(57)【要約】  本発明は、生物試料中の病原体特異的な核酸を単離、検出、増幅および定量するための組成物および方法を対象とする。また、本発明は、特異的な増幅プライマーおよびこれらから得られた増幅産物に特異的に結合する標識された検出プローブを含む診断キットを提供する。さらに、生物学的、環境、臨床的および／または獣医学的起源のものを含む多種多様な試料からの、例えば、インフルエンザウイルスおよびマイコバクテリウム・ツベルクロシスを含む１つ以上の病原体に特異的である核酸の単離および特徴付けのための組成物および方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分として：
約０．０５Ｕから約１Ｕの量で存在する熱安定性ポリメラーゼ；
約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；
約０．０１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に存在する、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるキレート剤；
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、グリセロール、非イオン性洗浄剤、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＰＣＲ浸透圧剤；
約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、哺乳動物アルブミンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるアルブミン；
約５０ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に集合的に存在する、第一の塩が塩化カリウムおよびグルタミン酸カリウムからなる群から選択されるカリウム塩であり、第二の塩が塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択されるマグネシウム塩である、少なくとも２つの塩；ならびに
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有する、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるバッファー
を含む、生物試料中の微生物を検出するためのＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物。
【請求項２】
熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、高忠実度ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼまたは次世代ポリメラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１つ以上の色素をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
１つ以上の色素が、フルオレセイン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンおよびＲＯＸからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ｐＨが、約６．５から約７．５である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
バッファーのｐＫａが、周囲温度でのバッファーのｐＨの０．５以内である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
バッファーのｐＫａが、周囲温度でのバッファーのｐＨの０．２以内である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
約０．５μＭから約５０μＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、微生物に特異的な核酸配列をＰＣＲによって増幅するように構成されたＰＣＲプライマー対をさらに含み、ここで、各ＰＣＲプライマーは、約５から約５０ヌクレオチドの長さである、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ＰＣＲプライマー対が、各々、約１８から３５ヌクレオチドの長さである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
微生物が、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
細菌が、マイコバクテリアである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ３またはＨ５Ｎ１である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
約１ｆｇから約１ｎｇの濃度で濃度中に存在する対照核酸をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
対照核酸が、ＰＣＲ増幅の定性的または定量的な尺度を与える、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
対照核酸が、配列番号８の配列、配列番号１２の配列または配列番号２１の配列を含む、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１６】
検出プローブをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
検出プローブが、微生物に特異的であるＰＣＲ増幅された核酸配列に特異的に結合する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
約５０ｍＭのＴＲＩＳ；約７０ｍＭの塩化カリウム；約３ｍＭの硫酸マグネシウム；約４５ｍＭのベタイン；約０．０３μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン；約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；約０．０５μＭの色素；約８μＭのＰＣＲプライマー対を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ＰＣＲプライマー対の一方のプライマーが、配列番号２または配列番号５の核酸配列を含み、ＰＣＲプライマー対の他方のプライマーが、配列番号３または配列番号６の核酸配列を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
検出プローブが、約２０から約３５ヌクレオチドの長さであるマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）特異的配列であり、配列番号４または配列番号７の配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
成分として：熱安定性ポリメラーゼ；ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；キレート剤；ＰＣＲ浸透圧剤；アルブミン；少なくとも２つの塩；ならびに少なくとも５０ｍＭの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有するバッファーを含む、生物試料中の微生物を検出するためのＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物。
【請求項２２】
熱安定性ポリメラーゼが、約０．０５Ｕから約１０Ｕの量で存在し；デオキシヌクレオチド三リン酸の混合体が、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で組成物中に存在し；キレート剤が、約０．０１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で組成物中に存在し；ＰＣＲ浸透圧剤が、約１ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に存在し；アルブミンが、約５ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在し；少なくとも２つの塩が、約５０ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に集合的に存在し；バッファーが、約１ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
生物試料中の微生物を検出するための方法であって、
生物試料を請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、混合物を形成すること；
前記混合物に複数の熱サイクリングステップを実施し、微生物に特異的である核酸から誘導される増幅産物を形成すること；
増幅産物の有無を検出し、生物試料中の微生物の有無を決定することを含む方法。
【請求項２４】
対照核酸の増幅された配列を検出することおよび複数の熱サイクリングステップから生じた増幅の質または量を決定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
生物試料が、個体から得られる生物材料、１つ以上のカオトロープ、１つ以上の洗浄剤、１つ以上の還元剤、１つ以上のキレート剤および１つ以上のバッファーを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
成分として：
約０．０５Ｕから約１Ｕの量で存在する熱安定性ポリメラーゼ；
約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；
約０．０１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に存在する１つ以上のキレート剤；
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する１つ以上のＰＣＲ浸透圧剤；
約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する１つ以上のアルブミンタンパク質；
約５０ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する１つ以上の塩；ならびに
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有する１つ以上のバッファー
を含有するＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物を提供することを含む、生物試料中の微生物の検出を提供するための方法。
【請求項２７】
バッファーのｐＨが、約６．５から７．５であり、ｐＫａが、周囲温度でｐＨの約０．５単位以内である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生物試料を組成物と接触させることおよび混合物に熱サイクリング反応を実施することをさらに含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上のキレート剤が、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムまたはこれらの任意の組合せを含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上のＰＣＲ浸透圧剤が、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、グリセロール、非イオン性洗浄剤、デオキシイノシン、グリセリン、７−デアザデオキシグアノシン三リン酸、水酸化ナトリウム、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムまたはこれらの任意の組合せを含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上のアルブミンが、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、哺乳動物アルブミンまたはこれらの任意の組合せを含む、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上の塩が、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよびこれらの任意の組合せを含む、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上のバッファーが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
生物試料の添加および熱サイクリングのために構成された滅菌容器内に含有される請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物ならびに熱サイクリングの結果から病原体の有無を決定するための使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、生物試料から得られるような単離されたポリヌクレオチド集団内の核酸セグメントを検出し、同定し、場合によって定量するための組成物および方法に関する。詳細には、本発明の組成物および方法は、成分の完全性または分析の忠実度を損なうことなく、周囲温度にて長期間維持することができる。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリアは単細胞の好気性グラム陽性細菌である。典型的に、マイコバクテリアは、厚い疎水性細胞壁を有し、外側の細胞膜を欠損している。マイコバクテリアによって引き起こされる感染は、宿主内で活性であるまたは潜在性および無症状であり得る。多剤耐性株の出現、長期間の抗菌療法の必要性、および患者のコンプライアンスの低いことにより、特に発展途上国におけるマイコバクテリア感染の治療は困難なものになっている。Ｍ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の多剤耐性（ＭＤＲ）株の出現は、特に、増加しているアフリカの人口において、ＴＢの診断および治療を優先度の高いものにしている。
【０００３】
マイコバクテリアは、典型的に、それらの外側の細胞膜の欠損に起因して、抗酸性のグラム陽性細菌として分類される。頻繁に使用されている抗酸性染色法は、Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色またはＫｉｎｙｏｕｎ法である。それらは、一般に、クリスタルバイオレット染色を十分に持続させず、そのため、グラム陽性細菌の典型的な代表例として見なされない。しかしながら、それらは、大部分の他の細菌種に存在する細胞壁構造よりも厚い特有の細胞壁構造を含む。典型的には、棒状であり、細胞壁は、疎水性ミコレート層（ミコール酸を含む）と多糖類であるアラビノガラクタンによってともに保持されるペプチドグリカン層からなる。この細胞壁構造は、極端な環境変化に耐えて生き残るそれらの能力においてマイコバクテリアを補助し、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の耐久性に寄与し、同様に、ともに様々なマイコバクテリウム属種によって引き起こされる結核およびハンセン病患者の治療の困難性をもたらす。ミコール酸は、生物を取り囲む脂質殻を形成し、細胞表面での透過性に影響を及ぼす強力な疎水性分子である。ミコール酸は、いくつかのマイコバクテリウム属種における病原性の重要な決定因子であると考えられている。ほとんどの場合、それらは、食作用顆粒中のカチオン性タンパク質、リゾチームおよび酸素ラジカルによるマイコバクテリアの攻撃を防止する。それらはまた、血清中の補体沈着から細胞外マイコバクテリアを保護する。
【０００４】
さらに、マイコバクテリアは、典型的に、ゆっくり増殖する生物であり、この種の培養を困難なものにする。それらの特有の細胞壁に起因して、マイコバクテリアは、酸、アルカリ、洗浄剤、酸化的破壊、補体による溶解および多くの抗生物質への長期曝露に耐えて生き残ることができる。大部分のマイコバクテリアは、抗生物質であるクラリスロマイシンおよびリファマイシンに感受性であるが、抗生物質耐性株が出現してきた。
【０００５】
結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）のメンバー、すなわち、Ｍ．ツベルクロシス、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．カネッティ（Ｍ．ｃａｎｎｅｔｔｉ）、Ｍ．カプラエ（Ｍ．ｃａｐｒａｅ）およびＭ．ピンニペジ（Ｍ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉ）は、結核の原因因子であり、マイコバクテリアの上記の特徴をすべて有している。ヒトにおけるマイコバクテリア感染の主な結果（特に、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｅｎｕｓ）の１つ以上の種による感染）は、結核（ＴＢ）であり、これは、例えばＭ．ツベルクロシス、Ｍ．ボビス、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．ミクロチ、Ｍ．カネッティ、Ｍ．カプラエおよびＭ．ピンニペジ種の病原性株を含む「結核菌群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」のメンバーによって引き起こされる伝染性感染である。ＴＢは、典型的には、哺乳動物宿主の肺を攻撃するが、さらに、生体の他の臓器および領域、例えば、骨、関節、腎臓および腹部などに拡散する可能性もある。結核菌群のメンバーは、遺伝的に密接に関連し、属全体で高度に保存された１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する。
【０００６】
ＴＢは、感染者の咳またはくしゃみからの空気中の液滴を吸い込むことによって獲得される可能性がある。したがって、結核菌群のメンバーを含むことが疑われる生物試料の回収は、それに感染していることが疑われる患者からの喀痰の回収を伴う。喀痰は、気道から咳により出される喀出物であり、理想的には、口腔細菌による喀痰試料の汚染を避けるために、唾液または鼻汁をほとんど乃至全く含まない。喀痰は、主に、糖タンパク質に富んだ粘性コロイドである粘液を含む。結核であることが疑われる患者は、典型的に、粘液の粘性増加および粘液の産生増加がある。粘液に加えて、喀痰は血液を含んでもよく、すなわち、喀血が生じてもよくおよび／または膿汁を含んでもよく、すなわち、化膿性であってもよい。活性な結核感染の症状は、慢性の咳（典型的に、血液を帯びた喀痰を含む）、発熱、夜間多汗症、慢性疲労、蒼白、体重減少および悪液質消耗（「消費」）を含み得る。他の症状は、呼吸困難、胸痛および喘鳴（「Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」、ＰｕｂＭｅｄ  Ｈｅａｌｔｈ）を含み得る。吸入された結核菌が肺胞に住み着く場合、感染が発生し、次に肺胞毛細血管拡張および内皮細胞の腫脹へと続く。肺胞炎は、結核菌の細胞内複製および肺胞への多形核白血球の流入をもたらす。その後、生物は、リンパ系を通じて循環系に拡散し、次に全身に拡散する。
【０００７】
Ｍ．ツベルクロシスは、米国において毎年２００，０００人未満に感染するが、世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、世界中で２０億人近くの人々が感染している可能性があり、そのうち９０％が感染後の数年間、無症状の状態のままであり得る。治療しないままでいると、ＴＢは、感染集団の＞５０％で致命的であり、疾患の播種形態では、死亡率は９０％に迫る。
【０００８】
ＴＢ感染は慢性および衰弱持続性のため、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む１つ以上の二次病原体との同時感染も広まっている。２００７年には、ＨＩＶ陽性のＴＢの少なくとも１３７万症例があり、主に新興集団に集中しているが、そこでは、診断および治療が、多くの場合、限定される、効果がないおよび／または法外な費用がかかる。
【０００９】
ＴＢ感染の従来の診断は、典型的に、身体検査（例えば、慢性の持続性の咳、腫大したまたは圧痛のあるリンパ節、胸水、異常な呼吸音、疾患の後期においては特徴的な「ばち状態」の手の指または足の指）ならびに診断試験（例えば、喀痰検査、被検体の微生物培養および核酸試験、気管支鏡検査、胸のＣＴスキャンおよびＸ線、肺生検、胸腔穿刺、インターフェロン−γ（ガンマ）血液試験およびツベルクリン皮膚試験）の組合せによる。
【００１０】
ＴＢ診断の「標準」であるマイコバクテリア生物の細胞培養は、部分的には、それらの長期の世代時間、すなわち、Ｍ．ツベルクロシスについては２４時間に起因して困難である。さらに、マイコバクテリアは、典型的に、感染した個体において低レベルで存在する。したがって、臨床被検体からの培養は、４週間から８週間の間のいずれかの期間を要する可能性があり、その期間、患者は重病になり、他人に対して伝染性になることもある。さらに、細胞培養は、試料が実験室環境において分析され得るような時間まで、試料中の生存マイコバクテリア生物の回収、輸送および維持を必要とする。ＴＢが蔓延しており、健康管理が最小である国において、これは選択肢になり得ず、したがって、感染を拡散させる危険を増加させることになる。
【００１１】
医療へのアクセスが限られている地域にとって残念であるが、全血は、試料を得てから１２時間以内に分析されなければならず、試験の有効性は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、糖尿病、珪肺症、慢性腎不全、血液疾患などの他の医学的状態を有する患者や、ＴＢ感染について治療された個体については分析されておらず、また、妊娠している個体または未成年者については試験されていない（「Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  Ｇｏｌｄ」、Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ）。ラジオイムノアッセイ、ラテックス凝集および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの他の非培養法は、生物試料中の結核菌の存在を確認するために、限られた成功度で使用されている。
【００１２】
臨床診断実験室の大半は、典型的に、大部分のウイルスについては３から７日を要し、いくつかの細菌株についてはより長く、例えばＭ．ツベルクロシスの培養については最大約２１日を要する、病原体の同定のための伝統的な培養を採用していた。伝統的な培養は、生存微生物の被検体の回収、凍結輸送および繁殖ならびに潜在的に感染性であり、多くの場合、未知の生物学的な微生物の取扱いを必要とする。さらに、多くの感染性因子、例えば、高度に病原性のトリインフルエンザ、ＳＡＲＳ、結核菌群などは、専門施設および分析のための予防措置を必要とするＢＳＬ−３レベルの病原体である。培養するための高品質の生存生物被検体を得る、出荷するおよび維持する点で課題がある。被検体は、低温流通系、最も多くの場合ドライアイスを用いて出荷しなければならない。商業的な輸送手段を用いて遠隔地からまたは国境を越えて、潜在的に感染性の試料を輸送することは、特に被検体を凍結して受け取らなければならない場合にはコストがかかり、面倒である場合がある。
【００１３】
回収は、微生物からの潜在的に微量の核酸を検出することを必要とする診断プラットフォームまたは分子のプロトコールの最初のステップである。用いられる核酸試験またはＲＮＡ／ＤＮＡ抽出プロトコールにかかわらず、被検体の回収、具体的には潜在的な感染因子の不活性化ならびに病原体ＲＮＡ／ＤＮＡの保存および安定性は、特に世界中での使用に関して、臨床診断において依然として重大なギャップのままである。
【００１４】
典型的に、結核であることが疑われる患者は、喀痰試料を得るために、激しく咳をし、次に被検体カップに喀痰を出すように求められる。通常、この手順は、感染性マイコバクテリアを拡散させる可能性を最小限にするように、十分に換気された場所で行われる。患者は、典型的に約５ｍＬから約２０ｍＬの量の、分析に十分な喀痰を回収するために、この手順を繰り返すように求められる場合がある。典型的に、回収された喀痰試料は、さらなる分析手順まで冷蔵され、例えば、細胞培養または試料に含まれるいずれの微生物をも不活性化するまたは死滅させるための除染手順を実施してもよい。喀痰試料中のマイコバクテリウム・ツベルクロシスを検出するために、喀痰１ｍＬあたり１０，０００個を超える生物が１００倍の顕微鏡対物レンズ（倍率１０００倍）を用いて、桿菌を可視化するために必要とされる。結核患者からの喀痰試料の直接的なスメア顕微鏡検査は、典型的に、治療に対する患者の応答をモニタリングするための有効なツールとして考えられている。典型的に、より多くの抗酸菌が喀痰の膿状部分で見出される。
【００１５】
臨床分子診断の分野は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、続くリアルタイムＰＣＲの出現により劇的に変化した。リアルタイム（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｒＲＴ−ＰＣＲ）は、数時間で優れた感度と特異性の結果をもたらすことができる。したがって、現在の大部分の診断実験室は、伝統的な培養からリアルタイムＰＣＲなどの核酸試験（ＮＡＴ）に移行している。
【００１６】
ＴＢのための核酸増幅試験は、患者の被検体中のマイコバクテリアＤＮＡを検出するための標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、培養中のマイコバクテリアを同定するための核酸プローブ、疫学研究に関してＴＢの異なる株を比較するための制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析およびマイコバクテリアの薬剤耐性株を同定するための遺伝子に基づく感受性試験の使用を含む。Ｍ．ツベルクロシスの完全なゲノムが配列決定され、公表されている；現在、ＴＢに関する２つの核酸増幅ベースの試験が食品医薬品局（ＦＤＡ）によって米国において使用が承認されている。１つ目は、「強化増幅マイコバクテリウム・ツベルクロシス直接試験」（Ｅ−ＭＴＤ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）として知られ、ＴＢであることが疑われる患者からのスメア陽性とスメア陰性の呼吸器被検体の両方において、抗酸菌における結核菌群細菌を検出するために承認されている。Ｅ−ＭＴＤ試験は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの一部の等温転写媒介増幅を結核菌群細菌に特異的なハイブリダイゼーションプローブを用いる検出方法と組み合わせる。２つ目は、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）マイコバクテリウム・ツベルクロシス試験（ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）として知られ、ＴＢであることが疑われる患者からのスメア陽性の呼吸器被検体においてのみ、結核菌群細菌を検出するために承認されている。この試験は、結核菌群細菌に特異的なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅するためにＰＣＲを使用する。（「Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。
【００１７】
結果は、これらの試験の感度および特異性が地理的位置とリスク要因に依存して変化する傾向があることを示している。さらに、これらの技法は、実施するために複雑な実験室条件と装置を必要とし、したがって、試験の速度と感度を低下させる。これらの理由および他の理由のために、臨床試料におけるマイコバクテリア病原体を検出するための信頼性のある正確な方法、特に、現場用途、遠隔地においておよび従来の実験室が不足し、財源が限られている途上国において、このような病原体を迅速に同定するための方法が当該技術分野においてなおも必要とされる。詳細には、病原性被検体を安全に回収、取扱いおよび輸送するための組成物ならびにこのような被検体中のＴＢ特異的な核酸を迅速に検出し、正確に同定するための分子生物学に基づく方法が非常に望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】「Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」、ＰｕｂＭｅｄ  Ｈｅａｌｔｈ
【非特許文献２】「Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  Ｇｏｌｄ」、Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ
【非特許文献３】「Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、現在の戦略および設計と関連した問題と欠点を克服し、核酸配列を検出および同定するための新規な組成物、ツールおよび方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一実施形態は、成分として：約０．０５Ｕから約１Ｕの量で存在する熱安定性ポリメラーゼ；約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；約０．０１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に存在する、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるキレート剤；約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド（ｆｏｒａｍｉｄｅ）、グリセロール、非イオン性洗浄剤、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＰＣＲ浸透圧剤；約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、哺乳動物アルブミンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるアルブミン；約５０ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に集合的に存在する、第一の塩が塩化カリウムおよびグルタミン酸カリウムからなる群から選択されるカリウム塩であり、第二の塩が塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択されるマグネシウム塩である、少なくとも２つの塩；ならびに約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有する、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ））、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるバッファーを含む、生物試料中の微生物を検出するためのＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物を対象とする。好ましくは、熱安定性ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、高忠実度ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼまたは次世代ポリメラーゼである。好ましくは、組成物は、フルオレセイン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンおよびＲＯＸからなる群から選択される１つ以上の色素をさらに含む。好ましくは、バッファーまたは全組成物のｐＨは、約６．５から約７．５であり、バッファーのｐＫａは、周囲温度でのバッファーのｐＨの０．５以内であり、より好ましくは、バッファーのｐＫａは、周囲温度でのバッファーのｐＨの０．２以内である。好ましくは、組成物は、約０．５μＭから約５０μＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、微生物に特異的な核酸配列をＰＣＲによって増幅するように構成されたＰＣＲプライマー対をさらに含み、ここで、各ＰＣＲプライマーは、約５から約５０ヌクレオチドの長さである。より好ましくは、ＰＣＲプライマー対の各プライマーは、約１８から３５ヌクレオチドの長さである。好ましくは、検出されるべき微生物は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫病原体であってもよい病原体である。より好ましくは、細菌はマイコバクテリアであるまたはウイルスはインフルエンザウイルス、例えばインフルエンザウイルス株のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ３もしくはＨ５Ｎ１である。好ましくは、組成物は、約１ｆｇから約１ｎｇの濃度で濃度中に存在する対照核酸をさらに含み、これは、ＰＣＲ増幅の定性的または定量的な尺度を与える。好ましい対照核酸は、例えば、配列番号８の配列、配列番号１２の配列または配列番号２１の配列を含む。好ましくは、組成物は、検出プローブ、例えば、微生物に特異的であるＰＣＲ増幅された核酸配列に特異的に結合する検出プローブをさらに含んでもよい。本発明の好ましい組成物は、約５０ｍＭのＴＲＩＳ；約７０ｍＭの塩化カリウム；約３ｍＭの硫酸マグネシウム；約４５ｍＭのベタイン；約０．０３μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン；約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；約０．０５μＭの色素；約８μＭのＰＣＲプライマー対を含む。好ましくは、ＰＣＲプライマー対の一方のプライマーは、配列番号２または配列番号５の核酸配列を含み、ＰＣＲプライマー対の他方のプライマーは、配列番号３または配列番号６の核酸配列を含む。また、検出プローブが、約２０から約３５ヌクレオチドの長さであるマイコバクテリウム特異的配列であり、配列番号４または配列番号７の配列を含む組成物も好ましい。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、成分として：熱安定性ポリメラーゼ；ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；キレート剤；ＰＣＲ浸透圧剤；アルブミン；少なくとも２つの塩；ならびに少なくとも５０ｍＭの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有するバッファーを含む、生物試料中の微生物を検出するためのＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物を含む。好ましくは、熱安定性ポリメラーゼは、約０．０５Ｕから約１０Ｕの量で存在し；デオキシヌクレオチド三リン酸の混合体は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で組成物中に存在し；キレート剤は、約０．０１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で組成物中に存在し；ＰＣＲ浸透圧剤は、約１ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に存在し；アルブミンは、約５ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在し；少なくとも２つの塩は、約５０ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に集合的に存在し；バッファーは、約１ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に存在する。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、生物試料中の微生物を検出するための方法であって、生物試料を請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、混合物を形成すること；前記混合物に複数の熱サイクリングステップを実施し、微生物に特異的である核酸から誘導される増幅産物を形成すること；増幅産物の有無を検出し、生物試料中の微生物の有無を決定することを含む方法を対象とする。好ましくは、本方法は、対照核酸の増幅された配列を検出することおよび複数の熱サイクリングステップから生じた増幅の質または量を決定することをさらに含む。また好ましくは、生物試料は、個体から得られる生物材料、１つ以上のカオトロープ、１つ以上の洗浄剤、１つ以上の還元剤、１つ以上のキレート剤および１つ以上のバッファーを含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、成分として：約０．０５Ｕから約１Ｕの量で存在する熱安定性ポリメラーゼ；約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；約０．０１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に存在する１つ以上のキレート剤；約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する１つ以上のＰＣＲ浸透圧剤；約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する１つ以上のアルブミンタンパク質；約５０ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する１つ以上の塩；ならびに約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有する１つ以上のバッファーを含有するＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物を提供することを含む、生物試料中の微生物の検出を提供するための方法を対象とする。好ましくは、バッファーのｐＨは約６．５から７．５であり、ｐＫａは周囲温度でｐＨの約０．５単位以内である。好ましくは、本方法は、生物試料を組成物と接触させることおよび混合物に熱サイクリング反応を実施することをさらに含む。好ましくは、１つ以上のキレート剤は、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムまたはこれらの任意の組合せを含み、１つ以上のＰＣＲ浸透圧剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、グリセロール、非イオン性洗浄剤、デオキシイノシン、グリセリン、７−デアザデオキシグアノシン三リン酸、水酸化ナトリウム、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムまたはこれらの任意の組合せを含み、１つ以上のアルブミンは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、哺乳動物アルブミンまたはこれらの任意の組合せを含み、１つ以上の塩は、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよびこれらの任意の組合せを含み、１つ以上のバッファーは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、生物試料の添加および熱サイクリングのために構成された滅菌容器内に含有される本発明の組成物ならびに熱サイクリングの結果から病原体の有無を決定するための使用説明書を含むキットを対象とする。
【００２５】
本発明の他の実施形態および利点は、部分的には、以下に続く説明に記載され、部分的には、この説明から明らかであり得るまたは本発明の実施から学ぶことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】１：１の比率でＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に保存された陽性スメア喀痰試料からのツベルクリンＤＮＡのリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ分析を示すグラフである。さらに、同じスメア陽性の喀痰試料を拭き取り、結果として、スワブ上の試料は約５０から約４００マイクロリットルとなり、スワブを１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れた。ＤＮＡは、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キット（ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に各喀痰試料から抽出された。４マイクロリットルの抽出されたＤＮＡは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キットを用いて、製造業者の使用説明書に従って、リアルタイムＰＣＲに使用された。試料の各々について得られたＣτ値を表２に示す。
【図２】７つのスメア陰性培養陽性の喀痰被検体および３つの不十分な（ｓｃａｎｔｙ）検体、すなわち、ステインがスライド上で僅かに視認された陽性スメア結果、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に保存された被検体スワブからのツベルクリンＤＮＡのリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ分析を示すグラフである。ＤＮＡは、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＰｒｅｐ（商標）Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ウイルスキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って抽出された。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キットは、製造業者の使用説明書に従って使用された。試料の各々について得られたＣτ値を表８に示す。
【図３】様々な回数、すなわち、１回、３回、５回および１０回、−２０℃の温度での保管から取り出され、室温に置かれ、次に、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイに使用された、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ成分のＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。
【図４】一本鎖ＤＮＡ内部陽性対照（ＩＰＣ）が６−ＦＡＭ（ＦＡＭ）またはＶＩＣ（商標）色素のいずれかで標識された検出プローブを用いたＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）アッセイにおいて検出されたときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。
【図５】様々な量の抽出された結核患者のＤＮＡ、すなわち、２μｌ、３μｌ、４μｌおよび５μｌの鋳型ＤＮＡが、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイにおいて使用されたときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。
【図６】多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイが実施されるときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。ここで、一本鎖ＤＮＡ内部陽性対照（ＩＰＣ）は、一重（ｕｎｉｐｌｅｘ）アッセイと比較して、ツベルクリン試料を含む溶液に添加され、初期溶液は、患者から得られた生物試料と保管溶液、すなわち、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）を含むだけである。
【図７】ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に入れられた内部陽性対照（「ＩＰＣ」）の濃度を変化させたとき、すなわち、１０−５、１０−６、１０−７および１０−８ｎｇ／μＬのＩＰＣが同量のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に入れられたときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。ＩＰＣ用のプローブは、６−ＦＡＭ（「ＩＰＣ  Ｆａｍ」）またはＶＩＣ（商標）色素（「ＩＰＣ  Ｖｉｃ」）のいずれかで標識された。また、多重反応が行われ、結核菌群に特異的なプライマーおよびプローブもまたＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）に添加され（結果を「多重におけるＭＴＢ」と表示された列に示す。）ならびにＩＰＣプライマーおよびプローブも添加された（結果を「多重におけるＩＰＣ  Ｖｉｃ」と表示された列に示す。）。
【図８】Ｍ．ツベルクロシス試料の初期量が１５μｌおよび１５０μｌ（１０倍の差）であるときに、各々が、初期に１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に保管された場合のＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。これは、６−ＦＡＭ（「ＩＰＣ  Ｆａｍ」）およびＶＩＣ（商標）色素（「ＩＰＣ  Ｖｉｃ」）で標識されたＩＰＣプローブについてならびにＭ．ツベルクロシス（「ＭＴＢ」）の一重検出およびＭ．ツベルクロシス（「多重におけるＭＴＢ」）とＩＰＣの多重検出について実施され、ここで、プローブはＶＩＣ（商標）色素（「多重におけるＩＰＣ  Ｖｉｃ」）で標識されている。
【図９】様々なマイコバクテリウム株、すなわち、５種のＭ．ツベルクロシス株、２種のＭ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）株、１種のＭ．イントラセルラエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）株、１種のＭ．ゴンジイ（Ｍ．ｇｏｎｄｉｉ）株、１種のＭ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）株がＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れられ、次にそこから抽出され、その後、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）手順の一重（「ＭＴＢ一重」）と多重（「多重におけるＭＴＢ」）フォーマットの両方を用いて分析されたときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。一重アッセイは、結核菌群に特異的なプライマーおよびプローブのみを使用し、一方、多重アッセイは、結核菌群に特異的なプライマーおよびプローブとＩＰＣ特異的プライマーおよびプローブの両方を使用した。
【図１０】特定の精製された株からのＭ．ツベルクロシスの量を変化させたとき、すなわち、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１は１０倍希釈を表し、ここで、１０−１は３３０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−２は３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−３は３．３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−４は０．３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示すときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。結核菌群に特異的なプライマーおよびプローブを用いた、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイを使用した一重反応が実施され（結果を「ＭＴＢ一重」列に示す。）ならびに多重ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）アッセイが実施され、結核菌群に特異的なプライマーおよびプローブとＩＰＣ特異的プライマーおよびプローブの両方が存在していた（結果を「多重におけるＭＴＢ」と「多重におけるＩＰＣ」列に示す。）。
【図１１】特定の精製された株からのＭ．ツベルクロシスの量を変化させたとき、すなわち、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１は１０倍希釈を代表とし、ここで、１０−１は３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−２は３．３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−３は０．３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−４は０．０３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、ＩＰＣ特異的プローブ上の異なる標識、６−ＦＡＭ（「ＩＰＣ  Ｆａｍ」）またはＶＩＣ（商標）色素（「ＩＰＣ  Ｖｉｃ」）のいずれかを用いたときのＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフである。
【図１２】非アセチル化ＢＳＡ（ｍｇ／ｍＬ最終濃度）対サイクル閾値（Ｃτ）を比較するチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、病原性生物を含むことが疑われる生物試料を安全に回収し、取扱いおよび輸送するために有用であり、非自明でありおよび新規な組成物ならびに分子生物学に基づく核酸試験を通じてこれらの病原体を迅速に検出し、同定しおよび定量するための方法を提供することによって、従来技術におけるこれらのおよび他の固有の制限を克服する。詳細には、本方法は、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫などの病原性微生物の１つ以上の株を特異的に検出するために提供される。特定の用途において、本発明は、標的被検体の回収、アッセイのための標的被検体の調製、被検体からのゲノム材料の単離、もし存在するならば、生物試料中の１つ以上の生物を同定するゲノム材料のその後の処理を可能にする診断製品を包含する。１つ以上の被検体回収デバイスと組み合わせる場合、本明細書に開示されている組成物は、遠隔または「現場」用途において回収される被検体（この場合、試料回収から試料アッセイまでの時間は、数時間から数日またはさらには数週間であり得る。）についてさえ、生物被検体の安全な回収、輸送および保管を可能にする。
【００２８】
本発明は、微生物、具体的にはインフルエンザおよび結核の原因因子である微生物の被検体の回収、調製および分子検出を簡素化および迅速化する組成物および方法をさらに包含する。特定の用途において、本発明は、低温流通系または費用がかかり時間を消費する試料の除染および被検体の乳化の必要なしに、被検体が下流のＰＣＲのために回収され、輸送され、迅速に調製される診断製品を包含する。分子診断製品は、すぐに使用できる溶液または懸濁液中のプライマー、プローブおよび酵素の、熱安定性であり包括的なＰＣＲ混合物を含む。この診断製品は、中央実験室において、ハイスループットシステムとともにまたは最小能力を備えた田園または移動のクリニックにおいて、信頼できる共同電力の不存在においてまたは携帯型デバイスと一緒でさえ、使用され得る。また、本発明は、疫学的なおよび突発の監視、世界的な大流行と流行の追跡ならびに回収部位での現場試料からの直接的な微生物の配列決定のための方法または周囲温度での標準的な郵送を介した安価であり、簡素化された、安全な出荷を用いることによる方法を包含する。また、本発明は、微生物、具体的には病原体の安全な医療現場（ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃａｒｅ）回収、迅速な抽出および迅速なＰＣＲ検出のための診断分子検出キットを包含する。
【００２９】
本明細書に開示されている病原体特異的な核酸検出プローブおよび増幅プライマーを用いることにより、本発明はまた、回収された試料における病原体の容易な同定を提供し、安全であり、費用効率が高く、短期の感染評価を可能にし、これには、例えば、可能性のある流行に対する監視におけるツールとして、突発のモニタリング、影響を受けたもしくは危険にある集団における疾患進行の評価ならびに／または診断試験もしくは特定の治療様式の決定のための微生物の特定種および／もしくは株の同定が含まれる。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、１つ以上の病原性微生物または病原性もしくは病原体感染細胞（総称して「病原体」）を含むことが疑われる試料から特定のポリヌクレオチド集団を得るための方法を提供する。全体的な意味において、この方法は、一般に、１つ以上の病原体を含むことが疑われる試料を有効な時間量で、ａ）１つ以上のカオトロープ、ｂ）１つ以上の洗浄剤；ｃ）１つ以上の還元剤；ｄ）１つ以上のキレート剤およびｅ）１つ以上の界面活性剤を含む十分量の組成物と接触させ、例えば、病原性細菌、真菌およびウイルス（試料中に存在する場合）を含む、試料中に存在する実質的にすべての、好ましくはすべての病原性生物を死滅させることを伴う。本方法の実施において、試料に含まれる実質的にすべての（好ましくは、すべての）細胞および微生物が溶解され、これらの細胞内容物が溶液中に遊離される。好ましくは、実質的にすべての（より好ましくは、すべての）細胞の酵素、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質および他の細胞内容物が変性および／または不活性化され、これらには試料中に存在し得る任意の外因性または内因性ヌクレアーゼが含まれ、その結果、得られた混合物は、不適当な影響を与えることなしに、さらに、病原性、毒性または試料の取扱いの危険性を懸念する必要もなく、作業者によって取扱い、保管および／または輸送について実質的に安全な（好ましくは安全な）状態にされ、現に、試料は、除染され、元々は試料中に存在するいずれの病原性生物も破壊、不活性化、死滅および／または溶解され、これらを無害化している。生物試料を回収するための組成物は、すぐに使用できる濃度で維持されてもよくまたは特定の用途に対して都合がよいもしくは必要とされる、例えば２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、３０倍またはこれを超えるなどの濃縮形態で維持されてもよい。
【００３１】
好ましくは、本方法からこのように得られたポリヌクレオチド集団は、好ましくは、実質的に安定であり、そのため核酸が実質的に分解せず、得られたポリヌクレオチド集団の完全性は、好ましくは、少なくとも実質的に維持され、そのため得られたポリヌクレオチドは実質的に無傷であり、組成物中に存在する成分の作用によって、ポリヌクレオチドを含む細胞が初期に遊離／溶解されたときの形態で試料中に存在する。本明細書に記述されているように、本発明の好ましい用途において、開示された方法を用いて得られた病原体特異的なポリヌクレオチド集団は、実質的に安定であり、分解されておらず、そのためこれらは、長期間（例えば、数時間から数日から数週間またはさらには数ヶ月の期間）、理想とは言えない周囲温度（例えば、約０℃からさらには約４０℃以上の温度）でさえ、遊離された核酸が有意に分解されることなく、有意な期間維持され得て、それによって、最初の試料回収とその後の分子分析の間に凍結され、氷上でまたは冷蔵された試料から抽出されたポリヌクレオチド集団を保管することができない場合でさえ、核酸の抽出が行われた数日から数週間後、下流の分子分析（例えば、鋳型依存的な増幅反応など）にポリヌクレオチドを適したものにする。
【００３２】
本明細書に記述されているように、好ましい実施形態において、（ｉ）１つ以上のカオトロープは、好ましくは、チオシアン酸グアニジン、イソシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンもしくはこれらの任意の組合せを含み；（ｉｉ）１つ以上の洗浄剤は、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンもしくはこれらの任意の組合せを含み；（ｉｉｉ）１つ以上の還元剤は、好ましくは、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、ジメチルスルホキシドもしくはこれらの任意の組合せを含み；（ｉｖ）１つ以上のキレート剤は、好ましくは、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムもしくはこれらの任意の組合せを含み；または（ｖ）１つ以上のバッファーは、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、重炭酸塩、リン酸塩もしくはこれらの任意の組合せを含む。
【００３３】
すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）濃度にある好ましい製剤は、以下を含む：（ａ）（ｉ）約３Ｍのチオシアン酸グアニジン；（ｉｉ）約１ｍＭのＴＣＥＰ；（ｉｉｉ）約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｖ）約０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン；（ｖ）約０．０００２％シリコーンポリマー；（ｖｉ）約１００ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（ＴＲＩＳ）；および（ｖｉｉ）約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；または（ｂ）（ｉ）約３Ｍのチオシアン酸グアニジン；（ｉｉ）１ｍＭのＴＣＥＰ；約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉｉ）約０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、ナトリウム塩；（ｉｖ）約０．０００２％シリコーンポリマー；（ｖ）約１００ｍＭのＴＲＩＳ；（ｖｉ）約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；および（ｖｉｉ）約１０％から約２５％エタノール（体積／体積）。
【００３４】
細胞の容易な死滅および溶解、タンパク質性細胞成分の変性ならびに無傷の核酸の保存に有害である内因性および外因性ヌクレアーゼなどの酵素の不活性化における、開示されている製剤の顕著な有効性のため、本発明者らは、ある種の例において、試料中に存在する実質的にすべての微生物は、組成物と接触後の最初の数分以内に死滅および／または溶解されることを実証している。いくつかの例において、細胞の死滅および溶解は、試料と組成物の接触後の約３分または約４分または約５分またはその程度の範囲内で実質的に完了される。同様に、他の例において、約６分または約７分または約８分または約９分または約１０分またはその程度の期間にわたる試料と組成物の接触は、回収された試料中に存在し得るすべての病原体を実質的に死滅および／または溶解させるのに十分である。同様に、試料中に存在する溶解された細胞から遊離された、実質的にすべてのタンパク質、酵素、ヌクレアーゼなどは、試料と組成物の接触後、ほんの数分以内に実質的にすべて不活性化および／または変性される。
【００３５】
好ましくは、試料は、生物学的、臨床的、獣医学的または環境起源のものであり、ある種の実施形態において、試料は、好ましくは、ヒト起源であり、特に、マイコバクテリウム属の１つ以上の株または種によって引き起こされる結核感染などの微生物感染を有する、微生物感染を有することが疑われるまたは微生物感染を発症する危険にあるヒト起源である。試料が採取される個体は、１つ以上の二次的または三次的な医学的状態、特に、細菌の１つ以上の非病原性種または真菌もしくはウイルス起源の１つ以上の病原性種またはこれらの任意の組合せによる二次的および／または三次的感染を有する、これらの症状を有することが疑われるまたはこれらの症状を発症する危険にある患者であってもよい。
【００３６】
好ましくは、試料から得られた複数の単離および精製されたポリヌクレオチドに含まれる核酸セグメント集団は、プライマー依存的な増幅に適し、特に、ポリヌクレオチドが、試料回収と分子分析時の間の約１日から約９０日の期間、組成物中に保管される場合に適しており、例えば約０℃から約４０℃の周囲温度以下、好ましくは周囲温度での保管を含む、理想とは言えない保管条件で保管された場合でさえ適している。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本方法は、得られた病原体特異的なポリヌクレオチド集団内で、この集団と標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブを接触させることによって、少なくとも第一の病原体特異的な核酸セグメントの存在を検出するステップをさらに含み、ここで、標識されたハイブリダイゼーション産物の存在は、得られたポリヌクレオチド集団における１つ以上の病原体特異的な核酸セグメントの存在を指示する。
【００３８】
例示的な実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブは、配列番号４または配列番号７の配列からなる少なくとも第一の配列領域を含む。組成物は、さらに、最初に、約５０から約５００ヌクレオチドの長さ、あるいは約７０から約２５０ヌクレオチドの長さ、さらにあるいは、約９０から約１５０ヌクレオチドの長さの既知量の少なくとも第一の内部陽性対照核酸セグメントを含み、ここで、この内部陽性対照核酸セグメントは、試料が得られた宿主のゲノム核酸および病原体のゲノム核酸に実質的にハイブリダイズしない。このようなＩＰＣは、本明細書に詳細に開示され、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを含んでもよい。ある種の実施形態において、ＩＰＣ核酸セグメントは、配列番号８からの少なくとも４０の連続するヌクレオチド配列、少なくとも５０の連続するヌクレオチド配列、少なくとも６０の連続するヌクレオチド配列、少なくとも７０の連続するヌクレオチド配列もしくは少なくとも８０の連続するヌクレオチド配列またはこれらの相補配列を含む。
【００３９】
例示的な実施形態において、ＩＰＣは、以下を含む：（ａ）第一の内部陽性対照核酸セグメントに対して特異的である、約１５から約４０ヌクレオチドの長さ、約１８から約３５ヌクレオチドの長さまたは約２０から約３０ヌクレオチドの長さの標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブに特異的に結合する第一の配列ドメイン；（ｂ）約１５から約４５ヌクレオチドの長さ、約２５から約３５ヌクレオチドの長さまたは約２０から約３０ヌクレオチドの長さのフォワードＰＣＲ増幅プライマーに特異的に結合する第二の配列ドメイン；および（ｃ）約１５から約４５ヌクレオチドの長さ、約１８から約４０ヌクレオチドの長さ、約２１から約３５ヌクレオチドの長さまたは約２４から約３０ヌクレオチドの長さのリバースＰＣＲ増幅プライマーに特異的に結合する第三の配列ドメイン、ここで、第二および第三の配列ドメインは、それぞれ、第一の配列ドメインの上流および下流に作動可能に位置され、少なくとも第一の部分を増幅するのに有効な条件下でフォワードおよびリバースプライマーから、内部陽性対照核酸セグメントの少なくとも第一の部分のＰＣＲに指向された増幅を促進する。
【００４０】
また、本方法は、好ましくは、少なくとも（ａ）少なくとも第一の増幅ステップおよび少なくとも第一のハイブリダイゼーションステップを含む、少なくとも１回の熱サイクリングステップを実施するステップ（ここで、少なくとも第一の増幅ステップは、得られたポリヌクレオチド集団を、少なくとも一対の別個の、独立して選択される特異的な増幅プライマー対、熱安定性ポリメラーゼ、ベタインまたは他のカチオン性官能化両性イオン化合物を含む第一の浸透圧剤、少なくとも第一の参照色素および複数のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む組成物と接触させ、少なくとも第一の病原体特異的な増幅産物を生成することを含む）；ならびに（ｂ）増幅産物を第一の標識された病原体特異的なオリゴヌクレオチド検出プローブと接触させることによって、このように生成された増幅産物の存在を検出するステップ（ここで、標識されたハイブリダイゼーション産物の存在は、得られたポリヌクレオチド集団における１つ以上の病原体特異的な核酸セグメントの存在を指示する。）をさらに含んでもよい。このような実施形態において、別個の、独立して選択される病原体特異的な増幅プライマー対は、好ましくは、１８から約３０ヌクレオチドの長さの第一のオリゴヌクレオチドプライマーと１８から約３０ヌクレオチドの長さの第二のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよく、ここで、第一と第二のプライマーの各々は、それぞれ、第一と第二の別個の配列領域に特異的にハイブリダイズする。マイコバクテリアの検出および同定について、好ましくは、プライマー対は、５’−配列番号１の配列またはこの相補配列を含む。
【００４１】
関連する実施形態において、本発明の方法は、得られたポリヌクレオチド集団における内部陽性対照核酸セグメントの少なくとも第一の配列領域のプライマー依存的な増幅を実施するステップ、得られたポリヌクレオチド集団中に存在する内部陽性対照核酸セグメントの量を定量するステップを場合によってさらに含んでもよい。
【００４２】
同様に、本方法は、分析プロセスに沿って、１つ以上のステップで組成物中に存在する内部陽性対照核酸セグメントの量を、試料が溶解／保管／輸送培地に初期に添加される前の元の組成物中に存在していたＩＰＣの量または元の組成物中に存在していた標的核酸の量と比較するステップを場合によってさらに含んでもよい。このような比較は、アッセイの下流点における試料になおも含まれるＩＰＣの量が、試料がＭＴＭ組成物に添加される前にＭＴＭ組成物中に存在していたＩＰＣの既知量に匹敵するまたは実質的に同じであることを実証するために役立つ可能性があり、回収された試料中の対象とする標的核酸の量または下流でアッセイされた成分の量を定量するために役立つ可能性がある。このような情報はまた、元々存在していたものと比較して、試料中に残存する核酸の量を指示することができ、経時的に元々存在するポリヌクレオチドの試料の分解度の推定値を提供することができる。
【００４３】
本技術のいくつかの用途において、内部陽性対照核酸セグメントの少なくとも第一の配列領域のプライマー依存的増幅は、病原体特異的な核酸セグメントの増幅の後に実施され、一方、他の態様において、内部陽性対照核酸セグメントの少なくとも第一の配列領域のプライマー依存的増幅は、病原体特異的な核酸セグメントの増幅と実質的に同時に実施される。
【００４４】
内部陽性対照核酸セグメントの増幅産物は、第一の検出可能な標識を含む適切なオリゴヌクレオチド検出プローブを用いて検出されてもよく、病原体特異的な核酸セグメントの増幅産物は、第二の別個の検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチド検出プローブを用いて検出される。
【００４５】
また、このような方法は、得られたポリヌクレオチド集団内の１つ以上の薬剤耐性遺伝子の存在を検出することを場合によってさらに含むことができる。
【００４６】
また、本発明は、好ましくは、（ａ）１つ以上のバッファー；（ｂ）１つ以上の浸透圧剤；（ｃ）１つ以上のアルブミンタンパク質；（ｄ）１つ以上のキレート剤；（ｅ）１つ以上の塩；（ｆ）少なくとも一対の別個の、独立して選択される病原体特異的な増幅プライマー対、ここで、第一と第二のプライマーの各々は、第一と第二の別個の配列領域に特異的にハイブリダイズする；（ｇ）第三の配列領域に特異的にハイブリダイズする第一の検出可能な標識を含む病原体特異的なオリゴヌクレオチド検出プローブ；（ｈ）少なくとも１つのプライマー依存的な増幅反応可能な熱安定性ポリメラーゼ；および（ｉ）少なくとも第一の病原体特異的な増幅産物の増幅を可能にするのに十分な量で各々が存在する複数のデオキシヌクレオシド三リン酸を含むプライマー依存的な増幅反応と適合性がある組成物を提供する。熱サイクリング対応（例えば、ＰＣＲ対応）である組成物は、すぐに使用できる濃度で維持されてもよくまたは特定の用途に対して都合がよいもしくは必要とされる、例えば２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、３０倍またはこれを超えるなどの濃縮形態で維持されてもよい。
【００４７】
例示的な実施形態において、（ａ）１つ以上のバッファーは、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含み；（ｂ）１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応浸透圧剤は、好ましくは、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、グリセロール、非イオン性洗浄剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムまたはそれらの任意の組合せを含み；（ｃ）１つ以上のアルブミンのタンパク質は、好ましくは、ＢＳＡ、ＨＡＳまたは任意の哺乳動物アルブミンであり；（ｄ）１つ以上のキレート剤は、好ましくは、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムまたはこれらの任意の組合せを含み；（ｅ）１つ以上の塩は、好ましくは、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、グルタミン酸カリウムまたはこれらの任意の組合せを含み、ならびにプライマー対は、好ましくは、（ｉ）病原体特異的な核酸配列と、少なくとも９５％同一である配列からなる少なくとも第一の配列領域を好ましくは含む、１８から約３０ヌクレオチドの長さの第一のオリゴヌクレオチドプライマー；および（ｉｉ）病原体特異的な核酸配列と、少なくとも約９０％同一、好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは約９８％同一である配列またはこの相補配列からなる少なくとも第一の配列領域を好ましくは含む、１８から約３０ヌクレオチドの長さの第二のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００４８】
病原体特異的なオリゴヌクレオチド検出プローブは、好ましくは、２４から約３５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは、病原体特異的な配列に由来する少なくとも第一の連続する核酸配列と、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一もしくは少なくとも９８％もしくはこれを超えて同一である配列またはこの相補配列からなる少なくとも第一の配列領域を含む。組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応と適合性がある１つ以上の内部参照色素、例えば、１つ以上のフルオロフォア、１つ以上のクエンチャー、１つ以上のレポーター分子、１つ以上の核酸挿入剤またはこれらの任意の組合せを含むものを場合によってさらに含んでもよい。
【００４９】
例示的な実施形態において、すぐに使用できる濃度の組成物は、好ましくは、（ａ）約５０ｍＭのＴＲＩＳ；（ｂ）約７０ｍＭの塩化カリウム；（ｃ）約３ｍＭの硫酸マグネシウム；（ｄ）約４５ｍＭのベタイン；（ｅ）約０．０３μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン；（ｆ）約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；（ｇ）約０．０１μＭから約１μＭの色素；（ｈ）１８から約３０ヌクレオチドの長さの約４μＭの第一のオリゴヌクレオチドプライマー；（ｉ）１８から約３０ヌクレオチドの長さの約４μＭの第二のオリゴヌクレオチドプライマー；（ｊ）２４から約３５ヌクレオチドの長さの約６μＭの病原体特異的なオリゴヌクレオチド検出プローブ；（ｋ）約１単位のＴａｑポリメラーゼ；および（ｌ）約０．２ｍＭのデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。
【００５０】
検出可能な標識は、好ましくは、１つ以上の放射性標識、１つ以上の発光標識、１つ以上の化学発光標識、１つ以上の蛍光標識、１つ以上のリン光発光標識、１つ以上の磁気標識、１つ以上のスピン共鳴標識、１つ以上の酵素標識またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。例示的な検出可能な標識は、限定されないが、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−スクシンイミジルエステル（６−ＦＡＭＳＥ）、ＶＩＣ色素またはこれらの任意の組合せを含む。
【００５１】
本明細書に記述されているように、本発明はまた、好ましくは、本明細書に開示されている１つ以上の組成物および水性試料中の病原体特異的な核酸セグメントの検出においてキットを用いるための使用説明書を含む診断キットを提供する；場合によって、本キットは、（典型的には、別々の別個の容器に）第一のＭＴＭ組成物をさらに含んでもよく、この組成物は、ａ）１つ以上のカオトロープ；ｂ）１つ以上の洗浄剤；ｃ）１つ以上の還元剤；ｄ）１つ以上のキレート剤；およびｅ）１つ以上の界面活性剤を含み、各々は、１つ以上の病原性細胞もしくは感染細胞を実質的に死滅させるもしくは溶解する量または有効な時間量で組成物に入れられたとき、ここから遊離される１つ以上のタンパク質、酵素もしくはヌクレアーゼを変性もしくは不活性化する量で存在する。ある種の実施形態において、キットはまた、（好ましくはＭＴＭ組成物内で）既知量の少なくとも第一の内部陽性対照核酸セグメント（好ましくは約５０から約５００ヌクレオチドの長さのセグメント）をさらに含んでもよく、ここで、内部陽性対照核酸セグメントは、試料が得られた宿主のゲノム核酸に対しておよび試料中にあることが疑われる１つ以上の微生物病原体のゲノム核酸に対して、実質的にハイブリダイズしない（好ましくは特異的にハイブリダイズしない）。本明細書に記述されているように、このようなキットはまた、ＭＴＭ製剤と接触させた、溶解された／遊離された／変性された試料由来のポリヌクレオチド集団を単離および精製するための１つ以上の抽出機器を場合によってさらに含んでもよい。このような抽出機器は、持ち運び可能な、卓上型のまたはさらには携帯型のデバイスであってもよく、このデバイスは、好ましくは、（ｉ）少なくとも１つの受信側を有し、ポリヌクレオチド集団を結合するように適合された膜フィルターを備える濾過器、ここで、膜フィルターは濾過器の幅を少なくとも実質的に横切って、少なくとも部分的にここに配置される；および（ｉｉ）通過させて液体を濾過するための濾過器と作動可能に関連付けられたある量の液体を制御可能に分注し、強制的に注射するように適合された体積分注機構；ならびにｂ）少なくとも第一の病原体を含むことが疑われる水性試料由来の精製されたポリヌクレオチド集団を得るための抽出機器を使用するための使用説明書を含む。
【００５２】
本発明は、有利には、従来の被検体回収を改善し、被検体に含まれるあらゆる微生物病原体の溶解を確実にし、回収時点から同定およびアッセイ時点までこのような試料の安全で有効な輸送および保管を促進する。さらに、本明細書に開示されている分子輸送培地組成物は、回収された微生物から遊離された核酸の安定化を促進しおよび周囲または理想とは言えない保管条件下でさえ、長期間、遊離された核酸の忠実度を維持し、完全性を保存する。
【００５３】
したがって、本発明は、有利には、生物病原体を溶解し、遊離された核酸（ＲＮＡとＤＮＡの両方）を安定化し、回収されたポリヌクレオチドの完全性を好ましくは少なくとも実質的に維持し、好ましくは完全に維持する回収および保存製剤を提供し、その結果、この回収されたポリヌクレオチドの少なくとも第一の部分は、容易に利用可能であり、回収された被検体内に含まれる核酸の下流の分子診断分析に理想的に適している。
【００５４】
本明細書に開示されている「ワンステップ」の単離／保管／輸送製剤は、有利には、少なくとも１つ以上、好ましくはすべての以下の主な機能を果たす：試料内の病原体の不活性化または死滅；細胞の溶解および細胞内からの核酸の放出；遊離された核酸の分解を防止するための内因性および外因性ヌクレアーゼを含む細胞酵素の不活性化；冷蔵または従来の氷点下の保管温度を必要としないで長時間にわたる周囲温度での、単離されたポリヌクレオチドの試料の容易な回収と安全な取扱い／輸送の促進；その後の試料の取扱い、輸送および／または保管中の核酸の有効な安定化；ならびに試料に含まれる少なくとも第一の核酸セグメントの分子の特徴付けおよび同定を可能にするのに十分な時間にわたる、試料に含まれるポリヌクレオチド集団の少なくとも第一の部分の完全性の保存および／または維持。
【００５５】
本発明に記載されている特定の態様において、特に、遠隔部または「現場」のいずれかにおいて獲得される被検体の分析のための方法を実施する場合、本発明の分子輸送培地（ＭＴＭ）組成物は、好ましくは、回収された試料から得られた核酸の少なくとも第一の集団の実質的な分解または喪失なしに、少なくともその後の分子分析を促進するのに十分な期間、回収された生物試料を安定化する。好ましくは、本明細書におけるＭＴＭ組成物は、周囲の環境温度で、長期間（数時間から数日またはさらには数週間または数ヶ月またはそれを超える）、その中に回収された生物被検体の回収／輸送／保管を促進し、その結果、回収された試料は、その後の分子試験のためにこれらの試料を保存するために冷蔵および／または凍結を必要としない。なおもより好ましくは、本明細書に開示されているＭＴＭ製剤は、回収された試料中に存在する少なくとも第一の微生物病原体由来の少なくとも第一の核酸配列のその後の増幅および同定を可能にするのに十分な方式で、回収された核酸を安定化および保存する。
【００５６】
例示的な実施形態において、本明細書に記載されているＭＴＭ製剤は、微生物特異的なポリヌクレオチドの改善された回収を促進し、回収された被検体の配列忠実度の決定および保存を可能にするために、少なくとも第一の内部陽性対照（ＩＰＣ）を場合によってさらに含む。典型的な知られているポリヌクレオチド配列は、被検体回収時の回収試薬に存在してもよく、この既知量のＩＰＣのその後の分析は、記載された同定法の回収／輸送／分析段階の全体でポリヌクレオチド集団の忠実度を正確にモニタリングするために使用されてもよい。
【００５７】
本発明の実施において、本明細書に開示されている輸送培地を用いて同定されるべき例示的な病原体は、限定されないが、１つ以上のマイコバクテリアを含み、限定されないが、マイコバクテリウム属の１つ以上の種および株を含み、例えば、１つ以上の結核の原因因子が挙げられる。
【００５８】
ポリヌクレオチド集団が、組成物において熱サイクリングステップの前の約１日から約３０日の期間、約１０℃から約４０℃の温度で保管される場合、ポリヌクレオチド集団の完全性は、少なくとも実質的に維持され、ポリヌクレオチド集団は、実質的に分解されていない状態のままであり、この組成物は、（ａ）（ｉ）約３Ｍのチオシアン酸グアニジン；（ｉｉ）約１ｍＭのＴＣＥＰ；（ｉｉｉ）約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｖ）約０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン；（ｖ）約０．０００２％シリコーンポリマー；（ｖｉ）約１００ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（ＴＲＩＳ）；および（ｖｉｉ）約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；または（ｂ）（ｉ）約３Ｍのチオシアン酸グアニジン；（ｉｉ）１ｍＭのＴＣＥＰ；約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉｉ）約０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩；（ｉｖ）約０．０００２％シリコーンポリマー；（ｖ）約１００ｍＭのＴＲＩＳ；（ｖｉ）約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；および（ｖｉｉ）約１０％から約２５％エタノール（体積／体積）を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド集団を含む組成物が、約１０℃から約４０℃の温度にて、約１日から約７日の期間または約７日から約１４日もしくは１４日から約２８日の期間保管される場合、ポリヌクレオチド集団の完全性は、少なくとも実質的に維持され、ポリヌクレオチド集団は、実質的に分解されていない状態のままである。
【００５９】
特定の実施形態において、集団内のポリヌクレオチドの完全性が実質的に維持され、その結果、少なくとも約７５％または少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、いくつかの例において少なくとも約９９％の初期のポリヌクレオチドは、約１０℃から約４０℃の温度にて、約１日から約３０日の期間、いくつかの実施形態において約１日から１４日の期間での、組成物の保管時に少なくとも実質的に全長を保持する。
【００６０】
本発明の実施において、このように分析されるポリヌクレオチド集団は、好ましくは、生物試料から得られ、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜などを含む）から得られる生物試料を含む。試料は、増幅プロトコールおよびその後の増幅産物の検出前の任意の適切な時点で得られてもよいが、特定の態様において、試料回収、試料からのポリヌクレオチド集団の単離と対象とする標的核酸の増幅／検出分析の間の時間は極めて短く、例えば、試料回収から増幅産物の検出まで数分から数時間程度であり、一方、他の実施形態において、対象とする標的核酸の増幅／検出分析はより長くてもよい。
【００６１】
一実施形態において、病原体から単離された少なくとも第一のポリヌクレオチド集団を含むことが疑われる生物試料を回収する方法は、ａ）１つ以上のカオトロープ；ｂ）１つ以上の洗浄剤；ｃ）１つ以上の還元剤；ｄ）１つ以上のキレート剤；およびｅ）１つ以上の界面活性剤を含む少なくとも第一の溶液を含む第一の回収デバイスに生物試料を置くことを含み、各々は、１つ以上のタンパク質を変性させるまたは１つ以上のヌクレアーゼを不活性化するのに十分な量で存在し、ここで、回収溶液は、安全な取扱いおよび輸送のために被検体中に存在するあらゆる病原体を死滅、不活性化または除染し、ポリヌクレオチド集団を含む回収溶液が、約１０℃から約４０℃の温度にて、回収溶液からポリヌクレオチド集団を抽出する前の約１日から約４２日の期間保管される場合、ポリヌクレオチド集団の完全性は、少なくとも実質的に維持され、ポリヌクレオチド集団は、実質的に分解されていない状態のままである。
【００６２】
さらなる実施形態において、死滅、不活性化または除染は、回収溶液と接触する約５分以内で生じる。いくつかの実施形態において、死滅、不活性化または除染は、回収溶液と接触する約２分以内で生じる。他の実施形態において、死滅、不活性化または除染は、回収溶液と接触する約１分以内で生じる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、生物試料から得られたポリヌクレオチド集団はさらに分析される。また、本発明は、微生物の配列を検出するための試薬混合体を包含し、この試薬混合体は、周囲温度にて少なくとも実質的に安定であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デバイスによる使用に適合され、構成されている、混合物中に存在する１つ以上の微生物特異的なプライマー、プローブもしくは酵素またはこれらの組合せを含む。一実施形態において、試薬混合体は、周囲温度で少なくとも約５日間、最大２週間、実質的に安定である。別の実施形態において、微生物の配列の検出は、この微生物の配列が試料から抽出された後、約９０分以内で生じる。試薬混合体は、微生物の配列、例えば、病原体、細菌もしくはウイルスの配列またはこれらの組合せを同定するために使用することができる。また、本発明の試薬混合体は、本明細書において「ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）」、いくつかの例において「ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢ」とも称され、ウイルスもしくは細菌配列の株またはさらには種特異的なツベルクリン株を同定するためにも使用することができる。
【００６４】
さらなる実施形態は、少なくとも１つの微生物特異的な核酸配列または少なくとも１つの微生物特異的な核酸配列を含むことが疑われる生物試料を含む組成物を含むことができ、溶液は、（ｉ）１つ以上のバッファー（各々、好ましくは、約１ｍＭから約１Ｍの量で組成物中に存在する）；（ｉｉ）１つ以上の浸透圧剤またはアルブミンタンパク質、このうち少なくとも１つはベタインを含む（各々、好ましくは、約１ｍＭから約１Ｍの量で組成物中に存在する）；（ｉｉｉ）１つ以上のキレート剤（各々、好ましくは、約０．０１ｍＭから約１ｍＭの量で組成物中に存在する）；（ｉｖ）１つ以上の参照色素（各々、好ましくは、約０．０１μＭから約５０ｍＭ、より好ましくは約０．０２μＭから約１μＭの量で組成物中に存在する）；および（ｖ）１つ以上の塩（各々、好ましくは、約５０ｍＭから約１Ｍの量で組成物中に存在する）；および第一の病原体特異的な増幅プライマー対を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、病原体特異的なプローブをさらに含む。一実施形態において、参照色素は、約０．０１μＭから約１μＭの量で存在する。好ましくは、組成物は１つ以上の塩を含む。塩は、好ましくは、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルタミン酸カリウムまたはこれらの任意の組合せである。好ましくは、組成物中の塩の濃度は、約０．５ｍＭから約５０ｍＭの間である。
【００６５】
１つ以上のバッファーの包含は、核酸および酵素を安定化する製剤のｐＨを調節するために望ましい。好ましいｐＨ範囲は、約６．０から約９．５であり、好ましくは約６．５から約８．０の間であり、より好ましくは約６．５から約７．５の間である。好ましくは、バッファーおよび／または全体的な組成物のｐＨは、バッファーのｐＫａの１単位以内であり、より好ましくは約０．５単位以内、より好ましくは約０．２単位以内、より好ましくは約０．１単位以内であり、すべては選択温度にて、好ましくは周囲温度にて測定された場合である。例示的なバッファーは、限定されないが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む。好ましい実施形態において、バッファーはＴＲＩＳを含む。
【００６６】
少なくとも第一の浸透圧剤は、特に、高い含有量のグアニンおよびシトシンが配列に存在する場合に、反応条件を最適化するために本方法において使用することができ、限定されないが、ベタイン、トリメチルグリシン、グリシンベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、デオキシイノシン、グリセリン、７−デアザデオキシグアノシン三リン酸もしくは水酸化ナトリウムまたはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００６７】
例示的なキレート剤は、限定されないが、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムまたはこれらの任意の組合せを含む。好ましい実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸またはこれらの組合せを含む。より好ましい実施形態において、キレート剤はＥＤＴＡを含む。
【００６８】
少なくとも第一の参照色素、好ましくは不活性な化学物質は、ＦＲＥＴ技術において使用されるものなどの蛍光化合物を用いた場合に得られる結果を標準化するために本方法において場合によって使用することができる。参照色素は、含まれる場合に、レポーター色素シグナルが標準化され得る内部参照を提供することができる。このような参照色素は、限定されないが、受動参照色素、例えばフルオレセイン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、市販の製剤、例えばＲＯＸ（商標）またはこれらの組合せを含むことができる。より好ましい実施形態において、参照色素はＲＯＸ（商標）を含む。
【００６９】
好ましくは、組成物は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの量で、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸またはデオキシウロシン三リン酸またはこれらの組合せの添加をさらに含む。
【００７０】
本発明の組成物は、１つ以上の追加の化合物または試薬、例えば、限定されないが、アルブミンをさらに含むことができる。アルブミンは、一般的に、水溶性であり、濃縮された塩溶液中で中程度に可溶性であり、熱変性を受ける任意のタンパク質を指す。アルブミンは、通常、血漿に見出され、アルブミンがグリコシル化されていないという点で、他の血液タンパク質と区別される。好ましくは、アルブミンは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、硫酸マグネシウム、水および酸または塩基、例えば塩酸および水酸化ナトリウムである。酸または塩基は、ｐＨを調整するために最終溶液に添加することができる。好ましくは、ＢＳＡは、約０．０１μｇ／μＬから約０．５μｇ／μＬの濃度で添加される。
【００７１】
本発明の組成物は、１つ以上のポリメラーゼをさらに含むことができる。１つ以上のポリメラーゼは、限定されないが、Ｔａｑポリメラーゼおよび高忠実度ポリメラーゼを含むことができる。好ましくは、１つ以上のポリメラーゼは、酵素の約１Ｕから最終溶液の約１０から約５０μＬの量で存在する。
【００７２】
特定の実施形態において、組成物は、好ましくは、放射性、発光、化学発光、蛍光、酵素、磁気もしくはスピン共鳴標識またはこれらの組合せを含む少なくとも第一のオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含む。蛍光標識は、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）もしくは６−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−スクシンイミジルエステル（６−ＦＡＭＳＥ）などまたはこれらの組合せを含むことができる。各核酸について好ましいプライマーおよび／またはプローブ濃度は、約１ｐｍｏｌから約１０μＭの間である。
【００７３】
本発明は、生物試料から得られたポリヌクレオチド集団における病原体特異的な核酸セグメントの有無を検出する方法をさらに提供し、本方法は、（ａ）少なくとも第一の増幅ステップおよび少なくとも第一のハイブリダイゼーションステップを含む、少なくとも１回の熱サイクリングステップを実施すること（ここで、少なくとも第一の増幅ステップは、病原体特異的な核酸セグメントが試料中に存在する場合に、病原体特異的な核酸セグメントを含むことが疑われる生物試料から得られたポリヌクレオチド集団を、少なくとも一対の別個の、独立して選択される病原体特異的な増幅プライマー対、ポリメラーゼ、ベタインを含む第一の浸透圧剤、場合によって（しかし、好ましくは）少なくとも第一の参照色素および複数のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む組成物と接触させ、病原体特異的な増幅産物を生成することを含む）；ならびに（ｂ）増幅産物を第一の検出可能な標識を含む病原体特異的なオリゴヌクレオチド検出プローブと接触させることによって、増幅産物の存在を検出すること（ここで、標識されたハイブリダイゼーション産物の存在は、ポリヌクレオチド集団における１つ以上の病原体特異的な核酸セグメントの存在を指示し、別個の、独立して選択される病原体特異的な増幅プライマー対は、１８から約３０ヌクレオチドの長さの第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび１８から約３０ヌクレオチドの長さの第二のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、第一および第二のプライマーの各々は、それぞれ、病原体特異的な配列内の第一および第二の別個の配列領域またはこの相補配列もしくは逆相補配列に特異的にハイブリダイズする。）を含む。
【００７４】
本発明のマイコバクテリウムＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）の例示的な製剤は、本明細書の実施例に記載され、限定されないが、（ａ）約１ＵのＴａｑポリメラーゼ；（ｂ）５’−ＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡ−３’（配列番号４）または５’−ＡＧＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列番号７）の核酸配列を含む、この核酸配列から本質的になる、あるいはこの核酸配列からなる核酸配列を含む約６μＭの検出プローブ；（ｃ）ＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＣＧＡ−３’（配列番号３）もしくは５’−ＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＡＣＧＴＣＧＣＡ−３’（配列番号６）の配列またはこれらの相補配列の１つ以上と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、この核酸配列から本質的になる、あるいはこの核酸配列からなる、約５０ヌクレオチド未満、好ましくは約４０ヌクレオチド未満、なおもより好ましくは約３０ヌクレオチド未満の長さの約４μＭのリバースオリゴヌクレオチドプライマー；（ｄ）５’−ＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２）もしくは５’−ＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＣＣＧＧＣＴ−３’（配列番号５）の配列またはこれらの相補配列の１つ以上と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、この核酸配列から本質的になる、あるいはこの核酸配列からなる、約５０ヌクレオチド未満、好ましくは約４０ヌクレオチド未満、なおもより好ましくは約３０ヌクレオチド未満の長さの約４μＭのフォワードオリゴヌクレオチドプライマー；（ｅ）約５０ｍＭのＴｒｉｓ；（ｆ）約７０ｍＭのＫＣｌ；（ｇ）約３ｍＭのＭｇＳＯ４；（ｈ）約４５ｍＭのベタイン；（ｉ）約０．０５μＭのＲＯＸまたは同等の参照色素；（ｊ）約０．０２５μｇ／μｌの超純粋ＢＳＡ；（ｋ）約０．２ｍＭのｄＮＴＰ；および（ｌ）約０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む組成物を含む。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態は、生物試料からゲノム核酸を得ること、１つ以上の微生物特異的なプライマー、プローブもしくは酵素またはこれらの組合せの試薬混合体に核酸を添加することによって、ゲノム材料を評価することを含む微生物の配列を検出するための方法を含み、ここで、混合体は、室温で実質的に安定であり、ＰＣＲデバイスを用いた使用に適合される。別の実施形態において、ＰＣＲデバイスは、リアルタイムＰＣＲ検出のための蛍光検出装置を含む。
【００７６】
さらなる実施形態において、本発明は、マイコバクテリアに特異的な核酸セグメントの有無を検出するための方法を提供し、特定の態様において、特定のタイプ、サブタイプまたは株のＭ．ツベルクロシスの有無を検出するための方法を提供する。例示的な実施形態において、本発明は、好ましくは生物試料から得られるポリヌクレオチド集団における１つ以上のＩＳ６１１０特異的な核酸セグメントを含むマイコバクテリア種および株を同定するための方法を提供する。
【００７７】
別の態様において、本発明は、生物試料中の特定のポリヌクレオチド配列、例えばマイコバクテリウム特異的なＩＳ６１１０配列のポリヌクレオチド配列を迅速に検出するための方法を提供する。全体的なおよび一般的な意味において、この方法は、例えばＰＣＲ、標的配列に特異的なフォワードおよびリバースプライマーなどの従来の方法を用いる、特定の配列を含むことが疑われるヌクレオチド集団の増幅、得られた一本鎖ＰＣＲ産物との特定のプローブセットのハイブリダイゼーション、融解曲線分析の実施ならびに一本鎖ＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションプローブのハイブリッドのＴｍ変化の分析を含む。
【００７８】
プローブへの標識は、限定されないが、分子の技術分野における当業者に知られている放射性、発光、化学発光、蛍光、酵素、磁気またはスピン共鳴標識を含むことができる。例示的な実施形態において、標識されたプローブは、少なくとも第一の副溝バインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）を含む。標識された「プローブ」配列を用いてポリヌクレオチドを検出するための１つのこのような方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを利用する。例示的なＦＲＥＴ検出法は、多くの場合、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアを含むフルオロフォア対を伴い、ここで、ドナーフルオロフォアは、アクセプターフルオロフォアに共鳴エネルギーを移動することができる。例示的なＦＲＥＴアッセイにおいて、ドナーフルオロフォアの吸収スペクトルは、アクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと実質的に重複しない。本明細書で使用するとき、「ドナーオリゴヌクレオチドプローブ」とは、蛍光共鳴エネルギー移動対のドナーフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、「アクセプターオリゴヌクレオチドプローブ」とは、蛍光共鳴エネルギー移動対のアクセプターフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、「ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド対」は、典型的に、「アンカー」または「ドナー」オリゴヌクレオチドプローブおよび「アクセプター」または「センサー」オリゴヌクレオチドプローブを含み、ドナーオリゴヌクレオチドプローブとアクセプターオリゴヌクレオチドプローブがともにこれらの相補標的核酸配列にハイブリダイズするとき、このような対はＦＲＥＴ関係を形成する。蛍光共鳴エネルギー移動対として使用するのに許容されるフルオロフォア対は当業者に周知であり、限定されないが、フルオレセイン／ローダミン、フィコエリスリン／Ｃｙ７、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ６４０およびフルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ７０５などを含む。
【００７９】
本方法の通常の実施において、当業者はまた、本方法の完全性、忠実度および精度を確実にするために、分子遺伝学的アッセイの技術分野において日常的に行われるように、１つ以上の「陰性」および／または「陽性」対照試料（単数または複数）に対してサイクリングステップを実施してもよい。このような対照の使用は、当業者に日常的であり、本明細書においてさらに記載する必要はない。同様に、本発明の実施において、開示されている方法の完全性、忠実度および／または精度をさらに確実にするために、１つ以上の既知の「内部陽性対照」（ＩＰＣ）を単離されるべきポリヌクレオチド集団に組み込むこともまた望ましい場合がある。
【００８０】
ある種の実施形態において、核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の添加は、ａ）「担体」として（少量の補足的ＲＮＡ／ＤＮＡの添加は、試料／被検体、特に少量の標的、すなわち細胞、ウイルス、細菌を含有し得る元の被検体の全体収率を増大／増加させることが従前に示されている。）、ｂ）下流の分子処理のためのおよび試料回収から検出までの核酸調製物の忠実度を追跡またはモニタリングするためのＩＰＣとしてならびにｃ）下流の定量分析、例えばｑＲＴ−ＰＣＲなどの「キャリブレーター」と比較するための、開示されている方法の様々な目的および用途に有益であると企図される。このような実施形態において、１つ以上の既知のまたは「対照」の核酸を、約１ａｇから約１ｍｇ、より好ましくは約１ｆｇから約１μｇ、なおもより好ましくは約１ｐｇから約１ｎｇの最終濃度で組成物に添加することができる。
【００８１】
例示的な実施形態において、本発明は、（ａ）核酸を含むことが疑われる生物試料からのポリヌクレオチドの回収を助けるための担体分子としてならびに／または（ｂ）被検体回収およびポリヌクレオチド単離／安定化の完全性および忠実度をモニタリングするためのＩＰＣ（すなわち、「既知の」、「レポーター」、「対照」、「標準」または「マーカー」）配列として有用である、単離された一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはこれらのハイブリッドを提供する。ある種の実施形態において、本発明は、担体分子および／またはＩＰＣとして有用である、単離されたｄｓ−ＲＮＡ、ｄｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＰＮＡまたはこれらのハイブリッドを提供する。他の実施形態において、本発明は、担体分子としておよび／またはＩＰＣ配列として有用である、単離されたｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＰＮＡまたはこれらのハイブリッドを提供する。例示的な実施形態において、本発明は、担体分子とＩＰＣ配列の両方として有用である、単離されたｓｓＲＮＡ分子を提供する。
【００８２】
このような分子は、天然供給源から単離されてもよく、実験室で調製されてもよく、あるいは天然配列と非天然配列の両方を含むハイブリッドであってもよい。本明細書に記述されているように、本発明の組成物は、病原体起源のポリヌクレオチドを含むことが疑われる哺乳動物（特にヒト）供給源から得られた生物被検体の単離および特徴付けに特に有用であるため、担体および／または陽性対照化合物として使用される配列（単数または複数）は、哺乳動物のゲノム内またはこのような哺乳動物に対して病原性である生物のゲノム内で普通は見出されない一次ヌクレオチド配列を実質的に含むことが好ましい。例示的な哺乳動物は、限定されないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、オオカミ、イヌ、ウマ、ネコ、クマ、ネズミ、ライオン、ウサギ、ヤギおよび非ヒト霊長類を含む。
【００８３】
好ましくは、この非哺乳動物、非病原体特異的担体／レポーター配列は交差反応性がなく、すなわち、哺乳動物または病原体特異的な配列に実質的にハイブリダイズせずまたは好ましくはハイブリダイズせず、そのため、非コード、非縮重（すなわち、ナンセンス）配列は、対照／担体配列と回収された被検体から得られた単離されたポリヌクレオチド集団のメンバーのハイブリダイゼーションを最小限にするための、対照／担体配列の製剤において特に好ましい。したがって、例示的な担体／対照配列は、哺乳動物ゲノムから単離されたポリヌクレオチド集団または哺乳動物に対して病原性である細菌、真菌、ウイルスのゲノムから単離されたポリヌクレオチド集団と実質的に結合しないまたは好ましくは結合しない（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない）。当業者に知られている例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、限定されないが、（ａ）約５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳおよび１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する溶液中でのプレ洗浄；（ｂ）一晩５×ＳＳＣ中での約６０℃から約７０℃の温度におけるハイブリダイゼーション；ならびに（ｃ）続く、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた２０分間約６５から約７０℃における洗浄またはこれらと同等のハイブリダイゼーション条件がある。
【００８４】
本発明の別の態様は、上記のプライマーおよびプローブを組み込んでいる試薬混合物ならびに熱サイクリング増幅方法の実施のためのこのような組成物を含むキットを提供する。一実施形態において、本発明は、診断核酸増幅／検出キットを提供し、このキットは、一般的に、適切な容器に、本明細書に記載された病原体特異的なオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットおよび生物試料または被検体から得られたポリヌクレオチド集団のＰＣＲ増幅においてプライマーセットを用いるための使用説明書を含む。このようなキットは、同一または別個の容器に、病原体特異的な核酸セグメントを含むまたは含むことが疑われる生物試料または被検体から得られたポリヌクレオチド集団のＰＣＲ増幅から生成された増幅産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド検出プローブを場合によってさらに含んでもよい。このようなキットは、同一または別個の容器に、任意の１つ以上の試薬、希釈剤、酵素、検出可能な標識（限定されないが、１つ以上の放射性、発光、化学発光、蛍光、酵素、磁気またはスピン共鳴標識を含む）、ｄＮＴＰ、本明細書に記載されたポリヌクレオチド集団の１つ以上の熱サイクリング増幅を実施するのに必要とされる場合があるようなものを場合によってさらに含んでもよい。
【００８５】
本発明の別の態様は、キットの中に包含されるポリヌクレオチド集団の遺伝学的分析前の、生物試料の回収および／または保管および／または輸送用のキットを提供する。本発明は、喀痰などの生物材料の最小回収を可能にし、すなわち、約０．０１ｍＬから約２５ｍＬが使用されてもよく、好ましくは約０．０５ｍＬから約１０ｍＬ、より好ましくは０．１ｍＬから約５ｍＬである。このような実施形態において、キットは、好ましくは、１つ以上のバッファー、界面活性剤、カオトロープ、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅまたは上記のもののような分析用試料を調製するために必要とされ得るような他の核酸単離および／もしくは精製試薬を含む。
【００８６】
さらなる実施形態において、本発明のキットはまた、回収された生物試料からの核酸の単離または分離を促進するために、上述された１つ以上の抽出デバイスまたは機器を場合によってさらに含んでもよい。本発明のキットはまた、１つ以上の持ち運び可能な、高耐久性のまたは現場で使用可能な熱サイクリングのＰＣＲ増幅システムならびに／または本発明の実施中に生成される増幅産物の視覚化に使用される検出可能な標識（単数または複数）の検出、定量および／もしくは分布を促進するための１つ以上のシステム、デバイスもしくは器具を場合によってさらに含むことができる。
【００８７】
本発明の診断試薬およびキットは、商業的流通のために包装されてもよく、場合によって、試料または被検体の回収、取扱いまたは処理のための１つ以上の回収、送達、輸送または保管デバイスをさらに含んでもよい。このようなキットのための容器（単数または複数）は、典型的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、被検体カップまたは他の容器を含んでもよく、この中に組成物（単数または複数）は入れられ、好ましくは、個々の被検体回収、輸送および保管のために適切に分割されてもよい。キットはまた、上記された容器を他の装置、使用説明書などともに含むより大きな容器、例えばケースを含んでもよい。また、キットは、１つ以上の追加の試薬、バッファーまたは化合物を場合によって含んでもよく、臨床、診断、環境または法医学的試料の回収においてキットを使用するための使用説明書および開示されている１つ以上の組成物に一度入れられたこのような試料の保管および輸送のための使用説明書を場合によってさらに含んでもよい。
【００８８】
ある種の実施形態において、本明細書に開示されている組成物は、全体の被検体回収および核酸増幅／検出プロセスが、増幅／検出法の忠実度、精度または効率を有意に制限することなしに、遠隔、現場、戦場、田園または他には実験室ではない条件において果たされ得るように製剤化されてもよいことが企図される。このような本発明の態様は、達成するために数日から数週間を要し、多くの場合、分析を適切に完了するために、試料および／またはアッセイ試薬の冷蔵または凍結を必要とする条件下で行われなければならない、従来の手間のかかる単離／回収／輸送／保管／分析プロトコールと比較して特定の利点を提供する。常温保存可能な、周囲温度で容易な試薬混合体中に、必要な単離、保管およびポリヌクレオチド安定化成分のすべてを含む混合物および選択された標的ヌクレオチドの増幅に必要な試薬のすべてを含む混合物（限定されないが、単独でまたは１つ以上のＰＣＲバッファー、希釈剤、試薬、ポリメラーゼ、検出可能な標識などと併用される、本明細書に記載された増幅プライマーおよび検出プローブを含む）を含む試薬混合物を提供することによって、有意なコスト削減、時間の短縮および他の規模の経済性が、市販されている従来のオリゴヌクレオチドプローブに基づく熱サイクリングアッセイの多数と比較して、本発明を用いて達成され得る。リアルタイムＰＣＲ法が増幅に使用される場合、検出は、場合によって、所定数のサイクルの終わりに、あるいは増幅プロトコールにおける１回以上の各サイクリングステップ後に実施されてもよい。
【００８９】
本発明の組成物および方法は、臨床もしくは獣医学的被検体の回収または法医学的もしくは環境試料の回収システムを対象とし、効率的に、１）当該技術分野において現在入手可能なものを超える高収量の適切な被検体を得る；２）結核菌群のメンバーなどの潜在的に感染性の生物病原体を、これらがもはや生存可能でなく、病原体の放出もしくは汚染の恐れが最小限の状態で、取扱い、出荷もしくは輸送することができるように不活性化する；または３）試料を診断実験室で処理することができるまで、周囲温度で長期間、加水分解もしくはヌクレアーゼ分解からの溶解された「裸状態の」ＲＮＡ／ＤＮＡポリマーを有効に安定化および保存するため、好ましくはこれらの目標の２つ以上または３つすべてを達成するための、１つ以上の回収ツールおよび１つ以上の試薬を含むことができる。本発明の回収溶液は、次のような利益：微生物、ウイルスまたは病原体の不活性化、死滅および／または溶解；外因性または内因性ヌクレアーゼ、例えば、限定されないが、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅの破壊および／または不活性化；従来の様々な核酸抽出、精製および増幅システムとの適合性；試料内のＲＮＡおよび／またはＤＮＡの完全性の保存；周囲温度または熱帯温度における、さらには長期間にわたるまたは極端な温度変化における、輸送および出荷の促進；ならびに短い（数時間から数日）、中間の（数日から数週間）または長い（数週間から数ヶ月）期間の単離された核酸の保管のための適切性を提供する。適切な組成物（「ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）」とも称される）および方法は２００８年１０月１日に出願された、共同所有の米国特許出願公開第２００９−０３１２２８５号（この全内容は明示的な参照により、全体として本明細書に具体的に組み込まれる。）に見出すことができる。
【００９０】
例示的な実施形態において、生物試料中のポリヌクレオチド集団の完全性および／または試料から得られたポリヌクレオチドの少なくとも１つの少なくとも第一の配列の忠実度は、試料を含む組成物が、約−２０℃から約４０℃または約−１０℃から約４０℃または約０℃から約４０℃または約１０℃から約４０℃の温度にて、約１日から約７日またはこれを超える期間；あるいは約−２０℃から約４０℃または約−１０℃から約４０℃または約０℃から約４０℃または約１０℃から約４０℃の温度にて、約７日から約１４日またはこれを超える期間；あるいは約−１０℃から約４０℃または約０℃から約４０℃または約１０℃から約４０℃または約２０℃から約４０℃の温度にて、約１４日から約４２日またはこれを超える期間で保管される場合、少なくとも実質的に維持される（すなわち、集団内のヌクレオチドの少なくとも７５％、いくつかの場合において約８０％、他の実施形態において少なくとも約８５％またはさらには少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％が実質的に全長である。）。さらに、集団内のポリヌクレオチドの完全性は、初期のポリヌクレオチドの少なくとも約８０％が、約−２０℃から約４０℃、好ましくは約１０℃から約４０℃の温度にて、約１日から約１４日またはこれを超える期間；あるいは約−２０℃から約４０℃、好ましくは約１０℃から約４０℃の温度にて、約１４日から約４２日またはこれを超える期間での、組成物の保管時に少なくとも実質的に全長のままに実質的に維持され得る。
【００９１】
あるいは、生物試料中のポリヌクレオチド集団の完全性は、試料が初期に回収された場合、溶液中に存在する量と比較すると、集団内の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超えるヌクレオチドが溶液中に存在するように、少なくとも実質的に維持される。好ましい実施形態において、試料の完全性は、初期の試料中に存在するすべてのまたはほぼすべての細菌特異的なポリヌクレオチドが経時的に維持される（すなわち、検出可能に分解されていない）ように実質的に維持される。
【００９２】
開示された方法の実施において、好ましくは、回収時から、そこにあるポリヌクレオチド集団の単離、精製または特徴付け時まで、回収された試料中に元々存在するポリヌクレオチド集団の約２０％未満が、その後の保管中に経時的に分解される。好ましくは、回収された試料中に元々存在するポリヌクレオチド集団の実質的に約１５％未満は、その後の保管中に経時的に分解され、より好ましくは、回収された試料中に元々存在するポリヌクレオチド集団の約１０％未満は、その後の保管中に経時的に分解され、なおもより好ましくは、回収された試料中に元々存在するポリヌクレオチド集団の約５％未満は、その後の保管中に経時的に分解される。特に好ましい実施形態において、回収された試料中に元々存在するポリヌクレオチド集団の約５％以下、約４％、約３％、約２％または約１％は、その後の保管中に経時的に分解される。試料の品質のこのような高い完全性の保存は、試料が保管される条件にかかわらず好ましく、少なくとも約１日、少なくとも約５日、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、少なくとも約３０日、少なくとも約４５日、少なくとも約６０日、少なくとも約９０日またはさらに少なくとも約１２０日またはこれを超える期間、実質的に維持される。
【００９３】
本発明の実施から得られたまたは本発明の実施において利用される特定のポリヌクレオチド配列の存在、完全性または配列忠実度は、分子の技術分野における当業者に知られている任意の従来の方法を用いて決定されてもよいが、一実施形態において、ＰＣＲ増幅が利用される。同様に、対象のポリヌクレオチドの完全性の決定は、所与の条件下でのＰＣＲサイクル閾値（ＣΤ）の決定を含んでもよく、回収された核酸の配列忠実度、品質完全性の決定は、限定されないが、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学に基づく方法、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖末端法、Ｍａｔｈｉｅｓらの色素フルオロフォアに基づく方法またはＮｙｒｅｎおよびＲｏｎａｇｈｉによって記載されたピロシークエンシング技法を含む、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定法によって決定されてもよい。例えば、ヌクレオチド配列決定は、ＴＯＰＯ（登録商標）２．０クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて精製されたアンプリコンをクローニングすることによって行われ、次に、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ３．１試薬キットを用いて配列決定されてもよい。組み込まれなかった蛍光ヌクレオチドは、製造業者の推奨に従ってＤｙｅＥｘ（登録商標）９６ウェルプレートキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて除くことができる。ヌクレオチド配列決定は、さらに、ＡＢＩ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実施することができる。
【００９４】
内部陽性対照（「ＩＰＣ」）
いくつかの実施形態において、回収溶液および方法は、処理された試料の忠実度をモニタリングするため、被検体回収およびポリヌクレオチド単離／安定化の完全性および忠実度をモニタリングするためならびに／または下流の分子処理もしくは分析をモニタリングするために、少なくとも１つの内部陽性対照（ＩＰＣ）をさらに含んでもよい。方法は、本発明の回収溶液中に少なくとも１つのＩＰＣ核酸セグメントを入れて、またはＩＰＣ核酸セグメントと抽出されたポリヌクレオチド集団を合わせて、試料および／または抽出された核酸の下流の分子処理をモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態において、ＩＰＣは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液の成分として存在し、したがって、実質的に安定であり、長期間、周囲温度にてこの溶液中で保管した場合、実質的に分解されていない。これらの例において、ＩＰＣは、回収溶液から抽出された場合、ポリヌクレオチド集団の一部と考えられてもよい。
【００９５】
好ましくは、ＩＰＣ配列は交差反応性がなく、すなわち、哺乳動物または病原体特異的な配列に実質的にハイブリダイズせずまたは好ましくはハイブリダイズせず、そのため、非コード、非縮重（すなわち、ナンセンス）配列は、対照／担体配列と回収された被検体から得られた単離されたポリヌクレオチド集団のメンバーのハイブリダイゼーションを最小限にするための、対照／担体配列の製剤において特に好ましい。したがって、例示的な担体／対照配列は、哺乳動物ゲノムから単離されたポリヌクレオチド集団または哺乳動物に対して病原性である細菌、真菌、原虫、ウイルスのゲノムから単離されたポリヌクレオチド集団と実質的に結合しないまたは好ましくは結合しない（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない）。
【００９６】
ある種の実施形態において、本発明は、ＩＰＣとして有用である単離された一本鎖（ｓｓ）−ＲＮＡ、ｓｓ−ＤＮＡ、ｓｓ−ＰＮＡ、二重鎖（ｄｓ）−ＲＮＡ、ｄｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＰＮＡまたはこれらのハイブリッドを提供する。好ましい実施形態において、結核菌群に特異的な核酸の単離および検出が望まれる場合、一本鎖デオキシリボ核酸セグメントが使用される。例示的な実施形態において、本発明は、配列番号８および配列番号１２から配列番号２１のいずれか１つと、好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％またはこれを超えて同一である核酸配列を含む、これらの核酸配列から本質的になるまたはこれらの核酸配列からなるＩＰＣ配列を提供する。
【００９７】
試料または抽出された核酸のさらなる分子処理が結核菌群に特異的な核酸の同定からなる場合、本発明のＩＰＣ配列は、限定されないが、分子標識されたプローブおよびこの誘導体を含む適切に検出可能なプローブに特異的にハイブリダイズする（すなわち、結合する）少なくとも第一の配列ドメインを含むべきである。例示的な標識されたプローブは、分子の技術分野における当業者に知られている放射性、発光、化学発光、蛍光、酵素、磁気またはスピン共鳴標識を含むものである。好ましい実施形態において、プローブは、６−ＦＡＭまたはＶＩＣ（商標）色素で標識される。例示的な実施形態において、標識されたプローブは、少なくとも第一の副溝バインダーを含む。ＰＣＲなどの増幅戦略が採用される、さらなる実施形態において、本発明のＩＰＣ配列は、少なくとも、フォワードＰＣＲ増幅プライマーに特異的に結合する第二の配列ドメインおよびリバースＰＣＲ増幅プライマーに特異的に結合する第三の配列ドメインを含む。
【００９８】
生物試料を含む溶液および本発明の回収液（単数または複数）からの核酸の抽出
生物試料からのポリヌクレオチド集団の回収後、回収溶液ならびに微生物破片、例えばタンパク質、脂質および糖質から核酸を抽出または分離する任意の方法は、当業者に知られているように実施されてもよく、例えば、限定されないが、標準的なフェノール／クロロホルム精製、シリカに基づく方法および磁気ガラス粒子に基づく抽出方法の使用が挙げられる。本発明で使用される組成物および方法は、すべてではないにしても、大部分の市販の核酸抽出組成物および方法と適合性があり、例えば、限定されないが、ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）およびＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（登録商標）抽出システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられる。一般的に、抽出されたゲノム核酸は、約０．１マイクロリットルから約１０，０００マイクロリットル、より好ましくは約１マイクロリットルから約１０００マイクロリットル、より好ましくは約１０マイクロリットルから１００マイクロリットルの量で存在する。核酸の例示的な量は２５マイクロリットルである。
【００９９】
ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）の例示的な組成物および方法において、本発明のプライマーおよびプローブは、ＰＣＲが実施され得るように特定の製剤に添加される。好ましくは、約８μＭのフォワードおよびリバースプライマー、約６μＭのプローブならびに約１単位のＴａｑがＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）中に存在する。ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）の追加の成分の例示的な濃度範囲は表１Ａに見ることができ、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）については表１Ｂに見ることができる。
【０１００】
【表１】
2014514930.tif 000002
好ましくは、所望の標的を増幅し、検出するように、この製剤に十分量のプライマーおよびプローブが添加される。
【０１０１】
２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（ＴＲＩＳ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から得られた。２−［２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル−（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＥＤＴＡ）ＧＩＢＣＯ（登録商標）超純粋ＢＳＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得られた。他のすべての試薬は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。
【０１０２】
一実施形態において、１０倍緩衝溶液は以下の通り調製される：
滅菌５．０ｍＬクライオバイアルに２５００μＬの２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加する。
このバイアルに３５００μＬの２Ｍ  ＫＣｌを添加する。
このバイアルに３００μＬのＭｇＳＯ４を添加する。
このバイアルに９００μＬの５Ｍベタインを添加する。
このバイアルに２００μＬのＲＯＸ（商標）を添加する。
このバイアルに５０μＬのＢＳＡを添加する。
このバイアルに８００μＬのｄＮＴＰミックスを添加する。
このバイアルに２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加する。
このバイアルに１６００μＬ＋１３０μＬのヌクレアーゼ不含水を添加する。
このバイアルを密栓し、パルスボルテックスを行い、この内容物を十分に混合する。
３８％ＨＣｌを用いて、この溶液のｐＨをｐＨ８．１−８．３に調整する。
滅菌容器に溶液を分割または移動する。使用の準備ができるまで約−２０℃にて保管する。ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）内で使用するとき、この１０倍緩衝溶液は、約０．５倍から約２倍、好ましくは約１倍に希釈される。
【０１０３】
【表２】
2014514930.tif 000003
【０１０４】
生物試料の多重分析のための組成物および方法
いくつかの実施形態において、単一の増幅プライマー対よりも多くを含む試薬混合物および所与の標的核酸配列に特異的である検出プローブを提供することが望ましい場合がある。例えば、２種以上のタイプの病原体の存在を決定することが望ましい場合、本発明の組成物は、ある病原体特異的なポリヌクレオチドの少なくとも第一の標的領域に特異的に結合する第一の増幅プライマー対および別の病原体特異的なポリヌクレオチドの少なくとも第一の標的領域に特異的に結合する第二の増幅プライマー対を含むように製剤化され得る。
【０１０５】
あるいは、２種以上の株の存在を決定することが望ましい場合、本発明の組成物は、特定の病原体特異的なポリヌクレオチドの少なくとも第一の標的領域に特異的に結合する第一の増幅プライマー対および第二の別個の病原体特異的なポリヌクレオチドの少なくとも第一の標的領域に特異的に結合する第二の増幅プライマー対を含むように製剤化され得る。
【０１０６】
さらに、１つ以上の追加の微生物の存在を決定することが望ましい場合、すなわち、患者が、他の細菌または真菌またはウイルス感染、例えば、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌、ヒト免疫不全ウイルス、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｃｏｃｕｓ）、インフルエンザ、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、クラミドフィラ・ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ニューモシスチス・ジロヴェチ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ）などと同時感染しているかどうかを同定することが望ましい場合。
【０１０７】
いくつかの例において、結核菌群に特異的なポリヌクレオチド内の薬剤耐性遺伝子または突然変異体について試験することが望ましい。多剤耐性（ＭＤＲ）−ＴＢ株は、単剤に対する耐性を付与する突然変異体の逐次蓄積の結果としてまたはＭＤＲ要素の獲得などの単一ステッププロセスによって生じ得る。リファンピン、ＩＮＨ、ストレプトマイシン、エタンブトール、ＥＴＨ、ＰＺＡ、カナマイシンおよびキノロンに対する耐性を付与する一連の別個の突然変異体が同定されている。個々の抗菌剤について標的をコードする遺伝子のランダム突然変異は、治療エラー、治療プロトコールの順守の低さまたは他の要因に起因する治療量以下の薬物レベルによって選択されるために、これらのＭＤＲ分離株のいくつかが生じる。
【０１０８】
これらの実施形態において、本発明の組成物は、特定の病原体特異的なポリヌクレオチドの少なくとも第一の標的領域に特異的に結合する第一の増幅プライマー対および例えば多剤耐性株または広範囲の薬剤耐性株内で見出された薬剤耐性ポリヌクレオチドの少なくとも第一の標的領域に特異的に結合する第二の増幅プライマー対を含むように製剤化されてもよい。例えば、これは、リファンピシンおよび／またはイソニアジド（これらの第一線の抗ＴＢ薬に対する耐性は、多剤耐性［ＭＤＲ］ツベルクロシスを古典的に定義する。）ならびにキノロンファミリーの１つ以上のメンバーまたはカナマイシン、カプレオマイシンもしくはアミカシンまたはこれらの任意の組合せに対する耐性を含むことができる。
【０１０９】
このような組成物から生成された特定の増幅産物（単数または複数）の検出のために、組成物はまた、第一の増幅プライマー対から生成された増幅産物に特異的に結合する第一の検出プローブおよび第二の増幅プライマー対から生成された増幅産物に特異的に結合する第二の別個の検出プローブをさらに含む。このような組成物では、製剤中に存在する２つ、３つまたは４つの検出プローブは別個のものであることが好ましく、そのため、プローブの各々（得られた増幅混合物において標的に特異的に結合する場合）は、従来の方法を用いて個々に検出可能であってもよい。このようなプローブの独自性は、例えば、２つ、３つまたは４つの明確に異なる波長で蛍光を発する検出部分を含む検出プローブを用いて、従来技術で容易に達成し得る。
【０１１０】
本発明のいくつかの態様において、標的核酸の増幅および／または検出は連続して行うことができ、一方、他の態様において、複数の標的核酸を同時に増幅および／または検出することが望ましい場合もある。例えば、所与の生物試料を、第一に、Ｍ．ツベルクロシスに特異的な標的配列（単数または複数）の存在についてスクリーニングすることができ、何も見出されない場合は、試料を、続いて第二に、Ｍ．ボビス、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．ミクロチ、Ｍ．カネッティ、Ｍ．カプラエおよびＭ．ピンニペジに特異的な標的配列（単数または複数）の存在についてスクリーニングすることができる。
【０１１１】
例示的な定義
長期間続く特許法の慣習に従って、語「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、特許請求の範囲を含めて本出願において使用するとき、「１つ以上」を示す。
【０１１２】
本明細書で使用するとき、用語「約」および「およそ」は交換可能であり、一般に、所与の数値周辺の一定範囲の数値および列挙する数値範囲内のすべての数値を指すと理解されるべきである（例えば、他に記載がない限り「約５から１５」は「約５から約１５」を意味する。）。さらに、本明細書におけるすべての数値範囲は、その範囲内のそれぞれの完全整数を含むと理解されるべきである。
【０１１３】
本明細書で使用するとき、用語「核酸」は、１つ以上のタイプのポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）およびプリンもしくはピリミジン塩基または修飾プリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位を含む）のＮ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用するとき、用語「核酸」はまた、典型的にはサブユニット間のホスホジエステル連結によって、ただし、いくつかの場合はホスホロチオエート、メチルホスホネートなどによって共有結合した、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーも含む。「核酸」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。例示的な核酸には、限定されないが、ｇＤＮＡ；ｈｎＲＮＡ；ｍＲＮＡ；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＯＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）および低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）などおよびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１１４】
２つの核酸の文脈において、語句「実質的に同一な」は、配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視により測定して、最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、少なくとも約９０％、好ましくは９１％、最も好ましくは約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはこれを超えるヌクレオチド残基の同一性を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。このような「実質的に同一な」配列は、実際の起源を参照せずに「相同的」であると典型的に考えられる。
【０１１５】
微生物（限定されないが、古細菌などの原核生物および真正細菌；シアノバクテリア；真菌、酵母、カビ、放線菌；スピロヘータおよびマイコプラズマを含む）；ウイルス（限定されないが、オルソヘパドナウイルス属［例えば、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルスを含む］、ヒトパピローマウイルス、フラビウイルス属［例えば、デングウイルスを含む］、リサウイルス属［例えば、狂犬病ウイルスを含む］、モルビリウイルス属［例えば、麻疹ウイルスを含む］、シンプレックスウイルス属［例えば、単純ヘルペスウイルスを含む］、ポリオーマウイルス属、ルブラウイルス属［例えば、ムンプスウイルスを含む］、ルビウイルス属［例えば、風疹ウイルスを含む］、バリセロウイルス属［例えば、水痘ウイルスを含む］、ロタウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、ワクシニア、ポックスウイルスなどを含む）、藻類、原虫、原生生物、植物、コケ類などおよび前述のいずれかの任意の組合せが挙げられる。
【０１１６】
また、本発明は、疾患の突発、進行、拡散または１つ以上の集団全体内、この集団全体のうちもしくはこの集団全体間の１つ以上の他の疫学統計をモニタリングするために使用されてもよく、例えば、限定されないが、マイコバクテリア感染の拡散、結核病の臨床徴候の発症および／または１つ以上の追加の感染、例えば、限定されないが、消耗症候群、デング熱、エボラ出血熱、ＨＩＶ、ＳＡＲＳとの共存症、１つ以上の細菌感染またはウイルス感染、例えば、限定されないが、肺炎、インフルエンザなどが挙げられる。ある種の実施形態において、試料は、好ましくは、哺乳動物起源、より好ましくはヒト起源である。
【０１１７】
用語「実質的に含まない」または「本質的に含まない」は、本明細書で使用するとき、典型的に、組成物が、約１０重量パーセント未満、好ましくは約５重量パーセント未満、より好ましくは約１重量パーセント未満の化合物を含有することを意味する。好ましい実施形態において、これらの用語は、約０．５重量パーセント未満、より好ましくは約０．１重量パーセント未満またはさらには約０．０１重量パーセント未満を指す。これらの用語は、化合物または他の記載された性質を完全に含まない組成物も包含する。分解または劣化に関して、用語「実質的」は前述の重量パーセントを指すこともでき、したがって実質的分解の防止は、約１５重量パーセント未満、約１０重量パーセント未満、好ましくは約５重量パーセント未満などが喪失されて分解することを指す。他の実施形態において、これらの用語は、用語「実質的に」が約１０パーセント未満、約５パーセント未満などの病原活性が残存することを指す用語「実質的に非病原性」に関してと同様に、重量パーセントというよりはむしろ、単なる百分率を指す。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、用語「異種」は、所定の参照核酸配列に関して定義される。例えば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、参照構造遺伝子に隣接して天然に存在しないが、分子生物学の技術分野における当業者によって日常的に使用される１つ以上の研究室での操作において、人の手によって位置されるプロモーターとして定義する。同様に、異種遺伝子または核酸セグメントは、参照配列、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント（単数または複数）などに隣接して天然に存在しない遺伝子または核酸セグメントとして定義される。
【０１１９】
本明細書で使用するとき、「相同的」は、ポリヌクレオチドを指す場合、異なる起源から生じたにもかかわらず、同じ本質的なヌクレオチド配列を有する配列を意味する。典型的に、相同的な核酸配列は、密接に関連した遺伝子または１つ以上の実質的に類似したゲノム配列を保有する生物に由来する。対照的に、「類似的」ポリヌクレオチドは、異なる種または生物に由来するポリヌクレオチドと同じ機能を共有するが、類似した機能を果たす１つ以上のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする有意に異なる一次ヌクレオチド配列を有するまたは類似した生物活性を保有する可能性があるポリヌクレオチドである。類似的ポリヌクレオチドは、多くの場合、（例えば、遺伝的もしくは系統的のいずれかで）密接に関連していない２種以上の生物に由来し得る。
【０１２０】
２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド配列の文脈において、用語「同一な」または「同一性」パーセントは、配列比較アルゴリズムを使用してまたは手動アラインメントおよび目視により測定して、比較ウインドウで最大対応性に関して比較しアラインメントをとるとき、同一であるまたは同一である特定の百分率のヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。
【０１２１】
本明細書で使用するとき、用語「実質的に相同的」は、一次ヌクレオチド配列レベルで互いに有意に類似した２つ以上の生体分子配列を包含する。例えば、２つ以上の核酸配列の文脈において、「実質的に相同的」は、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％または少なくとも約９０％同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、より好ましくは少なくとも約９８％同一である、より好ましくは少なくとも約９９％同一である、さらになおもより好ましくは、完全に同一であること（すなわち、１００％または「不変」）を指すことができる。
【０１２２】
同様に、本明細書で使用するとき、用語「実質的に同一な」は、ヌクレオチドレベルで互いに高度の同一性を示す２つ以上の生体分子配列（特にポリヌクレオチド配列）を包含する。例えば、２つ以上の核酸配列の文脈において、「実質的に同一な」は、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％または少なくとも約９０％互いに同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％同一である、より好ましくは少なくとも約９８％同一である、より好ましくは少なくとも約９９％同一である、さらになおもより好ましくは、完全に同一である（すなわち、１００％同一または「非縮重」）配列を指すことができる。
【０１２３】
本明細書で使用するとき、用語「作動可能に連結している」は、機能的関係における２つ以上のポリヌクレオチドまたは２つ以上の核酸配列の連結を指す。これが別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、核酸は「作動可能に連結している」。例えば、これがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列と作動可能に連結している。「作動可能に連結している」は、連結している核酸配列は典型的に連続しておりまたは実質的に連続しており、必要な場合、連続したおよびリーディングフレームの２つのタンパク質コード領域を接合していることを意味する。エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロベース離れているときに機能し、イントロン配列は様々な長さであり得るが、しかしながら、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結しているが、連続していない可能性がある。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するが、本発明の範囲を限定するものとして見なすべきではない。
【実施例】
【０１２５】
［実施例１］  生物試料の回収、核酸抽出および下流の分子処理
本発明の実施において、結核感染を有することが疑われる対象の口腔咽頭、鼻、気管および／または気管支の試料は、典型的に、喀痰または洗浄液試料の形態で採取される。この実施例は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）（Ｌｏｎｇｈｏｒｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）（また、明示的な参照により、全体として本明細書に具体的に組み込む米国特許出願公開第２００９／０３１２２８５号にも詳細に記載されている）、下流の分子診断試験のために具体的に製剤化された臨床または環境試料の回収システムの使用を記載している。
【０１２６】
光学顕微鏡検査によって観察された、＋、＋＋または＋＋＋の定性的等級分けおよび異なる粘度を有する喀痰バンク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｏｒｉａ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）から得られた４つのスメア陽性喀痰被検体は、患者に被検体カップに喀痰を出させることによって回収された。典型的な喀出体積は、約５ｍＬから約２０ｍＬの喀痰であった。喀痰試料は、これらが、血に染まった、膿状、泡沫状、泡状または唾液質であるかどうかについて定性的に観察された。「膿状」であると等級分けされた試料は、膿汁を含むことが観察されたものであり、一方、「唾液質」であると等級分けされた試料は、粘液などの他の成分より唾液を多量に含んでいた。次に、フロックドスワブ（Ｃｏｐａｎ  Ｉｔａｌｉａ  Ｓ．ｐ．Ａ．、Ｂｒｅｓｃｉａ、Ｉｔａｌｙ）は、各喀痰被検体容器内でスワブを５回、回転させることにより、少量の喀痰を回収するために使用された。喀痰被検体は、拭き取り前および各拭き取り後に秤量され、採取された喀痰の体積を推定した。各スワブは、およそ２５ｍＬから５００ｍＬの喀痰を含んでいた。個々のスワブは回収チューブに移され、各々は、本発明の回収および保存製剤（「ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）」）の１．５ｍＬを含んでいた。拭き取り手順は、各喀痰被検体について３連で行われた。また、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、対照として１：１の比率で喀痰被検体の残りに添加され、その後、処理されるまで−４℃で置かれた。スワブは、各回収チューブ中のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に懸濁され、室温にておよそ１２時間保たれ、その後、試料は、核酸抽出およびリアルタイムＰＣＲによる核酸処理のために取り出された。ＤＮＡは、製造業者の使用説明書に従って、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＭＴＢ呼吸器キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、対照の残りの喀痰被検体およびスワブチューブの１００μＬのアリコートから抽出された。すべての被検体は、核酸を抽出するために１０秒間、最大速度でボルテックスされた。抽出後のＤＮＡ濃度は、製造業者の使用説明書に従って、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて測定され、計算された結果を表２に示す。４マイクロリットルの抽出されたＤＮＡは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いるリアルタイムＰＣＲに使用された。
【０１２７】
微生物核酸のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）微生物不活性化および保存
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡ抽出技法のための生物試料からの核酸の調製ならびに下流の分子分析に使用するために有効であることが示された。表２から分かるように、各拭き取り後に回収された体積は、約０．０５ｍＬから約０．５ｍＬの範囲であった。抽出後のＤＮＡ濃度は約２３１から２８１ｎｇ／μＬの間の範囲であった。対照試料のＤＮＡ濃度とスワブの使用によって得られた試料のＤＮＡ濃度を比較した場合、有意差は得られなかった。
【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
拭き取り手順は、下流の分子処理のために回収された喀痰被検体から直接、被検体を回収するための有用な方法である。本研究において、抽出後のＤＮＡ濃度は、拭き取られた喀痰被検体成分と残りの喀痰被検体（対照）成分の両方について類似した範囲を示した。１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に希釈された約５０μＬの低い喀痰体積は、ＰＣＲ分析に十分であった。しかしながら、被検体のうちの２つにおいて、約３ｌｏｇのＣτ値の遅延が示されている。単一の阻害の場合において、これは、ＤＮＡ抽出プロセスからＰＣＲへの持ち越しの結果として存在する、残りのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液に起因している可能性がある。
【０１３１】
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）処理された拭き取られた被検体からの直接的な簡易および迅速な分子診断処理および日常的な従来の試験は、単一の喀痰回収物から行われた。少量のスメア陽性ＴＢ被検体からの分子処理結果は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）へのスワブ移動によって得られ、実施可能であり、正確である。
【０１３２】
［実施例２］  ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）を用いたツベルクリン試料における微生物の不活性化
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に曝露された場合の喀痰試料内の結核細菌の不活性化度を評価するために、３つの研究が実施された：
第一の研究において、Ｍ．ツベルクロシスの既知のＭＤＲ株は、ＭＧＩＴ（登録商標）液体ベースのシステム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  Ｔｕｂｅ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）において増殖させた。株の分離株は、抗酸性（ＡＦ）およびスメア陽性であり、多剤耐性（ＭＤＲ）は、ラインプローブアッセイ（Ｈａｉｎ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｎｅｈｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて確認された。既知のＭＤＲツベルクロシス株の０．１５ｍＬまたは０．５ｍＬの接種物は、２分または１０分のインキュベーションのいずれかの間、１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に入れられた。次に、各溶液は、製造業者の使用説明書に従って、ボルテックスされ、ＭＧＩＴ（登録商標）液体ベースのシステムにおいてさらに培養された。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に曝露されていない対照試料もまたＭＧＩＴ（登録商標）液体培養物に入れられた。
【０１３３】
第二の研究は、１分または５分のいずれかの間、１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に既知のスメア陽性喀痰試料（それぞれ１０を超える抗酸菌［ＡＦＢ］／ハイパワーフィールド［ｈｐｆ］）を入れ、次に、Ａｕｒａｍｉｎｅ  ＯおよびＺｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色を行い、細胞壁の形態学および完全性を観察した。
【０１３４】
第三の研究は、時間−死滅アッセイを実施するために、１０５から１０６濃度の参照マイコバクテリウム株、すなわち、Ｈ３７ｒｖ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｏｒｉａ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）を用いた。株の０．５ｍＬ接種物は、５秒、１０秒、２０秒、４０秒、８０秒または１６０秒のいずれかの間、１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に入れられ、次に、得られた溶液の２滴は、各々、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）上で継代培養された。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に曝露されていない対照試料もまた同様にプレーティングされた。１つの対照において、０．５ｍＬのＨ３７ｒｖ株は、１．５ｍＬの生理食塩水中に入れられた。別の対照において、０．５ｍＬのＨ３７ｒｖ接種物は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天上に直接置かれた。プレートは、周囲条件下で３０分間保たれ、次に密封され、好気条件下、３７℃にて６週間インキュベートされた。この研究は、２連で実施された。
【０１３５】
第一の研究において、４２日間のインキュベーション後でさえ、ＭＤＲ結核菌試料のいずれについても、ＭＧＩＴ（登録商標）液体培養物中で増殖が観察されなかった。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に曝露されていない対照試料は、９日後、増殖陽性を示した。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に保管された２つの試料のさらなる抽出および増幅は、良好なバンディングを実証し、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）における核酸の安定性を確認した。
【０１３６】
第二の研究において、いずれかの曝露時間にてＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）でインキュベートされた試料のいずれにおいてもＡＦＢは観察されなかった。
【０１３７】
第三の研究において、いずれの時間点においても、インキュベーションの４２日後に増殖は観察されなかった。コロニー形成単位は、７日後、対照プレート上で検出された。
【０１３８】
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、非常に短期間内の曝露において、多種のＭ．ツベルクロシス株を死滅させ、それによって、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）が、Ｍ．ツベルクロシスを含むことが疑われる生物試料の安全で迅速なポイントオブケアの回収および輸送を可能にすることが確認された。
【０１３９】
［実施例３］  ツベルクリン試料の保管、核酸抽出、分子処理および結核の診断
喀痰試料は、実施例１に記載されたものと同じ拭き取り技法を用いておよびＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）と喀痰を１：１の比率で用いて処理された。これらの実験において使用された喀痰試料は、前述のように喀痰バンクから得られ、予めスメア顕微鏡検査と培養結果の両方によって分類されていた。すべての試料は、最初に、酸堅牢度（すなわち、スメア顕微鏡検査の＋、＋＋または＋＋＋指標のいずれかによる）について特徴付けられ、その後、培養によって、Ｍ．ツベルクロシスについて陽性、陰性または不十分のいずれかとして分類された。
【０１４０】
ＤＮＡは、６日から６週間の範囲の様々な時間点でＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中の喀痰試料から抽出された。表４に示されるように、核酸抽出が行われる前に、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中の被検体は、周囲温度にて様々な期間で保たれた。ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による抽出およびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６（商標）システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）は、各々、製造業者の使用説明書に従って実施された。増幅のために処理されるまで、すべての核酸抽出物は−２０℃にて保たれた。
【０１４１】
ＤＮＡ抽出物は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キット（Ｒｏｃｈｅ）または本発明のプライムミックスの使用のいずれかによって増幅され、以下、これらは、「プライムミックスユニバーサルＴＢキット」、「ＰｒｉｍｅＭｉｘユニバーサルＴＢキット」または単に「ＰｒｉｍｅＭｉｘ」と称される。４マイクロリットルの抽出された核酸溶液は、プライムミックスユニバーサルＴＢキットとともに使用された。上記システムのすべてはリアルタイムＰＣＲプラットフォームであり、オンボードで製品を検出する。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）抽出物の増幅は、３連で実施され、ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キットおよびプライムミックスユニバーサルＴＢキットの再現性を決定した。
【０１４２】
表４から分かるように、４つの試料はスメア陽性であり、７つの試料はスメア陰性であり、３つの試料は不十分であった。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
【表７】
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【０１４６】
【表８】
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【０１４７】
表５から分かるように、拭き取られた喀痰試料について、ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットまたはＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ（商標）９６システムのいずれかを用いて抽出され、次に本発明のＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）を用いて処理されたＤＮＡは、スメア試料が僅かに陽性結果（すなわち、「＋」）を示した場合に、結核を引き起こす細菌ＤＮＡの存在を検出し、これは、ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットまたはＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ（商標）９６システムを用いて抽出され、次に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キットを用いて処理されたＤＮＡの結果とは異なり、これらはいずれの結核（ＴＢ）を引き起こす細菌に特異的な核酸をも検出しなかった。重要なことに、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）アッセイは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウムキットが検出できるよりも多くのスメア陰性、培養陽性被検体において、結核を引き起こす細菌の核酸を検出することができた。結核を引き起こす細菌のＤＮＡは、より多量の喀痰が分析される場合、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）手順の両方を用いて同等に検出された。
【０１４８】
全体として、拭き取り技法の実施およびＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の使用は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）キットの様々な結果と比較して、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）の使用と一貫した結果を示している。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、様々な抽出システムとの適合性を示しており、いずれの場合においてもＰＣＲ阻害が陰性結果の理由ではなかった。
【０１４９】
［実施例４］  診断アッセイとのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の適合性
１５個のスメア陽性および１５個のスメア陰性の喀痰試料（Ａｕｒａｍｉｎｅ  Ｏ染色によって決定された）は、肺結核であることが疑われる患者から得られた。スメア陽性試料は、ラインプローブアッセイを用いて試験され、続いて培養された。スメア陰性試料もまた培養された。続いて、すべての生の喀痰試料は、一般に、当業者に知られ、Ｋｕｂｉｃａ，Ｇ．Ｐ．ら（１９６３）Ｓｐｕｔｕｍ  Ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｓ  ａ  Ｓｐｕｔｕｍ  Ｄｉｇｅｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｍｅｒ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．；８９：２８４−２８６およびＫｕｂｉｃａ，Ｇ．Ｐ．ら（１９６３）Ｓｐｕｔｕｍ  Ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｍｅｒ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．；８７：７７５−７７９（これらの全内容は明示的な参照により組み込まれる。）に記載されているように、ＮａＬｃ／ＮａＯＨ（「ＤＴＴ／ＮａＯＨ」）手順を用いて液化され、除染されおよび濃縮された。一般に、ＮａＬｃ／ＮａＯＨ手順は、Ｍ．ツベルクロシスについて培養方法および核酸試験前に使用される。次に、ＮａＣｌ／ＮａＯＨで処理された喀痰試料０．５ｍＬのアリコートは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に添加され、一晩保管された。また、ＮａＣｌ／ＮａＯＨで処理された喀痰試料０．５ｍＬのアリコートがＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に添加されなかった対照も使用された。抽出は、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キット（Ｒｏｃｈｅ）によって実施された。２種の市販のアッセイであるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キット（Ｒｏｃｈｅ）およびＧｅｎｏｔｙｐｅ  ＭＴＢＤＲｐｌｕｓ（Ｈａｉｎ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ）は、Ｍ．ツベルクロシスに特異的な核酸の有無を検出するために使用された。Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ＭＴＢＤＲｐｌｕｓアッセイは、生の喀痰試料を接触させるＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の使用と適合性があることが見出され、薬剤耐性ＴＢ株が、このアッセイを用いて、これらの試料において検出された。
【０１５０】
表７は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キット（ＬＣ）を用いて得られた結果を実証する。
【０１５１】
【表９】
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表７から分かるように、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）における保管後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）アッセイは、スメア陰性試料においてＭ．ツベルクロシスについて陽性であるとし、これは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）が使用されなかった場合には得られなかった。したがって、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、より低量のＭ．ツベルクロシスを検出するより高い能力を有している場合がある。そうでなければ、得られた結果は同等であり、このようにＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は市販の検出アッセイと適合性がある。
【０１５２】
［実施例５］  ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）における保管後のＭ．ツベルクロシスの検出感度
喀痰バンク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｏｒｉａ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）からの７つのスメア陰性、培養陽性の被検体および３つの不十分な被検体（ＳＣ１、ＳＣ７およびＳＣ９）がこの評価に含まれた。フロックドスワブ（Ｃｏｐａｎ）は、各喀痰被検体（クライオバイアル中５００μＬ）内でスワブを回転させることにより、少量の喀痰を回収するために使用された。個々のスワブは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）回収チューブに移され、各々は１．２ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液を含んでいた。喀痰被検体は、拭き取り前および各拭き取り後に秤量され、被検体から取り出された喀痰の体積を推定した。また、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液は、対照として１：１の比率で喀痰被検体の残りに添加された。スワブは、各回収チューブ中のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液中に懸濁され、リアルタイムＰＣＲによる処理前に、室温にておよそ１２時間保たれた。ＤＮＡは、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットを用いて、残りの喀痰被検体（対照）およびスワブチューブから抽出された。また、同じ培養物から得られた喀痰被検体は、従来のＮａＬｃ／ＮａＯＨ手順に従って処理され、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）プロトコールを用いて抽出された。また、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＰｒｅｐ（商標）Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ウイルスキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた生の喀痰からの追加の抽出方法も、これらの被検体から評価された。すべての被検体は、最大速度で１０秒間、ボルテックスされ、１００μＬのアリコートは抽出手順に使用された。抽出後のＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）１０００器具を用いて決定された。４マイクロリットルの抽出されたＤＮＡは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キットを用いるリアルタイムＰＣＲに使用された。
【０１５３】
表８から分かるように、各拭き取り後に回収された体積は、約０．０５ｍＬから約０．１ｍＬの範囲であった。抽出後のＤＮＡ濃度は、スワブ、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）（１：１）およびＮａＬｃ／ＮａＯＨ被検体について、約２０５から約７０６ｎｇ／μＬの間の範囲であった。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＰｒｅｐ（商標）Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ウイルスキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から抽出された生の喀痰は、ＤＮＡ濃度が約７．０から約２２．６ｎｇ／μＬの範囲であった。
【０１５４】
【表１０】
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【０１５５】
【表１１】
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【０１５６】
スワブ被検体について不十分な被検体のうちの２つ、すなわち、不十分１および不十分９においては増幅が見られなかった。スメア陰性、培養陽性試料についての感度の１００％増加は、従来のＮａＬｃ／ＮａＯＨ法と比較して、１：１の比率のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）を用いた場合にまたは拭き取りによって観察された。実際に、拭き取りによるまたは１：１の比率でのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の使用は、従来のＮａＬｃ／ＮａＯＨ法の使用と比較した場合、２つの追加のスメア陰性、培養陽性試料の検出をもたらした。一般に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）のキットは、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）のキットよりも有効であり、したがって、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）データとＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）の使用によって得られたデータの間のいずれの変化も、この不一致によって説明され得る。
【０１５７】
［実施例６］  ＩＰＣを含むＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）製剤
この実施例は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）（Ｌｏｎｇｈｏｒｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）回収システムを用いて、回収時点から分子分析までの被検体の完全性を追跡するための、非特異的な外因性の内部陽性対照（ＩＰＣ）ポリヌクレオチドの使用を記載する。
【０１５８】
細菌および真菌の回収のための膜濾過法は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の死滅能力を評価するために使用された。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）［非メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）］、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびアスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）が一連の細菌およびカビ（酵母および糸状真菌）を有効に死滅させ、不活性化し得るかどうかを決定するために使用された。水マトリックス中でインキュベートされた陽性対照は、０日目だけ実施された。各細菌株について１×１０６ｃ．ｆ．ｕ．集団は、各時間点で０．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に接種され、その後、２０−２５℃にてインキュベートされた。容器は列挙され、０、１、７、１４および２８日目に評価された。接種物は、無菌的に滅菌濾過デバイスを通過させ、その後、１００ｍＬの滅菌中和液Ｄ［１．０ｌの滅菌水に溶解させた、動物組織の１ｇペプシン消化物（ペプトン）および１ｍＬポリソルベート８０（最終ｐＨ７．１±０．２）］を用いて３回濯がれた。必要に応じて、接種された試験物品の希釈は、フィルターあたり２５−２５０ｃ．ｆ．ｕ．の目標カウントに到達するように実施された。各時間点について、接種された陰性対照は同様に処理された。細菌を含む試料を接種されたフィルターは、レシチンおよびポリソルベート８０を含むトリプシン大豆寒天（ＴＳＡＰ）上にプレーティングされ、３０−３５℃にて７２時間インキュベートされた。酵母またはカビを含む試料を接種されたフィルターは、サブローデキストロース寒天（ＳＡＢ）上にプレーティングされ、２０−２５℃にて７２時間以上、しかし５日を超えない間インキュベートされた。コロニーは、微生物負荷中に使用された各生物について、ｌｏｇ１０回収および死滅パーセント（％）を計算するためにカウントされた。
【０１５９】
約１０８ｃｆｕのＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ３３５９２）を含むストックプレートは、ＴＳＢに移され、短時間ボルテックスされ、周囲温度にて１０分間インキュベートされた。全量０．１ｍＬの細菌懸濁液は、０．９ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に移され、６０秒間ボルテックスされた。全量０．１ｍＬの懸濁液は、０．３ｍＬのＴＳＢ（１：４希釈）に移され、１００μＬが、０、５および１５分後に血液寒天プレート（ＴＳＡ中の５％ヒツジＲＢＣ）に移された。陽性対照は、同等の体積のＭＲＳＡとＴＳＢを含んでいた。プレートは、乾燥され、一晩３７℃にてインキュベートされ、ｃｆｕ／ｍＬについて分析された。
【０１６０】
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、真菌、グラム陽性およびグラム陰性細菌ならびにウイルスを含む微生物を迅速に不活性化することが示された。抗菌有効性試験は、細菌および真菌を定量するために膜濾過技法を用いて実施された。第一の試験期間（２４時間）で、１００％の細菌および真菌は、陽性対照と比較して、死滅した。これらの微生物について、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、ＵＳＰカテゴリー１製品（水性塩基またはビヒクルで作られた注射剤、乳剤、視覚製品（ｏｐｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、滅菌鼻製品および眼科製品）に記載されているような不活性化基準を満たした。さらに、バチルス・サブチリス胞子は、微生物集団のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）不活性化をさらに評価するために、ＵＳＰ５１に記載の方法を用いて負荷された。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子は、曝露の２４時間以内に９９％減少した。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に接種されたＭＲＳＡの時間−死滅研究において、生存細菌は、最も早い研究時間（接種５分後）においてまたは後期の評価時間のいずれにおいても検出されなかった（１００％死滅）。また、データは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）が臨床喀痰試料からＭ．ツベルクロシスを迅速に死滅させることを実証した。
【０１６１】
例示的な実施形態において、試料回収時から抽出および検出を通じた試料安定性を検証するために、予めＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に添加され（例えば、約３×１０５標的コピー／０．５ｍＬ）、内部対照として使用され得る特有のＩＰＣ  ｓｓＲＮＡが記載されている。さらに、ＩＰＣ  ｓｓＲＮＡは、担体種（特に、非常に低レベルの標的核酸を含む試料について）として有用であり、回収時点から核酸分析までの核酸抽出プロセスの完全性、効率性および忠実度をモニタリングするための対照として役立つ。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）における製剤に適した例示的なＩＰＣは、限定されないが、外因性および／または（インビトロで）合成的に生成されたｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡを含み、好ましくは、哺乳動物宿主または１つ以上の病原体またはここに含まれる通常の細菌叢において見出されたポリヌクレオチド配列に相同的でない（例えば、ＢＬＡＳＴコンピュータに基づく分析によって決定される）ポリマーを含む。
【０１６２】
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、回収された被検体が、実験室の分析時間に到達しているときでさえまたは理想的とは言えない条件下でもしくはさらには周囲環境条件下で保管されたおよび／または輸送された被検体を含み、数日後でさえ、元々回収された被検体における標的微生物の核酸の品質を改善することによって元の臨床試料の標準的な配列決定およびメタゲノム分析を促進することが示されている。１４００塩基を超えるＲＴ−ＰＣＲ増幅断片の回収は、周囲温度にて数週間、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中で保存され、出荷されたウイルスＲＮＡから観察された。苛酷な条件、すなわち３８℃のインキュベーションにおいて、５７４ｂｐおよび８２５ｂｐ断片のＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）保存されたウイルスから観察され、この場合、市販のＶＴＭにおけるストックウイルスから増幅は観察されなかった。
【０１６３】
重要なことに、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、多くの市販の核酸抽出キットと適合性があることが実証されている。核酸は、標準的な製造業者のプロトコールに従って、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）から直接抽出され、カラムまたはビーズに基づくキット間でＣτ値にごく僅かな差が認められる。さらに、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、完全なＬｏｎｇｈｏｒｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１−０９  Ｐｒｉｍｅ  ＲＲＴ−ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ（商標）の一部としてＦＤＡの緊急使用許可を受けた。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、ＥＵＡ  ＦＤＡ承認を受けた最初の分子輸送培地であり、回収から検出までの被検体分解のモニタリングを制御するＩＰＣを含む最初のものである。
【０１６４】
［実施例７］  微生物試料およびＲＮＡ分離株の長期保存のためのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）
この実施例は、病原性生物を不活性化し、さらにこのような不活性化された生物から単離されたＲＮＡの長期保管および保持を持続させるＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）製剤の有用性を実証する。例示的な実施形態として、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザウイルスを含む生物試料を回収するために使用された。結果は、製剤が、回収された試料中のＨ５Ｎ１およびＡ／Ｍｅｘｉｃｏ／４１０８／０９（Ｈ１Ｎ１、臨床分離株）ウイルスを不活性化しただけでなく、その後のＰＣＲ分析のための微生物ＲＮＡを保存したことを実証した。研究は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞単層に対するＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試薬（１：１００希釈）の細胞変性効果（ＣＰＥ）またはＣＰＥ様反応の欠如、生存Ｈ５Ｎ１ウイルス（１．２６×１０７ＴＣＩＤ５０）を不活性化するＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の効力およびリアルタイムＰＣＲ分析で豊富なＲＮＡ産物の検出をもたらした、周囲条件下で最大６２日間、Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１からのウイルスＲＮＡを保存するＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の能力を実証した。
【０１６５】
研究の第１部は、２つのセクション：（１）Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）上皮細胞におけるＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試薬のインビトロ毒性評価および（２）Ｈ５Ｎ１に対するＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試薬の不活性化の効力試験から構成された。研究の第２部は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）におけるインフルエンザウイルスの長期保管の直接的な結果として影響を受けたＨ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１  ＲＮＡの品質を評価した。
【０１６６】
第１部のインビトロ毒性評価は、０．１ｍＬウイルス保管バッファー（完全細胞培養培地または最小必須培地＋１０％ウシ胎児血清）を３連の試料回収スワブに装填し、１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）を含む５ｍＬチューブに入れられ、室温（周囲温度）にて１０、３０または６０分間インキュベートされることによって実施された。インキュベーション後、スワブは、２つの方法を用いて処理された：（１）ウイルス保管バッファー＋ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試料からのアリコートが取り出され、ＭＤＣＫ細胞の単層を含む９６ウェルプレート中の完全細胞培養培地において１０４０まで連続して（１０倍）希釈された。細胞は、最大９６時間インキュベートされ、次に、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について視覚的に検査され、観察できるＣＰＥを示さなかった希釈を決定した。（２）ウイルス保管バッファーを装填されたスワブの各々は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）から取り出され、１０ｍＬの完全細胞培養培地を含む５０ｍＬコニカルチューブに入れられた。スワブは、２００ｒｐｍで１５分間撹拌され、各抽出物のアリコートが取り出され、ＭＤＣＫ細胞の単層を含む９６ウェルプレート中の完全細胞培養培地において連続して（１０倍）希釈された。細胞は、最大９６時間インキュベートされ、次に、ＣＰＥの存在について視覚的に検査され、観察できるＣＰＥを示さなかった希釈を決定した。
【０１６７】
第１部の不活性化の効力は、インビトロ毒性評価の結果に基づいて行われた。試料回収スワブ（ｎ＝６）は、０．１ｍＬのＨ５Ｎ１（１−５×１０７のＴＣＩＤ５０／ｍＬ）またはウイルス保管バッファー（陰性対照、ｎ＝３）を装填され、１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）を含む５ｍＬチューブに入れられ、周囲条件下で１０、３０または６０分間インキュベートされた。インキュベーション後、スワブは、インビトロ毒性試験から決定された最も適切なアプローチを用いて処理された。細胞は、最大９６時間インキュベートされ、次に、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について視覚的に検査され、全ＴＣＩＤ５０が決定された。不活性化効力は、未処理の対照と比較して、ｌｏｇ減少について計算された。
【０１６８】
第２部の長期の周囲条件保管研究は、室温にて最大６２日間の、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）におけるＨ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１  ＲＮＡの保存を伴った。時間点は、接種の日から０日目（ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）へのＨ５Ｎ１接種の日）、＋１、＋２、＋５、＋７、＋１４、＋３０および６２日であった。Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１ウイルスは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）への接種前に、１×１０５  ＴＣＩＤ５０に希釈された。各時間点で、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｃｒｏキット（Ａｍｂｉｏｎ  カタログ番号ＡＭ１９３１、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いたＲＮＡ単離は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に保管されたＨ５Ｎ１とＨ１Ｎ１試料の両方について実施された。得られたＲＮＡは、すべての時間点のＲＮＡが単離されるまで、−８０℃未満で保管された。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）７９００ＨＴ（ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム）で実施された。
【０１６９】
第１部のインビトロ毒性評価において用いられた第一の方法（ウイルス保管バッファー＋ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試料からのアリコートが取り出され、連続希釈され、次に９６ウェルプレートに添加された。）は、すべての時間点（１０、３０および６０分）で１：１０，０００にてＭＤＣＫ細胞単層におけるＣＰＥまたはＣＰＥ様反応の観察をもたらした。第１部のインビトロ毒性評価において用いられた第二の方法（ウイルス保管バッファーを装填されたスワブの各々は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）から取り出され、１０ｍＬの完全細胞培養培地を含む５０ｍＬコニカルチューブに入れられ、スワブは、１５分間撹拌され、各抽出物のアリコートが取り出され、連続希釈された。）は、すべての時間点で１：１００にてＭＤＣＫ細胞単層におけるＣＰＥまたはＣＰＥ様反応の観察をもたらした。したがって、第１部のインビトロ毒性評価は、試料抽出の第二の方法が、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）によってＭＤＣＫ細胞に対してＣＰＥまたはＣＰＥ様反応をもたらすことを決定し、この第二の方法は、第１部の不活性化の効力試験に適しているものと認められた。ＣＰＥまたはＣＰＥ様反応がいずれかの時間点と対応するかどうかを決定しなかったため、６０分の時間点（すなわち、記録された最長の時間点）が効力試験について選択された。最長の時間点についてのＣＰＥまたはＣＰＥ様反応は、最短の時間点（１０分）と同等であり、これは、ＣＰＥまたはＣＰＥ様反応が希釈（１：１００）依存的および抽出方法（第二の方法）依存的であることを明確に実証した。
【０１７０】
ウイルス回収は陰性対照（すなわち、ウイルスが添加されていないＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標））と同等であったため、第１部の不活性化の効力試験は、検出可能な生存Ｈ５Ｎ１をもたらさなかった。一方、陽性対照（すなわち、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）が添加されず、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試薬の代わりに細胞培養培地が使用され、ウイルスが添加されている）は、予期されるようにＨ５Ｎ１の優れた回収（６７．５９％の平均回収）をもたらした。結果は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試薬が、Ｈ５Ｎ１の高い力価（１．２６×１０７  ＴＣＩＤ５０）を、６０分において陰性対照のレベルまで不活性化することができたことを示す。
【０１７１】
第２部の長期の周囲温度保管研究からのリアルタイムＰＣＲは、６２日目の最長の時間点から抽出されたＲＮＡからの４つすべてのアッセイ（ＢＢＲＣ  Ｈ１Ｎ１、ＢＢＲＣ  Ｈ５Ｎ１、Ｌｏｎｇｈｏｒｎ  Ｈ１Ｎ１およびＬｏｎｇｈｏｒｎ  Ｈ５Ｎ１）に対する標的検出は、０日目（接種の日）の最短の時間点とまさに同程度に感受性（全平均Ｃτ＜２６．００）であることが証明されたことを示した。結果は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）試薬が、周囲条件下での長期保管持続期間中のＲＮＡに有害な影響を与えなかったことを示す。
【０１７２】
［実施例８］  マイコバクテリアに特異的な核酸を含む被検体の分析
普遍種特異的なアッセイは、ＩＳ６１１０遺伝子の高度に保存された領域を標的とし、これはマイコバクテリウム・ツベルクロシス複合体のメンバー内にほぼ排他的に見出される挿入エレメントである。ＩＳ６１１０エレメントの複数コピーは、結核菌群のメンバーのゲノムにおいて異なる位置で見出すことができ、そのため、これらのプライマーはまた、株の遺伝子型を決定するのを助ける。すべてのプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）から調達された。
【０１７３】
実験室ベースのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０器具（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）およびその軽量携帯版（５０ｌｂ）、高耐久性高度病原体同定デバイス（Ｒ．Ａ．Ｐ．Ｉ．Ｄ．、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ、ＵＳＡ）はともに、類似の構成要素と運用ソフトウェアを採用する３２ウェルキャピラリーリアルタイム器具である。Ｒ．Ａ．Ｐ．Ｉ．Ｄ．は硬化ケース内に構成され、遠隔的に（例えば、現場においてまたはポイントオブケア時に）用いることができる。
【０１７４】
プライマーおよびプローブの配列は、上記に示されている。プライマー対の融点は２℃以内であり、５８−６０℃でアニーリング／伸長する。それぞれのプローブは、これらのプライマーよりも８−１０℃高くアニーリング／伸長する。熱サイクリングは、それぞれ６０℃にて全体で少なくとも約３０秒間、アニーリングと伸長の迅速な２つの温度フォーマットにおいて動作し、これは、各アンプリコンの短い特質によって促進される。
【０１７５】
リアルタイム増幅は、単一ステップの単一反応容器フォーマットで実施された。ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ（Ｌｏｎｇｈｏｒｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いて、２μＬ、３μＬ、４μＬまたは５μＬのいずれかの核酸が、指示された最終濃度で以下の成分：（ａ）５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、７０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＳＯ４、４５ｍＭのベタイン、０．０５μＭのＲＯＸ（商標）、０．０２５μｇ／μＬの超純粋ＢＳＡ、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１×反応バッファー；（ｂ）２０μＭの各プライマー、１単位のＴａｑポリメラーゼおよび２０μＭの標識されたプローブを含む１×酵素混合物を含むマスターミックス（すなわち、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標））のそれぞれ１８μＬ、１７μＬ、１６μＬまたは１５μＬのいずれかに添加された。Ｍ．ツベルクロシス標的配列を増幅させるためのフォワードプライマーは、以下の配列：５’−ＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２）からなっていた。Ｍ．ツベルクロシス標的配列を増幅するためのリバースプライマーは、以下の配列：５’−ＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＣＧＡ−３’（配列番号３）からなっていた。Ｍ．ツベルクロシス標的配列の存在を検出するための標識されたプローブは、以下の配列：５’−６ＦＡＭ−ＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡ−ＭＧＢＮＦＱ−３’（配列番号４）からなっていた。図５は、より多くの鋳型Ｍ．ツベルクロシスＤＮＡ、すなわち、２μＬというよりは５μＬの抽出された親ＤＮＡの添加が、僅かにより良好なＲＴ−ＰＣＲ増幅および検出結果をもたらすことを示し、すなわち、２μＬについて平均Ｃτ値は２５．１であったのに対して、５μＬについて平均Ｃτ値は２３．４であった。
【０１７６】
熱サイクリングは以下のように実施された：９５℃にて５分間の初期のホットスタート、続く９５℃にて１０秒間の変性および６０℃にて３２秒間のアニーリングと伸長の組合せの４０サイクル。増幅効率は、方程式：Ｅ＝［１０（−１／勾配）−１］×１００に従うＣτ勾配法を用いて決定された。本明細書に記載されているすべてのアッセイは、９８．５％よりも大きい増幅効率を示した。
【０１７７】
各分析について、「鋳型なし」および「陽性」対照が含まれた。各分析のベースライン蛍光は、それぞれの「鋳型なし」の対照反応のベースライン蛍光に手動で調整された。「陽性」対照は、鋳型なしのベースラインと比較して、蛍光強度の増加を生じさせる。未知「陽性」は、ベースライン蛍光を超える増幅として定義され、対応するＣτ値は４０サイクルの実行において３６を超えない。
【０１７８】
試料は、喀痰被検体の周囲を５回、コパンスワブを旋回させることによって回収し、１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液を含むＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）回収チューブ内で浸漬させた。試料とＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）の１：１比率が、上述したようにまた使用された。この評価前に、拭き取られた材料は、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットを用いて抽出され、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出キットを用いて増幅された。被検体は、上記されたＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイを用いた核酸抽出および増幅前に、およそ６−３０日間、周囲温度にて保たれた。ＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイは、４℃（４日間）にて米国から実験室に出荷され、受領されると、−２０℃にて保管される前の４８時間、周囲温度にて保持された。
【０１７９】
核酸抽出は、製造業者の使用説明書に従って、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われた。ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）において拭き取られた材料の２００μｌは、短時間（例えば、５から１０秒間）ボルテックスされ、抽出手順のための出発材料として使用された。
【０１８０】
核酸増幅は、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイを用いて行われた。Ｍ．ツベルクロシス標的配列を増幅するためのフォワードプライマーは、以下の配列：５’−ＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２）からなっていた。Ｍ．ツベルクロシス標的配列を増幅するためのリバースプライマーは、以下の配列：５’−ＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＣＧＡ−３’（配列番号３）からなっていた。Ｍ．ツベルクロシス標的配列の存在を検出するための標識されたプローブは、以下の配列：５’−６ＦＡＭ−ＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡ−ＭＧＢＮＦＱ−３’（配列番号４）からなっていた。ＰＣＲ反応は、１８μｌのＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢおよび２μＬの抽出された核酸を含んでいた。増幅プロファイルは、上述されたように、９５℃にて５分間の初期のホットスタート、続く９５℃にて１０秒間の変性および６０℃にて３２秒間のアニーリングと伸長の組合せの４０サイクルからなっていた。増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）において行われ、アンプリコンは、プローブのＦＡＭ標識により検出された。
【０１８１】
上記の実施例と同様に、比較研究は、以下のプロトコールを用いて実施された：（１）ＮａＬｃ／ＮａＯＨ除染手順、続く、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットの使用による抽出およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）マイコバクテリウム検出（ＭＴＢ）キットを用いた増幅；（２）ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）への培養物の拭き取り手順、続く、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットの使用による抽出およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＭＴＢキットを用いた増幅；（３）１：１比率の被検体とＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）、続く、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットの使用による抽出およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＭＴＢキットを用いた増幅；（４）ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）への培養物の拭き取り手順、続く、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）呼吸器被検体調製キットの使用による抽出およびＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイを用いた増幅；ならびに（５）ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）への培養物の拭き取り手順、続く、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットの使用による抽出およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＭＴＢキットを用いた増幅。
【０１８２】
ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイの結果は、表１０および１１に見ることができる。
【０１８３】
【表１２】
2014514930.tif 000013
【０１８４】
【表１３】
2014514930.tif 000014
【０１８５】
ＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイは、スメア陰性例の７１％およびスメア陽性例の１００％を検出した。ＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＭＴＢを使用するよりも高い培養陽性試料数を検出した。ＰｒｉｍｅＭｉｘ（商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイは、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液の使用と適合性があった。
【０１８６】
［実施例９］  ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイの安定性
上述されたＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ成分は、様々な回数、すなわち、１回、３回、５回および１０回、−２０℃の温度での保管から取り出され、室温に置かれ、組み合わされた試薬の安定性を決定し、繰り返しの解凍および凍結が、核酸試料中の結核菌群の検出におけるＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイの性能を阻害するかどうかを決定した。単一チューブ内のアッセイ成分のすべては、室温にて約３分から約５分間解凍された。次に、チューブは、次の凍結解凍サイクルを開始するために、−２０℃にて約１時間置かれた。最終の凍結解凍サイクル後、ＲＴ−ＰＣＲは、従前に同定されたＭＤＲ−ＴＢ株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｏｒｉａ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）を用いたＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイについて上記の通りに行われた。実験は、凍結解凍サイクル数毎に３連で行われ、得られたＣτ値は平均された。
【０１８７】
多数の凍結／解凍サイクル内に置かれた後のＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイの結果は、図３に見ることができる。このグラフから分かるように、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイは、得られたＣτ値によって示されるように、ＰＣＲ増幅の減少を示さず、これは、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ成分が１０回解凍され、再凍結されるときでさえ、互いに有意に変化しない。１回の凍結解凍サイクル後の平均Ｃτ値（Ｃτ＝２３．６）と１０回の凍結解凍サイクル後の平均Ｃτ値（Ｃτ＝２３．７）は有意に変化しなかった。したがって、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイは、伝統的な実験室設定から離れて、現場での使用に特に適したものにする、様々な温度条件下で分解しない安定な成分を含む。
【０１８８】
［実施例１０］  ＰｒｉｍｅＭｉｘアッセイにおける試料完全性／核酸忠実度をモニタリングするためのＩＰＣ（単数または複数）の検出
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れられるべき内部陽性対照ならびにこれを検出するためのプライマーおよびプローブの設計
本明細書に記述されているように、ある種の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドの調製、安定化および定量を助けるように、核酸担体分子および／またはＩＰＣ配列を含むことが望ましい。本発明のＩＰＣは、従来の方法を用いて直接化学的に合成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて調製されてもよい。非ゲノム性であり、哺乳動物ゲノムまたは対象とする病原体種のゲノムに有意にハイブリダイズしないＩＰＣ配列を製剤化することが望ましい。特定の組成物および使用方法は、出願人の同時係属中の米国特許出願公開第２００９／０２３３３０９号（２００９年４月２０日出願）に見出すことができ、この内容は、参照により全体として本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１８９】
一実施形態において、本発明者らは、アッセイされる核酸の忠実度および完全性をモニタリングするために、内部陽性対照として配列番号８（５’−ＧＧＧＡＴＣＧＴＡＴＡＡＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＴＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＧＴＡＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＴＡ−３’）の配列を含む一本鎖ＤＮＡ分子を採用している。典型的に、約０．０２ｐｇ／ｍＬの一本鎖ＤＮＡ標的は、ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れられた。例示的な実施形態において、選択された増幅プライマーおよび標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブは、好ましくは、各々、少なくとも配列番号８の第一の単離されたヌクレオチド配列に結合する。以下の特定の増幅プライマーを用いると、得られた増幅産物は、約１００ｂｐの長さである：
フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＴＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号１０）
この増幅産物に特異的な例示的なオリゴヌクレオチド検出プローブとして、本発明者らは、配列番号１１（５’−［ＦＡＭ］−ＡＡＡＴＡＴＣＣＧＴＡＣＣＧＴＡＧＴＣＧ−［ＭＧＢ］−３’）の配列を選択した。
【０１９０】
本発明の実施に有用なＩＰＣは、本明細書に記載されている例示的な配列の１つを含む必要はなく、さらにＩＰＣは、本明細書に含まれるＩＰＣ配列のいずれかに実質的に相同的である必要さえない。この点を説明するために、以下の配列は、配列の縮重を有するにもかかわらず、担体ＤＮＡ／ＩＰＣ配列として機能的でもある配列番号８の変異体を表す。
【０１９１】
本発明のＩＰＣは、配列番号８として本明細書に開示されているまさに例示的なＤＮＡアンプリコンから調製される必要はない。適切な担体ＲＮＡ分子のインビトロにおける調製に有用なＤＮＡ配列のさらなる例は、限定されないが、以下の配列の１つ以上を含む。各々の例において、ポリメラーゼ転写部位は一重下線で示され、一方、例示的なフォワードおよびリバースＰＣＲプライマー結合ドメインの配列は二重下線で示されている。適切に標識された分子プローブが結合する例示的な配列ドメインは太字で示されている。
【０１９２】
【表１４】
2014514930.tif 000015
配列中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｎは０から約５００までの任意の整数である。
【０１９３】
【表１５】
2014514930.tif 000016
【０１９４】
［実施例１１］  ＩＰＣ  ＤＮＡ蛍光プローブ検出
ＩＰＣ検出プローブ（単数または複数）は、放射性、発光、化学発光、蛍光、酵素、磁気もしくはスピン共鳴標識またはこれらの組合せを含んでもよい。蛍光標識は、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）もしくは６−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−スクシンイミジルエステル（６−ＦＡＭＳＥ）、ＶＩＣ（商標）色素などまたはこれらの組合せを含むことができる。
【０１９５】
ＩＰＣ検出プローブ（配列番号１１）は、ＲＴ−ＰＣＲが実施されたならば、試料中のＩＰＣの検出におけるこれらの効果を評価するために、当業者に知られている方法によって、６−ＦＡＭ（ＦＡＭ）またはＶＩＣ（商標）色素のいずれかで標識された。これらのプローブおよびＩＰＣプライマー（配列番号９および配列番号１０）を含むＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）は、ＩＰＣを増幅し、次にＩＰＣの存在を検出するために使用された。実験は、各タイプの標識されたプローブについて４回実施された。検出は、ＡＢＩ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実施された。図４から分かるように、ＶＩＣ（商標）色素で標識されたＩＰＣ検出プローブについてのＣτ値（Ｃτ値＝３２．５）と６−ＦＡＭで標識されたＣτ値（Ｃτ値＝３１．５）の間に有意差はなかった。したがって、使用されるプローブ標識のタイプは、ＩＰＣの存在および量の分析および評価の実施において影響は最小限である乃至は影響がない。
【０１９６】
［実施例１２］  多重アッセイ：ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイと組み合わせた内部陽性対照
上述したように、非ゲノム性であり、哺乳動物ゲノムまたは対象とする病原体種のゲノムに有意にハイブリダイズしないＩＰＣ配列を製剤化することが望ましい。これは、試料中に存在し得る、対象ではない患者自体由来のＤＮＡまたは他の微生物由来のＤＮＡなどの、抽出された患者試料中に存在する他の核酸（単数または複数）を検出するＩＰＣプライマーおよびプローブの可能性を避けるためである。
【０１９７】
本発明のＩＰＣ、ＩＰＣプライマーおよびＩＰＣプローブが、試料中のＭ．ツベルクロシス配列の増幅または検出に影響を及ぼさないまたは阻害しないことを確実にするために、一本鎖ＤＮＡ  ＩＰＣは、従前に同定されたＭＤＲ−Ｍ．ツベルクロシスＤＮＡの約３３ｎｇ／μＬを含むＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れられた。次に、核酸は、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて抽出され、上記したように、Ｍ．ツベルクロシスとＩＰＣ用のプライマーおよびプローブの両方を含むＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）は、多重ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイに使用された。比較として、同じ手順が、同じＭ．ツベルクロシス株において行われたが、ＩＰＣ、ＩＰＣプライマーまたはＩＰＣプローブは添加されなかった。この実験は、多重手順と一重手順の両方について３連で行われた。図６から分かるように、Ｍ．ツベルクロシス核酸の増幅および検出は、多重手順によって有意に影響を受けなかった、すなわち、多重手順（「ＭＴＢ多重」）についての平均Ｃτ値は２４．６であり、一方、一重手順（「ＭＴＢ」）についてのＣτ値は２３．６であった。
【０１９８】
［実施例１３］  一重および多重アッセイ：ＩＰＣの濃度変化
ＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れられたＩＰＣの濃度を変化させた。１０−５、１０−６、１０−７および１０−８ｎｇ／μＬのＩＰＣは、同量のＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）に入れられた。一重反応または多重反応が実施されたかどうかに応じて、結核菌群に特異的なプライマーおよびプローブのセットもまたＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）に入れられた。結核菌群に特異的な核酸はＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）溶液に添加されなかった。図７から分かるように、多重ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイにおけるＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中のＩＰＣの濃度変化（「多重におけるＩＰＣ  Ｖｉｃ」）は、一重ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）アッセイ（ＩＰＣだけ用）におけるＩＰＣの同濃度変化（「ＩＰＣ  Ｆａｍ」および「ＩＰＣ  Ｖｉｃ」）と比較して有意差を示さなかった。さらに、ＩＰＣ濃度を変化させた場合の一重フォーマットにおいて、６−ＦＡＭで標識されたＩＰＣプローブとＶＩＣ（商標）色素で標識されたＩＰＣプローブの間に有意差はなかった。
【０１９９】
［実施例１４］  一重および多重アッセイ：Ｍ．ツベルクロシス試料の濃度変化
図８から分かるように、初期に１．５ｍＬのＰｒｉｍｅＳｔｏｒｅ（登録商標）中に保管された場合Ｍ．ツベルクロシス試料の初期量を１５μＬから１５０μＬ（１０倍の差）へ増加させることは、一重ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ（１５μＬ試料の平均Ｃτ値＝２６．５、１５０μＬ試料の平均Ｃτ値＝２４．１）および多重ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ（１５μＬ試料の平均Ｃτ値＝２６．８、１５０μＬ試料の平均Ｃτ値＝２４．２）から得られた結果を僅かに改善する。予期されるように、ＩＰＣの検出は影響を受けない状態のままである。一重と多重のＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）ユニバーサルＭＴＢアッセイ間のＣτスコアによって測定したとき、ＭＴＢ  ＰＣＲ増幅において、観察できる差はほとんどなかった。
【０２００】
［実施例１５］  一重および多重アッセイ：マイコバクテリウム株の検出
様々なマイコバクテリア株（すなわち、５種のＭ．ツベルクロシス株、２種のＭ．アビウム株、１つのＭ．イントラセルラエ株、１つのＭ．ゴンジイ株および１つのＭ．カンサシイ株）が、上述したものに類似した手順によって、一重（「ＭＴＢ一重」）と多重（「多重におけるＭＴＢ」）のＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）の両方を用いて試験された。核酸抽出量は、喀痰試料の内容物に応じて約８０から約１８０ｎｇ／μＬまで変化した。図９から分かるように、一重と多重アッセイの両方は、５種のＭ．ツベルクロシス株を容易に検出したが、他の非ＭＴＢ株を検出しなかった。これは、ＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）アッセイが、結核を引き起こす生物を容易に検出するが、他のマイコバクテリウム属種を検出しないことを示す。ＭＴＢ検出に関する一重と多重アッセイの結果の間に有意差は検出されず、これは、一重と多重のアッセイ間に感度の喪失がほとんど乃至は全くないことを示した。ＩＰＣは、どのマイコバクテリア株が用いられたかにかかわらず、すべての多重アッセイにおいて容易に検出された。
【０２０１】
［実施例１６］  一重および多重アッセイ：Ｍ．ツベルクロシス標的病原体の希釈
図１０から分かるように、特定の精製された株からのＭ．ツベルクロシス標的配列の濃度の量を変化させること（すなわち、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１は１０倍希釈を代表とし、ここで、１０−１は３３０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−２は３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−３は３．３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−４は０．３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示す）は、一重と多重アッセイの両方において、Ｍ．ツベルクロシスを有意に検出するＰｒｉｍｅＭｉｘ（登録商標）の能力を増加させた。ＩＰＣ標的配列の濃度は、各アッセイについて０．０２ｐｇ／ｍＬであった。標的配列の濃度が、一般に、ＩＰＣ標的の濃度よりもはるかに高い場合、多重アッセイの性能において典型的に予期されるように、ＩＰＣ検出は、Ｍ．ツベルクロシス核酸の最高濃度によって最小限に影響を受けた。これは、アッセイにおけるＩＰＣ標的配列の濃度を増加させることまたは多重反応におけるＩＰＣプライマーおよび／もしくはプローブのさらなるモル濃度の最適化によって対処され得る。
【０２０２】
［実施例１７］  多重アッセイ：Ｍ．ツベルクロシス株の希釈
図１１から分かるように、特定の精製された株からのＭ．ツベルクロシス核酸の量を変化させること（すなわち、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１は１０倍希釈を代表とし、ここで、１０−１は３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−２は３．３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−３は０．３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示し、１０−４は０．０３３ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を示す）は、６−ＦＡＭまたはＶＩＣ（商標）色素のいずれかで標識されたＩＰＣプローブを用いた場合、ＩＰＣの検出に有意な影響を与えなかった。６−ＦＡＭで標識されたプローブは、全体でより低いＣτ値を示したが、両方の検出方法は同等に有効であった。
【０２０３】
［実施例１８］  様々なＢＳＡ濃度でのリアルタイムＰＣＲサイクル閾値の変化
ＰＣＲ  ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ酵素ならびに１０倍ＰＣＲバッファーは、典型的に、別々のチューブに供給され、一定の−２０℃にて維持される。「マスターミックス」調製物は、典型的に、該酵素および１０倍ＰＣＲバッファーを解凍し、増幅のためのプライマーと組み合わせることによって調製される。本発明は、当該技術分野におけるＰＣＲバッファーよりもはるかに熱安定性である、１つ１回使用のチューブからのバッファー、塩、酵素ならびにリアルタイム増幅のためのプライマーおよびプローブを含む包括的な混和物である。例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０９６６−０１８および１０９６６−０２６）とともに供給される市販の１０倍ＰＣＲバッファーとは対照的に、本発明は、反応においてＰＣＲ酵素を安定化させるためのＢＳＡの添加を含む。
【０２０４】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、制限酵素反応において一般に使用され、ＤＮＡの消化中にいくつかの酵素を安定化させ、反応チューブ、特に、ＰＣＲに用いられるガラス毛細管への酵素の付着を防止する。長期の、すなわち、一晩の制限酵素反応におけるその安定化特性のため、ＢＳＡは、同様に、特にこれらの酵素が−２０℃未満の温度にて保管されている場合に、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用されるＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの安定性および完全性を高めることができる。ＢＳＡは、阻害物質およびＤＮＡ汚染物質に干渉することによって反応を安定化させることが報告されている。最終反応濃度が０．１−０．５ｍｇ／ｍＬの間の濃度でのＢＳＡの存在は、リアルタイムＰＣＲサイクル閾値によって決定される下流のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に有害な影響を与えない。
【０２０５】
ベタインは、前立腺特異的膜抗原ｍＲＮＡの２つの選択的スプライシング変異体の共増幅およびｃ−ｊｕｎのｃＤＮＡの増幅を改善する。ベタインおよびカチオン性官能化両性イオン化合物は、ＧＣ富化領域によって引き起こされる二次構造の形成を減少させることによって遺伝子増幅を改善し、したがって、任意のＧＣ富化ＤＮＡ配列の増幅を改善するために一般に適用可能である。ＰｒｉｍｅＭｉｘ中のベタインは、個々のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を保存および安定化し、ＰｒｉｍｅＭｉｘ溶液中のＰＣＲプライマーおよびプローブのアニーリング、安定性、加水分解および酸化的分解を防止する。１０−１００ｍＭの間の最終濃度で存在するベタインは、リアルタイム増幅中のサイクル閾値によって決定されるＰＣＲ増幅に対して相加効果を有した。ベタインは安定化された分子であり、−２０℃より高い温度で保持されるＰＣＲ反応混合物に十分に適し、これは、増幅中にヌクレオチドの突然変異率を促進せず、ＤＴＴおよびＤＭＳＯほど容易に分解しないためである。
【０２０６】
バッファーの最終ｐＨは、ＰＣＲ増幅中の全体的な安定性に大きな影響を与える。ＰＣＲのための好ましいｐＨは、典型的には８．４であると報告されているが、９．０程度に塩基性であるバッファーが有効であった。酵素、バッファーおよびプライマーの包括的な混合体を含む本発明において、本発明者らは、最適なｐＨは８．２（±０．１）であることを見出した。僅かに塩基性が低いバッファーは、具体的にはＰｒｉｍｅＭｉｘ製剤が−２０℃よりも高い温度にて経時的に保持される場合、リアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ増幅を高めることが示された。
【０２０７】
インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス（１０２  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）は、０．１−０．５ｍｇ／ｍＬ勾配のＢＳＡ中でＰｒｉｍｅＭｉｘユニバーサルインフルエンザＡを用いて増幅させた（図１２参照）。分かるように、これらの濃度でリアルタイムＰＣＲサイクル閾値における変化は認められず、ＢＳＡによるＰＣＲ阻害がなかったことを示している。
【０２０８】
本発明の他の実施形態および使用は、本明細書を考慮し、本明細書に開示されている本発明を実施することにより当業者に明らかとなる。本明細書中に引用されているすべての参考文献は、すべての刊行物、米国および外国の特許および特許出願を含め、参照により具体的におよび完全に組み込まれる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、いずれにおいて使用されようとも、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含することが意図される。さらに、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、限定を意図しない。本明細書および実施例は、単に例示にすぎないと見なされるべきであって、本発明の真の範囲および精神は、特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１】
2014514930.tif 000017
【図２】
2014514930.tif 000018
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2014514930000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分として：
約０．０５Ｕから約１Ｕの量で存在する熱安定性ポリメラーゼ；
約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；
約０．０１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に存在する、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるキレート剤；
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、グリセロール、非イオン性洗浄剤、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＰＣＲ浸透圧剤；
約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、哺乳動物アルブミンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるアルブミン；
約５０ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に集合的に存在する、第一の塩が塩化カリウムおよびグルタミン酸カリウムからなる群から選択されるカリウム塩であり、第二の塩が塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択されるマグネシウム塩である、少なくとも２つの塩；ならびに
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有する、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるバッファー
を含む、生物試料中の微生物を検出するためのＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物。
【請求項２】
熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、高忠実度ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ホットスタートポリメラーゼまたは次世代ポリメラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１つ以上の色素をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
１つ以上の色素が、フルオレセイン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンおよびＲＯＸからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ｐＨが、約６．５から約７．５である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
バッファーのｐＫａが、周囲温度でのバッファーのｐＨの０．５以内である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
バッファーのｐＫａが、周囲温度でのバッファーのｐＨの０．２以内である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
約０．５μＭから約５０μＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、微生物に特異的な核酸配列をＰＣＲによって増幅するように構成されたＰＣＲプライマー対をさらに含み、ここで、各ＰＣＲプライマーは、約５から約５０ヌクレオチドの長さである、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ＰＣＲプライマー対が、各々、約１８から３５ヌクレオチドの長さである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
微生物が、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
細菌が、マイコバクテリアである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ３またはＨ５Ｎ１である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
約１ｆｇから約１ｎｇの濃度で濃度中に存在する対照核酸をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
対照核酸が、ＰＣＲ増幅の定性的または定量的な尺度を与える、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
対照核酸が、配列番号８の配列、配列番号１２の配列または配列番号２１の配列を含む、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
検出プローブをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
検出プローブが、微生物に特異的であるＰＣＲ増幅された核酸配列に特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
約５０ｍＭのＴＲＩＳ；約７０ｍＭの塩化カリウム；約３ｍＭの硫酸マグネシウム；約４５ｍＭのベタイン；約０．０３μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン；約０．１ｍＭのＥＤＴＡ；約０．０５μＭの色素；約８μＭのＰＣＲプライマー対を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＣＲプライマー対の一方のプライマーが、配列番号２または配列番号５の核酸配列を含み、ＰＣＲプライマー対の他方のプライマーが、配列番号３または配列番号６の核酸配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
検出プローブが、約２０から約３５ヌクレオチドの長さであるマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）特異的配列であり、配列番号４または配列番号７の配列を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
成分として：熱安定性ポリメラーゼ；ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；キレート剤；ＰＣＲ浸透圧剤；アルブミン；少なくとも２つの塩；ならびに少なくとも５０ｍＭの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有するバッファーを含む、生物試料中の微生物を検出するためのＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物。
【請求項２３】
熱安定性ポリメラーゼが、約０．０５Ｕから約１０Ｕの量で存在し；デオキシヌクレオチド三リン酸の混合体が、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で組成物中に存在し；キレート剤が、約０．０１ｍＭから約１０ｍＭの濃度で組成物中に存在し；ＰＣＲ浸透圧剤が、約１ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に存在し；アルブミンが、約５ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在し；少なくとも２つの塩が、約５０ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に集合的に存在し；バッファーが、約１ｍＭから約１０Ｍの濃度で組成物中に存在する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
生物試料中の微生物を検出するための方法であって、
生物試料を請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、混合物を形成すること；
前記混合物に複数の熱サイクリングステップを実施し、微生物に特異的である核酸から誘導される増幅産物を形成すること；
増幅産物の有無を検出し、生物試料中の微生物の有無を決定することを含む方法。
【請求項２５】
対照核酸の増幅された配列を検出することおよび複数の熱サイクリングステップから生じた増幅の質または量を決定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物試料が、個体から得られる生物材料、１つ以上のカオトロープ、１つ以上の洗浄剤、１つ以上の還元剤、１つ以上のキレート剤および１つ以上のバッファーを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
成分として：
約０．０５Ｕから約１Ｕの量で存在する熱安定性ポリメラーゼ；
約０．１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に集合的に存在する、ほぼ当量のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸の混合体；
約０．０１ｍＭから約１ｍＭの濃度で組成物中に存在する１つ以上のキレート剤；
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する１つ以上のＰＣＲ浸透圧剤；
約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する１つ以上のアルブミンタンパク質；
約５０ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在する１つ以上の塩；ならびに
約１ｍＭから約１Ｍの濃度で組成物中に存在し、約６．５から約９．０のｐＨを有する１つ以上のバッファー
を含有するＰＣＲ対応組成物であって、バッファーのｐＫａが選択温度でｐＨの約１単位以内であり、前記成分がヌクレアーゼ不含水とともに合わせられるＰＣＲ対応組成物を提供することを含む、生物試料中の微生物の検出を提供するための方法。
【請求項２８】
バッファーのｐＨが、約６．５から７．５であり、ｐＫａが、周囲温度でｐＨの約０．５単位以内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物試料を組成物と接触させることおよび混合物に熱サイクリング反応を実施することをさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上のキレート剤が、エチレングリコール四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、エチレンジアミン四酢酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、重クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウムまたはこれらの任意の組合せを含む、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上のＰＣＲ浸透圧剤が、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルアミド、グリセロール、非イオン性洗浄剤、デオキシイノシン、グリセリン、７−デアザデオキシグアノシン三リン酸、水酸化ナトリウム、ポリエチレングリコール、塩化テトラメチルアンモニウムまたはこれらの任意の組合せを含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上のアルブミンが、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、哺乳動物アルブミンまたはこれらの任意の組合せを含む、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上の塩が、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよびこれらの任意の組合せを含む、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
１つ以上のバッファーが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、クエン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
生物試料の添加および熱サイクリングのために構成された滅菌容器内に含有される請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物ならびに熱サイクリングの結果から病原体の有無を決定するための使用説明書を含むキット。
【国際調査報告】
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