(57)【要約】  本発明は、ペットフードの分野に関する。特に、本発明は、非複製性プロバイオティクス微生物を含むペットフード組成物を提供する。これらの非複製性プロバイオティクス微生物は、例えば、生理活性のある熱処理プロバイオティクス微生物である。本発明は、これらの非複製性プロバイオティクス微生物によりもたらされる健康上の利益にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１食当たり約１０６〜１０１２ｃｆｕに相当する量で非複製性プロバイオティクス微生物を含むペットフード組成物。
【請求項２】
乾燥重量ベースで約４〜４０重量％の脂肪、約１２〜７０重量％の炭水化物、及び約１２〜約５０重量％のタンパク質を含む、請求項１に記載のペットフード組成物。
【請求項３】
乾燥重量ベースで約１０〜２０重量％の脂肪、約３０〜６０重量％の炭水化物、及び約２０〜約３５重量％のタンパク質を含む、請求項２に記載のペットフード組成物。
【請求項４】
乾燥重量ベースで約０．５〜４０重量％、好ましくは約０．５〜３０重量％、より好ましくは約１〜２０重量％、最も好ましくは約１〜１０重量％の食物繊維をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項５】
ペットフード、ペット用栄養食、ペット用サプリメント、ペット用トリート及びペット用フードトイ（例えば、咀嚼可能で摂取可能な玩具）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項６】
プレバイオティクス（例えば、オリゴフルクトース、イヌリン）をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項７】
前記プロバイオティクス微生物は、熱処理により、好ましくは少なくとも７１．５℃、少なくとも１秒の高温処理により非複製性にされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項８】
前記熱処理は、約７１．５〜１５０℃、約１〜１２０秒の高温処理であり、好ましくは高温／短時間（ＨＴＳＴ）処理又は超高温（ＵＨＴ）処理である、請求項７に記載のペットフード組成物。
【請求項９】
炎症性障害の予防又は治療のための、請求項８に記載のペットフード組成物。
【請求項１０】
前記熱処理は、約７０〜１５０℃で約３分〜２時間、好ましくは８０〜１４０℃で５分〜４０分実施される、請求項７に記載のペットフード組成物。
【請求項１１】
免疫防御不全に関連する障害の予防又は治療のための、請求項１０に記載のペットフード組成物。
【請求項１２】
少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的にはすべてのプロバイオティクスが非複製性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項１３】
前記プロバイオティクス微生物は、ビフィズス菌、乳酸菌、プロピオン酸菌又はそれらの組み合わせ（例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・フェルメントゥム、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・テルモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・ジアセチラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、エシェリヒア・コリ及び／又はそれらの混合物）からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項１４】
前記プロバイオティクス微生物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０、ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、エシェリヒア・コリ・ニッスル、ラクトバチルス・ブルガリクスＮＣＣ１５、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【請求項１５】
１日量当たり約０．００５ｍｇ〜１０００ｍｇの非複製性微生物を含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペットフードの分野に関する。特に、本発明は、非複製性プロバイオティクス微生物を含むペットフード組成物を提供する。これらの非複製性プロバイオティクス微生物は、例えば、生理活性のある熱処理プロバイオティクス微生物である。本発明は、これらの非複製性プロバイオティクス微生物によりもたらされる健康上の利益にも関する。
【０００２】
同時に、プロバイオティクスの健康上の利益は当技術分野において広く認められており、例えば、Ｂｌｕｍらにより、Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３年９月，４（２）：５３〜６０でまとめられている。しばしば、プロバイオティクスは、さらに強化された健康上の利益を有し得る共生的配合物においてプレバイオティクスと一緒に投与される。
【０００３】
家畜の健康は、それらの給餌と密接に関連している。適切な給餌により、ペットは体調が良くなり、健康になる。栄養価を付与することに加えて、フード組成物は、腸管微生物叢の平衡に影響を及ぼし、胃腸障害を引き起こすか又は予防し得る。したがって、実際の給餌の実践を理解するには、健康な動物の胃腸管及び消化プロセスに関する知識が不可欠である。
【０００４】
イヌ及びネコの胃腸障害は、細菌の異常増殖及び病原菌が産生するエンテロトキシンの産生と関連があることが多い。
【０００５】
ここ数年間、乳酸菌の一部の貴重な菌株及びそれら菌株のプロバイオティクス物質としての潜在的使用に焦点を合わせた研究が行われてきている。プロバイオティクスは、腸内の天然微生物叢を維持することにより哺乳類の健康を促進する生存可能な微生物調製物であると見なされている。プロバイオティクスは、腸粘膜に付着し、腸管に定着し、それにより腸管への有害な微生物の付着を防止すると考えられている。プロバイオティクスの作用の必要条件は、プロバイオティクスが、適当かつ生存可能な形態で腸の粘膜に達しなければならないことであり、特に、胃において一般的な低ｐＨの影響により破壊されないことである。特に、ネコ及びイヌの消化管の生理機能は、ヒトとは異なる。例えば、胃における平均ｐＨは、イヌについては約３．４、ネコについては約４．２である。
【０００６】
米国特許第７１８９３９０号は、プロバイオティクスとしての潜在力、及びペットの健康を改善することを意図したペットフード組成物の調製のための使用のために、単離され選択された新規の乳酸菌微生物について記載している。
【０００７】
免疫系の最大で７０％が動物の消化管内に含まれているので、プロバイオティクスは、動物の消化の健全性だけではなく、ペットの免疫系全体を援助する。
【０００８】
プロバイオティクス細菌は、腸細胞に付着し、腸細胞上の病原菌を排除できることが知られている。この活性を示すために、プロバイオティクス細菌は、摂取されるまで製品中で生存可能なままでなければならない。生菌体が摂取されるまで生存可能なまま製品中に残り、細菌が生存可能な状態で腸管に到着するように生菌体をペットフードキブルに添加することは、依然として課題であり、この課題を達成することは、かなりの技術的努力を必要とする。
【０００９】
調製し易いと同時に、プロバイオティクスにとって過酷な条件下での長時間の貯蔵後であってもプロバイオティクスの利益をもたらすことができるペットフード組成物を入手可能であることが望ましい。このことは、副作用がなく安全に投与でき、最先端の産業技術を使用してペットフード組成物に組み込み易い天然の成分を使用することにより達成することが好ましい。
【００１０】
そのような調製物におけるプロバイオティクスの追加免疫作用をさらに改善することも望ましい。
【００１１】
そのような調製物におけるプロバイオティクスの抗炎症作用をさらに改善することがさらに望ましい。
【００１２】
本発明者らは、この要求について検討してきた。それ故、本発明の目的は、当技術分野の水準を改善すること及び上記要求を満たすペットフード組成物を提供することである。
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、独立クレームの主題によりこの目的を達成できたことを知見した。従属クレームは、本発明のアイディアをさらに発展させるものである。
【００１４】
本発明者らは、非複製性プロバイオティクスであってもプロバイオティクスの健康上の利益をもたらすことができ、しかも改善された利益をも有し得ることを示すことができた。
【００１５】
それ故、最終製品中でプロバイオティクスを生かしておくため、及びそれらプロバイオティクスが必ず生きたまま腸内に到着するようにするための複雑な手段は不必要であると思われる。
【００１６】
したがって、本発明者らは、非複製性プロバイオティクス微生物を含むペットフード組成物を提供することを提案する。
【００１７】
本発明の目的のためのペットフード組成物は、様々な組成物、例えば、フード、栄養食、サプリメント、トリート及びフードトイ（例えば、咀嚼可能で摂取可能な玩具）を含む。
【００１８】
本発明の目的のためのペットは、家畜、例えば、イヌ、ネコ、鳥、ウサギ、モルモット、ヤギ、雌牛、ウマ、ブタを含む。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、任意の好適な形態を有するフード、例えば液状又は固形のフードである。液状フードの場合、非複製性プロバイオティクス微生物はフードと混ぜ合わせることができる。固形フードの場合、非複製性プロバイオティクス微生物はフードにコーティングするか、フードに組み込むか、又はその両方とすることができる。フードにコーティングするか又は組み込む場合、非複製性プロバイオティクス微生物は、均一又は不均一にフードの中又はその上に分散させることができる。
【００２０】
本発明のペットフード組成物は、一般に、炭水化物画分、タンパク質画分及び脂肪画分を含有する。
【００２１】
パーセンテージは、特に断らない限り乾物基準の重量％である。
【００２２】
本発明のペットフード組成物は、約１２％〜約７０％、好ましくは約１６％〜約６５％、より好ましくは約２０％〜約６０％、最も好ましくは約３０％〜約６０％の炭水化物画分；約１２％〜約５０％、好ましくは約１６％〜約４５％、より好ましくは約１８％〜約４０％、最も好ましくは約２０％〜約３５％のタンパク質画分；及び約４％〜約４０％、好ましくは約６％〜約３０％、より好ましくは約８％〜約２５％、最も好ましくは約１０％〜約２０％の脂肪画分を含み得る。
【００２３】
一部のペットフード組成物（例えばペット用トリート）については、組成物は、一般に嗜好性を強化するために、約１〜約１２％の脂肪をコーティングの形態で含有し得る。
【００２４】
本発明のペットフード組成物は、約０．５％〜約４０％、好ましくは約０．５％〜約３０％、より好ましくは約１％〜約２０％、最も好ましくは約１％〜約１０％の食物繊維も含み得る。
【００２５】
栄養調整剤（すなわち、ビタミン、ミネラル、微量元素及びそれらの組み合わせ）を添加することができる。一般に、そのような栄養調整剤は、約０．０１％〜約１５％、好ましくは約０．０５％〜約１０％、より好ましくは約１％〜約５％、最も好ましくは約１％〜約３％の量で添加することができる。
【００２６】
ある組成物中の各成分の具体的に適切な量は、様々な要因、例えば：該組成物を摂取する動物種；該組成物に含まれる特定の成分；動物の年齢、重量、一般的健康状態、性別及び食餌；動物の摂取速度によって異なる。したがって、成分量は幅広く変動してもよく、さらに、本明細書において示す比率から逸脱してもよい。そのような構成要素及び構成要素の量の選択は当業者の能力の範囲内である。一部のコンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）については、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ（ＡＡＦＣＯ）がそのような成分の推奨量を提示している。
【００２７】
タンパク質食物源は、様々な供給源、例えば、植物、動物又はその両方から得ることができる。動物性タンパク質としては、食肉、肉副産物、乳製品及び卵が挙げられる。食肉としては、家禽、魚、及び動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）からの肉が挙げられる。肉副産物としては、肺、腎臓、脳、肝臓、胃及び腸が挙げられる。タンパク質食品成分は、遊離アミノ酸及び／又はペプチドとすることもできる。好ましくは、タンパク質食品成分は、食肉、肉副産物、乳製品又は卵を含む。
【００２８】
脂肪及び炭水化物食物源は、様々な供給源、例えば、動物性脂肪、魚油、植物油、食肉、肉副産物、穀物、他の動物又は植物源、及びそれらの混合物から得ることができる。穀物としては、コムギ、トウモロコシ、オオムギ及びイネが挙げられる。
【００２９】
繊維食品成分は、様々な供給源、例えば植物繊維源（例えば、、セルロース、ビートパルプ、落花生殻、ダイズ繊維）から得ることができる。
【００３０】
特に、組成物が動物性食品である場合、ビタミン及びミネラルが、欠乏を回避し健康を維持するのに必要とされる量で含まれることが好ましい。これらビタミン及びミネラルの量は、当技術分野において容易に知ることができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）は、そのような成分の家畜への推奨量を提示している。例えば、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ（改訂第１０版，Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．Ｄ．Ｃ．，１９９８）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ（改訂第９版，Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．Ｄ．Ｃ．，１９９４）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｏｒｓｅｓ（改訂第５版，Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．Ｄ．Ｃ．，１９８９）等を参照されたい。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ（ＡＡＦＣＯ）は、そのような成分のイヌ及びネコの推奨量を提示している。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１２６  １４０頁（２００３）を参照されたい。一般に食品添加物として有用なビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ（ビオチン）、ビタミンＫ、葉酸、イノシトール、ナイアシン及びパントテン酸が挙げられる。一般に食品添加物として有用なミネラル及び微量元素としては、カルシウム、リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、銅、亜鉛、コリン及び鉄が挙げられる。
【００３１】
本発明の組成物は、当業者に知られているさらなる成分、例えば、ビタミン、ミネラル、充填剤、嗜好性強化剤、結合剤、香料、安定剤、乳化剤、甘味料、着色剤、緩衝剤、塩、コーティングを含有し得る。安定剤としては、組成物の貯蔵寿命を増大させる傾向がある物質、例えば、保存剤、共力剤及び金属イオン封鎖材、包装用ガス、安定剤、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤及び湿潤剤が挙げられる。乳化剤及び／又は増粘剤の例としては、ゼラチン、セルロースエーテル、デンプン、デンプンエステル、デンプンエーテル及び加工デンプンが挙げられる。各組成物構成要素、食品成分、及び他の成分の具体的な量は、様々な要因、例えば：該組成物に含まれる特定の構成要素及び成分；患者動物の種；患者動物の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食事；患者動物の摂取速度；治療される疾患のタイプ（存在する場合）によって異なる。したがって、成分量は幅広く変動することができ、本明細書に記載の好ましい比率から逸脱してもよい。組成物中のそのような添加剤の量は、一般に最大で約５重量％である。
【００３２】
本発明の組成物は、動物の健康を維持若しくは改善することを意図したさらなる成分、例えば、サプリメント、薬物、ハーブ、ホリスティックな薬物及び組成物であってもよく、又はそれらを含有してもよい。
【００３３】
本発明において有用なサプリメントとしては、全体の栄養のバランス又は性能を改善するために別の飼料と共に使用される飼料が挙げられる。サプリメントとしては、未希釈の状態でサプリメントとして他の飼料に供給されるか、別個に入手可能な動物の一日分の食料の他の部分と共に自由に選択できるか、又は動物の通常の飼料で希釈混合され完璧な飼料を提供する組成物が挙げられる。ＡＡＦＣＯは、サプリメントに関連する議論をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２２０頁（２００３）に示している。サプリメントは、粉末、液体、シロップ、丸薬、カプセル化組成物等を含む様々な形態とすることができる。
【００３４】
トリートとしては、動物が食事時間以外に食べるように気を引くために動物に与えられる組成物（例えば、イヌ用のドッグボーン）が挙げられる。トリートは、該組成物が１種又は複数の栄養素を含む場合は栄養的であり、フードに関連して上記した組成を有し得る。非栄養的なトリートは、非毒性の任意の他のトリートを包含する。非複製性プロバイオティクス微生物は、トリートにコーティングするか、トリートに組み込むか、又はその両方である。
【００３５】
玩具としては、咀嚼可能な玩具（例えば人工骨）が挙げられる。非複製性プロバイオティクス微生物は、玩具の表面又は玩具の構成要素の表面にコーティングを形成することができるか、玩具全体に部分的若しくは完全に組み込むことができるか、又はその両方とすることができる。一実施形態において、非複製性プロバイオティクス微生物は、意図した使用対象動物により経口利用可能である。様々な適切な玩具が現在販売されており、例えば、米国特許第５，３３９，７７１号、米国特許第５，４１９，２８３号、及びそれらが開示している参考文献である。本発明は、部分的に摂取することができる玩具（例えば、プラスチックの構成要素を含む玩具）及び完全に摂取することができる玩具（例えば、生皮及び様々な人工骨）の両方を提供する。さらに、本発明は、ヒト及び非ヒト動物が使用するための、特にコンパニオンアニマル、家畜、及び動物園の動物が使用するための、特にイヌ、ネコ又は鳥が使用するための玩具を提供する。
【００３６】
本発明の組成物の調製において、構成要素は、非複製性プロバイオティクス微生物が、組成物の少なくとも０．０１重量％、好ましくは約０．０１重量％〜約４重量％、最も好ましくは約０．５重量％〜約２重量％の濃度で組成物中に存在するように調整される。非複製性プロバイオティクス微生物は、配合物の加工の間（例えば、組成物の他の構成要素の混合の間及び／又は後）に組成物に含ませることができる。これらの構成要素の組成物への分配は従来の手段により達成される。
【００３７】
本発明の組成物（特にフード）は、従来のプロセスを使用してドライ形態で調製することができる。一実施形態において、動物性タンパク質源、植物性タンパク質源、穀物等を含む乾燥成分は、まとめて粉砕され、混合される。次いで、脂肪、油、動物性タンパク質源、水等の湿った又は液状の成分を乾燥ミックスに添加し、乾燥ミックスと混合する。次いで、混合物をキブル又は同様の乾燥片に加工する。キブルは、押出プロセスを使用して形成されることが多く、このプロセスでは、乾燥及び湿潤成分の混合物を高圧及び高温で機械的に加工し、小さい開口部を通して押し出し、回転ナイフにより切断してキブルとする。次いで、湿潤キブルを乾燥させ、場合により、香料、脂肪、油、粉末等を挙げることができる１種又は複数の局所コーティングでコーティングする。キブルは、押出ではなくベーキングプロセスを使用して生地から作製することもでき、このプロセスでは、乾熱加工の前に生地を型に入れる。
【００３８】
非複製性プロバイオティクス微生物は、ペットフード組成物に、その通常の調製工程（例えば、混合、押出、ベーキング）において添加することができ、好ましくは押出後の調製の後、該フードの表面への噴霧、コーティング等により添加する。これは、ドライフードにとって特に望ましく、押出ストランドを切断してキブルとする前に該ストランドに噴霧若しくはコーティングすることにより押出ストランドを非複製性プロバイオティクス微生物（又は非複製性プロバイオティクス微生物を含む溶液）と接触させるか、又はキブル自体に噴霧、コーティング若しくは液浸することによりキブルを非複製性プロバイオティクス微生物（又は非複製性プロバイオティクス微生物を含む溶液）と接触させる。
【００３９】
フードへの局所適用のためには、非複製性プロバイオティクス微生物を担体組成物と混合して、フード組成物の表面への適用を促進する。例えば、液体、スラリー、薄いゲル、又は水分の多い固形物はすべて、この組成物の化合物用の担体として利用することができる。標準的な噴霧又は液浸装置を採用して、該化合物をフード組成物の表面に適用する。そのような担体の一例は、アミノ酸、還元糖及びチアミンと併せてプロテアーゼで処置したミンチ状の動物副産物である。次いで、担体を非複製性プロバイオティクス微生物と混合し、キブルにコーティングし、それにより非常に美味で満足されるドライフードが調製される。特定の好ましい実施形態において、非複製性プロバイオティクス微生物を、単純に市販の液状嗜好強化剤又は他の香料組成物と混合して、新規の香味嗜好剤を作製してもよく、次いで、これを組成物に局所適用することができる。本発明において非複製性プロバイオティクス微生物と共に使用するのに適切な市販の液状嗜好強化剤としては、当業者に知られているペットフード嗜好強化剤又は他の香料の供給業者から入手できる、任意の既知の又は市販の液状嗜好強化剤が挙げられる。
【００４０】
本発明の組成物（特にフード）は、従来のペットフード加工法を使用して缶詰又はウェット形態で調製することができる。一実施形態において、粉砕した動物（例えば、哺乳動物、家禽、魚及び／又は海産物）のタンパク性組織を、魚油、穀粒、他の栄養調整成分、特別な目的の添加剤（例えば、ビタミン及びミネラル混合物、無機塩、セルロース及びビートパルプ、増量剤）を含む他の成分と混合する。加工に十分な水も添加することができる。ウェット形態の成分は、一般に、構成要素をブレンドしながら、加熱に適した容器において混合する。混合物の加熱は、任意の適切な様式を使用して、例えば、直接スチームインジェクションにより、又は熱交換器が取り付けられた容器を使用することにより達成することができる。最後の成分の添加に続いて、混合物を約５０°Ｆ〜約２１２°Ｆの温度まで加熱する。この範囲の外側の温度も許容可能であるが、他の加工助剤を使用しないと商業的に非実用的となる可能性がある。適切な温度まで加熱すると、該材料は一般に濃厚液の形態となる。濃厚液を缶に充填する。蓋をして、容器を気密封止する。次いで、封止された缶を、内容物を滅菌するように設計された従来の機器に入れる。これは、通常、約２３０°Ｆ超の温度まで、適切な時間（使用する温度及び組成物によって異なる。）加熱することにより達成される。
【００４１】
ウェットフードについては、非複製性プロバイオティクス微生物は、担体、例えば、アルコール組成物（すなわち、プロピレングリコール又はジプロピレングリコール）、シクロデキストリン、マルトデキストリン又はデンプンと共にウェットフード組成物に含ませることができる。あるいは、非複製性プロバイオティクス微生物は、ウェットフード組成物の形成前に乾燥材料に混合することができる。
【００４２】
本発明のトリートは、ドライフードに関連して上記したものと同様の押出又はベーキングプロセスにより調製することができる。他のプロセスを使用して、香料組成物を既存の形態のトリートの外側にコーティングするか、又は香料組成物を既存の形態のトリートに注入することもできる。
【００４３】
本発明の動物用玩具は、一般に、非複製性プロバイオティクス微生物が混ぜ込まれた香料組成物で任意の既存の玩具をコーティングすることにより調製する。
【００４４】
本発明のペットフード組成物中の非複製性プロバイオティクス微生物の量は、１食当たり約１０６〜１０１２ｃｆｕ相当とすることができる。
【００４５】
当然、非複製性微生物はコロニーを形成せず、したがって、この用語は、１０４及び１０１２ｃｆｕ／ｇ複製性細菌から得られる非複製性微生物の量として理解される。この量は、不活性化されている微生物、生存不能若しくは死んでいる微生物、又は例えばＤＮＡ、若しくは細胞壁若しくは細胞質の化合物等の断片として存在している微生物を含む。換言すると、組成物が含有する微生物の量は、例えば、不活性化されている若しくは死んでいる、断片化されている、又はこれらの状態のいずれか若しくはすべての混合状態である等、実際に非複製性であるかどうかにかかわらず、すべての微生物が生きているかのように考えて、その量の微生物のコロニー形成能（ｃｆｕ）で表す。
【００４６】
本発明のペットフード組成物はプレバイオティクスを含んでもよい。
【００４７】
「プレバイオティクス」とは、腸内のプロバイオティクスの増殖を促進する食品物質を意味する。プレバイオティクスは、胃及び／又は腸上部で分解されないか、あるいはそれらプレバイオティクスを摂取した人の胃腸管で吸収されないが、胃腸微生物叢及び／又はプロバイオティクスにより発酵する。プレバイオティクスは、例えば、Ｇｌｅｎｎ  Ｒ．Ｇｉｂｓｏｎ及びＭａｒｃｅｌ  Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ，Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９５  １２５：１４０１〜１４１２により定義されている。
【００４８】
本発明に従って使用可能なプレバイオティクスは特に限定されておらず、腸内のプロバイオティクスの増殖を促進するすべての食品物質が挙げられる。プレバイオティクスは、場合によりフルクトース、ガラクトース、マンノースを含有するオリゴ糖；食物繊維、特に可溶性繊維、ダイズ繊維；イヌリン；又はそれらの混合物からなる群から選択できることが好ましい。好ましいプレバイオティクスは、フラクト−オリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクト−オリゴ糖（ＩＯＳ）、イソマルト−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖、ダイズのオリゴ糖、グリコシルスクロース（ＧＳ）、ラクトスクロース（ＬＳ）、ラクツロース（ＬＡ）、パラチノース−オリゴ糖（ＰＡＯ）、マルト−オリゴ糖（ＭＯＳ）、ガム及び／又はそれらの加水分解物、ペクチン及び／又はそれらの加水分解物である。
【００４９】
プレバイオティクスの典型例はオリゴフルクトース及びイヌリンである。
【００５０】
本発明のペットフード組成物中のプレバイオティクスの量は、乳酸菌の発育を促進するそれらの能力によって異なる。一般論として、本発明の組成物は、（乾物含量に対して重量基準で）０．１〜２０％のそのようなプレバイオティクスを含有し得る。
【００５１】
本発明のペットフード組成物は、例えば、プレバイオティクス１ｇ当たり少なくとも１０３ｃｆｕ、好ましくは１０４〜１０７ｃｆｕ／ｇプレバイオティクスの量に相当する量の非複製性プロバイオティクスを含み得る。
【００５２】
本発明者らは、驚くべきことに、例えば、追加免疫作用の観点から及び／又は抗炎症作用の観点から、非複製性プロバイオティクス微生物が複製性プロバイオティクス微生物より効果的であり得ることを見出した。
【００５３】
プロバイオティクスは、「十分な量で投与されると健康上の利益を宿主に付与する生きた微生物」（ＦＡＯ／ＷＨＯガイドライン）として定義されることが多いので、これは驚くべきことである。公表されている文献の圧倒的多数は、生きたプロバイオティクスを扱っている。さらに、複数の研究は、非複製性細菌により付与される健康上の利益を調査しており、それらの研究の大部分は、例えば、熱処理によるプロバイオティクスの不活性化が、主張されているプロバイオティクスの健康上の利益の低下につながることを示していた（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ｄ．ら，２００４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２６：５２０〜５２８；Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏら，２００５，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１９７〜２０４；Ｇｉｌｌ，Ｈ．Ｓ．及びＫ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ，２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８６：２８５〜２８９；Ｋａｉｌａ，Ｍ．ら，１９９５，Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ  ７２：５１〜５３）。一部の研究は、死滅したプロバイオティクスが、一部の健康作用を保持し得ることを示していた（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ｄ．ら，２００４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２６：５２０〜５２８；Ｇｉｌｌ，Ｈ．Ｓ．及びＫ．Ｊ．Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ，２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８６：２８５〜２８９）が、明らかに、当技術分野において、今までのところ、生きたプロバイオティクスのほうが能力が高いと見なされていた。
【００５４】
「非複製性」プロバイオティクス微生物としては、熱処理されたプロバイオティクス細菌が挙げられる。「非複製性」プロバイオティクス微生物としては、不活性化された微生物、死んだ微生物、生存不能な微生物、並びに／又は、例えば、ＤＮＡ、代謝産物、細胞質の化合物及び／若しくは細胞壁材料等の断片として存在している微生物が挙げられる。
【００５５】
「非複製性」とは、生存可能な細胞及び／又はコロニー形成単位を古典的な平板分離法により検出できないことを意味する。そのような古典的な平板分離法は、微生物学の本：Ｊａｍｅｓ  Ｍｏｎｒｏｅ  Ｊａｙ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｅｎ，２００５，Ｍｏｄｅｒｎ  ｆｏｏｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第７版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．７９０頁にまとめられている。一般に、生存可能な細胞の不存在は、以下の通り示すことができる：様々な濃度の細菌調製物（「非複製性」試料）の接種及び適切な条件（好気性及び／又は嫌気性雰囲気で少なくとも２４時間）下でのインキュベーション後に、寒天プレートに可視コロニーが存在していないか、又は液体増殖培地において混濁度が増大していない。
【００５６】
本発明の目的のためのプロバイオティクスは、「宿主の健康又は福祉に対して有益な作用を有する微生物細胞調製物又は微生物細胞の構成要素」として定義する（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ．，Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．，Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．ら，Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９：１０  １０７〜１０）。
【００５７】
本発明の組成物は、少なくとも部分的に健康上の利益をもたらすのに十分な量でプロバイオティクス微生物及び／又は非複製性プロバイオティクス微生物を含み得る。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」として定義する。この目的のために効果的な量は、当業者に知られている多数の要因、例えば、個体の重量及び全身の健康状態、並びに食品基材の作用によって異なり得る。
【００５８】
予防的適用において、本発明の組成物は、ある障害に罹患しやすいか、罹患する危険性がある個体に、その障害を発症する危険性を少なくとも部分的に低減させるのに十分な量で投与する。そのような量は、「予防有効量」と定義する。やはり、正確な量は、多数の要因、例えば、個体の健康状態及び重量、並びに食品基材の作用によって異なる。
【００５９】
当業者は、治療有効量及び／又は予防有効量を適切に調整することができる。
【００６０】
一般に、本発明の組成物は、非複製性プロバイオティクス微生物を治療有効量及び／又は予防有効量で含有する。
【００６１】
例えば、治療有効量及び／又は予防有効量は、１日量当たり約０．００５ｍｇ〜１０００ｍｇの非複製性プロバイオティクス微生物とすることができる。
【００６２】
非複製性微生物は、乾燥した組成物１グラム当たり１０４〜１０９ｃｆｕに相当する量で、さらにより好ましくは、乾燥した組成物１グラム当たり１０５〜１０９ｃｆｕに相当する量で存在し得る。
【００６３】
プロバイオティクスは、当技術分野において知られている任意の方法により非複製性にすることができる。
【００６４】
プロバイオティクス菌株を非複製性にするのに今日利用可能な技術は、通常、熱処理、γ線照射、ＵＶ光、又は化学物質（ホルマリン、パラホルムアルデヒド）の使用である。
【００６５】
数量の観点から、例えば、「短時間高温」処理された非複製性微生物は、乾燥した組成物１グラム当たり１０４〜１０１２ｃｆｕ当量に相当する量で組成物中に存在し得る。
【００６６】
プロバイオティクスを非複製性にするために、食品産業における工業的環境下で相対的に適用し易い技術を使用することが好ましい。
【００６７】
今日市場に出回っているプロバイオティクスを含有する製品の大部分は、それらの製造の間に熱処理されている。それ故、製造された製品と共に又は少なくとも同様の方法で、プロバイオティクスを熱処理でき、それと同時に、プロバイオティクスがそれらの有益な特性を保持若しくは改善するか、又は個体にとって新しい有益な特性をさらに得られると、好都合である。
【００６８】
しかし、熱処理によるプロバイオティクス微生物の不活性化は、文字通り、一般に、少なくとも部分的なプロバイオティクス活性の低下を伴う。
【００６９】
今や、本発明者らは、驚くべきことに、プロバイオティクス微生物を、例えば熱処理により非複製性にすることが、結果としてプロバイオティクスの健康上の利益の低下につながらず、反対に、既存の健康上の利益を強化し、さらには、新しい健康上の利益を生み出すことができることを見出した。
【００７０】
それ故、本発明の一実施形態は、非複製性プロバイオティクス微生物が熱処理により非複製性にされたペットフード組成物である。
【００７１】
そのような熱処理は、少なくとも７１．５℃で少なくとも１秒実施することができる。
【００７２】
長時間の熱処理又は短時間の熱処理を使用することができる。
【００７３】
今日、工業規模において、通常、短時間熱処理（例えばＵＨＴ様熱処理）が好ましい。この種の熱処理により、細菌負荷が低減し、加工時間が低減し、それにより栄養素の損傷が低減する。
【００７４】
本発明者らは、初めて、高温で短時間熱処理されたプロバイオティクス微生物が、それらの最初の特性に関係なく抗炎症性免疫プロファイルを示すことを証明する。特に、この熱処理により、新しい抗炎症性プロファイルが生じるか、又は既存の抗炎症性プロファイルが強化される。
【００７５】
したがって、今や、生きた対応物が抗炎症性菌株ではなくても、一般的な工業的に適用可能な熱処理に対応する特定の熱処理パラメーターを使用することにより、抗炎症性プロファイルを有する非複製性プロバイオティクス微生物を生成することが可能である。
【００７６】
それ故、例えば、熱処理は、約７１．５〜１５０℃、約１〜１２０秒の高温処理とすることができる。高温処理は、高温／短時間（ＨＴＳＴ）処理又は超高温（ＵＨＴ）処理とすることができる。
【００７７】
プロバイオティクス微生物は、約７１．５〜１５０℃、約１〜１２０秒の短時間の高温処理に付すことができる。
【００７８】
より好ましくは、微生物は、約９０〜１４０℃（例えば９０〜１２０℃）、約１〜３０秒の短時間の高温処理に付すことができる。
【００７９】
この高温処理により、微生物は少なくとも部分的に非複製性となる。
【００８０】
高温処理は、通常の大気圧で実施することができるが、高圧下で実施することもできる。一般的な圧力範囲は、１〜５０バール、好ましくは１〜１０バール、さらにより好ましくは２〜５バールである。当然、熱を適用する場合、プロバイオティクスを液体又は固形の媒体中で熱処理することが好ましい。したがって、適用する理想的な圧力は、微生物が供給される組成物の特性及び使用する温度によって異なる。
【００８１】
高温処理は、約７１．５〜１５０℃、好ましくは約９０〜１２０℃、さらにより好ましくは約１２０〜１４０℃で実施することができる。
【００８２】
高温処理は、約１〜１２０秒、好ましくは約１〜３０秒、さらにより好ましくは約５〜１５秒の短時間実施することができる。
【００８３】
この所与の時間枠は、プロバイオティクス微生物が所与の温度に曝露される時間を指す。微生物が供給される組成物の特性及び量に応じて、並びに使用する加熱装置の構成に応じて、加熱時間が異なり得ることに留意されたい。
【００８４】
しかし、一般に、本発明の組成物及び／又は微生物は、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理、瞬間低温殺菌又は超高温（ＵＨＴ）処理により処理する。
【００８５】
ＵＨＴ処理は、短時間、約１〜１０秒、乳中の細菌胞子を死滅させるのに必要とされる温度である１３５℃（２７５°Ｆ）を上回る温度で加熱することにより、組成物が少なくとも部分的に滅菌されることを伴う超高温加工又は超高温処理（いずれもＵＨＴと略される）である。例えば、１３５℃を上回る温度を使用してこの方法で乳を加工することにより、必要な滞留時間（２〜５秒）で細菌負荷の低下が可能となり、連続流れ操作が可能となる。
【００８６】
２つの主要なタイプのＵＨＴシステム：直接及び間接システムが存在する。直接システムにおいて、製品は、スチームインジェクション又はスチームインフュージョンにより処理され、一方、間接システムにおいて、製品は、平板熱交換器、多管型熱交換器又はかき取り表面熱交換器を使用して熱処理される。ＵＨＴシステムの組み合わせは、製品調製プロセスの任意のステップ又は複数のステップで適用することができる。
【００８７】
ＨＴＳＴ処理は、以下の通り定義する（高温／短時間）：乳中の生存可能な微生物の数の９９．９９９９％を死滅させる、５対数減少を達成するように設計された低温殺菌法。ＨＴＳＴ処理は、ほとんどすべての酵母菌、カビ及び一般の腐敗細菌を破壊し、さらには一般の病原性の耐熱性菌を確実に破壊するのに十分であると見なされる。ＨＴＳＴプロセスにおいて、乳を７１．７℃（１６１°Ｆ）まで１５〜２０秒加熱する。
【００８８】
瞬間低温殺菌は、果実及び野菜ジュース、ビール並びに乳製品の様な腐敗し易い飲料の熱低温殺菌の方法である。瞬間低温殺菌は、腐敗微生物を死滅させるために容器への充填の前に実施して、製品をより安全にし、それらの貯蔵寿命を延長する。液体は、７１．５℃（１６０°Ｆ）〜７４℃（１６５°Ｆ）の温度に約１５〜３０秒曝露される間、制御された連続流れで移動する。
【００８９】
本発明の目的のために、「短時間高温処理」という用語は、例えば、高温短時間（ＨＴＳＴ）処理、ＵＨＴ処理、及び瞬間低温殺菌を含む。
【００９０】
そのような熱処理により、改善された抗炎症性プロファイルを有する非複製性プロバイオティクスが提供されるので、本発明の組成物は、炎症性障害の予防又は治療のためのものとすることができる。
【００９１】
本発明の組成物により治療又は予防することができる炎症性障害は、特に限定されていない。例えば、それら炎症性障害は、急性炎症、例えば敗血症；熱傷；及び慢性炎症、例えば炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸嚢炎）；壊死性腸炎；皮膚炎、例えば、ＵＶ又は化学物質誘発性の皮膚炎、湿疹、反応性皮膚；過敏性腸症候群；眼の炎症；アレルギー、喘息；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【００９２】
長時間熱処理を使用してプロバイオティクス微生物を非複製性にする場合、そのような熱処理は、約７０〜１５０℃で約３分〜２時間、好ましくは８０〜１４０℃で５分〜４０分実施することができる。
【００９３】
先行技術は、一般に、長時間の熱処理により非複製性にされた細菌が、それらのプロバイオティクス特性を発揮する観点から、通常、生菌体ほど効率的ではないことを教示しているが、本発明者らは、長時間熱処理されたプロバイオティクスが、それらの生きた対応物と比較して免疫系の刺激において優れていることを証明することができた。
【００９４】
本発明は、少なくとも約７０℃、少なくとも約３分の熱処理により非複製性にされたプロバイオティクス微生物を含む組成物にも関する。
【００９５】
非複製性プロバイオティクスの追加免疫作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫プロファイルにより確認した。使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカインのプロファイルを使用するものであり、免疫調節性化合物の試験用の標準的モデルとして当技術分野において広く認められている（Ｓｃｈｕｌｔｚら，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７０，  １６５〜１７３；Ｔａｙｌｏｒら，２００６，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，３６，  １２２７〜１２３５；Ｋｅｋｋｏｎｅｎら，２００８，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４，  １１９２〜１２０３）。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＢＭＣアッセイは、複数の著者／研究チームにより、例えば、プロバイオティクスをそれらの免疫プロファイル（すなわち、それらの抗炎症性又は炎症誘発性の特徴）に応じて分類するために使用されてきた（Ｋｅｋｋｏｎｅｎら，２００８，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４，  １１９２〜１２０３）。例えば、このアッセイは、腸大腸炎のマウスモデルにおけるプロバイオティクス候補の抗炎症作用の予測を可能にすることが示されてきた（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら，２００７，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。さらに、このアッセイは、通常、臨床試験において情報を読み出すだめに使用されており、臨床転帰と一致した結果をもたらすことが示された（Ｓｃｈｕｌｔｚら，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７０，  １６５〜１７３；Ｔａｙｌｏｒら，２００６，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，３６，  １２２７〜１２３５）。
【００９７】
アレルギー性疾患は、過去数十年の間に着実に増加してきており、現在、ＷＨＯにより流行病であると見なされている。一般的には、アレルギーは、免疫系のＴｈ１応答及びＴｈ２応答間の平衡異常から生じ、Ｔｈ２メディエーターの産生に対する強いバイアスをもたらすと見なされている。したがって、アレルギーは、免疫系のＴｈ１群及びＴｈ２群間の適切な平衡を回復させることにより緩和、下方制御又は予防することができる。このことは、Ｔｈ２応答を低減させるか、又は少なくとも一時的にＴｈ１応答を強化する必要性を暗示している。後者は、例えば、より高いレベルのＩＦＮγ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２を伴うことが多い追加免疫応答の特徴となる可能性がある（Ｋｅｋｋｏｎｅｎら，２００８，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４，  １１９２〜１２０３；Ｖｉｌｊａｎｅｎ  Ｍ．ら，２００５，Ａｌｌｅｒｇｙ，６０，  ４９４〜５００）。
【００９８】
それ故、本発明のペットフード組成物は、免疫防御不全に関連する障害の治療又は予防を可能にする。
【００９９】
したがって、本発明の組成物により治療又は予防可能な免疫防御不全関連障害は特に限定されるものではない。
【０１００】
例えば、それらの障害は、感染、特に細菌、ウイルス、真菌及び／又は寄生虫感染；食細胞欠損；低いレベルから厳しいレベルの免疫抑制、例えば、ストレス又は免疫抑制薬、化学療法若しくは放射線療法により誘発されるもの；免疫能が低い免疫系の自然な状態、例えば新生児の状態；アレルギー；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【０１０１】
本発明に記載されているペットフード組成物により、また、動物のワクチン、特に経口ワクチンに対する応答を強化することが可能となる。
【０１０２】
任意の量の非複製性微生物が効果的となる。しかし、一般に、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的にはすべてのプロバイオティクスが非複製性であることが好ましい。
【０１０３】
本発明の一実施形態において、すべての微生物は非複製性である。
【０１０４】
したがって、本発明の組成物において、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には少なくとも９９．９％、最も理想的にはすべてのプロバイオティクスが非複製性であってもよい。
【０１０５】
本発明の目的のために、すべてのプロバイオティクス微生物を使用することができる。
【０１０６】
例えば、プロバイオティクス微生物は、ビフィズス菌、乳酸菌、プロピオン酸菌又はそれらの組み合わせ（例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・フェルメントゥム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・テルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び／又はそれらの混合物）からなる群から選択することができる。
【０１０７】
本発明の組成物は、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０、ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）、エシェリヒア・コリ・ニッスル（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）、ラクトバチルス・ブルガリクスＮＣＣ１５、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるプロバイオティクス微生物を含むことができる。
【０１０８】
すべてのこれらの菌株は、ブダペスト条約に基づいて寄託及び／又は市販されている。
【０１０９】
ブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株は下記の通りである。
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１：  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５：  ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８
ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０：  ＣＮＣＭ  Ｉ−３８６５
ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８：  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６
ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１：  ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６
ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７：  ＣＧＭＣＣ１．３７２４
ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０１９：  ＣＮＣＭ  Ｉ−１４２２
ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０５９：  ＣＮＣＭ  Ｉ−４１５３
ラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７：  ＣＮＣＭ  Ｉ−４１５４
ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６：  ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１８
ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ１８２５：  ＡＣＡ−ＤＣ６００２
ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９：  ＡＴＣＣ７００３９６
ラクトバチルス・ブルガリクスＮＣＣ１５：  ＣＮＣＭ  Ｉ−１１９８
ラクトバチルス・ジョンソニイＬａ１：  ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９８３：  ＤＳＭ１７９８３
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０：  ＡＴＣＣ５５７３０
エシェリヒア・コリ・ニッスル１９１７：  ＤＳＭ６６０１
【０１１０】
ＡＴＣＣと命名されている菌株は、ＡＴＣＣ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０，ＵＳＡに寄託されたものである。
【０１１１】
ＣＮＣＭと命名されている菌株は、ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ  ＤＥ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ  ＤＥ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＥＳ（ＣＮＣＭ），２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託された菌株である。
【０１１２】
ＣＧＭＣＣと命名されている菌株は、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ２７１４，Ｂｅｉｊｉｎｇ  １０００８０，Ｃｈｉｎａに寄託された菌株である。
【０１１３】
ＡＣＡ−ＤＣと命名されている菌株は、Ｇｒｅｅｋ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｄａｉｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｔｈｅｎｓ，７５，Ｉｅｒａ  ｏｄｏｓ，Ｂｏｔａｎｉｋｏｓ，Ａｔｈｅｎｓ，１１８５５，Ｇｒｅｅｃｅに寄託された菌株である。
【０１１４】
ＤＳＭと命名されている菌株は、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７  Ｂ＾，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＧＥＲＭＡＮＹに寄託された菌株である。
【０１１５】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特色のすべてを、開示している本発明の範囲から逸脱することなく自由に組み合わせることができることを理解されたい。
【０１１６】
本発明のさらなる利点及び特色は、以下の実施例及び図面から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】「短時間高温」で処理されたプロバイオティクスの抗炎症性免疫プロファイルの強化を示す図である。
【図１Ｂ】「短時間高温」で処理されたプロバイオティクスの抗炎症性免疫プロファイルの強化を示す図である。
【図２】「短時間高温」で処理された後に抗炎症性となった（すなわち、明白な抗炎症性免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す）非抗炎症性プロバイオティクス菌株を示す図である。
【図３Ａ】「短時間高温」で処理された後に強化された又は新しい抗炎症性免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す、市販の製品中で使用されているプロバイオティクス菌株を示す図である。
【図３Ｂ】「短時間高温」で処理された後に強化された又は新しい抗炎症性免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す、市販の製品中で使用されているプロバイオティクス菌株を示す図である。
【図４Ａ】高温で熱処理されると強化された又は新しい抗炎症性免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す乳製品スターター菌株（Ｌｃ１スターター菌株）を示す図である。
【図４Ｂ】高温で熱処理されると強化された又は新しい抗炎症性免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す乳製品スターター菌株（Ｌｃ１スターター菌株）を示す図である。
【図５】ＨＴＳＴ処理で処理された後に抗炎症性免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す非抗炎症性プロバイオティクス菌株を示す図である。
【図６】生きた形態及び熱処理形態（１４０℃、１５秒）のプロバイオティクス及び乳製品スターター菌株を用いて生成したＰＢＭＣデータ（ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０）の主成分分析を示す図である。各点は、そのＮＣＣ番号又は名称により識別される、生きた又は熱処理された１つの菌株を表す。
【図７】生菌体及び熱処理菌体（８５℃、２０分）のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比を示す図である。全体として、本発明の「短時間高温」処理（図１、２、３、４及び５）とは対照的に、８５℃、２０分の熱処理により、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比の増大が生じている。
【図８】熱処理菌体を用いて刺激したヒトＰＢＭＣからのｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカイン分泌の強化を示す図である。
【図９】生理的食塩水に曝露されたＯＶＡ感作マウス（陰性対照）、ＯＶＡに曝露されたＯＶＡ感作マウス（陽性対照）、及びＯＶＡに曝露され、熱処理された又は生きたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０で処理されたＯＶＡ感作マウスにおいて観察された下痢強度（％）を示す図である。結果は、下痢強度１００％が、陽性対照（感作され、アレルゲンに曝露された）群において発現した症状に対応するものとして、４つの独立した実験から算出された平均±ＳＥＭで示している。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：
方法：
細菌調製物：
生きたプロバイオティクスにより宿主免疫系に対してもたらされる健康上の利益は、一般に、菌株特異的であると見なされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高レベルのＩＬ−１０を誘発する、及び／又は低レベルの炎症誘発性サイトカインを誘発する（ＰＢＭＣアッセイ）プロバイオティクスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗炎症性菌株であることが示されてきた（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら，２００７，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。
【０１１９】
複数のプロバイオティクス菌株を使用して、熱処理されたプロバイオティクスの抗炎症特性を調査した。これらのプロバイオティクスは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ３００１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＮＣＣ２８１８、ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ４００７、ラクトバチルス・カゼイＮＣＣ４００６、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＣ３００９、ラクトバチルス・カゼイＡＣＡ−ＤＣ６００２（ＮＣＣ１８２５）及びエシェリヒア・コリ・ニッスルであった。Ｎｅｓｔｌｅ  Ｌｃ１発酵製品の製造に商業的に使用されているいくつかの菌株を含む複数のスターター培養株も試験した：ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０１９、ストレプトコッカス・テルモフィルスＮＣＣ２０５９、ラクトバチルス・ブルガリクスＮＣＣ１５及びラクトコッカス・ラクティスＮＣＣ２２８７。
【０１２０】
菌体は、各菌株について最適化した条件下、５〜１５Ｌのバイオリアクターにおいて培養した。すべての一般的な細菌増殖培地が使用可能である。そのような培地は、当業者に知られている。ｐＨが５．５に調整されたとき、３０％の塩基溶液（ＮａＯＨ又はＣａ（ＯＨ）２のいずれか）を連続的に添加した。適切であれば、ヘッドスペースにＣＯ２を供給することにより嫌気性条件を維持した。Ｅ．コリを標準的な好気性条件下で培養した。
【０１２１】
菌体を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃）により回収し、約１０９〜１０１０ｃｆｕ／ｍｌという最終濃度に達するのに十分な量で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。調製物の一部は、１５％のグリセロールと共に−８０℃で冷凍した。菌体の別の部分は、
超高温：１４０℃、１５秒；間接スチームインジェクション
高温短時間（ＨＴＳＴ）：７４℃、９０℃及び１２０℃、１５秒の間接スチームインジェクション
水浴中で長時間低温（８５℃、２０分）
により熱処理した。
【０１２２】
試料は、熱処理後、使用するまで−８０℃で冷凍保存した。
【０１２３】
細菌調製物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫プロファイル：
生菌体調製物及び熱処理菌体調製物の免疫プロファイル（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト血球からの特定のサイトカインの分泌を誘発する能力）を評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離後、単核細胞を回収し、ハンクスの平衡塩類溶液を用いて２回洗浄した。次いで、１０％のウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％のゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ，Ｓｉｇｍａ）に細胞を再懸濁させた。次いで、４８ウェルプレートにおいて３６時間、ＰＢＭＣ（７×１０５細胞／ウェル）を生菌体及び熱処理菌体（当量７×１０６ｃｆｕ／ウェル）と共にインキュベートした。生菌体及び熱処理菌体の作用を、２つの別個の実験に分けた８人の個々のドナーからのＰＢＭＣで試験した。３６時間のインキュベーション後、培養プレートを冷凍し、サイトカイン測定まで−２０℃で保存した。サイトカインプロファイルは、生菌体及びその熱処理対応物について並行に（すなわち、ＰＢＭＣでの同じバッチの同じ実験において）実施した。
【０１２４】
３６時間のインキュベーション後の細胞培養上澄み中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）のレベルは、製造業者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１２ｐ４０，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦα，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ）により求めた。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αは、炎症誘発性サイトカインであり、一方、ＩＬ−１０は、強力な抗炎症性メディエーターである。結果は、４人の個々のドナーの平均（ｐｇ／ｍｌ）＋／−ＳＥＭとして表し、それぞれ４人のドナーを用いて実施した２つの個々の実験を代表するものである。ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗炎症作用の予測値として各菌株について算出する（Ｆｏｌｉｇｎｅ，Ｂ．ら，２００７，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：２３６〜２４３）。
【０１２５】
各菌株についてＥＬＩＳＡにより求めた（上を参照されたい）サイトカイン数値（ｐｇ／ｍｌ）をＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ  ｖ５．１０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ，Ｓｉｎｔ−Ｍａｒｔｅｎｓ−Ｌａｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移した。このセットのデータの主成分分析（ＰＣＡ、ディメンショニング技術）を実施した。各指標の平均値の減算及び各指標の偏差による除算をこの分析に含めた。
【０１２６】
結果：
超高温（ＵＨＴ）／高温短時間（ＨＴＳＴ）様処理により生じた抗炎症性プロファイル：
調査中のプロバイオティクス菌株を、一連の熱処理（超高温（ＵＨＴ）、高温短時間（ＨＴＳＴ）及び８５℃、２０分）に曝露し、処理菌株の免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生菌体の免疫プロファイルと比較した。生きた微生物（プロバイオティクス及び／又は乳製品スターター培養物）は、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートすると様々なレベルのサイトカイン産生を誘発した（図１、２、３、４及び５）。これらの微生物の熱処理により、ＰＢＭＣにより産生されるサイトカインのレベルが温度依存的に変更された。「短時間高温」処理（１２０℃又は１４０℃、１５秒）により、抗炎症性免疫プロファイルを有する非複製性細菌が生じた（図１、２、３及び４）。実際に、ＵＨＴ様処理をした菌株（１４０℃、１５秒）は、ＩＬ−１０産生を維持するか、又はさらなるＩＬ−１０産生を誘発する一方、誘発した炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０）が（生きた対応物と比較して）少なかった。得られたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、任意のＵＨＴ様処理をした菌株について、生菌体と比較して低かった（図１、２、３及び４）。この観測は、ＨＴＳＴ様処理により処置した、すなわち、１２０℃に１５秒（図１、２、３及び４）、又は７４℃及び９０℃に１５秒（図５）曝露した菌体についても妥当であった。熱処理（ＵＨＴ様又はＨＴＳＴ様処理）は、プロバイオティクス菌株（図１、２、３及び５）及び乳製品スターター培養物（図４）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫プロファイルに対して同様の作用を有していた。生きた及び熱処理された（１４０℃、１５秒）プロバイオティクス及び乳製品スターター菌株を用いて生成したＰＢＭＣデータの主成分分析により、生菌株はすべてｘ軸に沿って広がっていることが明らかになった。これは、菌株によって、炎症誘発性サイトカインを誘発する量が少ないもの（左側）から多いもの（右側）まで非常に異なる免疫プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示すことを示している。熱処理菌株群はグラフの左側に存在しており、熱処理菌株により誘発された炎症誘発性サイトカインがずっと少なかったことを示している（図６）。対照的に、８５℃で２０分熱処理された菌体は、生菌体より多い炎症誘発性サイトカイン及び少ないＩＬ−１０を誘発し、その結果、ＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比が高くなった（図７）。
【０１２７】
抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様処理により強化されるか、又は生じる。
【０１２８】
ＵＨＴ及びＨＴＳＴ処理された菌株は、それらのそれぞれの最初の免疫プロファイル（生菌体）に関係なく抗炎症性プロファイルを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏで抗炎症性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗炎症性プロファイルを示すことが知られているプロバイオティクス菌株（Ｂ．ロンガムＮＣＣ３００１、Ｂ．ロンガムＮＣＣ２７０５、Ｂ．ブレーベＮＣＣ２９５０、Ｂ．ラクティスＮＣＣ２８１８）は、「短時間高温」処理後に強化された抗炎症性プロファイルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示すことが示された。図１に示している通り、ＵＨＴ様処理をしたビフィドバクテリウム菌株のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、生きた対応物のＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比より低く、したがって、ＵＨＴ様処理をした試料の改善された抗炎症性プロファイルを示していた。より顕著なことに、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様処理により抗炎症性プロファイルが生じたことは、非抗炎症性の生菌株についても確認された。生きたＬ．ラムノサスＮＣＣ４００７及びＬ．パラカゼイＮＣＣ２４６１は、いずれも、高いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比をｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す（図２及び５）。２種の生菌株は、マウスにおけるＴＮＢＳ誘発性の大腸炎に対して保護作用を示さないことが示された。Ｌ．ラムノサスＮＣＣ４００７及びＬ．パラカゼイＮＣＣ２４６１により誘発されたＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、「短時間高温」処理（ＵＨＴ又はＨＴＳＴ）後に劇的に低減し、ビフィドバクテリウム菌株を用いて得られたレベルと同程度の低いレベルに達した。これらの低いＩＬ−１２ｐ４０／ＩＬ−１０比は、ＩＬ−１０分泌の変化無し（Ｌ．ラムノサスＮＣＣ４００７）又は劇的な誘発（Ｌ．パラカゼイＮＣＣ２４６１）（図２）と合わせて、低レベルのＩＬ−１２ｐ４０産生が原因である。
【０１２９】
結論：
−  生きた微生物の抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様熱処理により強化することができる（例えば、Ｂ．ロンガムＮＣＣ２７０５、Ｂ．ロンガムＮＣＣ３００１、Ｂ．ブレーベＮＣＣ２９５０、Ｂ．ラクティスＮＣＣ２８１８）。
−  抗炎症性プロファイルは、ＵＨＴ様及びＨＴＳＴ様熱処理により非抗炎症性の生きた微生物（例えば、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ４００７、Ｌ．パラカゼイＮＣＣ２４６１、乳製品スターターＳ．テルモフィルスＮＣＣ２０１９）から生じさせることができる。
−  抗炎症性プロファイルは、プロバイオティクスＥ．コリ菌株を含む市販の製品から単離された菌株についても証明された（図３Ａ＆Ｂ）。
【０１３０】
ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理の影響は、すべての試験したプロバイオティクス及び乳製品スターター、例えば、乳酸菌、ビフィズス菌及び連鎖球菌について同様であった。
【０１３１】
ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理を、異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫プロファイルを示す複数の乳酸菌、ビフィズス菌及び連鎖球菌に適用した。すべての菌株は、ＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理後に誘発した炎症誘発性サイトカインがそれらの生きた対応物より少なく（図１、２、３、４、５及び６）、得られた非複製性細菌の免疫特性に対するＵＨＴ／ＨＴＳＴ様処理の作用が、すべてのプロバイオティクス、特に乳酸菌及びビフィズス菌及び特定のＥ．コリ菌株、並びにすべての乳製品スターター培養物、特に連鎖球菌、ラクトコッカス及び乳酸菌に一般化できることを証明している。
【０１３２】
実施例２：
方法：
細菌調製物：
５種のプロバイオティクス菌株を使用して、非複製性プロバイオティクス：３種のビフィズス菌（Ｂ．ロンガムＮＣＣ３００１、Ｂ．ラクティスＮＣＣ２８１８、Ｂ．ブレーベＮＣＣ２９５０）及び２種の乳酸菌（Ｌ．パラカゼイＮＣＣ２４６１、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ４００７）の追加免疫特性を調査した。
【０１３３】
菌体を、３７℃で１６〜１８時間、ＭＲＳでｐＨを制御することなく、回分発酵で増殖させた。菌体を沈降（５，０００×ｇ、４℃）させ、約１０Ｅ１０ｃｆｕ／ｍｌという最終濃度に達するように生理的食塩水で希釈する前にリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。Ｂ．ロンガムＮＣＣ３００１、Ｂ．ラクティスＮＣＣ２８１８、Ｌ．パラカゼイＮＣＣ２４６１、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ４００７は、水浴中、８５℃で２０分熱処理した。Ｂ．ブレーベＮＣＣ２９５０は、水浴中、９０℃で３０分熱処理した。熱処理菌体懸濁液をアリコートし、使用するまで−８０℃で冷凍保存した。生菌体は、使用するまでＰＢＳ−グリセロール１５％中、−８０℃で貯蔵した。
【０１３４】
細菌調製物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫プロファイル：
生菌体調製物及び熱処理菌体調製物の免疫プロファイル（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト血球からの特定のサイトカインの分泌を誘発する能力）を評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液フィルターから単離した。細胞密度勾配による分離後、単核細胞を回収し、ハンクスの平衡塩類溶液を用いて２回洗浄した。次いで、１０％のウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％のゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ，Ｓｉｇｍａ）に細胞を再懸濁させた。次いで、４８ウェルプレートにおいて３６時間、ＰＢＭＣ（７×１０５細胞／ウェル）を生菌体及び熱処理菌体（当量７×１０６ｃｆｕ／ウェル）と共にインキュベートした。生菌体及び熱処理菌体の作用を、２つの別個の実験に分けた８人の個々のドナーからのＰＢＭＣで試験した。３６時間のインキュベーション後、培養プレートを冷凍し、サイトカイン測定まで−２０℃で保存した。サイトカインプロファイルは、生菌体及びその熱処理対応物について並行に（すなわち、ＰＢＭＣでの同じバッチの同じ実験において）実施した。
【０１３５】
３６時間のインキュベーション後の細胞培養上澄み中のサイトカイン（ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０）のレベルは、製造業者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ１２ｐ４０，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ヒトＴＮＦ，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  ヒトＩＦＮ−γ）により求めた。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αは、炎症誘発性サイトカインであり、一方、ＩＬ−１０は、強力な抗炎症性メディエーターである。結果は、４人の個々のドナーの平均（ｐｇ／ｍｌ）＋／−ＳＥＭとして表し、それぞれ４人のドナーを用いて実施した２つの個々の実験を代表するものである。
【０１３６】
アレルギー性下痢の予防における生きた及び熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０のｉｎ  ｖｉｖｏ作用：
アレルギー性下痢のマウスモデルを使用して、Ｂ．ブレーベＮＣＣ２９５０のＴｈ１促進作用を試験した（Ｂｒａｎｄｔ  Ｅ．Ｂら，ＪＣＩ  ２００３，  １１２（１１）：１６６６〜１６６７）。感作（１４日の間隔；０及び１４日目でのオボアルブミン（ＯＶＡ）及び硫酸カリウムアルミニウムの２回の腹腔内注射）後の雄のＢａｌｂ／ｃマウスに、ＯＶＡを６回（２７、２９、３２、３４、３６、３９日目）経口で曝露すると、一過性の臨床症状（下痢）及び免疫パラメーターの変化（総ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、マウス肥満細胞プロテアーゼ１（ＭＭＣＰ−１）の血漿中濃度）が生じた。生きた又は９０℃で３０分熱処理されたビフィドバクテリウム・ブレーベＮＣＣ２９５０を、ＯＶＡ感作の４日前（−３、−２、−１、０日目及び１１、１２、１３及び１４日目）及び曝露期間（２３〜３９日目）の間に胃管栄養により投与した。マウス１匹当たり１日量で約１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）又はこれと同等のｃｆｕの菌体を使用した。
【０１３７】
結果：
熱処理後の「炎症誘発性」サイトカインの分泌の誘発：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン分泌を刺激する熱処理菌株の能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。熱処理菌体によってＰＢＭＣが刺激されたときの４種のサイトカインに基づいた免疫プロファイルを、同じｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて生菌体により誘発された免疫プロファイルと比較した。
【０１３８】
熱処理菌体調製物を平板培養し、任意の生存可能数の不存在について評価した。熱処理菌体調製物は、平板培養後にコロニーを形成しなかった。
【０１３９】
生きたプロバイオティクスは、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートすると、異なる及び菌株依存的なレベルのサイトカイン産生を誘発した（図８）。プロバイオティクスの熱処理により、ＰＢＭＣにより産生されるサイトカインのレベルが、それらの生きた対応物と比較して変更された。熱処理菌体は、生きた対応物より多くの炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０）を誘発した。対照的に、熱処理菌体は、生菌体と比較して同等又は低い量のＩＬ−１０を誘発した（図８）。これらのデータは、熱処理菌体が、それらの生きた対応物より免疫系を刺激することができ、したがって、弱くなった免疫防御を増強することができることを示している。換言すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、熱処理後の菌株の強化された追加免疫作用を例示している。
【０１４０】
熱処理されたＢ．ブレーベＮＣＣ２９５０の免疫系に対する（生菌体と比較して）強化された作用を例示するために、生きた及び熱処理されたＢ．ブレーベＮＣＣ２９５０（菌株Ａ）の両方を、アレルギー性下痢の動物モデルにおいて試験した。
【０１４１】
陽性対照群と比較して、下痢の強度は、熱処理されたＢ．ブレーベＮＣＣ２９５０を用いた処理後に有意に及び一貫して低下した（４１．１％±４．８）が、一方、下痢の強度は、生きたＢ．ブレーベＮＣＣ２９５０を用いた処理後に２０±２８．３％しか低下しなかった。これらの結果は、熱処理されたＢ．ブレーベＮＣＣ２９５０が、その生きた対応物より、アレルギー性下痢に対する強化された保護作用を示すことを証明している（図９）。
【０１４２】
その結果、免疫防御を強化するプロバイオティクスの能力は、熱処理後に改善されることが示された。
【０１４３】
さらなる実施例：
下記ペットフード組成物は、本特許出願に記載の標準的技術を使用して調製することができる。
【０１４４】
【表１】
2014500007.tif 000002
【図１Ａ】
2014500007.tif 000003
【図１Ｂ】
2014500007.tif 000004
【図２】
2014500007.tif 000005
【図３Ａ】
2014500007.tif 000006
【図３Ｂ】
2014500007.tif 000007
【図４Ａ】
2014500007.tif 000008
【図４Ｂ】
2014500007.tif 000009
【図５】
2014500007.tif 000010
【図６】
2014500007.tif 000011
【図７】
2014500007.tif 000012
【図８】
2014500007.tif 000013
【図９】
2014500007.tif 000014
【国際調査報告】
2014500007.tif 000015
2014500007.tif 000016
2014500007.tif 000017