄ）：新たに分離され、ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２活性化され、そして、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたγδＰＢＬ中のＧｚｍＢｍＲＮＡ濃度のリアルタイムＰＣＲ数量化である。この図のデータは同じ結果の２〜３の独立した実験の代表である。
【００３６】
図２ａ、図２ｂ、図２ｃは、汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化されたγδＰＢＬ中の天然細胞障害性受容体発現の誘導を示す図である。γδＰＢＬは、図１で示されたように４〜１９日間培養され、様々なＮＫ受容体の表面発現はフローサイトメトリー法によって分析された。（Ａ）：ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２（灰色）又はＰＨＡ／ＩＬ−２（黒色）で活性化され、６つの独立の健常ドナーから抽出された１０日間の培養物中のＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、及びＤＮＡＭ−１に対する結果である。エラーバーはＳＤ（ｎ＝６；ｐ＞０．０５）を示す。（Ｂ）：（Ａ）と同じ培養物中のＮＫｐ３０の発現を示す。ＦＡＣＳプロットは、３つの個々のドナー由来の培養物に対応する。割合はＮＫｐ３０＋γδＰＢＬに関する。アイソタイプコントロール染色法、図７に示される。（Ｃ−Ｄ）：新たに分離され、ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２活性化され、そして、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたγδＰＢＬ中の、ＮＫｐ４４（Ｃ）及びＮＫｐ４６（Ｄ）ｍＲＮＡ濃度のリアルタイムＰＣＲ数量化である。（Ｅ）：１９日まで分析された、（Ａ）で示された培養物中のＮＫｐ３０＋細胞の割合の変遷。（Ｆ）：全体のγδＰＢＬ、又は、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたγδＰＢＬ培養物からＦＡＣＳ選別された（純度：＞９９％）ＮＫｐ３０（−）γδＰＢＬ（Ｂの場合）におけるＮＫｐ３０発現の誘導を示す。細胞は、ＰＨＡ／ＩＬ−２で１４日間刺激された。この図のデータは同じ結果の２〜４の独立した実験の代表である。
【００３７】
図３ａ、図３ｂは、天然細胞障害性受容体が選択的に発現し、Ｖδ１＋Ｔ細胞を急速に増殖させることを示す図である。（Ａ）：γδＰＢＬは、ＣＦＳＥで標的されて、図１に示されるように、又はＴ細胞マイトジェンの非存在下で（すなわち、ＩＬ−２のみ）培養される。流動細胞測定法により、７日後の培養物中のＣＦＳＥ希釈及びＶδ２ＴＣＲ発現を分析する。（Ｂ）：全体のγδＰＢＬ中のＶδ１＋又はＶδ２＋の割合が、ＰＨＡ／ＩＬ−２により１９日間まで培養された。エラーバーはＳＤ（Ｎ＝３）を示す。（Ｃ）：ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたγδＰＢＬ分画におけるＮＫｐ３０発現を示す。Ｖδ１＋又はＶδ２＋細胞は、末梢血からＦＡＣＳ分離され、ＣＦＳＥで標的され、ＰＨＡ／ＩＬ−２で７日間培養された。割合は、各細胞区分（長方形で示されたＣＦＳＥ標的による）でのＮＫｐ３０＋に関する。（Ｄ）：１９日間のＰＨＡ／ＩＬ−２刺激後のＶδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６の発現を示す。アイソタイプのｍＡｂコントロール染色も示されている。この図のデータは同じ結果の２〜３の独立した実験の代表である。
【００３８】
図４ａ、図４ｂは、ＡＫＴ−依存γｃ−サイトカイン及びＴＣＲシグナル伝達が、Ｖδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０発現を誘導することを示す図である。（Ａ−Ｂ）：フローサイトメトリー法は、ＩＬ−２又はＩＬ−５の存在下で、それのみで、あるいは、ＰＨＡ又はＯＫＴ３（抗ＣＤ３ｍＡｂ）との組み合わせで、７日間培養後、γδＰＢＬ培養物からプレゲートされたＶδ１＋Ｔ細胞でＮＫｐ３０発現を分析する。（Ｃ）：ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたγδＰＢＬにおける抗ＴＣＲγδブロッキングｍＡｂの効果のＮＫｐ３０誘導を示す。影付き灰色は、７日間コントロール培養物中でプレゲートされたＮＫｐ３０＋細胞である。（Ｄ）：ＣＦＳＥで事前標的された、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたγδＰＢＬにおけるＮＫｐ３０誘導での化学阻害剤ＬＹ２９４００２及びＵＯ１２６の効果を示す。この図のデータは同じ結果の２〜３の独立した実験の代表である。
【００３９】
図５は、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４は、ＮＣＲ＋γδＰＢＬによって滅殺する腫瘍細胞に影響を与える。（Ａ）：ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６の機能評価は、ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されて増殖したγδＰＢＬによってＦｃγＲ＋Ｐ８１５標的細胞株の、４時間、５１Ｃｒリリースリダイレクト滅殺アッセイ（エフェクタ：標的の比率を２：１）において、特殊なモノクローナル抗体を使用する。データは、３通りで実施された８つの独立の実験の平均値及びＳＤとして表す（＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ＝統計的に有意差なし）。（Ｂ）ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されて増殖したγδＰＢＬによって白血病細胞株Ｍｏｌｔ−４の滅殺アッセイでのＮＫｐ３０、Ｎｋｐ４４及びＮＫｐ４６へのブロッキング抗体（又はコントロールＩｇＧ１アイソタイプのコントロール）の効果を示す。ここで、抗ＴＣＲをブロックし、γδｍＡｂ（ＴＣＲ）がまた添加されたことに留意されたい。腫瘍細胞の死滅は、図１に示されるように、アネキシンＶ染色によって評価した。エラーバーは、ＳＤ（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）を示す。
【００４０】
図６ａ、図６ｂ、図６ｃは、ＮＣＲ＋γδＰＢＬが、プライマリーリンパ球性白血病に対して、増大した細胞障害性を与える安定した分画であることを示す図である。ＮＫｐ３０＋及びＮＫｐ３０（−）のγδＰＢＬは、１４日間ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化された培養物からＦＡＣＳ分離された。（Ａ）：精製された集団におけるＮＫｐ３０発現の再分析を示す。（Ｂ）：新たに分離されたγδＰＢＬと比較された、ＮＫｐ３０（−）又はＮＫｐ３０＋のγδＴ細胞における、ＮＫｐ４４（左図）及びＮＫｐ４６（右図）のｍＲＮＡ濃度のリアルタイムＰＣＲ数量化である。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を表す。（Ｃ）：分離されたＮＫｐ３０＋γδＰＢＬは、ＩＬ−２の存在下で培養された。１４日後のＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６の発現の分析を示す。（Ｄ）：ＮＫｐ３０（−）又はＮＫｐ３０＋のγδＴ細胞、又は新たに分離されたγδＰＢＬは、（図１のように）白血病細胞株Ｂｖ１７３を有する滅殺アッセイ中で使用された。腫瘍細胞の死滅は、アネキシンＶ染色によって評価された（ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５）。（Ｅ）：新たに分離された、ＮＫｐ３０（−）又はＮＫｐ３０＋γδＴ細胞におけるＧｚｍＢｍＲＮＡ濃度のリアルタイムＰＣＲ数量化である。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を表す。（Ｆ−Ｇ）：６つの異なるドナーから得て、ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２又はＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されたγδＰＢＬを有する（図１のように）滅殺アッセイに使用される、５つのプライマリーＢ細胞慢性リンパ球性白血病に対する代表的なプロット（Ｆ）及びデータサマリー（Ｇ）である。ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２で活性化された培養物からのＮＣＲ（−）γδＰＢＬ（灰色棒グラフ）は、ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化された培養物からのＮＣＲ＋γδＰＢＬ（黒色棒グラフ）と比較される。エラーバーはＳＤを表す（ｎ=６，＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００４１】
図７は、ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されたγδＰＢＬにおけるＮＫｐ３０に対するアイソタイプコントロール染色を示す図である。ＩｇＧ１のフローサイトメトリーは、図１〜図２に示されるＰＢＬ由来のゲート内のＴＣＲγδ＋細胞において染色した。データは６つの独立の実験を代表する。
【００４２】
図８は、Ｖγ９Ｖδ２ＰＢＬがＰＨＡ−誘導アポトーシスに選択的に影響され易くないことを示す図である。δγＰＢＬは、図１及び図３に示されたようにＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２又はＰＨＡ／ＩＬ−２で培養される。事前にゲートしたＶδ２＋細胞内のアポトーシスのアネキシンＶ＋細胞は、７日間培養後、フローサイトメトリー法によって分析された。
【００４３】
図９は、ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化されたγδＰＢＬ培養物中のＶδ１＋Ｔ細胞濃縮を示す図である。γδＰＢＬは、図１及び図３に示されたように、１９日間、ＰＨＡ／ＩＬ−２で培養され、Ｖδ１ＴＣＲ及びＣＤ３発現に対して、フローサイトメトリー法によって分析される。
【００４４】
図１０は、新たに分離されたγδＰＢＬがＮＫｐ３０を発現させないことを示す図である。２つの健常ドナーから新たに分離されたγδＰＢＬにおけるＮＫｐ３０及びＶδ１ＴＣＲ発現に対するフローサイトメトリーデータである。データは１５の異なる健常ドナーを代表する。
【００４５】
図１１は、ＴＣＲとＩＬ−２シグナル伝達が増殖性のＶδ１＋Ｔ細胞においてＮＫｐ３０発現を誘導することを示す図である。抹消血からＦＡＣＳ分離され、ＣＦＳＥで標的され、ＯＫＴ３及びＩＬ−２が存在又は不存在の状態で７日間培養した、Ｖδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０発現である。
【００４６】
図１２は、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ＰＢＬにおけるＣＤ５６の発現増加を示す図である。ＰＨＡ／ＩＬ−２で１９日間活性化され、ＮＫｐ３０（−）又はＮＫｐ３０＋細胞でゲートさせたＶδ１＋ＰＢＬにおけるＣＤ５６及びＣＤ２７発現に対するフローサイトメトリーデータである。
【００４７】
図１３は、Ｂ７ｈ６が多くのリンパ性白血病サンプルにおいて過剰発現しないことを示す図である。（Ａ）急性リンパ性白血病細胞株；（Ｂ）Ｔ細胞の急性リンパ性白血病患者のサンプル；（Ｃ）Ｂ細胞慢性リンパ性白血病患者サンプルで、Ｂ７ｈ６発現に対するリアルタイムＰＣＲ数量化である。健常で新たなＰＢＭＣは、リファレンス（破線）として示される。Ｂ７ｈ６濃度は、ハウスキーピング遺伝子Ｇｕｓｂ及びＰｓｍｂ６に正規化され、任意の単位で表した。３通りで測定したＳＤを表す。
【００４８】
図１４は、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化された培養物におけるγδＰＢＬの表現型を示す図である。γδＰＢＬは、図１及び図３に示されたように、１９日間、ＰＨＡ／ＩＬ−２で培養され、（Ａ）Ｖδ１ＴＣＲ及びＣＤ３発現；（Ｂ）ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８発現に対して、フローサイトメトリー法によって分析される。ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化された細胞が、実線で描かれている。
【００４９】
図１５は、ＮＫｐ３０＋γδＰＢＬが、様々な組織起源由来の癌細胞に対して高い細胞障害性があることを示す図である。γδ抹消血リンパ球（γδＰＢＬ）は、健康被験者の抹消血からＭＡＣＳ分離され、ＰＨＡ／ＩＬ−２で２週間刺激された。ＮＫｐ３０＋γδＰＢＬはさらに、ＦＡＣＳ分離され、そして、以下の腫瘍細胞株団を有する３ｈ滅殺アッセイに使用される：急性リンパ性白血病（ＡＬＬ（ＲＳ４−１１））、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ（ＨＬ−６０））、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ（Ｋ５６２））、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ（ＭＥＣ−１））、骨髄腫（ＫＭＭ１）、バーキットリンパ腫（ＲＡＪＩ）、濾胞性リンパ腫（ＤＯＨＨ２）、乳癌（ＭＤＡ２３１）、肺癌（ＮＣＩ−Ｈ５２０）、前立腺癌（ＰＣ３）、結腸癌（ＨＣＴ１１６）、膀胱癌（ＵＭ−ＵＣ−３）、腎細胞癌（ＶＭＲＣ−ＲＣＷ）、皮膚メラノーマ（ＭＥＬ−１）。腫瘍細胞死滅は、アネキシンＶ染色によって評価される（ｎ＝３，＊Ｐ＜０．０５）。
【００５０】
開示した主題は、γδＴ細胞を含む抹消血リンパ球の細胞株、その組成物、及びその製造方法、並びに、薬剤、すなわち、癌治療への使用に関する。これらのγδＴ細胞は、Ｖδ１＋Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：T cell receptor）及び機能的な天然細胞障害性受容体（ＮＣＲｓ：natural cytotoxicity receptors）を発現させる。ＮＣＲｓは、γｃ−サイトカイン及びＶδ１＋ＴＣＲにより相乗的にもたらされるＡＫＴ−依存シグナル伝達によってＶδ１＋Ｔ細胞において発現増加する。
【００５１】
本発明は、十分に活性化したＶγ９Ｖδ２ＰＢＬに強い抵抗性を示す血液腫瘍を標的とする、新規なＶδ１＋ＰＢＬを開示する。このようなＶδ１＋集団は、特別な滅殺機能を、誘導した天然細胞障害性受容体の発現に帰さねばならず、そして、大部分はＮＫ−特異マーカーとしてみなされた。Ｖδ１＋及びＶδ２＋細胞は定常的にＮＣＲを発現させるけれども、これらはγｃ−ファミリーサイトカイン及びＶδ１＋ＴＣＲにより相乗的にもたらされるＡＫＴ−依存シグナル伝達によってＶδ１＋細胞において選択的に発現増加され得るということを見出した。また、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４は共に、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ＰＢＬにおいて機能的であり、決定的にリンパ性白血病細胞の強化した標的化に寄与するということが分かった。
【００５２】
開示した主題は、γｃ−サイトカイン及び分裂促進的（ＰＨＡ又はＯＫＴ３）刺激の組合せに関し、血液腫瘍に対する増加細胞障害性活性を与える多くのＶδ１＋ＰＢＬ分画においてＮＣＲ発現を誘導する。ＰＨＡは、非生理的なＴ細胞マイトジェンであるけれども、ＮＣＲ導入の効果がＶδ１＋ＰＢＬでＴＣＲ／ＣＤ３複合体を架橋することによって十分に再現されるということを示す。従って、ＮＣＲ導入は、Ｖδ＋細胞のＴＣＲ媒介増殖と結びつく一方、γｃサイトカインシグナルを要求する。
【００５３】
誘導可能なＮＣＲにおいて、ＮＫｐ３０は、ＮＫｐ３０を発現させる細胞の割合（図３Ｄ）；ＮＫｐ３０トリガーのＶδ１＋Ｔ細胞の細胞障害性のさらなる強化（図５Ａ）；そして、ＮＫｐ３０遮断で滅殺する白血病細胞における有意な減少（図５Ｂ）に基づき、Ｖδ１＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性に対して最も重要である。それにも関わらず、ＮＫｐ４４（ＮＫｐ４６は除く）はまた、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋細胞において機能的であり（図５Ａ）、増強する腫瘍標的に対するＮＫｐ３０と協同する（図５Ｂ）。
【００５４】
ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４は、ウィルス感染細胞のヒトＮＫ細胞認識において意味づけられる。腫瘍に関して、抗体媒介ブロック実験は骨髄腫及び骨髄腫細胞の標的において重要な役割を果たした。さらに、ＮＣＲ発現不足は、ＡＭＬ患者の低い生存率と臨床的に関連付けられる。
【００５５】
Ｖδ１＋Ｔ細胞が既にウィルス感染に対応できるとき、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、胎児期／若年期の間、主要γδＴ細胞分画である。成人において、Ｖδ１＋Ｔ細胞増殖は、ＣＭＶ感染、ＨＩＶ−１感染、及び、上皮由来又は造血由来の腫瘍と関連した。活性化したＶδ１＋Ｔ細胞の養子移植に対する魅力的な見通しは、Ｖδ１＋Ｔ細胞が特に組織に存在する能力を示すことができ、その後、Ｖδ１＋Ｔ細胞がＶδ２＋カウンタパートを循環するに反して、Ｖδ１＋Ｔ細胞が組織関連リンパ球であることが好ましい（Groh, Spies, Science 1998）ということである。興味深いことに、粘膜表面で、Ｖδ１＋Ｔ細胞の存在量は、ＩＬ−１５に起因し、そして、ＴＣＲ遺伝子再構成をコントロールするクロマチン修飾を誘導する。
【００５６】
本発明は、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋細胞がプライマリーリンパ性白血病細胞を標的にすることができ、特に、Ｖδ１＋Ｔ細胞がプライマリー白血病細胞又はリンパ腫細胞の効果的ではないキラー細胞であると報告されていることを考慮すると興味深い。本発明はまた、体外ＰＨＡ処置で（γδＰＢＬの間で）Ｖδ１＋Ｔ細胞の優先的な増殖を開示する（図３Ｂ）。このことは、優性のＶδ２＋カウンタパートの選択的アポトーシスに起因しないことから（図８）、ＰＨＡ依存ＴＣＲシグナルを受けると、Ｖδ１＋細胞の増殖優位性に由来しなければならない（図３Ａ−Ｂ）。Ｖδ１＋Ｔ細胞は（Ｖδ２＋細胞と比較すると）ＣＤ２７共受容体の非常に高い濃度を発現させることを観察した。ヒトとマウスにおいて、ＣＤ２７刺激はサイクリンＤ２発現を強め、体外及び体内でのγδＴ細胞増殖を促進させる。
【００５７】
本発明は、Ｖδ１＋細胞でのＶＣＲ発現の効果的な誘導がＴＣＲ刺激に依存し；その不存在下では、γｃ−サイトカインがＶＣＲ発現の非常に少量の発現上昇をもたらし得ることを示す（図４Ａ−Ｂ）。従って、ＴＣＲシグナルは、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋リンパ球によって、ＮＣＲ媒介腫瘍細胞認識の上流にある。
【００５８】
臨床的観点において、本発明は、体外でＮＣＲを誘導する方法と、増殖させて患者に非常に多量の細胞を注射する最適な方法とを示す。これらの細胞の活性化状態は潜在的に、少量のＩＬ−２の投与を介して体内で維持され、十分にＮＣＲ発現を持続する。
【００５９】
ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化ＮＫｐ３０＋γδＴ細胞は、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８を発現させることが好ましい。ＣＤ１ｃは、他のリンパ球において通常発現する接着分子であり、腫瘍細胞の認識において作用することが分かった。
【００６０】
［材料及び方法］
（ヒト抹消血γδＴ細胞の分離）  抹消血は、匿名の健康被験者から収集され、ＰＢＳ（Invitrogen Gibco社）により１：１（ｖ／ｖ）で希釈し、１５００ｒｐｍで、２５℃で３０分間、１：３の体積比（希釈血液３に対してフィコール１）にフィコール−パックで分離される。界面に含有する単核細胞は収集されて（ＰＢＳ中で）洗浄され、δγＴ細胞が、（好ましくは、ＦＩＴＣ標的された抗γδ抗体を用いた）ポジティブ選択を介して、又は、（ビチオン標的された抗体の混合物（Miltenyi Biotec社）を用いた）ネガティブ選択を介して、磁気的な細胞分離によって、（純度９５％以上に）分離された。
【００６１】
（細胞培養）  分離されたγδＰＢＬは、１０％ウシ胎児血清が添加された２ｍＭのＬ−グルタミン（L-Glutamine）（Invitrogen Gibco社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Invitrogen Gibco社）、５０ｍｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen Gibco社）のＲＰＭＩ １６４０を用いて、丸底の９６個のウェルプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で、１０６細胞数／ｍＬ培養された。細胞は、１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（Roche Applied Science社）の存在下で、１０ｎＭのＨＭＢ−ＰＰ（４-ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸塩（Echelon Biosciences社））、及び１μｇ／ｍｌのフィトヘマアグルチニン（ＰＨＡ）（Sigma-Aldrich社）を用いて、又はこれらを用いることなく、増殖させた。細胞は洗浄され、培地は５〜６日毎に交換された。ＮＫｐ３０発現の誘導を観察するために、γδＰＢＬは、１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Roche Applied Science社）、１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３抗体（好ましくは、eBioscience社，clone OKT3）、及び２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５（Biolegend社）の存在下で又は不存在下で、培養された。ＴＣＲ遮断にために、新たに分離されたγδＰＢＬは、ＣＦＳＥ標的され、そして、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ及び１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２が添加された完全培地中で、１：２０に希釈された抗ＴＣＲγδＴＣＲ（Beckman Coulter社，clone IMMU510）で、７日間培養された。シグナル伝達の化学阻害剤の効果を観察するために、MEK inhibitor UO126及びPI-3K inhibitor LY294002（Calbiochem社）が２時間の培養時間で１０ｍＭ添加され、そして、１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２及び１μｇ／ｍｌのＰＨＡの培養物中に７日間維持された。
【００６２】
（フローサイトメトリー法を用いた細胞分離）  ＮＫｐ３０及びＶδ１＋ＴＣＲ発現に基づくγδＰＢＬの分離のために、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化培養物由来の細胞が、抗ＮＫｐ３０（Biolegend社，clone P30-15）、抗Ｖδ１（Thermo Fisher Scientific社，clone TS8.2）で染色され、そして、FACSAriaセルソーター（BD Biosciences社）で分離された。
【００６３】
（白血病患者サンプル）  Ｂ細胞慢性リンパ性白血病は、インフォームドコンセント及び治験審査委員会承認（Instituto Portugues de Oncologia de Lisboa, Portugal）の後、診察時に、患者の抹消血から採取した。サンプルは、フィコール−パックで密度遠心分離によって濃縮され、そして、（上述の）１０％ＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄された。
【００６４】
（体外腫瘍滅殺アッセイ）  全ての腫瘍細胞株が（上述の）完全１０％ＲＰＭＩ １６４０で培養され、希釈により１０５〜１０６細胞数／ｍＬで維持され、３〜４日毎に１：３に分割した。細胞障害性アッセイのために、磁気的に精製されたγδＰＢＬは、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）、並びに、１μｇ／ｍＬのＰＨＡ又は１０ｎＭのＨＭＢ−ＰＰの存在下で、７〜１９日間、事前に活性化された。受容体ブロックのために、γδＰＢＬは、ブロック抗体である、抗ＮＫｐ３０（clone F252）、抗ＮＫｐ４４（clone KS38）、抗ＮＫｐ４６（clone KL247）)、又は抗ＴＣＲγδ（Beckman Coulter社，clone IMMU510）を用いて、２時間培養された。ブロック抗体は、滅殺アッセイの培地中で維持された。腫瘍細胞株又は白血病プライマリーサンプルは、CellTrace Far Red DDAO-SE（１μＭ；Molecular Probes社，Invitrogen）で染色され、各３×１０４個の腫瘍細胞が、丸底９６個のウェルプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２のＲＰＭＩ中で、３時間、３×１０５個のγδＴ細胞を使って培養された。そして、細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences社）で培養され、フローサイトメトリー法で分析された。再分析滅殺アッセイのために、標準５１Ｃｒリリースアッセイ（standard 51Cr release assay）の間、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化γδＰＢＬはＮＣＲアゴニストである、抗ＮＫｐ３０（clone AZ20）、抗ＮＫｐ４４（clone Z231）又は抗ＮＫｐ４６（clone Bab281）を用いて４時間培養された。
【００６５】
（フローサイトメトリー法分析）  細胞は、次の蛍光性モノクローナル抗体で標的される：抗ＣＤ３‐PerCP-Cy5.5（eBioscience社，clone OKT3）、抗TCRγδ-FITC（eBioscience社，clone B1.1）、抗CD69-PE（BD Pharmingen社，clone FN50）、抗NKG2D-PE/Cy7（Biolegend社，clone 1D11）、抗2B4-APC（Biolegend社，clone C1.7）、抗DNAM-1-Alexa-Fluor647（Biolegend社，clone DX11）、抗NKp30-APC（Biolegend社，clone P30-15）、抗Vd2 TCR -PE（Biolegend社，clone B6）、抗NKp44-APC（Biolegend社，clone P44-8）、抗NKp46-AlexaFluor647（Biolegend社，clone 9E2）、抗Vd1 TCR -FITC（Thermo Fisher Scientific社，clone TS8.2）、抗NKp30-PE（Biolegend社，clone P30-15）、抗Mouse IgG1κ-APC Isotype Ctrl（Biolegend社，clone MOPC-21）、抗Mouse IgG1κ-PE Isotype Ctrl（Biolegend社，clone MOPC-21）、抗CD27-APC/Cy7（Biolegend社，clone O323）、抗CD56-APC（Biolegend社，clone HCD56）。細胞増殖は、標準ＣＦＳＥ染色方法（好ましくは、CellTrace CFSE細胞増殖キット，Invitrogen社；最終濃度０．５ｍＭ）に従って測定され、一方、アポトーシスはアネキシンＶ−FITC（BD Pharmingen社）染色法によって評価された。細胞は、FACSCantoフローサイトメトリー法（BD Pharmingen社）で分析された。
【００６６】
（ＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造）  全てのＲＮＡはメーカーの方法に従いRNeasyミニキット（Qiagen社，Hilden,ドイツ連邦共和国)を用いて抽出される。濃度及び純度は、分光光度測定によって決定され、整合性はRNA 6000 Nano Assayを用いたAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社，Palo Alto,カナダ）を用いて確認された。全てのＲＮＡは、ランダムヘキサマー及びSuperscript II first strand synthesisの試薬（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡに逆転写された。
【００６７】
（リアルタイムＰＣＲ数量化（ｑＰＣＲ））  ｑＰＣＲは、SYBR Green detection system（Applied Biosystems社）を用いてABI Prism 7500 FAST Sequence Detection Systemで実行された。プライマーは、Primer3 v.0.4.0オンラインプログラムを用いて設計した（http://primer3.sourceforge.net）。各スクリプトに対して、数量化は検量線法を用いて行った。β２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）、グルクロニダーゼβ（Ｇｕｓｂ）、及びプロテアソームサブユニット ベータタイプ ６（Ｐｓｍｂ６）は遺伝子発現の正常化のためのハウスキーピングコントロールとして使用された。次のプライマーが使用された。
【００６８】
【化１】
2014515259.tif 000002
【００６９】
全てのサンプルは３通りで実行され、３回繰り返された。ｑＰＣＲの分析結果は、ABI SDS v1.1 シーケンス分析ソフトウェア（Applied Biosystems社）を用いて実行された。
【００７０】
（統計分析）  亜集団間の相違は、スチューデントのｔ検定を用いて評価され、有意差が＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１であるとき、示された。
【００７１】
［結果］
（汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化されたγδＰＢＬ培養物の強化された細胞障害性）
ＰＨＡ、強力なＴ細胞マイトジェンとして作用する植物レクチン、又は特殊なＶγ９Ｖ２ＴＣＲアゴニストＨＭＢ−ＰＰで活性化された（ＩＬ−２存在下で常に維持される）γδＰＢＬ培養物の抗腫瘍滅殺能力を比較した（Morita, C.T., Jin, C., Sarikonda, G., and Wang, H. 2007. “Nonpeptide antigens, presentation mechanisms, and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2 T cells: discriminating friend from foe through the recognition of prenyl pyrophosphate antigens.” Immunol Rev 215:59-76）。レジメンは共に、細胞増殖及びＣＤ６９発現上昇（図１Ａ）によって評価されるように、活性化γδＰＢＬで同じように効果的であるけれども、ＰＨＡで活性化されたサンプルは常に、ＨＭＢ−ＰＰで刺激された（同じドナー由来の）サンプルよりも、優れた造血器腫瘍細胞株のキラーであったことに留意されたい（図１Ｂ〜１Ｃ）。このことは、治験された全てのドナーについて共通し（図１Ｂ）、グランザイムＢのより高い発現（図１Ｄ）と、リンパ球細胞障害性機構の重要な要素と関連する。グランザイムＢ発現がなかった、注目すべきことに、新たに分離されたγδＰＢＬ（図１Ｄ）は、上述の通り、非常に低い抗白血病細胞障害性（＜１０％の死滅）を示した。
【００７２】
ＰＨＡ刺激γδＰＢＬ培養物の優れた細胞障害性機能は、ＨＭＢ−ＰＰが顕著に優性なＶγ９Ｖδ２ＰＢＬ分画の非常に強力な活性化因子であるという驚くべき発見に至った（Morita, C.T., Jin, C., Sarikonda, G., and Wang, H. 2007. ”Nonpeptide antigens, presentation mechanisms, and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2 T cells: discriminating friend from foe through the recognition of prenyl pyrophosphate antigens. Immunol Rev 215:59-76”）。ＨＭＢ−ＰＰ活性化したγδＰＢＬと比較すると、ＰＨＡ刺激培養物は、Ｂｖ−１７３、ＲＥＨ、ＨＰＢ−ＡＬＬ等の様々な抵抗性白血病細胞株に対して向上した細胞障害性を示し、そして、重要なNKG2DリガンドULBP1の発現不足を示した。これらのデータは、汎Ｔ細胞マイトジェンＰＨＡが中期（１〜３週間）のγδＰＢＬ培養物の細胞障害性能力を増加させることができ、そして、養子細胞免疫治療に対して非常に価値があるということを示している。
【００７３】
（汎Ｔ細胞マイトジェンで活性化されたγδＰＢＬでのＮＣＲ発現の誘導）
ＰＨＡ活性化したγδＰＢＬ培養物の高められた細胞障害性の原因となるメカニズムを調べた。上記データは、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、又は２Ｂ４等の受容体の異なる発現によって説明され得る。全て事前に、キラーリンパ球によって腫瘍細胞認識に関与することが分かった。しかしながら、これらの候補はＰＨＡ活性化されたγδＰＢＬ培養物とＨＭＢ−ＰＰ活性化されたγδＰＢＬ培養物の間で、異なる発現はなかった（図２Ａ）。一方、予想外に、天然細胞障害性受容体ＮＫｐ３０、すなわち、重要なＮＫ細胞の細胞障害性のトリガーは特に、ＰＨＡ刺激γδＰＢＬで発見された（図２Ｂ、図７）。さらに、他のＮＣＲファミリーメンバー、すなわち、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６はまた、選択的に、これらのサンプルで発現した（図２Ｃ〜図２Ｄ、以下参照）。
【００７４】
ＮＫｐ３０＋細胞の増殖は、培養時間とともに直実に増加し（図２Ｅ）、細胞増殖とＮＫｐ３０の誘導との関連性を示した。想像できない、新たなサンプルにおける非常に少ない経験（図２Ｅ）により、微小分画の構造的発現ＮＫｐ３０がＰＨＡ刺激γδＰＢＬ培養物において増殖されることが好ましいという可能性がある。この点を明らかにするために、高純度ＦＡＣＳ精製されたＮＫｐ３０（−）細胞（＞９９％）を用いて実施を行い、ＮＫｐ３０（−）細胞がＰＨＡ＋ＩＬ−２刺激で区別されない細胞と同じように効率的なＮＫｐ３０発現をもたらし得るということが示された。さらに、この条件下で、ＮＫｐ３０（−）細胞及びＮＫｐ３０＋細胞は、同程度に増殖し、さらに、この条件下で、ＮＫｐ３０＋細胞の選択的発現と相反した。この結果は、ＮＫｐ３０発現がＰＨＡ／ＩＬ−２治療によってγδＰＢＬ活性化で新たに誘導され、細胞増殖に結びつくということを示唆している。
【００７５】
（ＮＣＲはＶδ１＋Ｔ細胞を増殖することによって選択的に発現する）
ＨＭＢ−ＰＰがＶγ９Ｖδ２細胞の最適なアゴニストであることを考慮すれば、ＨＭＢ−ＰＰと比べると、ＰＨＡを用いた処置が選択的にγδＰＢＬ間でＶδ２（−）細胞を増殖させた（図３Ａ）。この点は、２つの実験条件におけるＶδ２＋細胞アポトーシスにおける差異によるものではない（図８）。他の分画は健常成人の抹消血内に非常に少ないので、顕著に増殖する最も適したＶδ２（−）集団は（図３Ａ）は、Ｖδ１＋細胞である。Ｖδ１対Ｖδ２のＴＣＲにおける利用が評価されると、（１９日後の全てのγδＴ細胞のうち、８０％を超える）劇的なＶδ１＋細胞富化がＰＨＡ活性化培養物内で見られた。（図３Ｂ；図９）。逆に、上述したように、ＨＭＢ−ＰＰ活性化された培養物は次第に、Ｖδ２＋細胞によって多数を占めるようになった（図３Ａ）。
【００７６】
ＮＫｐ３０発現の誘導は、分離されたＶδ１＋又はＶδ２＋細胞の対応する培養物において試験され、ＰＨＡ＋ＩＬ−２を用いて刺激された。新たに分離されたＶδ１＋とＶδ２＋細胞はＮＫｐ３０を発現させず（図１０）、このＮＣＲは堅調にＶδ１＋細胞ではなくＶδ２＋細胞内で誘導された（図３Ｃ）。さらに、次のＣＦＳＥ希釈によって、Ｖδ１＋細胞の進行性の分裂でＮＫｐ３０＋細胞の著しい蓄積を示した（図３Ｃ）。これらのデータは、ＰＨＡ／ＩＬ−２培養物中のＶδ１＋細胞の活性化が同時に細胞増殖によりＮＫｐ３０発現を誘導するということを示唆している。
【００７７】
ＮＫｐ３０＋細胞の高い割合（＞５０％）は通常、２〜３週間後培養物中で検出されるのに対して、ＮＫｐ４４（〜３０％）及びＮＫｐ４６（＜２０％）はＶδ１＋細胞の低い比率で発現する（図３Ｄ）。さらに、ＮＫｐ４４＋Ｖδ１＋細胞又はＮＫｐ４６＋Ｖδ１＋細胞の多くはまた、ＮＫｐ３０を発現させた（図３Ｄ）。従って、ＮＫｐ３０が誘導可能なＮＣＲ＋Ｖδ１＋分画の最も有益なマーカーである考えられる。
【００７８】
（ＮＣＲ誘導はＡＫＴ−依存γｃ−サイトカイン及びＴＣＲシグナル伝達を要求する）
ＮＣＲ＋ Ｖδ１＋ Ｔ細胞の分化に対して要求される特定のシグナル伝達を調べた。第１に、活性化プロトコルの２つのコンポーネント、すなわち、ＩＬ−２及びＰＨＡが分離された。ＩＬ−２又はその関連したγｃ−サイトカイン、ＩＬ−１５だけが、ＮＫｐ３０発現を誘導するのに十分であるが、ＰＨＡ／ＩＬ−２（又はＰＨＡ／ＩＬ−１５）コンビネーションを比較すると、効果はあまり大きくなかった（図４Ａ）。一方、ＰＨＡだけでは培養物を生存可能に維持することができず、γδＴ細胞の生存においてγｃ−サイトカインの重要な役割、特に活性化／増殖と一致した。
【００７９】
ＰＨＡは広く使用されるＴ細胞マイトジェンであったけれども、ＴＣＲを含む、一連の表面受容体を架橋できる非生理的な化合物でもある。従って、ＰＨＡ刺激の分子媒介物はＶδ１＋ＴＣＲ複合体であり得る。ＰＨＡ及びＯＫＴ３ｍＡｂの能力を比較すると、特に、ＴＣＲ複合体のＣＤ３ε鎖を架橋し、Ｖδ１＋Ｔ細胞において（ＩＬ−２又はＩＬ−１５と結合したとき）ＮＫｐ３０発現を誘導する。ＯＫＴ３は十分に、これらのアッセイにおいてＰＨＡを再現することができ（図４Ａ〜図４Ｂ）、そして、増殖したＶδ１＋Ｔ細胞においてＮＫｐ３０を誘導する（図１１）。さらに、ＰＨＡ／ＩＬ−２培養物におけるＴＣＲγδ遮断はＮＫｐ３０誘導を抑制した（図４Ｃ）。これらのデータは、ＰＨＡ処置がＶδ１＋ＰＢＬでＮＣＲ発現を誘導するＴＣＲシグナル伝達をもたらすということを示唆している。さらに、サイトカインのみと、ＯＫＴ３（又はＰＨＡ）との併用療法との間の差異は、この処置において、γｃ−サイトカインとＴＣＲシグナル伝達との間の著しい相乗効果を強調する（図４Ａ〜図４Ｂ）。
【００８０】
さらにＮＣＲ誘導の分子メカニズムを詳しく調査するために、γｃ−サイトカイン受容体及び／又はＴＣＲシグナルの重要なシグナル伝達路の下流に化学的阻害剤を用いた。ＪＡＫシグナルをブロックすることはＮＣＲ誘導前に多くの細胞死滅をもたらす一方、ＰＩ−３Ｋ／ＡＫＴ阻害剤ＬＹ２９４００２との同時培養は特に、増殖したＶδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０誘導を抑制する（図４Ｄ）。ＡＫＴ培養は、γｃ−サイトカイン及び（ＴＣＲγδシグナルを含む）ＴＣＲシグナルを伝達することに関与する。一方、ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ阻害剤ＵＯ１２６は、増殖したＶδ１＋Ｔ細胞においてＮＫｐ３０誘導で検出可能な効果はなかった（図４Ｄ）。重要なことに、ＬＹ２９４００２の選択的な効果は細胞増殖からＮＣＲ誘導を解離し、Ｖδ１＋Ｔ細胞の増殖が、ＮＫｐ３０発現を誘導するのに不可欠であるが（図３Ｃ；図１１）、十分ではない（図４Ｄ）。総合的に、これらのデータは、ＡＫＴ−依存γｃ−サイトカイン及びＴＣＲシグナルは協同し、Ｖδ１＋Ｔ細胞におけるＮＫｐ３０発現を誘導する。
【００８１】
（機能的なＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４はＶδ１＋ＰＢＬによって死滅する腫瘍細胞をもたらす）
Ｖδ１＋増加（＞８０％；図９Ａ）ＰＢＬ培養物でのＮＣＲ調節の影響を評価するために、機能取得実験及び機能欠損実験に取り組み、図３ＤのＮＣＲと同じレベルでＮＣＲを発現させた。第１に、リバースＡｂ−依存細胞障害性アッセイを使用することによって、ＮＫｐ４６を除く、ＮＫｐ３０又はＮＫｐ４４の架橋がＰ８１５腫瘍細胞標的の溶解における非常に有意な増加を提供することを見出した（図５Ａ）。これらのデータは、誘導したＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４が機能的であり、介在する腫瘍細胞を死滅させるということを示す。ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４は白血病細胞を標的にする非冗長性の役割を果たす場合に評価するために、ＮＣＲ特有のｍＡｂの受容体遮断実験を実施した。ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４の封鎖で腫瘍細胞溶解において、有意な減少が観察された（図５Ｂ）。図５Ａの結果から予想されたように、ＮＫｐ４６遮断は腫瘍細胞死滅に影響を及ぼした。興味深いことに、ＮＫｐ３０とＮＫｐ４４の間の相乗効果も、はっきりと観察された。注目すべき、（抗ＮＣＲｍＡｂのみ、又は抗ＮＣＲｍＡｂと結合した）任意の状況におけるＴＣＲγδ封鎖は、滅殺アッセイの間でニュートラルイベントであった（図５Ｂ）。これらのデータは、ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ＰＢＬによって標的にする白血病細胞がＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４の相乗的な機能によってほとんど媒介されたＴＣＲ独立イベントであることを示唆している。
【００８２】
（ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ＰＢＬは、抵抗性のプライマリーリンパ性白血病を標的にするキラーを特定化する）
ＮＣＲ＋Ｖδ１＋ＰＢＬの抗腫瘍潜在能力を十分に特徴付けるために、ＮＫｐ３０＋細胞が、高い純度（＞９９％）でＦＡＣＳ分離され（図６Ａ）、一連の機能的なアッセイが実行された。予想されたように（図３Ｄ）、分離されたＮＫｐ３０＋細胞はまた、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６を発現させ（図６Ｂ）、３種類のＮＣＲが、２週間ＩＬ−２のみで培養されると、精製された細胞の表面で非常に安定化した（図６Ｃ）。これらのデータは、安定したＶＣＲ＋Ｖδ１＋Ｔ細胞分画の可能な増殖を示した。
【００８３】
ＮＫｐ３０＋細胞の細胞障害性機能が決定されると、抵抗性白血病細胞株Ｂｖ１７３等の増加した標的が（ＮＫｐ３０（−）カウンタパートと比較すると）観察された（図６Ｄ）。この点は、グランザイムＢの高い発現率で証明された（図６Ｅ）。さらに、ＮＫｐ３０発現はまた、ＣＤ５６発現の密接に関連し（図１２）、そして、Ｖδ２＋Ｔ細胞を含むヒトリンパ球の細胞障害性に関連付けられた。
【００８４】
最終的に、慢性リンパ性白血病患者から採取されたプライマリーサンプルを用いた機能的滅殺アッセイを実行した。重要なことに、ＨＭＢ−ＰＰ／ＩＬ−２活性化したγδＰＢＬは、ＮＣＲを発現させなかった（図２Ｂ）。ＰＨＡ／ＩＬ−２で活性化したγδＰＢＬ培養物から分離されたＮＣＲ＋細胞の抗腫瘍細胞障害性活性と当該活性とを比較した。６つの異なるドナーから採取したＮＣＲ＋γδＰＢＬは常に、より効果的にプライマリーＢ−ＣＬＬ細胞の除去に効果的であった。
【００８５】
もちろん、本発明は、上述した実施形態に制限されないが、当業者であれば本発明の基本的思想から逸脱することなく変更することができる。
【図１ａ】
2014515259.tif 000003
【図１ｂ】
2014515259.tif 000004
【図１ｃ】
2014515259.tif 000005
【図２ａ】
2014515259.tif 000006
【図２ｂ】
2014515259.tif 000007
【図２ｃ】
2014515259.tif 000008
【図３ａ】
2014515259.tif 000009
【図３ｂ】
2014515259.tif 000010
【図４ａ】
2014515259.tif 000011
【図４ｂ】
2014515259.tif 000012
【図５】
2014515259.tif 000013
【図６ａ】
2014515259.tif 000014
【図６ｂ】
2014515259.tif 000015
【図６ｃ】
2014515259.tif 000016
【図７】
2014515259.tif 000017
【図８】
2014515259.tif 000018
【図９】
2014515259.tif 000019
【図１０】
2014515259.tif 000020
【図１１】
2014515259.tif 000021
【図１２】
2014515259.tif 000022
【図１３】
2014515259.tif 000023
【図１４】
2014515259.tif 000024
【図１５】
2014515259.tif 000025
【配列表】
2014515259000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月5日(2013.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な天然細胞障害性受容体を発現させるＶδ１＋γδＴ細胞を含むリンパ球の細胞株であって、
前記天然細胞障害性受容体はＮＫｐ３０を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項２】
請求項１記載の細胞株であって、
機能的な天然細胞障害性受容体を発現させるＶδ１＋γδＴ細胞から構成される細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２記載の細胞株であって、
Ｖδ２＋γδＴ細胞をさらに含む細胞株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記リンパ球は末梢血サンプル由来であることを特徴とする細胞株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記天然細胞障害性受容体はＮＫｐ４４を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞株であって、
前記天然細胞障害性受容体はＮＫｐ４６を含むことを特徴とする細胞株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞株であって、
グランザイムＢを発現させる細胞を含む細胞株。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞株の細胞を含む組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物であって、
注射可能な物質であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の組成物であって、
薬剤に使用するための組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の組成物であって、
自己又は異種の養子細胞療法、腫瘍又は癌治療、腫瘍又は癌免疫療法、及び／又は、白血病治療に使用するための組成物。
【請求項１２】
請求項１０記載の組成物であって、
急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、又は、皮膚メラノーマの治療に使用するための組成物。
【請求項１３】
請求項１０記載の組成物であって、
ウィルス感染の治療に使用するための組成物。
【請求項１４】
請求項１３記載の組成物であって、
前記ウィルスはヘルペスウイルス科又はレトロウイルス科由来であることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７記載の細胞株の製造方法であって、
γδＰＢＬを分離する工程と、
適切な培地に、γδＴＣＲアゴニスト及び少なくとも１つのγｃ−ファミリーサイトカインを添加して、前記細胞を培養する工程とを備え、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−ファミリーサイトカインの添加は、前記細胞の少なくとも４０％が天然細胞障害性受容体を発現させるまで、実行されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加は、前記細胞の少なくとも４０％がＮＫｐ３０を発現させるまで、実行されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニストは、フィトヘムアグルチニン、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、抗γδＴＣＲモノクローナル抗体、又は、これらの混合物であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニストの濃度の範囲が０．０１〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記γｃ−サイトカインは、ＩＬ-２、ＩＬ-４，ＩＬ-９、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２１、又は、これらの混合物であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法であって、
前記γｃ−サイトカインの濃度の範囲が、１〜１００００Ｕ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法であって、
前記γｃ−サイトカインの濃度の範囲が、１００〜１０００Ｕ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加時間の範囲が、２〜６０日であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加時間の範囲が、９〜２５日であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法であって、
前記γδＴＣＲアゴニスト及びγｃ−サイトカインの添加時間の範囲が、１０〜１５日であることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2014515259.tif 000026
2014515259.tif 000027
2014515259.tif 000028