(57)【要約】  本開示は、開発可能性に関連する機能特性に関して予め選択される生殖系列タンパク質配列を部分的に含む可変重鎖と可変軽鎖との対のコレクションを可能にし、このコレクションは、例えばファージディスプレイを使用した、任意の抗原に対する選択に用いられ得る。
2014500725.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成抗体又はその断片のコレクションにおいて、前記抗体又は機能断片が可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、前記可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項２】
請求項１に記載のコレクションにおいて、前記抗体又は機能断片が、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記生殖系列タンパク質対が、以下の特性：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）
を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項３】
合成抗体又はその機能断片のコレクションにおいて、前記抗体又は機能断片が可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の２０個以上から選択される生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項４】
請求項３に記載の合成抗体又はその機能断片のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される３０個以上の可変重鎖と可変軽鎖との対を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又は機能断片が、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記生殖系列タンパク質対が、以下の特性：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）
を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項６】
合成抗体又はその機能断片のコレクションにおいて、前記抗体又は機能断片が可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項７】
請求項６に記載のコレクションにおいて、前記抗体又は機能断片が、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記生殖系列タンパク質対が、以下の特性：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；
ｖｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、及び
ｖｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点
を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項８】
請求項７に記載のコレクションにおいて、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）からさらに選択される生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ１領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ２領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、潜在的な翻訳後修飾部位を取り除くアミノ酸修飾を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１３】
請求項１２に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれの可変重鎖の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む１つ以上の重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１４】
請求項１３に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれのＨＣＤＲ１領域由来のＨＣＤＲ１領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれのＨＣＤＲ２領域由来のＨＣＤＲ２領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、ＪＨ４（配列番号２９３）、Ｊκ１（配列番号２９７）、及びＪλ２／３（配列番号３０１）からなる群から選択されるＦＲ４領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１７】
請求項１乃至１６の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１８】
請求項１乃至１７の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体又はその機能断片が、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項１９】
請求項１乃至１８（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｃｌａｉｍｓ）の何れか１項に記載のコレクションにおいて、少なくとも１×１０４個の抗体又はその機能断片を含むことを特徴とするコレクション。
【請求項２０】
請求項１乃至１９（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｃｌａｉｍｓ）の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤからなる群から選択されることを特徴とするコレクション。
【請求項２１】
請求項１乃至２０（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｃｌａｉｍｓ）の何れか１項に記載のコレクションにおいて、前記抗体の前記機能断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択されることを特徴とするコレクション。
【請求項２２】
請求項１乃至２１の何れか１項に記載の抗体又はその機能断片のコレクションをコードすることを特徴とする核酸のコレクション。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸のコレクションを含むことを特徴とするベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸又は請求項２３に記載のベクターを含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項２５】
合成抗体又はその機能断片のコレクションの作製方法において、
ａ）ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を同定するステップ；
ｂ）ステップａ）で同定された前記可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を、以下の特性について試験するステップ：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）；及び
ｃ）コレクションを作成するステップにおいて、前記抗体又はその機能断片が可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、ステップｂ）の特性を満たす生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む、ステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法において、ステップａ）が、
ａａ）サンプルからヒトＢ細胞を単離するステップ；
ａｂ）前記Ｂ細胞からｃＤＮＡを作成するステップ；
ａｃ）前記Ｂ細胞から前記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップ；
ａｄ）前記ＰＣＲ産物を配列決定するステップ；及び
ａｅ）各ＰＣＲ産物の生殖系列遺伝子を同定するステップ
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法において、ステップｂ）が、
ｂａ）ヒト免疫レパートリーに存在する対を代表する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を含む抗体又はその機能断片をコードするＤＮＡを合成するステップ；
ｂｂ）ｂａ）で合成された前記生殖系列タンパク質対を発現させるステップ；及び
ｂｃ）ｂｂ）の前記生殖系列タンパク質対を前記特性の各々について試験するステップ
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２５乃至２７の何れか１項に記載の方法において、ステップｃ）が、
ｃａ）前記抗体又はその機能断片をコードする核酸を合成するステップ；
ｃｂ）前記核酸をベクターにクローニングするステップ；
ｃｃ）前記抗体又はその機能断片を発現させるステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２５乃至２８の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又は機能断片が可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２５乃至２８の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又は機能断片が可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、生殖系列タンパク質配列を含み、前記抗体又はその機能断片が、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される２０個以上の可変重鎖と可変軽鎖との対を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２５乃至３０の何れか１項に記載の方法において、ステップｂ）が、以下の特性：
ｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；及び
ｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２５乃至３１の何れか１項に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２５乃至３２の何れか１項に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）から選択される生殖系列タンパク質配列をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２５乃至３３の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２５乃至３４の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又は機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ１領域をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項２５乃至３５の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又は機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ２領域をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項２５乃至３６の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、潜在的な翻訳後修飾部位を取り除くアミノ酸修飾を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項２５乃至３７の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれの可変重鎖の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項２５乃至３８の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれのＨＣＤＲ１領域由来のＨＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２５乃至３９の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれのＨＣＤＲ２領域由来のＨＣＤＲ２領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２５乃至４０の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、ＪＨ４（配列番号２９３）、Ｊκ１（配列番号２９７）、及びＪλ２／３（配列番号３０１）からなる群から選択されるＦＲ４領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項２５乃至４１の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２５乃至４２の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２５乃至４３の何れか１項に記載の方法において、前記コレクションが、少なくとも１×１０４個の抗体又はその機能断片を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項２５乃至４４の何れか１項に記載の方法において、前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ及びＩｇＭからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項２５乃至４５の何れか１項に記載の方法において、前記抗体の前記機能断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４７】
抗原に特異的な抗体又は抗体断片の同定方法において、
（ａ）前記抗原を抗体又はその機能断片のコレクションと接触させるステップにおいて、前記コレクションの前記抗体又は機能断片の少なくとも９０％が、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、以下の特性を含む生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む、ステップ：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、及び
（ｂ）前記抗原に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片を選択するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）由来の生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７又は４８に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）由来の生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４７乃至４９の何れか１項に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含み、以下の特性：
ｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；及び
ｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される生殖系列タンパク質配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）から選択される生殖系列タンパク質配列をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項４７乃至５２の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項４７乃至５３の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又は機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ１領域をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項４７乃至５４の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又は機能断片が、前記それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ２領域をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項４７乃至５５の何れか１項に記載の方法において、前記可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）から選択される生殖系列タンパク質配列をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項４７乃至５６の何れか１項に記載の方法において、発現させる前記抗体又はその機能断片が、潜在的な翻訳後修飾部位を取り除くアミノ酸修飾を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項４７乃至５７の何れか１項に記載の方法において、発現させる前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれの可変重鎖由来の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項４７乃至５８の何れか１項に記載の方法において、発現させる前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれのＨＣＤＲ１領域由来のＨＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項４７乃至５９の何れか１項に記載の方法において、発現させる前記抗体又はその機能断片が、配列番号２６６〜２７８に示されるそれぞれのＨＣＤＲ２領域由来のＨＣＤＲ２領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項４７乃至６０の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項４７乃至６１の何れか１項に記載の方法において、前記抗体又はその機能断片が、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項４７乃至６２の何れか１項に記載の方法において、前記コレクションが、少なくとも１×１０４個の抗体又はその機能断片を含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項４７乃至６３の何れか１項に記載の方法において、前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ及びＩｇＭからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項４７乃至６４の何れか１項に記載の方法において、前記抗体の前記機能断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４９４，４５２号明細書、及び２０１０年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／４１５，３６７号明細書の利益を主張し、これらの仮特許出願は、双方とも、全体として参照により援用される。
【０００２】
配列表
本願は配列表を含み、この配列表は、ＥＦＳ−ＷｅｂからＡＳＣＩＩ形式で提出されたもので、本明細書によって全体として参照により援用される。２０１１年２月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物の名称はＭＳ１３０ＵＳ．ｔｘｔであり、サイズは２２９，５６８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
医薬開発が、特に治療用抗体の分野で進歩し、多くの疾患の治療が急速に可能になり、及び／又は改良されつつある。新規の標的空間に到達し、且つ新規の作用機序を提供することによるこのような進歩により、最も重症で困難な疾患を有する場合にも、患者のクオリティ・オブ・ライフは一層改善されるようになっている。一般に医療システムにとっての、及び特に患者にとっての一つの難題は、これらの医薬の進歩により可能となる新薬のコストもまた、急速に上昇しつつあることである。コストが高いのは、医薬品、特に抗体の開発に要する投資の結果であり、現在、投資は一上市品につき１０億ドルを超えている。開発は失敗のリスクが大きく、且つ開発のタイムラインが非常に長いため、このような投資は不可避である。候補となる治療用抗体を同定した時点から、それが上市されて患者が恩恵を受け得るまでには、１５年以上かかり得る。同定、前臨床、臨床から上市までの開発段階それぞれに、難題及びリスクが多くある。製薬会社は、最も有効な医薬を迅速に患者のもとに届けるため、タイムラインを短縮し、且つ失敗のリスクを低減することによって、常に開発コストの削減に努めている。
【０００４】
以下の開示は、任意の疾患の治療に最適な治療用抗体のより速い同定を可能にする価値ある進歩を提供する。治療用抗体候補は、それを上市するために、長期安定性、低凝集傾向及び高発現収率などの数多くの開発基準を満たさなければならない。本開示の進歩により、厳しい開発基準の全てを最初から満たすことのできる抗体を同定する確率及び速度が増す。得られる抗体は生産費用が下がり、多数の疾患の治療において有効且つ安全であり得る。
【０００５】
治療用抗体を同定する公知の方法は、ファージディスプレイ技術の使用によるものである。ファージディスプレイは、細菌において成長するウイルス様粒子を利用して抗体を提示する。この技術の一つの利点は、使用するライブラリが膨大で、１×１０１１個の抗体にも上り、それらを任意の疾患に関連する任意の標的との結合性について迅速に試験し得ることである。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），“Ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＨｕＣＡＬ）ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ＣＤＲｓ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（モジュール共通フレームワーク及びトリヌクレオチドでランダム化されたＣＤＲに基づく完全合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ（ＨｕＣＡＬ））”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１；２９６（１）：５７−８６、及び米国特許第６，３００，０６４号明細書（双方とも、全体として参照により援用される）を参照のこと。このように多い数で作業する利点は、標的に対するスクリーニングの出力により、治療標的に結合する何百もの抗体が得られ、その全てが治療上関連性を有し得ることである。しかしながら、問題は、多くの場合にそれらの抗体のうち開発可能である、すなわち上市に必要な厳しい基準の全てを満たし得るものが、数個しかないことである。
【０００６】
新規のファージディスプレイコレクションについて同定のタイムラインを短縮し、且つ固有のリスクを低減するためには、そのコレクションが、選択及び臨床開発に必要な特性であって、且つ患者において安全で有効な治療をもたらし得る特性を有する抗体を含まなければならない。かかる特性としては、以下が挙げられる：１）高いファージ提示率、従って目的の標的に対してコレクションのありとあらゆる抗体を試験することができる；２）Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットにおける高い発現レベル、従って抗体又は断片を必要な量で効率的に再現することができる；３）Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットにおける高い熱安定性、それにより患者に送達される分子の構造上及び機能上の完全性が確保される；４）Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットにおける血清中での高い安定性、従って抗体が半減期の増加及び活性の延長を示す；５）Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットにおけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定するときの高い単量体含量（％単量体）、これは凝集傾向が低いことを意味する；６）ＩｇＧ１フォーマットにおける高い等電点（ｐＩ）；７）酸への曝露前及び曝露後のＦａｂ及びＩｇＧ１フォーマットにおける高い熱安定性；８）酸への曝露前及び曝露後のＦａｂ又はＩｇＧ１フォーマットにおける低い濁度；９）酸への曝露前及び曝露後の安定した分子半径及び％多分散性；１０）低い免疫原性リスク、それによる安全性の増加、及び／又は１１）高い多様性、従って１つのコレクションを、任意の治療標的に対する多くの抗体の同定に使用することができる。
【０００７】
本質的にはヒト免疫系を模倣するものであるコレクションは、極めて有益な、又はさらには最適な解決法であるはずである。ヒト免疫系は、生殖系列遺伝子によりコードされる抗体を含む。抗体は、一部には、可変重鎖と可変軽鎖とから構成される。約５０個の可変重鎖生殖系列遺伝子と約５０個の可変軽鎖生殖系列遺伝子とが存在し、合わせて約２，５００通りの組み合わせの異なる可変重鎖と可変軽鎖との対を提供する。ヒトでは、これらの２５００通りの組み合わせの全てが産生されると考えられる。しかしながら、特定の可変重鎖、可変軽鎖及び／又は可変重鎖と可変軽鎖との組み合わせ（対）が、他より高いレベルで存在することが分かっている。あるものが他より多く存在する何らかの理由があるはずで、そうであるならば、高度に存在する生殖系列遺伝子は好ましい機能特性を有し得ると仮定された。従って、好ましい機能特性を有する抗体のコレクションを提供する一つの方法は、ヒト免疫レパートリーに存在する豊富な可変重鎖、可変軽鎖、及び／又は可変重鎖と可変軽鎖との対を含むコレクションを作成することである。
【０００８】
加えて、ヒトに存在する生殖系列遺伝子配列は、明白な理由で、免疫原性が極めて低いと考えられ、従って組換え抗体において、免疫原性リスクを低下させるためにこれらの配列を模倣することができる。
【０００９】
ヒト免疫レパートリーにおける出現率が高い可変重鎖及び軽鎖生殖系列遺伝子の対形成を評価する手法が企図されている。ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｈａｐｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ（重鎖及び軽鎖の対形成の分析は、受容体エディティングがヒト抗体レパートリーを形作ることを示している），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２；２８５（３）：８９５−９０１（１９９９年１月）（全体として参照により援用される）を参照のこと。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒトドナーから血液試料を採取し、体細胞超突然変異を起こしたＩｇＧ＋  Ｂ細胞を分取し、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、各ｃＤＮＡを配列決定し、各配列を既知のヒト可変ドメイン生殖系列遺伝子とアラインメントした。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．によれば、僅か数種の生殖系列遺伝子が免疫レパートリーの大半を占めていたこと、及び多くの場合に高頻度の重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することが観察された。
【００１０】
個々のＢ細胞の重鎖及び軽鎖可変ドメインの対形成を維持する試みもまた企図されている。例えば、可変ドメイン「同種対」のライブラリが開示されている。Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇ（天然の重鎖及び軽鎖対形成を保つヒト抗体レパートリーの単離），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，３５８（３）：７６４−７２（２００６年５月５日）；及び国際公開第２００５０４２７７４号パンフレット（双方とも、全体として参照により援用される）を参照のこと。免疫宿主由来の個々のＢ細胞から、Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載される技法によるライブラリが作成されている。概して、Ｂ細胞をＦＡＣＳにより分取することで、体細胞超変異細胞を表すＣＤ３８ＨＩ  Ｂ細胞が選択され、それらのｃＤＮＡがＰＣＲ増幅され、選択のためＦａｂベクターに抗体遺伝子産物が挿入される。かかる同種対ライブラリに制約がないわけではない。例えば、Ｂ細胞を提供する宿主は、典型的には免疫され；及び分取されたＢ細胞集団は超変異しているため、得られるライブラリは特定の免疫原に偏っている。
【００１１】
加えて、コレクションの作成に、顕著な可変重鎖又は可変軽鎖を利用する試みが企図されている。例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｆａｂ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ  ａｓ  ｐＩＸ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｐＩＸ融合タンパク質としてファージ上に提示された合成Ｆａｂライブラリからの高親和性抗体のデノボ選択）；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，３９７（２）：３８５−９６（２０１０年３月２６日）及びそれぞれの特許出願である国際公開第２００９０８５４６２号パンフレット；及び国際公開第２００６０１４４９８号パンフレット（これらは全体として参照により援用される）。ここでは、可変重鎖又は可変軽鎖生殖系列タンパク質配列が、ヒト免疫レパートリーにおけるその使用頻度に基づきライブラリに組み込まれる。
【００１２】
また、特定の生殖系列対をコレクションに組み込む別の試みも企図されている。例えば、国際公開第１９９９０２０７４９号パンフレット（全体として参照により援用される）は、ヒト生殖系列重鎖遺伝子セグメントＤＰ−４７（ＩＧＨＶ３−２３）によりコードされる超可変ループのカノニカル構造及び／又は生殖系列遺伝子によりコードされるフレームワーク領域を有する重鎖、及び／又はヒト生殖系列軽鎖遺伝子セグメントＯ２／Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９）によりコードされる超可変ループのカノニカル構造及び／又は生殖系列遺伝子によりコードされるフレームワーク領域を有する軽鎖がメンバーに含まれるコレクションについて記載している。
【００１３】
別の手法では、ライブラリがＢ細胞から直接作成され、又はＢ細胞から誘導されている。例えば、Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｇｉｖｅｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ（コンビナトリアル抗体ライブラリの多様性を正確に決定することで、ヒト免疫グロブリンレパートリーに関する洞察が得られる），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １；１０６（４８）：２０２１６−２１（２００９年１２月）（全体として参照により援用される）は、６５４個のヒトドナー免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）レパートリーの多様性から構築された抗体コレクションについて記載している。具体的には、６５４個のヒトドナー由来の重鎖及び軽鎖Ｖ遺伝子ｃＤＮＡが、個別にＰＣＲ増幅され（可変重鎖及び軽鎖対を分ける）、次に重鎖及び軽鎖ドメインが無作為に関連付けし直された。国際公開第２００３０５２４１６号パンフレット（全体として参照により援用される）もまた、微生物による感染又はワクチンによる処置のいずれかによりもたらされた、目的の病原体に対する反応を顕著に示す宿主からのＢ細胞の単離について記載している。国際公開第２００３０５２４１６号パンフレットでは、可変領域のＣＤＲ３領域をコードするｃＤＮＡが配列決定され、支配的なＣＤＲ３を含む抗体断片が設計された。国際公開第２００９１００８９６号パンフレット（全体として参照により援用される）は、免疫宿主からのＢ細胞の単離について記載し、ここでは可変重鎖及び軽鎖領域をコードするｃＤＮＡが配列決定され、対を形成しなかった可変重鎖及び可変軽鎖配列の存在量が決定された。国際公開第２００９１００８９６号パンフレットでは、ランダムに組み換えられた可変重鎖及び可変軽鎖を含むライブラリが合成され、ここでは抗体は、一つの免疫原に特異的であった。これらの及びさらなる手法の概要は、Ｆｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（治療薬としての合成抗体），Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．，７（１）：７３−８７（２００７年１月）（全体として参照により援用される）に見出される。
【００１４】
従って、開発に関連する好ましい生物物理学的特性を有するヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖遺伝子対を組み込むと同時に、自然中に存在するが、かかる生物物理学的特性を有しない対が除外された抗体又はその断片のコレクションが、極めて必要とされている。これらの及び他の必要性が、本発明によって満たされる。
【発明の概要】
【００１５】
本開示は、開発可能で患者に安全且つ有効な、任意の抗原に対する抗体又は抗体断片を、効率的に同定するという問題に対して、有益な解決法を提供する。その最も広義の意味で、本発明者らは、本質的にヒト免疫系を模倣する抗体コレクションが有利であり得るという構想から出発した。ある面では、本発明者らは、最適な生殖系列遺伝子配列、又はその一部を、ヒト免疫レパートリーから抗体に組み込むことにより、ヒト免疫系を模倣することを決めた。そのため一部の実施形態では、コレクションの抗体は、配列が生殖系列である部分、例えばフレームワーク領域を含む。生殖系列配列を使用すると、患者において治療用に用いられる組換え抗体の免疫原性リスクが劇的に低下するはずである。
【００１６】
加えて、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーにおいて豊富な可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対が、より効率的な臨床開発につながり、且つ得られる抗体の患者における安全性及び有効性を高めるであろう好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという自らの仮説から取り組んだ。背景として、各Ｂ細胞が一つの抗体をコードし、及び各抗体が可変重鎖及び可変軽鎖を含む。抗体の可変重鎖及び可変軽鎖の各々は、抗体の起源を決定するために生殖系列配列とアラインメントすることができ、つまりその生殖系列遺伝子から可変重鎖及び可変軽鎖がコードされる。従って、各抗体について可変重鎖及び可変軽鎖が、生殖系列遺伝子又は生殖系列タンパク質の対、例えばＶＨ３−２３のＶＫ１−５との対を含む。
【００１７】
顕著な生殖系列遺伝子対が好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという仮説を証明するための第１のステップは、ヒト免疫レパートリーにおいて顕著な可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を同定することであった。これは、公的に利用可能な文献を広範に検索することにより、及び宿主からＢ細胞をサンプリングすることにより行われた。次のステップとして、このデータをプールし、分析して、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列対を、その出現率で順位付けした。このデータから、ヒト免疫レパートリーにおいて特定の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対が他より高頻度に存在することが明らかであった。
【００１８】
次のステップとして、ヒト免疫レパートリーには約２５００対あり、それぞれを試験することは好ましくないため、どの生殖系列タンパク質対を開発に関連する機能特性について試験すべきであるかを決定しなければならなかった。一つの方法は、ヒト免疫レパートリーに最も顕著に現れる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を試験することであり得た（例えば、表６を参照のこと）。例えば、上位４００対を試験用に選択するか、又は特定の閾値数以上で存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を選択することができた。この手法は、極めて多数の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対配列の合成及び試験を必要とするものと思われた；従って、かかる手法はあまり効率的とは言えない。
【００１９】
代替的な手法として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーの顕著な対の大多数を代表する、それを正確に再現する、又はそれを網羅する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列対のサブセットを選択した。この手法は、一部には、ヒト免疫レパートリーにおいて少数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列遺伝子（対でない）が支配的であるという観察に基づいた。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．８９５〜８９６頁がこの現象について記載している。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．はまた、多くの場合に高頻度の重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することも記載し、サンプリングされた対形成の半数が僅か５つの生殖系列対に対応したことを観察した。従って、少数の顕著な重鎖及び軽鎖生殖系列遺伝子（対でない）を組み合わせることで、ヒト免疫レパートリーを代表する一群の重鎖及び軽鎖対を作成することができる。
【００２０】
この手法は、以下のように行った。関連付けられるＶＨ／ＶＬ対を示すデータ（例えば表６を参照）、及び関連付けされないＶＨ鎖又はＶＬ鎖の存在を同定するデータ（例えば実施例３及び表５を参照）を分析し、ヒト免疫レパートリーにおいて顕著な可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列遺伝子（対でない）を決定した。
【００２１】
次のステップとして、顕著な可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列タンパク質配列（対でない）を評価して、開発に関連するそれらの生物物理学的特性を決定した（実施例４を参照）。可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列タンパク質配列は、以下の特性についてインシリコで評価した：（ｉ）ＣＤＲ長さ、（ｉｉ）等電点（ｐＩ）（中性又は弱酸性配合緩衝液中で安定性を提供するものと思われる７．５以上の等電点が好ましい）、（ｉｉｉ）潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）の潜在的部位（具体的には、Ｎ−結合型グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又は化学修飾、例えばＡｓｐ開裂（多くの場合にＤＰ又はＤＱにおける）、（ｉｖ）Ａｓｐ異性化（ＤＳ、ＤＧ）、（ｖ）アミド分解（ＮＳ、ＮＧ）、これは生体内（血清中）において又は配合緩衝液中での貯蔵時に起こり、抗原結合の喪失をもたらし得る）、（ｖｉ）ＣＤＲにおけるメチオニンの存在（溶媒に曝露されたときに酸化しやすい可能性がある）、（ｖｉｉ）対でないシステインの存在（任意の他の対でないシステインとジスルフィド結合を形成し、ひいてはタンパク質の架橋及び／又は発現レベルの低下をもたらし得る）、（ｖｉｉｉ）生殖系列からの偏差、（ｉｘ）あり得るＴ細胞エピトープの存在、及び（ｘ）理論上の凝集傾向。
【００２２】
次のステップとして、好ましいインシリコ生物物理学的特性を有する可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列タンパク質配列を組み合わせて、可変重鎖と可変軽鎖との対を形成した。表５、及び図２〜図３に概して示されるとおり、上位２０個のＶＨ、上位８個のＶλ及び上位１２個のＶκを、合成、組み合わせ、及び続く機能分析のために選択した。生殖系列遺伝子配列を合成し、次に組み合わせることにより、表６に示されるとおりの、ヒト免疫レパートリーから顕著な対の大多数を代表する、それを正確に再現する、又はそれを網羅する４００個の生殖系列タンパク質対（２０個のＶＨ×２０個のＶＬ）を作成した。これは、可変重鎖及び軽鎖生殖系列遺伝子を合成し、それらを対に組み合わせ、対をタンパク質として発現させ（生殖系列タンパク質対）、各々を試験してそれらの生物物理学的特性を同定することにより行った。以下の特性を試験した：（ｉ）Ｆａｂフォーマットにおけるファージ上での相対提示率、（ｉｉ）例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での、Ｆａｂフォーマットにおける相対発現レベル；（ｉｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性；（ｉｖ）Ｆａｂフォーマットにおけるウシ又はマウス血清中での安定性；（ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける相対発現レベル；及び（ｖｉ）ＩｇＧ１フォーマットにおけるウシ血清中での安定性。
【００２３】
４００個の生殖系列タンパク質対を、提示、発現、熱安定性及び血清安定性について試験することは、天然では存在するものの、治療薬開発に好ましいと考えられる生物物理学的特性を有しない生殖系列タンパク質対を除去する予備的なフィルタリングとして機能した。目標は、好ましい開発可能特性を有すると同時に、そのコレクションを使用して任意の抗原に対する開発可能な候補を同定することができるようなコレクション内での高度な多様性を維持する生殖系列タンパク質対のサブ群を選択することであった。表１２は、本開示の実施形態の閾値を満たした約６０個の太字及び下線の生殖系列タンパク質対を示す。表１２は、以前に、米国仮特許出願第６１／１８２，３５０号明細書、及び米国仮特許出願第６１／２９９，４０１号明細書の利益を主張する国際公開第２０１０／１３６５９８号パンフレット（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）（これらは全て、全体として参照により援用される）に開示された。
【００２４】
試験した４００個の生殖系列タンパク質対（結果は表１２に示す）のうち９５個をさらなる試験用に選択した。さらなる試験用に選択したそれらの９５個の生殖系列タンパク質対のうち一部は、前出の基準を満たし、且つさらなる試験が求められたという理由で選択した。他は、特定の閾値を満たさなかったものの、それらの対を再評価し得るようにするため選択した。図１６〜図２４に示される９５個の生殖系列タンパク質対を合成し、発現させ、精製し、次にＦａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットで以下について試験した：ａ）精製Ｆａｂ発現（ｍｇ／Ｌ単位）、ｂ）精製Ｆａｂ単量体含量（％単量体）、ｃ）精製Ｆａｂ熱安定性、ｄ）精製ＩｇＧ１発現（ｍｇ／Ｌ単位）、ｅ）精製ＩｇＧ１単量体含量（％単量体）、ｆ）精製ＩｇＧ１熱安定性、ｇ）ＩｇＧ１等電点、及びｈ）示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、吸収、動的光散乱及び粒子染色を含む、酸への曝露によるＩｇＧ１ストレス試験。
【００２５】
ある実施形態では、以下の生殖系列タンパク質対（５４個）が、開発可能性に関して優れた機能活性を有すると同定された（データは図１６〜図２４に示す）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）。具体的には、この実施形態において、生殖系列タンパク質対（５４個）は各基準について以下の閾値以上の値を有した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９８％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；及びｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）。従って、これらの可変重鎖と可変軽鎖との対を任意に含むコレクションを、任意の抗原に対する開発可能な抗体又はその断片の同定に使用することができた。
【００２６】
国際公開第２０１０／１３６５９８号パンフレットの表３２と比較すると、表３２は５４個の対のうち２１個のみを、特定の異なる機能特性を有するものとして示している。
【００２７】
本開示の実施形態は、開発可能性に関して優れた機能活性を有する上記の生殖系列タンパク質対のサブセット（５４個のうちの３６個）を含むコレクションを含む。一実施形態において、コレクションは、合成抗体又はその機能断片を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の生殖系列タンパク質配列を含む。この実施形態では、５４個の生殖系列タンパク質対から、ストレス試験データに基づきサブセット（３６個）の生殖系列タンパク質対を選択した。ストレス試験データは、実施例９．２．５（ａ〜ｄ）（データは図１９〜図２４に示す）、実施例９．２．６（ａ〜ｄ）（データは図１９〜図５４に示す）及び実施例９．２．７（スコアリングは図５５〜図６０に示す）に記載される方法を用いて同定した。このストレス試験では、ＩｇＧ１フォーマットで９５個の生殖系列タンパク質対を評価することにより、酸への曝露及びガラスビーズによる撹拌に耐えるそれらの能力を決定した。化学、製造及び品質管理（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＣＭＣ）の下流処理加工（ＤＳＰ）ではウイルス不活化ステップが標準的であるため、酸への曝露に耐える抗体の能力は、一層重要な要素になりつつある。処理加工中にろ過ステップは避けられず、且つシリンジ針又はプラスチックチューブによる投与中には剪断力（ｓｈｅｅｒ  ｆｏｒｃｅｓ）が生じるため、剪断力（ｓｈｅｅｒ  ｆｏｒｃｅｓ）に抵抗する抗体又は抗体断片の能力は、有用な基準である。
【００２８】
上記のサブセットコレクション、ある実施形態の（３６個の）生殖系列タンパク質対は、５４個のうちの他の対と比べて酸及び撹拌ストレスに対してより強い抵抗性を示したとおり、開発可能性に関連するさらなる優れた機能特性を有することから選択された。この実施形態で選択された３６個の生殖系列タンパク質対は、各基準について以下の閾値以上の値を有した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９８％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）及びｇ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）。
【００２９】
国際公開第２０１０／１３６５９８号パンフレットの表３２と比較すると、表３２は３６個の対のうち１４個のみを、特定の異なる機能特性を有するものとして示している。加えて、国際公開第２０１０／１３６５９８号パンフレットは、３６個の対の具体的な組み合わせを開示していない。
【００３０】
別の実施形態において、各基準についての閾値は以下のとおり選択した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９９％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）；ｇ）少なくとも８．３の精製ＩｇＧ１の等電点（実施例９．２．４に記載されるとおり）；及びｈ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）。この実施形態において、コレクションは、（３３個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【００３１】
国際公開第２０１０／１３６５９８号パンフレットの表３２と比較すると、表３２は３３個の対のうち１４個のみを、特定の異なる機能特性を有するものとして示している。加えて、国際公開第２０１０／１３６５９８号パンフレットは、３３個の対の具体的な組み合わせを開示していない。
【００３２】
さらなる実施形態において、それ自体が各基準における閾値の全てを満たさない対であったとしても、対がコレクションに加えられ、コレクションに加えることにより多様性を高めた。ある実施形態では、コレクションは、ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）をさらに含む。この実施形態において、コレクションは、（３６個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【００３３】
かかるコレクションは、先行技術の問題の多くを解消する。例えば、Ｂ細胞に由来するコレクションには、かかるコレクションに存在するＶＨとＶＬとの対形成がＢ細胞のサンプル中に存在する対形成と同じであるため、好ましい生物物理学的特性を有しないＶＨ／ＶＬ対が含まれる。十分に大きいＢ細胞サンプルをとった場合、約５０個のＶＨクラスと５０個のＶＬクラスとの対形成の組み合わせ（２５００個）の各々が存在し得る。本開示におけるＶＨとＶＬとの対の広範囲の試験は、天然で存在するＶＨとＶＬとの生殖系列遺伝子対（生殖系列タンパク質対）の多くが、臨床での開発可能性をもたらし得る特性を有しないことを示している。従って、かかるＢ細胞ライブラリは、開発可能である見込みのない多くのＶＨとＶＬとの対を含む。従って、有利な機能特性を有するＶＨとＶＬとの対を含む高い多様性のライブラリの作成が望ましいといえるが、しかしＢ細胞コレクション手法では、これは不可能である。
【００３４】
例えば、本開示のある態様は、開発可能性を高める有利な特性を有する可変重鎖及び軽鎖生殖系列タンパク質対を含むが、かかる特性を有しない可変重鎖及び軽鎖生殖系列遺伝子対は、それらがヒト免疫レパートリーで顕著に発現するとしても除かれている抗体又は機能断片のコレクションである。このように、コレクションは、有利な機能特性を有しない、天然に存在する可変重鎖及び軽鎖の組み合わせ又は対を（２，５００個の対から）除外するように設計した。例えば、ＶＨ４−３４は、表５に示されるとおりヒト免疫レパートリーに高頻度で存在するが、この重鎖生殖系列遺伝子に由来する抗体がＢ細胞傷害性であり得ることもまた知られており、従って、この遺伝子に由来する抗体はコレクション設計から除くことができた。Ｂｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＶＨ４−３４（ＶＨ４．２１）ｇｅｎｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＶＨ４−３４（ＶＨ４．２１）遺伝子によりコードされるモノクローナル抗体により誘発されたヒトＢリンパ球の急速な細胞傷害性），Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５（１）：１８３−９０（１９９６年７月）を参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、実施例１に詳細に記載するとおり、ｐｈｏＡ及びｏｍｐＡ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナル配列のＣ末端に組み込むために選択された制限部位を示し、ＣＤＲ３の周りの制限部位及びそれらのそれぞれの向きを含む。この図は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナル配列を示すが、同様に実施例１に詳細に記載されるとおり、ＩｇＧ１発現に用いられるヒト重鎖及びκ鎖リーダー配列に組み込むために選択されたＣ末端制限部位もまた表す。
【図２】図２は、実施例４に詳細に記載するとおり、合成、組み合わせ、及び機能特性決定用に選択された２０個のＶＨ生殖系列遺伝子を示す。この図はまた、各生殖系列遺伝子のインシリコ解析の結果も示し、ここでｐＩは等電点（ｉｓｏｌｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）を表し、ＰＴＭは、本明細書に記載されるとおり、相補性決定領域における潜在的な翻訳後修飾部位であり、ＮｘＳ／ＴはＮ−結合型グリコシル化部位であり、及びＣＤＲのＭｅｔはメチオニンである。
【図３】図３は、実施例４に詳細に記載するとおり、合成、組み合わせ、及び機能特性決定用に選択された８個のＶλ及び１２個のＶκ生殖系列遺伝子を示す。この図はまた、各生殖系列遺伝子のインシリコ解析の結果も示し、ここでｐＩは等電点（ｉｓｏｌｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）を表し、ＰＴＭは、本明細書に記載されるとおり、相補性決定領域における潜在的な翻訳後修飾部位であり、ＮｘＳ／ＴはＮ−結合型グリコシル化部位であり、及びＣＤＲのＭｅｔはメチオニンである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図４】図４は、実施例２．１及び実施例２．２からのプールデータのＶＨ／Ｖκ対を示す。数値エントリは、プールデータにおいて同定された個々のＢ細胞からの各ＶＨ／Ｖκ生殖系列遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、プールデータにおける発現の頻度に関して上（最も高い出現率）のＶＨ３−２３から下（より少ない出現率）のＶＨ３−２０まで順位付けされたＶＨ生殖系列遺伝子を示す。Ｘ軸は、プールデータにおける発現の頻度に関して左（最も高い出現率）のＩＧＫＶ３−２０から右（より少ない出現率）のＩＧＫＶ１Ｄ−１７まで順位付けされたＶκ生殖系列遺伝子を示す。数１３５８は、サンプリングされたＢ細胞の数である。
【図５】図５は、実施例２．１及び実施例２．２からのプールデータのＶＨ／Ｖλ対を示す。数値エントリは、プールデータにおいて同定された個々のＢ細胞からの各ＶＨ／Ｖλ生殖系列遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、プールデータにおける発現の頻度に関して上（最も高い出現率）のＶＨ３−２３から下（より少ない出現率）のＶＨ３−２０まで順位付けされたＶＨ生殖系列遺伝子を示す。Ｘ軸は、プールデータにおける発現の頻度に関して左（最も高い出現率）のＩＧＬＶ２−１４から右（より少ない出現率）のＩＧＬＶ４−６０まで順位付けされたＶλ生殖系列遺伝子を示す。数７７９は、サンプリングされたＢ細胞の数である。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｖｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｖｈ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐ（ヒト生殖系列Ｖｈ配列のレパートリーが、異なる超可変ループを有する約５０のＶｈセグメント群を明らかにする）”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｌｏｃｕｓｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の完全ヌクレオチド配列）”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８（１１）：２１５１−６２；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８（２）：１００−１６に記載されるとおりの、ＶＨ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号６３〜１１８）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｖｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｖｈ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐ（ヒト生殖系列Ｖｈ配列のレパートリーが、異なる超可変ループを有する約５０のＶｈセグメント群を明らかにする）”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｌｏｃｕｓｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の完全ヌクレオチド配列）”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８（１１）：２１５１−６２；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８（２）：１００−１６に記載されるとおりの、ＶＨ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号６３〜１１８）を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｖｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｖｈ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐ（ヒト生殖系列Ｖｈ配列のレパートリーが、異なる超可変ループを有する約５０のＶｈセグメント群を明らかにする）”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｌｏｃｕｓｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の完全ヌクレオチド配列）”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８（１１）：２１５１−６２；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８（２）：１００−１６に記載されるとおりの、ＶＨ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号６３〜１１８）を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｓｃｈａｅｂｌｅ  ａｎｄ  Ｚａｃｈａｕ（１９９３），“Ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の可変遺伝子）”，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ．３７４（１１）：１００１−２２；Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｅｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），“Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＹＡＣｓ）（酵母人工染色体（ＹＡＣ）上のヒト免疫グロブリンκ遺伝子座）”Ｇｅｎｅ．１９１（２）：１７３−８１；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｋａｐｐａ  ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の進化動態及びＶκ遺伝子の生殖系列レパートリー）”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１（４）：１０１７−２８；及びＬｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ（ＩＧＫ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１６１−１７４に記載されるとおりの、Ｖκ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号１１９〜１６４）を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｓｃｈａｅｂｌｅ  ａｎｄ  Ｚａｃｈａｕ（１９９３），“Ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の可変遺伝子）”，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ．３７４（１１）：１００１−２２；Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｅｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），“Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＹＡＣｓ）（酵母人工染色体（ＹＡＣ）上のヒト免疫グロブリンκ遺伝子座）”Ｇｅｎｅ．１９１（２）：１７３−８１；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｋａｐｐａ  ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の進化動態及びＶκ遺伝子の生殖系列レパートリー）”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１（４）：１０１７−２８；及びＬｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ（ＩＧＫ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１６１−１７４に記載されるとおりの、Ｖκ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号１１９〜１６４）を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｓｃｈａｅｂｌｅ  ａｎｄ  Ｚａｃｈａｕ（１９９３），“Ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の可変遺伝子）”，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ．３７４（１１）：１００１−２２；Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｅｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），“Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＹＡＣｓ）（酵母人工染色体（ＹＡＣ）上のヒト免疫グロブリンκ遺伝子座）”Ｇｅｎｅ．１９１（２）：１７３−８１；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｋａｐｐａ  ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の進化動態及びＶκ遺伝子の生殖系列レパートリー）”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１（４）：１０１７−２８；及びＬｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ（ＩＧＫ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１６１−１７４に記載されるとおりの、Ｖκ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号１１９〜１６４）を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンλ遺伝子座の１メガベース配列分析）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７（３）：２５０−６１；Ｆｒｉｐｐｉａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２ｑ１１．２（染色体２２ｑ１１．２上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の機構）”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９８３−９９１；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンλ（ＩＧＬ）遺伝子の命名法）．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．；１８：２４２−２５４に記載されるとおりの、Ｖλ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号１６５〜２０２）を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンλ遺伝子座の１メガベース配列分析）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７（３）：２５０−６１；Ｆｒｉｐｐｉａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２ｑ１１．２（染色体２２ｑ１１．２上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の機構）”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９８３−９９１；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンλ（ＩＧＬ）遺伝子の命名法）．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．；１８：２４２−２５４に記載されるとおりの、Ｖλ生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号１６５〜２０２）を示す。
【図９】図９は、ｐＪＰｄ１  Ｆａｂトリシストロン性ファージディスプレイベクターを示す。
【図１０】図１０は、ｐＪＰｘ１  Ｆａｂ発現ベクターを示す。
【図１１】図１１は、ｐＭｘ１１（ｐＭＯＲＰＨＸ１１）Ｆａｂ発現ベクターを示す。
【図１２】図１２は、ｐＭＯＲＰＨ３０  Ｆａｂディスプレイベクターを示す。
【図１３】図１３は、ｐＪＰ＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆ可変重鎖ＩｇＧ１発現ベクターを示す。
【図１４】図１４は、ｐＪＰ＿ｈ＿Ｉｇ＿κ可変κ軽鎖ＩｇＧ発現ベクターを示す。
【図１５】図１５は、ｐＪＰ＿ｈ＿Ｉｇ＿λ２可変λ軽鎖ＩｇＧ発現ベクターを示す。
【図１６】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図１６、この図は、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のｍｇ／Ｌ（培養物）単位の精製Ｆａｂ発現収率、精製Ｆａｂ単量体含量（％単量体）、℃単位の精製Ｆａｂ熱安定性、ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）単位の精製ＩｇＧ１発現収率、精製ＩｇＧ１単量体含量（％単量体）、℃単位の精製ＩｇＧ１熱安定性（示される遷移は可変ドメインのものであり、Ｆｃドメインの遷移は示さず）及びＩｇＧ１等電点を示す。データは、実施例９．１．１〜９．１．３及び９．２．１〜９．２．４に記載される方法を用いて決定した。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図１７】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図１７、この図は、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のｍｇ／Ｌ（培養物）単位の精製Ｆａｂ発現収率、精製Ｆａｂ単量体含量（％単量体）、℃単位の精製Ｆａｂ熱安定性、ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）単位の精製ＩｇＧ１発現収率、精製ＩｇＧ１単量体含量（％単量体）、℃単位の精製ＩｇＧ１熱安定性（示される遷移は可変ドメインのものであり、Ｆｃドメインの遷移は示さず）及びＩｇＧ１等電点を示す。データは、実施例９．１．１〜９．１．３及び９．２．１〜９．２．４に記載される方法を用いて決定した。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図１８】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図１８、この図は、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のｍｇ（精製Ｆａｂ）／Ｌ（培養物）単位の精製Ｆａｂ発現収率、精製Ｆａｂ単量体含量（％単量体）、℃単位の精製Ｆａｂ熱安定性、ｍｇ（精製ＩｇＧ１）／Ｌ（細胞培養物）単位の精製ＩｇＧ１発現収率、精製ＩｇＧ１単量体含量（％単量体）、℃単位の精製ＩｇＧ１熱安定性（示される遷移は可変ドメインのものであり、Ｆｃドメインの遷移は示さず）及びＩｇＧ１等電点を示す。データは、実施例９．１．１〜９．１．３及び９．２．１〜９．２．４に記載される方法を用いて決定した。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図１９】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図１９、この図は、実施例９．２．５（ａ）に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法を用いて決定したときの酸への曝露前及び曝露後の℃単位の熱安定性（見かけのＴｍ）（示される見かけのＴｍは可変ドメインのアンフォールディングに対応し、Ｆｃドメインのアンフォールディング中点は示さず）、実施例９．２．５（ｂ）に記載されるとおりの酸への曝露前及び曝露中並びに中和後の紫外吸収に基づく濁度の相対的変化を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図２０】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図２０、この図は、実施例９．２．５（ｃ）に記載されるとおりの酸への曝露前及び曝露後の粒子半径（ｎｍ）並びに酸への曝露前及び曝露後の多分散性、実施例９．２．５（ｄ）に記載されるとおりの酸の前及び後の粒子染色、及び実施例９．２．７に記載されるとおりの累積スコアを示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図２１】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図２１、この図は、実施例９．２．５（ａ）に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法を用いて決定したときの酸への曝露前及び曝露後の℃単位の熱安定性（見かけのＴｍ）（示される見かけのＴｍは可変ドメインのアンフォールディングに対応し、Ｆｃドメインのアンフォールディング中点は示さず）、実施例９．２．５（ｂ）に記載されるとおりの酸への曝露前及び曝露中並びに中和後の紫外吸収に基づく濁度の相対的変化を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図２２】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図２２、この図は、実施例９．２．５（ｃ）に記載されるとおりの酸への曝露前及び曝露後の粒子半径（ｎｍ）並びに酸への曝露前及び曝露後の多分散性、実施例９．２．５（ｄ）に記載されるとおりの酸の前及び後の粒子染色、及び実施例９．２．７に記載されるとおりの累積スコアを示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図２３】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図２３、この図は、実施例９．２．５（ａ）に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法を用いて決定したときの酸への曝露前及び曝露後の℃単位の熱安定性（見かけのＴｍ）（示される見かけのＴｍは可変ドメインのアンフォールディングに対応し、Ｆｃドメインのアンフォールディング中点は示さず）、実施例９．２．５（ｂ）に記載されるとおりの酸への曝露前及び曝露中並びに中和後の紫外吸収に基づく濁度の相対的変化を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図２４】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図２４、この図は、実施例９．２．５（ｃ）に記載されるとおりの酸への曝露前及び曝露後の粒子半径（ｎｍ）並びに酸への曝露前及び曝露後の多分散性、実施例９．２．５（ｄ）に記載されるとおりの酸の前及び後の粒子染色、及び実施例９．２．７に記載されるとおりの累積スコアを示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図２５】図２５は、特定の可変重鎖のフレームワーク１領域及びＨＣＤＲ１領域のＶＨ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２０４〜２１６）及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２１７〜２２９）を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は図６に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶＨ生殖系列遺伝子のみを含める。
【図２６】図２６は、特定の可変重鎖のフレームワーク２領域及びＨＣＤＲ２領域のＶＨ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２０４〜２１６（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２１７〜２２９（続き））を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は図６に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶＨ生殖系列遺伝子のみを含める。
【図２７】図２７は、特定の可変重鎖のフレームワーク３領域のＶＨ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２０４〜２１６（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２１７〜２２９（続き））を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は図６に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶＨ生殖系列遺伝子のみを含める。
【図２８】図２８は、特定の可変軽鎖のフレームワーク１領域及びＬＣＤＲ１領域のＶκ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２３０〜２３９）及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２４０〜２４９）を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は、図７に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶκ生殖系列遺伝子のみを含める。
【図２９】図２９は、特定の可変軽鎖のフレームワーク２領域及びＬＣＤＲ２領域のＶκ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２３０〜２３９（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２４０〜２４９（続き））を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は、図７に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶκ生殖系列遺伝子のみを含める。
【図３０】図３０は、特定の可変軽鎖のフレームワーク３領域のＶκ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２３０〜２３９（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２４０〜２４９（続き））を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は、図７に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶκ生殖系列遺伝子のみを含める。
【図３１】図３１は、特定の可変軽鎖のフレームワーク１領域及びＬＣＤＲ１領域のＶλ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２５０〜２５７）及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２５８〜２６５）を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は、図８に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶλ生殖系列遺伝子のみを含める。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図３２】図３２は、特定の可変軽鎖のフレームワーク２領域及びＬＣＤＲ２領域のＶλ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２５０〜２５７（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２５８〜２６５（続き））を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は、図８に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶλ生殖系列遺伝子のみを含める。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図３３】図３３は、特定の可変軽鎖のフレームワーク３領域のＶλ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２５０〜２５７（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２５８〜２６５（続き））を示す。アミノ酸配列は、本明細書に定義するとおり、生殖系列タンパク質配列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。示される生殖系列遺伝子は、図８に示されるものと同じであるが、コレクションの実施形態に選択されたＶλ生殖系列遺伝子のみを含める。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図３４】図３４は、特定の可変重鎖のフレームワーク１領域及びＨＣＤＲ１領域のＶＨ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２６６〜２７８）及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２７９〜２９１）を示す。アミノ酸配列がＨＣＤＲ１内で修飾され、潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）が取り除かれている。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。ＨＣＤＲ１における修飾されているアミノ酸は下線で示し、各位置をコードする対応するＤＮＡは太字及び下線で示す。
【図３５】図３５は、特定の可変重鎖のフレームワーク２領域及びＨＣＤＲ２領域のＶＨ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２６６〜２７８（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２７９〜２９１（続き））を示す。アミノ酸配列がＨＣＤＲ２内で修飾され、潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）が取り除かれている。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。ＨＣＤＲ２における修飾されているアミノ酸は下線で示し、各位置をコードする対応するＤＮＡは太字及び下線で示す。
【図３６】図３６は、特定の可変重鎖のフレームワーク３領域のＶＨ生殖系列タンパク質配列（それぞれ、掲載順に配列番号２６６〜２７８（続き））及びＤＮＡ配列（それぞれ、掲載順に配列番号２７９〜２９１（続き））を示す。アミノ酸配列は、フレームワーク領域内で取り除かれた潜在的な翻訳後修飾部位がなかったため、生殖系列である。ＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、まれなヒトコドンを回避して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドンが最適化されている。ＶＨ１−６９＊０１及びＶＨ３−２３は９４位にヌクレオチドＣＧＴを有してもよい。
【図３７】図３７は、実施例１１に記載されるとおり、サブコレクションＶＨ３−２３／ＶＫ１−３９、及びＶＨ３−２３／ＶＬ３−１から同定されたＤｋｋ３に特異的な代表的な抗体又は抗体断片を示す。この図は、各抗体又は断片が同定されたサブコレクション、抗原、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３の長さ、Ｆａｂの熱安定性及び親和性、ＩｇＧ１のｐＩ、発現収率（ｍｇ／Ｌ）、熱安定性及びＳＥＣにより決定される単量体含量（％単量体）を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図３８】図３８は、実施例１１に記載されるとおり、サブコレクションＶＨ３−２３／ＶＫ１−３９、及びＶＨ３−２３／ＶＬ３−１から同定されたＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃに特異的な代表的な抗体又は抗体断片を示す。この図は、各抗体又は断片が同定されたサブコレクション、抗原、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３の長さ、Ｆａｂの熱安定性及び親和性、ＩｇＧ１のｐＩ、発現収率（ｍｇ／Ｌ）、熱安定性及びＳＥＣにより決定される単量体含量（％単量体）を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図３９】図３９は、実施例９．１．２に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｎｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）（ＤＳＦ）により決定するときの、選択されたＦａｂの見かけの温度融点を示す。各点が、一つのユニークＦａｂを表す。四角は、実施例９に記載されるとおりの対照Ｆａｂを示す。バーは中央値を示す。対照は、生殖系列ＦＲ領域並びにそれぞれの生殖系列タンパク質対のＣＤＲ１及び２、及びＥｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌのＣＤＲ３を含む、実施例９で機能特性について試験した抗体に相当する。選択されたＦａｂは実施例１１で作成したもので、ＣＤＲ３においてのみ対照抗体と配列が異なる。ここでの精密なクラスタリングから、コレクションの出力、すなわちＤＫＫ３抗原又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に対して選択された抗体又は断片が、コレクション設計のメンバーの優れた機能特性を維持していることが示される。
【図４０】図４０は、アミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号２９３、２９５、２９７及び３０１）及び本発明のコレクションのＦＲ４領域をコードするコドンが最適化された核酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、２９９、３００、３０２及び３０３）を示す。
【図４１Ａ】図４１Ａは、アミノ酸配列（配列番号３０５）及び本発明のコレクションのＩｇＧ１ｆ重鎖定常ドメインをコードするコドンが最適化された核酸配列（配列番号３０４）を示す。示される核酸配列は、コドンが最適化されている。
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、アミノ酸配列（配列番号３０５）及び本発明のコレクションのＩｇＧ１ｆ重鎖定常ドメインをコードするコドンが最適化された核酸配列（配列番号３０４）を示す。示される核酸配列は、コドンが最適化されている。
【図４２】図４２は、アミノ酸配列（配列番号３０７）及び本発明のコレクションのＦａｂ重鎖定常ドメインをコードするコドンが最適化された核酸配列（配列番号３０６）を示す。
【図４３】図４３は、アミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号３０９及び３１１）及び本発明のコレクションのＩｇＧ１ｆ及びＦａｂ  κ軽鎖定常ドメインをコードするコドンが最適化された核酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号３０８及び３１０）を示す。示される核酸配列は、コドンが最適化されている。
【図４４】図４４は、アミノ酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号３１３及び３１５）及び本発明のコレクションのＩｇＧ１ｆ及びＦａｂ  λ軽鎖定常ドメインをコードするコドンが最適化された核酸配列（それぞれ、掲載順に配列番号３１２及び３１４）を示す。
【図４５】図４５は、実施例９．２．４に記載されるとおりの選択されたＩｇＧの等電点（ｐＩ）値を示す。各点が、一つのユニークＩｇＧを表す。四角は、実施例９に記載されるとおりの対照ＩｇＧを示す。バーは中央値を示す。対照は、生殖系列ＦＲ領域並びにそれぞれの生殖系列タンパク質対のＣＤＲ１及び２、及びＥｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌのＣＤＲ３を含む、実施例９で機能特性について試験した抗体に相当する。選択されたＩｇＧは実施例１１で作成したもので、ＣＤＲ３においてのみ対照抗体と配列が異なる。ここでの精密なクラスタリングから、コレクションの出力、すなわちＤＫＫ３抗原又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に対して選択された抗体又は断片が、コレクション設計のメンバーの優れた機能特性を維持していることが示される。
【図４６】図４６は、実施例９．２．２に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定するときの、選択されたＩｇＧの見かけのアンフォールディング中点を示す。各点が、一つのユニークＩｇＧを表す。四角は、実施例９に記載されるとおりの対照ＩｇＧを示す。バーは中央値を示す。対照は、生殖系列ＦＲ領域並びにそれぞれの生殖系列タンパク質対のＣＤＲ１及び２、及びＥｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌのＣＤＲ３を含む、実施例９で機能特性について試験した抗体に相当する。選択されたＩｇＧは実施例１１で作成したもので、ＣＤＲ３においてのみ対照抗体と配列が異なる。ここでの精密なクラスタリングから、コレクションの出力、すなわちＤＫＫ３抗原又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に対して選択された抗体又は断片が、コレクション設計のメンバーの優れた機能特性を維持していることが示される。
【図４７】図４７は、実施例９．２．１に記載されるとおり紫外分光測定法により決定するときの、選択されたＩｇＧの発現収率を示す。各点が、一つのユニークＩｇＧを表す。四角は、実施例９に記載されるとおりの対照ＩｇＧを示す。バーは中央値を示す。対照は、生殖系列ＦＲ領域並びにそれぞれの生殖系列タンパク質対のＣＤＲ１及び２、及びＥｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌのＣＤＲ３を含む、実施例９で機能特性について試験した抗体に相当する。選択されたＩｇＧは実施例１１で作成したもので、ＣＤＲ３においてのみ対照抗体と配列が異なる。ここでの精密なクラスタリングから、コレクションの出力、すなわちＤＫＫ３抗原又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に対して選択された抗体又は断片が、コレクション設計のメンバーの優れた機能特性を維持していることが示される。
【図４８】図４８は、実施例９．２．３に記載されるとおりサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定するときの、選択されたＩｇＧの単量体含量を示す。各点が、一つのユニークＩｇＧを表す。四角は、実施例９に記載されるとおりの対照ＩｇＧを示す。バーは中央値を示す。対照は、生殖系列ＦＲ領域並びにそれぞれの生殖系列タンパク質対のＣＤＲ１及び２、及びＥｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌのＣＤＲ３を含む、実施例９で機能特性について試験した抗体に相当する。選択されたＩｇＧは実施例１１で作成したもので、ＣＤＲ３においてのみ対照抗体と配列が異なる。ここでの精密なクラスタリングから、コレクションの出力、すなわちＤＫＫ３抗原又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に対して選択された抗体又は断片が、コレクション設計のメンバーの優れた機能特性を維持していることが示される。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図４９】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図４９、この図は、実施例９．２．６（ａ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌前及び撹拌中の紫外吸収に基づく濁度の相対的変化を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５０】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図５０、この図は、実施例９．２．６（ｂ）に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法を用いて決定するときのガラスビーズによる撹拌後の℃単位の熱安定性（見かけのＴｍ）（示される見かけのＴｍは可変ドメインのアンフォールディングに対応し、Ｆｃドメインのアンフォールディング中点は示さず）を示し、実施例９．２．６（ｃ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌後の粒子半径（ｎｍ）、ガラスビーズによる撹拌後の多分散性、及び実施例９．２．６（ｄ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌前及び撹拌後の粒子染色を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５１】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図５１、この図は、実施例９．２．６（ａ）に記載されるとおりのストレス試験の前及びその最中の紫外吸収に基づく濁度の相対的変化を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５２】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図５２、この図は、実施例９．２．６（ｂ）に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法を用いて決定するときのガラスビーズによる撹拌後の℃単位の熱安定性（見かけのＴｍ）（示される見かけのＴｍは可変ドメインのアンフォールディングに対応し、Ｆｃドメインのアンフォールディング中点は示さず）を示し、実施例９．２．６（ｃ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌後の粒子半径（ｎｍ）、ガラスビーズによる撹拌後の多分散性、及び実施例９．２．６（ｄ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌前及び撹拌後の粒子染色を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５３】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図５３、この図は、実施例９．２．６（ａ）に記載されるとおりのストレス試験の前及びその最中の紫外吸収に基づく濁度の相対的変化を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５４】実施例９に記載されるとおりさらに試験した９５個の生殖系列タンパク質対の図５４、この図は、実施例９．２．６（ｂ）に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法を用いて決定するときのガラスビーズによる撹拌後の℃単位の熱安定性（見かけのＴｍ）（示される見かけのＴｍは可変ドメインのアンフォールディングに対応し、Ｆｃドメインのアンフォールディング中点は示さず）を示し、実施例９．２．６（ｃ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌後の粒子半径（ｎｍ）、ガラスビーズによる撹拌後の多分散性、及び実施例９．２．６（ｄ）に記載されるとおりのガラスビーズによる撹拌前及び撹拌後の粒子染色を示す。示されるデータは、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５５】実施例９．２．７に記載されるとおり、実施例９．２．５〜９．２．６で行われたストレス試験実験の各々について正確な値が同定され、及び正確な値のそれぞれに対して対応するスコアが提供された。図５５は、実施例９．２．５で完了した実験、酸試験について、各値に与えられた０か、２５か、７５か、又は１００かのスコアを示す。示されるスコアは、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５６】実施例９．２．７に記載されるとおり、実施例９．２．５〜９．２．６で行われたストレス試験実験の各々について正確な値が同定され、及び正確な値のそれぞれに対して対応するスコアが提供された。図５６は、実施例９．２．６で完了した実験、ガラスビーズによる撹拌について、各値に与えられた０か、２５か、７５か、又は１００かのスコアを示す。加えて、この図は、実施例９．２．５〜９．２．６で行われた試験のスコアを加え合わせることにより計算した累積スコアを示す。示されるスコアは、試験した生殖系列タンパク質対１〜３２番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５７】実施例９．２．７に記載されるとおり、実施例９．２．５〜９．２．６で行われたストレス試験実験の各々について正確な値が同定され、及び正確な値のそれぞれに対して対応するスコアが提供された。図５７は、実施例９．２．５で完了した実験、酸試験について、各値に与えられた０か、２５か、７５か、又は１００かのスコアを示す。示されるスコアは、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５８】実施例９．２．７に記載されるとおり、実施例９．２．５〜９．２．６で行われたストレス試験実験の各々について正確な値が同定され、及び正確な値のそれぞれに対して対応するスコアが提供された。図５８は、実施例９．２．６で完了した実験、ガラスビーズによる撹拌について、各値に与えられた０か、２５か、７５か、又は１００かのスコアを示す。加えて、図５８は、実施例９．２．５〜９．２．６で行われた試験のスコアを加え合わせることにより計算した累積スコアを示す。示されるスコアは、試験した生殖系列タンパク質対３３〜６４番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図５９】実施例９．２．７に記載されるとおり、実施例９．２．５〜９．２．６で行われたストレス試験実験の各々について正確な値が同定され、及び正確な値のそれぞれに対して対応するスコアが提供された。図５９は、実施例９．２．５で完了した実験、酸試験について、各値に与えられた０か、２５か、７５か、又は１００かのスコアを示す。示されるスコアは、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６０】実施例９．２．７に記載されるとおり、実施例９．２．５〜９．２．６で行われたストレス試験実験の各々について正確な値が同定され、及び正確な値のそれぞれに対して対応するスコアが提供された。図６０は、実施例９．２．６で完了した実験、ガラスビーズによる撹拌について、各値に与えられた０か、２５か、７５か、又は１００かのスコアを示す。加えて、図６０は、実施例９．２．５〜９．２．６で行われた試験のスコアを加え合わせることにより計算した累積スコアを示す。示されるスコアは、試験した生殖系列タンパク質対６５〜９５番のものである。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６１Ａ】図６１Ａについて、本発明の実施形態の生殖系列タンパク質対がファージ上に提示され、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４  Ｆｃ、ＧＦＰ又はｅｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物に対して選択された。この図は、使用したサブコレクション、それに対して選択された抗原、スクリーニングしたクローンの数、ＥＬＩＳＡ陽性ヒット、ユニーク抗体の数を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６１Ｂ】図６１Ｂについて、本発明の実施形態の生殖系列タンパク質対がファージ上に提示され、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４  Ｆｃ、ＧＦＰ又はｅｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物に対して選択された。この図は、使用したサブコレクション、それに対して選択された抗原、スクリーニングしたクローンの数、ＥＬＩＳＡ陽性ヒット、ユニーク抗体の数を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６１Ｃ】図６１Ｃについて、本発明の実施形態の生殖系列タンパク質対がファージ上に提示され、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４  Ｆｃ、ＧＦＰ又はｅｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物に対して選択された。この図は、使用したサブコレクション、それに対して選択された抗原、スクリーニングしたクローンの数、ＥＬＩＳＡ陽性ヒット、ユニーク抗体の数を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６１Ｄ】図６１Ｄについて、本発明の実施形態の生殖系列タンパク質対がファージ上に提示され、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４  Ｆｃ、ＧＦＰ又はｅｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物に対して選択された。この図は、使用したサブコレクション、それに対して選択された抗原、スクリーニングしたクローンの数、ＥＬＩＳＡ陽性ヒット、ユニーク抗体の数を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６２Ａ】図６２Ａは、実施例１１に記載されるとおり、ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対して選択されたサブコレクションのＩｇＧを示す。これらの図は、各抗体が同定されたサブコレクション、抗原、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３の長さ、ＩｇＧ１のｐＩ、ＩｇＧ１発現収率（ｍｇ／Ｌ）、ＩｇＧ１熱安定性及びＳＥＣにより決定される単量体含量（％単量体）を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６２Ｂ】図６２Ｂは、実施例１１に記載されるとおり、ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対して選択されたサブコレクションのＩｇＧを示す。これらの図は、各抗体が同定されたサブコレクション、抗原、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３の長さ、ＩｇＧ１のｐＩ、ＩｇＧ１発現収率（ｍｇ／Ｌ）、ＩｇＧ１熱安定性及びＳＥＣにより決定される単量体含量（％単量体）を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【図６２Ｃ】図６２Ｃは、実施例１１に記載されるとおり、ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対して選択されたサブコレクションのＩｇＧを示す。これらの図は、各抗体が同定されたサブコレクション、抗原、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３の長さ、ＩｇＧ１のｐＩ、ＩｇＧ１発現収率（ｍｇ／Ｌ）、ＩｇＧ１熱安定性及びＳＥＣにより決定される単量体含量（％単量体）を示す。ここでは、ＶＬはＶλを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本発明の理解を促進するため、以下の定義及び説明を提供する。
【００３７】
「データベース又は可読媒体」は、本明細書で使用されるとき、配列データを格納する任意のフォーマット、ひいては任意の情報集合、例えばデータベースファイル、ルックアップテーブル、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートなどを指す。特定の実施形態においてデータベースは、コンピュータ可読記憶装置などの電子的形態で格納される。これには、媒体、例えば、サーバ、クライアント、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｐａｌｍ  Ｐｉｌｏｔなどの携帯情報端末、テープ、ｚｉｐディスク、コンピュータ内蔵ＲＯＭ（読出し専用メモリ）又はインターネット若しくはワールドワイドウェブが含まれる。コンピュータがアクセス可能なファイルを格納する他の媒体が、当業者に明らかであろう。
【００３８】
「インシリコ」は、コンピュータ上で実行される操作、分析、又は設計を指すが、また同様に紙上で又は思考によって実行されてもよい。
【００３９】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、全抗体を含む。抗体は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、マウス又はげっ歯類抗体、キメラ抗体、ラクダ科動物抗体又はヒト化抗体であってもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭなどの抗体クラスのいずれかに属し得る。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含むタンパク質である。
【００４０】
用語の抗体「断片」又は「機能断片」は、本明細書で使用されるとき、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ部分を含む単鎖、ナノボディ及び可変フレームワーク領域以外の足場を有する他の抗体様構造などの任意の抗原結合断片を含む。用語「機能断片」は、限定はされないが、目的の抗原との結合能を保持する抗体の任意の一部分を含む。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、抗原部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原部位内で、抗体の可変領域が抗原と数多くの部位で非共有結合性の力により相互作用する；相互作用が多いほど、親和性が強くなる。本明細書で使用されるとき、抗体又はその機能断片、例えばＩｇＧ抗体についての用語「高親和性」は、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、又は１０−１０Ｍ以下、又は１０−１１Ｍ以下、又は１０−１２Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、他の抗体アイソタイプについての「高親和性」結合は異なり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、又は１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００４２】
用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」は、本明細書で使用されるとき、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を指すことが意図され、一方、用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、本明細書で使用されるとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指すことが意図される。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用されるとき、平衡解離定数を指すことが意図され、これはＫｄのＫａに対する比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から求められ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤの決定方法は、表面プラズモン共鳴を用いるか、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
【００４３】
用語「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なる又は改変されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域に連結するように、定常領域、又はその一部分が、改変、置換又は交換されている抗体分子である。
【００４４】
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４など）を指す。アイソタイプにはまた、これらのクラスのうちの一つの修飾型も含まれ、ここでは修飾が加えられることによりＦｃ機能が改変され、それにより例えば、エフェクター機能又はＦｃ受容体との結合性が増強又は低減されている。
【００４５】
用語「生殖系列」は、親から子孫に受け継がれる抗体又はその機能断片をコードする核酸配列を意味する。
【００４６】
用語「生殖系列タンパク質配列」又は「生殖系列アミノ酸配列」は、ａ）生殖系列遺伝子によりコードされる抗体又はその機能断片の可変領域のアミノ酸配列；ｂ）生殖系列遺伝子によりコードされる抗体又はその機能断片の可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体又はその機能断片の可変領域をコードする修飾された核酸配列によりコードされるアミノ酸配列（ここで核酸配列は、例えば、コドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含量最適化、不要なｍＲＮＡスプライス部位の除去又はｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去により修飾されている）、又はｃ）生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列であるが、そのアミノ酸配列に、不要なシステインの除去、若しくは所望の制限部位、例えばＢｂｓＩの導入を目的とする、又は合成、増幅若しくはクローニングのエラーに起因するなどの、少数の突然変異を有するアミノ酸配列を意味する。「生殖系列タンパク質配列」又は「生殖系列アミノ酸配列」の例は、図６〜図８及び図２５〜図３３に示される。加えて、「生殖系列タンパク質配列」又は「生殖系列アミノ酸配列」には、実施例５で調製されるとおりのコンストラクトが含まれ、このようなコンストラクトは、以下を含む
ａ）ＶＨについて：リーダー配列（表１に示されるとおりＮｈｅＩ制限部位を組み込む修飾ｐｈｏＡ）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｓｓＨＩＩ制限部位（ＧＣＧＣＧＣ）を組み込む）；Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３において使用されるとおりの４Ｄ５抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）（配列番号１）；及びＪＨ４  ＦＲ４（図１に示されるとおりＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ）を組み込む）；
ｂ）Ｖｋについて：リーダー配列（表２に示されるとおりＮｄｅＩ制限部位を組み込むｏｍｐＡ）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｂｓＩ制限部位（ＧＡＡＧＡＣ）を組み込む）、Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３によるκ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）（配列番号２）；及びＪｋ１  ＦＲ４（図１に示されるとおりＫｐｎＩ／Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を組み込む）；及び
ｃ）Ｖλについて：リーダー配列（表２に示されるとおりＮｄｅＩ制限部位を組み込むｏｍｐＡ）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｂｓＩ制限部位（ＧＡＡＧＡＣ）を組み込む）、Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３によるλ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）（配列番号３）；及びＪｌ２／３  ＦＲ４（図１に示されるとおりＫｐｎＩ／Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を組み込む）。
【００４７】
生殖系列遺伝子によりコードされる抗体の「生殖系列タンパク質配列」又は「生殖系列アミノ酸配列」が、以下の文献に開示される、ＶＨについて：Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｖｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ｖｈ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐ（ヒト生殖系列Ｖｈ配列のレパートリーが、異なる超可変ループを有する約５０のＶｈセグメント群を明らかにする）”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），“Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の完全ヌクレオチド配列）”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８（１１）：２１５１−６２；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８（２）：１００−１６；Ｖλについて：Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンλ遺伝子座の１メガベース配列分析）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７（３）：２５０−６１；Ｆｒｉｐｐｉａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２ｑ１１．２（染色体２２ｑ１１．２上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の機構）”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４，９８３−９９１；及びＬｅＦｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンλ（ＩＧＬ）遺伝子の命名法）．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．；１８：２４２−２５４；及びＶκについて：Ｓｃｈａｅｂｌｅ  ａｎｄ  Ｚａｃｈａｕ（１９９３），“Ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の可変遺伝子）”，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ．３７４（１１）：１００１−２２；Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｅｐｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），“Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＹＡＣｓ）（酵母人工染色体（ＹＡＣ）上のヒト免疫グロブリンκ遺伝子座）”Ｇｅｎｅ．１９１（２）：１７３−８１；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｋａｐｐａ  ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座の進化動態及びＶκ遺伝子の生殖系列レパートリー）”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１（４）：１０１７−２８；及びＬｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκ（ＩＧＫ）遺伝子の命名法）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１６１−１７４（全て、本明細書によって全体として参照により援用される）。
【００４８】
本明細書の一部、例えば図５において、本願の中で用いられる可変ドメイン生殖系列遺伝子の命名法は、前段落に引用したＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．の文献に記載されるとおり、ＩＭＧＴである。命名法に関して、「ＶＨ」及び「ＩＧＨＶ」は重鎖可変ドメインを意味し、ここで遺伝子の付番はＩＭＧＴである；「ＶＬ」、「Ｖλ」及び「ＩＧＬＶ」はλ軽鎖可変ドメインを意味し、ここで遺伝子の付番はＩＭＧＴであり、及び「Ｖκ」、「ＶＫ」及び「ＩＧＫＶ」はκ軽鎖可変ドメインを意味し、ここで遺伝子の付番はＩＭＧＴである。或いは、「ＶＬ」が、Ｖκ及びＶλを含む可変軽鎖を意味するように用いられ得る。
【００４９】
用語「生殖系列遺伝子配列」は、ａ）抗体又はその機能断片の可変領域をコードする生殖系列遺伝子の核酸配列、又はｂ）生殖系列遺伝子によりコードされる抗体の可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体又はその機能断片の可変領域をコードする修飾された核酸配列（ここで核酸配列は、例えば、コドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含量最適化、不要なスプライス部位の除去又はｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去により修飾されている）を意味する。
【００５０】
用語「（１つ又は複数の）生殖系列遺伝子対」は、抗体又はその機能断片の可変重鎖及び可変軽鎖をコードする核酸配列の対、及びその対応する生殖系列遺伝子を意味する。例えば、生殖系列遺伝子対はＶＨ３−２３／Ｖκ１−５であってもよく、ここでＶＨ３−２３／Ｖκ１−５によりコードされる抗体は、生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３によりコードされる可変重鎖、又はその一部分と、生殖系列遺伝子Ｖκ１−５によりコードされる可変軽鎖、又はその一部分とを含む。
【００５１】
用語「生殖系列タンパク質対」は、抗体又はその機能断片であって、可変重鎖、又はその一部分、及び可変軽鎖、又はその一部分が、ａ）各々、特異的な生殖系列遺伝子によりコードされ、又はｂ）各々、特異的な生殖系列遺伝子によりコードされる抗体の可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体又はその機能断片の可変領域をコードする修飾核酸配列によりコードされ（ここで核酸配列は、例えば、コドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含量最適化、不要なｍＲＮＡスプライス部位の除去又はｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去により修飾されている）、又はｃ）各々、生殖系列遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含むが、そのアミノ酸配列に、不要なシステインの除去、若しくは所望の制限部位、例えばＢｂｓＩの導入を目的とする、又は合成、増幅若しくはクローニングのエラーに起因するなどの、点突然変異を有する抗体又はその機能断片を意味する。例えば、生殖系列タンパク質対は、ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５によりコードされる抗体又は機能断片であってもよく、ここで抗体は、生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３によりコードされる可変重鎖、又はその一部分と、生殖系列遺伝子Ｖκ１−５によりコードされる可変軽鎖、又はその一部分とを含む。「生殖系列タンパク質対」には、実施例５において調製されるとおりのコンストラクトが含まれ、このようなコンストラクトは、以下を含む
ａ）ＶＨについて：リーダー配列（表１に示されるとおりＮｈｅＩ制限部位を組み込む修飾ｐｈｏＡ）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｓｓＨＩＩ制限部位（ＧＣＧＣＧＣ）を組み込む）；Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３において使用されるとおりの４Ｄ５抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）（配列番号１）；及びＪＨ４  ＦＲ４（図１に示されるとおりＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ）を組み込む）；
ｂ）Ｖｋについて：リーダー配列（表２に示されるとおりＮｄｅＩ制限部位を組み込むｏｍｐＡ）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｂｓＩ制限部位（ＧＡＡＧＡＣ）を組み込む）、Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３によるκ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）（配列番号２）；及びＪｋ１  ＦＲ４（図１に示されるとおりＫｐｎＩ／Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を組み込む）；及び
ｃ）Ｖλについて：リーダー配列（表２に示されるとおりＮｄｅＩ制限部位を組み込むｏｍｐＡ）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｂｓＩ制限部位（ＧＡＡＧＡＣ）を組み込む）、Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３によるλ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）（配列番号３）；及びＪｌ２／３  ＦＲ４（図１に示されるとおりＫｐｎＩ／Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を組み込む）。
【００５２】
用語「可変重鎖と可変軽鎖との対」又は「ＶＨ／ＶＬ対」は、１つの可変重鎖と１つの可変軽鎖との組み合わせを意味する。抗体及び機能断片、例えばＦａｂは、可変軽鎖に結合した少なくとも１つの可変重鎖を含み、これが抗原結合領域を形成する。可変重鎖と可変軽鎖との対の一例は、ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５由来の生殖系列アミノ酸配列を含むか、又は生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５によりコードされる抗体又は機能断片、又はその一部分であり、ここで抗体は、ＶＨ３−２３由来の生殖系列アミノ酸配列を含むか、又は生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３によりコードされる可変重鎖、又はその一部分と、Ｖκ１−５由来の生殖系列アミノ酸配列を含むか、又は生殖系列遺伝子Ｖκ１−５によりコードされる可変軽鎖、又はその一部分とを含む。
【００５３】
用語「実質的に全て」は、少なくとも９０％を意味する。例えば、実質的に全ての抗体又は機能断片が、特定の特性を有する生殖系列タンパク質対の生殖系列アミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含むというのは、すなわち、抗体又は断片の少なくとも９０％が、かかる特性を有する生殖系列タンパク質対の生殖系列アミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含むことを意味する。
【００５４】
可変重鎖領域のＪＨ４、可変κ軽鎖領域のＪκ１、及び可変λ軽鎖領域のＪλ２／３の配列は、以下の文献に記載されている：Ｓｃａｖｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ，ｋａｐｐａ  ａｎｄ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ヒト免疫グロブリン重鎖、κ及びλ可変領域及び連結領域のタンパク質ディスプレイ）”Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１６（４）：２３４−４０；ＪＨについて：Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｕ  ｌｏｃｕｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  Ｊ  ａｎｄ  Ｄ  ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンμ遺伝子座の構造：胚性及び再構成Ｊ及びＤ遺伝子の特徴付け）”Ｃｅｌｌ  ２７（３  ｐｔ  ２）：５８３−９１；ＪＫについて：Ｈｉｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  Ｊ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ（ヒト免疫グロブリンκＪ領域遺伝子の進化）”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５７（３）：１５１６−２２；ＪＬについて：Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  &#8206;ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  Ｇｅｎｅ  Ｌｏｃｕｓ（ヒト免疫グロブリンλ遺伝子座の１メガベース配列分析）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７（３）：２５０−６１（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）。ＪＨ４アミノ酸配列は（ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）（配列番号４）であり；Ｊκ１アミノ酸配列は（ＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）（配列番号５）であり；及びＪλ２／３アミノ酸配列は（ＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）（配列番号６）である。
【００５５】
用語「可変ドメイン／領域／（ＶＨ又はＶＬ）」は、それぞれ軽鎖（κ及びλを含む）及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（Ｖｋ及びＶλを含む）、ＶＨ、ＪＬ（Ｊｋ及びＪλを含む）、及びＪＨ核酸のいずれかにより実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。軽鎖又は重鎖可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される３つの超可変領域が散在する「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域から構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、少なくとも以下の規則を用いて定義されており：Ｋａｂａｔ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，９１５−９２０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８）を参照；また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／ＮｕｍＦｒａｍｅ．ｈｔｍｌも参照（これは、抗体アミノ酸の周知の付番規則並びにＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置を示す）、及び図２５〜図３６において使用される。
【００５６】
用語「フレームワーク領域」は、抗原結合ループの足場として機能する可変ドメインの一部を意味する。フレームワーク領域の例には、可変重鎖又は可変軽鎖のいずれかのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４が含まれる。
【００５７】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗体の抗原結合ループを意味する。抗体Ｆｖ断片の２つの可変ドメインの各々が、３つのＣＤＲを含む。相補性決定領域には、可変重鎖又は可変軽鎖のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が含まれる。
【００５８】
用語「ヒト免疫レパートリー」は、ヒトの免疫系由来のＢ細胞から単離された核酸のレパートリーを意味する。レパートリーは、個体のものであっても、又は集団のものであってもよく、ナイーブＢ細胞及び／又は抗原を経験したＢ細胞に由来し得る。本発明は、十分なＢ細胞が得られるという条件で、単一の個体からの免疫レパートリーの決定に適している。好ましくは、免疫レパートリーは、サンプルの偏りを回避するため複数の個体から得られる。ヒト免疫レパートリーの一例を実施例２〜３に記載する。
【００５９】
「抗原」及び「免疫原」は、抗体が特異的に結合する任意の分子として定義される。
【００６０】
用語「抗原／免疫原に特異的」は、抗体と対応する分子との間の特異的な結合を意味する。特異性は、ＥＬＩＳＡ及び／又はＢｉａｃｏｒｅなどの、実施例１１に記載される方法により決定することができる。
【００６１】
「ＣＤＲの多様化」又は「多様化されたＣＤＲ」は、ＣＤＲ内のアミノ酸組成を変化させることにより達成される。多様化されたＣＤＲは、１つ以上の同一のフレームワーク領域、例えば生殖系列フレームワーク領域を有する抗体又は断片のコレクションに見出すことができ、ここで抗体又は断片は、異なるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する。多様化されたＣＤＲは、以下により記載される方法を含め、当業者に公知の任意の方法により実現することができる：国際公開第９７０８３２０号パンフレット、米国特許第６，３００，０６４号明細書（全体として参照により援用される）；国際公開第２００８０５３２７５号パンフレット、米国特許出願第１２／１５８，１８１号明細書（全体として参照により援用される）；国際公開第０７０５６４４１号パンフレット、米国仮特許出願第６０／８０６，６０２号明細書（全体として参照により援用される）；国際公開第２００９０３６３７９号パンフレット、米国仮特許出願第６０／９９３，７８５号明細書（全体として参照により援用される）；国際公開第２００９１１４８１５号パンフレット、米国特許出願第１２／９２２，１５３号明細書（全体として参照により援用される）；国際公開第０２０６１７０７１号パンフレット、米国特許出願第１２／７６２，０５１号明細書（全体として参照により援用される）。ＣＤＲは、概して免疫原結合領域であることが知られ、従ってＣＤＲ、特にＣＤＲ３内で高い多様性を表すメンバーを含むコレクションを有することにより、任意の免疫原に対する特異性及び最適な特性を有する抗体又はその断片がコレクションに含まれる可能性が高まる。
【００６２】
用語「変異体」は、別の抗体又は断片と異なるアミノ酸配列を有する抗体又は断片を意味する。用語「変異体」には、フレームワーク領域は本質的に配列が同じでありながら、ＣＤＲ領域、例えばＣＤＲ３のアミノ酸配列は異なる抗体又は断片が含まれる。可変重鎖と可変軽鎖との対の変異体は、フレームワーク領域内に本質的に同じアミノ酸配列を有するが、ＣＤＲ３領域内には異なるアミノ酸配列を有する。
【００６３】
用語「合成」又は「合成された」は遺伝子合成を意味し、ここでは核酸配列が、ポリヌクレオチドを含む物理的なＤＮＡに合成される。標準的なＤＮＡ合成は、単一のヌクレオチド合成を含み、ここでは一本鎖オリゴヌクレオチドが作成され、次にＰＣＲ様の構築を用いて重複オリゴヌクレオチドがライゲートされる。Ｓｌｏｎｉｎｇ（Ｐｕｃｈｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ  ＵＳＡ）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ＵＳＡ）などの会社が、遺伝子合成技術を提供している。例えばＳｌｏｎｉｎｇは、一組の予め作製された二本鎖トリプレットヌクレオチドを利用する。
【００６４】
用語「合成的」は、合成によって人体の外部で作られた、又は合成された分子、例えばＤＮＡを記載する。用語「合成的」はまた、合成ＤＮＡ分子から翻訳されたタンパク質、例えば抗体又は断片も記載する。
【００６５】
用語「コレクション」又は「ライブラリ」は、少なくとも２つのメンバーを意味する。用語「メンバー」は、限定はされないが、抗体又はその断片をコードする核酸、又は抗体又はその断片それ自体を含む。
【００６６】
用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」又は「ＤＮＡ」と同義的に使用され、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。この用語には、既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基若しくは連結基を含む核酸であって、合成の、天然に存在する、及び天然に存在しない、基準核酸と同様の結合特性を有する核酸が包含される。かかる類似体の例としては、限定なしに、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００６７】
特に指示されない限り、特定の核酸配列にはまた、暗黙に、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列も、並びに明示的に示される配列も包含される。具体的には、以下に詳述するとおり、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基に置換されている配列を作成することにより、縮重コドン置換を達成してもよい（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８，１９８５；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８，１９９４）。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「コドンが最適化された」又は「コドン最適化」は、ヌクレオチド配列が、特定の産生系、例えば細胞又は生物において好ましいコドンを含むように改変されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発ヌクレオチド配列によって本来コードされるアミノ酸配列を保持するように操作される。加えて、ヌクレオチド配列は、阻害モチーフ、ｍＲＮＡスプライス部位、ｍＲＮＡ不安定性モチーフ及び不要な制限部位を全く含まない又は最大限含まないように設計され得る。また、ヌクレオチド配列は、ＧＣ含量、所望の制限部位及び他のパラメータについて最適化されてもよい。配列は、細菌又は真核細胞、特に哺乳動物細胞を含め、異なる宿主における発現用に最適化されてもよい。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称することができる。
【００６９】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。
【００７０】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指して同義的に使用される。
【００７１】
用語「同一」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連において、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【００７２】
用語「ベクター」は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを運ぶ能力を有するポリヌクレオチド分子を指す。好ましいベクターは、それが連結されている核酸の自己複製能及び／又は発現能を有するものである。作動可能に連結された核酸の発現の誘導能を有するベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここではさらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及び哺乳動物ベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、従って宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それが作動可能に連結される遺伝子の発現の誘導能を有する。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合にプラスミドの形態である。ベクターは、原核細胞又は真核細胞と適合性を有し得る。プラスミドは最も一般的に用いられる形態のベクターであるため、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とは同義的に用いられ得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの、同等の機能を提供する他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００７３】
ベクターには、典型的には、それで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞におけるＶＨ及び／又はＶＬコードホモログの発現（転写及び翻訳）の誘導能を有する原核生物プロモーターを含み得る原核生物レプリコンが含まれる。加えて、ベクターには、哺乳動物細胞で使用されるＩｇＧ発現ベクターが含まれる（例えば図１３〜図１５を参照のこと）。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写を生じさせることが可能なＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、ＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミドベクターに提供される。かかるベクタープラスミドの例としては、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、及びｐＢＲ３２９、ｐＰＬ及びｐＫＫ２２３が挙げられ、市販されている。
【００７４】
「ディスプレイベクター」は、それで形質転換された細菌宿主細胞などの宿主細胞において、染色体外で組換えＤＮＡ分子を複製及び維持する能力を有するＤＮＡ配列を含む。かかるＤＮＡ配列は当該技術分野において周知されている。ディスプレイベクターは、例えば、ｆｄ、Ｍ１３、又はｆｌ繊維状バクテリオファージクラスに由来するファージベクター又はファージミドベクターであってもよい。かかるベクターは、繊維状バクテリオファージの表面上への、例えば結合タンパク質又はその断片を含めたタンパク質の提示を促進する能力を有する。ファージ、リボソーム、ＤＮＡ、細菌細胞又は真核細胞、例えば酵母又は哺乳動物細胞上への提示に好適なディスプレイベクターもまた、例えば、ウイルスベクター又はキメラタンパク質をコードするベクターと同様に、当該技術分野において公知である。
【００７５】
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。かかる用語は、特定の対象細胞のみを指すのではなく、かかる細胞の子孫もまた指すものと意図されることが理解されなければならない。後続の世代では、突然変異又は環境の影響のいずれかに起因した特定の修飾が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないこともあり得るが、それでもなお本明細書で使用されるとおりの用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。典型的な宿主細胞は、原核生物のもの（限定はされないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む細菌など）又は真核生物のもの（酵母、哺乳動物細胞などを含む）である。細菌細胞は好ましい原核生物宿主細胞であり、典型的には、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄから入手可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株である。好ましい真核生物宿主細胞には、酵母並びにマウス及びげっ歯類を含む哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル又はヒト細胞系由来のものなどの脊椎動物細胞、例えばＨＫＢ１１細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、又はＣＨＯ細胞が含まれる。
【００７６】
宿主細胞へのベクターの導入は、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、プロトプラスト融合、ウイルス感染などを含めた、当業者に公知の数多くの形質転換又はトランスフェクション方法により達成することができる。モノクローナル完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片及びｓｃＦｖ断片の産生が周知されている。
【００７７】
組換えＤＮＡ分子による適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には用いられるベクター及び細胞のタイプに応じた方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，Ｐ．２１１０（１９７２）；及びＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。ｒＤＮＡを含むレトロウイルスベクターによる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｓｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６（１９７３）；及びＷｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７６，Ｐ．１３７３−１３７６（１９７９）を参照のこと。
【００７８】
ｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）は以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＳＧＳＨＨＨＨＨＨＧＴＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＤＩ。下線及び斜体のアミノ酸はＨｉｓタグを表し、下線のみのアミノ酸は、制限酵素認識配列の付加を表す。
【００７９】
抗体又はその断片のコレクション
本開示は、任意の標的に対する治療用抗体の同定に使用することのできる抗体又はその機能断片及びかかる抗体又は断片をコードする核酸のコレクションを可能にし、ここで抗体又は断片は、臨床的に開発可能で、患者において安全且つ有効である。背景として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーにおいて豊富な可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対（ＶＨ３−２３／ＶＫ１−５など）が、より効率的な開発をもたらし、且つ得られる抗体の患者における安全性及び有効性を高め得る好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いと想定した。かかる好ましい生物物理学的特性には、以下が含まれ得る：ａ）Ｆａｂフォーマットにおける高い相対提示率；ｂ）高い相対Ｆａｂ発現収率；ｃ）Ｆａｂ及びＩｇＧの両フォーマットにおける温度安定性；ｄ）Ｆａｂ及びＩｇＧの両フォーマットのウシ／マウス血清安定性；ｅ）高いＩｇＧ１発現収率；ｅ）Ｆａｂ及びＩｇＧの両フォーマットにおけるＳＥＣ単量体含量（％単量体）；及び／又はｆ）高いＩｇＧ１等電点（ｐＩ）。
【００８０】
各Ｂ細胞が一つの抗体をコードし、及び各抗体が可変重鎖と可変軽鎖とを含む。抗体の可変重鎖及び可変軽鎖の各々を生殖系列遺伝子配列（又は生殖系列タンパク質配列）とアラインメントすることにより、抗体の起源、すなわちその可変重鎖及び可変軽鎖がどの生殖系列遺伝子に由来するのかを決定することができる。従って、各抗体について、可変重鎖及び可変軽鎖が、ある生殖系列遺伝子対、又は生殖系列タンパク質対、例えばＶＨ３−２３のＶＫ１−５との対を含むと言うことができる。
【００８１】
ヒト免疫レパートリーにおいて豊富な生殖系列タンパク質対が好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという仮説を証明するための第１のステップは、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対（生殖系列タンパク質対）を同定することであった。一部の態様において、データは、公的に利用可能な文献又はデータベースから、及びＢ細胞のサンプリングから得られる。
【００８２】
以下の論文を特定し、詳細に分析した：Ｗａｒｄｅｍａｎｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１３７４−１３７７及び任意の添付表；Ｙｕｒａｓｏｖ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１，７０３−７１２及び任意の添付表；Ｔｓｕｉｊｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３，３９３−４０１及び任意の添付表；Ｙｕｒａｓｏｖ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３，２２５５−２２６２及び任意の添付表、Ｔｉｌｌｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６，２０５−２１３及び任意の添付表、及びＭｉｅｔｚｎｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５，９７２７−９７３２及び任意の添付表（これらは全て、全体として参照により援用される）。
【００８３】
或いは、Ｉｇ−Ｂｌａｓｔを使用して、ＮＣＢＩなどのデータベースを検索することができる。２００５年現在、このデータベースは、少なくとも２５，０００個のＦＡＳＴＡフォーマットの再構成ヒト抗体配列を含んだ。２２，５００個のエントリのうち、１３，２３５個がＶＨ配列に相当し、１，５０６個がＶκに相当し、及び２，２５９個がＶλに相当した。
【００８４】
概して、関連性のある公的に利用可能な文献及びデータベースでは、以下の方法に従った：Ｂ細胞がヒトドナーから単離され、それらのＢ細胞を分取することにより発生又は分化の段階が決定され、各Ｂ細胞から抗体をコードするＤＮＡを表すｃＤＮＡが作成及び増幅され、それらのｃＤＮＡが配列決定され、可変重鎖及び可変軽鎖をコードするｃＤＮＡが既知の生殖系列遺伝子配列とアラインメントされて、各Ｂ細胞からの生殖系列遺伝子対が決定された。
【００８５】
一部の実施形態では、データは、ヒトＢ細胞のサンプリング及び単離から得られ、これには文献で用いられる方法と同様の方法が含まれた。このような態様では、合成抗体又はその機能断片のコレクションの作製方法は、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を含むデータを取得するステップを含み；ここでこの取得するステップは、ａａ）サンプルからヒトＢ細胞を単離するステップ；ａｂ）Ｂ細胞からｃＤＮＡを作成するステップ；ａｃ）Ｂ細胞からｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップ；ａｄ）ＰＣＲ産物を配列決定するステップ；及びａｅ）ＰＣＲ産物の生殖系列遺伝子を同定するステップをさらに含む。双方のデータセットから、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対が提供された。
【００８６】
抗体配列データを使用して、当業者は、各ＶＨ、Ｖκ及びＶλ可変ドメインの生殖系列ファミリー及び／又は遺伝子を同定することができる。この手法を用いて、各ＶＨ及びＶＬ生殖系列ファミリー及び／又は遺伝子、及び／又は各ＶＨ及びＶＬドメイン対の生殖系列ファミリー及び／又は遺伝子の顕著さを、当業者は容易に決定することができる。
【００８７】
文献及びＢ細胞から得られた生データをプールして分析し、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を各々の数に関して順位付けした。このデータから、特定の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対が、ヒト免疫レパートリーにおいて他より高頻度で存在することが明らかとなった。これらの顕著な対は、優れた生物物理学的特性を有するものと予想された。
【００８８】
次のステップとして、ヒト免疫レパートリーには約２５００対あるため、どの生殖系列タンパク質対を開発可能性に関連する機能特性について試験すべきであるかを決定しなければならなかった。一つの方法は、ヒト免疫レパートリーに最も顕著に現れる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を試験することであり得た（例えば、表６を参照のこと）。例えば、上位４００個の対を試験用に選択するか、又は特定の閾値数を上回って存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を選択することができた。しかしながらこの手法は、多数の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対配列の合成及び試験を必要とするものと思われた；従って、かかる手法はあまり効率的とは言えなかった。
【００８９】
代替的な手法として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーから顕著な対の大多数を代表する、それを正確に再現する、又はそれを網羅する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列対のサブセットを選択した。この手法は、一部には、ヒト免疫レパートリーにおいて少数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列遺伝子が支配的であるという観察に基づいた。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．８９５〜８９６頁がこの現象について記載している。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．はまた、多くの場合に高頻度で発現する重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することも記載し、サンプリングされた対形成の半数が僅か５つの生殖系列対に対応することを観察した。従って、少数の顕著な重鎖及び軽鎖生殖系列遺伝子（対でない）を組み合わせることで、ヒト免疫レパートリーを代表する一群の対を作成することができる。
【００９０】
従って、生データを分析し、ヒト免疫レパートリーにおいて顕著な可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖（対でない）生殖系列遺伝子を決定した。次に、それらの顕著な可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列タンパク質配列を評価して、開発に関連するその生物物理学的特性を決定した。可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列タンパク質配列は、以下の特性についてインシリコで評価した：ＣＤＲ長さ、等電点（ｐＩ）、等電点は、標準的なｐＨ５．５〜ｐＨ７の配合緩衝液中で安定性を提供するものと思われる７．５以上が好ましい、相補性決定領域における潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）の部位（具体的には、Ｎ−結合型グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又は化学修飾、例えばＡｓｐ開裂（多くの場合にＤＰにおける）、Ａｓｐ異性化（ＤＳ、ＤＧ）、アミド分解（ＮＳ、ＮＧ）、これは生体内（血清中）において又は配合緩衝液中での貯蔵時に起こり、抗原結合の喪失をもたらし得る）、ＣＤＲにおけるメチオニンの存在（溶媒に曝露されたときに酸化し得る）、対でないシステインの存在（任意の他の対でないシステインとジスルフィド結合を形成し、ひいてはタンパク質の架橋及び／又は発現レベルの低下をもたらし得る）、生殖系列からの偏差、潜在的なＴ細胞エピトープの存在、及び理論上の凝集傾向。
【００９１】
表５並びに図２及び図３に概して示されるとおり、上位２０個のＶＨ、上位８個のＶλ及び上位１２個のＶκを、合成、組み合わせ、及び続く機能分析のために選択した。生殖系列遺伝子配列を合成し、次に組み合わせて、免疫レパートリーに見られる生殖系列遺伝子対を代表する４００個の生殖系列タンパク質対を作成し、ここで可変領域の各々は、インシリコで同定されたとおりの好ましい生物物理学的特性を有する。４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系列タンパク質対を、以下の特性について試験した：ａ）Ｆａｂフォーマットにおけるファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後の相対提示；ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び産生されたＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後の相対Ｆａｂ発現収率；ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び高温でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートからのＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞におけるＩｇＧ１産生及び細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ検出後の相対ヒトＩｇＧ１発現収率レベル；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出によるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性。
【００９２】
試験した４００個の生殖系列タンパク質対（結果は表１２に示す）のうち９５個をさらなる試験用に選択した。合成、発現及び精製後、図１６〜図２４に示される９５個の生殖系列タンパク質対を、Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットで以下について試験した：ａ）ｍｇ／Ｌ単位の精製Ｆａｂ発現収率、ｂ）精製Ｆａｂ単量体含量（％単量体）、ｃ）精製Ｆａｂ熱安定性、ｄ）ｍｇ／Ｌ単位の精製ＩｇＧ１発現収率、ｅ）精製ＩｇＧ１単量体含量（％単量体）、ｆ）精製ＩｇＧ１熱安定性、ｇ）ＩｇＧ１等電点及びｈ）示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、吸収、動的光散乱及び粒子染色を含む、酸への曝露によるＩｇＧ１ストレス試験。結果は図１６〜図２４に示される。
【００９３】
ある実施形態では、以下の閾値を設定したｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及びｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。従って、ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。
【００９４】
さらなる実施形態において、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は各々が、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。
【００９５】
さらなる実施形態において、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域からなるか、又はそれから本質的になり、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。
【００９６】
特定の実施形態において、
ｉ）Ｆａｂフォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【００９７】
特定の実施形態において、
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【００９８】
特定の実施形態において、
ｉｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【００９９】
特定の実施形態において、
ｉｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１００】
特定の実施形態において、
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１０１】
特定の実施形態において、
ｖｉ）ＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１０２】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１０３】
以下の生殖系列タンパク質対（５４個）は、上記に記載される方法を用いて以下の閾値以上であった：ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及びｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、従って、開発可能性に関して優れた機能活性を有する（データは図１６〜図２４に示す）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）。従って、これらの生殖系列タンパク質対を任意に含むコレクションを、任意の抗原に対する開発可能な抗体又はその断片の同定に使用することができた。
【０１０４】
ある態様では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、特定の可変重鎖と可変軽鎖との対、例えばＶＨ１−１８／ＶＫ１−３９の生殖系列タンパク質配列を含む。これはすなわち、このコレクションが含む抗体又は断片においては、抗体又は断片のフレームワーク領域がＶＨ１−１８／ＶＫ１−３９の生殖系列タンパク質配列を含み、ここで可変重鎖フレームワーク領域がＶＨ１−１８の生殖系列タンパク質配列を含み、及び可変軽鎖フレームワーク領域がＶＫ１−３９の生殖系列タンパク質配列を含むということを意味する。多数の生殖系列タンパク質対を、コンストラクトとして（実施例５及び９に記載されるとおり）、開発に関連するその機能特性について試験した。試験した多数のコンストラクトが、開発可能性に関連する優れた機能特性を示した。本発明者らは、試験した機能特性に関して、入力（抗原に対する選択用に使用される抗体コレクション）と出力（抗原に対して特異的であるとしてコレクションから同定された抗体）との間には高い相関があると考える。従って、本発明のコレクションは、一部には、試験したコンストラクトと同じアミノ酸配列、例えばフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域を含む抗体又は断片を含む。ある態様では、コレクションは、試験したコンストラクトのアミノ酸配列、又はそれをコードする核酸を含むため、コレクションは、試験されるコンストラクトと開発可能性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｔｉｙ）に関して同じ優れた機能特性を有する抗体又は断片を含むと考えられる。従って、続いてある抗原に対してコレクションから選択される抗体又は断片もまた、開発可能性に関連する同じ優れた機能特性を有するものと予想される。この仮説は、実施例１１に記載される実験及びデータにより裏付けられる。図３７〜図３９、図４５〜図４８及び図６２を参照のこと。
【０１０５】
一部の実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、又は３６個以上、３７個以上、３８個以上、３９個以上、４０個以上、４１個以上、又は４２個以上、又は４３個以上、又は４４個以上、又は４５個以上、又は４６個以上、又は４７個以上、又は４８個以上、又は４９個以上、又は５０個以上、又は５１個以上、又は５２個以上、又は５３個以上、又は５４個の可変重鎖と可変軽鎖との対から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１０６】
ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々は、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１０７】
ある実施形態は、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸のコレクションを含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の、それらからなる、又はそれらから本質的になる、生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１０８】
５４個の対又はそのサブセットを含む実施形態において、コレクションに追加するためさらなる対が選択されてもよく、ここで追加される各生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定するとき少なくとも２．５ｍｇ／ｌのＦａｂフォーマットにおける発現収率、
ｉｉ）示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定するときＦａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性、
ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）、
ｉｖ）紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定するとき少なくとも３０ｍｇ／ｌのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率、
ｖ）示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定するときＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性、及び
ｖｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。
【０１０９】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１１０】
本開示の実施形態は、開発可能性に関して優れた機能活性を有する上記の生殖系列タンパク質対（５４個）のサブセットを含む。ある実施形態では、生殖系列タンパク質対のサブセット（５４個のうちの３６個）を、実施例９．２．５（ａ〜ｄ）（データは図１９〜図２４に示す）、実施例９．２．６（ａ〜ｄ）（データは図４９〜図５４に示す）及び実施例９．２．７（スコアリングは図５５〜図６０に示す）に記載される方法を用いて同定されたストレス試験データの比較に基づき選択した。ストレス試験方法においてＩｇＧ１フォーマットで９５個の生殖系列タンパク質対を評価することにより、酸への曝露及びガラスビーズによる撹拌に耐えるそれらの能力を決定した。ある実施形態の３６個の生殖系列タンパク質対を、それらが酸及び撹拌ストレスに対する強い耐性を示したため、開発可能性に関連するさらなる優れた機能特性を有するものとして選択した。ある実施形態で選択されたこれらの３６個の生殖系列タンパク質対は、５４個の閾値機能活性の全てを満たし、加えて、ストレス試験累積スコアにおいて１２２５以上のスコアを付け（実施例９．２．７に記載されるとおり）、この累積スコアは、生殖系列タンパク質対を以下の特徴に従い評価したものである：酸への曝露前及び曝露後の３２０ｎｍでの吸収、酸への曝露前及び曝露後の半径及び％多分散性、酸への曝露前及び曝露後の粒子染色、ガラスビーズによる撹拌前及び撹拌後の３２０ｎｍでの吸収、ガラスビーズによる撹拌後の半径及び％多分散性、及びガラスビーズによる撹拌後の粒子染色。この実施形態で選択された３６個の生殖系列タンパク質対は、各基準について以下の閾値以上の値を有した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９８％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）及びｇ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）。
【０１１１】
従って、ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１１２】
３６個の対又はそのサブセットを含む実施形態において、コレクションに加えるため、さらなる対が選択されてもよく、ここで加えられる各生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定するとき少なくとも２．５ｍｇ／ｌのＦａｂフォーマットにおける発現収率、
ｉｉ）示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定するときＦａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性、
ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）、
ｉｖ）紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定するとき少なくとも３０ｍｇ／ｌのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率、
ｖ）示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定するときＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性、及び
ｖｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。
【０１１３】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１１４】
実施形態において、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸のコレクション、ここで抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々が、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１１５】
他の実施形態において、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、以下の可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、又は３６個から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１１６】
ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、以下の可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の、それらからなる、又はそれらから本質的になる生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１１７】
別の実施形態において、各基準についての閾値は以下のとおり選択した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９９％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）；ｇ）少なくとも８．３の精製ＩｇＧ１の等電点（実施例９．２．４に記載されるとおり）；及びｈ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）。
【０１１８】
従って、ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；
ｖｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、及び
ｖｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
【０１１９】
特定の実施形態において、
ｉ）Ｆａｂフォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１２０】
特定の実施形態において、
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１２１】
特定の実施形態において、
ｉｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１２２】
特定の実施形態において、
ｉｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１２３】
特定の実施形態において、
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１２４】
特定の実施形態において、
ｖｉ）ＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１２５】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１２６】
さらなる実施形態において、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は各々は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；
ｖｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、及び
ｖｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
【０１２７】
さらなる実施形態において、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域からなるか、又はそれから本質的になり、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；
ｖｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、及び
ｖｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
【０１２８】
以下の生殖系列タンパク質対（３３個）は、以下の閾値以上であった：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９９％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）；ｇ）少なくとも８．３の精製ＩｇＧ１の等電点（実施例９．２．４に記載されるとおり）；及びｈ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）、従って、開発可能性に関して優れた機能活性を有する：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）。
【０１２９】
従って、ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１３０】
３３個の対又はそのサブセットを含む実施形態において、コレクションに加えるため、さらなる対が選択されてもよく、ここで加えられる各生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定するとき少なくとも２．５ｍｇ／ｌのＦａｂフォーマットにおける発現収率、
ｉｉ）示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定するときＦａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性、
ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）、
ｉｖ）紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定するとき少なくとも３０ｍｇ／ｌのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率、
ｖ）示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定するときＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性、及び
ｖｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）。
【０１３１】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１３２】
３３個の対又はそのサブセットを含む実施形態において、コレクションに加えるため、さらなる対が選択されてもよく、ここで加えられる各生殖系列タンパク質対は、以下の特性をさらに含む：
ｖｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
【０１３３】
さらなる実施形態において、それ自体が各基準における閾値の全てを満たさない対であったとしても、対がコレクションに加えられ、コレクションに加えることにより多様性を高めた。ある実施形態では、３３個の生殖系列タンパク質対のコレクションは、ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）をさらに含む。この実施形態において、コレクションは、（３６個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【０１３４】
実施形態では、これらの生殖系列タンパク質対又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を任意に含むコレクションを、任意の抗原に対する開発可能な抗体又はその断片の同定に使用することができた。
【０１３５】
一部の実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）からなる群から選択される２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上の可変重鎖と可変軽鎖との対から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１３６】
ある実施形態では、コレクションは、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々は、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１３７】
ある実施形態は、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸のコレクションを含み、ここで抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の、それらからなる、又はそれらから本質的になる生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１３８】
本発明に追加される態様は、任意の免疫原に対する抗体又はその機能断片の同定において有用となるコレクションの能力である。従って、一部の実施形態では、コレクションは、少なくとも２個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも５個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも６個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも７個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも８個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも９個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１０個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１１個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１２個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１３個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１４個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１５個の生殖系列タンパク質対；少なくとも１６個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１７個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１８個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも１９個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２０個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２１個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２２個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２３個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２４個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２５個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２６個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２７個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも２８個の可変重鎖生殖系列タンパク質；少なくとも２９個の異なる生殖系列タンパク質対配列；少なくとも３０個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３１個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３２個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３３個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３４個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３５個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３６個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３７個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３８個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも３９個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４０個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４１個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４２個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４３個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４４個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４５個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４６個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４７個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４８個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも４９個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも５０個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも５１個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも５２個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも５３個の異なる生殖系列タンパク質対；少なくとも５４個の異なる生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む。
【０１３９】
ヒトにおける免疫原性の可能性が低いことが治療用抗体の目標であるため、ある態様では、コレクションは、生殖系列タンパク質配列を含むフレームワーク領域又はそれをコードする核酸を含む。加えて、低い免疫原性リスクを維持するため、生殖系列タンパク質配列を含む相補性決定領域が用いられてもよい。ある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含む合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２５〜図３３に示す。より具体的には、ある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖及び／又は可変軽鎖対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ１領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２５、図２８、及び図３１、及び対応する配列番号２０４〜２６５に示す。ある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＨＣＤＲ１領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２５及び対応する配列番号２０４〜２２９に示す。ある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＬＣＤＲ１領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２８及び図３１及び対応する配列番号２３０〜２６５に示す。さらなる実施形態において、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ２領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２６、図２９、及び図３２、及び対応する配列番号２０４〜２６５に示す。さらなる実施形態において、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＨＣＤＲ２領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２６及び対応する配列番号２０４〜２２９に示す。さらなる実施形態において、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＬＣＤＲ２領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２９及び図３２及び対応する配列番号２３０〜２６５に示す。
【０１４０】
本開示のある態様は、生殖系列相補性決定領域を修飾して潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）を取り除くことを含む。修飾によりＰＴＭが取り除かれる可変重鎖相補性決定領域の例を、図３４〜図３６に示す。ある態様では、コレクションは、潜在的な翻訳後修飾部位を取り除くアミノ酸修飾を含む１つ以上の相補性決定領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。ある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示される相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む１つ以上の相補性決定領域又はそれをコードする核酸配列を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。さらなる実施形態において、コレクションは、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示されるＨＣＤＲ１を含むＨＣＤＲ１領域又はそれをコードする核酸を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２６６〜２７８に示す。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ１の核酸配列は、配列番号２７９〜２９１に示す。さらなる実施形態において、コレクションは、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示されるＨＣＤＲ２領域を含むＨＣＤＲ２領域又はそれをコードする核酸を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２６６〜２７８に示す。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ２の核酸配列は、配列番号２７９〜２９１に示す。
【０１４１】
本開示のある態様は、コレクションにおいて生殖系列ＦＲ４配列を利用することを含む。ある実施形態では、コレクションは、ＪＨ４（配列番号２９３）、Ｊκ１（配列番号２９７）、及びＪλ２／３（配列番号３０１）からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。ある実施形態では、コレクションは、生殖系列ＪＨ４  ＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。ＪＨ４  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号２９３）及び（配列番号２９５）に示される。ＪＨ４  ＦＲ４核酸配列は（配列番号２９２）及び（配列番号２９４）に示される。ある実施形態では、コレクションは、生殖系列Ｊｋ１  ＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。Ｊｋ１  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号２９７）に示される。Ｊｋ１  ＦＲ４核酸配列は、（配列番号２９６）、（配列番号２９８）及び（配列番号２９９）に示される。ある実施形態では、コレクションは、生殖系列Ｊλ２／３  ＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。Ｊλ２／３  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号３０１）に示される。Ｊλ２／３  ＦＲ４核酸配列は、（配列番号３００）、（配列番号３０２）及び（配列番号３０３）に示される。
【０１４２】
ある態様では、任意の抗原に対する抗体又はその断片を同定する能力を高めるため、コレクションは、多様化されたＣＤＲ３領域を含む。ある実施形態では、コレクションは、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。ある実施形態では、コレクションは、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。
【０１４３】
別の態様では、任意の抗原に対する抗体又はその断片を同定する能力を高めるため、コレクションは、少なくとも１×１０４個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０５個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０６個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０７個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０８個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０９個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０１０個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、又は少なくとも１×１０１１個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。
【０１４４】
ある実施形態ではコレクションは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤからなる群から選択される抗体又はかかる抗体をコードする合成核酸を含む。ある実施形態ではコレクションは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片又はかかる断片をコードする合成核酸を含む。
【０１４５】
実施形態において、コレクションの抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインは、図４１Ａ〜図４１Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号３０５）を含む。他の実施形態において、コレクションの抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４１Ａ〜図４１Ｂに示される核酸配列（配列番号３０４）を含む。実施形態において、コレクションの抗体断片のＦａｂ重鎖定常ドメインは、図４２に示されるアミノ酸配列（配列番号３０７）を含む。他の実施形態において、コレクションの抗体のＦａｂ重鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４２に示される核酸配列（配列番号３０６）を含む。実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３０９）及び／又はＦａｂ（配列番号３１１）κ軽鎖定常ドメインは、図４３に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３０８）及び／又はＦａｂ（配列番号３１０）κ軽鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４３に示される核酸配列を含む。実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３１３）及び／又はＦａｂ（配列番号３１５）λ軽鎖定常ドメインは、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３１２）及び／又はＦａｂ（配列番号３１４）λ軽鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４４に示される核酸配列を含む。
【０１４６】
ある態様は、本明細書に記載される核酸のコレクションを含むベクターを含む。ある実施形態では、ベクターはディスプレイベクターを含む。ある実施形態では、ベクターは、ファージミドベクター、酵母ディスプレイ又は哺乳動物ディスプレイベクターを含む。ある態様は、本明細書に記載される核酸、又は本明細書に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞である。ある実施形態では、組換え宿主は原核生物又は真核生物のものである。実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、哺乳動物又は酵母の組換え宿主細胞である。
【０１４７】
作製方法
ある態様は、本明細書に記載されるコレクションの作製方法を含む。
【０１４８】
ある態様は、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸のコレクションの作製方法を含み、この方法は、
ａ）ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を同定するステップ；
ｂ）ステップａ）で同定された可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を、以下の特性について試験するステップ：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）；及び
ｃ）コレクションを作成するステップにおいて、抗体又はその機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々、又は抗体又はその機能断片が、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、ステップｂ）の特性を満たす生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む、ステップ
を含む。
【０１４９】
この方法の特定の実施形態において、
ｉ）Ｆａｂフォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１５０】
特定の実施形態において、
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１５１】
特定の実施形態において、
ｉｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１５２】
特定の実施形態において、
ｉｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１５３】
特定の実施形態において、
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１５４】
特定の実施形態において、
ｖｉ）ＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１５５】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１５６】
ある実施形態では、ステップａ）は、
ａａ）サンプルからヒトＢ細胞を単離するステップ；
ａｂ）Ｂ細胞からｃＤＮＡを作成するステップ；
ａｃ）Ｂ細胞からｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップ；
ａｄ）ＰＣＲ産物を配列決定するステップ；
ａｅ）各ＰＣＲ産物の生殖系列遺伝子を同定するステップ
をさらに含む。
【０１５７】
各Ｂ細胞由来の抗体及びその断片をコードするＤＮＡは単離され、及び増幅され、例えば、重鎖及び軽鎖がＰＣＲ反応で物理的に単離される。ＤＮＡは、好ましくは配列決定される。配列決定されるＤＮＡは、Ｂ細胞ｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡであってもよい。Ｂ細胞などの真核細胞からのｍＲＮＡ抽出は、周知されている技術的手順である。数多くのプロトコルが存在し、市販のキットを利用することができる。ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）ｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）又は様々なＲＮｅａｓｙ及びＯｌｉｇｏｔｅｘ  ＤｉｒｅｃｔｍＲＮＡキット（双方とも、Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによる）など。これらの技術の多くが、例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロースなどのオリゴ（ｄＴ）基質に対するアフィニティー精製を介して、真核生物ｍＲＮＡのポリＡテールを利用する。
【０１５８】
ｃＤＮＡは、単離ｍＲＮＡから、特異的プライマーを使用した逆転写と、続く従来のＰＣＲによって選択的に増幅することができる。特異的プライマーを使用することにより、可変重鎖及び軽鎖ドメイン核酸が増幅される。Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．１９９７；３０：２１−４４，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９４；４７：４９３−６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９０；４３：８８８−９０又はＭｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；５５（２）：９８−１０１を参照のこと。一つのＢ細胞からの可変及び軽鎖ドメインの双方をコードするＤＮＡが共に維持され、従って可変ドメイン重鎖及び軽鎖クラス対形成を同定することができる。個々のＢ細胞から可変ドメインの対をコードする核酸を単離する技法は、当該技術分野において公知である。例えば、国際公開第０１／９２２９１号パンフレット；国際公開第９２／１５６７８号パンフレット；国際公開第９３／０３１５１号パンフレット、国際公開第２００５／０４２７７４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：６  ８６４−８６８；Ｃｈａｐａｌ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，５１８−５２４、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１５，３８３１−３８３７；Ｃｏｒｏｎｅｌｌａ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２０，Ｅ８５；Ｔｈｉｒｉｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ５：６  ５０７−５１１；及びＷａｎｇ，Ｘ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０，２１７−２２５を参照のこと。
【０１５９】
好ましくは、Ｂ細胞の各々からのＤＮＡは、配列決定される。Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）など、ゲノム全体を配列決定することが可能な様々な会社が存在する。そのＴｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）技術により、Ｈｅｌｉｃｏｓは、ＤＮＡ又はＲＮＡの単一の分子を、高速で、且つ効率的に直接配列決定することが可能である。同様の配列決定の試みを実施可能な他の会社としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｓｏｌｅｘａシステム）及びＲｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ，ＣＨ；４５４システム）が挙げられる。配列決定前にクローニングステップは不要である。
【０１６０】
別の態様では、本開示は、免疫レパートリーに存在する重鎖及び軽鎖可変ドメイン対の生殖系列ファミリーの同定方法を可能にする。全ての抗体又はその断片を、当業者に公知の方法を用いてその生殖系列ファミリーまで遡って調べることができる。抗体又はその断片をコードする核酸の配列を分析することにより、当業者に公知の方法によってＶＨ及びＶＬの双方の生殖系列ファミリーを決定することができる。例えば、Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ．ａｌ，（１９９９）は、３人の患者からＢ細胞をサンプリングし、３６５個のＶＨ及びＶＬクラス対形成を同定した。各Ｂ細胞由来のＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用して、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、配列決定した。Ｗｉｌｄｔの図１に示されるとおり、特定のＶＨ及びＶＬクラス、例えば、ＶＨ３−８とＶκ３−１、Ｖκ３−１９、Ｖκ４−１、Ｖλ２−３、又はＶλ１−２、及びＶＨ３−９とＶκ３−１、Ｖκ３−３又はＶλ１−５が、他より高頻度で対を形成した。
【０１６１】
ある実施形態では、ステップｂ）は、
ｂａ）ヒト免疫レパートリーに存在する対を代表する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を含む抗体又はその機能断片をコードするＤＮＡを合成するステップ；
ｂｂ）ｂａ）で合成された生殖系列タンパク質対を発現させるステップ；及び
ｂｃ）ｂｂ）の生殖系列タンパク質対を特性の各々について試験するステップ
をさらに含む。
【０１６２】
この方法のある態様では、本発明の抗体又はその断片のコレクションをコードする核酸は、抗原に対する選択に用いられ得るコレクションにおいて合成及び発現される。この実施形態において、この方法はステップｃ）を含み、ここでステップｃ）は、ｃａ）抗体又はその機能断片をコードする核酸を合成するステップ；ｃｂ）核酸をベクターにクローニングするステップ；ｃｃ）抗体又はその機能断片を発現させるステップを含む。
【０１６３】
この方法の別の実施形態において、抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１６４】
この方法の別の実施形態において、抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）からなる群から選択される２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、又は３６個以上、３７個以上、３８個以上、３９個以上、４０個以上、４１個以上、又は４２個以上、又は４３個以上、又は４４個以上、又は４５個以上、又は４６個以上、又は４７個以上、又は４８個以上、又は４９個以上、又は５０個以上、又は５１個以上、又は５２個以上、又は５３個以上、又は５４個の可変重鎖と可変軽鎖との対を含む生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１６５】
この方法のさらなる実施形態において、抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々、又は抗体又は機能断は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）
ｖｉｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
【０１６６】
この方法のこの実施形態において、抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）の可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１６７】
この方法のさらなる実施形態において、抗体又は機能断片は可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）の可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列をさらに含む。この方法のこの実施形態において、コレクションは、（３６個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【０１６８】
使用方法
ある態様は、抗原に特異的な抗体又は断片を同定するための本明細書に記載されるコレクションの使用方法を含む。
【０１６９】
本開示のある態様は、抗原に特異的な抗体又は抗体断片の同定方法を含み、この方法は、
（ａ）抗原を抗体又はその機能断片のコレクションと接触させるステップにおいて、コレクションの抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々、又は抗体又は機能断片が、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域が、以下の特性を含む生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む、ステップ：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９８％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；及び
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）、及び
（ｂ）前記抗原に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片を選択するステップ
を含む。
【０１７０】
特定の実施形態において、
ｉ）Ｆａｂフォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．５３８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１７１】
特定の実施形態において、
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１７２】
特定の実施形態において、
ｉｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ１０／３０カラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１７３】
特定の実施形態において、
ｉｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率は、紫外分光測定法により、１．３６９ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して、且つ２８０ｎｍでの吸光度を計測して決定した。
【０１７４】
特定の実施形態において、
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性は、示差走査型蛍光定量法によりＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１７５】
特定の実施形態において、
ｖｉ）ＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム及びｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ緩衝液を使用して決定した。
【０１７６】
紫外分光測定法は、Ｎａｎａｄｒｏｐシステム（ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実施してもよい。示差走査型蛍光定量法は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）を使用して実施してもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施してもよい。
【０１７７】
この方法のある実施形態では、可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）由来の生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１７８】
この方法のある実施形態では、抗体又はその機能断片は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される可変重鎖と可変軽鎖との対からなる群から選択される２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、又は３６個以上、３７個以上、３８個以上、３９個以上、４０個以上、４１個以上、又は４２個以上、又は４３個以上、又は４４個以上、又は４５個以上、又は４６個以上、又は４７個以上、又は４８個以上、又は４９個以上、又は５０個以上、又は５１個以上、又は５２個以上、又は５３個以上、又は５４個の可変重鎖と可変軽鎖との対を含む。
【０１７９】
この方法の実施形態において、抗体又は機能断片の実質的に全て、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は各々、又は抗体又は機能断片は、生殖系列タンパク質対の生殖系列タンパク質配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、ここで前記生殖系列タンパク質対は、以下の特性を含む：
ｉ）少なくとも２．５ｍｇ／ＬのＦａｂフォーマットにおける発現収率；
ｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける７０℃以上での熱安定性；
ｉｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＦａｂフォーマットにおける単量体含量（％単量体）；
ｉｖ）少なくとも３０ｍｇ／ＬのＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率；
ｖ）ＩｇＧ１フォーマットにおける７３℃以上での熱安定性；
ｖｉｉ）ＳＥＣにより決定するとき少なくとも９９％のＩｇＧ１フォーマットにおける単量体含量（％単量体）；及び
ｖｉｉｉ）少なくとも８．３のＩｇＧ１フォーマットにおける等電点。
【０１８０】
この方法のこの実施形態において、可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）由来の生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１８１】
この方法のさらなる実施形態において、可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）からさらに選択される生殖系列タンパク質配列を含む。この実施形態において、コレクションは、（３６個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【０１８２】
方法の態様
本明細書に開示される方法のさらなる態様において、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含む合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、図２５〜図３３に示す。より具体的には、この方法のある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖及び／又は可変軽鎖対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ１領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２５、図２８及び図３１及び対応する配列番号２０４〜２６５に示す。この方法のある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＨＣＤＲ１領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２５及び対応する配列番号２０４〜２２９に示す。この方法のある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＬＣＤＲ１領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２８及び図３１及び対応する配列番号２３０〜２６５に示す。この方法のさらなる実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ２領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２６、図２９及び図３２及び対応する配列番号２０４〜２６５に示す。この方法のさらなる実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＨＣＤＲ２領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２６及び対応する配列番号２０４〜２２９に示す。この方法のさらなる実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＬＣＤＲ２領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列及び核酸配列は、図２９及び図３２及び対応する配列番号２３０〜２６５に示す。
【０１８３】
この方法の実施形態において、コレクションは、潜在的な翻訳後修飾部位を取り除くアミノ酸修飾を含む１つ以上の相補性決定領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。この方法のある実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示される相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む１つ以上の相補性決定領域又はそれをコードする核酸配列を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。この方法のさらなる実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示されるＨＣＤＲ１を含むＨＣＤＲ１領域又はそれをコードする核酸を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２６６〜２７８に示す。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ１の核酸配列は、配列番号２７９〜２９１に示す。この方法のさらなる実施形態では、コレクションは、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示されるＨＣＤＲ２領域を含むＨＣＤＲ２領域又はそれをコードする核酸を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２６６〜２７８に示す。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ２の核酸配列は、配列番号２７９〜２９１に示す。
【０１８４】
この方法のある実施形態では、コレクションは、ＪＨ４（配列番号２９３）、Ｊκ１（配列番号２９７）、及びＪλ２／３（配列番号３０１）からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。この方法のある実施形態では、コレクションは、生殖系列ＪＨ４  ＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。ＪＨ４  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号２９３）及び（配列番号２９５）に示される。ＪＨ４  ＦＲ４核酸配列は（配列番号２９２）及び（配列番号２９４）に示される。この方法のある実施形態では、コレクションは、生殖系列Ｊｋ１  ＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。Ｊｋ１  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号２９７）に示される。Ｊｋ１  ＦＲ４核酸配列は、（配列番号２９６）、（配列番号２９８）及び（配列番号２９９）に示される。この方法のある実施形態では、コレクションは、生殖系列Ｊλ２／３  ＦＲ４領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。Ｊλ２／３  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号３０１）に示される。Ｊλ２／３  ＦＲ４核酸配列は、（配列番号３００）、（配列番号３０２）及び（配列番号３０３）に示される。
【０１８５】
ある態様では、任意の抗原に対する抗体又はその断片を同定する能力を高めるため、コレクションは、多様化されたＣＤＲ３領域を含む。この方法のある実施形態では、コレクションは、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。この方法のある実施形態では、コレクションは、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。
【０１８６】
別の態様では、任意の抗原に対する抗体又はその断片を同定する能力を高めるため、この方法のコレクションは、少なくとも１×１０４個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０５個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０６個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０７個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０８個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０９個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、少なくとも１×１０１０個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸、又は少なくとも１×１０１１個の抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を含む。
【０１８７】
この方法のある実施形態では、コレクションは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤからなる群から選択される抗体又はかかる抗体をコードする合成核酸を含む。この方法のある実施形態では、コレクションは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片又はかかる断片をコードする合成核酸を含む。
【０１８８】
この方法の実施形態において、コレクションの抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインは、図４１Ａ〜図４１Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号３０５）を含む。この方法の他の実施形態において、コレクションの抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４１Ａ〜図４１Ｂに示される核酸配列（配列番号３０４）を含む。実施形態において、コレクションの抗体断片のＦａｂ重鎖定常ドメインは、図４２に示されるアミノ酸配列（配列番号３０７）を含む。この方法の他の実施形態において、コレクションの抗体のＦａｂ重鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４２に示される核酸配列（配列番号３０６）を含む。この方法の実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３０９）及び／又はＦａｂ（配列番号３１１）κ軽鎖定常ドメインは、図４３に示されるアミノ酸配列を含む。この方法の他の実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３０８）及び／又はＦａｂ（配列番号３１０）κ軽鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４３に示される核酸配列を含む。この方法の実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３１３）及び／又はＦａｂ（配列番号３１５）λ軽鎖定常ドメインは、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。この方法の他の実施形態において、コレクションの抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３１２）及び／又はＦａｂ（配列番号３１４）λ軽鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４４に示される核酸配列を含む。
【０１８９】
本発明の抗体
別の態様では、本開示は、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくは機能断片をコードする合成核酸を提供し、ここで抗体又は機能断片は、可変重鎖と可変軽鎖との対を含み、ここで可変重鎖と可変軽鎖との対のフレームワーク領域は、可変重鎖と可変軽鎖との対ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）から選択される生殖系列タンパク質配列を含む。
【０１９０】
ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含む１つ以上の相補性決定領域を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列は、図２５〜図３３に示す。より具体的には、ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖及び／又は可変軽鎖対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ１領域を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列は、図２５、図２８、及び図３１、及び対応する配列番号２０４〜２６５に示す。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＨＣＤＲ１領域を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列は、図２５及び対応する配列番号２０４〜２２９に示す。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＬＣＤＲ１領域を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列は、図２８及び図３１及び対応する配列番号２３０〜２６５に示す。さらなる実施形態において、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＣＤＲ２領域を含み、ここで可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列は、図２６、図２９、及び図３２、及び対応する配列番号２０４〜２６５に示す。さらなる実施形態において、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＨＣＤＲ２領域を含み、可変重鎖及び可変軽鎖のＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列は、図２６及び対応する配列番号２０４〜２２９に示す。さらなる実施形態において、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖と可変軽鎖との対由来の生殖系列タンパク質配列を含むＬＣＤＲ２領域を含み、可変重鎖及び可変軽鎖のＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列は、図２９及び図３２及び対応する配列番号２３０〜２６５に示す。
【０１９１】
本開示のある態様は、生殖系列相補性決定領域を修飾して潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）を取り除くことを含む。修飾によりＰＴＭが取り除かれた可変重鎖相補性決定領域の例を、図３４〜図３６に示す。ある態様では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、潜在的な翻訳後修飾部位を取り除くアミノ酸修飾を含む１つ以上の相補性決定領域を含む。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示される相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む１つ以上の相補性決定領域又はそれをコードする核酸配列を含む。さらなる実施形態において、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示されるＨＣＤＲ１を含むＨＣＤＲ１領域又はそれをコードする核酸を含む。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２６６〜２７８に示す。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ１の核酸配列は、配列番号２７９〜２９１に示す。さらなる実施形態において、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、それぞれの可変重鎖由来の図３４〜図３６に示されるＨＣＤＲ２領域を含むＨＣＤＲ２領域又はそれをコードする核酸を含む。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２６６〜２７８に示す。低度ＰＴＭ  ＨＣＤＲ２の核酸配列は、配列番号２７９〜２９１に示す。
【０１９２】
本開示のある態様は、生殖系列ＦＲ４配列を利用することを含む。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、ＪＨ４（配列番号２９３）、Ｊκ１（配列番号２９７）、及びＪλ２／３（配列番号３０１）からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、生殖系列ＪＨ４  ＦＲ４領域を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。ＪＨ４  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号２９３）及び（配列番号２９５）に示される。ＪＨ４  ＦＲ４核酸配列は（配列番号２９２）及び（配列番号２９４）に示される。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、生殖系列Ｊｋ１  ＦＲ４領域を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。Ｊｋ１  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号２９７）に示される。Ｊｋ１  ＦＲ４核酸配列は、（配列番号２９６）、（配列番号２９８）及び（配列番号２９９）に示される。ある実施形態では、合成抗体若しくはその機能断片又はかかる抗体若しくはその機能断片をコードする合成核酸は、生殖系列Ｊλ２／３  ＦＲ４領域を含み、そのアミノ酸又は核酸配列は図４０に示される。Ｊλ２／３  ＦＲ４アミノ酸配列は（配列番号３０１）に示される。Ｊλ２／３  ＦＲ４核酸配列は、（配列番号３００）、（配列番号３０２）及び（配列番号３０３）に示される。
【０１９３】
ある実施形態では、合成抗体又はかかる抗体をコードする合成核酸は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤからなる群から選択される。ある実施形態では、合成抗体断片又はかかる抗体断片をコードする合成核酸は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される。
【０１９４】
実施形態において、抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインは、図４１Ａ〜図４１Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号３０５）を含む。他の実施形態において、抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４１Ａ〜図４１Ｂに示される核酸配列（配列番号３０４）を含む。実施形態において、抗体断片のＦａｂ重鎖定常ドメインは、図４２に示されるアミノ酸配列（配列番号３０７）を含む。他の実施形態において、抗体断片のＦａｂ重鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４２に示される核酸配列（配列番号３０６）を含む。実施形態において、抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３０９）及び／又はＦａｂ（配列番号３１１）κ軽鎖定常ドメインは、図４３に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３０８）及び／又はＦａｂ（配列番号３１０）κ軽鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４３に示される核酸配列を含む。実施形態において、抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３１３）及び／又はＦａｂ（配列番号３１５）λ軽鎖定常ドメインは、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体又は抗体断片のＩｇＧ（配列番号３１２）及び／又はＦａｂ（配列番号３１４）λ軽鎖定常ドメインをコードする核酸は、図４４に示される核酸配列を含む。
【実施例】
【０１９５】
実施例１：原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列のＣ末端における制限部位の生成による、完全な生殖系列ＦＲ１領域の提供
一態様において、本開示は、生殖系列タンパク質配列を含むフレームワーク領域、特にＦＲ１を含む抗体又はその断片のコレクションについて記載する。生殖系列配列を有することで、ヒトにおける投与時の抗体の免疫原性リスクが低下するものと予想される。しかしながら、抗体を免疫原に対してスクリーニングすることができるように、ディスプレイ及び／又は発現ベクターへの抗体のコレクションをコードする核酸の標準的なクローニングを可能にするため、適合性のある制限部位を使用しなければならない。過去には、クローニングに利用される制限部位は多くの場合にフレームワーク領域内に置かれ、従って核酸及び／又はアミノ酸配列が生殖系列から離れるように修飾された。本開示の抗体の各々の少なくともフレームワーク１（ＦＲ１）領域が生殖系列タンパク質配列を維持することを確実にするためには、ＦＲ１内に、生殖系列アミノ酸配列からのずれをもたらし得るいかなる制限部位も存在してはならない。従って、本開示のある態様は、原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列のＣ末端内、特にＣ末端の３残基内における同一の又は少なくとも適合性のある制限部位の組み込みである。加えて、同一の又は適合性のある制限部位を含む原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列は、原核生物及び哺乳動物の双方の発現系において機能性で、且つ抗体又はその断片の良好な提示及び発現収率をもたらすものでなければならない。
【０１９６】
図１は、選択された制限部位及びそれらの対応する位置を示す。ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）制限部位は、原核生物重鎖シグナル配列（ｐｈｏＡ）への組み込み用に選択された。野生型ｐｈｏＡシグナル配列及びＮｈｅＩ（ＶＬＡ）ｐｈｏＡシグナル配列の核酸配列及びアミノ酸配列は、表１に示される。
2014500725.tif 000003
【０１９７】
ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）制限部位は、原核生物κ及びλシグナル配列（ｏｍｐＡ）への組み込み用に選択した。野生型ｏｍｐＡシグナル配列及び修飾ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）ｏｍｐＡシグナル配列の核酸及びアミノ酸配列は、表２に示される。
2014500725.tif 000004
【０１９８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現するＦａｂフォーマットから哺乳動物で発現するＩｇＧフォーマットへの切り換えが容易に可能となるように、ＩｇＧ軽鎖（ヒトκリーダー）及びＩｇＧ重鎖（ヒト重鎖リーダー）のヒトリーダー配列を、ｏｍｐＡ（ＮｄｅＩ（ＡＹＡ））及びｐｈｏＡ（ＮｈｅＩ（ＶＬＡ））シグナル配列のＣ末端と同じ制限部位を含むように作成した。野生型及び修飾ヒト重鎖リーダー及びヒトκリーダー配列は、表３に示される。
2014500725.tif 000005
【０１９９】
選択された修飾原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列は、（ａ）用いられるベクター系に応じた高収率のＦａｂ及びＩｇＧタンパク質をもたらし、（ｂ）抗体フォーマット、ベクター及び発現系を原核生物系と哺乳動物系との間で切り換えるための完全な適合性を提供し、及び（ｃ）シグナル／リーダー配列に位置するため、ＦＲ１の完全な生殖系列配列が維持される。
【０２００】
実施例２：ヒトレパートリーにおいて最も豊富なＶＨ／ＶＬ対の同定
その最も広義の意味で、本発明者らは、本質的にヒト免疫系を模倣する抗体コレクションが有利であり得るという構想から出発した。本発明者らは、ヒト免疫レパートリーで豊富に発現する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対が、より効率的な臨床開発につながり、且つ得られる抗体の患者における安全性及び有効性を高めるであろう好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという自らの仮説から取り組んだ。この仮説を証明するための第１のステップは、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列遺伝子対を同定することであった。
【０２０１】
実施例２．１：ＶＨ／ＶＬ対生殖系列遺伝子利用の決定
ヒト免疫レパートリーから優位に発現するＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対を同定するため、公的に利用可能なデータを分析し、及びヒトＢ細胞をサンプリングした。第１のステップとして、公的に利用可能なデータをレビューすることにより、ヒトＢ細胞から単離されるＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対について記載している論文を特定した。記載されるとおり、多くの公的に利用可能なデータベースが抗体配列を提供しているが、しかしながら、多くは、いずれかの可変ドメイン、ＶＨ或いはＶＬの配列のみを提供し、ＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対の関連付けを提供するものはほとんどない。以下の論文を特定し、詳細に分析した：Ｗａｒｄｅｍａｎｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１３７４−１３７７及び任意の添付表；Ｙｕｒａｓｏｖ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１，７０３−７１２及び任意の添付表；Ｔｓｕｉｊｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３，３９３−４０１及び任意の添付表；Ｙｕｒａｓｏｖ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３，２２５５−２２６２及び任意の添付表、Ｔｉｌｌｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６，２０５−２１３及び任意の添付表、及びＭｉｅｔｚｎｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５，９７２７−９７３２及び任意の添付表（これらは全て、全体として参照により援用される）。以下に記載するとおり、さらなるＶＨ／ＶＬ対データをヒトＢ細胞のサンプルから同定した。
【０２０２】
実施例２．２：ヒトサンプルからのＶＨ／ＶＬ対遺伝子利用の決定
さらなるＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対利用データを得るため、ＰＢＭＣをヒト宿主から単離した。ＰＢＭＣは分取し、ＰＣＲを用いてＢ細胞のｃＤＮＡを増幅し、Ｂ細胞由来のＤＮＡを配列決定し、次にそれらの配列をＩｇＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）でブラストにかけて、各Ｂ細胞からＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対を同定した。
【０２０３】
静脈血からのヒトＰＢＭＣ及び骨髄からの単核細胞の一般的な単離及び分取方法は、Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８  Ｊａｎ  １；３２９（１−２）：１１２−２４（全体として参照により援用される）に記載されている。ＰＢＭＣを単離し、次に目的の表現型の細胞表面マーカーによりシングルソーティングした。次に、ＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対形成を決定するため、シングルソーティングした成熟ナイーブ（ｍｎ）Ｂ細胞及び抗体分泌細胞（ａｓｃ）のＩｇ遺伝子転写物をＰＣＲ増幅した。Ｂ細胞のｃＤＮＡ及びそれに有用なプライマーをＰＣＲ増幅する一般的な方法もまた、Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２００８（上記引用）に記載される。用いられる特異的プライマーは、表４に示される。
2014500725.tif 000006
【０２０４】
シングルソーティングした成熟ナイーブ（ｍｎ）Ｂ細胞及び抗体分泌細胞（ａｓｃ）のｃＤＮＡを合成した。ネステッドＰＣＲを実施し、ここではヒトＩｇＨ、Ｉｇｋ及びＩｇＬ  Ｖ遺伝子転写物が独立してＰＣＲ増幅された。配列決定の結果をＩｇＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）でＢＬＡＳＴにかけて、それぞれのＶＨ、ＶＫ、及びＶＬ生殖系列遺伝子を同定した。
【０２０５】
実施例２．３  ヒト免疫レパートリーにおいて同定されるＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対
実施例２．１に記載するとおり公的に利用可能な文献から同定したＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対データを、実施例２．２に記載するとおりヒトサンプルから同定したデータと共にプールした。プールしたデータを分析し、表６における順位、すなわちヒト免疫レパートリーにおいて同定されたＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対の百分率／割合（％）の順位として示す。
【０２０６】
実施例３：ＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子利用の決定
表６のレビューは、ヒト免疫レパートリーでは、生殖系列遺伝子の総数に比して少数のＶＨ／ＶＬ対が支配的であることを示す。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．８９５〜８９６頁がこの現象について記載している。Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．はまた、多くの場合に高頻度で発現する重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することも記載し、サンプリングされた対形成の半数が僅か５つのＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対に対応したことを観察した。
【０２０７】
加えて、プールデータ及びさらなる参考文献を評価して、ヒト免疫レパートリーにおいて独立して（対としてでなく）発現するＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系列遺伝子を同定した。対でないＶＨ及び／又はＶＬ生殖系列遺伝子発現が含まれるさらに参照した文献は、Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋ  Ｈ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９，２４８８、Ｄｅｍａｉｓｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２，３４２、及びＦｏｓｔｅｒ  Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９，１６１４（双方とも、全体として参照により援用される）であった。実施例２．１及び２．２並びにさらなる参考文献からのデータをプールして順位付けし、ヒト免疫レパートリーにおいて最も顕著に発現するＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系列遺伝子を決定した。順位は表５に示す。
【０２０８】
ヒト免疫レパートリーにおける関連付けられていないＶＨ、Ｖλ及びＶκ生殖系列遺伝子の出現率を示す表５と、ヒト免疫レパートリー内で関連付けられたＶＨ／ＶＬ対生殖系列遺伝子の出現率を示す表６とを比較すると、関連付け又は対形成と無関係に評価したときに高度に示されるＶＨ、Ｖλ及びＶκ生殖系列遺伝子の多くが、ＶＨ／ＶＬ対形成においても高度に示されたことが明らかであった。
【０２０９】
この観察は、図４〜図５に示すプロットで確認され、これはヒト免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対を示すものである。これらの図は、プールデータから同定された各ＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対の実際の数を行列にプロットしたものを示し、ここでＹ軸はＶＨ生殖系列遺伝子の順位を含み、Ｘ軸はＶＬ生殖系列遺伝子の順位を含む。
【０２１０】
実施例４：生物物理学的特性をさらに評価するためのＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対の選択
次のステップとして、ヒト免疫レパートリーには約２５００対あり、且つ本発明者らの目標は、生殖系列タンパク質対のうちどれが選択及び開発に役立ち得る好ましい生物物理学的特性を含むかを同定することであったため、どの生殖系列タンパク質対を試験すべきであるかを決定しなければならなかった。一つの方法は、ヒト免疫レパートリーに最も顕著に現れる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を試験することであり得た（例えば、表６を参照のこと）。例えば、上位４００個の対を試験用に選択するか、又は特定の閾値数を上回って存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対を選択することができた。この手法は、多数の異なる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質対配列の合成及び試験を必要とするものと思われた；従って、かかる手法はあまり効率的とは言えない。
【０２１１】
代替的な手法として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーから顕著な対の大多数を代表する、それを正確に再現する、又はそれを網羅する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列対のサブセットを選択した。この手法は、一部には、ヒト免疫レパートリーにおいて少数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列遺伝子（対でない）が支配的であるという上記の観察に基づいた。従って、少数の顕著な重鎖及び軽鎖生殖系列遺伝子（対でない）を組み合わせることで、ヒト免疫レパートリーを代表する一群のＶＨ／ＶＬ対を作成することができる。
【０２１２】
この手法は以下のように行った。実施例３では、可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系列遺伝子発現を決定した。次のステップとして、顕著なＶＨ、Ｖλ及びＶκ生殖系列遺伝子のインシリコ解析を完了し、ここでは少なくとも以下の要素を評価した：ＣＤＲ長さ、等電点（ｐＩ）（標準的なｐＨ５．５〜ｐＨ７の配合緩衝液中で安定性を提供するものと思われる７．５以上の等電点が好ましい）、潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）（具体的には、Ｎ−結合型グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又は化学修飾、例えばＡｓｐ開裂（多くの場合にＤＰ又はＤＱにおける）、Ａｓｐ異性化（ＤＳ、ＤＧ）、アミド分解（ＮＳ、ＮＧ）、これは生体内（血清中）において又は配合緩衝液中での貯蔵時に起こり、抗原結合の喪失をもたらし得る）、ＣＤＲにおけるメチオニンの存在（溶媒に曝露されたときに酸化し得る）、対でないシステインの存在（任意の他の対でないシステインとジスルフィド結合を形成し、ひいてはタンパク質の架橋結合及び／又は発現収率の低下をもたらし得る）、生殖系列からの偏差、あり得るＴ細胞エピトープの存在、及び理論上の凝集傾向。インシリコ解析から選択されたデータを図２〜図３に示す。
【０２１３】
合成し、組み合わせ、続いて機能を試験するため、最も顕著なＶＨ、Ｖλ及びＶκ生殖系列遺伝子のインシリコ解析に基づき、それらのサブセットを選択した。このサブセットは図２〜図３に示す。表５と図２〜図３とを比較すると、最も顕著なＶＨ、Ｖλ及びＶκ生殖系列遺伝子の全てがさらなる試験に選択されたわけではなかったことは明らかである。表５に示される最も顕著なＶＨ生殖系列遺伝子のうち、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、及びＩＧＨＶ３−９は選択されなかった。代わりに（図２〜図３を参照）、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−７３、及びＩＧＨＶ６−１が選択された。合計２０個のＶＨ生殖系列遺伝子が選択された。表５に示される最も顕著なＶκ生殖系列遺伝子のうち、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ２−２８／２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１−３３／１Ｄ−３３、及びＩＧＫＶ１−８は選択されなかった。合計１２個のＶκ生殖系列遺伝子が選択された。表５に示される最も顕著なＶλ生殖系列遺伝子のうち、ＩＧＬＶ１−４４は選択されなかった。合計８個のＶλ生殖系列遺伝子が選択された。
【０２１４】
表５は、ヒト免疫レパートリーからのＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系列遺伝子利用の順位を示し、太字及び下線の生殖系列遺伝子が、さらなる機能試験に選択されたものである。
2014500725.tif 000007
2014500725.tif 000008
【０２１５】
実施例４．１：ヒト免疫レパートリーにおいてＶＨ／ＶＬの最も顕著な対の表現を得るための豊富なＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系列遺伝子の組換え
次のステップとして、２０個のＶＨ、１２個のＶκ及び８個のＶλの選択されたＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系列遺伝子を合成し、組み合わせて、４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対を生成し、続いてこれらの対をその生物物理学的特性について試験した。表６は、機能試験用に生成した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対が、実際に、ヒト免疫レパートリーにおいて顕著なＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対の大部分を確かに正確に再現し、又は網羅することを示す。表６は、ヒト免疫レパートリーで発現するＶＨ／ＶＬ対の順位を示し、ここで試験した４００個のＶＨ／ＶＬ対は太字及び下線で示す。
2014500725.tif 000009
2014500725.tif 000010
2014500725.tif 000011
2014500725.tif 000012
2014500725.tif 000013
2014500725.tif 000014
2014500725.tif 000015
2014500725.tif 000016
2014500725.tif 000017
2014500725.tif 000018
2014500725.tif 000019
2014500725.tif 000020
2014500725.tif 000021
2014500725.tif 000022
2014500725.tif 000023
2014500725.tif 000024
【０２１６】
実施例５：機能分析用の生殖系列遺伝子の生成
次のステップとして、表５に示されるとおり、組み合わせ及び続く試験用に選択されたＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系列遺伝子を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に送り、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現に対してコドンを最適化し（哺乳動物発現に対しては中立的で、まれなヒトコドンを含まない）、遺伝子を最適化して潜在的な阻害又はスプライスモチーフを取り除き、及び合成した。
【０２１７】
ＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系列遺伝子の各々の生殖系列タンパク質配列を、図６〜図８に示す。各生殖系列遺伝子配列は、以下のとおり合成した：
ａ）ＶＨについて：リーダー配列（表１に示されるとおりＮｈｅＩ制限部位を組み込む修飾ｐｈｏＡシグナル配列）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｓｓＨＩＩ制限部位（ＧＣＧＣＧＣ）を組み込む）；Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３において使用されるとおりの４Ｄ５抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）（配列番号１）；及びＪＨ４  ＦＲ４（図１に示されるとおりＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限部位を組み込む）；
ｂ）Ｖｋについて：リーダー配列（表２に示されるとおりＮｄｅＩ制限部位を組み込む修飾ｏｍｐＡシグナル配列）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｂｓＩ制限部位（ＧＡＡＧＡＣ）を組み込む）、Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３によるκ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）（配列番号２）；及びＪｋ１  ＦＲ４（図１に示されるとおりＫｐｎＩ／Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を組み込む）；
ｃ）Ｖλについて：リーダー配列（表２に示されるとおりＮｄｅＩ制限部位を組み込む修飾ｏｍｐＡシグナル配列）；生殖系列ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２及びＦＲ３（図１に示されるとおりＢｂｓＩ制限部位（ＧＡＡＧＡＣ）を組み込む）、Ｅｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３によるλ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）（配列番号３）；及びＪｌ２／３  ＦＲ４（図１に示されるとおりＫｐｎＩ／Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を組み込む）。
【０２１８】
実施例６：ヒト免疫レパートリーを代表する生殖系列タンパク質対の機能試験
次に、４００個の生殖系列タンパク質対を、Ｆａｂ又はヒトＩｇＧ１のいずれかのフォーマットでファージディスプレイ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）及び哺乳動物（ｍａｍａｌｌａｎ）発現ベクターに挿入し、次に以下の特性について試験した：ａ）Ｆａｂフォーマットにおけるファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後の相対提示；ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び産生されたＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後の相対Ｆａｂ発現収率；ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び高温でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートからのＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞におけるＩｇＧ１産生及び細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ検出後の相対ヒトＩｇＧ１発現収率；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＩｇＧのＥＬＩＳＡ検出によるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性。
【０２１９】
実施例６．１：機能特性決定用のファージ上に提示されるＦａｂプールの生成
表５に示される、実施例５で合成した抗体又は抗体断片を、機能試験のため、トリシストロンＦａｂディスプレイベクターｐＪＰｄ１（図９）にクローニングした。２０個のＶＨの、８個のＶλ及び１２個のＶκとの組み合わせである主遺伝子の各々の組み合わせを含んだＦａｂプールを作成し、表６に示される４００個の組み合わせが得られた。
【０２２０】
９６ウェルプレートを使用して、上記の遺伝子対を含むファージを小規模で作製した。ウェルの各々に２ｘＹＴ／ＣＡＭ／ＴＥＴ／Ｇｌｕｃ培地を充填し、４００個のＶＨ／ＶＬの組み合わせ由来のクローンを接種することによりマスタープレートを作成し、ここではｐＭＯＲＰＨ３０＿Ｖｋ３−１１＿ＡＱＡ／ＶＨ３−２３＿ＴＫＡ又はｐＭＯＲＰＨ３０＿Ｖｋ３−１１＿ＡＹＡ／ＶＨ３−２３＿ＶＬＡ（ｐＭＯＲＰＨ３０は図１２に示される）を対照として使用した。プレートを振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。マスタープレートを１５％グリセロールの終濃度で保存し、−８０℃で凍結した。
【０２２１】
ファージ産生用に、２ｘＹＴ／ＣＡＭ／ＴＥＴ／Ｇｌｕｃを培地として使用してさらなる９６ウェルプレートを作製し、上記に記載されるマスタープレートのクローンを接種した。プレートを、ＯＤ６００ｎｍが約０．５に達するまで、４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で約２〜４時間インキュベートした。
【０２２２】
プレートに５μｌヘルパーファージ／ウェル（Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ；ＰＲＯＧＥＮ；１×１０１２ｐｆｕ／ｍｌ）を感染させた。プレートを振盪なしに３７℃で４５分間、次に４００ｒｐｍで振盪しながら６０分間インキュベートした。細菌を４℃で５分間、２２００ｇでスピンダウンした。
【０２２３】
ヘルパーファージを含む上清を廃棄し、感染させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペレットを、グルコース不含２ｘＹＴ／Ｃａｍ／ＴＥＴ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧに再懸濁した。再懸濁したペレットを、予め２ｘＹＴ／Ｃｍ／ＴＥＴ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧで充填された新しい９６ディープウェルプレートに移した。プレートを振盪しながら２２℃で一晩インキュベートした。ファージを含む上清をスピンダウンにより回収し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞及びデブリを廃棄した。
【０２２４】
実施例６．２：ＥＬＩＳＡを使用したＦａｂファージ提示順位の評価
実施例６．１に記載されるとおり調製したファージ上清を使用して、ファージＥＬＩＳＡにおいてＦａｂファージ提示を順位付けした。ファージＥＬＩＳＡにおいて、２つの異なる捕捉抗体を使用してＦａｂ断片の提示を評価した：
（１）主要コートタンパク質ｇ８ｐを介したファージ粒子の捕捉用に、抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃２７−９４２０−０１）を使用した；従って、ファージ力価を決定することができる。
（２）抗Ｆｄ抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  ＃ＰＣ０７５）を使用した。これは提示されたＦａｂに結合する；従って、主遺伝子を含むファージを提示するＦａｂのみが捕捉される。
【０２２５】
それぞれの捕捉抗体を、抗Ｍ１３抗体については７．５μｇ／ｍｌの濃度、及び抗Ｆｄ抗体については１．０μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ抗体溶液を異なるウェルに分注することにより、黒色の９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定化し、プレートをラミネート箔で密閉し、及び４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＴＢＳＴで２回洗浄し、各ウェルを３００μｌのＣＴＢＳＴにより室温で１時間ブロックした。
【０２２６】
ファージ上清及び基準サンプルの双方を、検出のため以下のとおり移した。ブロックしたＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで２回洗浄した。ＣＴＢＳＴ中に適切に希釈したファージ上清１００μｌを、希釈したプレートからコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで５回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＣＴＢＳＴ中１：５０００希釈した抗Ｍ１３ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。１部（例えば０．５ｍｌ）の過酸化物溶液を９部（例えば４．５ｍｌ）の基質溶液と混合し、それを少なくとも３０分間室温に平衡化させることにより、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｌｕ（Ｐｉｅｒｃｅ）ワーキング溶液を調製した。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＱｕａｎｔａＢｌｕワーキング溶液を添加した。約２分間のインキュベーション時間後、及び続いて５分間の間隔を置いて、蛍光を計測した（励起：３２０ｎｍ、放出：４３０ｎｍ）。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡデータの評価は、以下のとおり完了した：ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ基準ファージ調製物（ＶＨ３  κ＋λ）を使用することにより検量線を作成し、ファージ上清及び対照の力価を計算した。各サンプルについて、抗Ｆｄに関する力価を抗Ｍ１３（抗ｐＶＩＩＩ）に関する力価で除した。得られた比が相対提示率である。表１２は、４００個の生殖系列タンパク質対のほとんどについての相対提示率を示す。
【０２２８】
実施例６．３：４００個のＶＨ／ＶＬの組み合わせのスクリーニングＥＬＩＳＡによる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートにおけるＦａｂ発現収率の決定
Ｆａｂ発現ベクターｐＪＰｘ１（図１０に示される）におけるＶＨ／ＶＬの組み合わせのプールにより形質転換したクローンを２ＹＴ／Ｃａｍ／１％Ｇｌｕｃ培地／ウェルに選び取ることにより、マスタープレート（ＭＰ）を接種した。これらのプレートを振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。発現プレート（ＥＰ）は、ＭＰの２．５μｌの培養物で２ＹＴ／Ｃａｍ／０．１％グルコース／ウェルに接種した。対照（表８を参照）は、グリセロールストックから接種した。これらのプレートを３７℃で振盪しながら６時間インキュベートし、次にＩＰＴＧを添加することによりＦａｂ発現を誘導し、振盪しながら２２℃で一晩インキュベートした。ホウ素／酸／ＥＤＴＡ／リゾチーム緩衝液をＥＰに添加することにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解物を作製し（振盪しながら２２℃で１時間インキュベーション）、続いて細菌ライセートを１２．５％ＭＰＢＳＴで、室温で振盪しながら少なくとも３０分間ブロックした。発現プレートからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを、０．５％ＭＰＢＳで適切に希釈し、以下のアッセイで使用した。
【０２２９】
表７は、使用した非標識コーティング抗体及びＡＰ標識検出抗体を示す。
2014500725.tif 000025
【０２３０】
表８は、使用した対照を示す。
2014500725.tif 000026
【０２３１】
スクリーニングＥＬＩＳＡには以下のステップが含まれた：ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの３８４ウェルを、ＰＢＳ中に希釈した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｄ特異的抗体でコーティングするステップ、及び４℃で一晩インキュベートするステップ。翌日、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、各ウェルに（ＰＢＳ中５％粉乳）を添加して振盪しながら室温で１〜２時間インキュベートすることによりブロックした。次にプレートを再びＰＢＳＴで洗浄し、０．５％ＭＰＢＳに希釈した、予めブロックした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。また、対照＃３及び＃５も添加した。次にプレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＡＰ標識検出抗体を０．５％ＭＰＢＳに希釈した。希釈した検出抗体を添加し、次に穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。以下によりシグナルを同定した：ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、２０μｌのＡｔｔｏＰｈｏｓ（ｄｄＨ２Ｏで１：５希釈）を添加し、及びＴｅｃａｎ（ｉｎｆｉｎｉＴｅ  Ｆ２００）、プログラムＰｒｉｍｅＳｃｒｅｅｎを使用して５分及び７〜８分で読み取る。
【０２３２】
相対Ｆａｂ発現収率は、それぞれのＶＨ／ＶＬ対のＥＬＩＳＡシグナルを基準Ｆａｂ  ｐＭｘ１１＿ＦＨ  ＶＨ１−６９  ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０  ＡＹＡのＥＬＩＳＡシグナルで除すことにより計算される。従って同じ高さのＥＬＩＳＡシグナルでは、相対Ｆａｂ発現収率は１となる。基準Ｆａｂは、ａ）Ｃ末端ＮｈｅＩ制限部位を含む修飾ｐｈｏＡ重鎖シグナル配列；ｂ）Ｃ末端ＮｄｅＩ制限部位を含む修飾ｏｍｐＡ軽鎖シグナル配列；ｃ）図６Ａに示されるとおりのＶＨ１−６９＊  ０１生殖系列遺伝子の可変重鎖生殖系列タンパク質配列、ｄ）図８Ａに示されるとおりのＩＧＬＶ１−４０生殖系列遺伝子の可変軽鎖生殖系列タンパク質配列；ｅ）ｈｕ４Ｄ５−８抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）（配列番号１）、及び重鎖ＦＲ４のＪＨ４生殖系列タンパク質配列の組み込み；ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３領域（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）（配列番号３）及び軽鎖ＦＲ４のＪｌ２／３生殖系列タンパク質配列の組み込みを含むｐＭＯＲＰＨＸ１１プラスミド（図１１に示される）で発現する。ｈｕ４Ｄ５−８は、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｐ１８５Ｈｅｒ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト癌療法のための抗ｐ１８５Ｈｅｒ２抗体のヒト化）”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，４２８５−４２８９）及びＥｗｅｒｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３２５，５３１−５５３に記載される。遺伝子は全て、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で作成された。結果は表１２に示す。
【０２３３】
実施例６．４：４００個のＶＨ／ＶＬの組み合わせのスクリーニングＥＬＩＳＡによる、ＢＥＬライセートにおけるＦａｂの温度安定性の決定
実施例６．３のとおり発現プレートを作成した。発現プレートからの希釈した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを様々な温度で４５分間インキュベートし、以下のアッセイで使用した。表９は、使用した非標識コーティング抗体及びＡＰ標識検出抗体を示す。
2014500725.tif 000027
【０２３４】
スクリーニングＥＬＩＳＡは、以下のステップを含んだ：ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの３８４ウェルを、ＰＢＳに希釈したコーティング抗体（上記の表を参照）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに５％ＭＰＢＳを添加することによりブロックし、振盪しながら室温で１〜２時間インキュベートした。次に、発現プレートからの希釈した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを４つの９６ウェルＰＣＲプレート（各約４０μｌ）に分配し、ＰＣＲサイクラーで種々の温度（４℃（氷上）、６０℃、７０℃、８０℃の後氷上）に、各温度につき４５分間曝露した。ブロックした３８４ウェルプレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に予備インキュベートしたＦａｂライセートをプレートに加えた。次にプレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＡＰ標識検出抗体を０．５％ＭＰＢＳに希釈した。２０μｌ／ウェルの希釈した検出抗体を添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。以下によってシグナルを同定した：ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（ｄｄＨ２Ｏで１：５希釈）を全てのウェルに添加する。Ｔｅｃａｎ（ｉｎｆｉｎｉＴｅ  Ｆ２００）、プログラムＰｉｍｅＳｃｒｅｅｎを使用して、種々の時間点（５分〜１０分）でシグナルを読み取った。結果は表１２に示す。
【０２３５】
実施例６．５：４００個のＶＨ／ＶＬの組み合わせのスクリーニングＥＬＩＳＡによる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートにおけるＦａｂの血清安定性（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｂｉｌｔｙ）の決定
実施例６．３のとおり発現プレートを作成した。Ｆａｂを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを希釈し、以下のステップを用いてウシ及びマウス血清中でインキュベートした：発現プレートからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートを５０％血清に希釈し（全容積１００μｌ）、１：１０００  Ｃａｍを添加することにより細菌の増殖を防止し、ライセートを２つの９６ウェルプレートに分割し、及び両プレートとも凍結した。第１のプレートを解凍し、３７℃で１２〜１３日間インキュベートした。第２のプレートは、ＥＬＩＳＡの実施まで（３７℃で０日間インキュベーション）、−８０℃で保存した。
【０２３６】
表１０は、使用した非標識コーティング抗体及びＡＰ標識検出抗体を示す。
2014500725.tif 000028
【０２３７】
１１日目又は１２日目、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの３８４ウェルを、ＰＢＳに希釈した２０μｌコーティング抗体でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに５％ＭＰＢＳを添加することによりブロックし、振盪しながら室温で１〜２時間インキュベートした。次にブロックした３８４ウェルプレートをＰＢＳＴで洗浄した。−８０℃及び３７℃サンプル由来の血清中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＡＰ標識検出抗体を０．５％ＭＰＢＳに希釈した。ＡＰ標識検出抗体を添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。以下によってシグナルを同定した：ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、全てのウェルにＡｔｔｏＰｈｏｓ（ｄｄＨ２Ｏで１：５希釈）を添加する。Ｔｅｃａｎ（ｉｎｆｉｎｉＴｅ  Ｆ２００）、プログラムＰｒｉｍｅＳｃｒｅｅｎを使用して、種々の時間点（５分〜１０分）でシグナルを読み取った。このウシ血清安定性試験の結果を図１９に示す。マウス血清安定性試験の結果は表１２に示す。
【０２３８】
実施例７：生物物理学的特性の評価用ヒトＩｇＧ１の生成
４００個のＩｇＧ１生殖系列タンパク質対を生成するため、２０個の可変領域重鎖遺伝子を、図１３に示されるヒトＩｇＧ１発現ベクターｐＪＰ＿ｈＩｇＧ１ｆにサブクローニングした。同時に、１２個の可変領域κ遺伝子を、図１４に示される哺乳動物κ軽鎖発現ベクターｐＪＰ＿ｈＩｇκにサブクローニングし、及び８個の可変領域λ遺伝子を、図１５に示される哺乳動物λ軽鎖発現ベクターｐＪＰ＿ｈＩｇλ２にサブクローニングした。
【０２３９】
各々のコトランスフェクションにより、４０個の発現コンストラクトをクローニングするだけで４００個全てのＶＨ／ＶＬ対の重鎖及び軽鎖発現プラスミドを個別に産生することができる。従ってＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞に、２０個全ての重鎖コンストラクト及び２０個全ての軽鎖発現コンストラクトをコトランスフェクトした。トランスフェクションから数日後、細胞培養上清からヒトＩｇＧ１を回収又は検出した。
【０２４０】
実施例７．１：ＩｇＧ１発現の順位付け
コレクションに含めるＶＨ／ＶＬ対の選択基準の一つは、ＩｇＧ１フォーマットにおける４００個の異なるＶＨ／ＶＬ対の発現レベルである。ヒトＩｇＧ１フォーマットにおける各ＶＨ／ＶＬ対の発現レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。従って、ＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞にヒトＩｇＧ１フォーマットで４００個全てのＶＨ／ＶＬの組み合わせをトランスフェクトし、小規模で発現させた。数日後、細胞培養上清を回収し、ＩｇＧレベルを評価した。
【０２４１】
以下の手順を実施した。３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのＦｃγ−ｐａｎ  Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。プレートをＰＢＳＴ中５％ＢＳＡ又は１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒでブロックし、振盪しながら室温で１時間インキュベートし、再びＰＢＳＴで洗浄した。ＩｇＧ発現上清を２．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴに希釈し、その希釈したサンプルを、ブロック及び洗浄したＥＬＩＳＡプレートに添加した。以下の対照を使用した：何も含まない上清並びに低度に発現する抗体、中程度に発現する抗体及び高度に発現する抗体を含む上清。プレートを振盪しながら室温で２時間インキュベートした。次にプレートをＴＢＳＴで洗浄した。１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴ中の適切に希釈したＦｃγ−ｐａｎ  Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧビオチンコンジュゲートを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴに１：２０００希釈したストレプトアビジン−ＡＰを添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。使用直前にＴＢＳＴに希釈したＡｔｔｏＰｈｏｓ（商標）蛍光基質（製造者の指示に従い調製した）を添加した。５分後及び１０分後、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを用いて蛍光を計測した。
【０２４２】
それぞれのＶＨ／ＶＬ対のＥＬＩＳＡシグナルを基準ＩｇＧ１  ＭＯＲ０３０８０（表１１に示される）のＥＬＩＳＡシグナルで除すことにより、相対ＩｇＧ１発現収率を計算した。従って、同じ高さのＥＬＩＳＡシグナルは、相対ＩｇＧ１発現収率レベルが１となる。
2014500725.tif 000029
【０２４３】
結果は表１２に示す。Ｆｃ部分の配列は、図４８、図５０〜図５１に示す。
【０２４４】
実施例７．２：ＩｇＧ１血清安定性の順位付け
コレクションに含める可変重鎖と可変軽鎖との対の選択基準の一つは、ＩｇＧ１フォーマットにおける４００個の異なる可変重鎖と可変軽鎖との対の血清安定性である。各ＩｇＧ抗体上清の血清安定性を、５０％マウス血清中での１４日間のインキュベーションと、続くマウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ２）クローンＲ１０Ｚ８Ｅ９によるサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。ここでもヒトＩｇＧ１フォーマットにおける４００個全てのＶＨ／ＶＬの組み合わせをＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし、小規模で発現させた。数日後に細胞培養上清を回収し、上清中のＩｇＧを血清安定性について試験した。
【０２４５】
以下の手順を実施した。３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのＦｃγ−ｐａｎ  Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次に、５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ又は１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒにより、振盪しながら室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。ＩｇＧ１を含む細胞培養上清を、ａ）２．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ、及びｂ）５０％マウス血清に希釈し、３７℃で少なくとも１４日間インキュベートし、これらのサンプルを、ブロック及び洗浄したＥＬＩＳＡプレートに添加した。以下の対照を使用した：何も含まない上清並びに低度に発現する抗体、中程度に発現する抗体、及び高度に発現する抗体を含む上清。プレートを振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴ中０．８μｇ／ｍｌに希釈したＦｃγ−ｐａｎ  Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧビオチンコンジュゲートを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴに１：２０００希釈したストレプトアビジン−ＡＰを添加した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。使用直前にＴＢＳＴに１：５希釈したＡｔｔｏＰｈｏｓ（商標）蛍光基質（製造者の指示に従い調製した）を添加した。５分後及び１０分後、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを用いて蛍光を計測した。結果は表１２に示す。
【０２４６】
実施例８：コレクションに組み込むのに好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ／ＶＬ対の選択
４００個の生殖系列タンパク質対を以下の特性について試験した後：ａ）Ｆａｂフォーマットにおけるファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後の相対提示；ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び産生されたＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後の相対Ｆａｂ発現収率；ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び高温でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートからのＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞におけるＩｇＧ１産生及び細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ検出後の相対ヒトＩｇＧ１発現収率；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ検出によるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性；その後、次のステップは、どのＶＨ／ＶＬ生殖系列対をコレクションに組み込むかを選択することであった。各ＶＨ／ＶＬ生殖系列タンパク質対の機能試験の結果を表１２に示す。
2014500725.tif 000030
2014500725.tif 000031
2014500725.tif 000032
2014500725.tif 000033
2014500725.tif 000034
2014500725.tif 000035
2014500725.tif 000036
2014500725.tif 000037
【０２４７】
表１２の要点：
相対ＦＡＢ提示、相対ＦＡＢ発現及び相対ＩＧＧ１発現について、値は対照と比較したときのレベルを示す。大きい数値ほど高いレベルを示す。
【０２４８】
ＦＡＢ熱安定性について、数値６０及び７０は、試験条件下６０℃又は７０℃で４５分間安定であるＶＨ／ＶＬ対を示す。数値４は温度安定性のない対を示し、及びＢＧ（バックグラウンド）は低度の発現レベルを示す。
【０２４９】
マウス血清中でのＦＡＢ安定性、ウシ血清中でのＦＡＢ安定性及びウシ血清中でのＩＧＧ１安定性について、試験条件下での、Ｓは安定を表し、Ｕは不安定を表し、及びＢＧはバックグラウンドを表す。
【０２５０】
前出の例に記載するとおり、ヒト免疫レパートリーから支配的なＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子及び支配的なＶＨ／ＶＬ生殖系列遺伝子対を同定し、次に支配的なＶＨ及びＶＬ生殖系列タンパク質配列をインシリコで分析することにより、好ましい生物物理学的特性を有する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系列タンパク質配列を同定及び選択した。表５、及び概して図２〜図３に示されるとおり、合成、組み合わせ、及び続く機能分析のために、上位２０個のＶＨ、上位８個のＶλ及び上位１２個のＶκが選択された。生殖系列遺伝子配列を合成し、次に組み合わせることにより、ヒト免疫レパートリーで発現する豊富な生殖系列遺伝子対を代表する４００個の生殖系列タンパク質対を作成した。これらの４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系列タンパク質対を、以下の特性について試験した：ａ）Ｆａｂフォーマットにおけるファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後の相対提示；ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び産生されたＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後の相対Ｆａｂ発現収率；ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ産生、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞溶解及び高温でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＦａｂのＥＬＩＳＡ検出による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートからのＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞におけるＩｇＧ１産生及び細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ検出後の相対ヒトＩｇＧ１発現収率；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベートした後の非変性ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ検出によるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性。
【０２５１】
表１２に提供されるデータを使用して、当業者は、好ましい生物物理学的特性を有する生殖系列タンパク質対を容易に同定し得る。
【０２５２】
概して、コレクションに組み込むため、各機能特性における閾値を有する生殖系列タンパク質対を選択した。例えば、一部の実施形態では、コレクションへの組み込み用に、以下の特性の全てを含む生殖系列タンパク質対を選択した：ｉ）サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内に入る値を含むＦａｂフォーマットにおける相対提示率；ｉｉ）Ｆａｂ  ＶＨ１−６９  ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ＡＹＡと比較したとき少なくとも０．４のＦａｂフォーマットにおける発現収率；ｉｉｉ）Ｆａｂフォーマットにおける少なくとも４５分間の６０℃以上での熱安定性；ｉｖ）３７℃で１０日間を超えるＦａｂフォーマットにおけるウシ又はマウス血清中での安定性；ｖ）ＭＯＲ０３０８０と比較したとき少なくとも０．４のＩｇＧフォーマットにおける発現収率；及びｖｉ）３７℃で１４日間のＩｇＧフォーマットにおける血清中での安定性。表３２は、これらの機能特性を全て含む生殖系列タンパク質対を、太字及び下線で示す。
【０２５３】
しかしながら、上記に記載したとおり、コレクションへの組み込み用に、これらの機能特性のうちの１つ以上を有する生殖系列タンパク質対が選択されてもよい。ここで、試験した４００個の生殖系列タンパク質対の総合順位を作成し、従って試験した機能特性の各々を重み付けして各生殖系列タンパク質対を他に対して順位付けすることができた。これにより、本発明者らは、列挙される機能特性の１つ以上又は全てを有する１つ以上の生殖系列タンパク質対を選択することが可能となった。一部の実施形態では、コレクションは、上記の特性を有する生殖系列タンパク質対の全てを含む。一部の実施形態では、コレクションは、試験した４００対のうち最も高い総合スコアを有する生殖系列タンパク質対を含む。一部の実施形態では、コレクションへの組み込み用に、試験した４００対のうち上位１０％、上位２０％、又は上位３０％に入る総合スコアを有する生殖系列タンパク質対を選択した。
【０２５４】
実施例９：約１００個のＶＨ／ＶＬ対のさらなる試験
上記の試験した４００個の生殖系列タンパク質対のうち（結果は表１２に示される）、さらなる試験用に９５個を選択した。前出の、提示、発現収率、熱安定性及び血清安定性についての４００個の生殖系列タンパク質対の試験は、治療薬開発に好都合と思われる特性を有しない生殖系列タンパク質対を除去する予備的なフィルタリングとして機能した。目標は、好ましい開発可能特性を有すると同時に、コレクションを使用して任意の抗原に対する開発可能な候補を同定することができるようにコレクション内で高度な多様性を維持する生殖系列タンパク質対のサブ群を選択することであった。
【０２５５】
表１２は、本開示のある実施形態の閾値を満たす約６０個の太字及び下線の生殖系列タンパク質対を示す。さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の一部は、それらが前出の基準を満たし、且つそれらをさらに試験することが望ましかったため、選択された。他は、特定の閾値を満たさないものの、それらの対を再評価し得るように選択した。ここでも、本開示の目標の一つは、任意の抗原に対する抗体又は断片の同定に使用することが可能な多様なコレクションを提供することである。図１６〜図２４に示される９５個の生殖系列タンパク質対は、実施例５に記載されるとおり合成した。Ｆａｂ及びＩｇＧ１フォーマットで合成し、発現させた後、９５個の生殖系列タンパク質対を、以下に関してＦａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットでさらに試験した：ａ）ｍｇ／Ｌ（発現培養物）単位の精製Ｆａｂ発現収率、ｂ）精製Ｆａｂ単量体含量（％単量体）、ｃ）℃単位の精製Ｆａｂ熱安定性、ｄ）ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）単位の精製ＩｇＧ１発現収率、ｅ）精製ＩｇＧ１単量体含量（％単量体）、ｆ）℃単位の精製ＩｇＧ１熱安定性、ｇ）ＩｇＧ１等電点及びｈ）示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、吸収、動的光散乱及び粒子染色を含む、酸への曝露によるＩｇＧストレス試験。
【０２５６】
実施例９．１  精製Ｆａｂ試験
さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表すＦａｂ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、精製した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１  Ｆ細胞におけるＦａｂ断片の発現は、０．１％グルコース及びクロラムフェニコールを補足した２ｘＹＴ培地の５００ｍｌ培養物において実施した。培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで振盪した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、さらに一晩培養することにより、Ｆａｂ発現を誘導した。細胞を回収し、リゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ付き（配列番号２０３）Ｆａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により単離し、イミダゾールを使用して溶離した。ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）との緩衝液交換を実施した。サンプルを無菌ろ過した（０．２μｍ）。
【０２５７】
実施例９．１．１  精製Ｆａｂ発現収率の決定
９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表す精製Ｆａｂ断片のタンパク質濃度を、紫外分光測定法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により決定した。使用した吸光係数は１．５３８ｍＬ／ｍｇであり、２８０ｎｍの吸光度を計測した。結果は図１６〜図１８に示す。
【０２５８】
実施例９．１．２  精製Ｆａｂ熱安定性の決定
９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表す精製Ｆａｂ断片の熱安定性を、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）は、目的のタンパク質の熱的なアンフォールディング（融点）を観察する蛍光色素ベースの技法である。アンフォールディングしたタンパク質の疎水性アミノ酸側鎖と相互作用する疎水性色素の蛍光の温度勾配に伴う変化が観察される。
【０２５９】
以下の材料を使用した：Ｓｙｐｒｏオレンジ蛍光色素（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ５６９２）；ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  ＰＣＲプレート、９６ウェル（Ｂｉｏｒａｄ，＃２２３９４４１）；Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ｂ接着シーラー（Ｂｉｏｒａｄ  ＃ＭＳＢ−１００１）；９６ウェル光学パッド（Ｂｉｏｒａｄ，＃ＡＤＲ３２９６）；ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）及びＧｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）。
【０２６０】
希釈したＳｙｐｒｏオレンジを９６ウェルｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  ＰＣＲプレートの各ウェルに添加し、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの終濃度でサンプルを試験した。試験には、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した。温度を６０℃／時の加熱速度で２０℃から９５℃まで走査し、蛍光遷移の中点を分析することによりアンフォールディングの温度を計算した。結果は、図１６〜図１８の精製Ｆａｂ  Ｔｈｅｒｍａｆｌｕｏｒ欄に示す。
【０２６１】
実施例９．１．３  サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｆａｂ分離
９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表す精製Ｆａｂ断片の単量体含量（％単量体）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。ＳＥＣは、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。分離には、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。各サンプルについて、１０μｌのタンパク質をカラムに負荷し、０．０５ｍｌ／分の流量で分離を実施し、２６０及び２８０ｎｍでの紫外吸収を記録、分析した。ランニング緩衝液は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）から構成された。結果は図１６〜図１８に示す。
【０２６２】
実施例９．２  ＩｇＧ１の発現及び精製
さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表すＩｇＧ１を、ＨＫＢ１１細胞で発現させた。真核生物ＨＫＢ１１細胞に、１：１の比のＩｇＧ重鎖及び軽鎖発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後３〜４日目に細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した。１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で緩衝液交換を実施し、サンプルを無菌ろ過した（０．２μｍ孔径）。
【０２６３】
実施例９．２．１  精製ＩｇＧ１発現収率の決定
９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表す精製ＩｇＧ１のタンパク質濃度を、紫外分光測定法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により決定した。使用した吸光係数は１．３６９ｍＬ／ｍｇであり、２８０ｎｍの吸光度を計測した。結果は図１６〜図１８に示す。
【０２６４】
実施例９．２．２  精製ＩｇＧ１熱安定性の決定
精製ＩｇＧ１のＩｇＧ１熱安定性を、方法９．１．２に記載されるとおり、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。各ＩｇＧについて示される値は、ＩｇＧの可変領域内で起こるアンフォールディングイベントを示す。Ｆｃ部分のアンフォールディングを表す値は、概して各ヒトＩｇＧ１について同じであるため、示さない。結果は図１６〜図１８に示す。
【０２６５】
実施例９．２．３  サイズ排除クロマトグラフィーによる精製ＩｇＧ１の分離
９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表す精製ＩｇＧ１の単量体含量（％単量体）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。ＨＰ−ＳＥＣは、Ｗｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤＡＷＮ  Ｔｒｅｏｓ及びＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００チタンＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍｅｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。分離には、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。各サンプルについて１５μｇのタンパク質をカラムに負荷し、分離を０．５ｍｌ／分の流量で実施し、２８０ｎｍの紫外吸収を記録、分析した。ランニング緩衝液は、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）から構成された。結果は図１６〜図１８に示す。
【０２６６】
実施例９．２．４  精製ＩｇＧ１等電点（ｐＩ）の計算
ＩｇＧ１フォーマットにおける各生殖系列タンパク質対の等電点を計算した。タンパク質のｐＩの決定方法は、当業者に周知されている。例えば、以下のツールを使用することができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。結果は図１６〜図１８に示す。
【０２６７】
実施例９．２．５  酸への曝露による精製ＩｇＧ１ストレス試験
化学、製造及び品質管理（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＣＭＣ）の下流処理加工（ＤＳＰ）ではウイルス不活化ステップが標準的であるため、ｐＨを降下させ、ＩｇＧ１の各々についての凝集感度データを記録することにより、９５個の生殖系列タンパク質対の酸に耐える能力を試験した。生殖系列タンパク質対の各々を９６ディープウェルプレートフォーマットにおいて２ｍｇ／ｍＬの濃度で供給した。各１５０μＬを９６ウェルプレートに移した。初期の特性決定は、吸収、動的光散乱（ＤＬＳ）、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）の計測及び粒子染色により実施した。１．８μＬの１Ｍクエン酸塩、ｐＨ２．３を使用して、サンプルを酸性化した。２．５時間後、１Ｍトリス、ｐＨ９．０を使用して、サンプルを中和した。
【０２６８】
実施例９．２．５（ａ）  精製ＩｇＧ１の示差走査型蛍光定量
さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表すＩｇＧ１の酸への曝露前及び曝露後の熱安定性を評価するため、実施例９．１．２に記載されるとおり示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を実施した。各ＩｇＧについて示される値は、ＩｇＧの可変領域内で起こるアンフォールディングイベントを示す。Ｆｃ部分のアンフォールディングを表す値は、概して各ＩｇＧについて同じであるため、示さない。酸への曝露前及び曝露後のＴｍ（見かけの融点）値が等しい場合、抗体の分子構造が酸によって影響を受けなかったか、又は曝露後に効率的にリフォールディングすることが可能であったかのいずれかであった。結果は図１９、図２１、及び図２３に示す。
【０２６９】
実施例９．２．５（ｂ）  精製ＩｇＧ１の紫外／可視吸収
凝集性のサンプルを同定するため、３２０ｎｍで濁度を記録した。さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表す酸への曝露前及び曝露後のＩｇＧ溶液の濁度を評価した。結果は図１９、図２１、及び図２３に示す。ベースライン吸収は、透明な溶液について予想される０．０３５吸光単位（ｅｘｔｉｎｃｉｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ）であった。吸収の増加は光散乱によって引き起こされ、その結果、吸光が増加する。０．０３９を上回る値は、凝集物を含む可能性が高い。０．０４５を上回る値は、凝集物の明らかな存在を示す。０．０６を上回る値は、極めて好ましくない安定性を有する分子に認められたクリティカルな凝集レベルに相当する。
【０２７０】
実施例９．２．５（ｃ）  精製ＩｇＧ１の動的光散乱
加えて、選択された９５個の生殖系列タンパク質対を表す各ＩｇＧ１に対する動的光散乱（ＤＬＳ）を実施した。動的光散乱（ＤＬＳ）は、溶液中における粒子の流体力学半径を評価する分光法である。全てのＤＬＳ実験は、ＤｙｎａＰｒｏ  Ｔｉｔａｎキュベットシステム（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。
【０２７１】
ストレス試験後に可視粒子の混入がある場合、ＩｇＧを遠心することによって大きい凝集物を取り除いた。図２０、図２２及び図２４は、酸処理前及び処理後の調製物に見出される単量体ＩｇＧ１に対応する見かけの粒子半径及び多分散性を示す。データは、キュムラント解析の半径計算値に従い評価した。流体力学半径に加えて、調製物の％多分散性を評価した。多分散性の増加（＞１５％）はＩｇＧ分子の潜在的な凝集を示し、不均一な粒度分布をもたらす。ＩｇＧと明らかに区別可能な高分子量（ＨＭＷ）粒子（半径＞３倍）は、表に掲載しない。全てのＤＬＳ結果を、図２０、図２２及び図２４に示す。
【０２７２】
実施例９．２．５（ｄ）  精製ＩｇＧ１の粒子染色
可視凝集物の量及び形態を評価するため、選択された９５個の生殖系列タンパク質対を表す各ＩｇＧ１に対して酸への曝露前及び曝露後に粒子染色を実施した。以下の試薬を使用して、ＩｇＧ調製物中の粒子をろ過及び染色した：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ  ０．２２μｍ無菌フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＵＦＣ４０ＧＶ０Ｓ）；抗ヒトλ軽鎖、ＡＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ−２９０４）；ＡＰコンジュゲート用の発色剤、Ｆａｓｔ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｂ−５６５５）；Ｒｏｔｉ（登録商標）−ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ  ＃Ｔ１４４．１）；アルカリホスファターゼ停止液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ５８５２−１００ＭＬ）；ＴＢＳ：０．０５Ｍトリス；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有；及び５Ｍ  ＮａＣｌ溶液。
【０２７３】
タンパク質溶液を０．２２μｍフィルタでろ過した。続いて残りの抗体凝集物を、マウス抗ヒトＦａｂ２アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体及びウエスタンブロット発色剤を使用して染色する。アッセイは、製造者のマニュアルに従い実施した。続いてサンプルを、目視検査によって１〜４の範囲に、カテゴリー１が調製物の極めて低い粒子含有量を表し、及びカテゴリー４が高い粒子負荷を表すものとして分類した。全ての粒子染色結果を、図２０、図２２及び図２４に示す。
【０２７４】
実施例９．２．６  精製ＩｇＧ１の撹拌によるストレス試験
処理加工においてろ過工程は避けることができないため、抗体又は抗体断片の剪断力（ｓｈｅｅｒ  ｆｏｒｃｅｓ）に耐える能力は、有用な基準である。従って、ディープウェルプレートにおいて５５０ｒｐｍのオービタルシェーカー上の９６ウェルプレート内で加速させたガラスパールを使用して、ＩｇＧ１フォーマットで９５個の生殖系列タンパク質対を試験した。３５０μｌの各ＩｇＧを、この処理に供した。各１５０μＬを９６ウェルプレートに移した。初期の特性決定は、吸収、動的光散乱（ＤＬＳ）、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）の計測及び粒子染色により実施した。
【０２７５】
実施例９．２．６（ａ）  精製ＩｇＧ１の紫外／可視吸収
凝集性のサンプルを同定するため、３２０ｎｍで濁度を記録した。さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表すＩｇＧ溶液の濁度を、ストレス曝露前及び曝露後に評価した。結果は、図４９、図５１及び図５３に示す。ベースライン吸収は、透明な溶液について予想される０．０３５吸光単位（ｅｘｔｉｎｃｉｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ）であった。吸収の増加は光散乱によって引き起こされ、その結果、吸光が増加する。０．０３９を上回る値は、凝集物を含む可能性が高い。０．０４５を上回る値は、凝集物の明らかな存在を示す。０．０６を上回る値は、極めて好ましくない安定性を有する分子に認められたクリティカルな凝集レベルについて認められた。
【０２７６】
実施例９．２．６（ｂ）  精製ＩｇＧ１の示差走査型蛍光定量
さらなる試験用に選択された９５個の生殖系列タンパク質対の各々を表すＩｇＧ１の酸への曝露前及び曝露後の熱安定性を評価するため、実施例９．１．２に記載されるとおり、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を実施した。各ＩｇＧについて示される値は、ＩｇＧの可変領域内で起こるアンフォールディングイベントを表す。Ｆｃ部分のアンフォールディングを表す値は、概して各ヒトＩｇＧ１について同じであるため、示さない。結果は、図５０、図５２及び図５４に示す。
【０２７７】
実施例９．２．６（ｃ）  精製ＩｇＧ１の動的光散乱
加えて、選択された９５個の生殖系列タンパク質対を表す各ＩｇＧ１に対する動的光散乱（ＤＬＳ）を実施した。動的光散乱（ＤＬＳ）は、溶液中における粒子の流体力学半径を評価する分光法である。全てのＤＬＳ実験は、ＤｙｎａＰｒｏ  Ｔｉｔａｎキュベットシステム（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。
【０２７８】
ストレス試験後に可視粒子の混入がある場合、ＩｇＧを遠心することによって大きい凝集物を取り除いた。図５０、図５２及び図５４は、ストレス処理後の調製物に見出される単量体ＩｇＧ１に対応する見かけの粒子半径及び多分散性を示す。データは、キュムラント解析の半径計算値に従い評価した。流体力学半径に加えて、調製物の％多分散性を評価した。多分散性の増加（＞１５％）はＩｇＧ分子の潜在的な凝集を示し、不均一な粒度分布をもたらす。ＩｇＧと明らかに区別可能な高分子量（ＨＭＷ）粒子（半径＞３倍）は、表に掲載しない。全てのＤＬＳ結果を、図５０、図５２及び図５４に示す。
【０２７９】
実施例９．２．６（ｄ）  精製ＩｇＧ１の粒子染色
可視凝集物の量及び形態を評価するため、選択された９５個の生殖系列タンパク質対を表す各ＩｇＧ１に対してストレス曝露前及び曝露後に粒子染色を実施した。以下の試薬を使用して、ＩｇＧ調製物中の粒子をろ過及び染色した：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ  ０．２２μｍ無菌フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＵＦＣ４０ＧＶ０Ｓ）；抗ヒトλ軽鎖、ＡＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ−２９０４）；ＡＰコンジュゲート用の発色剤、Ｆａｓｔ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｂ−５６５５）；Ｒｏｔｉ（登録商標）−ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ  ＃Ｔ１４４．１）；アルカリホスファターゼ停止液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ５８５２−１００ＭＬ）；ＴＢＳ：０．０５Ｍトリス；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有；及び５Ｍ  ＮａＣｌ溶液。
【０２８０】
タンパク質溶液を０．２２μｍフィルタでろ過した。続いて残りの抗体凝集物を、マウス抗ヒトＦａｂ２アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体及びウエスタンブロット発色剤を使用して染色する。アッセイは、製造者のマニュアルに従い実施した。続いてサンプルを、目視検査によって１〜４の範囲に、カテゴリー１が調製物の極めて低い粒子含有量を表し、及びカテゴリー４が高い粒子負荷を表すものとして分類した。全ての粒子染色結果を、図５０、図５２及び図５４に示す。
【０２８１】
実施例９．２．７  ＩｇＧのストレス試験累積スコア
酸への曝露及びガラスビーズによる撹拌の双方のストレス試験結果の評価を補助するため、生殖系列タンパク質対を比較できるようなスコアリングシステムを作成した。実施例９．２．５（ａ〜ｄ）（結果は図１９〜図２４に示す）及び実施例９．２．６（ａ〜ｄ）（結果は図４９〜図５４に示す）で得られた各データ点に０〜１００の範囲のスコア（０、２５、７５又は１００）を付け、それらのスコアを足し合わせて累積スコアを求めた。実施例９．２．５（ａ）及び実施例９．２．６（ｂ）で特定された熱安定性の値には、スコアを付けなかった。
【０２８２】
図５５及び図５６は、実施例９．２．５〜９．２．６の生殖系列タンパク質対１〜３２のストレス試験スコアを示す。各スコアが、図１９、図２０、図４９及び図５０に示される生データ点を表す。図１９〜図２０は酸曝露に対する応答を示し、図４９〜図５０はガラスビーズによる撹拌に対する応答を示す。図５６は累積スコアを示し、これは図５５及び図５６に示されるスコアの各々を足したものである。
【０２８３】
図５７及び図５８は、実施例９．２．５〜９．２．６の生殖系列タンパク質対３３〜６４についてのストレス試験スコアを示す。各スコアが、図２１、図２２、図５１及び図５２に示される生データ点を表す。図２１〜図２２は酸曝露に対する応答を示し、図５１〜図５２はガラスビーズによる撹拌に対する応答を示す。図５８は累積スコアを示し、これは図５７及び図５８に示されるスコアの各々を足したものである。
【０２８４】
図５９及び図６０は、実施例９．２．５〜９．２．６の生殖系列タンパク質対６５〜９５のストレス試験スコアを示す。各スコアが、図２３、図２４、図５３及び図５４に示される生データ点を表す。図２３〜図２４は酸曝露に対する応答を示し、図５３〜図５４はガラスビーズによる撹拌に対する応答を示す。図６０は累積スコアを示し、これは図５９及び図６０に示されるスコアの各々を足したものである。
【０２８５】
実施例１０：コレクション組成の選択
要約すれば、実施例４に記載されるとおり、４００個の生殖系列タンパク質対が選択された。これらの４００個は、ヒト免疫レパートリーに存在する生殖系列タンパク質対の多様性を表すものである。４００個の生殖系列タンパク質対を、実施例６〜７に記載されるとおり試験した。４００個のうち９５個を、実施例９に記載されるとおりさらに試験した。
【０２８６】
以下の要素を考慮して、９５個の生殖系列タンパク質対を比較した：ａ）Ｆａｂ提示率；ｂ）Ｆａｂ発現収率、ｃ）Ｆａｂ熱安定性；ｄ）Ｆａｂ血清安定性；ｅ）Ｆａｂ  ＳＥＣ単量体含量（％単量体）；ｆ）ＩｇＧ１発現収率；ｇ）ＩｇＧ１熱安定性；ｈ）ＩｇＧ１血清安定性；ｉ）ＩｇＧ１  ＳＥＣ単量体含量（％単量体）；及びｊ）ＩｇＧ１等電点（ｐＩ）。これらの要素の各々のデータは、図１６〜図１８に示される。これらの要素は、治療用抗体の開発可能性との十分な相関を有する。
【０２８７】
Ｆａｂ提示率は、抗原に対する抗体又は断片の選択において重要な要素である。高率で提示するＦａｂほど、選択時に抗原に曝露される可能性が高い。様々なＦａｂの各々の提示率が高いことにより、選択時にコレクションの十分な多様性が抗原に曝露されることが確実となる。実施例６．２でＦａｂ提示率を同定し、そこでは基準は内部標準（ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ基準ファージ調製物（ＶＨ３  κ＋λ））であった。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ  ＶＨ３プレップは、高度提示調製物である。Ｆａｂ提示率は重要な要素であり、４００個の対をさらなる試験用に９５個まで絞り込むのに有用であったが、一部の実施形態では、コレクションに組み込むための生殖系列タンパク質対の選択における決定要素とは考えなかった。
【０２８８】
抗原に対して選択される抗体又は断片は、初めに、機能活性を決定するため、多くの場合にインビトロ又はインビボで試験し、次に毒性種で、最後にヒトでの臨床試験で試験しなければならないため、Ｆａｂ及びＩｇＧ１の双方の発現収率は重要である。抗原に対して選択される抗体又は断片が、治療薬開発に必要な様々な試験の全ての維持並びに臨床試験及び市場の供給に十分な多い量で効率的に発現できることが極めて重要である。精製Ｆａｂの発現収率（発現培養物１Ｌあたりのｍｇ精製Ｆａｂ）は実施例９．１．１で同定され（結果は図１６〜図１８に示される）、本開示のある実施形態では、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの閾値が選択された。他の実施形態では、他の閾値を選択した。精製ＩｇＧ１の発現収率（細胞培養物１Ｌあたりのｍｇ精製ＩｇＧ１）は実施例９．２．１で同定され（結果は図１６〜図１８に示される）、本開示のある実施形態では、少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの閾値を選択した。他の実施形態では、他の閾値を選択した。
【０２８９】
抗体などのタンパク質は高温の影響を受けやすく、従って治療薬を世界中に流通させるための保存及び輸送に関連する要件に耐えることが可能で、且つ有効期間が長い抗体が必須であるため、熱安定性は重要な要素である。精製Ｆａｂの熱安定性は実施例９．１．２で決定され（結果は図１６〜図１８に示される）、本開示のある実施形態では、少なくとも７０℃の閾値を選択した。他の実施形態では、他の閾値を選択した。精製ＩｇＧ１の熱安定性は実施例９．２．２で決定され（結果は図１６〜図１８に示される）、掲載する値は可変ドメインの不安定化を表し、ある実施形態では、少なくとも７３℃の閾値を選択した。他の実施形態では、他の閾値を選択した。
【０２９０】
治療用タンパク質は、ヒト血清中に存在する血清プロテアーゼに曝露されても、有効性及び機能的コンホメーションを維持しなければならないため、治療用抗体にとって血清安定性は重要な要素である。生殖系列タンパク質対の血清安定性は、実施例６．５、及び実施例７．２に記載する方法によって決定した。血清安定性は重要であるが、このアッセイでは少数のケースで偽陰性の結果が出る傾向があったため、生殖系列タンパク質対の選択における決定要素とは考えなかった。
【０２９１】
サイズ排除クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔａｇｒａｐｈｙ）（ＳＥＣ）により決定するときの単量体含量（％単量体）は、凝集傾向と高い相関を有するため、重要な要素である。凝集は、治療用タンパク質の開発で頻繁に起こる問題であり、これはタンパク質治療薬の不活性化、不均一性及び生産損失をもたらす。精製Ｆａｂ及び精製ＩｇＧ１の両フォーマットでサイズ排除クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔａｇｒａｐｈｙ）（ＳＥＣ）により決定するときの単量体含量（％単量体）は、実施例９．１．３及び９．２．３に記載される方法により決定した（結果は図１６〜図１８に示される）。精製Ｆａｂの単量体含量（％単量体）は実施例９．１．３で決定され、ある実施形態では、少なくとも９８％の閾値を選択した。他の実施形態では、他の閾値を選択した。精製ＩｇＧ１の単量体含量（％単量体）は実施例９．２．３で決定され、ある実施形態では、少なくとも９９％の閾値を選択した。他の実施形態では、他の閾値を選択した。
【０２９２】
等電点（ｐＩ）は、特定のｐＨにおける溶解度を予測し得るものである。溶液のｐＨが所与のタンパク質のｐＩと大きく異なる場合、タンパク質は可溶性である。等電点は重要であるが、一部の実施形態では、生殖系列タンパク質対の選択における決定要素とは考えなかった。
【０２９３】
本開示のある実施形態では、各基準の閾値は以下のとおり選択した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９８％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；及びｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）。以下の対の各々はこれらの閾値と等しいか、又はそれより良好な値を有したため（データは図１６〜図２４に示す）、以下の生殖系列タンパク質対（５４個）を、開発可能性に関連するそれらの優れた機能活性を有するものとして同定した：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ３−２１（配列番号２５７）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１６（配列番号２３４）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ２−１４（配列番号２５４）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−３０（配列番号２１２）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）。従って、これらの生殖系列タンパク質対を任意に含むコレクションを、任意の抗原に対する開発可能な抗体又はその断片の同定に使用することができる。
【０２９４】
加えて、生殖系列タンパク質対のサブセットを、実施例９．２．５（ａ〜ｄ）（データは図１９〜図２４に示す）、実施例９．２．６（ａ〜ｄ）（データは図４９〜図５４に示す）及び実施例９．２．７（スコアリングは図５５〜図６０に示す）に記載される方法を用いて同定されたストレス試験データの比較に基づき選択した。ストレス試験方法においてＩｇＧ１フォーマットで９５個の生殖系列タンパク質対を評価することにより、酸への曝露及びガラスビーズによる撹拌に耐えるそれらの能力を決定した。ある実施形態の３６個の生殖系列タンパク質対を、それらが酸及び撹拌ストレスに対する強い耐性を示したため、開発可能性に関連するさらなる優れた機能特性を有するものとして選択した。化学、製造及び品質管理（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＣＭＣ）の下流処理加工（ＤＳＰ）ではウイルス不活化工程が標準的であるため、酸への曝露に耐える抗体の能力は、ますます重要な要素になりつつある。酸処理工程では、ウイルスが感染に用い得るウイルスカプシドタンパク質が変性される。しかしながら、ｐＨの降下には、あらゆるタンパク質を不安定化させる効果がある。この工程で、不安定な抗体が変性し、天然の構造を失う。所定の時間を経た後、ウイルス活性化工程で中和によって酸処理が軽減され、ウイルスカプシドタンパク質は不活性なコンホメーションのままでありながら、処理された抗体が理想的にはその天然の構造を保持する。処理加工中のろ過工程は避けられないため、剪断力（ｓｈｅｅｒ  ｆｏｒｃｅｓ）に耐える抗体又は抗体断片の能力は、有用な基準である。ある実施形態で選択されたこれらの３６個の生殖系列タンパク質対は、前出の閾値機能活性を全て満たし、加えて、ストレス試験累積スコアで１２２５以上のスコアをつけた。ある実施形態では、各基準の閾値は以下のとおり選択した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９８％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）及びｇ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）。従って、本開示の実施形態は、完全に機能的な生殖系列タンパク質対のサブセット（５４個のうちの３６個）を含むコレクションを含み、且つ開発可能性に関連するさらなる優れた機能特性を有する。この実施形態において、コレクションは、ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【０２９５】
別の実施形態において、各基準の閾値は以下のとおり選択した：ａ）少なくとも２．５ｍｇ／Ｌの精製Ｆａｂ発現収率（実施例９．１．１に記載されるとおり）；ｂ）少なくとも３０．０ｍｇ／Ｌの精製ＩｇＧ１発現収率（実施例９．２．１に記載されるとおり）；ｃ）少なくとも７０℃の精製Ｆａｂの熱安定性（実施例９．１．２に記載されるとおり）；ｄ）少なくとも７３℃の精製ＩｇＧ１の熱安定性（実施例９．２．２に記載されるとおり）；ｅ）少なくとも９９％の精製Ｆａｂの単量体含量（実施例９．１．３に記載されるとおり）；ｆ）少なくとも９９％の精製ＩｇＧ１の単量体含量（実施例９．２．３に記載されるとおり）；ｇ）少なくとも８．３の精製ＩｇＧ１の等電点（実施例９．２．４に記載されるとおり）；及びｈ）少なくとも１２２５のストレス試験累積スコア（実施例９．２．７に記載されるとおり）。この実施形態において、コレクションは、（３３個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【０２９６】
さらなる実施形態において、それ自体が各基準における閾値の全てを満たさない対であったとしても、対がコレクションに加えられ、コレクションに加えることにより多様性を高めた。ある実施形態では、コレクションは、ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；及びＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）をさらに含む。この実施形態において、コレクションは、（３６個の対）：ＶＨ１−１８（配列番号２０４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ１−４６（配列番号２０５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ１−６９＊０１（配列番号２０６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−０７（配列番号２０７）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−４７（配列番号２５１）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−１１（配列番号２０８）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ１−２７（配列番号２３５）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＫ３−１１（配列番号２３７）；ＶＨ３−１５（配列番号２０９）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ３−２１（配列番号２１０）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ２−２３（配列番号２５５）；ＶＨ３−２３（配列番号２１１）／ＶＬ３−１（配列番号２５６）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＫ３−１５（配列番号２３８）；ＶＨ３−５３（配列番号２１３）／ＶＬ２−１１（配列番号２５３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０５（配列番号２３０）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−０６（配列番号２３１）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ１−１２（配列番号２３３）；ＶＨ３−７４（配列番号２１４）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＫ１−３９（配列番号２３６）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−４０（配列番号２５０）；ＶＨ５−５１（配列番号２１５）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ１−０９（配列番号２３２）；ＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＫ３−２０（配列番号２３９）及びＶＨ６−１（配列番号２１６）／ＶＬ１−５１（配列番号２５２）を含む。
【０２９７】
実施例１１：コレクションのベータ試験
コレクション設計の有効性を確認するため、それぞれが一つの生殖系列タンパク質対を含むサブコレクション又はサブコレクションのプールを作成し、抗原に対して選択した。次に選択された抗体を、Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットで、開発可能特性、例えば、Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性、ＩｇＧ１フォーマットにおけるｐＩ、Ｆａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットにおける発現収率、ＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性、及びＳＥＣにより決定するときのＩｇＧ１フォーマットにおける％単量体について試験した。加えて、ある場合には、Ｆａｂフォーマットでの抗原に対する親和性を決定した。
【０２９８】
コレクション生成
生殖系列タンパク質対を含むサブコレクションは、以下のとおり合成した：図２５〜図３３に示されるそれぞれの生殖系列タンパク質配列のＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３領域を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。ｐＪＰｄ１ディスプレイベクターに、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩを用いてＶＨを、及びＮｄｅＩ及びＡｃｃ６５Ｉを用いてＶＬをクローニングした。定常ＦＲ４領域を含むＣＤＲ−Ｈ３カセットを、ＢｓｓＨＩＩ及びＸｈｏＩを用いて挿入し、理論上の多様性を５．５×１０５〜１．９×１０１９の範囲とした。６〜１７アミノ酸のＣＤＲ−Ｈ３長さのＣＤＲ−Ｈ３カセットをＳｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。ＣＤＲ−Ｌ３多様性は、ＥＬＬＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成したκ又はλのいずれかのＴＲＩＭカセットを導入することにより実現し、理論上の多様性を４．６×１０６〜２．５×１０９の範囲とした。
【０２９９】
典型的にはサブコレクションのｐＪＰｄ１ファージミドＤＮＡ０．２５〜２μｇを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１  Ｆ’エレクトロコンピテント細胞に形質転換し、形質転換体をＴＢ培地に回収し、３７℃で１時間振盪した。増殖培地の希釈物をＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃに播いた。適量のＬＢ／ｃａｍ／１％Ｇｌｕにおいて一晩振盪することにより、ライブラリの増幅を実施した。サブコレクションのライブラリサイズは４．６×１０８〜４．４×１０９の範囲であった。全てのサブコレクションを合わせた総ライブラリサイズは、約１．３×１０１１メンバーである。操作されたサブコレクションの品質を分析するため、各サブコレクションについて少なくとも３０個のクローンを選び取り、ＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｈ３領域を配列決定して配列の正確さ及びユニークさを決定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グリセロール培養物としてライブラリを保存した。
【０３００】
Ｆａｂフォーマットでサブコレクションを提示するファージを、以下のとおり調製した。各ライブラリファージ調製物につき８０ｍｌの２ｘＹＴ／Ｃａｍ／Ｇｌｃ培地に、対応するライブラリグリセロールストック由来の細菌を、ＯＤ６００ｎｍが０．２〜０．３となるように接種した。培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．４５〜０．５５に達するまで振盪した。次にヘルパーファージを感染多重度１０で細菌培養物に添加し、続いて振盪なしに３７℃で４５分間、次に１２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートした。細菌をスピンダウンし、ヘルパーファージを含む上清を廃棄した。ファージ感染細菌を４００ｍｌの２ｘＹＴ／ＣＡＭ／ＫＡＮ／ＩＰＴＧ培地に再懸濁し、１２０ｒｐｍで振盪しながら２２℃で一晩インキュベートした。翌日、一晩培養物からの細菌をペレット状にし、Ｆａｂ提示ファージを含む上清を回収した。ファージを含む上清にＰＥＧ／ＮａＣｌを添加することにより、ファージ沈殿を実施した。サンプルを氷上で少なくとも３０分間インキュベートした。沈殿したファージをスピンダウンし、ＰＢＳに再懸濁した。サンプルをゆっくり回転させて均質な懸濁液を得て、残留する細菌デブリをペレット状にして廃棄した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを使用して、ファージを含む上清から再びファージを沈殿させた。最後に、ファージペレットをＰＢＳに再懸濁し、滅菌チューブに移し、ゆっくり振盪して均質な懸濁液を得た。スポットタイトレーション、ＥＬＩＳＡ及びＯＤ２６８ｎｍでの紫外吸光度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）により、ファージ力価を決定した。
【０３０１】
トリシストロンディスプレイベクターｐＪＰｄ１（図９に示される）により発現させ、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）によってファージ上に提示させたＦａｂ断片のファージ力価及び提示レベル（国際公開第０１／０５９５０号パンフレット、米国特許第６，７５３，１３６号明細書（全体として参照により援用される）に記載されるとおり）を、個別のファージ調製物ごとにＥＬＩＳＡにより評価した。
【０３０２】
捕捉には２つの異なる抗体が使用される：
（１）抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃２７−９４２０−０１）を使用した。これは主要コートタンパク質ｇ８ｐによりファージ粒子を捕捉する；従って、ファージ力価を決定することができる。
（２）抗Ｆｄ抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  ＃ＰＣ０７５）を使用した。これは提示されたＦａｂに結合する；従って、Ｆａｂを提示するファージのみが捕捉される。
【０３０３】
（１）及び（２）に対し、別個の基準曲線が用いられる。ＨＲＰとコンジュゲートしたモノクローナル抗Ｍ１３（Ｍ１３ファージの主要コートタンパク質ｇ８ｐに特異的）が、検出抗体として使用される。
【０３０４】
抗Ｍ１３抗体及び抗Ｆｄ抗体の抗体溶液を異なるウェルに分注し、プレートをラミネート箔で密閉して一晩インキュベートすることにより、それぞれの捕捉抗体を９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定化した。翌日、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、各ウェルをＣＴＢＳＴでブロックした。
【０３０５】
ファージ上清及び基準サンプル（ＣＳ）の出発希釈物を、マイクロタイタープレートにおいてＣＴＢＳＴ中に調製した。抗Ｍ１３抗体及び抗Ｆｄ抗体についてはファージ上清の出発希釈物を調製した。基準サンプル、ＶＨ３−２３  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ｌ＋ｋ  ＶＣＳＭ１３及びＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭプールハイパーファージκ及びλの出発希釈物を調製した。マイクロタイタープレートにＣＴＢＳＴを予め充填してファージを添加し、及び第２のマイクロタイタープレートにＣＴＢＳＴを予め充填してファージを添加することにより、ファージ上清の段階希釈物を調製した。基準サンプルについて、上記に記載される出発希釈物を播き、抗Ｍ１３及び抗Ｆｄの双方の抗体を含む段階希釈物を播いた。
【０３０６】
ファージ上清及び基準サンプルの双方とも、検出のため以下のとおり移した。ブロックしたＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで洗浄した。ファージ上清を希釈プレートからコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、室温でインキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。ＣＴＢＳＴに希釈した抗Ｍ１３ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。１部（例えば０．５ｍｌ）の過酸化物溶液を９部（例えば４．５ｍｌ）の基質溶液と混合することにより、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｌｕ（Ｐｉｅｒｃｅ）ワーキング溶液を調製した。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＱｕａｎｔａＢｌｕワーキング溶液を添加した。約２分間のインキュベーション時間後、及び続いて５分間の間隔を置いて、蛍光を計測した（励起：３２０ｎｍ、放出：４３０ｎｍ）。ＥＬＩＳＡデータの評価は、以下のとおり完了した：検量線を作成し、ファージ上清及び対照の力価を計算した。各サンプルについて、抗Ｆｄに関する力価を抗Ｍ１３（抗ｐＶＩＩＩ）に関する力価で除し、得られた比が相対提示率であった。結果は表１３に示す。
2014500725.tif 000038
【０３０７】
ヒトＤＫＫ３、ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対するファージディスプレイ選択
個別のサブコレクション又はサブコレクションのプールによる並行パニング戦略を実施することにより、所望の生物物理学的特性を有する多様な結合抗体を同定する可能性を最大化した。ヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ−３（ＤＫＫ３）（遺伝子番号２７１２２）、組換えヒト（ｒｈ）ＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４（遺伝子番号２０６６）＿Ｆｃ融合物タンパク質、ｒｈＦＺＤ−４（遺伝子番号８３２２）Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質；配列は上記に提供）を、コレクションの妥当性検証用のモデル抗原として選択した。以下に記載される磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製品番号１４０．１１）と共有結合したそれぞれの抗原によるＭ−４５０エポキシビーズベース溶液パニングにおいて、コレクションスクリーニングを実施した。
【０３０８】
ＤＫＫ３に対するビーズベース溶液パニング
ＤＫＫ３及び対照ＢＳＡでコーティングしたカルボキシルビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、室温（ＲＴ）においてＭＰＢＳＴでブロックした後、予め吸収させたファージと共にインキュベートした。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、ＴＧ１Ｆ＋細胞を感染させることにより増幅した。選択を３ラウンド行った後、ｐＪＰｄ１（図９に示される）ファージミドＤＮＡを単離し、Ｆａｂコード断片（修飾ｏｍｐＡ−ＶＬ及び修飾ｐｈｏＡ−Ｆｄ）をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによる制限消化により切り出し、発現ベクターｐＪＰｘ１（図１０に示される）にライゲートして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１  Ｆ−に形質転換した。次に感染培養物を大型ＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレートに播き、一晩成長させた。シングルクローンを単離し、Ｆａｂ発現収率及び抗原結合性についてＥＬＩＳＡにより試験した。ヒツジ抗ヒトＦｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  カタログＰＣ０７５）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＦａｂを含む細胞抽出物をインキュベートし、続いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  カタログ１０９−０５５−０９７）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体を用いて検出することにより、Ｆａｂ発現を検出した。ビーズベースアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム／ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用の蛍光定量的なマイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ（登録商標））によってＤＫＫ３結合カルボキシルビーズ及びＢＳＡ結合カルボキシルビーズ（Ｄｙｎａｌ）でＦａｂを含む細胞抽出物をスクリーニングすることにより、抗原特異性を試験した。一次ヒットは、２００の値に設定されたバックグラウンドを少なくとも５倍上回るＦＭＡＴ平均蛍光シグナルをもたらすＦａｂとして定義した。ＤＫＫ３に対する特異性は、同種抗原としてのＤＫＫ３及び陰性対照抗原としてのＣＤ３８＿Ｆｃを用いた二次ＥＬＩＳＡで確認した。ＶＨ３−２３／ＶＫ１−３９、ＶＨ３−２３／ＶＬ３−１及びＨｕＣＡＬ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＶＨ３−２３／κサブライブラリについての６３個、４３個及び４４個のクローンの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域を配列決定用に選ぶことにより、ＤＫＫ３結合抗体の配列多様性を推定した。選択した結合体のＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３の配列は、図８６に示される。ＶＨ３−２３／ＶＫ１−３９、ＶＨ３−２３／ＶＬ３−１及びＨｕＣＡＬ−Ｐｔ  ＶＨ３−２３／κサブライブラリについて、合計で、それぞれ５６個の成功した配列のうち３１個（５５％）、３５個の配列のうち２０個（４７％）及び４４個の配列のうち１７個（３９％）が異なったことから、構築されたライブラリがＤＫＫ３結合体の多様なレパートリーを含んだことが示された。結果は表１４に示す。
2014500725.tif 000039
【０３０９】
ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対するビーズベース溶液パニング
ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物又はｅＧＦＰ及び対照ＢＳＡエポキシＭ４５０ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、室温（ＲＴ）で２時間、Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒによりブロックした後、予め吸収させたファージと共に室温で２時間インキュベートした。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、ＴＧ１Ｆ＋細胞を感染させることにより増幅した。選択を３ラウンド行った後、ｐＪＰｄ１（図９に示される）ファージミドＤＮＡを単離し、Ｆａｂコード断片（修飾ｏｍｐＡ−ＶＬ及び修飾ｐｈｏＡ−Ｆｄ）をＰＣＲにより増幅し、精製し、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化して発現ベクターｐＪＰｘ１（図１０に示される）にライゲートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１  Ｆ−に形質転換した。次に感染培養物を大型ＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレートに播き、一晩成長させた。シングルクローンを単離し、Ｆａｂ発現収率及び抗原結合性についてＥＬＩＳＡにより試験した。ヒツジ抗ヒトＦｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  カタログＰＣ０７５）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＦａｂを含む細胞抽出物をインキュベートし、続いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  カタログ１０９−０５５−０９７）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体を用いて検出することにより、Ｆａｂ発現を検出した。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートに直接コーティングしたｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原、ｒｈＦＺＤ−４＿Ｆｃ抗原又はｅＧＦＰでのＦａｂを含む細胞抽出物によるＥＬＩＳＡスクリーニングにより、抗原特異性を試験した。バックグラウンドを少なくとも５倍上回るＥＬＩＳＡシグナルをもたらすＦａｂとして一次ヒットを定義した。結果は図６１Ａ〜図６１Ｄに示す。
【０３１０】
ＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃに対するＦｃ捕捉パニング
ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）上のヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ１０９−００５−０９８）又はマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ２０９−００５−０９８）を用いて捕捉することにより固定化したヒトＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４組換えＦｃタグ付きタンパク質を用いて、３ラウンドの固相Ｆｃ捕捉パニングを実施した。各選択ラウンドの前に、ファージを０．１ｍｇ／ｍｌのＭＰＢＳＴ／ＢＳＡ中ヒト、ヤギ及びマウス免疫グロブリンでブロックした。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、ＴＧ１Ｆ＋細胞を感染させることにより増幅した。３回目の選択ラウンドの後、ｐＪＰｄ１（図９に示される）ファージミドＤＮＡを単離し、Ｆａｂコード断片（修飾ｏｍｐＡ−ＶＬ及び修飾ｐｈｏＡ−Ｆｄ）をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによる制限消化により切り出し（ｅｘｉｓｅ）、発現ベクターｐＪＰｘ１（図１０に示される）にライゲートしてＴＧ１Ｆ−に形質転換した。次に感染培養物を大型ＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレートに播き、一晩成長させた。シングルクローンを単離し、Ｆａｂ発現収率及び抗原結合性についてＥＬＩＳＡにより試験した。ヒツジ抗ヒトＦｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  カタログＰＣ０７５）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＦａｂを含む細胞抽出物をインキュベートし、続いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  カタログ１０９  ０５５  ０９７）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体によって検出することにより、Ｆａｂ発現を検出した。抗原特異性を、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートにコーティングしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ１０９−００５−０９８）により捕捉されたＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原でのＦａｂを含む細胞抽出物によるＥＬＩＳＡスクリーニングによって試験した。一次ヒットは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回るＥＬＩＳＡシグナルをもたらすＦａｂとして定義した。ＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃに対する特異性を、同種抗原としてＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ及び陰性対照抗原としてＣＤ３８＿Ｆｃを用いた二次Ｆｃ捕捉ＥＬＩＳＡで確認した。
【０３１１】
ＶＨ３−２３／ＶＫ１−３９、ＶＨ３−２３／ＶＬ３−１及びＨｕＣＡＬ−Ｐｔ  ＶＨ３−２３／κサブライブラリについての、それぞれ１１２個、６１個及び９５個のクローンの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域を配列決定することにより、ＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ結合抗体の配列多様性を推定した。ＶＨ３−２３／ＶＫ１−３９、ＶＨ３−２３／ＶＬ３−１及びＨｕＣＡＬ−Ｐｔ  ＶＨ３−２３／κサブライブラリについて、合計で、１０６個の成功した配列のうち３１個（２９％）、６１個の配列のうち３０個（４９％）及び９１個の配列のうち１４個（１５％）が異なったことから、構築されたライブラリが結合体の多様なレパートリーを含んだことが示された。配列多様性は表１５に示される。
2014500725.tif 000040
【０３１２】
Ｆａｂフォーマットでの抗原捕捉セットアップによるＢｉａｃｏｒｅ  ＫＤ（親和性）測定
単量体Ｆａｂ画分の結合（分析的ＳＥＣにより分析；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による抗原の捕捉を、以下のとおり分析した：ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、適切な抗抗原タグ捕捉抗体を、ＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーを用いて共有結合的に固定化した。抗原を捕捉し、続いて６つの異なるＦａｂ濃度（２ｎ段階希釈）を注入することにより、動態計測を行った。サイクルが終わるごとに、センサーチップは再生した。二重参照のため、ランニング緩衝液のブランク注入を用いた。全てのセンサグラムは、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてフィッティングすることによりｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度定数を決定し、これを用いてＫＤを計算した。
【０３１３】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＫＤ測定を以下のとおり実施した：ランニング緩衝液はＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２  ＧＩＢＣＯ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）であった。Ｆｃ融合物タグ（ロット番号ＦＹＹ０３１００４１）を伴う約４００ＲＵの抗原を、抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉した。１５．６〜５００ｎＭの範囲のＦａｂ濃度を、２０μｌ／分の流量、３０秒の注入時間及び１００秒の解離時間で使用した。表面の再生は、１５μｌの３Ｍ  ＭｇＣｌ２試薬を２回注入することにより行った。結果は図３８に示す。
【０３１４】
ＤＫＫ３、ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対して同定された抗体及び抗体断片の開発可能性試験
開発可能特性、例えば、Ｆａｂフォーマットにおける熱安定性、Ｆａｂフォーマットにおける親和性、ＩｇＧ１フォーマットにおけるｐＩ、Ｆａｂ及びＩｇＧの両フォーマットにおける発現収率、ＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性、及びＳＥＣにより決定するときのＩｇＧ１フォーマットにおける％単量体について、抗原に特異的な抗体又は断片をＦａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットで試験した。ＩｇＧ１フォーマットにおける血清安定性は、実施例７．２に記載されるとおり試験した。Ｆａｂ及びＩｇＧ１フォーマットにおける熱安定性試験は、実施例９．１．２及び９．２．２に記載されるとおり完了した。ＩｇＧ１フォーマットにおけるｐＩは、実施例９．２．４に記載されるとおり完了した。ＩｇＧ１フォーマットにおける発現収率は、実施例９．２．１に記載されるとおり完了した。ＳＥＣにより決定するときのＩｇＧ１フォーマットにおける％単量体は、実施例９．２．３に記載されるとおり完了した。結果は、図３７〜図３９、図４５〜図４８及び図６２に示す。
【０３１５】
ここでも本発明者らは、試験した機能特性に関して、入力（抗原に対する選択用に使用される抗体コレクション）と出力（抗原に特異的であると同定された抗体）との間に高い相関があると考える。従って、本発明のコレクションは、一部には、試験したコンストラクトと同じアミノ酸配列、例えばフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域を含む抗体又は断片を含む。ＣＤＲ３は多様化される。ある態様では、コレクションは、試験したコンストラクトのアミノ酸配列、又はそれをコードする核酸を含むため、コレクションは、実施例９で試験したコンストラクトと開発可能性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｔｉｙ）に関して同じ優れた機能特性を有する抗体又は断片を含むと考えられる。従って、続いて抗原に対して選択される抗体又は断片の多くもまた、開発可能性に関連する同じ優れた機能特性を有することが予想される。
【０３１６】
図３７〜図３９、図４５〜図４８及び図６２Ａ〜図６２Ｃに示されるデータが、この結論を裏付ける。図３９は、本発明のコレクションからＤＫＫ３又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に対して選択されたＦａｂ、及びいかにＦａｂが、実施例９に記載されるとおり当初試験されたコンストラクトであった対照と同様の熱安定性を有するかを示す。加えて、図４５〜図４８が、本発明のコレクションから選択されたＤＫＫ３又はＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ抗原に特異的なＩｇＧ、及びいかにＩｇＧが、実施例９に記載されるとおり当初試験されたコンストラクトであった対照と同様の等電点（ｐＩ）、熱安定性、発現収率及び単量体含量を有するかを示す。図６２Ａ〜図６２Ｃは、ｒｈＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４＿Ｆｃ融合物、ｒｈＦＺＤ−４  Ｆｃ融合物及びｅＧＦＰに対して選択されたＩｇＧ、及びいかにＩｇＧが、実施例９に記載されるとおり当初試験されたコンストラクトであった対照と同様の等電点（ｐＩ）、発現収率、熱安定性、及び単量体含量を有するかを示す。
【０３１７】
総じてこれは、本発明のコレクションが、開発可能性に関して優れた特性を有する抗体又は断片を含むことを示しているとともに、試験され、且つ優れた機能特性を有することが示された生殖系列タンパク質対由来の配列、例えば、フレームワーク領域及び／又は相補性決定領域を用いた、入力であるコレクションが、任意の抗原に対して選択された、開発に関して同じ優れた機能特性を有する出力である抗体又は断片と十分な相関を有するという本発明者らの仮説を裏付けている。
【０３１８】
説明、具体例及びデータは、例示的な実施形態を示しているものの、例示として提供され、本発明を限定する意図はないことが理解されなければならない。本発明の範囲内の様々な変更及び改良は、本明細書に含まれる考察、開示及びデータから当業者に明らかになるであろうため、従って本発明の一部と見なされる。
【図１】
2014500725.tif 000041
【図２】
2014500725.tif 000042
【図３】
2014500725.tif 000043
【図４】
2014500725.tif 000044
【図５】
2014500725.tif 000045
【図６Ａ】
2014500725.tif 000046
【図６Ｂ】
2014500725.tif 000047
【図６Ｃ】
2014500725.tif 000048
【図７Ａ】
2014500725.tif 000049
【図７Ｂ】
2014500725.tif 000050
【図７Ｃ】
2014500725.tif 000051
【図８Ａ】
2014500725.tif 000052
【図８Ｂ】
2014500725.tif 000053
【図９】
2014500725.tif 000054
【図１０】
2014500725.tif 000055
【図１１】
2014500725.tif 000056
【図１２】
2014500725.tif 000057
【図１３】
2014500725.tif 000058
【図１４】
2014500725.tif 000059
【図１５】
2014500725.tif 000060
【図１６】
2014500725.tif 000061
【図１７】
2014500725.tif 000062
【図１８】
2014500725.tif 000063
【図１９】
2014500725.tif 000064
【図２０】
2014500725.tif 000065
【図２１】
2014500725.tif 000066
【図２２】
2014500725.tif 000067
【図２３】
2014500725.tif 000068
【図２４】
2014500725.tif 000069
【図２５】
2014500725.tif 000070
【図２６】
2014500725.tif 000071
【図２７】
2014500725.tif 000072
【図２８】
2014500725.tif 000073
【図２９】
2014500725.tif 000074
【図３０】
2014500725.tif 000075
【図３１】
2014500725.tif 000076
【図３２】
2014500725.tif 000077
【図３３】
2014500725.tif 000078
【図３４】
2014500725.tif 000079
【図３５】
2014500725.tif 000080
【図３６】
2014500725.tif 000081
【図３７】
2014500725.tif 000082
【図３８】
2014500725.tif 000083
【図３９】
2014500725.tif 000084
【図４０】
2014500725.tif 000085
【図４１Ａ】
2014500725.tif 000086
【図４１Ｂ】
2014500725.tif 000087
【図４２】
2014500725.tif 000088
【図４３】
2014500725.tif 000089
【図４４】
2014500725.tif 000090
【図４５】
2014500725.tif 000091
【図４６】
2014500725.tif 000092
【図４７】
2014500725.tif 000093
【図４８】
2014500725.tif 000094
【図４９】
2014500725.tif 000095
【図５０】
2014500725.tif 000096
【図５１】
2014500725.tif 000097
【図５２】
2014500725.tif 000098
【図５３】
2014500725.tif 000099
【図５４】
2014500725.tif 000100
【図５５】
2014500725.tif 000101
【図５６】
2014500725.tif 000102
【図５７】
2014500725.tif 000103
【図５８】
2014500725.tif 000104
【図５９】
2014500725.tif 000105
【図６０】
2014500725.tif 000106
【図６１Ａ】
2014500725.tif 000107
【図６１Ｂ】
2014500725.tif 000108
【図６１Ｃ】
2014500725.tif 000109
【図６１Ｄ】
2014500725.tif 000110
【図６２Ａ】
2014500725.tif 000111
【図６２Ｂ】
2014500725.tif 000112
【図６２Ｃ】
2014500725.tif 000113
【国際調査報告】
2014500725.tif 000114
2014500725.tif 000115
2014500725.tif 000116