(57)【要約】未加工の動物乳から乳タンパク質を提供する方法が記載される。該方法は、該乳を２つの精密ろ過工程に付すことを含む。１つは、25℃〜65℃での温精密ろ過であり、及び、他方は、0℃〜25℃での冷精密ろ過である。該工程群は、いずれの順番で行なわれてもよく、第１の工程において得られた保持物が、第２の工程に付される。得られた乳血清タンパク質及びβ−カゼインは、乳児又は幼児用調合物中における使用の為に適している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳タンパク質を提供する方法であって、動物の乳を第１の精密ろ過工程に付して第１の透過物及び第１の保持物を得ること、ここで該乳は変性していない乳タンパク質を含む、そして、該第一の保持物を第二の精密ろ過工程に付して第２の透過物及び第２の保持物を形成すること、ここで前記精密ろ過工程群は25℃〜65℃での温精密ろ過及び0℃〜25℃での冷精密ろ過を含む、前記方法。
【請求項２】
該温精密ろ過が40℃〜60℃で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該冷精密ろ過が0℃〜20℃で行なわれる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該温精密ろ過が、0.01μm〜5μm、好ましくは0.1μm〜1.2μm、及び最も好ましくは0.2μm〜0.45μmの孔サイズを有するマイクロフィルターを用いて行なわれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該冷精密ろ過が、0.01μm〜5μm、好ましくは0.1μm〜1.2μm、及び最も好ましくは0.2μm〜0.45μmの孔サイズを有するマイクロフィルターを用いて行なわれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該乳が雌ウシの乳である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該第一の精密ろ過工程の該保持物が、水性組成物により、好ましくは水により、5〜15重量％、好ましくは最大で10重量％のタンパク質濃度に希釈され、そして、該希釈された保持物が該第２の精密ろ過工程において用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該乳が、最初に該温精密ろ過工程に付され、そして、その保持物が該冷精密ろ過工程に付される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該乳が、最初に該冷精密ろ過工程に付され、そして、その保持物が該温精密ろ過工程に付される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらなる温精密ろ過工程が、該冷精密ろ過工程の透過物に対して行なわれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により得られた乳タンパク質を含む組成物であって、該第２の保持物の少なくとも一部及び／又は該第２の透過物の少なくとも一部を含む、前記組成物。
【請求項１２】
該第１の保持物の少なくとも一部と該第２の保持物の少なくとも一部とが組み合わされる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
該第１の透過物の少なくとも一部と該第２の透過物の少なくとも一部とが組み合わされる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により得られた乳タンパク質を、乳児又は幼児用調合物中の成分として使用する方法。
【請求項１５】
該乳タンパク質が、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物中に入れられる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳タンパク質を提供する方法に関する。特には、本発明は、幼児用及び乳児用調合物の為の乳タンパク質の組成物を作る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの母乳が乳児及び幼児の為の好ましい食物であることはよく確立されている。しかしながら、多くの例において、ヒト乳は不十分に利用可能であり、又は、授乳は、他の理由の故に可能でなく又は望ましくない。これらの場合、ウシ乳に基づく乳幼児食物が良い代替物と一般にみなされる。ウシ乳及びヒト乳は組成において、特にはタンパク質組成において非常に異なるので、乳幼児食物の組成をできる限りヒト乳のものに近づける為にすでに非常に多くの研究がなされている。このプロセスはまた、ウシ乳のヒト化とも呼ばれる。
【０００３】
ウシ乳をヒト乳タンパク質を模倣する為に用いられうるタンパク質組成物にすることについての背景文献は米国特許第5,169,666号明細書である。これにおいて、ウシ乳が低温の限外ろ過又は精密ろ過に付され、該乳は約４℃で４時間以上予備処理されている。後者は、β−カゼインのミセル分離を行うと述べられており、その結果として、他のカゼインが減少された透過物が得られる。好ましくは、β−ラクトグロブリンが減少され、これはｐＨ調整及び塩化ナトリウム添加により行われる。
【０００４】
他の背景文献は、欧州特許出願公開第1133238号明細書である。これにおいて、ホエーに由来するタンパク質組成物が、熱処理されていない又は多くとも穏やかな熱処理を受けた乳が、高められた温度（典型的には５０℃）での精密ろ過に付されることにより製造される。
【０００５】
さらなる背景文献は国際公開第2008/127104号パンフレットである。これは、例えばベビーフードの為の材料として適した血清タンパク質産物に関し、これは、０．３〜０．５μｍの孔サイズを有する膜を用いた、ウシ乳の１０℃〜２０℃の温度での精密ろ過により得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の文献を含め、従来技術は、ウシ乳のヒト化の目的に従事する特定のタンパク質組成物を提供する方法においてよく進歩しているが、開示された方法は、絶えず増える知識に追いつくのにより適していない。乳幼児用調合物における乳に基づくタンパク質の望ましい組成の知見は絶えず改善しており、従来技術で利用可能なものよりも広い多用途性を有する種々のタンパク質組成物が製造されうる方法を提供することが望ましい。さらに、現在の知見に基づき、特にはα−ラクトアルブミン及びβ−カゼインが夫々β−ラクトグロブリン及びα−カゼインに対して高い量で存在することをもたらす方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前述の願望の１以上により良く対処する為に、本発明は、１つの局面において、乳タンパク質を提供する方法を提供し、該方法は、動物の乳であって変性されていない乳タンパク質を含む前記乳を第一の精密ろ過工程に付して第一の透過物及び第一の保持物を得ること、そして、該第一の保持物を第二の精密ろ過工程に付して第二の透過物及び保持物を形成することを含み、前記精密ろ過工程群は、２５℃〜６５℃での温精密ろ過及び０℃〜２５℃での冷精密ろ過を含む。
【０００８】
他の局面において、本発明は、前述の方法により得られた乳タンパク質を含む組成物を提供し、該組成物は、該第二の保持物の少なくとも一部及び／又は該第二の透過物の少なくとも一部を含む。
【０００９】
さらの他の局面において、本発明は、前記方法により得られた乳タンパク質を、乳児又は幼児用調合物における材料として使用する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
広い意味で、本発明は、乳血清タンパク質及びβ−カゼインの別々の回収を許す２つの別々の精密ろ過工程を、組み合わせられた方法において使用する為の賢明な選択に関する。これらの工程は、いずれの順に行われてもよい。
【００１１】
関係する該２つの工程は、「温」精密ろ過工程、すなわち２５℃〜６５℃の温度でのもの、及び、「冷」精密ろ過、すなわち０℃〜２５℃でのものである。該精密ろ過は一般に、0.01μm〜5μm、好ましくは0.05〜1.2μm、より好ましくは0.1μm〜0.5μm、さらにより好ましくは0.2μm〜0.45μmの孔サイズを有するマイクロフィルターを用いて行われる。
【００１２】
適切なマイクロフィルターは、当技術分野で知られているものであり、及び、例えば有機スパイラル巻膜（例えばKoch、Synder、 DSSのものなど）、プレート及びフレームシステム（例えばNovasepにより提供されるとおりのもの）、又はセラミック膜（例えば、とりわけTAMI、Pall、Atechからのものなど）を包含する。
【００１３】
前記精密ろ過の為に、クロスフロー精密ろ過の為の任意の慣用の装置が用いられうる。すなわち、例えば、スパイラル巻精密ろ過膜、例えば欧州特許出願公開第1673975号明細書に記載されたとおりのものが用いられてよく、又はセラミック膜が用いられうる。好ましくは、複数のスパイラル巻モジュールを有するプロセスシステムが用いられる。該クロスフロー精密ろ過プロセスにおいて、膜間差圧（transmembrane  pressure）が最大で2.5 barであるように、膜を横切った膜間差圧を減少する為の手段がとられることが有用であることが分かった。その理由の故に、好ましくは、本発明に従う方法における精密ろ過の間の膜間差圧（ＴＭＰ）は比較的低く維持され、すなわち最大で2.5 barである。該透過物のタンパク質組成に関する良い結果が、例えば2 barの最大膜間差圧で得られた。平均の膜間差圧は変わってよく、例えば、1.5又は1.3又は0.5 barである。特定の実施態様において、最大の膜間差圧は1 barであり、他の実施態様において、0.9 bar又はそれより低い。
【００１４】
膜間差圧を減少する代わりに、異なる解決策は、膜層の多孔度又は厚さにおける勾配を有する精密ろ過膜の使用でありうる。
【００１５】
本発明に従う方法において、0.05〜1.0μｍの孔サイズを有する標準的な精密ろ過膜が用いられうる。一般に知られるとおり、孔サイズは、透過物及び保持物の最終的なタンパク質組成に影響する。本発明に照らし、該孔サイズが、特に血清タンパク質対カゼイン比及び該カゼイン画分中のβカゼインの割合に対して影響を有すると分かる。一つの実施態様において、0.05〜1.0μm、好ましくは0.1〜0.5μｍの孔サイズを有する膜、例えばスパイラル巻膜が使用される。他の好ましい孔サイズは、0.01μm〜5μm、好ましくは0.1μm〜1.2μm、及び最も好ましくは0.2μm〜0.45μmである。
【００１６】
該組み合わせられた精密ろ過工程は、変性されていない乳タンパク質を含む乳から出発して行われる。これは、未加工の（未処理の）乳、又は穏やかな熱処理を受けた乳を言いうる。該乳は、全乳又は、多かれ少なかれ、脱脂された乳、未加工の乳、バクテリア除去された乳又はバクテリアろ過された乳又は穏やかな条件下で殺菌された乳若しくは低温で乾燥された粉末化乳から再構成された乳でありうる。好ましくは、熱処理されていない、脱脂された未加工乳が用いられる。もし加熱処理されるならば、これは、該関係する乳タンパク質の変性温度より低い温度で、好ましくは６５℃より低い温度で行われる。
【００１７】
本発明の方法に提供される該乳は、原理的には、任意の乳畜からのものでありうる。これはたいていの場合ウシであり、特には乳牛（成体のメスのウシ）であるが、ウシに加えて、以下の動物が、乳製品のためにヒトにより用いられる乳を提供する：ラクダ、ロバ、ヤギ、ウマ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、ヤク、及びムース。最も好ましくは、本発明において用いられる乳は乳牛の乳である。
【００１８】
一つの実施態様において、該温精密ろ過は、第一の工程として行われる。これは、好ましくは、該マイクロフィルターとしてセラミック膜を用いて行われる。乳がこの工程に付される場合、得られる第一の透過物は、乳血清タンパク質を含む。得られる第一の保持物（これは該乳血清タンパク質の少なくとも一部が除去された乳固形物を含む）が次に、該冷精密ろ過工程に付される。一般に、該保持物は、例えば透析濾過により、該冷精密ろ過の前に希釈される。一般に、温精密ろ過は、最大で35重量％、好ましくは最大で25重量％のタンパク質濃度に行われうる。冷精密ろ過からの、得られるタンパク質濃度はより低いので（一般に最大で２０重量％、好ましくは最大で１５重量％）、冷精密ろ過に付されることになる該温精密ろ過工程からの保持物は、１５重量％より低い、一般には５〜１５重量％、好ましくは１０重量より高くないタンパク質濃度に希釈される必要があるであろう。
【００１９】
該冷精密ろ過工程は、β−カゼイン、小さいミセル物質、及びカルシウムを含む透過物を結果としてもたらす。この工程の保持物は、α−カゼインを含み、これが、例えば標準的な様式でのチーズ製造又はカゼイネート製造に付されうる。
【００２０】
この実施態様の例が以下のスキーム１に説明される。これにおいて、略語「ＣＮ」は、上記で言及されたカゼイン画分を表し、「ＳＰ」は上記で言及された血清タンパク質を表し、及び「ＤＭ」は乾燥物を表す。さらに、「Ｒｅｔ」は「保持物」を表し、及び、「Ｐｅｒｍ」は透過物を表す。
【００２１】
2014514929.tif 000002
【００２２】
他の実施態様において、該冷精密ろ過が最初に行われる。その場合、該第一の透過物は、該乳血清タンパク質（特にはα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリン）の一部（約半分）及びβカゼインを含むであろう。該第一の保持物（これはα−カゼイン及び該乳血清タンパク質の残りを含むであろう）は、次に、該温精密ろ過工程に付されて、乳血清タンパク質を含む透過物及びα−カゼインを含む保持物を得る。
【００２３】
この実施態様の例が以下のスキーム２及び３において説明される。これにおいて、略語は上記と同じ意味を有し、それにより「ＣＮ」及び「ＳＰ」画分が、本実施態様との関連で議論されたとおりの組成を有することが理解される。
【００２４】
2014514929.tif 000003
【００２５】
2014514929.tif 000004
【００２６】
上記スキーム１〜３においても示されるとおり、いずれの実施態様においても、両方の精密ろ過工程からの透過物は、任意の所望の組み合わせにおいて用いられて、乳タンパク質を含む組成物を提供する。該精密ろ過条件（例えば孔サイズ、温度、膜間差圧）によって、血清タンパク質対カゼインの比及び／又はβ−カゼインの含有量は変わりうる。通常、約60:40の血清タンパク質対カゼインの比が、乳幼児用食物において想定されて、可能な限り最良にヒト乳と一致するタンパク質組成をもたらす。本発明の方法に基づき、これは、スキムミルクを該第一及び第二の精密ろ過工程の透過物に、例えば５〜１５体積％、好ましくは約１０体積％添加することにより達成されうる。代替的に、乳タンパク質の種類間での所望の比を提供する為に、血清タンパク質及び／又はカゼインの他の源が用いられうる。
【００２７】
精密ろ過工程を実施した後に、該精密ろ過透過物はさらに、１又はそれより多くの慣用の方法、例えば限外ろ過、ナノろ過、イオン交換、電気透析、逆浸透、脱塩、蒸発、及びスプレードライなど、により処理されうる。例えば、Ｎａ及びＫが除去される。さらなるセラミック精密ろ過もまた実施されてよく、これは、バクテリアをろ過除去することにより穏やかな保存（mild  preservation）の目的にかなう。
【００２８】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、β−ラクトグロブリンを犠牲にして、α−ラクトアルブミンの比を最適化するように、１又はそれより多くの追加の工程を提供する。実際に、本発明の組み合わせ精密ろ過方法の利点の一つが、そのような追加の最適化が実施されることができることである。すなわち、該温精密ろ過が最初の工程であるところの実施態様の利益は、比較的高い量、典型的には0.3重量％〜0.5重量％、の利用可能な血清乳タンパク質を含む透過物が得られること、及び、この量がα−ラクトアルブミンのβ−ラクトグロブリンからの分離を許す技術、例えばβ−ラクトグロブリンの沈殿又は微粒子化など、又は50〜70 kDaのカットオフを有する逐次的限外ろ過に付されることができることである。これらの技術は当業者に知られており、該温精密ろ過の透過物に対して、該工程が第一の精密ろ過工程であるか第二の精密ろ過工程であるかに関係なく、行われることができる。
【００２９】
該冷精密ろ過が最初に行われそして該温精密ろ過工程が該冷精密ろ過の保持物に対して行われるところの一つの実施態様において、さらに好ましい実施態様は、該冷精密ろ過工程の透過物に対して温精密ろ過工程も行うことである。理論にとらわれることを望まないで、主なタンパク質の分子量は、この第三の精密ろ過工程が、β−ラクトグロブリンを犠牲にしてα−ラクトアルブミンのさらに改善された比を結果することができることを示す。例えば、冷精密ろ過からの透過物の該温精密ろ過が、該保持物中に主に存在するβ−ラクトグロブリンと一緒に、透過物としてα−ラクトアルブミン及びβ−カゼインを得ることの可能性を提供し、保持物中にβ−ラクトグロブリンが主に存在する。
【００３０】
他の局面において、本発明は、上記言及された実施態様のいずれかに従う方法により得られる乳タンパク質を含む組成物を提供し、該組成物は、該第二の保持物の少なくとも一部及び／又は該第二の透過物の少なくとも一部を含む。好ましくは、該全体の組成物は、本発明の方法により得られたとおりの乳タンパク質を含む。好ましい実施態様において、該第一の保持物の少なくとも一部及び該第二の保持物の少なくとも一部が、該組成物において組み合わされる。他の好ましい実施態様において、該第一の透過物の少なくとも一部及び該第二の透過物の少なくとも一部が該組成物において組み合わされる。
【００３１】
さらに他の局面において、本発明は、上記言及された実施態様のいずれかに従う方法により得られる乳タンパク質を、乳児又は幼児用調合物における成分として使用する方法を提供する。
【００３２】
乳児（赤ちゃん）用調合物（formula）は一般に、ヒトの母乳に加えて又はヒトの母乳の代わりに、最大で１２月齢の乳児による使用の為のものである（スターター＋以後のもの）。幼児フォーミュラは一般に、１２〜４８か月の子供の為の成長させるミルク（GUM）を言う。明らかに、本発明に従い、子供の為の及び高齢者の為の経腸食品、医学的栄養物などの、他の目的のためにも、得られた乳タンパク質及び乳タンパク質組成物を使用することは除外されない。
【００３３】
本発明に従い提供される任意の栄養組成物、例えば乳児の又は幼児用調合物が、任意の追加の慣用の成分を含みうることが理解されるであろう。例えば、赤ちゃん及び乳児の食品並びに治療的組成物に、炭水化物、例えばラクトース及びオリゴ糖、脂質及び、成分、例えばビタミン、アミノ酸、ミネラル、タウリン、カルニチン、ヌクレオチド、及びポリアミンなど、及び抗酸化剤、例えばＢＨＴ、アスコルビルパルミテート、ビタミンＥ、α−及びβ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、リコペン及びレシチンなど、を添加することは慣用的である。該脂質はたいてい、植物由来のものである。さらに、該食品又は該治療的組成物は、ポリ不飽和脂肪酸、例えばγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸及びドコサペンタエン酸など、を富化されうる。腸内フローラの適切な発達を目的として、プロバイオティクス、例えばラクトバチルス及び／又はビフィドバクテリア、並びにプレバイオティクスが、添加されうる。プロバイオティクスの好ましい組み合わせは、例えば、Bifidobacterium  lactisとL. casei、L. paracasei、L. salivarius又はL. reuterである。プレバイオティクスの例は、フコ−、フルクト−、及び／又はガラクト−オリゴ糖、短鎖−及び長鎖−の両方、（フコ）シアリルオリゴ糖、分枝（オリゴ）糖、シアル酸に富む乳産物又はその誘導体、イヌリン、カロブビーン粉、ガム、これは加水分解されていてよく又はされていなくてもよい、繊維、タンパク質加水分解物、ヌクレオチドであり、この全ては網羅的でないと理解される。
【００３４】
本発明は、以下の非限定的な例において今説明される。
【００３５】
実施例
６２℃での熱処理（thermization）後、スキムミルクが第一の精密ろ過工程に付された。0.14μｍのTami  isoflux膜での第一のバッチろ過が、穏やかな圧力条件下、典型的には約0.6 bar、で１０℃未満で行われた。該ミルクが、３倍に濃縮された（体積減少係数＝３）。この透過物が、透過物Ｉと呼ばれる。
【００３６】
この精密ろ過後、保持物が３倍に水で希釈され（１部の保持物及び２部の水）、そして、第二の精密ろ過工程に付された。この保持物が、0.14μmのTami  isofluxセラミック膜で、50℃で、やはり穏やかな圧力条件下で（ＴＭＰ約0.6 bar)、濃縮係数４へと、バッチろ過された。この工程の透過物が、透過物ＩＩと呼ばれ、そして、該保持物が保持物ＩＩとそれぞれ呼ばれる。
【００３７】
透過物Ｉ、透過物ＩＩ及び保持物ＩＩについて、タンパク質組成が測定される。
【００３８】
方法１−カゼイン
試料が水中に溶解され又は混合され、そして、カゼイン及び変性したタンパク質がｐＨ4.6で沈殿される。タンパク質の沈殿物が、溶液からろ過除去され、そして方法２を用いて別々に決定される。
【００３９】
方法２−Kjeldahlによる全タンパク質
試験タンパク質が、濃硫酸及び硫酸カリウムの混合物によりblock-digestion装置を用いることによって消化され、硫酸銅(II)を触媒として用いてそれにより存在する有機窒素を硫酸アンモニウムに転化する。該硫酸カリウムの機能は、硫酸の沸点を高めること、及び、より強力な酸化環境を提供することである。過剰水酸化ナトリウムが、冷却された消化物に添加されて、アンモニアを遊離させる。遊離アンモニアが、半自動蒸気蒸留ユニットを用いて、過剰ホウ酸溶液中に蒸気蒸留され、次に、塩酸により滴定される。窒素含有量は、産生されたアンモニアの量から計算される。
【００４０】
方法３−非タンパク質−窒素（ＮＰＮ）含有量
タンパク質が、試験試料から、混合物中のトリクロロ酢酸の終濃度が約１２％になるようにトリクロロ酢酸溶液を添加することにより、沈殿される。沈殿した乳タンパク質が、ろ過により除去され、そして、残ったろ液が、非タンパク質窒素成分を含む。ろ液の窒素含有量が、方法２に記載された手順により決定される。
血清タンパク質濃度が、全タンパク質−カゼイン−ＮＰＮとして計算される。
【００４１】
方法４−ＣＺＥにより測定される血清タンパク質
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）による乳タンパク質の決定が、ｐＨ８．６で、6 M尿素及びメチルヒドロキシエチルセルロースを含む水性溶液中に得られ、タンパク質の完全な分離を結果する。検出は、ＵＶ214 nmで実施される。種々の成分が、保持時間に基づき同定され、そして、ピーク面積を用いて外部標準により決定される。
【００４２】
方法５−ウシＩｇＧ、ELISA
分析物特異的抗体（捕捉抗体）が、ユーザーにより提供されたポリスチレンマイクロプレートに結合される。結合していない捕捉抗体は洗い落とされる。プレートがブロックされそして洗浄される。試料又は標準が添加され、そして、存在する任意の分析物が、その固定化抗体により結合される。結合していないものは洗い落とされる。ＨＲＰ結合ウシＩｇＧ検出抗体が、最終工程として用いられる。結合していない検出Ａｂが洗い落とされる。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液がウェルに添加され、そして、青い色が、試料中に存在する分析物の量に比例して発色する。色の発色が止められ、ウェル中の色が黄色に変わる。４５０ｎｍでの色の吸収が測定される。
【００４３】
方法６−ウシＩｇＡ、ELISA
分析物特異的抗体（捕捉抗体）が、ユーザーにより提供されたポリスチレンマイクロプレートに結合される。結合していない抗体が洗い落とされる。プレートがブロックされそして洗浄される。試料及び標準が添加され、そして存在する任意の分析物が、固定化抗体により結合される。結合していないものは洗い落とされる。ＨＲＰ結合ウシＩｇＡ検出抗体が最終工程として用いられる。結合していない検出Ａｂは洗い落とされる。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液が該ウェルに添加され、そして、青い色が、試料中に存在する分析物の量に比例して発色する。色の発色が止められ、ウェル中の色が黄色に変わる。４５０ｎｍでの色の吸収が測定される。
【００４４】
方法７−ウシＴＧＦ−β１、乳、ＥＬＩＳＡ
分析物特異的抗体（捕捉抗体）が、ユーザーにより提供されたポリスチレンマイクロプレートに結合される。結合していない捕捉抗体が洗い落とされる。プレートがブロックされそして洗浄される。試料及び標準が添加され、そして、存在する任意の分析物が、固定化抗体により結合される。結合していないものは洗い落とされる。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が、該検出抗体に結合する為に用いられる。結合していないストレプトアビジン−ＨＲＰが洗い落とされる。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液がウェルに添加され、そして、青い色が、試料中に存在する分析物の量に比例して発色する。色の発色が止められ、ウェル中の色が黄色に変わる。４５０ｎｍでの色の吸収が測定される。
【００４５】
方法８−ウシＴＧＦ−β２、乳、ＥＬＩＳＡ
分析物特異的抗体（捕捉抗体）が、ユーザーにより提供されたポリスチレンマイクロプレートに結合される。結合していない捕捉抗体が洗い落とされる。プレートがブロックされそして洗浄される。試料及び標準が添加され、そして、存在する任意の分析物が固定化抗体により結合される。結合していないものが洗い落とされる。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が、該検出抗体に結合する為に用いられる。結合していないストレプトアビジン−ＨＲＰが洗い落とされる。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液がウェルに添加され、そして青い色が、試料中に存在する分析物の量に比例して発色する。色の発色が止められ、ウェル中の色が黄色に変わる。４５０ｎｍでの色の吸収が測定される。
【００４６】
方法９−ウシラクトフェリン、ＥＬＩＳＡ
分析物特異的抗体（捕捉抗体）が、ユーザにより提供されたポリスチレンマイクロプレートに結合される。結合していない捕捉抗体が洗い落とされる。プレートがブロックされそして洗浄される。試料又は標準が添加され、そして、存在する任意の分析物が固定化抗体により結合される。結合していないものが洗い落とされる。ＨＲＰ結合ウシラクトフェリン検出抗体が最終工程として用いられる。結合していない検出Ａｂが洗い落とされる。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液がウェルに添加され、そして、青い色が、試料中に存在する分析物の量に比例して発色する。色の発色が止められ、ウェル中の色が黄色に変わる。４５０ｎｍでの色の吸収が測定される。
【００４７】
2014514929.tif 000005
【００４８】
上記表は、低温及び高温での精密ろ過工程の組み合わせの利点を示す。低温で得られた透過物の特定のタンパク質組成の利点が、高温での透過物の特定のタンパク質組成及び高温でのろ過システムのより高い処理能力と組合されうる。
【００４９】
該結果は、例えば、２つの精密ろ過工程を組み合わせることにより、最終保持物が、種々の血清タンパク質が高度に枯渇されることを示す。これは、最終産物についての血清タンパク質画分の選択についての大きな自由を与える。同時に、最終保持物の血清タンパク質画分が例えばラクトフェリンに富む。
【００５０】
例えば該２つの精密ろ過工程の透過物を組み合わせることにより、（より高い温度での１つの精密ろ過工程において得られた血清タンパク質産物と比較したときに）改善されたa-la、カゼイン、TGFβ1及びTGFβ2含有量を有する又は（より低い温度での１つの精密ろ過工程において得られた血清タンパク質産物と比較したときに）改善されたＩｇＡ又はカゼイン含有量を有する血清タンパク質産物が得られる。
【００５１】
各タンパク質の栄養的な利点は明らかである。イムノグロブリンが、病原性バクテリア及びウィルスに結合しうる。そうすることにより、それらは、腸上皮への付着を防ぎうるが、それらはまたＩｇ受容体を通じてマクロファージ及び樹状細胞によるこれら病原体の取り込みも促進する。これは、病原体クリアランスを促進するが、これはまた、免疫システムへの病原体の抗原提示の為及び免疫応答の誘発の為にも必要とされる。有効な免疫応答が、二次感染における病原体のクリアランスの為に必要とされる。
【００５２】
ＴＧＦ−βは抗炎症性サイトカインであり、これは複数の機能を有する。それは、腸上皮細胞の分化において重要であり、すなあわちバリア機能において役割を果たす。また、それは、制御性Ｔ細胞の誘発を促進する重要なサイトカインであり、及び、腸におけるＩｇＡの産生の誘発においても重要なサイトカインである。結果として、ＴＧＦ−βの影響下での免疫応答は、過剰でなく、及び組織損傷を誘発せず、及び強力な免疫応答を実際に下方制御できる。加えて、腸内腔へのＩｇＡの産生及び分泌が、非炎症様式において病原体クリアランスに寄与する。
【００５３】
ラクトフェリンは、抗炎症特性も有しうるタンパク質であるが、それは、主に、鉄を封鎖することについて知られている。鉄は、病原体バクテリアにより用いられ、及び、それらが使用できる鉄を制限することが、関連しうる。
【００５４】
ＴＧＦ−βは主にアレルギーにおいて利益を有しうる。母乳中のＴＧＦ−βレベルは、アレルギーに対する防御に関連する。イムノグロブリン（初乳）は、下痢を、例えば再発性下痢を有するＡＩＤＳ患者において、防ぎうるが、また、免疫されたウシの初乳が用いられた場合、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＲｏｔａｖｉｒｕｓ感染に対して防ぎうる。最終的に、ラクトフェリンは、低い出生体重の子供におけるバクテリア感染を防ぎうる。
【国際調査報告】
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