(57)【要約】  本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善に用いられる、細胞表面マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現しない間葉細胞集団を提供する。ＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの発現の低下による最も重大な結果は、ＮＫ介在性認識に対するそれらの抵抗性の増加であると考えられる。ｈＡＳＣは、宿主において期間を延長して残存することができ、養子細胞療法に最適な特性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された間葉幹細胞集団であって、該集団の細胞がＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現しないことを特徴とする、細胞集団。
【請求項２】
細胞表面マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、１Ｂ１０（αＦＳＰ）、ＦｃｅＲ１αおよびＣＤ１３３の少なくとも１つ、好ましくはそのすべてについて陽性であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞集団を単離する方法であって、
（ｉ）脂肪組織の試料から細胞懸濁液を調製する工程と；
（ｉｉ）前記細胞懸濁液から細胞を回収する工程と；
（ｉｉｉ）前記細胞を、固体表面上の適切な細胞培養培地で、細胞が固体表面に接着し、増殖することができる条件下でインキュベートする工程と；
（ｉｖ）非接着細胞を除去する工程と；
（ｖ）前記培地で少なくとも２回継代した後、前記固体表面に接着したままの細胞を選択する工程と；
（ｖｉ）個々の細胞または亜集団におけるマーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の存在または非存在を決定する工程と
（ｖｉｉ）マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５について陰性である細胞または亜集団を選択する工程と
を少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項４】
Ｔ−ｒｅｇ細胞集団の調製方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の細胞集団を末梢血白血球と接触させる工程と、
（ｂ）Ｔ−ｒｅｇ細胞集団を選択する工程と
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項５】
請求項４の方法によって得られる、単離されたＴ−ｒｅｇ細胞集団。
【請求項６】
請求項１から２のいずれか一項に記載の細胞集団、または請求項５に記載のＴ−ｒｅｇ細胞集団と、医薬的に許容される担体とを少なくとも含んでなる、医薬組成物。
【請求項７】
自己免疫疾患、炎症性障害、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療、または改善するための、請求項１から２のいずれか一項に記載の細胞集団、または請求項５に記載のＴ−ｒｅｇ細胞集団、または請求項６に記載の医薬細胞組成物の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患、炎症性障害、または免疫介在性疾患に関連する１つまたはそれ以上の症状を、前記障害または疾患に罹患している被検体において予防、治療、または改善するための方法であって、当該治療を必要とする前記被検体に、予防上または治療上有効な量の請求項１から２のいずれか一項に記載の細胞集団、または請求項５に記載のＴ−ｒｅｇ細胞集団、または請求項６に記載の医薬細胞組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
前記炎症性疾患が慢性炎症性疾患である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記慢性炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および関節リウマチ（ＲＡ）から選択されるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の細胞を選択する方法であって、
ｉ）少なくとも２つの細胞系統に分化する能力を有する細胞を含む間葉幹細胞集団を用意する工程と、
ｉｉ）前記脂肪由来細胞集団の細胞または亜集団におけるマーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の存在または非存在を決定する工程と、
ｉｉｉ）マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５について陰性である細胞または亜集団を選択する工程と
を少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成体組織由来の細胞集団を利用した、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善に関する。特に、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善に用いられる、細胞表面マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現しない間葉幹細胞集団を提供する。
【背景技術】
【０００２】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、種々の細胞型に分化できる多能性成体幹細胞である。ＭＳＣは、従来は骨髄から単離されていたが、最近の報告では、胎児の肝臓および肺、脂肪組織、骨格筋、羊水、滑膜、歯髄、および皮膚を含む種々の組織からの単離およびインビトロ増幅が行われている。ＭＳＣは、まず、その多分化能によって、そしてさらに重要なことには、局所前駆細胞を活性化し得る栄養因子の分泌によって、組織再生特性を有すると考えられている。ＭＳＣはまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、γδＴ細胞およびインバリアントＮＫＴ細胞の増殖および細胞傷害能を阻害する、強力な免疫調節能も有する。さらに、ＭＳＣは、抗原プロセシングおよび提示の効率を制限し、樹状細胞機能を調節することによって宿主免疫に影響を及ぼす。
【０００３】
間葉幹細胞（以下、ｈＡＳＣともいう）は、脂肪吸引手順により得ることができ、幹細胞の特性を有する、臨床的に有用な多数の細胞をもたらす。これらの細胞は、細胞療法のための興味深いツールであり、臨床診療のために培養で長期にわたって増幅され得る。ｈＡＳＣの治療への応用は研究中であり、いくつかの臨床治験が、移植片対宿主病、瘻孔、クローン病および尿失禁において進行中である。ｈＡＳＣの前臨床研究活動は、糖尿病、脊髄損傷、ハンチントン病、多発性硬化症、虚血、関節リウマチ、皮膚再生、神経膠芽腫および大腸炎といった多様な疾患に現在集中している。
【０００４】
ｈＡＳＣおよび骨髄間葉幹細胞（以下、ｈＢＭ−ＭＳＣという）は、異なる起源に由来するが、その分化能およびその免疫抑制機序において機能的類似性を共有する。
【０００５】
インビトロにおけるＭＳＣの免疫原性は低いが、患者の免疫抑制なしに同種異系セッティングにおいてＭＳＣを用いることには依然慎重でなければならない。適応免疫系におけるＭＳＣの重要な役割を考えると、この幹細胞の免疫特権が自然応答の状況で維持されるか否かを、特に同種異系セッティングにおいて明確にすることは、治療への応用にとって価値がある。その意味では、ｈＢＭ−ＭＳＣおよび歯髄由来ＭＳＣ（ＤＰ−ＭＳＣ）が、ＮＫ細胞などの細胞傷害性免疫エフェクターによって溶解され得ることが、いくつかのグループによって報告されている。これらの細胞のＮＫ感受性は、ＮＫ細胞と標的細胞との間の複数の相互作用に関与する活性化レセプターに対するリガンドの発現に起因し得る。ＮＫ細胞による同種異系ＭＳＣの認識および溶解は、安全性（免疫拒絶反応に関連する副作用）および効力（患者における細胞の持続性の低下）に影響するため、ＭＳＣとＮＫ細胞の相互作用を理解することは、それらの治療用途の可能性を最適化するために重要である。
【０００６】
ＮＫ細胞は、事前の感作なしに標的細胞を殺傷する能力を有するリンパ球系細胞のサブセットである。ＮＫ細胞の活性化は、活性化レセプターとこれらの各リガンドとの間の特異的な相互作用により介在される。これらの活性化レセプターは、結合すると、溶解およびサイトカイン放出を誘導する。反対に、ＮＫ細胞抑制へ均衡を転換させるために、抑制性のＮＫ細胞レセプターによってＮＫ細胞の活性化が阻止される。
【０００７】
ＤＮＡＭ−１などの活性化レセプターに対するリガンドは、ｈＢＭ−ＭＳＣ細胞の表面上で同定されており、活性化ＮＫ細胞がｈＢＭ−ＭＳＣを殺傷できること、およびＮＫレセプターの活性化が関与していることが実証されている。
【０００８】
本発明は、ＤＮＡＭ−１に対するＮＫレセプターリガンドを発現しない間葉幹細胞の単離された集団を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、免疫調節剤として作用することが可能な、脂肪組織に存在する多分化能を有する細胞集団を提供する。本発明者らは、細胞表面マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現しない間葉幹細胞の集団を単離した。この細胞の免疫調節効果は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するために用いられ得る。治療剤としての間葉幹細胞の使用は当該技術分野で公知であるが、本明細書に開示した細胞集団は、患者のＮＫ細胞に認識されないために患者により長く存続することによって、より大きな治療効果を発揮する可能性があるという点で、これまでに開示された細胞集団を超える重要な利点を示す。
【００１０】
したがって、一つの態様において、本発明は、細胞集団の細胞が細胞表面マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現しない間葉幹細胞集団に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、前記細胞集団の単離方法に関する。この方法により得られる細胞集団は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善に用いられる前記細胞集団に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性疾患を治療するための、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための、前記細胞集団に関する。特定の実施形態において、上記炎症性疾患は、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または関節リウマチ（ＲＡ）などの慢性炎症性疾患である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、例えば、移植免疫寛容を誘導するための医薬、または自己免疫疾患を治療するための医薬、または炎症性疾患を治療するための医薬、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための医薬など、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善のための医薬のような、医薬の調製における前記細胞集団の使用に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の調製または産生における前記細胞集団の使用に関する。前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団およびその単離方法は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性疾患を治療するための、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための、前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、例えば、移植免疫寛容を誘導するための医薬、または自己免疫疾患を治療するための医薬、または炎症性疾患を治療するための医薬、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための医薬、またはアレルギー（例えば、限定されないが、ＩＶ型過敏症反応）を治療するための医薬など、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善のための医薬のような、医薬の調製における前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団の使用に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、適切な条件下で制御された電離放射線源を用いて細胞集団を放射線照射する工程を含む、放射線照射細胞集団の単離方法に関する。前記放射線照射細胞集団は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性疾患を治療するための、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための、前記放射線照射細胞集団に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、例えば、移植免疫寛容を誘導するための医薬、または自己免疫疾患を治療するための医薬、または炎症性疾患を治療するための医薬、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための医薬など、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善のための医薬のような、医薬の調製における前記放射線照射細胞集団の使用に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、前記細胞集団をインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）での処理に付す工程を含む方法に関する。前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性疾患を治療するための、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための、前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、例えば、移植免疫寛容を誘導するための医薬、または自己免疫疾患を治療するための医薬、または炎症性疾患を治療するための医薬、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための医薬など、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善のための医薬のような、医薬の調製における前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団の使用に関する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、前記細胞集団を（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）ＩＦＮ−γでの刺激に付す工程を含み、処理（ｉ）および（ｉｉ）が任意の順序で行われる、方法に関する。前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団またはＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性疾患を治療するための、前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団またはＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団に関する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、例えば、移植免疫寛容を誘導するための医薬、または自己免疫疾患を治療するための医薬、または炎症性疾患を治療するための医薬、または免疫介在性炎症性疾患を治療するための医薬など、被検体の免疫系の調節が有益である障害の１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善のための医薬のような、医薬の調製における前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団またはＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団の使用に関する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、免疫介在性炎症性疾患または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するための前記細胞集団、または前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団、または前記放射線照射細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団、または前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団の使用に関する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、または免疫介在性疾患に関連する１つまたはそれ以上の症状を、前記障害または疾患のいずれかに罹患している被検体において予防、治療、または改善する方法であって、このような治療を必要とする前記被検体に、予防上または治療上有効な量の前記細胞集団、または前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団、または前記放射線照射細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団、または前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団を投与する工程を含む方法に関する。本発明はまた、併用療法における前記方法の使用に関し、換言すれば、本発明の細胞集団は１つまたはそれ以上の薬剤とともに、第二のまたはさらなる薬剤と同時に、あるいは別々に（例えば順次に）併用投与される。
【００２９】
別の態様において、本発明は、前記細胞集団、または前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団、または前記放射線照射細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団、または前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、細胞が細胞表面マーカーＤＮＡＭ−１を発現するか否かを確認する工程を含む、成体多能性細胞を分化細胞から識別する方法に関する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、前記細胞集団、または前記Ｔ−ｒｅｇ細胞集団、または前記放射線照射細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ処理細胞集団、または前記放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団、または前記ＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞集団を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣにおけるＨＬＡ分子およびＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの発現。健常ドナーから得たｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣを、多色フローサイトメトリーによって表現型的に特性決定した。ＨＬＡ分子およびＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの定量は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をそのネガティブコントロール（括弧内の数字）で除して算出される平均相対蛍光強度（ＭＲＦＩ）として示される。正規化スコアは、以下のキーにより蛍光強度から決定される：値＜１，５＝陰性、＞１，５＜２＝＋／−、２〜１０＝＋、＞１０＜１００＝＋＋、＞１００＝＋＋＋。各マーカーの代表的なヒストグラムは、左カラム（ｈＡＳＣ）と右カラム（ｈＢＭ−ＭＳＣ）の両方に示される。黒くはっきりとしたヒストグラムは、マーカー発現を示し、空の線はネガティブコントロールを表す。略語：ＨＬＡ−ＡＢＣ、組織適合遺伝子座抗原−ＡＢＣ；ＨＬＡ−ＤＲ、組織適合遺伝子座抗原−ＤＲ；Ｐ、継代；ＵＬＢＰ、ＵＬ１６結合タンパク質；ＮＣＲ、ナチュラル細胞傷害性レセプター；Ｆｃ、ＩｇＧのフラグメント結晶化可能領域；ＤＮＡＭ、ＤＮＡＸアクセサリー分子−１。
【図２】ｈＡＳＣはＩＬ−２増幅ＮＫ細胞において低い脱顆粒を誘導する。同種異系ＰＢＭＣ細胞をｒｈＩＬ−２で５日間予備刺激し、次いでＣＤ５６＋ＣＤ３−表現型に基づいて選別した。細胞傷害性顆粒エキソサイトーシスを定量するために、１：１（ＮＫ：標的）の比率で標的細胞（ｈＡＳＣ、ｈＢＭ−ＭＳＣ、Ｋ５６２、または無し）と共培養した精製ＮＫ細胞の活性化の後に、ＣＤ１０７ａ／ｂの表面発現を解析した。上図は、ＣＤ５６陽性細胞上のＣＤ１０７ａ／ｂのパーセンテージの平均値および標準偏差を示す。下列は、各条件の代表的なドットプロットを示す。プロット内の数値は、精製ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ／ｂのパーセンテージを表す。結果は５回の独立した実験の代表的なドットプロットとして示す。＊ｐ≦０．０５。
【図３】ｈＡＳＣはＩＬ−２増幅ＮＫ細胞においてＩＦＮ−γ産生を誘導する。同種異系ＰＢＭＣ細胞をｒｈＩＬ−２で５日間予備刺激し、次いでＣＤ５６＋ＣＤ３−表現型に基づいて選別した。１：１（ＮＫ：標的）の比率で標的細胞（ｈＡＳＣ、ｈＢＭ−ＭＳＣ、Ｋ５６２、または無し）で精製ＮＫ細胞を活性化した後、抗ヒトＩＦＮ−γを用いてＮＫ細胞の細胞内染色を行った。結果は、代表的なドットプロットとともに、６回の独立した実験の平均値±ＳＤとして示す。各条件の代表的なドットプロットを図に示し、各プロットの数値は精製ＮＫ細胞でのＩＦＮ−γのパーセンテージを示す。
【図４】ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣは接触依存性または非依存性機序によってＮＫ細胞活性を低下させた。ＣＤ５６＋ＣＤ３−表現型に基づいて選別された同種異系ＮＫ細胞を、ｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣの存在下または非存在下で１：１の比率で、トランスウェル中または直接接触させて７２時間、共培養した。これらの細胞を、続いてＮＫ感受性標的細胞株（Ｋ５６２細胞）に対する脱顆粒アッセイで試験した。上側のグラフは、ｈＡＳＣとともにプレインキュベートしたＮＫ細胞の脱顆粒を示す。下側のグラフは、ｈＢＭ−ＭＳＣとともにプレインキュベートしたＮＫ細胞の脱顆粒を示す。数値は、４回の独立して行った実験の平均値±ＳＤを表す。略語：ＮＫｈＡＳＣ、ｈＡＳＣで前感作したナチュラルキラー；ＮＫｈＢＭ−ＭＳＣ、ｈＢＭ−ＭＳＣで前感作したナチュラルキラー；ＮＫ対照、単独で培養したナチュラルキラー。＊ｐ≦０．０５。
【図５】ＮＫ細胞はＩＤＯ誘導を介してｈＡＳＣの免疫調節活性を促進する。上側および下側のグラフは、比率１：１で７２時間共培養したＮＫ／ｈＡＳＣまたはＮＫ／ｈＢＭ−ＭＳＣ由来の上清中のトリプトファン（Ｔｒｐ）およびキヌレニン（Ｋｙｎ）濃度をそれぞれ示す。馴化上清はＨＰＬＣ法で測定した。黒いバーは接触条件の平均値および標準偏差を示し、白いバーはトランスウェル条件の平均値および標準偏差を示す。バーに示す値は、４回の独立して行った実験の平均値±ＳＤを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
上記のように、本発明者らは、細胞表面マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現せず、免疫調節剤として作用することができる、間葉由来組織に存在する多分化能を有する細胞集団を単離した。上記細胞の免疫抑制性の免疫調節作用は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するために用いられ得る。
【００３４】
定義
本明細書の理解を容易にするために、本発明に関するいくつかの用語および表現の意味を以下に説明する。必要な場合には、明細書に従って、さらなる定義が包含される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「間葉幹細胞」（本明細書で「ＭＳＣ」ともいう）という用語は、元々は間葉に由来し、複数の異なる種類の細胞を生じさせることができる細胞を意味するものとする。この用語は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または筋細胞の少なくとも１つに分化することができる細胞をいう。ＭＳＣは、任意の種類の組織から単離され得る。通常、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血から単離される。
【００３６】
「免疫調節剤」という用語は、免疫系の１つまたはそれ以上の生物活性を阻害または低下させる薬剤をいう。免疫調節剤は、１つまたはそれ以上の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の１つまたはそれ以上の生物活性（例えば、増殖、分化、プライミング、エフェクター機能、サイトカインの産生、または抗原の発現）を阻害または低下させる薬剤である。
【００３７】
「免疫疾患」という用語は、被検体の免疫学的反応によって引き起こされる、細胞傷害、組織傷害および／または臓器傷害を特徴とする、被検体における状態をいう。用語「自己免疫疾患」とは、被検体の免疫学的反応によって引き起こされる、被検体自身の細胞、組織および／または臓器に対する細胞傷害、組織傷害および／または臓器傷害を特徴とする、被検体における状態をいう。本発明の免疫調節細胞で治療され得る自己免疫疾患の例示的で非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦｌＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡（ｃｉｃａｔｒｉｃａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、サルコイドーシス、強皮症、進行性全身性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｉｓｔｉｓ）／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎性血管炎などの血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質症候群、神経系の自己免疫疾患、家族性地中海熱、ランバート・イートン筋無力症症候群、交感性眼炎、多腺性内分泌障害、乾癬などが挙げられる。
【００３８】
「免疫介在性炎症性疾患」という用語は、正常な免疫応答の調節不全に起因するか、それに関連するか、またはそれによって誘発される、慢性または急性の炎症を特徴とする任意の疾患、例えば、クローン病、１型糖尿病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、橋本病、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性大腸炎、自己免疫性溶血性貧血、不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドウ病、血小板減少性紫斑病、ギランバレー症候群、アレルギー、喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、低形成性貧血、および臓器移植後の拒絶反応を意味するものとする。
【００３９】
「セリアック病（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）」はあるいは、セリアック病（ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアックスプルー（ｃ（ｏ）ｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ）、非熱帯性スプルー、地方病性スプルー（ｅｎｄｅｍｉｃ  ｓｐｒｕｅ）、グルテン腸症またはグルテン過敏性腸症、およびグルテン不耐性ともいう。
【００４０】
本明細書に記載される本発明の目的上、「免疫障害」は、自己免疫疾患および免疫介在性疾患を含む。
【００４１】
「炎症性疾患」という用語は、炎症、例えば、慢性炎症を特徴とする、被検体における状態をいう。炎症性障害の例示的で非限定的な例としては、セリアック病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解症、アレルギー性障害、敗血性ショック、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、炎症性血管炎（ｖａｃｕｌｔｉｄｅｓ）（例えば、結節性多発性動脈炎、ウェゲナー（Ｗｅｇｎｅｒ’ｓ）肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎、およびリンパ腫様肉芽腫症（ｌｙｍｐｈｏｍａｔｏｉｄ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｕｓ））、外傷後血管の血管形成（例えば、血管形成術後の再狭窄）、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解症、慢性肝炎、および慢性ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
細胞集団に適用される「単離」という用語は、ヒトまたは動物の体から単離された細胞集団であって、インビボまたはインビトロで上記細胞集団に関連する１つまたはそれ以上の細胞集団を実質的に含まないものをいう。
【００４３】
「ＭＨＣ」（主要組織適合複合体）という用語は、細胞表面抗原提示タンパク質をコードする遺伝子のサブセットをいう。ヒトでは、これらの遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。本明細書では、略語ＭＨＣまたはＨＬＡは、同義的に使用される。
【００４４】
「被検体」という用語は、動物、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウス）および霊長類（例えば、サル、またはヒト）を含めた哺乳類をいう。好ましい実施形態において、被検体はヒトである。
【００４５】
「Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するリンパ球のサブセットである免疫系の細胞をいう。
【００４６】
「調節性Ｔ細胞」（Ｔ−ｒｅｇ細胞）という用語は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病的自己反応性（すなわち、自己免疫疾患）を防ぐＴ細胞サブセットをいう。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」および「治療すること」という用語は、本発明の細胞集団、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞集団、または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞集団、またはこれらを含む医薬組成物を、当該治療が必要な被検体へ投与することによって生じる、障害（炎症性障害、自己免疫疾患、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるが、これらに限定されない）に関連する１つまたはそれ以上の症状の改善をいう。
【００４８】
「併用治療」という用語は、炎症性障害、自己免疫疾患、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない障害に関連する１つまたはそれ以上の症状の改善のための本発明の方法で、本発明の細胞集団を、他の活性薬剤または治療モダリティとともに使用することをいう。これらの他の薬剤または治療は、このような障害の治療のための公知の薬物および治療を含み得る。本発明の細胞集団はまた、副腎皮質ステロイド、非ステロイド系抗炎症化合物、または炎症の治療に有用な他の薬剤と組み合わせてもよい。本発明の薬剤とこれらの他の治療または治療モダリティとの併用は、同時であっても、または順次に施されてもよい。すなわち、２つの治療は、本発明の細胞集団またはそれを含む医薬組成物が、他の治療または治療モダリティの前または後に施されてもよいように、分けられ得る。主治医は、細胞集団、またはこれを含む医薬組成物を、他の薬剤、治療または治療モダリティと組み合わせて投与する適切な順序を決定し得る。
【００４９】
本発明の細胞
一つの態様において、本発明は、単離された間葉幹細胞集団（以下、「本発明の細胞集団」という）に関し、上記細胞集団の細胞がマーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現しないことを特徴とする。ＭＳＣは、多数の間葉由来の組織および他の組織（骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。本発明で使用されるＭＳＣは、いくつかの実施形態において、好ましくは骨髄から（ＢＭ−ＭＳＣ）または脂肪組織から（ＡＳＣ）単離され得る。本発明の特に好ましい態様において、ＭＳＣは、吸引脂肪組織（それら自体が脂肪組織から得られる）から得られる。ＡＳＣの生成は、例えばＷＯ−Ａ−２００６／１３６２４４に記載されるように、当該技術分野で公知である。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明の細胞集団の細胞は、哺乳類（例えば、齧歯類、霊長類など）に由来し、好ましくはヒトに由来する。
【００５１】
マーカー
本発明の細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５を発現せず、したがって、これらのマーカーについて「陰性」であるとみなされる。したがって、本発明の細胞は、前述の間葉幹細胞の亜集団を構成しない。
【００５２】
さらに、本発明の細胞は、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、１Ｂ１０（αＦＳＰ）、ＦｃｅＲ１αおよびＣＤ１３３の少なくとも１つ、２つ、または好ましくはすべてについて、好ましくは陰性である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、ＣＤ１１２（ＩＬ２ＲＢ）およびＣＤ１５５（ＰＶＲ、ネクチン２）という用語は、そのゲノム配列（ＮＭ＿０００８７８．２（ＣＤ１１２）およびＮＭ＿００１１３５７６８．１、ＮＭ＿００１１３５７６９．１、ＮＭ＿００１１３５７７０．１またはＮＭ＿００６５０５．３（ＣＤ１５５））から転写されたポリペプチドまたはフラグメント（すべてのスプライシング改変体およびアイソフォームを含む）であり、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）のリガンドに結合することができるか、またはこのリガンドとして機能することができるものを意味するものとする。
【００５４】
好ましい実施形態において、ＣＤ１１２という用語は、配列番号１によるアミノ酸配列またはその細胞外領域（アミノ酸２７〜２４０）と少なくとも８５％同一（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一）の配列を含むポリペプチドを意味するものとする。
【００５５】
本明細書で使用される場合、ＣＤ１５５はという用語は、配列番号２によるアミノ酸配列またはその細胞外領域（アミノ酸２１〜３４３）と少なくとも８５％同一（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一）の配列を含むポリペプチドを意味するものとする。
【００５６】
本明細書で使用される場合、細胞表面マーカーに関して「陰性」とは、本発明の細胞を含む細胞集団において、従来の方法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野で公知の標準プロトコルとともに用いられるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いて、フローサイトメトリーにおいて特定の細胞表面マーカーについてバックグラウンドシグナルよりも高いシグナルを示す細胞が１０％未満、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％であるか、または存在しないことを意味する。特定の実施形態において、本発明の細胞は、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ５９およびＣＤ１０５の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または好ましくはすべてを発現することを特徴とし、すなわち、本発明の細胞は、上記細胞表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ５９およびＣＤ１０５）の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つそして好ましくはすべてについて陽性である。好ましくは、本発明の細胞は、上記細胞表面マーカー（ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ５９およびＣＤ１０５）の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、そして好ましくはすべての有意な発現レベルを有することを特徴とする。本明細書で使用される場合、「有意な発現」という表現は、本発明の細胞を含む細胞集団において、１０％を上回る、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはすべての細胞が、従来の方法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野で公知の標準プロトコルとともに用いられるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いて、フローサイトメトリーにおいて特定の細胞表面マーカーについてバックグラウンドシグナルよりも高いシグナルを示すことを意味する。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ解析において各々の表面マーカーを検出するのに用いられる特異的抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体によってもたらされるシグナル強度として定義される。したがって、マーカーについて陽性とみなされるには、観察される特定のシグナルが、従来の方法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野で公知の標準プロトコルとともに用いられるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いて、バックグラウンドシグナル強度と比較して１０％より強く、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％またはそれ以上強い。
【００５７】
必要に応じて、本発明の細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）についても陰性である。
【００５８】
上記細胞表面マーカー（例えば、細胞レセプターおよび膜貫通タンパク質）に対する市販のおよび公知のモノクローナル抗体を用いて、本発明の細胞を同定することができる。
【００５９】
ＩＤＯの発現
本発明の細胞はＩＤＯを構成的に発現しないが、ＩＦＮ−γで刺激するとＩＤＯを発現する。本発明者らが行った実験では、上記細胞は、３ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられるインターロイキン−１（ＩＬ−１）、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、または１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる内毒素ＬＰＳのような他の炎症誘発性メディエーターで単独で刺激した際に、従来のＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析によって測定したところ、ＩＤＯ発現を誘導しなかったことが示されている。例えば、３ｎｇ／ｍｌ以上のＩＦＮ−γで刺激することによっても、本発明の細胞にＨＬＡＩＩの発現を誘導し、細胞表面マーカーについて本明細書で定義した陽性シグナルを生じることもできる。上記発現は、特異的タンパク質の発現を検出することができる任意の公知技術を用いて、当業者によって検出され得る。好ましくは、上記技術は、細胞サイトメトリー技術である。
【００６０】
分化
本発明の細胞は、増殖し、そして少なくとも２つ、より好ましくは３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上の細胞系統に分化する能力を示す。本発明の細胞が分化し得る細胞系統の例示的で非限定的な例としては、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、腱細胞、筋細胞、心筋細胞、造血支持間質細胞、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、および肝細胞が挙げられる。
【００６１】
本発明の細胞は、従来の方法によって増殖し、そして他の系統の細胞に分化し得る。分化細胞を同定し、続いて対応する未分化細胞から単離する方法も、当該技術分野で周知の方法によって行われ得る。
【００６２】
本発明の細胞は、エクスビボで増幅させることもできる。すなわち、単離後に、本発明の細胞を培地中で維持し、エクスビボで増殖させることができる。このような培地は、例えば、抗生物質（例えば、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含むかまたは抗生物質を含まず、２ｍＭグルタミンを含み、２〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる。培地および／または培地補充物の濃度を、用いる細胞の必要に応じて改変または調節することは、当業者の技術の範囲内にある。血清は、生存能および増幅に必要な細胞および非細胞因子および成分を含むことが多い。血清の例としては、ＦＢＳ、ウシ血清（ＢＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清（ＲＳ）などが挙げられる。本発明の細胞がヒト起源のものである場合、ヒト血清（好ましくは自己起源のもの）を用いた細胞培養培地の補充も考慮される。補体カスケードの成分を不活性化することが必要とされる場合、血清を５５〜６５℃で熱不活性化できることが理解される。血清濃度の調節、培地からの血清の除去を用いて、１つまたはそれ以上の所望の細胞型の生存を促進することもできる。好ましくは、本発明の細胞には約２％〜約２５％のＦＢＳ濃度がが有利である。別の実施形態において、本発明の細胞は、血清を、血清アルブミン、血清トランスフェリン、セレン、および当該技術分野で公知の組換えタンパク質（インスリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が挙げられるがこれらに限定されない）の組合せで置き換えた、一定の組成の培地で増幅させることができる。
【００６３】
多くの細胞培養培地はアミノ酸を既に含んでいるが、一部は細胞を培養する前に補充が必要である。このようなアミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
抗菌剤もまた、典型的に細胞培養に用いられ、細菌、マイコプラズマ、および真菌による汚染を軽減する。典型的には、用いられる抗生物質または抗真菌化合物は、ペニシリン／ストレプトマイシンの混合物であるが、アンホテリシン（ファンギゾン（登録商標））、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマシン（ｈｙｇｒｏｍａｃｉｎ）、カナマイシン、マイトマイシンなども挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
ホルモンもまた、細胞培養に有利に用いることができ、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、ｂ−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明の細胞の維持条件として、細胞を未分化形態のままにさせておく細胞因子を含むこともできる。分化の前に、細胞分化を阻害する補充物を培地から除去しなければならないことは、当業者には明らかである。また、すべての細胞がこれらの因子を必要とするわけではないことも明らかである。実際に、これらの因子は、細胞型によっては望ましくない影響を誘発し得る。
【００６７】
有利なことに、本発明の細胞は、インビボでの腫瘍形成活性を欠いている。したがって、上記細胞は腫瘍形成活性を示さない、すなわち、これらの細胞は腫瘍細胞を生じる挙動変化または増殖表現型を示さないことを特徴とする。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の細胞を、自己免疫疾患、炎症性疾患、または移植臓器および組織の拒絶反応のような免疫介在性疾患に罹患している被検体に投与して、免疫応答を抑制することができる。したがって、本発明の細胞は、腫瘍形成活性を示さないことが必要である。
【００６９】
本発明の細胞の腫瘍形成活性は、免疫不全マウス系統を用いて動物実験を行うことにより試験され得る。これらの実験では、数百万個の細胞をレシピエント動物の皮下に移植し、数週間保持し、腫瘍形成について解析を行う。詳細なアッセイは、実施例３に開示している。
【００７０】
本発明の細胞をトランスフェクトするかまたは遺伝子操作して、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドを発現させることができる。一つの実施形態において、抗原は、寛容が誘導されることが望ましい特異的抗原を提示する、精製または合成または組換えポリペプチド、あるいはこのような抗原のアミノ酸配列に由来する短い合成ポリペプチドフラグメントを含む。好ましくは、抗原の供給源は、ドナー組織移植片によって発現される抗原を含む。また、好ましくは、抗原の供給源は、患者が自己免疫障害を有するタンパク質を含む。
【００７１】
本発明の細胞の単離方法
一つの態様において、本発明は、組織試料から細胞集団を単離する方法であって、前記細胞集団の細胞が、（ｉ）マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５について陰性であり；（ｉｉ）少なくとも２つの細胞系統に分化する能力を示すことを特徴とする表現型を示し、当該方法が、
（ｉ）組織の試料から細胞懸濁液を調製する工程と；
（ｉｉ）前記細胞懸濁液から細胞を回収する工程と；
（ｉｉｉ）前記細胞を、固体表面上の適切な細胞培養培地で、細胞が固体表面に接着し、増殖することができる条件下でインキュベートする工程と；
（ｉｖ）非接着細胞を除去する工程と；
（ｖ）前記培地で少なくとも２回継代した後、前記固体表面に接着したままの細胞を選択する工程と；
（ｖｉ）個々の細胞または亜集団におけるマーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の存在または非存在を決定する工程と；
（ｖｉｉ）マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５について陰性である細胞または亜集団を選択する工程と
を少なくとも含む、方法に関する。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「固体表面」という用語は、本発明の細胞が接着することが可能な任意の材料をいう。特定の実施形態において、上記材料はその表面への哺乳類細胞の接着を促進する処理を行ったプラスチック材料であり、例えば、必要に応じてポリ−Ｄ−リジンまたは他の試薬でコーティングした市販のポリスチレンプレートである。
【００７３】
工程（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、当業者に公知の従来の技術によって行われ得る。簡潔に言うと、本発明の細胞は、任意の適切な動物（好ましくは、ヒト）由来の任意の適切な結合組織供給源から（例えば、ヒト脂肪組織から）従来の手段によって得ることができる。動物は、動物体内の結合組織細胞が生育可能である限り、生きていてもまたは死んでいてもよい。典型的には、ヒト脂肪細胞は、外科手術または吸引による脂肪組織切除のような周知のプロトコルを用いて、生きているドナーから得られる。実際に、脂肪吸引手順はごく一般的であるので、脂肪吸引流出物は本発明の細胞を得ることができる特に好ましい供給源である。したがって、特定の実施形態において、本発明の細胞は、脂肪吸引によって得られるヒト脂肪組織の間質画分に由来する。
【００７４】
脂肪組織の試料は、好ましくは、本発明の細胞を材料の残部から分離する処理を行う前に洗浄される。一つのプロトコルにおいて、組織の試料を生理学的に適合する食塩溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））で洗浄した後、激しく攪拌して静置し、この工程で、遊離物（例えば、損傷組織、血液、赤血球など）を組織から除去する。したがって、洗浄および静置工程は、一般的には上清に残骸が比較的見られなくなるまで繰り返す。残存している細胞は、一般的には様々な大きさの凝集塊で存在しており、このプロトコルは細胞自体の損傷を最小限に抑えながら全体構造を分解するように調整する工程を用いて進行する。この目的を達成する一つの方法は、洗浄した細胞塊を、細胞間の結合を弱めるかまたは破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシンなど）で処理することである。このような酵素処理の量および持続時間は使用条件によって変化するが、このような酵素の使用は当該技術分野で一般的に公知である。このような酵素処理の代わりに、またはこのような酵素処理とともに、細胞塊を、例えば機械攪拌、音波エネルギー、熱エネルギーなどの他の処理を用いて分解することができる。分解を酵素法によって行う場合には、適切な期間の後に酵素を中和して、細胞に対する有害な作用を最小限にするのが望ましい。
【００７５】
分解工程においては、典型的には、凝集細胞のスラリーまたは懸濁液と、遊離の間質細胞（例えば、赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および幹細胞）を一般に含む液体画分とを生じる。分離プロセスにおける次の段階は、凝集細胞を本発明の細胞から分離することである。これは遠心分離によって行うことができ、これによって細胞は上清に覆われたペレットとなる。次に、上清を廃棄して、ペレットを生理学的に適合する液体に懸濁させ得る。さらに、懸濁した細胞は典型的には赤血球を含み、ほとんどのプロトコルでは、それらを溶解するのが望ましい。赤血球を選択的に溶解する方法は当該技術分野で公知であり、任意の適切なプロトコル（例えば、高張培地または低張培地でのインキュベーション、塩化アンモニウムを用いる溶解によるなど）を用いることができる。赤血球を溶解する場合には、当然のことながら、次に残存している細胞を、例えば濾過、沈降、または密度分画によって、溶解物から分離すべきである。
【００７６】
赤血球が溶解しているか否かにかかわらず、懸濁した細胞を１回またはそれ以上連続的に洗浄し、再遠心分離し、再懸濁して、純度を高めることができる。あるいは、細胞を細胞表面マーカープロファイルに基づいてまたは細胞サイズおよび粒度に基づいて分離してもよい。
【００７７】
最終的な単離および再懸濁の後、細胞を培養し、必要に応じて数および生存率についてアッセイして、収率を評価することができる。細胞は、適切な細胞培養培地を用いて、適切な細胞密度および培養条件で、固体表面上で分化させずに培養するのが好ましい。したがって、特定の実施形態において、細胞は、適切な細胞培養培地［例えば、典型的には、５〜１５％（例えば、１０％）の適切な血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）を補充したＤＭＥＭ］の存在下で、通常はペトリ皿または細胞培養フラスコのようなプラスチック材料製の固体表面上で分化させずに培養し、細胞が固体表面に接着し、増殖することができる条件下でインキュベートする。インキュベーションの後、細胞を洗浄して、非接着細胞および細胞断片を除去する。細胞を、適切なコンフルエンス、典型的には約８０％の細胞コンフルエンスに達するまで、必要に応じて細胞培養培地を交換しながら、同一培地および同一条件下での培養で維持する。所望の細胞コンフルエンスに達した後、細胞を、トリプシンのような剥離剤を用い、より大きな細胞培養表面上に適切な細胞密度（通常は、２，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２）で播種する連続継代によって増幅させることができる。したがって、細胞は次に、発生表現型を保持したまま分化せずに上記培地で少なくとも２回継代され、より好ましくは、細胞は、発生表現型を失うことなく少なくとも１０回（例えば、少なくとも１５回、またはさらには少なくとも２０回）継代され得る。典型的には、細胞を約１００細胞／ｃｍ２〜約１００，０００細胞／ｃｍ２（例えば、約５００細胞／ｃｍ２〜約５０，０００細胞／ｃｍ２、またはより具体的には、約１，０００細胞／ｃｍ２〜約２０，０００細胞／ｃｍ２）などの所望の密度でプレーティングする。より低い密度（例えば、約３００細胞／ｃｍ２）でプレーティングすると、細胞をより容易にクローンとして単離することができる。例えば、数日後に、上記密度でプレーティングした細胞は、増殖して均一な集団となる。特定の実施形態において、細胞密度は２，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２である。
【００７８】
少なくとも２回の継代を含む上記処理の後に固体表面に接着したままの細胞を選択し、マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の発現を従来の方法によって解析し、本発明の細胞の同一性を確認する。一回目の継代後に固体表面に接着したままの細胞は異種起源に由来するので、上記細胞を少なくとももう一回継代に付さなければならない。少なくとも２回の継代を含む上記処理の後に固体表面に接着したままの細胞を選択し、マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の発現を従来の方法によって解析し、本発明の細胞の同一性を確認する。上記方法の結果として、目的の表現型を有する均一な細胞集団が得られる。
【００７９】
細胞表面マーカーは、通常は陽性／陰性選択に基づいて、任意の適切な従来技術によって同定することができ、例えば、細胞におけるその存在／非存在が確認されるべき細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を用いることができるが、他の技術を用いることもできる。したがって、特定の実施形態において、ＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５に対するモノクローナル抗体を用いて、選択された細胞における上記マーカーの非存在を確認する。さらなる実施形態において、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、１Ｂ１０（αＦＳＰ）、ＦｃｅＲ１αおよびＣＤ１３３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または好ましくはすべてに対するモノクローナル抗体を用いて、選択された細胞における上記マーカーの非存在を確認し、ＣＤ９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ５９およびＣＤ１０５の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または好ましくはすべてに対するモノクローナル抗体を用いて、上記マーカーの少なくとも１つそして好ましくはすべての存在または検出可能な発現レベルを確認する。上記モノクローナル抗体は公知であり、市販されているか、または当業者によって従来の方法で得ることができる。
【００８０】
選択された細胞が少なくとも２つの細胞系統に分化する能力は、当該技術分野で公知の従来の方法によってアッセイすることができる。
【００８１】
本発明によって提供される細胞および細胞集団は、好ましくは、細胞集団をクローニングする適切な方法を用いてクローンとして増幅される。例えば、増殖した細胞集団を物理的に採取して、セパレートプレート（またはマルチウェルプレートのウェル）に播種することができる。あるいは、単一の細胞を各ウェルに入れることを容易にする統計比率で（例えば、約０．１〜約１細胞／ウェルまたは約０．２５〜約０．５細胞／ウェル、例えば０．５細胞／ウェル）、細胞をマルチウェルプレート上にサブクローニングできる。当然のことながら、細胞を低密度でプレーティングし（例えば、ペトリ皿または他の適切な基体中に）、クローニングリングなどの器具を用いてそれらを他の細胞から単離することによってクローニングすることができる。クローン集団の生成物は、任意の適切な培地で増幅させることができる。いずれにせよ、単離した細胞を、発生表現型を評価することができる適切な時点まで培養することができる。
【００８２】
例えば、適切な血清（ウシ胎児血清またはヒト血清など）の特別にスクリーニングされたロットを用いることによって、分化を誘導せずに本発明の細胞のエクスビボ増幅を長期間達成できることが当該技術分野で公知である。生存率および収率を測定する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、トリパンブルー排除法）。
【００８３】
本発明の細胞集団の細胞を単離するための任意の工程および手順は、必要に応じて、手動で行うことができる。あるいは、上記細胞を単離するプロセスは、１つまたはそれ以上の適切な装置によって容易になり、かつ／または自動化することができ、これらの装置の例は、当該技術分野で公知である。
【００８４】
本発明の放射線照射細胞
必要に応じて、本発明の細胞を、ガンマ線照射装置などの適切な制御された電離放射線源を用いて放射線照射することができる。放射線照射条件は、本発明の細胞の長期増殖停止を引き起こす放射線量を与えるのに必要な曝露時間を決定するために、当業者によって実験的に調整されなければならない。上記放射線量は、例えば１〜１００Ｇｙ、５〜８５Ｇｙ、１０〜７０Ｇｙ、１２〜６０Ｇｙ、またはより好ましくは１５〜４５Ｇｙであってよい。
【００８５】
本発明の細胞は治療用途に用いられ得るので、被検体への投与前の本発明の細胞の放射線照射は有益な結果をもたらし得る。なぜなら、上記放射線照射処理により、細胞は被検体において長期間増殖または生存することができなくなるためである。上記放射線照射細胞は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００８６】
本発明の放射線照射細胞は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するために用いられ得る。
【００８７】
したがって、別の態様において、本発明の放射線照射細胞は、医薬として用いられる。特定の実施形態において、本発明の放射線照射細胞を含む医薬は、移植免疫寛容を誘導するために、あるいは自己免疫障害または炎症性障害、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患の症状を、上記障害または疾患のいずれかに罹患している被検体において治療し、これによって軽減するために用いられ得る。したがって、本発明の放射線照射細胞は、自己免疫障害または炎症性障害の症状を、上記障害のいずれかに罹患している被検体において治療的または予防的に治療し、これによって軽減するために、あるいは免疫介在性疾患の症状を、上記疾患に罹患している被検体において軽減するために用いられ得る。
【００８８】
実際に、任意の自己免疫疾患、炎症性障害または免疫介在性疾患は、本発明の放射線照射細胞で治療され得る。治療され得る上記疾患および障害の例示的で非限定的な例は、「定義」の項で前述したものである。特定の実施形態において、上記炎症性疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡなど）である。
【００８９】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するための医薬を調製するための本発明の放射線照射細胞の使用に関する。したがって、本発明はさらに、免疫応答を抑制するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性障害を治療するための医薬を調製するための本発明の放射線照射細胞の使用に関する。上記自己免疫疾患および炎症性疾患の例は前述した。特定の実施形態において、疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡ）などの炎症性疾患である。
【００９０】
本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞
さらに、必要に応じて、本発明の細胞をＩＦＮ−γで予備刺激することもできる。ＩＦＮ−γでの予備刺激の方法は、当業者に明らかである。好ましくは、ＩＦＮ−γ濃度０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、０．５〜８５ｎｇ／ｍｌ、１〜７０ｎｇ／ｍｌ、１．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、２．５〜４０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上、好ましくは３〜３０ｎｇ／ｍｌ、および好ましくは１２時間より長い刺激時間（例えば、１３時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間またはそれ以上）を用いて、細胞を予備刺激する。
【００９１】
本発明の細胞は治療用途に用いられ得るので、被検体への投与前の本発明の細胞のＩＦＮ−γでの予備刺激は有益な結果をもたらし得る。なぜなら、被検体におけるＩＦＮ−γ予備刺激細胞投与とＩＤＯ発現との間の期間を短縮することができるためである。
【００９２】
したがって、別の態様において、本発明は、ＩＦＮ−γで本発明の細胞を処理して上記細胞を予備刺激する工程を含む方法に関する。上記方法によって得られる細胞（以下、「本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞」という）は本発明のさらなる態様を構成する。本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞は、当業者に公知の従来の手段によって単離され得る。
【００９３】
本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するために用いられ得る。上記使用は本発明のさらなる態様を構成する。
【００９４】
したがって、別の態様において、本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞は、医薬として用いられる。特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞を含む医薬は、移植免疫寛容を誘導するために、あるいは自己免疫障害または炎症性障害、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患の症状を、上記障害または疾患のいずれかに罹患している被検体において治療し、これによって軽減するために用いられ得る。したがって、本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞は、自己免疫障害または炎症性障害の症状を、上記障害のいずれかに罹患している被検体において治療的または予防的に治療し、これによって軽減するために、あるいは免疫介在性疾患の症状を、上記疾患に罹患している被検体において軽減するために用いられ得る。
【００９５】
実際に、任意の自己免疫疾患、炎症性障害または免疫介在性疾患は、本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞で治療され得る。治療され得る上記疾患および障害の例示的で非限定的な例は、「定義」の項で前述したものである。特定の実施形態において、上記炎症性疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡなど）である。
【００９６】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するための医薬を調製するための本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞の使用に関する。したがって、本発明はさらに、免疫応答を抑制するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性障害を治療するための医薬を調製するための本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞の使用に関する。上記自己免疫疾患および炎症性疾患の例は前述した。特定の実施形態において、疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡ）などの炎症性疾患である。
【００９７】
本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞および本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞
また、必要に応じて、本発明の細胞を、放射線照射処理およびＩＦＮ−γ予備刺激処理に任意の順序で付すこともできる。すなわち、本発明の細胞をまず放射線照射に付し、得られた細胞をその後ＩＦＮ−γ予備刺激に付すことができ、また逆も同様に、本発明の細胞をまずＩＦＮ−γ予備刺激に付し、その後得られた細胞を放射線照射に付すことができる。
【００９８】
したがって、一つの態様において、本発明の細胞をＩＦＮ−γで予備刺激し、得られた細胞（本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞）を放射線照射して、放射線照射細胞（以下、「本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞」という）にすることができる。
【００９９】
別の態様において、本発明の細胞を放射線照射し、得られた細胞（本発明の放射線照射細胞）をＩＦＮ−γで予備刺激して、ＩＦＮ−γ予備刺激細胞（以下、「本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞」という）にすることができる。
【０１００】
細胞をＩＦＮ−γで予備刺激する方法および細胞を放射線照射する方法は当業者に周知であり、これらの方法のいくつかは前述されている。上記方法の任意のものを用いることができる。
【０１０１】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明の細胞を（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）ＩＦＮ−γでの刺激に付す工程を含み、処理（ｉ）および（ｉｉ）は任意の順序で（ＩＦＮ−γ予備刺激細胞を放射線照射するか、または放射線照射細胞をＩＦＮ−γ予備刺激する順序で）行うことができる方法に関する。上記方法によって得られる細胞は、本明細書でそれぞれ「本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞」または「本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞」といい、本発明のさらなる態様を構成する。上記本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞および上記本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞は、当業者に公知の従来の手段によって単離され得る。
【０１０２】
本発明の細胞は治療用途に用いられ得るので、予め任意の順序で放射線照射およびＩＦＮ−γ刺激に付された本発明の細胞の被検体への投与は、前述の理由で有益な結果をもたらし得る（例えば、細胞を放射線照射処理に付すと、細胞は被検体において長期間増殖または生存することができなくなり、一方、被検体への投与前のＩＦＮ−γでの細胞の予備刺激は、被検体におけるＩＦＮ−γ予備刺激細胞投与とＩＤＯ発現との間の期間の短縮に関与し得る。
【０１０３】
本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞および本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するために用いられ得る。上記使用は本発明のさらなる態様を構成する。
【０１０４】
したがって、別の態様において、本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞および本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞は、医薬として用いられる。特定の実施形態において、本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞を含む医薬は、移植免疫寛容を誘導するために、あるいは自己免疫障害または炎症性障害、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患の症状を、上記障害または疾患のいずれかに罹患している被検体において治療し、これによって軽減するために用いられ得る。したがって、本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞および本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞は、自己免疫障害または炎症性障害の症状を、上記障害のいずれかに罹患している被検体において治療的または予防的に治療し、これによって軽減するために、あるいは免疫介在性疾患の症状を、上記疾患に罹患している被検体において軽減するために用いられ得る。
【０１０５】
実際に、任意の自己免疫疾患、炎症性障害または免疫介在性疾患は、本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞で治療され得る。治療され得る上記疾患および障害の例示的で非限定的な例は、「定義」の項で前述したものである。特定の実施形態において、上記炎症性疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡなど）である。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するための医薬を調製するための本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞の使用に関する。したがって、本発明はさらに、免疫応答を抑制するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性障害を治療するための医薬を調製するための本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞の使用に関する。上記自己免疫疾患および炎症性疾患の例は前述した。特定の実施形態において、疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡ）などの炎症性疾患である。
【０１０７】
本発明のＴ−ｒｅｇ細胞
本発明はさらに、別の態様において、本発明の細胞から得られる調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）、すなわち、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病的自己反応性（すなわち、自己免疫疾患）を防ぐ細胞（Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ−ｒｅｇおよびＩＬ−１０／ＴＧＦｂ産生Ｔｒ１細胞を含む）（以下、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞といわれる）に関する。
【０１０８】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞集団の単離方法であって、
（ａ）本発明の細胞集団を末梢血白血球と接触させる工程と、
（ｂ）本発明のＴ−ｒｅｇ細胞集団を選択する工程と
を少なくとも含む方法に関する。
【０１０９】
その結果、本発明の細胞は、Ｔ細胞のサブセット（本発明のＴ−ｒｅｇ細胞）を生成するために用いることができ、これは本発明のさらなる態様を構成する。本発明のＴ−ｒｅｇ細胞は、当業者に公知の従来の手段によって単離され得る。
【０１１０】
本発明のＴ−ｒｅｇ細胞は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するために用いられ得る。上記使用は本発明のさらなる態様を構成する。
【０１１１】
したがって、別の態様において、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞は、医薬として用いられる。特定の実施形態において、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞を含む医薬は、移植免疫寛容を誘導するために、あるいは自己免疫障害または炎症性障害、または移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患の症状を、上記障害または疾患のいずれかに罹患している被検体において治療し、これによって軽減するために用いられ得る。したがって、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞は、自己免疫障害または炎症性障害の症状を、上記障害のいずれかに罹患している被検体において治療的または予防的に治療し、これによって軽減するために、あるいは免疫介在性疾患の症状を、上記疾患に罹患している被検体において軽減するために用いられ得る。
【０１１２】
実際に、任意の自己免疫疾患、炎症性障害または免疫介在性疾患は、本発明のＴ−ｒｅｇ細胞で治療され得る。治療され得る上記疾患および障害の例示的で非限定的な例は、「定義」の項で前述したものである。特定の実施形態において、上記炎症性疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡなど）である。
【０１１３】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善するための医薬を調製するための本発明のＴ−ｒｅｇ細胞の使用に関する。したがって、本発明はさらに、免疫応答を抑制するための、または移植免疫寛容を誘導するための、または自己免疫疾患を治療するための、または炎症性障害を治療するための医薬を調製するための本発明のＴ−ｒｅｇ細胞の使用に関する。上記自己免疫疾患および炎症性疾患の例は前述した。特定の実施形態において、疾患は、慢性炎症性疾患（例えば、ＩＢＤまたはＲＡ）などの炎症性疾患である。
【０１１４】
本発明はまた、選択された抗原または抗原群に特異的なＴｒｅｇ細胞の生成における本発明の細胞集団の使用、および上記抗原または抗原群に関連する疾患または障害の治療におけるこれらの細胞集団の使用も提供する。このような抗原の例は、例えば、関節リウマチ、クローン病、ＩＶ型過敏症反応、ループス、乾癬などの自己免疫疾患および当該技術分野で公知であり本明細書の他の箇所に記載される他の自己免疫障害に関与する抗原である。簡潔に言うと、本発明の細胞集団は、選択された抗原、抗原群、または上記抗原または抗原群を発現および／または提示する細胞型の存在下で、インビトロで培養される。本発明の細胞は、必要に応じて、ＩＦＮγ、ＬＰＳまたは当該技術分野で公知の他の活性化剤で予備刺激され得る。約２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間またはそれ以上、好ましくは約１２〜約２４時間の培養期間の後、本発明の細胞集団をさらに、必要に応じて抗原、抗原群、または上記抗原を有する細胞を除去した後に、被検体から得られる末梢血白血球と共培養する。この共培養により、選択された抗原に特異的なＴｒｅｇ細胞が生成し、これを被検体の治療に用いることができる。必要に応じて、これらのＴｒｅｇ細胞は、患者に投与する前に、当該技術分野で公知の培養技術を用いてエクスビボで数を拡張することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、本発明者らは、本発明の細胞集団が、細胞表面上のＨＬＡクラスＩＩを介して選択された抗原（ＩＦＮγによって誘導されると思われる）を末梢血白血球に提示でき、その結果、Ｔｒｅｇ細胞が末梢血白血球の集団内で増加および／または活性化すると考える。実施例１１に示されるように、本発明者らは、本発明の細胞集団が低分子量分子を貪食することができ、したがって、ＨＬＡクラスＩＩ分子を介してＩＦＮγ刺激の後にこれらの分子を提示することができることを明らかにした。末梢血白血球との相互作用を用いるこの機序によって選択された抗原を提示することにより、上記のＴｒｅｇ細胞生成が起こると思われる。代替の治療法としては、実施例７に記載されるように、本発明の細胞集団を共培養せずにインビボで直接投与して、特異的なＴｒｅｇ細胞を産生することができ、これにより、次いで障害を治療することができる。
【０１１５】
したがって、本発明は、選択された抗原または抗原群に特異的なＴｒｅｇ細胞を得るインビトロ法であって、
（ａ）本発明の細胞集団を前記選択された抗原または抗原群と接触させる工程と；
（ｂ）前記細胞集団を末梢血白血球と接触させる工程と；
（ｃ）前記選択された抗原または抗原群に特異的なＴ−ｒｅｇ細胞集団を選択する工程と
を少なくとも含む方法を提供する。
【０１１６】
本発明はまた、末梢血白血球を得た被検体に、上記Ｔｒｅｇ細胞を投与することによる、上記選択された抗原または抗原群に関連する疾患および障害の治療における工程（ｃ）の特異的なＴｒｅｇ細胞の使用も提供する。この方法に用いられる本発明の細胞集団は、被検体（自己）由来であってもドナー（同種異系）由来であってもよい。
【０１１７】
医薬組成物
本発明は、自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患などの、被検体の免疫系の調節が有益である障害に関連する１つまたはそれ以上の症状の治療、予防、および改善のための医薬組成物を提供する。
【０１１８】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明の細胞、または本発明のＴ−ｒｅｇ細胞、または本発明の放射線照射細胞、または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞、または本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞、または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」という）に関する。上記細胞種の２つまたはそれ以上の組み合わせは、本発明によって提供される医薬組成物の範囲に包含される。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、予防上または治療上有効な量の１つまたはそれ以上の予防剤または治療剤（すなわち、本発明の細胞、または本発明のＴ−ｒｅｇ細胞、または本発明の放射線照射細胞、または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞、または本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞、または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞、またはそれらの組合せ）と、医薬的に許容される担体とを含む。特定の実施形態において、「医薬的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用に関して、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、あるいは米国薬局方、または欧州薬局方、または他の一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。組成物は、必要に応じて、少量のｐＨ緩衝剤を含むこともできる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、予防上または治療上有効な量の予防剤または治療剤を、好ましくは精製された形態で適量の担体とともに含み、適切な投与形態を被検体に提供する。製剤は、投与の方法に適合するべきである。好ましい実施形態において、医薬組成物は滅菌されており、被検体、好ましくは動物被検体、より好ましくは哺乳類被検体、そして最も好ましくはヒト被検体への投与に適した形態である。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、多様な形態であってよい。これらの形態としては、例えば、凍結乾燥調製物、液体溶液または懸濁液、注射用および注入用溶液などのような、固体、半固体、および液体投与形態が挙げられる。好ましい形態は、目的とする投与方法および治療用途によって変化する。
【０１２１】
本発明の細胞集団またはこれを含む医薬組成物の投与は、、それを必要とする被検体へ従来の手段によって行うことができる。特定の実施形態において、上記細胞集団は、細胞を所望の組織にインビトロ（例えば、移植または生着の前の移植片として）またはインビボのいずれかで、動物組織へ直接移入することを包含する方法によって被検体に投与される。細胞は、任意の適切な方法によって所望の組織に移入することができ、この方法は一般に、組織の種類によって変化する。例えば、細胞は、この細胞を含む培地に移植片を浸す（または移植片を浸出させる）ことによって移植片に移入することができる。あるいは、細胞を組織内の所望の部位に播種して集団を樹立させることができる。細胞は、カテーテル、トロカール、カニューレ、ステント（細胞とともに播種することができる）などの器具を用いてインビボで部位に移植することができる。
【０１２２】
本発明の細胞は、被検体に投与する前に放射線照射することができる。この処理により、細胞は被検体において長期間増殖または生存することができなくなる。したがって、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の放射線照射細胞を含む。
【０１２３】
また、本発明の細胞は、被検体に投与する前にＩＦＮ−γで予備刺激して、被検体における細胞投与とＩＤＯ発現との間の期間を短縮することができる。したがって、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞を含む。
【０１２４】
さらに、本発明の細胞は、被検体に投与する前に、放射線照射およびＩＦＮ−γでの予備刺激を任意の順序で両方とも行うことができる。したがって、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞または本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞を含む。
【０１２５】
本発明の細胞集団および医薬組成物は、併用療法に用いることができる。特定の実施形態において、併用療法は、１つまたはそれ以上の抗炎症剤に抵抗性のある炎症性障害を有する被検体に投与される。別の実施形態において、併用療法は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド性抗炎症薬、β作動薬、抗コリン剤（ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｇｅｒｉｃ  ａｇｅｎｔ）、およびメチルキサンチンなどが挙げられるが、これらに限定されない他の種類の抗炎症剤と併用される。ＮＳＡＩＤの例としては、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトララック（ｋｅｔｏｒａｌａｃ）、オキサプロジン、ナブメントン（ｎａｂｕｍｅｎｔｏｎｅ）、スリンダク、トルメンチン（ｔｏｌｍｅｎｔｉｎ）、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナブメトンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症薬の例としては、グルココルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、およびトロンボキサンなどのエイコサノイド、およびロイコトリエンが挙げられるが、これらに限定されない。インフリキシマブなどのモノクローナル抗体を用いることもできる。
【０１２６】
上記実施形態によれば、本発明の併用療法は、このような抗炎症剤の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に用いることができる。さらに、これらの抗炎症剤は、リンパ組織誘導因子および／または免疫調節剤として本明細書に特徴付けられる薬剤を包含しない。
【０１２７】
本発明の細胞の使用
本発明の別の態様は、本発明の細胞または調節性Ｔ細胞の投与によって、損傷組織（好ましくは、間葉組織）を治療または修復するための、そして／あるいは炎症性障害および／または免疫障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を治療、調節、予防、および／または改善するための医薬の製造における本発明の細胞または本発明の調節性Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１２８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の細胞または調節性Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は、損傷組織、あるいは自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない炎症性障害および／または免疫障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を、治療、修復、予防、および／または改善するのに有用である。本発明の一つの実施形態において、医薬組成物は、抗原、抗原群、または上記抗原または抗原群を発現および／または提示する細胞型をさらに含み得る。一つの実施形態において、抗原は、自己免疫を患う患者に由来する自己抗原の混合物、ペプチド抗原、核酸、改変ペプチドリガンド、組換えタンパク質またはそのフラグメントからなる群から選択される。一つの実施形態において、上記抗原は関節炎に関連する（限定されないが、コラーゲン抗原など）。別の実施形態において、上記抗原はセリアック病に関連する。セリアック病に関連する抗原は、いくつかの形態のプロラミンを含むグルテンファミリーのメンバーである（限定されないが、グリアジン、ホルデイン、および／またはセカリンの抗原など）。グルテンおよびその成分、グルタニン（ｇｌｕｔａｎｉｎ）およびグリアジンは、セリアック病に関連する好ましい抗原である。さらなる実施形態において、上記抗原は多発性硬化症に関連する（限定されないが、ミエリン抗原およびミエリン成分抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびガラクトセレブロシドなどのミエリン糖脂質など）。このような抗原を単離、精製および調製する方法は、当業者に公知である。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、予防上または治療上有効な量の本発明の細胞または調節性Ｔ細胞と、必要に応じて抗原と、医薬担体とを含む。これらの細胞型の各々の投与量および投与計画の例は、上記に示されている。適切な医薬担体は、当該技術分野で公知であり、動物、より具体的にはヒトでの使用に関して、米連邦または州政府の規制当局によって承認されているもの、あるいは米国薬局方、または欧州薬局方、または他の一般に認められている薬局方に記載されているものが好ましい。「担体」という用語は、治療剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。組成物は、必要に応じて、少量のｐＨ緩衝剤を含むこともできる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、予防上または治療上有効な量の予防剤または治療剤を、好ましくは精製された形態で適量の担体とともに含み、適切な投与形態を被検体に提供する。製剤は、投与の方法に適合するべきである。好ましい実施形態において、医薬組成物は滅菌されており、被検体、好ましくは動物被検体、より好ましくは哺乳類被検体、そして最も好ましくはヒト被検体への投与に適した形態である。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、多様な形態であってよい。これらの形態としては、例えば、凍結乾燥調製物、液体溶液または懸濁液、注射用および注入用溶液などのような、固体、半固体、および液体投与形態が挙げられる。上記のように、医薬組成物は、好ましくは注射用である。
【０１３１】
本発明の方法、医薬、組成物、細胞および調節性Ｔ細胞は、損傷組織（好ましくは、間葉組織）を治療または修復するために、そして／あるいは炎症性障害および／または免疫障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を治療、調節、予防、および／または改善するために用いられることが好ましい。したがって、本発明の方法および細胞は、上記症状のいずれかまたはすべてを特徴とする任意の障害の治療に有用である。このような障害の代表的な包括的でないリストは、定義の項で提供される。免疫介在性炎症性疾患の治療における本発明の方法、医薬、組成物および細胞の使用が、特に好ましい。糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、クローン病および／または潰瘍性大腸炎を含む）および多発性硬化症（ＭＳ）の治療における本発明の方法、医薬、組成物および細胞の使用が、より好ましい。関節リウマチの治療における本発明の方法、医薬、組成物および細胞の使用がさらにより特に好ましい。
【０１３２】
本発明の方法または組成物が１つまたはそれ以上の抗原を含む場合には、当該方法または組成物は、上記抗原に関連するかまたは上記抗原によって誘導される障害の治療に用いられることが好ましく、例えば、抗原がコラーゲンである場合には、方法または組成物は関節炎の治療に用いられ、抗原がグルテン成分である場合には、方法または組成物はセリアック病の治療に用いられ、抗原がミエリン成分である場合には、方法または組成物は多発性硬化症を治療するために用いられ得る。したがって、好ましい組成物は、以下を含む：関節炎の治療用に、ＭＳＣ、好ましくはＡＳＣ、およびコラーゲン；セリアック病の治療用に、ＭＳＣ、好ましくはＡＳＣ、ならびにグルテンおよび／またはグルテン成分；多発性硬化症の治療用に、ＭＳＣ、好ましくはＡＳＣ、ならびにミエリンおよび／またはミエリン成分。
【０１３３】
さらなる態様において、本発明は、ｉ）本発明の細胞または調節性Ｔ細胞を含む医薬と、ｉｉ）本発明の方法によるその使用のための使用説明書とを含むキットを提供する。
【０１３４】
さらなる実施形態において、上記キットは、ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の抗原をさらに含み得る。
【０１３５】
本発明の細胞を同定する方法
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の細胞を選択する方法であって、以下の工程：
ｉ）少なくとも２つの細胞系統に分化する能力を有する細胞を含む間葉幹細胞集団を用意する工程と、
ｉｉ）前記脂肪由来細胞集団の細胞または亜集団におけるマーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の存在または非存在を決定する工程と、
ｉｉｉ）マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５について陰性である細胞または亜集団を選択する工程と
を少なくとも含む方法を提供する。
【０１３６】
ｉ）で用意される間葉幹細胞集団は、最も好ましくは、前述のような方法によって単離されるプラスチック接着性細胞集団である。最も好ましくは、上記細胞集団は、少なくとも２つの細胞系統に分化する能力を有する細胞を実質的に含む。
【０１３７】
簡潔に言うと、細胞集団は、任意の適切な動物（好ましくは、ヒト）由来の任意の適切な脂肪組織供給源から（例えば、ヒト脂肪組織から）従来の手段によって得られる。動物は、動物体内の結合組織細胞が生育可能である限り、生きていてもまたは死んでいてもよい。典型的には、ヒト脂肪細胞は、外科手術または吸引による脂肪組織切除のような周知のプロトコルを用いて、生きているドナーから得られる。脂肪吸引手順はごく一般的であるので、脂肪吸引流出物は本発明の細胞を得ることができる特に好ましい供給源である。したがって、特定の実施形態において、本発明の細胞は、脂肪吸引によって得られるヒト脂肪組織の間質画分に由来する。
【０１３８】
脂肪組織の試料は、好ましくは、本発明の細胞を材料の残部から分離する処理を行う前に洗浄される。一つのプロトコルにおいて、組織の試料を生理学的に適合する食塩溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））で洗浄した後、激しく攪拌して静置し、この工程で、遊離物（例えば、損傷組織、血液、赤血球など）を組織から除去する。したがって、洗浄および静置工程は、一般的には上清に残骸が比較的見られなくなるまで繰り返す。残存している細胞は、一般的には様々な大きさの凝集塊で存在しており、このプロトコルは細胞自体の損傷を最小限に抑えながら全体構造を分解するように調整する工程を用いて進行する。この目的を達成する一つの方法は、洗浄した細胞塊を、細胞間の結合を弱めるかまたは破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシンなど）で処理することである。このような酵素処理の量および持続時間は使用条件によって変化するが、このような酵素の使用は当該技術分野で一般的に公知である。このような酵素処理の代わりに、またはこのような酵素処理とともに、細胞塊を、例えば機械攪拌、音波エネルギー、熱エネルギーなどの他の処理を用いて分解することができる。分解を酵素法によって行う場合には、適切な期間の後に酵素を中和して、細胞に対する有害な作用を最小限にするのが望ましい。
【０１３９】
分解工程においては、典型的には、凝集細胞のスラリーまたは懸濁液と、遊離の間質細胞（例えば、赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および幹細胞）を一般に含む液体画分とを生じる。分離プロセスにおける次の段階は、凝集細胞を本発明の細胞から分離することである。これは遠心分離によって行うことができ、これによって細胞は上清に覆われたペレットとなる。次に、上清を廃棄して、ペレットを生理学的に適合する液体に懸濁させ得る。さらに、懸濁した細胞は典型的には赤血球を含み、ほとんどのプロトコルでは、それらを溶解するのが望ましい。赤血球を選択的に溶解する方法は当該技術分野で公知であり、任意の適切なプロトコル（例えば、高張培地または低張培地でのインキュベーション、塩化アンモニウムを用いる溶解によるなど）を用いることができる。赤血球を溶解する場合には、当然のことながら、次に残存している細胞を、例えば濾過、沈降、または密度分画によって、溶解物から分離すべきである。
【０１４０】
赤血球が溶解しているか否かにかかわらず、懸濁した細胞を１回またはそれ以上連続的に洗浄し、再遠心分離し、再懸濁して、純度を高めることができる。あるいは、細胞を細胞表面マーカープロファイルに基づいてまたは細胞サイズおよび粒度に基づいて分離してもよい。
【０１４１】
最終的な単離および再懸濁の後、細胞を培養し、必要に応じて数および生存率についてアッセイして、収率を評価することができる。細胞は、適切な細胞培養培地を用いて、適切な細胞密度および培養条件で、固体表面上で分化せずに培養されるのが好ましい。したがって、特定の実施形態において、細胞は、適切な細胞培養培地［例えば、典型的には、５〜１５％（例えば、１０％）の適切な血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）を補充したＤＭＥＭ］の存在下で、通常はペトリ皿または細胞培養フラスコのようなプラスチック材料製の固体表面上で分化させずに培養し、細胞が固体表面に接着し、増殖することができる条件下でインキュベートする。インキュベーションの後、細胞を洗浄して、非接着細胞および細胞断片を除去する。細胞を、適切なコンフルエンス、典型的には約８０％の細胞コンフルエンスに達するまで、必要に応じて細胞培養培地を交換しながら、同一培地および同一条件下での培養で維持する。所望の細胞コンフルエンスに達した後、細胞を、トリプシンのような剥離剤を用い、より大きな細胞培養表面上に適切な細胞密度（通常は、２，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２）で播種する連続継代によって増幅させることができる。したがって、細胞は次に、発生表現型を保持したまま分化せずに上記培地で少なくとも２回継代され、より好ましくは、細胞は、発生表現型を失うことなく少なくとも１０回（例えば、少なくとも１５回、またはさらには少なくとも２０回）継代され得る。典型的には、細胞を約１００細胞／ｃｍ２〜約１００，０００細胞／ｃｍ２（例えば、約５００細胞／ｃｍ２〜約５０，０００細胞／ｃｍ２、またはより具体的には、約１，０００細胞／ｃｍ２〜約２０，０００細胞／ｃｍ２）などの所望の密度でプレーティングする。より低い密度（例えば、約３００細胞／ｃｍ２）でプレーティングすると、細胞をより容易にクローンとして単離することができる。例えば、数日後に、上記密度でプレーティングした細胞は、増殖して均一な集団となる。特定の実施形態において、細胞密度は２，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２である。
【０１４２】
方法の工程ｉｉ）において、脂肪由来細胞集団の細胞または亜集団におけるマーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の存在または非存在を決定する。クローンまたは亜集団は、細胞集団をクローニングするために当該技術分野で一般に用いられる方法を用いて樹立することができる。例えば、細胞集団を物理的に採取して、セパレートプレート（またはマルチウェルプレートのウェル）に播種することができる。あるいは、単一の細胞を各ウェルに入れることを容易にする統計比率で（例えば、約０．１〜約１細胞／ウェルまたは約０．２５〜約０．５細胞／ウェル、例えば０．５細胞／ウェル）、細胞をマルチウェルプレート上にサブクローニングできる。当然のことながら、細胞を低密度でプレーティングし（例えば、ペトリ皿または他の適切な基体中に）、クローニングリングなどの器具を用いてそれらを他の細胞から単離することによってクローニングすることができる。マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５の存在または非存在は、当該技術分野で標準的な任意の手段で（例えば、限定されないがフローサイトメトリーで）決定できる。
【０１４３】
方法の工程ｉｉｉ）において、マーカーＣＤ１１２および／またはＣＤ１５５について陰性であるクローンまたは亜集団を選択する。本明細書で使用される場合、細胞表面マーカーに関して「陰性」とは、本発明の細胞を含む細胞集団において、従来の方法および装置（例えば、市販の抗体および当該技術分野で公知の標準プロトコルとともに用いられるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を用いて、フローサイトメトリーにおいて特定の細胞表面マーカーについてバックグラウンドシグナルよりも高いシグナルを示す細胞が１％未満、好ましくは０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％であるか、または存在しないことを意味する。上記細胞表面マーカー（例えば、細胞レセプターおよび膜貫通タンパク質）に対する市販のおよび公知のモノクローナル抗体を用いて、本発明の細胞を同定することができる。
【０１４４】
本発明の細胞の使用
本発明の別の態様は、本発明の細胞または調節性Ｔ細胞の投与によって、損傷組織（好ましくは、間葉組織）を治療または修復するための、そして／あるいは炎症性障害および／または免疫障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を治療、調節、予防、および／または改善するための医薬の製造における本発明の細胞または調節性Ｔ細胞の使用を提供する。
【０１４５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の細胞または調節性Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は、損傷組織、あるいは自己免疫疾患、炎症性障害、ならびに移植臓器および組織の拒絶反応を含む免疫介在性疾患が挙げられるがこれらに限定されない炎症性障害および／または免疫障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を、治療、修復、予防、および／または改善するのに有用である。本発明の一つの実施形態において、医薬組成物は、抗原、抗原群、または上記抗原または抗原群を発現および／または提示する細胞型をさらに含み得る。一つの実施形態において、抗原は、自己免疫を患う患者に由来する自己抗原の混合物、ペプチド抗原、核酸、改変ペプチドリガンド、組換えタンパク質またはそのフラグメントからなる群から選択される。一つの実施形態において、上記抗原は関節炎に関連する（限定されないが、コラーゲン抗原など）。別の実施形態において、上記抗原はセリアック病に関連する。セリアック病に関連する抗原は、いくつかの形態のプロラミンを含むグルテンファミリーのメンバーである（限定されないが、グリアジン、ホルデイン、および／またはセカリンの抗原など）。グルテンおよびその成分、グルタニン（ｇｌｕｔａｎｉｎ）およびグリアジンは、セリアック病に関連する好ましい抗原である。さらなる実施形態において、上記抗原は多発性硬化症に関連する（限定されないが、ミエリン抗原およびミエリン成分抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびガラクトセレブロシドなどのミエリン糖脂質など）。このような抗原を単離、精製および調製する方法は、当業者に公知である。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、予防上または治療上有効な量の本発明の細胞または調節性Ｔ細胞と、必要に応じて抗原と、医薬担体とを含む。これらの細胞型の各々の投与量および投与計画の例は、上記に示されている。適切な医薬担体は、当該技術分野で公知であり、動物、より具体的にはヒトでの使用に関して、米連邦または州政府の規制当局によって承認されているもの、あるいは米国薬局方、または欧州薬局方、または他の一般に認められている薬局方に記載されているものが好ましい。「担体」という用語は、治療剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。組成物は、必要に応じて、少量のｐＨ緩衝剤を含むこともできる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、予防上または治療上有効な量の予防剤または治療剤を、好ましくは精製された形態で適量の担体とともに含み、適切な投与形態を被検体に提供する。製剤は、投与の方法に適合するべきである。好ましい実施形態において、医薬組成物は滅菌されており、被検体、好ましくは動物被検体、より好ましくは哺乳類被検体、そして最も好ましくはヒト被検体への投与に適した形態である。
【０１４７】
本発明の医薬組成物は、多様な形態であってよい。これらの形態としては、例えば、凍結乾燥調製物、液体溶液または懸濁液、注射用および注入用溶液などのような、半固体、および液体投与形態が挙げられる。上記のように、医薬組成物は、好ましくは注射用である。
【０１４８】
本発明の方法、医薬、組成物、細胞および調節性Ｔ細胞は、損傷組織（好ましくは、間葉組織）を治療または修復するために、そして／あるいは炎症性障害および／または免疫障害に関連する１つまたはそれ以上の症状を治療、調節、予防、および／または改善するために用いられることが好ましい。したがって、本発明の方法および細胞は、上記症状のいずれかまたはすべてを特徴とする任意の障害の治療に有用である。このような障害の代表的な包括的でないリストは、定義の項で提供される。免疫介在性炎症性疾患の治療における本発明の方法、医薬、組成物および細胞の使用が、特に好ましい。糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、クローン病および／または潰瘍性大腸炎を含む）および多発性硬化症（ＭＳ）の治療における本発明の方法、医薬、組成物および細胞の使用が、より好ましい。関節リウマチの治療における本発明の方法、医薬、組成物および細胞の使用がさらにより特に好ましい。
【０１４９】
本発明の方法または組成物が１つまたはそれ以上の抗原を含む場合には、方法または組成物が、上記抗原に関連するかまたは上記抗原によって誘導される障害の治療に用いられることが好ましく、例えば、抗原がコラーゲンである場合には、方法または組成物は関節炎の治療に用いられ、抗原がグルテン成分である場合には、方法または組成物はセリアック病の治療に用いられ、抗原がミエリン成分である場合には、方法または組成物は多発性硬化症を治療するために用いられ得る。したがって、好ましい組成物は、以下を含む：関節炎の治療用に、ＭＳＣ、好ましくはＡＳＣ、およびコラーゲン；セリアック病の治療用に、ＭＳＣ、好ましくはＡＳＣ、ならびにグルテンおよび／またはグルテン成分；多発性硬化症の治療用に、ＭＳＣ、好ましくはＡＳＣ、ならびにミエリンおよび／またはミエリン成分。
【０１５０】
キット
別の態様において、本発明は、（ｉ）本発明の細胞、および／または（ｉｉ）本発明の調節性Ｔ細胞、および／または（ｉｉｉ）本発明の放射線照射細胞、および／または（ｉｖ）本発明のＩＦＮ−γ予備刺激細胞、および／または（ｖ）本発明の放射線照射したＩＦＮ−γ予備刺激細胞、および／または（ｖｉ）本発明のＩＦＮ−γ予備刺激した放射線照射細胞を含む細胞集団を含むキットに関する。本発明のキットは、上記細胞型の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてを含み得る。
【０１５１】
さらなる態様において、本発明は、ｉ）本発明の細胞または調節性Ｔ細胞を含む医薬と、ｉｉ）本発明の方法によるその使用のための使用説明書とを含むキットを提供する。
【０１５２】
さらなる実施形態において、上記キットは、ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の抗原をさらに含み得る。
【実施例】
【０１５３】
本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではなく、むしろ、これらの実施例は添付の図面を参照して本発明を説明するのに役立つ。
【０１５４】
材料および方法
ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣの培養
ｈＡＳＣを、健常成人ドナー由来のヒト脂肪組織から得た吸引脂肪組織から単離し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして３７℃で３０分間、ＰＢＳ中１８Ｕ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼで消化した。消化した試料を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄し、塩化アンモニウム１６０ｍＭで処理し、培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中に懸濁し、そして４０μｍのナイロンメッシュで濾過した。細胞を組織培養フラスコに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で、７日毎に培地を交換しながら増幅させた。培養物が９０％コンフルエンスに達したら、細胞を新しい培養フラスコに継代した。さらに、ｈＡＳＣを、特異的表面マーカーで染色することによって、ＨＬＡ−Ｉ、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５について陽性であり、かつＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ３４について陰性であることを確認した。６人の健常ドナー（３人の男性および３人の女性、３５〜４７歳）由来のプールを試験に用いた。細胞を継代４〜６回で用いた。適切な研究倫理委員会の指導下でインフォームドコンセントの後にｈＡＳＣを得た。
【０１５５】
ヒト骨髄間葉幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ）をＭＳＣ対照細胞源として用いた。ｈＢＭ−ＭＳＣをＬｏｎｚａ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で供給業社の推奨に従って培養した。
【０１５６】
ＦＡＣＳによるｈＡＳＣの表現型解析
ｈＡＳＣのフローサイトメトリー解析のために、細胞を以下のｍＡｂで染色した：抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｇ４６−２．６）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、抗ＣＤ１１２（Ｒ２．５２５）、抗ＣＤ１５５（３００９０７）、抗ＭＩＣＡ／Ｂ（６Ｄ４）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から）。ＵＬＢＰを、抗ＵＬＢＰ−１（１７０８１８）、抗ＵＬＢＰ−２（１６５９０３）および抗ＵＬＢＰ−３（１６６５１０）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から）を用い、適切なＦＩＴＣ結合二次抗体を用いる間接免疫蛍光法によって評価した。組換えヒトタンパク質キメラ（ＮＫｐ３０−、ＮＫｐ４４−およびＮＫｐ４６−ＩｇＧ１（Ｆｃ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）の解析を、以下のように行った：２×１０５ｈＡＳＣを１００μｌのＦｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｉｎｎｏｖｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）とともに室温で１０分間インキュベートした。洗浄緩衝液で２回洗浄した後、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中に再懸濁した。次に、細胞を５μｇ／ｍｌのタンパク質キメラまたはヒトＩｇＧとともに４℃で３０分間インキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で４℃で３回洗浄した後、細胞を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃフラグメント特異的なＦＩＴＣ結合ヤギ抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって解析した。１０５イベントの取得後に、ＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリー解析を行った。生存細胞を前方および側方散乱特性を用いて選択し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。アイソタイプの一致したネガティブコントロール抗体をすべての実験に用いた。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をそのネガティブコントロールで除して、平均相対蛍光強度（ＭＲＦＩ）を算出した。
【０１５７】
ＮＫ細胞の単離および培養
健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による遠心分離によって得て、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＭＣを、１０％ヒト血清、１％グルタミン、１％ペニシリン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ＵＳＡ）から）および５００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｔ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋから入手）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で５日間成長させた。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＮＫ細胞を精製し、選別した集団の典型的な純度は９５〜９８％であった。精製ＮＫ細胞を、続いて脱顆粒およびＩＦＮ−γ産生についてアッセイし、または共培養実験で試験した。
【０１５８】
ＮＫ細胞脱顆粒アッセイ
ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦＩＴＣ標識ＣＤ１０７ａ／ｂの混合物の存在下で、標的細胞と１：１の比率で精製ＮＫ細胞を活性化させた４時間後に、ＣＤ１０７ａ／ｂの表面発現を解析した。ＮＫ細胞をＰＥ標識抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で染色し、フローサイトメトリーによって解析して、ＣＤ１０７ａ／ｂ発現の頻度を測定した。
【０１５９】
インターフェロン−γアッセイ
ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、標的細胞と１：１の比率で共培養した精製ＮＫ細胞を用いて、インターフェロン−γアッセイを行った。共培養の８時間後に、精製ＮＫ細胞をＰＥ標識抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で染色し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ固定／透過処理キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定および透過処理した。最後に、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、ＩＦＮ−γ発現の頻度を測定することによってフローサイトメトリー解析を行った。
【０１６０】
ＮＫ細胞のｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣとの共培養
ＮＫ細胞に対するｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣの阻害作用を決定するために、直接的共培養法を用いて、または０．４μｍ孔径の膜を備えたトランスウェルプレートシステム（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、ｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣの存在下または非存在下で精製ＮＫ細胞を共培養した。１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２とともに７２時間後、ＮＫ細胞を採取し、続いてＮＫ細胞感受性標的細胞株Ｋ５６２に対する脱顆粒アッセイで試験した。上記のようにＣＤ１０７ａ／ｂ発現の頻度を測定することによってフローサイトメトリーによる解析を行った。共培養から得た上清を回収し、遠沈して、細胞または細胞片を除去し、−２０℃で凍結および保存した。
【０１６１】
ＮＫ細胞の表現型解析
精製ＮＫ細胞を、直接接触法またはトランスウェル共培養システム中で７２時間、ｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣと１：１の比率で共培養した。フローサイトメトリー解析のために、ＮＫ細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、適切な組み合わせの蛍光標識ｍＡｂで染色した。以下のｍＡｂを本試験に用いた：ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）結合抗ＣＤ３（ＳＫ１）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）およびフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＣＤ６９（ＨＰ−４Ｂ３）、抗ＮＫｐ４４（ｐ４４−８．１）、抗ＮＫｐ４６（９Ｅ２／ＮＫｐ４６）、抗ＣＤ２２６（ＤＸ１１）、抗ＮＫＧ２Ｄ（１Ｄ１１）、抗ＣＤ９４（ＨＰ−３Ｄ９）、抗ＣＤ６９（ＨＰ−４Ｂ３）、抗ＣＤ１６（ＮＫＰ１５）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）、抗ＮＫｐ３０（ｐ３０−１５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）から）および抗ＣＤ２４４（Ｃ１．７）（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から）。
【０１６２】
細胞内染色のために、表面マーカー標識の後、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ固定／透過処理キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を固定および透過処理した。抗パーフォリン（ＳＧ９）、抗グランザイムＡ（ＣＢ９）および抗グランザイムＢ（ＧＢ１１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で細胞を染色した。
【０１６３】
１０５〜１０６イベントの取得後にＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリー解析を行った。生存細胞を前方および側方散乱特性を用いて選択し、ＮＫ細胞をＣＤ５６＋ＣＤ３−表現型に基づいてゲート制御し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。アイソタイプの一致したネガティブコントロール抗体をすべての実験に用いた。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をそのネガティブコントロールで除して、平均相対蛍光強度（ＭＲＦＩ）を算出した。
【０１６４】
ＩＤＯ活性
ＮＫ細胞とｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣとの共培養物から得た上清中のＴｒｐ濃度およびＫｙｎ濃度の両方を決定することによって、ＩＤＯ活性を測定した。約２００μＬの上清を５０μＬのトリクロロ酢酸２Ｍに添加し、ボルテックスし、遠沈し（１３，０００ｒｐｍで１０分間）、そしてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ７１７ｐｌｕｓ  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）によって分析した。
【０１６５】
統計分析
スチューデントのｔ検定およびＳＰＳＳソフトウェアを用いる二元配置分散分析（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）の対検定によって、測定値の平均の差を比較した。ｐ値≦０．０５を有意とみなした。
【０１６６】
結果
ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣにおけるＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの発現
健常ドナーから単離したｈＢＭ−ＭＳＣと比較して、ｈＡＳＣにおけるＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの表現型解析を行った。
【０１６７】
結果は、ｈＡＳＣがｈＢＭ−ＭＳＣと比較して低レベルのＨＬＡクラスＩ分子を発現し、ＨＬＡクラスＩＩの発現は陰性であったことを示す。どちらの場合にも、ＣＤ４８分子（ＣＤ２４４のリガンド）を発現しなかった。ｈＡＳＣにおけるＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの表現型解析は、ｈＢＭ−ＭＳＣと比較して低いＣＤ１１２およびＣＤ１５５（ＤＮＡＭ−１のリガンド）の発現を示した。
【０１６８】
さらに、ＭＩＣＡ／ＢおよびＵＬＢＰ（ＮＫＧ２Ｄのリガンド）の発現は、ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣにおいて非常に低いかまたは陰性であることが分かった（図１）。フローサイトメトリーによるナチュラル細胞傷害性レセプター（ＮＣＲ）に対するリガンドの同定について、キメラＮＣＲを用いてｈＡＳＣおよびｈＢＭＭＳＣにおけるこれらのリガンドの表面発現を同定した。本発明者らの結果は、両方の細胞型におけるこれらのリガンドの陰性発現を示した（図１）。ｈＡＳＣは、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＦＣＲ１ａ、および１Ｂ１０について陰性であり、これは間質血管画分に含まれている可能性のある潜在的な混入細胞の非存在を示す。ｈＡＳＣは、ＣＤ２９、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５について陽性であり、種々のドナー由来のプールしたｈＡＳＣ試料および個々の試料の表現型において有意差はなく（データは示さず）、かつ、種々の継代の後に有意差はなかった。
【０１６９】
最後に、炎症セッティングにおけるＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの発現レベルを決定するために、ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣをＩＦＮ−γで７２時間刺激した（１、１０、および１００Ｕ／ｍＬ）。３回の独立した実験は、発現レベルがＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４８、またはＵＬＢＰにおいて有意に増加しなかったことを示した。
【０１７０】
予想通りに、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子の発現は、これらの細胞をＩＦＮ−γで処理すると増強された。１００Ｕ／ｍＬで７２時間後、ＨＬＡクラスＩ発現（ＭＲＦＩ）は、ｈＡＳＣにおいて３８．４７〜２０．７１まで、ｈＢＭ−ＭＳＣにおいて４８．７４〜３８．５まで増加した。さらに、ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣにおけるＨＬＡクラスＩＩは、ＭＲＦＩがそれぞれ２．４４〜１．２１および２．２１〜１．３２に達すると正値に転換した。
【０１７１】
ｈＡＳＣに応答するＮＫ細胞の低い脱顆粒活性
ＮＫ細胞介在性溶解に対するｈＡＳＣおよびｈＢＭＭＳＣの感受性を比較するために、前述のようにＣＤ１０７ａ／ｂ表面分子の検出によって脱顆粒アッセイを行った。脱顆粒アッセイは高感度の方法であり、その結果はＮＫ細胞傷害性と厳密に相関している。
【０１７２】
これらの実験について、同種異系ＮＫ細胞を予めｒｈＩＬ−２で刺激してそれらの細胞傷害能を高め、ＣＤ５６＋ＣＤ３−表現型に基づいて選別した。ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣの両方を脱顆粒アッセイの標的細胞として用いた。ネガティブおよびポジティブコントロールとして、ＮＫ細胞単独およびＮＫ感受性標的細胞株Ｋ５６２に対するＮＫ細胞を用いた。
【０１７３】
最大の脱顆粒活性を得るために他の比率を用いたが、脱顆粒アッセイにおける最適なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比率は１：１であった（データは示さず）。これらの結果は、ｈＡＳＣに応答した脱顆粒率は非常に低く、非刺激ＮＫ細胞（ＮＫコントロール）における脱顆粒と比較して統計学的に有意ではなかったことを示した。対照的に、ｈＢＭ−ＭＳＣは、ｈＡＳＣと比較した場合に有意に増強されたＮＫ細胞脱顆粒応答を誘導した（図２）。
【０１７４】
ＨＬＡクラスＩ特異的抑制性レセプターの役割を排除するために、共培養前にＨＬＡクラスＩ特異的モノクローナル抗体Ｗ６／３２で標的細胞を前処理することにより、ＨＬＡクラスＩブロッキングを行った。結果は、ＨＬＡクラスＩの抗体介在性マスキングがｈＡＳＣに対するＮＫ細胞脱顆粒を増大させなかったことを示した（データは示さず）。
【０１７５】
ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣはＮＫ細胞によるインターフェロンγ産生を誘導する
脱顆粒アッセイに加えて、本発明者らは、ｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣに対するＮＫ細胞サイトカイン応答を調べた。脱顆粒アッセイと同様に、ＩＦＮ−γ産生は、ｈＡＳＣ、ｈＢＭ−ＭＳＣ、およびＫ５６２（ポジティブコントロール）に対する精製ＮＫ細胞において解析した。ネガティブコントロールとして、標的細胞の非存在下で精製ＮＫ細胞を培養した。細胞内染色技術を用いて、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を評価した。図３は、ｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣを標的細胞として用いた場合に、ＩＦＮ−γ産生が認められたことを示す。さらに、興味深いことに、ＩＦＮ−γ応答は、ｈＢＭ−ＭＳＣをｈＡＳＣと比較した場合に統計学的に差はなかった。ＮＫ細胞集団によるＩＦＮ−γの発現についての代表的なドットプロットも図３に示した。サイトカインＩＦＮ−γはまた、ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘヒトＴｈ１／Ｔｈ２  １１ｐｌｅｘキット（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍ）を用いて、ｈＡＳＣと１：１の比率で７２時間共培養した精製ＮＫ細胞由来の上清中にも検出された。ＩＦＮ−γは、ＮＫ／ｈＡＳＣ共培養物中に分泌され（４０〜３２．５ｐｇ／ｍＬ）、非刺激ＮＫ細胞または非刺激ｈＡＳＣによっては分泌されなかった（データは示さず）。
【０１７６】
ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣは他の標的細胞よりもＮＫ細胞機能を弱める
ＮＫ細胞に対するｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣの調節作用の可能性をさらに試験するために、直接的接触共培養法において、またはトランスウェルインサートを用いることによって、共培養実験を行った。これらの実験は、ＮＫ活性の調節における可溶性因子および細胞対細胞接触の寄与の可能性を定量するように設計した。
【０１７７】
精製ＮＫ細胞をｈＡＳＣまたはｈＢＭＭＳＣと比率１：１で７２時間共培養し、次いで回収し、感受性標的細胞株に対する脱顆粒能について試験した。本発明者らの結果は、第一に、ＮＫ細胞とｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣとのプレインキュベーションにより、ＮＫ脱顆粒能を有意に低下させることができたことを明らかにした。第二に、本発明者らの結果は、ｈＡＳＣとともにトランスウェル条件で前培養したＮＫ細胞が、細胞対細胞接触よりも有意に強力な阻害作用を有したことを示した。最後に、ＮＫ細胞に対するｈＢＭ−ＭＳＣの作用に関して、ｈＡＳＣと同様の結果が得られた。興味深いことに、ｈＢＭ−ＭＳＣとプレインキュベートしたＮＫ細胞において、接触条件とトランスウェル条件との間に有意な差は認められなかった（図４）。
【０１７８】
ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣはＮＫ細胞において表現型変化を誘導する
ＮＫ細胞脱顆粒を誘導するｈＡＳＣ細胞の能力が低いことを実証した後で、本発明者らは、ＮＫ細胞表現型プロファイルの変化を解析し、細胞対細胞接触または単に可溶性因子のみが関与するのか否かを決定した。この目的のために、ｈＡＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣの存在下で接触またはトランスウェルの条件のいずれかで共培養したＮＫ細胞上の活性化レセプター、ＮＫ細胞マーカー、およびエフェクター分子を解析した。
【０１７９】
３回の独立実験を行い、統計解析から、ｈＢＭ−ＭＳＣと接触させて共培養したＮＫ細胞が、ＤＮＡＭ−１の発現の有意な減少を示したことが明らかとなり、酷似した結果（統計学的に有意ではないが）が、ｈＡＳＣと接触させて共培養したＮＫ細胞において得られた（表１）。
【０１８０】
活性化レセプターＮＫＧ２Ｄは、ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣとトランスウェル中で共培養したＮＫ細胞において増加した（この変化は、ｈＡＳＣの場合にのみ統計学的に有意であった）。さらに、直接的接触共培養法において差は認められなかった（表１）。ＮＣＲレパートリーの解析において、いくつかの変化が見られた（統計学的に有意ではない）。ＮＫｐ３０表面発現の減少は、ＮＫ細胞をｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣと接触させて共培養した場合に認められた。対照的に、ＮＫｐ４６発現はわずかに増加した（表１）。データは、ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣと接触させたＮＫ細胞が、ＣＤ１６の有意な減少を示すことを明らかにしたが、ＣＤ６９およびＣＤ９４発現はすべての実験条件において維持された。最後に、細胞内分子パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢも試験し、パーフォリンおよびグランザイムＢについて変化は見られなかったが、グランザイムＡは、接触およびトランスウェルの両方でｈＡＳＣと共培養したＮＫ細胞において有意に減少した（表１）。
【０１８１】
【表１】
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【０１８２】
ＩＤＯはＮＫ細胞に応答してｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣによって誘導される
Ｔｒｐ異化酵素であるＩＤＯの発現は、ＭＳＣの免疫調節機能に寄与し、エフェクター細胞の免疫抑制に関与することが知られている。ＩＤＯ発現は、ＩＦＮ−γ刺激後に誘導される。既に図３に示したように、ｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣは、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導した。本発明者らは、ＮＫ細胞によって放出された可溶性因子がｈＡＳＣおよびｈＢＭ−ＭＳＣにおけるＩＤＯ発現を誘発し、これがＮＫ活性の調節の一因となり得ると仮定した。したがって、本発明者らは、共培養後のＩＤＯ活性をＨＰＬＣによって測定した。
【０１８３】
図５に示すように、ＮＫ細胞はＩＤＯ活性（Ｔｒｐの分解およびその異化生成物Ｋｙｎの蓄積として測定される）を示さなかった。しかしながら、本発明者らは、ＮＫ細胞を接触またはトランスウェル条件でｈＡＳＣまたはｈＢＭ−ＭＳＣと共培養した場合に、Ｋｙｎの蓄積と同時にＴｒｐの濃度が徐々に低下したことを見出した。
【０１８４】
結論
インビトロでの結果は、ｈＡＳＣが同種異系セッティングにおける養子細胞療法に最適な特性を示すことを実証する。第一に、ＮＫ活性化レセプターに対するリガンドの発現の低下による最も重大な結果は、ＮＫ介在性認識に対するそれらの抵抗性の増加であろう。ｈＢＭ−ＭＳＣと比較して、ｈＡＳＣは、同種異系ＮＫ溶解からさらに保護された。このことにより、ｈＡＳＣは、宿主において期間を延長して残存することができるであろう。第二に、本発明者らは、ＮＫ細胞において寛容を誘導するためのｈＡＳＣの機序が、可溶性因子によって介在され得ることを示唆する。ＮＫ／ＭＳＣクロストーク中にＮＫ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは、ＩＤＯ発現および免疫抑制活性において相乗効果を発揮し得るＰＧＥ２などの他の因子を誘導し得る。
【０１８５】
要約すると、本試験は、ＮＫ細胞と養子導入ｈＡＳＣとの間の相互作用についての理解を深めるために重要な生物学的および治療的意義を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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