(57)【要約】生物学的サンプルにおいて特定の微粒子タイプを富化するための方法が開示される。特定の実施形態において、上記富化されるべき微粒子は、胎児微粒子もしくは疾患特異的微粒子である。特定の実施形態において、上記方法は、生物学的サンプルを、胎児微粒子もしくは疾患特異的微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、および上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程を包含し、ここで上記結合分子を含む画分は、それぞれ、胎児微粒子もしくは疾患特異的微粒子について富化される。また開示されるのは、生物学的サンプルの一画分中の胎児微粒子を富化し、次いで上記富化された画分から核酸を単離することにより生物学的サンプルにおいて胎児核酸を富化するための方法である。胎児における染色体異常の出生前診断を促進するための方法もまた開示される。
2014508290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中の微粒子の亜集団を富化するための方法であって、該方法は、
生物学的サンプルを、該亜集団に由来する微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、および
該生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで該結合分子を含む画分は、該微粒子の亜集団について富化される、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、および他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合分子は、胎児微粒子と結合し、母体微粒子と結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、もしくはＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）に結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇに結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、Ｇ１、Ｇ９、もしくはＧ２３３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、検出可能な標識を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、固体支持体に結合されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体支持体は、ポリスチレン、磁性物質、アガロース、およびポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミドのうちの少なくとも１種を含む、ビーズもしくは樹脂である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体は、カラムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的サンプルを前記結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプルは、内因性抗体を除去するように処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルを前記胎児特異的結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプルは、母体微粒子と結合する結合分子と合わされて、該生物学的サンプル中の母体微粒子を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的サンプル中の胎児核酸を富化するための方法であって、該方法は、
生物学的サンプルを、胎児微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、
該生物学的サンプルの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで該結合分子を含む画分は、胎児微粒子について富化される、工程、および
核酸を、該結合分子を含む該画分から単離し、それによって、該生物学的サンプル中の胎児核酸を富化する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、および他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、胎児微粒子と結合し、母体微粒子と結合しない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、もしくはＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇに結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、Ｇ１、Ｇ９、もしくはＧ２３３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、検出可能な標識を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、固体支持体に結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記固体支持体は、ポリスチレン、磁性物質、アガロース、およびポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミドのうちの少なくとも１つを含む、ビーズもしくは樹脂である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体は、カラムである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的サンプルを前記結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプルは、内因性抗体を除去するように処理される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的サンプルを前記胎児特異的結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプルは、母体微粒子と結合する結合分子と合わされて、該生物学的サンプル中の母体微粒子を除去する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
胎児の染色体異常の出生前診断を促進するための方法であって、該方法は、
生物学的サンプルを妊娠女性から得る工程、
該生物学的サンプルを、胎児微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、
該生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで該結合分子を含む画分は、胎児微粒子について富化される、工程
核酸を、該結合分子を含む該画分から単離する工程、および
該核酸を分析して、該染色体異常の存在もしくは非存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記染色体異常は、異数性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記異数性は、第１３染色体、第１８染色体、もしくは第２１染色体のものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記染色体異常は、疾患と関連した変異である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的サンプルは、前記胎児の妊娠持続期間が約１６週未満である場合に、前記女性から得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物学的サンプルを前記結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプルは、内因性母体抗体を除去するように処理される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物学的サンプルは、全血サンプルもしくは血漿サンプルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、胎児微粒子と結合し、母体微粒子と結合しない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、もしくはＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）に結合する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇに結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、Ｇ１、Ｇ９、もしくはＧ２３３である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、検出可能な標識を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、固体支持体に結合されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記固体支持体は、ポリスチレン、磁性物質、アガロース、およびポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミドのうちの少なくとも１つを含む、ビーズもしくは樹脂である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記固体支持体は、カラムである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＤＮＡは、デジタルＰＣＲを使用して分析される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的サンプルを該胎児特異的結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプルは、母体微粒子と結合する結合分子と合わされて、該生物学的サンプル中の母体微粒子を除去する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
癌の診断を促進するための方法であって、該方法は、
生物学的サンプルを患者から得る工程、
該生物学的サンプルを、癌細胞由来微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、
該生物学的サンプルの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで該結合分子を含む画分は、癌細胞由来微粒子について富化される、工程、
核酸を、該結合分子を含む該画分から単離する工程、および
該核酸を分析して、癌と関連した変異の存在もしくは非存在を検出する工程であって、ここで該変異の存在は、該患者が癌を有することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記生物学的サンプルは、該生物学的サンプルを前記結合分子と合わせる前に、内因性抗体を除去するように処理される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物学的サンプルは、該生物学的サンプル中に存在すると予測される細胞から形成される微粒子と結合する結合分子と合わされて、該生物学的サンプルを該癌特異的結合分子と合わせる前に、該生物学的サンプル中のそのような微粒子を除去する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、他の血液画分サンプル、もしくは癌細胞もしくは疾患細胞と接触した状態にあった任意の体液のサンプルのうちの少なくとも１つを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、癌由来微粒子と結合し、正常細胞由来微粒子と結合しない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、検出可能な標識を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、固体支持体に結合されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記固体支持体は、ポリスチレン、磁性物質、アガロース、およびポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミドのうちの少なくとも１つを含む、ビーズもしくは樹脂である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記固体支持体は、カラムである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＤＮＡは、デジタルＰＣＲを使用して分析される、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先の関連出願
本願は、２０１１年１月３１日に出願した米国仮出願第６１／４３７，７６８号に対する優先権を主張する。米国仮出願第６１／４３７，７６８号の内容は、その全体がこれにより参考として援用される。
【０００２】
（分野）
本発明の実施形態は、微粒子、細胞、もしくは核酸の稀な集団を、複雑な混合物（例えば、血液）から、特異的結合分子を使用して富化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
胎児の健康を評価し、モニターすることは、妊娠の間に最高に重要なことである。医師および他の医療専門家は、妊娠の間に胎児および母親両方に対するリスクを最小限にするために、および生まれてくる健康な新生児の数を最適化するために、上記胎児の健康に関して利用可能な最も正確な情報を有している必要がある。当然のことであるが、生まれてくる子供の両親および親族もまた、上記胎児の健康および状態についての情報を心配している。上記両親が、妊娠および上記胎児が有し得る任意の有害な医学的状態に関して、情報に基づく決定をし得るように、この情報が可能な限り早く入手可能であることは、望ましいことである。
【０００４】
胎児の遺伝物質へのアクセスは、上記胎児の健康に関する重大な情報を提供し得る。例えば、任意の遺伝的欠陥（例えば、染色体異常）は、胎児ＤＮＡを分析することによって検出され得る。染色体異常としては、点置換、欠失、付加、転座、もしくは異常な染色体数もしくは異常な染色体セット数（異数性）が挙げられる。異数性の一例は、モノソミー（一対のうちの一方の染色体が失われているタイプの異数性）である。異数性の別のタイプは、トリソミー（ここで一対の代わりに、３コピーの染色体が存在する）である。異数性は、致死的であり得るか、またはいくつかの異なる遺伝的障害（ダウン症候群（２１トリソミー）、エドワーズ症候群（１８トリソミー）、パトウ症候群（１３トリソミー）、およびターナー症候群（ＸＸもしくはＸＹの代わりに、Ｘ）が挙げられる）のうちの１つを引き起こし得る。
【０００５】
これら状態の出生前診断に関しては、現在利用可能な手順は制限されており、一定の欠点を有する。１つの現在使用される手順は、羊水穿刺（胎児ＤＮＡを含む羊水を、胎児が発生中である羊膜腔から引き抜く医療手順）であり、次いで、上記胎児ＤＮＡは、任意の遺伝的異常について分析される。羊水穿刺は、通常、妊娠１５週〜２０週の間（すなわち、妊娠トリメスターのうちの第２期中）に行われる。羊水穿刺は、いくつかの重大な合併症（早産、胎児外傷、およびさらには胎児の流産が挙げられる）のリスクがある。上記試験は、妊娠トリメスターのうちの第２期までは信頼性をもって行うことができず、かつ上記手順と関連した重大なリスクがあるので、羊水穿刺は、多くの患者にとっては望ましい手順ではないかもしれない。現在使用されている別の手順は、絨毛膜絨毛採取（ＣＶＳ）（ここで胎盤組織のサンプルが採取され、分析される）である。ＣＶＳは、羊水穿刺より早期に（すなわち、代表的には、妊娠の１０〜１２週の間に）行われ得るが、この手順もまた、感染、胎児外傷、羊水漏出、および流産の増大したリスクを伴う。ＣＶＳはまた、母体細胞が上記胎盤から完全には分離されない場合、母体細胞汚染を被る。従って、羊水穿刺およびＣＶＳはともに、比較的侵襲性の手順でありかつ一定の健康上のリスクがあるので、これら手順は、多くの患者にとって適切でないかもしれない。
【０００６】
ある胎児物質もまた、母親の血流中に存在する。この物質は、胎盤細胞がアポトーシスもしくは細胞死の他の形態を受ける場合に主に形成される微粒子中に含まれる胎児ＤＮＡ（小胞、微小胞、もしくはアポトーシス小体ともいわれる）を含む。形態的変化は、アポトーシスもしくは細胞死の他の形態（「細胞膜ブレビング（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｅｂｂｉｎｇ）」として公知のプロセスが挙げられ、これは、上記細胞からこれら微粒子の形成および放出をもたらす）の間に起こる。これら微粒子は、上記細胞膜から形成されるので、上記微粒子は、それらが形成される上記細胞に対して特異的であるそれらの表面生体マーカーを有する。さらに、上記微粒子の内容物は、核物質（例えば、それらを放出した細胞に対して特異的である核酸）を含み得る。上記微粒子のサイズおよび上記母親の血流に存在する微粒子の量は、上記個体に基づいて、およびより少ない程度には、上記胎児の妊娠持続期間に基づいて、変動し得る。いくつかの場合において、存在する微粒子の量は、妊娠の間の有害な状態と相関させられ得る。一般に、上記微粒子の平均サイズは、約０．１〜約１μｍの範囲に及ぶ。これらの微粒子は、上記母体の血流に非常に少量存在し得るに過ぎず、公知の方法を使用して、上記胎児ＤＮＡを上記母体ＤＮＡから区別することは、極めて難しい。しかし、上記胎児ＤＮＡが、単離もしくは精製され得るのであれば、上記母親にも上記胎児にも重大な健康上のリスクを負わせることなく、上記胎児の健康に関する価値ある情報（染色体異常もしくは遺伝的異常についての情報が挙げられる）が得られ得る。
【０００７】
微粒子の単離および富化は、他の適用もまた有する。例えば、微粒子はまた、癌細胞の活性化またはアポトーシスもしくは他のタイプの細胞死の間に、または特定の他の疾患における細胞の活性化またはアポトーシスもしくは他の細胞死の間に形成される。さらに、癌もしくは特定の他の疾患を有する患者において、微粒子は、細胞死の間のみならず、上記細胞によって意図的にも、例えば、癌の転移の間にも、上記細胞から放出される。これら疾患特異的微粒子は、上記患者の血流中に、または疾患細胞もしくは癌細胞と接触した状態になる他の体液中に循環して見いだされ得る。
【０００８】
従って、必要とされるものは、妊娠初期（すなわち、妊娠トリメスターのうちの第１期）の、胎児染色体異常もしくは胎児の他の遺伝的異常を検出するための、侵襲性がより低くかつ信頼性のある方法である。このような方法が、妊娠の間全体を通して正確でありかつ再現可能であることもまた、望ましい（例えば、妊娠の間全体を通して上記胎児の健康をモニターするため）。胎児微粒子および胎児ＤＮＡを母体物質から富化するための方法もまた、必要とされる。これら方法は、好ましくは、効率的であり、情報価値があり、そして安価である。また必要とされるものは、上記疾患、腫瘍、もしくは他の癌を検出し、モニターし、そして分析するために、疾患特異的微粒子（例えば、癌微粒子）もしくはこのような微粒子に含まれる核酸を富化するための方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
生物学的サンプル中の微粒子もしくは核酸の亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を富化するための方法が提供される。特定の局面において、上記富化方法は、生物学的サンプルを、上記亜集団の微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、および上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、上記微粒子の亜集団について富化される工程を包含する。一実施形態において、上記微粒子の亜集団は、胎児微粒子である。上記生物学的サンプルは、例えば、母体の全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、もしくは他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである。一般に、上記結合分子は、胎児微粒子と特異的に結合するが、母体微粒子とは結合しない。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、上記生物学的サンプルは、内因性抗体を除去するように処理される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、上記生物学的サンプルは、母体微粒子と結合する結合分子と合わせられて、上記生物学的サンプル中の母体微粒子を除去する。
【００１０】
他の局面において、生物学的サンプル中の胎児核酸（例えば、ＤＮＡ）を富化するための方法が提供され、上記方法は、生物学的サンプルを、胎児微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、胎児微粒子について富化される工程、および核酸を、上記結合分子を含む上記画分から単離し、それによって、上記生物学的サンプル中の胎児核酸を富化する工程を包含する。上記富化された胎児核酸は、例えば、デジタルＰＣＲを使用して分析され得る。上記生物学的サンプルは、例えば、母体の全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、もしくは他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである。一般に、上記結合分子は、胎児微粒子に特異的に結合するが、母体微粒子とは結合しない。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離され得る。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、上記生物学的サンプルは、内因性抗体を除去するように処理される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、上記生物学的サンプルは、母体微粒子と結合する結合分子と合わされて、上記生物学的サンプル中の母体微粒子を除去する。
【００１１】
特定の局面において、胎児における染色体異常の出生前診断を促進するための侵襲性のより低い方法が提供される。上記方法は、生物学的サンプルを妊娠女性から得る工程、上記生物学的サンプルを、胎児微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む上記画分は、胎児微粒子について富化される工程、核酸（例えば、ＤＮＡ）を、上記結合分子を含む上記画分から単離する工程、および上記核酸を分析して、上記染色体異常の存在もしくは非存在を検出する工程を包含する。上記生物学的サンプルは、例えば、母体の全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、もしくは他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態において、上記染色体異常は、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、もしくはＸ染色体の異数性である。他の実施形態において、上記染色体異常は、疾患と関連した変異である。あるいは、他の遺伝的異常が検出され得る。上記胎児核酸は、例えば、デジタルＰＣＲを使用して分析され得る。特定の実施形態において、この侵襲性がより低い方法は、上記胎児の妊娠持続期間が約１６週未満である場合に、妊娠女性から得られるサンプルについて信頼性がある。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである。一般に、上記結合分子は、胎児微粒子と特異的に結合するが、母体微粒子とは結合しない。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、内因性抗体を除去するように処理される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、母体微粒子と結合する結合分子と合わせられて、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、上記生物学的サンプル中の母体微粒子を除去する。
【００１２】
他の局面において、上記開示される方法はまた、疾患の検出に適用され得る。例えば、癌、または細胞活性化、細胞死、アポトーシスもしくは微粒子の放出（またはこれらの組み合わせ）と関連した別の疾患の診断を促進するための方法が提供される。上記方法は、患者から生物学的サンプルを得る工程、上記生物学的サンプルを、上記疾患細胞（例えば、癌細胞）に対して特異的な生体マーカーを含む微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、疾患特異的微粒子について富化される工程、ＤＮＡを、上記結合分子を含む上記画分から単離する工程、および上記ＤＮＡを分析して、上記疾患と関連する変異の存在もしくは非存在を検出する工程であって、ここで上記変異の存在は、上記患者が上記疾患を有することを示す工程を包含し得る。特定の実施形態において、上記疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである。一般に、上記結合分子は、癌由来微粒子もしくは疾患特異的微粒子と特異的に結合するが、正常細胞由来微粒子とは結合しない。いくつかの実施形態において、上記２つ以上の画分は、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮によって分離される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、上記生物学的サンプルを上記結合分子と合わせる前に、内因性抗体を除去するように処理される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルを、上記癌特異的結合分子もしくは疾患特異的結合分子と合わせる前に、上記生物学的サンプルは、上記サンプル中に存在すると予測される細胞から形成される微粒子と結合する結合分子と合わせられて、上記生物学的サンプル中のこのような微粒子を除去する。上記生物学的サンプルは、例えば、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、他の血液画分サンプル、または癌細胞もしくは疾患細胞と接触した状態にあった任意の体液のサンプルのうちの少なくとも１つを含み得る。上記富化された核酸は、例えば、デジタルＰＣＲを使用して分析され得る。上記生物学的サンプルを上記疾患特異的微粒子と結合する結合分子と合わせ、上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する（ここで上記結合分子を含む上記画分は、疾患特異的微粒子について富化される）ことによって、生物学的サンプル中の疾患特異的生体マーカーを含む微粒子を富化するための方法および上記疾患特異的核酸を富化するための方法もまた、提供される。
【００１３】
本発明の方法の非限定的実施形態は、以下の図面において例示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、示されるように、種々の抗体で捕捉された微粒子中の総ＤＮＡのゲノム当量（ｇｅｎｏｍｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を示すグラフである。総ＤＮＡのゲノム当量を、β−グロビン遺伝子に対するプライマーを用いたデジタルＰＣＲによって決定した。棒の各対の左の棒は、男子胎児を有する妊娠３２週の患者から単離されたゲノム当量を示し、右の棒は、非妊娠女性コントロールから単離されたゲノム当量を示す。ＰＬＡＰは、胎盤アルカリホスファターゼに結合する抗体を使用して、上記胎児微粒子を捕捉した場合に、上記結果が得られたことを示す。Ｇ２３３、Ｇ１、およびＧ９は、それら抗体の各々（これは、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）の異なるエピトープに結合する）を使用して、上記胎児微粒子を捕捉した場合に、上記結果が得られたことを示す。ＣＤ４１は、上記結果が、ＣＤ４１（血小板についてのマーカー）と結合する抗体を使用した場合に得られたことを示す。ＣＤ４１の結果については、棒のその対の左の棒は、この図面においては認められない。Ｆａｓ−Ｌは、Ｆａｓ−Ｌ（Ｆａｓリガンド、アポトーシスのマーカー）と結合する抗体を使用した場合に上記結果が得られたことを示す。
【図２】図２は、示されるように、種々の生体マーカーを用いて捕捉された微粒子中の胎児ＤＮＡのゲノム当量を示すグラフである。胎児ＤＮＡのゲノム当量を、Ｙ染色体特異的配列Ｙ４９ａ（ＤＹＳ１）遺伝子に対するプライマーを用いたデジタルＰＣＲによって決定した。棒の各対の左の棒は、男子胎児を有する妊娠３２週の患者から単離されたゲノム当量を示し、右の棒は、非妊娠女性コントロールから単離されたゲノム当量を示す。各実験において微粒子捕捉のために使用した生体マーカーは、棒の各対の下に示される。胎児ＤＮＡの富化を、このサンプルについての微粒子捕捉のための上記抗ＰＬＡＰ抗体を使用して達成した。ＰＬＡＰの結果については、対の棒のうちの右の棒は、この図面において認められない。Ｇ２３３の結果については、対の棒のうちの左の棒は、この図面において認められない。Ｇ１の結果については、対の棒のうちの左の棒は、この図面において認められない。Ｇ９の結果については、対の棒のうちの右の棒は、この図面において認められない。ＣＤ４１の結果については、対の棒のうちの右の棒は、この図面において認められない。Ｆａｓ−Ｌの結果については、対の棒のうちの右の棒は、この図面において認められない。
【図３Ａ】図３は、微粒子捕捉による富化の後およびデジタルＰＣＲによって決定した場合のＤＮＡのパーセント収率を示す。パネルＡは、富化後の総ＤＮＡのパーセント収率を示すグラフであり、パネルＢは、富化後の胎児ＤＮＡのパーセント収率を示すグラフである。上記収率は、微粒子捕捉前の母体血漿中に存在する量（すなわち、それぞれ、捕捉前の総ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡについての１３５０ゲノム当量（ＧＥ）／ｍＬ血漿および１９４  ＧＥ／ｍＬ血漿）に対する総ＤＮＡもしくは胎児ＤＮＡの量である。棒の各対の左の棒は、男子胎児を有する妊娠３２週の患者から単離されたゲノム当量を示し、右の棒は、非妊娠女性コントロールから単離されたゲノム当量を示す。各実験における微粒子捕捉のために使用される生体マーカーは、棒の各対の下に示される。
【図３Ｂ】図３は、微粒子捕捉による富化の後およびデジタルＰＣＲによって決定した場合のＤＮＡのパーセント収率を示す。パネルＡは、富化後の総ＤＮＡのパーセント収率を示すグラフであり、パネルＢは、富化後の胎児ＤＮＡのパーセント収率を示すグラフである。上記収率は、微粒子捕捉前の母体血漿中に存在する量（すなわち、それぞれ、捕捉前の総ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡについての１３５０ゲノム当量（ＧＥ）／ｍＬ血漿および１９４  ＧＥ／ｍＬ血漿）に対する総ＤＮＡもしくは胎児ＤＮＡの量である。棒の各対の左の棒は、男子胎児を有する妊娠３２週の患者から単離されたゲノム当量を示し、右の棒は、非妊娠女性コントロールから単離されたゲノム当量を示す。各実験における微粒子捕捉のために使用される生体マーカーは、棒の各対の下に示される。
【図４】図４は、種々の生体マーカーでの捕捉後に得られた胎児ＤＮＡの富化を示すグラフである。上記富化倍数を、捕捉後の胎児ＤＮＡ％を微粒子捕捉前の母体血漿中の胎児ＤＮＡ％で割ることにより計算した（例えば、２倍富化は、胎児画分の倍増であり；１倍は、富化なしである）。この実験において使用した血漿サンプルは、男子胎児を有する妊娠３２週の患者に由来した。各実験において微粒子捕捉のために使用した生体マーカーは、各棒の下に示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本発明の実施形態は、複雑な混合物中の微粒子、細胞、もしくは核酸の稀な集団を富化および定量するための方法を提供する。上記方法は、微粒子もしくは細胞の特定の集団の捕捉のため、およびそれによるこれら微粒子もしくは細胞内の核酸の富化のための生体マーカーの使用を伴う。これら方法はまた、当業者に公知の感度の高い方法（例えば、一分子計数法（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ））を使用して、これら核酸の定量を伴う。なぜなら、単離される核酸の量が非常に低く高純度であると予測され、そしてより従来的な定量法（例えば、分光光度法、色素インターカレーション（ｄｙｅ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）、もしくは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に関して検出限界未満であり得るからである（しかしこのような従来の定量法は、いくつかの場合においては適切であり得る）。上記開示される富化方法は、胎盤細胞のアポトーシスの間に微粒子中に封入された胎児ＤＮＡの単離、富化、および検出のための特定の適用を有する。これら胎児ＤＮＡ含有微粒子は、妊娠期間の間中ずっと母体血漿中に循環していることが公知である。上記開示される富化方法はまた、稀な疾患細胞（例えば、癌細胞）もしくは血中に循環している疾患特異的微粒子（例えば、癌微粒子）における変異の同定において適用を有する。
【００１６】
（定義および略語）
用語「微粒子」、「アポトーシス小体」、「微小胞」、および「小胞」とは、例えば、アポトーシスもしくは他のタイプの細胞死の間に、それらが由来する細胞の遺伝物質および表面生体マーカーを含み得る膜結合した粒子を言うために、本明細書において交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、用語「生体マーカー」とは、特定の細胞タイプ上もしくは細胞中に存在する分子（例えば、胎児細胞の表面にある胎盤アルカリホスファターゼタンパク質）を言う。「胎児微粒子」、「胎児由来微粒子」、「胎児関連微粒子」などは、胎児細胞のアポトーシスに主に起因して、生まれてくる子供の母親の血流もしくは他の生物学的サンプルにおいて見いだされ得る微粒子である。胎児微粒子は、胎児特異的生体マーカーをそれらの表面に有し得、胎児ＤＮＡを含み得る。「疾患微粒子」、「疾患特異的微粒子」、「疾患関連微粒子」などは、特定の疾患に対して特異的な生体マーカーを有する微粒子である。癌微粒子は、それらの表面に腫瘍特異的もしくは癌特異的なマーカーを有し得る。「癌微粒子」、「癌細胞由来微粒子」、「癌関連微粒子」などは、癌細胞のアポトーシスもしくは他のタイプの細胞死、または癌細胞からの他の放出に起因して、癌を有する患者の血流もしくは他の体液中に見いだされ得る微粒子である。癌微粒子は、それらの表面に腫瘍特異的もしくは癌特異的なマーカーを有し得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「生物学的サンプル」とは、稀な細胞、稀な微粒子、もしくは稀な核酸が、他の細胞、微粒子、もしくは核酸とともに同じサンプルに存在する、本発明の方法において使用するために適した生物学的供給源から得られる任意のサンプルを包含する。生物学的サンプルとしては、非限定的例によれば、全血、血清、血漿、他の血液画分、羊水、培養細胞、および／もしくは絨毛膜絨毛が挙げられ得る。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、任意の他の血液画分サンプル、もしくはこれらの組み合わせである。生物学的サンプルは、当業者に公知の任意の方法によって個体から得られ得、直接的に（例えば、上記個体からの静脈穿刺によって血液サンプルを得る）得てもよいし、間接的に（例えば、上記患者から生物学的サンプルを直接得たヘルスケア提供者、病院、もしくは実施者から上記生物学的サンプルを得る）得てもよい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「被験体」とは、ヒトもしくは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、もしくは霊長類）を言うために使用される。好ましくは、上記被験体はヒトである。被験体は、「患者」であり得、患者は、ある状態もしくは疾患のための診断、処置、もしくはケアについての医療提供者に紹介されるヒトをいう。用語「患者」および「個体」は、本明細書で交換可能に使用され得る。一実施形態において、上記患者もしくは個体は、女性であり、彼女の状態は、彼女が妊娠していることである。いくつかの実施形態において、被験体は、疾患もしくは障害に罹患していてもよいし、またはこれに罹りやすくてもよいが、上記疾患もしくは障害の症状を示してもよいし、示さなくてもよい。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死の形態を言う。アポトーシスは、細胞の表面に形態的変化を引き起こし、しばしば、細胞膜の「ブレビング」を生じ、これは、微粒子が形成する原因となる。上記微粒子は細胞膜から形成されるので、それらは、本来の細胞もまた発現した任意の膜特異的マーカーを有する（例えば、胎児特異的マーカー、疾患特異的マーカー、もしくは腫瘍特異的マーカー）。一例において、アポトーシスは、妊娠の間に、胎盤細胞もしくは胎児細胞に天然に起こる。
【００２０】
用語「富化」とは、複雑な混合物からの稀な微粒子、細胞、もしくは核酸の濃縮（例えば、母体の血液サンプル中の胎児微粒子の富化）を言うために本明細書において使用される。用語「免疫富化」とはまた、抗体、抗体フラグメント、もしくは特異的結合分子が、稀な微粒子、細胞もしくは核酸を複雑な混合物から捕捉するために使用される富化方法を言うために使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「結合分子」とは、複雑な混合物中の、目的の稀な粒子、細胞、もしくは核酸と特異的に結合する分子を言うために使用される。一実施形態において、上記結合分子は、上記目的の稀な粒子、細胞、もしくは核酸と特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、タンパク質レセプター、もしくは他のタンパク質である。別の実施形態において、上記結合分子は、「生体マーカー」であって、上記生体マーカーは、上記目的の稀な粒子、細胞、もしくは核酸と特異的に相互作用するタンパク質を言う。富化は、標的物質（例えば、胎児微粒子）の、捕捉が行われた後の上記サンプル中の他の物質に対する量の比と、上記標的物質の、捕捉前の最初のサンプル中の他の物質に対する比とを比較することによって決定される。富化は、上記標的物質を検出することに関して、上記捕捉された物質の質の増大（すなわち、標的物質の、存在する他の物質に対する比の増大）を生じる。
【００２１】
用語「染色体異常」とは、染色体と関連した欠陥の任意の種類（単一もしくは複数の塩基対の欠失、付加、および置換；転座；または完全な染色体の数もしくは染色体セットの欠陥が挙げられる）を言うために本明細書で使用される。用語「異数性」とは、１個以上の染色体が失われているか、または正常なコピー数より多く存在する場合を言う。異数性は、多くの疾患もしくは症候群と関連し、これらとしては、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトウ症候群、およびターナー症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」もしくは「ＰＣＲ」とは、少量の核酸（例えば、ＤＮＡ）を増幅し（その濃度を増大させ）そして／または定量するために使用される分子生物学技術を言う。特定の目的に特化されている多くの形態のＰＣＲが存在する（例えば、デジタルＰＣＲもしくはリアルタイムＰＣＲ）。例えば、デジタルＰＣＲは、個々の核酸分子を別個の領域に分割することによって、核酸の絶対的定量化をよりよく提供し得る独創的なＰＣＲ技術の改善である。種々の他のＰＣＲ技術（本明細書に記載されるもの（例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、およびデジタルＰＣＲ）が挙げられる）は、当業者に周知であり、特定のサンプルに存在する核酸の量に依存して、本発明の方法において使用され得る。
【００２３】
（複雑な組成物中の胎児微粒子の富化方法）
いくつかの実施形態において、本発明は、生物学的サンプルと、胎児微粒子と結合する結合分子とを合わせる工程、および上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、胎児微粒子について富化される工程によって、生物学的サンプル中の胎児微粒子を富化するための方法を提供する。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、および他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含む。微粒子は、それらが由来した細胞の表面生体マーカーおよび核酸（例えば、ＤＮＡ）を含むので、微粒子の捕捉および富化は、元の細胞の表面特異的生体マーカーを使用することによって達成され得る。例えば、胎児ＤＮＡ富化に関しては、胎児特異的タンパク質（例えば、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ；組織適合性抗原、クラスＩ、Ｇ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、もしくは胎児フィブロネクチン、またはこれらの組み合わせ）に結合する結合分子は、母体血漿中に循環する上記胎児微粒子を同定および捕捉するために使用され得る。他の実施形態において、上記胎児特異的タンパク質は、以下からなる群より選択される：胎盤ラクトゲン、２１番染色体オープンリーディングフレーム１０５、アデュシン１（α）（ａｄｄｕｃｉｎ  １（ａｌｐｈａ））、ビオチニダーゼ、クローディン６（ｃｌａｕｄｉｎ  ６）、凝固因子ＩＩ（トロンビン）、凝固因子ＶＩＩＩ凝固促進成分、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ  ＤＲ  β４、ラクトトランスフェリン、ＭＡＳ１癌遺伝子、タイチン、バソヒビン１、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン１、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン２、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン様１、インスリン様増殖因子結合タンパク質１、妊娠特異的β−１糖タンパク質１、Ｈ１９、組織因子経路インヒビター２、妊娠特異的β−１糖タンパク質３、妊娠特異的β−１糖タンパク質９、妊娠特異的β−１糖タンパク質６、インスリン様増殖因子２、δ様１ホモログ、プロテオグリカン２、ＥＦハンドドメインファミリーメンバーＤ１、妊娠特異的β−１−糖タンパク質７、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン１２、フィブロネクチン１、パパライシン１（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ  １）、コルチコトロピン放出ホルモン、インスリン様増殖因子結合タンパク質３、セマフォリン３Ｂ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ３Ｂ）、コラーゲンＩＶ型α１、妊娠特異的β−１−糖タンパク質５、妊娠特異的β−１−糖タンパク質２、アミロリド結合タンパク質１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｐ、増殖分化因子１５、内皮ＰＡＳドメインタンパク質１、ＣＤ５９抗原、成長ホルモン２、シンデカン１（ｓｙｎｄｅｃａｎ  １）、セリンプロテアーゼインヒビタークレードＥメンバー２、コラーゲン、タイプＩＩＩ、α−１、コラーゲン４型α２、ホスホリパーゼＡ２  グループＩＩＡ、ヒドロキシ−δ−５−ステロイドデヒドロゲナーゼ３β１、エプスタイン・バー・ウイルス誘導遺伝子３、ＫｉＳＳ−１転移抑制因子、ＫＩＳＳ１−Ｒ（レセプター）、シトクロームＰ４５０ファミリー１９  ｓｕｂＡ１、フィビュリン１（ｆｉｂｕｌｉｎ  １）、ケラチン１８、ポリ���ム（ｐｏｌｙｄｏｍ）、トランスグルタミナーゼ２、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１、アドレノメデュリン、プロテアーゼセリン１１、メタロプロテイナーゼ組織インヒビター２、フォリスタチン様１、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１、メタロプロテイナーゼ組織インヒビター３、上皮増殖因子レセプター、糖タンパク質ｎｍｂ、絨毛性ゴナドトロピンβポリペプチド７、絨毛性ゴナドトロピンβポリペプチド８、絨毛性ゴナドトロピンβポリペプチド２、ディスエーブルドホモログ２（ｄｉｓａｂｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子２、ＦＬＪ１４１４６、ファミリーウィズシークエンスシミラリティー４６メンバーＡ（ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ４６  ｍｅｍｂｅｒ  Ａ）、シトクロームｐ４５０ファミリー１１  ｓｕｂｆ  Ａポリペプチド１、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ２、セリンプロテアーゼインヒビタークレードＥメンバー１、コラーゲンＩ型α１、熱ショック２２ｋＤａタンパク質８、マンノシダーゼαクラス１Ｃメンバー１、グリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ  ３）、胎盤特異的１、新規ＭＡＦＦ様タンパク質、カルパイン６（ｃａｌｐａｉｎ  ６）、Ｇ抗原ファミリーＣ１、Ｒｈｏ関連ＢＴＢドメイン含有３、コラーゲン６型α１、腫瘍抑制因子候補３、ＥＧＦ様ドメインマルチプル６、タキキニン３（ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ３）、タキキニン３レセプター、分泌型ホスホプロテイン１、ＲＡＳ  ｐ２１タンパク質アクチベーター、レクチンガラクトシド結合可溶性１４（ｐｐｌ１３）、テンシン（ｔｅｎｓｉｎ）様ＳＨ２ドメイン含有１、システインリッチ運動ニューロン１、フィブリリン２（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ  ２）、マトリクスメタロプロテイナーゼ１１、絨毛性ゴナドトロピンβ  ポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンβポリペプチド５、トロンボスポンジン（ｔｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｇ）１型ドメイン３、父親性発現１０（ｐａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  １０）、ビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、コラーゲンＸＶ型α１、セリンプロテイナーゼインヒビタークレードＢメンバー２、デス関連プロテインキナーゼ１（ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １）、転写因子ＡＰ−２α、トランスゲリン（ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）、胎盤増殖因子、ミクロフィブリラー関連タンパク質５（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５）、パパライシン２（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ  ２）（ｐｌａｃ３）、リン脂質転移タンパク質、プレクストリン相同性−１様ドメイン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ）、ファミリーＡ（ｆａｍｉｌｙ  Ａ）、メンバー２（ｍｅｍｂｅｒ  ２）、ケラチン８、プロテインキナーゼインヒビターβ、インスリンレセプター、ディスクスラージホモログ５（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ５）、ヒドロキシステロイド（１１−β）デヒドロゲナーゼ  ２、骨形態形成タンパク質１、Ｔ−ｂｏｘ  ３、妊娠特異的β−１−糖タンパク質  １１、グリア細胞ミッシングホモログ１（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｓｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）、アルカリホスファターゼ胎盤様  ２、アンギオテンシンＩＩレセプター１型、カドヘリン５  ２型、ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、インスリン様４（胎盤）、インヒビンβ  Ａ（アクチビンＡ）、ＣＯＢＬ様  １、トランスホーミング増殖因子βレセプターＩＩＩ、組織因子経路インヒビター、レチノイン酸刺激遺伝子ホモログ（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｈｏｍｏｌｏｇ）、結合接着分子２（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）、ｖｅｓｔｉｇｉａｌ様１（ｖｅｓｔｉｇｉａｌ  ｌｉｋｅ  １）、ｒｈｏ関連ＢＴＢドメイン含有１、脳特異的タンパク質、インターロイキン１レセプター１型、ステロイドスルファターゼ、セリンプロテイナーゼインヒビタークレードＨメンバー１、Ｇタンパク質共役レセプター１２６、およびレクチンガラクトシド結合可溶性１３。あるいは、アポトーシスに特異的な生体マーカー（例えば、アネキシンＶもしくはＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）、またはこれらの組み合わせ）が使用され得る。さらに、胎児特異的マーカーおよびアポトーシスマーカーの組み合わせが使用され得る。
【００２４】
特定の実施形態において、上記使用される結合分子は、抗体もしくは抗体フラグメントである。他の実施形態において、上記結合分子は、上記所望の生体マーカーと特異的に結合するレセプターもしくは他のタンパク質である。好ましくは、上記結合分子は、胎児微粒子と結合し得るが、母体微粒子とは結合しない。特定の実施形態において、上記抗体もしくは抗体フラグメントは、ＰＬＡＰ、ＨＬＡ−Ｇ、もしくはＦａｓ−Ｌに結合する。ＨＬＡ−Ｇと結合する抗体の例としては、Ｇ１、Ｇ９、およびＧ２３３が挙げられる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは他の結合分子は、上記微粒子の直接的検出のための検出可能な標識を有し得る。検出可能な標識の例としては、当業者に公知の蛍光色素、放射活性タグ、比色タグなどが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「標識」および「タグ」は、上記結合分子もしくは二次抗体タンパク質に結合される部分を言うために交換可能に使用される。あるいは、上記結合分子／微粒子複合体は、間接的に検出される。いくつかの実施形態において、検出可能な標識を有し、かつ上記微粒子特異的抗体、抗体フラグメント、もしくは他の結合分子に結合し得る二次抗体は、微粒子の所望の集団を間接的に検出するために使用され得る。
【００２６】
特定の実施形態において、微粒子の所望の集団は、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは他の結合分子での免疫富化の前もしくは後にさらに富化される。例えば、対比染色（例えば、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ、もしくは特定の細胞条件下で核酸にも結合する当業者に公知の別の染料）は、核酸を含む微粒子についてさらに細分画（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅ）しかつ富化するために使用され得る。他の実施形態において、上記生物学的サンプルは、母体生体マーカーに対して特異的な結合分子を使用することによって、母体微粒子が選択的に除去される。検出および富化は、次いで、免疫富化を介して達成され得、ここで固体支持体が、上記抗体／微粒子および／もしくは生体マーカー／微粒子複合体を、上記血漿の残りから分離するために使用される。フローサイトメトリーはまた、サイズ、形状、および蛍光シグナルによって、上記標識された微粒子をえり分ける（ｓｏｒｔ）ソために、免疫富化の前に使用され得る。
【００２７】
特定の実施形態において、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは生体マーカーは、富化の前に、固体支持体に直接結合される。あるいは、上記結合分子／微粒子複合体は、最初に形成され得、次いで、直接的か、もしくは固体支持体に結合体化された二次抗体を介して間接的かのいずれかでの単離のために、固体支持体に結合され得る。さらに、上記抗体／微粒子および／もしくは生体マーカー／微粒子複合体の形成の前に、上記サンプル中の内因性抗体は、当業者に公知の方法によって除去され得る。なぜなら、上記内因性抗体は、免疫富化の間に上記固体支持体に非特異的に結合し得、それによって、上記プロセスの効率を低下させ得るからである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリスチレンのビーズもしくは樹脂である。上記固体支持体としての樹脂に結合される、上記結合分子として抗体を使用する免疫沈降のための方法の一例は、ＰＩＥＲＣＥ  ＤＩＲＥＣＴ  ＩＰ  ＫＩＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）である。他の実施形態において、上記固体支持体は、カラム、プレート、ウェル、チューブなどであり得る。他の固体支持体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：磁性のビーズもしくは樹脂、アガロースのビーズもしくは樹脂、およびポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミド樹脂。上記生物学的サンプルを２つ以上の画分へと分離することは、例えば、上記サンプルをフローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮に供することによって行われ得る。
【００２９】
上記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、もしくは任意の他の血液画分サンプルのうちの少なくとも１つを含み得、上記サンプルは、当業者に公知の任意の方法によって上記患者から得られ得る。全血サンプルを２つ以上の血液画分サンプルに分離するための種々の方法は、当業者に周知である。一実施形態において、全血サンプルは、静脈穿刺によって個体から得られ、次いで、血漿画分を残りの血液画分から分離するために、低速遠心分離を使用して、遠心分離される。
【００３０】
（胎児核酸を富化するための方法）
生物学的サンプル中の胎児核酸（例えば、ＤＮＡ）を富化するための方法もまた、提供され、上記方法は、生物学的サンプルを、胎児微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、胎児微粒子について富化される工程、およびＤＮＡを、上記結合分子を含む上記画分から単離し、それによって、上記生物学的サンプル中の胎児ＤＮＡを富化する工程を包含する。上記生物学的サンプルは、例えば、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、もしくは他の血液画分サンプルであり得る。上記結合分子は、胎児微粒子と結合し、母体微粒子とは結合せず、例えば、抗体、抗体フラグメント、レセプター、もしくは他の特異的結合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、もしくはＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）に結合する。ＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する抗体の例は、Ｇ１、Ｇ９、およびＧ２３３である。他の実施形態において、上記結合分子は、前の節において列挙された上記胎児特異的タンパク質のうちの１つと結合する。
【００３１】
上記ＤＮＡ富化方法の特定の実施形態において、上記結合分子は、検出可能な標識を有する。例えば、上記結合分子は、蛍光タグ、放射活性標識、もしくは比色標識を有し得る。上記結合分子は、直接的か、もしくは固体支持体に結合体化される二次抗体を介して間接的かのいずれかで、富化のために固体支持体に結合され得る。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリスチレンのビーズもしくは樹脂である。他の実施形態において、上記固体支持体は、カラム、プレート、ウェル、チューブなどである。他の実施形態において、上記固体支持体は、磁性のビーズもしくは樹脂、アガロースのビーズもしくは樹脂、またはポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミド樹脂であり得る。
【００３２】
上記生物学的サンプルを２つ以上の画分へ分離することは、上記サンプルをフローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮に供することによって行われ得る。特定の実施形態において、微粒子の所望の集団は、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは他の結合分子での免疫富化の前もしくは後に、さらに富化される。例えば、上記抗体／微粒子および／もしくは生体マーカー／微粒子複合体の形成の前に、上記サンプル中の内因性抗体は、当業者に公知の方法によって除去され得る。なぜなら、上記内因性抗体は、免疫富化の間に上記固体支持体に非特異的に結合し得、それによって、上記プロセスの効率を低下させ得るからである。さらに、対比染色（例えば、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ、もしくは特定の細胞条件下で核酸にも結合する当業者に公知の他のもう一つの染色）は、核酸を含むそれら微粒子についてさらに細分画および富化するために使用され得る。他の実施形態において、上記生物学的サンプルは、最初に、母体生体マーカーに対して特異的な結合分子を使用することによって、母体微粒子を選択的に枯渇させられる。検出および富化は、次いで、免疫富化を介して達成され得る。ここで固体支持体は、上記抗体／微粒子および／もしくは生体マーカー／微粒子複合体を残りの血漿から分離するために使用される。フローサイトメトリーはまた、サイズ、形状、および蛍光シグナルによって、上記標識された微粒子をえり分けるために、免疫富化の前に使用され得る。特定の実施形態において、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは生体マーカーは、富化の前に、固体支持体に直接結合される。
【００３３】
上記富化された微粒子画分から核酸を単離することは、当業者に周知の１つ以上の方法によって行われ得る。例えば、上記微粒子は、標準的な分子生物学技術を使用して、固体支持体上で直接可溶化され得る。このような方法の例は、上記微粒子を溶解もしくはばらばらにするために、界面活性剤もしくはカオトロピック塩の使用を含む。ＤＮＡ抽出法の一例は、ＱＩＡＡＭＰ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）とともに使用される方法である。あるいは、いくつかの場合においては、上記サンプルは、４００ｒｐｍにおいて振盪しながら、プロテイナーゼＫとともに、３０分間にわたって５６℃においてインキュベートされ得、続いて、９５℃において２０分間にわたって熱非働化され得、５，０００ｇにおいて５分間にわたって遠心分離され得、そしてさらなる分析のために砕片から上清が取り出され得る。種々の改変がまた、いくつかの実施形態において、抽出のために適切であり得る。さらに、ＤＮＡ抽出のための他の適切な方法は、当業者に周知である。
【００３４】
胎児核酸の量は、感度の高い方法（例えば、リアルタイムＰＣＲもしくはデジタルＰＣＲ）によって各画分において決定され得る。次いで、上記胎児核酸はまた、任意の遺伝的欠陥もしくは染色体異常について試験され得る。いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用され得る（すなわち、１つより多くの胎児遺伝子が、単一のＰＣＲ反応において同時に増幅され得る）。あるいは、上記胎児核酸は、当業者に公知の配列決定法によって分析され得る。上記標的分子が増幅され得る他の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全ゲノム増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖増幅、およびマルチプルＰＣＲ法（定量的リアルタイムＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、およびデジタルＰＣＲが挙げられる）。上記増幅される標的は、蛍光（例えば、プローブ、色素、もしくはヌクレオチド）；ケミルミネッセンス；放射活性；キャピラリー電気泳動；マイクロアレイ；配列決定；質量分析；およびナノストリング技術が挙げられるが、これらに限定されない方法で検出され得る。上記開示される富化方法は、妊娠トリメスター第１期程度の早期に行われ得、発育中の胎児の健康をモニターし続けるために上記妊娠の間を通じて反復され得る。
【００３５】
（胎児の健康の出生前診断のための侵襲性のより低い方法）
胎児における染色体異常の出生前診断を促進するための侵襲性のより低い方法が提供され、上記方法は、生物学的サンプルを妊娠女性から得る工程、上記生物学的サンプルを胎児微粒子と結合する結合分子とを合わせる工程、上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、胎児微粒子について富化される工程、核酸を、上記結合分子を含む上記画分から単離する工程、および上記単離された核酸を分析して、上記染色体異常の存在もしくは非存在を検出する工程を包含する。
【００３６】
一実施形態において、上記染色体異常は、疾患と関連する変異である。特定の局面において、上記染色体異常は、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、もしくはＸ染色体の異数性であり得る。特定の他の局面において、上記染色体異常は、父性で制御される対立遺伝子である。特定の他の局面において、上記染色体異常は、点変異である。いくつかの実施形態において、上記侵襲性のより低い方法は、上記胎児の妊娠持続期間が約１６週未満である場合に妊娠女性から得られるサンプルに対して信頼性がある。一実施形態において、上記非侵襲的な方法は、妊娠のトリメスター第１期の間に妊娠女性から得られるサンプルについて信頼性がある。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記結合分子は、胎児微粒子と結合し、母体微粒子とは結合せず、例えば、抗体、抗体フラグメント、レセプター、もしくは他の特異的結合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）、もしくはＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）に結合する。ＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する抗体の例は、Ｇ１、Ｇ９、およびＧ２３３である。上記に列挙される胎児特異的結合タンパク質のうちの１つに結合する他の結合分子が使用され得る。
【００３８】
上記核酸富化方法の特定の実施形態において、上記結合分子は、検出可能な標識を有する。例えば、上記結合分子は、蛍光タグ、放射活性標識、もしくは比色標識を有し得る。上記結合分子は、直接的か、または固体支持体に結合体化された二次抗体を介して間接的かのいずれかで、富化のための固体支持体に結合され得る。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリスチレンのビーズもしくは樹脂である。他の実施形態において、上記固体支持体は、カラム、プレート、ウェル、チューブなどである。他の実施形態において、上記固体支持体は、磁性のビーズもしくは樹脂、アガロースのビーズもしくは樹脂、またはポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミド樹脂である。上記生物学的サンプルを２つ以上の画分へ分離することは、上記サンプルを、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮に供することによって行われ得る。特定の実施形態において、微粒子の所望の集団は、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは他の結合分子での免疫富化の前もしくは後に、さらに富化される。例えば、上記抗体／微粒子および／もしくは生体マーカー／微粒子複合体の形成の前に、上記サンプル中の内因性抗体は、当業者に公知の方法によって除去され得る。なぜなら、上記内因性抗体は、免疫富化の間に上記固体支持体に非特異的に結合し得、それによって、上記プロセスの効率を低下させ得るからである。さらに、対比染色（例えば、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ、もしくは特定の細胞条件下で核酸にも結合する、当業者に公知の別の染料）は、核酸を含む微粒子をさらに細分画および富化するために使用され得る。他の実施形態において、上記生物学的サンプルは、最初に、母体生体マーカーに対して特異的な結合分子を使用することによって、母体微粒子が選択的に除去される。次いで、検出および富化は、固体支持体を使用して、上記抗体／微粒子および／もしくは生体マーカー／微粒子複合体を残りの血漿から分離する免疫富化を介して達成され得る。フローサイトメトリーをまた、免疫富化の前に使用して、サイズ、形状、および蛍光シグナルによって、上記標識された微粒子をえり分けし得る。特定の実施形態において、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは生体マーカーは、富化の前に、固体支持体に直接結合される。
【００３９】
上記富化された微粒子画分からの核酸単離は、当業者に周知の１つ以上の方法によって行われ得る。例えば、上記微粒子は、標準的な分子生物学技術を使用して、固体支持体上に直接可溶化され得る。このような方法の例は、上記微粒子を可溶化またはばらばらにするために、界面活性剤もしくはカオトロピック塩の使用を含む。ＤＮＡ抽出法の一例は、ＱＩＡＡＭＰ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）とともに使用される方法である。あるいは、いくつかの場合において、上記サンプルは、プロテイナーゼＫとともに、３０分間にわたって５６℃で、４００ｒｐｍにおいて振盪しながらインキュベートされ得、続いて、９５℃において２０分間にわたる熱非働化、５，０００ｇにおいて５分間にわたる遠心分離、およびさらなる分析のための砕片から上清の取り出しが行われ得る。これら抽出法の種々の改変はまた、いくつかの実施形態において、抽出のために適切であり得る。さらに、核酸抽出の他の適切な方法は、当業者に周知である。
【００４０】
胎児核酸の量は、感度の高い方法（例えば、リアルタイムＰＣＲもしくはデジタルＰＣＲ）によって、各画分において決定され得る。次いで、上記胎児核酸は、任意の遺伝的欠陥もしくは染色体異常についても試験され得る。いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用され得る（すなわち、１つより多くの胎児遺伝子が、単一のＰＣＲ反応において同時に増幅され得る）。あるいは、上記胎児核酸は、当業者に公知の配列決定法によって分析され得る。上記標的分子が増幅され得る他の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全ゲノム増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖増幅、およびマルチプルＰＣＲ法（定量的リアルタイムＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、およびデジタルＰＣＲが挙げられる）。上記増幅された標的は、蛍光（例えば、プローブ、色素、もしくはヌクレオチド）；ケミルミネッセンス；放射活性；キャピラリー電気泳動；マイクロアレイ；配列決定；質量分析；およびナノストリング技術が挙げられるが、これらに限定されない方法で検出され得る。上記開示される富化方法は、上記妊娠のトリメスター第１期と同程度に早く行われ得、上記発育中の胎児の健康をモニターし続けるために上記妊娠の間を通じて、反復され得る。
【００４１】
（疾患特異的微粒子を富化するための方法）
上記開示される方法はまた、疾患に対して特異的な微粒子の検出に適用され得る。例えば、複雑な混合物中の癌微粒子もしくは他の疾患特異的微粒子を富化するための方法、ならびに癌、もしくは細胞死およびアポトーシスと関連した他の疾患の診断を促進するための方法が提供される。上記富化方法および診断方法はともに、生物学的サンプルを、疾患特異的微粒子と結合する結合分子と合わせる工程、および上記生物学的サンプルのうちの２つ以上の画分を分離する工程であって、ここで上記結合分子を含む画分は、疾患特異的微粒子について富化される工程を包含する。癌のような疾患の診断のために、核酸は、次いで、上記結合分子を含む上記画分から単離され、上記疾患（例えば、癌）と関連した変異の存在もしくは非存在を検出するために分析される（ここで上記変異の存在は、上記個体が上記疾患を有することを示す）。上記生物学的サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、他の血液画分サンプル、または癌もしくは疾患細胞と接触した状態にあった任意の体液のサンプル（例えば、胆汁、尿、粘液、脳脊髄液、腹膜液、リンパ液など）であり得る。上記結合分子は、疾患微粒子と結合し、正常細胞由来の微粒子とは結合しない、抗体、抗体フラグメント、レセプター、または他の特異的結合タンパク質であり得る。
【００４２】
これら方法の特定の実施形態において、上記結合分子は、検出可能な標識（例えば、蛍光タグ、放射活性標識、もしくは比色標識）を有する。上記結合分子は、直接的か、もしくは固体支持体に結合体化される二次抗体を介して間接的かのいずれかで、富化のために固体支持体に結合され得る。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリスチレンのビーズもしくは樹脂である。他の実施形態において、上記固体支持体は、カラム、プレート、ウェル、チューブなどである。他の実施形態において、上記固体支持体は、磁性のビーズもしくは樹脂、アガロースのビーズもしくは樹脂、またはポリアクリルアミド／ビス−アクリルアミド樹脂である。上記生物学的サンプルを２つ以上の画分へと分離することは、上記サンプルを、フローサイトメトリー、サイズ排除濾過、もしくは磁性粒子濃縮に供することによって行われ得る。特定の実施形態において、癌微粒子の所望の集団は、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは他の結合分子を用いた免疫富化の前もしくは後に、さらに富化される。例えば、上記結合分子／微粒子複合体の形成の前に、上記生物学的サンプル中の内因性抗体は、当業者に公知の方法によって除去されて、免疫富化の間に上記内因性抗体が上記固体支持体に非特異的に結合することを除去もしくは低下させ得る。さらに、対比染色（例えば、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ、もしくは特定の細胞条件の下で核酸にも結合する、当業者に公知の他の別の染料）は、核酸を含む微粒子について細分画および富化するために使用され得る。他の実施形態において、上記生物学的サンプルは、上記特定の生物学的サンプルにおいて予測される細胞タイプによって生成される微粒子が、それら細胞に存在する生体マーカーに対して特異的な結合分子を使用することによって、選択的に除去される。次いで、検出および富化は、固体支持体が、上記結合分子／微粒子複合体を残りのサンプルから分離するために使用される免疫富化を介して達成され得る。フローサイトメトリーはまた、免疫富化の前に使用されて、上記標識された微粒子を、サイズ、形状、および蛍光シグナルによってえり分けし得る。特定の実施形態において、上記抗体、抗体フラグメント、もしくは生体マーカーは、富化の前に、固体支持体に直接結合される。
【００４３】
上記富化された微粒子画分からの核酸の単離は、当業者に周知の１つ以上の方法によって行われ得る。核酸の量は、感度の高い方法（例えば、リアルタイムＰＣＲもしくはデジタルＰＣＲ）によって、各画分において決定され得る。いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用され得る（すなわち、１つより多くの遺伝子が、単一のＰＣＲ反応において同時に増幅され得る）。あるいは、上記核酸は、当業者に公知の配列決定法によって分析され得る。上記標的分子が増幅され得る他の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全ゲノム増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖増幅、およびマルチプルＰＣＲ法（定量的リアルタイムＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、およびデジタルＰＣＲが挙げられる）。上記増幅された標的は、蛍光（例えば、プローブ、色素、もしくはヌクレオチド）；ケミルミネッセンス；放射活性；キャピラリー電気泳動；マイクロアレイ；配列決定；質量分析；およびナノストリング技術が挙げられるが、これらに限定されない方法で検出され得る。
【００４４】
前述は、本発明の特定の実施形態に関連し、多くの変更が、本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは理解されるべきである。本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、以下の実施例は、その範囲に対して限定を課すとは如何様にしても解釈されるべきではない。反して、種々の他の実施形態、改変、およびその等価物が含まれねばならないこともあることは明らかに理解されるべきである。これは、本明細書の説明を読めば、本発明の趣旨および／もしくは添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者にそれを連想させ得る。
【実施例】
【００４５】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによってよりよく理解され得る。
【００４６】
（実施例１：母体血液サンプル中の胎児ＤＮＡの富化）
全血サンプルを、妊娠３２週の男子胎児を有する妊娠女性から、または妊娠していないコントロール女性から得た。その血液サンプルを、１６００ｇにおいて１０分間にわたって、２２〜２３℃で遠心分離にかけて、血漿画分を分離した。次いで、その血漿サンプルを、３５００ｇにおいてさらに１０分間、２２〜２３℃で遠心分離して、細胞砕片および血小板を除去した。ポリスチレンビーズを、胎児生体マーカーＨＬＡ−Ｇ、ＰＬＡＰ、もしくはＦａｓＬに対して作製した抗体と架橋した。次いで、上記血漿サンプルを、数時間にわたって４℃において上記抗体架橋ビーズとともにインキュベートして、記胎児微粒子を捕捉した。捕捉後、上記微粒子を、標準的な分子生物学方法を使用して（例えば、界面活性剤もしくはカオトロピック塩を使用して）、上記ビーズ上で直接可溶化し、そのＤＮＡを、胎児ＤＮＡに対して特異的な標的および総ＤＮＡに対して特異的な標的を使用して、デジタルＰＣＲによって特徴付けおよび定量した。
【００４７】
図１および図２は、このデジタルＰＣＲ分析の結果を示す。総ＤＮＡの上記ゲノム当量を、β−グロビン遺伝子に対するプライマーでのデジタルＰＣＲによって決定した。図１における棒の各対の左の棒は、上記男性胎児を有する３２週の妊娠患者から単離したゲノム当量を示し、右の棒は、上記非妊娠女性コントロールから単離したゲノム当量を示す。ＰＬＡＰは、胎盤アルカリホスファターゼに結合する抗体を、上記胎児微粒子を捕捉するために使用した場合に結果が得られたことを示す。Ｇ２３３、Ｇ１、およびＧ９は、それら抗体の各々（これは、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）の異なるエピトープに結合する）を、上記胎児微粒子を捕捉するために使用した場合に結果が得られたことを示す。ＣＤ４１は、ＣＤ４１（血小板のマーカー）と結合する抗体を使用した場合に結果が得られたことを示す。Ｆａｓ−Ｌは、Ｆａｓ−Ｌ（アポトーシスのマーカーであるＦａｓリガンド）と結合する抗体を使用した場合に結果が得られたことを示す。図１は、上記抗体架橋ビーズが、ＤＮＡを含む微粒子を捕捉し得ることを実証する。
【００４８】
図２は、捕捉された微粒子中の胎児ＤＮＡのゲノム当量を示すグラフである。胎児は男性であったので、上記胎児ＤＮＡのゲノム当量を、ＤＹＳ１遺伝子に対するプライマーを用いたデジタルＰＣＲによって決定した。あるいは、父親によって与えられることが公知の特異的配列もまた、胎児ＤＮＡの検出のために使用され得た。図２における棒の各対の左の棒は、上記男子胎児を有する３２週の妊娠患者から単離されたゲノム当量を示し、右の棒は、上記非妊娠女性コントロールから単離されたゲノム当量を示す。各実験における微粒子捕捉のために使用した生体マーカーは、棒の各対の下に示される。胎児ＤＮＡの富化を、このサンプルについての微粒子捕捉のために抗ＰＬＡＰ抗体を使用して達成した。図２は、抗体架橋ビーズが、ＤＮＡを含む胎児微粒子を捕捉および富化し得ることを実証する。
【００４９】
図３は、この同じ実験からのＤＮＡの収率％を示す（微粒子捕捉による富化後で、およびデジタルＰＣＲによって決定される場合）。パネルＡは、富化後の総ＤＮＡの収率％を示すグラフであり、パネルＢは、富化後の胎児ＤＮＡの収率％を示すグラフである。上記収率は、微粒子捕捉前の母体血漿中に存在する量（すなわち、捕捉前に、総ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡについて、それぞれ、１３５０ゲノム当量（ＧＥ）／ｍＬ血漿および１９４  ＧＥ／ｍＬ血漿）に対する総ＤＮＡもしくは胎児ＤＮＡの量である。棒の各対の左の棒は、男子胎児を有する３２週の妊娠患者から単離されたゲノム当量を示し、右の棒は、非妊娠女性コントロールから単離されたゲノム当量を示す。各実験における微粒子捕捉のために使用される生体マーカーは、棒の各対の下に示され、抗ＰＬＡＰを富化のために使用した。図３は、上記抗体架橋ビーズが、ＤＮＡを含む胎児微粒子を捕捉および富化し得ることをさらに実証する。ＰＬＡＰは、妊娠後期マーカー（ｌａｔｅｒ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）であるので、捕捉および富化のためのこのマーカーの使用は、妊娠後期スクリーニングのために有用であり得る。他の妊娠早期マーカー（ｅａｒｌｉｅｒ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）は、より早期の出生前診断のために有用である。
【００５０】
図４は、この同じ実験における種々の生体マーカーでの捕捉後に得られた胎児ＤＮＡの富化を示すグラフである。上記富化倍数を、微粒子捕捉前の母体血漿中の胎児ＤＮＡ％で割った富化後の胎児ＤＮＡ％として計算した（例えば、２倍富化は、上記胎児画分の倍増であり；１倍は、富化されていない）。この実験において使用した上記血漿サンプルは、妊娠３２週の男子胎児を有する患者に由来した。各実験における微粒子捕捉のために使用した生体マーカーは、棒の各対の下に示される。図４は、上記抗体架橋ビーズが、ＤＮＡを含む胎児微粒子を首尾良く捕捉および富化し得ることをさらに実証する。
【００５１】
（実施例２：胎児染色体異常の出生前診断）
全血サンプルを、妊娠１２週において胎児の染色体状態を決定することを望んでいる妊娠女性患者から得て、上記サンプルを、１６００ｇにおいて１０分間にわたって２２〜２３℃で遠心分離にかけて、上記血漿画分を分離する。次いで、上記血漿画分を、３５００ｇおよび２２〜２３℃においてさらに１０分間遠心分離して、細胞砕片および血小板を除去する。胎児生体マーカーＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗体に架橋したポリスチレンビーズを、上記血漿画分に添加し、数時間にわたって４℃においてインキュベートして、上記胎児微粒子を捕捉する。捕捉後、上記微粒子を、標準的分子生物学方法を使用して、上記ビーズ上で直接可溶化する。上記ＤＮＡを、標準的な分子生物学技術を使用して特徴付けて、異数性もしくは他の特定の染色体異常を検出する。染色体異常が検出されず、この情報は、上記患者に提供される。
【００５２】
（実施例３：血液サンプル中の癌微粒子の富化）
全血サンプルを、リンパ腫を有すると疑われる患者から得る。上記全血サンプルを、１６００ｇにおいて１０分間にわたって２２〜２３℃で遠心分離にかけて、血漿画分を分離し、次いで、上記血漿画分を、３５００ｇおよび２２〜２３℃においてさらに１０分間遠心分離して、細胞砕片および血小板を分離する。癌細胞生体マーカーに対して作製した抗体に架橋したポリスチレンビーズを、上記血漿画分に添加し、４℃において数時間インキュベートして、上記患者の血中を循環している癌微粒子もしくは細胞を捕捉する。捕捉後、上記微粒子を、標準的分子生物学方法を使用して、上記ビーズ上で直接可溶化する。上記ＤＮＡを、標準的な分子生物学技術を使用して特徴付けて、上記リンパ腫と関連した変異を検出する。関連する変異が検出され、この情報は、提唱される処置選択肢とともに上記患者に提供される。
【００５３】
本発明は、その特定の実施形態を参照しながら記載されかつ例示されてきたものの、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の変更、改変および置換が本発明において行われ得ることを認識する。本明細書で言及される全ての特許、公開特許出願、および他の非特許文献は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００５４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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