(57)【要約】  本開示は、骨伝導性スカフォールド及び骨誘導性小分子を含む、骨成長を向上させるためのインプラントについて記載する。骨伝導性スカフォールドは、更に高分子バインダーを含んでもよい。インプラントは、骨形成性材料を含んで生存可能な細胞集団を提供し、骨の修復及び再構築を補助することもできる。本開示によるインプラントの治療的使用方法に加えて、骨成長を促進するインプラントを形成するためのシステム、及びインプラントの形成方法も開示する。
2014506522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨成長を促進するためのインプラントであって、
骨伝導性スカフォールドと、
骨誘導性小分子と、を含み、
前記スカフォールドが、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記骨誘導性小分子が、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、インプラント。
【請求項２】
骨形成性材料を更に含む、請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
前記骨形成性材料が、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群に由来する、請求項２に記載のインプラント。
【請求項４】
前記スカフォールドがセラミック骨代用材を含み、前記セラミック骨代用材が、アパタイト類及びリン酸三カルシウム類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるリン酸カルシウム系化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインプラント。
【請求項５】
前記セラミック骨代用材が、平均顆粒径約０．５ｍｍ〜約４．０ｍｍ及び平均孔径約２０μｍ〜約５００μｍを有する複数の多孔質顆粒を含む、請求項４に記載のインプラント。
【請求項６】
前記スカフォールドが、高分子バインダーを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインプラント。
【請求項７】
前記高分子バインダーが、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリカプロラクトン類、コラーゲン、セルロース、及びコポリマー類、これらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、請求項６に記載のインプラント。
【請求項８】
前記骨誘導性小分子が、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるコルチコステロイドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインプラント。
【請求項９】
前記骨誘導性小分子が賦形剤と組み合わされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のインプラント。
【請求項１０】
前記賦形剤が、カプチゾール（Captisol）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）、トゥイーン２０（Tween 20）、トゥイーン８０（Tween 80）、並びにこれらの混合物及び誘導体からなる群から選択される、請求項９に記載のインプラント。
【請求項１１】
骨伝導性スカフォールドを骨誘導性小分子と組み合わせてインプラントを形成する工程を含む、骨成長を促進するインプラントの形成方法であって、
前記スカフォールドが、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記合成小分子が、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
骨形成性材料を、前記骨伝導性スカフォールド、前記骨誘導性小分子、又はこれらの両方と組み合わせる工程を更に含み、
前記骨形成性材料が、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨誘導性小分子を賦形剤と組み合わせる工程を更に含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
骨成長を促進するインプラントを形成するためのシステムであって、
第２の容器と接続するように適合された開口部を有する第１の無菌容器内に収容されている骨伝導性スカフォールドと、
骨誘導性小分子と、
骨形成性材料が前記第２の容器から前記第１の容器に移動できるように前記第１の容器と接続するように適合された開口部を有する第２の無菌容器内に収容されている前記骨形成性材料と、を備え、
前記スカフォールドが、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記骨誘導性小分子が、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記骨形成性材料が、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群に由来する、システム。
【請求項１５】
前記骨誘導性小分子が前記第１の容器内に含まれる、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記骨誘導性小分子が前記第２の容器内に含まれる、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記骨誘導性小分子を収容し、かつ前記骨誘導性小分子が第３の容器から前記第１の容器に移動できるように、前記第１の容器と接続するように適合された開口部を有する前記第３の容器を更に備える、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記スカフォールドが、高分子バインダーを更に含むセラミック骨代用材である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記セラミック骨代用材が、アパタイト類及びリン酸三カルシウム類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるリン酸カルシウム系化合物であり、
前記高分子バインダーが、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリカプロラクトン類、コラーゲン、セルロース、及びコポリマー類、これらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記骨誘導性小分子が、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるコルチコステロイドである、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記骨誘導性小分子が賦形剤と組み合わされる、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記賦形剤が、カプチゾール（Captisol）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）、トゥイーン２０（Tween 20）、トゥイーン８０（Tween 80）、並びにこれらの混合物及び誘導体からなる群から選択される、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年２月２５日出願の米国特許仮出願第６１／４４６，７０６号の優先権を主張するものであり、その開示は、その全体が本明細書に記述されるが如く参照により組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、骨伝導性（osteoconductive）スカフォールド及び骨誘導性（osteoinductive）小分子を含む、骨成長を促進するためのインプラントに関する。インプラントは更に、骨形成性材料を含むことができる。インプラントを形成するためのシステム、及び本開示のインプラントを利用する処置方法も開示する。
【背景技術】
【０００３】
骨折修復及び脊椎固定は、多くの場合、骨を成長させるための生物学的促進を必要とする。自己移植片は、その証明された安全性及び有効性プロファイルにより、最も臨床的に所望される処置選択肢である。自己移植片は、骨形成性、骨誘導性及び骨伝導性であり、拒絶のリスクが皆無である。しかしながら、自己移植片による処置は、例えば、患者の腸骨稜からの移植片の回収に関連した罹患率の問題により、また必要な体積の自己移植片は常に入手可能ではないため、問題を生じる場合がある。それ故、非自己移植片ベースの骨誘導性及び骨形成処置選択肢に対する臨床的必要性が依然として存在する。
【０００４】
骨誘導は、増殖因子、ホルモン、幹細胞、及びプロセスに寄与する他の因子のホストを伴う、重複性の多数の層を含む複雑な経路である。骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）などの増殖因子による現在の処置は、時折、超生理学的投与量に影響され、このことは望ましくない副作用を有する場合があり、最良の解決法ではない可能性がある。骨誘導処置は、伝統的に、新たに骨成長を刺激することができる因子又はマトリクス、例えば、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７により定義付けられている。骨治癒は、異なる細胞と、多様な細胞シグナリング経路を介して制御及び管理される生物学的プロセスとを含む、多角的な、密接に連携するプロセスである。ＢＭＰｓなどのヒト増殖因子は、多くの場合これらの経路を駆動し、これらの治療的投与は、骨成長に影響を与える一つの方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、骨成長を引き起こすように重なり合う広範な経路が存在することを仮定すれば、ＢＭＰｓを超える骨誘導性特性を有する潜在的な技術が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、骨伝導性スカフォールド及び骨誘導性小分子を含む、骨成長を促進するためのインプラントに関する。スカフォールドは、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミックベースの骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物を含むことができる。骨誘導性小分子は、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物から選択されてもよい。
【０００７】
インプラントは、骨形成性材料を更に含むことができる。骨形成性材料は、自己又は同種供給源から得ることができ、自己移植片、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物を含んでもよい。
【０００８】
別の実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドはセラミック骨代用材であり、前記セラミック骨代用材は、例えば、アパタイト又はリン酸三カルシウム、並びにこれらのブレンド及び混合物などのリン酸カルシウム系化合物である。更なる実施形態によれば、セラミック骨代用材は、平均顆粒径約０．５ｍｍ〜約４．０ｍｍ及び平均孔径約２０μｍ〜約５００μｍを有する複数の多孔質顆粒である。
【０００９】
尚別の実施形態によれば、スカフォールドは、高分子バインダーを更に含むことができる。高分子バインダーは吸収性ポリマーであってもよく、例えば、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリラクトン類、コラーゲン、セルロース、及びコポリマー類、これらのブレンド及び混合物を含んでもよい。
【００１０】
本開示によれば、インプラントは、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類などの化合物類の群から選択される骨誘導性小分子を含む。好適なコルチコステロイド類としては、例えば、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、並びにこれらのブレンド及び混合物を挙げることができる。一実施形態によれば、骨誘導性小分子は、賦形剤と組み合わされてもよい。好適な賦形剤類としては、例えば、カプチゾール（Captisol）（登録商標）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）（登録商標）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）（登録商標）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）（登録商標）、トゥイーン２０（Tween 20）（登録商標）、トゥイーン８０（Tween 80）（登録商標）、並びにこれらの混合物及び誘導体を挙げることができる。
【００１１】
本開示によれば、患者における骨成長を誘導するための方法を提供し、方法は、本開示の任意の実施形態によるインプラントを患者に植え込む工程を含む。
【００１２】
別の実施形態によれば、インプラントの形成方法は、骨伝導性スカフォールドを骨誘導性小分子と組み合わせてインプラントを形成する工程を含む。更なる実施形態によれば、スカフォールドは、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物を含んでもよく、合成小分子は、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物を含んでもよい。尚別の実施形態によれば、本方法は、骨形成性材料をインプラントに組み合わせる工程を含んでもよい。好適な骨形成性材料としては、自己移植片、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物を挙げることができる。更なる別の実施形態によれば、本方法は更に、骨誘導性小分子を賦形剤と組み合わせる工程を含んでもよい。
【００１３】
本開示は、骨成長を促進するインプラントを形成するためのシステムも含み、前記システムは、第２の容器と接続するように適合された開口部を有する第１の無菌容器内に収容されている骨伝導性スカフォールドと、骨形成性材料が第２の容器から第１の容器に移動できるように第１の容器と接続するように適合された開口部を有する第２の無菌容器内に収容されている骨誘導性小分子及び骨形成性材料と、を備える。システムの一実施形態によれば、スカフォールドは、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物を含んでもよく、骨誘導性小分子は、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物を含んでもよく、骨形成性材料は、自己移植片、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物に由来してもよい。システムの別の実施形態によれば、骨誘導性材料は第１の容器内に含まれ、更なる実施形態によれば、骨誘導性材料は第２の容器内に含まれる。
【００１４】
システムの一実施形態によれば、スカフォールドはセラミック骨代用材であり、更なる実施形態では、スカフォールドは高分子バインダーを含む。システムの別の実施形態によれば、セラミック骨代用材は、アパタイト類及びリン酸三カルシウム類、並びにこれらのブレンド及び混合物などのリン酸カルシウム系化合物であり、尚別の実施形態では、高分子バインダーは、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリラクトン類、コラーゲン、セルロース、及びコポリマー類、これらのブレンド及び混合物を含む。
【００１５】
システムの更なる別の実施形態によれば、骨誘導性小分子は、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、並びにこれらのブレンド及び混合物を含むコルチコステロイド類の群から選択される化合物類を含んでもよい。システムの尚別の実施形態によれば、骨誘導性小分子は、賦形剤と組み合わせることができる。好適な賦形剤類としては、例えば、カプチゾール（Captisol）（登録商標）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）（登録商標）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）（登録商標）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）（登録商標）、トゥイーン２０（Tween 20）（登録商標）、トゥイーン８０（Tween 80）（登録商標）、並びにこれらの混合物及び誘導体を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
前述の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれた際により理解が深まるであろう。しかしながら、本出願は、記載した実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。図面において、
【図１】本開示の実施形態による２つの骨誘導性小分子に関する用量応答曲線のグラフ表示。
【図２】本開示の別の実施形態による小分子の相対抗力のグラフ表示。
【図３Ａ】一実施形態による、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した、骨伝導性スカフォールドからの数種の小分子のインビトロでの時間放出のグラフ表示。
【図３Ｂ】一実施形態による、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した、骨伝導性スカフォールドからの数種の小分子のインビトロでの時間放出のグラフ表示。
【図３Ｃ】一実施形態による、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した、骨伝導性スカフォールドからの数種の小分子のインビトロでの時間放出のグラフ表示。
【図４】別の実施形態による、放射標識を用いて測定した、別の骨伝導性スカフォールドからの小分子のインビトロでの時間放出のグラフ表示。
【図５】別の実施形態による、骨伝導性スカフォールドからの小分子の理論的なインビボ放出プロファイルのグラフ表示。
【図６】本開示の実施形態による、ＡＬＰアッセイにおける骨形成性材料上で測定した、数種の小分子の骨誘導性の測定値のグラフ表示。
【図７】本開示の実施形態による、選択された骨誘導性小分子でコーティングされた骨伝導性スカフォールド上に播種された骨形成性材料内のＡＬＰ  ＲＮＡ発現の量を示すグラフ表示。
【図８】本開示の実施形態による、骨誘導性小分子のインビトロでの放出プロファイルと、放射標識され、インビボで骨伝導性スカフォールドから放出された同一の骨誘導性小分子の放出プロファイルとのグラフ表示。
【図９】本開示の実施形態による、骨形成性材料内で発現されたヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の生成を反映する、骨誘導性小分子の分化可能性を示すグラフ表示。
【図１０】一実施形態による、高分子バインダーを含む骨伝導性スカフォールドを収容している第１の容器と、骨形成性材料を収容している第２の容器と、を有するインプラントシステム。
【図１１】第２の容器が第１の容器に接続されて、骨形成性材料を第２の容器から第１の容器に移動している、図１０のインプラントシステム。
【図１２】図１０及び１１に図示及び記載したインプラントシステムに従って形成されたインプラント。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示が完全に理解できるように、以下の定義を記述する。
【００１８】
本明細書で使用される「骨伝導」は、移植されたマトリクスが、その孔、チャネル、又は他の内部空隙の表面上での新たな骨成長を可能にし又は促すプロセスを指す。移植片材料又は移植片マトリクスは、新たな骨成長のスカフォールドとして機能し得る場合、「骨伝導性」であると言うことができる。修復されている宿主骨の欠損部位における骨芽細胞（骨形成細胞）は、移植された移植片材料を枠組みとして利用し、材料上にて新たな骨を展開し及び生成させる。
【００１９】
本明細書で使用される「骨誘導」は、骨細胞前駆細胞を刺激して骨芽細胞に分化させるプロセスを指し、骨芽細胞は次いで新たな骨形成を開始する。化学的又は生物学的組成物は、原始細胞、未分化細胞及び多能性細胞を骨形成細胞系統へと刺激し得る場合、「骨誘導性」であると言うことができる。
【００２０】
本明細書で使用される「骨形成」は、骨芽細胞、並びに骨細胞前駆細胞、幹細胞、及び成熟骨芽細胞へと分化することが可能な他の細胞タイプが、骨移植片インプラント部位にて新たな骨成長に寄与する場合に起こる。細胞又は細胞集団は、成熟骨芽細胞に分化することが可能な場合、「骨形成性」であると言うことができる。
【００２１】
本明細書で使用される「小分子」は、天然に存在するもの、及び人工的に合成されたものの両方を含む、比較的低分子量（即ち、約８００ダルトン未満）を有する有機分子を指す。本明細書で使用されるとき、この用語は、天然及び組換えベースの両方のヒト成長因子又はモルフォゲン、例えば、骨形成タンパク質などの約８００ダルトンを超える天然又は合成タンパク質を含まない。
【００２２】
本明細書で使用される「ＥＣ５０」は、ある特定の暴露時間後の、ベースラインと最大値との間の半分の治療的応答を誘導する組成物の濃度である用語、有効濃度（ＥＣ５０）を指す。したがって、段階的（graded）用量応答曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。
【００２３】
本明細書で使用される「ＣＣ５０」は、特定の暴露時間後の、ベースラインとある最大値との間の半分の細胞毒性応答を誘導する化合物の濃度である用語、細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を指す。
【００２４】
本明細書で使用される「治療指数」（治療可能比としても既知）は、細胞毒性の害を生じる量に対する治療効果をもたらす組成物の量の比較である。定量的には、ＣＣ５０をＥＣ５０で除算することによって与えられる比である。より大きい治療指数がより小さい治療指数よりも好ましい。そのような組成物が細胞毒性閾値に到達するには、治療的効果を引き出す用量よりも遙かに高い用量が必要であろう。
【００２５】
本明細書で使用される「賦形剤」は、活性剤、例えば、骨誘導性小分子と組み合わせて使用されて、活性剤の調製、哺乳類宿主における活性剤の投与、送達、吸着又は吸収を補助又は促進する、薬理学的に好適な不活性物質（類）を指す。
【００２６】
本開示は、骨伝導性スカフォールド及び骨誘導性小分子を含み、また高分子バインダーを有する骨伝導性スカフォールドも含み得る、骨成長を促進するためのインプラントに関する。インプラントは更に、骨形成性材料を含むことができる。本開示はまた、インプラントの形成方法、並びにインプラントの治療的処置及び使用に関する。最後に、本開示は、骨誘導性小分子、骨伝導性スカフォールドを収容する第１の容器、及び骨形成性材料を収容する第２の容器を備え、第２の容器が、骨形成性材料を第１の容器内へ移動するように適合されている、インプラントを形成するためのシステムに関する。
【００２７】
本開示による骨伝導性スカフォールドは、自己骨、同種骨、及びセラミック骨代用材を含んでもよい。自己骨は、腸骨稜などの骨から回収されてもよい。自己骨は、患者自身の身体を起源とするため、拒絶の危険性がより低い。また、自己骨は、骨伝導性特性に加えて、骨誘導性及び骨形成特性も提供することができる。高い中実（solid）骨含有量を有する自己骨スカフォールドは、より低い中実骨含有量を有する自己骨よりも高い骨伝導性の可能性を有する。同種骨スカフォールドは、自己スカフォールドと同一の骨伝導性特性を提供する。同種スカフォールドは、屍体サンプル、例えば、組織バンクから得ることができる。
【００２８】
一実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドは、セラミック骨代用材を含む。セラミック骨代用材は、多孔質又は非多孔質であってもよい。用語「多孔質」には、マクロ多孔質（平均孔径が１００ｕｍ以上）、メソ多孔質（平均孔径が１００ｕｍ未満であるが、１０ｕｍ以上）及びマイクロ多孔質（平均孔径が１０ｕｍ未満）が含まれるが、これらに限定されない。孔は、任意のサイズ、形状若しくは分布を有してもよく、又は所定の許容範囲内にあってもよい。加えて、孔は、相互接続していても、又は相互接続していなくてもよい。一実施形態において、孔の直径は約７５０ｕｍまでの範囲のサイズであってもよい。別の実施形態では、孔サイズは、約５００ｕｍまでの範囲であり、孔のおよそ７５％は、少なくとも１００ｕｍのサイズであり、孔の残りの２５％は、１０ｕｍ以下のサイズである。
【００２９】
一実施形態において、セラミック骨代用材は、リン酸カルシウム系化合物を含む。リン酸カルシウム類の好適な例としては、非晶質リン酸カルシウム、結晶性リン酸カルシウム、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、リン酸カルシウム化合物は、アパタイトであってもよい。アパタイトは、通常、ヒドロキシアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、フルオロアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（Ｆ）２、クロロアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（Ｃｌ）２及びブロモアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（Ｂｒ）２と称されるリン酸カルシウム無機質の群であり、更にシリケート（ＳｉＯ４４−）及びカーボネート（ＣＯ３２−）置換ヒドロキシアパタイトの両方を含むことができ、置換は、ヒドロキシ及び／又はホスフェート基の１つ以上にて行われる。別の実施形態では、セラミック骨代用材は、β−リン酸三カルシウムＣａ３（ＰＯ４）２、（ｂ−ＴＣＰ）を含む。
【００３０】
骨伝導性スカフォールドは、修復される特定の骨欠損に所望される任意の形状を有してもよい。一実施形態によれば、スカフォールドは、多孔質又は非多孔質のいずれかであってもよいモノリシックな組成物である。好適な形状としては、例えば、球形、立方形、くさび形、楕円形、円筒形、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。別の実施形態では、骨伝導性スカフォールドは、複数の多孔質顆粒又は非多孔質顆粒であってもよい。骨伝導性スカフォールドの比表面積は、様々であってもよい。例えば、スカフォールドが多孔質顆粒の場合、比表面積は、約０．１ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの範囲であってもよい。
【００３１】
骨伝導性スカフォールドは、任意のサイズ又は形状を有するセラミック骨代用材の粒子又は顆粒であってもよい。顆粒は、カルシウム化合物を所望の粒子サイズ又は粒径に研磨し又は挽くことにより得ることができる。一実施形態において、顆粒の平均直径は、約０．０５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲のサイズである。別の実施形態では、顆粒の平均粒径は、約０．０７５ｍｍ〜約５ｍｍの範囲のサイズである。別の実施形態では、顆粒の平均粒径は、約０．０７５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲のサイズである。別の実施形態では、顆粒の平均粒径は、約１．４ｍｍ〜約２．８ｍｍの範囲のサイズである。別の実施形態では、顆粒の平均粒径は、約２．８ｍｍ〜約５．６ｍｍの範囲のサイズである。別の実施形態では、顆粒の平均粒径は、約０．１ｍｍ〜約０．７５０ｍｍの範囲のサイズである。
【００３２】
本開示の別の実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドは更に、インプラントが、修復される骨の範囲に適合するように、所望通りに成形できる、例えば、成形可能な又は柔軟なインプラントに形成され得るように、高分子バインダーと組み合わされてもよい。
【００３３】
高分子バインダーは、ホモポリマー類及びコポリマー類（即ち、２種以上の異なるモノマー単位を含むポリマー類）などのポリマー類、並びにポリマーとコポリマーとのブレンド、混合物及び組み合わせを含んでもよい。ポリマーは、吸収性ポリマー、非吸収性ポリマー、又はこれらの組み合わせであってもよい。一実施形態において、高分子バインダーは吸収性ポリマーを含み、この高分子バインダーは、実質的に非吸収性ポリマーを含まない。一実施形態によれば、高分子バインダーは、インビボで吸収性であり、吸収性ポリマーを含む。高分子バインダーのポリマー（類）はまた、合成ポリマー、非合成ポリマー（即ち、植物又は動物から得られたポリマー）、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００３４】
ポリマーのバインダーの調製に有用な好適なポリマー類としては、Ｌ−ラクチド；Ｌ−乳酸；Ｄ−ラクチド；Ｄ−乳酸；グリコリド；α−ヒドロキシ酪酸；α−ヒドロキシ吉草酸；α−ヒドロキシ酢酸；α−ヒドロキシカプロン酸；α−ヒドロキシヘプタン酸；α−ヒドロキシデカン酸；α−ヒドロキシミリスチン酸；α−ヒドロキシオクタン酸；α−ヒドロキシステアリン酸；ヒドロキシブチレート；ヒドロキシバレレ−ト；β−プロピオラクチド；β−プロピオ乳酸；γ−カプロラクトン；β−カプロラクトン；ε−カプロラクトン；γ−ブチロラクトン；ピバロラクトン；テトラメチルグリコリド；テトラメチルグリコール酸；ジメチルグリコール酸；炭酸トリメチレン；ジオキサノン；液晶ポリマー類を形成するモノマー類；セルロースを形成するモノマー類；酢酸セルロースを形成するモノマー類；カルボキシメチルセルロースを形成するモノマー類；ヒドロキシプロピルメチル−セルロースを形成するモノマー類から選択されるモノマー類のホモポリマー類又はコポリマー類；ポリカプロラクトン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンアジペート）、ポリ（ブチレンオキシド）、及びこれらの混合物から選択されるマクロジオール類と、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、シクロヘキサンジイソシアネート、水素化メチレンジフェニレンジイソシアネート、及びこれらの混合物から選択されるイソシアネート官能化合物類を含むポリウレタン前駆体、並びにエチレンジアミン、１，４−ブタンジオール、１，２−ブタンジオール、２−アミノ−１−ブタノール、チオジエチレンジオール、２−メルカプトエチルエーテル、３−ヘキシン−２，５−ジオール、クエン酸、及びこれらの混合物から選択される鎖延長剤類、並びに前述の２つ以上の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
一実施形態において、高分子バインダーは、吸収性ポリマー類を含む。吸収性ポリマー類の好適な例としては、例えば、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド、グリコリド、ラクトン、ラクタム、ε−カプロラクトン、炭酸トリメチレン、環状カーボネート、環状エーテル、パラ−ジオキサノン、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、単糖類から選択されるモノマー類から誘導されるポリマー類、コラーゲン、フィブリン、アルブミン、及び前述の２つ以上の任意の組み合わせが挙げられる。
【００３６】
別の実施形態では、高分子バインダーは、吸収性合成ポリマーを含む。吸収性合成ポリマー類の非限定的な例としては、例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）（コ）ポリマー、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（コ）ポリマー、ポリグリコリド（コ）ポリマー、ポリカプロラクトン（コ）ポリマー、ポリ（テトラメチルグリコール酸）（コ）ポリマー、ポリジオキサノン（コ）ポリマー、ポリヒドロキシブチレート（コ）ポリマー、ポリヒドロキシバレレ−ト（コ）ポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（テトラメチルグリコール酸−コ−ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン−コ−Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）コポリマー、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）コポリマー、ポリ（ヒドロキシブチレート−コ−ヒドロキシバレレート）コポリマー、液晶（コ）ポリマー、これらの組み合わせ、又はこれらのコポリマーが挙げられる。
【００３７】
本開示の実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドがアパタイト又はｂ−ＴＣＰなどのセラミック骨代用材である場合、高分子バインダー用の好適なポリマー類は、例えば、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、セルロース系ポリマー類、ポリラクトン類、及びコラーゲン系ポリマー類、並びにこれらのブレンド及びコポリマー類を含んでもよい。別の実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０００３２５５号に記載されているような、ポリ−εカプロラクトンと組み合わせた複数の多孔質ｂ−ＴＣＰ顆粒を含む成形可能なインプラントである。本開示の更なる実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０００８５０４号に記載されているような、多孔質ｂ−ＴＣＰ顆粒の層と、吸収性ポリマーの層（１つ又は複数）と、を含む柔軟な細長片である。更なる別の実施形態によれば、骨伝導性スカフォールドは、コラーゲンと組み合わせた複数の多孔質ｂ−ＴＣＰ顆粒を含む成形可能なインプラントであり、インプラントは、剛性形態に凍結乾燥された後、流体によって成形可能な形態に再構成される。
【００３８】
高分子バインダーが吸収性ポリマー類を含む場合、それらを含む骨伝導性スカフォールドは、約１ヶ月〜約２．５年間、例えば、約２ヶ月〜約２年間の、インビボ又はインビトロでの完全な再吸収を有する傾向がある。
【００３９】
前述したように、インプラントは骨誘導性小分子を含む。骨誘導性小分子は、コルチコステロイド類、オキシステロール類、ＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、及び細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類を含む組成物を含んでもよい。骨誘導性小分子の好適な例を、下記の表１に提供する。一実施形態によれば、骨誘導性小分子の好適な例としては、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾールなどのコルチコステロイド類、並びにこれらのブレンド及び混合物が挙げられる。
【００４０】
骨誘導性小分子は更に、所望により賦形剤又は賦形剤類と組み合わされてもよい。薬学的に許容し得る賦形剤類は当該技術分野において既知であり、例えば、溶媒及び希釈剤類（例えば、アルコール類、プロピレングリコール、ジメチルアセトアミド、ＤＭＳＯ、ジメチルイソソルビド、メチルピロリドン）、可溶化剤類（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｓ（Ｒ））、抗酸化剤類（例えば、トコフェロール（ビタミンＥ）、アスコルビン酸、メチルパラベン、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、及び没食子酸プロピル）、界面活性剤類及び乳化剤類（例えば、ポリソルベート類（トゥイーン２０（TWEEN 20）、トゥイーン４０（TWEEN 40）、トゥイーン８０（TWEEN 80））、プルロニック類、ラブラゾール）、脂質類（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、充填剤類（例えば、マニトール、ポリビニルピロリドン）、有機酸類（例えば、クエン酸、乳酸、安息香酸）、親水性ポリマー類（例えば、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００）、錯化剤類（例えば、ナイアシンアミド、ニコチン酸、クレアチン、シクロデキストリン類）、並びに保存剤類（例えば、ベンジルアルコール）が挙げられる。一実施形態によれば、賦形剤は、カプチゾール（Captisol）（登録商標）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）（登録商標）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）（登録商標）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）（登録商標）、トゥイーン２０（Tween 20）（登録商標）、トゥイーン８０（Tween 80）（登録商標）、並びにこれらの混合物及び誘導体から選択されてもよい。
【００４１】
本開示による骨誘導性小分子は、手術前に、及び手術中に、スカフォールドと組み合わされてもよい。骨誘導性小分子が手術前に組み合わされる場合、小分子は、製造プロセスの一部としてスカフォールドと組み合わされてもよく、小分子は緩衝溶液中でスカフォールドに適用された後、凍結乾燥又は風乾され得る。小分子はまた、噴霧乾燥又は他のコーティング方法で適用されてもよい。次いで、インプラントを包装及び滅菌してもよい。骨誘導性小分子が手術中にスカフォールドと組み合わされる場合、骨誘導性小分子を含む緩衝溶液にスカフォールドを浸漬、又は溶液でスカフォールドをコーティングした後、修復される骨部位にスカフォールドを適用してもよい。
【００４２】
本開示の別の実施形態によれば、インプラントは更に骨形成性材料を含んで、骨修復部位に生存可能な細胞集団を提供することができる。骨形成性材料は、自己供給源と、屍体供給源又は組織バンクなどの同種供給源との両方から得ることができる。好適な骨形成性材料としては、例えば、幹細胞、多分化能細胞、多能性細胞、骨細胞前駆細胞、前骨芽細胞（pre-osteoblast）、成熟骨芽細胞、並びにこれらのブレンド及び混合物などの生存可能な細胞供給源を挙げることができる。一実施形態によれば、骨形成性材料は、自己及び／又は同種ヒト骨髄から得られ、別の実施形態によれば、骨形成性材料は、自己及び／又は同種ヒト脂肪吸引物から得られる。骨髄及び脂肪吸引物の両方は、例えば、濾過、分離及び／又は濃縮によって、所望の細胞集団を強化するよう処理されてもよい。骨形成性材料の細胞集団の生存能を保存するために、骨形成性材料は、典型的には、移植手技の時又はその付近にて、骨伝導性スカフォールド及び骨誘導性材料と組み合わされる。
【００４３】
図１０〜１２を参照すると、インプラント３０を形成するためのシステム２０は、開口部４８を有する第１の無菌容器４０内に収容されている骨伝導性スカフォールド４５と、開口部５８を有する第２の無菌容器５０内に収容されている骨形成性材料５５と、を備える。第２の容器開口部５８は、第１の容器開口部４８と接続されるように適合されおり、それにより骨形成性材料５５は、第１の開口部４８と第２の開口部５８との接続部を介して、第２の容器５０から第１の容器４０に移動することができる。システム２０は、第１の容器４０内に存在してもよく、かつ前述した方法で既にスカフォールド４５に組み込まれていてもよい骨誘導性小分子を含む。骨誘導性小分子はまた、骨形成性材料５５と共に第２の容器５０内に含まれてもよい。骨誘導性小分子はまた、骨形成性材料５５が第１の容器４５に移動し、スカフォールド４５に組み込まれた後に、スカフォールド４５と組み合わされてもよい。骨誘導性小分子はまた、開口部を有する第３の容器（図示せず）内に収容されてもよく、開口部は、骨誘導性小分子が第３の容器から第１の容器内へ移動し、スカフォールドと組み合わされ得るように、第１の容器開口部と接続するように適合されている。
【００４４】
スカフォールド４５は高分子バインダーを更に含んでもよく、高分子バインダーは、選択された所望のポリマー又はポリマー類に応じて、インプラント３０に成形性及び／又は柔軟性を与える。表面上に吸着された乾燥骨誘導性小分子と、自己骨髄吸引物の骨形成性材料５５と、を有する、ｂ−ＴＣＰ多孔質顆粒及びコラーゲンポリマーからなるスカフォールド４５を含む、システム２０から形成された成形可能なインプラント３０を図１２に示す。代替的に、骨誘導性小分子は、骨形成性材料５５をスカフォールド４５に移動する前又は後のいずれかにおいて手術中にスカフォールド４５と組み合わされてもよい。インプラント３０は、骨形成性材料５５をスカフォールド４５に注入した後に成形可能である。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
インビトロでの候補スクリーニング及び暴露プロファイルの分析：
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイにより、コルチコステロイド類、グルココルチコイド類、オキシステロール類、ＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、及び細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類を含む小分子化合物の数種のクラスからのサンプルを、一次ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）における骨誘導可能性に関してスクリーニングした。サンプル化合物を、ＤＮＡを使用して、多ウェルフォーマットにおいて一定の用量範囲にわたってスクリーニングし、ＡＬＰ応答を細胞数の関数として正規化した。これらの用量応答曲線により、化合物間の骨形成応答の相対抗力を測定するためのＥＣ５０の決定が可能となった。図１は、試験したコルチコステロイド化合物のうちの２つ、プロピオン酸クロベタゾール及びデキサメタゾンに関する代表的な用量応答曲線である。機能的分析に加えて、同定された所定の化合物をインビトロでのＬ９２９細胞毒性アッセイにかけてＣＣ５０を決定した。それ故、化合物は、最初にそれらの抗力に関して評価され、続いて下記の表１に示す毒性に関して評価された。
【表１】
2014506522.tif 000003
【００４６】
（実施例２）
相対抗力：
この技術の一部は、骨伝導性スカフォールドを骨誘導性小分子化合物でコーティングすることにより、スカフォールドが移植された際に化合物を局所的に送達することを含み得る。その結果、化合物がその部位に留まって骨形成結果に影響を与えるのに必要な最適時間及び濃度が決定された。当初、６日間にわたって暴露を確認することにより抗力を決定した。最適暴露プロファイルをより深く理解するために、ＭＳＣｓを、一連の用量範囲にわたって、１時間から開始して４日間の暴露時間処理し、その後、化合物処理培地を除去し、基本培地条件下で、アッセイ完了まで細胞を継続させた。これにより、短い暴露期間にわたる化合物の相対抗力を決定することができ、所望の骨形成結果を達成するのに必要であろう放出必要条件の指標を与えた。
【００４７】
下記の表２は、特定の時間枠１時間、４時間、２４時間、及び７２時間にわたって試験された、選択された化合物の相対抗力結果と、選択化合物がＡＬＰアッセイコントロール（１０ｎＭのデキサメタゾンの６日間）の完全応答に到達する時間範囲を列挙する。図２は、表２に示した結果に基づく、コルチコステロイド、プロピオン酸フルチカゾンの代表的な相対抗力である。
【表２】
2014506522.tif 000004
ＮＣ：計算せず
−−：測定せず
【００４８】
（実施例３）
インビトロでの放出動力学
表１で同定した選択された小分子化合物に関して、コーティング溶液（エタノール）中と水性放出培地中での溶解度を決定した。小分子化合物をエタノールに溶解し、その最大エタノール溶解度においてスカフォールドに添加し、風乾させた。スカフォールドＩは、柔軟な細長片の形態の多孔質ｂ−ＴＣＰ顆粒及び吸収性ポリ（ラクチド−コ−ｅ−カプロラクトン）から形成されていた（ＣｈｒｏｎＯＳ  Ｓｔｒｉｐ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．：０７．８０１．１００．９９Ｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓ  Ｓｐｉｎｅ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から市販）。スカフォールドＩＩは、堅い塊に凍結乾燥された多孔質ｂ−ＴＣＰ顆粒及びコラーゲンポリマーから形成されていた。小分子化合物でコーティングされたスカフォールドを、小分子の全部が放出された場合でも、分子の濃度が分子の溶解度を下回る条件（シンク条件）下で、細胞培養培地中に配置し、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を介して、又は放射標識含有量を測定することにより、小分子化合物放出を監視した。この分析は、ある時間にわたるスカフォールドからの小分子化合物の累積パーセント放出を提供することができた。図３Ａ〜３Ｃは、ＬＣ／ＭＳを用いて測定した、それぞれ小分子プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、及びプロピオン酸フルチカゾンに関するスカフォールドＩからのインビトロでの時間放出プロファイルのグラフ図である。図４は、放射標識含有量を用いて測定した、小分子プロピオン酸クロベタゾールに関するスカフォールドＩＩからのインビトロでの時間放出プロファイルのグラフ図である。
【００４９】
（実施例４）
バイオアッセイ
必要な暴露プロファイルと、対応する放出動力学を同定した後、これら２つのデータセットを分析し、組み合わせて、スカフォールドＩから直接放出された選択小分子化合物の時間−濃度プロファイルが、同一の小分子化合物の溶液中での場合と同一の骨誘導性結果を、骨形成性材料（ＭＳＣｓ）中で引き出す可能性を有するか否かを測定した。前述の暴露及び放出プロファイルデータに基づいて、コーティング濃度を決定した。図５は、前述のデータセットから決定した、スカフォールドＩからの放出小分子化合物の理論濃度暴露のグラフ図である。選択小分子化合物をスカフォールドＩ上にコーティングし、細胞培養培地中に放出させた。図５に特定した選択時点のそれぞれにおいて、培地を除去し、新鮮な培地で置き換えた。除去した培地を培養物中のＭＳＣｓに移動し、ＭＳＣｓを次の時点までその培地に暴露し、その時点でＭＳＣｓから培地を除去し、その時点でスカフォールドＩから培地を除去して、このプロセスを繰り返した。全６日間の試験後、ＭＳＣをＡＬＰアッセイにより分析した。この実験からの結果は、試験した小分子化合物の全部がスカフォールド上に吸着され、スカフォールドから放出されたこと、小分子化合物が骨誘導性であったこと、及び小分子化合物が、骨形成応答を引き出すのに十分な濃度プロファイルで放出されたこと（小分子化合物が接触したＭＳＣ細胞集団により示された）を示した。図６は、試験した各小分子化合物が、基本レベルよりも高い骨形成性応答を引き出したことを示す、ＡＬＰアッセイ結果のグラフ図である。
【００５０】
（実施例５）
インビトロでの３−Ｄ有効性
選択小分子化合物の骨誘導可能性を、ＭＳＣｓを３次元ｂ−ＴＣＰポリマー複合材料スカフォールド、スカフォールドＩ上に播種することによりインビトロで決定し、スカフォールドＩは、播種前に選択化合物でコーティングされていた。これらの細胞をある期間培養した後、骨形成分化の初期マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）ＲＮＡ含有量に関して細胞をアッセイした。図７は、基本条件（標準的な培養条件）に対する倍増加（fold increase）として表された、ＭＳＣｓ中でのＡＬＰ  ＲＮＡ発現の量を示すグラフ図である。この実施例では、デキサメタゾン（アッセイのコントロール）は溶液の培養培地に加えられた一方、他の全ての場合では、化合物はスカフォールドＩ上に予めコーティングされ、その後ＭＳＣｓを加えられた。次いで、細胞を３日間培養し、ＡＬＰ  ＲＮＡ発現を介して、それらの骨形成応答のレベルをアッセイした。フルチカゾン、クロベタゾール及びハルシノニドは全て、ＭＳＣｓの骨形成性分化を有意に上方調節した。
【００５１】
（実施例６）
インビボでの放出分析論
インビトロでの状況と比較して、インビボでの環境はより複雑であり、炎症性応答、限定された血液供給、及び一過性の細胞集団を含む場合がある。その結果、インビトロでのデータのインビボでの環境に対する適合可能性を検証することが重要である。これを行うために、スカフォールドＩを２つの化合物、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール及び３Ｈ−プロピオン酸クロベタゾール（放射標識した）で別々にコーティングし、ウサギ橈骨欠損モデル内に移植した。移植から１、４、及び２４時間後、周囲の筋組織及びスカフォールドを別々に外植し、薬物含有量に関してアッセイした。図８は、以前測定したインビトロでの放出プロファイルと共にプロットしたプロピオン酸クロベタゾールのインビボでの放出プロファイルのグラフ図である。
【００５２】
（実施例７）
インビボでの試験
２つの小分子化合物、デキサメタゾン及び２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの評価をウサギ橈骨欠損モデルにて行った。スカフォールドＩを手術中に化合物でコーティングし、自己骨髄と組み合わせ、１５ｍｍ橈骨欠損内に移植した。手術から３及び６週間後にＸ線写真を撮り、その後、動物を犠牲にし、外植片をマイクロＣＴにより分析した。手術から３週間後、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールのＸ線写真は向上された骨膜応答を有するように思われたが、６週間後では、サンプルのＸ線写真の間に統計的に有意な差異は存在しなかった。
【００５３】
（実施例８）
ミネラル化アッセイ
ＭＳＣｓ及び骨芽細胞中でのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の生成を試験することにより、クロベタゾールの分化誘導可能性を測定するアッセイを行った。凍結ＭＳＣｓ及び骨芽細胞（Ｌｏｎｚａ）を解凍し、８０％コンフルエンスまで増殖させた後、継代５〜７（ＭＳＣｓの場合）及び２〜１０（骨芽細胞）にて９６ウェルプレートにおよそ８０００細胞／ウェルで蒔き、一晩定着させた。プレート全部から培地を完全に吸引除去した。指定されたウェルを１５０ｕＬの以下のうちの１つで置き換えた。
基本−（ＭＳＣ／７．５ｍＭ  β−グリセロホスフェート（ＢＧＰ）＆アスコルビン酸）若しくは（骨芽細胞／７．５ｍＭ  ＢＧＰ）、
ミネラル化コントロール−（骨芽細胞／７．５ｍＭ  ＢＧＰ  ＆  ４００ｎＭヒドロコルチゾン）若しくは（ＭＳＣ／７．５ｍＭ  ＢＧＰ、１００ｎＭデキサメタゾン＆アスコルビン酸）、又は
クロベタゾール試験剤−（骨芽細胞／７．５ｍＭ  ＢＧＰ＋クロベタゾール）、若しくは（ＭＳＣ／７．５ｍＭ  ＢＧＰ、アスコルビン酸＋クロベタゾール）。
【００５４】
クロベタゾールは、以下の濃度で試験した：０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、及び１０ｎＭ。全ての培地は、１４日目に到達するまで３〜４日毎に置き換えた。
【００５５】
ＯｓｔｅｏＩｍａｇｅ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）及びＨｏｅｃｈｓｔ  Ｓｔａｉｎ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを用いて、処理後解析を行った。ＯｓｔｅｏＩｍａｇｅアッセイプロトコルを用いてＨＡデータを生成し、Ｈｏｅｃｈｓｔアッセイを用いてＤＮＡデータを生成した。ＨＡ／ＤＮＡ値はデータ解析から生成し、図９に示すようにグラフにプロットした。
【００５６】
（実施例９）
様々なｐＨレベルでの賦形剤試験
この実験の目標は、増大された用量を材料スカフォールドに添加できるように、化合物の溶解度を増大させることである。一組の実験において、一連の賦形剤を有するプロピオン酸クロベタゾール及びプロピオン酸フルチカゾンの溶解度を、３つの異なるｐＨレベルにて評価した。リン酸緩衝液をｐＨレベル３（低）、及び７（中）で調製し、Ｔｒｉｓ緩衝液をｐＨレベル９（高）で調製した。所定の賦形剤の存在下での化合物の溶解度を、賦形剤が存在しない化合物の溶解度に対する倍増加として、個々のｐＨレベルで測定した。プロピオン酸クロベタゾールと賦形剤との組み合わせの溶解度に関するデータを、下記の表３に示す。プロピオン酸フルチカゾンと賦形剤との組み合わせの溶解度に関するデータを、下記の表４に示す。
【表３】
2014506522.tif 000005
【表４】
2014506522.tif 000006
【００５７】
本開示をいくつかの実施形態に従って記載してきたが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、例えば、添付の特許請求の範囲に示されるような様々な変更、置換及び修正を本開示に為し得ることを理解するべきである。それ故、本開示の範囲は本開示に記載したプロセス、製造、及び物質の組成、方法及び工程の特定の実施形態に限定されるものではないことを認識するべきである。例えば、一実施形態による上述したような様々な特徴は、特に指摘されない限り、他の実施形態に組み込まれることができる。更に、当業者であれば本開示から直ちに認識されるように、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うか又は実質的に同じ結果を実現する既存の、又は将来的に開発されるプロセス、製造、物質の組成、方法、又は工程を本開示に基づいて利用することが可能である。
【００５８】
当業者であれば、添付の特許請求の広義の範囲から逸脱することなく本発明に様々な改変及び修正を行いうることは認識されるであろう。それらのいくつかについて上記に述べたが、他のものは当業者に明らかであろう。
【００５９】
〔実施の態様〕
（１）  骨成長を促進するためのインプラントであって、
骨伝導性スカフォールドと、
骨誘導性小分子と、を含み、
前記スカフォールドが、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記骨誘導性小分子が、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、インプラント。
（２）  骨形成性材料を更に含む、実施態様１に記載のインプラント。
（３）  前記骨形成性材料が、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物（autogenic lipoaspirate）、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群に由来する、実施態様２に記載のインプラント。
（４）  前記スカフォールドがセラミック骨代用材を含み、前記セラミック骨代用材が、アパタイト類及びリン酸三カルシウム類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるリン酸カルシウム系化合物である、実施態様１〜３のいずれかに記載のインプラント。
（５）  前記セラミック骨代用材が、平均顆粒径約０．５ｍｍ〜約４．０ｍｍ及び平均孔径約２０μｍ〜約５００μｍを有する複数の多孔質顆粒を含む、実施態様４に記載のインプラント。
【００６０】
（６）  前記スカフォールドが、高分子バインダーを更に含む、実施態様１〜５のいずれかに記載のインプラント。
（７）  前記高分子バインダーが、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリカプロラクトン類、コラーゲン、セルロース、及びコポリマー類、これらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、実施態様６に記載のインプラント。
（８）  前記骨誘導性小分子が、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン（fluoromethalone）、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるコルチコステロイドである、実施態様１〜７のいずれかに記載のインプラント。
（９）  前記骨誘導性小分子が賦形剤と組み合わされる、実施態様１〜８のいずれかに記載のインプラント。
（１０）  前記賦形剤が、カプチゾール（Captisol）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）、トゥイーン２０（Tween 20）、トゥイーン８０（Tween 80）、並びにこれらの混合物及び誘導体からなる群から選択される、実施態様９に記載のインプラント。
【００６１】
（１１）  骨成長を必要とする患者において前記骨成長を誘導する方法であって、実施態様１〜１０のいずれかに記載のインプラントを前記患者に植え込む工程を含む、方法。
（１２）  骨伝導性スカフォールドを骨誘導性小分子と組み合わせてインプラントを形成する工程を含む、骨成長を促進するインプラントの形成方法であって、
前記スカフォールドが、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記合成小分子が、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、方法。
（１３）  骨形成性材料を、前記骨伝導性スカフォールド、前記骨誘導性小分子、又はこれらの両方と組み合わせる工程を更に含み、
前記骨形成性材料が、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群に由来する、実施態様１２に記載の方法。
（１４）  前記骨誘導性小分子を賦形剤と組み合わせる工程を更に含む、実施態様１２又は１３に記載の方法。
（１５）  骨成長を促進するインプラントを形成するためのシステムであって、
第２の容器と接続するように適合された開口部を有する第１の無菌容器内に収容されている骨伝導性スカフォールドと、
骨誘導性小分子と、
骨形成性材料が前記第２の容器から前記第１の容器に移動できるように前記第１の容器と接続するように適合された開口部を有する第２の無菌容器内に収容されている前記骨形成性材料と、を備え、
前記スカフォールドが、自己移植片材料、同種移植片材料、セラミック骨代用材、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記骨誘導性小分子が、コルチコステロイド類、オキシステロール類、細胞内ｃＡＭＰを上方調節する化合物類、及びＨＭＧ  ｃｏＡ還元酵素経路に影響する化合物類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択され、
前記骨形成性材料が、自己骨髄吸引物、自己脂肪吸引物、同種骨髄吸引物、同種脂肪吸引物、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群に由来する、システム。
【００６２】
（１６）  前記骨誘導性小分子が前記第１の容器内に含まれる、実施態様１５に記載のシステム。
（１７）  前記骨誘導性小分子が前記第２の容器内に含まれる、実施態様１５に記載のシステム。
（１８）  前記骨誘導性小分子を収容し、かつ前記骨誘導性小分子が第３の容器から前記第１の容器に移動できるように、前記第１の容器と接続するように適合された開口部を有する前記第３の容器を更に備える、実施態様１５に記載のシステム。
（１９）  前記スカフォールドが、高分子バインダーを更に含むセラミック骨代用材である、実施態様１５〜１８のいずれかに記載のシステム。
（２０）  前記セラミック骨代用材が、アパタイト類及びリン酸三カルシウム類、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるリン酸カルシウム系化合物であり、
前記高分子バインダーが、ポリラクチド類、ポリグリコリド類、ポリカプロラクトン類、コラーゲン、セルロース、及びコポリマー類、これらのブレンド及び混合物からなる群から選択される、実施態様１９に記載のシステム。
【００６３】
（２１）  前記骨誘導性小分子が、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルオロメタロン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、並びにこれらのブレンド及び混合物からなる群から選択されるコルチコステロイドである、実施態様１５〜２０のいずれかに記載のシステム。
（２２）  前記骨誘導性小分子が賦形剤と組み合わされる、実施態様１５〜２１のいずれかに記載のシステム。
（２３）  前記賦形剤が、カプチゾール（Captisol）、クレモフォールＥＬ（Cremphor EL）、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、ラブラゾール（Labrasol）、ＮＭＰ、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＶＰ、ソルトールＨＳ  １５（Solutol HS 15）、トゥイーン２０（Tween 20）、トゥイーン８０（Tween 80）、並びにこれらの混合物及び誘導体からなる群から選択される、実施態様２２に記載のシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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