(57)【要約】本発明は、血友病Ａなどを有する患者においてＦＶＩＩＩに対する免疫応答を低下させるためまたはヒトＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導するために使用することができるペプチドに関する。さらに該ペプチドを、免疫診断目的で、ＦＶＩＩＩ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出して補充療法中および免疫寛容誘導療法中の血友病Ａを有する患者をモニターするために使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象においてＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する方法であって、
該対象に、
（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙ
からなるアミノ酸配列を有するペプチドの治療有効量を投与するステップ
を含み、
式中、
Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である、
方法。
【請求項２】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｘおよびｙがともに０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ｘが１であり、ｙが０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｘが０であり、ｙが１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｘおよびｙがともに１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが９〜１００個のアミノ酸からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが９〜５０個のアミノ酸からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが９〜２５個のアミノ酸からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象に、
（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙ
からなるアミノ酸配列を有する第２のペプチドの治療有効量を投与するステップ
をさらに含み、
式中、
Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬学的組成物の投与が、前記対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生を防止する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬学的組成物の投与が、前記対象中に存在する抗ＦＶＩＩＩ抗体の量を減少させる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
アミノ酸配列：
（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙ
からなる、ペプチドであって、
式中、
Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である、
ペプチド。
【請求項１７】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１９】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２０】
Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２１】
ｘおよびｙがともに０である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２２】
ｘが１であり、ｙが０である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２３】
ｘが０であり、ｙが１である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２４】
ｘおよびｙがともに１である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２５】
９〜１００個のアミノ酸からなる、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２６】
９〜５０個のアミノ酸からなる、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
９〜２５個のアミノ酸からなる、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれか１項に記載のペプチドを含む、組成物。
【請求項２９】
薬学的投与のために製剤化される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
アミノ酸配列：
（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙ
からなる第２のポリペプチドをさらに含み、
式中、
Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である、
請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
(ａ）請求項１６〜２７のいずれか１項に記載のＦＶＩＩＩペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の培養物を供給するステップ、および
(ｂ）該細胞の培養物において該ペプチドを発現させるステップ
を含む、ＦＶＩＩＩペプチドを作製する方法。
【請求項３２】
(ａ）ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成したペプチドと複数のＣＤ４＋Ｔ細胞を混合するステップであって、該ペプチドが、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載のＦＶＩＩＩペプチドである、ステップ、および
(ｂ）該ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成した該ペプチドに対して特異的な該複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のメンバーのうちの少なくとも１つを特定するステップ
を含む、ＦＶＩＩＩペプチド特異的Ｔ細胞を特定する方法。
【請求項３３】
前記ＭＨＣクラスＩＩ多量体がＭＨＣクラスＩＩ四量体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドまたは前記ＭＨＣクラスＩＩ多量体が検出可能部分をさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドに対して特異的な少なくとも１つの前記ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
フローサイトメトリーを用いて前記ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の第ＶＩＩＩ因子ペプチドと、
第２のペプチドと
を含む、融合タンパク質。
【請求項３８】
前記第２のペプチドがレポーターペプチドである、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
核酸によってコードされる、請求項３７または３８に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記ＦＶＩＩＩペプチドが前記第２のペプチドと化学的に連結している、請求項３７または３８に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４０７，４０２号、２０１１年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４６７，８９４号、および２０１１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０２，４７６号に基づく優先権を主張するものであり、前記出願の開示内容は参照によりあらゆる目的で全体が本明細書に援用される。
【０００２】
合衆国政府に支援された研究または開発の下でなされた発明の権利に関する陳述
該当なし。
【０００３】
コンパクトディスクで提出された付属書類の「配列リスト」、表、またはコンピュータプログラム一覧の参照
該当なし。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血漿中に見られるタンパク質であり、血液凝固をもたらす反応のカスケードにおいて補因子として機能する。血友病Ａは、機能的ＦＶＩＩＩタンパク質の減少または欠乏によって引き起こされ、およそ５０００人〜１００００人に１人の男性が侵される最も一般的な出血性障害である。血友病の臨床症状は、高頻度の筋肉内および関節内出血であり、外傷が命にかかわる状況につながる恐れすらある。現在、血友病の有効な治療には、組換えまたは血漿由来のＦＶＩＩＩ製剤の静脈内適用を用いた、不足しているＦＶＩＩＩタンパク質の補充がある。このような製剤は、一般に、出血症状の発現に対して投与されるか（オンデマンド療法）、または制御不良の出血を防ぐために高頻度の定期的間隔で投与される（予防）。残念なことに、中和抗ＦＶＩＩＩ抗体（ＦＶＩＩＩ阻害物質）の出現は、ＦＶＩＩＩ製剤による補充療法における主な合併症である。治療を受けている患者のおよそ２５％は、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するこの免疫を生じ、そのためさらに出血を制御することが非常に困難になる。
【０００５】
ＦＶＩＩＩタンパク質に対するこの免疫応答の原因は完全には解明されていないが、患者の免疫系の特性は、治療反応に影響を与える恐れがある。通常は、免疫系は特定の抗原、例えば「自己」抗原に対する寛容を生じる。この特性がなければ、自己抗原が外来抗原として認識された場合に自己免疫疾患が生じるため、この特性は重要である。とりわけ、血友病Ａの患者は、ＦＶＩＩＩ遺伝子に遺伝子異常を有し、これにより免疫系は投与されたＦＶＩＩＩタンパク質を「自己」抗原として認識しない。したがって、凝固因子補充療法においてＦＶＩＩＩタンパク質が投与されたとき、患者の免疫系は、ＦＶＩＩＩタンパク質を外来抗原または変性自己タンパク質として認識し、それに応じて抗ＦＶＩＩＩ抗体を発生する。
【０００６】
ＦＶＩＩＩ阻害物質、すなわち抗ＦＶＩＩＩ抗体は、ＦＶＩＩＩ特異的Ｂ細胞由来の形質細胞によって生成される。Ｂ細胞は、増殖して、抗ＦＶＩＩＩ抗体を生成する形質細胞に分化するために、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の助けを必要とする。例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球によって異なる方式で認識される。抗ＦＶＩＩＩ抗体の誘導は、Ｔヘルパー細胞に依存する。Ｂ細胞は、全タンパク質エピトープをその特異的Ｂ細胞受容体によって認識する。一方Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成した、プロセシングされたペプチドの形で、タンパク質を認識する。それぞれのＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、１つのみの特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する。ペプチドをＴ細胞に提示するために、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、様々な長さのペプチドを収め、細胞表面に提示させる、開放した結合溝を有する。さらに、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、種々のハプロタイプのための異なる４つの結合ポケットを含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７１−２８２（２００６）（非特許文献１））。特定のアミノ酸のみがこれらの結合ポケット内に収まり、結合ペプチドの最小サイズはアミノ酸９個である。特に、異なるＭＨＣクラスＩＩハプロタイプは、異なるペプチドを提示することができる。したがって、患者のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプが、抗ＦＶＩＩＩ抗体を発生する危険性に影響を及ぼす可能性が高い。実際に、いくつかの研究は、ヒトＭＨＣクラスＩＩハプロタイプＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１と抗ＦＶＩＩＩ抗体発生の危険性の増加との相関が存在することを示している（Ｐａｖｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７：２００６−２０１５（２００９）（非特許文献２）、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：２３８−２４２（１９９７）（非特許文献３）、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：２３４−２３７（１９９７）（非特許文献４））。
【０００７】
特定のアプローチが、ＦＶＩＩＩタンパク質投与による血友病の治療に関連する困難に対処するために研究されている。例えば、ＷＯ  ０３／０８７１６１（特許文献１）は、タンパク質上に存在する潜在的Ｔ細胞エピトープの数を減少または排除することによってＦＶＩＩＩタンパク質の免疫特性が改変された、改変ＦＶＩＩＩタンパク質を開示している。ＦＶＩＩＩタンパク質に沿ってＴ細胞エピトープを含む複数の領域が特定されているが、これには例えばＦＶＩＩＩ２０３０−２０４４が含まれる。この開示によると、そのような領域の除去は、抗ＦＶＩＩＩ抗体の生成を誘導しない機能的ＦＶＩＩＩタンパク質を提供するために使用できる。また、ＷＯ  ０９／０７１８８６（特許文献２）も、患者の免疫応答に関与するＨＬＡ−ＤＲ２結合ペプチドを生じると予想されるＦＶＩＩＩタンパク質の特定の領域、例えば、ＦＶＩＩＩ４７５−４９５、ＦＶＩＩＩ５４２−５６２、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５、およびＦＶＩＩＩ２１５８−２１７８を開示している。これらのペプチドは、患者の免疫寛容の誘導における使用可能性のために特定された。
【０００８】
免疫応答に関与するＦＶＩＩＩタンパク質の領域の特定においては進歩が見られるが、例えば、血友病Ａなどを有する患者を治療するために使用することができる他の治療用ペプチドおよび手法を開発するために使用することができるＦＶＩＩＩタンパク質の他の領域を特定する必要性は依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０８７１６１
【特許文献２】ＷＯ  ０９／０７１８８６
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７１−２８２（２００６）
【非特許文献２】Ｐａｖｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７：２００６−２０１５（２００９）
【非特許文献３】Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：２３８−２４２（１９９７）
【非特許文献４】Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：２３４−２３７（１９９７）
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＦＶＩＩＩ分子に対する免疫応答に関連するＦＶＩＩＩタンパク質の領域の特定に基づく。より具体的には、ＦＶＩＩＩタンパク質のその領域を含むＦＶＩＩＩペプチドは、血友病Ａなどを有する患者において、ヒトＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導するために使用することができる。さらに、このＦＶＩＩＩペプチドは、免疫診断目的で、補充療法中および免疫寛容誘導療法中の血友病Ａを有する患者をモニターするために使用することもできる。
【００１２】
一態様において、本発明は、それを必要とする対象においてＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する方法を提供し、この方法は、該対象に、（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙからなるアミノ酸配列を有するペプチドの治療有効量を投与するステップを含み、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である。
【００１３】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１４】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００１５】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１６】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１７】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００１８】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１９】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２０】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２１】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００２２】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２３】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２４】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２５】
上記で提供される方法の一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００２６】
上記で提供される方法の一実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【００２７】
上記で提供される方法の一実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【００２８】
上記で提供される方法の一実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【００２９】
上記で提供される方法の一実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【００３０】
上記で提供される方法の一実施形態において、ペプチドは９〜１００個のアミノ酸からなる。
【００３１】
上記で提供される方法の一実施形態において、ペプチドは９〜５０個のアミノ酸からなる。
【００３２】
上記で提供される方法の一実施形態において、ペプチドは９〜２５個のアミノ酸からなる。
【００３３】
上記で提供される方法の一実施形態において、薬学的組成物の投与は、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生を防止する。
【００３４】
上記で提供される方法の一実施形態において、薬学的組成物の投与は、対象中に存在する抗ＦＶＩＩＩ抗体の量を減少させる。
【００３５】
一態様において、本発明は、アミノ酸配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙからなり、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ペプチドを提供する。
【００３６】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００３７】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００３８】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００３９】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４０】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００４１】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４２】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４３】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４４】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４４の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００４５】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４６】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４７】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４８】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列と同一のアミノ酸配列である。
【００４９】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【００５０】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【００５１】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【００５２】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【００５３】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ペプチドは９〜１００個のアミノ酸からなる。
【００５４】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ペプチドは９〜５０個のアミノ酸からなる。
【００５５】
上記で提供されるペプチドの一実施形態において、ペプチドは９〜２５個のアミノ酸からなる。
【００５６】
一態様において、本発明は、本明細書に記載するペプチドを含む組成物を提供する。
【００５７】
上記で提供される組成物の一実施形態において、組成物は薬学的投与のために製剤化される。
【００５８】
上記で提供される組成物の一実施形態において、組成物は第２のポリペプチドをさらに含み、該第２のポリペプチドは、アミノ酸配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙからなり、式中、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。
【００５９】
一態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチドを作製する方法を提供し、この方法は、(ａ）請求項２４〜４１のいずれか１項に記載のＦＶＩＩＩペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の培養物を供給するステップ、および(ｂ）該細胞の培養物において該ペプチドを発現させるステップを含む。
【００６０】
一態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチド特異的Ｔ細胞を特定する方法を提供し、この方法は、(ａ）ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成した該ペプチドと複数のＣＤ４＋Ｔ細胞を混合するステップであって、該ペプチドが、請求項２４〜４１のいずれか１項に記載のＦＶＩＩＩペプチドである、ステップ、および(ｂ）ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成した該ペプチドに対して特異的な該複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のメンバーのうちの少なくとも１つを特定するステップを含む。
【００６１】
上記で提供される方法の一実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ多量体はＭＨＣクラスＩＩ四量体である。
【００６２】
上記で提供される方法の一実施形態において、ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ多量体は、検出可能部分をさらに含む。
【００６３】
上記で提供される方法の一実施形態において、方法は、当該ペプチドに対して特異的な少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップをさらに含む。
【００６４】
上記で提供される方法の一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はフローサイトメトリーを用いて単離される。
【００６５】
一態様において、本発明は、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドと第２のペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
【００６６】
上記で提供される方法の一実施形態において、第２のペプチドはレポーターペプチドである。
【００６７】
上記で提供される方法の一実施形態において、融合タンパク質は核酸によってコードされる。
【００６８】
上記で提供される方法の一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは第２のペプチドと化学的に連結している。
【００６９】
一態様において、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドを使用して、ＦＶＩＩＩ阻害物質の発生を防止するためにヒトＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する。
【００７０】
一態様において、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドを使用して、確立されたＦＶＩＩＩ阻害物質を有する患者を治療するためにヒトＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導する。
【００７１】
一態様において、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドを使用して、補充療法中または免疫寛容誘導療法中の患者の免疫モニタリングにおけるＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の直接染色に好適な試薬（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ多量体またはＭＨＣクラスＩＩ四量体）を作成する。
【００７２】
一態様において、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドを使用して、抗原特異的Ｔ細胞を特定する。一実施形態において、これらの試薬を使用して、インビトロ環境およびエクスビボ環境でＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を追跡することができる。別の実施形態において、これらの試薬を使用して、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を単離し、さらに特徴付けることができる。一実施形態において、これらの目的で蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）または単一細胞ＰＣＲを使用することができる。
【００７３】
一態様において、免疫寛容誘導療法中のＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の免疫モニタリングに、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドを使用することができる。
【００７４】
一態様において、ＦＶＩＩＩ治療中のＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の免疫モニタリングに、明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドを使用することができる。
【００７５】
一態様において、本明細書において提供されるＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩ阻害物質を阻止するための新しい免疫調節薬の臨床開発において、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の免疫診断に使用される。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、例えば血友病Ａを有する患者において、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する寛容を誘導するために使用することができる可第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ペプチドに関する。さらに、このペプチドは、補充療法中および免疫寛容誘導療法中の血友病Ａを有する患者におけるＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞をモニターするために、免疫診断目的で使用することもできる。
【００７７】
本発明は、部分的に、ＦＶＩＩＩのいくつかの領域、具体的にはＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、およびＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４が、第ＶＩＩＩ因子補充療法中にＦＶＩＩＩタンパク質に対して開始される免疫応答に関与する、あるいは後天性血友病と関連するという発見に基づく。特定されたそれらの領域のアミノ酸配列は、それぞれ
2014505014.tif 000002
である。本発明は、これらのＦＶＩＩＩタンパク質領域の初めての特定、およびそれらの領域とＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫応答との関係を提供すると考えられている。
【００７８】
本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、患者の免疫応答に関与するＴ細胞によって認識可能なＴ細胞エピトープを生成する領域であるＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、およびＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４の少なくとも一部を有するペプチドを含む。一部の実施形態において、このペプチドは、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４中の９個の連続アミノ酸に対応する、少なくとも９個の連続アミノ酸を含む。下記でさらに説明するように、本明細書において提供されるペプチドは、９アミノ酸長よりも長いペプチド、ならびにＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、およびＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４配列の変異体も含む。本発明のペプチドのそのような特定は、血友病Ａなどの血液凝固に関連する疾患を治療するための治療方針の改善および発展に影響を与え得る。
【００７９】
ＩＩ．定義
「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」または「ＦＶＩＩＩタンパク質」という用語は、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷であり、天然のヒトＦＶＩＩＩタンパク質に関連する生物活性を示す、あらゆるＦＶＩＩＩ分子を指す。ＦＶＩＩＩ分子は、全長ＦＶＩＩＩであってよい。また、ＦＶＩＩＩ分子は、天然のＦＶＩＩＩの保存的に改変された変異体であってもよい。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト血漿由来であっても、組換え技術によって生成されたものでもよい。ＦＶＩＩＩタンパク質のさらなる特徴付けは、例えば、米国特許第２０１０／０１６８０１８号の段落［００４２］〜［００５５］に記載されており、これは参照により本明細書に援用される。
【００８０】
「第ＶＩＩＩ因子ペプチド」または「ＦＶＩＩＩペプチド」という用語は、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答において重要であることが発見されたＦＶＩＩＩタンパク質の領域に対応するアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されるペプチドを指す。ＦＶＩＩＩペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質と複合体を形成して免疫応答に関与するＴ細胞に提示される、少なくとも９個のアミノ酸を含む。このペプチドの少なくとも９個のアミノ酸コアのいずれか一端に付加的なアミノ酸が存在してもよい。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、天然のヒトＦＶＩＩＩタンパク質の特定の領域と同一の配列を含んでもよい。他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質の領域の保存的に改変された変異体であってもよい。本明細書においてさらに説明するように、ＦＶＩＩＩペプチドは、天然ヒトＦＶＩＩＩタンパク質の領域の配列に対する特定の同一性パーセント、例えば８５％同一などによって特徴付けることができる。
【００８１】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、および天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を含む非天然アミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸には、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびにのちに修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンがある。天然に存在するアミノ酸は、例えば、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を含み得る。本明細書において使用するアミノ酸は、非天然アミノ酸も含んでよい。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合した任意の炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、またはメチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸は、本明細書において、一般に知られている３文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字表記のいずれかで言及することがある。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に認められている１文字コードで言及することがある。
【００８２】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸の両配列に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重により、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のペプチドをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定される全ての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく記載した対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に改変された変異の一種である。本明細書におけるポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、その核酸の全ての考えられるサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して機能的に同一な分子が得られることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現産物については記載した各配列に暗示されるが、実際のプローブ配列についてはそうではない。
【００８３】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな比率のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる、核酸もしくはペプチド配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変更によってアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸に置換することになる「保存的に改変された変異体」であることを理解するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表は、当技術分野で周知である。保存的に改変されたそのような変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを排除するものではない。
【００８４】
以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換体であるアミノ酸を含む：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい。
【００８５】
２つ以上の核酸配列またはペプチド配列に関連して、「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを後述のデフォルトパラメータで用いて、あるいは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定したときに、同じであるか、または指定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（すなわち、比較ウインドウまたは指定領域にわたって比較し、最大限の一致が得られるようにアラインメントしたときの、指定領域にわたる約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００８６】
「治療有効量もしくは用量」または「十分な量もしくは用量」は、本明細書において、投与した目的の効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、治療の目的によって異なり、既知の手法を用いて当業者により確定可能である（例えば、Ａｕｇｓｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｈｏａｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，３ｒｄ  Ｅｄ．２００８）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（３ｒｄ  Ｅｄ．，２００８）、Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（８ｔｈ  Ｅｄ．，２００７）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，２００５，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。
【００８７】
ＩＩＩ．ＦＶＩＩＩペプチド
本発明は、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答に関与するＦＶＩＩＩタンパク質の領域に対応するＦＶＩＩＩペプチドに関連する。一態様において、本発明は、アミノ酸配列：
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のうちの１つにおける９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなるＦＶＩＩＩペプチドであって、９〜１８０個のアミノ酸からなるＦＶＩＩＩペプチドを提供する。
【００８８】
具体的な実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。一実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【００８９】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【００９０】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【００９１】
一般に、本発明のＦＶＩＩＩペプチドは、特定された領域のＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４、あるいは例えば、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４と類似する、または同一の保持された機能を有することができる改変された変異体中に存在する任意のアミノ酸配列を含んでもよい。とりわけ、本発明のＦＶＩＩＩペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含むアミノ酸の配列を含む。ＦＶＩＩＩペプチドは、アミノ酸配列
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に対するパーセント同一性に幅があってもよい、少なくとも９個のアミノ酸の配列を含む。例えば、ＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４中の任意の９個の連続するアミノ酸と同一、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは８５％同一である９個のアミノ酸を有してもよい。
【００９２】
別の実施形態群において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９個のアミノ酸よりも長いアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４中の連続するアミノ酸の配列と同一、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であってもよい領域を含む。当業者は、アラニン置換などの既知の突然変異誘発技術を用いて、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４領域の機能を保持する改変された変異体を特定できることを理解するであろう。
【００９３】
さらに、ＦＶＩＩＩペプチドは、上述のＦＶＩＩＩペプチドのコア配列のいずれか一端に付加的なアミノ酸配列をさらに含んでもよい。この付加的な配列は、（Ｒ１）ｘおよび（Ｒ２）ｙと指定される。特定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、１〜約８０の範囲のアミノ酸長であってよい。あるいは、Ｒ１およびＲ２は、１〜約４０の範囲のアミノ酸長であってよい。特定の実施形態において、添字ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。さらに他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。いずれか一端の付加的なアミノ酸は、様々な目的で付加することができ、これにはペプチドの安定性の増加、ＭＨＣクラスＩＩ分子および／またはＴ細胞との結合の向上、ならびに当業者が理解するであろう他の態様が含まれる。
【００９４】
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、表１において特定される第ＶＩＩＩ因子領域の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。あるいは、Ｒ１およびＲ２は、１〜約４０の範囲のアミノ酸長であってよい。一実施形態において、Ｐは、表１において特定される第ＶＩＩＩ因子領域の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｐは、表１において特定される第ＶＩＩＩ因子領域の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。
【００９５】
（表１）Ｔ細胞エピトープを含むＦＶＩＩＩの領域
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【００９６】
上述のように、本発明のＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４の特定された領域、あるいは例えば、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４と類似する、または同一の保持された機能を有することができる改変された変異体中に存在する任意のアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態において、このペプチドは、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質のＢドメイン全体を包含してもよい。また、本発明は、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000006
のうちのいずれか１つに対するパーセント同一性に幅があってもよい、少なくとも９個のアミノ酸の配列を有するペプチドを含む、他のＦＶＩＩＩペプチドも含み得る。
【００９７】
例えば、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２中の任意の９個の連続するアミノ酸と同一、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは８５％同一である９個のアミノ酸を有する、ＦＶＩＩＩペプチド。別の実施形態群において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９個のアミノ酸よりも長いアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２中の任意の９個の連続するアミノ酸と同一、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であってもよい。当業者は、アラニン置換などの既知の突然変異誘発技術を用いて、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２領域の機能を保持する改変された変異体を特定できることを理解するであろう。本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４に関連してＦＶＩＩＩペプチドについて上述した方法を用いて作成することができる。
【００９８】
Ａ．第ＶＩＩＩ因子１０２−１１９ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000007
を有する第ＶＩＩＩ因子１０２−１１９ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【００９９】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000008
を有する第ＶＩＩＩ因子１０２−１１９ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１００】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１０１】
特定の実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１０２】
（表２）例示的ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド
2014505014.tif 000009
【０１０３】
Ｂ．第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000010
を有する第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１０４】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000011
を有する第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000012
を有する第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜１４６から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜１４６から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１０５】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１０６】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１０７】
（表３）例示的ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド
2014505014.tif 000013
2014505014.tif 000014
2014505014.tif 000015
【０１０８】
Ｃ．第ＶＩＩＩ因子４７４−４９４ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000016
を有する第ＶＩＩＩ因子４７４−４９４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１０９】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000017
を有する第ＶＩＩＩ因子４７４−４９４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000018
を有する第ＶＩＩＩ因子４７４−４９４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７〜２３７から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７〜２３７から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７〜２３７から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７〜２３７から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１１０】
特定の実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１１１】
（表４）例示的ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド
2014505014.tif 000019
2014505014.tif 000020
2014505014.tif 000021
【０１１２】
Ｄ．第ＶＩＩＩ因子５４０−５６０ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000022
を有する第ＶＩＩＩ因子５４０−５６０ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１１３】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000023
を有する第ＶＩＩＩ因子５４０−５６０ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000024
を有する第ＶＩＩＩ因子５４０−５６０ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８〜３２８から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８〜３２８から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８〜３２８から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８〜３２８から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１１４】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１１５】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１１６】
（表５）例示的ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド
2014505014.tif 000025
2014505014.tif 000026
【０１１７】
Ｅ．第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000027
を有する第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１１８】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000028
を有する第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000029
を有する第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９〜４６４から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９〜４６４から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９〜４６４から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２９〜４６４から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１１９】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１２０】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１２１】
（表６）例示的ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド
2014505014.tif 000030
2014505014.tif 000031
2014505014.tif 000032
【０１２２】
Ｆ．第ＶＩＩＩ因子１７８５−１８０５ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000033
を有する第ＶＩＩＩ因子１７８５−１８０５ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000034
を有する第ＶＩＩＩ因子１７８５−１８０５ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０１２３】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000035
を有する第ＶＩＩＩ因子１７８５−１８０５ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６５〜５５５から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６５〜５５５から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６５〜５５５から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６５〜５５５から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１２４】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１２５】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１２６】
（表７）例示的ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド
2014505014.tif 000036
2014505014.tif 000037
2014505014.tif 000038
【０１２７】
Ｇ．第ＶＩＩＩ因子２０２５−２０４５ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000039
を有する第ＶＩＩＩ因子２０２５−２０４５ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１２８】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000040
を有する第ＶＩＩＩ因子２０２５−２０４５ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000041
を有する第ＶＩＩＩ因子２０２５−２０４５ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５６〜６４６から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５６〜６４６から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５６〜６４６から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５６〜６４６から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１２９】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１３０】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１３１】
（表８）例示的ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド
2014505014.tif 000042
2014505014.tif 000043
【０１３２】
Ｈ．第ＶＩＩＩ因子２１６０−２１８０ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000044
を有する第ＶＩＩＩ因子２１６０−２１８０ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１３３】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000045
を有する第ＶＩＩＩ因子２１６０−２１８０ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000046
を有する第ＶＩＩＩ因子２１６０−２１８０ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４７〜７３７から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４７〜７３７から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４７〜７３７から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４７〜７３７から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１３４】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１３５】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１３６】
（表９）例示的ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド
2014505014.tif 000047
2014505014.tif 000048
2014505014.tif 000049
【０１３７】
Ｉ．第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチド
一実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有するポリペプチドであって、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000050
を有する第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ポリペプチドを提供する。
【０１３８】
一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000051
を有する第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、配列：
2014505014.tif 000052
を有する第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０１３９】
本発明に関して、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドは、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチドも含む。したがって、一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５および７３８〜７７３から選択される配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５および７３８〜７７３から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５および７３８〜７７３から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である。一実施形態において、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５および７３８〜７７３から選択されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ｘおよびｙはともに０であってよい。他の実施形態において、ｘは１であってよく、ｙは０であってよい。他の実施形態において、ｘは０であってよく、ｙは１であってよい。さらに別の実施形態において、ｘおよびｙはともに１であってよい。
【０１４０】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１４１】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１４２】
（表１０）例示的ＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチド
2014505014.tif 000053
【０１４３】
ＩＶ．ＦＶＩＩＩペプチドを生成する方法
別の態様において、本発明は、さらにＦＶＩＩＩペプチドを生成する方法に関する。一部の実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩペプチドは、当分野で一般に知られる固相（例えば、Ｆｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ）あるいは液相合成技術を用いて生成することができる。例えば、Ｃｈａｎ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｅｄｓ．，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００５）、Ｈｏｗｌ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）を参照されたい。
【０１４４】
一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチドを作成する方法を含み、この方法は、(ａ）固相または液相合成技術を用いてペプチドを合成するステップを含み、このＦＶＩＩＩペプチドは、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。一実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。特定の実施形態において、このペプチドは、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質のＢドメイン全体を包含してもよい。
【０１４５】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１４６】
他の実施形態において、ペプチドは、組換え技術を用いて生成することができる。一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチドを作成する方法を含み、この方法は、(ａ）ＦＶＩＩＩペプチドをコードするベクターを含む細胞の培養物を供給するステップであって、該ＦＶＩＩＩペプチドが配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ステップを含む。一実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。特定の実施形態において、このペプチドは、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質のＢドメイン全体を包含してもよい。
【０１４７】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１４８】
一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチドを作成する方法を提供し、この方法は、(ａ）ＦＶＩＩＩペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の培養物を供給するステップであって、該ＦＶＩＩＩペプチドが配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ステップ、ならびに(ｂ）該細胞の培養物において該ペプチドを発現させるステップを含む。
【０１４９】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１５０】
ＦＶＩＩＩペプチドを生成するための方法の一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１５１】
本発明のＦＶＩＩＩペプチドは、好適な原核細胞または真核細胞の宿主システムにおける発現によって生成することができる。真核細胞の例には、限定するものではないが、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２；昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞；ならびに酵母細胞、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞がある。一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞などで発現させてもよい。一部の実施形態において、ペプチドは、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株で発現させてもよい。特定の一実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞株である。
【０１５２】
幅広い種類のベクターをＦＶＩＩＩペプチドの発現に使用することができ、また真核細胞および原核細胞発現ベクターから選択することができる。ベクターは、本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドのうちの少なくとも１つの発現に必要なヌクレオチド配列を含むことになる。原核細胞発現用のベクターの例には、プラスミド、例えばｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどがあり、原核細胞発現ベクターに使用されるプロモータには、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどがある。真核細胞発現用のベクターの例には、（ｉ）酵母における発現の場合、ベクター、例えばｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴにプロモータ、例えばＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などを使用；（ｉｉ）昆虫細胞における発現の場合、ベクター、例えばｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどにプロモータ、例えばＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどを使用、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞における発現の場合、ベクター、例えばｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなど、およびウイルス系、例えばワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどに由来するベクターにプロモータ、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチンを使用などがある。
【０１５３】
本発明の一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドを生成するための核酸配列は、当業者に一般に知られている、タンパク質の制御された発現に好適な他の配列、例えばプロモータ配列、エンハンサ、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限部位、ポリＡ配列、タンパク質プロセシング配列、選択マーカなどをさらに含む。
【０１５４】
ＦＶＩＩＩペプチドを生成する細胞に使用する培養培地は、当分野で周知の好適な基本培地、例えばＤＭＥＭ、Ｈａｍ'ｓ  Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、ＭｃＣｏｙ、またはＲＰＭＩに基づいていてよい。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩、ならびに炭水化物源を含む、複数の成分を含んでもよい。各成分は、細胞の培養を援助する量、例えば当業者に一般に知られている量で存在してよい。培地は、補助物質、例えば緩衝物質、例えば、重炭酸ナトリウム、抗酸化剤、機械的応力の影響を軽減するための安定剤、またはプロテアーゼ阻害物質を含んでもよい。必要であれば、非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーおよび／または混合物を添加してもよい。
【０１５５】
一部の実施形態において、培養培地は、外因的に添加されたタンパク質を含まない。「タンパク質非含有」および関連する用語は、成長中にタンパク質を自然に放出する培養物中の細胞に対して外因的なタンパク質、またはそのような細胞以外に起源を持つタンパク質に関する。別の実施形態において、培養培地はポリペプチドを含まない。別の実施形態において、培養培地は血清を含まない。別の実施形態において、培養培地は動物性タンパク質を含まない。別の実施形態において、培養培地は動物性要素を含まない。別の実施形態において、培養培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清などの血清由来の動物性タンパク質を含む。別の実施形態において、培養物は、外因的に添加された組換えタンパク質を有する。別の実施形態において、このタンパク質は、認定された病原体除去動物に由来する。
【０１５６】
動物性タンパク質を含まない化学的に定義された培養培地を調製する方法は、当分野で既知であり、例えば、米国特許第２００８／０００９０４０号および米国特許第２００７／０２１２７７０号に記載されており、これら両特許は、あらゆる目的で本明細書に援用される。一実施形態において、本明細書に記載の方法において使用する培養培地は、動物性タンパク質非含有培地またはオリゴペプチド非含有培地である。特定の実施形態において、培養培地は、化学的に定義されていてもよい。本明細書において使用するとき、「化学的に定義された」という用語は、培地がいかなる定義されていないサプリメント、例えば、動物性要素、器官、腺、植物、または酵母の抽出物も含まないことを意味するものである。したがって、化学的に定義された培地の各要素は正確に定義される。
【０１５７】
特定の実施形態において、本発明の方法は、例えば、回分法、半回分法、流加回分法、または連続法で操作される細胞培養システムの使用を含んでもよい。回分培養は、タンクまたは発酵槽内で細胞接種材料を最大密度まで培養し、１回分として採取および処理する大規模細胞培養であってもよい。流加回分培養は、新鮮な栄養素（例えば、増殖制限基質）または添加物（例えば、生成物の前駆体）のいずれかが供給される回分培養であってよい。連続培養は、培養物の体積が通常は一定である、新鮮培地の流入により栄養素が連続的に供給される懸濁培養であってよい。同様に、連続発酵とは、新鮮培地の連続的添加によって、細胞または微生物が培養物中で対数増殖期に維持され、バイオリアクタから細胞懸濁液を除去することによって正確に均衡が保たれるプロセスを指し得る。さらに、攪拌タンク反応器システムは、懸濁培養、灌流培養、ケモスタット培養、および／またはマイクロキャリア培養に使用することができる。一般に、攪拌タンク反応器システムは、Ｒｕｓｈｔｏｎ、水中翼、傾斜翼、またはマリンなどの任意のタイプの攪拌装置を備える、いかなる従来の攪拌タンク反応器として操作してもよい。
【０１５８】
特定の実施形態において、本発明の細胞培養方法は、マイクロキャリアの使用を含んでもよい。一部の実施形態において、実施形態の細胞培養は、培養物の高い体積比表面積を提供するのに好適な条件下、大型バイオリアクタで実施して、高い細胞密度およびタンパク質発現を達成することができる。そのような成長条件を提供するための手段の１つは、攪拌タンクバイオリアクタ内での細胞培養にマイクロキャリアを使用することである。マイクロキャリア上での細胞成長の概念は、ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ（ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ，Ａ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２１６：６４−５（１９６７））によって最初に記載されたが、これは成長倍地に懸濁した小さい固形粒子の表面への細胞接着を可能にする。これらの方法は、高い表面積対体積比を提供し、それにより効率的な栄養利用を可能にする。さらに、真核細胞株での分泌タンパク質の発現について、表面積対体積比の増加は、高レベルの分泌、ひいては培養上澄み中のより高いタンパク質収量を可能にする。最後に、これらの方法は、真核細胞発現培養の容易なスケールアップを可能にする。
【０１５９】
ＦＶＩＩＩペプチドを発現する細胞は、細胞培養成長中に球状または多孔性のマイクロキャリアに結合させてもよい。マイクロキャリアは、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン、およびセルロースなどに基づくマイクロキャリアの群から選択されるマイクロキャリアであってよい。細胞を球状マイクロキャリア上でバイオマスに成長させ、その細胞が最終的発酵槽バイオマスに達したときに、多孔性マイクロキャリア上の発現タンパク質を生成する前に、その細胞を継代培養すること、またはその逆も可能である。好適な球状マイクロキャリアは、滑面マイクロキャリア、例えばＣｙｔｏｄｅｘ（商標）  １、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）  ２、およびＣｙｔｏｄｅｘ（商標）  ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ならびにマクロ多孔性マイクロキャリア、例えばＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）  １、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）  ２、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）  １、およびＣｙｔｏｌｉｎｅ（商標）  ２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含み得る。
【０１６０】
当業者は、上述の合成法および／または組換え法によって生成されたＦＶＩＩＩペプチドが、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸、例えばアミノ酸類似体および／またはアミノ酸模倣体を含んでもよいことを理解するであろう。
【０１６１】
Ｖ．免疫寛容を誘導するための第ＦＶＩＩＩ因子ペプチド組成物
別の態様において、本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドは、薬学的組成物に含まれていてもよい。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される、第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチド、第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチド、または第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【０１６２】
一実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチドを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチド、または第２のＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチドをさらに含む。
【０１６３】
別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチド、または第２のＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチドをさらに含む。
【０１６４】
別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、または第２のＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドをさらに含む。
【０１６５】
具体的な実施形態において、本発明は、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１６６】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１６７】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１６８】
具体的な実施形態において、薬学的組成物は第２のポリペプチドをさらに含み、該第２のポリペプチドは、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。一実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１６９】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１７０】
一実施形態において、第２のＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、第２のＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、第２のＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、第２のＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、第２のＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１７１】
Ａ．投与
組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様において、組成物は１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。「薬学的に」または「薬理学的に」許容可能なという表現は、安定であり、タンパク質またはペプチド分解、例えば凝集および切断産物を抑制し、さらに後述のように当分野で周知の経路を用いて投与したときにアレルギー反応または他の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容可能な担体」には、あらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
【０１７２】
薬学的組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧によって、経膣的に、直腸に、または頭蓋内注射によって投与することができる。本明細書において使用するとき、非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射または注入手法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射による投与、および／または特定の部位における外科的移植も想定されている。一般に、組成物は、発熱因子、およびレシピエントに害を与え得る他の不純物を本質的に含まない。
【０１７３】
投薬量および投与頻度は、例えば、患者の血友病の重症度、および／またはより高用量またはより低用量を用いて免疫寛容がより有効に誘導されるかどうかを含む、当業者に一般に認識されている様々な因子に応じて異なる。通常の１日用量は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇであってよい。１週間当たりＦＶＩＩＩペプチド０．０７〜７００ｍｇの範囲の用量は、有効であり、かつ良好な耐容性を示すが、さらに高い１週間の用量も適切であり得、および／または良好な耐容性を示し得る。適切な用量を規定する際の主な決定要素は、特定の状況で治療上有効であるために必要な特定のＦＶＩＩＩペプチドの量である。より長く持続する免疫寛容を達成するためには、反復投与が必要となり得る。この組成物の単回または複数回投与は、治療する医師によって選択された用量レベルおよびパターンで実施することができる。
【０１７４】
一態様において、本発明の組成物をボーラス投与してもよい。別の例として、ＦＶＩＩＩペプチドを１回のみの用量として投与してもよい。当業者は、適正な医療行為および個々の患者の臨床症状によって決定された有効な投薬量および投与計画を容易に最適にするであろう。投与頻度は、投与経路により異なる。最適な薬学的組成物は、投与経路および所望の投薬量に応じて当業者が決定する。例えば、開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ），２１ｓｔ  Ｅｄ．（２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照されたい。このような組成物は、投与した薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与える。投与経路に応じて、好適な用量は、体重、体表面積、または器官の大きさによって算出される。適切な投薬量は、適切な用量反応データと併せて、投薬量の血中レベルを決定するための確立されたアッセイを使用することによって確定することができる。最終的な投薬計画は、薬物の作用を変化させる様々な要素、例えば薬物の比活性、損傷の重症度および患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性別、および食習慣、あらゆる感染症の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要素を考慮して、担当医師が決定する。
【０１７５】
一部の実施形態において、本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドを含む組成物は、投与前に凍結乾燥される。凍結乾燥は、当分野で一般的な技術を用いて実施し、例えば、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２１：１９１−２００（２００４）およびＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：２４３−９（１９９６）に記載されているように、作製する組成物に対して最適化すべきである。薬学的組成物を調製する方法は、凍結乾燥前に混合物に安定化剤を添加するステップ、増量剤、浸透圧調節剤、および界面活性剤のうちの少なくとも１つの作用剤を凍結乾燥前に混合物に添加するステップ、のうちの１つまたは複数のステップを含んでもよい。凍結乾燥製剤は、一態様において、緩衝剤、増量剤、および安定剤のうちの１つまたは複数から少なくとも構成される。この態様において、凍結乾燥ステップ中または再構成中に凝集が問題になる場合には、界面活性剤の有用性を評価し、選択する。凍結乾燥中に、製剤を安定領域のｐＨ内に維持するために、適切な緩衝剤が含まれる。
【０１７６】
凍結乾燥材料の標準的再構成技法は、ある体積の注射用純水または滅菌水（ＷＦＩ）（通常は凍結乾燥時に除去された体積と等しい）を追加して戻すものであるが、非経口投与用の医薬品の製造時には抗菌剤の希薄溶液を使用する場合もある。したがって、凍結乾燥ＦＶＩＩＩペプチド組成物に希釈剤を添加するステップを含む、再構成ＦＶＩＩＩペプチド組成物の調製のための方法が提供される。
【０１７７】
一部の実施形態において、凍結乾燥材料を水溶液として再構成してもよい。様々な水性担体、例えば、注射用滅菌水、複数回投与用の場合の保存料を含む水、または適切な量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性化合物を含有する水性懸濁液）。種々の態様において、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、限定するものではないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、およびアカシアガムであり；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、限定するものではないが、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えば、限定するものではないが、ポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えば、限定するものではないが、ヘプタデカエチル−エネオキシセタノール（ｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトールとから得られる部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトール無水物とから得られる部分エステルとの縮合物、例えば、限定するものではないが、ポリエチレンソルビタンモノオレエートである。種々の態様において、水性懸濁液は、１つまたは複数の保存料、例えば、限定するものではないが、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を含有する。
【０１７８】
ＶＩ．治療方法
本発明は、さらに、ＦＶＩＩＩタンパク質に関連する疾患、例えば、血友病Ａまたは後天性血友病を有する患者を治療する方法に関する。このような方法は、本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドのうちの少なくとも１つの投与を含んでもよい。とりわけ、該ＦＶＩＩＩペプチドのうちの少なくとも１つを含む薬学的組成物は、患者においてＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容を誘導するために投与することができる。
【０１７９】
一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導するための方法は、ＦＶＩＩＩ投与後の、ＦＶＩＩＩ阻害物質発生の防止を含んでもよい。「防止すること」という用語は、実質的に検出可能なＦＶＩＩＩに対する免疫応答が生じないようにすることを指す。例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質投与前の患者は、いかなる検出可能な抗ＦＶＩＩＩ抗体も有さないかもしれない。しかしながら、ＦＶＩＩＩタンパク質による投与療法後、免疫寛容を誘導するためにＦＶＩＩＩペプチドを投与しなかった場合、検出可能な抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが増加する可能性がある。本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドの投与は、免疫寛容を誘導し、それによって血友病を有する患者を治療することができる。
【０１８０】
他の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容を誘導するための方法は、すでに確立されたＦＶＩＩＩ阻害物質を有する患者の治療を含んでもよい。これらの実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドの投与により、抗ＦＶＩＩＩ抗体を減少させる、またはその存在を排除することができる。「減少/低下させる」という用語は、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫応答の部分的低下を意味する。特定の実施形態において、免疫応答を低下させることは、ＦＶＩＩＩペプチドの投与前の患者における免疫応答のレベルと比較して、免疫応答の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低下を含み得る。例えば、低下率は、ＦＶＩＩＩペプチドの投与前後の血液中に存在する抗ＦＶＩＩＩ抗体の量を、存在するＦＶＩＩＩ抗体の量を特定するための標準的方法を用いて測定することによって分析することができる。他の実施形態において、免疫応答の低下は、ＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＦＶＩＩＩ抗体を分泌するＦＶＩＩＩ特異的Ｂ細胞、あるいはＴ細胞、Ｂ細胞、および抗ＦＶＩＩＩ抗体の３つ全ての組み合わせのレベルの減少を測定することを含み得る。免疫細胞、例えばＦＶＩＩＩに対して特異的なＴ細胞およびＢ細胞は、当分野で一般に知られている方法を用いて単離することができる。
【０１８１】
一態様において、本発明は、対象においてＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する方法を含み、この方法は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩペプチドを含む治療有効量の薬学的組成物を該対象に投与するステップを含む。具体的な実施形態において、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩペプチドは、第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチド、第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチド、または第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドである。
【０１８２】
一実施形態において、方法は、本明細書に記載される、第ＶＩＩＩ因子２４６−２６６ペプチドを含む治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチド、または第２のＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチドをさらに含む。
【０１８３】
別の実施形態において、方法は、本明細書に記載される第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドを含む治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチド、または第２のＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチドをさらに含む。
【０１８４】
別の実施形態において、方法は、本明細書に記載される第ＶＩＩＩ因子１０２−１２２ペプチドを含む治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む。別の実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ４７４−４９４ペプチド、ＦＶＩＩＩ５４０−５６０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１７８５−１８０５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２０２５−２０４５ペプチド、ＦＶＩＩＩ２１６０−２１８０ペプチド、ＦＶＩＩＩ１０２−１１９ペプチド、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、または第２のＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドをさらに含む。
【０１８５】
一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容を誘導する方法を提供し、この方法は、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１であるペプチドを含む、治療有効量の薬学的組成物を対象に投与し、それによって該対象においてＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容を誘導するステップを含む。特定の実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１８６】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１８７】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１８８】
免疫寛容を誘導する方法は、免疫寛容を誘導するためにいくつかのペプチドを投与することができる併用療法をさらに含んでもよい。一実施形態において、免疫寛容を誘導する方法は、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である少なくとも第２のペプチドの治療有効量を投与し、それによって対象においてＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容を誘導するステップをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。特定の実施形態において、第２のペプチドは、９〜８０個のアミノ酸からなる。別の特定の実施形態において、第２のペプチド中のいかなる付加的なアミノ酸も天然アミノ酸である。別の特定の実施形態において、第２のペプチドは、９〜４０アミノ酸長からなる。具体的な実施形態において、第２のペプチドは、９〜８０アミノ酸長からなり、第２のペプチド中のいかなる付加的なアミノ酸も天然アミノ酸である。
【０１８９】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１９０】
一実施形態において、第２のＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１００個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、９〜５０個のアミノ酸からなる。別の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、９〜２５個のアミノ酸からなる。さらに他の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、９〜１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、１６５個、１７０個、１７５個、または１８０個のアミノ酸からなる。
【０１９１】
投与される薬学的組成物が、ＰがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、または７４０の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であるペプチドを含む、免疫寛容を誘導するための方法の具体的な実施形態において、この組成物は、第２のポリペプチドをさらに含み、該第２のポリペプチドは、配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、６８、１５９、２５０、３４４、４７７、５６８、６５９、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。
【０１９２】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０１９３】
一態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩ補充療法に対して生じた免疫応答の治療用の薬剤を製造するための本明細書に記載されるＦＶＩＩＩの使用を提供する。具体的な実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチドである。関連する態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩ補充療法に対して生じた免疫応答の防止用の薬剤を製造するための本明細書に記載されるＦＶＩＩＩペプチドの使用を提供する。具体的な実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドはＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチドである。
【０１９４】
一態様において、本発明は、薬剤として使用するためのＦＶＩＩＩペプチドを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000054
を有する第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、薬剤として使用するためのポリペプチドを提供する。
【０１９５】
一態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩ補充療法に対して生じた免疫応答の治療用のＦＶＩＩＩペプチドを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000055
を有する第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ＦＶＩＩＩ補充療法に対して生じた免疫応答の治療用のポリペプチドを提供する。
【０１９６】
一態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩ補充療法に対して生じた免疫応答の防止用のＦＶＩＩＩペプチドを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、配列（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、配列：
2014505014.tif 000056
を有する第ＶＩＩＩ因子１４０１−１４２４ペプチドの少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ＦＶＩＩＩ補充療法に対して生じた免疫応答の防止用のポリペプチドを提供する。
【０１９７】
ＶＩＩ．免疫診断
一態様において、本発明は、対象から採取した生物試料におけるＦＶＩＩＩ阻害抗体またはＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の存在またはレベルを特定することによって、ＦＶＩＩＩ補充療法またはＦＶＩＩＩ免疫寛容誘導療法をそれを必要とする該対象においてモニターするための方法を提供する。
【０１９８】
一実施形態において、方法は、それを必要とする対象においてＦＶＩＩＩ補充療法をモニターするための方法を含み、この方法は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドに、該対象からの生物試料を接触させるステップ、および、ＦＶＩＩＩペプチドと試料中に存在するＦＶＩＩＩ阻害抗体との間で形成された複合体を検出するステップを含む。一実施形態において、方法は、試料中のＦＶＩＩＩ阻害抗体のレベルを測定するステップを含む。さらに別の実施形態において、方法は、異なる時期に対象から採取した少なくとも２つの試料中のＦＶＩＩＩ阻害抗体のレベルを測定するステップ、および、これら２つの試料間のＦＶＩＩＩ阻害抗体のレベルを比較するステップを含み、経時的な抗体レベルの増加は、ＦＶＩＩＩ補充療法の過程で該対象に投与されたＦＶＩＩＩに対する免疫応答の成立を示す。
【０１９９】
別の実施形態において、方法は、それを必要とする対象においてＦＶＩＩＩ免疫寛容誘導療法をモニターするための方法を含み、この方法は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドに、該対象からの生物試料を接触させるステップ、および、ＦＶＩＩＩペプチドと試料中に存在するＦＶＩＩＩ阻害抗体との間で形成された複合体を検出するステップを含む。一実施形態において、方法は、試料中のＦＶＩＩＩ阻害抗体のレベルを測定するステップを含む。さらに別の実施形態において、方法は、異なる時期に対象から採取した少なくとも２つの試料中のＦＶＩＩＩ阻害抗体のレベルを測定するステップ、および、これら２つの試料間のＦＶＩＩＩ阻害抗体のレベルを比較するステップを含み、経時的な抗体レベルの減少は、該対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容の成立を示す。
【０２００】
一実施形態において、方法は、それを必要とする対象においてＦＶＩＩＩ補充療法をモニターするための方法を含み、この方法は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドに、該対象からの生物試料を接触させるステップ、および、ＦＶＩＩＩペプチドと試料中に存在するＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞との間で形成された複合体を検出するステップを含む。一実施形態において、方法は、試料中のＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを測定するステップを含む。さらに別の実施形態において、方法は、異なる時期に対象から採取した少なくとも２つの試料中のＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを測定するステップ、および、これら２つの試料間のＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを比較するステップを含み、経時的な抗体レベルの増加は、ＦＶＩＩＩ補充療法の過程で該対象に投与されたＦＶＩＩＩに対する免疫応答の成立を示す。具体的な実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成している。
【０２０１】
別の実施形態において、方法は、それを必要とする対象においてＦＶＩＩＩ免疫寛容誘導療法をモニターするための方法を含み、この方法は、本明細書に記載される、ＦＶＩＩＩ２４６−２６６ペプチド、ＦＶＩＩＩ１４０１−１４２４ペプチド、またはＦＶＩＩＩ１０２−１２２ペプチドに、該対象からの生物試料を接触させるステップ、および、ＦＶＩＩＩペプチドと試料中に存在するＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞との間で形成された複合体を検出するステップを含む。一実施形態において、方法は、試料中のＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを測定するステップを含む。さらに別の実施形態において、方法は、異なる時期に対象から採取した少なくとも２つの試料中のＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを測定するステップ、および、これら２つの試料間のＦＶＩＩＩに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを比較するステップを含み、経時的な抗体レベルの減少は、該対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容の成立を示す。具体的な実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成している。
【０２０２】
当業者に理解されるように、免疫モニタリングを用いて、例えば血友病患者の治療を促進できる。例えば、免疫モニタリングを用いて、本発明のペプチドおよび／または組成物が、ＦＶＩＩＩ製剤に対する免疫応答を予防しているかどうかまたは低下させているかどうかを特定することができる。投与量および／または投与間隔は、免疫モニタリングによって最適化することができる。一部の実施形態において、免疫モニタリングからの抗ＦＶＩＩＩ抗体の阻止または減少の結果に基づいて、投与量を特別に適合させることができる。さらに、投与間隔は、投与量と同様に、個々の患者または患者群に対して決定することができる。
【０２０３】
Ａ．ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を特定する方法
別の態様において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞、より具体的には、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩタンパク質およびＦＶＩＩＩペプチドに対して特異的なＴ細胞を特定する方法を含む。そのような方法は、例えば、患者の免疫モニタリングなどの免疫診断に使用することができる。一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチド特異的Ｔ細胞を特定する方法を含み、この方法は、(ａ）ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成したＦＶＩＩＩペプチドと複数のＣＤ４＋Ｔ細胞を混合するステップであって、該ＦＶＩＩＩペプチドが配列：（Ｒ１）ｘ−Ｐ−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｐが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、３４４、および７４０から選択される配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ステップ、ならびに(ｂ）該ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成した該ペプチドに対して特異的な該複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のメンバーのうちの少なくとも１つを特定するステップを含む。一部の実施形態において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０２０４】
特定の実施形態において、本明細書において開示されるＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の直接染色に好適な試薬を作製するために使用することができる。例えば、本発明のＦＶＩＩＩペプチド中に存在するＭＨＣクラスＩＩ多量体は、ＭＨＣクラスＩＩ四量体などの様々な形態を含み得る。これらのＭＨＣクラスＩＩ分子をさらに改変して、診断用薬を含めてもよい。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成するＦＶＩＩＩペプチドが、診断用薬を含んでもよい。本発明において使用される診断用薬（すなわち、検出可能部分）は、当分野で一般に知られる免疫モニタリング用のものを含み得る。例えば、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ四量体によって提示される、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩペプチドと関連した診断用薬の検出に基づいて、特定および／または単離することができる。好適な診断用薬には、蛍光剤、化学発光剤、放射性物質、造影剤などを含み得る。好適な蛍光剤には、通常フローサイトメトリーに使用されるものが含まれ、フルオレセインイソチオシアネート、Ｒ−フィコエリトリン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびそれらの誘導体を含み得るが、これらに限定されない。
【０２０５】
特定の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドを用いて、インビトロでＣＤ４＋ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を再刺激することができる。これらの実施形態において、Ｔ細胞の再刺激は、増殖、サイトカインもしくはケモカインの分泌、当業者に既知の特定の活性化マーカの上方もしくは下方制御の検出によってモニターできるであろう。
【０２０６】
一部の実施形態において、診断用薬の検出を用いて、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩペプチドに対して特異的なＴ細胞を特定および／または単離することができる。例えば、上記の試薬（例えば、ペプチド、ＭＨＣクラスＩＩ四量体、および診断用薬）を用いて、インビトロまたはエクスビボでＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を追跡することができる。特定の実施形態において、当分野で一般に知られる様々な手法、例えば、フローサイトメトリー、例えば蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、および／またはＰＣＲ、例えば単一細胞ＰＣＲを用いて、Ｔ細胞をさらに単離し、特徴付けることができる。
【０２０７】
免疫モニタリング分析を実施する目的で、ＦＶＩＩＩペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ多量体複合体に結合するＴ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、これは当分野で一般に知られる種々の方法を用いて患者から単離することができる。例えば、Ｔ細胞は、患者の血液、器官、または他の組織から単離し、精製することができる。ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の単離および特定は、種々の免疫診断用途で使用可能である。特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチドまたは関連する試薬は、新しいＦＶＩＩＩ製剤の臨床開発時に、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の免疫モニタリングに使用することができる。他の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、免疫寛容誘導療法中に、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の免疫モニタリングに使用することができる。また他の実施形態において、このＦＶＩＩＩペプチドは、ＦＶＩＩＩ治療中に、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞の免疫モニタリングに使用することができる。
【０２０８】
ＶＩＩＩ．本発明のキット
また、本発明は、本発明によって提供される組成物の使用を容易にするため、および／または標準化するため、また本発明の方法を容易にするためのキットも提供する。これらの様々な方法を実施するための材料および試薬をキットとして提供し、方法の実行を容易にすることができる。本明細書において使用するとき、「キット」という用語は、プロセス、アッセイ、分析、または操作を容易にする物品の組み合わせに関して用いられる。
【０２０９】
キットは、化学試薬（例えば、ＦＶＩＩＩペプチドまたはＦＶＩＩＩペプチドをコードするポリヌクレオチド）、ならびに他の要素を含んでもよい。さらに、本発明のキットは、例えば、試料の回収および／または精製のための器具および試薬、生成物の回収および／または精製のための器具および試薬、細菌細胞形質転換のための試薬、真核細胞トランスフェクションのための試薬、すでに形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、試料管、ホルダー、トレイ、ラック、ディッシュ、プレート、キット使用者に対する使用説明、溶液、緩衝剤、または他の化学試薬、標準化、正規化、および／または対照試料に使用するのに好適な試料も含んでよいが、これらに限定されない。本発明のキットは、便利に保管し、安全に輸送するために、例えば蓋付きの箱に包装してもよい。
【０２１０】
一部の実施形態において、例えば、本発明のキットは、本発明のＦＶＩＩＩペプチド、本発明のＦＶＩＩＩペプチドをコードするポリヌクレオチドベクター（例えば、プラスミド）、ベクターの増殖に好適な細菌細胞株、および発現した融合タンパク質の精製のための試薬を提供してもよい。あるいは、本発明のキットは、ＦＶＩＩＩペプチドの突然変異誘発を実施して、ＦＶＩＩＩペプチドの保存的に改変された変異体を作製するために必要な試薬を提供してもよい。
【０２１１】
キットは、本発明の１つまたは複数の組成物、例えば、１つまたは複数のＦＶＩＩＩペプチド、あるいはＦＶＩＩＩペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含んでもよい。あるいは、キットは、患者の免疫モニタリングを実施するための試薬（例えば、ペプチド、ＭＨＣクラスＩＩ四量体、および診断用薬）を含んでもよい。
【０２１２】
また、本発明のキットは、同じでも異なってもよいＦＶＩＩＩペプチドをコードする１つまたは複数の組換え核酸分子を含んでもよく、また例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはリコンビナーゼ認識部位を含むまたはコードする、作用可能に連結した第２のポリヌクレオチド、または任意の対象ポリペプチドをさらに含んでもよい。さらに、キットの構成要素、特にキットに含まれる本発明の組成物を使用するための使用説明を含んでもよい。
【０２１３】
ＩＸ．具体的な実施形態
一実施形態において、本発明は、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000057
中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなるＦＶＩＩＩペプチドを提供し、このペプチドは、式：（Ｒ１）ｘ−ペプチド−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、添字ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。
【０２１４】
一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜７０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜６０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。さらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、別個に、またはともに、１〜２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
【０２１５】
上述のペプチドの具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【０２１６】
上述のペプチドの具体的な実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【０２１７】
上述のペプチドの具体的な実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【０２１８】
上述のペプチドの具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに１である。
【０２１９】
上述のペプチドの具体的な実施形態において、９個のアミノ酸の連続する配列は、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000058
中の９個の連続するアミノ酸と同一である。
【０２２０】
一実施形態において、本発明は、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000059
中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなるＦＶＩＩＩペプチドを含む薬学的組成物を提供し、このペプチドは、式：（Ｒ１）ｘ−ペプチド−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、添字ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。
【０２２１】
上述の組成物の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【０２２２】
上述の組成物の具体的な実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【０２２３】
上述の組成物の具体的な実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【０２２４】
上述の組成物の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに１である。
【０２２５】
上述の組成物の具体的な実施形態において、組成物は、
2014505014.tif 000060
からなる群から独立して選択されたアミノ酸配列中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなる少なくとも１つのペプチドをさらに含み、この少なくとも１つのペプチドは、最大８０アミノ酸長であり、この少なくとも１つのペプチド中のいかなる付加的なアミノ酸も天然アミノ酸である。
【０２２６】
一実施形態において、本発明は、対象においてＦＶＩＩＩに対する免疫寛容を誘導する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000061
中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなり、かつ式：（Ｒ１）ｘ−ペプチド−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、添字ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１であるＦＶＩＩＩペプチドを含む治療有効量の薬学的組成物を該対象に投与し、それによって、該対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫寛容を誘導するステップを含む。
【０２２７】
上述の方法の具体的な実施形態において、薬学的組成物は、
2014505014.tif 000062
からなる群から独立して選択されたアミノ酸配列中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなる少なくとも１つのペプチドをさらに含み、この少なくとも１つのペプチドは、最大８０アミノ酸長であり、この少なくとも１つのペプチド中のいかなる付加的なアミノ酸も天然アミノ酸である。
【０２２８】
上述の方法の具体的な実施形態において、薬学的組成物の投与は、対象における抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生を防止する。
【０２２９】
上述の方法の具体的な実施形態において、薬学的組成物の投与は、対象中に存在する抗ＦＶＩＩＩ抗体の量を減少させる。
【０２３０】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【０２３１】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【０２３２】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【０２３３】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに１である。
【０２３４】
一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチドを作成する方法を提供し、この方法は、(ａ）アミノ酸配列：
2014505014.tif 000063
中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなるＦＶＩＩＩペプチドをコードするベクターを含む細胞の培養物を供給するステップであって、該ペプチドが、式：（Ｒ１）ｘ−ペプチド−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、添字ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ステップ、ならびに(ｂ）該細胞の培養物において該ペプチドを発現させるステップを含む。
【０２３５】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【０２３６】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【０２３７】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【０２３８】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに１である。
【０２３９】
一実施形態において、本発明は、ＦＶＩＩＩペプチドを作成する方法を提供し、この方法は、(ａ）固相または液相合成技術を用いてペプチドを合成するステップを含み、このペプチドは、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000064
中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなり、このペプチドは、式：（Ｒ１）ｘ−ペプチド−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｒ１は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２は、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、添字ｘおよびｙはそれぞれ独立して、０または１である。
【０２４０】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【０２４１】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【０２４２】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【０２４３】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに１である。
【０２４４】
一実施形態において、ＦＶＩＩＩペプチド特異的Ｔ細胞を特定する方法を提供し、この方法は、(ａ）ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成したＦＶＩＩＩペプチドと複数のＣＤ４＋Ｔ細胞を混合するステップであって、該ＦＶＩＩＩペプチドが、アミノ酸配列：
2014505014.tif 000065
中の９個の連続するアミノ酸と少なくとも８５％同一である連続する９個のアミノ酸の配列からなり、該ペプチドが、式：（Ｒ１）ｘ−ペプチド−（Ｒ２）ｙを有し、式中、Ｒ１が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、Ｒ２が、１〜８０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、添字ｘおよびｙがそれぞれ独立して、０または１である、ステップ、ならびに(ｂ）ＭＨＣクラスＩＩ多量体と複合体を形成した該ペプチドに対して特異的な複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のメンバーのうちの少なくとも１つを特定するステップを含む。
【０２４５】
上述の方法の具体的な実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ多量体はＭＨＣクラスＩＩ四量体である。
【０２４６】
上述の方法の具体的な実施形態において、ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ多量体は、診断用薬をさらに含む。
【０２４７】
上述の方法の具体的な実施形態において、診断用薬は、当該ペプチドに対して特異的な複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの少なくとも１つのメンバーを特定する。
【０２４８】
上述の方法の具体的な実施形態において、方法は、診断用薬の検出に基づいて、複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの少なくとも１つのメンバーが当該ペプチドに対して特異的である、該少なくとも１つのメンバーを単離するステップをさらに含む。
【０２４９】
上述の方法の具体的な実施形態において、複数のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの少なくとも１つのメンバーは、フローサイトメトリーにより単離される。
【０２５０】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに０である。
【０２５１】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは１であり、ｙは０である。
【０２５２】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘは０であり、ｙは１である。
【０２５３】
上述の方法の具体的な実施形態において、ｘおよびｙはともに１である。
【０２５４】
次に、以下の実施例において、それらに限定することなく、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２５５】
Ｘ．実施例
実施例１
ＦＶＩＩＩペプチドを特定するためにヒトＭＨＣクラスＩＩ分子をより適切に模倣する目的で、ヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１特異的結合部位を含むキメラＭＨＣクラスＩＩ分子を用いて血友病Ａのマウスモデルが開発された。このマウスを全てのマウスＭＨＣクラスＩＩ遺伝子が完全に欠損したマウスに戻し交配した（Ｒｅｉｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７  Ｓｕｐｐｌ．１：９２−９７（２００９））。この新規のトランスジェニックマウスモデルでは、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞応答がヒトＭＨＣクラスＩＩ分子によって引き起こされる。このマウスモデルを用いて、これらのマウスにおいて抗ＦＶＩＩＩ免疫応答を引き起こす、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１によって提示されるＦＶＩＩＩペプチドを特定した。
【０２５６】
材料および方法
ＦＶＩＩＩ：
組換えヒトＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）は、アルブミンを含まないバルク製剤（Ｂａｘｔｅｒ  Ｎｅｕｃｈａｔｅｌ）、および臨床用スクロース配合ＦＶＩＩＩ製剤（Ａｄｖａｔｅ，Ｂａｘｔｅｒ，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）として製造された。
【０２５７】
血友病ＨＬＡ−ＤＲＢ１５  Ｅ１７マウス：
Ｒｅｉｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７  Ｓｕｐｐｌ．１：９２−９７（２００９）に記載されているようなＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１＋／−Ｅ１７−／−マウス。マウスは、全て雄で、実験開始時に生後８〜１２週間であった。
【０２５８】
ヒト組換えＦＶＩＩＩによる免疫化：
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１＋／−Ｅ１７−／−マウスに、０．２μｇまたは１μｇのヒトｒＦＶＩＩＩを１週間間隔で４〜８回静脈内または皮下投与した。ｒＦＶＩＩＩは、元の製剤緩衝液またはカルシウムおよびマグネシウムを含有するダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）で希釈した。
【０２５９】
細胞調製：
ｒＦＶＩＩＩによる最後の免疫化の３〜７日後に、脾臓を摘出した。脾臓細胞を細分化して、７０μｍの細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通した。培養培地：１０％  事前選択したウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）と、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と、５×１０−５Ｍ  メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で単細胞を回収した。０．１５Ｍ  塩化アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と、１０ｍＭ  重炭酸カリウム（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と、０．１ｍＭ  エチレン−ジアミンテトラ酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とから構成される低張緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、赤血球を溶解した。細胞を洗浄し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｚ１を用いて計数した。
【０２６０】
ＦＶＩＩＩペプチドを特定するためのＴ細胞ハイブリドーマの作製
ヒトｒＦＶＩＩＩによる脾臓細胞のインビトロ再刺激：
濃度１．５×１０６細胞／ｍＬで、培養培地中２０μｇ／ｍＬのヒトＦＶＩＩＩの存在下、脾臓細胞を３日間または１０日間再刺激した。１０日間培養のための培養培地を６日後に取り替えた。
【０２６１】
マウスＴ細胞のＢＷ細胞との融合：
インビトロで再刺激した脾臓細胞培養物とＢＷ細胞（α−β−）とを無血清培地で２回洗浄し、その後１：３〜１：１０（Ｔ細胞：ＢＷ細胞）の比率で混合した。ＢＷ細胞株は、マウスＡＫＲ／Ｊ  Ｔ細胞リンパ腫由来であった。これらの細胞は、Ｔ細胞受容体をその表面に有さず（α−β−）、そのためマウス脾臓細胞との融合後のあらゆるＴ細胞受容体は、融合パートナーに由来する。３回目の洗浄ステップ後、上澄みを除去した。１ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ；５０％  ＨｙｂｉＭａｘ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を４５秒以内に添加することによって、融合条件を達成した。さらに４５秒間のインキュベーション後、続いてＰＥＧの毒性作用を防止するために無血清培地５０ｍＬを添加した。細胞を１３００ｒｐｍで５分間連続的に遠心分離して、非常に堅いペレットを形成した。上澄みを廃棄し、新しい無血清培地５０ｍＬをペレットが移動しないように極めてゆっくり添加した。細胞が再懸濁するまで試験管をゆっくりと逆さにし、前回同様に遠心分離した。これを２回行って残留ＰＥＧを除去した。培養培地での最後の洗浄ステップを行った。次に細胞を希釈し、９６ウェルプレートで培養した。４８時間に培養培地を選択培地（ＨＡＴ培地サプリメント，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に交換し、成長しているクローンを選択した。選択培地を２週間維持した後、続いて培地を交換して通常の培養培地に戻した。
【０２６２】
ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマのペプチド特異性：
Ｔ細胞ハイブリドーマをその抗原特異性について試験した。この目的で、１×１０５の細胞を抗原提示細胞と共培養した。５×１０４のＭｇａｒ細胞（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１を発現）または未感作ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１−Ｅ１７マウス由来の１×１０５の全脾臓細胞のいずれかを使用した。１０μｇ／ｍＬのヒトｒＦＶＩＩＩまたは１μｇ／ｍＬのペプチド／ペプチドプールとともに、細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。上澄みを回収し、製造者の指示に従ってＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＩＬ−２  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用い、培養上澄み中へのＩＬ−２放出を測定した。ＦＶＩＩＩ（またはペプチド）の存在下で２０ｐｇ／ｍＬ以上でありＦＶＩＩＩ不在下ではそうではないＩＬ−２放出を陽性とみなすか、あるいはＦＶＩＩＩ不在下と比較してＦＶＩＩＩ存在下でのＩＬ−２放出の１０倍増加を陽性とみなした。
【０２６３】
Ｔ細胞ハイブリドーマのサブクローニング：
各クローンが１種類のみのＴ細胞を示すことを確実にするために、全てのハイブリドーマクローンをサブクローニングした。ハイブリドーマクローンを０．３細胞／ウェルの限界希釈まで希釈し、２００フィーダー細胞／ウェルと共培養した。フィーダー細胞は、融合パートナー細胞であるＢＷ細胞のマイトマイシンＣ処理によって生成した。２×１０８のＢＷ細胞をストレプトミセス・カエスピトーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のマイトマイシンＣを０．１ｍｇ用いて、室温で１０分間、およびインキュベーター中、３７°Ｃ、５％  ＣＯ２で２５分間処理した。クローン１個当たり５個の成長しているサブクローンを選択し、そのＦＶＩＩＩ特異性について試験した。
【０２６４】
Ｔ細胞ハイブリドーマの特異性を特定するために使用したＦＶＩＩＩペプチドプール：
ＦＶＩＩＩペプチドプールをＡｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８８：６４−７５（２００７））によって記載されるＳＰＯＴ合成法を用いて作製した。簡潔に述べると、１５量体ペプチドを２つの同一のセルロース膜上で合成した。膜を縦および横の条片に切断した。ペプチドをその膜条片から放出させ、上述のような特異性試験においてペプチドプールとして使用した。ペプチドをＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解し、ＰＢＳでさらに希釈した。
【０２６５】
結果
１８１個のＦＶＩＩＩ特異的ハイブリドーマクローンが生成された。これらのクローンをヒトＦＶＩＩＩ全体にわたるペプチドライブラリーに対してスクリーニングした。３個のアミノ酸が異なる１５量体ペプチドを使用した。この手法を用いて、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１に結合したペプチドを含む６つの異なるＦＶＩＩＩ領域を特定した。ヒトＦＶＩＩＩのＡ１ドメイン内に２つのペプチドドメイン、Ａ２ドメイン内に２つのペプチド、Ｂドメイン内に１つ、Ａ３ドメイン内に２つ、Ｃ１ドメイン内に１つのペプチドドメインを発見した。ＦＶＩＩＩペプチド１４０１−１４２４は、これまでに記載されていない（表１１）。ペプチドＦＶＩＩＩ４７４−４９４、ＦＶＩＩＩ５４５−５５９、ＦＶＩＩＩ１７８８−１８０２、およびＦＶＩＩＩ２１６１−２１７５は、コンピュータ予測プログラムに続いてＴ細胞ハイブリドーマ技術を用いるＷＯ０９／０７１８８６において、すでに特定されている。ペプチドＦＶＩＩＩ２０３０−２０４４は、ＷＯ０３／０８７１６１に開示されている。ペプチドＦＶＩＩＩ２１６１−２１８０は、Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１（４）：１３５１−８（２００３）によってすでに公表されている。
【０２６６】
（表１１）Ｔ細胞エピトープを含むＦＶＩＩＩの領域
2014505014.tif 000066
【０２６７】
本明細書に記載される実施例および実施形態が例示目的に過ぎないこと、ならびにこれらを踏まえて様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらは本出願の精神および範囲、ならびに添付される「特許請求の範囲」の範囲に含まれるものであることは理解される。本明細書において引用する全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により全体があらゆる目的で本明細書に援用される。
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月21日(2013.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014505014000001.app
【国際調査報告】
2014505014.tif 000067
2014505014.tif 000068