(57)【要約】  本発明は一般的に分子生物学および増殖因子制御の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌などの病理学的状態の治療のための療法に関する。
2014534949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、癌を有する患者を処置するための方法。
【請求項２】
有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる可能性が増加した癌患者を処置するための方法。
【請求項３】
癌患者に、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する感受性を増加および／または回復させるための方法。
【請求項４】
癌患者に、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト感受性の期間を延長するための方法。
【請求項５】
有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する患者を処置するための方法。
【請求項６】
有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する応答の持続期間を延長するための方法。
【請求項７】
有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、患者におけるＨＧＦ媒介性Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌の発生を遅延させるか、または防止するための方法。
【請求項８】
患者の癌が、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｂ−ｒａｆバイオマーカーがＢ−ｒａｆ  Ｖ６００である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂ−ｒａｆバイオマーカーがＢ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
患者の癌におけるＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現が、（ａ）試料に対して遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲハイブリダイゼーションアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、５’ヌクレアーゼアッセイ、突然変異検出アッセイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、またはＦＩＳＨのうちの１つまたは複数を実施すること、および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
患者の癌におけるＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現が、（ａ）患者癌試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを実施すること、および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者の癌が、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現することが示されている、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｃ−ｍｅｔバイオマーカーがポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現を決定することにより決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＧＦが腫瘍または腫瘍間質中で発現される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＧＦ発現が患者の血清中で決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストがアンタゴニスト抗ｃ−ｍｅｔ抗体である、請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストが、オナルツズマブ、クリゾチニブ、チバチニブ、カルボザンチニブ、ＭＧＣＤ−２６５、フィクラツズマブ、ヒト化ＴＡＫ−７０１、リロツムマブ、フォレチニブ、ｈ２２４Ｇ１１、ＤＮ−３０、ＭＫ−２４６１、Ｅ７０５０、ＭＫ−８０３３、ＰＦ−４２１７９０３、ＡＭＧ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＥＭＤ１２０４８３１、ＩＮＣ−２８０、ＬＹ−２８０１６５３、ＳＧＸ−１２６、ＲＰ１０４０、ＬＹ２８０１６５３、ＢＡＹ−８５３４７４および／またはＬＡ４８０のうちの１つまたは複数である、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストが、ソラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ−３６０３、ＧＳＫ２１１８４３６、ＧＤＣ−０８７９、Ｎ−（３−（５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル）−２，４−ジフルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミド、ベムラフェニブ、ＧＳＫ２１１８４３６、ＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ２８１、ＡＲＱ７３６、ＢＡＹ７３−４５０６のうちの１つまたは複数である、請求項１ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストがベムラフェニブである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストがＧＳＫ２１１８４３６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストが同時に投与される、請求項１ないし２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストが連続的に投与される、請求項１ないし２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストがｃ−ｍｅｔアンタゴニストの前に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストがＢ−ｒａｆアンタゴニストの前に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのさらなる処置を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１ないし２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
癌がメラノーマ、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌または甲状腺乳頭癌である、請求項１ないし２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
癌が、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００を発現することが示されたメラノーマである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
癌がＢ−ｒａｆアンタゴニストに耐性である、請求項１ないし３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
患者がＢ−ｒａｆアンタゴニストで以前に処置されていない、請求項１ないし３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するためのステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者が、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性を増加させるため、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性を回復させるため、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性の期間を延長するため、および／または患者の癌におけるＨＧＦ媒介性Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト耐性の発生を防止するための、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置の候補であることを示す、方法。
【請求項３４】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置の候補として患者を同定するための方法であって、（ａ）患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現すると決定すること；ならびに（ｂ）Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置の候補として患者を同定することを含む方法。
【請求項３５】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる危険性があるとして患者を同定するための方法であって、（ａ）患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現すると決定すること；および（ｂ）Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる危険性があるとして患者を同定することを含む方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）および（ｂ）の後に、患者が有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
患者における癌を処置するためのＢ−ｒａｆアンタゴニストの治療効果を決定する方法であって、前記患者から得られた試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーおよび／またはＢ−ｒａｆバイオマーカーの存在を免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＰＣＲ、５’ヌクレアーゼアッセイ、ＩＨＣ、および／またはＲＴ−ＰＣＲによって決定することと、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置のために患者を選択することとを含む方法。
【請求項３８】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置のために患者を選択することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いて患者を処置することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
メラノーマ患者の予後を決定する方法であって、患者に由来する試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定することを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーがＨＧＦであり、ＨＧＦの発現が対象における癌の予後である、方法。
【請求項４１】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを含むキット。
【請求項４２】
有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを患者に投与することを含む、メラノーマ患者を処置するための方法のための指示書をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
一緒に包装された、薬学的に許容される担体中のｃ−ｍｅｔアンタゴニストと、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストがＢ−ｒａｆバイオマーカーの発現に基づいてメラノーマを有する患者を処置するためのものであり、処置がＢ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わされることを示す添付文書とを含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１１年９月１９日に出願された米国特許出願第６１／５３６，４３６号、２０１１年１０月２５日に出願された米国特許出願第６１／５５１，３２８号、２０１２年２月１４日に出願された米国特許出願第６１／５９８，７８３号および２０１２年５月１日に出願された米国特許出願第６１／６４１，１３９号の優先権を主張し、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組込まれる。２０１２年８月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ４７３６１ＷＯ．ｔｘｔと命名され、１６，６６９バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、分子生物学および増殖因子制御の分野に一般的に関する。より具体的には、本発明は、癌などの病理学的状態の処置のための療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌は、依然としてヒトの健康に対して最も命取りとなる脅威の１つである。米国では、毎年約１３０万人の新しい患者が癌に罹り、癌は心疾患に次いで死因の第２位であり、４人の死亡のうちのおよそ１人を占める。例えば、乳癌は、２番目に最も一般的な形態の癌であり、米国人女性の間で癌による死亡の第２位である。また、癌は５年以内に死因の第１位として心血管疾患を上回るかもしれないと予測されている。固形腫瘍がこれらの死亡の多くを占める。特定の癌の医学的処置においては有意な進歩があったが、あらゆる癌の５年生存率は、過去２０年で約１０％しか改善していない。癌、または悪性腫瘍は転移し、制御されない様式で急速に増殖し、適時検出および処置を極端に困難にしている。
【０００５】
癌の処置における有意な進歩にも拘らず、改善された療法が依然として求められている。
【０００６】
特許出願および刊行物を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
癌患者を効率的に処置するためのｃ−ｍｅｔアンタゴニストの使用が提供される。本出願はまた、場合により、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わせたｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いた疾患の処置における使用のための疾患を診断するためのより良好な方法も提供する。特に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストであるベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２）およびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる組合せ処置が、ベムラフェニブ単独での処置と比較して、著しく改善された部分的応答を含む、腫瘍転帰の統計的に有意な改善をもたらしたことを示す結果が記載される。ｃ−ｍｅｔ発現は、ベムラフェニブ処置に対する感受性と逆相関していた。さらに、より高レベルの循環肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有するＢ−ｒａｆ突然変異メラノーマを有する患者は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで処置されたより低レベルの循環ＨＧＦレベルを有する患者と比較して、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで処置された場合に実質的に低下した無進行生存および全生存を示した。
【０００８】
本発明は、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストをＢ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わせることによって、顕著な抗腫瘍活性をもたらす、癌などの病理学的状態を処置するための組合せ療法を提供する。
【０００９】
一態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（組合せ）を投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる可能性が増加した癌患者を処置するための方法が提供される。
【００１０】
一態様において、癌患者に、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する感受性を増加および／または回復させるための方法が提供される。
【００１１】
一態様において、癌患者に、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト感受性の期間を延長するための方法が提供される。
【００１２】
一態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆ耐性（Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト耐性）癌を有する患者を処置するための方法が提供される。
【００１３】
一態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する応答の持続期間を延長するための方法が提供される。
【００１４】
一態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、ＨＧＦ媒介性Ｂ−ｒａｆ耐性癌の発症を遅延させるか、または防止するための方法が提供される。
【００１５】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するためのステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性があることを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はタンパク質発現であり、ＩＨＣを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。本明細書で用いられる「上昇した」または「高い」ｃ−ｍｅｔは、処置に対する患者の応答性と関連するｃ−ｍｅｔの量を指す。いくつかの実施形態においては、少量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が低いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。本明細書で用いられる場合、「少」量のｃ−ｍｅｔは、処置に対する応答の欠如と関連するｃ−ｍｅｔの量を指すか、またはいくつかの実施形態においては、処置に対する応答の悪化（例えば、処置なしの場合と比較して臨床利益が低下する）と関連するｃ−ｍｅｔの量を指す。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。
【００１６】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者がＢ−ｒａｆ耐性癌を発症する可能性が高いことを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はタンパク質発現であり、ＩＨＣを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストで処置される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。
【００１７】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者が、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性を増加させるため、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性を回復させるため、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性の期間を延長するため、および／または患者の癌におけるＨＧＦ媒介性Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト耐性の発生を防止するための、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置の候補であることを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はタンパク質発現であり、ＩＨＣを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストで処置される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。
【００１８】
一態様において、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示された癌を有する患者のための療法を選択するための方法であって、患者に由来する試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定すること、およびバイオマーカーの発現レベルに基づいて癌薬剤を選択することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、癌試料がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合にＢ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わせたｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置のために患者が選択される。いくつかの実施形態においては、患者は、治療上有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いて癌について処置される。いくつかの実施形態においては、癌試料が実質的に検出不可能なレベルのｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合にｃ−ｍｅｔアンタゴニスト以外の癌薬剤を用いる処置のために患者が選択される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。
【００１９】
一態様において、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現すると決定することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置の候補として患者を同定するための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。
【００２０】
一態様において、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現すると決定することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる危険性を有する患者を同定するための方法が提供される。
【００２１】
一態様において、患者における癌を処置するためのＢ−ｒａｆアンタゴニストの治療効果を決定する方法であって、前記患者から得られた試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーおよび／またはＢ−ｒａｆバイオマーカーの存在を免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＰＣＲ、５’ヌクレアーゼアッセイ、ＩＨＣ、および／またはＲＴ−ＰＣＲによって決定することを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーの存在が、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストが前記対象における癌を処置するのに治療上有効であることを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、Ｂ−ｒａｆ突然変異体である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、構成的に活性化されたＢ−ｒａｆである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ（ＧＴＧ＞ＡＡＧ）、Ｖ６００Ｒ（ＧＴＧ＞ＡＧＧ）、Ｖ６００Ｅ（ＧＴＧ＞ＧＡＡ）および／またはＶ６００Ｄ（ＧＴＧ＞ＧＡＴ）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）試料（患者癌試料など）に対して遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲもしくは対立遺伝子特異的ＰＣＲなど）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、またはＦＩＳＨのうちの１つまたは複数を実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸に対してＰＣＲを実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ発現は、対照細胞ペレットのｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定され、高いｃ−ｍｅｔ発現は、細胞系ＨＥＫ−２９３、Ａ５４９および細胞系Ｈ４４１と比較して決定された低い、中程度の、および強いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ発現は、対照細胞ペレットのｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定され、高いｃ−ｍｅｔ発現は、細胞系Ａ５４９および細胞系Ｈ４４１と比較して決定された中程度の、および強いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ発現は、低いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ発現は、対照細胞ペレットのｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定され、低いｃ−ｍｅｔ発現は、細胞系Ｈ１１���５および細胞系ＨＥＫ−２９３と比較して決定された全くないか、または低いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ発現は、対照細胞ペレットのｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定され、低いｃ−ｍｅｔ発現は、細胞系Ｈ１１５５と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は核酸発現であり、ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、またはＦＩＳＨを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、ホスホ−ＥＬＩＳＡを用いて決定される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、ホスホ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現を決定することにより（例えば、ＥＬＩＳＡを用いる）決定される。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は自己分泌である。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦは腫瘍または腫瘍間質中で発現される（例えば、ＩＨＣを用いて決定される）。いくつかの実施形態においては、発現は、患者の血清中で決定される（例えば、ＥＬＩＳＡを用いて決定される）。いくつかの実施形態においては、癌はメラノーマ、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、または甲状腺癌である。いくつかの実施形態においては、癌はメラノーマである。いくつかの実施形態においては、癌は甲状腺乳頭癌である。
【００２２】
一態様において、本発明は、メラノーマ患者の予後を決定するための方法であって、患者に由来する試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定することを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーがＨＧＦであり、ＨＧＦの発現が対象における癌の予後である、方法を提供する。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現の増加は、例えば、患者がＢ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ）で処置された場合の無進行生存の低下および／または全生存の低下の予後である。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて患者血清中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者血清中でのＨＧＦ発現は、中央ＨＧＦ発現レベル（集団における中央ＨＧＦ発現レベルなど）よりも上である。いくつかの実施形態においては、患者血清中でのＨＧＦ発現は、例えば、約３３０ｎｇ／ｍｌよりも上である。いくつかの実施形態においては、患者血清中でのＨＧＦ発現は、約３００ｎｇ／ｍｌ、３１０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌ、３３０ｎｇ／ｍｌ、３４０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３６０ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、３８０ｎｇ／ｍｌ、３９０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４２０ｎｇ／ｍｌ、４４０ｎｇ／ｍｌ、４６０ｎｇ／ｍｌ、４８０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ以上より上である。いくつかの実施形態においては、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置のために患者が選択される。いくつかの実施形態においては、患者は有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いて処置される。いくつかの実施形態においては、メラノーマは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００を発現する（発現することが示されている）。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている。Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、Ｂ−ｒａｆ突然変異体であってもよい。Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、構成的に活性化されたＢ−ｒａｆである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００である。Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅであってもよい。Ｂ−ｒａｆ突然変異体の非限定的例の一覧は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ（ＧＴＧ＞ＡＡＧ）、Ｖ６００Ｒ（ＧＴＧ＞ＡＧＧ）、Ｖ６００Ｅ（ＧＴＧ＞ＧＡＡ）および／またはＶ６００Ｄ（ＧＴＧ＞ＧＡＴ）である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリペプチドが検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体核酸が検出される。「Ｖ６００Ｅ」とは、Ｂ−ｒａｆのアミノ酸６００位でのグルタミンのバリンへの置換をもたらすヌクレオチド１７９９位でのＢＲＡＦ中の突然変異（Ｔ＞Ａ）を指す。「Ｖ６００Ｅ」は、以前の番号付け系（Ｋｕｍａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：３３６２〜３３６８頁、２００３）の下では「Ｖ５９９Ｅ」（１７９６Ｔ＞Ａ）としても知られる。
【００２４】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）試料（患者癌試料など）に対して遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲもしくは対立遺伝子特異的ＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ）、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、またはＦＩＳＨのうちの１つまたは複数を実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸に対してＲＴ−ＰＣＲを実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸に対してＰＣＲを実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、標的配列の１つの変異体とのみ相補的な少なくとも１つの内部選択的ヌクレオチドを有する、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドを、Ｂ−ｒａｆ標的配列の少なくとも１つの変異体にハイブリダイズさせること；（ｂ）核酸ポリメラーゼが、選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成する場合には優先的に前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることができるが、選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成しない場合には実質的にあまり伸長させることができない前記ポリメラーゼを用いて第２のオリゴヌクレオチドを伸長させること；ならびに（ｃ）伸長が、オリゴヌクレオチドが相補的選択的ヌクレオチドを有する標的配列の変異体の存在を示す、前記オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出することを含む方法を用いて検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ標的配列の１つまたは複数の変異体は、野生型Ｂ−ｒａｆおよびＶ６００Ｅ  Ｂ−ｒａｆである。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、患者の癌は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現することが示されている。ｃ−ｍｅｔバイオマーカーは、ｃ−ｍｅｔポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ、または例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ＩＨＣスコアは２である。いくつかの実施形態においては、ＩＨＣスコアは３である。いくつかの実施形態においては、ＩＨＣスコアは１である。いくつかの実施形態においては、ＩＨＣスコアは０である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、５０％以上の腫瘍細胞が中程度のｃ−ｍｅｔ染色強度、組み合わせた中程度の／高いｃ−ｍｅｔ染色強度または高いｃ−ｍｅｔ染色強度を有する。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、ホスホ−ＥＬＩＳＡを用いて決定される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はホスホ−ｍｅｔ発現であり、いくつかの実施形態においては、抗ホスホ−ｃ−ｍｅｔ抗体を用いて検出される。
【００２６】
ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、核酸発現であってもよい。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーは、ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲもしくは対立遺伝子特異的ＰＣＲなど）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、またはＦＩＳＨを用いて患者に由来する試料中で決定される。
【００２７】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現を決定することにより、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを決定することができる。かくして、いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーはＨＧＦ発現であり、ＨＧＦ発現は、例えば、血清中で（例えば、ＥＬＩＳＡを用いて）、またはＩＨＣにより（例えば、または腫瘍もしくは腫瘍間質）検出される。ＨＧＦ発現は自己分泌であってもよい。ＨＧＦは腫瘍間質中で発現されてもよい。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は、患者の血清中で決定される。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現レベルは、中央ＨＧＦ発現レベルより上である。いくつかの実施形態においては、中央ＨＧＦ発現レベルは、約３３０ｐｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態においては、血清中でのＨＧＦ発現は、中央ＨＧＦ発現レベルより高い。いくつかの実施形態においては、血清中でのＨＧＦ発現は、約３３０ｐｇ／ｍｌより高い。いくつかの実施形態においては、患者血清中でのＨＧＦ発現は、約３００ｎｇ／ｍｌ、３１０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌ、３３０ｎｇ／ｍｌ、３４０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３６０ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、３８０ｎｇ／ｍｌ、３９０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４２０ｎｇ／ｍｌ、４４０ｎｇ／ｍｌ、４６０ｎｇ／ｍｌ、４８０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ以上より上である。
【００２８】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、アンタゴニスト抗ｃ−ｍｅｔ抗体であってもよい。いくつかの実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列番号１に示される配列を含むＨＶＲ１−ＨＣ；（ｂ）配列番号２に示される配列を含むＨＶＲ２−ＨＣ；（ｃ）配列番号３に示される配列を含むＨＶＲ３−ＨＣ；（ｄ）配列番号４に示される配列を含むＨＶＲ１−ＬＣ；（ｅ）配列番号５に示される配列を含むＨＶＲ２−ＬＣ；および（ｆ）配列番号６に示される配列を含むＨＶＲ３−ＬＣを含む。いくつかの実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は一価であり、（ａ）配列番号１１に示される配列を含む、重鎖を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号１２に示される配列を含む、軽鎖を含む第２のポリペプチド；および配列番号１３に示される配列を含む、Ｆｃ配列を含む第３のポリペプチドを含み、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは複合体として存在し、単一の抗原結合アームを形成し、第１および第２のＦｃポリペプチドは複合体として存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。
【００２９】
いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、クリゾチニブ、チバチニブ、カルボザンチニブ、ＭＧＣＤ−２６５、フィクラツズマブ、ヒト化ＴＡＫ−７０１、リロツムマブ、フォレチニブ、ｈ２２４Ｇ１１、ＤＮ−３０、ＭＫ−２４６１、Ｅ７０５０、ＭＫ−８０３３、ＰＦ−４２１７９０３、ＡＭＧ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＥＭＤ１２０４８３１、ＩＮＣ−２８０、ＬＹ−２８０１６５３、ＳＧＸ−１２６、ＲＰ１０４０、ＬＹ２８０１６５３、ＢＡＹ−８５３４７４、ＧＤＣ−０７１２、および／またはＬＡ４８０のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、クリゾチニブである。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、チバチニブである。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストはＧＤＣ−０７１２である。
【００３０】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、ソラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ−３６０３、ＧＳＫ２１１８４３６、ＧＤＣ−０８７９、Ｎ−（３−（５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル）−２，４−ジフルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミド、ベムラフェニブ、ＧＳＫ２１１８４３６、ＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ２８１、ＡＲＱ７３６、ＢＡＹ７３−４５０６のうちの１つまたは複数である。さらなる実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストはベムラフェニブである。さらなる実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストはＧＳＫ２１１８４３６である。Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅに選択的であってもよい。
【００３１】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストとｃ−ｍｅｔアンタゴニストとを、同時に投与してもよい。Ｂ−ｒａｆアンタゴニストとｃ−ｍｅｔアンタゴニストとを、連続的に投与してもよい。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストを、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストの前に投与する。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストの前に投与する。
【００３２】
一態様において、少なくとも１つのさらなる処置（癌薬剤など）を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
【００３３】
癌はメラノーマ、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌または甲状腺乳頭癌であってもよい。他の癌は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態においては、癌はメラノーマである。いくつかの実施形態においては、癌はＢ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である。いくつかの実施形態においては、患者は以前にＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置されている。いくつかの実施形態においては、患者は以前にＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置されていない。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストに対して不応性である。
【００３４】
さらに、本発明は、標的聴衆に、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現に基づいて、およびいくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（例えば、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー）の発現にさらに基づいて、癌を有する患者を処置するための癌薬剤の使用を奨励することを含む、癌薬剤（例えば、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト）を宣伝する方法に関する。奨励は、利用可能な任意の手段によって行うことができる。いくつかの実施形態においては、奨励はｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（抗ｃ−ｍｅｔ抗体など）の商業的製剤に添付される添付文書による。奨励はまた、第２の薬剤の商業的製剤に添付される添付文書によってもよい（処置が、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストと第２の薬剤、例えば、ベムラフェニブなどのＢ−ｒａｆアンタゴニストとの組合せ療法である場合）。奨励は、医師またはヘルスケア提供者に対する文書または口頭での連絡によるものであってもよい。いくつかの実施形態においては、奨励は、添付文書がｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる療法、いくつかの実施形態においては、第２の薬剤、例えば、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト（ベムラフェニブなど）との組合せた療法を受けるための指示を提供する添付文書による。いくつかの実施形態においては、奨励を行った後、第２の薬剤（例えば、ベムラフェニブ）と共に、またはそれを用いずにｃ−ｍｅｔアンタゴニストで患者を処置する。いくつかの実施形態においては、奨励を行った後、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置と共に、またはそれを用いずに、第２の薬剤で患者を処置する。いくつかの実施形態においては、添付文書は、患者の癌試料が高いｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現した場合、患者を処置するためにｃ−ｍｅｔアンタゴニストが用いられるべきであることを示す。いくつかの実施形態においては、添付文書は、患者の癌試料が低いｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、患者を処置するためにｃ−ｍｅｔアンタゴニストが用いられるべきではないことを示す。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明は、例えば、患者の生存を増加させる、癌の再発の患者の危険性を低下させる、および／または患者の生存可能性を増加させるために、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を用いる処置、いくつかの実施形態においては、第２の薬剤（Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト、例えば、ベムラフェニブなど）を用いる処置を受ける指示を提供することにより、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する癌（メラノーマなど）を有する患者を指示する方法を特徴とする。いくつかの実施形態においては、処置は、メラノーマ患者に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト、例えば、ベムラフェニブと組み合わせて投与される抗ｃ−ｍｅｔ抗体（例えば、ＭｅｔＭＡｂ）を投与することを含む。いくつかの実施形態においては、方法は、少なくとも１つの化学療法剤を用いる処置を受ける指示を提供することをさらに含む。特定の実施形態においては、患者は、指示する方法により指示された通りに処置される。
【００３６】
本発明はまた、例えば、生存を増加させる、患者の癌の再発可能性を低下させる、および／または患者の生存可能性を増加させるために、ヒト患者の癌が高い（上昇した）ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を発現した前記患者における癌（例えば、メラノーマ）の処置のためにｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を市販することを含む、ビジネス方法も提供する。いくつかの実施形態においては、処置は、癌患者に、抗ｃ−ｍｅｔ抗体（例えば、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂ））、いくつかの実施形態においては、第２の薬剤（例えば、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト、例えば、ベムラフェニブ）を投与することを含む。
【００３７】
一態様において、本発明は、癌（例えば、メラノーマ）患者に由来する試料中でのｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定するための１つまたは複数の試薬を含む診断キットを提供する。診断キットは、本明細書に記載の方法のいずれかと共に使用するのに好適である。いくつかの実施形態においては、キットは、メラノーマ患者を処置するためのｃ−ｍｅｔ薬剤を選択するためのキットを使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態においては、処置は、癌患者に、抗ｃ−ｍｅｔ抗体（例えば、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂ））、いくつかの実施形態においては、第２の薬剤（例えば、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト、例えば、ベムラフェニブ）を投与することを含む。
【００３８】
本発明はまた、一緒に包装された、薬学的に許容される担体中のｃ−ｍｅｔアンタゴニストと、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストが、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現に基づいて癌を有する患者を処置するためのものであることを示す添付文書とを含む製品にも関する。処置方法は、本明細書に開示される任意の処置方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】ＲＴＫリガンドが、癌遺伝子依存的癌細胞系におけるキナーゼ阻害を弱めたことを示す図である。ＲＴＫリガンドマトリックススクリーニングからの結果を示す図である。キナーゼ依存的癌細胞系を、ＲＴＫリガンド（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、増加する濃度範囲の適切なキナーゼ阻害剤で処理した。
【図１Ｂ】ＲＴＫリガンドが、癌遺伝子依存的癌細胞系におけるキナーゼ阻害を弱めたことを示す図である。有効なキナーゼ阻害剤および６つの個々のＲＴＫリガンドのそれぞれで同時処理された４１種のキナーゼ依存的癌細胞系からのマトリックススクリーニング結果の概要である。ＮＲはレスキューなしを示し、Ｐは部分的レスキューを示し、Ｒは完全なレスキューを示す。
【図１Ｃ】ＲＴＫリガンドが、癌遺伝子依存的癌細胞系におけるキナーゼ阻害を弱めたことを示す図である。薬剤処理された癌細胞系に対するＲＴＫリガンド効果の多様性を示す細胞生存能力アッセイである（７２ｈ）。細胞を、示された５０ｎｇ／ｍＬのＲＴＫリガンドで同時処理したところ、３つの異なる結果が観察された−レスキューなし、部分的レスキューまたは完全なレスキュー。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図２Ａ】プロ生存経路再活性化がＲＴＫリガンドレスキューと相関していたことを示す図である。キナーゼ阻害（１μＭ、２ｈ）後のＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化に対する急性ＲＴＫリガンド処理（５０ｎｇ／ｍＬ）の効果を示す免疫ブロットである。ＲＴＫリガンドレスキューが示され、初回スクリーニングにより決定されたように（図１ｂ）、灰色の四角は完全なレスキューを示し、黒色の四角は部分的レスキューを示す。
【図２Ｂ】プロ生存経路再活性化がＲＴＫリガンドレスキューと相関していたことを示す図である。薬剤処理（７２ｈ）後の３つのキナーゼ依存的癌細胞系における細胞増殖の抑制を示す細胞生存能力アッセイである。細胞を、示されたように適切な二次キナーゼ阻害剤（０．５μＭ）の存在下で、５０ｎｇ／ｍＬのＲＴＫリガンドで同時処理した。ＰＤ：ＰＤ１７３０７４、Ｌａｐ：ラパチニブ、Ｃｒｉｚ：クリゾチニブ。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図２Ｃ】プロ生存経路再活性化がＲＴＫリガンドレスキューと相関していたことを示す図である。ＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化に対する、ＲＴＫリガンド（５０ｎｇ／ｍＬ、２ｈ）の存在下および非存在下での急性キナーゼ阻害（１μＭ）の効果を示す免疫ブロットである。細胞を、必要に応じて二次キナーゼ阻害剤（０．５μＭ）で同時処理した。Ｓｕｎ：スニチニブ、ＰＤ：ＰＤ１７３０７４、ＰＬＸ：ＰＬＸ４０３２、Ｌａｐ：ラパチニブ、Ｅｒｌ：エルロチニブ、Ｃｒｉｚ：クリゾチニブ。
【図３Ａ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。示されたように、ラパチニブ（Ｌａｐ、１μＭ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびクリゾチニブ（Ｃｒｉｚ、０．５μＭ）で処理した後のＡＵ５６５  ＨＥＲ２増幅乳癌細胞におけるアポトーシス（ＰＡＰＲの切断）の抑制を示す免疫ブロットである。
【図３Ｂ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。ＨＥＲ２増幅乳癌細胞系のパネルにおけるｐＭＥＴおよびＭＥＴ発現を示す免疫ブロットである。ＨＧＦレスキューが示され、初回スクリーニング（図１ｂ）により決定されたように、黒色の四角は部分的レスキューを示す。
【図３Ｃ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。示されたように、ラパチニブ（Ｌａｐ、１μＭ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはクリゾチニブ（Ｃｒｉｚ、０．５μＭ）のいずれかで処理されたＡＵ５６５  ＨＥＲ２増幅乳癌細胞のＳｙｔｏ６０染色である。細胞を示された時間、３日毎に処理した。画像は、３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図３Ｄ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。２つのＭＥＴ陽性（ＡＵ５６５、ＨＣＣ１９５４）および１つのＭＥＴ陰性（ＢＴ４７４）ＨＥＲ２増幅細胞系におけるｐＡＫＴおよびｐＥＲＫの再活性化を示す免疫ブロットである。細胞を、示されたようにラパチニブ（Ｌａｐ、１μＭ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはクリゾチニブ（Ｃｒｉｚ、０．５μＭ）のいずれかで処理した（２ｈ）。
【図３Ｅ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。ＨＥＲ２陽性（３＋）乳癌組織におけるＭＥＴ発現を示す代表的なスライドである。
【図３Ｆ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。ラパチニブ（１μＭ）およびＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で３回処理した後のＡＵ５６５細胞を発現するより高いＭＥＴの選択である。
【図３Ｇ】ＨＧＦがＨＥＲ２増幅細胞系中でのラパチニブ耐性を促進したことを示す図である。示されたように、ラパチニブ（５μＭ）およびクリゾチニブ（１μＭ）のいずれかで処理されたＨＣＣ１９５４  ＨＥＲ２増幅乳癌細胞のＳｙｔｏ６０染色である。細胞を、示された時間、週に２回処理した。画像は、３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図４Ａ】ＨＧＦがＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系におけるＰＬＸ４０３２耐性を促進したことを示す図である。左、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系のパネルにおけるｐＭＥＴおよびＭＥＴ発現を示す免疫ブロットである。ＨＧＦレスキューが示され、灰色の四角は完全なレスキューを示し、黒色の四角は部分的レスキューを示し、白色の四角はレスキューなしを示す。右、密度測定により決定されたＭＥＴ発現と、ＨＧＦの存在下でＰＬＸ４０３２（１μＭ）処理されたＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ系（７２ｈ）におけるレスキュー率（％）との相関を示す。
【図４Ｂ】ＨＧＦがＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系におけるＰＬＸ４０３２耐性を促進したことを示す図である。３つのＭＥＴ陽性（ＮＡＥ、６２４ＭＥＬ、Ａ３７５）および２つのＭＥＴ陰性（Ｍ１４、Ｈｓ６９３Ｔ）ＢＲＡＦ突然変異体細胞系におけるｐＥＲＫの再活性化を示す免疫ブロットである。細胞を、示されたようにＰＬＸ４０３２（ＰＬＸ、１μＭ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはクリゾチニブ（Ｃｒｉｚ、０．５μＭ）で処理した（２ｈ）。
【図４Ｃ】ＨＧＦがＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系におけるＰＬＸ４０３２耐性を促進したことを示す図である。示されたようにＰＬＸ４０３２（５μＭ）および／またはクリゾチニブ（１μＭ）のいずれかで処理した６２４ＭＥＬ  ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞のＳｙｔｏ６０染色を示す。細胞を、示された時間、週に２回処理した。画像は、３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図４Ｄ】ＨＧＦがＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系におけるＰＬＸ４０３２耐性を促進したことを示す図である。９２８ＭＥＬ異種移植片におけるＰＬＸ４０３２処理の効果に対する、３Ｄ６  ＭＥＴ作動抗体を用いてＭＥＴ受容体を活性化する効果を示す腫瘍増殖アッセイである。１群あたり１０匹のマウスを、４週間、示されたように対照抗体（抗ｇｐ１２０）、３Ｄ６（抗ＭＥＴ作動抗体）、ＲＧ７２０４（ＰＬＸ４０３２）またはＧＤＣ−０７１２（ＭＥＴ小分子阻害剤）のいずれかで処理した。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図５Ａ】ＰＤＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、３０ｍｉｎ）で刺激した後のＰＤＧＦＲの活性化を示す免疫ブロットである。
【図５Ｂ】シスプラチンおよび６つの個々のＲＴＫリガンドで同時処理された６つのキナーゼ依存的癌細胞系からのスクリーニング結果の概要である。ＮＲはレスキューなしを示す。
【図５Ｃ】薬剤処理（７２ｈ）後の３つのキナーゼ依存的癌細胞系における細胞増殖の抑制を示す細胞生存能力アッセイを示す。細胞を、示されたように適切な二次キナーゼ阻害剤（０．５μＭ）の存在下で５０ｎｇ／ｍＬのＲＴＫリガンドで同時処理した。ＰＤ：ＰＤ１７３０７４、Ｌａｐ：ラパチニブ、Ｃｒｉｚ：クリゾチニブ。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図５Ｄ】ＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化に対する、ＲＴＫリガンド（５０ｎｇ／ｍＬ、２ｈ）の存在下または非存在下での急性キナーゼ阻害（１μＭ）の効果を示す免疫ブロットである。細胞を、必要に応じて二次キナーゼ阻害剤（０．５μＭ）で同時処理した。Ｃｒｉｚ：クリゾチニブ、ＰＤ：ＰＤ１７３０７４、Ｌａｐ：ラパチニブ。
【図６Ａ】マトリックススクリーニングからの４１種のキナーゼ依存的癌細胞系のパネルにおけるＭＥＴ、ＰＤＧＦＲα、ＩＧＦ１Ｒβ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の発現を示す免疫ブロットである。ＲＴＫリガンドレスキューが示される；灰色の四角は完全なレスキューを示し、黒色の四角は部分的レスキューを示し、白色の四角はレスキューなしを示し、斜線の四角はリガンド結合キナーゼを示す。Ｘは除去された試料を示し、ａｍｐは増幅されていることを示し、ｍｕｔは突然変異されていることを示す。β−チューブリンを用いて等量を決定した。
【図６Ｂ】ＲＴＫ発現を、キナーゼ阻害からキナーゼ依存的細胞をレスキューするＲＴＫリガンドの能力と関連付ける表である。２ｘ２分割表を用いて統計的有意性を決定した。ｐ値を与える。
【図７Ａ】受容体発現非ＲＴＫリガンドレスキュー細胞における下流の生存シグナルにカップリングしない受容体の活性化を示す免疫ブロットである。ＰＬＸ：ＰＬＸ４０３２，Ｌａｐ：ラパチニブ。
【図７Ｂ】受容体発現非ＲＴＫリガンドレスキュー細胞における少なくとも１つの下流の生存シグナルにカップリングした受容体の活性化を示す免疫ブロットである。ＰＬＸ：ＰＬＸ４０３２、ＴＡＥ：ＴＡＥ６８４、Ｅｒｌ：エルロチニブ。
【図７Ｃ】ＲＴＫリガンドが、適切な受容体および受容体発現非ＲＴＫリガンドレスキュー細胞における対応する下流の生存シグナルを活性化することができないことを示す免疫ブロットである。ＰＬＸ：ＰＬＸ４０３２、ＴＡＥ：ＴＡＥ６８４、Ｅｒｌ：エルロチニブ。
【図８Ａ】ＴＡＥ６８４を用いる処理またはクリゾチニブ処理（７２ｈ）後の、Ｈ３１２２  ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座ＮＳＣＬＣ癌細胞系における細胞増殖の抑制を示す細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦで同時処理した。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図８Ｂ】ＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化に対する、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、２ｈ）の存在下および非存在下での急性ＴＡＥ６８４またはクリゾチニブ（１μＭ）処理の効果を示す免疫ブロットである。
【図８Ｃ】示されたようにＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下および非存在下でＴＡＥ６８４（２μＭ）で処理されたＨ２２２８  ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座ＮＳＣＬＣ細胞のＳｙｔｏ６０染色である。細胞を９日間にわたって、３日毎に処理した。
【図８Ｄ】示されたようにＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下および非存在下でエルロチニブ（５μＭ）で処理されたＨ３５８  ＥＧＦ様リガンド誘導性ＮＳＣＬＣ細胞のＳｙｔｏ６０染色である。細胞を９日間にわたって、３日毎に処理した。画像は３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図９Ａ】ＰＬＸ４０３２を用いる処理（７２ｈ）後の２つのＢＲＡＦ突然変異体細胞系における細胞増殖の抑制を示す細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞を、示されたように５０ｎｇ／ｍＬのＲＴＫリガンドおよびクリゾチニブ（Ｃｒｉｚ、０．５μＭ）で同時処理した。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図９Ｂ】ラパチニブ（１μＭ）処理されたＡＵ５６５  ＨＥＲ２増幅乳癌細胞におけるＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）刺激後の持続的生存シグナル（ｐＡＫＴおよびｐＥＲＫ）を示す時間経過を示す図である。
【図１０】ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｆを用いる細胞中の様々なＲＴＫリガンドのレスキュー結果を示す図である。
【図１１】示されたようにラパチニブ（５μＭ）およびクリゾチニブ（１μＭ）のいずれかで処理されたＨＣＣ１９５４  ＨＥＲ２増幅乳癌細胞のＳｙｔｏ６０細胞染色を示す図である。細胞を、示された時間、週に２回処理した。画像は３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図１２Ａ】ＭＥＴ陽性（ＮＡＥ、６２４ＭＥＬ、９２８ＭＥＬ、Ａ３７５）およびＭＥＴ陰性（Ｍ１４、Ｈｓ６９３Ｔ）ＢＲＡＦ突然変異体細胞系におけるＥＲＫの再活性化を示す免疫ブロットである。細胞を、示されたようにＰＬＸ４０３２（ＰＬＸ、１μＭ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはクリゾチニブ（Ｃｒｉｚ、０．５μＭ）で処理した（２ｈ）。
【図１２Ｂ】９２８ＭＥＬおよび６２４ＭＥＬ異種移植片におけるＰＬＸ４０３２の増殖阻害活性に対する、３Ｄ６ＭＥＴ作動抗体を用いるＭＥＴを活性化する効果を示す腫瘍増殖アッセイを示す図である。マウス（１群あたり１０匹）を、４週間、示されたように対照抗体（抗ｇｐ１２０）、３Ｄ６（抗ＭＥＴ作動抗体）、ＲＧ７２０４（ＰＬＸ４０３２）またはＧＤＣ−０７１２（ＭＥＴ小分子阻害剤）のいずれかで処理し、腫瘍体積を示された時間で測定した。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。２群間の差異を、二元配置分散分析を用いて決定した（*＝０．０００８）。
【図１３】ＰＬＸ４０３２で処置した転移性メラノーマ患者における無進行生存および全生存を示す図である。患者を、その血漿ＨＧＦレベルに基づいて２群に階層化した（緑色＜中央ＨＧＦ；赤色＞中央ＨＧＦ）。
【図１４Ａ】ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ経路の両方を活性化することによるキナーゼ阻害の付加的レスキューを示す細胞生存能力アッセイを示す図である（７２ｈ）。ＡＵ５６５細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＮＲＧ１またはＦＧＦと共にラパチニブ（１μＭ）で同時処理した。
【図１４Ｂ】ＰＩ３Ｋ経路の阻害は、リガンド誘導性レスキューの逆転においてＭＡＰＫ経路よりも強力であったことを示す細胞生存能力アッセイを示す図である。細胞を、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で適切なキナーゼ阻害剤で処理した。次いで、細胞を、１００ｎＭのＰＩ３Ｋ阻害剤（ＢＥＺ２３５）またはＭＡＰＫ阻害剤（ＡＺＤ６２４４）のいずれかで処理した。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図１５】マトリックススクリーニングに由来する４１種のキナーゼ依存的癌細胞系におけるＭＥＴ、ＰＤＧＦＲα、ＩＧＦ１Ｒβ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の発現を示す免疫ブロットである。ＲＴＫリガンドレスキューが示される；灰色の四角は完全なレスキューを示し、暗灰色の四角は部分的レスキューを示し、白色の四角はレスキューなしを示し、黒色の四角はリガンド結合キナーゼを示す。Ｘは除去された試料を示し、ａｍｐは増幅されていることを示し、ｍｕｔは突然変異されていることを示す。β−チューブリンを用いて等量を決定した。
【図１６】示されたようにＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でＴＡＥ６８４（２μＭ）で処理されたＨ２２２８  ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座ＮＳＣＬＣ細胞のＳｙｔｏ６０染色を示す図である。細胞を、９日間にわたって３日毎に処理した。画像は３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図１７Ａ】ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞におけるＰＬＸ４０３２感受性に関する４４６種の試験した分泌因子の分析を示す図である。
【図１７Ｂ】５０ｎｇ／ｍＬのリガンドの存在下、５μＭのＰＬＸ４０３２の存在下での、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に関する４４６種の試験した分泌因子の分析（７２ｈ）からの結果の概要である。グラフは、元の分析からのリガンドおよびＰＬＸ４０３２感受性からＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をレスキューした新しく同定された可溶性因子を表す。エラーバーは、平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図１８】示されたようにＰＬＸ４０３２（５μＭ）および／またはクリゾチニブ（１μＭ）のいずれかで処理されたＡ３７５および９２８ＭＥＬ  ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系のＳｙｔｏ６０細胞染色を示す図である。細胞を、示された時間にわたって週に２回処理した。画像は３回の独立実験の代表であり、値は平均＋／−ｓ．ｄ．を示す。
【図１９Ａ】９２８ＭＥＬ異種移植試験からの結果をまとめた表である。
【図１９Ｂ】６２４ＭＥＬ異種移植試験からの結果をまとめた表である。
【図２０】投与前、サイクル１の１２６人の転移性メラノーマ患者に由来する血漿中のＨＧＦタンパク質レベルのＥＬＩＳＡ結果の概要を示す図である。
【図２１】培養物中でのＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ癌細胞におけるＭＥＴのＩＨＣ染色を示す図である。
【図２２】クリゾチニブを用いる処理後のＨＣＣ１９５４およびＡＵ５６５における細胞増殖の抑制を示す細胞生存能力アッセイ（７２ｈ  Ｓｙｔｏ６０アッセイ）を示す図である。細胞を、クリゾチニブ（０．５μＭ）（ＭＥＴ  ＴＫＩ）およびラパチニブ（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２  ＴＫＩ）の存在下で５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦで同時処理した。
【図２３】ＡＫＴおよびＥＲＫリン酸化に対するＮＲＧ１（５０ｎｇ／ｍＬ、２ｈ）の存在下でのラパチニブ（１μＭ）の効果を示す免疫ブロットである。細胞を、示されたようにエルロチニブ（０．５μＭ）で同時処理した。Ｌａｐ：ラパチニブ、Ｅｒｌ：エルロチニブ。
【図２４Ａ】投与前サイクル１のＢＲＩＭ２試験に登録された１２６人の転移性メラノーマ患者からの、経験的密度（黒色）を重ね合わせた、対数（ＨＧＦ）レベルの頻度分布を示すヒストグラム（斜線）である（正常からの逸脱に関するＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｆｆ  ｐ値は０．１８である）。
【図２４Ｂ】ＰＬＸ４０３２で処置された転移性メラノーマ患者における無進行生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）を示す図である。患者を、その血漿ＨＧＦレベルに基づいて３つの群に階層化した。事象／患者数および中央時間事象が、各群について示される。連続的結果に関する結果のｃｏｘ比例モデルを用いて、ハザード比および対応するｐ値を算出した。
【図２５Ａ】ＧＤＣ−０７１２の構造を示す図である。
【図２５Ｂ】ｃＭｅｔおよび選択されたキナーゼに関する酵素ＩＣ５０を示す。活性化ｃＭｅｔキナーゼドメインによるポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）のリン酸化を用いてｃＭｅｔ効力を決定し、ＥＬＩＳＡにより検出した。データは、複数回の決定（ｎ＝５）の幾何平均である。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準的なプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｌｅｃｔｅｄＳｃｒｅｅｎサービスを用いて、他のキナーゼアッセイを実行した。全てのＩＣ５０は、Ｋｍの近似値で［ＡＴＰ］を用いて決定した。
【図２５Ｃ】細胞に基づくアッセイにおける選択されたＲＴＫに対するＧＤＣ−０７１２の効力および選択性を示す図である。全てのアッセイは、１０％ＦＢＳの存在下で化合物と共に２時間インキュベートした後、表中に特定された細胞系におけるＲＴＫ自己リン酸化を測定した。
【図２５Ｄ】キナーゼ選択性プロファイリングデータである。ＧＤＣ−０７１２を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎサービスを用いて２１０種のキナーゼのパネルに対して０．１μＭでアッセイした。５０％を超える阻害を示す全てのキナーゼが列挙される。
【図２５Ｅ】ＧＤＣ−０７１２キナーゼ選択性を図示したものである。０．１μＭの化合物での特異的キナーゼの阻害率（％）を、ヒトキノム上にオーバーレイした円のサイズおよび色で表す。
【図２６】ＧＤＣ−０７１２を、国際特許出願ＷＯ２００７１０３３０８Ａ２に概略された手順に従って調製した。試薬および条件：（ａ）（ＥｔＯ）3ＣＨ、Ｍｅｌｄｒｕｍの酸、８０℃、７６％；（ｂ）Ｄｏｗｔｈｅｒｍ、２２０℃、４５％；（ｃ）３，４−ジフルオロニトロベンゼン、Ｃｓ2ＣＯ3、ＤＭＦ、１００℃、８８％；（ｄ）ＴＦＡ、７０℃、９９％；（ｅ）Ｉ2、ＫＯＨ、ＤＭＦ、５０℃、８８％；（ｆ）ＰＭＢＣｌ、Ｋ2ＣＯ3、ＤＭＦ、ｒｔ、６１％；（ｇ）ＳｎＣｌ2二水和物、ＥｔＯＨ、６５℃；（ｈ）ＣｕＩ、インドール−２−カルボン酸、ＤＭＳＯ、Ｋ2ＣＯ3、１１５℃、５６％；（ｉ）ＥＤＣＩ、ＨＯＢｔ、ｉｐｒ2ＥｔＮＨ、ＤＭＦ、９２％；（ｊ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、ｒｔ；（ｋ）ＣＨ3ＣＨＯ、ＮａＨＢ（ＯＡｃ）3、７７％、２ステップを超える；（ｌ）ＴＦＡ、７０℃、７３％。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
Ｉ．定義
本明細書において、「患者」はヒト患者である。患者は、「癌患者」、すなわち、癌の１つまたは複数の症状に罹患しているか、または罹患する危険性がある患者であってもよい。さらに、患者は、以前に処置された癌患者であってもよい。患者は、「メラノーマ癌患者」、すなわち、メラノーマの１つまたは複数の症状に罹患しているか、または罹患する危険性がある患者であってもよい。さらに、患者は、以前に処置されたメラノーマ患者であってもよい。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ｃ−ｍｅｔ」または「Ｍｅｔ」とは、別途指摘しない限り、任意の天然または変異体（天然もしくは合成）ｃ−ｍｅｔポリペプチドを指す。用語「野生型ｃ−ｍｅｔ」は一般的には、天然に存在するｃ−ｍｅｔタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「ｃ−ｍｅｔ変異体」とは、天然ｃ−ｍｅｔ配列中に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むｃ−ｍｅｔポリペプチドを指す。場合により、１つまたは複数のアミノ酸突然変異は、（１つまたは複数の）アミノ酸置換を含む。
【００４３】
「抗ｃ−ｍｅｔ抗体」は、十分な親和性および特異性でｃ−ｍｅｔに結合する抗体である。選択された抗体は通常、ｃ−ｍｅｔに対する十分に強力な結合親和性を有し、例えば、その抗体は１００ｎＭ〜１ｐＭのＫd値でヒトｃ−ｍｅｔに結合することができる。抗体親和性を、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡの）により決定することができる。特定の実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体を、ｃ−ｍｅｔ活性が関与する疾患または状態の標的化および妨害における治療剤として用いることができる。また、前記抗体を他の生物活性アッセイにかけて、例えば、治療剤としてのその有効性を評価することもできる。そのようなアッセイは当業界で公知であり、標的抗原および抗体のための意図される使用に依存する。
【００４４】
「ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト」（「ｃ−ｍｅｔ阻害剤」と互換的に呼ばれる）は、ｃ−ｍｅｔ活性化または機能を妨害する薬剤である。特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約１，０００ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対する結合親和性（解離定数）を有する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約１００ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対する結合親和性を有する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約５０ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対する結合親和性を有する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約１０ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対する結合親和性を有する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約１ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対する結合親和性を有する。特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−ｍｅｔに共有結合される。特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、１，０００ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、５００ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、１０ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、１ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナリングを阻害する。
【００４５】
「ｃ−ｍｅｔ活性化」とは、ｃ−ｍｅｔ受容体の活性化、またはリン酸化を指す。一般に、ｃ−ｍｅｔ活性化は、シグナル伝達（例えば、ｃ−ｍｅｔまたは基質ポリペプチド中のｃ−ｍｅｔ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる）をもたらす。ｃ−ｍｅｔ活性化は、対象のｃ−ｍｅｔ受容体へのｃ−ｍｅｔリガンド（ＨＧＦ）結合により媒介され得る。ｃ−ｍｅｔへのＨＧＦ結合は、ｃ−ｍｅｔのキナーゼドメインを活性化し、それによって、ｃ−ｍｅｔ中のチロシン残基のリン酸化および／または（１つもしくは複数の）さらなる基質ポリペプチド中のチロシン残基のリン酸化をもたらすことができる。
【００４６】
「Ｂ−ｒａｆ活性化」とは、Ｂ−ｒａｆキナーゼの活性化、またはリン酸化を指す。一般に、Ｂ−ｒａｆ活性化は、シグナル伝達をもたらす。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「Ｂ−ｒａｆ」とは、別途指摘しない限り、任意の天然または変異体（天然もしくは合成）Ｂ−ｒａｆポリペプチドを指す。用語「野生型Ｂ−ｒａｆ」は一般に、天然に存在するＢ−ｒａｆタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「Ｂ−ｒａｆ変異体」とは、天然Ｂ−ｒａｆ配列中に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むＢ−ｒａｆポリペプチドを指す。場合により、１つまたは複数のアミノ酸突然変異は、（１つまたは複数の）アミノ酸置換を含む。
【００４９】
「Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト」（「Ｂ−ｒａｆ阻害剤」と互換的に呼ばれる）は、Ｂ−ｒａｆ活性化または機能を妨害する薬剤である。特定の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、約１，０００ｎＭ以下のＢ−ｒａｆに対する結合親和性（解離定数）を有する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、約１００ｎＭ以下のＢ−ｒａｆに対する結合親和性を有する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、約５０ｎＭ以下のＢ−ｒａｆに対する結合親和性を有する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＢ−ｒａｆに対する結合親和性を有する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、約１ｎＭ以下のＢ−ｒａｆに対する結合親和性を有する。特定の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、１，０００ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ−ｒａｆシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、５００ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ−ｒａｆシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ−ｒａｆシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、１０ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ−ｒａｆシグナリングを阻害する。別の実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ阻害剤は、１ｎＭ以下のＩＣ５０でＢ−ｒａｆシグナリングを阻害する。
【００５０】
「Ｖ６００Ｅ」とは、Ｂ−Ｒａｆのアミノ酸６００位のグルタミンからバリンへの置換をもたらすＢＲＡＦ遺伝子中の突然変異を指す。「Ｖ６００Ｅ」は、以前の番号付け系（Ｋｕｍａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：３３６２〜３３６８頁、２００３）の下では「Ｖ５９９Ｅ」としても知られる。
【００５１】
「親和性」とは、ある分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用の総計の強度を指す。別途指摘しない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性を、本明細書に記載のものなどの当業界で公知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例示的実施形態は以下に記載される。
【００５２】
「選択的」または「より高い親和性」は、野生型タンパク質に対するよりも突然変異体タンパク質に対してより強固に（より低い解離定数）結合するアンタゴニストを指す。いくつかの実施形態においては、より高い親和性または選択性は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００倍以上のより高い結合である。本明細書で用いられる用語「Ｂ−ｒａｆ標的化薬剤」とは、Ｂ−ｒａｆに結合し、Ｂ−ｒａｆ活性化を阻害する治療剤を指す。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「ｃ−ｍｅｔ標的化薬剤」とは、ｃ−ｍｅｔに結合し、ｃ−ｍｅｔ活性化を阻害する治療剤を指す。
【００５４】
例えば、受容体キナーゼ活性に適用される場合、本明細書で用いられる用語「構成的」とは、リガンドまたは他の活性化分子の存在に依存しない受容体の連続的シグナリング活性を指す。受容体の性質に応じて、全ての活性が構成的であってよいか、または受容体の活性が他の分子（例えば、リガンド）の結合によりさらに活性化されてもよい。受容体の活性化をもたらす細胞事象は、当業者には周知である。例えば、活性化は、より高次元の受容体複合体へのオリゴマー化、例えば、ダイマー化、トリマー化などを含んでもよい。複合体は、単一の種のタンパク質、すなわち、ホモマー複合体を含んでもよい。あるいは、複合体は、少なくとも２つの異なるタンパク質種、すなわち、ヘテロマー複合体を含んでもよい。複合体形成は、例えば、細胞の表面上での通常形態または突然変異形態の受容体の過剰発現により引き起こされ得る。複合体形成はまた、受容体中での特定の突然変異または複数の突然変異によっても引き起こされ得る。
【００５５】
語句「遺伝子増幅」とは、特定の細胞または細胞系中である遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが形成されるプロセスを指す。複製される領域（増幅ＤＮＡのストレッチ）は、「アンプリコン」と呼ばれることが多い。通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルはまた、発現される特定の遺伝子から作られるコピー数に比例して増加する。
【００５６】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、ｃ−ｍｅｔ受容体またはＢ−ｒａｆなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子である。
【００５７】
「ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ発現、増幅、または活性化を示す」癌または生物試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆを発現する（例えば、過剰発現する）、増幅されたｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ遺伝子を有する、ならびに／またはさもなければｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆの活性化もしくはリン酸化を示すものである。
【００５８】
「ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ発現、増幅、または活性化を示さない」癌または生物試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆを発現しない（例えば、過剰発現しない）、増幅されたｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ遺伝子を有さない、ならびに／またはさもなければｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆの活性化もしくはリン酸化を示さないものである。
【００５９】
「ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ活性化を示す」癌または生物試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆの活性化またはリン酸化を示すものである。そのような活性を直接的（例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣによりＣ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆリン酸化を測定することによる）または間接的に決定することができる。
【００６０】
「ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ活性化を示さない」癌または生物試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆの活性化またはリン酸化を示さないものである。そのような活性を直接的（例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣによりＣ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆリン酸化を測定することによる）または間接的に決定することができる。
【００６１】
「構成的ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ活性化を示す」癌または生物試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆの構成的活性化またはリン酸化を示すものである。そのような活性を直接的（例えば、ＥＬＩＳＡによりｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆリン酸化を測定することによる）または間接的に決定することができる。
【００６２】
「ｃ−ｍｅｔ増幅を示さない」癌または生物試料は、診断試験において、増幅されたｃ−ｍｅｔ遺伝子を有さないものである。
【００６３】
「ｃ−ｍｅｔを示す」癌または生物試料は、診断試験において、増幅されたｃ−ｍｅｔ遺伝子を有するものである。
【００６４】
「構成的ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆ活性化を示さない」癌または生物試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆの構成的活性化またはリン酸化を示さないものである。そのような活性を直接的（例えば、ＥＬＩＳＡによりｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆリン酸化を測定することによる）または間接的に決定することができる。
【００６５】
「リン酸化」とは、Ｂ−ｒａｆおよび／もしくはｃ−ｍｅｔ、またはその基質などの、タンパク質への１つまたは複数のリン酸基の付加を指す。
【００６６】
本明細書の「ホスホ−ＥＬＩＳＡアッセイ」は、１つまたは複数のｃ−ｍｅｔおよび／またはＢ−ｒａｆのリン酸化が、リン酸化されたｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＢ−ｒａｆを検出するための試薬、通常は抗体、基質、または下流のシグナリング分子を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において評価されるアッセイである。好ましくは、リン酸化されたｃ−ｍｅｔおよび／またはＢ−ｒａｆを検出する抗体が用いられる。このアッセイを、好ましくは、新鮮な、または凍結された生物試料に由来する細胞溶解物に対して実施することができる。
【００６７】
「ｃ−ｍｅｔ過剰発現または増幅」を有する癌細胞は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して有意により高いレベルのｃ−ｍｅｔタンパク質または遺伝子を有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によるか、または転写もしくは翻訳の増加により引き起こされ得る。ｃ−ｍｅｔ過剰発現または増幅を、細胞の表面上に存在するｃ−ｍｅｔタンパク質のレベルの増加を評価することにより（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣを介する）、診断または予後アッセイにおいて決定することができる。その代わりに、またはそれに加えて、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照されたい）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、細胞中でＣ−ｍｅｔをコードする核酸のレベルを測定することができる。上記アッセイとは別に、様々なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが当業者にとって利用可能である。例えば、場合により、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で標識された抗体に、患者の体内の細胞を曝露し、患者中の細胞への抗体の結合を、例えば、放射活性の体外走査によるか、または抗体に予め曝露された患者から取得した生検を分析することにより評価することができる。
【００６８】
「ｃ−ｍｅｔを過剰発現または増幅しない」癌細胞は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して正常レベルよりも高いｃ−ｍｅｔタンパク質または遺伝子を有さないものである。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「突然変異」は、それぞれ、野生型タンパク質または核酸と比較した、特定のタンパク質または核酸（遺伝子、ＲＮＡ）のアミノ酸または核酸配列における差異を意味する。突然変異したタンパク質または核酸を、ある遺伝子の１つの対立遺伝子（異型）または両方の対立遺伝子（同型）から発現させるか、またはその上に見出すことができ、体細胞または生殖系列であってもよい。本発明においては、突然変異は一般的には体細胞である。突然変異は、挿入、欠失、および点突然変異（単一ヌクレオチド／アミノ酸多型など）などの配列再配置を含む。
【００７０】
「阻害する」こととは、参照と比較して活性、機能、および／または量を低下または減少させることである。
【００７１】
タンパク質「発現」とは、ある遺伝子にコードされた情報の、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、次いでタンパク質への変換を指す。
【００７２】
本明細書において、対象のタンパク質（ｃ−ｍｅｔ受容体など）を「発現する」試料または細胞は、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはその断片を含むタンパク質が、試料または細胞中に存在すると決定されたものである。
【００７３】
「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するか、または低下させるものである。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を完全に阻害する。
【００７４】
患者の「集団」とは、例えば、臨床試験における、またはメラノーマ癌療法などの特定の適応症についてＦＤＡ認可後に腫瘍学者により認められたような、癌を有する患者のグループを指す。
【００７５】
本発明の方法について、患者を「指示すること」という用語は、任意の手段によるが、好ましくは、添付文書または他の文書化された奨励材料の形態などの文書により、適用可能な療法、薬剤、処置、処置レジメンなどに関する指示を提供することを意味する。
【００７６】
本発明の方法について、用語「奨励すること」は、例えば、添付文書の形態などの文書を含む任意の手段により、特定の薬剤、薬剤の組合せ、または処置様式を提供すること、宣伝すること、販売すること、または説明することを意味する。本明細書における奨励することとは、メラノーマ処置などの適応症のための治療剤、例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体および／またはＢ−ｒａｆアンタゴニストの奨励を指し、そのような奨励は、対象の集団における統計的に有意な治療効果および許容される安全性と関連することが証明されているものとして食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている。
【００７７】
用語「市販すること」は、製品（例えば、薬剤）の奨励、販売または配布を説明するために本明細書で用いられる。市販することは、具体的には、包装すること、宣伝すること、および製品を市販する目的での任意の商活動を含む。
【００７８】
本明細書の目的のために、「以前に処置された」癌患者は、以前の癌療法を受けたことがある。
【００７９】
「不応性」癌は、化学療法剤などの抗腫瘍剤が癌患者に投与された場合でも進行する。
【００８０】
「癌薬剤」は、癌を処置するのに有効な薬剤である。癌薬剤の例としては、以下に記載される化学療法剤および化学療法レジメンが挙げられる；ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト、例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体、例えば、ＭｅｔＭＡｂ；Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「バイオマーカー」または「マーカー」とは、組織もしくは細胞中もしくは上での発現または分泌を、公知の方法（または本明細書に開示される方法）により検出することができ、処置レジメンに対する細胞、組織、または患者の応答性を予測するか、またはそれを予測する（もしくは予測を補助する）ために用いることができる、遺伝子、ｍＲＮＡ、タンパク質、炭水化物構造、または糖脂質を含む分子を一般的に指す。
【００８２】
癌（例えば、メラノーマ）患者に対する臨床利益の低下と関連するバイオマーカーの「量」または「レベル」とは、生物試料中の検出可能なバイオマーカーの欠如または低い検出可能レベルを指し、バイオマーカーのレベルは患者に対する臨床利益の低下と関連する。これらのものを、当業者には公知の、およびまた本発明により開示される方法により測定することができる。評価されるバイオマーカーの発現レベルまたは量を用いて、処置に対する応答を決定することができる。いくつかの実施形態においては、バイオマーカーの量またはレベルは、ＩＨＣ（例えば、患者腫瘍試料の）および／またはＥＬＩＳＡおよび／または５’ヌクレアーゼアッセイおよび／またはＰＣＲ（例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ）を用いて決定される。
【００８３】
一般に、用語「発現のレベル」または「発現レベル」は互換的に用いられ、一般的には、生物試料中のポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、またはアミノ酸産物またはタンパク質の量を指す。「発現」は一般的に、遺伝子にコードされた情報が、細胞中に存在し、動作する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明による、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、またはさらにはタンパク質の翻訳後改変を指してもよい。転写されるポリヌクレオチド、翻訳されるタンパク質、または翻訳後改変されるタンパク質の断片も、それらが選択的スプライシングにより生成された転写物もしくは分解された転写物を起源とするにしろ、または例えば、タンパク質分解によるタンパク質の翻訳後プロセッシングを起源とするにしろ、発現されると見なすべきである。いくつかの実施形態においては、「発現のレベル」は、ＩＨＣを用いて決定された場合、生物試料中のタンパク質の量を指す。
【００８４】
「患者試料」とは、癌患者から得られた類似する細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された、および／もしくは保存された器官もしくは組織試料または生検もしくは吸引物に由来する固形組織；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹腔液、または間質液などの体液；対象の妊娠または発生における任意の時点に由来する細胞であってもよい。組織試料は、保存剤、凝固防止剤、バッファー、固定剤、栄養素、抗生物質などの、天然の組織と天然では混ざらない化合物を含有してもよい。本明細書における腫瘍試料の例としては、限定されるものではないが、腫瘍生検、循環腫瘍細胞、血清または血漿、循環血漿タンパク質、腹水、腫瘍から誘導されたか、または腫瘍のような特徴を示す一次細胞培養物または細胞系、ならびにホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍試料または凍結腫瘍試料などの保存された腫瘍試料が挙げられる。一実施形態においては、試料は、メラノーマ腫瘍試料を含む。
【００８５】
薬剤および同様の表現を用いる処置に対する患者の「有効な応答」または患者の「応答性」とは、癌薬剤の投与時に癌（例えば、メラノーマ）の危険性があるか、またはそれに罹患する患者に付与される臨床または治療利益を指す。そのような利益は、生存の延長（全生存および無進行生存を含む）；他覚的応答（完全な応答もしくは部分的応答を含む）をもたらすこと；または癌などの症候を改善することのいずれか１つまたは複数を含む。一実施形態においては、バイオマーカーは、同じレベルのバイオマーカーを発現しない患者と比較して、薬剤（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）で処置した場合により高い無進行生存（ＰＦＳ）を有することが期待される患者を同定するために用いられる。
【００８６】
「生存」とは、生き残っている患者を指し、全生存ならびに無進行生存を含む。
【００８７】
「全生存」とは、診断または処置の時点から、１年、５年などの規定の期間にわたって生き残っている患者を指す。
【００８８】
「無進行生存」とは、癌が進行するか、または悪化することなく、生き残っている患者を指す。
【００８９】
「生存の延長」とは、処置されていない患者と比較した（すなわち、薬剤で処置されていない患者と比較した）、または指定のレベルでバイオマーカーを発現しない患者と比較した、および／または認可された抗腫瘍剤（エルロチニブの化学療法レジメンなど）で処置された患者と比較した、処置された患者における全生存または無進行生存の増加を意味する。
【００９０】
「他覚的応答」とは、完全な応答（ＣＲ）または部分的応答（ＰＲ）などの測定可能な応答を指す。
【００９１】
「完全な応答」または「ＣＲ」とは、処置に応答した癌の全ての兆候の消失を意図する。これは、癌が治癒したことを必ずしも意味するわけではない。
【００９２】
「部分的応答」または「ＰＲ」とは、処置に応答した、１つもしくは複数の腫瘍もしくは病変のサイズ、または体内の癌の程度の低下を指す。
【００９３】
「処置」とは、治療的処置および予防的または保存的手段の両方を指す。処置を必要とするものとしては、良性、前癌性、または非転移性腫瘍を既に有しているもの、ならびに癌の発生または再発が防止されるべきものが挙げられる。
【００９４】
用語「治療上有効量」とは、哺乳動物における疾患または障害を処置または防止する治療剤の量を指す。癌の場合、治療剤の治療上有効量は、癌細胞数を減少させる；原発腫瘍サイズを減少させる；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害する；および／または障害に伴う１つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。薬剤が癌細胞の増殖を防止する、および／または存在する癌細胞を殺傷することができる程度まで、それは細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であってよい。癌療法のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を、例えば、生存期間、疾患が進行するまでの時間（ＴＴＰ）、応答率（ＲＲ）、応答期間、および／または生活の質を評価することにより測定することができる。
【００９５】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。良性および悪性の癌がこの定義に含まれる。「早期段階の癌」または「早期段階の腫瘍」とは、侵襲性もしくは転移性ではないか、またはステージ０、ＩもしくはＩＩの癌として分類される癌を意味する。癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫など）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、および島細胞癌など）中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫など）、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。そのような癌のより特定の例としては、メラノーマ、結腸直腸癌、甲状腺癌（例えば、甲状腺乳頭癌）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌、例えば、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌（転移性乳癌など）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管腫瘍、ならびに頭部および頸部癌が挙げられる。いくつかの実施形態においては、癌は、メラノーマ；結腸直腸癌；甲状腺癌、例えば、甲状腺乳頭癌；または卵巣癌である。
【００９６】
単数形または複数形で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般的に指す。かくして、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には、二本鎖であってもよく、または一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。そのような領域中の鎖は、同じ分子に由来するか、または異なる分子に由来するものであってもよい。領域は、１つまたは複数の分子の全部を含んでもよいが、より典型的には、いくつかの分子のある領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的には、ｃＤＮＡを含む。この用語は、１つまたは複数の改変塩基を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。かくして、安定性または他の理由で改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図される通り、「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの通常ではない塩基、またはトリチウム化塩基などの改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で定義される通り用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、全ての化学的、酵素的および／または代謝的に改変された形態の非改変ポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞、例えば、単純な、および複雑な細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００９７】
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンなどのエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ブテリン酸（ｂｕｔｅｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンなど）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体など）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１など）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６頁（１９９４）を参照されたい）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；ダイナミシン、例えば、ダイナミシンＡ；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連するクロモタンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンなど）、エピルビシ��、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフル（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎物質；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｏｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカリド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどの白金剤；チューブリン重合化が微小管を形成するのを防止するビンカ、例えば、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロ��ート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸、例えば、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））などのレチノイド；クロドロナート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロナート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロナート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロナート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロナート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロナート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロナート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホナート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照されたい）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照されたい）；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの組合せ療法の省略形であるＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＮＴＩＮ（商標））を用いる処置レジメンの省略形であるＦＯＬＦＯＸが挙げられる。
【００９８】
本明細書において、化学療法剤は、癌の増殖を促進し得るホルモンの効果を制御する、減少させる、遮断する、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌治療剤」を含む。それらは、それ自身ホルモンであってもよく、例えば、限定されるものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、および選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、例えば、ＳＥＲＭ３；アゴニスト特性を有さない純粋抗エストロゲン剤、例えば、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（そのような薬剤はエストロゲン受容体（ＥＲ）ダイマー化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、および／またはＥＲレベルを抑制することができる）；アロマターゼ阻害剤、例えば、フォルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイド性アロマターゼ阻害剤、およびアナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、およびボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、および４（５）−イミダゾールなどの他のアロマターゼ阻害剤；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えば、ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリン；性ステロイド剤、例えば、酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリンなどのエストロゲン、ならびにフルオキシメステロン、全てのトランスレチノイン酸およびフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御剤（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン剤；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組合せが挙げられる。
【００９９】
本明細書における化学療法剤または化学療法レジメンの特定例としては、アルキル化剤（例えば、クロラムブシル、ベンダムスチン、またはシクロホスファミド）；ヌクレオシド類似体または代謝拮抗物質（例えば、フルダラビン）、フルダラビンおよびシクロホスファミド（ＦＣ）；プレドニゾンまたはプレドニゾロン；アルキル化剤含有組合せ療法、例えば、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾロン（ＣＨＯＰ）、またはシクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾロン（ＣＶＰ）などが挙げられる。
【０１００】
「標的聴衆」は、例えば、個々の患者、患者集団、新聞、医学的文献、および雑誌の読者、テレビジョンまたはインターネットの閲覧者、ラジオまたはインターネットの視聴者、医師、製薬会社などの、特に、特定の目的、処置、または適応症のために市販または宣伝することによって特定の薬剤を奨励されるか、または奨励することを意図される人々の群または団体である。
【０１０１】
「添付文書」は、適応症、使用、用量、投与、禁忌、包装された製品と組み合わされる他の治療剤製品、および／またはそのような治療剤製品の使用に関する警告などに関する情報を含む、治療剤製品の商業的包装に慣用的に含まれる指示書を指すように用いられる。
【０１０２】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造、例えば、限定されるものではないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、および抗体断片を包含する。
【０１０３】
「抗体断片」とは、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【０１０４】
「親和性成熟された」抗体とは、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらすような変化を有さない親抗体と比較して、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）における１つまたは複数の変化を有する抗体を指す。
【０１０５】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体を指し、および逆に、参照抗体は競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する。
【０１０６】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種から誘導されるが、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種から誘導される抗体を指す。
【０１０７】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1およびＩｇＡ2にさらに分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212およびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、例えば、その断片および／または変異体；ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられる。
【０１０９】
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプと共に変化する、抗体のＦｃ領域に帰するこれらの生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【０１１０】
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。一実施形態においては、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、または存在しなくてもよい。本明細書で別途特定しない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載のような、ＥＵ指数とも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【０１１１】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）中の以下の配列中に出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【０１１２】
用語「完全長抗体」、「無傷抗体」および「全抗体」は、天然抗体構造と実質的に類似する構造を有するか、または本明細書で定義されたＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指すように、本明細書では互換的に用いられる。
【０１１３】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を使用する非ヒト起源から誘導される抗体のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を含まない。
【０１１４】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基およびヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態においては、ヒト化抗体は、全ての、または実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）が非ヒト抗体のものに一致し、全ての、または実質的に全てのＦＲがヒト抗体のものに一致する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体から誘導される抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。「ヒト化形態」の抗体、例えば、非ヒト抗体とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１１５】
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、配列において超可変性である、および／または構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、それぞれの抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性のものであり、および／または抗原認識に関与する。超可変ループの例は、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に生じる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７））。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、およびＨ３の９５〜１０２に生じる（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である、「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、省略−ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、およびＨ３の９５〜１０２に生じる（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３頁（２００８）を参照されたい）。別途指摘しない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔら、上掲に従って本明細書で番号付けられる。一実施形態においては、本明細書のｃ−ｍｅｔ抗体は、配列番号１〜６のＨＶＲを含む。
【０１１６】
「親和性」とは、ある分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用の総計の強度を指す。別途指摘しない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性を、本明細書に記載のものなどの当業界で公知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例示的実施形態は以下に記載される。
【０１１７】
「免疫コンジュゲート」は、限定されるものではないが、細胞傷害性薬剤などの１つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【０１１８】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能なバリアント抗体であり、一般に少量で存在する前記変異体を除いて、集団を含む個々の抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。かくして、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の特徴が抗体の実質的に均一な集団から得られるものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体を、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などの様々な技術により作製することができ、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的方法は、本明細書に記載される。
【０１１９】
「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬製剤中に存在してもよい。
【０１２０】
「天然抗体」とは、変化する構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、次いで、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、次いで、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの型のうちの１つに割り当てることができる。
【０１２１】
用語「医薬製剤」とは、薬剤の生物活性が有効であることを許容するような形態にあり、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性的なものであるさらなる成分を含有しない滅菌調製物を指す。
【０１２２】
「滅菌」製剤は、無菌性であるか、またはあらゆる生きている微生物およびその胞子を含まない。
【０１２３】
「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば、癌（例えば、メラノーマ、結腸直腸癌）の処置のための薬剤、またはバイオマーカー遺伝子もしくはタンパク質を特異的に検出するための試薬（例えば、抗体）を含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）である。この製品は、好ましくは、本発明の方法を実施するための単位として奨励、配布、または販売される。
【０１２４】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性的である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、バッファー、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられる。
【０１２５】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じて、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義され、任意の保存的置換を配列同一性の部分と考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントを、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公共的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の知識の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、配列を整列させるための適切なパラメータ、例えば、比較される配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著されたものであり、そのソースコードはＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザ文書と共にファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公共的に利用可能であるか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０ＤなどのＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルするべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【０１２６】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を用いる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、または、に対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、または、に対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように算出される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によるＡとＢとのそのプログラムのアラインメントにおける同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくないであろう。別途特に記述しない限り、本明細書で用いられる全てのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前の段落に記載のように得られる。
【０１２７】
ＩＩ．癌薬剤
一態様において、本発明は、対象における、癌などの病理学的状態を処置するための組合せ療法におけるｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストの使用を特徴とする。別の態様において、本発明は、本明細書に開示される１つまたは複数のバイオマーカーの発現に基づいて癌薬剤で処置することができる患者を選択することに関する。癌薬剤の例としては、限定されるものではないが、
−抗ｃ−ｍｅｔ抗体などのｃ−ｍｅｔアンタゴニスト、
−Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト、
−化学療法剤および化学療法レジメン、
−癌、例えば、メラノーマを処置するための、開発中の、または認可された他の薬剤またはその組合せ
が挙げられる。
【０１２８】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストの例としては、限定されるものではないが、可溶性ｃ−ｍｅｔ受容体、可溶性ＨＧＦ変異体、ｃ−ｍｅｔまたはＨＧＦに結合するアプタマーまたはペプチボディ、ｃ−ｍｅｔ小分子、抗ｃ−ｍｅｔ抗体および抗ＨＧＦ抗体が挙げられる。
【０１２９】
一実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、例えば、ｃ−ｍｅｔを指向するか、またはｃ−ｍｅｔに結合する抗体である。本明細書における抗体としては、モノクローナル抗体、例えば、キメラ、ヒト化またはヒト抗体が挙げられる。一実施形態においては、抗体は抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、１アーム（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）抗体、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）2断片である。別の実施形態においては、抗体は、完全長抗体、例えば、無傷のＩｇＧ１抗体または本明細書に定義された他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。一実施形態においては、抗体は一価である。別の実施形態においては、抗体は、Ｆｃ領域を含む１アーム抗体（すなわち、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが単一の抗原結合アームを形成する）であり、Ｆｃ領域は第１および第２のＦｃポリペプチドを含み、第１および第２のＦｃポリペプチドは複合体で存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。１アーム抗体は、一価であってもよい。
【０１３０】
別の実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ＭｅｔＭＡｂ（オナルツズマブ）またはそのバイオシミラー型である。ＭｅｔＭＡｂは、例えば、ＷＯ２００６／０１５３７１；Ｊｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００８）６８：４３６０頁に開示されている。別の実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列ＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨ（配列番号１）を含むＨＶＲ１−ＨＣ；（ｂ）配列ＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ２−ＨＣ；および／または（ｃ）配列ＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹ（配列番号３）を含むＨＶＲ３−ＨＣのうちの１つまたは複数を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、抗体は、（ａ）配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）を含むＨＶＲ１−ＬＣ；（ｂ）配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）を含むＨＶＲ２−ＬＣ；および／または（ｃ）配列ＱＱＹＹＡＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＨＶＲ３−ＬＣのうちの１つまたは複数を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列ＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨ（配列番号１）を含むＨＶＲ１−ＨＣ；（ｂ）配列ＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ２−ＨＣ；および（ｃ）配列ＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹ（配列番号３）を含むＨＶＲ３−ＨＣを含む重鎖可変ドメインと、（ａ）配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）を含むＨＶＲ１−ＬＣ；（ｂ）配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）を含むＨＶＲ２−ＬＣ；および（ｃ）配列ＱＱＹＹＡＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＨＶＲ３−ＬＣを含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【０１３１】
上記実施形態のいずれかにおいて、例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体はヒト化されていてもよい。一実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、上記実施形態のいずれかにおけるＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０１３２】
別の態様において、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態においては、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ヒトｃ−ｍｅｔに結合する能力を保持する。特定の実施形態においては、配列番号７において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、変化、挿入および／または欠失されている。特定の実施形態においては、置換、挿入、または欠失はＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）中に存在する。場合により、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、配列番号７中のＶＨ配列、例えば、その配列の翻訳後改変を含む。
【０１３３】
別の態様において、抗体が配列番号８のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ｃ−ｍｅｔ抗体が提供される。特定の実施形態においては、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔに結合する能力を保持する。特定の実施形態においては、配列番号８において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。特定の実施形態においては、置換、挿入、または欠失はＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）中に存在する。場合により、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、配列番号８中のＶＬ配列、例えば、その配列の翻訳後改変を含む。
【０１３４】
さらに別の実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬ領域と、配列番号７のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨ領域とを含む。さらなる実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１３５】
別の態様において、抗体が上記で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＨ、および上記で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＬを含む抗ｃ−ｍｅｔ抗体が提供される。
【０１３６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で提供される抗ｃ−ｍｅｔ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の実施形態においては、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含む抗ｃ−ｍｅｔ抗体と同じエピトープに結合するか、またはそれにより競合的に阻害され得る抗体が提供される。
【０１３７】
本発明のさらなる態様において、上記実施形態のいずれかに記載の抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、モノクローナル抗体、例えば、一価、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。一実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、抗体断片、例えば、１アーム、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）2断片である。別の実施形態においては、抗体は、完全長抗体、例えば、無傷のＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体または本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。別の実施形態によれば、抗体は二特異的抗体である。一実施形態においては、二特異的抗体はＨＶＲを含むか、または上記のＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は一価であり、（ａ）配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を有する重鎖可変ドメイン、ＣＨ１配列、および第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＡＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号８）を有する軽鎖可変ドメイン、およびＣＬ１配列を含む第２のポリペプチド；ならびに（ｃ）第２のＦｃポリペプチドを含む第３のポリペプチドを含み（またはそれからなるか、もしくは本質的にそれからなる）、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは複合体として存在し、単一の抗原結合アームを形成し、第１および第２のＦｃポリペプチドは複合体で存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。いくつかの実施形態においては、第１のポリペプチドは、Ｆｃ配列：ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９）を含み、第２のポリペプチドは、Ｆｃ配列：ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）を含む。
【０１３９】
別の実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は一価であり、（ａ）配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１）を含む、重鎖を含む第１のポリペプチド；（ｂ）配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＡＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１２）を含む、軽鎖を含む第２のポリペプチド；および（ｃ）配列：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３）を含む、Ｆｃ配列を含む第３のポリペプチドを含み、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは複合体として存在し、単一の抗原結合アームを形成する。
【０１４０】
本発明の方法における使用にとって好適な他の抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、本明細書に記載されており、当業界で公知である。例えば、ＷＯ０５／０１６３８２に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体（限定されるものではないが、抗体１３．３．２、９．１．２、８．７０．２、８．９０．３など）；ＧｅｎｏａのＣＢＡにＩＣＬＣ番号ＰＤ０３００１として寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されるか、またはモノクローナル抗体により認識されるものと同じである、ＨＧＦ受容体のβ鎖の細胞外ドメイン上のエピトープを認識する抗ｃ−ｍｅｔ抗体；ＷＯ２００７／１２６７９９に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体（限定されるものではないが、０４５３６、０５０８７、０５０８８、０５０９１、０５０９２、０４６８７、０５０９７、０５０９８、０５１００、０５１０１、０４５４１、０５０９３、０５０９４、０４５３７、０５１０２、０５１０５、０４６９６、０４６８２など）；ＷＯ２００９／００７４２７に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体（限定されるものではないが、ＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅに、番号Ｉ−３７３１の下で２００７年３月１４日に、番号Ｉ−３７３２の下で２００７年３月１４日に、番号Ｉ−３７８６の下で２００７年７月６日に、番号Ｉ−３７２４の下で２００７年３月１４日に寄託された抗体など）；２０１１０１２９４８１に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体；ＵＳ２０１１０１０４１７６に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体；ＷＯ２００９／１３４７７６に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体；ＷＯ２０１０／０５９６５４に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体；ＷＯ２０１１０２０９２５に開示された抗ｃ−ｍｅｔ抗体（限定されるものではないが、ＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅに、番号Ｉ−３９４９の下で２００８年３月１２日に寄託されたハイブリドーマおよび番号Ｉ−４２７３の下で２０１０年１月１４日に寄託されたハイブリドーマから分泌される抗体など）である。
【０１４１】
一態様において、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、抗体断片内のＦｃ配列の、ホモダイマー化を最小化しながら、ヘテロダイマー化を促進する少なくとも１つの特徴を含む。（１つまたは複数の）そのような特徴は、免疫グロブリン集団の収率および／または純度および／または均一性を改善する。一実施形態においては、抗体は、ＷＯ２００５／０６３８１６に記載の「ノブ」および「ホール」を構成するＦｃ突然変異を含む。例えば、ホール突然変異は、Ｆｃポリペプチド中のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖの１つまたは複数であってよく、空洞突然変異はＴ３６６Ｗであってもよい。
【０１４２】
いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、抗肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）抗体、例えば、ヒト化抗ＨＧＦ抗体ＴＡＫ７０１、リロツムマブ、フィクラツズマブ、および／またはＷＯ２００７／１４３０９０に記載されたヒト化抗体２Ｂ８である。いくつかの実施形態においては、抗ＨＧＦ抗体は、ＵＳ７７１８１７４Ｂ２に記載された抗ＨＧＦ抗体である。
【０１４３】
いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔ小分子阻害剤である。小分子阻害剤は、好ましくはｃ−ｍｅｔに特異的に結合する本明細書で定義された結合ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子であるのが好ましい。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ小分子阻害剤は、選択的ｃ−ｍｅｔ小分子阻害剤である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、キナーゼ阻害剤である。
【０１４４】
ＨＧＦに特異的に結合するｃ−ｍｅｔ受容体分子またはその断片を、本発明の方法において用いて、例えば、ＨＧＦタンパク質に結合し、それを隔離することによって、そのシグナリングを防止することができる。好ましくは、ｃ−ｍｅｔ受容体分子、またはそのＨＧＦ結合断片は、可溶性形態である。いくつかの実施形態においては、可溶性形態の受容体は、ＨＧＦに結合することによりｃ−ｍｅｔタンパク質の生物活性に対する阻害効果を示し、それによって、それが標的細胞の表面上に存在するその天然の受容体に結合するのを防止する。また、例えば、以下に記載される、ｃ−ｍｅｔ受容体融合タンパク質も含まれる。
【０１４５】
本発明の可溶性ｃ−ｍｅｔ受容体タンパク質またはキメラｃ−ｍｅｔ受容体タンパク質は、膜貫通ドメインを介して細胞の表面に固定されていないｃ−ｍｅｔ受容体タンパク質を含む。そのようなものとして、キメラ受容体タンパク質などの可溶性形態のｃ−ｍｅｔ受容体は、ＨＧＦに結合し、これを不活化することができるが、膜貫通ドメインを含まず、かくして、一般的には分子が発現される細胞の細胞膜と会合するようにならない。例えば、Ｋｏｎｇ−Ｂｅｌｔｒａｎ，Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００４）６（１）：７５〜８４頁を参照されたい。
【０１４６】
ｃ−ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ−ｍｅｔの活性化を遮断するか、または減少させることによって、そのシグナリングを防止するＨＧＦ分子またはその断片を、本発明の方法において用いることができる。
【０１４７】
アプタマーは、ＨＧＦまたはｃ−ｍｅｔポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの作製および治療的使用は、当業界で定着している。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＨＧＦアプタマーは、細胞外ＨＧＦに結合させることができる三次元コンフォメーションを採用する、ペグ化改変オリゴヌクレオチドである。アプタマーに関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。
【０１４８】
ペプチボディは、免疫グロブリン分子の断片または一部をコードするアミノ酸配列に連結されたペプチド配列である。ポリペプチドを、限定されるものではないが、ファージディスプレイ技術などの、特異的結合のための任意の方法により選択された無作為化配列から誘導することができる。好ましい実施形態においては、選択されたポリペプチドを、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列に連結することができる。ＨＧＦまたはｃ−ｍｅｔに特異的に結合し、それと拮抗するペプチボディも、本発明の方法において有用である。
【０１４９】
一実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔ細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔキナーゼドメインに結合する。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−ｍｅｔ結合について競合する。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ＨＧＦに結合する。
【０１５０】
特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ＧＤＣ−０７１２、ＳＧＸ−５２３、クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６；３−［（１Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン；ＣＡＳ番号８７７３９９−５２−５）；ＪＮＪ−３８８７７６０５（ＣＡＳ番号９４３５４０−７５−８）、ＢＭＳ−６９８７６９、ＰＨＡ−６６５７５２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＵ５４１６、ＩＮＣ−２８０（Ｉｎｃｙｔｅ；ＳＵ１１２７４（Ｓｕｇｅｎ；［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド；ＣＡＳ番号６５８０８４−２３−２］）、フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）、ＸＬ８８０（ＣＡＳ番号８４９２１７−６４−７；ＸＬ８８０はｍｅｔおよびＶＥＧＦＲ２およびＫＤＲの阻害剤である）；ＭＧＣＤ−２６５（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ；ＭＧＣＤ−２６５はｃ−ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＲｏｎおよびＴｉｅ−２受容体を標的化する；ＣＡＳ番号８７５３３７−４４−３）、チバンチニブ（ＡＲＱ１９７；（−）−（３Ｒ，４Ｒ）−３−（５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）ピロリジン−２，５−ジオン；Ｍｕｎｃｈｉら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  Ｊｕｎｅ  ２０１０  ９；１５４４頁を参照されたい；ＣＡＳ番号９０５８５４−０２−６）、ＬＹ−２８０１６５３（Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ２８７５３５８（Ｌｉｌｌｙ）、ＭＰ−４７０、リロツムマブ（ＡＭＧ１０２、抗ＨＧＦモノクローナル抗体）、抗体２２３Ｃ４またはヒト化抗体２２３Ｃ４（ＷＯ２００９／００７４２７）、ヒト化Ｌ２Ｇ７（ヒト化ＴＡＫ７０１；ヒト化抗ＨＧＦモノクローナル抗体）；ＥＭＤ１２１４０６３（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｏｒｏｎｏ）、ＥＭＤ１２０４８３１（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＮＫ４、カボザンチニブ（ＸＬ−１８４、ＣＡＳ番号８４９２１７−６８−１；カボザンチニブはｍｅｔおよびＶＥＧＦＲ２の二重阻害剤である）、ＭＰ−４７０（ＳｕｐｅｒＧｅｎ；ｃ−ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲ、Ｆｌｔ３、およびＡＸＬの新規阻害剤である）、Ｃｏｍｐ−１、フィクラツズマブ（ＡＶ−２９９；抗ＨＧＦモノクローナル抗体）、Ｅ７０５０（Ｃａｓ番号１１９６６８１−４９−８；Ｅ７０５０はｃ−ｍｅｔおよびＶＥＧＦＲ２の二重阻害剤である（Ｅｓａｉ）；ＭＫ−２４６１（Ｍｅｒｃｋ；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド；ＣＡＳ番号９１７８７９−３９−１）；ＭＫ８０６６（Ｍｅｒｃｋ）、ＰＦ４２１７９０３（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＭＧ２０８（Ａｍｇｅｎ）、ＳＧＸ−１２６、ＲＰ１０４０、ＬＹ２８０１６５３、ＡＭＧ４５８、ＥＭＤ６３７８３０、ＢＡＹ−８５３４７４、ＤＰ−３５９���のいずれか１つである。特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、クリゾチニブ、チバンチニブ、カボザンチニブ、ＭＧＣＤ−２６５、フィクラツズマブ、ヒト化ＴＡＫ−７０１、リロツムマブ、フォレチニブ、ｈ２２４Ｇ１１、ＤＮ−３０、ＭＫ−２４６１、Ｅ７０５０、ＭＫ−８０３３、ＰＦ−４２１７９０３、ＡＭＧ２０８、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＥＭＤ１２０４８３１、ＩＮＣ−２８０、ＬＹ−２８０１６５３、ＳＧＸ−１２６、ＲＰ１０４０、ＬＹ２８０１６５３、ＢＡＹ−８５３４７４、および／またはＬＡ４８０のいずれか１つまたは複数である。特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、クリゾチニブ、チバンチニブ、カボザンチニブ、ＭＧＣＤ−２６５、フィクラツズマブ、ヒト化ＴＡＫ−７０１、リロツムマブ、および／またはフォレチニブのいずれか１つまたは複数である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ＧＤＣ−０７１２である。
【０１５１】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、当業界で公知であり、例えば、ソラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ−３６０３、ＧＳＫ２１１８４３６、ＧＤＣ−０８７９、Ｎ−（３−（５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル）−２，４−ジフルオロフェニル）プロパン−１−スルホンアミド、ならびにＷＯ２００７／００２３２５、ＷＯ２００７／００２４３３、ＷＯ２００９１１１２７８、ＷＯ２００９１１１２７９、ＷＯ２００９１１１２７７、ＷＯ２００９１１１２８０および米国特許第７，４９１，８２９号に記載のものが挙げられる。他のＢ−ｒａｆアンタゴニストとしては、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｏｂｒａｆ（登録商標）およびＰＬＸ−４０３２としても知られる）、ＧＳＫ２１１８４３６、ＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ２８１、ＡＲＱ７３６、ＢＡＹ７３−４５０６が挙げられる。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、選択的Ｂ−ｒａｆアンタゴニストである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００の選択的アンタゴニストである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅの選択的アンタゴニストである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ、および／またはＶ６００Ｄである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｒである。
【０１５２】
Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、小分子阻害剤であってもよい。小分子阻害剤は、好ましくは、Ｂ−ｒａｆに特異的に結合する、本明細書で定義されたポリペプチドまたは抗体以外の有機分子であるのが好ましい。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、キナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストは、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマーまたはポリヌクレオチドである。
【０１５３】
一実施形態においては、抗体、例えば、本明細書に記載の方法において用いられる抗体は、以下のセクション１〜６に記載のような特徴のいずれかを単独で、または組み合わせて含んでもよい。
【０１５４】
１．抗体断片
特定の実施形態においては、本明細書に提供される抗体は抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｖおよびｓｃＦｖ断片、１アーム抗体ならびに下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２６９〜３１５ページ（１９９４）を参照されたい。ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増大しているＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１５５】
ダイアボディは、二価または二重特異性のこともある２つの抗原結合部位のある抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）に記載されている。
【０１５６】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態においては、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【０１５７】
１アーム抗体（すなわち、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが単一の抗原結合アームを形成する）は、例えば、ＷＯ２００５／０６３８１６；Ｍａｒｔｅｎｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００６）、１２：６１４４頁に開示されている。アンタゴニスト機能を必要とする病理学的状態の処置のために、および抗体の二価性が望ましくないアゴニスト効果をもたらす場合、１アーム抗体（すなわち、単一の抗原結合アームを含む抗体）の一価形質は、標的分子への抗体の結合の際にアンタゴニスト機能をもたらす、および／または確保する。さらに、Ｆｃ領域を含む１アーム抗体は、類似する／実質的に同一の抗原結合特性を有するＦａｂ形態と比較して優れた薬物動態属性（増強された半減期および／または減少したｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス速度）を特徴とし、かくして、従来の一価Ｆａｂ抗体の使用における主な欠点を克服する。１アーム抗体を作製するための技術としては、限定されるものではないが、「ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」工学が挙げられる（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）。ＭｅｔＭＡｂは、１アーム抗体の例である。
【０１５８】
抗体断片は、本明細書に記載されているように、無傷の抗体のタンパク質消化および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
【０１５９】
２．キメラおよびヒト化抗体
特定の実施形態においては、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変えられている「クラス転換された」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合断片が含まれる。
【０１６０】
特定の実施形態においては、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトへの免疫原性を抑えるために親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持したままヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体由来でＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列由来である１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むことになる。いくつかの実施形態においては、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１６１】
ヒト化抗体およびそれを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）で概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５〜３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植法を記載している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３〜６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１〜６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２〜２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。
【０１６２】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３））；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））；ヒト成熟（体細胞的に変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８））；およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることに由来するフレームワーク領域（Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８〜１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１〜２２６１８（１９９６））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
３．ヒト抗体
特定の実施形態においては、本明細書に提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は当技術分野で公知の種々の技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的には、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８〜７４（２００１）ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０〜４５９（２００８）に記載されている。
【０１６４】
ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有する無傷のヒト抗体または無傷の抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製し得る。そのような動物は典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有しており、その遺伝子座は内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わる、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中に無作為に取り込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般的には不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７〜１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および米国特許第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物により産生される無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変し得る。
【０１６５】
ヒト抗体はハイブリドーマベースの方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３ページ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体も、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７〜３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５〜２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されている方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ（Ｔｒｉｏｍａ）技術）も、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７〜９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５〜９１（２００５）に記載されている。
【０１６６】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても産生し得る。次に、そのような可変ドメイン配列は所望のヒト定常ドメインと組み合わせ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技法は下に記載されている。
【０１６７】
４．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、１種または複数の所望の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離し得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法は当技術分野では公知である。そのような方法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）で概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９２）；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１〜１７５（Ｌｏ編  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９〜１３２（２００４）にさらに記載されている。
【０１６８】
ある種のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換えられ、これは次に抗原結合ファージを求めてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで抗体断片を提示する。免疫源由来のライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要することなく免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代わりに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２：７２５〜７３４（１９９３）により記載されているように、未処置のレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）いかなる免疫化もせずに広範な非自己抗原および自己抗原にも単一源の抗体を提供することができる。最後に、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１〜３８８（１９９２）により記載されているように、幹細胞から再配列されていないＶ−遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再配列を実現するランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号、および米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１６９】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１７０】
５．多特異的抗体
特定の実施形態においては、本明細書に提供される抗体は多特異的抗体、例えば、二重特異的抗体である。多特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態においては、結合特異性の１つはｃ−ｍｅｔに対してであり、もう１つは他の任意の抗原（例えば、Ｂ−ｒａｆ）に対してである。特定の実施形態においては、二重特異的抗体はｃ−ｍｅｔの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異的抗体を使用して、細胞傷害性薬剤をｃ−ｍｅｔを発現する細胞に局在化させてもよい。二重特異的抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０１７１】
多特異的抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）参照）、および「ノブインホール」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号参照）が含まれるが、これらに限定されない。抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作する（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つまたはそれよりも多い抗体または断片を架橋する（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異的抗体を産生する（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）参照）；二重特異的抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用する（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）参照）；ならびにＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異的抗体を調製することにより、多特異的抗体を作製してもよい。
【０１７２】
「オクタパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多い機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１参照）。
【０１７３】
本明細書の抗体または断片には、ｃ−ｍｅｔおよびＥＧＦＲなどの別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０参照）。
【０１７４】
６．抗体バリアント
特定の実施形態においては、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が想定される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体を、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによるか、またはペプチド合成により調製することができる。そのような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはその中への挿入および／またはその置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを作製して、最終構築物を達成することができる。
【０１７５】
特定の実施形態においては、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換的突然変異誘発のための対象部位としては、ＨＶＲおよびＦＲが挙げられる。アミノ酸置換を対象の抗体中に導入し、その産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
【０１７６】
１つの型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる試験のために選択される（１つまたは複数の）得られる変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）における改変（例えば、改善）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて都合良く生成することができる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、１つまたは複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、バリアント抗体をファージ上に展示させ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１７７】
アミノ酸配列挿入物としては、１残基から、１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が挙げられる。末端挿入物の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体のＮもしくはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）との融合物または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドが挙げられる。
【０１７８】
特定の実施形態においては、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加するまたは減少するように変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または削除は、１つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現し得る。
【０１７９】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物を変化させ得る。哺乳動物細胞により産生された未処置の抗体は典型的には、一般的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６〜３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造体の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含むことがある。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを生み出すためになされ得る。
【０１８０】
一実施形態においては、Ｆｃ領域に結合している（直接的にまたは間接的に）フコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％まででもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合している全てのグリコ構造体（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造体）の合計と比べたＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域のおおよそ２９７位（Ｆｃ残基のＥｕ番号付け）に位置しているアスパラギン残基のことであるが、Ａｓｎ２９７は、抗体中の小さな配列変動のせいで、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位〜３００位までの間に位置していることもある。そのようなフコシル化バリアントは改善されたＡＤＣＣ機能を有することがある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「デフコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」または「フコース欠損」抗体バリアントに関係する出版物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９〜１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。デフコシル化抗体を産生することができる細胞系の例には、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３〜５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）；およびアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞系（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４ページ（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０〜６８８（２００６）；およびＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。
【０１８１】
二分されたオリゴ糖を有する、すなわち、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている抗体バリアントがさらに提供される。そのような抗体バリアントは減少したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；およびＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１８２】
特定の実施形態においては、１つまたは複数のアミノ酸改変を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを産生し得る。前記Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８３】
特定の実施形態においては、本発明は、いくつかのしかし全てではないエフェクター機能を有する抗体バリアントであって、そのエフェクター機能のおかげで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期は重要であるがある種のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）は必要ではないまたは有害である適用のための望ましい候補になる抗体バリアントを想定している。
【０１８４】
エフェクター機能が減少した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つまたは複数の置換がある抗体が含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換があるいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位のうちの２つまたはそれよりも多い位での置換のあるＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１８５】
ＦｃＲｓへの結合が改善されているまたは減少しているある種の抗体バリアントは記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）参照）。
【０１８６】
特定の実施形態においては、抗体バリアントはＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、および／または３３４位での置換のあるＦｃ領域を含む（残基のＥＵ番号付け）。
【０１８７】
いくつかの実施形態においては、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４（２０００）に記載されているように、変化した（すなわち、改善されたまたは減少した）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域においてなされる。
【０１８８】
半減期が増加し、母性ＩｇＧの胎児への移行の原因となる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体はＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つまたは複数の置換がその中にあるＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つまたは複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換のあるＦｃバリアントが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１８９】
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８〜４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１９０】
特定の実施形態においては、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作り出すのが望ましいことがある。特定の実施形態においては、置換される残基は抗体の接触可能部位に存在する。さらに本明細書で説明されるように、それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に置かれ、この基を使用して抗体を、薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを作り出し得る。特定の実施形態においては、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数をシステインで置換し得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載される通りに産生し得る。
【０１９１】
特定の実施形態においては、本明細書で提供される抗体は、当業界で公知であり、容易に利用可能であるさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化にとって好適な部分としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーもしくはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびその混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分枝しているか、または分枝していなくてもよい。抗体に結合されるポリマーの数は、変化してもよく、２つ以上のポリマーが結合される場合、それらは同じか、または異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために用いられるポリマーの数および／または型を、限定されるものではないが、改善しようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体を規定の条件下での療法において用いることができるかどうかなどの考慮に基づいて決定することができる。
【０１９２】
別の実施形態においては、放射線への曝露により選択的に加熱することができる抗体および非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態においては、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００〜１１６０５頁（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってもよく、限定されるものではないが、通常の細胞を害しないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近い細胞が殺傷される温度まで加熱する波長が挙げられる。
【０１９３】
一実施形態においては、薬剤は、化学療法剤または薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体などの、１つまたは複数の細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗体（ｃ−ｍｅｔ抗体など）を含む免疫コンジュゲートである。
【０１９４】
一実施形態においては、免疫コンジュゲートは、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０  ４２５  ２３５Ｂ１参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および米国特許第５，７８０，５８８号および米国特許第７，４９８，２９８号参照）；ドラスタチン；カリチアマイシンもしくはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号、および米国特許第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６〜３３４２（１９９３）；およびＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５〜２９２８（１９９８）参照）；ダウノマイシンもしくはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７〜５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８〜３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７〜７２１（２００５）；Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９〜８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９〜１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６〜４３４３（２００２）；および米国特許第６，６３０，５７９号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキシル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の薬物に抗体がコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０１９５】
別の実施形態においては、免疫コンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むがこれらの限定されない酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
【０１９６】
別の実施形態においては、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には種々の放射性同位元素が利用可能である。例には、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212およびＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）用のスピン標識を含むことがある。
【０１９７】
抗体と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシニミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアン酸（例えば、トルエン２，６−ジイソシアン酸）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二機能的タンパク質カップリング剤を使用して作製し得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載される通りに調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例となるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。前記リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬の放出を促進する「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７〜１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【０１９８】
本明細書の免疫コンジュゲートまたはＡＤＣは、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）を含むがこれらの限定されない架橋剤試薬で調製されたそのようなコンジュゲートを明確に想定しているが、これらに限定されない。
【０１９９】
化学療法剤
本発明の組合せ療法は、１つまたは複数の化学療法剤を用いる処置をさらに含んでもよい。組合せ投与は、別々の製剤または単一の医薬製剤を用いる、同時投与または併用投与、およびいずれかの順序での連続的投与を含み、両方（または全部）の活性薬剤がその生物活性を同時に発揮する期間が存在するのが好ましい。投与される場合、化学療法剤は通常、それについて公知である用量、または場合により、薬剤の組合せ作用もしくは化学療法剤の投与に起因する負の副作用のため低下させた用量で投与される。そのような化学療法剤の調製および投与スケジュールは、製造業者の指示書に従って、または当業者により経験的に決定された通りに使用することができる。
【０２００】
組み合わせることができる様々な化学療法剤が上記に開示されている。いくつかの実施形態においては、組み合わされる化学療法剤は、タキソイド（ドセタキセルおよびパクリタキセルなど）、ビンカ（ビノレルビンもしくはビンブラスチンなど）、白金化合物（カルボプラチンもしくはシスプラチンなど）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストラゾール、もしくはエキセメスタンなど）、抗エストロゲン剤（例えば、フルベストラントもしくはタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキサート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、またはプロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、化学療法剤は、テモゾロミドおよび／またはダカルバジンである。
【０２０１】
ＩＩＩ．組合せ療法
一態様において、有効（例えば、治療上有効）量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、癌を有する患者を処置するための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、抗ｃ−ｍｅｔ抗体（例えば、ＭｅｔＭＡｂ）である。いくつかの実施形態においては、処置は、ベムラフェニブなどのＢ−ｒａｆアンタゴニストを組み合わせた抗ｃ−ｍｅｔ抗体（例えば、ＭｅｔＭＡｂ）を投与することを含む。いくつかの実施形態においては、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ＭｅｔＭＡｂ（オナルツズマブ）である。
【０２０２】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる可能性が増加した癌患者を処置するための方法が提供される。
【０２０３】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを癌患者に投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する感受性を増加させるための方法が提供される。
【０２０４】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを癌患者に投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する感受性を回復させるための方法が提供される。
【０２０５】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを癌患者に投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト感受性の期間を延長させるための方法が提供される。
【０２０６】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆ耐性癌を有する患者を処置するための方法が提供される。
【０２０７】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する応答を延長させるための方法が提供される。
【０２０８】
別の態様において、有効量のＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、ＨＧＦ媒介性Ｂ−ｒａｆ耐性癌の発生を遅延させるか、または防止する方法が提供される。
【０２０９】
別の態様において、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定すること、ならびに患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（例えば、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー）を発現することが示された癌を有する患者を処置するための方法が提供される。
【０２１０】
別の態様において、（ｉ）患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を生じるかどうかを決定するためにｂ−ｒａｆアンタゴニストで処置される患者をモニタリングすること、ならびに（ｉｉ）患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現することが示される場合、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに加えて、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含むように患者の処置レジメンを改変することを含む、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（例えば、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー）を発現することが示された癌を有する患者を処置するための方法が提供される。
【０２１１】
別の態様において、（ｉ）患者の癌がＢ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じるかどうかを決定するためにＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置される患者をモニタリングすること、（ｉｉ）患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するために患者を試験すること、および（ｉｉｉ）患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現することが示される場合、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに加えて、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含むように患者の処置レジメンを改変することを含む、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（例えば、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー）を発現することが示された癌を有する患者を処置するための方法が提供される。
【０２１２】
用語「癌」は、限定されるものではないが、前癌性増殖、良性腫瘍、および悪性腫瘍などの、増殖性障害の集合を包含する。良性腫瘍は、出現部位に局在化したままであり、遠隔部位に浸潤、侵襲、または転移する能力を有さない。悪性腫瘍は、それらの周囲の他の組織に侵襲し、これを損傷する。それらはまた、通常は血流を介して、またはリンパ節が位置するリンパ系を介して、出現部位から剥離し、身体の他の部分に拡散する（転移する）能力を獲得することがある。原発腫瘍は、それらが生じる組織の型により分類される；転移性腫瘍は、癌細胞が誘導される組織型により分類される。時間と共に、悪性腫瘍の細胞は、より異常になり、正常細胞とは異なって見える。癌細胞の出現におけるこの変化は、腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は高分化型（低悪性度）、中分化型、低分化型、または未分化型（高悪性度）であると記載される。高分化型細胞は、全く正常な外見であり、それらが起源とする正常細胞と似ている。未分化型細胞は、細胞の起源を決定することが最早できないほど異常になった細胞である。
【０２１３】
癌の段階評価システムは、癌が解剖学的にどれぐらい遠くに拡散したかを記載するものであり、同様の予後および処置を用いる患者を同じ段階評価群に置くよう試みるものである。生検ならびに特定の画像化試験、例えば、胸部Ｘ線、マンノグラム、骨スキャン、ＣＴスキャン、およびＭＲＩスキャンなどのいくつかの試験を実施して、癌を段階評価するのを助けることができる。また、血液試験および臨床評価を用いて、患者の健康全般を評価し、癌が特定の器官に拡散したかどうかを検出する。
【０２１４】
癌を段階評価するために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒは、癌、特に固形腫瘍を、ＴＮＭ分類システムを用いる文字カテゴリーに初めて入れている。癌は、文字Ｔ（腫瘍サイズ）、Ｎ（触診可能なリンパ節）、および／またはＭ（転移）を指定される。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、およびＴ４は、原発病変のサイズの増加を記載する；Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３はリンパ節転移の進行を示す；ならびにＭ０およびＭ１は遠隔転移の非存在または存在を反映する。
【０２１５】
Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｔａｇｅ  ＧｒｏｕｐｉｎｇまたはＲｏｍａｎ  Ｎｕｍｅｒａｌ  Ｓｔａｇｉｎｇとしても知られる第２の段階評価方法においては、癌は、原発病変のサイズならびにリンパ節拡散および遠隔転移の存在を含む、ステージ０〜ＩＶに分割される。このシステムにおいては、症例はＲｏｍａｎ  ＮｕｍｅｒａｌのＩ〜ＩＶにより示される４つのステージにグループ化されるか、または「再発」と分類される。ｉｎ  ｓｉｔｕでの腺管癌または乳癌についてはｉｎ  ｓｉｔｕでの小葉癌などの、いくつかの癌については、ステージ０は「ｉｎ  ｓｉｔｕ」または「Ｔｉｓ」と呼ばれる。高悪性度アデノーマも、ステージ０として分類することができる。一般に、ステージＩの癌は、通常は治癒可能である小さい局在化された癌であるが、ステージＩＶは通常、手術不可能であるか、または転移癌を表す。ステージＩＩおよびＩＩＩの癌は通常、局部的に進行し、および／または局部リンパ節の転移を示す。一般に、ステージの数字が大きいほど、より広範囲の疾患を示し、例えば、腫瘍サイズが大きくなり、ならびに／または近隣のリンパ節および／もしくは原発腫瘍に隣接する器官への癌の拡散が多くなる。これらのステージは、正確に定義されるが、その定義は癌のそれぞれの種類について異なり、当業者には公知である。
【０２１６】
ＮＣＩ’ｓ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、およびＥｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＥＥＲ）などの多くの癌登録は、段階評価概要を用いる。このシステムは、あらゆる型の癌について用いられる。それは癌症例を５つの主要なカテゴリーにグループ化する。
【０２１７】
「ｉｎ  ｓｉｔｕ」は、それが始まった細胞層中にのみ存在する初期癌である。
【０２１８】
「限局性（Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）」は、拡散の証拠がなく、それが始まった器官に限定される癌である。
【０２１９】
「局所性（Ｒｅｇｉｏｎａｌ）」は、出現（原発）部位を超えて近隣のリンパ節または器官および組織に拡散した癌である。
【０２２０】
「遠隔（Ｄｉｓｔａｎｔ）」は、原発部位から遠隔器官または遠隔リンパ節に拡散した癌である。
【０２２１】
「不明（Ｕｎｋｎｏｗｎ）」は、ステージを示すための十分な情報がない症例を記載するために用いられる。
【０２２２】
さらに、原発腫瘍が除去された後、数ヶ月または数年で戻ることが、癌にとって一般的である。全ての眼に見える腫瘍が根絶された後に再発する癌は、再発疾患と呼ばれる。原発腫瘍の領域で再発する疾患は限局性再発であり、転移として再発する疾患は遠隔再発と呼ばれる。
【０２２３】
腫瘍は、固形腫瘍または非固形腫瘍または軟部組織腫瘍であってもよい。軟部組織腫瘍の例としては、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病、またはヘアリー細胞白血病）またはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、またはホジキン病）が挙げられる。固形腫瘍としては、血液、骨髄、またはリンパ系以外の体組織の任意の癌が挙げられる。固形腫瘍は、上皮細胞起源のものと非上皮細胞起源のものとにさらに分けることができる。上皮細胞固形腫瘍の例としては、胃腸管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭部および頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、および皮膚の腫瘍が挙げられる。非上皮起源の固形腫瘍としては、肉腫、脳腫瘍、および骨腫瘍が挙げられる。いくつかの実施形態においては、癌はメラノーマ（例えば、Ｂ−ｒａｆ突然変異体メラノーマ）である。いくつかの実施形態においては、癌は結腸直腸癌である。いくつかの実施形態においては、癌は乳癌（例えば、Ｈｅｒ２陽性乳癌）である。いくつかの実施形態においては、癌は甲状腺乳頭癌である。癌の他の例は、定義に提供されている。
【０２２４】
いくつかの実施形態においては、患者の癌はＢ−ｒａｆバイオマーカーを発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーはＢ−ｒａｆ突然変異体である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅである。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、構成的に活性である。
【０２２５】
いくつかの実施形態においては、患者の癌は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現することが示されている。ｃ−ｍｅｔ活性および発現の検出は、本明細書に記載されている。
【０２２６】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ耐性癌とは、癌患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト療法を受けているが進行した（すなわち、患者が「Ｂ−ｒａｆ不応性」である）か、または患者がＢ−ｒａｆアンタゴニストに基づく療法レジメンを完了した後、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月以上以内に進行したことを意味する。
【０２２７】
いくつかの実施形態においては、ベムラフェニブ耐性癌とは、癌患者がベムラフェニブに基づく療法を受けているが進行した（すなわち、患者が「ベムラフェニブ不応性」である）か、または患者がＢ−ｒａｆアンタゴニストに基づく療法レジメンを完了した後、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月以上以内に進行したことを意味する。
【０２２８】
いくつかの実施形態においては、例えば、Ｂ−ｒａｆ阻害剤に対する耐性は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置後に、または例えば、ＨＧＦへの曝露後（例えば、ＨＧＦ媒介性耐性）に生じる（獲得される）。他の実施形態においては、患者（例えば、Ｂ−ｒａｆ耐性癌を有する患者）は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで以前に処置されている。
【０２２９】
いくつかの実施形態においては、患者は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで現在処置されている。いくつかの実施形態においては、患者は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで以前に処置されていた。いくつかの実施形態においては、患者は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで以前に処置されていなかった。
【０２３０】
一態様において、癌患者はさらなる癌薬剤で処置される。いくつかの実施形態においては、さらなる癌薬剤は、化学療法剤である。いくつかの実施形態においては、さらなる癌薬剤は、Ｙｅｒｖｏｙである。いくつかの実施形態においては、さらなる癌薬剤は、癌免疫療法剤である。いくつかの実施形態においては、さらなる癌薬剤は、異なる（さらなる）Ｂ−ｒａｆアンタゴニストである。いくつかの実施形態においては、さらなる癌薬剤は、異なる（さらなる）ｃ−ｍｅｔアンタゴニストである。
【０２３１】
一態様において、癌細胞に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含有させることにより、前記細胞におけるＢ−ｒａｆリン酸化を減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞はｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３２】
一態様において、癌細胞をＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストと接触させることを含む、前記細胞におけるＰＩ３Ｋ媒介性シグナリングを減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３３】
一態様において、癌細胞に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含有させることにより、前記細胞におけるＰＩ３Ｋ媒介性シグナリングを減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３４】
一態様において、癌細胞に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含有させることにより、前記細胞におけるＭＡＰｋ媒介性シグナリングを減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３５】
一態様において、癌細胞に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含有させることにより、前記細胞におけるＡＫＴ媒介性シグナリングを減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３６】
一態様において、癌細胞に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含有させることにより、前記細胞におけるＥＲＫ媒介性シグナリングを減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３７】
一態様において、癌細胞に、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを含有させることにより、前記細胞におけるＢ−ｒａｆ媒介性シグナリングを減少させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３８】
一態様において、癌細胞を、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストと接触させることを含む、癌細胞の成長および／もしくは増殖を減少させるか、または癌細胞のアポトーシスを増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２３９】
一態様において、癌細胞を、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストと接触させることを含む、癌細胞のアポトーシスを増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、細胞は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じている）。いくつかの実施形態においては、細胞は、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する。
【０２４０】
本発明において用いられる治療剤を、良好な医療実務と一致する様式で製剤化、投薬、および投与することができる。この文脈での考慮のための因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の対象、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、組み合わされる薬剤の薬物間相互作用、および医師にとって公知の他の因子が挙げられる。
【０２４１】
治療製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、当業界で公知の標準的な方法を用いて調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版）、Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。許容される担体としては、塩水、またはリン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対抗イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２４２】
場合により、であるが好ましくは、製剤は、好ましくはほぼ生理学的な濃度の、薬学的に許容される塩、好ましくは、塩化ナトリウムを含有する。場合により、本発明の製剤は、薬学的に許容される保存剤を含有してもよい。いくつかの実施形態においては、保存剤の濃度は、０．１〜２．０％、典型的には、ｖ／ｖである。好適な保存剤としては、製薬業界で公知のものが挙げられる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、およびプロピルパラベンが好ましい保存剤である。場合により、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度の薬学的に許容される界面活性剤を含んでもよい。
【０２４３】
また、本明細書に記載の製剤は、処置される特定の適応症にとって必要な１つより多い活性化合物、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含んでもよい。そのような分子は、好適には、意図される目的にとって有効である量で一緒に存在する。
【０２４４】
活性成分を、例えば、液滴形成技術によるか、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕捉することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上掲に開示されている。
【０２４５】
本発明の治療剤は、ボーラスとして、もしくは一定期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下、経口、局所、または吸入経路などによる公知の方法に従って、ヒト患者に投与される。治療適用のためにｅｘ  ｖｉｖｏ戦略を用いることもできる。ｅｘ  ｖｉｖｏ戦略は、対象から得られた細胞に、ｃ−ｍｅｔまたはＢ−ｒａｆアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトまたは形質導入することを含む。次いで、トランスフェクトまたは形質導入された細胞を、対象に戻す。この細胞は、限定されるものではないが、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、もしくはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、または筋肉細胞などの幅広い範囲の細胞型のいずれかであってよい。
【０２４６】
例えば、ｃ−ｍｅｔまたはＢ−ｒａｆアンタゴニストが抗体である場合、抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻内、ならびに必要に応じて、局部免疫抑制処置のためには、病変内投与などの任意の好適な手段により投与される。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。さらに、抗体は、特に抗体の用量を減少させながら、パルス注入により好適に投与される。好ましくは、投薬は、投与が簡単であるか、または慢性的であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは、静脈内または皮下注射により与えられる。
【０２４７】
別の例においては、ｃ−ｍｅｔまたはＢ−ｒａｆアンタゴニスト化合物は、局部的に、例えば、障害または腫瘍の位置が許す場合、直接注射により投与され、注射は定期的に繰り返してもよい。ｃ−ｍｅｔまたはＢ−ｒａｆアンタゴニストを、対象に全身的に送達するか、または腫瘍細胞、例えば、腫瘍または腫瘍の外科的切除後の腫瘍床に直接送達して、局部再発または転移を防止するか、または減少させることもできる。
【０２４８】
組合せでの治療剤の投与は、典型的には、規定の期間（通常、選択された組合せに応じて、数分、数時間、数日または数週間）にわたって実行される。組合せ療法は、連続的様式でのこれらの治療剤の投与を包含することが意図される、すなわち、それぞれの治療剤は、異なる時間で投与され、ならびにこれらの治療剤、または少なくとも２つの治療剤の投与は実質的に同時的様式で行われる。
【０２４９】
治療剤を、同じ経路により、または異なる経路により投与することができる。例えば、組合せ中のＢ−ｒａｆおよび／またはｃ−ｍｅｔアンタゴニストを、静脈内注射により投与することができるが、組合せ中のタンパク質キナーゼ阻害剤を経口投与することができる。あるいは、例えば、両方の治療剤を、経口投与するか、または両方の治療剤を、特定の治療剤に応じて静脈内注射により投与することができる。治療剤が投与される順序はまた、特定の薬剤に応じて変化する。
【０２５０】
疾患の型および重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ）の各治療剤が、例えば、１回もしくは複数回の個別投与による場合であっても、または連続注入による場合であっても、患者への投与のための初期候補用量である。典型的な日用量は、上記因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上である。状態に応じて、数日以上にわたる反復投与のために、上記の方法により測定された場合に、癌が処置されるまで処置が持続される。しかしながら、他の用量レジメンも有用であり得る。一例においては、ｃ−ｍｅｔまたはＢ−ｒａｆアンタゴニストが抗体である場合、本発明の抗体は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、２〜３週間毎に投与される。ｃ−ｍｅｔまたはＢ−ｒａｆアンタゴニストが経口の小分子化合物である場合、薬剤を約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与することができる。さらに、本発明の経口化合物を、伝統的な高用量間欠的レジメンを用いて、またはスケジュール化された中断がないより低く、より頻繁な用量を用いて（「メトロノーム療法」と呼ばれる）投与することができる。間欠的レジメンを用いる場合、例えば、薬剤を、日用量および特定の適応症に応じて、２〜３週間にわたって毎日、次いで１週間の中断；または４週間にわたって毎日、次いで２週間の中断で与えることができる。本発明の療法の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２５１】
本出願は、遺伝子療法によるｃ−ｍｅｔおよび／またはＢ−ｒａｆアンタゴニストの投与を想定する。例えば、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用に関する１９９６年３月１４日に公開されたＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０２５２】
ＩＶ．診断方法
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の患者は、例えば、療法の前および／または間および／または後に、診断試験にかけられる。
【０２５３】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性があることを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（Ｂ−ｒａｆ突然変異体など）を発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はタンパク質発現であり、ＩＨＣを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストで処置される。
【０２５４】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者がＢ−ｒａｆ耐性癌を生じる可能性があることを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（Ｂ−ｒａｆ突然変異体など）を発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はタンパク質発現であり、ＩＨＣを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストで処置される。
【０２５５】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現を決定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現するかどうかを決定するステップを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現が、患者が、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性を増加させるため、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性を回復させるため、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する患者の癌の感受性の期間を延長するため、および／または患者の癌におけるＨＧＦ媒介性Ｂ−ｒａｆ薬剤耐性の発生を防止するための、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置の候補であることを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（Ｂ−ｒａｆ突然変異体など）を発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現はタンパク質発現であり、ＩＨＣを用いて患者に由来する試料中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストで処置される。
【０２５６】
本発明はまた、Ｂ−ｒａｆバイオマーカー（例えば、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー）を発現することが示された癌を有する患者のための療法を選択する方法であって、患者に由来する試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定すること、およびバイオマーカーの発現レベルに基づいて癌薬剤を選択することを含む方法に関する。一実施形態においては、癌試料がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わせたｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を用いる処置のために患者が選択される。いくつかの実施形態においては、患者は、治療上有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いて癌について処置される。かくして、いくつかの実施形態においては、患者の癌試料がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を用いる処置のために患者が選択され、（選択後）、患者は治療上有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いて癌について処置される。別の実施形態においては、癌試料が実質的に検出不可能なレベルのｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト以外の癌薬剤を用いる処置のために患者が選択される。いくつかの実施形態においては、患者は、治療上有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニスト以外の癌薬剤を用いて癌について処置される（例えば、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストを用いて処置される）。かくして、いくつかの実施形態においては、癌試料が実質的に検出不可能なレベルでｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト以外の癌薬剤（例えば、Ｂ−ｒａｆアンタゴニスト、例えば、ベムラフェニブ）を用いる処置のために患者が選択され、（選択後）、患者は治療上有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いて癌について処置される。
【０２５７】
別の態様において、本発明は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストおよびｃ−ｍｅｔアンタゴニストを用いる処置の候補として患者を同定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現すると決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置（以前に処置）されている。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、前記Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対して耐性である（例えば、耐性を獲得している）。
【０２５８】
別の態様において、本発明は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストに対する耐性を生じる危険性がある患者を同定するための方法であって、患者の癌がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現すると決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態においては、患者はＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置（以前に処置）されている。いくつかの実施形態においては、患者は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストで処置される。
【０２５９】
一態様において、本発明は、メラノーマ患者の予後を決定するための方法であって、患者に由来する試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定することを含み、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーがＨＧＦであり、ＨＧＦの発現が対象における癌の予後である、方法を提供する。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現の増加は、例えば、患者がＢ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ）で処置した場合の無進行生存および／または全生存の減少の予後である。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、患者血清中で決定される。いくつかの実施形態においては、患者血清中のＨＧＦ発現は、中央ＨＧＦ発現レベル（集団中での中央ＨＧＦ発現レベルなど）よりも上である。いくつかの実施形態においては、患者血清中のＨＧＦ発現は、例えば、約３３０ｎｇ／ｍｌよりも上である。いくつかの実施形態においては、患者血清中のＨＧＦ発現は、約３００ｎｇ／ｍｌ、３１０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌ、３３０ｎｇ／ｍｌ、３４０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３６０ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、３８０ｎｇ／ｍｌ、３９０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４２０ｎｇ／ｍｌ、４４０ｎｇ／ｍｌ、４６０ｎｇ／ｍｌ、４８０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ以上よりも上である。いくつかの実施形態においては、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストを用いる処置のために患者が選択される。いくつかの実施形態においては、患者は、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストおよびＢ−ｒａｆアンタゴニストで処置される。ＨＧＦ発現は、例えば、ＩＨＣ（例えば、または腫瘍もしくは腫瘍間質）により検出される。
【０２６０】
ｃ−ｍｅｔ発現、活性化および増幅の検出のための方法は、当業界で公知である。一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、（ａ）抗ｃ−ｍｅｔ抗体を用いる試料（患者癌試料など）のＩＨＣ分析を実施すること；および（ｂ）試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ染色強度は、参照値と比較して決定される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣまたは例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて決定される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５、およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、例えば、本明細書の表Ａに開示されるｃ−ｍｅｔ染色強度スコアリングスキームを用いて決定される。いくつかの実施形態においては、方法は、ＩＨＣスコアに基づいて患者を階層化することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、ＩＨＣスコアは、１である。いくつかの実施形態においては、ＩＨＣスコアは０であり、ｃ−ｍｅｔ発現が患者の癌において観察される。
【０２６１】
いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ発現はポリヌクレオチド発現である。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態においては、患者の癌は、２より大きい、３より大きい、４より大きい、５より大きい、６より大きい、７より大きい、８より大きい、またはそれ以上のｃ−ｍｅｔコピー数（例えば、ＦＩＳＨ分析による）を発現することが示されている。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔコピー数は、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満である。
【０２６２】
ＨＧＦを本発明の方法に従って検出することができることが想定される。かくして、いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーはＨＧＦであり、さらなる実施形態においては、ＨＧＦ発現は自己分泌発現である。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は患者の癌において検出される。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は、患者の腫瘍間質において検出される。いくつかの実施形態においては、ＨＧＦ発現は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、患者血清中で検出される。
【０２６３】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、試料（患者の癌試料など）中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定するステップを含み、患者の試料が抗ｃ−ｍｅｔ抗体を用いてＩＨＣ分析にかけられた試料である、方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣ染色強度は、参照値と比較して決定される。いくつかの実施形態においては、多量のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ｃ−ｍｅｔ  ＩＨＣまたは例えば、ＥＬＩＳＡもしくはＩＨＣを用いるＨＧＦの検出を用いて検出される）は、患者がＢ−ｒａｆアンタゴニスト耐性癌を有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５、およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低い、中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された中程度の、または高いｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔは、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された低いか、または全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、「低い」ｃ−ｍｅｔ発現は、例えば、本明細書に記載の対照細胞ペレットＡ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１１５５およびＨＥＫ−２９３のｃ−ｍｅｔ染色強度と比較して決定された全くないｃ−ｍｅｔ発現である。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、例えば、本明細書の表Ａに開示されるｃ−ｍｅｔ染色強度スコアリングスキームを用いて決定される。
【０２６４】
いくつかの実施形態においては、ＩＨＣ分析は、その前またはその後に、形態学的染色をさらに含む。一実施形態においては、ヘマトキシリンは、スライドの細胞核を染色するのに有用である。ヘマトキシリンは広く利用されている。好適なヘマトキシリンの例は、ヘマトキシリンＩＩ（Ｖｅｎｔａｎａ）である。より明るい青色の核が望まれる場合、ヘマトキシリン染色の後に青味剤を用いることができる。ＩＨＣを用いるｃ−ｍｅｔバイオマーカーの検出が本明細書に開示され、ｃ−ｍｅｔ染色強度スコアリングスキームが、本明細書、例えば、表Ａに開示される。本明細書に記載されるように、他のバイオマーカーを検出することができる。例示的な他のバイオマーカーは、本明細書に開示される。本明細書に開示される本発明のいずれかのいくつかの実施形態においては、高いｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、本明細書の表Ａに従って定義されたｍｅｔ診断陽性の臨床状態である。本明細書に開示される本発明のいずれかのいくつかの実施形態においては、低いｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、本明細書の表Ａに従って定義されたｍｅｔ診断陰性の臨床状態である。
【０２６５】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、（ａ）ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ホスホ−ＥＬＩＳＡ、ホスホ−ｍｅｔ抗体を用いるＩＨＣ、抗ＨＧＦ抗体を用いるＩＨＣのうちの１つまたは複数を実施すること；および（ｂ）試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ＨＧＦなど）の発現を決定することを含む方法を用いて決定される。
【０２６６】
一態様において、ｃ−ｍｅｔ活性化は、（ａ）ホスホ−ｃ−ｍｅｔ抗体を用いるＩＨＣまたはホスホ−ＥＬＩＳＡのうちの１つまたは複数を実施すること；および（ｂ）試料中のホスホ−ｃ−ｍｅｔバイオマーカー（例えば、ホスホ−ｃ−ｍｅｔ）の存在を決定することを含む方法を用いて決定される。
【０２６７】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、ｃ−ｍｅｔの下流のシグナリング経路分子の発現または活性化、例えば、ＡＫＴ（例えば、ホスホ−ＡＫＴ）の発現または活性化、ＥＲＫ（例えば、ホスホ−ＥＲＫ）の発現または活性化を決定するステップを含む方法を用いて決定される。
【０２６８】
一態様において、ｃ−ｍｅｔバイオマーカー発現は、（ａ）試料（患者癌試料など）に対して遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲもしくは対立遺伝子特異的ＰＣＲなど）、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、Ｔａｑ−ｍａｎ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＨＧＦ  ｍＲＮＡに関する）、ＩＨＣ（例えば、ｃ−ｍｅｔおよび／もしくはＨＧＦポリペプチドに関する）またはＦＩＳＨを実施すること；および（ｂ）試料中のｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。
【０２６９】
本明細書に記載のように、他のバイオマーカーを検出することができる。例示的な他のバイオマーカーは、本明細書に開示される。いくつかの実施形態においては、ＡＬＫバイオマーカーが検出される。いくつかの実施形態においては、ＦＧＦ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦ、および／またはＰＧＦＲバイオマーカーのうちの１つまたは複数が検出される。
【０２７０】
Ｂ−ｒａｆおよびＢ−ｒａｆ突然変異体の検出のための方法は当業界で公知であり、商業的に利用可能である。例えば、Ｈａｉｌａｔら、Ｄｉａｇｎ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１２年３月；２１（１）：１〜８頁を参照されたい。いくつかの実施形態においては、Ｖ６００Ｅ突然変異（Ｖ５９９Ｅ（１７９６Ｔ＞Ａ）としても知られる）は、エクソン１５のコドン６００中のヌクレオチド１７９９位における単一塩基突然変異（Ｔ＞Ａ）の存在を決定することを含む方法を用いて検出される。この突然変異はまた、ヌクレオチド１７９９〜１８００位における２塩基突然変異ＴＧ＞ＡＡからも生じ得る。２塩基突然変異を、１７９９位を評価することにより検出することもできる。いくつかの実施形態においては、１８００位における置換の存在について核酸を評価することもできる。他の突然変異もコドン６００において生じ得る。これらのものとしては、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｄ、およびＶ６００Ｒが挙げられる。いくつかの実施形態においては、Ｖ６００Ｅ突然変異を検出するプローブは、他のコドン６００突然変異、例えば、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｒを検出することもできる。いくつかの実施形態においては、プローブは、コドン６０１における突然変異を検出することもできる。
【０２７１】
１７９９位における塩基置換の存在について、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを評価することにより、Ｖ６００Ｅ突然変異の存在を決定することができる。いくつかの実施形態においては、核酸分析方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション、プライマー伸長、対立遺伝子特異的ライゲーション、配列決定、または電気泳動分離技術、例えば、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）およびヘテロ二本鎖分析のうちの１つまたは複数である。例示的なアッセイとしては、５’ヌクレアーゼアッセイ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、鋳型特異的ダイターミネーター組込み、分子ビーコン対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、単一塩基伸長アッセイ、およびリアルタイムピロリン酸配列決定を用いる突然変異分析が挙げられる。増幅された配列の分析を、マイクロチップ、蛍光偏光アッセイ、およびマトリックス援用レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析などの様々な技術を用いて実施することができる。用いることができる２つのさらなる方法は、Ｆｌａｐヌクレアーゼを用いる侵襲的切断に基づくアッセイおよび錠型プローブを用いる方法である。
【０２７２】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ（Ｖ６００Ｅ突然変異（ＧＴＧ＞ＧＡＧ）を含むＢ−ｒａｆポリペプチド）である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｋ（ＧＴＧ＞ＡＡＧ）、Ｖ６００Ｒ（ＧＴＧ＞ＡＧＧ）、Ｖ６００Ｅ（ＧＴＧ＞ＧＡＡ）および／またはＶ６００Ｄ（ＧＴＧ＞ＧＡＴ）のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体は、残基Ｖ６００での突然変異体である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチドは、Ｔ１７９９Ａ突然変異を含む。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチドは、エクソン１１および／またはエクソン１５中に突然変異を含む。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体発現は、（ａ）試料（患者癌試料など）に対して遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲもしくは対立遺伝子特異的ＰＣＲなど）、５’ヌクレアーゼアッセイ、ＩＨＣ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、またはＦＩＳＨのうちの１つまたは複数を実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカー発現は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸に対してＰＣＲを実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体バイオマーカーの発現を決定することを含む方法を用いて検出される。
【０２７３】
患者に由来する試料は、本明細書に記載の１つまたは複数のバイオマーカーの発現について試験される。組織または細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された、および／または保存された器官もしくは組織試料または生検もしくは吸引物に由来する固形組織；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹腔液、または間質液などの体液；対象の妊娠または発生中の任意の時点に由来する細胞であってもよい。組織試料は、保存剤、凝固防止剤、バッファー、固定剤、栄養素、抗生物質などの、天然の組織と天然には混ざらない化合物を含んでもよい。本明細書における腫瘍試料の例としては、限定されるものではないが、腫瘍生検、腫瘍細胞、血清または血漿、循環血漿タンパク質、腹水、一次細胞培養物または腫瘍から誘導されるか、もしくは腫瘍のような特性を示す細胞系、ならびにホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍試料または凍結腫瘍試料などの保存された腫瘍試料が挙げられる。一実施形態においては、患者試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍試料（例えば、メラノーマ腫瘍試料または結腸直腸癌腫瘍試料または腫瘍間質の試料）である。試料は、癌薬剤（抗ｃ−ｍｅｔアンタゴニストなど）を用いる患者の処置の前に取得することができる。試料は、原発腫瘍から、または転移腫瘍から取得することができる。試料は、癌が初めて診断された時、または例えば、腫瘍が転移した後に取得することができる。いくつかの実施形態においては、腫瘍試料は、肺、皮膚、リンパ節、骨、肝臓、結腸、甲状腺、および／または卵巣のものである。
【０２７４】
ｍＲＮＡ、タンパク質、または遺伝子増幅の発現を決定するための様々な方法としては、限定されるものではないが、遺伝子発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）などが挙げられる。いくつかの実施形態においては、タンパク質発現が定量される。そのようなタンパク質分析を、例えば、患者腫瘍試料に対してＩＨＣを用いて実施することができる。
【０２７５】
ここで、バイオマーカー発現を決定するための様々な例示的方法を、より詳細に説明する。
【０２７６】
１．遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法を、２つの大きな群：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法に分けることができる。試料中のｍＲＮＡ発現の定量のための当業界で公知の最も一般的に用いられる方法としては、ノーザンブロッティングおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ＆Ｂａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７〜２８３頁（１９９９））；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２〜８５４頁（１９９２））；およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３〜２６４頁（１９９２））が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖などの特定の二本鎖を認識することができる抗体を用いることができる。配列決定に基づく遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、および大規模並行特徴配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析が挙げられる。
【０２７７】
２．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および５’ヌクレアーゼアッセイ
高感度で可撓性のある定量法がＰＣＲであり、例えば、薬剤処置を用いて、または用いずに異なる試料集団中、正常および腫瘍組織中でのｍＲＮＡレベルを比較するため、密接に関連するｍＲＮＡ間を識別するため、ならびにＲＮＡ構造を分析するために用いることができる。しかしながら、他の核酸増幅プロトコール（すなわち、ＰＣＲ以外）を、本明細書に記載の核酸分析法において用いることもできることに留意すべきである。例えば、好適な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｗｕ＆Ｗａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０〜５６９頁、１９８８を参照されたい）；鎖置換アッセイ（例えば、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２〜３９６頁、１９９２；米国特許第５，４５５，１６６号を参照されたい）；およびいくつかの転写に基づく増幅システム、例えば、米国特許第５，４３７，９９０号；第５，４０９，８１８号；および第５，３９９，４９１号；転写増幅システム（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３〜１１７７頁、１９８９）；ならびに自己持続型配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４〜１８７８頁、１９９０；ＷＯ９２／０８８００）が挙げられる。あるいは、プローブを検出可能なレベルまで増幅させる方法、例えば、Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｋｒａｍｅｒ＆Ｌｉｚａｒｄｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：４０１〜４０２頁、１９８９；Ｌｏｍｅｌｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６〜１８３１頁、１９８９）を用いることができる。公知の増幅方法の概説は、例えば、ＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１〜４７頁、１９９３により提供されている。
【０２７８】
ｍＲＮＡを、出発組織試料から単離することができる。出発材料は、典型的には、それぞれ、ヒト腫瘍または腫瘍細胞系、および対応する正常組織または細胞系から単離された全ＲＮＡである。かくして、ＲＮＡを、健康なドナーに由来するプールされたＤＮＡと共に、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの腫瘍または腫瘍細胞系を含む様々な原発腫瘍から単離することができる。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、例えば、凍結された、または保管されたパラフィン包埋および固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織試料から、ｍＲＮＡを抽出することができる。ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は当業界で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）などの分子生物学の標準的教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４頁（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡ単離を、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎなどの商業的製造業者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを用いて実施することができる。例えば、培養中の細胞に由来する全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。他の商業的に入手可能なＲＮＡ単離キットとしては、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織試料に由来する全ＲＮＡを、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡを、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離により単離することができる。
【０２７９】
ＲＮＡはＰＣＲのための鋳型として役立つことができないため、いくつかの実施形態においては、ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第１のステップは、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写、次いで、ＰＣＲ反応におけるその指数的増幅である。他の実施形態においては、例えば、米国特許第５，３１０，６５２号；第５，３２２，７７０号；第５，５６１，０５８号；第５，６４１，８６４号；および第５，６９３，５１７号に記載のような混合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることができる。２つの最も一般的に用いられる逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉｌｏ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、典型的には、発現プロファイリングの環境および目標に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライミングされる。例えば、抽出されたＲＮＡを、製造業者の指示書に従って、ＧＥＮＥＡＭＰ（商標）ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いて逆転写することができる。次いで、誘導されたｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応における鋳型として用いることができる。
【０２８０】
米国特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２号；および第５，８０４，３７５号；ならびにＨｏｌｌａｎｄら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６〜７２８０頁に記載の「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」または「５’−ヌクレアーゼアッセイ」を用いることができる。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは、典型的には、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を用いるが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を用いることもできる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを作製する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によっては伸長せず、リポーター蛍光染料およびクエンチャー蛍光染料を用いて標識される。リポーター染料からのレーザー誘導放射は、２つ染料がプローブ上にあるため、それらが一緒に近くに位置する場合、クエンチング染料によってクエンチされる。増幅反応の間に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的様式でプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中で解離し、遊離したリポーター染料からのシグナルは、第２のフルオロフォアのクエンチング効果を含まない。合成されたそれぞれの新しい分子について１分子のリポーター染料が遊離され、クエンチされていないリポーター染料の検出は、データの定量的解釈のための基礎を提供する。アッセイにおいて用いられるハイブリダイゼーションプローブは、例えば、Ｖ６００Ｅ突然変異部位でＢＲＡＦの突然変異体と野生型対立遺伝子とを識別する対立遺伝子特異的プローブであってもよい。あるいは、前記方法を、増幅産物に結合する対立遺伝子特異的プライマーおよび標識されたプローブを用いて実施することができる。
【０２８１】
分解産物を検出するのに好適な任意の方法を、５’ヌクレアーゼアッセイにおいて用いることができる。検出プローブは、２つの蛍光染料で標識されることが多く、そのうちの一方は他方の染料の蛍光をクエンチすることができる。プローブがハイブリダイズしていない状態にある場合にクエンチングが起こるように、またＤＮＡポリメラーゼの５’から３’に向かうエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が２つの染料の間で起こるように、染料をプローブに結合させる、好ましくは、一方を５’末端に結合させ、他方を内部部位に結合させる。増幅は、染料の間でのプローブの切断と、それと同時に起こるクエンチングの消失および初期にクエンチされた染料から観察可能な蛍光の増加をもたらす。分解産物の蓄積を、反応蛍光の増加を測定することによりモニタリングする。米国特許第５，４９１，０６３号および第５，５７１，６７３号（両方とも参照により本明細書に組込まれる）は、増幅と同時に起こるプローブの分解を検出するための代替的方法を記載する。５’−ヌクレアーゼアッセイデータは最初、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表すことができる。上記で考察された通り、全サイクルの間に蛍光値が記録され、増幅反応においてその時点までに増幅された産物の量である。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【０２８２】
誤差および試料間変動の効果を最小化するために、ＰＣＲは通常、内部標準を用いて実施される。理想的な内部標準は、異なる組織間で定常レベルで発現され、実験処理によっては影響されない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最もよく用いられるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびＰ−アクチンのｍＲＮＡである。
【０２８３】
いくつかの実施形態においては、Ｖ６００Ｅを検出するプローブ、例えば、ＴＴＳ１５５−ＢＲＡＦ＿ＭＵはまた、Ｖ６００Ｄ（１７９９＿１８００ＴＧ＞ＡＴ）およびＶ６００Ｋ（１７９８＿１７９９ＧＴ＞ＡＡ）も検出する。いくつかの実施形態においては、Ｖ６００Ｅ突然変異を検出するプローブはまた、Ｋ６０１Ｅ（１８０１Ａ＞Ｇ）およびＶ６００Ｒ（１７９８＿１７９９ＧＴ＞ＡＧ）も検出する。
【０２８４】
いくつかの実施形態においては、プローブ配列と実質的に同一である配列を用いることができる。プローブ配列と実質的に同一である配列としては、プローブと同じ相補的配列にハイブリダイズするものが挙げられる。かくして、いくつかの実施形態においては、本発明における使用のためのプローブ配列は、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、時には、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態においては、プライマーは、ＴＴＳ１５５−ＢＲＡＦ＿ＭＵまたはＴＴＳ１４８−ＢＲＡＦ＿ＷＴの少なくとも２７、２８、２９または３０個の連続するヌクレオチドを有する。他の実施形態においては、本発明における使用のためのプライマーは、ＴＴＳ１５５−ＢＲＡＦ＿ＭＵまたはＴＴＳ１４８−ＢＲＡＦ＿ＷＴに対する少なくとも８０％の同一性、いくつかの実施形態においては、少なくとも８５％の同一性、他の実施形態においては、少なくとも９０％以上の同一性を有する。
【０２８５】
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅などの、ＲＮＡ源として固定されたパラフィン包埋組織を用いて遺伝子発現をプロファイルするための代表的なプロトコールのステップは、様々な公開された学術論文に与えられている（例えば、Ｈａｉｌａｔら、Ｄｉａｇｎ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１２年３月；２１（１）：１〜８頁；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４〜９１頁（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９〜２９頁（２００１））。簡単に述べると、いくつかの実施形態においては、代表的なプロセスは、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０マイクログラムの厚さの切片を切断することから始まる。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後、必要に応じて、ＲＮＡ修復および／または増幅ステップを含有させ、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写した後、ＰＣＲを行う。
【０２８６】
ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅しようとする遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいて設計される。この実施形態においては、プライマー／プローブ設計における第１のステップは、遺伝子内のイントロン配列の解明である。これは、公共的に利用可能なソフトウェアにより、例えば、Ｋｅｎｔ，Ｗ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６〜６４頁（２００２）により開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェア、またはＢＬＡＳＴソフトウェア、例えば、そのバリエーションなどにより行うことができる。その後のステップは、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計の定着した方法に従う。
【０２８７】
非特異的シグナルを回避するために、プライマーおよびプローブを設計する時のイントロン内の反復配列をマスクすることが重要であり得る。これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされるクエリー配列を戻す、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅを通してオンラインで利用可能なＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いることにより容易に達成することができる。次いで、マスクされたイントロン配列を用いて、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢアッセイバイデザイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（一般ユーザおよび生物学者プログラマーのためのＷＷＷ上のＲｏｚｅｎおよびＳｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３、Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ、Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、３６５〜３８６頁）などの、任意の市販の、またはさもなければ公共的に利用可能なプライマー／プローブ設計パッケージを用いて、プライマーおよびプローブ配列を設計することができる。
【０２８８】
ＰＣＲプライマー設計において考慮される因子としては、プライマー長、融点（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、および３’末端配列が挙げられる。一般的には、最適なＰＣＲプライマーは、一般的には１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。典型的には、５０〜８０℃、例えば、約５０〜７０℃のＴｍが好ましい。
【０２８９】
ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計に関するさらなる指針については、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５、１３３〜１５５頁；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ」、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４、５〜１１頁；ならびにＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０〜５２７頁（１９９７）（全開示は参照により本明細書に明示的に組込まれる）を参照されたい。
【０２９０】
別の態様において、標的核酸の対立遺伝子特異的増幅を用いて、核酸突然変異の存在または非存在を検出することができる。増幅は、対立遺伝子特異的プライマーの使用を含む。
【０２９１】
一実施形態においては、本発明は、いくつかの変異体配列の形態で存在する、標的配列の変異体の対立遺伝子特異的増幅の方法であって、標的配列の少なくとも１つの変異体をおそらく含有する試料を用意すること；標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的な第１のオリゴヌクレオチドを用意すること；標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であるが、標的配列の１つの変異体のみと相補的な少なくとも１つの内部選択ヌクレオチドを有する第２のオリゴヌクレオチドを用意すること；前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの、標的配列の少なくとも１つの変異体へのハイブリダイゼーションにとって好適な条件を用意すること；核酸ポリメラーゼが、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記相補的内部選択ヌクレオチドを有する標的配列の変異体にハイブリダイズした場合には前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることができるが、前記第２のオリゴヌクレオチドが非相補的内部選択ヌクレオチドを有する標的配列の変異体にハイブリダイズした場合には前記第２のオリゴヌクレオチドを実質的にあまり伸長させることができない、前記ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチド伸長にとって好適な条件を用意すること；ならびに配列のハイブリダイゼーションおよび伸長ステップを複数回反復することを含む方法である。
【０２９２】
本発明のいくつかの実施形態においては、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、鋳型変性、オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型へのアニーリング（ハイブリダイゼーション）、および核酸ポリメラーゼによるプライマーの伸長の反復サイクルを含む。いくつかの実施形態においては、アニーリングおよび伸長は、同じ温度ステップで行う。
【０２９３】
いくつかの実施形態においては、増幅反応は、ホットスタートプロトコールを含む。対立遺伝子特異的増幅の文脈においては、一致しない標的に関する対立遺伝子特異的プライマーの選択性を、ホットスタートプロトコールの使用により増強することができる。例えば、ワックスの使用、重要な試薬の残りの反応混合物からの分離（米国特許第５，４１１，８７６号）、抗体により可逆的に不活化された核酸ポリメラーゼ（米国特許第５，３３８，６７１号）、活性部位に特異的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドにより可逆的に不活化された核酸ポリメラーゼ（米国特許第５，８４０，８６７号）の使用または例えば、米国特許第５，６７７，１５２号および第５，７７３，５２８号に記載された可逆的化学的改変を有する核酸ポリメラーゼの使用などの、多くのホットスタートプロトコールが当業界で公知である。
【０２９４】
本発明のいくつかの実施形態においては、対立遺伝子特異的増幅アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイである。リアルタイムＰＣＲアッセイにおいては、増幅の尺度は、「閾値サイクル」またはＣｔ値である。対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの文脈においては、一致した鋳型と一致しない鋳型とのＣｔ値の差異が、対立遺伝子またはアッセイの選択性の間の識別の尺度である。差異が大きい場合、一致しない鋳型の増幅の遅延が大きく、かくして、対立遺伝子間の識別が大きいことを示す。一致しない鋳型は、一致した鋳型よりもはるかに多い量で存在することが多い。例えば、組織試料においては、ごく少量の細胞のみが悪性であり、対立遺伝子特異的増幅アッセイにより標的化される突然変異（「一致した鋳型」）を担持する。正常細胞中に存在する一致しない鋳型はあまり効率的に増幅されないが、圧倒的な数の正常細胞は増幅における遅延を克服し、突然変異鋳型の利点を打ち消す。野生型鋳型の存在下で稀な突然変異を検出するためには、対立遺伝子特異的増幅アッセイの特異性が重要である。ＣＯＢＡＳ（登録商標）４８００  ＢＲＡＦ  Ｖ６００  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔが市販されており、リアルタイムＰＣＲ技術を利用している。反応におけるそれぞれの標的特異的オリゴヌクレオチドプローブは、リポーターとして役立つ蛍光染料、および無傷のプローブ内のリポーター染料からの蛍光放射を吸収する（クエンチする）クエンチャー分子で標識される。増幅の各サイクルの間に、アンプリコン中の一本鎖ＤＮＡ配列と相補的なプローブが結合し、次いで、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’に向かうヌクレアーゼ活性により切断される。リポーター染料がこのヌクレアーゼ活性によりクエンチャーから分離されると、リポーター染料が適切なスペクトルの光により励起された時に特徴的な波長の蛍光を測定することができる。２つの異なるリポーター染料を用いて、標的特異的ＢＲＡＦ野生型（ＷＴ）プローブおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異（ＭＵＴ）プローブを標識する。専用の光チャンネルにおける２つの特徴的な波長で蛍光を測定することにより、２つのＢＲＡＦ配列の増幅を単一の反応において独立に検出することができる。
【０２９５】
一実施形態においては、Ｂ−ｒａｆとＶ６００Ｅ  Ｂ−ｒａｆとを区別するプライマーが、米国特許出願公開第２０１１／０３１１９６８号に従って用いられる。
【０２９６】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に対してＰＣＲを実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチドの発現を決定することを含む方法を用いて検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド発現は、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、標的配列の１つの変異体にのみ相補的な少なくとも１つの内部選択的ヌクレオチドを有する、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドを、Ｂ−ｒａｆ標的配列の少なくとも１つの変異体にハイブリダイズさせること；（ｂ）核酸ポリメラーゼが、選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成する場合には優先的に前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させるが、前記選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成しない場合、実質的にあまり前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることができない、前記ポリメラーゼを用いて第２のオリゴヌクレオチドを伸長させること；ならびに（ｃ）伸長が、オリゴヌクレオチドが相補的選択的ヌクレオチドを有する標的配列の変異体の存在を示す、前記オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出することを含む方法を用いて検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に対してＰＣＲを実施すること；および（ｂ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチドの発現を決定することを含む方法を用いて検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）からＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を単離すること；（ｂ）患者癌試料から抽出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施すること；および（ｃ）試料中のＢ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチドの発現を決定することを含む方法を用いて検出される。
【０２９７】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド発現は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）からＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を単離すること；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、標的配列の１つの変異体のみと相補的な少なくとも１つの内部選択的ヌクレオチドを有する、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ中のＢ−ｒａｆ標的配列の少なくとも１つの変異体にハイブリダイズさせること；（ｃ）核酸ポリメラーゼが、選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成する場合には優先的に前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させるが、前記選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成しない場合、実質的にあまり前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることができない、前記ポリメラーゼを用いて第２のオリゴヌクレオチドを伸長させること；ならびに（ｄ）伸長が、オリゴヌクレオチドが相補的選択的ヌクレオチドを有する標的配列の変異体の存在を示す、前記オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出することを含む方法を用いて検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド発現は、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが標的配列の１つまたは複数の変異体と少なくとも部分的に相補的であり、標的配列の１つの変異体のみと相補的な少なくとも１つの内部選択的ヌクレオチドを有する、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドを、Ｂ−ｒａｆ標的配列の少なくとも１つの変異体にハイブリダイズさせること；（ｂ）核酸ポリメラーゼが、選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成する場合には優先的に前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させるが、前記選択的ヌクレオチドが標的と塩基対を形成しない場合、実質的にあまり前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることができない、前記ポリメラーゼを用いて第２のオリゴヌクレオチドを伸長させること；ならびに（ｃ）伸長が、オリゴヌクレオチドが相補的選択的ヌクレオチドを有する標的配列の変異体の存在を示す、前記オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出することを含む方法を用いて検出される。
【０２９８】
いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、（ａ）患者癌試料（ＦＦＰＥ固定された患者癌試料など）から抽出された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に対してＰＣＲを実施すること；（ｂ）ＰＣＲ増幅された核酸を配列決定することにより、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチドの発現を決定することを含む方法を用いて検出される。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆ突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、配列決定（例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列またはパイロシーケンス法）を用いて検出される。
【０２９９】
３．他の核酸突然変異検出法
核酸突然変異（例えば、Ｂ−ｒａｆのアミノ酸６００位でのグルタミンのバリンへの置換をもたらすヌクレオチド１７９９位での（ＧＴＧ＞ＧＡＡ））の存在（または非存在）を、直接配列決定により検出することもできる。方法としては、ジデオキシ配列決定に基づく方法およびオリゴヌクレオチド長産物のＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）などの方法が挙げられる。そのような方法は、ＰＣＲなどの増幅技術を用いることが多い。配列決定のための別の類似方法は、完全なＰＣＲの使用を必要としないが、典型的には、調査しようとするヌクレオチドと相補的である単一の蛍光標識されたジデオキシリボ核酸分子（ｄｄＮＴＰ）によるプライマーの伸長のみを用いる。多型部位でのヌクレオチドを、１塩基により伸長された、蛍光標識されたプライマーの検出により同定することができる（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、９：１７５〜１８２頁、１９９５）。
【０３００】
増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を用いて生成された増幅産物を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動の使用により分析することもできる。異なる対立遺伝子を、異なる配列依存的融点特性および溶液中でのＤＮＡの電気泳動移動度に基づいて同定することができる（例えば、Ｅｒｌｉｃｈ（編）、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、第７章を参照されたい）。
【０３０１】
他の実施形態においては、例えば、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、２７６６〜２７７０頁（１９８９）に記載のような一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度の変化により塩基の相違を同定する、一本鎖コンフォメーション多型分析を用いて、標的配列の対立遺伝子を区別することができる。増幅されたＰＣＲ産物を上記のように生成し、加熱するか、またはさもなければ変性させて、一本鎖増幅産物を形成させることができる。一本鎖核酸は、塩基配列に一部依存する二次構造に再度折畳まれるか、またはそれを形成することができる。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度を、標的領域の対立遺伝子間の配列差異と関連付けることができる。
【０３０２】
突然変異（例えば、核酸突然変異）の存在または非存在を、対立遺伝子特異的増幅またはプライマー伸長法を用いて検出することができる。これらの反応は、典型的には、プライマーの３’末端、例えば、３’ヌクレオチドまたは最後から２番目の３’ヌクレオチドでの不一致を介して突然変異（または野生型）部位を特異的に標的化するように設計されたプライマーの使用を含む。不一致の存在は、ポリメラーゼが誤差補正活性を欠く場合にプライマーを伸長するポリメラーゼの能力をもたらす。例えば、対立遺伝子特異的増幅または伸長に基づく方法を用いてＶ６００Ｅ突然変異体配列を検出するために、３’末端ヌクレオチドが突然変異位置にハイブリダイズするように、ＢＲＡＦのコドン６００におけるヌクレオチド１７９９位での突然変異体Ａ対立遺伝子と相補的なプライマーを設計する。対立遺伝子突然変異体の存在を、伸長を開始するプライマーの能力により決定することができる。３’末端が一致しない場合、伸長は妨げられる。かくして、例えば、プライマーが３’末端で対立遺伝子突然変異体ヌクレオチドと一致する場合、プライマーは効率的に伸長されるであろう。また、１７９９位でＢＲＡＦ野生型配列から特異的である対立遺伝子特異的プライマーを用いて、増幅を実施することもできる。
【０３０３】
典型的には、プライマーは、増幅反応における第２のプライマーと共に用いられる。第２のプライマーは、突然変異位置とは関連しない部位にハイブリダイズする。増幅は、２つのプライマーから進行し、検出可能な産物をもたらし、特定の対立遺伝子形態が存在することを示す。対立遺伝子特異的増幅または伸長に基づく方法は、例えば、ＷＯ９３／２２４５６；米国特許第５，１３７，８０６号；第５，５９５，８９０号；第５，６３９，６１１号；および米国特許第４，８５１，３３１号に記載されている。
【０３０４】
対立遺伝子特異的増幅に基づく遺伝子型決定を用いる場合、対立遺伝子の同定には、増幅された標的配列の存在または非存在の検出のみが必要である。増幅された標的配列の検出のための方法は、当業界で周知である。例えば、核酸の存在を検出するために、記載されたゲル電気泳動およびプローブハイブリダイゼーションアッセイが用いられることが多い。
【０３０５】
代替的なプローブレス法においては、増幅された核酸は、反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの総量の増加をモニタリングすることにより検出され、例えば、米国特許第５，９９４，０５６号；ならびに欧州特許公開第４８７，２１８号および第５１２，３３４号に記載されている。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、二本鎖ＤＮＡに結合した場合に様々なＤＮＡ結合染料、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎが示す蛍光の増加に依るものである。
【０３０６】
当業者であれば理解できるように、対立遺伝子特異的増幅法を、特定の対立遺伝子を標的化するために複数の対立遺伝子特異的プライマーを用いる反応において実施することができる。そのような多重適用のためのプライマーは、一般的には識別可能な標識で標識されるか、または対立遺伝子から産生される増幅産物がサイズにより識別可能となるように選択される。かくして、例えば、単一の試料中の野生型およびＶ６００Ｅ対立遺伝子突然変異体の両方を、増幅産物のゲル分析による単一の増幅反応を用いて同定することができる。
【０３０７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイズする領域において対立遺伝子の１つと正確に相補的であってもよく、またはオリゴヌクレオチドの３’末端以外の位置にいくつかの不一致を有してもよい。例えば、最後から２番目の３’ヌクレオチドは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにおいて一致しなくてもよい。他の実施形態においては、不一致は、両方の対立遺伝子配列中の（非突然変異）部位で生じてもよい。
【０３０８】
いくつかの実施形態においては、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、固定された標的または固定されたプローブを用いるアッセイ形式で実施される。そのような形式は当業界で公知であり、例えば、ドットブロット形式および逆ドットブロットアッセイ形式が挙げられ、米国特許第５，３１０，８９３号；第５，４５１，５１２号；第５，４６８，６１３号；および第５，６０４，０９９号（それぞれ参照により本明細書に組込まれる）に記載されている。
【０３０９】
４．ＲＮＡ−Ｓｅｑ
Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＴＳＳ）とも呼ばれるＲＮＡ−Ｓｅｑとは、試料のＲＮＡ含量に関する情報を得るためにｃＤＮＡを配列決定するための高効率配列決定技術の使用を指す。ＲＮＡ−Ｓｅｑを記載する刊行物としては、Ｗａｎｇら、「ＲＮＡ−Ｓｅｑ：ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０（１）：５７〜６３頁（２００９年１月）；Ｒｙａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４５（１）：８１〜９４頁（２００８）；およびＭａｈｅｒら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３４）：９７〜１０１頁（２００９年１月）が挙げられる。
【０３１０】
５．マイクロアレイ
示差的遺伝子発現を、マイクロアレイ技術を用いて同定または確認することもできる。かくして、乳癌関連遺伝子の発現プロファイルを、マイクロアレイ技術を用いて、新鮮な、またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定することができる。この方法では、対象のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドなど）を、マイクロチップ基質上に塗布するか、または配置する。次いで、配置された配列を、対象の細胞または組織に由来する特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＰＣＲ法と全く同様に、ｍＲＮＡの供給源は典型的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞系、および対応する正常組織または細胞系から単離された全ＲＮＡである。かくして、ＲＮＡを、様々な原発腫瘍または腫瘍細胞系から単離することができる。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、ｍＲＮＡを、例えば、毎日の臨床業務において日常的に調製され、保存される、凍結されたか、または保管されたパラフィン包埋された、および固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織試料から抽出することができる。
【０３１１】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態においては、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入物を、高密度アレイ中の基質にアプライする。好ましくは、少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列を基質にアプライする。それぞれ１０，０００個のエレメントでマイクロチップ上に固定された、マイクロアレイされた遺伝子が、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにとって好適である。対象の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組込みを介して、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを作製することができる。チップに印加された標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイ上のそれぞれのＤＮＡスポットに特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡によるか、またはＣＣＤカメラなどの別の検出方法により、チップをスキャンする。それぞれの配置されたエレメントのハイブリダイゼーションの定量により、対応するｍＲＮＡ存在量の評価が可能になる。二色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から作製された別々に標識されたｃＤＮＡプローブを、対にしてアレイにハイブリダイズさせる。かくして、それぞれの特定の遺伝子に対応する２つの供給源に由来する転写物の相対的存在量が同時に決定される。小規模のハイブリダイゼーションにより、多数の遺伝子の発現パターンの便利で迅速な評価が得られる。そのような方法は、細胞１個あたり２〜３個のコピーで発現される、稀な転写物を検出し、発現レベルの少なくとも約２倍の差異を再現性を以て検出するのに必要とされる感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：１０６〜１４９頁（１９９６））。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＣＨＩＰ（商標）技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることなどにより、製造業者のプロトコールに従って市販の装備によりマイクロアレイ分析を実施することができる。
【０３１２】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ方法の開発により、様々な腫瘍型における癌分類および転帰予測の分子マーカーを体系的に検索することができるようになる。
【０３１３】
６．遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、それぞれの転写物のための個々のハイブリダイゼーションプローブを用意する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時的および定量的分析を可能にする方法である。第１に、タグがそれぞれの転写物内の独自の位置から得られるという条件で、転写物を独自に同定するための十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を作製する。次いで、多くの転写物を一緒に連結して長い連続的分子を形成させ、これを配列決定し、複数のタグの同一性を同時に示すことができる。個々のタグの存在量を決定し、それぞれのタグに対応する遺伝子を同定することにより、転写物の任意の集団の発現パターンを定量的に評価することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４〜４８７頁（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  ８８：２４３〜５１頁（１９９７）を参照されたい。
【０３１４】
７．ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）技術は、検出のために質量分析（ＭＳ）を用いる遺伝子発現分析の自動化された高効率の方法である。この方法によれば、ＲＮＡの単離、逆転写およびＰＣＲ増幅の後、ｃＤＮＡをプライマー伸長にかける。ｃＤＮＡ由来プライマー伸長産物を精製し、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳ試料調製にとって必要な成分を予め充填したチップアレイ上に分注する。得られた質量スペクトル中のピーク面積を分析することにより、反応中に存在する様々なｃＤＮＡを定量する。
【０３１５】
８．免疫組織化学
免疫組織化学（「ＩＨＣ」）法も、本発明のバイオマーカーの発現レベルを検出するのに好適である。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価または検出する信頼できる方法であることが示されている。免疫組織化学技術は、プローブに対する抗体を利用し、一般的には発色法または蛍光法により、ｉｎ  ｓｉｔｕで細胞抗原を可視化する。かくして、それぞれのマーカーに特異的な抗体または抗血清、好ましくは、ポリクローナル抗血清、最も好ましくは、モノクローナル抗体を用いて、発現を検出する。以下により詳細に考察されるように、抗体を、抗体自体の直接的標識化により、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素を用いて検出することができる。あるいは、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む、標識された二次抗体と共に未標識の一次抗体を用いる。免疫組織化学プロトコールおよびキットは当業界で周知であり、商業的に利用可能である。
【０３１６】
ＩＨＣの２つの一般的方法：直接および間接アッセイが利用可能である。第１のアッセイによれば、標的抗原への抗体の結合が直接決定される。この直接アッセイは、さらなる抗体相互作用なしに可視化することができる、蛍光タグまたは酵素標識一次抗体などの標識された試薬を用いる。典型的な間接アッセイにおいては、コンジュゲートされていない一次抗体が抗原に結合し、次いで、標識された二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体を酵素標識にコンジュゲートする場合、発色または蛍光基質を添加して、抗原の可視化を提供する。いくつかの二次抗体は一次抗体上の異なるエピトープと反応し得るため、シグナル増幅が起こる。
【０３１７】
免疫組織化学のために用いられる一次および／または二次抗体は、典型的には、検出可能部分を用いて標識される。いくつかの標識が利用可能であり、一般に、以下のカテゴリーに分類することができる：
（ａ）35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈおよび131Ｉなどの放射性同位体。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻および第２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら（編）、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載の技術を用いて、抗体を放射性同位体で標識し、放射活性をシンチレーション計測を用いて測定することができる。
（ｂ）コロイド金粒子。
（ｃ）限定されるものではないが、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、またはＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ（登録商標）およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）などの市販のフルオロフォアならびに／または上記のいずれか１つまたは複数の誘導体などの蛍光標識。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上掲に開示された技術を用いて、蛍光標識を抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光を、蛍光光度計を用いて定量することができる。
（ｄ）様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号はこれらのいくつかの概説を提供する。酵素は一般に、様々な技術を用いて測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質中の色の変化を触媒し、これを分光光度計を用いて測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させてもよい。蛍光の変化を定量するための技術は上記されている。化学発光基質は、化学反応により電気的に励起されるようになり、次いで、測定することができる（例えば、化学発光計を用いる）光を放出するか、または蛍光アクセプターにエネルギーを供給することができる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（編））、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７３：１４７〜１６６頁（１９８１）に記載されている。
【０３１８】
酵素−基質組合せの例としては、例えば、以下のものが挙げられる：
（ｉ）水素ペルオキシダーゼが染料前駆体［例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）］を酸化する、水素ペルオキシダーゼを基質として用いる西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）。３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて、ＨＲＰ標識された抗体を可視化することもできる；
（ｉｉ）発色基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸を用いるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および
（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を用いるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【０３１９】
いくつかの他の酵素−基質組合せが当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照されたい。
【０３２０】
時には、標識は抗体を用いて間接的にコンジュゲートされる。当業者であれば、これを達成するための様々な技術を知っているであろう。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせ、上記の４つの広いカテゴリーの標識のうちのいずれかをアビジンとコンジュゲートさせるか、またはその逆を行うことができる。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、かくして、標識をこの間接的様式で抗体とコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成するために、抗体を小さいハプテンとコンジュゲートさせ、上記の異なる型の標識の１つを抗ハプテン抗体とコンジュゲートさせる。かくして、標識と抗体との間接的コンジュゲーションを達成することができる。
【０３２１】
上記で考察された試料調製手順とは別に、ＩＨＣの前、間、または後の組織切片のさらなる処理が望ましい場合がある。例えば、クエン酸バッファー中での組織試料の加熱などのエピトープ回復方法を実行することができる［例えば、Ｌｅｏｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｔｏｃｈｅｍ．４（３）：２０１頁（１９９６）を参照されたい］。
【０３２２】
任意の遮断ステップの後に、組織切片を、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原に結合するような十分な期間および好適な条件下で一次抗体に曝露する。これを達成するための適切な条件を、日常的な実験により決定することができる。
【０３２３】
抗体の試料への結合の程度は、上記で考察された検出可能な標識のいずれか１つを用いることにより決定される。好ましくは、標識は、３，３’−ジアミノベンジジン色原体などの発色基質の化学的変化を触媒する酵素標識（例えば、ＨＲＰＯ）である。好ましくは、酵素標識は、一次抗体に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされる（例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である）。
【０３２４】
このように調製された標本を載せ、カバースリップすることができる。次いで、例えば、顕微鏡を用いて、スライド評価を決定する。
【０３２５】
ＩＨＣを、その前または後に、形態学的染色と組み合わせることができる。脱パラフィン化の後、スライド上に載せられた切片を、評価のために形態学的染色剤で染色することができる。用いられる形態学的染色剤は、組織切片の正確な形態学的評価を提供する。切片を、それぞれ異なる細胞成分を個別に染色する１つまたは複数の染料で染色することができる。一実施形態においては、ヘマトキシリンが、スライドの細胞核を染色するために用いられる。ヘマトキシリンは広く入手可能である。好適なヘマトキシリンの例は、ヘマトキシリンＩＩ（Ｖｅｎｔａｎａ）である。より明るく青い核を望む場合、ヘマトキシリン染色の後に青味剤を用いてもよい。当業者であれば、スライドが染料中に残存する時間の長さを増加させるか、または減少させることにより、所与の組織について染色を最適化することができることを理解するであろう。
【０３２６】
スライド調製およびＩＨＣプロセッシングのための自動化システムが市販されている。Ｖｅｎｔａｎａ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴシステムがそのような自動化システムの一例である。
【０３２７】
染色後、標準的な顕微鏡技術により組織切片を分析することができる。一般に、病理学者等は、異常または正常な細胞または特定の細胞型の存在について組織を評価し、対象の細胞型の位置を提供する。かくして、例えば、病理学者等は、スライドを検査し、正常細胞（正常肺細胞など）および異常細胞（異常細胞または新生物肺細胞）を同定する。対象の細胞の位置を規定する任意の手段を用いることができる（例えば、Ｘ−Ｙ軸上の座標）。
【０３２８】
ＩＨＣにおける使用にとって好適な抗ｃ−ｍｅｔ抗体は当業界で周知であり、例えば、ＳＰ−４４（Ｖｅｎｔａｎａ）、ＤＬ−２１（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ＭＥＴ４、ａｂ２７４９２（Ａｂｃａｍ）、ＰＡ１−３７４８３（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が挙げられる。当業者であれば、例えば、本明細書に開示されるＩＨＣプロトコールを用いてｃ−ｍｅｔ抗体と比較することにより、さらなる好適な抗ｃ−ｍｅｔ抗体を同定、特性評価することができることを理解できる。抗ホスホ−ｃ−ｍｅｔ抗体は当業界で公知であり、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ホスホ−ｃ−ｍｅｔ抗体Ｙ１２３４／５が挙げられる。ＩＨＣにおける使用にとって好適な抗ＨＧＦ抗体も当業界で周知であり、例えば、ａｂ２４８６５（Ａｂｃａｍ）、Ｈ００００３０８２−Ａ０１（Ａｂｎｏｖａ）、ＭＡ１−２４７６７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ＬＳ−Ｃ１２３７４３（Ｌｉｆｅ  Ｓｐａｎ）が挙げられる。本明細書で用いられる場合、患者の腫瘍の試料中でのＨＧＦの検出は、例えば、患者の腫瘍の試料中に存在する腫瘍間質中でのＨＧＦの検出ならびに腫瘍細胞中でのＨＧＦの検出を包含すると理解される。血清中でのＨＧＦの検出のためのアッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイなど）は市販されており、当業界で公知である。例えば、Ｃａｔｅｎａｃｃｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１１）１：５７３頁を参照されたい。
【０３２９】
いくつかの実施形態においては、様々な染色強度を有する対照細胞ペレットを、ＩＨＣ分析のための対照ならびにスコアリング対照として用いることができる。例えば、Ｈ４４１（強いｃ−ｍｅｔ染色強度）；Ａ５４９（中程度のｃ−ｍｅｔ染色強度）；Ｈ１７０３（弱いｃ−ｍｅｔ染色強度）、ＨＥＫ−２９３（２９３）（弱いｃ−ｍｅｔ染色強度）；およびＴＯＶ−１１２Ｄ（ｃ−ｍｅｔ染色強度なし）またはＨ１１５５（ｃ−ｍｅｔ染色強度なし）である。
【０３３０】
いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ染色強度基準を、表Ａに従って評価することができる。
【表１】
2014534949.tif 000003
【０３３１】
いくつかの実施形態においては、「臨床Ｍｅｔ診断陽性」および「臨床Ｍｅｔ診断陰性」カテゴリーは以下のように定義される：
臨床ｃ−ｍｅｔ診断陽性：ＩＨＣスコア２または３（表Ａに定義される）、および
臨床ｃ−ｍｅｔ診断陰性：ＩＨＣスコア０または１（表Ａに定義される）。
いくつかの実施形態においては、関連する高いｃ−ｍｅｔバイオマーカーは、ＩＨＣスコア＝２、ＩＨＣスコア＝３、またはＩＨＣスコア＝２もしくは３である。いくつかの実施形態においては、低いｃ−ｍｅｔバイオマーカーは、ＩＨＣスコア＝０、ＩＨＣスコア＝１またはＩＨＣスコア＝０もしくは１である。
【０３３２】
９．プロテオミクス
用語「プロテオーム」は、特定の時点で試料（例えば、組織、生物、または細胞培養物）中に存在するタンパク質の総計と定義される。プロテオミクスは、特に、試料中のタンパク質発現の全体的変化の研究を含む（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクスは、典型的には、以下のステップ：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）による試料中の個々のタンパク質の分離；（２）例えば、質量分析またはＮ末端配列決定による、ゲルから回収された個々のタンパク質の同定、および（３）バイオインフォマティクスを用いるデータの分析を含む。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する有用な補完であり、単独で、または他の方法と共に用いて、本発明の予後マーカーの産物を検出することができる。
【０３３３】
１０．遺伝子増幅
ｃ−ｍｅｔ遺伝子の増幅の検出は、当業者には公知の特定の技術を用いて達成される。例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて、染色体位置の関数としてＤＮＡ配列コピー数のマップを作成することができる。例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１８〜８２１頁を参照されたい。ｃ−ｍｅｔ遺伝子の増幅を、例えば、ｃ−ｍｅｔ遺伝子に特異的なプローブを用いるサザンハイブリダイゼーションによるか、またはリアルタイム定量的ＰＣＲにより検出することもできる。
【０３３４】
特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ遺伝子の増幅の検出は、例えば、ｃ−ｍｅｔ遺伝子にハイブリダイズするプローブを用いることにより、ｃ−ｍｅｔ遺伝子のコピー数を直接評価することによって達成される。例えば、ＦＩＳＨアッセイを実施することができる。特定の実施形態においては、ｃ−ｍｅｔ遺伝子の増幅の検出は、例えば、ｃ−ｍｅｔ遺伝子の外側にあるが、ｃ−ｍｅｔ遺伝子と共に同時増幅される染色体領域のコピー数を評価することにより、ｃ−ｍｅｔ遺伝子のコピー数を間接的に評価することによって達成される。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイを用いて、例えば、検出しようとする分子に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）でタグ付けられた分子（抗体など）を投与し、標識の局在化について患者を外部から走査することにより、バイオマーカー発現を評価することもできる。
【０３３５】
１１．他の例示的方法
バイオマーカーを、様々な免疫アッセイ法（例えば、上記のような本明細書に記載のＩＨＣなど）により検出することができる。免疫学的手順および免疫アッセイ手順の概説については、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ（編）、第７版、１９９１）を参照されたい。さらに、本発明の免疫アッセイを、いくつかの構成のいずれかにおいて実施することができ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ（編）、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、上掲に広く概説されている。一般的な免疫アッセイの概説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ（編）、１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｎ（編）、第７版、１９９１）も参照されたい。
【０３３６】
一般的に用いられるアッセイとしては、非競合的アッセイ、例えば、サンドイッチアッセイ、および競合的アッセイが挙げられる。典型的には、ＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイを用いることができる。ＥＬＩＳＡアッセイは当業界で公知であり、例えば、様々な組織および試料、例えば、血漿または血清をアッセイするためのものである。血清中のＨＧＦをアッセイするためのＥＬＩＳＡアッセイが本明細書に例示される。ＥＬＩＳＡにおける使用にとって好適な抗ＨＧＦ抗体は、当業界で公知である。
【０３３７】
そのようなアッセイ形式を用いる様々な免疫アッセイ技術が利用可能であり、例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号を参照されたい。これらのものは、非競合型の単一部位および２部位または「サンドイッチ」アッセイ、ならびに伝統的な競合結合アッセイの両方を含む。これらのアッセイはまた、標識された抗体の標的バイオマーカーへの直接結合を含む。サンドイッチアッセイは、一般的に用いられるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術のいくつかの変形が存在する。例えば、典型的なフォワードアッセイにおいては、未標識の抗体を固相基質上に固定し、試験しようとする試料を、結合した分子と接触させる。好適なインキュベーション期間の後、抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間にわたって、検出可能なシグナルを産生することができるリポーター分子で標識された、抗原に特異的な二次抗体を添加し、抗体−抗原標識抗体の別の複合体の形成にとって十分な時間インキュベートする。未反応の材料を洗浄除去し、抗原の存在を、リポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。その結果は、眼に見えるシグナルの単純な観察による定性的なものであるか、または既知量のバイオマーカーを含有する対照試料と比較することにより定量することができる。
【０３３８】
フォワードアッセイ上での変形は、試料と標識された抗体との両方を、結合した抗体に同時に添加する同時的アッセイを含む。これらの技術は当業者には周知であり、例えば、任意の小さい変形が容易に明らかである。典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいては、バイオマーカーに対する特異性を有する第１抗体を、固相表面に共有的または受動的に結合させる。固相表面はガラスまたはポリマーであってよく、最も一般的に用いられるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。固相支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、または免疫アッセイを行うのに好適な任意の他の表面の形態であってよい。結合プロセスは当業界で周知であり、一般的には、共有結合を架橋すること、または物理的に吸着することからなり、ポリマー−抗体複合体を、試験試料の調製において洗浄する。次いで、試験しようとする試料のアリコートを固相複合体に添加し、抗体中に存在する任意のサブユニットの結合を可能にするのに十分な時間（例えば、２〜４０分またはより都合の良い場合、一晩）および好適な条件下（例えば、室温〜４０℃、例えば、２５℃〜３２℃（包括的））でインキュベートする。インキュベーション期間の後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥し、バイオマーカーの一部に特異的な第２抗体と共にインキュベートする。第２抗体の分子マーカーへの結合を示すために用いられるリポーター分子に、第２抗体を連結する。
【０３３９】
代替的な方法は、試料中の標的バイオマーカーを固定すること、次いで、リポーター分子で標識されていても、または標識されていなくてもよい特異的抗体に、固定された標的を曝露することを含む。標的の量およびリポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体を用いて直接標識することにより検出可能であってよい。あるいは、第１抗体に特異的な、第２標識抗体を、標的−第１抗体複合体に曝露して、標的−第１抗体−第２抗体三次複合体を形成させる。この複合体を、標識されたリポーター分子により放出されるシグナルによって検出する。
【０３４０】
酵素免疫アッセイの場合、酵素を、一般的にはグルタルアルデヒドまたはペリオダートを用いて第２抗体にコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に認識されるように、様々な異なるコンジュゲーション技術が存在し、当業者には容易に利用可能である。一般的に用いられる酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが挙げられ、その他は本明細書で考察されている。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的には、対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色の変化の産生について選択される。好適な酵素の例としては、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。また、上記の発色基質よりもむしろ蛍光産物をもたらす蛍光発生基質を用いることもできる。全ての事例において、酵素−標識抗体を第１抗体−分子マーカー複合体に添加し、結合させた後、過剰の試薬を洗浄除去する。次いで、適切な基質を含有する溶液を、抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。基質は、第２抗体に連結された酵素と反応し、定性的な眼に見えるシグナルを与え、これを通常は分光光度分析によりさらに定量して、試料中に存在したバイオマーカーの量の指標を得ることができる。あるいは、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物を、その結合能力を変えることなく抗体に化学的にカップリングさせることができる。特定の波長の光を照射することにより活性化された場合、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸着し、分子中で励起状態を誘導した後、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を放出する。ＥＩＡと同様、蛍光標識された抗体を、第１抗体−分子マーカー複合体に結合させる。未結合の試薬を洗浄除去した後、残存する三次複合体を適切な波長の光に曝露すると、観察される蛍光は対象の分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は両方とも、当業界で非常に定着しており、本明細書で考察される。
【０３４１】
他の検出技術、例えば、ＭＡＬＤＩを用いて、試料中のバイオマーカー、例えば、Ｂｒａｆ突然変異体の存在を直接検出することができる。
【０３４２】
Ｖ．製品
本発明の別の実施形態においては、癌（メラノーマまたは甲状腺乳頭癌など）の処置における使用のための製品が提供される。製品は、容器と、容器上の、または容器と関連するラベルもしくは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器を、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、活性薬剤としての癌薬剤を含む組成物を保持または含有し、滅菌アクセスポート（例えば、容器は静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパを有するバイアルであってもよい）を有してもよい。
【０３４３】
製品は、無菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される希釈バッファーを含む第２の容器をさらに含んでもよい。製品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジなどの、商業的見地およびユーザの見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０３４４】
また、本発明の製品は、組成物が本明細書に記載の（１つまたは複数の）バイオマーカーの発現レベルに基づいて癌を処置するために用いられることを示す、例えば、添付文書の形態の情報を含む。添付文書またはラベルは、紙または磁気的に記録された媒体（例えば、フロッピーディスク）もしくはＣＤ−ＲＯＭなどの電気的媒体上などの、任意の形態を取ってもよい。ラベルまたは添付文書はまた、キットまたは製品中の医薬組成物および剤形に関する他の情報を含んでもよい。方法は、本明細書に記載の任意の処置および診断方法を含む。
【０３４５】
本発明の一実施形態によれば、一緒に包装された、薬学的に許容される担体中のｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）と、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストがｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現に基づいて癌（メラノーマなど）を有する患者を処置するためのものであることを示す添付文書とを含む製品が提供される。いくつかの実施形態においては、処置は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わされる。いくつかの実施形態においては、添付文書は、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストが、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーおよびＢ−ｒａｆバイオマーカーの発現に基づいて癌（メラノーマなど）を有する患者を処置するためにＢ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わされることを示す。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅである。
【０３４６】
本発明はまた、包装中で、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を含む医薬組成物と、医薬組成物がｃ−ｍｅｔバイオマーカーの発現に基づいて癌（ＮＳＣＬＣなど）を有する患者を処置するためのものであることを示す添付文書とを組み合わせることを含む、製品を製造するための方法に関する。いくつかの実施形態においては、処置は、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わされる。いくつかの実施形態においては、添付文書は、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストが、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーおよびＢ−ｒａｆバイオマーカーの発現に基づいて癌（メラノーマなど）を有する患者を処置するためにＢ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わされることを示す。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅである。
【０３４７】
製品は、無菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液および／またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される希釈バッファーを含むさらなる容器をさらに含んでもよい。製品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジなどの、商業的見地およびユーザの見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０３４８】
ＶＩ．診断キット
本発明はまた、本明細書で定義される任意の１つまたは複数のバイオマーカーを検出するのに有用な診断キットに関する。したがって、癌患者に由来する試料中の１つまたは複数のｃ−ｍｅｔ、およびＢ−ｒａｆ、例えば、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００バイオマーカーの発現を決定するための１つまたは複数の試薬を含む診断キットが提供される。場合により、キットは、患者がｃ−ｍｅｔバイオマーカーを発現する場合、および／または患者がＢ−ｒａｆバイオマーカーを発現する場合、癌患者を処置するための癌薬剤（例えば、Ｂ−ｒａｆアンタゴニストと組み合わせた、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト、例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を選択するためにキットを使用するための指示書をさらに含む。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００である。いくつかの実施形態においては、Ｂ−ｒａｆバイオマーカーは、（ａ）患者のメラノーマの試料から抽出された核酸（例えば、ＤＮＡ）上でＰＣＲまたは配列決定を実施すること；および（ｂ）試料中のＢＲＡＦV600の発現を決定することを含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態においては、メラノーマ試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーはＨＧＦであり、発現はＩＨＣを用いて患者のメラノーマ（またはメラノーマ間質）の試料中で検出される。いくつかの実施形態においては、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーはＨＧＦであり、発現はＥＬＩＳＡを用いて患者の血清の試料中で検出される。診断方法は、本明細書に記載の任意の診断方法を含む。
【０３４９】
ＶＩＩ．宣伝方法
本発明はまた、標的聴衆に、ｃ−ｍｅｔバイオマーカーおよび／またはＢ−ｒａｆバイオマーカーの発現に基づいて癌を有する患者を処置するための癌薬剤（例えば、抗ｃ−ｍｅｔ抗体）の使用を奨励することを含む、癌薬剤を宣伝するための方法に関する。
【０３５０】
宣伝は一般に、出資者が同定され、メッセージが制御される非個人媒体を介する通信に支払われる。本明細書の目的のための宣伝は、広報、広報活動、プロダクトプレイスメント、資金提供、引受業務、および販売奨励を含む。この用語はまた、大衆に、説得する、情報提供する、奨励する、動機付ける、またはさもなければ本発明を購入、支援、もしくは認可する好ましいパターンに向かって挙動を改変させるように訴えるように設計された、任意の印刷通信媒体中に出現する資金提供された情報公示も含む。
【０３５１】
本明細書に記載の診断方法の宣伝および奨励を、任意の手段により達成することができる。これらのメッセージを送達するために用いられる宣伝媒体の例としては、テレビジョン、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット、および掲示板、例えば、放送媒体に出現するメッセージであるコマーシャルが挙げられる。宣伝はまた、カートのシート、空港の歩道の壁、およびバスの側面上のもの、または電話に保持されたメッセージもしくは店内ＰＡシステム中で聞かれるものが挙げられ、または視覚的もしくは聴覚的通信をどこにでも置くことができる。
【０３５２】
奨励または宣伝手段のより具体的な例としては、テレビジョン、ラジオ、映画、ウェブ放送およびオンラインセミナーなどのインターネット、同時にユーザに届くように意図された双方向コンピュータネットワーク、固定掲示板または電子掲示板および他の公共用サイン、ポスター、雑誌および新聞などの伝統的文献または電子文献、例えば、電子メール、電話、インスタントメッセージ、郵便、国際宅配便、集団、または配達郵便、来店などによる他の媒体出力、プレゼンテーションもしくは個別コンタクトが挙げられる。
【０３５３】
用いられる宣伝の種類は、多くの因子、例えば、届けようとする標的聴衆の性質、例えば、病院、保険会社、診療所、医師、看護師、および患者、ならびに薬剤および診断の宣伝を左右する費用の考慮および関連する管轄の法律および規則に依存する。宣伝は、サービス相互作用により規定されるユーザ特性ならびに／またはユーザの人口動態および地理的位置などの他のデータに基づいて個別化またはカスタマイズすることができる。
【実施例１】
【０３５４】
抗癌キナーゼ阻害剤に対する増殖因子誘導性耐性
方法
ＲＴＫリガンドマトリックススクリーニング。核酸染料Ｓｙｔｏ６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞生存能力を評価した。細胞（３０００〜５０００個／ウェル）を９６穴プレートに播種し、一晩付着させた。次の日、細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＲＴＫリガンドで処理し（または処理せず）、増加する濃度範囲の関連キナーゼ阻害剤に同時に曝露した。７２時間の薬剤曝露後、細胞を４％ホルムアルデヒド中に固定し、Ｓｙｔｏ６０で染色し、細胞数をＯｄｙｓｓｅｙスキャナ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて評価した。薬剤処理された細胞から得られた蛍光を、対照（薬剤なし）処理された細胞から得られた蛍光で除算することにより、細胞生存能力を算出した。
【０３５５】
細胞系。以前に記載されたような自動化プラットフォームを用いて、ヒト癌細胞系を取得し、感受性について試験した（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．ら、「ＣＯＴ  ｄｒｉｖｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＲＡＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４６８、９６８〜９７２頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６２７（２０１０））。細胞系を、５％ＣＯ2で加湿雰囲気中３７℃で維持し、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）、５０ユニット／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を添加したＲＰＭＩ１６４０またはＤＭＥＭ／Ｆ１２増殖培地（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた。
【０３５６】
試薬。ラパチニブ、スニチニブおよびエルロチニブを、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。クリゾチニブ、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ６２４４およびＢＥＺ２３５を、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＰＤ１７３０７４を、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＰＬＸ４０３２を、Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。組換えヒト（ｒｈ）ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ−塩基性、ＩＧＦ−１およびＰＤＧＦ−ＡＢを、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。ｒｈＮＲＧ１−β１を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、３Ｄ６抗ＭＥＴアゴニスト抗体、ＲＧ７２０４（ＰＬＸ４０３２）およびＧＤＣ−０７１２は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈで作製された。ＧＤＣ−０７１２はクリゾチニブと類似するキナーゼプロファイルを有するため、それを異種移植実験において用いた（Ｌｉｅｄｅｒｅｒ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ４１、３２７〜３３９頁、ｄｏｉ：１０．３１０９／００４９８２５４．２０１０．５４２５００（２０１１））（図２５および図２６）。
【０３５７】
免疫ブロッティング。Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０溶解バッファーを用いて、細胞溶解物を収穫し、標準的なプロトコールを用いてタンパク質の免疫検出を実行した。ホスホ−ＨＥＲ２（Ｙ１２４８；＃２２４７）、ＨＥＲ２（＃２２４２）、ホスホ−ＨＥＲ３（Ｙ１２８９；＃４７９１）、ホスホ−ＭＥＴ（Ｙ１２３４／５；＃３１２６）、ＰＤＧＦＲα（＃５２４１）、ホスホ−ＦＲＳ２α（Ｙ１９６；＃３８６４）、ＩＧＦ−１Ｒβ（＃３０２７）、ホスホ−ＡＬＫ（Ｙ１６０４；＃３３４１）、ＡＫＴ（＃９２７２）、ホスホ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４；＃９１０１）、ＥＲＫ（＃９１０２）、ＧＡＰＤＨ（＃２１１８）およびβ−チューブリン（＃２１４６）抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＨＥＲ３（ＳＣ−２８５）、ＭＥＴ（ＳＣ−１０）、ホスホ−ＰＤＧＦＲα（ＳＣ−１２９１１）、ＦＲＳ２α（ＳＣ−８３１８）、ＦＧＦＲ１（ＳＣ−７９４５）、ＦＧＦＲ２（ＳＣ−１２２）、ＦＧＦＲ３（ＳＣ−１３１２１）およびＡＬＫ（ＳＣ−２５４４７）に対する抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ホスホ−ＡＫＴ（Ｓ４７３；＃４４−６２１Ｇ）抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｙ１０６８；ａｂ５６４４）抗体を、Ａｂｃａｍから購入した。ＥＧＦＲ（＃６１００１７）抗体を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＰＡＲＰ（＃１４−６６６６−９２）抗体を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。密度測定を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて実行した。
【０３５８】
組織試料。ＩＲＢに適切に認可され、患者のインフォームドコンセントを得た原発乳房腫瘍試料を、以下の供給源から取得した：Ｃｕｒｅｌｉｎｅ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ＩＬＳｂｉｏ（Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＤ）およびＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ。転移性メラノーマ腫瘍試料を、ＢＲＩＭ２試験から取得した。試験において用いられたヒト組織試料を、その使用の前に脱同定（二重暗号化）したので、これらの試料を用いる試験はＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓの規則および関連する指針の下でのヒト対象研究ではないと考えられる。ＭＥＴに関する免疫組織化学分析を、正に荷電したガラススライド上で４μｍの厚さに切断されたホルマリン固定パラフィン包埋切片上で実施した。ＭＥＴウサギモノクローナル抗体ＳＰ４４（Ｓｐｒｉｎｇ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ；＃Ｍ３４４１）およびＣＣ１標準抗原回復を用いて、Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ検出を含むＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ自動染色装置（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）上で染色を実施した。切片をヘマトキシリンで対抗染色し、ｃ−ＭＥＴに関する特異的染色（例えば、膜染色）を、０（染色なし）〜３＋（強い染色）のスケールでスコア化した。
【０３５９】
スコアリングスキームは、共同所有された米国特許出願公開第ＵＳ２０１２００８９５４１Ａ１号（この内容はその全体が参照により本明細書に組込まれる）に記載されている。簡単に述べると、腫瘍細胞を、ｃ−Ｍｅｔ染色についてスコア化した。染色を、対照細胞ペレットと比較した強い（３＋）、中程度の（２＋）、弱い（１＋）、不明瞭な（＋／−）または陰性（−）染色強度と分類したが、様々な染色強度をＩＨＣ分析のための対照として、ならびにスコアリング対照として用いてもよい。Ｈ４４１（強いｃ−ｍｅｔ染色強度）；Ａ５４９（中程度のｃ−ｍｅｔ染色強度）；Ｈ１７０３（弱いｃ−ｍｅｔ染色強度）、ＨＥＫ−２９３（２９３）（弱いｃ−ｍｅｔ染色強度）；およびＴＯＶ−１１２Ｄ（陰性のｃ−ｍｅｔ染色強度）またはＨ１１５５（陰性のｃ−ｍｅｔ染色強度）を用いた。染色強度の評価に加えて、様々な染色強度／パターンのパーセンテージを、異種シグナルを用いて試料中で視覚的に見積もった。
【０３６０】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）ＥＬＩＳＡ。血漿を、投与前サイクル１の転移性メラノーマ患者から取得し、患者由来血漿中のＨＧＦの濃度を、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量的に測定した。ＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレートのウェルを、１００μＬの被覆バッファー（０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ｍＬの親和性精製されたヤギ抗ヒト肝細胞増殖因子ポリクローナル抗体で被覆（ＯＮ、４℃）した後、アッセイバッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、０．２５％ＣＨＡＰＳ、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｐｐｍ  Ｐｒｏｃｌｉｎ３００、ｐＨ７．４）中の０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温で１時間遮断した。アッセイバッファー中の希釈したヒト肝細胞増殖因子対照および血漿試料（１００μＬ）を２回ロードし、室温で２時間インキュベートした後、１００μＬの親和性精製されたヤギ抗ヒト肝細胞増殖因子ビオチン（１５０ｎｇ／ｍＬ）を室温でさらに１時間添加した。ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｐ２０、１０ｐｐｍ  Ｐｒｏｃｌｉｎ３００、ｐＨ７．４中のアビジンコンジュゲート化西洋わさびペルオキシダーゼ（４０ｎｇ／ｍＬ）を添加し（１時間、室温）、１００μＬの発色基質（ＴＭＢ）を１５分間添加することにより反応を可視化した。１Ｍリン酸を用いて反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて６３０ｎｍでの還元を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各ステップの後、プレートを、洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。定量のための参照として、ヒト肝細胞増殖因子（ＣｒｉｔＲＳ  ＣＲ６７；２０００−１５．６２５ｐｇ／ｍＬ）の連続希釈により、標準曲線を確立した。
【０３６１】
異種移植試験。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより設定された指針および原則に従い、ＡＡＡＬＡＣ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ）認可施設にて実行された。１０００万個の９２８ＭＥＬまたは６２４ＭＥＬ  ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞（ＨＢＳＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁（例えば、１：１混合物））を、ＣＲＬ  Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤ．ｂｇマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に接種した。腫瘍が２００ｍｍ3の平均体積に達した時、マウス（１群あたり１０匹）を、４週間にわたって、示されたように対照抗体（抗ｇｐ１２０；１０ｍｇ／ｋｇ、週１回；腹腔内）、３Ｄ６（抗ＭＥＴアゴニスト抗体；１０ｍｇ／ｋｇ、週１回；腹腔内）、ＲＧ７２０４（ＰＬＸ４０３２；５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、眼周囲）、ＧＤＣ−０７１２（ＭＥＴ小分子阻害剤、１００ｍｇ／ｋｇ、毎日、眼周囲）で処置した。デジタルカリパス（Ｆｒｅｄ  Ｖ．Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）を用いて週２回、腫瘍を測定した。式（Ｌｘ（ＷｘＷ））／２を用いて、腫瘍体積を算出した。本実施例における部分的応答（ＰＲ）は、５０％を超えるが、１００％未満である腫瘍体積の減少と定義された。本実施例における完全な応答（ＣＲ）は、腫瘍体積の１００％の減少と定義された。ＰＬＸ４０３２処置された対照抗体群と、ＰＬＸ４０３２−およびＧＤＣ−０７１２−処置された対照抗体群との差異を、二元配置分散分析（*＝０．０００８）を用いて決定した。
【０３６２】
分泌因子スクリーニング。組換え精製された分泌因子を、必要に応じてＰｅｐｒｏｔｅｃｈおよびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で再構成させた。分泌因子を、１μｇ／ｍＬの濃度で９６穴プレート中に移した後、薬剤を含まないか、または５μＭのＰＬＸ４０３２を含む培地中で１００ｎｇ／ｍＬに希釈した。等量の希釈因子（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を、Ｏａｓｉｓ液体ハンドラーを用いてＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を予め播種した（前日に播種されたウェルあたり５００個の細胞）３８４穴プレート中に配置した。７２ｈのインキュベーションの後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞生存能力を決定した。
【０３６３】
統計分析。細胞生存能力アッセイにおけるエラーバーは、平均＋／−平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。受容体とリガンドとの相関付けのために、以下の群：受容体陽性、レスキューされたＲＴＫリガンド；受容体陽性、レスキューされていないＲＴＫリガンド；受容体陰性、レスキューされたＲＴＫリガンド；受容体陰性、レスキューされていないＲＴＫリガンドに関する２ｘ２の分割表を用いてレスキューを実行した。両側Ｆｉｓｈｅｒ直接確率検定を用いて、有意差を決定した。
【０３６４】
ＢＲＩＭ２臨床試料の統計分析。ＨＧＦレベルを対数変換し、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｆｆ検定を用いて、ガウス分布からの逸脱について得られた分布を検定した。Ｃｏｘ比例モデルを用いて、無進行生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）との関連について対数変換されたＨＧＦレベルを検定した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を用いて、応答とＨＧＦレベルとの関係を検定した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）曲線を用いて、ＨＧＦレベルと時間事象結果（ＰＦＳおよびＯＳ）との関係を示した。事象／患者数および中央時間事象を、各群について示す。連続的ＨＧＦレベルの関数としての結果のＣｏｘ比例モデルを用いて、ハザード比および対応するｐ値を算出した。
【０３６５】
結果
以前に定義されたキナーゼ依存性7〜9を有する４１種の異なるヒト腫瘍由来細胞系を用いて、本発明者らは、癌細胞および腫瘍間質中に広く発現されることが知られる10、６つの異なるＲＴＫリガンド（ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＲＧ１、ＩＧＦ）の、薬剤応答に対する効果を試験するための「マトリックス分析」を行った。具体的には、本発明者らは、さもなければ７２時間以内にその増殖を強力に抑制するキナーゼ阻害剤（例えば、ラパチニブ）のＩＣ５０に対する、各リガンドへのこれらの癌細胞系（例えば、ＡＵ５６５（ＨＥＲ２  ａｍｐ））の曝露の効果を定量した（図１ａ）。試験したほぼ全てのキナーゼ依存的癌細胞系は、複数の組織型から誘導され、異なるキナーゼ依存性（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲ、およびＦＧＦＲ）を有する細胞を含み、１つまたは複数のＲＴＫリガンドによる薬剤誘導性増殖阻害からレスキューすることができ、これは、キナーゼ依存的腫瘍細胞における選択的キナーゼ阻害剤に対する、応答に対するこれらのリガンドの潜在的に広い寄与を強調している（図１ｂ）。
【０３６６】
薬剤応答に対するリガンド曝露の結果を、３つのクラスに分類することができる（図１ｃ）；「レスキューなし」：リガンドの添加は薬剤応答に検出可能に影響しなかった；「部分的レスキュー」：リガンドは部分的に処置応答を無効化した、または「完全なレスキュー」：リガンドはＩＣ５０値を１０倍を超えて「右にシフトさせた」、もしくは薬剤応答を完全に抑制した。ＨＧＦ、ＦＧＦおよびＮＲＧ１は薬剤耐性の付与に関して最も広く活性なリガンドであり、次いでＥＧＦであったが、ＩＧＦおよびＰＤＧＦはその対応する受容体を活性化するその能力にも拘らず、比較的小さい効果を有していた（図５ａおよび図７ａ）。注目すべきことに、試験した細胞系の多くは、２つ、またはさらには３つの異なるリガンドへの曝露により処置感受性からレスキューすることができ、これは、様々なＲＴＫリガンドへの曝露時に冗長な生存経路に関与するそのような細胞の見かけの能力を強調している。有意には、試験したＲＴＫリガンドはいずれも、いくつかの試験した細胞系における化学療法剤シスプラチンの増殖抑制効果から細胞をレスキューすることができなかったが、これは、観察されたリガンドレスキュー効果が全身毒性薬剤からの広い保護を反映せず、むしろ、経路特異的シグナル破壊に限定されることを示唆している（図５ｂ）。
【０３６７】
キナーゼ依存性からのリガンド媒介性レスキューと関連するシグナリング力学をさらに探索するために、本発明者らは、ＲＴＫにより一般的に関与される２つの重要な下流生存シグナリング経路−ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路11を評価した。リガンド媒介性レスキューが達成された場合、ＲＴＫリガンドは、キナーゼ阻害剤の存在にも拘らずこれらの経路の少なくとも１つを効率的に「再活性化」することができた（図２ａ）。依存的キナーゼの自己リン酸化がＲＴＫリガンド同時処置後に抑制されたままであったため、経路再活性化は腫瘍形成性キナーゼの再活性化に起因するものではなかった。様々な試験したモデルにおいて、ＨＧＦはＰＩ３ＫとＭＡＰＫ経路の両方を再活性化し、ＩＧＦおよびＮＲＧ１はＰＩ３Ｋのみを再活性化し、ＦＧＦとＥＧＦはＭＡＰＫ経路のみを再活性化した。
【０３６８】
「冗長なＲＴＫ」の活性化および結果として生じる下流の生存シグナリングは、ラパチニブおよびＨＧＦで同時処置されたＡＵ５６５細胞を用いて証明されたように少なくとも４８時間持続した（図９ｂ）。ＰＩ３ＫとＭＡＰＫ経路の両方の再活性化に関する「付加的」役割は、ＮＲＧ１、ＦＧＦまたは組合せの存在下で、ラパチニブ処置されたＡＵ５６５細胞において観察された（図１４ａ）。しかしながら、ＰＩ３Ｋ経路（ＭＡＰＫではない）の特異的阻害は、ＨＧＦにより促進される薬剤耐性を弱め、両生存経路の関与と関連していた（図１４ｂ）。
【０３６９】
予想通り、細胞生存および経路シグナリングの観察されたＲＴＫリガンド誘導性レスキューを、二次活性化キナーゼを同時標的化することにより逆転させることができたが、これは、有効なリガンドがその同族ＲＴＫを介して作用していたことを確認するものである（図２ｂ、ｃ、図５ｃ、ｄ、図２２）。有意には、様々な試験したモデルにおいてリガンド誘導性レスキューを媒介した「二次」ＲＴＫの阻害剤は、これらの細胞系において単一薬剤処置としてほとんど効果がないか、または全く効果がなかったが、これは、キナーゼ依存的細胞が利用可能なリガンドの非存在下では複数の異なるＲＴＫに最初から依存しないことを示している。同様に、ＲＴＫリガンド刺激は、キナーゼ阻害剤の非存在下で細胞増殖に対してほとんど効果がないか、または全く効果がなかった（図１ｃおよび図２ｂ）。
【０３７０】
細胞系パネルにわたるベースラインＲＴＫ発現の分析により、これらのキナーゼ依存的癌細胞が全て、複数のＲＴＫを発現することが確認され、これは、多くの癌細胞が細胞外リガンドからの生存シグナルを受容するように「プライミング」されることを示唆している。注目すべきことに、リガンド誘導性レスキューは、いくつかの事例においては特定のＲＴＫの発現と良好に相関した（例えば、ＭＥＴ／ＨＧＦ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦおよびＨＥＲ３／ＮＲＧ１）（ｐ＜０．０１；図６）が、これは、処置前の腫瘍のＲＴＫプロファイルが腫瘍微小環境における対応するリガンドの利用可能性に応じて、癌細胞生存に寄与し得る２つ以上のキナーゼを同時標的化する必要性を予測する最適な処置戦略を知らせることができることを示唆している。
【０３７１】
いくつかの事例においては、リガンドは、リガンドに会合したＲＴＫの発現にも拘らず、薬剤感受性から細胞をレスキューすることができなかった。本発明者らは、この文脈におけるリガンド誘導性レスキューの失敗と関連する２つの異なる生化学的シナリオを同定した（図７）。いくつかの事例においては、ＲＴＫリガンドはＲＴＫリン酸化により証明されるように、その受容体を活性化することができたが、その結果として生じるＰＩ３ＫまたはＭＡＰＫを介する下流のシグナリングは観察されなかった。これは、例えば、ＩＧＦを用いる処置の際にＣＯＬＯ−２０１およびＢＴ４７４細胞系において見られた（図７ａ）。他の事例においては、ＲＴＫリガンドはその受容体ならびに少なくとも１つの下流の生存エフェクターを活性化したが、それはキナーゼ阻害から細胞をレスキューするには十分ではなかった。これは、例えば、ＨＧＦへの曝露時にＨ２２２８およびＨ３５８細胞について、またはＮＲＧ１への曝露時にＣＯＬＯ−２０１細胞について観察された（図７ｂ）。しかしながら、Ｈ２２２８およびＨ３５８細胞は、より長期にわたる処置の後にＨＧＦにより「レスキュー」されるが、これは、ＨＧＦに応答することができ、以下に詳述されるように、阻害的キナーゼの存在下で時間と共に選択することができる細胞のサブ集団の存在をおそらく示している（図８ｃ、ｄ）。
【０３７２】
細胞系の分析により、潜在的に重要な臨床的意義を持ついくつかの知見が得られた。例えば、ＡＬＫ関連染色体転座（ＮＣＩ−Ｈ３１２２）を担持し、ＡＬＫキナーゼ依存を示す２つの試験したＮＳＣＬＣ細胞系のうちの１つを、ＨＧＦへの簡単な曝露によりＡＬＫ阻害から効率的にレスキューすることができる（図８）。これらの細胞においては、ＨＧＦ受容体ＭＥＴが発現され、ＨＧＦはＡＬＫ選択的阻害剤ＴＡＥ６８４の存在下でもＥＲＫおよびＡＫＴ活性化を促進する。しかしながら、有意には、これらの細胞の生存は、ＡＬＫが転座したＮＳＣＬＣにおける印象的な臨床活性が最近示された12、二重ＡＬＫ／ＭＥＴキナーゼ阻害剤であるクリゾチニブを用いる処置によってＨＧＦの存在下でも効率的に抑制された。ＨＧＦに応答するこれらの細胞の観察された能力を考慮すると、多くのＡＬＫ転座ＮＳＣＬＣ患者において観察された比較的持続的な臨床応答は、ＡＬＫおよびＭＥＴ媒介性生存シグナルの両方を効率的に抑制することができるクリゾチニブの二重阻害的性質に一部起因し得る。興味深いことに、第２のＡＬＫ転座ＮＳＣＬＣ系であるＮＣＩ−Ｈ２２２８もまた検出可能なＭＥＴを発現するが、試験した７２時間の時点でＨＧＦによるＡＬＫ阻害からレスキューされなかった。しかしながら、ＨＧＦ処置は、ＴＡＥ６８４の存在下でＡＫＴおよびＥＲＫ活性を再活性化することができ（図７ｂ）、ＨＧＦの存在下でのより長期的なＴＡＥ６８４処置はこれらの細胞におけるＴＡＥ６８４に対する耐性獲得を防止した（図８ｃ）。この知見は、以前に記載された元々存在するＭＥＴ発現腫瘍細胞サブ集団がいくつかのＥＧＦＲ突然変異体ＮＳＣＬＣ患者中に存在することが示されたことを連想させる13。
【０３７３】
ＨＥＲ２キナーゼ阻害剤ラパチニブによる増殖阻害から９種の試験したＨＥＲ２増幅乳癌細胞系のうちの３種をレスキューするＨＧＦの能力も予想外であった（図３ａ）。これらの３種の細胞系は全てＭＥＴを発現し、その発現はラパチニブ応答を弱めるＨＧＦの能力と良好に相関していた（図３ｂ）。ＮＣＩ−Ｈ２２８細胞系と同様、部分的にＨＧＦでレスキューされたＡＵ５６５  ＭＥＴ発現細胞のより長期的な同時処置（１２日）は、ＨＧＦが、おそらくＭＥＴ発現細胞のサブ集団の選択を誘導することにより、ラパチニブに対する耐性を迅速に促進することを示していた（図３ｃ、９ｂ）。実際、ＡＵ５６５細胞の９日間のラパチニブおよびＨＧＦの同時処置により、ＭＥＴ発現が増加した細胞集団が得られたが、これはＨＧＦ曝露がＭＥＴ発現細胞のサブ集団を選択したことを示唆している（図３ｆ）。生化学的分析により、ＨＧＦが、ＭＥＴ陽性細胞においては特異的にＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫシグナリング経路を再活性化するが、ＭＥＴ陰性細胞においては再活性化しないことを示していた（図３ｄ）。
【０３７４】
本発明者らは次に、ＨＥＲ２陽性原発乳房腫瘍がＭＥＴタンパク質を検出可能に発現するかどうかを決定した（図３ｅ）。分析した１０個の試料のうち、１個の試料が腫瘍細胞の約３０％において中程度および高いＭＥＴ発現を示し、５個の試料が腫瘍細胞の約１０％においてＭＥＴ発現を示した。１つのＨＥＲ２増幅乳癌細胞系（ＨＣＣ１９５４）は、外因性ＨＧＦの非存在下でホスホ−ＭＥＴの上昇を示したが、これは、自己分泌機構を示し（図３ｂ）、これらの細胞におけるＭＥＴキナーゼ阻害はラパチニブ耐性の出現を遅延させた（図３ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＭＥＴを発現するＨＥＲ２陽性乳房腫瘍が、ＭＥＴを「プライミング」された腫瘍細胞のサブ集団に関与させることによりＨＥＲ２キナーゼ阻害を潜在的に回避し、標的化療法に対する耐性をもたらすことができること、およびＭＥＴ依存性へのこの切替えがＨＧＦの利用可能性により誘導され得ることを示唆している。この可能性と一致して、ＳＫＢＲ３およびＡＵ５６５細胞は同じ患者から誘導されたが、これは患者腫瘍内のＭＥＴ発現の相応しい異種性を強調している。本発明者らはまた、９種の試験したＨＥＲ２増幅乳房細胞系のうちの８種を、ＨＥＲ３リガンドＮＲＧ１への曝露によりラパチニブ感受性からレスキューすることができ、ＨＥＲ２標的化処置に対する可変的応答における腫瘍微小環境におけるＮＲＧ１発現にとって潜在的に重要な役割を含むことを見出した（図２３）。
【０３７５】
直接の潜在的な臨床的意義を持つ別の観察は、ＨＧＦ曝露が、いくつかの試験したＢＲＡＦ突然変異体ＰＬＸ４０３２感受性メラノーマおよび結腸直腸細胞系においてＢＲＡＦキナーゼ阻害剤ＰＬＸ４０３２に対する応答を有意に弱めるという予想外の知見であった。ＰＬＸ４０３２はＢＲＡＦ突然変異体メラノーマにおける顕著な臨床効果を最近示したが、これによって臨床的使用のためのその最近の認可が得られた14。
【０３７６】
ＰＬＸ４０３２感受性に同様に影響するＨＧＦ以外の増殖因子および他のサイトカインの潜在的な役割を決定するために、本発明者らは、４４６種の異なる組換え精製された分泌因子のそれぞれの存在下でのＰＬＸ４０３２に対するＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の感受性を比較した。この分析により、ＨＧＦを含む非常に少数の因子がＰＬＸ４０３２感受性を弱めることができることが示された（図１７）。
【０３７７】
本発明者らは、ＰＬＸ４０３２に応答するＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの潜在的により広い役割を探索するために、さらに１２種のＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞系を試験した（図４ａ）。ＨＧＦは、１２種の細胞系のうちの５種においてＰＬＸ４０３２感受性を有意に弱めた。１０種のＨＧＦでレスキューされた細胞系のうちの８種が検出可能なＭＥＴ発現を示したが、レスキューされなかった細胞においてはＭＥＴは検出不可能であるか、またはわずかに検出可能であった。注目すべきことに、ＭＥＴ発現はＨＧＦでレスキュー可能な細胞系においてＰＬＸ４０３２感受性と逆相関し、ＨＧＦはＨＧＦによりレスキューされた細胞系においてはＭＡＰＫシグナリングを再活性化することができたが、ＭＥＴ陰性ＨＧＦ非レスキュー細胞においては再活性化することができなかった（図４ｂ）。予測された通り、ＨＧＦによる生存レスキューは、ＭＥＴがクリゾチニブにより阻害された場合、逆転した（図４ｂおよび図９ａ）。１つのＢＲＡＦ突然変異細胞系（６２４ＭＥＬ）は、外因性ＨＧＦの非存在下でホスホ−ＭＥＴの上昇を示し、自己分泌機構（図４ａ）と一致し、これらの細胞におけるＭＥＴキナーゼ阻害はＰＬＸ４０３２耐性の出現を遅延させた（図４ｃ）。
【０３７８】
クリゾチニブ同時処置はまた、検出不可能なホスホ−ＭＥＴと共に２つの細胞系（Ａ３７５および９２８ＭＥＬ）におけるＰＬＸ４０３２に対する耐性も防止し、これはＰＬＸ４０３２に対する耐性の媒介におけるＨＧＦ活性化ＭＥＴの潜在的な役割をさらに支持している（図１８）。
【０３７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＲＡＦ阻害に対する耐性におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの潜在的な役割を検証するために、本発明者らはＢＲＡＦ突然変異体９２８ＭＥＬメラノーマ細胞を用いる異種移植試験を実施した。有意には、作動抗体３Ｄ６を用いるこれらの腫瘍におけるＭＥＴの活性化はＰＬＸ４０３２の増殖抑制効果を無効化した（図４ｄ）。ＰＬＸ４０３２に対する応答を弱める際の３Ｄ６によるＭＥＴ活性化の関連を、ＭＥＴ小分子キナーゼ阻害剤を用いる同時処置により証明した。まとめると、これらの結果は、ＭＥＴキナーゼが、ＨＧＦ活性化を介して、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマのサブセットにおけるＰＬＸ４０３２に対する臨床応答に寄与し得ることを示唆する。
【０３８０】
知見全体は、多くの腫瘍細胞中で同時に発現され得るＲＴＫ間のシグナルクロストークの広範な性質、および癌治療剤としての選択的キナーゼ阻害剤に対する先天的および後天的耐性に寄与する際のＲＴＫリガンドの潜在的に広い役割を強調する。そのようなリガンドを、自己分泌生存機構を誘導するために腫瘍細胞自体により産生させることができるか、または生存シグナリングに対する傍分泌効果により腫瘍細胞における薬剤応答に影響を与えるために腫瘍間質により産生させることができる15、16。
【０３８１】
ヒト腫瘍のますます理解される異種性は、薬剤耐性機構の解明を著しく困難にする17〜19。ＲＴＫリガンドの潜在的に広い役割を強調する本発明者らの知見の文脈において、本発明者らは、そのような異種性が耐性獲得に寄与し得る異なる機構を推測している。かくして、腫瘍細胞のサブ集団が生存促進性ＲＴＫリガンドに応答することができる療法の前に存在し、そのようなリガンドが腫瘍微小環境内で利用可能となる場合、このサブ集団を薬剤処置の選択圧を介して拡張することが可能である。実際、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞におけるＭＥＴ発現のＩＨＣ分析により、細胞の異種集団が示された（図２１）。ＥＧＦＲ突然変異体ＮＳＣＬＣの場合、ＭＥＴ誘導性腫瘍細胞のサブ集団は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による処置の間のＨＧＦに曝露時に出現し得る13。注目すべきことに、複数のＲＴＫの活性化がグリア芽腫において報告されており、前生存シグナルおよび細胞死の抑制は、複数の活性化受容体を同時標的化した後にのみ観察された（Ｓｔｏｍｍｅｌ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８、２８７〜２９０頁、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１４２９４６（２００７））。また、ＲＴＫリガンドを産生する能力を獲得する理由で腫瘍細胞のサブ集団を選択することも可能である。選択的キナーゼ阻害剤に対する耐性獲得の様々な前臨床モデルにおいて、観察された耐性機構は新しいＲＴＫ依存性への「切替え」を含み20〜25、いくつかの事例においては、それはＲＴＫリガンドの産生の増加に起因し得る。そのようなリガンド産生の増加は、突然変異またはエピジェネティックな機構により潜在的に達成され得る。ＢＲＡＦおよびＥＧＦＲ突然変異などのゲノムバイオマーカーは療法から利益を得る可能性が最も高い患者を同定する際に重要であったが、応答の規模および持続期間の両方に関して、そのような患者間でキナーゼ阻害剤に対する未だ説明されない広範囲の初期臨床応答が存在する12、14。腫瘍細胞により分泌され、腫瘍微小環境において発現されるか、またはさらには全身的に提供されるＲＴＫリガンドの潜在的な役割は、今までのところ大きく探索されていない。腫瘍由来細胞系は突然変異的に定義されるサブセットにおける選択的キナーゼ阻害剤に対する遺伝子型関連感受性を捕捉するための強固なモデルであることが示されているため7、8、このマトリックス分析からの知見は、そのような療法からの全体的な臨床利益におけるＲＴＫリガンドの潜在的に広い役割を支持し、ＲＴＫおよびその関連するリガンドの発現に基づくバイオマーカーの使用のための基礎を提供し、多くの広く発現されるＲＴＫに共通する重要なエフェクターを介する冗長な生存シグナリングと関連する先天的および後天的耐性機構の両方を予測する処置戦略を知らせる。
【実施例２】
【０３８２】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを有する細胞における様々なＰＴＫリガンドのレスキュー結果
ここで用いられる方法は、実施例１に記載のものと同様である。本発明者らは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを有する細胞における薬剤応答（ＰＬＸ４０３２）に対する６つの異なるＲＴＫリガンド（ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＲＧ１、ＩＧＦ）の効果を検査した。図１０は、ＰＬＸ４０３２で処理した細胞における様々なＰＴＫリガンドによるレスキューの結果を示す。
【実施例３】
【０３８３】
ラパチニブ耐性を遅延させる際のＭＥＴキナーゼ阻害の効果
ここで用いられる方法は、実施例１に記載のものと同様である。ＨＣＣ１９５４細胞におけるラパチニブ耐性を遅延させるＭＥＴキナーゼ阻害の効果を検査した。ＨＣＣ１９５４  ＨＥＲ２増幅乳癌細胞を、ラパチニブ（５μＭ）および／またはクリゾチニブ（１μＭ）で処理し、Ｓｙｔｏ６０で染色した。図１１は、ＨＣＣ１９５４細胞におけるＭＥＴキナーゼ阻害がラパチニブ耐性の出現を遅延させたことを示す。
【実施例４】
【０３８４】
ＰＬＸ４０３２に対する細胞応答におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの役割
ここで用いられる方法は、実施例１に記載のものと同様である。本発明者らは、ＰＬＸ４０３２に対する細胞応答におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの役割を検査した。本発明者らは、ＨＧＦがＨＧＦによりレスキューされた細胞系においてはＭＡＰＫシグナリングを再活性化させることができるが、ＭＥＴ陰性ＨＧＦ非レスキュー細胞においては再活性化することができないことを観察した（図４ａ、図１２ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＲＡＦ阻害に対する耐性におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの潜在的な役割を検証するために、本発明者らは、ＢＲＡＦ突然変異体９２８ＭＥＬおよび６２４ＭＥＬメラノーマ細胞を用いて異種移植試験を実施した。有意には、ＭＥＴ作動抗体３Ｄ６を用いるこれらの腫瘍におけるＭＥＴの活性化は、ＰＬＸ４０３２の増殖抑制効果を強く無効化した（図１２ｂ）。ＰＬＸ４０３２に対する応答を弱める際の３Ｄ６によるＭＥＴ活性化の関連を、ＭＥＴ小分子キナーゼ阻害剤を用いる同時処置により検証した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの知見と同様、本発明者らは、ＭＥＴキナーゼ活性の阻害がＰＬＸ４０３２で処置された異種移植片における腫瘍退縮に対するより大きい効果を有することを観察し、より部分的な応答が観察された（９２８ＭＥＬ：１対８；図１２ｂおよび図１９）。まとめると、これらの結果は、ＭＥＴキナーゼが、ＨＧＦ活性化を介して、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマのサブセットにおけるＰＬＸ４０３２に対する臨床応答に寄与することができることを示唆する。
【実施例５】
【０３８５】
臨床状況におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの役割
ここで用いられる方法は、実施例１に記載のものと同様である。臨床状況におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの潜在的な役割を検査するために、本発明者らは、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマ患者における循環ＨＧＦが臨床転帰に寄与することができるという仮説を試験した。かくして、予備処置された血漿ＨＧＦレベルを、ＢＲＩＭ２臨床試験に登録した１３２人の転移性メラノーマ患者（ＰＬＸ４０３２で処置されたＢＲＡＦ突然変異転移性メラノーマ患者）のうちの１２６人から測定した。ＨＧＦレベルは３３ｐｇ／ｍＬ〜７２００ｐｇ／ｍＬの範囲であり、中央レベルは３３４ｐｇ／ｍＬであった（図２０）。中央を超えるＨＧＦレベルを有するＰＬＸ４０３２処置された患者は、中央より低いＨＧＦレベルを有する患者よりも実質的に低下した無進行生存（ｐ＝０．００５）および全生存（ｐ＜０．００１）を示した（図１３）。ＨＧＦの増加は、無進行生存（ＰＦＳ、ハザード比は１．４２であり、ｐ＜０．００５である）および全生存（ＯＳ、ハザード比は１．８であり、ｐ＜０．００１である）により測定された場合、より悪い転帰と関連していた。患者を三分位に分離したところ、閾値効果よりもむしろ、ＨＧＦレベルと転帰との連続的関係が示された（図２４Ｂ）。これらの試験は、疾患進行および全生存におけるＨＧＦ−ＭＥＴシグナリング、ならびにおそらく、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマにおけるＢＲＡＦ阻害に対する臨床応答を暗示するものである。
【実施例６】
【０３８６】
細胞におけるリガンド誘導性レスキュー
ここで用いられる方法は、実施例１に記載のものと同様である。本発明者らは、細胞におけるＲＴＫの発現およびリガンド誘導性レスキューを分析した。その結果を図１５に示す。リガンド誘導性レスキューは、いくつかの事例（例えば、ＭＥＴ／ＨＧＦ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦおよびＨＥＲ３／ＮＲＧ１）において特定のＲＴＫの発現と良好に相関したが（ｐ＜０．０１；図１５）、これは、処置前の腫瘍のＲＴＫプロファイルが、腫瘍微小環境における対応するリガンドの利用可能性に応じて、癌細胞生存に寄与し得る２つ以上のキナーゼを同時標的化する必要性を予測する最適な処置戦略を知らせることができることを示唆している。
【実施例７】
【０３８７】
ＴＡＥ６８４に対する耐性獲得の防止におけるＨＧＦの効果
ここで用いられる方法は、実施例１に記載のものと同様である。本発明者らは、ＴＡＥ６８４で処理されたＨ２２２８細胞におけるＨＧＦの効果を検査した。図１６は、ＨＧＦの存在下でのより長期間のＴＡＥ６８４処理が、これらの細胞においてＴＡＥ６８４に対する耐性獲得を防止したことを示す。
【０３８８】
部分参考文献一覧
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【０３８９】
明確な理解のために例示および実施例によって前記発明をいくらか詳細に説明してきたが、説明および実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許および科学的文献の開示は、その全体が参照により本明細書に明示的に組込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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