(57)【要約】  本発明は、（ｉ）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去するステップと；（ｉｉ）引き抜いた毛髪の残りの部分をコラーゲン分解剤と共にインキュベートして、外毛根鞘から幹細胞を分離するステップと;（ｉｉｉ）幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの分化を誘導し、増殖を刺激する培地中で、ステップ（ｉｉ）で得られた分離された幹細胞を培養するステップであって、培地が、差黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含むステップとを含む、幹細胞からメラノサイトを生成する方法に関する。さらに、メラノサイトを含む自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法を本明細書に記載するとともに、皮膚の色素脱失に関連する疾患または瘢痕を治療するための自家移植片、同種移植片および同種異系移植片またはメラノサイトも記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去するステップと；
（ｉｉ）引き抜いた毛髪の残りの部分をコラーゲン分解剤と共にインキュベートして、外毛根鞘から幹細胞を分離するステップと;
（ｉｉｉ）幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの分化を誘導し、増殖を刺激する培地中で、ステップ（ｉｉ）で得られた分離された幹細胞を培養するステップであって、培地が、黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含むステップと
を含む、幹細胞からメラノサイトを生成する方法。
【請求項２】
コラーゲン分解剤とのインキュベーション後に、引き抜いた毛髪の残りの部分を洗浄溶液で洗浄する、ステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｉｉ）の間のさらなるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｖ）培養物中の分化した黒色メラノサイトを選択および／または単離するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
メラノサイトが、ステップ（ｉｖ）において、毛根小区分の解剖学的選択および／または示差的トリプシン処理を用いて単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択するステップがジェネティシン処理を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記選択および／または単離が、示差的トリプシン処理とその後のジェネティシン処理を使用してメラノサイトを単離することを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
コラーゲン分解剤が、細胞表面、細胞基底膜のベース、皮膚および毛髪を被覆しているコラゲナーゼＩ、ＩＶおよびＶからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分化培地が、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、Ｃａ２＋、Ｌ−グルタミン、インスリン、ウシ胎児血清、ヒト血清、およびウシ脳下垂体抽出物からなる群から選択される１種または複数の化合物をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
増殖因子および培養剤が、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ヒドロコルチゾン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ジブチリル環状アデノシン一リン酸（ｄｂｃＡＭＰ）、メラノサイト増殖因子（ＭｅＧＦ）、カポジ肉腫由来のＦＧＦ様因子（ｈｓｔ／Ｋ−ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、エンドセリン１、アルファ−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）または培養したヒトケラチノサイトによって条件付けした培地由来の、もしくはウシ下垂体エキス（ＢＰＥ）、ウシ脳抽出物、およびヒト血清由来の天然因子の混合物からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
メラノサイトを含む自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法であって、
（ｉ）請求項１〜９に記載の幹細胞からメラノサイトを生成する方法によって取得可能なメラノサイトを含む懸濁液を準備するステップと；
（ｉｉ）生体適合性担体を準備するステップと；
（ｉｉｉ）前記生体適合性担体上でメラノサイトを培養するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）の懸濁液が、前記メラノサイトに加えてケラチノサイトをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉｖ）前記生体適合性担体上で培養されたメラノサイト上にケラチノサイトを重層するステップと；
（ｖ）前記生体適合性担体上で培養されたメラノサイト上の前記ケラチノサイトを培養するステップと
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
生体適合性担体が３次元の繊維網目構造からなる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
生体適合性担体が、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、コラーゲン、ヒトコラーゲンＩ、ヒトコラーゲンＩＶ、ヒトコラーゲンＶ、フィブリンおよびゼラチンからなる群から選択される少なくとも１種の材料からなる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
メラノサイトが、基底層が形成されるまで培養される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
メラノサイト上のケラチノサイトの培養が、ステップ（ｉｖ）の角化層（stratum corneum）の形成まで培地−空気界面で行われる、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ケラチノサイトとメラノサイトとが１０：１の比率で準備される、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法によって取得可能な自家移植片、同種移植片または同種異系移植片。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって取得可能なメラノサイト。
【請求項２０】
白皮症、白斑、四色白斑、点状白斑、アルビノ症候群、例えば、アレサンドリニ症候群、ヘルマンスキー・プドゥラック症候群、チェディアック・東症候群、グリセリ症候群（エレジャルデ症候群、２型グリセリ症候群および３型グリセリ症候群）、ワールデンブルグ症候群、ティーツェ症候群、クロス・マキュージック・ブリーン症候群、ＡＢＣＤ症候群、白皮症・難聴症候群およびフォークト・小柳・原田症候群、眼皮膚白皮症、メラニン減少症（特発性滴状低メラニン症、葉状低メラニン症、進行性黄斑低メラニン症）、斑症、脱色素性母斑、炎症後色素沈着減少症、白色粃糠疹、浮浪者黒皮症、イエメン人視聴覚障害低色素症候群、ウェンデ・バックス症候群、ウォロノフ環、アメラニスム、先天性色素欠如症、および皮膚の色素脱失に関連する疾患の群から選択される疾患の治療で使用するための、請求項１８に記載の自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片、および／または請求項１９に記載のメラノサイト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医学の分野、詳しくは幹細胞生物学の分野、さらに詳しくはヒト毛根に由来する幹細胞および前駆物質からメラノサイトを生産または生成する分野に関する。さらに、本発明は、メラノサイトを含む自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素脱失は皮膚の色抜けまたは色素の消失である。皮膚の色素脱失は、多くの局所症状および全身症状によって発症し得る。色素の消失は、例えば皮膚の損傷のように部分的であるか、あるいは、例えば白斑などのように全身的である可能性があり、一時的または永続的であり得る。
【０００３】
皮膚の色素脱失は白斑に罹患している人達の疾患的特徴であって、薄い色の皮膚と濃い色の皮膚の異なる領域が生じる。外見上の不利益があるだけでなく、色素沈着が少ない皮膚領域は日焼けしやすく、あるいはそれ以上に悪影響を受けやすく、最悪の場合には、皮膚癌が発症する。それ故に、現在、色素産生を提供することによって、これらの色素脱失の領域を保護する、簡単で信頼性のある方法を提供するために多大なる努力を払っている。一つの手法は、色素脱失の皮膚領域にメラノサイトを適用することである。メラノサイトは、特に皮膚表皮の底層（基底層）に位置する、メラニン産生細胞である。メラニンは、主として皮膚の色を決定するとともに、太陽放射線からの重要な保護を可能にする色素である。
【０００４】
白斑に対する既存の治療法は部分的に有効ではあるが、症状緩和療法であるか侵襲的療法のいずれかである。したがって、治療作用をもたらし得る非侵襲的な自家移植治療に対して医療上の高い関心がもたれており、市場の将来性もある。
【０００５】
多能性成体幹細胞、一過性増幅細胞、前駆体および分化細胞を含有する、毛包外毛根鞘（ＯＲＳ）の発生能は公知ある。これらの細胞は、（他の細胞型の中で）メラノサイトを生じさせることができる。１９９５年にヒト毛包メラノサイト（ＨＭ）が初めて長期培養されて以来（Tobin D J, Colen S R, Bystryn J C. J Invest Dermatol 1995: 104: 86-89）、いくつかの方法論的な改良を行うことによって、持続時間、収率および培養純度に対処してきた。
【０００６】
しかし、さらなる処理と皮膚への適用を行うための純粋なメラノサイトを回収するためには、メラノサイト産生細胞を単離する方法および分化させる方法が必要である。さらに、短期間の培養後に産生されたメラノサイトの数を増加させる方法を提供する必要がある。本発明者らは、今回、この問題を解決する本明細書で以下に記載の手段および方法を提供する。さらに本発明者らは、このようなメラノサイトは色素脱失の治療に非常に適しており、メラニンの高生産と３次元構造における高い酵素効力を予想外に示すことができることを見出した。
【０００７】
メラノサイトをどのように取得し培養するかについて公知の方法がある。一つの手法は、毛包由来の幹細胞からのメラノサイトの分化と培養である（ＷＯ−Ａ２  ２００９／０４９７３４）。かかる目的において、引き抜いた毛髪を酵素で処理し、毛包から幹細胞を遊離させる。分化および培養を行った後に、患部への適用が提案された。しかし、本発明者らは、ＷＯ−Ａ２  ２００９／０４９７３４に開示されている方法によって、治療に求められている以外の不必要な細胞型、例えば、線維芽細胞およびケラチノサイトも培養し、それらが治療の効果に対して悪影響を示すことを確認した。公知の方法でも不必要な細胞型が培養されているが、それによって色素脱失の治療効果が失われるか、その最良の状態がより複雑化される。このため、メラノサイトを生成し取得する改良方法が必要とされている。さらに、高純度のそのような細胞を提供することも必要とされている。
【０００８】
Dieckmannら(2010);Experimental Dermatology;19(6):543-545には、引き抜いた毛包の外毛根鞘（ＯＲＳ）からこれらの成体幹細胞を取得する非侵襲的方法が開示されている。しかし、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）には、（１）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去し、引き抜いた毛髪の残りの部分を使用することと、（２）引き抜いた毛髪をコラゲナーゼで処理することについて開示されていない。さらに、本明細書で提供した方法による培養は、ジェネティシン処理を含むメラノサイトを選択および／または単離するステップを含み得る。このようなステップは、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）には開示されていない。
【０００９】
実施例２に示すように、本発明の方法は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法に比べて、メラノサイトを極めて顕著に成長および増殖させることができる。図１５は、本明細書で提供した方法によって、菌体数が数継代にわたって指数関数的に増加するのに対し、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法を使用した場合には菌体数が反対に減少することを示している。実施例２に示すように、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法は、合計で７１０，０００個を超えるメラノサイトを生産することはできなかったが、本発明の方法は、６継代後に、別の比較可能な条件下において、合計で約８０，８７５，０００個のメラノサイトを生産することができた。言いかえれば、本発明は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法と比べると、１００倍を超えるメラノサイトの高い生産を提供する。引き抜いたヒト毛髪当たり（あるいは同様に毛包当たり）に対応する生成されたメラノサイトの数を計算した場合、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法では、引き抜いたヒト毛髪当たり（あるいは毛包当たり）約７，０００個（より正確には７，７１７個のメラノサイト）よりも多くを生産することはできなかったが、本発明の方法では、６継代後に、他の点では比較可能な条件下において、引き抜いたヒト毛髪当たり（あるいは毛包当たり）約２，７００，０００個のメラノサイトを生産することができた。言いかえれば、本発明は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法と比べると、１００倍を超えるメラノサイトの高生産を提供する。本発明の方法は、有利には、メラノサイトの接着培養を含むことができる。
【００１０】
本明細書で提供した方法とＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法とを比べた第１の相違点は、引き抜いたヒト毛髪の毛球の除去である。毛球は多量の線維芽細胞を含有し担持していると考えられている。毛球を除去することによって、本明細書で使用する引き抜いた毛髪は、線維芽細胞をより少ない量で含有する／産生する。したがって、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）と比較すると、本明細書で提供した方法の最初から線維芽細胞は少なくなっている。細胞培養物の線維芽細胞による混入が少なくなり、その結果、最初から栄養と空間に対する競合が低減するため、メラノサイトの増殖がより良好になると考えられる。
【００１１】
本明細書で提供した方法とＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法とを比べた第２の相違点は、引き抜いた毛髪をコラーゲン分解剤（例えばコラゲナーゼ）と共にインキュベーションを行うことである。前記インキュベーションは１０分間かかり得る。コラーゲン分解剤は、引き抜いた毛髪の細胞間マトリックスを緩める。前記の緩みによって、幹細胞が細胞間マトリックスから遊離または遊走されやすくなると考えられる。したがって、コラーゲン分解剤と共にインキュベーションを行うと、幹細胞を外毛根鞘から分離させることができる。実施例２の図１３および図１４に示すように、本発明の方法を使用した場合、外毛根鞘の表面／細胞の数は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）に比べて確実に増加している。確かに、外毛根鞘の表面／細菌の数は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）に比べると、ほぼ２倍多かった（１．８４倍）。
【００１２】
それは、線維芽細胞の減少と幹細胞の細胞間マトリックスからの容易で／迅速で／増強された遊離が有利で驚くべき効果、すなわち、本方法が実施例２に示すように本発明に従ってメラノサイトの増殖と成長を顕著に増加させることができるという効果を有することによるものと考えられる。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）では、毛球の除去またはコラゲナーゼ処理、さらにはそれによって得られるいかなる利点についてもヒントの提供はされていない。逆に、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の教示では、酵素処理が細胞にとっては不利である可能性があったため、むしろその処理を回避していた。
【００１３】
以下に説明するように、ジェネティシン処理は、本明細書で提供した方法のさらに有利な態様である。図１５／図１６に示すように、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法でジェネティシン（Geniticin）を使用しても、本明細書で提供した方法とは異なり、メラノサイトの著しい増殖または選択／単離を達成することはできない。本発明の方法によるジェネティシン処理は、ゆっくりと分裂するメラノサイトにはほとんど影響しないのに対し、線維芽細胞およびケラチノサイトのような、急速に代謝し増殖する細胞を主として標的とするので有利である。このように、ジェネティシン処理は、細胞培養においてメラノサイトを富化し、メラノサイトの数を顕著に増加させることができる。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法におけるジェネティシン処理は、そのような望ましい作用を全く示さない。このため、ジェネティシン処理前のＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）による細胞培養物は、本発明の方法とは異なり、相当な量の線維芽細胞およびケラチノサイトと、わずかな量のメラノサイトを含有していると考えられる。したがって、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の細胞培養物のジェネティシン処理後のメラノサイトの量は、メラノサイトを効率的に選択／単離および増殖させるのには十分でないと考えられる。
【００１４】
上記で説明したように、本発明者らは、今回、引き抜いた毛包の外毛根鞘（ＯＲＳ）から成体幹細胞を取得し、機能性メラノサイトの純粋培養物へ分化させるための改良した非侵襲的方法を開発した。本明細書に記載の本発明に係る方法によって調製されるメラノサイトは、懸濁液、液体として、またはエアロゾルの形態で、単一培養物として、またはケラチノサイトと組み合わせて、白斑の治療に容易に使用することができる。本メラノサイトは、ケラチノサイトと共に自家移植片、同種移植片または同種異系移植片でさらに提供される。提供される移植片は、生体適合性（足場）担体によって安定化される。
【００１５】
本発明は、今回、４週間以内の少ない時間枠内で、多量かつ高純度で、引き抜いたヒト毛髪の外毛根鞘由来の幹細胞からの分化を介して、非侵襲的にメラノサイトを取得することを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、幹細胞および／またはメラノサイト前駆体からメラノサイトを生成するための改良された方法を提供する。したがって、本発明は、
（ｉ）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去するステップと；
（ｉｉ）引き抜いた毛髪の残りの部分をコラーゲン分解剤と共にインキュベートして、外毛根鞘から幹細胞を分離するステップと;
（ｉｉｉ）分化を誘導し、幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの増殖を刺激する培地中で、ステップ（ii）で得られた分離された幹細胞を培養するステップであって、培地が、分化した黒色メラノサイトのみが培養物中に残るまで黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含むステップと
を含む、幹細胞からメラノサイトを生成する方法に関する。
【００１７】
本発明者らは、毛髪の毛球を除去した場合に、線維芽細胞および他の細胞型の混入を大幅に低減できることを思いがけなく見出した。本発明に係る方法は、より短い時間枠内で純粋なメラノサイトの産生を増加させることを可能にする。上記方法のステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）を組み合わせることによって、本発明は、例えばＤｉｅｋｍａｎｎら（２０１０）の方法に比べて、より短い時間枠内で増量された高純度のメラノサイトを生成する方法を提供する。
【００１８】
本発明に係る方法によって生成されるメラノサイトは、驚いたことに、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片に非常に適する。したがって、本発明はまた、
（ｉ）本発明に係る幹細胞からメラノサイトを生成する方法によって取得可能なメラノサイトを含む懸濁液を準備するステップと；
（ｉｉ）生体適合性担体を準備するステップと；
（ｉｉｉ）前記生体適合性担体上でメラノサイトを培養するステップと
を含む、メラノサイトを含む自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法によって取得可能な自家移植片、同種移植片または同種異系移植片に関する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明に係る幹細胞および／またはメラノサイト前駆体からメラノサイトを生成する方法によって取得可能なメラノサイトに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一実施形態では、本発明は、
（ｉ）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去するステップと；
（ｉｉ）引き抜いた毛髪の残りの部分をコラーゲン分解剤と共にインキュベートして、外毛根鞘から幹細胞を遊離させるステップと;
（ｉｉｉ）分化を誘導し、幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの増殖を刺激する分化培地中で、ステップ（ｉｉ）で得られた分離された幹細胞を培養するステップであって、培地が、分化した黒色メラノサイトのみが培養物中に残るまで、黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含むステップと
を含む、幹細胞からメラノサイトを生成する方法に関する。
【００２２】
本発明者らは、毛包／引き抜いたヒト毛髪の近位部、すなわち毛球が切断されると、本発明に係る方法を使用するメラノサイトの収率および純度を大幅に高めることができることを思いがけず見出した。したがって、本発明に係る方法は、引き抜いた毛髪の毛球を除去することを含む。本発明の文脈における引き抜いたヒト毛髪の「毛球」とは毛根の近位部であって、それはほとんど分化した細胞、主に線維芽細胞を含有している。好ましい実施形態では、「バルジ」とも呼ばれる毛幹の末端部も、引き抜き時に失われていない場合、切断される。好ましい実施形態では、引き抜いた毛根（the epilated hair root）の中間部のみが使用される。本発明の文脈における引き抜いた毛髪（an epilated hair）の中間部とは、好ましくは、毛球（近位部）と皮脂腺チャネルとの間の形態学的な単位である。この部分は、各種の部分的に分化した前駆体（上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞）から完全に分化した細胞にわたっており、その大部分が上皮前駆体であって、表皮の再生に有用である、多能性神経堤様細胞由来の不均一に分化した細胞のプールを含有している。本発明の文脈においては、引き抜いた毛髪および引き抜いた毛包という用語は同義で使用される。
【００２３】
当業者は、生成されるメラノサイトの総量を調節するために、本発明の文脈で使用される、引き抜いた毛髪の量を適合させることができる。一実施形態では、幹細胞からメラノサイトを生成する方法のステップ（ｉ）で、１〜５００本の引き抜いた毛髪の毛球を除去し、好ましくは、幹細胞からメラノサイトを生成する方法のステップ（ｉ）で、１０〜８０本の引き抜いた毛髪の毛球を除去し、さらに好ましくは、幹細胞からメラノサイトを生成する方法のステップ（ｉ）で、３０〜６０本の引き抜いた毛髪の毛球を除去する。
【００２４】
幹細胞からメラノサイトを産生する方法の好ましい実施形態では、本方法は、コラーゲン分解剤と共にインキュベーションした後に、引き抜いた毛髪の残りの部分を洗浄溶液で洗浄する、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間のさらなるステップを含む。
【００２５】
適切な洗浄溶液は当該技術分野において公知であり、当業者の知識によって選択することができる。好ましい実施形態では、洗浄溶液は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。さらなる好ましい実施形態では、洗浄溶液は、抗生物質、好ましくは、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カルベニシリン、ペニシリンＧ、アンピシリン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、シプロフロキサシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリン（Cabenicilin）、チオストレプトン、セフタシジン（Ceftacidin）、アプラマイシン、バンコマイシン、トブラマイシン、リファンピシン、およびヒグロマイシンからなる群から選択され、好ましくは、洗浄溶液は、抗生物質、好ましくは、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシンからなる群から選択される。
【００２６】
当業者は、洗浄溶液に適した塩および/または抗生物質の濃度を決定することができる。しかし、以下に、好ましい抗生物質および好ましい濃度を括弧内に記す：ペニシリン、例えば（５０Ｕ／ｍｌ〜１５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０ｐｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ）、硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍｌ〜３０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（０．２５ｐｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、好ましくは２．５μｇ／ｍｌ）、（２５μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌ）、（５０ｐｇ／ｍｌ〜１００００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ）、（２５μｇ／ｍｌ〜３０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μ／ｍｌ）、アンピシリン三水和物（５０Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１００Ｕ／ｍｌ）、カルベニシリン、（５０Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１００Ｕ／ｍｌ）（５０Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１００Ｕ／ｍＬ）、硫酸ポリミキシン−Ｂ（２５μｇ／ｍｌ〜３０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ）、（２μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ）、７−ヒドロキシ−テトラサイクリン（それぞれ２〜２５μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ）、（５〜３５μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（５０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００μｇ／ｍｌ）、（２μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ）、（２μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）、リンコマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、チオストレプトン（２５μｇ／ｍｌ）、水和セフタシジン（１００μｇ／ｍｌ）、アプラマイシン（２．５μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）、塩酸バンコマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、トブラマイシン（４μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは８０μｇ／ｍｌ）、リファンピシン（４００μｇ／ｍｌ）、ヒグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）。
【００２７】
好ましい実施形態では、洗浄溶液は、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で、さらに好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜７５μｇ／ｍｌの濃度で、よりさらに好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度でゲンタマイシンを含む。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、洗浄溶液は、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度で、さらに好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌの濃度で、よりさらに好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ濃度でアムホテリシンＢを含む。
【００２９】
好ましい実施形態では、洗浄溶液は、２種類の抗生物質、好ましくはゲンタマイシンおよびアムホテリシンＢを含む。
【００３０】
またさらに好ましい実施形態では、洗浄溶液は、５０μｇ／ｍｌの濃度のＤＭＥＭ、ゲンタマイシンと、１０μｇ／ｍｌの濃度のアムホテリシンＢを含む。最も好ましい実施形態では、洗浄溶液は、５０μｇ／ｍｌの濃度のＤＭＥＭ、ゲンタマイシンと、１０μｇ／ｍｌの濃度のアムホテリシンＢからなる。
【００３１】
コラーゲン分解剤は当業者に公知である。本発明の文脈におけるコラーゲン分解剤は、タンパク質からなるポリマーであるコラーゲンをより小さなサブユニットへ消化するすべての作用剤である。本発明者らは、興味深いことに、コラーゲン分解剤で処理することにより、外毛根鞘（ＯＲＳ）の細胞が、それらの培養中に毛根鞘細胞の残りの部分からより容易に分離されることを見出した。コラーゲンの消化により、細胞間マトリックスが弱まり、幹細胞、前駆体および分化した細胞を含む細胞が遊離される。本発明の好ましい実施形態では、コラーゲン分解剤は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＶからなる群から選択されるコラーゲンを分解する。好ましい実施形態では、コラーゲン分解剤は、酵素、好ましくはコラゲナーゼである。さらなる好ましい実施形態では、コラーゲン分解剤は、コラゲナーゼＩ、ＩＶおよびＶからなる群から選択されるコラゲナーゼである。コラーゲンＩ、ＩＶおよびＶが細胞表面、細胞基底膜のベース、皮膚および毛髪をそれぞれ被覆していることは当業者に理解される。コラゲナーゼは、好ましくは、２種以上のコラーゲンを分解することができる。特に好ましい実施形態では、コラーゲン分解剤はコラゲナーゼＶである。よりさらに好ましい実施形態では、コラーゲン分解剤は、５ｍｇ／ｍｌの濃度のコラゲナーゼＶである。
【００３２】
当業者は、幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの分化を誘導し、増殖を刺激する分化培地に適した組成を知っており、その培地は、機能性黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含む。当技術分野で公知の標準的な分化培地を、本明細書で提供した方法で使用することができる。分化培地の例は、Szabad et al. Arch. Derm. Res. (2007) 299:191-200、Kauser et al. Endocrinology (2005) 146 (2):532-543、http://lifelinecelltech.com/docs/SPM_DermaLife_Mに開示されている。好ましくは、本明細書で用いられる分化培地は、腫瘍プロモーター（例えば、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ））を含有しない。好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは、低含有量ウシ血清のＤｅｒｍａｌｉｆｅ基礎培地（ＤＬＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ダルベッコ改変イーグル基礎培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｆ１２  Ｈａｍ栄養混合培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＣ−１基礎培地（Ｌｏｎｚａ）からなる群から選択される基礎栄養素を含む。好ましい実施形態では、分化培地は、基礎栄養素としてＤｅｒｍａＬｉｆｅ基礎培地（ＤＬＭ）を含み、さらに好ましくは、ＤＬＭが唯一の基礎栄養素である。コラーゲン分解剤がコラゲナーゼＶであること；分化培地が基礎栄養素としてＤｅｒｍａＬｉｆｅ基礎培地（ＤＬＭ）を含み、さらに好ましくは、ＤＬＭが、分化培地に含まれる唯一の基礎栄養素であることが特に好ましい。本発明に係る方法は、意外にも、血清含有量が低いか、または血清を含まない培地を使用することができる。したがって、分化培地は、低血清含有量の、好ましくは２．５％未満、さらに好ましくは２％未満、よりさらに好ましくは１％未満、より一層好ましくは０．５％以下の血清を有しているのが好ましい。分化培地の血清含有量が０．５％であるのがよりさらに好ましい。さらなる実施形態では、分化培地は血清を含まない。
【００３３】
さらなる栄養素および添加剤を適用することもできる。好ましい実施形態では、分化培地は、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、Ｃａ２＋、Ｌ−グルタミン、インスリン、ビタミンＣ、ウシ胎児血清、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子およびその変異型ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、神経増殖因子−ベータ（ＮＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗生物質からなる群から選択される１種または複数の化合物をさらに含む。好ましい実施形態では、分化培地は、基礎栄養素としてＤｅｒｍＬｉｆｅ基礎培地（ＤＬＭ）と、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、Ｃａ２＋、Ｌ−グルタミン、インスリン、ビタミンＣ、子ウシ血清、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子およびその変異型ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、神経増殖因子−ベータ（ＮＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗生物質からなる群から選択される１種または複数の化合物を含み、好ましくは、ＤＬＭは分化培地中に含まれる唯一の基礎栄養素であり、分化培地は、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、Ｃａ２＋、Ｌ−グルタミン、インスリン、ビタミンＣ、子ウシ血清、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子およびその変異型ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、神経増殖因子−ベータ（ＮＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗生物質からなる群から選択される１種または複数の化合物を含む。さらに、好ましい実施形態では、コラーゲン分解剤はコラゲナーゼＶであり；分化培地は、基礎栄養素としてのＤｅｒｍＬｉｆｅ基礎培地（ＤＬＭ）と、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、Ｃａ２＋、Ｌ−グルタミン、インスリン、ビタミンＣ、ウシ胎児血清、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子およびその変異型ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、神経増殖因子−ベータ（ＮＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗生物質からなる群から選択される１種または複数の化合物を含み、好ましくは、ＤＬＭは分化培地中に含まれる唯一の基礎栄養素であり、分化培地は、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、Ｃａ２＋、Ｌ−グルタミン、インスリン、ビタミンＣ、ウシ胎児血清、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞��殖因子およびその変異型ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、神経増殖因子−ベータ（ＮＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗生物質からなる群から選択される１種または複数の化合物をさらに含む。
【００３４】
さらなる栄養素および添加剤は、当技術分野で公知の適切な濃度で適用することができる。しかし、好ましい濃度を以下に記す。
【００３５】
好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは３ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で、より好ましくは４ｍＭ〜８ｍＭの濃度で、よりさらに好ましくは５ｍＭ〜７ｍＭの濃度でＬ−グルタミンを含み、分化培地が６ｍＭの濃度でＬ−グルタミンを含むのがよりさらに好ましい。
【００３６】
さらなる好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜８μｇ／ｍｌの濃度で、よりさらに好ましくは４μｇ／ｍｌ〜６μｇ／ｍｌの濃度でインスリンを含み、分化培地が５μｇ／ｍｌの濃度でインスリンを含むのがよりさらに好ましい。
【００３７】
さらなる好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは２０μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌの濃度で、よりさらに好ましくは４０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌの濃度でビタミンＣを含み、分化培地が５０μｇ／ｍｌの濃度でビタミンＣを含むのがよりさらに好ましい。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは０．１μＭ〜５μＭの濃度で、より好ましくは０．３μＭ〜２．５μＭの濃度で、よりさらに好ましくは０．５μＭ〜１．５μＭの濃度でエピネフリンを含み、分化培地が１μＭの濃度でエピネフリンを含むのがよりさらに好ましい。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは０．１ｍＭ〜０．４ｍＭの濃度で、より好ましくは１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの濃度で塩化カルシウムを含み、分化培地が０．２ｍＭの濃度で塩化カルシウムを含むのがよりさらに好ましい。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは１５μｇ／ｍｌ〜３５μｇ／ｍｌの濃度でウシ下垂体抽出物を含み、分化培地が２５μｇ／ｍｌの濃度でウシ下垂体抽出物を含むのがよりさらに好ましい。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度で塩基性線維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２を含み、分化培地が１０ｎｇ／ｍｌの濃度で塩基性線維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２を含むのがよりさらに好ましい。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは１．５ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの濃度で表皮増殖因子（ＥＧＦ）を含み、分化培地が２．５ｎｇ／ｍｌの濃度で表皮増殖因子（ＥＧＦ）を含むのがよりさらに好ましい。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度でエンドセリンを含み、分化培地が５ｎｇ／ｍｌの濃度でエンドセリンを含むのがよりさらに好ましい。
【００４４】
さらなる好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは０．１％〜５％の濃度で、より好ましくは０．３μＭ〜２．５μＭの濃度で、よりさらに好ましくは０．５％〜１．５％の濃度でＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含み、分化培地が１％の濃度でＳｔｉＭｅｌ因子カクテルを含むのがよりさらに好ましい。
【００４５】
さらなる実施形態では、分化培地はコレラ毒素を含まない。別の実施形態では、分化培地は腫瘍プロモーター、例えば、ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、ＴＰＡ）を含まない。好ましい実施形態では、分化培地は、コレラ毒素も腫瘍プロモーター、例えば、ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、ＴＰＡ）も含まない。
【００４６】
本発明の文脈における「抗生物質」とは、微生物、例えば細菌または真菌類の増殖の阻害および／または微生物の死滅を誘導できる薬剤、ならびに／あるいは細胞を迅速に分裂させるための追加選択的な薬剤を意味する。適した抗生物質は、当業者によって選択され得る。しかし、好ましい抗生物質は、ペニシリン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシンおよびストレプトマイシン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。抗生物質の好ましい組み合わせは、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢおよびジェネティシンである。
【００４７】
好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１．０００単位／ｍｌ〜２０．０００単位／ｍｌの濃度で、より好ましくは５．０００単位／ｍｌ〜１５．０００単位／ｍｌの濃度でペニシリンを含み、分化培地が１０．０００単位／ｍｌの濃度でペニシリンを含むのがよりさらに好ましい。
【００４８】
好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度でアムホテリシンＢを含み、分化培地が１０μｇ／ｍｌの濃度でアムホテリシンＢを含むのがよりさらに好ましい。
【００４９】
非常に好ましい実施形態では、分化培地は、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜７５μｇ／ｍｌの濃度で、よりさらに好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度でゲンタマイシンを含む。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、分化培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン（Stretpomycin）およびアムホテリシンを含む。最も好ましい実施形態では、分化培地は、１０．０００単位／ｍｌの濃度のペニシリン、１０．０００μｇ／ｍｌの濃度のストレプトマイシン、および２５μｇ／ｍｌの濃度のアムホテリシンＢを含む。
【００５１】
特に好ましい実施形態では、分化培地はＤＬＭであり、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンを含む。最も好ましい実施形態では、分化培地は、１０．０００単位／ｍｌの濃度のペニシリン、１０．０００μｇ／ｍｌの濃度のストレプトマイシン、および２５μｇ／ｍｌの濃度のアムホテリシンＢを含む。
【００５２】
別の特に好ましい実施形態では、分化基礎培地は、Dulbecco, R 及び Freeman, G. (1959);Virology 8:396 で開示されている、処方が公知のダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭであり、よりさらに好ましくは、ＧＭＰグレード品質でＳｉｇｍａ（登録商標）によって生産されているＤＭＥＭ５０３０である。
【００５３】
所望に応じて分化中に培地を交換することができる。当業者は、いつ、どのように培地を交換するかについて知っている。好ましい実施形態では、培地は、分化中、２日毎に交換される。
【００５４】
当業者は、分化培地に適した組み合わせおよび濃度を選択することができる。しかし、一部の好ましい組み合わせおよび濃度は以下のとおりである。
【００５５】
好ましい実施形態では、分化培地としてＬｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したＤｅｒｍａＬｉｆｅ分化培地を使用し、当該培地は、低含有量ウシ血清（０．５％）、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（１％）、ならびに抗菌剤（ペニシリン１０．０００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１０．０００μｇ／ｍｌおよびアムホテリシンＢ２５μｇ／ｍｌ）のＤＬＭ基礎培地を含む。別の実施形態では、分化培地は、低含有量ウシ血清（０．５％）、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（１％）（増殖因子の混合物、ＬｉｆｅＬｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）のＤＬＭ基礎培地を含む。
【００５６】
さらなる好ましい実施形態では、分化培地としてＬｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したＤｅｒｍａＬｉｆｅ分化培地を使用し、当該培地は、低含有量ウシ血清（０．５％）、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（１％）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）のＤＬＭ基礎培地を含む。別の実施形態では、分化培地は、低含有量ウシ血清（０．５％）、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、およびＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（１％）（増殖因子の混合物、ＬｉｆｅＬｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＤＬＭ基礎培地を含む。
【００５７】
さらに別の好ましい実施形態では、分化培地は、ＤＬＭ基礎培地、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、Ｃａ２＋（０．２ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、および／またはＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、および／またはｂＦＧＦ／ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはエンドセリン−１（２０ｎＭ）、および／またはα−ＭＳＨ（５ｎＭ）、および／またはヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、および／またはＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＮＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００５８】
さらに別の好ましい実施形態では、分化培地は、血清を含まないＰＣ−１基礎培地および／またはＤＭＥＭおよび／またはＦ１２、１〜１０％のヒト血清、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、Ｃａ２＋（０．２ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（０．２％）、エピネフリン（０．２％）、ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、および／またはｂＦＧＦ／ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、エンドセリン−１（２０ｎＭ）、および／またはα−ＭＳＨ（５ｎＭ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＮＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（ｆ．ｃ．５０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００５９】
さらに別の好ましい実施形態では、分化培地は、ＤＭＥＭ基礎培地、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、Ｃａ２＋（０．２ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、および／またはＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、および／またはｂＦＧＦ／ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはエンドセリン−１（２０ｎＭ）、および／またはα−ＭＳＨ（５ｎＭ）、および／またはヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、および／またはＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＮＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００６０】
さらに別の好ましい実施形態では、分化培地は、ＤＭＥＭ基礎培地、１〜１０％のヒト血清、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、Ｃａ２＋（０．２ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（０．２％）、エピネフリン（０．２％）、ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、および／またはｂＦＧＦ／ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、エンドセリン−１（２０ｎＭ）、および／またはα−ＭＳＨ（５ｎＭ）、および／またはヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、および／またはＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＮＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（ｆ．ｃ．５０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００６１】
さらに別の好ましい実施形態では、分化培地は、ＤＭＥＭ基礎培地、１〜１０％ヒト血清、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、Ｃａ２＋（０．２ｍＭ）、ウシ下垂体抽出物（２５μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（０．２％）、エピネフリン（０．２％）、ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、上皮増殖因子ＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、エンドセリン−１（２０ｎＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００６２】
よりさらに好ましい実施形態では、分化培地は、ＤＭＥＭ基礎培地、５％ヒト血清、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、Ｃａ２＋（０．２ｍＭ）、ウシ下垂体抽出物（２５μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（０．２％）、エピネフリン（０．２％）、ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、上皮増殖因子ＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、エンドセリン−１（２０ｎＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００６３】
本発明に係る方法に適した増殖因子および培養剤は当業者に公知であり、必要に応じて適合させることができる。好ましくは、これらの増殖因子および培養剤は、メラノサイトへの幹細胞の分化を誘発するか、少なくともメラノサイト分化プロセスを阻害せず、しかもメラノサイトの増殖と増加を促進する。しかし、本発明に係るメラノサイトを生成する方法の一実施形態では、増殖因子および培養剤は、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ヒドロコルチゾン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ジブチリル環状アデノシン一リン酸（ｄｂｃＡＭＰ）、メラノサイト増殖因子（ＭｅＧＦ）、カポジ肉腫由来のＦＧＦ様因子（ｈｓｔ／Ｋ−ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、エンドセリン−１、アルファ−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）および培養したヒトケラチノサイトによって条件付けした培地由来の、またはウシ下垂体エキス（ＢＰＥ）もしくはウシ脳抽出物由来の天然因子の混合物からなる群から選択される（Wilkins et al. 1985）。
【００６４】
好ましい実施形態では、幹細胞および／またはメラノサイト前駆体からメラノサイトを生成する方法の分化ステップ（ｉｉ）は、低酸素条件または酸素正常条件下で行われる。さらに好ましくは、分化ステップは、低酸素条件下で行われる。
【００６５】
「低酸素条件」とは、通常の大気中の酸素含有量未満の酸素含有量の条件を意味する。したがって、一実施形態では、幹細胞および／またはメラノサイト前駆体からメラノサイトを生成する方法のステップ（ｉｉ）は、２０％以下、好ましくは１０％以下のＯ２含有量、よりさらに好ましくは１％〜５％のＯ２含有量の条件下で行われる。好ましい実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の培養ステップは、５％のＯ２含有量と、５％のＣＯ２含有量の条件下で行われる。
【００６６】
さらに、好ましい実施形態では、分化ステップ（ｉｉ）は、培地−空気界面で行われる。当業者には、培地−空気界面で分化を行う方法は公知である。好ましくは、ステップ（ｉ）の引き抜いた毛包の残りの部分はメッシュ、好ましくは、ナイロンメッシュ上に置かれ、ここで、ナイロンメッシュは分化培地に接触している。好ましいナイロンメッシュは１μｍ以下、好ましくは０．５μｍ以下の細孔径を有し、さらに好ましいナイロンメッシュは０．４μｍの細孔径を有する。最も好ましい実施形態では、培地−空気界面は、０．４μｍのポアポリエステルメンブレンインサート（Pore Polyester Membrane Insert）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えた２４ｍｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ナイロンメッシュ上にステップ（ｉ）の引き抜いた毛包を置くことによって生成され、培地−空気界面条件で増殖させる。培地−空気界面の好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）の引き抜いた毛包の残りの部分は、低酸素条件下でインキュベートされ、好ましくは、それらは低酸素性気体混合物に曝露させる。低酸素性気体混合物は、好ましくは５％のＯ２ガス分圧を有し、さらに好ましくは、低酸素性気体混合物は５％のＣＯ２ガス分圧をさらに有し、最も好ましい低酸素性気体混合物は、５％のＯ２ガス圧、５％のＣＯ２ガス分圧、および９０％のＮ２ガス分圧を有する。
【００６７】
本発明者らは、本発明に係るメラノサイトを生成する方法の培養ステップ（ｉｉｉ）は、培地が幹細胞からメラノサイトを生成するのに選択的である場合に他のすべての細胞が消失するまで実施することができることを思いがけず見出した。興味深いことに、他の細胞型は、選択除去されて、唯一メラノサイトが残る。したがって、本発明のステップ（ｉｉｉ）の一実施形態では、細胞の少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９９％が分化したメラノサイトであるまで行われ、よりさらに好ましくは、細胞の全部が分化したメラノサイトであるまで行われる。
【００６８】
細胞が分化したメラノサイトであるかどうかを決定する方法は当業者には公知である。例えば、当業者は、細胞がメラノサイトマーカーを発現するか、線維芽細胞マーカーを発現しないかを判定することができる。公知のメラノサイトマーカーは、例えば、メラノサイトで特異的に発現される遺伝子としてのチロシナーゼ、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）変異型、カルシウム結合Ｓ１００タンパク質、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）である。さらに、ＤＯＰＡ−トートメラーゼ活性とその後のメラニン含有量は、メラノサイト機能の信頼性の高いマーカーである。線維芽細胞マーカーは、例えば、分化抗原群９０細胞表面タンパク質（ＣＤ−９０）、分化抗原群３４（ＣＤ３４）、線維芽細胞表面抗原（ＳＦＡ）、熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）である。完全分化したメラノサイトおよび線維芽細胞はまた、特有の形態学を呈する。
【００６９】
しかし、本発明に係るメラノサイトを生成する方法の一実施形態では、本方法は、培養物中の分化したメラノサイトを選択および単離するさらなるステップ（ｉｖ）を含む。
【００７０】
上記によれば、本明細書では、
（ｉ）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去するステップと；
（ｉｉ）引き抜いた毛髪の残りの部分をコラーゲン分解剤と共にインキュベートして、外毛根鞘から幹細胞を分離するステップと;
（ｉｉｉ）幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの分化を誘導し、増殖を刺激する培地中で、ステップ（ｉｉ）で得られた分離された幹細胞を培養するステップであって、培地が、黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含むステップと；
（ｉｖ）培養物中の分化した黒色メラノサイトを単離するステップであって、メラノサイトが毛根小区分の解剖学的な選択を使用してステップ（ｉｖ）において単離されるステップと
を含む幹細胞からメラノサイトを生成する方法を提供する。ステップ（ｉｖ）は、毛根の小区分の解剖学的選択を使用する代わりに、またはそれに加えて、示差的トリプシン処理を含んでいてもよい。ステップ（ｉｖ）は、毛根小区分の解剖学的選択を使用する代わりに、またはそれに加えて、あるいは／または示差的トリプシン処理の代わりに、もしくはそれに加えて、ジェネティシン処理を含んでいてもよい。
【００７１】
上述のように、本明細書で提供した方法に係る、コラーゲン分解剤で引き抜いた毛髪の残りの部分をインキュベートして外毛根鞘から幹細胞を分離するステップは、例えば細胞外マトリックスから幹細胞を遊離／遊走／放出することを含有し得る。
【００７２】
（ｉ）引き抜いたヒト毛髪の毛球を除去するステップと；
（ｉｉ）引き抜いた毛髪の残りの部分をコラーゲン分解剤と共にインキュベートして、外毛根鞘から幹細胞を分離するステップと;
（ｉｉｉ）幹細胞、メラノサイト前駆体およびメラノサイトの分化を誘導し、増殖を刺激する培地中で、ステップ（ｉｉ）で得られた分離された幹細胞を培養するステップであって、培地が、黒色メラノサイトへ分化させるための１種または複数の増殖因子を含むステップと；
（ｉｖ）培養物中の分化した黒色メラノサイトを選択するステップであって、ジェネティシン処理を含むステップと
を含む、幹細胞からメラノサイトを生成する方法を提供する。
【００７３】
本明細書で提供した方法における選択および／または単離のステップは、示差的トリプシン処理と、後続のジェネティシン処理を用いてメラノサイトを単離するステップを含んでいてもよい。言いかえれば、本明細書で提供した方法における選択および／または単離のステップは、示差的トリプシン処理と共にジェネティシン処理を用いてメラノサイトを単離するステップを含んでいてもよい。
【００７４】
培養物から分化した黒色メラノサイトを選択し、単離する様々な方法が知られている。示差的トリプシン処理またはジェネティシン処理の方法は公知の方法である（In Vitro. 1984 May;20(5):447-50, Exp Cell Res. 1982 Dec;142(2):309-15、Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Mar;79(6):2018-22）。当業者は、これらの方法を知っている。しかし、本発明者らは、上記の概説した方法により取得されたメラノサイトの純度および量が、示差的トリプシン処理および／またはジェネティシン処理を用いることによってさらに高めることができることを思いがけなく見出した。したがって、本発明に係るメラノサイトを生成する方法の一実施形態では、黒色メラノサイトは、示差的トリプシン処理および／またはジェネティシン処理を使用するステップ（ｉｖ）で単離される。本発明者らは、今回、両方の方法を実施した場合に、分化した黒色メラノサイトの選択および単離が大幅に促進されることを思いがけず見出し、好ましくは、示差的トリプシン処理は細胞培養の継代毎に実施し、一方、ジェネティシン処理は２４〜４８時間で一回、好ましくは４８時間で一回行う。本発明の一実施形態では、黒色メラノサイトは、一回のジェネティシン処理と組み合わせた示差的トリプシン処理を使用して単離される。
【００７５】
示差的トリプシン処理は当業者に公知である。示差的トリプシン処理の一実施形態では、細胞をバッファーで洗浄し、トリプシンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に曝露する。トリプシン処理のさらに好ましい実施形態では、細胞をＨＥＰＥＳバッファーで洗浄し、０．０４％のトリプシン／０．０３％のＥＤＴＡに４分間曝露する。４分間は、メラノサイトがトリプシンの刺激下でそれらの樹状突起を消失し、細胞培養容器のポリスチレン表面から剥離するのに十分な時間を示す。線維芽細胞とケラチノサイトは、それらの大きな細胞体によって、したがってより強力な接着力によって表面に付着しており、刺激ストレスに対してより完全な耐性があるため、それらに対しては、メラノサイトよりもトリプシンに長く曝露する必要があるが、それでもなお４分間のトリプシン消化後に付着したままである。緩慢なトリプシン処理を行った純粋なメラノサイトを含む上清は、培養の次の継代に入れ、さらに培養される。
【００７６】
ジェネティシン処理は、当業者に公知である。ジェネティシンは抗生物質であって、８０Ｓリボソームとそれによるタンパク質合成の公知の阻害物質である。ジェネティシンへ曝露すると、ＯＲＳ初代培養ケラチノサイトおよび線維芽細胞の場合には、タンパク質合成（protein sysnthesis）に必要とされる多量の急速に分裂する細胞に極めて大きな影響を及ぼすが、それは目的のメラノサイト培養物に重大な混入をもたらし得る。一方、メラノサイトはゆっくりと分裂されているため、ジェネティシンストレスに対して全く影響されず、したがって、メラノサイトはすべて、４８時間までのジェネティシン処理で生存する。この手順では、処理した培養物中で、健全な接着性メラノサイトと、アポトーシスを起こして壊死し円形の半分脱離状態の線維芽細胞とケラチノサイトを観察することができる。脱離された選択除外された線維芽細胞とケラチノサイトの大部分は、ＨＥＰＥＳバッファーで洗い流され、接着し続けているものも生存できず、そのため、次の継代の間に脱離する。一実施形態では、ジェネティシンは１２ｈ〜４８ｈ、好ましくは２４ｈ〜４８ｈ、さらに好ましくは約２４ｈ、よりさらに好ましくは約４８ｈ適用する。当業者は、ジェネティシンを適用する時間を決定することができる。この処理は、真核細胞の翻訳を阻害する。速く分裂する細胞は、非常に活性的にタンパク質を生産し（それによる非常に集中的な翻訳をする）ので、ジェネティシンに対しても非常に感受性が高い。本発明者らは、線維芽細胞とケラチノサイトは速く分裂し、選択除去されるが、メラノサイトはゆっくりと分裂し、選択から免れることを見出した。したがって、当業者は、線維芽細胞とケラチノサイトの量をモニタリングすることによって、細胞をジェネティシンで処理する時間を決定し、それに基づいて処理の最適時間を確立することができる。
【００７７】
さらに、本明細書で提供した方法は、メラノサイトの有利で改善された生成を可能にすることを本明細書に開示している。本明細書に記載したような毛包の培地−空気界面での培養（例えば、実施例１の方法のセクションを参照）した後、メラノサイトは、接着培養でさらに培養され、定期的に継代することができる。したがって、本明細書で提供した方法は、有利には、メラノサイトの接着培養を含むことができる。本明細書で提供した方法は、メラノサイトの継代をさらに含むことができる。
【００７８】
例えば、メラノサイトは、１、２、３、４、５、６回以上（かつ１５回まで）継代し、メラノサイトの数または収率を高めることができる。「継代」とは、一定数の細胞の数（例えば、細胞容器表面の１０％を超えて被覆するのに十分な細胞の数、好ましくは２５ｃｍ２容器当たり１００．０００個の細胞）が、本発明により生産される、第１の培地−空気界面での毛包培養物から得られることを意味する。これらの細胞は、実施例１の接着培養と同様に、本明細書に記載の接着培養条件下で培養される。細胞が増殖し、所定の表面でのコンフルエンスが８０％を超えた場合、それらをトリプシンによって脱離させ、より大きな容器の表面に移す。この手順／サイクルは、本明細書では継代と呼ばれる。
【００７９】
この手順は、長時間メラノサイト個体群を維持するために何回も実施することができる。この手順は、本発明によるメラノサイトの生産に使用することができる。
【００８０】
本発明は、本明細書で提供したメラノサイトを生成する方法によって取得可能なメラノサイト、またはそれによって取得されるメラノサイトを提供する。付属の実施例で示したように、本発明により取得されるメラノサイト（また本明細書では、ヒト毛包メラノサイト、または略称「ＨＭ」ともいう）は、メラノサイトの特徴的な形質、例えば、特徴的なデンドリマー型形態、マーカータンパク質（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００タンパク質の変異型、ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ、ＨＭＢ４５）の発現などを有している。さらに、本明細書で提供されるメラノサイトは、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）への反応を示す。さらに、本メラノサイトは、Ｌ−ＤＯＰＡのメラニンへの変換および自発的なメラニン生産に利用される、チロシナーゼ、ＣＤＴ／ＴＲＰ−２およびＴＲＰ−１の活性も示す。メラノサイトはメラニン内容物を示し、ＣＤ９０シグナル／発現の欠如を特徴とする。これらの特長によれば、本明細書で提供されるメラノサイト（ＨＭ）は、正常なヒト表皮のメラノサイト（ＮＨＥＭ）に対する良好な代替物である。実施例１および実施例３を参照されたい。しかし、本明細書で提供されるメラノサイトはまた、ＮＨＥＭのように、他のメラノサイト細胞とは異なった重要な相違点も示す。例えば、本明細書で提供される方法により取得可能なメラノサイトは、ＮＨＥＭと比べると異なる細胞表面マーカーを有する。これらの異なる表面マーカーに基づいて、本明細書に提供されるメラノサイトは、例えば、実施例３で示すように、ＦＡＣＳなどの常法により、ＮＨＥＭ細胞から容易に区別することができる。
【００８１】
さらに、本発明の方法によって取得可能なメラノサイトは、他のメラノサイト、例えば、ＮＨＥＭなどの成体の皮膚メラノサイト細胞と比較すると、小さな細胞体とより短い樹状突起を有している。実施例３と図１７を参照されたい。さらに、樹状突起の数は、他のメラノサイト、例えば、ＮＨＥＭなどの成体の皮膚メラノサイト細胞と比較すると、本発明の方法によって取得可能なメラノサイトではわずかに少ない。ＮＨＥＭの細胞表面は、本発明のメラノサイト（ＨＭ細胞）よりも平均で２３％大きく、それらの樹状突起は３９％長い。さらに、ＮＨＥＭは、平均でＨＭよりも多くの樹状突起を有する傾向がある。
【００８２】
ＮＨＥＭ細胞は、３７７±１３５μｍ２の平均表面を示すが、ＨＭは２９０±７４μｍ２を示す。これによれば、ＮＨＥＭ細胞体は、ＨＭ細胞体よりも表面が２３％大きい（ｐ＝０．０４５１）。したがって、本発明の方法によって取得可能なメラノサイトは、他のメラノサイト、例えば、ＮＨＥＭなどの成体の皮膚メラノサイト細胞よりも小さな平均表面または細胞体を有する。本発明の方法によって取得可能なメラノサイトの平均表面または細胞体は、他のメラノサイト、例えば、ＮＨＥＭなどの成体の皮膚メラノサイト細胞の平均表面または細胞体よりも少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９％小さく、好ましくは２０％小さい。
【００８３】
ＮＨＥＭの樹状突起は平均の長さが３５．７３±１５μｍであり、それは本発明（ＨＭ細胞）の方法によって取得可能なメラノサイトの樹状突起の長さ２１．５７±１０μｍよりも３９％長い（ｐ＝０．０４５）。したがって、本発明の方法によって取得可能なメラノサイトは、他のメラノサイト、例えば、ＮＨＥＭなどの成体の皮膚メラノサイト細胞よりも平均して短い樹状突起を有する。本発明の方法によって取得可能なメラノサイトの平均樹状突起は、他のメラノサイト、例えば、ＮＨＥＭなどの成体の皮膚メラノサイト細胞の平均樹状突起よりも少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３１、３２、３３または３４％、好ましくは少なくとも３５％短い。
【００８４】
さらに、実施例３に示すように、ＮＨＥＭは、平均の樹状突起の数がＨＭ（２．４７±０．６４）よりもわずかに多い（３．１３±１．１９）（ｐ＝０．０６５、有意差なし）。
【００８５】
【表１】
2014534815.tif 000002
【００８６】
さらに下記の本明細書で提供した表５は、本発明の方法によって取得可能なメラノサイト、またはそれによって取得されるメラノサイトに特徴的なマーカーの包括的な概要を示す（「＋」は、マーカーの存在／発現を示す）。本発明の方法によって取得可能なメラノサイト、またはそれによって取得されるメラノサイトは、表５の１種または複数の前記マーカーを発現し得る。言いかえれば、本明細書で提供されるメラノサイトは、１種のマーカーを単独で、あるいは他のマーカーのいずれか１種と組み合わせて（すなわち、１種または複数の他のマーカーと組み合わせて）発現され得る。
【００８７】
表３は、本明細書で提供されるメラノサイトでは発現されるか存在し、かつＮＨＥＭ細胞では発現されないか存在しないマーカーを示す。さらにこの文脈においては、本明細書で提供されるメラノサイトは、１種のマーカーを単独で、または表３の他のマーカーのいずれか１種と組み合わせて（すなわち、１種または複数の他のマーカーと組み合わせて）発現され得る。本明細書に記載のように、単独のマーカー、あるいは他の（１種または複数の）マーカーと組み合わせたマーカーの存在は、測定／分析することができる。
【００８８】
本明細書に示すように、本発明によって取得可能なメラノサイトは、本明細書の表３および表５に例示したような１種または複数の公知のマーカー遺伝子を発現させる。そのようなマーカー遺伝子の限定されない例としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ７７、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３７リガンド、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２８２、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６、ＣＤ１４２がある。
【００８９】
本明細書で提供され記載されているメラノサイトは、少なくとも１種の上記の遺伝子を単独で発現するか、あるいは、１種または複数のこれらのマーカー遺伝子または表３および表５に例示したようなさらなるマーカー遺伝子との組み合わせで発現するのが好ましい。
【００９０】
本明細書で使用されるこれらのマーカー遺伝子の核酸配列またはタンパク質配列は、各データベース、例えばＮＣＢＩなどから推定され得る。また表は、各データベースのアクセッション番号も提供する。
【００９１】
「＋」の表示（例えばＣＤ１ａ＋）は各マーカーの存在を示し、すなわち、このマーカー遺伝子の検出可能な発現レベル（タンパク質、ｍＲＮＡなど）に反映され得るマーカーの発現を示す。一般に、本明細書に記載した少なくとも１種のマーカー遺伝子が検出可能な発現レベルで存在する場合、細胞は、本明細書で提供される方法によって取得可能な「メラノサイト」、または取得される「メラノサイト」として分類される。このような遺伝子の発現レベルを検出し評価する方法は当技術分野で公知であり、また付属の実施例で明示している。したがって、本明細書で提供される方法によって取得可能なメラノサイトは次のメラノサイトであってもよい（ＣＤ１ａ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ７７＋、ＣＤ７９ｂ＋、ＣＤ１３７リガンド＋、ＣＤ１４０ａ＋、ＣＤ１４０ｂ＋、ＣＤ２８２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋、ＨＬＡ−ＤＱ＋、ＣＤ１０４＋、ＣＤ１０６＋、および／またはＣＤ１４２＋）。
【００９２】
例えば、タンパク質発現レベルは、ＦＡＣＳ、免疫凝集、免疫沈降（例えば、免疫拡散、免疫電気泳動（immunelectrophoresis）、免疫固定）、ウェスタンブロッティング法、（ｉｎ  ｓｉｔｕ）免疫組織化学、（ｉｎ  ｓｉｔｕ）免疫細胞化学、アフィニティークロマトグラフィー、酵素イムノアッセイ法などを利用することにより検出することができる。これらの方法およびタンパク質と接触させる他の適切な方法は当技術分野で公知であり、例えば、Sambrook 及び Russell (2001)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Burke et al. (1990)、Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990.)に開示されている。
【００９３】
遺伝子産物がｍＲＮＡである場合、接触と結合はノーザンブロッティング法またはＰＣＲ法、例えばｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲなどを利用することにより実施することができる。これらの方法および（特定の）ｍＲＮＡを結合する他の適切な方法は当技術分野で公知であり、例えば、Sambrook 及び Russell（2001、上掲）に開示されている。
【００９４】
タンパク質レベルの定量は、上述の方法、特にウェスタンブロッティング法を利用することにより行うことができる。一般に、当業者には、ポリペプチドの定量方法が知られている。溶液中の精製ポリペプチドの量は、物理的方法、例えば測光によって測定することができる。混合物中の特定のポリペプチドの定量方法は、例えば、抗体の特異的結合に依存する。抗体の特異性を利用する特異的検出および定量方法には、例えば免疫組織化学（ｉｎ  ｓｉｔｕ）が含まれる。ウェスタンブロッティング法は、電気泳動によるタンパク質混合物の分離と抗体による特異的検出を組み合わせている。電気泳動は、例えば２Ｄ電気泳動のように多次元であってもよい。通常、ポリペプチドは、１次元に沿ったそれらの見かけの分子量と、他の次元に沿ったそれらの等電点によって２Ｄ電気泳動において分離される。
【００９５】
遺伝子産物、特にＲＮＡ／ｍＲＮＡのレベルの定量は、ノーザンブロッティング法、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション、またはｍＲＮＡの転写に特異的な１種または複数のプローブもしくはプローブセットを装備したＤＮＡチップ、または上述のＰＣＲ法、例えば、リアルタイムＰＣＲのなどの定量的ＰＣＲ法を利用することにより行うことができる。当業者は、シグナル強度と測定する成分の量との間の相関、好ましくは線形相関を利用することによって、成分、特に前記遺伝子産物の量を測定することができる。
【００９６】
当業者は、その一般的な知識と本明細書で提供した教示に基づいて、本明細書に記載したマーカー遺伝子の発現レベルを容易に測定することができる立場にある。特に、当業者は、本明細書で提供される方法によって取得可能なメラノサイトで特定のマーカーが発現さるか否かを容易に判定することができる。
【００９７】
表面タンパク質の発現を決定するための本明細書で使用され、付属の実施例で使用されている例示的な方法は、フルオロフォア標識抗体結合と、フローサイトメトリーによる分析の組み合わせに基づくものである。この方法は、レーザー光線に曝露されている毛細管に単一細胞懸濁液を流すことによる。細胞壁側の回析（Diffraction off）（前方散乱光（Forward Scatter）、ＦＳＣ）、およびその細胞内の含有量（側方散乱光（Side Scatter）、ＳＳＣ）を定量し、相対的なサイズ（ＦＳＣ  ｒｅａｄｏｕｔ）または複雑性（ＳＳＣ  ｒｅａｄｏｕｔ）として解釈することができる。両方の読み出しをグラフのｘ軸とｙ軸上にプロットし、分析の開始時に読み出された基本的な形態学的パラメーターを定義することができる（図１７、ａ）。前方散乱光と側方散乱光の測定は蛍光シグナルに依存しない。蛍光シグナル自体は、接着されているフルオロフォア、実施例３に記載した事例では、蛍光抗体で標識された表面受容体マーカーの数に正比例する（図１７、ｂ）。実施例３で使用されている、ＢＤ  ＦＡＣＳ−アレイなどのハイスループット測定フローサイトメーター装置は、フルオロフォアのフェードアウトや損失のリスクなしに、抗体パネルを迅速に測定することができる。
【００９８】
本明細書で使用される細胞表面マーカー分析の原理と方法論は、実施例３に明示し記載している（例えば、方法のセクションを参照されたい）。
【００９９】
本発明者らは、本発明に係るメラノサイトを取得するための方法により誘導されるメラノサイトは、移植片成分として非常に優れた特性を示すことを思いがけず見出した。したがって、本発明はさらに、
（ｉ）本発明に係る幹細胞からメラノサイトを生成する方法によって取得可能なメラノサイトを含む懸濁液を準備するステップと；
（ｉｉ）生体適合性担体を準備するステップと；
（ｉｉｉ）前記生体適合性担体上でメラノサイトを培養するステップと
を含む、メラノサイトを含む自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法に関する。
【０１００】
メラノサイトを含む懸濁液は、フィブリン、トロンビン、またはその両方を含んでいてもよい。
【０１０１】
メラノサイトは、次の経路：液体懸濁液の形態で、エアロゾル（噴霧剤）として、さらに適用することができ、生体適合性担体上で単一のメラノサイト培養物として、またはケラチノサイトと組み合わせて増殖させ、基底メラノサイト層と重層ケラチノサイトからなる表皮相当物または細胞表皮相当物を形成させることができる。さらなる実施形態では、メラノサイトは、線維芽細胞およびケラチノサイトと組み合わせて、メラノサイト、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を含む皮膚相当物を形成させてもよい。
【０１０２】
一実施形態では、本発明に係る方法によって生産される自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、ケラチノサイトを含む。
【０１０３】
ケラチノサイトを取得および／または重層する方法は、当業者に公知である。しかし、ケラチノサイトは様々な方法でメラノサイトとともに適用することができる。例えば、ケラチノサイトは、得られる自家移植片、同種移植片または同種異系移植片中に含まれていてもよい。したがって、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の一実施形態では、本方法は、前記生体適合性担体上で培養されたメラノサイト上にケラチノサイトを重層するステップ（ｉｖ）と；メラノサイトを含む生体適合性担体上で前記ケラチノサイトを培養するステップ（ｖ）とをさらに含む。さらに、ケラチノサイトは、場合によってはさらなる生体適合性担体上に、例えば懸濁液または噴霧剤として個別に提供されてもよい。
【０１０４】
本発明者らは、メラノサイトは様々な方法で治療しようとする領域に適用することができることを見出した。例えば、固体状の自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を使用することができる。この場合、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法で使用される生体適合性担体は、足場として機能し、治療しようとする領域の形状で提供することができる。しかし、別の場合には、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、前もって設定していない形状で提供することが有利なこともある。そのような場合、本発明者らは、懸濁液または噴霧剤として提供することが非常に有利であることを見出した。また懸濁液または噴霧剤は、生体適合性担体なしで提供することもできる。しかし、一実施形態では、懸濁液または噴霧剤は、下に概説したような生体適合性担体を含み、ここで、生体適合性担体は、微細粒子（微細生体適合性担体）高分子網目構造からなる。微細とは、粒子または生体適合性担体がナノメートルまたはマイクロメートルの範囲の厚さを有することを意味する。
【０１０５】
本発明の文脈における「生体適合性担体」とは、ヒトまたは動物の生体に移植可能であって、細胞がその表面に付着することができる構造および生体力学的支持体を提供することが可能な担体である。さらに、担体は非毒性であって、受け手の生物学的機能と適合するものとし、担体が組織適合性であり、かつ／またはその場で生物学的に分解されることは当業者には、理解される。好ましい実施形態では、生体適合性担体は、繊維の網目構造からなる３次元構造を提供する。このような構造は細胞に足場を提供し、当該足場は、細胞の培養、完全な形態および機能を促進し、さらには、担体への細胞の接着性を高め、移植片の機能促進を強化する。本発明者らは、このような繊維の網目構造はメラノサイトに対する効果的な環境として有用であり、これらのメラニン特性を促進することを見出した。このような特性は、細胞のドーパトートメラーゼ活性および／またはメラニン生産により測定することができる。本発明者は、これらの特性が、本発明に係る生体適合性担体の使用によって強化されることを思いがけず見出した。メッシュ、または網目構造を提供している様々な材料が存在し、それらの繊維は全方向に突起しており、細胞の繊維への接合を可能にしている。さらに、繊維は、細胞を繊維に接着させるサイズ／厚さを有しているものとする。本発明者らは、このような生体適合性担体上で培養された細胞はこれらのメッシュ内には３次元形態を形成するが、細胞培養での平面上には、細胞の２次元網目構造だけが形成されることをさらに見出した。３次元構造は、メラノサイトを繊維のネットワークにより形成されたメッシュを通過させて遊走させ、足場全体を移植できるようにすることは、当業者には知られている。例えば、Loth, T. (Electrospinning als Methode zur Herstellung von fibrillaren Zelltragern aus bioabbaubaren Polymeren, 2009)は、そのような足場の生産方法を提供している。本発明の好ましい実施形態では、生体適合性担体は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、コラーゲン、ヒトコラーゲンＩ、ヒトコラーゲンＩＶ、ヒトコラーゲンＶ、短縮化し化学的に架橋結合されているコラーゲン鎖または修飾されているコラーゲン鎖、フィブリン、ゼラチン、および表皮に相当するケラチノサイト系担体からなる群から選択される材料の少なくとも１種からなる。ケラチノサイトを含む生体適合性担体は当業者に公知であり、市販されている。本発明の一実施形態では、ケラチノサイトを含む生体適合性担体は、Ｅｐｉｄｅｘ（登録商標）のケラチノサイト系毛根鞘（Ｅｕｒｏｄｅｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＆  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）である。特に好ましい実施形態では、生体適合性担体はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）からなる。このような生体適合性担体の生産方法は当業者には公知である。
【０１０６】
一実施形態では、本発明に係るメラノサイトは、コラーゲンとフィブリンを含む懸濁液で提供される。
【０１０７】
本発明に係る方法によって誘導できる自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、様々な移植適用経路、例えば、懸濁液、エアロゾル、（足場としての固体状生体適合性担体を使用する）表皮相当物などの固体状移植片によって適用されることが望ましい。様々な経路に対する自家移植片、同種移植片または同種異系移植片の特性は、生体適合性担体の特性によって適合させることができる。したがって、生体適合性担体は様々な形態で提供することができる。生体適合性担体は、肉眼で見える形態で、例えば、同種移植片または同種異系移植片が提供される領域にフィットする形状の足場としての固体状生体適合性担体などで提供することができる。また自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は懸濁液および／またはエアロゾルとして提供することができ、すなわち、治療しようとする領域上にそのものとして適用され得るか、または噴霧剤として使用され得る。したがって、本発明の一実施形態では、生体適合性担体は、生産される自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を肉眼で見えるマトリックスとして提供する。別の実施形態では、生体適合性担体は懸濁液および／または噴霧剤として提供される。
【０１０８】
また、得られた自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、疾患の治療で使用するまでのストック用に調製することもできる。したがって、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法は、適切なバッファーおよび／または培地の使用をさらに含む。得られた自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、本方法で使用される生体適合性担体の形態にほぼ依存している（前出）、様々な形態で提供することができることは当業者には理解される。
【０１０９】
当業者は、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法において、メラノサイトの培養期間を適合させることができる。本発明者らは、基底層を形成させることができる条件下でメラノサイトを培養すると、表皮と同様の完全な形態と細胞間相互作用が可能になり、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片の治療における可能性を著しく高めることを見出した。したがって、本発明の一実施形態では、メラノサイトは、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法で培養され、基底層の形成を解剖学的に模倣する。
【０１１０】
メラノサイトが基底層を形成するかどうか決定する方法は、当業者には公知である。基底層は表皮の基底層であり、そこに、メラノサイトは存在する。表皮は皮膚の領域に応じて４〜５層からなると考えられている。これらの層は、昇順で、基底層／胚芽層（stratum basale/germinativum）、有棘層（stratum spinosum）、顆粒層（stratum granulosum）、透明層／クリア層（stratum lucidum）、および角化層（stratum corneum）である。ケラチノサイトは、その細胞の大多数が上方の４つの層で示される。したがって、培養物中のケラチノサイトは、（表皮相当物と呼ばれる）表皮解剖学を模倣するために重層することができる。本発明者らは、表皮解剖学的構造に対応する自家移植、同種移植または同種異系移植の提供は、メラノサイトの機能性を保持し、色素脱失疾患の最終的な治療上の可能性を提供することを見出した。
【０１１１】
さらに本発明者らは、角質層形成までケラチノサイトを培養すると、自家移植、同種移植または同種移植の治療成績が飛躍的に向上することを見出した。したがって、本発明の一実施形態では、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の重層前に、角質層が形成されるまでケラチノサイトを培地−空気界面で培養する。角質層は表皮の上部層である。それは平坦な角質化ケラチノサイトから構成されている。上部層が角質化された重層表皮相当物の断面を形態学的に判定することができる。さらに、形態学的分析を確証するために角質化された細胞を染色することができる。したがって、当業者は、ケラチノサイトが角質層を形成した時を判定することができる。しかし、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の好ましい実施形態では、ケラチノサイトは８〜２０日間、好ましくは１０〜１５日間、よりさらに好ましくは１１〜１２日間培養する。好ましい実施形態では、ケラチノサイトは、培地−空気界面で培養する。
【０１１２】
ケラチノサイトを培養する培地と条件は、当業者には公知である。適した培養方法、例えば培地と条件は、Int Wound J. 2009 Jun;6(3):226-32に開示されている。
【０１１３】
本発明者らは、１０：１のケラチノサイトとメラノサイトとの比率が、表皮と同様のメラノサイト機能と細胞相互作用を維持することによって、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片の効果を高め、これによって、本明細書の下記で概説しているような疾患の治療可能性の期待を高めることを思いがけず見出した。したがって、本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の一実施形態では、ケラチノサイトは、１０：１の比率で培養されたメラノサイト上に重層される。
【０１１４】
自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のステップにおける培養は、メラノサイトとケラチノサイトの両方を培養するために行われるものとする。一実施形態では、培養ステップはニュートラル培養培地で実施される。本発明の文脈における「ニュートラル培地」とは、メラノサイトまたはケラチノサイトに影響を及ぼす補助剤を含有していない培地を意味する。したがって、本発明の一実施形態では、ニュートラル培養培地は、β−アドレナリン受容体リガンド、例えばエピネフリンおよびその誘導体、および／またはＣａ２＋および／またはビタミンＣおよび／またはＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦ／ＦＧＦ２および／またはエンドセリン−１、α−ＭＳＨ、ＳＣＦおよび／またはＮＧＦ−βおよび／またはＨＧＦおよび／またはゲンタマイシン、表皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素、アデニン、トリヨードサイロニンおよびアルファ−ＭＳＨからなる群から選択される増殖因子を含んでいない。さらなる実施形態では、ニュートラル培養培地は、基礎培地、好ましくはＤＬＭ基礎培地またはＤＭＥＭ基礎培地、線維芽細胞成長因子、Ｎ６−２’−ジブチリルアデノシン−３’−５’−環状一リン酸（ｄｂＡＭＰ）、Ｌ−グルタミン、０．５％〜２０％の血清、好ましくは０．５％の胎児血清または１０％以下のヒト血清からなる群から選択される１種または複数の成分を含む。
【０１１５】
好ましい実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の（１つまたは複数の）培養ステップは、低酸素条件または酸素正常条件下で行われる。
【０１１６】
さらに、一実施形態では、培養は、培地−空気界面として、または培地で被覆した表皮相当物として実施することができる。
【０１１７】
「低酸素条件」とは、正常な空気中酸素含有量未満の酸素含有量の条件を意味する。したがって、一実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のステップ（ｉｖ）は、Ｏ２含有量が２０％以下、好ましくは１０％以下の条件下で、よりさらに好ましくはＯ２含有量が１％〜５％の条件下で実施される。好ましい実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の培養ステップは、Ｏ２含有量が５％、ＣＯ２含有量が５％の条件下で実施される。
【０１１８】
「酸素正常条件」とは、酸素含有量が正常な空気中酸素含有量である条件を意味する。したがって、一実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法の（１つまたは複数の）培養ステップは、Ｏ２含有量が約２０％の条件下で行われる。
【０１１９】
好ましい実施形態での自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法は、下記の条件下で行われる：Ｏ２含有量が約５％、ＣＯ２含有量が約５％、温度が３７℃（Dieckmann et al, Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5に開示されているとおりである）。
【０１２０】
当業者には、細胞の培養および／またはインキュベーションを実施する方法は公知である。例えば、細胞は培地で被覆されていてもよいし、細胞は培地−空気界面に存在していてもよい。本発明の一実施形態では、生体適合性担体は、培地−空気界面に配置されており、すなわち、生体適合性担体は、その下部側が培地と接触し、その上部側が大気と接触している。本発明の別の実施形態では、細胞を含む生体適合性担体は培地で被覆されており、すなわち、空気と接触してはいない。
【０１２１】
さらなる好ましい実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のインキュベーションステップは、酸素正常条件下で行われ、ここで、生体適合性担体はインキュベーション培地で被覆される。別の実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のインキュベーションステップは、酸素正常条件下で行われ、ここで、生体適合性担体は培地／空気の界面にある。さらに別の実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のインキュベーションステップは、低酸素条件下で行われ、ここで、生体適合性担体は培地／空気の界面にある。さらに別の実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のインキュベーションステップは、低酸素条件下で行われ、ここで、生体適合性担体はインキュベーション培地で被覆される。
【０１２２】
自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のインキュベーションステップは、所望の特性が得られるまで行われる。これらの特性は生体力学的安定性を含んでおり、すなわち、ケラチノサイトおよびメラノサイトで被覆されている得られた生体適合性担体は硬さを提供するものとし、その特性によって自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は崩壊することなく、誘導された自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を目的の部位へ適用することができる。さらに、メラニン、チロシナーゼ、ｇｐ１００変異型を染色している断面は、移植片の下部相にメラノサイトが存在することを示し、それは基底層の解剖学的相当物である。メラノサイトは、ケラチノサイト（解剖学的に上層部に相当−表皮有棘層（stratum spinosum））、顆粒層（stratum granulosum）、クリア層／透明層（stratum lucidum）、および角化層（stratum corneum）から構成される、上部相へそれらの樹状突起を伸長していく。各メラノサイトは４０個以下のケラチノサイトと接合し、いわゆる表皮ユニットを形成する。細胞体およびメラノサイトの樹状突起は、特にケラチノサイトとの接合点で、Ｉ〜ＩＶ型の可視性メラノソームを含有するものとする。メラノソームは、メラニンの分泌に有用である、送達パッケージ−ベシクルである。メラノソームは、メラニンと、さらに糖タンパク質１００（ｇｐ１００）の種々のアイソフォームを含有しているため、メラノソームはｇｐ１００タンパク質を染色することにより確認することができる（例えば、ＨＭＢ４５およびＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ変異型）。
【０１２３】
好ましい実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法のインキュベーションステップは、１〜１０日間、好ましくは２〜３日間行われる。
【０１２４】
さらに、インキュベーションの温度は細胞の要求に適合していなければならないという事実を当業者は十分認識している。本発明の範囲内のすべてのインキュベーションは約２０℃〜３７℃の温度で実施され、好ましくは、本明細書に記載の方法のすべてのインキュベーションステップは３７℃で実施される。
【０１２５】
本発明者らは、本発明に係る自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片、および／または本発明に係るメラノサイトは、皮膚の色素脱失の治療に使用することができることを見出した。したがって、本発明はまた、疾患の治療で使用するための、好ましくは瘢痕の治療で使用するためおよび／または白皮症、白斑、四色白斑（quadrichrome vitiligo）、点状白斑（vitiligo ponctue）、アルビノ症候群、例えば、アレサンドリニ症候群、ヘルマンスキー・プドゥラック症候群、チェディアック・東症候群、グリセリ症候群（エレジャルデ症候群、２型グリセリ症候群および３型グリセリ症候群）、ワールデンブルグ症候群、ティーツェ症候群、クロス・マキュージック・ブリーン（Cross-McKusick-Breen）症候群、ＡＢＣＤ症候群、白皮症・難聴症候群およびフォークト・小柳・原田症候群、眼皮膚白皮症、メラニン減少症（特発性滴状低メラニン症、葉状低メラニン症、進行性黄斑低メラニン症）、斑症、脱色素性母斑、炎症後色素沈着減少症、白色粃糠疹、浮浪者黒皮症、イエメン人視聴覚障害低色素症候群、ウェンデ・バックス症候群（Wende-Bauckus syndrome）、ウォロノフ環（Woronoff's ring）、アメラニスム、先天性色素欠如症、および皮膚の色素脱失に関連する疾患の群から選択される疾患の治療で使用するための本発明に係る自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片、および／または本発明に係るメラノサイトに関する。
【０１２６】
一実施形態では、本発明は、疾患の治療で使用するための本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法によって誘導可能な自家移植片、同種移植片または同種異系移植片に関する。好ましい実施形態では、本発明はまた、瘢痕の治療、および／または白皮症、白斑、限局性白皮症症候群、脱色素性母斑、炎症後色素沈着減少症、および皮膚の色素脱失に関連する疾患の群から選択される疾患の治療で使用するための本発明に係る自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片、および／または本発明に係るメラノサイトに関する。
【０１２７】
自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、色素脱失した皮膚領域または瘢痕上に直接適用することができる。しかし、治療しようとする領域は、一実施形態では、事前に治療されていてもよい。好ましい実施形態では、本発明により治療しようとする皮膚領域は、移植片の厚さに対応している表皮層の皮膚剥離により、好ましくはエルビウム：ＹＡＧレーザーを使用することにより事前に治療されている。
【０１２８】
好ましい実施形態では、疾患の治療で使用するための本発明に係る自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を生産する方法によって誘導可能な自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、懸濁液または噴霧剤として、治療しようとする領域に適用される。別の実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、固体状の自家移植片、同種移植片または同種異系移植片として、治療しようとする領域に適用される。好ましい実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、上記で概説したように、皮膚剥離後の治療しようとする領域上に適用される。本発明の一実施形態では、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、本発明に係る方法によって取得可能な単離メラノサイトを含む。
【０１２９】
自家移植片、同種移植片または同種異系移植片の適用は、様々な方法で実施することができる。例えば、固体状の自家移植片、同種移植片または同種異系移植片が使用される場合、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、治療しようとする領域上に直接適用することができる。しかし、上記で概説したように、本発明の一実施形態における自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、懸濁液または噴霧剤である。このような場合、自家移植片、同種移植片または同種異系移植片は、それぞれ、治療しようとする領域上に懸濁液として適用されるか、その上に噴霧される。
【０１３０】
一実施形態では、メラノサイトおよびケラチノサイトは、治療しようとする領域上に適用される。分離メラノサイトおよびケラチノサイトを含む懸濁液または噴霧剤を用いて実施する場合、様々な順序で実施することができる。例えば、本発明に係るメラノサイトを含む懸濁液または噴霧剤は、本明細書で概説したように、ケラチノサイトを含む懸濁液と混合し、次いで、懸濁液または噴霧剤として一緒に適用することができる。別の実施形態では、本発明に係るメラノサイトを含む懸濁液は、懸濁液または噴霧剤として治療しようとする領域上に適用され、次いで、ケラチノサイトを含む懸濁液が、本明細書で概説したように、懸濁液または噴霧剤として前記領域上に適用される。噴霧剤は、上記で概説したように、線維芽細胞およびケラチノサイトをさらに含んでいてもよい。
【０１３１】
本発明の一実施形態では、治療しようとする領域は、それぞれの懸濁液または固体状の自家移植片、同種移植片または同種異系移植片を適用した後に封着される。
【０１３２】
本明細書で概説したように治療された領域は、一実施形態では、治療後は未刺激とし、回復させ自発色素沈着させる。さらなる実施形態では、その領域は、既に開示されているように（Dermatology. 2009;218(4):342-3）、週に２〜３回、紅斑線量未満の３１１ｎｍのＵＶＢを使用し、ＵＶ光で刺激される。
【０１３３】
また本発明に係る自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片および／またはメラノサイトは、例えば化粧品において、美容目的で使用することができる。したがって、本発明に係る自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片および／または（１種もしくは複数の）メラノサイトを含む化粧品用組成物を提供する。同様に、本発明は、本明細書で提供した自家移植片、同種移植片もしくは同種異系移植片および／またはメラノサイトで個体または対象を治療することを含む、美容的処置を行うための方法に関する。
【０１３４】
以下の限定されない実施例および図面により本発明を説明する。
【実施例１】
【０１３５】
実験計画および方法
培養、拡大、分化、純粋なメラノサイト培養物の選択
毛髪の生検
毛根からメラノサイトを抽出する手順を開始するためには、側頭部の頭皮から３０〜８０本の成長期の毛髪を抜き取る必要がある。生検は痛みがなく、瘢痕がなく、毎日自然に失われるよりも少ない毛髪を必要とする。一時的な領域の５本までの毛髪に対して、消毒済みの鉗子で毛根付近をつかみ、髪の成長方向に引っ張る。毛髪はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に保存し、調製するまでカルシウムは添加しない。
【０１３６】
ＯＲＳの中央部分の選択、調製
毛幹の長い部分をカットし、毛幹の短い部分を目的の処理のために残した。毛根は、毛球をカットすることによって近接端部から短くした（図１）。本発明者らの経験では、毛球は通常９０％を超える線維芽細胞を産生するので、この部分を除去することによりかなりの部分の細胞の混入が除かれる。
【０１３７】
毛髪は、別々に５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）と１０μｇ／ｍｌのアムホテリシン（Ａｍｉｍｅｄ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で１分間、５回洗浄し、その後、ＰＢＳで洗浄した。
【０１３８】
細胞間マトリックスの緩み
細胞間マトリックスは、コラゲナーゼＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液を５ｍｇ／ｍｌ用いて、３７℃で１０分間消化することによって緩めた。
【０１３９】
培地
毛包およびＯＲＳ細胞は、メーカー仕様書に従って、ＤｅｒｍａＬｉｆｅメラノサイト培地（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）、低含有量ウシ血清のＤＬＭ基礎培地（０．５％）、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（１％）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）中で培養した。培地は、コレラ毒素もいかなる腫瘍促進剤も、例えばホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ、ＴＰＡ）も含有していなかった。
【０１４０】
培地−空気界面培養条件
短くした毛根を、０．４μｍのポアポリエステルメンブレンインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えた２４ｍｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ナイロンメッシュ上に置き、培地−空気界面条件で増殖させた。栄養は、メッシュと真下の細胞とを接触させることができる十分な量である、１ｍｌのＤＬＭ培地（ＤｅｒｍａＬｉｆｅ）を補充し、これによって必要な栄養素を供給した。毛包の上部部分は、低酸素気体混合物、５％のＯ２、５％のＣＯ２および９０％のＮ２に曝露させた。毛根を２週間拡大させ、次いで、ＤＬＭ培地で被覆した。この期間は、通常、メッシュ上で４０％までのコンフルエンスに達するのに十分である（図１ｅ）。
【０１４１】
接着培養
細胞を、９０％超のコンフルエンスに達するまでＤＬＭ培地でさらに培養した。次いで、細胞をトリプシン処理し、回収し、改良した初代培養物に入れた。得られた外毛根鞘細胞は、第３週の培養物（１８日±２）の入った１０ｃｍ２のウェル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の接着表面上に接種した。接着表面での培養の開始を、継代開始（ｐ０）として示した。
【０１４２】
示差的トリプシン処理
細胞は、未被覆の接着表面で８０％のコンフルエンスに達した際、さらに示差的トリプシン処理した。室温で０．０４％トリプシン／０．０３％ＥＤＴＡによるインキュベーションを４分間行った後、脱離したメラノサイトを回収し、Ｔ２５細胞培養フラスコへ入れた。残りの細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞は接着したままであり、それらは次の継代の培養には移されなかった。示差的トリプシン処理は、培養メンテナンスのルーチン的手段として、すべての継代で行った。
【０１４３】
ジェネティシン処理
分化の後期段階のケラチノサイトと線維芽細胞の増殖は、分化の２２±２日に、４８時間ジェネティシン（５０μｇ／ｍｌ）を用いて全培養物を処理することによってまず防止した。ジェネティシンの効果は、すべての細胞の翻訳を阻害し、それによって迅速に分裂する細胞（例えば、ケラチノサイトおよび線維芽細胞）に主として影響を及ぼすものである。培養中のメラノサイトの代謝および分裂は緩慢であるため、それらはジェネティシンによる短時間処理には影響されないままであった（図２、Ｆ〜Ｈ）。
【０１４４】
ＯＲＳ細胞の改良した初代培養を、ＤｅｒｍａＬｉｆｅメラノサイト培地（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）、低含有量ウシ血清のＤＬＭ基本培地（０．５％）、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、エピネフリン（１μＭ）、ＳｔｉＭｅｌ因子カクテル（１％）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）中で維持した。培地は、コレラ毒素もいかなる腫瘍促進剤も、例えばホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ、ＴＰＡ）も含有していなかった。
【０１４５】
対照細胞
表皮メラノサイト（正常なヒト表皮メラノサイト、ＮＨＥＭ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）は、メーカーのガイドラインに基づき、３７℃の酸素正常条件下で、Ｍ２補充ミックス（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を補充したメラノサイトＭ２基礎培地で培養した。これらの細胞は、完全に分化した対照細胞として使用した。
【０１４６】
非メラニン対照として使用される線維芽細胞は、１０％ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、ならびに０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１４７】
生体適合性担体（ＰＣＬ足場）の生産
生体適合性担体（この場合、ＰＣＬからなる足場；ＰＣＬ足場という）は、Loth, T., Electrospinning als Methode zur Herstellung von fibrillaren Zelltragern aus bioabbaubaren Polymeren. 2009に開示されている標準エレクトロスピニング法により生産した。
【０１４８】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）繊維メッシュは、高電圧にポリカプロラクトン液の噴流を施すことにより、繊維のネットワークを作製するエレクトロスピニング法から開始する。ポリマー溶液は、１時間撹拌したクロロホルム（ＣＨＣｌ３）：メタノール（ＭｅｔＯＨ）（７：１）中に溶解させたＰＣＬ粉末から調製する。溶液を平滑末端針の付いたシリンジに入れ、シリンジポンプに装着した（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）。ＤＣ電流を注射針と接地した集電板の両方に接続し、閉回路を形成させた。これによって、ＰＣｌポリマー溶液とガラス集電板との間に電界が作製され、針の上部の維持された液滴とガラス集電板との間の連続的ジェットが形成される。ガラス板に対してジェットが衝突した場合、網目構造が形成されると考えられる。クロロホルムとメタノールの溶液は速やかに蒸発し、ＰＣＬ繊維はメッシュに残る。メッシュは１００％エタノールによってガラスから取りはずされる。最後に、繊維メッシュは、メンブレン真空ポンプに連結したデシケーター（exicator）装置（ＶＰ  ８２０；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）を用いて乾燥させる。
【０１４９】
エレクトロスピニング法のパラメーターを組み合わせることにより、繊維の太さ、繊維配向とメッシュの厚さを変化させることができる。本願においては、２つの基本的なパラメーターのセットを使用して、「細い」繊維から「太い」繊維でネットワーク形成された１００μｍ厚のメッシュを形成した。「細い」繊維メッシュ（２〜３μｍ直径）は、集電電極から１８．５センチ離した電極で、０．４〜０．５ｍｌの液滴からジェットを形成するため２２ゲージの針を用いて、流速２ｍｌ／ｈの１４％ＰＣＬを使用することによって得た。「太い」繊維メッシュ（８〜１０μｍ直径）は、集電電極から３０センチ離した電極で、０．４〜０．５ｍｌの液滴からジェットを形成するため１４ゲージの針を用いて、流速１０ｍｌ／ｈの２０％ＰＣＬを使用することによって得た。
【０１５０】
構造、繊維配向および繊維の厚みは、光学顕微鏡検査（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ２０００−Ｓ；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）および電子顕微鏡検査（Ｒａｓｔｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＣＳ  ４４；ＣａｍＳｃａｎ；Ｏｂｄｕｃａｔ  ＣａｍＳｃａｎ  Ｌｔｄ、ＵＫ）の手段によって分析し定量した。
【０１５１】
足場は、基準条件で９６ウェルプレートの１０．７ｍｍ幅の底部を被覆するように、直径８ｍｍの滅菌した穴あけパンチで円形形状にした。それらを３０分間７５％エタノールで殺菌し、ＰＢＳで５回洗浄した。細胞を足場上に接種する前に、材料を２４時間ＤＬＭ培地またはＰＣ−１培地中で調整した。細胞を足場上に接種し、１０．０００個の細胞に事前の足場形成を行い、２００μｌの培地に懸濁した。
【０１５２】
細胞型の特性決定
これらの細胞は、細胞の形態、マーカータンパク質チロシナーゼ、ｇｐ１００タンパク質（メラノソームマーカー）−ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂおよびＨＭＢ４５の変異型の発現、ＤＯＰＡトートメラーゼの活性、ならびにＩＢＭＸへの反応性およびメラニン含有量により特性決定した。
【０１５３】
文献データと一致して、いくつかの細胞型が以下の形態学に基づいて決定された：小型円形細胞、小型紡錘体状細胞、特有の線維芽細胞形態を有する細胞、および水晶状ケラチノサイト形態を有する細胞、メラノサイト形態を有するトリデンドリマー細胞または多重デンドリマー型細胞（Tobin D J, Colen S R, Bystryn J C. J Invest Dermatol 1995: 104: 86-89; Dieckmann C, Milkova L, Hunziker T, Emmendorffer A, Simon JC. Human melanocytes can be isolated, propagated and expanded from plucked anagen hair follicles. Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5; Zhu WY, Zhang RZ, Ma HJ, Wang DG. Pigment Cell Res. 2004 Dec;17(6):668-73. Isolation and culture of amelanotic melanocytes from human hair follicles; Bosserhoff AK, Ellmann L, Kuphal S. Melanoblasts in culture as an in vitro system to determine molecular changes in melanoma. Exp Dermatol. 2011 May;20(5):435-40）。
【０１５４】
メラノサイトは、Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆらによって報告されたメラノサイトの形態の基準に基づいて特性決定した。メラニン性の特徴、増殖および接着の点からこの研究で使用される基準のセットは、誘導ヒトメラノサイトＨＭ細胞と略記される、メラノサイト前駆体から毛包由来の誘導メラノサイトを本発明者らが識別するのに有用であった。最終培養で得られた細胞は、メラニン性で、ＮＨＥＭ表皮メラノサイトに匹敵するペースで増殖し、細胞培養容器の表面への接着は弱く、Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆによって報告されているメラニン欠乏性で、速やかに分裂し、接着が強い前駆体とは異なる。
【０１５５】
メラノサイトの形態学的基準は、マーカータンパク質：チロシナーゼ（図３ｅ）およびｇｐ１００タンパク質（メラノソームマーカー）−ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂの変異型（図３ｄ）およびＨＭＢ４５（図３ｆ）の発現と組み合わせた。さらに、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）への反応（図１２ｆ、１２ｈ）、チロシナーゼ、ドーパクロム−トートメラーゼ／チロシナーゼ関連タンパク質２（ＤＣＴ／ＴＲＰ−２）の活性を、Ｌ−ＤＯＰＡ変換試験でのＤＨＩＣオキシダーゼ／チロシナーゼ関連タンパク質１活性（ＴＲＰ−１）とともに試験した（図１２ｅ、１２ｇ）。さらに、メラニン含有量は未刺激のＨＭ細胞の１３．７ｐｇ／細胞において、さらにＬ−ＤＯＰＡをメラニンへ変換した後の２２．６ｐｇ／細胞において測定した。
【０１５６】
ＣＤ９０の発現を、規定の線維芽細胞により、未分化細胞に対する基準として使用し（陽性ＣＤ９０シグナル、図１２ｃ）、さらに分化したメラノサイトに対する排除因子として使用した（ＣＤ−９０シグナルの欠如、図１２ｄ）。
【０１５７】
免疫蛍光法（Immunfluorescence）
メラノサイト
ゼラチンで被覆したチャンバースライドで増殖させた細胞をＰＢＳで洗浄し、８分間、氷冷パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、４％）で固定し、再度ＰＢＳで洗浄した。細胞を２％ウシ血清アルブミン０．５ｍｌでブロックし、１時間０．１％トリトンＰＢＳ溶液で透過させた。ＮＫＩ＼ｂｅｔｅｂチロシナーゼおよびＨＭＢ−４５（Ａｂｃａｍ）に対する一次マウス産生抗体の溶液を２％ＢＳＡ／０．１％トリトンを含むＰＢＳ中で２％に設定し、一晩４℃にて足場上の細胞と共にインキュベートした。２％ＢＳＡ／０．１％トリトン溶液で洗浄した後、ビオチン化抗マウス二次抗体を細胞に添加して１時間インキュベートし、次いで洗浄した。２％ＢＳＡ−ＰＢＳ／０．１％トリトン／０．２５％ＩＧＧの溶液を細胞と共に１時間インキュベートし、次いで洗浄した。最後に、ストレプトアビジン結合のＡｌｅｘａ５９４（登録商標）およびＡｌｅｘａ４８８（登録商標）蛍光色素０．２５％溶液を含む２％ＢＳＡ／０．１％トリトンを、１／１０００核色素ＤＡＰＩと共に細胞と共にインキュベートし、次いで、２％ＢＳＡ／０．１％トリトン溶液で２回洗浄した。細胞はＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（登録商標）シール液を用いてガラス上に固定し、ガラス薄片で覆った。
【０１５８】
マーカーのシグナルは蛍光顕微鏡によって分析した（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｓ；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）。細胞および核のシグナルは、ＩｍａｇｅＪ  １．４２ｑ  ＮＩＨ公開ソフトウェアによってカウントした。
【０１５９】
移植片
足場上の細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、４％）で８分間固定し、次いで、再度ＰＢＳで洗浄した。細胞を２％ウシ血清アルブミン２％ＢＳＡ−ＰＢＳの０．５ｍｌでブロックし、０．１％のトリトンＰＢＳ溶液で１時間透過させた。ＮＫＩ＼ｂｅｔｅｂおよびチロシナーゼに対する一次マウス産生抗体の溶液を２％ＢＳＡ／０．１％トリトンを含むＰＢＳ中で２％に設定し、一晩４℃にて足場上の細胞と共にインキュベートした。２％ＢＳＡ／０．１％トリトン溶液で洗浄した後、ビオチン化抗マウス二次抗体を細胞に添加して１時間インキュベートし、次いで洗浄した。２％ＢＳＡ−ＰＢＳ／０．１％トリトン／０．２５％ＩＧＧの溶液を細胞と共に１時間インキュベートし、次いで洗浄した。最後に、ストレプトアビジン結合のＡｌｅｘａ５９４（登録商標）（レッド）およびＡｌｅｘａ４８８（登録商標）（グリーン）蛍光色素０．２５％溶液を含む２％ＢＳＡ／０．１％トリトンを、１／１０００核色素ＤＡＰＩと共に細胞と共にインキュベートし、次いで、２％ＢＳＡ／０．１％トリトン溶液で２回洗浄した。細胞を含む足場を２分間放置して乾燥させ、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（登録商標）シール液を用いてガラス上に固定し、ガラス薄片で覆った。
【０１６０】
マーカーのシグナルは蛍光顕微鏡によって分析し（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｓ；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）、さらにレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｊｅｎａ  ＧｍｂＨ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）によって分析した。
【０１６１】
Ｌ−ドーパトートメラーゼ活性
Ｌ−ドーパ互変異性化とその後の酸化の際のメラニン蓄積による色の変化を目視により記録した。細胞は、足場と共に、ドライアイス／３７℃水浴上で行う５回の凍結／解凍操作に供し、細胞膜を破壊した。溶解物を、４℃で３０分間１４０００ｒｐｍの遠心分離にかけた。上清を使用して、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の酵素活性を試験した。溶解物（１００μｌ）を６時間２００μｌのＬ−ＤＯＰＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）でインキュベートした。４７５ｎｍでの吸光度はＭｕｌｔｉｓｃａｎ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｅｒｍａｎｙ  Ｌｔｄ．  ＆  Ｃｏ．  ＫＧ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）ＥＬＩＳＡプレートリーダーの手段によって測定し、生産されたメラニンの正確な量を決定した。Ｌ−ＤＯＰＡ基質から合成されたメラニンの存在は、チロシナーゼ、ＤＯＰＡトートメラーゼ／チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）およびＤＨＩＣオキシダーゼ／チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）の活性を確認した。
【０１６２】
ＩＢＭＸ誘導
ＨＭ細胞を７日間２０ｍｇ／ｍｌの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）とともに培養し、次いで、本出願の上記で説明したように、未処理のＨＭに対してメラニン含有量について分析した。
【０１６３】
メラニン含有量
細胞
細胞をトリプシン処理し、計数するか、または合計１００００個の細胞に調整し、１５０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨで処理し、ピペットで数回洗浄し、次いで、４℃で３０分間１４０００ｒｐｍにて遠心分離することによりペレット化した。細胞ペレットを１ＭのＮａＯＨ中で６時間３７℃にてインキュベートした。１５０μｌ量の得られた細胞溶解物を平底の９６ウェルプレートに移し、３００μｌの最終容量になるまで１ＭのＮａＯＨの溶解液でフィルアップし、４７５ｎｍでの吸光度をプレートリーダーにより測定し、メラニン濃度を定量し、続いて、測定した試料中の総含有量を定量した。メラニン含有量は、１細胞当たりの量に調整した。
【０１６４】
合成メラニンを標準曲線用の溶液として使用した。１００μｇ／ｍｌのメラニン溶液を６０℃で５時間、１ＭのＮａＯＨ中でインキュベートし、連続希釈物を調製し（１００；５０；２５；１２．５；６．２５；３．１２５μｇ／ｍｌ）、４７５ｎｍでの吸光度を測定し、濃度比較に使用した。
【０１６５】
移植片
細胞を含むＰＣＬ足場を１５０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨで処理し、ピペットでマニホールドを洗浄した。その後、足場を回収した。細胞ペレットを６時間３７℃でインキュベートした。１５０μｌの細胞溶解物を平底の９６ウェルプレートに移し、３００μｌの溶解液でフィルアップし、４７５ｎｍでの吸光度をプレートリーダーにより測定し、メラニン含有量を定量した。
【０１６６】
合成メラニンを標準曲線用の溶液として使用した。１００μｇ／ｍｌのメラニン溶液を６０℃で５時間、１ＭのＮａＯＨ中でインキュベートし、連続希釈物を調製し（１００；５０；２５；１２．５；６．２５；３．１２５μｇ／ｍｌ）、４７５ｎｍでの吸光度を測定し、濃度比較に使用した。
【０１６７】
表皮相当物への組み込み
メラノサイトとケラチノサイトは、毛包のＯＲＳ、本願に記載のメラノサイト、およびCells Tissues Organs 2002;172:79-85に記載のケラチノサイトから培養した。メラノサイトは、０．４μｍのポアポリエステルメンブレンインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えた２４ｍｍＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ナイロンメッシュに接種した。４時間接着させたら、ケラチノサイトを９倍サフィックスに含む懸濁液を添加し、１１日かけてＤｅｒｍａＬｉｆｅケラチノサイト培地（Ｌｉｆｅ  Ｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）または１０％ヒト血清、２０ｎｇ／ｍｌの表皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素１０ｎｇ／ｍｌ、アデニンおよびトリヨードサイロニンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）中で重層させた。層状構築物は、表皮の解剖学的構造を模倣する表皮相当物を示す。メラノサイトは基底層に存在し、ケラチノサイトは上位層の構成成分である。１２日目で、上部のケラチノサイト層は、平坦化細胞とは形態学的に識別できる角質層に相当するものとする。
【０１６８】
表皮相当物は、クライオトームを用いて２００μｍスライスへと断面化し、固定し、記載の免疫蛍光法を用いて染色し、蛍光顕微鏡によって分析した。さらに、スライスをナイルブルーで染色し、メラニン内容物を含む細胞とその小区分を示した。
【０１６９】
データ妥当性の検証
すべての実験は、３連の技術的複製で設定した５種の生物学的実験において、４人のドナーの材料を使用して実施した。データは、スチューデント両側ｔ検定を用いて、処理間相違の統計的有意差について検証した。
【０１７０】
比較データ
本発明者らは、さらに、毛髪サンプル由来のＨＭメラノサイトを培養するために同様のこの実験プラットフォームを使用して、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら（Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5. Epub 2010 Mar 30）の方法を本発明の方法と比較した。本発明者らは、培養方法と分化方法の両方を同時に行った。ジェネティシンの選択時に、本発明者らはすべての細胞を同時に処理し、その段階での両調製物の線維芽細胞とケラチノサイトの含有量を調べた。
【０１７１】
結果
純粋なメラノサイト培養物の培養、拡大、分化、選択
その手順によって、９５〜１００％純粋で、ほぼ完全に分化されたヒトメラノサイトのより高い拡大培養物が得られた。これは、早ければ初代培養のＰ３またはＰ４として、生検３〜４週間以内でメラニン段階に達した（図１〜５）。特に、６０個の毛包からの培養手順と分化手順によって、接着培養の第３〜第５継代で、引き抜いた後３〜４週間以内にメラニン段階に達した、１０６個の純粋で分化されたヒトメラノサイトが産生された。
【０１７２】
Ｄｉｅｃｋｍａｎらの結果と比較すると、本明細書で示した方法は、その半分の時間で１０６個のＨＭの取得を達成した。さらには、両方法間の違いは、接着培養へそれらを入れるためにＴｒａｓｎｗｅｌｌナイロンメッシュから細胞を回収する時点で既に明らかであった。回収した細胞の数は、２．４６倍まで、Ｄｉｅｃｋｍａｎ法（上掲）の数を上回った。さらに、回収物中の線維芽細胞およびケラチノサイトの部分は、それらのほとんどがジェネティシン選択中に死滅し、ジェネティシン処理後に残った細胞の数は非常に少なかったため、Ｄｉｅｃｋｍａｎ法（上掲）よりもはるかに高かった。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら（上掲）に従って培養した細胞のジェネティシン選択の結果とは反対に、本明細書に記載に従って培養した大多数の細胞はこの選択ステップで生存し、４週間で１０６個のＨＭまで増加させることができた。
【０１７３】
ＤＬＭ培地、顕微解剖（毛包（毛球）の近位部の単離）、コラゲナーゼによる消化、ジェネティシンによる選択、および示差的トリプシン処理を同時に組み合わせることによって、最高純度が得られ、９６％のメラノサイトマーカー発現細胞が生じ（図４）、ＣＤ−９０−表現細胞は無視できる残りの含有量（２．３９〜４．２％）である（図５）。
【０１７４】
顕微解剖、コラゲナーゼおよびジェネティシン処理を組み合わせることによって、未処理培養物と比べて、ＨＭ培養物の純度が８７．６５％増加し（図４）、ＨＭ培養物中の線維芽細胞の含有量は８２．１２％低下した（図５）。ジェネティシン処理によってＨＭ培養物の純度は６７．７％増加し（図２ｄ）、線維芽細胞含有量は６８％低下した（図５）。
【０１７５】
コラゲナーゼ処理によって、ジェネティシン処理したＨＭ培養物の純度が１２．７２％増加した（図５）。
【０１７６】
毛包の近位部の除去（顕微解剖）は、後続のコラゲナーゼ処理およびジェネティシン処理と組み合わせると、ＨＭ含有量が２０％増加し（図４）、線維芽細胞の存在は１４．１５％まで低下した（図５）。処理間のすべての相違は、ＤＬＭ／−Ｃｏｌ／−ＨＦ／＋Ｇ（ＤＬＭで増殖させ、ジェネティシンで選択された、未消化の短い毛胞）と他の処理との間の相違を除き、スチューデントｔ検定により、統計的に有意（ｐ＜０．０５）から極めて非常に有意（ｐ＜０．００５）であった。ＨＭの培養純度は、示差的トリプシン処理、４分間室温でのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液への接着細胞培養物の曝露を利用し、上清中の脱離メラノサイトをさらなる培養に使用することによって、細胞継代により維持された（In Vitro. 1984 May;20(5):447-50, Exp Cell Res. 1982 Dec;142(2):309-15に基づく）。
【０１７７】
接着培養の第３継代後、ＨＭ細胞は完全に分化したメラノサイトの特徴を示した。細胞は、通常、大きなトリデンドリマー〜マルチデンドリマー型の細胞体であり（図１ｄおよび図２ｈ）、ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ、ＨＭＢ４５およびチロシナーゼを発現し（図２ａ〜ｃ）、Ｌ−ＤＯＰＡを変換しメラニンを合成した（図１２のｅおよびｇ）。ＩＢＭＸ処理によって、すべての細胞で樹状突起成長とメラニン合成が誘導された（図１２のｆおよびｈ）。
【０１７８】
結論
本発明は、引き抜いた毛髪の顕微解剖、コラゲナーゼによる処理、抗生物質による処理、上記で定義した分化培地における分化を含む、メラノサイトを生成する改善された方法を提供する。さらなる改良は、示差的トリプシン処理により取得された培養物の純度を維持することにより達成された。この方法により、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら（Dieckmann C, Milkova L, Hunziker T, Emmendorffer A, Simon JC. Human melanocytes can be isolated, propagated and expanded from plucked anagen hair follicles. Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5. Epub 2010 Mar 30）に記載されている方法と比較した場合、メラノサイトの高収率、迅速な分化、および高純度のＨＭ培養物が得られる。迅速な増殖、高収率、十分な分化と競合細胞の選択除外の相乗作用によって、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）と比較して、１０６個のＨＭを培養するのに必要な時間を５０％まで短縮した。
【０１７９】
本発明に係る方法においては、毛包近くの線維芽細胞に富んだ部分を除去した。線維芽細胞は速やかに分裂し、分裂の遅いメラノサイトを競合的に選択除外する。培養物中の初期の線維芽細胞含有量を低減することにより、栄養的および空間的競合が低下する。
【０１８０】
コラゲナーゼＶによる毛包コラーゲンの部分消化によって、細胞外マトリックスは緩み、ＯＲＳプールからの細胞遊走を加速させた。
【０１８１】
ジェネティシンによる単一の短時間処理は、培養液からケラチノサイトおよび線維芽細胞を効果的に除去し、無傷のメラノサイトを残した。
【０１８２】
示差的トリプシン処理はＨＭの純度を高め、維持した。メラノサイトは弱く接着しており、短時間のトリプシン処理で樹状突起を速やかに除き、懸濁液中で早い段階で終えると、付着している線維芽細胞およびケラチノサイトが後に残る。無視可能な付着の残存メラノサイトの損失は、ＨＭの高収率によって補われる（３〜４週間内で１０６個の細胞）。ＯＲＳ細胞プールは、非侵襲的に獲得した最少の材料から、速やかに推定上の増殖したメラノサイトまで増幅された。
【０１８３】
上記のすべては、定義された、純粋で無菌のＨＭ培養物を提供し、移植片に基づく治療目的の非侵襲的ＨＭ培養において好ましい改善された方法が得られる。
【０１８４】
細胞増殖が加速され、細胞の純度が上記の組み合わせ処理によって高まった。処理の完全な組み合わせによって得られた培養物は最も迅速に増殖し、９６％のメラノサイトマーカー発現細胞を生じる高純度に達した（図２）。このことは、不純物細胞の存在が最も少なく、不純物ＣＤ−９０−発現細胞が無視できる程度の残量で含まれていることを示唆している（図５）。
【０１８５】
細胞収率（４週間以内に少なくとも１００万個の細胞）と純度の観点から、同様の結果がすべての被験者から得た材料と生物学的実験で得られた。純度／混入の観点において、被験者と実験の間に有意差は生じなかった。収率に関しては、少なくとも１００万個の分化したメラノサイトを得るのに必要な時間で個体差が認められた。しかし、すべての被験者、生物学的実験および複製において、最小収率の１００万個の分化したメラノサイトは、通常、４週間以内に得られた。
【０１８６】
特性決定
特性決定基準は第３継代以降、満たされていた。Ｐ３前では、細胞は、メラノサイトに関する特定の特性決定パラメーターに対してまだ陰性であった。細胞は、典型的には、大きな細胞体と少なくとも３つの樹状突起を有しており（図１Ｄ）、チロシナーゼ、ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂおよびＨＭＢ４５を発現し（図３、７、９）、順調にＬ−ＤＯＰＡを変換し、メラニンを合成した（図１０）。すべての細胞がＩＢＭＸ試験に反応し、メラニン合成および樹状突起成長へと順調に誘導された。
【０１８７】
ＰＣＬ繊維メッシュへの組み込み
ＰＣＬ足場上で増殖させた細胞を適切に組み込み、３次元組織状態のメラノサイトの典型的な形態を取った。それらは複数の方角に樹状突起を拡張し、足場の繊維と接合した（図７Ａおよび図７Ｂ）。細胞は足場へ遊走し、網目構造の深さ全体に存在した（図７Ｃ）。さらに、チロシナーゼの散在パターンとｇｐ１００変異型の局所パターンもまたメラノサイトに典型的であった（図７、図９）。ｇｐ１００変異型は樹状突起境界近くのメラノソーム小胞に局在していた（図９）。ＮＨＥＭおよびＨＭの両方における高くほぼ等しい細胞割合は、ＰＣＬ足場とポリスチレン表面上のｇｐ１００変異型およびチロシナーゼを示した（図８）。
【０１８８】
さらに、足場上の細胞のＬ−ＤＯＰＡ活性とメラニン含有量は、平面接着ポリスチレン表面上の細胞よりもそれぞれ高く、表皮メラノサイトにおいては約６〜７倍、ＯＲＳメラノサイトにおいては２倍高かった（図１０）。
【０１８９】
ケラチノサイトベースの表皮相当物への組み込み
表皮ＮＨＥＭは、ケラチノサイトベースの表皮相当物へ順調に組み込まれた。これらは、ヒト皮膚表皮の基底層に対応する下層方向に向かい続けた。メラノサイトはそれらの特性を維持しており、本明細書に記載のメラノサイトに関する特性決定パラメーターを完全に示した（図１１）。
【実施例２】
【０１９０】
本明細書で提供した方法は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）と比べて、メラノサイトの生産においてより効率的である
材料および方法
Ｄｉｅｃｋｍａｎｎらの方法（Exp Dermatol. 2010 Jun;19(6):543-5. Epub 2010 Mar 30）は、毛髪サンプル由来のＨＭメラノサイトを培養するためにこれと同様の実験プラットフォームを使用して、本発明に係る方法と比較した。本発明者らは、両方の手順を同時に行った。本明細書に記載の方法による調製、培養、分化および特性決定の手順は、実施例１に記載のように行った。上記のように、本明細書で提供した方法は、毛髪の毛球を除去したことにより、かつ引き抜いた毛髪をコラーゲン分解剤とインキュベーションすることにより、引き抜いた毛髪を使用することによるＤｉｅｃｋｍａｎｎらの方法とはとりわけ異なる。さらに、本発明の方法は、ジェネティシン処理を含み得る。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎらの手順（上掲）は、所定の参考文献に従って行われた。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）で使用されるＭ２に対する補充は、ウシ下垂体エキス０．００４ｍｌ／ｍｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ヒト組換え型）１ｎｇ／ｍｌ、インスリン（ヒト組換え型）５μｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．５μｇ／ｍｌ、およびホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１０ｎｇ／ｍｌを含有する。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）による接着培養のための培養条件は、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生産されている、ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘを補充した培地のメラノサイト増殖培地Ｍ２を含む。この培地のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘは有効な腫瘍プロモーターであるＰＭＡを含有するので、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法によって得られた細胞は治療での使用には不利である。
【０１９１】
ジェネティシン選択の時点で、本発明者らは、本発明に従って培養したすべての細胞を同時に処理し、本明細書に記載の接着培養の段階で、調製物の線維芽細胞およびケラチノサイト内容物を選択的に廃棄する。さらには、分化したメラノサイトに対する競合物としての混入線維芽細胞とケラチノサイトの役割を明確にするために、本発明者らは、ジェネティシンを用いる、接着培養の最初の継代の時点で、個別に「Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ」（上掲）培養の実験を設定した。細胞はトリプシンブルーで染色し、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー内において各継代で計数した。
【０１９２】
外毛根鞘表面変化の測定：
毛包ＯＲＳの表面は、Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢＲ（Ｖｅｒｓｉｏｎ：３．００）ソフトウェアにより測定した。ＯＲＳは、形態学的に明白に識別可能であるが、調節可能な多角形フレームを用いてこれを毛包表面の顕微鏡観察から選択し、表面値をソフトウェアによって読み取った。３連の技術的複製を用意し、独立してセットアップした４つの培養実験のＯＲＳ表面の平均値を、０日、７日および１４日に比較した（図１３および図１４）。
【０１９３】
Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法と本明細書で提供したジェネティシンを添加した方法の比較：
さらに、分化しているメラノサイトに対する競合物としての混入線維芽細胞およびケラチノサイトを取り除くために、本発明者らは、既存の方法で使用されている対応する選択手段として、ｐ０の後に、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の接着培養物を５０μｇ／ｍｌのジェネティシンで処理した。
【０１９４】
結果
純粋なメラノサイト培養の培養、増殖、分化、選択
その手順によって、純度が９５〜１００％のほぼ完全に分化したヒトメラノサイトの拡大された培養物が得られ、これは、２０生検後の３〜４週間以内に、早ければ初代培養のｐ３またはｐ４以内にメラニン段階に達した（図１〜図５）。特に、６０個の毛包からの培養および分化手順によって１０６個の純粋な分化したヒトメラノサイトが得られ、これは引き抜いた後３〜４週間以内に、接着培養の第２〜第５継代でメラニン段階に達した。Ｄｉｅｃｋｍａｎらの結果と比較すると、本明細書で示した方法は、刊行物による時間の半分で、本発明者らの知見による接着培養の非常に早い継代で既にＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）によるプロトコルの収率をはるかに超え、１０６個のＨＭの取得が達成された。
【０１９５】
ＯＲＳ表面増殖：
それぞれの方法の間の増殖の相違は、ナイロンメッシュ上での毛包培養の７日目および１４日目に既に目視可能であり、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法との比較において、本明細書に記載の方法で培養した毛包で明白なより優れた増殖が明らかとなった（図１４）。コラゲナーゼで消化され、本発明によって培養された毛包のＯＲＳ表面は、実施例１で記載したように、０日目の４２．４８０±１７．４５１μｍ２から７日目の８７．７３５±４５．３９７μｍ２、および１４日目の１２５．８３８±５８．４４６μｍ２まで上昇したのに対し、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法によって培養した毛包は、０日目の４３．３０２±９．２２６μｍ２から７日目の５０．０３９±１０．７５３μｍ２、および１４日目の７７．４８８±２９．５６９μｍ２までの上昇であった。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法と本明細書による新規方法の間の外毛根鞘表面の比率は、０日目の０．９４から７日目の０．６９（ｐ＝０．０１＊）および１４日目の０．７２（ｐ＝０．０１８＊）までこれにより減少し（図１３）、コラーゲン処理した毛包由来の細胞でより速い増殖と遊走が明らかとなった。細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌナイロンメッシュから回収して接着培養へそれらを用いる時点で、回収した細胞数は、サンプリングしたすべての毛包を検討した場合、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法の１．８４倍を超えていた（図１６）。
【０１９６】
接着培養における増殖の比較：
接着培養における細胞は、本明細書に記載した方法に従って培養され、分裂し続け、第２継代の接着培養１１日目に１，０００，０００個の数に達し、第６継代で８０，８７５，０００個に達した。本発明者らの方法とは反対に、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら（上掲）のプロトコルによって培養された接着培養における細胞は最も高い菌体数として、接着培養の第１継代で７１０，０００個の細胞に達し、接着培養の第２継代１１日目までで６５０，０００個の細胞であった。本明細書に記載の方法で培養された細胞とは異なり、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法により培養された細胞は、さらなる継代で数が減少した（図１５および図１６）。
【０１９７】
ジェネティシン（genetycine）処理。
本発明者らの新規方法で使用される対応の選択手段として使用する５０μｇ／ｍｌのジェネティシンを用いてＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）による接着培養を追加処理すると、生存する細胞数が非常に少ないという結果に終わった（コンフルエンス２％未満）（図１５および図１６）。
【０１９８】
新規方法によって培養された細胞は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）によって培養された細胞よりも高い数値に達した。
【０１９９】
結論
ＯＲＳ表面の変化。コラーゲンタンパク質分解によって細胞外マトリックスを分解する際のコラゲナーゼの影響では、ＯＲＳから細胞をより簡単に遊走できることが明らかであった。この効果は、ＯＲＳの拡大表面によって、またＯＲＳからナイロンメッシュへの細胞のより完全な遊走によって目視することができる（図１４）。新規方法に従ってコラゲナーゼＶで消化した毛包中のＯＲＳの最初の増殖は、０日目以降の接着培養のすべての日において、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法による未消化の毛包のそれらの増殖を上回っていた。これによって、本発明による方法では、培地−空気界面での毛包培養物からより多くの細胞を回収するという利点と、接着培養を開始するためのセットアップ用により多くの細胞を保有するという利点が得られた。接着培養０日目で新規方法によって培養された毛包から回収した細胞数は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法を１．８４倍上回っていた（図１５）。
【０２００】
接着培養における増殖の比較。接着培養における細胞は、本明細書に記載の方法による培養試験で連続的に分裂し、接着培養の第２継代で１，０００，０００個の細胞に達し（Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら（上掲）による場合の同じ数に必要とされる時間の半分）、第６継代まで８０，８７５，０００個で同量であった。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法によって培養された細胞は、そのような数には到達せず、実際のところ、その数は、接着培養の第２継代の後、一貫して減少した。
【０２０１】
ジェネティシン処理。培地−空気界面での毛包培養物から回収された物質中の線維芽細胞およびケラチノサイトの部分は、明らかに、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法による調製よりもはるかに多かった。その理由は、それらのほとんどがジェネティシン選択中に死滅し、非常に少ない数の細胞しかジェネティシン処理で残存しなかったためであり、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法は、接着培養でメラノサイトを迅速に培養するための十分な幹細胞および前駆体を提供することができなかったことを示す（図１５）。Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら（上掲）によって培養された細胞のジェネティシン選択の結果とは反対に、本明細書で記載に従って培養された多数の細胞は、この選択ステップで生存しており、非常に高い細胞数まで増加させることができた（図１５）。
【０２０２】
幹細胞および前駆体の開始時のより多くの数と、より好ましい接着培養条件の相乗作用によって、新規方法ではＨＭの収率を有意に高めることができる（図１５）。
【実施例３】
【０２０３】
本明細書で提供した方法によって得られるメラノサイトは、公知のメラノサイトとは異なる。
本発明によって得られるメラノサイト（ＨＭ）は、成人の皮膚メラノサイトに形態的にも機能的にも対応しているにもかかわらず、細胞表面マーカーの発現から（表１〜５）、また定量的な形態学的パラメーターから明らかように、それらは全く新しい本質の細胞である（図１７）。
【０２０４】
材料および方法
形態学的特性
細胞の表面および樹状突起の長さは、Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢＲ（バージョン：３．００）ソフトウェアによって測定した。３回の培養実験において実験当たり合計５つの細胞を、実施例１に記載したように評価した。細胞の表面を調節可能な多角形フレームを用いて選択し、ソフトウェアで表面の値を読み取った。樹状突起の長さはマルチポイントライン長さ計測器具によって測定した。
【０２０５】
Ｌｙｏｐｌａｔｅ、ＦＡＣＳ測定による表面マーカー分析
表面マーカーの発現は、ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅヒト細胞表面マーカーのスクリーニングパネルを用いて分析した。ヒト細胞表面マーカーに対する２４２個の抗体のこのパネルは、正常なヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）とＯＲＳ由来メラノサイト（ＨＭ）の標識に使用した。細胞を、実施例１の方法セクションに記載のように培養し、特性決定し、第１０〜第１１継代で回収し、メーカーによって提供されている染色バッファー中に再懸濁した。２００，０００細胞／ウェルのアリコートを９６ウェルプレートに接種した。各ウェル中の細胞を、単一表面マーカー用の個別にマウスで生成した一次抗体またはラットで生成した一次抗体で標識し、その後、それぞれ、Ａｌｅｘａ６４７フルオロフォアで標識した、マウスまたはラットに対する対応二次抗体で標識した。４０分間のインキュベーションステップの間で、細胞を染色バッファーで洗浄し、４分間３００ｇで遠心分離した。染色後、標識した細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳアレイシステムによって測定した。測定は、ＢＤ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用して分析した。陰性対照（非標識の細胞）を使用して蛍光シグナルの閾値を確立した。２×１０３の蛍光強度を、少なくとも一名の被験者において正（＋）として示した閾値以上のマーカー発現蛍光強度の閾値として設定した。
【０２０６】
結果：
形態学的特徴
ＮＨＥＭ細胞は３７７±１３５μｍ２の平均表面を示すのに対し、ＨＭは２９０±７４μｍ２を示す。これによれば、ＮＨＥＭ細胞体は、ＨＭ細胞体よりも表面において２３％大きい（ｐ＝０．０４５１）。ＮＨＥＭの樹状突起は、平均３５．７３±１５μｍの長さであり、これはＨＭ細胞の長さ２１．５７±１０μｍの樹状突起よりも３９％長い（ｐ＝０．０４５）。ＮＨＥＭは、ＨＭ（２．４７±０．６４）よりもわずかに平均の数が多い樹状突起（３．１３±１．１９）を有する（ｐ＝０．０６５、有意差なし）（図１７）。
【０２０７】
表面マーカー
２４２種の試験した細胞表面マーカーのうち、２２９種がＨＭで発現され、そのうちの１３種のマーカーはＨＭにおいて限定的であった（細胞マーカー総数の５．３７％）。また２２９種のマーカーがＮＨＥＭ中で発現され、１３種のマーカーがＮＨＥＭにおいて限定的であった（５．３７％）。ＮＨＥＭとＨＭの両方で、試験したすべてのマーカーの２４２種の細胞表面マーカーのうち、８４種が発現した。ＮＨＥＭとＨＭとの間の細胞表面マーカーの発現の差は、試験したすべてのマーカーの１０．７４パーセントと発現されたマーカーの３４．７％を構成する（表１〜５）。ＨＭとＮＨＥＭの間で違った形で発現される大部分のマーカーは免疫の制御に関与しており（ＨＭでのＣＤ１９５  ＣＤ１０８  ＣＤ４０  ＣＤ３６  ＣＤ１５ｓ  ＣＤ２８２  ＣＤ１７３、ＣＤ２７４、ＮＨＥＭでのＣＤ１、ＣＤ２８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８２、ＨＬＡ−Ａ２（Ａ２）、ＨＬＡ−ＤＱ）、成長において重要な機能を果たさないものである。特定のマーカーは一般的に機能性であり、メラノサイト以外の他の系統で発現される（ＨＭでの間葉系細胞マイトジェンに対するＣＤ４０ａおよびＣＤ４０ｂ受容体は、ＮＨＥＭで接着分子ＣＤ５７をニューロンにより発現した）。メラノサイトで通常発現されるマーカーのＣＤ１１７とＣＤ２２１は、ＨＭ中ではなくＮＨＥＭ中で発現された。表２および表３は、ＮＨＥＭ細胞および本明細書で提供した方法によって得られるメラノサイト（ＨＭ）中で異なって発現される表面マーカーを示す。表４および表５は、ＮＨＥＭ細胞および本明細書で提供した方法によって得られるメラノサイト（ＨＭ）中で発現された表面マーカーの一覧を示す。ＮＨＥＭおよびＨＭにそれぞれ特異的なマーカーは、ＮＣＢＩタンパク質データベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）からＮＰ番号を割り当てた。このようなタンパク質データベースの使用は公知であり、したがって、本明細書で使用されるマーカーの対応するアミノ酸および核酸配列に、当業者は容易にアクセスすることができる。
【０２０８】
結論：
形態学的パラメーター
ＨＭおよびＮＨＥＭは共通の形態を共有し、両方とも突出した樹状突起を持つ大きな細胞体を有する。ＨＭはより小さな細胞表面を示し、ＨＭよりも多少数の少ない短い樹状突起がある。
【０２０９】
表面マーカー
本発明により取得されるメラノサイトとＮＨＥＭは、表面マーカー発現（２４２種の試験したマーカーの１０．７４％）、と全体マーカー発現（すべての発現マーカーの３４．７％）において異なる。マーカー発現の差は、ＨＭとＮＨＥＭの間の細胞同一性における相違を反映する。
【０２１０】
他の系統に典型的なマーカーの発現は、ＨＭおよびＮＨＥＭの性質に適合している。神経細胞接着分子であるＣＤ５７の発現は、メラノサイトと神経系細胞に共通する発生学的起源に付随する。ＣＤ４０ａ、ＣＤ４０ｂは、間葉系細胞におけるマイトジェンの受容体であって、ＨＭを間葉系のシグナル伝達の合図の影響を受けやすくし得るが、間葉系ニッチにＨＭを置くことは本出願の目的の範囲内ではない。
【０２１１】
ＣＤ４０ａ、ＣＤ４０ｂ、ＣＤ１０４およびＣＤ１０６は細胞増殖および接着に関与し、ＨＭで発現される。ＣＤ１１７の発現は欠如と共に、これは、ＨＭが幹細胞起原であることを反映し、ＨＭ細胞の残りのナイーブ性を示し、ＨＭ細胞を完全な成人黒色メラノサイト段階の直前の進行した部分的黒色メラノブラスト段階に置く。
【０２１２】
ＣＤ２２１（インスリン様増殖因子１チロシンキナーゼ受容体）は、ほとんどのヒト細胞において発現される。ＣＤ２２１は、細胞増殖、細胞培養における非常に重要な機能に影響を及ぼすインスリン様増殖因子ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のシグナル伝達を介在している。ＨＭにおけるＣＤ２２１発現の欠如によって、ＨＭ細胞ではこの受容体を介したＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２シグナル伝達が機能しなくなり、インスリン受容体の競合的結合にＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２因子を提供する。これは、本発明者らの培養系には影響しない。その理由は、培地へのインスリンの補充によって、インスリン受容体への親和性が１００倍高いこの競合的結合を解消し、正常細胞を増殖させるからである。
【０２１３】
本明細書で得られたメラノサイトは、発現マーカーが異なり、さらに、本明細書の上記のように定量できる定性的な形態学的形質が異なる。これらの違いに基づけば、本明細書で提供され、かつ取得されるメラノサイトは新規な細胞実体である。
【０２１４】
様々なレベルの特性決定における一連の類似性は、ＯＲＳ分化ＨＭが、表皮の皮膚から誘導したＮＨＥＭに、形態学的および機能的に匹敵するものであることを示唆している。これらの定性的および定量的な特性は、ＨＭがＮＨＥＭの優れた代替物であり、それらが非侵襲的に取得されることを考えると十分であることを意味する。
【０２１５】
ＯＲＳメラノサイトは、同じ細胞内マーカー（チロシナーゼ、ｇｐ１００変異型）を発現し、Ｌ−ＤＯＰＡ基質をメラニンに変換し、補充された基質から、および自然発生的にメラニンを産生する能力を示す、メラニン形成に設定されている活性酵素（チロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）を維持している。さらに、ＨＭは遊走し、新しいニッチに存在させることができる。本発明者らが示したとおり、ＨＭは、ＦＡＣＳ分析で前方散乱によって測定した場合に、さらには、細胞表面および樹状突起の長さなどの量的な形態学的パラメーターにより、細胞体が小さく樹状突起が短いことを除いては、形態学的にＮＨＥＭと非常によく似ている。さらに、細胞表面マーカーの発現がＮＨＥＭとＨＭの間で異なる。これらの違いにより、本明細書で提供したメラノサイト（ＨＭ）は、表皮ＮＨＥＭに比べて新しい細胞実体である。したがって、本明細書で提供した方法によって取得可能なメラノサイトは新規である。
【０２１６】
【表２】
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【０２１７】
【表３】
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【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【０２２０】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】４週間以内の毛根ＯＲＳ由来のＯＲＳ細胞のメラノサイトの純粋培養への培養、選択および拡大を示す図である。Ａ：培養初日にＴｒａｎｓｗｅｌｌ微多孔膜（培地−空気界面）上にセットされた、引き抜き調製した側頭毛根の中央部分。密な外毛根鞘（ＯＲＳ）は目視可能である。Ｂ：ＯＲＳの外に遊走している第１の細胞を伴う大きくなったＯＲＳ。Ｃ：増殖細胞がＯＲＳから離れて凝集を形成している。Ｄ：４週間培養した後のＯＲＳメラノサイトの純粋培養。細胞は、大きな細胞体と３倍から多数の樹状突起を示す（三極形態〜星状形態）。
【図２】ＯＲＳメラノサイトの純粋培養の開発における方法論的な改良の組み合わせを示す図である。Ａ：未調製で未処理の毛髪。ＯＲＳは密である（矢印）。Ｂ：未調製で、コラゲナーゼＶで処理した毛髪であって、中央部分と、さらに近くの（毛球）部分の外側（矢印）のＯＲＳ外側に目視できる遊走した細胞がある。Ｃ：毛球をカットし（破線）、コラゲナーゼＶで処理していない、調製した毛髪であって、密なＯＲＳを示す（矢印）。Ｄ：毛球をカットし（破線）、コラゲナーゼＶで処理した、調製した毛髪であって、ＯＲＳの外側に遊走した細胞がある（矢印）大きくなったＯＲＳを示す。スケールの棒表示は５００μｍに相当する。Ｅ：培養の１４日目のＯＲＳの外側で大きくなり、ほぼコンフルエントに広がった細胞。Ｆ：２０日目のコラーゲン処理されていない毛髪から成長させたＯＲＳ細胞プールの初代培養物。細胞型をいくつか見ることができる。Ｇ：２０日目のコラーゲン処理した毛髪から成長させたＯＲＳ細胞プールの初代培養物。培養細胞は、より典型的な形態を示す。Ｈ：２６日目の選択されたメラノサイトの純粋培養物。Ｉ：３０日目の純粋培養物における分化したメラノサイト。スケールの棒表示は１００μｍに相当する。
【図３】ＯＲＳ培養物の免疫細胞科学的な特性決定に関する図である。Ａ：ＮＫＩ＼ｂｅｔｅｂは、すべての表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）で発現される；Ｂ：チロシナーゼは、すべての表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）で発現される；Ｃ：ＣＤ９０は、すべての非メラノサイト細胞、線維芽細胞で広く発現される；Ｄ：ＮＫＩ＼ｂｅｔｅｂは、ほぼすべてのＯＲＳメラノサイト（ＨＭ）で発現される；Ｅ：チロシナーゼは、ほぼすべてのＨＭで発現される；Ｆ：純粋なＨＭ培養物におけるＣＤ９０発現の欠如。棒表示は５０μｍに相当する。
【図４】ＯＲＳメラノサイト培養物の純度を示す図である。灰色の棒は、培養物中のＮＫＩ／ｂｅｔｅｂ−陽性メラノサイトのパーセンテージを示している。この表は、培養における拡大、分化および選択の手順を示し、培養物中のメラノサイトの明確な増加傾向を表すものであって、培養手順の適切な組み合わせを用いると、ＮＫＩ−ｂｅｔｅｂ−発現メラノサイトは９６％に達する。Ｃｏｌｌ＋／−はコラゲナーゼＶ処理に対応し、ＨＷ＋は毛球の存在を表し、ＨＷ−は毛球の存在しないことを表し（毛球を毛包の残りの部分から切り離したことを示す）、Ｇ＋／−はジェネティシン処理を表し、ＤＬＭはＤｅｒｍａＬｉｆｅ培地に対して用いる。黒い棒は、個別培養で増殖させた、表皮メラノサイトの対照を表し（分化したＮＨＥＭ）、９９％のＮＫＩ／ｂｅｔｅｂ−発現細胞を示す。相違は、ＤＬＭ／−Ｃｏｌ／−ＨＷ／＋Ｇ（ジェネティシンで処理され、ＤＬＭ培地で分化された、未消化の短くした毛包）と残りのカテゴリーの間の相違を除いて、すべて統計的に有意（ｐ＜０．０５）から極めて非常に有意（ｐ＜０．００５）である。
【図５】ＯＲＳメラノサイト培養物の線維芽細胞混入を示す図である。灰色の棒は、培養物中のＣＤ−９０−陽性細胞（広がった線維芽細胞）のパーセンテージを示している。この表は、培養におけるメラノサイトの拡大、分化および選択の手順を示し、手順の最適な組み合わせを用いた場合にＣＤ−９０−発現細胞が２％になり、培養物中の線維芽細胞の明白な減少傾向を表している。Ｃｏｌｌ＋／−はコラゲナーゼＶ処理に対応し、ＨＷ＋は毛球の存在を表し、ＨＷ−は毛球の存在しないことを表し（毛球を毛包の残りの部分から切り離したことを示す）、Ｇ＋／−はジェネティシン処理を表し、ＤＬＭはＤｅｒｍａＬｉｆｅ培地に対して用いる。白い棒は、個別培養で増殖させた、線維芽細胞の対照を表し、１００％のＣＤ−９０−発現細胞を示している。相違は、ＤＬＭ／−Ｃｏｌ／−ＨＷ／＋Ｇと残りのカテゴリーの間の相違を除いて、すべて統計的に有意（ｐ＜０．０５）から極めて非常に有意（ｐ＜０．００５）である。
【図６】ポリカプロラクトン（policaprolactone）（ＰＣＬ）足場構造を示す図である。Ａ：８〜１０μｍ繊維のＲＥＭ捕獲、拡大８００倍。Ｂ：２〜３μｍ繊維のＲＥＭ捕獲、拡大８００倍。スケールの棒表示は２５μｍに相当する。
【図７】ＰＣＬ足場上のＨＭおよびＮＨＥＭ捕獲のレーザー走査顕微鏡を示す図である。ＰＣＬ繊維（反射された赤色光からのシグナル）。チロシナーゼを発現するＮＨＥＭメラノサイト（緑色蛍光）および核（ＤＡＰＩ  ＵＶ蛍光）が目視できる。Ａ：チロシナーゼを発現するＨＭ；Ｂ：ＮＫＩ＼ｂｅｔｅｂを発現するＮＨＥＭ；Ｃ：ＯＲＳメラノサイトが存在するＰＣＬ足場の側面図（断面３Ｄモデル）；ＨＭはチロシナーゼ抗体（緑色シグナル）で標識化されていた。Ｄ：表皮メラノサイトが存在しているＰＣＬ足場の側面図（断面３Ｄモデル）。断面は、細胞がＰＣＬ足場の十分な深さに存在していることを示す。スケールの棒表示は２００μｍに相当する。矢印は、メッシュ繊維と接合されている典型的な細胞体と広がった樹状突起を指している。
【図８】ＰＣＬ足場およびポリスチレン接着表面でのメラノサイトマーカー発現を示す図である。マーカー陽性細胞に対する核の数の比率は、パーセンテージとして表す。表皮メラノサイト（暗褐色）およびＯＲＳメラノサイト（ベージュ色）のチロシナーゼおよびＮＫＩ／ｂｅｔｅｂマーカー発現は、ポリスチレン接着表面（黒色）上の表皮メラノサイトの発現と等しく、ＨＭとＮＨＥＭの両方がＰＣＬ足場上でそれらの特徴を維持していることを示している。
【図９】表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）とＯＲＳメラノサイト（ＨＭ）の両方が、樹状突起の先端から分泌される準備ができているメラノソームを形成していることを示す図である。この図は、ＮＨＥＭとＨＭにおけるメラノソームのＮＫＩ／ｂｅｔｅｂ標識を示す。Ａ：３μｍのＰＣＬ足場上のＮＨＥＭ、Ｂ：１０μｍのＰＣＬ足場上のＮＨＥＭＣ：３μｍのＰＣＬ足場上のＨＭＤ：１０μｍのＰＣＬ足場上のＨＭ。スケールの棒表示は拡大４０倍で５０μｍに相当する。
【図１０】ＰＣＬ足場および接着表面上のＮＨＥＭおよびＨＭのメラニン含有量およびＬ−ＤＯＰＡトートメラーゼ活性を示す図である。すべてのグラフは、ＰＳ接着表面よりもＰＣＬ足場で、メラニン産生およびＬ−ＤＯＰＡトートメラーゼ活性がより高いという明確な傾向を示している。黒い棒はＮＨＥＭを表し、灰色の棒はＨＭを表す。（Ａ）接着表面と比較したＰＣＬ足場での表皮メラノサイト中のメラニン含有量：表皮メラノサイトは、接着ポリスチレン表面よりもＰＣＬ足場で４．５９倍以上のメラニンを生産する。（Ｂ）接着表面と比較したＰＣＬ足場でのＯＲＳメラノサイト中のメラニン含有量：ＨＭ  ＯＲＳメラノサイトは、接着ポリスチレン表面よりもＰＣＬ足場で２．５８倍以上のメラニンを生産する。（Ｃ）接着表面と比較したＰＣＬ足場での表皮メラノサイト中のＬ−ＤＯＰＡ活性：表皮メラノサイトは、接着ポリスチレン表面よりもＰＣＬ足場でＬ−ＤＯＰＡを６．６５倍以上変換する。（Ｄ）接着表面と比較したＰＣＬ足場でのＯＲＳメラノサイト中のＬ−ＤＯＰＡ活性：ＨＭ  ＯＲＳメラノサイトは、接着ポリスチレン表面よりもＰＣＬ足場でＬ−ＤＯＰＡを１．７２倍以上変換する。すべての値は、１００％としている、接着表面上の特定の細胞型の対応する値に対して示されている。すべての相違は、統計的に非常に有意である（ｐ＜０．０１）から非常に極めて有意（ｐ＜０．００５）である。
【図１１】表皮ケラチノサイト相当物に埋め込まれている外毛根鞘メラノサイト（ＨＭ  ＯＲＳ）は、表皮基底層に相当する移植片の下層に残り、メラノサイトマーカーを発現することを示す図である。チロシナーゼおよび核のＤＡＰＩシグナルは目視できる。Ａ：表皮メラノサイト、正常光；Ｂ：表皮メラノサイト、蛍光。スケールの棒表示は２００μｍに相当する。
【図１２】対照の免疫細胞化学的な特性決定を示す図である：正常なヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）でのＮＫＩ−ｂｅｔｅｂの発現（ａ）、表皮メラノサイトでのチロシナーゼ（ｂ）、純粋な皮膚の線維芽細胞培養でのＣＤ−９０の発現（ｃ）、ＨＭ培養物でのＣＤ−９０発現の欠如（ｄ）、Ｌ−ＤＯＰＡを添加しない培養物でのＨＭ（ｅ）、ＨＭの形態におけるＩＢＭＸが介在する変化と増加したメラニン含有量、Ｌ−ＤＯＰＡなし（ｆ）、ＨＭにＬ−ＤＯＰＡ基質を添加した際のメラニン含有量（ｇ）、ならびに、ＩＢＭＸで事前処理したＨＭにＬ−ＤＯＰＡを添加した際のメラニン含有量の増加（ｈ）。スケールの棒表示（ａ〜ｄ）は５０μｍに相当し、棒表示（ｅ〜ｆ）は１００μｍに相当する。
【図１３】図１３は、外毛根鞘表面の比較変化を示す図である。新規の方法（黒菱形）およびＤｉｅｃｋｍａｎｎら（上掲）（黒四角）の方法の両方を、ＯＲＳ表面の増加について比較した。表面の増加は、７日目と１４日目で測定した場合、新規のプロトコルによって培養された毛包のＯＲＳにおいて、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法の増加と比べて有意に高かった。
【図１４】ＯＲＳ表面の比較変化の画像表示である。（ａ）新規方法、０日目、（ｂ）Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）、０日目、（ｃ）新規方法、７日目、（ｄ）Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）、７日目（ｅ）新規方法、１４日目、（ｆ）Ｄｉｅｃｋｍａｎｎの方法（上掲）、１４日目。  新規方法（ａ、ｃ、ｅ）において培地-空気界面で培養した毛包は、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法（ｂ、ｄ、ｅ）によって培養した場合よりも、ＯＲＳ表面での増加が高かった。０日目では、毛包は密である（ａ、ｂ）。７日目に、細胞の増殖および遊走が明白であり（ｃ、ｄ）、１４日目（e、f）も同様であった。新規方法によって培養された毛包の増殖が増強されているのが目視できる。
【図１５】接着培養の最初の６継代中における、新規方法（黒三角）、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法（黒丸）、ジェネティシンを補充したＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法（＊）によって培養されたＯＲＳ細胞の接着培養増殖曲線における細胞増殖の比較を示す図である。グラフの下の部分は線形で示し、上の部分は対数を用いて示している。本明細書に記載の方法で培養された細胞は、接着培養の第２継代によって１，０００，０００個の細胞数に達した。
【図１６】毛包当たりの接着培養における増殖の比較を示す図である。接着培養の最初の６継代中における、新規方法（黒三角）、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法（黒丸）、ジェネティシンを補充したＤｉｅｃｋｍａｎｎ（上掲）の方法（＊）によって培養されたサンプル毛包に対するＯＲＳ細胞の増殖曲線を示す。グラフは対数を用いて示している。
【図１７】ＮＨＥＭおよびＨＭにおける細胞体と樹状突起の長さの様々な大きさを示す図である。（ａ）前方散乱光プロット（Ｘ軸）によって測定されたＮＨＥＭおよびＨＭの相対的な細胞の大きさ、（ｂ）ＮＨＥＭおよびＨＭの細胞の大きさ（μｍ２）、（ｃ）ＮＨＥＭおよびＨＭの樹状突起の長さ（μｍ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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