(57)【要約】本願明細書は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いた興味のタンパク質の送達用の組成物、システム及び方法を開示する。５’及び３’末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモーター、ポリヌクレオチドを挿入するための制限部位、及び転写後調節エレメントを含むＡＡＶベクターを開示する。中和抗体を発現用のＡＡＶベクターの使用を更に開示する。
2014511180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ；
プロモーター；
１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするための、前記プロモーターの下流の制限部位；
前記制限部位の下流の転写後調節エレメント；
を含み、
前記プロモーター、前記制限部位、及び前記転写後調節エレメントは、前記５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流、且つ前記３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する、
ウイルスベクター。
【請求項２】
前記制限部位に挿入され、且つ前記プロモーターに操作可能に結合されたポリヌクレオチドを更に含み、
前記ポリヌクレオチドは興味のタンパク質のコード領域を含む、
請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドは、前記興味のタンパク質の前記コード領域のすぐ上流のシグナルペプチド配列を含む、
請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記シグナルペプチドは、インターフェロンのシグナルペプチド、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のシグナルペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のシグナルペプチド、インスリンのシグナルペプチド、及びこれらのあらゆる組み合わせ、からなる群から選択される、
請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記ベクターは、コザック共通配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項２〜４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記興味のタンパク質は、全長の抗体、成長ホルモン（ＧＨｓ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）、Ｇ−ＣＳＦｓ、エリスロポエチン（ＥＰＯｓ）、インスリン、抗体Ｆａｂ断片、抗体ｓｃＦＶ断片、血友病に関連する凝固タンパク質、ジストロフィン、リソソーム酸リパーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、糖原病に関連する酵素、及びこれらのあらゆる変異体、からなる群から選択される、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記興味のタンパク質は、ウイルス中和抗体である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
前記ウイルス中和抗体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、又はインフルエンザウイルスに対する中和抗体である、
請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記ＨＩＶに対する中和抗体は、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される、
請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記ＨＣＶに対する中和抗体は、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される、
請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記興味のタンパク質は、マラリアに対する中和抗体である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、又はこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記プロモーターは、スプライス供与部位、スプライス受容部位、又はこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
前記スプライス供与部位は、配列番号：５の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
前記スプライス受容部位は、配列番号：６の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１３に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
前記プロモーターは、配列番号：１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１７】
前記プロモーターは、配列番号：２〜４のいずれか一つの配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
前記転写後調節エレメントは、ウイルスの転写後調節エレメントである、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
前記ウイルスの転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）、ＲＮＡ輸送要素（ＲＴＥ）、又はこれらのあらゆる変異体である、
請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
前記転写後調節エレメントの下流の転写終結領域を更に含む、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
前記転写終結領域は、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列、又はこれらのあらゆる変異体を含む、
請求項２０に記載のウイルスベクター。
【請求項２２】
前記プロモーターは、イントロンを含む、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２３】
前記イントロンは、配列番号：８の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む合成イントロンである、
請求項２２に記載のウイルスベクター。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドは、免疫グロブリンの重鎖可変領域についての第一のコード領域、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域についての第二のコード領域を含む
請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項２５】
前記第１のコード領域及び第２のコード領域は２Ａ配列により分離されている、
請求項２４に記載のウイルスベクター。
【請求項２６】
前記２Ａ配列は、Ｆ２Ａ配列である、
請求項２５に記載のウイルスベクター。
【請求項２７】
前記第１のコード領域の５’は、第１のシグナルペプチド配列と融合しており、前記第２のコード領域の５’は、第２のシグナルペプチド配列と融合している、
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２８】
前記第１のシグナルペプチド配列、及び前記第２のシグナルペプチド配列は、異なっている、
請求項２７に記載のウイルスベクター。
【請求項２９】
前記５’ＩＴＲから開始し、前記３’ＩＴＲで終了する領域が、少なくとも約２．５ｋｂである、
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項３０】
興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供するステップと、
前記組換え型のＡＡＶを被験者に投与し、前記組換え型のＡＡＶが被験者中で抗体を発現し、前記ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂである、ステップと
を含む、興味のタンパク質をインビボで製造するための方法。
【請求項３１】
前記興味のタンパク質は、抗体である、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体は、全長の抗体である、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体は、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、抗−マラリア抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される、
請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記興味のタンパク質は、前記被験者の血清中で少なくとも約９μｇ／ｍＬの量で発現される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記興味のタンパク質は、前記被験者の血清中で少なくとも約１００μｇ／ｍＬの量で発現される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記興味のタンパク質は、前記被験者の血清中で少なくとも約５００μｇ／ｍＬの量で発現される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換え型ＡＡＶは、
ウイルスベクター、ＡＡＶ増殖性感染を発生させるためのヘルパー機能、及びＡＡＶキャップ遺伝子と共に、パッケージング細胞株を提供するステップ、ここで、前記ウイルスベクターは、５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）、３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、及び興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む；
前記パッケージング細胞株の上澄みから組換え型のＡＡＶウイルスを回収するステップ；
により製造される、
請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターは、請求項２〜２９のいずれか一項のウイルスベクターである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスに対する中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供するステップと；
前記組換え型ＡＡＶを被験者に投与し、前記組換え型のＡＡＶが被験者中で抗体を発現するステップと、
を含む、
被験者におけるウイルス感染のリスクを低減又は抑制するための方法。
【請求項４０】
前記ウイルスに対する第２の中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え型ＡＡＶを更に含む、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験者が哺乳動物である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験者がヒトである、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記中和抗体は、全長の抗体である、
請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ウイルスベクター治療のない被験者と比較して、少なくとも約５倍、被験者における感染のリスクを低減させる、
請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ウイルスベクター治療のない被験者と比較して、少なくとも約２０倍、被験者における感染のリスクを低減させる、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
被験者におけるウイルス感染を抑制する、
請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体は、前記被験者の血清中で少なくとも約９μｇ／ｍＬの量で発現される、
請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体は、前記被験者の血清中で少なくとも約１００μｇ／ｍＬの量で発現される、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体は、前記被験者の血清中で少なくとも約５００μｇ／ｍＬの量で発現される、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、である、
請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記中和抗体は、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＹ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される、
請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記組換え型のＡＡＶは、筋肉内注射、膣内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮膚上投与、皮内投与、又は経鼻投与により前記被験者に投与される、
請求項３９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組換え型のＡＡＶは、前記被験者に多くて１年に１回投与される、
請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組換え型のＡＡＶは、前記被験者に多くて５年に１回投与される、
請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換え型のＡＡＶは、前記被験者に多くて１０年に１回投与される、
請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、ＡＡＶ増殖性感染を発生させるためのヘルパー機能、及びＡＡＶキャップ遺伝子を含むウイルスコンストラクトを有するパッケージング細胞株を提供するステップ；
前記パッケージング細胞株の上澄みから組換え型のＡＡＶウイルスを回収するステップ；
を含む、
組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を製造する方法。
【請求項５７】
前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、又はこれらの変異体由来のカプシドをコードする、
請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ウイルスコンストラクトは、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のウイルスベクターである、
請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記組換え型ＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ではない、
請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号：１の配列に対して少なくとも約９０％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含む、
単離、合成、又は組換え型ポリヌクレオチド。
【請求項６１】
配列番号：２〜４の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、
請求項６０に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１１年２月２２日出願の米国仮出願第６１／４４５４４９号、２０１１年１０月２１日出願の第６１／５５０１２３号、及び２０１２年２月１４日出願の第６１／５９８７２８号について、米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張するものである。
【０００２】
（連邦支援の研究開発であることの声明）
本発明は、米国衛生研究所により与えられたＨＨＳＮ２６６２００５０００３５Ｃの政府支援を用いてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本願は、電子的フォーマットの配列表と共に出願される。配列表は、２０１２年２月２１日作成の「ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴ」という題名のファイル、サイズ１４８Ｋｂ、として提供される。電子的フォーマットの情報は、その全てについて参照により本願明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
本願は、概して免疫学及び遺伝子送達の分野に関する。特に、本願は、抗体等の興味のタンパク質を生産するための組成物、システム、及び方法に関する。
【０００５】
多大な努力にも拘らず、ヒト免疫不全型ウイルス（ＨＩＶ）に対して有効なワクチンは、今日までのところ開発されていない。多くの抗体は、大部分の血液循環中のＨＩＶ株を中和することが可能であると同定されている。類似のエピトープを標的とするであろう抗体をデノボで生じさせることが可能な抗原のデザインに、相当の努力が向けられてきたが、従来のワクチンが広範に存在する中和抗体のアナログを生じさせることができるものかどうか不確かなままであった。免疫の代替物として、本願明細書に記載されるベクター仲介の遺伝子導入を、広範に存在する中和抗体の血液循環中への分泌を操作するために用いることができる。
【０００６】
遺伝的にコードされた治療用タンパク質を生産することを目的とした既存の方法は、限られたレベルの遺伝子発現しか得られない。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターを用いて体液性免疫を操作する以前の試みは、少量の抗体産生しか得られず（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：  ８７６９-８７７５  （２００２））、後に、運搬能を犠牲にして発現を増加させる、代わりのカプシド（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２３：  ５８４-５９０  （２００５））、及び自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター（ＭｃＣａｒｔｙ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １６：  １６４８-１６５６  （２００８））の使用により改良された。最近、ｓｃＡＡＶベクターが、小さいな人工的に融合された抗体断片からなる、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）−中和イムノアドヘシンの直接発現のために用いられた（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  １５（８）：  ９０１-９０６  （２００９））。しかしながら、この予防法の効能は、イムノアドヘシンタンパク質に向けられた内在性の免疫反応により制限される。加えて、既存のＡＡＶ−ベースの方法の効能の欠乏は、ＡＡＶベクターが約４８００超の塩基対の長さの配列を伝達することができないことに帰着し得る（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ７：２１０１−２１１２  （１９９６））。このＡＡＶベクターの制限は、治療用タンパク質をコードする遺伝子、及び特にビボで高いレベルの産生を可能にする発現を促進する要素の両方を含むベクターをデザインすることを困難にしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：  ８７６９-８７７５  （２００２）
【非特許文献２】Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２３：  ５８４-５９０  （２００５）
【非特許文献３】ＭｃＣａｒｔｙ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １６：  １６４８-１６５６  （２００８）
【非特許文献４】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  １５（８）：  ９０１-９０６  （２００９）
【非特許文献５】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ７：２１０１−２１１２  （１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのため、遺伝子を効率的に発現することができる小型のベクター及びシステムの開発が、早急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願明細書に開示される幾つかの実施形態は、ウイルスベクターを提供し、該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ；プロモーター；１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするための、前記プロモーターの下流の制限部位；前記制限部位の下流の転写後調節エレメント；を含み、前記プロモーター、前記制限部位、及び前記転写後調節エレメントは、前記５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流、且つ前記３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。
【００１０】
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、前記制限部位に挿入され、且つ前記プロモーターに操作可能に結合されたポリヌクレオチドを更に含み、前記ポリヌクレオチドは興味のタンパク質のコード領域を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、前記興味のタンパク質の前記コード領域のすぐ上流のシグナルペプチド配列を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、前記シグナルペプチドは、インターフェロンのシグナルペプチド、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のシグナルペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のシグナルペプチド、インスリンのシグナルペプチド、及びこれらのあらゆる組み合わせ、からなる群から選択される。
【００１３】
幾つかの実施形態では、前記ベクターは、コザック共通配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、全長の抗体、成長ホルモン（ＧＨｓ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）、Ｇ−ＣＳＦｓ、エリスロポエチン（ＥＰＯｓ）、インスリン、抗体Ｆａｂ断片、抗体ｓｃＦＶ断片、血友病に関連する凝固タンパク質、ジストロフィン、リソソーム酸リパーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、糖原病に関連する酵素、及びこれらのあらゆる変異体、からなる群から選択される。
【００１５】
幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、ウイルス中和抗体である。幾つかの実施形態では、前記ウイルス中和抗体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、又はインフルエンザウイルスに対する中和抗体である。幾つかの実施形態では、前記ＨＩＶに対する中和抗体は、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、前記ＨＣＶに対する中和抗体は、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスに対する中和抗体は、Ｆ１０抗−インフルエンザ抗体、ＣＲ６２６１抗−インフルエンザ抗体、ＦＩ６抗−インフルエンザ抗体、ＴＣＮ３２抗−インフルエンザ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、マラリアの中和抗体である。幾つかの実施形態では、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、前記プロモーターは、スプライス供与部位、スプライス受容部位、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、前記スプライス供与部位は、配列番号：５の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、前記スプライス受容部位は、配列番号：６の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、前記プロモーターは、配列番号：１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、前記プロモーターは、配列番号：２〜４のいずれか一つの配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態では、前記転写後調節エレメントは、ウイルスの転写後調節エレメントである。幾つかの実施形態では、前記ウイルスの転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）、ＲＮＡ輸送要素（ＲＴＥ）、又はこれらのあらゆる変異体である。
【００１８】
幾つかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、前記転写後調節エレメントの下流の転写終結領域を更に含む。幾つかの実施形態では、前記転写終結領域は、ＳＶ４０後期ポリＡ配列、又はこれらのあらゆる変異体を含む。前記プロモーターは、イントロンを含む。
【００１９】
幾つかの実施形態では、前記イントロンは、配列番号：８の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む合成イントロンである。
【００２０】
幾つかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、免疫グロブリンの重鎖可変領域についての第一のコード領域、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域についての第二のコード領域を含む。幾つかの実施形態では、前記第１のコード領域及び第２のコード領域は２Ａ配列により分離されている。幾つかの実施形態では、前記２Ａ配列は、Ｆ２Ａ配列である。
【００２１】
幾つかの実施形態では、前記第１のコード領域の５’は、第１のシグナル配列と融合しており、前記第２のコード領域の５’は、第２のシグナル配列と融合している。幾つかの実施形態では、前記第１のシグナル配列、及び前記第２のシグナル配列は、異なっている。
【００２２】
幾つかの実施形態では、前記５’ＩＴＲから開始し、前記３’ＩＴＲで終了する領域が、少なくとも約２．５ｋｂである。
【００２３】
本願明細書に開示される幾つかの実施形態は、興味のタンパク質をインビボで生産するための方法を提供し、該方法は、興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供するステップと、前記組換え型のＡＡＶを被験者に投与し、前記組換え型のＡＡＶが被験者中で抗体を発現し、前記ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂである、ステップとを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、抗体である。幾つかの実施形態では、前記抗体は、全長の抗体である。幾つかの実施形態では、前記抗体は、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、Ｆ１０抗−インフルエンザ抗体、ＦＩ６抗−インフルエンザ抗体、ＴＣＮ３２抗−インフルエンザ抗体、ＣＲ６２６１抗−インフルエンザ抗体、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、抗−マラリア抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、前記被験者の血清中で少なくとも約９μｇ／ｍＬの量で発現される。幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、前記被験者の血清中で少なくとも約１００μｇ／ｍＬの量で発現される。幾つかの実施形態では、前記興味のタンパク質は、前記被験者の血清中で少なくとも約５００μｇ／ｍＬの量で発現される。
【００２６】
幾つかの実施形態では、前記組換え型ＡＡＶは、ウイルスベクター、ＡＡＶ増殖性感染を発生させるためのヘルパー機能、及びＡＡＶキャップ遺伝子と共に、パッケージング細胞株を提供すること、ここで、前記ウイルスベクターは、５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）、３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、及び興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む；前記パッケージング細胞株の上澄みから組換え型のＡＡＶウイルスを回収すること；により生産される。
【００２７】
幾つかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、本願明細書に開示されるウイルスベクターのいずれか１つである。
【００２８】
本願明細書に開示される幾つかの実施形態は、被験者におけるウイルス感染のリスクを低減又は抑制するための方法を提供し、該方法は、ウイルスに対する中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供するステップと；
前記組換え型ＡＡＶを被験者に投与し、前記組換え型のＡＡＶが被験者中で抗体を発現するステップと、を含む。
【００２９】
幾つかの実施形態では、前記ウイルスに対する第２の中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え型ＡＡＶを更に含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、前記被験者が哺乳動物である。幾つかの実施形態では、前記被験者がヒトである。
【００３１】
幾つかの実施形態では、前記中和抗体は、全長の抗体である。
【００３２】
幾つかの実施形態では、ウイルスベクター治療のない被験者と比較して、少なくとも約５倍、被験者における感染のリスクを低減させる。幾つかの実施形態では、ウイルスベクター治療のない被験者と比較して、少なくとも約２０倍、被験者における感染のリスクを低減させる。幾つかの実施形態では、被験者におけるウイルス感染を抑制する。
【００３３】
幾つかの実施形態では、前記抗体は、前記被験者の血清中で少なくとも約９μｇ／ｍＬの量で発現される。幾つかの実施形態では、前記抗体は、前記被験者の血清中で少なくとも約１００μｇ／ｍＬの量で発現される。幾つかの実施形態では、前記抗体は、前記被験者の血清中で少なくとも約５００μｇ／ｍＬの量で発現される。
【００３４】
幾つかの実施形態では、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、又はインフルエンザウイルスである。
【００３５】
幾つかの実施形態では、前記中和抗体は、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、Ｆ１０抗−インフルエンザ抗体、ＣＲ６２６１抗−インフルエンザ抗体、ＴＣＮ３２抗−インフルエンザ抗体、ＦＩ６抗−インフルエンザ抗体、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＹ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体からなる群から選択される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、前記組換え型のＡＡＶは、筋肉注射、膣内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮膚上投与、皮内投与、又は経鼻投与により前記被験者に投与される。幾つかの実施形態では、前記組換え型のＡＡＶは、前記被験者に多くて１年に１回投与される。幾つかの実施形態では、前記組換え型のＡＡＶは、前記被験者に多くて５年に１回投与される。幾つかの実施形態では、前記組換え型のＡＡＶは、前記被験者に多くて１０年に１回投与される。
【００３７】
本願明細書に開示される幾つかの実施形態は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生産する方法を提供し、該方法は、５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、ＡＡＶ増殖性感染を発生させるためのヘルパー機能、及びＡＡＶキャップ遺伝子を含むウイルスコンストラクトを有するパッケージング細胞株を提供するステップ；前記パッケージング細胞株の上澄みから組換え型のＡＡＶウイルスを回収するステップ；を含む。
【００３８】
幾つかの実施形態では、前記ＡＡＶキャップ遺伝子は、血清型１、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、又はこれらの変異体由来のカプシドをコードする。
【００３９】
幾つかの実施形態では、前記ウイルスコンストラクトは、願明細書に記載のウイルスベクターのいずれか１つである。
【００４０】
幾つかの実施形態では、前記組換え型ＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ではない。
【００４１】
本願明細書に開示される幾つかの実施形態は、単離、合成、又は組換え型ポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、配列番号：１の配列に対して少なくとも約９０％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、配列番号：２〜４の配列から選択されたヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】図１Ａは、パネルのプロモーターからルシフェラーゼを発現する、２×１０９ＧＣのＡＡＶ２／８ベクターを筋肉内注射して１５週間後におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである（ｎ＝２）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＭＶエンハンサー及びβ−アクチンプロモーター、それに続くユビキチンエンハンサー領域を挟んだスプライス供与部位（ＳＤ）とスプライス受容部位（ＳＡ）を結合させたＣＡＳＩプロモーターの実施形態の模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、２×１０９ＧＣの図示のプロモーターにより動かされるルシフェラーゼをコードするＡＡＶ２／８を筋肉内注射して８週間後における、ＣＡＳＩプロモーターにより動かされるＡＡＶベクターからのルシフェラーゼ活性を、従来のＣＭＶ及びＣＡＧと比較して、示すグラフである（ｎ＝２）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図示のポリアデニル化シグナルにより終結される、ＷＰＲＥあり又はなしの、ＣＭＶ−駆動のＡＡＶベクターの投与６週間後におけるルシフェラーゼの活性を示すグラフである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、末端逆位配列（ＩＴＲ）、ＣＡＳＩプロモーター、自己プロセッシング２Ａ配列により分離されたカッパ軽鎖に結合したＩｇＧ１重鎖、発現向上のためのＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期−ポリアデニル化シグナルを含む、抗体発現のための発現カセットの模式図である。抗体Ｖ−領域の重鎖及び軽鎖は、黒箱で図示される位置でベクターにクローン化された。
【図２】図２は、本発明の範囲内にあるＡＡＶベクターの実施形態の模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、上部に示される抗体導入遺伝子、及び、標準又はフリン切断部位を含む最適化されたＦ２Ａ配列を有するベクターを用いたトランスフェクション後の、インビトロでのＥＬＩＳＡによる抗体発現の比較を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、４Ｅ１０と、天然、又は、重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子、又は両遺伝子と結合した、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）由来のシグナルペプチドとを有するベクターを用いたトランスフェクション後の、インビトロでのＥＬＩＳＡによる抗体発現の比較を示す棒グラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、標準の発現カセット、又はスプライス供与部位及び受容部位が内在的スプライシングの可能性を低減するように変異されたカセット中に４Ｅ１０を有するベクターを用いたトランスフェクション後の、インビトロでのＥＬＩＳＡによる４Ｅ１０抗体発現の比較を示す棒グラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、インビトロでの発現に最適化された、例示的なＩｇＧ１導入遺伝子の模式図である。シグナル配列（「ＳＳ」）、Ｆ２Ａ自己プロセッシングペプチド（「Ｆ２Ａ」）、及び予測されるスプライス供与部位及び受容部位（「重鎖定常領域」及び「カッパ定常」内の実線）が強調される。
【図４Ａ】図４Ａは、発現−最適化された導入遺伝子；ｂ１２（図４Ａ）から発現される抗体によるＨＩＶの中和について示す図である（ｎ＝３、ＲＬＵ＝相対的ルシフェラーゼユニット）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、発現−最適化された導入遺伝子；２Ｇ１２（図４Ｂ）から発現される抗体によるＨＩＶの中和について示す図である（ｎ＝３、ＲＬＵ＝相対的ルシフェラーゼユニット）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、発現−最適化された導入遺伝子；４Ｅ１０（図４Ｃ）から発現される抗体によるＨＩＶの中和について示す図である（ｎ＝３、ＲＬＵ＝相対的ルシフェラーゼユニット）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、発現−最適化された導入遺伝子；２Ｆ５（図４Ｄ）から発現される抗体によるＨＩＶの中和について示す図である（ｎ＝３、ＲＬＵ＝相対的ルシフェラーゼユニット）。
【図５Ａ】図５Ａは、１×１０１０ゲノムコピーのルシフェラーゼを発現するＡＡＶ２／８を筋肉内注射して１５週間後の、代表的なＲａｇ２／γｃマウスのゼノジェン（Ｘｅｎｏｇｅｎ、登録商標）写真を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、１×１０１０又は１×１０１１ＧＣのルシフェラーゼをコードするＡＡＶ２／８を筋肉内注射された、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスのゼノジェン（Ｘｅｎｏｇｅｎ、登録商標）写真によるルシフェラーゼ活性の量が、長期の用量依存的な発現を示すことを示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１×１０１０又は１×１０１１ＧＣの４Ｅ１０−ＩｇＧ１を発現するＡＡＶ２／８を、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに筋肉内注射した後に採取した血清サンプルについての、総ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより測定した、血液循環中のヒトＩｇＧの濃度を示すグラフである（ｎ＝２）。
【図６】図６は、免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ（ＮＳＧ）及びＲａｇ２／γｃ（Ｒａｇ２）、又は免疫適格性のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）及びＢａｌｂ／Ｃマウスのいずれかに、１×１０１０ゲノムコピーのｂ１２−ＩｇＧを産生する最適化された発現ベクターを筋肉内注射した後の、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧの量を示すプロットである。
【図７】図７は、ＨＩＶ暴露後のＨｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウス中のＣＤ４細胞の枯渇を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、ルシフェラーゼ又はｂ１２−ＩｇＧのいずれかを発現するベクターを筋肉内注射した６週間後に採取した血清サンプルについて、ＥＬＩＳＡにより測定した、血液循環中のヒトＩｇＧの濃度を示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ルシフェラーゼ（左グラフ）又はｂ１２−ＩｇＧ（右グラフ）を発現するＡＡＶ２／８ベクターを６週間前に受けた動物に１０ｎｇのｐ２４  ＮＬ４−３を腹腔内投与した後のヒト化マウス中のＣＤ４  Ｔ細胞の欠乏について示す図である。
【図９Ａ】図９は、種々のＨＩＶ中和抗体により仲介される保護の比較を示す。図９Ａは、４つの種々のＨＩＶ中和抗体を発現するベクターを筋肉内注射した後に採取した血清サンプルについて、総ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡにより測定された血液循環中の抗体濃度を示す図である（ｎ＝８）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、５ｎｇのｐ２４  ＮＬ４−３を用いたＨＩＶの静脈内注射後のＣＤ４細胞欠損に対して、ｈｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウスを保護する際における、４つの種々のＨＩＶ中和抗体の相対的効果の比較を示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、注射９週間後の、脾臓から採取された部分の免疫組織化学的染色によるＨＩＶｐ２４検出を示す。矢印はｐ２４発現について陽性のスコアの細胞。スケールバーは４０ｍｍ。
【図９Ｄ】図９Ｄは、脾臓の免疫化学的染色の定量を示す図であり、感染した動物の脾臓中のｐ２４を発現する細胞の相対度数を示す。ＮＤ、未検出。アスタリスクは、両側ｔ−ｔｅｓｔにより、ルシフェラーゼコントロールマウスと抗体を発現するマウスとで大きく異なる結果を示す（ｎ＝４〜６）、＊＊Ｐ、０．０１、＊＊＊Ｐ、０．０００１。図９Ａ〜Ｂは、平均値及びｓ．ｅ．ｍ．を示す；図９Ｄは平均値及びｓ．ｄ．を示す。
【図１０Ａ】図１０は、ＨＩＶ投与前の総ヒトＩｇＧ及びｇｐ１２０結合ＩｇＧの血清濃度を示す。図１０Ａは、ルシフェラーゼ又はｂ１２抗体のいずれかを発現するベクターの筋肉内注射５週間後、ヒトＰＢＭＣの養子移入３週間後、及びＨＩＶ静脈内注射の前日に採取した血清サンプルについての、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより測定した、生着細胞により産生される総ヒト抗体の濃度、及びＶＩＰを示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＨＩＶに特異的な抗体の濃度を測定するために、ｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡを用いて定量した同じ時間点における抗体濃度を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１１】ｂ１２抗体に仲介されるＣＤ４細胞保護の経時的に示すグラフである。右端に示されるＮＬ４−３の用量による静脈内注射の結果としてのｈｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウスにおけるＣＤ４細胞欠損である。ルシフェラーゼを発現するマウス（左プロット）はＣＤ４細胞喪失に脆弱であり、ｂ１２を発現するもの（右プロット）は全ての用量でＨＩＶからの保護を示した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＡＡＶ投与後に採取した血清サンプルについて、総ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより決定した、用量の関数としてのｂ１２発現を、経時的に示すプロットである。ルシフェラーゼ発現ベクターを受けたマウスはヒト抗体の検出を示さなかった（ｎ＝１２）。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＨＩＶに結合することが可能な抗体画分を測定するために、投与１日前、ヒトＰＢＭＣの養子移入３週間後、及びｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡにより決定される図示のＡＡＶ容量の筋肉内投与１５週間後における、血清中のｂ１２濃度を示す（ｎ＝８〜１２）。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、１０ｎｇのＮＬ４−３をある範囲のｂ１２を発現する動物への静脈内注射の結果としての、ｈｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウスにおけるＣＤ４細胞欠損を示すプロットであり、感染に対する保護のために必要な最小用量の抗体を示す。図１２Ａ及び１２Ｃは、平均値及び標準誤差を示し、図１２Ｂは、個々の動物及び平均を示す（ｎ＝８〜１２）。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＡＡＶ投与後に採取した血清サンプルについて総ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡにより決定した、用量の関数としてのＶＲＣ０１発現を、経時的に示すプロットである（ｎ＝８）。ルシフェラーゼ発現ベクターを受けたマウスはヒト抗体の検出を示さなかった（ｎ＝１２）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＨＩＶに結合することが可能な抗体画分を測定するために、投与１日前、ヒトＰＢＭＣの養子移入３週間後、及びｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡにより決定される図示のＡＡＶ容量の筋肉内投与１５週間後における、血清中のＶＲＣ０１濃度を示す（ｎ＝８〜１２）。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、１０ｎｇのＮＬ４−３をある範囲のＶＲＣ０１を発現する動物への静脈内注射の結果としての、ｈｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウスにおけるＣＤ４細胞欠損を示すプロットであり、感染に対する保護のために必要な最小用量の抗体を示す。図１３Ａ及び１３Ｃは、平均値及び標準誤差を示し、図１３Ｂは、個々の動物及び平均を示す（ｎ＝８〜１２）。
【図１４】図１４は、１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける未変性のｂ１２、Ｆ１０、又はＣＲ６２６１抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスの筋肉内注射後の、ＥＬＩＳＡによる血清中のヒトＩｇＧの定量を示すグラフである（プロットは平均及び標準誤差を示す、ｎ＝８）。
【図１５Ａ】図１５は、未変性のＦ１０及びＣＲ６２６１抗体の発現の増大を示す。図１５Ａは、Ｆ１０又はＣＲ６２６１重鎖及びｂ１２軽鎖からなるキメラコンストラクトと比較した、ｂ１２抗体とＦ１０及びＣＲ６２６１  ＷＴ配列とを比較した棒グラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＡＡＶベクター中に用いられる、様々な変性ｂ１２及び／又は４Ｅ１０抗体軽鎖をリストする表である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ｂ１２に融合されたＦ１０ＶＬ配列からなるＦ１０抗体軽鎖変異体、及び／又は４Ｅ１０抗体軽鎖配列の発現レベルを比較する棒グラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ｂ１２に融合されたＣＲ６２６１配列からなるＣＲ６２６１抗体軽鎖変異体、及び／又は４Ｅ１０抗体軽鎖配列の発現レベルを比較する棒グラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおけるｂ１２、Ｆ１０、又はＣＲ６２６１抗体を産生する最適化した発現ベクターの筋肉内注射後の、ＥＬＩＳＡによる血清中のヒトＩｇＧの定量を示すグラフである（プロットは平均及び標準誤差を示す、ｎ＝６）。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＧＦＰレポーターアッセイを用いた５つの株のインフルエンザ（ＰＲ／８、ＣＡ／０９、ＳＩ／０６、ＶＮ／０４、ＪＰ／５７）に対して測定した、ｂ１２、Ｆ１０又はＣＲ６２６１抗体を発現するＶＩＰを与えられたマウスから採取した血清の中和活性を示すプロットである。値は、インフルエンザ感染を５０％中和する血清の系列希釈として計算した。ダッシュ線は試験した最低の希釈（２０倍）を示し、この線以下の値は、カーブフィッティングから外掃され、中和活性が検出されないことを示す軸に沿ってプロットされたものである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ｂ１２、Ｆ１０、又はＣｒ６２６１を発現するベクターの筋肉内注射５週間後、及びウイルス注射の２日前に採取した血清サンプル中の総ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより決定された血液循環中のヒトＩｇＧの濃度を示すグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、１×１０４ＰＦＵのＣＡ／０９インフルエンザをコントロール（ｂ１２）又はＦ１０−ＩｇＧを発現するＶＩＰを受けた動物中に経鼻投与した後の、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて観察される体重減少を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＣＡ／０９の投与４日後の体重減少とＣＲ６２６１−ＩｇＧ濃度との相関を示すグラフである。ｄ、５×１０４ＰＦＵのＳＩ０６をコントロール（ｂ１２）又はＦ１０−ＩｇＧを発現するＶＩＰを受けた動物に経鼻投与した後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて観察された体重減少。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ＰＲ／８の経鼻投与後のｂ１２及びＦ１０を発現するＢａｌｂ／Ｃマウスにおける生存率を示すグラフである。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、１０００ＰＦＵのＰＲ／８を、コントロール（ｂ１２）又はＦ１０−ＩｇＧを発現するＶＩＰを受けた動物に経鼻投与した後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて観察された体重減少を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、ＣＡ／０９（図１７Ｆ）投与後の、ｂ１２、Ｆ１０又はＣＲ６２６１のいずれかを発現する組換え型ＡＡＶを受けた動物から採取された血清を用いてＧＦＰレポーターアッセイにより検出した、５つのインフルエンザ株（ＰＲ／８、ＣＡ／０９、ＳＩ／０６、ＶＮ／０４、ＪＰ／５７）のインビトロ中和を示すプロットである。
【図１７Ｇ】図１７Ｇは、ＳＩ０６（図１７Ｇ）投与後の、ｂ１２、Ｆ１０又はＣＲ６２６１のいずれかを発現する組換え型ＡＡＶを受けた動物から採取された血清を用いてＧＦＰレポーターアッセイにより検出した、５つのインフルエンザ株（ＰＲ／８、ＣＡ／０９、ＳＩ／０６、ＶＮ／０４、ＪＰ／５７）のインビトロ中和を示すプロットである。値は、インフルエンザ感染を５０％中和する血清の系列希釈として計算した。ダッシュ線は試験した最低の希釈（２０倍）を示し、この線以下の値は、カーブフィッティングから外掃され、中和活性が検出されないことを示す軸に沿ってプロットされたものである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、１×１０１１ＧＣのルシフェラーゼを発現するベクターの筋肉内注射後の、若齢（３月）又は高齢（１２月）のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスのゼノジェン（登録商標）イメージングによるルシフェラーゼ発現の定量を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、１×１０１１ＧＣのＦ１０−ＩｇＧを発現するベクターの筋肉内注射後の、若齢（３月）又は高齢（１２月）のＮＳＧマウスの血清中のＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧの定量を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、１０００ＰＦＵのＰＲ／８インフルエンザの経鼻投与後の、ルシフェラーゼ又はＦ１０−ＩｇＧを発現する組換え型ＡＡＶを受けた３月齢のＮＳＧマウスの生存率（左）及び体重減少（右）を示すグラフである（ｎ＝６〜８）。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、１０００ＰＦＵのＰＲ／８インフルエンザの経鼻投与後の、ルシフェラーゼ又はＦ１０−ＩｇＧを発現する組換え型ＡＡＶを受けた１２月齢のＮＳＧマウスの生存率（左）及び体重減少（右）を示すグラフである（ｎ＝４〜６）。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、１０００ＰＦＵのＰＲ／８インフルエンザの投与５日後の、ＶＩＰを発現するルシフェラーゼ又はＦ１０−ＩｇＧのいずれかを受けた３月齢のＮＳＧマウスから採取した代表的な肺切片のヘマトキシリン及びエオシン染色を示す図である。
【図１８Ｆ】図１８Ｆは、熟練の病理学者により定量された炎症を示す序数スコアを示すプロットである（０＝炎症なし、５＝最大の炎症）。
【図１８Ｇ】図１８Ｇは、動物が分析のために殺処分された時の、時間の関数としての肺組織中のインフルエンザＲＮＡの定量を示すプロットである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、実施例１２で用いられる低用量のマウスへのＨＩＶ投与計画の模式図である。隔週、マウスを採決し、その時に太矢印により示されるように、種菌の表面を傷つけない膣内投与により、５０ｎｇのＪＲ−ＣＳＦのｐ２４を投与した。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、フローサイトメトリーにより測定されたＨＩＶ感染の結果としての血液循環中のＣＤ４細胞欠損を経時的に示すグラフである。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、Ａｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＩＶ−１  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ  ｑＰＣＲ  ａｓｓａｙにより測定された、１３回の膣内投与後の、殺処分時の、血漿中のＨＩＶウイルス量を示すプロットである。このアッセイの検出限界は２００コピー／ｍＬである。未検出サンプルは検出限界にプロットした。
【図２０】図２０は、ｂ１２、ＡＲ３Ａ、及びＡＲ３Ｂを発現する組換え型ＡＡＶウイルスの投与後の、ＥＬＩＳＡによる血清中のヒトＩｇＧの定量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
下記の詳細な説明は添付図面を参照しその一部とする。詳細な説明、図面、及び請求項に例示される実施形態は限定することを意味しない。本願発明の主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を用いることができ、他の変更をなすことができる。本願明細書に概して記載され図面に例示される、本願発明の態様は、広範な異なる構成において、変更、置換、結合、設計されることができ、これら全ては本開示に明確に示されその一部をなす。
【００４４】
本願発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）の産生に有用なウイルスベクター、適切な環境、例えば、細胞、組織、器官、又は組換え型ＡＡＶｘでトランスフェクトされた患者中で、１種又は複数種の興味のタンパク質を発現することが可能な組換え型ＡＡＶｓを提供する。本願明細書は、組換え型ＡＡＶｓの製造及び使用方法も開示する。例えば、組換え型ＡＡＶｓは、ビボ、エクスビボ、又はインビトロで、興味のタンパク質を産生するために用いることができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質の発現は、１つ又は複数の疾患又は障害を、ウイルス感染のリスクを低減又は阻害するなど、診断、予防、治療するために用いることができる。
【００４５】
幾つかの実施形態では、ＡＡＶの５’末端逆位配列（ＩＴＲ）及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、プロモーター、１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能とするプロモーターの下流の制限部位、制限部位の下流の転写調節エレメントを含み、ここで、プロモーター、制限部位、及び転写調節エレメントは、５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。ウイルスベクターは、例えば、１種又は複数種の興味のタンパク質（例えば、抗体）を発現さえるために用いることができる。例えば、ウイルスベクターは、１種又は複数種の抗−ＨＩＶ抗体、抗−ＨＣＶ抗体、抗−インフルエンザ抗体をコードするポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ウイルスベクターは、例えば、診断又は治療目的で患者中で、高レベルの興味のタンパク質（例えば、抗体）を産生するために用いることができる。
【００４６】
［定義］
特に断りのない限り、本願明細書に用いられる技術的及び化学的用語は、本願発明が属する技術の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する；例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  １９８９）参照。本願発明の目的のため、下記の用語を定義する。
【００４７】
本願明細書に用いられる「ベクター」という用語は、宿主細胞に対して遺伝子材料を伝達するために用いられる、ポリヌクレオチドコンストラクト、一般的に、プラスミド又はウイルスを指す。ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド°、又はファージとし得る。本願発明で用いられるベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかからなる。幾つかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡからなる。「発現ベクター」は、適切な環境にあるときに、１つ又は複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の発現を行うことができるベクターである。ベクターは、好適には自己複製することができる。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下におかれ、遺伝子はプロモーターに対して「操作可能に結合」されると言われる。
【００４８】
本願明細書に用いられる「コンストラクト」という用語は、特定のヌクレオチド配列の発現の目的で生成された組換え型の核酸、又は他の組換え型ヌクレオチド配列の構築において用いられるものを指す。
【００４９】
本願明細書に用いられる「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、変換可能であり、あらゆる核酸を指し、ホスホジエステル結合、又は、リン酸ジエステル、アミド亜リン酸エステル、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダイト、カーバメート、チオエステル、架橋アミド亜リン酸エステル、架橋メチレンホスホネート、架橋アミド亜リン酸エステル、架橋アミド亜リン酸エステル、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート、又はスルホン結合、及びかかる結合の組み合わせ等の変性した結合のいずれかからなる。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、５種の生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル）以外の塩基からなる核酸をも特に含む。
【００５０】
「調節エレメント」及び「発現制御エレメント」という用語は、変換可能に用いられ、特定のホスト生物における操作可能に結合されたコード配列の発現に影響し得る核酸分子を指す。これらの用語は、広く用いられ、転写を促進又は制御する全てのエレメントに及び、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサー、及び反応エレメント（Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  Ｖ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）  ｐａｇｅｓ  ８４７−８７３）を含む。原核生物における例示的な調節エレメントは、プロモーター、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞において用いられる調節エレメントは、制限なく、宿主細胞中におけるコード配列の発現及び／若しくはコードされたポリペプチドの産生を、提供及び／又は調節する、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、及びその同類物等の、転写及び翻訳制御配列を含む。
【００５１】
本願明細書に用いられる、２Ａ配列又は要素は、２つのタンパク質の間にリンカーとして導入される小ペプチドを指し、自律的なリボソーム内のポリタンパク質の自己プロセッシングを可能にする（例えば、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒ．  ２：１３  （２００４）；ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｆｆｉｃ  ５：６１６−６２６  （２００４）参照）。これらの短いペプチドは、１つのベクターからの複数のタンパク質の共発現を可能にする。多くの２Ａエレメントは当技術分野において知られている。２Ａ配列の例は、本願明細書に開示される方法及びシステムにおいて用いることができ、限定されることなく、米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号明細書に記載される、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、及びブタテッショウウイルス（Ｐ２Ａ）由来の２Ａ配列を含む。
【００５２】
本願明細書に用いられる「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写をさせるヌクレオチド配列である。一般的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位付近の、遺伝子の５’コード領域、に位置する。転写かの開始において機能するプロモーター内の配列要素は、共通ヌクレオチド配列を特徴とする。プロモーターの例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳類（ヒトを含む）由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導的、抑制的、及び／又は恒常的であり得る。誘導的プロモーターは、例えば、温度変化等の培養条件の何らかの変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写のレベルの増大を開始する。
【００５３】
本願明細書に用いられる「エンハンサー」という用語は、転写の開始部位に関するエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を増加することが可能な調節エレメントの一種を指す。
【００５４】
本願明細書に用いられる「抗体」という用語は、広義で用いられ、特に、ヒト、非ヒト（例えば、マウス）、及びヒト化のモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の生物学的活性を示す限り抗体断片に及ぶ。様々な工程を、本願明細書に記載されるシステム及び方法を用いて発現することができる。「抗体」及び「免疫グロブリン」は、通常、ヘテロ四量体の糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）及び２つの同じ重鎖（Ｈ）を含む。各軽鎖はジスルフィド結合により重鎖に結合される。ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンのイソタイプの重鎖の中で変化する。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）とそれに続く多数の定常領域を含む。各軽鎖は、一端の可変領域（ＶＬ）及び他端の定常領域を含む。軽鎖の定常領域は重鎖の第一の定常領域と繋がっており、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と繋がっている。抗体は、特定の抗原に対する結合能力を示し、免疫グロブリンは、抗体と、抗原特異性を欠く他の抗体様分子との両方を含む。後者のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで、ミエローマにより高レベルで産生される。
【００５５】
本願明細書に用いられる「変異体」は、参照ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）に実質的に類似する配列を有するポリヌクレオチド（又はポリペプチド）を指す。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、参照ポリヌクレオチドと比較して、５’末端、３’末端、及び／又は１つ又は複数の内部部位に、１つ又は複数のヌクレオチドの欠損、置換、追加を有することができる。変異体と参照ポリヌクレオチドとの間の配列の類似及び／又は相違は、当技術分野における従来の技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びハイブリダイゼーション技術を用いて検出することができる。変異体のポリヌクレオチドは、例えば、部位特異的変異導入を用いて生じさせたもの等の、合成的に生み出されたポリヌクレオチドをも含む。一般的に、変異体のポリヌクレオチドは、特に限定されないが、ＤＮＡを含み、参照ポリヌクレオチドに対して、当業者に知られる配列アラインメントプログラムにより決定して、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれを超える配列同一性を有することができる。
【００５６】
ポリペプチドの場合、変異体は、参照ポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の欠損、置換、追加を有することができる。変異体と参照ポリペプチドとの間の配列の類似及び／又は相違は、当技術分野において既知の従来の技術、例えば、ウェスタンブロットを用いて検出することができる。一般的に、ポリペプチドの変異体は、参照ポリペプチドと比較して、当業者に知られるアラインメントプログラムにより決定して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれを超える配列同一性を有することができる。
【００５７】
本願明細書に用いられる「トランスフェクション」は、例えば、細胞を下記の組換え型ＡＡＶウイルスで接触させること等による、宿主細胞への核酸を導入することを指す。
【００５８】
本願明細書に用いられる「導入遺伝子」は、ヒトの介入により標的細胞の１つ又は複数のクロモソーム（染色体切断点）に組み入れられるあらゆるヌクレオチド又はＤＮＡ配列を指す。幾つかの実施形態では、導入遺伝子は、興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、興味の遺伝子の所望の発現を得るために有用である、転写調節配列等の他の配列に、一般的に操作可能に結合される。幾つかの実施形態では、導入遺伝子は、追加的に、核酸、又は組み入れられたクロモソームをマークするために用いられる他の分子を含むことができる。
【００５９】
本願明細書に用いられる「治療」は、患者により明らかにされたか、又は、患者が感染しやすい、疾患、障害、又は治療学的な症状に応じてなされる医療上の介入を指す。治療の目的は、特に限定されないが、徴候の緩和若しくは予防、疾患、障害若しくは症状の進行若しくは悪化の減速若しくは停止、及び／又は疾患、障害若しくは症状の寛解を含む。「治療」は、治療上の処置及び予防的若しくは予防上の手段の１つ又は両方を指す。治療を必要とする被験者は、疾患、障害、若しくは不所望の生理的症状に既に罹患しているもの、及び疾患、障害、若しくは不所望の生理的症状が予防されるべきものを含む。
【００６０】
本願明細書に用いられる「有効量」という用語は、有益又は所望の、生物学的及び／又は臨床的結果に効果を与えるのに十分な量を指す。
【００６１】
本願明細書に用いられる「被験者」は、治療、観察又は実験の対象である動物を指す。「動物」は、魚、貝、爬虫類、特に、哺乳類等の、低血−及び温血−の脊椎動物及び無脊椎動物を含む。本願明細書に用いられる「哺乳類」は、哺乳類の分類に属する個体を差、特に限定されないが、ヒト、飼育動物及び家畜、動物園の動物、スポーツ及びペットの動物を含む。哺乳類の非制限例としては、マウス；ラット；ウサギ；ギニアブタ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ヤギ；乳牛；ウマ；サル、チンパンジー、及び類人猿等の霊長類、並びに、特にヒトを含む。いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。しかしながら、幾つかの実施形態では哺乳類はヒトではない。
【００６２】
［アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損性のパルボウイルスであり、１４５塩基の末端逆位配列を含む長さ約４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡゲノムである。ＩＴＲｓはＡＡＶ  ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの導入の役割をする。ＡＡＶが宿主細胞に感染したとき、ウイルスゲノムは宿主のクロモソームに導入し、細胞に潜伏感染する。自然系では、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）が感染細胞においてＡＡＶウイルスの産生を安納にする遺伝子を提供する。アデノウイルスの場合、遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡがヘルパー機能を提供する。ヘルパーウイルスでの感染時、ＡＡＶパルボウイルスは救出、増幅され、ＡＡＶ及びアデノウイルスの両方が産生される。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ遺伝子を有しない組換え型ＡＡＶベクターの例では、ＡＡＶは非導入である。
【００６３】
１種又は複数種の興味のタンパク質、例えば、長さで５００アミノ酸を超えるタンパク質のコード領域を含むＡＡＶベクターが提供される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶの５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、プロモーター、及び、１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするプロモーターの下流の制限部位を含み、ここで、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶベクターは、制限部位の下流、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流の転写後調節エレメントを含む。幾つかの実施形態では、本願明細書に開示されるＡＡＶベクターは、宿主細胞において興味のタンパク質を発現することができる組換え型ＡＡＶウイルスを産生するための、興味のタンパク質をコードする導入遺伝子を有するＡＡＶ導入ベクターとして用いることができる。
【００６４】
ウイルスベクターの精製は、特に制限されることなく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．    Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼダイジェッション、ライゲーション、トランスフォーメーション（形質転換）、プラスミド精製、及びＤＮＡシーケンシングを含む、当該技術分野においてよく知られたあらゆる適切な遺伝子工学技術を用いて行うことができる。
【００６５】
ウイルスベクターは、あらゆる公知の生物のゲノム由来の配列を導入することができる。配列は、その未変性の形式で導入することができ、所望の活性を得るためにあらゆる方法で変性することができる。例えば、配列は、挿入、欠損又は置換を含む。
【００６６】
［プロモーター］
様々なプロモーターは、操作可能に本願明細書に開示のウイルスベクター中の興味のタンパク質のコード領域を含む核酸に結合することができる。幾つかの実施形態では、プロモーターは、標的細胞等、ウイルスベクター由来のウイルスで感染した細胞における興味のタンパク質の発現を動かすことができる。プロモーターは、天然の又は非天然のものとすることができる。
【００６７】
プロモーターの例は、特に限定されることなく、ウイルスプロモーター、植物のプロモーター及び哺乳類のプロモーターを含む。ウイルスプロモーターの例は、特に限定されることなく、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）仲介初期プロモーター、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：２，  （２００８））に記載されるＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、及びニワトリβ−アクチンプロモーターの組み合わせ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８４，  ３１０：５１１−５１４に記載されるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ＳＲＮＡ及び１９ＳＲＮＡプロモーター、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に対する外被タンパク質プロモーター、及びこれらのあらゆる変異体、を含む。
【００６８】
植物のプロモーターの例は、特に限定されることなく、Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９８６，  ６：５５９−５６５に記載される大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ等のヒートショックプロモーター、及びこれらのあらゆる変異体を含む。哺乳類のプロモーターの例は、特に限定されることなく、ヒト伸長因子（ＥＦ１−１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵＣＢ）プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、及びこれらのあらゆる変異体を含む。
【００６９】
幾つかの実施形態では、プロモーターは、少なくともＣＡＧプロモーターの一部を含む合成プロモーターである。ＣＡＧプロモーターの一部は、配列番号：３に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、プロモーターはＣＭＶエンハンサーを含む。幾つかの実施形態では、プロモーターはＵＢＣエンハンサーを含む。幾つかの実施形態では、プロモーターは少なくともＣＭＶエンハンサーの一部を含む。例えば、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号：２に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、プロモーターはＵＢＣエンハンサーの少なくとも一部を含む。ＵＣＢエンハンサーは、配列番号：４に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する。
【００７１】
幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する合成ＣＡＳＩプロモーターである。合成ＣＡＳＩプロモーターはＣＭＶエンハンサーの一部、ニワトリβ−アクチンプロモーター、及びＵＢＣエンハンサーの一部を含む。幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号：１に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号：１に対して少なくとも約９０％同一である核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号：１に対して少なくとも約９５％同一である核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号：１の核酸配列を含む。
【００７２】
幾つかの実施形態では、ベクターは、哺乳類宿主細胞中のＲＮＡ転写物のプロセッシングを促進する１つ又は複数のイントロンを含むことができる。かかるイントロンの非制限例は、ウサギβ−グロビンイントロンである。幾つかの実施形態では、イントロンは合成イントロンである。例えば、合成イントロンは、配列番号：８に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。ベクター中のイントロンの位置は変えることができる。幾つかの実施形態では、イントロンはプロモーターと制限部位との間に位置する。幾つかの実施形態ではイントロンはプロモーターの中に位置する。幾つかの実施形態では、イントロンはＵＣＢエンハンサーを含む。ＵＣＢエンハンサーは、配列番号：４に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【００７３】
幾つかの実施形態では、プロモーターは１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合される。幾つかの実施形態では、プロモーターは、興味の抗体の重鎖及び／又は軽鎖（抗体の重鎖及び軽鎖可変領域等）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合される。幾つかの実施形態では、プロモーターは、重鎖及び軽鎖遺伝子の多シストロン性発現を可能にするために、興味の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合される。幾つかの実施形態では、２Ａ配列又はＩＲＥＳ要素は、各サブユニットの同等な発現を容易にするために、ベクター中の重鎖可変領域のコード領域と、軽鎖可変領域のコード領域との間に位置する。代わりに、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ適切なウイルスベクター中で、標的細胞に別々に導入されることができる。
【００７４】
プロモーターのサイズは変えることができる。ＡＡＶのパッケージング能力が限られているため、サイズの小さいプロモーターを用いることが好ましいが、同時に、宿主細胞中で興味のタンパク質の高レベルの産生を可能にする。例えば、幾つかの実施形態では、多くとも約１．５ｋｂ、多くとも約１．４ｋｂ、多くとも約１．３５ｋｂ、多くとも約１．３ｋｂ、多くとも約１．２５ｋｂ、多くとも約１．２ｋｂ、多くとも約１．１５ｋｂ、多くとも約１．１ｋｂ、多くとも約１．０５ｋｂ、多くとも約１ｋｂ、多くとも約８００塩基対、多くとも約６００塩基対、多くとも約４００塩基対、多くとも約２００塩基対、多くとも約１００塩基対である。
【００７５】
プロモーターのヌクレオチド配列は、発現効率を向上するために変性させることもできる。例えば、プロモーターは、１つ又は複数のスプライス供与部位、１つ又は複数のスプライス受容部位、及び／又はその組み合わせを含むことができる。幾つかの実施形態では、プロモーターは、スプライス供与部位、及びスプライス受容部位を含む。幾つかの実施形態では、プロモーターは、１つ又は複数のスプライス供与部位を含み、スプライス受容部位を含まない。幾つかの実施形態では、プロモーターは、スプライス供与部位を含まず、１つ又は複数のスプライス受容部位を含む。例えば、幾つかの実施形態では、スプライス供与部位は、配列番号：６に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【００７６】
［調節エレメント］
様々な転写後調節エレメントは、例えば、宿主細胞で興味のタンパク質の発現レベルを増加させるために、ウイルスベクター中に用いることができる。幾つかの実施形態では、転写後調節エレメントは、ウイルスの転写後調節エレメントとすることができる。ウイルスの転写後調節エレメントの非制限例としては、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）転写後調節エレメント、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）、ＲＮＡ輸送要素（ＲＴＥ）、及びこれらの変異体を含む。ＷＰＲＥは、配列番号：７に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。ＲＴＥは、ｒｅｖ応答エレメント、例えば、レンチウイルスのＲＲＥとすることができる。非制限例は、ウシ免疫不全ウイルスｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である。ＣＴＥの例は、特に限定されることなく、マソン・ファイザー・サルウイルスＣＴＥ、及びトリ白血病ウイルスＣＴＥを含む。
【００７７】
本願明細書に記載されるウイルスベクターは、細菌宿主細胞、それに導入されたもの等の、原核生物のレプリコン（すなわち、原核宿主細胞において染色体外で組換え型ＤＮＡ分子の自発的付す製及び維持を行う能力を有するＤＮＡ配列）を含むことができる。かかるレプリコンは、当技術分野でよく知られている。加えて、原核生物のレプリコンを含むベクターは、その発現が薬剤耐性等の検出可能なマーカーを与える遺伝子をも含むことができる。一般的な細菌の薬剤耐性遺伝子はアンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。
【００７８】
幾つかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、薬剤耐性選択マーカー等、真核細胞において効果的な選択マーカーの遺伝子を含むことができる。この選択マーカー遺伝子は選択的培養培地中において生育される形質転換した宿主細胞の生存又は増殖に必要な因子をコード化することができる。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。一般的な選択遺伝子は、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、カナマイシン、ゲンタマイシン、ゼオシン、又はテトラサイクリン等の抗生物質又は他の毒物に対する耐性を与え、栄養要求性の欠損を補完し、又は培地から引かれる必須栄養を供給するタンパク質をコード化する。
【００７９】
本願明細書に開示されるウイルスベクターは、転写開始領域及び／又は転写終結領域等、様々な調節エレメントを含むことができる。転写終結領域の例は、特に限定されることなく、ポリアデニル化シグナル配列である。ポリアデニル化シグナル配列は、特に限定されることなく、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）、ポリ（Ａ）、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）、ウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリ（Ａ）配列、及びこれらのあらゆる変異体を含む。幾つかの実施形態では、転写終結領域は転写後調節エレメントの下流に位置する。幾つかの実施形態では、転写終結領域は、ポリアデニル化シグナル配列である。幾つかの実施形態では、転写終結領域はＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列である。
【００８０】
本願明細書に開示されるウイルスベクターは、プロモーターの下流の制限部位の直後に１つ又は複数のＡヌクレオチドを含むことができる、ここで、制限部位は、興味のタンパク質をコード化するポリヌクレオチドの挿入を可能にする。例えば、１つ又は複数のＡヌクレオチドは、ベクターに興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した後に、興味のタンパク質のＴＡＡ終止コドンの直後に位置する。幾つかの実施形態では、１つのＡヌクレオチド、２つのＡヌクレオチド、３つのＡヌクレオチド、又はそれを超えるものが制限部位の直後に位置する。幾つかの実施形態では、１つのＡヌクレオチド、２つのＡヌクレオチド、３つのＡヌクレオチド、又はそれを超えるものが興味のタンパク質のＴＡＡ終止コドンの直後に位置する。
【００８１】
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、真核生物における複製及び組込みに適したベクターを作製する追加の配列を含むことができる。他の実施形態では、本願明細書に開示されるウイルスベクターは、原核生物及び真核生物の両方における複製及び組込みに適したベクターを作製するシャトルエレメントを含むことができる。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーター及びエンハンサー等の追加の転写及び翻訳開始配列；及びポリアデニル化シグナル等の追加の転写及び翻訳ターミネーターを含むことができる。
【００８２】
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、１本のｍＲＮＡからの複数のタンパク質の翻訳を可能にする制御配列を含むことができる。かかる制御配列の非制限例としては、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、及び２Ａ自己プロセッシング配列が挙げられる。幾つかの実施形態では、２Ａ配列は、口蹄疫ウイルスからの２Ａペプチド部位（Ｆ２Ａ配列）である。幾つかの実施形態では、Ｆ２Ａ配列は、標準的なフリン結合部位を有する。例えば、フリン結合部位を有するＦ２Ａ配列は、配列番号：９に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、Ｆ２Ａ配列は、変性されたフリン結合部位を有する。例えば、変性されたフリン結合部位を有するＦ２Ａ配列は、配列番号：１０に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【００８３】
ウイルスベクターは、また、幾つかの実施形態では、１種又は複数種の興味のタンパク質及び他のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列付近に位置する、１つ又は複数の制限部位を有する。
【００８４】
［興味のタンパク質］
本願明細書に用いられる「興味のタンパク質」は、天然由来及び非天然由来のタンパク質を含む、あらゆるタンパク質とすることができる。幾つかの実施形態では、１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本願明細書に開示されるウイルスベクターに挿入することができ、ポリヌクレオチドはプロモーターに操作可能に結合される。幾つかの実施形態では、プロモーターは、宿主細胞（例えば、ヒト筋肉細胞）において興味のタンパク質の発現を駆動することができる。
【００８５】
興味のタンパク質の例としては、特に限定されることなく、ルシフェラーゼ；蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）；成長ホルモン（ＧＨｓ）及びその変異体；インスリン様成長因子（ＩＧＦｓ）及びその変異体；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦｓ）及びその変異体；エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びその変異体；プロインスリン、プレプロインスリンインスリン、インスリン、インスリンアナログ等のインスリン及びその同等物；ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体等の抗体及びその変異体；抗体の抗原結合断片（Ｆａｂ断片）、抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦＶ断片）；ジストロフィン及びその変異体；凝固因子及びその変異体；嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＴＲ）及びその変異体；並びに、インターフェロン及びその変異体、が挙げられる。
【００８６】
幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、治療用タンパク質又はその変異体である。治療用タンパク質の非制限例は、β−グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、及び凝固因子等の血液因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９等のインターロイキン；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦ等のＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−９）、肝細胞がん由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）等の成長因子及びその同等物；可溶性ＴＮＦ−α受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ−１受容体、及び可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体）、可溶性γ／δＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド−結合断片等の可溶性受容体及びその同等物；α−グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ等の酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーター等の酵素アクチベーター；ＩＰ−１０、インターフェロン−γにより誘導されたモノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏα／ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＰＦ−４等のケモカイン及びその同等物；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦｓ、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子−β、塩基性線維芽細胞増殖因子、神経膠腫由来の成長因子−β、アンジオゲニン、アンジオゲニン−２等の血管形成剤及びその同等物；可溶性ＶＥＧＦ受容体等の抗血管新生薬；タンパク質ワクチン；神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガストリン、セクレチン、オキシトシン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、β−エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドＹ、黄体ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、睡眠ペプチド等の神経活性ペプチド及びその同等物；血小板溶解薬；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトα−１アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦｓ）；組織因子；黄体ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＮＴＦ）；好中球走化性因子（ＮＣＦ）；神経成長因子；組織メタロプロテアーゼ阻害物質；血管作用性小腸ペプチド；アンジオゲニン；アンジオトロピン；フィブリン；ヒルジン；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；並びにその同等物、を含む。幾つかの他の興味のタンパク質の非制限例は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３及び４／５（ＮＴ−３及び４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等の血友病関連凝固タンパク質；ジストロフィン又はミニ−ジストロフィン；リソソーム酸リパーゼ；フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）；グルコース-6-ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えば、ＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えば、ＧＬＵＴ２）、アルドラーゼＡ、β−エノラーゼ、グリコーゲン合成酵素、リソソーム酵素（例えば、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼＡ）等の糖原病関連酵素及びそのあらゆる変異体、を含む。
【００８７】
幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は上記タンパク質のいずれか等のタンパク質の活性断片である。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は２種以上のタンパク質の幾つか又は全てを含む融合タンパク質である。幾つかの実施形態では、融合タンパク質は上記タンパク質の何れかの全部又は一部である。
【００８８】
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、２種以上のタンパク質のコード領域を含むポリヌクレオチドを含む。２種以上の興味のタンパク質は、同じ又は互いに異なることができる。幾つかの実施形態では、２種以上の興味のタンパク質は、例えば、同じウイルスについての中和抗体等の関連ポリペプチドである。
【００８９】
幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、複数のサブユニットのタンパク質である。例えば、興味のタンパク質は、２以上のサブユニット、又は２以上の独立したポリペプチド鎖を含むことができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は抗体とすることができる。抗体の例としては、特に限定されることなく、抗体が抗原に対して結合することが可能である限り、様々なアイソタイプの抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＤ、ＩｇＧＥ、及びＩｇＧＭ）；モノクローナル抗体の抗原−結合断片を含む、当業者に知られたあらゆる手段により産生されたモノクローナル抗体；ヒト化抗体；キメラ抗体；一本鎖抗体；Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｃｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片、並びにその同等物を含む。幾つかの実施形態では、抗体は全長抗体である。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質はイムノアドヘシンである。
【００９０】
幾つかの実施形態では、抗体は抗−マラリア抗体である。抗−マラリア抗体の非制限例としては、２Ａ１０抗−マラリア抗体及び２Ｃ１１抗−マラリア抗体を含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、抗体は、ウイルス中和抗体である。例えば、抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、又はインフルエンザウイルスに対する中和抗体とすることができる。幾つかの実施形態では、抗体は抗−ＨＩＶ中和抗体である。幾つかの実施形態では、抗−ＨＩＶ中和抗体は、例えば、ＨＩＶ−１の異なる遺伝型の多くの初代単離物を中和するヒトモノクローナル中和抗体とすることができる。
【００９２】
幾つかの実施形態では、抗体は抗−ＨＣＶ中和抗体である。
【００９３】
幾つかの実施形態では、抗体は抗−インフルエンザ中和抗体である。ウイルス中和抗体の非制限例としては、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、ＶＲＣ０１抗−ＨＩＶ抗体、３ＢＮＣ６０抗−ＨＩＶ抗体、３ＢＮＣ１１７抗−ＨＩＶ抗体、ＮＩＨ４５−４６抗−ＨＩＶ抗体、ＮＩＨ４５−４６Ｗ抗−ＨＩＶ抗体、ＶＲＣ−ＰＧ０４抗−ＨＩＶ抗体、ＶＲＣ−ＣＨ３１抗−ＨＩＶ抗体、ＰＧＴ１２１抗−ＨＩＶ抗体、ＰＧＴ１２８抗−ＨＩＶ抗体、Ｆ１０抗−インフルエンザ抗体、ＣＲ６２６１抗−インフルエンザ抗体、ＴＣＮ３２抗−インフルエンザ抗体、ＦＩ６抗−インフルエンザ抗体、ＦＩ６ｖ３抗−インフルエンザ抗体、ＡＲ３Ａ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、及びそのあらゆる変異体を含む。
【００９４】
本願明細書に記載される通り、興味のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列は、タンパク質の発現効率を向上させるために変性することができる。本願明細書の遺伝子の転写及び／又は翻訳を向上させるために用いることができる方法は、特に限定されない。例えば、ヌクレオチド配列は、宿主（例えば、哺乳類）中における遺伝子発現（例えば、タンパク質産生）を増加するために、宿主のコドン使用頻度をよく反映させるように変性することができる。変性の別の非制限例として、興味のタンパク質のヌクレオチド配列における１つ又は複数のスプライス供与部位及び／又はスプライス受容部位が、外来性スプライシングの可能性を低減するために変性される。
【００９５】
興味のタンパク質は、様々な長さとすることができる。例えば、興味のタンパク質は、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、の長さとすることができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、少なくとも約４８０アミノ酸の長さとすることができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、少なくとも約５００アミノ酸の長さとすることができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、少なくとも約７５０アミノ酸の長さとすることができる。
【００９６】
１つのウイルスベクター中に、２種以上の興味のタンパク質、２以上の個々のポリペプチド鎖、又は２以上の興味のタンパク質、興味のタンパク質の２以上のサブユニットについてのコード領域を含めることを望む場合には、初期に対して追加するコード領域のそれぞれを、好適には、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）又は２Ａエレメント等の、宿主細胞においてタンパク質の共発現を促進するエレメントに結合される。例えば、ＩＲＥＳ又は２Ａエレメントは好適には、１つのベクターが複数サブユニットのタンパク質の各サブユニットをコードする配列を含む場合に、用いられる。興味のタンパク質が所望の特異性を有する免疫グロブリンである場合、例えば、（免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかをコードする）第一のコード領域は、プロモーターの下流に位置する。（免疫グロブリンの残りの鎖をコードする）第二のコード領域は、第一コード領域の下流に位置することができ、ＩＲＥＳ又は２Ａエレメントは、２つのコード領域の間、好適には、第二のコード領域の直前に位置することができる。（それぞれ、重鎖及び軽鎖をコードする）第一及び第二の遺伝子の配列の間へのＩＲＥＳ又は２Ａエレメントの導入により、両鎖が細胞中でほぼ同じレベルで同じプロモーターから発現することが可能となる。
【００９７】
幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、２以上のサブユニット、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）を含む。ウイルスベクターは、各サブユニットについてのコード領域を含む。例えば、ウイルスベクターは、Ｉｇ重鎖（又はＩｇ重鎖の可変領域）のコード領域、及びＩｇ軽鎖（又はＩｇ軽鎖の可変領域）のコード領域の両方を含むことができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、抗体の重鎖可変領域についての第一のコード領域、及び抗体の軽鎖可変領域についての第二のコード領域を含む。２つのコード領域は、例えば、２つのコード領域の多シストロン性転写を可能にする２Ａ自己プロセッシング配列により、分離することができる。
【００９８】
ウイルスベクターは、２種以上の興味のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、第一の興味のタンパク質についてのコード領域、及び第二の興味のタンパク質についてのコード領域を含むことができる。第一の興味のタンパク質、及び第二の興味のタンパク質は同じ又は異なるものとすることができる。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、第三又は第四の興味のタンパク質についてのコード領域を含むことができる。１つのウイルスベクターによりコードされる２種以上の興味のタンパク質の全長は変えることができる。例えば、２種以上の興味のタンパク質の全長は、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、又はそれより長く、することができる。
【００９９】
コザック共通配列（Ｋｏｚａｋ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、コザック共通（Ｋｏｚａｋ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）又はコザック配列（Ｋｏｚａｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、真核のｍＲＮＡにおいて生じ、共通の（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ配列、ここで、Ｒは、別の「Ｇ」に続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である。幾つかの実施形態では、ベクターは、コザック共通配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれえを超える配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、ベクターはコザック共通配列を含む。幾つかの実施形態では、ベクターは、１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクター、例えば、プロモーターの下流の制限部位に、挿入した後に、コザック共通配列を含むことができる。例えば、ベクターは、ＧＣＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号：４１）のヌクレオチド配列、ここで、ＡＴＧは興味のタンパク質の開始コドン、を含むことができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号：４２）のヌクレオチド配列、ここで、ＡＴＧは興味のタンパク質の開始コドン、を含むことができる。
【０１００】
所望の場合、当業者に知られた従来の手法に従って、興味のタンパク質は、単離、精製することができる。例えば、ライセートは発現宿主細胞のものを調整することができ、このライセートは、ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、限外ろ過、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、及び／又は他の精製技術を用いて、精製することができる。
【０１０１】
［シグナルペプチド配列］
様々なシグナルペプチド配列を本願明細書に開示するウイルスベクターにおいて用いることができる。シグナルペプチド配列は天然又は非天然由来のものとすることができる。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、シグナルペプチドは、哺乳類細胞から分泌の分泌物を提供することができる。シグナルペプチドの例としては、特に限定されることなく、ＨＧＨの内在的シグナルペプチド及びその変異体；タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩインターフェロンのシグナルペプチド及びその変異体を含む、インターフェロンの内在性シグナルペプチド及びその変異体；並びに、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ＴＧＦ−β１、ＴＮＦ、ＩＬ１−α、及びＩＬ１−βのシグナルペプチド、並びにその変異体等の、既知のサイトカインの内在性シグナルペプチド及びその変異体、を含む。幾つかの実施形態では、シグナルペプチドは、変性ＨＧＨシグナルペプチドである。幾つかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１１に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１２に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、興味のタンパク質とは異なるタンパク質についてのシグナルポリペプチドを用いることができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質についての未変性のシグナルポリペプチドが用いられる。幾つかの実施形態では、非天然のシグナルペプチドを用いることができる。
【０１０４】
一般的には、シグナルペプチドのヌクレオチド配列は、ベクター中の興味のタンパク質のコード領域のすぐ上流に（例えば、興味のタンパク質の５’コード領域で融合して）位置する。ウイルスベクターが２種以上の興味のタンパク質のコード領域を含む例では、シグナルペプチド配列は、１つ又は複数のコード領域のすぐ上流に挿入することができる。幾つかの実施形態では、各コード領域は５’末端で融合されたシグナルペプチド配列を有する。各コード領域に加えられたシグナルペプチド配列は、同じ又は異なるものとすることができる。例えば、興味のタンパク質が２つのサブユニットを有する場合、ウイルスベクターは、１つのサブユニットについてのコード領域、及び他のサブユニットについてのコード領域を含むことができ、シグナルペプチド配列は、コード領域のいずれか１つ、又はコード領域の両方のすぐ上流に挿入することができる。別の非制限例として、ウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖可変領域についてのコード領域、及び免疫グロブリンの軽鎖可変領域についてのコード領域を含むことができ、各コード領域は５’末端でシグナルペプチド配列に融合される。幾つかの実施形態では、２つのシグナルペプチド配列が同じである。幾つかの実施形態では、２つのシグナルペプチド配列は異なる。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、タンパク質の発現及び／又は分泌の後、シグナルペプチドは前駆体タンパク質から切断され、成熟タンパク質となることができる。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、５’ＡＡＶ  ＩＴＲから開始し、３’ＡＡＶ  ＩＴＲで終了する、ウイルスベクター中の領域は、宿主細胞に運搬され、宿主細胞のゲノムに導入される。この領域は変化することができる。例えば、この領域の長さは、少なくとも約２ｋｂ、少なくとも約２．２５ｋｂ、少なくとも約２．２５ｋｂ、少なくとも約２．７５ｋｂ、少なくとも約３ｋｂ、少なくとも約３．２５ｋｂ、少なくとも約３．５ｋｂ、少なくとも約３．７５ｋｂ、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約４．２５ｋｂ、少なくとも約４．５ｋｂとすることができる。幾つかの実施形態では、この領域は少なくとも約２．５ｋｂである。幾つかの実施形態では、この領域は約４．５ｋｂである。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターではない。
【０１０７】
上記開示の通り、ウイルスベクターは、例えば、特に限定されることなく、プロモーター、興味のタンパク質をコードする導入遺伝子、シグナルペプチド配列、転写後調節エレメント、転写終結エレメント、及び１本のｍＲＮＡから複数のタンパク質の翻訳を可能にする制御配列等の様々なエレメントを含むことができる。当業者は、ウイルスベクターがこれらのエレメントの１つ、又は２以上のこれらのエレメントのあらゆる組み合わせを含むことができることを理解するであろう。例えば、ウイルスベクターは、表１に挙げられる少なくとも１つのエレメント又はエレメントの組み合わせを含むことができる。表１に用いられる表記は下記の通りである：
Ａ＝プロモーター
Ｂ＝導入遺伝子
Ｃ＝シグナルペプチド配列
Ｄ＝転写後調節エレメント
Ｅ＝転写終結エレメント
Ｆ＝１本のｍＲＮＡからの複数のタンパク質の翻訳を可能にする制御配列
Ｇ＝コザック共通配列
【０１０８】
ウイルスベクターのいくつかの実施形態に含まれるエレメント又はエレメントの組み合わせ
【表１】
2014511180.tif 000003
【０１０９】
上記の通り、各上記列挙のエレメントのヌクレオチド配列は、宿主細胞中の興味のタンパク質の発現効率を増加させるために、変性することができる。幾つかの実施形態では、ウイルスベクター中に１つ又は複数の導入遺伝子がある場合、どう縫う遺伝子の共発現を容易にする配列を用いることができる。かかる配列の非制限例は、ＩＲＥＳ、２Ａ配列、及びその変異体を含む。
【０１１０】
ＡＡＶベクターの非制限例の配列は、配列番号：１３〜３０に示される。例えば、ＣＭＶプロモーター、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１３に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ルシフェラーゼタンパク質のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡｖベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１４に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ルシフェラーゼタンパク質のコード配列、ＷＰＲＥ、及びウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）配列を含むＡＡｖベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１５に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ルシフェラーゼタンパク質のコード配列、ＷＰＲＥ、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）配列を含むＡＡｖベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１６に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１７に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、４Ｅ１０Ｂ抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１８に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：１９に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、２Ｆ５ＡＢ抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２０に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２１に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＡＲ３抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２２に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＡＲ３抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２３に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＶＲＣ０１抗−ＨＩＶ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２４に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＴＣＮ３２抗−インフルエンザ抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２５に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＣＲ６２６１抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２６に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、Ｆ１０抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２７に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＡＲ４抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２８に示さ���；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＦＩ６抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：２９に示され；ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＦＩ６抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：３０に示される。幾つかの実施形態では、抗体のコード配列は、抗体の野生型のコード配列の変異体である。別の例としては、ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含むＡＡＶベクターのヌクレオチド配列は、配列番号：４０に示される。当業者は、各上記ウイルスベクターにおいて、抗体をコードするヌクレオチド配列は、抗体をコードするあらゆる他の核酸配列、例えば、あらゆる既知の抗−ＨＩＶ、抗−ＨＣＶ、及び／又は抗−インフルエンザ抗体等の、興味のタンパク質をコードするあらゆる他の核酸配列で置換され得ることを理解するであろう。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号：１３〜３０に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号：４０に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれを超える配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含む。幾つかの実施形態では、ＡＡＶ配列は、ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含む。幾つかの実施形態では、ＡＡＶ配列は、ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＷＰＲＥ、及びウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）配列を含む。幾つかの実施形態では、ＡＡＶ配列は、ＣＡＳＩ合成プロモーター、ＷＰＲＥ、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）配列を含む。幾つかの実施形態では、ＡＡＶ配列は含む。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＡＧプロモーター、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含む。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列を含む。
【０１１３】
［組換え型ＡＡＶの製造方法］
本願は、宿主細胞中で１種又は複数種の興味のタンパク質を発現することができる組換え型ＡＡＶを製造する方法及び材料を提供する。本願明細書に記載されるように、本願明細書に開示の方法及び材料は、興味のタンパク質、例えば、全長抗体等の抗体の高い生産を可能にする。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶの製造方法は、本願明細書に記載される、ＡＡＶの５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲを含むウイルスコンストラクトを備えるパッケージング細胞株を提供するステップと、パッケージング細胞株の上澄みから組換え型ＡＡＶを回収するステップと、を含む。様々なタイプの細胞をパッケージング細胞株として用いることができる。例えば、用いることができるパッケージング細胞株は、特に限定されることなく、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号明細書に開示されるように、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、及びベロ細胞を含む。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、パッケージング細胞株の上澄みは、ウイルスを濃縮するためのＰＥＧ沈殿により処理される。幾つかの実施形態では、沈殿は、約４℃以下（例えば、約３℃、約２℃、約１℃、又は約１℃）で、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間、又は少なくとも約２４時間で生じる。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、低速遠心分離とそれに続くＣｓＣｌ勾配により、ＰＥＧ−沈殿した上澄みから単離した。低速遠心分離は、約４０００ｒｐｍ、約４５００ｒｐｍ、約５０００ｒｐｍ、又は約６０００ｒｐｍで、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、又は約６０分間とすることができる。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、ＰＥＧ−沈殿した上澄みから、約５０００ｒｐｍ約３０分間の遠心分離とそれに続くＣｓＣｌ勾配により単離する。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、ウイルスコンストラクトは、プロモーター、及び１種又は複数種の興味のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするためのプロモーターの下流の制限部位を含みここで、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。幾つかの実施形態では、ウイルスコンストラクトは、制限部位の下流、及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に、転写後調節エレメントを更に含む。幾つかの実施形態では、ウイルスコンストラクトは、制限部位に挿入され、プロモーターに操作可能に結合されたポリヌクレオチドを更に含み、ポリヌクレオチドは、興味のタンパク質のコード領域を含む。当業者は、本願に開示されるＡＡＶベクターのいずれか１つが、組換え型ＡＡＶを製造するためにウイルスコンストラクトとして、本方法に用いることができることを、理解するであろう。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、ヘルパー機能が、アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む、１つ又は複数のヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスにより供される。アデノウイルスヘルパー遺伝子の非制限例としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡを含み、ＡＡＶパッケージングに対してヘルパー機能を供することができる。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、ＡＡＶｃａｐ遺伝子はプラスミド中に存在する。プラスミドは、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を更に含むことができる。本願では、（特に限定されることなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びそのあらゆる変異体を含む）あらゆるＡＡＶ血清型由来のｃａｐ遺伝子及び／又はｒｅｐ遺伝子が、１種又は複数種の興味のタンパク質を発現させるための、本願明細書に開示の組換え型ＡＡＶを製造するために、用いることができることも想定される。幾つかの実施形態では、ＡＡＶｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、及びその変異体由来のカプシドをオードする。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、パッケージング細胞株は、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、ウイルスコンストラクト、及びＡＡＶｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを用いて、トランスフェクトし；組換え型ＡＡＶウイルスは、コトランスフェクション後様々な時間点で回収することができる。例えば、組換え型ＡＡＶウイルスは、コトランスフェクション後、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、又はあらゆるこれらの２つの時間点の間の時間で、回収することができる。
【０１２０】
ＡＡＶヘルパーウイルスは、当技術分野で知られており、例えば、アデノウイルスファミリー及びヘルペスウイルスファミリー由来のウイルスを含む。ＡＡＶヘルパーウイルスの例としては、特に限定されることなく、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号明細書に記載されるＳＡｄＶ−１３ヘルパーウイルス及びＳＡｄＶ−１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）を含む。当業者は、ＡＡＶに対して適切なヘルパー機能を提供することができるあらゆるＡＡＶのヘルパーウイルス又はヘルパープラスミドが、本願明細書に用いることができることを理解するであろう。
【０１２１】
本願明細書に記載される組換え型ＡＡＶウイルスは、感染性の組換え型ＡＡＶを産生するのに適する、当該技術分野において既知のあらゆる従来的手法を用いて産生することもできる。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、ＡＡＶ粒子産生に必要な構成要素の幾つかを安定的に発現する細胞株を用いることによって産生することができる。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを含む１つのプラスミド（又は複数のプラスミド）は、細胞（パッケージング細胞）のゲノムに導入することができる。パッケージング細胞株は、その後にヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス）と、５’及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、並びに興味のタンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターで、共感染することができる。この方法の利点は、細胞が、選択可能であり、組換え型ＡＡＶのラージスケールの産生に適していることである。別の非制限例としては、プラスミドよりもアデノウイルス又はバキュロウイルスを、パッケージング細胞中にｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を導入するためにもちることができる。更に別の非制限例としては、５’及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ、並びにｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むウイルスベクターの両方を、産生細胞のＤＮＡに安定的に導入することができ、組換え型ＡＡＶを産生するための野生型のアデノウイルスにより、ヘルパー機能が提供され得る。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ではない。
【０１２３】
当業者に理解されるように、本願明細書に記載の実施形態では、組換え型ＡＡＶを精製するために、ＡＡＶの精製に適切なあらゆる従来的手法を用いることができる。例えば、組換え体は、パッケージング細胞及び／又はパッケージング細胞の上澄みから単離、精製することができる。幾つかの実施形態では、ＡＡＶはＣｓＣｌ勾配を用いる分離方法により精製することができる。また、米国出願公開第２００２０１３６７１０号明細書は、ＡＡＶを精製するための方法の別の非制限例を記載し、ここで、ＡＡＶは、人工的受容体又はＡＡＶの付着を仲介する受容体様分子を固定化するマトリックスを含む固体支持体を用いてサンプルから単離、精製される。
【０１２４】
［ウイルスベクター及び組換え型ＡＡＶの応用］
本願明細書に開示されるウイルスベクターは、興味のタンパク質を発現する組換え型ＡＡＶを生成するために用いることができる。本願明細書に記載される方法及びシステムにより生成された組換え型ＡＡＶにより産生されたタンパク質は、広く様々な用途を有し、例えば、診断、治療、研究、化合物スクリーニング、及びドラッグデリバリー等の用途に有用であり得る。
【０１２５】
［インビトロでのタンパク質の産生］
非制限例として、本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶは、インビトロ、例えば、細胞培養中で、興味のタンパク質を産生するために用いることができる。１つの非制限例として、幾つかの実施形態では、インビトロで興味のタンパク質を産生する方法、ここで、該方法は、興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型ＡＡＶを提供するステップと；細胞培養中に組換え型ＡＡＶを細胞と接触させるステップ、ここで、組換え型ＡＡＶは細胞中で興味のタンパク質を発現する、と；を含む。興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変化させることができる。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約１．４ｋｂ、少なくとも約１．５ｋｂ、少なくとも約１．６ｋｂ、少なくとも約１．７ｋｂ、少なくとも約１．８ｋｂ、少なくとも約２．０ｋｂ、少なくとも約２．２ｋｂ、少なくとも約２．４ｋｂ、少なくとも約２．６ｋｂ、少なくとも約２．８ｋｂ、少なくとも約３．０ｋｂ、少なくとも約３．２ｋｂ、少なくとも約３．４ｋｂ、又は少なくとも約３．５ｋｂ、の長さとすることができる。幾つかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも約１．４ｋｂの長さとすることができる。
【０１２６】
上に開示されるように、興味のタンパク質はいかなる意味でも限定されない。例えば、興味のタンパク質は、抗体、例えば、ウイルス中和抗体とすることができる。本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶはインビトロで高いレベルの興味のタンパク質を産生することができる。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）である。蛍光タンパク質を発現する組換え型ＡＡＶは、蛍光で細胞をラベルするために用いて、感染した細胞、例えば、筋肉細胞を可視化することができる。
【０１２８】
［インビボでのタンパク質の産生］
非制限例として、本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶは、インビボ、例えば、哺乳類等の動物中で興味のタンパク質を産生するために用いることができる。幾つかの実施形態は、インビボで興味のタンパク質を産生する方法を提供し、ここで該方法は、興味のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型ＡＡＶを提供するステップと；被験者に対して組換え型ＡＡＶを投与するステップ、ここで、組換え型ＡＡＶは被験者中で興味のタンパク質を発現する。被験者は、幾つかの実施形態では、非ヒト哺乳類、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、又は乳牛とすることができる。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約１．４ｋｂ、少なくとも約１．５ｋｂ、少なくとも約１．６ｋｂ、少なくとも約１．７ｋｂ、少なくとも約１．８ｋｂ、少なくとも約２．０ｋｂ、少なくとも約２．２ｋｂ、少なくとも約２．４ｋｂ、少なくとも約２．６ｋｂ、少なくとも約２．８ｋｂ、少なくとも約３．０ｋｂ、少なくとも約３．２ｋｂ、少なくとも約３．４ｋｂ、又は少なくとも約３．５ｋｂ、の長さとすることができる。幾つかの実施形態では、ヌクレオチドは、少なくとも約１．４ｋｂの長さとすることができる。
【０１２９】
上に開示されるように、興味のタンパク質はいかなる意味でも限定されない。例えば、興味のタンパク質は、抗体、例えば、ウイルス中和抗体とすることができる。本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶはインビトロで高いレベルの興味のタンパク質を産生することができる。例えば、興味のタンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００μｇ／ｍＬ、の量で発現することができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５００μｇ／ｍＬ、又はこれらの値のうちあらゆる２つの間の範囲の量で、発現することができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬの量で、発現することができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約１００μｇ／ｍＬの量で、発現することができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約５００μｇ／ｍＬの量で、発現することができる。
【０１３０】
我々は、動物中で一般的に抗体を発現することについてのみについての明示的なサポートがある−おそらく発現レベルについての何らかの良好な記載を有する部分があることを確かめたかった可能性がある。例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶ、又はインフルエンザ抗体の（あるレベルでの）動物における発現−治療に言及することなく−特定の文脈を用いた（また、可能ならばあるレベルでの）発現の請求項がある可能性がある。そのため、これらに関す特定の記載があることはよいことである。
【０１３１】
［診断への応用］
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターを、疾患又は障害を検出する及び／又は疾患又は障害の進行をモニタリングするために有用な、１種又は複数種の興味のタンパク質を発現する組換え型ＡＡＶを生成するために用いることができる。本願明細書に用いられる、「診断」という用語は、疾患又は障害の存在若しくは不存在又は性質を同定することを指す。例えば、興味のタンパク質が抗体である場合、組換え型ＡＡＶウイルスは、抗原を検出するために用いることができる。疾患又は障害に関連する抗原（例えば、抗原タンパク質、抗原核酸配列、抗原ペプチド、抗原脂質、抗原炭水化物、及び抗原小分子）の検出は、疾患又は障害を診断する手段を提供する。かかる検出方法は、被験者が疾患若しくは障害にかかりやすくなっているかどうかを決定するために、疾患若しくは障害の進行又は治療プロトコルの進行をモニターするために、疾患若しくは障害の重症度を査定するために、疾患若しくは障害の発症及び又は回復の見込みを予測するために、又は、被験者について適切な治療を決定するのを援助するために、例えば、症状の初期診断に用いることができる。検出はインビトロ又はインビボで行うことができる。
【０１３２】
本願明細書に記載される実施形態における診断を検討される疾患は、特に限定されることなく、疾患に関連する抗原等の抗原が興味の抗体に対して特異的に結合することができるあらゆる疾患を含む。例えば、抗原は腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、アレルゲン、及び自己抗原とすることができる。幾つかの実施形態では、抗原は、ＨＩＶ抗原等のウイルス抗原である。幾つかの実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。
【０１３３】
疾患に対する多くの抗原が既知であり、本発明において興味のタンパク質として用いることができる。例えば、抗−環状シトルリン化ペプチド抗体（ａｎｔｉ−ＣＣＰ２）を、関節リウマチを検出するために、興味のタンパク質として用いることができる。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、診断することができる疾患は、例えば、白血病、がん、リンパ腫、星状細胞腫、肉腫特にユーイング肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、メラノーマ、ウィルムス腫瘍、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、子宮頸癌、精巣癌、腎細胞癌、脳癌等のガンの一種である。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、診断することができる疾患は、細胞内寄生体による感染に関連する。例えば、細胞内寄生体としては、例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はヒトT細胞白血病ウイルス等のウイルスとすることができる。幾つかの実施形態では、細胞内寄生体は、バクテリア、原生動物、真菌、又はプリオンとすることができる。より特に、細胞内寄生体は、例えば、クラミジア、リステリア、サルモネラ、レジオネラ、ブルセラ、コクシエラ、リケッチア、マイコバクテリア、リーシュマニア、トリパノソーマ、トキソプラズマ、及びマラリア原虫とすることができる。幾つかの実施形態では、疾患はマラリアである。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、被験者中の疾患を検出する方法は、検出される疾患についての工程を選択するステップと、本願明細書に開示されるウイルスベクターに対する抗体のコード領域を含むポリヌクレオチドを挿入するステップと、ウイルスベクターから組換え型ＡＡＶを産生するステップと、被験者に対して組換え型ＡＡＶを感染させるステップと、抗体とそれに特異的な抗原との間での特異的な結合の存在又は不存在に基づいて被験者中の疾患の存在又は不存在を決定するステップと、を含む。
【０１３７】
抗体の多くの他の用途も当該技術分野においてよく知られており、治療的、診断的、法医学的、環境的、及び商業的応用が含まれる。例えば、インビトロ又はインビボでの抗原は、興味の抗体に対して結合することができる。このように、本願明細書に開示される方法は、法医学的／環境的サンプル又は組織／細胞において、生物体及び／又は抗原（例えば、ポリペプチド、炭水化物、脂質。又は核酸）の存在を検出するために用いることができる。幾つかの実施形態では、この方法は活性化状態の酵素の検出を可能にする抗体を算出する際に用いることができる。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、この方法は、例えば、実験又は産業規模で、タンパク質を精製するために用いることができる。
【０１３９】
［治療的応用］
本願明細書に記載される組換え型ＡＡＶ及び方法は、被験者における１種又は複数種の疾患又は障害を予防又は治療するために、１種又は複数種の治療用タンパク質を発現するために用いることができる。
【０１４０】
本願明細書に記載される組換え型ＡＡＶ及び方法は、様々なウイルス感染のリスクを阻害又は低減するために用いることができる。幾つかの実施形態は、被験者中のウイルスの感染リスクを低減又は阻害するための方法を開示し、該方法は、ウイルスについての中和抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型ＡＡＶを提供するステップと；被験者に対して組換え型ＡＡＶを投与するステップ、ここで、組換え型ＡＡＶは被験者中で抗体を発現する、を含む。組換え型ＡＡＶは、高いレベルのウイルス中和抗体を産生することができる。例えば、幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００μｇ／ｍＬの量のウイルス中和抗体を発現することができる。幾つかの実施形態では、ウイルス中和抗体は、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５００μｇ／ｍＬ、又はこれらの値のうちあらゆる２つの間の範囲の量で、発現される。
【０１４１】
本願明細書に開示される方法は、例えば、被験者における感染リスクを、ウイルスの治療をしない被験者と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、低減することができる。幾つかの実施形態では、この方法は、被験者における感染リスクを、ウイルスの治療をしない被験者と比較して、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約８倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、又はこれらの値のうちあらゆる２つの間の範囲で、低減することができる。幾つかの実施形態では、この方法は、被験者における感染リスクを、ウイルスの治療をしない被験者と比較して、約５倍低減することができる。幾つかの実施形態では、この方法は、被験者における感染リスクを、ウイルスの治療をしない被験者と比較して、約２０倍低減することができる。幾つかの実施形態では、この方法は、被験者において生じたウイルス感染を予防する。幾つかの実施形態では、この方法は被験者におけるウイルス感染を阻害する。
【０１４２】
ウイルス感染の非制限例としては、アデノウイルス、アルファヴィリダエ（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）、アルボウイルス、アストロウイルス、ブニヤウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、アルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科、ガンマヘルペスウイルス亜科、ノーウォークウイルス、アストロウイルス科、カリシウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラミクソウイルス、ルブラウイルス、モルビリウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、アフトウイルス、カルジオヴィリダエ（Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｉｄａｅ）、エンテロヴィリダエ（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、コクサッキーウイルス感染症、ポリオウイルス、リノヴィリダエ（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィコドナヴィリダエ（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスヴィリダエ（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、レオヴィリダエ（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ロタウイルス、レトロヴィリダエ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、Ａ型レトロウイルス、免疫不全ウイルス、白血病ウイルス、トリ肉腫ウイルス、ラブドウイルス、ルビヴィリダエ（Ｒｕｂｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガヴィリダエ（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、及びこれらのあらゆる組み合わせ、から選択されるウイルスにより生ずる感染を含む。ウイルス感染の非制限例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、エプスタイン・バーウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、呼吸器多核体ウイルス感染を含む。幾つかの実施形態では、ウイルス感染はＣ型肝炎ウイルス感染である。幾つかの実施形態では、ウイルス感染はインフルエンザ感染である。
【０１４３】
幾つかの実施形態は、ウイルスに暴露された被験者（例えば、ウイルスに感染した別の被験者と接触した被験者）についてのウイルス感染のリスクを低減する方法を提供する。幾つかの実施形態は、ウイルスに暴露されるであろう被験者（例えば、ウイルスに感染した別の被験者と接触するであろう被験者）についてのウイルス感染のリスクを低減する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ウイルス感染を予防する方法を提供する。
【０１４４】
本願明細書に記載される、ウイルスベクター、組換え型ＡＡＶ、及び方法は、様々な疾患を治療するための１種又は複数種の治療用タンパク質を発現するために用いることができる。疾患の非制限例としては、例えば、癌、肉腫、白血病、リンパ腫、及び多発性硬化症等の自己免疫疾患を含む。癌の非制限例としては、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌；扁平上皮癌（様々な組織における）；移行上皮癌を含む膀胱癌；気管支原性肺癌；大腸癌；結腸直腸癌；胃癌；肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む肺癌；副腎皮質癌；甲状腺癌；膵癌；乳癌；卵巣癌；前立腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳頭癌；乳頭状腺癌；嚢胞腺癌；髄様癌；腎細胞癌；腺管上皮内癌又は胆管癌；絨毛癌；精上皮腫（セミノーマ）；胚性癌腫；ウィルムス腫瘍；子宮頸癌；子宮癌；精巣癌；骨肉腫；上皮性癌；及び上咽頭癌を含む。肉腫の非制限例としては、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟組織の肉腫を含む。固形腫瘍の非制限例としては、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫（メラノーマ）、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫を含む。白血病の非制限例としては、慢性骨髄増殖性疾患；急性骨髄増殖性疾患；Ｂ−細胞ＣＬＬ、Ｔ−細胞ＣＬＬ前リンパ球性白血病、及びヘアリーセル白血病を含む慢性リンパ性白血病；並びに急性リンパ性白血病を含む。リンパ腫の非制限例としては、特に限定されることなく、バーキットリンパ腫等のＢ−細胞リンパ腫；ホジキンリンパ腫；及びその同等物を含む。本願明細書に開示される、ＡＡＶベクター、組換え型ウイルス、及び方法を用いて治療することができる疾患の他の非制限例としては、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症１、テイ・サックス病、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原病（ＧＳＤ、例えば、ＧＳＤＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ，ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、及びＸＩＶ型）、ガラクトース血症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、及び血友病を含む遺伝的障害を含む。
【０１４５】
被験者中で発現される興味のタンパク質の量（例えば、被験者の血清）は変化させることができる。例えば、幾つかの実施形態では、タンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００μｇ／ｍＬ、の量で発現することができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質は、被験者の血清中で、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５００μｇ／ｍＬ、又はこれらの値のうちあらゆる２つの間の範囲の量で、発現することができる。当業者は、興味のタンパク質が当該方法を有効にするために必要となる発現レベルが、特定の興味のタンパク質及び治療を受ける被験者等の非制限的因子に依存することができ、有効量のタンパク質は角の実験なくとも当該技術分野で既知の従来の方法を用いて容易に決定することができることを、理解するであろう。
【０１４６】
当業者は、１種又は復習主のウイルスベクター、及び組換え型ＡＡＶは、本願明細書に記載される応用において一緒に用いることができることを理解するであろう。例えば、異なる興味のタンパク質、又は興味のタンパク質の異なるサブユニットを発現する組換え型ＡＡＶウイルスは、診断的及び／又は治療的目的で同じ被験者に対して投与することができる。幾つかの実施形態では、組換え型ウイルスは、被験者に対して共投与される。幾つかの実施形態では、第一の興味のタンパク質を発現する第一の組換え型ＡＡＶ、及び第二の興味のタンパク質を発現する第二の組換え型ＡＡＶは、一緒に又は別々に被験者に対して投与することができ、第一の興味のタンパク質及び第二の興味のタンパク質は同じもの又は異なるものとすることができる。幾つかの実施形態では、第一の興味のタンパク質は抗−ＨＩＶ中和抗体、第二の興味のタンパク質は異なる抗−ＨＩＶ中和抗体である。幾つかの実施形態では、第一の興味のタンパク質は抗−インフルエンザ中和抗体であり、第二の興味のタンパク質は異なる抗−インフルエンザ中和抗体である。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質の第一のサブユニットを発現する第一の組換え型ＡＡＶ、及び興味のタンパク質の第二のサブユニットを発現する第二の組換え型ＡＡＶは、被験者に対して一緒に又は別々に投与することができる。
【０１４７】
［薬学的組成物及び投与方法］
本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶウイルスを含む薬学的組成物、及び薬学的に許容可能なキャリアも、本願明細書に開示される。組成物は、希釈剤、安定化剤、賦形剤、及びアジュバンド等の追加の成分も含むことができる。本願明細書で用いられる「薬学的に許容可能な」キャリア、賦形剤、希釈剤、アジュバンド、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度においてさらされる細胞又は被験者にとって無毒（好適には不活性）であるか、又は、当行者により決定される許容可能なレベルで毒性があるものである。
【０１４８】
キャリア、基借財、及びアジュバンドは、リン酸、クエン酸、若しくは他の有機酸等のバッファ；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリシン等のアミノ酸；モノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール若しくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩−形成カウンターイオン；並びに／又はＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含むことができる。幾つかの実施形態では、生理的に許容可能なキャリアは水性ｐＨ緩衝液である。
【０１４９】
投与することができる組換え型ＡＡＶウイルスの力価は、例えば特定の組換え型ＡＡＶウイルス、投与モード、治療目的、個体、及び標的とされる細胞型に依存して変化させることができ、当該技術分野において標準的な手法により決定することができる。
【０１５０】
当業者に明らかなように、投与することができる有用な組換え型ウイルスのインビボの用量、及び投与の特定のモードは年齢、体重、苦痛の重症度、及び治療される動物種、用いられる興味のタンパク質を発現する特定の組換え型ウイルス、並びに、組換え型ウイルスが用いられる特定の用途に依存して変化する。用量レベル、すなわち、所望の結果を達成するために必要な用量レベルの決定は、通常の薬学的方法を用いて当業者により行われる。一般的に、生成物のヒト臨床応用は低用量レベルで開始され、所望の効果が達成されるまで用量を増大させる。代わりに、許容可能なインビトロ研究を、確立された薬学的手法を用いて当該方法により規定される組成物の投与についての有用な用量及び経路を確立するために用いることができる。
【０１５１】
実際の用量は薬剤ごとに決定されるが、ほとんどの場合、用量に関していくらかの一般化をなすことができる。幾つかの実施形態では、興味のタンパク質を発現する組換え型ＡＡＶは、被験者のｋｇ当たり組換え型ウイルスの１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）及びｋｇ当たり１×１０１３ＧＣの間、例えば、５×１０１１ＧＣ／ｋｇ及び５×１０１２ＧＣ／ｋｇの用量で、被験者に注射により投与することができる。
【０１５２】
本願明細書に開示される組換え型ウイルスは、それを必要としている被験者（例えば、ヒト）に対して投与することができる。投与のルートは特に限定されない。例えば、治療的に有効量の組換え型ウイルスは、当該技術分野において標準的なルートにより被験者に投与することができる。ルートの非制限例としては、筋肉内、腟内、静脈内、腹腔内、皮下、皮膚上、皮内、直腸、眼内、肺、頭蓋内、骨内、口、頬側、又は鼻を含む。幾つかの実施形態では、組換え型ウイルスは筋肉内注射により被験者に対して投与される。幾つかの実施形態では、組換え型ウイルスは腟内注射により被験者に対して投与される。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、非経口的ルートにより（例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下注射により）、表面乱切により、又は被験者の体腔への接種により、被験者に対して投与される。組み換え型ＡＡＶウイルスについての、投与ルート及びＡＡＶ構成要素の血清型は、治療される感染及び／又は疾患の状態、並びに興味のタンパク質を発現する標的の細胞／組織を考慮に入れて、当業者者により容易に決定することができる。幾つかの実施形態では、組換え型ウイルスは筋肉細胞に対して投与される。
【０１５３】
組換え型ＡＡＶウイルスの実際の投与は、組換え型ＡＡＶウイルスを被験者の標的組織に輸送するあらゆる物理的方法を用いることによって行うことができる。例えば、組換え型ＡＡＶウイルスは筋肉、血流、及び／又は直接的に肝臓に注射することができる。組換え型ＡＡＶウイルスのカプシドタンパク質は、組換え型ＡＡＶウイルスが筋行く及び膣等の特定の興味の標的組織に向けられるように、変性することができる。薬学的組成物は、経皮輸送により筋肉まで運搬することができる、注射可能な製剤として、又は、局所製剤として、調製することができる。
【０１５４】
筋肉内注射について、ゴマ又はピーナッツオイル等のアジュバンド中、又は水性プロピレングリコール中の溶液、及び無菌の水溶液を用いることができる。かかる水性溶液はバッファとすることができ、所望ならば、液体の基借財はまず生理食塩水又はグルコースと共に等張にされる。フリーアシッド（ＤＮＡは酸性のリン酸基を含む）としての組換え型ＡＡＶウイルス、又は薬学的に許容可能な塩の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合して、水中で調製することができる。組み換え型ＡＡＶウイルスの分散は、グリセロール、液体のポリエチレングリコール、及びその混合物中、並びにオイル中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を予防するための保存剤を含む。
【０１５５】
用いることができる組換え型ウイルスは、液体又は凍結乾燥物の形式で（凍結乾燥工程中ウイルスを保護するための、１種又は複数種の適切な保存剤及び／又は保護材と組み合わせて）用いることができる。遺伝子治療（例えば、特定の遺伝子産物により寛解され得る神経障害）のために、治療的に有効用量の、治療用タンパク質を発現する組換え型ウイルスを、かかる治療を必要とする宿主に対して投与する。宿主に免疫を誘導し、又は遺伝子治療を提供する医薬の製造における、本願明細書に開示される組換え型ウイルスの使用も本願の範囲内にある。
【０１５６】
組換え型ＡＡＶウイルスのヒトへの用量が少なくとも何らかの症状について確立している例では、それと同じ用量、又は確立されたヒトへの用量の約０．１％〜５００％の間、より好ましくは約２５％〜２５０％の間である用量を用いることができる。非ヒトの用量が確立している場合には、新規に発見された薬学的組成物の場合と同様に、適切なヒトへの用量をＥＤ５０又はＩＤ５０の値、又は、動物における毒性試験及び効能試験により定められるような、インビトロ若しくはインビボ研究から得られた他の適切な値から与えることができる。
【０１５７】
治療的に有効量の組換え型ＡＡＶは様々な時間点で被験者に対して投与することができる。例えば、組換え型ＡＡＶは、ウイルスによる感染前、中、後に被験者に対して投与することができる。組換え型ＡＡＶは、疾患（例えば、ガン）の発症前、中、後に被験者に対して投与することができる。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、ガン寛解中に被験者に対して投与することができる。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶは、免疫学的予防用のウイルスによる感染前に投与される。
【０１５８】
組換え型ＡＡＶウイルスの投薬回数は変化させることができる。例えば、組換え型ＡＡＶウイルスは、１週間に約１回、２週間に約１回、１月に約１回、６月に約１回、１年に約１回、２年に約１回、３年に約１回、４年に約１回、５年に約１回、６年に約１回、７年に約１回、８年に約１回、９年に約１回、１０年に約１回、１５年に約１回、被験者に対して投与することができる。幾つかの実施形態では、組換え型ＡＡＶウイルスは、多くとも１週間に約１回、多くとも２週間に約１回、多くとも１月に約１回、多くとも６月に約１回、多くとも１年に約１回、多くとも２年に約１回、多くとも３年に約１回、多くとも４年に約１回、多くとも５年に約１回、多くとも６年に約１回、多くとも７年に約１回、多くとも８年に約１回、多くとも９年に約１回、多くとも１０年に約１回、多くとも１５年に約１回、被験者に対して投与することができる。
【実施例】
【０１５９】
追加の実施形態を下記の実施例において更に詳細に開示するが、いかなる意味においても請求項の範囲を限定するものではない。
【０１６０】
［実験材料及び方法］
下記の実験材料及び方法を以下の実施例１〜９について用いた。
【０１６１】
［ＡＡＶ定量及び機能的検証］
精製したＡＡＶを下記の一般的手順を用いてｑＰＣＲにより定量した。凍結したＡＡＶのアリコットを融解し、１０ユニットのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を含む処理バッファ中１０倍希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ処理したウイルスを連続的に希釈し、５ｍＬの各希釈を、ＰｅｒｆｅＣＴａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｚ，Ｒｏｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び、ＣＭＶエンハンサー（５’ＣＭＶ：ＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号：３１）、３’ＣＭＶ：ＧＧＧＣＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴ（配列番号：３２））又はルシフェラーゼ導入遺伝子（５’Ｌｕｃ：ＡＣＧＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＡＣＣＧ（配列番号：３３）、３’Ｌｕｃ：ＡＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧ（配列番号：３４））に対してデザインされたプライマーを用いた、１５μＬのｑＰＣＲ反応に用いた。サンプルを２回、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍに供した。下階のサイクリング条件を用いた：５０℃２分１サイクル、９５℃１０分１サイクル、９５℃１５秒及び６０℃６０秒４０サイクル。ウイルス力価を、ｐＶＩＰルシフェラーゼ発現ベクターをＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで切断した精製ＤＮＡ断片、又は、前もってＤＮＡ標準に対して滴定した精製済みの４Ｅ１０抗体を発現するＡＡＶ２／８からなる対照標準のいずれかを用いて作成した標準曲線と比較して、決定した。
【０１６２】
滴定したウイルスの各ロットの機能的活性を検証するため、インビトロ感染アッセイを２９３Ｔ細胞を用いて、抗体の濃度を細胞上澄み中で測定した。感染２４時間前、１２ウェルプレートに１ｍＬ培地中の５００Ｋ細胞を播種した。感染２時間前、培地をウェル当たり５００μＬの新鮮な培地で置換した。各ウイルスのゲノムコピー（１０１１）を各ウェルに加え、６日間感染させた。上澄みを取り出し、ＤＬＩＳＡにより総ＩｇＧ産生を定量した。
【０１６３】
［マウス株］
免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ（ＮＳＧ）、免疫適格のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、及びＢａｌｂ／Ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。免疫不全のＲａｇ２／gｃマウスをＡ．Ｂｅｒｎｓから得た。
【０１６４】
［ＡＡＶ筋肉内注射及び生物発光イメージング］
前もって滴定したウイルスのアリコットを氷上でゆっくりと融解し、ＴＦＢ２中に希釈して、４０μＬ容量の所定用量を得た。マウスをイソフルラン吸引により麻酔し、４０μＬ１回注射を２８Ｇインスリンシリンジを用いて腓腹筋に投与した。ベクター投与後様々な時間点で、マウスを、血清中の抗体濃度を決定するために出血させるか、又は、ゼノジェン（登録商標）ＩＶＩＳ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて画像化した。画像化するために、マウスをイソフルラン吸引により麻酔し、１００μＬの１５ｍｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン（Ｇｏｌｄ  Ｂｏｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を腹腔内注射により与えた。画像をＤ−ルシフェリン注射後５〜１０分の間に撮った。
【０１６５】
［ＤＬＩＳＡによる抗体産生の定量］
総ヒトＩｇＧを検出するために、ＥＬＩＳＡプレートを１ウェル当たり１μｇのヤギ抗−ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）で１時間被覆した。プレートを、ＴＢＳ中の１％ＢＳＡ（ＫＰＬ）で少なくとも２時間ブロックした。サンプルを１％ＢＳＡ（ＫＰＬ）を含むＴＢＳＴ中で室温で１時間インキュベートし、その後、ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトカッパ軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて３０分間インキュベートした。サンプルを、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ）を用いて検出した。標準曲線を、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｌｏｔ３、Ｂｅｔｈｙｌ）又は精製ヒトＩｇＧ／Ｋａｐｐａ（Ｂｅｔｈｙｌ）のいずれかを用いて作成した。
【０１６６】
ｇｐ１２０−結合ＩｇＧを検出するために、ＥＬＩＳＡプレートを１ウェル当たり０．０４−０．１０μｇのＨＩＶ−１ｇｐ１２０ＭＮタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１時間被覆した。サンプルを１％ＢＳＡ（ＫＰＬ）を含むＴＢＳＴ中で室温で１時間インキュベートし、その後、ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて３０分間インキュベートした。サンプルを、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ）を用いて検出した。標準曲線を、精製ｂ１２又はＶＲＣ０１タンパク質のいずれかをサンプルに対して適切に用いて作成した。
【０１６７】
［ＨＩＶウイルスの産生及び力価］
２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンミックス（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１％グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにおいて維持した。トランスフェクション３日前に、２つの１５ｃｍプレートに、各２５μＬ培地中の３．７５×１０６細胞を播種した。トランスフェクション２時間前に、培地を１５ｍＬの新たな培地に交換した。４０μｇのＨＩＶの感染力ある分子クローンをコードするｐＮＬ４−３プラスミド３６を、製造業者の指示に従って、Ｔｒａｎｓ−ＩＴ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション２４、４８、及び７２時間後に、上澄み回収を行い、それぞれの培養後に１５ｍＬの新鮮な培地をプレートにゆっくりと加えた。集めた上澄みを０．４５μｍフィルターを用いてフィルターして、細胞片を取り除き、−８０℃での保存のためにアリコットした。ＨＩＶを、製造業者の指示に沿って、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量した。
【０１６８】
［インビトロＨＩＶ保護アッセイ］
ルシフェラーゼレポーター細胞中でのインビトロ中和アッセイを、下記の一般的な手順に従って行った。国立保健研究所の“ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ”から得たＴＺＭ−ｂｌ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンミックス（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１％グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにおいて維持した。アッセイの前に、ＴＺＭ−ｂｌ細胞をトリプシン処理し、計数し、合計容量１５ｍＬで１ｍＬ当たり１０５細胞の濃度で再懸濁した。細胞を、７５μｇ／ｍＬのＤＥＡＤ−デキストラン、及び図示される様々な濃度の各抗体と混合し、ウイルスの調製中氷上でインキュベートさせた。ウイルス希釈を調製するために、保存のＮＬ４−３を生育培地中で２５０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、その後、アッセイプレート中で４倍の系列希釈をした。抗体とプレインキュベートした１００００細胞を含む１００μＬの培地を、前もって希釈したウイルスを含むウェルに加えた。感染を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにいて４８時間進行させた。プレートを読む前に、１００ｍＬｎｏＢｒｉｔｅＬｉｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルに加え、プレートを室温で２分間インキュベートした。各ウェルの１２０μＬをその後不透明プレートに写し、ＶＩＣＴＯＲ３（Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＶＩＣＴＯＲ３  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により読んだ。
【０１６９】
［インビボ感染用のヒト化マウス］
ヒト化マウスを実質的に下記の手順に従って産生した。ヒト末梢血単核細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）を−８０℃から融解し、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンミックス（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１％グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、５０μＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１３非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ培地中に増殖させ、Ｔ−細胞増加のために５μｇ／ｍＬのフィトヘムアグルチニン（Ｓｉｇｍａ）及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いて３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにおいて刺激した。細胞を使用前に７〜１３日間増殖させた。生着のため、２ミリオン〜４ミリオンの細胞を３００ｍＬ容量の培地中で、ＮＳＧマウスに腹腔内で注射した。
【０１７０】
［ＨＩＶ保護実験］
ＨＩＶ感染の１日前に、各マウスからの血液サンプルを、抗体定量のためのＥＬＩＳＡ及びベースラインとなるＣＤ４／ＣＤ８比を決定するためのフローサイトメトリーの両方に供した。翌日、マウスを、ＰＢＳ中に希釈した特定の用量のＨＩＶを含む１００μＬの腹腔内又は静脈内注射のいずれかにより感染させた。感染させたマウスについて、T細胞サブセット中のＣＤ４とＣＤ８との比をフローサイトメトリーにより決定するために、毎週の血液サンプリングを行った。
【０１７１】
［フローサイトメトリー］
血液サンプルを、後眼窩採決によりマウスから採取し、１１５０ｇで５分間遠心分離して血漿を細胞ペレットから分離した。血漿は、取り出されて将来の分析のために凍結され、細胞ペレットは１．１ｍＬの１×ＲＢＣ溶解バッファ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中に再懸濁され赤血球細胞を取り除くために少なくとも１０分間氷上でインキュベートされた。溶解後、サンプルを微小遠心管中、室温で５分間１１５０ｇでペレットにし、５μＬの抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、５μＬの抗−ヒトＣＤ４−ＰＥ、５μＬの抗−ヒトＣＤ８ａ−ＡＰＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び、２％ウシ胎仔血清（ＰＢＳ１）を添加した５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水を含む６５μＬのカクテルを用いて染色した。サンプルを１ｍＬのＰＢＳ＋で洗浄し、微小遠心管中５分間１１５０ｇで再びペレットにした。ペレットにした細胞を、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した２００μＬのＰＢＳ＋中に再懸濁して、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｃｅｃｋｔｏｎ−Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。サンプルを、このサブセット内のＣＤ４とＣＤ８細胞の非を決定する前に、初めにＣＤ３発現でゲートをかけた。２０未満のＣＤ３＋の現象を有するサンプルは分析から除外した。
【０１７２】
［ＨＩＶｐ２４についての組織学的染色］
インビボ投与実験の結果、脾臓をマウスから取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中に２４時間含浸した。固定後に組織を取り出し、標準的なパラフィン包埋及び処理まで７０％エタノール中においた。一片（４ｍｍ厚）をその後採取し、Ｋａｌ−１マウスモノクローナル抗体及び標準的な抗原回復手法を用いて、免疫組織化学染色をＨＩＶ−ｐ２４検出のために行った。スライドは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ上で病理学者（Ｄ．Ｓ．Ｒ．）により観察され、ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて画像が得られた。
【０１７３】
（実施例１）モジュラーＡＡＶ導入ベクターの構築及びクローニング
ＡＡＶ導入ベクターを構築するために、１４５塩基対（ｂｐ）の、ユビキチン制限部位により分離された、「フリップ」方向のＡＡＶ２−由来の末端逆位配列１（ＩＴＲ１）及び「フロップ」配列のＩＴＲ２をコードするオリゴヌクレオチドを合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＢＲ３２２プラスミドベクターにライゲーションする前にアニールした。その後、適した部位に挟まれた、プロモーター、導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルをＰＣＴにより増幅し、ＩＴＲ間でクローン化して、制限部位の特有の組み合わせが各要素を挟む、モジュラーＡＡＶ導入ベクターを得た。
【０１７４】
筋肉発現における様々なプロモーターの発現能力を評価するため、パネルの遍在及び組織特有のプロモーターにより動かされるルシフェラーゼ遺伝子を有する一連のベクターを作製した。これらのベクターを、腓腹筋に単回投与により筋肉内で投与し、ルシフェラーゼ発現をモニターして、この標的組織における各プロモーターの相対的な発現能力を決定した。サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、キメラトリ−β−アクチン（ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターは、着実な筋肉発現を与えた（図１Ａ）
【０１７５】
新規の合成ＣＡＳＩプロモーター（長さ約１．０５ｋｂ）を生成した（図１Ｂ）。ＣＡＳＩプロモーターは、転写開始部位を含む、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）とそれに続くトリ−β−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの断片からなる。この融合体には、直後に、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターのエンハンサー領域を挟む共通のスプライス供与及びスプライス受容配列を用いる、合成的にデザインされたイントロンが続いている。インビボ試験は、ＣＡＳＩプロモーターが３４％超コンパクトであるにも拘らず、ＣＡＧプロモーターよりも筋肉において大幅に活性があることが示された（図１Ｃ）。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をその後ＡＡＶ導入ベクターに導入したところ、導入遺伝子の発現を有意に向上させた（図１Ｄ）。
【０１７６】
様々なポリアデニル化シグナルの効率も筋肉由来の発現について調べた。ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）、ウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）ポリ（Ａ）、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）の全ては、同等のレベルの発現を示した（図１Ｄ）。
【０１７７】
図１Ｅは、モノクローナル抗体由来の重鎖及び軽鎖Ｖ領域を挿入することができる、ＩｇＧ１スキャフォールドをコードする筋肉−最適化発現ベクターの一部の模式図を示す。
【０１７８】
図２は、挿入されたルシフェラーゼ導入遺伝子を有する、筋肉−最適化発現ベクターのマップの模式図を示す。補足図２に示される通り、ベクターは、各モジュラー要素に挟まれた特有の制限部位を有する（例えば、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＮｈｅＩ）。このベクターでは、ＡＡＶ配列は、ＸｈｏＩ制限部位に直後に続き、ＡＡＶ２由来の１４５ｂｐの「フリップ」末端逆位配列（ＩＴＲ）を有し、ＳｐｅＩ制限部位及びＣＡＳＩプロモーターに続く。ＣＡＳＩプロモーターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子のＡＴＧの前に、ＮｏｔＩ制限部位、及びコザック共通配列を模倣する共通認識配列のＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号：３５）切断部位に続く１つの追加のＣ残基に続く。導入遺伝子の３’末端は、ＢａｍＨＩ部位の前に、ＴＡＡストップコドンで終結し、１つの追加のＡ残基に続く。ＷＰＴＥ要素は、この制限部位に続き、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルに先立つＡｃｃ６５Ｉ制限部位、及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位まで続く。加えて、２つ目の１４５ｂｐＡＡＶ２「フロップ」−ＩＴＲがＮｈｅＩ部位の前に位置する。
【０１７９】
（実施例２）組換え型ＡＡＶウイルスの産生及び精製
組換え型ＡＡＶウイルスを、以下に記載する手順による培養物の上澄みで産生及び精製した。
【０１８０】
２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンミックス（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１％グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ中に、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにおいて維持した。トランスフェクションの３日前に、４つの１５ｃｍプレートについて、３．７５×１０６細胞を各２５ｍＬの培地中に、播種した。代わりに、トランスフェクションの４日前に、１プレートにつき、１．８７５×１０６細胞を、播種した（ウイルス当たり７．５×１０６細胞を播種）。トランスフェクションの２時間前に、培地を１５ｍＬの新鮮な培地に交換した。
【０１８１】
ＡＡＶ導入ベクターを、アデノウイルスヘルパーベクター（ｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）又はｐＡｄ−ｄｅｌｔａ−Ｆ６）、及びＡＡｖ（ｐＡＡＶ２／８  ＳＥＥＤ）のＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子産物を発現するヘルパープラスミドを用いて、０．２５：１：２で、Ｂｉｏトランスフェクション試薬（Ｂｉｏｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、同時トランスフェクションした。トランスフェクション当たりに用いられたＤＮＡの総量は８０μｇであった。５つのＡＡＶウイルス回収を、トランスフェクションの３６、４８、７２、９６、及び１２０時間後に行った。各時間点において、培地を０．２μｍフィルターにより濾過し、１５ｍＬの新鮮な培地をゆっくりとプレートに加えた。
【０１８２】
回収後、約７５ｍＬの５×ＰＥＧ溶液（４０％ポリエチレングリコール、２．５Ｍ  Ｎａｃｌ）を、回収された上澄みの全量（〜３００ｍＬ）に加え、ウイルスを氷上で少なくとも２時間沈殿させた。珍談させたウイルスは、７２７７ｇで３０分間（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ３Ｂ  Ｐｌｕｓ、Ｈ−６０００Ａ  ｒｏｔｏｒ）でペレットにし、１．３７ｇ／ｍＬの塩化セシウム中に再懸濁した。再懸濁したウイルスを、Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）中に均等に分け、３２９７３８ｇで２０℃で２４時間スパンした（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、  Ｏｐｔｉｍａ  ＬＥ−８０Ｋ、７０Ｔｉ  ｒｏｔｏｒ）。１００−２００ｍＬの画分を９６ウェル平底組織培養プレート中に回収し、屈折計を用いて５ｍＬの各画分の屈折率を定量した。屈折率が１．３７５５及び１．３６５５の間を示すウェルを混ぜ合わせ、ＴＥＳＴ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２（ＴＦＢ２、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭトリス、ｐＨ８）を用いて、最終容量１５ｍＬに希釈した。ウイルスを１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に加え、１ｍＬの残余分が残るまで４℃で５００ｇで遠心分離した。残ったウイルスをその後再び、ＴＦＢ２中で最終容量１５ｍＬに希釈し、この操作をウイルスが３回洗浄されるように繰り返した。最終残余分の容量は全部で５００〜１０００ｍＬの間であり、アリコットして−８０℃で保存した。
【０１８３】
（実施例３）抗体導入遺伝子の最適化
抗体の発現について最適なフレームワークを作るため、Ｆ２Ａ自己プロセッシングペプチド配列により分離された、幾つかの広範な中和ＨＩＶ抗体の重鎖及び軽鎖を、ＣＭＶプロモーターのコントロールの下、哺乳類発現ベクターにクローン化した。これらのベクターでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出され得る培養物の上澄み中に、ヒトＩｇＧの分泌を示した（図３Ａ）。発現を向上させるため、Ｆ２Ａ配列を、哺乳類のコドン使用頻度をよく反映させるために再操作し、また、最適なプロセッシングのためにそのＮ末端にフリン切断部位を導入した。最適化されたＦ２Ａ配列を有するベクター（配列番号：９）と、標準のＦ２Ａ配列を有するベクター（配列番号：１０）とをトランスフェクションによる比較により、最適化されたＦ２Ａ配列を有するベクターが、より高いレベルでテストされた４つ全ての抗体を産生することが示した。
【０１８４】
抗体の分泌を向上させるために、内在的なシグナル配列を、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）由来のコドン最適化配列と置き換え、重鎖、軽鎖、又は両鎖のいずれかが分離したＨＧＨシグナル配列により動かされる４Ｅ１０発現ベクターのバージョンを作製し、トランスフェクションによりそれらの発現を比較した。ベクター中の繰り返し配列を最小化するために、２つのＨＧＨ配列（配列番号：１１及び１２）を合成した。異なるヌクレオチド配列を有するが、同じアミノ酸をコード化し、それぞれは重鎖又は軽鎖のいずれかにのみ用いられる。重鎖又は軽鎖のいずれかでの内在的シグナル配列のＨＧＨ配列での置換により、より高いレベルの抗体産生が得られ、両鎖のシグナル配列の置換により最高の結果が得られた（図３Ｂ）。
【０１８５】
抗体をコード化する転写物の不適切なスプライシングの可能性を取り除くために、配列をインシリコのスプライス予測に供し、その部位、又は、これが可能でないときは周辺配列に、保存的変位を用いて、可能性のあるスプライス供与及び受容配列の全てを取り除いた。このスプライス−最適化フレームワーク中におかれたとき、４Ｅ１０抗体の向上した発現が観察された（図３Ｃ）。
【０１８６】
最終の抗体導入遺伝子の構造の模式図を図３Ｄに示す。図３Ｄに示すように、抗体導入遺伝子は、ＨＧＨシグナル配列と、それに続く交換可能なＶＨ領域、スプライス−最適化された重鎖定常領域、２つ目のＨＨシグナル配列と融合した最適化したＦ２Ａペプチドに結合したフリン切断部位、交換可能なＶＬ領域、及びスプライス−最適化されたカッパ軽鎖定常領域、からなる。
【０１８７】
遺伝子発現を向上させるためになされた上記最適化が、抗体の中和能力に影響を与えていないことを確認するために、数種類のよく研究された広範な中和抗体（例えば、ｂ１２、２Ｇ１２、４Ｅ１０、及び２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体）を、最適化した発現ベクターから発現させた。産生した抗体を精製し、ＴＺＭ−ｂｌルシフェラーゼレポーター細胞を用いたインビトロプロテクションアッセイで試験した。ＨＩＶの量を増加させながらの投与する前に、ＨＩＶ−誘発翻訳因子（ＴＺＭ−ｂｌ細胞）のコントロールの下、ルシフェラーゼ遺伝子を有する細胞を、各抗体の希釈物とインキュベートした。細胞を、ＮＬ４−３  ＨＩＶ株の力価を増大させながら投与する前に、様々な濃度の抗体と共に播種した。投与の２日後、細胞をリンスし、ルシフェリン基質の添加後ルシフェラーゼ活性を定量した。ＴＺＭ−ｂｌ細胞感染における着実な低減が、以前に確立された、この株についてテストされた４つの抗体全てに関するＩＣ５０及びＩＣ９０の値とよく相関する抗体濃度で、観察された（図４Ａ−Ｄ）。
【０１８８】
（実施例４）抗体導入遺伝子のインビボ発現
ルシフェラーゼ、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより動かされる４Ｅ１０ＨＩＶ中和抗体のいずれかを発現する、血清型８由来のカプシドを有する組換え型ＡＡＶウイルスを、腓腹筋への単回注射によりマウスに投与した。１×１０１０ゲノムコピーのルシフェラーゼを発現するＡＡＶ２／８を筋肉内注射して１５週後の、代表的なＲａｇ２／γｃマウスのゼノジェン画像を示す（図５Ａ）。投与の１週間以内に、ルシフェラーゼ又は抗体遺伝子発現のいずれかが検出できた（それぞれ、図５Ｂ及び５Ｃ）。発現は上昇し続け、１２〜１６週後に最大に達し、その後２から３倍減少し、少なくとも６４週間の研究の期間に亘って安定した。図５Ｂ−Ｃは、抗体産生が用量依存的であり、少なくとも６４週間維持されたことを示す。
【０１８９】
ＨＩＶ−中和ｂ１２抗体の重鎖及び掲載可変領域を、ＡＡＶ導入ベクターにクローン化し、２つの免疫不全、及び２つの免疫適格のマウス株：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ（ＮＳＧ）、Ｒａｇ２／γｃ（ＲＡＧ）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、及びＢａｌｂ／Ｃの腓腹筋中への１×１０１１ゲノムコピーの筋肉内投与について、組換え型ＡＡＶストックを産生させた。マウスは、コード化された抗体を、非最適化ベクターを用いて達成されるレベルとよりも１００倍高い血清濃度で産生し、この発現レベルは少なくとも５２週間続いた（図５Ｃと比較した図６）。Ｂ６マウス中でヒトｂ１２−ＩｇＧに対して非常に限られたマウス抗体が生じ、Ｂａｌｂ／Ｃ動物はヒトＩｇＧレベルに影響を与えないと見られる導入遺伝子に対する検出可能なマウス抗体を生じた。
【０１９０】
（実施例５）ＨＩＶ投与により生じるＣＤ４細胞の喪失の予防
ＨｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウスは、複製可能なＨＩＶを用いた投与後にＣＤ４細胞欠損を示す（２０ｎｇ  ｐ２４  ＮＬ４−３、ｎ＝４、図７）。このマウスモデルを、インビボ投与からマウスを保護するための本願明細書に記載されるベクターの能力をテストするために用いた。
【０１９１】
ルシフェラーゼ又はｂ１２抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを、ＮＳＧマウスに投与し、６週間以内に、濃度約１００μｇ／ｍＬの安定な血清ｂ１２抗体を産生させた。これらのマウスに、増殖した末梢血単核球（ｈｕＰＢＭＣｓ）を適合的に移植し、２週間の間に亘って生着させた。マウスをその後、ＨＩＶのＮＬ４−３株の腹腔内注射により投与した。
【０１９２】
ＨＩＶ投与の後、ルシフェラーゼを発現する大部分のマウスは、ＣＤ４細胞の劇的な喪失を示したが、ｂ１２抗体を発現するマウスはＣＤ４細胞の欠損を全く示さなかった（図８Ｂ）。
【０１９３】
この実施例は、抗−ＨＩＶ抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスが、ＨＩＶ感染により生じるＣＤ４細胞の喪失からマウスを保護することができることを示す。
【０１９４】
（実施例６）様々なＨＩＶ中和抗体を用いた保護
様々な広範な中和ＨＩＶ抗体の保護能力を比較するために、ｂ１２、２Ｇ１２、４Ｅ１０、及び２Ｆ５を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを、それぞれ産生してＮＳＧマウスに投与した。投与７週間後、ＮＳＧマウスは２０−２５０μｇ／ｍＬの図示の抗体を産生した。各ＨＩＶ抗体のインビボの血清濃度を測定した。結果を図３Ａに示す。
【０１９５】
形質導入されたマウスに、ｈｕＰＢＭＣｓを適合的に移植し、ＨＩＶを静脈内注射により投与し、経時的にＣＤ４細胞の欠損を定量するために毎週資料採取した（図９Ｂ）。図９Ｂに示されるように、ｂ１２を発現する動物は、感染から完全に保護され、２Ｇ１２、４Ｅ１０、及び２Ｆ５を発現するものは部分的に保護された。部分的な保護を示した群は、遅れたＣＤ４細胞の欠損のある動物、及び実験コースを通して高いＣＤ４細胞レベルを維持した動物、からなる。
【０１９６】
投与８週間後、マウスを殺処分し、感染の程度を定量するために、パラフィン包埋の脾臓部位を、ＨＩＶ−発現ｐ２４抗体について、の疫組織化学的染色に供した。
【０１９７】
（実施例７）抗−ＨＩＶ保護の頑強性の決定
ｂ１２抗体を発現するマウスの大コホートに、ｈｕＰＢＭＣｓを適合的に移植した。投与前に、全マウスは高レベルのヒトＩｇＧを発現しており、これは生着させたヒトＢ細胞によるものと思われた（図１０Ａ）が、ｂ１２−発現ベクターを受けたもののみが、ｇｐ１２０に特異的なＩｇＧを産生し、１００μｇ／ｍＬに達した（図１０Ｂ）。
【０１９８】
ルシフェラーゼ又はｂ１２のいずれかを発現するモック感染のマウスは、着実な高レベルのＣＤ４細胞生着を、実験コースを通して、示し、導入遺伝子の毒性はＣＤ４細胞喪失に寄与していないことを示した（図１１）。対照的に、１ｎｇのＨＩＶを受けたルシフェラーゼを発現する細胞は、迅速かつ大規模なＣＤ４細胞の欠損を生じた。高用量では、ルシフェラーゼを発現するマウスにおける感染は、より着実であり、幾つかのケース（２５、１２５ｎｇ）において検出レベル以下ＣＤ４細胞の欠失となった。特記すべきことに、ｂ１２を発現する全てのマウスは、８つ中７つのコントロール動物において欠損するための必要量の１００倍超のＨＩＶ用量を受けているにも拘らず、ＣＤ４細胞喪失からの保護を示す（図１１）。
【０１９９】
この実施例は、本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶウイルスが、ＨＩＶ感染に対して効果的且つ頑強な免疫学的予防を提供するために用いることができることを示す。
【０２００】
（実施例８）ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体の発現
図１２Ａは、ＡＡｖ投与青に採取された血清サンプルについての、総ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより決定した、用量に応じた、経時的なｂ１２発現を示すプロットである（ｎ＝８）。ルシフェラーゼ−発現ベクターを受けたマウスは、検出可能なヒト抗体を示さなかった（ｎ＝１２）。図１２Ｂは、投与１日前、ヒトＰＢＭＣｓの適合的導入の３週間後、及び、ＨＩＶに結合することができる抗体の断片を測定するためのｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡにより決定される図示した用量のＡＡＶの筋肉内投与の１５週間後における、血清中のｂ１２の濃度を示す（ｎ＝８−１２）。図１２Ｃは、ｂ１２の範囲を発現する動物への１０ｎｇのＮＬ４−３の静脈内投与の結果として、ｈｕＰＢＭＣ−ＮＳＧヒト化マウスにおけるＣＤ４細胞欠損を示し、感染に対する保護に必要な抗体の最小用量を示す。図１２Ａ及びＣに、平均及び標準誤差を示し、プロットＢは個別の動物及び平均を示す。
【０２０１】
（実施例９）抗−ＨＩＶ保護におけるｂ１２及びＶＲＣ０１抗体の比較
この実施例では、ｂ２抗体をＶＲＣ０１抗体と比較し、抗−ＨＩＶ抗体がインビトロで９０％超の血液循環のＨＩＶ株を中和することを見出した。ｂ１２又はＶＲＣ０１のいずれかを発現するベクターの用量を減少させながらＮＳＧマウスに投与し、経時的な抗体の発現をモニターした。
【０２０２】
両方の抗体について、用量依存的な発現が分析された全ての時間点において観察された（図１２Ａ、及び図１３Ａ）。様々なレベルのルシフェラーゼ又は抗体を発現するマウスに、ｈｕＰＢＭＣを適合的に生着させた。投与直前に、ｇｐ１２０−特異的な酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により各群における効果的な抗体濃度を確認した（図１２Ｂ、及び図１３Ｂ）。１０ｎｇのＨＩＶによる静脈内投与の後、ＣＤ４細胞をモニターして抗体濃度の影響を決定した。平均３４μｇ／ｍＬのｂ１２濃度、及び８．３μｇ／ｍＬのＶＲＣ０１濃度が、感染からマウスを保護した（図１２Ｃ、及び図１３Ｃ）。低能度のｂ１２及びＶＲＣ０１を発現する群は、部分的に保護され、検出可能なＣＤ４の喪失は見られない動物も、ＣＤ４細胞の欠損の遅れを示す動物もあった。
【０２０３】
（実施例１０）インフルエンザ感染からの保護
この実施例では、本願明細書に開示されるＡＡＶベクターを、抗−インフルエンザ抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを産生するために用い、組換え型ＡＡＶウイルスがインフルエンザウイルス感染からマウスを保護するのに効果的であることが見出された。
【０２０４】
（実験材料及び方法）
［インフルエンザウイルス産生及び定量］
この実施例におけるマウス感染に用いられる全てのインフルエンザウイルスは、その６つの内部遺伝子（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ）が、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株に由来する。ＨＡ及びＮＡ遺伝子は、下記の３つの株に由来し、下記の略号が与えられる：
（１）ＰＲ８：Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ及びＮＡ、広く用いられている実験用株
（２）ＣＡ／０９：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ及びＮＡ、ヒトにおける２００９年豚由来のＨ１Ｎ１の大流行発生の所期に単離された株
（３）ＳＩ／０６：Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡ及びＮＡ、季節性のヒトＨ１Ｎ１ワクチン株
【０２０５】
インフルエンザウイルスは、８−プラスミド  双方向逆遺伝学システムを用いて発生させた。手短に言えば、２９３Ｔ及びＭＤＣＫ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１％Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に維持した。２９３Ｔ及びＭＤＣＫ細胞の共培養物を含む６−ウェル細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、２５０ｎｇの各８つのプラスミドを用いてコトランスフェクトした。トランスフェクション１４時間後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、インフルエンザ生育培地、及び３μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を細胞に加えた。インフルエンザ成長培地は、０．０１％ウシ胎仔血清、０．３％ウシ血清アルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍＬ塩化カルシウムを有する、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる。７２時間後、上澄みを回収し、インフルエンザ生育培地及び３μｇ／ｍＬトリプシン中のほぼコンフルエントなＭＤＣＫ細胞を含む１５ｃｍ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。７２時間後、ウイルスの上澄みを培養し、２０００×ｇで５分間遠心分離した。ウイルスの上澄みを取り除き、アリコットを−８０℃で冷凍した。
【０２０６】
［プラークアッセイ］
インフルエンザウイルスを、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）微結晶性セルロースの被覆を用いて、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイにより定量した。手短に、ＭＤＣＫ細胞を６ウェル細胞培養皿に播種した。細胞が９５％コンフルエントになったとき、培地を取り除き、ウイルス種菌の連続的な１０倍希釈を、最終容量１ｍＬのインフルエンザ生育培地に加えた。４０分後、種菌を吸引により取り除き、２．４％Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）微結晶性セルロース、及び３μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシンを含む４ｍＬのインフルエンザ生育培地により置換した。プレートを３７℃で３日間静置して生育した。被覆をその後吸引により取り除き、細胞層をＰＢＳで２回洗浄し、細胞を２０％エタノール中の０．１％クリスタルバイオレットで１５分間染色した。この染色液をその後吸引により除去し、細胞を再びＰＢＳで洗浄し、プラークを視認で数えてプラーク形成単位（ＰＦＵ）の単位でウイルス力価を決定した。
【０２０７】
［マウス染色］
４〜５週齢の免疫適格性のＢＡＬＢ／ｃＪ（ＢＡＬＢ／ｃ）及び免疫不全性のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−（ＮＳＧ）マウスを、ＪＡｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＪＡＸ）から入手し、高齢のマウスを用いた実験については、これらの動物を、インフルエンザ投与前に所定の期間障壁条件下で生育及び収容した。
【０２０８】
［インフルエンザ中和抗体のＡＡＶベクターへのクローニング］
様々なインフルエンザ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域に対応する配列を、合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、また、ＩｇＧ１定常領域フレームワークを含むＡＡＶ導入ベクターにクローン化した。幾つかの例では、抗体遺伝子を、ビボにおける抗体産生を向上させるように最適化した。
【０２０９】
［マウスに対するＡＡＶ産生及び投与］
ＡＡＶ産生及び静脈内注射を下記手順に従って行った。手短に言えば、１．２×１０８の２９３Ｔ細胞を、０．２５：１：２の、８０μｇの興味の抗体をコードするベクター、ｐＨＥＯＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）、及びｐＡＡＶ  ２／８  ＳＥＥＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ）を用いてトランスフェクションした。上澄みを１２０時間かけて５回回収した。ウイルスを、１００ｋ  ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して１００ｍＭクエン酸ナトリウム、及び１０ｍＭトリスｐＨ８からなるバッファ中に、透析濾過、濃縮、及びバッファ交換される前に、ＰＥＧ沈殿及び塩化セシウム画分により精製し、アリコット及び−８０℃で凍結した。アリコットを定量するために、ウイルスを凍結乾燥し、ＤＮＡｓｅで処理し、前述（１３）の通りｑＰＣＴにより滴定した。手短に言えば、ウイルス力価を、前述の滴定、精製した４Ｅ１０抗体をコードするＡＡＶ２／８から生成した標準曲線を用いて、定量ＰＣＲにより決定した。ウイルスアリコットの感染力を、２９３Ｔ細胞に形質導入すること、且つＥＬＩＳＡにより細胞上澄み液の抗体濃度を定量することによって、インビトロで確認した。
【０２１０】
［マウスのＡＡＶ形質導入、及び遺伝子発現の定量］
筋肉内注射の前に、組換え型ＡＡＶウイルスを凍結乾燥し、図示の用量にまで４０μＬ容量のバッファ（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭトリスｐＨ８）を用いて希釈した。マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、ウイルスを４０μＬの一回注射として腓腹筋に投与した。
【０２１１】
生物発光イメージングを、ＩＶＩＳ２００機器を用いて、特に、前述のように下記の修正により行った：生物発光イメージを、１．５ｍｇのＤ−ル氏フェリン（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の腹腔内注射後１０分間撮った。ヒトＩｇＧマウス血清の濃度を、精製したヒトＩｇＧ／Ｋａｐｐａ（Ｂｅｔｈｙｌ）から作成した標準曲線を用いて、ＥＬＩＳを行うことによって決定した。
【０２１２】
［マウスのインフルエンザの投与］
インフルエンザウイルスを凍結乾燥し、２０μＬ容量において図示の用量とするために、ＰＢＳ中に希釈した。接種前に、マウスを軽量し、ＰＢＳ中に希釈された２ｍｇのケタミン及び０．２ｍｇのキシラジンを含む２００μＬのカクテルの腹腔内注射により麻酔した。マウスを、２０μＬの希釈したウイルスの鼻腔内接種により、１０μＬを鼻孔を通して、インフルエンザで罹患させた。感染したマウスを毎日同じ時間に計量した。
【０２１３】
［ＧＦＰインフルエンザウイルス産生及び定量］
ＧＦＰをＰＢ１部分にパッケージした、ＰＢ１フランク−ＧＦＰインフルエンザウイルスを、Ｂｌｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８：１２７２（２０１０）に記載の方法に従って精製した。Ｂｌｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．に記載の通り、ＰＢ１フランク−ＧＦＰウイルスを、喪失したＰＢ１タンパク質をトランスで供給された、２９３Ｔ−ＣＭＶ−ＰＢ１及びＭＤＣＫ−ＳＩＡＴ１−ＣＭＶ−ＰＢ１細胞において生育及びアッセイした。ＰＢ１フランク−ＧＦＰウイルスを、８−プラスミド双方向逆遺伝学システムを用いて、但し、標準的なＰＢ１プラスミドをｐＨＨ−ＰＢ１フランク−ｅＧＦＰにより置換して、形成した。これらのウイルスについて、他の５つの内部遺伝子（ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ）を、マウス感染に用いられるウイルスに関するＰＲ８株から由来させた。ＰＲ８、ＣＡ／０９、及びＳＩ／０６由来のＨＡ及びＮＡを有するウイルスに加えて、２つの追加のウイルスをこれらのアッセイにおいて用いた。
（１）ＪＰ／５７：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７（Ｈ２Ｎ２）由来のＨＡ及びＮＡ、アジアでのインフルエンザの大流行由来の初期株
（２）Ｖｉｅｔ／０４：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来のＨＡ、高病原性トリインフルエンザ株。このウイルスのＮＡは、実験用のＡ／ＷＳＮ／１９３３  （Ｈ１Ｎ１）株に由来する。多塩基の切断部位をＨＡから除去した。
【０２１４】
ＰＢ１フランク−ＧＦＰウイルスをフローサイトメトリーにより定量した。ＭＤＣＫ−ＳＩＡＴ１−ＣＭＶ−ＰＢ１細胞を、１ｍＬのインフルエンザ生育培地中、ウェル当たり１０５細胞で、１２ウェル皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。播種の８時間後、ウイルスを１：１０、１：１００、及び１：１０００で培地中に希釈した。ウェルを５０μＬのこれらの各希釈液を用いて感染させた。細胞を、２５０μＬｎｏトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた５分間のインキュベーション、トリプシンの吸引による除去、２％ウシ胎仔血清、及び２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＰＢＳ中での懸濁により、感染後１６．５時間培養した。サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析し、０．３〜３％の間のＧＦＰ−陽性細胞のパーセントを有するサンプルを、ウイルス力価の定量のために用いた。力価をＧＦＰ−陽性細胞のパーセント、希釈因子、及びウェル当たり１０５細胞の総カウントから計算した。
【０２１５】
［中和アッセイ］
ＰＢ１フランク−ＧＦＰインフルエンザウイルス及びＭＤＣＫ−ＳＩＡＴ１−ＣＭＶ−ＰＢ１細胞を用いて行った。４０μＬのインフルエンザ生育培地を、５７μＬの培地を入れた列Ａ以外、平底９６ウェル組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の全てのウェルに加えた。マウス血清サンプルを、３μＬの血清を、５７μＬの列Ａ中のインフルエンザ生育培地に加えることによって、連続的に希釈し、その後、１：３連続希釈を列Ｇまで行い、１：２０の初期希釈物及び１：４．３７４×１０４の最終希釈物を得た。２×１０４のＰＢ１フランク−ＧＦＰウイルスの感染粒子（フローサイトメトリータイターにより決定）を、２０μＬ容量のインフルエンザ生育培地中のサンプルに加えた。希釈された血清及びウイルスの混合物を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬ容量のインフルエンザ生育培地中の２×１０４のＭＤＣＫ−ＳＩＡＴ１−ＣＭＶ−ＰＢ１細胞を、ＭＯＩを１として全てのウェルに加えた。細胞のみのコントロール、これは、未変性のＢＡＬＢ／ｃマウス血清、ウイルスなし、を受けたものン、及び、ウイルスコントロール、これは未変性のＢＡＬＢ／ｃマウス血清を受けたものを各ウイルスについて含めた。プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ中で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、４０μＬのＰＢＳ中の１．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を各ウェルに加えて、最終濃度０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を得て、プレートを室温で５分間インキュベートした。読み取りのため、１００μＬの各サンプルを不透明の９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＧＦＰ蛍光を、４８５ｎｍの励起波長、５１５ｎｍの発光波長、励起及び発光両方についてのスリット幅１２ｎｍ、「最適」ゲインセット、５００μｓの積分時間、ウェル当たり５回読みで、初めから読み取るように構成された、Ｓａｆｉｒｅ２  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を用いて定量した。細胞のみのコントロールからのベースライン蛍光を全ての読み取り地から引いた。サンプルをウイルスコントロールに対して標準化した。
【０２１６】
［組織学］
インビボ感染実験の結論として、肺をマウスから除去し、この組織の半分を１０％中和バッファホルマリン中に２４時間含浸した。固定化後、組織をホルマリンから取り出し、標準的なパラフィン包埋及び操作を行うまで７０％エタノール中に入れた。４ミクロン厚の切片を取り出し、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を行った。スライドは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＳ５１  蛍光顕微鏡を用いて、病理学者（Ｄ．Ｓ．Ｒ．）により観察され、イメージをＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて得た。炎症を以下のように評価した；０＝なし〜最小の炎症、１＝細気管支中に時折の浸潤（１０％未満の細気管支）、２＝細気管支中に容易に同定される浸潤（１０〜５０％の細気管支）、３＝実質性の浸潤及び／又は初期のパッチ状の線維症を伴う細気管支中に容易に同定される浸潤、４＝＞５０％の浸潤を伴う細気管支、又は、細気管支、血管壊死、又は広範な線維症における、１０〜５０％の広範なネクローシスの上皮を伴う細気管支。スコアリングは、盲検により行われ、順序尺度はあらゆる統計試験について見積もられた。
【０２１７】
［ＲＴ−ＰＣＲによる相対的なウイルス定量］
肺組織を１００μＬＰＢＳ中でホモジナイズした。２５μＬのホモジネートをＴＲＩｚｏｌ氏訳（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＲＮＡ抽出のために用いた。精製したＲＮＡをヌクレアーゼフリーの水に再懸濁し、ＲＮＡ濃度を１５０ｎｇ／μＬに標準化した。リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを、ｑＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ、Ｒｏｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＰＲ８Ｍに対してデザインされたプライマー、及びマウスリボソームタンパク質Ｌ３２のみからなる内在性コントロールを用いて、行った。Ｆｏｒｗａｒｄ−Ｍ：ＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡ  （配列番号：３６）、Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｍ：ＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＧＡ  （配列番号：３７）、Ｆｏｒｗａｒｄ−Ｌ３２：ＡＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣ  （配列番号：３８）、Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｌ３２：ＴＡＡＣＣＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧ  （配列番号：３９）。サンプルをＴｕｒｂｏ  ＤＮＡｓｅ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡｓｅ処理し、下記のプログラムで、ＡＢＩ７３００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３回実験した：５０℃１０分間、９５℃５分間、４０サイクルの９５℃１５秒間及び５５℃３０秒間、融解曲線分析。インプットされるＲＮＡにおける変化の要因であるＬ３２シグナルにより各サンプルを個別に標準化した。
【０２１８】
［インビボにおける抗−インフルエンザ抗体の発現］
未就職の全長Ｆ１０又はＣＲ６２６１抗インフルエンザ抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを産生した。１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の組換え型ＡＡＶの筋肉内注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腓腹筋に投与した。血清サンプルを毎週得て、ヒトＩｇＧをＳＬＩＳＡにより定量した（図１４）。１００μｇ／ｍＬを超えるｂ１２抗体の顕著な発現が見られた。対照的に、Ｆ１０及びＣＲ６２６１抗体の両方は、１週間に約１μｇ／ｍＬの発現を示した。第７週まで血清の数μｇ／ｍＬにまでゆっくりと上昇する前に、以下の時間点で検出できなかった。
【０２１９】
Ｆ１０及びＣＲ６２５１抗体のインビボ発現を向上させるため、Ｆ１０及びＣＲ６２５１抗体の各々の軽鎖をｂ１２の軽鎖で置換したキメラ抗体コンストラクトを準備した。２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後、ｂ１２軽鎖を対にしたときに、両抗体の実質的に高い発現が観察された。非未変性の軽鎖が抗体発現を向上させることを示した（図１５Ａ）。天然の軽鎖の発現を向上させるために、ｂ１２又は４Ｅ１０抗体のいずれかの軽鎖に由来する５’及び３’結合配列を含む変性した軽鎖可変領域のセット、を作製した。用いられた変性した軽鎖可変領域を図１５Ｂに挙げる。２９３Ｔ細胞のトランスフェクションの後、ｂ１２及び４Ｅ１０由来の配列を含むＦ１０Ｏ２４軽鎖は、インビトロにおいて１２倍の高い発現を示した（図１５Ｃ）。同様に、ｂ１２抗体由来の配列を有するＣＲ６２６１ＬＯ１３軽鎖を含むコンストラクトのトランスフェクションは、２０倍の高い発現を示す（図１５Ｄ）。これらの変性抗体はインビトロ中和アッセイを用いて試験され、結果から変性の軽鎖を含む抗体はインフルエンザの２つの株を中和する能力を維持することが確認された。変性した掲載について見られる実質的に向上した抗体発現の点では、全ての後の実験を、Ｆ１０ＬＯ２４及びＣＲ６２６１ＬＯ１３、それぞれ、変性され、Ｆ１０及びＣＲ６２６１と称される配列を用いて行った。用いられた完全な可変領域配列は、キメラ軽鎖可変領域を含めて、配列番号：４０〜４３に与えられる。
【０２２０】
図１６Ａに示すように、１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）のＡＡＶのＢＡＬＢ／ｃマウスへの１回の筋肉内注射により、注射１週間以内に検出可能な抗体が産生された。抗体濃度は、一過的に減少し、それに続く６〜８週に亘って増加し、５０〜２００μｇ／ｍＬでプラトーに達し、４０週の研究の期間維持された。
【０２２１】
［インビトロ中和アッセイ］
組換え型ＡＡＶウイルスで処理した動物由来の血清中和能力の大きさを決定するため、３つの異なるＨＡサブタイプ（Ｈ１、Ｈ２、及びＨ５）由来の５つの異なるヘマグルチニンを含むＧＦＰ−レポーターインフルエンザビリオンを用いて、インビトロ中和アッセイを行った。１６Ｂに示すように、ネガティブコントロールの抗体（ｂ１２、ＨＩＶに対する抗体）を発現するマウス由来の血清は、テストされた５つの株のいずれかの感知できるほどの中和は示さなかった。対照的にＦ１０又はＣＲ６２６１のいずれかを発現する組換え型ＡＡＶウイルスを受けた動物由来の血清は、全ての５つの株を中和する顕著な能力を示した。
【０２２２】
（実施例１０）
［インビボ保護］
マウスをインフルエンザ感染から保護するための組換え型ＡＡＶウイルスの能力を決定するために、組換え型ウイルスを動物に投与し、５週間抗体発現させた。インフルエンザ感染の直前に、約１００〜２００μｇ／ｍＬのｂ１２及びＦ１０抗体の両方、並びに、０．１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍLまでの広範な濃度のＣＲ６２６１をマウスの血液循環中に観察した（図１７B）。ＣＲ６２６１を発現するマウスは、血清ＩｇＧ濃度に対して逆比例する重量喪失を示し、この抗体の７．５μｇ／ｍＬの最小血清濃度がＣＡ／０９感染由来の疾患を予防するために必要であることが示唆された。
【０２２３】
インビボにおけるＶＩＰの他の株に対して保護する能力を試験するために、ｂ１２コントロール、又はＦ１０抗体を発現する動物にＳＩ／０６株を投与した（図１７Ｃ）。コントロール抗体を発現するマウスは２週間の期間に亘って重量喪失を示した。対照的に、Ｆ１０を発現するマウスは、ＳＩ／０６投与後に疾患の徴候を示さなかった。
【０２２４】
インフルエンザを投与されたマウスにおいけるＣＡ／０９及びＳＩ／０６投与の、内在的な免疫反応に対する影響を決定するために、かかる動物由来の血清サンプルを中和アッセイを用いて分析した。コントロールのｂ１２抗体を発現した以前に投与を受けたマウス由来の血清は、投与株に対して強い中和活性を示したが、異種株に対して検出可能な活性を示さなかった（図１７Ｆ〜Ｇ）。これらの結果から、広範な中和抗体の発現が疾患に対して保護し、追加的な、より効能ある、内在的な体液性免疫の形成を更に可能にすることを示唆した。
【０２２５】
この実施例は、本願明細書に開示される組換え型ＡＡＶウイルスが、様々なインフルエンザウイルスにより生じる感染に対する効果的な免疫学的予防を提供するために用いることができる。
【０２２６】
（実施例１１）
［高齢且つ免疫不全の動物におけるインフルエンザ感染からの保護］
広範にインフルエンザ抗体を中和するＦ１０及びＣＲ６２６１由来の可変領域を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを産生した。
【０２２７】
免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−（ＮＳＧ）マウスは、適合性免疫を完全に欠くマウスであり、生まれつきの免疫反応の相当の低下を示す。Ｆ１０及びＣＲ６２６１抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを、ｋｇ当たり５×１０１２ＧＣの標準化された用量で、比較的若齢（１４〜１９週齢）又は高齢（４６〜５５週齢）であるＮＳＧ動物に対して投与した。遺伝子発現をゼノジェンイメージング又はＥＬＩＳＡを用いて４週間に亘って定量した（それぞれ、図１８Ａ及び１８Ｂ）。両方の動物群は、全ての時間点でほぼ同様のレベルの遺伝子発現を示し、年齢はＡＡＶ由来の筋肉ベースの遺伝子発現の能力に影響を与えないことを示唆した。インビボ抗体発現がこれらの免疫不全動物をインフルエンザの投与から保護するのに十分であるかどうか決定するために、１０００ＰＦＵの致死量のＰＲ８株を若齢及び高齢のマウス群の両方に投与した（それぞれ、図１８Ｃ及び１８Ｄ）。
【０２２８】
両方の場合において、ルシフェラーゼを発現するコントロールマウスにおいて、疾患及び重量喪失が見られ、研究コースに亘って全てのかかる動物が死亡した。対照的に、Ｆ１０を発現する若年及び高齢のＮＳＧ動物の両方は、インフルエンザ誘導される重量喪失から完全に保護され、これらの濃度のＦ１０抗体のみでも内在的な免疫反応の非存在下においてマウスを保護するのに十分であることを示唆した。Ｆ１０がＮＳＧマウスにおいて疾患を予防可能である程度を更に調査するために、動物を、研究期間を通して犠牲にし、肺組織の組織学的サンプルにおける炎症のレベルを評価した。ルシフェラーゼを発現する感染したマウスは、細気管支の実質的な管腔の炎症を感染５日後に示した（図１８Ｅ左）。対照的に、Ｆ１０により保護された動物は、これらのマウスの実質的に低レベルの病理と一致して、非常に低レベルの炎症、及びきれいな細気管支を示した（図１８Ｆ）。Ｆ１０抗体を発現するマウスは、ルシフェラーゼコントロールマウスと比較して、全ての時間点において実質的に低い炎症を示した。
【０２２９】
組換え型ＡＡＶウイルスのウイルス複製を制御する能力を直接定量するために、殺処分時に培養した肺組織由来の総ＲＮＡを抽出することによって、ＮＳＧマウスにおけるウイルスの量を決定し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりウイルスＲＮＡを測定した。図１８Ｇに示すように、ルシフェラーゼを発現するマウス由来の肺は、実験過程を通して高いウイルス量を示した。対照的に、初期の時間点で分析されたＦ１０を発現する動物は、内在的適合性免疫を欠如しているにも拘らず、Ｆ１０抗体の存在下において劇的にウイルス複製が低減した結果として、経時的に実質的に減少する中程度のウイルスＲＮＡレベルを含んでいた。
【０２３０】
（実施例１２）
［骨肝臓胸腺（ＢＬＴ）ヒト化マウスにおけるＨＩＶ感染からの保護］
骨肝臓胸腺（ＢＬＴ）ヒト化マウスモデルは、腟内ＨＩＶ感染の予防のよく確立されたモデルである。ＢＬＴヒト化マウスは、胎生組織を免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γＣ（ＮＳＧ）レシピエントへの外科的移植、その後の造血幹細胞の移植により産生した。これらの移植された細胞は、ＨＩＶ感染後の機能的免疫反応を生むことができるマウスにおいて鍛えられた完全な免疫細胞のレパートリーを生む。ＢＬＴモデルは、腟及び大腸を含む粘膜組織の有意なヒト細胞の生着を示すことが見出され、粘膜を濃縮したＣＣＲ５−向性ＪＲ−ＣＳＦ  ＨＩＶウイルスへの暴露に続く、ＨＩＶ感染を支持することが示された。この実施例において、ＢＬＴマウスは、抗−ＨＩＶ抗体を発煙する組換え型ＡＡＶウイルスの、粘膜経路を通したＨＩＶ感染を予防する能力を試験するために用いた。
【０２３１】
ＶＲＣ０１抗−ＨＩＶ抗体又はルシフェラーゼタンパク質を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを、本願明細書に記載される方法に従って産生した。ＶＲＣ０１抗体の粘膜表面におけるＨＩＶ感染を予防する効能を試験するために、ＢＬＴ動物のコホートを産生し、ＶＲＣ０１を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを、ＢＬＴマウスに投与して、１００μｇ／ｍＬの血清濃度のＶＲＣ０１中和抗体、及びネガティブコントロールとしてのルシフェラーゼタンパク質のいずれかを発現する動物を生み出した。
【０２３２】
ヒト粘膜ＨＩＶ感染の比較的低頻度な性質をモデル化するために、非濃縮のＪＲ−ＣＳＦ  ＨＩＶウイルスの表面を傷つけない毎週の腟内投与という低用量の繰り返し投与の投与計画（レジメン）を採用した。ＨＩＶの投与計画の概要を図１９Ａに示す。１４週の期間、マウスを出血させ、種菌の表面を傷つけない腟内投与により、毎週５０ｎｇのＪＲ−ＣＳＦ  ＨＩＶウイルスのｐ２４を投与した。ＣＤ４細胞レベルを毎週フローサーとメトリーを用いて測定した（図１９Ｂ）。図１７Ｂに示すように、ルシフェラーゼを発現する動物におけるＣＤ４＋細胞について、ＶＲＣ０１を産生するものと比較して、中程度しかし統計学的に有意な減少があった。繰り返しのＨＩＶの膣内投与の１３週後、殺処分時のＨＩＶプラズマウイルス量をＡｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＩＶ−１  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄ  ｑＰＣＲ  ａｓｓａｙ（このアッセイの検出限界は２００コピー／ｍＬ）により測定した。結果を図１９Ｃに示し、ルシフェラーゼを発現する全ての動物は感染する一方、ＶＲＣ０１を発現する８つ中２つのマウスしかウイルス複製の実質的なエビデンスを示さないことを明らかにする。これらの結果は、抗−ＨＩＶ抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスが、ＢＬＴマウスにおける粘膜ＨＩＶを予防することができることを示す。
【０２３３】
（実施例１３）
［ＦＶＢマウスにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体の産生］
この実施例は組換え型ＡＡＶウイルスがビボで高レベルのＨＣＶ抗体を産生するために用いられることを例示する。
【０２３４】
Ｂ１２、ＡＲ３Ａ、及びＡＲ３Ｂ抗体のコード配列を含むＡＡＶベクターを構築した。ＡＡＶベクターは、それぞれ、Ｂ１２、ＡＲ３Ａ、及びＡＲ３Ｂ抗体を発現する組換え型ＡＡＶウイルスを産生するために用いられる。組換え型ＡＡＶウイルスはＦＶＢマウスに投与される。動物の血清中の対応する抗体の発現レベルを毎週測定した。結果を図２０に示す。図２０に示すように、ＨＣＶ抗体の相当なレベルが動物中で産生した。
【０２３５】
（実施例１４）
［ＨＩＶ感染の予防］
この実施例は、ＨＩＶ感染の発症のリスクにある患者の免疫学的予防を例示する。
【０２３６】
組換え型ＡＡＶを、抗−ＨＩＶ中和抗体をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ導入ベクターを用いて産生した。特に限定されることなく、ｂ１２抗−ＨＩＶ抗体、２Ｇ１２抗−ＨＩＶ抗体、４Ｅ１０抗−ＨＩＶ抗体、２Ｆ５抗−ＨＩＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体を含む、あらゆる公知の抗−ＨＩＶ中和抗体を用いることができる。例えば、ＣＡＳＩプロモーター、抗−ＨＩＶ中和抗体のコード配列、ＷＰＲＥ及びＳＳＶ４０ポリ（Ａ）配列を有するＡＡＶ導入ベクターを用いることができる。かかるＡＡＶ導入ベクターの例は、配列番号：１７〜２１、２４に示されるベクターを含むベクターを含む。患者は、ＨＩＶ感染の発症のリスク時に同定され、有効量の組換え型ＡＡＶを投与された。組換え型ＡＡＶは筋肉内注射により患者に投与された。組換え型ＡＡＶは抗−ＨＩＶ抗体を患者中で発現させ、患者がＨＩＶ注射で発症するリスクを低減する。患者中のＨＩＶウイルス量を、患者が組換え型ＡＡＶを投与された後の様々な時間点で決定することができる。適切な用量（すなわち、抗−ＨＩＶ抗体の発現レベル）及び治療計画は、特に限定されることなく、投与の経路及び患者へのＨＩＶ暴露の程度を含む多くの要因に基づいて、当業者が容易に決定することができる。免疫学的予防の効能を、ＡＡＶ治療を受けていない患者と比較したＨＩＶ感染のリスクを低減を観察することによって評価した。
【０２３７】
（実施例１５）
［大腸ガンの治療］
この実施例は、大腸ガンを受けている又は発症のリスクにある患者の治療を例示する。
【０２３８】
組換え型ＡＡＶを、ＩＭＣ−Ｃ２２５抗体（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体）をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ導入ベクターを用いて産生した。例えば、ＩＭＣ−Ｃ２２５抗体のコード配列は、ＣＡＳＩプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０ポリ（Ａ）配列を有するＡＡＶ導入ベクター中に挿入することができる。大腸ガンを受けている又は発症のリスクにある患者を、同定し、有効量の組換え型ＡＡＶを投与した。組換え型ＡＡＶを筋肉内注射により患者に投与した。組換え型ＡＡＶはＩＭＣ−Ｃ２２５抗体を患者中で発現させ、患者中でのガンの進行を阻害した。適切な用量（すなわち、ＩＭＣ−Ｃ２２５抗体の発現レベル）、及び治療計画は、特に限定されることなく、投与経路及び患者の疾患状態を含む、多数の因子に基づいて、当業者が容易に決定することができる。治療効果は、疾患進行の遅延又は緩徐、疾患状態の寛解又は緩和、及び緩解を観察することによって評価された。
【０２３９】
（実施例１６）
［感染の予防］
この実施例は、ＨＣＶ感染の発症のリスク時の患者の免疫学的予防を例示する。
【０２４０】
組換え型ＡＡＶを、抗−ＨＣＶ中和抗体をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ導入ベクターを用いて産生した。特に限定されることなく、ＡＲ３Ａ、抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ３Ｂ抗−ＨＣＶ抗体、ＡＲ４Ａ抗−ＨＣＶ抗体、及びこれらのあらゆる変異体を含む、あらゆる公知の抗ＨＣＶ中和抗体を用いることができる。例えば、ＣＡＳＩプロモーター、抗−ＨＣＶ中和抗体のコード配列、ＷＰＲＥ、及びＳＶ４０ポリ（Ａ）配列を有するＡＡＶ導入ベクターを用いることができる。かかるＡＡＶ導入ベクターの例は、配列番号２２、２３、２８に示されるベクターを含む。
【０２４１】
患者は、ＨＣＶ感染の発症のリスク時に同定され、有効量の組換え型ＡＡＶを投与される。組換え型ＡＡＶは、筋肉内注射により患者に投与される。組換え型ＡＡＶは患者中でＡＲ３Ａ抗体を発現し、患者がＨＣＶ注射で発症するリスクを低減する。適切な用量（すなわち、抗−ＨＣＶ抗体の発現量）及び治療計画は、特に限定されることなく、投与経路及び患者に対するＨＣＶ暴露の程度を含む多数の因子に基づいて、当業者が容易に決定することができる。免疫学的予防能力は、ＡＡＶ治療を受けていない患者と比較した、ＨＣＶ感染のリスクの低減を観察することによって、評価された。
【０２４２】
（実施例１７）
［インフルエンザウイルス感染の予防］
この実施例は、インフルエンザウイルス感染の発症のリスク時の患者の免疫学的予防を例示する。
【０２４３】
組換え型ＡＡＶを抗−インフルエンザ中和抗体をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ導入ベクターを用いて産生した。特に限定されることなく、Ｆ１０抗−インフルエンザ抗体、ＣＲ６２６１抗−インフルエンザ抗体、ＦＩ６抗−インフルエンザ抗体、ＴＣＮ３２抗−インフルエンザ抗体、及びこれらのあらゆる変異体を含む、あらゆる公知の抗−インフルエンザ中和抗体を用いることができる。例えば、ＣＡＳＩプロモーター、抗−インフルエンザ中和抗体のコード配列、ＷＰＲＥ及びＳＶ４０ポリ（Ａ）配列を有するＡＡＶ導入ベクターを用いることができる。かかるＡＡＶ導入ベクターの例は、配列番号：２５〜２７、２９、３０で示されるベクターを含む。
【０２４４】
患者は、インフルエンザ感染の発症のリスク時に同定され、有効量の組換え型ＡＡＶを投与される。組換え型ＡＡＶは、筋肉内注射により患者に投与される。組み換え型ＡＡＶは患者中でＦ１０抗体を発現し、患者がインフルエンザウイルス注射で発症するリスクを低減する。適切な用量（すなわち、抗−インフルエンザ中和抗体の発現レベル）及び治療計画は、特に限定されることなく、投与経路及び患者に対するインフルエンザウイルス暴露の程度を含む多数の因子に基づいて、当業者が容易に決定することができる。患者中のインフルエンザウイルス量は、患者が組換え型ＡＡＶを投与された後の様々な時間点で決定することができる。
【０２４５】
少なくとも幾つかの前述の実施形態において、そのような置換が技術的に可能ではないわけでない場合には、ある実施形態において用いられた１つ又は複数のエレメントは、別の実施形態において交換可能に用いることができる。請求に係る主題の範囲から逸脱することなく、様々な他の脱落、追加、及び変性を上記の方法及び構造に対してなすことができることは、当業者によって理解される。全てのかかる変性及び変更は、添付の請求項により規定されるように、主題の範囲内とすることを意図する。
【０２４６】
本願明細書における実質的にあらゆる複数及び／又は単数形の使用に関して、文脈及び／又は応用に適切であるように、当業者は複数から単数に、及び／又は単数から複数に置き換えて理解することができる。様々な単数／複数の置換は、明確性のために本願明細書に明示的にと説明され得る。
【０２４７】
当業者により理解される。一般的に、本願明細書、及び特に添付の請求項（例えば、添付の請求項の本体部）で用いられる用語は、一般的に、「開いた（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「特に限定されることなく、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」）と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ，）」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「特に限定されることなく、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ，）」と解釈されるべきである）を意図する。更に、当業者は、特定の番号の組み込まれた請求項の引用が意図される場合、かかる意図は明示的に請求項中に記載され、そのような記載がない場合、かかる意図は存在しない。例えば、理解の助けとして、以下に添付する請求項は、請求項の引用を導入する「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」、及び「１つ又は複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」という導入句の使用を含むことができる。しかしながら、  たとえ、同じ請求項が、導入句「１つ又は複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」又は「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」と、「ａ」又は「ａｎ」等の不定冠詞とを含む（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」が、「１つ又は複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」又は「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を意味すると解釈されるべき場合であっても、かかる句の使用が、不定詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の引用の導入が、１つのみのかかる引用を含む実施形態に対するかかる導入された請求項の引用を含む、あらゆる特定の請求項を限定することを示唆すると解されるべきでない；同様のことが請求項の引用の導入に用いられる不定冠詞の使用についても当てはまる。加えて、たとえ、特定の番号の導入された請求項の引用が明示的に記載されていたとしても、当業者はかかる引用が少なくとも記載された番号を意味するものと解されるべきであると理解する（例えば、「２つの引用」の裸の引用は、他の修正なく、少なくとも２つの引用、又は２以上の引用を意味する）。更には、「少なくともＡ、Ｂ及びＣ等の１つ」に類する慣用句が用いられる例では、概して、かかる構成は、当業者がかかる慣用句を理解するであろう意味を意図する（例えば、「少なくともＡ、Ｂ、及びＣの１つを有するシステム」は、特に限定されることなく、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを共に、Ａ及びＣを共に、Ｂ及びＣを共に、並びに／又は、Ａ、Ｂ及びＣを共に、有するシステムを含む）。「少なくとも１つのＡ、Ｂ、又はＣ等の１つ」に類する慣用句が用いられる例では、概して、かかる構成は、当業者がかかる慣用句を理解するであろう意味を意図する（例えば、「少なくともＡ、Ｂ、又はＣの１つを有するシステム」は、特に限定されることなく、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを共に、Ａ及びＣを共に、Ｂ及びＣを共に、並びに／又は、Ａ、Ｂ及びＣを共に、有するシステムを含む）。明細書、請求項、又は図面のいずれかにある、２つ以上の代替用語を示す、実質的にあらゆる離接語及び又は句は、１つの用語、いずれかの用語、又は両方の用語を含む可能性を考慮するものと理解されたい。例えば、「Ａ又はＢ」は、「Ａ」、「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むものと理解されたい。
【０２４８】
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループの形式で記載される場合には、当業者は、当該開示がマーカッシュグループのあらゆる個々の要素又は要素のサブグループについても記載されることを認識するであろう。
【０２４９】
当業者に理解されるように、明細書を提供するという点等、あらゆる全ての目的について、本願明細書に開示されるあらゆる範囲は、そのあらゆる全ての部分的範囲及び部分的範囲の組み合わせも包含する。挙げられているあらゆる範囲は、同範囲を少なくとも半分、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一等とすることを、十分に、記載しまた可能にする。非制限例として、本願明細書に記載される各範囲は、容易に、下三分の一、真ん中三分の一、上三分の一等にすることができる。「ｕｐ  ｔｏ」、「ａｔ  ｌｅａｓｔ」、「ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ」、「ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ」等のあらゆる言葉、及びその同等物は、記載された数字を含み、上記議論のようにその後部分的範囲にすることができる範囲を指すことを、当業者によって理解される。最後に、当業者に理解されるように、１つのグループは各個々の要素を含む。このように、例えば、１〜３項目を有するグループは、１、２又は３項目を有するグループを指す。同様に１〜５項目を有するグループは、１、２、３、４又は５項目を有するグループ等を指す。
【０２５０】
様々な態様及び実施形態が本願明細書に開示されるが、他の態様及び実施形態は当業者に明らかである。本願明細書に開示される様々な態様及び実施形態は例示の目的であり、限定を意図するものでなく、真の範囲及び精神は下記の請求項により示される。
【図１Ａ】
2014511180.tif 000004
【図１Ｂ】
2014511180.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2014511180.tif 000012
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2014511180.tif 000014
【図４Ｂ】
2014511180.tif 000015
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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