(57)【要約】  本発明は、Ｓｒｃとの相互作用に関与するＮＤ２のコア領域を、ＮＤ２の残基２８９〜３２１内、より具体的にはＮＤ２の残基３１０〜３２１内に、特定することに部分的に基づいている。この領域を含む、この領域に重なる、またはこの領域内からのペプチドは、ＮＤ２のＳｒｃとの相互作用を阻害するために使用することができる。この相互作用を阻害することは、神経疾患および神経障害、疼痛ならびに癌の治療および予防に有用である。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６０の残基と同一の４〜４０個の残基であって、少なくとも４個の残基が配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間の連続残基である残基を有することを特徴とするＮＤ２ペプチド。
【請求項２】
配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１から成るアミノ酸配列であって、６個までのアミノ酸は削除、挿入または保存的置換をされていてもよいアミノ酸配列を有することを特徴とするＮＤ２ペプチド。
【請求項３】
配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１２個の連続残基から成るアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項４】
配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項５】
アミノ酸３１０〜３２１から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項６】
脂質付加されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項７】
脂肪酸に結合することによって脂質付加されていることを特徴とする請求項６に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項８】
ミリストイル化されていることを特徴とする請求項７に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項９】
Ｎ末端にてミリストイル化されていることを特徴とする請求項８に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項１０】
内在化ペプチドに結合されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項１１】
前記内在化ペプチドは、当該ＮＤ２ペプチドのＮ末端に結合されていることを特徴とする請求項１０に記載のＮＤ２ペプチド
【請求項１２】
前記内在化ペプチドは、当該ＮＤ２ペプチドのＣ末端に結合されていることを特徴とする請求項１０に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項１３】
前記内在化ペプチドと当該ＮＤ２ペプチドとは融合ペプチドとして結合されていることを特徴とする請求項１０，１１または１２に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項１４】
前記内在化ペプチドは、少なくとも５個のアルギニン残基またはリジン残基を含み、アミノ酸１５個までの全長を有することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項１５】
前記内在化ペプチドはＴａｔペプチドであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＮＤ２ペプチド。
【請求項１６】
長さがアミノ酸５０個までのキメラペプチドであって、配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間に位置する少なくとも３個の連続アミノ酸を含むＮＤ２ペプチド、および前記ＮＤ２ペプチドに結合された内在化ペプチドを含むことを特徴とするキメラペプチド。
【請求項１７】
長さがアミノ酸２５個までであることを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項１８】
前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間の４〜２０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項１９】
前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１２個の連続残基から成るアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２０】
前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２１】
前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１であって、６個までのアミノ酸が削除、挿入または置換をされていてもよいアミノ酸から成ることを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２２】
前記ＮＤ２ペプチドは配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１から成るアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２３】
前記内在化ペプチドは、前記ＮＤ２ペプチドのＮ末端に結合されていることを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２４】
前記内在化ペプチドは、前記ＮＤ２ペプチドのＣ末端に結合されていることを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２５】
前記内在化ペプチドと前記ＮＤ２ペプチドとは融合ペプチドとして結合されていることを特徴とする請求項２２または２３に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
前記内在化ペプチドは、少なくとも５個のアルギニン残基またはリジン残基を含み、アミノ酸１５個までの全長を有することを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２７】
前記内在化ペプチドはＴａｔペプチドであることを特徴とする請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のキメラペプチドまたはＮＤ２ペプチドのペプチド模倣体。
【請求項２９】
レトロインベルソペプチド模倣体であることを特徴とする請求項２８に記載のペプチド模倣体。
【請求項３０】
神経障害を有しまたは神経障害を発現するおそれのある患者に、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のキメラペプチド、ＮＤ２ペプチドまたはペプチド模倣体の有効な投与計画を実施することを含むことを特徴とする神経疾患または神経障害の治療または有効な予防の方法。
【請求項３１】
前記神経疾患または前記神経障害は、脳卒中、ＣＮＳへの外傷、てんかん、不安神経症または神経変性疾患であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
疼痛を有しまたは疼痛を発現するおそれのある患者に、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のキメラペプチド、ＮＤ２ペプチドまたはペプチド模倣体の有効な投与計画を実施することを含むことを特徴とする疼痛の治療または有効な予防の方法。
【請求項３３】
前記疼痛は、神経障害性の、生理的な、または炎症性の疼痛であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
癌を有しまたは癌を発現するおそれのある患者に、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のキメラペプチド、ＮＤ２ペプチドまたはペプチド模倣体の有効な投与計画を実施することを含むことを特徴とする癌の治療または有効な予防の方法。
【請求項３５】
ＮＤ２−Ｓｒｃ相互作用を阻害する薬剤を同定する方法であって、
ＳｒｃペプチドおよびＮＤ２ペプチドを薬剤に接触させること、ならびに
ＳｒｃペプチドとＮＤ２ペプチドとの結合を判断することを含み、
ここで、前記薬剤の存在によって前記薬剤を欠く対照試験に対して結合が低下することが、前記薬剤がＳｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害剤であることを示し、前記薬剤は、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のキメラペプチドもしくはＮＤ２ペプチド、またはそれらのペプチド模倣体であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
ＮＤ２−Ｓｒｃ相互作用を阻害する薬剤を同定する方法であって、
Ｓｒｃペプチドおよび請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のＮＤ２ペプチドを薬剤に接触させること、ならびに
ＳｒｃペプチドとＮＤ２ペプチドとの結合を判断することを含み、
ここで、前記薬剤の存在によって前記薬剤を欠く対照試験に対して結合が低下することが、前記薬剤がＳｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害剤であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項３７】
さらに、神経疾患、疼痛または癌のうちの１つの動物モデルにおける神経疾患、疼痛または癌に対する薬理活性について、前記薬剤を試験することを含むことを特徴とする請求項３５または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、非仮出願であって、米国特許出願第６１／３８７４３９号の利益を主張しており、該出願の全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）複合体は、６０個を超えるタンパクを含んでいる［４］。ＮＭＤＡＲ複合体は、脳卒中、神経外傷、神経変性疾患、記憶および長期増強、視覚および聴覚の神経障害、疼痛などを含む、いくつかの神経疾患ならびに神経障害に関連していると報告されている。しかしながら、ＮＭＤＡＲ複合体を直接阻害するいくつかの試みは、副作用が過大なため、臨床上失敗している。
【０００３】
シナプス後肥厚タンパク９５ｋＤ（ＰＳＤ９５）は、その最初の２つのＰＤＺドメインつまりＰＤＺ１およびＰＤＺ２を介して［１２］、ＮＭＤＡＲのＣ末端ＮＲ２サブユニットに直接結合する［１１］。ＰＳＤ９５とＮＭＤＡＲとの相互作用を妨害することで、ＮＭＤＡＲの電気的活動およびカルシウム流出活動を阻害することなく、脳卒中の損傷作用から動物を保護することが可能であると報告されている［１３］。
【０００４】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＮＤ２）は、チロシンキナーゼＳｒｃと関連していると報告されている（図１Ａを参照）。Ｓｒｃは、ＮＭＤＡＲ複合体（つまり、Ｓｒｃ，Ｆｙｎ，ＬｙｎおよびＹｅｓ）におけるいくつかのＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）の１つである［５〜７］。Ｓｒｃは、細胞の接着、成長、移動および分化を含む、多くの機能に関与している。Ｓｒｃは多くの細胞種で広く発現しており、細胞内の別の位置を取ることができる。Ｓｒｃの細胞内位置はその機能に影響し得るようである。Ｓｒｃは形質膜、核周辺膜およびエンドソーム膜などの細胞膜と関連し得る。形質膜において、Ｓｒｃは種々の受容体からの信号を、これらの信号を、核、細胞骨格および他の細胞構成体へと伝える内部シグナル経路に、伝達することが可能である。たとえば、Ｓｒｃは、成長因子受容体を通して作用し、細胞成長および増殖に影響し得る。
【０００５】
ＮＭＤＡＲ，ＳｒｃおよびＮＤ２相互間の推定される分子配列が、ＬｉｕらのＮａｔ Ｍｅｄ ２００８に提示されており、ここで、Ｓｒｃは、アダプタータンパクとして作用するＮＤ２を介して、ＮＭＤＡＲと相互作用すると推定されている。ＮＤ２は、Ｓｒｃをシナプス後肥厚（ＰＳＤ）内のＮ−メチル−ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体複合体に固定して、ＮＭＤＡ受容体活性を制御する。Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔと呼ばれるＳｒｃのフラグメントは、脳の興奮性シナプスにおいてＳｒｃとＮＤ２との相互作用を阻害して、ＮＲ２Ｂサブユニットのリン酸化を低減し、痛覚を調整することができると報告されている［１，２，３］。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１から成るアミノ酸配列であって、６個までのアミノ酸の削除、挿入または保存的置換が可能なアミノ酸配列を有するＮＤ２ペプチドを提供する。上述のペプチドのいずれかを含むＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１２個の連続残基から成るアミノ酸配列を有することが可能である。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の、４〜１０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有する。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、アミノ酸３１０〜３２１から成る。これらのＮＤ２ペプチドはいずれも、たとえば脂肪酸に結合することによって、脂質付加することが可能である。好ましくは、ＮＤ２ペプチドはミリストイル化される。これらのＮＤ２ペプチドはいずれも、ＮＤ２ペプチドのＮ末端またはＣ末端にて、たとえば融合タンパクとして、内在化ペプチドに結合することが可能である。前記内在化ペプチドは、少なくとも５個のアルギニン残基またはリジン残基を含むことが可能であり、アミノ酸残基１５個までの全長を有する。前記内在化ペプチドは、Ｔａｔペプチドであり得る。
【０００７】
本発明は、アミノ酸５０個までの長さのキメラペプチドを提供する。このペプチドは、配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間に位置する少なくとも３個の連続アミノ酸を含むＮＤ２ペプチドを含む。前記ＮＤ２ペプチドは内在化ペプチドに結合し、および／または前記ＮＤ２ペプチドは脂質付加されている。随意的に、前記キメラペプチドはアミノ酸２５個までの長さである。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間の４〜２０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有する。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１２個の連続残基から成るアミノ酸配列を有する。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の４〜１０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有する。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１から成る。ただし、６個までのアミノ酸の削除、挿入または置換が可能である。随意的に、前記ＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１から成るアミノ酸配列を有する。随意的に、前記内在化ペプチドは、ＮＤ２ペプチドのＮ末端に結合している。随意的に、前記内在化ペプチドは、ＮＤ２ペプチドのＣ末端に結合している。随意的に、前記内在化ペプチドおよびＮＤ２ペプチドは、融合ペプチドとして結合している。随意的に、前記内在化ペプチドは、少なくとも５個のアルギニン残基またはリジン残基を含み、アミノ酸１５個までの全長を有する。随意的に、前記内在化ペプチドはＴａｔペプチドである。本発明は、さらに、配列番号６０の残基と同一の４〜４０個の残基を有し、それらの残基の少なくとも４個が配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間の連続残基である、ＮＤ２ペプチドを提供する。
【０００８】
本発明は、さらに、上述のキメラペプチドまたはＮＤ２ペプチドのペプチド模倣体を提供する。随意的に、前記ペプチド模倣体は、レトロインベルソペプチド模倣体である。
【０００９】
本発明は、さらに、神経障害を有しまたは神経障害を発現するおそれのある患者に、いずれかの先行クレームのキメラペプチド、ＮＤ２ペプチドまたはペプチド模倣体の有効な投与計画を実施することを含む、神経疾患または神経障害の治療または有効な予防の方法を提供する。随意的に、前記神経疾患または神経障害は、脳卒中、ＣＮＳへの外傷、てんかん、不安神経症または神経変性疾患である。
【００１０】
本発明は、さらに、疼痛を有しまたは疼痛を発現するおそれのある患者に、上述のキメラペプチド、ＮＤ２ペプチドまたはペプチド模倣体の有効な投与計画を実施することを含む、疼痛の治療または有効な予防の方法を提供する。随意的に、前記疼痛は、神経障害性のまたは炎症性の疼痛である。
【００１１】
本発明は、さらに、癌を有しまたは癌を発現するおそれのある患者に、上述のキメラペプチド、ＮＤ２ペプチドまたはペプチド模倣体の有効な投与計画を実施することを含む、癌の治療または有効な予防の方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、ＳｒｃペプチドおよびＮＤ２ペプチドを薬剤に接触させて、ＳｒｃペプチドとＮＤ２ペプチドとの結合を判断することを含む、ＮＤ２−Ｓｒｃ相互作用を阻害する薬剤を同定する方法を提供し、ここで、前記薬剤の存在によって前記薬剤を欠く対照試験に対して結合が低下することが、前記薬剤がＳｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害剤であることを示し、前記薬剤は、上記でまたは本明細書のどこかで定義されるキメラペプチドもしくはＮＤ２ペプチド、またはそれらのペプチド模倣体である。
【００１３】
本発明は、さらに、Ｓｒｃペプチドおよび上記で定義されたＮＤ２ペプチドを薬剤に接触させて、ＳｒｃペプチドとＮＤ２ペプチドとの結合を判断することを含む、Ｓｒｃ−ＮＤ２相互作用を阻害する薬剤を同定する方法を提供し、ここで、前記薬剤の存在によって前記薬剤を欠く対照試験に対して結合が低下することが、前記薬剤がＳｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害剤であることを示す。この方法は、神経疾患、疼痛または癌のうちの１つの動物モデルにおける神経疾患、疼痛または癌に対する薬理活性について、前記薬剤を試験することも含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ＮＤ２のＳｒｃとの相互作用を示す図であって、Ｓｒｃ−ＮＤ２−ＮＭＤＡＲ複合体における相互作用を模式的に示す図。
【図１Ｂ】ＮＤ２のＳｒｃとの相互作用を示す図であって、Ｓｒｃ−相互作用ドメインを特定するための異なるＮＤ２配列設計の構造を示す図。
【図１Ｃ】ＮＤ２のＳｒｃとの相互作用を示す図であって、アミノ酸２３９とアミノ酸３２１との間に位置するＮＤ２のＳｒｃ−相互作用配列の表すドットブロットを示す図。
【００１５】
【図２Ａ】実験で使用したＮＤ２フラグメントの構造を、ＮＤ２の全長を基準とするアミノ酸番号と共に示す図。
【図２Ｂ】スクランブル化ｓＳｒｃ４０〜５８ではなくビオチニル化Ｓｒｃ４０〜５８が、ＮＤ２．１．３よりもＮＤ２，ＮＤ２．１およびＮＤ２．１．４によく結合し得ることを表すドットブロットを示す図。
【図２Ｃ】ＮＤ２，ＮＤ２．１およびＮＤ２．１．４がすべてのビオチニル化Ｓｒｃ４０〜５８に結合し得ることを表すＥＬＩＳＡを示す図。
【００１６】
【図３Ａ】Ｓｒｃ４０〜５８への結合を試験したＮＤ２構築物の配列を示す図。
【図３Ｂ】Ｓｒｃ４０〜５８へのＮＤ２配列の結合を表すドットブロットを示す図。
【図３Ｃ】スクランブル化対照ではなくＳｒｃ４０〜５８へのＮＤ２構築物の結合を表すＥＬＩＳＡを示す図。
【００１７】
【図４Ａ】ＮＤ２ ３１０〜３２１，ＮＤ２ ３０７〜３１８およびＮＤ２ ３１０〜３１８からの強い結合を有する、Ｓｒｃ４０〜５８への結合を表すＮＤ２フラグメントのドットブロットを示す図。
【図４Ｂ】Ｓｒｃ４０〜５８へのＮＤ２構築物の結合を表すＥＬＩＳＡを示す図。
【００１８】
【図５Ａ】Ｓｒｃ４０〜４９に結合し得るビオチニル化ＮＤ２ ３１０〜３２１、および、アミノ末端またはカルボキシ末端にＴａｔを有するＳｒｃ４０〜４９のバージョンを表すドットブロットを示す図。
【図５Ｂ】Ｓｒｃ４０〜５８への結合を含む図５Ａの配列を表すＥＬＩＳＡを示す図。
【図５Ｃ】Ｓｒｃ４０〜４９がＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１に結合し得ることを表すＥＬＩＳＡ試験を示す図。
【図５Ｄ】Ｓｒｃ４０〜４９およびＴａｔ−Ｓｒｃ４０〜４９が、ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１への結合に競合し得ることを表すＥＬＩＳＡ試験を示す図。
【図５Ｅ】Ｓｒｃ４０〜４９およびＴａｔ−Ｓｒｃ４０〜４９が、ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１への結合に競合し得ることを表すＥＬＩＳＡ試験を示す図。
【００１９】
【図６】Ｓｒｃ４０〜５８がＮＤ２ ３１０〜３２１よりもＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１に強く結合し得ることを表すＥＬＩＳＡ試験を示す図。
【００２０】
【図７】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１が、ＮＤ２ ３１０〜３２１に結合したＳｒｃ４０〜４９に対して、結合に競合し得ることを表すＥＬＩＳＡを示す図。
【００２１】
【図８Ａ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＤ２とＳｒｃとの共局在化の定量化を示す図。
【図８Ｂ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＤ２とＳｒｃとの共局在化の定量化を示す図。
【００２２】
【図９Ａ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ複合体中のタンパクの共局在化の定量化を示す図であって、ＮＤ２のＮＲ２Ｂとの共局在化の定量化を示す図。
【図９Ｂ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ複合体中のタンパクの共局在化の定量化を示す図であって、ＮＲ２ＢのＮＤ２との共局在化の定量化を示す図。
【図９Ｃ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ複合体中のタンパクの共局在化の定量化を示す図であって、ＮＤ２のＰＳＤ９５との共局在化の定量化を示す図。
【図９Ｄ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ複合体中のタンパクの共局在化の定量化を示す図であって、ＰＳＤ９５のＮＤ２との共局在化の定量化を示す図。
【図９Ｅ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ複合体中のタンパクの共局在化の定量化を示す図であって、ＮＲ２ＢのＰＳＤ９５との共局在化の定量化を示す図。
【図９Ｆ】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ複合体中のタンパクの共局在化の定量化を示す図であって、ＰＳＤ９５のＮＲ２Ｂとの共局在化の定量化を示す図。
【００２３】
【図１０】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＳｒｃとＮＭＤＡＲ ２Ｂとの共局在化の定量化を示す図。
【００２４】
【図１１】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで処理したおよび処理しなかった１４ＤＩＶ海馬ニューロンにおけるＳｒｃとＰＳＤ９５との共局在化の定量化を示す図。
【００２５】
【図１２Ａ】ＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５，ＮＲ２ＢおよびＮＲ１に対する抗体がすべて、他のタンパクを含有する複合体を免疫沈降させ得ることを表すラット脳溶解物からの免疫沈降実験を示す図。
【図１２Ｂ】ＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５，ＮＲ２ＢおよびＮＲ１に対する抗体がすべて、他のタンパクを含有する複合体を免疫沈降させ得ることを表すラット脳溶解物からの免疫沈降実験を示す図。
【図１２Ｃ】ＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５，ＮＲ２ＢおよびＮＲ１に対する抗体がすべて、他のタンパクを含有する複合体を免疫沈降させ得ることを表すラット脳溶解物からの免疫沈降実験を示す図。
【図１２Ｄ】ＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５，ＮＲ２ＢおよびＮＲ１に対する抗体がすべて、他のタンパクを含有する複合体を免疫沈降させ得ることを表すラット脳溶解物からの免疫沈降実験を示す図。
【図１２Ｅ】ＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５，ＮＲ２ＢおよびＮＲ１に対する抗体がすべて、他のタンパクを含有する複合体を免疫沈降させ得ることを表すラット脳溶解物からの免疫沈降実験を示す図。
【００２６】
【図１３Ａ】対照、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔで１μＭにて１時間処理した１４ＤＩＶ海馬ニューロンからの抗ＮＲ２Ｂ抗体を用いた免疫沈降を示す図。
【図１３Ｂ】図１３Ａと同様の図であって、３μＭにて２時間処理したときの図。
【図１３Ｃ】ＩＰについて図示した抗体を用いた図１３Ａの繰り返しを示す図。
【図１３Ｄ】図１３Ａに類似する図であって、免疫沈降抗体として抗ＰＳＤ９５を用いたときの図。
【００２７】
【図１４Ａ】ＮＤ２ ３１０〜３２１がＰＡＣＡＰ増強ＮＭＤＡ誘起電流を阻害し、Ｓｒｃ４０〜４９が阻害しないことを示す図。
【図１４Ｂ】ＮＤ２ ３１０〜３２１がＰＡＣＡＰ増強ＮＭＤＡ誘起電流を阻害し、Ｓｒｃ４０〜４９が阻害しないことを示す図。
【００２８】
【図１５】３ＰＶＯに付したまたは３ＰＶＯに付して３μＭのＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１で処理したラット脳からの抗ＮＲ２Ｂ抗体を用いた共免疫沈降を示す図であって、Ｃは対側性脳抽出物を表し、Ｉは同側性脳抽出物を表し、ラベルは用いた検出抗体を示し、Ｐ−ＴｙｓはＳｒｃのリン酸化チロシン１００に対する抗体を表す図。
【００２９】
【図１６Ａ】抗ＰＳＤ９５抗体または抗ＮＲ２Ｂ抗体のいずれかを用いた共免疫沈降を示す図であって、Ｓｒｃ−ＴａｔまたはＴａｔ−ＮＤ２の存在下または非存在下におけるタンパクのＮＲ２Ｂ複合体との状態を表す図。
【図１６Ｂ】抗ＰＳＤ９５抗体または抗ＮＲ２Ｂ抗体のいずれかを用いた共免疫沈降を示す図であって、Ｓｒｃ−ＴａｔまたはＴａｔ−ＮＤ２の存在下または非存在下におけるタンパクのＮＲ２Ｂ複合体との状態を表す図。
【００３０】
【図１７】Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１での処理がＣＦＡ誘導疼痛のモデルにおける痛覚過敏を軽減することを示す図。
【００３１】
【図１８】Ｔａｔ−ＮＲ２Ｂ９ｃ，Ｓｒｃ４０〜４９−ＴａｔまたはＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１の存在下において３ＰＶＯに付したラットの梗塞サイズを示す図。
【００３２】
【図１９】ＮＤ２の配列を、予測膜トポロジーと共に示す図であって、３１０〜３２１の位置が強調され、細胞内であると予測されている図。
【００３３】
【図２０】ラットに高濃度で静脈内注射したときの、血圧に対するＴａｔ−ＮＤ２、ミリストイル化ＮＤ２およびＮＡ−１（Ｔａｔ−ＮＲ２Ｂ９ｃとしても知られる）の作用を示す図。
【００３４】
【図２１】ＮＡ−１，Ｔａｔ−ＮＤ２またはｍｙｒ−ＮＤ２の静脈内注射に続いて観察された最小血圧（最大の血圧降下）を表すグラフを示す図。
【００３５】
【図２２】３ＰＶＯモデルにおいて誘導された脳卒中に対する、脳卒中の発症後１時間に静脈内投与されたときの、Ｔａｔ−ＮＤ２，ｍｙｒ−ＮＤ２およびｍｙｒ２−ＮＤ２の保護効果を表すグラフを示す図。
【００３６】
【図２３】末梢神経損傷に付した動物における肢引き込み閾値によりアロディニアを測定することによって、異なる２つの濃度のｍｙｒ−ＮＤ２が有意に疼痛を軽減し得ることを表すグラフを示す図。
【００３７】
定義
「キメラペプチド」とは、天然には相互に関連せず、融合タンパクとしてまたは化学結合によって相互に連結された２個の成分ペプチドを有するペプチドを意味する。
【００３８】
「融合」タンパクまたはポリペプチドは、単一のポリペプチド配列においては通常融合していない２個（またはそれ以上）の別個の非相同ポリペプチドから成る複合ポリペプチドすなわち単一の連続アミノ酸配列を指す。
【００３９】
薬剤は通常単離型で提供される。単離とは、対象種（たとえばペプチド）が、天然にはそれに関連しているか、あるいはその製造において使用される汚染物から、少なくとも部分的に分離されていることを意味するが、単離種との組み合わせにおいて作用するように意図された、内在化ペプチドまたは医薬品賦形剤などの他の成分の存在を必ずしも排除しない。好ましくは、薬剤は、試料に存在する主要な（すなわち、組成物におけるモル基準で）高分子であって、一般に、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を成す、高分子（たとえば、ポリペプチド）種である。概して、単離薬剤は、組成物におけるすべての高分子種の８０〜９０パーセント超を成す。最も好ましくは、組成物が本質的に単一の高分子種で構成されるように、薬剤は、本質的に均質（すなわち、汚染種は従来の検出法によって組成物中に検出することができない）に精製される。
【００４０】
「特異的結合」の用語は、２分子、たとえばリガンドと受容体、の間の結合であって、分子（リガンド）が、他の様々な多くの分子の存在下においても他方の特異的分子（受容体）と結合する能力、すなわち、分子の不均質混合物における１つの分子の他の分子に対する優先的な結合を示す能力、によって特徴づけられる結合を指す。リガンドの受容体への特異的結合は、検出可能に標識されたリガンドの受容体への結合が、過剰の非標識リガンドの存在下において低下すること（すなわち、結合競合試験）によっても証明される。特異的結合は、特定の官能基間の結合の形成または特定の空間的適合（たとえば、錠と鍵の型）の結果であり得、一方、非特異的結合は、通常ファンデルワールス力の結果である。
【００４１】
興奮毒性は、それによりＮＭＤＡ受容体などのグルタミン酸受容体の過剰活性化によってニューロンが損傷し死ぬ病理過程である。
【００４２】
「患者」または「対象」の用語には、ヒトおよび他の動物、特に、齧歯｛げっし｝動物、猫、犬、有蹄動物、豚およびヒト以外の霊長類が含まれる。
【００４３】
「薬剤」の用語には、あらゆる元素、化合物または薬理活性を有するまたは有するかもしれない存在が含まれる。薬剤は、生物製剤（たとえば、ペプチド、ペプチド模倣体もしくは抗体）または有機小分子（通常５００Ｄａ未満）などであり得る。薬剤は、天然の産物または合成化合物であり得る。薬剤には、既知の（すなわち、ＦＤＡまたは他国における同様の機関により承認された）薬物である化合物、薬理活性が特定されているがさらなる評価が行われている化合物、または、薬理活性についてスクリーニングが行われている化合物が含まれる。
【００４４】
薬剤は、活性な薬物が疾患の予防または治療に有用であるまたは有用かも知れないことを示すスクリーニングシステムにおいて活性を示した場合は、薬理活性を有するとされ得る。このスクリーニングシステムは、インビトロの、細胞の、動物のまたはヒトのシステムであり得る。薬剤は、疾患の治療において実際の予防上のまたは治療上の有用性を確立するためにさらなる試験が必要とされるかも知れないにもかかわらず、薬理活性を有するとされ得る。
【００４５】
他に文脈から明らかでない場合、薬剤への言及は、単独のまたは内在化ペプチドに結合した、その薬品または薬剤を意味する。
【００４６】
Ｔａｔ（またはＴＡＴもしくはｔａｔ）ペプチドとは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６０）を含むかまたはそれから成るペプチドであって、その配列内で５個を超える残基が削除、置換、または挿入されていてもよく、結合ペプチドまたは他の薬剤の細胞内への取り込みを促進する能力を保持しているペプチドを意味する。好ましくは、いかなるアミノ酸変化も保存的置換である。好ましくは、集合体におけるいかなる置換、削除または内部挿入も、正味の正電荷、好ましくは上記配列のものに類似した正電荷を、ペプチドに残す。Ｔａｔペプチドのアミノ酸配列は、ビオチンまたは類似の分子で誘導体化して炎症応答を低減することが可能である。
【００４７】
統計的に有意とは、ｐ値が０．０５未満、好ましくは０．０１未満、最も好ましくは０．００１未満であることを指す。
【００４８】
ペプチドまたはアミノ酸配列がアミノ酸のある範囲内に存在するというとき、そのペプチドは、その範囲を規定する始点および終点と、間のアミノ酸とを含み得る。
【００４９】
アミノ酸置換を保存的または非保存的に分類するために、アミノ酸は次のようにグループ化されてよい。すなわち、グループＩ（疎水的側鎖）：ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ，ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ；グループＶ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅである。保全的置換には、同一グループ内のアミノ酸間での置換が含まれる。非保全的置換は、これらのグループの１つのメンバーを他のグループのメンバーと交換することである。
【００５０】
ペプチドは、そのペプチドと参照配列との厳密な一致の数が最大になるときに、基準配列と最もよく整合する。整合は目視で実施することできる。これに代えて、ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアが、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。一般に、デフォルトのプログラムパラメータを使用することができる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０を使用し、また、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １０９１５ （１９８９）を参照）。
【００５１】
アミノ酸の特定の範囲に存在するペプチドには、その範囲の両端を規定するアミノ酸の一方または両方を含むペプチドと、その範囲を規定するアミノ酸の間のアミノ酸のみを含むペプチドとが含まれ得る。
【発明の詳細な説明】
【００５２】
Ｉ．概要
本発明は、Ｓｒｃとの相互作用に関与するＮＤ２のコア領域を、ＮＤ２の残基２８９〜３２１内、より具体的にはＮＤ２の残基３１０〜３２１内に特定することに、部分的に基づいている。この領域を含む、この領域に重なる、またはこの領域内からのペプチドは、ＮＤ２のＳｒｃとの相互作用を阻害するために使用することができる。この相互作用を阻害することは、神経疾患および神経障害、疼痛ならびに癌の治療および予防に有用である。
【００５３】
ＩＩ．タンパク
他に文脈から明らかでない場合、ＮＤ２タンパクはＮＤ２の天然のヒト型を指し、これには、以下および図１９に再現した例示の配列Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０３８９１が割り当てられている。冒頭のＭ残基は切除可能である。この配列の単一アミノ酸の約２０個の天然変異型がＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに記載されている。
2014505655.tif 000003
【００５４】
同様に、他に示されていない場合、Ｓｒｃは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ． Ｐ１２９３１によって提供され、最初のＭｅｔ残基を有するまた有しないものなどの、Ｓｒｃの天然のヒト配列を意味する。
【００５５】
ＩＩＩ．薬剤
本発明の薬剤には、ＮＤ２タンパク（配列番号６０）の残基２８９〜３２１を含む、残基２８９〜３２１に重なる、残基２８９〜３２１から成る、または残基２８９〜３２１内の、好ましくは、残基３１０〜３２１を含む、残基３１０〜３２１に重なる、残基３１０〜３２１から成る、または残基３１０〜３２１内の、ＮＤ２ペプチドが含まれる。ＮＤ２ペプチドは、通常、ＮＤ２の残基２８９〜３２１内の少なくとも３個の連続残基を有する。ＮＤ２ペプチドは、好ましくは、Ｓｒｃのアミノ酸４０〜４９をほぼ含むまたはアミノ酸４０〜４９内のサイトの特異的領域内のＳｒｃタンパクに結合して、ＮＤ２タンパクとＳｒｃタンパクとの相互作用を競合的に阻害する。ＮＤ２ペプチドは、一般に、配列番号６０の１０，１１，１２，１５，２０，３０または４０個までの残基を有しており、これは、ＮＤ２ペプチド内の指定数の残基が、最大に整合したときに、ＮＤ２配列の全長内の対応残基と同一であることを意味する。好ましくは、これらの残基の少なくとも３，４，５，６，７，８，９，１０，１１または１２個は、ＮＤ２の残基２８９〜３２１内の、好ましくは残基３１０〜３２１内の連続残基である。好ましくは、ペプチドは、最大に整合したときに、ＮＤ２配列からの対応残基と同一の４〜２０個のアミノ酸を有し、好ましくは、４〜１２個または５〜１０個のそのような残基を有する。いくつかのＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸２８９とアミノ酸３２１との間の４〜２０個の連続残基から成るアミノ酸配列を有する。いくつかのＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間の３〜１２個の連続残基から成るアミノ酸配列を有する。いくつかのＮＤ２ペプチドは、配列番号６０のアミノ酸３１０〜３２１と共に、少なくとも３，４，５，６，７，８，９，１０または１１個の残基から成るアミノ酸配列を有する。いくつかのＮＤ２ペプチドは、配列番号６０の残基３１０〜３２１から成る。
【００５６】
ＮＤ２ペプチドには、配列番号６０に関連しない隣接アミノ酸、たとえば内在化ペプチド（以下に説明するように、膜貫通を促進し、ビオチンまたはＧＳＴなどのタグとして、精製、同定またはスクリーニングにおいて援助するペプチド）を結合することができる。アミノ酸の関連しない隣接配列を除き、配列番号６０とは異なるＮＤ２ペプチド内のあらゆるアミノ酸は、好ましくは、配列番号６０の対応残基に対して保存的置換である。配列番号６０とは異なる配列を有する（関連しない隣接配列を含まない）ＮＤ２ペプチドは、好ましくは、配列番号６０に対して、わずか６，５，４，３，２または１個の削除、挿入または置換を有する。ＮＤ２ペプチドは、好ましくは、合計でわずか４０，３０，２０，１５または１２個のアミノ酸を有する（内在化ペプチドなどの関連しない隣接配列を含まない）。
【００５７】
本発明の薬剤には、ＮＤ２ペプチドのペプチド模倣体も含まれる。ペプチド模倣体は、天然のアミノ酸から成るＮＤ２ペプチドと実質的に同一の構造および／または機能的特性を有するが、少なくとも１つの非ペプチド結合または１つの非天然アミノ酸を有する合成化学物質である。
【００５８】
ペプチド模倣体は、全体的にアミノ酸の合成の非天然アナログを含むことができ、または、部分的に天然ペプチドアミノ酸で部分的にアミノ酸の非天然アナログのキメラ分子であり得る。ペプチド模倣体は、また、任意の数の天然アミノ酸の保存的置換を、その置換が模倣構造および／または阻害もしくは結合活性を実質的に変化させない限り、包含し得る。ＮＤ２ペプチドおよび内在化ペプチドを含むキメラペプチドのペプチド模倣体において、活性部位または内在化部位のどちらかまたは双方は、ペプチド模倣体であり得る。
【００５９】
本発明のペプチドおよびペプチド模倣体は、修飾アミノ酸残基、たとえばＮ−アルキル化残基を含有することができる。Ｎ末端アルキル化修飾物には、たとえば、Ｎ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−プロピル、Ｎ−ブチル、Ｎ−シクロヘキシルメチル、Ｎ−シクロヘキシルエチル、Ｎ−ベンジル、Ｎ−フェニルエチル、Ｎ−フェニルプロピル、Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）プロピル、Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）プロピル、およびＮ−（ナフタレン−２−イル）エチルが含まれる。ペプチドおよびペプチド模倣体は、また、アセチル化、リン酸化および／またはグリコシル化することも可能である。
【００６０】
いくつかのペプチド模倣体において、Ｌ配置（化学物質の構造に応じてＲまたはＳと呼ぶことも可能である）で天然に存在するあらゆるアミノ酸は、同じ化学構造型で、一般にＤアミノ酸と呼ばれるがＲまたはＳ型とも呼ぶことができる、反対のキラリティーのアミノ酸またはペプチド模倣体で置き換えることができる。よって、ペプチド模倣体は、１，２，３，４または５個の、少なくとも５０％の、またはすべてのＤアミノ酸残基を含有してよい。いくつかまたはすべてのＤ残基を含有するペプチド模倣体は、「インベルソ」ペプチドと呼ばれることもある。
【００６１】
ペプチド模倣体には、レトロペプチドも含まれる。レトロペプチドは、逆向きのアミノ酸配列を有する。ペプチド模倣体には、また、アミノ酸の順序が逆で、したがって元のＣ末端アミノ酸がＮ末端に現れ、Ｌアミノ酸に代えてＤアミノ酸が用いられるレトロインベルソペプチドも含まれる。
【００６２】
個々のペプチド模倣残基は、ペプチド結合、他の化学結合、または、たとえばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能基マレイミド、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）もしくはＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などの、他の結合手段によって結合することが可能である。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）の代替となり得る結合基には、たとえば、ケトメチレン（たとえば、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に代えて−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが含まれる（たとえばＳｐａｔｏｌａ （１９８３） ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ ２６７−３５７， Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹを参照）。
【００６３】
芳香族アミノ酸の模倣体は、たとえば、Ｄ−またはＬ−ナフィルアラニン；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２−チエネイルアラニン；Ｄ−またはＬ−１，−２，３−もしくは４−ピレネイルアラニン；Ｄ−またはＬ−３−チエネイルアラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−またはＬ−ｐ−メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；および、Ｄ−またはＬ−アルキルアミンで置き換えることによって生成してよく、ここで、アルキル基は、置換もしくは非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、セカンダリーブチル、イソペンチルまたは非酸性アミノ酸であり得る。非天然アミノ酸の芳香環には、たとえば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
【００６４】
酸性アミノ酸の模倣体は、たとえば、負電荷を保持したままの非カルボキシレートアミノ酸；（ホスホノ）アラニン；および硫酸化スレオニンで置換することによって生成することが可能である。カルボキシル側鎖（たとえば、アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４−アゾニア−４，４―ジメトールペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ＝）との反応によって、選択的に変更することも可能である。アスパルチル基またはグルタミル基も、また、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル基またグルタミニル基に変換することが可能である。
【００６５】
塩基性アミノ酸の模倣体は、たとえば、（リジンおよびアルギニンに加えて）オルニチン、シトルリンなどのアミノ酸、または（グアジニノ）酢酸もしくは（グアジニノ）アルキル酢酸で置換することによって生成することが可能であり、ここでアルキル基は上で規定したとおりである。ニトリル誘導体（たとえば、ＣＯＯＨに代えてＣＮ部分を含有する）は、アスパラギンまたはグルタミンに代替し得る。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、脱アミノ化して対応するアスパルチルまたはグルタミル残基とすることが可能である。
【００６６】
アルギニン残基模倣体は、アルギニル基を、たとえば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンまたはニンヒドリンなどを含む１以上の従来の試薬と、好ましくはアルカリ条件下で、反応させることによって生成することが可能である。
【００６７】
チロシン残基模倣体は、チロシル基を、たとえば、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと、反応させることによって生成することが可能である。Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンは、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するのに使用することができる。
【００６８】
システイン残基模倣体は、システイニル残基を、たとえば、２−クロロ酢酸またはクロロアセタミドなどのアルファ−ハロアセテート、および対応するアミンと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体とすることによって生成することが可能である。システイン残基模倣体は、また、たとえば、ブロモ−トリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジル ジスルフィド；メチル ２−ピリジル ジスルフィド；ｐ−クロロ水銀安息香酸；２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール；またはクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても生成することが可能である。
【００６９】
リジン模倣体は、リジニル基を、たとえば、コハク酸および他のカルボン酸の無水物と反応させることによって生成することが可能である（および、アミノ末端残基を変更することが可能である）。リジンおよび他のアルファ−アミノ含有残基の模倣体は、また、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンと反応させることによって、およびグリオキシル酸とのトランスアミダーゼ触媒反応によって、生成することが可能である。
【００７０】
メチオニンの模倣体は、たとえば、メチオニンスルホキシドとの反応によって生成することが可能である。プロリンの模倣体には、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−もしくは４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−もしくは４−メチルプロリン、または３，３−ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジニル基を、たとえば、ジエチルプロカルボン酸またはパラ−ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することが可能である。
【００７１】
他の模倣体には、たとえば、プロリンおよびリジンの水酸化；セリル基またはスレオニル残基の水酸基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのアルファ−アミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミノ酸残基のメチル化もしくはＮ−メチルアミノ酸による置換；またはＣ末端カルボキシル基のアミド化によって生成されるものが含まれる。
【００７２】
リンカー、たとえばポリエチレングリコールリンカーは、ＮＤ２ペプチドまたはそのペプチド模倣体を二量化して、Ｓｒｃに対する親和性および選択性を高めるために使用することができる。随意的に、リンカーとして、ＰＥＧの約２〜１０個のコピーを直列に結合することが可能である。
【００７３】
ペプチド、ペプチド模倣体または他の薬剤の適切な薬理活性は、必要に応じて、インビトロまたは下記の動物モデルにおけるＳｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害を示すことによって、確認することが可能である。有用なペプチドまたはペプチド模倣体は、一般に、上記の試験において、５０μＭ，２５μＭ，１０μＭ，０．１μＭまたは０．０１μＭ未満のＩＣ５０値を有する。好ましいペプチドは、一般に、０．００１〜１μＭ、より好ましくは０．０５〜０．５または０．０５〜０．１μＭのＩＣ５０値を有する。
【００７４】
ＩＶ．ペプチドの内在化および脂質化
細胞膜伝達ペプチドまたは細胞貫通ペプチドとしても知られる内在化ペプチドは、よく知られた、多くの細胞タンパクまたはウイルスタンパクが膜を横断することを可能にする比較的短い（たとえば、５〜３０、７〜２０または９〜１５個のアミノ酸）ペプチドのクラスである。これらのペプチドは、一般に、アルギニンおよび／またはリジン残基の通常以上の表記から（一般のタンパクと比較して）正電荷を有し、それらの膜横断を容易にすると考えられている。これらのペプチドのいくつかは、少なくとも５，６，７または８個のアルギニンおよび／またはリジン残基を有する。その例には、アンテナペディアタンパク（Ｂｏｎｆａｎｔｉ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， １４４２−６ （１９９７））（および、その変異型）、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク、タンパクＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスタイプ１のＵＬ４９遺伝子の産物、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＳｙｎＢ１およびＳｙｎＢ３，Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ、ｇｐ４１ＮＬＳ、ｐｏｌｙＡｒｇ、ならびに、リシン、モデシン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、易熱性毒素および緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ）などのいくつかの植物毒素およびバクテリア毒素がある。他の例は、次の参考資料に記載されている（Ｔｅｍｓａｍａｎｉ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， ９（２３）：１０１２−１０１９， ２００４； Ｄｅ Ｃｏｕｐａｄｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ３９０：４０７−４１８， ２００５； Ｓａａｌｉｋ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １５： １２４６−１２５３， ２００４； Ｚｈａｏ， Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１）：１−１２， ２００４； Ｄｅｓｈａｙｅｓ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６２：１８３９−４９， ２００５）（すべて参照によって取り込まれる）。
【００７５】
好ましい内在化ペプチドは、ＨＩＶウイルスからのＴａｔである。Ｔａｔペプチドは、先行研究で報告されており、ＨＩＶＴａｔタンパクに見られる標準的なアミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）を含み、またはそれから成る。配列番号２は標準的Ｔａｔペプチドに指定されている。このＴａｔモチーフに隣接する追加の残基が（薬物の傍らに）存在する場合、その残基は、たとえば、Ｔａｔタンパク、スペーサー、もしくは一般に２つのペプチドドメインを連結するために使用される種類のリンカーアミノ酸からの、このセグメントに隣接する天然アミノ酸、たとえば、ｇｌｙ（ｓｅｒ）４（配列番号４４）、ＴＧＥＫＰ（配列番号４５）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４６）もしくはＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４７）（たとえば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １５６８２−１５６８６； Ｈｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１， ４０５−４１０）を参照）、であり得、または、隣接アミノ酸をもたない変異型の取り込みをもたらす能力を大きく低減しない他のアミノ酸であり得る。好ましくは、活性ペプチド以外の隣接アミノ酸の数は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）のどちら側においても１０個を超えない。ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）のＣ末端に隣接する追加のアミノ酸残基を含む１つの好適なＴａｔペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号４８）である。しかし、好ましくは、隣接アミノ酸が存在しない。
【００７６】
Ｎ型カルシウムチャンネルへの結合能が低下した上記Ｔａｔペプチドの変異型が、国際公開公報ＷＯ／２００８／１０９０１０号に記載されている。この変異型は、アミノ酸配列ＸＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４９）を含み、またはそれから成り、ここで、ＸはＹ以外のアミノ酸であるか、あるいは存在しない（その場合、Ｇは自由Ｎ末端である）。好ましいＴａｔペプチドはＮ末端のＹ残基がＦで置換されている。したがって、ＦＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）を含む、またはそれから成るＴａｔペプチドが好ましい。他の好ましいＴａｔペプチド変異型は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）から成る。使用し得る他のＴａｔペプチドには、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号４）およびＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ（配列番号５９）が含まれる。他のＴａｔペプチドは、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲの少なくとも８個の連続アミノ酸を含む。Ｎ型カルシウムチャンネルを阻害することなく薬剤の取り込みを促進する他のＴａｔペプチドには、上記のものが含まれる。他の好ましいＴａｔペプチドは、ｒｖ−ＴａｔまたはＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＹ（配列番号５８）と呼ばれる。
2014505655.tif 000004
【００７７】
Ｘは、自由アミノ末端、１個以上のアミノ酸、または共役型の部分を表し得る。内在化ペプチドは、インベルソ、レトロまたはトロインベルソ型で使用することが可能であり、その型の結合ペプチドまたはペプチド模倣体を有しても有しなくてもよい。
【００７８】
内在化ペプチドは、従来の方法で薬剤に結合させることが可能である。たとえば、薬剤は、化学結合によって、たとえばカップリング試薬または共役試薬を介して、内在化ペプチドに結合することが可能である。数多くのそのような試薬が市販されており、Ｗｏｎｇ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）によって論評されている。架橋試薬のいくつかの例には、Ｊ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセタミド）または他のそのような炭素６〜１１個のメチレン架橋（これはスルフヒドリル基に比較的特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（これはアミノ基およびチロシン基と不可逆結合を形成する）が含まれる。他の架橋試薬には、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（これはアミノ基およびフェノール基と不可逆結合を形成する）；ジメチルアジプイミド酸（これはアミノ基に特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（これは原則的にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（これは原則的にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（これはいくつかの異なる側鎖と反応する）およびジスジアゾベンジジン（これは主としてチロシンおよびヒスチジンと反応する）が含まれる。
【００７９】
薬剤がペプチドである場合、内在化ペプチドの付加は、好ましくはＮ末端にて内在化ペプチドに融合したペプチド配列を含む融合タンパクを生成することによって達成することが可能である。
【００８０】
ペプチド、随意的にＴａｔペプチドに融合したペプチドは、固相合成または組み換え法によって合成することが可能である。ペプチド模倣体は、化学文献および特許文献、たとえば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ， Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ （１９９８） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：２０５−２２３； Ｈｒｕｂｙ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １：１１４−１１９； Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ （１９９７） Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ３：１７−２７； Ｏｓｔｒｅｓｈ （１９９６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６７：２２０−２３４に記載されている種々の手順および方法を用いて合成することが可能である。融合ペプチドまたは好ましい他のものとして内在化ペプチドに結合したペプチドまたはペプチド模倣体には、全部でわずか５０個のアミノ酸を、より好ましくは２５個または２０個のアミノ酸を含有する。
【００８１】
ＮＤ２ペプチドを内在化ペプチドに結合することに代えてもしくは加えて、ＮＤ２ペプチドは、脂質に結合（脂質化）して、ペプチド単体に比べて共役体の疎水性を高め、これによって、結合したＮＤ２ペプチドが細胞膜および／または脳関門を通過するのを容易にすることも可能である。脂質化は、好ましくはＮ末端またはＣ末端のアミノ酸に実施するが、Ｓｒｃに対するＮＤ２ペプチドの解離定数が５０％を超えて低下しないことを条件に、内部アミノ酸に実施することも可能である。脂質は、水よりもエーテルに溶け易い有機分子であり、脂肪酸、グリセリドおよびステロールが含まれる。脂質化の好適な形態には、ミリストイル化、パルミトイル化、または、好ましくは炭素１０〜２０個の鎖長を有するラウリン酸およびステアリン酸などの他の脂肪酸の付加のほか、ゲラニル化、ゲラニルゲラニル化およびイソプレニル化が含まれる。天然タンパクの翻訳後修飾において生じる型の脂質化が好ましい。ペプチドのＮ末端アミノ酸のアルファ−アミノ基へのアミド結合の形成を介する、脂肪酸での脂質化もまたは好ましい。脂質化は、あらかじめ脂質化したアミノ酸を含むペプチド合成によって実施すること、インビトロで酵素的にまたは組み換え発現によって実施すること、ペプチドの化学架橋または化学誘導化によって実施することが可能である。ミリストイル化および他の脂質修飾により変更されたアミノ酸は、市販されている。
【００８２】
脂質化は、好ましくは、標準的なＴａｔペプチドが高い用量（たとえば、３ｍｇ／ｋｇ以上）で投与されたときに見られるような一過性の血圧降下を起こすことなく、または、少なくとも、標準的なＴａｔペプチドに結合したそのＮＤ２ペプチドよりも降下が小さくなるように、結合したＮＤ２ペプチドが細胞膜および／または血液脳関門を通過するのを容易にする。
【００８３】
ＮＤ２ペプチドを投与したとき（たとえば、標準的なＴａｔペプチドに結合させて高用量で投与したとき）に一過性の血圧降下が生じる場合、それは、抗炎症剤、好ましくは肥満細胞脱顆粒阻害剤の共投与によって、軽減することが可能である（国際公開公報ＷＯ２００９／０７６１０号を参照）。
【００８４】
Ｖ．治療または予防の対象となる患者
本発明の薬剤は、神経疾患または神経障害、疼痛および癌の治療および効果的な治療に有用である。これらの部類は相互に排他的ではない。たとえば、脳腫瘍は、これら３部類すべてに該当する。
【００８５】
様々な神経疾患および神経障害が、治療または予防の対象となる。このような疾患には、不安神経症；てんかん；視覚または網膜の神経障害；脳卒中（たとえば、自然発生性、急性、虚血性、出血性、手続き誘導性）；てんかん；低酸素症；神経外傷、外傷性脳損傷および脊髄損傷などの脳卒中には関連しないＣＮＳへの外傷；アルツハイマー病；パーキンソン病；牛海綿状脳症；クロイツフェルト・ヤコブ病；多発性硬化症；脊髄変性症；脊髄小脳失調；テイ・サックス病；ならびに、伝達性海綿状脳症が含まれる。このような障害には、また、血液を脳に供給するもしくは脳から除く血管（たとえば頸静脈または頸動脈）に影響を及ぼすもしくは及ぼすかも知れない外科手術を受ける患者、特に神経外科手術を受ける患者、動脈瘤を修復するための血管内手術または手足、脊髄、網膜もしくは腎臓に供給する血管の血管内手術を受ける患者も含まれる。このような修復は、動脈瘤を被った血管にステントまたはコイルを挿入することによって達成することが可能である。少なくとも部分的に興奮毒性に関連する神経疾患および神経障害は、特に、本発明の方法による治療の対象である。
【００８６】
脳卒中は、理由の如何を問わず、ＣＮＳにおける損傷した血流に起因する状態である。あり得る原因には、塞栓症、出血、血栓形成および手術が含まれる。血流損傷の結果、いくつかの神経細胞が即座に死ぬ。これらの細胞はグルタメートを含むその成分分子を放出し、このグルタメートがＮＭＤＡ受容体を活性化し、これが細胞内カルシウムレベルおよび細胞内酵素レベルを上昇させて、さらなる神経細胞の死（興奮毒性カスケード）へと至る。酸素の欠乏による組織の死は、梗塞と呼ばれる。梗塞ボリューム（すなわち、脳における卒中による死神経細胞のボリューム）は、脳卒中による病理的損傷の程度の指標として用いることができる。この症候的効果は、梗塞のボリュームとそれが脳内の何処に位置するかの双方に依存する。傷害指数は、Ｒａｎｋｉｎストロークアウトカムスケール（Ｒａｎｋｉｎ， Ｓｃｏｔｔ Ｍｅｄ Ｊ；２：２００−１５ （１９５７））、ＮＩＨストロークスケールおよびＢａｒｔｈｅｌインデックスなどの、症候的損傷の尺度として使用することが可能である。Ｒａｎｋｉｎスケールは、次のように、患者の全体的状態を直接評価することに基づいている。
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【００８７】
Ｂａｒｔｈｅｌインデックスは、日常生活の１０の基本的行動を行う患者の能力についての一連の質問に基づいており、０〜１００の点数で表して、低い点数がより大きな障害を示す（Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １４：５６−６１ （１９６５））。
【００８８】
上記に代えて、脳卒中重度／転帰は、ワールドワイドウェブｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｔｏｒｓ／ＮＩＨ＿Ｓｔｒｏｋｅ＿Ｓｃａｌｅ＿Ｂｏｏｋｌｅｔ．ｐｄｆにて入手可能な、ＮＩＨストロークスケールを用いて測定することができる。
【００８９】
このスケールは、患者の意識、運動、知覚および言語機能のレベルの評価を含む、１１群の機能を行う患者の能力に基づいている。
【００９０】
虚血性脳卒中とは、より特異的に、脳への血流の妨害によって引き起こされるタイプの脳卒中をいう。このタイプの妨害の基礎疾患は、通常、脂肪蓄積物が血管壁を覆うことの進行である。この状況はアテローム性動脈硬化症と呼ばれている。脳血栓とは、血管の詰まった部分で発達する血栓（血塊）をいう。脳塞栓とは、一般に、循環系の別の場所、通常は心臓ならびに胸郭上部および頸部の大動脈、で生成した血塊をいう。血塊の一部分が取れて血流に入り、脳血管を流れ通って、最終的に、それを通すには小さ過ぎる血管に達する。塞栓症の第２の重要な原因は、心房細動として知られる、不規則な鼓動である。これは、心臓内で血塊が生じて、流出し、脳へと流れ得る状況を創る。虚血性脳卒中のさらなる潜在的原因は、出血、血栓形成、動脈または静脈の切開、心停止、出血を含むあらゆる原因のショック、および、脳血管もしくは脳に至る血管の直接の手術損傷または心臓もしくは肺の手術などの医原性の原因である。虚血性脳卒中は、脳卒中の全原因の８３％を占める。
【００９１】
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、小脳卒中または警鐘脳卒中である。ＴＩＡにおいては、虚血性脳卒中を示す状況が存在し、脳卒中の一般的な危険信号が現れる。しかし、障害物（血塊）は、短時間生じて、通常のメカニズムを通じて溶解する。心臓、肺または神経手術を受ける患者は、特に一過性脳虚血発作の危険性がある。
【００９２】
出血性脳卒中は脳卒中原因の約１７％を占める。これは、破裂して周囲の脳に出血する弱くなった血管に起因する。この血液は溜まって周囲の脳組織を圧迫する。出血性脳卒中の２つの一般的なタイプは、脳内出血およびくも膜下出血である。出血性脳卒中は弱くなった血管の破裂に起因する。弱くなった血管の破裂の潜在的原因には、高い血圧が血管の破裂を引き起こす高血圧性出血、または、他の、脳動脈瘤、動静脈奇形（ＡＶＭ）もしくは海綿状奇形を含む破裂脳血管奇形などの、血管が弱くなったことについての根本原因が含まれる。出血性脳卒中は、また、梗塞における血管を弱める虚血性脳卒中の出血性変化、または、異常に弱い血管を含むＣＮＳにおける原発性もしくは転移性の腫瘍からの出血からも生じる。出血性脳卒中は、また、脳血管への直接の外科的傷害などの医原性の原因からも生じる。動脈瘤は血管の弱くなった領域の膨張である。治療せず放置しておいた場合、動脈瘤は弱くなり続け、最終的に破裂して脳に出血する。動静脈奇形（ＡＶＭ）は、異常に形成された血管の塊である。海綿状奇形は、弱くなった静脈構造からの出血を引き起こす静脈異常である。これらの血管のいずれも、破裂して脳への出血を引き起こし得る。出血性脳卒中は、身体外傷にも起因し得る。脳の一部位における出血性脳卒中は、出血性脳卒中で失われた血液の欠乏を通して、他の部位における虚血性脳卒中に至り得る。
【００９３】
本発明の薬剤は、疼痛の治療または予防にも有用である。疼痛は、それを経験する個人に主観的な経験的現象であり、環境および文化的背景を含む個人の精神状態によって影響される。「身体的」疼痛は、実際のまたは潜在的な組織損傷の原因となる、第三者が感知し得る刺激に関連することもあり得る。この意味において、疼痛は、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）によれば、「実際のまたは潜在的な組織損傷に関連する、またはその損傷の観点で記述された感覚的および感情的な経験」とみなし得る。しかし、疼痛のいくつかの例は、感知し得る原因をもたない。たとえば、既往の身体的疼痛の心因性要因による憎悪を含む心因性疼痛、または、疼痛の感知可能な原因の証拠を欠いた精神的障害をもつ人における、時に永続的な、感知される疼痛の症候群である。
【００９４】
疼痛は、一般に、生理的、炎症性および神経障害性の、３つの主な範疇に分類される。しかし、これらの各々には多重機構が寄与しており、それらの機構は、各々が神経可塑性に依存しまたはその発現であるので、いくつかが重複している。神経可塑性は、一般に、活性化、変調および変更に分類され、各々が感受性の閾値の変化に寄与し得て、その結果、疼痛刺激に対する過感受性が生じる。疼痛は、明確な末梢入力の大脳皮質の痛覚中枢への伝達の受動的帰結ではなく、むしろ、可塑性における変化によって、部分的に末梢において、かつ部分的に中枢神経系において生成される能動的過程である。
【００９５】
生理的疼痛は、有害刺激（針穿刺、温度限界、化学物質）に対する反応として始まり、炎症性疼痛は、組織損傷／炎症によって始まり、神経障害性疼痛は神経系の病変によって始まる。各々は、損傷の部位および隣接正常組織における過感受性によって特徴づけられる。これらの場合、通常は疼痛を生じない刺激が疼痛を生じ（異痛）、有害刺激（鋭器、熱、化学物質）がより大きくより長引く疼痛を誘起する（痛覚過敏）。炎症性および生理的な過感受性は、一般に、その疾患過程または病理が一旦正常に戻ると、正常に戻る。神経障害性疼痛は、初期の事象が癒えた後も持続し、病変に対する反応というよりも、神経系の異常な作用である。
【００９６】
疼痛は、また、急性または慢性とも呼ばれる。急性疼痛は、その性質において一過性の鋭い痛みであり、針穿刺によって引き起こされるものなどである。慢性疼痛は、より長い期間、通常１日以上、持続する疼痛または疼痛過感受性である。慢性疼痛のＲｏｄｅｎｔモデルには、ホルマリン足蹠注射、完全フロイントアジュバント足蹠注射、神経結紮モデル（脊髄／坐骨）、およびすべての神経障害性疼痛モデルが含まれる。
【００９７】
疼痛には、侵害受容性疼痛（体性および内臓性を含む）、神経障害性／神経原性疼痛（退行性、圧力誘導性、炎症性、感染誘導性など）、交換神経性疼痛、炎症性疼痛、虚血性疼痛、および、疼痛突出疼痛、異痛、痛覚過敏、知覚過敏、感覚異常、錯感覚、痛感過敏、幻肢痛、心因性疼痛、有痛性知覚脱失、神経痛、神経炎、悪性疼痛、狭心痛、および／または、突発性疼痛、ならびに、複合性局所疼痛症候群Ｉ，ＩＩ、複合性局所疼痛症候群ＩＩが含まれる。これらの述語は、国際疼痛学会によって定義されており、また相互に排他的ではない。
【００９８】
侵害受容性疼痛は、有害刺激を活動電位にコード化する有害刺激への反応における、末梢神経の特化した知覚侵害受容器によって始まる。侵害受容器は、一般にＡ−δ線維およびＣ繊維に存在し、皮膚の直下、腱内、関節内および体器官内で終わる自由神経終末である。後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンは、末梢と脊髄との間の連絡の場を提供する。信号は、脊髄を通して脳幹および視床部へと処理され、最終的に大脳皮質に送られて、そこで通常（常にではない）疼痛の感覚を生じさせる。侵害受容性疼痛は、体組織を刺激または損傷する潜在力を有する、広範な種々の化学的、熱的、生物的（たとえば炎症性）または機械的事象に起因し得、これらは、一般に、侵害受容器において侵害受容活性を生じさせるために必要な特定の最小強度閾値よりも高い。
【００９９】
炎症性疼痛は、炎症に関連する疼痛を指す。炎症は、感染、刺激および／または損傷に対する器官の免疫応答である。炎症は、発赤、腫れおよび温かみによって特徴づけられる。疼痛誘起刺激は炎症反応を誘起し、これ自体が疼痛の経験に寄与し得る。
【０１００】
神経障害性疼痛は、一般に、それぞれ末梢または中枢神経障害性疼痛を起こす、末梢または中枢神経系における異常な作用の結果である。神経障害性疼痛は、国際疼痛学会によって、神経系における原発性の損傷または機能障害によって引き起こされる疼痛である、と定義されている。神経障害性疼痛には、神経系への実際の、特に慢性的症例における、損傷が含まれることが多い。炎症性の侵害受容性疼痛は、一般に、組織損傷およびそれに起因する炎症過程の結果である。神経障害性疼痛は、組織への何らかの観察可能な損傷の表面上の回復を超えて、長く（たとえば、数月または数年）持続し得る。
【０１０１】
神経障害性疼痛においては、影響された領域からの感覚処理は異常となり得、通常は疼痛を引き起こさない無害の刺激（たとえば熱、接触／圧力）が疼痛を引き起こし（つまり、異痛）、または、有害な刺激が、通常は疼痛を伴う刺激への応答において疼痛の誇大な知覚（つまり、痛覚過敏）を生じさせるかも知れない。加えて、電気的な疼きもしくはショックまたは「チクチク感」に似た感覚（つまり、錯感覚）、および／または、不快な性質を有する感覚（つまり、感覚異常）が、通常の刺激によって引き起こされるかも知れない。突出痛は、既往の慢性疼痛の激化である。痛覚過敏は、刺激に対する異常に痛い反応に起因する痛みを伴う症候群である。ほとんどの症例における刺激は、痛覚閾値の上昇を伴う反復性であり、この閾値は、患者が疼痛と認識し得る疼痛の最小の経験とみなし得る。
【０１０２】
神経障害性疼痛の例には、接触性アロディニア（たとえば、神経損傷後に誘導される）、神経痛（たとえば、ヘルペス後（すなわち帯状疱疹後）神経痛、三叉神経痛）、反射性交感神経性ジストロフィー／灼熱痛（神経外傷）、癌疼痛の成分（たとえば、癌そのものまたは炎症などの関連症状による疼痛、化学療法、外科手術または放射線治療による疼痛）、幻肢痛、エントラップメント神経障害（たとえば、手根管症候群）、および、末梢神経障害（たとえば、糖尿病、ＨＩＶ、慢性アルコール使用、他の毒素（多くの化学療法を含む）への曝露、ビタミン欠乏、および多様な医学的状態による）などの神経障害がある。神経障害性疼痛には、様々な原因、たとえば、外科手術、外傷、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、脚または腕の切断術など、による神経損傷の後の神経系の病理的手術の実施で誘導される疼痛が含まれる。神経障害性疼痛に関連する医学的状態には、外傷性神経損傷、脳卒中、多発性硬化症、脊髄空洞症、脊髄損傷および癌が含まれる。
【０１０３】
いくつかの症状において、疼痛は、侵害受容性因子と神経障害性因子の複雑な混じり合いによって引き起こされるように見える。たとえば、慢性疼痛は、炎症性侵害疼痛もしくは神経障害性疼痛、または両者の混じり合いを含む。初期の神経系機能障害または損傷は、炎症性メディエータの神経放出および後続の神経障害炎症のきっかけとなるかも知れない。たとえば、片頭痛は、神経障害性疼痛と侵害受容性疼痛の混じり合いを表し得る。また、筋筋膜性疼痛は、おそらく、筋肉からの侵害受容性入力に続発するが、異常な筋肉活動は、神経障害状態の結果かも知れない。
【０１０４】
患者が経験する疼痛の症状は、臨床医にとって認識可能な疼痛の兆候を伴うかも知れず、伴わないかも知れない。逆に、疼痛は、患者が症状を自覚することなく、臨床的兆候によって明らかになり得る。疼痛の症状には、たとえば行動変化の形態の、疼痛に対する応答が含まれ得る。疼痛に対する例示的な応答には、痛刺激の意識的忌避、身体または身体の一部を痛刺激から守るための保護的応答、疼痛を最小化し治癒を促進するための応答、疼痛の伝達、および生理的応答が含まれ得る。伝達応答には、疼痛の発声、顔の表情または姿勢の変更が含まれ得る。生理的応答は、自律神経系または内分泌系によって仲介される応答、たとえば、アドレナリンおよびノルアドレナリンの放出増加、グルカゴンおよび／またはホルモンおよび／または副腎皮質ステロイドの産出増大、が含まれる。監視可能な生理的変化には、単収縮、けいれん、まひ、散瞳、振戦、知覚過敏および／または反射変化などの、自発運動増加作用が含まれる。疼痛に対する生理的心臓血管系応答には、血圧の変化、鼓動の数および質の変化、末梢循環の低下、チアノーゼおよび鬱血が含まれ得る。筋緊張（トーン）の増大も疼痛の兆候である。疼痛への応答における脳機能の変化は、脳波検査（ＥＥＧ）、前頭筋電図描画（ＦＥＭＧ）またはポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）などの、種々の技術によって監視することが可能である。
【０１０５】
疼痛の他の症状は、痛刺激の実際の場所に隣接するまたはその場所から離れた場所に局在する痛みの知覚である関連痛であり得る。関連痛は、しばしば、その起点においてまたは起点の近くで、神経が圧迫されまたは損傷したときに、生じる。この状況において、痛覚は、一般に、たとえ損傷が他の場所で生じたとしても、神経が働く領域に感じられる。一般的な例は、脊髄から生じる神経根が隣接する椎間板材料によって圧迫される、椎間板ヘルニアに見られる。疼痛は損傷した椎間板そのものから生じるかも知れないが、疼痛は、圧迫された神経が働く（たとえば、大腿、膝、または足）領域においても知覚される。
【０１０６】
侵害受容活性は侵害受容性疼痛の症状である。侵害受容活性は、意識的に知覚される疼痛がなくても、引き込み反射、および、蒼白、発汗、徐脈、低血圧、立ちくらみ、悪心および失神などの様々な自律反応のきっかけとなるかも知れない。
【０１０７】
本発明の薬剤は、癌の治療または効果的な予防にも有用である。Ｓｒｃはヒトの体内に存在する癌遺伝子であり、多くの癌は、その過剰発現、突然変異または活性に関連している。これらには、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、頭部癌、頸部癌などの固形癌が含まれる。Ｓｒｃはまた、それを制御する他のタンパクにおける突然変異によって、異常に活性化し得る。本発明の方法は、ｍＲＮＡまたはタンパクレベルでのＳｒｃの発現の増大に関連する癌タイプ、特に、Ｓｒｃ発現が同一患者における組織適合非癌性組織に比べて増大する癌に、特に有用である。いくつかの方法において、癌におけるＳｒｃの発現が、随意的に、同一患者からの組織適合非癌性試料の発現と比較して、検査される。しかし、発現レベルの検査は必要でない。Ｓｒｃキナーゼの検出可能な活性、および組織適合非癌性対照試料に対する特に増大した活性は、癌が本発明の方法での治療の対象であることの指標となる。癌細胞においてＳｒｃ遺伝子のコピー数が増加することは、癌が治療の対象であることの、代替のまたは追加の指標となり得る。コピー数の増加は、たとえば、サザンブロット、定量的ＰＣＲ、中期染色体スプレッドのハイブリダイゼーションのインサイチュ蛍光発光、および他の細胞遺伝学的技術によって検出可能である。癌遺伝子に関連するＳｒｃの突然変異の存在もまた、癌が本発明の方法によって治療し得ることの指標である。
【０１０８】
ＩＸ．治療／予防の方法
ａ）治療の方法
随意的に内在化ペプチドに結合した薬剤が、治療的に有効な投与計画において、上述の疾患もしくは障害の兆候および／または症状を有する患者に投与される。この投与計画は、治療中の疾患または症状を患っている患者（または動物モデル）の集団における疾患の少なくとも１つの兆候または症状の、本発明の薬剤での治療を受けていない、その疾患または症状を患っている患者（または動物モデル）の対照集団に対する、有効な治癒、軽減またはさらなる悪化の阻止に有効な量、頻度および投与経路を意味する。この投与計画はまた、個々の治療患者が、本発明の方法により治療されない比較患者の対照集団における平均の結果よりも、良好な結果を達成する場合に、治療上有効であると認められる。投与の回数は、治療する疾患または障害に依存する。脳卒中、外傷性損傷、不安神経症、急性疼痛またはてんかんなどの急性または一過性の症状については、多くの場合、少なくとも１回の発症当たり単回の投与で十分である。神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病またはパーキンソン病、癌、慢性疼痛などの慢性の症状については、複数回投与および、時に生涯にわたる治療が指示される。
【０１０９】
脳卒中またはＣＮＳの他の虚血性症状を患う患者については、脳卒中または他の虚血性症状の損傷作用を低減するために有効な量、頻度および投与経路を含む投与計画で薬剤が投与される。治療を必要とする症状が脳卒中の場合、結果は、梗塞ボリュームまたは障害指数によって決めることができ、投与量は、個々の治療患者が、Ｒａｎｋｉｎスケールで２以下およびＢａｒｔｈｅｌスケールで７５以上を示す場合に、または、治療患者の集団が、障害指数のスコア上で、比較の非治療集団よりも、有意に改善された（つまり、障害が減少した）分布を示す場合に、治療上有効であると認められる。Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：５８８−６００を参照。脳卒中の治療には、薬剤の単回投与で十分なことが多い。
【０１１０】
本発明の薬剤は、一定の時間における、再かん流の有効性もしくは安全窓を広げる、または再かん流の安全性もしくは有効性を向上させるためにも有用である。これは、時間の経過につれて出血事象の頻度が増すことにより、有益な投与の窓が脳卒中の後わずか０〜４．５時間であるプラスミノーゲン活性化因子などの、血塊を壊す他の薬剤との併用での虚血性脳卒中の治療において、特に有用である。本発明の薬剤は、脳内の血塊を壊す薬剤の安全性および／または有効性を向上させるために、投与することができる。
【０１１１】
通常は薬剤の１〜８用量が癌を治療するために投与されるが、より多くの用量を投与することも可能である。薬剤は、たとえば、薬剤の半減期が１週、２週、４週、８週、３〜６月またはそれ以上であることに応じて、毎日、週２回、毎週、隔週、毎月または他の間隔で、投与することができる。長期投与のような繰り返しの治療パターンも可能である。
【０１１２】
薬剤による癌の治療は、たとえば、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル）もしくはその誘導体、カルボプラチンもしくはシスプラチンなどの白金化合物、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗物、またはエトポシドの、従来の治療と組み合わせることが可能である。本発明の薬剤は、たとえば乳癌および卵巣癌に対して、標準的化学療法における２，３またはそれ以上の薬剤、たとえばタキソールおよびカルボプラチン、との組み合わせで使用することができる。組み合わせのための他の薬剤には、モノクローナル抗体などの生物製剤、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（商標）、またはＥＧＦ受容体への抗体のほか、小分子の抗血管形成剤またはＥＧＦ受容体拮抗薬が含まれる。さらに、薬剤は、放射線治療または外科手術と併用することが可能である。
【０１１３】
本発明の薬剤による治療は、この薬剤を含まない対照投与計画と比較して、癌を有する患者の平均無増悪生存率または全生存期間を、少なくとも３０％もしくは４０％、好ましくは５０％，６０％〜７０％、または１００％以上も、向上させ得る。これに加えてまたは代えて、この薬剤を含む治療は、この合成抗体を含まない同じ投与計画と比較して、再発したまたは難治性の癌を有する患者の完全寛解率、部分寛解率または客観的寛解率（完全＋部分）を、少なくとも３０％もしくは４０％、好ましくは５０％，６０％〜７０％、または１００％以上も、向上させるかも知れない。随意的に、治療は、腫瘍成長、侵襲、転移または血管形成を阻害し得る。
【０１１４】
一般に、臨床試験（たとえば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）において、化学療法と本発明の薬剤との併用で治療した患者の、化学療法のみ（または偽薬の併用）を受けた患者の対照群に対する、平均無増悪生存率および／または寛解率の向上は、ｐ＝０．０５または０．０１のレベルで統計的に有意である。完全および部分寛解率は、癌についての臨床試験、たとえば、国立がん研究所および／または食品医薬品局で普通に用いられる客観的基準で決定される。
【０１１５】
ヒトの疼痛に対する薬剤の効果は、種々の試験を用いて評価することができる。患者の疼痛を評価するために、異なる方法を用いて、数多くの疼痛質問表および尺度が設計されている。疼痛は、単一の基準で（強度のみ）、またはいくつかの基準を用いて（持続時間と強度）、評価してよい。有用な疼痛の尺度には、視覚的アナログ尺度、ＭｃＧｉｌｌ疼痛質問表、および記述子ディファレンシャルスケール（Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ９ （５）： ７６８-９． ＰＭＩＤ ６１８４４７４． Ｍｅｌｚａｃｋ． （１９７５） Ｐａｉｎ １ （３）： ２７７-９９， Ｇｒａｃｅｌｙ （１９８８）， Ｐａｉｎ ３５ （３）： ２７９-８８を参照）。疼痛に対する患者の感受性（疼痛閾値）は、ソニックパルモメータ、圧力制御パルモメータ、レーザー痛覚計アナルジアメータ（ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ベースラインアルゴリメータ（Ｋｏｍ Ｋａｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）、疼痛に対する皮膚の感度を測定するＢｊoｒｎｓｔｒoｍ痛覚計、上腹部の疼痛についての感受性を測定するＢｏａｓ痛覚計などの、痛覚計を用いて測定することも可能である。疼痛の治療に併用し得る薬物の例には、ＮＳＡＩＤ，ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−３阻害剤、ｉＮＯＳ阻害剤、ＰＡＲ２受容体拮抗薬、神経遮断薬、オピオイド、Ｎ−アセチルコリン受容体作動薬、グリシン拮抗薬、バニロイド受容体拮抗薬、ニューロキニン拮抗薬、カルシトニン遺伝子関連ペプチド拮抗薬、および、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害性一酸化窒素供与体（ＣＩＮＯＤ）が含まれる。他の疼痛軽減薬には、コデイン、バオコディン、モルフィン、Ｄｅｍｅｒｏｌ、パーコセット、ＤａｒｖｏｎおよびＤａｒｖｏｃｅｔコノトキシン、ならびにＳｙｍｌｉｎがある。
【０１１６】
ｂ）予防の方法
本発明は、疾患の危険がある対象者における疾患の予防のための方法および組成物を提供する。通常このような対象者は、対照集団と比べて、疾患（たとえば、症状、病気、疾患または障害）の進行する可能性が高まっている。たとえば対照集団は、その疾患と診断されたことがなく、その疾患の家族歴を有しない、一般集団から無作為に選択された１人以上の個人を含む（たとえば、年齢、性別、人種および／または民族性で整合させる）。対象者は、疾患に関連する危険因子がその対象者に関連していることが判った場合、その疾患について危険性があると認められる。危険因子には、たとえば、その対象者の集団の統計的または疫学的研究を通じてその疾患に関連する、あらゆる活動、形質、出来事または性質を含まれ得る。対象者は、したがって、根本的な危険因子を特定する研究が具体的にその対象者を含まなかった場合でも、疾患についての危険性があると分類され得る。たとえば、心臓手術を受ける対象者は、心臓手術を受けたことのある対象者の集団における一過性脳虚血発作の頻度が、心臓手術を受けたことのない対象者の集団と比べて高いので、脳卒中の危険性がある。
【０１１７】
脳卒中についての他の一般的な危険因子には、年齢；家族歴；性別；脳卒中、一過性虚血発作または心臓発作の既発；高血圧；喫煙；糖尿病；頸動脈または他の動脈疾患；心房細動、心臓病、心臓まひ、拡張型心筋症、心臓弁膜症および／または先天性心臓欠陥などの他の心臓疾患；高い血中コレステロール；ならびに飽和脂肪、トランス脂肪、またはコレステロール高含有の食事が含まれる。
【０１１８】
癌についての危険因子には、癌への遺伝的感受性、放射線または毒素などの発癌物質への曝露を経験した患者、および、癌の治療を経験したことがあり、再発の危険性のある患者、が含まれる。
【０１１９】
疼痛についての危険因子には、外科手術の経験、戦闘もしくは他の危険への曝露、または、糖尿病および癌などの激しいもしくは慢性の疼痛に関連する疾患の経験、が含まれる。
【０１２０】
随意的に内在化ペプチドに結合された薬剤は、疾患の危険性があるが、その疾患を有していない患者に、予防上有効な投与計画で投与され、前記投与計画は、その疾患の危険性がありその薬剤で処理される患者（または動物モデル）の集団における、その疾患の少なくとも１つの兆候または症状の発生を、その疾患の危険性があるが本発明のキメラ剤で処理されない患者（または動物モデル）の対照集団と比べて、防止、遅延または阻止するための用量、頻度および経路を意味する。用量は、また、処理された個々の患者が、本発明の方法で処理されない対照患者の集団の平均結果よりも良好な結果を達成した場合に、予防上効果があると認められる。予防上効果のある投与計画には、予防上効果のある投与量を、意図する目的を達成するために必要な頻度および投与経路で、投与することが含まれる。切迫した危険性のある患者（たとえば、心臓手術を受ける患者）における脳卒中または他の急性発症の疾患もしくは障害の予防には、通常、薬剤の単回投与で十分である。より長期の危険性、たとえば、発癌物質への曝露後の癌の危険性、のある患者については、複数回投与が指示されてよい。
【０１２１】
Ｘ．医薬組成物、投与量および投与経路
本発明の薬剤、随意的に内在化ペプチドに結合された薬剤は、医薬組成物の形態で投与することが可能である。医薬組成物は、一般に、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位容量の形態（つまり、単回投与のための投与量）で提供することが可能である。医薬組成物は、従来の、混合、溶解、粒状化、糖衣化、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥の処理によって製造することが可能である。たとえば、凍結乾燥された薬剤は、以下に述べる剤形および組成で使用することができる。
【０１２２】
医薬組成物は、キメラ薬剤を処理して薬剤的に使用可能な製剤とすることを容易にする、生理的に許容される１つ以上の担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して、従来の態様での剤形とすることが可能である。適切な剤形は、選択される投与経路に依存する。
【０１２３】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所的、鼻腔内、吸入、経皮たとえばパッチ、または筋肉内であり得る。静脈内投与が好ましい。
【０１２４】
非経口投与の医薬組成物は、好ましくは、殺菌され実質上等張である。注射用には、薬剤は、水溶液の剤形、好ましくは、Ｈａｎｋ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、生理食塩水または酢酸緩衝液などの、生理的に適合する緩衝液（注射部位の不快感を軽減する）の剤形である。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。
【０１２５】
代替の薬剤は、適切な媒体たとえば無菌の無発熱物質水と使用前に組み合わせるために、粉末状であり得る。
【０１２６】
本発明の薬剤は、マンニトール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）またはＤＭＳＯなどの、本発明の薬剤の血液脳関門通過性を高める他の薬剤と、併せて投与することが可能である。
【０１２７】
経粘膜投与には、浸透させるべき障壁に適する浸透剤が製剤内に使用される。この投与経路は、化合物を鼻腔に届けるために、または舌下投与に、使用することが可能である。
【０１２８】
経口投与には、治療する患者による経口摂取のために、薬剤は、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして薬理的に許容される媒体とともに製剤化することが可能である。たとえば封末剤、カプセルおよび錠剤などの経口固形剤形のために好適な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールなどの糖；トウモロコシでんぷん、小麦でんぷん、米でんぷん、ジャガイモでんぷん、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物；粒状化剤；および結合剤などの、増量剤が含まれる。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、たとえばアルギン酸ナトリウム、などの崩壊剤を加えることが可能である。必要に応じて、固形の投与剤形は、標準的な技術を用いて糖コーティングまたは腸溶コーティングを施すことが可能である。たとえば懸濁液、エリキシル剤および溶液などの経口液体調製物のために、好適な担体、添加剤または希釈剤には、水、グリコール、油、アルコールが含まれる。さらに、香味剤、保存剤、着色剤などを添加することが可能である。
【０１２９】
上記の剤形に加えて、前記薬剤は、デポ剤として製剤化することも可能である。この効果持続時間の長い剤形は、埋め込み（たとえば皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することが可能である。したがって、たとえば、この化合物は、適切な高分子または疎水性材料（たとえば、許容される油内の乳化剤）もしくはイオン交換樹脂と共に、または、やや難溶性の誘導体として、たとえば、やや可溶の塩として、製剤化することが可能である。
【０１３０】
これに代えて、他の薬理的送達システムを採用することも可能である。リポソームおよび乳化剤を、キメラ薬剤の送達に使用することができる。ジメチルスルホキシドなどの一定の有機溶媒もまた、通常は毒性が大きいけれども、採用することが可能である。さらに、この化合物は、この治療剤を含有する固形高分子の半透過性マトリックスなどの、徐放性システムを使用して送達することができる。
【０１３１】
徐放性カプセルは、その化学的性質に応じて、数週から１００日までの期間、このキメラ剤を放出することができる。治療剤の化学的性質および生物的安定性に応じて、タンパク安定化のための追加の方略を採用することが可能である。
【０１３２】
本発明の薬剤は荷電した側鎖または末端を含有することができるので、遊離の酸もしくは塩基として、または薬理的に許容される塩として、上述の剤形のいずれにも含め得る。薬理的に許容される塩は、遊離の塩基の生物活性を実質的に保持した、無機酸との反応で調製される塩である。薬理的塩は、対応する遊離塩基型よりも、水および他のプロトン性溶媒に溶け易い傾向にある。
【０１３３】
投与すべき薬剤の量は、処理される患者、疾患または障害、処理が治療的な性質であるか予防的な性質であるか、患者の体重、苦痛の重度、投与の態様、および処方する医師の判断に依存する。治療は、症状が検出される間、あるいは症状が検出されないときにも、間欠的に繰り返すことができる。治療は、単独で、または他の薬物と組み合わせて、提供することができる。
【０１３４】
本発明の薬剤の有効な用量は、実質的な毒性をもたらすことなく、利益を提供し得る。薬剤の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬理手続きで、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対して致死的な量）を測定することによって、決定することができる。毒性と治療効果との量比が、治療指数である。高い治療指数を示す薬剤、たとえば、ペプチドまたはペプチド模倣体が好ましい（たとえば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， Ｉｎ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０１３５】
薬剤に結合した内在化ペプチドを含むキメラ剤は、その薬剤単独のモル基準で、同じまたはより低い用量で使用することが可能であり、その薬剤単独と同じ経路で、その薬剤単独と同じ疾患のために、投与することが可能である。
【０１３６】
随意的に内在化ペプチドに結合した薬剤の好適な用量は、通常２５ｍｇ／ｋｇよりも少ない。用量は、１０〜４ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇに、たとえば、０．１または０．５ｍｇ／ｋｇ〜１，５０または１０ｍｇ／ｋｇに、わたることがある。患者当たりの総用量は、ｋｇ体重当たりの用量にｋｇ単位の患者の体重を乗じて、計算することができる。たとえば、７５ｋｇの患者についての総用量は、上記の用量に７５を乗じることによって計算される。
【０１３７】
ＸＩＩ．スクリーニング方法
１．スクリーニングされる薬剤
薬剤は、所望の結合または阻害活性について、まずインビトロでスクリーニングすることが可能である。薬剤には、上述したように、ＮＤ２ペプチドまたはそのペプチド模倣体が含まれ得る。スクリーニングされる薬剤は、海洋微生物、藻類、植物、菌類などの天然源から、または合成ペプチドもしくは他の化合物のライブラリーから、得ることが可能である。段階的に合成することが可能な多種類の化合物について、組み合わせライブラリーを創生することも可能である。このような化合物には、ポリペプチド、ベータ−ターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、Ｎ置換グリシンオリゴマーおよびオリゴカルバメートが含まれる。Ａｆｆｙｍａｘ，国際公開公報ＷＯ９５／１２６０８号、 Ａｆｆｙｍａｘ，国際公開公報ＷＯ９３／０６１２１号、 Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，国際公開公報ＷＯ９４／０８０５１号、 Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，国際公開公報ＷＯ９５／３５５０３号、および、Ｓｃｒｉｐｐｓ，国際公開公報ＷＯ９５／３０６４２号（これらは各々、あらゆる目的のために、参照によって取り込まれる）に記載されているコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって、化合物の大きな組み合わせライブラリーを構築することが可能である。ペプチドライブラリーは、また、ファージディスプレイ法によって創生することも可能である。たとえば、Ｄｅｖｌｉｎ，国際公開公報ＷＯ９１／１８９８０号を参照。
【０１３８】
２．インビトロスクリーニング
薬剤は、まず、所望の活性について、たとえば、ＳｒｃまたはＳｒｃの残基４０〜４９を含むＳｒｃペプチドへの結合する能力について、スクリーニングすることが可能である。これに代えてまたは加えて、薬剤は、Ｓｒｃまたはその残基４０〜４９もしくは残基４０〜５８を含むペプチドへの結合能において、ＮＤ２または上記のＮＤ２ペプチド（たとえば、ＮＤ２の残基３１０〜３２１から成るペプチド）と競合する能力について、スクリーニングすることが可能である。結合は、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、またはウェスタンブロットなどの方法によって、評価することができる。いくつかのフォーマットにおいて、それらの結合試験の１つの要素は固定される。実施例において説明するように、いくつかのフォーマットが可能である。Ｓｒｃに結合するおよび／またはＮＤ２もしくはＮＤ２ペプチドのＳｒｃへの結合を阻害する薬剤の能力は、その薬剤が、神経疾患、疼痛または癌の治療において有用な薬理活性を有することの指標となる。薬剤は、次いで、以下に説明するように、様々な動物モデルにおいてさらに試験される。
【０１３９】
薬剤は、また、Ｓｒｃキナーゼに対する阻害活性についてもスクリーニングすることが可能である。キナーゼ試験を行うためのキットが市販されている。Ｓｒｃ、一般に組み換表現型のＳｒｃは、リン酸化可能な残基およびＡＴＰの存在で固定化を可能にするタグを有するペプチド、ならびにキナーゼ緩衝剤と混合される。キナーゼ活性の指標となるリン酸化ペプチドの量を、そのリン酸化ペプチドに特異的な抗体を使用して検出することができる。この試験は、試験対象の薬剤がリン酸化および暗示的にＳｒｃ活性を低下させる場合は、その薬剤を存在させておよび存在させずに行われる。
【０１４０】
３．脳卒中の動物モデル
薬剤は、脳卒中の種々の動物モデルで試験することが可能である。それらのモデルの１つにおいて、雄の成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、管腔内縫合法により一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に９０分間付す。動物を一夜絶食させ、硫酸アトロピン（０．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を注射する。１０分後、麻酔が誘導される。ラットに経口で挿管して、機械的に換気し、臭化パンクロニウム（０．６ｍｇ／ｋｇ、静脈内）で麻痺させる。体温は、加温ランプで、３６．５〜３７．５℃に維持する。大腿動静脈内でポリエチレンのカテーテルを使用して、血圧を連続して測定し、ガスおよびｐＨ測定のために血液を採取する。一過性ＭＣＡＯは、ポリ−Ｌ−リジン被覆の３−０モノフィラメントナイロン縫合糸（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を、内頸動脈経由でウィリス輪に挿入して、中大脳動脈を効果的に閉塞することにより、９０分間行う。これは、大脳皮質および脳幹神経節を包含する広範な梗塞を生じる。動物を、試験対象の薬剤または陰性もしくは陽性対照のいずれかで処理する。処理は、虚血の誘導前または誘導後１時間までのどちらかに、可能である。陰性対照は媒体であり得る。陽性対照は、有効であることが既に示されている、Ｔａｔ−ＮＲ２Ｂ９ｃペプチド、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号６）であり得る。動物への薬剤の投与後、梗塞ボリュームおよび／または障害指数を決定する。梗塞ボリュームは通常、処理後２４時に測定されるが、３，７，１４または６０日などのより遅い時に測定することも可能である。障害指数は、たとえば、処理後２時、処理後２４時、処理後１週または１月の期間にわたって、監視することができる。梗塞ボリュームおよび／または障害指数において、薬剤で処理しない対照動物と比べて統計的に有意な減少を示す薬剤は、本発明の方法を実施するために有用な活性を有すると、確認される。
【０１４１】
類似の実験を、永続的虚血に付した動物で行うことも可能である。中大脳動脈軟膜血管の永続的虚血は、Ｆｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８８：Ｈ１９８９−Ｈ１９９６ （２００５）に記載されているようにして実施することができる。簡潔に説明すると、右ＥＣＡにＰＥ１０ポリエチレンチューブのカニューレを挿入する。正中切開で頭蓋骨を露出し、右の体性感覚皮質の上に、６〜８ｍｍの頭蓋窓（プレグマに対して、２ｍｍ後方、５ｍｍ横）を形成する。通常の生理食塩水中の生体染色色素パテントブルーバイオレット（１０ｍＭｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）の小ボーラスをＥＣＡに注射することによって、軟膜動脈を可視化する。同一の３つの軟膜血管ＭＣＡブランチを電気的に焼灼し、焼灼した軟膜細動脈を通る流れの遮断を確実にするために、色素注射を繰り返す。次いで、切開部を閉じ、動物をケージに戻して、食物および水を自由に与える。この永続的虚血モデルは、再現性が高く、凝固した末端軟膜動脈の下の皮質に限定された小さな梗塞を生成する。
【０１４２】
４．疼痛の動物モデル
哺乳動物（たとえば、齧歯動物）における疼痛の侵害受容試験には、テールフリック（脊髄媒介侵害受容反射）試験（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． （１９４１）， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ７２： ７４−７９）、ホットプレート試験、Ｒａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｉｔｔｏ試験（Ｓｗｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９７１）， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １３７： ５３６−５３８）、およびテールピンチ試験がある。これらの試験は、熱に対する閾値（テールフリック試験、ホットプレート試験、肢引き込みのＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験、および熱水への尾または後肢の短時間の浸漬）などの異種の有害刺激に対する侵害受容閾値；または、たとえば、異痛試験についてのＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ法，１９９９ Ｍａｒ １；８７（２）：１８５−９３による刺す刺激に対する触知性閾値を評価するために使用することが可能である。動的異痛は、後肢の裏の表皮を綿棒で軽く打ち、打ち始めてから８秒以内に動物が綿の刺激に反応する場合に動的異痛が存在すると判断することによって評価することが可能である。有害な化学剤に対する疼痛応答は、たとえば、希酢酸の腹腔内注射後の腹部ライジングを監視することによって、および、飲み水にカプサイシンを加えることによる嫌悪水飲み試験（これは、三叉神経侵害を評価するのに使用することができる）によって、測定することが可能である。
【０１４３】
炎症性疼痛および過感受性の試験には、ホルマリン肢試験（Ｔｊｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２）， Ｐａｉｎ ５１： ５−１７）、完全フロイントアジュバント肢試験（ＣＦＡ）、ホルマリン誘導顔面痛（Ｃｌａｖｅｌｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９８９）， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． １０３： ３４９−３５３）、および、カラゲナン、カプサイシンまたはブラジキニンなどの物質の投与に基づく肢試験が含まれる。関節炎状態は、カラゲナン、尿酸もしくはからし油などの物質またはアジュバントを様々な関節に注射することを含む様々なモデルによって模倣することが可能である。内臓痛は、ブラジキニン、アセチルコリン、酢酸またはフェニルキノンなどの物質の腹腔内注射によってモデル化することが可能である。ストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病神経障害モデルは、３週以内の再現性のある機械的異痛を誘導する（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｐａｎ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ８７： ２７２６−２７３３， ２００２）。
【０１４４】
末梢神経損傷に起因する神経障害性疼痛の試験には、慢性絞縮傷（たとえば、坐骨神経結紮のＢｅｎｎｅｔおよびＸｉｅモデル、Ｐａｉｎ ３３： ８７−１０７）；部分的神経結紮（Ｓｅｌｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９１）、脊髄神経切断または結紮（Ｌｏｍｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ． １９７９ ６：１６３−７４； Ｋｉｍ ＆ Ｃｈｕｎｇ， Ｐａｉｎ． １９９２；５０：３５５−６３）、寒冷神経剥離（Ｄｅｌｅｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ． １９９４；５６：９−１６）、坐骨神経虚血（Ｋｕｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ． ９９８；７６：４５−５９）が含まれる。一般的な試験は、触知性異痛試験（Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ． ５３： ５５−６３）である。Ｔａｘｏｌ誘導神経障害性疼痛は、炎症性の要素を含まない。特定の末梢神経障害状態に特異的なモデルには、三叉神経神経痛（Ｖｏｓ ａｎｄ Ｍａｃｉｅｗｉｃｚ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９４；１４：２７０８−２３）、糖尿病性神経障害（Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ． １９８５；３４：１２１０−３）、およびビンクリスチン神経炎（Ａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． １９９６；７３：２５９−６５）の動物モデルが含まれる。神経腫モデル（Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｉｎ． １９７９ Ｏｃｔ；７：１０３−１１）は、手足の切断に起因する幻想痛を反映する。
【０１４５】
脊髄損傷に起因する疼痛の動物モデルには、索切断または部分的切断（Ｌｅｖｉｔｔ ＆ Ｌｅｖｉｔｔ， Ｐａｉｎ． １９８１；１０：１２９−４７）、放射線誘導虚血モデル（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ． １９９１ ８；１２８：１０５−８）、キスカル酸の髄腔内注射を用いる興奮毒性モデル（Ｙｅｚｅｉｅｒｓｋ電ａｒｋ， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ． １９９３ ９；１５７１）：１１５−９）、および挫傷モデル（Ｓｉｄｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ． １９９５；６：１２４１−４）が含まれる。
【０１４６】
５．てんかんの動物モデル
異なるてんかん状態の広範な動物モデルが、よく特徴づけられている。ＳｅｉｚｕｒｅｓおよびＥｐｉｌｅｐｓｙモデル（ｅｄ． Ｐｉｔｋaｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＩＳＢＮ： ９７８−０−１２−０８８５５４−１； Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．， ２００６）を参照。この全体が、参照によって取り込まれる。動物は、ショウジョウバエから霊長類までにわたり、ここで、てんかんは、化学物質の投与、または発作および／もしくはてんかんを自発的に発現する検体の遺伝子スクリーニングを含む様々な方法によって、引き起こされる。動物モデルの例には、発熱発作に似たラットの高熱誘導発作、ならびに、トッタラー、スターゲイザー、嗜眠性、および短時間行動停止（つまり、注視または凝視）などのヒト欠神てんかんに類似する特徴を共有する徐波てんかん（ＳＷＥ）のマウスなどの、マウスの変異が含まれる。
【０１４７】
よく特徴づけられた動物モデルは、また、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）を有する患者に見られる複雑部分発作についても記載されている。カイニン酸およびピロカルピン（ＰＩＬＯ）発作モデルが、おそらく、最も一般に研究されているＴＬＥの化学物質誘導動物モデルである。初期の準けいれん電気刺激の反復的限局的適用が最終的に激しい部分性および全身性けいれん発作となる現象であるキンドリングは、ＴＬＥの情報モデルであり続ける。
【０１４８】
さらに、いくつかの遺伝的にてんかんを発症し易い種が、光感受性および聴覚原性反射てんかんの研究のための動物モデルとして、記載されている。これらの種には、ギニアヒヒ、ニワトリのてんかん（ＦＥｐｉ）種であるファイオウミ（Ｆａｙｏｕｍｉ）、遺伝的にてんかんを発症し易いラット（ＧＥＰＲ）およびＤＢＡ／２マウスが含まれる。
【０１４９】
高度に発作を生じ易いまたは自発的発作を有するいくつかの遺伝的動物モデルなどの、動物における全身性硬直間代発作または欠神発作を誘導するための、多くの方法が利用可能である。以下は、そのような発作型を誘発するいくつかの従来の方法である。
【０１５０】
間代性活動が続く緊張性の後肢伸張／屈曲によって特徴づけられるけいれん発作は、最大の電気ショックによって確実に誘導され、新たな抗けいれん薬の速やかなスクリーニングのための一般的な方法であり続ける。
【０１５１】
ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）は、おそらく最も広く使用されている全身投与のけいれん誘発薬である。ＰＴＺの反復注射を、電気的キンドリングに類似する一種の化学的キンドリングを創生するために行うことができる。高用量では、ＰＴＺ（通常、皮下または静脈内投与される）は、ラットまたはマウスにおいて硬直間代けいれんを確実に生じさせ、発作感受性および新たな薬物のスクリーニングの双方の速やかで効果的な尺度となる。低用量で全身的に投与されると、ＰＴＺは、欠神様発作を引き起こすためにも使用される。
【０１５２】
ヘキサフルオロ化エーテルであるフルロチルは、齧歯動物において再現性のあるけいれん発作パターンを誘導するために使用される化学吸入剤である。この方法において、ラットまたはマウスは、気密室に入れられ、ここでフルロチルが中枢に投与される。１０〜２０分後、フルロチルは、まずミオクローヌス反射を、次いで激しい硬直間代けいれんを、引き起こす。最後に、全身性の欠神発作の他の実験動物モデルには、視床刺激、ネコにおける全身性ペニシリン投与、ｇ−ヒドロキシブチレート処理（ＧＨＢ）、および脳室内アヘン誘導体のほか、ラット（ＧＡＥＲＳ， ＷＡＧ／Ｒｉｊ， ＳＥＲ）ならびに既述のマウス（スターゲイザー、トッタリング、嗜眠性、短時間行動停止のマウス、モカおよびダッキ）における遺伝的モデルが含まれる。
【０１５３】
上述のものなどの動物モデルは、インビボおよびインビトロの双方で、部分性または全身性発作の関連現象の基本的機構を理解する上でこれまで有益であり、また、新しい治療法の評価のための標準的技術である。Ｓａｒｋｉｓｉａｎ， Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ＆ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ２， ２０１-２１６ （２００１）を参照。この全体が、参照によって取り込まれる。
【０１５４】
６．不安神経症の動物モデル
不安神経症は、ラットなどの動物を、なじみのない環境に置いて、反応（たとえば、格子線を横断する、または開いたもしくは閉じたチューブを選択する）を観察することによって誘導される。たとえば、覚醒の状態および新しい環境に慣れる能力の双方を明らかにするために、ラットをオープンフィールドアリーナにおいて試験して、格子線を横断することから評価することができる。横断の減少は不安感の低下を示す。ラットを迷路で試験して、ラットにおける不安感／情動性を評価することもできる。好適な迷路は、中央のプラットホームから延びて床からの高さが１．５ｍの４本のアーム（２本は開き、２本は閉じている：幅１５ｃｍで長さ６０ｃｍ）を有する。ラットを迷路の中央に置き、どのアームに入るかを自由に選択できるようにする；運用上、入るとは、頭と前肢とをアーム内に入れることと規定する。開いたアームおよび閉じたアームそれぞれでの経過時間を、２方向（頭上および水平）から同時に撮影したビデオ記録から記録し、採点する。ラットは開いた空間を避けようとする生来の性向があるので、開いたアームでの経過時間が長いことは、不安感の低下を示す。
【０１５５】
７．癌の動物モデル
癌に対する薬剤の活性は、免疫不全のまたはヒトの腫瘍を移植したマウスまたはラットで試験することが可能である。使用可能なマウスの免疫不全系統の例には、ＣＤ−１ヌード、Ｎｕ／Ｎｕ、Ｂａｌｂ／ｃヌード、ＮＩＨ−ＩＩＩ（ＮＩＨ−ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄ ＢＲ）などのヌードマウス；Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤ）， Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ｏｕｔｂｒｅｄ ＳＣＩＤおよびＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅなどのｓｃｉｄマウス；ＲＡＧ酵素欠乏のマウス；のほか、ヌードラットがある。実験は、たとえば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１ （１９９２）に記載されているようにして実施する。完全ＤＭＥＭ培地で培養したヒト腫瘍細胞は、一般に、ＨＢＳＳに採取される。雌の免疫不全の、たとえば、胸腺欠損ヌードマウス（４〜６週齢）に、一般には０．２ｍｌのＨＢＳＳ中の５×１０６細胞を、背側領域に注射する。腫瘍サイズが５０〜１００ｍｍ３に達すると、ラットを無作為にグループ分けして、薬剤の適切な投与計画を、その薬剤を欠いた対照投与計画と並行して、実施する。腫瘍サイズは、一般に週に２回、２方向（長さ（ａ）および幅（ｂ））について測定することによって、判定する。腫瘍サイズは、Ｖ＝ａｂ２／２に従って計算し、平均腫瘍サイズ±ＳＥＭで表す。薬剤の効果は、時間経過による腫瘍の成長、マウスの生存期間の延長、または、一定の時点もしくは不定時に生存しているマウスの割合の増加、によって測定する。対照群と比較する統計解析は、たとえばスチューデントのｔ検定を使用して行ってよい。
【０１５６】
８．内在化ペプチド
ペプチドまたは他の薬剤は、動物における内在化または輸送活性について試験することが可能である。薬剤（Ｔａｔペプチドなど）は、たとえば標識化して、マウスなどの動物に注射することが可能である。たとえば、腹腔内または静脈内注射が好適である。注射後約１時間で、マウスを殺処分し、固定液（３％パラホルムアルデヒド、０．２５％グルタルアルデヒド、１０％スクロース、生理食塩中１０Ｕ／ｍＬヘパリン）で灌流する。次いで、脳を取り出して、凍結し薄片にする。切片を、共焦点顕微鏡を用いて、蛍光について分析する。内在化活性を、蛍光から、随意的に陰性対照および陽性対照と比較して、決定する。適切な陽性対照は、標準的なＴａｔペプチドを含む薬剤である。適切な陰性対照は、Ｔａｔを欠く蛍光標識した活性薬物である。非標識媒体もまた、陰性対照として使用することができる。
【０１５７】
内在化ペプチドまたは他の薬剤を試験するために、類似の実験を細胞培養において行うことが可能である（米国特許公報第２００３００５０２４３号を参照）。随意的に活性ペプチドに結合した、変異型蛍光標識Ｔａｔペプチドを、皮質神経細胞培養に投与する。投与後数分にわたって、蛍光顕微鏡を使用して、取り込みを判定する。取り込みの向上は、動物における取り込みの実験について記載したように、陽性対照および陰性対照と比べて判定することができる。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：Ｓｒｃキナーゼへの結合に関与するＮＤ２配列の同定
ＧＳＴ融合タンパクを、ＮＤ２の異なるフラグメントを用いて設計し、標準的プロトコルを用いて発現および精製した。これらの精製タンパクを、ビオチニル化Ｓｒｃ４０〜５８ペプチドまたはスクランブル化対照ペプチド（ｓＳｒｃ４０〜５８）で調べるために、膜にスポットした。一般に、１〜１０μｇのペプチドまたは組み換えタンパクを、ニトロセルロースにスポットして、一夜乾燥した。膜を５％ミルクで室温にて１時間ブロックし、次いで、ビオチニル化ペプチド（〜１５μｇ／ｍｌ）と共に２時間インキュベートして、標準の洗浄緩衝液で洗浄した。結合プローブを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰ）および標準検出試薬、主に化学発光キット、での短時間インキュベーションを用いて検出した。図１Ｂは、構築物の第１のセットを示しており、図１Ｃは、ＮＤ２の全長がＳｒｃ４０〜５８に結合し得ること、および、ＮＤ２．１（ＡＡ２３９−３２１）と呼ばれるサブフラグメントもＳｒｃ４０〜５８に結合し得ることを示すドットブロットである。コアＳｒｃ結合領域を狭めるために、さらなるＧＳＴ構築物を作成した（図２Ａ）。これらの構築物でドットブロットを作成し、ビオチニル化Ｓｒｃ４０〜５８を捕捉するそれらの能力について試験した（図２Ｂ）。ＮＤ２．１．４（ＡＡ２８９〜３２１）が、Ｓｒｃ４０〜５８への結合に最も有効なサブフラグメントであり、一方、試験したどのフラグメントもスクランブル化陰性対照（Ｂ−ｓＳＲＣ４０〜５８）に結合せず、これは相互作用の特異性を示している。
【０１５９】
確証として、ＥＬＩＳＡ試験を行って、この結合を異なる試験形式で示した。ＧＳＴ−ＮＤ２，ＧＳＴ−ＮＤ２．１またはＧＳＴ−ＮＤ２．１．４を、図示した濃度にて標準の条件下でインキュベートすることによって、ＥＬＩＳＡウェルに被覆した。５％ミルクを用いてウェルをブロックし、ビオチン−Ｓｒｃ４０〜５８（図２Ｃ上図）またはビオチン−ｓＳｒｃ４０〜５８（下図）のいずれかを６μＭでインキュベートした。ＳＡ−ＨＲＰおよび標準の検出試薬は、Ｓｒｃ４０〜５８が、これらのＮＤ２構築物のそれぞれに、濃度非依存の態様で、結合し得ることを示した。
【０１６０】
Ｓｒｃ４０〜５８への結合に関与するＮＤ２．１．４中のアミノ酸配列を特定するために、さらなるＧＳＴ構築物を作成した（図３Ａ）。これらの配列は、ＮＤ２に対応する配列に対する結合への関与がごくわずかであるが、これらの配列およびこれらに隣接する配列は、Ｓｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害に使用することができるであろう。これらのＧＳＴタンパクを用いたドットブロットおよびビオチン−Ｓｒｃ４０〜５８を用いた再度の試験は、ＮＤ２ ３１０〜３２１の結合が相対的に高い親和性を有することを示した。さらに、結合はＮＤ２，ＮＤ２ ２８９〜３０９，２９９〜３１８，３０２〜３２１および３０７〜３２１でも見られた（図３Ｂ）。上述のように、すべてのフラグメントとの相互作用がＥＬＩＳＡ試験で確認され（図３Ｃ）、ＮＤ２ ３１０〜３２１，ＮＤ２ ２８９〜３０９，ＮＤ２ ２９９〜３１８，ＮＤ２ ３０７〜３２１およびＮＤ２の全長が、上位の結合物であった。これら４個のフラグメントは、Ｓｒｃ４０〜５８に対して、ＮＤ２の全長よりも優れた結合を示した。試験したすべてのフラグメントは、陰性対照ペプチドｓＳｒｃ４０〜５８よりも、Ｓｒｃ４０〜５８によく結合することが可能であった。
【０１６１】
次に、Ｓｒｃ結合ドメインのより短いバージョンであるＳｒｃ４０〜４９へのＮＤ２構築物の結合能を調べた（図４Ａ，４Ｂ）。ＮＤ２ ３１０〜３２１，ＮＤ２ ３０７〜３１８およびＮＤ２ ３１０〜３１８が、ドットブロット分析で、Ｓｒｃ４０〜４９の上位の結合物であった（図４Ａ）。これらの相互作用は、ＥＬＩＳＡによって確認し、ＮＤ２ ３１０〜３２１が最も強い結合を示した。
【０１６２】
次に、ＮＤ２ ３１０〜３２１とＳｒｃ４０〜４９の相互作用を、異なる構築物での異なる試験形式で調べた。図５Ａは、図示したＳｒｃフラグメントを、ビオチニル化ＮＤ２ ３１０〜３２１（Ｂｉｏ−ＮＤ２ ３１０〜３２１）またはスクランブル化ビオチニル化ＮＤ２ ３１０〜３２１（Ｂｉｏ−ｓＮＤ２ ３１０〜３２１）で、調べたドットブロットを示している。Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔは、ヒトＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク形質導入ドメイン［ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ］がＳｒｃ４０〜４９のＣ末端に融合して、配列ＫＰＡＳＡＤＧＨＲＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有するペプチドになった融合ペプチドを指し、一方、Ｔａｔ−Ｓｒｃ４０〜４９は、ＴａｔドメインがＳｒｃ４０〜４９のＮ末端に融合して、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＰＡＳＡＤＧＨＲＧを有するペプチドを生成した融合ペプチドを指す。このドットブロットは、両方のＴａｔ融合Ｓｒｃ４０〜４９ペプチドが、Ｓｒｃ４０〜４９ペプチド自体と同様に、ＮＤ２ ３１０〜３２１に結合したことを示す。ビオチニル化ＮＤ２ ３１０〜３２１の、示した被覆Ｓｒｃペプチドへの結合をＥＬＩＳＡ試験でも評価し、４個のＳｒｃ構築物の各々がビオチンＮＤ２ ３１０〜３２１を捕捉することができた（図５Ｂ）。これらのペプチドは、〜５μＭの濃度で被覆した。同様に、ＥＬＩＳＡプレートを、標準条件にてＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１で被覆し、Ｂｉｏ−Ｓｒｃ４０〜４９は濃度非依存の態様で結合することができた。一方、ビオチニル化スクランブル化対照ペプチドでは、結合は見られなかった（図５Ｃ；Ｂｉｏ−ｓＳｒｃ４０〜４９）。
【０１６３】
競合ＥＬＩＳＡも実施した。図５Ｄは、ビオチニル化Ｓｒｃ４０〜４９のＮＤ２ ３１０〜３２１への結合を阻害するＴａｔ−Ｓｒｃ４０〜４９の能力を試験する競合ＥＬＩＳＡ試験を示している。結果は、ビオチニル化Ｓｒｃ４０〜４９のＮＤ２ ３１０〜３２１への結合が、Ｔａｔ−Ｓｒｃ４０〜４９ペプチドによって阻害されたことを示している。図５Ｅは、前もってＥＬＩＳＡプレートに被覆しておいたＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１へのビオチニル化Ｓｒｃ４０〜４９の結合を阻害するＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔの能力を示している。結果は、ビオチニル化Ｓｒｃ４０〜４９のＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１への結合が、Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔペプチドによって阻害されたことを示している。同様にして、３００〜３２１領域からのアミノ酸配列を有するＮＤ２構築物は、ＮＤ２とＳｒｃとの相互作用を阻害するように作用し得る。
【０１６４】
図６も、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１が、ＧＳＴ−ＮＤ２よりもＳｒｃ４０〜５８によく結合し得ることを示している。図７は、競合ＥＬＩＳＡにおいて、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１の濃度を増すことが、被覆されたＮＤ２ ３１０〜３２１ペプチドへのＢｉｏ−Ｓｒｃ４０〜４９の結合に競合し得ることを示している。
【０１６５】
総合すると、ＮＤ２とＳｒｃとの結合を媒介するコアＮＤ２配列は、ＮＤ２のアミノ酸３１０とアミノ酸３２１との間のようであり、２８９〜３２１のアミノ酸配列が、ＮＤ２とＳｒｃとの結合に寄与または影響するようである。
【０１６６】
実施例２：Ｓｒｃ−ＮＤ２相互作用の阻害剤は、インビボにおけるＳｒｃ−ＮＤ２の共局在化を低減するが、ＮＤ２とＮＭＤＡＲとの共局在化を低減しない
海馬ニューロンにおけるＮＤ２，Ｓｒｃ，ＮＭＤＡＲサブユニットおよびＰＳＤ９５の局在化を調べるために、Ｔａｔ，Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１、またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔの存在下における免疫細胞化学によって、一連の実験を行った。簡潔に説明すると、海馬ニューロンを、胎生期の＃１７／Ｅ１８ Ｗｉｓｔａｒラットから単離し、Ｂ２７およびｇｌｕｔａｍａｘを有しカバースリップを含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地において培養した。次いで、細胞を１μＭペプチドで１時間処理し、その後、標準的な方法で固定した。特異的抗体および蛍光分子に結合した二次抗体を用いてタンパクを可視化した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにおいて画像を融合し、総局在化蛍光クラスターをクラスターの総数で除算することにより（たとえば、Ｓｒｃとの％共局在化ＮＤ２＝（総局在化）／（総ＮＤ２クラスター）；ＮＤ２との％共局在化Ｓｒｃ＝（総局在化）／（総Ｓｒｃ２クラスター））、対の間の％共局在を計算することによって、蛍光の共局在を計算した。
【０１６７】
図８Ａおよび図８Ｂは、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔのいずれかとのインキュベーションが、ＳｒｃとＮＤ２との共局在化の量を減少させ得るのに対し、対照Ｔａｔ輸送体は減少させないことを、示している。したがって、これらのペプチドは、細胞膜を横断して、細胞内に前もって形成された複合体を破壊することが可能であり、治療剤として使用し得る。
【０１６８】
次に、ＮＤ２とＮＭＤＡ受容体サブユニット２Ｂ（ＮＲ２Ｂ）およびＰＳＤ９５との、これらの阻害剤の存在下における共局在化を調べた。Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１およびＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔは共に、ＮＤ２とＳｒｃとの相互作用を破壊するにもかかわらず、ＮＤ２とＮＲ２Ｂとの会合に大きく影響しない（図８Ａおよび図８Ｂと対比した図９Ａおよび図９Ｂ）。驚いたことに、ＮＤ２とＳｒｃとの相互作用の破壊は、ＮＤ２とＰＳＤ９５との共局在化を減少させる（図９Ｃ、図９Ｄ）。ＰＳＤ９５は、ＮＲ２ＢのＣ末端とＰＳＤ９５の初めの２つのＰＤＺドメインとの相互作用を通じて、ＮＲ２Ｂと関連することが知られているので（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２）、これらの薬剤は、ＮＭＤＡＲ−ＰＳＤ９５相互作用を破壊することによる利益を達成するための、代替の組成物およびその方法を提供する。その利益には、脳卒中、興奮毒性に関連する疾患、疼痛、神経変性疾患、不安神経症、てんかん、視神経症などの治療が含まれる。ＰＳＤ９５の共局在化の破壊と整合して、図９Ｅおよび図９Ｆは、ＰＳＤ９５とＮＲ２Ｂとの共局在化が、同様に破壊されることを示している。類似の態様で、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１およびＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔは、ＮＲ２ＢとＳｒｃとの共局在化（図１０）、およびＰＳＤ９５とＳｒｃとの共局在化（図１１）を減少させ得る。
【０１６９】
このように、ＳｒｃとＮＤ２との結合を阻害するＮＤ２配列を含有する化合物は、ＮＭＤＡ受容体複合体、特に、ＮＲ２ＢとＳｒｃとの会合およびＮＲ２ＢとＰＳＤ９５との会合を、調節することが可能である。
【０１７０】
抗体
次の一次抗体を試験において使用した：ＮＲ２Ｂに対するマウスｍＡｂ（Ｃａｔ＃：ａｂ２８３７３）、ＰＳＤ９５に対するマウスｍＡｂ（クローン７Ｅ３−１Ｂ８，Ｃａｔ＃：ａｂ１３５５２）およびＳｒｃに対するマウスｍＡｂ（クローン３２７，Ｃａｔ＃：ａｂ１６８８５）をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から；ウサギ抗ＮＲ２Ｂ（Ｃａｔ＃：０６−６００）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から；ヤギ抗ＮＤ２（Ｍ−１６，Ｃａｔ＃：ｓｃ−２０４９６）およびウサギ抗ＧＳＴ（Ｚ−５，Ｃａｔ＃：ｓｃ−４５９）をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から；ホスホチロシンマウスｍＡｂ（Ｐ−Ｔｙｒ−１００，Ｃａｔ＃：９４１１），ホスホＮＲ２Ｂ（Ｔｙｒ１４７２，Ｃａｔ＃：４２０８）およびウサギ抗ＰＳＤ９５（Ｄ２７Ｅ１１，Ｃａｔ＃：３４５０）をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から得た。
【０１７１】
この試験に用いたすべての二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｅａｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から得た：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｄｏｎｋｅｙ抗ウサギ（７１１−０７５−１５２），Ｔｅｘａ Ｒｅｄ−Ｄｏｎｋｅｙ抗マウス（７１１−０７５−１５０），Ｔｅｘａ Ｒｅｄ−Ｄｏｎｋｅｙ抗ヤギ（７０５−０７５−００３），ＦＩＴＣ−Ｄｏｎｋｅｙ抗ウサギ（７１１−０９５−１５２），ＦＩＴＣ−Ｄｏｎｋｅｙ抗マウス（７１５−０９５−１５０），ＦＩＴＣ−Ｄｏｎｋｅｙ抗ヤギ（７０５−０９５−００３），ペルオキシダーゼヤギ抗マウス（１１５−０３６−００６），ペルオキシダーゼヤギ抗ウサギ（１１１−０３６−０４７）およびペルオキシダーゼウサギ抗ヤギ（３０５−０３６−００３）。
【０１７２】
免疫細胞化学
カバースリップ上で培養した海馬ニューロンを、第１４日に、１μｍのＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔ，Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＴａｔで１時間処理した。次いで、ニューロンを、リン酸緩衝生理食塩水中４％パラフォルムアルデヒドおよび４％スクロース中で１０分間、その後、室温（ＲＴ）にて２０％メタノールで５分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中０．２５％トリトンＸ−１００での５分間の処理、およびＰＢＳ中５％ロバ血清中での３０分間の処理により、透過性にした。培養物を、様々な種を高めた一次抗体の混合物と共に、０．２５％トリトンＸ−１００中で室温にて２時間インキュベートし、洗浄して、ロバにおいて高めた、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄまたはＦＩＴＣフルオロフォアのいずれかに共役の種特異的二次抗体の混合物（０．２５％トリトンＸ−１００中１：２００希釈）と共に、室温にて１時間インキュベートした。カバークリップをＰＢＳで洗浄して、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてマウントした。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ ２００顕微鏡上の６０×の汎蛍光対物レンズで、画像を収集した。画像は、ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ ７（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。輝度およびコントラストを調整し、アンシャープマスクツールを用いて鮮明にし、色共局在化のために融合した。
【０１７３】
共局在化の定量化のために、フルオロフォアチャンネルの最大強度を規格化し、樹状突起に見られる各チャンネルの背景蛍光を減じて、カラー画像を融合した。２つのチャンネルのうちの一方の表面の少なくとも６６％が、他のチャンネルのクラスターと重複するときに、異なる２つのチャンネルにおける２つのクラスターが共局在化していると判断する。抗体の各組み合わせの各々について、３つの独立した免疫蛍光実験を行った。各測定は、長さ５０ｍの樹状セグメント（平均幅２ｍを有する）から得た。共局在化は、分析した全クラスターの割合として表した。
【０１７４】
実施例３：ＮＤ２−Ｓｒｃ相互作用の阻害はＮＭＤＡ受容体複合体の構成に影響する
共免疫沈降実験を使用して、ニューロンのＮＭＤＡ受容体複合体中の選択されたタンパクの状態を調べた。これらは、３軟膜血管閉塞モデル（３ＰＶＯ）を使用した脳卒中に付した海馬ニューロンとラット脳の双方において、Ｓｒｃ−ＮＤ２相互作用の存在下および非存在下で、調べた。図１２Ａ〜図１２Ｅは、第１４日の海馬ニューロンのＮＭＤＡＲの状態を表している。ＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５，ＮＲ２ＢおよびＩｇＧに対する抗体を単独で、以下に述べるように溶解物に加えて、きれいな免疫沈降物（ブロットの上に記載した抗体）を生成するために使用した。次いで、各ブロットの下に記した抗体を用いて、各ブロットを標準的なウェスタンブロット法を用いる検出抗体によって調べた。これらの図は、免疫沈降抗体の各々がＮＤ２，Ｓｒｃ，ＰＳＤ９５およびＮＲ２Ｂを含有する複合体を沈降させ得ることを表している。
【０１７５】
次に、１４ＤＩＶの培養海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡＲ信号伝達複合体のタンパクの会合に対する、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１およびＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔの作用を調べた。ニューロンを、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはＳｒｃ４０〜４９で、１μＭにて１時間（図１３Ａ）または３μＭにて２時間（図１３Ｂ）処理した。細胞溶解物を精製して、抗ＮＲ２Ｂ（左）で免疫沈降させ、次いでＮＲ２Ｂ、抗ＰＳＤ９５、抗Ｓｒｃおよび抗ＮＤ２抗体で染色した。これらの試験は、両方のＴａｔペプチドでのニューロンの処理が、ＮＲ２ＢとＳｒｃとの会合を減少させることを表している。使用した濃度および露出時間では、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１で前処理したときに、ＰＳＤ９５とＮＲ２Ｂとの会合がわずかに減少するようである。この実験を繰り返したところ、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１処理が、ＮＲ２Ｂに対する抗体での免疫沈降後のＳｒｃ４０〜４９−Ｔａｔと比較して（図１３Ｃ、左）、ＮＭＤＡＲ複合体中のＰＳＤ９５およびＳｒｃの量を、大きく低下させることが明らかになった。同じペプチド処理を施した溶解物を抗ＰＳＤ９５抗体での免疫沈降に使用すると、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１での処理は、正常にＰＳＤ９５と会合したＮＲ２Ｂの量を大きく減少させた。さらに、ペプチド処理した海馬ニューロン溶解物に抗ＰＳＤ９５抗体を用いる別組の免疫沈降実験では、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１はＮＲ２ＢとＰＳＤ９５との会合をほとんど消失させ、また、ＰＳＤ９５と会合したリン酸化ＮＲ２Ｂの量を減少させることが可能であった（図１３Ｄ）。
【０１７６】
次に、これら３つのタンパクの状態を、３ＰＶＯ脳卒中に付したラット脳で調べた。３ＰＶＯ虚血の後、齧歯動物にＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１または生理食塩水のいずれかを、尾静脈注射で投与した。手術後１時間に、脳を速やかに採取し溶解させた。抗ＮＲ２Ｂ抗体でのＩＰに続いて、膜を抗リン酸チロシン抗体と共にインキュベートし、展開し、次いで抗Ｓｒｃ、リン酸化Ｓｒｃ（ｐＴｙｓ）および抗ＰＳＤ９５抗体で調べた。内部対照として、同側および対側脳半球（それぞれＩおよびＣ）の双方を用意した。図１５は、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１で処理した動物において、はるかに少ないＰＳＤ９５がＮＲ２Ｂサブユニットと共に免疫沈降し、Ｓｒｃの量が同様に減少することを示している。ＮＲ２Ｂ構成におけるこの変化は、脳卒中に付さなかった脳半球ではＰＳＤ９５はＮＲ２Ｂと会合したままのようなので、脳卒中半球にのみ生じるようである。このことは、脳卒中組織におけるＰＳＤ９５：ＮＲ２Ｂ会合の減少は保護的であるが、ＮＭＤＡＲ複合体がニューロン信号伝達および長期増強などの他の組織機能に必要とされるので、重要である。したがって、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１は、脳卒中に影響された脳領域を、影響されていない領域における複合体を破棄することなく、選択的に保護し、一般化されているＰＳＤ９５：ＮＭＤＡＲ阻害剤と比べて、副作用がおそらく少なくなるであろう、という可能性を示している。
【０１７７】
３ＰＶＯに付した動物に対して、生理食塩水、Ｓｒｃ４０〜４９−ＴａｔまたはＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１を手術後１時間に尾静脈注射で投与し、手術後２時間に脳を採取して溶解させるという、第２組の実験を行った。図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＩＰ抗体としてのＰＳＤ９５（図１６Ａ）またはＮＲ２Ｂ（図１６Ｂ）を用いた、これらの脳からの免疫沈降の結果を示している。図１６Ａにおいて、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１は、ＰＳＤ９５と会合したＮＲ２Ｂ、リン酸化ＮＲ２ＢおよびＳｒｃの量を大きく減少させた。逆に、図１６Ｂにおいて、抗ＮＲ２Ｂ抗体での免疫沈降に続き、複合体と会合したＰＳＤ９５はほとんどなく、Ｓｒｃおよびリン酸Ｓｒｃ（ｐＳｒｃ）も同様に少ない。Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔ構築物は、ＮＭＤＡ受容体からＰＳＤ９５およびＳｒｃを解離させるのに、ほとんど有効でなかった。
【０１７８】
共免疫沈降法
ＮＭＤＡＲおよびその関連タンパクを、培養海馬（ＨＰ）ニューロンまたはラット脳から調製した。インビトロ競合実験のために、Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔ，Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１もしくはＴａｔペプチドの濃度１μＭでの１時間または濃度３μＭでの２時間の処理の後、２週ＨＰニューロンを収集し、次いで、細胞を速やかに採取し均質化した。インビボ実験のために、３ＰＶＯ虚血後１時間に、記載したペプチドまたは生理食塩水を、ラットに尾静脈注射で投与した。手術後２時間（化合物投与の１時間後）に、選択した大脳皮質を速やかに採取し均質化した。
【０１７９】
溶解物を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および選択した抗体と共に、室温にて３０分間インキュベートした。単離した免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を選択した検出抗体で調べ、次いで、剥ぎ取り、他の検出抗体で再び調べた。
【０１８０】
実施例４：ＮＤ２阻害剤はＣＡ１ニューロンにおけるＰＡＣＡＰ増強ＮＭＤＡ誘起電流を阻害する
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、ラットニューロンにおけるＮＭＤＡ受容体媒介反応を選択的に増加させ、このペプチドは、シナプス可塑性のみならず長期増強および長期抑圧の双方に関与していると考えられている。ＰＡＣＡＰ増強ＮＭＤＡ誘起電流に対するＮＤ２ ３１０〜３２１およびＳｒｃ４０〜４９の作用を調べるために、これらのペプチドの存在下または非存在下で、単離ＣＡ１ニューロンを一連のパッチクランプ実験に付した。図１４Ａは、パッチピペット内でのＰＡＣＡＰ（１ｎＭ）またはＰＡＣＡＰ＋ＮＤ２ ３１０〜３２１（６ｍＭ）による規格化したピーク電流を示している。ＮＤ２ ３１０〜３２１はＰＡＣＡＰ誘導増強を防止し得る。Ｓｒｃ選択的阻害ペプチド、Ｓｒｃ（４０〜５８）（１４ｍＭ）または切除ペプチド、Ｓｒｃ（４０〜４９）（６ｍＭ）用いる同様の実験も行った。ＰＡＣＡＰ投与前の反応を、ＰＡＣＡＰ投与後２５〜３０分での応答に対して規格化した。棒グラフは、ニューロンからの記録の３群を表しており、３つの条件でのピークＮＭＤＡＲ電流の相対的変化を示している。ＮＤ２ ３１０〜３２１はＰＡＣＡＰ増強ＮＭＤＡ誘起電流を阻害するが、Ｓｒｃ４０〜４９は阻害しない。したがって、ＮＤ２ ３１０〜３２１は、ＰＡＣＡＰ増強ＮＭＤＡ誘起信号伝達を遮断するために使用可能であり、したがって、長期増強で損傷した多くの神経疾患または神経障害（たとえば、加齢、アルツハイマー、神経変性疾患、神経障害情動記憶）において使用可能である。
【０１８１】
実施例５：ＮＤ２阻害剤は齧歯動物における痛覚過敏を軽減する
Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１が痛覚過敏の軽減に有効であることを示すために、フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の皮下注射により後肢に炎症を誘導しておいたラットに、１０ｐｍｏｌ／ｇのＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはスクランブル化ＮＤ２もしくはＳｒｃ陰性対照ペプチドを尾静脈注射で投与した。痛覚過敏の測定は、ペプチドの注射後１時間または２時間に、方法の欄に記載したように、剛性の異なるフィラメントを用いて行った。Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１で処理した動物は、スクランブル化対照ペプチドで処理した動物よりも、疼痛に対して有意に感受性が低かった。さらに、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１などのＮＤ２ ３１０〜３２１領域を含むペプチドは、これらの実験において、Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔよりも、有意に良好に作用した。この差異は、これらの条件下で、投与後１時間において、投与後２時間におけるよりも大きかった（図１７）。
【０１８２】
Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔは、ニューロン溶解物中のＳｒｃとＮＤ２との会合を破壊すると報告されている（Ｌｉｕ， Ｘ−Ｊ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ３）。この破壊は、ＳｒｃとＮＭＤＡ Ｒ２サブユニットとの会合も破壊し、このことはＮＭＤＡ誘起電流を減少させ、炎症性疼痛（ホルマリンモデルおよびＣＦＡモデル）および神経障害性疼痛（末梢神経結紮）の両方に有益な効果を有した。本実施例の結果は、ＮＤ２ ３１０〜３２１が、ＣＦＡモデルにおける疼痛を軽減するより優れた能力を有し（図１７）、ＳｒｃとＮＭＤＡ Ｒ２サブユニットとの会合をより破壊し（図１３Ｃ、抗Ｓｒｃで調べたＴａｔ−ＮＤ２またはＳｒｃ４０〜４９−ＴａｔにおけるＩＰ ＮＲ２Ｂ）、また、ＮＭＤＡ電流を減少させる（図１４Ｂ）、ことを示している。この結果は、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１などのＮＤ２の３１０〜３２１領域を含むＮＤ２化合物が、種々の動物の疼痛モデル（ＣＦＡ、ホルマリン、末梢神経結紮）において、Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔよりも良好に作用すること、ならびに、炎症性および神経障害性の疼痛、慢性疼痛ならびに過感受性による疼痛の治療に有効な治療剤の可能性を有すること、の証拠であると解釈される。
【０１８３】
方法
ＣＦＡモデル：
動物：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｔ． Ｃｏｎｓｔａｎｔ， Ｑｕｅｂｅｃ）から入手したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄、２５０〜３００ｇ）で、実験を行った。ラットを、１／８”コーンコブベッドを有するプラスチックケージに収容して、１２時間の明／暗サイクルに保った。ラットを対にして収容し、餌および水を自由に与えた。これらの動物の使用は、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅのガイドラインに従って行い、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０１８４】
炎症の誘導：簡潔に説明すると、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）を後肢の裏表面に皮下注射した（１００μｌ，２７Ｇ１／２針、イソフルラン麻酔下）。動物を元のケージに８時間戻して、炎症および感作を進行させた。
【０１８５】
尾静脈注射：炎症の誘導後、ペプチドを静脈内投与するために、動物を透明な誘導室に置き、酸素中２．５％イソフルラン混合物で、動物が完全に麻酔されるまで（約１分後）麻酔した。マスクで動物の鼻および口を覆い、注射の間、イソフルラン濃度を１．５〜２．０％に下げた。ペプチドを１μＬ／ｇの滅菌生理食塩水に溶かし、２５Ｇ１／２翼状針（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で注射を行った。次いで、動物をケージに戻した。
【０１８６】
肢引き込み閾値の測定：Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９９）に記載されている手順に基づいて、動物を透明プレキシガラスの観察室（３０×３０×３０ｃｍ）内の直径１．５ｍｍの孔を有するプラットホームに置いた。昇順の校正ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ， ＵＳＡ）（．００８ｇ〜１５ｇ）を、後肢の裏表面に当てて、肢引き込みを誘発するために必要な最小の刺激を測定した。各フィラメントは、２秒間または引き込みが生じるまで、垂直に当てた。後続の各フィラメントを、５秒周期で５回当てた。閾値は、５回の試行のうち３回陽性反応を示したフィラメントで決定した。１５ｇを超えるフィラメントは、組織損傷を避けるために、使用しなかった。肢引き込み閾値を、ＣＦＡ注射の前、ＣＦＡ注射後８時間、ペプチド注射の６０分後、ペプチド注射の１２０分後に測定した。
【０１８７】
実施例６：ＮＤ２阻害剤は脳卒中後の脳損傷の軽減に有効である
脳卒中の治療におけるＮＤ２阻害剤の有効性を、脳卒中の３軟膜血管閉塞（３ＰＶＯ）モデルを用いて調べた。これは、２４時間後に小さいながら確実な梗塞を引き起こす脳卒中の永続的モデルである。
【０１８８】
雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（各グループｎ＝１０）を、外科的に永続的な軟膜血管閉塞に付した。手術後１時間に動物に生理食塩水、Ｔａｔ−ＮＲ２Ｂ９ｃ（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２），Ｓｒｃ４０〜４９−ＴａｔまたはＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１を静脈内注射し、元のケージ内にてさらに回復させた。手術後２４時間に、脳を採取して薄片にし、ＴＴＣとインキュベートして梗塞の領域を可視化した。各動物の梗塞ボリュームを、各グループ１０匹についての平均ボリュームと共に、測定した。図１８は、この実験の結果を示している。Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１およびＴａｔ−ＮＲ２Ｂ９ｃは、どちらも梗塞ボリュームの約４０％の減少を示しているが、これに対し、Ｓｒｃ４０〜４９−Ｔａｔは、このモデルにおける梗塞ボリュームの減少に統計的に有効ではなかった。このことは、Ｓｒｃ−ＮＤ２相互作用のＮＤ２阻害剤、特にＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１が、脳卒中の治療に有効な薬剤であり得ることを示唆する。
【０１８９】
第２の実験において、２個のＮＤ２ペプチドのミリストイル化バージョンを、Ｔａｔ−ＮＤ２に対して評価した。それらの配列を次の例に示すようにして準備した。両ペプチドを、ペプチドのＮ末端アミノ酸のアルファアミノ基へのアミド結合で、ミリストイル化した。Ｍｙｒ−ＮＤ２は、このモデルにおける脳卒中による損傷に対して、同等またはより優れた保護を与え、ｍｙｒ２−ＮＤ２は、効果がより少なかった（図２２）。このように、Ｔａｔ−ＮＤ２およびｍｙｒ−ＮＤ２は共に、脳卒中後に投与する場合、脳卒中の治療に有効な薬剤である。脳卒中に先だって投与した場合も、これらの阻害剤が有効であることも判明した。
【０１９０】
虚血の３軟膜血管閉塞モデル
体重２３０〜２９０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（各グループｎ＝１０）を、この研究に使用した。実験は絶食したラット（一夜、水は自由に与えたが、餌は与えなかった）で行った。永続的３軟膜血管閉塞（３ＰＶＯ）は、前述のように実施した（Ｆｏｒｄｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５，前記）。簡潔に説明すると、必要な初期用量の１／３で補完したケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）、アセプロマジン（２ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の０．５ｍｌ／ｋｇ筋肉内注射で、ラットを麻酔した。肛門温度プローブを挿入し、動物を３７℃に保った加温パッドに置いた。頭蓋骨を正中切開を介して露出して、組織を擦り落とした。解剖顕微鏡および歯科用空気ドリルを使用して、頭蓋骨を貫通する長方形の孔を明け、硬膜をそのままにしながら頭蓋骨片を取り除くことによって、体性感覚皮質の上に６〜８ｍｍの頭蓋窓（プレグマに対して、２ｍｍ後方、５ｍｍ横）を形成した。バレル皮質の周りの３軟膜血管中大脳動脈分岐を選択し、硬膜を介して電気的に焼灼した。焼灼の後、頭蓋骨を接合した。各ラットを個々のケージに戻し、ラットが完全に回復するまで、体温を保つための加温ランプの下に置いた。３ＰＶＯ虚血の１時間後に、図示した薬剤（３ｎｍｏｌ／ｇ）または生理食塩水を、ラットに尾静脈内注射した。餌と水を与えた。手術後２４時間に、脳を速やかに採取した。冠状薄片（２ｍｍ）を脳から取り、２％トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）（Ｓｉｇｍａ）中で１５分、室温にてインキュベートした。画像をスキャンした（Ｃａｎｏｎ ４２００Ｆ）。
【０１９１】
実施例７：ＮＤ２阻害剤は神経障害性疼痛の齧歯動物モデルにおける痛覚過敏を軽減する
次に、どちらも機械的肢引き込み閾値の低下で特徴づけられるラットの末梢神経損傷（ＰＮＩ）のモデルおよび完全フロイントアジュバントモデル（ＣＦＡ）を用いて、神経障害性および炎症性疼痛挙動に及ぼすＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１の効果を、スクランブル化ＮＤ２陰性対照（ｓＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１）との対比で、試験した。機械的肢引き込み閾値へのＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１の効果を、ＰＮＩ後８〜１５日に評価した。静脈内に投与した場合、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１は、損傷神経と同側の肢引き込み閾値を有意に上昇させるが、ｓＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１は上昇させないことが、判明した。同様の結果がＣＦＡモデルにおいても観察され（図１７）、このモデルでは、肢引き込み閾値の上昇は、最初の４５分以内に生じて、３時間の試験期間全体にわたって持続した。
【０１９２】
このように、Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１、およびＮＤ２のこの領域を包含するペプチドまたはペプチド模倣体は、神経障害性疼痛の寛解をもたらし得る。
【０１９３】
方法
慢性坐骨神経絞扼モデル：動物：末梢神経損傷（ＰＮＩ）を起こすために、ラットまたはマウスの坐骨神経の周りに、イソフルラン麻酔下で、２ｍｍのポリエチレンカフを外科的に植え込んだ。試験前の７日間、動物を順応させた。
【０１９４】
薬剤投与：Ｔａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１またはｓＴａｔ−ＮＤ２ ３１０〜３２１を、神経カフの外科的植え込みの後８〜１５日に、１ｎｍｏｌ／ｇで尾静脈内に投与した。注射後、動物を元のケージに戻した。
【０１９５】
肢引き込み閾値の測定：Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９９）に記載されている手順に基づいて、動物を透明プレキシガラスの観察室（３０×３０×３０ｃｍ）内の直径１．５ｍｍの孔を有するプラットホームに置いた。昇順の校正ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ， ＵＳＡ）（．００８ｇ〜１５ｇ）を、後肢の裏表面に当てて、肢引き込みを誘発するために必要な最小の刺激を測定した。各フィラメントは、２秒間または引き込みが生じるまで、垂直に当てた。後続の各フィラメントを、５秒周期で５回当てた。閾値は、５回の試行のうち３回陽性反応を示したフィラメントで決定した。１５ｇを超えるフィラメントは、組織損傷を避けるために、使用しなかった。肢引き込み閾値を、神経絞扼の前、坐骨神経絞扼後７日、ペプチドまたは対照の注射後４５分、９０分、１３５分および１８０分に測定した。
【０１９６】
実施例８：ＮＤ２阻害剤は疼痛軽減に有効である
イソフルラン麻酔化で、ラットまたはマウスの坐骨神経の周りにポリエチレンカフ（長さ２ｍｍ）を外科的に植え込むことによる、慢性坐骨神経絞扼を通じて、齧歯動物に末梢神経損傷（ＰＮＩ）を誘導した。次いで、前述のｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ， ２００８）で機械的肢引き込み閾値（ＰＷＴ）を、ベースラインとして手術前、および手術後８〜１４日の両方に、測定した。２０％酢酸中のｍｙｒ−ＮＤ２（１００マイクロモル／Ｌ）を、ストック溶液として調製し、試験の前に作業濃度に希釈した。１０ｐｍｏｌまたは１００ｐｍｏｌのいずれかのｍｙｒ−ＮＤ２および担体を腰髄内に注射し、注射後４５分、９０分、１３５分および１８０分にＰＷＴ試験を行った。試験をしたｍｙｒ−ＮＤ２の濃度は、両方とも、試験をしたすべての時点にわたって疼痛に対する感受性の低下を示した（図２３）。このように、ｍｙｒ−ＮＤ２を含めて、ＮＤ２ペプチドは、疼痛の有効な阻害剤である。
【０１９７】
実施例９：ミリストイル化は、高用量において、血圧を低下させることなく、疼痛および脳卒中モデルでの効果を維持する
ＮＤ２ペプチドが疼痛および脳卒中後の損傷の両方の低減に有効であることを、本明細書において示してきた。Ｔａｔペプチドは、高用量で急速に投与されると血圧の低下をもたらすことが、これまで示されている。高濃度のｍｙｒ−ＮＤ２ペプチドの急速ボーラス投与の、Ｔａｔ−ＮＤ２およびＮＡ−１（Ｔａｔ−ＮＲ２Ｂ９ｃ）との対比における、有効性の試験を行った。動脈圧測定のための外科的植え込み装置を有するラットに、監視後１０分に、〜２５ｍｇ／ｋｇの各ペプチドを尾静脈へのボーラス注射で投与した。Ｔａｔ配列を包含する両ペプチドは、平均動脈圧を通常の半分のレベルに降下させる結果となった。これらの血圧降下は、介入なしで、約１０〜１５分以内に解消した。しかし、ｍｙｒ−ＮＤ２ペプチドは、試験をしたどの動物においても、同様の濃度で血圧の低下を全く示さなかった（図２０）。図２１は、血圧の最下点を示しており、さらに、ｍｙｒ−ＮＤ２がこのモデルにおいて血圧に影響しないことを表している。このように、ｍｙｒ−ＮＤ２は、Ｔａｔ−ＮＤ２よりも高い用量レベルで、ヒトにおいて血圧の副作用が生じる可能性無くまたは低い可能性で、投与することが可能である。
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【０１９８】
理解の明瞭化のために本発明を詳細に説明したが、添付した特許請求の範囲内で、いくつかの変更を行ってよい。本明細書において引用したすべての出版物（たとえば、雑誌記事、アクセッション番号、ウェブサイトなど）および特許文献は、あらゆる目的のために、各々を個別に示した場合と同じ程度にその全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。異なる配列が異なる時に同じアクセッション番号に関連づけられた場合には、有効な提出日におけるアクセッション番号に関連づけられた配列を意図する。有効な提出日とは、問題のアクセッション番号が開示された最も早い日を意味する。他に文脈から明らかでない限り、本発明のあらゆる要素、実施形態、工程、特徴または側面は、相互に組み合わせて実施することが可能である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｄ】
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【図９Ｅ−Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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