(57)【要約】  本発明は、特に悪性腫瘍もしくは自己免疫に関する疾患もしくは医学的状態の治療もしくは予防または移植拒絶の予防のための、ヒトＣＤ８３プロモーターのプロモーター／エンハンサー領域を含み樹状細胞特異的である変異体ＣＤ８３プロモーター、およびその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＣＤ８３上流プロモーター（ＵｐＰ）配列、配列番号４のＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ）配列および配列番号５のＣＤ８３エンハンサー配列、あるいは、
全長にわたり９０％の相同性を有し、および／または、Ｎ末端および／またはＣ末端で最大３０ヌクレオチドまでトランケートされており、かつプロモーター活性を有する、前記配列のバリアント、
を含むＣＤ８３プロモーターであって、
前記ＵｐＰ配列が前記ＭＰ配列の上流に位置し、前記エンハンサー配列が前記ＵｐＰ配列の２００から４０００ヌクレオチド上流または前記ＭＰ配列の２００から４０００ヌクレオチド下流に位置する、
前記ＣＤ８３プロモーター。
【請求項２】
（ｉ）前記ＵｐＰ配列と前記ＭＰ配列との間の距離が５０から２００ヌクレオチド、好ましくは７０から１２０ヌクレオチドであり、および／または
（ｉｉ）前記ＵｐＰ配列／ＭＰ配列と前記エンハンサーとの間の距離が２００から４０００ヌクレオチド、好ましくは２５０から７５０ヌクレオチドである、
請求項１に記載のＣＤ８３プロモーター。
【請求項３】
（ｉ）前記ＵｐＰ配列が配列番号２を有し、
（ｉｉ）前記ＭＰ配列が配列番号４を有し、および／または
（ｉｉｉ）前記ＣＤ８３エンハンサー配列が配列番号５を有する、
請求項１または２に記載のＣＤ８３プロモーター。
【請求項４】
（ｉ）前記ＵｐＰ配列が、前記ＭＰ配列に、配列番号３の介在配列、もしくはその全長にわたり配列番号３と９５％の相同性を有し、プロモーター活性を有する、そのバリアントによって連結されており、および／または
（ｉｉ）前記ＣＤ８３エンハンサー配列が、前記ＵｐＰ配列に対して４５０から５５０ヌクレオチド上流もしくは前記ＭＰ配列の４５０から５５０ヌクレオチド下流に、好ましくは、前記ＵｐＰ配列に対して４５０から５５０ヌクレオチド上流に位置する、
請求項３に記載のＣＤ８３プロモーター。
【請求項５】
（ｉ）配列番号２８のヌクレオチド２９〜１２５９の配列もしくは配列番号２９のヌクレオチド２７〜１２５７の配列を含み、および／または
（ｉｉ）ヒト樹状細胞特異的である、
請求項１に記載のＣＤ８３プロモーター。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＤ８３プロモーターを含むベクターまたはウイルスベクター。
【請求項７】
（ｉ）前記ＣＤ８３プロモーターが、標的遺伝子に機能的に連結されており、好ましくは、前記標的遺伝子が、腫瘍抗原、免疫調節性分子、例えば、免疫賦活性サイトカイン、免疫受容体、および免疫シグナル伝達分子など、ウイルス性抗原および／または細菌性抗原から選択され、および／または
（ｉｉ）前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、
請求項６に記載のベクターまたはウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＤ８３プロモーター、あるいは請求項６または７に記載のベクターもしくはウイルスベクターを含む、細胞、組織培養物または非ヒトトランスジェニック生物。
【請求項９】
樹状細胞、好ましくは成熟樹状細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
（ａ）抗腫瘍性免疫応答の誘導、（ｂ）自己免疫疾患の状況における望ましくない免疫応答の減衰化、（ｃ）細胞および／または臓器の移植の状況における望ましくない免疫応答の減衰化、（ｄ）患者におけるウイルス性抗原および／または細菌性抗原に対する免疫応答のｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導において使用される、請求項６または７に記載のベクターもしくはウイルスベクター。
【請求項１１】
抗腫瘍性免疫応答の誘導、自己免疫疾患の状況における望ましくない免疫応答の減衰化、細胞および／または臓器の移植の状況における望ましくない免疫応答の減衰化、あるいは、ウイルス性抗原および／または細菌性抗原に対する免疫応答の誘導において使用される、請求項１０に記載のベクターまたはウイルスベクターであって、
（ｉ）所望の遺伝子が成熟樹状細胞のみにおいて発現され、および／または
（ｉｉ）抗腫瘍性免疫応答を誘導するために、前記ベクターもしくはウイルスベクターが腫瘍抗原をコードし、および／または
（ｉｉｉ）自己免疫疾患の状況における望ましくない免疫応答を減衰させるために、前記ベクターもしくはウイルスベクターが、腫瘍抗原、またはその代わりにもしくはそれに加えて、例えば、免疫賦活性サイトカイン、免疫受容体、および免疫シグナル伝達分子などの、免疫調節性分子をコードし、および／または
（ｉｖ）前記ベクターもしくはウイルスベクターがワクチン接種において使用される
ベクターまたはウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項６または７に記載のベクターもしくはウイルスベクターを含む医薬組成物またはワクチン。
【請求項１３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで樹状細胞を生産する方法であって、請求項６または７に記載のベクターもしくはウイルスベクターをＤＣ前駆細胞内に導入することを含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項６または７に記載のベクターもしくはウイルスベクターを含むトランスフェクション試薬。
【請求項１５】
患者において抗腫瘍性免疫応答を誘導する方法、患者において自己免疫疾患の状況における望ましくない免疫応答を減衰させる方法、患者において細胞および／または臓器の移植の状況における望ましくない免疫応答を減衰させる方法、患者においてウイルス性抗原および／または細菌性抗原に対する免疫応答を誘導する方法、あるいは患者にワクチン接種をする方法であって、好適な量の請求項６または７に記載のベクターもしくはウイルスベクターを患者に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に悪性腫瘍もしくは自己免疫に関する疾患もしくは医学的状態の治療もしくは予防または移植拒絶の予防のための、ヒトＣＤ８３のプロモーター／エンハンサー領域を含み樹状細胞特異的である変異体ＣＤ８３プロモーター、およびその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのＣＤ８３遺伝子は、染色体６ｐ２３上に位置し、１９．２８４ｋｂの全長にわたる、５つのエキソンおよび４つのイントロンからなる（Berchtold, S.ら、Ann. Hum. Genet.63:181-183 (1999)）。同様に、ネズミのＣＤ８３遺伝子は、約１９ｋｂの全長にわたり、５つのエキソンおよび４つのイントロンからなるが、１３番染色体のバンドＡ５上に位置する。ＣＤ８３は、すべてではないとしても、ほとんどの脊椎動物の種において発現される。これは、ヒト、チンパンジー、ウマ、ブタ、ウシ、パンダ、イヌ、ラット、マウス、カエル、板鰓類および真骨魚類によって発現されることが報告されており、最も高いアミノ酸（ａａ）配列相同性をチンパンジー（pan troglodytes、９９％）、ウマ、（equus caballus、７６％）、ウシ（bos taurus、７４％）、ブタ（sus scrofa、７２％）およびマウス（mus musculus、６５％）と、より低い程度で魚（oncorhynchus mykissおよびginglymostoma cirratum、それぞれ２８％および３２％）と共有している（Lechmann, M.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 329:132-139(2005)；Ohta, Y.ら J. Immunol. 173:4553-4560(2004)）。
【０００３】
ヒトの最小ＣＤ８３プロモーター配列は、Berchtold, S.ら Immunobiology 205:231-246(2002)内に開示された。転写開始コドンの上流の３０３７ｂｐの長さの断片がクローニングされており、これを使用してコアプロモーター配列が２６１ｂｐにしぼられた。バイオインフォマティクスの解析により、４つの特異性タンパク質１（ＳＰ−１）結合エレメントおよび１つのＮＦκＢ結合エレメントが同定され、これらを電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって確認することができた。これらの発見は、他のグループからのものと一致している：ＭｃＫｉｎｓｅｙおよび同僚達は、ＮＦκＢが活性化Ｔリンパ球において誘導可能なＣＤ８３遺伝子発現を調節することを記載し（McKinsey, T.A.ら、Mol. Immunol. 37:783-788(2000)）、Ｄｕｄｚｉａｋおよび共同研究者達は、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスの潜伏感染膜タンパク質１（ＬＭＰ１）がＮＦκＢシグナル伝達経路を介してＢ細胞におけるＣＤ８３発現を誘導することを公表した（Dudziak, D.ら、J. Virol. 77:8290-8298(2003)）。興味深いことに、Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄおよび共同研究者達は、ＤＣとは別のいくつかの細胞型において２６１ｂｐのＣＤ８３最小プロモーターの同様の活性を見出した。この最小プロモーターは、成熟ヒトｍｏＤＣにおいて活性を示したが、ヒト単球細胞系Ｕ９３７においてならびにヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞において（いずれもＣＤ８３を発現している）ならびにネズミＤＣ様細胞系ＤＣ２．４においても活性を示した。
【０００４】
ネズミのＣＤ８３の正確なプロモーター配列はまだ同定されていないが、ヒトのＣＤ８３プロモーター領域と一致して、ネズミのＣＤ８３遺伝子の５’領域は明確なＴＡＴＡボックス配列を欠いている。しかし、マウスとヒトとの間での特異的な転写因子結合配列の保存は、最小プロモーター領域内にまだ見出されていない（Twist, C.J.ら、Immunogenetics 48:383-393 (1998)）。
【０００５】
要約すると、ヒトの２６１ｂｐのＣＤ８３最小プロモーターは、ＤＣについて細胞型特異的な活性も成熟特異的な活性も示さなかった。これにより、まだ同定されていない、さらなる調節エレメントが、細胞型および時期に特異的なヒトＣＤ８３遺伝子発現の調節に関与しているに違いないという結論が導かれる（Ilka Knippertz, I., Thesis Universitat Erlangen-Nueremberg, 91-98. 1-7-2008）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒト樹状細胞特異的なＣＤ８３プロモーターの完全な特徴付けならびに細胞型および成熟状態に特異的なＣＤ８３調節の根底にある分子機構が、今確立された。ＣＤ８３発現の細胞型特異性に寄与している調節エレメントを同定するために、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）におけるヒストン３のアセチル化リシン９（Ｈ３Ｋ９）に対するＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ（商標）マイクロアレイを行った。ＣｈＩＰアッセイにより、ｍＤＣにおいて特異的にＨ３Ｋ９アセチル化されたＣＤ８３イントロン２内の領域が明らかにされたのに対して、ｉＤＣおよびＨＦＦ細胞は、この型のアセチル化を示さなかった。欠失変異導入法およびルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ＭＰ−２６１をＤＣ様細胞系ＸＳ５２およびｍＤＣにおいて特異的に誘導した１８５ｂｐの長さのエンハンサー（１８５ｂｐエンハンサー）がこのアセチル化領域内で明らかにされたのに対して、この誘導は、対照細胞系においてだけでなくｉＤＣにおいても存在しなかった。
【０００７】
１８５ｂｐエンハンサーと組み合わせたＭＰ−２６１のバイオコンピュータ解析により、ＭＰ−２６１内の３つのＮＦκＢ部位および５つのＳＰ１部位ならびに１８５ｂｐエンハンサー内の２つのＩＲＦ部位および１つのＳＰ１部位が予測された。さらに、第３の調節エレメントである、ＣＤ８３上流プロモーター（ＵｐＰ）、が提唱された。２つのさらなるＮＦκＢ部位、１つのＩＲＦ部位および１つのＳＰ１部位がＵｐＰ内にあることが予測された。さらに、このバイオコンピュータのモデルにより、よく知られているＮＦκＢ−ＩＲＦ−ＮＦκＢ転写モジュールの３つのコピーをトランスで形成するための、これらの３つの調節エレメントの相互作用が予言された。トランスでのこうしたモジュールの形成は、これまでのところ記載されていない完全に新しい分子機構を表している。
【０００８】
このモデルを証明するために、一連の実験を行った。第一に、染色体様配置において、ルシフェラーゼレポーターベクターのアデノウイルス形質導入により、成熟樹状細胞で特異的に転写を誘導するためには、３つすべての調節エレメント、すなわち、ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーが同一のベクター内に存在していなければならないことが証明された。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写活性を誘導するために３つすべての調節エレメントが協力していることが明らかに証明された。
【０００９】
第二に、予測されたＩＲＦ部位およびＮＦκＢ部位の機能を、それぞれ機能喪失実験および機能獲得実験によって個別に検証している：一方では、ＵｐＰおよびエンハンサー内のＩＲＦ部位の変異により、３つすべての部位が、ＸＳ５２細胞およびｍＤＣにおいて三者構成の複合体における転写の誘導に必要であることが明らかにされた。他方では、ＩＲＦ−５と組み合わせたｐ５０、ｐ６５およびｃＲｅｌのコトランスフェクションにより、ＵｐＰおよびＭＰ−２６１を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドを２９３Ｔ細胞において誘導することによってＮＦκＢ部位の機能性が確認された。
【００１０】
これらを合わせると、細胞型および成熟状態に特異的なＣＤ８３の発現は、ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーからなる三者構成の複合体によって調節されることがわかってきた。この複合体は、ｍＤＣにおいて特異的に形成され、ＩＲＦ転写因子とＮＦκＢ転写因子との相互作用を通して主に媒介される。
【００１１】
したがって、本発明は、ヒトＣＤ８３のプロモーター／エンハンサー領域を含みヒト樹状細胞特異的であるＣＤ８３プロモーターのための基礎を提供する。このプロモーターは、悪性腫瘍もしくは自己免疫に関する疾患もしくは医学的状態の治療もしくは予防または移植拒絶の予防に特に好適である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特に、本発明は以下：
（１）配列番号２のＣＤ８３上流プロモーター（ＵｐＰ）配列、配列番号４のＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ）配列および配列番号５のＣＤ８３エンハンサー配列、あるいは、
全長にわたり９０％の相同性を有し、および／または、Ｎ末端および／またはＣ末端で最大３０ヌクレオチドまでトランケートされており、かつプロモーター活性を有する、前記配列のバリアント、
を含むＣＤ８３プロモーター（以下、これを野生型ＣＤ８３プロモーターと区別するために「変異体ＣＤ８３プロモーター」とも呼ぶ）であって、
前記ＵｐＰ配列が前記ＭＰ配列の上流に位置し、前記エンハンサー配列が前記ＵｐＰ配列の２００から４０００ヌクレオチド上流または前記ＭＰ配列の２００から４０００ヌクレオチド下流に位置する、
前記ＣＤ８３プロモーター；
（２）上記の（１）の変異体ＣＤ８３プロモーターを含むベクターまたはウイルスベクター；
（３）上記の（１）の変異体ＣＤ８３プロモーターを含む、または上記の（２）のベクターもしくはウイルスベクターを含む、細胞、組織培養物または非ヒトトランスジェニック生物；
（４）（ａ）抗腫瘍性免疫応答の誘導、（ｂ）自己免疫疾患の状況における望ましくない免疫応答の減衰化、（ｃ）細胞および／または臓器の移植の状況における望ましくない免疫応答の減衰化、（ｄ）患者におけるウイルス性抗原および／または細菌性抗原に対する免疫応答のｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導において使用される上記の（２）のベクターまたはウイルスベクター；
（５）上記の（２）のベクターまたはウイルスベクターを含む医薬組成物またはワクチン；
（６）ｅｘ  ｖｉｖｏで樹状細胞を生産する方法であって、上記の（２）のベクターまたはウイルスベクターをＤＣ前駆細胞内に導入することを含む、前記方法；
（７）上記の（２）のベクターまたはウイルスベクターを含むトランスフェクション試薬；ならびに
（８）患者において抗腫瘍性免疫応答を誘導する方法、患者において自己免疫疾患の状況における望ましくない免疫応答を減衰させる方法、患者において細胞および／または臓器の移植の状況における望ましくない免疫応答を減衰させる方法、患者においてウイルス性抗原および／または細菌性抗原に対する免疫応答を誘導する方法、あるいは患者にワクチン接種をする方法であって、好適な量の上記の（２）のベクターまたはウイルスベクターを患者に投与することを含む、前記方法
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＣＤ８３が、ＤＣ成熟期間中に上方制御され、ＨＦＦ細胞によって発現されないことを示した図である。
【図２】ＣＤ８３遺伝子座の概略描写およびＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ（商標）マイクロアレイ解析から結果として得られるそれぞれのアセチル化データを示した図である。
【図３】遺伝子レポーターアッセイのためのコンストラクトの概略描写を示した図である。
【図４】ＣＤ８３イントロン２の高アセチル化領域のサブクローニング戦略の概略描写を示した図である。
【図５】断片ＣがＸＳ５２細胞において特異的にＭＰ−２６１活性を促進することを示した図である。
【図６】断片Ｃの欠失変異体Ｃ１〜Ｃ１４の概略描写を示した図である。
【図７】断片Ｃの長さ１８５ｂｐの欠失変異体Ｃ１３がＸＳ５２細胞において特異的にＭＰ−２６１活性を促進することを示した図である。
【図８】断片Ｃおよび１８５ｂｐエンハンサーがｍＤＣにおいて特異的にＭＰ−２６１活性を誘導することを示した図である。
【図９】断片Ａ、Ｂ、Ｃも１８５ｂｐエンハンサーもＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞においてＭＰ−２６１を誘導しないことを示した図である。
【図１０】ＣＤ８３上流プロモーター、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの相互作用についての推定されたバイオコンピュータのモデルを示した図である。
【図１１】ＵｐＰおよびスペーサー配列Ｓ１を含有するレポーターコンストラクトの概略描写を示した図である。
【図１２】スペーサー配列Ｓ１がＸＳ５２細胞におけるＭＰ−２６１およびＰ−５１０の誘導に有意には影響しないことを示した図である。
【図１３】図１３Ａは、スペーサー配列Ｓ１がｍＤＣにおけるＭＰ−２６１の誘導に有意には影響しないことを示した図である。図１３Ｂは、スペーサー配列Ｓ１がｍＤＣにおけるＰ−５１０の誘導に有意には影響しないことを示した図である。
【図１４】ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの三者複合体がｍＤＣにおいて特異的な転写誘導を示すことを示した図である。
【図１５】ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの三者複合体がＲａｊｉ、ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭ細胞において特異的な転写誘導を示さないことを示した図である。
【図１６】ルシフェラーゼアッセイに使用する変異されたＩＲＦ部位を含有するレポーターコンストラクトの概略描写を示した図である。
【図１７】三者複合体における３つのＩＲＦ部位のうちのいずれの変異もＸＳ５２細胞におけるルシフェラーゼ発現を有意に低下させることを示した図である。
【図１８】三者複合体における３つのＩＲＦ部位のうちのいずれの変異も、ｍＤＣにおけるルシフェラーゼ発現を有意に低下させることを示した図である。
【図１９】ＮＦκＢファミリーの転写因子およびＩＲＦ−５が２９３Ｔ細胞においてＭＰ−２６１を誘導することを示した図である。
【図２０】図２０Ａは、ｐ６５およびＩＲＦ−５が２９３Ｔ細胞においてＵｐＰを誘導することを示した図である。図２０Ｂは、ＩＲＦ部位３が変異されたときに、ｐ６５およびＩＲＦ−５によるＵｐＰの誘導が抑止されることを示した図である。
【図２１】機能的なヒト樹状細胞特異的ＣＤ８３プロモーター／エンハンサー領域のＣＤ８３上流プロモーター、介在配列、ＣＤ８３最小プロモーターおよび１８５ｂｐエンハンサーのゲノム配列（ＮＣＢＩゲノムビルド３７．２、コンティグＧＲＣｈ３７．ｐ２）を示した図である。１６６ｂｐの長さのＣＤ８３上流プロモーター（ＵｐＰ）と２６１ｂｐの長さのＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ−２６１）とは、８３ｂｐの長さの介在配列によって分離されている。共に、これらの配列は、ＣＤ８３プロモーターＰ−５１０を構成している。Ｐ−５１０は、ＣＤ８３イントロン２内の、ＣＤ８３転写開始点の４１７７ｂｐ下流に位置する、１８５ｂｐの長さのエンハンサーエレメント（１８５ｂｐエンハンサー）と協力する。ＮＣＢＩヒトゲノムのビルド３７．２、コンティグＧＲＣｈ３７．ｐ２（参照番号ＮＴ ００７５９２．１５；配列番号１）を参照すれば、ＵｐＰはｂｐ１４０５７５３３からｂｐ１４０５７６９８、介在配列はｂｐ１４０５７６９９から１４０５７７８２、ＭＰ−２６１はｂｐ１４０５７７８３から１４０５８０４２、１８５ｂｐエンハンサーはｂｐ１４０６２２２０からｂｐ１４０６２４０４を占める。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の態様（１）による変異体ＣＤ８３プロモーターは、配列番号２のＣＤ８３上流プロモーター（ＵｐＰ）配列、配列番号４のＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ）配列および配列番号５のＣＤ８３エンハンサー配列、または、（ｉ）全長にわたり９０％の相同性を有し、プロモーター活性を有する、および／または、（ｉｉ）Ｎ末端および／またはＣ末端で最大３０ヌクレオチドまでトランケートされており、プロモーター活性を有する、前記配列のバリアント、を含み、前記ＵｐＰ配列は、前記ＭＰ配列の上流に位置し、前記エンハンサー配列は、該ＵｐＰ配列の２００から４０００ヌクレオチド上流または前記ＭＰ配列の２００から４０００ヌクレオチド下流に位置する。
【００１５】
バリアントの「プロモーター活性を有している」という特徴は、変異体ＣＤ８３プロモーターを開始させるプロモーター活性を指す。
【００１６】
「上流に位置している」および「下流に位置している」という語法は、本発明によれば、それぞれの配列が、同一のヌクレオチド鎖上にあり、リンカー／スペーサーの長さが特に示されていない限り、可変の長さのリンカー／スペーサーのヌクレオチド分子によって連結されているという意味を含む。
【００１７】
本発明によれば、ＵｐＰ配列とＭＰ配列との間の距離は、５０から２００ヌクレオチド、好ましくは７０から１２０ヌクレオチドであることが好ましい。ＵｐＰ配列／Ｍｐ配列とエンハンサーとの間の距離が、２００から４０００ヌクレオチド、好ましくは２５０から７５０ヌクレオチドであることも好ましい。
【００１８】
本発明によれば、配列番号２、４および５のバリアントは、それぞれの基礎配列の全長にわたり９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性、最も好ましくは９８％の相同性を有し得る。最大３０ヌクレオチド、または最大２０ヌクレオチドもしくは最大１０ヌクレオチドまでのトランケーションが可能である。特に好ましいのは、ＵｐＰ配列が配列番号２を有し、ＭＰ配列が配列番号４を有し、および／またはＣＤ８３エンハンサー配列が配列番号５を有するものである。
【００１９】
さらに好ましいのは、ＵｐＰ配列が、ＭＰ配列に、配列番号３の介在配列もしくは、その全長にわたり配列番号３と９５％の相同性を有する、そのバリアントによって連結されているもの、および／またはＣＤ８３エンハンサー配列が、ＵｐＰ配列に対して４５０から５５０ヌクレオチド上流もしくはＭＰ配列の４５０から５５０ヌクレオチド下流に、好ましくは、ＵｐＰ配列に対して４５０から５５０ヌクレオチド上流に位置するものである。
【００２０】
特に好ましい変異体ＣＤ８３プロモーターは、配列番号２８のヌクレオチド２９〜１２５９の配列または配列番号２９のヌクレオチド２７〜１２５７の配列を含む。変異体ＣＤ８３プロモーターがヒト樹状細胞特異的であるものも好ましい。
【００２１】
ＣＤ８３プロモーターを、成熟ＤＣにおけるＣＤ８３発現の細胞型特異性および成熟状態特異性をもたらすすべての調節エレメントを含めて、完全に特徴付けするために、ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ（商標）マイクロアレイアッセイを使用して、ｉＤＣ、ｍＤＣおよびＨＦＦ細胞における示差的なＨ３Ｋ９アセチル化の解析によって、例えばエンハンサーのような、潜在的な調節エレメントを含有する領域を同定した。ＣＤ８３イントロン２の最初の６ｋｂは、ｍＤＣにおいて独占的にＨ３Ｋ９アセチル化されることが明らかにされ、この領域内にある細胞型および成熟状態に特異的な転写活性のホットスポットが暗示された。
【００２２】
次に、この領域内にある潜在的なエンハンサーエレメントをしぼった。これは、変異導入法およびルシフェラーゼアッセイによって達成された。結果として、ＣＤ８３イントロン２内のＨ３Ｋ９アセチル化領域の１８５ｂｐの断片（１８５ｂｐエンハンサー）が、ｍＤＣにおいてＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ−２６１）を細胞型および成熟状態に特異的な様式で誘導することが示されている。
【００２３】
次に、１８５ｂｐエンハンサーによるＭＰ−２６１の誘導の根底にある分子機構を解明した。したがって、共同発明者のＷｅｒｎｅｒ博士によってバイオコンピュータ解析が行われた。この解析により、ＭＰ−２６１内の３つのＮＦκＢ結合部位および５つのＳＰ１結合部位、１８５ｂｐエンハンサー内の２つのＩＲＦ部位および１つのＳＰ１部位、ならびにさらに、推定された上流プロモーター（ＵｐＰ）内の２つのＮＦκＢ部位および１つのＩＲＦ部位が予測された。さらに、ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーからなる、三者構成の調節複合体の形成が予言された。この複合体の形成は、ＩＲＦ転写因子とＮＦκＢ転写因子との相互作用によっておそらく媒介されており、それによって、３つのＮＦκＢ−ＩＲＦ−ＮＦκＢ転写モジュールをトランスで形成している。
【００２４】
このモデルを証明するために、３つすべての予測された調節エレメント、すなわち、ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの協力、ならびに予測されたＮＦκＢ部位およびＩＲＦ部位の機能性を検証しなければならなかった。したがって、以下のいくつかの異なる実験的なアプローチを行った：（ｉ）染色体様の配置における３つの調節エレメントの協力を証明するための、ルシフェラーゼレポーターベクターを用いたアデノウイルス形質導入。（ｉｉ）三者構成の調節複合体の形成に対するＩＲＦ部位の機能性および重要性を検証するための、ルシフェラーゼレポータープラスミド中の３つのＩＲＦ部位の変異。（ｉｉｉ）ＮＦκＢ部位の機能性を検証するための、ＮＦκＢ転写因子ファミリーのメンバーをコードしているプラスミドとルシフェラーゼレポータープラスミドとのコトランスフェクションによる、予測されたＮＦκＢ部位の誘導。それによって、転写因子結合部位ならびにＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの協力の双方を確認した。
【００２５】
以下の実施例において本発明をさらに説明する。これは本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２６】
方法
一過的トランスフェクション法およびルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いたＤＮＡのトランスフェクション：プロモーター解析のために、ＤＥＡＥ−デキストラン法により、接着性のＸＳ５２、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞を、プロモーターコンストラクトとホタルルシフェラーゼのための遺伝子とを含有するレポータープラスミドＤＮＡを用いて同じものをそれぞれ３組ずつでトランスフェクトした。したがって、１ウェルあたり２×１０５個の細胞を、１２ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、２．５μｇのエンドトキシン非含有プラスミドＤＮＡを１５０μｌのＴＢＳ緩衝液中に希釈し、５０μｌの５ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン溶液と混合させ、トランスフェクションあたり２００μｌの量にした。次いで、この反応混合物に、０．２μｌのクロロキン溶液（１μｇ／μｌ、Ｒｏｔｈ）を添加した。細胞を５００μｌ／ウェルのＴＢＳ緩衝液で１×洗浄した。次いで、ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン溶液を添加し、プレートをロッカー上で室温で３０分間から１時間までインキュベートした。その後、ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン溶液を５００μｌの１０％ＤＭＳＯによって２分間置き換え、細胞を２×２ｍｌの温かいＤＰＢＳで洗浄し、最後に１ウェルあたり２ｍｌの温かい細胞培地を添加した。トランスフェクトした細胞を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行う前に、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で２日間培養した。ＧＦＰをコードしている対照プラスミドのトランスフェクションおよびその後のＦＡＣＳ解析によってトランスフェクション効率を評価した。
【００２７】
ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞系のエレクトロポレーション：プロモーター解析のために、懸濁液のＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞を、エレクトロポレーションにより、プロモーターコンストラクトとホタルルシフェラーゼの遺伝子とを含有するレポータープラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。
【００２８】
したがって、１０×１０６個の細胞を回収し、ＤＰＢＳ中で１×洗浄して、２０μｇのＤＮＡを含有する２５０μｌのウシ胎仔血清（ＰＡＡ）中に再懸濁した。この細胞懸濁液を室温で１０分インキュベートした。次いで、添加物を含まない２５０μｌのＲＰＭＩ１６４０を添加し、細胞を４ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｐｅｑｌａｂ）に移した。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて９７５μＦおよび２６０ボルトで行った。この細胞を室温で３分間インキュベートし、次いで、予め温めておいた１０ｍｌの増殖培地中に移して、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２４時間後、１０ｍｌの増殖培地を添加した。エレクトロポレーションの４８時間後に細胞をルシフェラーゼアッセイに適用した。ＧＦＰをコードしている対照プラスミドのエレクトロポレーションおよびその後のＦＡＣＳ解析によってエレクトロポレーション効率を評価した。
【００２９】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸおよびＰＬＵＳ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を用いたＤＮＡのリポフェクション：アデノウイルスの作製および構築のために、２９３細胞を、以下のように、Ｔ２５組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）内でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸを用いてＰＬＵＳ（商標）試薬なしでトランスフェクトした：最適なトランスフェクション効率のために、細胞を、４０〜６０％のコンフルエンスでトランスフェクトした。トランスフェクション当日に、２０μｌの水中にある、ＰａｃＩで消化した４μｇのｐＡｄプラスミドを、５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、１３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬と混合させ、室温で３０分間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで１×洗浄し、２．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭをかけた。インキュベーション後、トランスフェクション混合物を細胞に直接添加し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で６時間インキュベートした。その後、この混合物を７ｍｌの温かい増殖培地によって置き換え、細胞を、ウイルスのプラークを検出することができるまで１０〜１２日間培養した。次いで、後述のように、ウイルスをさらに増幅させた。
【００３０】
ルシフェラーゼレポーターコンストラクトと転写因子をコードしているｐＣＤＮＡ３．１ベクターとのコトランスフェクションのために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸをＰＬＵＳ（商標）試薬と共に使用した。したがって、１ウェルあたり６×１０４個の２９３Ｔ細胞を、２４ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）内に、トランスフェクションの１日前に、５００μｌの抗生物質非含有増殖培地中に播種した。０．０５μｇのレポーターコンストラクト、０．１５μｇずつの転写因子コンストラクトおよびｐＣＤＮＡ３．１ベクターバックボーンからなり、０．５μｇにフィルアップした、０．５μｇのトータルＤＮＡを、トランスフェクション当日に、１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に希釈した。次いで、トランスフェクション混合物あたり０．５μｌのＰＬＵＳ試薬をトランスフェクション混合物に添加し、激しく混合させ、室温で５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物に１．２５μｌのＬｉｐｏｆｅｋｔａｍｉｎ（商標）ＬＴＸを添加して、ボルテックス処理し、室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、全反応混合物を細胞に直接に滴下して添加した。トランスフェクトした細胞を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行う前に、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で２日間培養した。２４時間後に増殖培地を交換した。ＧＦＰをコードしている対照プラスミドのリポフェクションおよびその後のＦＡＣＳ解析によってトランスフェクション効率を評価した。
【００３１】
ＡＭＡＸＡ技術を使用する、ＤＮＡでの樹状細胞のエレクトロポレーション：さらなるプロモーター解析のために、製造業者の説明書に従って、ＡＭＡＸＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｉエレクトロポレーション装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ｉＤＣにエレクトロポレーションを行った。簡単に説明すると：回収して温かいＤＰＢＳで洗浄した後に、２×１０６個の未成熟ＤＣを、４μｇのプラスミドＤＮＡを含有する、新たに調製した１００μｌのエレクトロポレーション溶液（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔと共に提供される）中に再懸濁した。細胞を、エレクトロポレーションキュベットに移し、プログラムＵ−２でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に、添加物を含まない５００μｌのＲＰＭＩ１６４０をキュベットに添加し、全細胞懸濁液を、２％の自己血清、５００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−４および８００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ（いずれもＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補った、予め温めた６００μｌのＲＰＭＩ１６４０を含有する１２ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）内に移した。移動の直後に、細胞懸濁液を、ピペットで６００μｌを空のウェル内に移すことによって２つのウェル内に分けた。４時間後、１％の自己血清、２５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、４００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび、細胞を成熟させるために、ＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように補った１．４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を細胞に添加し、これを、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行う前に、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で２４時間培養した。エレクトロポレーション効率、樹状細胞の生成および成熟を、それぞれＧＦＰをコードしている対照プラスミドのエレクトロポレーションならびに適切な系列および成熟のマーカーの抗体染色により、その後、ＦＡＣＳ解析によって評価した。
【００３２】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：ＤＮＡをトランスフェクトしたまたはアデノウイルスによって形質導入した細胞系およびｍｏＤＣのルシフェラーゼ活性の測定は、トランスフェクションの１〜２日後に、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて同じものをそれぞれ３組ずつで行った。接着性の２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＸＳ５２およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を温かいＤＰＢＳで洗浄し、次いで、２００μｌ／ウェルの１×Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、蒸留水で１：５に希釈）を添加し、その後、プレートを少なくとも２時間−８０℃に凍結させた。Ｒａｊｉ、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＣＡＭおよび樹状細胞を、最初に反応バイアルに移し、次いで１ｍｌの温かいＤＰＢＳ中で洗浄した。その後、細胞を、遠心分離（５００ｇ、５分、室温）によって回収し、２００μｌ／バイアルの１×Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させ、少なくとも２時間−８０℃に凍結させた。次いで、プレートまたはバイアルを室温で解凍し、１０μｌ（２９３Ｔ細胞）または２０μｌ（ＤＣ、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ、ＪＣＡＭ）の細胞溶解液を９６ウェルのＬｕｍｉＮｕｎｃプレート（Ｎｕｎｃ）内で５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合させた。ＲＬＵ（相対発光単位）の決定を、Ｗａｌｌａｃ蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｔｇａｕ）内で行い、溶解液のタンパク質濃度に対して標準化した。
【００３３】
組換えアデノウイルス
組換えアデノウイルスゲノムを含有するプラスミドのクローニング：組換えアデノウイルスゲノムを含有するプラスミドを作製するために、ｐＡｄＥａｓｙ１システムを使用した。結果として得られたプラスミドを、ウイルスの構築および増幅のために２９３細胞内にトランスフェクトした。
【００３４】
組換えアデノウイルスの調製：すべてのウイルスを、２９３細胞内で増幅させ、２回のＣｓＣｌ平衡密度勾配超遠心分離によって精製した。したがって、ウイルスプラークを示すトランスフェクトされた２９３細胞を回収し、４℃において１１００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／２％ＦＣＳ中に再懸濁した。３回の凍結融解サイクルによってウイルスを細胞から遊離させ、４℃における４０００ｒｐｍで１５分間の溶解液の遠心分離によって細胞片を除去した。ウイルスを含有する上清（２ｍｌ）を使用して、より多く（最大１５×Ｔ１７５フラスコまで）の新しい２９３細胞を感染させてウイルスを増幅した。残りの上清は、さらなる回のウイルス産生のために−８０℃で保存した。１５×Ｔ１７５フラスコの２９３細胞からのウイルスを、上述のように３回の凍結融解サイクルによって調製し、次いで、ＣｓＣｌ勾配上にロードした。ＣｓＣｌ平衡密度勾配のために、１．４１ｇ／ｍｌの密度の３ｍｌのＣｓＣｌの上に１．２７ｇ／ｍｌの密度の５ｍｌのＣｓＣｌを重ね、次いで、濃縮されたウイルスを含有する上清をＤＰＢＳで７ｍｌにフィルアップして勾配上にロードした。４℃における３２０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離後、ウイルスのバンドを回収し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に希釈して８ｍｌにして、上述のように２回目のＣｓＣｌ平衡密度勾配上にロードした。ウイルスを、超遠心分離機内で４℃において３２０００ｒｐｍで２４時間回転させた後に、回収し、製造業者の説明書に従ってＰＤ−１０チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。最後に、（ＤＰＢＳ中に）溶出したウイルスを、１０％のグリセリンと混合させ、２５μｌに分取して−８０℃に凍結した。ウイルスゲノムの確認および野生型混入の排除をＰＣＲによって行った。物理的な粒子濃度［ウイルス粒子（ｖｐ）／ｍｌ］をＯＤ２６０の測定値によって決定し、感染性の粒子濃度を２９３細胞におけるＴＣＩＤ５０アッセイによって決定した。
【００３５】
物理的な粒子濃度の決定：物理的な粒子濃度は、１ｍｌあたりのウイルス粒子の量［ｖｐ／ｍｌ］によって定義される。ウイルスＤＮＡを定量するために、ウイルス調製物を、ウイルス溶解緩衝液（ＶＬＢ［１０ｍＭ  ＴＥ、０．５％ＳＤＳ］）を用いて異なる比率（１：３、１：５、１：１０、１：５０、１：１００）で希釈し、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で５６℃で１０分間インキュベートした。冷却した試料を分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いてＯＤ２６０で測定し、希釈率を考慮して平均値を算出した。
【００３６】
感染性の粒子濃度の決定：感染性のウイルス粒子の濃度は、「組織培養感染量５０」（ＴＣＩＤ５０）の方法によって決定される。したがって、２９３細胞を、９６ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）内に、１０５／ウェルの密度で、ＲＰＭＩ１６４０／２％ＦＣＳ中に播種した。ウイルスをＲＰＭＩ１６４０／２％ＦＣＳ中に１０−１から１０−１２まで希釈し、それぞれ２つの希釈系列で細胞を感染させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、感染１０日後ならびに１２日後に細胞溶解を顕微鏡で評価した。少なくとも１個のプラークを示したウェルを「陽性」とみなした。
【００３７】
細胞のアデノウイルス形質導入：未成熟５日目のＤＣを、１２ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）内に、細胞１×１０６個／ウェルの濃度で、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を補った２５０μｌの培地中に播種した。直ちに、２５０μｌの最終量のサイトカイン非含有培地中にある、５００ＴＣＩＤ５０／細胞のアデノウイルスを細胞に添加した。室温での１．５時間のインキュベーション後、前述のようなサイトカインを補充した２．５ｍｌの増殖培地をウェルごとに添加した。ｍＤＣが必要とされる場合には、ＬＰＳを、形質導入の４時間後に、０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。
【００３８】
Ｒａｊｉ、ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭ細胞を、１２ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）内に、細胞１×１０６個／ウェルの濃度で、２％のＦＣＳを補った２５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に播種した。直ちに、２％のＦＣＳを補った２５０μｌの最終量のＲＰＭＩ１６４０培地中にある、５００ＴＣＩＤ５０／細胞（ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭ細胞）または５０ＴＣＩＤ５０／細胞（Ｒａｊｉ）のアデノウイルスを細胞に添加した。ロッカー上での室温での１．５時間のインキュベーション後、１０％のＦＣＳを補充した２．５ｍｌの増殖培地をウェルごとに添加した。形質導入の効力を決定するために、細胞をＡｄ５ＴＬで形質導入し、生存している緑色の蛍光細胞の百分率を、「ＦＡＣＳｃａｎ」フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いたフローサイトメトリー解析によって評価した。７０％を超える形質導入効率が得られた実験のみを評価し、示している。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：ＰＣＲは、（ｉ）クローニングのために染色体またはプラスミドのいずれかのＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅するため、および（ｉｉ）挿入用のアデノウイルスＤＮＡをスクリーニングするために用いた。
（ｉ）クローニングのために増幅したＤＮＡ断片は、プルーフリーディング活性を含有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、５０μｌの最終反応量で作製した。
（ｉｉ）アデノウイルスＤＮＡのスクリーニングのためのＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを製造業者の説明書に従って用いて２５μｌの最終反応量で行った。
【００４０】
【表１】
2014518617.tif 000002
【００４１】
材料
ルシフェラーゼアッセイのためのＣＤ８３イントロン２断片の概略描写：イントロン２を３つの断片（Ａ、Ｂ、Ｃ）に分割し、ｐＧＬ３／ＭＰ−２６１レポーターコンストラクト内にサブクローニングした。次いで、断片Ｃを、欠失変異導入法を介して断片Ｃ１〜Ｃ１４にしぼった。
【００４２】
【表２】
2014518617.tif 000003
【００４３】
アデノウイルス
【００４４】
【表３】
2014518617.tif 000004
【００４５】
細胞系および細胞培地：他に示していない場合、すべての細胞培地および試薬は、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＰＡＡ（Colbe）から購入した。
【００４６】
【表４】
2014518617.tif 000005
【００４７】
ＤＮＡ改変酵素
【００４８】
【表５】
2014518617.tif 000006
【００４９】
ヒトのサイトカインおよび成熟剤
【００５０】
【表６】
2014518617.tif 000007
【００５１】
クローニング
ルシフェラーゼレポーターコンストラクト
注記および略語：ｓ：センス、ａｓ：アンチセンス、ＣＤＳ：コード配列、
ｅｎｈ：エンハンサー、ＵＰＰ：上流プロモーター、Ｓ１：スペーサー配列１。
【００５２】
【表７】
2014518617.tif 000008
【００５３】
変異されたＩＲＦ部位を有するルシフェラーゼレポーターコンストラクト
注記および略語：
ＰＣＲ変異導入法を介して、１８５ｂｐエンハンサー内のＩＲＦ部位１および２をＰＣＲ変異導入法によって変異させた。Ｐ−５１０プロモーター内の（またはむしろＵｐＰ内の）３番目のＩＲＦ部位は、ＧＥＮＥＡＲＴによって変異させて、「ＧＥＮＥＡＲＴ標準ベクター／ＣＤ８３ −５１０ｍｕｔ３ｒｄＩＲＦ部位」に入れて得た。３つのＩＲＦ部位の変異の組合せにより、１つ、２つまたは３つの変異されたＩＲＦ部位を有する、以下のコンストラクトを結果として得た：
ｍｕｔ：変異された
ｐＧＬ３／ＵＰＰｍｕｔ３ｒｄＩＲＦ部位
ｐＧＬ３／Ｐ−５１０ｍｕｔ３ｒｄＩＲＦ部位
ｐＧＬ３／１８５ｂｐ  ｅｎｈ．ｓ ａｓ  １ｓｔＩＲＦ部位ｍｕｔ／Ｐ−５１０
ｐＧＬ３／１８５ｂｐ  ｅｎｈ．ｓ ａｓ  ２ｎｄＩＲＦ部位ｍｕｔ／Ｐ−５１０
ｐＧＬ３／１８５ｂｐ  ｅｎｈ．ｓ ａｓ  １ｓｔ／２ｎｄＩＲＦ部位ｍｕｔ／Ｐ−５１０
ｐＧＬ３／１８５ｂｐ  ｅｎｈ．ｓ ａｓ  １ｓｔ／２ｎｄｍｕｔ／Ｐ−５１０ｍｕｔ３ｒｄＩＲＦ部位
次いで、これらのコンストラクトをスペーサー配列「Ｓ１」で拡張した。
【００５４】
【表８】
2014518617.tif 000009
【００５５】
８．プライマー
すべてのプライマーは、ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入したものである。
【００５６】
注記および略語：
ｆｗ、ｆｏｒ：フォワード方向のＤＮＡオリゴヌクレオチド
ｒｅｖ：リバース方向のＤＮＡオリゴヌクレオチド
ｍｔ：変異体
ｗｔ：野生型
ａａ：アミノ酸
【００５７】
Ｋａｙ  Ｃｈｉｌｄｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕ．Ｋ．）によって提供された元のＩＲＦ−２のＰＣＲ鋳型（ＥＦ１α／ＩＲＦ−２）は、欠陥のある３個のａａ（３、４、５）を含有していた。最初に、この欠陥のある配列を、ＰＣＲ（プライマー：ＩＲＦ−２  ｆｗｄ  ＨｉｎｄＩＩ；ＩＲＦ−２  ｒｅｖ  ＸｂａＩ）を介してｐＣＤＮＡ３．１内にサブクローニングし、その鋳型から、ＰＣＲ変異導入法（プライマー：ＩＲＦ−２ｍｕｔ；ｆｗｄ  ＩＲＦ−２ｍｕｔ  ｒｅｖ；）を用いることによって、修正された配列を有するＰＣＲ産物が生成された。
【００５８】
ルシフェラーゼレポーターコンストラクトのためのクローニングプライマー
【００５９】
【表９】
2014518617.tif 000010
【００６０】
変異された１８５ｂｐエンハンサーのためのクローニングプライマー
【００６１】
【表１０】
2014518617.tif 000011
【００６２】
［実施例１］
ＣＤ８３は、ＤＣ成熟期間中に上方制御され、ＨＦＦ細胞によって発現されない。
図１、（Ａ）：フローサイトメトリー解析のために、セットアップごとに１０万個の５日目のｉＤＣ、２０時間ＬＰＳで成熟させたＤＣおよびＨＦＦ細胞を、回収して、ＰＥで標識されたマウス抗ヒトＣＤ８３ｍＡＢまたはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照で染色した。各区画は、前方および側方の光散乱におけるゲートならびにＰＩ染色によって決定される１×１０４個の生存細胞を表している。各ヒストグラムプロットにおいて、黒線は、アイソタイプ対照で染色した細胞の平均蛍光強度を表し、赤線は、抗ＣＤ８３で染色した細胞の平均蛍光強度を表している。（Ｂ）：１ウェルあたり１００万個の５日目のｉＤＣまたはＨＦＦ細胞を、１２ウェルの組織培養プレート内に播種した。未成熟ＤＣを、３時間、６時間、１０時間および２４時間成熟させるか、またはＨＦＦ細胞のように未処理のまま残した。表示の各時点において、細胞をＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させた。ウエスタンブロットのために、未成熟ＤＣ、成熟しているＤＣ（ＬＰＳの添加の３〜２４時間後）またはＨＦＦ細胞のいずれかからの全細胞溶解液を、変性１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に１レーンあたり２０μｇロードし、その後、ニトロセルロースメンブレン上にブロットした。このメンブレンをラット抗ヒトＣＤ８３一次抗体およびマウス抗ヒトＧＡＰＤＨ一次抗体と共に、次いで、それぞれ抗ラットＨＲＰ結合二次抗体または抗マウスＨＲＰ結合二次抗体と共にインキュベートした。そのシグナルを、フォトフィルム上に可視化された化学発光を介して検出した。（Ｃ）製造業者の説明書に従ってＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒおよびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して、ｉＤＣ、２０時間ＬＰＳで成熟させたＤＣおよびＨＦＦ細胞からトータルＲＮＡを単離し、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２〜１８プライマーで逆転写させた。その後、ＣＤ８３用のイントロンにわたるプライマー対およびＧＡＰＤＨ用の対照プライマー対でＰＣＲを行った。さらに、陰性対照としてＤＮＡの代わりに水で１つのＰＣＲ反応物を調製した。
【００６３】
［実施例２］
ＣＤ８３遺伝子座の概略描写およびＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ（商標）マイクロアレイ解析から結果として得られる、それぞれのアセチル化データ。
図２、（Ａ）：６番染色体上のＣＤ８３の遺伝子座およびヌクレオチド部位の概略描写。コード配列を青色（ＣＤＳ）で、エキソンを灰色（Ｅ１〜Ｅ５）で、イントロンを赤色（Ｉ１〜Ｉ４）で表している。（Ｂ）ＣＤ８３高アセチル化についてのデータを、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎシステムによって得て、次いで、Ｓｉｇｎａｌ  Ｍａｐソフトウェアを使用して５００ｂｐのスペースにわたって補間した。（Ｃ）成熟ＤＣについての補間データのオーバーレイをＣＤ８３のエキソン（黒色；Ｅ１〜Ｅ５）およびイントロン（赤色；Ｉ１〜Ｉ４）の部位に合わせて配置した。
【００６４】
［実施例３］
遺伝子レポーターアッセイのためのコンストラクトの概略描写。
図３：ルシフェラーゼ遺伝子のみをコードしており、いかなる調節エレメントも欠いているｐＧＬ３ベクターバックボーン（ｐＧＬ３／Ｂａｓｉｃ）をバックグラウンド対照に使用した。ＣＭＶプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含有しているｐＧＬ３バックボーン（ｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃ）は、陽性対照としてのその使用および内部標準化のために作製した。ルシフェラーゼの代わりにＧＦＰをコードしている同一のプラスミド（ｐＧＬ３／ＣＭＶ／ＧＦＰ）は、トランスフェクション効率を決定するために使用した。参照対照として、ＣＤ８３最小プロモーターＭＰ−２６１によって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子をコードしているｐＧＬ３プラスミド（ｐＧＬ３／ＭＰ−２６１）を作製した。最後に、推定上の調節エレメントをＭＰ−２６１の上流に両方向で含有するプラスミド（ｐＧＬ３／Ｐｕｔ．ｒｅｇ．／ＭＰ−２６１）は、ＭＰ−２６１に対するその影響を試験するために作製した。
【００６５】
［実施例４］
ＣＤ８３イントロン２の高アセチル化領域のサブクローニング戦略の概略描写。
図４：ＣＤ８３イントロン２の最初の６ｋｂを、３つの断片Ａ（１２３９ｂｐ）、Ｂ（２３５９ｂｐ）、およびＣ（２２２０ｂｐ）に細分した。ＰＣＲ増幅後、各断片を、ｐＧＬ３／ＭＰ−２６１プラスミド中にＭＰ−２６１の上流にセンスおよびアンチセンスの方向でサブクローニングした。高アセチル化領域を青色のバーとして、エキソンを黒色のバー（Ｅ１〜Ｅ５）として表し、イントロンを赤色でマークしている（Ｉ１〜Ｉ５）。赤色の囲み線は、転写開始点（ｂｐ１）に対して相対的に塩基対の位置を示している。
【００６６】
［実施例５］
断片Ｃは、ＸＳ５２細胞において特異的にＭＰ−２６１活性を促進する。
図５：１ウェルあたり２０万個のＸＳ５２、ＮＩＨ３Ｔ３またはＨｅＬａ細胞を、１２ウェルの組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、ＤＥＡＥ−デキストラン法を使用して、細胞に、ＭＰ−２６１の上流にセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）の方向でＣＤ８３イントロン２の断片Ａ、ＢもしくはＣを含有する２．５μｇのレポータープラスミド、または参照対照として２．５μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１でトランスフェクションを行った。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。細胞系ごとに、断片Ａ、ＢおよびＣを含有するプラスミドをｐＧＬ３／ＭＰ−２６１ベクターと比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００６７】
［実施例６］
断片Ｃの欠失変異体Ｃ１〜Ｃ１４の概略描写。
図６：ＣＤ８３イントロン２断片Ｃの欠失変異体Ｃ１〜Ｃ１４を、ＰＣＲ増幅によって作製し、ｐＧＬ３／ＭＰ−２６１レポータープラスミド中にＭＰ−２６１の上流にセンス（ｓ）およびアンチセンス（ａｓ）の方向でクローニングした。最小プロモーター活性の誘導を、ＸＳ５２、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞系においてルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定した。誘導は、ｐＧＬ３／ＭＰ−２６１の活性に対して相対的に表している。−−−ＭＰ−２６１の誘導なし、＋ＭＰ−２６１の弱い誘導、＋＋ＭＰ−２６１の中程度の誘導、＋＋＋ＭＰ−２６１の強い誘導。
【００６８】
［実施例７］
断片Ｃの長さ１８５ｂｐの欠失変異体Ｃ１３は、ＸＳ５２細胞において特異的にＭＰ−２６１活性を促進する。
図７：１ウェルあたり２０万個のＸＳ５２、ＮＩＨ３Ｔ３またはＨｅＬａ細胞を、１２ウェルの組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、ＤＥＡＥ−デキストラン法を使用して、細胞に、ＭＰ−２６１の上流にセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）の方向でＣＤ８３イントロン２の断片Ｃの欠失変異体Ｃ１〜Ｃ１４を含有する２．５μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１レポータープラスミド、または参照対照として２．５μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１のいずれかでトランスフェクションを行った。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。それぞれの細胞系ごとに、異なる断片を含有するプラスミドをｐＧＬ３／ＭＰ−２６１ベクターと比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００６９】
［実施例８］
断片Ｃおよび１８５ｂｐエンハンサーは、ｍＤＣにおいて特異的にＭＰ−２６１活性を誘導する。
図８：ＡＭＡＸＡ技術を使用して、２００万個の５日目のｉＤＣに、４μｇのｐＧＬ３／Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ３／ＭＰ−２６１、ｐＧＬ３／断片Ｃ／ＭＰ−２６１ｓ／ａｓまたはｐＧＬ３／１８５ｂｐＥｎｈ．（Ｃ１３）／ＭＰ−２６１ｓ／ａｓルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかでエレクトロポレーションを行った。その後、細胞を、１２ウェルの組織培養プレートに移し、２つの等しい画分に分けた。画分のうちの１つを、エレクトロポレーションの３時間後に、ＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように用いて成熟させ、もう１つの画分にＬＰＳなしの増殖培地を補充した。次いで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間培養した。バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定し、結果として得られたＲＬＵを各溶解液のタンパク質濃度に対して標準化した。異なる断片を含有するプラスミドをｐＧＬ３／ＭＰ−２６１ベクターと比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。結果は、（Ａ）では４種の異なるドナーを代表する独立に行った４回の実験の、（Ｂ）では３種の異なるドナーを代表する３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７０】
［実施例９］
断片Ａ、Ｂ、Ｃも１８５ｂｐエンハンサーも、ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞においてＭＰ−２６１を誘導しない。
図９：Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを使用して、１０００万個のＲａｊｉまたはＪｕｒｋａｔ細胞に、ＭＰ−２６１の上流にセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）の方向で断片Ａ、Ｂ、Ｃもしくは１８５ｂｐエンハンサーを含有する２０μｇのレポータープラスミド、または参照対照として２０μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１でエレクトロポレーションを行った。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、予め温めておいた１０ｍｌの増殖培地中に移し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定し、結果として得られたＲＬＵを各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。それぞれの細胞系ごとに、異なる断片を含有するプラスミドをｐＧＬ３／ＭＰ−２６１ベクターと比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７１】
［実施例１０］
ＣＤ８３上流プロモーター、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの相互作用についての推定されたバイオコンピュータのモデル。
図１０、（Ａ）：ＣＤ８３転写を制御している、予測された転写因子結合部位を有する以下の３つの調節エレメントの描写：（ｉ）ＮＦκＢ部位１および２、ＩＲＦ部位３ならびに１つのＳＰ１部位を含有する上流プロモーター（ＵｐＰ）、（ｉｉ）ＮＦκＢ部位３、４および５ならびに４つのＳＰ１部位を含有する、２６１ｂｐの長さのＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ−２６１）（ｉｉｉ）ＩＲＦ部位１および２ならびに１つのＳＰ１部位を含有する１８５ｂｐエンハンサー。８２ｂｐの天然に存在するスペーサー配列を含むＵｐＰおよびＭＰ−２６１は、５１０ｂｐプロモーター（Ｐ−５１０）と呼ばれる。以前に確認および公表されている転写因子結合部位を赤色の矢印でマークしている。（Ｂ）：ＩＲＦ部位１および２とそれぞれＮＦκＢ部位３および５との相互作用によって媒介される、１８５ｂｐエンハンサーとＭＰ−２６１との所定の相互作用。（Ｃ）：ＵｐＰを第３の相互作用パートナーとした三者複合体形成。ＵｐＰとＭＰ−２６１との間の相互作用は、ＩＲＦ部位３およびＮＦκＢ部位４によって媒介される。
【００７２】
［実施例１１］
ＵｐＰおよびスペーサー配列Ｓ１を含有するレポーターコンストラクトの概略描写。
図１１：Ｐ−５１０ならびにＣＤ８３上流プロモーター（ＵｐＰ）をｐＧＬ３／Ｂａｓｉｃプラスミド中にルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローニングし、このようにしてそれぞれｐＧＬ３／Ｐ−５１０およびｐＧＬ３／ＵｐＰを作製した。Ｐ−５１０内に含まれているＵｐＰは、紫色で強調されている。さらに、５００ｂｐの長さのスペーサー配列（Ｓ１）を、ＭＰ−２６１およびＰ−５１０の間に挿入して、それぞれプラスミドｐＧＬ３／１８５ｂｐ  Ｅｎｈ．／Ｓ１／ＭＰ−２６１およびｐＧＬ３／１８５ｂｐ  Ｅｎｈ．／Ｓ１／ＭＰ−５１０を作製した。該スペーサー配列をプラスミドｐＧＬ３／ＭＰ−２６１およびｐＧＬ３／Ｐ−５１０中にも導入し、結果としてプラスミドｐＧＬ３／Ｓ１／ＭＰ−２６１およびｐＧＬ３／Ｓ１／Ｐ−５１０を得た。
【００７３】
［実施例１２］
スペーサー配列Ｓ１は、ＸＳ５２細胞におけるＭＰ−２６１およびＰ−５１０の誘導に有意には影響しない。
図１２：１ウェルあたり２０万個のＸＳ５２、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞を、１２ウェルの組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法を使用して、細胞に、スペーサー配列Ｓ１を含むまたは含まない、センス（ｓ）またはアンチセンス（ａｓ）の方向で１８５ｂｐエンハンサーを有するまたは有さない、２．５μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１またはｐＧＬ３／Ｐ−５１０のいずれかでトランスフェクションを行った。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。それぞれの細胞系ごとに、スペーサー配列Ｓ１を含有するプラスミドを、スペーサー配列のない対応するプラスミドと比較した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７４】
［実施例１３Ａ］
スペーサー配列Ｓ１は、ｍＤＣにおけるＭＰ−２６１の誘導に有意には影響しない。
図１３、（Ａ）：ＡＭＡＸＡ技術を使用して、２００万個の５日目のｉＤＣに、ＭＰ−２６１の上流にセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）の方向で１８５ｂｐエンハンサーを有するもしくは有さない、またはスペーサー配列Ｓ１を含むこれらのそれぞれの対応物を有する、４μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１のいずれかでエレクトロポレーションを行った。その後、細胞を、１２ウェルの組織培養プレートに移し、２つの等しい画分に分けた。細胞を、エレクトロポレーションの３時間後に、ＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように用いて成熟させ、次いで、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で２０時間培養した。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。スペーサー配列Ｓ１を含有するプラスミドを、スペーサー配列を欠いた対応するプラスミドと比較した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、種々のドナーを代表する独立に行った５回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７５】
［実施例１３Ｂ］
スペーサー配列Ｓ１は、ｍＤＣにおけるＰ−５１０の誘導に有意には影響しない。
図１３、（Ｂ）：（Ａ）におけるのと同一の方法で、しかし、ＭＰ−２６１を有するプラスミドの代わりに、Ｐ−５１０を含むプラスミドを使用して、細胞を処理してエレクトロポレーションを行った。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、種々のドナーを代表する独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７６】
［実施例１４］
ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの三者複合体は、ｍＤＣにおいて特異的な転写誘導を示す。
図１４、（Ａ）：１ウェルあたり１００万個の５日目のｉＤＣを、１２ウェルの組織培養プレート内で、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を補った２５０μｌの培地中に播種した。この細胞に、２５０μｌの最終量のサイトカイン非含有培地中にある、５００ＴＣＩＤ５０／細胞で示されるような組換えアデノウイルスを添加した。室温での１．５時間のインキュベーション後、前述のようなサイトカインを補充した２．５ｍｌの増殖培地をウェルごとに添加した。ｍＤＣを作製するために、形質導入の３時間後に、ＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。形質導入の２４時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。対照として、内部標準化のためにＡｄ５ｌｕｃ１を形質導入した。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。これらの形質導入セットアップをＡｄ２６１／Ｓ１の形質導入と比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。結果は、種々のドナーを代表する独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７７】
［実施例１５］
ＵｐＰ、ＭＰ−２６１および１８５ｂｐエンハンサーの三者複合体は、Ｒａｊｉ、ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭ細胞において特異的な転写誘導を示さない。
図１５、（Ａ）〜（Ｃ）：１ウェルあたり１００万個のＲａｊｉ、ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭ細胞を、１２ウェルの組織培養プレート内で、２％のＦＣＳを補った２５０μｌのＲＰＭＩ１６４０中に播種した。この細胞に、２％のＦＣＳを補った２５０μｌの最終量のＲＰＭＩ１６４０中にある、ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭについては５００ＴＣＩＤ５０／細胞、ならびにＲａｊｉについては５０ＴＣＩＤ５０／細胞で示されるような組換えアデノウイルスを添加した。室温での１．５時間のインキュベーション後、２．５ｍｌの適切な完全増殖培地をウェルごとに添加した。Ｒａｊｉ細胞を、形質導入の３時間後にＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように用いて刺激するか、または未処理のまま残した。ＪｕｒｋａｔおよびＪＣＡＭ細胞を、形質導入の３時間後にＰＧＥ２およびＴＮＦ−αをそれぞれ１μｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように用いて刺激するか、または未処理のまま残した。形質導入の２４時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。さらなる対照として、内部標準化のためにＡｄ５ｌｕｃ１を形質導入した。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。これらの形質導入セットアップをＡｄ２６１／Ｓ１の形質導入と比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００７８】
［実施例１６］
ルシフェラーゼアッセイに使用する、変異されたＩＲＦ部位を含有するレポーターコンストラクトの概略描写。
図１６：ｐＧＬ３／ＵｐＰプラスミドを作製するために、ＵｐＰを含有する、Ｐ−５１０のＣＤ８３上流プロモーターの２４４ｂｐ断片を酵素消化によって単離し、ｐＧＬ３／Ｂａｓｉｃプラスミド中にルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローニングした。ｐＧＬ３／ＵｐＰ、ｐＧＬ３／Ｓ１／Ｐ−５１０およびｐＧＬ３／１８５ｂｐ  Ｅｎｈ．／Ｓ１／Ｐ−５１０プラスミド中の個々のＩＲＦ部位を、ＰＣＲ変異導入法によって変異させた。ＩＲＦ部位を、ＥＭＳＡ対照オリゴヌクレオチドにおける点変異と一致した異なる組合せで変異させた。
【００７９】
［実施例１７］
三者複合体における３つのＩＲＦ部位のうちのいずれの変異も、ＸＳ５２細胞におけるルシフェラーゼ発現を有意に低下させる。
図１７、（Ａ）および（Ｂ）：１ウェルあたり２０万個のＸＳ５２細胞を、１２ウェルの組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法を使用して、細胞に、Ｐ−５１０の上流にセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）の方向で１８５ｂｐエンハンサーを有するおよび有さない、または１つ、２つもしくは３つの変異されたＩＲＦ部位を有する類似のプラスミドを有する、２．５μｇの野生型ｐＧＬ３／ＵｐＰまたはｐＧＬ３／Ｓ１／Ｐ−５１０でトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対して標準化した。異なる変異を含有するプラスミドをそれぞれの野生型対照と比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。変異させたＩＲＦ部位は、それらのそれぞれの番号で示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００８０】
［実施例１８］
三者複合体における３つのＩＲＦ部位のうちのいずれの変異も、ｍＤＣにおけるルシフェラーゼ発現を有意に低下させる。
図１８：ＡＭＡＸＡ技術を使用して、２００万個の５日目のｉＤＣに、Ｐ−５１０の上流にセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）の方向で１８５ｂｐエンハンサーを有するおよび有さない、または１つ、２つもしくは３つの変異されたＩＲＦ部位を有する類似のプラスミドを有する、４μｇの野生型ｐＧＬ３／Ｓ１／Ｐ−５１０のいずれかでエレクトロポレーションを行った。その後、細胞を、１２ウェルの組織培養プレートに移し、２つの等しい画分に分けた。細胞を、エレクトロポレーションの３時間後に、ＬＰＳを０．１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように用いて成熟させ、次いで、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で２０時間培養した。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。異なる変異を含有するプラスミドをそれぞれの野生型対照と比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。変異させたＩＲＦ部位は、それらのそれぞれの番号で示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、種々のドナーからの独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００８１】
［実施例１９］
ＮＦκＢファミリーの転写因子およびＩＲＦ−５は、２９３Ｔ細胞においてＭＰ−２６１を誘導する。
図１９、（Ａ）および（Ｂ）：１ウェルあたり６万個の２９３Ｔ細胞を、２４ウェルの組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、細胞を、０．０５μｇのｐＧＬ３／ＭＰ−２６１レポータープラスミドと、０．１５μｇの、表示の転写因子をコードしている各プラスミド（ｐＣＤＮＡ３．１内のｐ５０、ｐ６５、ｃＲｅｌまたはＩＲＦ−５）または対照として空ベクターバックボーンとを用いてコトランスフェクトした。ＤＮＡの総量は、ｐＣＤＮＡ３．１空ベクターバックボーンで０．５μｇに調整した。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸシステムを使用した。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。これらのコトランスフェクションをｐＧＬ３／ＭＰ−２６１対照と比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００８２】
［実施例２０Ａ］
ｐ６５およびＩＲＦ−５は、２９３Ｔ細胞においてＵｐＰを誘導する。
図２０、（Ａ）：１ウェルあたり６万個の２９３Ｔ細胞を、２４ウェルの組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、細胞を、０．０５μｇのｐＧＬ３／ＵｐＰレポータープラスミドと、０．１５μｇの、表示の転写因子をコードしている各プラスミド（ｐＣＤＮＡ３．１内のｐ５０、ｐ６５およびＩＲＦ−５）または対照として空ベクターバックボーンとを用いてコトランスフェクトした。ＤＮＡの総量は、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターバックボーンで０．５μｇに調整した。トランスフェクションの４８時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによってプロモーター活性を決定した。対照として、バックグラウンド活性を評価するためおよび内部標準化のために、それぞれｐＧＬ３／ＢａｓｉｃベクターおよびｐＧＬ３／ＣＭＶ／ｌｕｃベクターをトランスフェクトした。結果として得られたＲＬＵを、各溶解液のタンパク質濃度に対してさらに標準化した。これらのコトランスフェクションをｐＧＬ３／ＵｐＰ対照と比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【００８３】
［実施例２０Ｂ］
ｐ６５およびＩＲＦ−５によるＵｐＰの誘導は、ＩＲＦ部位３が変異されたときに抑止される。
図２０、（Ｂ）：細胞を、（Ａ）に記載のように、０．０５μｇのｐＧＬ３／ＵｐＰもしくはｐＧＬ３／ＵｐＰ  ３．ＩＲＦｍｕｔレポータープラスミド単独でトランスフェクト、または０．１５μｇの、表示のそれぞれの転写因子（ｐＣＤＮＡ３．１内のｐ６５およびＩＲＦ−５）と共にコトランスフェクトした。ＤＮＡの総量は、ｐＣＤＮＡ３．１ベクターバックボーンで０．５μｇに調整した。ｐＧＬ３／ＵｐＰおよびｐＧＬ３／ＵｐＰ３．ＩＲＦｍｕｔのセットアップを比較し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を介して、結果として得られるｐ値を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞０．０５）。結果は、独立に行った３回の実験の平均（±ＳＥＭ）を表している。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号  説明
配列番号１：  ＮＴ ００７５９２．１５；ＵｐＰ  ｂｐ２５３１〜２６９６、介在配列ｂｐ２６９７〜２７７９、ＭＰ−２６１  ｂｐ２７８０〜３０４０、および１８５ｂｐエンハンサーｂｐ７２１８〜７４０２のＣＤ８３プロモーターのゲノム配列
配列番号２：  上流プロモーター（ＵｐＰ）
配列番号３：  介在配列
配列番号４：  ＣＤ８３最小プロモーター（ＭＰ−２６１）
配列番号５：  １８５ｂｐエンハンサー
配列番号６〜２７：  プライマー
配列番号２８〜２９：  それぞれベクターｐＧＬ３／−５１０／Ｓ１／ＥｓおよびｐＧＬ３／−５１０／Ｓ１／Ｅａｓのプロモーター領域
【図１】
2014518617.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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