(57)【要約】  逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、疎水性固定相を提供する工程；該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子および必要に応じて有機溶媒を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および該分離した有機化合物を含む、該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、ここで該非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子が、本開示で定義したとおりの一般式［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］を有する中性双性イオン性を含む。
2014534421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、
疎水性固定相を提供する工程；
該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；
非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および
該分離した有機化合物を含む、該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、
ここで該非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子が、一般式：
［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］
を有する疎水性中性双性イオンを含み、
ここで該一般式において、ＣＭが、四級アンモニウム（Ｉ）、四級ホスホニウム（ＩＩ）、スルホニウム（ＩＩＩ）、スルホキソニウム（ＩＶ）、イミダゾリニウム（アミジニウム）（Ｖ）、グアニジニウム（ＶＩ）、イミダゾリウム（ＶＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニウム（ＶＩＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニウム（ＩＸ）、イソインドリニウム（Ｘ）、インドリニウム（ＸＩ）、ベンズイミダゾリウム（ＸＩＩ）、ピリジニウム（ＸＩＩＩａ，ＸＩＩＩｂ，ＸＩＩＩｃ，ＸＩＩＩｄ）、キノリニウム（ＸＩＶ）、イソキノリニウム（ＸＶ）から選択される形式正（＋）電荷を有する独立した疎水性化学部分であり、そしてＣＭ’が、カルボキシレート（ＸＶＩ）、Ｎ−アシル−α−アミノ酸（ＸＶＩＩ）、スルホネート（ＸＶＩＩＩ）、硫酸モノエステル（ＸＩＸ）、リン酸モノエステル（ＸＸ）、リン酸ジエステル（ＸＸＩ）、ホスホン酸モノエステル（ＸＸＩＩ）、ホスホネート（ＸＸＩＩＩ）、テトラアリールボレート（ＸＸＩＶ）、ボロネート（ＸＸＶ）、ボロン酸エステル（ＸＸＶＩ）から選択される形式負（−）電荷を有する独立した疎水性化学部分であり；ここで、化学部分（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）が、以下の化学構造を有し：
【化１】
2014534421.tif 000023
ここで該一般式において、ＣＭおよびＣＭ’が、分子が全体として操作ｐＨにてゼロの形式電荷を有する電気的に中性の双性イオンであるように、反対の形式電荷を有する独立した荷電化学部分であり；そしてＣＭおよびＣＭ’は、二重連結化学部分Ｒ＊により互いに化学的に付着され、該二重連結化学部分Ｒ＊はＣＭ上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し、かつＣＭ’上の１つのＲ１’、Ｒ２’（存在するならば）、Ｒ３’（存在するならば）またはＲ４’（存在するならば）化学部分を置換し；
ここでＲ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の各々が、式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−ＡＲ２
によって独立して定義された直鎖状または分岐状化学部分であり、
Ｒ＊が、直接化学結合であるか、または式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−
によって定義された二重連結直鎖状または分岐状化学部分であり、
そして、Ｒ５が、式
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ２
により定義された直鎖状または分岐状化学部分であり；
ここで各ＡＲ１が独立して、二重連結メチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−、メタン由来）、二重連結フェニレン部分（−Ｃ６Ｇ４−、ベンゼン由来）、二重連結ナフチレン部分（−Ｃ１０Ｇ６−、ナフタレン由来）または二重連結ビフェニレン部分（−Ｃ１２Ｇ８−、ビフェニル由来）であり；
ここで各ＡＲ２が独立して、水素（−Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、フェニル基（−Ｃ６Ｇ５）、ナフチル基（−Ｃ１０Ｇ７）またはビフェニル基（−Ｃ１２Ｇ９）であり；
ここで各Ｘ、Ｘ１およびＸ２が個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＨであり；
ここで任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−内または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−内または任意の−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−内の任意のメチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−）が個々にかつ独立して、独立したエーテル酸素原子−Ｏ−、独立したチオエーテル硫黄原子−Ｓ−、または独立したケトンカルボニル基−Ｃ（Ｏ）−と、各エーテル酸素原子、各チオエーテル硫黄原子または各ケトンカルボニル基がそれぞれの側で脂肪族炭素原子または芳香族炭素原子に結合されるように置換されていてもよく；
ここで２以下のエーテル酸素原子、２以下のチオエーテル硫黄原子および２以下のケトンカルボニル基が、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−に置換されていてもよく；
ここでｍｘが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−におけるメチレン基の総数であり、そしてｍｕが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−におけるメチレン基の総数であり；
ここでＧが個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＧ＊が個々にかつ独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｒ２、−ＯＨ、−ＯＲ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＲ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の対が、Ｒ２／Ｒ３、Ｒ２／Ｒ４、Ｒ３／Ｒ４、Ｒ２’／Ｒ３’、Ｒ２’／Ｒ４’またはＲ３’／Ｒ４’が個々にかつ独立して、−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−（ここでｐ＝３、４、５または６）であるような単一化学部分を含んでもよく；
ここでｘ、ｒ、ｕ、ｓ、ｍｘ、ｍｕの各々の整数値が、各Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ＊について独立して選択され、整数値ｒおよびｓは、含有され単離されたシス／トランスオレフィン（アルケン）基の総数＋含有された単純単環式構造の総数であり、そして０≦ｒ≦２および０≦ｓ≦２の範囲内にあり、数量ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕが０≦ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕ≦１１の範囲内にあり；
ここで少なくとも１つの芳香族化学部分、複素環芳香族化学部分、イミダゾリン化学部分、アミジン化学部分またはグアニジン化学部分がＣＭまたはＣＭ’内に含有され；
ここで各Ｒ化学部分についての基疎水性指数（ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル酸素原子数＋１／２×ケトン炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで各［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル酸素原子数＋１／２×ケトン炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここでＲ１およびＲ１’についての基疎水性指数（１ｎおよび１’ｎ）の各々が、４．０＜１ｎ，１’ｎ＜１２．０の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ＊についての基疎水性指数（２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎおよび＊ｎ）の各々が、存在する場合、０．０≦２ｎ，２’ｎ，３ｎ，３’ｎ，５ｎ，５’ｎ，＊ｎ＜１２．０の範囲内にあり、そしてＲ４およびＲ４’についての基疎水性指数（４ｎおよび４’ｎ）が、存在する場合、０．０≦４ｎ，４’ｎ≦５．０の範囲内にあり；
ここで該全体疎水性指数（Ｎ）が、１０．０≦Ｎ＜２４．０の範囲内にあり；
ここで環式化学部分について算出した基疎水性指数の数値が、該２つのそれぞれのＲ化学部分間で等しく分割され；
ここで１つのこのような化学部分のみがＣＭまたはＣＭ’に付着されている場合、Ｒ１が、そのＲ化学部分として同定され；ここでＣＭまたはＣＭ’に付着された１より多くのこのような化学部分が存在する場合、Ｒ１が、基疎水性指数の最大値を有するそのＲ化学部分として同定され；ここでＣＭまたはＣＭ’に付着された３より多くのこのようなＲ化学部分が存在する場合、Ｒ４が、基疎水性指数の最小値を有するそのＲ化学部分として同定される、
方法。
【請求項２】
非界面活性双性イオン性疎水性置換剤分子を含む前記水性組成物が、ｐＨ緩衝液以外の添加塩を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化２】
2014534421.tif 000024
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１ヒドロカルビル部分であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４ヒドロカルビル部分またはベンジルであり、そしてＲ４がベンジル、ハロ置換ベンジル、４−アルキルベンジル、４−トリフルオロメチルベンジル、４−フェニルベンジル、４−アルコキシベンジル、４−アセトアミドベンジル、Ｈ２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ＰｈＨＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ジアルキル−ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−（ここでアルキルがＣ１〜Ｃ４である）から選択され、但し、ＣＭに存在するベンジル基が１以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化３】
2014534421.tif 000025
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２が独立してＣ４〜Ｃ８アルキルまたはシクロヘキシルであり、Ｒ３がＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がフェニル、２−、３−もしくは４−ハロフェニル、ベンジル、２−、３−もしくは４−ハロベンジル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジハロベンジル、２，４，６−もしくは３，４，５−トリハロベンジル、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ２−または２−、３−もしくは４−トリフルオロメチルベンジルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＭが一般式ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩを有し、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、そしてＲ２がＣ１〜Ｃ８アルキルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化４】
2014534421.tif 000026
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、１−（ＣＨ２）ナフチレン、９−（ＣＨ２）アントラセン、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−またはベンジルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化５】
2014534421.tif 000027
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＲ４が、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ベンジル、３−ＣｌＣ６Ｈ４ＣＨ２−、２，６−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、３，５−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−または（ＣＨ３ＣＨ２）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化６】
2014534421.tif 000028
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ４〜Ｃ６アルキル、ベンジルまたは２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−またはＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、そしてＲ４が、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ナフチレン−１−ＣＨ２−、アントラセン−９−ＣＨ２−またはＰｈ（ＣＨ２）ｎ−（ここでｎ＝５〜８）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＣＭが一般式［（Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３Ｇ］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＧがＨまたはＦである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＭが一般式［Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＮＲ１Ｒ２Ｒ３］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＭが一般式ＩＩＩまたはＩＶを有し：
【化７】
2014534421.tif 000029
ここで該一般式ＩＩＩまたはＩＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたは４，４’−ＣＨ３（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルまたは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、そしてＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＭが一般式ＸＩＶまたはＸＶを有し：
【化８】
2014534421.tif 000030
ここで該一般式ＸＩＶまたはＸＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルであり、そして各ＧおよびＲ５は上に定義したとおりである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＭが一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅを有し：
【化９】
2014534421.tif 000031
ここで該一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたはＣ８〜Ｃ１１  ４−フェニルであり、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアルコキシ、２−ピリジル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル置換２−ピリジル、またはピロリジニルであり、そして各Ｇは上に定義したとおりである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＭが一般式ＶＩＩを有し：
【化１０】
2014534421.tif 000032
ここで該一般式ＶＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＭが一般式ＸＩＩを有し：
【化１１】
2014534421.tif 000033
ここで該一般式ＸＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルであり、そしてＧは上に定義したとおりである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＭ’が一般式ＸＸＩＶまたはＸＸＶを有し：
【化１２】
2014534421.tif 000034
ここで該一般式ＸＸＩＶにおいて、Ｒ１がフェニル、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ｎＰｒＣ６Ｈ４−、４−ｎＢｕＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−、またはＣ６Ｆ５−であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してフェニル、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−またはＣ６Ｆ５−であり；そしてここで該一般式ＸＸＶにおいて、Ｒ１が４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）Ｃ６Ｈ４−または４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）−３−ＣｌＣ６Ｈ３−である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＣＭ’が、４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＳＯ３Ｈ、４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−４’−ＳＯ３Ｈ、および４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−３’−ＳＯ３Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０そしてＸがＨまたはＯＨである、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＣＭ’が一般式ＸＶＩＩＩまたはＸＸＩＩＩを有し：
【化１３】
2014534421.tif 000035
ここで該一般式ＸＶＩＩＩにおいておよび該一般式ＸＸＩＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝５〜１１である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＣＭ’が、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＣＯ２ＨおよびＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＣＯ２Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＣＭ’が一般式４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＰＯ３Ｈ２を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記水性組成物がさらに有機溶媒を、約２５容積％未満、または約２０容積％未満、または約１５容積％未満、または約１０容積％未満、または約５容積％未満の量で含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
置換クロマトグラフィー（ＤＣ）は、カラムクロマトグラフィーの３つの明確に定義された型−溶出、置換、前端（frontal）の１つである。ＤＣは、主として分取法であるが、また、充填された「狭口径」またはキャピラリーカラムを有する「マイクロ分取」ＤＣを用いる分析的適用もある。
【０００２】
置換クロマトグラフィーは、適切な高純度置換剤分子が利用可能であれば、４つの一般クロマトグラフ法のどれを用いても実行され得る。ＤＣは、（ａ）イオン交換クロマトグラフィー（カチオン置換、アニオン置換）、（ｂ）疎水性クロマトグラフィー（逆相、疎水的相互作用、疎水的電荷誘導、チオフィリック）、（ｃ）親水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む順相クロマトグラフィー、（ｄ）固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）において使用される。
【０００３】
最適化されたＤＣを用いて、同時に、高純度（高分解能）、高回収（高収量）および高カラム処理量（高容量）が得られ得る。後者は、過負荷分取溶出クロマトグラフィーよりもずっと高い。ほとんどの場合、これらの利点は、ＤＣの欠点（流速が遅い、実行時間が長い、高純度の置換剤が必要）を補って余りある。
【０００４】
置換クロマトグラフィーは、（ａ）適用可能なクロマトグラフィー方法、（ｂ）適切な寸法を有する適したクロマトグラフィーカラム、（ｃ）適切な移動相条件、（ｄ）適した置換剤分子および（ｅ）適切に設定されたＬＣ機器とともに適した操作プロトコルを選択することで実行される。最初は、適した「弱置換移動相」（キャリア）が選択され、カラムは適切な流速で平衡化される。キャリアは、有用なｐＨ値に調整されたｐＨ緩衝性化合物を含有し得る。最適な置換流速は遅い傾向にあり、典型的には３５〜１０５ｃｍ／時間の範囲であるが、時折より速い。適切な量の試料溶液が、試料負荷流速でカラムに負荷される。試料溶液は、試料または置換剤分子が荷電されているかまたは双性イオン性であれば、適切なレベルのイオン対形成剤またはイオン対形成塩とともに、キャリア内に精製されるべき物質を含有する。典型的な試料負荷は、操作ブレークスルー容量の５０〜８０％である。次に、キャリア溶液中で適切な濃度にて適した置換剤化合物から調製された置換剤移動相（置換剤緩衝液）が、置換剤のブレークスルーが観察されるまで、置換流速でカラムにポンプで送給される。精製された試料は、置換剤ブレークスルー前端の前に、カラムから落ちる。カラムからの画分は集められ、内容物および純度について別々に分析される。最終的に、置換剤は、「置換剤除去溶液」を用いてカラムから除かれ、次いで、カラムはきれいにされ、保存または次の使用のために最初の状態に再生される。
【０００５】
いくつかの局面において、溶出クロマトグラフィーとは異なるが、置換クロマトグラフィーは、理解が容易であり、かつ実施も容易である。ＤＣにおいて、試料は、移動相によりカラムから「溶出」されるよりも、置換剤によりカラムから「置換」される。カラムの生成物がオンラインでモニタリングされると（例えば、ＵＶ吸収、ｐＨ、または伝導度を介して）、「溶出クロマトグラム」よりも「置換トレーン（displacement train）」が得られる。置換トレーンは、クロマトグラムの溶媒分離「溶出ピーク」よりも、並んだ「置換バンド」から構成される。置換バンドが固定相を飽和するのに十分に大きければ、台形の「飽和バンド」が形成される。置換バンドが固定相を飽和するのに十分に大きくなければ、小さな三角形の「非飽和バンド」が形成される。飽和バンドの高さは、操作時点の結合等温線により決定される。台形バンドまたは三角バンドの面積は、成分の量に比例する。
【０００６】
疎水性クロマトグラフィーは、ほぼ例外なく、水の独特の溶媒和特性に依存する。この溶媒和特性は、高度に構造化され、自己会合し、水素結合した液体から生じる。従来の逆相クロマトグラフィー固定相（非荷電のＣ１８カラム）にとって、結合は通常エントロピー（＋ＴΔＳ）により実行され、これは、しばしば、好ましくないエンタルピー（＋ΔＨ）を乗り越えなければならない。それゆえ、クロマトグラファーによってよく使われる温度範囲（１０〜７０℃）にわたって、しばしば、温度の増加に伴って分析物結合および置換剤結合がより強くなる。疎水性クロマトグラフィーのもう１つの有用な特徴は、水ベースの溶媒の自己水素結合の構造と強さとの両方を改変する添加剤の使用である。これらの添加剤としては、以下が挙げられる：塩（ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４）、有機溶媒（ＭｅＣＮ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）、および極性有機分子（尿素、オリゴ−エチレングリコール）（クロマトグラフィー緩衝液中）。
【０００７】
疎水性置換クロマトグラフィーは、キラル分析物、キラル置換剤およびキラルクロマトグラフィーマトリックスを使用して実行することができる。これらの条件下で、アキラルな置換剤が使用され得るが、キラルな置換剤のラセミ体混合物は使用され得ない。ラセミ体のキラルな分析物はまた、アキラルなクロマトグラフィーカラムとアキラルな置換剤を用いて精製され得る。この場合において、ジアステレオマーを含む不純物は、目的のラセミ混合物から除去されるが、エナンチオマーのキラル分割はない。有用な逆相の分取置換クロマトグラフィーの開発が、適切な高純度の置換剤分子が利用できないことにより妨げられてきた。我々は、本明細書において、疎水性置換クロマトグラフィーの種々の形態において有用性を有する新規な置換剤分子およびそれらの使用方法を記載する。
【０００８】
良好な疎水性置換剤分子は、それらが効果的に機能するために、化学的および物理的特性の独特の組合せを有するべきである。いくつかの可溶な疎水性分子は、置換剤として機能し得るが、限られた少ない機能のみがよく機能する。本明細書に記載の分子の多くは、充分に機能する置換剤に必要とされる要求を満たす。
【０００９】
有用な逆相の分取置換クロマトグラフィーの開発が、適切な高純度の置換剤分子が利用できないことにより妨げられてきた。例えば、米国特許第６，２３９，２６２号は、低分子量界面活性化合物を置換剤として用いる様々な逆相液体クロマトグラフィーシステムを記載している。米国特許第６，２３９，２６２号は、疎水性部分と結合し、置換剤として使用される開示された界面活性化合物を形成し得る、極端に広い範囲の可能な荷電部分を開示するが、開示された置換剤の界面活性特性を軽減するために高い比率の有機溶媒を含む必要があることを開示している。そのような高い比率の有機溶媒の存在は、顕著にプロセスを変え、逆相疎水性置換クロマトグラフィーの利点を損なう。さらに、米国特許第６，２３９，２６２号に開示された強界面活性置換化合物はよく機能せず、「精製された」生産物中に有意レベルの不純物が存在し得る相対的に不十分〜並の品質の置換トレーンを生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
我々は、疎水性置換クロマトグラフィーにおける良好な置換剤挙動に必要な化学的特性および物理的特性の組合せを独特に有する中性疎水性双性イオン性または二双性イオン性化合物のクラスを発見し、開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、１つの実施形態では、逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、
疎水性固定相を提供する工程；
該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；
非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および
該分離した化合物を含む、該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、
ここで該非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子が、一般式：
［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］
を有する疎水性中性双性イオン性分子を含み、
ここで該一般式において、ＣＭが、四級アンモニウム（Ｉ）、四級ホスホニウム（ＩＩ）、スルホニウム（ＩＩＩ）、スルホキソニウム（ＩＶ）、イミダゾリニウム（アミジニウム）（Ｖ）、グアニジニウム（ＶＩ）、イミダゾリウム（ＶＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニウム（ＶＩＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニウム（ＩＸ）、イソインドリニウム（Ｘ）、インドリニウム（ＸＩ）、ベンズイミダゾリウム（ＸＩＩ）、ピリジニウム（ＸＩＩＩａ，ＸＩＩＩｂ，ＸＩＩＩｃ，ＸＩＩＩｄ）、キノリニウム（ＸＩＶ）、イソキノリニウム（ＸＶ）から選択される形式正（＋）電荷を有する独立した疎水性化学部分であり、そしてＣＭ’が、カルボキシレート（ＸＶＩ）、Ｎ−アシル−α−アミノ酸（ＸＶＩＩ）、スルホネート（ＸＶＩＩＩ）、硫酸モノエステル（ＸＩＸ）、リン酸モノエステル（ＸＸ）、リン酸ジエステル（ＸＸＩ）、ホスホン酸モノエステル（ＸＸＩＩ）、ホスホネート（ＸＸＩＩＩ）、テトラアリールボレート（ＸＸＩＶ）、ボロネート（ＸＸＶ）、ボロン酸エステル（ＸＸＶＩ）から選択される形式負（−）電荷を有する独立した疎水性化学部分であり；ここで、化学部分（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）が、以下の化学構造を有し：
【００１２】
【化１】
2014534421.tif 000003
【００１３】
ここで該一般式において、ＣＭおよびＣＭ’が、分子が全体として操作ｐＨにてゼロの形式電荷を有する電気的に中性の双性イオンであるように、反対の形式電荷を有する独立した荷電化学部分であり；そしてＣＭおよびＣＭ’は、二重連結化学部分Ｒ＊により互いに化学的に付着され、該二重連結化学部分Ｒ＊は、ＣＭ上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し、かつＣＭ’上の１つのＲ１’、Ｒ２’（存在するならば）、Ｒ３’（存在するならば）またはＲ４’（存在するならば）化学部分を置換し（本明細書中においては、ＣＭ’上のＲ基を、プライム（’）と共に称する、例えば、Ｒ１’は、ＣＭ’上のＲ１基である）；
ここでＲ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の各々が、式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−ＡＲ２
によって独立して定義された直鎖状または分岐状化学部分であり、
Ｒ＊が、直接化学結合であるか、または式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−
によって定義されたＣＭをＣＭ’に連結する二重連結直鎖状または分岐状化学部分であり、
そして、Ｒ５およびＲ５’が独立して、式
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ２
によって定義された直鎖状または分岐状化学部分であり；
ここで各ＡＲ１が独立して、二重連結メチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−、メタン由来）、二重連結フェニレン部分（−Ｃ６Ｇ４−、ベンゼン由来）、二重連結ナフチレン部分（−Ｃ１０Ｇ６−、ナフタレン由来）または二重連結ビフェニレン部分（−Ｃ１２Ｇ８−、ビフェニル由来）であり；
ここで各ＡＲ２が独立して、水素（−Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、フェニル基（−Ｃ６Ｇ５）、ナフチル基（−Ｃ１０Ｇ７）またはビフェニル基（−Ｃ１２Ｇ９）であり；
ここで各Ｘ、Ｘ１およびＸ２が個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＨであり；
ここで任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−内または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−内または任意の−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−内の任意のメチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−）が個々にかつ独立して、独立したエーテル酸素原子−Ｏ−、独立したチオエーテル硫黄原子−Ｓ−、または独立したケトンカルボニル基−Ｃ（Ｏ）−と、各エーテル酸素原子、各チオエーテル硫黄原子または各ケトンカルボニル基がそれぞれの側で脂肪族炭素原子または芳香族炭素原子に結合されるように置換されてもよく；
ここで２以下のエーテル酸素原子、２以下のチオエーテル硫黄原子および２以下のケトンカルボニル基が、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−に置換されてもよく；
ここでｍｘが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−におけるメチレン基の総数であり、そしてｍｕが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−におけるメチレン基の総数であり；
ここでＧが個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＧ＊が個々にかつ独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｒ２、−ＯＨ、−ＯＲ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＲ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の対が、Ｒ２／Ｒ３、Ｒ２／Ｒ４、Ｒ３／Ｒ４、Ｒ２’／Ｒ３’、Ｒ２’／Ｒ４’またはＲ３’／Ｒ４’が個々にかつ独立して、−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−（ここでｐ＝３、４、５または６）であるような単一化学部分を含んでもよく；
ここでｘ、ｒ、ｕ、ｓ、ｍｘ、ｍｕの各々の整数値が、各Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ＊について独立して選択され、整数値ｒおよびｓは、含有され単離されたシス／トランスオレフィン（アルケン）基の総数＋含有された単純単環式構造の総数であり、かつ０≦ｒ≦２および０≦ｓ≦２の範囲内にあり、数量ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕが０≦ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕ≦１１の範囲内にあり；
ここで少なくとも１つの芳香族化学部分、複素環芳香族化学部分、イミダゾリン化学部分、アミジン化学部分またはグアニジン化学部分がＣＭまたはＣＭ’内に含有され；
ここで各Ｒ化学部分についての基疎水性指数（ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル酸素原子数＋１／２×ケトン炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで各［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル酸素原子数＋１／２×ケトン炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここでＲ１およびＲ１’についての基疎水性指数（１ｎおよび１’ｎ）の各々が、４．０＜１ｎ，１’ｎ＜１２．０の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ＊についての基疎水性指数（２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎおよび＊ｎ）の各々が、存在する場合、０．０≦２ｎ，２’ｎ，３ｎ，３’ｎ，５ｎ，５’ｎ，＊ｎ＜１２．０の範囲内にあり、そしてＲ４およびＲ４’についての基疎水性指数（４ｎおよび４’ｎ）が、存在する場合、０．０≦４ｎ，４’ｎ≦５．０の範囲内にあり；
ここで該全体疎水性指数（Ｎ）が、１０．０≦Ｎ＜２４．０の範囲内にあり；
ここで環式化学部分について算出した基疎水性指数の数値が、該２つのそれぞれのＲ化学部分間で等しく分割され；
ここで１つのこのような化学部分のみがＣＭまたはＣＭ’に付着されている場合、Ｒ１が、そのＲ化学部分として同定され；ここでＣＭまたはＣＭ’に付着された１より多くのこのようなＲ化学部分が存在する場合、Ｒ１が、基疎水性指数の最大値を有するそのＲ化学部分として同定され；ここでＣＭまたはＣＭ’に付着された３より多くのこのような化学部分が存在する場合、Ｒ４が、基疎水性指数の最小値を有するそのＲ化学部分として同定される、
方法に関する。
【００１４】
一般に、本明細書中において、ＣＭはカチオンであり、そしてＣＭ’はアニオンであり、そしてＣＭおよびＣＭ’の各々は、［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］の電気的中性が維持される限り、１より多くのカチオンまたはアニオンをそれぞれ含み得る。
【００１５】
１つの実施形態では、非界面活性疎水性置換剤分子を含む水性組成物は、ｐＨ緩衝液以外の添加塩を含まない。
【００１６】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００１７】
【化２】
2014534421.tif 000004
【００１８】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１ヒドロカルビル部分であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４ヒドロカルビル部分またはベンジルであり、そしてＲ４がベンジル、ハロ置換ベンジル、４−アルキルベンジル、４−トリフルオロメチルベンジル、４−フェニルベンジル、４−アルコキシベンジル、４−アセトアミドベンジル、Ｈ２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ＰｈＨＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ジアルキル−ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−（ここでアルキルがＣ１〜Ｃ４である）から選択され、但し、ＣＭに存在するベンジル基が１以下である。
【００１９】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００２０】
【化３】
2014534421.tif 000005
【００２１】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２が独立してＣ４〜Ｃ８アルキルまたはシクロヘキシルであり、Ｒ３がＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がフェニル、２−、３−もしくは４−ハロフェニル、ベンジル、２−、３−もしくは４−ハロベンジル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジハロベンジル、２，４，６−もしくは３，４，５−トリハロベンジル、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ２−または２−、３−もしくは４−トリフルオロメチルベンジルである。
【００２２】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩを有し、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、そしてＲ２がＣ１〜Ｃ８アルキルであり、そしてＧは上に定義したとおりである。
【００２３】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００２４】
【化４】
2014534421.tif 000006
【００２５】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、１−（ＣＨ２）ナフチレン、９−（ＣＨ２）アントラセン、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−またはベンジルである。
【００２６】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００２７】
【化５】
2014534421.tif 000007
【００２８】
Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＲ４が、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ベンジル、３−ＣｌＣ６Ｈ４ＣＨ２−、２，６−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、３，５−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−または（ＣＨ３ＣＨ２）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−である。
【００２９】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００３０】
【化６】
2014534421.tif 000008
【００３１】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ４〜Ｃ６アルキル、ベンジルまたは２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−またはＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、そしてＲ４が、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ナフチレン−１−ＣＨ２−、アントラセン−９−ＣＨ２−またはＰｈ（ＣＨ２）ｎ−（ここでｎ＝５〜８）である。
【００３２】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式［（Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３Ｇ］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＧがＨまたはＦである。
【００３３】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式［Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＮＲ１Ｒ２Ｒ３］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−である。
【００３４】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩＩＩまたはＩＶを有し：
【００３５】
【化７】
2014534421.tif 000009
【００３６】
ここで該一般式ＩＩＩまたはＩＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたは４，４’−ＣＨ３（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルまたは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、そしてＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００３７】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＩＶまたはＸＶを有し：
【００３８】
【化８】
2014534421.tif 000010
【００３９】
ここで該一般式ＸＩＶまたはＸＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルであり、そして各ＧおよびＲ５は上に定義したとおりである。
【００４０】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅを有し：
【００４１】
【化９】
2014534421.tif 000011
【００４２】
ここで該一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたはＣ８〜Ｃ１１  ４−フェニルであり、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアルコキシ、２−ピリジル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル置換２−ピリジル、またはピロリジニルであり、そして各Ｇは上に定義したとおりである。
【００４３】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＶＩＩを有し：
【００４４】
【化１０】
2014534421.tif 000012
【００４５】
ここで該一般式ＶＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルである。
【００４６】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＩＩを有し：
【００４７】
【化１１】
2014534421.tif 000013
【００４８】
ここで該一般式ＸＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルであり、そしてＧは上に定義したとおりである。
【００４９】
１つの実施形態では、ＣＭ’は、一般式ＸＸＩＶまたはＸＸＶを有し：
【００５０】
【化１２】
2014534421.tif 000014
【００５１】
ここで該一般式ＸＸＩＶにおいて、Ｒ１がフェニル、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ｎＰｒＣ６Ｈ４−、４−ｎＢｕＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−、またはＣ６Ｆ５−であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してフェニル、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−またはＣ６Ｆ５−であり；そして
ここで該一般式ＸＸＶにおいて、Ｒ１が４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）Ｃ６Ｈ４−または４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）−３−ＣｌＣ６Ｈ３−である。
【００５２】
１つの実施形態では、ＣＭ’は、４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＳＯ３Ｈ、４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−４’−ＳＯ３Ｈ、および４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−３’−ＳＯ３Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０そしてＸがＨまたはＯＨである。
【００５３】
１つの実施形態では、ＣＭ’は、一般式ＸＶＩＩＩまたはＸＸＩＩＩを有し：
【００５４】
【化１３】
2014534421.tif 000015
【００５５】
ここで該一般式ＸＶＩＩＩにおいておよび該一般式ＸＸＩＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝５〜１１である。
【００５６】
１つの実施形態では、ＣＭ’は、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＣＯ２ＨおよびＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＣＯ２Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である。
【００５７】
１つの実施形態では、ＣＭ’は、一般式４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＰＯ３Ｈ２を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である。
【００５８】
１つの実施形態では、水性組成物はさらに有機溶媒を、約２５容積％未満、または約２０容積％未満、または約１５容積％未満、または約１０容積％未満、または約５容積％未満の量で含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１Ａは、本発明の例示の実施形態に従う置換クロマトグラフィー方法について、時間（Ｘ軸）対相対吸光単位（Ｙ軸）をプロットする、粗合成ペプチドの精製に関する置換トレースである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本明細書中において使用されるように、本発明に従って用いられる中性双性イオン性非界面活性置換剤化合物に関して、「非界面活性」とは、そのように記載された化合物が、本発明による置換クロマトグラフィー方法で用いられる化合物の濃度より大きい臨界ミセル濃度（「ＣＭＣ」）を有することを意味する。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の薬剤の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約８０％未満である。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の薬剤の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約６０％未満である。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の薬剤の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約５０％未満である。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明に従って用いられる非界面活性疎水性中性双性イオン性置換剤分子を含む水性組成物は、以下の１つまたは２つもしくはそれ以上の組み合わせによって、不利な界面活性特性を示さない：（１）そのＣＭＣより低い濃度で双性イオン性非界面活性置換剤化合物が存在する；（２）各［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が１０≦Ｎ＜２４の範囲内にある；（３）Ｒ１またはＲ１’についての基疎水性指数（１ｎ）が、４＜１ｎ＜１２の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ＊（存在する場合）の各々についての基疎水性指数（２ｎ、３ｎ、５ｎおよび＊ｎ）が、０≦２ｎ，３ｎ，５ｎ，＊ｎ＜１２の範囲内にあり、そしてＲ４またはＲ４’（存在する場合）についての基疎水性指数（４ｎ）が、０≦４ｎ≦５の範囲内にある；（４）組成物が約５容積％またはそれ以上より多くの有機溶媒を含有する；（５）組成物が、組成物のｐＨの調節および制御に必要なｐＨ緩衝液以外に０．１Ｍ未満の塩または１．０Ｍより多くの塩を含有する。
【００６２】
本明細書中において使用されるように、「低有機溶媒含量」とは、例えば、本発明に従う中性双性イオン性非界面活性置換剤化合物を含む水性「キャリア」組成物中で、約２５容積％未満の有機溶媒含量を一般にいう。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約２０容積％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約１５容積％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約１０容積％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約５容積％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００６３】
１つの実施形態では、有機溶媒は、メタノール（ＣＨ３ＯＨまたはＭｅＯＨ）、エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨまたはＥｔＯＨ）またはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮまたはＭｅＣＮ）の１つまたは２つもしくはそれ以上の混合物である。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、適切な有機溶媒の混合物を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００６４】
疎水性置換クロマトグラフィーは、キラル分析物、キラル置換剤およびキラルクロマトグラフィーマトリックスを用いて実施され得る。これらの条件下では、アキラル置換剤を用いてもよいが、キラル置換剤のラセミ混合物は用いられ得ない。ラセミキラル分析物はまた、アキラルクロマトグラフィーカラムおよびアキラル置換剤を用いて精製され得る。この場合、不純物（ジアステレオマーを含む）が目的のラセミ化合物から取り除かれるが、エナンチオマーのキラル分割はない。
【００６５】
本明細書中に記載の中性双性イオン性置換剤のいくつかは、４つの異なる基が付着した四級窒素を有し、したがって固有にキラルである；例えば、以下の表Ｖ中のラセミ置換剤化合物７２２、７３６、７５５参照。さらに、中性双性イオン性置換剤のいくつかは、アキラル窒素原子に付着した１つのキラル基を含有する；例えば、置換剤化合物７３１参照。キラルクロマトグラフィーマトリックス、移動相およびアキラル置換剤の適切な選択と共に、エナンチオマーは、規定通りに分取分割（分離）される。特定の環境に依存して、良好な鏡像異性的に純粋なキラル置換剤は、キラル固定相上でエナンチオマーの置換分離を実施する際に、良好なアキラル置換剤を超える性能の利点を有し得る。
【００６６】
（有用ｐＨ範囲）−一般式ＡまたはＢを有する種々のクラスの中性双性イオン性疎水性置換剤は、荷電部分の化学的性質に依存して異なる有用ｐＨ範囲を有する。脱プロトン化可能なカチオン基を含有する中性双性イオン性疎水性置換剤は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上下回るｐＨにて操作されるべきである。プロトン化可能なアニオン基を含有する中性双性イオン性疎水性置換剤は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上上回るｐＨにて操作されるべきである。
・オニウム基−一般に、四級アンモニウム、四級ホスホニウム、三級スルホニウム、三級スルホキソニウムおよび関連カチオン性基（例えば、ピリジニウム、イミダゾリウム、グアニジニウム）は、広範な有用ｐＨ範囲（１〜１１またはより大きい）を有する。なぜなら、これらの基は、通常の条件下で、脱プロトン化可能なＮ−Ｈ、Ｓ−ＨまたはＰ−Ｈ部分を有しないためである。
・アミンおよびグアニジン基−三級脂肪族アミン（ｐＫａ約９．５）および関連置換グアニジン（ｐＫａ約１３．５）（脱プロトン化可能なＮ−Ｈ部分を有する）は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上下回るｐＨにて操作された場合に有用なカチオン性基である。
・スルホネート基−一般に、脂肪族スルホネート（ｐＫａ約−２．０）および芳香族スルホネート（ｐＫａ約−２．５）は、それらの非常に低いｐＫａ値のために、広範な有用ｐＨ範囲（１〜１１）を有する。
・カルボキシレート基−一般に、単純脂肪族カルボキシレート（ｐＫａ約３．０〜５．０）、芳香族カルボキシレート（ｐＫａ約２．５〜４．５）、グリシン誘導体（ベタインを含む）（ｐＫａ約２．０）およびβ−アラニン誘導体（ホモベタインを含む）（ｐＫａ約３．５）は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上上回るｐＨにて操作された場合に有用なアニオン性部分である。
・ホスホネート基−ホスホネートは有用なアニオン性基であり得るが、それらの使用は、第二の酸解離（ｐＫａ２）により複雑化される。ホスホネート基を含有する中性双性イオン性疎水性置換剤は、実際のｐＫａ１値を１〜２単位またはそれ以上上回り、かつ同時に実際のｐＫａ２値を１〜２ｐＨ単位下回るｐＨにて操作されるべきである。同様に、ホスホネート基を含有する置換剤は、良好なクロマトグラフィー挙動を得るために、実際のｐＫａ２値を１〜２ｐＨ単位またはそれ以上上回るｐＨにて操作されるべきである。一般に、単純脂肪族ホスホネートは、ｐＫａ１値およびｐＫａ２値がそれぞれ約２．２および７．７であり、そして単純芳香族ホスホネートは、ｐＫａ１値およびｐＫａ２値がそれぞれ約２．０および７．２である。
【００６７】
（置換剤結合強度）−置換剤は、試料の全成分よりも強く、または少なくとも目的の主要成分全てよりも強く、カラムに結合すべきである。確かな経験則では、試料質量のわずか１〜４％しか、置換剤よりも強く結合すべきではない。
【００６８】
最適な置換剤は、固定相への結合が強すぎずかつ弱すぎないものであるべきである。適切な結合強度は、目的の分析物および付随する結合等温線に依存する。通常、広範な結合強度を有する広範な置換剤が、種々の異なるカラムおよび精製されるべき分析物に必要とされる。置換剤の結合が強すぎると、得られる性能は不十分である（例えば、分解能がより低くなる、分析物結合能が低くなる、置換剤の除去が困難、およびサイクル時間が長くなる）。置換剤の結合が弱すぎると、置換剤の下に置換された分析物の「テーリング」が過度に多い不十分な置換トレーンが生じ得るか、または部分的な置換のみとなるか、もしくは全く置換がないものとなり得る。
【００６９】
適切な結合強度を有する置換剤を選択するのに役立つ便利な経験上の方法は、置換実験に用いられるものと同様のカラムおよび移動相を用いて、可能性のある置換剤および分析物の簡易グラジエント溶出クロマトグラフィーを実施することである。第一のスクリーンでは、置換剤は、６０分グラジエントで目的の分析物よりも５〜１５分遅く溶出するべきである。理想的には、１つの分析物および分析物混合物の等温線を測定するが、これは、時間を要し、かつしばしば非実用的である。それは結合等温線において早期に動作するので、この経験上の方法は、完全ではないが、さらなるＤＣ至適化に好都合な出発点を提供する。
【００７０】
（使用可能な結合等温線）−適切な結合強度とは別に、有用な疎水性置換剤は、特定の他の有用な特徴を有する結合等温線を有するべきである。
【００７１】
（１）置換剤および分析物分子について単峰性で上に凸の等温線（ラングミュア型等温挙動）であることは、イソタクチック置換トレーンの規則的な形成を促進し、そして方法の最適化プロセスを簡素化する。これは、多くの中性双性イオン性置換剤の有用な特性である。これに対し、多くの他の非荷電疎水性置換剤分子（非双性イオン）（例えば、芳香族アルコール（例えば、置換フェノール、ナフトール、ヒドロキシビフェニル）、脂肪族アルコール（例えば、１−ドデカノール、１，２−ドデカンジオール）および非荷電脂肪族カルボン酸（例えば、ミリスチン酸））の結合等温線は、低濃度で正常に挙動し、高濃度になると二峰性になり、再度上昇する（ＢＥＴ型等温挙動）。この結合挙動は、しばしば、各層が異なる結合特徴を有する多層の疎水性置換剤の堆積から生じる。この結合挙動は、置換プロセスおよびその有用な実行を大いに複雑化させる。
【００７２】
（２）ＤＣにおけるクロマトグラフィー結果は、置換剤分子が液中で自己会合を受けた場合に複雑化され得る。濃度が増大するにつれて、置換剤の自己会合の問題が悪化する。また、中性双性イオン性疎水性置換剤における荷電基は、水溶液中の自己会合の問題を減少させるかまたは防ぐ。
【００７３】
（３）生成物および／または不純物の等温線がより高い非線形結合領域で置換剤の等温線と交叉する場合に、さらなる複雑化が生じ得る。この挙動は、置換順序の反転、置換バンド間の重なり領域のブロード化、および共置換の問題を生じる。このような場合、置換剤濃度のわずかな変動が置換トレーンに大きな変化を生じ得、それにより方法の最適化を非常に困難なものとし得る。
【００７４】
我々は、適切に設計した疎水性中性双性イオン性置換剤分子に適切な対イオンおよび少量の選択した有機溶媒を補充することで、ラングミュア型結合挙動および有用範囲の結合強度を有する効果的な疎水性中性双性イオン性置換剤のファミリーを提供することを見出した。
【００７５】
（イオン対形成剤）−それらの多くの利点の全てと共に、疎水性置換剤分子は、分析物にとって良好なイオン対形成剤および中性双性イオン性疎水性置換剤にとって良好なイオン対形成塩の両方を有するべきである。イオン対形成アニオンは、強イオン対形成アニオンおよび弱イオン対形成カチオンを有する塩である。イオン対形成カチオンは、弱イオン対形成アニオンおよび強イオン対形成カチオンを有する塩である。イオン対形成塩は、アニオンおよびカチオンの両方が強イオン対形成特性を有する塩である。実際には、アニオンおよびカチオンの両方ともが過度に強いイオン対形成特性を有する場合、水中であまり良好に溶解しない。イオン対形成塩は、それらのｐＩ付近の中性双性イオン性置換剤および双性イオン性分析物を除いて、本発明にとってほぼ関わりがない。ｐＩは「等電点」であり、これは、正電荷数が負電荷数と等しく、そして双性イオン性化合物全体が正味ゼロ電荷である任意の双性イオン性化学的化合物（しばしばタンパク質またはペプチド）ｐＨまたはｐＨ値範囲である。
【００７６】
イオン対形成剤は、置換剤の結合等温線ならびに置換剤の機能および有用性に有意に影響する。イオン対形成剤の濃度は、イオン対形成アニオンの適量のＫ＋、ＮＨ４＋，プロトン化アミン塩またはイオン対形成カチオンのＣｌ−／ＨＣＯ２−塩を添加することにより、独立して調整される。荷電疎水性置換剤のイオン対形成対イオンの特性は、その置換特性に強く影響する。これはまた、それほどではないにせよ、中性双性イオン性疎水性置換剤にも当てはまる。少数の対イオンが液中イオン対形成に関与し得、そしてほぼ全ての対イオンが、疎水性クロマトグラフィーマトリックス上で吸着状態にて対イオン形成に関与する。良好なクロマトグラフィー分解能のために、置換剤および分析物について、同じイオン対形成剤が用いられるべきである。有用なイオン対形成対イオンは、通常、一荷電である。それらの高い溶媒和エネルギーのために、通常、二価イオン（ＳＯ４２−、Ｃａ２＋）および三価イオン（ＰＯ４３−、Ｌａ３＋）はやや有用ではないが、いくつかの特殊な場合において用いられ得る。この原則に対する例外は、１つの有機イオン中で離れて位置する複数の一荷電部分（例えば、−Ｏ３Ｓ（ＣＨ２）４ＳＯ３−およびＭｅ３Ｎ＋（ＣＨ２）４Ｎ＋Ｍｅ３）である。
【００７７】
対イオンは、疎水性特徴が大きいほど結合強度を増大しかつ溶解度を減少させる傾向にある。さらに、疎水性置換剤塩を用いる場合、ＤＣの分解能は、対イオンそれ自体が過度に疎水性または過度に親水性であれば減少し得る。典型的には、対イオンの中間の疎水性／親水性特徴が最良の結果を与えるが、これは、精製される分子に依存して変動する。各精製について最適な対イオンは、実験的に決定されるべきである。例えば、ＣＨ３ＣＯ２−対イオンを有する疎水性四級アンモニウム置換剤は、良好な溶解度および並の分解能を与え、そしてＣＦ３ＣＯ２−を有するものは、並であるが許容可能な溶解度および良好な分解能を与え、そしてＣＣｌ３ＣＯ２−を有するものは、不十分な溶解度および並の分解能を与える。揮発性のイオン対形成剤は減圧下で好都合に除去されるが、他方非揮発性のものは他の手段（例えば、ダイアフィルトレーション、沈降または結晶化）によって容易に除去される。表Ｉは、有用な一価イオン対形成アニオンの部分的な表を示す。表ＩＩは、有用な一価イオン対形成カチオンの部分的な表を示す。プロトン化アミン（ｐＫａ約９．８〜１１．０）、プロトン化アミジン（ｐＫａ約１２．５）またはプロトン化グアニジン（ｐＫａ約１３．５）のイオン対形成剤を用いる場合、操作ｐＨは、それぞれのアミンのｐＫａを１〜２ｐＨ単位またはそれ以上下回るべきである。アニオン性イオン対形成剤を用いる場合、操作ｐＨは、それぞれの酸のｐＫａを１〜２ｐＨ単位またはそれ以上上回るべきである。このガイドラインに対する顕著な例外は、同時にイオン対形成剤およびｐＨ緩衝液の両方として作用するトリフルオロ酢酸である。
【００７８】
【表１】
2014534421.tif 000016
【００７９】
【表２】
2014534421.tif 000017
【００８０】
（ＲＰマトリックスに対するアニオンの結合を補助するアンモニウムイオン対形成を評価するためのガイドライン）
・疎水性および結合増強は、脂肪族炭素原子数と共に増大する。
・同数の脂肪族炭素原子については、一級アンモニウム基が四級アンモニウム基よりも良好に分析物結合を増強する（ｎブチル−ＮＨ３＋＞Ｅｔ２ＮＨ２＋＞ＥｔＭｅ２ＮＨ＋＞Ｍｅ４Ｎ＋）。
・同数の脂肪族炭素原子については、直鎖状基が分岐状基よりも良好に分析物結合を増強する（ｎブチル＞ｉブチル）。
・同数の脂肪族炭素原子については、直鎖状基が環状基よりも良好に分析物結合を増強する（ｎペンチル＞シクロペンチル）。
・特定の化学部分については、アンモニウムイオンといくつかの分析物との間の水素結合が分析物結合を増強する；例えば、一級アンモニウムとリン酸ジエステル（オリゴヌクレオチド）およびグアニジニウムとカルボキシレート（Ａｓｐ含有ペプチドおよびＧｌｕ含有ペプチド）。
【００８１】
混合対イオンはしばしばクロマトグラフィー分解能の損失を生じるので、一般には回避されるべきである。しかし、混合対イオンが用いられ得る場合の１つの条件セットがある；すなわち、（ａ）目的の対イオンが、存在する他の対イオンよりも有意に強いイオン対形成特性を有し、かつ（ｂ）目的の対イオンが、試料負荷混合物中および置換剤緩衝液中で化学量論的に過度に存在する場合である。
【００８２】
最も一般的に用いられるイオン対形成アニオンは、ホルメート、アセテート、クロライド、ブロマイド、およびトリフルオロアセテートである。より低いイオン対形成強度のため、ホルメートおよびアセテートは、良好な分解能を得るために慎重な最適化を要する。ブロマイドおよびトリフルオロアセテートは、低ｐＨにてペプチドについて最良の結果を与えると思われる。一般に、良好なクロマトグラフィー結果は、イオン対形成対イオンとしてクロライドおよびブロマイドを用いて得られ得るが、２つの特別な注意が払われるべきである。（１）酸性条件下では、クロマトグラフィー溶液は、気体ＨＣｌまたはＨＢｒの損失のためにヘリウムパージまたは真空脱ガスによって脱気することができず、それによりｐＨを変化させ、そしてアニオンの濃度を変化させ得る。この問題は、クロマトグラフィー溶液の調製に脱気蒸留水を用い、そして密閉容器中で当該溶液を保存して空気の再吸着を予防することにより克服される。（２）クロライドおよびブロマイドは、ステンレス鋼ＨＰＬＣ装置を腐食する可能性があるが、ＰＥＥＫ、テフロン（登録商標）、セラミック、ガラス、およびチタンからなる装置は安全である。主な問題は、低ｐＨにて空気（酸素）により引き起こされるステンレス鋼のハライド触媒腐食である。ＨＰＬＣ溶液が適切に脱酸素されれば、ステンレス鋼のハライド促進腐食は大きく減少する。
【００８３】
イオン対形成剤の時間を要する可能性のあるスクリーニングを簡素化するために、種々の分析物のための最初の出発点として、以下の推奨を供する：
・ペプチドおよび小タンパク質（ｐＨ＝２．０〜３．５）：Ｂｒ−、ＣＦ３ＣＯ２−
・ペプチドおよび小タンパク質（ｐＨ＝６．５〜８．０）：Ｍｅ４Ｎ＋、Ｍｅ３ＮＨ＋、Ｍｅ３ＮＥｔ＋、Ｍｅ２ＥｔＮＨ＋
・オリゴヌクレオチド（ｐＨ＝６．５〜８．０）：ｎＣ４Ｈ９−ＮＨ３＋、ｎＣ５Ｈ１１−ＮＨ３＋、ｎＣ６Ｈ１３−ＮＨ３＋
・ＤＭＴ−Ｏｎオリゴヌクレオチド（ｐＨ＝７．０〜８．０）：ＥｔＮＨ３＋、Ｅｔ３ＮＨ＋
【００８４】
（溶解度）−「疎水性クロマトグラフィー」またはより適切には「疎溶媒性クロマトグラフィー」において、主溶媒成分が水である場合、可能な疎水性置換剤分子はしばしば限られた溶解度を有する。疎水性分子は、当該疎水性分子に付着した「親水基」（例えば、荷電イオン性基、親水性対イオン、極性基、または水素結合供与体もしくは受容体として機能する基）が存在しない限り、通常、感知され得る程度にまで水中に溶解しない。芳香族分子は、パイ電子が弱水素結合受容体として作用する独特の様式のために、独特の様式にて水と相互作用する。さらに、芳香族分子は、水溶液中で直面するパイスタッキングに関与し得る。これらの小さいが重要な効果は、シクロヘキサン（約１０μＭ）およびトランスデカリン（＜１μＭ）と比較してベンゼン（９ｍＭ）およびナフタレン（２００μＭ）の方が水中溶解度が高く、非水酸化アレーンと比較してフェノール（９６０ｍＭ）およびβ−ナフトール（７ｍＭ）の方が溶解度が高いことに反映されている。有用な置換剤分子の分子構造は、水中または低有機溶媒含量の水中の適度な溶解度（１０〜５０ｍＭ）を促進すべきであり、なお同時に、それが固定相に強く結合するのに十分に疎水性であるべきである。一般に、荷電した置換剤分子は、荷電した種（特に対イオン）の増大した溶媒和エネルギーのために、中性のものよりも良好な溶解度特性を有する。それは、中性双性イオン性分子が良好な置換剤として挙動するために、物理的特性および化学的特性の独特の平衡を必要とする。中性双性イオン性疎水性置換剤は、独特の溶解度特性を呈する。典型的なアニオンまたはカチオン性化合物とは異なり、中性双性イオン性置換剤化合物は、塩濃度が増大するにつれて、しばしば水中溶解度を増大する。この独自の「塩溶」効果は、中性双性イオン性化合物がＨＩＣクロマトグラフィーにおける置換剤として用いられることを可能にする。さらに、水性置換剤緩衝液中の少量のエタノールは、有意に溶解度を増大し得るが、他方、同様の量のアセトニトリルはほとんど効果を有しない。
【００８５】
一般的にいえば、不十分な置換剤溶解度を補うために有機溶媒のレベルを増大することが、有用な結果を生じることはまれであることに留意することが重要である。最良のクロマトグラフィー結果は、０〜２５％の有機溶媒、またはより好ましくは２〜１５％の有機溶媒で得られる。いくつかの場合では、より高い有機溶媒含量（２５〜７５％）での移動相が用いられ得るが、しばしば容量および分解能が悪くなる。
【００８６】
（還元生成物・置換剤会合）−疎水性置換クロマトグラフィーを用いて生じ得る１つの問題は、溶液中の疎水性分析物と疎水性置換剤との会合である。これは、分解能の顕著な損失およびコンタミネーションを生じ得る。固定相上の吸着した状態での置換剤−分析物会合もまた生じ得るが、適量のイオン対形成剤が存在する場合はそれほど問題ではない。この問題を取り扱うのによい方法は、同じ電荷を有する荷電した分析物および荷電した疎水性置換剤を用いることである。これらの問題は、中性の疎水性置換剤と中性の疎水性分析物とが相互作用する場合に時々生じ得るが、この問題は、中性の置換剤が双性イオン特性を有する場合にはあまり見られない。
【００８７】
（置換剤自己会合およびミセル形成）−化学的構造および物理的特徴が貢献するいくつかの場合において、中性双性イオン性疎水性分子が自己会合し、溶液中でミセルおよびミセル様の自己会合構造を形成し得る。この状況は、ＤＣの分解能の損失ならびに置換剤溶液の望ましくない発泡を生じ得る。溶液中の置換剤は、種々の化学平衡によって相関される種々の形態におかれる。さらに、ミセルは、疎水性分析物分子のためのキャリアとして作用し、それらの分子を種々の形態で溶液中に存在させ得る。この望ましくない現象は濃度依存性であり、そして少量の適切な有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールまたはアセトニトリル）の添加によって有効に阻害される。適切に設計された中性双性イオン性置換剤分子はミセル形成を増強することなく、より良好な置換結果を与える。本明細書中に記載の中性双性イオン性置換剤分子は、中性非双性イオン性置換剤分子よりも、溶液中で自己会合構造を形成する傾向がずっと少ない。したがって、Ｒ基のＲ１〜Ｒ３について１２．０を下回る基疎水性指数を維持することは、望ましくない界面活性の問題を減少する。
【００８８】
（高純度−置換剤中の不純物）−置換剤は、十分な程度の純度で用いられるべきである。分取クロマトグラフィーの目的は、目的の成分から不純物を除去することである。置換物自体と関連した不純物による所望の化合物のコンタミネーションが問題となることはまれであるが、置換剤溶液中の「早期置換」不純物によるコンタミネーションは、場合によっては問題となり得、これは、不純物の量およびそれらの結合特性に依存する。したがって、良好な置換剤は、早期置換不純物をほとんどまたは全く含まないものであるべきである。
【００８９】
（適切なＵＶ吸光度）−ＤＣ実験を通して置換剤の位置および量を追跡して、置換剤ブレークスルー曲線を監視しそしてカラム再生手順の間に置換剤除去を追うために、紫外線吸収が中程度である置換剤を有することが有用である。高い吸収は必要ではなく、また高濃度の置換剤および分析物のために好ましくない。一般に、分析物のＵＶ吸光度の領域に対応する低吸光度の戦略的に位置づけられたウインドウを有するＵＶスペクトルを有する、無色の置換剤が好ましい。それにより、分析物をある周波数で追跡し、かつ置換剤を他の周波数でモニタリングすることができる。
【００９０】
（製造容易性および費用）−化学合成、生産および製造の便利な費用効果の高い方法は、有用な置換剤および合理的な費用を生じるために重要である。さらに、精製（特に、非クロマトグラフィー精製）のための実用的な方法が、費用効果的に純度要求を達成するために必要である。
【００９１】
（化学的安定性、低毒性および長期貯蔵寿命）−他の所望の化学的特性および物理的特性全ての中でも、有用な置換剤分子は、化学的に安定であるべきである。それは、分析物分子に対して不活性であり、かつ水、一般有機溶媒、穏やかな塩基、穏やかな酸、および酸素（空気）に対して化学的に安定（非反応性）であるべきである。それは、典型的な使用および保存条件下で光安定性でありかつ熱的に安定であり、そして、適度な貯蔵寿命を有するべきである。置換剤分子は、視覚的に無色であるにも関わらず、必要レベルのＵＶ吸光度を有することが好ましい。一般に、染料は、疎水性置換クロマトグラフィーにとって有用な置換剤とならない。有用な置換剤分子はまた、作業者の保護のためだけでなく、置換剤と接触し得る生物学的試料および薬物試料の保護のために、低毒性である必要がある。
【００９２】
（適切なクロマトグラフィーカラム）：逆相カラムの最も一般的なタイプはオクタデシル被覆シリカであるが、多くの疎水性の固定相がＤＣにおける有用性を見出している。適切な固定相の例を表ＩＩＩに列挙する。最終的には、固定相の最良の選択は、研究中の各システムについて実験的に決定される。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
置換クロマトグラフィーにおけるより良好な結果は十分に充填されたカラム長さが長いほど得られ、より良好な回収および収率を与える。表ＩＶは、カラム寸法および初期流速の初期選択のためのガイドを提供する。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
適切なカラム長さが良好な結果にとって重要である。それは、置換トレーンを十分にシャープにし、良好な分解能を与えるのに十分な長さであるべきである。なお、過度に長いカラムは分離時間を不要に増大させるので、床の充填が不十分となり、そして分解能を低下させ得る。多くの場合、良好なクロマトグラフィー結果を有する２つの十分に充填された短いカラムが、末端間接合され得る。小さな分子（ＭＷ＜３ＫＤａ）を用いる相当の実験は、最適なカラム長が、５μｍ粒子について１５〜４５ｃｍおよび１０μｍ粒子について２０〜６０ｃｍの範囲内にあることを示している。８０〜１００Åの孔径を有する多孔性粒子が伝統薬および小さなペプチドに適しており、１２０〜１５０Åの孔径が中程度および大きなオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドに適しており、そして３００〜５００Åの孔径がほとんどのタンパク質およびＤＮＡに適している。無孔性粒子が用いられ得るが、負荷容量は有意に減少する。
【００９７】
円筒カラムにおいて、流れの軸に対して垂直であるように平面フローフロントを樹立することが重要である。小型のカラムで最適化プロトコルが一旦開発されれば、より大量の試料の精製までスケールアップすることは、置換クロマトグラフィーにおいて簡単かつ容易である。最短の許容可能なカラム長が見出された後、スケールアップは単に、一定の線形流速を維持しながらカラム直径を増大させることにより達成される。適切な改変と共に、置換クロマトグラフィーは、半径流カラムと共に、および軸流モノリスカラムと共に用いられ得る。置換クロマトグラフィーの原理はまた、分析用および分取用の薄層クロマトグラフィーにおいて適用され得る。
【００９８】
（成功した置換クロマトグラフィー実験の実行）
有機化合物、伝統薬およびペプチドの置換クロマトグラフィーは長年にわたって実施されているが、並〜不十分という結果がしばしば得られる。本明細書中に記載するような良好な置換剤、良好なカラムおよび良好な操作プロトコルにより、優れた再現性および顕著に良好なクロマトグラフィー性能に至る。
【００９９】
（置換剤および濃度）−初期評価は、適切な結合強度を有する良好な汎用の中性双性イオン性置換剤を用いて実施される。中性双性イオン性置換剤は、カチオン性、中性非イオン性、中性双性イオン性およびアニオン性の分析物を精製するために用いられ得る。置換剤は、精製されるべき材料よりも強くカラムに結合すべきであるが、置換剤は、過度に強く結合すべきではない。典型的な置換剤濃度は、１０〜５０ｍＭの範囲内である。初めは、置換剤濃度は１０〜１５ｍＭに設定される。必要に応じて、ｐＨ緩衝液およびイオン対形成剤が置換剤溶液に添加される。置換剤溶液およびキャリア溶液は、置換剤の存在およびイオン対形成塩の濃度を除いて、同一の組成（ｐＨを含む）を有するべきである。置換剤７１３、７３８および７５３（以下の表Ｖ参照）は、良好な汎用の中性双性イオン性置換剤の例である。方法の最適化の間、２０〜３０ｍＭまたはそれ以上まで置換剤濃度を増大させることが有用であり得る。
【０１００】
（イオン対形成剤の選択）−イオン対形成剤を用いないこと、有効でないイオン形成剤を用いること、混合されたイオン対形成剤を用いること、および良好なイオン対形成剤を不十分なレベルで用いることは、置換クロマトグラフィー実験において不十分なクロマトグラフィー性能となる主要原因のいくつかである。表ＩおよびＩＩは、疎水性クロマトグラフィーにとって有用である、有用な一価のイオン対形成アニオンおよびイオン対形成カチオンのリストを含む。それらは、分析物または置換剤が荷電されている場合に必要である。荷電した分析物および置換剤について、結合等温線は、対イオンの化学的特性およびその濃度に強く依存する。また、我々のデータは、中性双性イオン性置換剤を有するイオン対形成塩が、疎水性固定相への結合を増強し、よりシャープな置換バンドを生じることを示している。中〜中強の結合特性を有するイオン対形成剤が、通常、使用に最良である。イオン対形成剤を用いて実験を開始するとき、イオン対形成アニオンとしてブロマイドまたはトリフルオロアセテート（遊離酸またはＮＨ４＋塩）を試み、そしてイオン対形成カチオンについてＫ＋、ＮＨ４＋またはプロトン化モノ−、ジ−、もしくはトリメチルアミン（遊離アミンまたはギ酸塩）を試みる。初期実験の間は、トリフルオロ酢酸メチルアンモニウム（［ＭｅＮＨ３］［ＣＦ３ＣＯ２］）で開始する。分析物がイオン対形成剤を必要とする場合、それは、通常、ＤＣ実験の間にＩＰ剤の選択を決定づける。分析物および置換剤のイオン対形成剤（塩）は同じであるべきである。
【０１０１】
（イオン対形成剤の濃度）−先に述べたように、良好なイオン対形成剤を不十分なレベルで用いることは、置換クロマトグラフィー実験において不十分なクロマトグラフィー性能となる主要原因の１つである。試料溶液中のイオン対形成剤の適切な濃度（ＣＩＰＳ，ｍＭ）を算出する式を以下により示す：
ＣＩＰＳ＝Ｅｓ×Ｃｓ（ｍＭ）×Ｇｓ
ここでＥｓは試料についての過剰係数であり、Ｃｓは試料濃度（ｍＭ）であり、そしてＧｓは操作ｐＨでの試料の正味電荷の絶対値である。Ｅｓの最適値は、実験的に決定される必要があるパラメーターである。置換剤溶液中のイオン対形成剤の適切な濃度（ＣＩＰＤ，ｍＭ）を算出する式を以下により示す：
ＣＩＰＤ＝Ｅｄ×Ｃｄ（ｍＭ）×Ｇｄ
ここでＥｄは置換剤についての過剰係数であり、Ｃｄは置換剤濃度（ｍＭ）であり、そしてＧｄは操作ｐＨでの置換剤の正味電荷の絶対値である。Ｅｄの最適値は、実験的に決定される必要があるパラメーターである。少なくとも化学量論量のイオン対形成剤が溶液中に存在することが必須である（Ｅｓ≧１．０およびＥｄ≧１．０）。実際、我々の経験では、Ｅｓは１．１〜１０．０の範囲内、より好ましくは１．２〜６．０の範囲内、よりなお好ましくは１．５〜４．５の範囲内にあるべきである。さらに、我々の経験上、Ｅｄは１．１〜１０．０の範囲内、より好ましくは１．２〜４．０の範囲内にあるべきである。クロマトグラフィー性能の重大な低下は、イオン対形成濃度が最適でないかまたは低すぎる場合、すなわち、Ｅｓ＜１．０および／またはＥｄ＜１．０の場合に生じる。
【０１０２】
その等電点付近であるペプチドもしくはタンパク質、または中性双性イオン性置換剤の場合、ＧｓおよびＧｄはゼロ付近である。それにもかかわらず、我々は、特定の有用濃度のイオン対形成塩（イオン対形成カチオンとイオン対形成アニオンとの）が、ペプチド／タンパク質（ｐＨ約ｐＩ）および中性双性イオン性置換剤の置換バンドのシャープさを有意に増強し、それにより、より良好な置換精製に至ることを見出している。
【０１０３】
以下の実施例２において、イオン対形成塩を用いた場合、用いない場合よりも良好な結果が得られる。ペプチドはｐＨ６．０にて、２つの１＋電荷および２つの１−電荷を有し、正味電荷はゼロ付近である。置換剤はｐＨ６．０にて、１つの１＋電荷および１つの１−電荷を有し、正味電荷はゼロ付近である。Ｇｓが２でありかつＧｄが１であるとすることにより、良好なクロマトグラフィー結果が得られる。
【０１０４】
（ＲＰカラムの選択）−初期の逆相作業について、いくつかの良質のオクタデシル担持シリカおよびフェニルヘキシル担持シリカカラムが評価されるべきである（５μｍ球状粒子、寸法４．６×２５０ｍｍを伴う）。より大きな分取カラムへのスケールアップはこれからすることができ、比較的容易である。重要な問題は、適切な孔径を選択することである。過度に大きいまたは過度に小さい孔を有するマトリックスはしばしば、容量低下、および時に分解能低下に至る。上記表ＩＩＩおよびＩＶ参照。
【０１０５】
（流速）−置換クロマトグラフィーは「準平衡技術」であるので、比較的遅い流速がしばしば必要とされる。最適な流速は、分解能を損失することなく可能な限り最速の流速である。試料負荷の流速および置換剤流速は、ともに３５〜１０５ｃｍ／時間の範囲内で、ほぼ同じであるべきである。伝統薬、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドについては７５ｃｍ／時間、またはタンパク質およびＤＮＡについては４０ｃｍ／時間で開始する。再生流速は、置換流速の２〜８倍であるべきである。逆相カラム上で高温にて薬、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを精製する場合、より速い流速であっても用いられ得る。
【０１０６】
（温度）−逆相クロマトグラフィーおよび他の形態の疎水性クロマトグラフィーは大部分は＋ΔＨと共に＋ＴΔＳによって流されるので、温度が高いほど、しばしば結合が強くなり、結合反応速度が速くなり、そして分解能の差異が明瞭となる。結果として、カラムの温度およびある程度は置換剤緩衝液の温度が、バンドのブロード化を防ぐために注意深く制御されるべきである（＋／−０．５℃）。初期作業はしばしば２５℃にて実施され、次いで試料が許容しかつ有機溶媒の沸点が適切であれば、温度上昇（４５、６５℃）が試みられる。
【０１０７】
（有機溶媒の選択）−ほとんどの水混和性有機溶媒が機能するが、アセトニトリル、メタノールおよびエタノールが最も一般的に用いられる。いくつかのＤＣ精製は、有機溶媒をほとんどまたは全く用いずに実施される。これは、低塩および低有機溶媒による非変性タンパク質の実用的なＲＰＣおよびＨＩＣ精製を可能にする。有機溶媒を用いない操作は、揮発性の可燃性の溶媒に関連した安全性の問題がある場合にも有用であり得る。実験する場合、まず、ペプチド、低分子量有機薬物および小さなタンパク質についてアセトニトリル、または大きなタンパク質、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡについてメタノールを試みる。水中の試料の溶解度が許容可能であれば、キャリア緩衝液、置換剤緩衝液、および試料負荷溶液中３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、４％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨまたは５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨで開始する；これらの３つの溶液中の有機溶媒含量は、同じであるべきである。有機溶媒含量は、各試料、カラム、および置換剤について最適化される必要がある重要なパラメーターである。汎用の操作のために、有機溶媒は、約１５容積％未満、より好ましくは約１０容積％未満、よりなお好ましくは約５容積％未満であるべきである。オクタデシルカラムを用いる場合、２〜３容積％アセトニトリル、３〜４容積％エタノールまたは４〜５容積％メタノールが、通常、マトリックスの最適な機能化のために必要とされる。フェニルヘキシルカラムおよびオクチルカラムは、通常、有機溶媒の非存在を許容し得る。
【０１０８】
（ｐＨおよびｐＨ緩衝液の選択）−ｐＨ緩衝液は、試料、置換剤、イオン対形成剤中、または固定相上にイオン化可能なプロトンが存在する場合、必要とされる。いくつかの試料は、特定のｐＨ範囲内でのみ安定である。いくつかの試料については、クロマトグラフィー分解能はｐＨ依存性が強い。一般には、カチオン性試料は、中性双性イオン性置換剤およびカチオン性緩衝液を用いて精製される。カチオン性緩衝液と関連したアニオンは、イオン対形成アニオンと同じであるべきである。いくつかの場合において、異なるアニオンは、それが有意に弱いイオン対形成特性を有する限り用いられ得る。同様に、アニオン性ｐＨ緩衝液は、それが、原則のイオン対形成アニオンよりずっと弱いイオン対形成特性を有する場合用いられ得る；したがって、ギ酸または酢酸は、トリフルオロ酢酸塩がイオン対形成アニオンである場合、ｐＨ緩衝液として用いられ得る。明白な理由で、低ｐＫａ値を有する中性およびカチオン性のアミンが、有用なｐＨ緩衝液である：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（５．９，ＴＭＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン（４．２，ＤＭＰ）、ジアゾビシクロオクタン（３．０，ＤＡＢＣＯ）。
【０１０９】
同様に、アニオン性試料は、中性双性イオン性置換剤およびアニオン性ｐＨ緩衝液を用いて精製される。アニオン性ｐＨ緩衝液と関連したカチオンは、イオン対形成カチオンと同じであるべきであるが、ある場合においては、有意に弱いイオン対形成特性を有するカチオンであってもよい。さらに、時にカチオン性ｐＨ緩衝液が用いられ得るが、原則のイオン対形成カチオンより弱いイオン対形成特性を有する場合のみである；したがって、時にＮ−メチルモルホリン（７．４，ＮＭＭ）、トリエタノールアミン（７．８，ＴＥＯＡ）およびＴＲＩＳ（８．１）が、トリメチルアンモニウムまたはトリエチルアンモニウムがイオン対形成カチオンである場合、ｐＨ緩衝液として用いられ得る。中範囲のｐＫａ値を有するアニオン性化合物が、有用なｐＨ緩衝液であり得る：ＴＡＰＳ（８．４）、ＴＡＰＳＯ（７．６）、メチルホスホン酸（７．６，ＭＰＡ）、ＭＯＰＳ（７．２）、ＭＯＰＳＯ（６．９）、リン酸（６．８）、モノメチルリン酸（６．３）、亜リン酸（６．３）、ＭＥＳ（６．２）、３，３−ジメチルグルタル酸（５．９，ＤＭＧ）、コハク酸（５．２，ＳＵＣ）、酢酸（４．６，ＨＯＡｃ）。
【０１１０】
（共置換）−数百もの成分および不純物を含む試料を用いて作業する場合、共置換が、ほとんど回避不能な現象である。ＤＣ実験が起こる結合等温線のどこにでも、目的の主成分と共置換するいくつかの微量成分が存在すると思われるためである。幸いなことに、置換クロマトグラフィーにおける共置換は、分取溶出クロマトグラフィーにおける共溶出に比べて遥かに深刻な問題ではない。共置換は、２つの条件下で生じる：（１）結合等温線が非常に類似しており、分解能が不十分である場合、および（２）結合等温線の操作領域近辺で結合等温線の交叉がある場合。幸いなことに、この問題を取り扱う簡単な方法がある：異なる条件下で第二のＤＣ実験を実施することであり、以下により結合等温線上の異なる点で操作することによる：
ａ．置換剤の濃度を変更する、
ｂ．異なる結合特性を有する異なる置換剤に変更する。
あるいは、等温線自体が、以下により変更され得る：
ｃ．クロマトグラフィーマトリックス（固定相）を変更する、
ｄ．有機溶媒の濃度を変更する、
ｅ．異なる有機溶媒に変更する、
ｆ．異なるイオン対形成剤に変更する、
ｇ．温度を変更する。
第二の「直交」ＩＰ−ＲＰ  ＤＣ工程は、典型的には、優れた収率（９０〜９５％）にて優れた純度（約９９．５％）を与える。
【０１１１】
（試料負荷の方法）−２つの方法のうち１つを用いて、試料注入バルブを介して試料をカラムに負荷する。試料は、ＤＣ実験が起こる結合等温線上の同じ点で、前端クロマトグラフィー条件下にて負荷されるべきである。方法１：試料負荷ポンプが用いられる；方法２：注入ループが用いられる。通常、部分ループ注入のみが用いられる。ループ内の試料は、まずキャリアによって、次いで置換剤溶液によって、カラム上のループ外へ流されるべきである。キャリアによって希釈された試料が負荷されないように、ループ容積の８５〜９５％以下がカラム上に負荷されるべきである。
【０１１２】
（カラム負荷）−ＤＣ実験は比較的高い負荷、典型的には、最大負荷容量の６０〜８０％の範囲内で実施される。操作カラム負荷容量は定数ではなく、むしろ結合等温線上でＤＣ実験が作用する場所に依存する。
【０１１３】
使用のために、カラム容量の全部が利用可能であるわけではない（以下の「例外」参照）。実際には、カラム容量の９０〜９８％のみが使用可能である。試料をカラムに負荷したら、置換剤緩衝液をカラムにポンプ注入する。展開する３つの前端があり、各々が、異なる速度でカラム下方に移動する：（１）液体前端（Ｔ１，置換剤緩衝液−置換剤）、（２）試料前端（Ｔ２）および（３）置換剤飽和前端自体（Ｔ３）。第一の前端は、第二の前端および第三の前端よりも速く移動して、使用可能なカラム容量を制限する。これは、第一の前端が、置換トレーン（Ｔ２）が外へ出始める前にカラムから出るべきであるためである。これらの前端の実際の速度は、置換流速に直接的に依存する。これらの前端速度の割合α（Ｖｅｌ１／Ｖｅｌ２）を以下の式によって示す：
α＝Ｋｍ／（Ｒ×Ｃｄ）
ここでＫｍは、Ｃｄの置換剤濃度でのマトリックスの置換剤結合容量（ｍｇ置換剤／ｍＬ充填マトリックス）であり、Ｃｄは、置換剤緩衝液中の置換剤濃度（ｍｇ置換剤／ｍＬ置換剤緩衝液）であり、Ｒは、カラムの全容積に対するカラム中の液の容積の比（ｍＬ液／ｍＬ床容積）である。使用可能カラム容量の最大％は、以下により示される：
（１００×（α−１））／α。
以下の実施例２では、それぞれのα値は２１．９８であり、それぞれの最大使用可能容量は９５．４％である。Ｃｄが増大するにつれてＫｍもまた増大するが、等温線の非線形部の高い部分で操作する場合はそれほどでもないことに留意されたい。したがって、αが減少すると、使用可能カラム容量の最大％は減少する。
【０１１４】
前記には例外がある。有意レベルの望ましくない早期置換不純物が試料中に存在する場合は、１００％超でさえもカラムの使用可能容量を増大させ得る。これは、カラムを過負荷し、置換剤流を開始させる前の試料負荷の間にこれらの不純物をあふれ出させることによる。したがって、カラム負荷は、全試料に基づき最大１０５％であり得るが、カラム負荷は、主生成物＋後置換不純物の量に基づき８０％のみであり得る。
【０１１５】
（試料溶液の濃度および容積）−負荷試料の濃度は重要な操作パラメーターである。最適試料負荷濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、置換実験からの精製生成物の出力濃度と同じである−置換トレーンのプラトー領域。結合等温線、カラム結合容量および出力濃度は、初期は不明である。以下に示すような初期概算を用いて試料溶液をカラムに負荷する、最初の置換実験を単に実施する：
（１）作業を望む初期カラム負荷率を選定する、例えば７５％。  
試料負荷時間＝置換剤ブレークスルー時間（Ｔ３−Ｔ１）×０．７５
＝（４３４分−２２０分）×０．７５＝１６１分（以下の実施例２について）
（２）２つの方法のうち１つにより、試料の初期濃度を選定する：
（ａ）初期試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝０．２５×置換剤濃度（ｍＭ）×処方重量（ｍｇ／μモル）＝０．２５×１０ｍＭ×１．７４６６ｍｇ／μモル＝４．３７ｍｇ／ｍＬ（以下の実施例２について）
（ｂ）試料の概算カラム結合容量を選定する、例えば５０ｍｇ試料／ｍＬマトリックス。置換流速および試料負荷流速が同じであるとする：
初期試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝（カラム結合容量（ｍｇ／ｍＬｍ）×カラム容積（ｍＬｍ）／（（Ｔ２−Ｔ１）×試料流速（ｍＬ／分））
＝（５０ｍｇ／ｍＬｍ×４．１５５ｍＬｍ）／（（４３４分−２２０分）×０．２０８ｍＬ／分）＝４．６７ｍｇ／ｍＬ（以下の実施例２について)。
【０１１６】
負荷試料を用いた最初のＤＣ実験が過負荷状態（＞１００％負荷）を生じる場合、試料濃度を半分にして実験を繰り返す。試料を用いる間の最初の成功したＤＣ実験の結果から、実際の負荷濃度および実際のカラム負荷容量が容易に算出され、次いでこれらの値は第二のＤＣ実験のために試料濃度および負荷を調整するのに用いられる。
【０１１７】
（試料調製）−負荷試料溶液は、上記濃度および量にて調製される。ループの過充填または試料負荷ポンプおよび送達ラインのデッドボリュームの充填のために、十分過剰な溶液が必要とされる。ｐＨ、ｐＨ緩衝液の量および有機溶媒の量は、キャリアおよび置換剤緩衝液と同じである。試料をキャリアに溶解することでそのｐＨが変化するので、試料溶液のｐＨは、溶解後に再調整されなければならない。しかし、イオン対形成剤の量は異なっていてもよい。試料溶液において用いられるイオン対形成剤は、置換剤緩衝液において用いられるものと同じでなければならない。これに関して、試料のイオン対形成要件が、試料溶液中および置換剤溶液中でどのイオン対形成剤が用いられるかを決定づける。操作ｐＨでの形式化学電荷および主分析物の濃度に基づいて、イオン対形成剤またはイオン対形成塩の濃度が算出される。上記「イオン対形成剤の濃度」参照。
【０１１８】
試料の組成および履歴は既知であるべきである。試料がアニオンまたはカチオンを含有する場合、その化学的性質および量（濃度）もまた既知であるべきである。（ａ）アニオンまたはカチオンが存在しないことが明らかな場合、試料調製において調整はなされない。（ｂ）試料中のアニオン／カチオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成剤と同じである場合、それに応じて試料溶液へのイオン対形成剤の添加量を減らすべきである。（ｃ）試料中のアニオン／カチオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成剤よりも有意に弱いイオン対形成特性を有する場合、その存在は無視される。（ｄ）試料中のアニオン／カチオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成剤よりも強いイオン対形成特性を有する場合、進める前に、そのアニオン／カチオンは交換または除去されるべきである。
【０１１９】
（画分採集）−置換クロマトグラフィーは、優れたクロマトグラフィー分解能を与える（特に、良好なＣ１８逆相カラムを用いる最適化プロトコルの場合）。しかし、分解能は、見るのが困難である。バンドは全て、置換トレーンにおいて相次ぐバンドとして一緒にカラムから出てくるためである。小さな不純物の三角形バンドの多くは、３０秒未満の幅である（＜１００μＬ）。したがって、置換剤ブレークスルー時間が２５０分であり、かつ８０％試料負荷の実験では置換トレーンは約２００分幅であり、画分採集プロセスの間にクロマトグラフィー分解能が失われないように、４００を超える画分が採取されなければならない。４００画分の分析は実に啓発的であり興味深いが、困難な作業でもある。これは、オンラインのリアルタイム画分分析が有用である場合である。実際には、分解能を幾分か無視し、１００〜１３０のより大きな画分のみを採集し得る。この数の画分ですら分析は、相当量の作業となる。
【０１２０】
分取ＤＣ実験を実施し、精製された主成分のみを目的とする場合、画分採集プロセスは、大いに簡素化される。種々の周波数（ＵＶ）で観察された置換トレーンの形状に基づいて、目的の主バンドの始まりおよび終わりを判断し、次いで両領域において約１０画分を分析し、どの画分をプールするかを決定する。１００〜１３０画分の代わりに２０画分を分析するのは、より容易な作業である。
【０１２１】
以下の実施例２では、分析はずっと容易である。上記方法に基づいて、目的の主バンドの始まりおよび終わりを判断し、いかなる分析を行うこともなく保存的なプールを行い、最終のプールで１つの分析のみを実施する。
【０１２２】
（置換剤除去およびカラム再生）−置換剤は、いかなるｐＨ緩衝液またはイオン対形成剤も用いることなく、５〜１０カラム容積の９５／５（ｖ／ｖ）エタノール−水または８０／１０／１０（ｖ／ｖ／ｖ）アセトニトリル−ｎプロパノール−水を用いて除去される。目的は、最短時間にてカラムから置換剤の９９．９％またはそれ以上より多くを効率的に除去することである。マトリックスが増大した背圧を許容する場合、カラム再生プロセスを加速するために流速が増大される（１００〜４００ｃｍ／時間）。置換剤の最大吸収（置換剤の指示書を参照）の付近で置換剤除去を観察することは、再生プロセスがＵＶ検出によって注意深くモニタリングされて最適化されることを可能にする。
【０１２３】
（添加塩の効果）−水性溶媒中の塩によって、溶解された疎水性分析物および疎水性置換剤にとってより適切でない溶媒となり、疎水性クロマトグラフィーマトリックスに対するより強い結合を生じさせる。これは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の背後にある原理である。分析物の溶解度がこの塩溶液で十分である限り、塩の添加は、疎水性マトリックスへの分析物結合および選択性を調整するために良好な方法である。前記のように、中性双性イオン性疎水性置換剤はこの点に関して独特である。典型的なアニオン性またはカチオン性化合物とは異なり、中性双性イオン性置換剤化合物はしばしば、塩濃度が増大するにつれて溶解度が増大する。この独自の「塩溶」効果は、中性双性イオン性化合物がＨＩＣクロマトグラフィーにおいて置換剤として用いられることを可能にする。
【０１２４】
ある場合には、疎水性マトリックスに対する分析物結合は非常に弱く、十分な分析物結合を得るために添加塩が必要とされる。一般に用いられる塩溶液は、約０．５〜約２．５Ｍの濃度として、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＣｌおよびＫＣｌの１つを含む。種々の濃度での多くの異なる塩の助けで、置換モードのＨＩＣは、タンパク質の有用なクロマトグラフィー分離に多くのオプションを提供する。
【０１２５】
（機器プロトコル）−実施例１のプロトコル例を参照（デュアルポンプ操作）。前の実験から残った置換剤は問題となる可能性があるので、プロトコルは、ラインパージ操作、迅速カラム再生、および平衡操作を有する。ＨＰＬＣシステムおよびカラムが完全にクリーンであり、試料負荷直前に適切に平衡化されることを確実にするためである。これらのステップは、単に予防であり、常に必要ではない。プロトコルは、１つのプロトコルの間に以下を含む：（ａ）予備平衡化シークエンス、（ｂ）平衡化シークエンス、（ｃ）試料負荷シークエンス、（ｄ）置換シークエンスおよび（ｅ）再生シークエンス。システムにおけるデッドボリュームの問題を克服するために、カラムにポンプ注入する直前に、負荷緩衝液、置換緩衝液および試料溶液が全て、システムを通じて廃液にパージされる。このように、カラムでは、バルブ切り替え直後に無希釈溶液のシャープな前端が見える。試料溶液は、中で気泡が生じないように脱気されるべきである。注入ループを用いる場合、それらは、約１０％過充填される必要がある。過充填は、さらなる使用のために採集され得る。全量ループ注入は用いられるべきではなく、部分ループ注入のみである。経験によれば、ループチューブの内径に依存して、ループ容積の８５〜９５％のみが用いられ得ることが必要である。試料溶液は、流れる溶液と混合して、それを希釈するためである。ループ内の試料は、負荷緩衝液によってカラムに流されるが、試料負荷プロセスの終わり頃に、流す溶液は置換剤緩衝液に変更される。このことは、置換剤緩衝液それ自体がカラムに直接ポンプ注入される直前に、置換剤緩衝液がシステム全体にわたってパージされることを可能にする。再生プロセスの初期の間は、より遅い流速が用いられる。したがって、高背圧の問題が生じることはまれである。置換剤のほとんどが除去されれば、より高い流速が用いられ得る。
【０１２６】
（方法最適化）−全ての形態の分取クロマトグラフィーと同様、クロマトグラフィーの方法および手順の最適化が重要であるが、それは、いくらかの実験を要する。置換クロマトグラフィーの利益は、しばしば時間という代償を伴う。時間を要する要因は、方法最適化の間に最小化され得る。
・分離時間を考慮することなく、置換精製について最適に近い条件を決定する。
・置換剤濃度および試料負荷溶液の濃度を分解度が低下するまで増大する。
・置換流速および試料負荷流速を分解度が低下するまで増大する。
・前平衡シークエンスおよび置換剤除去／カラム再生シークエンスを短縮する。
【０１２７】
既存のプロトコルは方法の最適化の有用な開始点を提供するが、それらは、研究中の特定試料について改変を必要とする。試料プロトコル（実施例１）を以下に示すが、これは、時間を考慮することなく純度について最適化したものである。目的の試料の特定の物理的特性およびクロマトグラフィー特性に適応した方法最適化を実施することが重要である。最適化に際し、長いプロセス時間（６００〜８００分）がしばしば２００〜３００分に減少され得、またある場合には１００〜１５０分に減少され得る。
【０１２８】
置換モードで使用する疎水性クロマトグラフィーは、（ａ）高マトリックス生産性（マトリックスの寿命にわたるマトリックス１リットル当たりの生成物のグラム）、（ｂ）高容積生産性（カラム容積１リットル当たりの生成物のグラム）、（ｃ）高溶媒生産性（用いた溶媒１リットル当たりの生成物のグラム）を有するが、（ｄ）並の時間生産性（時間単位当たり生成物のグラム）を有し得る。適切な方法最適化は、時間要因を軽減する。
【０１２９】
（適切に構成した計装）：小型分取ＨＰＬＣシステムについての典型的な計装構成を以下に示す。
・主ポンプ：ステンレス鋼、チタン、セラミック、ＰＥＥＫ；正確には０．０１〜１０ｍＬ／分  流速；３０００〜４５００ｐｓｉ圧。
・オプションのカラムバイパスバルブ：２ポジション６ポート切換バルブ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）；カラムインラインまたはバイパスカラム。これは便宜オプションである。
・必要な試料注入バルブ：２ポジション６ポート注入バルブ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）、注入ループまたは試料注入ポンプ用。
・注入ループ：２０〜４０ｍＬ注入ループ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）。ループは過負荷（約１０％）されるべきである。部分ループ注入のみが用いられ、典型的には、ループ容積の８５〜９５％以下である。注入ループまたは試料ポンプのいずれか１つを用いる。
・試料ポンプ：これは、試料注入用の主ポンプと同様である。試料はポンプヘッドの流路と適合するものであるべきである。注入ループまたは試料ポンプのいずれか１つを用いる。
２ポンプ操作を用いる場合、２つのポンプの流速は、それらの流れが釣り合うように較正されるべきである。
・グラジエントミキサーは不要：置換クロマトグラフィーにおいてはグラジエントミキサーを回避または除去する。
・ＵＶ検出器：多波長またはフォトダイオードアレイ検出器、２００〜４００ｎｍ周波数範囲、短光路低体積石英フローセルを有する（０．２〜２．０ｍｍ流路、＜１０μＬ流量容積）。
・オプションの電気伝導度検出器：ＵＶ検出器後のフローセル（０．１〜２００ｍＳ、＜１００μＬ流量容積）を有する電気伝導度検出器；置換流速＜５００μＬ／分にて分析のために画分を採集する場合、伝導度フローセルを回避する。
・画分採集器：１０μＬ〜１０ｍＬ／画分（時間または滴数による）
・カラム冷却器／加熱器：０〜１００℃＋／−０．５℃。カラムを周辺温度と実質的に異なる温度で操作する場合、緩衝液溶液を加熱または冷却する配置を行う必要がある。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：粗合成α−エンドルフィンの精製のための置換プロトコル
（機器構成）：主ポンプ（１）（４つの緩衝液ラインを有する）、試料負荷ポンプ（２）（１つの溶媒ラインを有する）、ポンプ選択バルブ、カラムバイパスバルブ
ポンプ選択バルブ：６ポートバルブ（単一チャネルトグルロジックにより制御）（Ｓ３＝０、ポンプ１からカラム−ポンプ２から廃液、Ｓ３＝１  ポンプ１から廃液−ポンプ２からカラム）
カラムバルブ：６ポートバルブ（単一チャネルトグルロジックにより制御）（Ｓ６＝０、液流はカラムを通る、Ｓ６＝１、液流はカラムを回避する）
カラム後ＵＶフォトダイオードアレイ検出器（フローセル：０．５ｍｍ路長、９μＬ容積）に続き電気伝導度検出器（フローセル：１７０μＬ容積）；電気伝導度フローセルは、画分を分析のために採集中である場合、除去される。
負荷緩衝液＝ポンプ１上のＡライン（Ｓ１＝１、フローオン（ｆｌｏｗ  ｏｎ）、Ｓ１＝０  フローオフ（ｆｌｏｗ  ｏｆｆ））；置換剤緩衝液＝ポンプ１上のＢライン（Ｓ２＝１、フローオン、Ｓ２＝０  フローオフ）；置換剤除去緩衝液＝ポンプ１上のＣライン（Ｓ４＝１、フローオン、Ｓ４＝０  フローオフ）；カラム保存緩衝液＝ポンプ１上のＤライン（Ｓ５＝１、フローオン、Ｓ５＝０  フローオフ）；試料溶液＝ポンプ２上のＡライン（Ｓ７＝１，試料フローオン、Ｓ７＝０  試料フローオフ）。試料溶液を濾過（０．２μ）し、脱気する。
シークエンスの着手前、清浄したカラムをＡ緩衝液を用いて短時間パージし、カラム保存緩衝液を除去する。他の詳細の説明については実施例２を参照。
置換剤除去緩衝液（Ｃ緩衝液）＝１０％（ｖ／ｖ）１−プロパノール、１０％（ｖ／ｖ）ＤＩ水（アセトニトリル中）。
カラム保存緩衝液（Ｄ緩衝液）＝７０／３０（ｖ／ｖ）メタノール／水（ギ酸（１５ｍＭ）およびギ酸アンモニウム（１５ｍＭ）を有する）。
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
実施例２：ｐＨ６．０（ｐＨ約ｐＩ）にて置換剤７４０（中性双性イオン性置換剤）を用いる粗合成α−エンドルフィンの置換クロマトグラフィー精製（図１Ａ参照）
（操作条件）：
出発ペプチド：脱塩した粗合成α−エンドルフィン（試料Ｂ）、５９．３％純度、ＦＷ  約１．７４６６ｍｇ／μモル、電荷＝約０（＋２／−２）（ｐＨ＝６．０にて）。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０、５ｍｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍ  ＳＳ，−Ｃ１８担持シリカ。
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分。
イオン対形成塩：トリフルオロ酢酸メチルアンモニウム
温度＝２３℃          ｐＨ＝６．０
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ置換剤７４０＋２０ｍＭ  ＭＥＳ（酸）＋２０ｍＭトリフルオロ酢酸（ＤＩ水＋５％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ、ｐＨ＝６．０＋４０％  ＭｅＮＨ２中）。
負荷緩衝液：２０ｍＭ  ＭＥＳ（酸）＋２０ｍＭトリフルオロ酢酸（ＤＩ水＋５％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ、ｐＨ＝６．０＋４０％  ＭｅＮＨ２中）．
試料溶液：６．８８ｍｇ／ｍＬペプチド（ＤＩ水＋５％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ中）、２０ｍＭ  ＭＥＳ（酸）＋２０ｍＭトリフルオロ酢酸（ｐＨ＝６．０）＋４０％  ＭｅＮＨ２。
負荷量：２２６．１ｍｇ（負荷ポンプ（ポンプ２）より）；負荷時間＝１５８．０分（２．６３時間）
画分サイズ：４１６μＬ；各画分に５μＬギ酸を添加し、ｐＨを３．５に下げる；画分を即座に凍結する（−２０℃）（分析またはプールまで）。
【０１３３】
（結果）：
画分分析：画分分析は実施せず。精製画分を置換トレースの形状に基づいて保存的にプールする。  
プール生成物の分析を分析溶出ＨＰＬＣ−ＩＰＲＰクロマトグラフィーを用いて実施する。画分を２１５ｎｍでモニタリングする；算出は面積％に基づく。
総実行時間：６．２時間
出力濃度：７．０２ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：全試料基準の最大容量の７３．４％
カラム容量：約７４．１ｍｇペプチド／ｍＬマトリックス（７．０２ｍｇペプチド／ｍＬ溶液（全試料基準））
約１０７μモル置換剤／ｍＬマトリックス（１５．０μモル置換剤／ｍＬ溶液）
純度％：９９．０％
収率％：７４％；データは、画分分析なしの保存的画分プールに基づく；実際の収率は、もっと高いと思われる（８０〜８５％）。
【０１３４】
（コメント）：試料濃度／出力濃度＝０．９８
ＩＰ塩（試料中）＝２．５倍化学量論量（Ｇｓ＝２とする）
粗ペプチドから一工程で小型の「分析型」カラムを用いて、負荷容量が適度であり（７４．１ｇ／Ｌ）、純度に優れかつ収率が適度である（＞７４％収率にて９９．０％純度）という良好な結果が得られる。本実施例は、中性双性イオン性置換剤を用いたｐＨが約ｐＩ（ｐＨ＝６．０）である場合の粗合成ペプチドの精製を示すように設計される。良好な結果がその非存在下で得られる（データは示さず）が、イオン対形成塩（［ＭｅＮＨ３］［ＣＦ３ＣＯ２］）の使用によって、よりシャープな置換トレーンとなる。イオン対形成塩の２０ｍＭ濃度は、Ｇｓ＝２、Ｅｓ＝２．５、Ｇｄ＝１、Ｅｄ＝２．０とすることに基づく；上記参照。５容積％  ＥｔＯＨを含有する溶媒は、５容積％  ＭｅＣＮと共に、わずかにより良好な結果を示す（データは示さず）。置換剤置換バンドおよびペプチド置換バンドは、非常にシャープである。カチオン性置換剤を用いたｐＨ＝２．０の置換結果（データは示さず）と比べて、双性イオン性置換剤を用いたｐＨ＝６．０でのこれらの結果は、幾分低い負荷容量（７４ｇ／Ｌ対８４ｇ／Ｌ）にて、わずかにより高い純度（９９．０％対９８．８％）を示す；収率は比較され得ない。
【０１３５】
実施例３：ＨＰＬＣ分析−
方法３ａ、３ｂ−中性双性イオンについての逆相：以下を用いて分析を実施した：Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）グラジエントＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器をＤｉｏｎｅｘ／ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）Ｃｏｒｏｎａ  Ｐｌｕｓ  ＣＡＤ検出器と並列して備える）およびＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０，５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍ  ＳＳ，−Ｃ１８担持シリカ、逆相クロマトグラフィーカラム（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）。
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝液中）
ＵＶ検出：２０８〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝液：５％ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレード蒸留水中）＋０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
Ｂ緩衝液：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ中）＋０．１％（ｖ／ｖ）  トリフルオロ酢酸
サーベイグラジエント法：１００％Ａ                ０〜２分
１００％Ａから１００％Ｂ  ２〜６２分
１００％Ｂ                ６２〜７０分
分析グラジエント法：    １０％Ｂ                ０〜２分
１０％Ｂから５０％Ｂ    ２〜５７分
５０％Ｂから１００％Ｂ  ５７〜６２分
１００％Ｂ                ６２〜６７分
【０１３６】
方法３ｃ−長鎖アルキルハライドについての逆相：
１０ａ、１０ｂと同じ
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝液中）
ＵＶ検出：２００〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝液：５％ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレード蒸留水中）＋０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
Ｂ緩衝液：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ中）＋０．１％（ｖ／ｖ）  トリフルオロ酢酸
グラジエント法：  ５０％Ａ／５０％Ｂ                    ０〜２分
５０％Ａ／５０％Ｂから１００％Ｂ      ２〜６２分
１００％Ｂ                            ６２〜７０分
【０１３７】
実施例４：Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルオクチルアミン（ｆｗ＝２３３．３９）の調製
２５４．５ｇの新たに蒸留したＮ−メチルベンジルアミン（２．１モル、ｆｗ＝１２１．１８、約２７１ｍＬ）を、１Ｌの４口丸底フラスコ（加熱用マントル、メカニカルスターラー、２５０ｍＬ添加漏斗、還流冷却器およびテフロン（登録商標）コーディング熱電温度計を備える）中で３５０ｍＬの攪拌中のアセトニトリルに添加する。反応をゆるやかなＮ２パージとともに窒素雰囲気下で実施する。１３５．２ｇの新たに蒸留した１−ブロモオクタン（０．７０モル、ｆｗ＝２２１．１９、約１２１ｍＬ）を、反応発熱が５５〜６５℃の範囲の反応温度を維持するような速度にて、滴下しながら攪拌中の混合物に添加する。これらの条件下、ブロモオクタン添加は、約２時間を要する。全ブロモオクタンを添加し、反応温度が４５℃を下回った後、攪拌中の反応混合物を８０℃にて２時間加熱し、次いで冷却させた。反応混合物をＨＰＬＣによって定期的にモニタリングし、ブロモオクタンが完全に消費されたことを確認する。反応が冷却されるにつれて、生成物のより密度の低い上層が形成し始める。反応が周辺温度にまで冷却されると、１００ｍＬの蒸留水を攪拌中の混合物に少しずつ添加し、これにより、層分離を促進しかつ臭化水素酸アミンの結晶化を防ぐ。反応混合物を１Ｌ分液漏斗に移し、それらを２時間にわたり約−２０℃にまで冷却し、完全な層分離を達成させる。下の層を捨て、上の層を漏斗中に残す。１．０Ｌの１０％  ｗ／ｗ  ＮａＯＨ（蒸留水中）を添加し、混合物を十分に混合し、次いで約１時間、沈殿させる。再度層が分離すると、上の生成物層を残し、１．０Ｌ蒸留水を混合物に添加し、十分に混合する。約２時間後に層が分離すると、上の生成物層をロータリーエバポレーター（８０℃浴温度）に入れ、水、アセトニトリル、および残余する出発アミンを除去する。この手順により、１４３ｇ（８８％）の淡黄色の粘性の液体が、９６〜９８％の純度にて得られる（ＧＣ、ＨＰＬＣ）。主要不純物は出発アミンである（２〜４％）。この物質を減圧蒸留（１７２〜１７５℃、１トール）することで、無色液体（９９．８％純度）が９０％蒸留収率で得られる。出発物の二級アミンおよびハロゲン化一級アルキルがそれら自体純粋であれば、これは、良質な生成物を生じるクリーンな反応である。
【０１３８】
実施例５：Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−ｎオクチルグリシン分子内塩（ｆｗ＝２９１．４３）の調製
１１６．７ｇの蒸留Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルオクチルアミン（０．５０モル、ｆｗ＝２３３．３９、１３２ｍＬ）を５００ｍＬの４口丸底フラスコ（メカニカルスターラー、２５０ｍＬ添加漏斗、およびテフロン（登録商標）コーディング熱電温度計を備える）に添加する。反応をゆるやかなＮ２パージとともに窒素雰囲気下で、溶媒なしで実施する。周辺温度で攪拌中のアミンに、８４．２ｇの蒸留ブロモ酢酸、メチルエステル（０．５５モル、ｆｗ＝１５２．９７、約５４ｍＬ）を、約４５分にわたって滴下しながら添加する。少しではあるが顕著な発熱がある。初期の均質な反応混合物を、これが過粘性となるまで（約１時間）攪拌する。１５分以内に、粘性の下方の生成物層が形成する。この混合物を室温にて２０時間静置する。この間に、全ての混合物が黄色の粘性油状物になる。過剰なアルキル化剤をデカンテーションにて取り除き、そしてこの粘性油をＭＴＢＥにて注意深く数回洗浄する。ＭＴＢＥ洗浄液は捨てる。残余ＭＴＢＥをロータリーエバポレーターを用いて除去し、粗粘性黄色油を得る。この水溶性の油状生成物を３５０ｍＬ蒸留水に室温にて溶解し、透明な淡黄色の溶液を得る。周辺温度にて、７５ｇの４５％ＫＯＨ水溶液を滴下にて、ポリプロピレンフラスコに入れた攪拌中の水性混合液に添加する。室温にてほぼ即座にエステル鹸化が生じる。混合物を８０℃に短時間（３０分）加熱し、確実に反応を完了させる。溶媒（水）をロータリーエバポレーターを用いて完全に除去し、粘着性の淡黄色の生成物残渣を生じる。この生成物を最少量のイソプロピルアルコール中に取り込み、次いで濾過し、白色固体（ＫＢｒ）を除去する。透明な濾液をＭＴＢＥで倍散（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）すると、淡黄色油を形成する。溶媒をデカンテーションにて取り除き、そして油状生成物をＭＴＢＥで洗浄し、ＭＴＢＥは捨てる。生成物中の残余ＭＴＢＥをロータリーエバポレーターを用いて除去する。この油を最少量の無水エタノール中に溶解し、次いで水で倍散する。水／エタノール溶媒をデカンテーションにて取り除き、粘性の無色液体を得る。もう一度イソプロパノール／ＭＴＢＥでの倍散、その後エタノール／水での倍散を実施する。生成物を一晩真空オーブン中で乾燥し、そして室温に冷却し、無溶媒の無色の粘性油として純粋生成物を形成する（１１７ｇ、８０％収率）。この物質は、分析上純粋であり、そして限られたものではあるが十分な蒸留水溶解度を有する。無機塩（ＫＢｒ、ＮａＣｌ）および有機塩（［ＭｅＮＨ３］［ＣＦ３ＣＯ２］）の存在下で、水溶解度は有意に増大する。周辺温度に静置した後、油はゆっくりと固化し、ろう状の低融点固体を形成する。
【０１３９】
β−アラニン誘導体を、同様に、ブロモプロピオン酸、メチルエステルから生成する；初期の臭化四級アンモニウムは白色結晶固体であるが、加水分解された双性イオンは粘性液体である。プロパンスルトンおよびブタンスルトンとの反応をアセトニトリル中でアミンを用いて実施する；反応が完了した後、溶媒を除去し、ワークアップ（ｗｏｒｋｕｐ）は同様である。ブロモエタンスルホン酸ナトリウムとの反応を９５／５ｗｔ％エタノール／水中で実施する。Ｃ１１、Ｃ１０およびＣ９化合物のほとんどは、低融点固体として単離される。ほとんどのＣ８およびＣ７化合物は、粘性液体として単離され、そのうちいくらかはゆっくりと固形化する。
【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
【表７】
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【図１】
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【国際調査報告】
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