(57)【要約】  本発明は、親アルブミンと比べて、改変された血漿中半減期を有する親アルブミンの変異体に関する。本発明は前記アルブミン変異体を含む融合ポリペプチド及びコンジュゲートにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準アルブミン、その断片又は融合物のＦｃＲｎに対する結合親和性と比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性が改変されてなるアルブミンの変異体、その断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであるポリペプチドを調製する方法であって、前記方法は、
（ａ）配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する親アルブミンをコードする核酸を用意し、
（ｂ）配列番号２内の（ａ）75〜91の何れか（好ましくは83）；（ｂ）492〜538の何れか；（ｃ）505、531、524、472、108、190、197及び425；（ｄ）186〜201の何れか；（ｅ）457〜472の何れか；（ｆ）414〜426の何れか；（ｇ）104〜120の何れか；（ｈ）144〜150の何れか；（ｉ）30〜41の何れか、（ｊ）550〜585の何れか、（ｋ）276、410及び414の何れかから選択される位置に対応する１又は２以上の位置に、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yのうち１又は２以上による、１又は２以上の改変を有する、アルブミン変異体、その断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであるポリペプチドをコードするように、工程（ａ）の配列を修飾し、
ここで、前記ポリペプチドが、
（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584からなる群；
（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585からなる群から選択される１又は２以上（数個）の位置におけるCysによる挿入又は置換；
（iii）ジスルフィド結合を遮断するための、位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置における改変；及び／又は
（iv）D63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E
から選択される１又は２以上の改変を含む場合には、
前記ポリペプチドは更に、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585からなる群から選択される位置における１又は２以上の改変、及び／又は、497〜585から選択される位置に挿入若しくは置換された停止コドンを含み、
（ｃ）工程（ｂ）で修飾された配列を好適な宿主細胞に導入し、
（ｄ）前記ポリペプチドを発現させる条件下、好適な増殖培地中で前記細胞を増殖させ、
（ｅ）前記増殖培地から前記ポリペプチドを回収することを含み、
ここで、前記ポリペプチドは、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性を有する、及び／又は、親アルブミン、基準アルブミン、その断片、若しくは前記親アルブミン、基準アルブミン若しくはその断片若しくは融合物を含む融合ポリペプチドの半減期と比べて、改変された血漿中半減期を有する、方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585からなる群、又は位置82、114、119、464、201、505、510、513、533、535、536、550、560、563、565、573、574からなる群から選択される位置における１又は２以上の改変を含む場合、前記ポリペプチドは更に、位置30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、502、507、508、509、511、513、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、568、569、570、571、572、576、583からなる群から選択される位置に１又は２以上の改変、及び／又は、497〜585から選択される位置に挿入若しくは置換された停止コドンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基準が、ＨＳＡ（配列番号２）若しくはその断片、又はＨＳＡ若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、最も好ましくは配列番号２である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記改変が置換である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
親アルブミン、基準アルブミン、その断片、又は前記親アルブミン、基準アルブミン、若しくはその断片若しくは融合物を含む融合ペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性と比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性が改変されてなるアルブミンの変異体、その断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであるポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号２内の（ａ）75〜91（好ましくは83）；（ｂ）492〜538；（ｃ）505、531、524、472、108、190、197及び425；（ｄ）186〜201；（ｅ）457〜472；（ｆ）414〜426；（ｇ）104〜120；（ｈ）144〜150；（ｉ）30〜41；（ｊ）550〜585、（ｋ）276、410及び414の何れかから選択される位置に対応する１又は２以上の位置に、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yのうち１又は２以上による１又は２以上の改変を含み、ここで、
前記ポリペプチドが、
（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584からなる群；
（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585からなる群１又は２以上（数個）の位置におけるにおけるCysによる挿入又は置換；
（iii）ジスルフィド結合を遮断するための、位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置における改変；及び／又は
（iv）位置D63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584Eからなる群
から選択される１又は２以上の改変を含む場合には、
前記ポリペプチドは更に、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585からなる群から選択される位置における１又は２以上の改変、及び／又は、497〜585から選択される位置に挿入若しくは置換された停止コドンを含む、ポリペプチド。
【請求項６】
前記基準が、ＨＳＡ（配列番号２）若しくはその断片、又はＨＳＡ若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、最も好ましくは配列番号２である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記改変が置換である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
親アルブミン、基準アルブミン、その断片、又は前記親アルブミン、基準アルブミン、若しくはその断片若しくは融合物を含む融合ポリペプチドと比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性がより強い、及び／又は、血漿中半減期がより長い、請求項５〜７の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
親アルブミン、基準アルブミン、その断片、又は前記親アルブミン、基準アルブミン、若しくはその断片若しくは融合物を含む融合ポリペプチドと比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性がより弱い、及び／又は、血漿中半減期がより短い、請求項５〜７の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
コンジュゲート可能なチオール基を前記ポリペプチドに付与する１又は２以上の更なる改変を含む、請求項５〜９の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２に対する前記ポリペプチドの配列同一性が、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、より好ましくは９６％超、さらにより好ましくは９７％超、より好ましくは９８％超、最も好ましくは９９％超である、請求項５〜１０の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記断片が、少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも３００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも４００個のアミノ酸、及び最も好ましくは少なくとも５００個のアミノ酸である、請求項５〜１１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項５〜１２の何れか一項に記載のポリペプチドと、治療用部分、予防用部分、診断用部分、イメージング用部分、又は他の有益な部分から選択される融合パートナーポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチドと、コンジュゲーションパートナーとを含むコンジュゲート。
【請求項１５】
前記コンジュゲーションパートナーが、治療用部分、予防用部分、診断用部分、イメージング用部分、又は他の有益な部分である、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチドと、治療用部分、予防用部分、診断用部分、イメージング用部分、又は他の有益な部分とを含むアソシエート。
【請求項１７】
請求項５〜１２の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項１３に記載の融合ポリペプチド、請求項１４若しくは１５に記載のコンジュゲート、又は、請求項１６に記載のアソシエートを含む、ナノ粒子又はマイクロ粒子。
【請求項１８】
請求項５〜１７の何れか一項に記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、又はナノ粒子若しくはマイクロ粒子を含む組成物であって、前記ポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、又はナノ粒子若しくはマイクロ粒子のＦｃＲｎに対する結合親和性が、対応する親アルブミン、基準アルブミン、それらの断片、若しくは融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、又は前記親アルブミン、基準アルブミン、これらの断片若しくは融合物を含むナノ粒子若しくはマイクロ粒子を含む組成物のＦｃＲｎに対する結合親和性よりも強い、組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、又はナノ粒子若しくはマイクロ粒子のＦｃＲｎに対する結合親和性が、ＨＳＡのＦｃＲｎに対する結合親和性よりも強い、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチドの変異体、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、又はナノ粒子若しくはマイクロ粒子のＦｃＲｎに対する結合係数が、ＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．９未満、より好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．５未満、より好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．１未満、さらにより好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．０５未満、さらにより好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．０２未満、そして最も好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．０１未満である、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド若しくは融合ポリペプチド、請求項１４若しくは１５に記載のコンジュゲート、請求項１６に記載のアソシエート、又は請求項１７に記載のナノ粒子若しくはマイクロ粒子を含み、さらに抗体結合ドメイン（ＡＢＤ）及び治療用部分、予防用部分、診断用部分、イメージング用部分、又は他の有益な部分をふくむ化合物を含む、請求項１８〜２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
医薬的に許容される担体を含む、請求項１８〜２１の何れか一項に組成物。
【請求項２３】
治療用部分、予防用部分、診断用部分、イメージング用部分又は他の有益な部分のＦｃＲｎに対する結合親和性又は（好ましくは血漿中の）半減期を改変するための、請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド若しくは融合ポリペプチド、請求項１４若しくは１５に記載のコンジュゲート、請求項１６に記載のアソシエート、請求項１７に記載のナノ粒子若しくはマイクロ粒子、又は請求項１８〜２２の何れか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
ＦｃＲｎに対する結合親和性が、ＨＳＡ（配列番号２）又はその断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子からなる基準、或いはＨＳＡ（配列番号２）又はその断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子を含む基準の、ＦｃＲｎに対する結合親和性と比べて増加するように改変される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ＦｃＲｎに対する結合親和性が、ＨＳＡ（配列番号２）又はその断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子を含む基準、或いはＨＳＡ（配列番号２）又はその断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子からなる基準の、ＦｃＲｎに対する結合親和性と比べて減少している、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
分子のＦｃＲｎに対する結合親和性又は（好ましくは血漿中の）半減期を改変する方法であって、
（ａ）前記分子がポリペプチドである場合には、前記分子を請求項５〜１２の何れか一項に記載のポリペプチド又は請求項１４若しくは１５に記載のコンジュゲートと融合、或いはコンジュゲートさせ；前記分子を請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド又は請求項１３若しくは１４に記載のコンジュゲートとアソシエートさせ；前記分子を請求項１６に記載のアソシエート又は請求項１７に記載のナノ粒子若しくはマイクロ粒子、若しくは請求項１８〜２２の何れか一項に記載の組成物に組み込むことを含み；
（ｂ）前記分子がポリペプチドでない場合には、前記分子を請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド又は請求項１４若しくは１５に記載のコンジュゲートと融合、或いはコンジュゲートさせ；前記分子を請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド又は請求項１３若しくは１４に記載のコンジュゲートとアソシエートさせ；前記分子を請求項１６に記載のアソシエート又は請求項１７に記載のナノ粒子若しくはマイクロ粒子、若しくは請求項１８〜２２の何れか一項に記載の組成物に組み込むことを含む、方法。
【請求項２７】
前記分子が、治療用部分、予防用部分、診断用部分、イメージング用部分、又は他の有益な部分である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子、又は組成物が、本明細書に記載されるものから選択される１又は２以上の部分を含む、請求項５〜２２の何れか一項に記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子、又はこれらの組成物。
【請求項２９】
請求項５〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸、又は請求項３５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３２】
前記宿主細胞が、真核生物、好ましくは酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、又は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ又はＨＥＫ）、又は植物細胞（例えばコメ）である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
請求項５〜２２及び２８〜２９の何れか一項に記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、組成物、アソシエート、ナノ粒子若しくはマイクロ粒子、又はポリヌクレオチドを対象に投与することを含む予防、治療、又は診断の方法。
【請求項３４】
基準アルブミン、その断片若しくは融合物のＦｃＲｎに対する結合親和性と比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性を有するアルブミン変異体、その断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであるポリペプチドを調製する方法であって、
（ａ）アルブミン、その断片、又はアルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分内の、アルブミンとＦｃＲｎとの結合に重要な１又は２以上のアミノ酸残基位置を同定し、ここで当該同定は、
（ｉ）アルブミン、例えばＨＳＡ（配列番号２）の１〜５８５残基の三次元構造（モデル）を用意し；
（ii）６．３以下のｐＨで溶解するＦｃＲｎの三次元構造（モデル）を用意し；
（iii）前記（ｉ）のアルブミン構造及び前記（ii）のＦｃＲｎ構造を用いて、ＦｃＲｎとアルブミンとの結合により形成される複合体の構造をモデリングし、これによりドッキングモデルを生成し；
（iv）前記ドッキングモデルを用いて、ＦｃＲｎと相互作用する、或いはＦｃＲｎとアルブミンとの相互作用に影響を与えるアルブミン中のアミノ酸残基を同定する
ことにより行われ；
（ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸を用意し；
（ｃ）前記（ａ）において同定された位置に存在する１又は２以上のアミノ酸残基に改変が生じるように、前記（ｂ）において用意された核酸を修飾し；
（ｄ）当該修飾された核酸を、好適な宿主細胞において発現させ；そして
（ｅ）ポリペプチドを回収する
ことを含む、方法。
【請求項３５】
前記用意されるＦｃＲｎの三次元構造（モデル）が、３．７〜４．７のｐＨで溶解する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記基準が、ＨＳＡ（配列番号２）若しくはその断片、又はＨＳＡ若しくはその断片融合ポリペプチド、最も好ましくは配列番号２である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１又は２以上の改変が置換である、請求項３４〜３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ａ）が、
（ｖ）前記（iv）において同定されたものと同等のアミノ酸を同定するために、第二のアルブミン（例えば非ヒトアルブミン）の一次構造及び／又は三次構造を、前記（ｉ）のアルブミンの一次構造及び／又は三次構造と比較すること；
及び／又は、
（vi）前記（iv）又は（ｖ）において同定された１又は２以上の改変を含むポリペプチドを調製し、そして調製されたポリペプチドが、前記（ｉ）のアルブミンのＦｃＲｎに対する結合親和性と比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性を有することを（例えば、結合親和性解析により）確認すること、
をさらに含む、請求項３４〜３７の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、コンピューター読取可能な形態の配列表を含む。これは援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アルブミン、その断片、又はアルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性における変化及び／又は半減期における変化を有するアルブミンの変異体若しくはその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドに関する。本発明は、アルブミンの結合親和性及び／又は半減期を利用者又は適用の要求及び要望に適合させることを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
アルブミンは、哺乳類血漿中の天然タンパク質であり、血漿において最も豊富なタンパク質である。アルブミンは、血液の所望の浸透圧を維持する上で重要な役割を果たすとともに、血流内における種々の物質の輸送においても重要な役割を果たす。ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ及びヤギを含む多くの生物種について、アルブミンの特性決定がなされており、その配列及び構造には高度の相同性が見られる。
【０００４】
アルブミンは、インビボにおいて、その受容体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）「ブランベル」（Brambell）に結合し、この相互作用は、アルブミンのアルブミンの血漿中半減期にとって重要であることが知られている。ＦｃＲｎは、多くの細胞及び組織型で発現される膜タンパク質である。ＦｃＲｎは、アルブミンを細胞内分解から再生することが判明している（Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725.）。ＦｃＲｎは、ヒト等の哺乳類の血清において、ＩｇＧ及びアルブミンを高レベルに維持するのに寄与する二機能性の分子である。
【０００５】
ＦｃＲｎと免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）との相互作用については、従来技術において既に解明が進んでいるのに対し、ＦｃＲｎとアルブミンとの相互作用についてはそれほど解明されていない。主なＦｃＲｎ結合部位は、ＤIII内（３８１〜５８５）に局在する（Andersen et al （2010) Clinical Biochemistry 43, 367-372）。データによれば、ＩｇＧ及びアルブミンが、ＦｃＲｎ上の個別の部位に、非協同的に結合することが示されている（Andersen, et al. （2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury, et al. （2006), Biochemistry 45, 4983-4990.）。
【０００６】
マウスＦｃＲｎは、マウス及びヒトのＩｇＧと結合することが知られているが、ヒトＦｃＲｎは、より識別力を有すると考えられている（Ober et al. (2001) Int. Immunol 13, 1551-1559）。Andersen et al. (2010)（Journal of Biological Chemistry 285(7):4826-36）は、マウス及びヒトアルブミンの各々に対するヒト及びマウスＦｃＲｎの（可能な組み合わせ全ての）親和性について記載する。生理学的ｐＨでは、何れの生物種のアルブミンによる、何れの受容体に対する結合も観察されなかった。酸性ｐＨでは、１００倍の結合親和性の違いが観察された。全ての場合において、両受容体に対する各生物種のアルブミン及びＩｇＧの結合は相加的であった。
【０００７】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸からなるポリペプチドとしてその特性が十分に決定されており、その配列は Peters, T., Jr. (1996)（All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications, pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3)）に記載されている。ＨＳＡはその受容体であるＦｃＲｎへの結合特性を有する。斯かる結合はｐＨ６．０で生じるが、ｐＨ７．４では結合しない。
【０００８】
ＨＳＡの血漿中半減期はおよそ１９日間であることが知られている。より短い血漿中半減期を有する天然の変異体として、置換Ｄ４９４Ｎを有する変異体が同定されている（Peach, R. J. and Brennan, S. 0., (1991) Biochim Biophys Acta.1097:49-54）。この置換によって、変異体には、野生型アルブミン中には存在しないＮ−グリコシル化部位が生成される。血漿中半減期の変化の原因がグリコシル化にあるのか、それともアミノ酸の変化にあるのかは分かっていない。
【０００９】
アルブミンは長い血漿中半減期を有し、この特性ゆえに薬物送達への使用が提案されている。アルブミンは医薬的に有益な種々の化合物にコンジュゲートされており（国際公開第２０００／６９９０２Ａ号）、斯かるコンジュゲートは、アルブミンの長い血漿中半減期を維持することが見出されている。得られた該コンジュゲートの血漿中半減期は概して、有益な治療的化合物単独の場合の血漿中半減期よりも、はるかに長くなった。
【００１０】
更に、アルブミンを治療的に有益なペプチドと遺伝子的に融合する試みもなされており（国際公開第２００１／７９２７１Ａ号及び国際公開第２００３／５９９３４Ａ号）、斯かる融合物は概して、治療的に有益なペプチドの活性を維持すると共に、治療的に有益なペプチド単独の場合の血漿中半減期よりも、はるかに長い血漿中半減期を有するという結果が得られている。
【００１１】
Otagiri et al (2009)（Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534）は、７０種超のアルブミン変異体のうちの２５種において、ドメインIIIに変異が見られる旨を開示する。カルボキシ末端の最後の１７５個のアミノ酸を欠失する天然変異体では、半減期が短縮されることが示されている（Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372）。Iwao et al (2007) は、マウスモデルを用いて天然ヒトアルブミン変異体の半減期を研究したところ、Ｋ５４１Ｅ及びＫ５６０Ｅでは半減期が短縮され、Ｅ５０１Ｋ及びＥ５７０Ｋでは半減期が延長され、Ｋ５７３Ｅでは半減期に殆ど影響がなかったことを示した（Iwao, et. al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590）。
【００１２】
Galliano et al (1993)（Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32）は、天然変異体Ｅ５０５Ｋを開示する。Minchiotti et al (1990) は、天然変異体Ｋ５３６Ｅを開示する。Minchiotti et al (1987)（Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418）は、天然変異体Ｋ５７４Ｎを開示する。Takahashi et al (1987)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417）は、天然変異体Ｄ５５０Ｇを開示する。Carlson et al (1992)（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229）は、天然変異体Ｄ５５０Ａを開示する。
【００１３】
国際公開第２０１１／０５１４８９号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６５７２）は、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合を調節するアルブミン中の多数の点変異を開示し、国際公開第２０１０／０９２１３５号は、アルブミンのコンジュゲートに使用可能なチオール基の数を増加させたアルブミン中の多数の点変異を開示し、該開示は、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合に関して変異の影響を与えない。国際公開第２０１１／１０３０７６号は、ＨＳＡのドメインIII中の置換をそれぞれ含むアルブミン変異体を開示する。
【００１４】
アルブミンは多数のリガンドの結合を許容する能力を有し、これらのリガンドはアルブミンに連結される（associated with）（会合する（associates with））。この特性は、アルブミンと非共有結合的に結合する能力を有する薬剤の血漿中半減期の延長に利用されてきた。これは、アルブミン結合特性に乏しい、或いは有さない医薬的に有益な化合物を、アルブミン結合特性を有する部分と結合させることにより達成され得る。概説としてKratz (2008)（Journal of Controlled Release 132, 171-183）、及び、本概説内で引用される文献を参照のこと。
【００１５】
アルブミンは、医薬的に有益な種々の化合物の調製物に使用される。斯かる調製物の例としては、これに限定されるものではないが、アルブミンのナノ粒子又はマイクロ粒子が挙げられる。これらの例の中には、医薬的に有益な化合物、或いは斯かる化合物の混合物の送達に際して、斯かる有益な化合物を送達手段たるアルブミンに連結させることが示されている場合、その受容体に対するアルブミンの親和性に変更を加えることが望ましい場合がある。
【００１６】
形成されるアソシエート（associate）（例えば、これに限定されるものではないが、Levemir（登録商標）、Kurtzhals P et al. Biochem. J. 1995; 312:725-731等）、コンジュゲート、又は融合ポリペプチドの血漿中半減期を決定するものが何であるのかは不明であるが、アルブミン及び選択された医薬的に有益な化合物／ポリペプチドの組み合わせの結果であるように思われる。治療を意図する兆候の詳細に応じて個別の薬物を設計可能とするためには、所定のアルブミンコンジュゲート、アソシエート、又はアルブミン融合ポリペプチドの血漿中半減期を制御し、当該アソシエート、コンジュゲート又は融合体の個々の構成要素により得られる血漿中半減期と比べてより長い、或いはより短い血漿中半減期を達成できるようにすることが望ましい。
【００１７】
アルブミンは腫瘍で蓄積され、そして分解されることが知られており、関節リウマチ患者の炎症関節に蓄積することも示されている。概説 Kratz (2008)（Journal of Controlled Release 132, 171-183）及び本概説内で引用される文献を参照のこと。ＨＳＡ変異体のＦｃＲｎに対する親和性を増大させることができれば、医薬的に有益な化合物の送達に有利であると予想される。
【００１８】
Kenanova et al (2009)（J. Nucl. Med.; 50 (Supplement 2):1582)）に記載のとおり、半減期の短縮や血清薬物動態の制御を達成するには、ＦｃＲｎに対して殆ど、或いは全く結合能を有さないアルブミンの変異体を得ることが好ましい。
【００１９】
Kenanova et al（2010, Protein Engineering, Design & Selection 23(10): 789-798; WO2010/118169）は、ＨＳＡのドメインIIIの構造モデル（ｐＨ７〜８において溶解）及びＦｃＲｎの構造モデル（ｐＨ６．４において溶解）を含むドッキングモデルを開示する。Kenanova et al は、ＦｃＲｎと相互作用する可能性があるドメインIII中の位置４６４、５０５、５１０、５３１及び５３５を開示する。位置４６４、５１０、及び５３５におけるヒスチジンは、Chaudhury et al. (2006) により、特に興味深いものとして同定されており、これらはマウスにおいて、親和性の著しい減少及び短縮された半減期を有することが、Kenanova (2010) により示された。しかしながら、Kenanova et alの研究は、ＨＳＡのドメインIIIに限定され、それ故、その天然の無傷の配置におけるＨＳＡを検討していない。さらに、同定された位置は、ＦｃＲｎ受容体に対する親和性の減少をもたらす。
【００２０】
国際公開第２０１１／０５１４８９号（ＰＣＴ／ＥＰ１０／０６６５７２）は、アルブミン配列中の１又は２以上の点変異の存在により、ＦｃＲｎ受容体に対する調節された（即ち、増加した又は減少した）結合親和性を有するアルブミン変異体の第一の分類を開示する。国際公開第２０１１／１２４７１８号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５５５７７）は、ＦｃＲｎ受容体に対する調節された結合親和性を有するアルブミン変異体であって、該変異体が、アルブミンの１又は２以上の他のドメインとともにアルブミンのドメインIIIを含み、１又は２以上の点変異を任意で含む、アルブミン変異体の第二の分類を開示する。
【００２１】
本発明は、一群の分子の提供を通して、ＦｃＲｎ受容体に対する調節された結合親和性を有する変異体を提供し、結合親和性（及びそれ故）半減期を要求に従って調整することを可能にする。斯かる調整は、ＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は半減期の著しい増加からＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は半減期のわずかな増加まで、ＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は半減期のわずかな減少からＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は半減期の著しい減少に及ぶ。それ故、該アルブミン部分を、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子、及びアルブミン部分を含む構成要素のＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は半減期を調整するために用いることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、親アルブミンと比べて改良された特性を有するアルブミンの変異体を同定及び／又は設計する方法を提供する。ＷＯ２０１１／０５１４８９（ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６５７２）は、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合親和性を調節する多数のアルブミン中の点変異を開示する。該点変異は、ＨＳＡ及びＦｃＲｎを含むドッキングモデルを調製するために用いられた。ドッキングモデルは、結合の間におけるＦｃＲｎと相互作用するアルブミンの領域を同定するために用いられ、それ故、これらの変異は、野生型ＨＳＡ及びＦｃＲｎ間の結合親和性と比べて、アルブミン及びＦｃＲｎ間の結合親和性を改変する。
【００２３】
本発明は、その親又は基準と比べて、改良された特性を有するアルブミンの変異体を提供する。特に、本発明は、その親又は基準と比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性、及び／又は改変された血漿中半減期を有するアルブミンの変異体を提供する。
【００２４】
それ故、本発明は、配列番号２内の（ａ）492〜538；（ｂ）505、531、524、472、108、190、197及び425；（ｃ）186〜201；（ｄ）457〜472；（ｅ）414〜426；（ｆ）104〜120；（ｇ）75〜91；（ｈ）144〜150；（ｉ）30〜41；（ｊ）550〜585及び（ｋ）276、410及び414の何れかから選択される位置と同等のアルブミン中の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置のA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yのうち１又は２以上（数個）による改変、及び／又は、497〜585の位置における停止コドンを含む、親又は基準のアルブミンの単離されたアルブミンの変異体、若しくはその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであって、
ここで、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584からなる群、及び／又は（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585からなる群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585における１又は２以上（数個）の天然の残基（例えば非Cys残基）からCysへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567における１又は２以上（数個）のCysの欠失若しくはCysから非Cys残基へ置換）、及び／又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584からなる群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含む場合には；前記ポリペプチドは更に、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585からなる群から選択される位置における１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置に挿入若しくは置換された停止コドンを含むことが好ましい、ポリペプチドに関する。
【００２５】
本発明は、残基497〜585の位置、即ち497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585のいずれかの位置（又は配列番号２と比べて同等の位置）における停止コドンの導入も含む。停止コドンの導入は、本明細書で言及する１又は２以上（数個）の改変の代わりに、或いは一緒に行なわれる。
【００２６】
本発明は、
（ａ）配列番号２内の以下の位置：30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197のいずれかに対応する１又は２以上（数個）の位置、及び／又は
（ｂ）配列番号２内の以下の位置：189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、276のいずれかに対応する１又は２以上（数個）の位置、及び／又は
（ｃ）配列番号２内の以下の位置：410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、498、502、507、508、509、511、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、566、568、569、570、571、572、576、583に対応する１又は２以上（数個）の位置、
において改変（例えば、置換、欠失、又は挿入）を含む、親又は基準アルブミンと比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性が改変されてなるアルブミン変異体又はその断片であって、
ここで、変異体又はその断片の改変された結合親和性が、改変を含まない親アルブミン又は断片等の基準の結合親和性と比べられる、アルブミン変異体又はその断片を提供する。
【００２７】
（上記の）（ａ）に記載される位置は、アルブミン、例えばＨＳＡなどのポリペプチドの第一のドメイン（例えばドメインＩ）中に存在し得る。（上記の）（ｂ）に記載される位置は、アルブミン、例えばＨＳＡなどのポリペプチドの第二のドメイン（例えばドメインII）中に存在し得る。（上記の）（ｃ）に記載される位置は、アルブミン、例えばＨＳＡなどのポリペプチドの第三のドメイン（例えばドメインIII）中に存在し得る。
【００２８】
アルブミン変異体又はその断片は、配列番号２の以下の位置：
（ｉ）417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582、584のいずれか、
（ii）34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585のいずれか（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585における１又は２以上（数個）の天然の残基（例えば非Cys残基）からCysへの置換、及び／又は91、200、461、514、558、559、567における１又は２以上（数個）のCysの欠失若しくはCysから非Cys残基への置換）、及び／又は
：（iii）63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584のいずれか（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）、
に対応する１又は２以上（数個）の位置において、更に改変（例えば、置換又は挿入）を含み得る。
【００２９】
親アルブミン及び／又はアルブミン変異体は、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（ii）（ｉ）の全長相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び／又は
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片
を含む、或いはからなることが好ましい。
【００３０】
１又は２以上の位置における改変は、置換、挿入、及び欠失の中から独立して選択されてもよく、置換は好ましい。
【００３１】
本発明は、変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド；核酸コンストラクト、ベクター、及び該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞；及び変異体を生産する方法にも関する。
【００３２】
本発明は、本発明のアルブミン変異体若しくはその断片、及び有益な治療用部分を含むコンジュゲート又はアソシエート、又は本発明のアルブミン変異体若しくはその断片、及び融合パートナーポリペプチドを含む融合ポリペプチドにも関する。
【００３３】
本発明は、さらに、アルブミン変異体、その断片、アルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含む本発明によるコンジュゲート、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含む本発明によるアソシエートを含む組成物に関する。該組成物は、好ましくは医薬組成物である。
【００３４】
本発明は、さらに、アルブミン変異体、その断片、アルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲート、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含むアソシエートを含む医薬組成物であって、ここで、前記アルブミン変異体、その断片、アルブミン変異体若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲート、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含むアソシエートが、ＨＳＡ、若しくはその断片、ＨＳＡ若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又はＨＳＡ若しくはその断片を含むコンジュゲート若しくはアソシエートと比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性及び／又は改変された血漿中半減期を有する、医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−１】図１：（ｉ）全長成熟ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿２＿３）、（ii）ＨＳＡのドメインＩ及びドメインIIIを含むアルブミン変異体（Ｈｕ＿１＿３）、（iii）ＨＳＡのドメインII及びドメインIIIを含むアルブミン変異体（Ｈｕ＿２＿３）、（ｉｖ）全長アカゲザル（Macaca mulatta）アルブミン（Ｍａｃ＿ｍｕｌ）、（ｖ）全長ドブネズミ（Rattus norvegicus）アルブミン（ラット）、及び（ｖｉ）全長ハツカネズミ（Mus musculus）アルブミン（マウス）のアミノ酸配列の多重アラインメント。位置５００、５５０及び５７３（全長ＨＳＡを基準とする）を矢印で示す。図４ではドメインＩ、II及びIIIをそれぞれ１、２及び３と記す。
【図１−２】同上。
【００３６】
【図２−１】図２：ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギ及びヤギ由来の成熟アルブミン、並びにチンパンジー（「Chimp」）、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ及びブタ由来の未成熟アルブミンのアミノ酸配列の多重アラインメント。ドメイン１、２及び３の開始及び終了アミノ酸（Dockal et al (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310）の定義による）は、成熟ヒトアルブミンを基準として表示する。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【００３７】
【図３】図３：特性に基づくアミノ酸の保存された基。
【００３８】
【図４−１】図４：ＨＳＡのドメイン構造及びＨＳＡハイブリッド分子のｓｈＦｃＲｎ結合特性。（Ａ）ｐＨ依存性可動ループ（標識「Ｈｉｓ１６６」の真下のオレンジ色のリボン））、及びＩｇＧ結合部位を基準としたＨｉｓ−１６６（ボール及びスティックで表した赤い残基（標識「α２」の下、且つ標識「Ｇｌｕ１１５、Ｇｌｕ１１６」及び「ＩｇＧ」の左のボールとスティックで表した残基）の位置を示すｓｈＦｃＲｎの全体構造（２３）。（Ｂ）全長ＨＳＡの結晶構造は、３つのαヘリックスドメイン；ＤＩ（ピンク）、ＤII（オレンジ）、及びＤIII（シアン／ブルー）からなる（１９）。ＤIIIは、サブドメインＤIIIａ（シアン）及びＤIIIｂ（ブルー）に分けられる。（Ｃ）構築されたハイブリッドＨＳＡ分子のドメイン構成（ＤＩ−ＤII、ＤＩ−ＤIII、ＤII−ＤIII、ＤIII；該ドメインは、図４Ａ及び４Ｂと同一のスキームは陰影がつけられる）。（Ｄ）ＨＳＡドメイン変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動。（Ｅ）ｐＨ６．０において固定化されたｓｈＦｃＲｎ上に注入されたＷＴ ＨＳＡ及びドメインの組み合わせのＳＰＲセンサーグラム。（Ｆ）ｐＨ７．４及びｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ、ＨＳＡ ＤIIIａ、及びＨＳＡ ＢａｒｔｉｎのｓｈＦｃＲｎに対するｐＨ依存的な結合を示すＥＬＩＳＡ。
【図４−２】同上。
【００３９】
【図５−１】図５：ｓｈＦｃＲｎ結合に関するＨＳＡ ケースブルック（Casebrook）の構造的暗示。（Ａ）ＨＳＡ中のＡｓｐ−４９４の周辺の相互作用ネットワークの拡大図。Ａｓｐ−４９４は、サブドメインＤIIIａ（シアン）及びＤIIIｂ（ブルー）と連結するループ中に位置する。Ａｓｐ−４９４は、Ａｒｇ−４７２とイオン的相互作用を、そしてＧｌｎ４１７と水素結合相互作用を形成し、これらの双方は、サブドメインＤIIIａ内に位置する。Ａｓｐ−４９４はまた、Ｔｈｒ−４９６と水素結合を形成し、これによりＤIIIａとＤIIIｂとを連結するループを安定化する。（Ｂ）変異体Ｄ４９４Ｎ、Ｄ４９４Ａ、Ｄ４９４Ｑ、Ｅ４９５Ｑ、Ｅ４９５Ａ、Ｔ４９６Ａ及びＤ４９４Ｎ／Ｔ４９６ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動。（Ｃ）ＷＴ ＨＳＡ、及び組み換え生産されたケースブルック（Casebrook）（Ｄ４９４Ｎ）、Ｄ４９４Ａ及びＤ４９４Ｑに対するｓｈＦｃＲｎの結合を示すＳＰＲセンサーグラム。（Ｄ）Ｅ４９５Ｑ及びＥ４９５Ａ、並びに（Ｅ）ｐＨ６．０におけるＴ４９６Ａ及びＤ４９４Ｎ／Ｔ４９６Ａ。（Ｆ）ＷＴ ＨＳＡ及びヘテロ接合体患者から単離されたケースブルック（Casebrook）に対するｓｈＦｃＲｎ結合のＳＰＲセンサーグラム（Ｇ）ｐＨ６．０におけるｓｈＦｃＲｎに対するＷＴ ＨＳＡ及びケースブルック（Casebrook）の競合的結合。該受容体は、固定化されたＨＳＡ上に、ＷＴ又はケースブルック（Casebrook）ＨＳＡの滴定量の存在下で注入された。（Ｈ）ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ及びＱ４１７Ａに対するｓｈＦｃＲｎの結合を示すＳＰＲセンサーグラム。
【図５−２】同上。
【００４０】
【図６】図６：保存されたヒスチジンは、ｓｈＦｃＲｎとの結合に重要である。（Ａ）ＨＳＡのＤIII内の選択された残基の位置。変異誘発のために選択されたサブドメインＤIIIａ及びＤIIIｂと連結するするループ中の残基（Ａｓｐ−４９４、Ｇｌｕ−４９５、Ｌｙｓ−５００及びＧｌｕ−５０１）及び保存されたヒスチジンなどの連結ループに近い更なる残基（Ｈｉｓ−４６４、Ｈｉｓ−５１０及びＨｉｓ−５３６）、並びにＬｙｓ−５３６及びＰｒｏ−５３７は、ボール及びスティックとして表される（くり色）。非保存的なＨｉｓ−４４０は、遠位に位置する。最後のＣ末端のα−ヘリックスは、黄色で強調される（標識された「Ｃ−末端のα−ヘリックス」）。酸性ｐＨ（６．０）におけるＷＴ ＨＳＡ及び（Ｂ）Ｐ４９９Ａ、Ｋ５００Ａ及びＥ５０１Ａ、及び（Ｃ）Ｈ４４０Ｑ、Ｈ４６４Ｑ、Ｈ５１０Ｑ及びＨ５３５Ｑ、並びに（Ｃ）Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ及びＫ５３８Ａに対するＦｃＲｎ結合のＳＰＲセンサーグラム。
【００４１】
【図７−１】図７：Ｈｉｓ−１６６は、ｐＨ依存的な態様で可変ループを安定化する。異なるｐＨ条件におけるＦｃＲｎ ＨＣループ領域の拡大図。（Ａ）低ｐＨ（４．２）において、正に帯電したＨｉｓ−１６６は、ｓｈＦｃＲｎの表面が曝露されたループ内のＧｌｕ−５４及びＴｙｒ−６０と電荷が安定した水素結合相互作用を形成する（２３）。（Ｂ）高ｐＨ（８．２）において、非帯電のＨｉｓ−１６６は、Ｇｌｕ−５４及びＴｙｒ−６０との相互作用を緩め、残基Ｔｒｐ−５１とＴｙｒ−６０の間のループは、可変となり、構造的に不規則となる（点線で表される）（８）。（Ｃ）ｐＨ６．０においてＥＬＩＳＡウェルにコートされた滴定量のＨＳＡとのｓｈＦｃＲｎに対するＷＴ及び変異体（Ｅ５４Ｑ、Ｑ５６Ａ及びＨ１６６Ａ）の結合。
【図７−２】同上。
【００４２】
【図８−１】図８：提案されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡドッキングモデル。（Ａ）ＦｃＲｎ ＨＣ（緑色、「ＦｃＲｎα１」、「ＦｃＲｎα２」及び「ＦｃＲｎα３」と標識される）、β２ｍ（灰色）、及び三つのＨＳＡ α−ヘリックスドメインＤＩ（ピンク）、ＤII（オレンジ）及びＤIII（シアン／ブルー）を示す、二つの向きにおけるドッキングされた分子の外観図。ＤIIIサブドメインは、ＤIIIａ（シアン）とＤIIIｂ（ブルー）に分けられる。（Ｂ）ドッキングモデルにおけるｓｈＦｃＲｎ（緑色カートゥーン）及びＨＳＡ（空間充填ダイアグラムで示されるブルーの表面（グレースケール：暗い灰色））間の相互作用界面の拡大図。ＨＳＡのＣ末端（暗いブルー（グレースケール：暗い灰色））及びサブドメインＤIIIａとＤIIIｂ間の残基４９０〜５１０に対応するループは、ｓｈＦｃＲｎのｐＨ依存性且つ可変なループ（残基５１〜５９）が結合し得るＨＳＡ表面上のクレバスを形成する。ｓｈＦｃＲｎのＨｉｓ−１６６は、ＨＳＡ残基Ｇｌｕ−５４及びＧｌｕ−５０５との強力な、電荷安定的な相互作用を形成し得る。ＨＳＡ Ｇｌｕ−５０５は、ｓｈＦｃＲｎ Ａｒｇ−１６２とさらに相互作用することができる。塩橋は、ｓｈＦｃＲｎのＬｙｓ−１５０及びＧｌｕ−１５１とＨＳＡのＧｌｕ−５０１及びＬｙｓ−５００とで形成される可能性がある。ＨＳＡ表面上のの割れ目は、ＤIIIａとＤIIIｂを連結するループと、残基５２０−５３５を包含するα−ヘリックス間で形成される。ｓｈＦｃＲｎのＨｉｓ−１６１は、低いｐＨにおいて、ＨＳＡのＧｌｕ−５３１と相互作用してもよく、そして錯体は、ｓｈＦｃＲｎ Ｇｌｕ−１６８及びＨＳＡ Ｌｙｓ−５２４間の塩橋によりさらに強化され得る。（Ｃ）ドッキングモデルにおけるｓｈＦｃＲｎ（緑色表面（図の左下の空間充填ダイアグラム）及びＨＳＡ（ピンク、ブルー、及びシアンカートゥーン（リボンダイアグラム））間の相互作用界面。ｓｈＦｃＲｎのβ−ヘアピンループは、ＨＳＡのドメインＤＩ（ピンク、標識Ｌｙｓ１９０、Ａｓｐ１０８及びＡｒｇ１９７を含む）とＤIIIａ（シアン、標識Ｇｌｕ４２５及びＨｉｓ４６４を含む）に挟まれる。ｓｈＦｃＲｎ Ａｓｐ１１０は、この界面において以下のいくつかの構造的再配列に従うＨＳＡのＬｙｓ１９０又はＡｒｇ１９７のいずれかとパートナーになり得る。保存されたＨｉｓ４６４は、β−ヘアピンループと接触するＤIIIａα−ヘリックス中に位置する。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【００４３】
【図９】図９：ｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡ ドッキングモデルの表示。（Ａ−Ｂ）複合体の二つの向きを示す。アルブミンを、空間充填ダイアグラムにより表し、ＦｃＲｎをリボンダイアグラムにより表す。ＨＳＡの中核の結合界面は、ピンク（グレースケールにおいて、最も暗い（ほぼ黒色の）領域；ＤＩ（ＣＢＩ））で強調される一方で；界面から遠位に位置する領域は、ＤII（オレンジ）で示され、ＤIIIはサブドメインＤIIIａ（シアン）とＤIIIｂ（ブルー）に分けられる。
【００４４】
【図１０】図１０：ｐＨ６．０及びｐＨ７．４における一連のＨＳＡ ケースブルック（Casebrook）変異（１００〜０．０４５μｇ／ｍｌ）に対するｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴの結合。ＥＬＩＳＡ値は二重反復試験の平均を表す。
【００４５】
【図１１】図１１：ｐＨ６．０におけるｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴに対するヘテロ接合個体から単離されたケースブルック（Casebrook）ＨＳＡ変異体及びＷＴ ＨＳＡ（２００〜１．６２５μｇ／ｍｌ）の結合。
【００４６】
【図１２】図１２：ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ及びケースブルック（Casebrook）変異体のＣＤスペクトル。５μＭの各変異体を評価し、示されるスペクトルは５回の測定の平均を表す。
【００４７】
【図１３】図１３：ＨＳＡのヒスチジン変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の減少。レーン１、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２（６μｌ）、及び各レーンあたり１μｇの（２）Ｈ４４０Ｑ、（３）Ｈ４６４Ｑ、（４）Ｈ５１０Ｑ及び（５）Ｈ５３５Ｑ。
【００４８】
【図１４】図１４：切断されたＷＴ ＨＳＡ及びＨＳＡ変異体５６８ｓｔｏｐの結合（最後の１７個のアミノ酸を欠損している切断された変異体）。ｓｈＦｃＲｎに対するＣ末端が切断されたＨＳＡ変異体ＨＳＡの結合。１０μＭのそれぞれは、ｐＨ６．０において、固定化されたｓｈＦｃＲｎ（２０００ＲＵ）上に注入された。
【００４９】
【図１５】図１５：ｐＨ６．０及びｐＨ７．４におけるＷＴ ＨＳＡ及びＨＳＡ Ｅ１６８Ａ（２００〜０．０４５μｇ／ｍｌ）に対するｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴの結合。ＥＬＩＳＡ値は二重反復試験の平均を表す。
【００５０】
【図１６】図１６：二つの向きにおける、ＦｃＲｎに対する二つのリガンド（ＩｇＧ及びＨＳＡ）の同時の結合を示す、提案されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡドッキングモデル。
【００５１】
【図１７】図１７：結合する場合に、ＨＳＡのサブドメインＤIII内の実質的な再配置をしないが、ＨＳＡ ＤIIIを基準としてＨＳＡ ＤＩの方向における著しいシフトを示す、ＨＳＡの脂肪酸結合状態と遊離の状態との比較。Ｍｙｒ：ミリステート；β２ｍ：β２−ミクログロブリン。
【００５２】
【図１８−１】図１８は、実施例１に記載されるＨＳＡ及びＦｃＲｎのドッキングモデルからのＨＳＡ（配列番号２）のＰＤＢファイルからのα炭素の抽出である。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【図１８−６】同上。
【図１８−７】同上。
【図１８−８】同上。
【図１８−９】同上。
【図１８−１０】同上。
【図１８−１１】同上。
【図１８−１２】同上。
【図１８−１３】同上。
【００５３】
【図１９−１】図１９は、実施例１に記載されるＨＳＡ及びＦｃＲｎのドッキングモデルからのＦｃＲｎ（ＦｃＲｎの配列番号）のＰＤＢファイルからのα炭素の抽出である。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図１９−４】同上。
【図１９−５】同上。
【図１９−６】同上。
【図１９−７】同上。
【図１９−８】同上。
【００５４】
【図２０】図２０：Ｃ末端が切断されたＨＳＡ変異体のｓｈＦｃＲｎとの結合。ｐＨ６．０において、固定化したｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ（２０００ＲＵ）上に１０μＭの各変異体を注入した。
【００５５】
【図２１−１】図２１：Ｃ末端が切断されたＨＳＡ変異体の競合的結合。競合的結合を、ｐＨ６．０において、固定化したＨＳＡ（約２２００ＲＵ）上にｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ（１００ｎＭ）を単独で、或いは段階希釈したＨＳＡ変異体と一緒に注入することにより測定した。
【図２１−２】同上。
【００５６】
【図２２】図２２：ＨＳＡのＣ末端における点変異は、ｓｈＦｃＲｎに対する結合を調節する。１０μＭのＨＳＡ ＷＴ及びＨＳＡ（Ａ）ＨＳＡ Ｑ５８０Ａ、（Ｂ）ＨＳＡ Ｋ５７４Ａ及び（Ｃ）ＨＳＡ Ｋ５７３Ｐ／Ｑ５８０ＡをｐＨ６．０において、固定化したｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ（約２０００ＲＵ）上に注入した。
【００５７】
【図２３】図２３：ｐＨ５．５におけるＷＴ ＨＳＡ、ＨＳＡ Ｋ５７３Ｐ及びＨＳＡ Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３ＰのｓｈＦｃＲｎ結合、サンプルをｐＨ５．５において、固定化されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳ（約１５００〜２５００ＲＵ）上に注入した。
【００５８】
【図２４】図２４：ｓｈＦｃＲｎ（空間充填ダイアグラム）と位置７８〜８８及び１０８〜１１２を含むＨＳＡのループを含むＨＳＡ（リボンダイアグラム）ＤＩ、ＤII及びＤIIIの空間的関係を示す、提案されたｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡドッキングモデル。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、アルブミンとＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼし、そして／又はその相互作用に関与する１又は２以上（数個）の位置での改変、好ましくは配列番号２の成熟ポリペプチドの位置30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410、及び/又は411に対応する１又は２以上（数個）の位置での改変を含んでなる、親又は基準アルブミンの単離アルブミン変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドに関し、ここで、好ましくは、前記変異体、その断片又は融合物が、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 及び584から成る群、及び／又は（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）から選択される位置で１又は２以上（数個）の置換を含む場合、前記変異体、その断片又は融合物はまた、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置で１又は２以上（数個）の改変を含んでなる。
【００６０】
好ましい改変は、534、505、111、527、510及び/又は108に相当する位置（位置は配列番号２を基準にしている）で起こるそれらの改変を包含する。置換K534V、E505Q、N111D、T527M、H510D及びD108A又はそれらに相当する位置でのそのような置換がより好ましい。置換K534I、K534L、D108E及びN111E、又はそれらに相当する位置でのそのような置換はまた、それらがK534V、D108A及びN111Dの高く保存された置換であるので、好ましい。位置105〜120（配列番号２を基準とする）を含むループに相当する位置での改変が好ましく、位置106〜115に相当する位置での改変がより好ましく、そして108、109、110、111及び112に相当する位置での改変がさらにより好ましい。当業者は、本明細書に記載されるように、配列番号２のそれらの位置に相当する位置を同定することができる。
【００６１】
本発明は、
（ａ）配列番号２の次の位置：30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197の何れかに対応する１又は２以上（数個）の位置；及び／又は
（ｂ）配列番号２の次の位置：189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、276の何れかに対応する１又は２以上（数個）の位置；及び／又は
（ｃ）配列番号２の次の位置：410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、498、502、507、508、509、511、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、566、568、569、570、571、572、576、583の何れかに対応する１又は２以上（数個）の位置、
において改変（例えば、置換、欠失又は挿入）を含む、親又は基準アルブミンと比べて、ＦｃＲｎに対する結合親和性が改変されてなるアルブミン変異体又はその断片であって、
ここで前記変異体又はその断片の改変された結合親和性は、改変を含まない親アルブミン又は断片等の基準の結合親和性と比べられる、アルブミン変異体又はその断片を提供する。
【００６２】
（上記の）（ａ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第１ドメイン（たとえば、ドメインＩ）に存在することができる。（上記の）（ｂ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第２ドメイン（例えば、ドメインII）に存在することができる。（上記の）（ｃ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第３ドメイン（例えば、ドメインIII）に存在することができる。
【００６３】
アルブミン変異体又はその断片はさらに、配列番号２の下記位置：
（ｉ）417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582、584の何れか；
（ii）34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の何れか（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は
（iii）63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584の何れか（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）
に対応する１又は２以上（数個）の位置で改変（例えば、置換又は挿入）を含んでなる。
【００６４】
好ましくは、親アルブミン及び／又はアルブミン変異体は、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（ii）（ｉ）の完全長相補鎖と、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び／又は
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片
を含んでなるか又はそれから成る。
【００６５】
１又は２以上の位置での改変が、置換、挿入及び欠失から独立して選択され得、ここでは置換が好ましい。
【００６６】
本発明はまた、残基497〜585（又は配列番号２に対する相当の位置）又は残基497（又は配列番号２に対する相当の位置）〜アルブミンの成熟配列の最後の残基の位置で停止コドンの導入も含んでなる。停止コドンの導入は、本明細書に言及される１又は２以上（数個）の改変の代わりであるか又は一緒であり得る。
【００６７】
本発明は、特定の利用者又は適用の必要条件を満たすよう、ＦｃＲｎ受容体のためのアルブミン部分の結合親和性（及び従って、半減期）を調整できる。そのような調整は、半減期の大きな上昇〜半減期の小さな上昇、半減期の小さな減少〜半減期の大きな減少の範囲であり得る。従って、アルブミン部分は、アルブミン部分を含んでなる、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子及び組成物の半減期を調整するために使用され得る。本発明は特に、医薬に適用できる。いくつかの医薬は、例えば投与間隔を広げるために、長い半減期から利益を得る。いくつかの医薬は、患者の身体からのクリアランスを促進するために短い血漿中半減期が効果的である。従って、本発明のアルブミン部分の医薬への使用は、必要に応じて、医薬の半減期の調整を可能にする。
【００６８】
定義：
変異体：用語「変異体」（variant）とは、１又は２以上（数個）の位置で、１又は２以上（数個）の改変、すなわち置換、挿入及び／又は欠失による親アルブミン由来のポリペプチドを意味する。置換とは、異なったアミノ酸による、１つの位置を占有するアミノ酸の置換を意味し；欠失とは１つの位置を占有するアミノ酸の除去を意味し；そして挿入とは、１つの位置を占有するアミノ酸に直接隣接して、１又は２以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。置換に関して、「直接隣接して」（immediately adjacent）とは、１つの位置を占有するアミノ酸（「命名されたアミノ酸」）のN−側（「上流」（upstream））又はC-側「下流」（downstream）に対してであり得る。従って、「X」として命名された／番号付けされたアミノ酸に関しては、挿入は位置「X+1」（「下流」）又は位置「X-1」（上流）であり得る。
【００６９】
変異体：用語「変異体」（mutant）とは、変異体（variant）をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００７０】
野生型アルブミン：用語「野生型」（wild type）（ＷＴ）アルブミンとは、動物又はヒトにおいて、天然で見出されるのと同じアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。
【００７１】
ＦｃＲｎ及びｓｈＦｃＲｎ：用語「ＦｃＲｎ」とは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を意味する。ｓｈＦｃＲｎは、ＦｃＲｎの可溶性組換え形態である。ｈＦｃＲｎは、配列番号３０（主要組織適合性複合体クラスI様Ｆｃ受容体（ＦＣＧＲＴ）の切断された重鎖）及び配列番号３１（β−マイクログロブリン）のヘテロダイマーである。一緒に、配列番号３０及び３１はｈＦｃＲｎを形成する。
【００７２】
ｓｍＦｃＲｎ：用語「ｓｍＦｃＲｎ」とは、マウス新生児Ｆｃ受容体の可溶性組換え形態である。
【００７３】
単離変異体：用語「単離変異体」（isolated variant）とは、人の手により修飾され、そして天然に存在する少なくとも１つの成分から完全に又は部分的に分離される変異体を意味する。変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＧＰ−ＨＰＬＣにより決定される場合、少なくとも１％純粋、例えば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、及び少なくとも９０％純粋であり得る。
【００７４】
実質的に純粋な変異体：用語「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）とは、天然又は組換え的に関連する他のポリペプチド材料の含有率が重量基準で、最大１０％、最大８％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、及び最大０．５％である調製物を意味する。好ましくは、前記変異体は、調製物に存在する総ポリペプチド材料に対して、重量基準で少なくとも９２％の純度、例えば少なくとも９４％純度、少なくとも９５％純度、少なくとも９６％純度、少なくとも９７％純度、少なくとも９８％純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％純度、及び１００％純度を有する。本発明の変異体は好ましくは、実質的に純粋な形で存在する。これは、例えば、周知の組換え法及び精製法により変異体を調製することにより達成され得る。
【００７５】
成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）とは、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセッシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等に続いてのその最終形態でのポリペプチドを意味する。成熟ポリペプチドは、任意の翻訳後修飾の包含を含めて、配列番号２のアミノ酸１〜585であり得る。
【００７６】
成熟ポリペプチドコーディング配列：用語「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）とは、成熟アルブミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。成熟ポリペプチドコーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜1758であり得る。
【００７７】
配列同一性：２種のアミノ酸配列間の、又は２種のヌクレオチド配列間の関連性が、パラメーター「配列同一性」により記載される。
【００７８】
本発明の目的においては、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一残基数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００７９】
本発明の目的においては、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の程度は、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行することにより決定される。任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleの出力値（-nobriefオプションを用いて得られるもの）を％同一性として使用する。これは以下の式に従い算出される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数 × １００）／（アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数）
【００８０】
断片：用語「断片」（fragment）とは、アルブミンのアミノ及び／又はカルボキシル末端、及び／又はＦｃＲｎへの結合能力を保持しているアルブミンの内部領域から欠失された、１又は２以上（数個）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味する。断片は、ＨＳＡ由来の１つの中断されない配列から成るか、又はそれはＨＳＡ由来の２以上（数個）の配列を含んでなる。本発明の断片は、約２０個以上のアミノ酸残基、好ましくは３０個以上のアミノ酸残基、より好ましくは４０個以上のアミノ酸残基、より好ましくは５０個以上のアミノ酸残基、より好ましくは７５個以上のアミノ酸残基、より好ましくは１００個以上のアミノ酸残基、より好ましくは２００個以上のアミノ酸残基、より好ましくは３００個以上のアミノ酸残基、さらにより好ましくは４００個以上のアミノ酸残基及び最も好ましくは５００個以上のアミノ酸残基のサイズを有する。断片は、アルブミンの１以上のドメイン、例えばDI + DII、DI + DIII、DII + DIII、DIII + DIII、DI + DIII + DIII、DIII + DIII +DIII、又はそのようなドメイン断片又はドメインの組み合わせを含んでなるか、又はそれらから成ることができる。
【００８１】
ドメインI、II及びIIIは、ＨＳＡ（配列番号２）を基準として定義され得る。例えば、ＨＳＡドメインIは配列番号２のアミノ酸１〜１９４（±１〜１５個のアミノ酸）から成るか又はそれらを含んでなり、ＨＳＡドメインIIは配列番号２のアミノ酸１９２（±１〜１５個のアミノ酸）〜３８７（±１〜１５個のアミノ酸）から成るか又はそれらを含んでなり、そしてドメインIIIは配列番号２のアミノ酸残基３８１（±１〜１５個のアミノ酸）〜５８５（±１〜１５個のアミノ酸）から成るか又はそれらを含んでなることができる。「±１〜１５個のアミノ酸」（± 1 to 15 amino acids)とは、残基数が言及されるアミノ酸位置のＣ末端及び／又はＮ末端に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸、逸脱することを意味する。ドメインＩ、II及びIIIの例は、Dockal et al （The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310）及びKjeldsen et al （Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169）により記載されており、そして下記の表にまとめられる。
【００８２】
【表１】
2014515614.tif 000002
【００８３】
当業者は、例えばEMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行されるNeedleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いて、ＨＳＡとのアミノ酸配列アラインメントにより、非ヒトアルブミン中のドメインＩ、II及びIIIを同定することができる。用いられる任意パラメーターは、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）が０.５であり、また、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスを使用する。他の適切なソフトフェアとしては、ユーザー・ガイド（バージョン３．６、２００５年９月）に記載されるように、既定の測定を用いて使用されてもよいＭＵＳＣＬＥ（対数予測（log-expectation）による多重配列比較、Robert C. Edgar, Version 3.6, http://www.drive5.com/muscle; Edgar (2004) Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97 and Edgar (2004) BMC Bioinformatics, 5(1):113）を挙げることができる。３．６以降のＭＵＳＣＬＥのバージョンがまた、本発明のいずれかの側面のために使用され得る。適切なアラインメントの例は、図１及び２に提供される。
【００８４】
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」（allelic variant）とは、同一の染色体座を択一的に占める一遺伝子の複数形態の何れかを意味する。対立遺伝子変異（allelic variation）は自然界において突然変異により生じる。これにより個体集団内に多型が生じる場合もある。遺伝子の突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドは変化しない）場合もあるが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化が生じる場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体とは、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
【００８５】
コーディング配列：用語「コーディング配列」（coding sequence）とは、その翻訳されたポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は通常、オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）により画定される。オープン・リーディング・フレームは通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧやＴＴＧ等の代替開始コドンから開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ等の停止コドンで停止する。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は組換えポリヌクレオチドの何れでもよい。
【００８６】
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」とは、真核細胞から得られるスプライス後の成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写により調製されるＤＮＡ分子として定義される。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に通常存在するイントロン配列を有さない。初期一次ＲＮＡ転写産物がｍＲＮＡの前駆体となり、これが一連の処理工程、例えばスプライシングを経て、最終的にスプライス後の成熟ｍＲＮＡを生じる。
【００８７】
核酸コンストラクト：用語「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）とは、天然遺伝子から単離され、或いは天然では存在しない核酸のセグメントを含むように修飾され、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味する。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現に必要な調節配列を含む場合、核酸コンストラクトなる用語は「発現カセット」（expression cassette）と同義となる。
【００８８】
調節配列：用語「調節配列」（control sequence）とは、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を意味する。各調節配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して同種でも外来でもよく、互いに同種でも外来でもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、調節配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを付加してもよい。これにより斯かる調節配列と、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域との連結が容易になる。
【００８９】
作動式に連結され：用語「作動式に連結され」（operably linked）とは、ポリヌクレオチドのコーディング配列が調節配列により発現されるように、ポリヌクレオチド配列の調節配列がコーディング配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【００９０】
発現：用語「発現」（expression）とは、変異体の産生に関与する任意の工程を意味する。前記工程としては、これらに制限されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
【００９１】
発現ベクター：用語「発現ベクター」（expression vector）とは、変異体をコードするポリヌクレオチドを含むとともに、その発現を可能とする更なるヌクレオチドと作動式に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子として定義される。
【００９２】
宿主細胞：用語「宿主細胞」（host cell）とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等が可能な任意の細胞型を含む。「宿主細胞」という語には、親細胞の任意の子孫であって、複製時に生じた突然変異により親細胞とは同一ではなくなったものも含まれる。
【００９３】
血漿中半減期：血漿中半減期は、適切な個体においてインビボで理想的には決定される。しかしながら、それは時間がかかり、且つ費用が高く、そして動物又はヒトにおいて実験を行うことに関連して避けられない倫理的な問題が存在するので、血漿中半減期が延長又は短縮されるかどうかを決定するためにインビトロアッセイを用いることが所望される。アルブミンのその受容体ＦｃＲｎへの結合は、血漿中半減期のために重要であり、受容体結合と血漿中半減期とは、アルブミンの受容体ＦｃＲｎに対する親和性が高いほど血漿中半減期が長くなるという相関関係にあることが考えられる。従って、本発明では、アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が高いほど、血漿中半減期が増加したものと判断し、アルブミンのＦｃＲｎ受容体に対する親和性が低いほど、血漿中半減期が低減したものと判断する。
【００９４】
本出願及び請求項においては、アルブミンのその受容体ＦｃＲｎへの結合は、用語、親和性及び表現、「より強い」（stronger）又は「より弱い」（weaker）を用いて記載されている。従って、ＨＳＡよりもＦｃＲｎに対して高い親和性を有する分子はＨＳＡよりもＦｃＲｎに対してより強く結合すると思われ、そしてＨＳＡよりもＦｃＲｎに対して低い親和性を有する分子は、ＨＳＡよりもＦｃＲｎに対して弱く結合すると思われることは理解されるべきである。
【００９５】
用語「より長い血漿中半減期」（longer plasma half-life）又は「より短い血症半減期」（shorter plasma half-life）、及び類似する表現は、その対応する親又は基準、又は対応するアルブミン分子との関係であると理解される。従って、本発明のアルブミン変異体に関してのより長い血漿中半減期とは、前記変異体が、例えば配列番号２の成熟ポリペプチドの30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410、及び/又は411に対応する、１又は２以上（数個）の位置での本明細書に記載される改変を除いて、同じ配列を有するその対応するアルブミンよりも長い血漿中半減期を有することを意味し、ここで好ましくは、前記変異体、断片又は融合ポリペプチドは、（i）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び 584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択された位置で１又は２以上（数個）の改変を含んでなり；前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択された位置で１又は２以上の改変、及び／又は497〜585、又は残基497（又は、配列番号２を基準として、同等の位置）〜アルブミンの成熟配列の最後の残基から選択された位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。停止突然変異の導入は、本明細書に言及される１又は２以上（数個）の改変の代わりであるか、又はそれらと一緒であり得る。
【００９６】
基準：基準（reference）とは、アルブミン、融合物、コンジュゲート、組成物、アソシエート又はナノ粒子であり、これらに対して、アルブミン変異体、融合物、コンジュゲート、組成物、アソシエート又はナノ粒子が比較される。基準は、完全長アルブミン（例えば、ＨＳＡ又はその天然の対立遺伝子）、又はその断片を含んでなるか又はそれらから成ることができる。基準はまた、「対応する」（corresponding）アルブミン、融合物、コンジュゲート、組成物、アソシエート又はナノ粒子としても言及され得、それらに対して、アルブミン変異体、融合物、コンジュゲート、組成物、アソシエート又はナノ粒子が比較される。基準は、ＨＳＡ（配列番号２）、又はその断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子又はマイクロ粒子を含んでなるか又はそれらから成る。好ましくは、基準は、（「研究される」）本発明のポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、組成物、アソシエート、ナノ粒子又はマイクロ粒子とアルブミン部分を除いては同一である。好ましくは、基準のアルブミン部分は、アルブミン（例えば、ＨＳＡ、配列番号２）又はその断片を含んでなるか又はそれから成る。基準のアルブミン部分のアミノ酸配列は、（「研究される」）本発明のポリペプチド、融合物、ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子又はマイクロ粒子のアルブミン部分のアミノ酸配列よりも長いか、短いか、又は好ましくは同じ（±１〜１５個のアミノ酸）であり得る。
【００９７】
同等のアミノ酸位置：本明細書を通して、アミノ酸位置は、完全長の成熟ヒト血清アルブミン（すなわち、リーダー配列を有さない、配列番号２）に関して定義される。しかしながら、当業者は、本発明がまた、非ヒトアルブミンの変異体（例えば、本明細書に開示されるそれら）及び／又はヒト又は非ヒトアルブミンの断片にも関することを理解している。同等の位置は、対（例えば、ClustalW）又は多重（例えば、MUSCLE）アラインメントを用いて、アミノ酸配列を比較することにより、ヒト血清アルブミンの断片、動物アルブミン、及びその断片、融合物及び他の誘導体又は変異体に同定され得る。例えば、図１は、完全長ヒト血清アルブミンにおける500、550及び573に相当する位置がヒト血清アルブミンの断片及び他の種のアルブミンに容易に同定されることを示している。位置500、550及び573は、矢印により示されている。さらなる詳細は下記表に提供される。
【００９８】
【表２】
2014515614.tif 000003
【００９９】
図１は、ClustalW 1.81フォーマットでの出力を包含するデフォールトパラメーターを用いて、MUSCLEにより作成された。生の出力データは、出力フォーマット: RTF_new; フォントサイズ: 10; コンセンサスライン: コンセンサスラインなし; 配列のフラクション（影付きにするために一致しなければならない）: 0.5; 入力配列フォーマット: ALNを用いて、BoxShade 3.21 (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)により影付きにされた。従って、本明細書を通して、ヒト血清アルブミンにおいて定義されるアミノ酸位置はまた、ヒト血清アルブミン、他の種からの動物の血清アルブミンの断片、誘導体又は変異体及び融合物、及びそれらの断片における同等の位置に適用される。そのような同等の位置は、（ｉ）その生来のタンパク質における異なった残基番号、及び／又は（ii）その生来のタンパク質における異なった生来のアミノ酸を有することができる。
【０１００】
同様に、図２は、同等の位置が配列番号２（ＨＳＡ）を基準として、アルブミンの断片（例えば、ドメイン）に同定され得ることを示す。
【０１０１】
変異体の設計上の規約：
本発明のためには、配列番号２で開示される成熟ポリペプチドは、別のアルブミンにおけるその対応するアミノ酸残基を決定するために使用される。別のアルブミンのアミノ酸配列を、配列番号２で開示される成熟ポリペプチドとアラインし、そしてこのアラインメントに基づいて、配列番号２で開示される成熟ポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277）のNeedleプログラム（好ましくはバージョン３.０.０以降）で実行されるNeedleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いて決定する。
【０１０２】
別のアルブミンにおけるその対応するアミノ酸残基の同定は、「ClustalW」（Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948）を用いて、多重ポリペプチド配列のアラインメントにより確かめられ得る。
【０１０３】
他のポリペプチド（又はタンパク質）が配列番号２の成熟ポリペプチドから分岐し、その結果、従来の配列に基づく比較ではそれらの関連性を検出できない場合（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615）、他の対配列比較アルゴリズムが使用され得る。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を用いてデータベースを検索する検索プログラムを用いることにより、より高い感度で配列に基づく検索を行うことができる。例えば、PSI-BLAST プログラムは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成するもので、遠縁のホモログを検出することが可能である（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが１又は２以上の代表がタンパク質構造データベースに存在する場合には、更に高い感度が達成可能である。例えばGenTHREADER（Jones 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881）等のプログラムは、種々のソース由来の情報（PSI-BLAST、二次構造予測（secondary structure prediction）、構造アラインメントプロファイル（structural alignment profiles）、及び溶媒和ポテンシャル（solvation potentials））をニューラルネットワークに入力し、クエリー配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313:903-919 の方法を用いれば、未知の構造の配列を SCOP データベースに存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。これらのアラインメントを用いれば、ポリペプチドのホモロジーを生成することができる。斯かるモデルの精度を検証するには、その目的で開発された種々のツールを用いればよい。
【０１０４】
構造既知のタンパク質の場合、構造的アラインメントの検索及び生成に、幾つかのツールやリソースが利用できる。例えばタンパク質の SCOP スーパーファミリーは構造的にアラインメントがなされており、斯かるアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２以上のタンパク質構造のアラインメントには、種々のアルゴリズム、例えばディスタンス・アラインメント・マトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96）又はコンビナトリアル・エクステンション（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747）が使用できる。更には、これらのアルゴリズムを実行し、着目する構造について構造データベースにクエリーすれば、可能性のある構造的ホモログを発見することも可能である（例えば Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567）。
【０１０５】
本発明のアルブミン変異体を記述する場合、参照の便宜のため、以下に記載の命名法を採用する。アミノ酸の略称としては、周知のＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の略称を用いる。用語「点突然変異」（point mutation）及び／又は「改変」（alteration）とは、欠失、挿入及び置換を包含する。
【０１０６】
置換  アミノ酸置換については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、置換アミノ酸。従って、位置２２６におけるスレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重突然変異（又は改変）については、例えば加算記号（「＋」）により区切って表記する。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）に置換し、位置４１１のセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）に置換する突然変異を表す。図においてはまた、「／」、例えば「E492T/N503D」が使用され、これは「＋」と相互交換可能に用いるものとして見なされるべきである。
【０１０７】
欠失  アミノ酸欠失については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置*。従って、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５*」又は「Ｇ１９５*」と表す。多重欠失については、例えば加算記号（「＋」）により区切る。例えば「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」又は「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」等。
【０１０８】
挿入  上記に開示されるように、挿入は、１つの位置を占有するアミノ酸（「命名された（又は、原）アミノ酸」、「X」）のN−側（「上流」、「X−１」）又はC−側（「下流」、「X＋１」）に存在することができる。
【０１０９】
原アミノ酸(「Ｘ」)のC−側（「下流」、「X＋１」）へのアミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、原アミノ酸、挿入されるアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」又は「G195GK」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、原アミノ酸、挿入されるアミノ酸＃１、挿入されるアミノ酸＃２；等］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの後にリシン及びアラニンを挿入する場合、「Gly195GlyLysAla」又は「G195GKA」と表す。
【０１１０】
そのような場合において、挿入されるアミノ酸残基の番号付けは、挿入されるアミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対し、小文字を付加することにより行う。すなわち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
【０１１１】
【表３】
2014515614.tif 000004
【０１１２】
原アミノ酸(Ｘ)のＮ−側（「上流」、「X−１」）へのアミノ酸挿入については、以下の命名法を使用する：原アミノ酸、位置、挿入されるアミノ酸、原アミノ酸。従って、位置１９５のグリシン(G)の前へのリシン(K)の挿入は、「Gly195LysGly」又は「G195KG」と表す。アミノ酸の多重挿入は、［原アミノ酸、位置、挿入されるアミノ酸＃１、挿入されるアミノ酸＃２；等、原アミノ酸］と表す。例えば、位置１９５のグリシンの前にリシン(K)及びアラニン(A)を挿入する場合、「Gly195LysAlaGly」又は「G195KAG」と表す。そのような場合において、挿入されるアミノ酸残基の番号付けは、挿入されるアミノ酸残基に続いてアミノ酸残基の位置番号に対し、プライムと共に小文字を付加することにより行う。すなわち、上記例の場合、配列は以下のようになる。
【０１１３】
【表４】
2014515614.tif 000005
【０１１４】
多重改変  多重改変を含んでなる変異体は、加算記号「＋」により区切る。例えば「Arg170Tyr+Gly195Glu」 又は 「R170Y+G195E」は、それぞれ位置１７０及び１９５でトレオニン及びグルタミン酸によるアルギニン及びグリシンの置換を表す。
【０１１５】
異なる置換  異なる置換が１つの位置で導入され得る場合、異なる置換はカンマにより区切る。例えば「Arg 170Tyr, Glu」は、位置１７０でのトレオニン又はグルタミン酸によるアルギニンの置換を表す。従って、「Tyr167Gly, Ala + Arg170Gly,Ala」は、次の変異体：「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」及び 「Tyr167Ala+Arg170Ala」を示す。
【０１１６】
親アルブミン
アルブミンは、タンパク質であり、そして哺乳類における血漿中に最も豊富なタンパク質を構成し、そして多数の哺乳類からのアルブミンが、生化学法及び／又は配列情報により特徴づけられている。数個のアルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はまた、結晶学的に特徴づけられており、そしてその構造も決定されている（HSA: He XM, Carter DC (July 1992). "Atomic structure and chemistry of human serum albumin". Nature 358 (6383): 209-15; horse albumin: Ho, J.X. et al. (2001). X-ray and primary structure of horse serum albumin (Equus caballus) at 0.27-nm resolution. Eur J Biochem. 215(1):205-12）。
【０１１７】
用語「親」（parent）又は「親アルブミン」（parent albumin）とは、本発明のアルブミン変異体を製造するために、改変がヒトにより行われているアルブミンを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその対立遺伝子、又はさらに、その変異体であり得る。
【０１１８】
用語「アルブミン」（albumin）とは、ＨＳＡ又はＨＳＡドメインと同じか及び／又は非常に類似する三次元構造を有するタンパク質を意味し、そして類似する性質を有する。類似する三次元構造は例えば、親アルブミン下で言及される種からのアルブミンの構造である。アルブミンの主要性質の一部は、それが正常血漿の浸透圧効果の８５％に寄与するので、血漿量を調節するその能力、約１９日±５日の長い血漿中半減期、リガンド結合、例えば内因性分子、例えば酸性、脂溶性化合物、例えばビリルビン、脂肪酸、ヘミン及びチロキシンの結合（また、引用により本明細書に組込まれる、Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１を参照のこと）、酸性又は電気的陰性特徴を有する小有機化合物、例えば薬物、例えばワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェン及びパクリタキセルの結合（また、引用により本明細書に組込まれる、Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１を参照のこと）である。それらの性質のすべてが、アルブミンのようなタンパク質又は断片を特徴づけるために満たされる必要はない。
【０１１９】
ＨＳＡは、本発明の好ましいアルブミンであり、そして５８５個のアミノ酸残基から成るタンパク質であり、そして６７kＤａの分子量を有する。その天然形態で、それはグルコシル化されない。ＨＳＡのアミノ酸配列は、配列番号２で示される。当業者は、ＨＳＡと実質的に同じ性質を有するが、しかし配列番号２と比べて、１又は２以上のアミノ酸変化を有する天然の対立遺伝子が存在することを理解しており、そして本発明者はまた、本発明の親アルブミンとしてのそのような天然の対立遺伝子の使用を熟考している。
【０１２０】
アルブミンは一般的に、約２０日又はそれ以上の長い血漿中半減期を有し、例えばＨＳＡは１９日の血漿中半減期を有する。ＨＳＡの長い血漿中半減期はその受容体ＦｃＲｎとの相互作用を介して介在されるが、しかしながらＨＳＡの長い半減期の背後の正確な機構の理解又は知識は、本発明のためには必須ではない。
【０１２１】
本発明によれば、用語「アルブミン」（albumin）とは、ＨＳＡと同じか又は非常に類似する三次元構造を有し、そして長い血漿中半減期を有するタンパク質を意味する。本発明のアルブミンタンパク質の例として、次のものを挙げることができる：ヒト血清アルブミン（例えば、AAA98797 又は P02768-1、配列番号２（成熟）、配列番号４（未熟））、霊長類血清アルブミン、(例えば、チンパンジー血清アルブミン（例えば、予測される配列XP_517233.2 配列番号５）、ゴリラ血清アルブミン又はニホンザル血清アルブミン（例えば、NP_001182578、配列番号６)、齧歯類血清アルブミン（例えば、ハムスター血清アルブミン (例えば、A6YF56、配列番号7)、モルモット血清アルブミン（例えば、Q6WDN9-1、配列番号８）、マウス血清アルブミン（例えば、AAH49971 又は P07724-1 バージョン 3、配列番号９）及びラット血清アルブミン（例えば、AAH85359 又は P02770-1 バージョン2、配列番号１０）））、ウシ血清アルブミン（例えば、乳牛血清アルブミン P02769-1、配列番号１１）、ウマ科血清アルブミン、例えば、ウマ血清アルブミン（例えば、P35747-1、配列番号１２）又はロバ血清アルブミン（例えば、Q5XLE4-1、配列番号１３）、ウサギ血清アルブミン（例えば、P49065-1 バージョン 2、配列番号１４）、ヤギ血清アルブミン（例えば、ACF10391、配列番号１５）、ヒツジ血清アルブミン（例えば、P14639-1、配列番号１６）、イヌ血清アルブミン (例えば、P49822-1、配列番号１７）、ニワトリ血清アルブミン（例えば、P19121-1 バージョン 2、配列番号１８）及びブタ血清アルブミン（例えば、P08835-1 バージョン 2、配列番号１９）又はそのようなアルブミンに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド。親又は基準アルブミンは、人工変異体、例えば、HSA K573P （配列番号３）又はキメラアルブミン、例えば、ＨＳＡのＮ−末端及びオナガザルアルブミンのＣ−末端（配列番号２０）、ＨＳＡのＮ−末端及びマウスアルブミンのＣ−末端（配列番号２１）、ＨＳＡのＮ−末端及びウサギアルブミンのＣ−末端（配列番号２２）、ＨＳＡのＮ−末端及びヒツジアルブミンのＣ−末端（配列番号２３）であり得る。
【０１２２】
本出願の範囲にも包含されるアルブミンの他の例としては、オボアルブミン（例えば、P01012.pro: ニワトリオボアルブミン; O73860.pro: 七面鳥オボアルブミン）を挙げることができる。配列番号２で開示されるようなＨＳＡ又はその天然に存在する対立遺伝子は、本発明の好ましいアルブミンである。
【０１２３】
親アルブミン、その断片、又は本発明のアルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は一般的に、配列番号２で示されるＨＳＡの配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。配列同一性は、配列番号２の完全長に対して、又は断片、例えば配列番号２の１又は２以上のドメインから成るか又はそれを含んでなる分子、例えばドメインIIIから成るか又はそれを含んでなる分子（例えば、配列番号２７）、ドメインII及びドメインIIIから成るか又はそれらを含んでなる分子（例えば、配列番号２５）、ドメインＩ及びドメインIIIから成るか又はそれらを含んでなる分子（例えば、配列番号２４）、ドメインIIIの２つコピーから成るか又はそれらを含んでなる分子（例えば、配列番号２６）、又はドメインIIIの３つのコピーから成るか又はそれらを含んでなる分子（例えば配列番号２８）又はドメインＩ及びドメインIIIの２つのコピーから成るか又はそれらを含んでなる分子（例えば、配列番号２９）に対してであり得る。
【０１２４】
親は好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるか又はそれらから成る。親は、配列番号２の成熟ポリペプチドを含んでなるか又はそれらから成る。
【０１２５】
別の実施形態によれば、親は、配列番号２の成熟ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１２６】
親アルブミンは、（i）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ii）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（iii）（i）又は（ii）の完全長相補鎖と、非常に低いストリンジェンシー条件、低いストリンジェンシー条件、中位のストリンジェンシー条件、中位〜高いストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件、又は非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。
【０１２７】
配列番号１のポリヌクレオチド又はその下位配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はその断片は、周知の方法に従って、異なった属又は種の菌株からの親をコードするＤＮＡを同定し及びクローン化するための核酸プローブを設計するために使用され得る。特に、そのようなプローブは、興味ある属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用され得、標準のサザンブロット法に従って、そこにおけるその対応する遺伝子を同定し、そして単離することができる。そのようなプローブは完全配列よりも相当に短くてもよいが、少なくとも１４、例えば少なくとも２５、少なくとも３５又は少なくとも７０ヌクレオチド長であるべきである。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、例えば少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも６００ヌクレオチド長、少なくとも７００ヌクレオチド長、少なくとも８００ヌクレオチド長、又は少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡ及びＲＮＡの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、その対応する遺伝子を検出するために標識され得る（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン又はアビジンによる）。そのようなプローブは本発明により包含される。
【０１２８】
そのような他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上記に記載されるプローブとハイブリダイズし、そして親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。そのような生物からのゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡが、ニトロセルロース又は他の適切な担体材料に移行され、そしてその上に固定され得る。配列番号１又はその下位配列と相同であるクローン又はＤＮＡを同定するためには、担体材料がサザンブロットに使用される。
【０１２９】
本発明のためには、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが配列番号１で示されるポリヌクレオチド、その相補鎖又はその下位配列に対応する標識ヌクレオチドプローブに対して、低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルム、又は周知の任意の他の検出手段を用いて検出され得る。
【０１３０】
核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、すなわち配列番号１のヌクレオチド１〜１７８５を含んでなるか又はそれらから成ることができる。核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなるか、又はそれらから成る。
【０１３１】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブに関して、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準のサザンブロット方法に従っての、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断され、そして変性されたサケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミド（非常に低い及び低いストリンジェンシーに関して）、３５％ホルムアミド（中位及び中−高ストリンジェンシーに関して）、又は５０％ホルムアミド（高い及び非常に高いストリンジェンシーに関して）における４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。担体材料は最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、５０℃（低いストリンジェンシー）、５５℃（中位の高いストリンジェンシー）、６０℃（中くらいに高いストリンジェンシー）、６５℃（高いストリンジェンシー）及び７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、それぞれ１５分間、３度洗浄される。
【０１３２】
約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチド長ドである短いプローブに関しては、ストリンジェンシー条件は、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５のＮＰ−４０、１×デンハート液（Denhardt’s solution）、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ及び０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ（ｍｌ当たり）における、Bolton and McCarthy（1962、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390）に従って計算されたＴmよりも約５℃〜約１０℃低い温度での、最適には１２〜２４時間の標準のサザンブロット方法に従ってのプレハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーションとして定義される。担体材料は、６×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより１５分間、１度、及び６×ＳＳＣを用いて、計算されたＴmよりも約５℃〜約１０℃低い温度でそれぞれ１５分間、２度、洗浄される。
【０１３３】
親は、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、アルブミンとして機能することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされ得る。一実施形態によれば、親は、配列番号１を含んでなるか又はそれから成るポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３４】
アルブミン部分
本発明のアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子又は組成物のアルブミン部分は、「アルブミン部分」（albumin moiety）又は「アルブミン成分」（albumin camponent）として言及され得る。本発明のポリペプチドは、アルブミン部分を含んでなるか又はそれから成る。
【０１３５】
本発明の特定の側面が、下記に論じられる：
【０１３６】
変異体の調製
本発明の第一の側面は、好ましくは基準アルブミンと比べて改変されているＦｃＲｎ（好ましくは、ｓｈＦｃＲｎ）への結合親和性又は半減期（例えば、血漿中の）を有する、アルブミン変異体、その断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドであるポリペプチドの調製方法に関し、ここで前記方法は、
ａ．アルブミン又はその断片、又はアルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分において、ＦｃＲｎとアルブミンとの結合又は半減期（例えば、血漿における）に重要である１又は２以上（数個）のアミノ酸残基位置を同定する工程；
ｂ．前記アルブミン又はその断片、又はアルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分をコードする核酸を供給する工程；
ｃ．ｂ．において供給される核酸を修飾する工程、その結果、ａ．において同定される位置に位置する１又は２以上（数個）のアミノ酸残基に、改変、例えば欠失、置換又は挿入、最も好ましくは置換が存在し；
ｄ．適切な宿主細胞に修飾された核酸を発現させる工程、そして
ｅ．前記アルブミン変異体、その断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを回収する工程、
を含んでなる。
【０１３７】
アルブミン又はその断片、又は融合ポリペプチドのアルブミン部分において、ＦｃＲｎとアルブミンとの結合又は半減期（例えば、血漿における）に重要である１又は２以上（数個）のアミノ酸残基位置の同定は、いくつかの手段で、例えば次の手段（但しそれらだけには限定されない）：ランダム突然変異誘発、続く生成された変異体の分析及び非変異親又は基準分子との比較、及び構造上の考慮事項に基づいての同定、続いて、同定される改変を有する変異体の生成及び非変異親分子との比較で実施され得る。
【０１３８】
基準アルブミンは本明細書に開示されており、特に好ましくは、基準アルブミンはＨＳＡ（配列番号２）である。
【０１３９】
天然のＨＳＡに比べて、改変されたＦｃＲｎに対する結合又は半減期（例えば、血漿における）を有する変異体ＨＳＡを調製するために変更される１又は２以上（数個）のアミノ酸残基位置の同定のための好ましい方法は、次の工程：
ｉ）アルブミン、例えばＨＳＡの三次元構造（モデル）を供給する工程；
ii）ＦｃＲｎの三次元構造（モデル）を供給する工程；
iii）（ｉ）のアルブミン構造体及び（ii）のＦｃＲｎ構造体を用いて、それらが一緒に結合する場合、アルブミン及びＦｃＲｎにより形成される複合体の構造体をモデリングし、従って「ドッキングモデル」（docking model）を生成する工程；
iv）ＦｃＲｎと相互作用するか、又はＦｃＲｎとの相互作用に関与する、アルブミンにおけるアミノ酸残基を同定するために前記ドッキングモデルを用いる工程
を含んで成り；工程iii）及びｉv）は当業者によく知られている技法を用いて実施され得る。
【０１４０】
斯かるドッキングモデルは、任意の適切な方法又はソフトウェアを用いて調製され得る。適切なソフトウェアとしては、高速フーリエ型のソフトウェア（fast fourier based software）、例えばZDOCK高速フーリエ変換型のタンパク質ドッキングプログラム（ZDOCK Fast Fourier Transform based protein docking program）（Chen R et al (2003). Proteins 52(1):80-87）を挙げることができる。ＦｃＲｎ及びアルブミンについてのドッキングモデルの構築に関しては、好ましくは、アルブミンのモデルは、ドメインIII及びドメインI又はドメインIIの少なくとも１つ、好ましくはすべてのドメインを含んでなる。好ましくは、アルブミンはＨＳＡ（例えば、配列番号２）である。好ましくは、アルブミンのモデルは、ｐＨ７〜８で溶解する。アルブミンのモデルは、２．５ÅでＨＳＡの結晶構造であり得るか、又はその結晶構造に基づかれ得る（ＰＤＢコード  １ｂｍ０）(Sugio S et al (1999) Protein Eng 12(6):439-446）。好ましくは、ＦｃＲｎはヒトＦｃＲｎであり、最も好ましくは、可溶性ヒトFｃＲｎである。好ましくは、ＦｃＲｎのモデルは、６．４よりも低いｐＨで、例えばｐＨ６．３、６．２、６．１、６、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０に等しいか又はそれよりも低いｐＨで溶解する。より好ましくは、ｐＨは、３．７〜４．７、４．０〜４．４及び最も好ましくは４．２である。低ｐＨの利点は、それが、アルブミン及びＦｃＲｎが結合する天然の生理学的環境をより代表するからである。ＦｃＲｎのモデルは、ｐＨ８．２でのＦｃＲｎの２．７Åの解像度構造であり得るか、又はその構造に基づかれ得る（ＰＤＢコード１ｅｘｕ）。
【０１４１】
第二ＦｃＲｎモデルは、第一ＦｃＲｎモデルに加えて使用され得、そして好ましくは、その第二モデルは、第一モデルとは異なったｐＨ、例えば高いｐＨ、例えば６．４、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８又は９．０に等しいか、又はそれよりも高いｐＨで溶解する。追加のＦｃＲｎモデルを使用する利点は、ＦｃＲｎとアルブミン部分との間の結合に対するｐＨの影響が研究され得ることである。従って、異なったｐＨで溶解するＦｃＲｎを用いて作製されたドッキングモデルが比較され、１つのｐＨにおいてはアルブミン−ＦｃＲｎ結合に関与するが、他のｐＨにおいては関与しない、すなわちｐＨ依存性結合に関与するアミノ酸残基が同定され得る。
【０１４２】
ＦｃＲｎと相互作用するか、又はＦｃＲｎとの相互作用に関与する、アルブミンのアミノ酸残基の同定は、手動的に及び／又は視覚的に行われ得る。
【０１４３】
任意には、調製方法及び／又は同定方法は、第二アルブミン（例えば、非ヒトアルブミン）の一次構造及び／又は三次構造と、（ｉ）のアルブミンの一次構造及び／又は三次構造とを比較し、（iv）において同定されるそれらのアミノ酸と同等のアミノ酸を同定することを含んでなることができる。一次構造比較は、第二アルブミンと（ｉ）のアルブミンとの間の配列アラインメントにより行われ得る。二次構造比較は、公的に入手できるソフトウェア、例えばPDBeFold（ＳＳＭとしても知られている）、すなわち３Ｄでのタンパク質構造を比較するための双方向サービス（例えば、http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm/で入手でき、そして出版物、例えばKrissinel et al (2004) Acta Cryst. D60, 2256---2268 and Krissinel (2007) Bioinformatics 23, 717-723に記載される、バージョン2.36又はそれ以降）を用いて行われ得る。
【０１４４】
任意には、調製方法及び／又は同定方法は、（iv）又は（v）で同定される位置でのアルブミンの変異体を調製し、そして基準、例えば（i）のアルブミンと比べて、調製された変異体がＦｃＲｎへの改変された結合性を有することを確認することを含んでなる。結合親和性分析は、表面プラズモン共鳴（例えば、本明細書に開示されるような）及び／又はＥＬＩＳＡ（例えば、引用により本明細書に組込まれる、国際公開第2011／051489号（国際出願／欧州特許第10／066572号）に開示されるような）により実施され得、そして／又は調製された変異体が、基準、（i）のアルブミンと比べて、例えば血漿における改変された半減期を有することを確認することができる。しかしながら、当業者は、他の方法を用いて、ＨＳＡよりもＦｃＲｎに対して異なった結合性質を有するポリペプチドを同定することができ、そして前記方法が、ＦｃＲｎに対する異なった結合性質を有するポリペプチドがいかにして同定されたかに依存しないことを理解するであろう。
【０１４５】
本発明の第一の側面によれば、好ましくは、ＦｃＲｎへのアルブミンの結合性又は半減期（例えば、血漿における）に影響を及ぼすアルブミンのアミノ酸残基は、１又は２以上（数個）の次の領域に位置する：(a) 505、531、524、472、108、190、197及び 425; (b) 492〜538; (c) 186〜201; (d) 457〜472; (e) 414〜426; (f) 104〜120; (g) 75〜91; (h) 144〜150; (i) 30〜41、(j) 550 〜585 及び(k) 276、410及び414の１又は２以上（数個）のA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及び/又は位置497〜585における停止コドン；ここで、好ましくは、ポリペプチドが（i）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 及び 584から成る群、及び／又は（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は（iii）位置82、114、119、464、201、505、510、513、533、535、536、550、560、563、565、573、574から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択された位置で１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択された位置（位置は、配列番号２を基準とするが、しかしながら、本発明はまた、配列番号２以外の配列における同等の位置も包含する)で挿入されるか又は置換される停止コドンも含んでなる。
【０１４６】
さらに、停止コドンの導入は、位置497〜585、すなわち位置497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585（又は、配列番号２を基準として同等の位置）の何れかで行われ得る。導入は、挿入又は置換により行われ得る。そのような停止コドンの導入は、本明細書に記載される改変に加えてであるか又はそれの代わりであり得る。
【０１４７】
従って、本発明の第一の側面は、下記位置で改変（例えば、置換、欠失又は挿入）を含んでなる、親又は基準アルブミンと比べて、ＦｃＲｎへの改変された結合親和性を有する、アルブミン変異体又はその断片を提供する：
（ａ）配列番号２の次の位置：30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197に対応する１又は２以上（数個）の位置；及び／又は
（ｂ）配列番号２の次の位置：189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199に対応する１又は２以上（数個）の位置：及び／又は
（ｃ）配列番号２の次の位置：414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、498、502、507、508、509、511、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、566、568、569、570、571、572、576、583に対応する１又は２以上（数個）の位置；
ここで、変異体又はその断片の改変された結合親和性は、基準、例えば改変を含まない親アルブミン又はその断片の結合親和性に対してである。
【０１４８】
（上記の）（ａ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第一ドメイン（例えば、ドメインＩ）においてであり得る。（上記の）（ｂ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第二ドメイン（例えば、ドメインII）においてであり得る。（上記の）（ｃ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第三ドメイン（例えば、ドメインIII）においてであり得る。
【０１４９】
アルブミン変異体又はその断片はさらに、配列番号２の次の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置で改変（例えば、置換又は挿入）を含んでなる：
（ｉ）417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582、584の何れか、
（ii）34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の何れか（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は
（iii）63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584の何れか（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）。
【０１５０】
好ましくは、親アルブミン及び／又はアルブミン変異体は、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド：
（ｂ）（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（ii）（ｉ）の完全長相補鎖と、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び／又は
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片、
を含んでなるか又はそれらから成る。
【０１５１】
本発明の第一の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。当業者は、本発明の何れかの側面が本発明の別の側面、及び／又は１又は２以上（数個）の本発明の側面の選択、及び／又は本明細書においてなされる他の開示と共に組合され得ることを理解している。
【０１５２】
本発明の第二の側面は、アルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、又はアルブミン変異体若しくはその断片のアソシエートを得るための方法に関し、ここで前記方法は、
（ａ）親アルブミン又はその断片、又は親アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド中に、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410、及び/又は 411に対応する１又は２以上（数個）の位置で改変を導入し、ここで好ましくは、ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群、及び／又は（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択された位置で、１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなり；そして
（ｂ）アルブミン変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを回収することを含んでなる。
【０１５３】
従って、位置は、１又は２以上（数個）の30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585から選択され得る。
【０１５４】
さらに、停止コドンの導入は、位置497〜585の何れかで、すなわち位置497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585の何れか（又は、配列番号２を基準として、相当の位置）で行われ得る。導入は、挿入又は置換により行われ得る。そのような停止コドンの挿入は、本明細書に記載される改変に加えてであるか又はそれの代わりであり得る。
【０１５５】
従って、本発明の第二の側面は、アルブミン変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、又はアルブミン変異体若しくはその断片のアソシエートを得るための方法に関し、ここで前記方法は、
（ａ）親アルブミン又はその断片、又は親アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド中に、下記位置で改変（例えば、置換、欠失又は挿入）を含んでなる、親又は基準アルブミンに比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性を有する、アルブミン変異体又はその断片の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置で、改変を導入することを含んでなり：
（ａ）配列番号２の次の位置：30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197の何れかに対応する１又は２以上（数個）の位置；及び／又は
（ｂ）配列番号２の次の位置：189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199の何れかに対応する１又は２以上（数個）の位置；及び／又は
（ｃ）配列番号２の次の位置：414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、498、502、507、508、509、511、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、566、568、569、570、571、572、576、583に対応する１又は２以上（数個）の位置、
ここで前記変異体又はその断片の改変された結合親和性は、基準、例えば改変を含まない親アルブミン又はその断片に対してである。
【０１５６】
（上記の）（ａ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第１ドメイン（例えば、ドメインＩ）に存在する。（上記の）（ｂ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第２ドメイン（例えば、ドメインII）に存在できる。（上記の）（ｃ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミンＨＳＡの第３ドメイン（例えば、ドメインIII）に存在できる。
【０１５７】
アルブミン変異体又はその断片はさらに、配列番号２の次の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置で、改変（例えば、置換又は挿入）を含んでなり：
（ｉ）417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582、584の何れか、
（ii）34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の何れか（特に、１又は２以上（数個）の位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は１又は２以上（数個）の位置91、200、461、514、558、559、567でのＣＹｓの欠失、又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は
（iii）63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584の何れか（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）。
【０１５８】
好ましくは、親アルブミン及び／又はアルブミン変異体は、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（ii）（ｉ）の完全長相補鎖と、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び／又は
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片、
を含んでなるか又はそれらから成る。
【０１５９】
変異体は、周知の任意の突然変異誘発法、例えば部位特異的突然変異誘発法、合成遺伝子構築法、半合成遺伝子構築法、ランダム突然変異誘発法、シャフリング（shuffling）法等を用いて、当業者により調製され得る。
【０１６０】
部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutanogenesis）は、親をコードするポリヌクレオチド内の１又は２以上（数個の）所定の部位に１又は数個の突然変異(改変)を形成する手法である。
【０１６１】
部位特異的突然変異誘発法は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、インビトロで実施可能である。また、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の部位を制限酵素で切断し、次いで当該ポリヌクレオチド中に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドを連結する工程を含むカセット突然変異誘発法によっても、部位特異的突然変異誘発法をインビトロで実施することができる。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを同一の制限酵素で消化することにより、プラスミド及び挿入物の付着末端を互いに連結することが可能となる。例えばScherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4949-4955；及び Barton et al., 1990, Nucleic Acids Research 18:7349-4966 等を参照のこと。
【０１６２】
部位特異的突然変異誘発法は、当業界で周知の任意の手法により、インビボでも実施可能である。例えば、米国特許出願第2004/0171154号；Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19:773-776； Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及び Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43:15-16 等を参照のこと。
【０１６３】
本発明では任意の部位特異的突然変異誘発法を使用できる。変異体の調製に使用し得るキットは多々市販されている。
【０１６４】
合成遺伝子構築法（synthetic gene construction）は、所望のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド分子を設計し、これをインビトロで合成するものである。遺伝子合成は数々の手法を用いて実施可能である。例としては、Tian, et. al.が報告する多重マイクロチップ法（multiplex microchip-based technology）（Tian, et. al., Nature 432:1050-1054）や、類似の手法が挙げられる。これらの手法は、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で、オリゴヌクレオチドを合成、構築するものである。
【０１６５】
単一又は多重のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を形成・検証するには、公知の突然変異誘発法、組換え、及び／又はシャッフリングを用いた後、適切なスクリーニング法、例えば Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156；国際公開第95/17413号；又は国際公開第95/22625号等に開示の手法を用いればよい。他の使用可能な方法としては、エラープローンＰＣＲ（error-prone PCR）、ファージ・ディスプレイ（phage display）（例えば Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837；米国特許第5,223,409号；国際公開第92/06204号等）及び領域特異的突然変異誘発法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145；Ner et al., 1988, DNA 7:127）等が挙げられる。
【０１６６】
突然変異誘発法／シャッフリング法をハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせることにより、宿主細胞により発現されるクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出することが可能となる(Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896)。当業界の標準法により、活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、即時に配列決定することができる。これらの手法により、着目するポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となる。
【０１６７】
半合成遺伝子構築法（semi-synthetic gene construction）は、合成遺伝子構築法、及び／又は部位特異的突然変異誘発法、及び／又はランダム突然変異誘発法、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることにより実施される。半合成構築法の代表的なプロセスは、合成ポリヌクレオチド断片をＰＣＲ法と組み合わせたものである。すなわち、例えば遺伝子の所定の領域を新規合成し、他の領域は部位特異的突然変異プライマー等を用いて増幅し、更に別の領域についてはエラープローンＰＣＲや非エラープローンＰＣＲ（non-error-prone PCR）増幅等を用いることができる。その後、ポリヌクレオチド下位配列をシャッフルしてもよい。
【０１６８】
本発明の第二の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下に提供される。
【０１６９】
変異体
本発明の第三の側面は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410 及び/又は411に対応する１又は２以上（数個）の位置で改変を含んでなる、親アルブミンのアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを提供し；ここで好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群、及び／又は（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）のＣｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。
【０１７０】
さらに、停止コドンは、位置497〜585の何れかで挿入され得る。導入は、挿入又は置換により行われ得る。そのような停止コドンの導入は、本明細書に記載される突然変異に加えてであるか又はその代わりであり得る。
【０１７１】
従って、本発明の第三の側面は、下記位置で改変（例えば、置換、欠失又は挿入）を含んでなる、親アルブミンのアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２の次の位置：30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197の何れかに対応する１又は２以上（数個）の位置；及び／又は
（ｂ）配列番号２の次の位置：189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199の何れか；に対応する１又は２以上（数個）の位置及び／又は
（ｃ）配列番号２の次の位置：414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、498、502、507、508、509、511、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、566、568、569、570、571、572、576、583に対応する１又は２以上（数個）の位置。
【０１７２】
（上記の）（ａ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第１ドメイン（例えば、ドメインＩ）に存在する。（上記の）（ｂ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミン、例えばＨＳＡの第２ドメイン（例えば、ドメインII）に存在できる。（上記の）（ｃ）に記載される位置は、ポリペプチド、例えばアルブミンＨＳＡの第３ドメイン（例えば、ドメインIII）に存在できる。
【０１７３】
アルブミン変異体又はその断片はさらに、配列番号２の次の位置に対応する１又は２以上（数個）の位置で、改変（例えば、置換又は挿入）を含んでなり：
（ｉ）417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582、584の何れか、
（ii）34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の何れか（特に、１又は２以上（数個）の位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567での１又は２以上（数個）のＣＹｓの欠失、又はＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は
（iii）63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584の何れか（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）。
【０１７４】
好ましくは、親アルブミン及び／又はアルブミン変異体は、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は（ii）（ｉ）の完全長相補鎖と、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び／又は
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片、
を含んでなるか又はそれらから成る。
【０１７５】
本発明のアルブミン変異体、その断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドのアルブミン部分は一般的に、配列番号２で示されるＨＳＡの配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１７６】
一側面によれば、本発明の変異体における改変の数は、１〜２０、例えば１〜１０及び１〜５、例えば、1、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の改変である。
【０１７７】
アルブミン変異体、その断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、その対応する親又は基準アルブミン、その断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性及び／又は改変された血漿中半減期を有する。
【０１７８】
特に好ましい実施形態によれば、親又は基準アルブミンは、ＨＳＡであり、そしてアルブミン変異体、その断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、ＨＳＡ、その対応する断片、又はＨＳＡ若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドと比べて、ＦｃＲｎに対する改変された結合親和性及び／又は改変された血漿中半減期を有する。
【０１７９】
アルブミンのその受容体への結合と血漿中半減期との間の相関関係は、天然に存在するＨＳＡ Ｄ４９４Ｎの対立遺伝子に基づいて本発明者により現実化された。本発明者は、この対立遺伝子を以前に分析しており、そしてそれが、ＦｃＲｎへのＷＴ ＨＳＡの親和性よりもその受容体ＦｃＲｎへの低い親和性を有することを見出した。
【０１８０】
さらに、ヒトＦｃＲｎにより置換された天然のマウスＦｃＲｎを有するトランスジェニックマウスが正常マウスよりも高い血清アルブミンレベルを有することが開示されている（J Exp Med. (2003) 197(3):315-22）。本発明者は、ヒトＦｃＲｎがマウスＦｃＲｎよりもマウス血清アルブミンに対して高い結合性を有し、そして従って、トランスジェニックマウスにおける血清アルブミンに観察される上昇性が血清アルブミンとその受容体との間の高い親和性に対応することをこれまで発見しており、これがＦｃＲｎに対するアルブミン結合と血漿中半減期との間の相関関係を確認している。さらに、ＦｃＲｎに対して少々結合するか又はまったく結合しないアルブミンンの変異体は、マウスモデルにおいて短縮された半減期を有することが示されている（Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med.; 50 (Supplement 2):1582）。
【０１８１】
ＦｃＲｎに対して変異体の親和性が親又は基準アルブミンよりも高いか又は低いかどうかを決定するための１つの手段は、下記に記載されるような表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）を使用することである。当業者は、他の方法が、FｃＲｎへのアルブミン変異体の親和性がＦｃＲｎへの親又は基準アルブミンの親和性よりも高いか又は低いかどうかを決定することに、例えば結合定数ＫＤの決定及び比較のために有用であることを理解している。従って、本発明によれば、天然ＨＳＡについてのＫＤよりも低いＫＤを有するアルブミン変異体は、ＨＳＡよりも長い血漿中半減期を有するとして見なされ、そして天然のＨＳＡについてのＫＤよりも高いＫＤを有するアルブミン変異体は、ＨＳＡよりも短い血漿中半減期を有するとして見なされる。
【０１８２】
アルブミン変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、１又は２以上（数個）の改変、例えば配列番号２の成熟ポリペプチドの30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜 472、492〜538、550〜585、276、410 及び/又は411から成る群から選択されたＨＳＡにおける位置に対応する１又は２以上（数個）の位置での置換、欠失又は挿入を含んでなり、そして／又は停止コドンの導入は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置497〜585の何れかで行われ得、ここで好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 及び584から成る群、及び／又は（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。導入は、挿入又は置換により行われ得る。そのような停止コドンの導入は、本明細書に記載される改変に加えてであるか又はそれに変わるものであり得る。置換は、天然のアルブミン配列におけるアミノ酸が、残る１９個の天然に存在するアミノ酸間で選択された異なったアミノ酸により置換される任意の置換であり得る。
【０１８３】
一側面によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410 及び/又は411に対応する１又は２以上（数個）の位置で改変を含んでなり、ここで好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。
【０１８４】
別の側面によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、及び/又は 276、410、411の何れかに対応する複数（数個）の位置で改変を含んでなり、ここで、好ましくは、変異体、その断片又は融合物は、位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 及び584で１又は２以上（数個）の置換を含んでなる場合、前記変異体、その断片又は融合物はまた、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置で１又は２以上（数個）の置換、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。また、好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。
【０１８５】
別の側面によれば、変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410、及び/又は411の何れかに対応する３個の位置で改変を含んでなり、ここで、好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び 584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。
【０１８６】
言及される各位置に関しての可能性ある挿入及び置換が下記表２に提供される。
【０１８７】
【表５】
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【０１８８】
【表６】
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【０１８９】
【表７】
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【０１９０】
【表８】
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【０１９１】
【表９】
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【０１９２】
【表１０】
2014515614.tif 000011
【０１９３】
上記表２においては、ＨＳＡ（配列番号２）を基準として行われる。しかしながら、本発明はまた、ＨＳＡについて言及されるそれらの位置に同等の位置で、本明細書に言及される改変を有する、非ヒトアルブミンの変異体及び／又はヒト又は非ヒトアルブミンの断片も包含する。当業者は、配列番号２との配列アラインメントにより同等の位置を同定することができる。
【０１９４】
変異体はさらに、34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585（番号は配列番号２を基準とする）から成る群から選択される１又は２以上（数個）の位置での改変、特にそれらの位置の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓへの置換又はＣｙｓの挿入を含んでなる。例えば、そのチオール基を介して接合のために利用できるＣｙｓを導入するために、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又はそのチオール基を介しての接合のために利用できるＣｙｓを生成するために存在するジスルフィド結合を破壊できる、位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓへの置換が存在する。それらの位置の１又は２以上（数個）の位置が単独で、又はより好ましくは、本明細書に開示される別の位置と組み合わせて改変され得る。
【０１９５】
変異体はさらに、63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584（番号は配列番号２を基準とする）から成る群から選択される１又は２以上（数個）の位置で存在する改変を含んでなる。それらの位置の１又は２以上（数個）の位置は、単独で、又はより好ましくは、本明細書に開示される別の位置と組み合わせて改変され得る。好ましくは、特に１又は２以上（数個）の次の置換：D63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、H464N、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584Eから選択される改変が存在する場合、それは本明細書に開示される別の位置での改変と組み合わされる。
【０１９６】
誤解を避けるために、１〜８８個のアミノ酸のＣ−末端切断を含むアルブミンの変異体は、本発明のすべての側面に包含され、そしてまた、それら自体、本発明の側面を形成する。従って、変異体は、配列番号２の位置1〜497〜１〜584に相当する配列を有するアルブミンを含んでなるか又はそれらから成ることができる。そのような変異体は、位置497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585の何れかの位置で停止コドンを導入することにより調製され得る。従って、アルブミンは、それが由来する親アルブミン又はその断片に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88個切断され得る。好ましくは、その切断は、８８個よりも長くないアミノ酸であり、従って、好ましくは、アルブミンは、それが由来する親アルブミン又はその断片に対して、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88個のアミノ酸により切断され得る。あまり好ましくはないが、変異体は、位置406、407、408、409、410、411又は585で停止コドンを含んでなる。変異体は、本明細書に記載されるような１又は２以上（数個）の他の改変を含んでも又は含まなくてもよい。切断は、「断片」（fragments）として呼ばれ得る。
【０１９７】
好ましい切断は、位置500〜584、例えば573又は574〜584に存在する。従って、そのような変異体は、親アルブミン、例えばＨＳＡ（配列番号２）に対して切断されるが、しかしアルブミンの断片、例えばＤII＋ＤIII、ＤIII又はＤＩ＋ＤIIIに対して同等に適用される。当業者は、そのような断片内の切断の位置を、ＨＳＡと前記断片とのアラインメントにより決定することができる。従って、変異体は、親アルブミン又はその断片のＮ−末端側の少なくとも８５〜９９．５％、例えばＮ−末端側の８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．５％を含んでなるか又はそれらから成ることができる。好ましい切断は、親アルブミン又はその断片のＮ−末端側の８５、９６、９７又は９８％を含んでなる。従って、断片、融合物、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート及び組成物の調製方法は、そのような切断された変異体を包含する。好ましくは、切断された変異体は、位置５７３（又はその同等物）を保持する。さらに好ましくは、５７３でのアミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒである。
【０１９８】
一実施形態によれば、本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、配列番号２における30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択されるＨＳＡにおける位置に対応する位置で１つの置換を含む。
【０１９９】
一実施形態によれば、本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、配列番号２における30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、502、507、508、509、511、513、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、568、569、570、571、572、576、583から成る群から選択されるＨＳＡにおける位置に対応する位置で１つの置換を含む。
【０２００】
本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、ＨＳＡにおける他の位置に対応する１又は２以上（個数）の位置で、追加の置換、挿入又は欠失を含んでなる。
【０２０１】
別の実施形態によれば、本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドの30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410及び/又は411から成る群から選択される、ＨＳＡにおける位置に対応する位置で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の置換を含み、ここで好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、ＨＳＡにおける他の位置に対応する位置で追加の置換、挿入又は欠失を含んでなる。
【０２０２】
更なる実施形態によれば、本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、親若しくは基準アルブミン又はその断片、又は前記親若しくは基準アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの血漿中半減期よりも長い血漿中半減期、及び／又はＦｃＲｎに対する強い結合親和性を有する。
【０２０３】
更なる実施形態によれば、本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、親若しくは基準アルブミン又はその断片、又は前記親若しくは基準アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの血漿中半減期よりも短い血漿中半減期、及び／又はＦｃＲｎに対する弱い結合親和性を有する。
【０２０４】
配列番号２における位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585に対応する１又は２以上（数個）の位置での１又は２以上（数個）の置換に加えて、本発明のアルブミン変異体又はその断片、又は前記アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、分子の他の位置に追加の置換、欠失又は挿入を含むことができる。そのような追加の置換、欠失又は挿入は、分子の他の性質、例えば改変されたグリコシル化；表面の反応基、例えばチオール基の導入；カルバモイル化部位の除去／生成；等（但し、それらだけには制限されない）を改変するために有用であり得る。
【０２０５】
表面上に反応性残基を供給するために改変され得、そして本発明に都合良く適用され得る残基は、国際公報第2010/092135号（引用により本明細書に組込まれる）に開示されている。特に好ましい残基は、配列番号２における位置に対応する位置を包含する。
【０２０６】
表面上に反応性チオール基を供給するために、配列番号２に又は他のアルブミンにおける対応する位置に行われ得る改変の例として、配列番号２における次の改変：L585C、D1C、A2C、D562C、A364C、A504C、E505C、T79C、E86C、D129C、D549C、A581C、D121C、E82C、S270C、A578C、L595LC、D1DC、A2AC、D562DC、A364AC、A504AC、E505EC、T79TC、E86EC、D129DC、D549DC、A581AC、A581AC、D121DC、E82EC、S270SC、A579AC、C360*、C316*、C75*、C168*、C558*、C361*、C91*、C124*、C169* 及びC567*に対応する改変を挙げることができる。他方では、システイン残基は、アルブミンンのＮ又はＣ末端に付加され得る。用語「反応性チオール」（reactive thiol）とは、システインとジスルフィド結合していないＣｙｓ、及び／又はパートナー、例えば接合パートナーへの結合のために立体的に利用できるＣｙｓによる供給されるチオール基を意味し、そして／或いは含む。
【０２０７】
ポリヌクレオチド
本発明の第四の側面は、本発明の変異体の何れかをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。斯かるポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドであり得る。斯かるポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、プラスミド）及び／又は宿主細胞に含まれ得る。
【０２０８】
核酸コンストラクト
本発明は、調節配列に適合する条件下、適切な宿主細胞中においてコーディング配列の発現を指示する１又は２以上（数個）の調節配列と作動式に連結する本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトにも関する。
【０２０９】
ポリヌクレオチドは変異体の発現を提供するために種々の手法で操作され得る。発現ベクターの種類によっては、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドを操作することが好適又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を用いてポリヌクレオチドを修飾する手法は、当業者には周知である。
【０２１０】
調節配列としては、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞に認識される、適切なプロモーター配列が挙げられる。プロモーター配列は、変異体の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示すものであれば、如何なる核酸配列であってもよく、突然変異型、切断型、ハイブリッド型等のプロモーターであってもよい。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする何れの遺伝子から取得されたものでもよい。
【０２１１】
酵母宿主の場合、有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＡ（ＰＲＡ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＢ（ＰＲＢ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）翻訳伸長因子（ＴＥＦ２）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼに関する遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488 に記載されている。
【０２１２】
当業者はコメ及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫへの使用のための有用なプロモーターを知っている。コメ宿主の場合、有用なプロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）及びαＡｍｙ３から得られる。
【０２１３】
哺乳類宿主細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫの場合、有用なプロモーターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）及びＣＡＧハイブリッドプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサー要素及びニワトリβ−アクチンプロモーターのハイブリッド）、サル空腔ウィルス４０（ＳＶ４０）から得られる。
【０２１４】
調節配列としては、転写を停止するために宿主細胞に認識される、適切な転写ターミネーター配列も挙げられる。ターミネーター配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のターミネーターを使用することができる。
【０２１５】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）チトロームＣ（ＣＹＣ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのための遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。当業者は、コメ及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫへの使用のための有用なターミネーターを知っている。例えば、コメ宿主の場合、好ましいターミネーターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）及びカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）から得られる。
【０２１６】
調節配列としては、適切なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たすｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能し得る任意のリーダー配列を使用することができる。
【０２１７】
酵母宿主細胞に適したリーダー配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子由来のリーダー配列が挙げられる。
【０２１８】
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、変異体−コーディング配列の３’末端に作動式に連結され、転写時に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。宿主細胞において機能し得る任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０２１９】
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990 に記載されている。
【０２２０】
調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異体のＮ末端に連結され、変異体を細胞の分泌経路に誘導するためのシグナルペプチドをコードするシグナルペプチドコーディング配列である。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端が、翻訳リーディングフレーム内において、変異体をコードするコーディング領域のセグメントと当初から連結された、固有のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。他方では、コーディング配列の５’末端が、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング領域を有していてもよい。外来のシグナルペプチドコーディングド領域が必要となるのは、例えば、コーディング配列が生来のシグナルペプチドコーディング領域を有さない場合である。他方では、変異体の分泌を促進するために、外来のシグナルペプチドコーディング領域により、生来のシグナルペプチドコーディング領域をそのまま置換してもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導し得るものであれば、任意のシグナルペプチドコーディング領域を使用できる。
【０２２１】
酵母宿主細胞において有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。当業者は、コメ及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫへの使用のための有用なシグナルペプチドを知っている。
【０２２２】
変異体のＮ末端にシグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方が存在する場合には、プロペプチド領域は変異体のＮ末端の隣に配置され、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のＮ末端の隣に配置される。
【０２２３】
本発明の第四の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２２４】
生成方法
本発明の第五の側面は、本発明の変異体の調製方法に関する。本発明の変異体は、当業者によく知られている技法を用いて調製され得る。１つの便利な手段は、親アルブミン又はその断片、又は前記アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸をクローニングし、前記核酸を、配列番号２の成熟ポリペプチドの位置30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201、414〜426、457〜472、492〜538、550〜585、276、410 及び/又は 411に対応する１又は２以上（数個）の位置で所望する置換を導入するために修飾し、ここで好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置でのＣｙｓの欠失若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなり、適切な遺伝子コンストラクトを調製し、ここで前記修飾された核酸が適切な調節遺伝子要素、例えばプロモーター、ターミネーター、活性化部位、リボソーム結合部位、等と作動式に連結して配置されており、前記遺伝子コンストラクトを適切な宿主生物中に導入し、変異体の発現を導く条件下で、前記形質転換された宿主生物を培養し、そして変異体を回収することによってである。すべてのそれらの技法は周知であり、そして本発明の特定の変異体を調製するための適切な方法を企画することは平均的実施者の技能の範囲内である。
【０２２５】
本発明の変異体ポリペプチドはまた、形質転換された宿主生物の培養の間、増殖培地中に変異体ポリペプチドを分泌するようシグナル配列に連結され得る。回収及び精製を容易にするために、変異体ポリペプチドを増殖培地中に分泌せしめることが一般的に好都合である。
【０２２６】
変異体ポリペプチドを調製するための技法はまた、国際公開第2009019314号（参照により包含される）に開示されており、そしてそれらの技法はまた、本発明に適用され得る。
【０２２７】
アルブミンは、広範囲の宿主、例えば真菌類 (アスペルギラス（Aspergillus） (国際公開第06066595号)、クルイベロミセス（Kluyveromyces） (Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975)、ピチア（Pichia） (Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262)及びサッカロミセス（ Saccharomyces） (Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46))、細菌（bacteria）(Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 105, 279-285)を包含するが、但しそれらだけには限定されない)、動物 (Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276) 及び植物(ジャガイモ及びタバコ (Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 and Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346)及びコメ、例えばオリザ・サチバ（Oryza sativa）を包含するが、但しそれらだけには限定されない) 及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ及びＨＥＫにおいて組換えタンパク質として、好結果を伴って発現されてきた。本発明の変異体ポリペプチドは好ましくは、適切な宿主細胞において組換え的に生成される。原理的には、適切な量でポリペプチドを生成できる何れかの宿主細胞が使用され得、そして本発明の適切な宿主細胞を選択することは、平均的実施者の技能の範囲内である。好ましい宿主生物は、好ましくはサッカロミセス属（Saccharomycacae）、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から選択された酵母である。
【０２２８】
本発明の変異体ポリペプチドは、既知の分離技法、例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、及び親和性分離技法等の組み合わせを用いて、増殖培地から回収され、そして精製され得る。そのような既知の分離工程の特定の組み合わせを用いて、本発明の変異体を精製することは、平均的実施者の技術の範囲内である。本発明の変異体に適用され得る精製技法の例としては、国際公開第00/44772号に言及されている。
【０２２９】
本発明の変異体ポリペプチドは、治療的に有益な化合物（例えば、予防的に有益な化合物、例えばワクチン）を、その必要な動物又はヒト個体に供給するために使用され得る。そのような治療的に有益な化合物として、標識及び診断への使用のために容易に検出できる化合物、例えば種々のイメージング技法；医薬的活性化合物、例えば薬物、又は特異的に結合する成分、例えば抗体を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。本発明の変異体は、複数（数個）の異なった治療的に有益な化合物、例えば抗体及び薬物に連結され得、これにより、組合された分子に所望する標的物への特異的結合能力を付与し、そして、それにより、その特定標的物に高濃度の前記結合された薬物を提供する。
【０２３０】
本発明の第五の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２３１】
融合ポリペプチド
本発明の第六の側面は、融合ポリペプチドに関する。従って、本発明の変異体又はその断片は、非アルブミンポリペプチド融合パートナーと融合され得る。その融合パートナーは原則的に任意のポリペプチドであり得るが、しかし一般的に、好ましくは融合パートナーは、治療、予防（ワクチンを包含する）、診断、イメージング又は他の有益な性質を有するポリペプチドである。そのような性質は、「医薬的に有益な性質」（pharmaceutically beneficial properties）として言及され得る。アルブミン又はその断片を含んでなる融合ポリペプチドは周知である。アルブミン又はその断片及び融合パートナーポリペプチドを含んでなるそのような融合ポリペプチドは、単独での融合されていない融合パートナーポリペプチドと比べて、より長い血漿中半減期を有することが見出されている。本発明によれば、本発明の融合ポリペプチドの血漿中半減期を、従来技術のその対応する融合ポリペプチドに比べて、改変することが可能である。「改変する」（Alter）とは、血漿中半減期を延長すること又は血漿中半減期を短縮することの両者を包含する。血漿中半減期を高めることが好ましい。本発明は、所望する期間への半減期の調整を可能にする。
【０２３２】
１又は２以上（数個）の治療、予防（ワクチンを包含する）、診断、イメージング又は他の有益な性質のポリペプチドが、アルブミンのＮ末端、Ｃ末端に融合され、アルブミン構造体のループ中に挿入され、又はその何れかの組み合わせを伴う。それは、融合ポリペプチドの種々の成分を分離するリンカー配列を含んでも又は含まなくてもよい。
【０２３３】
アルブミン又はその断片の融合に関する技法は周知であり、そして当業者は、そのような技法がまた、本発明にも適用され得ることを理解しているのであろう。国際公開2001/70271A号（特に、第９頁及び／又は表１）、国際公開第2003／59934A号（特に、表１）、国際公開第03／060071号（特に表１）及び国際公開第01／079480号（特に、表１）（それらの全体が引用によりそれぞれ本明細書に組込まれる）はまた、アルブミン又はその断片に融合され得る、治療、予防（ワクチンを包含する）、診断、イメージング又は他の有益なポリペプチドの例も含み、そしてそれらの例はまた、本発明にも適用される。本発明の第六の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下でに提供される。
【０２３４】
コンジュゲート
本発明の第七の側面は、コンジュゲート（コンジュゲーション）に関する。従って、本発明のアルブミン又はその断片の変異体は、周知の技法を用いて、第二分子（「コンジュゲーションパートナー」（conjugation partner））にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションパートナーは、治療用部分、予防用部分（ワクチンを包含する）、診断用部分、イメージング用部分又は他の有益な部分であり得る。前記コンジュゲーションパートナーは、ポリペプチド又は非ポリペプチド化学物質であり得る。コンジュゲーションパートナーは、ポリペプチド、化学物質（例えば、化学的合成された薬物）又は核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）であり得る。
【０２３５】
前記第二分子は、診断又はイメージング用部分を含んでなることができ、そしてこの実施形態によれば、コンジュゲートは、診断ツールとして、例えばイメージングにおいて有用であり；又は第二分子は治療又は予防（例えば、ワクチン）化学物であり得、そしてこの実施形態によれば、コンジュゲートは治療又は予防（例えば、ワクチン接種）目的のために使用され得、ここでコンジュゲートは治療又は予防化合物の治療又は予防的性質、及びコンジュゲートのアルブミン部分により提供される所望する血漿中半減期を有するであろう。アルブミン及び治療分子のコンジュゲートは周知であり、そしてそのようなコンジュゲートが、治療分子を有さない非コンジュゲートと比べて、長い血漿中半減期を有することが確認されている。本発明によれば、本発明のコンジュゲートのＦｃＲｎへの結合親和性及び／又は血漿中半減期を、従来技術のその対応するコンジュゲートに比べて、改変することが可能である。「改変する」（Alter）とは、血漿中半減期を延長し、そして血漿中半減期を短縮し、そして／或いはＦｃＲｎの結合親和性を高め、そしてＦｃＲｎへの結合親和性を低めることを包含する。血漿中半減期を延長しそして／或いはＦｃＲｎの結合親和性を高めることが好ましい。コンジュゲートは、よく知られている化学的手段を用いて、ＨＳＡの表面上に存在する遊離チオール基（成熟ＨＳＡのアミノ酸残基３４）を介して便利には連結され得る。
【０２３６】
１つの特に好ましい側面によれば、アルブミン変異体又はその断片は、有益な治療又は予防（ワクチンを包含する）化合物にコンジュゲートされ、そしてそのコンジュゲートがその必要な患者における病状の治療のために使用され、前記病状は特定の選択された治療化合物に応答する。アルブミン変異体又はその断片へのそのような治療的に有用な化合物をコンジュゲートするための技法は周知である。国際公開第2009／019314号（その全体を引用により本明細書に組込む）は、ポリペプチドに治療化合物をコンジュゲートするのに適切な技法の例を開示しており、この技法はまた、本発明にも適用され得る。さらに、国際公開第2009／019314号は、置換されたトランスフェリンにコンジュゲートされ得る化合物及び部分の例を開示しており、そしてそれらの例はまた、本発明に適用され得る。国際公開第2009／019314号の技法は、引用により本明細書に組込まれる。
【０２３７】
ＨＳＡは、その天然形態で、コンジュゲーションのために便利に使用され得る１つの遊離チオール基（Ｃｙｓ３４）を含む。この側面内の特定の実施形態によれば、アルブミン変異体又はその断片はさらに、表面上に追加の遊離チオール基を生成するために提供される追加の修飾を含んでなる。これは、アルブミン変異体又はその断片のペイロードが高められ、その結果、治療（例えば、予防）化合物の１超の分子がアルブミン変異体又はその断片の各分子にコンジュゲートされ得、又は複数（数個）の異なった治療化合物がアルブミン変異体又はその断片の各分子、例えば標的とする性質を有する化合物、例えば腫瘍に対して特異的な抗体にコンジュゲートされ得；そして細胞毒性薬物が変異体又はその断片にコンジュゲートされ、それにより、腫瘍に対する高い特異性を有するな薬物を作り出す利点を有する。表面上にさらなる遊離チオール基を供給するために修飾され得る特定残基の教示は、引用により組込まれる同時係属特許出願の国際公開第2010／092135号に見出され得る。
【０２３８】
コンジュゲーションパートナーは、他方では、融合ポリペプチド（本明細書に記載される）にコンジュゲートされ得、アルブミンに融合される融合パートナー、及び同じアルブミン又は融合パートナーにコンジュゲートされるコンジュゲーションパートナーを含んでなる分子をもたらすことができる。
【０２３９】
本発明の第七の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２４０】
アソシエート
本発明の第八の側面は、アソシエートに関する。従って、アルブミンの変異体又はその断片はさらに、[アソシエート]（associates）の形態で使用され得る。これに関しては、用語「アソシエート」（associate）とは、アルブミンの変異体又はその断片、及び非共有結合により前記アルブミン変異体若しくはその断片に結合されるか又はアソシエートされる別の化合物を含んでなる化合物を意味する。そのようなアソシエートの例としては、アルブミン変異体及び疎水性相互作用によりアルブミンにアソシエートされる脂質から成るアソシエートが言及され得る。そのようなアソシエートは周知であり、そしてそれらはよく知られている技法を用いて調製され得る。本発明の好ましいアソシエートの例としては、アルブミン変異体及びタキサン、タキサノール又はタキサノール誘導体（例えば、パクリタキセル）を含んでなるアソシエートが言及され得る。アソシエートのさらなる例としては、治療、予防（ワクチンを包含する）、診断、イメージング用部分又は有益な部分を挙げることができる。
【０２４１】
本発明のアルブミンアソシエートの半減期は、「他の化合物」（other compound）のみの半減期よりも長くも又は短くもあり得る。本発明のアルブミンアソシエートの半減期は、基準アルブミン、例えば生来のＨＳＡ（本発明のアルブミン変異体又は誘導体の代わりの）及び「他の化合物」を含んでなるか又はそれらから成る類似／同等のアルブミンアソシエートの半減期よりも長くも又は短くもあり得る。同様に、本発明のアルブミンアソシエートのＦｃＲｎへの結合親和性は、基準アルブミン、例えば生来のＨＳＡ（本発明のアルブミン変異体又は誘導体の代わりの）及び「他の化合物」を含んでなるか又はそれらから成る類似／同等のアルブミンアソシエートのＦｃＲｎへの結合親和性よりも強くあるか又は弱くあり得る。アソシエートの調製方法は、周知であり、例えばリポ化合物とＨＳＡとの構築（アソシエーションによる）は、Hussain, R. and Siligardi, G. (2006) International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 12, NO: 3, pp. 311-315に記載されている。本発明の第八の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２４２】
他の使用
本発明の第九の側面は、アルブミン変異体、その断片、融合物又はコンジュゲート、又はそのナノ粒子又はアソシエートの使用に関する。本発明のアルブミン変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドは、ＦｃＲｎへのそれらの結合親和性及び／又は血漿中半減期が、親又は基準アルブミン又はその断片、又は親又は基準アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドに比べて、改変される利点を有する。これは、アルブミン変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなるコンジュゲート、又は本発明のアルブミン変異体又はその断片を含んでなるアソシエートのＦｃＲｎへの結合親和性及び／又は血漿中半減期が特定の治療目的に応じて選択され得る点で利点を有する。
【０２４３】
例えば、動物又はヒトにおけるイメージング目的のために使用されるコンジュゲート、アソシエート又は融合ポリペプチドに関しては、前記イメージング用部分は非常に短い半減期を有し、そしてＨＳＡを含んでなるコンジュゲート又は融合ポリペプチドは、イメージングのために必要とされるよりもはるかに長い血漿中半減期を有する場合、イメージング目的のために十分に長いが、しかしそれが適用される特定の患者の身体からクリアランスされるのに十分に短い血漿中半減期を有する融合ポリペプチドのコンジュゲートを供給するために、親又は基準アルブミン又はその断片よりも短い血漿中半減期を有する、本発明のアルブミン変異体又はその断片を使用することが好都合であろう。
【０２４４】
治療の必要な患者における特定の病状を治療するか又は軽減するのに有効的な治療化合物を含んでなる、コンジュゲート、アソシエート又は融合ポリペプチドについての別の例の場合、本発明のアソシエート又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドの投与が、親若しくは基準アルブミン又はそのアソシエート、又はその断片が使用される状況に比べて、低い副作用を伴って、低頻度で又は低用量で必要とされる有益性を有する、長い血漿中半減期を有するアソシエート又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドを供給するために、親若しくは基準アルブミン又はその断片よりも長い血漿中半減期を有するアルブミン変異体又はその断片を使用することが好都合であろう。例えば、本発明は、個人における増殖性疾患の治療方法を提供し、ここで前記方法は、タキサン、タキソール又はタキソール誘導体（例えば、パクリタキセル）を含んでなる、本発明のアソシエートの有効量を個人に投与することを含んでなる。
【０２４５】
さらなる側面によれば、本発明は、本発明によるアルブミン変異体、そのアソシエート又はその断片、アルブミン変異体断片又はそのアソシエート、又は本発明のアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる組成物に関する。組成物は好ましくは、医薬組成物である。組成物は、当業界において知られている、例えば医薬分野内の認識されるハンドブックに開示される技法を用いて調製され得る。アルブミン、その変異体、断片、融合物、コンジュゲート又はアソシエートは基準分子のＦｃＲｎへの結合親和性及び／又は血漿中半減期よりも調節される（すなわち、より強いか又は弱いか及び／又は長いか又は短い）、ＦｃＲｎへの結合融和性及び／又は血漿中半減期を有するので、組成物はまた、本明細書に記載されるようなアルブミン、その変異体、断片、融合物、コンジュゲート又はアソシエートの代わりに基準分子を含んでなる同等の組成物に比べて、調節された、ＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は調節された血漿中半減期を有する。斯かる組成物は、ワクチンでもよい。本発明のポリペプチドは、活性医薬であっても又は賦形剤であってもよい。任意には、組成物は単位投与形で提供される。
【０２４６】
好ましくは、アルブミン、その変異体、断片、融合物、コンジュゲート又はアソシエートは、基準分子、例えばアルブミン成分（例えば、アルブミン、変異体、断片、融合物、コンジュゲート又はアソシエート）が野生型アルブミン（例えば、ＨＳＡ）又は変異体、断片、融合物、コンジュゲート又はアソシエートであることを除いて、同じ組成物の血漿中半減期よりも長い血漿中半減期を有する。
【０２４７】
特定の実施形態によれば、組成物は、本発明のアルブミン変異体又はその断片、及び医薬的に有益な部分及びアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含んでなる化合物を含んでなる。本発明によれば、ＡＢＤとは、インビボで循環アルブミンに結合でき、そしてそれにより、ＡＢＤ及び前記ＡＢＤに結合される任意の化合物又は部分の循環への輸送を付与できる、部位、部分又はドメインを意味する。ＡＢＤは、周知であり、そしてアルブミンに対して非常に強く結合することが示されており、その結果、アルブミンンと結合するＡＢＤを含む化合物は、単一分子として、ある程度、挙動するであろう。本発明者は、医薬的に有益な部分及びＡＢＤを含む化合物と一緒に、本発明のアルブミン変異体又はその断片を用いることにより、前記化合物がその必要な患者に注入されるか、又は天然のアルブミン又はその断片を含む製剤として投与される状況に比べて、医薬的に有益な部分及びＡＢＤを含む化合物のＦｃＲｎへの結合親和性及び／又は血漿中半減期の改変を可能にすることを実現している。
【０２４８】
本発明のアルブミン変異体又はその断片、アルブミン変異体又はその断片を含んでなるコンジュゲート、アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、又はアルブミン変異体又はその断片を含んでなるアソシエートはまた、当業界においてよく知られている技法を用いて、ナノ−又はマイクロ粒子中にも組込まれ得る。本発明のアルブミン変異体又はその断片に適応され得るナノ−又はマイクロ粒子を調製するための好ましい方法は、国際公開第2004/071536号又は国際公開第2008/007146号、又はOner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, pages 1387 to 1388)（それらは引用により本明細書に組込まれる）に開示している。
【０２４９】
本発明の第九の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２５０】
組成物
本発明の第十の側面は、組成物に関する。従って、本発明はまた、医薬組成物の製造のための、アルブミンの変異体又はその断片、アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、アルブミンの変異体若しくはその断片を含んでなるコンジュゲート、又はアルブミンの変異体若しくはその断片を含んでなるアソシエートの使用に関し、ここで前記アルブミンの変異体又はその断片、アルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、アルブミンの変異体若しくはその断片を含んでなるコンジュゲート、又はアルブミンの変異体若しくはその断片を含んでなるアソシエートは、ＨＳＡ又はその対応する断片、ＨＳＡ若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド又はＨＳＡを含むコンジュゲートと比べて、ＦｃＲｎへの改変された結合親和性及び／又は改変された血漿中半減期を有する。
【０２５１】
これに関連して、ＨＳＡのその対応する断片とは、比較されるアルブミン変異体の断片とアラインし、そして同じアミノ酸番号を有するＨＳＡの断片を意味することを意図する。同様に、ＨＳＡ、又はＨＳＡを含むコンジュゲートを含んでなるその対応する融合ポリペプチドは、比較される、アルブミン変異体を含むコンジュゲートの融合ポリペプチドと同じサイズ及びアミノ酸配列を有する分子を意味する。本発明の第十の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２５２】
ナノ粒子
本発明の第十一の側面は、本明細書に開示されるように、変異体、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子、組成物又はポリヌクレオチドを含んでなるナノ粒子に関する。
【０２５３】
ナノ粒子又はマイクロ粒子中に分子を導入するための技法は、周知である。本発明に従ってアルブミン、その変異体、断片、融合物、コンジュゲート又はアソシエートに適用され得るナノ粒子又はマイクロ粒子を調製するための好ましい方法は、国際公開第2004/071536号又は国際公開第2008/007146号又はOner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, pages 1387 to 1388)（それらは引用により本明細書に組込まれる）に開示されている。好ましくは、ナノ粒子の平均直径は、５〜１０００ｎｍ、より好ましくは５、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は９９９〜５、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｎｍである。２００ｎｍ未満の直径及びより特に、１３０ｎｍ未満の直径を有するマイクロ粒子の利点は、０．２μｍのフィルターを通しての濾過による殺菌に適していることである。好ましくは、マイクロ粒子の平均直径は、１０００ｎｍ（１μｍ（ミクロン））〜１００μｍ（ミクロン）、より好ましくは１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００〜１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｍ（ミクロン）である。
【０２５４】
本発明の第十一の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２５５】
本発明の第十二の側面は、治療、予防又は診断法への本明細書に開示されるような変異体、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子、組成物又はポリヌクレオチドの使用に関する。ある情況下で、基準分子又は組成物よりも長い血漿中半減期を有する、アルブミン、変異体、断片、融合物、コンジュゲート、又はアソシエート、又はその組成物を使用することが好都合であろう。なぜならば、これは、アルブミン、変異体、融合物、コンジュゲート又はアソシエート、又はその組成物の投与は、基準分子又は組成物が使用される状況に比べて、より低い頻度で又は減少した用量（及び従って、より少ない副作用を伴う）で必要とされるからである。変異体、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子、組成物又はポリヌクレオチドの使用に関して、アルブミン部分は、本明細書に開示されるように、１以上の改変を含むことができる。
【０２５６】
本発明の第十二の側面の更なる選択は、本発明の第十三の側面の下で提供される。
【０２５７】
本発明の第十三の側面は、分子の半減期を改変するための方法を提供し、ここで前記方法は、
（ａ）前記分子がポリペプチドである場合、本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるコンジュゲートに前記分子を融合するか又はコンジュゲートし；本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるコンジュゲートに前記分子をアソシエートし；本明細書に開示されるナノ粒子又は本明細書に開示される組成物に前記分子を組み込み；
（ｂ）前記分子がポリペプチドでない場合、本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるコンジュゲートに前記分子をコンジュゲートし；本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるコンジュゲートに前記分子をアソシエートし；本明細書に開示されるナノ粒子又は本明細書に開示される組成物に前記分子を組み込むことを含んでなる。
【０２５８】
「分子」（molecule）の例として、治療用部分、予防用部分（活性医薬成分又は賦形剤としてワクチンに使用されるそれらを包含する）、イメージング用部分及び診断用部分、例えば本明細書に記載されるそれらにおいて有用なそれらの分子を挙げることができる。
【０２５９】
本発明のすべての側面についての選択が下記に提供される。当業者は、本発明の任意の側面が、本発明の別の側面と、及び／又は本発明の側面についての１又は２以上（数個）の選択及び／又は本明細書における他の開示と共に組み合わされ得る。
【０２６０】
アルブミンの変異体又はその断片又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物は、対応するアルブミン又はその断片、アルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物よりも長いか又は短い、好ましくは長い血漿中半減期、又或いは強いか又は弱い、好ましくは弱いＦｃＲｎに対する結合性を有することができる。好ましくは、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物は、ＨＳＡ、又は対応するアルブミン又はその断片、又はアルブミン若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲートナノ粒子、アソシエート又は組成物の血漿中半減期よりも長い血漿中半減期を有する。
【０２６１】
他方では、これは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ又はその対応する断片、又はＨＳＡ若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドについてのその対応するＫＤよりも低い、ＦｃＲｎ（例えば、ｓｈＦｃＲｎ）に対するＫＤを有する、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物として表され得る。好ましくは、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物についてのＫＤは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．９未満、より好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．５未満、より好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．１未満、さらにより好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．０５未満、さらにより好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．０２未満、及び最も好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×０．０１未満（ここで×は「〜により乗じられる」（multiplied by）を意味する）である。アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物のＫＤは、ＦｃＲｎに対するＷＴアルブミン（例えば、配列番号２）のＫＤとＦｃＲｎに対するＨＳＡ K573P（配列番号３）のＫＤとの間であり得る。そのようなＫＤは、ＨＳＡとＦｃＲｎとの間の結合親和性よりも高い結合親和性を表す。より高い結合親和性は、より長い半減期、例えば血漿中半減期を示す。
【０２６２】
他方では、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物は、ＨＳＡ又はその対応する断片、又はＨＳＡ若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドの血漿中半減期よりも短い血漿中半減期を有する。
【０２６３】
これは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ又はその対応する断片、又はＨＳＡ若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチドについてのその対応するＫＤよりも高い、ＦｃＲｎに対するＫＤを有する、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物として表され得る。好ましくは、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物についてのＫＤは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×２超、より好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×５超、さらにより好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×１０超、さらにより好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×２５超、及び最も好ましくはＦｃＲｎに対するＨＳＡのＫＤ×５０超である。アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物は、ＦｃＲｎへの結合体として無価値である。
【０２６４】
アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、又はアルブミンの変異体若しくはその断片を含んでなるコンジュゲート又はナノ粒子又はアソシエート又は組成物は好ましくは、本発明のアルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、又はアルブミンの変異体若しくはその断片を含んでなるコンジュゲート又はナノ粒子又はアソシエート又は組成物である。より低い結合親和性は、より短い半減期、例えば血漿中半減期を示す。
【０２６５】
本発明の１つの利点は、利用者の必要性を満たす結合親和性又は半減期を達成するために、アルブミン、アルブミンの変異体又はその断片、又はアルブミン変異体若しくはその断片を含んでなる融合ポリペプチド、その断片、コンジュゲート、ナノ粒子、アソシエート又は組成物の半減期の調整を可能にすることである。
【０２６６】
ＫＤを決定し、そして／或いは比較する場合、１又は２以上（及び好ましくは、すべて）の次のパラメーターが使用され得る：
計器：Biacore 3000計器（GE Healthcare）
流動細胞：ＣＭ５センサーチップ
ＦｃＲｎ：ヒトＦｃＲｎ、好ましくは可用性ヒトＦｃＲｎ、任意には、標識、例えばＧＳＴにカップリングされる
ＦｃＲｎの量：１５００〜２５００ＲＵ
カップリング化学:アミンカップリング化学(例えば、計器の製造者により提供されるプロトコルに記載されるような)。
【０２６７】
カップリング方法：カップリングは、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）（GE Healthcare）中、１０μｇ／ｍｌのタンパク質の注入により実施され得る。リン酸緩衝液（６７ｍＭのリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％Tween20、ｐＨ６．０）を、ランニング緩衝液及び希釈緩衝液として使用できる。表面の再生は、ｐＨ７．４でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０（Biacore AB）の注入により行われ得る。
【０２６８】
試験分子（例えば、ＨＳＡ又は変異体）の注入量：１．０〜０．５ｍＭ
注入の流速：一定、例えば４０μｌ／ｍｌ
注入温度：２５℃
データ評価ソフトウェア：BIAevalution 4.1ソフトウェア（BIAcore AB）。
【０２６９】
本発明は、アルブミン、断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子又は組成物の結合親和性及び／又は半減期、例えば血漿中半減期を調節するために（高めるか又は低める）、改変され得る配列番号２の位置（及び従って、ヒト血清からのアルブミン及び断片及びアルブミン及び非ヒト血清アルブミンの相当位置）を開示する。改変は、置換、挿入又は欠失であり得る。置換が好ましい。
【０２７０】
置換又は挿入は、保存されたアミノ酸、すなわち興味ある位置でのアミノ酸に関して保存されているアミノ酸の導入を含んでも又は含まなくてもよい。次の保存されたアミノ酸の例が図３のグループ：脂肪族、芳香族、疎水性、荷電された、極性、陽性、極小又は小さなアミノ酸により示される。
【０２７１】
好ましい位置は、結合の間、ＦcＲｎと相互作用する、そして／或いはＦcＲｎとのアルブミン、断片、融合物、コンジュゲート、アソシエート、ナノ粒子又は組成物の相互作用に影響を与える位置である。
【０２７２】
好ましい位置は、(a) 492〜538; (b) 505、531、524、472、108、190、197及び425; (c) 186〜201; (d) 457〜472; (e) 414〜426; (f) 104〜120; (g) 75〜91; (h) 144〜150; (i) 30〜41、(j) 550〜585及び(k) 276、410 及び414から選択された配列番号２における位置に対応し、前記位置で１又は２以上(数個) のA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及び／又は497〜585の位置で停止コドンを有し；
ここで好ましくは、前記ポリペプチドが、（ｉ）位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582 及び 584から成る群、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。
【０２７３】
より好ましくは、前記ポリペプチドが、（ii）位置34、38、40、75、76、80、82、83、86、90、91、104、113、115、116、200、461、471、496、498、501、503、504、505、506、512、514、538、550、558、559、560、562、564、565、567、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585から成る群（特に、位置34、38、40、76、80、82、83、86、104、113、115、116、471、496、498、501、503、504、505、506、512、538、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置での生来の残基（例えば、非Ｃｙｓ残基）からＣｙｓへの置換、及び／又は位置91、200、461、514、558、559、567の１又は２以上（数個）の位置での、Ｃｙｓの欠失、若しくはＣｙｓから非Ｃｙｓ残基への置換）、及び／又は（iii）位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584から成る群（特に、１又は２以上（数個）のD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584E）から選択される１又は２以上（数個）の改変を含んでなる場合、前記ポリペプチドはまた、位置30、31、32、33、35、36、37、39、41、77、78、79、81、84、85、87、88、89、105、106、107、108、109、110、111、112、117、118、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、462、463、465、466、467、468、469、470、472、497、502、507、508、509、511、513、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、534、551、552、553、554、555、556、557、561、568、569、570、571、572、576、583から成る群から選択される位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択される位置で挿入されるか又は置換される停止コドンを含んでなる。
【０２７４】
本発明によれば、好ましくは、アルブミン変異体がD63N、E82K、E84K、D87N、L90P、K106E、R114G、E119K、V146E、H464A、C201F、D494N、E501K、E503K、E505K、H510A、I513N、D518N、K525E、E529K、V533M、H535A、K536E、I537N、D550G、D550A、V557M、K560E、D563N、E565K、E570K、K573E、K574N、K574E、K584Eから選択された改変を含んでなる場合、その改変は、本明細書に記載される１又は２以上（数個）の改変と組み合わせて提供される。位置63、82、84、87、90、106、114、119、146、464、201、494、501、503、505、510、513、518、525、529、533、535、536、537、550、550、557、560、563、565、570、573、574、574、584の１又は２以上（数個）の位置での他の改変が、本明細書に記載される１又は２以上（数個）の改変と組み合わせて提供される、或いは組み合わせて提供されない。
【０２７５】
停止コドンは、位置497〜585の何れか、すなわち位置497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、より好ましくは570〜585（又は配列番号２に対して同等の位置）の何れかで導入され得る。導入は挿入又は置換により行われ得る。そのような停止コドンの導入は、本明細書に記載される改変に加えてであるか又はその代わりであり得る。
【０２７６】
位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群から選択された位置でのアミノ酸のＮ−側（「Ｘ−１」）への１又は２以上（数個）のアミノ酸の挿入に関しては、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択された追加の改変、及び／又は497〜585から選択された位置で挿入されるか又は置換される停止コドンが存在しても又は存在しなくてもよい。
【０２７７】
逆に言えば、位置417、464、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584から成る群から選択された位置でのアミノ酸のＣ−側（「Ｘ＋１」）への１又は２以上（数個）のアミノ酸の挿入に関しては、位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択された追加の改変、及び／又は497〜585から選択された位置で挿入されるか又は置換される停止コドンが存在することが好ましい。
【０２７８】
ＦｃＲｎと相互作用するＨＳＡのアミノ酸残基は、ＦｃＲｎのアミノ酸から１０Å未満（例えば、５Å未満）離れて位置するＨＳＡの何れかのアミノ酸残基、又はＦｃＲｎのアミノ酸から１０Å未満離れて位置するアミノ酸残基との水素結合、塩橋、又は極性若しくは非極性相互作用に関与する何れかのアミノ酸残基であると思われる。好ましくは、ＨＳＡのアミノ酸残基は、ＦｃＲｎのアミノ酸から１０Å未満離れて、より好ましくはＦｃＲｎにおけるアミノ酸から６Å未満離れて、及び最も好ましくは、ＦｃＲｎのアミノ酸から３Å未満離れて位置する。
【０２７９】
好ましくは、ＦｃＲｎに対するアルブミンの結合に影響を及ぼすアルブミンのアミノ酸残基は、結合表面、例えば図９（ピンク（グレースケールで、これは最も暗いと見られる（ほとんど黒））領域）に定義される結合表面に位置する。アミノ酸は、アルブミンのドメインＩにより供給される結合表面の一部、又はドメインIIにより供給される結合表面の一部に存在することができる。
【０２８０】
従って、１又は２以上（数個）の改変は、ドメインＩ、例えば30〜41、75〜91、104〜120、144〜150、186〜201から成る群から選択された位置に存在することができる。１又は２以上の改変は、ドメインII、例えば位置276に存在することができる。１又は２以上の改変は、ドメインIII、例えば414〜426、457〜472、492〜538、550〜585から成る群から選択された位置に存在することができる。
【０２８１】
位置83、108、109、110、111、112、105 to 120、190、197、425、472、505、510、524、527、531、534が特に好ましい。
【０２８２】
好都合には、ポリペプチドは、基準又は親アルブミン、例えばＨＳＡと実質的に同じ三次構造（又は断片に関しては、前記構造の関連部分）を保持する。当業者は、すべてのタンパク質はある程度の構造的柔軟性を有するので、三次構造のある程度の変動が予測されることを念頭に置いて、用語「実質的に同じ三次元構造」を理解している。これは、親又は基準アルブミン（例えば、ＨＳＡ）が有するＦｃＲｎに対する結合親和性よりも高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有するポリペプチドに特に適用される。
【０２８３】
１又は２以上のＨｉｓ残基は、親アルブミンに対して維持されても又はされなくても良い。例えば、配列番号２を基準として、１又は２以上の次のＨｉｓ残基：3、9、39、67、105、128、146、242、247、288、338、367、440、464、510、535が維持され得る。ドメインＩにおける１又は２以上、好ましくはすべてのＨｉｓ残基が維持される（すなわち、3、9、39、67、105、128、146）。ドメインIIにおける１又は２以上、好ましくはすべてのＨｉｓ残基が維持される（すなわち、440、464、510、535）。１又は２以上、又はすべての３個のＨｉｓ  464、510、535が維持され得る。
【０２８４】
好ましくは、アルブミンの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17個のジスルフィド結合がポリペプチド中に維持される。完全長アルブミンに由来するポリペプチドに関しては、好ましくは、そのアルブミンに通常存在するすべてのジスルフィド結合が維持される。アルブミンの断片に由来するポリペプチドに関しては、好ましくは、その断片に通常存在するすべてのジスルフィド結合が維持される。好ましくは、Ｃｙｓ−３４（又は、非ヒトアルブミンにおける同等物）が維持される。
【０２８５】
改変が１又は２以上（数個）の75、90、91、200、461、514、558、559 及び567から選択された位置で存在する場合、好ましくは、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、144、145、146、147、148、149、150、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、276、410、411、414、415、416、418、419、420、421、422、423、424、425、426、457、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、472、497、498、502、507、508、509、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、567、568、569、570、571、572、576、583、585から成る群から選択された位置での１又は２以上（数個）の改変、及び／又は497〜585から選択された位置で挿入されるか又は置換された停止コドンがまた存在する。
【０２８６】
ポリペプチド、特に単一の改変を含んでなるポリペプチドに関しては、好ましくは、改変は、Ｃｙｓによる置換、Ｃｙｓの挿入、及び／又はジスルフィド結合を破壊し、そして従って、ポリペプチド内に追加のコンジュゲートできるＣｙｓを供給する残基の欠失を含まない。特に好ましくは、位置75、90、91、200、461、514、558、559 及び567の１又は２以上（数個）の位置での改変は、いずれか他のアミノ酸（A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y）へのＣｙｓからの置換ではなく、Ｃｙｓの欠失ではなく、そのＣｙｓのジスルフィド結合パートナーの置換又は欠失ではなく、従って、好ましくは、位置53、62、75、90、91、101、124、168、169、177、200、245、246、253、265、278、279、289、316、360、361、369、392、437、438、448、461、476、477、487、514、558、559、567の１又は２以上の位置でのＣｙｓは、欠失されず、置換されず、そして／又は挿入にゆだねられない。最も好ましくは、ジスルフィド結合に通常関与するＣｙｓは、欠失されず、置換されず、そして／又は挿入にゆだねられない。従って、好ましくは、改変が位置34、38、40、76、79、80、82、83、86、104、113、115、116、471、490、496、498、501、503、504、505、506、512、538、542、550、560、562、564、565、573、574、577、578、579、580、581、582、584、585の１又は２以上（数個）の位置に存在する場合、改変は、Ｃｙｓへの置換及び／又はＣｙｓの挿入ではない。
【０２８７】
本発明のすべての側面に関しては、好ましくは、位置573（又はその同等物）は、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基である。従って、複数（数個）の改変が存在する場合、好ましくは位置573（又は、その同等物）は、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ又はＴｙｒである。
【０２８８】
本発明のすべての側面に関しては、融合パートナーポリペプチド及び／又はコンジュゲートは、１又は２以上（数個）の次のものを含んでなる：4-1BB リガンド、5-ヘリックス、ヒト C-C ケモカイン、ヒト L105 ケモカイン、ヒト L105 ケモカイン 指定 huL105_3、γ−インターフェロンにより誘発されたモノカイン(MIG)、部分的 CXCR4B タンパク質、血小板塩基性タンパク質 (PBP)、α1-抗トリプシン、ACRP-30 相同体; 補体成分 C1q C、アデノイド発現型ケモカイン（Adenoid-expressed chemokine） (ADEC)、aFGF; FGF-1、AGF、AGF タンパク質、アルブミン、エトポシド、アンギオスタチン、炭疽菌ワクチン、コラプシンに対して特異的な抗体、アンチスタシン、抗-TGF βファミリー抗体、アンチトロンビン III、APM-1; ACRP-30; ファモキシン（Famoxin）、アポ−リポタンパク質種、アリールスルファターゼ B、b57 タンパク質、BCMA、β-トロンボグロブリンタンパク質 (β-TG)、bFGF; FGF2、血液凝固因子、BMP プロセッシング酵素フリン、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形成タンパク質-2、カルシトニン、カルパイン-10a、カルパイン-10b、カルパイン-10c、癌ワクチン、カルボキシペプチダーゼ、C-C ケモカイン、MCP2、CCR5 変異体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137; 4-1BB 受容体タンパク質、CD20 Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30 リガンド、CD33 イムノトキシン、CD40、CD40L、CD52 Mab、セレバスタンパク質、ケモカインエオタキシン、ケモカイン hIL-8、ケモカイン hMCP1、ケモカイン hMCP1a、ケモカイン hMCP1b、ケモカイン hMCP2、ケモカイン hMCP3、ケモカイン hSDF1b、ケモカイン MCP-4、ケモカイン TECK 及び TECK 変異体、ケモカイン様タンパク質 IL-8M1 完全長及び成熟、ケモカイン様タンパク質 IL-8M10 完全長及び成熟、ケモカイン様タンパク質 IL-8M3、ケモカイン様タンパク質 IL-8M8 完全長及び成熟、ケモカイン様タンパク質 IL-8M9 完全長及び成熟、ケモカイン様タンパク質 PF4-414 完全長及び成熟、ケモカイン様タンパク質 PF4-426 完全長及び成熟、ケモカイン様タンパク質 PF4-M2 完全長及び成熟、コレラワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、c-kit リガンド; SCF; 肥満細胞増殖因子; MGF; 線維肉腫由来の幹細胞因子、CNTF 及び その断片 (例えば CNTFAx15`(Axokine（登録商標）)、プレ及び活性型の両者での凝固因子、コラーゲン、補体 C5 Mab、結合組織活性化タンパク質-III、CTAA16.88 Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3; CXC ケモカイン受容体 3、シアノビリン-N、ダーベポエチン、命名されたエクソダス、命名された huL105_7.、DIL-40、DNアーゼ、EDAR、EGF 受容体 Mab、ENA-78、エンドスタチン、エオタキシン、上皮好中球活性化タンパク質-78、EPO 受容体; EPOR、エリスロポエチン (EPO) 及び EPO模倣体、ユートロピン、エクソダスタンパク質、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第X因子及び第XIII因子、FAS リガンド阻害タンパク質 (DcR3)、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12; 線維芽細胞増殖因子相同因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3; INT-2、FGF-4; ゲロニン、HST-1; HBGF-4、FGF-5、FGF-6; ヘパリン結合分泌形質転換因子-2、FGF-8、FGF-9; グリア活性因子、フィブリノゲン、flt-1、flt-3 リガンド、卵胞刺激ホルモンα−サブユニット、卵胞刺激ホルモンβ−サブユニット、フォリトロピン、フラクタル、断片. 筋細線維タンパク質トロポニンI、FSH、ガラクトシダーゼ、ガレクチン-4、G-CSF、GDF-1、遺伝子療法、神経膠腫由来増殖因子、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコデリン-A; プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質、GM-CSF、ゴナドトロピン、顆粒球走化性タンパク質-2 (GCP-2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン、成長関連癌遺伝子-α (GRO-α)、成長関連癌遺伝子-β(GRO-β)、成長関連癌遺伝子-γ(GRO-γ)、hAPO-4; TROY、hCG、B型肝炎表面抗原、B型肝炎ワクチン、HER2 受容体 Mab、ヒルジン、HIV gp120、HIV gp41、HIV阻害剤ペプチド、HIV阻害剤ペプチド、HIV阻害剤ペプチド、HIVプロテアーゼ阻害ペプチド、HIV-1プロテアー阻害剤、HPV ワクチン、ヒト 6CKine タンパク質、ヒト Act-2 タンパク質、ヒト脂質生成阻害因子、ヒト B 細胞刺激因子-2 受容体、ヒト β-ケモカイン H1305 (MCP-2)、ヒト C-C ケモカイン DGWCC、ヒト CC ケモカイン ELC タンパク質、ヒト CC型ケモカインインターロイキン C、ヒト CCC3 タンパク質、ヒト CCF18 ケモカイン、ヒト CC-型ケモカインタンパク質指定 SLC (二次リンパケモカイン)、ヒトケモカイン β-8短縮型、ヒトケモカイン C10、ヒトケモカイン CC-2、ヒトケモカイン CC-3、ヒトケモカイン CCR-2、ヒトケモカイン Ckβ-7、ヒトケモカイン ENA-78、ヒトケモカインエオタキシン、ヒトケモカイン GRO αヒトケモカイン GROαヒトケモカイン GROβヒトケモカイン HCC-1、ヒトケモカイン HCC-1、ヒトケモカイン I-309、ヒトケモカイン IP-10、ヒトケモカイン L105_3、ヒトケモカイン L105_7、ヒトケモカイン MIG、ヒトケモカイン MIG-β タンパク質、ヒトケモカイン MIP-1α、ヒト ケモカイン MIP1β、ヒト ケモカイン MIP-3α、ヒトケモカイン MIP-3β、ヒトケモカイン PF4、ヒトケモカインタンパク質 331D5、ヒトケモカインタンパク質 61164、ヒトケモカイン受容体 CXCR3、ヒトケモカイン SDF1α、ヒトケモカイン SDF1β、ヒトケモカイン ZSIG-35、ヒト Chr19Kine タンパク質、ヒト CKβ-9、ヒト CKβ-9、ヒト CX3C 111 アミノ酸 ケモカイン、ヒトDNAX インターロイキン-40、ヒトD Vic-1 C-C ケモカイン、ヒト EDIRF I タンパク質配列、ヒト EDIRF II タンパク質配列、ヒト好酸球CC 型ケモカインエオタキシン、ヒト好酸球-発現型ケモカイン (EEC)、ヒト速筋骨格筋トロポニンC、ヒト速筋骨格筋トロポニン I、ヒト速筋骨格筋トロポニンサブユニット C、ヒト速筋骨格筋トロポニンサブユニットI タンパク質、ヒト速筋骨格筋トロポニンサブユニット T、ヒト速筋骨格筋トロポニンT、ヒト胎児脾臓発現型ケモカイン、FSEC、ヒト GM-CSF 受容体、ヒト gro-αケモカイン、ヒト gro-β ケモカイン、ヒト gro-γケモカイン、ヒト IL-16 タンパク質、ヒト IL-1RD10 タンパク質配列、ヒト IL-1RD9、ヒト IL-5 受容体 α鎖、ヒト IL-6 受容体、ヒト IL-8 受容体タンパク質 hIL8R、ヒト IL-9 受容体タンパク質、ヒト IL-9 受容体タンパク質変異体 #3、ヒト IL-9 受容体タンパク質変異体断片、ヒト IL-9 受容体タンパク質変異体断片#3、ヒトインターロイキン 1 δ、ヒトインターロイキン 10、ヒトインターロイキン 10、ヒトインターロイキン 18、ヒトインターロイキン 18 誘導体、ヒトインターロイキン-1 β 前駆体、ヒトインターロイキン-1 β 前駆体、ヒトインターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質、ヒトインターロイキン-1 受容体拮抗剤 β、ヒトインターロイキン-1 型-3 受容体、ヒトインターロイキン-10 (前駆体)、ヒトインターロイキン-10 (前駆体)、ヒトインターロイキン-11 受��体、ヒトインターロイキン-12 40 kD サブユニット、ヒトインターロイキン-12 β-1 受容体、ヒトインターロイキン-12 β-2 受容体、ヒトインターロイキン-12 p35 タンパク質、ヒトインターロイキン-12 p40 タンパク質、ヒトインターロイキン-12 受容体、ヒトインターロイキン-13 α 受容体、ヒトインターロイキン-13 β 受容体、ヒトインターロイキン-15、クローン P1からのヒトインターロイキン-15 受容体、ヒトインターロイキン-17 受容体、ヒトインターロイキン-18 タンパク質 (IL-18)、ヒトインターロイキン-3、ヒトインターロイキン-3 受容体、ヒトインターロイキン-3 変異体、ヒトインターロイキン-4 受容体、ヒトインターロイキン-5、ヒトインターロイキン-6、ヒト インターロイキン-7、ヒトインターロイキン-7、ヒトインターロイキン-8 (IL-8)、ヒト細胞内 IL-1 受容体拮抗剤、ヒト IP-10 及び HIV-1 gp120超可変領域融合タンパク質、ヒト IP-10 及び ヒト Muc-1 コアエピトープ (VNT) 融合タンパク質、ヒト肝臓及び活性化調節型ケモカイン (LARC)、ヒト Lkn-1 完全長及び成熟タンパク質、ヒト乳腺関連ケモカイン (MACK) タンパク質完全長及び成熟、ヒト成熟ケモカイン Ckβ-7、ヒト成熟 gro-α、敗血症を処置するために用いられるヒト成熟 gro-γポリペプチド、ヒト MCP-3 及び ヒト Muc-1 コアエピトープ (VNT) 融合タンパク質、ヒト MI10 タンパク質、ヒト MI1A タンパク質、ヒト単球走化性因子 hMCP-1、ヒト単球走化性因子 hMCP-3、ヒト単球走化性プロタンパク質 (MCPP) 配列、ヒトニューロタクチンケモカイン様ドメイン、ヒト非ELR CXC ケモカイン H174、ヒト非ELR CXC ケモカイン IP10、ヒト非ELR CXC ケモカイン Mig、ヒト PAI-1 変異体、IL-16 活性を有するヒトタンパク質、IL-16 活性を有するヒトタンパク質、ヒト二次リンパケモカイン (SLC)、ヒト SISD タンパク質、ヒト STCP-1、ヒト間質細胞由来ケモカイン、SDF-1、ヒト T細胞混合リンパ球反応発現型ケモカイン (TMEC)、ヒト胸腺及び活性化調節型サイトカイン (TARC)、ヒト胸腺発現型、ヒト TNF-α、ヒト TNF-α、ヒト TNF-β (LT-α)、ヒト型 CC ケモカインエオタキシン 3 タンパク質配列、ヒト型 II インターロイキン-1 受容体、ヒト野生型インターロイキン-4 (hIL-4) タンパク質、ヒト ZCHEMO-8 タンパク質、ヒト化抗VEGF 抗体、及びその断片、ヒト化抗VEGF 抗体、及びその断片、ヒアルロニダーゼ、ICE 10 kD サブユニット、ICE 20 kD サブユニット.、ICE 22 kD サブユニット、イズロン酸-2-スルファターゼ、イズロニダーゼ、IL-1 α、IL-1 β、IL-1 阻害剤 (IL-1i)、IL-1 成熟、IL-10 受容体、IL-11、IL-11、IL-12 p40 サブユニット、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15 受容体、IL-17、IL-17 受容体、Il-17 受容体、Il-17 受容体、IL-19、IL-1i 断片、IL1-受容体拮抗剤、IL-21 (TIF)、IL-3 含有融合タンパク質、IL-3 変異体タンパク質、IL-3 変異体、IL-3 変異体、IL-4、IL-4 ムテイン、IL-4 ムテイン Y124G、IL-4 ムテイン Y124X、IL-4 ムテイン、Il-5 受容体、IL-6、Il-6 受容体、IL-7 受容体クローン、IL-8 受容体、IL-9 成熟タンパク質変異体 (Met117 バージョン)、免疫グロブリン又は免疫グロブリンに基づく分子又は何れかの断片 (例えば、Small Modular ImmunoPharmaceutical（登録商標）(“SMIP”) 又は dAb、Fab’ 断片、F(ab’)2、scAb、scFv 又は scFv 断片)（但しそれらだけには限定されない）、プラスミノーゲン、インフルエンザワクチン、インヒビンα、インヒビンβ、インスリン、インスリン様成長因子、インテグリンMab、αトリプシン間阻害剤、αトリプシン間阻害剤、インターフェロンγ誘発性タンパク質 (IP-10)、インターフェロン(例えば インターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜-種、インターフェロンγ種及び亜種)、インターフェロン (例えばインターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種)、インターロイキン 6、インターロイキン 8 (IL-8) 受容体、インターロイキン 8 受容体 B、インターロイキン-1α、インターロイキン-2 受容体関連タンパク質 p43、インターロイキン-3、インターロイキン-4 ムテイン、インターロイキン-8 (IL-8) タンパク質、インターロイキン-9、インターロイキン-9 (IL-9) 成熟タンパク質 (Thr117 バージョン)、インターロイキン(例えば IL10、IL11 及び IL2)、インターロイキン (例えば IL10、IL11 及び IL2)、日本脳炎ワクチン、カリクレイン阻害剤、ケラチン生成細胞増殖因子、クニッツドメインタンパク質 (例えば、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質及び国際公報第03/066824号に記載されるそれら、アルブミン融合体を有するか又は有さない)、クニッツドメインタンパク質 (例えばアプロチニン、アミロイド前駆体 タンパク質及び国際公報第WO 03/066824号に記載されるそれら、アルブミン融合体を有するか又は有さない)、LACI、ラクトフェリン、潜在性TGF-β 結合タンパク質 II、レプチン、肝臓発現ケモカイン-1 (LVEC-1)、肝臓発現型ケモカイン-2 (LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体化ホルモン、ライムワクチン、リンホタ
クチン、マクロファージ由来ケモカイン類似体 MDC (n+1)、マクロファージ由来ケモカイン類似体MDC-eyfy、マクロファージ由来ケモカイン類似体 MDC-yl、マクロファージ由来ケモカイン、MDC、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、マスピン;プロテアーゼ阻害剤 5、MCP-1 受容体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4 受容体、M-CSF、メラノーマ阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Met117 ヒトインターロイキン 9、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-γ、MIRAP、修飾されたRantes、モノクローナル抗体、MP52、変異体インターロイキン 6 S176R、筋原線維収縮タンパク質トロポニン I、ナトリウム利尿ペプチド、神経成長因子-β、神経成長因子-β2、ニューロピリン-1、ニューロピリン-2、ニューロタクチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-4a、ニューロトロフィン-4b、ニューロトロフィン-4c、ニューロトロフィン-4d、好中球活性化ペプチド-2 (NAP-2)、NOGO-66 受容体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、新規β-ケモカイン指定 PTEC、N-末端修飾されたケモカイン GroHEK/hSDF-1α、N-末端修飾されたケモカイン GroHEK/hSDF-1β、N-末端修飾されたケモカイン met-hSDF-1 α、N-末端修飾されたケモカイン met-hSDF-1 β、OPGL、骨形成性タンパク質-1; OP-1; BMP-7、骨形成性タンパク質-2、OX40; ACT-4、OX40L、オキシトシン(ニューロフィジン I)、副甲状腺ホルモン、パッチド（Patched）、パッチド-2、PDGF-D、百日咳トキソイド、下垂体発現型ケモカイン (PGEC)、胎盤成長因子、胎盤成長因子-2、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1; PAI-1、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-2; PAI-2、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-2; PAI-2、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子 Bv-sis、血小板由来増殖因子前駆体 A、血小板由来増殖因子前駆体 B、血小板 Mab、血小板由来内皮細胞増殖因子 (PD-ECGF)、血小板由来増殖因子A 鎖、血小板由来増殖因子B 鎖、敗血症を処置するために使用されるポリペプチド、プレプロアポリポタンパク質「ミラノ」（milano） 変異体、プレプロアポリポタンパク質 「パリス」（paris）変異体、プレトロンビン、霊長類CC ケモカイン "ILINCK"、霊長類 CXC ケモカイン "IBICK"、プロインスリン、プロラクチン、プロラクチン2、プロサプチド（prosaptide）、プロテアーゼ阻害剤ペプチド、タンパク質 C、タンパク質 S、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTES ペプチド、RANTES 受容体、組み換えインターロイキン-16、レジスチン、リクトトシン、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤、リシン、ロタウイルスワクチン、RSV Mab、サポリン、サルシン（sarcin）、分泌及び膜貫通ポリペプチド、分泌及び膜貫通ポリペプチド、血清コリンエステラーゼ、血清タンパク質 (例えば血液凝固因子)、可溶性BMP 受容体キナーゼタンパク質-3、可溶性VEGF 受容体、幹細胞阻害因子、スタフィリコッカス（Straphylococcus）ワクチン、間質由来因子-1 α、間質由来因子-1 β、サブスタンスP（タキキニン）、T1249 ペプチド、T20ペプチド、T4エンドヌクレアーゼ、TACI、Tarc、TGF-β 1、TGF-β 2、Thr117 ヒトインターロイキン 9、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体1、トロンボポエチン誘導体2、トロンボポエチン誘導体3、トロンボポエチン誘導体4、トロンボポエチン誘導体5、トロンボポエチン誘導体6、トロンボポエチン誘導体7、胸腺発現型ケモカイン (TECK)、甲状腺刺激ホルモン、ダニ抗凝���ペプチド、Tim-1 タンパク質、TNF-α 前駆体、TNF-R、TNF-RII; TNF p75 受容体; デス（Death）受容体、tPA、トランスフェリン、形質転換増殖因子 β、トロポニンペプチド、切断型単球走化性タンパク質 2 (6-76)、切断型単球走化性タンパク質 2 (6-76)、切断型RANTES タンパク質 (3-68)、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ 、ウロキナーゼ、バソプレシン(ニューロフィジン II)、VEGF R-3; flt-4、VEGF 受容体; KDR; flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E; VEGF-X、フォン・ヴィルブラント因子、野生型単球走化性タンパク質 2、野生型単球走化性タンパク質 2、ZTGF-β 9、別の抗体スキャフォールド、例えばアンチカリン、アドネクチン、フィブリノゲン断片、ナノボディ（nanobody）、例えばラクダナノボディ、インフェスチン、及び/又は国際公開第01/79271号に言及される分子の何れか(特に第9頁及び/又は表１)、国際公開第2003/59934号(特に、表１)、国際公開第03/060071号(特に、表１)又は国際公開第01/079480号（特に、表１）（その全体が引例により本明細書に組み込まれる)。
【０２８９】
さらに、コンジュゲートは、１又は２以上（数個）の化学療法薬物、例えば次のものを含んでなることができる：13-cis-レチノイン酸、2-CdA、2-クロロデオキシアデノシン、5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、5-FU、6-メルカプトプリン、6-MP、6-TG、6-チオグアニン、A、アブラキサン、アキュテイン（登録商標）、アクチノマイシン-D、アドリアマイシン（登録商標）、アドルシル（Adrucil）（登録商標）、アグリリン（Agrylin）、アラ−コート（Ala-Cort）（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ALIMTA）、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ（Alkaban-AQ）（登録商標）、アルケラン（Alkeran）（登録商標）、オールトランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン（Amifostine）、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（Anandron）（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ara-C、アラネスプ（Aranesp）（登録商標）、アレディア（Aredia）（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、アロマシン（登録商標）、アラノン（Arranon）（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ATRA、アバスチン（登録商標）、アザシチジン、BCG、BCNU、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベクザー（BEXXAR）（登録商標）、ビカルタミド、BiCNU、ブレノキサン（Blenoxane）（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（Busulfex）（登録商標）、C225、カルシウムロイコボリン、キャンパス（Campath）（登録商標）、カンプトサール（Camptosar）（登録商標）、カンプトセシン-11、カペシタビン、キャラック（Carac）（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチンウェーハ、カソデックス（Casodex）（登録商標）、CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、セルビジン（Cerubidine）（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム（Citrovorum）因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン（登録商標）、CPT-11、シクロホスファミド、Cytadren（登録商標）、シタラビン、シタラビンリポソーム、シトサール−Ｕ（Cytosar-U）（登録商標）、シトキサン（Cytoxan）（登録商標）、ダカルバジン、ダコゲン（Dacogen）、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシンポソーム、ダウノキソーム（DaunoXome）（登録商標）、デカドロン、デシタビン、デルタ−コーテフ（Delta-Cortef）（登録商標）、デルタゾン（Deltasone）（登録商標）、デニロイキンジフチトキシ（Denileukin diftitox）、デポサイト（DepoCyt）（商標）、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、デキサゾン（Dexasone）、デクスラゾキサン、DHAD、DIC、ジオデクス（Diodex）、ドセタキセル、ドキシル（Doxil）（登録商標）、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、ドロキシア（Droxia）（登録商標）、DTIC、DTIC−ドーム（DTIC-Dome）（登録商標）、デュラローン（Duralone）（登録商標）、エフデックス（Efudex）（登録商標）、エリガード（商標）、エレンス（Ellence）（商標）、エロキサチン（商標）、エルスパー（Elspar）（登録商標）、エムサイト（Emcyt）（登録商標）、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルビタックス（登録商標）、エルロチニブ、エルビニア・L-アス���ラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール、エトポホス（Etopophos）（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン（Eulexin）（登録商標）、エビスタ（Evista）（登録商標）、エキセメスタン、フェレストン（Fareston）（登録商標）、フェソロデックス（Faslodex）（登録商標）、フェマーラ（登録商標）、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラ（Fludara）（登録商標）、フルダラビン、フルオロプレクス（Fluoroplex）（登録商標）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、FUDR（登録商標）、フルベストラント、G-CSF、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（登録商標）、グリーベック（商標）、グリアデル（Gliadel）（登録商標）ウエハー、GM-CSF、ゴセレリン、顆粒-コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハロテスチン（Halotestin）（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、ヘキサドロール（Hexadrol）、ヘキサレン（Hexalen）（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、HMM、ハイカムチン（Hycamtin）（登録商標）、ハイドレア（Hydrea）（登録商標）、酢酸ヒドロコート（Hydrocort Acetate）（登録商標）、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、ヒドロコドンリン酸塩、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン（登録商標）、イダルビシン、イフェックス（Ifex）（登録商標）、IFN-α、イホスファミド、IL-11、IL-2、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα-2b (PEG コンジュゲート)、インターロイキン-2、インターロイキン-11、イントロンA（登録商標）(インターフェロンα-2b)、イレッサ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、キドロラーゼ（Kidrolase）（登録商標）、ラナコート（Lanacort）（登録商標）、ラパチニブ、L-アスパラギナーゼ、LCR、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、ロイキン（商標）、ロイプロリド、ロイロクリスチン（Leurocristine）、ロイスタチン（Leustatin）（商標）、リポソームAra-C、リキッド・プレド（Liquid Pred）（登録商標）、ロムスチン、L-PAM、L-サルコリシン、リュープロン（登録商標）、リュープロン・デポー（登録商標）、Ｍ、マチュレーン（Matulane）（登録商標）、マキシデックス（Maxidex）、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸塩、メドラロン（Medralone）（登録商標）、メドロール（Medrol）（登録商標）、メゲース（Megace）（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（Mesnex）（商標）、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（Meticorten）（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン−C、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール（M-Prednisol）（登録商標）、MTC、MTX、ムスタルゲン（Mustargen）（登録商標）、ムスチン（Mustine）、ムタマイシン（Mutamycin）（登録商標）、ミレラン（登録商標）、マイロセル（Mylocel）（登録商標）、マイロターグ（登録商標）、ナベルビン（登録商標）、ネララビン、ネオサール（Neosar）（登録商標）、ニューラスタ（Neulasta）（商標���、ニューメガ（Neumega）（登録商標）、ニューポジェン（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、ニランドロン（Nilandron）（登録商標）、ニルタミド、ニペント（Nipent）（登録商標）、ナイトロジェンマスタード、ノバルデックス（Novaldex）（登録商標）、ノバントロン（Novantrone）（登録商標）、オクトレオチド、オクトレオチド酢酸塩、オンコスパー（Oncospar）（登録商標）、オンコビン（登録商標）、オンタック（Ontak）（登録商標）、オンキサル（Onxal）（商標）、オプレルベキン（Oprevelkin）、オラプレッド（Orapred）（登録商標）、オラソン（Orasone）（登録商標）、オキサリプラチン、タキソール又はタキソール誘導体、例えば、パクリタキセル又はパクリタキセルタンパク結合、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（Panretin）（登録商標）、パラプラチン（登録商標）、ペディアプレッド（Pediapred）（登録商標）、PEGインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧイントロン（商標）、PEG-L-アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、プラチノール（登録商標）、プラチノール−ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（Prelone）（登録商標）、プロカルバジン、プロクリット（登録商標）、プロロイキン（Proleukin）（登録商標）、カルムスチンインプラントと共にプロリフェプロスパン20、ピュリネソール（Purinethol）（登録商標）、R、ラロキシフェン、レブリミド（登録商標）、リウマトレックス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、リツキシマブ、ロフェロン-A（登録商標） (インターフェロンα-2a)、ルベックス（Rubex）（登録商標）、ルビドマイシン塩酸塩、サンドスタチン（登録商標）、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチム、ソル・コーテフ（solu-cortef）（登録商標）、ソル・メドロール（solu-Medrol）（登録商標）、ソラフェニブ、スプリセル（登録商標）、STI-571、ストレプトゾシン、SU11248、スニチニブ、スーテント（登録商標）、タモキシフェン、タルセバ（登録商標）、ターグレチン（Targretin）（登録商標）、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）、テモダール（Temodar）（登録商標）、テモゾロミド、テニポシド、テスパ（TESPA）、サリドマイド、サロミド（Thalomid）（登録商標）、テラシス（TheraCys）（登録商標）、チオグアニン、チオグアニン・タブロイド（登録商標）、チオホスホアミド、チオプレックス（Thioplex）（登録商標）、チオテパ、TICE（登録商標）、トポサール（Toposar）（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トレクサール（商標）、トリセノックス（登録商標）、トスパ（TSPA）、タイケルブ（TYKERB）（登録商標）、VCR、ベクティビックス（Vectibix）（登録商標）、ベルバン（Velban）（登録商標）、ベルケイド（Velcade）（登録商標）、ベプシド（VePesid）（登録商標）、ベサノイド（Vesanoid）（登録商標）、ビアドゥール（Viadur）（商標）、ビダーザ（Vidaza）（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンカサール・Pfs（Vincasar Pfs）（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビン酒石酸塩、VLB、VM-26、ボリノスタット、VP-16、ヴューモン（Vumon）（登録商標）、ゼローダ（Xeloda��（登録商標）、ザノサール（Zanosar）（登録商標）、ゼバリン（Zevalin）（登録商標）、ザインカード（Zinecard）（登録商標）、ゾラデックス（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、ゾメタ（登録商標）; 放射性医薬品、例えば: 炭素-11、炭素-14、クロム-51、コバルト‐57、コバルト−58、エルビウム-169、フッ素−18、ガリウム−67、金-198、インジウム‐111、インジウム‐113ｍ、ヨウ素‐123、ヨウ素‐125、ヨウ素‐131、鉄−59、クリプトン-81m、窒素-13、酸素-15、リン-32、レニウム−186、ルビジウム−82、サマリウム-153、セレン-75、ストロンチウム−89、テクネチウム-99m、タリウム-201、トリチウム、キセノン-127、キセノン−133、イットリウム-90; イメージング剤、例えばガドリニウム、マグネタイト、マンガン、テクネチウム、I125、I131、P32、TI201、イオパミドール、PET-FDG。
【０２９０】
本発明のナノ粒子、アソシエート又は組成物への包含のためのさらなる融合パートナー、コンジュゲーションパートナー及び／又は分子は、次のものを包含する：末端肥大症の薬、例えばソマチュリン、ランレオチド、オクトレオチド、サンドスタチン; 抗血栓薬、例えばビバリルジン、アンギオマックス（Angiomax）、ダルテパリン、フラグミン、エノキサパリン、ロベノックス、ドロトレコギンα(例えば、活性化された)、ザイグリス、ヘパリン; 生殖補助治療化合物、例えば絨毛性性腺刺激ホルモン、オビドレル（登録商標）、フォリトロピン、α/β;酵素、例えばヒアルロニダーゼ、ヒレネクス（Hylenex）（登録商標）; 糖尿病治療薬、例えばエクセナチド、バイエッタ、グルカゴン、インスリン、リラグルチド、アルビグルチド、GLP-1アゴニスト、エキセン又はエキセン類似体; 診断に有用な化合物、例えばプロチレリン、チレルTRHチピノン（Thyrel TRH Thypinone）、セクレチン(例えば、合成ヒト)、チリョスチム（Chirhostim）（登録商標）、甲状腺刺激ホルモン(例えば、α)、チロゲン（Thyrogen）の赤血球生成薬、例えばダルベポエチンα、アラネスプ、エポエチンα、エポゲン、エプレックス（Eprex）、遺伝的欠損の治療のための薬剤、例えばペガデマーゼ、成長障害の治療薬、例えばアダジェン、メカセルミン、リンファバート（rinfabate）、嚢胞性線維症の治療薬、例えばドルナーゼα、プルモザイム（Pulmozyme）、代謝性疾患の治療薬、例えばアガルシダーゼβ、ファブラザイム、アルグルコシダーゼα、マイオザイム、ラロニダーゼ、アルドラザイム、生殖器疣贅の病巣の治療のための薬剤、例えばインターフェロα-n3、アルフェロンN、肉芽腫性疾患の治療のための薬剤、例えばインターフェロンγ-1b、アクティミューン; 成長障害の治療薬、例えばペグビソマント、ソマバート、ソマトロピン、ジェノトロピン、ニュートロピン、ヒューマトロープ、セロスティム、プロトロピン; 心不全の治療薬、例えばネシリチド、ナトレコル（Natrecor）; 血友病の治療薬、例えば凝固因子、例えば第VIII因子、ヘリクサート（Helixate ）FS、コージネイトFS、第IX因子、BeneFIX、第VIIa因子、ノボセブン、デスモプレシン、スチマート（Stimate）、DDAVP; 造血薬、例えばフィルグラスチム(G-CSF)、ニューポジェン、オプレルベキン、ネウメガ（Neumega）、ペグフィルグラスチム、ネウラスタ（Neulasta）、サルグラモスチム、ロイキン（Leukine）；Ｃ型肝炎の治療薬、例えばインターフェロンα-2a、ロフェロンA、インターフェロンα-2b、イントロンA、インターフェロンアルファコン-1、インファーゲン、ペグインターフェロンα-2a、ペガシス、ペグインターフェロンα-2b、PEG-イントロン; HIVの治療薬、例えばエンフビルチド、フゼオン; Fabs 、例えばFab (抗トロンビン)、アブシキシマブ、レオプロ;モノクローナル抗体、例えばダクリズマブ、ゼナパックス; 抗ウイルスモノクローナル抗体、例えばパリビズマブ、シナジス; 喘息の治療のためのモノクローナル抗体、例えばオマリズマブ、ゾレア;診断イメージングに用いられるモノクローナル抗体、例えばアルシツモマブ、CEA-Scan、カプロマブペンデチド、プロスタシント（ProstaScint）、サツモマブペンデチド（Satumomab Pendetide）、OncoScint CR/OV、診断イメージングで使用するためのFabs 、例えばノフェツモマブ（Nofetumomab）、ベル��マ（Verluma）; 免疫抑制モノクローナル抗体、例えばバシリキシマブ、シムレクト、ムロモナブ-CD3、オルソクローンOKT3;悪性腫瘍の治療のためのモノクローナル抗体、例えばアレムツズマブ、キャンパス、イブリツモマブ・チウキセタン、ゼバリン、リツキシマブ、リツキサン、トラスツズマブ、ハーセプチン;関節リウマチ(RA)の治療のためのモノクローナル抗体、例えばアダリムマブ、ヒュミラ、インフリキシマブ、レミケード; 放射性免疫療法としての使用のためのモノクローナル抗体、例えばトシツモマブ及びヨウ素I131、トシツモマブ、ベクザー; 黄斑変性症の治療のための薬剤、例えばペガプタニブ、マキュジェン; 悪性腫瘍の治療薬、例えばアルデスロイキン、プロロイキン、インターロイキン-2、アスパラギナーゼ、エルスパル（Elspar）、ラスブリカーゼ、エリテック（Elitek）、デニロイキンジフチトクス、オンタック（Ontak）、ペグアスパラガーゼ、オンカスパル（Oncaspar）、ゴセレリン、ロイプロリド;多発性硬化症(MS)の治療のための薬物、例えば酢酸グラチラマー(例えば、コポリマー-1)、コパキソン、インターフェロンβ-1a、アボネックス、インターフェロンβ-1a、レビフ、インターフェロンβ-1b、ベタセロン; 粘膜炎の治療薬、例えばパリフェルミン、ケピバンス（Kepivance）;失調症の治療のための薬、例えば、神経毒、ボツリヌス毒素タイプA、ボトックス、美容用ボトックス、ボツリヌス毒素タイプB、MYOBLOC;骨粗しょう症の治療のための薬剤、例えばテリパラチド、フォルテオ; 乾癬の治療のための薬剤、例えばアレファセプト、アメビベ（Amevive）; RAの治療薬、例えばアバタセプト、オレンシア、アナキンラ、キネレット、エタネルセプト、エンブレル;血栓溶解剤、例えばアルテプラーゼ、アクチバーゼ、rtPA、アニストレプラーゼ、エミナーゼ、レテプラーゼ、レタバーゼ（Retavase）、ストレプトキナーゼ、ストレプターゼ、テネクテプラーゼ、TNKase、ウロキナーゼ、アボキナーゼ（Abbokinase）、キンライチック（Kinlytic）;骨粗しょう症の治療のための薬剤、例えばカルシトニン(例えば、サケ)、ミカルシン（Miacalcin）、フォルチカル（Fortical）、皮膚潰瘍の処置のための薬剤、例えばベカプレルミン、レグラネックス（Regranex）、コラゲナーゼ、サンチル（Santyl）。
【０２９１】
そのようなポリペプチド及び化合物は、診断用部分、治療用部分、予防用部分又は有益な部分としても言及され得る。
【０２９２】
好ましくは、融合パートナー及び／又はコンジュゲーションパートナーは、アルブミン、変異体又はその断片ではない。
【０２９３】
１又は２以上（数個）の治療又は予防ポリペプチドは、アルブミンのＮ末端、Ｃ末端融合され、アルブミン構造におけるループ中に挿入されるか、又はその何れかの組み合わせを伴う。それは、融合ポリペプチド中の種々の成分を分離するリンカー配列を含んでもよく又は含まなくてもよい。
【０２９４】
アルブミン又はその断片の融合物に関する教示は、周知であり、そして当業者は、そのような技法がまた、本発明の適用され得ることを理解しているのであろう。国際公開第2001/79271Ａ号及び国際公開第2003/59934Ａ号（引用により本明細書に組み込まれる）はまた、アルブミン又はその断片に融合され得る治療及び予防ポリペプチドの例を含んでおり、そしてそれらの例はまた、本発明に適用される。
【０２９５】
本発明はさらに、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない次の実施例により記載される。
【実施例】
【０２９６】
材料及び方法
アルブミンのＣ−末端切断の生成を包含するＨＳＡ変異体及びハイブリッド分子の作製
アルブミンの変異体を、当業者に既知の技法を用いて、例えば国際公開第2001／051489号（国際特許出願／欧州特許第10／066572号）の方法を用いて、又は変異原オリゴヌクレオチドプライマーを用いてのＰＣＲにより調製した。
【０２９７】
ｓｈＦｃＲｎの作製。ｓｈＦｃＲｎ、例えばＧＳＴ−標識されたｓｈＦｃＲｎの組換え変異体の構築及び作製は、これまでに記載されている（３６）。他方では、ＨＩＳ−タグが付けられたたｓｈＦｃＲｎへテロダイマーは、国際公開第2011／124718号に記載のようにして調製された。
【０２９８】
ＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡは、ＨＳＡ変異体により被覆されたマイクロタイタープレートを用いる。ＧＳＴ−タグが付けられたｓｈＦｃＲｎ及びホースラディッシュペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗ＧＳＴ抗体を、Andersen et al (2012; Nature Communications 3:610;  DOI:10.1038/ncomms1607)に従って実施した。
【０２９９】
表面プラズモン共鳴。Biacore 300計器（GE Healthcare）を、製造業者により記載されるようにアミンカップリング化学を用いて、ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ（約１０００〜２０００ＲＵ）によりカップリングされたＧＭ５センサーチップと共に使用した。カップリングは、１０〜１２μｇ／ｍｌの各タンパク質を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（GE Healthcare）中に注入することにより実施した。すべての実験に関して、ｐＨ６．０又は７．４でのリン酸緩衝液（６７ｍＭのリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）、又はｐＨ７．４でのＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を、ランニング緩衝液及び希釈緩衝液として使用した。動的測定を、５０μｌ／分の流速で２５℃で、ＨＳＡ変異体の一連の希釈溶液（８０〜０．１μＭ）を注入することにより実施した。すべての実験の場合、データはゼロに調節され、そして対照細胞値が減算された。動的速度値を、BIAevaluation ４．１ソフトウェアを用いることにより提供される、事前に定義されたモデル（Langmuir １：１リガンドモデル及び定常状態の親和性モデル）を用いて計算した。
【０３００】
競合結合を、ｓｈＦｃＲｎ（１００ｎＭ）のみを、又は滴定量のＨＳＡ変異体（１０００〜０．０１５ｎＭ）と共に、固定されたＨＳＡ（約２０００〜２５００ＲＵ）上に注入することにより測定した。チップ上に固定されたＨＳＡへのｓｈＦｃＲｎの結合百分率（％）を、ＨＳＡ変異体と共にプレインキュベートされる場合のその応答により、ｓｈＦｃＲｎのみを注入することにより得られる総ＳＰＲ応答を除することにより計算した。
【０３０１】
円偏光二色性分光法
円偏光ニ色性（ＣＤ）スペクトルを、アンモニウムｄ−カンファー−１０−スルホネート（Icatayama Chemicals, Tokyo Japan）により校正されたJasco J-810分光偏光計（Jasco International Co., Ltd., Tokyo Japan）を用いて記録した。全ての測定を、０．１ｃｍの経路長を有するクォーツキュベット（Starna, Essex, UK）を用いて、２３℃で、ＮａＣｌの添加なしで、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ６．０）中、２ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ濃度により実施した。各サンプルを、１秒の応答時間で、２０ｎｍ／分（１ｎｍのバンド幅）で７度スキャンし、そしてその波長範囲は、１９０〜２６０ｎｍに設定された。収集されたデータの平均を取り、そしてサンプルフリーの対照のスペクトルを減じた。二次構造要素の含有率を、ニューラルネットワークプログラムＣＤＮＮバージョン２．１、及び３３−メンバー基準組に基づいて供給されるニューラルネットワーク（Bohm etl al (1992) Protein Eng 5, 191-195）を用いて、楕円率データ（ellipticity data）の平滑化（移動手段、コンボリューション幅５）の後、計算した。
【０３０２】
ドッキング方法。ＨＳＡ及びｓｈＦｃＲｎのドッキングモデルを、タンパク質ドッキングプログラムン基づくＺＤＯＣＫ高速フーリエ変換（３７）を用いて生成した。ＨＳＡ ＤIII（残基３８２〜５８２）についての座標を、２．５Å（（ＰＤＢコード１ｂｍ０）（１９）の結晶構造から取得した。ｓｈＦｃＲｎの次の２種の異なったモデルを用いた：ｐＨ８．２でのＦｃＲｎの２．７Å解像度構造（ＰＤＢコード１ｅｘｕ）及びｐＨ４．２での２．６Å解像度構造（（ＰＤＢコード３ｍ１７）９８、２３）。ｓｈＦｃＲｎの両構造モデルに存在するβ２ｍドメインは、ドッキングの間、受容体モデルに包含された。ＺＤＯＣＫプログラムを、ＦｃＲｎの２つのヒスチジンＨｉｓ−１６１及びＨｉｓ−１６６、及びＨＳＡの残基であるＨｉｓ−４６４、Ｈｉｓ−５１０及びＨｉｓ−５３５を用いてドッキングポーズの環境で実施した。すべての結晶構造図は、本明細書に記載される結晶学的データと共に、ＰｙＭＯＬ（Delano Scientific）を用いて設計された。
【０３０３】
実施例１：ドッキングモデルの構築
ＨＳＡ及びｓｈＦｃＲｎのドッキングモデルを、タンパク質ドッキングプログラムに基づくＺＤＯＣＫ高速フーリエ変換（Chen R et al (2003) Proteins 52(1):80-87）を用いて生成した。ＨＳＡ ＤIII（残基３８２〜５８２）についての座標を、２．５Å（（ＰＤＢコード１ｂｍ０）（Sugio S et al (1999) Protein Eng 12(6):439-446）の結晶構造から取得した。ｓｈＦｃＲｎの次の２種の異なったモデルを用いた：ｐＨ８．２でのＦｃＲｎの２．７Å解像度構造（ＰＤＢコード１ｅｘｕ）及びｐＨ４．２での２．６Å解像度構造（（ＰＤＢコード３ｍ１７）（West et al (2000) Biochemistry 39(32):9698-9708、及びMezo AR et al (2010) J Biol Chem 285(36):27694-27701）。ｓｈＦｃＲｎの両構造モデルに存在するβ２ｍドメインは、ドッキングの間、受容体モデルに包含された。ＺＤＯＣＫプログラムを、ＦｃＲｎの２つのヒスチジンＨｉｓ−１６１及びＨｉｓ−１６６、及びタンパク質−タンパク質界面におけるＨＳＡ中の残基であるＨｉｓ−４６４、Ｈｉｓ−５１０及びＨｉｓ−５３５を用いてドッキングポーズの環境で実施した（１９）。すべての結晶構造図は、本明細書に記載される結晶学的データと共に、ＰｙＭＯＬ（Delano Scientific））を用いて設計された。
【０３０４】
ソフトウェアは、ｐＨ４．２で、秩序立ったループを有するｓｈＦｃＲｎに対するサブドメインＤIIIのドッキングについての１つのモデル、及びループ残基５２〜５９を欠いている、ｐＨ８．２でのｓｈＦｃＲｎについての８個のモデルに戻った。それらの８モデルの中で、５モデルは、ＨＳＡドメインＤＩ及びＤIIの位置により判断されるような誤った（不適合性）ポーズを明らかに示し、そして拒否された。残る３モデルは、密接に関連し、そして同じ一般構造ポーズを有した。次に、それらの上のＦｃＲｎの低ｐＨ型の重ね合わせは、構成されたループが、ドッキングされたＨＳＡと重度の競合を行わなかったことを示した。最終的に選択されたモデル（座標は図１８及び１９に示される）は、得られる結合データと非常に良く適合する相互作用領域を示す（図８Ａ）。特に、サブドメインＤIIIａとＤIIIｂとの間の長いループ（４９０〜５１０）、及びＨＳＡのＣ−末端部分（最後のＣ−末端α−ヘリックス）が、ＨＳＡの表面上に割れ目を形成し、この中に、ｓｈＦｃＲｎにおけるｐＨ依存性で且つ柔軟なループ（残基５１〜６０）が結合できる（図８Ｂ）。ｓｈＦｃＲｎの構造は、Ｈｉｓ−１６６がＧｌｕ−５４との分子内相互作用を通してループを安定化することを示しているが（図７Ａ）、ところがそのドッキングモデルは、Ｈｉｓ−１６６がさらに、ＨＳＡのＧｌｕ−５０５への結合に従事できることを示唆している（図８Ｂ）。Ｇｌｕ−５０５はまた、受容体のＡｒｇ−１６２と相互作用することができる。Ｈｉｓ−５１０の主要な役割は、ｐＨ依存性α１−ドメインループ内のＧｌｕ−５４と相互作用することが予測される（図８Ｂ）という事実により支持される。Ｈｉｓ−５１０の突然変異（Ｈ５１０Ｑ）は、１４倍、結合性を低めた（図３Ｃ、表１）。従って、ｈＦｃＲｎ中のＨｉｓ−１６６及びＨＳＡ中のＨｉｓ−５１０は、ｈＦｃＲｎ−ＨＳＡ相互作用界面のコアにおけるイオンネットワークの調整に関与しているように見える。
【０３０５】
モデルはまた、それぞれ、ｓｈＦｃＲｎのＬｙｓ−１５０とＧｌｕ−１５１との間、及びＨＳＡのＧｌｕ−５０１とＬｙｓ−５００との間の可能性ある塩橋を予測する（図８Ｂ）。これは、それらの位置で突然変異誘発されたＨＳＡ変異体の低下した結合能力を示す結合データに沿うものである（図６Ｂ）。さらに、モデルは、ＨＳＡのＣ−末端でのαヘリックスの主要な役割を提案する。これは、ＤIIIｂの最後の１７個のアミノ酸の欠失がｓｈＦｃＲｎへの結合をほとんど排除する事実により支持される（図１４）。
【０３０６】
ＨＳＡの表面上の別の割れ目が、ＤIIIａ−ＤIIIｂ連結ループとＤIIIｂの他のα−ヘリックスの１つ（残基５２０〜５３５）との間に形成される。ここで、ｓｈＦｃＲｎのＨｉｓ−１６１は、酸性ｐＨでＧｌｕ−５３１と相互作用できる（図８Ｂ）。これは、Ｈｉｓ−１６１が突然変異誘発される場合に１０倍低下した結合親和性が見出されたこれまでの発見と一致する（Andersen JT et al (2006) The conserved histidine 166 residue of the human neonatal Fc receptor heavy chain is critical for the pH-dependent binding to albumin. Eur J Immunol 36(11):3044-3051）。ＨＳＡ−ｓｈＦｃＲｎ複合体はさらに、ｓｈＦｃＲｎのＧｌｕ−１６８とＤIIIのＬｙｓ−５２４との間に形成される塩橋により強化され得、この予測は、Ｇｌｕ−１６８の突然変異がＨＳＡへの結合を適度に低める事実により支持される（図１５）。
【０３０７】
さらに、Ｈｉｓ−５３５は、Ｐｈｅ−１５７と好意的に相互作用でき、そしてＨｉｓ−４６４は、ＨＳＡにおけるドメインＤＩとサブドメインＤIIIａとの中間に狭まれる残基９９〜１０２を包含するＦｃＲｎ内のβ−ヘアピン近くに位置している（図８Ｃ）。ここで、ｓｈＦｃＲｎ Ａｓｐ−１０１は、ＤＩにおける数個の可能性あるパートナー、例えばＡｒｇ−１９７及びＬｙｓ−１９０を有するが、しかしながら、それらは、Ａｓｐ−１０１に近づくためには、いくらかのコンホメーション変化を必ず受けなければならない。興味深いことには、β−ヘアピンは、ｐＨに依存する２種の異なったコンホメーションを有する（West et al (2000)）。これは、Ａｓｐ−１０１がｓｈＦｃＲｎの柔軟な要素に実際位置することを示唆する。ヒト主要組織適合性複合体関連Ｆｃ受容体の結晶構造及び免疫グロブリンＧ結合特性（Biochemistry 39(32):9698-9708, 及び Mezo ARet al (2010)）、ヒト新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎとの複合体におけるモノマー及びダイマーペプチド阻害剤のＸ−線結晶構造（J Biol Chem 285(36):27694-27701）は、それがｓｈＦｃＲｎにおいて柔軟要素を形成することを示唆する。
【０３０８】
ＭＨＣクラスＩ関連ＦｃＲｎは、代謝からＩｇＧ及びアルブミンを保護するために進化している（５、８、２２）。ＩｇＧに結合するＦｃＲｎは何十年もの間、非常に詳細に研究されてきたが、その最近発見された、アルブミンとの相互作用は分子レベルでは十分には理解されていない。本明細書におけるデータは、両分子がｐＨ感受性態様で相互作用し、細胞再循環をいかにして促進するかを明らかにするそれらの両分子上の数個の相互作用表面の重要性のための機械的証拠を提供する。
【０３０９】
ＤＩ＋ＤIIとは異なって、ＤIIIのみが受容体に結合でき、ｐＨにより変調できる発見は、ＤIIIが、以前の報告と一致して、ＦｃＲｎのための主要コア結合部位を内部に有していることを決定的に示す（９）。しかしながら、それらのデータはまた、結合におけるＤＩについての役割を示し、例えばドッキングモデルは、ＦｃＲｎとＨＳＡ ＤＩとの間の相互作用を示唆する。より具体的には、ＤIII単独での親和性は、完全長のＨＳＡについての親和性よりも相当に弱く、この発見は、直接的又は間接的に、ＤＩ又はＤIIからの受容体に対する結合への適度な寄与が存在できることを示唆する。それらのデータはまた、ＤＩ−ＤIIIコンストラクトが単一のＨＳＡ−ＤIIIよりもわずかに強くｈＦｃＲｎを結合したことも示す。これは、ＤIIIの構造安定化のためであり得るか、又はＤＩ−ＤIII融合におけるＤＩは完全長ＨＳＡにおけるＤＩよりも異なった位置に位置するが、ＤIIIに融合される場合、ＤＩはｈＦｃＲｎと相互作用するからであり得る。興味深いことには、そのモデルは、ＤＩとｓｈＦｃＲｎとの間にいくらかの相互作用が存在することを示唆する。
【０３１０】
ＤIIIに位置する数個のＨＳＡ多型（１６）は、受容体結合、及び従って、血液におけるそれらのレベルに影響を及ぼすことができる。Ｎ−結合グリコシル化部位を導入する単一の点突然変異を有する１つのそのような多型体ケースブルック（Casebrook）は、ヘテロ接合キャリアにおける約３５％のＷＴアルブミンに存在する（２０）。ウサギアルブミンへの突然変異の導入は、ウサギ中に注入される場合、半減期の５０％低下を有する変異体をもたらした（２４）。それらの観察に基づいて、ケースブルック（Casebrook）を模倣するＨＳＡ変異体が調製され（国際公開第2011/051489号）（国際特許出願／欧州特許第10/066572号）（引用により本明細書に組込まれる）、そしてそれがｓｈＥｃＲｎに対する親和性が２倍低下したことが見出された。これは、ＷＴアルブミンの存在下でｓｈＦｃＲｎへの結合について競合する能力の５０％の低下を示す、ヘテロ接合個体から単離されたケースブルック（Casebrook）変異体についての場合でもあった。酸性ｐＨで溶解されたｓｈＦｃＲｎの結晶構造を検証する場合、部分的に露出され、そしてプロトン化されたＨｉｓ−１６６は、それぞれ、酸性（Ｇｌｕ−５４）及び極性（Ｔｙｒ−６０）アミノ酸との結合を通して、塩基性ｐＨで無秩序になるループの安定化に従事することが見出された。ループが無秩序であることは、塩基性ｐＨでのＨｉｓ−１６６のプロトン化の損失によりおそらく説明され、次に、これがｐＨ依存性態様でループの柔軟性及びコンホメーションをおそらく制御する。
【０３１１】
ＨＳＡ ＤIIIにおける総４個のヒスチジン残基を、グルタミン残基に個々に突然変異した。３個の高度に保存されるヒスチジン残基（Ｈｉｓ−４６４、Ｈｉｓ−５１０及びＨｉｓ−５３５）は、酸性ｐＨでの結合のために重要であることが見出された。ＤIIIに存在するヒスチジン残基の重要性、及びまた、ＨＳＡへの結合についてＦｃＲｎ内のＨｉｓ−１６６の重要性に関する情報が、ＨＳＡ−ｓｈＦｃＲｎ複合体のドッキングを導くために使用された。分子データに従って、ＤIIIは、わずかに寄与するＤＩとともに、主要な相互作用界面を形成する。さらに、ＩｇＧ及びアルブミンの両者は、他のタンパク質の結合を妨害することなく非オーバーラップ部位に結合することが示されている（９、２１）。これは、２つのリガンドの同時結合に関して障害が存在しないドッキングモデルと十分に適合する（図１６）。アルブミン結合が受容体上のコンホメーション変化を誘発するか又は否か（又は逆も同様である）は除外され得ない。
【０３１２】
ドッキングモデルの検証に続いて、ＨＳＡ ケースブルック（Casebrook）変異体に存在するオリゴ糖結合部位（Ａｓｎ−４９４）とｓｈＦｃＲｎとの間の直接的接触は見出されなかった。しかしながら、Ａｓｐ−４９４はＤIIIａ及びＤIIIｂを連結する延長されたループ（４９０〜５１０）のＮ−末端領域の一部であり、そしてループのＮ−末端での組成の改変が、ループにおけるコンホメーション変化を大きく誘発すること可能性は非常に高い。Ａｓｐ−４９４及びＧｌｕ−４９５残基の構造的重要性は、その両者が高度に種を越えて保存される事実により支持される（図２）。重要なことには、ドッキングモデルは、ループのＣ−末端における数個の残基が受容体のα１−α２−プラットフォームと直接接触して存在し、そして予測される重要残基はＨＳＡ上のＨｉｓ−５１０及びＧｌｕ−５０５、並びにｓｈＦｃＲｎ上のＧｌｕ−５４であることを示唆する。Ｈｉｓ−５１０は３個の保存されるヒスチジン残基の１つであり、そしてこの残基の突然変異（すなわち、Ｈ５１０Ｑ）は、ｓｈＦｃＲｎへの結合性を有意に低下させた。ＦｃＲｎ結合に関与するＨＳＡ上の残る２つの保存されたヒスチジン残基のうち、Ｈｉｓ−５３５は、ＨＳＡにおけるサブドメインＤIIIａとＤIIIｂとの間のループの芳香族スタッキング又は安定化により、ＨＳＡ−ＦｃＲｎ複合体を強化することができる。Ｈｉｓ−４６４は、ＦｃＲｎにおける柔軟なβ−ヘアピン要素と、直接的に又は間接的に相互作用することができる。興味深いことには、このβ−ヘアピンループは、低ｐＨ結晶構造と高ｐＨ結晶構造の比較により判断される場合、ＦｃＲｎにおける最も柔軟な部分である（但し、Ｈｉｓ−１６６により安定化されたｐＨ依存性ループを除く）。柔軟なβヘアピンループは、低ｐＨ結晶構造と高ｐＨ結晶構造の比較により判断される場合、ＦｃＲｎにおける最も柔軟な部分である（但し、Ｈｉｓ−１６６により安定化されたｐＨ−依存性ループを除く）。ｓｈＦｃＲｎにおける柔軟なβ−ヘアピンは、Ｈｉｓ−４６４を含むＨＳＡにおけるα−ヘリックスとＤＩにおける長いループの両者と接触して存在し、このことは、ＤＩ及びＤIIIａを包含するｓｈＦｃＲｎ−ＨＳＡ界面の間接的コンホメーションの「チューニング」（tuning）を示唆する。要約すると、データは、ＦｃＲｎ及びアルブミンの両者上のヒスチジン残基が最適なｐＨ依存性結合に重要であることを示している。データは、アラニンによる保存されたヒスチジン残基の突然変異は、マウスに注入される場合、抗体断片に融合されるＨＳＡ ＤIII変異体の高められたクリアランスをもたらすが、しかしながら、ＦｃＲｎ結合との相関関係は示されなかったことを示す研究を支持する（２５）。さらに、進化的視点から、興味深いことには、異なった機能を有する、２つの完全に無関係な可溶性分子は、両者の場合、分解からの再生及び延長された半減期をもたらす類似するｐＨ及びヒスチジン依存性態様で単一の細胞受容体と結合するよう進化した。
【０３１３】
アルブミンの主要機能は、３個のドメイン内又は間の疎水性ポケットに非対称的に結合される脂肪酸を輸送することである（１、２６、２７）。ＨＳＡ ＤIIIは、２つの高親和性結合部位を有し、そして脂肪酸が、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすことが見出された数個の残基をまた含む、ＨＳＡ IIIａとＤIIIｂとの間のループ近くに結合する。結合される脂肪酸及びＨＳＡの遊離状態（１９、２７）の比較は、結合に基づくＨＳＡのサブドメインＤIII内の実質的な再配置を示さないが、しかしＨＳＡ ＤIIIに対してのＨＳＡ ＤＩの配向の相当な移行を示す（図１７）。事実、ドッキングモデルにおける脂肪酸結合ＨＳＡにおけるＤIIIの、その対応するＦｃＲｎ結合ドメイン上への重ね合わせは、脂肪酸を結合する場合、ＤＩがＦｃＲｎから離れて移動できることを示す。
【０３１４】
ＦｃＲｎの半減期調節機能が、別の場所で議論されるように（２８、２９）、治療及び診断目的のために利用され得る。明らかに、コンビナトリアルライブラリー又は分子工学から得られる生体活性ペプチド及び小タンパク質は有望な候補であるが、しかしながら、それらは（及びすべての薬物）、腎クリアランス閾値以下であるそれらのサイズ、及びプロテアーゼによる分解に対する感受性の結果としての非常に短い半減期のために、インビボでの説得力のある効果を示すことに失敗している（３０、３１）。これは、市場での薬物への先導候補体からのそのような分子の遷移を制限する。それらの障害の解決策は、ＦｃＲｎにより制御されたＩｇＧ又はアルブミンの延長された半減期を活用することである。いくつかの例は、ＩｇＧ  Ｆｃ又はＨＳＡに対する治療用タンパク質の遺伝子的融合が生体内分布及び薬物動態を改善することを示している（２９）。
【０３１５】
ＩｇＧの血清半減期はまた、性質的に進化したその半減期を越えて広範囲に改善することができる。これは、改善されたｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、及び従って、インビボでの拡張された半減期をもたらす、それらのＦｃ部分に点突然変異を有する組換え的に構築されたＩｇＧ変異体を生成する研究の激しい領域である（４、５、３２）。まだアルブミンについての例はこれまでのところ、マウスアルブミンがＨＳＡよりも強くｓｈＦｃＲｎに対して結合する観察を除いて、提示されていない（２１）。。この研究に提供されるドッキングモデルは、化学的及び生物学的薬物の送達のために魅力的である、延長された血清中半減期を有する新規ＨＳＡ変異体の開発を導くことができる。
【０３１６】
腫瘍及び炎症組織は、漏れる毛細血管及び欠陥性リンパドレンの結果としてアルブミンの増加した蓄積を示す（３３）。結果的に、アルブミン基材の治療薬又は診断薬は、腫瘍又は炎症の部位で蓄積する。さらに、アルブミン半減期の微調整はまた、融合された分子の組織毒性のために、腫瘍標的化及びイメージングに関しての魅力的アプローチでもあり得る。ＦｃＲｎに対する親和性を減衰させることによるＩｇＧ半減期の変調は、正常組織に対する腫瘍組織比率を改善し、そして従って、腫瘍イメージングを改善することを示している（３４、３５）。実質的に低下した又は低下していない、又は中間のＦｃＲｎ結合親和性を有するこの文献に記載されるＨＳＡ変異体は、魅力的アルブミン候補として機能することができる。
【０３１７】
国際公開第2011/051489号（国際特許出願／欧州特許第10/066572号；引用により本明細書に組込まれる）は、ＦｃＲｎに対する結合親和性を改変するために、アルブミンの所定の位置（例えばＨＳＡの位置５７３）がいずれか他のアミノ酸により置換され得ることを示す。従って、シグナル位置の改変は、親アルブミン（ＷＴ ＨＳＡ、配列番号２）の結合親和性とは異なった結合親和性を有するアルブミン変異体グループを提供する。位置５７３に関して、すべての変異体は、ＷＴ ＨＳＡと比べて、ｓｈＦｃＲｎに対する改善された結合性を示した。特に、変異体K573F、K573H、K573P、K573W及びK573Yは、親ＨＳＡよりも、１０倍超低いｓｈＦｃＲｎに対するＫＤを有した。変異体K573STOPは、位置５７３に停止コドンを有する、切断されたアルブミンであり、そしてＷＴ ＨＳＡに比べて、有意に低下した結合性を有する。
【０３１８】
実施例２．ＦｃＲｎに対する最適な結合性のために必要とされ、それ故それらの改変がＦｃＲｎとアルブミンとの間の結合親和性を改変するＨＳＡの領域の同定。
ドッキングモデルに基づいて、アルブミンとＦｃＲｎとの間の相互作用界面に直接的に位置するか、又はその界面近くに位置する、アミノ酸残基の位置を可視的に同定した。それらの位置は、図９に濃い陰影により示され、そしてアルブミンのドメインＩの次の位置：30〜41、75〜91、104〜120、144〜150及び186〜201、及びアルブミンのドメインIIIの次の位置：414〜426、457〜572、492〜538及び550〜585に対応する。
【０３１９】
実施例３．ＦｃＲｎへのＨＳＡの結合に関与するアミノ酸位置の同定。
ＤIIIは、ＦｃＲｎに対するｐＨ依存性結合に関与する。
アルブミンは、６個のジスルフィド橋を形成する１２のシステイン残基の複雑なネットワークにより安定化されたα−ヘリックスを含んでなる、３個の相同ドメイン（ＤＩ、ＤII及びＤIII）から成る（１９）。前記３個のドメインは、ループにより連結され、そしてハート型の構造を形成する（図４Ｂ）。２つのこれまでの研究が、ＦｃＲｎ結合のために重要なものとして、アルブミンのＤIIIを指摘している（２、１７）。これを確認し、そして各個々のドメインがＦｃＲｎ結合部位にいかにして寄与するかを、さらに調べるために、いくつかのドメイン変異体（DI-DIII、DII-DIII、DI-DII、DIII）、及び完全長ＨＳＡ（図４Ｃ）を、酵母において生成した（図４Ｄ）。固定化された可溶性組換えヒトＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ）への個々の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定し、ここで等量のドメイン変異体がｐＨ６．０及びｐＨ７．４で注入された。ＤIII結合ｓｈＦｃＲｎのみから成る変異体、及びＤIIIを有さない変異体は結合しなかった（図４Ｅ）。さらに、ＤＩ−ＤIII変異体は、ＤIII単独よりもｓｈＦｃＲｎに対してわずかに強く結合した（表２ａ）。他方では、ＤIIは、結合には寄与していないように見えた。
【０３２０】
３種のＨＳＡドメインの個々は、２つのサブドメイン、ａ及びｂを有する。Ｃ−末端サブドメインＤIIIｂの重要性に対処するために、このドメインを欠失しているＨＳＡ変異体を調製した（ＨＳＡ ＤIIIａ）。ＤIIIｂの欠失は、ｓｈＦｃＲｎ結合を完全に止めた（図４Ｆ）。組換えＨＳＡ Ｂａｒｔｉｎ変異体が比較のために包含され（１７）、そしてＤIIIｂが受容体結合のために重要であるという観察を支持する。それらの結果は、損なわれていないＤIIIが受容体結合のために重要であることを示す。
【０３２１】
【表１１】
2014515614.tif 000012
【０３２２】
ケースブルック（Casebrook）−ＦｃＲｎ結合を改変する、ＨＳＡ ＤIIIにおける点突然変異
ＨＳＡは通常、グリコシル化されていないが、しかし希な多型により、少数の例外が存在する（１６）。１つのそのような変異体（ケースブルック（Casebrook））は、アミノ酸残基４９４でのＡｓｐからＡｓｎにコードを変える単一のヌクレオチド置換を有し（２０）、ここで前記コードは、サブドメインＤIIIａ及びＤIIIｂを連結する長いループを形成するアミノ酸のストレッチ（残基４９０〜５１０）に位置する（図５Ａ及び６Ａ）。この天然の多型は、グリコシル化モチーフ（494Asn-Glu-Thr496)及びＮ結合オリゴ糖の結合を導入する。494Asn-Glu-Thr496でのオリゴ糖及び各アミノ酸の役割の細かい分析を可能にする多くの組換えＨＳＡ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの泳動及び前記変異体のＦｃＲｎ結合性の研究を実施した。ケースブルック（Casebrook）（D494N）の組換え型は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて野生型（ＷＴ）ＨＳＡよりもより遅く泳動し、このことは、オリゴ糖残基の結合を反映する（図５Ｂ）。さらに、６種の変異体D494A、D494Q、E495Q、E495A、T496A及びD494N/T496Aの場合、グリコシル化モチーフは破壊され、そして結果的に、それらの変異体のすべては、それらのＷＴの対応物のように泳動した(図５Ｂ)。
【０３２３】
すべての変異体を、固定したｓｈＦｃＲｎに対する結合についてＳＰＲにより試験し、そして明確な結合差異が、酸性ｐＨで検出され、そして最も強い結合から最も弱いの結合の順位は次の通りである：WT > T496A > D494N/T496A > D494N > E495Q E495A > D494A > D494Q（図５Ｃ−Ｆ、表２ａ）。結合がＥＬＩＳＡにより研究される場合、同じ傾向が得られた（図１０）。結合動態は、D494N（ケースブルック（Casebrook））を除くほとんどの変異体に関して解離速度の差異を示し、これは、改変された会合定数及び解離定数の両者に起因する、２倍低下した結合親和性を示した。Ａｌａ又はＧｌｎによるＡｓｐ−４９４及びＧｌｕ−４９５の突然変異は受容体結合に対して大きな効果を有した一方で、隣接するＴｈｒ−４９６の突然変異は結合に対して小さな影響を与えるのみであった。ヘテロ接合固体から単離されたＨＳＡ ケースブルック（Casebrook）変異体は、その組換え対応物と同様のしてｓｈＦｃＲｎと結合した（図５Ｆ、図１１、表２ａ）。
【０３２４】
ケースブルック（Casebrook）変異体は、ヘテロ接合固体において正常ＨＳＡよりも２〜３倍低いレベルで存在する（２０）。ケースブルック（Casebrook）変異体がＦｃＲｎ結合に対して競合する多量のＷＴ ＨＳＡの存在下で存在するインビボ状況を模倣するために、競合的なＳＰＲに基づくアッセイが使用され、そして受容体結合に対して競合するケースブルック（Casebrook）変異体の能力が、ＨＳＡ ＷＴと比べて、ほとんど５０％低下した（図５Ｇ）ことが見出され、結合親和性の２倍の低下を反映する（表２ａ）ことが発見された。
【０３２５】
ケースブルック（Casebrook）の構造的推測−ＤIIIａ−ＤIIIｂ連結ループの安定性
ＨＳＡ変異体の完全性及び折りたたみを、円偏光二色性により調べた。ＷＴ ＨＳＡとの主要な差異は、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０の両者で、何れの変異体に関しても観察されなかった（図１２、表３）。
【０３２６】
【表１２】
2014515614.tif 000013
【０３２７】
次に、ＨＳＡの結晶構造（１９）が調べられ、そしてＡｓｐ−４９４が両ＤIIIサブドメインａ及びｂにおけるアミノ酸を包含する極性相互作用の分子内ネットワークに関与していることが見出された（図５Ａ）。Ａｓｐ−４９４のカルボン酸側鎖が、Ａｒｇ−４７２と電荷が安定化された塩橋を、及びＧｌｎ−４１７及びＴｈｒ−４９６の両者と水素結合を形成する。Ａｓｎ−４９４のＮ結合グリコシル化が、その水素結合能力を低下させ、そしてループの安定化のために重要であり得る塩橋の陰性成分を排除する。この支持下で、Ｑ４１７Ａ突然変異がまた、ｓｈＦｃＲｎへの結合性を減少させることが判明した（図５Ｈ、表２ａ）。さらにグリコシル化、すなわち笠のある部分の導入は、残基４９０〜４９５を包含するループのＮ−末端を非常に無秩序にし、そして従って、そのコンホメーションに影響を及ぼす。
【０３２８】
ループのＮ−末端でのＡｓｐ−４９４、Ｇｌｕ−４９５及びＴｈｒ−４９６の他に、ループの中間におけるＰｒｏ−４９９、Ｌｙｓ−５００及びＧｌｕ−５０１（図６Ａ）が突然変異誘発により標的化され、そしてｓｈＦｃＲｎ結合に関する影響が調べられた。わずかな影響がＰ４９９Ａ及びＥ５０１Ａに関して見られた一方で、Ｋ５００Ａは受容体に対する結合性を劇的に低下させた（図６Ｂ、表２ａ）。
【０３２９】
ＨＳＡ ＤIIIにおける保存されたヒスチジン残基の役割
ヒスチジン残基が厳密にｐＨ依存性であるＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用において重要な役割を果たす事実により導かれ（４、５）、ＨＳＡ ＤIII内に見出される４個のヒスチジン残基の役割を評価した。それらの中で、３個が種を越えて高度に保存されており（Ｈｉｓ−４６４、Ｈｉｓ−５１０及びＨｉｓ−５３５）、そして１つは保存されていない（Ｈｉｓ−４４０）（図２）。Ｈｉｓ−４４０及びＨｉｓ−４６４は、サブドメインＤIIIａ内に見出されるが、Ｈｉｓ−５１０は、サブドメインＤIIIａ及びＤIIIｂを連結するループの末端に位置し、そしてＨｉｓ−５３５はＤIIIｂのα−ヘリックスの１つに見出される（図６Ａ）。すべての４種のヒスチジン残基は、それぞれグルタミンに突然変異誘発され（図１３）、そしてｐＨ６．０でｓｈＦｃＲｎへの結合性について試験された。各３個の保存されたヒスチジン残基の突然変異はほとんど完全に、結合を破壊した一方で、保存されていないＨｉｓ−４４０の突然変異はそうではなかった（図６Ｃ、表２ａ）。従って、データは、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合に重要なＤIII内の３個のヒスチジン残基を正確に位置づけ、ＩｇＧのＦｃエルボー領域における保存されたヒスチジン残基（Ｈｉｓ−３１０及びＨｉｓ−４３５）のための必要性に匹敵する。
【０３３０】
さらに、Ｈｉｓ−５３５の近傍のアミノ酸（Ｌｙｓ−５３６、Ｐｒｏ−５３７及びＬｙｓ−５３８）は、それぞれアラニン残基に突然変異誘発される場合、結合を減衰することがまた示された（図４Ｄ、表２ａ）。これらを踏まえると、結合データは、ｐＨ依存性ＦｃＦｎ結合に重要なＤIII上のコア構造領域を規定する。
【０３３１】
ＦｃＲｎ上の結合部位のマッピング
本発明者は、アルブミン結合のために重要であるマウス及びヒトＦｃＲｎ ＨＣの両者のα２−ドメインに位置する高度に保存されたヒスチジン残基（それぞれ、Ｈｉｓ−１６８及びＨｉｓ−１６６）を以前に同定している（２１、２２）。分子についての理解を得るために、近年、酸性条件（ｐＨ４．２）下で溶解したｓｈＦｃＲｎの結晶構造（図４Ａ）（２３）が調べられた。Ｈｉｓ−１６６は、α１−ドメイン内の表面露出しているループ（残基５１〜６０）上に見出されるＧｌｕ−５４及びＴｙｒ−６０との電荷が安定化された水素結合に関与する分子内相互作用のネットワークに従事していることが見出された（図７Ａ）。低ｐＨで、Ｈｉｓ−１６６は正の電荷を有し、そしてこれは、荷電していないＨｉｓ−１６６が生理学的ｐＨでＧｌｕ−５４及びＴｙｒ−６０とのその相互作用を緩めるか、或いは失い、これがより柔軟なループをもたらすであろうことを示唆する。この説明は、このループ領域が塩基性ｐＨ（ｐＨ８．５）で溶解するｓｈＦｃＲｎの結晶構造において構造的に無秩序である事実により支持される（図７Ｂ）。さらに、その対応するループはまた、酸性ｐＨで溶解するラットＩｇＧ２ａ  Ｆｃを有する複合体におけるラットＦｃＲｎの共結晶構造での定義されたコンホメーションにより命令される（６）。低ｐＨ及び高ｐＨでの２種のヒトＦｃＲｎ構造の比較は、Ｔｒｐ−５１とＴｙｒ−６０との間の柔軟ループのロッキング及び解除におけるＨｉｓ−１６６の極めて重要な調節役割を示唆する（図７ａ及び７ｂ）。
【０３３２】
Ｇｌｕ−５４はまた、Ｇｌｎ−５６との相互作用に関与している（図７Ａ）。Ｇｌｕ−５４及びＧｌｎ−５６の重要性に対処するために、両残基を、それぞれグルタミン又はアラニンに個々に突然変異誘発し、そして２つの得られる受容体変異体（ｓｈＦｃＲｎ Ｅ５４Ｑ及びｓｈＦｃＲｎ Ｑ５６Ａ）を、ｐＨ６．０でＥＬＩＳＡにより、ＨＳＡへの結合について（引用により本明細書に組込まれる国際公開第2011/051489号（国際特許出願／欧州特許第10/066572号）に記載される方法を用いて）試験した。Ｅ５４Ｑ突然変異の影響は、ＨＳＡに結合する受容体がほとんど検出されなかったので、印象的であった一方で、Ｑ５６Ａ変異体は、ＨＳＡの結合性を一部失った（図７Ｃ）。従って、データは、Ｇｌｕ５４への結合を介してｐＨ依存性の態様でｓｈＦｃＲｎのα１−ドメインループの安定化におけるＨＩｓ−１６６についての重要な構造的役割を示し、そして酸性ｐＨでのこのループの秩序立ったされた構造が効果的なアルブミン結合のために不可欠であることを示す。
【０３３３】
実施例４．ＨＳＡのＣ−末端の切断がｓｈＦｃＲｎへの結合を調節する
切断されたＨＳＡ変異体の発現コンストラクト（表６、下記）を、ＰＣＲ及びギャップ修復により生成した。ＰＣＲ生成物を、Phusionポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて、その製造業者の説明書に従って、鋳型としてｐＤＢ３９２７（引用により本明細書に組込まれる国際公開第2010/092135号に記載される）及びオリゴヌクレオチドを用いて生成した（表４及び５）。これは、特異的コドン（すなわち、位置５７３を除くアミノ酸５６８及び５７２〜５８５、）が、翻訳停止コドンアミノＴＡＡにより置換されているＤＮＡをもたらした。それらのＰＣＲ生成物を、プラスミド中にクローン化し、そしてそれを用いて、ギャップ修復により酵母において発現プラスミドを形成した。
【０３３４】
【表１３】
2014515614.tif 000014
【０３３５】
表４においては、「ＨＳＡ ５８５ｓｔｏｐ」が、位置５８５での生来のアミノ酸が停止コドンにより置換されているＨＳＡ変異体となるよう命名された。
【０３３６】
特に、ＨＳＡ５６８ｓｔｏｐ発現コンストラクトに関して、オリゴヌクレオチドｘＡＰ３１４及びｘＡＰ３０７を用いて、製造業者の説明書に従って、ＨＳＡ ＤＩIIをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐＤＢ３９２７からの４９３ｂｐ断片を増幅した。停止コドンを、オリゴヌクレオチドｘＡＰ３０７に組換え、その結果、ＨＳＡをコードするＤＮＡ配列の翻訳がアミノ酸５６７に続いて終結した。ＰＣＲ断片を、ＡｖｒII／Ｂｓｕ３６Ｉにより消化し、Qiagen PCRクリーンアップキット（その製造業者の説明書に従って）を用いて精製し、そしてＡｖｒII/Ｂｓｕ３６Ｉ消化したｐＤＢ３９２７中に連結した。その連結物を用いて、大腸菌（E. coli）ＤＨ５αを形質転換し、続いて、プラスミドを形質転換体から単離し（Qiagen miniprepキット（その製造業者の説明書に従って））、そして正しいコンストラクトを、制限分析により同定した。これは、ＨＳＡ５６８ｓｔｏｐ発現コンストラクトｐＤＢ４５５７を生成した。
【０３３７】
ＨＳＡ５７２ｓｔｏｐ及びＨＳＡ５７４ｓｔｏｐ〜ＨＳＡ５８１ｓｔｏｐ発現コンストラクトを、オリゴヌクレオチド（表５）を用いて、ＨＳＡ５６８ｓｔｏｐコンストラクトと同じ態様で作製し、プラスミドｐＤＢ４５４８〜ｐＤＢ４５５６（表４）を生成した。
【０３３８】
ＨＳＡ５８２ｓｔｏｐ〜ＨＳＡ５８５ｓｔｏｐコンストラクト（１.１２２ｋｂ）に関して、断片を、オリゴスクレオチド（表５）を用いて、ｐＤＢ３９２７からＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ断片をそれぞれ、ＢｇｌII／ＨｉｎｄIIIにより消化し、単離し、そしてｐＤＢ２９２３中に連結し（Finnis, C. J. et al. (2010). High-level production of animal-free recombinant transferrin from Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact 9, 87）、それぞれプラスミド＃１０Ｄ、＃１１Ｂ、＃１２Ｃ及び＃１３Ｄを生成した。プラスミド＃１０Ｄ〜＃１３Ｄを、ＡｖｒII／ＳｐｈＩにより消化し、そして６６６ｂｐの断片（アルブミンのＣ末端をコードするＤＮＡを含む）を個々から単離し、そしてＡｖｒII／ＳｐＨＩ消化されたｐＤＢ３９２７中に連結し、それぞれ、ギャップ修復コンストラクトｐＤＢ４５４４〜ｐＤＢ４５４７を生成した（表４）。
【０３３９】
プラスミドｐＤＢ４５４４〜ｐＤＢ４５５７を、ＮｓｉＩ／ＰｖｕＩにより消化し、そのＤＮＡを精製し（Qiagen ＰＣＲ精製キット、その製造業者の説明書に従って）、使用の前にＡｃｃ６５Ｉ/ＢａｍＨＩ消化したｐＤＢ３９３６と共に、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10cir0を、上記のようにして共形質転換し、ギャップ修復により酵母において発現プラスミドを生成した。
【０３４０】
ストックを、得られる各酵母株のために調製した。１０ｍｌのＢＭＭＤブイヨン（アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含有しない０．１７％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース（Difco）、３７．８ｍＭの硫酸アンモニウム、３６ｍＭのクエン酸、１２６ｍＭのオルトリン酸水素二ナトリウムｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）グルコース、ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調整された）を、必要とされる菌株により接種し、そして２００ｒｐｍでのオービタル振盪により、３０℃で４８時間、増殖させた。次に、５ｍｌの各培養物を、等体積の４０％（ｗ／ｖ）トレハロースと共に混合し、そして１ｍｌのアリコートを、−８０℃での貯蔵のために、凍結バイアルに移した。
【０３４１】
ＨＳＡ５７３ｓｔｏｐ変異体を生成する酵母株の構築は、国際公開第2011/0541489号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。
【０３４２】
【表１４】
2014515614.tif 000015
【０３４３】
次の変異体（断片）を生成し、そしてｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴに対する結合性を、材料及び方法に記載のようにして、決定した。より具体的には、ＨＳＡのＣ末端でアミノ酸をコードするコドンをそれぞれ、ＴＡＡ（すなわち、翻訳停止コドン）により置換し、表６の切断されたＨＳＡ変異体を生成した。ｓｈＦｃＲｎに対して結合するＨＳＡ変異体についての結合データが、表６、図２０及び図２１に示されている。
【０３４４】
【表１５】
2014515614.tif 000016
【０３４５】
表６及び図２０のデータは、ｓｈＦｃＲｎに対してｐＨ依存性性結合におけるＨＳＡのＣ末端の重要性を示す。驚くべきことには、最後のアミノ酸（Ｌｅｕ５８５）の除去が、ＷＴ ＨＳＡに比べて、受容体への結合を５０％低下させ、そして更なる切断はその影響を増大させた（図２０）。
【０３４６】
同様に、切断長が長くなるに従って、親和性が減少する一般的傾向が競合結合アッセイにおいて観察され（図２１）、すなわち競合は更なるアミノ酸の除去により、徐々に減少した。
【０３４７】
ＫＤの決定は、Ｃ末端切断の劇的な影響を示す（表４）。
【０３４８】
実施例５．ＨＳＡのＣ末端での改変がｓｈＦｃＲｎに対する結合を調節する。
ＨＳＡ変異体の発現コンストラクト（下記表７）を、ＰＣＲ及びギャップ修復により生成した。これは、鋳型としてのｐＤＢ３９２７、及びオリゴヌクレオチドを用いて、Phusion ポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて、その製造業者の説明書に従って、ＰＣＲ生成物を生成することにより達成された（表７及び８）。各ＰＣＲ断片を、ＡｖｒII／Ｂｓｕ３６Ｉにより消化し、精製し（Qiagen PCRクリーンアップキット）（その製造業者の説明書に従って））、そしてＡｖｒII／Ｂｓｕ３６Ｉ消化したｐＤＢ３９２７中に連結した。連結物を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、続いて、プラスミドを形質転換体から単離し（Qiagen miniprepキット（その製造業者の説明書に従って））、そして正しいコンストラクトを配列決定により同定した。
【０３４９】
【表１６】
2014515614.tif 000017
【０３５０】
【表１７】
2014515614.tif 000018
【０３５１】
所望する置換を含むプラスミドｐＤＢ4535〜ｐＤＢ4537（表７）を、ＮｓｉＩ／ＰｖｕＩにより消化し、ＤＮＡを精製し（Qiagen PCR精製キット；その製造業者の説明書に従って）、使用の前にＡｃｃ６５Ｉ/ＢａｍＨＩ消化したｐＤＢ３９３６と共に、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）BXP10cir0を、上記のようにして共形質転換し、ギャップ修復により酵母において発現プラスミドを生成した。ストックを、上記のようにして、得られる各酵母株のために調製した。
【０３５２】
次の変異体を生成し、そしてｓｈＦｃＲｎ−ＧＳＴに対する結合親和性を、材料及び方法に記載のようにして決定した。結果は、表９及び図２２に示される。
【０３５３】
【表１８】
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【０３５４】
データは、ｓｈＦｃＲｎに対するｐＨ依存性結合におけるＨＳＡのＣ末端の重要性のさらなる証拠を提供する。Ｑ５８０及びＫ５７４のアラニン置換は、それぞれ、約２及び４倍、結合親和性を低下させることを示した（図２２及び表５）。二重変異体（Ｋ５７３ＰとＱ５８０Ａと組み合わせる）は、ｓｈＦｃＲｎに対して改善された親和性を引き起こした。これらを踏まえると、実施例４及び５のデータは、ｓｈＦｃＲｎに対するアルブミンの結合について、ＤIIIｂの最後のα−ヘリックスにおけるアミノ酸の重要性を示す。
【０３５５】
実施例６．ｓｈＦｃＲｎに対するアルブミン変異体の結合親和性のＳＰＲ分析
アルブミンの変異体を、下記方法に従って生成した。
【０３５６】
特異的なＨＳＡムテイン発現プラスミドの調製
ＨＳＡ変異体を、いくつかの標準の分子生物学技法、例えばSambrook, J. and D.W. Russell, 2001 (Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)に記載のような技法を用いて発現させた。ＷＴ ＨＳＡをコードするプラスミドｐＤＢ３９６４における適切な制限部位への近接性に依存して、ＨＳＡ配列内に突然変異を導入するために使用される２種の方法が下記に記載される（引用により本明細書に記載される国際公開第2010/092135号）。
【０３５７】
方法１：所望する突然変異の近傍に制限部位が存在する場合、所望する変化及び関連する制限部位を組込む変異原オリゴヌクレオチドを設計した（表１０及び１１）。関連するプライマーを、New England Biolabs Phusionキット及び鋳型としてのｐＤＢ３９６４を用いて、ＰＣＲ反応（表１２及び１３に記載される）に使用した。得られる生成物を精製した（QIAquick PCR精製キット、その製造業者の説明書に従って）。得られる断片を、ＷＴ ＨＳＡ配列が所望する突然変異を含むＨＳＡ配列により置換されるよう、適切に消化されたｐＤＢ３９６４中に連結した。連結物を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、そしてプラスミドを単離した（QIAquick PCR精製キット；その製造業者の説明書に従って）。すべてのプラスミドを配列決定し、ＨＳＡ配列が所望する位置でのみ突然変異誘発されたことを確認した。
【０３５８】
【表１９】
2014515614.tif 000020
【０３５９】
【表２０】
2014515614.tif 000021
【０３６０】
【表２１】
2014515614.tif 000022
【０３６１】
【表２２】
2014515614.tif 000023
【０３６２】
方法２．適切な制限部位が所望する突然変異の近くに存在しない場合、合成ＤＮＡ断片を、遺伝子アセンブリー（GeneArt, Life Technologies）により生成し、そしてＨＳＡ遺伝子内に突然変異、及び野生型ＨＳＡをコードするプラスミドｐＤＢ３９６４中への挿入のための適切な制限部位を含み、変更されていないアミノ酸をコードする合成断片のヌクレオチド配列がｐＤＢ３９６４におけるそれらの配列と同一であるように設計した（表１４及び１５を参照のこと）。合成コンストラクトを、表１４に示される制限酵素により消化し、所望する断片を精製し（QIAquick ゲル抽出キット）、そして適切に消化されたｐＤＢ３９６４に連結し、その結果、ＷＴ ＨＳＡ配列を、所望する突然変異を含むＨＳＡ配列により置換した。連結されたプラスミドを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、そしてプラスミドを単離した（Qiagen Plasmid Plus キット、その製造業者の説明書に従って）。すべてのプラスミドを配列決定し、ＨＳＡ配列が所望する位置でのみ突然変異誘発されたことを確認した。
【０３６３】
【表２３】
2014515614.tif 000024
【０３６４】
【表２４】
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【０３６５】
Ｋ５７３Ｐを有する組み合わせ変異体の生産
組み合わせ変異体（表１６）を生産し、表１０及び１４に記載されるサブセットの突然変異とＨＳＡ Ｋ５７３Ｐ変異体（プラスミドｐＤＢ４１１０）とを組み合わせた。Ｋ５７３Ｐ変異体ＤＮＡをコードする０．３５８ｋｂの断片を、ＳａｃＩ／ＳｐｈＩ制限酵素による消化によりプラスミドｐＤＢ４１１０から単離し、QIAquick ゲル抽出キットを用いて精製し、そして同じ酵素により消化したｐＤＢ４７０４、ｐＤＢ４７１６及びｐＤＢ４７５３（表１０を参照のこと）中に連結し、それぞれＨＳＡ変異体Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ、Ｅ４２５Ａ／Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ／Ｋ５７３Ｐを生成した。さらに、組み合わせ変異体を、ＮａｅＩ／ＮｃｏＩ制限酵素によるｐＤＢ４１１０の消化、上記のようにしての単離及びｐＤＢ４７４５、ｐＤＢ４７４６及びｐＤＢ４７４７（表１４に記載される）からの同等の断片の連結により調製し、それぞれ組み合わせ変異体Ｎ１１１Ｄ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１１１Ｇ／Ｋ５７３Ｐ及びＮ１１１Ｈ/Ｋ５７３Ｐを生成した。変異体Ｋ５３４Ｖ／Ｋ５７３Ｐを生成するために、遺伝子アセンブリー（GeneArt, Life Technologies）により両者の所望の変異を含む合成ＤＮＡ断片生成した。その断片をＳａｌＩ／Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位を通して消化し、上記のようにして単離し、そして適切に消化されたｐＤＢ３９６４中に連結した。
組み合わせ変異体Ｎ１１１Ｒ／Ｋ５７３Ｐ、Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３Ｐ及びＮ１１１Ｅ／Ｋ５７３Ｐを生成するために、Ｎ１１１突然変異を含む断片を、ＳａｃII／ＮｈｅＩ制限部位を通してGeneArtコンストラクトから除き、そして上記のようなＫ５７３Ｐ突然変異（ｐＤＢ４８５２として命名された）をコードする、ｐＤＢ４１１０のＳａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を含む、適切に消化されたｐＤＢ３９６４中にクローン化した。連結されたプラスミドを用いて、大腸菌細胞を形質転換し、そして次に、プラスミドを単離した（Qiagen Plasmid Plusキット、その製造業者の説明書に従って）。すべてのプラスミドを配列決定し、ＨＳＡ配列が所望する位置でのみ突然変異誘発されたことを確認した。
【０３６６】
【表２５】
2014515614.tif 000026
【０３６７】
発現プラスミド及び酵母ストックの製造
発現のプラスミド調製及びＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）の形質転換を、細胞がプレートされ、そして続いて、０．６９ｇ／ＬのＣＳＭ−Ｌｅｕ（MP Biomedicals）により補充されたＢＭＭＤプレート上にパッチ（pathched）される変更を伴って、上記のようにして実施した。
【０３６８】
ストックを、ＢＭＭＳブイヨン（アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含有しない０．１７％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース（Difco）、３７．８ｍＭの硫酸アンモニウム、３６ｍＭのクエン酸、１２６ｍＭのオルトリン酸水素二ナトリウム  ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）スクロース、ＮａＯＨによりｐＨ６．５に調節された）が両者の場合に使用される変更を伴って、上記４８時間方法（ｐＤＢ４７０３〜ｐＤＢ４７２０、ｐＤＢ４７３７〜ｐＤＢ４７５６、ｐＤＢ４８４９〜ｐＤＢ４８５５）又は国際公開第2011/051489号に記載される２４時間方法（ｐＤＢ４８６０〜ｐＤＢ４８７６）の何れかにより調製した。
【０３６９】
ＳＰＲ分析
ＳＰＲ分析を、Biacore3000測定器（GE Healthcare）上で実施した。固定化を、その製造業者の説明書に従って、GE Healthcareアミンカップリング化学を用いて、ｓｈＦｃＲｎとカップリングされたＣＭ５チップ（GeneArt 105291）上で実施した。ｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳの固定化されたレベルは、１５００〜２５００ＲＵであり、そして５〜１０μｇ／ｍｌのｓｈＦｃＲｎを酢酸ナトリウムｐＨ５．０（GE Healthcare）中に注入することにより達成された。チップ表面を、２５℃で約１〜２時間、ｐＨ７．４でのランニング緩衝液−ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）（GE Healthcare）の一定速度（５μＬ／分）で安定化するために放置した。リガンド安定化後、チップ表面を、二塩基／一塩基性リン酸緩衝液ｐＨ５．５によりプライミングし（２回）、そして４５ｍｌの二塩基／一塩基性リン酸緩衝液を、３０μｌ／分で５〜１２回、注入することによりコンディショニングした（各注入間でＨＢＳ＿ＥＰ再生工程が存在した）。次に、表面を、４５μｌの陽性対照を３０μｌ／分で３度、注入することにより（１２秒の再生パルスが伴う）、活性について調べた。動態測定を、２５℃で、固定されたｓｈＦｃＲｎ上に、ＨＳＡ及びＨＳＡ変異体の希釈溶液（１００μＭ〜１μＭ）を３０μｌ／分で注入することにより実施した。次に、対照細胞値を差し引き、そしてBiaevaluationソフトウェア４．１を用いて、動態データを入手し、そしてＫＤ値を確かめた。
【０３７０】
斯かる変異体はアルブミン（配列番号２）であり、各変異体は、下記：D108A、N111D、N111G、N111H、N111K、K190A、R197A、K276N、R410A、Y411A、P416A、E425A、E425K、K466A、D471A、R472A、N503D、N503K、E505K、E505Q、H510D、H510E、D512A、D512E、K524A、K525A、T527A、T527D、T527M、E531A、E531H、K534V、H535F、E565V、A569L、A569S、A569V及びV576Fから選択された１つの点突然変異を有する。
【０３７１】
最初に、変異体をＳＰＲにより分析し、ｓｈＦｃＲｎに対するそれらの結合応答（ＲＵ）を決定した。野生型アルブミンの結合応答よりも、２０％以上高いか又は低い結合応答を示す変異体のみを分析し、ＫＤを同定した（下記表１８）。野生型ＨＳＡ及び突然変異Ｋ５７３Ｐを有するＨＳＡを、対照として使用した。
【０３７２】
【表２６】
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【０３７３】
野生型ＨＳＡよりも低いＫＤを有する変異体は、ｓｈＦｃＲｎに対して高い結合親和性を有する。逆に、野生型ＨＳＡよりも高いＫＤを有する変異体は、ｓｈＦｃＲｎに対する低い結合親和性を有する。
【０３７４】
位置１０８及び１１１についてのデータは、ＦｃＲｎとの相互作用において、位置１０５〜１２０を含むループの関与を支持し、そして従って、このループ内の何れかの位置での改変がＦｃＲｎに対するアルブミンの結合親和性を調節するであろうことを予測する。
【０３７５】
実施例７．ｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳに対するアルブミン変異体の結合親和性のＳＰＲ分析
変異体はアルブミン（配列番号２）であり、N111D、N111G、N111H、N111D/K573P、N111G/K573P、N111H/K573P、E505Q、E425A、T527M、E505Q/K573P、E425A/K573P及びT527M/K573Pから選択された１つの点突然変異を有する各変異体は上記のようにして調製された。
【０３７６】
【表２７】
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【０３７７】
野生型ＨＳＡよりも低いＫＤを有する変異体は、ｓｈＦｃＲｎに対して高い結合親和性を有する。逆に、野生型ＨＳＡよりも高いＫＤを有する変異体は、ｓｈＦｃＲｎに対して低い結合親和性を有する。
【０３７８】
Ｋ５７３Ｐを含むことについてのデータは、Ｋ５７３Ｐ置換のみと一致する親和性の上昇をもたらす。
【０３７９】
実施例８．ｓｈＦｃＲｎ−ＨＩＳに対するアルブミン変異体の結合親和性のＳＰＲ分析
変異体はアルブミン（配列番号２）であり、N111R、N111Q、N111E、N111R/K573P、N111Q/K573P、N111E/K573P、N109D、N109E、N109Q、N109R、N109K、N109H、N109G、D108E、T83N、L575F及びK534V/K573Pから選択された１つの点突然変異を有する各変異体は上記のようにして調製された。
【０３８０】
【表２８】
2014515614.tif 000029
【０３８１】
データは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡの結合における１０８〜１１１ループの役割を示し、そしてＤ１０８Ａ及びＮ１１１Ｋ変異体において低下した結合親和性が観察された（表１８）。位置１１１での追加の突然変異は、Ｎ１１１Ｋ変異体について観察される低下した親和性から、ＷＴ ＨＳＡに比べて、ＦｃＲｎに対して増加した親和性を示したＮ１１１Ｅ変異体までの、広範囲の結合親和性を示した（表２０）。変異体Ｎ１１１Ｑ／Ｋ５７３Ｐ（図２３）は、Ｋ５７３Ｐ置換と一致する増加した応答性及び低下した解離性を有する結合曲線を示す。ＨＳＡ及びＦｃＲｎのループ領域１０８〜１１２の相対的位置（図２４）は、この領域が、実施例６において予測されるように、ＦｃＲｎ結合に寄与する可能性を有することを示唆する。
【０３８２】
残基７８〜８８を含んでなる、ドメイン１の隣接するループ領域の相対的位置（図２４）は、この領域がＦｃＲｎ結合に寄与する可能性を有することを示唆する。これは、Ｔ８３Ｎ変異体がＷＴ ＨＳＡに比べて、ＦｃＲｎに対して増加した親和性を示す観察により支持される（表２０）。
【０３８３】
隣接する残基、特にＥ８２、Ｐ１１０及びＬ１１２の突然変異（図２４）は、ＦｃＲｎに対するＨＳＡの結合親和性を改変することが予測されるであろう。
【０３８４】
本明細書に開示される特定の態様は、本発明のいくつかの態様の例証として意図され、本明細書に記載され、請求される本発明は、これらの態様により範囲が限定されるものではない。任意の同等の態様は、本発明の範囲内であることを意図する。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変は、上述の記載から当業者に明らかになる。かかる改変はまた、特許請求の範囲内であることを意図する。矛盾する場合、定義を含む本開示が支配する。
【０３８５】
実施例１、２、及び３の参考文献
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１８−９】
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【図１８−１０】
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【図１８−１１】
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【図１８−１２】
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【図１８−１３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図１９−７】
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【図１９−８】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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