(57)【要約】本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４から直接、作成され、または遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ株から直接、生産された莢膜多糖Ｋ４の酸加水分解によって順番に得られた、硫酸化されていないコンドロイチン主鎖から出発する、化学硫酸化による１０〜３０ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有するコンドロイチン硫酸の生産法を開示する。今までに記載された合成法で得られる硫酸化とは異なり、天然のコンドロイチン硫酸で観察された硫酸化パターンを模倣して、同じ多糖鎖内で、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４位または６位での硫酸化が同時に起こる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ多糖鎖中の全てのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン単位が、ランダムに、または４位もしくは６位でモノ硫酸化される、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩の調製方法であって、
前記方法は以下のステップ
ａ．コンドロイチンナトリウム塩の、その遊離酸、またはテトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムもしくはテトラブチルアンモニウムから選択された第４級アンモニウムカチオンとの塩、あるいは、ピリジニウム塩、またはメチルエステルへの変換ステップ；
ｂ．酸触媒作用の存在中で、ステップａ）で得られた化合物と、式ＲＣ（ＯＲ１）３のオルトエステル、ただし、Ｒは水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択され、Ｒ１はメチルまたはエチルから選択される、とを反応させ、コンドロイチン中に存在する繰り返し二糖単位が式Ｉを含む化合物を与えるステップ
【化１】
2014514424.tif 000010
ただし、ＲおよびＲ１は上記のように定義される；
ｃ．ピリジン、あるいはトリエチルアミンまたはトリイソプロピルアミンから選択された第三級有機塩基、ならびに４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在中での、式（Ｒ２ＣＯ）２Ｏの無水物、ただし、Ｒ２はメチル、エチルまたはプロピルから選択される、との反応によって、前のステップで得られた化合物のグルクロン酸単位の２’位および３’位でヒドロキシル基を保護して、コンドロイチン中に存在する繰り返し二糖単位が式ＩＩを含む化合物を与えるステップ
【化２】
2014514424.tif 000011
ただし、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は上記のように定義される；
ｄ．水溶性有機酸を用いた、ステップｃ）で得られた生成物中に存在するオルトエステル官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の転位により、トリアシル誘導体からなる多糖中の繰り返しＧａｌＮＡｃ単位が式ＩＩＩＩａまたはＩＩＩｂを含むエステル誘導体を与えるステップ
【化３】
2014514424.tif 000012
【化４】
2014514424.tif 000013
ただし、Ｒ、およびＲ２は上記のように定義される；
ｅ．ステップｄ）で得られた化合物をモノ硫酸化した後、前のステップで得られた化合物ＩＩＩａおよびＩＩＩｂ中に存在するＯ−アシル基を除去するステップ、
を有する方法。
【請求項２】
ステップａ）のコンドロイチンナトリウム塩は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４の培養ブロスによって生産された莢膜多糖Ｋ４、またはＥ．ｃｏｌｉ株ＤＳＭ２３６４４の培養ブロスによって生産された多糖、の何れかから出発して得られる、請求項１の方法。
【請求項３】
ステップｂ）は、トリメチルオルト酢酸、トリエチルオルト酢酸、トリメチルオルトギ酸、トリエチルオルトギ酸、トリメチルオルトプロピオン酸、トリエチルオルトプロピオン酸、またはトリメチルオルト安息香酸から選択されたオルトエステル、好ましくはトリメチルオルト酢酸、またはトリエチルオルト酢酸、より好ましくはトリメチルオルト酢酸を用いて行われる、請求項１の方法。
【請求項４】
ステップｂ）の酸触媒作用は、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸から選択される酸、またはスルホン樹脂、好ましくはカンファースルホン酸、またはスルホン樹脂、より好ましくはカンファースルホン酸を用いて行われる、請求項１の方法。
【請求項５】
ステップｃ）は、無水酢酸を用いて行われる、請求項１の方法。
【請求項６】
ステップｄ）は、２０〜４０℃、好ましくは室温で行われる、請求項１の方法。
【請求項７】
ステップｄ）は、４０〜７０℃、好ましくは６０℃で行われる、請求項１の方法。
【請求項８】
ステップｄ）は、水／水溶性有機酸混合物中、または水中だけで行われる、請求項１の方法。
【請求項９】
有機酸は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酒石酸、クエン酸、またはプロピオン酸樹脂、好ましくは酢酸、またはプロピオン酸、より好ましくは酢酸から選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩は、１０〜３０ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１の方法。
【請求項１１】
コンドロイチン硫酸ナトリウム塩は、９０／１０の４Ｓ／６Ｓから１０／９０の４Ｓ／６Ｓまでの範囲の比のモノ硫酸基の分布を有する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩中の、４位および６位における硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン単位間の比が、１未満である、請求項１の方法。
【請求項１３】
得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩中の、４位および６位における硫酸化Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン単位間の比が、１を超える、請求項１の方法。
【請求項１４】
請求項１の方法により得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩。
【請求項１５】
同じ多糖鎖中の全てのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン単位が、ランダムに、または４位もしくは６位でモノ硫酸化されたバイオテクノロジー源からなり４０００〜９０００ダルトンの平均分子量を有する、コンドロイチン硫酸。
【請求項１６】
９０／１０の４Ｓ／６Ｓから１０／９０の４Ｓ／６Ｓまでの範囲の比のモノ硫酸基の分布を有する、請求項１５のコンドロイチン硫酸。
【請求項１７】
骨関節炎の予防および治療での、ならびに／または筋骨格系の健康維持のための、請求項１４〜１６のコンドロイチン硫酸の使用。
【請求項１８】
請求項１４〜１６に記載のコンドロイチン硫酸、および１以上の薬理学的もしくは栄養補助的に許容できる添加剤を含む組成物。
【請求項１９】
骨関節炎の予防および治療での、ならびに／または筋骨格系の健康維持のために使用するための、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、硫酸化されていないコンドロイチン主鎖から出発する化学硫酸化によるコンドロイチン硫酸の製造方法に関する。本発明の方法では、同じ多糖鎖内で、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４位または６位が同時に硫酸化する。今までに記載された合成法で得られたものとは異なり、このようにして得られたコンドロイチン硫酸には、天然のコンドロイチン硫酸で観察されたものと同じ硫酸化パターンが存在する。
【０００２】
本発明は、ＳＥＣによって決定された、４〜９ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有するコンドロイチン硫酸、ならびに９０％の４−硫酸塩および１０％の６−硫酸塩から１０％の４−硫酸塩および９０％の６−硫酸塩までの範囲のモノ硫酸化基の分布に関するものでもある。
【背景技術】
【０００３】
技術的な背景
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、異なる位置で硫酸化されベータ１−３結合によって結合されたグルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の残基によって形成された二糖配列からなるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）類に属する、天然の複合多糖である。
【０００４】
ＣＳは、構造的および生理学的な機能を有する、動物の組織内に存在する。その起源に応じて、ＣＳは主に、割合が変化し得るＧａｌＮＡｃの４位または６位でモノ硫酸化された二種類の二糖単位（それぞれ、二糖ＡおよびＣ）からなる。しかし、硫酸基が異なる数および異なる位置に存在する二糖は、多糖鎖中で様々な割合で存在することができる。硫酸化されていない二糖も含むＣＳ主鎖は、一般的に少量である。ＧｌｃＡの２位およびＧａｌＮＡｃの６位（二糖Ｄ）、ＧｌｃＡの２位およびＧａｌＮａｃの４位、あるいはＧａｌＮＡｃの４位および６位（二糖Ｅ）のような様々な位置で酸素原子を通して結合した、２つの硫酸基を有する硫酸化された二糖は、特定の動物源に応じて、様々な割合でＣＳ主鎖中に存在することができる（Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６１，１２７１，２００９．Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６，３１６８，２００７．Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １２  ６３９，２００６）。
【０００５】
ＣＳ中に発見される繰り返し二糖単位は、以下の化学式を有する。
【０００６】
【化１】
2014514424.tif 000002
【０００７】
式中、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６は、独立して、ＨまたはＳＯ３−である。
【０００８】
繰り返し二糖単位中のカルボキシル基および硫酸基の負電荷は、ナトリウムイオンによって中性化される。
【０００９】
様々な硫酸化された二糖を特定するのに大部分で共通して使用される頭字語の意味は、以下のように説明される。
【００１０】
【数１】
2014514424.tif 000003
【００１１】
異なる動物源に由来するＣＳのサンプルも異なる分子量および電荷密度によって特徴づけられ、この後者のパラメータは直接的に特定の硫酸基と関連している。
【００１２】
表１は、様々な動物種の軟骨および他の組織から抽出した天然のＣＳ中に発見された主な二糖を示している。
【００１３】
【表１】
2014514424.tif 000004
【００１４】
表１  Ｍｎ＝数平均分子量；Ｍｗ＝重量平均分子量；多分散度＝Ｍｗ／Ｍｎ；電荷密度は二糖単位当たりの硫酸基の数である；ＮＤ＝同定不能
表１に示すように、陸生動物に由来するＣＳは、類似した分子量パラメーラー（ＭｎおよびＭｗ）を有するが、それは、より高い分子量値を有する魚属に由来するＣＳの分子量パラメーラーとは異なる。陸生のＣＳサンプルは１．０未満の電荷密度（ＣＤ）値によって特徴づけられるが、水生ＣＳサンプルは常に１．０を超えるＣＤ値を有する。この特性は、硫酸化された二糖の異なる分布による。一般的に、硫酸化された二糖は、陸生のＣＳ中に微量で発見され、ポリ硫酸化された二糖（トリ−およびテトラ−硫酸塩）は天然のＣＳ中では観察されない。
【００１５】
トリ−およびテトラ−硫酸化された二糖が存在しないことは、ポリ硫酸化された二糖に対応する多糖鎖を加水分解できないが、ジ硫酸化された二糖を消化でき、モノ硫酸化された二糖（Ｄｉ−４ＳおよびＤｉ−６Ｓ）および硫酸化されていない二糖（Ｄｉ−０Ｓ）に対して特異的な溶解酵素である、コンドロチナーゼＡＢＣを用いた多糖の消化を分析することによって、容易に証明することができる。コンドロチナーゼＡＢＣで消化された天然のＣＳのＦＡＣＥ（蛍光標識糖質電気泳動法、Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis）分析は、先行技術に由来する合成または半合成ＣＳ中で発見される、部分的に消化されないオリゴ糖に典型的な電気泳動バンドを検出しない。
【００１６】
生合成プロセスにより、全ての天然のＣＳは常に、同じ多糖鎖のＧａｌＮＡｃの４位または６位におけるモノ硫酸化された二糖が同時に存在するのを示すことも周知である（Ｄ’Ａｒｃｙ  ＳＭら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｍａｒ  ４；２５５：４１−５９．  Ｈａｒｄｉｎｇｈａｍ  ＴＥら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｍａｒ  ４；２５５：２４１−５４．  Ｃｈｅｎｇ  Ｆら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９２  Ｄｅｃ；２（６）：５５３−６１．Ｃｈａｉ  Ｗら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６  Ｍａｙ  １５；２３７（１）：８８−１０２．  Ｚａｉａ  Ｊら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｄｅｃ  １５；７３（２４）：６０３０−９．  Ｄｅｓａｉｒｅ  Ｈら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１  Ａｕｇ  １；７３（１５）：３５１３−２０）。
【００１７】
ＣＳについては、その分子構造に関して様々な活性が報告された（Ｋｉｍａｔａ  Ｋら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １，２１１、１９６３．  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３，３０１５，２００２．  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ，Ｔａｒｕｇｉ  Ｐ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１，９５５，１９９９．  Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０，１３５９，１９９９．  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４３，７，１９６８）。
【００１８】
ＣＳは抗炎症活性を有しており、臨床的証拠および多数の臨床試験の対応するメタ分析(meta-analyse)に基づいて、現在、欧州で変形性関節症（ＳＹＳＡＤＯＡ）用、特に膝関節（Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６２，１１４５，２００３）、腰（Ｊｏｒｄａｎ  ＫＭら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６２，１１４５，２００３）、および手関節（Ｚｈａｎｇ  Ｗら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６６，３７７，２００７）の変形性関節症の治療用の症候性の遅効性薬物(Symptomatic Slow-Acting Drug)として、変形性関節症(ＯＡ)の治療で推奨される。ＣＳは欧州および米国で、単独でまたは他の成分と組み合わせて、栄養補助食品としても広く使用されている（ＭｃＡｌｉｎｄｏｎ  ＴＥら、ＪＡＭＡ  ２８３，１４６９、２０００．Ｖｏｌｐｉ  Ｎら、Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌ  Ｍｅｔｈ  １，１９５，２００８．  Ｖｏｌｐｉ  Ｎら、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃ  １，２２，２００９）。
【００１９】
市販のＣＳは、ウシおよびブタの組織（Ｆｕｅｎｔｅｓ  ＥＰら、Ａｃｔａ  Ｆａｒｍ  Ｂｏｎａｅｒｅｎｓｅ  １７，１３５，１９９８）、トリの組織（Ｌｕｏ  ＸＭら、Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ８１，１０８６−１０８９，２００２）、および魚の軟骨（Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｋら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３９，８７１，１９９６．  Ｌｉｇｎｏｔ  Ｂら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０３，２８１，２００３）等の動物組織からの抽出によって得られる。
【００２０】
市販のＣＳの動物起源は、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）等の疾病を引き起こす伝染性の感染性病原体と関連した安全上の問題をはらんでおり、増大する世界的な要望を満たすのに利用できる可能な原料を制限する。これらの要因は、ＣＳを生産する代替法の研究を促した。
【００２１】
ＣＳの構造に部分的に類似した構造を有する多糖前駆体の原料として微生物を用い、化学硫酸化を行って天然のＣＳに類似するＣＳを生産する、ＣＳのバイオテクノロジー的生産法を見つけるために、徹底的な努力がなされてきた。
【００２２】
この戦略の一例は、ＥＰ１３０４３３８  Ｂ１(特許文献１)に記載のように、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４の莢膜多糖  Ｋ４から、バイオテクノロジー的にＣＳを生産することである。前記特許は、液体培地中で生産された多糖Ｋ４が抽出、精製され、次いで、再溶解され、酸加水分解に供されて、ポリマーのＧｌｃＡ残基に結合したフルクトース残基を除去する方法を開示している。ＣＳ（ＣＨ）の硫酸化されていない主鎖と同一の、フルクトースを除去した(defructosylated)ポリマーは次いで、二つの異なる化学合成法に従って、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位が硫酸化される。前記特許は、４位および６位の両方で硫酸化されたＣＳが得られる第三の方法も開示する。そこに記載のＣＳは、ＧａｌＮＡｃ残基の４位および６位、硫酸化されていないＧｌｃＡ残基の２’位で、モノ−および／またはジ−硫酸化されたものからなる、少なくとも７０％の含量の硫酸化多糖を含み、６〜２５ｋＤａの分子量（Ｍｗ）および０．７〜２．０の電荷密度（ＣＤ）を有する。
【００２３】
ＥＰ１３０４３３８  Ｂ１では、著者は、使用される合成法に応じて、
ａ）全ての存在するＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基の６位を選択的に保護することによってＣＳ  ４Ｓを合成し、従って、全てのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基の４位でだけ選択的に硫酸化されたポリマーを得るステップ、
ｂ）同様にして、好適には４位に存在するヒドロキシル残基を保護しながら、全てのＧａｌＮＡｃ残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されたポリマーを得るステップ、
の可能性を開示し、権利を主張している。
【００２４】
ＥＰ１３０４３３８  Ｂ１に記載の方法では、それ故、天然のＣＳの状態とは異なり、同じ鎖の４位または６位で同時に硫酸化が起こらない。
【００２５】
最近の文献（Ｂｅｄｉｎｉ  Ｅら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１  Ｍａｙ  １８）(非特許文献１)には、生産される多糖Ｋ４が、同じ鎖のＧａｌＮＡｃ残基の４位および／または６位で硫酸化される方法が記載されている。しかし、ベディニ（Ｂｅｄｉｎｉ）らによって記載されたバイオテクノロジー的なＣＳは天然のＣＳ、すなわち、約１７ｋＤａの分子量と類似した分子量を有し、結果的に、天然の抽出生産物に特有の低い生体利用効率となる。ベディニらは、彼らが得た生産物の何れの薬理特性も報告していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】ＥＰ１３０４３３８  Ｂ１
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｂｅｄｉｎｉ  Ｅら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１  Ｍａｙ  １８
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】コンドロチナーゼ  Ｃ．で処理した、ウシ起源の天然のコンドロイチン硫酸に関する。
【図２】コンドロチナーゼ  Ｃ．で処理した、ブタ起源の天然のコンドロイチン硫酸に関する。
【図３】コンドロチナーゼ  Ｃ．で処理した、本発明のバイオテクノロジー的なコンドロイチン硫酸に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
コンドロチナーゼ  Ｃ．で処理した、ウシ起源の天然のコンドロイチン硫酸に関する。異なる長さの様々なオリゴ糖は、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位における硫酸基の存在を示す。
【００３０】
クロマトグラムは、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）での勾配分離(gradient separation)および２３２ｎｍにおけるＵＶ検出によって得られた。勾配(gradient)は、５０ｍＭ  ＮａＣｌから１．２Ｍ  ＮａＣｌまでの０から６０分間で得られた。
【００３１】
図２は、コンドロチナーゼ  Ｃ．で処理した、ブタ起源の天然のコンドロイチン硫酸に関する。異なる長さの様々なオリゴ糖は、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位における硫酸基の存在を示す。
【００３２】
クロマトグラムは、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）での勾配分離(gradient separation)および２３２ｎｍにおけるＵＶ検出によって得られた。
【００３３】
図３は、コンドロチナーゼ  Ｃ．で処理した、本発明のバイオテクノロジー的なコンドロイチン硫酸に関する。この多糖用でもある、異なる長さの様々なオリゴ糖は、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位における硫酸基の存在を示す。
【００３４】
クロマトグラムは、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）での勾配分離(gradient separation)および２３２ｎｍにおけるＵＶ検出によって得られた。
【００３５】
発明の説明
本発明は、硫酸化されていないコンドロイチン主鎖（ＣＨ）から出発する化学硫酸化に続くＣＳの生産法を記載し、このＣＨは、特許出願ＭＩ２０１０Ａ００１３００およびＭＩ２０１０Ａ００１２６４に記載のように、天然の微生物の多糖ｉ．ｌ．（Ｋ４）の酸加水分解によって得られ、またはＥ．ｃｏｌｉ株ＤＳＭ２３６４４等の遺伝子操作を行ったＥ．ｃｏｌｉから直接、生産される。本明細書に記載の菌株は、Ｋ４のフルクトース化(fructosylation)用のＫｆｏＥ遺伝子の不活性化を引き起こす突然変異体を保有する。
【００３６】
本発明の方法で得られたＣＳには、欧州薬局方に記載の分析法に基づいて９５％を超える滴定濃度(titre)を有する天然のＣＳの特性が存在する。
【００３７】
本発明の方法で得られたＣＳは、ＳＥＣで測定された、１０〜３０ｋＤａ、好ましくは２０〜３０ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有し、９０％の４−硫酸塩および１０％の６−硫酸塩から１０％の４−硫酸塩および９０％の６−硫酸塩の範囲のモノ硫酸基の分布が存在する（表２）。
【００３８】
【表２】
2014514424.tif 000005
【００３９】
本発明の方法で得られたＣＳは、少量の（＜１０％）の硫酸化されていない二糖、および非常に低い割合（＜５％）のジ硫酸化された二糖を含む；トリ硫酸化された二糖は、同定できない。
【００４０】
本発明の方法で得られたＣＳは、０．８〜１．０の電荷密度値によって特徴づけられる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、得られたＣＳは、４位で硫酸化された二糖（Ｄｉ−４Ｓ）および６位で硫酸化された二糖（Ｄｉ−６Ｓ）の比率が１未満であることを示すが、他の形態では、（４Ｓ）二糖および（６Ｓ）二糖の比率は１よりも大きいことを示す。
【００４２】
本発明の方法は、部位特異的な硫酸化を調節して、上記の範囲内の特定の４Ｓ／６Ｓ比を有するＣＳを生産する。
【００４３】
本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４によって生産された莢膜多糖Ｋ４の酸加水分解によって順に得られ、または遺伝子操作を行ったＥ．ｃｏｌｉから直接、生産された、非硫酸化コンドロイチン主鎖からの化学硫酸化による、低分子量（ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣ，４０００〜９０００ダルトン）を有する、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の生産にも関する。発明の目的である低分子量のコンドロイチン硫酸は、４０００〜９０００ダルトンの分子量分布(molecular weight interval)によって特徴づけられ、その分子量分布は、特にウシ、ブタもしくはトリ起源の陸生生物のコンドロイチン硫酸の分子量分布（１４０００〜２６０００ダルトン）か、または、例えば、サメ、イカ、エイもしくは硬骨魚から得られた海洋生物起源のコンドロイチン硫酸の分子量分布（一般的に＞４００００ダルトン）の、天然起源のコンドロイチン硫酸の分子量分布よりもずっと少ない。これらの特性を考慮すると、発明のコンドロイチン硫酸は、経口投与後、より高い吸収作用を示し、それ故、より高純度な天然のコンドロイチン硫酸、またはバイオテクノロジー的／化学的プロセスによって生産されるコンドロイチン硫酸よりも、人間での生体利用効率が優れている。発明のコンドロイチン硫酸は、高純度な天然のコンドロイチン硫酸と同程度の抗炎症活性および抗関節炎活性を有する。発明のコンドロイチン硫酸は、炎症および骨関節炎／関節炎の症状(process)の治療に使用するのに適している。
【００４４】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、ＳＥＣによって測定された、４〜９ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有し、９０％の４−硫酸塩および１０％の６−硫酸塩から１０％の４−硫酸塩および９０％の６−硫酸塩の範囲のモノ硫酸基の分布を有する。発明の低分子量のＣＳの特性は、実質的に上記表２に記載のより高い分子量誘導体の特性と同一である。
【００４５】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、少量の（＜１０％）の非硫酸化二糖、および非常に低い割合（＜５％）のジ硫酸化された二糖を含むが、トリ硫酸化された二糖は同定できない。
【００４６】
ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、陸生生物起源の天然のＣＳの電荷密度値と同程度の０．８〜１．０の電荷密度値によって特徴づけられる（表１を参照）。
【００４７】
発明の方法は、天然起源のＣＳに存在する４Ｓ／６Ｓ比と類似の、上記の特定された制限内の特定の４Ｓ／６Ｓ比を有するＣＳを提供するために、部位特異的な硫酸化も調節する。
【００４８】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、コンドロチナーゼＡＢＣによって認識され、消化され、コンドロチナーゼＡＢＣは、特定の有機体中の天然のＣＳを分解する作用を有し、従って、バイオテクノロジー的にＬＭＷ−ＣＳの多糖鎖は天然酵素の特定の高感度の認識を抱かせがちな構造的な遺伝子組み替えを行っていないことを示す溶解酵素である。
【００４９】
最終的に、４位ではなく、６位で硫酸化された残基中の多糖を加水分解するエンドリアーゼ(endolyase)である、コンドロチナーゼＣで消化されたＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、天然のＣＳ中で起こるように、同じ多糖鎖中でＤｉ−６Ｓ単位と置換されたＤｉ−４Ｓ単位の存在に特有のオリゴ糖配列を生産する（図１、２および３）。図１は特に、コンドロチナーゼＣで処理されたウシ起源の天然のコンドロイチン硫酸を表す。同じ多糖鎖でのＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位に硫酸基の存在を示す、異なる長さのオリゴ糖を見ることができる。クロマトグラムは、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）での勾配分離(gradient separation)および２３２ｎｍにおけるＵＶ検出によって得られた。勾配(gradient)は、５０ｍＭ  ＮａＣｌから１．２Ｍ  ＮａＣｌまでの０から６０分間で得られた。
【００５０】
図２は、コンドロチナーゼＣで処理されたブタ起源の天然のコンドロイチン硫酸を表す。同じ多糖鎖でのＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位に硫酸基の存在を示す、異なる長さのオリゴ糖を見ることができる。クロマトグラムは、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）での勾配分離(gradient separation)および２３２ｎｍにおけるＵＶ検出によって得られた。
【００５１】
図３は、コンドロチナーゼＣで処理された、本発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを表す。再び、同じ多糖鎖でのＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位に硫酸基の存在を示す、異なる長さのオリゴ糖が見える。
【００５２】
クロマトグラムは、強陰イオン交換カラム（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）での勾配分離(gradient separation)および２３２ｎｍにおけるＵＶ検出によって得られた。
【００５３】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、欧州薬局方の第１標準である、ウシ起源の高純度な天然のＣＳと比較した人間の経口吸収および生体利用効率について評価された。ＣＳ（および低分子量の誘導体）の分解(breakdown)に特異的な溶解酵素を生合成できる細菌が人間では存在するが、動物の細菌叢では存在しないため（Ａｈｎ  ＭＹら、Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９８；４４：４２３−９）、このことは特に重要である。
【００５４】
ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの経口吸収および生体利用効率は、公知の技術によって、人間で評価された。
【００５５】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、
白血球、すなわち、人間の白血球エラスターゼによる炎症プロセスの間に生産されるタンパク質分解酵素を阻害する能力（Ｋｏｓｔｏｕｌａｓ  Ｇ．ら、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３７８、１４８１、１９９７；Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １０５，１５７，１９９７；Ｙｉｎｇ  ＱＬら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２，Ｌ５３３，１９９７）；人間の好中球におけるフリーラジカルによる抗走化性、食作用活性、リゾチーム遊離、および生体膜への損傷を阻害する能力（Ｍａｔｚｎｅｒ  Ｙ．ら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ５２，１３４，１９８４；Ｒｏｎｃａ  Ｆ，Ｐａｌｍｉｅｒｉ  Ｌら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ６  Ｓｕｐｐｌ  Ａ，１４、１９９８）
等の特異的試験を用いた、起こりえる抗炎症活性について評価した。
【００５６】
これらの試験は、欧州薬局方の第１標準である、ウシ起源の高純度な天然のＣＳである参照化合物と比較して、発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣについて行われた。
【００５７】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、科学界によって広く認められ、多数の学術論文で公表された動物モデルである「アジュバント関節炎（ＡＡ）モデル」における抗関節炎特性についても評価された。再び、結果は、参照分子である欧州薬局方標準のウシ起源の高純度な天然のＣＳで以前に得られた結果（Ｖｏｌｐｉ  Ｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９６，３１６８，２００７）と比較された。事実、ＯＡおよびリウマチ性関節炎（ＡＲ）の動物モデルは、これらの発病プロセスの研究に有用な手段である。「アジュバント関節炎」（ＡＡ）は、最も一般的に使用されるモデルの一つである。ラットのＡＡは、臨床試験前後の多数の抗関節炎剤および薬剤を試験するために広く使用されてきた、多発性関節炎の実験モデルである（Ｂｅｎｄｅｌｅ  Ａら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２７，１３４，１９９９；Ｒｏｖｅｎｓｋｙ  Ｊら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｉｎｔ．３１，５０７，２０１１；Ｂａｕｅｒｏｖａ  Ｋら、Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４，１０１，２０１１）。ＡＡ試験で得られた動物データを人間での結果と比較した多数の研究も行われた（Ｋａｎｎａｎ  Ｋら、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２，１６７，２００５）。
【００５８】
高純度で低分子量のポリマー鎖の４位または６位での同時の硫酸化により、発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの経口吸収をより良くし、生体利用効率をより優れたものとする。
【００５９】
本発明の一態様は、発明によるＣＳの組成物、および薬剤分野もしくは栄養補助食品分野で許容できるキャリヤに関する。前記組成物は、錠剤、固いカプセル、柔らかいゼラチンカプセル、若しくは飲用の粉末混合物等の様々な固体の形態で、または液体の形態(溶液)で、好ましくは非経口投与もしくは経口投与用の薬剤または栄養補助食品の形態で、製剤化することができる。組成物は他の活性成分または不活性成分を含むことができる。
【００６０】
組成物は好ましくは以下の物質の少なくとも一つを含むこともできる。グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ケラチン、デルマチン(dermatin)、メチルスルホニルメタン、葉酸および還元葉酸、グループＢビタミン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アスコルビン酸、またはアスコルビン酸マグネシウム。組成物は、必要に基づく有効量で患者に投与できる。
【００６１】
例えば、その使用を制限しないが、ＣＳまたは本発明に記載の組成物は、１日につき約６００ｍｇで２回の服用または４００ｍｇで３回の服用に分けられて、１日につき１００から３０００ｍｇの量、好ましくは１日につき１０００から２０００ｍｇの量、より好ましくは１日につき１２５０ｍｇから１７５０ｍｇの量、で投与することができる。
【００６２】
本発明は、骨関節炎の治療もしくは予防用の、または薬剤成分もしくは栄養補助成分として健康な筋骨格の維持用の、記載のＣＳあるいはその組成物の使用に関するものでもある。
【００６３】
例えば、記載のＣＳあるいはその組成物は、腰、手もしくは膝の骨関節炎、およびその主症状（痛み、関節腫脹、炎症）、アルツハイマー病、細菌感染、動脈硬化症、および骨粗しょう症の予防ならびに／あるいは治療用の、薬剤調製物、ダイエット添加物、あるいは栄養補助食品を作るために使用でき、抗腫瘍治療および神経組織を含む組織再生における補助剤として使用できる。
【００６４】
発明の方法の有利な特性は、今まで記載された合成法で得られたものとは異なり、天然のＣＳで観察された硫酸パターンを模倣して、同じ多糖鎖中で、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位での硫酸化が同時に起こることである。この態様は、２つの異なる酵素系、すなわち、４位および６位で硫酸化された単位ならびに硫酸化されていない単位を消化できるコンドロチナーゼＡＢＣ、ならびに、６位で硫酸化された残基および硫酸化されていない残基に対応して加水分解できるが、４位で硫酸化された残基に対応して同様の溶解開裂(lytic cleavage)を行うことができないエンドリアーゼ(endolyase)であるコンドロチナーゼＣ、を使用して得られたデータによって確認される。コンドロチナーゼＡＢＣだけ、およびコンドロチナーゼＣだけで得られた消化製品は、Ｊｏｏｎ−Ｓｏｏ  Ｓｉｍら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，２００５  ｖｏｌ．８１８，１３３−１３９）によって記載された、質的および量的に二糖Ｄｉ−０Ｓ、Ｄｉ−４ＳおよびＤｉ−６Ｓの存在、ならびに酵素によって消化されない何れかのオリゴ糖の存在を示す、ＨＰＬＣクロマトグラフィー技術で分析される。
【００６５】
コンドロチナーゼＡＢＣによる消化製品の分析は、硫酸化されていない二糖Ｄｉ−０Ｓ、モノ硫酸化された二糖Ｄｉ−４ＳおよびＤｉ−６Ｓ、および微量のジ硫酸化された二糖Ｄｉ−４，６Ｓの形成により、製品がほとんど全て消化されたことを実証している。
【００６６】
しかし、コンドロチナーゼＣを用いた消化製品で行われた同じ分析は、４位で硫酸化されたＧａｌＮＡｃの同じ鎖の存在のため、多糖を完全に分解する酵素の能力がないことを示しており、二糖配列、および上記全てのオリゴ糖配列の存在を明確に示す。これは、硫酸残基が４位に存在する時、酵素は作用できず、結果としてオリゴ糖残基を残すためである。前記残基は、例えば、天然のＣＳ（ウシおよびブタ）のコンドロチナーゼＣならびにバイオテクノロジー(biotechnology)的に本発明で得られたＣＳを用いた消化に関する図１、２および３のクロマトグラフの痕跡に示されているように、ゲルクロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）のようなクロマトグラフィーならびに電気泳動技術によっても明確に検出される。それらは、同じ多糖鎖のＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位に硫酸基が存在する、異なる長さの様々なオリゴ糖を含む。
【００６７】
全てのこれらの特性は、本発明の方法で得られたＣＳに、以下の特徴を有する天然のＣＳの構造を与える：
ａ）全て、またはほとんど全てのＧａｌＮＡｃ残基が、６位または４位でモノ硫酸化される；
ｂ）使用される合成条件に応じて、４Ｓおよび６Ｓ残基比（４Ｓ／６Ｓ）は完全に、陸生生物および魚起源の両方のＣＳで発見された４Ｓ／６Ｓに類似する。
【００６８】
典型的には、本発明のＣＳは、出発物質としてＥ．ｃｏｌｉ株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４（ＥＰ１３０４３３８Ｂ１）によって自然に生産された莢膜多糖Ｋ４、または硫酸化されていないコンドロイチン（ＣＨ）の構造を有する他の多糖を用いて得られる。
【００６９】
最初の場合では、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４の培養ブロスから得られた多糖Ｋ４は、熱酸加水分解によって発酵の終わりにフルクトースが除去され(defructosylated)、コンドロイチンはロドリゲスおよびヤーン（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｊａｎｎ）によって記載された方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７，１１７−１２４、ＦＥＢＳ  １９８８）の適用に従って精製される。
【００７０】
あるいは、出発物質である多糖は、例えば、Ｋ４のフルクトース化(fructosylation)の原因であるＫｆｏＥ遺伝子中で誘発された突然変異のため、天然の硫酸化されていないＣＨと同一の多糖を生産する、ＭＩ２０１０Ａ００１３００に記載のＥ．ｃｏｌｉ株ＤＳＭ２３６４４の培養物から得られる。この場合、フルクトースの除去(defructosylation)は必要ではない；しかし、熱酸加水分解ステップは、処理の結果として沈殿する細菌内毒素を含むいくつかの不純物を取り除くために維持される。コンドロイチン（ＣＨ）は次いで、遠心分離、透析、および噴霧乾燥によって精製される。
【００７１】
加水分解は、連続的な遠心分離によってバイオマスから分離された、培養物の上澄み液に対して行われる。Ｋ４の部分加水分解およびフルクトースの除去(defructosylation)は、９０〜９５℃で３０〜５０分間、ｐＨ２．８〜３．０での培養によって行われる。
【００７２】
培養期間後、得られた懸濁液は４０℃未満の温度、好ましくは２０〜３０℃で冷却され、加水分解反応を終了させ(quench)、ｐＨは同時に４〜４．５に調節される。得られた懸濁液は順に、連続的な遠心分離、限外濾過、最終的には３０ｋＤａの膜を通した水の透析によって精製される。
【００７３】
透析された保持液(retentate)（最初の培養ブロスの体積の約１／１０）は濾過され、最終的に噴霧乾燥機によって乾燥されて、硫酸化プロセスに供する、ＣＨの構造を有する多糖を得る。得られたＣＨは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）またはＨＰＬＣによって決定された、乾燥基準（ｗ／ｗ）で８０〜９０％の滴定濃度(titre)を有する。
【００７４】
このようにして得られたＣＨは、ナトリウム塩の形態を有し、硫酸化されるために、遊離酸またはその塩に変換される必要がある。
【００７５】
本発明の硫酸化プロセスでは同じ多糖鎖のＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位をランダムにモノ硫酸化し、それはＧａｌＮＡｃの４位と６位を同時に含むオルトエステルの形成ならびにそれに続くエステルへの転位を含み、それは驚くべきことに４位または６位で主にヒドロキシルを遊離させるように調節でき、従って、これらのヒドロキシルを選択的に硫酸化させる。
【００７６】
発明の方法は、以下のステップを含む：
ａ）コンドロイチンナトリウム塩の遊離酸への変換、または、代わりに、テトラメチル−、テトラエチル−、もしくはテトラブチル−アンモニウム等の第４級アンモニウムイオン、またはピリジンを有するその塩への変換。好ましくは、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩が使用される。
【００７７】
あるいは、酸の形態のコンドロイチン（ＣＨ）は、メタノールおよびアセチル塩化物中での反応後、そのメチルエステルに変換される。
【００７８】
ｂ）酸触媒作用の存在中で、式ＲＣ（ＯＲ１）３（式中、Ｒは水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択され、Ｒ１はメチルまたはエチルから選択され）のオルトエステルを用いたコンドロイチン塩あるいはコンドロイチンメチルエステルの反応であり、従って、ＧａｌＮＡｃ残基の４位および６位のアルコール官能基(alcohol functions 4 and 6)による、出発物質であるオルトエステルの二つのアルコキシルの移動によって得られた、環状オルトエステルを得る反応。このステップで得られた化合物では、存在する全て、またはほとんど全ての二糖単位は、式Ｉで表される環状オルトエステル構造を含む。
【００７９】
【化２】
2014514424.tif 000006
【００８０】
（式中、Ｒ、Ｒ１は上記のように定義される。）。
【００８１】
使用できるオルトエステルの例は、トリメチルオルト酢酸、トリエチルオルト酢酸、トリメチルオルトギ酸、トリエチルオルトギ酸、トリメチルオルトプロピオン酸、トリエチルオルトプロピオン酸、またはトリメチルオルト安息香酸エステルである。好ましくは、トリメチルオルト酢酸、またはトリエチルオルト酢酸が使用される。トリメチルオルト酢酸の使用が特に好ましい。
【００８２】
酸触媒として、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、またはスルホン樹脂から選択される酸、好ましくはカンファースルホン酸またはスルホン樹脂、より好ましくはカンファースルホン酸が使用される。
【００８３】
ｃ）ピリジン、あるいはトリエチルアミンまたはトリイソプロピルエチルアミン等の第三級有機塩基の存在中で、式（Ｒ２ＣＯ）２Ｏ、ただし、Ｒ２は好ましくはメチル、エチルまたはプロピルから選択される、のカルボン酸無水物を用いたアシル化によって、ＧｌｃＡ残基の２’位または３’位におけるアルコール基、ならびに触媒量の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の保護により、コンドロイチン中に見出される繰り返し二糖単位が式ＩＩで表される２’位または３’位でアシル化された環状オルトエステル構造を有する生産物を与える。
【００８４】
【化３】
2014514424.tif 000007
【００８５】
ただし、Ｒ、Ｒ１、およびＲ２は上記のように定義される。
【００８６】
好ましくは、無水酢酸が使用される。
【００８７】
ｄ）水溶性有機酸および水の混合物中、または水中だけで行われる反応である、環状オルトエステルからエステルへの転位。この転位は多糖配列の様々なＧａｌＮＡｃ単位上でランダムに起こり、転位は、残っている位置（６位または４位でそれぞれ）で使用される可溶性有機酸を用いたエステルの同時形成と共に、一つもしくは他のヒドロキシル（４位または６位でそれぞれ）の放出を促進するように調節できる。その結果、同じ多糖鎖中での二つの異なる二糖単位、すなわち：
−６位、２’位および４’位のヒドロキシルがアシル化され、４位のヒドロキシルが自由であり、前記単位が式ＩＩＩａで表される構造を有する二糖単位；
【００８８】
【化４】
2014514424.tif 000008
【００８９】
（式中、Ｒ、およびＲ２は上記のように定義される。）、あるいは、
−４位、２’位および４’位のヒドロキシルがアシル化され、６位のヒドロキシルが自由であり、前記単位が式ＩＩＩｂで表される構造を有する二糖単位
【００９０】
【化５】
2014514424.tif 000009
【００９１】
（式中、Ｒ、およびＲ２は上記のように定義される。）、
が形成される。
【００９２】
２０〜４０℃の温度、好ましくは室温で、１〜４８時間、好ましくは３〜３８時間、より好ましくは３８時間、反応が行われることによって、驚くべきことに６位に自由なヒドロキシルを有する大量の化合物が観察されるが、他方、４０〜７０℃の温度、好ましくは６０℃で、１〜４８時間、好ましくは３〜３８時間、より好ましくは１８時間、反応が行われる時、４位の位置に自由なヒドロキシルを有する生産物が優先する。水溶性有機酸は酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酒石酸、クエン酸、または例えばＳｅｐｒａ  ＳＣＸ  ５０μｍ  ６５Ａ等のカチオン樹脂から選択され、好ましくは酢酸またはプロピオン酸、より好ましくは酢酸である。
【００９３】
ｄ）この後に、ＥＰ１３０４３３８  Ｂ１に既に記載の方法によるＤＭＦ中のピリジン三酸化硫黄、またはＤＭＦ−三酸化硫黄錯体(complex)を用いた硫酸化が行われ、使用される転位条件ならびにその結果としてそこに存在する構造ＩＩＩａおよびＩＩＩｂの割合に従って、二糖ＩＩＩａの４位、または二糖ＩＩＩｂの６位で同時に、様々に硫酸化されるであろうＣＳを得る。硫酸化反応の次に、ＥＰ１３０４３３８  Ｂ１に記載の手法に従って、基本的な処理による、ＧｌｃＡ残基の２’位および３’位、ならびにＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位に存在するアシル基の除去を行い、４位および６位で部分的に硫酸化されたＣＳナトリウム塩を与える。
【００９４】
プロセス中に使用されるいくつかの技術では、低分子量（ＬＭＷ）によって特徴づけられるＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位で硫酸化されたＣＳを生産するように、多糖鎖の脱重合に至る。
【００９５】
コンドロイチンは、オルトエステル転位の段階で、反応の溶媒または共溶媒としての酸を用いて脱重合することもできる。この段階の高濃度の酸により多糖鎖が破壊され、結果として４〜９ｋＤの範囲の低分子量の鎖が生産される。
【００９６】
記載されたプロセスによって得られた、ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣ，４０００〜９０００ダルトンの、ラットでの実験的動物関節炎モデル（アジュバント関節炎ＡＡ）における有効性を評価し、その結果は、毎日、９００ｍｇ／ｋｇで経口治療後、同じ実験モデル（Ｂａｕｅｒｏｖａ  Ｋ．ら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２０１１，印刷前の電子出版）で使用された抽出起源の薬剤グレードの天然のＣＳの有効性と比較した。
【００９７】
ＡＡは、フロイント不完全アジュバント中でのマイコバクテリアム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の１回の(single)皮内注射によって誘発された。実験は、健常な動物、未治療の関節炎動物、および治療した関節炎動物を含んでいた。治療した動物の中で、一群の動物は、関節炎が誘発される前の１４日間、１日につき９００ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの投与からなる前処置に供され、続いてＡＡの誘発後、２８日間、治療に供された。他の群の動物は、ＡＡの誘発後、２８日間、単に１日につき、９００ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣで治療した。
【００９８】
後足中で成長した浮腫は、前処置した動物中で著しく減少した。発明によるＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣでの前治療（９００ｍｇ／ｋｇ／日）は、未治療の対照群と比較して、実験を通して浮腫を著しく減少させた。ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを用いた前治療は、未治療の関節炎対照群と比較して約８〜１５％、体重も回復させる。
【００９９】
関節炎の重症度は、腫張(swelling)および関節周囲の紅斑の増加レベルに基づいて測定された。前治療および治療の両方で投与された９００ｍｇ／ｋｇ／日のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、関節炎のスコア減少させる上で著しく有効である。また、前治療は、準急性段階（ＡＡの誘発後、１４〜２８日まで）を通して有効であるが、治療は、急性段階（ＡＡの誘発後、最初の１４日）ではないＡＡの誘発後、２１〜２８日である中長期でだけ有効である。
【０１００】
関節炎／骨関節炎プロセスで起こる慢性的な炎症プロセスの結果である酸化的ストレスは、急性および準急性段階の両方の動物モデルで著しく増加する。増加した酸化的ストレスは、血漿(plasma)中での内因性の抗酸化物質の高い消費を誘発し、結果として、全抗酸化物質の状態として測定される、血漿抗酸化物質容量の減少を引き起こす。ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを用いた前処理は、動物モデルの全抗酸化物質の状態を是正し、内因性の抗酸化物質の消費を著しく減少させる上で有効である。酸化的ストレスに対応して増加し、それ故、酸化的ストレスの優れたマーカーであると考えられているγ−グルタミントランスフェラーゼの活性は、関節組織ホモジネートで測定され、実験的に誘発された多発性関節炎に罹患した動物において大幅に大きくなることを示し、未治療の動物と比較してＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを用いて治療した動物では大幅に低くなることを示した。
【０１０１】
インターロイキン−１β（１Ｌ−１βおよびインターロイキン−６（ＩＬ−６）、副炎症性サイトカイン(pro-inflammatory cytokines)は、健康な対照群よりも１０倍、高いレベルを示す急性段階でのＩＬ−６の劇的な増加と共に、実験的に誘発された関節炎の動物モデルで大幅に増加した。急性段階における１４日目から、ＡＡに罹患した動物と比較して約３０〜４０％のＩＬ−６濃度を減少させており、ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの治療効果は既に明白であった。
【０１０２】
炎症性タンパク質、すなわち、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）の基本的なマーカーは、ＩＬ−６と非常に類似した時間プロファイルを有する。急性段階における増加は、健康な対照群よりも、実験的な関節炎モデルにおいて約７．５倍、大きかった。ＣＲＰに対するＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの効果は、ＩＬ−６レベルに対するその効果のように、血漿ＣＲＰ濃度の大幅な減少と共に、急性段階で観察される。
【０１０３】
好中球の食細胞活性および細胞内酸化力の増加については、健康な対照群と実験的に誘発されたＡＡに罹患した対照群との間で観察された相違は、増加した食細胞活性の場合に著しかった。前処理基準でのＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの投与は、食作用および酸化的破壊の大幅な減少を引き起こした。
【０１０４】
発明のＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、関節炎プロセスの重症度および慢性的な炎症プロセスの結果として生じた酸化的ストレスを大幅に減少させる。ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを用いた前処理は、準急性段階を通して有効であるが、ＡＡの開始の１日目からの治療は、慢性期の間のみ有効である。効果は、全抗酸化物質の状態およびγ−グルタミントランスフェラーゼの活性の改善によって確認される。前処理として投与されたＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、血漿中の副炎症性サイトカイン、Ｃ−反応性タンパク質の生成、好中球の食細胞活性および細胞内酸化的破壊も減少させる。最終的に、ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、急性および準急性の両方の段階における実験的な関節炎／骨関節炎の進行を遅くし、疾患のマーカーを減少させるのに有効であり、従って、参照化合物と同様に有益な活性を保持することを示した。
【実施例】
【０１０５】
発明はこれから、以下の実施例によって更に説明される。
【０１０６】
実施例１：コンドロイチンのテトラ−アルキルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の調製
多糖Ｋ４またはＥ．Ｃｏｌｉ株ＤＳＭ２３６４４の発酵により得られた多糖から出発し、上記の方法によって加水分解、精製、および乾燥の後に得られたＣＨナトリウム塩を、水性媒体中に溶解させる。完全な溶解後、溶液を、Ａｍｂｅｒｊｅｔ  １２００  Ｈ、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ等のカチオン交換樹脂、あるいは同等のもので充填されたカラムの中に導入される。
【０１０７】
ｐＨ１．５〜４．０、または、好ましくはｐＨ１．５〜２．０で溶離した画分は捕集され、テトラメチル−、テトラエチル−、およびテトラブチル−アンモニウム、あるいはピリジニウムから選択されたイオンの水溶液が、６．０〜８．０のｐＨ、または好ましくは６．５〜７．０のｐＨまで添加され、得られた。次いで、溶液は、凍結乾燥または噴霧乾燥によって完全に蒸発乾固され、相当する塩を得る。
【０１０８】
実施例２：対応する環状メチルオルトエステルＣＨ（ＣＨ−ｃＭＯＥ）の生成によるＧａｌＮＡｃ部分のヒドロキシル化された官能基（４位および６位）の保護
テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩等のコンドロイチンから得られた塩を、フラスコ中でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とそれぞれ、５．２ｇおよび１３０ｍｌの量で混合する。８．４９ｇのトリメチルオルト酢酸をフラスコ中に滴下し、次いで、３００ｍｇのカンファースルホン酸を添加し、反応混合物を７０℃で７２時間、維持する。次いで、反応物は真空下で蒸発乾固され、更に４０℃で２０時間、温室乾燥され(stove-dried)、固体の形態の６．１ｇのコンドロイチン−ＭＯＥ  ＴＢＡを得る。
【０１０９】
反応生成物の分析は、保護が起こったことを確かめるために行われた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、出発生産物が消失し、高分子量（４８ｋＤａ）を有する新規生産物が出現したことが確認された。自由なＣＨは加水分解できるか、保護されたＣＨは加水分解できない酵素である、コンドロチナーゼＡＢＣを用いた消化によって行われた分析は、出発物質であるＣＨ分子の保護されていない割合は１５％未満であることを示した。
【０１１０】
実施例３：コンドロイチン環状オルトエステル（２’，３’ジアセチルＣＨ−ｃＭＯＥ）の２’，３’アセチル化
環状メチルオルトエステル（ＣＨ−ｃＭＯＥ）（４．７９ｇ）として保護された、先行するステップから生じるコンドロイチンが、２３．９５ｍｌのアセトニトリル、１５．６９ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）、６．２１ｍｌの無水酢酸、および７８．９６ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を有する反応フラスコに導入される。２５〜２６℃での２時間の攪拌後、９４ｍｌのジ−イソプロピルエーテルが添加され、粘着性の固体が得られ、その固体は次いで濾紙を通して濾過され、真空下、４５℃で２４時間、温室乾燥される。このように得られた環状オルトエステル中間体は、ピンクの固体の外観を有する。
【０１１１】
実施例４：環状メチルオルトエステルから、４位で通常の(prevalent)酢酸形成があり、６位で自由なヒドロキシルを有するエステルへの転位（図ＩＩＩＢを参照）
先行するステップから得られた中間体（２．４２ｇ）は、反応フラスコ中に導入され、反応フラスコには、１８．８ｍｌの９６％酢酸および２．３５ｍｌの脱塩水が添加される。１００ｍｌの０．６Ｍ  ＮａＣｌ溶液を添加後、混合物を室温で３８時間、攪拌し、混合物を５ｋＤａの膜を通して限外濾過し、透析してｐＨ３．３２の保持液を回収する。
【０１１２】
溶液を真空下、４５〜５０℃で濃縮する：終夜、更なる温室乾燥後、ガラス質の固体の外観を有する１．３８ｇの生成物が得られる。
【０１１３】
実施例５：環状メチルオルトエステルから、６位で通常の(prevalent)酢酸形成があり、４位で自由なヒドロキシルを有するエステルへの転位（図ＩＩＩＡを参照）
先行するステップから得られた２．４２ｇの環状オルトエステル中間体を、１４．５２ｍｌの９６％酢酸、および９．８ｍｌの脱塩水を有する反応フラスコ中に導入し、１７．５時間、６０℃まで加熱し、次いで、１００ｍｌの０．６ＭのＮａＣｌを添加し、溶液（ｐＨ２．２７）を限外濾過し、透析してｐＨ３．５６の保持液を回収する。
【０１１４】
溶液を真空下、４５〜５０℃で濃縮し、終夜、更なる温室乾燥後、ガラス質の固体の外観を有する１．１２ｇの生成物が得られる。
【０１１５】
実施例６：三酸化硫黄・ピリジニウム錯体を用いたコンドロイチン硫酸の調製
実施例４に記載のようにして得られた中間体（０．７６ｇ）を、４６．０ｍｌのＤＭＦを有するフラスコ中に導入し、混合物を３０℃で１０分間、攪拌する。０．７２ｇの三酸化硫黄ピリジニウムを添加し、出発物質が溶解した時（約１０分）、３０℃で１時間、攪拌のもとで溶液を残す。次いで、更に０．７２ｇの三酸化硫黄ピリジニウムを添加し、続いて、更に０．７２ｇの三酸化硫黄ピリジニウムを添加する。溶液を更に１時間、３０℃で攪拌する。
【０１１６】
室温で、混合物を１０％のＮａＨＣＯ３水溶液の５０ｍｌ中に添加することによって、反応を終了させる(quenched)（ｐＨ７．８１）。濾過後、溶液を真空下（１０ｍＢａｒ）で蒸発乾固し、残留物を１５０ｍｌの０．６ＭのＮａＣｌで再溶解させ、最終的に溶液を限外濾過する。
【０１１７】
体積を６回、変化させた後、保持液はｐＨ９．２２を有する；ｐＨは１ＮのＨＣｌで６．７に調節され、０．６ＮのＮａＣｌ溶液を脱塩水に換えて、限外濾過を続ける。
【０１１８】
得られた溶液を再び、２倍の体積で限外濾過し、次いで、２０ｍｌの体積まで透析する。透析した溶液を真空下（１０ｍＢａｒ、４５℃）、濃縮乾固する。
【０１１９】
このようにして得られた生成物（０．８８ｇ）を３４．０ｍｌの０．２Ｎソーダ（ＮａＯＨ）で溶解させ、２時間の攪拌下、４０℃まで加熱する。最終的に溶液は、０．６Ｍの塩化ナトリウム水溶液で希釈され、５ｋＤａの膜を通して限外濾過され、脱塩水で透析される。保持液を真空下（４５℃、１０ｍＢａｒ）、濃縮乾固して０．６７ｇのコンドロイチン硫酸を得る。最終生成物は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定された、２９ｋＤａの分子量を有し、
−コンドロチナーゼＡＢＣを用いた９５％を超える消化率；
−１８／８２の４Ｓ／６Ｓ比；
−約０．９の全電荷密度値；
−本発明の特徴である、４−硫酸化単位および６−硫酸化単位の両方の同一の多糖鎖上での存在に起因するオリゴ糖の存在によって示される、コンドロチナーゼＣを用いた最適な(only)部分消化率
を示す。
【０１２０】
実施例７：三酸化硫黄ピリジニウム錯体を用いたコンドロイチン硫酸の調製
実施例５に記載のようにして得られた中間体（１．１２ｇ）を、６７．２ｍｌのＤＭＦを有するフラスコ中に導入し、混合物を５０℃で１０分間、攪拌する。１．０５ｇの三酸化硫黄ピリジニウムを添加し、出発物質が溶解した時（約１０分）、５０℃で１時間、攪拌のもとで溶液を残す。次いで、更に１．０５ｇの三酸化硫黄ピリジニウムを添加する。溶液を更に１時間、５０℃で攪拌する。
【０１２１】
室温（ＲＴ）で、混合物を１０％のＮａＨＣＯ３水溶液の６０ｍｌ中に添加することによって、反応を終了させる(quenched)（ｐＨ７．８１）。濾過後、溶液を真空下（１０ｍＢａｒ）で蒸発乾固し、残留物を３０ｍｌの０．６ＭのＮａＣｌで再溶解させる。最終的に溶液を限外濾過する。
【０１２２】
体積を６回、変化させた後、保持液はｐＨ９．２２を有する；ｐＨは１ＮのＨＣｌで中性（７．５）に調節され、０．６ＮのＮａＣｌ溶液を脱塩水に換えて、精密濾過を続ける。
【０１２３】
得られた溶液を再び、２倍の体積で限外濾過し、次いで、２０ｍｌの体積まで透析する。透析した溶液を真空下（１０ｍＢａｒ、４５℃）、濃縮乾固して１．５３ｇの生成物を得る。
【０１２４】
この残留物を５９．６ｍｌの０．２Ｍのソーダ（ＮａＯＨ）に溶解させ、６０℃で２時間、加熱する。最終的に溶液は、０．６Ｍの塩化ナトリウム水溶液で希釈され、３ｋＤａの膜を通して限外濾過され、脱塩水で透析される。保持液を真空下（４５℃、１０ｍＢａｒ）、濃縮乾固して０．７６ｇのコンドロイチン硫酸を得る。
【０１２５】
このようにして得られた生成物は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定された、１５．４ｋＤａの分子量；９５％を超えるコンドロチナーゼＡＢＣを用いた消化率；８２／１８の４Ｓ／６Ｓ比；および約１．０９の全電荷密度値を有する。本発明の特徴である、コンドロチナーゼＣによる消化率が減少すると共に、コンドロチナーゼＡＢＣで得られたほとんど完全な消化（９５％を超える生成物が分解する）は、同じ多糖鎖上の４−硫酸化単位および６−硫酸化単位の両方の存在を示している。
【０１２６】
コンドロチナーゼＡＢＣを用いた９５％を超える消化率は、本発明が関連するＣＳ多糖鎖中のポリ硫酸（トリ硫酸化およびテトラ硫酸化）二糖が存在しないことも示す。
【０１２７】
実施例８：コンドロイチン（ＣＨ）メチルエステルの調製
３リットルのフラスコ中で、室温で２時間、攪拌した１．３Ｌのメタノールおよび１４．４３ｇのアセチルクロライドの溶液に、酸の形態の１０．０ｇのＣＨを添加し、得られた懸濁液を２０時間、攪拌したままとする。
【０１２８】
時間が経過した時、懸濁液を濾過し、固体を１００ｍｌのメタノール（２×５０ｍｌ）で洗浄し、真空下、５０℃で乾燥して、９．４ｇの乾燥固体を回収する。
【０１２９】
反応を同じ手法で２回、繰り返し、２回目の期間が経過した後、濾過前に、懸濁液を０〜５℃で６０分間、冷却する。得られた固体を冷メタノール（０〜５℃）で洗浄し、真空下、５０℃で３時間、温室乾燥して、６．３ｇの固体を回収する。
【０１３０】
実施例９：オルトエステル形成による、ＣＨメチルエステルのＧａｌＮＡｃ部のヒドロキシル化された官能基（４位および６位）の保護
窒素を流しながら、塩化カルシウムバルブを有する５００ｍｌのフラスコ中に、１５０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と先行するステップで得られた６．０ｇの生成物を導入する。次いで、２０．０６ｇのトリメチルオルト酢酸と０．７１ｇのカンファースルホン酸を添加する。得られた溶液を５０℃（内部温度）で１８時間、加熱する。
【０１３１】
その期間の最後に、ＲＴで冷却したままとし、真空下で濃縮して、８．５ｇの生成物を得る。
【０１３２】
実施例１０：実施例９に由来する生成物の２’，３’ヒドロキシルのアセチル化
窒素を流しながら、塩化カルシウムバルブを有する２５０ｍｌのフラスコ中に、室温で、先行するステップで得られた８．０ｇの生成物、４０ｍｌのＤＭＦ、２８．６ｇのトリエチルアミン、１７．１５ｇの無水酢酸、および９６ｍｇのジメチルアミノピリジンが導入される。
【０１３３】
得られた溶液を３時間、攪拌したままとする；時間が経過した時、１５０ｍｌのイソプロピルエーテルをフラスコに添加し、アモルファス固体が沈殿する。デカンテーションによって水を取り除き、１００ｍｌのイソプロピルエーテルを固体に添加し、１時間、攪拌したままとする。次いで、固体を濾過し、５０ｍｌのイソプロピルエーテルで洗浄し、真空下、４０℃で乾燥して、８．５２ｇの生成物を回収する。
【０１３４】
実施例１１：実施例１０で得られたオルトエステルの転位
先行するステップで得られた７．０ｇの生成物、７２．８ｇの氷酢酸、および８．７ｍｌの水を、２５０ｍｌのフラスコ中に導入して溶液を得て、溶液をＲＴで３時間、攪拌したままとする。次いで、溶液を０．６Ｍの塩化ナトリウム１５０ｍｌで希釈し、得られた溶液を５ｋＤａの膜を通した限外濾過により精製する。透析後、得られた溶液を真空下で濃縮して、６．７ｇの固体生成物を回収する。
【０１３５】
実施例１２：トリアセチルメチルエステルの硫酸化
窒素を流しながら、塩化カルシウムバルブを有し、４０ｍｌのＤＭＦを有する２５０ｍｌのフラスコ中に、先行するステップで得られた６７０ｍｇの生成物が導入される。
【０１３６】
得られた溶液に、６３０．４４ｇの三酸化硫黄ピリジニウム錯体を添加し、得られた溶液を５０℃（内部温度）で１時間、加熱する。次いで、同じ温度で６３０．４４ｇの三酸化硫黄ピリジニウム錯体をフラスコに添加し、再び１時間、攪拌したままとする。
【０１３７】
時間が経過した時、溶液をＲＴまで冷却し、同じ温度で４０ｍｌの３％ＮａＨＣＯ３をフラスコに添加して溶液を生成し、溶液を真空下で濃縮して、無機塩と混合された２．３ｇの固体を得る。得られた生成物を、１５０ｍｌの０．６Ｍの塩化ナトリウムで希釈し、５ｋＤａの膜を通して限外濾過する。
【０１３８】
透析後、得られた溶液を真空下で濃縮して、１．３２ｇの固体生成物を回収する。
【０１３９】
実施例１３：コンドロイチン硫酸を得ること
０．２Ｍのソーダ３３ｍｌを有する、１００ｍｌのフラスコ中に、先行するステップで得られた生成物が導入される。溶液を４０℃（内部温度）で２時間、加熱し、その後、ＲＴまで冷却され、１ＭのＨＣｌで中性化される。
【０１４０】
溶液を、１５０ｍｌの０．６Ｍの塩化ナトリウムで希釈し、５ｋＤａの膜を通して限外濾過する。透析および真空下での溶液の濃縮後、３５０ｍｇの固体が得られる。
【０１４１】
本実施例で得られた生成物は、１１ｋＤａの分子量、４７／５３の４Ｓ／６Ｓ比、および０．９の電荷密度値を有する。
【０１４２】
実施例１４：多糖鎖の脱重合と同時に起こる、ＧａｌＮＡｃ部の４位および６位のヒドロキシル化された官能基上での環状オルトエステルの形成
ジメチルホルムアミド（１０１ｍｌ）中で、上記のようにして得られた、コンドロイチンテトラブチルアンモニウム塩（４．０７ｇ；６．５３５ミリモル）の懸濁液を、攪拌し、窒素を流したまま室温（２０〜２５℃）に維持した。トリメチルオルト酢酸（９．０３ｍｌ、７１．８９ミリモル）、およびカンファースルホン酸（１．８２ｇ；７．８４ミリモル）を添加した。懸濁液を７０℃（内部温度）まで加熱し、ほんの数分後に完全な溶解が観察された。反応は攪拌下、同じ温度で１８〜２０時間、維持された。次の日、真空下での蒸発によって溶媒を除去して反応物を濃縮し、鮮黄色の弾力のある残留物の形態の１３．６７ｇの生成物を得た。
【０１４３】
消化後の保護されていないコンドロイチンの残留含量は４．６％である。ＦＴＩＲの対応するシグナルによって、オルトエステルの存在が示される。
【０１４４】
このように得られた生成物を、上記のように、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位で硫酸化されたＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣが観察されるまで、次のステップで使用した。
【０１４５】
実施例１５：ＧａｌＮＡｃ部の４位または６位での通常の(prevalent)酢酸形成、および同時に起こる多糖鎖の脱重合による、コンドロイチンの環状オルトエステルのエステルへの開裂
コンドロイチンオルトエステル（３．００ｇ）、水（３．１４ｍｌ）、および酢酸（２６．２５ｇ；４３７ミリモル）が、２５０ｍｌの三つ口フラスコに導入された。得られた懸濁液を３６時間、室温（２０〜２５℃）で加熱した。次いで、水が添加され、全体積が１００ｍｌの溶液を形成した。このように得られた溶液を、限外濾過した（５ＫＤの膜）。捕集された保持液を透析して少量の体積（２０ｍｌ）とし、次いで、真空下での蒸発による乾燥により所望の生成物（トリアセチルコンドロイチン）に対応する１．５５ｇの固体残留物が得られるまで濃縮した。
【０１４６】
このようにして得られた生成物を、上記のように、ＧａｌＮＡｃ残基の４位または６位で硫酸化されたＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣが観察されるまで、次のステップで使用した。
【０１４７】
実施例１６：ラット中での関節炎（アジュバント関節炎、ＡＡ）の誘発、およびＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを用いた治療
体重が１５０〜１９０ｇの、４０匹のオスのルイスラットを無作為に選び、１０匹の動物ごとの４つのグループに分け、２２±２℃の温度に維持された環境中でポリプロピレンのカゴの中で飼育し、水の利用を無制限として標準実験食を与えた。
【０１４８】
実験グループは以下の通りであった：
１）未治療の健康な参照グループ
２）アジュバント−誘発関節炎（ＡＡ）に罹患した、未治療の参照グループ
３）ＡＡの誘発後、２８日間、体重ｋｇ当たり９００ｍｇ／日の投与量で、ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを経口で治療した関節炎ラットのグループ（実験の０〜２８日）
４）ＡＡ（Ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の誘発前１４日間とＡＡの誘発後２８日間、体重ｋｇ当たり９００ｍｇ／日の投与量で、ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣを経口で前治療したグループ（実験の−１４日〜２８日）。
【０１４９】
関節炎は、フロイント不完全アジュバント中で熱により不活性化されたマイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）からなる１ｍｌの混合物の１回の(single)皮内注射によって、０日目にラット中で実験的に誘発された。
【０１５０】
ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣは、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈水中に溶解され、毎日、１回の強制経口投与をされた。
【０１５１】
２８日目の治療の最後に、ラットは全身麻酔のもとで犠牲となり、関係する血液および組織を採取、分析され、研究で観察されたパラメータを評価した。
【０１５２】
実施例１７：発生した浮腫、体重、および関節炎スコアを記録することによる、ラット中のＡＡの評価に対するＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの効果
測定に好適なカリパス(caliper)で後足の体積増加を観察することにより、関節炎の結果として発生した浮腫を測定した。測定は、ＡＡの誘発前および研究の２８日目に行われた。
【０１５３】
ラットの体重は、ＡＡの誘発前および治療の最後（２８日目）に測定された。このパラメータへの治療の効果は、治療期間中の異なるグループの様々な体重増加を比較することによって評価された。
【０１５４】
関節炎スコアは、スコアを足の関節膨張および関節周囲の紅斑の広がりと関連させることによって評価した。関節炎スコアまたは関節造影写真は、各動物について、浮腫（ｍｌ中、最大８点）と前足の直径（ｍｍ中、最大５点）と脊柱に沿って測定されたマイコバクテリウム・ブチリカムの適用部位のかさぶたの直径（ｍｍ中、最大５点）を足したものの総計として測定された。
【０１５５】
実施例１８：ＡＡによって誘発された酸化的ストレスのマーカーとしてのγ−グルタミントランスフェラーゼの活性へのＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの効果
酸化的ストレスは、ＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣによる治療の最後にラットから採取された関節組織のホモジネート中のγ−グルタミントランスフェラーゼの活性を測定することによって評価した。γ−グルタミントランスフェラーゼは酸化的ストレスのマーカーであると考えられている。
【０１５６】
細胞のγ−グルタミントランスフェラーゼ活性は、後足から採取された組織のホモジネート中で決定され、オンドレジコバ（Ｏｎｄｒｅｊｉｃｋｏｖａ）らによって改良された（Ｃａｒｄｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；４：２２５−２３０）オルロウスキーおよびマイスター（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｍｅｉｓｔｅｒ）法（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  Ｍ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ａ．ガンマ−グルタミン酸回路：可能なアミノ酸の輸送システム。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９７０；６７：１２４８−１２５５）によって評価された。サンプルは、０℃で１分間、ＵｌｔｒａＴｕｒａｘ  ＴＰ  １８／１０（Ｊａｎｋｅ＆Ｋｕｎｋｅｌ、ドイツ）を用いた１：９（ｗ／ｖ）溶液中のバッファー（２．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ、６８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）中で、均質化された。物質である、８．７ｍＭのγ−グルタミン・ｐ−ニトロアニリドおよび４４ｍＭのメチオニンが、６５％のイソプロピルアルコールにそれぞれ、２．５ｍＭおよび１２．６ｍＭの最終濃度で添加された。３７℃で６０分間の培養後、２．３ｍｌの冷メタノールを添加することによって反応を停止させ、試験管を５０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。Ｓｐｅｃｏｒｄ  ４０  分光光度計（Ｊｅｎａ、ドイツ）を用いて４０６ｎｍで０．５ｃｍのキュベット中での、上澄み液の吸光度を測定した。基質またはアクセプターが存在しない反応混合物を、参照サンプルとして使用した。
【０１５７】
実施例１９：血漿中の副炎症性サイトカイン（Ｉ−１、ＩＬ−６）およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを評価することによる、ＡＡにより誘発された炎症状態に対するＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの効果
実験の最後に、ラットから血液サンプルが採取され、抗凝固剤としてヘパリンを含む試験管中に入れられた；血漿は、遠心分離による血液細胞および炎症サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６）からなる血球部から分離され、特定の市販のキットを用いたＥＬＩＳＡ技術を用いて分析された。
【０１５８】
Ｃ−反応性タンパク質は、ＥＬＩＳＡキットを用いたラット血漿中で分析された（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＩＣＬ）。ビオチン接合二次抗体と抗ラットＣ−反応性タンパク質抗体との反応は、ストレプトアビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の活性の方法を用いて評価した。次いで、免疫複合体に結合したＨＲＰとメチル−ベンジジンとの反応は、４５０ｎｍで、ラボシステム・マルチスキャン  ＲＣ  マイクロプレート・リーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定された。結果は、ＥＬＩＳＡキット説明書に従って、標準校正カーブを用いて計算された。
【０１５９】
実施例２０：食細胞活性、およびＡＡによって誘発された好中球の酸化的破壊に対するＬＭＷ−ＣＳ  ＢＩＯＴＥＣの効果
食細胞活性および酸化的破壊の評価の最後に、ラットの血液から好中球の集団を抽出した。フルオレセインでラベルしたオプソニン化したスタフィロコッカス・オーレアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＰＡ−ＦＩＴＣ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国）を用いた制御した条件下で、食細胞、すなわち、細菌の摂取の測定を行った。次いで、リチウム−ヘパリン中の末梢血のアリコートを、ヒドロエチジン(hydroethidine)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、米国）（５ｍｌのジメチルホルムアミド中の１５．７５ｍｇ、メルク、ドイツ）を用いて３７℃で１５分間、培養した。３７℃で１５分間、ＳＰＡ−ＦＩＴＣでの処理後、試験管を氷中に置くことによって反応を停止させた。続く赤血球の溶解は、冷塩化アンモニウム／塩化カリウム（２００ｍｌの脱イオン水、１．６５８ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．２ｇのＫＨＣＯ３、および７．４ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４）からなる溶解溶液を用いて、１５分間、行われた。食細胞の平均割合はＳＰＡ−ＦＩＴＣの少なくとも一つの粒子を摂取した顆粒球の割合を表し、呼吸バーストの平均割合はエチジウムでラベル化された顆粒球の割合を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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