(57)【要約】本発明は、バイオマスを加水分解する際に使用することのできる、グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及び／又はβ−グルコシダーゼポリペプチドを含む組成物などといった組成物、バイオマス材料を加水分解する方法、並びにこのような組成物を使用する方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第１群の又は第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｄ）β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド又は前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項２】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）第１群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｄ）β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド又は前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項３】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第１群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｄ）β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド又は前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項４】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第１群の又は第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド又は前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項５】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項６】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第１群の又は第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｄ）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項７】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）第１群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｄ）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項８】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第１群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；
ｃ）第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｄ）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項９】
遺伝子操作型酵素組成物であって：
ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
ｂ）第１群の又は第２群のβ−キシロシダーゼから選択されるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；及び
ｃ）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドに富む全セルラーゼ、を含み、
リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解することのできるものである、酵素組成物。
【請求項１０】
前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドが：配列番号２４、２６、４２若しくは４３に対し又はこれらの変異配列に対し少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドから選択されるか、あるいは配列番号２３、２５若しくは４１に対し少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチドにより、又は厳密度の高い条件下で配列番号２３、２５若しくは４１と又はこれらの相補配列とハイブリッド形成することのできるヌクレオチドによりコードされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１１】
ａ）前記β−キシロシダーゼ活性を有する第１群のポリペプチドが、配列番号２若しくは１０に対し又はこれらの成熟配列に対し少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記第２群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０若しくは４５と又はこれらの成熟配列と少なくとも７０％を有するアミノ酸配列を含む；
ｂ）前記第１群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２若しくは１０に対し又はこれらの成熟配列に対し少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含むヌクレオチドによりコードされ、かつ前記第２群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０若しくは４５と又はこれらの成熟配列と少なくとも７０％を有するアミノ酸配列を含む；
ｃ）前記第１群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１若しくは９に対し少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチドによりコードされ；かつ前記第２群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２７若しくは２９に対し少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチドによりコードされる；あるいは
ｄ）前記第１群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、厳密度の高い条件下で、配列番号１若しくは９と、又はこれらの相補配列とハイブリッド形成することができ；かつ前記第２群のβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドが、厳密度の高い条件下で、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２７若しくは２９と又はこれらの相補配列とハイブリッド形成することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１２】
前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドが：
ａ）配列番号１２、１４、２０、２２若しくは３２に対し又はこれらの成熟配列に対し少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
ｂ）配列番号１１、１３、１９、２１若しくは３１に対し少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチドにより、又は厳密度の高い条件下で、配列番号１１、１３、１９、２１若しくは３１とハイブリッド形成することのできるヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１３】
前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが：
ａ）配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３及び９５に対し少なくとも約６０％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
ｂ）２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むハイブリッドポリペプチドであって、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のうちの１つ以上又は全てを含み、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のうちの１つ以上又は全てを含み、及び場合により、第３のβ−グルコシダーゼに由来する第３の配列は、アミノ酸残基３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、配列番号２０４又は２０５を含むループ配列をコードしている、ハイブリッドポリペプチド；又は
ｃ）配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２又は９４に対し少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、あるいは厳密度の高い条件下で、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２若しくは９４と又はこれらの相補配列とハイブリッド形成することのできるポリペプチド、である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１４】
前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが：
ａ）配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のいずれか１つの配列の少なくとも１００残基の領域にわたって少なくとも７０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
ｂ）少なくとも２００の残基の長さであり、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有し、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１；からなる群から選択される配列のうちの１種以上を含む、ポリペプチド；又は
ｃ）配列番号５１に対し少なくとも７０％配列同一性を有するヌクレオチドによりコードされ、又は厳密度の高い条件下で、配列番号５１と若しくはこれらの相補配列とハイブリッド形成することができるポリペプチド、である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１５】
前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むハイブリッドポリペプチドであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列が、少なくともアミノ酸残基２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２の１つ以上又は全てを含み、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列が、少なくともアミノ酸残基５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び場合により、アミノ酸残基３〜１１個分の長さでありかつ配列番号２０４又は配列番号２０５を含む第３のポリペプチド配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１６】
培養混合物、前記ポリペプチドの１種以上を発現している宿主細胞の発酵ブロス、又は前記発酵ブロスの全ブロス製剤である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１７】
前記宿主細胞は、バクテリア又は真菌のうちの一方である、請求項１６に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１８】
前記バクテリアが、バチルス（Bacillus）又は大腸菌（E. coli）である、請求項１７に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項１９】
前記真菌が、酵母、アスペルギルス（Aspergillus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、又はトリコデルマ（Trichoderma）である、請求項１７に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２０】
セロルビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、及び／又はエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２１】
全セルラーゼを更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２２】
前記酵素組成物中の総タンパク質量に対するキシラナーゼ量が、約１０重量％〜約２０重量％である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２３】
前記酵素組成物中の総タンパク質量に対する前記β−キシロシダーゼ量が、約５重量％〜約２０重量％である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２４】
前記酵素組成物中の総タンパク質量に対する前記β−グルコシダーゼ量が、約１８重量％〜約３０重量％である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２５】
前記酵素組成物中の総タンパク質量に対する前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ量が、約０．２重量％〜約２重量％である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２６】
前記酵素組成物中の総タンパク質量に対する前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの量が、約６重量％〜約２０重量％である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２７】
前記酵素組成物中の総タンパク質量に対する前記セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの量が、約１５重量％〜約２５重量％である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２８】
前記第１群のβ−キシロシダーゼの重量対前記第２群のβ−キシロシダーゼの重量比が、１：１０〜１０：１、１：９〜９：１、１：８〜８：１、１：７〜７：１、１：６〜６：１、１：５〜５：１、１：４〜４：１、１：３〜３：１、１：２〜２：１、又は１：１である、請求項２〜５、７〜８、及び１０〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドのうち少なくとも１、２又は３種が、前記ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作した前記宿主細胞にとって異種性のものである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項３０】
前記ポリペプチドのうち少なくとも２種が、異なる微生物に由来する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項３１】
前記ポリペプチドのうち少なくとも１種が、フザリウム（Fusasrium）又はトリコデルマ（Trichoderma）に由来する、請求項３０に記載の遺伝子操作型酵素組成物。
【請求項３２】
ヘミセルロース、セルロース、又はいずれものセルロース、及びヘミセルロースを含む、リグノセルロース系バイオマス材料を加水分解又は消化する方法であって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の酵素組成物を、前記リグノセルロース系バイオマスの混合物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記リグノセルロース系バイオマス混合物が、農作物、食品／飼料製造時の副産物、リグノセルロース系廃棄物、植物残渣、又は古紙を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記植物残渣が、穀類、種子、茎、葉、外皮、トウモロコシの皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、ポテト、大豆、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビート、サトウキビバガス、サトウモロコシ、麦わら、草類、ケーン類、葦、木材、木片、木材パルプ又はおがくずから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記草類が、インディアングラス又はスイッチグラスから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記リグノセルロース系バイオマス混合物中の前記バイオマス材料に、前処理を行う、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記リグノセルロース系バイオマス混合物が、発酵性糖質を更に含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記前処理が、酸又は塩基による前処理である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記塩基による前処理が、希アンモニアによるものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記酸による前処理が、希酸によるものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
リグノセルロース系バイオマス材料を、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の酵素組成物と接触させて、１種以上の発酵性糖質を生成した後、エタノール生産微生物（ethanologen microorganism）を使用して、前記発酵性糖質をエタノールへと発酵させる工程を含む、エタノールの生産方法。
【請求項４２】
前記酵素組成物に接触させる前に、前記リグノセルロース系バイオマス材料に前処理を行う、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エタノール生産微生物が、酵母、又は、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記酵素組成物が、前記バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇあたり約２ｇ〜約２０ｇのキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵素組成物が、前記バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇあたり約２ｇ〜約４０ｇのβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素組成物が、前記バイオマス材料中のセルロース１ｋｇあたり約３ｇ〜約５０ｇのセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量が、セルラーゼ活性を有するポリペプチドの総重量の最大で約５０％を構成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記バイオマス材料中の前記キシランのうち６０％〜９０％をキシロースへと変換するのに十分な量、及び条件下、及び期間で、前記酵素組成物を使用する、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
商用酵素供給モデル戦略若しくはオン・サイト・バイオリファイナリーモデル戦略に従う、工業用設定又は商業用設定で、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の酵素組成物を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月１７日に出願された米国仮出願特許第６１／４５３，９３１号の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、概して、グリコシルヒドロラーゼ、及び遺伝子操作型酵素組成物、遺伝子操作型発酵ブロス組成物、及びこのような酵素を含むその他の組成物、並びに研究、産業、又は商業用途でこれらの酵素及び組成物を製造し、使用する方法、例えば、糖化、すなわち、ヘミセルロースと、場合によりセルロースとを含むバイオマス材料を発酵性糖質へと変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
石油危機が発生した１９７０年代から、研究者らは、再生可能なリグノセルロース系バイオマスを発酵性糖質へと生物変換し、続いて発酵させて、液体燃料の代替としてアルコール（例えば、エタノール）を生成する工程に強い関心を持っている（Ｂｕｎｇａｙ，Ｈ．Ｒ．，「Ｅｎｅｒｇｙ：ｔｈｅ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｏｐｔｉｏｎｓ」ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；１９８１；Ｏｌｓｓｏｎ  Ｌ，Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ  Ｂ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９６，１８：３１２〜３１；Ｚａｌｄｉｖａｒ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１，５６：１７〜３４；Ｇａｌｂｅ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２，５９：６１８〜２８）。ここ数十年程の間、エタノールは、アメリカではガソリンに１０％混合され、あるいはブラジルではそのまま乗り物用の燃料として使用されてきた。バイオエタノール燃料の重要性は、油の価格が上昇し、かつ資源が徐々に枯渇していることに関連して増加している。加えて、発酵性糖質は、プラスチック、ポリマー、及びその他のバイオ系材料の製造時にますます使用されるようになっている。低コストであり、石油系燃料原料の代わりに使用することができる発酵性糖質に対する需要が急増している。
【０００４】
再生可能なバイオマス材料の中でも、発酵性糖質へと変換することができるセルロース及びヘミセルロース（キシラン）は有用である。酵素による、これらの多糖類の、可溶性糖質（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、及び／又は他のヘキソース及びペントース）への変換は、多様な酵素の複合作用により生じる。例えば、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＧ）及びエキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）は、不溶性セルロースのセロオリゴ糖への加水分解（例えば、セロビオースが主生成物となる）を触媒するのに対し、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）は、オリゴ糖をグルコースに変換する。キシラナーゼは、その他のアクセサリータンパク質（非限定的な例としては、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、フェルロイル及びアセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、及びβ−キシロシダーゼが挙げられる）とともに、ヘミセルロースの加水分解を触媒する。
【０００５】
植物の細胞壁は、共有結合及び非共有結合的な手法により相互作用する複合多糖類の不均一な混合物からなる。高等植物の細胞壁に含まれる複合多糖類としては、例えば、セルロース（β−１，４グルカン）が挙げられる。一般的に、セルロースは、細胞壁の成分に含まれる炭素原子のうちの３５〜５０％を占める。セルロースポリマーは、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用及び疎水性相互作用により自己集合し、準結晶性セルロースミクロフィブリルを形成する。これらのミクロフィブリルには、一般に非晶質セルロースとして知られる、非結晶性領域も含有する。セルロースミクロフィブリルは、ヘミセルロース（例えば、キシラン、アラビナン、及びマンナン）、ペクチン（例えば、ガラクツロナン及びガラクタン）、及びその他の各種β−１，３及びβ−１，４グルカンから構成されるマトリックスに埋め込まれている。これらのポリマーは、多くの場合、例えば、アラビノース、ガラクトース及び／又はキシロース残基による置換を受け、非常に複雑なアラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトマンナン、及びキシログルカンを形成する。ヘミセルロースマトリックスは、次にポリフェノールのリグニンにより包囲される。
【０００６】
有用な発酵性糖質をバイオマス材料から得るために、一般的には、リグニンを分解し、可溶化させ、かつヘミセルロースを分解させて、セルロース加水分解酵素を接近させる。発酵性糖質を得る前にバイオマス材料の複雑なマトリックスを分解させるには、酵素活性を協調的に作用させる必要がある場合がある。
【０００７】
セルロース系資源の種類とは関係なく、酵素の費用効果及び加水分解効率は、バイオマスの生物化学的変換工程の商業化を制限する主要な要因である。微生物により酵素を生産させる際にかかる生産コストは、酵素生産株の生産性と、発酵により得られる最終的な活性収率とに関係する。多酵素複合体による加水分解効率は、例えば、個々の酵素の特性、それらの相乗作用、及び多酵素配合物に含まれる酵素の比率などの、多数の要因に基づいて決定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野では、植物及び／又はその他のセルロース性材料又はヘミセルロース性材料を、発酵性糖質ヘと変換し得る効率が十分であるか若しくは向上している、発酵性糖質の収率が向上している、及び／又は様々なセルロース性材料又はヘミセルロース性材料に対する作用性能が向上している酵素及び／又は酵素組成物を特定することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、セルロース系及び／又はヘミセルロース系バイオマス材料の糖化に利益を提供するポリペプチドであって、セルラーゼ活性又はセルロース分解活性を有する、例えば、特定のβ−グルコシダーゼ及びエンドグルカナーゼポリペプチドなどの、特定のポリペプチド、並びにヘミセルロース分解活性を有する、例えば、キシラナーゼ（例えば、エンドキシラナーゼ）、キシロシダーゼ（例えば、β−キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ）などの、特定のポリペプチド、を提供する。本開示は、これらのポリペプチドをコードしている核酸、これらの核酸を発現している組み換え細胞、これらの核酸を含むベクター及び発現カセットも提供する。更に、本開示は、ポリペプチド及び核酸の製造及び使用方法を提供する。本開示は、本開示のポリペプチドから選択された２種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上など）の酵素の配合物又は混合物を含む組成物、並びに糖化を実施するための又は糖化活性及び／若しくは効率を向上させるための、組成物中に存在するポリペプチドの好適な比率又は相対重量も提供する。本開示の１種以上又は全ての酵素は宿主細胞に対して異種性のものであってよい。その一方で、本開示の１種以上又は全ての酵素は、対応する野生型宿主細胞と比較して異なるレベルで発現されるよう、遺伝子操作されていても、又は改変されていてもよい。更に、本開示は、実験室環境、工業環境（例えば、バイオ燃料の製造）、又は商業環境での使用法を提供する。
【００１０】
本開示の目的に際し、酵素は、当業者により分類される酵素分類に基づき参照することができる。酵素は、各酵素活性に基づき参照することもできる。例えば、キシラナーゼは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドとして参照され、あるいは互換的にキシラナーゼポリペプチドとして参照される。したがって、本開示は、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、及び／又はエンドグルカナーゼ活性を有する、特定の新規酵素及び変異体の発見に一部基づくものである。本開示は、これらのヘミセルロース分解活性及び／又はセルロース分解活性を有するポリペプチドを、セルロース系材料及びヘミセルロース系材料の効率的な糖化を可能にするしかるべき特定の配合物として含む又は重量比で含む、新規酵素組成物の同定に基づくものでもある。
【００１１】
本開示の酵素及び／又は酵素組成物を使用して、バイオマスから発酵性糖質を製造する。次に、この糖は、例えば、発酵又はその他の培養法によるエタノール生産の際に、微生物に利用させることができ、あるいはその他の有用な生物製剤又は生物材料の製造に使用することができる。本開示は、本明細書に記載の酵素及び／又は酵素組成物を用いる工業用途（例えば、糖化工程、エタノール生産工程）を提供する。本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、様々な用途の数多くの工業工程において、例えば、バイオ燃料の生産において、酵素にかかる費用を有利に削減することができる。
【００１２】
関連して、本開示は、商業的環境での本発明の酵素及び／又は酵素組成物の使用を提供する。本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、酵素及び／又は組成物の典型的な又は好ましい使用方法についての指示書と組み合わせて適切な市場で販売することができる。したがって、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、商用酵素供給モデルにより使用又は市販することができる。このモデルでは、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、バイオエタノール製造業者、燃料精製業者、又は燃料若しくはバイオ製品を製造する事業を行っているバイオケミカル製造業者若しくはバイオマテリアル製造業者に販売される。一部の態様では、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、オン・サイト・バイオリファイナリーモデルを用い市販又は商品化され、酵素及び／又は酵素組成物は、燃料精製施設又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造施設又は施設の付近にて製造又は調製され、本発明の酵素及び／又は酵素組成物は、燃料精製施設又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造業者の具体的な要求に合わせてリアルタイムで調整される。更に、本開示は、所望のバイオ産物（例えば、バイオ燃料、バイオケミカル、バイオ材料など）を製造し、市販することのできる酵素及び／又は酵素組成物の使用時に、これらの製造業者に技術的な支援及び／又は指示を提供する工程に関する。
【００１３】
したがって、第一態様では、本発明は、グリコシルヒドロラーゼ活性を有する数多くのポリペプチド（これらの変異体を含む）に関係する。本発明は、単離ポリペプチド、変異体、並びにポリペプチド及び変異体をコードしている核酸に関係する。
【００１４】
一部の態様では、本開示は、配列番号４４、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００）残基にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列の、単離、合成又は組み換えポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、単離、合成、又は組み換えポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。特定の実施形態では、単離、合成、又は組み換えポリペプチドは、β−グルコシダーゼポリペプチドであり、例えば、β−グルコシダーゼポリペプチドの変異体（variants）、変異体（mutants）、及び融合／ハイブリッド／キメラ体を包含する。本開示に関し、用語「融合」、「ハイブリッド」及び「キメラ」は、互換的に、互いに等価なものとして使用される。特定の実施形態では、本開示は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるハイブリッド体又はキメラ体であり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。例えば、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００個分）の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含む。一部の実施形態では、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分）の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、第１の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ又はハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２の配列はＣ末端に位置する。一部の実施形態では、第１の配列のＣ末端残基と第２の配列のＮ末端残基とが連結されている。例えば、第１の配列は第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されている。他の実施形態では、第１の配列は第２の配列の直後に隣接しておらず、第１の配列はリンカードメインを介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１の配列、第２の配列、又は両方の配列は、１箇所以上にグリコシル化部位を含む。���部の実施形態では、第１又は第２の配列は、ループ配列又はループ様の構造をコードしている配列を含む。ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）の配列を含んでよい。他の実施形態では、第１の及び第２の配列を連結しているリンカードメインは、ループ配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドのハイブリッド又はキメラポリペプチドは、第１の配列、第２の配列又はリンカードメイン配列の各々が由来する、対応するβ−グルコシダーゼポリペプチドと比較して、向上した安定性を有する。安定性の向上、例えば、タンパク質分解耐性の向上は、標準的な保存条件下での保存時、あるいは標準的な発現／生産条件下での発現及び／又は生産中の、タンパク質の切断に対する、安定性又は耐性の向上という点で反映される。例えば、ハイブリッド／キメラポリペプチドは、ループ配列内の残基、又はループ配列内のものではない残基若しくは位置でのタンパク質の切断を受けにくくなる。
【００１５】
特定の実施形態では、本開示は、β−グルコシダーゼ活性を有する単離、合成、組み換えポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド体であり、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００）個分の長さであり、かつ配列番号４４、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する配列を含み、それに対し少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個）個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する。代替的な実施形態では、本開示は、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離、合成、組み換えポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド体であり、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００）個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する配列を含み、それに対し少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個）個分の長さであり、配列番号４４、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、第１の配列はβ−グル��シダーゼのキメラ又はハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２の配列はＣ末端に位置する。一部の実施形態では、第１の配列のＣ末端残基と第２の配列のＮ末端残基とが連結されている。例えば、第１の配列は第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されている。他の実施形態では、第１の配列は第２の配列の直後に隣接しておらず、第１の配列はリンカードメインを介して第２の配列に連結されている。第１の配列、第２の配列、又は両方の配列には、１箇所以上にグリコシル化部位を含ませることができる。一部の実施形態では、第１又は第２の配列は、ループ配列又はループ様の構造をコードしている配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）の配列を含んでよい。特定の実施形態では、第１の及び第２の配列を連結しているリンカードメインは、ループ配列を含む。
【００１６】
代表的な実施形態では、本開示は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列に由来するβ−グルコシダーゼポリペプチドのハイブリッド又はキメラポリペプチドを提供し、第１のβ−グルコシダーゼ配列はＦｖ３Ｃに由来し、かつ少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、第２のβ−グルコシダーゼ配列はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（又は「Ｔｒ３Ｂ」）ポリペプチドに由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さである。一部の実施形態では、第１の配列のＣ末端残基と第２の配列のＮ末端残基とが連結されている。したがって、第１の配列は第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されている。他の実施形態では、第１の配列は、リンカードメイン配列を介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１又は第２の配列のいずれかがループ配列を含む。一部の実施形態では、ループ配列は、第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来する。特定の実施形態では、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでありＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）の配列を含む。第１の配列と第２の配列を連結しているリンカードメイン配列は、このようなループ配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は、Ｔｅ３Ａポリペプチドに由来する。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドのハイブリッド又はキメラポリペプチドは、各キメラ部位が由来する対応するβ−グルコシダーゼポリペプチドと比較して、例えばＦｖ３Ｃポリペプチド、Ｔｅ３Ａポリペプチド、及び／又はＴｒ３Ｂポリペプチドと比較して、向上した安定性を有する。一部の実施形態では、安定性の向上とは、標準的な保存条件下での保存時、又は標準的な発現／生産条件下での発現及び／又は生産時の、ループ配列中の残基での、又はループ配列の外側の残基又は位置でのタンパク質の切断を受けにくくするという点で反映される。
【００１７】
特定の態様では、本開示は、配列番号４４、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００）残基の領域にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、単離、合成又は組み換えヌクレオチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド又はキメラ体であるβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼのハイッブリッド／キメラポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００）個からなる第１の配列と、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼのハイッブリッド／キメラポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約５０（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００）個を含み、かつ配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含む第２のβ−グルコシダーゼ配列を含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列のＣ末端は、第２のβ−グルコシダーゼ配列のＮ末端に連結される。あるいは、第１の及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、リンカードメインをコードしている第３のヌクレオチド配列を介して連結される。第１のドメイン、第２のドメイン又はリンカードメインは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなりかつＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）のアミノ酸配列を有するループ配列を含んでよい。一部の実施形態では、ループ配列は、第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来する。
【００１８】
特定の態様では、本開示は、β−グルコシダーゼ活性を有し、少なくとも２つ（例えば、２、３、又は更には４つ）β−グルコシダーゼ配列からなるハイブリッド体である、ポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供し、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ配列のうちの１つ目の配列は、アミノ酸残基少なくとも約２００個（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個）分であり、かつ配列番号４４、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含み、一方少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ配列のうちの２つ目の配列は、アミノ酸残基少なくとも約５０個（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個）分であり、配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する。あるいは、本開示は、少なくとも２つ（例えば、２、３、又は更には４つ）のβ−グルコシダーゼ配列からなるハイブリッド体であるβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供し、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ配列のうちの１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含み、少なくとも２つのβ−グルコシダーゼ配列のうちの２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個分）の長さであり、配列番号４４、５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうちの２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、β−グルコシダーゼのキメラ又はハイブリッド��リペプチドのＮ末端に位置する第１のアミノ酸配列と、Ｃ末端に位置する第２のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、第１のアミノ酸配列のＣ末端残基は、第２のアミノ酸配列のＮ端末残基と連結されている。あるいは、第１のアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列の直後に隣接しておらず、第１の配列はリンカードメインを介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列、又はリンカードメインは、ループ配列を含むアミノ酸配列、あるいはアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有するループ様の構造を示す配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来する。
【００１９】
一部の態様では、本開示は、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２又は９４のうちのいずれか１つの配列又はこれらの少なくとも約３００残基分、（例えば、少なくとも約３００、４００、５００、又は６００残基分）の長さの断片と少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する単離、合成、又は組み換えヌクレオチド、を提供する。特定の実施形態では、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、厳密度の高い条件下、厳密度の非常に高い条件下で、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２又は９４のいずれか１つの配列、あるいはこれらの少なくとも約３００残基分の長さの断片、あるいはこれらの相補鎖と、ハイブリッド形成し得る単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、本開示は、配列番号４４、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のいずれか１つの配列と、触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する単離、合成又は組み換えポリペプチドを提供する。単離、合成、又は組み換えポリペプチドはβ−グルコシダーゼ活性を有し得る。
【００２１】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００）残基の領域にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する単離、合成又は組み換えポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、単離、合成、又は組み換えポリペプチドは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する。「ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性」は、ポリペプチドが、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の酵素活性を有すること、及び／又はエンドグルカナーゼ活性を有することを意味する。一部の実施形態では、本開示は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個分）の長さであり、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１つ以上を含む、単離、合成又は組み換えポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドである（例えば、微生物又は他の好適な種由来の、限定するものではないがＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４酵素などのＥＧ  ＩＶ型ポリペプチド）。一部の実施形態では、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４由来の変異体（variant）、変異体（mutant）、又は融合ポリペプチドである（例えば、ポリペプチドは、配列番号５２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する）。
【００２２】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、８０〜８１、及び２０６〜２０７のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）全長若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有するポリペプチドをコードしている、単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。例えば、単離、合成、又は組み換えヌクレオチドは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本開示は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個分）の長さであり、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１種以上を含むポリペプチドをコードしている単離、合成又は組み換えヌクレオチドを提供する例えば、ヌクレオチドは、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチドである。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする（例えば、限定するものではないが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などの、好適な生物に由来するＥＧ  ＩＶ型ポリペプチド）。
【００２３】
一部の態様では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５のうちのいずれか１つのポリペプチドと、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、若しくは３５０残基にわたって、又は未熟なポリペプチド、成熟ポリペプチド、触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％）配列同一性を有する単離、合成、組み換えポリペプチドを提供する。
【００２４】
一部の態様では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５の配列のいずれか１つと、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、若しくは３５０残基の領域にわたって、又は未熟なポリペプチド、成熟ポリペプチド、触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％））配列同一性を有するポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。一部の態様では、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のうちのいずれか１つの配列、又はこれらの断片と、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％））配列同一性を有する単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。この断片は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００残基の長さであってよい。一部の実施形態では、本開示は、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、厳密度の高い条件下、又は厳密度の非常に高い条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のいずれか１つの配列、又はこれらの断片若しくは下位配列とハイブリッド形成する単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。
【００２５】
本開示のポリペプチド配列は、本開示の核酸（例えば以降第５．１節で記載される核酸）によりコードされる配列も含む。
【００２６】
本開示は、少なくとも１つのポリペプチドドメイン（例えば、ＣＤ、ＣＢＭ、又はこれらのいずれも）を含む、キメラ又は融合タンパク質も提供する。少なくとも１つのドメインは、第２のアミノ酸配列、例えばシグナルペプチド配列に操作可能に連結させることができる。したがって、本開示は、本開示のポリペプチドに関するシグナル配列を含むヌクレオチド配列を、第２の異なるポリペプチド、例えば天然ではシグナル配列と関係のない異種ポリペプチドをコードしている第２のヌクレオチド配列と操作可能に連結させて発現させることにより、第１の種類のキメラ又は融合酵素を提供する。本開示は、例えば、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４５、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８〜８３、９３、又は９５の配列の、残基１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、又は１〜４０を含み、天然には関連付けられないポリペプチドを有する、組み換えポリペプチドを提供する。その他のキメラ又は融合ポリペプチドを以降の節５．１．１．に記載する。
【００２７】
本開示は、第１の連続して延びるアミノ酸残基からなる第１のポリペプチド配列を含み、第２の連続して延びるアミノ酸残基からなる第２のポリペプチド配列と操作可能に連結されている、第２の種類のキメラ又は融合酵素を提供する。第１の及び／又は第２の連続して延びる配列には、場合によりシグナルペプチドを含ませることができる。適宜に、この種類のキメラ又は融合酵素は、第１の連続して延びるアミノ酸残基からなる第１のポリペプチド配列をコードしている第１の遺伝子、及び第２の連続して延びるアミノ酸残基からなる第２のポリペプチド配列をコードしている第２の遺伝子を含むポリヌクレオチドを発現させることにより得られ、第１の遺伝子及び第２の遺伝子は直接及び操作可能に連結されている。その他の特定の実施形態では、キメラ又は融合法を使用して、異なる酵素から得られた２種以上の連続して延びるアミノ酸残基を操作可能に連結させることができる。連続して延びるアミノ酸残基は天然に由来するものではなく、又は天然に連結されるもの若しくは関連付けられるものではない。特定の実施形態では、操作可能に連結されている連続して延びるアミノ酸残基は、類似する酵素活性を有するものの互いに及び／又は宿主細胞に対して異種性のものである酵素から得ることができる。更に追加的な実施形態では、操作可能に連結されている２種以上の連続して延びるアミノ酸残基は、更に、本明細書に記載されるような好適なシグナルペプチドと連結させることができる。更に他の実施形態では、第１の連続して延びるアミノ酸残基、及び第２の連続して延びるアミノ酸残基はリンカードメインを介して連結される。一部の実施形態では、第１の連続して延びるアミノ酸残基、第２の連続して延びるアミノ酸残基、又はリンカー配列は、例えば、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）のアミノ酸配列を有するループ配列を含み得る。特定の実施形態では、ループ配列は第１の及び第２の連続して延びるアミノ酸残基の由来する酵素とは異なる酵素に由来する。一部の実施形態では、得られるキメラ又は融合酵素は向上した安定性を有しており、例えば、安定性の向上は、キメラ部位の由来する対応する各酵素と比較した場合の、標準的な貯蔵条件下での保管中の、又は標準的な発現若しくは生産条件下での発現／生産中の、タンパク質の加水分解又はタンパク質の分解に対する安定性という点で反映される。
【００２８】
本開示に関し、キメラ又は融合酵素は、キメラ配列の由来する酵素のうちの１つを起源とする酵素活性により定義される。例えば、キメラ配列のうち１つの配列がβ−グルコシダーゼに由来するか又はβ−グルコシダーゼの変異体である場合、ハイブリッド／キメラ酵素は、このポリペプチドに含まれる他のキメラ配列の由来する酵素とは無関係に、β−グルコシダーゼポリペプチドとして参照される。本開示の目的に際し、「Ｘポリペプチド」は、Ｘ酵素活性を有する、変異体（variant）、変異体（mutant）、又はＸポリペプチドのキメラ／融合体、を包含する。
【００２９】
したがって、本開示は、ヘミセルロース分解活性又はセルロース分解活性を有する、ポリペプチド及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド若しくは核酸を提供する。ヘミセルロース分解活性としては、限定するものではないが、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性が挙げられる。ヘミセルロース分解活性を有するポリペプチドとしては、限定するものではないが、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼが挙げられる。セルラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、限定するものではないがβ−グルコシダーゼ活性又はβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ活性、及びＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性又はエンドグルカナーゼに富むセルラーゼ活性が挙げられる。
【００３０】
本開示は、本開示の核酸又はこれらの下位配列を含む発現カセットを更に提供する。例えば、核酸は、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６９、７１、７３、７５、７７、９２、９４の核酸配列と、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００残基にわたって少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有する。一部の態様では、β−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている核酸は、例えば、２種以上のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来する２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むキメラ／融合ポリペプチドであってよく、第１の配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号９６〜１０８のうちの１つ以上又は全てを含み、一方で第２の配列は少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１０９〜１１６のうちの１つ以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。
【００３１】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、又は（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちのいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するポリペプチドをコードしている核酸を含む発現カセットを提供する。
【００３２】
一部の態様では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００残基の領域にわたって、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するポリペプチドをコードしている核酸を含む発現カセットを提供する。一部の態様では、本開示は、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、又は厳密度の高い条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のうちのいずれか１つの配列と、又はこれらの断片又は下位配列とハイブリッド形成する核酸を含む、発現カセットを提供する。断片又は下位配列は、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０残基分の長さである。
【００３３】
一部の態様では、発現カセットの核酸は、所望により操作可能なようにプロモーターに連結されている。プロモーターは、例えば、真菌、ウイルス、バクテリア、哺乳類、又は植物のプロモーターであってよい。プロモーターは、例えば、糸状菌で発現させることのできる常時発現型プロモーター又は誘導型プロモーターであってよい。糸状菌に由来するプロモーターが好適なである場合がある。例えば、プロモーターはＴ．リーゼイ由来のセロビオヒドロラーゼ１（「ｃｂｈ１」）遺伝子プロモーターであってよい。
【００３４】
一部の態様では、本開示は、本開示の核酸、又は本開示の発現カセットを発現するよう遺伝子操作された組み換え細胞を提供する。組み換え細胞は、所望により、バクテリア細胞、哺乳類細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である。例えば、組み換え細胞は、組み換え糸状菌細胞、例えばトリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポラム（Cephalosporium）、アキルヤ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボラス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）細胞である。
【００３５】
本開示は、（ａ）本開示のポリペプチドを発現するよう遺伝子操作した宿主細胞を培養する工程；及び（ｂ）ポリペプチドを回収する工程、を含む、組み換えポリペプチドを生産する方法も提供する。ポリペプチドの回収法としては、例えば、ポリペプチドを含む発酵ブロスの回収が挙げられる。発酵ブロスは、生産後に例えば、精製、限外濾過、細胞殺傷工程などの最小限の加工を行い使用してもよく、及びこのような場合、発酵ブロスは全ブロス製剤として使用されると言われる。あるいは、ポリペプチドは更なる精製工程を用い回収することもできる。
【００３６】
更なる態様では、本発明は、本発明の２種以上、３種以上、４種以上、又は５種以上のポリペプチド（好適な変異体（variants）、変異体（mutants）、又は融合／キメラポリペプチドなど）を含む遺伝子操作型酵素組成物に関し、酵素組成物は、リグノセルロース系バイオマス材料に含まれる１種以上の成分を加水分解し得る。このような組成物としては、例えば、ヘミセルロース、及び場合によりセルロースが挙げられる。好適なリグノセルロース系バイオマス材料としては、限定するものではないが、種子、穀類、塊茎、植物性廃棄物、すなわち食品加工又は工業加工に関係する副産物（例えば、茎など）、トウモロコシ（例えば、穂軸、及びまぐさなど）、草本類（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアングラス、又は例えば、キビ（Panicum）種などパニクム・バーガタム（Panicum virgatum）といったスイッチグラス）、多年生植物のケーン類（例えば、暖竹（giant reeds））、木材（例えば、木片、加工廃棄物など）、紙、パルプ、及び再生紙（例えば、新聞紙）が挙げられる。酵素配合物／組成物を使用することで、植物間で異なる複雑な構造体を形成するβ−１，４−結合型グルコースからなる直鎖を含むセルロース又はヘミセルロースを加水分解することができる。
【００３７】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物は、例えば、ヘミセルラーゼ活性又はセルラーゼ活性を有する数多くの異なるポリペプチドを含み得る。ヘミセルラーゼ活性は、キシラナーゼ活性、アラビノフラノシダーゼ活性、又はキシロシダーゼ活性であってよい。セルラーゼ活性は、グルコシダーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、又はエンドグルカナーゼ活性であってよい。本発明の酵素組成物のポリペプチドは、ヘミセルラーゼ活性及び／又はセルラーゼ活性のうちの１種以上を有するものであってよい。例えば、酵素組成物のポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性をいずれも有していてよい。同様に、所定の酵素組成物に含まれる２種以上のポリペプチドの酵素活性は同様のもの、又は類似したものであってよい。例えば、組成物に含まれる１種以上のポリペプチドは、独立してエンドグルカナーゼ、β−キシロシダーゼ、又はβ−グルコシダーゼ活性を有し得る。
【００３８】
本発明の好適なポリペプチドは、天然由来の資源から単離することができる。例えば、１種以上のポリペプチドは、天然由来の資源から精製され、又は実質的に精製される。他の例では、１種以上のポリペプチドは、遺伝子組換え型バクテリア又は真菌などのように生物に遺伝子操作を行い生産させてよい。１種以上のポリペプチドを組み換え生物により過剰発現させてもよい。１種以上のポリペプチドを、１種以上の異種（すなわち、同様の生物から天然には生じない）ポリペプチドと共に発現又は共発現させることもできる。本発明の１種以上のポリペプチドをコードしている遺伝子を、組み換え宿主生物、例えば、宿主真菌細胞又は宿主バクテリア細胞の遺伝物質に組み込み、次いで遺伝子産物を生産させるのに使用することができる。
【００３９】
本発明の酵素組成物は、天然型又は遺伝子操作型組成物であってよい。用語「天然型酵素組成物」は、天然に存在する組成物、例えば、その天然の環境条件下で増殖させた未改変の生物から直接誘導された組成物を指す。用語「遺伝子操作型組成物」は、少なくとも１種の酵素が（１）遺伝子組み換えにより生産される；（２）異種遺伝子の発現を介し微生物により生産される；及び／又は（３）同一又は類似する種類の酵素を含む天然に得られる酵素組成物中に存在するよりも多いか少ないかする量若しくは相対的な重量％で存在する組成物を指す。「遺伝子組み換えにより生産された」酵素は、遺伝子組換えを介し生産された酵素である。遺伝子組み換えにより生産された酵素は、混合物として存在させることができ、この場合、遺伝子組み換えにより生産された酵素は、天然には同時に存在しない他の酵素との混合物として存在する。更に、遺伝子操作した組成物は、天然に見られる生物（すなわち、未改変の生物）により、これらの生物が天然に生息する場所で見られる条件とは異なる条件下で生産させることもできる。
【００４０】
本発明のポリペプチド、これらの混合物、及び／又は遺伝子操作型酵素組成物を使用して、バイオマス材料又は他の好適な原材料を加水分解することができる。酵素組成物は、望ましくはキシラナーゼ、キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、グルコシダーゼ、及び場合によりアラビノフラノシダーゼから選択される本発明の２種以上、３種以上、４種以上、若しくは更には５種以上のポリペプチド、及び／又はヘミセルロース材料の発酵性糖質への消化又は変換を触媒し得る若しくは補助し得るその他の酵素との混合物を含む。好適なグルコシダーゼとしては、例えば、限定するものではないが、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有する数多くのβ−グルコシダーゼが挙げられる。同様に好適なグルコシダーゼとしては、例えば、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むキメラ／融合β−グルコシダーゼポリペプチドが挙げられ、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。
【００４１】
好適なエンドグルカナーゼとしては、例えば、限定するものではないが、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有する１種以上のＧＨ６１エンドグルカナーゼが挙げられる。同様に好適なエンドグルカナーゼとしては、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１種以上の配列モチーフを含むポリペプチドも挙げられる。
【００４２】
ヘミセルロースを発酵性糖質へと分解することができる他の酵素としては、限定するものではないが、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、又はセルラーゼ若しくはヘミセルラーゼを含む組成物が挙げられる。同様に存在させることのできる好適な他のポリペプチドとしては、例えば、セロビオースデヒドロゲナーゼが挙げられる。本発明の遺伝子操作型酵素組成物は、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及びセルラーゼ群から選択された本発明の２種以上、３種以上、４種以上、又は更には５種以上のポリペプチドの混合物を含ませることができる。遺伝子操作型酵素組成物には、場合により１種以上のセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませてもよい。全セルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼポリペプチドに富むもの、又はエンドグルカナーゼポリペプチドに富むもの、又はβ−グルコシダーゼポリペプチド及びエンドグルカナーゼポリペプチドのいずれもに富むものであってよい。一部の実施形態では、エンドグルカナーゼポリペプチドは、例えば、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有する、ＧＨ６１ファミリーのメンバーであってよい。エンドグルカナーゼポリペプチドは、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１種以上の配列モチーフを含むものであってよい。例えば、エンドグルカナーゼポリペプチドは、Ｔ．リーゼイＥｇ４などの好適な生物由来のＥＧＩＶであってよい。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００残基）の領域にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有するものであってよい。
【００４３】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第１の非限定例は、４種のポリペプチド、すなわち：（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチドを含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼを有する第４のポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むキメラ／融合ポリペプチドであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、及び配列番号９６〜１０８の配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含み、一方で第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、及び配列番号１０９〜１１６の配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしておりアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチドは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）に対して、例えば、Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）のＮ末端から少なくとも２００残基に対して、すなわちＮ末端付近の位置のアミノ酸に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ，配列番号６４）に対して、例えば、配列番号６４のＣ末端若しくはＣ末端付近の残基から少なくとも５０残基長に対して、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列、を含む。第４のポリペプチドは、更に、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列に由来するアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個からなる第３の配列を含んでもよく、又はＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）若しくはＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）のアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対して、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基からなる下位配列又は断片に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、遺伝子操作型酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第５のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含む。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧＩＶポリペプチドである。ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧＩＶポリペプチドに富む全セルラーゼである。一部の実施形態では、第５のポリペプチドは、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、又は（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１；及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１種以上の配列モチーフを含む。一部の実施形態では、酵素組成物は、セロビオースデヒドロゲナーゼを更に含む。
【００４５】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２である。
【００４６】
一部の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群又は第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択される。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであり得る。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００４７】
一部の実施形態では、アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【００４８】
第１、第２、第３、第４又は第５のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００４９】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第２の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するβ−グルコシダーゼポリペプチドに富む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドに富み、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基２００個分の長さであり、かつ配列番号９６〜１０８の配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含み、一方、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１０９〜１１６の配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、並びに少なくとも５０残基のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ��Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端近傍の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列とを含むβ−グルコシダーゼポリペプチドに富む。β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列に由来する又はアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）若しくはＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含む、β−グルコシダーゼポリペプチドに富む。一部の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対し、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基を含む下位配列若しくは断片に対し、少なくとも約６０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、遺伝子操作型酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含む。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＥＧＩＶポリペプチドに富む全セルラーゼである。
【００５１】
一部の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有するものであるか、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフを１つ以上含むものである。一部の実施形態では、酵素組成物は更に、セロビオースデヒドロゲナーゼを含む。
【００５２】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２である。
【００５３】
一部の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群又は第２群のいずれかのβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択される。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００５４】
一部の実施形態では、アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【００５５】
第１、第２、第３、又は第４のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００５６】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第３の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド；（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド；（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド；及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを含む。一部の実施形態では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチドはＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、好適な微生物から得られる、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＥＧＩＶポリペプチドに富む全セルラーゼである。一部の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するものであるか、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含むものである。組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００５７】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【００５８】
一部の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群又は第２群のいずれかのβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されてよい。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つの配列又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００５９】
一部の実施形態では、アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【００６０】
第１、第２、第３、第４又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００６１】
本発明の遺伝子操作酵素組成物の第４の非限定例は、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性（第１のポリペプチドとは異なる）を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチドを含む。特定の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むキメラ／融合ポリペプチドβ−グルコシダーゼであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、及び配列番号９６〜１０８の配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含み、一方で第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、及び配列番号１０９〜１１６の配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、第４のポリペプチドは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端付近の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する��２の配列を含む。第４のポリペプチドは、相当する長さのＴｅ３Ａ配列（配列番号６６）に由来する約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含み、あるいはＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対して、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基からなる下位配列又は断片に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する。
【００６２】
一部の実施形態では、酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第５のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含み得る。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第５のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００６３】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第１ポリペプチドは、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。
【００６４】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２ポリペプチドは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００６５】
一部の実施形態では、アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【００６６】
第１、第２、第３、第４、第５又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００６７】
酵素組成物の第５の非限定例は、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、及び（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するポリペプチドに富む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドに富み、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により、第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端近傍の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列に由来する又はアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）若しくはＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する配列に由来する、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含む、ポリペプチドに富む。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、配列番号９３又は９５と、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０残基以上からなる下位配列又は断片と、少なくとも約６０％配列同一性を有するポリペプチドに富む。
【００６８】
特定の実施形態では、酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含み得る。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第５のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００６９】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第１ポリペプチドは、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。
【００７０】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２ポリペプチドは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００７１】
一部の実施形態では、アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【００７２】
第１、第２、第３、第４又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００７３】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第６の非限定例は、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド；（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）；（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド；及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、又はＥＧＩＶに富む全セルラーゼを含む。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第５のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００７４】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第１ポリペプチドは、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。
【００７５】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２ポリペプチドは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００７６】
一部の実施形態では、アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【００７７】
第１、第２、第３、第４又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００７８】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第７の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチドを含む。特定の実施形態では、第４のポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有する。特定の実施形態では、第４のポリペプチドは、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしておりアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、第４のポリペプチドは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端近傍の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。特定の実施形態では���第４のポリペプチドは、相当する長さのＴｅ３Ａ配列（配列番号６６）に由来する約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含み、あるいはＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）のアミノ酸配列を有する。例えば、第４のポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対して、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基からなる下位配列又は断片に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含む。
【００７９】
酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第５のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含み得る。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第５のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００８０】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【００８１】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。
【００８２】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第３ポリペプチドは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００８３】
第１、第２、第３、第４、第５又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００８４】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第８の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及びβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有するポリペプチドに富む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドに富み、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端近傍の残基から少なくとも５０残基と、少���くとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列に由来する約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含む、又はアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）若しくはＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する、ポリペプチドに富む。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、配列番号９３又は９５と、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０残基以上からなる下位配列又は断片と、少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含むポリペプチドに富む。
【００８５】
酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含み得る。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第４のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００８６】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【００８７】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。
【００８８】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第３ポリペプチドは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００８９】
第１、第２、第３、第４又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００９０】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第９の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ、を含む。一部の実施例では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第５のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００９１】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【００９２】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。
【００９３】
特定の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第３ポリペプチドは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものである。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００９４】
第１、第２、第３、第４又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【００９５】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第１０の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及び（３）β−グルコシダーゼ活性を有する第３のポリペプチドを含む。特定の実施形態では、第３のポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有する。特定の実施形態では、第３のポリペプチドは、２つ又はそれ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、第３のポリペプチドは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端近傍の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。特定の実施形態では、第３のポリペプチドは、相当する長さのＴｅ３Ａ配列（配列番号６６）���由来する約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含み、あるいはＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）のアミノ酸配列を含む。例えば、第３のポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対して、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基からなる下位配列又は断片に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含む。
【００９６】
酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含み得る。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第４のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【００９７】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【００９８】
一部の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群又は第２群のいずれかのβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されてよい。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであり得る。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【００９９】
第１、第２、第３、第４又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【０１００】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の第１１の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及びβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼを含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一性を有するポリペプチドに富む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドに富み、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしており、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端又はＮ末端近傍から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端又はＣ末端近傍の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコ��ダーゼに富む全セルラーゼは、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列に由来する約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を更に含む、又はアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）若しくはＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む、ポリペプチドに富む。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼは、配列番号９３又は９５と、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０残基以上からなる下位配列又は断片と、少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含むポリペプチドに富む。
【０１０１】
酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第３のポリペプチド、あるいはＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼを更に含み得る。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第３のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【０１０２】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【０１０３】
一部の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群又は第２群のいずれかのβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されてよい。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであり得る。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【０１０４】
第１、第２、又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【０１０５】
遺伝子操作型酵素組成物の第１２の非限定例は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及び（３）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第３のポリペプチド、又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ、を含む。一部の実施例では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのバクテリア又は真菌といった好適な微生物由来のＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、第３のポリペプチドはＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドであり、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の同一性を有し、あるいは（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含む。酵素組成物には更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含ませることもできる。
【０１０６】
一部の実施形態では、キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１のポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【０１０７】
一部の実施形態では、キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチドは、第１群又は第２群のいずれかのβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されてよい。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであり得る。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【０１０８】
第１、第２、第３、又はその他のポリペプチドは、天然に得られる資源から単離されたものであっても又は精製されたものであってもよい。あるいは、組み換え宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。これらのペプチドは、単離又は精製形態で酵素組成物に加える事ができる。これらは、培養混合物、例えば、発酵ブロスの一部として、宿主生物又は宿主細胞により発現又は過剰発現させることもできる。一部の実施形態では、このようなポリペプチドをコードしている遺伝子は、コードさせたポリペプチドを宿主生物により発現させることのできる、宿主生物の遺伝子物質に組み込むことができる。
【０１０９】
本明細書に記載の遺伝子操作型酵素組成物は、例えば、発酵ブロスである。発酵ブロスは、例えば、微生物から得られるものである。微生物は、糸状菌又は酵母などのバクテリア又は真菌であってよい。好適な糸状菌としては、限定するものではないが、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アキラ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボーラス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）が挙げられる。好適な真菌のうちトリコデルマ菌種（Trichoderma spp.）の一例としては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）が挙げられる。好適な真菌のうちペニシリウム菌種（Penicillium spp. ）の一例としては、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）が挙げられる。発酵ブロスは、例えば、無細胞発酵ブロス又は全ブロス製剤であってよい。
【０１１０】
本明細書に記載の酵素組成物が、セルラーゼ活性（例えば、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性）を有する酵素を含む場合、あるいは全セルラーゼを含む場合、本発明の酵素組成物はセルラーゼ組成物である。セルラーゼは、例えば、バクテリア又は真菌由来のセルラーゼ組成物であってよい。例えば、糸状菌由来のセルラーゼ組成物は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、又はクリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）などのトリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）由来のセルラーゼ組成物であってよい。セルラーゼ組成物は、糸状菌により好適に製造することができ、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）（トリコデルマ・リーゼイなど）、アスペルギルス（Aspergillus）（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はコウジカビ（Aspergillus oryzae）など）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）（クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）など）により製造することができる。あるいは、酵素組成物は、酵母などの組み換え生物で製造することもできる。
【０１１１】
本明細書に記載の酵素組成物の成分は、当該技術分野で既知の手法により測定することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、成分の相対量を測定することもできるが、この場合の測定値は正確なものではなく、せいぜいで半定量的なものである。ＨＰＬＣは、一般的に、より正確な酵素成分測定方法であると見なされているものの、その正確さは多くの場合、測定量で組み合わせることのできる品質の良い酵素標準を入手できるかどうか、及び混合物の清浄度、並びに特定の共溶出成分を分離させるのに使用されるカラムの性能に依存する。互いから特定のタンパク質を溶出するにあたって制限があるものの、これらの制限はタンパク質の異なる組に対して生じる傾向のある、ＨＰＬＣなどの超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を用い成分を測定することもできる。したがって、ＨＰＬＣでは溶出されないタンパク質でも、ＵＰＬＣでは溶出させることができる場合もあれば、その逆もある。これらの手法を用いる測定に使用する条件は、本明細書において実施例に記載する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、又はＵＰＬＣのいずれかにより測定した場合に、遺伝子操作組成物に含まれる、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、酵素組成物中の合計タンパク質重量又は総タンパク質重量の約０．０５重量％〜約８０重量％（例えば、約０．０５重量％〜約７５重量％、約０．１重量％〜約７０重量％、約１重量％〜約６０重量％、約５重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約４０重量％、約０．５重量％〜約４０重量％、約１重量％〜約３５重量％、約５重量％〜約２５重量％、約９重量％〜約１７重量％、約５重量％〜約１５重量％、約１０重量％〜約１５重量％、約１０重量％〜約２５重量％、約１０重量％〜約３５重量％など）であるとして表すことができる。特定の実施例では、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３を含む組成物中の、例えば、本明細書に記載の任意の遺伝子操作酵素組成物中の、これらのキシラナーゼ量として測定される。混合物中のキシラナーゼの総重量は、本明細書に記載の手法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、又はＵＰＬＣを用い測定した場合、組成物中のタンパク質の総重量の約１０重量％〜約２０重量％、又は約１４重量％〜約１８重量％である。
【０１１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣにより測定した場合にβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、遺伝子操作酵素組成物中の総タンパク質の約０．０５重量％〜約７５重量％（例えば、約０．０５重量％〜約７０重量％、約０．１重量％〜約６０重量％、約１重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約４０重量％、約２０重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約４５重量％、約５重量％〜約４０重量％、約１０重量％〜約３５重量％、約２重量％〜約３０重量％、約５重量％〜約２５重量％、約５重量％〜約１０重量％、約９重量％〜約１５重量％、約１０重量％〜約２０重量％など）に相当する。特定の実施例では、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、第１群のβ−キシロシダーゼ及び第２群のβ−キシロシダーゼ（例えば、Ｆｖ３Ａ及びＦｖ４３Ｄ）を含む組成物（例えば、本明細書に記載の任意の遺伝子操作型酵素組成物）中のこれらのβ−キシロシダーゼの量として測定される。混合物中のβ−キシロシダーゼの総重量は、約３重量％〜約２０重量％であり、例えば、本明細書に記載の方法に従い、ＨＰＬＣを用い測定した場合に約４重量％〜約６重量％、ＵＰＬＣを用い測定した場合に約１０重量％〜約１４重量％、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い測定した場合に約１５重量％〜約１８重量％である。
【０１１３】
本発明の遺伝子操作酵素組成物がβ−キシロシダーゼ活性を有する第１群のポリペプチド、及びβ−キシロシダーゼ活性を有する第２群のポリペプチドを含む場合、第１群のポリペプチドの合計重量は、組成物中の総タンパク質重量の約０．１重量％〜約３０重量％（例えば、約０．２重量％〜約２５重量％、約０．５重量％〜約２０重量％、約４重量％〜約１０重量％、約４重量％〜約８重量％など）に相当し、一方、第２群のポリペプチドの合計重量は、組成物中の総タンパク質重量の約０．１重量％〜２０重量％（例えば、約０．２重量％〜約１８重量％、約０．５重量％〜約１５重量％、約５重量％〜約１０重量％など）に相当する。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドと第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドの重量比は、約１：１０〜約１０：１であってよく、例えば、約１：８〜約８：１、約１：６〜約６：１、約１：４〜約４：１、約１：２〜約２：１、又は約１：１であってよい。
【０１１４】
存在させる場合、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、又はＵＰＬＣを用い測定した場合、遺伝子操作酵素組成物の合計又は総タンパク質重量の約０．０５重量％〜約２０重量％（例えば、０．１重量％〜約１５重量％、１重量％〜約１０重量％、２重量％〜約１２重量％、４重量％〜約１０重量％、３重量％〜約９重量％、５重量％〜約９重量％など）に相当し得る。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、例えば、このＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含む組成物（例えば、本明細書に記載の任意の遺伝子操作型酵素組成物）中のＦｖ５１Ａの量として測定される。混合物中のＬ−α−アラビノフラノシダーゼの総重量は、約０．２重量％〜約２重量％であり、例えば、本明細書に記載の方法に従い、ＨＰＬＣを用い測定した場合に約０．３重量％〜約０．５重量％であり、ＵＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い測定した場合に約０．８重量％〜約１．２重量％である。
【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＵＰＬＣ、又はＨＰＬＣのいずれかにより測定した場合に、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド（変異体（variants）、変異体（mutants）、又はβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドなど）の合計重量は、遺伝子操作型酵素組成物中の合計タンパク質重量又は総タンパク質重量の、約０．０５重量％〜約５０重量％（例えば、約０．１重量％〜約４５重量％、約１重量％〜約４２重量％、約２重量％〜約４５重量％、約２重量％〜約４０重量％、約２重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約２５重量％、約５重量％〜約５０重量％、約９重量％〜約１７重量％、約１０重量％〜約５０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、約２５重量％〜約５０重量％、約３０重量％〜約５０重量％など）に相当する。特定の実施例では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、例えば、配列番号９２及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１からなるβ−グルコシダーゼのハイブリッド／キメラ体を含む組成物（例えば、本明細書に記載の任意の遺伝子操作型酵素組成物）中のこれらの酵素の量として測定される。混合物中のβ−グルコシダーゼの総重量は、約１８重量％〜約２８重量％であり、例えば、本明細書に記載の方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＵＰＬＣを用い測定した場合に約２２重量％〜約２５重量％、及びＨＰＬＣを用い測定した場合に約１８重量％〜約２２重量％である。
【０１１６】
ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドの総重量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣにより測定した場合に、遺伝子操作型酵素組成物中の合計又は総タンパク質重量の約２重量％〜約５０重量％（例えば、約２重量％〜約４５重量％、約２重量％〜約４０重量％、約２重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約２５重量％、約４重量％〜約１６重量％、約５重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約５０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、約２５重量％〜約５０重量％、約３０重量％〜約５０重量％など）として表すことができ、又はこれらの重量に相当する。特定の実施例では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの合計重量は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載の任意の遺伝子操作型酵素組成物）中のこのような酵素の量として測定される。混合物中のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の総重量は、約６重量％〜約２０重量％であり、例えば、本明細書に記載の方法に従い、ＨＰＬＣを用い測定した場合に約６重量％〜約１０重量％であり、及びＵＰＬＣ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い測定した場合に約６重量％〜約１８重量％である。
【０１１７】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の一例は、本明細書の実施例に記載の条件を用いＨＰＬＣにより測定した場合に、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドを約４重量％〜約６重量％、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチド及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼポリペプチドを合計重量で約５重量％〜約９重量％、β−グルコシダーゼポリペプチドを約９重量％〜約１７重量％、キシラナーゼを約９重量％〜約１７重量％、ＧＨ６１エンドグルカナーゼを約４重量％〜約１６重量％含む。酵素組成物は、更に１種以上のセロビオヒドロラーゼを約２５重量％〜約４５重量％含む。酵素組成物は、その他のセルラーゼも約７重量％〜約２０重量％含む。
【０１１８】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の一例は、本明細書の実施例に記載の条件を用いＵＰＬＣにより測定した場合に、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドを約４重量％〜約６重量％、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドを約５重量％〜約９重量％、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼポリペプチドを約０．５重量％〜約２重量％、β−グルコシダーゼポリペプチドを約１８重量％〜約２２重量％、キシラナーゼポリペプチドを約１３重量％〜約１５重量％、及びＧＨ６１エンドグルカナーゼを約８重量％〜約２０重量％含む。酵素組成物には、更に、セロビオヒドロラーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１及びＣＢＨ２）を約１５重量％〜約２５重量％含ませることができる。酵素組成物には、その他のセルラーゼも約２重量％〜約８重量％含ませることができる。
【０１１９】
本発明の遺伝子操作型酵素組成物の少なくとも１種の（例えば、１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、又は更には６種以上の）酵素は、異種生物資源などに、例えば、宿主細胞とは異なる微生物に由来する。非限定例では、遺伝子操作型酵素組成物中の１種の酵素は糸状菌のフザリウム菌種（Fusarium spp.）であるのに対し、遺伝子操作型酵素組成物はフザリウム菌種（Fusarium spp.）以外の微生物、真菌から製造される。他の例では、遺伝子操作型酵素組成物中の１種の酵素は糸状菌のトリコデルマ菌種（Trichoderma spp.）に由来するのに対し、遺伝子操作型酵素組成物は、真菌のトリコデルマ菌種（Trichoderma spp.）以外の微生物、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）又はクリソスポリウム（Chrysosporium）から製造される。
【０１２０】
本明細書に記載の遺伝子操作型酵素組成物中の少なくとも２種の酵素は、異なる生物資源に由来する。代表的な遺伝子操作型酵素組成物では、１種以上の酵素はフザリウム菌種（Fusarium spp.）に由来するのに対し、他の１種以上の酵素はフザリウム菌種（Fusarium spp.）以外の真菌に由来する。
【０１２１】
遺伝子操作型酵素組成物は、例えば、適切な発酵ブロス組成物である。発酵ブロスは、例えば、糸状菌によるものであり、限定するものではないが、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクルヤ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボーラス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）のものである。好適な真菌のうちトリコデルマ菌種（Trichoderma spp.）の一例としては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）が挙げられる。真菌のうちペニシリウム菌種（Penicillium spp. ）の一例としては、ペニシリウム・フニクロサム（ペニシリウム（Penicillium  funiculosum）が挙げられる。真菌のうちアスペルギルス菌種（Aspergilllus spp.）の一例としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はコウジカビ（Aspergillus oryzae）が挙げられる。真菌のうちクリソスポリウム菌種（Chrysosporium spp.）の一例としては、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）が挙げられる。発酵ブロスは、例えば、無細胞発酵ブロスであってよく、所望により、例えば、限外濾過、精製、細胞の殺傷などの最小限の生産後加工を行ってよく、例えば、全ブロス製剤に使用することができる。
【０１２２】
遺伝子操作型酵素組成物はセルラーゼ組成物であってよく、例えば、真菌由来のセルラーゼ組成物又はバクテリア由来のセルラーゼ組成物であってよい。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）などの糸状菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母により製造することができる。
【０１２３】
本開示の酵素又は遺伝子操作型酵素組成物は、食品産業に（例えば、焼成食品、果物、及び野菜の加工時）、農業廃棄物の分解時に、動物用飼料の製造時に、パルプ及び紙の製造時に、布地の製造時に、又は家庭用及び工業用洗浄剤に使用することができる。本明細書に記載の酵素は、例えば、それぞれ別個に真菌又はバクテリアなどの微生物により製造することができる。
【０１２４】
本明細書に記載の酵素又は遺伝子操作型酵素組成物は、植物バイオマス、例えば、トウモロコシ、穀類、草本類（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアングラス、又は例えば、キビ（Panicum）菌種などパニクム・バーガタム（Panicum virgatum）といったスイッチグラス）、多年生植物のケーン類（例えば、暖竹）、又は木材若しくは木材加工副産物、例えば、木材加工、パルプ及び／又は製紙工業時、繊維製造時、家事、及び工業用洗浄剤、及び／又は廃棄バイオマスの加工時の副産物などの、全ての生物資源が挙げられる、任意の好適な資源に含まれるリグノセルロースの消化にも使用することができる。本開示は、セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー又はグルカン若しくはセルロースを含む組成物を、加水分解、切断又は破壊する方法を提供するものであり、好適な条件下で、組成物を本開示の酵素又は酵素組成物と接触させる工程を包含し、酵素又は酵素組成物が、セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー又はグルカン若しくはセルロースを含む組成物を加水分解、切断又は破壊する。
【０１２５】
本開示は、本明細書に記載のポリペプチド又は本明細書に記載の核酸によりコードされるポリペプチドを含む遺伝子操作型酵素組成物を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及び／又はＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性から選択される１種以上の活性を有する。遺伝子操作型酵素組成物は、セルロース系及びヘミセルロース系ポリマーを代謝可能な炭素基へと脱重合させる際に使用され、又は脱重合させる際に有用である。遺伝子操作型酵素組成物は、好適には、例えば、製造製品の形態である。組成物は、例えば製剤であってよく、及び例えば液体又は固体などの物理形態をとってよい。
【０１２６】
本明細書に記載の遺伝子操作型酵素組成物は、更に場合によりセルラーゼを含み、例えば、少なくとも（１）エンドグルカナーゼ、（２）セロビオヒドロラーゼ、及び（３）β−グルコシダーゼ、から選択される３種の異なる酵素を含む全セルラーゼを含むか、あるいは（１）セルロース系又はヘミセルロース系材料内部のβ−１，４結合の切断を触媒し、より短いグルコオリゴ糖を生成するエンドグルカナーゼ活性、（２）「エキソ」型でのセロビオース単位（例えば、β−１，４グルコース−グルコース二糖）の切断及び生成を触媒するセロビオヒドロラーゼ活性、並びに（３）短鎖セロオリゴ糖（例えば、セロビオース）からのグルコースモノマーの生成を触媒するβ−グルコシダーゼ活性、から選択される少なくとも３種の異なる酵素活性を有する。全セルラーゼは、１種以上のβ−グルコシダーゼポリペプチドに富むものであってよい。特定の実施形態では、全セルラーゼは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧＩＶポリペプチドといったＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドに富むものであってもよい。特定の実施形態では、全セルラーゼは、β−グルコシダーゼポリペプチド、及びＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドに富むものであってよい。本開示の遺伝子操作型酵素組成物は、更に以降の第５．３節で記載する。
【０１２７】
他の態様では、本開示は、リグノセルロース及び／又は発酵性糖を含む組成物を、本明細書に記載の任意の酵素、本明細書に記載の核酸によりコードされるポリペプチド又は本明細書に記載の遺伝子操作型酵素組成物（例えば、製造製品又は製剤）と接触させる工程を含む、バイオマス材料の加工法を提供する。リグノセルロースを含む好適なバイオマス材料は、例えば、農作物、食品又は飼料製造時の副産物、リグノセルロース系廃棄物、植物残渣、又は古紙若しくは古紙製品に由来する。ポリペプチドは、好適には、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及び他のヘミセルラーゼ活性から選択される１種以上の酵素活性を有し得る。好適な植物残渣には、穀類、種子、茎、葉、外皮、トウモロコシの皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、麦わら、草本類、ケーン類、葦、木材、木片、木材パルプ、及びおがくずが含まれ得る。草本類は、例えば、インディアングラス（Indian grass）又はスイッチグラスであってよい。葦は、例えば、暖竹などの多年生のケーン類であってよい。代表的な古紙としては、廃棄された又は使用済みコピー用紙、コンピュータープリンター用紙、ノートブック、メモ帳、タイプライター用紙、新聞紙、雑誌、ダンボール及び紙製包装材が挙げられる。
【０１２８】
本開示は、ヘミセルロース加水分解酵素及びセルロース加水分解酵素と、少なくとも１種のバイオマス材料との混合物を含む組成物（酵素又は遺伝子操作型酵素組成物など、例えば、製造製品又は配合物）を提供する。場合により、バイオマス材料は、農作物に由来するリグノセルロース系材料を含み、あるいは食品又は飼料製造時の副産物である。リグノセルロース系廃棄物、植物残渣、古紙又は古紙製品も好適なバイオマス材料になる場合があり、すなわち好適なバイオマス材料は植物残渣を含むものである。例えば、植物残渣は、穀類、種子、茎、葉、外皮、トウモロコシの皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、草本類、麦わら、葦、木材、木片、木材パルプ、又はおがくずを含むものであってよい。代表的な草本類としては、限定するものではないが、インディアングラス又はスイッチグラスが挙げられる。代表的な葦としては、限定するものではないが、暖竹などの特定の多年生ケーン類が挙げられる。代表的な古紙としては、限定するものではないが、廃棄された又は使用済みコピー用紙、コンピュータープリンター用紙、ノートブック紙、メモ帳、タイプライター用紙、新聞紙、雑誌、ダンボール及び紙製包装材が挙げられる。
【０１２９】
したがって、本開示はヘミセルロース系材料を加水分解し、酵素機能による好適なバイオマス基質の発酵性糖質への変換を触媒するのに有用な組成物（酵素又は遺伝子操作型酵素組成物など、例えば、製造製品又は配合物）を提供する。本開示は、このような組成物を製造する方法、並びに研究環境、工業環境又は商業環境でこのような組成物を用いる若しくは適用する方法も提供する。
【０１３０】
本明細書に引用される、出願日以降の現在公的に入手可能な全ての情報、例えば、公報、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列、及びＡＴＣＣ受入番号は、参照により本明細書に例示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
以下の図表は、例示を意図したものであり、本明細書の開示又は請求項の範囲及び内容を制限するものではない。
【図１Ａ】各種酵素及び配列モチーフに関し本開示で使用される配列番号一覧。
【図１Ｂ】各種酵素及び配列モチーフに関し本開示で使用される配列番号一覧。
【図１Ｃ】各種酵素及び配列モチーフに関し本開示で使用される配列番号一覧。
【図１Ｄ】各種酵素及び配列モチーフに関し本開示で使用される配列番号一覧。
【図２Ａ】ＴｒＥＧｂ（すなわち、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、「ＴｒＥＧ７」とも参照）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋの結晶構造受入番号：ｐｄｂ：２ｖｔｃ）及びＴｔＥＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋの結晶構造受入番号：ｐｄｂ：３ＥＩＩ）の配列アラインメント及び既知の構造により推測されるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の保存残基。
【図２Ｂ】Ｔｒ６Ａ、Ｔｒ７Ａの既知の配列との配列アラインメントにより推測される、ＣＢＭドメインの保存残基。
【図３】サブサイト−１でグルコースと複合体を形成しているＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）Ｂｇｌ３Ｂの結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋの結晶構造受入番号：ｐｄｂ：２Ｘ４１）をもとに予測される、Ｆｖ３Ｃ相同体間で保存される活性部位の残基。
【図４】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａにより産生される発酵ブロスの酵素組成についての表。この組成の測定法は実施例２に記載する。
【図５】実施例２の各サンプルに個々に加えた酵素（精製又は未精製）、及びこれらの酵素の貯蔵タンパク質濃度（stock protein concentrations）についての表。
【図６】実施例４（実験１）でのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の添加チャート。サンプル「＃２７」は、実施例４に記載されるとおりのＨ３Ａ／Ｅｇ４組み込み株である。「サンプル詳細」の下に、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の添加量を、重量％又は質量（Ｇ＋Ｘ  １ｇあたりタンパク質１ｍｇ）のいずれかで掲載した。
【図７Ａ】実施例４（実験２）でのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の別の添加チャート。図６同様にサンプルを説明する。実施例４の実験１（上記）と比較して、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量を少しずつ増量して添加した。
【図７Ｂ】実施例４（実験３）でのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の別の添加チャート。図６及び７Ａ同様にサンプルを説明する。実施例４の実験１及び２（上記）と比較して、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量を更に微量ずつ増量して添加した。
【図８Ａ】実施例１５に示すとおりの、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２混合物の組成。
【図８Ｂ−１】各種酵素組成物を使用した場合のグルカン変換率（％）。実験条件については実施例１５に記載する。
【図８Ｂ−２】各種酵素組成物を使用した場合のグルカン変換率（％）。実験条件については実施例１５に記載する。
【図９】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から、実施例６に従ってＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物により生成されたキシロース収率（％）。
【図１０】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から、実施例６に従ってＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物により生成されたグルコース収率（％）。
【図１１】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から、実施例６に従ってＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物により生成された総発酵性モノマー収率（％）。
【図１２】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４不含有の酵素組成物による加水分解で生成されるグルコース量と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を０．５３ｍｇ／ｇ含有させた酵素組成物による加水分解で生成されるグルコース量との比較。実験は実施例７に記載する。
【図１３】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）、Ｆｖ３Ｃ、Ｆｖ３Ｄ及びＰａ３Ｃといった数多くのβ−グルコシダーゼ相同体のβ−グルコシダーゼ活性を示す表。セロビオース及びＣＮＰＧ基質のいずれもに対する活性を、実施例１８に記載のとおりに測定した。
【図１４】実施例１９で試験した酵素混合物／組成物中の酵素の相対重量を示す表。
【図１５】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する酵素組成物の効果を比較する表。実験の詳細は実施例２１に記載する。
【図１６Ａ】Ｆｖ３Ａヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図１６Ｂ】Ｆｖ３Ａアミノ酸配列（配列番号２）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図１７Ａ】Ｐｆ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図１７Ｂ】Ｐｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号４）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載し、予測炭水化物結合モジュール（「ＣＢＭ」）は大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭを分離する予測リンカーをイタリック体で記載する。
【図１８Ａ】Ｆｖ４３Ｅヌクレオチド配列（配列番号５）。
【図１８Ｂ】Ｆｖ４３Ｅアミノ酸配列（配列番号６）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図１９Ａ】Ｆｖ３９Ａヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１９Ｂ】ｖ３９Ａアミノ酸配列（配列番号８）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図２０Ａ】Ｆｖ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図２０Ｂ】Ｆｖ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１０）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載し、予測ＣＢＭは大文字で記載し、保存ドメイン及びＣＢＭを分離する予測リンカーはイタリック体で記載する。
【図２１Ａ】Ｆｖ４３Ｂヌクレオチド配列（配列番号１１）。
【図２１Ｂ】Ｆｖ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号１２）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図２２Ａ】Ｐａ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号１３）。
【図２２Ｂ】Ｐａ５１Ａアミノ酸配列（配列番号１４）。予測シグナル配列には下線を付した。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、ゲノムＤＮＡのコドンはＴ．リーゼイ（T. reesei）での発現に最適化させた（図３９Ｂを参照されたい）。
【図２３Ａ】Ｇｚ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号１５）。
【図２３Ｂ】Ｇｚ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１６）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、予測シグナル配列は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号１１７））で置き換えた。
【図２４Ａ】Ｆｏ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号１７）。
【図２４Ｂ】Ｆｏ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１８）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、予測シグナル配列は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号１１７））で置き換えた。
【図２５Ａ】Ａｆ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号１９）。
【図２５Ｂ】Ａｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号２０）。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図２６Ａ】Ｐｆ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号２１）。
【図２６Ｂ】Ｐｆ５１Ａアミノ酸配列（配列番号２２）。予測シグナル配列には下線を付した。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際、予測シグナル配列は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号１１７））で置き換え、かつＴ．リーゼイ（T. reesei）で発現させる際にＰｆ５１Ａヌクレオチド配列のコドンを最適化させた。
【図２７Ａ】ＡｆｕＸｙｎ２ヌクレオチド配列（配列番号２３）。
【図２７Ｂ】ＡｆｕＸｙｎ２アミノ酸配列（配列番号２４）。予測シグナル配列には下線を付した。ＧＨ１１の予測保存ドメインをボールド体で記載する。
【図２８Ａ】ＡｆｕＸｙｎ５ヌクレオチド配列（配列番号２５）。
【図２８Ｂ】ＡｆｕＸｙｎ５アミノ酸配列（配列番号２６）。予測シグナル配列には下線を付した。ＧＨ１１の予測保存ドメインをボールド体で記載する。
【図２９Ａ】Ｆｖ４３Ｄヌクレオチド配列（配列番号２７）。
【図２９Ｂ】Ｆｖ４３Ｄアミノ酸配列（配列番号２８）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図３０Ａ】Ｐｆ４３Ｂヌクレオチド配列（配列番号２９）。
【図３０Ｂ】Ｐｆ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号３０）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図３１Ａ】Ｆｖ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号３１）。
【図３１Ｂ】Ｆｖ５１Ａアミノ酸配列（配列番号３２）。予測シグナル配列には下線を付した。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。
【図３２Ａ】Ｃｇ５１Ｂヌクレオチド配列（配列番号３３）。
【図３２Ｂ】Ｃｇ５１Ｂアミノ酸配列（配列番号３４）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図３３Ａ】Ｆｖ４３Ｃヌクレオチド配列（配列番号３５）。
【図３３Ｂ】Ｆｖ４３Ｃアミノ酸配列（配列番号３６）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図３４Ａ】Ｆｖ３０Ａヌクレオチド配列（配列番号３７）。
【図３４Ｂ】Ｆｖ３０Ａアミノ酸配列（配列番号３８）。予測シグナル配列には下線を付した。
【図３５Ａ】Ｆｖ４３Ｆヌクレオチド配列（配列番号３９）。
【図３５Ｂ】Ｆｖ４３Ｆアミノ酸配列（配列番号４０）。予測シグナル配列には下線を付した。
【図３６Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ヌクレオチド配列（配列番号４１）。
【図３６Ｂ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３アミノ酸配列（配列番号４２）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図３７Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２のアミノ酸配列（配列番号４３）。シグナル配列には下線を付ける。予測保存ドメインはボールド体で記載する。コード配列はＴｏｒｒｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：１４６１〜６５に見ることができる。
【図３７Ｂ】Ｐ．アンセリナ（P. anserina）のＧＨ３酵素であるＰａ３Ｃ（配列番号４４）のアミノ酸配列を示す。
【図３８】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１のアミノ酸配列（配列番号４５）。シグナル配列には下線を付ける。予測保存ドメインはボールド体で記載する。コード配列はＭａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６，６２（１０）：３８４０〜４６に見ることができる。
【図３９Ａ】Ｐａ５１Ａに推定されるｃＤＮＡ（配列番号４６）。
【図３９Ｂ】Ｐａ５１Ａのコドンを最適化したｃＤＮＡ（配列番号４７）。
【図３９Ｃ】Ｇｚ４３Ａの成熟配列をコードしているゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含むコンストラクトのコード配列（配列番号４８）。
【図３９Ｄ】Ｆｏ４３Ａの成熟配列をコードしているゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含むコンストラクトのコード配列（配列番号４９）。
【図３９Ｅ】Ｐｆ５１Ａをコードしている、コドンを最適化したゲノムＤＮＡの上流に、ＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含む、コンストラクトのコード配列（配列番号５０）。
【図４０Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のヌクレオチド配列（配列番号５１）。
【図４０Ｂ】にはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のアミノ酸配列（配列番号５２）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。予測リンカーはイタリック体で記載する。
【図４１Ａ】Ｐａ３Ｄのヌクレオチド配列（配列番号５３）。
【図４１Ｂ】Ｐａ３Ｄのアミノ酸配列（配列番号５４）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４２Ａ】Ｆｖ３Ｇのヌクレオチド配列（配列番号５５）。
【図４２Ｂ】Ｆｖ３Ｇのアミノ酸配列（配列番号５６）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４３Ａ】図４３Ａには、Ｆｖ３Ｄのヌクレオチド配列（配列番号５７）。
【図４３Ｂ】Ｆｖ３Ｄのアミノ酸配列（配列番号５８）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４４Ａ】Ｆｖ３Ｃのヌクレオチド配列（配列番号５９）。
【図４４Ｂ】Ｆｖ３Ｃのアミノ酸配列（配列番号６０）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４５Ａ】Ｔｒ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６１）。
【図４５Ｂ】Ｔｒ３Ａのアミノ酸配列（配列番号６２）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４６Ａ】Ｔｒ３Ｂのヌクレオチド配列（配列番号６３）。
【図４６Ｂ】Ｔｒ３Ｂのアミノ酸配列（配列番号６４）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４７Ａ】コドンを最適化（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させるために）したＴｅ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６５）。
【図４７Ｂ】Ｔｅ３Ａのアミノ酸配列（配列番号６６）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４８Ａ】Ａｎ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６７）。
【図４８Ｂ】Ａｎ３Ａのアミノ酸配列（配列番号６８）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図４９Ａ】Ｆｏ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号６９）。
【図４９Ｂ】Ｆｏ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７０）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図５０Ａ】Ｇｚ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号７１）。
【図５０Ｂ】Ｇｚ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７２）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図５１Ａ】Ｎｈ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号７３）。
【図５１Ｂ】Ｎｈ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７４）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図５２Ａ】Ｖｄ３Ａのヌクレオチド配列（配列番号７５）。
【図５２Ｂ】Ｖｄ３Ａのアミノ酸配列（配列番号７６）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図５３Ａ】Ｐａ３Ｇのヌクレオチド配列（配列番号７７）。
【図５３Ｂ】Ｐａ３Ｇのアミノ酸配列（配列番号７８）。予測シグナル配列には下線を付した。予測保存ドメインはボールド体で記載する。
【図５４】Ｔｎ３Ｂのアミノ酸配列（配列番号７９）。一般的なシグナル予測プログラムＳｉｇｎａｌ  Ｐでは予測シグナル配列は得られなかった。
【図５５Ａ−１】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５５Ａ−２】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５５Ａ−３】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５５Ａ−４】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５５Ａ−５】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５５Ａ−６】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５５Ａ−７】特定のβ−グルコシダーゼ相同体のアミノ酸配列のアラインメント。
【図５６】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４と、ＴｒＥＧｂ（又はＴｒＥＧ７（配列番号８０）及びＴｔＥＧ（配列番号８１）の、アミノ酸配列のアラインメント。
【図５７】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のＣＢＭドメインのＴｒ６Ａ（配列番号８２）及びＴｒ７Ａ（配列番号８３）と、更にＴ．アウランティアカス（T. aurantiacus）の２種類のＧＨ６１／エンドグルカナーゼ（配列番号２０６及び２０７）の、部分的なアミノ酸配列のアラインメント。
【図５８Ａ】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、図５に記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物の添加により糖化した後に生成される、グルコース量。これらの酵素は、実施例２に従いＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに加えた。
【図５８Ｂ】図５に記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物を、実施例２に従ってＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに加え、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を糖化することによるセロビオースの生成。
【図５８Ｃ】図５に記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物を、実施例２に従ってＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに加え、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を糖化することによるキシロビオースの生成。
【図５８Ｄ】図５に記載の各種精製又は未精製酵素を含む酵素組成物を、実施例２に従ってＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに加え、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を糖化することによるキシロースの生成。
【図５９Ａ】実施例３に示すとおりの発現カセットｐＥＧ１−ＥＧ４−ｓｕｃＡ。
【図５９Ｂ】実施例３に示すとおりに発現カセットｐＥＧ１−ＥＧ４−ｓｕｃＡを収容する、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯのプラスミドマップ。
【図６０】実施例３に従いＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現しているＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ形質転換体により生産される酵素を含む酵素組成物による、グルカン／キシランのセロビオース／グルコースへの変換量／割合（％）。
【図６１】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現している形質転換体Ｈ３Ａにより生産される酵素組成物を増量した場合に観察されるグルカン変換率（％）の上昇。実験の詳細は実施例３に記載する。
【図６２Ａ】実施例２３に記載するとおりのｐＥＧ１−Ｆｖ５１Ａ発現カセットを含有しているｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯプラスミドのプラスミドマップ。
【図６２Ｂ】実施例２３に記載するとおりのｃｂｈ１転写終結配列を有するｐＥＧ１−Ｆｖ３Ａを含有しているｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯプラスミドのプラスミドマップ。
【図６２Ｃ】実施例２３に記載するとおりのＰｃｂｈ２−Ｆｖ４３Ｄを含有しているｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯプラスミドのプラスミドマップ。
【図６２Ｄ】実施例２３に記載するとおりのＰｃｂｈ２−Ｆｖ４３Ｄ−ａｌｓマーカー（ｐＳＫ４９）を含有しているｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯプラスミドのプラスミドマップ。
【図６２Ｅ】実施例２３に記載するとおりのＰｃｂｈ２−Ｆｖ４３Ｄ（ｐＳＫ４２）を有するｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯのプラスミドマップ。
【図６２Ｆ】実施例２３に記載するとおりのＦｖ３Ａ配列を含有しているｐＴｒｅｘ６ｇのプラスミドマップ。
【図６２Ｇ】実施例２３に記載するとおりのＦｖ４３Ｄ配列を有するｐＴｒｅｘ６Ｇのプラスミドマップ。
【図６３Ａ】実施例１６に記載する実験に従って、各種酵素組成物を使用してトウモロコシ穂軸を加水分解することによるグルコースの生産。
【図６３Ｂ】実施例１６の記載に従って、各種酵素組成物を使用してトウモロコシ穂軸を加水分解することによるキシロースの生産。
【図６４】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化によるグルコース生成に対し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４が示す効果。Ｘ軸は、酵素組成物サンプルの名称／略称を掲載する。Ｙ軸は、反応混合物中で生成されたグルコース又はキシロース濃度を意味する。実験の詳細は実施例４に記載する。
【図６５】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化によるキシロース生成に対し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４が示す効果。Ｘ軸は、酵素組成物サンプルの名称／略称を掲載する。Ｙ軸は、反応混合物中で生成されたグルコース又はキシロース濃度を意味する。実験の詳細は実施例４に記載する。
【図６６Ａ】実施例４に記載されるとおりの、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化によるグルコース生成に対し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量変化（０．０５ｍｇ／ｇ〜１．０ｍｇ／ｇ）が示す効果。
【図６６Ｂ】実施例４に記載されるとおりの、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化によるグルコース生成に対し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量変化（０．１ｍｇ／ｇ〜０．５ｍｇ／ｇ）が示す効果。
【図６７】実施例５に記載されるとおりの、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉を各種固形分量で糖化させた際のグルコース及びキシロースの生成に対し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４が示す効果。
【図６８】実施例７に記載されるとおりに、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のみを使用し、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を処理した結果生成される、グルコースモノマー。
【図６９】実施例８に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により生産された酵素組成物を、酵素添加量１４ｍｇ／ｇで加えた場合の、各種基質に対する糖化性能及び比較。
【図７０】実施例９に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により生産された酵素組成物を、各種酵素添加量で加えた場合の、酸で前処理したトウモロコシ茎葉に対する糖化性能及び比較。
【図７１】実施例１０に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により生産された酵素組成物の、希アンモニアで前処理したトウモロコシ葉、茎、又は穂軸に対する糖化性能。
【図７２Ａ−１】（左側パネル）糖化を行う際の各種酵素組成物の量。
【図７２Ａ−２】（左側パネル）糖化を行う際の各種酵素組成物の量。
【図７２Ａ−３】（左側パネル）糖化を行う際の各種酵素組成物の量。
【図７２Ｂ−１】（右側パネル）図７２Ａに相当する各種酵素組成物により生成されるグルコース量、グルコース＋セロビオース量、又はキシロース量。実験の詳細は実施例１４に見ることができる。
【図７２Ｂ−２】（右側パネル）図７２Ａに相当する各種酵素組成物により生成されるグルコース量、グルコース＋セロビオース量、又はキシロース量。実験の詳細は実施例１４に見ることができる。
【図７２Ｂ−３】（右側パネル）図７２Ａに相当する各種酵素組成物により生成されるグルコース量、グルコース＋セロビオース量、又はキシロース量。実験の詳細は実施例１４に見ることができる。
【図７３】実施例１１に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により生産される酵素組成物により生成される、グルコース又はキシロース量の観点からの、糖化性能比較。
【図７４】実施例１２に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により生成される酵素組成物を増量させることで、グルカン及びキシラン変換率において生じる変化。
【図７５】実施例１３のＡ節に従って、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を添加することで、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に示される効果。
【図７６】実施例１３のＢ節の、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４によるＣＭＣ加水分解。
【図７７】実施例１３のＣ節の、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４によるセロビオース加水分解。
【図７８】実施例１７に記載のとおりのＦｖ３Ｃ翻訳領域を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター。
【図７９Ａ】実施例１７に記載のとおりの発現ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ。
【図７９Ｂ】実施例１７に記載のとおりにｐＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎコンストラクトｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ｃ。
【図８０】実施例１７に記載のとおりのＦｖ３ＣのゲノムＤＮＡ配列の予測コード領域。
【図８１Ａ】Ｆｖ３ＣのＮ端末のアミノ酸配列。矢印は推定シグナルペプチド切断部位を示す。成熟タンパク質の開始部位には下線を付した。
【図８１Ｂ】実施例１７に従って、注釈した（１）、あるいは選択的な（alternative）（２）の開始コドンからＦｖ３Ｃを発現しているＴ．リーゼイ（T. reesei）形質転換体の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図８２】リン酸膨潤セルロースの５０℃での糖化における全セルラーゼとβ−グルコシダーゼ混合物の性能比較。セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇ／ｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してリン酸膨潤セルロース（０．７％セルロース、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。図中の「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で２時間実施した。サンプルは、実施例１９のＡ節に従って三つ組で試験した。
【図８３】酸で前処理したトウモロコシ葉茎（ＰＣＳ）の５０℃での糖化における全セルラーゼとβ−グルコシダーゼ混合物の性能比較。セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してＰＣＳ（固形分１３％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。サンプルは、実施例１９のＢ節に記載のとおり３つ組で試験した。
【図８４】アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の５０℃での糖化における全セルラーゼとβ−グルコシダーゼ混合物の性能比較。セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを８ｍｇ／ｇのヘミセルラーゼ及び５ｍｇ／ｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用して、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ＋８ｍｇ／ｇヘミセルロース混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。サンプルは、実施例１９のＣ節に記載のとおり３つ組でアッセイした。
【図８５】水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で前処理したトウモロコシ穂軸の５０℃での糖化における、全セルラーゼとβ−グルコシダーゼ混合物の性能比較。セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用して、ＮａＯＨで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分１７％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／全セルラーゼ混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。実施例１９のＤ節に従い、各サンプルは４つ組でアッセイした。
【図８６】希アンモニアで前処理したスイッチグラスの５０℃での糖化における全セルラーゼとβ−グルコシダーゼ混合物の性能比較。セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してスイッチグラス（固形分１７％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／全セルラーゼ混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。各サンプルは、実施例１９のＥ節に従って４つ組でアッセイした。
【図８７】ＡＦＥＸトウモロコシ葉茎の５０℃での糖化における全セルラーゼとβ−グルコシダーゼ混合物の性能比較。セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを５ｍｇ／ｇのβ−グルコシダーゼと混合し、この酵素混合物を使用してＡＦＥＸトウモロコシ葉茎（固形分１４％、ｐＨ  ５．０）を加水分解した。「バックグラウンド」として表記したサンプルの変換率は、β−グルコシダーゼを添加せずに１０ｍｇ／ｇ全セルラーゼ混合物単独を添加した場合に得られた変換率である。反応はマイクロタイタープレートで５０℃で４８時間実施した。各サンプルは、実施例１９のＦ節に従って４つ組でアッセイした。
【図８８】β−グルコシダーゼ対全セルラーゼの比を０〜５０％で変化させた場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％）から得られるグルカン変換率を示すグラフ群。各実験間で酵素投与量は一定に維持した。
【図８８Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１で実施した実験についてのグラフ。
【図８８Ｂ】Ｆｖ３Ｃで実施した実験についてのグラフ。
【図８８Ｃ】Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）で実施した実験についてのグラフ。実験の詳細は本明細書において実施例２０に見ることができる。
【図８９】実施例２１に従って、３種の異なる酵素組成物をグルカン１ｇあたり２．５〜４０ｍｇの投与量で投与した場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２０％）から得られるグルカン変換率。△は、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  １５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔキシラナーゼについて観察されるグルカン変換率を示し、◇は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ由来の全セルラーゼについて観察されるグルカン変換率を示し、◆はＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ由来の７５重量％の全セルラーゼに加え、２５重量％のＦｖ３Ｃを含む酵素組成物について観察されるグルカン変換率を示す。
【図９０Ａ】Ａ．ニガー（A. niger）で発現させる際に使用した実施例２２に記載のとおりのｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃ発現プラスミドマップ。
【図９０Ｂ】実施例２に記載のとおりのｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１−９４３／９４２プラスミド。
【図９０Ｃ】実施例２に記載のとおりのｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２ベクター。
【図９０Ｄ】実施例２に記載のとおりのｐＥＮＴＲ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３プラスミド。
【図９０Ｅ】実施例２に記載のとおりのｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３発現ベクター。
【図９０Ｆ】実施例２に記載のとおりのｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａプラスミド。
【図９０Ｇ】実施例２に記載のとおりのｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａ発現ベクター。
【図９０Ｈ】実施例２に記載のとおりのＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄプラスミド。
【図９０Ｉ】実施例２に記載のとおりのＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａプラスミド。
【図９１】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−キシロシダーゼ及びＦｖ３Ａ間のアミノ酸アラインメント。
【図９２】特定のＧＨ３９  β−キシロシダーゼのアミノ酸配列のアラインメント。ボールド体に下線を付された残基は、予測一般酸−塩基触媒残基（上記アラインメントでは「Ａ」を付した）、及び求核触媒残基（上記アラインメントでは「Ｎ」を付した）である。２つの配列の下側に下線を付された通常フォントの残基は、各３Ｄ構造の活性部位において、基質と４Å以内のものである（各ｐｄｂ：１ｕｈｖ及び２ｂｓ９）。Ｆｖ３９Ａ配列において下線を付した残基は、活性部位において結合している基質と４Å以内のものであると予測される。
【図９３Ａ】ＧＨ４３ファミリーに属する特定の加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。このファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線を付し、ボールド体で記載した。
【図９３Ｂ】ＧＨ４３ファミリーに属する特定の加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。このファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線を付し、ボールド体で記載した。
【図９４】特定のＧＨ５１ファミリー酵素のアミノ酸配列のアラインメント。このファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線を付し、ボールド体で記載した。
【図９５Ａ】特定のＧＨ１０ファミリーキシラナーゼのアラインメント。ボールド体で記載し下線を付した残基は、触媒性求核残基である（アラインメント上部に「Ｎ」と示す）。
【図９５Ｂ】特定のＧＨ１１ファミリーキシラナーゼのアラインメント。ボールド体で記載し下線を付した残基は、触媒性求核残基であり、一般的な酸塩基性残基である（それぞれアラインメント上部に「Ｎ」及び「Ａ」と示す）。
【図９６Ａ】ＧＨ３ファミリーに属する数多くの加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。このファミリーのメンバー間で高度に保存されているアミノ酸残基には下線を付し、ボールド体で記載した。
【図９６Ｂ】ＧＨ３ファミリーに属する数多くの加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。このファミリーのメンバー間で高度に保存されているアミノ酸残基には下線を付し、ボールド体で記載した。
【図９７】フザリウム（Fusarium）ＧＨ３０ファミリーに属する２種の代表的な加水分解酵素のアミノ酸配列のアラインメント。このファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基には下線を付し、ボールド体で記載した。
【図９８】ＧＨ６１エンドグルカナーゼのアミノ酸配列モチーフ。
【図９９Ａ】Ｆｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３キメラ／融合ポリペプチドをコードしている遺伝子の概略図。
【図９９Ｂ−１】融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３をコードしているヌクレオチド配列（配列番号９２）。
【図９９Ｂ−２】融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３をコードしているヌクレオチド配列（配列番号９２）。
【図９９Ｃ】融合／キメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３をコードしているアミノ酸配列（配列番号９３）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３由来の配列をボールド体で記載する。実験の詳細は実施例２３に記載する。
【図１００】実施例２３に記載のとおりのｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合プラスミドマップ。
【図１０１Ａ】Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３キメラをコードしているヌクレオチド配列（配列番号９２）。
【図１０１Ｂ】Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３キメラをコードしているアミノ酸配列（配列番号９５）。
【図１０２Ａ】例えば、変異体（variants）、変異体（mutants）、又はこれらの融合／キメラポリペプチドなどを含む、β−グルコシダーゼポリペプチドの好適なアミノ酸配列モチーフを掲載する表。
【図１０２Ｂ】β−グルコシダーゼのハイブリッド／キメラポリペプチドを設計するのに使用したアミノ酸配列モチーフを掲載している表。
【図１０３Ａ】ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−ＦＡＢ（すなわち、Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３キメラ）融合プラスミドを掲載する表。
【図１０３Ｂ】ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−Ｐｃｂｈ２−ｘｙｎ３−ｃｂｈ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒプラスミド。
【図１０３Ｃ】ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ／Ｐｅｇｌ１−Ｅｇｌ４−ｓｕｃプラスミド。実験の詳細は実施例２３に見ることができる。
【図１０４】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する形質転換体の糖化性能及び比較。実施例２３に従って、キシラン及びグルカン変換率の良好な株を選択し、更に特性評価した。
【図１０５Ａ】第１の角度から見て、Ｆｖ３Ｃ及びＴｅ３Ａ、並びにＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１を３Ｄで重ねあわせ、「挿入１」の構造が見えるようレンダリングして示す。
【図１０５Ｂ】同様に第２の角度から見て構造を重ねあわせ、「挿入２」の構造が見えるようレンダリングして示す。
【図１０５Ｃ】同様に第３の角度から見て構造を重ねあわせ、「挿入３」の構造が見えるようレンダリングして示す。
【図１０５Ｄ】同様に第４の角度から見て構造を重ねあわせ、「挿入４」の構造が見えるようレンダリングして示す。
【図１０５Ｅ−１】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｑ１２７１５＿ＴＲＩ）、Ｔｅ３Ａ（ＡＢＧ２＿Ｔ＿ｅｍｅ）、及びＦｖ３Ｃ（ＦＶ３Ｃ）の配列アラインメント。挿入１〜４は、全てループ様構造。
【図１０５Ｅ−２】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｑ１２７１５＿ＴＲＩ）、Ｔｅ３Ａ（ＡＢＧ２＿Ｔ＿ｅｍｅ）、及びＦｖ３Ｃ（ＦＶ３Ｃ）の配列アラインメント。挿入１〜４は、全てループ様構造。
【図１０５Ｆ】Ｆｖ３Ｃ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の一部の構造を重ねあわせて示す。各残基Ｗ５９／Ｗ３３及びＷ３５５／Ｗ３２５（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）間で保存されている相互作用を示す。
【図１０５Ｇ】Ｆｖ３Ｃ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の一部の構造を重ねあわせて示す。第１残基対：Ｓ５７／３１及びＮ２９１／２６１（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）；並びに第２残基群：Ｙ５５／２９、Ｐ７７５／７２９及びＡ７７８／７３２（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）で保存されている相互作用を示す。
【図１０５Ｈ】Ｆｖ３Ｃ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の一部の構造を重ねあわせて示す。Ｆｖ３ＣのＫ１６２と「挿入２」中の骨格酸素原子Ｖ４０９との水素結合相互作用は、Ｔｅ３Ａでは保存されているものの、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１では観察されなかった。
【図１０５Ｉ（ａ）】Ｆｖ３Ｃ、Ｔｅ３Ａ及び配列番号９５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ間で共有されており、配列番号２０１で保存されているグリコシル化部位。（ａ）には、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）を重ねあわせて同様の領域を示す；（ｂ）には、配列番号９５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）を重ねあわせて同様の領域を示す。黒色の矢印によりＴｅ３Ａ中の「挿入３」のループ構造を示す（配列番号９５のハイブリッドβ−グルコシダーゼ中にも存在する）。このループ構造はグリコシル化グリカンを包埋しているようである。
【図１０５Ｉ（ｂ）】Ｆｖ３Ｃ、Ｔｅ３Ａ及び配列番号９５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ間で共有されており、配列番号２０１で保存されているグリコシル化部位。（ａ）には、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）を重ねあわせて同様の領域を示す；（ｂ）には、配列番号９５のキメラ／ハイブリッドβ−グルコシダーゼ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）を重ねあわせて同様の領域を示す。黒色の矢印によりＴｅ３Ａ中の「挿入３」のループ構造を示す（配列番号９５のハイブリッドβ−グルコシダーゼ中にも存在する）。このループ構造はグリコシル化グリカンを包埋しているようである。
【図１０５Ｊ】Ｆｖ３Ｃ（明灰色）、Ｔｅ３Ａ（暗灰色）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（黒色）の構造を一部重ねあわせて示す。残基Ｗ３８６／３５５と、Ｆｖ３Ｃ及びＴｅ３Ａの「挿入２」の残基Ｗ９５／６８（Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ）との相互作用において保存されている相互作用を示す。相互作用はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１には存在していない。
【図１０６Ａ】実施例２４に記載のとおりの酵素組成物の代表的なＵＰＬＣ分析。
【図１０６Ｂ】同様の実施例に記載の酵素組成物に含まれる酵素成分の測定量を掲載する表。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
従来、酵素は、基質特異性及び反応産物により分類されてきた。プレゲノム時代では、酵素を比較する際、機能は最も適した（かつおそらく最も有用な）基準であると見なされ、各種酵素活性についてのアッセイが長年にわたって広く開発され、お馴染みのＥＣ分類スキームが誕生した。２つの糖残基間（又は、ニトロフェノール−グリコシド誘導体に生じるものなどのように、糖及び非糖残基間）のグリコシド結合に対し作用する、セルラーゼ及びその他のグリコシルヒドロラーゼは、この分類スキーム下ではＥＣ  ３．２．１．−として命名され、名前の最後に記される数字により、切断させる結合の正確な種類が示される。例えば、このスキームに従うと、エンド型セルラーゼ（１，４−β−エンドグルカナーゼ）は、ＥＣ  ３．２．１．４と表記される。多様なゲノム配列決定プロジェクトの出現に伴い、配列決定データをもとに、関係する遺伝子とタンパク質とを解析及び比較することが容易になってきている。更に、糖残基に作用し得る酵素（すなわち、カルボヒドラーゼ）が数多く結晶化され、その３次元構造が明らかにされている。このような解析から、関係する配列を有しており、アミノ酸配列に基づき予測することのできる３次元構造が保存されている、各酵素のファミリーが同定されている。更に、同様の又は類似する３次元構造を有する酵素は、異なる反応を触媒する場合であってさえも、加水分解の際に同様の又は類似の立体特異性を示すことが明らかになっている（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９８，４２５（２）：３５２〜４；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，１９９９，Ｔ．Ｋｉｍｕｒａ．Ｔｏｋｙｏ，Ｕｎｉ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｃｏ：１５〜２３．）。これらの発見がもととなって、配列に基づくカルボヒドラーゼモジュールの分類がなされており、この分類は、インターネットデータベースの形態（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅサーバー（ＣＡＺｙ））で、ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用することができる（カルボヒドラーゼ活性酵素：データベースアプローチに組み込まれる。Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３３−３８を参照されたい）。
【０１３３】
ＣＡＺｙは、触媒される反応の種類に基づきカルボヒドラーゼを識別することのできる、４つの主要な分類：グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ’ｓ）、糖転移酵素（ＧＴ’ｓ）、多糖除去付加酵素（ＰＬ’ｓ）、及び糖エステラーゼ（ＣＥ’ｓ）を定義している。本開示の酵素は、グリコシルヒドロラーゼである。ＧＨ’ｓは、２つの糖間の、又は糖と非糖残基との間のグリコシド結合を加水分解する酵素群である。配列類似性によりグリコシルヒドロラーゼをグループ分けする分類系では、８５を超える異なるファミリーが定義されている。この分類はＣＡＺｙウェブサイトで利用できる。
【０１３４】
本開示の酵素は、特にグリコシルヒドロラーゼファミリー３、１０、１１、３０、３９、４３、５１、及び／又は６１に属する。
【０１３５】
グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）の酵素としては、例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；ｅｘｏ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；及びβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２３）が挙げられる。例えば、ＧＨ３酵素は、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ、グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ、セロデキストリナーゼ、ｅｘｏ−１，３−１，４−グルカナーゼ、及び／又はβ−ガラクトシダーゼの活性を有する酵素であってよい。一般的に、ＧＨ３酵素は球状タンパク質であり、２つ以上のサブドメインからなる。β−グルコシダーゼでは、第３ペプチドのＮ末端に位置するアスパラギン酸残基が触媒残基として同定されており、この残基はアミノ酸フラグメントＳＤＷ内部に位置している（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：８３５〜８４０）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）由来のＢｇｌ１に相当する配列は、Ｔ２６６Ｄ２６７Ｗ２６８（開始位置のメチオニンから計数）であり、触媒残基のアスパラギン酸残基としてはＤ２６７を備える。試験されたＧＨ３  β−キシロシダーゼでは、ヒドロキシル／アスパルテート配列も保存されている。例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１で相当する配列はＳ３１０Ｄ３１１であり、かつＦｖ３Ａで相当する配列はＳ２９０Ｄ２９１である。
【０１３６】
グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）又はβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性を有する。Ｔ．サッカロリチカム（T. saccharolyticum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ３６９０６）及びＧ．ｓ．ステアロサーモフィルス（G. s stearothermophilus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＺＦＭ２）由来の２種のＧＨ３９  β−キシロシダーゼの三次元構造は解明されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４，３３５（１）：１５５〜６５、及びＣｚｊｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，３５３（４）：８３８〜４６を参照されたい）。これらの酵素において高度に保存されている領域のうち大部分はＮ端末領域に位置しており、Ｎ端末領域は、第４番目（酸／塩基）及び第７番目の（求核）のβ鎖のＣ末端に２つの重要な活性部位を備える古典的な（α／β）８  ＴＩＭバレルフォールドを有する。Ｆｖ３９Ａの残基Ｅ１６８及びＥ２７２は、それぞれＦｖ３９Ａを有するＴ．サッカロリチカム（T. saccharolyticum）及びＧ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）由来のＧＨ３９β−キシロシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基触媒及び求核触媒として機能するものと予測される。
【０１３７】
グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素としては、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）；ｅｎｄｏ−アラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）；及び／又はガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４５）が挙げられる。例えば、ＧＨ４３酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、ｅｎｄｏ−アラビナナーゼ活性、及び／又はガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ活性を有し得る。ＧＨ４３ファミリー酵素は、５枚羽のβ−プロペラ構造を示す。プロペラ様構造は、４本鎖からなる一般的なβ−シートが５回繰り返し折り畳まれ形成される羽からなる。一般塩基のｐＫａを調節する、一般塩基触媒のアスパラギン酸、一般酸触媒のグルタミン酸及びアスパラギン酸が、Ｃ．ジャポニクス（C. japonicus）ＣｊＡｂｎ４３Ａの結晶構造により同定されており、かつ部位特異的変異導入により確認されている（Ｎｕｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００２，９（９）６６５〜８を参照されたい）。触媒残基は、アミノ酸配列中に広範囲に広がる３つの保存ブロックに配置される（Ｐｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，５４：４２４〜４３２）。ＧＨ４３ファミリーの複数種の酵素を、バイオマスの加水分解に有用な活性について試験した。図９３の配列中で予測触媒残基をボールド体で示し、下線を付した。Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophylus）キシロシダーゼ（Ｂｒｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２００６，３５９：９７〜１０９）の結晶構造によると、この酵素と基質との結合にはその他のいくつかの残基も重要であることが示唆される。バイオマスの加水分解について試験したＧＨ４３ファミリー酵素は異なる基質選択性を有していたため、これらの残基は図９３に整列させた配列において完全に保存されているわけではない。しかしながら試験したキシロシダーゼ間では、疎水性相互作用又は水素結合のいずれかを介する基質結合に寄与する残基が複数保存されており、これらについては図９３において一重下線を付して示す。
【０１３８】
グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）及び／又はエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）活性を有する。Ｇ．ｓ．ステアロサーモフィルス（G. s stearothermophilus）Ｔ−６由来のＧＨ５１  Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの高解像度の結晶構造解析により、この酵素が六量体であり、各モノマーが２つのドメイン：８バレル（β／α）と、ジェリーロール様のトポロジーを持つ１２−ストランドのβサンドウィッチを形成していることが示される（Ｈｏｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２００３，２２（１９）：４９２２〜４９３２を参照されたい）。触媒残基は酸性であり、及びファミリー内の酵素配列間で保存されているものと予測することができる。Ｆｖ５１Ａ、Ｐｆ５１Ａ及びＰａ５１Ａのアミノ酸配列を、より配列が異なるＧＨ５１酵素と整列させたところ、８つの酸性残基が保存されていた。これらを図９４にボールド体で示し、下線を付す。
【０１３９】
グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）酵素も８バレル（β／α）構造を有する。この酵素は、一般的に酸／塩基の触媒する工程において、少なくとも１つの酸性触媒残基を使用するという機序を保有しており、エンド型の様式で加水分解を行う（Ｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９（１０）：９５９７〜９６０５）。活性部位において基質を結合している、Ｐ．シンプリシシマム（P. simplicissimum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ５６５８８）、及びＴ．アウランティアカス（T. aurantiacus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２３３６０）のＧＨ１０キシラナーゼの結晶構造が判明している（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，３８：２４０３〜２４１２；及びＬｏ  Ｌｅｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１，５０９：３０３〜３０８を参照されたい）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の、基質に結合し触媒作用を行う際に重要となる残基は、Ｐ．シンプリシシマム（P. simplicissimum）、及びＴ．アウランティアカス（T. aurantiacus）由来の上記ＧＨ１０キシラナーゼの配列とのアラインメントにより得ることができる（図９５Ａ）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の残基Ｅ２８２は、求核性触媒残基であるものと予測されるのに対し、残基Ｅ９１、Ｎ９２、Ｋ９５、Ｑ９７、Ｓ９８、Ｈ１２８、Ｗ１３２、Ｑ１３５、Ｎ１７５、Ｅ１７６、Ｙ２１９、Ｑ２５２、Ｈ２５４、Ｗ３１２及び／又はＷ３２０は、基質の結合及び／又は触媒に関与するものと予測される。
【０１４０】
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「ＧＨ１１」）酵素は、βジェリーロール構造を有する。この酵素は、一般的に酸／塩基触媒工程において少なくとも１種の酸性触媒残基を使用する、関係する機序により、エンド型の様式で加水分解を行う。構造内に分布するいくつかの他の残基は、構造内の、加水分解により切断されるキシロースモノマー対に隣接するキシロース単位の安定化に寄与する。３つのＧＨ１１ファミリーエンドキシラナーゼを試験した。これらの配列のアラインメントを図９５Ｂに示す。Ｅ１１８（又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２の成熟配列ではＥ８６）及びＥ２０９（又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２の成熟配列ではＥ１７７）は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２において、それぞれ求核性の触媒残基及び一般／酸塩基性残基として同定されている（Ｈａｖｕｋａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，３５：９６１７〜２４を参照されたい）。
【０１４１】
グリコシドヒドロラーゼファミリー３０（「ＧＨ３０」）酵素は、グリコシルセラミダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４５）；β−１，６−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）；β−グルコシダーゼ（３．２．１．２１）活性を有する酵素を包含する。ＧＨ３０の結晶構造は、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．により、ゴーシェ病に関係するヒトβグルコセレブロシダーゼのものが最初に明らかにされた（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９０；２５（６）３８５−４１４）。ＧＨ３０は、β鎖のＣ末端の第４番目（酸／塩基触媒残基）及び第７番目（求核触媒残基）に位置する２つの重要なグルタミン酸活性部位を備える、（α／β）８  ＴＩＭバレル様の折りたたみを有する（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９２（１５）：７０９０〜４，１９９５；Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８６：１６４７，２０１０）。１４種類のＧＨ３０タンパク質の全てをアラインメントさせたところ（１３種は微生物由来のタンパク質であり、１種は真菌のバイオスポラ（Biospora）由来のエンド−ｂ−キシラナーゼ（受入番号ＡＤＧ６２３６９）である）、アラインメントさせた１４種類のタンパク質においてＦｖ３０Ａのグルタメート１６２が保存されており、１０種類ではＦｖ３０Ａのグルタメート２５０が保存されていた。中程度に保存されている他の酸性残基も存在していたが、それ以外のものは広範には保存されていなかった。
【０１４２】
グリコシドヒドロラーゼ６１（「ＧＨ６１」）酵素は真核生物で同定されている。Ｈ．ジェコリナ（H. jecorina）のＣｅｌ６１Ａには、弱いエンドグルカナーゼ活性が観察されている（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１，２６８（２４）：６４９８〜６５０７）。ＧＨ６１ポリペプチドは、セルラーゼによるリグノセルロース系基質の酵素加水分解を増強する（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１５），３３０５〜１６）。キチン分解に関与する内在性ポリペプチドに対する研究により、ＧＨ６１ポリペプチドは、電子供与基質を必要とするものであり二価の金属イオンが関与する、酸化的加水分解機序を採用するものと予測されている（Ｖａａｊｅ−Ｋｏｌｓｔａｄ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０（６００１），２１９〜２２）。この予測は、ＧＨ６１ポリペプチドは、リグノセルロース系基質の分解時に二価のイオンに依存して相乗効果を示すという観察結果と一致する（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１５），３３０５〜１６）。加えて、利用可能な構造を持つＧＨ６１ポリペプチドは、完全に保存されている多くのアミノ酸残基により二価の原子と結合している（Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８３（１），１４４〜５４；Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１５），３３０５〜１６）。ＧＨ６１ポリペプチドは、保存残基により形成されかつ基質の結合に関与するものと考えられる金属結合部位において、平坦な表面を有する（Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８３（１），１４４〜５４）。
【０１４３】
本明細書において、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸について使用するとき、用語「単離」は、それぞれ、核酸に関係する天然資源中に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を指す。更に、「単離核酸」は、天然には断片として生じず、天然環境では見出されない、核酸断片を包含することを意図する。ポリペプチドについて使用するとき、用語「単離」は、他の細胞タンパク質から単離されている単離物又は精製されている単離物、及び組み換えポリペプチドを指す。用語「単離」は、組み換えＤＮＡ法により生産させた際の細胞成分、ウイルス成分又は培養培地を実質的に含まない、核酸又はペプチドも指す。本明細書で使用するとき、用語「単離」は、化合した際の化学的な前駆体又は他の化合物を実質的に含まない、核酸又はペプチドも指す。
【０１４４】
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びにＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）を、本発明に使用される多くの用語に関し一般的な辞書として、当業者に提供する。本明細書に記載のものと同様の、又は本明細書に記載のものに相当する任意の方法及び材料を、本開示を実施又は試験するために使用できるが、好ましい方法及び材料が記載される。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。本発明は、記述されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更し得るものであることが理解されるべきである。
【０１４５】
本開示で提供される表題は本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられるものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。
【０１４６】
本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、提供されるポリペプチドをコードしているヌクレオチド、提供されるヌクレオチドを含有しているベクター、並びに提供されるヌクレオチド及び／又はベクターを含有している細胞、を含む組成物を提供する。本開示は、バイオマス材料を加水分解する方法及び／又は提供された組成物を用いバイオマス混合物の粘度を低下させる方法、も提供する。
【０１４７】
本明細書で使用するとき、ポリペプチドＸの「変異体（variant）」は、１箇所以上のアミノ酸残基が変更されているポリペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は保存的又は非保存的な変更を有し得る。生物活性に影響を及ぼさずに、置換、挿入又は欠失させるアミノ酸残基を決定する際の指針は、当該技術分野において周知のコンピュータ・プログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用い見つけることができる。本発明の変異体は、酵素前駆体のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が変更されているポリペプチドを包含し、酵素変異体は、酵素前駆体がもつセルロース分解特性を保持しつつ、例えば、酵素前駆体と比較して、至適ｐＨの上昇又は下降、酸化安定性の増大又は低下；熱安定性の増大又は低下、及び１種以上の基質に対する非活性の増大及び減少を示すなど、一部の特定の点で特性が変更されていてよい。
【０１４８】
ポリヌクレオチド配列についての文脈で使用する際、用語「変異体（variant）」は、遺伝子又はこれらのコード配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、又は「多型」変異体も包含される。スプライス変異体は、参照ポリヌクレオチドと非常に高い同一性を有するものの、一般的に、ｍＲＮＡのプロセシング時のエキソンの選択的スプライシングに起因し、残基数が多くなっているか、又は少なくなっている。対応するポリペプチドは、更なる機能ドメインを保有していたり、あるいはドメインを欠損していたりする。種変異体は、ポリヌクレオチド配列が種によって異なる変異体である。得られるポリペプチドは、一般的に、互いに非常に高いアミノ酸同一性を有する。多型変異体は、所与のそれぞれの種間で、ポリヌクレオチド配列の特定の遺伝子において生じる、偏差である。
【０１４９】
本明細書で使用するとき、ポリペプチドＸの「変異体（mutant）」は、１種以上のアミノ酸残基に対し、アミノ酸置換が生じているものの、天然の酵素活性（すなわち、特定の加水分解反応を触媒する能力）を保持しているポリペプチドを指す。そのため、ポリペプチドＸ変異体は、本明細書で用語が定義されるとおり、特定の種類のポリペプチドＸを構成する。ポリペプチドＸ変異体は、ポリペプチドのネイティブな又は野生型アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を置換することで作成できる。一部の態様では、本発明は、酵素前駆体のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が変更されているポリペプチドを包含し、酵素変異体は、酵素前駆体がもつセルロース分解特性又はヘミセルロース分解特性を保持しつつ、例えば、酵素前駆体と比較して、至適ｐＨの上昇又は下降、酸化安定性の増大又は低下；熱安定性の増大又は低下、及び１種以上の基質に対する非活性の増大及び減少を示すなど、一部の特定の点で特性が変更されていてよい。生物活性に影響を及ぼさずに、置換、挿入又は欠失させるアミノ酸残基を決定する際の指針は、当該技術分野において周知のコンピュータ・プログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用い見つけることができる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。アミノ酸置換は、ポリペプチドの糖質結合ドメイン（ＣＢＭｓ）、ポリペプチドの触媒ドメイン（ＣＤ）、並びに／又はＣＢＭ及びＣＤのいずれもに局在させることができる。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【０１５０】
本明細書で使用するとき、宿主細胞に対し「異種性」のポリペプチド又は核酸とは、宿主細胞において天然には生じないポリペプチド又は核酸を指す。
【０１５１】
本明細書において値又はパラメータに付く「約」には、その値又はパラメータ自体を目的とする変動を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載には、「Ｘ」についての記載を含む。
【０１５２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。
【０１５３】
本明細書に記載の方法及び組成物の態様及び変形には、態様及び変形「からなる」及び／又は「から本質的になる」ものが含まれることは理解される。用語「含む（comprising）」は、「からなる（consisting）」又は「から本質的になる（consisting essentially）」よりも幅広い。
【０１５４】
本明細書で使用するとき、用語「操作可能に連結された」は、選択されたＤＮＡの発現を制御するために、選択したヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードしている）を制御配列（例えば、プロモーター）に近接させていることを意味する。例えば、プロモーターは、転写及び翻訳の向きの観点から、選択されたヌクレオチド配列の上流に位置する。「操作可能に連結された」は、適切な分子（例えば、転写活性化因子）が制御配列に結合した際に、遺伝子発現が可能になるような様式で、ヌクレオチド配列及び制御配列が連結されていることを意味する。
【０１５５】
本明細書で使用するとき、用語「厳密度の低い条件下、中程度に厳密な条件下、厳密度の高い条件下、又は厳密度の非常に高い条件下」は、ハイブリッド形成及び洗浄についての条件を示す。ハイブリッド形成を実施する際の指針は、現行のプロトコル「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６）」に見出すことができる。文献には、水を使用する方法及び使用しない方法が記載されており、これらのいずれをも使用することができる。本明細書で参照する具体的なハイブリダイゼーション条件は次のとおりのものである。１）厳密度の低いハイブリダイゼーション条件：約４５℃下で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で行った後、少なくとも５０℃下で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で２回洗浄（厳密度の低いハイブリダイゼーション条件では、洗浄温度は５５℃にまで上昇させることができる）；２）厳密度が中程度のハイブリダイゼーション条件：約４５℃下で６Ｘ  ＳＳＣ中で行った後、６０℃下で、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で１回以上洗浄；３）厳密度の高いハイブリダイゼーション条件：約４５℃下で６Ｘ  ＳＳＣ中で行った後、６５℃下で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで１回以上洗浄；及び好ましくは４）厳密度の非常に高いハイブリダイゼーション条件：６５℃下で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳ中で行った後、６５℃下で０．２  ＸＳＳＣ、１％  ＳＤＳ中で１回以上洗浄する。（４）「厳密度の非常に高い条件」は、別途記載のない限り好ましい条件である。
【０１５６】
５．１  本開示のポリペプチド
本開示は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００）残基の領域にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列の、単離、合成又は組み換えポリペプチドを提供する。単離、合成、又は組み換えポリペプチドはβ−グルコシダーゼ活性を有し得る。特定の実施形態では、単離、合成、又は組み換えポリペプチドは、β−グルコシダーゼポリペプチドであり、例えば、β−グルコシダーゼポリペプチドの変異体（variants）、変異体（mutants）、及び融合／ハイブリッド／キメラ体を包含する。特定の実施形態では、本開示は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるハイブリッド／キメラ体である、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを提供し、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち第１の配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００個分）の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分）の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうちの１種以上を含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、第１の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ／ハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ／ハイブリッドポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、第１の配列のＣ末端残基と第２の配列のＮ末端残基とが連結されている。例えば、第１の配列は第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されている。あるいは、第１の配列は第２の配列の直後に隣接しておらず、第１及び第２の配列はリンカードメインを介して連結されている。特定の実施形態では、第１の配列、第２の配列、又は第１の配列及び第２の配列の両方には、１箇所以上にグリコシル化部位を含ませることができる。一部の実施形態では、第１又は第２の配列は、ループ配列又はループ様の構造をコードしている配列を含む。特定の実��形態では、ループ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでありアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。特定の実施形態では、第１の及び第２の配列はいずれもループ配列を含まず、むしろ第１の及び第２の配列を連結しているリンカードメインがループ配列を含む。β−グルコシダーゼポリペプチドのハイブリッド／キメラポリペプチドは、第１の配列、第２の配列又はリンカードメイン配列の各々が由来する、対応するβ−グルコシダーゼポリペプチドと比較して、向上した安定性を有する。一部の実施形態では、安定性の向上とは、標準的な保存条件下での保存時あるいは標準条件下での発現及び／又は生産時のタンパク質の切断（例えば、ループ配列中の残基又はループ配列の外側の残基の切断）に対するタンパク質の安定性又は抵抗性が向上していることを意味する。
【０１５７】
特定の態様では、本開示は、β−グルコシダーゼの単離、合成、組み換えポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド体であり、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含み、それに対し少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個分）の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。本開示は、β−グルコシダーゼ活性を有する単離、合成、組み換えポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイブリッド体であり、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％同一性を有する配列を含み、それに対し少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９の相当する長さの配列と少なくとも約６０％同一性を有する配列を含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、第１の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ又はハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ又はハイブリッドポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、第１の配列のＣ末端残基と第２の配列のＮ末端残基とが連結されており、例えば、第１の配列は第２の配列と隣接して又は直接連結されている。あるいは、第１の配列は第２の配列と隣接しておらず、第１の配列及び第２の配列はリンカードメインを介して連結されている。第１の配列、第２の配列、又は第１の配列及び第２の配列の両方には、１箇所以上にグリコシル化部位を含ませることができる。第１又は第２の配列には、ループ配列を含ませてよく、あるいは第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含むループ様の構造をコードする配列を含ませてよい。特定の実施形態では、第１の及び第２の配列はいずれもループ配列を含まず、むしろ第１の及び第２の配列を連結しているリンカードメインがループ配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドのハイブリッド／キメラポリペプチドは、第１の配列、第２の配列又はリンカードメイン配列の各々が由来する、対応するβ−グルコシダーゼポリペプチドと比較して、向上した安定性を有する。一部の実施形態では、安定性の向上とは、タンパク質の安定性が向上することを意味し、これにより、融合／キメラポリペプチドは、標準的な保存条件下での保存時、あるいは標準的な発現／生産条件下での発現及び／又は生産時の、ループ配列中の残基での、又はループ配列の外側の残基又は位置でのタンパク質の切断を受けにくくなる。
【０１５８】
特定の態様では、本開示は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列に由来するβ−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドを提供し、第１の配列はＦｖ３Ｃに由来し、かつ少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、第２の配列はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（又は「Ｔｒ３Ｂ」）に由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さである。一部の実施形態では、例えば、第１の配列が第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されているなど、第１の配列のＣ末端は第２の配列のＮ末端と連結される。あるいは、第１の配列は、リンカードメイン配列を介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１又は第２の配列のいずれもがループ配列を含み、このループ配列は第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。特定の実施形態では、第１の及び第２の配列を連結しているリンカードメインは、ループ配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は、Ｔｅ３Ａに由来する。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドは、各キメラ部位の由来する、対応するβ−グルコシダーゼポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｔｅ３Ａ、及び／又はＴｒ３Ｂ）と比較して向上された安定性を有する。一部の実施形態では、安定性の向上とは、タンパク質の安定性が向上することを意味し、これにより、融合／キメラポリペプチドは、標準的な保存条件下での保存時、あるいは標準的な発現／生産条件下での発現及び／又は生産時の、ループ配列中の残基での、又はループ配列の外側の残基又は位置でのタンパク質の切断を受けにくくなる。例えば、融合／キメラポリペプチドは、ループ配列のＣ末端上流の残基での切断を、例えば、キメラ及びＦｖ３Ｃポリペプチドを整列させた場合にＦｖ３Ｃポリペプチドの同じ部位にある残基と比較して受けにくい。
【０１５９】
本開示は、β−グルコシダーゼ活性を有し、かつ配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離、合成又は組み換えポリペプチドも提供する。
【０１６０】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列の少なくとも約１０（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００）残基にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列の、単離、合成又は組み換えポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、単離、合成、又は組み換えポリペプチドは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する。一部の実施形態では、本開示は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個分）の長さであり、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１つ以上を含む、単離、合成又は組み換えポリペプチドも提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４といった好適な微生物由来のＥＧ  ＩＶポリペプチドなどの、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドである。一部の実施形態では、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４由来の変異体（variant）、変異体（mutant）、又は融合ポリペプチドである（例えば、ポリペプチドは、配列番号５２と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する）。
【０１６１】
一部の態様では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５のうちのいずれか１つのポリペプチドと、少なくとも約１０残基、例えば、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、若しくは３５０残基残基にわたって、又は未熟なポリペプチド、成熟ポリペプチド、触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％）同一性を有する単離、合成、組み換えポリペプチドも提供する。
【０１６２】
特定の態様では、本開示は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、単離、合成又は組み換えヌクレオチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００個分）の長さである、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含む第１の配列、及び少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分）の長さである、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含む第２の配列、を含む、β−グルコシダーゼ活性を有する融合／キメラポリペプチドをコードする。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。特定の実施形態では、第１の配列のＣ末端残基と第２の配列のＮ末端残基とが連結されている。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含んでよく、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来する、リンカードメインを介して連結される。
【０１６３】
特定の態様では、本開示は、β−グルコシダーゼポリペプチドをコードしているの単離、合成又は組み換えヌクレオチドを提供し、このヌクレオチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド体であり、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含むものであり、それに対し第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個分）の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含むものである。本開示は、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドも提供し、このヌクレオチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド又は融合体であり、第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）であり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含むものであり、それに対し第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個分）の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含むものである。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、β−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドのＮ端末に位置する第１のアミノ酸配列と、β−グルコシダーゼのキ���ラ／融合ポリペプチドのＣ末端に位置する第２のアミノ酸配列とをコードし、第１の配列のＣ末端は、第２の配列のＮ末端と連結されている。あるいは、第１の配列は、リンカードメイン配列を介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列又はリンカードメインは、ループ様の構造を示す配列を含むアミノ酸配列を含みループ様の構造は、第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０１６４】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２又は９４のうちのいずれか１つの配列又は少なくとも約３００残基（例えば、少なくとも約３００、４００、５００、又は６００残基）の長さのこれらの断片と、少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する、単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本開示は、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、厳密度の高い条件下、厳密度の非常に高い条件下で、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２又は９４のいずれか１つの配列、これらの少なくとも約３００残基分の長さの断片、あるいはこれらの相補鎖とハイブリッド形成し得る単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。
【０１６５】
本開示は、特定の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有し、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００）残基にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有するポリペプチドをコードしている、単離、合成、又は組み換えヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、本開示は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個分）の長さであり、（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１種以上を含むポリペプチドをコードしている単離、合成又は組み換えヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする（例えば、限定するものではないが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などの、好適な生物に由来するＥＧ  ＩＶ型ポリペプチド）。
【０１６６】
一部の態様では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５のうちのいずれか１つのポリペプチドと、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、若しくは３５０残基の領域にわたって、又は未熟なポリペプチド、成熟ポリペプチド、触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％））同一性を有するポリペプチドをコードしている、単離、合成、又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。一部の態様では、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のいずれか１つと、又は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００残基の長さのこれらの断片と、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％））同一性を有する単離、合成、又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、厳密度の高い条件下、又は厳密度の非常に高い条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のいずれか１つの配列、又はこれらの断片若しくは下位配列とハイブリッド形成する単離、合成、又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。
【０１６７】
本明細書に記載の任意のアミノ酸配列は、特定（specified）のアミノ酸配列の各Ｃ−及び／又はＮ端末に隣接した少なくとも１個、例えば、少なくとも２、３、５、１０、又は２０個の異種アミノ酸と共に、あるいはこのようなアミノ酸と複合させて製造することができ、及び／あるいは本開示の酵素のＣ末端及び／又はＮ端末のから少なくとも１個、例えば、少なくとも２、３、５、１０、又は２０個のアミノ酸を欠失させて製造することができる。
【０１６８】
他の変形も同様に本開示の範囲内のものである。例えば、１種以上のアミノ酸残基を改変させて、酵素のｐＩを上昇させても低下させても良い。ｐＩ値の変更は、グルタメート残基を除去するか、又はこの残基の他のアミノ酸残基で置き換えることでなすことができる。
【０１６９】
本開示は、具体的には、例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ（又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１）、Ｔｒ３Ｂ（又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３）、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、及びＴｎ３Ｂポリペプチドなどのβ−グルコシダーゼポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、β−グルコシダーゼの融合／キメラ体であり、上記のβ−グルコシダーゼポリペプチド（変異体（variants）又は変異体（mutants）を含む）のいずれかに由来する２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む。例えば、β−グルコシダーゼポリペプチドは、Ｔｒ３Ｂの一部に操作可能に連結されているＦｖ３Ｃ部位を含むキメラ／融合ポリペプチドである。例えば、β−グルコシダーゼポリペプチドはキメラ／融合ポリペプチドであり、このポリペプチドは、Ｆｖ３ＣのＮ端末配列から連続的に延びる少なくとも約２００残基を含む第１領域、ループ配列を含むリンカードメインを含み、ループ配列が約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１残基分の長さであり、Ｔｅ３Ａに由来する配列（例えば、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む）を含む、第２領域、並びにＴｒ３ＢのＣ端末配列に由来する連続的に延びる少なくとも約５０残基を含む第３領域、を含む。
【０１７０】
本開示は、更に、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（「ＴｒＥＧ４」とも呼ばれる）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７（「ＴｒＥＧ７」又は「ＴｒＥＧｂ」とも呼ばれる）、ＴｔＥＧなどの、数多くのＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本発明のＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドは、少なくとも１００残基の長さであり、（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１種以上を含む。
【０１７１】
本開示は、例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１などの、多様なセルラーゼポリペプチド及びヘミセルラーゼポリペプチドを提供する。
【０１７２】
これらの酵素を１種以上（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、又は更には６種以上）組み合わせたものが、本発明の遺伝子操作型酵素組成物中に適切に存在しており、酵素のうちの少なくとも２種は異なる生物資源に由来する。本発明の遺伝子操作型酵素組成物中の酵素のうちの少なくとも１種以上は、組成物中のタンパク質の合計重量に対し、天然に生じる組成物の場合の割合（重量％）とは異なる割合（重量％）で適切に存在し、例えば、酵素のうちの少なくとも１種は過剰発現又は低発現させることができる。
【０１７３】
Ｆｖ３Ａ：Ｆｖ３Ａ（配列番号２）のアミノ酸配列を図１６Ｂ及び９１に示す。配列番号２は、未成熟なＦｖ３Ａ配列である。Ｆｖ３Ａは配列番号２の残基１〜２３に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号２の残基２４〜７６６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１６Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、ヘミセルロース由来の分岐アラビノキシランオリゴマー、又は希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基がＤ２９１であったのに対し、フランキング残基Ｓ２９０及びＣ２９２は基質結合に関与するものと予測された。Ｅ１７５及びＥ２１３は他の酵素ＧＨ３及びＧＨ３９間で保存されており、触媒機能を有するものと予測される。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３Ａポリペプチド」は、配列番号２の残基２４〜７６６間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＦｖ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ａと比較したときに、残基Ｄ２９１、Ｓ２９０、Ｃ２９２、Ｅ１７５、及びＥ２１３において変更が存在しない。好ましくは、Ｆｖ３Ａポリペプチドは、図９１のアラインメントに示すとおり、Ｆｖ３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ａポリペプチドは、好適には、図１６Ｂに示すようなネイティブなＦｖ３Ａの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明のＦｖ３Ａポリペプチドはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２の残基（ｉ）２４〜７６６、（ｉｉ）７３〜３２１、（ｉｉｉ）７３〜３９４、（ｉｖ）３９５〜６２２、（ｖ）２４〜６２２、又は（ｖｉ）７３〜６２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。
【０１７４】
Ｐｆ４３Ａ：Ｐｆ４３Ａ（配列番号４）のアミノ酸配列を図１７Ｂ及び９３に示す。配列番号４は、未成熟なＰｆ４３Ａ配列である。Ｐｆ４３Ａは配列番号４の残基１〜２０に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号４の残基２１〜４４５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図１７Ｂ中、予測保存ドメインはボールド体で記載し、予測ＣＢＭは大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭを分離する予測リンカーはイタリック体で記載する。Ｐｆ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、又はアンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３２又はＤ６０のいずれか、Ｄ１４５、及びＥ２０６が挙げられる。図９３において、Ｃ末端中で下線を付して示される領域が予測ＣＢＭである。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号４の残基２１〜４４５間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＰｆ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＰｆ４３Ａと比較したときに残基Ｄ３２又はＤ６０、Ｄ１４５、及びＥ２０６において変更はなされていない。好ましくは、Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、Ｐｆ４３Ａファミリーのタンパク質間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、又は８種全てのアミノ酸配列間で保存されていることが判明しているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、次のドメイン：図１７Ｂに示すとおりＰｆ４３Ａの（１）予測ＣＢＭ、（２）予測保存ドメイン、及び（３）リンカーのうちの２つ以上又は全てを適宜含む本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４の残基（ｉ）２１〜４４５、（ｉｉ）２１〜３０１、（ｉｉｉ）２１〜３２３、（ｉｖ）２１〜４４４、（ｖ）３０２〜４４４、（ｖｉ）３０２〜４４５、（ｖｉｉ）３２４〜４４４、又は（ｖｉｉｉ）３２４〜４４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好適なポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。
【０１７５】
Ｆｖ４３Ｅ：Ｆｖ４３Ｅ（配列番号６）のアミノ酸配列を図１８Ｂ及び９３に示す。配列番号６は、未成熟なＦｖ４３Ｅ配列である。Ｆｖ４３Ｅは配列番号６の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号６の残基１９〜５３０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１８Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｅは、例えば、基質として４−ニトフェニル（nitophenyl）−β−Ｄ−キシロピラノシド、キシロビオース、及び混合物、直鎖キシロオリゴマー、又はアンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基と、Ｄ４０又はＤ７１のいずれか、Ｄ１５５、及びＥ２４１が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ｅポリペプチド」は、配列番号６の残基１９〜５３０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましいＦｖ４３Ｅポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ｅと比較したときに残基Ｄ４０又はＤ７１、Ｄ１５５、及びＥ２４１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｅ酵素ファミリー間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、又は８種全てのアミノ酸配列間で保存されていることが判明しているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。本発明のＦｖ４３Ｅポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６の残基（ｉ）１９〜５３０、（ｉｉ）２９〜５３０、（ｉｉｉ）１９〜３００若しくは（ｉｖ）２９〜３００に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１７６】
Ｆｖ３９Ａ：Ｆｖ３９Ａ（配列番号８）のアミノ酸配列を図１９Ｂ及び９２に示す。配列番号８は、未成熟なＦｖ３９Ａ配列である。Ｆｖ３９Ａは配列番号８の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号８の残基２０〜４３９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図１９Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ３９Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。Ｆｖ３９Ａの残基Ｅ１６８及びＥ２７２は、それぞれ、Ｆｖ３９Ａを有するＴ．サッカロリエィカム（T. saccharolyticum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ３６９０６）及びＧ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＺＦＭ２）に由来する、上記ＧＨ３９キシロシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性触媒及び求核性触媒として機能するものと予測される。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ３９Ａポリペプチド」は、配列番号８の残基２０〜４３９間の連続するアミノ酸残基の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましいＦｖ３９Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３９Ａと比較したときに、残基Ｅ１６８及びＥ２７２において変更は存在しない。好ましくは、Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、Ｆｖ３９Ａ、並びにＴ．サッカロリティカム（T. saccharolyticum）及びＧ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）由来のキシロシダーゼ（上記を参照のこと）のファミリー又は酵素間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、好適には、図１９Ｂに示すようなネイティブなＦｖ３９Ａの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明のＦｖ３９Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８の残基（ｉ）２０〜４３９、（ｉｉ）２０〜２９１、（ｉｉｉ）１４５〜２９１、若しくは（ｉｖ）１４５〜４３９に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１７７】
Ｆｖ４３Ａ：Ｆｖ４３Ａ（配列番号１０）のアミノ酸配列を図２０Ｂ及び９３に提供する。配列番号１０は、未成熟なＦｖ４３Ａ配列である。Ｆｖ４３Ａは配列番号１０の残基１〜２２に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号１０の残基２３〜４４９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図２０Ｂ中、予測保存ドメインはボールド体で記載し、予測ＣＢＭは大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭを分離する予測リンカーはイタリック体で記載する。Ｆｖ４３Ａは、例えば、基質として４−ニトフェニル（nitophenyl）−β−Ｄ−キシロピラノシド、キシロビオース、直鎖キシロオリゴマーの混合物、ヘミセルロース由来の分岐アラビノキシランオリゴマー、及び／又は希直鎖キシロオリゴマーを用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３４又はＤ６２のいずれか、Ｄ１４８、及びＥ２０９が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１０の残基２３〜４４９間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個のアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ａと比較して、残基Ｄ３４又はＤ６２、Ｄ１４８、及びＥ２０９において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、Ｆｖ４３Ａ酵素ファミリー間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、図２０Ｂに示すネイティブなＦｖ４３Ａの予測ＣＢＭの全長、及び／又はネイティブなＦｖ４３Ａの予測保存ドメインの全長、及び／又はＦｖ４３Ａのリンカーを適切に含む。本発明のＦｖ４５Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０の残基（ｉ）２３〜４４９、（ｉｉ）２３〜３０２、（ｉｉｉ）２３〜３２０、（ｉｖ）２３〜４４８、（ｖ）３０３〜４４８、（ｖｉ）３０３〜４４９、（ｖｉｉ）３２１〜４４８若しくは（ｖｉｉｉ）３２１〜４４９に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１７８】
Ｆｖ４３Ｂ：Ｆｖ４３Ｂ（配列番号１２）のアミノ酸配列を図２１Ｂ及び９３に示す。配列番号１２は、未成熟なＦｖ４３Ｂ配列である。Ｆｖ４３Ｂは配列番号１２の残基１〜１６に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号１２の残基１７〜５７４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図２１Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｂは、例えば、基質として４−ニトフェニル（nitophenyl）−β−Ｄ−キシロピラノシド及びｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる第１酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示された。Ｆｖ４３Ｂは、第２酵素アッセイにおいては、分枝アラビノキシロオリゴマーからのアラビノースの生成を触媒し、かつ他のキシロシダーゼ酵素の存在下では、オリゴマー混合物からキシロースをより多量に生成させるよう触媒することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３８又はＤ６８の（登録商標）いずれか、Ｄ１５１、及びＥ２３６が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ｂポリペプチド」は、配列番号１２の残基１７〜５７４間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ｂと比較して、残基Ｄ３８又はＤ６８、Ｄ１５１、及びＥ２３６において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ酵素ファミリー間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、好適には、図２１Ｂ及び９３に示すようなネイティブなＦｖ４３Ｂの、予測保存ドメインの全長を含む。本発明のＦｖ４３Ｂポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又はβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性のいずれもを有し、配列番号１２のアミノ酸配列又は配列番号１２の残基（ｉ）１７〜５７４、（ｉｉ）２７〜５７４、（ｉｉｉ）１７〜３０３若しくは（ｉｖ）２７〜３０３に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１７９】
Ｐａ５１Ａ：Ｐａ５１Ａ（配列番号１４）のアミノ酸配列を図２２Ｂ及び９４に示す。配列番号１４は、未成熟なＰａ５１Ａ配列である。Ｐａ５１Ａは配列番号１４の残基１〜２０に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号１４の残基２１〜６７６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図２２Ｂでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｐａ５１Ａは、例えば、人工基質のｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド及びｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示された。Ｐａ５１Ａは、分枝アラビノキシロオリゴマーからのアラビノースの生成を触媒し、かつ他のキシロシダーゼ酵素の存在下では、オリゴマー混合物からキシロースをより多量に生成させるよう触媒することが示された。保存されている酸性残基としては、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２５７、Ｅ２９６、Ｅ３４０、Ｅ３７０、Ｅ４８５、及びＥ４９３が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐａ５１Ａポリペプチド」は、配列番号１４の残基２１〜６７６間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００，、又は６５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐａ５１Ａポリペプチドは、ネイティブなＰａ５１Ａと比較して、残基Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２５７、Ｅ２９６、Ｅ３４０、Ｅ３７０、Ｅ４８５及びＥ４９３において変更はなされていない。好ましくは、Ｐａ５１Ａポリペプチドは、Ｐａ５１Ａファミリーの酵素間、及び図９４のアラインメント中に示すとおり、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＰｆ５１Ａなどの酵素群間で保存されているアミノ酸残基の、少なくと７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｐａ５１Ａポリペプチドは、図２２Ｂに示すとおりの、ネイティブなＰａ５１Ａの予測保存ドメインを適切に含む。本発明のＰａ５１Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又はβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性のいずれもを有し、配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１４の残基（ｉ）２１〜６７６、（ｉｉ）２１〜６５２、（ｉｉｉ）４６９〜６５２若しくは（ｉｖ）４６９〜６７６に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８０】
Ｇｚ４３Ａ：Ｇｚ４３Ａ（配列番号１６）のアミノ酸配列を図２３Ｂ及び９３に示す。配列番号１６は、未成熟なＧｚ４３Ａ配列である。Ｇｚ４３Ａは配列番号１６の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号１６の残基１９〜３４０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図２３Ｂ中にボールド体で示す。Ｇｚ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合及び／若しくは直鎖キシロオリゴマーを用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３３又はＤ６８のいずれか、Ｄ１５４、及びＥ２４３が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｇｚ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１６の残基１９〜３４０間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＧｚ４３Ａと比較して、残基Ｄ３３又はＤ６８、Ｄ１５４、及びＥ２４３において変更はなされていない。好ましくは、Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、Ｇｚ４３Ａファミリーの酵素間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、図２３Ｂに示すネイティブなＧｚ４３Ａの予測保存ドメインを適宜含む。本発明のＧｚ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号１６のアミノ酸配列又は配列番号１６の残基（ｉ）１９〜３４０、（ｉｉ）５３〜３４０、（ｉｉｉ）１９〜３８３若しくは（ｉｖ）５３〜３８３に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８１】
Ｆｏ４３Ａ：Ｆｏ４３Ａ（配列番号１８）のアミノ酸配列を図２４Ｂ及び９３に示す。配列番号１８は、未成熟なＦｏ４３Ａ配列である。Ｆｏ４３Ａは配列番号１８の残基１〜２０に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号１８の残基２１〜３４８に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図２４Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｏ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３７又はＤ７２のいずれか、Ｄ１５９、及びＥ２５１が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｏ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１８の残基１８〜３４４間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個のアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｏ４３Ａと比較して、残基Ｄ３７又はＤ７２、Ｄ１５９、及びＥ２５１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、Ｆｏ４３Ａファミリーの酵素間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。本発明のＦｏ４３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号１８の残基（ｉ）２１〜３４１、（ｉｉ）１０７〜３４１、（ｉｉｉ）２１〜３４８、又は（ｉｖ）１０７〜３４８に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８２】
Ａｆ４３Ａ：Ａｆ４３Ａ（配列番号２０）のアミノ酸配列を図２５Ｂ及び９３に示す。配列番号２０は、未成熟なＡｆ４３Ａ配列である。予測保存ドメインを、図２５Ｂ中にボールド体で示す。Ａｆ４３Ａは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる酵素機能アッセイにおいて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。Ａｆ４３Ａは、エンドキシラナーゼの作用を介してヘミセルロースから生成される一連のオリゴマーからアラビノースを生成させるよう触媒することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ２６又はＤ５８のいずれか、Ｄ１３９、及びＥ２２７が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ａｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号２０の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個のアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、ネイティブなＡｆ４３Ａと比較して、残基Ｄ２６又はＤ５８、Ｄ１３９、及びＥ２２７において変更はなされていない。好ましくは、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、Ａｆ４３Ａファミリーの酵素間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、図２５Ｂに示すとおりの、ネイティブなＡｆ４３Ａの予測保存ドメインを適切に含む。本発明のＡｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有し、配列番号２０のアミノ酸配列又は配列番号２０の残基（ｉ）１５〜５５８若しくは（ｉｉ）１５〜２９５に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８３】
Ｐｆ５１Ａ：Ｐｆ５１Ａ（配列番号２２）のアミノ酸配列を図２６Ｂ及び９４に示す。配列番号２２は、未成熟なＰｆ５１Ａ配列である。Ｐｆ５１Ａは配列番号２２の残基１〜２０に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号２２の残基２１〜６４２に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図２６Ｂでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｐｆ５１Ａは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる酵素機能アッセイにおいて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。Ｐｆ５１Ａは、エンドキシラナーゼの作用を介してヘミセルロースから生成される一連のオリゴマーからアラビノースを生成させるよう触媒することが示された。予測される、保存されている酸性残基としては、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２４８、Ｅ２８７、Ｅ３３１、Ｅ３６０、Ｅ４７２、及びＥ４８０が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐｆ５１Ａポリペプチド」は、配列番号２２の残基２１〜６４２間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、ネイティブなＰｆ５１Ａと比較して、残基Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２４８、Ｅ２８７、Ｅ３３１、Ｅ３６０、Ｅ４７２、及びＥ４８０において変更はなされていない。好ましくは、Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、図９４のアラインメントに示すとおり、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及びＦｖ５１Ａ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。本発明のＰｆ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有し、配列番号２２のアミノ酸配列又は配列番号２２の残基（ｉ）２１〜６３２、（ｉｉ）４６１〜６３２、（ｉｉｉ）２１〜６４２若しくは（ｉｖ）４６１〜６４２に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８４】
ＡｆｕＸｙｎ２：ＡｆｕＸｙｎ２（配列番号２４）のアミノ酸配列を図２７Ｂ及び９５Ｂに示す。配列番号２４は、未成熟なＡｆｕＸｙｎ２配列である。この配列は配列番号２４の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号２４の残基１９〜２２８に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインＧＨ１１を、図２７Ｂ中にボールド体で示す。ＡｆｕＸｙｎ２は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で酵素を作用させた場合に、キシロースモノマーの生産を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた触媒残基としては、Ｅ１２４、Ｅ１２９、及びＥ２１５が挙げられる。本明細書で使用するとき、「ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチド」は、一部の態様では、配列番号２４の残基１９〜２２８間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、ネイティブなＡｆｕＸｙｎ２と比較して、残基Ｅ１２４、Ｅ１２９、及びＥ２１５において変更はなされていない。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、図９５Ｂのアラインメントに示すとおり、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、図２７Ｂに示す、ネイティブなＡｆｕＸｙｎ２の予測保存ドメインの全長を適切に含む。本発明のＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１８５】
ＡｆｕＸｙｎ５：ＡｆｕＸｙｎ５（配列番号２６）のアミノ酸配列を図２８Ｂ及び９５Ｂに示す。配列番号２６は、未成熟なＡｆｕＸｙｎ５配列である。ＡｆｕＸｙｎ５は配列番号２６の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号２６の残基２０〜３１３に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインＧＨ１１を、図２８Ｂ中にボールド体で示す。ＡｆｕＸｙｎ５は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で作用させた場合に、キシロースモノマーの生産を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた触媒残基としては、Ｅ１１９、Ｅ１２４、及びＥ２１０が挙げられる。予測ＣＢＭは、セリン、スレオニンに富むアミノ酸長鎖に続いてＣ末端付近に存在し、多数の疎水性残基が存在することを特徴とする。図９５Ｂ中に下線を付してこの領域を示す。本明細書で使用するとき、「ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド」は、配列番号２６の残基２０〜３１３間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は２７５個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、ネイティブなＡｆｕＸｙｎ５と比較して、残基Ｅ１１９、Ｅ１２０、及びＥ２１０において変更はなされていない。ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、図９５Ｂのアラインメントに示すとおり、ＡｆｕＸｙｎ５、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、図２８Ｂに示すネイティブなＡｆｕＸｙｎ５の予測ＣＢＭの全長、及び／又はネイティブなＡｆｕＸｙｎ５の予測保存ドメインの全長（下線部）を適切に含む。本発明のＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１８６】
Ｆｖ４３Ｄ：Ｆｖ４３Ｄ（配列番号２８）のアミノ酸配列を図２９Ｂ及び９３に示す。配列番号２８は、未成熟なＦｖ４３Ｄ配列である。Ｆｖ４３Ｄは配列番号２８の残基１〜２０に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号２８の残基２１〜３５０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図２９Ｂ中にボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｄは、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測触媒残基としては、Ｄ３７又はＤ７２のいずれか、Ｄ１５９、及びＥ２５１が挙げられる。本明細書で使用するとき、「Ｆｖ４３Ｄポリペプチド」は、配列番号２８の残基２１〜３５０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、又は３２０個の残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はこれらの変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、ネイティブなＦｖ４３Ｄと比較して、残基Ｄ３７又はＤ７２、Ｄ１５９、及びＥ２５１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｄファミリーの酵素間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、図２９Ｂに示す、ネイティブなＦｖ４３Ｄの予測ＣＤの全長を適切に含む。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号２８のアミノ酸配列又は配列番号２８の残基（ｉ）２０〜３４１、（ｉｉ）２１〜３５０、（ｉｉｉ）１０７〜３４１若しくは（ｉｖ）１０７〜３５０に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８７】
Ｐｆ４３Ｂ：Ｐｆ４３Ｂ（配列番号３０）のアミノ酸配列を図３０Ｂ及び９３に示す。配列番号３０は、未成熟なＰｆ４３Ｂ配列である。Ｐｆ４３Ｂは配列番号３０の残基１〜２０に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号３０の残基２１〜３２１に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図３０Ｂ中にボールド体で示す。保存ドメイン内の保存酸残基としては、Ｄ３２、Ｄ６１、Ｄ１４８、及びＥ２１２が挙げられる。Ｐｆ４３Ｂは、例えば、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐｆ４３Ｂポリペプチド」は、配列番号３０の残基２１〜３２１間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は２８０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＰｆ４３Ｂと比較して、残基Ｄ３２、Ｄ６１、Ｄ１４８、及びＥ２１２において変更はなされていない。好ましくは、Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、Ｐｆ４３Ｂファミリーの酵素間、及び図９３のアラインメント中のその他の１、２、３、４、５、６、７、８又は９種全てのアミノ酸配列間で保存されているアミノ酸残基の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％％が未改変である。Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、図３０Ｂに示すとおりの、ネイティブなＰｆ４３Ｂの予測保存ドメインを適切に含む。本発明のＰｆ４３Ｂポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号３０のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８８】
Ｆｖ５１Ａ：Ｆｖ５１Ａ（配列番号３２）のアミノ酸配列を図３１Ｂ及び９４に示す。配列番号３２は、未成熟なＦｖ５１Ａ配列である。Ｆｖ５１Ａは配列番号３２の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号３２の残基２０〜６６０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図３１Ｂでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの予測保存ドメインをボールド体で示す。Ｆｖ５１Ａは、例えば、基質として４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いる酵素機能アッセイにおいて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。Ｆｖ５１Ａは、エンドキシラナーゼの作用を介してヘミセルロースから生成される一連のオリゴマーからアラビノースを生成させるよう触媒することが示された。保存残基としては、Ｅ４２、Ｄ４９、Ｅ２４７、Ｅ２８６、Ｅ３３０、Ｅ３５９、Ｅ４７９、及びＥ４８７が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ５１Ａポリペプチド」は、配列番号３２の残基２０〜６６０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又は６２５個のアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｖ５１Ａと比較して、残基Ｅ４２、Ｄ４９、Ｅ２４７、Ｅ２８６、Ｅ３３０、Ｅ３５９、Ｅ４７９、及びＥ４８７において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、図９４のアラインメントに示すとおり、Ｆｖ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及びＰｆ５１Ａ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、図３１Ｂに示すとおりの、ネイティブなＦｖ５１Ａの予測保存ドメインを適切に含む。本発明のＦｖ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有し、配列番号３２のアミノ酸配列又は配列番号３２の残基（ｉ）２１〜６６０、（ｉｉ）２１〜６４５、（ｉｉｉ）４５０〜６４５若しくは（ｉｖ）４５０〜６６０に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１８９】
Ｘｙｎ３：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３（配列番号４２）のアミノ酸配列を図３６Ｂ及び９５Ａに示す。配列番号４２は、未成熟なＴ．リーゼイＸｙｎ３配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３は配列番号４２の残基１〜１６に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号４２の残基１７〜３４７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図３６Ｂ中にボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で作用させた場合に、キシロースモノマーの生産を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた触媒残基としては、ＧＨ１０ファミリーの別の酵素、すなわちストレプトミセス・ハルステディ（Streptomyces halstedii）由来のＸｙｓ１  δ（Ｃａｎａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｃｔ  Ｃｒｙｓｔａｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．５９：１４４７〜５３）（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３とは３３％の配列同一性を有する）とのアラインメントにより示されるとおり、Ｅ９１、Ｅ１７６、Ｅ１８０、Ｅ１９５、及びＥ２８２が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチド」は、配列番号４２の残基１７〜３４７間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドの残基Ｅ９１、Ｅ１７６、Ｅ１８０、Ｅ１９５、及びＥ２８２は、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３のものから改変されていない。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３及びＸｙｓ１  δ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、好適には、図３６Ｂに示すようなネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の予測保存ドメインの全長を適切に含む。本発明のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１９０】
Ｘｙｎ２：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２（配列番号４３）のアミノ酸配列を図３７及び９５Ｂを示す。配列番号４３は、未成熟なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２は、配列番号４３の残基１〜３３に相当する予測プレプロペプチド配列を有する。残基１６及び１７間の予測シグナル配列が切断されることで、プロペプチドが生成されるものと予測され、このプロペプチドはケキシン様プロテアーゼにより残基３２及び３３間にプロセシングを受け、配列番号４３の残基３３〜２２２に相当する配列を有する成熟タンパク質を生成する。予測保存ドメインを、図３７Ｂ中にボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２は、前処理したバイオマス又は単離ヘミセルロースに、キシロビオシダーゼの存在下で酵素を作用させた場合に、キシロースモノマーの生産を上昇させるよう触媒する能力が観察されたことから、間接的にエンドキシラナーゼ活性を有することを示した。保存されていた酸性残基としては、Ｅ１１８、Ｅ１２３、及びＥ２０９が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチド」は、配列番号４３の残基３３〜２２２間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、又は１７５個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドの残基Ｅ１１８、Ｅ１２３、及びＥ２０９は、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２のものから改変されていない。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、図９５Ｂのアラインメントに示すとおり、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、及びＡｆｕＸｙｎ５間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、図３７に示す、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２の予測保存ドメインの全長を適切に含む。本発明のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【０１９１】
Ｂｘｌ１：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１（配列番号４５）のアミノ酸配列を図３８及び９１に示す。配列番号４５は、未成熟なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１は配列番号４５の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号４５の残基１９〜７９７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインを、図３８中にボールド体で示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１は、例えば、基質としてｐ−ニトフェニル（nitophenyl）−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は直鎖キシロオリゴマーの混合物を用いた酵素機能アッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。保存されていた酸性残基としては、Ｅ１９３、Ｅ２３４及びＤ３１０が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１ポリペプチド」は、配列番号４５の残基１７〜７９７間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１ポリペプチドの残基Ｅ１９３、Ｅ２３４及びＤ３１０は、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１のものから改変されていない。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１ポリペプチドは、図９１のアラインメントに示すとおり、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１及びＦｖ３Ａ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１ポリペプチドは、好適には、図３８に示すようなネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１の予測保存ドメインの全長を適切に含む。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１ポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性を有し、配列番号４５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０１９２】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（配列番号５２）のアミノ酸配列を図４０Ｂ及び５６に示す。配列番号５２は、未成熟なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は配列番号５２の残基１〜２１に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号５２の残基２２〜３４４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測保存ドメインは配列番号５２の残基２２〜２５６及び３０７〜３４３に相当し、後者については糖結合ドメイン（ＣＢＭ）であるものと予測される。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は、例えば、基質としてカルボキシメチルセルロースを用いる酵素アッセイにおいて、エンドグルカナーゼ活性を有することが示されている。既知のエンドグルカナーゼ、例えば、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）由来のエンドグルカナーゼ（受入番号ＡＣＥ１０２３４、本明細書において「ＴｔＥＧ」としても参照する）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）由来のその他のエンドグルカナーゼＥｇ７（受入番号ＡＤＡ２６０４３．１）（本明細書において「ＴｔＥＧ７」又は「ＴｒＥＧｂ」としても参照する）と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（図５６を参照されたい）とのアミノ酸配列のアラインメントによると、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の残基Ｈ２２、Ｈ１０７、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｙ１９５は、金属配位子として機能するものと予測され、残基Ｄ６１及びＧ６３は表面保存残基であると予測され、かつ残基Ｙ２３２は活性に関与するものと予測された。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド」は、配列番号５２の残基２２〜３４４間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの残基Ｈ２２、Ｈ１０７、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｙ１９５、Ｄ６１、Ｇ６３、及びＹ２３２は、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ものから改変されていない。好ましくは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドは、図５６のアラインメントに示すとおり、ＴｒＥＧ７、ＴｔＥＧ及びＴｒＥＧ４間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドは、好適には、図５６に示すようなネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の予測保存ドメインの全長を適切に含む。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドは、好ましくは、エンドグルカナーゼＩＶ（ＥＧＩＶ）活性を有し、配列番号５２のアミノ酸配列又は配列番号５２の残基（ｉ）２２〜２５５、（ｉｉ）２２〜３４３、（ｉｉｉ）３０７〜３４３、（ｉｖ）３０７〜３４４、又は（ｖ）２２〜３４４に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１��０％配列同一性を有する。
【０１９３】
Ｐａ３Ｄ：Ｐａ３Ｄ（配列番号５４）のアミノ酸配列を図４１Ｂ及び５５に示す。配列番号５４は、未成熟なＰａ３Ｄ配列である。Ｐａ３Ｄは配列番号２の残基１〜１７に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号５４の残基１８〜７３３に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。本開示のこの及びその他のポリペプチドに対するシグナル配列予測は、本明細書においてはＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）により行った。図４１Ｂにおいて、予測保存ドメインはボールド体で示す。本開示のこの及びその他のポリペプチドに対するドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースを基に行った。Ｐａ３Ｄの残基Ｅ４６３、及びＤ２６２は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する数多くのＧＨ３ファミリーβグルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐａ３Ｄポリペプチド」は、配列番号５４の残基１８〜７３３間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０又は７００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、ネイティブなＰａ３Ｄと比較して、残基Ｅ４６３及びＤ２６２において変更はなされていない。好ましくは、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｐａ３Ｄポリペプチドは、図４１Ｂに示すネイティブなＰａ３Ｄの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｐａ３Ｄポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号５４のアミノ酸配列又は配列番号５４の残基（ｉ）１８〜２８２、（ｉｉ）１８〜６０１、（ｉｉｉ）１８〜７３３、（ｉｖ）３５６〜６０１、又は（ｖ）３５６〜７３３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００��配列同一性を有する。
【０１９４】
特定の実施形態では、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＰａ３Ｄポリペプチドに由来する。例えば、Ｐａ３Ｄポリペプチドは、Ｐａ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末由来の同じ長さの配列に由来し配列番号５４と少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含むキメラ／融合ポリペプチドであってよい。あるいは、Ｐａ３Ｄキメラ／融合ポリペプチドは、Ｐａ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末由来の同じ長さの配列に由来し配列番号５４と少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含むポリペプチドであってよい。特定の実施形態では、Ｐａ３Ｄキメラ／融合ポリペプチドは、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでありアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含むループ配列を含んでよい。
【０１９５】
Ｆｖ３Ｇ：Ｆｖ３Ｇ（配列番号５６）のアミノ酸配列を図４２Ｂ及び５５に示す。配列番号５６は、未成熟なＦｖ３Ｇ配列である。Ｆｖ３Ｇは配列番号５６の残基１〜２１に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号５６の残基２２〜７８０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。上記のように、シグナル配列の予測は、本開示のその他のポリペプチドに対して行ったとおり、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）を用い行った。予測保存ドメインを、図４２Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、本明細書においてその他のポリペプチドに対して行ったように、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｖ３Ｇの残基Ｅ５０９、及びＤ２７２は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３Ｇポリペプチド」は、配列番号５６の残基２０〜７８０間の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ｇと比較して、残基Ｅ５０９及びＤ２７２において変更はなされていない好ましくは、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、図４２Ｂに示すネイティブなＦｖ３Ｇの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号５６のアミノ酸配列又は配列番号５６の残基（ｉ）２２〜２９２、（ｉｉ）２２〜６２９、（ｉｉｉ）２２〜７８０、（ｉｖ）３７３〜６２９又は（ｖ）３７３〜７８０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％���は１００％配列同一性を有する。
【０１９６】
特定の実施形態では、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドであり、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ配列は、Ｆｖ３Ｇポリペプチドに由来する。例えば、Ｆｖ３Ｇキメラ／融合ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号５６に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよい。例えば、Ｆｖ３Ｇキメラ／融合ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号５６に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよい。特定の実施形態では、Ｆｖ３Ｇポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＦｖ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０１９７】
Ｆｖ３Ｄ：Ｆｖ３Ｄ（配列番号５８）のアミノ酸配列を図４３Ｂ及び５５に示す。配列番号５８は、未成熟なＦｖ３Ｄ配列である。Ｆｖ３Ｄは配列番号５８の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号５８の残基２０〜８１１に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４３Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｖ３Ｄの残基Ｅ５３４、及びＤ３０１は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３Ｄポリペプチド」は、配列番号５８の残基２０〜８１１間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個のアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ｄと比較して、残基Ｅ５３４及びＤ３０１において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、図４３Ｂに示すネイティブなＦｖ３Ｄの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号５８のアミノ酸配列又は配列番号５８の残基（ｉ）２０〜３２１、（ｉｉ）２０〜６５１、（ｉｉｉ）２０〜８１１、（ｉｖ）４２３〜６５１、又は（ｖ）４２３〜８１１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。好適なポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する。
【０１９８】
特定の実施形態では、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドであってよく、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ配列は、Ｆｖ３Ｄポリペプチドに由来する。例えば、Ｆｖ３Ｄキメラ／融合ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号５８に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよい。例えば、Ｆｖ３Ｄキメラ／融合ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号５８に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよい。特定の実施形態では、Ｆｖ３Ｄポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＦｖ３Ｄポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０１９９】
Ｆｖ３Ｃ：Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）のアミノ酸配列を図４４Ｂ及び５５に示す。配列番号６０は、未成熟なＦｖ３Ｃ配列である。Ｆｖ３Ｃは配列番号６０の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号６０の残基２０〜８９９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４４Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｖ３Ｃの残基Ｅ５３６及びＤ３０７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３Ｃポリペプチド」は、配列番号６０の残基２０〜８９９間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個のアミノ酸残基と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、ネイティブなＦｖ３Ｃと比較して、残基Ｅ５３６及びＤ３０７において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、図４４Ｂに示すネイティブなＦｖ３Ｃの予測保存ドメイン全長を適切に含む。本発明のＦｖ３Ｃポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号６０のアミノ酸配列又は配列番号６０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２２〜６００、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜８９９、又は（ｖ）４２８〜６６０に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０２００】
特定の実施形態では、Ｆｖ３Ｃポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドであってよく、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ配列は、Ｆｖ３Ｃポリペプチドに由来する。例えば、Ｆｖ３Ｃキメラ／融合ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号６０に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよい。例えば、Ｆｖ３Ｃキメラ／融合ポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号６０に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよい。特定の実施形態では、Ｆｖ３Ｃキメラ／融合ポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＦｖ３Ｃポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２０１】
Ｔｒ３Ａ：Ｔｒ３Ａ（配列番号６２）のアミノ酸配列を図４５Ｂ及び５５に示す。配列番号６２は、未成熟なＴｒ３Ａ配列である。Ｔｒ３Ａは配列番号６２の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号６２の残基２０〜７４４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４５Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｔｒ３Ａの残基Ｅ４７２、及びＤ２６７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．デフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔｒ３Ａポリペプチド」は、配列番号６２の残基２０〜７４４間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００個の連続するアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔｒ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＴｒ３Ａと比較して、残基Ｅ４７２及びＤ２６７において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｒ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｒ３Ａポリペプチドは、図４５Ｂに示すネイティブなＴｒ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｔｒ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号６２のアミノ酸配列又は配列番号６２の残基（ｉ）２０〜２８７、（ｉｉ）２２〜６１１、（ｉｉｉ）２０〜７４４、（ｉｖ）３６２〜６１１、又は（ｖ）３６２〜７４４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する。
【０２０２】
特定の実施形態では、Ｔｒ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＴｒ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ｔｒ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｒ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号６２に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｔｒ３Ａキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｒ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号６２に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｔｒ３Ａポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＴｒ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２０３】
Ｔｒ３Ｂ：Ｔｒ３Ｂ（配列番号６４）のアミノ酸配列を図４６Ｂ及び５５に示す。配列番号６４は、未成熟なＴｒ３Ｂ配列である。Ｔｒ３Ｂは配列番号６４の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号６４の残基１９〜８７４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４６Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｔｒ３Ｂの残基Ｅ５１６、及びＤ２８７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔｒ３Ｂポリペプチド」は、配列番号６４の残基１９〜８７４間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくはＴｒ３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＴｒ３Ｂと比較して、残基Ｅ５１６及びＤ２８７において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、図４６Ｂに示すネイティブなＴｒ３Ｂの予測保存ドメイン全長を適切に含む。本発明のＴｒ３Ｂポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号６４のアミノ酸配列又は配列番号６４の残基（ｉ）１９〜３０７、（ｉｉ）１９〜６４０、（ｉｉｉ）１９〜８７４、（ｉｖ）４０７〜６４０、又は（ｖ）４０７〜８７４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２０４】
特定の実施形態では、Ｔｒ３Ｂポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＴｒ３Ｂポリペプチドに由来する。例えば、Ｔｒ３Ｂキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｒ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号６４に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｔｒ３Ｂキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｒ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号６４に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｔｒ３Ｂポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＴｒ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２０５】
Ｔｅ３Ａ：Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）のアミノ酸配列を図４７Ｂ及び５５に示す。配列番号６６は、未成熟なＴｅ３Ａ配列である。Ｔｅ３Ａは配列番号６６の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号６６の残基２０〜８５７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４７Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｔｅ３Ａの残基Ｅ５０５、及びＤ２７７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．デフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔｅ３Ａポリペプチド」は、配列番号６６の残基２０〜８５７間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔｅ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＴｅ３Ａと比較して、残基Ｅ５０５及びＤ２７７において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｅ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｅ３Ａポリペプチドは、図４７Ｂに示すネイティブなＴｅ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。本発明のＴｅ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号６６のアミノ酸配列又は配列番号６６の残基（ｉ）２０〜２９７、（ｉｉ）２０〜６２９、（ｉｉｉ）２０〜８５７、（ｉｖ）３９６〜６２９、又は（ｖ）３９６〜８５７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２０６】
特定の実施形態では、Ｔｅ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＴｅ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ｔｅ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｅ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号６２に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｔｅ３Ａキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｅ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号６２に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｔｅ３Ａポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＴｅ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２０７】
Ａｎ３Ａ：Ａｎ３Ａ（配列番号６８）のアミノ酸配列を図４８Ｂ及び５５に示す。配列番号６は、未成熟なＡｎ３Ａ配列である。Ａｎ３Ａは配列番号６８の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号６８の残基２０〜８６０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４８Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ａｎ３Ａの残基Ｅ５０９、及びＤ２７７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ａｎ３Ａポリペプチド」は、配列番号６８の残基２０〜８６０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個のアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくはＡｎ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＡｎ３Ａと比較して、残基Ｅ５０９及びＤ２７７において変更はなされていない。好ましくは、Ａｎ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ａｎ３Ａポリペプチドは、図４８Ｂに示すネイティブなＡｎ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ａｎ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号６８のアミノ酸配列又は配列６８の残基（ｉ）２０〜３００、（ｉｉ）２０〜６３４、（ｉｉｉ）２０〜８６０、（ｉｖ）４００〜６３４、又は（ｖ）４００〜８６０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２０８】
特定の実施形態では、Ａｎ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドであってよく、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ配列は、Ａｎ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ａｎ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドは、Ａｎ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末の同じ長さの配列に由来し、配列番号６８に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ａｎ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドは、Ａｎ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末の同じ長さの配列に由来し、配列番号６８に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ａｎ３Ａ融合／キメラポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＡｎ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２０９】
Ｆｏ３Ａ：Ｆｏ３Ａ（配列番号７０）のアミノ酸配列を図４９Ｂ及び５５に示す。配列番号７０は、未成熟なＦｏ３Ａ配列である。Ｆｏ３Ａは配列番号７０の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号７０の残基２０〜８９９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図４９Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｆｏ３Ａの残基Ｅ５３６及びＤ３０７は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｏ３Ａポリペプチド」は、配列番号７０の残基２０〜８９９間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個のアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｏ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＦｏ３Ａと比較して、残基Ｅ５３６及びＤ３０７において変更はなされていない。好ましくは、Ｆｏ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３  β−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｆｏ３Ａポリペプチドは、図４９Ｂに示すネイティブなＦｏ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｆｏ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号７０のアミノ酸配列又は配列番号７０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜６６０、又は（ｖ）４２８〜８９９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２１０】
特定の実施形態では、Ｆｏ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドであってよく、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ配列は、Ｆｏ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ｆｏ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドは、Ｆｏ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末の同じ長さの配列に由来し、配列番号７０に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｆｏ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドは、Ｆｏ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号７０に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｆｏ３Ａ融合／キメラポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＦｏ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２１１】
Ｇｚ３Ａ：Ｇｚ３Ａ（配列番号７２）のアミノ酸配列を図５０Ｂ及び５５に示す。配列番号７２は、未成熟なＧｚ３Ａ配列である。Ｇｚ３Ａは配列番号７２の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号７２の残基１９〜８８６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図５０Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｇｚ３Ａの残基Ｅ５２３及びＤ２９４は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｇｚ３Ａポリペプチド」は、配列番号７２の残基１９〜８８６間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｇｚ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＧｚ３Ａと比較して、残基Ｅ５３６及びＤ３０７において変更はなされていない。好ましくは、Ｇｚ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｇｚ３Ａポリペプチドは、図５０Ｂに示すネイティブなＧｚ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｇｚ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号７２のアミノ酸配列又は配列番号７２の残基（ｉ）１９〜３１４、（ｉｉ）１９〜６４７、（ｉｉｉ）１９〜８８６、（ｉｖ）４１５〜６４７、又は（ｖ）４１５〜８８６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２１２】
特定の実施形態では、Ｇｚ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＧｚ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ｇｚ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＧｚ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７２に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｇｚ３Ａキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＧｚ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７２に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｇｚ３Ａポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＧｚ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２１３】
Ｎｈ３Ａ：Ｎｈ３Ａ（配列番号７４）のアミノ酸配列を図５１Ｂ及び５５に示す。配列番号７４は、未成熟なＮｈ３Ａ配列である。Ｎｈ３Ａは配列番号７４の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号７４の残基２０〜８８０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図５１Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｎｈ３Ａの残基Ｅ５２３及びＤ２９４は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．デフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｎｈ３Ａポリペプチド」は、配列番号７４の残基２０〜８８０間の連続する少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個のアミノ酸残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｎｈ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＮｈ３Ａと比較して、残基Ｅ５２３及びＤ２９４において変更はなされていない。好ましくは、Ｎｈ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｎｈ３Ａポリペプチドは、図５１Ｂに示すネイティブなＮｈ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。Ｎｈ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号７６のアミノ酸配列又は配列番号７６の残基（ｉ）２０〜２９５、（ｉｉ）２０〜６４７、（ｉｉｉ）２０〜８８０、（ｉｖ）４１４〜６４７、又は（ｖ）４１４〜８８０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２１４】
特定の実施形態では、Ｎｈ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドであってよく、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ配列は、Ｎｈ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ｎｈ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、Ｎｈ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号７４に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよい。例えば、Ｎｈ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、Ｎｈ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末の同じ長さの配列に由来し、かつ配列番号７４に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよい。特定の実施形態では、Ｎｈ３Ａポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＮｈ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２１５】
Ｖｄ３Ａ：Ｖｄ３Ａ（配列番号７６）のアミノ酸配列を図５２Ｂ及び５５に示す。配列番号７６は、未成熟なＶｄ３Ａ配列である。Ｖｄ３Ａは配列番号７６の残基１〜１８に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号７６の残基１９〜８９０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図５２Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｖｄ３Ａは、例えば、ｃＮＰＧ及びセロビオースを用いる酵素アッセイにおいて、並びに希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として加水分解する際に、β−グルコシダーゼ活性を有することが示された。Ｖｄ３Ａの残基Ｅ５２４及びＤ２９５は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｖｄ３Ａポリペプチド」は、配列番号７６の残基１９〜８９０間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、又は８５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｖｄ３Ａポリペプチドは、ネイティブなＶｄ３Ａと比較して、残基Ｅ５２４及びＤ２９５において変更はなされていない。好ましくは、Ｖｄ３Ａポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｖｄ３Ａポリペプチドは、図５２Ｂに示すネイティブなＶｄ３Ａの予測保存ドメイン全長を適切に含む。本発明のＶｄ３Ａポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号７６のアミノ酸配列又は配列番号７６の残基（ｉ）１９〜２９６、（ｉｉ）１９〜６４９、（ｉｉｉ）１９〜８９０、（ｉｖ）４１５〜６４９、又は（ｖ）４１５〜８９０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９��％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２１６】
特定の実施形態では、Ｖｄ３Ａポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＶｄ３Ａポリペプチドに由来する。例えば、Ｖｄ３Ａキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＶｄ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７６に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｖｄ３Ａキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＶｄ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７６に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｖｄ３Ａポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＶｄ３Ａポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２１７】
Ｐａ３Ｇ：Ｐａ３Ｇ（配列番号７８）のアミノ酸配列を図５３Ｂ及び５５に示す。配列番号７８は、未成熟なＰａ３Ｇ配列である。Ｐａ３Ｇは配列番号７８の残基１〜１９に相当する予測シグナル配列を有しており、このシグナル配列が切断されることで配列番号７８の残基２０〜８０５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズムにより行った。予測保存ドメインを、図５３Ｂ中にボールド体で示す。ドメイン予測は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。Ｐａ３Ｇの残基Ｅ５１７及びＤ２８９は、それぞれ、例えば、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．デフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｐａ３Ｇポリペプチド」は、配列番号７８の残基２０〜８０５間の、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐａ３Ｇポリペプチドは、ネイティブなＰａ３Ｇと比較して、残基Ｅ５１７及びＤ２８９において変更はなされていない。好ましくは、Ｐａ３Ｇポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｐａ３Ｇポリペプチドは、図５３Ｂに示すネイティブなＰａ３Ｇの予測保存ドメイン全長を適切に含む。本発明のＰａ３Ｇポリペプチドは、好ましくは、β−グルコシダーゼ活性を有し、配列番号７８のアミノ酸配列又は配列番号７８の残基（ｉ）２０〜３５４、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８０５、（ｉｖ）４４９〜６６０、又は（ｖ）４４９〜８０５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する。
【０２１８】
特定の実施形態では、Ｐａ３Ｇポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＰａ３Ｇポリペプチドに由来する。例えば、Ｐａ３Ｇキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＰａ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７８に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｐａ３Ｇキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＰａ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７８に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｐａ３Ｇポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＰａ３Ｇポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２１９】
Ｔｎ３Ｂ：Ｔｎ３Ｂ（配列番号７９）のアミノ酸配列を図５４及び５５に示す。配列番号７９は、未成熟なＴｎ３Ｂ配列である。ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）では予測シグナル配列は得られなかった。Ｔｎ３Ｂの残基Ｅ４５８及びＤ２４２は、それぞれ、例えば、Ｐ．アンセリア（P. anserina）（受入番号ＸＰ＿００１９１２６８３）、Ｖ．ダフリアエ（V. dahliae）、Ｎ．ハエマトコッカ（N. haematococca）（受入番号ＸＰ＿００３０４５４４３）、Ｇ．ゼアエ（G. zeae）（受入番号ＸＰ＿３８６７８１）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（受入番号ＢＧＬ  ＦＯＸＧ＿０２３４９）、Ａ．ニガー（A. niger）（受入番号ＣＡＫ４８７４０）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）（受入番号ＡＡＬ６９５４８）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＰ５７７５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（受入番号ＡＡＡ１８４７３）、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）、及びＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）（受入番号Ｑ０ＧＣ０７）などに由来する上記ＧＨ３グルコシダーゼの配列アラインメントに基づき、酸塩基性及び求核性触媒として機能するものと予測される（図５５を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語、「Ｔｎ３Ｂポリペプチド」は、配列番号７９の残基少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、ネイティブなＴｎ３Ｂと比較して、残基Ｅ４５８及びＤ２４２において変更はなされていない。好ましくは、Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、図５５のアラインメントに示すとおり、本明細書に記載のＧＨ３ファミリーβ−グルコシダーゼ間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％が未改変である。Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、図５４に示すネイティブなＴｎ３Ｂの予測保存ドメイン全長を適切に含む。本発明のＴｎ３Ｂポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【０２２０】
特定の実施形態では、Ｔｎ３Ｂポリペプチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合又はキメラポリペプチドであってよく、β−グルコシダーゼ配列のうち少なくとも１つはＴｎ３Ｂポリペプチドに由来する。例えば、Ｔｎ３Ｂキメラ／融合ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｎ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体のＮ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７９に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。例えば、Ｔｎ３Ｂキメラ／融合ポリペプチドには、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さのポリペプチドを含んでよく、このポリペプチドはＴｎ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体のＣ端末に由来する同じ長さの配列に由来し、配列番号７９に対し少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｔｎ３Ｂキメラ／融合ポリペプチドは更に、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含み、ループ配列は、同じ長さのＴｎ３Ｂポリペプチド又はこれらの変異体の配列に由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２２１】
したがって、本開示は、下記：
（１）（ｉ）配列番号２の２４〜７６６；（ｉｉ）配列番号２の７３〜３２１；（ｉｉｉ）配列番号２の７３〜３９４；（ｉｖ）配列番号２の３９５〜６２２；（ｖ）配列番号２の２４〜６２２；又は（ｉｖ）配列番号２の７３〜６２２の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２）（ｉ）配列番号４の２１〜４４５；（ｉｉ）配列番号４の２１〜３０１；（ｉｉｉ）配列番号４の２１〜３２３；（ｉｖ）配列番号４の２１〜４４４；（ｖ）配列番号４の３０２〜４４４；（ｖｉ）配列番号４の３０２〜４４５；（ｖｉｉ）配列番号４の３２４〜４４４；又は（ｖｉｉｉ）配列番号４の３２４〜４４５の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（３）（ｉ）配列番号６の１９〜５３０；（ｉｉ）配列番号６の２９〜５３０；（ｉｉｉ）配列番号６の１９〜３００；又は（ｉｖ）配列番号６の２９〜３００の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（４）（ｉ）配列番号８の２０〜４３９；（ｉｉ）配列番号８の２０〜２９１；（ｉｉｉ）配列番号８の１４５〜２９１；又は（ｉｖ）配列番号８の１４５〜４３９の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（５）（ｉ）配列番号１０の２３〜４４９；（ｉｉ）配列番号１０の２３〜３０２；（ｉｉｉ）配列番号１０の２３〜３２０；（ｉｖ）配列番号１０の２３〜４４８；（ｖ）配列番号１０の３０３〜４４８；（ｖｉ）配列番号１０の３０３〜４４９；（ｖｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４８；又は（ｖｉｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４９の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（６）（ｉ）配列番号１２の１７〜５７４；（ｉｉ）配列番号１２の２７〜５７４；（ｉｉｉ）配列番号１２の１７〜３０３；又は（ｉｖ）配列番号１２の２７〜３０３の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（７）（ｉ）配列番号１４の２１〜６７６；（ｉｉ）配列番号１４の２１〜６５２；（ｉｉｉ）配列番号１４の４６９〜６５２；又は（ｉｖ）配列番号１４の４６９〜６７６の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性をいずれも有するポリペプチド；又は
（８）（ｉ）配列番号１６の１９〜３４０；（ｉｉ）配列番号１６の５３〜３４０；（ｉｉｉ）配列番号１６の１９〜３８３；又は（ｉｖ）配列番号１６の５３〜３８３の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（９）（ｉ）配列番号１８の２１〜３４１；（ｉｉ）配列番号１８の１０７〜３４１；（ｉｉｉ）配列番号１８の２１〜３４８；又は（ｉｖ）配列番号１８の１０７〜３４８の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は、
（１０）（ｉ）配列番号２０の１５〜５５８；又は（ｉｉ）配列番号２０の１５〜２９５の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１１）（ｉ）配列番号２２の２１〜６３２；（ｉｉ）配列番号２２の４６１〜６３２；（ｉｉｉ）配列番号２２の２１〜６４２；又は（ｉｖ）配列番号２２の４６１〜６４２の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１２）（ｉ）配列番号２８の２０〜３４１；（ｉｉ）配列番号２８の２１〜３５０；（ｉｉｉ）配列番号２８の１０７〜３４１；又は（ｉｖ）配列番号２８の１０７〜３５０の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は、
（１３）（ｉ）配列番号３２の２１〜６６０；（ｉｉ）配列番号３２の２１〜６４５；（ｉｉｉ）配列番号３２の４５０〜６４５；又は（ｉｖ）配列番号３２の４５０〜６６０の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１４）配列番号５２のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５２の残基（ｉ）２２〜２５５、（ｉｉ）２２〜３４３、（ｉｉｉ）３０７〜３４３、（ｉｖ）３０７〜３４４、若しくは（ｖ）２２〜３４４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１５）配列番号５４のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５４の残基（ｉ）１８〜２８２、（ｉｉ）１８〜６０１、（ｉｉｉ）１８〜７３３、（ｉｖ）３５６〜６０１、若しくは（ｖ）３５６〜７３３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１６）配列番号５６のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５６の残基（ｉ）２２〜２９２、（ｉｉ）２２〜６２９、（ｉｉｉ）２２〜７８０、（ｉｖ）３７３〜６２９、若しくは（ｖ）３７３〜７８０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１７）配列番号５８のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５８の残基（ｉ）２０〜３２１、（ｉｉ）２０〜６５１、（ｉｉｉ）２０〜８１１、（ｉｖ）４２３〜６５１、若しくは（ｖ）４２３〜８１１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１８）配列番号６０のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６０のアミノ酸配列の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２２〜６００、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜８９９、若しくは（ｖ）４２８〜６６０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１９）配列番号６２のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６２の残基（ｉ）２０〜２８７、（ｉｉ）２２〜６１１、（ｉｉｉ）２０〜７４４、（ｉｖ）３６２〜６１１、若しくは（ｖ）３６２〜７４４に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２０）配列番号６４のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６４の残基（ｉ）１９〜３０７、（ｉｉ）１９〜６４０、（ｉｉｉ）１９〜８７４、（ｉｖ）４０７〜６４０、若しくは（ｖ）４０７〜８７４に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２１）配列番号６６のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６６の残基（ｉ）２０〜２９７、（ｉｉ）２０〜６２９、（ｉｉｉ）２０〜８５７、（ｉｖ）３９６〜６２９、若しくは（ｖ）３９６〜８５７に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２２）配列番号６８のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６８の残基（ｉ）２０〜３００、（ｉｉ）２０〜６３４、（ｉｉｉ）２０〜８６０、（ｉｖ）４００〜６３４、若しくは（ｖ）４００〜８６０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２３）配列番号７０のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜６６０、若しくは（ｖ）４２８〜８９９に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２４）配列番号７２のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７２の残基（ｉ）１９〜３１４、（ｉｉ）１９〜６４７、（ｉｉｉ）１９〜８８６、（ｉｖ）４１５〜６４７、若しくは（ｖ）４１５〜８８６に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２５）配列番号７４のアミノ酸配列、又は配列番号７４の残基（ｉ）２０〜２９５、（ｉｉ）２０〜６４７、（ｉｉｉ）２０〜８８０、（ｉｖ）４１４〜６４７若しくは（ｖ）４１４〜８８０少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２６）配列番号７６のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７６の残基（ｉ）１９〜２９６、（ｉｉ）１９〜６４９、（ｉｉｉ）１９〜８９０、（ｉｖ）４１５〜６４９、若しくは（ｖ）４１５〜８９０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２７）配列番号７８のアミノ酸配列、又は配列番号７８の残基（ｉ）２０〜３５４、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８０５、（ｉｖ）４４９〜６６０、若しくは（ｖ）４４９〜８０５に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２８）配列番号７９のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２９）アミノ酸残基少なくとも約１００（例えば、少なくとも約１５０、１７５、２００、２２５、又は２５０）個分の長さであり、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１種以上を含み、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（３０）少なくとも２種以上β−グルコシダーゼ配列を含むポリペプチドであって、第１のβ−グルコシダーゼ配列の長さは少なくとも約２００残基分（例えば、少なくとも約２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、又は４００残基分）であり、かつ配列番号１９７〜２０２のうちの１つ以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列の長さは少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００個分）であり、かつ配列番号２０３を含み、同様に場合により第３のβ−グルコシダーゼ配列、すなわちアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、配列番号６６のループ配列に由来する又はアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）若しくはＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む第３のβ−グルコシダーゼ配列を含み、β−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；のとおりの数多くの単離、合成、又は組み換えポリペプチド又は変異体を提供する。
【０２２２】
本開示は、遺伝子操作型酵素組成物（例えば、セルラーゼ組成物）、又は上記の１つ以上のポリペプチドが濃縮された発酵ブロスも提供する。セルラーゼ組成物は、例えば、糸状菌セルラーゼ組成物（トリコデルマ（Trichoderma）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、又はアスペルギルス（Aspergillus）セルラーゼ組成物など）；酵母セルラーゼ組成物（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）セルラーゼ組成物など）、又はバクテリアセルラーゼ組成物（例えば、枯草菌（Bacillus）セルラーゼ組成物など）であってよい。発酵ブロスは糸状菌の発酵ブロスであってよく、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクルヤ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボーラス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）の発酵ブロスであってよい。特に、発酵ブロスは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）などのトリコデルマ菌種（Trichoderma spp）、又はＰ．フニクロサム（P. funiculosum）などのペニシリウム菌種（Penicillium spp.）のものであってよい。発酵ブロスは、好適には生産後加工工程、例えば、精製、濾過、限外濾過、又は細胞殺傷工程などの多少の処理を行った後で全ブロス製剤に使用することもできる。
【０２２３】
本開示は、上記のポリペプチドを発現するよう遺伝子組み換えを施した宿主細胞も提供する。例えば、宿主細胞は、真菌宿主細胞又はバクテリア宿主細胞であってよい。真菌宿主細胞は、例えば、糸状菌宿主細胞であってよく、トリコデルマ（Trichoderma）、ヒュミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクルヤ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボーラス（Cochliobolus）、ピリクラリア（Pyricularia）、又はクリソスポリウム（Chrysosporium）細胞などであってよい。詳細には、宿主細胞は、例えば、トリコデルマ菌種（Trichoderma spp.）細胞（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）細胞など）、又はペニシリウム（Penicillium）細胞（Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）細胞）、アスペルギルス（Aspergillus）細胞（コウジカビ（A. oryzae）又はＡ．ニデュランス（A. nidulans）細胞など）、又はフザリウム（Fusarium）細胞（Ｆ．バーティシリオイド（F. verticilloides）又はＦ．オキシスポラム（F. oxysporum）細胞など）であってよい。
【０２２４】
５．１．１  融合又はキメラタンパク質
本開示は、典型的には、本開示のタンパク質にとって異種性のものである（すなわち、本開示のタンパク質とは異なる供給源に由来する）１つ以上の融合断片に取り付けた本開示のタンパク質ドメインを含む、融合／キメラタンパク質を提供する。好適な融合／キメラ断片としては、限定するものではないが、タンパク質の安定性を高める、その他の望ましい生物活性を提供する又は望ましい生物活性を高める、及び／又はタンパク質の精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製）を容易にすることのできる断片が挙げられる。好適な融合断片は所望の機能（例えば、安定性、溶解度特性、作用又は生物活性を向上させる；及び／又はタンパク質の生成を簡略化させるなど）を有する任意の大きさのドメインであってよい。融合／ハイブリッドタンパク質は、２つ以上の融合／キメラ断片から構成することができ、各断片又は少なくとも２つの断片は異なる供給源又は微生物に由来する。本開示のタンパク質のドメインのアミノ及び／又はカルボキシ末端に、融合／ハイブリッド断片を組み合わせることもできる。融合断片を切断されやすいものにすることもできる。キメラ断片を切断されやすいものにすることで、例えば、対象とするタンパク質を簡単に回収できるようになる。融合タンパク質は、好ましくは、タンパク質のカルボキシ又はアミノ末端のいずれかに取り付けた融合断片、あるいはタンパク質のカルボキシ及びアミノ末端の両方に取り付けた融合断片、あるいはこれらのドメイン、を包含するタンパク質をコードしている融合核酸を形質移入させた、組み換え細胞を培養することで生産される。
【０２２５】
一部の態様では、本開示は、分類の異なる２種以上の酵素あるいは分類が同じであるか又は類似するものの異なる生物に由来する２種以上の酵素に由来する、２種以上の配列を含むよう遺伝子操作された特定のキメラ／融合タンパク質を提供する。特定の態様では、本開示は、特定の特性が向上するよう、例えば、キメラ／融合ポリペプチドが、望ましい工業用途に（例えば、バイオマス材料の加水分解時に使用する際に）より適したものになるよう遺伝子操作された、特定のキメラ／融合タンパク質又はポリペプチドを提供する。一部の態様では、改良される特性としては、例えば、安定性の改良が挙げられる。安定性の向上は、タンパク質分解耐性の向上に反映され、例えば、標準的な保存条件下での一定期間の保存後に観察されるタンパク質の切断の程度が低減する、好適な発現条件下での発現工程中に宿主細胞によりタンパク質を発現させた後に観察されるタンパク質の切断の程度が軽減する、又は例えば、標準的な生産条件下で、遺伝子操作した宿主細胞により遺伝子組み換え的にタンパク質を生産させた後に観察されるタンパク質の切断の程度が軽減するという点で反映される。
【０２２６】
特定の実施形態では、本開示は、β−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドを提供する。一部の態様では、キメラ／融合β−グルコシダーゼは２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含み、第１の配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含むのに対し、第２の配列は少なくとも約５０（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個）の長さであり、配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。一部の態様では、キメラ／融合β−グルコシダーゼは２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含み、第１の配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含むのに対し、第２の配列は少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個）の長さであり、配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドはβ−グルコシダーゼ活性を有する。一部の実施形態では、第１の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドのＮ末端に位置するのに対し、第２の配列はβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、例えば、第１の配列が第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されているなど、第１の配列のＣ末端は第２の配列のＮ末端と連結される。他の実施形態では、第１の配列は、リンカードメインを��して第２の配列に連結されている。特定の実施形態では、第１の配列、第２の配列、又は第１の配列及び第２の配列の両方には、１箇所以上にグリコシル化部位を含ませることができる。一部の実施形態では、第１又は第２の配列のいずれかはループ配列を含み、あるいは第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来する、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さである、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む、ループ様の構造をコードする配列を含む。特定の実施形態では、第１の及び第２の配列はいずれもループ配列を含まず、むしろ第１の及び第２の配列を連結しているリンカードメインがループ配列を含む。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドの融合／キメラポリペプチドは、第１の配列、第２の配列又はリンカードメイン配列の各々が由来する、対応するβ−グルコシダーゼポリペプチドと比較して、向上した安定性を有する。一部の実施形態では、安定性の向上は、標準的な保存条件下での保存時、あるいは標準的な発現／生産条件下での発現及び／又は生産時の、ループ配列中の残基での、又はループ配列の外側の残基又は位置での、タンパク質の切断を受けにくくするという点で反映される。
【０２２７】
代表的な実施形態では、本開示は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列に由来するβ−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドを提供し、第１の配列はＦｖ３Ｃに由来し、かつ少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、第２の配列はＴｒ３Ｂに由来し、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さである。一部の実施形態では、例えば、第１の配列が第２の配列の直後に隣接して又は直接連結されているなど、第１の配列のＣ末端は第２の配列のＮ末端と連結される。他の実施形態では、第１の配列は、リンカー配列を介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１又は第２の配列のいずれもがループ配列を含み、このループ配列は第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。特定の実施形態では、第１の配列又は第２の配列はいずれもループ配列を含まず、むしろ第１の配列及び第２の配列を連結するリンカー配列が、かかるループ配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は、Ｔｅ３Ａポリペプチドに由来する。一部の実施形態では、β−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドは、各キメラ部位の由来する、対応する各β−グルコシダーゼポリペプチドと比較して向上された安定性を有する。例えば、安定性の向上とは、Ｆｖ３Ｃポリペプチド、Ｔｅ３Ａポリペプチド、及び／又はＴｒ３Ｂポリペプチドに対し向上することを意味する。一部の実施形態では、安定性の向上とは、標準的な保存条件下での保存時、又は標準的な発現／生産条件下での発現／生産時の、ループ配列中の残基での、又はループ配列の外側の残基又は位置での、タンパク質の切断を受けにくくするという点で反映される。例えば、融合／キメラポリペプチドは、ループ配列のＣ末端上流の残基又は位置での切断を、例えば、キメラ及びＦｖ３Ｃポリペプチドを整列させた場合にＦｖ３Ｃポリペプチドの同じ部位にある残基と比較して受けにくい。
【０２２８】
したがって、本開示のタンパク質には、融合遺伝子（例えば、過剰発現させた、可溶性の、活性型組み換えタンパク質）、変異導入遺伝子（例えば、転写及び翻訳が増大するようコドンに変更が加えられた遺伝子）、及びトランケート型遺伝子（例えば、シグナル配列が除去されている、又は異種シグナル配列により置換されている遺伝子）の発現産物も包含する。
【０２２９】
多くの場合、不溶性の基質を利用するグリコシルヒドロラーゼはモジュラー酵素である。これらは通常、１つ以上の非触媒性糖質結合ドメイン（ＣＢＭ）が付加された触媒モジュールからなる。従来、ＣＢＭは、グリコシルヒドロラーゼと、その標的基質の多糖類との相互作用を促進するものであると考えられている。したがって、本開示は、例えば、異種ＣＢＭをスプライシング時に転写させた（“spliced-in”）結果として複数の基質をもつなど、基質特異性に変更が加えられたキメラ酵素を提供する。本開示のキメラ酵素の異種ＣＢＭは、同様に、グリコシルヒドロラーゼと異種又は同種であってよい触媒モジュール又は触媒ドメイン（「ＣＤ」、例えば、活性部位）に取り付けられるようなモジュラーとして設計することもできる。したがって、本開示は、ＣＢＭ／ＣＤモジュールからなる、又はこのモジュールを含む、ペプチド及びポリペプチドを提供し、本モジュールは、相同的に対を形成するか、又は結合してキメラ／異種ＣＢＭ／ＣＤ対を形成する。このキメラポリペプチド／ペプチドを使用して、対象とする酵素の性能を向上又は変更することができる。
【０２３０】
したがって、本開示は、例えば、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する酵素又はポリペプチドの少なくとも１つのＣＢＭを含む、キメラ酵素を提供する。一部の態様では、本開示は、例えば、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する酵素又はポリペプチドの少なくとも１つのＣＢＭを含む、キメラ酵素を提供する。一部の態様では、本開示は、例えば、少なくとも（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される配列モチーフの１種以上を含み、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個分）の長さを有する酵素又はポリペプチドの少なくとも１つのＣＢＭを含む、キメラ酵素を提供する。一部の態様では、本開示は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５のうちのいずれか１つのポリペプチドと、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、若しくは３５０残基にわたって、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％）同一性を有する酵素又はポリペプチドの少なくとも１つのＣＢＭを含む、キメラ酵素を提供する。
【０２３１】
したがって、本開示のポリペプチドは、２種以上の異なるタンパク質に由来する機能ドメインを含む（例えば、あるタンパク質に由来するＣＢＭが、他のタンパク質に由来するＣＤと連結されている）適切な融合タンパク質であってよい。
【０２３２】
本開示のポリペプチドは、「実質的に純粋な」状態で得る及び／又は使用するのに好適である。例えば、本開示のポリペプチドは、所定の組成物に含まれる総タンパク質のうち少なくとも約８０重量％（例えば、少なくとも約８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、又は９９重量％）を構成する。この組成物は、緩衝液又は溶液などのその他の成分も含む。
【０２３３】
同様に、本開示のポリペプチドは、適宜得ることができ、及び／又は培養ブロス（例えば、糸状菌培養ブロス）に使用することができる。培養ブロスは、遺伝子操作型酵素組成物であってもよく、例えば、培養ブロスは、本開示の異種ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された宿主細胞により、又は内在性ポリペプチドの発現レベルをより増大させて又は抑制させて（例えば、内在性ポリペプチドの発現レベルの約１、２、３、４、又は５倍以上の量で、あるいは内在性ポリペプチドの発現量未満の量sで）本開示の内在性ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞により産生させることができる。更に、本発明の培養ブロスは、本開示の複数のポリペプチドを所望の比で発現するよう遺伝子操作を施した、特定の「遺伝子組み換え型」宿主細胞株により生産させることもできる。代表的な望ましい比については、本明細書において、例えば、以下第５．３節において記載する。
【０２３４】
５．２  核酸及び宿主細胞
本開示は、本開示のポリペプチドをコードしている核酸、例えば、上記第５．１節に記載の核酸を提供する。
【０２３５】
一部の態様では、本開示は、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有するβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、単離、合成又は組み換えヌクレオチドは、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列の融合／キメラ体であるβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている。β−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００個分）の長さの第１の配列を含んでよく、かつ配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含んでよい。β−グルコシダーゼのハイッブリッド／キメラポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００個分）の長さの第２のβ−グルコシダーゼ配列を含んでよく、かつ配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうちの１つ以上又は全てを含んでもよい。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。第１のβ−グルコシダーゼ配列のＣ末端は、第２のβ−グルコシダーゼ配列のＮ末端に連結されてもよい。他の実施形態では、第１の及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、リンカー配列を介して連結される。リンカー配列にはアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さのループ配列を含ませることができ、このループ配列は、第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２３６】
特定の態様では、本開示は、β−グルコシダーゼの単離、合成、組み換えポリペプチドをコードしているヌクレオチドを提供し、このポリペプチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイッブリッド体であり、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含み、それに対し少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個分）の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。代替的な実施形態では、本開示は、β−グルコシダーゼポリペプチドをコードしている単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供し、このヌクレオチドは、少なくとも２種（例えば、２、３、又は更には４種）のβ−グルコシダーゼ配列のハイブリッドであり、少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分（例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、又は４００個分）の長さであり、かつ配列番号６０の相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含み、それに対し少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列のうちの第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００個分）の長さであり、かつ配列番号５４、５６、５８、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの相当する長さの配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドは、β−グルコシダーゼ活性を有する融合／キメラβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、かつ２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは第１のアミノ酸配列をコードし、この第１のアミノ酸配列は、β−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドのＮ端末に位置する。一部の実施形態では、ヌクレオチドは第２のアミノ酸配列をコードし、この第１のアミノ酸配列は、β−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドのＣ端末に位置する。第１のアミノ酸配列のＣ末端は、第２のアミノ酸配列のＮ末端に連結されてもよい。他の実施形態では、第１のアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列の直後に隣接しておらず、第１の配列はリンカードメインを介して第２の配列に連結されている。一部の実施形態では、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列又はリンカードメインは、ループ配列を含むアミノ酸配列又はループ様の構造を示す配列を含む。特定の実施形態では、ループ配列は第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）、又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を含む。
【０２３７】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２、又は９４のうちのいずれか１つの配列と、あるいは配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２、又は９４のうちのいずれか１つの配列の少なくとも約３００残基（例えば、少なくとも約３００、４００、５００、又は６００残基）の長さの断片と、少なくとも６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有する単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本開示は、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、厳密度の高い条件下、厳密度の非常に高い条件下で、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、９２又は９４のいずれか１つの配列、これらの少なくとも約３００残基分の長さの断片、あるいはこれらの相補鎖とハイブリッド形成し得る単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。
【０２３８】
一部の態様では、本開示は、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）にわたって、又は触媒ドメイン（ＣＤ）の全長にわたって、又は糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている、単離、合成、又は組み換えヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離、合成、又は組み換えヌクレオチドは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本開示は、少なくともアミノ酸残基約５０個分（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個分）の長さであり、（１）配列番号８４及び８８；（２）配列番号８５及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８及び９０；（９）配列番号８４、８８及び９１；（１０）配列番号８５、８８及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１：並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される配列モチーフのうちの１種以上を含むポリペプチドをコードしている単離、合成又は組み換えヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする（例えば、限定するものではないが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などの、好適な生物に由来するＥＧ  ＩＶ型ポリペプチド）。
【０２３９】
一部の態様では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、及び４５の配列のうちのいずれか１つと、少なくとも約１０残基、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、若しくは３５０残基の領域にわたって、又は未熟なポリペプチド、成熟ポリペプチド、触媒ドメイン（ＣＤ）若しくは糖結合ドメイン（ＣＢＭ）の全長にわたって、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％））配列同一性を有するポリペプチドをコードしている、単離、合成、又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。一部の態様では、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のうちのいずれか１つの配列、又はこれらの断片と、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は完全に（１００％））配列同一性を有する単離、合成、又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。例えば、この断片は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００残基の長さであってよい。一部の実施形態では、本開示は、厳密度の低い条件下、厳密度の中程度の条件下、厳密度の高い条件下、又は厳密度の非常に高い条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、及び４１のいずれか１つの配列、又はこれらの断片若しくは下位配列とハイブリッド形成する単離、合成、又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。
【０２４０】
したがって、本開示は、特に、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｆｖ３Ｃ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、又はＴｎ３Ｂポリペプチド（これらの変異体（variant）、変異体（mutant）、又は融合／キメラ体を含む）をコードしている核酸を提供する。本開示は、Ｆｖ３Ｃの一部及びＴｒ３Ｂの一部を含むキメラ又は融合酵素をコードしている核酸を更に提供する。一部の実施形態では、キメラ又は融合ポリペプチドには、更にリンカードメインを含ませることができ、このリンカードメインは、Ｔｅ３Ａに由来する少なくともアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個からなるループ配列を含む。例えば、本開示は、配列番号９２又は９４と少なくとも約６０％同一性を有する単離ヌクレオチドを提供する。
【０２４１】
例えば、本開示は、単離核酸分子を提供し、本核酸分子は、
（１）（ｉ）配列番号２の２４〜７６６；（ｉｉ）配列番号２の７３〜３２１；（ｉｉｉ）配列番号２の７３〜３９４；（ｉｖ）配列番号２の３９５〜６２２；（ｖ）配列番号２の２４〜６２２；又は（ｉｖ）配列番号２の７３〜６２２；の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２）（ｉ）配列番号４の２１〜４４５；（ｉｉ）配列番号４の２１〜３０１；（ｉｉｉ）配列番号４の２１〜３２３；（ｉｖ）配列番号４の２１〜４４４；（ｖ）配列番号４の３０２〜４４４；（ｖｉ）配列番号４の３０２〜４４５；（ｖｉｉ）配列番号４の３２４〜４４４；又は（ｖｉｉｉ）配列番号４の３２４〜４４５；の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（３）（ｉ）配列番号６の１９〜５３０；（ｉｉ）配列番号６の２９〜５３０；（ｉｉｉ）配列番号６の１９〜３００；又は（ｉｖ）配列番号６の２９〜３００；の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（４）（ｉ）配列番号８の２０〜４３９；（ｉｉ）配列番号８の２０〜２９１；（ｉｉｉ）配列番号８の１４５〜２９１；又は（ｉｖ）配列番号８の１４５〜４３９；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（５）（ｉ）配列番号１０の２３〜４４９；（ｉｉ）配列番号１０の２３〜３０２；（ｉｉｉ）配列番号１０の２３〜３２０；（ｉｖ）配列番号１０の２３〜４４８；（ｖ）配列番号１０の３０３〜４４８；（ｖｉ）配列番号１０の３０３〜４４９；（ｖｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４８；又は（ｖｉｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４９；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（６）（ｉ）配列番号１２の１７〜５７４；（ｉｉ）配列番号１２の２７〜５７４；（ｉｉｉ）配列番号１２の１７〜３０３；又は（ｉｖ）配列番号１２の２７〜３０３；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を両方有する、ポリペプチド；又は
（７）（ｉ）配列番号１４の２１〜６７６；（ｉｉ）配列番号１４の２１〜６５２；（ｉｉｉ）配列番号１４の４６９〜６５２；又は（ｉｖ）配列番号１４の４６９〜６７６；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（８）（ｉ）配列番号１６の１９〜３４０；（ｉｉ）配列番号１６の５３〜３４０；（ｉｉｉ）配列番号１６の１９〜３８３；又は（ｉｖ）配列番号１６の５３〜３８３；の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（９）（ｉ）配列番号１８の２１〜３４１；（ｉｉ）配列番号１８の１０７〜３４１；（ｉｉｉ）配列番号１８の２１〜３４８；又は（ｉｖ）配列番号１８の１０７〜３４８；の位置に相当するアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１０）（ｉ）配列番号２０の１５〜５５８；又は（ｉｉ）配列番号２０の１５〜２９５；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１１）（ｉ）配列番号２２の２１〜６３２；（ｉｉ）配列番号２２の４６１〜６３２；（ｉｉｉ）配列番号２２の２１〜６４２；又は（ｉｖ）配列番号２２の４６１〜６４２；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１２）（ｉ）配列番号２８の２０〜３４１；（ｉｉ）配列番号２８の２１〜３５０；（ｉｉｉ）配列番号２８の１０７〜３４１；又は（ｉｖ）配列番号２８の１０７〜３５０；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、β−キシロシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は、
（１３）（ｉ）配列番号３２の２１〜６６０；（ｉｉ）配列番号３２の２１〜６４５；（ｉｉｉ）配列番号３２の４５０〜６４５；又は（ｉｖ）配列番号３２の４５０〜６６０；の位置に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１４）配列番号５２のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５２の残基（ｉ）２２〜２５５、（ｉｉ）２２〜３４３、（ｉｉｉ）３０７〜３４３、（ｉｖ）３０７〜３４４、若しくは（ｖ）２２〜３４４；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１５）配列番号５４のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５４の残基（ｉ）１８〜２８２、（ｉｉ）１８〜６０１、（ｉｉｉ）１８〜７３３、（ｉｖ）３５６〜６０１、若しくは（ｖ）３５６〜７３３；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１６）配列番号５６のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５６の残基（ｉ）２２〜２９２、（ｉｉ）２２〜６２９、（ｉｉｉ）２２〜７８０、（ｉｖ）３７３〜６２９、若しくは（ｖ）３７３〜７８０；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１７）配列番号５８のアミノ酸配列に対し、又は配列番号５８の残基（ｉ）２０〜３２１、（ｉｉ）２０〜６５１、（ｉｉｉ）２０〜８１１、（ｉｖ）４２３〜６５１、若しくは（ｖ）４２３〜８１１；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１８）配列番号６０のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２２〜６００、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜８９９、若しくは（ｖ）４２８〜６６０；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（１９）配列番号６２のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６２の残基（ｉ）２０〜２８７、（ｉｉ）２２〜６１１、（ｉｉｉ）２０〜７４４、（ｉｖ）３６２〜６１１、若しくは（ｖ）３６２〜７４４；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２０）配列番号６４のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６４の残基（ｉ）１９〜３０７、（ｉｉ）１９〜６４０、（ｉｉｉ）１９〜８７４、（ｉｖ）４０７〜６４０、若しくは（ｖ）４０７〜８７４；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２１）配列番号６６のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６６の残基（ｉ）２０〜２９７、（ｉｉ）２０〜６２９、（ｉｉｉ）２０〜８５７、（ｉｖ）３９６〜６２９、若しくは（ｖ）３９６〜８５７に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２２）配列番号６８のアミノ酸配列に対し、又は配列番号６８の残基（ｉ）２０〜３００、（ｉｉ）２０〜６３４、（ｉｉｉ）２０〜８６０、（ｉｖ）４００〜６３４、若しくは（ｖ）４００〜８６０に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２３）配列番号７０のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７０の残基（ｉ）２０〜３２７、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８９９、（ｉｖ）４２８〜６６０、若しくは（ｖ）４２８〜８９９；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２４）配列番号７２のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７２の残基（ｉ）１９〜３１４、（ｉｉ）１９〜６４７、（ｉｉｉ）１９〜８８６、（ｉｖ）４１５〜６４７、若しくは（ｖ）４１５〜８８６；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２５）配列番号７４のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７４の残基（ｉ）２０〜２９５、（ｉｉ）２０〜６４７、（ｉｉｉ）２０〜８８０、（ｉｖ）４１４〜６４７、若しくは（ｖ）４１４〜８８０；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２６）配列番号７６のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７６の（ｉ）１９〜２９６、（ｉｉ）１９〜６４９、（ｉｉｉ）１９〜８９０、（ｉｖ）４１５〜６４９、若しくは（ｖ）４１５〜８９０の残基；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２７）配列番号７８のアミノ酸配列に対し、又は配列番号７８の残基（ｉ）２０〜３５４、（ｉｉ）２０〜６６０、（ｉｉｉ）２０〜８０５、（ｉｖ）４４９〜６６０、又は（ｖ）４４９〜８０５；に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２８）配列番号７９のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（２９）少なくとも約１００残基（例えば、少なくとも約１５０、１７５、２００、２２５、又は２５０残基）の長さであり、（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１；からなる群から選択される配列モチーフを１つ以上含み、好ましくはＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する、ポリペプチド；又は
（３０）少なくとも２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むポリペプチドであって、第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくとも約２００残基分（例えば、少なくとも約２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、又は４００残基分）の長さであり、かつ配列番号９６〜１０８のうちの１つ以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は少なくとも約５０残基分（例えば、少なくとも約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００残基分）の長さであり、かつ配列番号１０９〜１１６のうちの１つ以上又は全てを含み、同様に場合により第３のβ−グルコシダーゼ配列、すなわちアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、配列番号６６のループ配列に由来する第３のβ−グルコシダーゼ配列を含み、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；を提供する。
【０２４２】
本開示は：
（１）配列番号１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２）配列番号３と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（３）配列番号５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％種以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（４）配列番号７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（５）配列番号９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号９又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（６）配列番号１１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号１１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（７）配列番号１３と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号１３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（８）配列番号１５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号１５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（９）配列番号１７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号１７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１０）配列番号１９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号１９又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１１）配列番号２１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号２１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１２）配列番号２７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号２７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１３）配列番号３１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号３１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１４）配列番号５１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号５１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１５）配列番号５３と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号５３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１６）配列番号５５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号５５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１７）配列番号５７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号５７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１８）配列番号５９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号５９又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（１９）配列番号６１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号６１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２０）配列番号６３と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号６３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２１）配列番号６５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号６５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２２）配列番号６７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号６７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２３）配列番号６９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号６９又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２４）配列番号７１と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号７１又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２５）配列番号７３と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号７３又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２６）配列番号７５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号７５又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２７）配列番号７７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号７７又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２８）配列番号９２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号９２又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；又は
（２９）配列番号９４と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を有する核酸、すなわち厳密度の高い条件下で、配列番号９４又はその断片の相補鎖とハイブリッド形成することのできる核酸；も提供する。
【０２４３】
本開示は、上記の核酸を含む、発現カセット及び／又はベクターも提供する。好適には、本開示の酵素をコードしている核酸は、操作可能にプロモーターに連結される。特に、糸状菌宿主に組み換え体を発現させることが望ましい場合、プロモーターは糸状菌のプロモーターであってよい。核酸は、異種プロモーターの調節下のものであってよい。核酸は、常時発現型又は誘導型プロモーターの調節下で発現させることもできる。使用することができるプロモーターの例としては、限定するものではないが、セルラーゼのプロモーター、キシラナーゼのプロモーター、１８１８プロモーター（これまでに、ＥＳＴマッピングしたトリコデルマ（Trichoderma）により高発現されるタンパク質として同定されている）が挙げられる。例えば、プロモーターは、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターであってよい。特に好適なプロモーターは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターである場合がある。例えば、プロモーターは、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）プロモーターである。プロモーターの非限定例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。その他のプロモーターの非限定例としては、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。
【０２４４】
本明細書で使用するとき、用語「操作可能に連結された」は、選択されたＤＮＡの発現をプロモーターにより制御するために、選択したヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードしている）をプロモーターに近接させていることを意味する。加えて、プロモーターは、転写及び翻訳の方向の観点から、選択されたヌクレオチド配列の上流に位置する。ヌクレオチド配列と調節配列は、適切な分子（例えば、転写活性化因子）が調節配列に結合したときに遺伝子が発現されるよう、連結される。
【０２４５】
本開示は、本開示の１つ以上の酵素を発現するよう遺伝子操作された宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、任意の微生物（例えば、バクテリア細胞、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）、又はその他の微生物）が挙げられ、好ましくは宿主細胞はバクテリア細胞、酵母細胞、又は糸状菌細胞である。
【０２４６】
好適な細菌属宿主細胞としては、限定するものではないが、大腸菌（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（LactoBacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、及びストレプトマイセス（Streptomyces）が挙げられる。好適なバクテリア種の細胞としては、限定するものではないが、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｌ．ブレビス（L. brevis）、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）、及びＳ．リビダンス（S. lividans）が挙げられる。
【０２４７】
酵母族の好適な宿主細胞としては、限定するものではないが、サッカロマイセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、ピキア（Pichia）、クリヴェロミセス（Kluyveromyces）、及びファフィナ（Phaffia）細胞が挙げられる。好適な酵母種細胞としては、限定するものではないが、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、Ｐ．カナデンシス（P. canadensis）、クリヴェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）及びファフィア・ロードザイマ（Phaffia rhodozyma）細胞が挙げられる。
【０２４８】
好適な糸状菌宿主細胞としては、エウミコチニア（Eumycotina）亜門の全ての糸状菌が挙げられる。好適な糸状菌属の細胞としては、例えば、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシディウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスカス（Corynascus）、ケトミウム（Chaertomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ヒュミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ムコール（Mucor）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリカム（Sporotrichum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、及びトリコデルマ（Trichoderma）細胞が挙げられる。
【０２４９】
好適な糸状菌種細胞としては、限定するものではないが、アワモリコウジカビ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、こうじ菌（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイドス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブキナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トルコテキオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジャカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオシス・カレジエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオシス・ギルベッセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオシス・パンノキンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオシス・サブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・キネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ハースタス（Coriolus hirsutus）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネッセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソルタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、白色腐朽菌（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラブス（Talaromyces flavus）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa）、カワラタケ（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞が挙げられる。
【０２５０】
本開示は、第１態様では、更に、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチド、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第２態様では、更に、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第３態様では、更に、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド；及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。
【０２５１】
本開示は、第４態様では、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチド、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第５態様では、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第６態様では、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド；（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいは、ＥＧＩＶに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【０２５２】
本開示は、第７態様では、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチド、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第８態様では、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及びβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第９態様では、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。
【０２５３】
本開示は、第１０態様では、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及び（３）β−グルコシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第１１態様では、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及びβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。本開示は、第１２態様では、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及び（３）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第３のポリペプチド、あるいは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ、を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞を提供する。
【０２５４】
上記第１〜第１２態様のうちのいずれかの組み換え宿主細胞では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼを有するポリペプチドは、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列を含むβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含む、融合又はキメラβ−グルコシダーゼポリペプチドであり、及び同様に場合により、第３のβ−グルコシダーゼに由来する、アミノ酸残基３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さである、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有するループ配列をコードしている、第３の配列も含む。詳細には、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち１つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号１９７〜２０２のアミノ酸配列モチーフのうち少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３、４、又は全て）を含み、及び２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列のうち２つ目の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号２０３を含み、及び同様に場合により第３の配列は、第１又は第２のβ−グルコシダーゼポリペプチドとは異なる第３のβ−グルコシダーゼポリペプチドに由来し、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さであり、かつアミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。特定の実施形態では、上記のとおり第１及び第２の配列を含みβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、更に、相当する長さのＴｅ３Ａ（配列番号６６）配列に由来��る約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる、すなわち相当する長さのＴｅ３Ａ配列（配列番号６６）に由来する、例えば、アミノ酸配列ＦＤＲＲＳＰＧ（配列番号２０４）又はＦＤ（Ｒ／Ｋ）ＹＮＩＴ（配列番号２０５）を有する第３の配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対して、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基からなる下位配列又は断片に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含む。
【０２５５】
上記第１〜第１２態様のうちのいずれかの組み換え宿主細胞では、組み換え宿主細胞は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現するよう遺伝子操作されている。一部の実施形態では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するものであるか、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含むものである。特定の実施形態では、組み換え宿主細胞は、セロビオースデヒドロゲナーゼも発現するよう遺伝子操作することもできる。
【０２５６】
上記第１〜第１２態様のうちのいずれかの組み換え宿主細胞では、組み換え宿主細胞は、キシロシダーゼ活性を有する、第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたポリペプチドを発現するよう、遺伝子操作される。第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号２及び１０のいずれか１つに対し、あるいはこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、β−キシロシダーゼ群はＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってよい。組み換え宿主細胞は、キシロシダーゼ活性を有する、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたポリペプチドを発現するよう、遺伝子操作することもできる。第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０及び４５のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【０２５７】
上記第１、第２及び第３態様のうちのいずれかの組み換え宿主細胞では、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有する。例えば、キシラナーゼポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【０２５８】
上記第４、第５及び第６態様のうちのいずれかの組み換え宿主細胞では、宿主細胞は、アラビノフラノシダーゼ活性を有し、配列番号１２、１４、２０、２２、及び３２のいずれか１つの配列に対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有するポリペプチドを発現するよう遺伝子操作することもできる。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【０２５９】
本開示の組み換え宿主細胞は、例えば、適宜、組み換えＴ．リーゼイ（T. reesei）などの糸状菌といった、組み換え真菌宿主細胞又は組み換え生物であってよい。例えば、組み換え宿主細胞は好適にはトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）宿主細胞である。組み換え真菌は、好適には組み換えトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である。本開示は、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞を提供する。
【０２６０】
更に、本開示は、糖化に好適な比で好適な酵素を含む酵素配合物を発現するよう遺伝子操作された組み換え宿主細胞又は組み換え真菌を提供する。組み換え宿主細胞は、例えば、真菌宿主細胞である。組み換え真菌としては、例えば、組み換えトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）若しくはコウジカビ（Aspergillus oryzae）、又はクリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrisosporium lucknowence）が挙げられる。組み換え宿主バクテリア細胞はバチルス（Bacillus）であってよい。酵素配合物中に存在する好適な酵素比／量の例については、第５．３．４．節に記載する。
【０２６１】
５．３  糖化用酵素組成物
本開示は、リグノセルロース材料を分解することのできる酵素組成物を提供する。本発明の酵素組成物は、典型的には複数種の酵素の配合物であり、本開示の１種以上の酵素又はポリペプチドを含む。本発明の酵素組成物には、微生物、植物、又は生物に由来する１種以上の更なる酵素を好適に含有させ得ることができる。相乗的な酵素の組み合わせ及び関連する方法が想到される。本開示は、各種リグノセルロース系材料を分解するために酵素組成物に含有させる酵素の最適比を特定する方法を包含する。これらの方法としては、例えば、各種リグノセルロース系基質をそれらの構成成分の発酵性糖質へと効率的に変換させるのにあたって、本発明の酵素組成物に含有させる酵素の最適比又は比重を特定するための試験が挙げられる。以下の実施例には、糖化工程において、各種リグノセルロース系材料を効率的に加水分解又は分解させる酵素組成物中の、酵素の最適比／比重を特定するために使用することのできるアッセイが包含される。
【０２６２】
５．３．１．バックグラウンド
高等植物の細胞壁は、様々な糖ポリマー（ＣＰ）成分から構成される。これらのＣＰは、共有結合及び非共有結合により相互作用し、堅固な細胞壁を形成し、かつ膨圧に耐えるのに必要とされる構造一体性を植物にもたらす。植物に見られる主なＣＰはセルロースであり、セルロースは細胞壁の構造骨格を形成する。セルロースの生合成時に、ポリ−β−１，４−Ｄ−グルコース鎖は水素結合及び疎水性相互作用により自己集合してセルロースミクロフィブリルを形成し、セルロースミクロフィブリルは更に自己集合してより大きな繊維を形成する。セルロースミクロフィブリルは、多くの場合不規則な形状であり、及び結晶化度の異なる領域を含有する。セルロースフィブリルの結晶化度は、これらのセルロース鎖構成要素間の水素結合が、どれだけ緊密であるかによって変化する。結合密度がより疎である、すなわちグルコース鎖をより利用しやすい領域は、非晶質領域と呼ばれる。
【０２６３】
セルロースをグルコースへと解重合する際に一般的なモデルは、最低限で３つの異なる酵素活性を包含する。工程において、エンドグルカナーゼはセルロース鎖の内部を切断し、より短い鎖を生成することから、接近可能な末端の数が増加し、セルロース鎖を未処理である場合と比較してエキソグルカナーゼ活性が作用しやすくなる。これらのエキソグルカナーゼ（例えば、セロビオヒドロラーゼ）は、多くの場合、セロビオース、グルコース二量体において遊離（liberating）する還元末端又は非還元末端のいずれかに特異的なものである。次に、蓄積させたセロビオースをセロビアーゼ（例えば、β−１，４−グルコシダーゼ）により切断させて、グルコースを生成する。
【０２６４】
セルロースは無水グルコースのみを含有する。対照的に、ヘミセルロースは数多くの異なる糖モノマーを含有する。例えば、ヘミセルロース中の、グルコース以外の糖モノマーとしては、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、及びアラビノースを挙げることもできる。多くの場合、ヘミセルロースはＤ型五炭糖を含有しており、場合により少量のＬ型糖を含有する。キシロースは典型的には最も多量に存在するが、マンヌロン酸及びガラクツロン酸も存在する傾向がある。ヘミセルロースとしては、キシラン、グルクロンオキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、及びキシログルカンが挙げられる。
【０２６５】
本開示の酵素及び多酵素組成物は、ヘミセルロース材料、例えば、キシラン、アラビノキシラン、及びキシラン含有物質若しくはアラビノキシラン含有物質の糖化に有用である。アラビノキシランはキシロース及びアラビノースからなる多糖であり、Ｌ−α−アラビノフラノース残基が分岐点としてβ−（１，４）−結合キシロースポリマー主鎖に結合している。
【０２６６】
大部分のバイオマス資源はより複雑であり、数ある成分の中でも特にセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、タンパク質、及びトネリコを含有する。したがって、特定の態様では、本開示は、最も効果的な様式で一緒に作用させてバイオマスを発酵性糖質へと分解させる際に幅広く又は多様な基質特異性を付与する酵素を含有している、酵素配合物／組成物を提供する。本発明の多酵素配合物／組成物の一例としては、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、及び所望によりアクセサリータンパク質、の混合物が挙げられる。酵素配合物／組成物は、適宜非天然に得られる組成物である。
【０２６７】
したがって、本開示は、キシラン加水分解酵素、ヘミセルロース酵素及び／又はセルロース加水分解酵素の混合物を含む酵素配合物／組成物（製造製品など）を提供し、酵素配合物／組成物は、グルカナーゼ；セロビオヒドロラーゼ；Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ；キシラナーゼ；β−グルコシダーゼ；及びβ−キシロシダーゼなどのセルラーゼのうちの少なくとも１種、複数種、又は全てを含有する。好ましくは、本開示の各酵素配合物／組成物は、本開示の少なくとも１種の酵素を含む。本開示は、非天然に得られる組成物である、酵素配合物／組成物も提供する。本明細書で使用するとき、用語「酵素配合物／組成物」は：（１）発酵ブロス形態のあるいは一部若しくは完全に単離又は精製した形態のいずれかの酵素成分を組み合わせて調製した組成物；（２）酵素成分を１種以上発現するよう改質された生物により生産された組成物；特定の実施形態では、１種以上の酵素成分を発現させるために使用する生物は、１つ以上の遺伝子を欠失するよう改質させてもよい；特定の実施形態では、生物はキシラン加水分解、ヘミセルロース加水分解及び／又はセルロース加水分解に影響を与えるタンパク質タンパク質を更に含み得る；（３）糖化又は発酵反応中に、同時に、別個に、又は連続的に酵素成分を組み合わせて製造した組成物；（４）インサイツで、例えば、糖化又は発酵反応中に製造した酵素混合物；及び（５）これら（１）〜（４）のうちのいずれか又は全てに従って製造した組成物；を指す。
【０２６８】
本明細書で使用するとき、用語「発酵ブロス」は、発酵により生産され、発酵後に全く又はほとんど回復操作及び／又は精製されない酵素調製物を指す。例えば、微生物培養物を炭素制限条件下でインキュベートし、定常状態になるまで増殖させて、タンパク質を合成させる（例えば、酵素を発現させる）。次に、酵素が細胞培養培地に分泌されたら発酵ブロスを使用することができる。本開示の発酵ブロスは、発酵終了時に得られる発酵材料の、分画されていない又は分画された内容物を含有し得る。例えば、本発明の発酵ブロスは未分画のものであり、使用した培養培地と、及び微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を発酵工程にかけた後に存在する細胞片とを含む。発酵ブロスは、好適には、使用した細胞培養培地、細胞外酵素及び微生物の生又は死細胞を含有し得る。あるいは、発酵ブロスを分画して、微生物細胞を除去することもできる。これらの場合、例えば、発酵ブロスは、使用した細胞培養培地と、細胞外酵素とを含み得る。
【０２６９】
本明細書に具体的に記載される任意の酵素を、本明細書に記載の任意の１つ以上の酵素又は任意のその他の利用可能でかつ好適な酵素と組み合わせて、好適な多酵素配合物／組成物を生成することができる。本開示は、以下に列挙される特定の例示的な組み合わせに制限されず、すなわち限定されない。
【０２７０】
５．３．２．バイオマス
本開示は、本開示の酵素、酵素配合物／組成物を用いバイオマスを糖化させるための、方法及び工程を提供する。本明細書で使用するとき、用語「バイオマス」は、セルロース及び／又はヘミセルロースを含む（場合により、リグノセルロース系バイオマス材料中のリグニンも含む）任意の組成物を指す。本明細書で使用するとき、バイオマスとしては、限定するものではないが、種子、穀類、塊茎、植物性廃棄物、すなわち食品加工又は工業加工に関係する副産物（例えば、茎など）、トウモロコシ（例えば、穂軸、及びまぐさなど）、草本類（例えば、ソルガストラム・ヌタンス（Sorghastrum nutans）などのインディアングラス、又は例えば、キビ（Panicum）種などパニクム・バーガタム（Panicum virgatum）といったスイッチグラス）、多年生植物のケーン類（例えば、暖竹）、木材（例えば、木片、加工廃棄物など）、紙、パルプ、及び再生紙（例えば、新聞紙、及び印刷紙など）が挙げられる。他のバイオマス材料としては、限定するものではないが、ジャガイモ、マメ科植物（例えば、菜種）、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビート、及びサトウキビバガスが挙げられる。
【０２７１】
本開示は、バイオマス材料、例えば、キシラン、ヘミセルロース、セルロース、及び／又は発酵性糖質を含む材料を、本開示のポリペプチド、又は本開示の核酸によりコードされるポリペプチド、又は酵素配合物／組成物のうちのいずれか１つ、又は本開示の製造製品と接触させる工程を含む、糖化方法を提供する。
【０２７２】
糖化させたバイオマス（例えば、本開示の酵素により加工したリグノセルロース系材料）に、例えば、微生物による発酵及び／又は化学合成などの加工を行うことで、数多くのバイオ系製品を製造することができる。本明細書で使用するとき、「微生物による発酵」は、好適な条件下で発酵微生物を増殖及び回収するプロセスを指す。発酵微生物は、バイオ系産物を生産するための所望の発酵プロセスで使用するのに好適な任意の微生物であり得る。好適な発酵微生物としては、限定するものではないが、菌類（例えば、糸状菌）、酵母、及びバクテリアが挙げられる。糖化させたバイオマスを、発酵及び／又は化学合成により燃料（例えば、バイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料、又は同様物などのバイオ燃料）にすることができる。糖化させたバイオマスを、発酵により及び／又は化学合成により、汎用化学物質（例えば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、タンパク質及び酵素にすることができる。
【０２７３】
５．３．３．前処理
糖化前に、好ましくは、バイオマス（例えば、リグノセルロース系材料）には、キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び／又はリグニン材料を、酵素がより接近しやすく又は作用しやすい状態にするために、ひいては、本開示の酵素及び／又は酵素配合物／組成物により加水分解されやすい状態にするために、１つ以上の前処理工程を行う。
【０２７４】
特定の実施形態では、前処理は、反応器内で、バイオマス材料を、強酸及び金属塩の希釈溶液からなる触媒に曝露することを伴う。バイオマス材料は、例えば、原材料又は乾燥させた材料であってよい。この前処理により、セルロースの加水分解にまつわる活性化エネルギー、又は温度を低くすることができ、最終的にはより多量の発酵性糖質を生成できるようになる。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照されたい。
【０２７５】
他の例示的な前処理法は、大部分のセルロースをグルコースへと脱重合させずに、ヘミセルロースの一次脱重合を実施するために選択される温度及び圧力レベルにて、バイオマス材料に対し、水性媒質中での第１の加水分解工程を実施することで、バイオマスを加水分解する工程を伴う。この工程により、スラリーには、ヘミセルロースの脱重合から得られる単糖が溶解している液体水相並びにセルロース及びリグニンを含有する固相が生じる。次に、セルロースの大部分を脱重合させ、セルロースが溶解している／セルロースの可溶性脱重合産物を含有している液体水相を生成することのできる条件下で、スラリーに第２の加水分解工程を行う。例えば、米国特許第５，５３６，３２５号を参照のこと。
【０２７６】
更なる方法例は、約０．４％〜約２％の強酸を使用する１段階以上の希酸加水分解工程によりバイオマス材料を加工し、続いて酸加水分解させた材料のうち、未反応の固体リグノセルロース系成分をアルカリ系脱リグニン化処理する工程を含む。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照のこと。
【０２７７】
他の方法例は、前加水分解反応容器中で、バイオマス（例えば、リグノセルロース系材料）を予め加水分解する工程；酸性の液体をリグノセルロース系固形材料に添加して、混合物を作製する工程；混合物を反応温度に加熱する工程；リグノセルロース系材料を、リグノセルロース系材料由来のリグニンを少なくとも約２０％含有している可溶性画分及びセルロースを含有している固体画分へと分画するのに十分な時間にわたり、反応温度を維持する工程；固体画分から可溶性画分を分離させ、可溶性画分を反応温度にて、又は反応温度付近にて取り出す工程；並びに、可溶性タンパク質を回収する工程、を含む。固形画分中のセルロースを、酵素による消化を受けやすい状態にする。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照のこと。
【０２７８】
その他の前処理方法は、過酸化水素Ｈ２Ｏ２の使用を伴うものである。Ｇｏｕｌｄ，１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｒ．２６：４６〜５２を参照されたい。
【０２７９】
前処理は、バイオマス材料を、非常に低濃度の化学量論の水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムと接触させる工程も含む。Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７〜７９：１９〜３４を参照されたい。前処理には、リグノセルロースを、温和な温度、圧力及びｐＨで、例えばｐＨ約９〜約１４の化学物質（例えば、炭酸ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基）と接触させる工程を含有させることもできる。国際公開第２００４／０８１１８５号を参照されたい。
【０２８０】
例えば、好ましい前処理方法ではアンモニアを使用する。例えば、前処理方法は、固形分濃度の高い条件下で、バイオマス材料を低濃度のアンモニアに晒すことを含む。例えば、米国特許第２００７００３１９１８号、及び国際公開第０６１１０９０１号を参照されたい。
【０２８１】
５．３．４．酵素組成物
本開示は、本開示の酵素を複数（すなわち、１種以上）含む数多くの酵素組成物を提供する。本発明の各酵素組成物に関し少なくとも１種の酵素は組み換え宿主細胞又は組み換え生物により生産させることができる。酵素組成物の少なくとも１種の酵素は異種性酵素であってよく、例えば、宿主細胞又は宿主生物において異種遺伝子を発現させることで生産させた異種酵素であってよい。酵素組成物の少なくとも１種の酵素は、宿主細胞又は宿主生物で内在性遺伝子を過剰発現又は低発現させた結果として生産されてもよい。酵素組成物は、適宜非天然に得られる組成物である。本開示は、４種のポリペプチド：（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチド、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第１の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第２の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド；（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド；（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド；及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ組成物、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第３の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチド、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第４の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、及び（４）β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を含む、本発明の遺伝子組み換え型酵素組成物の、第５の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド（第１のポリペプチドとは異なる）、（３）アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド；及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいは、ＥＧＩＶに富む全セルラーゼ組成物、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第６の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドと���異なる）、及び（４）β−グルコシダーゼ活性を有する第４のポリペプチド、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第７の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及びβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を含む、第８の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、（３）キシロシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド（第２のポリペプチドとは異なる）、及び（４）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第４のポリペプチド、あるいは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ組成物、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第９の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及び（３）β−グルコシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド、を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第１０の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド及びβ−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ、を含む、本発明の遺伝子組み換え型酵素組成物の、第１１の非限定例を提供する。本開示は、（１）キシラナーゼ活性を有する第１のポリペプチド、（２）キシロシダーゼ活性を有する第２のポリペプチド、及び（３）ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する第３のポリペプチド、あるいは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼに富む全セルラーゼ組成物を含む、本発明の遺伝子操作型酵素組成物の、第１２の非限定例を提供する。
【０２８２】
上記の代表的な酵素組成物のうちの任意のものでは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、７９、９３、及び９５のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼを有するポリペプチドは、２つ以上のβ−グルコシダーゼ配列からなるβ−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドであり、第１のβ−グルコシダーゼに由来する第１の配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、配列番号９６〜１０８のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼに由来する第２の配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、配列番号１０９〜１１６のアミノ酸配列モチーフのうち１種以上又は全てを含み、及び同様に場合により第３の配列は、第３のβ−グルコシダーゼに由来するループ配列をアミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さでコードしている、β−グルコシダーゼの融合又はキメラポリペプチドである。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、少なくとも２００残基長のＦｖ３Ｃ（配列番号６０）と、例えば、配列番号６０のＮ末端から少なくとも２００残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第１の配列、並びに少なくとも５０残基長のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３（Ｔｒ３Ｂ、配列番号６４）と、例えば、配列番号６４のＣ末端の残基から少なくとも５０残基と、少なくとも約６０％配列同一性を有する第２の配列を含む。特定の実施形態では、上記のとおり第１及び第２の配列を含みβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、更に、Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）の相当する長さの配列に由来する、約３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個のアミノ酸残基からなる第３の配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９３又は９５に対して、あるいは配列番号９３又は９５の少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、又は７０個以上の残基からなる下位配列又は断片に対して少なくとも約６０％配列同一性を有する配列を含む。
【０２８３】
本明細書に記載の酵素組成物のうちの任意のものでは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドはＥＧＩＶポリペプチドであり、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するものであるか、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含むものである。特定の実施形態では、組成物は更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含む。
【０２８４】
本明細書に記載の酵素組成物のうちの任意のものでは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４、２６、４２、及び４３のうちのいずれか１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し少なくとも約７０％配列同一性を有するものであってよい。例えば、キシラナーゼポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２であってよい。
【０２８５】
本明細書に記載の酵素組成物のうちの任意のものでは、キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドは、第１群の又は第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドから選択されたものであってよい。組成物が第１の及び第２のβ−キシロシダーゼを含む場合、第１のβ−キシロシダーゼは第１群のβ−キシロシダーゼポリペプチドであり、配列番号２及び１０のうちの１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し、少なくとも約７０％配列同一性を有するものであってよいことが企図される。例えば、第１群のβ−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであり得る。第２のβ−キシロシダーゼは、第２群のβ−キシロシダーゼポリペプチドであり、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２８、３０、及び４５のうちの１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し、少なくとも約７０％配列同一性を有するものであってよいことも企図される。例えば、第２群のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１であってよい。
【０２８６】
上記の酵素組成物の例のうち任意のものでは、アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２、１４、２０、２２及び３２のうちの１つに対し、又はこれらの成熟配列に対し、少なくとも約７０％配列同一性を有するものであってよい。例えば、第３のポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、又はＦｖ５１Ａであってよい。
【０２８７】
キシラナーゼ：キシラナーゼは、本開示の酵素組成物の約３重量％〜約３５重量％を適宜構成する。重量％は、所定の組成物中の全ての酵素の合計重量に対する、キシラナーゼの合計重量を意味する。キシラナーゼは、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％を下限とし、及び５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％を上限とする範囲で存在させることができる。好適には、本発明の酵素組成物中の１種以上のキシラナーゼの合計重量は、例えば、酵素組成物中の全ての酵素の合計重量の約３重量％〜約３０重量％（例えば、３重量％〜２０重量％、５重量％〜１８重量％、８重量％〜１８重量％、１０重量％〜２０重量％など）を占める。本開示の酵素組成物に含有させるのに好適なキシラナーゼの例を、第５．３．７．節に記載する。
【０２８８】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ：Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、本開示の酵素組成物の酵素の総重量の約０．１％重量％〜約５重量％を適宜構成する。ここで、重量％は、所定の組成物中の全ての酵素の合計重量に対する、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの合計重量を意味する。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、０．７重量％、０．８重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％を下限とし、及び２重量％、３重量％、４重量％、又は５重量％を上限とする範囲で存在させることができる。例えば、１種以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、本開示の酵素組成物の酵素の総重量の約０．２重量％〜約５重量％（例えば、０．２重量％〜３重量％、０．４重量％〜２重量％、０．４重量％〜１重量％など）を適宜構成し得る。本開示の酵素配合物組成物に含有させるのに好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼの例を、第５．３．８．節に記載する。
【０２８９】
β−キシロシダーゼ：β−キシロシダーゼは、酵素配合物／組成物中の酵素の総重量の約０重量％〜約４０重量％を適宜構成する。この量は、既知の手法を用い、例えば、実施例に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、及びＵＰＬＣなどの手法を用い算出することができる。任意に組み合わせたタンパク質の、互いに対する比は、容易に算出することができる。本明細書で開示される重量％から導かれる任意の重量比で酵素を含む配合物／組成物が企図される。β−グルコシダーゼ含量は、下限が、配合物／組成物に含まれる酵素の総重量の約０重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％であり、かつ上限が、組成物に含まれる酵素の総重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、又は４０重量％である範囲であってよい。例えば、β−キシロシダーゼは、配合物／組成物中の酵素の総重量の２重量％〜３０重量％；１０重量％〜２０重量％；又は５重量％〜１０重量％を適宜示す。好適なβ−キシロシダーゼについては、本明細書において、例えば、第５．３．７．節にに記載する。
【０２９０】
５．３．５．セルラーゼ
本開示の酵素配合物組成物は、１つ以上のセルラーゼを含み得る。セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成する酵素である。セルラーゼは、従来的に、３つの主要なクラス：エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及びβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）に分類されてきた（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５（９）：２５５〜２６１；Ｓｈｕｌｅｉｎ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：２３４〜２４２）。エンドグルカナーゼが主にセルロース繊維の非晶質部位に作用する一方で、セロビオヒドロラーゼは結晶質セルロースも分解することができる。
【０２９１】
本開示の方法及び組成物に好適なセルラーゼは次の微生物のうちの１種以上から得ることができ、又はこれらの微生物の組み換えにより生産することができる：クリニペリス・スカペラ（Crinipellis scapella）、マクロフォミア・ファセオリナ（Macrophomina phaseolina）、ミセリオフィソーラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ソルダリア・フィミコラ（Sordaria fimicola）、ボルテラ・セロトリコイド（Volutella colletotrichoides）、チェラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、アクレモニウム菌種（Acremonium sp.）、エキシジア・グランデュロサ（Exidia glandulosa）、フォムス・フォメンタリウス（Fomes fomentarius）、スポンジペリス菌種（Spongipellis sp.）、リゾフィリクティス・ロセア（Rhizophlyctis rosea）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、フィコマイセス・ニテウス（Phycomyces niteus）、カエトスチラム・フレセニィ（Chaetostylum fresenii）、ディプロディア・ゴシピナ（Diplodia gossypina）、ウロスポラ・ビルグラミイ（Ulospora bilgramii）、サッコボラス・ジルテラス（Saccobolus dilutellus）、ペニシリウム・ベルクロサム（Penicillium verruculosum）、アオカビ（Penicillium chrysogenum）、サーモマイセス・ベルコサス（Thermomyces verrucosus）、ジアポルテ・シンゲネシア（Diaporthe syngenesia）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、ニグロスポラ菌種（Nigrospora sp.）、キシラリア・ヒポキシロン（Xylaria hypoxylon）、ネクトリア・ピネア（Nectria pinea）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、カエトミウム・モロラム（Chaetomium mororum）、カエトミウム・バーセンス（Chaetomium virscens）、カエトミウム・ブラシリエンシス（Chaetomium brasiliensis）、カエトミウム・クニコロラム（Chaetomium cunicolorum）、シスパストスポラ・ボニネンシス（Syspastospora boninensis）、クラドリナム・フォエカンヂシマム（Cladorrhinum foecundissimum）、スキタリジウム・サーモフィラ（Scytalidium thermophila）、グリオクラジウム・カテヌラタム（Gliocladium catenulatum）、フザリウム・オキシスポラム菌種・リコペルシキ（Fusarium oxysporum ssp. lycopersici）、フザリウム・オキシスポラム菌種パッシフローラ（Fusarium oxysporum ssp. passiflora）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・アングイオイド（Fusarium anguioides）、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）、ヒュミコラ・ニグレッセンス（Humicola nigrescens）、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）、パナエオラス・レチルギス（Panaeolus retirugis）、トラメテス・サングイネア（Trametes sanguinea）、シゾフィラム・コミューン（Schizophyllum commune）、トリコテキウム・ロゼウム（Trichothecium roseum）、ミクロスファロシス菌種（Microsphaeropsis sp.）、アクソボロス・スチクトイデウス（Acsobolus stictoideus spej.）、ポロニア・パンクタタ（Poronia punctata）、ノデュリスポラム菌種（Nodulisporum sp.）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei））、及びシリンドロカルポン菌種（Cylindrocarpon sp.）。
【０２９２】
例えば、本開示の方法及び／又は組成物に使用するセルラーゼは全セルラーゼであり、及び／又は以下の第６．１．１１．に記載するカルコフローアッセイにより測定した場合に少なくとも０．１画分（例えば、０．１〜０．４画分）を得ることのできるものである。
【０２９３】
５．３．５．１．β−グルコシダーゼ
本開示の酵素配合物／組成物には、場合により１種以上のβ−グルコシダーゼを含有させてもよい。本明細書で使用するとき、用語「β−グルコシダーゼ」は、ＥＣ  ３．２．１．２１として分類されるβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、及び／又は特定のＧＨファミリーのメンバー（限定するものではないが、セロビオースの加水分解を触媒してβ−Ｄ−グルコースを生成するＧＨファミリー１、３、９又は４８のメンバーなど）を指す。
【０２９４】
好適なβ−グルコシダーゼは、遺伝子組換え法により数多くの微生物から得ることができ、あるいは供給業者から購入することができる。微生物由来のβ−グルコシダーゼの例としては、限定するものではないが、バクテリア及び真菌に由来するものが挙げられる。例えば、本開示のβ−グルコシダーゼは、糸状菌から得ることもできる。
【０２９５】
β−グルコシダーゼは、とりわけ、Ａ．アキュレタス（A. aculeatus）（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９９６，１７３：２８７〜２８８）、カワチコウジカビ（A. kawachi）（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９，６５：５５４６〜５５５３）、ニホンコウジカビ（A. oryzae）（国際公開第２００２／０９５０１４号）、Ｃ．ビアゾテア（C. biazotea）（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，１９９８，２０７：７９〜８６）、Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）（国際公開第２００４／０７８９１９号）、Ｓ．フィブリゲラ（S. fibuligera）（Ｍａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８，５４：３１４７〜３１５５）、Ｓ．ポンベ（S. pombe）（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１５：８７１〜８８０）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）（例えば、β−グルコシダーゼ１（米国特許第６，０２２，７２５号）、β−グルコシダーゼ３（米国特許第６，９８２，１５９号）、β−グルコシダーゼ４（米国特許第７，０４５，３３２号）、β−グルコシダーゼ５（米国特許第７，００５，２８９号）、β−グルコシダーゼ６（米国特許第２００６０２５８５５４号）、β−グルコシダーゼ７（米国特許第２００６０２５８５５４号））から得ることができ、又は遺伝子組み換えにより産生することができる。
【０２９６】
β−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで生産できる。例えば、β−グルコシダーゼは、グラム陽性細菌（例えば、バチルス（Bacillus）又はアクチノマイセス（Actinomycetes）など）、又は真核生物宿主（例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、サッカロマイセス、又はピキア）により、細胞外の空間に分泌させることができる。β−グルコシダーゼは、一定の条件下で、過剰発現又は低発現させることができる。
【０２９７】
β−グルコシダーゼは、供給業者から入手することもできる。本開示に使用するのに好適なβ−グルコシダーゼ調製物の市販例としては、例えば、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）に含まれるＴ．リーゼイ（T. reesei）のβ−グルコシダーゼ；ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（Ａ．ニガー（A. niger）由来のβ−グルコシダーゼ）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．，Ｉｒｅｌａｎｄ．）の、アグロバクテリウム菌種（Agrobacterium sp.）のβ−グルコシダーゼ、及びＴ．マリティマ（T. maritima）のβ−グルコシダーゼが挙げられる。
【０２９８】
更に、β−グルコシダーゼは、以下、第５．３．６．節に記載のような全セルラーゼの成分であり得る。
【０２９９】
本開示は、２種以上のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチドである、所定のβ−グルコシダーゼポリペプチドを提供する。例えば、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さの配列を含み、かつ配列番号９６〜１０８の配列モチーフのうちの１つ又は全てを含んでよい。第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さの配列を含み、かつ配列番号配列番号１０９〜１１６の配列モチーフのうちの１つ又は全てを含んでよい。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、融合／キメラポリペプチドのＮ端末に位置するのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は融合／キメラポリペプチドのＣ末端に位置する。特定の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は、直接隣接している。例えば、第１のβ−グルコシダーゼ配列のＣ末端は、第２のβ−グルコシダーゼ配列のＮ末端に連結される。他の実施形態では、第１及び第２のβ−グルコシダーゼ配列は直接隣接していないものの、第１の及び第２のβ−グルコシダーゼ配列はリンカードメインを介して連結されている。一部の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列、第２のβ−グルコシダーゼ配列又はリンカードメインは、アミノ酸残基約３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個分の長さの配列を含んでよい。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつＦｖ３Ｃ配列の同じ長さのＮ端末に対し、少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号５４、５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちのいずれか１つの同じ長さのＣ末端に対し、少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、β−グルコシダーゼの融合／キメラポリペプチドは向上した安定性を有しており、例えば、キメラ／融合ポリペプチドのキメラ部の由来する酵素のいずれか１つと比較して安定性が向上している。特定の実施形態では、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつＴｒ３Ｂの同じ長さのＣ末端配列に対し、少なくとも約６０％配列同一性を有する。特定の実施形態では、第１のβ−グルコシダーゼ配列、第２のβ−グルコシダーゼ配列又はリンカーモチーフ中のループ配列は、Ｔｅ３Ａに由来し、アミノ酸残基３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１個分の長さである。
【０３００】
β−グルコシダーゼ活性は、当該技術分野において既知の、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９９２，１２１：５４〜６０に記載のアッセイ（ここで、１  ｐＮＰＧは、５０℃（１２２°Ｆ）及びｐＨ  ４．８にて１０分間に４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドから１μｍｏＬのニトロフェノールが遊離することを意味する）などの、数多くの適した手法により決定することができる。
【０３０１】
β−グルコシダーゼは、本発明の酵素配合物／組成物中の酵素の総重量の約０重量％〜約５５重量％を適宜構成する。この量は、既知の手法を用い、例えば、実施例に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、及びＵＰＬＣなどの手法を用い算出することができる。任意に組み合わせたタンパク質の、互いに対する比は、算出することができる。本明細書で開示される重量％から導かれる任意の重量比で酵素を含む配合物／組成物が企図される。β−グルコシダーゼ含量は、下限が、配合物／組成物に含まれる酵素の総重量の約０重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％であり、かつ上限が、組成物に含まれる酵素の総重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％である範囲であってよい。例えば、β−グルコシダーゼは、配合物／組成物中の酵素の総重量の２重量％〜３０重量％；１０重量％〜２０重量％；又は５重量％〜１０重量％を適宜示す。
【０３０２】
５．３．５．２．エンドグルカナーゼ
本開示の酵素配合物／組成物は、場合により、本明細書に記載のＧＨ６１エンドグルカナーゼＩＶ（ＥＧＩＶ）ポリペプチドに加えて１種以上のエンドグルカナーゼを含む。本開示の方法及び組成物には、ＥＧＩＶポリペプチドに加えて任意のエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）を使用することができる。このようなエンドグルカナーゼは、内在性又は外来性エンドグルカナーゼ遺伝子を発現させて生産することができる。エンドグルカナーゼは、一定の条件下で過剰発現又は低発現させることができる。
【０３０３】
例えば、本開示の方法及び組成物には、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ６３：１０３〜１１２）及び／又はＥＧ２（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９８８，６３：１１〜２１）が適宜使用される。熱安定性のＴ．テレスティス（T. terrestris）エンドグルカナーゼ（Ｋｖｅｓｉｔａｄａｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９５，５０：１３７〜１４３）が、例えば、本開示の方法及び組成物に使用される。更に、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ３（Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８，６４：５５５〜５６３）、ＥＧ５（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４，１３：２１９〜２２８）、ＥＧ６（米国特許第２００７０２１３２４９号）又はＥＧ７（米国特許第２００９０１７０１８１号）、Ａ．セルロリチカス（A. cellulolyticus）ＥＩエンドグルカナーゼ（米国特許第５，５３６，６５５号）、Ｈ．インソレンス（H. insolens）エンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  ４ＥＮＧ）、Ｓ．コッコスポラム（S. coccosporum）エンドグルカナーゼ（米国特許第２００７０１１１２７８号）、Ａ．アキュレアタス（A. aculeatus）エンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣ（Ｏｏｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：５８８４）、Ａ．カワチイ（A. kawachii）ＩＦＯ  ４３０８エンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，２７：４３５〜４３９）、Ｅ．カロトバラ（E. carotovara）（Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９９０，９０：９〜１４）；又はＡ．サーモフィラム（A. thermophilum）ＡＬＫＯ４２４５エンドグルカナーゼ（米国特許第２００７０１４８７３２）も使用することができる。その他の好適なエンドグルカナーゼは、例えば、国際公開第９１／１７２４３号、同第９１／１７２４４号、同第９１／１０７３２号、米国特許第６，００１，６３９号に記載のものである。
【０３０４】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する好適なポリペプチドを、本開示により提供する。一部の実施形態では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＥＧＩＶポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２、８０〜８１、２０６〜２０７のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも約１０残基（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００残基）の領域にわたって少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）配列同一性を有するものであるか、あるいは（１）配列番号８４、及び８８；（２）配列番号８５、及び８８；（３）配列番号８６；（４）配列番号８７；（５）配列番号８４、８８、及び８９；（６）配列番号８５、８８、及び８９；（７）配列番号８４、８８、及び９０；（８）配列番号８５、８８、及び９０；（９）配列番号８４、８８、及び９１；（１０）配列番号８５、８８、及び９１；（１１）配列番号８４、８８、８９、及び９１；（１２）配列番号８４、８８、９０、及び９１；（１３）配列番号８５、８８、８９、及び９１：及び（１４）配列番号８５、８８、９０、及び９１からなる群から選択される１つ以上の配列モチーフを含むものである。特定の実施形態では、組成物は更にセロビオースデヒドロゲナーゼを含む。
【０３０５】
ＧＨ６１エンドグルカナーゼは、酵素配合物／組成物中の酵素の総重量の約０．１重量％〜約５０重量％を適宜構成する。この量は、既知の手法を用い、例えば、実施例に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、及びＵＰＬＣなどの手法を用い算出することができる。タンパク質の互いに対する比は、これらの測定法に基づき容易に算出することができる。本明細書で開示される重量％から導かれる任意の重量比で酵素を含む配合物／組成物が企図される。ＧＨ６１エンドグルカナーゼ含量は、下限が、配合物／組成物に含まれる酵素の総重量の約０重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％であり、かつ上限が、組成物に含まれる酵素の総重量の約１０重量％、１５重量％、１６重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％である範囲であってよい。例えば、ＧＨ６１エンドグルカナーゼは、セルラーゼ組成物に含まれる酵素の総重量の約２重量％〜約３０重量％；約８重量％〜約２０重量％；約３重量％〜約１８重量％、約４重量％〜約１９重量％、又は約５重量％〜約２０重量％を適宜示す。
【０３０６】
５．３．５．３．セロビオヒドロラーゼ
本開示の方法及び配合物／組成物には、所望により、任意のセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）を使用することができる。セロビオヒドロラーゼは、内在性又は外来性セロビオヒドロラーゼ遺伝子を発現させて生産することもできる。一部の状況では、セロビオヒドロラーゼは、過剰発現又は低発現させることができる。
【０３０７】
例えば、本開示の方法及び配合物／組成物にはＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨＩ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８３，１：６９１〜６９６）及び／又はＣＢＨＩＩ（Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８３，１：６９６〜６９９）を使用することができる。
【０３０８】
好適なＣＢＨは、Ａ．ビスポラス（A. bisporus）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９２４００）、Ａ．アキュレアタス（A. aculeatus）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｏ５９８４３）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）ＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４２００１９）又はＣＢＨＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４２００２０）、Ａ．ニガー（A. niger）ＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５６２６８）又はＣＢＨＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５６２６９）、Ｃ．パープレア（C. purpurea）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｏ０００８２）、Ｃ．カルボナラム（C. carbonarum）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ００３２８）、Ｃ．パラシチカ（C. parasitica）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ００５４８）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）ＣＢＨ１（Ｃｅｌ７Ａ）（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ４６２３８）、Ｈ．グリセア（H. grisea）ＣＢＨ１．２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ５０５９４）、Ｈ．グリセア変種サーモイデア（H. grisea var. thermoidea）ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｄ６３５１５）ＣＢＨＩ．２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１２３４４１）、又はｅｘｏ  １（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ００３１０５）、Ｍ．アルボマイセス（M. albomyces）Ｃｅｌ７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ５１５７０５）、Ｎ．クラッサ（N. crassa）ＣＢＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ７７７７８）、Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）ＣＢＨＩ（Ｃｅｌ７Ａ）（米国特許第２００７０１４８７３０号）、Ｐ．ジャンチネラム（P. janthinellum）ＣＢＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｓ５６１７８）、Ｐ．クリソスポラム（P. chrysosporium）ＣＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ２２２２０）、又はＣＢＨＩ−２（Ｃｅｌ７Ｄ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２２６５６）、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）ＣＢＨ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４３９９３５）、Ｔ．ビリデ（T. viride）ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５３９３１）、又はＶ．ボルバセア（V. volvacea）Ｖ１４ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５６６９３）から選択することができる。
【０３０９】
５．３．６．全セルラーゼ
本開示の酵素配合物／組成物には、更に全セルラーゼを含有させてよい。本明細書で使用するとき、「全セルラーゼ」は、少なくとも３種の異なる酵素型：（１）エンドグルカナーゼ、（２）セロビオヒドロラーゼ、及び（３）β−グルコシダーゼを含むか、あるいは少なくとも３種の異なる酵素活性：（１）エンドグルカナーゼ活性（β−１，４結合の内部の切断を触媒し、より短いグルコオリゴ糖を生成する）、（２）セロビオヒドロラーゼ活性（セロビオース単位（β−１，４グルコース−グルコース二糖）の「エキソ」型の生成を触媒する）、及び（３）β−グルコシダーゼ活性（短鎖セロオリゴ糖（例えば、セロビオース）からのグルコースモノマーの生成を触媒する）、を含む、天然に得られる又は非天然に得られるセルラーゼ含有組成物のいずれかを指す。
【０３１０】
「天然に生じるセルラーゼ含有」組成物は、セロビオヒドロラーゼ型の成分又は活性物質を１つ以上、エンドグルカナーゼ型の成分又は活性物質を１つ以上、及びβ−グルコシダーゼ型の成分又は活性物質を１つ以上含む、天然に生じる供給源により生成される組成物であり、これらの成分又は活性物質のそれぞれは、人工的に加工されていない、天然に生じる比及び濃度で見出される。したがって、天然に生じるセルラーゼ含有組成物は、例えば、セルロース分解酵素に関する改質を受けていない微生物（天然微生物により天然に生成される場合と比べて酵素成分の比又は濃度が変更されていないものなど）により生成される。「非天然に生じるセルラーゼ含有組成物」は、（１）セルロース分解酵素成分を、天然に生じる比、又は非天然に生じる、すなわち変更された比のいずれかで組み合わせること、あるいは、（２）セルロース分解酵素を１つ以上過剰発現するよう、あるいは過小発現するよう微生物を改変すること、あるいは、（３）セルロース分解性酵素を少なくとも１つ欠失するよう微生物を改変すること、により生成される組成物を指す。「非天然に生じるセルラーゼ含有」組成物は、天然に生じる微生物を非天然条件下で増殖させ、濃度又は比を変更させて酵素を生成させるよう、天然に生じる微生物のための培養条件を調整することで得られる組成物も指す。したがって、一部の実施形態では、本開示の全セルラーゼ調製物では、１つ以上のＥＧ及び／又はＣＢＨ及び／又はβ−グルコシダーゼが欠失しており、及び／又は過剰発現している。
【０３１１】
全セルラーゼ調製物は、セルロース系材料を加水分解することのできる任意の微生物由来のものであってよい。例えば、全セルラーゼ調製物は、糸状菌の全セルラーゼである。例えば、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、エメリセラ（Emericella）、フザリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、スシタリジウム（Scytalidium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、又はトリコデルマ属由来のものであり得る。全セルラーゼ調製物は、例えば、アスペルギルス・アキュリタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、又はコウジカビ（Aspergillus oryzae）の全セルラーゼである。全セルラーゼ製剤は、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、（フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）の全セルラーゼ調製物であり得る。全セルラーゼ調製物は、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、スシタリジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）又はチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）の全セルラーゼ調製物でもあり得る。更に、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（例えば、ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８４，２０，ｐｐ．４６〜５３）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ  １５７０９、ＡＴＣＣ  １３６３１、５６７６４、５６４６６、５６７６７）、又はトリコデルマ・��リデ（Trichoderma viride）（例えば、ＡＴＣＣ  ３２０９８及び３２０８６）の全セルラーゼ調製物であってよい。
【０３１２】
特に好適な全セルラーゼ調製物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ＡＴＣＣ  ５６７６５として入手可能な、Ｔ．リーゼイＲｕｔＣ３０全セルラーゼ調製物であり得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＰ．フニクロサムＡＴＣＣ番号：１０４４６として入手可能な、Ｐ．フニクロサムの全セルラーゼも、好適な全セルラーゼ調製物であり得る。更に、全セルラーゼ調製物は、微生物由来の全セルラーゼ調製物であってよく、例えば、バチルス（Bacillus）又は大腸菌（E. coli）由来のものであってよい。
【０３１３】
全セルラーゼ調製物は、供給業者から入手することもできる。本開示の方法及び組成物での使用に好適な市販のセルラーゼ調製物の例としては、例えば、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）及びＣｅｌｌｉｃ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、並びにＬＡＭＩＮＥＸ（商標）ＢＧ、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）４４Ｌ、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）１００、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）２００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＣＰ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
【０３１４】
全セルラーゼ調製物は、セルロース系材料を加水分解することのできる酵素を発現させる、既知の任意の微生物培養法を用い調製することができる。本明細書で使用するとき、用語、「発酵」は、フラスコ振とう培養法、並びに対象とするセルラーゼ及び／又は酵素を発現させる及び／又は単離するような好適な培地及び条件下で実験室用発酵槽又は工業発酵槽で実施される、連続式、バッチ式、フェドバッチ式又は固体状態での発酵などの小規模又は大規模発酵、を指す。
【０３１５】
概して、微生物は、セルロース系材料を加水分解することのできる酵素の生成に好適な細胞培養培地で培養される。培養は、当該技術分野において既知の手順及び変法を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行なわれる。増殖及びセルラーゼ生成に好適な培地、温度範囲及び他の条件が既知である。例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）にセルラーゼを生産させる際の典型的な温度範囲は２４℃〜２８℃である。
【０３１６】
全セルラーゼ調製物は、全く又はほとんど回復操作及び／又は精製せずに、発酵により生成されたものとして使用することができる。例えば、細胞培養培地にセルラーゼが分泌されたならば、このセルラーゼ含有細胞培養培地を直接使用することができる。全セルラーゼ調製物は、馴化培地（spent cell culture medium）、細胞外酵素及び細胞を含む、未分画の発酵材料成分を含み得る。その一方で、全セルラーゼ調製物は更に、例えば、沈殿、遠心沈降、アフィニティクロマトグラフィー、ろ過、又は同様の操作などの多数の所定の工程で加工することもできる。例えば、全セルラーゼ調製物は、濃縮し、次いで更に精製せずに使用することができる。全セルラーゼ調製物には、例えば、細胞生存率を低下させる、すなわち発酵後に細胞を死滅させる特定の化学製剤を配合することができる。例えば、当該技術分野において既知の方法を用い、細胞を溶解又は透過処理することができる。
【０３１７】
全セルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼ活性は、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用い測定することができる。好適なアッセイは、酵素混合物がＣＭＣに対して作用することで生成される、還元末端の生成量を測定する。ここで、１ユニットは１μｍｏＬ生成物／分を遊離する酵素量である（Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．、Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５９，ｐｐ．２５７〜２６８）。
【０３１８】
全セルラーゼは、β−グルコシダーゼ濃縮セルラーゼ（β-glucosidase-enriched cellulase）であり得る。β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼは、概してβ−グルコシダーゼと、全セルラーゼ調製物を含む。β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼ組成物は、組み換え法により生成することができる。例えば、このような全セルラーゼ調製物は全セルラーゼを生産することのできる微生物でβ−グルコシダーゼを発現させることで得ることができる。例えば、β−グルコシダーゼに富む全セルラーゼ組成物は、同様に全セルラーゼ調製物及びβ−グルコシダーゼを含み得る。本明細書に記載の任意のβ−グルコシダーゼポリペプチド、例えば、β−グルコシダーゼのキメラ／融合ポリペプチドなどが好適なものであり得る。例えば、β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼ組成物は、配合物／組成物中のタンパク質の総重量に基づいて、少なくとも約５重量％、７重量％、９重量％、１０重量％、又は１４重量％、及び最大で約１７重量％、約２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、又は５０重量％のβ−グルコシダーゼを適宜含み得る。
【０３１９】
５．３．７．キシラナーゼ＆  β−キシロシダーゼ
本開示の酵素配合物／組成物は、例えば、１種以上のキシラナーゼを含んでよく、このキシラナーゼはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、又はＡｆｕＸｙｎ５であってもよい。好適なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、又はＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドを本明細書に記載する。
【０３２０】
本開示の酵素配合物／組成物は、所望により１種以上のキシラナーゼに加え、又はこれの代わりに１種以上のキシラナーゼを含む。任意のキシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）を１種以上の追加のキシラナーゼとして加えてよい。好適なキシラナーゼとしては、例えば、Ｃ．サッカロリティカム（C. saccharolyticum）・キシラナーゼ（Ｌｕｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（９）：２６７７〜２６８３）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）キシラナーゼ（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ  ＆  Ｌｉｅｂｅｌ，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（５）：１８１０〜１８１５）、サーマトガ菌種（Thermatoga Sp.）ＦＪＳＳ−Ｂ．１株キシラナーゼ（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７，４１３〜４１７）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）・キシラナーゼ（ＢｃＸ）（米国特許第５，４０５，７６９号）、Ａ．ニガー（A. niger）キシラナーゼ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７９（５）：４２２〜４２８）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）・キシラナーゼ（Ｓｈａｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｇｅｎｅ  １０７：７５〜８２；Ｍｏｒｏｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９：５８７〜５９２；Ｋｌｕｅｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７：４５〜５０）、枯草菌（B. subtilis）キシラナーゼ（Ｂｅｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｇｅｎｅ  ２６（１）：５９〜６５）、Ｃ．フィミ（C. fimi）・キシラナーゼ（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３９：２７〜３５）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）・キシラナーゼ（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３４：３２３９〜３２４７）、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）・キシラナーゼ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：５６９〜５７６）、Ｂ．プミラス（B. pumilus）・キシラナーゼ（Ｎｕｙｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００１，５６：４３１〜４３４；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（１４Ｂ）：７１８７）、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）Ｐ２６２・キシラナーゼ（Ｚａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（８）：２１７９）、又はＴ．ハルジアナム（T. harzianum）キシラナーゼ（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４（４）：７５５〜７５６）が挙げられる。
【０３２１】
キシラナーゼは、キシラナーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで生産できる。例えば、キシラナーゼは、過剰発現又は低発現させることができる。
【０３２２】
本開示の酵素配合物／組成物には、例えば、１種以上のβ−キシロシダーゼを適宜含有させることができる。例えば、β−キシロシダーゼは、第１群のβ−キシロシダーゼ酵素（例えば、Ｆｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａ）又は第２群のβ−キシロシダーゼ酵素（例えば、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１）である。例えば、本開示の酵素配合物／組成物には、１種以上の第１群のβ−キシロシダーゼ及び１種以上の第２群のβ−キシロシダーゼを適宜含有させることができる。
【０３２３】
本開示の酵素配合物／組成物には、所望により、上記の第１群の及び／若しくは第２群のβ−キシロシダーゼに加えて又はこれの代わりに１種以上のβ−キシロシダーゼを含有させることができる。任意のβ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）を追加のβ−キシロシダーゼとして使用することができる。好適なβ−キシロシダーゼとしては、例えば、Ｔ．エマーソニィ（T. emersonii）Ｂｘｌ１（Ｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０５（３）：５７９〜８５）、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）β−キシロシダーゼ（Ｓｈａｌｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：３８７〜３９７）、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）β−キシロシダーゼ（Ｚａｎｏｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１７０〜１７６）、Ｔ．リグノラム（T. lignorum）β−キシロシダーゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：６６２〜６７１）、アワモリコウジカビ（A. awamori）β−キシロシダーゼ（Ｋｕｒａｋａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７２６：２７２〜２７９）、Ａ．バーシカラー（A. versicolor）β−キシロシダーゼ（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１９３１〜１９３８）、ストレプトマイセス菌種（Streptomyces sp.）β−キシロシダーゼ（Ｐｉｎｐｈａｎｉｃｈａｋａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７２７〜７３３）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）β−キシロシダーゼ（Ｘｕｅ  ａｎｄ  Ｓｈａｏ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６：１５１１〜１５１５）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）ＳＹ  β−キシロシダーゼ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６４３〜６４５）、Ａ．ニガー（A. niger）β−キシロシダーゼ（Ｏｇｕｎｔｉｍｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｌｌｙ，１９８０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２２：１１４３〜１１５４）、又はＰ．ウォルトマニ（P. wortmanni）β−キシロシダーゼ（Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：２３６７〜２３７９）が挙げられる。
【０３２４】
β−キシロシダーゼは、β−キシロシダーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで生産できる。β−キシロシダーゼは、一定の条件下で、過剰発現又は低発現させることができる。
【０３２５】
５．３．８．Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ
本開示の酵素配合物／組成物には、例えば、１種以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを適宜含有させることができる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ又はＦｖ５１Ａポリペプチドである。
【０３２６】
本開示の酵素配合物／組成物は、所望により、前述のＬ−α−アラビノフラノシダーゼに加えて、又はこれの代わりに１種以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含む。任意の好適な生物由来のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）を追加のＬ−α−アラビノフラノシダーゼとして使用することができる。好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼとしては、例えば、ニホンコウジカビ（A. oryzae）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、ショウユコウジカビ（A. sojae）（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．２００５，５２：２６１〜２６５）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，１４：４７４〜４８２）、Ｂ．ブレビ（B. brevei）（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，６９：７１１６〜７１２３）、Ｂ．ロンガム（B. longum）（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，６９：５０９６〜５１０３）、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００６，３９５：３１〜３７）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（Ｐａｎａｇｉｏｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４９：６３９〜６４４）、Ｆ．オキシスポラムｆ．菌種ジアンチ（F. oxysporum f. sp. dianthi）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）Ｔ−６（Ｓｈａｌｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：４３６６７〜４３６７３）、大麦（H. vulgare）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：５３７７〜５３８７）、アオカビ（P. chrysogenum）（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００３，１６２１：２０４〜２１０）、ペニシリウム菌種（Penicillium sp.）（Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４９：５８〜６４）、Ｐセルローサ（P. cellulosa）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｒ．プシラス（R. pusillus）（Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００３，３３８：１４６９〜１４７６）、Ｓ．シャトリューシス（S. chartreusis）、Ｓ．サーモビオラカム（S. thermoviolacus）、Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）、Ｔ．キシラニリティカス（T. xylanilyticus）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｔ．フスカ（T. fusca）（Ｔｕｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，（Ｐｒａｈａ）４８：１６８〜１７２）、��．マリティマ（T. maritima）（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ２００５，９：３９９〜４０６）、トリコデルマ菌種（Trichoderma sp.）ＳＹ（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，４８：７〜１０）、カワチコウジカビ（A. kawachii）（Ｋｏｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００６，１７６０：１４５８〜１４６４）、Ｆ．オキシスポラムｆ．菌種ジアンチ（F. oxysporum f. sp. dianthi）（Ｃｈａｃｏｎ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．２００４，６４：２０１〜２０８）、Ｔ．キシラニリティカス（T. xylanilyticus）（Ｄｅｂｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２００２，１５：２１〜２８）、Ｈ．インソレンス（H. insolens）、Ｍ．ギガンテウス（M. giganteus）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００７，２３：１００〜１０７）、又はＲ．サチバス（R. sativus）（Ｋｏｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．２００６，５７：２３５３〜２３６２）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼが挙げられる。
【０３２７】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼをコードしている内在性又は外来性遺伝子を発現させることで生産できる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、一定の条件下で過剰発現又は低発現させることができる。
【０３２８】
５．３．９．セロビオースデヒドロゲナーゼ
用語「セロビオースデヒドロゲナーゼ」は、アクセプターの存在下でセロビオノ−１，５−ラクトンの還元型アクセプターセロビオースへの変換を触媒する、Ｅ．Ｃ．１．１．９９．１８の酸化還元酵素を指す。２，６−ジクロロインドフェノールは、鉄、酸素分子、ユビキノン、又はシトクロムＣ、又はその他のポリフェノール同様、アクセプターとして機能することができる。セロビオースデヒドロゲナーゼの基質としては、限定するものではないが、セロビオース、セロオリゴ糖、ラクトース、及びＤ−グルコシル−１，４−β−Ｄ−マンノース、グルコース、マルトース、マンノビオース、チオセロビオース、ガラクトシル−マンノース、キシロビオース、及びキシロースが挙げられる。電子供与体としては、還元末端にグルコース又はマンノースを有するβ−１−４ジヘキソン、α−１−４−ヘキソシド、ヘキソース、ペントース、及びβ−１−４−ペントマーが挙げられる。Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１３８３：４８〜５４；Ｓｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０：５６５〜５７１を参照されたい。
【０３２９】
セロビオースデヒドロゲナーゼの２つのファミリーは、本開示の酵素組成物に適宜含有させることができ、又は本明細書に記載の遺伝子操作を施した宿主細胞ファミリー１及びファミリー２により発現させることができる。この２つのファミリーは、ファミリー１にはセルロース結合モチーフが存在するのに対しファミリー２にはそれが存在しないという点で異なっている。セロビオースデヒドロゲナーゼの３次元構造は２つの球状ドメインを示し、その各々は補因子のヘム又はフラビンのうちのいずれかを含有している。活性部位は２つのドメイン間の間隙に存在する。セロビオースデヒドロゲナーゼの触媒するサイクルは、規則正しく連続する機序に従う。セロビオースからフラビンへの２つの電子の移動により、セロビオースが酸化され、セロビオノ−１，５−ラクトン及び還元型フラビンが生成される。次に、ヘム基への電子の移動により活性型ＦＡＤが生成され、還元型のヘムが残される。第２の活性部位で基質を酸化させる反応により、天然状態のヘムが再生される。
【０３３０】
酸化させる基質は、フェリシアン化鉄、シトクロムＣ、又は酸化型フェノール化合物であってよく、例えば、比色分析に一般的に使用される基質のジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）であってよい。金属イオン及びＯ２も酵素に好適な基質であるものの、これらの基質を使用した場合、セロビオースデヒドロゲナーゼの反応速度は、鉄又は酸化型有機化合物を基質として使用した場合と比較してかなり遅くなる。セロビオノラクトンの生成後、生成物には自発的に開環させて、セロビオン酸を生成することもできる。Ｈａｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：７１６０〜６６を参照されたい。
【０３３１】
５．３．１０．他の成分
本開示の遺伝子操作型酵素配合物／組成物は、例えば、更に好ましくはアクセサリタンパク質を１つ以上含む。アクセサリタンパク質の例としては、限定するものではないが、マンナナーゼ（例えば、エンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、及びβ−マンノシダーゼ）、ガラクタナーゼ（例えば、エンド型及びエキソ型ガラクタナーゼ）、アラビナーゼ（例えばエンド型アラビナーゼ及びエキソ型アラビナーゼ）、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ（例えば、フェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、クマリン酸エステラーゼ又はペクチンメチルエステラーゼ）、リパーゼ、その他グリコシドヒドロラーゼ、キシログルカナーゼ、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、スオレニン（swollenins）、エクスパンシン（expansins）、及びセルロース破壊タンパク質が上げられる。特定の実施形態では、セルロース破壊タンパク質はセルロース結合モジュールである。
【０３３２】
５．４．方法及び工程
したがって、本開示は、ヘミセルロース及び場合によりセルロースを含む、バイオマス材料の糖化工程を更に提供する。代表的なバイオマス材料としては、限定するものではないが、トウモロコシ穂軸、スイッチグラス、サトウモロコシ、及び／又はバガスが挙げられる。したがって、本開示は、ヘミセルロース及び場合によりセルロースを含む本明細書に記載のバイオマス材料を、本明細書に記載されるとおりの酵素配合物／組成物により処理する工程を含む、糖化工程を提供する。本発明のこのような工程で使用される酵素配合物／組成物は、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇにつき、１ｇ〜４０ｇ（例えば、２ｇ〜２０ｇ、３ｇ〜７ｇ、１ｇ〜５ｇ、又は２ｇ〜５ｇ）含有する。このような工程で使用される酵素配合物／組成物には、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇあたり１ｇ〜５０ｇ（例えば、２ｇ〜４０ｇ、４ｇ〜２０ｇ、４ｇ〜１０ｇ、２ｇ〜１０ｇ、３ｇ〜７ｇ）含有させてもよい。このような工程で使用される酵素配合物／組成物には、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇあたり０．５ｇ〜２０ｇ（例えば、１ｇ〜１０ｇ、１ｇ〜５ｇ、２ｇ〜６ｇ、０．５ｇ〜４ｇ、又は１ｇ〜３ｇ）含有させてもよい。酵素配合物／組成物には、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを、バイオマス材料中のセルロース１ｋｇあたり１ｇ〜１００ｇ（例えば、３ｇ〜５０ｇ、５ｇ〜４０ｇ、１０ｇ〜３０ｇ、又は１２ｇ〜１８ｇ）含有させてもよい。所望により、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドの総重量の最大で５０％を構成する。
【０３３３】
本発明の好適な工程は、好ましくは、処理されるバイオマス材料のヘミセルロースキシランから、収率６０％〜９０％でキシロースを生成する。好適なバイオマス材料としては、例えば、トウモロコシ穂軸、スイッチグラス、サトウモロコシ、及び／又はバガスのうちの１種以上が挙げられる。このようなものとして（As suich）、本発明の工程は、好ましくは、これらの１種以上のバイオマス材料由来のヘミセルロースキシランから、少なくとも収率７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％）でキシロースを生成する。例えば、本工程により、限定するものではないが、トウモロコシ穂軸、スイッチグラス、サトウモロコシ、及び／又はバガスなどの、ヘミセルロースを含むバイオマス材料のヘミセルロースキシランから、収率６０％〜９０％でキシロースが生成される。
【０３３４】
本発明の工程には、所望により、更に単糖を回収する工程を包含させる。バイオマスの糖化だけではなく、本開示の酵素及び／又は酵素配合物は、工業用、農業用、食品及び飼料、並びに食品及び飼料用サプリメントの加工工程に使用することができる。適用例を以下に記載する。
【０３３５】
５．４．１．木材、紙材及びパルプ処理
本開示の酵素、酵素配合物／組成物及び方法は、木材、木製品、木材廃棄物又は副産物、紙材、紙製品、紙パルプ若しくは木材パルプ、クラフトパルプ、又は木材若しくは紙材の再利用処理又は工業加工に使用することができる。これらの工程には、例えば、木材、木材パルプ、古紙、紙材、若しくはパルプを処理する工程又は木材若しくは紙材に脱インキさせる工程が包含される。本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、例えば、紙パルプ、又は再生紙若しくは再生紙パルプなどの処理／前処理に使用することができる。紙材、パルプ、再生紙又は紙パルプの処理／前処理材に含有させる場合、本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、紙の輝度を上昇させるために利用することができる。紙材の等級がより高くなるにつれ輝度はより高くなるものと見なせる。輝度は、光学走査装置による走査性能を付与する。このような場合、酵素、酵素配合物／組成物及び方法／工程は、インクジェット紙、レーザー用紙、及びフォトプリント用紙などの高級「上白」紙（“bright” papers）を製造するのに使用できる。
【０３３６】
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、例えば、木材、綿、麻、亜麻又はリネン由来の繊維などの、数多くのその他のセルロース材料を加工又は処理するのに使用できる。
【０３３７】
したがって、本開示は、本開示の酵素、酵素配合物／組成物を用いる木材、木材パルプ、紙材、紙パルプ、古紙、又は木材若しくは紙材の再生利用処理工程を提供する。
【０３３８】
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、例えば新聞紙などの、印刷面を持つ古紙の脱インキ、又は非接触式に印刷された印刷面を持つ古紙、例えば、乾式電子写真方式でレーザープリントされた印刷面を持つ古紙の脱インキ、並びに接触式及び非接触式の印刷を組み合わせて印刷された印刷面を持つ古紙の脱インキに使用することができる（米国特許第６，７６７，７２８号又は同第６，４２６，２００号；Ｎｅｏ，Ｊ．Ｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１９８６，６（２）：１４７）。また、パルプが含有しているキシランを液相に抽出し、得られた液相中のキシランを、キシランをキシロースに加水分解するのに十分な条件で処理し、キシロースを回収する工程を包含する手順において、製紙等級の広葉樹材製パルプからキシロースを生成する際にも使用することができる。例えば、抽出工程には、パルプ又はアルカリ可溶性材料の水性懸濁液を酵素又は酵素配合物／組成物により少なくとも１回処理することを包含させることができる（米国特許第６，５１２，１１０号を参照されたい）。本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、広葉樹繊維、広葉樹繊維及び針葉樹繊維の混合物、古紙、例えば、米国特許第６，２５４，７２２号に記載されるような、未印刷の封筒、脱インキした封筒、未印刷の帳簿用紙、脱インキした帳簿用紙、及び同様物、からなる再生紙製品などのセルロース系繊維から、パルプを溶解させるために使用することができる。
【０３３９】
５．４．２．繊維類及び繊維製品の処理
本開示は、本開示の酵素、酵素配合物／組成物を１種以上用い、繊維類及び布地を処理する方法を提供する。酵素、酵素配合物／組成物は、当該技術分野において既知である任意の繊維又は布地処理法に使用することもできる。例えば、米国特許第６，２６１，８２８号；同第６，０７７，３１６号；同第６，０２４，７６６号；同第６，０２１，５３６号；同第６，０１７，７５１号；同第５，９８０，５８１号；米国特許公報第２００２０１４２４３８（Ａ１）号を参照されたい。例えば、本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、繊維及び／又は布地の湯通し（desizing）に使用できる。例えば、溶液中で、布地を本開示の酵素又は酵素配合物／組成物と接触させる工程を含む方法により、布地の手触り及び外観を向上させることができる。所望により、布地は圧力下で溶液により処理される。本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、染みを除去させる際にも使用できる。
【０３４０】
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、繊維（例えば、綿、麻、亜麻又はリネン製繊維）、縫製した布地及び未縫製の布地、例えば、編物、織布、デニム生地、糸、並びに綿製の、綿混の、又は天然の若しくは人工のセルロース若しくはこれらのブレンドから製造されたタオルを含む、その他の数多くのセルロース系材料を処理するために使用することができる。繊維製品の処理工程は、例えば、こすり洗い及び／又は漂白などの、繊維製品のその他の処理法と共に使用することができる。例えば、こすり洗いは、綿繊維から非セルロース系材料、例えば、角質（主にワックスからなる）及び一次細胞壁（主にペクチン、タンパク質及びキシログルカンからなる）を除去する。
【０３４１】
５．４．３．食品処理及び食品加工
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、食品加工業において数多くの用途を有する。例えば、含油量の多い植物材料からの、例えば、含油量の多い種からの油の抽出を向上するのに使用できる。本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、大豆由来の大豆油、オリーブ由来のオリーブ油、菜種由来の菜種油、又はヒマワリ由来のヒマワリ油を抽出するのに使用できる。
【０３４２】
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、植物細胞材料の成分を分離する際にも使用できる。例えば、植物細胞の各成分を分離する際に使用できる。本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、作物からタンパク質、油、及び外皮画分を分離する際にも使用できる。分離工程は、既知の手法を用い実施することができる。
【０３４３】
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、上記の使用法に加え、果汁又は野菜汁、シロップ、及び抽出液などの調製時の収率を向上させるために使用することができる。植物細胞壁に由来する様々な材料、又は廃棄物、例えば、穀類（cereals）、穀物（grains）、ワイン、又はジュース製品、又は農業廃棄物、例えば、野菜のへた（hull）、豆のさや、サトウダイコンパルプ、オリーブパルプ、ポテトパルプ、及び同様物の酵素処理に使用することもできる。更に、加工した果実又は野菜の稠度及び／又は外観を改良するために使用することができる。植物材料を処理する際に、植物材料（例えば、食品など）の加工、植物成分の精製又は抽出を容易にするために使用することができる。本開示の酵素及び配合物／組成物を使用することで、栄養価を改良すること、水結合能を低下させること、排水プラント内での分解性能を改良すること、及び／又は植物材料をエンシレージに変換する変換効率を改良することなどが可能になる。
【０３４４】
本明細書に記載の酵素、酵素配合物／組成物は、焼成用途に使用できる。例えば、機械による取り扱い及びビスケット大への成形が難しくない、粘り気の少ないパン生地を作製する際に使用できる。焼成した製品が急速に再水和され、サクサク感が損なわれたり及び品質保持期限が短縮されたりするのを防ぐ目的で、アラビノキシランを加水分解するために使用することもできる。例えば、パン生地の加工時に添加剤として使用される。
【０３４５】
５．４．４．動物用飼料及び食品又は飼料添加物又は食品添加物
本開示の酵素及び配合物／組成物を用い、動物用飼料／食品及び食品又は食品添加物（サプリメント）を処理する際の方法が提供される。動物には、哺乳動物（例えば、ヒト）、鳥類、及び魚類などが包含される。本開示は、本開示の酵素及び酵素配合物／組成物を含む動物用飼料、食品及び添加物（サプリメント）を提供する。酵素を用い動物用飼料、食料及び添加物を処理することで、動物用飼料又は添加物（サプリメント）中の栄養素の、例えば、デンプン、タンパク質、及び同様物の利用効率を増加させることができる。難分解性タンパク質を消化することで、又は間接的に若しくは直接的にデンプン（又は他の栄養素）を脱マスキングすることで、酵素及び配合物／組成物は、栄養素を他の内在性又は外来性の酵素にとって利用しやすいものにする。これらの酵素は、容易に消化できかつ容易に吸収することのできる栄養素及び糖を、単に生成することもできる。
【０３４６】
動物用飼料に添加する場合、本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、腸の粘度を低下させることによりインビボでの植物細胞壁材料の分解性を改善し（例えば、Ｂｅｄｆｏｒｄｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９９３，ｐｐ．７３〜７７を参照されたい）、これにより植物栄養素を動物にとってより利用しやすいものにする。したがって、飼料に本開示の酵素、酵素配合物／組成物を使用することで、動物の成長速度及び／又は飼料効率（すなわち、体重増加に対する飼料摂取重量）を改良することができる。
【０３４７】
本開示の動物用飼料用添加物は、飼料成分と容易に混合することのできる粒状酵素製品であり得る。あるいは、本開示の食事用添加物は、プレミックス成分を形成し得る。本開示の粒状酵素製品は、コーティングしてもしなくてもよい。酵素粒剤の粒径は、飼料及び／又はプレミックス成分の粒径と混合可能なものである。このような酵素粒剤は、酵素を飼料に組み込むのに安全でかつ容易な手段を提供する。あるいは、本開示の動物用飼料添加物は、安定化された液体組成物であり得る。この液体組成物は、水系又は油系スラリーであり得る。例えば、米国特許第６，２４５，５４６号を参照されたい。
【０３４８】
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、例えば、穀物、穀類、トウモロコシ、大豆、ナタネ、ルピナス及び同様物などの、遺伝子組み換え飼料作物（例えば、遺伝子組み換え植物、種及び同様物など）で直接発現させた酵素により供給され得る。上記のように、本開示は、本開示のポリペプチドをコードしている核酸配列を含む遺伝子組み換え植物、植物部位及び植物細胞を提供する。核酸は、本開示の酵素が回収可能な量で産生されるように発現する。キシラナーゼは、任意の植物、又は植物部位から回収することができる。あるいは、組み換えポリペプチドを含有している植物、又は植物部位は、それ自体が、食品、又は飼料の品質の改善のために、例えば、栄養価、味、及びレオロジー特性が改善のために、又は栄養のない要素を破壊するために使用することもできる。
【０３４９】
本開示は、動物種により消費される前に、本開示の酵素、酵素配合物／組成物を用いて飼料からオリゴ糖を除去するような方法を提供する。このプロセスでは、代謝可能なエネルギー価が増加した飼料が作製される。本開示の酵素、酵素配合物／組成物に加えて、ガラクトシダーゼ、セルラーゼ及びこれらの組み合わせを使用できる。
【０３５０】
他の態様では、本開示は、本開示の組み換え酵素を含有している栄養補助サプリメントを調製し、栄養補助サプリメントを動物に投与することで、動物により消化される食物中に含有されているヘミセルラーゼの利用を増加させることにより、本開示の酵素酵素配合物／組成物を、栄養サプリメントとして動物用飼料に利用する方法を提供する。
【０３５１】
５．４．５廃棄物処理
本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、その他の各種工業用途、例えば、廃棄物処理に使用できる。例えば、一態様では、本開示は、本開示の酵素、酵素配合物／組成物を用いる固体ゴミの消化工程を提供する。この方法は、実質的に未処理の固体ゴミの質量及び体積を減少させることを含み得る。固体ゴミは、酵素溶液の存在下で（本開示の酵素、酵素配合物／組成物を含む）、制御温度下での、酵素による消化プロセスにより処理することができる。この処理は、添加した微生物に由来する、感知され得るようなバクテリア発酵以外の反応によるものである。固体ゴミを、液化ゴミ及び残渣固形ゴミに変換させる。生じる液化ゴミを、前述の任意の残渣固化ゴミから分離することができる。例えば、米国特許第５，７０９，７９６号を参照のこと。
【０３５２】
５．４．６洗剤、殺菌剤及びクリーニング組成物
本開示は、本開示の酵素、酵素配合物／組成物を１種以上含む洗剤、殺菌剤、又はクレンザー（クリーニング、又はクレンジング）組成物、並びにこれらの組成物の製造方法及び使用方法を提供する。本開示は、洗剤、殺菌剤、又はクレンザー組成物の全ての既知の製造方法及び使用方法を組み込むものであり、例えば、米国特許第６，４１３，９２８号；同第６，３９９，５６１号；同第６，３６５，５６１号；同第６，３８０，１４７号を参照されたい。
【０３５３】
特定の実施形態では、洗剤、殺菌剤、又はクレンザー組成物は、１部及び２部式の水性組成物、非水性液体組成物、鋳造固体、顆粒形態、粒子形態、圧縮錠、ゲル及び／又はペースト並びにスラリー形態であり得る。本開示の酵素、酵素配合物／組成物は、固体、又は液体形態の、洗剤、殺菌剤、又はクレンザー添加剤製品として使用することもできる。このような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補う、又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の工程で添加することができる。
【０３５４】
本開示は、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物、布地クリーニング用の洗剤組成物、食器洗浄用組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、及びコンタクトレンズ洗浄液を包含するクリーニング組成物を提供する。
【０３５５】
本開示の酵素が、洗濯機による洗浄法に使用するのに好適な組成物の成分である場合、組成物は、本開示の酵素、酵素配合物／組成物に加え、界面活性剤及びビルダー化合物の両方を含み得る。これらには更に、１種以上の洗剤成分、例えば、有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、酸化カルシウム石鹸分散剤（lime-soap dispersants）、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、並びに腐食防止剤を含み得る。
【０３５６】
本開示の洗濯用組成物には、追加の洗剤成分として柔軟剤を含有させることもできる。カルボヒドラーゼを含有しているこのような組成物は、洗濯洗剤組成物として処方された場合に布地洗浄、染み除去、白色度の維持、柔軟化、顕色、移染防止及び衛生化を提供し得る。
【０３５７】
５．４．７．工業用方法、商用方法及びビジネス方法
本開示のセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、更に、工業的及び／又は商業的環境に使用できる。したがって、方法、すなわちインスタント式セルラーゼ及び非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物の製造、販売、あるいは市販方法も企図される。
【０３５８】
特定の実施形態では、セルラーゼポリペプチドとしては、例えば、エンドグルカナーゼポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドなどのＧＨ６１エンドグルカナーゼ）、β−グルコシダーゼポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＰａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｆｖ３Ｃ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ及びＴｎ３Ｂポリペプチド、このポリペプチドは、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、及び７９のうちの任意の配列と少なくとも約６０％配列同一性を有する、及び／又は少なくとも２種のβ−グルコシダーゼ配列を含む融合／キメラポリペプチド、このポリペプチドの第１のβ−グルコシダーゼ配列は少なくともアミノ酸残基約２００個分の長さであり、かつ配列番号９６〜１０８のうちの１つ以上又は全てを含むのに対し、第２のβ−グルコシダーゼ配列は、少なくともアミノ酸残基約５０個分の長さであり、かつ配列番号１０９〜１１６のうちの１つ以上又は全てを含む）、セロビオヒドロラーゼポリペプチド、及びヘミセルロースポリペプチド、例えばβ−キシロシダーゼポリペプチド、キシラナーゼポリペプチド、及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼポリペプチド、が挙げられ、並びに上記ポリペプチドを含むセルラーゼ組成物及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、特定のエタノール（バイオエタノール）精製業者又はその他のバイオケミカル又はバイオマテリアル製造業者に供給又は販売することができる。第１の例では、非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、工業規模での酵素の製造に特化した酵素製造施設で製造することができる。次に、非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は包装することができ、又は酵素製造業に関係する顧客に販売することができる。本明細書では、この運用戦略を「商用酵素供給モデル」と呼ぶ。
【０３５９】
他の運用戦略では、本発明の非天然に得られるセルラーゼ及びヘミセルラーゼ組成物は、バイオエタノール精製所又はバイオケミカル／バイオマテリアル製造所（「オン・サイト」）に又はその周辺に位置する施設で酵素製造業者により構築される酵素生産系に関係する形態で生産することができる。一部の実施形態では、酵素の供給契約は、酵素製造業者と、バイオエタノール精製業者又は生化学的／バイオマテリアル製造業者とにより締結される。酵素製造業者は、本明細書に記載されるとおりの、現場で宿主細胞を用いる酵素生産系、発現方法、及び生産方法を設計し、制御し、操作して、非天然に得られるセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物を生産する。特定の実施形態では、好適なバイオマスに対し好ましくは本明細書に記載のとおりに適切に前処理を行い、バイオエタノール精製所又は生化学的／バイオマテリアル製造施設にて、又はその付近で、糖化方法並びに本明細書の酵素及び／又は酵素組成物を用いて加水分解することができる。次に、得られる発酵性糖質を用い、同じ施設で、又は近隣の施設で発酵を行うことができる。この運用戦略を、本明細書では「オン・サイト・バイオリファイナリーモデル」と呼ぶ。
【０３６０】
オン・サイト・バイオリファイナリーモデルは、例えば、酵素供給業者から購入する必要のある酵素を最小限に抑える自給自足型運用法を提供するなど、酵素の商用供給モデルに対し一定の利点を提供する。その他に、このモデルにより、バイオエタノール精製所又は生化学的／バイオマテリアル製造施設は、リアルタイムでの又はほぼリアルタイムでの要求に応じ酵素の供給をより良好に調節しやすくなる。特定の実施形態では、互いに近接している２箇所以上のバイオエタノール精製所及び／又は生化学的／バイオマテリアル製造所間で共有することのできる、オン・サイトの酵素生産設備が企図され、この様な設備により、酵素の輸送及び貯蔵費用が削減される。更に、このモデルでは、オン・サイトの酵素生産設備を改良した、より近接した「差し込み（drop-in）」法が可能になり、この手法では、酵素組成物を改良してから、発酵性糖質、究極的にはバイオエタノール又はバイオケミカルをより高収率で生産するまでのタイムラグが減少する。
【０３６１】
オン・サイト・バイオリファイナリーモデルは、本明細書に記載のセルラーゼ及び非天然に得られるヘミセルラーゼ組成物だけでなく、デンプン（例えば、トウモロコシ）をより効率的にかつ有効に加工してバイオエタノール／バイオケミカルへと直接変換させることのできるこれらの酵素及び酵素組成物も、製造、供給、及び生産に使用することのできる、バイオエタノール及びバイオケミカルの工業生産及び商業化においてより一般的な適用法を有する。特定の実施形態では、デンプン加工酵素は、オン・サイト・バイオリファイナリーで製造した後、バイオエタノールを製造する目的で容易にバイオエタノール精製所又は生化学的／生物材料製造施設に組み入れることができる。
【０３６２】
したがって、特定の態様では、本発明は、特定のバイオエタノール、バイオ燃料、バイオケミカル又はその他のバイオマテリアルの製造及び市販時に、本明細書に記載の酵素（例えば、特定のβ−グルコシダーゼポリペプチド（変異体（variants）、変異体（mutants）又はキメラポリペプチド）、及び特定のＧＨ６１エンドグルカナーゼ（変異体（variants）、及び変異体（mutants）など））、細胞、組成物、並びに工程を提供する、特定のビジネス方法にも関係する。一部の実施形態では、本発明は、オン・サイト・バイオリファイナリーモデルでのこのような酵素、細胞、組成物及びプロセスの利用に関する。他の実施形態では、本発明は、商用酵素供給モデルでのこのような酵素、細胞、組成物及びプロセスの利用に関する。
【実施例】
【０３６３】
６．１  実施例１：アッセイ／方法
以下のアッセイ／方法を、概して、以降に記載の実施例において使用した。以下に提供するプロトコルに由来する任意の変法を、具体例に示す。
【０３６４】
６．１．１．Ａ．バイオマス基質の前処理
酵素により加水分解する前に、国際公開第０６１１０９０１（Ａ）号に記載の方法及び加工条件により、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、及びスイッチグラスを前処理した（別途記載がない限りこの手法による）。前処理についてのこれらの参照は、米国特許第２００７−００３１９１８（Ａ１）号、同第２００７−００３１９１９（Ａ１）号、同第２００７−００３１９５３（Ａ１）号、及び／又は同第２００７−００３７２５９（Ａ１）号の開示にも包含される。
【０３６５】
アンモニア繊維爆砕した（ＡＦＥＸ）トウモロコシ茎葉を、国際ミシガン・バイオテクノロジー協会（Michigan Biotechnology Institute International（ＭＢＩ））から得た。トウモロコシ茎葉の組成は、国際再生可能エネルギー機関（National Renewable Energy Laboratory）（ＮＲＥＬ）の手法（ＮＲＥＬ  ＬＡＰ−００２）を用い測定した（Ｔｅｙｍｏｕｒｉ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１１３：９５１〜９６３）。ＮＲＥＬの手順は：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌにて利用できる。
【０３６６】
ＦＰＰパルプ及び紙材基質は、ＳＭＵＲＦＩＴ  ＫＡＰＰＡ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＵ  ＰＩＮ（フランス）から得た。
【０３６７】
蒸気爆砕させたサトウキビバガス（ＳＥＢ）をＳｕｎＯｐｔａから得た（Ｇｌａｓｓｅｒ，ＷＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １９９８，１４（３）：２１９〜２３５；Ｊｏｌｌｅｚ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒｍｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，１９９４，２：１６５９〜１６６９）。
【０３６８】
６．１．２．Ｂ．バイオマスの組成分析
「バイオマス中の糖及びリグニンの構造決定」［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ  ２００８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｄｆｓ／４２６１８．ｐｄｆ）］に記載の２段階酸加水分解法を使用し、バイオマス基質の組成を測定した。変換率（％）を基質の初期グルカン及びキシラン含量を元にした理論収量と比較して、上記手法を用いた酵素加水分解の結果を本明細書に報告する。
【０３６９】
６．１．３．Ｃ．総タンパク質のアッセイ
ＢＣＡタンパク質アッセイは、タンパク質濃度を分光光度計により測定する比色分析法である。製造元の指示に従って、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、製品番号２３２２７）を使用した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）を用い、試験チューブに酵素希釈物を調製した。１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１ｍＬを含有させた２ｍＬのエッペンドルフ遠心分離チューブに、希釈酵素溶液（０．１ｍＬ）を加えた。チューブをボルテックスにかけ、１０分間アイスバスに置いた。次にこのサンプルを、１４０００ｒｐｍで６分遠心分離させた。上清を除去し、ペレットを１ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨに再懸濁し、ペレットが溶解するまでこのチューブをボルテックスにかけた。２ｍｇ／ｍＬ原液からＢＳＡ標準液を調製した。０．５ｍＬの試薬Ｂと２５ｍＬの試薬Ａとを混合し、ＢＣＡ希釈溶液を調製した。酵素を再懸濁させたサンプルを、３本のエッペンドルフ遠心分離チューブに０．１ｍＬずつ分注した。サンプルを入れた各エッペンドルフチューブと、ＢＳＡ標準を入れたエッペンドルフチューブに、２ｍＬのＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた。全てのチューブを３７℃のウォーターバスで３０分インキュベートした。次にサンプルを室温に冷却し（１５分）、分光光度計により５６２ｎｍで吸光度を測定した。
【０３７０】
各標準に関し、タンパク質吸光度の平均値を算出した。吸光度をｘ軸にとり、濃度（ｍｇ／ｍＬ）をｙ軸にとって、タンパク質標準の平均値をプロットした。各点は等式：
ｙ＝ｍｘ＋ｂと一致した。
【０３７１】
未希釈濃度の酵素サンプルに関しては、ｘ軸の吸光度を減算して算出した。総タンパク濃度は、希釈係数を乗じて算出した。
【０３７２】
精製試料に含まれる総タンパク質量は、Ａ２８０により測定した（Ｐａｃｅ，ＣＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４：２４１１〜２４２３）。
【０３７３】
ヴァイクセルバウム（Weichselbaum）及びゴルナール（Gornall）により改変されたビウレット法により、ウシ血清アルブミンを標準物質として用い、一部のタンパク質サンプルを測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，Ｔ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１９６０，１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４９，１７７：７５２）。
【０３７４】
発酵産物中の総タンパク含量は、場合により、ケルダール法（ｒｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｗｗｗ．ｒｔｅｃｈｌａｂｓ．ｃｏｍ）又は研究室内でＤＵＭＡＳ法（ＴｒｕＳｐｅｃ  ＣＮ，ｗｗｗ．ｌｅｃｏ．ｃｏｍ）（Ｓａｄｅｒ，Ａ．Ｐ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９（２）：７３〜７９）のいずれかを用い、燃焼、並びに放出窒素の捕捉及び測定により総窒素量として測定した。タンパク質を含有している複雑なサンプル（例えば、発酵ブロスなど）については、平均Ｎ含量は１６％とし、窒素からタンパク質への平均係数は６．２５とした。場合によっては、総沈殿タンパク質を測定し、タンパク質以外に由来する窒素による干渉を除外した。最終濃度が１２．５％になるようＴＣＡを用い、タンパク質を含有しているＴＣＡペレットを０．１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁した。
【０３７５】
場合によっては、製造元の推奨に従って、ベターブラッドフォードアッセイ（Better Bradford Assay）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ製品番号２３２３８）としても知られるクーマシープラスを使用した。
【０３７６】
６．１．４  Ｄ．ＡＢＴＳを用いるグルコース測定
グルコース測定用の、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチレンチアゾリン−６）−スルホン酸）アッセイは、グルコース酸化酵素が、Ｏ２の存在下では、グルコースの酸化を触媒しつつ化学量論量の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成するという原理に基づくものであった。この反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によりＡＢＴＳの酸化を触媒する。この反応はＨ２Ｏ２の濃度に直接相関する。酸化ＡＢＴＳの発生は、緑色の発色により示される。この発色をＯＤ  ４０５ｎｍで定量する。暗所で、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）に２．７４ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ粉末（Ｓｉｇｍａ）と０．１Ｕ／ｍＬのＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）と１Ｕ／ｍＬのグルコース酸化酵素（ＯｘｙＧＯ（登録商標）ＨＰ  Ｌ５０００，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳＡ）とを混合した混合液を調製し、保管した。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を用い、グルコース標準（０、２、４、６、８、１０ｎｍｏｌ）を調製した。各９６ウェル平底マイクロタイタープレートに、１０μＬの標準を３ウェルずつ加えた。段階希釈したサンプル１０μＬもプレートに加えた。各ウェルに１００μＬのＡＢＴＳ基質溶液を加え、プレートを分光光度式プレートリーダーに配置した。ＡＢＴＳの酸化を４０５ｎｍで５分読み取りした。
【０３７７】
あるいは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）及び２％  ＳＤＳを含有させた停止液を用い反応を停止させた後、１５〜３０分インキュベートし、サンプルの４０５ｎｍでのＯＤを測定した。
【０３７８】
６．１．５．Ｅ．ＨＰＬＣによる糖分析
０．２２μｍナイロンＳｐｉｎ−Ｘ遠心チューブフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）による遠心ろ過を用い不溶性の成分を除去し、蒸留水を用い可溶性糖類を所望の濃度に希釈して、トウモロコシ穂軸の糖化加水分解物からサンプルを調製した。６×５０ｍｍ  ＳＨ−１０１１Ｐガードカラム（ｗｗｗ．ｓｈｏｄｅｘ．ｎｅｔ）を取り付けたＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ−Ｇ  ＳＨ１０１１，８×３００ｍｍで単糖類を測定した。０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を溶媒として使用し、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを実施した。カラム温度は５０℃に維持し、屈折率を基に検出を行った。あるいは、糖の量は、Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを取り付けたＷａｔｅｒｓ  ２４１０屈折率検出器を用い分析した。分析時間は約２０分であり、注入体積は２０μＬであり、移動相には、０．２μｍフィルタによりろ過し脱気した０．０１Ｎの硫酸を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで用い、カラム温度は６０℃に維持した。グルコース、キシロース、及びアラビノースの外部標準を各サンプルセットに関し溶出させた。
【０３７９】
分子ふるいクロマトグラフィーを用い糖を分離し、オリゴ糖を同定した。Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  Ｇ２０００ＰＷカラム（７．５ｍｍ×６０ｃｍ）を使用した。蒸留水を使用して糖を溶出させた。流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとし、室温のカラムで実施した。六炭糖の標準としては、スタキオース、ラフィノース、セロビオース及びグルコースが挙げられ；五炭糖の標準としては、キシロヘキソース、キシロペントース、キシロテトロース、キシロトリオース、キシロビオース、及びキシロースが挙げられる。キシロオリゴマー標準は購入した（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）。屈折率を基に検出を行った。結果の記録には、ピーク面積単位又は相対的なピーク面積のいずれかを使用した。
【０３８０】
遠心分離及びろ過清澄（上記のとおり）したサンプルを加水分解し、可溶性糖類の総量を測定した。清澄化させた試料は、０．８ＮのＨ２ＳＯ４により１：１希釈した。得られた溶液をバイアル瓶に入れ、蓋をし、１２１℃で１時間オートクレーブ処理した。加水分解時の単糖類の損失について補正を行わずに結果を報告する。
【０３８１】
６．１．６．Ｆ．穂軸からのオリゴマーの調製及び酵素アッセイ
希アンモニアで前処理した乾燥重量２５０ｇのトウモロコシ穂軸と、８ｍｇのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３と、１ｇのグルカン＋キシランと、を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）に加え、インキュベートして、トウモロコシ穂軸をＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３により加水分解させ、オリゴマーを調製した。１８０ｒｐｍで回転振とうさせながら、４８℃で７２時間反応を進行させた。上清を９，０００×Ｇで濃縮させ、次に０．２２μｍ  Ｎａｌｇｅｎｅフィルタによりろ過し、可溶性糖類を回収した。
【０３８２】
６．１．７．Ｇ．トウモロコシ穂軸の糖化アッセイ
特定の変法を示す特定の実施例を除き、本明細書における典型例では、以降の手順に従って、マイクロタイタープレート形式でトウモロコシ穂軸の糖化アッセイを実施した。バイオマス基質、例えば、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を水に希釈し、硫酸によりｐＨ  ５に調整して７％セルローススラリーを調製し、更なる加工は行わずに本アッセイに使用した。トウモロコシ穂軸中のセルロース１ｇあたりの総タンパク質量（ｍｇ）を基に、酵素サンプルを充填した（上掲の従来の組成解析法を用い測定した）。５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）により酵素を希釈し、所望の充填濃度を得た。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸７０ｍｇ（各ウェル７％セルロース）に、４０μＬの酵素溶液を加えた（各ウェルのセルロースの最終濃度は４．５％相当になる）。次に、アッセイプレートをアルミニウム製プレートシーラーで覆い、室温で混合し、５０℃、２００ｒｐｍで３日間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、各ウェルに１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）を１００μＬ加え、糖化反応を停止させ、プレートを３，０００ｒｐｍで５分遠心分離した。９６ウェルＨＰＬＣプレート中で、１０μＬの上清に２００μＬのミリＱ水を添加し、可溶性糖類をＨＰＬＣにより測定した。
【０３８３】
６．１．８．Ｈ．セロビオース加水分解アッセイ
Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，５９（２），２５７〜２６８の手法を用い、セロビアーゼ活性を測定した。セロビオース単位（Ｇｈｏｓｅが記載のとおりに誘導）は、アッセイ条件下で０．１ｍｇグルコースを生成させるのに必要な酵素量により除算し、０．８１５として定義した。
【０３８４】
６．１．９．Ｉ．クロロ−ニトロ−フェニル−グルコシド（ＣＮＰＧ）加水分解アッセイ
マイクロタイタープレートの各ウェルに、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）２００μＬを加えたプレートを覆い、エッペンドルフ・サーモミキサーにおいて３７℃で１５分平衡化させた。個々のウェルに、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）で希釈した５μＬの酵素も加えた。プレートを再度覆い、３７℃で５分間平衡化させた。ミリポア水を用い、２ｍＭの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＮＰＧ，Ｒｏｓｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，ＣＡ）２０μＬを調製し、各ウェルに加え、プレートを手早く分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に移した。ＯＤ  ４０５ｎｍで１５分間動態を読み取り、データをＶｍａｘとして記録した。ＣＮＰの吸光係数を用い、Ｖｍａｘの単位をＯＤ／ｓｅｃからμＭ  ＣＮＰ／ｓｅｃへと変換した。μＭ  ＣＮＰ／ｓｅｃを、本アッセイで使用したタンパク質酵素量（ｍｇ）で除算し、比活性（μＭ  ＣＮＰ／ｓｅｃ／タンパク質（ｍｇ））を割り出した。
【０３８５】
６．１．１０．Ｊ．マイクロタイタープレートを用いる糖化アッセイ
基質に含まれるセルロース１ｇごとの総タンパク質量（ｍｇ）に基づき、精製セルラーゼ及び全セルラーゼの無細胞産物を糖化アッセイに組み入れた。基質のキシラン含量に基づき、精製ヘミセルラーゼを充填した。バイオマス基質としては、例えば、希酸で前処理したトウモロコシ葉茎（ＰＣＳ）、アンモニア繊維膨潤（ＡＦＥＸ）トウモロコシ葉茎、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で前処理したトウモロコシ穂軸、及びアンモニアで前処理したスイッチグラスを記載の固形分濃度（％）で混合し、混合物のｐＨを５．０に調節した。プレートをアルミニウム製プレートシーラーで覆い、予め５０℃に設定しておいたインキュベーターに入れた。振とうさせながら２日間インキュベートした。各ウェルに１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを加え、反応を停止させた。十分混合した後、プレートを遠心分離し、１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０）を１００μＬ含有させたＨＰＬＣプレートで上清を１０倍希釈した。生成された可溶性糖類の濃度を、セロビオース加水分解アッセイ（下記）について記載されるとおりにＨＰＬＣを用い測定した。グルカン変換率（％）は、［グルコース（ｍｇ）＋（セロビオース（ｍｇ）×１．０５６＋セロトリオース（ｍｇ）×１．０５６）］／［基質中セルロース（ｍｇ）×１．１１１］として定義し、キシラン変換率（％）は、［キシロース（ｍｇ）＋（キシロビオース（ｍｇ）×１．０６）］／［基質中キシラン（ｍｇ）×１．１３６］と定義する。
【０３８６】
６．１．１１．Ｋ．カルコフローアッセイ
全ての化合物は分析等級のものを使用した。ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）からＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１を購入した。セロビオース及びカルコフローホワイトは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から購入した。Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２のプロトコールに変更を加え、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１によりリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。簡潔に述べると、Ａｖｉｃｅｌを濃リン酸で可溶化させ、次に冷脱イオン水により沈殿させた。セルロースを回収し、多量の水で洗浄してｐＨを中和させた後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で固形分１％に希釈した。
【０３８７】
全ての酵素希釈液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用い調製した。ＧＣ２２０セルラーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を２．５、５、１０、及び１５ｍｇのタンパク質／Ｇ  ＰＡＳＣへと希釈し、線形の較正曲線を作成した。試験する試料は、較正曲線の範囲内に収まるよう（すなわち、０．１〜０．４フラクション生成物に相当するよう）希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中で、２０μＬの酵素溶液に１５０μＬの１％冷ＰＡＳＣを加えた。プレートを覆い、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター／振とう器において、５０℃、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。５０μｇ／ｍＬカルコフロー／１００ｍＭのグリシン（ｐＨ１０）１００μＬを用い反応を停止させた。励起波長Ｅｘ＝３６５ｎｍ、放出波長Ｅｍ＝４３５ｎｍにて、蛍光マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））で、蛍光を読み取りした。この結果を、等式：
ＦＰ＝１−（Ｆｌサンプル−Ｆｌ緩衝液重量／セロビオース）／（Ｆｌ酵素不含有−Ｆｌ緩衝液重量／セロビオース）
（式中、ＦＰはフラクション生成物であり、Ｆｌ＝蛍光単位である）に従うフラクション生成物として表現する。
【０３８８】
６．１．１２．Ｌ．ソホロース加水分解アッセイ
β−グルコシダーゼのもつソホラーゼ活性を試験するために、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入したソホロース（Ｓ１４０４）を用い、マイクロタイタープレートでアッセイを行った。ソホロースを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）に懸濁して５ｍｇ／ｍＬ原液を調製し、室温で３０分回転ミキサーに設置した。非結合性９６ウェルマイクロタイタープレート（ｃｏｒｎｉｎｇ，０４８０９００９）の平底ウェルにソホロース（ウェルあたり５０μＬ）を分注した。分注した基質を室温で５分保管した。２枚目の平底９６ウェルマイクロタイタープレート（ｃｏｒｎｉｎｇ，０４８０９００９）では、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）によりβ−グルコシダーゼ分子を１０倍連続希釈した。反応プレートをアルミニウム製プレートシーラー（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で覆い、６００ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で３０分インキュベートした（ＴｈｅｒｍｏＣｙｃｌｅｒ）。インキュベートの終了時に、プレート中で、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）により反応物を連続的に２倍希釈した。３枚目の平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，０４８０９００９）に１０μＬの希釈酵素サンプル又はグルコース標準を入れ、９０μＬのＡＢＴＳ試薬を加えた。５分にわたり、反応動態を１５秒毎に４２０ｎｍで観察した。グルコース標準（５ｍｇ／ｍＬ）を利用してグルコース濃度を測定した。
【０３８９】
６．２  実施例２：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み発現株の構築
５種の遺伝子：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ３Ａ、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ４３Ｄ、及びＦ．バーティシリオイド（F. verticillioides）α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａを共発現させて、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の組み込み型発現株を構築した。
【０３９０】
これらの異なる遺伝子の発現カセットの構築、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換を以下に記載する。
【０３９１】
６．２．１．Ａ．β−グルコシダーゼ発現ベクターの構築
ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１のＮ末端領域のコドンをＤＮＡ  ２．０により（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）最適化させた。この合成領域は、コード領域の最初の４４７塩基からなる。プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４１を使用し、この断片をＰＣＲ増幅させた。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、ネイティブなｂｇｌ１遺伝子の残りの領域を、プライマーＳＫ９４０及びＳＫ９４２を使用しＰＣＲ法により増幅させた。プライマーＳＫ９４３及びＳＫ９４２を用い、ｂｇｌ１遺伝子のこれらの２つのＰＣＲ産物を、融合ＰＣＲ反応により融合させた。
順方向プライマーＳＫ９４３：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号１１８）
逆方向プライマーＳＫ９４１：（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’）（配列番号１１９）
順方向プライマー（ＳＫ９４０）：（５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１２０）
逆方向プライマー（ＳＫ９４２）：（５’−ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号１２１）
【０３９２】
得られる融合ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、中間ベクターｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）（図９０Ｂ）を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｂｇｌ１配列を有するｐＥＮＴＲ−９４３／９４２ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによりプロトコルの概要されたＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み替えた。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、最終的な発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２を得た（図９０Ｃを参照されたい）。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ７４５及びＳＫ７７１を使用してこの発現カセットをＰＣＲ増幅させ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換体を作製した。
順方向プライマーＳＫ７７１：（５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号１２２）
逆方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１２３）
【０３９３】
６．２．２  Ｂ．エンドキシラナーゼ発現カセットの構築
プライマーｘｙｎ３Ｆ−２及びｘｙｎ３Ｒ−２を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルからネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３をＰＣＲ増幅させた。
順方向プライマーｘｙｎ３Ｆ−２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧ−３’）（配列番号１２４）
逆方向プライマーｘｙｎ３Ｒ−２：（５’−ＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＧ−３’）（配列番号１２５）
【０３９４】
得られるＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＥｎｔｒｙベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセルを形質転換させ、ベクターを得た（図９０Ｄを参照されたい）。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｘｙｎ３配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによりプロトコルの概要されたＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み替えた。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、最終的な発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｘｙｎ３を得た（図９０Ｅを参照されたい）。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ７４５及びＳＫ８２２を使用してこの発現カセットをＰＣＲ増幅させ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換体を作製した。
順方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１２６）
逆方向プライマーＳＫ８２２：（５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣ−３’）（配列番号１２７）
【０３９５】
６．２．３．Ｃ．β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現ベクターの構築
プライマーＭＨ１２４及びＭＨ１２５を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからＦ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼｆｖ３Ａの遺伝子を増幅させた。
順方向プライマーＭＨ１２４：（５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧ−３’）（配列番号１２８）
逆方向プライマーＭＨ１２５：（５’−ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＡＧ−３’）（配列番号１２９）
【０３９６】
ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、中間ベクターｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａ（図９０Ｆを参照されたい）を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。正しいｆｖ３Ａ配列を有するｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによりプロトコルの概要されたＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ６ｇ（図７９Ａ）で組み替えた。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、最終的な発現ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａを得た（図９０Ｇを参照されたい）。ベクターはまた、ａｌｓＲと表記される、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）アセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）遺伝子のクロリムロンエチル耐性変異体も、そのネイティブなプロモーター及びターミネーターとともに、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）形質転換体の選択マーカーとして含有する（国際公開第２００８／０３９３７０（Ａ１）号）。プライマーＳＫ１３３４、ＳＫ１３３５及びＳＫ１２９９を使用してこの発現カセットをＰＣＲ増幅させ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換体を作製した。
順方向プライマーＳＫ１３３４：（５’−ＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧ−３’）（配列番号１３０）
順方向プライマーＳＫ１３３５：（５’−ＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣ−３’）（配列番号１３１）
逆方向プライマーＳＫ１２９９：（５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’）（配列番号１３２）
【０３９７】
６．２．４．Ｄ．β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットの構築
Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットを構築するため、プライマーＳＫ１３２２及びＳＫ１２９７を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからｆｖ４３Ｄ遺伝子産物を増幅させた。ＲＬ−Ｐ３７株から抽出したＴ．リーゼイ（T. reesei）ゲノムＤＮＡサンプルのエンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーター領域を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１３２１を使用しＰＣＲ増幅させた。続いて、ＰＣＲ増幅させたこれら２種のＤＮＡ断片を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７を使用して融合ＰＣＲ反応により一緒に融合させた。得られる融合ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄ（図９０Ｈを参照されたい）を作成し、このプラスミドを用い、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。複数のＥ．ｃｏｌｉクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して確認した。
順方向プライマーＳＫ１３２２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号１３３）
逆方向プライマーＳＫ１２９７：（５’−ＧＧＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧ−３’）（配列番号１３４）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１３５）
逆方向プライマーＳＫ１３２１：（５’−ＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号１３６）
【０３９８】
プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７を使用してこの発現カセットをＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３ＤからＰＣＲ増幅させ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換体を作製した。
【０３９９】
６．２．５．Ｅ．α−アラビノフラノシダーゼ発現カセットの構築
Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａ発現カセットの構築の際、プライマーＳＫ１１５９及びＳＫ１２８９を用い、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）ゲノムＤＮＡサンプルからｆｖ５１Ａ遺伝子産物を増幅させた。ＲＬ−Ｐ３７株から抽出したＴ．リーゼイ（T. reesei）ゲノムＤＮＡサンプルのエンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーター領域を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２６２を使用しＰＣＲ増幅させた。続いて、ＰＣＲ増幅させたこれら２種のＤＮＡ断片を、プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１２８９を使用して融合ＰＣＲ反応により一緒に融合させた。得られる融合ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａ（図９０Ｉを参照されたい）を作成し、このプラスミドを用い、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。
順方向プライマーＳＫ１１５９：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＴＡＧ−３’）（配列番号１３７）
逆方向プライマーＳＫ１２８９：（５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）（配列番号１３８）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１３９）
逆方向プライマーＳＫ１２６２：（５’−ＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡ  ＧＧＡＣ−３’）（配列番号１４０）
【０４００】
プライマーＳＫ１２９８及びＳＫ１２８９を使用してこの発現カセットをＰＣＲ増幅させ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換体を作製した。
順方向プライマーＳＫ１２９８：（５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号１４１）
逆方向プライマーＳＫ１２８９：（５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）（配列番号１４２）
【０４０１】
６．２．６．Ｆ．β−グルコシダーゼ及びエンドキシラナーゼ発現カセットによるＴ．リーゼイ（T. reesei）の同時形質転換
ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３．）に由来し、かつ高セルラーゼ生産であるものとして選択したＴ．リーゼイ（T. reesei）変異株を、ＰＥＧによる形質転換方法（Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９８７，６１（２）：１５５〜６４）を用い、β−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、及びａｍｄＳマーカー）、及びエンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、及びｃｂｈ１ターミネーター）を利用して同時形質転換させた。多数の形質転換体を単離し、β−グルコシダーゼ生成及びエンドキシラナーゼ生成について試験した。他の発現カセットによる形質転換に際し、形質転換体のＴ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９を使用した。
【０４０２】
６．２．７．Ｇ．２種類のβ−キシロシダーゼ及びα−アラビノフラノシダーゼを備える発現カセットによるＴ．リーゼイ（T. reesei）株２２９の同時形質転換
例えば、電気穿孔法（国際公開第０８１５３７１２号を参照されたい）を用い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９を、β−キシロシダーゼｆｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、ｆｖ３Ａ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、及びａｌｓＲマーカー）、β−キシロシダーゼｆｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、ｆｖ４３Ｄ遺伝子、ネイティブ型ｆｖ４３Ｄターミネーター）、及びｆｖ５１Ａ  α−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、ｆｖ５１Ａ遺伝子、ｆｖ５１Ａネイティブ型ターミネーター）により同時形質転換させた。形質転換体は、クロリムロンエチル（８０ｐｐｍ）を含有しているフォーゲル寒天プレートで選択した。フォーゲル寒天プレートを１Ｌにつき次のとおりに調製した。
【０４０３】
【表１】
2014508535.tif 000003
【０４０４】
多数の形質転換体を単離し、β−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ生成について試験した。実施例１（上掲）に記載の穂軸糖化アッセイに従って、バイオマスの変換率についても形質転換体を選択した。本明細書に記載のＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み発現株の例としては、Ｈ３Ａ、３９Ａ、Ａ１０Ａ、１１Ａ、及びＧ９Ａが挙げられ、これらはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄを異なる比でこれらの遺伝子の全てを発現する。他の組み込み型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株としては、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄの遺伝子の殆ど異なる比率で発現していたものが挙げられる。例えば、ある株はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の過剰発現を欠損し；他の株はウェスタンブロットにより測定したときにＦｖ５１Ａを欠損しており；その他の２株はＦｖ３Ａを欠損しており、１株はＢｇｌ１の過剰発現を欠損していた（例えば、Ｈ３Ａ−５株）。
【０４０５】
６．２．８．Ｈ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの組成
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの発酵により、下記実施例２、Ｉに記載されかつ本明細書において図４に示されるとおりに測定される比で、次のタンパク質、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄが生成される。
【０４０６】
６．２．９．Ｉ．ＨＰＬＣによるタンパク質アッセイ
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及びマススペクトロスコピー（ＭＳ）を実施して、発酵ブロスに含まれている酵素を分離し、同定し、定量した。始めに、遺伝子組換えによりＳ．プリカタス（S. plicatus）（例えば、ＮＥＢ  Ｐ０７０２Ｌ）に発現させたエンドＨグリコシダーゼにより酵素サンプルを処理した。サンプルの総タンパク質量１μｇに対し０．０１〜０．０３μｇ  ｅｎｄｏＨタンパク質の比率となるようＥｎｄｏＨを使用し、ｐＨ  ４．５〜６．０にて３７℃で３時間インキュベートし、ＨＰＬＣ解析前にＮ結合型糖鎖を酵素作用により除去した。次に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うため、ＨＩＣ−フェニルカラムを取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに約５０μｇのタンパク質を注入し、３５分かけて高塩濃度から低塩濃度への勾配溶出を行った。勾配は、高塩濃度の緩衝液Ａ：４Ｍの硫酸アンモニウム／２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．７５）と、低塩濃度の緩衝液Ｂ：２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ  ６．７５）とを用い得た。ＵＶ光により２２２ｎｍにてピークを検出し、画分を回収し、マススペクトロスコピーにより同定した。タンパク質濃度を、クロマトグラム面積の総積分値に占める割合（％）として報告する。
【０４０７】
６．２．１０．Ｊ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの発酵ブロスに精製タンパク質を添加することにより希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対し生じる効果
精製タンパク質（及び１種の未精製タンパク質）を原液から連続希釈し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの発酵ブロスに加え、前処理したバイオマスの糖化に対し生じる効果を評価した。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、固形分重量２０％（ｐＨ  ５）でマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）ウェルに充填した（ウェルあたり約５ｍｇのセルロース）。各ウェルに、セルロース１ｇあたり２０ｍｇずつＨ３Ａタンパク質（発酵ブロスの形態）を加えた。各ウェルに各希釈タンパク質（図５）を１０、５、２、及び１μＬずつ加え、各ウェルに対する液体の添加が合計１０μＬになるよう水を加えた。参照ウェルには水１０μＬ、又は追加のＨ３Ａ発酵ブロス希釈物のいずれかを添加した。ホイルによりＭＴＰをシーリングし、Ｉｎｎｏｖａ恒温振とう器にて２００ＲＰＭで振とうしながら５０℃で３日間インキュベートした。１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬによりサンプルの反応を停止した。停止したサンプルをプラスチックシールで覆い、４℃にて３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。停止した反応液のアリコート（５μＬ）を１００μＬの水で希釈し、反応により生産されたグルコースの濃度をＨＰＬＣにより測定した。Ｈ３Ａ  １ｇあたり２０ｍｇとなるよう添加したタンパク質濃度の関数として、グルコースデータをプロットした（タンパク質の添加濃度は、異なる開始濃度及び添加する用量に応じ変動し得る）。結果を図５８Ａ〜５８Ｄに示す。
【０４０８】
６．３．実施例３：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株の構築
６．３．１．Ａ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７の構築及び選択
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ１（「Ｃｅｌ  ７Ｂ」とも呼ばれる）プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｅｇ４（「ＴｒＥＧ４」又は「Ｃｅｌ  ６１Ａ」とも呼ばれる）翻訳領域、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）の転写終結配列ｃｂｈ１（Ｃｅｌ  ７Ａ）（図５９Ａ）、並びにＡ．ニガー（A. niger）のｓｕｃＡ選択マーカー（Ｂｏｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３，２４：６０〜６６を参照されたい）を収容させた発現カセットを、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した（図５９Ｂ）。
【０４０９】
次のプライマーを使用し、発現カセットＰｅｇｌ１−ｅｇ４−ｓｕｃＡをＰＣＲにより増幅させた：
ＳＫ１２９８：５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１４３）
２１４：５’−ＣＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＡＧＣＡＣＡＴ−３’（配列番号１４４）
【０４１０】
ＰＣＲ反応用のポリメラーゼとしてはＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。製造元のプロトコルに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ＰＣＲの反応産物を精製した。次に、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃを用い、ＰＣＲの反応産物を１〜３μｇ／μＬに濃縮させた。形質転換させたＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主株（Ｈ３Ａ）を、ポテトデキストロース寒天プレート上で２８℃にて５日間生育させ、一面に胞子を形成させた。ミリＱ水を用い、２枚のプレートから胞子を回収し、４０μＭセルストレイナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通してろ過した。胞子を５０ｍＬのコニカルチューブに移し、５０ｍＬの水を加え繰り返し３回遠心分離を行い洗浄した。最後に１．１Ｍソルビトール溶液を用い洗浄を行った。１．１Ｍのソルビトール溶液を用い、胞子を少量（ペレット体積の２倍未満）再懸濁した。胞子懸濁液を氷上に置いた。胞子懸濁液（６０μＬ）を１０〜２０μｇのＤＮＡと混合し、電気穿孔用キュベット（Ｅ−ｓｈｏｔ，０．１ｃｍ電気穿孔用標準キュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に移した。ＢｉｏｒａｄジーンパルサーＸｃｅｌｌ（１６ｋＶ／ｃｍ，２５μＦ，４００Ωに設定）を用い、胞子に電気穿孔を行った。電気穿孔後、胞子懸濁液に１ｍＬの１．１．Ｍのソルビトール溶液を添加した。炭素源として２％スクロースを含有させたフォーゲル寒天培地（実施例２Ｇを参照されたい）に胞子懸濁液を蒔いた。
【０４１１】
形質転換プレートを３０℃で５〜７日間インキュベートした。スクロースを含有させた２枚目のフォーゲル寒天プレートに一次形質転換体を再画線し、３０℃にて更に５〜７日間生育させた。次に、２枚目の選択プレートで生育させた単一コロニーを、国際公開第２００９／１１４３８０号に記載の方法を用いマイクロタイタープレートのウェル内で生育させた。糖化性能選択に先立ち上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、発現レベルを確認した。
【０４１２】
Ｈ３Ａ株では合計９４の形質転換体がＥＧ４を過剰発現していた。Ｈ３Ａ／ＥＧ４株と同様に、２株のＨ３Ａ対照株をマイクロタイタープレート上で生育させた。アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用い、ＥＧ４タンパク質を発現しているＴ．リーゼイ（T. reesei）株の性能選択を実施した。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を水に再懸濁し、硫酸によりｐＨ  ５．０に調整し、７％セルロースを得た。スラリーを平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，２６９７８７）に分注し、３，０００ｒｐｍで５分遠心分離した。
【０４１３】
基質を入れた各ウェルに、Ｈ３Ａ又はＨ３Ａ／ＥＧ４株の培養ブロスを２０μＬ加え、トウモロコシ穂軸の糖化反応を開始した。トウモロコシ穂軸の糖化反応物をアルミニウム（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシーリングし、２４℃かつ６５０ｒｐｍで５分間混合した。次に、５０℃かつ２００ｒｐｍに設定したＩｎｎｏｖａインキュベーターにプレートを７２時間設置した。７２時間の糖化後、１００μＬの１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０．０）を加え、反応を停止させた。次にプレートを十分に混合し、３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。ＨＰＬＣ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｇｉｌｅｎｔ，５０４２〜１３８５）中の水２００μＬに上清（１０μＬ）を添加した。ガードカラムを予め装着させたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ，１２５〜００９８）を使用し、ＨＰＬＣにより、グルコース、キシロース、セロビオース、及びキシロビオース濃度を測定した。
【０４１４】
トウモロコシの穂軸に対する選択により、Ｈ３Ａ対照株と比較してグルカン及びキシラン変換率が向上している次のＨ３Ａ／ＥＧ４株：１、２、３、４、５、６、１４、２２、２７、４３、及び４９が同定された（図６０）。
【０４１５】
選択したＨ３Ａ／ＥＧ４株を再度生育させた。株毎に、振とうフラスコあたり、合計３０ｍＬの培養タンパク質ろ液を回収した。１０ｋＤａの限外ろ過濃縮用遠心チューブ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ，ＶＳ２００１）を使用し、培養ろ液を１０倍濃縮し、実施例１Ｃに記載のとおりに総タンパク質濃度をＢＣＡにより測定した。トウモロコシ穂軸基質のウェル毎に、セルロース１ｇにつき、Ｈ３Ａ／ＥＧ４株サンプルのタンパク質を２．５、５、１０、又は２０ｍｇ使用し、トウモロコシの穂軸の糖化反応を実施した。１４Ｌ発酵スケールでＨ３Ａ株を生産した。対照としては、振とうフラスコスケールで生産させた際に低性能であることが予め同定されているサンプル（Ｈ３Ａ／ＥＧ４株＃２０）を包含させた。実施例４（下記）に記載されるとおりに糖化反応を実施した。ＥＧ４発現株に由来する培養上清の全てで、タンパク質添加量を増加させるにつれグルカン変換率が上昇していたことが観察された（図６１）。追加の糖化反応にＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７を使用し、シングルコロニーをポテトデキストリンプレート上に画線し、そこから単独コロニーを単離し、株を精製した。
【０４１６】
６．４．実施例４：希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化を向上させるためのＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の濃度範囲
好ましい添加量を決定するため、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａのいずれかの発酵ブロスを用い、精製ＥＧ４を反応混合物に添加し、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（固形分２５％、セルロース８．７％、キシラン７．３％）の加水分解をｐＨ  ５．３で実施した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａの総添加タンパク質量は、グルカン（Ｇ）及びキシラン（Ｘ）１ｇあたり１４ｍｇとした。図６、７Ａ及び７Ｂの添加チャートに従い、２０ｍＬシンチレーションバイアルに総反応用量５ｍＬで反応混合物（総質量５ｇ）を充填した。
【０４１７】
実験１の設定を図６に示す。コニカルチューブ中でミリＱ水及び６Ｎ硫酸を混合し、各バイアル瓶に加え、このバイアル瓶を振って内容物を混合した。バイアル瓶に酵素サンプルを加え、５０℃にて６時間インキュベートした。様々な時点でバイアル瓶のサンプルのうち１００μＬを９００μＬの５ｍＭの硫酸に加え、ボルテックスにかけ、遠心分離し、上清を使用して、生成された可溶性糖類の濃度をＨＰＬＣにより測定した。グルカン転換率についての結果を図６４に、及びキシラン転換率についての結果を図６５に示す。
【０４１８】
実験２の設定を図７Ａに示す。好ましいＥＧ４濃度を決定するために、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａのいずれかの発酵ブロスを使用して、精製ＥＧ４（Ｇ＋Ｘ  １ｇあたり０．０５〜１．０ｍｇの範囲）を反応混合物に添加し、希釈アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸（固形分２５％、セルロース８．７％、キシラン７．３％）の糖化をｐＨ  ５．３で行った。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａの総充填量は、グルカン＋キシラン１ｇあたり１４ｍｇであった。
【０４１９】
実験結果を図６６Ａに示す。
【０４２０】
実験３の設定を図７Ｂに示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のその他の好ましい濃度範囲を特定するため、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７又はＨ３Ａを用い、Ｇ＋Ｘ  １ｇあたり０．１〜０．５ｍｇの濃度で精製ＥＧ４を添加し、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉（固形分２５％、セルロース８．７％及びキシラン７．３％）をｐＨ  ５．３にて加水分解した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａの総充填量は、グルカン及びキシラン１ｇあたり１４ｍｇであった。
【０４２１】
結果を図６６Ｂに示す。
【０４２２】
６．５  実施例５希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対する様々な濃度のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果
希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ又はＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７（グルカン及びキシラン１ｇあたり１４ｍｇ）の発酵ブロスとともに、固形分７、１０、１５、２０、及び２５％（％Ｓ）で、ｐＨ  ５．３かつ５０℃にて３日間インキュベートした（２０ｍＬバイアル瓶中、総湿潤バイオマス量は５ｇ）。上記実施例４に記載されるとおりに反応を実施した。グルコース及びキシロースをＨＰＬＣにより解析した。結果を図６７に示す。全ての試料は、１日目に、最大固形分２０％で見かけ上、液化された。
【０４２３】
６．６  実施例６希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の加水分解に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の過剰発現の効果
Ｈ３Ａ株においてＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を過剰発現させた場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対し示される効果を、Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃  ２７株及びＨ３Ａ株由来の発酵ブロスを使用し試験した。２０ｍＬのガラス製バイアル瓶中で、次のとおりに３ｇスケールでトウモロコシ穂軸の糖化を実施した。酵素製剤、１Ｎの硫酸及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）（０．０１％アジ化ナトリウム及び５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有）を添加し、グルコース＋キシラン１ｇあたり総タンパク質１．７及び２１．０ｍｇの間で添加量を変化させて酵素を用い、総反応量３ｇの、固形分２２％の最終的なスラリーを得た。全ての糖化バイアル瓶を、１８０ｒｐｍで振とうさせながら４８℃でインキュベートした。７２時間後に、各バイアル瓶にろ過ミリＱ水１２ｍＬを加えて、糖化反応物を５倍希釈した。サンプルを１４，０００×ｇで５分間遠心分離し、次に０．２２μｍのナイロンフィルタ（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルタ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通してろ過し、ろ過ミリＱ水により更に４倍希釈して、最終的に２０倍希釈液を調製した。２０μＬのサンプルを注入し、ＨＰＬＣ解析して、生成されている糖類を測定した。
【０４２４】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の過剰発現又は添加により、Ｈ３Ａ単独の場合と比較してキシロース及びグルコースモノマーの生成が向上していた（図９及び１０）。様々な量でＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７を添加した所、Ｈ３Ａ株単独の場合、あるいはグルカン＋キシラン１ｇに対しＥｇ４＋１．１２ｍｇ一定Ｘｙｎ３の場合と比較して、キシロースの収率が向上していた（図９）。
【０４２５】
様々な量でＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７を添加した場合には、Ｈ３Ａ株単独の場合、あるいはグルカン＋キシラン１ｇに対しＥｇ４＋１．１２ｍｇ一定Ｘｙｎ３の場合と比較して、グルコースの収率が向上していた（図１０）。
【０４２６】
発酵性モノマー（キシロース、グルコース、及びアラビノース）の総生成量に対する、組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃  ２７又はＨ３ＡによるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を図１１に記載する。Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７組み込み株では、組み込みＨ３Ａ株の場合、あるいはＥｇ４＋１．１２ｍｇ  Ｘｙｎ３／ｇグルコース＋キシランの場合と比較して、発酵性モノマーの総生成量が向上していた。
【０４２７】
６．７  実施例７:精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４による希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸からのグルコース生成
グルコース＋キシラン１ｇあたり０．５３ｍのＸｙｎ３の存在下又は非存在下で、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用し、生成糖濃度に対する精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を試験した。実験は実施例６に記載のとおりに実施した。結果を図１２に示す。
【０４２８】
このデータからは、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼなどのその他のセルラーゼの作用が存在せずともグルコースモノマーの生成を促すことが示される。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸と、精製Ｅｇ４単独（Ｘｙｎ３は添加しない）とを組み合わせて用いる糖化実験も実施した。８７２μＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）（０．０１％アジ化ナトリウム及び５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有）、１６５ｍｇの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（６７．３％乾燥固形分，１１１ｍｇ乾燥固形分を添加）及び１６．５μＬの１Ｎの硫酸を入れた５ｍＬバイアル瓶に、３．３μＬの精製Ｅｇ４（１５．３ｍｇ／ｍＬ）を加えた。バイアル瓶を４８℃でインキュベートし、かつ１８０ｒｐｍで振とうさせた。定期的に２０μＬのアリコートを取り出し、ろ過滅菌した二重蒸留水より１０倍希釈し、ナイロンフィルタによりろ過した後、Ｄｉｏｎｅｘイオンクロマトグラフィーシステムでグルコース生成について解析した。グルコース標品溶液を外部標準として使用した。結果を図６８に示す。この図により、精製Ｅｇ４を添加することで、他のセルラーゼ又はエンドキシラナーゼの非存在下かつ４８℃下で、７２時間にわたってインキュベートすると、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸からグルコースモノマーが生成されたことが示される。
【０４２９】
６．８  実施例８：様々な基質に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７の糖化性能
この実験では、グルコース＋キシラン１ｇに対しタンパク質１４ｍｇになるようＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込みＨ３Ａ株又はＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７株由来の発酵ブロスを用い、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、希アンモニアで前処理し、洗浄したトウモロコシ穂軸、アンモニア繊維爆砕（ＡＦＥＸ）前処理したトウモロコシ茎葉（ＣＳ）、蒸気爆砕したサトウキビバガス（ＳＥＢ）、及び予めクラフト処理を行った紙パルプＦＰＰ２７（工業用針葉樹材無漂白パルプ脱リグニン化−κ  １３．５、グルカン８１．９％、キシラン８．０％、Ｋｌａｓｏｎリグニン１．９％）、ＦＰＰ−３１（広葉樹材無漂白パルプ脱リグニン化−κ  １０．１、グルカン７５．１％、キシラン１９．１％、Ｋｌａｓｏｎリグニン２．２％）、及びＦＰＰ−３７（針葉樹無漂白パルプ風乾−κ  ８２、グルカン７１．４％、キシラン８．７％、Ｋｌａｓｏｎリグニン１１．３％）などの異なる基質に対する糖化性能について試験した。
【０４３０】
糖化反応は、２５ｍＬガラス製バイアル瓶を用い、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）中最終質量１０ｇで設定し、２００ｒｐｍで振とうさせながら５０℃で６日間インキュベートした。６日目の終了時に、１００μＬのアリコートを５ｍＭの硫酸で１：１０希釈し、サンプルをＨＰＬＣにより解析して、グルコース及びキシロース組成を測定した。結果を図６９に示す。
【０４３１】
６．９  実施例９：酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の効果
酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対するＥｇ４の効果を試験した。希硫酸で前処理したトウモロコシ茎葉（Ｓｃｈｅｌｌ，ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，１０５（１〜３）：６９〜８５）をＮＲＥＬから得て、固形分２０％に調節し、ソーダ灰を添加してｐＨ  ５．０に調整した。前処理した基質の糖化を、マイクロタイタープレートで総固形分２０％で実施した。発酵ブロス中の総タンパク質量をビウレット・アッセイにより測定した（上記実施例１を参照されたい）。基質に対し加えるＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７及びＨ３Ａの発酵ブロスの量を増量させ、２００ＲＰＭで振とうさせながら５０℃にて５日間インキュベートした後、糖化性能を測定した。ＨＰＬＣによりグルコース生成（ｍｇ／ｇ）を測定した。結果を図７０に示す。
【０４３２】
６．１０  実施例１０：希アンモニアで前処理したトウモロコシ葉、茎及び穂軸に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７の糖化性能
本実験では、希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉、葉、茎又は穂軸に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７の糖化性能を比較した。前処理は国際公開第０６１１０９０１Ａ号に記載のとおりに実施した。２０ｍＬバイアル瓶を用い、グルカン＋キシラン１ｇに対しタンパク質を１４ｍｇ使用し、総質量５ｇ（固形分７％）をｐＨ  ５．３（ｐＨは６ＮのＨ２ＳＯ４を添加して調節した）にて加水分解させた。５０℃にて糖化反応を実施し、４日目に、生成されたグルコース及びキシロースについてＨＰＬＣよりサンプル解析を行った。結果を図７１に示す。
【０４３３】
６．１１．実施例１１：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）にＥＧ４を過剰発現させることによる希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する糖化性能
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用し、３ｇスケールで糖化反応を実施した。２０ｍＬのガラス製バイアル瓶に、十分に前処理した穂軸調製物の乾燥固形分を０．７５ｇ量りとった。酵素調製物、１Ｎの硫酸及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）（０．０１％アジ化ナトリウム添加）を加え、総反応物３ｇ（２５％乾燥固形分、ｐＨ  ５．０）の最終スラリーを得た。Ｅｇ４を過剰発現させたＴ．リーゼイ（T. reesei）株（Δｃｂｈ１  Δｃｂｈ２  Δｅｇ１  Δｅｇ２）（国際公開第０５／００１０３６号を参照されたい）の未精製の培養上清として、１４ｍｇのタンパク質を更に５％添加し又は添加せずに、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの細胞外タンパク質（発酵ブロス）を、グルカン＋キシラン１ｇに対し１４ｍｇ添加した。糖化反応物を５０℃で７２時間インキュベートした。インキュベート後、反応物を３倍希釈し、ろ過し、グルコース及びキシロース濃度についてＨＰＬＣ解析を行った。結果を図７３に示す。Ｈ３Ａと比較してタンパク質を過剰発現させたＴ．リーゼイ（T. reesei）株由来の細胞外タンパク質の形態でＥｇ４タンパク質を添加した所、グルコースモノマーの生成量が実質的に上昇し、かつキシロースモノマーの生成量がわずかに上昇した。
【０４３４】
６．１２  実施例１２：アンモニアで前処理したスイッチグラスに対するＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７株の糖化性能
タンパク質添加量を増量させ、希アンモニアで前処理したスイッチグラス（国際公開０６１１０９０１Ａ号）に対するＨ３Ａ／Ｅｇ４株＃２７の糖化性能を、Ｈ３Ａ株と比較した（１８．５％固形分）。２０ｍＬのガラス製バイアル瓶に、前処理したスイッチグラス調製物の乾燥固形分を０．９２５ｇ量りとった。１Ｎの硫酸及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．３）（０．０１％アジ化ナトリウム添加）を加え、総反応物５ｇの最終スラリーを得た。Ｈ３Ａの酵素添加量は１４、２０、及び３０ｍｇ／ｇ（グルカン＋キシラン）で試験し、Ｈ３Ａ−ＥＧ４  ＃２７の添加量は５、８、１１、１４、２０、及び３０ｍｇ／ｇ（グルカン＋キシラン）で試験した。反応物を５０℃で３日間インキュベートした。インキュベート後、反応物を３倍希釈し、ろ過し、グルコース及びキシロース濃度についてＨＰＬＣ解析を行った。スイッチグラス基質の組成に基づきグルカン及びキシラン変換率を算出した。結果を図７４に示す。この図により、酵素添加量が同じである場合、Ｈ３Ａ−ＥＧ４＃２７のグルカン変換性能は、Ｈ３Ａよりも有効であることが示される。
【０４３５】
６．１３  実施例１３．トウモロコシの穂軸の糖化並びにＣＭＣ及びセロビオースの加水分解に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の効果
６．１３．１  Ａ．トウモロコシ穂軸の糖化
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を２０％固形分、７％セルロースに調節し、マイクロタイタープレートのウェルに６５ｍｇずつ分注した。グルカン１ｇあたり５ｍｇ（最終濃度）のＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１と、グルカン１ｇあたり０、１、２、３、４及び５ｍｇの最終濃度で関連する酵素（ＣＢＨ１又はＥｇ４）を含有している、３５μＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）緩衝を添加し、糖化反応を開始した。Ｅｇ４対照には、同様の添加量でＥＧ４のみを投与したため、これらのウェル中の総添加タンパク質量は少なかった。マイクロタイタープレートをアルミニウム製プレートシール（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシーリングし、２４℃で、６００ｒｐｍで２分間混合した。次に、５０℃かつ２００ｒｐｍに設定したＩｎｎｏｖａインキュベーターにプレートを７２時間設置した。
【０４３６】
７２時間の糖化後、プレートには１００μＬの１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０．０）を加え、反応を停止させた。次にプレートを３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。ＨＰＬＣ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｇｉｌｅｎｔ，５０４２〜１３８５）中の水１００μＬに上清（２０μＬ）を添加した。ガードカラムを予め装着させたＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ，１２５−００９８）を使用し、ＨＰＬＣにより、グルコース及びセロビオース濃度を測定した。１００×（ｍｇセロビオース＋ｍｇグルコース）／基質中総グルカンとしてグルカン変換率（％）を算出した（図７５）。
【０４３７】
６．１３．２  Ｂ．ＣＭＣ加水分解
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ，Ｓｉｇｍａ  Ｃ４８８８）を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）により１％に希釈した。３種のＴ．リーゼイ（T. reesei）精製酵素のＥｇ４、ＥＧ１及びＣＢＨ１を最終濃度２０、１０、５、２．５、１．２５及び０ｍｇ／ｇで、それぞれ別個に９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  ＃２６９７８７）中の１００μＬの１％  ＣＭＣに添加し、加水分解反応を開始した。各ウェルにｐＨ  ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウムを加えて最終用量１５０μＬを得た。ＣＭＣ加水分解反応物をアルミニウム製プレートシール（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシーリングし、２４℃で、６００ｒｐｍで２分間混合した。次に、５０℃かつ２００ｒｐｍに設定したＩｎｎｏｖａインキュベーターにプレートを３０分設置した。
【０４３８】
３０分間のインキュベート終了後、プレートを氷水上に１０分間置いて反応を停止させ、サンプルをエッペンドルフチューブに移した。各チューブに３７５μＬのジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液（以下参照）を加えた。次にサンプルを１０分間沸騰させ、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により５４０ｎｍでＯ．Ｄを測定した。結果を図７６に示す。
【０４３９】
ＤＮＳ溶液：
４０ｇの３．５−ジニトロサリチル酸（Ｓｉｇｍａ，Ｄ０５５０）
８ｇのフェノール
２ｇの亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）
８００ｇのＮａ−Ｋ酒石酸塩（ロッシェル塩）。これらの全てを２Ｌの２％のＮａＯＨに加える。アルミ箔で覆い、一晩撹拌する。脱イオン蒸留水を加え、最終用量４Ｌにする。十分に混合する。暗色瓶に入れ冷蔵保存する。
【０４４０】
６．１３．３．Ｃ．セロビオース加水分解
セロビオースを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）により５ｇ／Ｌに希釈した。最終濃度２０、１０、５、２．５及び０ｍｇ／ｇで２種類の酵素ＥＧ４及びＢＧＬ１をそれぞれ別個に５ｇ／Ｌの１００μＬのセロビオース溶液に添加し、加水分解反応を開始した。各ウェルに酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）を加え、最終用量１２０μＬを得た。反応プレートをアルミニウム製プレートシール（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシーリングし、２４℃で、６００ｒｐｍで２分間混合した。次に、５０℃かつ２００ｒｐｍに設定したＩｎｎｏｖａインキュベーターにプレートを２時間設置した。
【０４４１】
２時間の加水分解工程後、プレートには１００μＬの１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０．０）を加え、反応を停止させた。次にプレートを３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アッセイ（実施例１）によりグルコース濃度を測定した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ  ９０１７  ＥＩＡ／ＲＩＡプレート，９６ウェル平底，培地結合型）内で、９０μＬのＡＢＴＳ溶液に１０μＬの上清を添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によりＯ．Ｄ．４２０ｎｍを測定した。結果を図７７に示す。
【０４４２】
６．１４．実施例１４：精製Ｅｇ４は各種セルラーゼ混合物と混合させた場合に希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から生成されるグルコース量を向上させる
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用し、グルカン＋キシラン１ｇあたり０．５３ｍｇのＴ．リーゼイＸｙｎ３の存在下で、精製Ｅｇ４と精製セルラーゼ（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、ＥＧ２、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、及びＢｇｌ１）とを組み合わせることで、糖生成濃度に生じる効果を試験した。０．１１１ｇ乾燥穂軸固形分（１０．５％固形分）を含有させた５ｍＬバイアル瓶中で１．０６ｇの反応物を調製した。酵素調製物（図７２Ａ）、１Ｎの硫酸、及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）（０．０１％のアジ化ナトリウム及び５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有）を添加し、最終反応重量を得た。反応バイアル瓶を、１８０ｒｐｍで振とうさせながら４８℃でインキュベートした。７２時間後、ろ過したミリＱ水を各糖化反応物に加え５倍希釈した。サンプルを１４，０００ｘｇで５分間遠心分離し、次に０．２２μｍのナイロンフィルタ（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルタ，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通してろ過し、ろ過ミリＱ水により更に４倍希釈して、最終的に２０倍希釈液を調製した。２０μＬのサンプルをＨＰＬＣにより解析し、生成された糖類（グルコース、セロビオース及びキシロース）を測定した。
【０４４３】
図７２Ｂは、各組み合わせにより生成された、グルコース（図７２Ｂ−１）、グルコース＋セロビオース（図７２Ｂ−２）、又はキシロース（図７２Ｂ−３）を示す。精製Ｅｇ４は、各セルラーゼ及び混合物の性能を向上させた。全ての精製セルラーゼを存在させた場合、グルコース＋キシラン１ｇに対し０．５３ｍｇのＥｇ４を添加することで、変換効率はほぼ４０％近く向上した。この向上は、ＣＢＨ１と、Ｅｇｌ１と、Ｂｇｌ１との組み合わせにＥｇ４を添加した場合にも見られた。別個のセルラーゼをトウモロコシ穂軸と共に存在させた場合、グルコースの総生成量は、セルラーゼ組み合わせてトウモロコシ穂軸と存在させた実験から得られる結果と比較して実質的に少なかったものの、各事例において、Ｅｇ４の存在下での向上率は有意なものであった。Ｅｇ４を精製セルラーゼに添加した所、総グルコース生成量において次のような変換率の向上が得られた−Ｂｇｌ１（１２１％）、Ｅｇｌ２（１１２％）、ＣＢＨ２（２３９％）、及びＣＢＨ１（７１％）。この結果から、Ｅｇ４は、バイオマスに対するセルラーゼの性能の向上に対し、有意であり、かつ幅広い効果を有していたことが示される。
【０４４４】
６．１５．実施例１５：ＥＧ４を基質のＣＢＨ１、ＣＢＨ２、及びＥＧ２−希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸−と混合した場合に観察される相乗効果
９６ウェルＭＴＰｓ（ＶＷＲ）において、酵素混合物を次のとおりに（２０％固形分、７％セルロースのウェルあたり６５ｍｇ）トウモロコシの穂軸に加え、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化反応物を調製した。各ウェルには８０μＬの５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）、グルカン１ｇあたり１ｍｇのＢｇｌ１、及びグルカンバックグラウンド１ｇあたり０．５ｍｇのＸｙｎ３も加えた。
【０４４５】
Ｅｇ４を別個にＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２と混合した場合の効果について試験するために、各ウェルに、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２の各々を、グルカン１ｇに対し０、１．２５、２．５、５、１０及び２０ｍｇ加え、かつＥＧ４をグルカン１ｇに対し２０、１８．７５、１７．５、１５、１０、及び０ｍｇとなる濃度で加え、それぞれのウェルの総タンパク質量をグルカン１ｇに対し２０ｍｇとした。対照ウェルには、これらのウェルに対するタンパク質の総添加量が２０ｍｇ／ｇ未満になるように、同量のＣＢＨ１又はＣＢＨ２又はＥＧ２又はＥＧ４のみを添加した。
【０４４６】
セルラーゼの組み合わせに対するＥｇ４の効果を試験するために、異なる比でのＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２の混合物（図８Ａを参照されたい）を、グルカン１ｇに対し０、１．２５、２．５、５、１０、及び２０ｍｇ加え、かつＥＧ４をグルカン１ｇに対し２０、１８．７５、１７、５、１５、１０、及び０ｍｇとなる濃度で混合物に加え、それぞれのウェルの総タンパク質量をグルカン１ｇに対し２０ｍｇとした。上記のとおり、対照ウェルには、総タンパク質添加量が２０ｍｇ／ｇ未満になるように１種類のタンパク質のみを添加した。
【０４４７】
トウモロコシ穂軸の糖化反応物を、アルミニウム（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシーリングし、６００ｒｐｍで振とうさせながら２４℃で２分間混合した。次にこのプレートを、２００ｒｐｍ、５０℃に設定したＩｎｎｏｖａ  ４４インキュベーター振とう器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に７２時間設置した。７２時間の糖化工程後、プレートには１００μＬの１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０．０）を加え、反応を停止させた。次に、このプレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した（Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ）。ＨＰＬＣ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｇｉｌｅｎｔ，５０４２〜１３８５）中の水１００μＬに上清２０μＬを添加した。Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ，１２５−００９８）とガードカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、ＨＰＬＣにより、グルコース及びセロビオース濃度を測定した。
【０４４８】
結果を図８Ｂの表に示す。表中、グルカン変換率（％）は、（グルコース＋セロビオース）／総グルカン（％）として定義される。
【０４４９】
本実験により、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化を向上させるには、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２及び／又はＥＧ２にＥｇ４を追加することが有効であったことが示される。更に、特にＣＢＨ２を含む混合物にＥｇ４を加えた場合には相乗効果が観察された。これに加え、Ｅｇ４とその他の酵素（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２又はＥＧ２）を当量で糖化混合物に加えた場合に、最も大幅な向上が観察された。ＣＢＨ１とＣＢＨ２の混合物に対してもＥｇ４のかなりの効果が観察された。Ｅｇ４による最適な向上は、Ｅｇ４量がＣＢＨ１及びＣＢＨ２に対し１：１である場合に観察された。結果を図８Ｂに示す。
【０４５０】
６．１６．実施例１６：ＥＧ４は様々なヘミセルラーゼ組成物の糖化性能を向上させる。
ビウレットアッセイの変法（本明細書に記載）により、市販のセルラーゼ酵素製剤Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ）の総タンパク質濃度を測定した。
【０４５１】
精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４を各酵素製剤に加え、次に、基質グルカン及びキシラン１ｇに対し総タンパク質が１４ｍｇになるよう、希アンモニアで前処理した固形分２５％のトウモロコシ穂軸を使用して、糖化性能についてサンプルを解析した（グルカン及びキシラン１ｇに対し５ｍｇのＥＧ４に加え、グルカン及びキシラン１ｇに対し全セルラーゼ９ｍｇ）。２０ｍＬバイアル瓶に反応混合物（ｐＨ  ５）を計５ｇ入れ、２００ｒｐｍに設定した回転振盪器により５０℃で７日間インキュベートし、糖化反応を実施した。５ｍＭの硫酸により糖化サンプルを１０倍希釈し、０．２μｍフィルタを通してろ過した後、ＨＰＬＣに注入した。ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン交換カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）を使用しＨＰＬＣ解析を実施した。
【０４５２】
精製Ｅｇ４を全セルラーゼに組み入れたところ、図６３Ａに示されるように試験した全てのセルラーゼ産物においてグルカン変換率が向上した。図６３Ｂに示されるように、キシラン変換率はＥｇ４の組み入れによる明らかな影響を受けてはいなかった。
【０４５３】
６．１７  実施例１７：Ｆｖ３Ｃのクローン化、発現及び精製
６．１７．１．Ａ．Ｆｖ３Ｃクローニング及び発現
Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）のフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）ゲノムに対しＧＨ３のβ−グルコシダーゼ相同体について検索を行い、Ｆｖ３Ｃ配列（配列番号６０）を得た。テンプレートとしてフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）由来のゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＦｖ３Ｃ翻訳領域を増幅させた。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＣＲサーモサイクラーとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＤＮＡポリメラーゼとして使用した。翻訳領域を増幅する際に使用したプライマーは次のとおりのものである：
順方向プライマーＭＨ２３４（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣ−３’）（配列番号１４５）
逆方向プライマーＭＨ２３５（５’−ＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’）（配列番号１４６）
【０４５４】
順方向プライマーには、４つの追加のヌクレオチド（配列−ＣＡＣＣ）を５’末端に含有させて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）への定方向クローニングを促進させた。翻訳領域を増幅する際のＰＣＲ条件は以下の次のとおりのものである。工程１：９４℃で２分。工程２：９４℃で３０秒。工程３：５７℃で３０秒。工程４：７２℃で６０秒。工程２、３及び４を更に２９サイクル繰り返した。工程５：７２℃で２分。Ｆｖ３Ｃ翻訳領域のＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。生成したＰＣＲ産物を、最初にｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、５０ｐｐｍのカナマイシンを含有させたＬＡプレートに播種した。ＱＩＡｓｐｉｎプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、大腸菌（E. coli）形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入されたＤＮＡの配列を、Ｍ１３順方向及び逆方向プライマーと、次のその他の配列プライマーとを用い確認した：
ＭＨ２５５（５’−ＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号１４７）
ＭＨ２５６（５’−ＴＡＴＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＴ−３’）（配列番号１４８）
ＭＨ２５７（５’−ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＴ−３’）（配列番号１４９）
ＭＨ２５８（５’−ＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号１５０）
【０４５５】
Ｆｖ３Ｃ翻訳領域（図７８）の正しいＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを、ＬＲクロナーゼ（登録商標）反応混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｐＴｒｅｘ６ｇ（図７９Ａ）デスティネーションベクターに組み込んだ。
【０４５６】
続いて、ＬＲクロナーゼ（登録商標）による反応産物により、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、次に、５０ｐｐｍカルベニシリンを含有させたＬＡプレートに播種した。Ｆｖ３Ｃ翻訳領域と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）変異型アセト乳酸合成酵素選択マーカー（ａｌｓ）とを含有しているｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ｃ（図７９Ｂ）を発現コンストラクト（pExpression construct）として得た。Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用い、Ｆｖ３Ｃ翻訳領域を含有している発現コンストラクト（pExpression construct）のＤＮＡを単離し、遺伝子銃によるＴ．リーゼイ（T. reesei）芽胞の形質転換に使用した。
【０４５７】
遺伝子銃を用い、適切なＦｖ３Ｃ翻訳領域を含有しているｐＴｒｅｘ６ｇ発現ベクターにより、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換を行った。特に、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１、ｅｇ２、ｅｇ３、及びｂｇｌ１の欠失していた（すなわち、６欠失株、国際公開第０５／００１０３６号を参照されたい）Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株を、製造元の指示に従ってＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）ＰＤＳ−１０００／ｈｅ粒子デリバリーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いヘリウムイオンビームにより形質転換させた（米国特許第２００６／０００３４０８号を参照されたい）。形質転換体を、新しいクロリムロンエチル選択培地に移植した。滅菌後に炭素供給源として約２％のグルコース／ソホロース混合物と、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌの４００Ｘ  Ｔ．リーゼイ（T. reesei）微量元素溶液（１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３を含有）を添加した２００μＬ／ウェルのグリシン最少培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ（ｐＨ  ５．５）を含有）を、フィルタマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に含有させ、好適な形質転換体を播種した。形質転換体を液体培地で５日間生育させた（２８℃インキュベーター）。真空マニホールドで、フィルタマイクロタイタープレートから上清サンプルを回収した。上清サンプルを４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲルで電気泳動させ、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。
【０４５８】
６．１７．２．Ｂ．Ｆｖ３Ｃの精製
振とうフラスコ濃縮物から、２５ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．８）にＦｖ３Ｃを一晩透析した。透析した酵素溶液を、分取用ＳＥＣ  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００架橋アガロース及びデキストランカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速１ｍＬ／ｍｉｎで充填した。カラムは前もって２５ｍＭのＴＥＳ／０．１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ  ６．８）で平衡化させておいた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、ＳＥＣ分離により得られた画分にＦｖ３Ｃが存在していることを同定及び確認した。Ｆｖ３Ｃを含有している画分をプールし、濃縮した。ＳＥＣ精製も用い、低分子量及び高分子量の夾雑物からＦｖ３Ｃを分離した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルをクーマシーブルー染色し、酵素調製物の純度を確認した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥでは、単一の主要なバンドが９７ｋＤａに検出された。
【０４５９】
６．１７．３．Ｃ．Ｆｖ３Ｃの選択的翻訳
Ｆｖ３Ｃ遺伝子を発現させる際、フザリウム（Fusarium）データベースにおいて注釈されるとおりにＯＲＦを含有しているゲノム配列を使用した（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ｆｕｓａｒｉｕｍ＿ｇｒｏｕｐ／ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。予測コード領域はイントロンを３つ含有し、最初のイントロンはシグナルペプチド配列中に介在している（図８０）。
【０４６０】
３’末端では、最初のイントロンは、同様にシグナルペプチド用のコードとして予測される成熟配列のフレーム中に選択的ＯＲＦを含有していた（図８０）。Ｎ末端配列解析により決定されるとおり、いずれの翻訳においても、成熟タンパク質（図８１Ａ下線部）の開始部位は、どちらも推定シグナルペプチド切断部位（矢印により示す）の下流から開始していた。すなわち、翻訳推定開始コドンとしてどちらのＡＴＧを用いた場合にも、Ｆｖ３Ｃを効果的に発現させることができることが示された（図８１Ｂ）。
【０４６１】
６．１８．実施例１８：セロビオース及びＣＮＰＧに対するβ−グルコシダーゼ活性
本実験では、セロビオース及びＣＮＰＧに対する、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｆｖ３Ｃ（配列番号６０）、Ｆｖ３Ｄ（配列番号５８）、及びＰａ３Ｃ（配列番号４４）のβ−グルコシダーゼの活性を試験した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（「Ａｎ３Ａ」）は精製タンパク質であった。Ｆｖ３Ｃ、Ｆｖ３Ｄ及びＰａ３Ｃは未精製タンパク質である。これらのタンパク質はＴ．リーゼイ（T. reesei）６欠失株（上記を参照のこと）で発現させたが、バックグラウンドにタンパク質活性が幾分存在していた。図１３に示すとおり、セロビオースに対しては、Ｆｖ３ＣはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して約２倍の活性を有すること、それに対しＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して約１２倍もの活性を有することが判明した。
【０４６２】
ＣＮＰＧ基質に対しては、Ｆｖ３Ｃ活性はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のものと概ね等しかったが、Ａ．ニガー（A. niger）ＢｇｌｕではＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌｕ１の活性の約１４％であった（図１３）。Ｆｖ３Ｃと同様に発現させた、その他のフザリウム・バーティシリオイド（Fusarium verticillioides）β−グルコシダーゼのＦｖ３Ｄの場合、セロビアーゼ活性は検出されなかったものの、ＣＮＰＧに対する活性はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の約５倍であった。更に、同様に生成したポドスポラ・アンセリナ（Podospora anserina）β−グルコシダーゼ相同体のＰａ３Ｃの場合、セロビオース又はＣＮＰＧ基質に対する活性は測定されなかった。これらの試験により、セロビオース及びＣＮＰＧに対するＦｖ３Ｃの活性は分子自体によるものであり、バックグラウンドのタンパク質の活性によるものではないことが示された。
【０４６３】
６．１９．実施例１９：Ｆｖ３Ｃによる様々なバイオマス基質の糖化
６．１９．１．Ａ．ＰＡＳＣに対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、ＰＡＳＣに対する、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び数種のＦｖ３Ｃ相同体の糖化性能を試験する。９６ウェルＨＰＬＣプレートに、セルロース１ｇあたりタンパク質量が５ｍｇ〜１０ｍｇになるよう各β−グルコシダーゼ２０μＬを加え、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１抑制株由来の全セルラーゼを充填した。固形分０．７％のＰＡＳＣスラリー１５０μＬを各ウェルに加え、プレートをアルニウム製プレートシーラーで覆い、５０℃に設定したインキュベーターに設置し、２時間振とうした。１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ１０）１００μＬを各ウェルに加え、反応を停止させた。十分に混合した後、プレートを遠心分離し、上清を、各ウェルに１０ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０）１００μＬを含有させた他のＨＰＬＣプレートで１０倍希釈した。生成された可溶性糖類の濃度を、ＨＰＬＣを用い測定した（図８２）。
【０４６４】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１を含有させた混合物と比較して、同じ条件下ではＦｖ３Ｃを含有させた混合物の方が、グルコースの収率が高いことが示された。これにより、Ｆｖ３Ｃの有するセロビアーゼ活性はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のものよりも高いことが示される（同様に図１３を参照されたい）。Ｆｖ３Ｇ、Ｐａ３Ｄ及びＰａ３ＧはＰＡＳＣ加水分解に対し何ら効果を示さなかったことから、ＰＡＳＣ加水分解に対し、６遺伝子を欠失させたバックグラウンド（各種Ｆｖ３Ｃ相同体をクローン化し発現させた）による影響はなかったことが示された。
【０４６５】
６．１９．２．Ｂ．希酸で前処理したトウモロコシ葉茎（ＰＣＳ）に対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、固形分１３％のＰＣＳの糖化の向上に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び数種のＦｖ３Ｃ相同体の性能を、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）を用い試験した。各酵素を試験する際、セルロース１ｇあたり５ｍｇのβ−グルコシダーゼに、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）−Ｂｇｌ１欠損株に由来する、セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼを添加した。
【０４６６】
具体的には、セルロース１ｇあたり５ｍｇの各β−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び相同体）に、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１欠損株に由来する、セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼ、又はセルロース１ｇあたり８ｍｇの精製ヘミセルラーゼ混合物（成分を図１４に示す）を添加した。酵素混合物と基質とを５０℃で２日間インキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。
【０４６７】
結果を図８３に示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較して、Ｆｖ３Ｃは、グルカン変換率（％）に対して明らかに効果を示す。更に、Ｆｖ３Ｃも、グルコース及び糖の合計収率がＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１よりも高かった。
【０４６８】
この結果により、宿主細胞由来のバックグラウンドのタンパク質の影響は、あったとしてもわずかなものであることが示された。
【０４６９】
６．１９．３．Ｃ．アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する、Ｆｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、アンモニアで前処理した固形分２０％のトウモロコシ穂軸の糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に従って試験した。特に、セルロース１ｇあたり５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び相同体）に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸基質と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１欠損株に由来するセルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼとを添加した。更に、Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ及びＦｖ５１Ａを含有している精製ヘミセルラーゼミックス（図１４）も、セルロース１ｇあたり８ｍｇとなるよう混合物に添加した。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。
【０４７０】
結果を図８４に示す。Ｆｖ３Ｃの性能は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）などのその他のβ−グルコシダーゼと比較して明らかに良好である。Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）を、セルロース１ｇあたり２．５ｍｇを上回る量で酵素混合物に加えた場合、糖化が阻害されることも観察された。
【０４７１】
６．１９．４．Ｄ．水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で前処理したトウモロコシ穂軸に対するＦｖ３Ｃの糖化性能
各種基質の前処理方法が、Ｆｖ３Ｃ性能に対し示す影響を試験するために、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａとも呼ぶ）、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、ＮａＯＨで前処理した固形分１２％のトウモロコシ穂軸の糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に記載の方法に従って測定した。水酸化ナトリウムによるトウモロコシの穂軸の前処理は次のとおりに実施した：１，０００ｇのトウモロコシの穂軸を約２ｍｍ大に挽き、次に４Ｌの５％の水酸化ナトリウム水溶液に懸濁し、１１０℃で１６時間加熱した。実験室において、高熱真空下で暗褐色の液体をろ過した。溶出液に呈色が観察されなくなるまで、フィルタ上の固体残渣を水で洗浄した。固体を、実験室において真空下で２４時間乾燥させた。１００ｇのサンプルを７００ｍＬの水に懸濁し、撹拌した。溶液のｐＨを測定したところ、１１．２であった。クエン酸水溶液（１０％）を添加してｐＨを５．０に下げ、この懸濁液を３０分撹拌した。次に固形分をろ過し、水で洗浄し、室温にて真空下で２４時間乾燥させた。乾燥後、多糖類に富む８６．２ｇのバイオマスを得た。このバイオマスの湿分含量は約７．３重量％であった。糖解析用のＮＲＥＬ法により、水酸化ナトリウム処理の前後に、グルカン、キシラン、リグニン、及び総糖含量を測定した。前処理によりバイオマスを脱リグニン化させつつ、グルカン／キシランの重量比を未処理のバイオマスの１５％以内に維持した。
【０４７２】
セルロース１ｇに対し約５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（Ｆｖ３Ｃ及び相同体）を、ＮａＯＨで前処理した基質に加え、それとともに、特にＢｇｌ１を低発現している株について選択した、遺伝子組み込み型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株Ｈ３Ａ（「Ｈ３Ａ−５株」）に由来する全セルラーゼを、セルロース１ｇに対し８．７ｍｇ加えた。本実験では、全セルラーゼバックグラウンドには、その他の精製ヘミセルラーゼ（例えば、図１４の混合物）を添加しなかった。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。
【０４７３】
結果を図８５に示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ａｎ３Ａ及びＴｅ３Ａなどのその他のβ−グルコシダーゼと比較して、Ｆｖ３Ｃはある程度良好な性能を有することが観察された。セルロース１ｇあたり４ｍｇ以上のＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）を加えた場合、変換率が低くなることも観察された。
【０４７４】
６．１９．５．Ｅ．希アンモニアで前処理したスイッチグラスに対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、希アンモニアで前処理した固形分１７％のスイッチグラスの糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に従って試験した。希アンモニアで前処理したスイッチグラスをＤｕＰｏｎｔから得た。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）の手法（ＮＲＥＬ  ＬＡＰ−００２）（ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌで利用可能）により、組成を測定した。
【０４７５】
乾燥重量に基づき、組成は、グルカン（３６．８２％）、キシラン（２６．０９％）、アラビナン（３．５１％）、酸不溶性リグニン（２４．７％）、及びアセチル（２．９８％）であった。１ｍｍスクリーンを通過させ、この原材料をナイフで細断した。細断した材料を、６重量％（乾燥固形分）アンモニアの存在下で、約１６０℃で９０分前処理した。初期固形充填量は、乾物約５０％であった。処理したバイオマスを、使用時まで４℃で保管した。
【０４７６】
この実験では、β−グルコシダーゼを低発現しているものの中から選択した遺伝子組み込み型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株（Ｈ３Ａ）に由来する、セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼの存在下で、希アンモニアで前処理したスイッチグラスにセルロース１ｇあたり５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及び相同体）を添加した。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。結果を図８６に示す。
【０４７７】
Ｆｖ３Ｃは、スイッチグラス基質に対して、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕよりも良好に機能した。
【０４７８】
６．１９．６．Ｆ．ＡＦＥＸトウモロコシ葉茎に対するＦｖ３Ｃの糖化性能
本実験では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ｃ、及びＡ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）が、固形分１４％のＡＦＥＸトウモロコシ葉茎の糖化を向上させる性能について、マイクロタイタープレート糖化アッセイ（上掲）に従って試験した。ＡＦＥＸで前処理したトウモロコシ茎葉は、ミシガン・バイオテクノロジー・国際研究所（Michigan Biotechnology Institute International）（ＭＢＩ）より得た。トウモロコシ茎葉の組成は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）の手法ＬＡＰ−００２により測定した（ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌで利用可能）。
【０４７９】
乾燥重量に基づき、組成は、グルカン（３１．７％）、キシラン（１９．１％）、ガラクタン（１．８３％）、及びアラビナン（３．４％）であった。５ガロンの圧力反応器（Ｐａｒｒ）において、９０℃、湿分含量６０％、バイオマス量対アンモニア充填量１：１で、この原材料を３０分ＡＦＥＸ処理した。処理したバイオマスを反応器から取り出し、ドラフト内に置き、残存しているアンモニアを蒸発させた。処理したバイオマスを、使用時まで４℃で保管した。
【０４８０】
本実験では、前処理した基質に、β−グルコシダーゼを発現している遺伝子組み込み型Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株に由来する、セルロース１ｇあたり１０ｍｇの全セルラーゼの存在下で、セルロース１ｇあたり５ｍｇのβ−グルコシダーゼ（Ｆｖ３Ｃ及び相同体）を加えた。５０℃下で２日間、酵素混合物と基質をインキュベートした後、グルカン変換率（％）を測定した。結果を図８７に示す。
【０４８１】
グルカンの変換において、Ｆｖ３Ｃが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１よりも良好に機能した。上記条件下で、セルロース１ｇあたり１０ｍｇのＦｖ３Ｃと、セルロース１ｇあたり１０ｍｇのＨ３Ａ全セルラーゼにより、完全に又は一見したところ完全にグルカンが変換されたことにも留意した。セルロース１ｇあたり１ｍｇ未満の濃度では、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（Ａｎ３Ａ）は、見たところ、Ｆｖ３Ｃ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１と比較してグルコース変換率及び総グルカン変換率が高いものの、セルロース１ｇあたり２．５ｍｇ超の濃度になると、Ｆｖ３Ｃ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１の方が、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕよりもグルコース変換率（Ａｎ３Ａ）及び総グルカン変換率が高くなることが示された。
【０４８２】
６．２０  実施例２０：アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を糖化する際のＦｖ３Ｃ対全セルラーゼ比の最適化
本実験では、Ｆｖ３Ｃ対全セルラーゼ比を変えて、ヘミセルラーゼ組成物におけるＦｖ３Ｃ対全セルラーゼの最適比を決定した。アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として使用した。β−グルコシダーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）、Ｆｖ３Ｃ、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ）対Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）由来の全セルラーゼ比を、ヘミセルラーゼ組成物において０〜５０％で変化させた。アンモニアで前処理した固形分２０％のトウモロコシ穂軸を、タンパク質濃度がセルロース１ｇあたり２０ｍｇとなるよう混合物に添加し、加水分解させた。結果を図８８Ａ〜８８Ｃに示す。
【０４８３】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（Ｔｒ３Ａ）対全セルラーゼの最適比には幅があり、中央値が約１０％であり、混合物濃度が５０％になると、全セルラーゼを単独で充填した場合と同様の結果が得られる。対照的に、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（又はＡｎ３Ａ）は約５％で最適になり、ピークはよりシャープであった。ピーク／最適濃度では、Ａ．ニガー（A. niger）Ｂｇｌｕ（又はＡｎ３Ａ）は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌｕ（Ｔｒ３Ａ）を含有している最適な混合物よりも変換率が高かった。
【０４８４】
Ｆｖ３Ｃ対全セルラーゼの最適比は約２５％であることが判明した。この場合、セルロース１ｇあたり総タンパク質２０ｍｇの混合物により、９６％超のグルカンが変換されることになる。したがって、全セルラーゼ中の酵素のうち２５％を、単独の酵素Ｆｖ３Ｃで置き換えることで、糖化性能を向上させることができる。
【０４８５】
６．２１  実施例２１：異なる酵素配合物によるアンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）由来の２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼ混合物を、用量反応実験において、その他の高性能なセルラーゼ混合物と比較した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）単独に由来する全セルラーゼ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）混合物に由来する２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼ、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼを、希アンモニアで前処理した固形分２０％のトウモロコシ穂軸に対する糖化性能に関し比較した。反応時には、セルロース１ｇあたり２．５〜４０ｍｇとなるよう酵素配合物を投与した。結果を図８９に示す。
【０４８６】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）混合物由来の２５％Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼは、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ配合物と比較して劇的に良好であり、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）由来の全セルラーゼと比較して大幅な向上を示した。７０、８０、又は９０％のグルカンを変換させるのに必要とされる投与量を図１５に掲載する。グルカン変換率７０％では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）混合物由来の２５％  Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼは、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ配合物と比較して投与量が３．２倍削減される。７０、８０、又は９０％のグルカン変換率では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）混合物由来の２５％Ｆｖ３Ｃ／７５％全セルラーゼは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株（Ｈ３Ａ）単独に由来する全セルラーゼと比較して、必要とされる酵素が約１．８倍削減される。
【０４８７】
６．２２  実施例２２：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株でのＦｖ３Ｃの発現
Ａ．ニガー（A. niger）においてＦｖ３Ｃを発現させるために、米国特許第７４５９２９９号に記載のとおりにＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、デスティネーションベクターｐＲＡＸｄｅｓｔ２によりｐＥｎｔｒｙ−Ｆｖ３Ｃプラスミドを組み換えた。発現プラスミドには、Ａ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼのプロモーター及びターミネーターの調節下のＦｖ３Ｃゲノム配列、選択マーカー用のＡ．ニデュランス（A. nidulans）ｐｙｒＧ遺伝子、真菌細胞での自律複製用のＡ．ニデュランス（A. nidulans）ａｍａ１配列を含有させた。生成された組み換え産物により大腸菌（E. coli）  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、発現コンストラクトｐＲＡＸ２−Ｆｖ３Ｃ（図９０Ａ）を含有しているクローンを２ｘＹＴ寒天プレート（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／Ｌのバクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有）で選択した。
【０４８８】
約５０〜１００ｍｇの発現プラスミドによりＡ．ニガー（A. niger）変異体アワモリ（awamori）株を形質転換させた（米国特許第７４５９２９９号を参照されたい）。内在性グルコアミラーゼｇｌａＡ遺伝子をこの株から欠失させ、かつウリジン要求性の形質転換体を選択するためにｐｙｒＧ遺伝子に変異を生じさせた。Ａ．ニガー（A. niger）形質転換体をＭＭの培地（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換に使用したものと同様の最少培地だが、アセトアミドの代わりに１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを窒素供給源として使用した）で３７℃で４〜５日生育させ、異なる形質転換体のプレート由来の総芽胞集団を使用して（約１０６芽胞／ｍＬ）、産生培地（１Ｌあたり）：１２ｇのトリプトン；８ｇのソイトン；１５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；１２．１ｇのＮａＨ２ＰＯ４ｘＨ２Ｏ；２．１９ｇのＮａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ；１ｇのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ；１ｍＬのＴｗｅｅｎ  ８０；１５０ｇのマルトース；（ｐＨ  ５．８）を入れた振とうフラスコに接種した。２００ｒｐｍで振とうさせながら３０℃で３日間発酵させた後、形質転換体におけるＦｖ３Ｃの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０４８９】
６．２３．実施例２３：その他のＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株の構築及び選択
６．２３．１．Ａ．ＣＢ＃２０１株の生成
ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｂ．Ｓ．Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）に由来し、かつ高セルラーゼ生産性について選択したＴ．リーゼイ（T. reesei）変異株を、Ｆ．バーティシリオイド（F. verticillioides）の３種のヘミセルラーゼ遺伝子（Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ及びＦｖ５１Ａ）により同時形質転換させた。これらは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ１プロモーター（Ｐｅｇｌ１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｃｂｈ２プロモーター（Ｐｃｂｈ２）又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ｃｂｈ１プロモーター（Ｐｃｂｈ１）、及びアセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）マーカー（米国特許第２００７／０２０４８４号、国際公開第２００９／１１４３８０号）を含有する３種の異なる組み合わせで電気穿孔法により同時形質転換を行った。３種の組み合わせは次のとおりのものである：１）Ｐｅｇｌ１−ｆｖ５１ａ、Ｐｃｂｈ２−ｆｖ４３ｄ−ａｌｓ及びＰｅｇｌ１−ｆｖ３ａ、２）Ｐｃｂｈ１−ｆｖ３ａ−ａｌｓマーカー、Ｐｅｇｌ１−ｆｖ５１ａ及びＰｃｂｈ２−ｆｖ４３ｄ、及び３）Ｐｅｇｌ１−ｆｖ５１ａ、Ｐｃｂｈ１−ｆｖ４３ｄ−ａｌｓ及びＰｅｇｌ１−ｆｖ３ａ。電気穿孔法後に、クロリムロンエチルを含有させた選択寒天培地に形質転換混合物を蒔いた。次に、形質転換体を、国際公開第／２００９／１１４３８０号に記載のとおりにマイクロタイタープレート中で生育させた。得られた形質転換体を、これまでに記載したとおりのＭＴＰスケールでのトウモロコシ穂軸の糖化性能アッセイにより選択した。選択により、グルコース及びキシロースの高変換率を示した株（ＣＢ  ＃２０１）が同定された。
【０４９０】
発現カセットの増幅には、次のプライマー対を使用した：
Ｐｅｇｌ１−ｆｖ５１ａプライマー対：
ＳＫ１２９８  ５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１５１）
ＳＫ１２８９  ５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１５２）
Ｐｃｂｈ２−ｆｖ４３ｄ−ａｌｓプライマー対：
ＳＫ１４３８  ５’−ＣＧＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１５３）
ＳＫ１２９９  ５’−ＧＴＡｇｃｇｇｃｃｇｃＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１５４）
Ｐｅｇｌ１−ｆｖ３ａプライマー対
ＳＫ１２９８  ５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１５５）
ＳＫ８２２−５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣ−３’（配列番号１５６）
Ｐｃｂｈ１−ｆｖ３ａ−ａｌｓプライマー対：
ＳＫ１３３５  ５’−ＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１５７）
ＳＫ１２９９  ５’−ＧＴＡｇｃｇｇｃｃｇｃＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１５８）
Ｐｃｂｈ２−ｆｖ４３ｄプライマー対：
ＳＫ１４３８  ５’−ＣＧＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１５９）
ＳＫ１４４９  ５’−ＣＡＴｇｇｃｇｃｇｃｃＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号１６０）
Ｐｃｂｈ１−ｆｖ４３ｄ−ａｌｓプライマー対：
ＳＫ  １３３５  ５’−ＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１５７）
ＳＫ１２９９  ５’−ＧＴＡｇｃｇｇｃｃｇｃＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１６１）
【０４９１】
図６２Ａ〜６２Ｇに示すプラスミドから発現カセットを増幅させた。
【０４９２】
６．２３．２  Ｂ．ＣＢ＃２０１株の形質転換
プライマーＳＫ１５９７及びＳＫ１６０３を用い増幅させたＴ．リーゼイ（T. reesei）ｅｇ４、プライマーＳＫ１４３８及びＳＫ１６０３を用い増幅させたＴ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３並びにプライマーＲＰＧ１５９及びＲＰＧ１６３（下記実施例２３を参照のこと）を用い増幅させたＦ．バーティシリオイド（F. verticillioides）のＦｖ３Ｃ  β−グルコシダーゼキメラ体、を収容しているＰＣＲ産物を用いて電気穿孔法（国際公開第２００９１１４３８０号）を行い、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢ＃２０１株を更に形質転換させた。形質転換の際には、プライマーＲＰＧ１５９及びＲＰＧ１６３により増幅させた発現カセットに収容させたＡ．ニデュランス（A. nidulans）のａｍｄＳ遺伝子を選択マーカーとして使用した。アセトアミドを含有させた選択培地で形質転換体を生育させた（国際公開第２００９１１４３８０号）。（国際公開第２００９１１４３８０号）に記載のとおりに発現させるために、安定した形態を示す形質転換体をマイクロタイタープレートで培養した。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びｃＮＰＧアッセイ（上記）により解析した。トウモロコシ穂軸の糖化アッセイにおいて性能について選択した形質転換を選択する（下記第Ｆ節）。
【０４９３】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）を形質転換させるための発現カセットの増幅には、次のプライマー対を使用した：
Ｐｅｇｌ１−Ｔｒ  ｅｇｌ４−ｃｂｈ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒプライマー対：
ＳＫ１５９７  ５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１６２）
ＳＫ１６０３  ５’−ＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１６３）
Ｐｃｂｈ２−Ｔｒ  ｘｙｎ３−ｃｂｈ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒプライマー対：
ＳＫ１４３８  ５’−ＣＧＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１６４）
ＳＫ１６０３  ５’−ＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１６５）
Ｐｃｂｈ１−ｆａｂ−ｃｂｈ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−ａｍｄＳプライマー対：
ＲＰＧ１５９  ５’−ＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１６６）
ＲＰＧ１６３  ５’−ＴＣＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１６７）
【０４９４】
６．２３．３．Ｃ．エンドキシラナーゼ（Ｘｙｎ３）発現カセットの構築
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８９４６５．２）を、プライマーｘｙｎ３Ｆ−２及びｘｙｎ３Ｒ−２を使用しＰＣＲにより増幅させた。
順方向プライマー（ｘｙｎ３Ｆ−２）：
【０４９５】
［配列表１］
2014508535.tif 000004
（下線を付した残基ＣＡＣＣは、ＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）へのクローン化を容易にするために使用した）
逆方向プライマー（ｘｙｎ３Ｒ−２）：５’−ＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１６９）
【０４９６】
得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、中間ベクターｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。
【０４９７】
正しいｘｙｎ３配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによりプロトコルの概要されたＬＲクロナーゼ（登録商標）反応により、ｐＴｒｅｘ３ｇで組み替えた。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｘｙｎ３を得た。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、アセトアミダーゼをコードしているアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子も含有させた。プライマーｘｙｎ３−Ｆ−ＳＯＥ及びＳＫ８２２を使用し、ｘｙｎ３翻訳領域、ｃｂｈ１ターミネーター及びａｍｄＳ配列を増幅させた。プライマーＳＫ１０１９及びｃｂｈ２Ｐ−Ｒ−ＳＯＥによりＴ．リーゼイ（T. reesei）野生株ＱＭ６ＡのゲノムＤＮＡからｃｂｈ２のプロモーターを増幅させた。続いてプライマーＳＫ１０１９及びＳＫ８２２により、２つの断片の融合ＰＣＲを実施し、Ｐｃｂｈ２−ｘｙｎ３−及びｃｂｈ１ターミネーターからなるカセットを得た。この融合ＰＣＲ産物を次にｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、発現ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ／Ｐｃｂｈ２−ｘｙｎ３−ｃｂｈ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを得た（図１０３Ｂを参照されたい）。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。
順方向プライマー（ｘｙｎ３−Ｆ−ＳＯＥ）５’−ＡＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡ  ＧＣＡＡＡＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１７０）
逆方向プライマー（ｃｂｈ２Ｐ−Ｒ−ＳＯＥ）５’−ＴＧＡＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧ  ＧＧＴＧＡＴＣＴ−３’（配列番号１７１）
順方向プライマー（ＳＫ１０１９）：５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’（配列番号１７２）
逆方向プライマー（ＳＫ８２２）：５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣ−３’（配列番号１７３）
【０４９８】
６．２３．４．Ｄ．エンドグルカナーゼのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の発現カセットの構築
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、ネイティブなＴ．リーゼイ（T. reesei）エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇ４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＪ５７７０３．１）を、プライマーＳＫ１４３０及びＳＫ１４３１を使用しＰＣＲにより増幅させた。
順方向プライマー（ＳＫ１４３０）：
【０４９９】
［配列表２］
2014508535.tif 000005
（下線を付した「ＣＡＣＣ」は、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）へのクローン化を容易にするために使用した）。
逆方向プライマー（ＳＫ１４３１）：５’−ＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡ−３’（配列番号１７５）
【０５００】
得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、中間ベクターｐＥＮＴＲ／Ｅｇｌ４を得た。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。
【０５０１】
正しいｅｇｌ４配列を有するｐＥＮＴＲ／ＥＧ４ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより概説されたＬＲクロナーゼ（登録商標）反応プロトコルを使用しｐＴｒｅｘ９ｇＭで組み替えた。ＬＲクロナーゼ反応混合物により大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、発現ベクターｐＴｒｅｘ９ｇＭ／Ｅｇｌ４を得た。ベクターには、形質転換したＴ．リーゼイ（T. reesei）の選択マーカーとして、スクラーゼをコードしているＡ．ニガー（A. niger）ｓｕｃＡ遺伝子も含有させた。プライマーＳＫ１４３０及びＳＫ１４３２を使用し、ｅｇｌ４翻訳領域、ｃｂｈ１ターミネーター及びｓｕｃＡ配列を増幅させた。プライマーＳＫ１２３６及びＳＫ１４３３を使用し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）野生株ＱＭ６ＡのゲノムＤＮＡからｅｇｌ１プロモーターをＰＣＲ増幅させた。続いて、２種のＤＮＡ断片を、プライマーＳＫ１２９８及びＳＫ１４３２を使用して融合ＰＣＲ反応により一緒に融合させた。得られる融合ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化してＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ  ｗ／Ｐｅｇｌ１−ｅｇｌ４−ｓｕｃＡ（図１０３Ｃを参照されたい）を作成し、大腸菌（E. coli）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を確認した。
順方向プライマー（ＳＫ１２３６）：５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号１７６）
逆方向プライマー（ＳＫ１４３３）：５’−ＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡ  ＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１７７）
順方向プライマー（ＳＫ１４３０）：
【０５０２】
［配列表３］
2014508535.tif 000006
（下線を付した残基は、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）へのクローン化を容易にするために使用した）。
逆方向プライマー（ＳＫ１４３２）：５’−ＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＡＧＣ−３’（配列番号１７９）
順方向プライマー（ＳＫ１２９８）：５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１８０）
【０５０３】
プライマーＳＫ１５９７及びＳＫ１６０３を使用してこの発現カセットをＰＣＲ増幅させ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換体を作製した。
順方向プライマー（ＳＫ１５９７）：５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１８１）
逆方向プライマー（ＳＫ１６０３）：５’−ＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１８２）
【０５０４】
６．２３．５．Ｅ．β−グルコシダーゼキメラポリペプチドＦｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ３発現ベクターの構築
Ｆｖ３Ｃの構造データ及びＢｇｌ３に予測されるモデルをもとに、Ｆｖ３Ｃ全長の第６９２番目の位置のアミノ酸（ａａ）で２つの分子が融合するよう設計を行った。すなわち、Ｆｖ３Ｃの最初の第１番目〜第６９１番目のアミノ酸残基を、Ｂｇｌ３の第６６８番目〜第８７４番目のアミノ酸領域と融合させた。融合ＰＣＲ法によりキメラ分子を構築した。Ｆｖ３Ｃ及びＢｇｌ３をコードしているゲノム配列のエントリークローンをＰＣＲのテンプレートとして使用した。いずれのエントリークローンも、供給元の推奨に従いｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で構築した。２段階で融合産物を組み立てた。まず始めに、ｐＥｎｔｒｙ  Ｆｖ３Ｃクローンをテンプレートとして使用し、かつ次の特異的なオリゴヌクレオチド：
ｐＤｏｎｏｒ順方向５’ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ  ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号１８３）；及び
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３逆方向５’ＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＣＣ  ＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＧ−３’（配列番号１８４）、を使用し、Ｆｖ３Ｃに特異的な配列をＰＣＲ反応により増幅させた。
【０５０５】
次のオリゴヌクレオチド：
ｐＤｏｎｏｒ逆方向：５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１８５）；及び
Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３順方向：５’−ＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣ  ＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１８６）、を使用し、同様の反応により、ｐＥＮＴＲ  Ｂｇ３ベクターからＢｇｌ３の３’末端領域を増幅させた。
【０５０６】
次の工程では、ネストプライマー対:
Ａｔｔ  Ｌ１順方向５’ＴＡＡＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴ−３’（配列番号１８７）；及び
ＡｔｔＬ２逆方向５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡ−３’（配列番号１８８）、を使用する、続く融合ＰＣＲ反応のため、各ＰＣＲ産物（第１工程のＰＣＲ反応からそれぞれ約１μＬ及び０．２μＬ）をテンプレートとして当量加えた。
【０５０７】
全てのＰＣＲには高忠実性融合Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ（Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ））を使用し、供給元により推奨される標準条件下で実施した。融合させた最終的なＰＣＲ産物は、インタクトなＧａｔｅｗａｙ特異的ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２組み換え部位を両末端に含有しており、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））により最終的なデスティネーションベクターに直接クローニングすることができた。
【０５０８】
０．８％アガロースゲルで特定のＤＮＡ断片を分離させた後、この断片をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  ｃｏ．ＫＧ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製し、このうち１００ｎｇを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコルに従いＬＲクロナーゼ（商標）ＩＩ酵素ミックスを使用してｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３（国際公開第２００９／０４８４８８号を参照されたい）デスティネーションベクターに組み込んだ。生成した組み換え産物により、供給元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による記載のとおりに、大腸菌（E. coli）Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αを形質転換させ、発現コンストラクトｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３  ｆｕｓｉｏｎ（図１００）とβ−グルコシダーゼキメラを含有しているクローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した２ｘＹＴ寒天プレート（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、１０ｇ／Ｌのバクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６ｇ／Ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ））で選択した。バクテリア培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した２ｘＹＴ培地で生育させた後、制限酵素のＢｇｌＩ又はＥｃｏＲＶのいずれかを使用して単離プラスミドを切断し、解析し、ＡＢＩ３１００配列解析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３（「ＦＢ」）に特異的な領域を配列決定した。
【０５０９】
キメラの、Ｂｇｌ３に由来する領域に、２つのＮ−グリコシル化部位、Ｓ７２５Ｎ及びＳ７５１Ｎを導入した。Ｆｖ３Ｃでは相当する部位をグリコシル化し、Ｂｇｌ３ではグリコシル化を行わなかった。第１工程のＰＣＲ反応で、ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３融合プラスミド（図１００）をテンプレートとして使用したことを除き、上記のものと本質的に同様のＰＣＲ融合法により、Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３（ＦＢ）骨格にグリコシル化変異（mutation）を導入した。次のプライマーを使用し、ＰＣＲ産物を１種類生成した：
Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向：５’ＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣ−３’配列番号１８９）；及び
７２５／７５１逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＣＣＴＴＡＡＧ  ＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号１９０）
【０５１０】
第２のＰＣＲ産物は、次のオリゴヌクレオチド対を使用して増幅させた：
７２５／７５１順方向：５’−ＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＡＣＣＣＣＴＡ  ＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号１９１）；及び
Ｔｅｒ  ＣｂｈＩ逆方向：５’ＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号１９２）
【０５１１】
最後に、Ｐｒ  ＣｂｈＩ順方向及びＴｅｒ  ＣｂｈＩ逆方向プライマーを使用し、得られた第１及び第２のＰＣＲ産物を上記のとおりに一緒に融合させた。２箇所にグリコシル化変異を導入した融合産物には、供給元の推奨に従いＧａｔｅｗａｙ  ＢＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｐＤｏｎｏｒ２２１ベクターにより組み換えを行うために、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位を含有させた。２箇所に過剰なグリコシル化変異Ｓ７２５Ｎ  Ｓ７５１Ｎを有するＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３キメラβ−グルコシダーゼを収容しているｐＥＮＴＲクローンを含有している大腸菌（E. coli）ＤＨ５αコロニーを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した２ｘＹＴ寒天プレートで選択した。バクテリア細胞からプラスミドを単離し、制限酵素認識パターンをもとに挿入の有無について解析し、かつＡＢＩ３１００配列アナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列解析を行い変異を確認した。これにより、更に改変を行うためのｐＥｎｔｒｙ−Ｆｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３／Ｓ７２５Ｎ  Ｓ７５１Ｎクローンを得た。
【０５１２】
上記のＦｖ３Ｃ／Ｂｇｌ３ハイブリッド体の第６６５番目〜第６８３番目のアミノ酸残基を、タラロマイセス・エマーソニィ（Talaromyces emersonii）の相当する配列により置き換え、融合／キメラ体Ｆｖ３Ｃ／Ｔｅ３Ａ／Ｂｇｌ３／Ｓ７１３Ｎ  Ｓ７３９Ｎを得た（使用したプラスミドについては図１０３Ａを参照されたい）。Ｔｅ３Ａ（配列番号６６）として参照されるＴ．エマーソニィ（T. emersonii）β−グルコシダーゼ配列を導入するため、次のプライマー：
第１組：
ｐＤｏｎｏｒ順方向：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号１９３）；及び
ＡＢＧ２逆方向：５’−ＧＡＴＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣ  ＴＴＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１９４）；
第２組：
ＡＢＧ２順方向：５’−ＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＧＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号１９５）；及び
ｐＤｏｎｏｒ逆方向：５’ＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１９６）、を使用し、第１のＰＣＲ反応を実施した。
【０５１３】
６．２３．６．Ｆ．バイオマスの選択手順
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用し、バイオマス性能について、マイクロタイタープレートスケールで形質転換体を選択した。前処理したトウモロコシ穂軸を水に懸濁し、硫酸によりｐＨ  ５．０に調整し、８．７％セルロース（２５．２％固形分）を得た。スラリーを平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に分注し（７０ｍｇ／ウェル）、３，０００ｒｐｍで５分遠心分離させた。形質転換細胞株を、振とうフラスコ形式で生育させた。新しい株をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して発現レベルについて確認した後、トウモロコシ穂軸基質とインキュベートした。各サンプルの総タンパク質量を測定し、サンプルを２ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【０５１４】
トウモロコシ穂軸を入れたウェルに、株産物を５、１０、２０、又は３０μＬ添加し、トウモロコシ穂軸の糖化反応を開始した。この形式に従って、形質転換株はトウモロコシ穂軸基質に対し、幅広い用量応答を示した。
【０５１５】
トウモロコシ穂軸の糖化反応物をアルミニウム製プレートシール（Ｅ＆Ｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でシーリングし、室温で４５０ｒｐｍで１分混合した。次に、５０℃かつ２００ｒｐｍに設定したＩｎｎｏｖａインキュベーターにプレートを７２時間設置した。
【０５１６】
７２時間の糖化工程後、プレートには１００μＬの１００ｍＭのグリシン（ｐＨ  １０．０）を加え、反応を停止させた。次にプレートを十分に混合し、３，０００ｒｐｍで５分遠心分離させた（Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｆｒｏｍ  Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ）。
【０５１７】
ＨＰＬＣ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｇｉｌｅｎｔ，５０４２−１３８５）中の水１００μＬに上清（１０μＬ）を添加した。ガードカラムを予め装着させたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ，１２５−００９８）を使用し、ＨＰＬＣにより、グルコース、キシロース、セロビオース、及びキシロビオース濃度を測定した。
【０５１８】
１１種の株：Ａ４、Ｃ３、Ｃ８、Ｄ９、Ｄ１２、Ｅ１２、Ｆ５、Ｆ７、Ｇ２、Ｈ１、Ｈ７の性能を図１０４に示す。これらの株のグルカン（セロビオース及びグルコース）及びキシラン（キシロビオース＋キシロース）変換率を示す。
【０５１９】
実施例２４：ＵＰＬＣによる酵素組成物のタンパク質定量
タンパク質定量用のＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム。Ａ  Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ４カラム（１．７μｍ，１×５０ｍｍ）を使用した。初期勾配５％〜３３％アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．５分、続いて３３％〜４８％の勾配を４．５分、次に９０％アセトニトリルへの勾配を用いる６分間のプログラムを使用した。対象とするタンパク質を、３３％〜４８％アセトニトリル間で溶出させた。ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、エンドグルカナーゼｓ、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼなどの精製タンパク質の保持時間を標準として使用した。任意の酵素配合物中の各タンパク質のピーク面積に基づき、配合物中の総タンパク質に対する各タンパク質の割合（％）を算出した。本明細書で使用した酵素配合物例は、図１０６Ａ〜Ｂに示すとおりのものである。
【図１Ａ】
2014508535.tif 000007
【図１Ｂ】
2014508535.tif 000008
【図１Ｃ】
2014508535.tif 000009
【図１Ｄ】
2014508535.tif 000010
【図２Ａ】
2014508535.tif 000011
【図２Ｂ】
2014508535.tif 000012
【図３】
2014508535.tif 000013
【図４】
2014508535.tif 000014
【図５】
2014508535.tif 000015
【図６】
2014508535.tif 000016
【図７Ａ】
2014508535.tif 000017
【図７Ｂ】
2014508535.tif 000018
【図８Ａ】
2014508535.tif 000019
【図８Ｂ−１】
2014508535.tif 000020
【図８Ｂ−２】
2014508535.tif 000021
【図９】
2014508535.tif 000022
【図１０】
2014508535.tif 000023
【図１１】
2014508535.tif 000024
【図１２】
2014508535.tif 000025
【図１３】
2014508535.tif 000026
【図１４】
2014508535.tif 000027
【図１５】
2014508535.tif 000028
【図１６Ａ】
2014508535.tif 000029
【図１６Ｂ】
2014508535.tif 000030
【図１７Ａ】
2014508535.tif 000031
【図１７Ｂ】
2014508535.tif 000032
【図１８Ａ】
2014508535.tif 000033
【図１８Ｂ】
2014508535.tif 000034
【図１９Ａ】
2014508535.tif 000035
【図１９Ｂ】
2014508535.tif 000036
【図２０Ａ】
2014508535.tif 000037
【図２０Ｂ】
2014508535.tif 000038
【図２１Ａ】
2014508535.tif 000039
【図２１Ｂ】
2014508535.tif 000040
【図２２Ａ】
2014508535.tif 000041
【図２２Ｂ】
2014508535.tif 000042
【図２３Ａ】
2014508535.tif 000043
【図２３Ｂ】
2014508535.tif 000044
【図２４Ａ】
2014508535.tif 000045
【図２４Ｂ】
2014508535.tif 000046
【図２５Ａ】
2014508535.tif 000047
【図２５Ｂ】
2014508535.tif 000048
【図２６Ａ】
2014508535.tif 000049
【図２６Ｂ】
2014508535.tif 000050
【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５Ａ−１】
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【図５５Ａ−２】
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【図５５Ａ−３】
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【図５５Ａ−４】
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【図５５Ａ−５】
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【図５５Ａ−６】
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【図５５Ａ−７】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６２Ｃ】
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【図６２Ｄ】
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【図６２Ｅ】
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【図６２Ｆ】
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【図６２Ｇ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２Ａ−１】
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【図７２Ａ−２】
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【図７２Ａ−３】
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【図７２Ｂ−１】
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【図７２Ｂ−２】
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【図７２Ｂ−３】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図８０】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８２】
2014508535.tif 000161
【図８３】
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【図８４】
2014508535.tif 000163
【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８Ａ】
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【図８８Ｂ】
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【図８８Ｃ】
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【図８９】
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【図９０Ａ】
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【図９０Ｂ】
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【図９０Ｃ】
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【図９０Ｄ】
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【図９０Ｅ】
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【図９０Ｆ】
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【図９０Ｇ】
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【図９０Ｈ】
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【図９０Ｉ】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３Ａ】
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【図９３Ｂ】
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【図９４】
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【図９５Ａ】
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【図９５Ｂ】
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【図９６Ａ】
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【図９６Ｂ】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９Ａ】
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【図９９Ｂ−１】
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【図９９Ｂ−２】
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【図９９Ｃ】
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【図１００】
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【図１０１Ａ】
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【図１０１Ｂ】
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【図１０２Ａ】
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【図１０２Ｂ】
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【図１０３Ａ】
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【図１０３Ｂ】
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【図１０３Ｃ】
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【図１０４】
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【図１０５Ａ】
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【図１０５Ｂ】
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【図１０５Ｃ】
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【図１０５Ｄ】
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【図１０５Ｅ−１】
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【図１０５Ｅ−２】
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【図１０５Ｆ】
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【図１０５Ｇ】
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【図１０５Ｈ】
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【図１０５Ｉ（ａ）】
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【図１０５Ｉ（ｂ）】
2014508535.tif 000214
【図１０５Ｊ】
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【図１０６Ａ】
2014508535.tif 000216
【図１０６Ｂ】
2014508535.tif 000217
【配列表】
2014508535000001.app
【国際調査報告】
2014508535.tif 000218
2014508535.tif 000219
2014508535.tif 000220
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