(57)【要約】  腸表面結合領域と連結している、好ましくは飼料用または食品用酵素である酵素を含有する、融合タンパク質が提示される。融合タンパク質は、動物における飼料利用率を高めるのに使用し得る。特定の実施例では、フィターゼに連結する腸表面結合ポリペプチド断片を含んでなる、本発明に従った融合酵素は、腸内滞留時間の増大を示し、それは酵素が対応する反応を触媒するのにかけられる時間の増大をもたらし、それは最終的に飼料利用率の改善をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは飼料用または食品用酵素である、ポリペプチドまたは酵素に連結する、腸表面結合ポリペプチド断片を含んでなる組成物。
【請求項２】
前記腸表面結合ポリペプチド断片が、細菌コラーゲン結合ポリペプチド断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記腸表面結合ポリペプチド断片が、粘液結合タンパク質の断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵素がフィターゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記腸表面結合ポリペプチド断片および前記酵素が、融合タンパク質の部分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物をコードする、核酸配列を含んでなる単離核酸配列。
【請求項７】
適切な発現宿主における融合タンパク質生成を誘導する、１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結する、請求項６に記載の核酸配列を含んでなる核酸コンストラクト。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸コンストラクトを含んでなる、組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸コンストラクトおよび／または請求項に８に記載の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項９に記載の宿主細胞を培養して、前記融合タンパク質を含んでなる上清を生成するステップと、
（ｂ）前記融合タンパク質を回収するステップと
を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物または融合タンパク質を生成する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組成物または融合タンパク質と、
（ａ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン；
（ｂ）少なくとも１つの水溶性ビタミン；および／または
（ｃ）少なくとも１つの微量ミネラル
を含んでなる動物飼料組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組成物または融合タンパク質が飼料に添加される、動物飼料の栄養価を改善する方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物を動物に投与するステップを含んでなる、動物における飼料利用率を高める方法。
【請求項１４】
動物における飼料利用率を高めるための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、本明細書において下で考察するように、付着性を有する微生物の適応特性に基づいて、動物の胃腸管内の滞留時間を増大させるためのポリペプチドおよび酵素を構築する、革新的な方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、参照ポリペプチドまたは酵素と比較して、動物飼料中で改善された能力を示す、例えば飼料用酵素などの新しいタイプのポリペプチドおよび酵素に関する。
【０００３】
［発明の背景］
例えばブタおよび家禽などの家畜は、どちらも飼料利用率を増大させるために、飼料用酵素が慣例的に補給される動物である。
【０００４】
例えばフィターゼは、動物飼料の栄養価を改善して、飼料への亜リン酸補給を低下させ、ひいては集約的家畜生産地域における環境汚染を低下させるために、単胃動物で一般に使用される飼料用酵素である。
【０００５】
あらゆる飼料用酵素について、生じる生成物量（ここでは亜リン酸）は、基質濃度（ここではフィチン酸）、酵素活性、および酵素が反応を触媒するのにかけられる時間の関数であるので、酵素製剤を改変することで、または新しいタイプの酵素を開発することで、飼料利用率および酵素活性を最適化することがなおも必要である。
【０００６】
［技術背景の簡単な説明］
乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の構成員、そしてその他の細菌、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の構成員もまた、鳥類および哺乳類の胃腸管内に頻繁に見られる。細菌が、この開放流環境でコロニー形成できるためには、粘膜への付着が必要条件であると考察される。腸管の上皮細胞は、大型糖タンパク質ムチンを主成分とする、糖タンパク質と糖脂質の複合混合物である、粘液の保護層によって被覆される。粘膜にコロニー形成する細菌は、粘液層内に見られ、また上皮細胞に付着しても見られる。ほとんどの場合、付着はタンパク質によって媒介されることが報告されているが、乳酸桿菌細胞表面の糖類部分は、粘膜成分と相互作用することも記載されている。現在の知識を要約すると、胃腸成分に付着する微生物株の能力は、胃腸粘液またはその主成分ムチンに対する、および腸細胞の脱落によって粘液中に捕捉された、または上皮が損傷を受けた際にアクセスできる、コラーゲンに対する、それらの親和性に基づくことが知られている。（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）構成員をはじめとする）天然腸細菌は、バイオフィルムを形式して上皮細胞に付着し、バイオフィルムを生成できない細菌よりも顕著により長く腸内に残留できることもまた知られている。したがって自己生成細胞外バイオフィルムマトリックスもまた、微生物株が胃腸成分に付着する能力にとって重要な役割を果たす。
【０００７】
粘液結合タンパク質は、主に乳酸桿菌中で特性解析されている。ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３からの遺伝子は、粘液成分に付着する、Ｍｕｂと命名される細胞表面タンパク質をコードすることが知られている。Ｍｕｂは、ムチン結合領域（ＭｕｃＢＰ、Ｐｆａｍ０６４５８）として、細胞表面に共有結合的に付着する、大型の多ドメインタンパク質（３５７ｋＤａ）である。
【０００８】
コラーゲン結合ドメインは、２つのカテゴリーに分割し得る：
−その典型がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｐｆａｍ０５７３８）からのプロテインＡである、コラーゲンへの細菌付着を媒介するＣｎａ型タンパク質
−クロストリジウムコラゲナーゼの一部である、ＣＢＤドメイン。
【０００９】
ＴａｓＡは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の構成員によって生成されるバイオフィルムの主要タンパク質成分である。ＴａｓＡは、ＥＰＳ（細胞外ポリマー物質）および胞子の双方と結合して検出されており、表面付着に必要と考えられている。
【００１０】
［発明の説明］
特に本発明は、好ましくは飼料用または食品用酵素である、ポリペプチドまたは酵素に連結する、腸表面結合ポリペプチド断片に関する。本発明はまた、酵素と腸表面結合ポリペプチド断片からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ、核酸コンストラクト、ベクター、およびＤＮＡを含んでなる宿主細胞；ならびにそれらを生成する方法；ならびに例えば動物飼料と動物飼料添加剤におけるその使用にも関する。
【００１１】
本発明はまた、本発明に従った融合タンパク質を動物に投与するステップを含んでなる、動物において消化吸収率を高める方法にも関する。本発明はまた、融合タンパク質を含んでなる、飼料組成物またはプレミックスも提供する。
【００１２】
融合タンパク質、特に腸内滞留時間増大を示す酵素と連結する腸表面結合ポリペプチド断片を含んでなる融合酵素は、酵素が対応する反応を触媒するのにかけられる時間の増大をもたらし、それが飼料用酵素であれば、最終的に飼料利用率の改善をもたらす。
【００１３】
タンパク質相同性に基づいて、本発明者らは、候補株プロバイオティックバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１ゲノム上に、前述の付着現象に関与するコラーゲン結合タンパク質を同定した。このタンパク質は、以下に記載される腸表面結合ポリペプチド断片の最初の例である。さらに本発明に従って使用し得る腸表面結合ポリペプチド断片は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来するコラーゲン結合領域である。これは、Ｃｎａ（ＰｒｏｔＡ）として知られている。
【００１４】
本発明者らは、プロバイオティック株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１の遺伝子ｂｂｓｐ１１００およびｂｂｓｐ１１０１からのコラーゲン結合ドメイン、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのｃｎａ遺伝子の一部を含有する融合タンパク質を構築し、それはサイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）のフィターゼ遺伝子ａｐｐＡに融合された。
【００１５】
融合タンパク質のいくつかの実施形態では、コラーゲン結合ポリペプチド断片は、細菌コラーゲン結合ポリペプチド断片である。より具体的な実施形態では、それは、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）コラーゲン結合ポリペプチド断片である。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、コラーゲン結合ポリペプチド断片は、コラゲナーゼ、または細菌コラゲナーゼ、またはクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）コラゲナーゼの断片である。好ましくは断片はコラゲナーゼのほんの一部分であり、コラーゲン結合ポリペプチド断片はコラゲナーゼ活性を有しない。
【００１７】
本発明はまた、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する間接的腸結合ペプチドとしての、バイオフィルム細胞外マトリックスからのＴａｓＡまたは別のタンパク質の使用にも関し、それは細菌バイオフィルムと腸内胞子の双方を標的とする。ＴａｓＡタンパク質の配列は、下に示されるように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の構成員間で高度に保存されることが分かっている。
【００１８】
【表１】
2014518634.tif 000002
【００１９】
バイオフィルム細胞外マトリックスからのＴａｓＡ、または別のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、あらゆる分子対象（例えばペプチド、酵素）のカルボキシ末端またはアミノ末端部分で融合して、細菌バイオフィルムおよび腸内胞子に結合し得る。本発明者らは、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）のフィターゼ遺伝子ａｐｐＡと融合した、プロバイオティック株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１の遺伝子ｂｂｓｐ３７５３からのバイオフィルム結合ペプチドを含有する、融合タンパク質を構築した。
【００２０】
本発明は、実施例で開示される腸表面結合ポリペプチド断片と少なくとも９０％の同一性を有する、腸表面結合ポリペプチド断片にも関する。
【００２１】
「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」または「融合酵素」という用語は、例えば腸表面結合ポリペプチド断片および酵素などの、２つの機能的部分を含んでなる単一ポリペプチド、好ましくは飼料用酵素ポリペプチド断片を指すのに使用されてもよい。融合タンパク質はいかなるサイズであってもよく、融合タンパク質の単一ポリペプチドは、例えば２つのモノマーの単一ポリペプチドへのシステインジスルフィド結合によって、その機能的状態にある多量体形式で存在してもよい。ポリペプチド断片は、合成ポリペプチドまたは天然ポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドは、ポリペプチドの部分であってもよく、または１つまたは複数の変異を含んでなってもよい。
【００２２】
「腸表面結合」という用語は、直接結合（コラーゲンへの、またはフィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への結合）、胃腸管が分泌する粘液（ムチンへの結合）とそれが腸細胞（コラーゲンおよびＥＣＭ）脱落後に捕捉する分子とを通じた間接的結合、または微生物叢によって生成されて腸表面に付着するバイオフィルムまたは構造体を通じて、胃腸管表面に結合する、あらゆるタイプのポリペプチド配列を指すのに使用されてもよい。
【００２３】
本発明に従った好ましい酵素は、飼料または食品工業で使用される酵素から選択され、本明細書で「飼料用酵素」または「食品用酵素」とも称される。特に有用な酵素は、フィターゼ（ＥＣ  ３．１．３．８または３．１．３．２６）、キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、ガラクタナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８９）、α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）、プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．）、ホスホリパーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３１）、アルカリホスファターゼ、例えばα−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）などのアミラーゼ、β−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４またはＥＣ  ３．２．１．６）またはセルラーゼから選択される。ホスホリパーゼの例は、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ  ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ  ３．１．１．４）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．５）、ホスホリパーゼＣ（ＥＣ  ３．１．４．３）またはホスホリパーゼＤ（ＥＣ  ３．１．４．４）である。
【００２４】
本発明のフィターゼは、あらゆる野生型または変異フィターゼの変種であってもよい。
【００２５】
本文脈では、フィターゼは、フィターゼ活性を有するポリペプチド、すなわちフィチン酸（ミオイノシトールヘキサキスリン酸）の（１）ミオイノシトールおよび／または（２）そのモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−および／またはペンタ−リン酸、および（３）無機物への加水分解を触媒する酵素である。
【００２６】
インターネットの酵素サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｅｎｚｙｍｅ／）は、酵素命名法に関連する情報のリポジトリである。これは、主にＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢ−ＭＢ）の勧告に基づき、それに対してＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）番号が提供されている、各タイプの特性解析された酵素を記載する（Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．Ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：３０４−３０５。ＮＣ−ＩＵＢＭＢからのハンドブック、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２もまた参照されたい）。
【００２７】
酵素サイトによれば、異なる３つのフィターゼタイプが知られている：いわゆる３−フィターゼ（代替名１−フィターゼ；ミオイノシトール六リン酸３−ホスホヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．１．３．８）、いわゆる４−フィターゼ（代替名６−フィターゼ、１Ｄ番号付与体系でなく１Ｌ番号付与体系に基づく名称、ＥＣ  ３．１．３．２６）、およびいわゆる５−フィターゼ（ＥＣ  ３．１．３．７２）。本発明の目的で、全ての３つのタイプがフィターゼの定義に含まれる。
【００２８】
フィターゼの例は、例えば本発明のフィターゼをはじめとする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サイトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、およびハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）フィターゼおよびその変種などのグラム陰性フィターゼなどの細菌フィターゼである。真菌発現宿主の例は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である。
【００２９】
本発明に従って腸表面結合部分に連結し得るポリペプチドは、抗菌性または抗真菌ペプチドである。
【００３０】
抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の例は、国際公開第０３／０４４０４９号パンフレットおよび国際公開第０３／０４８１４８号パンフレットで開示される化合物およびポリペプチドをはじめとする、ＣＡＰ１８、ロイコシンＡ、トリトルプチシン、プロテグリン−１、タナチン、デフェンシン、ラクトフェリン、ラクトフェリシン、およびノビスピリンなどのオビスピリン（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌｅｈｒｅｒ，２０００）、プレクタシン、およびスタチン、ならびに抗菌性活性を保つ上記の変種または断片である。
【００３１】
抗真菌ポリペプチド（ＡＦＰ）の例は、国際公開第９４／０１４５９号パンフレットおよび国際公開第０２／０９０３８４号パンフレットで開示されるような、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ペプチド、ならびに抗真菌活性を保つその変種および断片である。
【００３２】
［動物飼料中での能力］
特定の実施形態では、本発明の融合フィターゼは、動物の胃腸管内におけるその滞留時間を増大させることによって、参照酵素と比較して、動物中で改善された能力を有する。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明の架橋フィターゼは、酵素活性に関して参照酵素と比較して同様の能力を有する。酵素活性は、３０％ダイズミールと７０％トウモロコシミールから構成される飼料サンプルを調製し；それらを４０℃およびｐＨ３．０で３０分間前保温し、ペプシン（３０００Ｕ／ｇ飼料）およびフィターゼの追加がそれに続き；サンプルを４０℃およびｐＨ３．０で６０分間、それに続いてｐＨ４．０で３０分間インキュベートし；反応を停止させ；ＨＣｌを最終濃度０．５Ｍに添加して、フィチン酸およびイノシトールリン酸を抽出し、４０℃で２時間インキュベーションし、１回の凍結解凍サイクルと４０℃で１時間のインキュベーションがそれに続き；高性能イオンクロマトグラフィーによって、フィチン酸およびイノシトールリン酸を分離し；残留フィチン酸リン（ＩＰ６−Ｐ）の量を測定し；フィターゼ処理と非フィターゼ処理空試験サンプルの間の残留ＩＰ６−Ｐの差（この差が分解ＩＰ６−Ｐである）を計算し；参照フィターゼの分解ＩＰ６−Ｐと比較して、本発明のフィターゼの分解ＩＰ６−Ｐを表すことにより、生体外モデル中で測定し得る。
【００３４】
本発明の融合フィターゼと、参照フィターゼは、もちろん同量で、好ましくはフィターゼ活性単位（ＦＹＴ）に基づいて投与される。好ましい投与量は、１２５ＦＹＴ／ｋｇ飼料である。さらに好ましい投与量は、２５０ＦＹＴ／ｋｇ飼料である。フィターゼは、精製フィターゼの形態で、または発酵上清の形態で投与されてもよい。精製フィターゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、好ましくは少なくとも９５％の純度を有する。
【００３５】
好ましい実施形態では、参照フィターゼの分解ＩＰ６−Ｐ値と比較した、本発明の精製融合フィターゼの分解ＩＰ６−Ｐ値は、少なくとも９０％、９５％、９８％であり、または少なくとも同等である。なおもさらに好ましい実施形態では、参照フィターゼの分解ＩＰ６−Ｐ値と比較した、本発明の精製融合フィターゼの分解ＩＰ６−Ｐ値は、少なくとも１０５％、１１０％である。
【００３６】
なおもさらなる特定の実施形態では、本発明の融合フィターゼの相対的能力は、参照フィターゼによって放出される亜リン酸量と比較した、本発明のフィターゼによって放出される亜リン酸の百分率として計算してもよい。
【００３７】
［核酸配列およびコンストラクト］
本発明はまた、本発明に従った融合タンパク質または融合ポリペプチド、好ましくは融合フィターゼをコードする核酸配列を含んでなる、核酸配列にも関する。
【００３８】
「単離核酸配列」という用語は、例えばアガロース電気泳動による測定で、少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは少なくとも約６０％純粋、なおもより好ましくは少なくとも約８０％純粋、および最も好ましくは少なくとも約９０％純粋である、本質的にその他の核酸配列を含まない核酸配列を指す。例えば単離核酸配列は、その天然位置から、それが複製される異なる部位に、核酸配列を再配置させるために、遺伝子工学で使用される標準クローニング手順によって得られ得る。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる所望の核酸断片の切除と単離、断片のベクター分子への挿入、および核酸配列の複数コピーまたはクローンが複製される宿主細胞への組換えベクターの組み込みを伴ってもよい。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、またはそれらのあらゆる組み合わせであってもよい。
【００３９】
［核酸コンストラクト］
核酸コンストラクトは、制御配列に適合する条件下において、適切な宿主細胞中でコード配列の発現を誘導する１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結する、本発明の核酸配列を含んでなる。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、ポリペプチドの生成に関与する、あらゆるステップが含まれるものと理解される。
【００４０】
「核酸コンストラクト」という用語は、本明細書の用法では、天然遺伝子から単離された、またはそうでなければ天然には存在しない様式で核酸断片を含有するように修飾された、一本または二本鎖いずれかの核酸分子を指す。核酸コンストラクトが本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、核酸コンストラクトという用語は、「発現カセット」という用語と同義である。
【００４１】
「制御配列」という用語は、本明細書で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に、必要なまたは有利な全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にとって天然であっても、または外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも制御配列には、プロモーターと、転写および翻訳停止シグナルとが含まれる。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域と制御配列とのライゲーションを容易にする、特定の制限部位を導入する目的で、リンカーと共に提供されてもよい。
【００４２】
「作動可能に連結する」という用語は、本明細書において、その中で、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を誘導するように、制御配列がポリヌクレオチド配列のコード配列に対して、適切な位置に配置される立体配置を意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「コード配列」（ＣＤＳ）という用語は、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接規定する、ヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、概して、通常はＡＴＧ開始コドン、またはＧＴＧおよびＴＴＧなどの代替開始コドンで始まる読み取り枠によって判定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または組換えヌクレオチド配列であってもよい。
【００４４】
［発現ベクター］
「発現」という用語は、ポリペプチド、すなわち本発明の融合タンパク質または融合ポリペプチドの生成に関与する、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆるステップを含む。
【００４５】
「発現ベクター」という用語は、本明細書で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、その発現を提供する追加的なヌクレオチドと作動可能に連結する、直鎖または環状ＤＮＡ分子と定義される。
【００４６】
本発明の融合酵素をコードする核酸配列は、典型的に、プロモーターおよびオペレーターをコードする制御配列、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、任意選択的に、リプレッサー遺伝子または様々な活性化遺伝子を含む、発現ベクターを使用して、発現させ得る。
【００４７】
本発明の融合フィターゼをコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターは、好都合には組換えＤＮＡ手順を施してもよいあらゆるベクターであってもよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に左右されることが多い。ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００４８】
［宿主細胞］
「宿主細胞」という用語は、本明細書の用法では、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸コンストラクトによる、形質転換、形質移入、形質導入などを受けやすいあらゆる細胞タイプを含む。
【００４９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞にも関し、それは有利にはポリペプチドの組換え生産で使用される。本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、前述のように、ベクターが、染色体の組み込み体として、または自己複製染色体外ベクターとして、維持されるように宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に起きる変異のために、親細胞と同一でない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞の選択は、大体において、ポリペプチドをコードする遺伝子とその起源に左右される。
【００５０】
宿主細胞は、例えば原核生物などの単細胞微生物、または例えば真核生物などの非単細胞微生物であってもよい。
【００５１】
有用な単細胞微生物は、例えばバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞；または例えばストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）およびストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）などのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではないグラム陽性細菌、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などのグラム陰性細菌などの細菌細胞である。好ましい態様では、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。別の好ましい態様では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、好アルカリ性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。
【００５２】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換によって（例えばＣｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６８：１１１−１１５を参照されたい）、コンピテント細胞（例えばＹｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６：２０９−２２１を参照されたい）、電気穿孔（例えばＳｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照されたい）、または接合（例えばＫｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：５７７１−５２７８を参照されたい）を使用して、もたらされてもよい。
【００５３】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核生物であってもよい。
【００５４】
好ましい態様では、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」は、本明細書の用法では、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって定義される）、ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，前出，ｐａｇｅ  １７１で言及される）、および全ての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，前出）を含む。
【００５５】
より望ましい態様では、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」は、本明細書の用法では、子嚢菌類酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子形成酵母、および不完全菌類に属する酵母（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は、将来変化することもあるので、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されるように定義されるものとする。
【００５６】
さらにより望ましい態様では、酵母宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリヴェロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００５７】
最も望ましい態様では、酵母宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ダイアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も望ましい態様では、酵母宿主細胞は、クリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も望ましい態様では、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
【００５８】
［生産方法］
本発明は、（ａ）融合ポリペプチドまたは酵素の生産に寄与する条件下で、宿主細胞を培養するステップと；（ｂ）融合ポリペプチドまたは酵素を回収するステップとを含んでなる、本発明の融合ポリペプチドまたは融合酵素を生産する方法にも関する。
【００５９】
本発明の生産方法では、細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用して、融合ポリペプチドまたは酵素の生産に適する栄養培地中で培養される。例えば細胞は、ポリペプチド（または酵素）の発現および／または単離を可能にする条件下で、適切な培地中で実施される、振盪フラスコ培養によって、および実験室発酵槽または産業発酵槽内での（連続的、バッチ、流加、または固体状発酵をはじめとする）小規模または大規模発酵によって、培養されてもよい。培養は、当該技術分野で公知の手順を使用して、炭素および窒素源および無機塩を含んでなる、適切な栄養培地中で行われる。適切な培地は、販売元から入手でき、または（例えば米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログで）公表された組成に従って調製されてもよい。栄養培地中にポリペプチドが分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収し得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解産物から回収し得る。
【００６０】
得られた融合ポリペプチドまたは酵素は、当該技術分野で公知の方法を使用して回収してもよい。例えばポリペプチドまたは酵素は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿をはじめとするが、これに限定されるものではない、従来の手順によって、栄養培地から回収してもよい。
【００６１】
本発明の融合ポリペプチドまたは酵素は、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば分取用等電点電気泳動）、示差溶解度（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の多様な手順によって精製してもよい（例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。
【００６２】
［組成物および用途］
なおもさらなる態様では、本発明は、融合ポリペプチドまたは融合酵素、特に本発明の融合飼料用酵素を含んでなる組成物、ならびにこれらを使用する方法に関する。
【００６３】
組成物は、当該技術分野で公知の方法に従って調製されてもよく、液体または乾燥組成物の形態であってもよい。例えば組成物は、顆粒または微粒の形態であってもよい。組成物に含まれる融合酵素は、当該技術分野で公知の方法に従って安定化されてもよい。
【００６４】
したがって本発明の融合酵素の好ましい用途は、（ヒト用食品をはじめとする）動物飼料調製品中、またはこのような調製品のための添加剤中にある。
【００６５】
特定の実施形態では、動物飼料の栄養価を改善するために、本発明の融合酵素を使用し得る。（ヒト用食品をはじめとする）動物飼料の栄養価を改善する非限定的例は、次のようである：飼料消化吸収率を改善する；動物の成長を促進する；飼料利用率を改善する；タンパク質の生物学的利用能を改善する；可消化リン酸塩のレベルを増大させる；フィチン酸の放出および／または分解を改善する；微量ミネラルの生物学的利用能を改善する；多量ミネラルの生物学的利用能を改善する；補足的リン酸塩、微量ミネラル、および／または多量ミネラルの添加に対する必要性を排除または低下させる；および／または卵殻の質を改善する。したがって飼料の栄養価が増大され、動物の成長速度および／または体重増加および／または飼料要求率（すなわち体重増加と比較した摂取飼料重量）が改善されてもよい。
【００６６】
さらに堆肥のフィチン酸レベルを低下させるのに、本発明の融合酵素を使用し得る。
【００６７】
［動物、動物飼料、および動物飼料添加剤］
動物という用語は、ヒトをはじめとする全ての動物を含む。動物の例は、非反芻動物、および反芻動物である。反芻動物としては、例えばヒツジ、ヤギ、および畜牛、例えば肉牛や乳牛などのウシなどの動物が挙げられる。特定の実施形態では、動物は非反芻動物である。非反芻動物としては、例えば（子ブタ、育成ブタ、および雌ブタをはじめとするが、これに限定されるものではない）ブタ（ｐｉｇ）またはブタ（ｓｗｉｎｅ）などの単胃動物；シチメンチョウ、カモ、および（ブロイラーひよこ、産卵鶏をはじめとするが、これに限定されるものではない）ニワトリなどの家禽；（サケ、マス、イズミダイ、ナマズ、およびコイをはじめとするが、これに限定されるものではない）魚；および（エビおよびクルマエビをはじめとするが、これに限定されるものではない）甲殻類が挙げられる。
【００６８】
飼料または飼料組成物という用語は、動物による摂取に適する、またはそれを意図する、あらゆる化合物、調製品、混合物、または組成物を意味する。
【００６９】
本発明に従った使用において、融合酵素は、食餌の前、後、または同時に、動物に与え得る。同時に与えるのが好ましい。
【００７０】
特定の実施形態では、融合酵素は、それが飼料に添加され、または飼料添加剤に含まれる形態において、実質的に純粋である。特定の実施形態では、それは明確に定義される。「明確に定義される」という用語は、サイズ排除クロマトグラフィーによる測定で、酵素製剤が少なくとも５０％純粋であることを意味する（国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの実施例１２を参照されたい）。その他の特定の実施形態では、酵素、例えばフィターゼ製品は、この方法による測定で、少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９４、または少なくとも９５％純粋である。
【００７１】
酵素製剤は、（ａ）飼料に直接添加し得る（またはタンパク質処理工程で直接使用し得る）、または（ｂ）引き続いて飼料に添加される（または処理工程で使用される）飼料添加剤またはプレミックスなどの１つまたは複数の中間組成物の製造において、使用し得る。上述の純度は、上の（ａ）または（ｂ）に従って使用されるかどうかに関わらず、元のポリペプチド調製品の純度を指す。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、動物飼料添加剤など、動物飼料で使用するための組成物、例えばプレミックスに関する。
【００７３】
通常、脂溶性および水溶性ビタミン、ならびに微量ミネラルが、飼料への添加を意図するいわゆるプレミックスの一部を形成するのに対し、多量ミネラルは、通常、飼料に別に添加される。これらの組成物タイプのどちらもが、本発明の酵素で強化されれば、本発明の動物飼料添加剤である。
【００７４】
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、および例えばビタミンＫ３などのビタミンＫである。
【００７５】
水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、および例えばＣａ−Ｄ−パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）などのパントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）である。
【００７６】
微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、およびコバルトである。
【００７７】
多量ミネラルの例は、カルシウム、リン、およびナトリウムである。
【００７８】
さらに、任意選択の飼料添加剤成分は、例えばβ−カロテンなどのカロテノイド、アスタキサンチン、およびルテインなどの着色剤；芳香化合物；安定剤；抗菌性ペプチド；多価不飽和脂肪酸；反応性酸素発生種；および／またはフィターゼ（ＥＣ  ３．１．３．８または３．１．３．２６）；ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１；ＥＣ  ３．１．３．２；ＥＣ  ３．１．３．３９）；キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）；ガラクタナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８９）；α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．−．−）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ  ３．１．１．３２）；ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ  ３．１．１．４）；リゾホスホリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．５）；ホスホリパーゼＣ（３．１．４．３）；ホスホリパーゼＤ（ＥＣ  ３．１．４．４）；例えばα−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）などのアミラーゼ；および／またはβ−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４またはＥＣ  ３．２．１．６）から選択される、少なくとも１つのその他のポリペプチドである。
【００７９】
多価不飽和脂肪酸の例は、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓｏｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸、およびγ−リノール酸などのＣ１８、Ｃ２０、およびＣ２２多価不飽和脂肪酸である。
【００８０】
反応性酸素発生種の例は、過ホウ酸塩、過硫酸塩または過炭酸塩などの化学物質；およびオキシダーゼ、オキシゲナーゼまたはシンセターゼ（ｓｙｎｔｅｔｈａｓｅ）などのポリペプチドである。
【００８１】
本発明は、動物飼料組成物にも関する。動物飼料組成物または食餌は、比較的高含量のタンパク質を有する。家禽およびブタの食餌は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの２〜３欄の表Ｂに示されるように特徴付け得る。魚の食餌は、この表Ｂの４列に示されるように特徴付け得る。さらにこのような魚の食餌は、通常２００〜３１０ｇ／ｋｇの粗製脂肪含量を有する。
【００８２】
本発明に従った動物飼料組成物は、５０〜８００ｇ／ｋｇの粗製タンパク質含量を有し、本明細書で特許請求される少なくとも１つの融合酵素をさらに含んでなる。
【００８３】
さらに、または（上で示される粗製タンパク質含量の）代案では、本発明の動物飼料組成物は、１０〜３０ＭＪ／ｋｇの代謝エネルギー含量；および／または０．１〜２００ｇ／ｋｇのカルシウム含量；および／または０．１〜２００ｇ／ｋｇの有効態リン含量；および／または０．１〜１００ｇ／ｋｇのメチオニン含量；および／または０．１〜１５０ｇ／ｋｇのメチオニン＋システイン含量；および／または０．５〜５０ｇ／ｋｇのリジン含量を有する。
【００８４】
特定の実施形態では、代謝エネルギー、粗製タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン、および／またはリジンの含量は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ｂの２、３、４または５（Ｒ．２〜５）のいずれか１つの範囲内である。
【００８５】
粗製タンパク質は、窒素（Ｎ）に計数６．２５を乗じて計算され、すなわち粗製タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５である。窒素含量は、ケルダール法によって判定される（Ａ．Ｏ．Ａ．Ｃ．，１９８４，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １４ｔｈ  ｅｄ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）。
【００８６】
代謝エネルギーは、ＮＲＣ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｗｉｎｅ，ｎｉｎｔｈ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８８，ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｓｗｉｎｅ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ａｎｉｍａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｕｎｃｉｌ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２−６、およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｖａｌｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｆｅｅｄ−ｓｔｕｆｆｓ，Ｓｐｅｌｄｅｒｈｏｌｔ  ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  ｐｏｕｌｔｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，７３６１  ＤＡ  Ｂｅｅｋｂｅｒｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．Ｇｒａｆｉｓｃｈ  ｂｅｄｒｉｊｆ  Ｐｏｎｓｅｎ  ＆  ｌｏｏｉｊｅｎ  ｂｖ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ．ＩＳＢＮ  ９０−７１４６３−１２−５に基づいて計算し得る。
【００８７】
完全動物食餌中のカルシウム、有効態リン、およびアミノ酸の含量は、Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｔａｂｅｌ  １９９７，ｇｅｇｅｖｅｎｓ  ｏｖｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  ｓａｍｅｎｓｔｅｌｌｉｎｇ，ｖｅｒｔｅｅｒｂａａｒｈｅｉｄ  ｅｎ  ｖｏｅｄｅｒｗａａｒｄｅ  ｖａｎ  ｖｏｅｄｅｒｍｉｄｄｅｌｅｎ，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｂｕｒｅａｕ，Ｒｕｎｄｅｒｗｅｇ  ６，８２１９  ｐｋ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ．ＩＳＢＮ  ９０−７２８３９−１３−７などの飼料表に基づいて計算される。
【００８８】
特定の実施形態では、本発明の動物飼料組成物は、少なくとも１つのタンパク質を含有する。タンパク質は、食肉および骨粉、および／または魚粉などの動物タンパク質であってもよく；またはそれは、植物性タンパク質であってもよい。植物性タンパク質という用語は、本明細書の用法では、変性タンパク質およびタンパク質誘導体をはじめとする、植物に由来するまたはそれから生じる、少なくとも１つのタンパク質を含む、あらゆる化合物、組成物、調製品または混合物を指す。特定の実施形態では、植物性タンパク質のタンパク質含量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、または６０％（ｗ／ｗ）である。
【００８９】
植物性タンパク質は、例えばダイズミール、ルピナスミール、およびナタネミールなど、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物からの材料などの、マメ類および穀類などの植物性タンパク質原料に由来してもよい。
【００９０】
なおもさらなる特定の実施形態では、本発明の動物飼料組成物は、０〜８０％のトウモロコシ；および／または０〜８０％のソルガム；および／または０〜７０％のコムギ；および／または０〜７０％のオオムギ；および／または０〜３０％のオートムギ；および／または０〜４０％のダイズミール；および／または０〜２５％の魚粉；および／または０〜２５％の食肉および骨粉；および／または０〜２０％の乳清を含有する。
【００９１】
動物食餌は、例えば粉餌（非ペレット化）またはペレット化飼料または押出し飼料として製造し得る。典型的に、粉砕飼料は混合されて、当該動物種のための規格に従って、十分な量の必須ビタミンおよびミネラルが添加される。本発明に従った融合酵素は、固体または液体ポリペプチド調合物として添加され得る。例えば固体ポリペプチド調合物は、典型的に混合ステップの前または最中に添加され；液体ポリペプチド調製品は、典型的にペレット化ステップ後に添加される。
【００９２】
食餌中の最終融合酵素濃度は、例えば動物食餌１ｋｇあたり５〜３０ｍｇのポリペプチドタンパク質の範囲内など、食餌１ｋｇあたり０．０１〜２００ｍｇのポリペプチドタンパク質の範囲内である。
【００９３】
融合酵素、特に本発明の融合フィターゼは、もちろん有効量で、すなわち可溶化を改善しおよび／または飼料栄養価を改善するのに適切な量で、適用されるべきである。現在のところ、ポリペプチドを以下の１つまたは複数の量で投与することが検討される（投与量範囲）：０．０１〜２００；０．０１〜１００；０．５〜１００；１〜５０；５〜１００；１０〜１００；０．０５〜５０；または０．１０〜１０。これらの範囲は全て、飼料１ｋｇあたりの酵素またはフィターゼポリペプチドタンパク質のｍｇ数（ｐｐｍ）である。
【００９４】
飼料１ｋｇあたりの酵素またはフィターゼポリペプチドタンパク質のｍｇ数を判定するために、飼料組成物から酵素またはフィターゼを精製し、妥当なアッセイを使用して精製酵素の比活性を測定する。
【００９５】
［実施例］
本明細書で開示される特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様の例証であることが意図されるので、本明細書で記載され特許請求される本発明の範囲は、これらの実施形態によって限定されない。あらゆる同等の実施形態は、本発明の範囲内であることが意図される。確かに、前述の記述から、当業者には、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が明白になるであろう。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【００９６】
［一般手法］
最初の段落では、一般手法を要約する。
【００９７】
［株およびプラスミド］
本発明のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（ｔｒｐＣ２）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＬ００９１２６）の原栄養株誘導体である、１Ａ７４７株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ  ４３２１０  ＵＳＡ）に由来する。
【００９８】
［培地］
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のための標準最少培地（ＭＭ）は、１×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩、０．０４％ナトリウムグルタミン酸、および０．５％グルコースを含有する。標準固体完全培地は、トリプトン血液寒天ブロス（ＴＢＡＢ、Ｄｉｆｃｏ）である。標準液体完全培地は、子牛肉浸出液−酵母抽出物ブロス（ＶＹ）である。これらの培地の組成について下で述べる。
ＴＢＡＢ培地：３３ｇのＤｉｆｃｏトリプトン血液寒天ベース（カタログ番号０２３２）、１Ｌの水。高圧蒸気滅菌。
ＶＹ培地：２５ｇのＤｉｆｃｏ子牛肉浸出液ブロス（カタログ番号０３４４）、５ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物（カタログ番号０１２７）、１Ｌの水。高圧蒸気滅菌。
最少培地（ＭＭ）：１００ｍｌの１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩；１０ｍｌの５０％グルコース；１ｍｌの４０％グルタミン酸ナトリウム、水で１Ｌにする。
１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ塩：１４０ｇのＫ２ＨＰＯ４；２０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；６０ｇのＫＨ２ＰＯ４；１０ｇのＮａ３クエン酸・２Ｈ２Ｏ；２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；水で１Ｌにする。
１０×ＶＦＢ最少培地（１０×ＶＦＢＭＭ）：２．５ｇのグルタミン酸Ｎａ；１５．７ｇのＫＨ２ＰＯ４；１５．７ｇのＫ２ＨＰＯ４；２７．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ；４０ｇのＮＨ４Ｃｌ；１ｇクエン酸；６８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；水で１Ｌにする。
微量成分溶液：１．４ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．４ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．１５ｇの（ΝΗ４）６Μｏ７Ｏ２４・４Η２Ｏ；０．１ｇのＡＩＣｌ３・６Ｈ２Ｏ；０．０７５ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；水で２００ｍｌにする。
Ｆｅ溶液：０．２１ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；水で１０ｍｌにする。
ＣａＣｌ２溶液：１５．６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；水で５００ｍｌにする。
Ｍｇ／Ｚｎ溶液：１００ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．４ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；水で２００ｍｌにする。
ＶＦＢ  ＭＭ培地：１００ｍｌの１０×ＶＦＢＭＭ；１０ｍｌの５０％グルコース；２ｍｌの微量成分溶液；２ｍｌのＦｅ溶液；２ｍｌのＣａＣｌ２溶液；２ｍｌのＭｇ／Ｚｎ溶液；８８２ｍｌの無菌蒸留水。
バイオフィルムの成長を促進するＭＳｇｇ培地：２．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１００ｍＭのＭＯＰＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、７００μΜのＣａＣｌ２、５０μΜのＭｎＣｌ２、１μΜのＺｎＣｌ２、５０μΜのＦｅＣｌ３、２μΜのチアミン、０．５％グリセロール、０．５％グルタミン酸、５０μｇ／ｍｌのトリプトファン、５０μｇ／ｍｌのフェニルアラニン。
【００９９】
［分子および遺伝子技術］
標準遺伝子および分子生物学技術は、一般に当該技術分野で既知であり、以前記載されている。ＤＮＡ形質転換、ＰＢＳ１普遍形質導入、およびその他の標準Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子技術もまた、一般に当該技術分野で既知であり、以前記載されている。（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，１９９２）。
【０１００】
［タンパク質精製］
ＶＹ培地中における３７℃で２４時間の培養に続いて、培養物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。タンパク質を濃縮するために、Ｈｉｓ標識対象タンパク質を含有する上清に、４℃での緩慢な添加を通じて８０％の硫酸アンモニウムを添加した。１０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離後、ペレットタンパク質を５ｍＬの２０ｍＭのトリスＨＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液中に回収してから、４℃において１Ｌの同一緩衝液中で２回連続透析した。濾過後、濃縮タンパク質をヒスチジン親和性クロマトグラフィーカラム（ＨｉｓＴｒａｐ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。Ｈｉｓ標識対象タンパク質を製造会社の推奨事項に従って、当業者によって知られているように精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて同定された、対象タンパク質を含有する画分を透析して、微量のイミダゾールを除去した。
【０１０１】
［フィターゼ活性試験］
Ｈａｎ  Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって記載されるように、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼ活性を５０℃およびｐＨ４で評価した。最初に、７５μＬのサンプルを、３００μＬの反応緩衝液、１００ｍＭのＣ４Ｈ６Ｏ４、２ｍＭのＣ６Ｈ１８Ｏ２４Ｐ６、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ４と共に、５０℃でインキュベートした。３０分後に３７５μＬの１５％トリクロロ酢酸（ｖ／ｗ）を添加して、酵素反応を停止させた。次に４５０μＬの蒸留水と、５００μＬの６００ｍＭのＨ２ＳＯ４、１００ｍＭのＣ６Ｈ７ＮａＯ６、４ｍＭの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４の溶液と共に、５０μＬの停止予備反応液を５０℃で２０分間インキュベートすることで、放出されたオルトリン酸塩を測定した。次に光学濃度を８２０ｎｍで測定した。次に以下の式に従って、酵素活性を測定した：
活性（Ｕ／Ｌ）＝［（ＯＤｓａｍｐｌｅ−ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈係数］／（係数ｃａｔ×３０分間）
【０１０２】
［ドットブロット結合アッセイ］
一次抗体である抗ＨｉｓＴａｇ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、二次抗体であるペルオキシダーゼ共役抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）とを使用して、ＥＬＩＳＡ手順に従って、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンへの結合アッセイを実施した。製造会社の推奨事項に従って、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により顕色を行った。当業者に良く知られているドットブロット手順に従って、タンパク質を予備スポットしてブロットを形成した。
【０１０３】
［バイオフィルム結合アッセイ］
「タンパク質精製」の節に記載されるように精製した後、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のバイオフィルム結合領域ＴａｓＡと、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を、ＶＹ培地中で一晩調製されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１バイオフィルム形成株の前培養に混合した。同一手順に従って、しかしＴａｓＡ＿ＢＳＰ１−Ｐｈｙ融合タンパク質をバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１の前培養に混合するのを省いて、対照を調製した。それぞれの混合物の１００μＬを、０．５％寒天を添加したＭＳｇｇ培地の表面に注ぐ。静置培養物を２２℃で５日間培養して、バイオフィルム形成を誘発した。次に無菌ループによってバイオフィルムを採取して、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１バイオフィルムに組み込まれなかったＴａｓＡ＿ＢＳＰ１−Ｐｈｙタンパク質融合物を排除するために、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＣａＣｌ２からできた溶液で３回洗浄した。次に「フィターゼ活性試験」の節に記載されるように、フィターゼ活性アッセイのために、バイオフィルムを反応緩衝液に懸濁した。
【０１０４】
［実施例１−翻訳融合Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、野生の有益な株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１中で同定されたＣｎａ型コラーゲン結合領域と、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１０５】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表１）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）３個の結合モチーフを潜在的に含有して、３６個の最初のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、１０７６個のＡＡ  Ｃｎａ−型コラーゲン結合タンパク質をコードするＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１遺伝子配列
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１０６】
表１．Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化１】
2014518634.tif 000003
【化２】
2014518634.tif 000004
【化３】
2014518634.tif 000005
【０１０７】
［実施例２−翻訳融合Ｃｎａ−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）コラーゲン結合領域Ｃｎａと、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１０８】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表２）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）３０個の最初のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、３１３個のＡＡコラーゲン結合タンパク質をコードするスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ｃｎａ配列
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１０９】
表２．Ｃｎａ−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化４】
2014518634.tif 000006
【化５】
2014518634.tif 000007
【０１１０】
［実施例３−融合Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙを発現するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築］
本実施例は、Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物を過剰発現するようにデザインされた、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰＢ２９株の構築について記載する。
【０１１１】
Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ合成遺伝子は、当業者に知られているように、マルチコピープラスミドに挿入され、次にプロテアーゼ欠損Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に形質転換された。
【０１１２】
［実施例４−融合Ｃｎａ−ｐｈｙを発現するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築］
本実施例は、Ｃｎａ−ｐｈｙを過剰発現するようにデザインされた、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰＢ３２株の構築について記載する。
【０１１３】
Ｃｎａ−ｐｈｙ合成遺伝子は、当業者に知られているように、マルチコピープラスミドに挿入され、次にプロテアーゼ欠損Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に形質転換された。
【０１１４】
［実施例５−翻訳融合Ｃｎａ  Ｄｄ−ａｍｙのデザイン］
本実施例は、デニトロバクテリム・デトキシフィカンス（Ｄｅｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｎｓ）（Ｄｒ．Ｓｔａｎｔｏｎ，，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｔｒ，ＵＳＤＡ−Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡからの提供）のコラーゲン結合領域Ｃｎａと、α−アミラーゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１１５】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表３）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）７７１個のＡＡコラーゲン結合タンパク質をコードする、デニトロバクテリム・デトキシフィカンス（Ｄｅｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｎｓ）Ｄｄ０１ｇ０１４９２０配列
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の３８個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＬ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１１６】
表３．Ｃｎａ＿Ｄｄ−ａｍｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。Ｂ．リチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ配列は、小文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体太字小文字である。
【化６】
2014518634.tif 000008
【化７】
2014518634.tif 000009
【化８】
2014518634.tif 000010
【０１１７】
［実施例６−Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｖ融合物のコラーゲン親和性結合］
本実施例は、精製Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物のＩ型およびＩＶ型コラーゲンへの生体外結合を実証する。
【０１１８】
図１は、Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。低下する異なる量のコラーゲンをメンブラン上にスポットしてから、一定量のＣｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物（５ｎＭ）と共に、インキュベートした。翻訳融合物のＨｉｓタグに対する一次抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって顕色を行った。
【０１１９】
［実施例７−Ｃｎａ−ｐｈｙ融合のコラーゲン親和性結合］
本実施例は、精製Ｃｎａ−ｐｈｙ融合物のＩ型およびＩＶ型コラーゲンへの生体外結合を実証する。
【０１２０】
図２は、Ｃｎａ−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。低下する異なる量のコラーゲンをメンブラン上にスポットしてから、一定量のＣｎａ−ｐｈｙ融合物（５ｎＭ）と共に、インキュベートした。翻訳融合物のＨｉｓタグに対する一次抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって顕色を行った。
【０１２１】
［実施例８−Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙの親和性スペクトル］
本実施例は、コラーゲン結合ドメインを含有する融合物が、生体外で、その他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、すなわちラミニン、フィブロネクチン、およびフィブリノーゲンにもまた結合できることを実証する。
【０１２２】
図３は、Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。２つの異なる量の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質をメンブラン上にスポットしてから、一定量のＣｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物（５ｎＭ）と共に、インキュベートした。翻訳融合のＨｉｓタグに対する一次抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって顕色を行った。
【０１２３】
［実施例９−コラーゲン結合Ｃｎａ−ｐｈｙ融合物のフィターゼ活性］
本実施例は、コラーゲンに結合する融合物が、顕著なフィターゼ活性を示すことを実証する。
【０１２４】
図４は、ＩおよびＩＶ型コラーゲンに結合する、フィターゼ酵素活性のヒストグラムを示す。図４で言及される異なる量の標的コラーゲンをマイクロタイタープレートに塗布してから、一定の量のＣｎａ−ｐｈｙ融合物（５０ｎＭ）と共にインキュベートした。洗浄後、一般手法に記載されるようにして、コラーゲン結合融合物のフィターゼ活性を評価した。コラーゲン結合フィターゼ活性は、ＢＳＡ（１０μｇ）で被覆されたウェル内のインキュベーション後に観察されたものよりも、顕著により高い。
【０１２５】
［実施例１０−翻訳融合物ＣＢＤ−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼのコラーゲン結合領域ＣＢＤと、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１２６】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表４）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）ｃｏｌＨのＳ２ＢおよびＳ３ドメインからの２１５個のＡＡをコードするクロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）配列（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１２７】
表４．ＣＢＤ−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化９】
2014518634.tif 000011
【化１０】
2014518634.tif 000012
【０１２８】
［実施例１１−翻訳融合物ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３のムチン結合領域と、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１２９】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表５）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＦ１２０１０４配列内の位置５４９と位置９３９の間のラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３Ｍｕｂ１（ＲＩ＋ＲＩＩ反復）３９０ＡＡ（Ｒｏｏｓ  ａｎｄ  Ｊｏｎｓｓｏｎ，２００２）
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１３０】
表５．ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化１１】
2014518634.tif 000013
【化１２】
2014518634.tif 000014
【０１３１】
［実施例１２−融合ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙの生成］
本実施例は、ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙを過剰発現するようにデザインされた、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰＢ３３株の構築と、その精製について記載する。
【０１３２】
ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ合成遺伝子は、当業者に知られているように、マルチコピープラスミドに挿入され、次にプロテアーゼ欠損Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に形質転換された。一般手法の節に記載される手順に従った精製後、フィターゼ比活性が３５００Ｕ／ｇであるＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）融合物が得られた。
【０１３３】
［実施例１３−ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ融合物のムチン親和性結合］
本実施例は、精製ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ融合物とムチンとの生体外結合を実証する。
【０１３４】
図５は、ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。２つの異なる量のムチンをメンブラン上にスポットしてから、と一定量のＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ融合物（３０ｎＭ）と共に、インキュベートした。翻訳融合のＨｉｓタグに対する一次抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって顕色を行った。
【０１３５】
［実施例１４−翻訳融合物ＭｕｂＢＰ（Ｒ５＋Ｒ６）−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３のムチン結合領域Ｒ５およびＲ６と、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１３６】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表６）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＡＦ１２０１０４配列内の位置２１０５と位置２４７５の間のラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３のＲ５＋Ｒ６反復３７０個のＡＡ（Ｒｏｏｓ  ａｎｄ  Ｊｏｎｓｓｏｎ，２００２）
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１３７】
表６．ＭｕｂＢＰ（Ｒ５＋Ｒ６）−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化１３】
2014518634.tif 000015
【化１４】
2014518634.tif 000016
【０１３８】
［実施例１５−翻訳融合ＳｐａＢ−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧのＳｐａＢからの付着領域と、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１３９】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表７）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）配列ＬＧＧ＿００４４３の位置２７と位置２０３の間のラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ付着ドメイン１７７個のＡＡ
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１４０】
表７．ＳｐａＢ−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は下線付き小文字の斜体である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化１５】
2014518634.tif 000017
【化１６】
2014518634.tif 000018
【０１４１】
［実施例１６−翻訳融合物Ｍｓａ−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｔａｒｕｍ）マンノース（ｍａｎｏｓｅ）特異的付着ＭｓａのｃｏｎＡ様レクチンドメインと、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
【０１４２】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表８）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｍｓａからのコンカナバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）様レクチンドメイン：配列ＥＨＳ８３６５０内の位置２６３と位置５１７の間の２５７個のＡＡ
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１４３】
表８．Ｍｓａ−ｐｈｙ翻訳融合の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は下線付き小文字の斜体である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは、太字の小文字である。停止コドンは、太字の大文字である。ペプチドシグナルは、下線付き小文字である。プロモーターは、斜体の小文字である。
【化１７】
2014518634.tif 000019
【化１８】
2014518634.tif 000020
【０１４４】
［実施例１７−翻訳融合物ｔａｓＡ  ＢＳＰ１−ｐｈｙのデザイン］
本実施例は、野生の有益な株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１のＴａｓＡタンパク質と、サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、遺伝子配列について記載する。
【０１４５】
５’から３’方向で、構成はそれぞれ以下を含有する（表９）：
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｔｂｉｌｉｓ）ａｍｙＱからのプロモーター領域
−）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｗＤ遺伝子からのシグナルペプチド（３２個の最初のＡＡをコードする）
−）停止コドンが欠失した、（バイオフィルムマトリックスの主要構成要素をコードする）２６１個のＡＡ  ＴａｓＡタンパク質をコードするＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１遺伝子配列
−）１０個のアラニンスペーサー（ＰｖｕＩＩ制限部位を含む）
−）最初の２２個のＡＡ１５（シグナルペプチド）が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａｋｉｉ）フィターゼ遺伝子ａｐｐＡ
−）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎｅ）切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、２個の連続停止コドン、およびＮｈｅｌ切断部位をそれぞれ含有する、５６個のｂｐ配列。
【０１４６】
表９．ｔａｓＡ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ翻訳融合物の配列。ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｈｅｌクローニング部位は、太字で下線付きである。アラニンスペーサー領域は、下線付き大文字である。コドンペア最適化フィターゼ配列は、斜体の大文字である。Ｈｉｓタグは太字である。
【化１９】
2014518634.tif 000021
【０１４７】
［実施例１８−融合ｔａｓＡ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙを発現するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築］
本実施例は、ｔａｓＡ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物を過剰発現するようにデザインされた、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１−２８株の構築について記載する。
【０１４８】
ｔａｓＡ＿ＢＳＰ１遺伝子は、ＳａｌＩ制限部位（５’−ＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧ）を持つプライマーと、ＰｖｕＩＩ（５’−ＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧＴＧＣＧＣＴＴＴＴＴＣ）を持つプライマーとを用いて、ＰＣＲによって増幅された。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩ制限酵素によって、二重消化した。ゲル精製後、ＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩ制限酵素であらかじめ二重消化されたマルチコピープラスミド（実施例ＧＳ３に記載される）に、ｔａｓＡ＿ＢＳＰ１断片を挿入した。次に当業者に知られているように、ｔａｓＡ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物を保有する組換えベクターをＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株に形質転換した。
【０１４９】
［実施例１９−バイオフィルム結合ＴａｓＡ＿ＢＳＰ１−Ｐｈｙ融合物のフィターゼ活性］
本実施例は、細菌バイオフィルムに結合する融合物が、顕著なフィターゼ活性を示すことを実証する。図６（ＴａｓＡ＿ＢＳＰ１−Ｐｈｙ融合タンパク質が添加された、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１バイオフィルムのフィターゼ活性）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に結合する、フィターゼ酵素活性のヒストグラムを示す。洗浄後、バイオフィルム結合融合物のフィターゼ活性は、「一般手法」に記載されるように評価される。ＴａｓＡ＿ＢＳＰ１−Ｐｈｙ融合タンパク質をバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１バイオフィルム形成株の前培養に混合するのを省いて調製された対照は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の内在性フィターゼ活性を示す。ＴａｓＡ＿ＢＳＰ１−Ｐｈｙ融合タンパク質（７２０Ｕ／ｍｇの全タンパク質）と共にインキュベートされたバイオフィルム中でアッセイされたフィターゼ活性は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳＰ１の内在性フィターゼ活性よりも顕著に高い。この追加的な活性は、バイオフィルム結合フィターゼに起因する。フィターゼの１単位は、１分間で、ナトリウムフィチン酸から１μｍｏｌの無機リン酸塩を放出するのに要する、酵素量と規定された。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。
【図２】Ｃｎａ−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。
【図３】Ｃｎａ＿ＢＳＰ１−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。
【図４】ＩおよびＩＶ型コラーゲンに結合する、フィターゼ酵素活性のヒストグラムを示す。
【図５】ＭｕｂＢＰ（ＲＩ＋ＲＩＩ）−ｐｈｙ融合物のドットブロットを示す。
【図６】Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に結合する、フィターゼ酵素活性のヒストグラムを示す。
【図１】
2014518634.tif 000022
【図２】
2014518634.tif 000023
【図３】
2014518634.tif 000024
【図４】
2014518634.tif 000025
【図５】
2014518634.tif 000026
【図６】
2014518634.tif 000027
【配列表】
2014518634000001.app
【国際調査報告】
2014518634.tif 000028
2014518634.tif 000029
2014518634.tif 000030