(57)【要約】  本発明は、例えば、抗体などのIL-21リガンドならびにその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73の1つまたは複数、以下のアミノ酸Lys 117、His 118、Arg 119の1つまたは複数ならびに以下のアミノ酸:Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるモノクローナル抗体mAb14ではない、抗体。
【請求項２】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65からTrp 73の1つまたは複数、以下のアミノ酸:Lys 117からArg 119の1つまたは複数および以下のアミノ酸:Leu 143からHis 151の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるモノクローナル抗体mAb14ではない、抗体。
【請求項３】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸Arg 40からVal 67の1つまたは複数およびアミノ酸Glu 129からHis 149の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【請求項４】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、IL-21(配列番号1)のアミノ酸Glu 65からTrp 73の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【請求項５】
前記抗体は、配列番号1に記載のGlu 65、Asp 66およびVal 67の1つまたは複数と結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号1に記載のHis 149と結合する、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸Glu 65、Asp 66、Val 67およびHis 149の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【請求項８】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Arg 40、Lys 50、Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145およびHis 149の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【請求項９】
IL-21上のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151の1つまたは複数を含むが、ただし、前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【請求項１０】
配列番号6に記載のCDR1、CDR2およびCDR3の少なくとも1つを含む軽鎖ならびに配列番号7に記載のCDR1、CDR2およびCDR3の少なくとも1つを含む重鎖を含む、請求項9に記載の抗体。
【請求項１１】
共通のγC鎖のIL-21との結合を妨げる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14のバリアントであり、前記抗体は、CDR配列に1つまたは複数の変異を含み、前記変異は、A61S(配列番号7)、D62E(配列番号7)、V64I(配列番号7)およびK65R(配列番号7)、R24K(配列番号6)、S26T(配列番号6)、Q27N(配列番号6)、D30E(配列番号6)、S53T(配列番号6)およびS56T(配列番号6)からなる一覧由来の1つまたは複数から選択される、請求項10に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体および任意選択で1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
免疫学的障害を処置するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
IL-21と結合するリガンドを選択するための方法であって、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67およびHis 149を含むエピトープを含むIL-21模倣体を用いてリガンドの1つまたは複数のライブラリーをスクリーニングするステップならびに前記不連続のエピトープと結合する1つまたは複数のリガンドを単離するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IL-21に存在する不連続のエピトープおよびこのエピトープと結合するリガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
IL-21は、I型サイトカインであり、自然および獲得免疫応答の両方に多面的作用を及ぼす。IL-21は、主に活性化CD4+T細胞、濾胞性T細胞およびナチュラルキラー細胞(NKT)によって産生される。さらに、最近の証拠は、Th17細胞が大量にIL-21を産生できることを示唆している。
【０００３】
IL-21は、CD8+T細胞の細胞傷害性を増加させ、抗原の存在下でCD8+細胞の増殖を促進することができる。IL-21は、Th17細胞の発現を促進することが知られているサイトカインであるIL-6によって誘導される。IL-21は、自己分泌の形でヘルパーT細胞に作用して、それ自体の産生を促進し、ヘルパーT細胞のTh17細胞への分化を助ける。これに一致して、IL-21欠損マウスは、Th17応答が正常に機能しない。IL-21は、B細胞にも作用し、抗体産生を増加させる。しかしながら、IL-21は、機能性抗体の産生に必須ではない一方で、IL-21Rα陰性マウスは、CD8+細胞の増殖が減少し、CD8+細胞の細胞傷害性も正常に機能しない。最近の一連の研究は、CD4+細胞によって産生されるIL-21は、ウイルス感染を抑制するCD8+T細胞の能力に対して重要であることを示唆している。
【０００４】
成熟IL-21は、上-上-下-下の配置で並んだ4つのらせん状部分を特徴とする133アミノ酸ポリペプチド(配列番号1の残基30〜162、図2)である。IL-21は、専用のIL-21受容体アルファ鎖からなるヘテロダイマー受容体複合体(IL-21Rαおよび共通のガンマ鎖(γC)(配列番号8の残基23〜369)を介してシグナル伝達する。IL-21は、2つの結合部位、結合部位1(BS1)および結合部位2(BS2)を含み、これらを介して、それぞれIL-21RαおよびγCと相互作用する。IL-21は、BS1を介してIL-21Rαと高い親和性で結合するが、受容体の活性化およびシグナル伝達には、三重複合体を形成することになるBS2を介したIL-21とγCとの間の構造的な相互作用も必要とされる。IL-21Rαと高い親和性で結合するが、γCと構造的に相互作用する能力が欠如しているIL-21バリアントは、シグナル伝達を誘導することなくIL21受容体をふさぐことになるため、IL-21受容体アンタゴニストとして機能する。
【０００５】
免疫を増強するIL-21の能力は、IL-21の治療的使用への関心を大幅に高めた。IL-21は、転移性黒色腫タイプおよび腎臓癌に対する臨床試験において現在評価されている。動物研究では、IL-21と腫瘍特異的抗体との間の相乗作用について証明されており、これは、抗腫瘍抗体の増強物質としてのIL-21の今後の治療的使用を示唆するものであろう。さらに、IL-21は、自己免疫性疾患において複雑な役割を果たしている。IgEの産生を下方制御するIL-21の能力は、IL-21が喘息およびアレルギーに対して治療的に使用される可能性を示唆する。動物研究の結果は、この見解を裏付けるものである。一方、Th17の発現を促進するIL-21の能力は、IL-21を炎症性サイトカインにするため、多数のさまざまなIL-21およびIL-21Rαアンタゴニスト/インヒビターがさまざまな自己免疫性疾患の処置の際に使用できるか現在調べられている。
【０００６】
IL-21に特異的なモノクローナル抗体は、例えば、WO2007111714およびWO2010055366(Zymo-Genetics, Inc.)により、当該技術分野において知られている。特に、WO2010055366は、クローン番号366.328.10.63(本明細書中では「mAb14」と呼ぶ)と指定されたIL-21抗体について記載しており、これは、同種の抗原に対して高い親和性があり、ヒトおよびカニクイザルのIL-21に対して特異性を示すその他の望ましい特性がある。この抗体は、ホモダイマーIL-21Rα-FcコンストラクトまたはヘテロダイマーIL-21Rα/γC-Fcコンストラクトのいずれかを使用したIL-21のIL-21RαまたはγCの結合のいずれとも競合しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2007111714
【特許文献２】WO2010055366
【特許文献３】WO2005040219
【特許文献４】米国特許出願公開第20050238646号
【特許文献５】米国特許出願公開第20020161201号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】MacDonald、Nature Medicine、16巻(2010年)、1194〜1195ページ
【非特許文献２】Bondensgaardら、J. Biol. Chem.(2007年)、282巻、23326〜23336ページ
【非特許文献３】Birdら、Science 1988年;242巻:42S〜426ページ
【非特許文献４】Hustonら、PNAS 1988年;85:5879〜5883ページ
【非特許文献５】Illら、Protein Eng 1997年;10巻:949〜57ページ
【非特許文献６】HolligerおよびHudson、Nat Biotechnol 2005年;2S巻:1126〜1136ページ
【非特許文献７】Edelman G.M.ら、Proc. Natl. Acad. USA 63巻、78〜85ページ(1969年)
【非特許文献８】Dorner Tら、(2009年)Arthritis Res. Therapy
【非特許文献９】Ozaki、K.ら、Science、2002年
【非特許文献１０】Ettinger R. J.ら、J Immunol、2005年
【非特許文献１１】Kuchen、S.ら、J Immunol、2007年
【非特許文献１２】Ettinger、R.ら、Immunol Rev、2008年
【非特許文献１３】Leonard、W. J.ら、Nat. Rev. Immunol. 2005年
【非特許文献１４】WalesおよびEngen、Mass Spectrom. Rev. 25巻、158ページ(2006年)
【非特許文献１５】AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302巻、139〜148ページ(2011年)
【非特許文献１６】Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17巻、1700ページ(2006年)
【非特許文献１７】Garcia、PantazatosおよびVillareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2巻、81ページ(2004年)
【非特許文献１８】Mandell、FalickおよびKomives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、14705ページ(1998年)
【非特許文献１９】Durocherら、Nucleic Acid Research、2002年
【非特許文献２０】Edelman G.M.ら、Proc. Natl. Acad. USA 63巻、78〜85ページ(1969年)
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、本明細書中においてIL-21の新規のエピトープについて定義する。例えば、抗体などのIL-21リガンドのこのエピトープとの結合は、BS2を介したγCのIL-21との結合と競合するか、またはそれを妨げるが、BS1を介したIL-21RαのIL-21との結合は妨げない。
【００１０】
本発明者らは、本発明によるエピトープと特異的に結合するが、ただし、mAb14でもγCでもない、抗体などのIL-21リガンド、ならびにそのようなリガンドを作製および使用するための方法についても記載する。本発明者らは、mAb14のIL-21との結合がγCのIL-21との結合をどのように妨げるかについても記載する。
【００１１】
本発明によるIL-21リガンドの特有の特徴は、γCのIL-21との結合と競合するか、またはそれを妨げるが、リガンドと複合体を形成したIL-21がIL-21Rαと結合能力のあるBS1を維持する能力である。したがって、本発明のリガンドは、IL-21の存在下において細胞表面に存在するIL-21Rαに特異的に高い親和性で結合する能力を有するリガンド:IL-21複合体を形成することになる。
【００１２】
BS1を介して高い親和性でIL-21Rαと結合する能力を保持しているが、γCと相互作用する能力が欠如したBS2をもつIL-21バリアントは、IL-21Rα受容体をふさぐことになり、IL-21Rα受容体アンタゴニストとして機能する。BS2の結合を弱める一方法は、γCとの相互作用に決定的に関与するIL-21残基に1つまたは複数の点変異を導入することである。別の方法は、BS2リガンドをIL-21に結合させることによってBS2をブロックすることである。それにより、本質的に本発明のリガンドについて記載されるように、効果的にBS2をブロックするが、BS1には影響を及ぼさないままにしておくIL-21リガンドは、IL-21の存在下インビボにおいてIL-21Rα受容体アンタゴニストとして作用することが予想される。
【００１３】
一般的に、モノクローナル抗体は、自己免疫性疾患および慢性炎症性疾患における炎症促進性分子などの可溶性標的(soluble target)を「中和する」ために治療的に使用される。溶液中のIL-21分子のBS2を妨げるIL21リガンドの結合は、その特定のIL-21分子の「中和」をもたらすことになる。一方、形成されたリガンド:IL-21複合体は、アンタゴニストの特性を獲得するため、IL-21Rαをもつ細胞の1つのIL-21Rα分子の機能をさらにブロックおよび「中和」できることになる。この二重の作用様式、すなわち、可溶性IL-21の中和および膜に結合したIL-21Rαの阻害が、IL-21のBS1を妨げるリガンドと比較した場合、BS2をブロックする/妨げるそのようなIL-21リガンドの効力を強力に改善することになる。この場合、形成されたリガンド:IL-21複合体は、IL-21Rαアンタゴニストの特性は獲得しない。
【００１４】
したがって、本発明のリガンドは、中和する特性および受容体をブロックする特性の組み合わせにより改善された効力をもつ場合もある。
【００１５】
一般に、本発明のリガンドは、IL-21と結合し、BS1の能力を保持することによりIL-21Rαと高い親和性で結合する能力を保持するリガンド:IL-21複合体を形成することになる。したがって、リガンド:IL-21複合体は、可溶性のIL-21Rαフラグメント(例えば、その細胞外ドメイン)または細胞表面に存在する膜に結合したIL-21Rαと結合することができる。言い換えると、本発明によるリガンドは、IL-21の存在下においてIL-21Rαをもつ細胞と特異的に結合する能力をもつ場合もある。
【００１６】
リガンドがADCCおよび/またはCDCを誘導できるFcドメインを含む抗体である場合、そのようなリガンドは、その高い親和性およびIL-21Rαをもつ細胞と特異的に結合する特長によって、IL-21Rαをもつそのような細胞を殺す能力をもつ場合もある。
【００１７】
したがって、本発明の別の態様のリガンドでは、例えば、もともとエフェクター機能をもつFcドメインを含む抗体は、表面にIL-21Rαをもつ細胞の特異的な欠乏をもたらす場合もある。
【００１８】
特定の細胞サブセット、例えば、クローン病(CD)の患者の腸におけるT細胞およびマクロファージの欠乏は、CDにおける現在の抗TNFα療法の作用様式において重要な要素であることが示されてきた(MacDonald、Nature Medicine、16巻(2010年)、1194〜1195ページおよびその参考文献)。したがって、特定の炎症細胞の欠乏は、一部の炎症性疾患の処置に有利である場合もある。
【００１９】
抗体のエフェクター機能は、アイソタイプにより決まり、抗体のFc受容体との結合を変えることになるFcドメインに変異を導入するなどの当該技術分野において既知のいくつかの方法によって改変することができる。本発明のリガンドには、エフェクター機能が改変されたそのようなリガンドも含まれる。
【００２０】
本発明のエピトープと結合するIL-21リガンドは、γCのIL-21との結合と競合するか、またはそれを妨げる。本発明者らは、実験および相同性モデリング法を使用して、IL-21とγCとの間の相互作用を破壊することによりIL-21の作用を阻害するよう設計されたIL-21リガンドの標的となる、相互作用に関与するIL-21とγCとの間の結合面の位置およびIL-21の特定のアミノ酸残基を予測した。
【００２１】
X線結晶データによって本明細書中で示される以下のIL-21のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151またはそのサブセット(配列番号1を参照のこと)には、mAb14(WO2010055366において抗体366.328.10.63と称される)のものと類似したCDR配列を有する抗体が結合する。
【００２２】
別に明記されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に解釈されるのと同じ意味をもつ。本発明の実務では、別に指示がある場合を除いて、化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の当業者に知られた従来の方法を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本明細書中で言及されるアミノ酸配列の図である。
【図２】太字にし、下線を引いた(それぞれ配列番号1のアミノ酸34〜50(配列番号2)、配列番号1のアミノ酸72〜82(配列番号3)、配列番号1のアミノ酸93〜103(配列番号4)および配列番号1のアミノ酸133〜152(配列番号5)に対応する)らせんA、B、CおよびDを含む成熟IL-21アミノ酸配列(配列番号1の残基30〜162)の図である。BS1、BS2ならびにmAb14およびmAb5のエピトープ(それぞれエピトープ14およびエピトープ5)に属する残基は、アミノ酸配列の下に「X」でマークされている。Mab5エピトープを図中では「エピトープ5」と示す。Mab14のエピトープを図中では「エピトープ14」と示す。
【図３】mAbの結合に関与するhIL-21の領域を特定する、質量分析によってモニタされたHXの図である。すべての枠について、上段のスペクトルは重水素で置換されてない対照を示し、下段の枠は重水素で置換された対照、すなわち、mAbの非存在下においてD2O中でインキュベーションした30秒後のhIL-21を示す。中間の枠は、示した各mAbの存在下において交換した30秒後のペプチドを示す。(A)らせんAに位置するペプチドフラグメント29〜44、MQGQDRHMIRMRQLID(m/z=676.68、z=3)に対応する質量/電荷スペクトル。mAb5は、この領域で交換プロテクションが生じる。(B)ループおよびらせんBに位置するペプチドフラグメント67〜76、VETNCEWSAF(m/z=1185.49、z=1)に対応する質量/電荷スペクトル。mAb14は、この領域で交換プロテクションが生じる。(C)らせんCに位置するペプチドフラグメント93〜98、ERIINV(m/z=743.47、z=1)に対応する質量/電荷スペクトル。mAb5は、この領域で交換プロテクションが生じる。(D)らせんDに位置するペプチドフラグメント138〜162、ERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(m/z=738.63、z=4)に対応する質量/電荷スペクトル。mAb14は、この領域で交換プロテクションが生じる。
【図４ａ】mAb5またはmAb14の非存在下または存在下におけるhIL-21の代表的なペプチドの水素交換時間グラフである。hIL-21ペプチドの重水素組み込み(Da)について、mAb5の存在下(黒いひし形、◆)または存在下(白い三角形、△)あるいはmAb14(白い円、○)の存在下の対数目盛を時間に対してグラフ化した。
【図４ｂ】mAb5またはmAb14の非存在下または存在下におけるhIL-21の代表的なペプチドの水素交換時間グラフである。hIL-21ペプチドの重水素組み込み(Da)について、mAb5の存在下(黒いひし形、◆)または存在下(白い三角形、△)あるいはmAb14(白い円、○)の存在下の対数目盛を時間に対してグラフ化した。
【図５】mAb14の存在下および非存在下においてHX分析されたhIL-21のペプチドの配列範囲である。HX分析されたペプチド(横棒として示す)の上に一次配列を示す。mAb14の存在下および非存在下の両方において、類似の交換パターンを示しているペプチドは白で表示し、一方、mAb14の結合時に重水素の組み込みが減少しているペプチドは黒で着色している。囲まれた配列領域は、エピトープの範囲を定めている。
【図６】異なるhIL-21/Fab複合体のX線構造におけるモデル化されたhIL-21残基である。比較用にFab35(実施例1より)を付ける。
【図７】CCP4プログラムスイート(Bailey、1994年)のCONTACTソフトウェアを動作させることによって特定したhIL-21のFab56、Fab57、Fab59およびFab60 hIL-21のエピトープの一覧である。「=」は、FabフラグメントおよびhIL-21分子間が4.0Å以下の距離であることを指す。「-」は、FabフラグメントおよびhIL-21分子間が4.0から5.0Åの間の距離であることを指す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
IL-21は、具体的に明記されている場合を除いて、ヒトのIL-21を指す。シグナル配列を含むIL-21のアミノ酸配列は、図1に示される(配列番号1)。成熟IL-21ポリペプチドは、配列番号1の残基30〜162に相当する。IL-21は、クラスIサイトカインに典型的な上-上-下-下の配置で並んだ4つのらせん状部分を特徴とする。IL-21は、専用の鎖IL-21RαならびにIL-2、IL-4、IL-7、IL-9およびIL-15が共有するγCからなるヘテロダイマー受容体複合体を介してシグナル伝達をする。IL-21Rαは、IL-21の結合部位1(BS1)を介して高い親和性でIL-21と結合する。一方で、IL-21とγCとの間の相互作用は、親和性が比較的低い。IL-21は、その結合部位2(BS2)を介してγCと結合する。シグナル伝達のためには、IL-21はIL-21RαおよびγCの両方と結合する必要がある。したがって、IL-21Rαに対して高い親和性があり、γCに対して親和性がないか、または強力に低減された親和性があるIL-21バリアントは、IL-21Rを発現している細胞の表面のIL-21Rαと結合することにより、細胞内のIL-21誘導シグナル伝達をブロックすることが予想される。
【００２５】
ヒトIL-21の構造は、NMR分光測定によって以前に確認された(Bondensgaardら、J. Biol. Chem.(2007年)、282巻、23326〜23336ページ)。遊離型または受容体鎖と複合体を形成したIL-21の結晶構造は、未だ発表されていないが、X線結晶学によって確認された、3つの受容体鎖との複合体(IL-2:IL2Rα:IL-2Rβ:γC)の状態の構造的に関連するIL-2分子が発表され、その座標が公に利用可能なデータベース(Protein Data Bank)に寄託された。
【００２６】
γCのIL-21との結合を妨げるリガンド:γCのIL-21との結合を妨げる能力をもつ本発明によるリガンドは、この文脈において、IL-21と結合することで、IL-21との結合についてγCと直接競合するか、またはそのIL-21と結合する能力/IL-21に対する親和性を低下させるリガンドを意味する。そのようなリガンドは、さらにIL-21RαのIL-21との結合を妨げることはない。これは、本発明によるリガンドが、BS2と重なるか、またはγC結合に対する立体障害をもたらすほどBS2と十分に近い場所に位置するエピトープと結合する場合もあり、それにより、IL-21と結合するγCの能力を少なくとも25%、好ましくは、少なくとも50%、好ましくは、少なくとも60%、好ましくは、少なくとも70%、好ましくは、少なくとも75%、好ましくは、少なくとも80%、好ましくは、少なくとも90%、最も好ましくは、少なくとも95%低下させることもあることを意味する。当然、本発明によるリガンドの結合はIL-21RαのIL-21との結合を著しく妨げないことから、本発明によるリガンドのIL-21のエピトープは、BS1から十分に離れている。γC結合の妨害は、実施例に示されるような、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)によって検出することができる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「処置」という用語は、それを必要とするあらゆるヒトまたはその他の動物対象の医学療法を指す。上記対象は、医師または獣医師による身体的診察を受け、上記の特定の処置の使用が上記ヒトまたはその他の動物対象の健康に対して有益であることを示すであろう仮の診断または確定診断を下されていることが要求される。上記処置の時期および目的は、対象の健康現状に従って個体ごとに変化することもある。したがって、上記処置は、予防、緩和、対症および/または治癒的であってもよい。
【００２８】
本発明に関して、予防、緩和、対症および/または治癒的処置は、本発明の個別の態様を表す場合もある。
【００２９】
本発明は、ヒトIL-21で発見されたエピトープに関する。したがって、このエピトープを含むポリペプチドは、三次元構造のヒトIL-21の少なくとも一部を共有するポリペプチドである。
【００３０】
ポリペプチドのフラグメントは、CまたはN末端で切断されているか、またはその配列から除去された1つまたは複数のアミノ酸をもつポリペプチドである。本発明の文脈において、フラグメントは、本発明のエピトープまたはパラトープを定める十分な三次元構造を保持していなければならない。
【００３１】
結合活性(または任意のその他の所望の活性)についてのスクリーニングは、当該技術分野において周知の方法に従って行われ、例えば、SPR(表面プラズモン共鳴)、FACS、ELISAなどである。スクリーニングにより、所望の特徴に従って範囲のメンバーの選択が可能になる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「単離」化合物とは、その本来の環境から取り出された化合物のことである。
【００３３】
IL-21バリアント:本発明によるIL-21模倣体/バリアントは、配列番号1に記載の少なくとも2つの以下のIL-21ペプチドセグメント:Glu 65からPhe 73、Lys 117からArg 119およびLeu 143からHis 151からの少なくとも1つのアミノ酸残基を含む不連続のエピトープを含む。そのような模倣体/バリアントは、多数の方法で作製されてもよく、その1つは、アミノ酸の挿入、置換または除去による未変性のIL-21の変異である。挿入、置換または除去は、分子中のその位置に応じて大きさおよび範囲が大きく変化することもある。例えば、C末端の除去が可能なように、大きなNまたはC末端の挿入は、本発明のエピトープを改変することなく許容され得る。他の位置の、さらに小さな挿入、除去または置換は、さらに許容され得る。
【００３４】
抗体:本明細書中で言及される場合、「抗体」という用語は、生殖系列免疫グロブリン(germline immunoglobulin)配列由来のポリペプチドを指す。この用語には、全長抗体および例えば、Fabフラグメントなどの任意の抗原結合性フラグメントならびにその他の一価抗体が含まれる。本明細書中で使用される場合、「抗体」、「モノクローナル抗体」および「mAb」という用語は、抗原と特異的に結合する能力をもつ免疫グロブリン分子およびそのフラグメントを指すことが意図される。特定の薬学的対象の免疫グロブリンのサブクラスは、IgGファミリーに属するものであり、これは、アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に細分できる。IgG分子は、2つまたはいくつかのジスルフィド結合によって連結された2つの重鎖および1つずつジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に結合した2つの軽鎖からなる。IgGの重鎖は、可変ドメイン(VH)ならびに3つの定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3)を含む4つのIgドメインからなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。VHおよびVL領域は、より保存されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域に散在し、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域(regions of hypervariability)にさらに細分することができる。VHおよびVLはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で並んだ3つのCDRおよび4つのFRからなる。
【００３５】
抗原結合性フラグメントの例としては、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(一般に、抗体の1つの腕のVLおよびVHドメイン)、単鎖Fv(scFv;例えば、Birdら、Science 1988年;242巻:42S〜426ページ;およびHustonら、PNAS 1988年;85:5879〜5883ページを参照のこと)、dsFv、Fd(一般に、VHおよびCHIドメイン)およびdAb(一般に、VHドメイン)フラグメント;VH、VL、VhHおよびV-NARドメイン;1つのVHおよび1つのVL鎖を含む一価の分子;ミニボディ(minibody)、ディアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)およびカッパボディ(kappa body)(例えば、Illら、Protein Eng 1997年;10巻:949〜57ページを参照のこと);ラクダIgG;IgNAR;ならびに機能性抗体フラグメントを形成するために単離CDRまたは抗原結合性残基もしくはポリペプチドを一緒に結合もしくは連結してもよい1つまたは複数の単離CDRまたは機能性パラトープが挙げられる。さまざまな種類の抗体フラグメントについて、例えば、HolligerおよびHudson、Nat Biotechnol 2005年;2S巻:1126〜1136ページ;WO2005040219ならびに米国特許出願公開第20050238646号および20020161201号に記載または概説されてきた。
【００３６】
本発明による抗体のFcドメインは、例えば、補体結合および/または特定のFcγ受容体との結合などの特定のエフェクター機能を調節するために改変されてもよい。Fcドメインは、胎児性Fc受容体(FcRn)に対する親和性を高めるためにさらに改変されてもよい。IgG1のFcドメインにおける位置234、235および237(EUインデックスによる残基ナンバリング)の変異は、一般にFcγRI受容体との結合ならびに、ことによるとFcγRIIaおよびFcγRIII受容体との結合も低減する。これらの変異は、FcRn受容体との結合は変えず、これは、エンドサイトーシスリサイクリング経路(endocytic recycling pathway)によって循環半減期(circulatory half life)を延長する。好ましくは、改変された本発明による抗体のIgG1 Fcドメインは、それぞれ、特定のFcγ受容体に対する親和性を低下させ(L234A、L235EおよびG237A)、C1qを介した補体結合を低減させる(A330SおよびP331S)ことになる前述の変異の1つまたは複数を含む(EUインデックスによる残基ナンバリング)。あるいは、Fcドメインは、S241P/S228P変異を任意選択で含むIgG4 Fcドメインであってもよい(S241Pは、Kabatによる残基ナンバリングを意味する、S228Pは、EUナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する(Edelman G.M.ら、Proc. Natl. Acad. USA 63巻、78〜85ページ(1969年))。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を意味する。本発明のヒト抗体としては、例えば、CDR、特にCDR3のヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、インビトロにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボにおける体細胞変異によって導入された変異)を挙げることもできる。しかしながら、本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体、例えば、いわゆる、「ヒト化抗体」またはヒト/マウスキメラ抗体を含むことは意図しない。
【００３８】
「キメラ抗体」という用語は、軽鎖および重鎖の遺伝子が一般に、遺伝子操作によって異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域および定常領域の遺伝子から構築された抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変セグメントがヒトの定常セグメントに連結されてもよい。
【００３９】
半減期延長部分:本発明によるリガンドは、血清半減期を増加させるために、例えば、循環半減期を増加させるための脂肪酸もしくは脂肪酸誘導体、PEG(ポリエチレングリコール)またはポリサッカライドポリマーなどのその他の水溶性ポリマーなどの分子を添加することによって改変されてもよい。「延長基(protractive group)」/「半減期延長部分」は、本明細書中では1つまたは複数のアミノ酸側鎖官能基、例えば、-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2または1つもしくは複数のN-および/もしくはO-グリカン構造と結合した1つまたは複数の化学基と解釈され、多くの治療用タンパク質/ペプチドと結合させた場合、こうしたタンパク質/ペプチドのインビボにおける循環半減期を増加させることができる。延長基/半減期延長部分の例としては、以下に限定されるものではないが、以下のものが挙げられる:生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサン(Heparosan)ポリマー(HEP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(PCポリマー)、Fleximer、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTENポリマー、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチドおよびそれらの任意の組み合わせ。
【００４０】
ビニング(binning)/競合結合:同じ抗原と結合する抗体は、それらに共通の抗原と同時に結合する能力に関して特徴づけることができる。抗体は、「ビニング」に供してもよく、本明細書の文脈においてこの用語は、同じ抗原と結合する抗体を分類する方法を指す。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISAまたはフローサイトメトリなどの標準的技術に基づくアッセイにおける2つの抗体の共通の抗原に対する競合結合に基づいてもよい。
【００４１】
「ビン(bin)」は、参照抗体によって規定される。第2の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できない場合、第2の抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると考えられ、この場合、参照抗体および第2の抗体は、抗原との結合について競合しているため、この対の抗体は、「競合抗体」と呼ばれる。第2の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できる場合、第2の抗体は、別々の「ビン」に属すると考えられる。この場合、参照抗体および第2の抗体は、その抗原との結合について競合していないため、この対の抗体は、「非競合抗体」と呼ばれる。
【００４２】
抗体「ビニング」は、直接エピトープについての情報を提供するものではない。競合する抗体、すなわち、同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープまたは、さらには別々のエピトープをもつ場合もある。後者は、抗原のエピトープと結合した参照抗体が、第2の抗体が抗原のエピトープと接触するために必要とされる空間をとる場合である(「立体障害」)。非競合抗体は、別々のエピトープをもつ。
【００４３】
エピトープ、パラトープおよび抗原:本明細書中で使用される場合、「エピトープ」という用語は、「抗原結合性分子」、例えば、抗体(Ab)とその対応する「抗原」(Ag)との間の分子の相互作用との関連で定義される。抗原(Ag)という用語は、Agを認識する抗体(Ab)を産生する免疫応答性脊椎動物の免疫化のために使用される分子要素を指す場合もある。本明細書中で、Agは、より広く使われ、Abによって特異的に認識される標的分子を含むことが一般に意図されるため、Abを産生させる免疫化過程において使用される分子のフラグメントまたは模倣体を含む。一般に、「エピトープ」は、Abが特異的に結合するAgの範囲または領域、すなわち、Abと物理的に接触する範囲または領域を指す。物理的な接触は、AbおよびAg分子中の原子についての距離基準により定義されてもよい(例えば、4Åの以下の距離)。
【００４４】
「不連続のエピトープ」とは、直鎖のペプチド配列においては互いに隣接していないが、立体構造的なエピトープを形成するためのポリペプチドの三次元構造においては並んでいるポリペプチドの2つ以上の領域によって形成されるエピトープのことである。他のタイプのエピトープとしては、以下のものが挙げられる:直鎖ペプチドエピトープ、抗原の三次元構造において互いに近接して位置する隣接していない2つ以上のアミノ酸からなる高次構造エピトープ(conformational epitope);および炭水化物基などの抗原と共有結合した分子構造の全体または部分のいずれかからなる翻訳後エピトープ(post-translational epitope)。
【００４５】
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)対についてのエピトープは、さまざまな実験およびコンピュータによるエピトープマッピング法を使用して異なるレベルの詳細さで定義および特徴づけることができる。実験方法としては、当該技術分野において既知の変異誘発、X線結晶学、核磁気共鳴(NMR)分光測定および水素重水素交換質量分析(Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry)(HX-MS)法が挙げられる。それぞれの方法は、固有の方式によるため、エピトープの説明は、測定した方法に密接に関連づけられる。したがって、利用されるエピトープマッピング法により、所与のAb/Ag対についてのエピトープは、さまざまに示されることになる。
【００４６】
最も詳細なレベルでは、AgとAbとの間の相互作用に関してエピトープを、Ag-Ab相互作用に存在する原子の接触を定義する空間座標ならびに結合熱力学に対するそれらの相対的寄与についての情報によって示すことができる。もう少し低い詳細レベルでは、エピトープをAgとAbとの間の原子の接触を定義する空間座標によって示すことができる。さらに低い詳細レベルでは、AbおよびAgの原子間距離などの特定の基準によって定義される場合に、エピトープが含むアミノ酸残基によってエピトープを示すことができる。さらに低い詳細レベルでは、例えば、その他のAbとの競合結合および「ビニング」によってAb-Ag相互作用を機能により特徴づけることができるが、競合結合からは、エピトープについての構造的な情報はまったく得られない。
【００４７】
例えば、FabフラグメントなどのAbと、そのAgとの複合体の空間座標によって定義されるX線により導き出された結晶構造の文脈において、エピトープという用語は、本明細書中では、他に指定がないか、または文脈に矛盾しない限り、Abの重原子から、例えば、4Åなどの約3.5から約5.0Å以内の距離の重原子(すなわち、非水素原子)を有することを特徴とするIL21残基と具体的に定義される。
【００４８】
使用されるエピトープマッピング法によって決まるエピトープの説明および定義は、異なるレベルの詳細で得られるという事実から、当然、同じAgに対するさまざまなAbについてのエピトープの比較は、同様に異なるレベルの詳細で行うことができる。
【００４９】
例えば、X線構造によって決定されたアミノ酸レベルで示されるエピトープが、同じセットのアミノ酸残基を含む場合、同一であると考えられる。エピトープが少なくとも1つのアミノ酸を共有する場合、エピトープは、一部が重なると考えられる。エピトープがアミノ酸残基を全く共有しない場合、エピトープは、別々(固有)であると考えられる。
【００５０】
「パラトープ」という用語の定義は、観点を逆転させることによって上記「エピトープ」の定義から導き出される。したがって、「パラトープ」という用語は、Agが特異的に結合する、すなわち、Agと物理的に接触するAbの範囲または領域を指す。
【００５１】
FabフラグメントなどのAbとそのAgとの複合体の空間座標によって定義されるX線により導き出された結晶構造の文脈において、エピトープという用語は、本明細書中では、他に指定がないか、または文脈に矛盾しない限り、IL21の重原子から約4Å(3.5から5.0Å)以内の距離の重原子(すなわち、非水素原子)を有することを特徴とするAb残基と具体的に定義される。
【００５２】
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)対についてのエピトープおよびパラトープは、通常の方法によって示されてもよい。例えば、エピトープの全体的な位置は、IL21の異なるフラグメントまたはバリアントと結合する抗体の能力を評価することによって求めてもよい。抗体と接触するIL21内の特定のアミノ酸(エピトープ)およびIL21と接触する抗体の特定のアミノ酸(パラトープ)も通常の方法を使用して求めてもよい。例えば、AbおよびAg分子が混合されてもよく、Ab/Ag複合体が結晶化されてもよい。複合体の結晶構造が求められ、AbとAgとの間の相互作用の詳細な部位を特定するために使用されてもよい。
【００５３】
1箇所の相互作用を介した2つの分子、例えば、抗体またはそのフラグメントと抗原との間の結合親和性は、平衡解離定数(KD)の算出によって定量されてもよい。さらには、KDは、例えば、SPR法による複合体形成および解離反応速度の測定によって求めることができる。一価の複合体(monovalent complex)の結合および解離に対応する速度定数は、それぞれ結合速度定数ka(またはkon)および解離速度定数kd(またはkoff)と呼ばれる。KDは、式KD=kd/kaによりkaおよびkdと関連している。上記の定義に従って、異なる分子の相互作用と関連づけられる結合親和性、例えば、所与の抗原に対するさまざまな抗体の結合親和性の比較は、個々の抗体/抗原複合体についてのKD値の比較によって比較されてもよい。
【００５４】
非抗体リガンド:本発明によるエピトープに対して特異的なリガンドは、本明細書に記載されるエピトープに対して特異的な分子スカフォールド(タンパク質または炭水化物スカフォールドなど)の上に構築された1つまたは複数のIL-21結合部を含む抗体模倣体も包含してもよい。一般に、タンパク質スカフォールドと呼ばれる、相対的に定められた三次元構造を有するタンパク質が抗体模倣体設計のための鋳型として使用されてもよい。こうしたスカフォールドは、一般に、特異的またはランダムな配列変化が起こりやすい1つまたは複数の領域を含み、そのような配列のランダム化は、所望の産生物が選択され得るタンパク質ライブラリーをつくるために行われることが多い。例えば、抗体模倣体は、それぞれのループに挿入された親抗体の異なるCDRを含む溶媒曝露された2つ以上のループを有するスカフォールドを含む免疫グロブリン様ドメインをもち、親抗体が結合するリガンドに対して選択的結合活性を示すキメラの非免疫グロブリン結合ポリペプチドを含んでもよい。非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドは、新規の結合特性をもつタンパク質を得るために提案されてきた。
【００５５】
リガンドの構造:上記のとおり、本明細書中で言及される場合、リガンドは、抗体(例えば、IgG、IgM、IgA、IgE)または互いに相補的であるため、互いに結合してVH/VL対を形成することができる少なくとも1つの重鎖および軽鎖可変ドメインを含むそのフラグメント(例えば、Fab、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、ディアボディ)であってもよい。リガンドは、抗体を天然に産生する任意の種に由来するものであってもよく、または血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ(transfectoma)、哺乳類細胞、酵母菌または細菌のいずれから単離されたものであれ、組換えDNA技術によって作り出されたものであってもよい。
【００５６】
治療応用:IL-21は、T細胞を介する免疫に関与し、いくつかの炎症性サイトカインを促すことが示されてきた。したがって、本発明によるリガンドは、炎症、自己免疫、そのような機構が関与する状態などの不適正なまたは望まれない免疫応答が関与する疾患(免疫学的障害)ならびに移植片対宿主病の処置に使用することができる。一実施形態において、そのような疾患または障害は、自己免疫性疾患および/または炎症性疾患である。そのような自己免疫性疾患および/または炎症性疾患の例は、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ(RA)および炎症性腸疾患(IBD)(潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)など)、多発性硬化症(MS)、強皮症および1型糖尿病(T1 D)、ならびにPV(尋常性天疱瘡)、乾癬、アトピー性皮膚炎、小児脂肪便症、kol、橋本病、グレーブス病(甲状腺)、シェーグレン症候群、ギラン-バレー症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆管硬化症(primary biliary sclerosis)、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発筋痛、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、ぶどう膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、I型糖尿病、大腸炎関連腫瘍(Colitis-Associated Tumorigenesis)および白斑などのその他の疾患および障害である。
【００５７】
一実施形態において、そのような疾患または障害はSLE、RAまたはIBDである。一実施形態において、そのような疾患または障害はMSである。
【００５８】
本発明のIL-21リガンドは、当該技術分野において既知のその他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。
【００５９】
本発明は、薬学的に許容される担体および本発明によるポリペプチド/リガンド/抗体を含む医薬組成物/製剤ならびにそのような組成物を含むキットをさらに含む。本発明による医薬組成物は、水溶性製剤または投与前に水/水性緩衝液に溶かれる乾燥製剤の形態であってもよい。
【００６０】
本発明によるリガンド/抗体/ポリペプチドを含む医薬組成物は、本発明による化合物を含む容器を含むキットとして供給されてもよい。治療用のポリペプチドは、単回用量もしくは多回用量の注射可能な溶液または注射の前に溶かれる殺菌粉末の形態で提供されてもよい。本発明による化合物を含む医薬組成物は、皮下および/またはIV投与に適している。
【００６１】
併用処置:本発明による抗体は、1つまたは複数のその他の治療用薬剤または製剤と同時投与されてもよい。その他の薬剤は、患者の他の症状または状態を処置する目的であってもよい。例えば、その他の薬剤は、鎮静剤、免疫抑制剤または抗炎症剤であってもよい。
【００６２】
2つ以上の薬剤の併用投与は、いくつかのさまざまな方法で達成されてもよい。一実施形態において、抗体およびその他の薬剤は、単一の組成物としてともに投与されてもよい。別の実施形態において、抗体およびその他の薬剤は、併用療法の一部として個々の組成物で投与されてもよい。例えば、修飾薬が、その他の薬剤の前、後またはそれと同時に投与されてもよい。
【００６３】
本発明による抗体/タンパク質は、その他の薬物(例えば、メトトレキサート、デキサメタゾンおよびプレドニゾン)ならびに/またはその他の生物学的薬物とともに投与されてもよい。自己免疫に既に使用されている薬剤としては、IFNベータ、オレンシア(CTLA4-Ig)、ヒュミラ(抗TNF)、シムジア(抗TNF、PEG Fab)、タイサブリ(a4-インテグリンmAb)、シンポニー、リツキサン/マブセラ、アクテムラ/RoActemra、Kineretなどの免疫修飾薬(immune modulator)、アスピリン、イブプロフェンなどのような非ステロイド系抗炎症性薬(NSAIDS)、副腎皮質ステロイド薬、プラケニル、アザルフィジン、メトトレキサートなどのような疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARDS)、Copaxone(グラチラマー酢酸塩)、ジレニア(フィンゴリモド)、フラジール、シプロのような抗生物質、局所用副腎皮質ステロイド薬、ビタミンD類似体クリーム(ドボネックス)、局所用レチノイド(Tazorac)、保湿剤、局所用の免疫調節薬(タクロリムスおよびピメクロリムス)、コールタール、アントラリンおよびその他などの局所用の(皮膚に塗布される)薬物、ラプティバ、ウステキヌマブ、PUVA、UVBのような光線療法、セルセプト(ミコフェノール酸モフェチル)が挙げられる。
【００６４】
実施形態
以下の実施形態の一覧は、本発明の実施形態の例を表す。したがって、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６５】
1.配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67およびHis 149を含むエピトープを含むIL-21模倣体。
【００６６】
2.前記模倣体のエピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Arg 40、Lys 50、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142およびGln 145のうちの1つまたは複数をさらに含む、実施形態1に記載の模倣体。
【００６７】
3.前記模倣体のエピトープは、以下のアミノ酸:Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、Gln 150およびHis 151のうちの1つまたは複数をさらに含む、実施形態1に記載の模倣体。
【００６８】
4.前記模倣体のエピトープは、以下のアミノ酸:Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、Gln 150およびHis 151をさらに含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の模倣体。
【００６９】
5.IL-21と結合するリガンドを選択するための方法であって、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のIL-21模倣体を用いて1つまたは複数のリガンドのライブラリーをスクリーニングするステップおよび前記エピトープと結合する1つまたは複数のリガンドを単離するステップを含む方法。
【００７０】
6.IL-21と選択的に結合するリガンドを選択するための、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のIL-21模倣体の使用。
【００７１】
7.好ましくは抗体であり、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のIL-21模倣体のエピトープと特異的に結合するリガンドであって、ただし、(i)天然の共通のγC(配列番号8)でも、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるモノクローナル抗体mAb14でもない、リガンド。リガンドが抗体である場合、抗体は、モノクローナルmAb14抗体ではない。
【００７２】
8.好ましくは抗体であり、IL-21のエピトープと結合するリガンドであって、前記エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸Arg 40からVal 67の1つまたは複数ならびにアミノ酸Glu 129からHis 149の1つまたは複数を含むが、ただし、このリガンドは、(i)天然の共通のガンマ鎖(配列番号8)でも、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14でもない、リガンド。前記リガンドは、好ましくは、アミノ酸Glu 65からVal 67の1つまたは複数およびアミノ酸Glu 129からHis 149の1つまたは複数を含む。リガンドが抗体である場合、抗体は、モノクローナルmAb14抗体ではない。
【００７３】
9.IL-21と結合するリガンドであって、好ましくは抗体であり、配列番号1に記載のアミノ酸Arg 40、Lys 50、Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145およびHis 149の少なくとも1つと結合するが、ただし、(i)天然の共通のγC(配列番号8)でも、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14でもない、リガンド。
【００７４】
10.配列番号1に記載のアミノ酸Arg 40、Lys 50、Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145およびHis 149と結合する、実施形態9に記載のリガンド。
【００７５】
11.IL-21と結合するリガンドであって、好ましくは抗体であり、IL-21(配列番号1)のアミノ酸Glu 72からAla 82の少なくとも1つと結合するが、ただし、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、リガンド。好ましくは、前記リガンドは、アミノ酸Glu 65からTrp 73の少なくとも1つと結合するが、ただし、このリガンドは、天然の共通のγC(配列番号8)でも、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14でもない。前述のリガンドが抗体である場合、抗体は、モノクローナルmAb14抗体ではない。
【００７６】
12.好ましくは抗体であり、IL-21(配列番号1)のアミノ酸Asn 70、Glu 72およびTrp 73と結合する、実施形態7〜11のいずれか1つに記載のリガンド。
【００７７】
13.好ましくは抗体であり、配列番号1に記載のアミノ酸Glu 65、Asp 66およびVal 67の1つまたは複数とさらに結合する、実施形態7〜12のいずれか1つに記載のリガンド。
【００７８】
14.好ましくは抗体であり、配列番号1に記載のアミノ酸His 149とさらに結合する、実施形態7〜13のいずれか1つに記載のリガンド。
【００７９】
15.好ましくは抗体であり、配列番号1に記載のアミノ酸Glu 65、Asp 66、Val 67およびHis 149と結合する、実施形態7〜14のいずれか1つに記載のリガンド。
【００８０】
16.IL-21と結合するリガンドであって、好ましくは抗体であり、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Arg 40、Lys 50、Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145およびHis 149の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個を含むエピトープと結合し、ただし、(i)天然の共通のガンマ鎖(配列番号8)でも、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14でもない、リガンド。好ましくは、リガンドは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Arg 40、Lys 50、Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145およびHis 149と結合する。
【００８１】
17.好ましくは抗体であり、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Arg 40、Lys 50、Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 129、Glu 135、Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145およびHis 149を含むエピトープと結合する、実施形態16に記載のリガンド。
【００８２】
18.好ましくは抗体であり、以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個を含むエピトープと結合する、実施形態7〜15のいずれか1つに記載のリガンド。
【００８３】
19.IL-21と結合するリガンドであって、好ましくは抗体であり、以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151を含むエピトープと結合し、ただし、(i)天然の共通のγC(配列番号8)でも、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14でもない、リガンド。
【００８４】
20.好ましくは抗体であり、配列番号6に記載のCDR1、CDR2およびCDR3の1つ、2つまたは3つならびに配列番号7に記載のCDR1、CDR2およびCDR3の1つ、2つまたは3つを含み、ただし、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、実施形態7〜19のいずれか1つに記載のリガンド。mAb14抗体は、WO2010/055366に開示され、そこで、ハイブリドーマクローン番号366.328.10.63と指定された抗体と同じ抗体である。
【００８５】
21.好ましくは抗体であり、共通のγCとのIL-21の結合を妨げる、実施形態7〜20のいずれか1つに記載のリガンド。
【００８６】
22.抗体である、実施形態7〜21のいずれか1つに記載のリガンド。この抗体は、抗体、モノクローナル抗体、抗体の抗原結合性フラグメント、一価抗体、二価抗体であってもよい。この抗体は、ヒトまたはヒト化形態の任意の上記のものであってもよい。
【００８７】
23.前記抗体はIgG1抗体である、実施形態22に記載のリガンド。このリガンドは、あるいはIgG4抗体であってもよい。
【００８８】
24.前記抗体は、抗体エフェクター機能をもたらすFcドメインを含む、実施形態22〜23のいずれか1つに記載のリガンド。
【００８９】
25.低減されたエフェクター機能を有するFcドメインを含む、実施形態24に記載のリガンド。
【００９０】
26.それぞれ(EUインデックスによる残基ナンバリング)特定のFc受容体(L234A、L235EおよびG237A)に対する親和性を低下させ、C1qを介した補体結合(A330SおよびP331S)が低減される1つ、2つ、3つ、4つまたは全部の変異を含むIgG1のFcドメインを含む、実施形態25に記載のリガンド。そのようなリガンドは、比較的長いインビボ半減期および著しく低減されたエフェクター機能を保持することになる。
【００９１】
27.前記リガンドは、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14のバリアントである抗体であり、前記リガンドは、CDR配列に1つまたは複数の変異を含み、前記変異は、A61S(配列番号7)、D62E(配列番号7)、V64I(配列番号7)およびK65R(配列番号7)、R24K(配列番号6)、S26T(配列番号6)、Q27N(配列番号6)、D30E(配列番号6)、S53T(配列番号6)およびS56T(配列番号6)からなる一覧の1つまたは複数から選択される、実施形態20に記載のリガンド。したがって、これらの変異のそれぞれは、別々の実施形態を表す。それらの任意の組み合わせも、別々の実施形態を表す。
【００９２】
28.IL-21のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73の1つまたは複数、以下のアミノ酸Lys 117、His 118、Arg 119の1つまたは複数ならびに以下のアミノ酸:Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151の1つまたは複数を含むが、ただし、この抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるモノクローナル抗体mAb14ではない、抗体。この抗体は、あるいは、IL-21のエピトープと結合してもよく、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118およびArg 119の1つまたは複数ならびに以下のアミノ酸:Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151の1つまたは複数を含む。この抗体は、あるいは、IL-21のエピトープと結合してもよく、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72およびTrp 73の1つまたは複数ならびに以下のアミノ酸:Lys 117、His 118およびArg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151の1つまたは複数を含む。
【００９３】
29.IL-21のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65からTrp 73の1つまたは複数、以下のアミノ酸:Lys 117からArg 119の1つまたは複数および以下のアミノ酸:Leu 143からHis 151の1つまたは複数を含むが、ただし、この抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるモノクローナル抗体mAb14ではない、抗体。この抗体は、あるいは、IL-21のエピトープと結合してもよく、前記エピトープは、配列番号1に記載の以下のアミノ酸:Glu 65からTrp 73の1つまたは複数および以下のアミノ酸:Leu 143からHis 151の1つまたは複数を含む。
【００９４】
30.IL-21のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸Arg 40からVal 67の1つまたは複数およびアミノ酸Glu 129からHis 149の1つまたは複数を含むが、ただし、この抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【００９５】
31.IL-21のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、IL-21(配列番号1)のアミノ酸Glu 65からTrp 73の1つまたは複数を含むが、ただし、この抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【００９６】
32.IL-21のエピトープと結合する抗体であって、前記エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸Glu 65、Asp 66、Val 67およびHis 149の1つまたは複数を含むが、ただし、この抗体は、軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号6および配列番号7に記載されるmAb14ではない、抗体。
【００９７】
33.実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体および任意選択で1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。そのような賦形剤/担体は、当該技術分野において周知である。そのような医薬組成物は、好ましくは、IV投与および/または皮下投与用である。
【００９８】
34.実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体を含むキット。
【００９９】
35.実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の薬剤としての使用。
【０１００】
36.免疫学的障害を処置するための、実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の使用。
【０１０１】
37.自己免疫疾患を処置するための、実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の使用。
【０１０２】
38.SLEを処置するための、実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の使用。
【０１０３】
39.RAを処置するための、実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の使用。
【０１０４】
40.IBDを処置するための、実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の使用。
【０１０５】
41.CDを処置するための、実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体の使用。
【０１０６】
42.免疫学的障害を処置する方法であって、それを必要とする人に適切な用量の実施形態7〜32のいずれか1つに記載のリガンド/抗体を投与するステップを含む方法。
【０１０７】
本明細書中におけるmAb14(Fab35)のFabフラグメントとIL-21との複合体の結合面などの詳細な三次元構造の情報の提供は、所望の特性をもち相互作用する分子のバリアントを合理的に設計するための基礎をなしてもよい。改善が望ましい場合もある抗体の特性は、溶解度、粘度および安定性などの化学的または物理的特性であってもよい。改変が望ましい場合もあるその他の特性は、抗体の抗原特性および抗抗体によって結合されるその能力である。
【０１０８】
(実施例)
(実施例1)
mAb14のFabフラグメント(Fab35)と複合体を形成したIL-21の結晶構造
ヒト抗IL-21モノクローナル抗体mAb14のFabフラグメント(Fab35)と複合体を形成したIL-21の三次元構造を解明し、X線結晶学を使用して1.64Åの分解能で精密化した。この結果は、IL-21にあるFab35(mAb14を表す)のエピトープが、mAb5のものと比較した場合に、IL-21分子の完全に異なる部分に位置し、異なる結合様式で結合することを示している。「mAb5」は、WO2010055366において開示されているクローン362.78.1.44抗体のIgG1の一種に当たり、mAb5のFc領域は、L234A、L235EおよびG237A(低減されたFc受容体結合)ならびにA330SおよびP331S変異(低減されたC1qを介した補体結合)をもつ。mAb5は、IL-21のらせんAおよびCの表面の露出した面と結合するのに対して、Fab35(mAb14)は、4つのらせん束の一方の末端にむかって結合して、露出したループと相互作用するが、トリプトファン残基の側鎖、重鎖のW102をらせんBとDの間に挿入することによってさらにIL-21分子に入り込み、それにより、らせんDのC末端部分をわずかにゆがませる。Fab35(mAb14を表す)は、mAb5のようにIL-21RαのIL-21との結合と競合する代わりに、γCのIL-21との結合と競合し、その高い結合親和性によりγCのIL-21との結合をブロックすることになる。したがって、mAb14は、γCを介してIL-21によってもたらされる生物学的影響を阻害することになる。
【０１０９】
記載のエピトープを、Fab35とIL-21との複合体の構造を使用して特徴づけた。しかしながら、IL-21のFab35のエピトープに関する結論は、IL-21と、Fab35が由来する対応する完全な抗体、mAb14との相互作用にも適用されることになる。
【０１１０】
pH5.3の10mMのヒスチジン緩衝液中のhIL-21(成熟ペプチドとして大腸菌(E.coli)に発現させた;N末端のメチオニン残基を付け加えた配列番号:1の残基30〜162)およびpH7.4のPBS緩衝液(2リットルの水に4錠剤、GIBCOカタログNo.18912-014 Invitrogen Corporation)に配合された(配列番号9に対応する軽鎖および配列番号10に対応する重鎖フラグメントを含む)抗IL-21Fab35を、1:1のモル比で混合した。複合体の最終濃度を10.3mg/mlとした。1:1の割合(沈殿剤溶液体積:タンパク質溶液体積)で混合した30%w/vPEG1000および200mMギ酸マグネシウムにおけるシッティングドロップ技術により結晶を成長させた。全体のドロップ大きさを0.2μlとした。75%の沈殿剤溶液および25%グリセロールを含む3μlの低温溶液を、結晶を含むドロップに移し、約30秒間浸すことによって、低温凍結するための結晶を作製した。その後、その結晶を液体N2中で急速凍結し、極低温のN2ガス流によってデータ収集の間100Kの温度に維持した。MAX-lab、ルンド、スウェーデンにおけるビームラインBL911-2(1)において1.64Åの分解能で結晶学的データを収集した。データの空間群決定、積分およびスケーリングは、XDSソフトウェアパッケージ(2)によって行った。データの格子パラメータを、それぞれ89.4、65.2、106.7Å、90°、111.57°および90°ならびに空間群をC2と決定した。1.64Åの分解能に対するR-symは6.4%、完全性は98.2%であった。CCP4スイート(5)のPHASERソフトウェアプログラム(3;4)を使用した分子置換技術を構造決定に使用した。IL-21と複合体を形成した抗IL-21 Fab9(mAb5に対応する)のX線構造(結果は公開されていない)をPHASERソフトウェア用のインプットモデルとして使用した。PHASERソフトウェア用のインプットとしてFabとは別にFab9:IL-21複合体構造のIL-21分子も使用した。その後、初期段階のモデル構築のためにソフトウェアARP/wARP(6)を使用した後、CCP4ソフトウェアパッケージのソフトウェアプログラムREFMAC5(7)およびPHENIXソフトウェアパッケージ(9)のソフトウェアプログラムPHENIX.REFINE(8)を使用した結晶学的精密化ならびにCootソフトウェアプログラム(10)を使用した電子密度図、モデル修正および構築のコンピュータグラフィックス検証を行った。モデルがそれ以上大幅に改善できなくなるまで上記手順を繰り返した。最終的な全データのR-およびR-freeは、それぞれ0.179および0.211であり、このモデルは、0.022Åの理想的な結合長の平均二乗偏差(RMSD)を示した。
【０１１１】
結果
Fab35の結合部位は、γCのIL-21との結合と競合し、その高い結合親和性によりγCのIL-21との結合をブロックすることになる。したがって、これは、γCを介してIL-21によってもたらされる生物学的影響を阻害することになる。
【０１１２】
結晶構造状態のIL-21/Fab35分子複合体について、CCP4プログラムスイート(5)のソフトウェアプログラムAreaimol(11;12)によって一組の相互作用において除外された面積の計算値はそれぞれ、IL-21についてが1082Å2および抗IL-21についてが1041Å2であった。IL-21分子およびFab35との間の一組の相互作用において除外された平均面積は、1061Å2と算出された。
【０１１３】
IL-21とFab35との間の直接的接触については、Fab35およびIL-21分子間に4.0Åのカットオフ距離を使用してCCP4プログラムスイート(5)のcontactソフトウェアを動作させることによって特定した。IL-21/Fab35複合体結晶構造の結果をTable 1に示す。Fab35(mAb14を表す)についての得られたIL-21のエピトープは、IL-21(配列番号1)の以下の残基を含むことがわかった:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150およびHis 151。
【０１１４】
したがって、Fab35(mAb14)のエピトープは、らせんBのN末端部分の残基(残基72〜73)およびらせんDのC末端部分の残基(残基143〜151)を含む。さらに、らせんBに続くループ部分(残基65〜70)およびらせんCとらせんDの間のループ(残基117〜119)にいくつかの接触残基を特定した。このエピトープは、予測されるγCのIL-21との結合部位と部分的に重なる部分をもつ。
【０１１５】
IL-21に対するFab35(mAb14を表す)のパラトープは、軽(L)鎖(配列番号9、Table 2)の残基Ser 31、Asp 50、Phe 91、Asn 92およびTyr 94ならびに重(H)鎖(配列番号10、Table 2)の残基Ile 28、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Ser 33、Thr 52、Ser 53、Gly 54、Ser 55、Tyr 56、Tyr 57、His 59、Glu 99、Arg 100、Gly 101、Trp 102、Gly 103、Tyr 104およびTyr 105を含む。Fab35フラグメント/mAb14抗体についてのエピトープを図2に示す。
【０１１６】
【表１Ａ】
2014518198.tif 000002
【０１１７】
【表１Ｂ】
2014518198.tif 000003
【０１１８】
【表１Ｃ】
2014518198.tif 000004
【０１１９】
【表２Ａ】
2014518198.tif 000005
【０１２０】
【表２Ｂ】
2014518198.tif 000006
【０１２１】
【表２Ｃ】
2014518198.tif 000007
【０１２２】
【表２Ｄ】
2014518198.tif 000008
【０１２３】
【表２Ｅ】
2014518198.tif 000009
【０１２４】
【表３】
2014518198.tif 000010
【０１２５】
(実施例2)
BS1、BS2、mAb14およびmAb5のエピトープの説明および比較
この実施例で提供する結合部位およびエピトープは、3つの実験的(結晶/X線)構造および1つのホモロジーモデルに基づく。3つの結晶構造とは以下のものである:
(i)IL-21:IL-21Rα複合体、
(ii)IL-21:Fab35複合体(「Fab35」は、mAb14に対応するFabフラグメントである)および
(iii)IL-21:Fab9複合体(「Fab9」は、WO2010/055366において開示されている362.78.1.44抗体と称されるmAb5に対応するFabフラグメントである)。
【０１２６】
IL-21:IL-21Rαの結晶構造(PDB、3TGX)は、三元のIL-21:IL-21Rα:γC複合体のモデルを構築するための基礎を提供したのものである。鋳型としてIL-21:IL-21Rα、IL-2:IL-2RA:IL-2RB:γCおよびIL-4:IL-4R:γC複合体を使用してIL-21:IL-21Rα:γC複合体のホモロジーモデルを構築した。注意すべき点は、このモデルには軽微な誤りがある可能性もあり、そのような誤りが、BS2に属するIL-21残基の予測の正確さに影響を及ぼすことになることである。
【０１２７】
受容体結合部位およびエピトープは、4Åのカットオフ距離を使用して実験的構造およびモデル構造から決定される。
【０１２８】
IL-21:IL21Rα複合体の結晶構造から決定されたIL-21のBS1残基(配列番号1)は、以下の残基を含む:
【０１２９】
【表４】
2014518198.tif 000011
【０１３０】
IL-21:IL21Rα:γC複合体のホモロジーモデル構造から決定されたIL-21のBS2残基は、以下の残基を含む:
【０１３１】
【表５】
2014518198.tif 000012
【０１３２】
IL-21:Fab35複合体の結晶構造(実施例1)から決定されたIL-21のエピトープ残基(mAb14)は、以下の残基を含む:
【０１３３】
【表６】
2014518198.tif 000013
【０１３４】
IL-21:Fab9複合体の結晶構造(結果は公開されていない)から決定されたIL-21のエピトープ残基(mAb5)は、以下の残基を含む:
【０１３５】
【表７】
2014518198.tif 000014
【０１３６】
BS1、BS2、mAb14およびmAb5のエピトープ残基を、図2のIL-21の一次配列上にマッピングしている。予測されるBS2とmAb14のエピトープとの間の重複部分は、アミノ酸残基E65、D66、V67およびH149に対して観察されている。
【０１３７】
(実施例3)
表面プラズモン共鳴(SPR)によるヒトIL-21の抗IL-21 mAbおよびIL-21Rα/γCサブユニットとの共結合(co-binding)の研究
表面プラズモン共鳴により分子の相互作用をリアルタイムで測定するBiacore T100計器によって結合の研究を行った。実験は、25℃で行った。Biacoreによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、4つの連続したフローセルにある個々のセンサーチップ表面の質量と直接対応する。
【０１３８】
製造業者の使用説明書に従って、抗IL-21モノクローナル抗体mAb6、mAb14およびmAb19をCM5センサーチップのフローセル上に直接固定化した。「mAb6」は、WO2010055366において開示されているクローン362.78.1.44抗体のIgG1の一種に当たり、mAb6のFc領域は、低減されたFc受容体結合についてのL234A、L235EおよびG237Aならびに低減されたC1qを介した補体結合についてのA330SおよびP331S変異を含む。すなわち、mAb6は、mAb5と同じ抗体である。2つの抗体の異なる点は、mAb産生に使用される哺乳類発現宿主だけである。「mAb19」は、WO2007111714に開示されているクローン「272.21.1.13.4.2」/「272.21.1.3.4.2」によって産生される抗体である。抗体の最終的な固定化レベルは、1回の実験でおよそ500〜800RUであった。IL-21の捕捉は、ランニング緩衝液(10mM Hepes、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性剤P20、pH7.4)中にタンパク質を100nMに希釈し、フローセル2に30μl/minで120秒間注入することによって行い、それぞれの抗IL-21抗体のみが固定化されたフローセル1に基準表面を作り出した。これにより、一般に、およそ40から140RUのIL-21の最終的な捕捉レベルがもたらされた。hIL-21Rαの細胞外ドメイン、hIL21Rα-ECDまたはγC-ECDの結合は、検体を全フローセルに注入することによって行われ、基準フローセルとの結合と比較して、異なる抗IL21抗体によって捕捉されたIL-21との結合の比較分析が可能になる。IL-21Rα-ECDまたはγC-ECDタンパク質を、ランニング緩衝液中に0.3〜10または625nM〜10μMに1:2連続希釈し、30μl/minで120秒間注入し、300秒間解離させた。CM5表面は、1Mのギ酸を30μl/minで8秒、2回注入することにより、検体の各注入サイクルの後に再生させた。この再生段階により、IL-21および結合したいかなるhIL-21Rα-ECDまたはγC-ECD鎖も固定化された捕捉抗体表面から除去され、次の相互作用サンプル対の次の結合を可能にする。この再生手順では、直接固定化された抗IL-21捕捉抗体はチップ表面から除去されない。
【０１３９】
データ分析を、Biacore T100評価ソフトウェア2.0.3を使用して行った。基準対照表面との有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線を、ダブルリファレンス(double referencing)によって処理した(基準表面シグナルならびに捕捉されたIL-21上への何も含まれていない緩衝液の注入の減算)。これにより、計器ノイズ、サンプル注入時の大部分のシフトおよびドリフトを修正できる。
【０１４０】
固定化されたmAb6によって捕捉されたIL-21が、同時にhIL-21Rα-ECDと相互作用できなかったことは、この抗体がIL-21のBS1に結合するか、またはその近くに結合するため、hIL-21Rα受容体サブユニットのこの部位との結合に対して競合することを証明している。対照的に、mAb14によって捕捉されたIL-21がIL-21Rα-ECDと安定な複合体を形成できたことは、mAb14がこの受容体サブユニットのBS1との結合に対して競合しないため、IL-21にある別のエピトープと結合することを証明している。
【０１４１】
同じ競合研究を、γC-ECDとともにmAb14およびmAb6を用いて行った。固定化されたmAb14によって捕捉されたIL-21が、同時にγC-ECDと相互に作用できなかったことは、この抗体がIL-21のBS2に結合するか、またはその近くに結合するため、γC受容体サブユニットのこの部位との結合に対して競合することを証明している。対照的に、mAb6によって捕捉されたIL-21がγC-ECDと弱く結合できたことは、mAb6がこの受容体サブユニットのBS2との結合に対して競合しないため、IL-21にある別のエピトープと結合することを証明している。mAb19によって捕捉されたIL-21は、同時にIL-21Rα-ECDともγC-ECDとも結合できなかったが、これについてのメカニズムは明らかでない。
【０１４２】
【表８】
2014518198.tif 000015
【０１４３】
SPR結合競合研究により、mAb6およびmAb14は、IL-21のそれぞれの結合部位に対するIL-21受容体複合体の異なる受容体サブユニットの結合を妨げることから、これらの抗体は別々のメカニズムによって働くことが明らかに示されている。さらに、mAb/IL-21/IL-21受容体の研究については、実施例16に記載する。
【０１４４】
(実施例4)
表面プラズモン共鳴(SPR)によるIL-21に対する抗IL-21抗体mAb37についての相互作用カイネティクスの研究
表面プラズモン共鳴により分子の相互作用をリアルタイムで測定するBiacore T200計器によって結合の研究を行った。実験は、25℃で行い、サンプルをサンプル区画に10℃で保存した。Biacoreによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、4つの連続したフローセルにある個々のセンサーチップ表面の質量と直接対応する。
【０１４５】
製造業者の使用説明書に従って、BiacoreヒトFc捕捉キットの抗ヒトFcモノクローナル抗体をCM4センサーチップのフローセル上に固定化した。捕捉抗体の最終的な固定レベルは、1回の実験でおよそ2,000RUであった。IgG4のヒンジ領域に、半抗体(half antibody)の形成を妨げるが、抗原との結合には影響を及ぼさない1つの点変異、S241P(Kabatによるナンバリング)を含むmAb14のバリアントであるmAb37を用いてカイネティクス研究を行った。ヒト抗IL-21抗体mAb37の捕捉は、ランニング緩衝液(10mM Hepes 0.3M NaCl、5mM CaCl2、0.05%界面活性剤P20、pH8.0、1mg/mlのBSAを含む)中に抗体を0.1μg/mlに希釈し、フローセル2〜4のうちの1つに10μl/minで180秒間注入することによって行い、抗Fc抗体のみが固定化されたフローセル1に基準表面を作り出した。これにより、一般に、およそ30〜50RUの試験抗体の最終的な捕捉レベルおよび6〜8RUの検体のRmax値が得られた。IL-21タンパク質の結合は、検体を全フローセルに注入することによって行い、基準フローセルとの結合と比較して、異なる捕捉抗IL-21抗体との結合の比較分析が可能になる。IL-21タンパク質を、ランニング緩衝液中に0.2〜54nMに1:3連続希釈し、100μl/minで210秒間注入し、600または14000秒間解離させた。CM4表面は、3MのMgCl2を50μl/minで2回注入することにより、検体の各注入サイクルの後に再生させた。この再生段階により、抗IL-21抗体およびあらゆる結合IL-21も固定化された捕捉抗体表面から除去され、次の相互作用サンプル対の次の結合を可能にする。この再生手順では、直接固定化された抗Fc捕捉抗体はチップ表面から除去されない。
【０１４６】
ka(結合速度)、kd(解離速度)およびKD(平衡解離定数)などのカイネティクスデータを得るために、データを1:1 Langmuirモデルに合わせてBiacore T200評価ソフトウェア1.0を使用してデータ分析を行った。基準対照表面との有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線を、ダブルリファレンスによって処理した(基準表面シグナルならびに捕捉された抗IL-21抗体上への何も含まれていない緩衝液の注入の減算)。これにより、計器ノイズ、サンプル注入時の大部分のシフトおよびドリフトを修正できる。
【０１４７】
ヒトIL-21は、現在使用されるアッセイによって正確に測定できる解離速度未満(kd<1E-5s-1)でmAb37から解離し、平均kaが6E+5(Ms)-1であるから、<20pMのKDが得られた。結果は、3回の測定に基づく。パラメータkaおよびkdの個々の標準誤差率(RSE)は<0.6%であった。これらのデータは、mAb37が、ヒトIL-21と高い親和性で結合することを明らかに示している。
【０１４８】
【表９】
2014518198.tif 000016
【０１４９】
(実施例5)
B細胞増殖および成熟アッセイ
生物学的に適切な状況における抗IL-21抗体の効果を試験するために、3つの機能的アッセイを設けた。ここでは、関連するIL-21の作用をヒト一次細胞において研究した。
【０１５０】
CD19+CD27highCD38high表現型をもつ形成芽球の出現率によって測定される場合、抗CD40抗体および組換え型IL-21の組み合わせによる刺激は、一次B細胞(primary B cell)の増殖およびB細胞の成熟を誘導する。(1つまたは複数の)抗IL-21抗体は、増殖および成熟の両方を防ぐことができた。
【０１５１】
B細胞の慢性炎症性疾患との関連性については、文献中ならびに、例えば、関節リウマチにおけるリツキシマブによるB細胞欠乏の臨床効果によって説明されてきた。この文献では、慢性炎症を生じさせる際に抗原提示細胞ならびに(自己)抗体の産生細胞の両方としてB細胞が重要な役割を果たすことが示された(Dorner Tら、(2009年)Arthritis Res. Therapy)。IL-21は、B細胞増殖(CD40の同時刺激が組み合わさった場合)、特定のIgG1およびIgG3への免疫グロブリン(Ig)クラススイッチングおよびIg産生形質細胞への活性化B細胞の分化を誘導する(Ozaki、K.ら、Science、2002年;Ettinger R. J.ら、J Immunol、2005年;Kuchen、S.ら、J Immunol、2007年;Ettinger、R.ら、Immunol Rev、2008年;Leonard、W. J.ら、Nat. Rev. Immunol. 2005年)。したがって、IL-21の作用の中和は、B細胞の分化を低下させることが予想され、それにより、自己免疫性患者においてB細胞の免疫刺激特性および自己抗体産生が低下する可能性がある。
【０１５２】
健康なヒトボランティアから血液バッグを入手し、50mlのヘパリン処理された末梢血液から、Ficoll-Paque(商標)Plus(GE Healthcare)勾配遠心分離によってPBMCを単離した。血液を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に100mlになるよう室温で希釈し、35mlのアリコートを室温で50mlのコニカルチューブに分注して、14mLのFicoll-Paque(商標)Plus(Ge Healthcare)で注意深く覆った。そのチューブを、室温において1680rpm(600×g)で25分間連続的に回転させた。PBMC界面層を注意深く除去し、2%のFCSを含むPBSで2回洗浄した。EasySep human B Cell enrichment Kit(StemCell Technologies SERL、グルノーブル、フランス)を使用した負の選択によってB細胞を単離した。精製B細胞の小サンプルをFACS分析によって純度について調べ、全実験において>95〜97%純粋であることがわかった。
【０１５３】
熱失活させたウシ胎仔血清(FCS)(Gibco)または健康なヒト血清(HS)(Sigma)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を添加したRPMI-1640培地(InVitrogen)においてB細胞を培養した。50,000細胞/ウェルで96ウェルU底組織培養プレート(BD Biosciences)に精製ヒトB細胞を蒔いた。この細胞を0.1μg/mlの抗CD40(ヤギ抗ヒトCD40ポリクローナル;R&D Systems)で処理するか、または処理せず、さらに、1:3連続希釈として作製された組換え型ヒトIL-21(Novo Nordisk A/S)の滴定を行った。その細胞のプレートを、その後、37℃、5%CO2において加湿されたインキュベーター内で3日間インキュベートした。3日後、その細胞に1μCi/ウェルの[3H]-チミジン(Perkin Elmer Life Sciences)を加えた。16時間後、UniFilter-96 GF/Cフィルタープレート(Packard、Perkin Elmer)上の細胞を回収し、TopCount NXT(Perkin Elmer Life Sciences)を使用して[3H]-チミジンの組み込み量を定量化した。50%および90%最大増殖(それぞれEC50およびEC90)の誘導に必要とされるIL-21の有効濃度を、GraphPad Prism v5.0ソフトウェア(GraphPad Inc)およびシグモイド用量反応(可変勾配)式を使用して算出した。
【０１５４】
2つの抗IL-21抗体mAb14およびmAb37を、B細胞増殖アッセイにおいて組換え型ヒトIL-21の中和能力について試験し、比較した。
【０１５５】
ヒトB細胞を、2個体のドナーから単離した。そのB細胞を、1ウェルあたり50,000細胞で96ウェルU底組織培養プレートに蒔いた。その細胞を、0.1μg/mlの抗CD40(R&D Systems)、50ng/ml(3.21nM)の組換え型ヒトIL-21で処理した。その細胞を、37℃および5%CO2において加湿されたインキュベーター内で3日間インキュベートした。その抗体を3倍滴定し、3日後、最後の20時間にその細胞に1μCi/ウェルの[3H]-チミジン(Perkin Elmer Life Sciences)を加えた。UniFilter-96 GF/Cフィルタープレート(Packard Instruments、Perkin Elmer)上に細胞を回収し、TopCount NXT(Perkin Elmer)を使用して[3H]-チミジンの組み込み量を定量化した。増殖を50%低下させるために必要とされる各抗体の阻害濃度(IC50)を、GraphPad Prism v5.0ソフトウェア(GraphPad Inc.)およびシグモイド用量反応(可変勾配、4パラメータ)式を使用して算出した。
【０１５６】
両抗体のIC50は、低いナノモル範囲で求められたが、mAb14と比較してmAb37がわずかにIL-21の中和により有効であった、これは、安定化S241Pヒンジ変異によりmAb37分子の安定性が増したことによる可能性が最も高い。
【０１５７】
【表１０】
2014518198.tif 000017
【０１５８】
(実施例6)
本発明による抗体の設計
本明細書に記載されるエピトープと結合するmAb14の変異体を設計するために、mAb14についてのKabat定義のCDRループを分析した。
【０１５９】
mAb14の重鎖および軽鎖のCDR領域は、それぞれ配列番号7および6による以下の残基(CDR残基)を含む:
【０１６０】
【化１】
2014518198.tif 000018
【０１６１】
4Åのカットオフ距離を使用して定義されるパラトープを、Fab35:IL-21複合体の結晶構造から決定した。Fab35は、mAb14に対応するFabフラグメントである。このパラトープは、以下の残基を含むことが明らかである:
CDR_H1中: I28, S30, S31, Y32, S33
CDR_H2中: T52, S53, G54, S55, Y56, Y57, H59
CDR_H3中: E99, R100, G101, W102, G103, Y104, Y105
CDR_L1中: S31
CDR_L2中: D50
CDR_L3中: F91, N92, Y94
【０１６２】
したがって、パラトープに含まれないCDR残基は、以下のものである(合計38個):
CDR_H1中: M34, N35
CDR_H2中: S50, I51, I58, Y60, A61, D62, S63, V64,
K65, G66
CDR_H3中: G106, M107, D108, V109
CDR_L1中: R24, A25, S26, Q27, D28, I29, D30, A32, L33, A34
CDR_L2中: A51, S52, S53, L54, E55, S56
CDR_L3中: Q89, Q90, S93, P95, Y96, T97
【０１６３】
変異部位の可能性があるとして38個の非パラトープCDR残基のうちの10個を選択した。この選択は、結晶構造の検証に基づくものであった。広範囲にわたって埋もれた残基(buried residue)および側鎖がいくつかの重要な相互作用に関与していると考えられる残基を選択から外した。変異部位の可能性がある特定した部位をTable 6に列挙する。これらの部位の特定の変異(Table 6)は、タンパク質構造に影響がないかまたは影響が最小限になるよう選択した。
【０１６４】
【表１１】
2014518198.tif 000019
【０１６５】
この実施例は、Fab35:IL-21の結晶構造に含まれる情報に基づく、本発明による抗体を設計するために適用できる一方法について記載する。当然、本発明によるリガンドを設計する際、いくつかのその他のアプローチをとることができる。
【０１６６】
一アプローチは、例えば、1つまたは複数の保存的置換が行われる場合があることを除いて、本質的にmAb14のパラトープを含むリガンドを設計することであろう。
【０１６７】
別のアプローチは、IL-21とγCとの間の結合面の構造に基づいてIL-21リガンドを設計することであろう。このリガンドは、例えば、抗体または上記のγC結合面の構造を本質的に保持するγCバリアント/模倣体の形態であってもよいであろう。
【０１６８】
当然、1つまたは複数のそのようなアプローチが組み合わされてもよい。
【０１６９】
自己免疫性障害およびその他の免疫関連の障害は、例えば、治療用ヒトモノクローナル抗体により処置される場合がある。しかしながら、上記モノクローナル抗体は、免疫原性である場合もあり、HAHA(ヒト抗ヒト抗体)とも称される抗抗体を形成させる可能性もある。HAHAが治療用抗体のその抗原との結合に影響を及ぼす治療用抗体の領域と結合する、すなわち、HAHAが中和抗体になることが予想される。mAb14に対する抗抗体の発生につながるそのような潜在的に免疫原性のある部位が認識され、特徴づけられるなら、Fab35:IL-21複合体の三次元構造から導き出される抗体mAb14についてのパラトープの詳細な説明は、IL-21との高い親和性の結合を保持するが、潜在的に免疫原性が低いmAb14のバリアントを合理的に設計する可能性を提供する。あるいは、特定の抗抗体との望ましくない結合が低減されるか、または妨げられるようにmAb14のバリアントが設計されてもよい。したがって、改善型のmAb14を得るために結晶構造情報が使用できる。
【０１７０】
このFabフラグメントならびにそのパラトープの結晶構造の提供は、例えば、その残基置換の可能性も提供する。これは、場合によっては、IL-21との高い親和性の結合などのその生物学的機能を維持しながら、このパラトープを含む分子の安定性、溶解度またはその他の化学的もしくは物理的特性に関して改善された抗体をもたらすであろう。安定性は、例えば、凝集、自己会合、断片化およびジスルフィド形成/交換を低減することによって改善されてもよい。粘度などのその他の特性も、1つまたは複数の変異の導入によって改変されてもよい。
【０１７１】
Fab35:IL-21結晶構造の提供は、IL-21に対する高い親和性などのその生物学的機能を維持しながらこのパラトープを含む分子の物理的/化学的安定性を改善することになる、例えば、脱アミド、異性化および/または酸化のリスクが低減されたmAb14のバリアントをもたらす可能性をさらに提供する。
【０１７２】
抗体mAb14の安定性を改善する可能性のある変異の一例は、メチオニン残基の変異による潜在的な酸化部位の除去である。そのような変異の1つの特定の例は、重鎖(配列番号7)にある83位のメチオニンを類似の特性をもつアミノ酸、例えば、イソロイシンに変えることである。そのような変異の第2の特定の例は、重鎖(配列番号7)にある107位のメチオニンを類似の特性をもつアミノ酸、例えば、イソロイシンに変えることである。
【０１７３】
抗体mAb14の安定性を改善する可能性のある変異の一例は、アスパラギン酸残基の異性化についての潜在的なホットスポット(DXモチーフ、例えば、DGおよびDSモチーフ)の除去である。そのような潜在的に変化を起こしやすいDXモチーフは、構成要素DもしくはX残基の一方または両方の適切な変異によって除去できる。そのような変異の1つの特定の例は、重鎖(配列番号7)にある62位のアスパラギン酸(DSモチーフ中に存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸に変えることである。そのような変異の第2の特定の例は、重鎖(配列番号7)にある206位のアスパラギン酸(DSモチーフ中に存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸に変えることである。そのような変異の第3の特定の例は、軽鎖(配列番号6)にある167位のアスパラギン酸(DSモチーフ中に存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸に変えることである。そのような変異の第4の特定の例は、軽鎖(配列番号6)にある170位のアスパラギン酸(DSモチーフ中に存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸に変えることである。
【０１７４】
抗体mAb14の安定性を改善する可能性のある変異の一例は、アスパラギン残基の脱アミドについての潜在的なホットスポット(NXモチーフ、例えば、NGまたはNSモチーフ)の除去である。そのような潜在的に変化を起こしやすいNXモチーフは、構成要素NまたはX残基の一方または両方の適切な変異によって除去することができる。そのような変異の1つの特定の例は、重鎖(配列番号7)にある77位のアスパラギン(NSモチーフに存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミンに変えることである。そのような変異の第2の特定の例は、重鎖(配列番号7)にある84位のアスパラギン(NSモチーフに存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミンに変えることである。そのような変異の第3の特定の例は、軽鎖(配列番号6)にある158位のアスパラギン(NSモチーフに存在する)を類似の特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミンに変えることである。
【０１７５】
(実施例7)
mAb14およびmAb5のHX-MSによるエピトープマッピング
HX-MS概論
HX-MS技術は、タンパク質の水素交換(HX)に続いて容易に質量分析(MS)を行うことができることを活用する。水素を含む水溶性溶媒を、重水素を含む水溶性溶媒に置換することによって、タンパク質の所与の部位における重水素原子の組み込みが質量を1Da増加させる。この質量増加は、交換反応のクエンチされたサンプルの質量分析によって時間に応じて観察することができる。重水素標識情報は、クエンチ条件下のペプシン消化によってタンパク質の各領域にわずかに局在して、得られたペプチドの質量を増加させることができる。
【０１７６】
HX-MSの一使用は、タンパク質-タンパク質複合体形成時に水素交換が減少した領域を特定することによって分子の相互作用に関与する部位を探すことである。一般には、結合面は、溶媒の立体排除による水素交換の著しい減少によって明らかにされることになる。タンパク質-タンパク質複合体形成は、それぞれの結合相手の存在下および非存在下における時間に応じた、いずれかのタンパク質メンバーに組み込まれる重水素の総量を単に測定することによりHX-MSによって検出されてもよい。HX-MS技術は、天然の構成成分、すなわち、タンパク質および抗体またはFabフラグメントを使用して、溶液中で行われる。したがって、HX-MSは、インビボ条件をまねる実現性を提供する(HX-MS技術に対する最近の報告については、WalesおよびEngen、Mass Spectrom. Rev. 25巻、158ページ(2006年)を参照のこと)。
【０１７７】
材料
使用されるタンパク質のバッチは以下のものとした:
hIL-21:ヒト組換え型IL-21(成熟ペプチドとして大腸菌に発現させた;N末端のメチオニン残基を付け加えた配列番号:1の残基30〜162)。抗体は、mAb5およびmAb14とした。
【０１７８】
すべてのタンパク質を、実験前にpH7.4のPBSに緩衝液交換した。
【０１７９】
方法:HX-MS実験
装置およびデータ記録
HX実験は、重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLCシステムへの注入および消化時間制御を行うLeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)によって作動されるLeap robot(H/D-x PAL;Leap Technologies Inc.)によって自動化されたものとした。Leap robotは、それぞれ、緩衝液保存およびHX反応のために20℃に、さらにタンパク質およびクエンチ溶液の保存のために2℃に維持される温度制御された2つのスタックを備えるものとした。Leap robotは、プレカラム、分析的カラム、LC管およびスイッチングバルブを収納する1℃に冷却されたTrio VSユニット(Leap Technologies Inc.)をさらに含むものとした。Trio VSユニットのスイッチングバルブは、HPLCからMicrobore UHPLCスイッチバルブ(Cheminert、VICI AG)にアップグレードした。インライン式ペプシン消化のために、200pmolのhIL-21を含む100μlのクエンチされたサンプルを入れ、20℃に置かれたPoroszyme(登録商標)Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))上を200μl/minの均一の流速(isocratic flow rate)(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を使用して通過させた。得られたペプチドは、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))に取り込まれ、脱塩された。その後、プレカラムが分析カラム、UPLC-BEH C18 1.7μm(2.1×100mm(Waters Inc.))と直列に並ぶようバルブを切り換え、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から200μl/minで送り出される9分の濃度勾配15〜35%のBを使用してペプチドを分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸およびB:0.1%ギ酸CH3CNから成るものとした。ESI MSデータならびに個々のデータ依存MS/MS取得(data dependent MS/MS acquisition)(CID)および高エネルギー(MSE)実験(elevated energy experiment)は、Q-TOF Premier MS(Waters Inc.)を使用したポジティブイオンモードで得た。ロイシン-エンケファリンを、ロックマスとして使用し(m/z 556.2771における[M+H]+イオン)、データを連続モードで収集した(セットアップのさらなる説明については、AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302巻、139〜148ページ(2011年)を参照のこと)。
【０１８０】
データ分析
消化ペプチドを、標準的なCID MS/MSまたはMSE法(Waters Inc.)を使用した個々の実験で明らかにした。MSEデータは、BiopharmaLynx 1.2(バージョン017)を使用して処理した。CIDデータ依存的MS/MS取得は、MassLynxソフトウェアおよび社内MASCOTデータベースを使用して分析した。
【０１８１】
HX-MS未処理データファイルを連続的なロックマス較正に供した。データ分析、すなわち、重水素で置換されたペプチドの質量中心の決定および交換曲線のプロッティングを、プロトタイプカスタムソフトウェア(HDXブラウザ、Waters Inc.)およびHX-Express((バージョンベータ);Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17巻、1700ページ(2006年))を使用して行った。全データは、分解されたペプチドの同位体エンベロープ(isotopic envelope)のみが分析されることを確実にするために視覚的にも評価した。
【０１８２】
エピトープマッピング実験
アミド水素/重水素交換(HX)は、mAb5またはmAb14の存在下または非存在下においてhIL-21を、対応する重水素で置換された緩衝液(すなわち、D2O中で調製したPBS、96% D2O最終、pH7.4(未修正の値))中に16倍希釈することによって開始した。全HX反応は、20℃で行い、2.4μMのmAbの非存在下または存在下において4μMのhIL-21を含むものとした。したがって、1.2倍モル過剰なmAb結合部位がもたらされた。10秒から10000秒に及ぶ適切な時間間隔における50μlのアリコートのHX反応を、50μlの氷冷クエンチング緩衝液(1.35M TCEP)によってクエンチして、最終pHが2.5(未修正の値)になった。mAb5およびmAb14のエピトープを特定する未処理データの例を図3に示す。
【０１８３】
結果および考察
mAb5およびmAb14のエピトープマッピング
mAb5のエピトープは、前にマッピングした(実施例2および図2)。
【０１８４】
hIL-21の一次配列の100%を範囲に含む34個のペプチドのHX経時変化を、mAb5またはmAb14の非存在下または存在下において10から10000秒間モニタした(図1および図2)。早い時点、例えば、<300秒において観察された交換プロテクション(exchange protection)は、表面露出したアミドプロトンに関連するため、タンパク質接合面にも関連する。対照的に、時間経過において遅れて観察された影響は、ゆっくりとしたアミド水素交換に関連するため、タンパク質の構造的中心部に関連する。したがって、エピトープの影響は、早い時点で現われるのに対して構造的安定化の影響は、遅い時点の交換減少として現われることになる(Garcia、PantazatosおよびVillareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2巻、81ページ(2004年);Mandell、FalickおよびKomives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、14705ページ(1998年))。
【０１８５】
mAb14のエピトープマッピング
mAb14の存在下または非存在下において、早い時点(<300秒)で観察された交換パターンは、2つの異なるグループに分けることができる:あるグループのペプチドは、mAb14の結合による影響を受けない交換パターンを示す。反対に、hIL-21の別のグループのペプチドには、mAb14の結合時の交換からのプロテクションが現われている(図3B、図3Dおよび図4)。例えば、D2Oによる30秒の交換において、mAb14の結合時に、領域V67〜F76の2つ以上のアミドが交換プロテクションされている(図3Bおよび図4)。mAb14の結合時にプロテクションを示す領域は、残基V67〜F76およびA112〜S162に及ぶペプチドを包含する(図4および図5)。しかしながら、mAb14の結合時の各ペプチド内の交換プロテクションの相対量ならびにこれらの領域のいくつかのその他のペプチドおよびさらに小さなペプチドにおけるエピトープの影響の欠如を比較することによって、エピトープを残基V67〜S74およびL143〜K146に絞ることができる。さらに、ペプチドA112〜L127におけるエピトープの影響は、この長いペプチド内の2つの異なる領域から生じているであろう。これら2つのうち、領域R115〜L120のみが他の2つのエピトープ領域の3D構造において極めて接近しており、したがって、エピトープの影響は、この領域に対応づけられる(図5)。
【０１８６】
mAb5およびmAb14のエピトープは重なっていない
図5の例および図4の交換のグラフからわかるように、mAb5およびmAb14についてのエピトープは、完全に分かれており、重なっていない。
【０１８７】
(実施例8)
mAb14のCDRループ変異型Fabフラグメントと複合体を形成したhIL-21の結晶構造
4つの異なるFabフラグメント、Fab56、Fab57、Fab59およびFab60と複合体を形成したhIL-21の三次元構造を解明し、X線結晶学を使用して高い分解能で精密化した。これらのFabはすべて、抗IL-21ヒトモノクローナル抗体mAb14のFab35フラグメントのバリアントであり、それぞれ実施例6および14に記載のとおり設計し、作製した。Fab56、Fab57、Fab59およびFab60は、それぞれmAb61、mAb62、mAb64およびmAb65のFabフラグメントに当たる。結果は、Fab56、Fab57、Fab59およびFab60は、hIL-21のエピトープをFab35と共有することを示している。したがって、Fab56、Fab57、Fab59およびFab60の結合部位は、Fab35に関する実施例2の比較研究/モデリングに従い、γC受容体鎖のhIL-21との結合と競合し、その高い結合親和性によりγC受容体鎖のhIL-21との結合をブロックすることになる。したがって、これらは、γCを介してhIL-21によってもたらされる生物学的影響を阻害することになる。
【０１８８】
Fab59は、他の変異体と比較した場合、エピトープの計算に4.0Åのカットオフを使用すると、他の変異体およびFab35と比較して異なる結晶充填(crystal packing)になり、4つの追加の残基を含むエピトープが生じる。
【０１８９】
示されるエピトープを、それぞれFab56、Fab57、Fab59またはFab60とhIL-21との複合体の三次元構造を使用して特徴づけた。hIL-21に対するFab56、Fab57、Fab59またはFab60のエピトープに関する結論は、さらに、hIL-21と、Fab35を介してFab56、Fab57、Fab59またはFab60が由来する完全な抗体mAb14との間の相互作用にも適用されることになる。
【０１９０】
材料および方法
pH7.4のPBS緩衝液(2リットルの水に4錠剤、GIBCOカタログNo.18912-014 Invitrogen Corporation)中のIL-21(成熟ペプチドとして大腸菌に発現させた;N末端のメチオニン残基を付け加えた配列番号:1の残基30〜162)およびpH7.4のPBS緩衝液中に配合された(それぞれ配列番号9および10のWTまたは変異体に対応する軽鎖および重鎖を含む、実施例6および14を参照のこと)各抗IL-21Fabを1:1のモル比で混合した。複合体の最終濃度をTable 7に示す。Table 7による体積を用いてシッティングドロップ技術により結晶を成長させた。全体のドロップ大きさは、混合比率に応じて0.2μlまたは0.3μlとした。75%の沈殿剤溶液および25%グリセロールを含む3μlの低温溶液を、結晶を含むドロップに移すことによって、低温凍結するための結晶を作製した。約1分間浸した。その後、結晶をMiTeGen MicroLoop(商標)に取り上げ、液体N2中で急速凍結し、極低温のN2ガス流によってデータ収集の間100Kの温度に維持した。MAX-lab、ルンド、スウェーデンにおけるビームラインBL911-3(Ursbyら、2004年)においてTable 8に示した分解能で結晶学的データを収集した。データの空間群決定、積分およびスケーリングは、XDSソフトウェアパッケージ(Kabsch、2010年)によって行った。得られた格子パラメータ、空間群、分解能、R-symおよび完全性の一覧をTable 8に示す。hIL-21と、それぞれFab56、Fab57またはFab60との結晶複合体について、Fab35/hIL-21結晶構造を、CCP4結晶学ソフトウェアスイート(Bailey、1994年)のRefmac5ソフトウェア(Murshudovら、2011年)の剛体精密化(rigid body refinement)用の開始モデルとして使用した。剛体精密化に続いて、ソフトウェアプログラムRefmac5を使用した拘束結晶学的精密化(restrained crystallographic refinement)ならびにCootソフトウェアプログラム(Emsleyら、2010年)を使用した電子密度図、モデル修正および構築のコンピュータグラフィックス検証を行った。モデルがそれ以上大幅に改善できなくなるまで上記手順を繰り返した。Table 10、Table 11およびTable 13。
【０１９１】
【表１２】
2014518198.tif 000020
【０１９２】
【表１３】
2014518198.tif 000021
【０１９３】
hIL-21とFab59との間の結晶複合体について、CCP4ソフトウェアスイートのMolrepソフトウェア(Vagin & Teplyakov、1997年)による分子置換技術を使用した構造決定の開始モデルとして複合体Fab35/hIL-21結晶構造を使用した。それに続いて、ソフトウェアプログラムRefmac5を使用した拘束精密化ならびにCootソフトウェアプログラム(Emsley、Lohkamp、Scott、& Cowtan、2010年)を使用したモデルおよび電子密度図のコンピュータグラフィックス検証を行った。そのモデルは、らせんAのN末端部分およびらせんCとDの間のループ構造の部分に変更が必要だった。ソフトウェアプログラムRefmac5を再び使用した結晶学的精密化ならびに電子密度図、モデル修正および構築のコンピュータグラフィックス検証のためにCootソフトウェアを続けて行う自動モデル構築の場合、初期段階にソフトウェアARP/wARP(Perrakisら、1999年)を使用した。モデルがそれ以上大幅に改善できなくなるまで上記手順を繰り返した。そのモデルを、その後、(双晶則(twin-law)h、-k、-h-lを使用して)Phenixソフトウェアパッケージ(Adamsら、2010年)のPhenix.Refine(Afonineら、2005年)において双晶-精密化(twin-refinement)に供した。双晶部分を0.03で精密化し、得られたRおよびR-freeは、それぞれ0.166および0.201であった。最後に、その構造を、Refmac5において拘束精密化の最終段階を行うCCP4ソフトウェアシステムに再び移し、続いて構造解釈を行った。Table 12。
【０１９４】
最終的なR-およびR-free、理想的な結合長の平均二乗偏差(RMSD)およびFab35-hIL-21をそれぞれのFab56-、Fab57-、Fab59-およびFab60-hIL-21複合体に重ね合わせたSecondary Structure Matching(Krissinel & Henrick、2004年)の結果をそれぞれTable 8に示す。
【０１９５】
結果
結果は、Fab59/hIL-21構造は、他のFabバリアントと比較して、結晶内分子間相互作用(結晶充填)に軽微な違いを示しているが、Fab56、Fab57、Fab59およびFab60は、hIL-21のエピトープをFab35と共有することを示している。結晶充填の違いの理由は、Fab軽鎖のGln 27残基は、Fab35、Fab56、Fab57およびFab60結晶内の結晶充填(対称関係にあるhIL-21分子のAsp 44と水素結合を形成する)に関与している一方で、Fab59ではその残基がAsnに変異しており、他のバリアントと同じ分子間接触(結晶充填相互作用)を形成できないが、わずかに異なるタイプに過ぎない。この違いにより、対応するFab35の対称関係にあるFab/hIL21-複合体分子同士の充填と比較して、Fab59の対称関係にある2つのFab/hIL21-複合体分子同士に比較的密な充填がもたらされる。それぞれ、Fab39/hIL-21と比較してFab59/hIL-21については2つの複合体間の距離が約2.3Å減少し(2つの系の主慣性モーメント(principal moment of inertia)の第一軸間の距離として算出される)、一組の相互作用において除外された平均面積がFab35/hIL-21結晶の738Å2からFab59/hIL-21の967Å2結晶に増加した(ソフトウェアプログラムAreaimol(Lee & Richards、1971年、Saff & Kuijlaars、1997年)によって算出した)。局所的にFab59/hIL-21結晶のより密な結晶充填により、結果的に、Fab35/hIL-21結晶では観察されない、hIL-21のらせんCとDの間のループの残基の欠失が、Fab59/hIL-21結晶の安定な立体構造を形成し、明らかに電子密度図に示されている。さらに、hIL-21のらせんCとDの間のループの部分の立体構造は、Fab59/hIL21ではより近い対称の関係にある分子によって、hIL-21のらせんAの方向へ動かされる。これにより、hIL-21のらせんAの先頭の部分が構造に組み込まれなくなり、Fab59/hIL-21複合体の電子密度図には示されなかった。さらに、Fab56、Fab57、Fab60およびFab35 hIL-21複合体と比較した場合、hIL-21のらせんCとDの間のループにある残基105から119の順序および移動が、hIL-21の4つの追加の残基(Phe 76、Ala 112、Gly 113およびGln 116:配列番号1)をFab59の重鎖から4Å以下の距離内に入れる(図6を参照のこと)。しかしながら、Fab59のhIL-21結合特性は、他のFabバリアントと変わらない。Fab56、Fab57、Fab59およびFab60の結合部位はすべて、Fab35に関する実施例2の比較研究/モデリングに従い、専用のhIL-21受容体鎖(IL-21Rα)と競合する代わりにγC受容体鎖のhIL-21との結合と競合し、その高い結合親和性によりγC受容体鎖のhIL-21との結合をブロックすることになる。したがって、これは、γCを介してhIL-21によってもたらされる生物学的影響を阻害することになる。
【０１９６】
Table 9は、(ソフトウェアAreaimol(Lee & Richards、1971年、Saff & Kuijlaars、1997年)によって)算出された、それぞれhIL-21/Fab56、hIL-21/Fab57、hIL-21/Fab59およびhIL-21/Fab60複合体についての一組の相互作用において除外された平均面積を示している。表に含まれるFab35/hIL-21結晶複合体についての対応する計算値は、非常に類似した値(実施例1を参照のこと)を示している。
【０１９７】
それぞれhIL-21とFab56、Fab57、Fab59またはFab60との間の直接的接触を、抗IL-21FabおよびhIL-21分子間に4.0および5.0Åのカットオフ距離を使用したCCP4プログラムスイート(Bailey、1994年)のContactソフトウェアを動作させることによって明らかにした。hIL-21/Fab56、hIL-21/Fab57、hIL-21/Fab59、hIL-21/Fab60複合体結晶構造の結果をそれぞれTable 14、Table 15、Table 16およびTable 17に示している。Fab56、Fab57、Fab59およびFab60についての得られたhIL-21のエピトープは、Table 9および図6に示されるとおりのhIL-21(配列番号1)の残基を含むことがわかった。これらのエピトープは、Table 9および図7に含まれる実施例1のFab35のhIL-21のエピトープと非常によく合致している。
【０１９８】
【表１４Ａ】
2014518198.tif 000022
【０１９９】
【表１４Ｂ】
2014518198.tif 000023
【０２００】
したがって、Fab56/Fab57/Fab59/Fab60 hIL-21のエピトープは、らせんBのN末端部分に複数の残基(配列番号1)、残基72〜76およびらせんDのC末端部分に複数の残基、残基143〜151を含む。さらに、いくつかの接触残基、らせんBに続くループ部分に残基65〜70およびらせんCとらせんDとの間のループに残基112〜119が特定されている。図7。これらの接触面積は、実施例2でγCに対する結合部位として算出されたものとよく合致する。
【０２０１】
hIL-21対するFab56、Fab57、Fab59およびFab60のパラトープをTable 9に示す。hIL-21のパラトープおよび水素結合に関与する残基もTable 14、Table 15、Table 16およびTable 17に示す。
【０２０２】
【表１５Ａ】
2014518198.tif 000024
【０２０３】
【表１５Ｂ】
2014518198.tif 000025
【０２０４】
【表１５Ｃ】
2014518198.tif 000026
【０２０５】
【表１６Ａ】
2014518198.tif 000027
【０２０６】
【表１６Ｂ】
2014518198.tif 000028
【０２０７】
【表１６Ｃ】
2014518198.tif 000029
【０２０８】
【表１７Ａ】
2014518198.tif 000030
【０２０９】
【表１７Ｂ】
2014518198.tif 000031
【０２１０】
【表１７Ｃ】
2014518198.tif 000032
【０２１１】
【表１８Ａ】
2014518198.tif 000033
【０２１２】
【表１８Ｂ】
2014518198.tif 000034
【０２１３】
【表１８Ｃ】
2014518198.tif 000035
【０２１４】
【表１９Ａ】
2014518198.tif 000036
【０２１５】
【表１９Ｂ】
2014518198.tif 000037
【０２１６】
【表１９Ｃ】
2014518198.tif 000038
【０２１７】
【表１９Ｄ】
2014518198.tif 000039
【０２１８】
【表１９Ｅ】
2014518198.tif 000040
【０２１９】
【表１９Ｆ】
2014518198.tif 000041
【０２２０】
【表１９Ｇ】
2014518198.tif 000042
【０２２１】
【表１９Ｈ】
2014518198.tif 000043
【０２２２】
【表１９Ｉ】
2014518198.tif 000044
【０２２３】
【表１９Ｊ】
2014518198.tif 000045
【０２２４】
【表１９Ｋ】
2014518198.tif 000046
【０２２５】
【表１９Ｌ】
2014518198.tif 000047
【０２２６】
【表１９Ｍ】
2014518198.tif 000048
【０２２７】
【表１９Ｎ】
2014518198.tif 000049
【０２２８】
【表１９Ｏ】
2014518198.tif 000050
【０２２９】
【表２０Ａ】
2014518198.tif 000051
【０２３０】
【表２０Ｂ】
2014518198.tif 000052
【０２３１】
【表２０Ｃ】
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【０２３２】
【表２０Ｄ】
2014518198.tif 000054
【０２３３】
【表２０Ｅ】
2014518198.tif 000055
【０２３４】
【表２０Ｆ】
2014518198.tif 000056
【０２３５】
【表２０Ｇ】
2014518198.tif 000057
【０２３６】
【表２０Ｈ】
2014518198.tif 000058
【０２３７】
【表２０Ｉ】
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【０２３８】
【表２０Ｊ】
2014518198.tif 000060
【０２３９】
【表２０Ｋ】
2014518198.tif 000061
【０２４０】
【表２０Ｌ】
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【０２４１】
【表２０Ｍ】
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【０２４２】
【表２０Ｎ】
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【０２４３】
【表２０Ｏ】
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【０２４４】
【表２０Ｐ】
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【０２４５】
【表２１Ａ】
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【０２４６】
【表２１Ｂ】
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【０２４７】
【表２１Ｃ】
2014518198.tif 000069
【０２４８】
【表２１Ｄ】
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【０２４９】
【表２１Ｅ】
2014518198.tif 000071
【０２５０】
【表２１Ｆ】
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【０２５１】
【表２１Ｇ】
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【０２５２】
【表２１Ｈ】
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【０２５３】
【表２１Ｉ】
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【０２５４】
【表２１Ｊ】
2014518198.tif 000076
【０２５５】
【表２１Ｋ】
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【０２５６】
【表２１Ｌ】
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【０２５７】
【表２１Ｍ】
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【０２５８】
【表２１Ｎ】
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【０２５９】
【表２１Ｏ】
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【０２６０】
【表２１Ｐ】
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【０２６１】
【表２１Ｑ】
2014518198.tif 000083
【０２６２】
【表２２Ａ】
2014518198.tif 000084
【０２６３】
【表２２Ｂ】
2014518198.tif 000085
【０２６４】
【表２２Ｃ】
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【０２６５】
【表２２Ｄ】
2014518198.tif 000087
【０２６６】
【表２２Ｅ】
2014518198.tif 000088
【０２６７】
【表２２Ｆ】
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【０２６８】
【表２２Ｇ】
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【０２６９】
【表２２Ｈ】
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【０２７０】
【表２２Ｉ】
2014518198.tif 000092
【０２７１】
【表２２Ｊ】
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【０２７２】
【表２２Ｋ】
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【０２７３】
【表２２Ｌ】
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【０２７４】
【表２２Ｍ】
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【０２７５】
【表２２Ｎ】
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【０２７６】
【表２２Ｏ】
2014518198.tif 000098
【０２７７】
【表２３】
2014518198.tif 000099
【０２７８】
(実施例9)
表面プラズモン共鳴(SPR)によるhIL-21に対する抗hIL-21 mAb37、mAb61、mAb62およびmAb65についての相互作用カイネティクスの比較
表面プラズモン共鳴により分子の相互作用をリアルタイムで測定するBiacore T200計器によって結合の研究を行った。実験は、25℃で行い、サンプルをサンプル区画に10℃で保存した。Biacoreによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、4つの連続したフローセルにある個々のセンサーチップ表面の質量と直接対応する。
【０２７９】
製造業者の使用説明書に従って、BiacoreヒトFc捕捉キットの抗ヒトFcモノクローナル抗体をCM4センサーチップのフローセル上に固定化した。捕捉抗体の最終的な固定レベルは、1回の実験でおよそ2,500RUであった。ヒト抗hIL21抗体mAb37、mAb61、mAb62、mAb65の捕捉は、ランニング緩衝液(10mM Hepes 0.3M NaCl、5mM CaCl2、0.05%界面活性剤P20、pH8.0、1mg/mlのBSAを含む)中に抗体を0.125μg/mlに希釈し、フローセル2〜4のうちの1つに10μl/min180秒間注入することによって行い、抗Fc抗体のみが固定化されたフローセル1に基準表面を作り出した。これにより、およそ50〜85RUの試験抗体の最終的な捕捉レベルおよび10〜16RUの検体のRmax値が得られた。hIL-21タンパク質の結合は、検体を全フローセルに注入することによって行われ、基準フローセルとの結合と比較して、異なる捕捉抗IL-21抗体との結合の比較分析が可能になる。hIL-21タンパク質を、ランニング緩衝液中に2〜162nMに1:3連続希釈し、100μl/minで210秒間注入し、600または14000秒間解離させた。CM4表面は、3MのMgCl2を50μl/minで2回注入することにより、検体の各注入サイクルの後に再生させた。この再生段階により、抗IL-21抗体およびあらゆる結合IL-21も固定化された捕捉抗体表面から除去され、次の相互作用サンプル対の次の結合を可能にする。この再生手順では、直接固定化された抗Fc捕捉抗体はチップ表面から除去されない。
【０２８０】
ka(結合速度)、kd(解離速度)およびKD(平衡解離定数)などのカイネティクスデータを得るために、データを1:1 Langmuirモデルに合わせてBiacore T200評価ソフトウェア1.0を使用してデータ分析を行った。基準対照表面との有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線を、ダブルリファレンスによって処理した(基準表面シグナルならびに捕捉された抗IL-21抗体上への何も含まれていない緩衝液の注入の減算)。これにより、計器ノイズ、サンプル注入時の大部分のシフトおよびドリフトを修正できる。
【０２８１】
ヒトIL-21は、現在使用されるアッセイによって正確に測定できる解離速度未満(kd<1E-5s-1)でmAb37、mAb61、mAb62およびmAb65から解離し、平均ka値が5-7E+5(Ms)-1であるから、<20pMのKDが得られた。結果は、2回の異なる実験に基づく。パラメータkaの個々の標準誤差率は、<1.1%であった。結果をTable 18に示す。
【０２８２】
これらのデータは、試験された4つの異なる抗体が、ヒトIL-21に対して類似した結合特性を共有していることを明らかに示している。
【０２８３】
【表２４】
2014518198.tif 000100
【０２８４】
(実施例10)
ヒトB細胞の増殖に対する抗IL-21 mAb37バリアントの阻害効果
6つの抗IL-21抗体の中和能力をB細胞増殖アッセイにおいて比較した。この6つの抗体には、mAb37ならびに実施例12に記載される5つのバリアントmAb61、mAb62、mAb63、mAb64およびmAb65が含まれる。これらの抗体を、組換え型ヒトIL-21を中和する能力についてB細胞増殖アッセイにおいて試験した。
【０２８５】
健康なヒトボランティアから血液バッグを入手し、50mlのヘパリン処理された末梢血液から、Ficoll-Paque(商標)Plus(GE Healthcare)勾配遠心分離によってPBMCを単離した。血液を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に100mlになるよう室温で希釈し、35mlのアリコートを室温で50mlのコニカルチューブに分注して、14mLのFicoll-Paque(商標)Plus(Ge Healthcare)で注意深く覆った。そのチューブを、室温において1680rpm(600×g)で25分間連続的に回転させた。PBMC界面層を注意深く除去し、2%のFCSを含むPBSで2回洗浄した。EasySep human B Cell enrichment Kit(StemCell Technologies SERL、グルノーブル、フランス)を使用した負の選択によってB細胞を単離した。精製B細胞の小サンプルをFACS分析によって純度について調べ、全実験において>95〜97%純粋であることがわかった。
【０２８６】
熱失活させたウシ胎仔血清(FCS)(Gibco)または健康なヒト血清(HS)(Sigma)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を添加したRPMI-1640培地(Invitrogen)においてB細胞を培養した。mAb37バリアントの阻害効果を試験するために、ヒトB細胞を、2個体のドナー、ドナー1および2から単離した。
【０２８７】
そのB細胞を、1ウェルあたり50,000細胞で96ウェルU底組織培養プレートに蒔いた。細胞を0.1μg/ml抗CD40(R&D Systems)、50ng/ml(3.21nM)組換え型ヒトIL-21で処理した。その細胞を、37℃および5%CO2において加湿されたインキュベーター内で3日間インキュベートした。その抗体を滴定し、3日後、最後の20時間にその細胞に1μCi/ウェルの[3H]-チミジン(Perkin Elmer Life Sciences)を加えた。UniFilter-96 GF/Cフィルタープレート(Packard Instruments、Perkin Elmer)上の細胞を回収し、TopCount NXT(Perkin Elmer)を使用して[3H]-チミジンの組み込み量を定量化した。増殖を50%低下させるために必要とされる抗IL-21 mAbの濃度(IC50)を、GraphPad Prism v5.0ソフトウェア(GraphPad Inc.)およびシグモイド用量反応(可変勾配、4パラメータ)式を使用して算出した。
【０２８８】
WTのmAb37および5つのバリアントについてのIC50はすべて、ナノモル以下の範囲のIC50値で非常に類似していることがわかった。全抗体を両ドナーのB細胞において試験し、データを下記Table 19に列挙する。技術的な問題から、mAb62についての完全なデータセットはドナー2についてのみ得られた。
【０２８９】
【表２５】
2014518198.tif 000101
【０２９０】
(実施例11)
NK92アッセイにおける抗IL21抗体の生物活性
NK細胞ベースのバイオアッセイにおいて、組換え型ヒトIL-21の中和能力について抗体を試験した。抗IL21 mAb37を参照材料として含めた。
【０２９１】
抗IL21抗体の生物活性のインビトロ測定のために、NK細胞ベースのバイオアッセイを使用した。NK92細胞株(ATCC/LGC Promochem)は、末梢血液単核細胞由来のヒトリンパ芽球懸濁液である。細胞は、内因的にIL-21受容体を発現し、細胞増殖については、IL-2またはIL-21に依存している。抗IL-21によるIL-21の中和を、alamarBlue(登録商標)(細胞生存度指示薬)の添加による増殖阻害によって測定する。
【０２９２】
維持の間、IL-2の添加によってNK92細胞を増殖させ続けた。アッセイについては、NK92細胞を洗浄し、1.6×105細胞/ml(1ウェルあたり12,800細胞と等しい)の密度で96ウェルプレート(Matrix Technology)に蒔いた。この細胞を、5431pg/mlの固定濃度で組換え型ヒトIL-21で刺激した。アッセイ培地中に調製した0〜12,800pg/mlに及ぶ抗IL-21抗体の連続希釈液を、96ウェルプレートの3つの異なる位置にトリプリケートで添加した。その細胞を、37℃および5%CO2において加湿されたインキュベーター内で3日間インキュベートした。3日目に10mlのalamarBlue(登録商標)(Biosource)を添加し、5時間のインキュベーション後にSynergy計器(Bio Tek)により蛍光を測定した。
【０２９３】
データをBioCalc(MicroLex)において4パラメータロジスティック曲線モデルで分析した。結果は、1測定に基づく参照材料mAb37に対する割合(%)として得た。
【０２９４】
5つの変異型抗体について測定された生物活性(Table 20)のすべては、参照材料mAb37の生物活性と比較すると、非常に類似していることがわかった。
【０２９５】
【表２６】
2014518198.tif 000102
【０２９６】
(実施例12)
抗IL-21m Ab14のクローニングおよび配列決定
この実施例は、ハイブリドーマ366.328.10.63の抗IL-21 mAb14のヒト重鎖および軽鎖配列のクローニングおよび配列決定について記載する。
【０２９７】
QiagenのRNeasy-Miniキットを使用してハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出し、cDNA合成の鋳型として使用した。ClontechのSMARTer(商標)RACE cDNA増幅キットを使用した5'-RACE反応でcDNAを合成した。続いてHCおよびLC配列の標的増幅を、Phusion Hot Startポリメラーゼ(Finnzymes)およびフォワードプライマーとしてSMARTer(商標)RACEキットに含まれるユニバーサルプライマーミックス(UPM)を使用したPCRによって行った。HCおよびLC配列のPCR増幅に、それぞれヒトIgGの定常領域またはヒトカッパ定常領域に特異的なリバースプライマーを使用した。PCR産物をゲル電気泳動によって分離し、GE Healthcare Bio-SciencesのGFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitを使用して抽出し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitおよび化学的コンピテントTOP10 E.coli(Invitrogen)を使用して配列決定のためにクローン化した。選択したコロニーに対して、Applied BiosystemsのAmpliTaq Gold(登録商標)FAST Master MixおよびM13uni/M13revプライマーを使用してコロニーPCRを行った。ExoSAP-IT酵素ミックス(USB)を使用してコロニーPCRの精製を行った。M13uni(-21)/M13rev(-29)またはT3/T7配列決定プライマーのいずれかを使用してMWG Biotech、マルティンスリート、ドイツにおいて配列決定を行った。VectorNTIプログラムを使用して配列を分析し、注釈をつけた。すべてのキットおよび試薬は、製造業者の使用説明書に従って使用した。
【０２９８】
1つの特有のヒトカッパ型LCおよび1つの固有のヒトHC、サブクラスIgG4を特定した。
【０２９９】
(実施例13)
抗IL-21 mAb14抗体およびFabフラグメントバリアントの一過性発現のための発現ベクターの作製。
エピトープマッピングおよび結合分析を可能にするため、Yves Durocher(Durocherら、Nucleic Acid Research、2002年)によって開発されたHEK293-6E EBNAベースの発現系におけるmAb14バリアントの一過性発現のための一連のCMVプロモーターベースの発現ベクター(pTTベクター)を作製した。CMVプロモーターに加えて、このベクターは、pMB1起点、EBV起点およびAmp耐性遺伝子を含む。
【０３００】
抗IL-21 mAb14のVHドメインに対応する領域を、操作されたヒトIgG4のCHドメインの配列を含む直線状にしたpTTベースのベクターに標準的なPCRおよび制限酵素ベース(restriction-based)のクローニング法を使用してクローン化した。PCR増幅の一部として、標準的なオーバーラップPCRによって、未変性のIgGシグナルペプチドについての配列をヒトCD33由来のシグナルペプチド配列と交換した。使用したPCRの鋳型は、実施例12に記載されるとおりに作製したtopoベクターとした。操作されたヒトIgG4のCHドメインは、ヒンジ領域に1つのアミノ酸置換:S241Pを含む。241位のプロリン変異(S241P、Kabatによる残基ナンバリング、S228P、EUナンバリングシステムによる残基ナンバリング(Edelman G.M.ら、Proc. Natl. Acad. USA 63巻、78〜85ページ(1969年)およびS228P、配列番号7のナンバリング)を、1つのLCおよび1つのHCからなる単量体の抗体フラグメント、すなわち「半抗体」の形成を無くすために、IgG4のヒンジ領域に導入した。
【０３０１】
選択のためにベクターコンストラクトを大腸菌にトランスフォームした。最終的なコンストラクトの配列は、DNA配列決定によって確認した。ヒトIgG4のヒンジ領域の安定化S241P変異がmAb14とmAb37との間の唯一の違いとなり、すなわち、mAb37は、mAb14のヒンジが安定化されたものである。HC mAb37のアミノ酸は、残基228におけるS228P置換を含む配列番号7に相当する。mAb14およびmAb37の名称は同義に使用されるが、組換えで作製されたすべてのmAbバリアントのIgG4の定常領域は安定化S241P変異を含む。
【０３０２】
mAb37のFabフラグメント;Fab35の一過性発現のためのpTTベースのベクターも作製した。VHドメインに対応する領域を、切断型ヒトIgG4の定常ドメインの配列を含む直線状にしたpTTベースのベクターにクローン化した。IgG4のCHドメインは、切断型HCを形成するヒンジ領域で終結して、配列番号7として列挙した完全なHCのうちのアミノ酸残基1〜221を構成する。VHドメインを制限酵素ベースのクローニングによってFab発現ベクターに入れ換え、選択のために大腸菌にトランスフォームした。最終的なコンストラクトの配列は、DNA配列決定によって確認した。Fab35のHCのアミノ酸配列は、配列番号10として列挙されている。このFab35のLCは、mAb37のLCに対応し、このアミノ酸配列は、配列番号9(および配列番号6)として列挙されている。
【０３０３】
増幅のための標準的なPCR法およびmAb37のHCについて上に記載したシグナルペプチド交換および標準的な制限酵素ベースのクローニング法を使用して、mAb37のVLドメインに対応する領域を、ヒトカッパCLドメインの配列を含む直線状にしたpTTベースのベクターにクローン化した。使用したPCRの鋳型は、実施例12に記載されるとおりに作製したtopoベクターとした。選択のためにベクターコンストラクトを大腸菌にトランスフォームした。最終的なコンストラクトの配列は、DNA配列決定によって確認した。mAb37のLCのアミノ酸配列は、mAb14のLCに対応し、配列番号6(および配列番号9)として列挙されている。
【０３０４】
mAb37およびFab35の組み換え発現を、実施例14に記載されるとおり行った。
【０３０５】
(実施例14)
抗IL-21 mAb37の部位特異的変異誘発
Table 21に列挙される抗IL-21 mAb37/Fab35のバリアントを作製するために部位特異的変異誘発を行った。mAb14のLC、配列番号6、mAb14のHC、配列番号7、Fab35のLC、配列番号9、Fab35のHC、配列番号10に対応する参照配列のナンバリングにより変異を列挙した。変異は、StratageneのQuikChange(商標)部位特異的変異誘発キットを使用して標準的な部位特異的変異誘発によってHCまたはLCに導入し、点変異を導入するために特異的変異プライマー(mutagenic primer)を使用した。キットは、製造業者の手順に従って使用した。実施例13に記載したWTのmAb37/Fab35のLCのためのpTTベースの発現プラスミドを、LCの変異誘発のための鋳型として使用した。HC変異体を、実施例13に記載したWTのFab35のための切断型HC発現プラスミドを鋳型として使用して作製した。
【０３０６】
その後、変異型VHドメインを、ヒトIgG4(S241P)のCHドメインの配列を含む直線状にしたpTTベースのベクターに入れ換えることによって、完全長HC変異体の発現のためのプラスミドを作製した。ドメインの入れ換えは、標準的な制限酵素ベースのクローニング法によって行った。選択のためにベクターコンストラクトを大腸菌にトランスフォームした。最終的なコンストラクトすべての配列は、DNA配列決定によって確認した。
【０３０７】
【表２７】
2014518198.tif 000103
【０３０８】
mAb37変異体を発現させるために、HEK293-6E細胞に、以下に記載されるようにLCプラスミド(WTまたは変異体)およびHCプラスミド(WTまたは変異体)を同時トランスフェクトした。mAb37のFabフラグメントを発現させるために、HEK293-6E細胞にLCプラスミド(WTまたは変異体)および切断型HCプラスミド(WTまたは変異体)を同時トランスフェクトした。
【０３０９】
mAbバリアントの組み換え発現
Fab35のバリアントを含むmAb37のバリアントを、以下に列挙される一般的な抗体発現手順に従ってpTTベースのHCおよびLCベクターによるHEK293-6E細胞の同時形質導入によって発現させた。
【０３１０】
・細胞の維持:
HEK293-6E細胞を、25μg/mlのGeneticin(Gibco)、0.1%v/vの界面活性剤Pluronic F-68(Gibco)および1%v/vペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加したFreeStyle(商標)293発現培地(Gibco)中において懸濁状態で増殖させた。細胞を、37℃、8%CO2および125rpmにおいて振盪インキュベーター中のErlenmeyer振盪フラスコで培養し、0.1〜1.5×106細胞/mlの細胞密度で維持した。
【０３１１】
・DNAトランスフェクション:
・トランスフェクションのために使用した培養物の細胞密度は0.9〜2.0×106細胞/mlとした。
・細胞培養物1mlあたり0.5μgのLCベクターDNA+0.5μgのHCベクターDNAの混合物を使用した。
・DNAをOpti-MEM培地(Gibco)中で30μl培地/μgDNAに希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートした。
・トランスフェクション試薬として1μl/μgDNAの濃度で293Fectin(商標)(Invitrogen)を使用した。
・293Fectin(商標)を、Opti-MEM培地(Gibco)中で30倍希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートした。
・DNAおよび293Fectin溶液を混合し、室温(23〜25℃)で25分間インキュベートし続けた。
・DNA-293Fectin混合物を、その後、細胞培養物に直接添加した。
・トランスフェクトされた細胞培養物を、37℃、8%CO2および125rpmの振盪インキュベーターに移した。
・トランスフェクションの5日後、細胞培養物の上清を遠心分離によって回収後、0.22μmのPESフィルター(Corning)を通して濾過した。
・澄んだ細胞培養物の上清に直接ForteBio Octetシステムを使用したバイオレイヤー干渉法によってまたはSDS-PAGE分析によって抗体産生の定量分析を行った。
【０３１２】
mAbおよびFabフラグメントバリアントの精製
GE HealthcareのMabSelectSuRe樹脂を使用した標準的なアフィニティークロマトグラフィーによってmAb37バリアントを精製した。精製抗体を、pH7.2のPBS緩衝液に緩衝液交換した。
【０３１３】
GE HealthcareのKappaSelect樹脂を使用した標準的なアフィニティークロマトグラフィーによってFabフラグメントを精製した。精製Fabフラグメントを、pH7.2のPBS緩衝液に緩衝液交換した。
【０３１４】
SEC-HPLCによって品質評価および濃度測定を行い、標準的なカイネティック比色LAL法によってエンドトキシン量を測定した。
【０３１５】
略語
Aa:アミノ酸
mAb:モノクローナル抗体
HC:重鎖
LC:軽鎖
VH:可変ドメイン-重鎖
VL:可変ドメイン-軽鎖
CH:定常領域-重鎖
CL:定常領域-軽鎖
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
WT:野生型
【０３１６】
(実施例15)
HX-MSによるhIL-21についてのmAb37ならびにバリアントmAb61、mAb62およびmAb65のエピトープマッピング(実施例7も参照のこと)
材料
使用されるタンパク質のバッチは以下のものとした:
hIL-21:ヒト組換え型IL-21(成熟ペプチドとして大腸菌に発現させた;N末端のメチオニン残基を付け加えた配列番号:1の残基30〜162)、実施例14に記載されるとおりの配列のmAb37ならびにバリアントmAb61、mAb62およびmAb65。
【０３１７】
すべてのタンパク質を、実験前にpH7.4のPBSに緩衝液交換した。
【０３１８】
方法:HX-MS実験
装置およびデータ記録
HX実験は、Synapt G2質量分析計(Waters Inc.)と接続したnanoACQUITY UPLC System with HDX Technology(Waters Inc.)により行った。WatersのHDXシステムは、重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLCシステムへの注入および消化時間制御を行うLeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc/Waters Inc.)によって作動されるLeap robot(H/D-x PAL;Waters Inc.)を含むものとした。Leap robotは、それぞれ、緩衝液保存およびHX反応のために20℃に、さらにタンパク質およびクエンチ溶液の保存のために2℃に維持される温度制御された2つのスタックを備えるものとした。WatersのHDXシステムは、プレカラム、分析的カラム、LC管およびスイッチングバルブを収納する1℃に保持する温度制御されたチャンバーをさらに含むものとした。別に温度制御されたチャンバーは、ペプシンカラムを25℃に保持する。インライン式ペプシン消化のために、100pmolのhIL-21を含む100μlのクエンチされたサンプルを入れ、25℃に置かれたPoroszyme(登録商標)Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))上を100μL/minの均一の流速(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を使用して通過させた。得られたペプチドは、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))に取り込まれ、脱塩された。その後、プレカラムが分析カラム、UPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters Inc.))と直列に並ぶようバルブを切り換え、nanoAQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から200μl/minで送り出される9分の濃度勾配10〜40%のBを使用してペプチドを分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸およびB:0.1%ギ酸CH3CNから成るものとした。ESI MSデータおよび高エネルギー(MSE)実験による個々のデータは、Synapt G2質量分析計(Waters Inc.)を使用したポジティブイオンモードで得た。ロイシン-エンケファリンを、ロックマスとして使用し(m/z 556.2771における[M+H]+イオン)、データを連続モードで収集した(さらなる説明については、AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302巻、139〜148ページ(2011年)を参照のこと)。
【０３１９】
データ分析
消化ペプチドを、標準的なMSE法を使用して個々の実験において特定し、ペプチドおよびフラグメントを、Synapt G2(Waters Inc.)のイオンモビリティ特性を利用してさらに調整した。MSEデータは、ProteinLynx Global Serverバージョン2.5(Waters Inc.)を使用して処理した。HX-MS未処理データファイルは、DynamXソフトウェア(Waters Inc.)で処理した。DynamXは、ロックマス較正および重水素組み込み測定、すなわち、重水素で置換されたペプチドの質量中心の決定を自動的に行う。さらに、ソフトウェアによる正しいピークおよび重水素化の指定を確実にするために全ペプチドを手作業で調べた。
【０３２０】
エピトープマッピング実験
アミド水素/重水素交換(HX)は、mAb37、mAb61、mAb62またはmAb65の存在下または非存在下においてhIL-21を、対応する重水素で置換された緩衝液(すなわち、D2O中で調製したPBS、96% D2O最終、pH7.4(未修正の値))中に10倍希釈することによって開始した。全HX反応は、20℃で行い、1.2μMのmAbの非存在下または存在下において2μMのhIL-21を含むものとした。したがって、1.2倍モル過剰なmAb結合部位がもたされた。10秒から3000秒に及ぶ適切な時間間隔における50μlのアリコートのHX反応は、50μlの氷冷クエンチング緩衝液(1.35M TCEP)によってクエンチして、最終pHが2.5(未修正の値)になった。
【０３２１】
結果および考察
mAb37、mAb61、mAb62およびmAb65のエピトープマッピング
hIL-21上のmAb14のエピトープマッピングについては、実施例7に示している。しかしながら、mAb37の形態のmAb14(実施例12〜13を参照のこと)も参照のためにこれらの実験に含めた。
【０３２２】
hIL-21の一次配列の97%を範囲に含む29個のペプチドのHX経時変化を、mAb37、mAb61、mAb62またはmAb65の非存在下または存在下において10から3000秒間モニタした(Table 22)。
【０３２３】
エピトープマッピング
mAb37、mAb61、mAb62またはmAb65の存在下または非存在下において早い時点(<300秒)で観察された交換パターンは、異なるグループに分けることができる:あるグループのペプチドは、早い時点において、これらmAbの結合による影響を受けない交換パターンを示す。対照的に、hIL-21の別のグループのペプチドは、非常に早い時点(Table 22、1分未満の交換におけるfxペプチドF76〜L84)でmAb37、mAb61、mAb62またはmAb65の結合時の交換によるプロテクションが現われている。興味深いことに、hIL-21由来の同じグループのペプチドは、これらのmAbの結合による影響を受けた。したがって、mAb37、mAb61、mAb62またはmAb65についてのエピトープは、一致するようであるため、実施例7で決定されたmAb14についてのエピトープと一致する。あるグループのペプチドは、やや長い時間、弱いプロテクションを示した。これらは、mAbの結合の副次的な影響、例えば、安定化の影響であろう(Table 22、例えば、ペプチドI45〜D55)。
【０３２４】
結論
mAb37、mAb61、mAb62またはmAb65のいずれかの結合時にhIL-21の全領域が類似の反応を示した。同じグループのペプチドは、早い時点においてmAbの結合による影響を受けたため、mAb37、mAb61、mAb62またはmAb65についてのエピトープは、実施例7で決定されたmAb14についてのエピトープと一致するようである。
【０３２５】
【表２８】
2014518198.tif 000104
【０３２６】
(実施例16)
表面プラズモン共鳴(SPR)によるmAb6、mAb37およびmAb24を用いたヒトIL-21の抗IL-21およびIL-21Rα/γCサブユニットとの共結合の研究
実施例3に記載されるとおりにBiacore T200によって結合の研究を行ったが、この実施例では、抗ヒトIL-21モノクローナル抗体mAb6、mAb37およびmAb24(IL-21と結合するがmAb6またはmAb37とは競合しない)をCM5センサーチップのフローセル上に直接固定化した。mAb24は、WO2010055366に開示されているハイブリドーマクローン338.28.6.3/338.28.6によって産生される抗体である。実施例3との別の違いは、個々のIL-21受容体鎖IL-21Rα-ECDおよび共通のγC-ECDタンパク質を連続して注入して、(mAb)/IL-21/IL-21Rα/γCの段階的な結合を作り出したことである。このセットアップでは、共通のγCタンパク質が結合しないことはいずれも、IL-21Rαが存在しないこととは無関係だが、IL-21を捕捉するために使用された競合抗体に左右された。
【０３２７】
実施例3に記載のとおりにデータ分析を行ったが、Biacore T200評価ソフトウェア1.0を使用した。
【０３２８】
この実施例では、捕捉されたIL-21とのIL-21Rαの結合は、共通のγCの結合の前提条件であることが示された。mAb37がγCのIL-21/IL-21Rα複合体との相互作用を妨げることも結論づけられた。したがって、mAb37は、γCを介してIL-21によってもたらされる生物学的影響を阻害し、細胞表面に存在するIL-21Rαと特異的に結合する能力を有するリガンド:IL-21複合体を形成することになる。
【０３２９】
IL-21が、mAb6およびmAb37の両方と比較してIL-21の別の部位と結合する対照抗体によって捕捉された場合、個々のIL-21受容体鎖IL-21Rαおよび共通のγCタンパク質の両方の一連の結合が観察された。
【０３３０】
これらの結果は、実施例3に記載されるように、なぜmAb19によって捕捉されたIL-21が同時にIL-21Rα-ECDともγC-ECDとも結合できなかったのかの説明にもなる。
【０３３１】
【表２９】
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【図３】
2014518198.tif 000106
【図５】
2014518198.tif 000107
【図１】
2014518198.tif 000108
【図２】
2014518198.tif 000109
【図４ａ】
2014518198.tif 000110
【図４ｂ】
2014518198.tif 000111
【図６】
2014518198.tif 000112
【図７】
2014518198.tif 000113
【配列表】
2014518198000001.app
【国際調査報告】
2014518198.tif 000114
2014518198.tif 000115
2014518198.tif 000116