(57)【要約】  本発明は、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体Ｌ４−Ｈ３及びそのコード遺伝子を開示する。該抗体は、重鎖及び軽鎖からなり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３の１位〜１４５位で表され、前記重鎖定常領域は、ヒト抗体ＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖及び軽鎖からなる抗体であって、前記重鎖は、重鎖可変領域と重鎖定常領域との組合せにより形成され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３の１位〜１４５位で表され、前記重鎖定常領域は、ヒト化抗体ＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されることを特徴とする抗体。
【請求項２】
抗体の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号３で表される請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体のコード遺伝子、又は
軽鎖のコード遺伝子が、
Ｉ）配列番号２の８５位〜７２６位で表されるか、又は配列番号２の９位〜７２９位で表されるヌクレオチド配列、
ＩＩ）Ｉ）に規定するＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記軽鎖をコードするＤＮＡ分子、又は
ＩＩＩ）Ｉ）に規定するＤＮＡ配列と７０％を超える同一性を示し、前記軽鎖をコードするＤＮＡ分子
で表されるか、又は重鎖のコード遺伝子が、
１）配列番号４で表されるヌクレオチド配列、
２）１）に規定するＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記重鎖をコードするＤＮＡ分子、又は
３）１）に規定するＤＮＡ配列と７０％を超える同一性を示し、前記重鎖をコードするＤＮＡ分子
で表されることを特徴とするコード遺伝子。
【請求項４】
請求項３のコード遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター、組換え株、組換え細胞、又は発現カセット。
【請求項５】
軽鎖のコード遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳのＮｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位及びＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位の間に、Ｎｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位からＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位の方向に挿入して中間組換えベクターとしての組換えベクターを得る工程と、重鎖のコード遺伝子を、前記中間組換えベクターのＸｂａ  Ｉ制限酵素認識部位及びＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位の間に、Ｘｂａ  Ｉ制限酵素認識部位からＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位の方向に挿入し、得られた組換えベクターが目的の組換え発現ベクターである工程と、を含む方法によって作製された組換え発現ベクターである請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
請求項５の組換え発現ベクターを開始細胞に導入することによって得られた組換え細胞であるか、又は請求項５の組換え発現ベクターを開始細胞に導入することによって得られた組換え細胞であり且つ前記開始細胞が２９３Ｔ細胞である請求項４に記載の組換え細胞。
【請求項７】
請求項６の組換え細胞を培養する工程、及び上清を回収して請求項１又は２の抗体を得る工程を含む、請求項１又は２の抗体を作製することを特徴とする方法。
【請求項８】
有効成分が、請求項１又は２の抗体、請求項３のコード遺伝子、請求項４又は５の組換えベクター、請求項４の組換え株、請求項４又は６の組換え細胞、及び請求項４の発現カセットの少なくともいずれかであり、腫瘍は結腸癌であり、腫瘍細胞はＳＷ４８０細胞であることを特徴とする、上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤、腫瘍細胞の浸潤を阻害する阻害剤、及び腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品。
【請求項９】
請求項１又は２の抗体、請求項３のコード遺伝子、請求項４又は５の組換えベクター、請求項４の組換え株、請求項４又は６の組換え細胞、及び請求項４の発現カセットの少なくともいずれかの、上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤の製造のための使用、請求項１又は２の抗体、請求項３のコード遺伝子、請求項４又は５の組換えベクター、請求項４の組換え株、請求項４又は６の組換え細胞、及び請求項４の発現カセットの少なくともいずれかの、腫瘍細胞浸潤を阻害する阻害剤の製造のための使用、及び、請求項１又は２の抗体、請求項３のコード遺伝子、請求項４又は５の組換えベクター、請求項４の組換え株、請求項４又は６の組換え細胞、及び請求項４の発現カセットの少なくともいずれかの、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品の製造のための使用であって、腫瘍が結腸癌であり、腫瘍細胞がＳＷ４８０細胞であることを特徴とする使用。
【請求項１０】
タンパク質フラグメント及びそのコード遺伝子であって、
前記タンパク質フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号３の１位〜１４５位で表され、
前記タンパク質フラグメントの前記コード遺伝子は、
ａ）配列番号４の１位〜４３５位で表されるヌクレオチド配列、
ｂ）ａ）に規定するＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記タンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ分子、又は
ｃ）ａ）に規定するＤＮＡ配列と７０％を超える同一性を示し、前記タンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ分子
で表されることを特徴とするタンパク質フラグメント及びそのコード遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＥＧＦＲヒト化抗体Ｌ４−Ｈ３、並びにそれらのコード遺伝子及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮成長因子受容体遺伝子（ｅｒｂＢ）ファミリーの１メンバーであり、約３０％のヒト腫瘍、特に非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌及び結腸直腸癌等において過剰発現している。国内外での多くの研究が、ＥＧＦＲに対する抗体が、リガンドの細胞外での結合を効果的に遮断してＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害することによって、ＥＧＦＲの過剰発現及び変異の少なくともいずれかによって引き起こされる様々なヒト腫瘍、特に頭頸部扁平上皮癌（８０％〜１００％）、結腸直腸癌（２５％〜７７％）、及び非小細胞肺癌（４０％〜８０％）等に対して優れた治療効果を示すことを実証している。上皮成長因子受容体は、現在深く研究がなされ多くの注目を集めている腫瘍の治療標的の１つとなっている。遺伝子工学を使用して抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を研究し作製することが、腫瘍免疫治療における研究のホットスポットの１つとなっている。
【０００３】
２００４年及び２００６年には、米国ＦＤＡが、結腸直腸癌の治療のためのＥＧＦＲに対するマウス−ヒトキメラ抗体セツキシマブ及び完全ヒト抗体パニツムマブを順調に承認し、２００５年には、抗ＥＧＦＲヒト化抗体ニモツズマブが、中国国家食品薬品監督管理局（ＳＦＤＡ）によって承認される新薬登録証の第１のクラスを取得し、現在では、その第ＩＩ相／第ＩＩＩ相の臨床試験が行われている。ヒトの体内で使用される場合、マウス由来のモノクローナル抗体は、ヒト抗マウス抗体反応を引き起こし、それによってその機能に負の影響を与え得る。遺伝子工学技術を用いて設計されたマウス−ヒトキメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体の免疫原性を大きく低下させ、体内における抗体の半減期を延長させ、ヒト免疫グロブリンのＦｃフラグメントと協力して免疫調節及びＡＤＣＣ作用を仲介し、これによって抗体の生物学的効果を高める。しかしながら、キメラ抗体の抗原に結合する能力は、マウス由来の抗体のものよりも９８．７％低い。多くの前臨床試験及び臨床試験により、セツキシマブが、単独及び化学療法／放射線療法との組合せで、優れた治療効果を示すことが実証されている。しかしながら、単純なＣＤＲグラフトは、抗原と抗体との結合親和性の低下を引き起こす傾向がある。パニツムマブは、トランスジェニックマウス技術を用いて作製された完全なヒト抗体であり、キメラ抗体及びヒト化抗体と比べて、ほぼ１００％のヒト化配列を有し、抗体と標的との間の結合親和性を大幅に高める。しかしながら、このような抗体は、マウスグリコシル化パターン、半減期の短縮、及び更なる過敏症等の欠点を示す。ニモツズマブは、抗ＥＧＦＲマウス由来モノクローナル抗体のヒト化工学によって得られたヒト化抗体である。抗体の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子は、発現のためにそれぞれ異なる発現ベクターに連結されている。軽鎖発現と重鎖発現との間には大きな差があるので、それが完全な抗体分子の発現レベルを非常に低下させる傾向がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１つの目的は、抗体及びそのコード遺伝子を提供することにある。
【０００５】
本発明によって提供される抗体は、重鎖及び軽鎖からなり、前記重鎖は、重鎖可変領域を重鎖定常領域に結合させることにより形成され、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３の１位〜１４５位で表され、前記重鎖定常領域は、ヒト化抗体ＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表される。
【０００６】
具体的には、上述の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３で表すことができる。
【０００７】
上述の抗体の軽鎖のコード遺伝子は、
Ｉ）配列番号２の８５位〜７２６位で表されるか、又は配列番号２の９位〜７２９位で表されるヌクレオチド配列、
ＩＩ）Ｉ）に規定するＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記軽鎖をコードするＤＮＡ分子、又は
ＩＩＩ）Ｉ）に規定するＤＮＡ配列と７０％を超える同一性を示し、前記軽鎖
をコードするＤＮＡ分子
で表される。
【０００８】
上述の抗体の重鎖のコード遺伝子は、
１）配列番号４で表されるヌクレオチド配列、
２）１）に規定するＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記重鎖をコードするＤＮＡ分子、又は
３）１）に規定するＤＮＡ配列と７０％を超える同一性を示し、前記重鎖をコードするＤＮＡ分子
で表される。
上述のコード遺伝子のいずれかを含む組換えベクター、組換え株、組換え細胞、又は発現カセットもまた、本発明の保護範囲に入る。
【０００９】
上述の組換えベクターは、具体的には、軽鎖のコード遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳのＮｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位及びＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位の間に、Ｎｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位からＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位の方向に挿入して中間組換えベクターとしての組換えベクターを得る工程、及び、重鎖のコード遺伝子を、中間組換えベクターのＸｂａ  Ｉ制限酵素認識部位及びＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位の間に、Ｘｂａ  Ｉ制限酵素認識部位からＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位の方向に挿入する工程を含む方法によって作製した組換え発現ベクターであってもよい。得られた組換えベクターは、目的の組換え発現ベクターである。
【００１０】
上述の組換え細胞は、特に、上述の組換え発現ベクターを開始細胞に導入することによって得られた組換え細胞であってもよい。
【００１１】
ここで、開始細胞は２９３Ｔ細胞である。
【００１２】
上述の抗体のいずれかを作製する方法もまた、本発明の保護範囲に入る。
【００１３】
上述の抗体のいずれかを作製する方法は、上述の組換え細胞を培養する工程、及び上清を回収して抗体を得る工程を含むことができる。
【００１４】
組換え細胞の培養中に、抗体の軽鎖及び抗体の重鎖がそれぞれ発現され、抗体の軽鎖及び抗体の重鎖は、抗体へと自己組織化される。
【００１５】
本発明の別の目的は、上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤を提供することにある。
【００１６】
本発明において提供される上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤の有効成分は、上述の抗体、上述のコード遺伝子、上述の組換えベクター、上述の組換え株、上述の組換え細胞、及び上述の発現カセットの少なくともいずれかである。
【００１７】
本発明の別の目的は、腫瘍細胞の浸潤を阻害する阻害剤を提供することにある。
【００１８】
本発明において提供される腫瘍細胞の浸潤を阻害する阻害剤の有効成分は、上述の抗体、上述のコード遺伝子、上述の組換えベクター、上述の組換え株、上述の組換え細胞、及び上述の発現カセットの少なくともいずれかである。
【００１９】
本発明の別の目的は、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品を提供することにある。
【００２０】
本発明において提供される腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品の有効成分は、上述の抗体、上述のコード遺伝子、上述の組換えベクター、上述の組換え株、上述の組換え細胞、及び上述の発現カセットの少なくともいずれかである。
【００２１】
上述の阻害剤または製品においては、腫瘍は結腸癌であり、腫瘍細胞はＳＷ４８０細胞である。
【００２２】
上述の抗体、上述のコード遺伝子、上述の組換えベクター、上述の組換え株、上述の組換え細胞、及び上述の発現カセットの少なくともいずれかの、上皮成長因子受容体のシグナル伝達経路を阻害する阻害剤の製造のための使用もまた、本発明の保護範囲に入る。
【００２３】
上述の抗体、上述のコード遺伝子、上述の組換えベクター、上述の組換え株、上述の組換え細胞、及び上述の発現カセットの少なくともいずれかの、腫瘍細胞浸潤を阻害する阻害剤の製造のための使用もまた、本発明の保護範囲に入る。
【００２４】
上述の抗体、上述のコード遺伝子、上述の組換えベクター、上述の組換え株、上述の組換え細胞、及び上述の発現カセットの少なくともいずれかの、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかのための製品の製造のための使用もまた、本発明の保護範囲に入る。
【００２５】
上述の用途においては、腫瘍は結腸癌であり、腫瘍細胞はＳＷ４８０細胞である。
【００２６】
本発明の最後の目的は、タンパク質フラグメント、及びそのコード遺伝子を提供することにある。
【００２７】
本発明において提供されるタンパク質フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号３の１位〜１４５位で表される。
【００２８】
本発明において提供されるタンパク質フラグメントのコード遺伝子は、
ａ）配列番号４の１位〜４３５位で表されるヌクレオチド配列、
ｂ）ａ）に規定するＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ分子、又は
ｃ）ａ）に規定するＤＮＡ配列と７０％を超える同一性を示し、前記タンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ分子
で表される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、軽鎖遺伝子及び重鎖可変領域遺伝子のＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動のプロットである。
【図２】図２は、本発明の抗体を含む発現ベクターの概略図である。
【図３】図３は、本発明の抗体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図４】図４は、本発明の抗体の免疫ブロット分析である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
特に断りがない限り、以下の実施例において使用した実験方法は、全て従来の方法である。
【００３１】
特に断りがない限り、以下の実施例で使用される材料及び薬剤等は、全て市販されている。
【００３２】
ｐＩＲＥＳバイナリ発現ベクターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号：６３１６０５で購入し、ｐＭＤ１８−Ｔ発現ベクターを、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｃｏｍｐａｎｙから製品カタログ番号：Ｄ５０４  ＣＡで購入した。
【００３３】
ベクターｐＩＲＥＳ−Ａｎｔｉ−ＣＤ２０は、軍事医学科学院バイオテクノロジー研究所から公開された「Ａｎｔｉ−ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体の構築、発現及び特性評価，Ｃｈｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５，２５（７）：３４−３９」に開示されている。
【００３４】
実施例１  抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のコード遺伝子の取得
【００３５】
マウス−ヒトキメラ抗体セツキシマブのタンパク質構造及びアミノ酸配列は、新規抗体のコンピュータモデリング設計のための鋳型として使用される。設計に続いて、軽鎖のこれらのアミノ酸配列、及び重鎖の「可変領域＋重鎖定常領域１」のアミノ酸配列に基づく遺伝子の合成工程が行われる。
【００３６】
本発明の抗体は、軽鎖Ｌ４及び重鎖Ｈ３から構成され、前記重鎖Ｈ３は、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）から構成される（Ｈ３＝ＶＨ＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）。本発明の抗体を、Ｌ４−Ｈ３とした。
【００３７】
軽鎖Ｌ４：アミノ酸配列は、配列番号１で表され、コード遺伝子の配列は、配列番号２の８５位〜７２６位で表される。
【００３８】
重鎖Ｈ３：アミノ酸配列は、配列番号３で表され、コード遺伝子の配列は、配列番号４で表される。
【００３９】
配列番号３において、１位〜１４５位のアミノ酸が重鎖可変領域（ＶＨ）であり、１４６位〜２４３位のアミノ酸が重鎖定常領域１（ＣＨ１）であり、２４４位〜２５８位のアミノ酸がヒンジ領域であり、２５９位〜３６９位のアミノ酸が重鎖定常領域２（ＣＨ２）であり、３７０位〜４７５位のアミノ酸が重鎖定常領域３（ＣＨ３）である。
【００４０】
配列番号４において、１位〜４３５位のヌクレオチドが重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子であり、４３６位〜７２９位のヌクレオチドが重鎖定常領域１（ＣＨ１）遺伝子であり、７３０位〜７３９位のヌクレオチドがスプライスドナーであり、７４０位〜１，１１７位のヌクレオチドがイントロン１であり、１，１１８位〜１，１６２位のヌクレオチドがヒンジ領域であり、１，１６３位〜１，２８０位のヌクレオチドがイントロン２であり、１，２８１位〜１，６１３位のヌクレオチドが重鎖定常領域２（ＣＨ２）であり、１，６１４位〜１，７１０位のヌクレオチドがイントロン３であり、１，７１１位〜２，０３１位のヌクレオチドが重鎖定常領域３（ＣＨ３）であり、２，０３２位〜２，２３０位のヌクレオチドがイントロン４である。
【００４１】
重鎖Ｈ１の「可変領域＋定常領域１」：コード遺伝子の配列は、配列番号５で表される。
【００４２】
軽鎖Ｌ４のコード遺伝子は、人工合成によって得られた（即ち、配列番号２の９位〜７２９位のヌクレオチドは、人工的に合成された）。重鎖Ｈ３の「定常領域２＋定常領域３」のコード遺伝子（即ち、配列番号４の７３０位〜２，２３０位のヌクレオチド）は、人工合成によって得ることができ、ベクターｐＩＲＥＳ−Ａｎｔｉ−ＣＤ２０の酵素消化によって得ることもできる。
【００４３】
重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子は、人工合成によって得ることができ、配列番号５で表されるコード遺伝子を人工合成する以下の方法によって得ることもできる。配列番号５で表される人工的に合成したコード遺伝子を鋳型として使用し、重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子を、重複ＰＣＲ法を用いて、プライマー１、プライマー２、プライマー３、プライマー４、プライマー５及びプライマー６から増幅することによって得た。フラグメント（Ａ、Ｂ、及びＣと名付けた）を、プライマー対１及び３、プライマー対４及び５、並びにプライマー対６及び２を用いてそれぞれ増幅した。次いで、増幅したＡ、Ｂ及びＣを鋳型として混合し、重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」の標的コード遺伝子を、プライマー１及びプライマー２で増幅した。
１：  ５’−ｇｔｇｔｃｔａｇａｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔｇｇａ−３’  （ＸｂａＩ）；（配列番号６）
２：  ５’−ｇｇｇａｔｃｃａｃｔｔａｃｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔｃｔ−３’  （ＢａｍＨＩ）；（配列番号７）
３：  ５’−ａｔｃｃａｃｔｃａａｇｔｃｔｔｔｇｔｃｃａｇｇｇｇｃｃｔｇｔｃｇｃａｃｃｃａｇｔｇｇａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔａｇｔｃａｇｇｃｔｇａａｔｃｃａｇ−３’  （配列番号８）
４：  ５’−ｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇａｇｔｇａｔｃｔｇｇａｇｔｇｇｔｇｇｔａａｃａｃｔｇａｃｔａｃａａｃａｃｃｃｃｃｔｔｃａｃｔａｇｃａｇａｇｔｃａｃｃ−３’  （配列番号９）
５：  ５’−ｇａｃｃａｇｇｇｔｔｃｃｃｔｇｇｃｃｃｃａｇｔａｇｇｃｇａａｃｔｃｇｔａｇｔｃｇｔａａｔａａｇｔｃａｇｇｇｃｔｃｔｃｇｃａｃａｇ−３’  （配列番号１０）
６：  ５’−ｃｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇ−３’  （配列番号１１）
【００４４】
得られたそれぞれの遺伝子についてゲル電気泳動分析を行い、結果は予想されたサイズと一致した。軽鎖Ｌ４のフラグメントサイズは、約７２０ｂｐであり、重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子のサイズは、約７２９ｂｐである（図１）。Ｍ：相対分子量標準、Ａ：レーン１は、軽鎖Ｌ４のコード遺伝子であり、Ｂ：レーン１は、重鎖Ｈ１の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子であり、レーン３は、重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子である。
【００４５】
得られた軽鎖のコード遺伝子、及び重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子を、ベクターｐＭＤ１８−Ｔにそれぞれクローニングし、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、モノクローナル株を選択し、プラスミドを抽出し、識別のためにシークエンシングした。結果は、配列番号２の９位〜７２９位のヌクレオチドで表されるＤＮＡ（即ち、軽鎖のコード遺伝子）がベクターｐＭＤ１８−Ｔに挿入されたことを実証し、組換えベクターをｐＭＤ１８−Ｔ／Ｌ４とした。配列番号４の１位〜７２９位で表されるヌクレオチド（即ち、重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のコード遺伝子）をベクターｐＭＤ１８−Ｔに挿入し、組換えベクターをｐＭＤ１８−Ｔ／ＶＨ＋ＣＨ１とした。
【００４６】
実施例２  抗体の発現及び精製
【００４７】
Ａ．組換え発現ベクターの構築：
【００４８】
組換えベクターｐＭＤ１８−Ｔ／Ｌ４及びｐＩＲＥＳバイナリ発現ベクターを、対応する制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｈｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉ）でそれぞれ酵素消化した。アガロースゲル電気泳動後、精製された標的フラグメントを回収した。軽鎖遺伝子フラグメントＬ４とベクター断片とを混合し、リンキング剤の作用の下で、１６℃で１２時間互いに反応させた。大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、モノクローナル株を選択し、プラスミドを抽出し、識別のためにシークエンシングした。結果：配列番号２における９位〜７２９位のヌクレオチドで表される軽鎖のコード遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳのＮｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位及びＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位の間に（Ｎｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位からＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位の方向に）挿入した。構築した組換えベクターは正しいことが実証され、これを組換え発現ベクターｐＩＲＥＳ／Ｌ４とした。
【００４９】
プラスミドの大型フラグメントを、ｐＩＲＥＳ／Ｌ４を鋳型として使用し、Ｘｂａ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉでの酵素消化によって回収し、フラグメント１とした。約７２９ｂｐのフラグメント（即ち、重鎖Ｈ３の「可変領域＋定常領域１」のフラグメント）を、ｐＭＤ１８−Ｔ／ＶＨ＋ＣＨ１を鋳型として使用し、Ｘｂａ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉでの酵素消化によって回収し、フラグメント２とした。約１５０２ｂｐのフラグメント（即ち、「重鎖の定常領域２＋定常領域３」を含むフラグメント）を、ｐＩＲＥＳ−Ａｎｔｉ−ＣＤ２０を鋳型として使用し、ＢａｍＨ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉでの酵素消化によって回収し、フラグメント３とした。フラグメント１、フラグメント２、及びフラグメント３を、組換えベクターを得るために連結し、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、モノクローナル株を選択し、プラスミドを抽出し、識別のためにシークエンシングをした。結果は、配列番号４で表される重鎖のコード遺伝子が、ベクターｐＩＲＥＳのＸｂａ  Ｉ制限酵素認識部位とＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位との間に（Ｘｂａ  ＩからＮｏｔ  Ｉの方向に）挿入され、配列番号２における９位〜７２９位のヌクレオチドで表される軽鎖のコード遺伝子が、ベクターｐＩＲＥＳのＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位とＮｈｅ  Ｉ制限酵素認識部位との間に（Ｎｈｅ  ＩからＥｃｏＲ  Ｉの方向に）挿入され、ＩＲＥＳ（内部リボソーム導入部位ＩＲＥＳは、独立してリボソームを補充して重鎖のｍＲＮＡを翻訳し得る）が、軽鎖のコード遺伝子と重鎖のコード遺伝子との間に配置されたことを実証した。陽性の組換え発現ベクターを、ｐＩＲＥＳ／Ｌ４／Ｈ３とした（図２）。
【００５０】
Ｂ．抗体のベクター形質転換及び発現
【００５１】
２９３Ｔ細胞（２９３Ｔヒト胎児腎臓Ｔ細胞）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から製品カタログ番号ＣＲＬ−１１２６８で購入し、リポフェクタミン２０００を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号１２５６６０１４で購入し、ＨｙＱＳＦＭ４ＣＨＯ培地を、ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号ＳＨ３０５１８．０２で購入し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムを、ＧＥ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号１７−５０７９−０１で購入した。
【００５２】
２９３Ｔ細胞を、直径１０ｃｍの培養皿に１×１０６／ｍＬの濃度でそれぞれ植菌した。培養皿を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で充填し、５％のＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。工程Ａにおいて得られた５μｇのプラスミドｐＩＲＥＳ／Ｌ４／Ｈ３を、薬剤リポフェクタミン２０００の説明に従った詳細な操作で、２９３Ｔ細胞に導入するのに使用した。組換え細胞２９３Ｔ−ｐＩＲＥＳ／Ｌ４／Ｈ３が得られた。
【００５３】
組換え細胞２９３Ｔ−ｐＩＲＥＳ／Ｌ４／Ｈ３を、無血清ＤＭＥＭ培地で培養した。６時間〜８時間後、無血清培地を取り除いてＨｙＱＳＦＭ４ＣＨＯ培地と交換した。同じ条件で合計８４時間培養を続け、細胞の上清を１２時間毎に一回回収した。次いで、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体の発現を大まかに評価した。トランスフェクションシステムを増幅し、４Ｌ〜５Ｌの細胞培養上清を回収し、それをｐＨ６．０〜ｐＨ７．０に調整し、０．４５μｍのフィルター膜を介して濾過し、次いで抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムにより製品の説明に従った詳細な操作で精製した。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ：未知の抗原を分析するための、二重抗体サンドイッチ法：
【００５５】
１．コーティング：タンパク質の濃度が１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬになるまで抗体（一次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧである）を希釈するために、０．０５Ｍ及びＰＨ９．０の炭酸コーティング緩衝液を使用した。ポリスチレンプレートの各反応ウェルに０．１ｍＬを添加し、４℃で一晩置いた。翌日、ウェル内の溶液を捨て、プレートを、洗浄緩衝液で３回、それぞれ３分間洗浄した（洗浄と簡略化し、以下同様である）。
【００５６】
２．充填：コーティングされた反応ウェルを、０．１ｍＬの試料で充填し、一定の割合に希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した。また、ブランクのウェル、陰性対照ウェル（導入されていないプラスミドの２９３Ｔ細胞の上清）及び陽性対照ウェル（セツキシマブ注射液（エルビタックス），輸入医薬品認可番号：Ｓ２００５００９５  ＭＥＲＣＫ ＆ＣＯ． ＩＮＣ．，ドイツ，製品ロット番号：７６６７２０１）を充填した。
【００５７】
３．酵素標識抗体（二次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ）である）の添加：０．１ｍＬの新たに希釈した酵素標識抗体（滴定後の希釈）を、各反応ウェルに添加し、３７℃で０．５時間〜１時間インキュベートし、洗浄した。
【００５８】
４．発色基質溶液の添加：０．１ｍＬの一時的に作製したＴＭＢ基質溶液を、１０分間〜３０分間、３７℃で各反応ウェルに添加した。
【００５９】
５．反応のクエンチング：０．０５ｍＬの２Ｍ硫酸を、各反応ウェルに添加した。
【００６０】
６．結果の評価：結果は、白を背景にして肉眼で直接観察してもよく、ここで、反応ウェルの内部の色がより深い程、より強い陽性を示しており、陰性反応は、無色であるか又は非常に明るかった。「＋」及び「−」の指標を、色の程度に従って使用した。ＯＤ値の測定：ブランクの対照ウェルでのゼロ点調整後、各ウェルのＯＤ値を、ＥＬＩＳＡ装置上で４５０ｎｍで（ＡＢＴＳで着色されている場合は、４１０ｎｍで）測定した。ＯＤ値が、所定の陰性対照の値より２．１倍を超えて大きい場合は、陽性であった。
【００６１】
薬剤
（１）コーティングバッファー（ＰＨ９．６及び０．０５Ｍの炭酸塩緩衝液）：１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３、及び２．９３ｇのＮａＨＣＯ３に蒸留水を加えて１０００ｍＬにした。
【００６２】
（２）洗浄緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳ）：０．１５Ｍ：０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．５ｍＬの０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０に蒸留水を加えて１０００ｍＬにした。
【００６３】
（３）希釈：０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を洗浄バッファーに添加して全体で１００ｍＬとするか、又は、ヤギ血清及びウサギ血清等を使用する洗浄溶液とともに５％〜１０％に調製した。
【００６４】
（４）クエンチング溶液（２ＭのＨ２ＳＯ４）：１７８．３ｍＬの蒸留水を、２１．７ｍＬの濃硫酸（９８％）に滴下した。
【００６５】
リン酸ナトリウム緩衝液（結合緩衝液）：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを精製するための結合緩衝液。作製の方法：５７．７ｍＬの１ＭのＮａ２ＨＰＯ４及び４２．３ｍＬの１ＭのＮａＨ２ＰＯ４を均一に混合して、１００ｍＬの０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を得、これを次いで蒸留水によって使用できる状態の２０ｍＭに希釈した。
【００６６】
クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（抽出緩衝液）：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを精製するための抽出緩衝液。作製の方法：１８６ｍＬの０．１Ｍのクエン酸及び１４ｍＬの０．１Ｍのクエン酸ナトリウムを均一に混合して、２００ｍＬの０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．０）を得た。
【００６７】
抗体は、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムで精製した（精製培地：５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦを、ＧＥ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからロット番号：１７−５０７９−０１で購入した）。詳細な使用方法の説明については、本企業が提供する説明を参照。
【００６８】
手順：
【００６９】
１）チューブを、１ＭのＮａＯＨ及びｄｄＨ２Ｏによってこの順で洗浄し、小型フィルターを０．１ＭのＮａＯＨ中で１０分間煮沸し、次いでそれをｄｄＨ２Ｏへ１分間〜２分間浸漬し、
２）プログラムを設定してｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムを接続し、
３）２０ｍＭの結合緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてクロマトグラフィーカラムを平衡化し、
４）調整した細胞上清を１ｍＬ／分〜２ｍＬ／分の流量で充填し（前記細胞上清の調整：１２，０００ｇで１５分間の遠心の後に上清を取り出し、次いで該上清をろ過滅菌用の０．２２ｕｍの硝酸セルロースフィルター膜を通過させる）、
５）充填の終了直前に１Ｍの抽出バッファー（ｐＨ３．０）で標的タンパク質を抽出し、
６）抽出溶液（即ち、標的タンパク質）を回収し、トリス塩基（ｐＨ９．０）を用いてｐＨを７．０に調整し、次いで電気泳動によって分析し、
７）工程１）に記載のチューブ及び小型フィルターを洗浄する。
【００７０】
Ｃ．タンパク質の分析
【００７１】
ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号（０４６Ｋ４８０１）で購入し、ヤギ抗マウスＩｇＧ１を、ＳＢＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）から製品カタログ番号（１０１０−０５）で購入した。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：１５μＬの抽出溶液（即ち、抗体溶液）を取り出して１２％のゲル上で還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
【００７３】
結果は、精製して得られた抗体の重鎖及び軽鎖の相対分子量が、それぞれ２５×１０３及び５０×１０３であることを示し（図３）、予想された結果と一致した。図３において、レーン１〜レーン４は、本発明の抗体Ｌ４−Ｈ３を表し、レーン５は、陽性対照セツキシマブを表す。
【００７４】
免疫ブロット分析：抽出溶液の別の部分を取り出して１２％のゲル上で還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、次いで硝酸セルロース膜に転写した。次いで、膜を取り出し、室温で２時間ブロッキング緩衝液（５％の脱脂粉乳を含む１×ＰＢＳＴ）中でブロッキングし、１：５，０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体とともに２時間（室温で）インキュベートし、次いで１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。最後に、膜をＥＣＬで着色し、Ｘ線フィルムに露光した。図４において、レーン１は、陽性対照セツキシマブを表し、レーン２〜レーン５は、本発明の抗体Ｌ４−Ｈ３を表す。
【００７５】
免疫ブロッティング（１２％）分析は、抗体がヤギ抗ヒトＩｇＧと特異的に結合することができることを実証している。しかしながら、抗ヒトＩｇＧ二次抗体（市販のセツキシマブを含む）と反応する部分的な非特異的にハイブリダイズしたレーンがあり、これは精製中の部分的な非全長重鎖フラグメントの混合によって生じた可能性がある。しかしながら、上記の結果は、抗体の結合親和性の評価には影響を与えない。上述の抗体はいずれも、ヤギ抗マウスＩｇＧ１とは反応しない。
【００７６】
本抗体の軽鎖及び重鎖は同じ発現ベクターにおいて比例的に発現されるので、それらは、２つの軽鎖と２つの重鎖とを含む完全な抗体へと自己組織化される。
【００７７】
Ｄ．タンパク質の発現量
【００７８】
４Ｌ〜５Ｌの発現抗体Ｌ４−Ｈ３の細胞培養上清を、工程Ａ及び工程Ｂの方法に従って得た。抗体を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムにより精製して２９３Ｔ細胞における抗体の発現量を分析したところ、結果は抽出溶液中に０．６μｇ／ｍＬである。
【００７９】
実施例３  抗体の機能特性
【００８０】
Ａ．表面プラズモン共鳴［Ｂｉａｃｏｒｅ］での抗体と抗原との結合能の測定
【００８１】
センサーチップＣＭ５を、ＢＤ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号ＢＲ−１０００−１０１４で購入し、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）マトリゲル（登録商標）インベーションチャンバーを、ＢＤ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号３５４４８０で購入した。
【００８２】
ＥＧＦＲタンパク質を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号Ｅ２６４５−５００ＵＮで購入した。
【００８３】
抗体とＥＧＦＲとの間の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置で分析した。１０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウムで希釈した異なるｐＨ（４．０、４．５、５．０及び５．５）を有するＥＧＦＲタンパク質を作製し、ＣＭ５チップ上に予め凝縮して最適ｐＨを有する酢酸ナトリウム希釈タンパク質を選択した。精製した抗体（即ち、実施例２の工程Ｂで得られた洗浄溶液）をＣＭ５センサーチップに共有結合させた。移動相はＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．４）であり、流量は２０μＬ／分であった。５つの異なる濃度（０ｎｍｏｌ／Ｌ、１０．５５ｎｍｏｌ／Ｌ、２１．１ｎｍｏｌ／Ｌ、４２．２ｎｍｏｌ／Ｌ及び８４．４ｎｍｏｌ／Ｌ）の抗体とＥＧＦＲタンパク質との間の結合親和性を分析した。結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００により付属のソフトウェアで計算した。同時に、セツキシマブを対照群として用いた。
【００８４】
実験は３回繰り返し、結果を平均した。
【００８５】
結果は、抗体と抗原ＥＧＦＲとの間に良好な結合活性があることを示し、結合親和性は２．７５×１０−９Ｍであり、セツキシマブの結合親和性は１．１×１０−９Ｍである。結果は、本発明のヒト化抗体が、親の抗体の良好な結合活性を維持し、マウス由来の抗体の有害反応を克服し、かつ十分な臨床応用価値を有することを実証している。
【００８６】
Ｂ．腫瘍細胞浸潤の実験
【００８７】
ＳＷ４８０細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＣＬ−２２８（登録商標）で購入し、セツキシマブ抗体を、ドイツのＭｅｒｃｋ−Ｌｉｐｈａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄから購入した（商標：ＥＲＢＩＴＵＸ、薬剤名：セツキシマブ、中国における参照商標：ａｉ  ｂｉ  ｔｕｏ、分子構造名：セツキシマブ、起源：ドイツ、製造元：ドイツのＭｅｒｃｋ−Ｌｉｐｈａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ）。
【００８８】
ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからカタログ番号３１８００−０２２で購入）を、ＳＷ４８０細胞の培養に使用した。インベーションチャンバーを、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で水分補給し、２時間（３７℃、５％ＣＯ２）インキュベートした。無血清ＲＰＭＩ１６４０を捨て、７５０μＬのＲＰＭＩ１６４０（１０％血清を含む）を、インベーションチャンバー（ＢＤ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから製品カタログ番号３５４４８０で購入した、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）マトリゲル（登録商標）インベーションチャンバー）のウェルチャンバーに添加し、４７５μＬのＲＰＭＩ１６４０（１％血清を含む）を、インサートチャンバーに添加し、次いで２５μＬの消化したＳＷ４８０細胞（細胞数＞１０５／５００μＬ）を添加した。最後に、陰性対照ＰＢＳ及び本発明の抗体を別々にインサートチャンバーに添加し、各試料が、抗体の最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬである２つの繰り返しウェルを有するようにした。２４時間のインキュベーション後、浸潤カセットの基底膜を貫通していなかった細胞を、滅菌綿棒で拭き取り、浸潤カセットの基底膜を貫通した細胞を、固定し、染色し、室温で乾燥し、次いで光顕微鏡下で数えた。
【００８９】
統計：対応する３セットの各インサートチャンバー内の試料の細胞の数を、１００倍の顕微鏡下で数えた。ＳＰＳＳ１２．０解析ソフトウェアにより、細胞浸潤実験データに対してｔ検定を実行し、本発明の抗体をヒトＩｇＧのセットと比較した。結果がＰ＜０．０５であった場合は、２つの処理効果の間の差異は統計的に有意であった。
【００９０】
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は有意差を有しており、そのＳＷ４８０腫瘍細胞の浸潤に対する阻害が有意である。実験は３回繰り返し、結果を平均した。ｔ検定の結果は、ヒトＩｇＧのセット、及び本発明の抗体のＰ値が、対照セットにおけるヒトＩｇＧと比較して０．０１未満であることを示している（表１）。
【００９１】
【表１】
2014506455.tif 000002
細胞浸潤実験のｔ検定の結果
注：ヒトＩｇＧと比較して、＊Ｐ＜０．０１
【産業上の利用可能性】
【００９２】
実験結果は、本発明の抗体が、優れた抗原結合活性、並びに腫瘍細胞の増殖、転移、及び浸潤を阻害する能力を有することを実証している。その一方で、国際市場での一般的な抗ＥＧＦＲヒト−マウスキメラ抗体であるセツキシマブの結合親和性は、１．１×１０−９Ｍである。本発明のヒト化抗体は、良好にＥＧＦＲと結合することができ、従ってその抗腫瘍効果を確実にする。本発明の抗体を作製する方法は、軽鎖と重鎖とを同時に発現することができ、軽鎖と重鎖との１：１に近い発現比率をもたらし、従ってより大きな割合の整合した二重鎖抗体を製造する。結論として、本発明の抗体及びその作製方法は、腫瘍の予防及び治療の少なくともいずれかを行う分野において広い実用性の見込みを有するであろう。
【図１】
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【図２】
2014506455.tif 000004
【図３】
2014506455.tif 000005
【図４】
2014506455.tif 000006
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014506455.tif 000009
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