(57)【要約】提供されるのは、対象の炎症性神経変性疾患、またはそれらの少なくとも１つの症状を、少なくとも１つの本発明の動電学的変性流体（例えば、動電学的生成酸素富化流体）を含む治療用組成物の投与により、治療する方法である。特定の態様は、エフェクターＴ細胞の機能および／または活性を抑制および／または調節するための、および／または細胞ベース寛容原性療法のための方法を提供する。特定の態様では、このような方法は、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ（例えば、樹状細胞）を、少なくとも１つの本明細書で開示の動電学的変性流体にエクスビボで暴露することを含む。併用療法が、追加で提供される。【選択図】図２１Ｂ
2014511879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節方法であって、
炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意すること；
その細胞を、主に約１００ナノメーター未満の平均径を有し、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節のために提供するのに十分な量の流体中で安定に形成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む流体に接触させ、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節のための方法が与えられること；
を含む方法。
【請求項２】
細胞を用意することが、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を含む細胞を用意することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞を用意することが、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
エフェクターＴ細胞が、神経炎症および／または脱髄性疾患に関与するエフェクターＴ細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炎症性神経変性状または疾患が、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病、からなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
炎症性神経変性状または疾患が、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病の内の少なくとも１つを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
神経炎症および脱髄性疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の発生および／または機能および／または活性の調節を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）が、内在性ＴＲＥＧ細胞（ｎＴＲＥＧ）および誘導性ＴＲＥＧ細胞（ｉＴＲＥＧ）の内の少なくとも１つを含み、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、単球および樹状細胞（ＣＤ）（例えば、骨髄ＤＣおよび形質細胞様ＤＣ）の内の少なくとも１つを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させることが、エクスビボで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔｈ１７細胞、好ましくは、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、抑制および／または調節することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔｒｅｇ細胞（好ましくは、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間のバランスを、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の量および／または機能および／または活性に比べ、Ｔｒｅｇ細胞の量および／またはＴｒｅｇ細胞機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、増加させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔｒｅｇ細胞のＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞への分極化を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節（好ましくは、減少または防止）することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞および／または機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、抑制することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞のＴｒｅｇ細胞へ（このましくは、脱分極ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞のＮＴｒｅｇ細胞、および／またはＮＴｒｅｇ細胞の機能および／または活性を有する細胞へ）、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、変換することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触させることが、炎症性神経変性状または疾患またはその症状の治療のための細胞ベース療法または細胞ベース寛容原性療法の一部としてエクスビボで行われ、治療有効量のエクスビボで接触させた細胞が、それを必要としている対象に導入され、対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節が与えられる請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
炎症性神経変性状または疾患が、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病、からなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性神経変性状または疾患が、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病の内の少なくとも１つを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性神経変性状または疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）またはそれらの症状を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
電荷安定化酸素含有ナノ構造が、生細胞の流体による接触時に、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量のイオン性水性流体中で安定に形成される請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
電荷安定化酸素含有ナノ構造が、主に９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満、からなる群より選択されるサイズより小さい平均径を有する請求項１に記載の動電学的流体。
【請求項２３】
イオン性水溶液が、塩類溶液（好ましくは生理的塩類溶液）を含む請求項１に記載の動電学的流体。
【請求項２４】
イオン性水溶液が、超酸素化される請求項１に記載の動電学的流体。
【請求項２５】
少なくとも１つのそれらの症状が、中枢神経系および脳の慢性炎症、ならびに中枢神経系および脳の急性炎症、からなる群より選択される少なくとも１つの状態に関連する請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
他の抗炎症剤を使った同時のまたは補助的な対象の治療による相乗的または非相乗的炎症の抑制もしくは減少をさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記他の抗炎症剤が、ステロイドまたはグルココルチコイドステロイドを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療薬が患者に投与される請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの追加の治療薬が、下記からなる群より選択される請求項２８に記載の方法：酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の阻害剤を含むＭＭＰの阻害剤、短時間作用型β２−アゴニスト、長時間作用型β２−アゴニスト、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエンモディファイア、メチルキサンチン、β２−アゴニスト、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、フォルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含むロイコトリエンモディファイア；クロモリンおよびネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドならびにフォルモテロールを含む組み合わせ薬剤；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む免疫系調節剤；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；およびそれらの組み合わせ。
【請求項３０】
少なくとも１つの追加の治療薬が、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストが、ＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子または２つ以上の受容体鎖の成分をコードするポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体特異的中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、およびＴＳＬＰ受容体融合タンパク質、からなる群より選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節が、高次構造、リガンド結合活性または膜結合タンパク質の触媒活性の内の少なくとも１つの調節を含む細胞膜構造または機能の内の少なくとも１つの調節を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
膜結合タンパク質が、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリン、からなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
膜貫通受容体が、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が、Ｇタンパク質αサブユニットと相互作用する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｇタンパク質αサブユニットが、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２、からなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットがＧαｑである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞膜伝導率の調節が、全細胞コンダクタンスの調節を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
全細胞コンダクタンスの調節が、全細胞コンダクタンスの少なくとも１つの電圧依存性寄与の調節を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節が、カルシウム依存性細胞メッセージ伝達経路またはシステムの調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節が、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節が、アデニレートシクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節が、中枢神経および脳の慢性炎症、ならびに中枢神経および脳の急性炎症、からなる群より選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内のシグナル伝達の調節を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項４４】
細胞ネットワークまたはレイヤーへの投与を含み、また、その中の細胞間結合部の調節をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
細胞間結合が、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソームからなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞ネットワークまたはレイヤーが、内皮細胞およびＣＮＳ血管中の内皮−アストロサイト密着結合、血液−脳脊髄液密着結合またはバリア、肺上皮タイプ結合、気管支上皮タイプ結合、および腸上皮タイプ結合、からなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
イオン性水溶液が酸素化され、流体中の酸素が、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５、ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
膜結合タンパク質が、ＣＣＲ３および／またはＣＣＲ６を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
炎症性神経変性状もしくは疾患または少なくとも１つのそれらの症状の治療が、細胞内のＮＦ−κＢ発現および／または活性の調節を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項５０】
炎症性神経変性状または疾患またはその症状の治療方法であって、：
炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意すること；
その細胞を、実質的に約１００ナノメーター未満の平均径を有し、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節のために供給するのに十分な量の流体中で安定に形成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む流体とエクスビボで接触させること；
接触させた細胞を、対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節を提供するために、それを必要としている対象に導入し、炎症性神経変性状または疾患またはその症状の治療方法を与えること；
を含む方法。
【請求項５１】
細胞を用意することが、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を含む細胞を用意することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を用意することが、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の発生および／または機能および／または活性の調節を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）が、内在性ＴＲＥＧ細胞（ｎＴＲＥＧ）および誘導性ＴＲＥＧ細胞（ｉＴＲＥＧ）の内の少なくとも１つを含み、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、単球および樹状細胞（ＣＤ）（例えば、骨髄ＤＣおよび形質細胞様ＤＣ）の内の少なくとも１つを含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞が、対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むか、または対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）由来細胞を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
Ｔｈ１７細胞、好ましくは、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の機能および／または活性を抑制および／または調節することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
Ｔｒｅｇ細胞（好ましくは、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間のバランスを、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の量および／または機能および／または活性に比べ、Ｔｒｅｇ細胞の量および／またはＴｒｅｇ細胞機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、増加させることを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
Ｔｒｅｇ細胞のＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞への分極化を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節（好ましくは、減少または防止）することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞および／または機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、抑制することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞のＴｒｅｇ細胞へ（このましくは、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の、ＮＴｒｅｇ細胞、および／またはＮＴｒｅｇ細胞の機能および／または活性を有する細胞への脱分極）、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、変換することを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
導入が、静脈内投与を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液が、本明細書で開示の表１および２由来の塩またはイオンの内の少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
特定の態様では、一般的には、多発性硬化症（これに限定されない）を含む炎症性神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ、加齢性認知機能低下に関連する炎症性神経変性状態；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病）および神経炎症の制御または調節に関し、さらに具体的には、少なくとも１つの動電学的に生成された本発明の流体（例えば、動電学的に生成された酸素富化流体）を含む治療用組成物を投与することによる対象の多発性硬化症または少なくとも１つの炎症性神経変性疾患の症状の治療または予防のための組成物および方法に関し、またさらに具体的には、脳炎誘発性Ｔ細胞を抑制する、および／または調節する、および／または分極化させるための組成物および方法、および／または細胞ベース寛容原性療法（例えば、Ｔｈ１７細胞および／またはＴＲＥＧ細胞および／または樹状細胞（ＤＣ）の発生（例えば、分極化）および／または機能の調節による）のための組成物および方法に関する。追加の態様は、併用療法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月１６日に出願の米国特許仮出願第６１／４９７，８８２号、および２０１１年４月１３日出願の同６１／４７５，１１９号の優先権を主張する。これら両方の特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
神経変性疾患は、ニューロン、またはそれらのミエリン鞘の劣化を特徴とする疾患群である。ニューロンのこの破壊は、また、最終的に機能障害および能力障害に繋がる。多くの場合、炎症が神経変性疾患の構成要素であることが認められており、これが神経変性の病原性を大きくする（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。一括りに言って、これらの疾患は、当該分野で承認されている炎症性神経変性疾患を含む。一部の神経変性障害では、神経炎症は、何らかのニューロンのかなりの量の損失より数年前に発生する可能性がある（非特許文献６）。マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、星状神経膠細胞、およびミクログリアを含む多くの異なる型の免疫細胞が、多発性硬化症（Ｍ．Ｓ．）、パーキンソン病、アミロイド症（例えば、アルツハイマー病）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、プリオン病、およびＨＩＶ関連認知症のような免疫関連疾患の病理学の一因となり得る。さらに具体的には、いくつかの研究グループが、ＭＳでは、ミエリンに対する傷害が炎症反応により媒介されること（非特許文献７）、および白血球がＣＮＳに湿潤する場合にＭ．Ｓ．発病が加速されることに注目している（非特許文献８）。ＭＳでのＣＮＳ炎症とその効果を試験する遺伝学的モデルが開発されている（動物モデル実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を使って）。さらに、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）では炎症促進性のサイトカイン（特に、ＴＮＦ−α）が増加していることが明らかになった（非特許文献９）。従って、これらの炎症性神経変性疾患は、抗炎症性薬剤によって、効果的に治療できる。
【０００４】
炎症性神経変性疾患には、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、アミロイド症（例えば、アルツハイマー病）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＨＩＶ関連認知症、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病が含まれる。
【０００５】
多発性硬化症。多発性硬化症（ＭＳ）は、世界中で、約１，１００，０００の人が罹患する、特に、若年成人が罹患する中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症性神経変性疾患である（非特許文献１０）。ＭＳは、病理学的に、神経組織の脱髄が特徴であり、これが、良性から慢性進行型の疾患状態までにわたる臨床的に多くの形の疾患の内の１つをもたらす。さらに具体的には、５つの主要型の多発性硬化症が報告されている：１）良性多発性硬化症；２）再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）；３）二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）；４）一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）；および５）進行再発型多発性硬化症（ＰＲＭＳ）。慢性進行型多発性硬化症は、ＳＰＭＳ、ＰＰＭＳ、およびＰＲＭＳを一括して指定するために使用される用語である。再発型の多発性硬化症は、再発、ＲＲＭＳおよびＰＲＭＳの重なり合ったＳＰＭＳである。
【０００６】
疾患の全経過で、軸索の周りのミエリン鞘の進行性破壊が存在する。軸索の健全性の保存には、インタクトミエリンは必須であるから（非特許文献１１）、系統的破壊は、最終的に、麻痺および疼痛、協調とバランスの問題、失明、ならびに全般的認知機能障害、等の種々の神経学的機能障害に、臨床的に繋がる。興味深いことに、数十年の疾患を持つた生活の後であっても、その他の人が診断された後のわずか数年で車椅子に依存するようになる一方で、軽度の身体障害を有する一部の人と一緒の患者は、ＭＳの進行がかなり違ってくる場合がある。
【０００７】
詳細なＭＳの病因は、現状未知であるが、遺伝学的証拠、分子的基盤、および免疫学的因子を調べる研究により、疾患の経過および脱髄が発生する機序が明らかになり始めている。遺伝学的解析では、いくつかの報告は、血縁個体は、正常な集団（０．１％ＭＳ有病率）に比べて、より高いＭＳ発生率を有し：双子のもう片方がＭＳである場合一卵性双生児は、３０％の疾患発症の確率を有し、また、他の同胞がＭＳに罹患している場合、同胞は１〜２％の確率を有することを示している。この遺伝率の原因となる遺伝子を見つけるために連鎖および関連試験を利用することにより、いくつかのグループが、ＭＳに罹患する相対的リスクは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ２対立遺伝子の主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩＩ対立遺伝子を保有する人に比べ、３〜４倍高いことを見つけた。ＭＳに関連する他の遺伝子が特定されたが、リスクはずっと低い。ＭＳ感受性およびＭＨＣクラスＩＩの間の関連は、ＭＳの発病におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の関与を強く示唆する（非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００８】
さらに、健康な個人に比べて、ＭＳに苦しんでいるＭＳ患者で発現が異なっている遺伝子の特定が試みられてきた。遺伝子のマイクロアレイを使って、１）ＭＳプラーク型（急性対慢性）およびプラーク領域（活性対不活性）からの転写の調査（非特許文献１４）；２）インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β治療の有りと無しの両方の患者からのＲＲＭＳ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と、対照との比較（非特許文献１５）；および３）ＭＳ動物モデルのマウスの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の各段階のＣＮＳ細胞の調査（非特許文献１６）、を行った。これらの実験により解明されたことの多くは、抗炎症性、抗アポトーシス性遺伝子が発現減少し、炎症促進性であり、また、増殖遺伝子が発現増加しているという知見を含め、予測されていた。驚くべき結果には、治療適用の有望な新規標的、例えば、オステオポンチン（非特許文献１７）およびＴＲＡＩＬ（非特許文献１８）等が含まれる。しかし、ＭＳ感受性および／または進行に影響を与える可能性のある遺伝子が未知であるために、ＭＳ患者での発現を健康な個人と比較した場合に、異なる制御を有する多くの遺伝子のＭＳ発生における意義は、未知である。
【０００９】
さらなる研究により、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞により開始される炎症反応は、ミエリンに対する傷害を媒介できることが明らかになった（非特許文献１９）。一般的に、ＭＳの発症の間にミエリン鞘および軸索に起こる損傷の多くは炎症促進性のサイトカイン（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ１７）の分泌を含む炎症反応を生成する自己反応性Ｔ細胞応答を介して発生すると考えられている（非特許文献２０；非特許文献２１）。
【００１０】
ＭＳ対し最近利用可能な治療薬には、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ナタリズマブ、およびミトキサントロンが含まれる。一般的に、これらの薬剤は、非特異的な方法で免疫系を抑制し、全体的な疾患の進行をわずかに制限するのみである（非特許文献２２）。従って、より効果的にＭＳを治療する治療方法を開発するニーズが存在する。
【００１１】
酢酸グラチラマーは、ランダムポリマーとして、グルタミン酸、リシン、アラニン、およびチロシンから構成される。酢酸グラチラマーは、有効性が限られ、大きな副作用、例えば、注射部位のしこり、悪寒、発熱、疼痛、息切れ、心臓の速い鼓動および不安がある。９４３人の一次進行型ＭＳの患者を使った重要な臨床試験では、酢酸グラチラマーは、身体障害および疾患の進行を止めることができなかった（非特許文献２３）。
【００１２】
インターフェロン（「ＩＦＮ」）−βは、線維芽細胞および一部の固有の免疫応答により産生される天然タンパク質である。ＭＳ用薬剤として、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−βは、ＭＳ発症速度を遅らせるのに約１８〜３８％有効である。副作用には、軽度インフルエンザ様症状、および注射部位の反応、ならびに、さらに重篤な副作用（例えば、うつ状態、てんかん発作、および肝臓の問題）が含まれる。
【００１３】
ミトキサントロンは、ＭＳ用の治療薬である。癌との戦い（ＤＮＡ修復および合成を妨害することにより作用する）に使用される化学療法治療薬として開発された。これは、癌細胞に特異的ではない。ミトキサントロンの副作用は、極めて重度である可能性があり、これには、悪心、嘔吐、脱毛、心臓損傷、および免疫抑制が含まれる。
【００１４】
ナタリズマブは、α４−インテグリンを標的とするヒト化モノクローナル抗体であり、α４−インテグリンは細胞接着分子である。ナタリズマブは、炎症を起こす免疫細胞に脳血液関門（ＢＢＢ）を通過させないことにより作用すると考えられている。副作用には、疲労、頭痛、悪心、悪寒、およびアレルギー反応が含まれる。
【００１５】
ＭＳにおける調節性Ｔ細胞および樹状細胞の関与。  遺伝的に感受性が強い個体のＣＮＳ自己抗原に対する免疫寛容の破壊は、ＭＳの発生の重要事象であると考えられている。非特許文献２４；また、非特許文献２５も参照されたい、さらに、非特許文献２６も参照されたい；ＭＳに関連する調節性Ｔ（ＴＲＥＧ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）、Ｔ細胞ベースのＥＡＥおよびＭＳの免疫療法、ならびに、ＭＳのＴｈ１７に対するＴｈ１に関する教示のために、これら全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の概説で考察されているように、炎症反応および免疫自己寛容の調節障害がＭＳの自己反応性免疫応答の重要な要素であると考えられ、調節性Ｔ（ＴＲＥＧ）細胞が、ＣＮＳ自己免疫性炎症の病原性シナリオの重要なプレーヤーとして登場した。標的とされる、ＴＲＥＧ細胞の欠失は、マウスで自然発生的な自己免疫疾患を起こし、一方、ＴＲＥＧ細胞機能の増強は、ＭＳの動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎の変異型の発生を防ぐか、または減らすことができる。ＴＲＥＧ細胞の発生と機能は、樹状細胞（ＤＣ）に密接に関連し、樹状細胞は、ＣＮＳの脳炎誘発性細胞の活性化および再活性化で中心的役割を有している。ＤＣおよびＴＲＥＧ細胞は、密接な双方向性関係を持ち、また、他の因子および細胞型と組み合わせて、特定の型のＤＣは、ＴＲＥＧ細胞を誘発することができる。その結果、ＴＲＥＧ細胞およびＤＣは、ＭＳの有望な治療標的と認識されている（同上）。
【００１６】
ＴＲＥＧ細胞および特定の型のＤＣは、末梢免疫寛容を誘導し維持する機序の不可欠な構成要素である。２つの主要なＴＲＥＧ細胞のサブセット：内在性ＴＲＥＧ（ｎＴＲＥＧ）細胞および誘導性ＴＲＥＧ（ｉＴＲＥＧ）細胞、がある。最もよく特徴がわかっているｎＴＲＥＧ細胞の集団は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＲＥＧ細胞から構成され、これは、フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ３（ＦＯＸＰ３）を発現できる。ｉＴＲＥＧ細胞は、Ｔ−ヘルパー３（ＴＨ３）細胞を含み、これは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであるナイーブＴ細胞、およびＣＤ４＋前駆細胞由来の１型ＴＲＥＧ（ＴＲ１）細胞が起源である。ｉＴＲＥＧ細胞は、末梢で非調節性Ｔ細胞から、または自己免疫応答の間に自己抗原により誘導され、ＦＯＸＰ３を発現する場合も、発現しない場合もある。
【００１７】
２つの一般なＤＣのサブセットが、ヒトおよびマウスで識別でき、これらは：骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）（名前からわかるように、骨髄由来である）；および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）（リンパ系由来である）である。これらの２つの細胞型は、異なるレパートリーのパターン認識受容体を発現し、異なるサイトカイン産生プロファイルを示す。通常、両タイプのＤＣは、自然および獲得免疫に関連し、環境要因に応じて異なる免疫応答を生じる（同上）。ＣＮＳ自己免疫との関連で、実験的証拠から、ＤＣが、投与経路または分化手段に応じて、免疫寛容誘発または免疫原性特性を示すことができることがわかっている。脳由来ＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞活性化および耐性をインビトロで誘導することが示され、また、ＤＣは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＲＥＧ細胞の増殖を効率的に促進できる。ＤＣは、ＣＮＳから末梢へと通行でき、血液脳関門を容易に通過し、脳に戻る。
【００１８】
非特許文献２７は、Ｔｇ  ＭＢＰ／Ｒａｇ−／−マウスへの野性型動物由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の養子移入により、自然発症的ＥＡＥの発生を防ぐことができることを示すことによって、ＴＲＥＧ細胞が実際にこの現象に大きく寄与していることを示す実験を行った。さらに、養子移入実験により、Ｃ５７Ｂｌ／６（非特許文献２８）およびＳＪＬ（非特許文献２９）の両方のレシピエントマウス株（それぞれ、慢性および再発性−寛解型のＥＡＥを経験している）で、ナイーブマウスの末梢リンパ節から精製された大量のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、ＥＡＥの発生率と重症度を減らすことができることが示された。非特許文献３０により行われた研究で、ＥＡＥのマウス由来の末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、レシピエントラットの慢性ＥＡＥの進行を抑制した。自己免疫の自然分解の間の末梢区画から炎症性ＣＮＳへの抗原反応性ＴＲＥＧ細胞の直接の流入が起こることが示唆されており、これらのＣＮＳ抗原特異的ＴＲＥＧ細胞は、遊出ＴＥＦＦ細胞と同様な方式で、ＣＮＳ中でクローン的に増殖できる可能性がある（非特許文献３１）。
【００１９】
さらなる研究で、ＭＳ患者のＴＲＥＧ細胞機能の一次欠損は、ＴＲＥＧ細胞に固有であることが示され、より高い活性化状態または自己反応性Ｔ細胞の抑制に対する抵抗性に原因があるのではなかった（非特許文献３２）（非特許文献３３）。
【００２０】
ＭＳの治療に使われる酢酸グラチラマー（ＧＡ）は、ＧＡ反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｈ１からＴｈ２サイトカインへのシフトを誘導することが示されたが、この機序は未解明である。ＣＮＳ中に補充されたＴｈ２細胞は、隣接する自己侵襲性Ｔｈ１細胞を抑制すると考えられている（「傍観者効果」）。さらに最近、非特許文献３４は、酢酸グラチラマー（ＭＳの治療に使われる）が単球の反応性をインビトロおよびインビボで阻害することを示した。単球は、循環抗原提示細胞（ＡＰＣ）の大部分を構成する。従って、ＧＡは、Ｔ細胞に直接影響を与えることができるが、ＡＰＣ（例えば、単球および樹状細胞）に影響することにより間接的に作用し、それにより、例えば、Ｔ細胞がＴｈ２細胞を優先的に誘導できる。
【００２１】
Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞は、ケモカイン産生および好中球の炎症性組織への補充の原因となる炎症促進性のサイトカインＩＬ−１７Ａ（以降、ＩＬ−１７と呼ぶ）を産生する異なる系列のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞であると特定され、マウスでは、Ｔｈ１７細胞は、以前には、抑制されていないＴｈ１応答が原因とされていた実験的自己免疫疾患の発病に関与することが示された（非特許文献３５）。さらに自己免疫疾患の患者の評価により、ヒト自己免疫障害へのＴｈ１７細胞の関与が示唆された。ＲＯＲγｔは、Ｔｈ１７細胞に対する系列特異的転写因子として特定された。
【００２２】
最近の研究で、ＦＯＸＰ３＋ＴｒｅｇおよびＴｈ１７系列の間の密接な関連が報告され、さらに、最近、非特許文献３６；参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、ヒト循環ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の分化は、実際、主に、ナイーブＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ（主にＮＴｒｅｇ）から得られ、また、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞へのＮＴｒｅｇからの分極化は、ＩＬ−２および系列特異的分化／分極化因子の存在下での刺激の後で、最も適切となるように起こる（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの存在下の最適誘導）ことを示した。その発現がＩＬ−１７分泌に不可欠である、Ｔｈ１７系列特異的転写因子ＲＯＲγｔと、ＲＯＲγｔの作用に拮抗するＴｒｅｇ特異的転写因子ＦＯＸＰ３との間のバランスが、Ｔｈ１７細胞分極化に影響することが提唱された。Ｖａｌｍｏｒｉ、等（同上）は、ＮＴｒｅｇから分化するＴｈ１７細胞は、高レベルのＲＯＲγｔを発現したＦＯＸＰ３-またはＦＯＸＰ３ｌｏｗであり、ＣＣＲ６＋発現細胞中で高度に富化されていることを示した（同上）。
【００２３】
パーキンソン病。別の炎症性神経変性疾患であるパーキンソン病は、筋硬直および遅い身体運動を含む運動障害を特徴とする。最近のパーキンソン病の研究により、サイトカインおよびＨＬＡ−ＤＲ抗原の発現増加に起因して、免疫応答が神経細胞の損傷の原因になる可能性があることが認められている（非特許文献３７）。
【００２４】
特定のタンパク質が構造を変え、特定の組織中で積み重なって、正常組織の機能を遮断してそれぞれ結合する傾向がある場合、アミロイド症が発生する。これらの変化した構造のタンパク質は、アミロイドと呼ばれる。アミロイド症は、２つのカテゴリー：原発性または二次、に分類される場合が多い。原発性アミロイド症は、不適正な免疫細胞機能の病気から生じる。二次アミロイド症は、通常、他の一部の慢性感染性または炎症性疾患の合併症から発生する。この例には、アルツハイマー病および関節リウマチが含まれる。二次アミロイド症の根底にある問題は炎症であるから、おそらく、炎症の治療が有益となるであろう。
【００２５】
アルツハイマー病。アルツハイマー病は、別のタイプの炎症性神経変性疾患である。学習および記憶の機能障害が次第に増加するのがその例であるが、この疾患は、認知能力が変化したことを示す他の形で顕在化する可能性もある。疾患の全過程を通して、大脳皮質中のニューロンおよびシナプシスの漸減が神経組織全体の萎縮に繋がる。アルツハイマー病の原因は未解明であるが、炎症が重要な役割を演じると考えられており、臨床試験は、炎症が疾患の発病に大きく寄与することを示した（非特許文献３８）。
【００２６】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）。筋萎縮性側索硬化症では、炎症と疾患の間の関連が示唆された（非特許文献３９）。さらに、ＴＮＦ−アルファｍＲＮＡが、筋萎縮性側索硬化症用の遺伝子導入マウスモデルの脊髄で発現することが認められた。興味深いことに、運動困難の発症前の早い段階からＡＬＳが原因で死亡する迄、転写産物が検出された（非特許文献４０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｍｉｎａｇａｒ、ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉ．２０２：１３−２３
【非特許文献２】Ａｎｔｅｌ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎｓ（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１００：１８１−１８９
【非特許文献３】Ｅｌｌｉｏｔｔ（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．９５：１７２−１７８
【非特許文献４】Ｎａｋａｍｕｒａ（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：９４５−９５３
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｔｏｎ  ＰＳ．（２００７）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０：９６３−７６
【非特許文献６】Ｔａｎｓｅｙ  ｅｔ．ａｌ．、Ｆｒｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３：７０９−７１７、２００８
【非特許文献７】Ｒｕｆｆｉｎｉ  ｅｔ．ａｌ．（２００４）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６４：１５１９−１５２２
【非特許文献８】ＤｏｓＳａｎｔｏｓ  ｅｔ．ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ５：４９
【非特許文献９】Ｇｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉ  １０３５：２９０−３１５
【非特許文献１０】Ｐｕｇｌｉａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓ．１０４：１８２−１９１
【非特許文献１１】Ｄｕｂｏｉｓ−Ｄａｌｃｑ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ．４８、９−１２（２００５）
【非特許文献１２】Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＡＭＡ  ２７０：２３６３−２３６９（１９９３）
【非特許文献１３】Ｏｌｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３８：１−３（１９９１）
【非特許文献１４】Ｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｒ（２００３）
【非特許文献１５】Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）
【非特許文献１６】Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）
【非特許文献１７】Ｃｈａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）
【非特許文献１８】Ｗａｎｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）
【非特許文献１９】Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０６：１８１−１８５（２００３）
【非特許文献２０】Ｐｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３９：１８７−１９９（２００２）
【非特許文献２１】Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：２９１−３０１（２００２）
【非特許文献２２】Ｌｕｂｅｔｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２３７−２４４
【非特許文献２３】Ｗｏｌｉｎｓｋｙ、ｅｔｌ．（２００７）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１：１３−２４
【非特許文献２４】Ｚｏｚｕｌｙａ  ＆  Ｗｉｅｎｄｌ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４：３８４−３９８、２００８
【非特許文献２５】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２：９９−１１５、２０１０
【非特許文献２６】Ｌｏｖｅｔｔ−Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８１２：２４６−２５１、２０１１
【非特許文献２７】Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ  ９９：８２１３−８２１８、２００２
【非特許文献２８】Ｋｏｈｍ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  ２５２：４５−５２、２００３
【非特許文献２９】Ｚｈａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：２４９−２５６、２００４
【非特許文献３０】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １８７：４４−５４、２００７
【非特許文献３１】Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：９５８−９６６、２００７
【非特許文献３２】Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９：９７１−９７９、２００４
【非特許文献３３】Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００：２７３−２７６、２００４
【非特許文献３４】Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒａｉｎ１２７：１３７０−１３７８、２００４
【非特許文献３５】Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：６７７−６８８、２００６
【非特許文献３６】Ｖａｌｍｏｒｉ、等（ＰＮＡＳ  １０７：１９４０２−１９４０７、２０１０
【非特許文献３７】Ｃｚｌｏｎｋｏｗｓｋａ  ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ  ８：ＲＡ１  ６５−７７
【非特許文献３８】Ａｋｉｙａｍａ、ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．２１：３８３−４２１
【非特許文献３９】Ｃｅｎｔｏｎｚｅ、ｅｔ．ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２８：１８０−７
【非特許文献４０】Ｅｌｌｉｏｔ（２００１）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ９５：１７２−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明の態様の要約
特定の態様では、は、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を抑制、および／または調節する方法を提供し、この方法は、：炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意すること；その細胞を、実質的に約１００ナノメートル未満の平均径を有し、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を抑制、および／または調節のために提供するのに充分な量の流体中で安定に構成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む流体に接触させること、を含み、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を抑制、および／または調節する方法を提供する。特定の態様では、細胞を用意することは、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を含む細胞を用意することを含む。特定の態様では、細胞を用意することは、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意することを含む。特定の態様では、エフェクターＴ細胞は、神経炎症および脱髄性疾患に関与するエフェクターＴ細胞を含む。好ましい態様では、神経炎症および脱髄性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）を含む。
【００２９】
特定の態様では、炎症性神経変性状態または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病、の内の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、神経炎症および脱髄性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）を含む。
【００３０】
方法の特定の実施形態は、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の発生および／または機能および／または活性を調節することを含む。特定の態様では、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）は、内在性ＴＲＥＧ細胞（ｎＴＲＥＧ）および誘導性ＴＲＥＧ細胞（ｉＴＲＥＧ）の内の少なくとも１つを含み、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、単球および樹状細胞（ＣＤ）（例えば、骨髄ＤＣおよび形質細胞様ＤＣ）の内の少なくとも１つを含む。
【００３１】
特定の態様では、前記接触させることが、エクスビボで細胞を接触させることを含む。
【００３２】
特定の態様では、方法は、Ｔｈ１７細胞の、好ましくはＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、抑制および／または調節することを含む。
【００３３】
特定の態様では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞（好ましくは、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間のバランスを、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節することを含む。
【００３４】
特定の態様では、方法は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の量および／または機能および／または活性に比べて、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞機能および／または活性の量を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、漸増させることを含む。
【００３５】
特定の態様では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞のＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞への分極化を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節する（好ましくは、減少または防止させる）ことを含む。
【００３６】
特定の態様では、方法は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞および／または機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、抑制することを含む。
【００３７】
特定の態様では、方法は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞をＴｒｅｇ細胞に、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、変換する（好ましくは、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞をＮＴｒｅｇ細胞、および／またはＮＴｒｅｇ細胞の機能および／または活性を有する細胞に脱分極化する）ことを含む。
【００３８】
特定の実施形態では、前記接触させることが、炎症性神経変性状または疾患またはその症状の治療のための細胞ベース療法または細胞ベース寛容原性療法の一部としてエクスビボで行われ、エクスビボで接触された細胞の治療有効量がそれを必要としている対象に導入され、さらに、対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制、および／または調節が提供される。特定の態様では、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病、の内の少なくとも１つを含む。好ましくは、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）またはその症状を含む。
【００３９】
方法の特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、生細胞の接触時に細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を行うのに十分な量のイオン性水性流体中で、安定に形成される。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、実質的に、９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満、からなる群より選択されるサイズ未満の平均径を有する。特定の実施形態では、イオン性水溶液は、塩類溶液（好ましくは、生理的塩類溶液）を含む。特定の態様では、イオン性水溶液は、超酸素化される。
【００４０】
方法の特定の実施形態では、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。好ましくは、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病、の内の少なくとも１つを含む。好ましくは、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症を含む。
【００４１】
方法の特定の態様では、それの少なくとも１つの症状は、中枢神経系および脳の慢性炎症、ならびに中枢神経系および脳の急性炎症、からなる群より選択される少なくとも１つの状態に関連している。
【００４２】
特定の態様では、方法は、別の抗炎症剤（例えば、ステロイドまたはグルココルチコイドステロイド）で同時にまたは補助的に対象を治療することによる炎症の相乗的もしくは非相乗的抑制または減少をさらに含む。
【００４３】
特定の態様では、方法は、併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療薬が患者に投与される。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療薬が下記からなる群より選択される：酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の阻害剤を含むＭＭＰの阻害剤、短時間作用型β２−アゴニスト、長時間作用型β２−アゴニスト、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエンモディファイア、メチルキサンチン、β２−アゴニスト、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、フォルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含むロイコトリエンモディファイア；クロモリンおよびネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドならびにフォルモテロールを含む組み合わせ薬剤；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む免疫系調節剤；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；およびそれらの組み合わせ。
【００４４】
特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストである（例えば、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびに、２つ以上の受容体鎖成分をコードするＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含むＴＳＬＰ受容体融合タンパク質、からなる群より選択される）。
【００４５】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質の高次構造、リガンド結合活性、または触媒活性の内の少なくとも１つの調節を含む細胞膜構造または機能の内の少なくとも１つの調節を含む。特定の実施形態では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリン、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニットと相互作用する（例えば、Ｇタンパク質αサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群より選択される少なくとも１つを含む）。特定の態様では、少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットは、Ｇαｑである。
【００４６】
特定の態様では、細胞膜伝導率の調節は、全細胞コンダクタンスの調節を含む。特定の態様では、全細胞コンダクタンスの調節は、全細胞コンダクタンスの電圧依存性の少なくとも１つの寄与を調節することを含む。
【００４７】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、カルシウム依存細胞メッセージ伝達経路またはシステムの調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む。
【００４８】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む。
【００４９】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、アデニレートシクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む。
【００５０】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、中枢神経および脳の慢性炎症、および中枢神経および脳の急性炎症、からなる群より選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内のシグナル伝達の調節を含む。
【００５１】
方法の特定の実施形態は、細胞ネットワークまたはレイヤーへの投与を含み、また、その中の細胞間結合部の調節をさらに含む。特定の態様では、細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソームからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【００５２】
特定の態様では、細胞ネットワークまたはレイヤーは、ＣＮＳ血管中の内皮細胞および内皮−アストロサイト密着結合、血液−脳脊髄液密着結合またはバリア、肺上皮タイプ結合、気管支上皮タイプ結合、および腸上皮タイプ結合、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【００５３】
方法の特定の実施形態では、イオン性水溶液は、酸素化され、流体流の酸素は、大気圧下、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５、ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。
【００５４】
特定の態様では、膜結合タンパク質は、ＣＣＲ３および／またはＣＣＲ６を含む。
【００５５】
特定の方法の態様では、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制、および／または炎症性神経変性状または疾患または少なくとも１つのそれらの症状の治療は、細胞内ＮＦ−κＢ発現および／または活性の調節（例えば、増加または減少）を含む。
【００５６】
またさらなる態様は、炎症性神経変性状または疾患またはその症状の治療方法を提供し、その方法は：炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意すること；細胞を、実質的に約１００ナノメーター未満の平均径を有し、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制および／または調節を行うのに充分な量の流体中で安定に生成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む流体とエクスビボで接触させること；およびその接触させた細胞をそれを必要としている対象に導入し、対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞に対し抑制および／または調節を提供することを含み、それにより、炎症性神経変性状または疾患またはその症状を治療する方法が与えられる。特定の態様では、細胞を用意することが、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を含む細胞を用意することを含む。特定の態様では、細胞を用意することが、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞を用意することを含む。
【００５７】
特定の態様では、方法は、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の発生および／または機能および／または活性の調節を含む。特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）は、内在性ＴＲＥＧ細胞（ｎＴＲＥＧ）および誘導性ＴＲＥＧ細胞（ｉＴＲＥＧ）の内の少なくとも１つを含み、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、単球および樹状細胞（ＣＤ）（例えば、骨髄ＤＣおよび形質細胞様ＤＣ）の内の少なくとも１つを含む。
【００５８】
特定の態様では、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞は、対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、または対象の炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）に由来する細胞を含む。
【００５９】
特定の態様では、方法は、Ｔｈ１７細胞の、好ましくは、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の機能および／または活性を抑制および／または調節することを含む。
【００６０】
特定の態様では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞（好ましくは、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間のバランスを、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節することを含む。
【００６１】
特定の態様では、方法は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の量および／または機能および／または活性に比べて、Ｔｒｅｇ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞機能および／または活性の量を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、漸増することを含む。
【００６２】
特定の態様では、方法は、Ｔｒｅｇ細胞のＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞中への分極化を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、調節すること（好ましくは、減少または増加）を含む。
【００６３】
特定の態様では、方法は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞および／または機能および／または活性を、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、抑制することを含む。
【００６４】
特定の態様では、方法は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞をＴｒｅｇ細胞に変換すること（好ましくは、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞をＮＴｒｅｇ細胞および／またはＮＴｒｅｇ細胞の機能および／または活性を有する細胞に、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、分極化すること）を含む。
【００６５】
特定の態様では、導入は、静脈内投与を含む。
【００６６】
特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液は、本明細書で開示の表１および２からの少なくとも１つの塩またはイオンを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】は、ガス富化流体および脱イオン対照流体の存在下でのマイトジェンアッセイのサイトカインプロファイルを示す。
【図２】は、加圧ポット酸素化流体（１）、発明のガス富化流体（２）、または脱イオン流体対照（３）の存在下で、脾細胞をＭＯＧと接触させた結果を示す。
【図３】は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデルで充分に有効であったことを示す。
【図４】は、図３の実験で使ったＥＡＥ誘導および治療計画の模式図を示す。
【図５Ａ】は、図３と４の実験で使ったＥＡＥ治療計画を受けた動物の体重（グラム表示）のグラフ表示である。
【図５Ｂ】は、ＥＡＥ治療計画を受けた動物の体重変化の計算結果（パーセンテージ表示）を示す。
【図６Ａ−Ｄ（１）】は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が、図３と４の実験で使用されたＥＡＥ治療計画の間に、ビークル対照に比べて、合計白血球（ＷＢＣ）、好中球、およびリンパ球のレベルにほとんど影響を与えなかったことを示す。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ、ｄａｙ０、７、１４、および２１の結果を示す。
【図６Ａ−Ｄ（２）】は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が、図３と４の実験で使用されたＥＡＥ治療計画の間に、ビークル対照に比べて、合計白血球（ＷＢＣ）、好中球、およびリンパ球のレベルにほとんど影響を与えなかったことを示す。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ、ｄａｙ０、７、１４、および２１の結果を示す。
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（１）】は、図３と４の実験で使用されたＥＡＥ治療計画を開始後、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が７日（Ａ−Ｄ）および１８日（Ｅ−Ｈ）のサイトカインレベルに与える効果を示す。パネルＡとＥは、治療後のＩＬ−１７のレベルを示す。パネルＢとＦは、治療後のＩＬ−１αのレベルを示す。パネルＣとＧは、治療後のＩＬ−１βのレベルを示す。パネルＤとＨは、治療後のＩＬ−４のレベルを示す。
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（２）】は、図３と４の実験で使用されたＥＡＥ治療計画を開始後、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が７日（Ａ−Ｄ）および１８日（Ｅ−Ｈ）のサイトカインレベルに与える効果を示す。パネルＡとＥは、治療後のＩＬ−１７のレベルを示す。パネルＢとＦは、治療後のＩＬ−１αのレベルを示す。パネルＣとＧは、治療後のＩＬ−１βのレベルを示す。パネルＤとＨは、治療後のＩＬ−４のレベルを示す。
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（３）】は、図３と４の実験で使用されたＥＡＥ治療計画を開始後、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が７日（Ａ−Ｄ）および１８日（Ｅ−Ｈ）のサイトカインレベルに与える効果を示す。パネルＡとＥは、治療後のＩＬ−１７のレベルを示す。パネルＢとＦは、治療後のＩＬ−１αのレベルを示す。パネルＣとＧは、治療後のＩＬ−１βのレベルを示す。パネルＤとＨは、治療後のＩＬ−４のレベルを示す。
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（４）】は、図３と４の実験で使用されたＥＡＥ治療計画を開始後、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が７日（Ａ−Ｄ）および１８日（Ｅ−Ｈ）のサイトカインレベルに与える効果を示す。パネルＡとＥは、治療後のＩＬ−１７のレベルを示す。パネルＢとＦは、治療後のＩＬ−１αのレベルを示す。パネルＣとＧは、治療後のＩＬ−１βのレベルを示す。パネルＤとＨは、治療後のＩＬ−４のレベルを示す。
【図８】は、対照生理的食塩水（ＮＳ）を除いて、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）がマウスミクログリア細胞（ＢＶ−２ミクログリア細胞）中の誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）のＭＰＰ＋誘導発現を弱めることを示す。
【図９】は、対照生理的食塩水（ＮＳ）を除いて、ＲＮＳ６０がヒトＳＨＳＹ５Ｙ神経細胞の原繊維Ａβ（１−４２）媒介アポトーシスを抑制することを示す。分化後、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０またはＮＳと共に１時間インキュベートし、続けて、１μＭ原繊維Ａβ（１−４２）ペプチドで傷害した。１８時間の処理後、ＴＵＮＥＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によりアポトーシスをモニターした。また、Ａβ（４２−１）ペプチドを対照としてインキュベートした。結果は、３つの独立した実験を表す。
【図１０】は、ビークル対照（ビークル）を除いて、ＲＮＳ６０が、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスＭＯＧモデルで、用量反応により充分効果的に臨床スコアを低減することを示す。ＲＮＳ−６０の高および低用量（治療）の両方の毎日投与、ならびにＲＮＳ−６０の３日毎の高用量投与（全ての場合のＲＮＳ−６０投与は、最初の臨床的徴候と同時に開始した）は、臨床スコアの著しい減少を示した（中空ダイア＝ビークル対照；中空正方形＝デキサメタゾン陽性対照；明色「ｘ」＝低用量（０．０９ｍｌ  ＲＮＳ６０）を臨床徴候の発症から毎日投与；暗色「ｘ」＝高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）を臨床徴候の発症から３日毎投与；および中空三角形＝高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）を臨床徴候の発症から毎日投与）。
【図１１Ａ−Ｂ】は、白血球上の細胞表面受容体、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）の発現レベルを生理的食塩水またはＲＮＳ−６０を使って比較した蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は、試料のｌｏｇ蛍光であり、Ｙ軸は、試料中で発生する蛍光イベントである。
【図１２Ａ−Ｃ】は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示し、生理的食塩水またはＲＮＳ−６０を使って、白血球上の細胞表面受容体、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）（パネルＡ）；ＣＤ１１Ｂ（パネルＢ）；およびＣＤ３（パネルＣ）の発現レベルを比較した図である。Ｘ軸は、試料のｌｏｇ蛍光であり、Ｙ軸は、試料で発生する蛍光イベントである。
【図１３Ａ−Ｃ】は、ＲＮＳ６０のＭＢＰ刺激Ｔ細胞中のＮＦκＢ活性化に与える効果を調べた、２つのゲルシフト実験（パネルＡとＢ）およびルシフェラーゼ活性（レポーター遺伝子）アッセイ（パネルＣ）の結果を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が、マウスのＭＯＧ誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床的症状を抑制し（図１４Ａ）、全身のＩＬ６およびＩＬ１７のレベルを低減した（図１４Ｂ）ことを示す。
【図１５】は、マウスの養子移入再発寛解型ＥＡＥの臨床症状に対する本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）の用量依存効果を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）が、マウスの養子移入再発寛解型ＥＡＥの進行を抑制したことを示す。ＥＡＥは、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞の養子移入により雌マウスに導入された。図１６Ａで、マウスは、その後、急性期（８ｄｐｔ（移入後日数））の開始からＲＮＳ６０または生理的食塩水で治療された。あるいは、マウスは、再発寛解型期（２２ｄｐｔ；図１６Ｂ）の開始からＲＮＳ６０または生理的食塩水で治療された。
【図１７】は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）でのエクスビボ治療がＭＢＰ刺激Ｔ細胞の脳炎誘発性を抑制したことを示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】は、特定の代表的実施形態に従い、ＲＮＳ６０によるＴｈ１細胞の調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離された末梢リンパ節細胞（以降、「ＬＮＣ」と表す）を、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）のそれぞれ存在または非存在下、ＭＢＰで刺激した。図１８Ａ：刺激の７２時間後、Ｔ細胞を、適切に希釈したＰＥ標識ＰＥ抗Ｔ−ｂｅｔおよびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。図１８Ｂ：上清のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡでアッセイした。ａｐ＜０．００１ｖｓ対照；ｂｐ＜０．００１ｖｓＭＢＰ。
【図１９Ａ−１９Ｂ】は、特定の代表的実施形態に従い、ＲＮＳ６０によるＴｈ２細胞の調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離されたＬＮＣを、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）のそれぞれ存在または非存在下、ＭＢＰで刺激した。図１９Ａ：刺激の７２時間後、Ｔ細胞を、適切に希釈したＰＥ標識抗ＧＡＴＡ３およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。図１９Ｂ：上清のＩＬ−１０をＥＬＩＳＡでアッセイした。ａｐ＜０．００１ｖｓ対照；ｂｐ＜０．００１ｖｓＭＢＰ。
【図２０】は、特定の代表的実施形態に従い、細胞内のＩＬ−４の発現に対するＲＮＳ６０の効果を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離されたＬＮＣを、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）のそれぞれ存在または非存在下、ＭＢＰで刺激した。刺激の７２時間後、Ｔ細胞を、適切に希釈したＰＥ標識ＰＥ抗ＣＤ４およびＦＩＴＣ標識抗ＩＬ−４Ａｂと共にインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【図２１Ａ−２１Ｂ】は、特定の代表的実施形態に従い、ＲＮＳ６０によるＴｈ１７細胞の調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離されたＬＮＣを、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）のそれぞれ存在または非存在下、ＭＢＰで刺激した。図２１Ａ：刺激の７２時間後、Ｔ細胞を、適切に希釈したＰＥ標識抗ＲＯＲγＴおよびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。図２１Ｂ：上清のＩＬ−１７をＥＬＩＳＡでアッセイした。ａｐ＜０．００１ｖｓ対照；ｂｐ＜０．００１ｖｓＭＢＰ。
【図２２】は、特定の代表的実施形態に従って、ＲＮＳ６０が細胞内ＩＬ−１７発現に与える効果を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離されたＬＮＣを、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）のそれぞれ存在または非存在下、ＭＢＰで刺激した。刺激の７２時間後、Ｔ細胞を、適切に希釈したＰＥ標識抗ＩＬ−１７およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４Ａｂと共にインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【図２３】は、特定の代表的実施形態に従って、ＲＮＳ６０によるＴｒｅｇの調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離されたＬＮＣを、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）のそれぞれ存在または非存在下、ＭＢＰで刺激した。刺激の７２時間後、Ｔ細胞を、適切に希釈したＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本明細書で開示の特定の実施形態は、限定されないが、多発性硬化症を含む炎症性神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病）の治療組成物および治療方法ならびに本明細書に記載の動電学的に生成された流体を含む治療用組成物との細胞の接触、および／またはその治療用組成物の投与による神経炎症の制御と調節の提供に関する。特定の具体的実施形態では、動電学的生成流体は、電荷安定化酸素含有ナノ構造を含むガス富化された動電学的生成流体を含む。特定の態様は、エフェクターＴ細胞の機能および／または活性を抑制および／または調節する、および／または細胞ベース寛容原性療法（例えば、ＴＲＥＧ細胞および／または樹状細胞（ＤＣ）および／またはＴｈ１７細胞（例えば、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞）の発生および／または機能および／または活性の調節により）に関する方法を提供する。特定の態様では、このような方法は、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ（例えば、樹状細胞）の少なくとも１つの本明細書で開示の動電学的変性流体へのエクスビボ暴露を含む。併用療法も追加で提供される。
【００６９】
動電学的生成流体：
本明細書で使われる「動電学的生成流体」、または「動電学的変性流体」は、本明細書の実施例として、本明細書で詳細に記載の代表的混合装置により生成された出願人発明の動電学的生成流体を意味する（米国特許公開第２００８０２１９００８８号および国際公開第ＷＯ２００８／０５２１４３号も参照されたい。両特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書で開示され提示されているデータにより立証されているように、動電学的流体は、先行技術の酸素化非動電学的流体（例えば、圧力ポット酸素化流体、等）を含む先行技術の非動電学的流体に比べ、新規で基本的に異なる流体である。本明細書の種々の態様で開示のように、動電学的生成流体は、独特で新規の物理的および生物学的特性を有し、これらには、限定されないが、以下が含まれる：
【００７０】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均粒径を実質的に有し、生細胞のその流体との接触時に、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を提供するのに充分な量のイオン性水性流体中で安定に構成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む。
【００７１】
特定の態様では、動電学的生成流体は、流体力学的に誘導された、本明細書記載の装置の局在機能効果、等の、局在型（例えば、全液量に対し不均一な）動電学的効果（例えば、電圧／電流パルス）の存在下で生成される流体を意味する。特定の態様では、前記流体力学的に誘導された、局在型動電学的効果は、本明細書で開示され考察される表面関連二重層および／または流動電流効果と組み合わされる。
【００７２】
特定の態様では、投与される発明の動電学的変性流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量の電荷安定化酸素含有ナノ構造を含む。特定の実施形態では、動電学的変性流体は、超酸素化される（例えば、それぞれ、標準塩類溶液中の２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍおよび６０ｐｐｍの溶存酸素を含む、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０およびＲＮＳ−６０）。特定の実施形態では、動電学的変性流体は、超酸素化されない（例えば、１０ｐｐｍの酸素（例えば、標準塩類溶液中のほぼ環境レベルの溶存酸素）を含むＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓ）。特定の態様では、本発明の動電学的変性流体の塩分、無菌、ｐＨ、等は、流体の動電学的製造時に定められ、無菌の流体が適切な経路により投与される。あるいは、流体の塩分、無菌、ｐＨ、等の内の少なくとも１つは、流体の投与の前に、生理学的に投与経路と適合するように適切に調整される（例えば、無菌の塩類溶液または適切な希釈剤を使って）。好ましくは、流体の塩分、無菌、ｐＨ、等の内の少なくとも１つを調節するために使われる希釈剤および／または塩類溶液および／または緩衝液組成物もまた、動電学的流体であるか、そうでなければ適合するものである。
【００７３】
特定の態様では、本発明の動電学的変性流体は、塩類溶液（例えば、１つまたは複数の溶解塩；例えば、アルカリ金属ベース塩（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、等）、アルカリ土類ベース塩（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）、等、または遷移金属ベース陽イオン（例えば、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、等）を含み、また、それぞれのケースで、限定されないが、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＰＯ４−、ＳＯ４−、および窒素ベース陰イオン、等の、いずれかの適切な陰イオン成分を一緒に含む。特定の態様では、種々の組み合わせおよび濃度の混合塩（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、遷移金属イオン（複数可）、等）ベース動電学的流体を、および、任意選択で、対イオン混合物と一緒に、含む。特定の態様では、本発明の動電学的変性流体は、標準的生理食塩水（例えば、約０．９％ＮａＣｌ、または約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の動電学的変性流体は、少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの濃度の塩類溶液を含む。特定の態様では、本発明の動電学的変性流体は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、もしくは、少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍの伝導率である。特定の態様では、本明細書で開示の生物学的に活性な塩安定化ナノ構造（例えば、塩安定化酸素含有ナノ構造）の形成を可能とする限り、いずれの塩も、本発明の動電学的変性流体の調製に使用可能である。
【００７４】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ガス含有ナノ構造を含む流体組成物の生物学的効果は、流体のイオン成分を変えることにより、および／または流体のガス成分を変えることにより、調節（例えば、増加、減少、調整、等）可能である。
【００７５】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ガス含有ナノ構造を含む流体組成物の生物学的効果は、流体のガス成分を変えることにより、調節（例えば、増加、減少、調整、等）可能である。好ましい態様では、本発明の動電学的流体の調製に酸素が使われる。さらなる態様では、酸素は、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素およびキセノンから選択される少なくとも１つの他のガスと一緒に混合される。上述のように、イオンは、また、ガス成分（複数可）の変更と一緒に、変えることができる。
【００７６】
本明細書で開示の教示およびアッセイシステム（例えば、細胞ベースサイトカインアッセイ、パッチクランプアッセイ、等）を考慮すれば、当業者なら、適切な塩およびその濃度を選択し、本明細書に開示の生物活性を容易に得ることができるであろう。
【表１】
2014511879.tif 000003
2014511879.tif 000004
【表２】
2014511879.tif 000005
2014511879.tif 000006
【００７７】
本開示は、限定されないが、ガス富化イオン水溶液、水性塩類溶液（例えば、いずれかの生理的な適合性塩類溶液を含む標準水性塩類溶液、および本明細書で考察される、および当技術分野で認識される可能性のある他の塩類溶液を含む新規ガス富化流体）、糖尿病または糖尿病関連障害の治療に有用な細胞培地（例えば、最少培地、および他の培地）を規定する。培地または複数培地は、成長に必須の栄養素のみを含む場合は、「最小」と命名されている。原核生物宿主細胞に対しては、最少培地は、典型的な例では、炭素、窒素、リン、マグネシウム、および痕跡量の鉄とカルシウムの供給源を含む（Ｇｕｎｓａｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｔｅｒ、Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖ．１、Ｃｈ．１  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．（１９６０））。大抵の最少培地は、炭素供給源としてブドウ糖、窒素供給源としてアンモニア、およびリン供給源としてオルトリン酸塩（例えば、ＰＯ４）を使う。成長させる特定の原核生物または真核生物体（複数可）に応じて、培地成分を変えるか、または補充して、標的タンパク質産生を阻害することなく最適成長を促進できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．２７：８１８−８２４（１９８５））。
【００７８】
特定の態様では、動電学的変性水性の流体は、その中に溶解しているレポーター溶質（例えば、トレハロース）の１３Ｃ−ＮＭＲ線幅を調節するのに適する。ＮＭＲ線幅効果は、例えば、本明細書の特定の実施例中で記載のように、試験流体中で「動き回って」いる溶質の間接的測定方法である。
【００７９】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、下記の内の少なくとも１つを特徴とする：−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖおよび−１．３６Ｖの内のいずれか１つで特有の矩形波ボルタンメトリーピーク差異；−０．９Ｖにポーラログラフピーク；および本明細書の特定の実施例で開示の動電学的生成流体に固有の−０．１９および−０．３Ｖにポーラログラフピークの非存在。
【００８０】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、細胞膜伝導率を変えるのに適する（例えば、本明細書で開示のパッチクランプ調査の尺度としての全細胞コンダクタンスの電圧依存的寄与）。
【００８１】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、酸素化され、流体中の酸素は、大気圧で少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶存酸素の量で存在する。特定の態様では、動電学的変性水性流体は、大気圧で、１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満の溶存酸素、またはほぼ環境酸素レベルの溶存酸素を有する。
【００８２】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、酸素化され、流体中の酸素は、約８ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、本明細書で「Ｓｏｌａｓ」と呼ばれることもある。
【００８３】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、溶媒和電子（例えば、分子状酸素により安定化された）、および動電学的に改質されたおよび／または帯電した酸素種の内の少なくとも１つを含み、特定の実施形態では、溶媒和電子および／または動電学的に改質されたまたは帯電した酸素種が、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
【００８４】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、細胞内のシグナル伝達の調節を提供するために充分な細胞膜構造または機能を変えるのに（例えば、高次構造、リガンド結合活性、または膜結合タンパク質の触媒活性の変更）適し、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、ベータ２アドレナリン性の受容体、ブラジキニン受容体、等）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群より選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、刺激されたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニット（例えば、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２）と相互作用する。
【００８５】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、細胞内のシグナル伝達を調節するのに適し、調節には、カルシウム依存細胞メッセージ伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニレートシクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。
【００８６】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、実施例中または本明細書の他の場所で記載される種々の生物活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素および他のタンパク質ならびに細胞内のシグナル伝達経路の調節）を特徴とする。
【００８７】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、酢酸グラチラマーインターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブと相乗作用を示す。特定の態様では、本明細書の実施例で示されるように、動電学的変性水性流体は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）中のＤＥＰ誘導ＴＳＬＰ受容体発現を低減する。
【００８８】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、本明細書の実施例で示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）中のＤＥＰで誘導される細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを抑制する。
【００８９】
特定の態様では、動電学的変性水性流体の生物学的効果は、本明細書の実施例で示されるように、ジフテリア毒素により阻害され、ベータ遮断、ＧＰＣＲ遮断およびＣａチャネル遮断が動電学的変性水性流体の活性に影響する（例えば、調節性Ｔ細胞機能に対し）ことを示す。
【００９０】
特定の態様では、動電学的変性水性流体の物理的および生物学的効果（例えば、細胞膜構造を変える能力、または細胞内シグナル伝達の調節を行うのに充分な機能）は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６ヶ月、またはさらに長い期間のあいだ密閉容器（例えば、密閉気密容器）中で持続する。
【００９１】
従って、さらなる態様は、前記動電学的生成溶液および動電学的変性酸素化水性流体または溶液の製造方法を提供し、この方法は：相対運動する２つの間隔をおいて配置された面の間の流体材料の流れを提供すること、および混合容量内およびそこを通って流れている流体材料の単回通過の滞留時間が、０．０６秒超または０．１秒超となるように、その間の混合容量を規定すること；さらに、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素をその材料中に溶解し、動電学的に流体または溶液を変性させるのに適した条件下で、混合容量内を流れている流体材料中に酸素（Ｏ２）を導入すること、を含む。特定の態様では、酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満の時間で材料中に注入される。特定の実施形態では、容量に対する、その面の面積の比率は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００９２】
またさらなる態様は、動電学的変性酸素化水性流体または溶液を製造する方法を提供し、この方法は：その間の混合容量を規定する２つの間隔をおいて配置された面の間の流体材料の流れを提供すること；および混合容量内を流れている材料中に、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素を、その材料中に１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満の時間で注入するのに適した条件下で、酸素を導入することを含む。特定の態様では、混合容量内を流れている材料の滞留時間は、０．０６秒超または０．１秒超である。特定の実施形態では、容量に対する面の面積の比率は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００９３】
追加の実施形態は、動電学的変性酸素化水性流体または溶液を製造する方法を提供し、この方法は、第１の材料および第２の材料を混合することにより出力混合物を生成する混合装置の使用を含み、この装置は：第１の材料の供給源から第１の材料を受けるよう形成された第１のチャンバー；ステーター；ステーターの内側に配置された回転軸を有するローターであって、その回転軸の周りに回転するように形成され、ローターおよびステーターの内の少なくとも１つが複数の貫通孔を有するローター；ローターおよびステーターの間で規定される混合チャンバーであって、第１のチャンバーと流体連通しており、さらに、そこから第１の材料を受けるように形成され、ローターおよびステーターの内の１つに形成された複数の貫通孔を介して第２の材料が提供される混合チャンバー；混合チャンバーと流体連通しており、そこから出力材料を受けるように形成されている第２のチャンバー；ならびに第１のチャンバーの内側に収容された第１の内部ポンプであって、第１のチャンバーからの第１の材料を混合チャンバーへ送るように形成されている第１の内部ポンプ、を含む。特定の態様では、第１の内部ポンプは、第１の材料が混合チャンバーに入る前に、周速を第１の材料に分け与えるように形成されている。
【００９４】
さらなる実施形態は、動電学的変性酸素化水性流体または溶液を製造する方法を提供し、この方法は、第１の材料および第２の材料を混合することにより出力混合物を生成するための混合装置の使用を含み、この装置は：ステーター；回転軸を有するローターであって、ステーターの内側に配置され、それの回転軸の周りに回転するように形成されたローター；ローターおよびステーターの間で規定される混合チャンバーであって、第１の材料が混合チャンバーに入る第１開口端および出力材料が混合チャンバーから出て行く第２開口端を有し、第２の材料がローターおよびステーターの内の少なくとも１つを通って入る混合チャンバー；混合チャンバーの少なくとも大部分の第１の開口端と連通している第１のチャンバー；ならびに、混合チャンバーの第２の開口端と連通している第２のチャンバー、を含む。
【００９５】
追加の態様は、上記方法のいずれかにより作られる動電学的変性酸素化水性流体または溶液を提供する。特定の態様では、投与された本発明の動電学的変性流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量の電荷安定化酸素含有ナノ構造を含む。特定の実施形態では、動電学的変性流体は、超酸素化される（例えば、それぞれ、標準的塩類溶液中に、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍおよび６０ｐｐｍの溶存酸素を含むＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０およびＲＮＳ−６０）。特定の実施形態では、動電学的変性流体は、超酸素化されない（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準的塩類溶液中に、およそ環境レベルの溶存酸素）を含むＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓ）。特定の態様では、塩分、無菌、ｐＨ、等の本発明の動電学的変性流体が流体の動電学的生成時に確定され、無菌の流体が適切な経路により投与される。あるいは、流体の塩分、無菌、ｐＨ、等の内の少なくとも１つが、適宜調節され（例えば、無菌の塩類溶液または適切な希釈剤を使って）、流体の投与の前に投与経路に生理学的に適合される。好ましくは、流体の塩分、無菌、ｐＨ、等の内の少なくとも１つの調節に使われる希釈剤および／または塩類溶液および／または緩衝液組成物は、これもまた動電学的流体であるか、またはそうでなければそれらと相溶性のものである。
【００９６】
本開示は、新規ガス富化流体を規定し、これには、限定されないが、ガス富化イオン水溶液、水性塩類溶液（例えば、標準水性塩類溶液、および本明細書で考察した、およびいずれかの生理的に適合した塩類溶液、等の当技術分野で認識される可能性のある他の塩類溶液）、細胞培地（例えば、最少培地、および他の培地）が含まれる。
【００９７】
炎症性神経変性状態の治療。特定の態様は、炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状を治療する方法を提供し、この方法は、実質的に約１００ナノメーター未満の平均径を有し、炎症性神経変性疾患または少なくとも１つのその症状の治療を提供するのに十分な量のイオン性水性流体中で安定に形成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む治療有効量の動電学的変性水性流体を、それを必要としている対象に投与することを含む。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、生細胞の流体との接触時に、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を提供するのに充分な量のイオン性水性流体中で安定に形成される。特定の実施形態では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、流体中で主要な電荷安定化ガス含有ナノ構造種である。特定の態様では、流体中に電荷安定化酸素含有ナノ構造として存在する溶存酸素分子の割合は：０．０１％、０．１％、１％、５％；１０％；１５％；２０％；２５％；３０％；３５％；４０％；４５％；５０％；５５％；６０％；６５％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；および９５％超、からなる群より選択される割合である。特定の態様では、合計溶存酸素は、実質的に、電荷安定化酸素含有ナノ構造中に存在する。特定の実施形態では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、実質的に：９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満、からなる群より選択される寸法未満の平均径を有する。
特定の態様では、イオン性水溶液は、塩類溶液を含む。
特定の態様では、流体は、超酸素化される。
特定の態様では、流体は、一形態の溶媒和電子を含む。
【００９８】
特定の実施形態では、動電学的変性水性流体の変性は、流体力学的に誘導された、局在型動電学的効果に流体を曝すことを含む。特定の態様では、局在型動電学的効果への暴露は、電圧パルスおよび電流パルスの内の少なくとも１つに曝すことを含む。特定の態様では、流体の流体力学的に誘導された、局在型動電学的効果への暴露は、流体の生成に使われる動電学的効果を誘導する構造的特徴の装置に流体を曝すことを含む。
【００９９】
特定の態様では、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、大脳アミロイド血管障害、ＡＩＤＳ関連炎症性神経変性状態、加齢性認知機能低下；軽度認知機能障害および哺乳動物のプリオン病、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。好ましくは、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、の内の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、炎症性神経変性状または疾患は、多発性硬化症を含む。
【０１００】
特定の態様では、少なくとも１つのその症状は、状態中枢神経系および脳の慢性炎症、および中枢神経系および脳の急性炎症、からなる群より選択される少なくとも１つに関連する。
【０１０１】
特定の実施形態では、動電学的変性水性流体は、酸化窒素の局在化または細胞レベルを調節する。特定の態様では、動電学的変性水性流体は：ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８、ＴＮＦ−アルファ、およびＴＮＦ−ベータ、からなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインの投与部位で局在化減少を促進する。
【０１０２】
特定の方法の態様は、さらに対象の別の抗炎症剤との同時または補助的治療による炎症の相乗的または非相乗的抑制または減少を含む。特定の実施形態では、前記他の抗炎症剤には、ステロイドまたはグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニドまたはその活性誘導体を含むグルココルチコイドステロイド）が含まれる。
【０１０３】
特定の方法の態様は、さらに併用療法を含み、少なくとも１つの追加の治療薬が患者に投与される。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、下記からなる群より選択される：酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の阻害剤を含むＭＭＰの阻害剤、短時間作用型β２−アゴニスト、長時間作用型β２−アゴニスト、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエンモディファイア、メチルキサンチン、β２−アゴニスト、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、フォルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含むロイコトリエンモディファイア；クロモリンおよびネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドならびにフォルモテロールを含む組み合わせ薬剤；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む免疫系調節剤；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；およびそれらの組み合わせ。
【０１０４】
特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療薬は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストである（例えば、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストは、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体特異的中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、および２つ以上の受容体鎖の成分をコードするＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含むＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群より選択される）。
【０１０５】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、高次構造、リガンド結合活性、または膜結合タンパク質の触媒活性の内の少なくとも１つの調節を含む細胞膜構造もしくは機能の内の少なくとも１つの調節を含む。特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリン、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニットと相互作用する（例えば、Ｇタンパク質αサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２、からなる群より選択される少なくとも１つを含む）。
【０１０６】
特定の実施形態では、細胞膜伝導率の調節は、全細胞コンダクタンスの調節を含む。特定の態様では、全細胞コンダクタンスの調節は、少なくとも１つの全細胞コンダクタンスの電圧依存的寄与の調節を含む。
【０１０７】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節は、下記の内の少なくとも１つの調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節を含む：カルシウム依存的細胞メッセージ伝達経路またはシステムの調節；ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節；アデニレートシクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内のシグナル伝達の調節；および中枢神経および脳の慢性炎症、ならびに中枢神経および脳の急性炎症、からなる群より選択される少なくとも１つの状態または症状と関連する細胞内のシグナル伝達の調節。
【０１０８】
特定の態様は、細胞ネットワークまたはレイヤーへの投与を含み、また、その中の細胞間結合部の調節をさらに含む。特定の実施形態では、細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソーム、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、細胞ネットワークまたはレイヤーは、ＣＮＳ血管の内皮細胞および内皮−アストロサイト密着結合、血液−脳脊髄液密着結合またはバリア、肺上皮タイプ結合、気管支上皮タイプ結合、ならびに腸上皮タイプ結合、からなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【０１０９】
特定の実施形態では、動電学的変性水性流体は酸素化され、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５、ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。特定の態様では、動電学的変性流体の電荷安定化酸素含有ナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５、ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量である。
【０１１０】
特定の態様では、動電学的変性水性流体は、溶媒和電子、および動電学的に改質されたまたは帯電した酸素種形態の内の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、溶媒和電子または動電学的に改質されたもしくは帯電した酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。特定の態様では、動電学的変性酸素化水性流体は、少なくとも部分的に、分子酸素により安定化された溶媒和電子を含む。
【０１１１】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つを調節する能力は、密閉気密容器中で、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１２ヶ月間、またはそれよい長い期間、持続する。
【０１１２】
特定の態様では、膜結合タンパク質は、ＣＣＲ３を含む。
【０１１３】
特定の態様では、炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療は、細胞内のＮＦ−κＢ発現および／または活性の調節を含む。
【０１１４】
追加の態様は、炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療での使用に適する治療薬を処方する方法を提供し、この方法は：対象の炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療での使用に適する治療薬を得ること；およびその治療薬を、ある量の実質的に約１００ナノメーター未満の平均径を有し、炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療に充分な量のイオン性水性流体中で安定に形成された電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む動電学的変性水性流体と組み合わせて、炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療での使用に適する治療薬の処方が得られること、を含む。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、生細胞と流体の接触時に、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量のイオン性水性流体中で安定に形成される。
【０１１５】
さらなる態様は、対象の炎症性神経変性状態または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療での使用に適する治療薬；および実質的に約１００ナノメーター未満の平均径を有し、炎症性神経変性状または疾患、または少なくとも１つのその症状の治療に十分な量のイオン性水性流体中で安定に形成される電荷安定化酸素含有ナノ構造のイオン性水溶液を含む、ある量の動電学的変性水性流体を含む医薬組成物を提供する。
【０１１６】
追加の態様は、本明細書で開示の方法により調製される医薬組成物を提供する。
【０１１７】
特定の治療方法の態様では、治療は、局所的、吸入、鼻腔内の、経口および静脈内の内の少なくとも１つの投与を含む。
【０１１８】
特定の態様では、動電学的変性流体の電荷安定化酸素含有ナノ構造は、本明細書で開示の表１および２由来の少なくとも１つの塩またはイオンを含む。
【０１１９】
エフェクターＴ細胞。本明細書で使用される語句の「エフェクターＴ細胞」は、炎症性神経変性状または疾患に関与するエフェクターＴ細胞を意味する。特定の態様では、「エフェクターＴ細胞」は、限定されないが、神経炎症および脱髄性疾患（例えば、ＭＳ）に関与するエフェクターＴ細胞を含む。特定の態様では、神経炎症および脱髄性疾患（例えば、ＭＳ）に関与するＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、高レベルのＶＬＡ４を発現している細胞を含むＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むエフェクターＴ細胞、およびＴ−ｂｅｔを発現している細胞を含むＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む少なくとも１つのエフェクターＴ細胞を含む。特定の態様では、Ｔｈ１細胞は、ＣＤ４およびＴ−ｂｅｔ陽性であり、ＩＦＮγを放出する。特定の態様では、Ｔｈ２細胞は、ＣＤ４およびＧＡＴＡ４陽性であり、ＩＬ１０を放出する。特定の態様では、Ｔｈ１７細胞は、ＣＤ４およびＲ１３ｇ陽性であり、ＩＬ１７を放出する。
【０１２０】
特定の態様では、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の発生および／または機能の「調節」は、前記発生および／または機能を減少させることを含み、一方、他の態様では、調節は、前記成長および／または機能を増加させることを含む。特定の態様では、反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｈ１からＴｈ２へのサイトカインシフトが生じる。
【０１２１】
炎症
炎症は、対象への外来性の、特に、微生物由来の物質の侵入に対する防御反応として発生する場合がある。さらに、機械的な外傷、毒素、および腫瘍形成が、炎症反応を誘導する場合もある。白血球の蓄積とその後の活性化は、大抵の炎症の形の発病の中心的イベントである。炎症の欠如は、宿主を感染症または外傷の悪化しやすいまま放置する危険にさらす可能性がある。長引く炎症反応、等の過度の炎症は、限定されないが、糖尿病、動脈硬化、白内障、慢性皮膚障害、再潅流障害、および癌を含む炎症性疾患、感染性髄膜炎、リウマチ熱の場合のような感染後症候群、およびリウマチ性疾患、例えば、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチ、に繋がる可能性がある。これらの疾患は、毎年世界中で数百万人の人々が罹患し、死亡率および罹患率の増加に繋がる。これらの様々な疾患プロセスでの炎症反応の共通性により、炎症反応の調節が、予防、またはヒト疾患治療における主要な因子となっている。
【０１２２】
炎症促進性のサイトカインの過剰産生は、多くの炎症性および自己免疫疾患の発病に結びつけられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症性カスケードの開始の主要イベントであり（Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｆ．Ｍ．、ｅｔ．ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ、１９８９、２：２４４−７；Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｃ、ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１、２１：２５７５−２５７９）、これらの疾患の開始と維持に直接寄与する。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＦＮ−γ、顆粒球コロニー刺激因子子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＩＬ−１０を含む他のサイトカインもまた、関与している。サイトカインのいくつか（例えば、ＩＬ−８）は、炎症反応を増加するか、または悪化させる可能性があり、他方、他のもの（例えば、ＩＬ−１０）は、炎症反応を減らすか、または緩和できる。
【０１２３】
免疫系の細胞、特にマクロファージは、活性化刺激に応答してこれらのサイトカインの多くを分泌する。サイトカインの標的細胞は、いずれの身体の区画で局在化されてもよく、また、長距離機序を介して作用しても、または、隣接細胞に作用してもよい。従って、サイトカインは、局部的に、または全身的に炎症を調節できる。
【０１２４】
メタロプロテイナーゼ
メタロプロテイナーゼは、例えば、Ｎ．Ｍ．Ｈｏｏｐｅｒ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５４：１−６、１９９４、に記載のファミリーおよびサブファミリーに分類されるプロテイナーゼ（酵素）のスーパーファミリーである。メタロプロテイナーゼの例には、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、例えば、コラゲナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９）、ストロメライシン（ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰＩＩ）、マトリライシン（ＭＭＰ７）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、エナメリシン（ＭＭＰ１９）、ＭＴ−ＭＭＰ（ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７）；レプロリシンまたはアダマライシンまたはセクレターゼおよびＴＮＦ変換酵素（ＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥ）等のシェダーゼを含むＭＤＣファミリー；プロコラーゲン処理プロテイナーゼ（ＰＣＰ）等の酵素を含むアスタシンファミリー；ならびに、アグリカナーゼ等の他のメタロプロテイナーゼ、エンドセリン変換酵素ファミリーおよびアンギオテンシン変換酵素ファミリー、が含まれる。一括りにして述べると、メタロプロテイナーゼは、広範囲のマトリックス基質、例えば、コラーゲン、プロテオグリカンおよびフィブロネクチンを切断することが知られている。メタロプロテイナーゼは、生物学的に重要な細胞伝達物質、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のプロセッシングまたは分泌；および、生物学的に重要な膜タンパク質、例えば、低親和性ＩｇＥ受容体ＣＤ２３の翻訳後タンパク質分解プロセッシング、または切断に関与する（例えば、Ｎ．Ｍ．Ｈｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２６５−２７９、１９９７、を参照）。
【０１２５】
従って、当然のことながら、メタロプロテイナーゼは、組織リモデリング（例えば、胚の発生、骨形成、月経の間の子宮リモデリング、等）を伴う多くの生理的な疾患プロセスで重要であると考えられている。さらに、１つまたは複数のメタロプロテイナーゼの活性の抑制は、例えば、下記に示す疾患または状態に対し充分に有効となりうる：種々の炎症性およびアレルギー性疾患、例えば、関節の炎症（特に、関節リウマチ、骨関節炎および痛風）、胃腸管の炎症（特に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎および胃炎）、皮膚の炎症（特に、乾癬、湿疹、皮膚炎）；腫瘍転移または侵襲の炎症；細胞外マトリックスの無制御分解に関連する疾患、例えば、骨関節炎の炎症；骨吸収疾患（例えば、骨粗鬆症およびパジェット病）の炎症；異常血管新生に関連する疾患の炎症；糖尿病、歯周病（例えば、歯肉炎）、角膜潰瘍形成、皮膚の潰瘍形成、手術後の状態（例えば、結腸吻合）および皮膚の創傷治癒に関連する強化コラーゲンリモデリング；中枢および末梢神経系の脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症）；アルツハイマー病；循環器疾患、例えば、再狭窄および粥状動脈硬化症で観察される細胞外マトリックスリモデリング；喘息；鼻炎；および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＥＤ）。
【０１２６】
マクロファージエラスターゼまたはメタロエラスターゼとしても知られるＭＭＰ１２は、最初、マウスでクローン化され（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：４６６４、１９９２）、また、同じグループにより１９９５にヒトでクローン化された。ＭＭＰ１２は、活性化マクロファージ中で優先的に発現し、喫煙者の肺胞マクロファージから（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８：２３８２４）、ならびに、動脈硬化病変中の泡沫細胞で分泌されることが示された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１０９、１９９８）。ＣＯＰＤのマウスモデルは、タバコ２本／日で週６日間のたばこの煙を用いた、６ヶ月間にわたるマウスの刺激に基づいている。野性型マウスは、この処理後、肺気腫を発症した。このモデルでＭＭＰ１２ノックアウトマウスを試験した場合は、マウスは、顕著な気腫を発症しなかったが、これは、ＭＭＰ１２がＣＯＰＤ発病に重要な酵素であることを強く示唆している。ＭＭＰ１２等のＭＭＰのＣＯＰＤ（気腫および気管支炎）における役割は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎａｇａｗａ、１９９９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １（１）：２９−３８、で考察されている。喫煙により、ヒト頚動脈プラークでのマクロファージ浸潤およびマクロファージ由来ＭＭＰ−１２発現が増えることが最近明らかになった（Ｍａｔｅｔｚｋｙ  Ｓ、Ｆｉｓｈｂｅｉｎ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：（１８）、３６−３９  Ｓｕｐｐｌ．Ｓ、Ｏｃｔ．３１、２０００）。
【０１２７】
ＭＭＰ９−（ゼラチナーゼＢ；９２ｋＤａ−ＩＶ型コラゲナーゼ；９２ｋＤａゼラチナーゼ）は、最初、１９８９に、精製され、その後、クローン化され、配列決定された分泌タンパク質である（Ｓ．Ｍ．Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２９）：１７２１３−１７２２１、１９８９；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３６）：２２５７０、１９９０、に正誤表掲載）（このプロテアーゼの詳細情報および参考文献については、（マトリックスメタロプロテアーゼ、１９９８、編集：Ｗ．Ｃ．Ｐａｒｋｓ＆Ｒ．Ｐ．Ｍｅｃｈａｍ、ｐｐ．１１５−１４８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ０−１２−５４５０９０−７、中のＴ．Ｈ．Ｖｕ＆Ｚ．Ｗｅｒｂ（１９９８）を参照）。ＭＭＰ９の発現は、通常、栄養膜、破骨細胞、好中球およびマクロファージ等の少数の細胞型に限定されている（Ｖｕ＆Ｗｅｒｂ、同上）。しかし、発現は、細胞を増殖因子またはサイトカインへの暴露を含むいくつかのメディエーターにより、これらの同じ細胞中および他の細胞型中で誘導されうる。これらは、炎症反応の開始に関与することが多い同じメディエーターである。他の分泌ＭＭＰと同様に、ＭＭＰ９は、不活性酵素前駆体として放出され、これは、その後、切断されて触媒的に活性な酵素を形成する。このインビボ活性化に必要なプロテアーゼは、知られていない。不活性酵素に対する活性ＭＭＰ９のバランスは、天然タンパク質のＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤）との相互作用により、インビボでさらに調節されている。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ９のＣ末端領域に結合し、ＭＭＰ９の触媒ドメインの抑制に繋がる。ＰｒｏＭＭＰ９の誘導発現、前駆体から活性ＭＭＰ９への切断、およびＴＩＭＰ−１の存在のバランスが組み合わされて、局所部位に存在する触媒的に活性なＭＭＰ９の量が決定される。タンパク分解性活性ＭＭＰ９は、ゼラチン、エラスチン、および天然ＩＶ型コラーゲンおよび天然Ｖ型コラーゲンを含む基質を攻撃し；天然Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカンまたはラミニンに対しては活性を持たない。様々な生理的および病理学的プロセスにおいてＭＭＰ９の関与を示唆するデータが増えてきた。生理的な関与には、胚移植の初期段階で子宮上皮を通った胚栄養膜の侵入；骨の成長および発生でのいくつかの役割；および炎症性細胞の脈管構造から組織中への遊走、が含まれる。
【０１２８】
酵素イムノアッセイを使って測定したＭＭＰ９放出は、他の集団由来のものに比べて、未治療喘息患者由来の流体およびＡＭ上清で著しく強化された（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：５８３−５９１、１９９７）。また、ＭＭＰ９発現の増加が特定の他の病理学的状態で観察され、それにより、疾患プロセス、例えば、ＣＯＰＤ、関節炎、腫瘍転移、アルツハイマー病、多発性硬化症、および急性の冠血管状態、例えば、心筋梗塞に繋がる粥状動脈硬化症のプラーク破裂が、ＭＭＰ９に結びつけられる（また、国際公開第ＷＯ０７０８７６３７Ａ３号も参照されたい。この特許は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２９】
最近、ＭＭＰ−９のレベルは、健康な対照である対象に比べて、安定喘息の患者で著しく増加し、また、急性喘息患者でさらに高いことが示された。ＭＭＰ−９は、気道炎症性細胞の浸潤および気道応答性亢進の誘導で重大な役割を果たし、ＭＭＰ−９が喘息を誘導し維持するのに重要な役割を有する可能性があることを示している（Ｖｉｇｎｏｌａｅｔａｌ．、痰メタロプロテイナーゼ−９／メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤比率は、喘息および慢性気管支炎の気流閉塞と相関する（Ｓｐｕｔｕｍ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｒａｔｉｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｉｒｆｌｏｗ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５８：１９４５−１９５０、１９９８；Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、喘息のマトリックスメタロプロテアーゼ−９およびメタロプロテイナーゼ−１発現の組織阻害剤の間のバランスの調節により、吸入副腎皮質ステロイドは上皮下コラーゲン沈着を低減する（Ｉｎｈａｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃｏ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ）、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１０４：３５６−３６３、１９９９；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、好酸球および好中球性喘息の特異なタンパク分解性酵素活性（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｓｔｈｍａ）、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７２：５５９−５６５、２００５；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、トルエンジイソシアナート誘導喘息のマウスモデルは、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤で治療可能である（Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０８：１０２１−１０２６、２００１；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、トルエンジイソシアナート誘導された喘息のマウスモデルで、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１発現を減らすことにより、炎症性の細胞遊走を調節する（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ＶＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔ��ｍａ）、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：１２７８−１２８４）。
【０１３０】
ＭＭＰ阻害剤：
いくつかのメタロプロテイナーゼ阻害剤が知られている（例えば、ＢｅｃｋｅｔｔＲ．Ｐ．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ、８（３）：２５９−２８２；およびＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９９（９）：２７３５−２７７６、によるＭＭＰ阻害剤のレビューを参照）。国際公開第ＷＯ０２／０７４７６７号は、ＭＭＰ阻害剤、特に強力なＭＭＰ１２阻害剤として有用な組成のヒダントイン誘導体を開示している。米国特許出願第１１／７２１，５９０号（米国特許公開第２００８／００３２９９７号として公開）は、メタロプロテイナーゼの阻害剤であり、ＭＭＰ１２およびＭＭＰ９等のＭＭＰ阻害に特に興味深い追加のヒダントイン誘導体グループを開示する。ＭＭＰ１２およびＭＭＰ９等のＭＭＰを阻害する新規のトリアゾロン誘導体が、米国特許出願第１０／５９３,５４３号（米国特許公開第２００７／０２１９２１７号として公開）で開示されている。追加のＭＭＰ１２およびＭＭＰ９阻害剤は、米国特許出願１１／５０９、４９０号（米国特許公開第２００６／０２８７３３８号として公開）で開示されている（また、米国特許出願１０／８３１,２６５号（米国特許公開第２００４／０２５９８９６号として公開）の参照）。
【０１３１】
さらに、２つの化合物、４−（４−フェノキシフェニルスルホニル）ブタン−１，２−ジチオール（１）および５−（４−フェノキシフェニルスルホニル）ペンタン−１，２−ジチオール（２）、が、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に選択的に結合し、それらを強力に阻害することが示された（Ｂｅｒｎａｒｄｏ、ｅｔ．ａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１１２０１−１１２０７）。これら２つの化合物は、診療室でＭＭＰ−２および−９を阻害し、従って炎症を減らす重要な用途を持つ可能性がある。さらに、特定のテトラサイクリン抗生物質（例えば、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン）の準抗生物質的レベルでの使用が、効果的にＭＭＰ活性を阻害することが示された。特定の本発明の態様は、ＭＭＰを阻害するのに有用な準抗生物質的レベルと組み合わせて、本発明の流体を使用することを含む。
【０１３２】
治療方法：
用語の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患、障害もしくは状態または１つまたは複数のそれらの症状の進行の逆転、軽減、阻害またはそれらの防止を意味し、包含し；また、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」は、本明細書で定義の治療の行為を意味する。
【０１３３】
「治療有効量」は、本明細書で提供される発明を実施する過程で使用されるいずれかの化合物のいずれかの、疾患、障害もしくは状態または１つまたは複数のそれらの症状の進行の逆転、軽減、阻害またはそれらの防止に充分な量である。
【０１３４】
本明細書の特定の実施形態は、治療組成物および特定の状態または疾患に関連する炎症性神経変性疾患のような炎症の少なくとも１つの症状の防止または軽減による対象の治療方法に関する。例えば、治療組成物および／または本明細書に開示の方法は、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、アミロイド症（ｅ．ｇ．アルツハイマー病）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、プリオン病、およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される１つまたは複数の状態または疾患の治療または防止に有用でありうる。
【０１３５】
炎症に関連する多くの状態または疾患が、ステロイド；メトトレキサート；シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリンおよびレフルノミドを含む免疫抑制剤；非ステロイド性抗炎症薬、例えば、アスピリン、アセトアミノフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤；金薬剤および抗マラリア薬治療、で治療されてきた。これらの薬剤は、様々な欠点、および有害反応を有し、これらには、注射部位反応、発疹、上気道感染症、自己免疫障害および感染に対する高まった感受性、が含まれる。さらに、多くの抗炎症性医薬品は、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与が必要であり、より簡便で、投薬計画を遵守しやすい経口または局所的皮膚経路とは対照的である。従って、炎症に関連する状態および疾患のための新規薬物および治療方法の開発に対するニーズがまだ存在する。
【０１３６】
多発性硬化症および状態：
本明細書の特定の実施形態は、多発性硬化症および／またはその症状の治療するための治療組成物および方法（例えば、認知機能障害の症状の軽減を含む）に関する。
【０１３７】
現状のＭＳの治療には、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、およびナタリズマブが含まれる。酢酸グラチラマーは、ランダムポリマーとして、グルタミン酸、リシン、アラニン、およびチロシンから構成される。酢酸グラチラマーは、有効性が限られ、大きな副作用、例えば、注射部位のしこり、悪寒、発熱、疼痛、息切れ、心臓の速い鼓動および不安がある。一次進行型ＭＳの９４３人の患者を使った重要な臨床試験では、酢酸グラチラマーは、身体障害および疾患の進行を止めることができなかった（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ、ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１：１３−２４）。
【０１３８】
インターフェロン（「ＩＦＮ」）−βは、線維芽細胞および一部の自然免疫応答により産生される天然タンパク質である。ＭＳの薬剤として、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−βは、ＭＳ発症の速度を遅らせるのに約１８〜３８％有効である。副作用には、軽度の副作用の注射部位のインフルエンザ様症状および反応、および、さらに重篤な副作用（例えば、うつ病、てんかん発作、および肝臓の問題）が含まれる。
【０１３９】
ミトキサントロンは、ＭＳ用治療薬である。これは、癌との戦いに使用される化学療法治療薬として開発された。それは、ＤＮＡ修復と合成を妨害することにより作用するが、癌細胞に特異的ではない。ミトキサントロンの副作用は、非常に重篤で、悪心、嘔吐、脱毛、心臓損傷、および免疫抑制を含む場合がある。
【０１４０】
ナタリズマブは、細胞接着分子であるα４−インテグリンを標的にするヒト化モノクローナル抗体である。ナタリズマブは、炎症の原因となる免疫細胞が血液脳関門を通過するのを防ぐことにより作用すると考えられている。副作用には、疲労、頭痛、悪心、悪寒、およびアレルギー反応が含まれる。
【０１４１】
一般的に、これらの薬剤は、非特異的に免疫系を抑制し、全体の疾患の進行を少しだけ制限する（Ｌｕｂｅｔｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８：２３７−２４４）。従って、ＭＳをより良く治療する治療方法を開発するニーズが存在する。
【０１４２】
併用療法：
追加の態様は、併用療法をさらに含む、本明細書に開示される本発明の方法を提供し、この場合、少なくとも１つの追加の治療薬が患者に投与される。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、およびナタリズマブおよび／またはＭＭＰの阻害剤、からなる群より選択される。
【０１４３】
動電学的生成ガス富化流体および溶液の抗炎症活性：
本発明の特定の態様では、本明細書で開示のガス富化流体および／または溶液は、抗炎症性の特性および効果を有し、炎症性神経変性に関する疾患または障害に悩まされている対象の治療のための抗炎症剤として使用できる。図１は、健康な血液ドナー由来の刺激を受けたリンパ球中のサイトカインプロファイルの実験結果を示す。図１からわかるように、本発明の酸素富化流体（水）は、特定のサイトカイン、特に、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βの発現低下をもたらした。
【０１４４】
炎症促進性のサイトカインの産生増加は、多くの炎症性疾患および自己免疫疾患の発病に結びつけられた。ＴＮＦαの分泌は、炎症性カスケードの開始の主要イベントであり（Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｆ．Ｍ．、ｅｔ．ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ、１９８９、２：２４４−７；Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｃ、ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１、２１：２５７５−２５７９）、炎症性および自己免疫疾患の開始と維持に直接寄与する。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２一酸化窒素、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ、等の他の炎症促進性のサイトカインもまた、関与し、一方、ＩＬ−１０等の抗炎症性のサイトカインは、疾患を低減できる。免疫系の細胞、特にマクロファージは、活性化刺激に反応して、これらのサイトカインの多くを分泌する。
【０１４５】
種々の細胞型が炎症性プロセスに関与する。単球、マクロファージおよび他の免疫細胞によるＴＮＦαの過剰産生は、多数の疾患の発病における重要な要因である。マクロファージおよびＴ細胞は、特に、免疫応答の開始と維持に中心的役割を果たす。病理学的または免疫原性刺激により活性化されるとすぐに、マクロファージは、多数のサイトカインを放出することにより応答する。これらのサイトカインには、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、等が含まれる。Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、および他の炎症性サイトカインを放出する。これらのサイトカインは、他の免疫細胞を活性化し、一部は、独立した細胞傷害性薬剤としても作用できる。炎症性のメディエーター由来のマクロファージおよびＴ細胞の過度の放出は、特に、正常細胞および周辺組織の損傷に繋がる可能性がある。
【０１４６】
炎症促進性サイトカインは、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルスおよびヘルペスファミリーのウイルスを含むＨＩＶ−ＡＩＤＳ、および他のウイルス性感染症に結びつけられてきた。ＴＮＦαは、ヒトサイトメガロウイルスの主要な最初期のエンハンサー／プロモーターの基礎活性を強化し、前単球細胞の潜伏ＨＣＭＶ感染の再活性化に関与する（Ｐｒｏｓｃｈ  Ｓ．、ｅｔ．ａｌ．ウイルス学１９９５、２０８：１９７−２０６）。
【０１４７】
さらに、いくつかの炎症性のサイトカインは、敗血症またはエンドトキシンショックを患っている患者の死亡率の一因となる。例えば、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βは、敗血症、敗血症性ショックおよびエンドトキシンショックで確立された中心的役割を有する。これらのサイトカインのレベルの増加は、ホスホリパーゼＡ２およびＮＯ合成酵素に対する遺伝子発現の誘導（Ｇｒｏｎｉｃｈ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４、９３：１２２４−１２３３）と一緒に、発熱、低血圧およびおよびショック（Ｓｍｉｔｈ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９２、１０：１１４１−１１５２；Ｃｈａｐｍａｎ  Ｐ．Ｂ．、ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９８７、５：１９４２−１９５１）に関連する。
【０１４８】
平滑筋細胞からのＮＯの誘導は、平均動脈圧の減少と敗血症性ショックの間の全身性血管抵抗を媒介し、ＮＯの基本的な関与を示唆する。従って、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、およびＮＯに対する発現低下効果を標的とする治療は、敗血症、敗血症性ショック、およびエンドトキシンショック等の炎症性疾患または障害の治療に有益である可能性がある。
【０１４９】
ＴＮＦαの過剰産生は、多くの自己免疫疾患、例えば、糖尿病および関節リウマチの臨床的特徴の原因である。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、また、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαレベルの増加により誘発される。狼瘡患者の内で、血清Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαレベルは、対照よりは高く、炎症反応の増加が疾患に関与することを示唆する（Ｌｉｏｕ  Ｌ．Ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００１、１９：５１５−５２３）。１つの形態のＳＬＥ、精神神経系紅斑性狼瘡（ＮＰＬＥ）の患者の調査では、ＴＮＦαのｍＲＮＡを発現している末梢血単核細胞の数、ならびに、ＮＯ代謝物脳脊髄液レベルは、ＮＰＬＥ疾患重症度と相関することが示された（Ｓｖｅｎｕｎｇｓｓｏｎ  Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．２００１、６０：３７２−９）。
【０１５０】
ＩＬ−１およびＴＮＦαは、動物モデルの種々の急性、ならびに、慢性応答における中心的役割を果たしている。さらに、ＩＬ−１１、ＩＦＮαおよびＩＦＮβは、また、炎症性反応を上方制御できる。逆に、いくつかのサイトカインは、炎症反応の下方制御に関与できる（すなわち、残りのサイトカインの内のＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）。実施例１で記載のように、Ｔ３抗原を含む本発明のガス富化流体と接触した細胞は、Ｔ３抗原を含む対照培地の場合より、ＩＦＮ−γレベルの増加を示し、他方、Ｔ３抗原を含む対照培地の場合より、Ｔ３抗原を含む本発明のガス富化培地で、ＩＬ−８が少なかった。さらに、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αレベルは、ＰＨＡを含む対照培地の場合より、ＰＨＡを含む本発明のガス富化培地で低く、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡを含む対照培地の場合に比べて、ＰＨＡを含む本発明のガス富化流体中で、より低かった。本発明のガス富化培地単独中では、ＩＦＮ−γレベルは、対照培地の場合より高かった。これらの結果は、抗炎症性の微小環境と一致する。
【０１５１】
ＮＯは、炎症反応のメディエーターおよび制御因子として認識されている。それは病原体に対し細胞傷害性の特性を有するが、対象自身の組織にも有害作用を及ぼす可能性がある（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４（４）：４７１−９、２００５）。ＮＯは、可溶性グアニル酸シクラーゼと反応し、環式グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を形成し、これは多くのＮＯの効果を媒介する。ＮＯは、また、分子酸素および超酸化物陰イオンと相互作用し、種々の細胞機能を修飾可能な反応性酸素種を産生できる。これらのＮＯの間接的効果は、炎症に関し重要な役割を有し、ＮＯが誘導性ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）により多量に産生され、活性化炎症性細胞により反応性酸素種が合成される。
【０１５２】
ＮＯは、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、および場合によって他のものにより産生されうる。ＮＯの血管作用の一部には、血管拡張、血管内皮への血小板付着の抑制、血管内皮への白血球付着の抑制、およびスーパーオキシドの掃除が含まれる（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐ．ｖ．１０６（５）：１１３９−１１４３）。
【０１５３】
さらに、ＮＯ合成の抑制は、創傷収縮を遅らせ、コラーゲン組織化を変え、および新表皮の厚さを変えることが示された（Ａｍａｄｅｕ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａ、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３３：４６５−４７３、２００６）。創傷中のマスト細胞遊走および血管新生は、また、ＮＯの抑制により影響を受ける（同上）。いずれかの特定の機序の理論に拘泥するものではないが、特定の実施形態では、本発明のガス富化流体は、局在化および／または細胞ＮＯ産生、または分解を調節でき、本明細書で開示の実施例セクションに例示の創傷治癒効果の範囲と一致する。可変調節経路に起因して、特定の実施形態では、本発明のガス富化流体は、ＮＯ産生を増加させる、および／またはＮＯ分解を遅らせることができ、一方、他の特定の実施形態では、本発明のガス富化流体は、ＮＯ産生を遅らせる、および／またはＮＯ分解を早めることができる。
【０１５４】
具体的には、酸素富化塩類溶液で治療した創傷は、本明細書の実施例９で記載のように、４〜１１日に創傷治癒の増加を示し、ｄａｙ３〜１１の間に、酸素富化塩類溶液で治療の創傷の新表皮が、生理的食塩水で治療した創傷の表皮の２〜４倍速く移動した。この調査は、また、１５〜２２日の間に、酸素富化塩類溶液で治療した創傷は、より成熟した上皮性レイヤーのより早期の形成からも明らかなように、より高速で分化されることを示した。全ての段階で、正常な治癒に関連した表皮で起こる肥厚は、酸素富化塩類溶液で治療した創傷内では起こらなかった。
【０１５５】
従って、いかなる特定の理論にも拘泥する意図はないが、この創傷治癒効果の範囲に基づいて、酸素富化塩類溶液は、創傷内の局在化および／または細胞レベルのＮＯを調節することができると考えられる。ＮＯは、創傷治癒において、増殖因子、コラーゲン沈着、炎症、マスト細胞遊走、上皮性肥厚、および血管新生を調節する。さらに、一酸化窒素は、酸素により調節されている誘導性酵素により産生される。
【０１５６】
マスト細胞遊走の場合は、また、酸素富化溶液に対する早期および後期遊走で差異が発生した。これは、ＮＯ合成の抑制に関し当技術分野で既知のことと一致する（Ａｍａｄｅｕ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａ、Ｊ．Ｃｕｔａｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３３：４６５−４７３、２００６）。
【０１５７】
炎症性プロセスの最初の２つの段階で、異物は破壊されるか（例えば、異物が生物体の場合）、またはその周辺の組織がほぐされる（例えば、破片の場合）。治癒段階では、炎症は、静まり始め；個別血管および血管パターンは再度正常になり；さらに創傷の修復が開始される。修復プロセスの３つの主要イベントは、（１）線維芽細胞の増殖による新規結合組織の形成；（２）上皮の再生；および（３）新毛細管の成長、である。
【０１５８】
炎症の鎮静の前であっても、線維芽細胞は、通常それらが休眠状態で存在する周辺正常組織から損傷部位に移動を始める。それらはアメーバ運動によりフィブリンの繊維に沿って移動し、治癒領域全体に広がる。傷害組織中の位置に固定されるとすぐに、それらはコラーゲンの合成を始め、このタンパク質を分泌し、これが繊維中に並ぶ。繊維は最大応力の方向で、それらの長軸の方向に配列する。コラーゲン束が堅く成長するにつれ、線維芽細胞が徐々に退化し、その束に密接に付着し、損傷部位は瘢痕組織に変わる。
【０１５９】
瘢痕組織形成と同時に、創傷の縁のインタクト上皮性細胞が増殖を始め、１つのシートとして、損傷部位の中心へ移動する。炎症が鎮静するにつれ、血液の直接供給が必要になり、創傷部位で血管新生が起こる。
【０１６０】
炎症は、複数の細胞型を伴う複合プロセスである。例えば、マスト細胞が、血管拡張の初期段階のトリガーとなるメディエーターを放出し、続いて、内皮細胞の分離および内皮下層のコラーゲン繊維を露出させる。血管中にできる細胞間ギャップ中の繊維は、血小板を捕捉し、これらの細胞からのメディエーター放出の引き金となる。
【０１６１】
血小板に加えて、露出コラーゲン繊維もまた、拡張血管壁の気孔を通して濾過する血漿のタンパク質と相互作用をする。これには、血液凝固カスケード、血管拡張の増加、血管透過性の増加、および走化性、の引き金となる因子が含まれる。
【０１６２】
さらに、補体カスケードが、次記のいくつかの刺激により活性化されうる：傷害血管、傷害性細胞により放出されたタンパク分解性酵素、いずれかの関与細菌の膜成分、および抗原−抗体複合体。いくつかの活性化補体成分は、走化性因子として作用し、白血球の炎症性領域への流入の原因となり、他方、他の活性化補体成分は、食作用を促進し、細胞溶解に関与する。
【０１６３】
さらに、本発明のガス富化流体または溶液は、また、炎症の少なくとも１つの状況に関与する少なくとも１つのサイトカインを調節できると考えられ、このサイトカイン（複数可）には、限定されないが、以下のものが含まれる：ＭＡＦ（マクロファージ活性化因子）、ＭＭＩＦ（マクロファージ遊走抑制因子）、ＭＣＦ（マクロファージ走化性因子）、ＬＭＩＦ（白血球遊走阻止因子）、ＨＲＦ（ヒスタミン放出因子）、ＴＦ（トランスファー因子）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、等）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ζ、ＩＦＮ−δ、等）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージＣＳＦ）、マルチＣＳＦ（ＩＬ−３）、繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、等）、ＮＡＰ−２（好中球活性化タンパク質２）、ＰＦ−４（血小板因子４）、トロンボグロブリン、ＭＣＰ−１（単球化学誘引物質タンパク質１）、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β−＋（マクロファージ炎症性タンパク質）、ＲＡＮＴＥＳ（（血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質）、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）、ＧＲＰ（ブドウ糖調節タンパク質）、ユビキチン、等。
【０１６４】
従って、特定の実施形態では、ガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症性分子もしくはサイトカインの産生および／または分泌を増やすか、または抗炎症性分子もしくはサイトカインの分解を減らすことができ、それにより、炎症および／または炎症性神経変性の少なくとも１つの症状を軽減または防止できる。他の実施形態では、本発明のガス富化流体および／または治療組成物は、炎症促進性分子もしくはサイトカインの産生および／または分泌を減らすか、または炎症促進性分子もしくはサイトカインの分解を増やすことができ、それにより、炎症および／または炎症性神経変性の少なくとも１つの症状を軽減または防止できる。
【０１６５】
以前の調査は、脱髄増大およびＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎：ヒト関節リウマチの自己免疫障害の動物モデル系）の悪化における抗ＭＯＧ抗体の重大な役割を示した（Ｌｉｎｉｎｇｔｏｎ、ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２１９−２２４）。さらに、ＭＯＧに対する抗体は、多発性硬化症の発病に結びつけられてきた（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００３  Ｊｕｌ  １０；３４９（２）：１３９−４５）。
【０１６６】
図２および例３で示したように、本発明のガス富化流体は、動物が以前感作された抗原に対するリンパ球応答を増幅する。図２に得示すように、加圧、酸素化流体（圧力ポット）または対照脱イオン流体に比べて、溶媒和電子を含む本発明のガス富化流体で再構成された流体中で培養した場合、リンパ球増殖は、ＭＯＧ刺激への応答に対し、より大きくなった。
【０１６７】
代表的関連分子相互作用：
慣例に従い、量子特性は、１０−１０ｍ未満の素粒子に属すると考えられるが、一方、日常の巨視的な世界は、ニュートンの運動法則に従って挙動するという理由から、古典的と呼ばれる。
【０１６８】
近年、分子は、希釈に伴いサイズが増加するクラスターを形成するとして説明されている。これらのクラスターは、直径が数μという測定値であり、希釈と共に非線形的にサイズが増加すると報告されている。直径１００ナノメーターの量子コヒーレントドメインが純粋な水中で生じると想定されており、コヒーレントドメイン中での水分子の集団振動が、実質的に電磁場のゆらぎに束縛された相になり、水の中に安定な振動を与え、水の集団構造を変える水中の溶解物質に特異的な長く続くコヒーレント振動の励起の形での一形態の「記憶」を提供し、これにより、次に、発生する特異的コヒーレント振動を決定できる。これらの振動が磁場相カップリングにより安定化される場合、水は、希釈時でも、「種（ｓｅｅｄ）」コヒーレント振動を保持できる。分子のクラスターが大きくなるに伴い、その電磁気シグネチャが対応して増幅され、水が持つコヒーレント振動を強化する。
【０１６９】
水の詳細な微視的構造および溶解分子のクラスターサイズの変動にもかかわらず、コヒーレント振動の特異性は、存在できる。水の特性の変化を考察する１つのモデルは、結晶化をともなう考察に基づいている。
【０１７０】
ナノスケールケージを形成する単純化されたプロトン化水クラスターは、出願人の以前の国際公開特許第ＷＯ２００９／０５５７２９号に示されている。プロトン化水クラスターは、典型的な例では、Ｈ＋（Ｈ２Ｏ）ｎの形を取る。一部のプロトン化水クラスターは、例えば、電離層中で天然に発生する。いずれか特定の理論に拘泥するものではないが、特定の態様では、他のタイプの水クラスターまたは構造（クラスター、ナノケージ、等）が可能であり、これには、本発明の出力材料に与えられた酸素および安定化電子を含む構造が含まれる。酸素原子は、生じた構造中に捕獲されうる。半結合ナノケージの化学作用により、酸素および／または安定化電子が長期間溶解したまま残存するのを可能とする。他の原子または薬用化合物等の分子は、送達継続のためにケージに入れることができる。溶液材料および溶解化合物の固有の化学作用は、これらの材料の相互作用に依存する。
【０１７１】
混合装置で処理された流体は、以前に、実験により、クラスター構造に関連した流体の分析と一致する異なる構造特性を示すことが明らかになった。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０５５７２９号を参照されたい。
【０１７２】
電荷安定化ナノ構造（例えば、電荷安定化酸素含有ナノ構造）：
出願人の国際公開第ＷＯ２００９／０５５７２９号で以前に記載のように、動電学的混合装置が、ミリ秒足らずの内に、「二重層効果」、「滞留時間」、「注入速度」、および「泡サイズ測定値」を生成し、第１の材料および第２の材料の複合的な動的乱流の固有の非線形流体動的相互作用が、本明細書記載の新規動電学的効果を付与する効果的な巨大表面積（装置および１００ｎｍ未満の極めて小さい気泡のものを含む）と接触して複合混合を提供する。さらに、絶縁ローターおよびステーター装備を含む特別に設計された混合装置を使って、機能局在化動電学的効果（電圧／電流）が、立証された。
【０１７３】
当技術分野でよく知られているように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、水溶液中で極めて不安定であることが知られている。特定の態様では、出願人の動電学的効果（例えば、特定の態様では、溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、驚いたことに、出力材料（例えば、塩類溶液、イオン溶液）内で安定化される。実際、本明細書記載のように、本発明の動電学的流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ）の特性および生物活性の安定性は、気密容器中で数ヶ月間維持でき、溶解ガス（例えば、酸素）が、発明の溶液の特性および活性の形成および／または維持、および／または媒介の支援に関与することを示している。重要なことには、電荷再分配および／または溶媒和電子は、生細胞（例えば、哺乳動物細胞）の流体との接触時、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節を行うのに充分な量の本発明の動電学的イオン水性流体中で、安定に生成される（例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０５５７２９号の細胞パッチクランプ実施例２３および本明細書に開示の実施例を参照）。
【０１７４】
本明細書の「分子相互作用」で記載のように、本発明の動電学的流体（例えば、動電学的塩類溶液）の安定性および生物学的適合性を説明するために、出願人は、水分子および水中に溶解した物質の分子（例えば、酸素）の間の相互作用が、水の集団構造を変え、本発明の出力材料に与えられる酸素および／または安定化電子を含むナノ構造を含む、ナノスケールケージクラスターを与えることを提案した。機序に拘泥するものではないが、特定の態様におけるナノ構造の配置は、（少なくとも、形成および／または安定性および／または生物活性のために）溶解ガス（例えば、酸素）を含み；動電学的流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ塩類溶液流体）が細胞膜またはその関連成分と接触時に電荷および／または電荷効果を調節する（例えば、与えるまたは受ける）のを可能とし；さらに、特定の態様では、生物学的に関連した形で安定化（例えば、保持、包含、捕捉）した溶媒和電子を提供する、ような配置である。
【０１７５】
特定の態様では、また、本開示により裏付けられるように、イオンまたは塩類（例えば、標準塩類、ＮａＣｌ）溶液では、本発明のナノ構造は、電荷安定化水和シェル内に少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を含むことができる電荷安定化ナノ構造（例えば、平均径：１００ｎｍ未満）を含む。追加の態様では、電荷安定化水和シェルは、少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を包含するケージまたは空隙を含むことができる。さらなる態様では、適切な電荷安定化水和シェルの提供により、電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、溶媒和電子（例えば、安定化溶媒和電子）をさらに含むことができる。
【０１７６】
機序または特定の理論に拘泥するものではないが、本件の優先日後に、環境（大気）ガスと平衡状態にある水性液体中のイオンにより安定化された電荷安定化微小気泡が提案された（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１０４：４８６−４９８、２００７；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の態様では、出願人の新規動電学的流体は、新規の生物学的に活性な電荷安定化酸素含有ナノ構造を含み、このような構造の新規配列、クラスターまたは会合をさらに含むことができる。
【０１７７】
電荷安定化微小気泡モデルによれば、水構造の短距離の分子整列は、ガス分子の存在により破壊され（例えば、溶解ガス分子は、最初、非吸着性イオンと複合化され、短距離整列欠陥を与える）、イオン液滴の凝縮物を与え、この場合、欠陥は、水分子の第１および第２の配位領域により取り囲まれ、これらは、代わりに吸着イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ＋イオンの「選別シェル」の取得）により満たされ、非吸着性イオン（例えば、第２の配位領域を占めるＣｌ−イオン）が配位領域中の、それぞれ、６および１２の空位を占める。不飽和イオン溶液（例えば、不飽和塩類溶液）中で、この水和「核（ｎｕｃｌｅｕｓ）」は、第１のおよび第２の領域が、６つの吸着および５つの非吸着性イオンによりそれぞれ満たされるまで安定に残存し、その後、クーロン爆発を受け、ガス分子を含む内部空隙を生成し、吸着イオン（例えば、Ｎａ＋イオン）は生じた空隙の表面に吸着され、一方、非吸着性イオン（またはその一部）は、溶液中に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、同上）。このモデルでは、ナノ構造中の空隙は、その表面に吸着されたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）間のクーロン反発による崩壊を免れている。空隙を含む有ナノ構造の安定性は、空隙／気泡表面上に同じ電荷を有する溶解イオンの選択的吸着および溶解ガスと気泡内部のガスの間の拡散平衡によると想定されており、生じた電気二重層から加えられた負の外向き静電圧力が、表面張力に対する安定な補償を提供し、気泡内のガス圧力は、環境圧力とバランスされる。モデルによれば、このような微小気泡の形成は、イオン成分を必要とし、また、特定の態様では、衝突に媒介される粒子間の会合は、より大きな整列クラスター（配列）を形成させることができる（同上）。
【０１７８】
電荷安定化微小気泡モデルは、粒子がガス微小気泡でありうることを示唆するが、環境大気と平衡にあるイオン溶液中のこのような構造の自然発生的形成のみを意図しており、酸素がこのような構造を形成できるか否かに関しては解明も、言及もされておらず、また、同様に、溶媒和電子がこのような構造に関連しているか、および／またはこれにより安定化されているか否かについても言及されていない。
【０１７９】
特定の態様では、電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造を含む本発明の動電学的流体は、新規であり、微小気泡モデルによる想定される非動電学的、大気中電荷安定化微小気泡構造とは基本的に異なる。重要なことは、対照塩類溶液は、本明細書で開示の生物学的特性を持たないが、一方で、出願人の電荷安定化ナノ構造は、新規の生物学的に活性型の電荷安定化酸素含有ナノ構造を提供するという事実があり、少なくとも部分的には、これが理由となって、この結論は不可避であることである。
【０１８０】
本発明の特定の態様では、出願人の新規動電学的装置および方法は、大気と平衡状態にあるイオン流体中で、またはいずれかの非動電学的に生成される流体中で自然発生的に起こっても、起こらなくてもよいいずれの量をも超えるかなりの量の電荷安定化ナノ構造を含む新規動電学的変性流体を提供する。特定の態様では、電荷安定化ナノ構造は、電荷安定化酸素含有ナノ構造を含む。追加の態様では、電荷安定化ナノ構造は、全て、または実質的に全て電荷安定化酸素含有ナノ構造であるか、または電荷安定化酸素含有ナノ構造が動電学的流体中の主要な電荷安定化ガス含有ナノ構造種である。
【０１８１】
またさらなる態様では、電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、溶媒和電子を含むまたは収容でき、それにより、新規の安定化溶媒和電子キャリアを提供する。特定の態様では、電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、新しいタイプのエレクトライド（または逆エレクトライド（ｉｎｖｅｒｔｅｄｅｌｅｃｔｒｉｄｅ））を与え、これは、有機的に配位した単一の陽イオンを有する従来の溶質エレクトライドとは対照的に、むしろ、空隙または酸素原子を含む空隙の周りに安定に配列された複数の陽イオンを有し、配列したナトリウムイオンは、有機分子ではなく、水和シェルにより配位される。
【０１８２】
特定の態様では、溶媒和電子は、水分子の水和シェルに収容されるか、または好ましくは、全陽イオンに分配されたナノ構造空隙内に収容される。特定の態様では、本発明のナノ構造は、複数の配列ナトリウム陽イオン全体に対して溶媒和電子の分配／安定化を提供することによるのみではなく、また、溶媒和電子と空隙中のケージ化酸素分子（複数可）−ナトリウム原子の配列に対し分配されている溶媒和電子および少なくとも１つの酸素原子の結合または部分結合を行わせることにより、溶液中の新規「超エレクトライド」構造を与える。特定の態様では、従って、本発明の動電学的流体と関連する本開示の「溶媒和電子」は、水分子による直接的水和を含む従来モデルの溶媒和ではない可能性がある。その代わりに、乾燥エレクトライド塩と限られた範囲での類似性で、本発明の動電学的流体中の溶媒和電子は、水溶液中で複数の電荷安定化ナノ構造に全体に分布し、「格子接着剤」を提供してより高次に整列した配列を安定化させることができる。
【０１８３】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質、等と相互作用でき、生物活性を媒介できる。特定の態様では、本発明の溶媒和電子を持つ電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質、等と相互作用でき、生物活性を媒介できる。
【０１８４】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、電荷および／または電荷効果ドナー（送達）として、および／または電荷および／または電荷効果レシピエントとして、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質、等と相互作用し、生物活性を媒介する。特定の態様では、本発明の溶媒和電子を持つ電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、電荷および／または電荷効果ドナーとして、および／または電荷および／または電荷効果レシピエントとして、細胞膜と相互作用し、生物活性を媒介する。
【０１８５】
特定の態様では、本発明の電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造は、観察された本発明の動電学的流体の安定性および生物学的特性と一致し、それ等を説明し、また、イオン水溶液（例えば、塩類溶液、ＮａＣｌ、等）中で安定化溶媒和電子を与える新規エレクトライド（または逆エレクトライド）をさらに提供する。
【０１８６】
特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、実質的に、電荷安定化酸素含有ナノ気泡を含むか、その形態を取るか、またはそれを生ずる。特定の態様では、電荷安定化酸素含有クラスターは、電荷安定化酸素含有ナノ構造の相対的に大きな配列の形成を行い、および／または電荷安定化酸素含有ナノ気泡またはその配列を提供する。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、疎水性の表面と接触時に疎水性のナノ気泡の形成ができる。
【０１８７】
特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は実質的に、少なくとも１つの酸素分子を含む。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、実質的に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、またはそれ超の酸素分子を含む。特定の態様では、電荷安定化酸素含有ナノ構造は、約２０ｎｍ  ｘ  １．５ｎｍのナノ気泡（例えば、疎水性ナノ気泡）を含むか、または生じ、約１２酸素分子を含む（例えば、酸素分子のサイズ（およそ０．３ｎｍ  Ｘ  ０．４ｎｍ）をベースに、理想気体を仮定し、ｎ＝ＰＶ／ＲＴを適用して（Ｐ＝１ａｔｍ、Ｒ＝０．０８２０５７  ｌ・ａｔｍ／ｍｏｌ・Ｋ；Ｔ＝２９５Ｋ；Ｖ＝ｐｒ２ｈ＝４．７ｘ１０−２２Ｌ、（ｒ＝１０ｘ１０−９ｍ、ｈ＝１．５ｘ１０−９ｍ）、およびｎ＝１．９５ｘ１０−２２モル））。
【０１８８】
特定の態様では、イオン性水性流体中で電荷安定化配置を有するこのようなナノ構造、またはその配列の流体中に存在する酸素分子の割合は：０．１％、１％；２％；５％；１０％；１５％；２０％；２５％；３０％；３５％；４０％；４５％；５０％；５５％；６０％；６５％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％より大きい、および９５％より大きいパーセンテージ量、からなる群より選択される。好ましくは、この割合は、約５％超、約１０％超、約１５％超、または約２０％超である。追加の態様では、イオン性水性流体中で電荷安定化配置を有する電荷安定化酸素含有ナノ構造、またはその配列の実質的なサイズは、１００ｎｍ；９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；５ｎｍ；４ｎｍ；３ｎｍ；２ｎｍ；および１ｎｍ未満、からなる群より選択されるサイズである。好ましくは、このサイズは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
【０１８９】
特定の態様では、本発明の動電学的流体は、溶媒和電子（複数可）を含む。さらなる態様では、本発明の動電学的流体は、電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造、および／またはその配列、を含み、これらは、溶媒和電子；および固有の電荷分布（極性、対称、非対称電荷分布）の内の少なくとも１つを含む。特定の態様では、電荷安定化ナノ構造および／または電荷安定化酸素含有ナノ構造、および／またはその配列は、常磁性の特性を有する。
【０１９０】
対照的に、本発明の動電学的流体に比較して、対照圧力ポット酸素化流体（非動電学的流体）、等は、細胞膜電位および細胞膜伝導率の内の少なくとも１つの調節の可能な、このような動電学的生成電荷安定化された生物学的に活性なナノ構造および／または生物学的に活性な電荷安定化酸素含有ナノ構造および／またはその配列を含まない。
【０１９１】
ガス富化流体作製システム：       
以前の国際公開第ＷＯ２００９／０５５７２９号特許出願で出願人が開示のシステムと方法は、ガス（例えば、酸素）を、最小限の受動的損失により高濃度で安全に富化することを可能とする。このシステムと方法を効果的に使用して、各種のガスを高い割合で各種の流体中に富化できる。例のみの意図であるが、典型的な例では、約２〜３ｐｐｍ（パーツパーミリオン）の溶存酸素レベルの室温の脱イオン水から、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約１５ｐｐｍ、少なくとも約２０ｐｐｍ、少なくとも約２５ｐｐｍ、少なくとも約３０ｐｐｍ、少なくとも約３５ｐｐｍ、少なくとも約４０ｐｐｍ、少なくとも約４５ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約５５ｐｐｍ、少なくとも約６０ｐｐｍ、少なくとも約６５ｐｐｍ、少なくとも約７０ｐｐｍ、少なくとも約７５ｐｐｍ、少なくとも約８０ｐｐｍ、少なくとも約８５ｐｐｍ、少なくとも約９０ｐｐｍ、少なくとも約９５ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、またはいずれかのさらに大きい値またはそれらの間の値の範囲のレベルの溶存酸素を開示のシステムおよび／または方法を使って得ることができる。特定の代表的実施形態では、約３０〜６０ｐｐｍの溶存酸素レベルの酸素富化水を生成できる。
【０１９２】
表３は、酸素富化塩類溶液（表３）で治療された治癒創傷および本発明のガス富化酸素富化塩類溶液の試料で採取した種々の分圧測定値を示す。
【表３】
2014511879.tif 000007
【０１９３】
投与経路および形態：
特定の代表的実施形態では、本発明のガス富化流体は、単独でまたは別の治療薬と組み合わせて、治療用組成物として作用させて、その治療用組成物により、少なくとも１つの炎症の症状を防ぐかまたは軽減できる。本発明の治療組成物は、それを必要としている対象に投与することができる組成物を含む。特定の実施形態では、治療用組成物製剤は、また、キャリア、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味料、調味料、香料、および結合剤、からなる群より選択される少なくとも１つの追加の薬剤を含むことができる。
【０１９４】
本明細書で使われる「薬学的に許容可能なキャリア」および「キャリア」は、通常、無毒の、不活性の固体、半固形または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイプの補助製剤を意味する。薬学的に許容可能なキャリアとして役立つ一部の材料の非制限的例は、糖、例えば、ラクトース、ブドウ糖およびショ糖；デンプン、例えば、コーンスターチおよびバレイショデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；滑石；賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ろう；オイル、例えば、ピーナッツオイル、綿実オイル；ベニバナオイル；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油および大豆オイル；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、エチルオレアートおよびエチルラウラート；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質不含水；等張性塩類溶液；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸塩緩衝液、ならびに他の無毒の適合する潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色料、離型剤、コーティング剤、スイートニング、調味料および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤であり、調合者の判断に従って、組成物中に混合できる。特定の態様では、このようなキャリアおよび賦形剤は、本発明のガス富化流体または溶液であってもよい。
【０１９５】
本明細書記載の薬学的に許容可能なキャリア、例えば、ビークル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤、は、当業者にはよく知られている。典型的な例では、薬学的に許容可能なキャリアは、治療薬に対し化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を持たない。薬学的に許容可能なキャリアには、ポリマーおよびポリマー基質、ナノ粒子、微小気泡、等を含んでもよい。
【０１９６】
本発明の治療用ガス富化流体に加えて、治療用組成物には、不活性の希釈剤、例えば、追加の非ガス富化水または他の溶剤、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（特に、綿実油、ピーナツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物、をさらに含んでもよい。当業者には理解されるように、１つまたは複数の不活性の希釈剤をガス富化流体を、同じ、類似の、または異なる組成物と置き換えることにより、新規で改善された特定の治療用組成物製剤、新規ガス富化治療流体、および新規ガス富化治療流体を送達する新規方法を得ることができる。例えば、酸素を水または脱イオン水に混合し、ガス富化流体を提供することにより作られたガス富化流体を使って、従来の水を置換または補充できる。
【０１９７】
特定の実施形態では、本発明のガス富化流体は、１つまたは複数の治療薬と組み合わせることができ、および／または単独で使用できる。ガス富化流体を使用する特定の実施形態は、当技術分野で既知の１つまたは複数の溶液、例えば、脱イオン水、塩類溶液、等を１つまたは複数のガス富化流体で置き換え、それにより、対象への送達用の改善された治療用組成物を提供することを含んでもよい。
【０１９８】
特定の実施形態は、本発明のガス富化流体、医薬組成物もしくは他の治療薬または薬学的に許容可能なそれらの塩もしくは溶媒和物、および少なくとも１つの医薬品キャリアまたは希釈剤を含む治療組成物を提供する。これらの医薬組成物を使って、前出の疾患または状態の予防および治療、および上述の治療に使用できる。好ましくは、キャリアは、薬学的に許容可能で、また、組成物中の他の成分に適合し、すなわち、それらに有害作用を持たなくすべきである。キャリアは、固体でも、液体でもよく、好ましくは、単位用量製剤、例えば、０．０５〜９５重量％の有効成分を含む錠剤として処方されるのが好ましい。
【０１９９】
可能な投与経路には、経口、舌下、頬側、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、大槽内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸；経皮、腟内、眼内、耳内、鼻腔内、吸入、および埋め込み型装置または材料の注入または挿入を含む局所、が含まれる。
【０２００】
投与経路：
特定の対象に対するほとんどの適切な投与手段は、治療される疾患または状態の特性と重症度、使用される療法の特性、ならびに治療用組成物または追加の治療薬の特性に依存する。特定の実施形態では、経口または局所投与が好ましい。
【０２０１】
経口投与に適する製剤は、それぞれ、所定量の活性化合物を含む別個の単位、例えば、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、シロップ剤、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ」製剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、ロゼンジ、またはゲルコートアンプルとして、；粉剤または粒剤として；水性または非水性の液体中の溶液または懸濁液として；または水中油型もしくは油中水型乳剤として、提供できる。
【０２０２】
経口投与に適する追加の製剤は、種々のタイプの計量用量加圧噴霧器、アトマイザ、噴霧器、または吸入器によって生成できる微粒子ダストまたはミストを含むように提供できる。特に、粉剤または他の治療薬化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解、または懸濁できる。
【０２０３】
経粘膜的方法、例えば、舌下または頬側投与に適する製剤には、活性化合物および、典型的な例では、風味基剤、例えば、糖およびアラビアゴムまたはトラガントを含むロゼンジ貼付剤、錠剤、等、および不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖アラビアゴム中に活性化合物を含むトローチが含まれる。
【０２０４】
非経口投与に適する製剤には、典型的な例では、所定濃度の活性ガス富化流体および可能なら別の治療薬を含む無菌水溶液が含まれ；溶液は、目的のレシピエントの血液と等張性であるのが好ましい。非経口投与に適する追加の製剤には、生理学的に適する共溶媒および／または錯化剤、例えば、界面活性剤およびシクロデキストリンを含む製剤が含まれる。水中油型乳剤は、また、ガス富化流体の非経口投与用製剤にも適する場合がある。このような溶液は、静脈内に投与されるのが好ましいが、皮下または筋肉内注射により投与してもよい。
【０２０５】
尿道、直腸または腟投与に適する製剤には、ゲル、クリーム剤、ローション、水性または油性懸濁液、分散可能粉末または粒剤、乳剤、溶解可能固形材料、灌注液、等が含まれる。製剤は、１つまたは複数の坐薬基剤を形成する固形キャリア、例えば、ココアバター中の有効成分を含む単位用量坐剤として提供されるのが好ましい。あるいは、本発明のガス富化流体を使った結腸洗浄剤は、結腸または直腸の投与用に処方できる。
【０２０６】
局所、眼内、耳内、または鼻腔内の適用に適した製剤には、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション、ペースト剤、ゲル（例えば、ヒドロゲル）、噴霧剤、分散可能粉末および粒剤、乳剤、流動推進剤を使った噴霧剤またはエアロゾル（例えば、リポソーム噴霧剤、点鼻薬、点鼻薬、等）およびオイルが含まれる。このような製剤用の適切なキャリアには、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせが含まれる。鼻または鼻腔内送達は、計量用量のこれらの製剤、等のいずれかを含んでもよい。同様に、耳内または眼内送達は、滴下剤、軟膏、刺激流体、等を含んでもよい。
【０２０７】
本発明の製剤は、いずれかの適切な方法により、典型的な例では、任意選択で、液体もしくは微粉砕固形キャリアまたは両方を含む活性化合物を含むガス富化流体を必要な比率で均一に、かつ、充分に混合し、その後、必要に応じ、生じた混合物を所望形状に成形することにより、調製できる。
【０２０８】
例えば、錠剤は、有効成分および１つまたは複数の任意選択成分、例えば、バインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、または界面活性分散剤の粉末または顆粒を含む均一な混合物を圧縮することにより、または粉末有効成分および本発明のガス富化流体の均一混合物を成形することにより、調節できる。
【０２０９】
吸入投与用の適切な製剤には、種々のタイプの計量用量の加圧噴霧器、アトマイザ、噴霧器、または吸入器を使って生成できる微粒子ダストまたはミストが含まれる。特に、粉剤または他の治療薬化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁できる。
【０２１０】
経口による肺内投与に関して、粉末または液滴の粒径は、気管支樹中への送達を確実にするためには、典型的な例では、０．５〜１０μＭの範囲、好ましくは、１〜５μＭの範囲である。鼻投与に関しては、粒径は、鼻腔での保持を確実にするためには、１０〜５００μＭの範囲が好ましい。
【０２１１】
計量用量の吸入器は、加圧エアロゾル分注器であり、典型的な例では、液化噴霧剤中の治療薬の懸濁液または溶液製剤を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示のように、本発明のガス富化流体を、標準的液化噴霧剤に加えて、またはその代わりに使用できる。使用中、これらの装置は、計量容量、典型的な例では、１０〜１５０μＬを送達するように適合されたバルブを通って製剤を放出し、治療薬およびガス富化流体を含む微粒子噴霧を生成する。適切なスプレー用高圧ガスには、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびこれらの混合物が含まれる。
【０２１２】
製剤は、１つまたは複数の共溶媒、例えば、オレイン酸またはソルビタントリオレアート等のエタノール界面活性剤、抗酸化剤および適切な調味料をさらに含んでもよい。噴霧器は、狭いベンチュリオリフィスを通って、圧縮ガス（典型的な例では、空気または酸素）の加速により、または、超音波撹拌によって、有効成分の溶液または懸濁液を治療用エアロゾルミストに変換する市販の装置である。噴霧器での使用に適切な製剤は、ガス富化流体中の別の治療薬から構成され、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは、２０％ｗ／ｗ未満を含む。さらに、他のキャリア、好ましくは、塩化ナトリウム等の塩の添加により体液と等張性にされた蒸留水、無菌水、または希釈アルコール水溶液を利用可能である。任意選択の添加物は、製剤が無菌として調製されていない場合は特に、防腐剤を含み、また、メチルヒドロキシ−ベンゾアート、抗酸化剤、調味料、揮発油、緩衝剤および界面活性剤を含んでもよい。
【０２１３】
吹送法による投与用に適切な製剤には、空気吸入器により送達できる、または鼻から吸い込む方式で鼻腔中に取り込むことができる細かく粉砕した粉末を含んでもよい。空気吸入器では、粉末は、典型的な例では、ゼラチンまたはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに入れられ、その場で穴があくか、または開封され、吸入時に装置から吸い込まれた空気により、または手動操作ポンプにより、粉末が送達される。空気吸入器に供給される粉末は、有効成分のみ、または有効成分、ラクトース等の適切な粉末希釈剤、および任意選択の界面活性剤を含む粉末混合物から構成される。有効成分は、典型的な例では、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。
【０２１４】
具体的に上記で記載の成分に加えて、本発明の製剤は、目的の製剤のタイプに留意して当業者に既知の他の薬剤を含んでもよい。例えば、経口投与に適する製剤は、調味料を含んでもよく、鼻腔内投与に適する製剤は、香料を含んでもよい。
【０２１５】
本発明の治療組成物は、個別治療薬として、または治療薬の組み合わせとして、医薬品薬剤と併せて使用できるいずれかの従来の方法により投与できる。
【０２１６】
投与量は、勿論、既知の因子、例えば、特定の薬剤の薬力学的特性およびその投与モードおよび経路；レシピエントの年齢、健康および体重；症状の特性および程度；併用治療の種類；治療頻度；および所望の効果、に応じて変化し、変わるであろう。毎日の有効成分の投与量は、キログラム（ｋｇ）体重当たり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であると予測でき、好ましい用量は、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇである。特定の態様では、毎日の有効成分の投与量は、０．００１リットルｓ〜１０リットルであってよく、好ましい用量は、約０．０１リットル〜１リットルである。
【０２１７】
剤形（投与に適する組成物）は、１個当たり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分を含む、これらの医薬組成物には、有効成分は通常、組成物の合計重量に対し約０．５〜９５重量％の量で存在する。
【０２１８】
軟膏、ペースト、発泡剤、咬合剤、クリームおよびゲルもまた、賦形剤、例えば、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、シリコーン、ベントナイト、シリカ酸、および滑石、またはこれらの混合物を含むことができる。粉剤および噴霧薬は、また、賦形剤、例えば、ラクトース、滑石、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。ナノ結晶の抗菌金属の溶液は、エアロゾル医薬品製造に日常的に使われている既知の手段のいずれかにより、エアロゾルまたは噴霧薬に変換できる。一般的に、このような方法は、通常、不活性のキャリアガスを使って、溶液の容器に加圧するか、またはこれを加圧する手段を提供すること、および小さいオリフィスを通して加圧ガスを通過させることを含む。噴霧薬は、通例の噴霧剤、例えば、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガスをさらに含むことができる。さらに、本発明のガス富化治療組成物または流体と一緒にミクロ球またはナノ粒子を、対象への治療化合物投与に必要ないずれかの経路で採用できる。
【０２１９】
注射用製剤は、単位用量または多重用量シール容器、例えば、アンプルおよびバイアル中に入れて、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で貯蔵でき、使用直前に、無菌液体賦形剤、またはガス富化流体の添加のみが必要となる。急に必要な注射溶液および懸濁液は、無菌の粉剤、粒剤、および錠剤から調製できる。注射可能組成物に対し有効な医薬品キャリアの要件は、当業者にはよく知られている。例えば、薬剤学および薬局実務（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ、Ｅｄｓ．、２３８−２５０（１９８２）およびＡＳＨＰ注射可能薬剤ハンドブック（ＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ）、Ｔｏｉｓｓｅｌ、４ｔｈ  ｅｄ．、６２２−６３０（１９８６）、を参照されたい。
【０２２０】
局所投与に適する製剤には、本発明のガス富化流体および任意選択の追加の治療薬および香料、通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガントを含むロゼンジ；ガス富化流体および不活性の基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴム中の任意選択の追加の治療薬を含むトローチ；およびガス富化流体および適切な液体キャリア中の任意選択の追加の治療薬を含む口洗浄剤または経口リンス剤；ならびにクリーム剤、乳剤、ゲル、等が含まれる。
【０２２１】
さらに、直腸投与に適する製剤は、種々の基材、例えば、乳化基材または水可溶性基剤との混合による坐剤の形態であってもよい。腟投与に適する製剤は、有効成分に加えて、当技術分野で適するとわかっているキャリアを含むペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル、ペースト、あわ剤、または噴霧製剤の形態であってもよい。
【０２２２】
適切な医薬品キャリアは、この分野の標準的参考書である「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、に記載されている。
【０２２３】
本発明との関連で、対象、特に動物、とりわけ、ヒト、に投与する用量は、合理的な時間枠の間に動物の治療応答をもたらすのに充分でなければならない。当業者なら、投与量は、動物の状態、動物の体重、ならびに、治療される状態、を含む種々の因子に依存することはわかっているであろう。適切な用量は、対象で所望の応答をもたらすとわかっている治療用組成物の濃度をもたらすと思われる量である。
【０２２４】
用量の大きさは、また、経路、タイミング、および投与頻度、ならびに、治療用組成物の投与および所望の生理的な効果に付随する可能性のあるいずれかの有害副作用の存在、特性、および程度、により決定される。
【０２２５】
組み合わせの化合物は、（１）共製剤で化合物の組み合わせを同時に、または（２）交互に、すなわち、化合物を別々の医薬製剤で逐次に、順次に、平行して、または同時に、送達することにより、投与できることは理解されよう。交互療法では、第２の、および任意選択で、第３の有効成分の投与の遅延は、有効成分の組み合わせの相乗的治療効果の利益を失わないようにすべきである。（１）または（２）のいずれかの投与方法による特定の実施形態では、理想的には、組み合わせは、最も効果的な結果が得られるように投与すべきである。（１）または（２）のいずれかの投与方法による特定の実施形態では、理想的には、組み合わせは、有効成分のそれぞれのピーク血漿中濃度が達成されるように投与すべきである。組み合わせ共製剤の１丸薬１日１回投与による治療法は、炎症性神経変性疾患に罹患している一部の患者に実行可能である。特定の実施形態では、組み合わせた有効成分の有効なピーク血漿中濃度は、約０．００１〜１００μＭの範囲にあるであろう。最適ピーク血漿中濃度は、特定の患者のために処方された製剤および投与計画により実現できる。本発明の流体および酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−ベータ、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブまたはそれらのいずれかの生理学的機能性誘導体、同時であれ、または逐次的であれ、個々に、一緒に、またはそれらの内のいずれかの組み合わせで、投与できることは理解されよう。一般的に、交互療法（２）の間に、各化合物の有効な投与量が逐次的に投与され、共製剤療法（１）では、２つ以上の化合物の有効な投与量が一緒に投与される。
【０２２６】
本発明の組み合わせは便宜的に、単一剤形の医薬製剤として提示できる。便利な単一投与量製剤は、それぞれ、１ｍｇ〜１ｇのいずれかの量、例えば、限定されないが、１０ｍｇ〜３００ｍｇの有効成分を含む。本発明の流体の、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブ、との組み合わせの相乗的効果は、広範な比率、例えば、１：５０〜５０：１（発明の流体：酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブ）にわたり実現できる。一実施形態では、比率は、約１：１０〜１０：１の範囲であってもよい。別の実施形態では、発明の流体の、共製剤による組み合わせ剤形、例えば、丸薬、錠剤、カプレットまたはカプセルにおける、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブ、に対する重量／重量比は、約１、すなわち、ほぼ等量の発明の流体と、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−ベータ、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブである。他の代表的共製剤では、発明の流体と、酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブ、は多い場合も少ない場合もあってよい。一実施形態では、各化合物は、単独で使用する場合に抗炎症性活性を示す量の組み合わせで採用される。前記組み合わせの化合物の他の比率と量は、本発明の範囲にあることが意図されている。
【０２２７】
単一剤形は、発明の流体および酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブ、またはそれらのいずれかの生理学的機能的誘導体、ならびに薬学的に許容可能なキャリア、をさらに含んでもよい。
【０２２８】
本発明の組み合わせにおける治療での使用に必要な有効成分の量は、治療される状態の特性および患者の年齢および状態を含む種々の因子に応じて変化し、最終的には、主治医または健康ケア開業医の自由裁量に任されることは当業者には理解されよう。考慮すべき因子には、投与経路および製剤の特性、動物の体重、年齢および一般状態、および治療される疾患の特性および重症度、が含まれる。
【０２２９】
また、第３の有効成分との同時または逐次投与のために、単一剤形中で有効成分の内のいずれかの２つを組み合わせることも可能である。３部構成の組み合わせを、同時にまたは逐次的に投与できる。逐次的に投与される場合は、組み合わせは、２回、または３回の投与に分けて投与できる。特定の実施形態では、発明の流体および酢酸グラチラマー、インターフェロン（「ＩＦＮ」）−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブ、の３部構成の組み合わせは、どの順番に投与してもよい。
【０２３０】
本発明の特定の態様は、動電学的変性流体／溶液で、エクスビボで細胞を治療することを含む。特定の態様は、炎症性神経変性疾患の治療方法を提供し、この方法は、動電学的変性流体／溶液を使って、エクスビボで細胞を治療すること、および治療された細胞をそれを必要としている対象に導入し、炎症性神経変性状態または疾患に関与するエフェクターＴ細胞の抑制を提供することを含む。治療される細胞は、治療された細胞を受ける対象の細胞であるか、またはそれ由来であるのが好ましい。
【０２３１】
以下の実施例は、例示のみのためであり、何ら制限を意図するものではない。
【実施例】
【０２３２】
実施例１
微小気泡サイズ
ガス微小気泡サイズ限界を決定するために、本発明のディフューザーを使って、ガス富化流体で実験を行った。０．２２および０．１ミクロンフィルターを通してガス富化流体を通過させることにより、微小気泡サイズ限界を確定した。これらの試験実施中に、大量の流体が本発明のディフューザーを通過させ、ガス富化流体を生成した。６０ｍｌのこの流体を６０ｍｌシリンジに流し込んだ。次に、シリンジ内の流体の溶存酸素レベルをウィンクラー滴定により測定した。シリンジ内の流体を０．２２ミクロンＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ５０フィルターを通して５０ｍｌビーカーに注入した。その後、５０ｍｌビーカー中の材料の溶存酸素比率を測定した。実験を３回行って、下表４に示す結果を得た。
【表４】
2014511879.tif 000008
【０２３３】
表からわかるように、シリンジ内で測定された溶存酸素レベルおよび５０ｍｌビーカー内の溶存酸素レベルは、拡散物質を、０．２２ミクロンフィルターを通過させることによる大きな変化はなく、このことは、流体内の溶解ガスの微小気泡が、０．２２ミクロンより大きくはないことを示唆している。
【０２３４】
第２の試験を行い、１バッチの塩類溶液を本発明のディフューザーで富化し、無濾過状態の出力溶液の試料を集めた。無濾過試料の溶存酸素レベルは４４．７ｐｐｍであった。０．１ミクロンフィルターを使って本発明のディフューザー由来の酸素富化溶液を濾過し、２つの追加の試料を採取した。第１の試料に対しては、溶存酸素レベルは、４３．４ｐｐｍであった。第２の試料に対しては、溶存酸素レベルは、４１．４ｐｐｍであった。最後に、フィルターを取り除き、無濾過溶液から最終試料を採取した。この場合は、最終試料は、４５．４ｐｐｍの溶存酸素レベルであった。これらの結果は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．２２ミクロンフィルターを使用した場合のものと一致した。従って、塩類溶液内のほとんどの気泡または微小気泡は、約０．１ミクロン未満のサイズである。
【０２３５】
実施例２
サイトカインプロファイルを決定した。
混合リンパ球を、ただ一人の健康なボランティアドナーから入手した。バフィコート試料を標準的方法に従って洗浄し、血小板を除去した。リンパ球を２ｘ１０６／プレートの濃度で、発明のガス富化流体または蒸留水（対照）で希釈したＲＰＭＩ培地（＋５０ｍｍＨＥＰＥＳ）に播種した。細胞を、１マイクログラム／ｍＬ  Ｔ３抗原で刺激するか、または１マイクログラム／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）レクチン（ｐａｎ−Ｔ細胞活性化因子）で刺激するか、または無刺激とした（陰性対照）。２４時間のインキュベーション後、細胞の生存率をチェック後、上清を抽出し、凍結した。
【０２３６】
上清を解凍し、遠心分離後、ＸＭＡＰ（登録商標）（ルミネックス）ｂｅａｄ  ｌｉｔｅプロトコルおよびプラットフォームを使って、サイトカイン発現の試験を行った。
【０２３７】
２百万細胞を、２４−ウエルプレートの６ウエル中の発明の酸素富化流体（水）（ウエル１、３、および５）または蒸留水（２、４および６）（１０Ｘ  ＲＰＭＩを水中に希釈して１Ｘにする）を含む完全ＲＰＭＩ＋５０ｍｍヘペス中に播種した。１ｕｇ／ｍｌのＴ３抗原（ウエル１および２）またはＰＨＡ（ウエル３および４）で細胞を刺激した。対照ウエルの５および６は、刺激しなかった。２４時間後、細胞の生存率をチェックし、上清を集め、凍結した。次に、上清を解凍し、８，０００ｇで遠心分離してペレットを得た。透明になった上清中のリストに記載したサイトカインをＬＵＭＩＮＥＸ  ＢＥＡＤ  ＬＩＴＥ（登録商標）プロトコルおよびプラットフォームを使ってアッセイした。数値データを表５に記載し、対応する棒グラフを図１に示す。特に、ＩＦＮ−γレベルは、Ｔ３抗原を含む対照培地の場合より、Ｔ３抗原を含む本発明のガス富化培地で高かったが、一方、ＩＬ−８は、Ｔ３抗原を含む対照培地の場合より、Ｔ３抗原を含む本発明のガス富化培地で低かった。さらに、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αレベルは、ＰＨＡを含む対照培地の場合より、ＰＨＡを含む本発明のガス富化培地で低く、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡを含む対照培地の場合に比べ、ＰＨＡを含む本発明のガス富化流体で低かった。本発明のガス富化培地単独では、ＩＦＮ−γレベルは、対照培地の場合より高かった。
【表５】
2014511879.tif 000009
【０２３８】
実施例３
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）
図２で示したように、本発明のガス富化流体の存在下で培養した場合、加圧、酸素化流体（圧力ポット）または脱イオン対照流体に比較して、ＭＯＧ抗原性ペプチドに応答したリンパ球増殖が増加した。従って、本発明のガス富化流体は、細胞が以前刺激された抗原に対するリンパ球の増殖応答を増幅する。
【０２３９】
既知のマウス配列に対応するミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）（Ｍ−Ｅ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｆ−Ｓ−Ｒ−Ｏ−Ｖ−Ｈ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｋ）（配列番号１；米国特許公開第２００８０１３９６７４号参照。この特許は、この配列番号１のためを含め、参照によって本明細書に組み込まれる）を合成した。次に、５ｘ１０５脾臓細胞を、以前にＭＯＧで免疫したＭＯＧＴ細胞受容体遺伝子導入マウスから取り出し、発明のガス富化流体、加圧酸素化水（圧力ポット水）、または対照脱イオン水、で再構成された０．２ｍｌ  ＴＣＭ流体中で培養した。脾細胞をＭＯＧｐ３５−５５と共にそれぞれ、４８または７２時間培養した。培養液に１Ｃｉ［３Ｈ］チミジンを適用し、１６時間後回収した。［３Ｈ］チミジン組み込みんだものの平均ｃｐｍを３組の培養液について計算した。結果を図２に示す。
【０２４０】
実施例４
サイトカイン発現
特定の態様では、ヒト混合リンパ球を、発明の動電学的流体、または対照流体中のＴ３抗原もしくはＰＨＡで刺激し、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｂ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、レプチン、ＴＮＦ−β、ＴＦＧ−β、およびＮＧＦの変化を評価した。図１で認められるように、試験した炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）は、対照流体に比べ、試験流体で減少した。対照的に、抗炎症性のサイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰｓ）は、対照流体に比べ、試験流体で増加した。
【０２４１】
これらのデータを拡張するために、出願人は、アレルギー性過敏反応の評価のために、卵白アルブミン感作を含む人工適合反応モデルシステムを使った。試験の終点は、特定の反応の細胞学的および細胞成分、ならびにタンパク質およびＬＤＨの血清学的測定値とした。エオタキシン、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１Ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−Ａ、およびＶＣＡＭの分析を含むサイトカイン分析を行った。
【０２４２】
簡単に説明すると、雄Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットに、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）（２００ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）中の０．５ｍＬ卵白アルブミン（ＯＶＡ）  Ｇｒａｄｅ  Ｖ（Ａ５５０３−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ）を、ｄａｙ１、２、および３にそれぞれ１回、腹腔内注射した。試験を、治療の２ｘ２要因配置法（４群）で無作為化した。免疫反応を起こさせるための２週間の待ち期間後、ラットをＲＤＣ１６７６−００（Ｒｅｖａｌｅｓｉｏの特許装置を使って処理した無菌塩類溶液）、およびＲＤＣ１６７６−０１（Ｒｅｖａｌｅｓｉｏの特許装置を使って処理し、追加の酸素添加した無菌塩類溶液）で、１週間、暴露または治療した。１週間の１日１回の治療の終わりに、２つの群を半分に分割し、各群のラットの５０％に対し、塩類溶液またはＯＶＡの吸入により刺激した。
【０２４３】
具体的には、最初の連番付加の１４日後、１２匹のラットを７連続日の間、毎日、吸入により３０分間ＲＤＣ１６７６−００に暴露した。システムを通過する空気流量は、１０リットル／分に設定した。合計１２匹のラットを、噴霧材料を導入し、Ａｅｒｏｎｅｂの１２個のサブチャンバーに均等に分配するための単一ポートを有するパイチャンバーに整列させた。
【０２４４】
最初の感作の１５日後、１２匹のラットを、７連続日の間、毎日３０分間の超音波噴霧によりＲＤＣ１６７６−０１に暴露した。この場合も、同じ噴霧器とチャンバーを使って、空気流れを、１０リットル／分に設定した。ＲＤＣ１６７６−００を最初に噴霧し、Ａｅｒｏｎｅｂチャンバーを完全に乾燥後、ＲＤＣ１６７６−０１を噴霧した。
【０２４５】
最後の噴霧処理の約２時間後、ＲＤＣ１６７６−００群由来の６匹のラットを、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（モデル１Ａ−１Ｂ）を使った気管内投与により送達したＯＶＡ（塩類溶液中１％）で再刺激した。ＲＤＣ１６７６−００群由来の他の６匹のラットは、対照群として生理食塩水を気管内投与で送達して、刺激した。次の日、この方法をＲＤＣ１６７６−０１群で繰り返した。
【０２４６】
再刺激の２４時間後、各群の全ラットを、ナトリウムペントバルビタールの過剰投与で安楽死させた。全血試料を下大静脈から収集し、２つの異なる血液収集チューブ：Ｑｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）血液ＲＮＡチューブおよびＱｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）血液ＤＮＡチューブ、に入れた。肺器官を処理し、管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）およびＲＴ−ＰＣＲ用肺組織を得て、このモデルで肺炎症に関連することがわかっているサイトカイン発現マーカーの変化を評価した。片側洗浄技術を採用して、肺の右側の４つの肺葉の健全性を保存した。左の「大きな」肺葉を洗浄し、一方、４つの右肺葉を結紮し、直ちにＴＲＩ−ｚｏｌ（登録商標）に入れ、ホモジナイズし、さらなる処理のために、研究室に送付した。
【０２４７】
ＢＡＬ分析。肺洗浄液を集め、６００〜８００ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を新規チューブに移し、−８０℃で凍結した。気管支洗浄液（「ＢＡＬ」）を２つの分割量に分けた。第１の分割量を遠心沈降させ、上清を粉砕ドライアイス上で急速凍結し、−８０℃に保持しさらなる処理のために研究室に送った。存在するタンパク質およびＬＤＨの量は、それぞれ、血清タンパク質（このタンパク質は、この実験の場合のように、刺激されると膜を通って漏出する血清成分である）、および細胞死のレベルを示す。本発明の試験の方が、対照より、わずかに少ないタンパク質を示した。
【０２４８】
気管支洗浄液の第２の分割量は、総タンパク質およびＬＤＨ含量を評価し、さらに、細胞学的調査を行った。対照に比べ、塩類溶液治療群で、合計細胞数が大きいことを示した。さらに、対照群に比べ、治療群で好酸球が増加した。また、対照群に比べ、治療群でわずかに異なる多形核細胞が存在した。
【０２４９】
血液分析。１．２〜２．０ｍＬの血液をチューブに移し、少なくとも３０分間、凝血させて、全血を分析した。残りの血液試料（約３．５〜５．０ｍＬ）は、ＴＲＩ−ｚｏｌ（登録商標）またはＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）を使ったＲＮＡ抽出用に保存した。次に、凝固血液試料を、１２００ｇ、室温で１０分間遠心分離した。血清（上清）を取り出し、２つの新しいチューブに入れ、血清を−８０℃で貯蔵した。
【０２５０】
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢ−１２６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｉｎｃ．）を使ったＲＮＡ抽出のために、０．２ｍＬの全血または血漿を、０．２ｍＬの全血または血漿当たり２０μＬの５Ｎ酢酸を補充した０．７５ｍＬのＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ  ＢＤに加えた。チューブを振盪し、−８０℃で貯蔵した。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）を使って、チューブを室温で約２時間インキュベートした。その後、チューブを横倒しに置き、−２０℃フリーザーで２４時間貯蔵した後、長期保存のため、−８０℃に移した。
【０２５１】
ルミネックス分析。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにより、ミクロビーズ分析を、明度単位で読み取られ、定量化基準と比較できる抗体関連結合反応用のベースとして利用した。各血液試料を、２試料として同時に分析した。測定単位は、明度単位であり、群をＯＶＡ刺激対照、ＯＶＡ刺激後本発明の流体治療、および塩類溶液刺激後本発明の流体治療、に分割した。
【０２５２】
Ａｇｉｌａｎｔ遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｉｎｃ．）中に浸した。簡単に説明すると、約１ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔを、各チューブ中の５０〜１００ｍｇの組織に加えた。ガラス−テフロン（登録商標）またはポリトロン（登録商標）ホモジナイザーを使って、試料をＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ中でホモジナイズした。試料を−８０℃で貯蔵した。
【０２５３】
まとめると、この既知の感作に対する標準的炎症性反応アッセイは、少なくとも、血液試料において、顕著な臨床的および血清学的効果を生じた。さらに、多くの数の対照動物が、その過程において、生理学的にストレスを受け、ほとんど瀕死状態であったが、ＲＤＣ１６７６−０１治療群のいずれもこのような臨床的ストレス効果を示さなかった。このことは、その後、サイトカインの循環レベル中に反映され、ＯＶＡ刺激群中のＲＤＣ１６７６−０１−治療群およびＲＤＣ１６７６−０１−治療群の間で約３０％の差異を生じた。対照的に、非ＯＶＡ刺激群中のＲＤＣ１６７６−０１−治療群およびＲＤＣ１６７６−０１−治療群の間では、サイトカイン、細胞および血清学的プロファイルは、小さく、ほとんど意味のない変化であり、これは、単に流体それ自体の最小のベースラインの変化を表すものと思われる。
【０２５４】
実施例５
（調節性Ｔ細胞アッセイを使って、Ｔ細胞増殖の調節ならびに調節性Ｔ細胞アッセイにおけるサイトカイン（Ｉｌ−１０）および他のタンパク質（例えば、ＧＩＴＲ、グランザイムＡ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、およびＦｏｘｐ３））の生成、および例えば、ＰＢＭＣ中のトリプターゼの生成に対する本発明の動電学的生成流体の効果を示した）
本明細書で開示の特定の実施形態のＴ細胞を調節する能力を、抗原提示細胞を放射線照射し、抗原およびＴ細胞を導入することによりにより調査した。典型的な例では、これらの刺激されたＴ細胞は増殖する。しかし、調節性Ｔ細胞を導入すると、通常のＴ細胞増殖性は抑制される。
【０２５５】
方法：
簡単に説明すると、選別に使用されるＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２５（ＡＣＴ−１）抗体をＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）から購入した。使用した他の抗体は以下の通り：ＣＤ３（可溶条件用のＨＩＴ３ａ）、ＧＩＴＲ（ＰＥ結合）、ＣＤ４（Ｃｙ−５およびＦＩＴＣ標識）、ＣＤ２５（ＡＰＣ結合）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、グランザイムＡ（ＰＥ標識）、ＦｏｘＰ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇＧ１（アイソタイプ対照）、およびＸＣＬ１抗体。全ての抗体は、メーカーの取扱説明書に従って使用した。
【０２５６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って末梢全血から単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体と共に、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａを使ってフローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ｎＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞に選別した。
【０２５７】
丸底９６ウエルマイクロタイタープレートで抑制アッセイを行った。３．７５ｘ１０３ＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇレスポンダーＴ細胞、３．７５ｘ１０３自己Ｔｒｅｇ、３．７５ｘ１０４同種放射線照射ＣＤ３−枯渇ＰＢＭＣを、示したように加えた。全ウエルに、抗ＣＤ３（ＨＩＴ３ａを５．０ｕｇ／ｍｌでクローン化）を補充した。Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃で７日間培養した。インキュベーション終了の１６時間前に、１．０ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウエルに加えた。Ｔｏｍｔｅｃ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使ってプレートから採取し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒシンチレーションカウンターを使って３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。ＳｔｅｍＳｅｐ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使い、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をＴ細胞枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から構成し、続けて、４０Ｇｙの照射を行った。
【０２５８】
調節性Ｔ細胞を、抗ｂＣＤ３および抗ＣＤ２８条件で刺激した後、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＲｅｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および表面マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７を使って染色した。細胞をＬｙｚｅ／Ｆｉｘ  ＰｈｏｓＦｌｏｗ（登録商標）緩衝液中で固定し、変性Ｐｅｒｍｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（登録商標）中で透過処理した。その後、各特定の選択分子に対する抗体を使って細胞を染色した。
【０２５９】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使って統計的分析を行った。２群間の比較は、両側、独立スチューデントｔ−検定を使って行った。３群間の比較は、一元配置分散分析を使って行った。０．０５未満のＰ値は、有意であると見なした（両側）。２群間の相関は、スピアマン係数により、値が０．７超か、または−０．７未満（両側）である場合は、統計的に有意であると判定した。
【０２６０】
まとめると、データは、対照流体（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）中のＰＭに比べて、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で増殖の減少を示し、アッセイでの相対的に低減された増殖により示されるように、本発明の動電学的生成流体Ｒｅｖが調節性Ｔ細胞機能を改善したことを示す。さらに、この実施例の証拠は、ベータ遮断、ＧＰＣＲ遮断およびＣａチャネル遮断がＴｒｅｇ機能に対するＲｅｖｅｒａの活性に影響することを示している。
【０２６１】
実施例６
（発明の動電学的生成流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）で灌流したＣａｌｕ−３細胞で行ったパッチクランプ分析により、（ｉ）ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓへの暴露により、全細胞コンダクタンスの増加を生じ、（ｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露により、１５分のインキュベーション時間で明らかな非線形コンダクタンスの増加がもたらされ、さらに（ｉｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露により、カルシウム透過性チャンネルに与えるＲＮＳ−６０塩類溶液の効果が得られることが示された）
【０２６２】
概要：
この実施例では、パッチクランプ調査を行い、本明細書記載のように、本発明の動電学的生成塩類溶液流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の全細胞電流を調節する有用性、等の有用性をさらに確証した。２セットの実験を行った。
【０２６３】
第１セットの実験データの要約は、Ｓｏｌａｓ塩類溶液で得られた全細胞コンダクタンス（電流／電圧の関係）は、両インキュベーション時間（１５分、２時間）に対し、および全電圧プロトコルに対し、高度に線形であることを示す。しかし、Ｓｏｌａｓとのより長いインキュベーション（２時間）は、全細胞コンダクタンスを増加させたことは明らかである。ＲＮＳ−６０に対する暴露は、デルタ電流（Ｒｅｖ−Ｓｏｌ引き算）に示されるように、非線形コンダクタンスの増加をもたらし、これは、１５分インキュベーション時間のみで明らかになっている。ＲＮＳ−６０のこの非線形電流に対する効果は、消失し、その代わり、２時間のインキュベーション時間で、高度に線形である。非線形全細胞コンダクタンスの寄与は、全ての電圧プロトコルに存在するが、以前観察のように、電圧感受性であった。
【０２６４】
第２セットの実験データの要約は、ＲＮＳ−６０塩類溶液の非線形電流に与える効果が存在することを示し、これは、外液中の高カルシウムの場合に明らかにされた。非線形全細胞コンダクタンスの寄与は、電圧感受性であったが、両方の電圧プロトコルに存在し、ＲＮＳ−６０塩類溶液のカルシウム透過性チャンネルに対する効果を示している。
【０２６５】
第１セットの実験（コンダクタンスの増加；および非線形電圧調節コンダクタンスの活性化）
材料と方法：
パッチクランプ調査に気管支上皮株Ｃａｌｕ−３を使った。Ｃａｌｕ−３気管支上皮細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−５５）を、実験の時間までガラスカバーガラス上に１０％ＦＢＳを補充したハムＦ１２およびＤＭＥＭ培地の１：１混合物中で成長させた。手短に説明すると、全細胞電圧クランプ装置を使って、本発明の動電学的生成流体（例えば、ＲＮＳ−６０；６０ｐｐｍ溶存酸素を含む動電学的に処理した塩類溶液；この実施例中では、「薬剤」と呼ばれる場合もある）に暴露したＣａｌｕ−３細胞に対する効果を測定した。
【０２６６】
パッチクランプ技術を利用して、試験材料（ＲＮＳ−６０）の上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に与える効果を評価した。具体的には、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭヘペス（ｐＨは、Ｎ−メチルＤ−グルカミンで７．４に調節）からなる細胞外液中で気管支上皮株Ｃａｌｕ−３に対し全細胞電圧クランプを行った。ベース電流を測定し、その後、ＲＮＳ−６０を細胞上に灌流した。
【０２６７】
さらに具体的には、パッチピペットを、ホウケイ酸ガラス（Ｇａｒｎｅｒ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ、Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から２段階Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＰＢ−７  ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｐｕｌｌｅｒで引き、その後、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＭＦ−９マイクロホージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＵＳＡ、Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ、ＮＹ）を使って６〜１２メガオームの抵抗になるように先端熱加工した。ピペットを（ｍＭ）：１３５ＫＣｌ、１０ＮａＣｌ、５ＥＧＴＡ、１０ヘペス（ｐＨは、ＮＭＤＧ（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）で７．４に調節）を含む細胞内溶液で満たした。
【０２６８】
培養Ｃａｌｕ−３細胞を次の細胞外溶液：１３５ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ２、０．５ＭｇＣｌ２および１０ヘペス（遊離酸）（ｍＭ）（ｐＨは、ＮＭＤＧで７．４に調節）、を含むチャンバーに入れた。
【０２６９】
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）の４０Ｘ  ＤＩＣ対物レンズを使って細胞を観察した。細胞接着型ギガシールを確立後、軽く吸引して、侵入し、全細胞配置にした。侵入するとすぐ、細胞を−１２０、−６０、−４０および０ｍＶの電圧にクランプし、±１００ｍＶの間の電圧ステップ（５００ｍｓ／ステップ）で刺激した。全細胞電流を対照条件で収集後、同じ細胞を、上記対照流体のように同じ細胞外溶質およびｐＨを含む試験流体を含む浴を通して灌流し、異なる保持電位での全細胞電流を同じプロトコルを用いて記録した。
【０２７０】
電気生理学的データをＡｘｏｎ  Ｐａｔｃｈ  ２００Ｂアンプで取得し、１０ｋＨｚでローパスフィルタをかけ、１４００Ａ  Ｄｉｇｉｄａｔａ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でデジタル化した。ｐＣＬＡＭＰ１０．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使ってデータを取得し、解析した。電流（Ｉ）／電圧（Ｖ）の関係（全細胞コンダクタンス）を、保持電位（Ｖ）に対し、約４００ｍｓｅｃの実際の電流値をステップ状にプロットすることにより得た。Ｉ／Ｖ関係の傾斜が、全細胞コンダクタンスである。
【０２７１】
薬剤および化学薬品。適宜、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（５００ｍＭ）、ＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン、２００ｍＭ）およびフォルスコリン（１０ｍＭ）を含むｃＡＭＰ刺激性反応混液で細胞を刺激した。ｃＡＭＰ類似体８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）は、Ｈ２Ｏ溶液中の２５ｍＭストックから使用した。フォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）およびＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）は、１０ｍＭフォルスコリンおよび２００ｍＭ  ＩＢＭＸストック溶液の両方を含むＤＭＳＯ溶液から使用した。取得データは、５〜９細胞に対し平均±ＳＥＭ全細胞電流として表した。
【０２７２】
結果：
米国特許公開第２０１０−０３１０６０９−Ａ１の図３Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分（左パネル）および２時間（右パネル））での、および異なる電圧プロトコル（Ａ：０ｍＶからのステッピング；Ｂ：−６０ｍＶからのステッピング；およびＣ：−１２０ｍＶからのステッピング）での、動電学的生成流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に与える効果を評価した一連のパッチクランプ実験の結果を示す。結果は、Ｓｏｌａｓ（中空丸）よりも、ＲＮＳ−６０（中実円）が、全細胞コンダクタンスに対し、大きな効果を有することを示す。この実験では、３つの電圧プロトコル、および１５分および２時間インキュベーションの両時点で、類似の結果が認められた。
【０２７３】
米国特許公開第２０１０−０３１０６０９−Ａ１の図４Ａ〜Ｃは、３つの電圧プロトコル（「デルタ電流」）（Ａ：０ｍＶからのステッピング；Ｂ：−６０ｍＶからのステッピング；およびＣ：−１２０ｍＶからのステッピング）および２つの時点（１５分（中空丸）および２時間（中実円））でのＲＮＳ−６０電流データからＳｏｌａｓ電流データの引き算した場合のグラフを示す。これらのデータは、ＲＮＳ−６０の１５分の時点で、２時間の時点では存在しない非線形電圧依存成分が存在することを示す。
【０２７４】
以前の実験の場合のように、「生理」食塩水のデータは、参照として使われる非常に一貫性のある、時間非依存性のコンダクタンスを与えた。今回の結果はＳｏｌａｓまたはＲＮＳ−６０塩類溶液を含む適合群により得られ、ベース条件下（ｃＡＭＰ、またはいずれかの他の刺激がない）での、Ｃａｌｕ−３細胞のＲＮＳ−６０塩類溶液への暴露が、時間依存効果（複数可）をもたらし、より短いインキュベーション時間（１５分）での電圧調節コンダクタンスの活性化と一致することを示している。この現象は、２時間のインキュベーションポイントでは明らかではなかった。本明細書の他のところで記載のように、線形成分は、コンダクタンスが、ｃＡＭＰ「反応混液」の刺激により増加する場合に、さらに明らかである。にもかかわらず、２時間のインキュベーション時間は、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ塩類溶液の両方に対し、より高い線形コンダクタンスを示し、この場合、ＲＮＳ−６０塩類溶液は、Ｓｏｌａｓ単独に比べ、全細胞コンダクタンスが２倍であった。この証拠は、全細胞コンダクタンスに対する少なくとも２つの寄与、すなわち、非線形電圧調節コンダクタンスの活性化、および線形コンダクタンス（より長いインキュベーション時間では、より明瞭である）がＲＮＳ−６０塩類溶液により影響を受けたことを示す。
【０２７５】
第２セットの実験（カルシウム透過性チャンネルに対する効果）
第２セットの実験方法：
パッチクランプ方法に関しては上記を参照されたい。下記の第２セットの実験では、さらに追加のパッチクランプ試験を行い、０ｍＶまたは−１２０ｍＶの保持電位からのステッピングのプロトコルと、ベース条件下のＣａｌｕ−３細胞を使って、本発明の動電学的生成塩類溶液流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の全細胞電流調節の有用性をさらに確認した。
【０２７６】
それぞれの場合の、全細胞コンダクタンスを、いずれかの塩類溶液と共に１５分間インキュベートした細胞の電流／電圧関係から得た。カルシウム透過性チャンネルの全細胞コンダクタンスに対する寄与があるか否か、およびこの部分の全細胞コンダクタンスが、ＲＮＳ−６０塩類溶液とのインキュベーションにより影響を受けているか否かを判定するために、細胞に、インキュベーション期間後生理的食塩水中で電流を流した（高ＮａＣｌ外液を伴い、他方、内部溶液は、高ＫＣｌを含む）。その後、外部塩類溶液を、ＮａＣｌをＣｓＣｌに置換した溶液で置き換え、主要外部陽イオンを置換することによりコンダクタンスの変化があるか否かを判定した。次に、カルシウム流入ステップがより明らかになるように、これらの条件下、同じ細胞を漸増濃度のカルシウムに暴露した。
【０２７７】
結果：
米国特許公開第２０１０−０３１０６０９−Ａ１の図５Ａ〜Ｄは、異なる外部塩溶液、および異なる電圧プロトコル（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、一方、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）を使った、動電学的生成流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する効果を評価した一連のパッチクランプ実験の結果を示す。これらの実験では、１つの１５分の時点を使用した。Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）に対しては、結果は、１）外液としてＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（正方形記号）の使用により、対照（ダイヤ記号）に比較して、線形挙動を有する全細胞コンダクタンスを増加させ；さらに、２）２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（円記号）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（三角形記号）の両方で、ＣａＣｌ２が全細胞コンダクタンスを非線形的に増加させたことを示している。ＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）に対しては、結果は、１）外液としてＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（正方形記号）の使用で、対照（ダイヤ記号）に比較して、全細胞コンダクタンスに対しほとんど効果がなく；さらに、２）４０ｍＭ（三角形記号）でＣａＣｌ２が全細胞コンダクタンスを非線形的に増加させたことを示している。
【０２７８】
米国特許公開第２０１０−０３１０６０９−Ａ１の図６Ａ〜Ｄは、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）に対し、２つの電圧プロトコル（パネルＡおよびＣ：０ｍＶからのステッピング；およびパネルＢおよびＤ：−１２０ｍＶからのステッピング）を用いた、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ダイヤ記号）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（正方形記号）電流データから、ＣｓＣｌ電流データ（米国特許公開第２０１０−０３１０６０９−Ａ１の図５に示されている）の減算により得られたグラフを示す。結果は、ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０溶液の両方が、カルシウム誘導された非線形全細胞コンダクタンスを活性化したことを示す。この効果は、ＲＮＳ−６０（投与量応答性を示す）でより大きく、ＲＮＳ−６０の場合は、効果は、より高いカルシウム濃度でのみ増加した。さらに、より高いカルシウム濃度での非線形カルシウム依存性コンダクタンスは、また、電圧プロトコルによって増加した。
【０２７９】
この第２セットの実験のデータは、ＲＮＳ−６０塩類溶液およびＳｏｌａｓ塩類溶液の、Ｃａｌｕ−３細胞で得られた全細胞コンダクタンスデータに対する効果をさらに示す。データは、いずれかの塩類溶液との１５分間インキュベーションにより、全細胞コンダクタンスに対する明らかな効果がもたらされ、これは、ＲＮＳ−６０の場合、および外部カルシウムが増加する場合に、最も明らかであることを示し、また、ＲＮＳ−６０塩類溶液が、全細胞コンダクタンスのカルシウム依存非線形成分を増加させることをさらに示す。
【０２８０】
これまでの多くの証拠は、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏの塩類溶液によるイオンチャネルの活性化が、ベース細胞コンダクタンスに対し、異なる寄与をすることを示唆している。
【０２８１】
出願人の他のデータ（例えば、出願人の他の実施例のデータ）を総合すれば、本発明の特定の態様は、細胞内のシグナル伝達の調節の組成物と方法を提供し、これは、限定されないが、ＧＰＣＲ、および／またはｇ−タンパク質を含む膜状構造（例えば、膜および／または膜タンパク質、受容体または他の膜成分）の電気化学、および／または立体構造の変化を与える本発明の動電学的生成溶液の使用を含む、細胞により交換可能な膜構造、膜電位または膜伝導率、膜タンパク質または受容体、イオンチャネル、脂質成分、または細胞内成分（例えば、カルシウム依存細胞シグナル伝達系、等のシグナル伝達経路）の内の少なくとも１つの調節を含む。追加の態様では、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個別メッセージ伝達成分、等の半減期に依存して、持続できる。
【０２８２】
実施例７
（本発明の動電学的流体は、当該分野で承認されている急性の実験的アレルギー性（自己免疫）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰ多発性硬化症（ＭＳ）モデルで用量反応的に有効であることが実質的に示された）
概要：
この実施例では、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０を、当該分野で承認されているミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ誘導急性の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデルを使って、予防および治療投与計画の両方に関し、２つの用量で評価した。本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、実質的に用量反応的に有効であることが示された。治療（ＭＢＰ注射と同時に開始したＲＮＳ−６０の毎日投与）および予防（ＭＢＰ注射の７日前に開始したＲＮＳ−６０の毎日投与）の両方のＲＮＳ−６０投与計画が、臨床スコアの際だった減少、ならびに、遅延した発症（高用量群で）を示した。本発明の特定の態様では、本発明の動電学的組成物は、治療に対し実質的な有用性を有し、これには、当該分野で承認されているヒトＭＳのラットモデルのＥＡＥの症状の軽減および予防を含む。本発明のさらなる態様では、従って、本発明の動電学的組成物は、治療に対し実質的な有用性を有し、これには、苦しめられている哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＭＳの症状の軽減および予防を含む。またさらなる態様では、本発明の動電学的組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、従って、中枢神経系の炎症性の状態の新規治療方法を提供した。
【０２８３】
多発性硬化症（ＭＳ）。多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性疾患であり、最もよく見られる若年成人の障害を引き起こす神経性疾患の１つである。この疾患の主要な特徴は、局所領域の脱髄と炎症である。疾患の過程は、予測不能で、生涯にわたり、男性より女性がより多く罹患する。疾患の病因学は、遺伝学的および環境的要因に依存するように見える。末梢では、抗原がＭＣＨＩＩを介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合されている。Ｔｈ０細胞は、抗原に結合し、活性化と分化を受ける。接着分子およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、Ｔｈ１細胞が結合し、血液脳関門（ＢＢＢ）に侵入するのを支援する。ＢＢＢを通過してＣＮＳに至る際、Ｔｈ１細胞は、抗原−ＭＨＣ複合体に結合し、損傷の原因となる炎症促進性サイトカインをＣＮＳ中に生成する。自己免疫系は、ミエリンタンパク質を異物と認識し、攻撃を開始する。歴史的には、Ｔｈ１細胞は、疾患の病理学で支配的役割を演ずると考えられているが、最近の証拠は、Ｔｈ１７細胞、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βの炎症促進性カスケードが、ＥＡＥおよびＭＳの発病で重大な役割を果たすことを示している。
【０２８４】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、また、実験的アレルギー性脳脊髄炎とも呼ばれ、多発性硬化症（ＭＳ）の非ヒト動物モデルである。ＭＳではないが、異なる形態と段階のＥＡＥは、種々の形態と段階のＭＳに多くの側面で非常によく似ている。さらに具体的には、ＥＡＥは、急性または慢性−再発性、後天性、炎症性および脱髄性自己免疫疾患である。動物に、種々のタンパク質（例えば、ミエリンを作り上げるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ））、神経細胞（ニューロン）を取り囲む絶縁性髄鞘、の全部または一部を注入し、ヒトのＭＳに極めて似ている動物自体のミエリンに対する自己免疫応答を誘導する。ＥＡＥは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、マカク、アカゲザルおよびマーモセット、を含むいくつかの異なる動物種で誘導された。免疫学的なツールの数、動物の利用可能性、寿命および繁殖力および誘導された疾患のＭＳに対する類似点を含む種々の理由のために、マウスおよびラットが最もよく使われる種である。急性のラットＥＡＥモデルは、強い炎症性の成分を有し、従って、ＭＳの免疫的イベントを標的とする薬剤としての治療的潜在能力を調べる適切なモデルである。
【０２８５】
ＭＢＰ誘導ＥＡＥ。一回投与後のＬｅｗｉｓラット中のＭＰＢは、主に後足麻痺が特徴の再発を起こす。Ｌｅｗｉｓラットは、ＭＢＰ注射をｄａｙ０に受ける。疾患は、ｄａｙ１２〜１６の間に発症し、完全疾患回復が、ｄａｙ１８〜２１の間に起こる。モデルは、自己制限的であり、脱髄を示さない。
【０２８６】
材料と方法：
試験流体（ＲＮＳ−６０）の製造とキャラクタリゼーション。フィルター滅菌ＲＮＳ−６０が、米国特許公開第２００８／０２１９０８８号（２００８年９月１１日に出願）、米国特許公開第２００８／０２８１００１号（２００８年１２月１１日出願）および国際公開第ＷＯ２００８／０５２１４３号（２００８年５月２日出願）に記載の方法に従って出願人により調製された。これらの特許は、参照によりその全体が、特に、出願人の発明の動電学的流体の調製のための装置および／または方法に関する全ての態様が本明細書に組み込まれる。使用されたＲＮＳ−６０の溶存酸素（ＤＯ）含量は、ウィンクラー滴定アッセイにより測定して、５９ｐｐｍであった（Ｙ．Ｃ．Ｗｏｎｇ  ＆  Ｃ．Ｔ．Ｗｏｎｇ．香港Ａ−Ｌｅｖｅｌのための新しい化学の方法（Ｎｅｗ  Ｗａｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ａ−Ｌｅｖｅｌ）、第４巻、ページ２４８、または水と廃水の標準的調査方法（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ）−２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＩＳＢＮ  ０−８７５５３−２３５−７）。ＲＮＳ−６０流体に、試験項目（ＴＩ）番号、受け取り日付、貯蔵条件および使用期限のラベルを添付した。貯蔵条件およびＲＮＳ−６０の取扱は、試験の間の試験設備の安定性を確実にするために、出願人の仕様の通りとした。流体は、使用中でない場合は、２〜８℃で冷蔵保存した。流体を含むバイアルを単回用途容器として使用した。
【０２８７】
ビークル対照流体。ビークル対照流体は、Ｈｏｓｐｉｒａから入手した注射用生理的食塩水（０．９％）とした。
【０２８８】
デキサメタゾン。デキサメタゾンは、Ｓｉｇｍａから購入した（カタログ番号Ｄ１７５６；ロット番号０９６Ｋ１８０５）。投与のために、デキサメタゾン（白色粉末）をエタノール中に希釈し、１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、その後、蒸留水に再度希釈して、投与用量濃度の０．１ｍｇ／ｍｌを得た。
【０２８９】
ＥＡＥ誘導項目：
ＭＢＰ抗原。ＭＢＰは、モルモット（Ｄｅｓ−Ｇｌｙ−７７、Ｄｅｓ−Ｈｉｓ−７８）−ＭＢＰ（６８−８４）由来のミエリン塩基性タンパク質であった；カタログ番号Ｈ−６８７５；ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから提供を受けた）。ＭＢＰは、生理的食塩水中に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した；
【０２９０】
ＣＦＡ感作剤。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）は、ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｒｗｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨから入手（カタログ番号ＩＭＡＤ−４）。４ｍｇ／ｍｌの濃度の熱殺菌マイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒａを含むＣＦＡ懸濁液を受け入れたまま使用；さらに
【０２９１】
ＭＢＰ／ＣＦＡ乳剤（抗原／感作剤）。試験のｄａｙ０に単回接種を行う前に、ルアーフィッティングにより連結された２つのシリンジを用いて、乳剤混合物を完全に混合して、１００μｌ／動物の合計投与容量と等しくすることにより、１容量のＭＢＰ溶液を等容量のＣＦＡ４ｍｇ／ｍｌと混合した。その用量を両側足底内領域に２ｘ５０μｌ皮下（ＳＣ）注射により送達した。
【０２９２】
試験動物；ラット。６０匹の雌Ｌｅｗｉｓラット（試験開始時６〜７週齢）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ、Ｌｔｄから入手した。治療開始時点の動物の重量変動は、平均重量の２０％を越えるべきではない。この試験に使用した動物の健康状態をそれらの到着時に調べた。良好な健康状態の動物のみを研究室条件に順化させ、試験に使用した。試験に入る前に、動物を少なくとも５日間順化させた。環境順化および全体調査継続の間、動物をアクセス制限げっ歯類施設内に収容し、固体底と、寝具材料として無菌の鉋屑を敷き詰めたポリプロピレンを装備したケージ中で最大５匹のラット群として飼育した。動物に市販げっ歯類食事を自由に与え、また、飲み水を自由に利用させたが、これは、ステンレス鋼製シッパーチューブを備えたポリエチレンボトルを介して各ケージで与えられた。試験に使用した食事バッチの飼料ロット分析は、データを入れたアーカイブに含めた。水を定期的にモニターした。自動制御環境条件を、相対湿度（ＲＨ）：３０〜７０％で温度２０〜２４℃、１２：１２時間の明：暗サイクル、および試験室の１５〜３０回換気／時間、を維持するように設定した。温度とＲＨを毎日モニターした。光サイクルを親時計によりモニターした。動物は、尾部標識を使って固有の動物識別番号を与えられた。この番号は、また、ケージカードにも記入され、各ケージの前面で視認できる。ケージカードには、また、試験および群番号、投与経路、性別、株および他の治療群に関する全ての関連詳細事項も含められた。
【表６】
2014511879.tif 000010
【０２９３】
試験方法および急性ＥＡＥマウスモデルの原理。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の多くの臨床的および病理学的な特徴を模倣する中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫性脱髄性疾患である。急性のラットモデルは、試験のｄａｙ０に、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）で乳化されたミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の単回皮下（ＳＣ）注射により誘導された感作期間からなる。
【０２９４】
ＥＡＥ誘導および治療計画の模式図を図４に示す。
【０２９５】
ＥＡＥ誘導：
ＭＢＰ／ＣＦＡ。図４の模式図による説明で示すように、全ての動物は、試験ｄａｙ０（試験開始）に、ＭＢＰおよびＣＦＡのホモジネート乳剤混合物からなる単回接種材料注射を受けた（ＭＢＰ／ＣＦＡ脳炎誘発性乳剤接種材料（１００μｇ  ＭＢＰ／２００μｇＣＦＡ）を、１００μｌ／動物の合計投与容量で注射され、両足底内領域に２ｘ５０μｌ皮下（ＳＣ）注入として送達された）。
【０２９６】
治療：
治療計画および方法。全ての化合物は、動物を採点する人とは別のヒトにより毎日新しく調製された。動物を採点する人は群番号のみを記したバイアルを受け、治療については知らされなかった。
【０２９７】
投与経路：（ｉ）ＲＮＳ−６０：（ＩＶ）；（ｉｉ）ビークル対照：（ＩＶ）；および（ｉｉｉ）陽性対照：（ＩＰ）。
【０２９８】
用量レベルおよび投与容量：（ｉ）ＲＮＳ−６０：低用量、３５０ｇに対し２ｍｌ；高用量、３５０ｇに対し４ｍｌ；（ｉｉ）ビークル対照：０；および（ｉｉｉ）陽性対照（デキサメタゾン）：１ｍｇ／ｋｇ。
【０２９９】
支持療法。試験の過程の間での決定がない限り、ＥＡＥ実験的効果が予測される、および／または観察される（単回脳炎誘発性接種後約８〜１２日）とすぐに、または、動物が、それらの前の測定値から１５％を越える体重減を示す場合、またはそれらの初期体重測定値から２０％を越える体重減少を示す場合、ケースバイケースの原則に基づき適切な支持療法を行った。
【０３００】
給餌および給水。飲料水に浸した細断ペレットまたは粗びき粉のげっ歯類食事からなる追加の水供給源をケージ底および腹這いの／非可動性動物の前に置く。
【０３０１】
脱水症。動物は、体重が初期測定値の１０％内に戻るまで、２ｍｌ／動物／日まで、少なくとも毎日２回、デキストロース５％溶液による皮下（ＳＣ）補充流体療法を受けることができる。
【０３０２】
排尿。排尿を支援し、動物が膀胱を空にすることができるかどうかを観察すために、動物の腹部の触診を行う。
【０３０３】
他の特殊な世話。必要に応じ、動物の肛門周囲領域および後ろ脚を湿潤したガーゼパッドで浄化した。
【０３０４】
観察および検査：
臨床徴候。全体の２１日の試験を通して、ＥＡＥ臨床的スコアリングおよび評価（下記参照）の他に、少なくとも毎日１回慎重な臨床的検査を行い、記録した。観察には、皮膚、毛皮、眼、粘膜の変化、分泌および排泄（例えば、下痢）の発生、ならびに、自律神経活動（例えば、流涙、唾液分泌、起毛、瞳孔の大きさ、異常呼吸パターン）、歩行、姿勢および取扱いに対する応答、ならびに、異常挙動、振戦、痙攣、睡眠および昏睡の存在、が含まれる。
【０３０５】
体重。体重減は、発病の最初の徴候である可能性があり、他方、突然の顕著な体重増は、ＥＡＥ症状の寛解を伴う傾向がある。従って、動物の個別体重の測定は、試験ｄａｙ０（試験開始）のＥＡＥ誘導直前に行われ、その後は、全２１日観察期間にわたり、原則毎日行われる。
【０３０６】
ＥＡＥ臨床スコア付けおよび評価。最初に、ＥＡＥ誘導（試験ｄａｙ０）の前に全ての動物を何らかの神経学的応答および症状の徴候に関し検査し、その後、全２１日の観察期間にわたり、原則毎日検査した。実験的偏りを避けるために、ＥＡＥ反応は、適用された特定の治療について知らないスタッフメンバーにより、可能な限り、盲検方式で判定される。ＥＡＥ反応を、古典的な、当該分野で承認されている従来の０〜５目盛りを使って、下表７に示すように、重症度の昇順でスコア化し、記録した。
【表７】
2014511879.tif 000011
【０３０７】
血液試料。試験終了（ｄａｙ２１）の日に、全動物から注射１時間後に採血した。試験ｄａｙ０（予防群のみ）、７、１４、および２１に試料を集めた。血漿をヘパリン処置したバイアル中に集め、−２０℃で保存した。３００μｌの容量を血球数分析用に貯蔵し、また、１００μｌを貯蔵し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるさらなるサイトカイン分析用に使用した。ｄａｙ０、７、１４、および２１の血球数を分析した。
【０３０８】
組織収集。試験終了時に、動物を４％ＰＦＡで灌流した。脳と脊髄を集め、４％ＰＦＡ中に保存した。
【０３０９】
人道的終点。瀕死状態が認められる動物、および／または重度疼痛の動物および重度の苦痛徴候に耐えている動物を人道的に安楽死させた。
【０３１０】
統計／データ評価：
評価は、主に、ビークル対照群と比較して、全治療群で得られた絶対値、パーセンテージ（％）変化および平均値として表された神経学的症状および体重の両方の記録の相対的変化に基づいて行った。適切な統計的方法によるデータ分析を適用して、治療効果の有意性を判定した。
【０３１１】
動物ケアおよび使用ステートメント：
ケアおよび実験動物の使用における倫理行動のための適切な委員会に提出された、試験が定められた規則や規定に従うことに関する申請書の承認後、この試験を行った。
【０３１２】
結果：
試験結果を図３に示す。この図では、時間（ＭＢＰ注射後の日数）をＸ軸で、「臨床スコア」（上記「材料および方法」セクションを参照）をＹ軸で表す。
【０３１３】
図３は、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデル（上記「材料および方法」セクションを参照）で、本発明の動電学的流体（ＲＨＳ−６０）が実質的に効果的であったことを示す。
【０３１４】
具体的には、１７日間全体のビークル対照群（中実ダイヤ）に比較して、治療（ＭＢＰ注射と同時にＲＮＳ−６０の毎日投与の開始）および予防（ＭＢＰ注射の７日前のＲＮＳ−６０の毎日投与の開始）の両群のＲＮＳ−６０投与計画が、臨床スコアの顕著な減少、ならびに発症の遅延を示した（高用量群で）。
【０３１５】
低用量（毎日１ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０治療群の臨床スコアは、ビークル対照群の約半分（１／２）であったが、一方、高用量（毎日２ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０治療群の臨床スコアは、ビークル対照群の約５分の１（１／５）から１０分の１（１／１０）であっただけでなく、発症の遅延も示した。
【０３１６】
低用量（毎日１ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０予防群の臨床スコアは、ビークル対照群の約３分の１（１／３）であったが、一方、高用量（毎日２ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０予防群の臨床スコアは、ｄａｙ１６までゼロ（検出不能臨床スコア）（すなわち、実質的に発症遅延を示す）であっただけでなく、観察可能になったｄａｙ１７には、同時点のビークル対照群の１０分の１（１／１０）未満でさえあった。
【０３１７】
本発明の特定の態様では、従って、本発明の動電学的組成物は、当該分野で承認されているヒトＭＳのラットモデルのＥＡＥの症状の軽減および予防を含む、治療に対する実質的な有用性を有する。
【０３１８】
実施例８
（本発明の動電学的流体は、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルの体重維持に関し、効果があることが示された）
概要：
この実施例は、実施例７に記載の実験を行ったラットの体重変化に関し開示する。体重減は、疾患開始の最初の徴候である場合があるが、他方、急速な顕著な体重増は、ＥＡＥ症状の寛解を伴う傾向がある。従って、試験ｄａｙ０（試験開始）のＥＡＥ誘導の直前に、および２１日の観察全期間にわたり原則毎日、動物の個別体重の測定を行った。本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０の体重に対する作用は、ＥＡＥラットモデルのラットの体重の維持に効果的であることが示された（図５）。
【０３１９】
体重データ：
図５は、グラムで（パネルＡ）および１００グラムに基づくパーセンテージとして（パネルＢ）体重を示す。治この実施例で、治療動物の平均体重のわずかな減少後、平均体重は、試験終了まで増加に転じた。試験終了時に、平均体重増加は、ビークル治療動物（１Ｆ群）で２０％であった。試験全体を通し、デキサメタゾン治療群（２Ｆ群）（試験ｄａｙ０に投与を開始）は、試験中、１０％の平均体重減があった。試験終了時、デキサメタゾン治療動物は、２％の平均体重減であった。予防の低用量治療群（３Ｆ群）は、試験ｄａｙ１〜３に、４％までの平均体重減、その後、試験終了日までに２３％の平均体重増を示した。予防の高用量治療群（４Ｆ群）は、試験ｄａｙ１〜３に、５％までの平均体重減、その後、試験終了日までに２８％の平均体重増を示した。治療の低用量治療群（５Ｆ群）は、試験ｄａｙ１〜３に、４％までの平均体重減、その後、試験終了日までに２１％の平均体重増を示した。治療の高用量治療群（６Ｆ群）は、試験ｄａｙ１〜３に、４％までの平均体重減、その後、試験終了日までに１９％の平均体重増を示した。
【０３２０】
このように、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、ＥＡＥラットモデルのラットの体重の維持に効果的であることが明らかになった。
【０３２１】
本発明の特定の態様では、従って、本発明の動電学的組成物は、当該分野で承認されているヒトＭＳのラットモデルのＥＡＥの症状の軽減および予防を含む治療に対し実質的な有用性を有する。
【０３２２】
実施例９
（本発明の動電学的流体は、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルのラットから採取した血液試料中の白血球、好中球、およびリンパ球のレベルに対し、ほとんど効果がないことが示された）
概要：
この実施例は、実施例７で記載の実験中にラットから採取された血液試料中の白血球、好中球、およびリンパ球のレベルに関し開示する。サイトカインレベルの変化が白血球の全体的な変化に起因するのか否かを判定するために、出願人は、実験全体を通し、ＥＡＥ実験に供したラットから血液試料を採取した。
【０３２３】
白血球、好中球、およびリンパ球のレベル：
図６Ａ〜Ｄは、ＥＡＥ実験全体にわたり採取した血液試料中の白血球、好中球、およびリンパ球のレベルを示す。
【０３２４】
試験ｄａｙ０（パネルＡ）、７（パネルＢ）、１４（パネルＣ）および２１（パネルＤ）の試験項目投与の１時間後に、白血球（ＷＢＣ）、好中球およびリンパ球の数を数えた。試験Ｄａｙ７にビークルで治療された動物の１時間後の最大ＷＢＣ数は、８．２３±０．３６ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を２．４６±０．３８ポイントに有意に減らした（ｐ＜０．０５）。低用量（５Ｆ群）での試験項目による治療は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を９．５９±０．４６ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．１）。試験項目による治療群の高用量（６Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を１０．８４±０．８８ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。
【０３２５】
試験ｄａｙ１４にビークルで治療した動物の１時間後の最大ＷＢＣ数は、６．３４±０．２８ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、平均ＷＢＣ数を３．７９±０．６９ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による予防群の高用量（４Ｆ群）は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を７．８３±０．５１ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による治療群の低用量（５Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を７．６５±０．５２ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による治療群の高用量（６Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を８．０５±０．４３ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。試験ｄａｙ２１にビークルで治療した動物の１時間後の最大ＷＢＣ数は、９．０９±０．７５ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均ＷＢＣ数を５．１２±０．５７ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。
【０３２６】
試験ｄａｙ７にビークルで治療した動物の１時間後の最大好中球数は、２６．２０±１．６２ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均好中球数を６５．３８±４．６２ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による高用量（４Ｆ群）での予防処置は、ビークルに対し、平均好中球数を３１．９０±０．９６ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による治療群の高用量（６Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均好中球数を３３．９０±２．７９ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。
【０３２７】
試験ｄａｙ１４にビークルで治療した動物の１時間後の最大好中球数は、３３．００±２．５８ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均好中球数を７３．１０±３．１５ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。
【０３２８】
試験ｄａｙ２１にビークルで治療した動物の１時間後の最大好中球数は、４１．４０±２．３２ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均好中球数を８９．３３±１．９７ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による治療群の高用量（６Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均好中球数を３４．６０±３．０８ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．１）。
【０３２９】
試験ｄａｙ７にビークルで治療した動物の１時間後の最大リンパ球数は、７３．２０±１．９５ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均リンパ球数を３０．６３±１．３１ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による高用量（４Ｆ群）での予防処置は、ビークルに対し、平均リンパ球数を６８．３０±１．４２ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．１）。試験項目による治療群の高用量（６Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均好リンパ球数を６４．８０．±３．００ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。
【０３３０】
試験ｄａｙ１４にビークルで治療した動物の１時間後の最大リンパ球数は、６６．１０±２．５３ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均リンパ球数を２６．８０±３．２３ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。
【０３３１】
試験ｄａｙ２１にビークルで治療した動物の１時間後の最大リンパ球数は、５７．５０±２．０９ポイントであった。デキサメタゾンによる治療は、ビークルに対し、平均リンパ球数を１０．１１±２．０８ポイントに有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。試験項目による治療群の高用量（６Ｆ群）での治療は、ビークルに対し、平均好リンパ球数を６６．２０±２．７４ポイントに有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。
【０３３２】
このように、予防的におよび治療的に高用量で投与された本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、試験ｄａｙ７で、ビークルに対し、好中球数を有意に増加させ、リンパ球数を有意に減少させた。予防的に高用量で、および高低両用量で治療的に投与された本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、試験ｄａｙ１４で、ビークルに対し、ＷＢＣ数を有意に増加させた。治療的に高用量で投与された試験項目ＲＮＳ６０は、試験ｄａｙ２１で、ビークルに対し、好中球数を有意に減少させ、リンパ球数を有意に増加させた。従って、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、ＷＢＣ、好中球、およびリンパ球の全体的なレベルに対し、ほとんど効果がないことが明らかになった。
【０３３３】
実施例１０
（本発明の動電学的流体は、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルのラットから採取した血液試料中の特定のサイトカインのレベルに影響することが示された）
概要：
この実施例は、実施例７に記載の実験の間にラットから採取された血液試料中に見つかったサイトカインのレベルに関し開示する。本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０を、実施例７に記載の治療投与計画により評価した。本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、ＥＡＥラットモデルのラットから採取した血液試料中の特定のサイトカインのレベルに影響することが示された。
【０３３４】
特定のサイトカインは、多発性硬化症において役割を有することが示されている。特に、ＣＴＬＡ−８またはＩＬ−１７Ａとしても知られるインターロイキン１７（ＩＬ−１７）は、急性および慢性ＥＡＥの中枢神経系に高レベルで存在することが示されている（Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ、Ｈ．Ｈ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）、２３７：１２３−１３０）。ＩＬ−１７は、炎症促進性のサイトカインで、種々の非免疫細胞由来の広範な他のサイトカインの分泌を刺激する。ＩＬ−１７は、付着細胞様線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮および内皮細胞によるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＰＧＥ２、ＭＣＰ−１およびＧ−ＣＳＦの分泌を誘導でき、また、照射された線維芽細胞の存在下で培養した場合、ＩＣＡＭ−１表面発現、Ｔ細胞の増殖、ならびに、ＣＤ３４＋ヒト前駆細胞の増殖および好中球への分化を誘導できる（Ｆｏｓｓｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６、５４１−５５１）。ＩＬ−１７は、主に活性化した記憶Ｔ細胞により産生され、広範に分布した細胞表面受容体（ＩＬ−１７Ｒ）に結合することにより作用する（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、９、７９４−８００）。いくつかのＩＬ−１７の相同体が特定されており、これらは、炎症反応の調節で類似の役割と異なる役割の両方を有する。ＩＬ−１７サイトカイン／受容体ファミリーの概要については、Ｄｕｍｏｎｔ、２００３、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ、１３、２８７−３０３、を参照されたい。
【０３３５】
ＩＬ−１７は、異常な免疫応答により媒介されるいくつかの疾患、例えば、関節リウマチおよび気道炎症、ならびに、臓器移植拒絶反応および抗腫瘍免疫の原因となる可能性がある。ＩＬ−１７活性の阻害剤は、当技術分野でよく知られており、例えば、ＩＬ−１７Ｒ：Ｆｃ融合タンパク質を使って、コラーゲン誘導関節炎におけるＩＬ−１７の役割が立証され（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１、１６７、１００４−１０１３）、また、中和ポリクローナル抗体を使って、腹膜癒着形成が減らされた（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９５、１４７１−１４７８）。中和モノクローナル抗体は、市販されている（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＫ）。
【０３３６】
従って、役割ＩＬ−１７がＭＳの発病で果たす役割に基づいて、出願人は、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０が、ＥＡＥ試験のラットから採取された血液試料中のＩＬ−１７のレベルに与える影響を調べた。
【０３３７】
サイトカインデータ：
血液中の種々のサイトカインのレベルを試験の間に分析した。簡単に説明すると、全ての動物から、注射１時間後に採血し、血漿をヘパリン処置したバイアル中に集めた。１００μｌの試料の種々の炎症性のサイトカインをＬｕｍｉｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで分析した（ＰａｎｏｍｉｃｓのＰｒｏｃａｒｔａラットサイトカインアッセイキットＰＣ４１２７を使って）。この分析は、同じ試料から同時に複数のサイトカインの測定を可能とする。非ガウス分布データおよび時折生ずるアッセイ検出閾値未満の結果のために、打ち切りデータに対するノンパラメトリックコックス回帰モデルを異なる流体と比較するように構成した。図７Ａ〜Ｈに示すように、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、およびＩＬ１７のレベルは、治療群の両方ＲＮＳ６０治療用量（高および低）により、最も著しく低減した。ＭＢＰ誘導ＥＡＥの臨床症状は、凡そｄａｙ１０で始まり、凡そｄａｙ１８でピークに達する。従って、我々は、ｄａｙ７（疾患の発症直前）およびｄａｙ１８（凡そ疾患のピーク）をサイトカイン分析にとって最も重要な時点であると考えた。１０動物／群からのｄａｙ７および１８のＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂおよびＩＬ１７の全身レベルを図７Ａ〜Ｈに示した。
【０３３８】
ＩＬ−１は、主要炎症促進性サイトカインの１つであり、自然免疫応答の上流メディエーターである。ＩＬ−１は、種々の増殖および栄養性因子、炎症性のメディエーター、接着分子ならびに他のサイトカインを直接的、間接的に、ならびに正のフィードバックループを使って誘導する（Ａ．Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、１型インターロイキン−１受容体は、ミクログリアの効率的活性化および脳損傷に応答した複数の炎症促進性のメディエーターの誘導にとって必須である（Ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（２００２）、ｐｐ．６０７１−６０８２；Ｐ．Ｎ．Ｍｏｙｎａｇｈ、星状神経膠細胞中のインターロイキン−１シグナル伝達経路：脳の炎症に対する重要な寄与体（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ：ａ  ｋｅｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ）、Ｊ．Ａｎａｔ．２０７（２００５）、ｐｐ．２６５−２６９）。これらには、重要なモジュレーター、例えば、ＮＧＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＬ６、ＴＮＦａ、ＣＳＦ等が含まれる。ＭＳの進行は、末梢における自己抗原反応性Ｔ細胞の活性化を伴い、続いて、ＣＮＳへの侵入が起こる。それらは、ミエリン特異的Ｔ細胞活性化に関与するのみならず、末梢でのマクロファージ活性化の主要メディエーターでもあるので、ＩＬ−１は、ＭＳの発生に、非常に重要である［Ｒ．Ｆｕｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＨＳＶ−１媒介ＩＬ−１受容体アンタゴニスト遺伝子治療がＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＯＧ（３５−５５）誘導実験的自己免疫性脳脊髄炎を寛解させる（ＨＳＶ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ＭＯＧ（３５−５５）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｉｃｅ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４（２００７）、ｐｐ．９３−９８））。ＭＳのＥＡＥモデルでは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方が炎症性のプロセスのメディエーターであることが示された。ＩＬ−１βの末梢レベルは、臨床的過程と相関し、ＩＬ−１βの反応性が、ＣＮＳ湿潤性マクロファージおよび常在性ミクログリア細胞中でＥＡＥの間に示された（（Ｃ．Ａ．Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＩＬ−１アルファにより実験的自己免疫性脳脊髄炎が悪化し、可溶性ＩＬ−１受容体により抑制される（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｓ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−１  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（１９９１）、ｐｐ．２９８３−２９８９））。従って、ＩＬ−���は、ＥＡＥおよびＭＳの適切な治療標的である。ＩＬ−１の非選択的阻害機序が、ＭＳに対する既存の治療薬；すなわち、インターフェロンベータ、抗炎症性のグルココルチコイド、免疫抑制剤、アトルバスタチンおよびオメガ−３多価不飽和脂肪酸で示されている［Ｆ．Ｌ．Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．、インターフェロンベータによるＩＬ−１受容体アンタゴニストの誘導：多発性硬化症の治療に対する示唆（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｅｔａ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．６（Ｓｕｐｐｌ．２）（２０００）、ｐｐ．Ｓ３３−Ｓ３７．；Ｒ．Ｐａｎｎｕ  ｅｔ  ａｌ．、ラットの脊髄損傷後のアトルバスタチンによる急性炎症反応の減衰化（Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７９（２００５）、ｐｐ．３４０−３５０；Ａ．Ｐ．Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ、炎症および自己免疫疾患におけるオメガ−３脂肪酸（Ｏｍｅｇａ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．２１（２００２）、ｐｐ．４９５−５０５］］］］］］］］。図１１Ｃ〜Ｆに示すように、ＲＮＳ６０のＩＶ投与が、ＩＬ１αとＩＬ１βの両方の全身性レベルを効果的に低下させる。ＩＬ１αに関しては、ＲＮＳ６０治療は、ビークル治療群に比べて、血中濃度を有意に低下させ、この時点でデキサメタゾンと同等の有効性であった。しかし、１８日時点では、治療は、ＩＬ１α全身性レベルに対し有意な効果を示さない。ＩＬ１βの全身性レベルは、また、７日のＲＮＳ６０のＩＶ治療後、何らの毒性副作用の徴候もなく、デキサメタゾン治療群と同等なレベルまで有意に減らされた。同じ傾向が１８日時点で認められたが、対照群と比べた場合、差異は統計的に有意ではなかった。ＩＬ−１７は、また、強力な炎症促進性効果を有する非常に重要なエフェクターサイトカインである。それは、他の炎症促進性サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子−αおよびケモカインの発現を誘導し、好中球性白血球を攻撃し、また、樹状細胞の成熟を強化する（Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ、Ｌｉｎｄeｎ  Ａ．インターロイキン−１７ファミリーメンバーおよび炎症（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００４  Ｏｃｔ；２１（４）：４６７−７６）。ＩＬ−１７産生細胞は、自己免疫疾患、例えば、コラーゲンに誘導された関節炎、大腸炎、乾癬、およびＥＡＥにおける必須の炎症性のメディエーターであると考えられる。ＥＡＥのＴヘルパー１７細胞は、ＣＤ４＋細胞であり、それらは、ＥＡＥの末梢免疫系および炎症性中枢神経系の両方中に存在する。さらに、ＩＬ−１７の中和は、臨床的疾患を寛解させ、この所見は、ＩＬ−１７欠損動物中のＥＡＥ重症度の低下に対応する（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｌuｈｄｅｒ、多発性硬化症における中心的存在としてのインターロイキン−１７の広範な特徴（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７-Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｋｅｙ  Ｐｌａｙｅｒｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００８  Ｊａｎｕａｒｙ；１７２（１）：８−１０．）。７日間のＲＮＳ６０によるＩＶ治療は、再度、デキサメタゾン治療動物と類似のレベルまでの血液中のＩＬ１７レベルの有意な減少を生じた。１８日の治療後でも、同様のことが起こったが、結果は、統計的に有意でなかった。ＲＮＳ６０が、ＩＬ１レベルの低下に効果的であるだけでなく、ＥＡＥで、ＩＬ１およびＩＬ１７の２つの重要なサイトカインの組み合わせのレベルの低下に対し、ＩＶ注射２１日後でも顕著な毒性副作用もなく、効果があることに留意することは重要である。
【０３３９】
ＩＬ１およびＩＬ１７に加えて、神経系の炎症に重大な役割を果たすいくつかの他の分子もまた、ＲＩＳ６０により調節される。これらには、Ｒａｎｔｅｓ、ＫＣ、ＮＧＦおよびＩＣＡＭが含まれる（データは示さず）。
【０３４０】
このように、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、ＥＡＥ試験のラットから採取した血液試料中のＩＬ−１７のレベルに対し有意な効果があった。さらに、ＩＬ−１７は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＰＧＥ２、ＭＣＰ−１およびＧ−ＣＳＦの分泌を刺激するために、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０は、血液中のこれらのサイトカインのレベルに対しても有意な効果を持つであろうと思われる。本発明の特定の態様では、従って、本発明の動電学的組成物は、当該分野で承認されているヒトＭＳのラットモデルのＥＡＥの症状の軽減や予防を含む、治療に対し実質的な有用性を有する。
【０３４１】
実施例１１
（蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により、ＲＮＳ−６０は、細胞表面受容体：ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現に対し明らかな効果があることが示された）
概要：
出願人は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を使って、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）または対照生理食塩水流体と共にインキュベートした白血球の細胞表面受容体、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現レベルを比較した。
【０３４２】
方法：
フィコール・ハイパック分離ＰＢＭＣ（アフェレーシス−全細胞）をＲＮＳ６０または生理的食塩水（ＮＳ）の３０％溶液中で約１時間プレインキュベート；
２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌで２４または４０時間ＰＢＭＣを活性化；
細胞を集め、ブロッキング／染色緩衝液中で洗浄、染色および固定；さらに
細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０３４３】
結果：
ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）に関しては、生理的食塩水対照中での受容体の発現レベルに比べ、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下、下方制御される。この発現低下は、ＭＡＰＫｐ３８のリン酸化に影響を与え（データは示さず）、これが、次にエオタキシンを下方制御し（例えば、出願人の２００９年４月３０日広告の国際公開第ＷＯ２００９／０５５７２９号の実施例１３および図５７を参照）、これがさらには、ＩＬ５を下方制御し、その上、好酸球数を変化させ、これが、例えば、気管支収縮性応答を変更する因子の１つである。
【０３４４】
出願人の２００９年４月３０日広告の国際公開第ＷＯ２００９／０５５７２９号の実施例１３で卵白アルブミン刺激モデルとの関連で考察のように、ＲＮＳ−６０は、生理的食塩水の効果に比べて、ＯＶＡ刺激群の血清エオタキシンレベルを低減させた。従って、特定の態様では、ＲＮＳ−６０は、リガンドエオタキシンおよびその受容体ＣＣＲ３の両方を減少させる可能性を有する。
【０３４５】
ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に関しては、生理的食塩水中での受容体発現のレベルに比べて、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で下方制御される。
【０３４６】
ＣＤ１１Ｂに関しては、生理的食塩水中での受容体発現のレベルに比べて、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で下方制御される。
【０３４７】
ＣＤ３に関しては、生理的食塩水中での受容体発現のレベルに比べて、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で下方制御される。
【０３４８】
特定の態様では、また、本明細書の実施例の別の場所に記載のように、本発明の動電学的組成物は、炎症の低減に対し実質的な有用性を有する。機序に拘泥するものではないが、例えば、また、本明細書の実施例の別の場所に記載のように、ＩＬ７Ｒは、サイトカイン受容体様因子２遺伝子（ＣＲＬＦ２）と二量体化して、ＴＳＬＰ受容体を形成する（ＡｌＳｈａｍｉｅｔａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１５９−１６８）。ＴＳＬＰは、未成熟Ｂ細胞の発生をインビトロで駆動し、骨髄樹状細胞では、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴヘルパータイプ２（Ｔｈ２）表現型への分化を促進でき、ＣＤ４＋Ｔｈ２記憶細胞の増殖を促進できるＩＬ７様サイトカインである（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐ．６：３７２−３７６）。ＴＳＬＰは、樹状細胞媒介Ｔｈ２型炎症反応を誘発し、また、アレルギー性炎症のマスタースイッチであると考えられており（Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５７：９９−１０４）、ＭＳの病因学に関連する（例えば、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９：１０８３−１０９１；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２９  Ｊｕｌｙ  ２００７（参照によって本明細書に組み込まれる）、を参照のこと；ＩＬ７Ｒα対立遺伝子とＭ．Ｓ．の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ７Ｒα  ａｌｌｅｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｍ．Ｓ．））。さらなる態様では、本発明の動電学的組成物は、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）の調節（例えば、低下）に関し実質的な有用性を有する。多発性硬化症（ＭＳ）では、組織中のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性は、ＭＭＰおよびそれらの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）の間のバランスの結果である。ＭＭＰ−９は、急性のＭＳ病変で多く、ＴＩＭＰ−１により抑制されているが、一方、ＭＭＰ−２は、慢性疾患の場合等の細胞外のマトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングに関与する場合があり、ＴＩＭＰ−２により抑制されている（例えば、Ａｖｏｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：４６−５３、２００３、を参照。この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３４９】
本発明のさらなる態様では、従って、本発明の動電学的組成物は、罹患した哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＭＳの症状の軽減および予防を含む治療のための実質的な有用性を有する。
【０３５０】
またさらなる態様では、本発明の動電学的組成物は、本明細書の別の場所に記載された少なくとも１つの追加のＭ．Ｓ．治療薬と一緒に投与できる。
【０３５１】
本発明のさらなる態様では、従って、本発明の動電学的組成物は、罹患した哺乳動物（好ましくは、ヒト）の炎症性神経変性疾患（例えば、本明細書の別の場所で定義されたアルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイド症型障害）の症状の軽減および予防を含む治療のための実質的な有用を有する。
【０３５２】
実施例１２
（本発明の動電学的流体（例えば、ＲＮＳ６０）は、ミクログリア細胞中のｉＮＯＳおよびＩＬ−１βの発現を用量依存性方式で阻害することが示された）
概要：
本明細書記載の特定の態様では、本発明の動電学的流体は、パーキンソン病（ＰＤ）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３５３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、ヒトの最も破壊的な神経変性障害の１つである。ＰＤは、どの年齢でも発病するが、３０才より若い人では希である。臨床的には、ＰＤは、振戦、運動緩慢、硬直および姿勢調節障害を特徴とする。病理学的には、それは、神経膠症および黒質緻密部（ＳＮｐｃ）中の細胞質内封入体（レビー小体）の存在に関連するドパミン作動性ニューロンの進行性変性により示される。死後のＰＤ脳で、臨死ニューロンが、細胞収縮、クロマチン凝縮、およびＤＮＡ断片化を含むアポトーシスの形態学的特性を呈することが報告されている。従って、疾患進行を停止する効果的な神経保護治療手法の開発が極めて重要である。ＭＰＴＰマウスモデルは、ＰＤに対する治療の手法の試験および検証のための実質的な有用性を有する。
【０３５４】
ミクログリア活性化は、パーキンソン病（ＰＤ）ならびに他の神経変性障害の発病で重要な役割を果たす。ＰＤの固有の特徴が１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）中毒性動物でモデル化されている。ＭＰＴＰの神経毒作用は、ＭＰＰ＋への変換に依存する。グリア細胞では、モノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯ−Ｂ）がＭＰＴＰをＭＰＰ＋に変換し、次に、これがグリア細胞を活性化する。最近、ミクログリア中のＭＰＰ＋が炎症促進性分子の発現を誘導することが明らかになった。
【０３５５】
この実施例では、ＲＮＳ６０のＭＰＰ＋刺激されたミクログリア細胞中の炎症促進性分子の発現を調節する能力が確認された。
【０３５６】
材料および方法：
簡単に説明すると、マウスＢＶ−２ミクログリア細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０および生理的食塩水（ＮＳ）と共に、１時間インキュベートし、続けて、無血清条件下で２μＭ  ＭＰＰ＋で刺激した。
【０３５７】
結果：
図８の半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析からも明らかなように、ＭＰＰ＋単独で、マウスＢＶ−２ミクログリア細胞中の、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの発現を誘導した。重要なことは、ＲＮＳ６０がミクログリア細胞中のｉＮＯＳおよびＩＬ−１βの両方の発現を用量依存的に阻害したことである（図８）。対照的に、類似の実験条件下で、生理的食塩水対照（ＮＳ）は、これら２つの炎症促進性遺伝子の発現に効果を示さず（図８）、効果の特異性を示している。
【０３５８】
具体的には、図８は、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）は、対照の生理的食塩水（ＮＳ）とは異なり、マウスミクログリア細胞中の誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）のＭＰＰ＋誘導発現を弱めることを示す。異なる濃度のＲＮＳ６０および生理的食塩水（ＮＳ）と共に無血清培地中で１時間、プレインキュベートしたＢＶ−２ミクログリア細胞は、ＭＰＰ＋（パーキンソン病様毒素）で刺激された。６時間の刺激後、全体ＲＮＡを単離し、ｉＮＯＳおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。結果は、３つの独立した実験となる。
【０３５９】
特定の態様では、従って、ＭＰＰ＋は、パーキンソン病様毒素であるので、これらの結果は、ＲＮＳ６０が当該分野で承認されているパーキンソン病のＭＰＴＰ誘導マウスモデルにおいて保護効果を有することを示す。
【０３６０】
特定の態様では、本発明の動電学的流体は、パーキンソン病（ＰＤ）の治療に対する実質的な有用性を有する。
【０３６１】
実施例１３
（本発明の動電学的流体（例えば、ＲＮＳ６０）は、アミロイド−β毒性からニューロンを保護することが示された）
概要：
本明細書記載の特定の態様では、本発明の動電学的流体は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に対し実質的な有用性を有する。
【０３６２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性神経細胞死および記憶喪失をもたらす神経変性障害である。死後ＡＤ脳のＴＵＮＥＬ染色の増加は、ＡＤ患者の脳のニューロンがアポトーシスで死ぬことを示す。原繊維アミロイド−βペプチドがＡＤの病態生理学に関与する。神経病理学的には、疾患は、アミロイド前駆物質タンパク質、およびリン酸化タウ由来のβ−アミロイド（Ａβ）タンパク質（４０〜４３アミノ酸タンパク分解断片）の凝集体からなる神経原線維変化および老人斑を特徴とする。遺伝子導入マウスの細胞内でＡβペプチドの過剰発現が、クロマチンの分断、凝縮、およびＴＵＮＥＬ染色の増加を引き起こすことが認められた。細胞培養調査は、また、Ａβペプチドは、神経細胞に対しアポトーシス性および細胞傷害性であることが示され、さらに、原繊維Ａβ１−４２ペプチドは、神経細胞のアポトーシスを誘導できることが示された。
【０３６３】
さらに、調査は、炎症とＡＤの間の関連の解明を標的にすることが多くなっており、広範なグリアの活性化が、プラークおよび神経原線維変化の周辺で見つかっている。
【０３６４】
この実施例では、ヒトＳＨＳＹ５Ｙ神経細胞のＡβ（１−４２）誘導アポトーシスの遮断に対するＲＮＳ６０の効果が確認された。
【０３６５】
材料および方法：
原繊維Ａβ１−４２に応答して生成されたＤＮＡ断片の３’−ＯＨ末端の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介結合により、ＳＨＳ５Ｙヒト神経細胞の断片化したＤＮＡを、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍの市販のキット（ＴｄＴ  ＦｒａｇＥＬ（登録商標））を使って、インサイツで検出した。簡単に説明すると、カバーガラスを２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで室温で１５分間処理し、洗浄後、ＴｄＴ染色を行った。
【０３６６】
結果：
図９に示すように、原繊維Ａβ１−４２ペプチドは、神経細胞中のアポトーシス性物質の形成を顕著に誘導した。我々は、また、Ａβ１−４２処理後、神経細胞の処理の喪失を観察した（２行目；図９）。対照的に、リバースペプチドＡβ４２−１は神経細胞のアポトーシスおよび処理の喪失を誘導できなかった（３行目；図９）．重要なのは、異なる用量で試験したＲＮＳ６０は、Ａβ（１−４２）誘導アポトーシスを大きく阻止し、神経細胞の処理を保存したことである（４、５、６行目；図９）．対照的に、生理的食塩水対照流体（ＮＳ）は、Ａβ（１−４２）誘導アポトーシスおよび処理の喪失に対し効果がなかった（７、８行目；図９）。
【０３６７】
具体的には、図９は、生理的食塩水対照（ＮＳ）とは異なり、ＲＮＳ６０は、原繊維Ａβ（１−４２）媒介ヒトＳＨＳＹ５Ｙ神経細胞のアポトーシスを抑制することを示す。分化後、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０またはＮＳと共に１時間インキュベートし、続けて、１μＭ原繊維Ａβ（１−４２）ペプチドで侵襲した。１８時間の処理後、アポトーシスをＴＵＮＥＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でモニターした。Ａβ（４２−１）ペプチドも、対照として同様にインキュベートした。結果は、独立した実験となる。
【０３６８】
これらの結果は、ＡＤの病因学的試薬（原繊維Ａβ１−４２）が、ＲＮＳ６０感受性経路を介してニューロンのアポトーシスを誘導することを示す。
【０３６９】
特定の態様では、本発明の動電学的流体は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に対し実質的な有用性を有する。
【０３７０】
実施例１４
（本発明の動電学的流体は、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）のマウスＭＯＧモデルで、用量反応的に臨床スコアを下げるのに実質的に有効であることを示した）
概要：
この実施例では、本発明の動電学的流体ＲＮＳ−６０を、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスＭＯＧモデルを使って、治療投与計画による２つの用量で評価した。
【０３７１】
材料および方法：
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の多くの臨床的および病理学的特徴を模倣する中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫性脱髄性疾患である。ＭＯＧマウスモデルは、試験ｄａｙ０にフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中で乳化されたＭＯＧの単回皮下（ＳＣ）注射（２００μｌ／動物の合計用量容量で２００μｇＭＯＧ／３００μｇＣＦＡ注射により２Ｘ１００μｌ皮下傍腰部領域両側への注入として送達）により誘導される感作期間；続けて、試験ｄａｙ０のＥＡＥ誘導時に１回および試験ｄａｙ２の４８時間後もう１回、２０μｇ／ｋｇ（約４００ｎｇ／マウス）の百日咳毒素（ＰＴ）の腹腔内（ＩＰ）注射による腹腔内（ＩＰ）追加免疫活性化、から構成される（Ｇｉｌｇｕｎ−Ｓｈｅｒｋｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：２０１−２０７、２００３）。その後、動物を図１０に示すようにＲＮＳ６０  ＩＶ注入で治療した。使用動物は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ、Ｌｔｄ．から入手した雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０動物／群）；若年成体；試験開始時８〜９週齢、であった。
【０３７２】
ＥＡＥ誘導（試験ｄａｙ０）の前に、全ての動物の神経学的応答および症状の徴候を検査し、その後、３５日の観察期間にわたり原則毎日、検査した。当該分野で承認されている重症度の昇順の０〜１５目盛りを使って、ＥＡＥ反応をスコア化し、記録した。各セクションのスコアを合計して臨床スコアを決定した（例えば、Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＡＳＥＢ  ２００５；Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０４−２０３０ｆｊｅ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ａｕｇｕｓｔ  ４、２００５、を参照）。
【０３７３】
結果：
図１０は、ビークル対照（ビークル）と異なり、ＲＮＳ６０は、当該分野で承認されている多発性硬化症（ＭＳ）のマウスＭＯＧモデルで、用量反応的に臨床スコアを下げるのに実質的に有効であることを示す。高および低用量両治療群のＲＮＳ−６０の毎日投与、ならびに、ＲＮＳ−６０の３日毎の高用量投与（全ての場合のＲＮＳ−６０投与は、第１の臨床徴候と同時に開始）は、臨床スコアの顕著な減少を示した（中空ダイア＝ビークル対照；中空正方形＝デキサメタゾン陽性対照；明色「ｘ」＝低用量（０．０９ｍｌ  ＲＮＳ６０）の臨床徴候の開始から毎日投与；暗色「ｘ」＝高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）の臨床徴候開始から３日毎の投与；および中空三角形＝高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）の臨床徴候開始から毎日投与）。
【０３７４】
本明細書の上記実施例のＭＢＰモデルに比較して、このマウスＭＯＧモデルは、当技術分野で、ＭＢＰモデルが示すことがない特徴的なＭＳの軸索損傷を模倣するその能力で知られており、観察される治療の効力を長期間にわたり延長する（ＭＢＰモデルの２１日に比べ、２８〜３０日）。さらなる態様では、ビークル対照（ビークル）と異なり、ＲＮＳ６０は、このマウスＭＯＧモデルで、軸索の損傷を低減するのに実質的に有効である。
【０３７５】
本発明の特定の態様では、本発明の動電学的組成物は、当該分野で承認されているヒトＭＳのマウスモデルの症状の軽減および予防を含む治療に対し、実質的な有用性を有する。本発明のさらなる態様では、本発明の動電学的組成物は、罹患している哺乳動物（好ましくはヒト）のＭＳの症状の軽減および予防を含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３７６】
またさらなる態様では、本発明の動電学的組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、それにより、中枢神経系の炎症性の状態を治療する新規方法を提供する。
【０３７７】
実施例１５
（蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を使って、ＲＮＳ−６０が、細胞表面受容体：ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現に対し、明らかな効果を有することが示された）
概要：
出願人は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を使って、細胞表面受容体、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の、本発明の動電学的流体（ＲＮＳ−６０）または生理的食塩水対照流体と共にインキュベートした白血球上での発現レベルの比較を行った。
【０３７８】
方法：
フィコール・ハイパックによる分離ＰＢＭＣ（アフェレーシス−全細胞）をＲＮＳ６０または生理的食塩水（ＮＳ）の３０％溶液中で１時間プレインキュベートし；
２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌで２４  ４０時間ＰＢＭＣ活性化し；
細胞を集め、ブロッキング／染色緩衝液で洗浄、染色および固定し；さらに
細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０３７９】
結果：
ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）に関しては、図１１Ｂに示すように、生理的食塩水対照の受容体発現レベルと比較して、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で実質的に下方制御される。この発現低下は、ＭＡＰＫｐ３８（データは示さず）のリン酸化に影響を与え、次に、エオタキシンを下方制御し（例えば、実施例４参照）、これが次に、ＩＬ５を下方制御し（データは示さず）、さらに、好酸球数を変更し（例えば、実施例４参照）、これは、例えば、気管支収縮性の応答を変える因子の１つである。
【０３８０】
実施例４で卵白アルブミン刺激モデルに関連して考察したように、生理的食塩水の効果に比べて、ＲＮＳ−６０は、ＯＶＡ刺激群の血清エオタキシンレベルを低下させた。従って、特定の態様では、ＲＮＳ−６０は、リガンドエオタキシンおよびその受容体ＣＣＲ３の両方を低減させる潜在能力がある。
【０３８１】
ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に関しては、図１２Ａに示すように、生理的食塩水の受容体発現レベルと比べて、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で下方制御される。
【０３８２】
ＣＤ１１Ｂに関しては、図１２Ｂに示すように、生理的食塩水の受容体発現レベルと比べて、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で下方制御される。
【０３８３】
ＣＤ３に関しては、図１２Ｃに示すように、生理的食塩水の受容体発現レベルと比べて、受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で下方制御される。
【０３８４】
実施例１６
（生理的食塩水（ＮＳ）とは異なり、ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞のＮＦκＢの活性化を弱める）
概要：
ＮＦ−κＢキナーゼは、炎症媒介状態および疾患の炎症反応を媒介するものとして当技術分野で広く認識されているキナーゼである。
【０３８５】
この実施例は、生理的食塩水（ＮＳ）とは異なり、ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞のＮＦκＢの活性化を弱めることを示す。特定の態様では、従って、本発明の動電学的生成流体は、限定されないが、下記を含む炎症および炎症媒介状態および疾患の治療に実質的な有用性を有する：糖尿病および関連代謝障害、インスリン抵抗性、神経変性疾患（例えば、Ｍ．Ｓ．、パーキンソン病、アルツハイマー病、等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠血管疾患、網膜および／または黄斑変性、消化器疾患（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、等）。
【０３８６】
方法：
図１３Ａおよび１３Ｂに示す実験に関しては、ＭＢＰ免疫マウスから単離したＴ細胞をＭＢＰで再刺激し、２４時間後、細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳで処理した。処理の２時間後、電気泳動の移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により核抽出物中のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性をモニターした。
【０３８７】
図１３Ｃで示す実験に関しては、ＭＢＰ免疫マウスから単離したＴ細胞にＮＦ−κＢ依存性レポーター構築物であるＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃを形質移入し、続けて、ＭＢＰで再刺激した。ＭＢＰ初回抗原刺激の２４ｈ時間後、細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳで２時間処理し、続けて、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って、全体細胞抽出物のルシフェラーゼ活性アッセイを行った。他のケースでは、また、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞を、３０ｎＭ  ＰＭＡで１時間刺激した。これらのケースでは、ＲＮＳ６０およびＮＳで前処理した１時間後、ＰＭＡを添加した。結果を、３つの異なる実験の平均＋（標準偏差）ＳＤで示す。
【０３８８】
結果：
図１３Ａ〜Ｃは、生理的食塩水（ＮＳ）とは異なり、ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞中有のＮＦ−κＢの活性化を弱めた。具体的には、図１３Ａと１３Ｂは、ＮＳ（図１３Ａと１３Ｂの右端レーン参照）とは異なり、ＲＮＳ６０（図１３Ａと１３Ｂの中央レーンを参照）は、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞中のＮＦ−κＢの活性化を用量反応的に弱めたことを示す。
【０３８９】
同様に、図１３Ｃの棒グラフは、ＮＳ（図１３Ａと１３Ｂの５番目のバーを参照）とは異なり、ＲＮＳ６０（図１３Ａと１３Ｂの２、３、４番目のバー参照）は、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞中のＮＦ−κＢの活性化を弱め、従って、また、全体細胞抽出物中の形質移入ＮＦ−κＢ依存性レポーター構築物（ＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃ）からのルシフェラーゼ活性を用量反応的に弱めたことを示す。
【０３９０】
特定の態様では、従って、開示の動電学的生成流体は、限定されないが、下記を含む炎症および炎症媒介状態ならびに疾患の治療に実質的な有用性を有する：糖尿病および関連代謝障害、インスリン抵抗性、神経変性疾患（例えば、Ｍ．Ｓ．、パーキンソン病、アルツハイマー病、等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠血管疾患、網膜および／または黄斑変性、消化器疾患（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、等）。
【０３９１】
実施例１７
（生理的食塩水（ＮＳ）と異なり、ＲＮＳ６０は、３つのＭＳのＥＡＥモデルの臨床スコアを低下させるのに有効であり、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞の脳炎誘発性の阻害に有効であった（細胞のエクスビボ処理を含む））
概要：
多発性硬化症（ＭＳ）は、慢性自己免疫性の中枢神経系脱髄疾患である。既存の治療は、限定され、大きな副作用がある。ＲＮＳ６０は、複数のインビトロおよびインビボモデルで、極めて低毒性で広範囲の抗炎症性に有効であることを立証したので、我々は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルでその効力を試験した。
【０３９２】
材料および方法：
本明細書記載のように、生理的食塩水を高酸素圧力下でテーラー・クエット・ポアズイユ（ＴＣＰ）流れにさらすことにより、ＲＮＳ６０を生成した。静脈内／腹腔内ＲＮＳ６０治療を、ａ）ラットのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）誘導ＥＡＥ、ｂ）マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導慢性ＥＡＥ、およびｃ）マウスの養子性Ｔ細胞移入誘導再発寛解型ＥＡＥで、試験した。
【０３９３】
結果：
ＲＮＳ６０の治療投薬は、３つ全てのモデルで臨床スコア低下に有効であった。ＭＯＧ誘導モデルでは、対照群（ｎ＝１０／群、Ｐ＜．０１）に比較して、最初の臨床症状の徴候時に開始したＲＮＳ６０治療群の治療は、最初の臨床症状の開始後、試験ｄａｙ９〜１２および１８〜２３の臨床スコアを有意に下げ、炎症促進性のサイトカインＩＬ−６とＩＬ−１７の循環レベルを低下させた。同様に、移入後１３〜４０日のＲＮＳ６０は、雌ＳＪＬ／Ｊマウスの養子移入再発寛解型ＥＡＥの臨床症状を弱めた。（ｎ＝５／群、Ｐ＜．０１）。
【０３９４】
特に、図１４Ａは、ＲＮＳ６０が、マウスのＭＯＧ誘導ＥＡＥの臨床症状を抑制することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株の雌マウスをｄａｙ０にＭＯＧおよびフロイント完全アジュバントの皮下注射により感作し、続けて、百日咳毒素（ＰＴ）で腹腔内（ＩＰ）の追加免疫刺激をＥＡＥ誘導時に１回および４８時間後に再度１回、行った。動物は、ＭＯＧ投与後、試験ｄａｙ８〜１０にＥＡＥ関連臨床徴候を示し始めた。治療群のＲＮＳ６０（毎日０．２ｍｌ／マウスの投与）による治療は、生理的食塩水対照群に比較して、最初の臨床症状の開始後、試験ｄａｙ９〜１２および１８〜２３の疾患の臨床スコアを有意に低減させた。
【０３９５】
図１４Ｂは、ＲＮＳ６０治療がＩＬ６とＩＬ１７の全身性レベルを低減させることを示す。ｄａｙ３５の試験終了時、全動物（ｎ＝１０／群）から血液試料を集めた。血液をヘパリン処置したバイアル中に集め、３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。遠心分離後、血漿上清を取り出し、それぞれの標識をしたエッペンドルフチューブに移し、−８０℃で貯蔵した。試料をｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｋｉｔを使ってＬｕｍｉｎｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで分析した。
【０３９６】
図１５は、マウスの養子移入再発寛解型ＥＡＥの臨床症状に対するＲＮＳ６０の用量依存的効果を示す。ＥＡＥは、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞の養子移入により雌ＳＪＬ／Ｊマウスで誘導された。ｄｐｔ（移入後日数）０から、マウスを異なる用量のＲＮＳ６０またはＮＳのｉ．ｐ．注射により治療した（ｄｐｔ１〜８、隔日；ｄｐｔ９〜１６、毎日；ｄｐｔ１７以降隔日）。５匹のマウスを各群に含めた。マウスの臨床症状を毎日５４ｄｐｔまで検査した。
【０３９７】
図１６Ａおよび１６Ｂは、ＲＮＳ６０が、マウスの養子移入再発寛解型ＥＡＥの進行を抑制することを示す（ＥＡＥは、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞の養子移入により雌ＳＪＬ／Ｊマウスで誘導された）。（Ａ）マウスは、その後、急性期（ｄｐｔ８）の開始からＲＮＳ６０またはＮＳのｉ．ｐ．注射により治療された（ｄｐｔ８〜１６、毎日；ｄｐｔ１７以降隔日）。５匹のマウスを各群に含めた。マウスの臨床症状を毎日ｄｐｔ４５まで検査した。（Ｂ）あるいは、マウスを、再発寛解型相の開始（ｄｐｔ２２）から、ＲＮＳ６０またはＮＳのｉ．ｐ．注射で治療した（隔日）。５匹のマウスを各群に含めた。マウスの臨床症状を毎日ｄｐｔ５４まで検査した。
【０３９８】
図１７は、ＲＮＳ６０が、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞の脳炎誘発性を抑制することを示す。ＭＢＰ刺激Ｔ細胞を雌ＳＪＬ／Ｊドナーマウスから単離し、４日間のＭＢＰ再刺激の間、ＲＮＳ６０またはＮＳで治療し、続けて、ＭＢＰ刺激Ｔ細胞のナイーブ雌ＳＪＬ／Ｊマウスの尾部への静脈注射を行った。５匹のマウスを各群に含めた。マウスの臨床症状を毎日ｄｐｔ５４まで検査した。
【０３９９】
特定の態様では、従って、ＲＮＳ６０は：（１）ＥＡＥの複数のモデルで臨床症状の重症度を低下させた；（２）炎症促進性のサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１７の血漿レベルを低下させた；（３）再発寛解型ＥＡＥの養子移入モデルで、誘導の８または２２日後注射した場合、有効であった；および（４）ＭＢＰ刺激Ｔ細胞の脳炎誘発性を抑制した（細胞（例えば、感作Ｔ細胞）によるエクスビボ処理を含む）。
【０４００】
実施例１８
（ＣＤ４の表面染色に加えて、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＩＬ−４、ＲＯＲγＴ、ＩＬ−１７およびＦｏｘｐ３のための、ＭＢＰ免疫マウスから単離した末梢リンパ節細胞（ＬＮＣ）の細胞内染色は、生理的食塩水（ＮＳ）とは異なり、ＲＮＳ６０が、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトの誘導に有効であり、ＩＬ−４とＩＬ−１０の発現を増加させ、Ｔｈ１７マーカーを発現する細胞の数を減少させ、Ｔｒｅｇ細胞の数を増加させたことを示した）
概要：
本明細書で上述のように、ＭＳの発症の間にミエリン鞘および軸索で起こる損傷の多くは、炎症促進性の（例えば、Ｔｈ１やＴｈ１７）サイトカインの分泌を含む炎症反応を起こす自己反応性Ｔ細胞応答を介して発生すると考えられている（Ｐｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３９：１８７−１９９（２００２）；Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：２９１−３０１（２００２））。さらに、本明細書で上記したように、炎症反応および免疫自己寛容の調節障害は、ＭＳの自己反応性免疫応答で重要な要素であると考えられており、また、調節性Ｔ（ＴＲＥＧ）細胞が、ＣＮＳ自己免疫性炎症の病原性シナリオにおける非常に重要なプレーヤーとして登場した。標的とされたＴＲＥＧ細胞の欠失は、マウスの自然発症的自己免疫疾患の原因であり、一方で、ＴＲＥＧ細胞機能の増強により、ＭＳの動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎の変異体の発生を防ぐか、または減らすことができる。
【０４０１】
方法：
この実施例では、ＭＢＰ免疫マウスから単離された末梢リンパ節細胞（ＬＮＣ）が、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の非存在または存在下、ＭＢＰで再刺激され、続けて、ＣＤ４の表面染色に加えて、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＩＬ−４、ＲＯＲγＴ、ＩＬ−１７およびＦｏｘｐ３の細胞内染色、さらに続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。上清のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７をＥＬＩＳＡでアッセイした。
【０４０２】
簡単に述べると、フロー染色バッファー中に懸濁した末梢リンパ節細胞（ＬＮＣ）を、適宜希釈したＦＩＴＣ標識ＣＤ４に対するＡｂと共に、４℃で３０分間インキュベートし、洗浄後、固定および透過処理溶液中に再懸濁した。暗所で３０分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、透過バッファー中の試験Ｆｃ  ｂｌｏｃｋ（抗マウスＣＤ１６／３２）でブロックし、その後、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲγＴ、ＩＬ−１７、またはＦｏｘｐ３に対する、適宜希釈したＰＥ標識Ａｂと共に暗所、４℃でインキュベートした。一実験（図２０）では、ＦＩＴＣ標識したＩＬ−４に対するＡｂと一緒にＰＥ標識抗ＣＤ４  Ａｂを使った。インキュベーション後、細胞懸濁液を遠心分離し、３回洗浄後、適切な容量のフロー染色バッファー中に再懸濁した。次に、細胞をＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。細胞を形態学的特性に基づいてゲーティングした。アポトーシスおよび壊死細胞は、ＦＡＣＳ分析用には用いなかった。
【０４０３】
結果：
図１８Ａと１８Ｂは、特定の代表的実施形態において、ＲＮＳ６０によるＴｈ１細胞の調節を示す。末梢リンパ節細胞（以降「ＬＮＣ」とする）をＭＢＰ免疫マウスから単離し、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下、ＭＢＰで再刺激した。図１８Ａ：刺激の７２時間後、適宜希釈したＰＥ標識抗Ｔ−ｂｅｔおよびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にＴ細胞をインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±ＳＤである。図１８Ｂ：上清のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡでアッセイした。対照に対し、ａｐ＜０．００１；ＭＢＰに対し、ｂｐ＜０．００１。
【０４０４】
図１９Ａと１９Ｂは、特定の代表的実施形態における、ＲＮＳ６０によるＴｈ２細胞の調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離したＬＮＣをＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下、ＭＢＰで再刺激した。図１９Ａ：刺激の７２時間後、適宜希釈したＰＥ標識抗ＧＡＴＡ３およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にＴ細胞をインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。図１９Ｂ：上清のＩＬ−１０をＥＬＩＳＡでアッセイした。対照に対し、ａｐ＜０．００１；ＭＢＰに対し、ｂｐ＜０．００１。
【０４０５】
図２０は、特定の代表的実施形態における、ＩＬ−４の細胞内発現に対するＲＮＳ６０の効果を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離したＬＮＣをＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下、ＭＢＰで再刺激した。刺激の７２時間後、適宜希釈したＰＥ標識抗抗ＣＤ４およびＦＩＴＣ標識抗ＩＬ−４  Ａｂと共にＴ細胞をインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【０４０６】
図２１Ａと２１Ｂは、特定の代表的実施形態における、ＲＮＳ６０によるＴｈ１７細胞の調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離したＬＮＣをＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下、ＭＢＰで再刺激した。図２１Ａ：刺激の７２時間後、適宜希釈したＰＥ標識抗ＲＯＲγＴおよびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にＴ細胞をインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。図２１Ｂ：上清のＩＬ−１７をＥＬＩＳＡでアッセイした。対照に対し、ａｐ＜０．００１；ＭＢＰに対し、ｂｐ＜０．００１。
【０４０７】
図２２は、特定の代表的実施形態における、ＩＬ−１７の細胞内発現に対するＲＮＳ６０の効果を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離したＬＮＣをＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下、ＭＢＰで再刺激した。刺激の７２時間後、適宜希釈したＰＥ標識抗ＩＬ−１７およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にＴ細胞をインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±ＳＤである。
【０４０８】
図２３は、特定の代表的実施形態における、ＲＮＳ６０によるＴｒｅｇの調節を示す。ＭＢＰ免疫マウスから単離したＬＮＣをＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下、ＭＢＰで再刺激した。刺激の７２時間後、適宜希釈したＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４  Ａｂと共にＴ細胞をインキュベートし、続けて、ＦＡＣＳ分析を行った。各象限に細胞の割合を示す。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。
【０４０９】
要約すると、この実施例では、ＣＤ４の表面染色に追加して行われた、ＭＢＰ免疫マウスから単離され、ＲＮＳ６０（１０％ｖ／ｖ）およびＮＳ（１０％ｖ／ｖ）の、それぞれ、存在または非存在下のＭＢＰで再刺激された末梢リンパ節細胞（ＬＮＣ）の、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＩＬ−４、ＲＯＲγＴ、ＩＬ−１７およびＦｏｘｐ３のための細胞内染色は、生理的食塩水（ＮＳ）の場合とは異なり、ＲＮＳ６０が、Ｔｈ１からＴｈ２へのサイトカインシフトの誘導に有効であり、ＩＬ−４とＩＬ−１０の発現を増加させ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の発現を減少させ（図１８Ａ、１８Ｂ、１９Ａ、１９Ｂ、２０および２１Ｂ）、Ｔｈ１７マーカー発現細胞の数を減少させ（図２１Ａ、２１Ｂおよび２２）、さらにＴｒｅｇ細胞（例えば、内在性ＴＲＥＧ細胞（ｎＴＲＥＧ））の数を増加させた（図２３）ことを示した。
【０４１０】
本明細書の上記で考察のように、Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞は、炎症促進性サイトカインＩＬ−１７Ａ（以降ＩＬ−１７）産生ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の異なる系列であると特定され、ケモカイン産生および好中球の炎症性組織への補充につながる。マウスでは、Ｔｈ１７細胞は、以前は抑制されていないＴｈ１応答が原因とされていた実験的自己免疫疾患の発病に関与することが示された（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：６７７−６８８、２００６）。さらに、自己免疫疾患の患者の評価は、Ｔｈ１７細胞のヒト自己免疫障害への関与を示唆した。ＲＯＲγｔは、Ｔｈ１７細胞に対する系列特異的転写因子として特定された。さらに、最近の研究では、ＦＯＸＰ３＋ＴｒｅｇおよびＴｈ１７系列の間の密接な関係について報告されており、さらに、最近、Ｖａｌｍｏｒｉ等（ＰＮＡＳ１０７：１９４０２−１９４０７、２０１０；参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞のヒト循環性ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からの分化が、実際、主にナイーブＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇから（主にＮＴｒｅｇから）起こり、ＩＬ−２および系列特異的分化／分極化因子の存在下での刺激（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、およびＴＧＦ−βの存在下の最適誘導）の後で、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞へのＮＴｒｅｇからの分極化が最適に起こることが示された。Ｔｈ１７系列特異的転写因子ＲＯＲγｔ（この発現は、ＩＬ−１７分泌には不可欠である）、およびＴｒｅｇ特異的転写因子ＦＯＸＰ３（ＲＯＲγｔ活性をアンタゴナイズする）の間のバランスが、Ｔｈ１７細胞の分極に影響することが提案された。Ｖａｌｍｏｒｉ等（同上）は、ＮＴｒｅｇから分化するＴｈ１７細胞は、ＦＯＸＰ３−またはＦＯＸＰ３ｌｏｗであり、高レベルのＲＯＲγｔを発現し、さらにＣＣＲ６＋発現細胞で高度に富化されていることを示した（同上）。
【０４１１】
特定の態様では、従って、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、このような炎症性神経変性状または疾患に関与するエフェクターＴ細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）の抑制および／または調節；および／または分極（または脱分極）によって、また、同時に、ＴＲＥＧ細胞数／機能の強化、および炎症性のサイトカインプロファイル（例えば、Ｔｈ１のＴｈ２へのサイトカインシフト）の調節によって、炎症性神経変性状または疾患の治療に対し実質的な有用性を有する。
【０４１２】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間の、インビボでの、エクスビボでの、インビトロでの、またはそれらの組み合わせでの、調節に関し、実質的な有用性を有する。
【０４１３】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞および／または機能および／または活性の量に比べて、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＮＴｒｅｇ細胞）および／またはＴｒｅｇ細胞機能および／または活性の、インビボでの、エクスビボでの、インビトロでの、量の増加に関し、実質的な有用性を有する。
【０４１４】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＮＴｒｅｇ細胞）のＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞への分極化の、インビボでの、エクスビボでの、インビトロでの、調節（例えば、減少または防止）に関し、実質的な有用性を有する。
【０４１５】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞および／または機能および／または活性の、インビボでの、エクスビボでの、インビトロでの、抑制に関し、実質的な有用性を有する。
【０４１６】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、（脱分極）ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞のＴｒｅｇ細胞への（例えば、ＮＴｒｅｇ細胞、および／またはそれらの機能および／またはそれらの活性への）、インビボでの、エクスビボでの、インビトロでの、変換に関し、実質的な有用性を有する。
【０４１７】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間のバランスを正常化するかまたは改善することにより、Ｍ．Ｓ．患者の治療に関し、実質的な有用性を有する。特定の態様では、このような治療は、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の前記患者への投与を含む。特定の態様では、このような治療は、炎症性神経変性状または疾患またはその症状の治療のための、細胞ベース療法または細胞ベース寛容原性療法の一部として、細胞（例えば、その患者または適切なドナー由来の）にエクスビボで接触させることを含み、エクスビボで接触させた細胞の治療有効量が、それを必要としている対象に導入され、対象への治療が提供される。
【０４１８】
特定の態様では、動電学的変性流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＮＴｒｅｇ細胞）およびＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の間のバランスを、インビボで、エクスビボで、インビトロで、またはそれらの組み合わせで、確立し、維持するための、実質的な有用性を有する。
【０４１９】
参照による組込み。この明細書で引用された、および／または出願データシートにリストされた全ての上記米国特許、米国特許公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２０】
本明細書の図および詳細説明は、制限的というよりは、説明的と見なされるべきであり、本発明を開示された特定の形態および例に限定する意図はないことは理解されよう。それどころか、本発明は、以下の請求項で規定される本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、当業者には明らかな、追加の修正、変更、再構成、置換、代替物、設計上の選択、および実施形態のいずれかを含む。従って、以下の請求項は、全てのこのような追加の修正、変更、再構成、置換、代替物、設計上の選択、および実施形態を包含することが意図されている。
【０４２１】
先に記載の実施形態は、異なる他の構成要素の内に含まれる、またはそれに関連する異なる構成要素を示す。このように示された構成は、単に代表的であるに過ぎず、実際に多くの他の同じ機能を実現する構成が実行できるうことは理解されよう。概念的な意味では、同じ機能性を実現するためのいずれの要素の配置も、所望の機能が実現されるように有効に「関連付け」られる。従って、本明細書で特定の機能を実現するために組み合わされたいずれの２つの要素も、構成または仲介要素に関わりなく、所望の機能が実現されるように相互に［関連付けられる］と見ることができる。同様に、そのように関連付けられたいずれの２つの要素は、また、所望の機能を実現するために、相互に「実施可能なように連結されている」、または「実施可能なように結合されている」と見なされる。
【０４２２】
本発明の特定の実施形態を示し、説明したが、当業者なら、本明細書の教示に基づいて、本発明およびその広範な態様を逸脱することなく、変更および修正が可能であり、従って、添付の請求項は、それらが本発明の本来の趣旨および範囲内にある限り、その範囲内に全てのこのような変更および修正を包含するはずである。さらに、本発明は、添付請求項によってのみ規定されることは理解されよう。当業者には、一般に、本明細書、および、特に、添付請求項（例えば、添付請求項の本文）で使われる用語は、通常、「オープン（ｏｐｅｎ）」タームとして意図されていることは理解されよう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「限定されないが、〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」、と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「限定されないが、〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」、と解釈されるべきである、等）。さらに、請求項の記載において特定の数の導入が意図される場合、このような意図は明示的に請求項中に記載され、このような記載が無い場合は、このような意図も存在しないことも当業者には理解されよう。例えば、理解の一助として、以下の添付請求項は、請求項の記載に導入するために、導入語句「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓ  ｔｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」の使用を含めることができる。しかしながら、たとえ同じ請求項が導入語句「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」および「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞を含む場合であったとしても、このような語句の使用により、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」を使った請求項の記載の導入が、このような導入請求項の記載を含むいずれかの特定の請求項を、このような記載を１つのみ含む発明に限定することを意味すると解釈されるべきではない（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、典型的な例では、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」または「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」を意味すると解釈されるべきである）；請求項の記載の導入に使用される定冠詞の使用に関しても同じことが言える。さらに、導入請求項の記載において、特定の数が明示的に記載される場合であっても、当業者なら、このような記載は、典型的な例では、少なくとも記載の数を意味すると解釈されるべきであることを理解するであろう（例えば、他の修飾語の付かない裸の記載の「２つの記載事項」は、典型的な例では、少なくとも２つの記載事項、または２つ以上の記載事項を意味する）。従って、本発明は、添付請求項による場合を除いて、限定されない。
【図１】
2014511879.tif 000012
【図２】
2014511879.tif 000013
【図３】
2014511879.tif 000014
【図４】
2014511879.tif 000015
【図５Ａ】
2014511879.tif 000016
【図５Ｂ】
2014511879.tif 000017
【図６Ａ−Ｄ（１）】
2014511879.tif 000018
【図６Ａ−Ｄ（２）】
2014511879.tif 000019
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（１）】
2014511879.tif 000020
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（２）】
2014511879.tif 000021
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（３）】
2014511879.tif 000022
【図７Ａ−Ｈ（Ａ−Ｄ）（４）】
2014511879.tif 000023
【図８】
2014511879.tif 000024
【図９】
2014511879.tif 000025
【図１０】
2014511879.tif 000026
【図１１Ａ−Ｂ】
2014511879.tif 000027
【図１２Ａ−Ｃ】
2014511879.tif 000028
【図１３Ａ−Ｃ】
2014511879.tif 000029
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2014511879.tif 000030
【図１５】
2014511879.tif 000031
【図１６Ａ−１６Ｂ】
2014511879.tif 000032
【図１７】
2014511879.tif 000033
【図１８Ａ−１８Ｂ】
2014511879.tif 000034
【図１９Ａ−１９Ｂ】
2014511879.tif 000035
【図２０】
2014511879.tif 000036
【図２１Ａ−２１Ｂ】
2014511879.tif 000037
【図２２】
2014511879.tif 000038
【図２３】
2014511879.tif 000039
【国際調査報告】
2014511879.tif 000040
2014511879.tif 000041