(57)【要約】細胞における工業的に有用な化合物（例えば、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸）の生産、例えば、１つ以上のかかる化合物を生産するように遺伝的に修飾された微生物細胞における該化合物の生産の検出に有用な方法および組成物を本明細書に提供する。１つの実施形態において、前記方法は、前記細胞をヒドロゲル粒子に封入する工程、および前記ヒドロゲル粒子内の前記化合物を検出する工程を含む。一部の実施形態において、上記ヒドロゲル粒子は、直径約１ミリメートル未満である。
2014508516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において組み換え生産された水不混和性化合物を検出する方法であって、
（ａ）ヒドロゲル粒子に前記細胞を封入する工程；および
（ｂ）前記ヒドロゲル粒子内の前記組み換え生産された水不混和性化合物を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記検出する工程が、前記ヒドロゲル粒子と、前記組み換え生産された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素とを接触させること、および前記ヒドロゲル粒子内の前記蛍光色素を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光色素が、ソルバトクロミック色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光色素が、ナイルレッドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出する工程が、前記ヒドロゲル粒子内の水不混和性化合物の量を前記ヒドロゲル粒子内の細胞バイオマスの量に対して正規化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が酵母細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換え生産された水不混和性化合物が、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒドロゲル粒子が、水不混和性化合物を保持することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルが、アガロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒドロゲル粒子が、直径約１ミリメートル未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒドロゲル粒子が、直径約１００マイクロメートル未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドロゲル粒子が、直径約５０マイクロメートル未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドロゲル粒子が、直径約５０マイクロメートル、約４５マイクロメートル、約４０マイクロメートル、約３５マイクロメートル、約３０マイクロメートルまたは約２５マイクロメートルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記封入する工程が、前記細胞と水性ヒドロゲル懸濁液とを、前記細胞を含むヒドロゲル粒子を形成するのに十分な条件下で接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記条件が、前記細胞を含む前記水性ヒドロゲル懸濁液と、フッ素系界面活性剤を含むフルオロカーボン油とを接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
フルオロカーボン油との前記接触が、前記細胞を含む前記水性ヒドロゲル懸濁液を、前記フルオロカーボン油を含むマイクロ流体デバイスに負荷することを含み、前記ヒドロゲル懸濁液が、前記マイクロ流体デバイスのＴ字接合部で前記フルオロカーボン油と接触し、前記フルオロカーボン油との前記接触により、前記細胞を含む非水性ヒドロゲル粒子が形成されることとなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒドロゲル粒子を前記フルオロカーボン油から分離する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出する工程の前に前記ヒドロゲル粒子内で前記細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養が、１２時間から２４時間の期間にわたるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組み換え生産された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組み換え生産された水不混和性化合物がファルネセンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組み換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組み換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−リン酸に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、メバロン酸経路の１つより多くの酵素をコードしている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
イソプレノイド化合物を形成するようにＩＰＰまたはポリプレニルを修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、ポリケチド生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記組み換え酵母細胞が、ポリケチドシンターゼ系（ＰＫＳ）をコードしている１つ以上の核酸を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＫＳがモジュラーＰＫＳである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＫＳが芳香族ＰＫＳである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み換え酵母細胞が、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記組み換え酵母細胞が、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記組み換え酵母細胞が、アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）活性を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記組み換え酵母細胞が、シクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域またはホロＡＣＰシンターゼ活性を含む酵素をコードしている核酸をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項４３】
前記組み換え酵母細胞が、アセチル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組み換え酵母細胞が、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記組み換え酵母細胞が、マロニル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記組み換え酵母細胞が、異種ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰまたはｆａｂＦヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
細胞において組み換え生産された水不混和性化合物を検出する方法であって、
（ａ）前記細胞を水性ヒドロゲル懸濁液と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を含む前記水性ヒドロゲル懸濁液を、フルオロカーボン油を含むマイクロ流体デバイスに負荷する工程であって、ここで、前記ヒドロゲル懸濁液は、前記マイクロ流体デバイスのＴ字接合部で前記フルオロカーボン油と接触し、前記フルオロカーボン油との前記接触によって、前記細胞を含む非水性ヒドロゲル粒子が形成されることとなる、工程；
（ｃ）前記ヒドロゲル粒子を前記フルオロカーボン油から分離する工程；
（ｄ）前記ヒドロゲル粒子内で前記細胞を培養する工程；
（ｅ）前記ヒドロゲル粒子と、前記組み換え生産された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素とを接触させる工程；および
（ｆ）前記ヒドロゲル粒子内の前記蛍光色素を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項４８】
水不混和性化合物を組み換え生産する細胞について細胞のライブラリをスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ライブラリの各細胞をヒドロゲル粒子に封入する工程；
（ｂ）各ヒドロゲル粒子内の組み換え生産された水不混和性化合物を検出する工程；および
（ｃ）前記組み換え生産された水不混和性化合物を生産する細胞を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
水不混和性化合物を組み換え生産する細胞について細胞の集団を富化する方法であって、
（ａ）水不混和性化合物を生産するように遺伝的に修飾された細胞または細胞のクローン集団を封入するヒドロゲル粒子を含む、ヒドロゲル粒子の集団を提供する工程；
（ｂ）組み換え生産された水不混和性化合物を含むヒドロゲル粒子を検出する工程；
（ｃ）前記細胞または前記細胞のクローン集団を工程（ｂ）のヒドロゲル粒子から回収する工程；
（ｄ）工程（ｃ）からの細胞または細胞のクローン集団を再び封入する工程；および
（ｅ）工程（ａ）〜（ｃ）を反復する工程
を包含する、方法。
【請求項５０】
ヒドロゲル粒子内に細胞を封入する方法であって、
（ａ）前記細胞を水性ヒドロゲル懸濁液と接触させる工程；および
（ｂ）前記細胞を含む水性ヒドロゲル懸濁液を、フルオロカーボン油を含むマイクロ流体デバイスに負荷する工程であって、ここで、前記ヒドロゲル懸濁液は、前記マイクロ流体デバイスのＴ字接合部で前記フルオロカーボン油と接触し、前記フルオロカーボン油との前記接触によって、前記細胞を含む非水性ヒドロゲル粒子が形成されることとなる、工程
を包含する、方法。
【請求項５１】
組み換え生産された水不混和性化合物を含む、ヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５２】
蛍光ソルバトクロミック色素と接触させられる、請求項５１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５３】
ナイルレッドと接触させられる、請求項５１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５４】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群より選択される、請求項５１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５５】
前記細胞が酵母細胞である、請求項５１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５６】
前記組み換え生産された水不混和性化合物が、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸からなる群より選択される、請求項５１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５７】
前記組み換え生産された水不混和性化合物が、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、請求項５６に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５８】
前記組み換え生産された水不混和性化合物がファルネセンである、請求項５６に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項５９】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項５５に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６０】
前記組み換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６１】
前記組み換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６２】
前記組み換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−リン酸に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６３】
前記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、メバロン酸経路の１つより多くの酵素をコードしている、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６４】
イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６５】
イソプレノイド化合物を形成するようにＩＰＰまたはポリプレニルを修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６６】
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される、請求項６５に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６７】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項６５に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６８】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される、請求項６７に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項６９】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項５９に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７０】
前記細胞が、ポリケチド生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項５５に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７１】
前記組み換え酵母細胞が、ポリケチドシンターゼ系（ＰＫＳ）をコードしている１つ以上の核酸を含む、請求項７０に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７２】
前記ＰＫＳがモジュラーＰＫＳである、請求項７１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７３】
前記ＰＫＳが芳香族ＰＫＳである、請求項７１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７４】
前記組み換え酵母細胞が、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項７１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７５】
前記組み換え酵母細胞が、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項７１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７６】
前記組み換え酵母細胞が、アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）活性を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項７１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７７】
前記組み換え酵母細胞が、シクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域またはホロＡＣＰシンターゼ活性を含む酵素をコードしている核酸をさらに含む、請求項７１に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７８】
前記細胞が、脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項５５に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項７９】
前記組み換え酵母細胞が、アセチル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項７８に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項８０】
前記組み換え酵母細胞が、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項７８に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項８１】
前記組み換え酵母細胞が、マロニル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項７８に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項８２】
前記組み換え酵母細胞が、異種ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰまたはｆａｂＦヌクレオチド配列を含む、請求項７８に記載のヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団。
【請求項８３】
細胞または細胞集団を含み、かつ組み換え生産された水不混和性化合物をさらに含む、ヒドロゲル粒子。
【請求項８４】
蛍光ソルバトクロミック色素と接触させられる、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項８５】
ナイルレッドと接触させられる、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項８６】
前記細胞が、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群より選択される、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項８７】
前記細胞が酵母細胞である、請求項８４に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項８８】
前記組み換え生産された水不混和性化合物が、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸からなる群より選択される、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項８９】
前記イソプレノイドが、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである、請求項８８に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９０】
前記イソプレノイドがファルネセンである、請求項８８に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９１】
前記組み換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９２】
水不混和性化合物を保持することができる、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９３】
前記水不混和性化合物が、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸からなる群より選択される、請求項９２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９４】
前記水不混和性化合物がファルネセンである、請求項９２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９５】
前記ヒドロゲルがアガロースを含む、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９６】
直径約１ミリメートル未満である、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９７】
直径約５００マイクロメートル未満である、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９８】
直径約１００マイクロメートル未満である、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９９】
直径約５０マイクロメートル未満である、請求項８３に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１００】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項８７に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０１】
前記組み換え酵母細胞が、ファルネセンシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０２】
前記組み換え酵母細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０３】
前記組み換え酵母細胞が、メバロネートをメバロン酸５−リン酸に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０４】
前記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、メバロン酸経路の１つより多くの酵素をコードしている、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０５】
イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０６】
イソプレノイド化合物を形成するようにＩＰＰまたはポリプレニルを修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０７】
前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される、請求項１０６に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０８】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項１０６に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０９】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される、請求項１０８に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１０】
前記細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項１００に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１１】
前記細胞が、ポリケチド生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項８７に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１２】
前記組み換え酵母細胞が、ポリケチドシンターゼ系（ＰＫＳ）をコードしている１つ以上の核酸を含む、請求項１１１に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１３】
前記ＰＫＳがモジュラーＰＫＳである、請求項１１２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１４】
前記ＰＫＳが芳香族ＰＫＳである、請求項１１２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１５】
前記組み換え酵母細胞が、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項１１２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１６】
前記組み換え酵母細胞が、鎖長因子（ＣＬＦ）触媒領域を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項１１２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１７】
前記組み換え酵母細胞が、アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）活性を含む酵素をコードしている核酸を含む、請求項１１２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１８】
前記組み換え酵母細胞が、シクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域またはホロＡＣＰシンターゼ活性を含む酵素をコードしている核酸をさらに含む、請求項１１２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１９】
前記細胞が、脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である、請求項８７に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１２０】
前記組み換え酵母細胞が、アセチル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項１１９に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１２１】
前記組み換え酵母細胞が、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１１９に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１２２】
前記組み換え酵母細胞が、マロニル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む、請求項１１９に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１２３】
前記組み換え酵母細胞が、異種ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰまたはｆａｂＦヌクレオチド配列を含む、請求項１１９に記載のヒドロゲル粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
この出願は、２０１１年１月２８日に出願され、表題「ＧＥＬ−ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤ  ＭＩＣＲＯＣＯＬＯＮＹ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ」の米国仮特許出願第６１／４３７，２１４号、および２０１１年５月１３日に出願され、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＷＡＴＥＲ−ＩＭＭＩＳＣＩＢＬＥ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ」の米国仮出願第６１／４８６，２１１号（これらは、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
２．発明の分野
本明細書に提供する組成物および方法は、一般に、微生物の工業利用に関する。詳細には、細胞における工業的に有用な化合物（例えば、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸）の生産、例えば、１つ以上のかかる化合物を生産するように遺伝的に修飾された微生物細胞におけるかかる化合物の生産の検出に有用な方法および組成物を本明細書に提供する。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
合成生物学の出現により、再生可能供給源から生産規模および品質で微生物により生産されるバイオ燃料、化学物質および生体材料に期待が持てるようになった。しかし、工業合成生物学の商業的成功は、再生可能製品の生産コストをそれらそれぞれの再生不能対応物の生産コストと競争させることができるかどうか、またはその競争に勝たせることができるかどうかに大きく依存することとなる。この目標に向かって、株改変およびスクリーニングの努力は、理想的には、生産プロセスにおけるできる限り早期の望ましい株（例えば、高い収率（基質１グラム当たりの化合物のグラム）、高い生産量（１リットル当たりのグラム）および／または高い生産性（１時間当たりの１リットル当たりのグラム）が可能な株）の同定に向けられる。
【０００４】
生合成遺伝子または経路を含むように宿主細胞微生物を改変することができ、これらの経路による代謝フラックスを最適化して高い産物力価を達成することができる。例えば、抗マラリア薬アルテミシニンの前駆体の工業生産のためにメバロン酸（ＭＥＶ）代謝経路の一部分またはすべてを過発現するように微生物が改変された。例えば、非特許文献１；非特許文献２；および特許文献１および特許文献２参照（前記参考文献それぞれの内容は、それら全体が参考として本明細書に援用されている）。
【０００５】
所望の表現型への株の改変は、代謝フラックスの数ラウンドの改変、分析およびモデリングを含む反復プロセスとして行われることが多い。このプロセスの間に、個々の経路構成要素の発現を微調整するための異種プロモーターの組み入れ、最適化されたネットワークおよび経路の合理的設計、ならびにランダム突然変異誘発を含む定向進化的戦略をはじめとする（しかしこれらに限定されない）、代謝フラックスの制御に対する幾つかのアプローチを試験でき、最適化できる。
【０００６】
改善された性能を有する株についてのスクリーニング方法は、理想的には、（１）修飾集団から修飾集団へと増分の性能改善を識別するのに十分なほど高感度であり；（２）内因性分子と組み換え生産された異種産物とを、細胞内に含有されていようと、周囲の培地に分泌されていようと、区別するのに十分なほど特異的であり；（３）修飾株の多くのライブラリを一度にスクリーニングするのに十分なほど頑強であり；および（４）宿主に対する生産の代謝的影響についての情報を与える。最後のことに関しては、異種遺伝子の宿主への移入および宿主での発現が、代謝不均衡および／または毒性代謝産物の蓄積につながることとなるケースであることがある。かかるシナリオでは、その生産が宿主の生存率低減を犠牲にして生ずるのかどうかを知ることが有用である。さらに、生産集団によって大きく異なるバイオマスの可能性にかんがみて、特異的におよび細胞バイオマスからの影響またはインプットなしに組み換え産物を検出できることで、所与の株の収率、生産量および／または生産性をより正確に描写することができる。さらに、工業用化合物が宿主細胞によって分泌される場合、スクリーニング法にさらなる要件、すなわち、細胞によって生産される化合物の量とこの表現型を生じさせる基礎となる遺伝子型との物理的関連性を維持できること、が課せられる。
【０００７】
細胞封入技術とフローサイトメトリーを併用する当該技術分野における様々な方法は、一般に、細胞ライブラリ中の細胞によって生産される高分子の存在または不在の同定を目的にしている。フローサイトメトリーは、毎秒４０，０００事象までの極めて高速な細胞または粒子の評価を可能にする強力な分析機能を有し、この故に、この技術は細胞集団の信頼性のある正確な定量的評価におよび特定の細胞の選択に理想的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，１７２，８８６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１９２，７５１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１：７９６〜８０２
【非特許文献２】Ｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４０：９４０９４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それにもかかわらず、合成生物学での株から株へと代謝フラックスの微妙な改善を同定するという課題を考えると、現行技術より感度が高く、同時に信頼性もあり、同時に頑強でもあり、同時に効率的でもあるスクリーニングシステムおよび方法論が依然として必要とされている。特に、同定後の宿主細胞の生存率を含まずに表現型と遺伝子型との関連性を維持する様式で組み換え化合物の生産を検出および定量する方法が特に必要とされている。本発明は、これらの必要性に取り組み、関連する利点も提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
４．発明の概要
細胞において組み換え生産された水不混和性化合物の検出に有用な方法および組成物であって、該細胞が、例えば、遺伝的に修飾されていない親微生物細胞と比較して大きな収率でおよび／または増大した持続性で１つ以上の水不混和性化合物を生産するように遺伝的に修飾された微生物細胞である、方法および組成物を本明細書に提供する。詳細には、本明細書に提供する前記方法は、代替的に「ピコスクリーニング」と呼ばれ、例えば、イソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸およびこれらの誘導体をはじめとする（しかしそれらに限定されない）工業的に有用な水不混和性化合物を生産するように改変されている微生物株をスクリーニングするための高スループットで高感度で定量的な手段を提供する。本明細書に提供する前記方法は、増大したレベルのかかる組み換え生産された水不混和性化合物を生産するおよび／または含む細胞、例えば組み換え細胞およびそのクローン細胞集団についての同定、選択および富化を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、前記方法は、細胞をヒドロゲル粒子に封入する工程、および該ヒドロゲル粒子内の組み換え生産された水不混和性化合物を検出する工程を含む。一部の実施形態において、前記細胞は、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００１３】
一部の実施形態において、前記検出方法は、前記ヒドロゲル粒子と、前記組み換え生産された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素とを接触させる工程、および該ヒドロゲル粒子内の該蛍光色素を検出する工程を含む。一部の実施形態において、前記蛍光色素はナイルレッドである。一部の実施形態において、前記検出する工程は、前記ヒドロゲル粒子内の水不混和性化合物の量を該ヒドロゲル粒子内の細胞バイオマスの量に対して正規化することを含む。
【００１４】
一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、水不混和性化合物、例えば、前記細胞によって生産された水不混和性化合物を保持する能力がある。一部の実施形態において、前記ヒドロゲルはアガロースを含む。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約１ミリメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５００マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約１００マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５０マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５０マイクロメートル、約４５マイクロメートル、約４０マイクロメートル、約３５マイクロメートル、約３０マイクロメートルまたは約２５マイクロメートルである。
【００１５】
本明細書に提供する検出方法の一部の実施形態において、前記封入する工程は、前記細胞と水性ヒドロゲル懸濁液とを、該細胞を含むヒドロゲル粒子を形成するのに十分な条件下で接触させることを含む。一部の実施形態において、前記条件は、前記細胞を含む前記水性ヒドロゲル懸濁液とフルオロカーボン油とを接触させることを含む。一部の実施形態において、前記フルオロカーボン油は、フッ素系界面活性剤を含む。一部の実施形態において、フルオロカーボン油との前記接触は、前記細胞を含む前記水性ヒドロゲル懸濁液を、前記フルオロカーボン油を含むマイクロ流体デバイスに負荷することを含み、該ヒドロゲル懸濁液は、該マイクロ流体デバイスのＴ字接合部で該フルオロカーボン油と接触し、このフルオロカーボン油との接触により、該細胞を含む非水性ヒドロゲル粒子が形成されることとなる。一部の実施形態において、前記検出方法は、前記ヒドロゲル粒子を前記フルオロカーボン油から分離する工程をさらに含む。
【００１６】
一部の実施形態において、前記検出方法は、該検出する工程の前に前記ヒドロゲル粒子内で前記細胞を培養する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記培養する工程は、１２時間から２４時間の期間にわたるものである。
【００１７】
一部の実施形態において、前記組み換え生産された水不混和性化合物は、テルペン、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイドまたはＣ１５イソプレノイドである。一部の実施形態において、前記組み換え生産された水不混和性化合物はファルネセンである。一部の実施形態において、前記細胞は、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である。一部の実施形態において、前記組み換え生産された水不混和性化合物はファルネセンである。一部の実施形態において、前記細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−二リン酸（ＤＸＰ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である。一部の実施形態において、前記組み換え酵母細胞は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記組み換え酵母細胞は、イソプレノイド化合物を形成するようにＩＰＰまたはポリプレニルを修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態において、前記細胞は、ポリケチド生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である。一部の実施形態において、前記組み換え酵母細胞は、ポリケチドシンターゼ系（ＰＫＳ）をコードしている１つ以上の核酸を含む。一部の実施形態において、前記ＰＫＳはモジュラーＰＫＳである。一部の実施形態において、前記ＰＫＳは芳香族ＰＫＳである。
【００１９】
一部の実施形態において、前記細胞は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む組み換え酵母細胞である。一部の実施形態において、前記組み換え酵母細胞は、アセチル−ＣｏＡシンターゼをコードしている核酸を含む。一部の実施形態において、前記組み換え酵母細胞は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、細胞において組み換え生産された水不混和性化合物を検出する前記方法は、（ａ）前記細胞を水性ヒドロゲル懸濁液と接触させる工程；（ｂ）前記細胞を含む水性ヒドロゲル懸濁液を、フルオロカーボン油を含むマイクロ流体デバイスに負荷する工程（ここで、前記ヒドロゲル懸濁液は、前記マイクロ流体デバイスのＴ字接合部で前記フルオロカーボン油と接触し、このフルオロカーボン油との前記接触によって、前記細胞を含む非水性ヒドロゲル粒子が形成されることとなる）；（ｃ）前記ヒドロゲル粒子から前記フルオロカーボン油を分離する、例えば洗い流す工程；（ｄ）前記ヒドロゲル粒子内で前記細胞を培養する工程；（ｅ）前記ヒドロゲル粒子と、その組み換え生産された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素とを接触させる工程；および（ｆ）前記ヒドロゲル粒子内の前記蛍光色素を検出する工程を含む。
【００２１】
１つの態様では、水不混和性化合物を組み換え生産する細胞について細胞のライブラリをスクリーニングする方法を本明細書に提供し、この方法は、前記ライブラリの各細胞をヒドロゲル粒子に封入する工程；各ヒドロゲル粒子内の組み換え生産された水不混和性化合物を検出する工程；および前記組み換え生産された水不混和性化合物を生産する細胞を選択する工程を含む。
【００２２】
もう１つの態様では、水不混和性化合物を組み換え生産する細胞について細胞の集団を富化する方法を本明細書に提供し、この方法は、（ａ）水不混和性化合物を生産するように遺伝的に修飾された細胞または細胞のクローン集団を封入するヒドロゲル粒子を含む、ヒドロゲル粒子の集団を提供する工程；（ｂ）組み換え生産された水不混和性化合物を含むヒドロゲル粒子を検出する工程；（ｃ）前記細胞または細胞のクローン集団を工程（ｂ）のヒドロゲル粒子から回収する工程；（ｄ）工程（ｃ）からの細胞または細胞のクローン集団を再封入する工程；および（ｅ）工程（ａ）〜（ｃ）を反復する工程を含む。
【００２３】
もう１つの態様では、ヒドロゲル粒子内に細胞を封入する方法を本明細書に提供し、この方法は、（ａ）前記細胞を水性ヒドロゲル懸濁液と接触させる工程；および（ｂ）前記細胞を含む水性ヒドロゲル懸濁液を、フルオロカーボン油を含むマイクロ流体デバイスに負荷する工程（ここで、前記ヒドロゲル懸濁液は、前記マイクロ流体デバイスのＴ字接合部で前記フルオロカーボン油と接触し、前記フルオロカーボン油との接触によって、前記細胞を含む非水性ヒドロゲル粒子が形成されることとなる）を含む。
【００２４】
もう１つの態様では、組み換え生産された水不混和性化合物を含むヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団を本明細書に提供する。一部の実施形態において、前記細胞は、真菌細胞、例えば酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２５】
もう１つの態様では、細胞またはクローン細胞集団を含み、組み換え生産された水不混和性化合物をさらに含むヒドロゲル粒子を本明細書に提供する。一部の実施形態において、前記細胞は、真菌細胞、例えば酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態において、前記ヒドロゲルはアガロースを含む。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約１ミリメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５００マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約１００マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５０マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５０マイクロメートル、約４５マイクロメートル、約４０マイクロメートル、約３５マイクロメートル、約３０マイクロメートルまたは約２５マイクロメートルである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、イソペンテニル二リン酸（「ＩＰＰ」）の生産のためのメバロン酸（「ＭＥＶ」）経路の略図を提供するものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）およびジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）の生産のための１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−二リン酸（「ＤＸＰ」）経路の略図を提供するものである。Ｄｘｓは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼであり；Ｄｘｒは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＩｓｐＣとしても公知）であり；ＩｓｐＤは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼであり；ＩｓｐＥは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼであり；ＩｓｐＦは、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼであり；ＩｓｐＧは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）であり；およびｉｓｐＨは、イソペンテニル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼである。
【図２】図２は、ＩＰＰおよびジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）およびゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）への転化の略図を提供するものである。
【図３】図３は、本明細書に記載のヒドロゲル粒子の形成に有用な例示的マイクロ流体デバイスを提供するものである。このデバイスは平面担体に作製され、細胞流入口を備え、該流入口は細胞溶液フロー流路に流体的に接続しており、該細胞溶液フロー流路は粒子フロー流路へ、続いてその終端部の粒子回収流出口へと流体的に接続している。このデバイスは、油流入口をさらに備え、該流入口は油フロー流路に流体的に接続しており、該油フロー流路は、前記細胞溶液フロー流路に対して横に配置されており、Ｔ字接合部で前記細胞溶液フロー流路と交差する。
【図４】図４は、ヒドロゲル封入細胞を形成するための例示的プロセスの描写を提供するものである。細胞は、水性流で左から入り、ノズルを通って粒子を分断する２本の油流により収束される。このデバイスの出口（すなわち、粒子回収流出口）で、粒子は、一定の長さの管状材料に入り、容器へと流れる。
【図５】図５は、ピコスクリーンプロセスの例示的実施形態を提供するものである。（Ａ）溶融アガロース中の酵母細胞の懸濁液をマイクロ流体デバイスに負荷する。前記アガロース懸濁液は、Ｔ字接合部で油／界面活性剤混合物に出会う。流れている油が、油に懸濁している均一なサイズのアガロース液滴を切り取る。（Ｂ）前記液滴を回収した後、油を粒子から洗浄除去し、それらの粒子を成長培地に再懸濁させる。（Ｃ）２４時間の成長後、細胞数４０と８０の間の形態のマイクロコロニーが形成する。その後、それらの粒子を蛍光色素で染色し、その後、蛍光ベースのアッセイを用いてそれらをスクリーニングすることができる。
【図６】図６は、ナイルレッドの発光スペクトルを提供するものである。（Ａ）ナイルレッドの発光スペクトルは、非生産酵母の主としてリン脂質環境での約５９０ｎｍの最大値（右のピーク）から、純粋なファルネセンでの約５５０ｎｍの最大値（左のピーク）へとシフトする。（Ｂ）波長の関数としてのファルネセン中のナイルレッドの非生産細胞に対する比率。緑色（左）および赤色（右）の縦棒は、レシオメトリック分析（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）において緑色／赤色蛍光比を最大にするようにスペクトルを選択した、ピコスクリーンＦＡＣＳアッセイの１つの実施形態に使用した発光フィルタを表す。
【図７】図７は、ヒドロゲル粒子に封入し、ナイルレッドで染色したファルネセン生産株の例示的ＦＡＣＳ分析を提供するものである。
【図８】図８は、他のアッセイによって決定したファルネセン生産量（ｙ軸；左から右へ：２Ｌ発酵槽収率、ナイルレッド振盪プレートアッセイ、そしてファルネセンフラックスアッセイ）に対してプロットした、ピコスクリーンによって決定したファルネセン生産量（ｘ軸、「ＦＡＣＳ」）の相関関係を提供するものである。様々な量のファルネセンを生産するように改変した７つの株について、ファルネセン生産をアッセイした。
【図９】図９は、ＰＣＲ富化アッセイを提供するものである。（Ａ）株ＦＳ２（ファルネセンシンターゼ（ＦＳ）の２つのコピーを含む）を株ＦＳ５（ＦＳの５つのコピーを含む）と区別するために、２つのバンドを増幅するための３つのプライマーを設計した。８９ｂｐ断片が、株ＦＳ２と株ＦＳ５の両方の第二のＦＳ組み込み部位から生産される一方で、３０４ｂｐ断片が、株ＦＳ５にのみ存在する第五のＦＳ組み込み部位から生産される。（Ｂ）前記３０４ｂｐバンドの存在を、コロニーが株ＦＳ５に由来する明白なマーカーとして用いる。
【図１０】図１０は、モデルライブラリからの高ファルネセン生産酵母株（ＦＳ５）の富化を提供するものである。株ＦＳ２（低ファルネセン生産株）とＦＳ５を１０：１、１００：１および１０００：１で混合し、ピコスクリーニングを行って、より生産性の高い生産体（ＦＳ５）を富化した。（Ａ）純粋な株のＦＡＣＳヒストグラムデータを列１および２に提示する。ラウンド１、２および３の封入および分取後の混合集団のヒストグラム（列３から５）は、株ＦＳ５の実質的富化がラウンド３によって実現されることを示す。（Ｂ）前記混合比それぞれについての分取ラウンド間の富化の定量。１０：１および１００：１の出発比をそれぞれ含むライブラリについてのラウンド３によるＦＳ５の富化は、得られた集団のほぼ１００％がＦＳ５由来コロニーから成るような富化である。
【図１１】図１１は、封入酵母細胞から組み換え生産されたリモネンの検出のためのピコスクリーンの結果を提供するものである。（Ａ）ピコスクリーンプロセスに付した一定の範囲のリモネン生産株のＧ／Ｒ蛍光ピーク。株Ｙ０は、非生産体であり、株Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、一定の範囲のリモネン生産レベルに及ぶ。左のパネルは、異なる集団のメジアンが蛍光に関して増大することを示す。右のパネルは、９６ウェル振盪プレート力価の関数としてプロットしたＦＡＣＳメジアンを示すものであり、ピコスクリーン値が振盪プレート値に比例することを実証する。（Ｂ）一緒に共培養した（黒塗りピーク）または別々に培養した（白抜きピーク）封入生産細胞（Ｌ１）および非生産細胞（Ｙ０）の蛍光ピーク。Ｙ０およびＬ１についての別個の蛍光ピークが共培養条件下で維持され、これは、産物が、生産株を含有する粒子内に封入されたままであること、および非生産株を含有する粒子から流出せず、該粒子に流入しないことを示す。メジアンの差は、管ごとのばらつきに起因し得る。
【図１２】図１２は、封入酵母細胞から組み換え生産されたパチョリの検出のためのピコスクリーンの結果を提供するものである。（Ａ）封入し、ピコスクリーンに付した非生産株（Ｙ０）および２つの異なるパチュロール生産株（Ｐ１およびＰ２）のＧ／Ｒ蛍光ピーク。（Ｂ）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した標準振盪プレート力価（ｙ軸）に対してプロットしたピコスクリーンによって決定したパチュロール生産量（ｘ軸、「ＦＡＣＳ」）の相関関係。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
６．実施形態の詳細な説明
６．１  定義
本明細書において用いる場合、用語「メバロン酸経路」または「ＭＥＶ経路」は、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに転化させる生合成経路を指すために本明細書では用いる。このＭＥＶ経路を図１Ａに略図で示す。
【００２８】
本明細書において用いる場合、用語「デオキシキシルロース５−リン酸経路」または「ＤＸＰ経路」は、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルベートをＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに転化させる経路を指すために本明細書では用いる。このＤＸＰ経路を図１Ｂに略図で示す。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「封入された」は、ヒドロゲル粒子の表面に単に存在するまたは付着しているのとは対照的に、ヒドロゲル粒子の主として内部に存在する１つ以上の細胞、例えばクローン細胞集団を指す。一部の実施形態において、細胞の濃度は、ヒドロゲル粒子内に単一の細胞といったような低い濃度であることもある。この実施形態では、前記ヒドロゲル粒子内の単一の細胞から細胞分裂により封入クローン細胞集団が生産される。
【００３０】
本明細書において用いる場合、用語「ヒドロゲル」は、溶解せずに水または水溶液に膨潤する能力およびその構造内に水または水溶液の有意な部分を保持する能力を呈示する架橋ポリマー材料を指す。一部の実施形態において、本明細書において用いる場合の「ヒドロゲル粒子」は、そのヒドロゲル粒子内に封入された細胞によって生産された水不混和性化合物、例えば、組み換え生産された水不混和性化合物を保持する能力を有する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、句「異種ヌクレオチド配列」は、（ａ）その宿主細胞にとって外来であり得る（すなわち、該細胞にとって「外因性」である）；（ｂ）その宿主細胞中で自然に見出せることができる（すなわち「内因性」である）が、該細胞内に不自然な量（すなわち、該宿主細胞中で自然に見出せられるものより多いまたは少ない量）で存在し得る；または（ｃ）その宿主細胞中で自然に見出せることができるその天然遺伝子座外に位置し得るヌクレオチド配列を指す。
【００３２】
本明細書において用いる場合、遺伝的に修飾された微生物細胞によるイソプレノイドの生産の文脈での用語「持続性」は、工業的発酵の際に遺伝的に修飾されていない親微生物細胞と比較してより長い期間にわたってイソプレノイド化合物を生産する遺伝的に修飾された微生物細胞の能力を指す。
【００３３】
本明細書において用いる場合、用語「親」は、例えば、細胞内での水不混和性化合物、例えばイソプレノイド、ポリケチドまたは脂肪酸の生産増大および／またはレベル増大を果たすように遺伝的に修飾された、本明細書に記載の遺伝的に修飾された微生物細胞の産生につながる遺伝的修飾の導入の起点として役立つが、前記遺伝的に修飾された細胞についての遺伝的修飾を一切含まない細胞を指す。
【００３４】
本明細書において用いる場合、句「組み換え生産（された）水不混和性化合物」および「異種の水不混和性化合物」は、少なくとも４個の炭素原子を有する、遺伝的に修飾された細胞または微生物から生産される化合物であって、水と不混和性である化合物を指す。少なくとも４個の炭素原子を有する前記化合物は、分岐していることもあり、直鎖状であることもあり、または環状であることもあり、ならびに場合により１個以上のヘテロ原子（例えば、窒素、酸素および硫黄）および１個以上の置換基または官能性部分（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｈ）＝Ｏ、−ＮＯ３、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、およびこれらに類するもの）を含むこともある。一部の実施形態において、前記化合物は油である。他の実施形態において、前記化合物は疎水性である。本明細書に提供する方法および組成物の例示的組み換え生産、すなわち異種の水不混和性化合物としては、イソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記組み換え生産、すなわち異種の水不混和性化合物は、長さが４炭素原子から４０炭素原子にわたる炭素鎖を含む。一部の実施形態において、前記組み換え生産、すなわち異種の水不混和性化合物は、５から３０、１０から２５、または１５から２０炭素原子の炭素鎖を含む。一部の実施形態において、前記組み換え生産、すなわち異種の水不混和性化合物は、５、１０、１５または２０炭素原子より長い炭素鎖を含む。一部の実施形態において、前記組み換え生産、すなわち異種の水不混和性化合物は、４０炭素原子未満の炭素鎖を含む。
【００３５】
本明細書において用いる場合、句「直接結合する」は、抗体などの二次的結合試薬を必要としない、第一の分子（例えば蛍光色素）と第二の分子（例えば水不混和性化合物）の間の物理的相互作用を指す。
【００３６】
６．２  細胞において組み換え生産された水不混和性化合物を検出するための方法
６．２．１  細胞を封入する方法
一定の実施形態において、細胞において組み換え生産された水不混和性化合物（ＷＩＣ）を検出する方法は、細胞をヒドロゲル粒子に封入する工程、およびそのヒドロゲル粒子内の組み換え生産された水不混和性化合物レベルを検出する工程を含む。前記ヒドロゲル粒子は、反応容器または小型発酵槽として機能し、これは、そうしなければ細胞から出て行ってしまうことがある組み換え生産された水不混和性化合物を捕捉し、その後、その細胞を異種の水不混和性化合物生産についてスクリーニングおよび／または分離できる。好ましい実施形態において、前記方法は、ヒドロゲル粒子内に単一の細胞を封入する工程を含み、前記単一の細胞は、適する細胞培養条件下で前記粒子内で成長し、分裂して、細胞のクローンコロニーを生じさせる。前記ヒドロゲルのケージング作用により、例えば水不混和性化合物特異的蛍光色素でのヒドロゲル粒子の染色、および例えば蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）による、異種の水不混和性化合物生産の定量が可能になる。
【００３７】
本明細書に提供する方法の一部の実施形態において、ヒドロゲル粒子に細胞を封入する工程は、該細胞と水性ヒドロゲル懸濁液とを、ヒドロゲル粒子に該細胞を封入するのに十分な条件下で接触させることを含む。細胞の封入に有用な例示的ヒドロゲルをセクション５．２．１．１に記載し、アガロース粒子に細胞を封入するための例示的プロトコルを下の実施例２で提供する。
【００３８】
一部の実施形態では、スクリーニングすべき細胞を培養物から回収し、生理的緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回以上すすぎ、例えばＰＢＳまたは培養培地に再懸濁させた後、前記水性ヒドロゲル懸濁液と接触させる。
【００３９】
一部の実施形態では、前記再懸濁細胞と前記水性ヒドロゲル懸濁液とを特定の容積対容積（ｖ／ｖ）比で接触させる。特定の実施形態において、前記細胞懸濁液の濃度は、所望の粒径、封入に用いることとなるヒドロゲル、および粒子内の組み換え生産された水不混和性化合物を検出する方法（例えば、ＦＡＣＳ）に依存することなる。一部の実施形態では、次のように細胞の濃度を所望の粒径の関数として計算することができる：濃度（細胞／Ｌ）＝１つの粒子あたりの所望の数の細胞／（４／３×Ｐｉ×ｒ３）（式中、ｒ＝所望の粒子の半径）。１つの粒子あたりの所望の数の細胞は、好ましくは、マイクロコロニーのクローン形成能を維持するために、すなわち１粒子に１個以下の細胞が封入することを保証するために、１以下である。
【００４０】
一部の実施形態において、前記細胞懸濁液は、ヒドロゲルの所望の粒径および／またはタイプに適切な最終濃度の濃度２Ｘで細胞を含むことができる。一部の実施形態では、水性ヒドロゲル懸濁液を前記最終濃度の２Ｘで同様に処方することができ、前記接触は、それらの溶液を１：１比（ｖ／ｖ）で併せることを含む。細胞生存能を有意に損なわせないように、それらの溶液を穏やかに混合する。一部の実施形態において、前記所望の粒径は、直径約２５マイクロメートルであり、約７．３×１０７細胞／ｍＬの２Ｘ濃度で細胞を再懸濁させる。他の実施形態において、前記所望の粒径は、直径約３２マイクロメートルであり、約３．５×１０７細胞／ｍＬの２Ｘ濃度で細胞を再懸濁させる。他の実施形態において、前記所望の粒径は、直径約５０マイクロメートルであり、約９×１０６細胞／ｍＬの２Ｘ濃度で細胞を再懸濁させる。他の実施形態において、前記所望の粒径は、直径約１００マイクロメートルであり、約１×１０６細胞／ｍＬの２Ｘ濃度で細胞を再懸濁させる。一部の実施形態では、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７の、または１×１０７より高い２Ｘ濃度で細胞を再懸濁させる。
【００４１】
特定の実施形態では、約３．７×１０７細胞／ｍＬを含む２Ｘ濃度の細胞を、１．５％アガロースを含む２Ｘアガロース水溶液と接触させる。もう１つの特定の実施形態では、約９×１０６細胞／ｍＬを含む２Ｘ濃度の細胞を、２％アガロースを含む２Ｘアガロース水溶液と接触させる。もう１つの特定の実施形態では、約１×１０６細胞／ｍＬを含む２Ｘ濃度の細胞を、３％アガロースを含む２Ｘアガロース水溶液と接触させる。
【００４２】
細胞と水性ヒドロゲル懸濁液の接触後、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてヒドロゲル粒子を形成することができる。一部の実施形態では、水不混和性油、例えばフルオロカーボン油、に（細胞を含む）液体ヒドロゲルマトリックスを分散させることにより、球形ヒドロゲル粒子を形成する。一部の実施形態では、所望のサイズの均一なサイズの粒子を確実に生産するために、水性フロー流路と横に配置された油フロー流路との交差部分によって形成される接合部、例えばＴ字接合部、を含むマイクロ流体デバイスを使用して、油中水型エマルジョンを形成する。一方の流路に（細胞を含む）液体ヒドロゲルマトリックスを負荷し、すなわち流し、その水性ヒドロゲル溶液を含む流路に対して横に配置された流路に不混和性油を負荷し、すなわち流し、そしてＴ字接合部で接触を果たして、細胞を含むヒドロゲル粒子の形成に至る。その後、新たに形成された粒子を回収流路に流し、例えば回収管に回収する。その後、そのゲルを、例えば、溶液の温度を低下させることによって、または架橋剤の添加によって硬化させ、それらの粒子を油から水溶液に、例えば栄養成長培地に移送する。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書に提供する方法において有用なヒドロゲル粒子を、マイクロ流体デバイスを使用せずに形成することができる。例えば、膜乳化により、比較的小さいサイズ分布を有するエマルジョンを生じさせることができる。低いサイズ多分散性があまり重要でない状況では、他のエマルジョン形成方法、例えば、撹拌、均質化または振盪が有用である。他の有用な方法は、空中で液体のジェットを形成する工程、次に、紡糸ワイヤでの前記ジェットの機械的切断、高周波数変換器での前記ジェットの振盪、または前記ジェットを加圧空気でオリフィスに押し通すことによる剪断により、前記ジェットを破断してエーロゾル粒子にする工程を含む。
【００４４】
６．２．１．１  ヒドロゲル
ヒドロゲルは、固体マトリックスへと硬化されたポリマーであり、水により膨潤するが溶解しない。一部の実施形態において、ヒドロゲルのメッシュサイズは、細胞およびマイクロメートル規模の水不混和性化合物の液滴などのより大きい物体を封入するのに十分なほど小さいが、例えば細胞成長および増殖を支持するまたは組み換え生産された水不混和性化合物の検出に必要とされる、小さな分子およびイオンを、そのマトリックスを通って自由に拡散させるのに十分なほど大きい。
【００４５】
一部の実施形態において、前記ヒドロゲルのメッシュサイズは、約１ｎｍと１００ｎｍの間である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲルのメッシュサイズは、約１０ｎｍと９０ｎｍの間である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲルのメッシュサイズは、約２０ｎｍと８０ｎｍの間である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル封入のメッシュサイズは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｍである。
【００４６】
一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子のサイズは、数十個の細胞のコロニーを捕捉するのに十分なほど大きいが、例えば市販のセルソーターの流体要素を通り抜けるのに十分なほど小さい。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径２０〜５０マイクロメートルである。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径３０〜４０マイクロメートルである。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０  ４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０マイクロメートルである。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５０から１００マイクロメートルの間である。一部の実施形態において、前記ヒドロゲル粒子は、直径約５０、６０、７０、８０、９０、１００マイクロメートルであるか、１００マイクロメートルより大きい。
【００４７】
一部の実施形態では、単一の起始細胞（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ）の完全封入により、クローン集団細胞を含有する小コロニーは、該起始細胞に直接隣接して捕捉したままであり、他の起始細胞から離れたままであることが可能になる。したがって、１つの遺伝子型の表現型を何十もの細胞にわたって平均することができ、それによりアッセイノイズが大きく低減される。好ましい実施形態において、前記ヒドロゲルマトリックスは、剪断力および対流からヒドロゲル内に包埋された物体を保護することにより、組み換え生産された水不混和性化合物を局在させる。したがって、分子炭化水素などの小分子は、拡散のみによってゆっくりと泳動して生産細胞から離れることができる。生産起点からのこのゆっくりとした移動は高濃度をもたらし、それがマイクロメートル規模の水不混和性化合物液滴の核形成および成長を開始させる。水不混和性化合物液滴がゲルのメッシュサイズに近づき、そのサイズを超えると、それらはマトリックス内に永続的にケージされ、それらを生産する細胞に付随したままである。それらの液滴は、ゲルマトリックス外に存在する剪断力から保護されるため、それらは、粒子の外に拡散できる、より小さい液滴に解体され得ない。
【００４８】
一部の実施形態では、細胞成長を支持する任意のバイオポリマーから形成されたヒドロゲルに細胞を封入する。バイオポリマーは、天然に存在するポリマー、例えば、タンパク質および炭水化物である。好ましい実施形態において、前記バイオポリマーは、生体適合性であり、封入細胞に対して非毒性である。本発明の方法において有用な適するバイオポリマーの例としては、コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲン）、変性コラーゲン（またはゼラチン）、組み換えコラーゲン、フィブリン−フィブリノゲン、エラスチン、糖タンパク質、アルギネート、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸およびグリコサミノグリカン（またはプロテオグリカン）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記バイオポリマーは、その天然に存在する形態のものである。他の実施形態では、前記バイオポリマーを、合成ポリマーとの架橋を助長するように誘導体化する。
【００４９】
特定の実施形態において、前記バイオポリマーは、アガロースなどの熱ゲル化性多糖またはゼラチンなどの熱ゲル化性タンパク質からなる群より選択される。
【００５０】
アガロースは、海藻から抽出される天然ポリマーであり、その特性（例えば、分子量、正確な化学組成、側鎖など）は様々である。溶液の温度を下げることにより、任意の他の成分を添加せずに、アガロースを凝固させることができる。この特性は、特に、粒子の形成、とりわけ、本明細書に記載するヒドロゲル粒子を形成するためにマイクロフルイディクスまたは他のエマルジョンベースの方法を用いるとき、有用である。好ましい実施形態において、アガロースは、細胞生存能を有意に損なわない温度で生細胞をアガロースの溶液に混合することができるようなゲル化温度を有する。好ましい実施形態において、アガロースは、細胞生存能に適合した温度より高い温度ではゲル化しない。したがって、アガロースのゲル化温度が、細胞生育可能温度より高い場合、そのアガロースまたはゲルは、そのゲル化温度より下の温度では細胞をアガロース溶液（前ゲル状態）に混合するのに必要とされるよりも急速にゲル化しないはずである。一部の実施形態において、アガロースは、約１８℃から６０℃、２４℃から５０℃、３０℃から４０℃、または３２℃から３７℃の範囲の温度で（例えば、穏やかな機械的撹拌またはピペッティングにより）混合可能である。
【００５１】
一部の実施形態において、アガロース溶液は、ゲル化するのに１分より長くかかるので、細胞をその溶液に混合するのに十分な時間を与える。一部の実施形態において、アガロース溶液は、約４時間未満、さらに好ましくは１時間未満、およびさらに好ましくはおよそ数分（例えば約１から２０分、または約２から５分）でゲル化する。ゲル化が十分に遅く、かつゲルが細胞生存能を保つ温度範囲で安定している限り、実際のゲル化点温度は重要でないことは、当業者には理解されるであろう。
【００５２】
本明細書に提供する方法に有用な他の熱ゲル化性タンパク質としては、エラスチン模倣タンパク質ポリマーおよび絹−エラスチンブロックコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＨｕｒｔおよびＧｅｈｒｋｅ、Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｓｃｉ．第９６巻、第３号（２００７年３月）；ＭｃＭｉｌｌａｎら、（１９９９）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３２：３６４３−３６４８；Ｈｕａｎｇら、（２０００）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３３：２９８９−２９９７およびＭｃＭｉｌｌａｎら、（２０００）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３３：４８０９−４８２１参照（前記参考文献の開示は、それら全体が参考として本明細書に援用されている）。他の潜在的に有用な熱ゲル化性多糖としては、κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンが挙げられる。
【００５３】
一部の実施形態では、細胞成長を支持する任意の生合成マトリックスに前記細胞を封入する。一部の実施形態において、前記生合成マトリックスは、ポリアクリルアミドまたは１つ以上のアクリルアミド誘導体を含むポリマーである。本明細書において用いる場合、「アクリルアミド誘導体」は、Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキル置換アクリルアミドまたはメタクリルアミドを指す。細胞の封入の際の使用に適しているアクリルアミド誘導体の例としては、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮｉＰＡＡｍ）、Ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−シクロヘキシルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−シクロヘキシルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５４】
一部の実施形態では、細胞成長を支持する物理的に架橋されたポリマー、化学的に架橋されたポリマー、静電的に架橋されたポリマーまたは交絡ポリマー（ｅｎｔａｎｇｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）に細胞を封入する。一部の実施形態では、物理的に架橋されたポリマー、化学的に架橋されたポリマー、静電的に架橋されたポリマーまたは交絡ポリマーのうちの１つ以上を含むヒドロゲル網目構造に細胞を封入する。一部の実施形態において、前記１つ以上のコポリマーは、ヒドロゲル形成を助長するために水溶液に十分可溶性でなければならない。
【００５５】
特定の実施形態において、前記交絡ポリマーは、アガロースなどの熱ゲル化性多糖またはゼラチンなどの熱ゲル化性タンパク質からなる群より選択され、および物理的に架橋されたコポリマー、化学的に架橋されたコポリマーまたは静電的に架橋されたコポリマーは、水溶性ビニルモノマー、例えばポリエチレングリコールジアクリレート（「ＰＥＧ−ＤＡ」）および２−ヒドロキシエチルメタクリレート（「ＨＥＭＡ」）からホモポリマーまたはコポリマーのいずれかとして合成される。
【００５６】
一部の実施形態において、前記ヒドロゲル網目構造は、合成ポリマーに該合成ポリマー中のペンダント架橋性部分によって架橋されている、バイオポリマーまたはその誘導体化バージョンを含む。したがって、この実施形態において、前記バイオポリマーは、前記合成ポリマーの架橋性部分（例えば、第一級アミンまたはチオール）と反応する能力がある１つ以上の基を含有するか、かかる基を含有するように前記バイオポリマーを誘導体化することができる。前記バイオポリマーと混合して架橋ヒドロゲルを形成する前の前記合成ポリマーの溶液に細胞を添加することにより、該細胞を最終マトリックスに容易捕捉することができる。あるいは、架橋工程前に、前記合成ポリマーとバイオポリマーの両方を含有する溶液に細胞を添加することができる。前記マトリックスへの細胞の封入のために、水性培地、例えば細胞培養培地またはその希釈もしくは変性バージョンに、様々な成分（細胞、合成ポリマーおよびバイオポリマー）を分散させる。その細胞懸濁液をポリマー溶液に、該細胞が該溶液に実質的に均一に分散されるまで穏やかに混ぜ入れ、その後、上で説明したようにヒドロゲルを形成する。
【００５７】
一部の実施形態において、１つ以上の架橋ポリマー、例えば物理的に架橋された、化学的に架橋されたまたは静電的に架橋されたポリマー、で構成されているヒドロゲルに細胞を封入すべき場合、好ましくは、生細胞の実質的な部分が生存可能なままであるような期間にわたり前記ポリマーを重合および／または架橋する。一部の実施形態では、前記細胞を約１時間未満、約５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１分未満架橋する。
【００５８】
６．２．１．２  マイクロ流体デバイス
上で説明したようなヒドロゲル粒子の形成に有用な例示的マイクロ流体デバイスは、複数のフロー流路が作製された少なくとも１つの表面を有する担体を備える。本明細書において用いる場合の「流路」は、流体のフローを少なくとも部分的に方向づける担体上または内の特徴を指す。場合によっては、流路は、少なくとも一部は、単一要素、例えばエッチングされた担体または成形ユニットによって構成され得る。流路は、任意の断面形状、例えば円形、楕円形、三角形、不規則形状、正方形もしくは（任意のアスペクト比を有する）長方形またはこれらに類するものを有することがあり、覆われていることもあり、または覆われていない（すなわち、流路周囲の外部環境に開放されている）こともある。流路が完全に覆われている実施形態において、該流路の少なくとも一部分は、完全に密閉されている断面を有することがあり、および／または流路全体が、その流入口および流出口を除いてその全長にわたって密閉されていることがある。
【００５９】
一部の実施形態において、前記デバイスは、表面に作製された少なくとも２本のフロー流路を備え、この場合、少なくとも１本の流路は、各流路内の第一の地点、すなわちＴ字接合部、で少なくとも１本の横に配置された流路に流体的に接続している。一部の実施形態において、前記デバイスは、少なくとも２つの流入口、すなわち、例えば水溶液中の細胞またはフルオロカーボン油をそれぞれ受け取る該デバイスの領域を備える。各流入口は、１つ以上の流入口流路、ウェルまたはレザバ、開口部、および例えば水溶液中の細胞のまたはフルオロカーボン油の担体への流入を助長する他の特徴を備え得る。流入口は、一般に、試料流入口流路（例えば、細胞流入口流路または油流入口流路）と主流路（例えば、それぞれ、細胞溶液フロー流路または油フロー流路）の間に、試料の溶液（例えば、水溶液中の細胞、またはフルオロカーボン油）が該主流路に導入されるような接合部を備える。一部の実施形態において、前記デバイスは、１つより多くの流入口、例えば１つより多くの細胞流入口または１つより多くの油流入口を、必要に応じて含有することがある。一部の実施形態では、異なる試料流入口流路が異なる流入口で主流路と連通することができる、すなわち、流体連通することができる。例えば、多数の細胞流入口が細胞溶液フロー流路と連通することができ、および多数の油流入口流路が油フロー流路と連通することができる。あるいは、異なる試料流入口流路が同じ流入口で主流路と連通することができる。
【００６０】
一部の実施形態において、前記デバイスは、流入口、例えば細胞流入口または油流入口に、流入口流路と流体連通している、試料溶液レザバ、またはウェル、または試料を該デバイスに導入するための他の器具を備える。前記マイクロ流体デバイスに１つ以上の試料を負荷するためのレザバおよびウェルとしては、シリンジ、カートリッジ、バイアル、エッペンドルフ管および細胞培養材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
ヒドロゲル粒子形成の形成の助長に有用なマイクロ流体デバイスの１つの実施形態を図３に示す。このデバイス全体が平面担体に作製され、細胞流入口を備え、該流入口は細胞溶液フロー流路に流体的に接続しており、該細胞溶液フロー流路は粒子フロー流路へ、続いてその終端部の粒子回収流出口へと流体的に接続している。このデバイスは、油流入口をさらに備え、該流入口は油フロー流路に流体的に接続しており、該油フロー流路は、前記細胞溶液フロー流路に対して横に配置されており、Ｔ字接合部で前記細胞溶液フロー流路と交差する。前記油フロー流路と前記細胞溶液流路は、該細胞溶液フロー流路を通過する流体の流れに垂直な角度で該細胞溶液フロー流路に油が導入されるように、交差することができる。一部の実施形態において、前記油フロー流路および細胞溶液フロー流路は、Ｔ字接合部で、すなわち、該油フロー流路が該細胞溶液フロー流路に対して垂直（９０度）であるように交わる。他の実施形態において、前記油フロー流路は、任意の角度で前記細胞溶液フロー流路と交わることができ、油を前記細胞溶液フロー流路に、そのフローに垂直である角度で導入する必要はない。一部の実施形態において、交差する流路間の角度は、約６０から約１２０度の範囲である。一部の実施形態において、交差する流路間の角度は、約４５、６０、９０または１２０度である。
【００６２】
一部の実施形態では、前記マイクロ流体デバイスの中での溶液、例えば、水溶液中の細胞またはフルオロカーボン油、の移動を圧力駆動流量制御によって駆動し、弁およびポンプを用いて、該溶液の１方向以上の方向でのフローおよび／または該マイクロ流体デバイスの１本以上の流路へのフローを操作することができる。一部の実施形態において、フロー流路内の圧力は、それぞれの流入口流路に対する圧力を調節することによって、例えば、加圧シリンジで該流入口流路に供給することで調整することができる。油源と細胞溶液源の間のそれらそれぞれの流入口での圧力の差を制御することにより、生成されるヒドロゲル粒子のサイズおよび周期性を調整することができる。前記ヒドロゲル粒子のサイズおよび周期性は、流路直径、流体の粘度、および剪断圧力にも依存し得る。
【００６３】
図４は、ヒドロゲル封入細胞を形成するための例示的プロセスの描写を提供するものである。細胞は、左から入り、細胞流入口から連続水性流で細胞溶液フロー流路を通る。油フロー流路を流れるフルオロカーボン油とＴ字接合部で接触すると、細胞溶液は分散されまたは不連続になり、粒子が形成され、それらの粒子は油に包囲され、粒子フロー流路を通って運ばれる。このデバイスの出口（すなわち、粒子回収流出口）で、粒子は、一定の長さの管状材料に入り、微量遠心管などの容器へと流れる。それらのゲル粒子が硬化されて、フルオロカーボン油から分離される、すなわち、フルオロカーボン油から水性緩衝液へと洗い出される。
【００６４】
一部の実施形態において、前記マイクロ流体デバイスの粒子フロー流路の断面寸法は、形成される、すなわちヒドロゲル懸濁液がＴ字接合部でフルオロカーボン油と接触した後の、ヒドロゲル粒子のサイズに寄与することとなる。一部の実施形態において、前記粒子フロー流路は、例えば、約０．１μｍから約５００μｍ、０．１μｍから約２００μｍ、０．１μｍから約１００μｍ、０．１μｍから約５０μｍ、または５０μｍ未満の範囲の断面寸法を有するだろう。同様に、一部の実施形態において、前記油フロー流路の断面寸法は、ヒドロゲル懸濁液がＴ字接合部でフルオロカーボン油と接触した後に形成されるヒドロゲル粒子のサイズに寄与することとなる。一部の実施形態において、前記油フロー流路は、例えば、約０．１μｍから約５００μｍ、０．１μｍから約２００μｍ、０．１μｍから約１００μｍ、０．１μｍから約５０μｍ、または５０μｍ未満の範囲の断面寸法を有するだろう。
【００６５】
ヒドロゲル粒子の形成を助長するのに有用な、前記マイクロ流体デバイスの製造に適する担体材料は、一般に、形成される粒子の性質とのそれらの適合性に基づいて選択される。かかる条件としては、ｐＨの両極値、温度、それに適用されるフルオロカーボン油／フッ素系界面活性剤、それに適用されるポリマー、およびこれらに類するものを挙げることができる。有用な担体材料の例としては、例えば、ガラス、石英およびケイ素ならびにポリマー基材、例えばプラスチックが挙げられる。一部の実施形態において、前記担体材料は、硬質、半硬質または非硬質、不透明、半透明または透明である。例えば、粒子形成のモニタリングを可能にする光学または視覚要素を含むデバイスは、一般に、少なくとも一部は、そのモニタリングを可能にするまたは少なくとも助長するために透明材料から作製されることとなる。あるいは、これらのタイプのモニタリング要素のために、例えばガラスまたは石英の透明な窓が場合により前記デバイスに組み込まれている。加えて、前記ポリマー材料は、直鎖状または分岐したバックボーンを有することがあり、場合により、架橋されている、または架橋されていない。特に適するポリマー材料の例としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネートおよびこれらに類するものが挙げられる。
【００６６】
前記担体表面へのマイクロスケール要素、例えばフロー流路、の作製は、任意の数の微細製造技術によって一般に行うことができ、これらの技術は、当該技術分野において周知である。例えば、リソグラフィ技術は、フォトリソグラフエッチング、プラズマエッチングまたは湿式化学エッチングなどの半導体製造業界で周知の方法を用いる、例えばガラス、石英またはケイ素担体の作製の際に、場合により利用される。あるいは、レーザードリル加工、マイクロミリングおよびこれらに類するものなどの微細加工法が場合により利用される。同様に、ポリマー担体についても周知の製造技術を用いることができる。これらの技術としては、射出成形法、またはマイクロスケールの担体の大きなシートを製造するために例えば回転スタンプを使用して多数の担体を場合により製造するスタンプ成形法、または微細加工された型の中で基材を重合させるポリマーマイクロ注型技術が挙げられる。
【００６７】
前記デバイスは、流路のある担体に被せ、コンジットを形成する様々なフロー流路を密閉し、流体を封止する追加の平面要素を典型的に含む。前記平面カバー要素の取り付けは、例えば熱接着、接着剤または、一定の担体、例えばガラスもしくは半硬質および非硬質ポリマー担体、の場合の２要素間の自然接着をはじめとする、様々な手段によって実現される。ヒドロゲル粒子形成に必要な様々な流体要素を導入するためのアクセスポートおよび／またはレザバを前記平面カバー要素にさらに設けてもよい。
【００６８】
ポリマー担体の表面改質を様々な異なる形態で行うことができる。例えば、材料（例えば、細胞および／またはヒドロゲル粒子）が流路の側面に接着しないようにするために、流路（および使用する場合にはカバーガラス）は、接着を最小にするコーティングを有することができる。前記マイクロ流体デバイスの流路の表面を分散相のための任意の抗湿潤（ａｎｔｉ−ｗｅｔｔｉｎｇ）またはブロッキング剤で被覆することがある。生体試料／化学試料の接着を防止するために任意のタンパク質で前記流路を被覆することもできる。当該技術分野において公知の任意の手段によって流路を被覆することができる。例えば、商標ＡｑｕａｐｅｌでＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているおよび米国特許第５，５２３，１６２号に開示されているタイプの疎水性被覆剤で流路を被覆（例えば、シリカプライマー層の使用と組み合わせた、プラスチック担体表面および被覆プラスチック担体表面のペルフルオロアルキルアルキルシラン表面処理）することができる。流路の表面をフッ素化することにより、連続相が優先的に流路を湿潤させ、そのデバイスを通した液滴の安定した生成および移動を可能にする。その結果、流路壁の低い表面張力が、流路を詰まらせる微粒子の蓄積を最小にする。流路の表面をフッ素化することにより、連続相が優先的に流路を湿潤させ、そのデバイスを通した材料（例えば、細胞および／またはヒドロゲル粒子）の安定した生成および移動を可能にする。その結果、流路壁の低い表面張力が、流路を詰まらせる微粒子の蓄積を最小にする。
【００６９】
１つの実施形態において、担体の荷電表面の調製は、ポリマー担体の表面を部分的に溶解または軟化する適切な溶媒への改質すべき表面、例えばフロー流路、の曝露を含む。適切な溶媒の選択は、一般に、その担体に使用されるポリマー材料に依存することとなる。例えば、塩素化炭化水素溶媒、すなわち、トリクロロエタン（ＴＣＥ）、ジクロロエタンおよびこれらに類するものは、ＰＭＭＡおよびポリカーボネートポリマーに関して使用するための溶媒として特に有用である。次に、洗浄剤をその部分的に溶解した表面と接触させる。その洗浄剤分子の疎水性部分が、その部分的に溶解したポリマーと会合することとなる。多種多様な洗浄剤、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、またはＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）を使用することができる。次に、例えば水を使用して、その表面から溶媒を洗浄し、そうするとポリマー表面が硬化し、それに伴って洗浄剤がその表面に包埋され、荷電ヘッド基を流体界面に提示する。
【００７０】
代替態様では、ポリジメチルシロキサンなどのポリマー材料をプラズマ照射によって改質することができる。詳細には、ＰＤＭＳのプラズマ照射は、メチル基を酸化させて、それらの位置の炭素および脱離ヒドロキシル基を遊離させ、その結果、その会合ヒドロキシル官能基を有するガラス様表面をポリマー材料上に作る。
【００７１】
前記ポリマー担体は、硬質、半硬質、非硬質、または硬質要素と非硬質要素の組み合わせであり得る。１つの実施形態において、担体は、少なくとも１つのより軟質で可撓性の担体要素と少なくとも１つのより堅い、より硬質の担体要素とで構成され、これらの一方が、その表面に製造された流路およびチャンバを含む。前記２つの担体を合わせると、軟質要素が含まれることで流路およびチャンバに有効な流体シールを形成することができ、より硬質のプラスチック成分を互いに貼り付けるまたは一緒に溶融することに関連した要求および問題をうまく回避することができる。
【００７２】
６．２．１．３  フルオロカーボン油
フルオロカーボン油連続相は、本明細書に提供するようなヒドロゲル粒子の形成に使用するための連続相としてよく適している。フルオラス油（ｆｌｕｏｒｏｕｓ  ｏｉｌ）は、疎水性でもあり、撥油性でもあり、したがって、水性相の成分に対して低い溶解度を有する。加えて、炭化水素またはシリコーン油とは対照的に、フルオラス油は、マイクロ流体流路の構築に適便な材料であるＰＤＭＳ材料を膨潤させない。
【００７３】
一部の実施形態において、フルオロカーボン油は、水性相と不混和性である。一部の実施形態において、フルオロカーボン油は、形成およびその後の硬化／重合時にヒドロゲル粒子を安定させる。一部の実施形態において、フルオロカーボン油は、ヒドロゲル粒子に対して化学的および生物学的不活性を維持し、該粒子内の細胞の生存能に悪影響を及ぼさない。一部の実施形態において、前記油溶液は、マイクロ流体デバイスを構築するために使用される材料を膨潤、溶解または分解しない。好ましくは、前記油の物理的特性（例えば粘度）は、封入プロセスの流動および動作条件に適していなければならない。
【００７４】
本明細書に提供する方法で使用するための例示的フルオロカーボン油としては、化学およびエーテル結合により炭化水素とカップリングされたフッ素化アルキル鎖であるである、ヒドロフルオロエーテルが挙げられる（すなわち、Ｎｏｖｅｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＦｌｕｉｄｓまたはＨＦＥシリーズの油）。有用なＨＦＥシリーズの油としては、ＨＦＥ−７５００、ＨＦＥ−７１００、ＨＦＥ−７２００およびＨＦＥ−７６００が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、前記フルオロカーボン油は、１重量％での３Ｍ  Ｎｏｖｅｃ  ＨＦＥ−７５００である。ＨＦＥシリーズの油は、単体の油として使用することができ、またはエマルジョン特性および性能を最適化するために油混合物の成分として使用することができる。他の有用なフルオロカーボン油としては、ペルフルオロアルキルアミン（すなわち、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｅｓ（ＦＣ油））が挙げられ、これは、ペルフルオロアルキルアミン構造に基づくペルフルオロ化（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ）油である。有用なＦＣ油としては、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  ＦＣ−３２８３およびＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ  ＦＣ−４０が挙げられる。ＦＣ油は、単体の油として使用することもでき、またはエマルジョン特性および性能を最適化するために油混合物の成分として使用することもできる。
【００７５】
一部の実施形態において、前記フルオロカーボン油は、フッ素系界面活性剤を含む。前記連続相流体に添加することができる界面活性剤としては、界面活性剤、例えば、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ  ２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ  ４０）、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ  ６０）およびソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ  ８０）をはじめとするソルビタン系カルボン酸エステル（例えば、「Ｓｐａｎ」界面活性剤、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ）、ならびにペルフルオロ化ポリエーテル（例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭ、および／またはＥＳＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる非イオン性界面活性剤の他の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール（例えば、ノニル−、ｐ−ドデシル−およびジノニルフェノール）、ポリオキシエチレン化直鎖アルコール、ポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル（例えば、天然脂肪酸のグリセリルおよびポリグリセリルエステル、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルなど）およびアルカノールアミン（例えば、ジエタノールアミン−脂肪酸縮合生成物およびイソプロパノールアミン−脂肪酸縮合生成物）が挙げられる。特定の実施形態において、前記フッ素系界面活性剤は、Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＨのカルボン酸アンモニウム塩である。
【００７６】
前記連続相流体、例えばフルオロカーボン油、に添加することができる追加の例示的フッ素系界面活性剤は、次のように合成することができる：
【００７７】
【化１】
2014508516.tif 000003
【００７８】
【化２】
2014508516.tif 000004
６．２．２  検出方法
６．２．２．１  細胞培養
ヒドロゲル粒子形成後、そのゲル粒子懸濁液をフルオロカーボン油から分離し、成長培地に移して適する条件下で、例えば、炭素源を含む培地中、異種の水不混和性化合物生産に適する条件下で成長させる。一部の実施形態において、前記条件は、細胞が分裂し、異種の水不混和性化合物を生産できるように３０℃振盪インキュベーター内のチューブの中で細胞を成長させることを含む。産物は、アガロース粒子内に留まり、したがって、それを生産した細胞と会合したままである。
【００７９】
微生物細胞の培養に適する条件および適する培地は、当該技術分野において周知である。一部の実施形態において、炭素源は、単糖（単糖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒ））、二糖、多糖、非発酵性炭素源、またはこれらの１つ以上の組み合わせである。適する単糖の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボースおよびこれらの組み合わせが挙げられる。適する二糖の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびこれらの組み合わせが挙げられる。適する多糖の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。適する非発酵性炭素源の非限定的な例としては、アセテートおよびグリセロールが挙げられる。一部の実施形態では、適する培地に１つ以上の追加の薬剤、例えば、誘導物質（例えば、遺伝子産物をコードしている１つ以上のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にあるとき）、抑制因子（例えば、遺伝子産物をコードしている１つ以上のヌクレオチド配列が抑制性プロモーターの制御下にあるとき）、または選択剤（例えば、遺伝的修飾を含む微生物細胞について選択するための抗生物質）などを補足する。
【００８０】
一部の実施形態では、前記細胞を含むヒドロゲル粒子を異種の水不混和性化合物生産に適する条件下で、少なくとも１２時間の期間にわたって培養する。一部の実施形態では、前記細胞を含むヒドロゲル粒子を異種の水不混和性化合物生産に適する条件下で、１２時間から２４時間の期間にわたって培養する。一部の実施形態では、前記細胞を含むヒドロゲル粒子を異種の水不混和性化合物生産に適する条件下で、少なくとも２４時間の期間にわたって培養する。一部の実施形態では、前記細胞を含むヒドロゲル粒子を異種の水不混和性化合物生産に適する条件下で、約１２、２４、３６、４８、６０、７２時間または７２時間より長い期間にわたって培養する。
【００８１】
６．２．２．２  検出
ヒドロゲル粒子内に封入された組み換え生産された水不混和性化合物、すなわち、その中に封入された細胞または細胞のクローン集団から生産された組み換え生産された水不混和性化合物を、当該技術分野において公知の任意の標準的な細胞検出技術、例えば、フローサイトメトリー、細胞分取、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気励起細胞分取（ＭＡＣＳ）を用いて、光学顕微鏡検査もしくは共焦点顕微鏡検査を用いる該粒子および／もしくはその中に封入された細胞の検査により、ならびに／または封入細胞の単離により、検出することができる。
【００８２】
特定の実施形態では、蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ）を用いて、水不混和性化合物生産細胞を含む粒子を分取することができる。蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）は、細胞をはじめとする粒子を粒子の蛍光特性に基づいて分離するための周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５１：１５０−１６５）。個々の粒子中の蛍光部分のレーザー励起が小さな電荷を生じさせる結果となり、それによって混合物からの正および負の粒子の電磁的分離が可能になる。１つの実施形態では、粒子を、該粒子に封入された細胞によって生産される異種の水不混和性化合物に結合する、例えば直接結合する親油性蛍光色素で染色する。使用する蛍光標識に結合する粒子の能力に基づいて粒子を分離することができる細胞分取装置によって、細胞を処理する。一部の実施形態では、前方または側方散乱を用いて、細胞占有ヒドロゲル粒子と細胞非占有ヒドロゲル粒子とを区別することができる。その後、それらの占有粒子をさらにゲートして、所望の蛍光プロファイルを有する細胞の亜集団を検出することができる。ＦＡＣＳ分取粒子を９６ウェルまたは３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接堆積させて、それらの中に封入された細胞の分離、単離およびクローニングを助長することができる。
【００８３】
本明細書に提供する検出、スクリーニングおよび／または富化方法の一部の実施形態において、前記方法は、ヒドロゲル粒子と、組み換え生産された水不混和性化合物に直接結合する蛍光色素とを接触させる工程、および前記ヒドロゲル粒子内の前記蛍光色素を検出する工程を含む。一部の実施形態において、前記蛍光色素は、ソルバトクロミック（ｓｏｌｖａｔｏｃｈｒｏｍｉｃ）色素である。蛍光ソルバトクロミック色素は、分子を包囲する溶媒の極性に依存して色を変化させる色素であり、例えば、生体分子（特に、脂質分子）の動態の高感度実時間観察の際にプローブとして使用される。それらの変色メカニズムは、直接結合によって実現され、特定の化学種との接触を必要としない。かかる蛍光ソルバトクロミック色素としては、ＮＢＤ、ダンシル、ＤＡＳＰＭＩ、プロダン（ｐｒｏｄａｎ）、ダポキシル（ｄａｐｏｘｙｌ）、４−ＤＭＡＰ、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド誘導体、Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ色素、およびナイルレッドが挙げられる。
【００８４】
一部の実施形態において、前記蛍光ソルバトクロミック色素はナイルレッドである。ナイルレッドは、哺乳動物細胞、細菌、酵母および微小藻類をはじめとする動物細胞および微生物の脂質含有量を評価するための、例えば蛍光顕微鏡検査およびフローサイトメトリーによる細胞内脂質小滴の検出に使用されることが多い、脂溶性蛍光色素である。ナイルレッドは、それを本明細書に記載する組み換え生産された水不混和性化合物の高スループット検出に理想的なものにする、幾つかのユニークな特性を有する。例えば、ナイルレッドは、疎水性環境で高蛍光性であり、親水性環境で消光され、および他のソルバトクロミック色素と同様にその励起および発光スペクトルは、その環境の性質によってスペクトルの位置、形状および強度が変化する。ナイルレッドのこのソルバトクロミック特性により、リン脂質および極性脂質に結合したナイルレッドと中性脂質に結合したナイルレッドの部分的区別が可能になる。リン脂質細胞膜などの極性脂質の場合、ナイルレッドは、約５９０ｎｍの蛍光発光最大値を有する。対照的に、中性脂質、例えば炭化水素生成物（例えば、ファルネセン）の存在下では、スペクトルが青色側にシフトし、発光最大値は５５０ｎｍである。したがって、本明細書に記載する方法の一定の実施形態では、理想的生産細胞（例えば、純粋なファルネセン）と完全非生産細胞の間の緑色対赤色蛍光比を最大にするために、検出中にスペクトルの緑色（５２５＋／−２０ｎｍ）領域および赤色（６７０＋／−２０ｎｍ）領域における光学フィルターを使用する。緑色および赤色両方のスペクトルでの蛍光データを収集し、その緑色対赤色蛍光比を使用して、マイクロコロニー中の細胞バイオマスの量に対して正規化された該マイクロコロニー内の水不混和性化合物の量を決定することができる。このように、本明細書に提供する方法は、有利なことに、ナイルレッドなどのソルバトクロミック色素を利用して、（ａ）封入されたマイクロコロニーによって生産された水不混和性化合物の量と（ｂ）封入されたマイクロコロニー内の細胞バイオマスとを同時に決定する。例えば、前記マイクロコロニーの細胞壁もしくは核特異的染色剤での対比染色または前記マイクロコロニーの光学密度の測定によって、細胞バイオマスの独立した決定の必要を回避することにより、他のスクリーニング法と比較して高いスループットおよび効率を実現することができる。
【００８５】
有利には、マイクロコロニーの緑色対赤色蛍光（Ｇ／Ｒ）比を用いて、細胞の封入コロニー内の相対産物：バイオマス比を決定することができ、したがって、その集団をランクづけすることができる。例えば、ピコスクリーニングされたコロニーを、（ａ）相対的に高いＧ／Ｒ比（これは、相対的に遅い成長／高い生産性の集団を示すことができる）；または（ｂ）相対的に低いＧ／Ｒ比（これは、相対的に速い成長／低い生産性の集団、相対的に速い成長／高い生産性の集団、もしくは相対的に遅い成長／低い生産性の株を示すことができる）を有するものとして、ランクづけすることができる。マイクロコロニーのＧ／Ｒ比は、さらに、その緑色蛍光値のみ（Ｇ）（これは、その集団によって生産された化合物の量の指標となる）と併用して、その集団をさらに特性づけすることができる。例えば、低いＧ／Ｒ比だが高いＧ値を有する、ピコスクリーニングされたコロニーは、相対的に速い成長／高い生産性の集団を示すことができ、低いＧ／Ｒ比だが低いＧ値を有する、ピコスクリーニングされたコロニーは、相対的に遅い成長／低い生産性の集団または速い成長／低い生産性の集団を示すことができる。
【００８６】
したがって、本明細書に提供する検出、スクリーニングおよび／または富化方法の一部の実施形態において、前記方法は、ヒドロゲル粒子内の水不混和性化合物の量を該ヒドロゲル粒子内の細胞バイオマスの量に対して正規化する工程を含む。一部の実施形態において、前記正規化は、（ａ）前記ヒドロゲル粒子内の水不混和性化合物の蛍光レベルおよび（ｂ）前記ヒドロゲル粒子内の細胞バイオマスの蛍光レベルを決定すること；ならびに（ａ）で決定した蛍光の（ｂ）で決定した蛍光に対する比を決定することを含む。一部の実施形態において、前記蛍光色素はナイルレッドであり、前記正規化は、前記ヒドロゲル粒子内の水不混和性化合物のレベルに相当する緑色スペクトル（例えば、５２５＋／−２０ｎｍ）範囲内の蛍光レベルを決定すること、および前記ヒドロゲル粒子内の細胞バイオマスのレベルに相当する赤色スペクトル（例えば、６７０＋／−２０ｎｍ）範囲内の蛍光レベルを決定すること、および緑色対赤色蛍光（Ｇ／Ｒ）比を決定することを含む。一部の実施形態において、前記方法は、高いＧ／Ｒ比を有するヒドロゲル粒子を選択する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、高い緑色蛍光レベルを有するヒドロゲル粒子を選択する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、高いＧ／Ｒ比および高い緑色蛍光レベルを有するヒドロゲル粒子を選択する工程をさらに含む。
【００８７】
６．２．２．３  検出のためのスペクトル条件の選択
複数の封入細胞から生産されたＷＩＣに結合している蛍光色素の選択的検出に適するスペクトル条件の決定を幾つかの実施形態で行うことができる。１つの実施形態では、（１）複数の細胞によって組み換え生産されたＷＩＣと（２）前記ＷＩＣを直接結合する蛍光色素と（３）宿主細胞との任意の組み合わせについてのスペクトル条件を、前記ＷＩＣに結合している前記色素の特異的検出を可能にする励起波長を同定する工程を含む方法によって決定することができる。一部の実施形態において、前記方法は、前記ＷＩＣに結合している前記色素の特異的検出を可能にする発光波長を同定する工程を含む。一部の実施形態において、前記方法は、前記ＷＩＣに結合している前記色素の特異的検出を可能にする励起波長と発光波長のペアリングを同定する工程を含む。好ましい実施形態において、前記方法は、前記ＷＩＣに結合している蛍光色素の検出のために十分選択的である励起波長と発光波長のペアリングを同定する工程を含むので、宿主細胞バイオマスの蛍光を検出しない。
【００８８】
一部の実施形態において、ＷＩＣに結合している蛍光色素の検出に選択的なスペクトル条件を決定する方法は、適合している励起波長を決定する工程を含む。１つの実施形態では、適合している励起波長を、
（ａ）蛍光色素と、第一の複数の細胞集団および第二の複数の細胞集団と接触させること（この場合、前記第一および第二の複数の細胞集団の細胞は、スクリーニングされるＷＩＣ生産細胞と同じ細胞タイプのものであり、前記複数の細胞集団各々が、ｘの細胞密度を有する細胞集団と５ｘの細胞密度を有する細胞集団とを含み、前記第一の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、および前記第二の複数の細胞集団はＷＩＣを含まない）；
（ｂ）前記第一の複数の細胞集団および第二の複数の細胞集団についての励起スペクトルをそれぞれ決定すること；ならびに
（ｃ）励起波長であって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第一の複数の細胞集団からの細胞集団と前記第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差が、少なくとも８０％である、および
（ｉｉ）前記第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差が、２５０％以下である、
励起波長を選択すること
によって決定する。
【００８９】
一部の実施形態において、ＷＩＣに結合している蛍光色素の選択的検出に十分なスペクトル条件を決定する前記方法は、適合している発光波長を決定する工程を含む。１つの実施形態では、適合している発光波長を、
（ａ）蛍光色素と、第一の複数の細胞集団および第二の複数の細胞集団の細胞集団と接触させること（この場合、前記第一および第二の複数の細胞は、スクリーニングされるＷＩＣ生産細胞と同じ細胞タイプのものであり、前記複数の細胞集団各々は、ｘの細胞密度を有する細胞集団と５ｘの細胞密度を有する細胞集団とを含み、前記第一の複数の細胞集団の各々がＷＩＣを含み、および前記第二の複数の細胞集団はＷＩＣを含まない）；
（ｂ）前記第一の複数の細胞集団および第二の複数の細胞集団についての発光スペクトルをそれぞれ決定すること；ならびに
（ｃ）発光波長であって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第一の複数の細胞集団からの細胞集団と前記第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差が、少なくとも８０％である、および
（ｉｉ）前記第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差が、２５０％以下である、
発光波長を選択すること
によって決定する。
【００９０】
特定の実施形態において、ＷＩＣに結合している蛍光色素の選択的検出に十分なスペクトル条件を決定する前記方法は、励起波長と発光波長の両方を選択する工程、すなわち、（ｉ）同じ光学密度を有する、前記第一の複数の細胞集団からの細胞集団と前記第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差が、少なくとも８０％である、および（ｉｉ）前記第二の複数の細胞集団からのＯＤ５の細胞集団とＯＤ２５の細胞集団の蛍光の差が、２５０％以下である、適合した発光波長と励起波長のペアリングを選択する工程を含む。
【００９１】
前記方法が、前記第一および第二の複数の細胞についての励起スペクトルを決定する工程を含む場合、発光波長を一定に保持し、励起スペクトルを例えば２５０ｎｍから５００、またはこの波長のサブセットから得る。一部の実施形態では、前記発光波長を、得られた励起スペクトルの励起波長の範囲の直ぐ外側の波長で一定に保持する。特定の実施形態では、前記発光波長を５５０ｎｍで一定に保持する。同様に、前記方法が、前記第一および第二の複数の細胞についての発光スペクトルを決定する工程を含む場合、励起波長を一定に保持し、発光スペクトルを例えば２６０ｎｍから７２０、またはこの波長のサブセットから得る。特定の実施形態では、前記励起波長を２９０ｎｍで一定に保持する。蛍光スペクトルを得る能力がある当該技術分野において公知の任意の蛍光計を、本明細書に記載する方法に使用することができる。
【００９２】
上で説明した方法に有用な第一および第二の複数の細胞集団は、好ましくは、はっきりと感知できる量のバックグラウンド蛍光をアッセイにもたらさない液体培地の中に含有されている。例えば、前記細胞を、マイクロタイタープレートのウェルの、細胞培養または細胞ベースのアッセイにおいて一般に用いられている水溶液、例えば、生理的緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、または細胞の成長を支持することができる任意の培地に添加することができる。
【００９３】
一部の実施形態において、細胞集団の前記細胞密度ｘは、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での細胞集団の光学密度である。例えば、細胞密度ｘを有する第一の細胞集団が、１のＯＤ６００を有する場合、細胞密度５ｘの細胞集団は、５のＯＤ６００を有する。一部の実施形態では、前記第一および第二の複数の細胞各々が、漸増細胞密度の少なくとも２つの細胞集団、例えば、ｘおよび５ｘ（例えば、１および５のＯＤ６００）、ｘおよび１０ｘ（例えば、１および１０のＯＤ６００）、またはｘおよび２０ｘ（例えば、１および２０のＯＤ６００）の細胞集団を含む。一部の実施形態において、前記第一および第二の複数の細胞は、より低いまたはより高い光学密度の集団を含む。例えば、前記第一および第二の複数の細胞は、ＯＤ１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３５、４０、４５の、または５０より高い細胞集団をさらに含むことがある。一部の実施形態において、前記第一および第二の複数の細胞は、漸増細胞密度の細胞の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２のまたは１２より多くの集団を含み、それらから蛍光スペクトルを得、これらの複数の細胞は、５のＯＤ６００および２５のＯＤ６００の集団を含む。特定の実施形態において、前記第一および第二の複数の細胞は、５、１０、１５、２０および２５のＯＤ６００の細胞集団を含む。他の実施形態において、前記第一および第二の複数の細胞は、１および１０、１および１５、５および２０、１０および２０、または１０および２５のＯＤ６００の集団を含む。好ましくは細胞密度ｘおよび細胞密度５ｘは、所与の細胞タイプに関する６００ｎｍでの分光光度検出についてのダイナミックレンジ内である。
【００９４】
選択的スペクトル条件を捜している水不混和性化合物（ＷＩＣ）に関しては、それらのスペクトル条件を決定するために、例えば、前記第一の複数の細胞集団の細胞を含む水性培地に、精製化合物として前記ＷＩＣを添加してもよい。あるいは、前記第一の複数の細胞集団の細胞は、ＷＩＣを生産するように修飾された組み換え細胞であってもよい。ＷＩＣを生産する組み換え細胞を利用する一部の実施形態では、前記細胞によって生産されるＷＩＣの量を、例えば収率（基質、例えばスクロース、１グラム当たりの化合物のグラム）、生産量レベル（１リットル当たりのグラム）および／または生産性レベル（１時間当たりの１リットル当たりのグラム）として、前もって確立する。第一の複数の細胞集団が、ＷＩＣを生産する組み換え細胞を含む一部の実施形態では、ＷＩＣに対して特異的なスペクトル条件を決定する前に、ＷＩＣの生産に十分な期間、細胞を培養する。
【００９５】
一部の実施形態において、前記第一の複数の細胞集団の各々の細胞集団は、等量のＷＩＣを含む。他の実施形態において、前記第一の複数の細胞集団の細胞集団は、異なる量のＷＩＣを含む。好ましくは、ＷＩＣの量は、前記接触中にＷＩＣを結合するのに利用可能な蛍光色素の量を超えない。一部の実施形態において、前記第一の複数の細胞集団の各々の細胞集団は、少なくとも０．１ｇ／Ｌの量のＷＩＣを含む。他の実施形態において、前記第一の複数の細胞集団の各々の細胞集団は、０．１ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの量のＷＩＣを含む。一部の実施形態において、前記第一の複数の細胞集団の各々の細胞集団は、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０または１５．０ｇ／Ｌより多い量のＷＩＣを含む。特定の実施形態では、ＷＩＣを前記第一の複数の細胞集団の各々の集団に、例えばはっきりと感知できる量のバックグラウンド蛍光をアッセイにもたらさない溶媒中の、純粋なＷＩＣとして添加する。特定の実施形態では、第一の複数の細胞集団の細胞の各々集団にＷＩＣを少なくとも２ｇ／Ｌの濃度で外因的に添加する。
【００９６】
好ましくは、前記第一および第二の複数の細胞集団の細胞は、蛍光色素が結合できる内因性細胞標的の量または質のあらゆる相違を最少にするために、同じ細胞タイプのものである。好ましくは、前記第二の複数の細胞集団の細胞は、ＷＩＣ、例えば、外因的に添加されたまたは組み換え生産されたＷＩＣを含まない。しかし、ＷＩＣが、前記第二の複数の細胞集団の細胞中に内因性分子として存在し得る場合、該ＷＩＣは、前記第一の複数の細胞集団の細胞中にも内因性分子として存在するであろう。
【００９７】
一部の実施形態において、ＷＩＣの特異的検出のために選択した励起および／または発光波長で、同じ細胞密度を有する（ＷＩＣを含む）第一の複数の細胞集団からの細胞集団と（ＷＩＣを含まない）第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差は、少なくとも８０％である。一部の実施形態において、これらの細胞集団間の蛍光の差は、少なくとも約８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００％となるか、または５００％より大きくなる。
【００９８】
一部の実施形態において、ＷＩＣの特異的検出のために選択した励起および／または発光波長で、第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差は、２５０％以下である。一部の実施形態において、この差は、約２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、２０または１０％以下である。
【００９９】
ナイルレッドの蛍光、例えばＷＩＣに結合しているナイルレッドの蛍光からの影響がない、細胞からの自己蛍光の検出に対して選択的であるスペクトル条件を決定するための方法を、さらに本明細書に提供する。自己蛍光を細胞バイオマスの代用品として使用することができ、したがって、自己蛍光に対して選択的であるスペクトル条件を決定してしまえば、２つの選択的励起／発光波長ペアを使用して所与のＷＩＣ生産細胞集団についてのＷＩＣ：細胞バイオマス比を得ることができる。
【０１００】
一部の実施形態において、細胞自己蛍光に対して選択的なスペクトル条件を決定する方法は、
（ａ）前記蛍光色素と、第一の複数の細胞集団および第二の複数の細胞集団とを接触させる工程（この場合、前記第一および第二の複数の細胞集団は、同じ細胞タイプであり、前記複数の細胞集団各々は、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第一の複数の細胞集団の各々の細胞集団がＷＩＣを含み、および前記第二の複数の細胞集団の細胞集団はＷＩＣを含まない）；
（ｂ）前記第一の複数の細胞集団および前記第二の複数の細胞集団についての励起スペクトルをそれぞれ決定する工程；
（ｃ）励起波長であって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第一の複数の細胞集団からの細胞集団と前記第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差が、８０％以下である、および
（ｉｉ）前記第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差が、少なくとも２５０％である
励起波長を選択する工程
を含む。
【０１０１】
一部の実施形態において、細胞自己蛍光に対して選択的なスペクトル条件を決定する方法は、
（ａ）前記蛍光色素と、第一の複数の細胞集団および第二の複数の細胞集団とを接触させる工程（この場合、前記第一および第二の複数の細胞集団は、同じ細胞タイプであり、前記複数の細胞集団各々は、ｘの細胞密度を有する細胞集団および５ｘの細胞密度を有する細胞集団を含み、前記第一の複数の細胞集団の各々の細胞集団がＷＩＣを含み、および前記第二の複数の細胞集団の細胞集団はＷＩＣを含まない）；
（ｂ）前記第一の複数の細胞集団および前記第二の複数の細胞集団についての発光スペクトルをそれぞれ決定する工程；
（ｃ）発光波長であって、
（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第一の複数の細胞集団からの細胞集団と前記第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差が、８０％以下である、および
（ｉｉ）前記第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差が、少なくとも２５０％である
発光波長を選択する工程
を含む。
【０１０２】
特定の実施形態において、細胞自己蛍光に対して選択的なスペクトル条件を決定する方法は、励起波長と発光波長の両方を選択する工程、すなわち、（ｉ）同じ細胞密度を有する、前記第一の複数の細胞集団からの細胞集団と前記第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差が、８０％以下である、および（ｉｉ）前記第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差が、少なくとも２５０％である、適合した発光波長と励起波長のペアリングを選択する工程を含む。
【０１０３】
一部の実施形態において、細胞自己蛍光の特異的検出のために選択される励起および／または発光波長で、同じ細胞密度を有する（ＷＩＣを含む）第一の複数の細胞集団からの細胞集団と（ＷＩＣを含まない）第二の複数の細胞集団からの細胞集団の蛍光の差は、８０％以下である。一部の実施形態において、これらの細胞集団間の蛍光の差は、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０％以下となる。
【０１０４】
一部の実施形態において、細胞自己蛍光の特異的検出のために選択される励起および／または発光波長で、前記第二の複数の細胞集団からの細胞密度ｘを有する細胞集団と細胞密度５ｘを有する細胞集団の蛍光の差は、少なくとも２５０％である。一部の実施形態において、この差は、少なくとも２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００％であるか、または５００％より大きい。
【０１０５】
６．２．３  スクリーニングおよび富化方法
もう１つの態様では、水不混和性化合物を組み換え生産する細胞について細胞のライブラリをスクリーニングする方法を本明細書に提供し、この方法は、前記ライブラリの各細胞をヒドロゲル粒子に封入する工程；各ヒドロゲル粒子内の組み換え生産された水不混和性化合物を検出する工程；および前記組み換え生産された水不混和性化合物を生産する細胞を選択する工程を含む。一部の実施形態において、前記方法は、選択されたヒドロゲル粒子から前記細胞を単離する工程と、前記封入、検出および選択工程を反復して、水不混和性化合物生産細胞または細胞のクローン集団を逐次的選択ラウンドで富化する工程とをさらに含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、遺伝的に修飾された微生物細胞における工業的に有用な化合物の生産の検出に有用な方法および組成物であって、該微生物細胞が、遺伝的に修飾されていない親微生物細胞、例えば、水不混和性化合物のいかなる量も天然に生産しないナイーブ親細胞、または天然の量の水不混和性化合物を生産するが異種的にはいかなる量も生産しないナイーブ親細胞と比較して、大きな収率、生産量、生産性で、および／または増大した持続性で１つ以上のかかる化合物を生産するように遺伝的に修飾されたものである方法および組成物を本明細書に提供する。他の実施形態において、前記方法は、同じく遺伝的に修飾された親微生物細胞と比較して、大きな収率、生産量、生産性で、および／または増大した持続性で１つ以上のかかる化合物を生産するように遺伝的に修飾された微生物細胞の同定に有用である。例えば、前記方法は、細胞のすべてが水不混和性化合物を生産するように遺伝的に修飾された集団から、より高い生産性の細胞を同定するために使用することができる。一部の実施形態では、前記集団内のすべての細胞が、同じ手法で遺伝的に修飾されている。他の実施形態において、前記細胞集団は、前記水不混和性化合物の生産を増大するように異なる戦略によって遺伝的に修飾された細胞を含む。例えば、スクリーニングされる細胞集団は、前記化合物の代謝経路の１つ以上の要素の様々なコピー数または様々な調整モード（例えば、様々なプロモーターの使用）を含むように修飾された細胞を含み得る。本明細書に提供する方法は、前記水不混和性化合物を生産するように同一の様式で遺伝的に修飾され、その後、突然変異誘発に付された細胞の集団から、より生産性の高い生産体を同定するのに特に有用である。一部のかかる実施形態では、１つ以上の突然変異を持つ細胞であって、該１つ以上の突然変異を持たない細胞に比べて前記水不混和性化合物の収率、産物または生産性を増大させる細胞を同定するために、前記スクリーニング方法を用いる。変異誘発させた細胞集団の生産のために当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、ＵＶ照射、ガンマ線照射、Ｘ線、制限酵素誘導突然変異誘発、突然変異誘発性もしくは催奇形性化学物質、ＤＮＡ修復突然変異誘発因子、ＤＮＡ修復阻害剤、エラープローンＤＮＡ複製タンパク質、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）およびＩＣＲ１９１をはじめとする（しかしこれらに限定されない）物理化学的突然変異誘発因子の使用；または１つ以上の多重クローニング部位、１つ以上の転写終結部位、１つ以上の転写調整配列、１つ以上の翻訳シグナル配列、１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、ＯＲＦを突然変異させる１つ以上の配列、１つ以上の停止コドン、停止コドンを突然変異させるもしくは排除する１つ以上の配列、１つ以上のｍＲＮＡ不安定化エレメント、１つ以上のヘアピン配列、ヘアピンを突然変異させるもしくは排除する１つ以上の配列、１つ以上のレポーター遺伝子、１つ以上のスプライスアクセプター配列、１つ以上のスプライスドナー配列、１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上のトランスポゾン配列、１つ以上の部位特異的組み換え部位配列、１つ以上の制限酵素配列、融合パートナータンパク質もしくはペプチドをコードしている１つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の選択可能マーカーもしくは選択モジュール、宿主細胞内での前記ベクターの伝播に有用な１つ以上の細菌配列、１つ以上の３’遺伝子トラップ、１つ以上の５’遺伝子トラップ、局在シグナルをコードしている１つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の複製起点、１つ以上のプロテアーゼ切断部位、遺伝子もしくは遺伝子の一部分によってコードされている１つ以上の所望のタンパク質もしくはペプチド、および１つ以上の５’もしくは３’ポリヌクレオチドテイルをコードしている１つ以上の配列の使用を用いることができる。
【０１０７】
一部の実施形態において、前記方法は、前記集団内の前記水不混和性化合物を生産する細胞についての、例えば、前記集団内の他の細胞に比べて高レベルで生産する細胞についての、封入、検出および選択１ラウンドにつき少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍のまたは５倍より大きい富化を提供する。一部の実施形態において、前記方法は、最初の集団内で１：１０、１：１００または１：１０００比を有する細胞または細胞集団を富化して、富化集団内で１：２より大きくする、または１：２と１：１の間にすることを提供する。一部の実施形態において、前記富化は、１、２または３ラウンドの封入、検出および選択にわたり生ずる。一部の実施形態において、前記富化は、３、４または５ラウンド以内の封入、検出および選択で生ずる。
【０１０８】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、ＷＩＣの細胞バイオマスに対する比率として表される、１つ以上の水不混和性化合物を組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態では、前記細胞バイオマスを、ＷＩＣに結合している蛍光色素からの蛍光が検出されないスペクトル条件下で前記複数の細胞の自己蛍光を検出する工程を含む方法によって決定する。一部の実施形態において、前記ＷＩＣ：バイオマス比は、本明細書に記載の選択スペクトル条件を利用して、それぞれ、ＷＩＣおよびバイオマスの別々の、しかも特異的な測定の相対蛍光単位（ＲＦＵ）に基づいて計算し得る。一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、約１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５または１：１００のＷＩＣ：バイオマス比で１つ以上の水不混和性化合物を組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１００：１より大きいまたは１：１００未満のＷＩＣ：バイオマス比で１つ以上の水不混和性化合物を組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。
【０１０９】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムより多い量で１つ以上の水不混和性化合物を組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態では、前記組み換え生産された水不混和性化合物を細胞培養物１リットル当たり約１０から約５０グラムの量、約１５グラムより多い量、約２０グラムより多い量、約２５グラムより多い量、または約３０グラムより多い量で生産する。
【０１１０】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、細胞乾燥重量１グラム当たり約５０ミリグラムより多い量で１つ以上の水不混和性化合物を組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態では、前記組み換え生産された水不混和性化合物を、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０から約１５００ミリグラムの量、約１００ミリグラムより多い量、約１５０ミリグラムより多い量、約２００ミリグラムより多い量、約２５０ミリグラムより多い量、約５００ミリグラムより多い量、約７５０ミリグラムより多い量または約１０００ミリグラムより多い量で生産する。
【０１１１】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、細胞培養物の単位体積ベースで、本明細書に記載の遺伝的に修飾されていない微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、細胞培養物の単位体積ベースで、本明細書に記載の同じく遺伝的に修飾されている微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。
【０１１２】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、単位乾燥細胞重量ベースで、本明細書に提供する方法に従って遺伝的に修飾されていない微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、単位乾燥細胞重量ベースで、本明細書に提供する方法に従って同じく遺伝的に修飾されている微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。
【０１１３】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、単位時間当たりの細胞培養物の単位体積ベースで、本明細書に提供する方法に従って遺伝的に修飾されていない微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、単位時間当たりの細胞培養物の単位体積ベースで、本明細書に提供する方法に従って同じく遺伝的に修飾されている微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。
【０１１４】
一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、単位時間当たりの単位乾燥細胞重量ベースで、本明細書に提供する方法に従って遺伝的に修飾されていない微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。一部の実施形態において、前記スクリーニング方法は、１つ以上の水不混和性化合物を、単位時間当たりの単位乾燥細胞重量ベースで、本明細書に提供する方法に従って同じく遺伝的に修飾されている微生物細胞によって生産される水不混和性化合物の量より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上多い量で組み換え生産する細胞または細胞のクローン集団の同定に十分なものである。
【０１１５】
６．２．４  ヒドロゲル封入細胞組成物
もう１つの態様では、１つ以上の組み換え生産された水不混和性化合物を含むヒドロゲル封入細胞またはヒドロゲル封入クローン細胞集団を本明細書に提供する。もう１つの態様では、細胞またはクローン細胞集団を含み、１つ以上の組み換え生産された水不混和性化合物をさらに含むヒドロゲル粒子を本明細書に提供する。本明細書に提供する前記方法および組成物において有用な細胞には、水不混和性化合物、例えばイソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸およびこれらに類するもの、を天然生産または組み換え生産することができる任意の細胞が含まれる。一部の実施形態において、前記細胞は、原核細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、細菌細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性癌細胞、またはマウス胚性幹細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、昆虫細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、Ｓ２細胞、シュナイダー細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞、またはＳｆ９細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、単細胞真核生物の細胞である。
【０１１６】
一部の実施形態において、前記細胞は、菌糸体の細菌細胞である。一部の実施形態において、前記菌糸体の細菌細胞は、放線菌類のものである。特定の実施形態において、前記菌糸体の細菌細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のもの、例えば、
【０１１７】
【化３】
2014508516.tif 000005
である。
【０１１８】
もう１つの実施形態において、前記細胞は、真菌細胞である。より特定の実施形態において、前記細胞は、酵母細胞である。本明細書に提供する前記方法および組成物において有用な酵母としては、微生物寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託されている酵母であって、数ある中でも、以下の属
【０１１９】
【化４】
2014508516.tif 000006
に属する酵母が挙げられる。
【０１２０】
特定の実施形態において、本明細書に提供する前記方法および組成物において有用な酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれていた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（今ではＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして公知）が挙げられる。一部の実施形態において、前記微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ属の株、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓである。
【０１２１】
特定の実施形態において、前記細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。一部の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の株は、パン酵母、ＣＢＳ  ７９５９、ＣＢＳ  ７９６０、ＣＢＳ  ７９６１、ＣＢＳ  ７９６２、ＣＢＳ  ７９６３、ＣＢＳ  ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１およびＡＬ−１からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１およびＳＡ−１からなる群より選択される。特定の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＰＥ−２である。もう１つの特定の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＣＡＴ−１である。もう１つの特定の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＢＧ−１である。
【０１２２】
一部の実施形態において、前記細胞は、一倍体微生物細胞である。他の実施形態において、前記細胞は、二倍体微生物細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ヘテロ接合性である。他の実施形態において、前記細胞は、その接合型対立遺伝子以外はホモ接合性である（すなわち、前記細胞は、胞子を形成するはずであり、得られる４つの一倍体微生物細胞は、それらの接合型対立遺伝子を除いて遺伝子的に同一であり、前記一倍体細胞のうちの２つは接合型ａであり、他の２つの一倍体細胞は、接合型αであろう）。
【０１２３】
一部の実施形態において、前記細胞は、工業的発酵、例えば、バイオエタノール発酵に適している細胞である。特定の実施形態では、工業的発酵環境について認知されているストレス条件である高い溶媒濃度、高温、基質利用拡大、栄養制限、相応の浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩および細菌汚染またはこれらの組み合わせのもとで生存するように前記細胞を馴化する。
【０１２４】
例示的水不混和性化合物生産細胞、例えばイソプレノイド、ポリケチドおよび脂肪酸を組み換え生産する細胞、およびかかる細胞の産生方法を下で提供する。
【０１２５】
６．２．４．１  イソプレノイドを生産する組み換え細胞
１つの態様では、例えば１つ以上のイソプレノイド化合物を組み換え生産するように遺伝的に修飾された、細胞または細胞のクローン集団におけるイソプレノイド生産の検出方法を本明細書に提供する。メバロン酸依存性（「ＭＥＶ」）経路または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−二リン酸（「ＤＸＰ」）経路の酵素によって生合成され得るイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）からイソプレノイドを誘導する。ＭＥＶ経路の略図を図１Ａに記載し、ＤＸＰ経路の略図を図１Ｂに記載する。
【０１２６】
６．２．４．１．１  ＭＥＶ経路
本明細書に提供するイソプレノイド生産細胞の検出方法の一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、遺伝的に修飾されていない親細胞と比較して１つ以上のイソプレノイド化合物の生産増大をもたらす、ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１２７】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、２つのアセチル補酵素Ａ分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成することができる酵素（例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿０００９１３  領域：２３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、アセトアセチル−ＣｏＡと別のアセチル−ＣｏＡ分子を縮合させて３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成し得る酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿００１１４５．相補鎖１９０６１．２０５３６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＭ＿２０６５４８；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７０；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ＮＭ＿２０４４８５；Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、（ＡＢ０１５６２７；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＫＯ  ３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｔｔｅｎｕａｔａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＡＸ１２８２１３、短縮されたＨＭＧＲをコードしている配列をもたらす；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および（ＮＣ＿００１１４５：相補鎖（１１５７３４．１１８８９８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、メバロネートをメバロン酸５−リン酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転化させることができる酵素、例えばメバロン酸キナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）および（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ５−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転化させることができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ４２９３８５；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）および（ＮＣ＿００１１４５．相補鎖７１２３１５．７１３６７０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、メバロン酸５−ピロリン酸をＩＰＰに転化させることができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｘ９７５５７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）および（Ｕ４９２６０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路の１つより多くの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路の２つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素とメバロネートをメバロン酸５−リン酸に転化させることができる酵素とをコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路の３つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路の４つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路の５つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路の６つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路によって産生されたＩＰＰをその異性体、ジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。ＤＭＡＰＰを様々なさらなる酵素の作用によって縮合および修飾して、単純なおよびより複雑なイソプレノイドを形成することができる（図２）。
【０１３５】
６．２．４．１．２  ＤＸＰ経路
本明細書に提供するイソプレノイド生産細胞の検出方法の一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、遺伝的に修飾されていない親細胞と比較して１つ以上のイソプレノイド化合物の生産増大をもたらす、ＤＸＰ経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３６】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、２つのアセチル補酵素Ａ分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成することができる酵素（例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿０００９１３  領域：２３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ピルベートとＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を縮合させて１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を作ることができる酵素、例えば１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ０３５４４０；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ０５２７；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）、（ＣＰ００００２６、遺伝子座タグＳＰＡ２３０１；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ、ＡＴＣＣ  ９１５０参照）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿０２５４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、（ＮＣ＿００５２９６、遺伝子座タグＲＰＡ０９５２；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９）、（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座タグＰＤ１２９３；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）および（ＮＣ＿００３０７６、遺伝子座タグＡＴ５Ｇ１１３８０；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に転化させることができる酵素、例えば１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＢ０１３３００；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＡＦ１４８８５２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ１５９７；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）、（ＡＬ９３９１２４、遺伝子座タグＳＣＯ５６９４；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿２７０９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、および（ＮＣ＿００７４９２、遺伝子座タグＰｆｌ＿１１０７；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに転化させることができる酵素、例えば４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ２３０７３６；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿２８３５；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、（ＮＣ＿００３０７１、遺伝子座タグＡＴ２Ｇ０２５００；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）および（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ１６１４；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールを４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸に転化させることができる酵素、例えば４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ２１６３００；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿１７７９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸に転化させることができる酵素、例えば２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ２３０７３８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿６０７１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）および（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ１６１８；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸を１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸に転化させることができる酵素、例えば１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＹ０３３５１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ０８５３；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）および（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座タグＲＳＰ＿２９８２；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸をＩＰＰまたはその異性体、ＤＭＡＰＰ、に転化させることができる酵素、例えばイソペンチル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＹ０６２２１２；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座タグＰＰ０６０６；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の１つより多くの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の２つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の３つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の４つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の５つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の６つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の５つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＤＸＰ経路の７つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、宿主細胞の固有の代謝プロセスとＩＰＰの生産にかかわるプロセスの間の「クロストーク」（または干渉）を最小化または完全に排除する。例えば、宿主微生物がＩＰＰ合成に関して排他的にＤＸＰ経路に依存し、追加のＩＰＰをもたらすためにＭＥＶ経路が導入されるとき、クロストークは最小化または完全に排除される。かかる宿主生物は、ＭＥＶ経路酵素の発現を変更するようにまたはＭＥＶ経路に随伴する中間体をプロセッシングするように装備されていない。排他的にまたは主にＤＸＰ経路に依存する生物としては、例えば大腸菌が挙げられる。
【０１４６】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、排他的にまたはＤＸＰ経路と併用でＭＥＶ経路によりＩＰＰを生産する。他の実施形態では、該宿主細胞が、排他的に、異種的に導入されたＭＥＶ経路によってＩＰＰを生産するように、宿主のＤＸＰ経路を機能不能にする。前記ＤＸＰ経路は、１つ以上のＤＸＰ経路酵素の遺伝子発現をできないようにする、または１つ以上のＤＸＰ経路酵素の機能を不活性化することによって、機能不能にすることができる。
【０１４７】
一部の実施形態において、前記細胞によって生産されるイソプレノイドは、Ｃ５イソプレノイドである。これらの化合物は、１つのイソプレン単位から誘導され、ヘミテルペンとも呼ばれる。ヘミテルペンの例証となる例はイソプレンである。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ１０イソプレノイドである。これらの化合物は、２つのイソプレン単位から誘導され、モノテルペンとも呼ばれる。モノテルペンの例証となる例は、リモネン、シトロネロール（ｃｉｔｒａｎｅｌｌｏｌ）、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロール、ツジョンおよびミルセン（ｍｙｒｃｅｎｅ）である。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ１５イソプレノイドである。これらの化合物は、３つのイソプレン単位から誘導され、セスキテルペンとも呼ばれる。セスキテルペンの例証となる例は、ペリプラノンＢ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｏｎｅ  Ｂ）、ギンコライド（ｇｉｎｇｋｏｌｉｄｅ）Ｂ、アモルファジエン（ａｍｏｒｐｈａｄｉｅｎｅ）、アルテミシニン、アルテミシン酸（ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、バレンセン（ｖａｌｅｎｃｅｎｅ）、ノートカトン（ｎｏｏｔｋａｔｏｎｅ）、エピセドロール（ｅｐｉ−ｃｅｄｒｏｌ）、エピアリストロケン（ｅｐｉ−ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｅｎｅ）、ファルネソール、ゴシポール、サノニン（ｓａｎｏｎｉｎ）、ペリプラノン（ｐｅｒｉｐｌａｎｏｎｅ）、ホルスコリン、およびパチュロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｏｌ）（これはパチョリアルコール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉ  ａｌｃｏｈｏｌ）としても公知である）である。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ２０イソプレノイドである。これらの化合物は、４つのイソプレン単位から誘導され、ジテルペンとも呼ばれる。ジテルペンの例証となる例は、カスベン（ｃａｓｂｅｎｅ）、エロイテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）、パクリタキセル、プロストラチン（ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ）、プソイドプテロシン（ｐｓｅｕｄｏｐｔｅｒｏｓｉｎ）、およびタキサジエン（ｔａｘａｄｉｅｎｅ）である。さらに他の例では、前記イソプレノイドは、Ｃ２０＋イソプレノイドである。これらの化合物は、４つより多くのイソプレン単位から誘導され、トリテルペン（６つのイソプレン単位から誘導されるＣ３０イソプレノイド化合物）、例えば、アルブルシド（ａｒｂｒｕｓｉｄｅ）Ｅ、ブルセアンチン（ｂｒｕｃｅａｎｔｉｎ）、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシン、およびスクアレン；テトラテルペン（８つのイソプレン単位から誘導されるＣ４０イソプレノイド化合物）、例えばβ−カロテン；およびポリテルペン（８つより多くのイソプレン単位から誘導されるＣ４０＋イソプレノイド化合物）、例えばポリイソプレンを含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、アビエタジエン（ａｂｉｅｔａｄｉｅｎｅ）、アモルファジエン、カレン（ｃａｒｅｎｅ）、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、ミルセン、ネロリドール（ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ）、オシメン（ｏｃｉｍｅｎｅ）、パチュロール、β−ピネン、サビネン（ｓａｂｉｎｅｎｅ）、γ−テルピネ��、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される。イソプレノイド化合物としては、カロテノイド（例えば、リコペン、α−およびβ−カロテン、α−およびβ−クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびルテイン）、ステロイド化合物、ならびに他の化学基によって修飾されたイソプレノイドで構成されている化合物、例えば混合型テルペン−アルカノイド、および補酵素Ｑ−１０も挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４８】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＭＥＶ経路によって産生されたＩＰＰをＤＭＡＰＰに転化させることができる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および（ＡＦ０８２３２６；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させて、５個より多くの炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１５０】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、１つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子を縮合させてゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）を形成することができる酵素、例えばＧＰＰシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ５１３１１１；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１３；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（Ｙ１７３７６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８７７、遺伝子座ＡＰ１１０９２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ  １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４５；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）、（ＤＱ２８６９３０；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、遺伝子座ＣＡＤ２４４２５；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８；Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）および（ＡＦ２０３８８１、遺伝子座ＡＡＦ１２８４３；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、２つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子を縮合させるか、またはＩＰＰ分子をＧＰＰ分子に付加させて、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＴＵ８０６０５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＡＵ３６３７６；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ４６１０５０；Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、（Ｄ００６９４；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、遺伝子座ＡＡＬ９５５２３；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＣＰ０００００９、遺伝子座ＡＡＷ６００３４；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＬＡＵ１５７７７；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳＣＦＰＰ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３、遺伝子座ＡＡＴ８７３８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００００１７、遺伝子座ＡＡＺ５１８４９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２、遺伝子座ＹＰ＿５９８８５６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、遺伝子座ＹＰ＿６００８４５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、遺伝子座ＹＰ＿６０２８３２；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、（ＡＥ０００６５７、遺伝子座ＡＡＣ０６９１３；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｄ８４４３２、遺伝子座ＢＡＡ１２５７５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８、遺伝子座ＡＡＣ２８８９４；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、遺伝子座ＮＰ＿８７３７５４；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ  ３５０００Ｈ��）、（Ｌ４２０２３、遺伝子座ＡＡＣ２３０８７；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＹＰ＿３９５２９４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、遺伝子座ＹＰ＿０００２７３；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ．Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、遺伝子座ＹＰ＿２０８７６８；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、遺伝子座ＡＡＢ９１７５２；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１、遺伝子座ＡＡＶ９３５６８；Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、遺伝子座ＡＡＫ９９８９０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）および（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＮＰ  ７７９７０６；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰを組み合わせてゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ＡＴＣＣ  ３５６４６  ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ＿００１４４５０９；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ  ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ０５５４９６；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９；Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ；Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７、遺伝子座ＢＡＡ１４１２４；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１、遺伝子座ＣＡＡ３６５３８；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２、遺伝子座ＡＡＦ２４２９４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）および（ＮＣ＿００４３５０、遺伝子座ＮＰ＿７２１０１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
一部の実施形態において、前記イソプレノイド生産細胞は、ポリプレニルを、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイドまたは修飾イソプレノイド化合物を形成するように修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１５４】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、カレンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ４６１４６０、領域  ４３．１９２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＦ５２７４１６、領域：７８．１８７１；Ｓａｌｖｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ゲラニオールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＪ４５７０７０；Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）、（ＡＹ３６２５５３；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  １８６４）、（ＤＱ２３４２９９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ｓｔｒａｉｎ  １８６１）、（ＤＱ２３４２９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ｓｔｒａｉｎ  ４９３５）および（ＤＱ０８８６６７；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、リナロールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ４９７４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＣ００２２９４、遺伝子座ＡＡＢ７１４８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＹ０５９７５７；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１０４７９３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＦ１５４１２４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ０６７６０３；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；Ｃｌａｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、（ＡＦ０６７６０１；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（Ｕ５８３１４；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＤＱ２６３７４１；Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔｅ）、（ＡＹ６９３６４７；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＰ００４０７８、遺伝子座ＢＡＤ０７６０５；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＸＭ＿４６３９１８、遺伝子座ＸＰ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＹ９１７１９３；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２３；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＤＱ１９５２７４；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）および（ＡＦ４４４７９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｎｏ．７９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、リモネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、領域：４７．１８６７；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）および（ＡＹ０５５２１４、領域：４８．１８８９；Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ）ならびに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、領域：１．１９０５；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、領域：７３．１９８６；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、領域：２９．１８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ミルセンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｕ８７９０８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＡＦ３６９９１９；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＪ３０４８３９；Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、オシメンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＹ１９５６０７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＫ２２１０２４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ＣｉｔＭＴＳＬ４）および（ＡＹ５７５９７０；Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、α−ピネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、領域：１．１８８７；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、領域：３２．１９２１；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）および（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、領域：６１１１８９２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、β−ピネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、領域：１．１７４９；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）および（ＡＦ５１４２８８、領域：２６．１８３４；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、サビネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからのＡＦ０５１９０１、領域：２６．１７９８が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、γ−テルピネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎからのＡＦ５１４２８６、領域：３０．１８３２）および（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕからのＡＢ１１０６４０、領域１．１８０３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、テルピノレンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｏｓｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍからのＡＹ６９３６５０）および（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉからのＡＹ９０６８６６、領域：１０．１８８７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、アモルファジエンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例は、米国特許出願公開第２００４／０００５６７８号の配列番号３７である。
【０１６６】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、α−ファルネセンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ｄ’ＡｎｊｏｕからのＤＱ３０９０３４（セイヨウナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）およびＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａからのＡＹ１８２２４１（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｅｃｈｏｕｕｓら、Ｐｌａｎｔａ  ２１９（１）：８４−９４（２００４）。
【０１６７】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、β−ファルネセンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａからのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６１５（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａ１１）、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａからのＡＹ８３５３９８が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｉｃａｕｄら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６（９）：９６１−９６７（２００５）。
【０１６８】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ファルネソールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｚｅａ  ｍａｙｓからのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５２９２６６、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＹＤＲ４８１Ｃ（遺伝子Ｐｈｏ８）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｏｎｇ，Ｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２８：１４９−１５８（２００６）。
【０１６９】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ネロリドールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｚｅａ  ｍａｙｓからのＡＦ５２９２６６（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、パチュロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎからのＡＹ５０８７３０  領域：１．１６５９が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ノートカトンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓからのＡＦ４４１１２４  領域：１．１６４７およびＰｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓからのＡＹ９１７１９５  領域：１．１６５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、アビエタジエンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｕ５０７６８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＡＹ４７３６２１；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
６．２．４．２  ポリケチドを生産する組み換え細胞
もう１つの態様では、例えば１つ以上のポリケチド化合物を組み換え生産するように遺伝的に修飾された、細胞または細胞のクローン集団におけるポリケチド生産の検出方法を本明細書に提供する。ポリケチド合成は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に関係づけられる多機能性酵素であるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）によって媒介される。ＰＫＳは、アシルチオエステルの間の反復的（脱炭酸性）クライゼン縮合によるポリケチド（通常はアセチル、プロピオニル、マロニルまたはメチルマロニル）の生合成を触媒する。各縮合後、ＰＫＳは、成長ポリケチド鎖のβ−ケト基に対するケト還元、脱水およびエノイル還元を含む還元サイクルのすべてを触媒する、一部を触媒する、または該還元サイクルを全く触媒しないことで、ポリケチド産物に構造の多様性をもたらす。
【０１７４】
本明細書に提供するポリケチド生産細胞の検出方法の一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、遺伝的に修飾されていない親細胞と比較して１つ以上のポリケチド化合物の生産増大をもたらすようにポリケチドの合成を触媒することができるＰＫＳ系、すなわち１つ以上のＰＫＳ、をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１７５】
ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）には芳香族ＰＫＳおよびモジュラーＰＫＳという２つの主要クラスがあり、これらは、それぞれ、触媒部位の使用の仕方が異なる。芳香族ＰＫＳについては、ポリケチドの生産を触媒するために必要とされる最小系、すなわち最小限の成分がケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、鎖長因子（ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＣＬＦ）触媒領域およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）活性を含む。モジュラーＰＫＳ系については、最小系がＫＳ触媒領域、ＡＴ触媒領域およびＡＣＰ活性を含むが、但し、その合成の中間体が基質として提供されることを条件とする。デノボポリケチド合成が必要になる場合、最小モジュラーＰＫＳ系は、追加のＡＴおよびＡＣＰ領域を含む負荷アシルトランスフェラーゼをさらに含む。
【０１７６】
したがって、一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＫＳ触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードしている１つより多くの異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードしている１つより多くの異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１７７】
特定の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、最小芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素とＡＴ触媒領域を含む酵素とＣＬＦ触媒領域を含む酵素とＡＣＰ活性を含む酵素とをそれぞれコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、最小モジュラーＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素とＡＴ触媒領域を含む酵素とＡＣＰ活性を含む酵素とをそれぞれコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。さらに別の特定の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、デノボポリケチド合成のためのモジュラー芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素とＡＴ触媒領域を含む酵素とＡＣＰ活性を含む１つ以上の酵素とをそれぞれコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１７８】
一部の実施形態において、最小ＰＫＳ系、例えば上記の最小芳香族ＰＫＳ系または最小モジュラーＰＫＳ系、を含むポリケチド生産細胞は、最終産物ポリケチドの生産に寄与し得る追加の触媒活性をさらに含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、発生期ポリケチドバックボーンの環化を助長する、シクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ＡＣＰのパンテテイニル化（ｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）をもたらすホロ−ＡＣＰシンターゼ活性を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１７９】
一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、合成後ポリケチド修飾活性を付与する１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、例えば抗生物質活性を有するポリケチドが所望される場合、ポリケチドの合成後修飾をもたらすグリコシラーゼ活性を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、ヒドロキシラーゼ活性を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、エポキシダーゼ活性を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、メチラーゼ活性を含む酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１８０】
一部の実施形態において、前記ポリケチド生産細胞は、異種ヌクレオチド配列、例えば、ポリケチドを生産することができるＰＫＳ酵素およびポリケチド修飾酵素をコードしている配列を含み、前記ポリケチドは、以下のポリケチドから選択されるが、それらに限定されない：アベルメクチン（例えば、米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第４，７０３，００９号；欧州特許出願公開第１１８，３６７号；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」；Ｂａｌｔｚ、ＨｅｇｅｍａｎおよびＳｋａｔｒｕｄ編（ＡＳＭ）、ｐｐ．２４５−２５６、「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ，Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ  Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ」；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９２、Ｇｅｎｅ  １１５：１１９−１２５；およびＩｋｅｄａおよびＯｍｕｒａ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．９７：２５９９−２６０９参照）；カンジシジン（ＦＲ００８）（例えば、Ｈｕら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１６３−１７２参照）；カルボマイシン、クラマイシン（Ｃｕｒａｍｙｃｉｎ）（例えば、Ｂｅｒｇｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２  Ｆｅｂ；１５（１）：８０−９参照）；ダウノルビシン（例えば、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；１７６（２０）：６２７０−８０参照）；エポチロン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／６６０２８号；およびＰＣＴ公開第００／０３１２４７号参照パンフレット）；エリスロマイシン（例えばＰＣＴ公開第９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；米国特許第５，８２４，５１３号；Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：６７５−９；およびＣｏｒｔｅｓら、Ｎｏｖ．８、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：１７６−８参照）；ＦＫ−５０６（例えば、Ｍｏｔａｍｅｄｉら、１９９８；Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：５２８−５３４；およびＭｏｔａｍｅｄｉら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：７４−８０参照）；ＦＫ−５２０（例えば、ＰＣＴ公開第００／０２０６０１号；およびＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：５７８９−９６参照）；グリソイジン（Ｇｒｉｓｅｕｓｉｎ）（例えば、Ｙｕら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４  Ｍａｙ；１７６（９）：２６２７−３４参照）；ロバスタチン（例えば、米国特許第５，７４４，３５０号参照）；フレノリシン（Ｆｒｅｎｏｌｙｃｉｎ）（例えば、Ｋｈｏｓｌａら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９３  Ａｐｒ；１７５（８）：２１９７−２０４；およびＢｉｂｂら、Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｍａｙ  ３；１４２（１）：３１−９参照）；グラナチシン（Ｇｒａｎａｔｉｃｉｎ）（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８９  Ｓｅｐ；８（９）：２７１７−２５；およびＢｅｃｈｔｏｌｄら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９５  Ｓｅｐ  ２０；２４８（５）：６１０−２０参照）；メデルマイシン（Ｍｅｄｅｒｍｙｃｉｎ）（例えば、Ｉｃ��ｉｎｏｓｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３  Ｊｕｌ；１４９（Ｐｔ  ７）：１６３３−４５参照）；モネンシン（例えば、Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２  Ａｕｇ；２３４（２）：２５４−６４参照）；ノナクチン（Ｎｏｎａｃｔｉｎ）（例えば、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０００  Ｆｅｂ  １；１８３（１）：１７１−５参照）；ナナオマイシン（Ｎａｎａｏｍｙｃｉｎ）（例えば、Ｋｉｔａｏら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）．１９８０  Ｊｕｌ；３３（７）：７１１−６参照）；ネマデクチン（Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ）（例えば、ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３、上掲）；ニッダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）（例えば、ＰＣＴ公開第９８／５１６９５号；およびＫａｋａｖａｓら、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７５１５−７５２２参照）；オレアンドマイシン（例えば、Ｓｗａｎら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：３５８−３６２；ＰＣＴ公開第００／０２６３４９パンフレット；Ｏｌａｎｏら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９（３）：２９９−３０８；およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ  ９９／０５２８３号参照）；オキシテトラサイクリン（例えば、Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．１９９４  Ａｐｒ  ８；１４１（１）：１４１−２参照）；ピクロマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／６１５９９号；ＰＣＴ公開第００／００６２０号；Ｘｕｅら、１９９８、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１１）：６６１−６６７；Ｘｕｅら、Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１２１１１  １２１１６参照）；プラテノリド（Ｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅ）（例えば、欧州特許出願公開第７９１，６５６号；および米国特許第５，９４５，３２０号参照）；ラパマイシン（例えば、Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、Ａｕｇｕｓｔ  １９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８３９−７８４３；およびＡｐａｒｉｃｉｏら、１９９６、Ｇｅｎｅ  １６９：９−１６参照）；リファマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９８／０７８６８号；およびＡｕｇｕｓｔら、Ｆｅｂ．１３、１９９８、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５（２）：６９−７９参照）；ソランジウム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）（例えば、米国特許第６，０９０，６０１号参照）；ソラフェン（例えば、米国特許第５，７１６，８４９号；Ｓｃｈｕｐｐら、１９９５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３６７３−３６７９参照）；スピノシン（Ｓｐｉｎｏｃｙｎ）（例えば、ＰＣＴ公開第９９／４６３８７号参照）；スピラマイシン（例えば、米国特許第５，０９８，８３７号参照）；テトラセノマイシン（Ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２  Ｍａｒ；１７４（６）：１８１０−２０；およびＳｈｅｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２  Ｊｕｎ；１７４（１１）：３８１８−２１参照）；テトラサイクリン（例えば、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９  Ｄｅｃ  ９；１３１（４８）：１７６７７−８９参照）；タイロシン（例えば、米国特許第５，８７６，９９１号；米国特許第５，６７２，４９７号；米国特許第５，１４９，６３８号；欧州特許出願公開第７９１，６５５号；欧州特許出願公開第２３８，３２３号；Ｋｕｈｓｔｏｓｓら、１９９６、Ｇｅｎｅ  １８３：２３１−６；およびＭｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９９４、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：３４９−３５５参照）；および６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．１９９９  Ａｐｒ；１（２）：１８０−７；およびＳｈａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６  Ｊｕｎ  ２３；３４５（１）：１３３−９参照）。
【０１８１】
６．２．４．３  脂肪酸を生産する組み換え細胞
もう１つの態様では、例えば１つ以上の脂肪酸を組み換え生産するように遺伝的に修飾された、細胞または細胞のクローン集団における脂肪酸生産の検出方法を、本明細書に提供する。脂肪酸合成は、アシル鎖の開始および伸長を触媒する脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）によって媒介される。ＦＡＳ経路における酵素と共にアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）が、生産される脂肪酸の長さ、飽和度および分岐を制御する。脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを含む。この経路における工程は、脂肪酸生合成（ｆａｂ）およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅ）遺伝子の酵素によって触媒される。
【０１８２】
本明細書に提供する脂肪酸生産細胞の検出方法の一部の実施形態において、前記脂肪酸生産細胞は、遺伝的に修飾されていない親細胞と比較して１つ以上の脂肪酸の生産増大をもたらすアセチル−ＣｏＡシンターゼおよび／またはマロニル−ＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８３】
例えば、アセチル−ＣｏＡ生産を増大させるために、以下の遺伝子のうちの１つ以上を前記細胞において発現させることができる：ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルビン酸および２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥＩｐデヒドロゲナーゼ成分およびＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分をコードしている）、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰおよびｆａｂＦ。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡとしても公知、ＡＡＣ７６９５２）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡＣ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
一部の実施形態では、脂肪酸分解に関与するタンパク質をコードしている遺伝子を減弱またはノックアウトすることにより、前記細胞において脂肪酸レベル増大を果たすことができる。例えば、当該技術分野において公知の技術を用いて改変宿主細胞におけるｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｉｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡおよび／またはａｃｋＢの発現レベルを減弱またはノックアウトすることができる。かかるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇｓｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、ＩｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａｄｈＥ（ＡＡＣ７４３２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡＣ７５３５６）およびａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）が挙げられるが、これらに限定されない。結果として生ずる宿主細胞は、適切な環境で成長させると増大したアセチル−ＣｏＡ生産レベルを有することとなる。
【０１８５】
一部の実施形態において、前記脂肪酸生産細胞は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転化させることができる酵素、例えばマルチサブユニットＡｃｃＡＢＣＤタンパク質、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。ＡｃｃＡＢＣＤをコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号ＡＡＣ７３２９６、ＥＣ６．４．１．２が挙げられるが、これに限定されない。
【０１８６】
一部の実施形態において、前記脂肪酸生産細胞は、リパーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。リパーゼをコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号ＣＡＡ８９０８７およびＣＡＡ９８８７６が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
一部の実施形態では、ＰｌｓＢの阻害により前記細胞における脂肪酸レベル増大を果たすことができ、前記ＰｌｓＢの阻害は、長鎖アシル−ＡＣＰレベルの増大をもたらすことができ、脂肪酸生合成経路における初期工程（例えば、ａｃｃＡＢＣＤ、ｆａｂＨおよびｆａｂｌ）を阻害することとなる。当該技術分野において公知の技術を用いて改変宿主細胞におけるＰｌｓＢの発現レベルを減弱またはノックアウトすることができる。ＰｌｓＢをコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号ＡＡＣ７７０１１が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、ｐｌｓＢ  Ｄ３１  ＩＥ突然変異を用いて、細胞内の利用可能なアシル−ＣｏＡの量を増大させることができる。
【０１８８】
一部の実施形態では、ｆａｂＡの抑圧をもたらすｓｆａ遺伝子の過発現によって、一不飽和脂肪酸の生産増大を果たすことができる。ｓｆａをコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号ＡＡＮ７９５９２が挙げられるが、これに限定されない。
【０１８９】
一部の実施形態では、脂肪酸基質の鎖長を制御する酵素、例えばチオエステラーゼ、の発現を変調することにより、前記細胞における脂肪酸レベル増大を果たすことができる。一部の実施形態において、前記脂肪酸生産細胞は、ｔｅｓまたはｆａｔ遺伝子を過発現するように修飾されている。適するｔｅｓヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号（Ｃ１８：１脂肪酸を生産することができる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの、ｔｅｓＡ：ＡＡＣ７３５９６）および（大腸菌からのｔｅｓＢ：ＡＡＣ７３５５５）が挙げられるが、これらに限定されない。適するｆａｔヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｃ１２：０脂肪酸を生産することができる、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａからの、ｆａｔＢ：Ｑ４１６３５およびＡＡＡ３４２１５）、（Ｃ８：０〜Ｃ１０：０脂肪酸を生産することができる、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａからの、ｆａｔＢ２：Ｑ３９５１３およびＡＡＣ４９２６９）、（Ｃ１４：０〜Ｃ１６：０脂肪酸を生産することができる、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａからの、ｆａｔＢ３：ＡＡＣ４９２６９およびＡＡＣ７２８８１）、（Ｃ１４：０脂肪酸を生産することができる、Ｃｉｎｎａｍｏｎｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍからの、ｆａｔＢ：Ｑ３９４７３およびＡＡＣ４９１５１）、（Ｃ１６：１脂肪酸を生産することができる、ｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの、ｆａｔＢ［Ｍ１４１Ｔ］：ＣＡＡ８５３８８）、（Ｃ１８：１脂肪酸を生産することができる、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの、ｆａｔＡ：ＮＰ  １８９１４７およびＮＰ  １９３０４１）、（Ｃ１８：１脂肪酸を優先的に生産することができる、Ｂｒａｄｖｒｈｉｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの、ｆａｔＡ：ＣＡＣ３９１０６）、（Ｃ１８：１脂肪酸を生産することができる、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａからの、ｆａｔＡ：ＡＡＣ７２８８３）および（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓからの、ｆａｔＡ１、ＡＡＬ７９３６１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
一部の実施形態では、当該技術分野において公知の技術を用いてチオエステラーゼＣ１８の発現または活性を減弱することにより、前記細胞におけるＣ１０脂肪酸レベル増大を果たすことができる。チオエステラーゼＣ１８をコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号ＡＡＣ７３５９６およびＰ０ＡＤＡ１が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、当該技術分野において公知の技術を用いてチオエステラーゼＣ１０の発現または活性を増大させることにより、前記細胞におけるＣ１０脂肪酸レベル増大を果たすことができる。チオエステラーゼＣ１０をコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号Ｑ３９５１３が挙げられるが、これに限定されない。
【０１９１】
一部の実施形態では、当該技術分野において公知の技術を用いて非Ｃ１４脂肪酸を生産する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減弱することにより、前記細胞におけるＣ１４脂肪酸レベル増大を果たすことができる。他の実施形態では、当該技術分野において公知の技術を用いて、基質Ｃ１４−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現または活性を増大させることにより、前記細胞におけるＣ１４脂肪酸レベル増大を果たすことができる。かかるチオエステラーゼをコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号Ｑ３９４７３が挙げられるが、これに限定されない。
【０１９２】
一部の実施形態では、当該技術分野において公知の技術を用いて非Ｃ１２脂肪酸を生産する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減弱することにより、前記細胞におけるＣ１２脂肪酸レベル増大を果たすことができる。他の実施形態では、当該技術分野において公知の技術を用いて、基質Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現または活性を増大させることにより、前記細胞におけるＣ１２脂肪酸レベル増大を果たすことができる。かかるチオエステラーゼをコードしている適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、アクセッション番号Ｑ４１６３５が挙げられるが、これに限定されない。
【０１９３】
６．２．４．４  追加の遺伝的修飾
本明細書に提供する方法および組成物の一部の実施形態において、１つ以上の水不混和性化合物を生産するように改変された遺伝的に修飾された細胞は、工業的発酵に関連して有用な特性を該細胞に付与する１つ以上の遺伝的修飾をさらに含む。
【０１９４】
一部の実施形態において、前記細胞は、フロキュレーションを増大させる１つ以上のタンパク質をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。フロキュレーションは、液体成長基質の底部に急速に沈殿する多数の細胞を含有する綿状沈降物を形成する、微生物細胞の無性、可逆的かつカルシウム依存性の凝集である。フロキュレーションは、例えばバイオエタノール、ワイン、ビールおよび他の製品の生産のための酵母の工業的発酵では、該工業的発酵における懸濁酵母細胞とそれらから生産された発酵産物との分離プロセスを大いに単純化するので、重大なことである。前記分離は遠心分離または濾過によって実現されるが、これらの方法による分離には時間がかかり、高価である。代替として、清澄化を微生物細胞の自然沈降によって実現することができる。単一微生物細胞は、時間をかけて沈降する傾向があるが、工業プロセスにおいて細胞が凝集（すなわち、フロキュレーション）したときだけは自然沈降が実行可能な選択肢となる。最近の研究により、特定の工業的要件を満たすように酵母細胞のフロキュレーション挙動を厳密に制御でき、微調整できることが実証されている（例えば、Ｇｏｖｅｒｎｄｅｒら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４（１９）：６０４１−５２（２００８）参照；この参考文献の内容は、それら全体が参考として本明細書に援用されている）。酵母細胞のフロキュレーション挙動は、ＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ８、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０およびＦＬＯ１１遺伝子の産物をはじめとする（しかしこれらに限定されない）特定のフロキュレーションタンパク質の機能に依存する。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載する１つ以上の水不混和性化合物を生産するように改変された遺伝的に修飾された細胞は、Ｆｌｏ１ｐ、Ｆｌｏ５ｐ、Ｆｌｏ８ｐ、Ｆｌｏ９ｐ、Ｆｌｏ１０ｐおよびＦｌｏ１１ｐからなる群より選択される１つ以上のフロキュレーションタンパク質をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９５】
一部の実施形態において、前記細胞には胞子形成欠陥および／または内因性接合欠陥がある。胞子形成および／または内因性接合に欠陥のある遺伝的に修飾された微生物細胞は、（１）天然での播種、および（２）遺伝的に修飾された微生物細胞と天然での播種する能力が損なわれていない野生型微生物との間の遺伝物質の交換についてのリスクが低減されている。酵母の場合、二倍体微生物細胞の胞子形成能力、および一倍体微生物細胞の接合能力は、特定の遺伝子産物の機能に依存する。酵母におけるこれらには、胞子形成遺伝子産物、例えば、ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１遺伝子産物、ならびにフェロモン応答遺伝子の産物、例えば、ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１遺伝子の産物がある。
【０１９６】
一部の実施形態において、前記細胞は、以下のフェロモン応答遺伝子のうちの１つ以上が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１。一部の実施形態において、前記細胞は、以下の胞子形成遺伝子のうちの１つ以上が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１。一部の実施形態において、前記細胞は、次のフェロモン応答遺伝子：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１のうちの１つ以上、ならびに次の胞子形成遺伝子：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１のうちの１つ以上が、機能的に破壊されている、一倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されている一倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されており、かつＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、一倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ＩＭＥ１遺伝子およびＳＴＥ５遺伝子が機能的に破壊されており、かつメバロネートをメバロン酸５−リン酸に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、一倍体酵母細胞である。
【０１９７】
一部の実施形態において、前記細胞は、以下のフェロモン応答遺伝子のうちの１つ以上の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１。一部の実施形態において、前記細胞は、以下の胞子形成遺伝子のうちの１つ以上の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１。一部の実施形態において、前記細胞は、次のフェロモン応答遺伝子：ＳＴＥ５、ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８、ＳＴＥ１２、ＳＴＥ７およびＳＴＥ１１のうちの１つ以上の両方のコピー、ならびに次の胞子形成遺伝子：ＩＭＥ１、ＩＭＥ２、ＮＤＴ８０、ＳＰＯ１１、ＳＰＯ２０、ＡＭＡ１、ＨＯＰ２およびＳＰＯ２１のうちの１つ以上の両方のコピーが、機能的に破壊されている、二倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されている二倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されており、かつＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、二倍体酵母細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、ＩＭＥ１遺伝子の両方のコピーおよびＳＴＥ５遺伝子の両方のコピーが機能的に破壊されており、かつメバロネートをメバロン酸５−リン酸に転化させることができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む、二倍体酵母細胞である。
【０１９８】
フロキュレーションタンパク質をコードしている異種配列の導入に有用な、ならびに１つ以上の胞子形成遺伝子および／またはフェロモン応答遺伝子の機能破壊に有用な方法および組成物は、米国特許出願公開第２０１０／０３０４４９０号明細書および米国特許出願公開第２０１０／０３１１０６５号明細書に記載されており、これらの参考文献の開示は、それら全体が参考として本明細書に援用されている。
【０１９９】
一部の実施形態において、前記細胞は、１つ以上の生合成遺伝子の機能破壊を含み、この細胞は、その破壊の結果として栄養要求性である。一定の実施形態において、前記細胞は、抗生物質化合物に対する耐性を付与する異種ヌクレオチド配列を含まない。他の実施形態において、前記細胞は、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含む。一部の実施形態において、前記選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの例証となる例としては、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲおよびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌からのＢＬＡ遺伝子産物は、β−ラクタム抗生物質（例えば、狭域セファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）に対する耐性およびテモシリンを除くすべての抗グラム陰性菌ペニシリンに対する耐性を付与し；Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉからのＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与し；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  Ｔｕ９４からのＰＡＴ遺伝子産物は、ビアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対する耐性を付与し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジン（Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｎ）Ａ（ＡｂＡ）に対する耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに対する耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチル（ｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ  ｍｅｔｈｙｌ）に対する耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポゾンからのＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子産物は、ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与し；大腸菌のＤＳＤＡ遺伝子産物は、唯一の窒素原としてＤ−セリンを伴うプレートでの細胞の成長を可能にし；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を付与し；およびＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓからのＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。一部の実施形態において、前記抗生物質耐性マーカーは、例えば、宿主細胞が水不混和性化合物の生産増大を果たすように遺伝的に修飾された後に該宿主細胞から切除される。遺伝的に修飾された宿主細胞のゲノムからのヌクレオチド配列、例えばかかる抗生物質耐性マーカーをコードしている配列、の正確な切除に有用な方法および組成物は、２０１０年１２月２３日出願の米国特許出願公開第１２／９７８，０６１号に記載されており、この参考文献の開示はその全体が参考として本明細書に援用されている。
【０２００】
一部の実施形態において、前記選択可能マーカーは、遺伝的に修飾された微生物細胞中の栄養要求株（例えば、栄養学的栄養要求株（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ））をレスキューする。かかる実施形態において、親微生物細胞は、例えば酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２およびＵＲＡ３遺伝子産物などの、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路において機能する１つ以上の遺伝子産物に関する機能破壊を含み、この破壊は、該親微生物細胞を、１つ以上の栄養素を補給せずに培地で成長することができないもの（栄養要求性表現型）にする。その後、破壊された遺伝子産物の機能性コピーをコードするように発現ベクターまたは染色体組み込みで前記親微生物細胞を形質転換することによって前記栄養要求性表現型をレスキューすることができ、生じた遺伝的に修飾された微生物細胞をその親微生物細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択することができる。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２遺伝子の選択可能マーカーとしての利用は、ポジティブセレクションとネガティブセレクションの両方が可能であるので、顕著な利点を有する。ポジティブセレクションは、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ３突然変異の栄養要求性の相補によって行われ、これに対してネガティブセレクションは、特異的阻害剤、すなわち、それぞれ５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸およびα−アミノアジピン酸（αＡＡ）に基づき、これらは、それぞれ、原栄養株の成長を妨げるが、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２変異体の成長を可能にする。
【０２０１】
他の実施形態において、選択可能マーカーは、公知の選択法によって同定され得る他の非致死的欠失または表現型をレスキューする。
【０２０２】
発現ベクターまたは染色体組み込み構築物を使用する、例えば、上で説明したような宿主細胞における１つ以上の水不混和性化合物の生産増大を果たすためのまたはかかる細胞に有用な特性を付与するための、微生物の遺伝的修飾方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９７８）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．ら（編集）Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第１９４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ参照；これらの参考文献の開示は参考として本明細書に援用されている。加えて、例えば細胞における１つ以上の水不混和性化合物の生産を増大させる結果となる遺伝子発現の阻害を、欠失、突然変異および／または遺伝子再配列によって果たすことができる。それを、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、３本鎖ＤＮＡ、ならびに転写および／または翻訳阻害剤を使用して行うこともできる。加えて、トランスポゾンを利用して、例えば、それをプロモーターとコーディング領域の間に挿入することにより、または２つの隣接する遺伝子間に挿入して一方または両方の遺伝子を不活性化することにより、遺伝子発現を乱すことができる。
【０２０３】
一部の実施形態では、前記細胞における水不混和性化合物の生産増大を、特定のタンパク質、例えば上で説明したような生合成経路に関与するタンパク質、を発現させる発現ベクターの使用により果たす。一般に、発現ベクターは、複製シグナルと、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に作動するように連結された制御配列、例えばプロモーターおよびターミネーター、とを含む、組み換えポリヌクレオチドである。ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現に有用な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）、プラスミドベクター、およびコスミドが挙げられる。酵母細胞での使用に適する発現ベクターの例証となる例としては、ＣＥＮ／ＡＲＳおよび２μプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。酵母細胞での使用に適するプロモーターの例証となる例としては、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、および誘導性プロモーター、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトース誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
発現ベクターおよび染色体組み込み構築物を、限定ではなく、当業者に公知の任意の方法により微生物細胞に導入することができる。例えば、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１２９２−３（１９７８）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５（１９８５）；米国特許第５，２７２，０６５号明細書；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ参照。例示的技術としては、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション、ＰＥＧ  １０００媒介形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０２０５】
７．１  実施例１  水不混和性化合物を生産する遺伝的に修飾された細胞の産生
本実施例は、イソプレノイドであるファルネセンを生産するように改変された遺伝的に修飾された一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の例示的産生方法を記載するものである。
【０２０６】
第Ｉ相組み込み構築物は、選択可能マーカー（ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与するｈｙｇＡ）と、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の制御下の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の２つの酵素（短縮されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている短縮されたＨＭＧ１コーディング配列とＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしているＥＲＧ１３コーディング配列）と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのもう１つの酵素（アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードしているＥＲＧ１０コーディング配列）とをコードしているヌクレオチド配列であって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ８０遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列から成る相同配列に隣接しているヌクレオチド配列を、組み込み配列ヌクレオチド配列として含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入によって、第Ｉ相組み込み構築物を相同組み換えにより該Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＧＡＬ８０遺伝子座に組み込むことができ、その組み込み配列でＧＡＬ８０コーディング配列を置換することによりＧＡＬ８０遺伝子座を機能的に破壊することができる。その第Ｉ相組み込み構築物をＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローニングして、プラスミドＴＯＰＯ−第Ｉ相組み込み構築物を生じさせた。その構築物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天で成長させたＴＯＰ１０細胞で増幅させた。
【０２０７】
第ＩＩ相組み込み構築物は、選択可能マーカー（ノウロセオトリシンに対する耐性を付与するｎａｔＡ）と、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の制御下のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の幾つかの酵素（メバロン酸キナーゼをコードしているＥＲＧ１２コーディング配列、およびホスホメバロン酸キナーゼをコードしているＥＲＧ８コーディング配列）とをコードしていると共に、ＧＡＬ４ｏｃプロモーター（ＭＩＢ１結合部位を除去する、したがって、該プロモーターをグルコースによる抑制に対して低感受性にする突然変異を含む、ＧＡＬ４プロモーター）の制御下のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４遺伝子のコーディング配列をコードしているヌクレオチド配列であって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列から成る相同配列に隣接しているヌクレオチド配列を、組み込み配列として含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入によって、第ＩＩ相組み込み構築物を相同組み換えにより該Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＬＥＵ２遺伝子座に組み込むことができ、その組み込み配列でＬＥＵ２コーディング配列を置換することによりＬＥＵ２遺伝子座を機能的に破壊することができる。その第ＩＩ相組み込み構築物をＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターにクローニングして、プラスミドＴＯＰＯ−第ＩＩ相組み込み構築物を生じさせた。その構築物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天で成長させたＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で増幅させた。
【０２０８】
第ＩＩＩ相構築物は、選択可能マーカー（Ｇ４１８に対する耐性を付与するｋａｎＡ）と、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７のプロモーター）の制御下の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＥＶ経路の酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードしているＥＲＧ１９コーディング配列）およびＭＥＶ経路の産物ＩＰＰのＦＰＰへの転化に関与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの酵素（ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードしているＥＲＧ２０コーディング配列、およびイソペンテニルピロリン酸デカルボキシラーゼをコードしているＩＤＩ１コーディング配列）とをコードしていると共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＴＲ３遺伝子のプロモーターをコードしているヌクレオチド配列であって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ９遺伝子座の上流およびコーディングヌクレオチド配列に隣接しているヌクレオチド配列を、組み込み配列として含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入によって、第ＩＩ相組み込み構築物を相同組み換えにより該Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞ゲノムのＥＲＧ９遺伝子座の上流に組み込むことができ、その結果、ＥＲＧ９（スクアレンシンターゼ）の発現を銅によって変調することができるようにＣＴＲ３プロモーターで天然ＥＲＧ９プロモーターを置換することができる。その第ＩＩＩ相組み込み構築物をＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターにクローニングして、プラスミドＴＯＰＯ−第ＩＩＩ相組み込み構築物を生じさせた。その構築物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天で成長させたＴＯＰ１０細胞で増幅させた。
【０２０９】
第Ｉ相マーカー再利用構築物は、選択可能マーカー（ウラシル不含の培地で成長する能力を付与する、ＵＲＡ３）と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの調節制御下の、Ａ．ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードしているＦＳコーディング配列）とをコードしているヌクレオチド配列であって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ８０遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ１遺伝子のコーディング配列に隣接しているヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入によって、第Ｉ相マーカー再利用構築物を、既に組み込まれている第Ｉ相組み込み配列に、相同組み換えにより選択マーカーｈｐｈＡがＵＲＡ３で置換されるように組み込むことができる。
【０２１０】
第ＩＩ相マーカー再利用構築物は、選択可能マーカー（ウラシル不含の培地で成長する能力を付与する、ＵＲＡ３）と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの調節制御下の、Ａ．ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードしているＦＳコーディング配列）とをコードしているヌクレオチド配列であって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ１２遺伝子のコーディング配列に隣接しているヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入によって、第ＩＩ相マーカー再利用構築物を、既に組み込まれている第ＩＩ相組み込み配列に、相同組み換えにより選択マーカーｎａｔＡがＵＲＡ３で置換されるように組み込むことができる。
【０２１１】
第ＩＩＩ相マーカー再利用構築物は、選択可能マーカー（ウラシル不含の培地で成長する能力を付与する、ＵＲＡ３）と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの調節制御下の、Ａ．ａｎｎｕａの酵素（ファルネセンシンターゼをコードしているＦＳコーディング配列）とをコードしているヌクレオチド配列であって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ９遺伝子座の上流ヌクレオチド配列およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＲＧ１９遺伝子のコーディング配列に隣接しているヌクレオチド配列を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞への導入によって、第ＩＩ相マーカー再利用構築物を、既に組み込まれている第ＩＩＩ相組み込み配列に、相同組み換えにより選択マーカーｋａｎＡがＵＲＡ３で置換されるように組み込むことができる。
【０２１２】
発現プラスミドｐＡＭ４０４は、β−ファルネセンシンターゼをコードしている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のためにコドン最適化したＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａのβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子のコーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８３５３９８）をテンプレートとして使用して、合成により前記ヌクレオチド配列挿入物を産生させた。
【０２１３】
１００ｕｇ／ｍＬのカルバミシリン（ｃａｒｂａｍｉｃｉｌｌｉｎ）と５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンとを含有する５ｍＬのＹＰＤ培地に活性乾燥ＰＥ−２酵母（１９９４年に単離；ブラジル、セルタンジーニョのＳａｎｔｅｌｉｓａ  Ｖａｌｅからの寄贈品）を再懸濁させることによってスターター宿主株Ｙ１１９８を産生させた。２００ｒｐｍの回転振盪機を用いて一晩、３０℃でその培養物をインキュベートした。その後、その培養物の１０ｕＬアリコートをＹＰＤプレートにプレーティングし、放置して乾燥させた。それらの細胞を単一コロニーについて逐次的に画線し、２日間、３０℃でインキュベートした。１２の単一コロニーを選取し、新たなＹＰＤプレートに植え継ぎ（ｐａｔｃｈ  ｏｕｔ）、一晩、３０℃で放置して成長させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｌｕｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）をその製造業者の仕様書にしたがって使用してＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦ  ＤＲ  ＩＩシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で染色体サイズを分析することにより、コロニーの株の正体を検証した。１つのコロニーを選取し、株Ｙ１１９８として保管した。
【０２１４】
遺伝子改変を可能にするために、株Ｙ１１９８からこの株を一倍体にすることにより株Ｙ１６６１、Ｙ１６６２、Ｙ１６６３およびＹ１６６４を産生させた。株Ｙ１１９８をローラードラム内のガラス管の中で一晩、３０℃で５ｍＬのＹＰＤ培地で成長させた。ＯＤ６００を測定し、２％酢酸カリウムを含有する５ｍＬのＹＰ培地で０．２のＯＤ６００に細胞を希釈した。その培養物をローラードラム内のガラス管の中で一晩、３０℃で成長させた。ＯＤ６００を再び測定し、５，０００×ｇでの２分間の遠心分離によって４ＯＤ６００＊ｍＬの細胞を回収した。その細胞ペレットを滅菌水で１回洗浄し、その後、０．０２％ラフィノースを含有する３ｍＬの２％酢酸カリウムに再懸濁させた。それらの細胞をローラードラム内のガラス管の中で３日間、３０℃で成長させた。胞子形成を顕微鏡検査によって確認した。その培養物の３３μＬアリコートを１．５ｍＬ遠心管に移し、１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。その細胞ペレットを、２μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  Ｚｙｍｏｌａｓｅ  １００Ｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、オハイオ州ソロン）を含有する５０μＬの滅菌水に再懸濁させ、それらの細胞を３０℃の水浴内で１０分間、インキュベートした。その管を氷に移し、１５０μＬの氷冷水を添加した。この混合物の１０μＬアリコートを１２ｍＬ  ＹＰＤプレートに添加し、Ｓｉｎｇｅｒ  ＭＳＭ  ３００解剖顕微鏡（Ｓｉｎｇｅｒ、英国サマセット）を用いて四分子を切り離した。そのＹＰＤプレートを３０℃で３日間インキュベートし、その後、新鮮なＹＰＤプレート上に胞子を植え継ぎ、一晩、３０℃で成長させた。８つの４胞子四分子からの各胞子の接合型をコロニーＰＣＲによって分析した。２つのＭＡＴα胞子と２つのＭＡＴα胞子を有する単一の４胞子四分子を選取し、株Ｙ１６６１（ＭＡＴａ）、Ｙ１６６２（ＭＡＴａ）、Ｙ１６６３（ＭＡＴα）およびＹ１６６４（ＭＡＴα）として保管した。
【０２１５】
酵母細胞形質転換のために、２５ｍＬの酵母エキスペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地に出発宿主株の単一コロニーを接種した。２００ｒｐｍの回転振盪機を用いて一晩、３０℃でその培養物を成長させた。培養物のＯＤ６００を測定し、その後、その培養物を使用して５０ｍＬのＹＰＤ培地に接種して、０．１５のＯＤ６００にした。その新たに接種した培養物を、２００ｒｐｍの回転振盪機を用いて３０℃で０．７から０．９のＯＤ６００になるまで成長させ、なった時点でそれらの細胞を１μｇのＤＮＡで形質転換した。細胞をＹＰＤ培地中で４時間放置して回復させた後、選択剤を含有する寒天にプレーティングして宿主細胞形質転換体を同定した。
【０２１６】
ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して完全に消化したプラスミドＴＯＰＯ−第Ｉ相組み込み構築物で株Ｙ１６６４を形質転換することにより、宿主株Ｙ１５１５を産生させた。３００ｕｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢを含有するＹＰＤ培地で宿主細胞形質転換体を選択し、ＧＡＬ８０遺伝子座に組み込まれた第Ｉ相組み込み配列を含む陽性形質転換体をＰＣＲ増幅によって検証した。
【０２１７】
ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して完全に消化したプラスミドＴＯＰＯ−第ＩＩ相組み込み構築物で株Ｙ１５１５を形質転換することにより、宿主株Ｙ１７６２を産生させた。１００ｕｇ／ｍＬのノウルセオトリシンを含有するＹＰＤ培地で宿主細胞形質転換体を選択し、ＬＥＵ２遺伝子座に組み込まれた第ＩＩ相組み込み配列を含む陽性形質転換体をＰＣＲ増幅によって検証した。
【０２１８】
発現プラスミドｐＡＭ４０４と、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して完全に消化したプラスミドＴＯＰＯ−第ＩＩＩ相組み込み構築物とで、二工程で株Ｙ１７６２を形質転換することにより、宿主株Ｙ１７７０を産生させた。ｐＡＭ４０４での宿主細胞形質転換体をメチオニンおよびロイシン不含の完全合成培地（ＣＳＭ）で選択した。ｐＡＭ４０４および第ＩＩＩ相組み込み構築物での宿主細胞形質転換体を、メチオニンおよびロイシング不含であり２００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））を含有するＣＳＭで選択し、ＥＲＧ９遺伝子座に組み込まれた第ＩＩＩ相組み込み配列を含む陽性形質転換体をＰＣＲ増幅によって検証した。
【０２１９】
株Ｙ１７７０をＵＲＡ３ノックアウト構築物（配列番号１５４）で形質転換することにより、宿主株Ｙ１７９３を産生させた。前記ＵＲＡ３ノックアウト構築物は、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ２ゲノムＤＮＡから産生された）ＵＲＡ３遺伝子座の上流および下流配列を含む。５−ＦＯＡを含有するＹＰＤ培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０２２０】
株Ｙ１７９３を第Ｉ相マーカー再利用構築物で形質転換することにより、宿主株ＹＡＡＡを産生させた。メチオニンおよびウラシル不含のＣＳＭで宿主細胞形質転換体を選択した。２００ｒｐｍの回転振盪機を用いて一晩、ＹＰＤ培地中、３０℃で細胞を成長させることにより、ＵＲＡ３マーカーを切除し、その後、５−ＦＯＡを含有する寒天にそれらの細胞をプレーティングした。マーカー切除をコロニーＰＣＲによって確認した。
【０２２１】
株ＹＡＡＡを第ＩＩ相マーカー再利用構築物で形質転換することにより、宿主株ＹＢＢＢを産生させた。メチオニンおよびウラシル不含のＣＳＭで宿主細胞形質転換体を選択した。２００ｒｐｍの回転振盪機を用いて一晩、ＹＰＤ培地中、３０℃で細胞を成長させることにより、ＵＲＡ３マーカーを切除し、その後、５−ＦＯＡを含有する寒天にそれらの細胞をプレーティングした。マーカー切除をコロニーＰＣＲによって確認した。
【０２２２】
株ＹＢＢＢを第ＩＩＩ相マーカー再利用構築物で形質転換することにより、宿主株Ｙ１９１２を産生させた。メチオニンおよびウラシル不含のＣＳＭで宿主細胞形質転換体を選択した。２００ｒｐｍの回転振盪機を用いて一晩、ＹＰＤ培地中、３０℃で細胞を成長させることにより、ＵＲＡ３マーカーを切除し、その後、５−ＦＯＡを含有する寒天にそれらの細胞をプレーティングした。マーカー切除をコロニーＰＣＲによって確認した。
【０２２３】
７．２  実施例２  細胞の封入
本実施例は、細胞をヒドロゲルに封入し、封入された細胞を１つ以上の水不混和性化合物の組み換え生産についてスクリーニングするための例示的方法を記載するものである。
【０２２４】
７．２．１  マイクロ流体システムの調製
弾性ポリマーポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）で構成されたマイクロ流体デバイスであって、Ｔ字接合部で相互接続されている少なくとも２本の流路を備えるデバイスを、型として、例えばフォトリソグラフィによって調製された、エッチングされたウェーハ担体を使用して作製した。
【０２２５】
簡単に言うと、ウェーハをアセトンおよびイソプロピルアルコールですすぐことにより、ウェーハ担体を調製する。フォトレジスト、例えばＳＵ８−３０００フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ、マサチューセッツ州ニュートン）をスピンコーティングによってウェーハに塗布する。その後、選択されたパターン、例えば、Ｔ字接合部で相互接続されている２本の流路を含むパターンでフォトレジストへの露光を可能にするように設計されたマスクによって、そのフォトレジストコーティングにＵＶ線を選択的に照射する。ＵＶ露光後、６５℃で１分間の焼成、続いて９５℃で４分間の焼成により、そのウェーハを加工する。８０ＲＭＰで４〜５分間、振盪しながらグリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）溶液にウェーハを浸漬し、その後、イソプロピルアルコールで３回すすぐことにより、そのフォトレジストを現像する。その後、ウェーハを２００℃で５〜３０分間焼成し、その後、放置して室温に冷却する。
【０２２６】
そのエッチングされたウェーハをＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ、ミシガン州ミッドランド）と接触させて、マイクロ流体デバイスを形成する。簡単に言うと、７０グラムのＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）エラストマー基剤を容器の中で７グラムのＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）架橋剤と混合し、混合する。３４グラムの混合組成物をそのエッチングされたウェーハに注ぎ、その後、おおよそ５分間（またはそのウェーハの表面に気泡が認められなくなるまで）真空デーシケータの中に置き、その後、６５℃で６０〜９０分間焼成する。
【０２２７】
重合されたＰＤＭＳをそのウェーハから除去し、プラズマ処理（０．３ｍｂａｒ、２０秒間）に付す。マイクロ流体デバイスを密閉するために使用するスライドガラスもプラズマ処理（０．３ｍｂａｒ、２０秒間）に付す。プラズマ処理後、プラズマ露光した側を下にしてスライドガラスをＰＤＭＳ上に置き、軽く押して気泡を除去する。その後、その封止されたマイクロ流体デバイスを６５℃で１０分間、焼成する。その後、撥水剤、例えば、シラン／シロキサン系撥水剤、例えばＡｑｕａｐｅｌ（商標）（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ  ＬＬＣ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）での処理にそのデバイスの流路を付す。本明細書に記載するように調製した、Ｔ字接合部で相互接続されている２本の流路を備える例示的マイクロ流体デバイスの二次元図を図４および図５Ａに提供する。
【０２２８】
７．２．２  封入のための細胞の調製
異種の水不混和性化合物生産についてスクリーニングすべき細胞を含む５００ｕＬの液体細胞培養物、またはプレートからの少数のコロニー、を１ｍＬのＰＢＳ−ＭＢＦ（１０ｍＭマンノース、０．５％ＢＳＡ、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を伴う、１×ＰＢＳ）に添加し、おおよそ１０秒間ボルテックスにかけ、３０秒間、５０００ｇで遠心分離する。上清を除去し、１ｍＬ  ＰＢＳ−ＭＢＦを添加し、それらの細胞を１０秒間ボルテックスにかけ、１分間、５０００ｇで遠心分離する。上清を除去し、それらの細胞を１ｍＬのＰＢＳ−Ｆに再懸濁させる。
【０２２９】
その細胞懸濁液を、黒色１０μＭ  Ｐａｒ−ｔｅｃフィルタへのその懸濁液の添加によって濾過し、短時間、遠心分離（約５００ｒｅｆ）する。その試料を短時間、ボルテックスにかけることで再懸濁させ、ＰＢＳで１：９希釈する。ＯＤ６００を決定し、ＰＢＳ−Ｆ（１０ｍＭマンノース、０．５％ＢＳＡ、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を伴う、１×ＰＢＳ）で希釈して、１ｍＬの、正確なＯＤ６００、すなわち所与の液滴サイズのために必要な最終細胞濃度の２倍、の培養物にする。
【０２３０】
それらの細胞を封入するためのアガロース溶液を調製する。簡単に言うと、０．５ｇ  ＬＭＰアガロース（例えば、Ｏｍｎｉｐｕｒ（登録商標）、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州ギブズタウン）を１００ｍＬビンの中で２５ｍＬの水に懸濁させ、完全に溶融および溶解するまで、１０秒間隔でマイクロ波照射する。そのアガロースを放置して約３０〜３５℃に冷却し、その後、同じく３０〜３５℃に温めておいた細胞懸濁液と１：１混合する。
【０２３１】
７．２．３  ヒドロゲル粒子への細胞の封入
上で説明したように調製した細胞懸濁液を２６ゲージ針のシリンジに添加し、１２インチのＰＥ／２管状材料をその針の先端に取り付ける。例えば自動化手段によって、その針の先端から管状材料へと細胞を排出する。その管状材料を細胞溶液フロー流路の入口通路に挿入する。油／ヒドロゲルエマルジョンのための流出口としての役割を果たすそのフロー流路の反対側の端部に、１２インチの１／３２”ＯＤ  ＰＥＥＫ管状材料を挿入する。
【０２３２】
自動油分配装置にシリンジおよび管状材料を取り付け、５，０００から１０，０００μＬ／時の流量で油をシリンジに満たす（ｐｒｉｍｅ）。マイクロ流体デバイス上の油フロー流路の入口通路にその管状材料を挿入し、油の流量を８５０から１，０００μＬ／時に設定する。管状材料とデバイスの間の接合部を湿潤させるように油のフローを時々刻々と調整する。
【０２３３】
細胞溶液フロー流路による水性フロー（アガロース中の細胞を含む）を開始させ、その後直ぐに油フロー流路による油フローを開始させる。ヒドロゲル粒子を含むエマルジョンをＰＥＥＫ管状材料から、氷上で保管された２ｍＬ回収管に回収する。
【０２３４】
ヒドロゲル粒子を氷上で５分間凝固させた後、下部油層をピペットで除去する。５００ｕＬの２０％ＰＦＯ（ＨＦＥ−７５００中の２０％  Ｖ／Ｖ  ペルフルオロオクタノール）をそれらの粒子に添加し、その懸濁液をボルテックスにかけ、その後、３０秒間、６０００ｇで遠心分離する。残留油を除去し、５ｍＬの所望の成長培地＋０．００１％Ｆ１２７を添加し、上清を徹底的にボルテックスにかける。追加の５ｍＬの成長培地を添加し、その懸濁液を１分間、６０００ｇで遠心分離する。上清を注ぎ出し、そのピペットを短時間ボルテックスにかけた後、１．５ｍＬエッペンドルフ管に移す。５００μＬの成長培地を添加し、その懸濁液を短時間ボルテックスにかけ、その後、１分間、６０００ｇで遠心分離する。上清を除去し、ヒドロゲル粒子のおよその重量を書き留め、その粒子重量の二倍の成長培地を添加する。それらの粒子を再懸濁させ、１４ｍＬのファルコン管に移す。その後、細胞増殖および異種油水不混和性化合物生産を可能にするための適する細胞培養条件下、２４時間、３４℃でその溶液を振盪する。
【０２３５】
７．３  実施例３  粒子分析および分取
本実施例は、水不混和性化合物を生産する細胞を含むヒドロゲル粒子の例示的分析および分取方法を記載するものである。
【０２３６】
７０μｍ  ＢＤセルストレーナを５０ｍＬコニカルチューブ上に配置する。封入細胞を含む培養物を５ｍＬピペットでフィルタ膜の中央に適用する。２つの１ｍＬ  ＰＢＳアリコートでその膜から粒子を洗い出し、３０秒間、１００ｇで遠心分離し、１ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁させ、再び３０秒間、１００ｇで遠心分離する。その後、その濾過された培養物を１０μｍ  Ｐａｒｔｅｃフィルタにアリコートで添加し、９０秒間、１００ｇで遠心分離する。１ｍＬのＰＢＳを各フィルタのフィルタケークに添加し、ピペットで吸引、排出することによりそのケークを再懸濁させる。別の１ｍＬのＰＢＳをその懸濁液に添加し、９０秒間、１００ｇで遠心分離する。
【０２３７】
２００μＬナイルレッドストック（ＥｔＯＨ中、１００μｇ／ｍＬ）を１０ｍＬずつのＰＢＳ（最終２μｇ／ｍＬ）に必要に応じて添加することにより、ナイルレッド染色溶液（２ｍＬ／試料）を調製する。
【０２３８】
１ｍＬの染色溶液を各フィルタのフィルタケークに添加し、ピペットで吸引、排出することにより再懸濁させる。別の１ｍＬの染色溶液を添加し、９０秒間、１２０ｇで遠心分離する。１ｍＬのプレーンＰＢＳを添加することにより粒子をフィルタから除去して、ピペットで吸い上げ、吸い出して再懸濁させ、それらの粒子をＦＡＣＳ管に移す。別の１ｍＬのＰＢＳで膜を洗浄し、同じ管に移す。
【０２３９】
その後、粒子を、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）により、その粒子に含有されている細胞のバイオマスに対して正規化した異種の水不混和性化合物生産レベルに対応する蛍光強度に基づいて分取する。この分析は、ナイルレッドのソルバトクロミック特性を利用する。リン脂質細胞膜などの極性脂質の場合、ナイルレッドは、約５９０ｎｍの蛍光発光最大値を有する。対照的に、中性脂質の存在下ではスペクトルが青色側にシフトされ、発光最大値は５５０ｎｍである。したがって、スペクトルの緑色（５１５＋／−２０ｎｍ）および赤色（６７０＋／−２０ｎｍ）領域の光学フィルタを使用して、理想的生産体（純粋なファルネセン）と完全非生産体の間の緑色対赤色蛍光比を最大にする（図６Ｂ参照）。
【０２４０】
封入した試料をＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホゼ）で分析する。ピーク高、面積および幅を次の４つのパラメータから収集する：ソリッドステート４８８ｎｍレーザーからの前方および側方散乱（それぞれ、ＦＳＣおよびＳＳＣ）、５１５ｎｍバンドパスフィルタからの緑色蛍光、ならびに６７０ｎｍバンドパスフィルタからの赤色蛍光。先ず、ＦＳＣ面積パラメータの関数としてのＳＳＣ面積のプロットを用いて、あらゆる残渣、残存未封入細胞および空の粒子から封入コロニーをゲートする（図７Ａ参照）。
【０２４１】
粒子内で生産された産物の量を決定するために、粒子内の可変数の細胞に起因するノイズを説明する第一の分析を行う。炭化水素産物（例えば、ファルネセン）などの中性脂質におけるナイルレッドの蛍光は、リン脂質膜などの極性脂質におけるその蛍光に比べて青色側にシフトされる。赤色（細胞バイオマス）に対する緑色（産物）からの蛍光の比を使うことにより、細胞数の変動から生ずるノイズのほとんどを排除する。この正規化は、株に依存してその変動係数を８０〜１００％から８〜１２％に低減させる（例えば、それぞれ図７Ｃおよび７Ｄ参照）。したがって、分取集団を選択するための第二のプロットは、緑色対赤色蛍光（Ｇ／Ｒ）比のものであり；高緑色（Ｇ）および高Ｇ／Ｒシグナル両方を有する集団を選択する（例えば、図７Ｂにおける枠で囲まれた集団を参照されたし）。
【０２４２】
ゲート設定用の１０，０００事象を収集するために、毎秒５００〜１０００事象で事象を収集する。高Ｇ＋Ｇ／Ｒコロニーの「分取ゲート」は、突然変異体の予想表現型変化、スクリーニングのラウンド、および集団サイズに依存して、全コロニーの０．５％と２０％の間を含有する。分取集団を栄養寒天ペトリ皿に直接プレーティングする；細胞は、粒子の外へ成長し、寒天上にコロニーを形成し、それらを更なる加工、例えば、後の封入、分取および培養ラウンドのために回収する。２から６ラウンドの間のこの封入、分取および成長サイクルを含むスクリーニングを行って、高い水不混和性化合物量を生産する細胞集団を富化することができる。最終分取ラウンドの後、高レベル生産の確証のための従来のバルク培養スクリーニング法での評価のために個々のコロニーを選択することができる。
【０２４３】
７．４  実施例４  ファルネセン生産細胞の同定および選択
この実施例は、低レベル〜高レベルのファルネセンを生産するように改変された組み換え酵母細胞中の異種の水不混和性化合物の検出についての感度および忠実度を実証するものである。実施例１で説明した方法に従って産生させた酵母株であって、広範囲のファルネセン生産を提示する酵母株のラダーを、実施例２および３でそれぞれ説明した方法に従って封入および分取した。ナイルレッドを検出剤として使用した。２リットル発酵槽収率、ナイルレッド９６ウェル振盪プレート、およびファルネセンフラックスを含む、ピコスクリーニング法によって検出されたファルネセンレベルを、標準的測定法によって検出されたレベルと比較した。
【０２４４】
ナイルレッド９６ウェル振盪プレートアッセイは、次のように行った。各株について、単一コロニーを寒天プレートから選取して、３６０μＬのＢｉｒｄ  Ｓｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＳＭ）２％スクロース０．２５Ｎ＋ｃｒｂ（前培養培地）を含む１．１ｍＬ  ９６ウェルプレートに入れた。その前培養プレートを通気性メンブレンシールで封止し、培養物を１０００ＲＰＭで振盪しながら９６時間、３３．５℃、湿度８０％でインキュベートした。１４．４μＬの前培養培地を、１．１ｍＬ  ９６ウェル生産プレートに含まれている３６０μＬ（１：２５希釈）のＢＳＭ４％スクロースに移した。その生産プレートを通気性メンブレンシールで封止し、培養物を１０００ＲＰＭで振盪しながら４８時間、３３．５℃、湿度８０％でインキュベートした。インキュベーション後、９８μＬの生産培養物を９６ウェル黒色ポリスチレン平底アッセイプレートにおいて２μＬのナイルレッド溶液（２μｇ／ｍＬの最終ナイルレッド濃度）と混合した。プレートを３０秒間混合した後、分光光度計に入れ、２９０ｎｍでの励起および５５０ｎｍでの発光を有するファルネセン特異的読取値を得た。３５０ｎｍでの励起および４５０ｎｍでの発光を有する細胞バイオマス特異的読取値も得、ファルネセン対バイオマス比を決定した。
【０２４５】
ファルネセンフラックスアッセイは、次のように行った。各株について、単一コロニーを寒天プレートから選取して、３６０μＬのＢＳＭ  ２％スクロース（前培養培地）を含む１．１ｍＬ  ９６ウェルプレートに入れた。その前培養プレートを通気性メンブレンシールで封止し、培養物を１０００ＲＰＭで振盪しながら６５〜７２時間、３３．５℃、湿度８０％でインキュベートした。３０μＬの前培養培地を、１．１ｍＬ  ９６ウェル生産プレートに含まれている３６０μＬのＢＳＭ４％スクロースに移した。その生産プレートを通気性メンブレンシールで封止し、培養物を１０００ＲＰＭで振盪しながら４８時間、３３．５℃、湿度８０％でインキュベートした。各培養物についてのＯＤ６００測定値をとった後、ファルネセン力価を決定した。２００μＬの各培養物を２．２ｍＬプレートに移し、４００μＬ／ウェルのメタノールを添加した。プレートを封止し、３０〜４０分間振盪した。シールを外し、０．００１％ｔｒａｎｓ−カリオフィレンを含有する６００μＬ／ウェルのｎ−ヘプタンを添加し、プレートを封止し、９０分間振盪した。その後、プレートを２５００ｇで５分間、遠心分離した。各試料について、２．２ｍＬプレートから２００μＬ／ウェルの上部ヘプタン層を１．１ｍＬプレートのウェルに移し、０．００１％ｔｒａｎｓ−カリオフィレンを含有する２００μＬ／ウェルのｎ−ヘプタンを添加した。プレートを封止し、２分間振盪し、２５００ｇで２分間、遠心分離した。水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０ガスクロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）でそのヘプタン抽出物を分析した。ヘプタン中の精製された生物由来ｔｒａｎｓ−β−ファルネセン（Ａｍｙｒｉｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州エメリービル）の定量較正曲線に対して生成ピーク面積を比較することにより、ファルネセン力価を計算した。
【０２４６】
２Ｌ発酵槽収率は、次のように決定した。各株について、コハク酸塩で緩衝された５０ｍＬ滅菌ＢＳＭ２％スクロースを含む２５０ｍＬバッフルなし振盪フラスコに１．０ｍＬの解凍した作業用シードストックを接種した。その接種物フラスコは、おおよそ２４時間、２秒間の工程で２００ｒｐｍ、３４℃で、おおよそ３．５のＯＤ６００に成長した。８００ｍＬの滅菌培地を含むフェルンバッハ振盪フラスコに５０ｍＬの接種物を接種した。シードフラスコを、約２４時間、２秒間の工程で２００ｒｐｍ、３４℃で、おおよそ３．５のＯＤ６００およびエタノール＞２ｇ／Ｌに成長させた。接種後の容積全体を２Ｌ発酵に使用した。２Ｘバッチ基剤とＤＩ水を併せ、オートクレーブ処理することによって、発酵槽バッチ培地を調製した。滅菌後の追加分として無菌の微量金属およびビタミンを添加し、その培地を目標プロセス条件で平衡させた後、接種した。接種後、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｌ−８１消泡剤（最終容積０．１ｍＬ／Ｌ）も発酵槽に添加した。２８％水酸化アンモニウムを使用してｐＨを制御した。糖供給物は、７５０ｇ／Ｌスクロースであった。発酵は、６日間、３３．５℃、ｐＨ５、インペラ撹拌、生産相中ＯＵＲ８０〜１５０で進行した。上で説明したように、細胞密度を測定し、ファルネセン力価をガスクロマトグラフィーによって決定した。
【０２４７】
図８は、様々なレベルのファルネセンを生産するように改変した７つの株各々について、２Ｌ発酵槽収率によってなされた収率決定（ｘ軸、左プロット）、ナイルレッド振盪プレートアッセイによってなされた収率決定（ｘ軸、中央プロット）およびファルネセンフラックス分析によってなされた収率決定（ｘ軸、右プロット）に対してそれぞれプロットした、（バイオマスに対して正規化し、任意単位で表した）ピコスクリーニングによって決定したファルネセン収率（ｙ軸）を提供するものである。相関関係は、広範な生産値にわたって良好である（Ｒ２＞９０％）。これらの相関関係により、ピコスクリーンアッセイは、様々な量のファルネセンを生産する株の集団にわたってファルネセン生産を区別することができると確証される。
【０２４８】
７．５  実施例５  高ファルネセン生産集団の富化
この実施例は、本明細書に提供する封入および検出方法（「ピコスクリーニング」）が、繰り返し実施すると、より生産性の低い生産体のバックグラウンドからの高生産細胞の富化に有効であることを実証するものである。
【０２４９】
より生産性の低い生産体のバックグラウンドから生産性の高い生産体を富化するピコスクリーニング方法論の能力を実証するために、分取前および分取後に単一集団内の共培養された異なる封入株を明確に区別するための、そしてある株の別の株に対する相対的存在度を決定するための、デジタルコロニーＰＣＲアッセイを開発した。ゲノム内に組み込まれたファルネセンシンターゼ（ＦＳ）遺伝子の数が異なる株のペアをモデル系として用いた。ゲノム内のＦＳのコピー数が多いほど、結果として、その株によって生産されるファルネセンの量は多くなる。第一の株、ＦＳ２は、組み込まれたＦＳコピーを２つ有し、第二の株、ＦＳ５は、組み込まれたコピーを５つ有する。ＦＳ５がＦＳ２より約３０％多い収率でファルネセンを生産することを独立して確認した。
【０２５０】
単一ＰＣＲ反応でＦＳ２株とＦＳ５株とを明確に区別するために利用することができる３つのプライマーを設計した。第一のプライマーは、両方の株に共通であるＴＣＹＣ１ターミネーター配列を標的にし、フォワードプライマーとしての役割を果たす。第二のプライマーは、リバースプライマーとしての役割を果たし、このプライマーは、ＦＳの第二のコピーを含む組み込まれた配列内で見出せられる領域を標的にし、この領域も両方の株に共通である；この遺伝子座からの増幅は、８９ｂｐアンプリコンを生産する。第三のプライマーもリバースプライマーとしての役割を果たし、このプライマーは、ＦＳの第５のコピーを含む組み込まれた配列内で見出せられる領域を標的にし、この領域は、株ＦＳ５に固有であり、株ＦＳ２には存在しない；この遺伝子座からの増幅は、３０４ｂｐアンプリコンを生産する。前記３つのプライマーの混合物を用いて各株に関してＰＣＲを行うと、株ＦＳ２は１バンド（８９ｂｐのみ）を生じさせ、株ＦＳ５は、２バンド（８９ｂｐおよび３０４ｂｐ）を生じさせた（図９参照）。コロニーが株ＦＳ５に由来することの明確なマーカーとして、３０４ｂｐバンドの存在を用いる。
【０２５１】
株ＦＳ２およびＦＳ５を、それぞれ１０：１、１００：１および１０００：１のＦＳ２：ＦＳ５比で単一の別個のライブラリに混合し、これらのモデルライブラリの各々に関してピコスクリーニングを行った。３ラウンドの封入および分取を各ライブラリに関して行った。ラウンド間に、分取粒子を大きいペトリトレーに直接プレーティングして成長させ、９６コロニーを各ラウンドから選択し、上述の３つのプライマーを使用するコロニーＰＣＲに付して各コロニーの正体を決定した。これらのＰＣＲデータから、各封入および分取ラウンド後に、株ＦＳ５に由来するコロニーによって代表されるプレーティングされた集団の百分率を決定した。
【０２５２】
図１０に提供する結果は、３ラウンドの封入および分取での株ＦＳ５の成功裏の富化を実証する。図１０Ａは、純粋な株のＦＡＣＳヒストグラムデータを提供するものであり、それらを列１および２に提示する。ラウンド１、２および３の封入および分取後の１００：１混合集団のヒストグラム（列３〜５）は、株ＦＳ５の実質的富化がラウンド３によって実現されたことを示す。図１０Ｂは、１０：１、１００：１および１０００：１ライブラリの各々についての分取ラウンド間の富化に関してｃＰＣＲデータから導出した定量的結果を提供するものである。これらの研究では、１０：１および１００：１の出発ＦＳ２：ＦＳ５比をそれぞれ有するライブラリについてはＦＳ５の富化がほぼ完全であったので、ラウンド３によって得られた集団のほぼ１００％がＦＳ５由来コロニーから成った。ＦＳ５が出発集団内に極めて少なかった（約１０％）ときでさえ、１ラウンド当たりおおよそ５倍の富化が観察された。これらの結果は、より低生産性の細胞集団内の極めて少ない高生産性細胞集団についてのほぼ完全な富化をピコスクリーニングによって効率的に実現できることを実証する。
【０２５３】
７．６  実施例６  他の水不混和性化合物を生産する細胞の同定および選択
本実施例は、他の水不混和性化合物を組み換え生産する細胞の検出、分取および選択のためのピコスクリーニングの有効性を実証するものである。
【０２５４】
７．６．１  リモネン生産細胞
セスキテルペンであるファルネセンの組み換え生産に加えて、細胞中のモノテルペンをはじめとする他のイソプレノイドをピコスクリーニングによって検出することができる。モノテルペンは、一般に、２つのイソプレン単位を含み、分子式Ｃ１０Ｈ１６を有する。モノテルペンであるリモネンは、柑橘類果実の皮およびペパーミントにおいて天然に見出せられ、構造：
【０２５５】
【化５】
2014508516.tif 000007
によって表される。リモネンは、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）からリモネンシンターゼによって作られる。ファルネセンシンターゼではなくリモネンシンターゼをコードしている遺伝子を発現するように株を改変したことを除き、実施例１で説明した方法に従って、様々な量のリモネンを生産する一連の酵母株を産生させた。
【０２５６】
実施例２および３でそれぞれ説明した方法に従って、リモネン生産株を封入し、分取した。ナイルレッドを検出剤として使用した。ピコスクリーニング法によって検出されたリモネンレベルを、以下のように行った９６ウェル振盪プレートアッセイによって検出されたレベルと比較した。各株について、単一コロニーを寒天プレートから選取して、３６０μＬのＢｉｒｄ  Ｓｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＳＭ）２％スクロース  ０．２５Ｎ＋ｃｒｂ（前培養培地）を含む１．１ｍＬ  ９６ウェルプレートに入れた。その前培養プレートを通気性メンブレンシールで封止し、培養物を１０００ＲＰＭで振盪しながら７２時間、３０℃、湿度８０％でインキュベートした。６μＬの前培養培地を、１．１ｍＬ  ９６ウェル生産プレートに含まれている７５μＬのＢＳＭ４％ガラクトースおよび７５μＬのミリスチン酸イソプロピルに移した。Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ｐｌａｔｅ  ｌｏｃ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓ）を用いて非透過性アルミ箔ヒートシールでその生産プレートを封止し、培養物を１０００ＲＰＭで振盪しながら７２時間、３０℃、湿度８０％でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを−２０℃で２時間、瞬間冷凍してそのモノテルペン産物の蒸気圧を低下させた。この段階で、プレートシールを迅速に除去し、１５ｍｍの分注高さ（ｄｉｓｐｅｎｓｅ  ｈｉｇｈｔ）および３ｍｍ／秒のポンプ速度でＰｈｏｅｎｉｘリキッドハンドラ（Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ヘキサデカン内部標準を含有する３００ｕｌの酢酸エチルをその凍結培養ブロスに直接添加した。非透過性アルミニウムシールを使用して直ちにそのプレートを封止し、マイクロタイタープレート攪拌機を用いて９０ＲＰＭの回転速度で２時間、室温で振盪した。２時間の振盪の後、プレートを２０００ＲＰＭで２分間、遠心分離し、ＧＣ−ＦＩＤ（水素炎イオン化検出を伴うガスクロマトグラフィー）を用いて直接アッセイした。メチルシリコーン固定相カラムに１：５０の分割比で２ｕＬの酢酸エチルを注入することにより、モノテルペン生産についてのＧＣ−ＦＩＤ分析を定量した。オーブンパラメータを２．５分の過程にわたり２５℃から２５０℃に上昇させ、その後、次の試料注入のために急冷した。リモネンおよびミルセンの標準物質を注入し、その後、各試行を行い、試料ピーク下の正確なｐｐｍ積分面積を定量した。その後、これらの値を絶対力価に換算して、図１１に示す値を決定した。
【０２５７】
図１１Ａは、様々なレベルのリモネンを生産するように改変した３つの株（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）およびナイーブ非生産株（Ｙ０）の各々についての：（左パネル）１株当たりの生産されたリモネンのレベルに対応するＧ／Ｒ蛍光ピーク；および（右パネル）振盪フラスコ発酵槽収率によってなされた収率決定（ｘ軸）に対してプロットした、ピコスクリーニングによって決定した（バイオマスに対して正規化し、任意単位で表した）リモネン収率（ｙ軸）を提供するものである。広範なリモネン生産値にわたって相関関係を見ることができる。図１１Ｂは、一緒に共培養した封入生産細胞（Ｌ１）および非生産細胞（Ｙ０）の蛍光ピーク（黒塗りピーク）、または別々に培養した封入生産細胞（Ｌ１）および非生産細胞（Ｙ０）の蛍光ピーク（白抜きピーク）を提供するものである。Ｙ０およびＬ１についての別々の蛍光ピークが共培養条件下で維持され、これは、産物が、生産株を含有する粒子に封入されたままであること、および非生産株を含有する粒子から流出せず、該粒子に流入しないことを示す。メジアンの差は、管ごとのばらつきに起因し得る。
【０２５８】
これらの結果は、ピコスクリーンアッセイを用いて、様々なレベルのリモネンを生産する宿主株を同定でき、区別できることを実証する。
【０２５９】
７．６．２  パチュロール生産細胞
パチュロールは、構造が、
【０２６０】
【化６】
2014508516.tif 000008
であるセスキテルペンであり、パチョリアルコールとしても公知であり、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｐａｔｃｈｏｕｌｉの精油の成分である。パチュロールは、ＦＰＰからパチュロールシンターゼによって作られる。ファルネセンシンターゼではなくパチュロールシンターゼを発現するように株を改変したことを除き、実施例１で説明した方法に従って、様々な量のパチュロールを生産する一連の酵母株を産生させた。実施例２および３でそれぞれ説明した方法に従って、パチュロール生産株を封入し、分取した。ナイルレッドを検出剤として使用した。ピコスクリーニング法によって検出されたパチョロールレベルを、以下のように９６ウェル振盪プレート収率によって検出されたものと比較した。各株について、１ウエル当たり２％スクロースを伴う３６０μＬのＢｉｒｄ  Ｓｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＳＭ）を含む９６ウェルプレートの別個のウェルで単一コロニーをインキュベートした（前培養）。９９９ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で２日のインキュベーションの後、各ウエルの６．４ｕＬを、４％ガラクトース、３．３３％鉱油およびＢｒｉｊ−５６エマルジョンと共に１５０ｕＬの新鮮なＢＳＭ（生産培地）を含む新たな９６ウェルプレートのウェルに接種した。９９９ｒｐｍで撹拌しながら３０℃でさらに４日のインキュベーションの後、試料を採取し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によりパチュロール生産について分析した。ＧＣ分析のために、試料をメタノール−ブトキシエタノール−ヘプタン（１００ｕＬ：５０ｕＬ：４００ｕＬ  ｖ／ｖ）で抽出し、その細胞材料を重力によって沈降させた。そのヘプタン抽出物のアリコートをヘプタンでさらに希釈し、その後、パルス式の分割注入（）を用いてメチルシリコーン固定相に注入した。
【０２６１】
図１２は、封入酵母細胞から組み換え生産されたパチュロールの検出のためのピコスクリーンの結果を提供するものである。非生産株（Ｙ０）および２つの異なるパチュロール生産株（Ｐ１およびＰ２）を封入し、ピコスクリーンに付した。図１２Ａは、１株当たりの生産されたパチュロールのレベルに対応するＧ／Ｒ蛍光ピークを提供するものである。図１２Ｂは、９６ウェル振盪プレート収率によってなされた収率決定（ｘ軸）に対してプロットした、ピコスクリーニングによって決定した（バイオマスに対して正規化し、任意単位で表した）リモネン収率（ｙ軸）を提供するものである。これらの結果は、ＦＡＣＳ値が、ＧＣによって測定した標準振盪プレート力価に比例することを示す。
【０２６２】
これらの結果は、ピコスクリーンアッセイを用いて、様々なレベルのパチュロールを生産する宿主株を同定でき、区別できることを実証する。
【０２６３】
本明細書に引用した特許および特許出願は、個々の公報および特許出願各々が参照により援用されていると具体的にかつ個々に示されているかのごとく参考として本明細書に援用されている。理解の明確さのために上記発明を実例および実施例として多少詳細に説明したが、本発明の教示にかんがみて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく本発明に一定の変更および修飾を施すことができることは、当業者には容易に分かるであろう。
【図５】
2014508516.tif 000009
【図１Ａ】
2014508516.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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