(57)【要約】  ＣＤ４４に特異的な抗体を含む組成物を提供する。これらの抗体は、血液悪性腫瘍細胞に特異的に結合する。また、治療および診断目的で、ＣＤ４４を発現する細胞を標的とするためにＣＤ４４抗体を使用する方法も提供する。【選択図】  図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４４に特異的に結合する、単離された抗体または抗体断片。
【請求項２】
その抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＦＶ断片、単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）断片、ｄｓＦＶ断片、ＣＨ断片、および二量体ｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片は、ヒト化されている、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
前記抗体または抗体断片は、ＣＬＬ細胞上に発現されるＣＤ４４に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体または抗体断片と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体または抗体断片を生成する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の抗体または抗体断片をコードする核酸分子を含む発現構築物で宿主細胞を形質転換することと、
ｉｉ）コンジュゲートを生成するのに好適な条件下で前記宿主細胞を培養し、それによってタンパク質コンジュゲートを生成することと、を含む、方法。
【請求項９】
試料中のＣＤ４４タンパク質を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を請求項１に記載の検出可能に標識された抗体または抗体断片と接触させることと、
（ｂ）前記検出可能に標識されたペプチドと試料中のＣＤ４４との間の免疫反応性を検出することと、を含む、方法。
【請求項１０】
（ｃ）ＣＤ４４の対照レベルと比較して、前記対象においてＣＤ４４タンパク質の量における増加または減少が生じたかどうかを判定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体または抗体断片に、ＣＤ４４受容体を有する細胞を標的とさせる方法であって、前記細胞を本発明の抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
血液悪性腫瘍細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる対象からの試料において、ＣＤ４４タンパク質の存在を検出するためのキットであって、請求項１に記載の抗体または抗体断片と、アッセイ環境においてそれを使用するための指示と、を含む、キット。
【請求項１３】
血液悪性腫瘍を治療または予防するための方法であって、治療有効量のＣＤ４４に対する抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
血液悪性腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を治療するための治療計画を監視する方法であって、ＣＤ４４に特異的な抗体を投与することの結果としてのＣＤ４４タンパク質の活性または発現における変化を判定し、それによって前記対象における前記治療計画を監視することを含む、方法。
【請求項１５】
ＣＬＬ細胞上のＣＤ４４に結合する抗ＣＤ４４抗体がそれに生存優位性を付与する、ＣＬＬを治療または予防するための方法であって、請求項１に記載の抗体または抗体断片を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
対象における血液悪性腫瘍を治療または予防するための方法であって、ＣＤ４４に特異的に結合する治療有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記血液悪性腫瘍は、化学療法および／または生物学的療法に不応である、方法。
【請求項１７】
前記化学療法は、プリンヌクレオシド類似体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法は、アルキル化剤を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法は、プリンヌクレオシド類似体およびアルキル化剤を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液悪性腫瘍は、化学療法および生物学的療法に不応である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的療法は、モノクローナル抗体を含む、請求項１６または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液悪性腫瘍は、白血病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記白血病は、リンパ性白血病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンパ性白血病は、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１０月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／５５１，８５２号の利益を主張するものであり、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
助成金情報
本発明は、米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成金番号Ｐ０１  ＣＡ０８１５３４およびＲ３７  ＣＡ０４９７８０の下、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、概して、血液悪性腫瘍を標的とする抗体に関する。本発明はさらに、ＣＤ４４に特異的に結合し、慢性リンパ性白血病細胞を標的とする抗体に関する。
【０００４】
背景情報
血液悪性腫瘍は、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼす。これらの悪性腫瘍は、典型的には、２つの主要な血液細胞系列である骨髄細胞株およびリンパ球系細胞株のいずれかに由来する。骨髄系細胞株は、通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、およびマスト細胞を産生し、リンパ球系細胞株は、Ｂ、Ｔ、ＮＫ、およびプラズマ細胞を産生する。リンパ腫、リンパ性白血病、および骨髄腫は、リンパ球系に由来し、急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに骨髄増殖性疾患は、骨髄起源である。
【０００５】
Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、高度に可変性の臨床経過を有し、血液、二次リンパ組織、および骨髄におけるＣＤ５＋Ｂ細胞のクローン発現によって特徴付けられる。ＣＬＬは、可変性の予後を伴う異種疾患である：無痛期間および実質的に通常の平均余命を有する患者もあれば、侵襲性疾患および短い生存期間を有する患者もある。ＣＬＬに罹患する患者は、一般的に、疾患初期には治療を受けず、疾患の進行を監視する。治療は、通常、患者の生活の質が影響を受けた時に開始される。ＣＬＬの治癒は存在しないが、この疾患は典型的には治療可能であり、現在の標準的な化学療法計画により生存期間が延長されることが示されている。しかしながら、標準的な化学療法計画に不応であるか、または不応になるＣＬＬ患者の集団が存在する。
【０００６】
ＣＬＬ細胞の生存は、組織環境内の細胞によって、ならびに細胞外マトリックス、およびＣＬＬ細胞上に高レベルで発現されるＣＤ４４との相互作用のシグナルによって支持される。ＣＤ４４は、細胞間接着および細胞−マトリックス間接着、細胞遊走の支持、対応する細胞表面受容体または関連基質への成長因子、ケモカイン、または酵素の提示、ならびに膜から細胞骨格または核へのシグナルの伝達を含む、多くの生理的および病理的機能に関与する多重構造の糖タンパク質である［Ｎａｏｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１，２４１−３１９，（１９９７）；Ｌｅｓｌｅｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４，２７１−３３５，（１９９３）］。このタンパク質は、リンパ球の活性化、再循環、およびホーミング、造血発生、ならびに腫瘍転移を含む様々な細胞機能に関与する。この糖タンパク質は、複数のリガンド（例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、アラニン、コラーゲン）に結合することが分かっており、その主たるものはヒアルロン酸（ＨＡ）である。
【０００７】
多くのＣＬＬ患者がＣＬＬの標準的な化学療法計画に反応する一方で、上で述べたように、これらの標準的な治療に不応であるか、または不応になるＣＬＬ患者の集団が存在する。これらの患者集団には、既存の化学療法計画のいずれも奏功しないため、ＣＬＬを治療するための新しい治療法の必要性が明らかである。本発明は、そのような治療法である、ＣＬＬ細胞に特異的な新規ＣＤ４４抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、非常に影響力の大きい抗ＣＤ４４抗体の生成に基づいている。また、本発明は、抗ＣＤ４４抗体を使用して血液悪性腫瘍を治療または予防する方法に基づいている。さらに、本発明は、ＣＤ４４抗体を作製する方法を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ＣＤ４４に特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。
【００１０】
別の態様において、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＦＶ断片、単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）断片、ｄｓＦＶ断片、ＣＨ断片、または二量体ｓｃＦＶを含む。
【００１１】
種々の実施形態において、抗体または抗体断片は、ヒト化されている。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ＣＬＬ細胞上のＣＤ４に特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片をコードする単離された核酸を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、抗体をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片と、任意選択的に、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、抗体を生成する方法を提供する。この方法は、抗体をコードする核酸分子を含む発現構築物で宿主細胞を形質転換することと、抗体を生成するのに好適な条件下で宿主細胞を培養し、それによって抗体を生成することとを含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、試料中のＣＤ４４タンパク質を検出するための方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、抗体に、ＣＤ４４受容体を有する細胞を標的とさせる方法を提供する。この方法は、細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、血液悪性腫瘍細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる対象からの試料においてＣＤ４４タンパク質の存在を検出するためのキットを提供する。このキットは、抗体と、アッセイ環境においてそれを使用するための指示とを含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体を使用してヒト対象における血液悪性腫瘍を治療するための方法を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本発明のＣＤ４４抗体を投与することにより、ＣＬＬ細胞上のＣＤ４４に結合する抗体がそれに生存優位性を付与する、ＣＬＬを治療または予防するための方法を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体を使用して、血液悪性腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を治療するための治療計画を監視する方法を提供する。
【００２２】
もう１つの態様において、本発明は、対象における血液悪性腫瘍を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、治療有効量のＣＤ４４に対する抗体を必要とする対象に投与することを含み、血液悪性腫瘍は、化学療法および／または生物学的療法に不応である。一実施形態において、化学療法は、プリンヌクレオシド類似体および／またはアルキル化剤を含む。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、化学療法および生物学的療法に不応である。さらなる実施形態において、生物学的療法は、モノクローナル抗体を含む。一実施形態において、モノクローナル抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は、白血病である。別の実施形態において、白血病は、リンパ性白血病である。もう１つの実施形態において、リンパ性白血病は、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】慢性リンパ性白血病Ｂ細胞上のＣＤ４４の発現レベルが疾患侵襲性の特性と相関することを示す。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２Ａ】ＺａｐＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞に対する効力を増加させると、抗ＣＤ４４  ｍＡｂが、ＣＬＬ細胞のアポトーシスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接誘導することを示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図２Ｅ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【図３Ａ】ＣＬＬ細胞中で抗ＣＤ４４  ｍＡｂによって媒介されたアポトーシスがカスパーゼ依存性であることを示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図４】たとえＭＳＣの存在下であっても、抗ＣＤ４４  ｍＡｂがＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞のアポトーシスを選択的に誘導することを示す。
【図５Ａ】抗ＣＤ４４モノクローナル抗体が、ＣＬＬ細胞中でＨＡによって誘導されるＡＫＴのリン酸化および生存をブロックすることを示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図６Ａ】抗ＣＤ４４  ｍＡｂが、ＣＬＬ細胞におけるＣＤ４４およびＺＡＰ−７０タンパク質の発現を下方制御し、ＣＤ４４−ＺＡＰ−７０複合体を妨害し、ＢＣＲが誘導する生存シグナル伝達を抑制することを示す。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６Ｅ】同上。
【図６Ｆ】同上。
【図６Ｇ】同上。
【図６Ｈ】同上。
【図７Ａ】抗ＣＤ４４  ｍＡｂがｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＬＬ細胞の生存を妨げることを示す。
【図７Ｂ】同上。
【図８】抗ＣＤ４４  ｍＡｂは、ＣＬＬ細胞の食作用を媒介することができるが、補体誘導性の細胞死は媒介できないことを示す。
【図９】ＣＬＬ細胞において同様のＣＤ４４の発現レベル（ＭＦＩＲ）を有するＺＡＰ−７０の発現を伴うかまたは伴わない患者に、抗ＣＤ４４  ｍＡｂが与える影響を示す。
【図１０Ａ】抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたはリツキシマブで処理したＣＬＬ細胞の生存率を表す。
【図１０Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、非常に影響力の大きい抗ＣＤ４４抗体の生成に基づいている。また、本発明は、抗ＣＤ４４抗体を使用して血液悪性腫瘍を治療または予防する方法に基づいている。さらに、本発明は、ＣＤ４４抗体を作製する方法を提供する。
【００２５】
本発明の方法について説明する前に、記載される特定の組成物、方法、および実験条件は変化し得るため、本発明は、そのような組成物、方法、および条件に限定されないということを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施例を説明する目的で使用されているに過ぎず、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上、明らかにそうではないという指示のない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形の指示対象を含むものとする。よって、例えば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本開示等を読むことにより当業者に明らかとなるであろう本明細書に記載される種類の１つ以上の方法および／またはステップを含む。
【００２７】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有するものとする。
【００２８】
前述のように、血液悪性腫瘍は、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼす。これらの悪性腫瘍は、２つの主要な血液細胞系列である骨髄細胞株およびリンパ球系細胞株のいずれかに由来する。骨髄系細胞株は、通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、およびマスト細胞を産生し、リンパ球系細胞株は、Ｂ、Ｔ、ＮＫ、およびプラズマ細胞を産生する。リンパ腫、リンパ性白血病、および骨髄腫は、リンパ球系に由来し、急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに骨髄増殖性疾患は、骨髄起源である。
【００２９】
歴史的に、血液悪性腫瘍は、悪性腫瘍が主に血液中に位置するか（白血病）、またはリンパ節に位置するか（リンパ腫）によって、最も一般的に分割されてきた。白血病は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、および急性単球性白血病を含む。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む。
【００３０】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、白血病の一形態であり、つまりは過剰なリンパ芽球によって特徴付けられる白血球の癌である。急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）としても知られる急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）は、血液細胞の骨髄系列の癌であり、骨髄中に蓄積して正常な血液細胞の産生を妨げる異常な白血球の急速な増殖によって特徴付けられる。慢性顆粒球性白血病（ＣＧＬ）としても知られる慢性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）は、白血球の癌である。これは、骨髄における主として骨髄系細胞の増加する未制御の増殖、および血液中のこれらの細胞の蓄積によって特徴付けられる白血病の一形態である。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）としても知られるＢ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、最も一般的な種類の白血病である。ＣＬＬは、Ｂ細胞に影響を及ぼす。急性単球性白血病（ＡＭｏＬまたはＡＭＬ−Ｍ５）は、急性骨髄性白血病の一種であると考えられる。以前はホジキン病として知られていたホジキンリンパ腫は、リンパ腫の一種であり、リンパ球と呼ばれる白血球から生じる癌である。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、ホジキンリンパ腫を除くあらゆる種類のリンパ腫を含む多様な血液癌の多様な群である。
【００３１】
前述のように、ＣＬＬは一般的には治癒可能ではないが、通常、生存期間を延長する標準的な化学療法計画を用いて治療可能である。しかしながら、標準的な化学療法計画に不応であるか、または不応になるＣＬＬ患者の集団が存在する。ＣＬＬの標準治療は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、幹細胞移植、およびこれらの組み合わせを含む。
【００３２】
用語「抗ＣＤ４４抗体」、「抗ＣＤ４４」、「ＣＤ４４抗体」、または「ＣＤ４４に結合する抗体」は、抗体がＣＤ４４を標的とする際に診断薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＣＤ４４に結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗ＣＤ４４抗体は、ＣＤ４４に特異的に結合する。
【００３３】
一実施形態において、抗ＣＤ４４抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤ４４の定常領域に特異的に結合する。好ましい実施形態において、ヒト化抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｅｉｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｓｅｐ  １；７２（１７）：４３２９−３９に記載されるＲＧ７３５６抗体である。別の実施形態において、ヒト化抗体は、細胞の表面上に発現されたＣＤ４４に結合する際の細胞内への内在化によって特徴付けられる。
【００３４】
本明細書における用語「抗体」は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む種々の抗体構造を包含する。
【００３５】
「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片（その名称は、容易に結晶化する能力を反映している）とを生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なおも抗原を架橋させることできるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００３６】
参照抗体として「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する抗体を指し、反対に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する。例示的な競合アッセイを本明細書に提供する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す：すなわち、例えば、自然に生じる突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、考えられる変異体抗体（そのような変異体は、一般に微量で存在する）を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。よって、「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得られたという抗体の特徴を示しており、いずれか特定の方法による抗体の生成を必要とすると見なされるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を用いた方法を含む様々な技術によって作製することができ、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、当業者に既知である。
【００３８】
「裸の抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒性部分）または放射性標識とコンジュゲートされていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的処方物中に存在してもよい。
【００３９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによって、ｓｃＦｖは、抗原結合に望ましい構造を形成することができる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
【００４０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要な抗体のクラスが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ．ｓｕｂ．１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分割されてもよい。異なる免疫グロブリンのクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される。
【００４１】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対を形成することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第ＷＯ１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より詳細に記載されている。また、トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００４２】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、後に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むか、またはアミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００４３】
「親和性成熟」抗体は、そのような変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）内に１つ以上の変化を有する抗体を指し、そのような変化は、抗原に対する抗体の親和性の向上をもたらす。
【００４４】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原に結合させることに関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）の可変ドメインは、一般に同様の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬｈ、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、相補性ＶＬまたはＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーンするために、抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを用いて単離されてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと。
【００４５】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載されるようなサブグループである。一実施形態において、ＶＬの場合、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるようなサブグループκＩである。一実施形態において、ＶＨの場合、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるようなサブグループＩＩＩである。
【００４６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基と、ヒトＦＲのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てのまたは実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）が非ヒト抗体のものに対応し、全てのまたは実質的に全てのＦＲがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を行った抗体を指す。
【００４７】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、残りの重鎖および／または軽鎖が異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００４８】
「Ｆａｂ」断片は、重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、さらに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を担持するＦａｂ’に対する本明細書における記号表示である。元々、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。また、抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００４９】
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。
【００５０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）の残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、通常、ＶＨ（またはＶＬ）内の次の配列に見られる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００５１】
用語「完全長抗体」、「無傷の抗体」、および「全抗体」は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるようなＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指して、本明細書において交換可能に使用される。
【００５２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、緊密に非共有結合的に会合した１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。「二量体」構造類似体において、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種の類似体に会合できるように、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインを可塑性ペプチドリンカーによって共有結合させることができる。この構成において、各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つのＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、たとえ単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも低い親和性ではあるものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００５３】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態において、個体または対象はヒトである。
【００５４】
「単離された」抗体は、その天然の環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価に関する方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「治療」（およびその文法上の変形、「治療する」または「治療すること」等）は、治療を受けている個体の自然経過を変化させようという試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過途中で行うことができる。望ましい治療の効果として、限定されないが、疾患の発症または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理的結果の消失、疾患進行の速度の低減、病態の改善または緩和、および寛解または予後の向上を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、または疾病の進行を遅らせるために使用される。
【００５６】
用語「難治性腫瘍」または「難治性癌」または「難治性血液悪性腫瘍」は、特定の治療（「標準治療」による治療、例えば、化学療法剤を単独で用いたもしくは併用した治療、生物学的療法のみ、放射線療法、幹細胞移植、またはこれらの組み合わせ等）が奏功しないかまたはそれらに耐性を示す腫瘍、癌、または血液悪性腫瘍を指して本明細書において使用される。
【００５７】
用語「標準治療」は、通常の技術を有する良識ある医師が、癌等の特定の疾患を治療するために用いる治療プロセスを指すために使用される。標準治療は、癌の種類および病期、患者の状態および治療歴等に応じて異なり、当業者には明白であろう。
【００５８】
一態様において、血液悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））の「標準治療」は、化学療法および／または生物学的療法を用いた治療を含む。一実施形態において、化学療法は、単一の化学療法剤または１つより多くの化学療法剤を含む。別の実施形態において、化学療法は、プリンヌクレオシド類似体および／またはアルキル化剤を含む。もう１つの実施形態において、生物学的療法は、モノクローナル抗体を含む。さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は抗ＣＤ２０抗体である。一実施形態において、抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブである。
【００５９】
薬剤、例えば、薬学的処方物の「有効量」は、所望の治療または予防結果を達成するために必要な投与量および時間で効果的な量を指す。
【００６０】
本明細書において使用される場合、血液悪性腫瘍（例えば、ＣＬＬ）の標準治療は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、幹細胞移植、およびこれらの組み合わせを含む。ＣＬＬのための現在の治療は、単独でまたは併用して与えられるいくつかの異なる種類の化学療法を含む。典型的な化学療法剤は、ヌクレオシド類似体（例えば、プリンヌクレオシド類似体）、アルキル化剤、およびモノクローナル抗体を含む。フルダラビンは、プリン類似体の一例であり、ＣＬＬ療法のために併用して用いられることが多い。シクロホスファミドおよびベンダムスチンは、アルキル化剤の例である。生物学的療法は、抗体を含む、ポリペプチド系薬剤の投与を含む。一実施形態において、抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブおよびオファツムマブ等の抗ＣＤ２０抗体、ならびにアレムツズマブ等の抗ＣＤ５２抗体が、ＣＬＬの化学免疫療法に使用される。他の化学療法剤は、ベンダムスチン、フラボピリドール、レナリドマイド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンを含む。典型的な組み合わせは、ＦＣＲ（フルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキサン）ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾン）を含む。ＣＬＬの代替治療は、放射線照射および幹細胞移植を含む。
【００６１】
一態様において、対象の血液悪性腫瘍は、プリンヌクレオシド類似体および／またはアルキル化剤を含む化学療法に不応である。一実施形態において、化学療法は、フルダラビン、ペントスタチン、アザチオプリン、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、デオキシコホルマイシン、チアミプリン、ヒドロキシウレア、およびクラドリビンからなる群から選択される１つ以上のプリンヌクレオシド類似体を含む。別の実施形態において、化学療法は、ナイトロジェンマスタード類似体（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、トロホスファミド、ベンダムスチン、およびエストラムスチン）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、トレオスルファン、およびマンノスルファン）；エチレンイミン（チオテパ、アルトレタミン、トリアジコン、およびカルボコン）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン）；ならびにトリアゼン（例えば、ダカルバジンおよびテモゾロミド）からなる群から選択される１つ以上のアルキル化剤を含む。好ましい実施形態において、血液悪性腫瘍は、プリンヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン）および／またはシクロホスファミドを含む化学療法に不応である。
【００６２】
もう１つの態様において、対象の血液悪性腫瘍は、ステロイドを含む化学療法に不応である。別の実施形態において、化学療法は、ステロイドおよびアルキル化剤を含む。一実施形態において、ステロイドはプレドニゾンである。もう１つの実施形態において、アルキル化剤はクロラムブシルである。さらなる実施形態において、化学療法は、プレドニゾンおよびクロラムブシルを含む。
【００６３】
もう１つの態様において、対象の血液悪性腫瘍は、有糸分裂阻害剤を含む化学療法に不応である。別の実施形態において、化学療法は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、およびステロイドを含む。一実施形態において、有糸分裂阻害剤はビンクリスチン硫酸塩である。別の実施形態において、アルキル化剤はシクロホスファミドである。さらなる実施形態において、ステロイドはプレドニゾンである。もう１つの実施形態において、化学療法は、シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、およびプレドニゾン（ＣＶＰ）である。
【００６４】
別の態様において、対象の血液悪性腫瘍は、（ｉ）プリンヌクレオシド類似体および／またはアルキル化剤を含む化学療法、ならびに（ｉｉ）生物学的療法に不応である。一実施形態において、生物学的療法は、モノクローナル抗体療法を含む。別の実施形態において、モノクローナル抗体療法は、抗ＣＤ２０抗体療法または抗ＣＤ５２抗体療法を含む。好ましい実施形態において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブまたはオファツムマブである。好ましい実施形態において、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブである。別の好ましい実施形態において、血液悪性腫瘍は、（ｉ）フルダラビンを含む化学療法、ならびに（ｉｉ）リツキシマブまたはオファツムマブを含むモノクローナル抗体療法に不応である。もう１つの好ましい実施形態において、血液悪性腫瘍は、（ｉ）シクロホスファミドを含む化学療法、およびｉｉ）リツキシマブを含むモノクローナル抗体療法に不応である。さらに別の好ましい実施形態において、血液悪性腫瘍は、（ｉ）ベンダムスチンを含む化学療法、および（ｉｉ）リツキシマブを含むモノクローナル抗体療法に不応である。
【００６５】
一実施形態において、対象の血液悪性腫瘍は、ＦＣＲ（フルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブ）ならびにベンダムスチンを含む治療法に不応である。別の実施形態において、対象の血液悪性腫瘍は、アレムツズマブを含む治療法に不応である。さらなる実施形態において、対象の血液悪性腫瘍は、アレムツズマブ、クロラムブシル、オファツムマブ、ベンダムスチン塩酸塩、シクロホスファミド、またはリン酸フルダラビンを含む治療法に不応である。別の実施形態において、対象の血液悪性腫瘍は、クロラムブシルおよびプレドニゾンを含む治療法に不応である。別の実施形態において、対象の血液悪性腫瘍は、シクロホスファミド、ビンクリスチン硫酸塩、およびプレドニゾン（ＣＶＰ）を含む治療法に不応である。好ましい実施形態において、血液悪性腫瘍はＣＬＬである。
【００６６】
以前に記述したように、ＣＬＬ細胞は、細胞表面上にタンパク質ＣＤ４４を高度に発現する。ＣＤ４４は、細胞間接着および細胞−マトリックス間接着、細胞遊走の支持、対応する細胞表面受容体または関連基質への成長因子、ケモカイン、または酵素の提示、ならびに膜から細胞骨格または核へのシグナルの伝達を含む、多くの生理的および病理的機能に関与する多重構造の糖タンパク質である［Ｎａｏｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１，２４１−３１９，（１９９７）；Ｌｅｓｌｅｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４，２７１−３３５，（１９９３）］。このタンパク質は、リンパ球の活性化、再循環、およびホーミング、造血発生、ならびに腫瘍転移を含む様々な細胞機能に関与する。この糖タンパク質は、複数のリガンド（例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、アラニン、コラーゲン）に結合することが分かっており、その主たるものはヒアルロン酸（ＨＡ）である。ＣＤ４４遺伝子の転写は、βカテニン、および腫瘍発症と関連するＷｎｔシグナル伝達によって、少なくとも一部活性化される。
【００６７】
ＣＤ４４は、細胞外ドメインのセグメントをコードする少なくとも１０個の可変エクソンの差次的なスプライシングによって、および細胞型特異的なグリコシル化によって決定される、いくつかの変異体を有する。
【００６８】
ＣＤ４４は、多くの種類の悪性腫瘍に発現されるため、ＣＤ４４に対する抗体は、悪性腫瘍を治療する上で非常に有用であり得る。そのような抗体は、ＣＤ４４のマトリックス相互作用を妨害し、ＣＤ４４を占有することによって、アポトーシスを引き起こすことができるＣＤ４４シグナル伝達を誘導する。しかしながら、正常細胞上でのＣＤ４４の内因性発現レベルが低いため、そのような抗体は、望ましくない副作用を回避するために悪性細胞上に発現されるＣＤ４４に特異的でなければならない。
【００６９】
したがって、一態様において、本発明は、ＣＤ４４に特異的に結合する抗体または抗体断片を提供する。一実施形態において、抗体または抗体断片は、ＣＬＬ細胞上に発現されるＣＤ４４に特異的に結合する。
【００７０】
種々の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＦＶ断片、単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）断片、ｄｓＦＶ断片、ＣＨ断片、または二量体ｓｃＦＶであり得る。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「特異的結合」は、所定の抗原に対する抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、約１０−８Ｍ以下のＫＤに対応する親和性で結合し、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するための親和性よりも、少なくとも１０倍低い、また好ましくは少なくとも１００倍低い親和性（ＫＤによって表される）で所定の抗原に結合する。代替として、抗体は、約１０６Ｍ−１、または約１０７Ｍ−１、または約１０８Ｍ−１、または１０９Ｍ−１以上のＫＡに対応する親和性で結合することができ、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するための親和性よりも、少なくとも１０倍高い、また好ましくは少なくとも１００倍高い親和性で（ＫＡによって表される）で所定の抗原に結合する。
【００７２】
用語「ｋａ」（Ｍ−１ｓｅｃ−１）は、本明細書において使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を指すことが意図される。用語「ＫＡ」（Ｍ）は、本明細書において使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図される。
【００７３】
自然に生じる抗体は、一般に、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体である。実験的に、重鎖の各々を分解するタンパク質分解酵素パパインで抗体を切断し、３つの別個のサブユニットを生成することができる。軽鎖と、該軽鎖と質量がほぼ等しい重鎖の断片とからなる２つのユニットは、Ｆａｂ断片（すなわち、「抗原結合」断片）と称される。２つの等しい重鎖のセグメントからなる第３のユニットは、Ｆｃ断片と称される。Ｆｃ断片は、典型的には抗原−抗体結合には関与しないが、抗原の本体を除去することに関与する後のプロセスにおいて重要である。
【００７４】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、無傷の抗体分子よりも小さいため、全抗体分子が用いられる場合よりも多くの抗原結合ドメインが利用可能である。パパインを用いた典型的なＩｇＧ分子のタンパク質切断は、ジスフィルド結合によって近接する重鎖のアミノ末端部分に結合された無傷の軽鎖を含む、Ｆａｂ断片と称される２つの別個の抗原結合断片を生成することが分かっている。パパインで消化された免疫グロブリン分子の残りの部分は、Ｆｃ断片として知られ、無傷な状態で残った抗体のカルボキシ末端部分からなり、ジスフィルド結合によって結合される。抗体をペプシンで消化した場合は、Ｆ（ａｂ’）２断片として知られる断片が生成される：該断片は、Ｆｃ領域は有しないが、近接する軽鎖と重鎖との間のジスフィルド結合と、さらに、近接する重鎖の残りの部分の間のジスフィルド結合とによって一緒に保持される、両方の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ断片）を含む（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８６））。
【００７５】
当業者には容易に認識されるように、改変された抗体（例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、二官能性、抗体ポリペプチド二量体（すなわち、抗体の二つのポリペプチド鎖成分の会合、例えば、重鎖および軽鎖；またはＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ抗体ドメインを含むＦａｂ断片；またはＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片を含む、抗体の１つのアーム）、単鎖抗体（例えば、リンカーによってＶＨドメインに結合されたＶＬドメインを含むｓｃＦｖ（すなわち、単鎖Ｆｖ）断片等）は、当技術分野において周知の方法によって生成することもできる。
【００７６】
ｓｃＦｖを生成するために、標準的な逆転写酵素プロトコルを用いて、最初に、ＣＤ４４抗原に対するｍＡｂを生成するハイブリドーマから単離されたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを生成する。次いで、マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域に対するプライマーセットを使用する標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、ｍＡｂの重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ分子を増幅することができる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  （１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８）。次いで、組換えｓｃＦｖ  ＤＮＡ分子を作製するために、ｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域をコードする増幅ｃＤＮＡをリンカーオリゴヌクレオチドと一緒に結合させる。ｇ３ｐと称される微小コートタンパク質をコードするファージ遺伝子の５’領域内に増幅ｃＤＮＡ配列を融合するように設計された繊維状ファージプラスミド中に、ｓｃＦｖ  ＤＮＡをライゲートする。次いで、大腸菌細菌細胞を組換えファージプラスミドで形質転換し、繊維状ファージを増殖させて採取する。所望の組換えファージディスプレイ抗原結合ドメインを、微小コートタンパク質のアミノ末端領域に融合する。次いで、例えば、「パニング」として知られる方法を使用して、固定化抗原にそのような「ディスプレイファージ」を通過させ（Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１，２１５−２１８；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３７８−６３８２を参照のこと）、抗原に結合することができるｓｃＦｖ抗体タンパク質を含むこれらのファージ粒子を吸着させる。次いで、標準的なファージ感染法により抗原結合性ファージ粒子を増幅させることができ、増幅した組換えファージ集団を抗原結合能について再び選択する。そのような抗原結合能のための連続的な選択ラウンドの後、増幅し、組換えファージ上に表示されたｓｃＦｖ中で、増強された抗原結合能について選択する。増大した抗原結合能についての選択は、結合が起こる条件を、より厳密な結合活性を必要とするように調節することによって行われてもよい。増強された抗原結合活性を選択するための別の方法は、ｓｃＦｖの結合ドメインをコードするｃＤＮＡ内のヌクレオチド配列を変化させ、組換えファージ集団を抗原結合活性のための連続的な選択ラウンドおよび増幅に供することである（Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，１０８３２−１０８３８；およびＣｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３７８−６３８２を参照のこと）。
【００７７】
一旦、ｓｃＦｖを選択したら、大腸菌株ＨＢ２１５１とともに適切なベクターを用いて、遊離形態で生成することができる。これらの細菌は、実際には、ファージ成分を含まない可溶型でｓｃＦｖを分泌する（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７）。ＨＢ２１５１細菌培養培地からの可溶型ｓｃＦｖの精製は、ＡＦＦＩＧＥＬ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）等の支持体上に固定化された抗原分子を用いた親和性クロマトグラフィーにより達成することができる。
【００７８】
組換え抗体技術における他の発展は、ｓｃＦｖｓを二量体および四量体に重合することによる結合力の増加等のさらなる改良への可能性を示している（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８を参照のこと）。
【００７９】
さらに、組換え抗体技術は、ハイブリドーマと比較して、抗体のより安定な遺伝子源を提供する。組換え抗体はまた、標準的な細菌ファージ生成法を使用して、より迅速かつ経済的に生成することもできる。
【００８０】
本明細書に記載される抗体または抗体断片を組換えによって生成するために、抗体または抗体断片をコードする核酸が発現ベクターに挿入される。軽鎖および重鎖は、同じかまたは異なる発現ベクターにクローニングすることができる。Ｋｉｐｐｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，２８７，５６９号の教示（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）および本明細書に記載される方法は、本発明のｓｃＦｖｓを作製するために当業者によって容易に適応され得る。
【００８１】
発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体の不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。大腸菌は、本発明の抗体を発現させるために特に有用な１つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主は、枯草菌等の桿菌、ならびに他の腸内細菌科、例えば、サルモネラ、セラチア、および種々のシュードモナス種等を含む。これらの原核生物宿主において、宿主細胞に適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）および調節配列、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系、またはファージλからのプロモーター系等を典型的に含む発現ベクターを作製することもできる。酵母等の他の微生物もまた、発現に使用することができる。サッカロミセスは、発現制御配列、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素を含むプロモーター等を含む好適なベクターと、必要に応じて、複製起点、終止配列等とを有する好ましい宿主である。哺乳動物の組織細胞培養物も、本発明の抗体を発現させるおよび生成するために使用することができる（例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８７を参照のこと）。無傷の抗体を分泌することができる多数の好適な宿主細胞株が開発されているため、真核細胞が好ましい。本発明の免疫グロブリンをコードする核酸を発現させるために好ましい好適な宿主細胞は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換させたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；およびＴＲＩ細胞を含む。
【００８２】
対象となるポリヌクレオチド配列を含むベクターを、宿主細胞に移入することができる。塩化カルシウムによる遺伝子導入が、一般に原核細胞に用いられるのに対し、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理または電気穿孔法を使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。組換えＤＮＡの導入後に免疫グロブリン生成物を発現する細胞株が、選択される細胞である。安定した発現が可能な細胞株が好ましい（すなわち、細胞株の５０継代後に発現レベルが低下していない）。
【００８３】
一旦、発現させてから、本発明の抗体または抗体断片は、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当該技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％均一性である実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。
【００８４】
標識された抗体または検出可能に標識された抗体は、一般に、検出可能な標識が付着した抗体（または結合特異性を保持する抗体断片）である。検出可能な標識は、通常、化学的コンジュゲーションによって付着しているが、標識がポリペプチドである場合、代替として遺伝子操作技術によって付着させることもできる。検出可能に標識されたタンパク質の生成のための方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において既知の検出可能な標識は、放射性同位元素、フルオロフォア、常磁性標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または、検出可能なシグナル（例えば、放射活性、蛍光、色）を放出するか、もしくは標識がその基質に曝露された後に検出可能なシグナルを放出するかのいずれかである、他の部分もしくは化合物を含む。種々の検出可能な標識／基質の対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および標識抗体を使用するための方法が、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。同様により高い感受性をもたらし得る別の技術は、抗体を低分子量ハプテンにカップリングすることからなる。これらのハプテンは、次いで、第２の反応により特異的に検出することができる。例えば、そのようなハプテンを、アビジンと反応するビオチンとして、または特異的な抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェニル、ピリドキサール、およびフルオレセインとして用いることが一般的である。
【００８５】
抗体は、抗原結合に直接関与していないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域から同等な配列で置き換えることによってヒト化されてもよい。ヒト化キメラ抗体の概説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７（１９８５））およびＯｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６））によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離すること、操作すること、および発現させることを含む。そのような核酸の源は、当業者に周知であり、例えば、抗体産生ハイブリドーマから得ることができる。次いで、ヒト化もしくはキメラ抗体またはそれらの断片をコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８６】
ヒト化抗体は、代替として、ＣＤＲ置換によって生成することができる（米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）；およびＢｅｉｄｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０（１９８８））。よって、特定の実施形態において、コンジュゲートに使用される抗体は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ２４３９を有するハイブリドーマによって生成される抗体のヒト化またはＣＤＲグラフト化形態である。他の実施形態において、抗体は、抗体ｍＡｂ  ３Ｅ１０のヒト化またはＣＤＲグラフト化形態である。例えば、ＣＤＲ領域は、図に示すもの等から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の相違等のアミノ酸置換を含むことができる。場合によっては、１〜５個のアミノ酸の相違がいずれかに存在する。
【００８７】
そのような変異体は、１つ以上の置換が抗体または抗体断片の重鎖ヌクレオチド配列および／もしくは軽鎖ヌクレオチド配列に導入されるものを含む。
【００８８】
本発明の抗体は、別の分子とコンジュゲートされてもよい。本明細書に記載されるコンジュゲートの部分を結合するために様々なリンカーが使用され得る。本明細書において使用される用語「分解可能なリンカー」は、種々の条件下で切断することができるリンカー部分を指す。切断に好適な条件は、限定されないが、ｐＨ、ＵＶ照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離、および置換反応、ならびに結合の熱力学的特性を含む。本明細書において使用される用語「感光性リンカー」は、特定のＵＶ波長で選択的に切断される、当該技術分野において既知のリンカー部分を指す。感光性リンカーを含む本発明の化合物は、対象とする標的細胞または組織に化合物を送達するために使用することができ、後にＵＶ源の存在下で放出することができる。
【００８９】
本明細書において使用される用語「リンカー」は、例えば、コンジュゲートの個々の部分を物理的に結合することによって、基質および活性分子が、同じ領域、組織、または細胞を標的とすることを可能にする任意の結合、低分子、または他のビヒクルを指す。
【００９０】
特定の実施形態において、切断可能または分解可能なリンカーが使用されてもよい。一実施形態において、リンカーは、１つ以上の基質と１つ以上の治療部分との間の化学結合である。したがって、結合は、共有結合性またはイオン性であってもよい。リンカーが化学結合である治療複合体の一例は、融合タンパク質であろう。一実施形態において、化学結合は酸感受性であり、ｐＨ感受性結合は、血流（ｐＨ７．５）から細胞輸送小胞または細胞内部（ｐＨ約６．０）へ移行する際に切断される。代替として、結合は、酸感受性でなくてもよいが、後に添加されるかもしくは標的部位の微小環境内に自然に見られる特異的な酵素または化学物質によって切断されてもよい。代替として、結合は、還元条件下で切断される結合、例えば、ジスルフィド結合であってもよい。
【００９１】
代替として、結合は切断可能でなくてもよい。あらゆる種類の酸切断可能または酸感受性のリンカーが使用され得る。酸切断可能な結合の例として、限定されないが、ｃｉｓ−ポリカルボキシルアルケンとして知られる有機酸のクラスが挙げられる。このクラスの分子は、少なくとも１つの二重結合を含む炭素鎖に付着した少なくとも３つのカルボン酸基（ＣＯＯＨ）を含む。これらの分子、およびそれらがどのように作製され、使用されるかは、Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６３１，１９０号に開示されている。
【００９２】
別の実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカー等の低分子である。一実施形態において、ペプチドリンカーは切断可能ではない。さらなる実施形態において、ペプチドリンカーは、塩基によって、還元条件下で、または特異的酵素によって切断可能である。一実施形態において、酵素は常在性である。代替として、小ペプチドは、治療複合体の後にまたはそれに加えて投与される非常在性酵素によって切断されてもよい。代替として、小ペプチドは、例えば、ペプチドがジスルフィド結合を含む場合、還元条件下で切断されてもよい。代替として、小ペプチドは、ｐＨ感受性であってもよい。
【００９３】
ペプチドリンカーはまた、ペプチドタグ（例えば、ｍｙｃもしくはＨｉｓ６（配列番号１））として有用であり得るか、または既知のリンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２）の１つ以上の繰り返しであってもよい。当業者は、コンジュゲートを形成するために結合されるポリペプチド部分に応じてリンカー配列が変化し得ることを認識するであろう。エピトープタグ、親和性タグ、可溶性増強タグ等のさらなるペプチドリンカーおよびタグが、当該技術分野において既知である。本発明とともに使用され得る種々のさらなるタグおよびリンカーの例として、赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ、ｍｙｃエピトープ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｎｕｓ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓタンパク質、ストレプトアビジン、ＳＢＰ、ポリ（Ａｒｇ）、ＤｓｂＡ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡＴ、セルロース結合ドメイン、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、およびユビキチン（Ｕｂ）等が挙げられる。さらなる例として、ポリ（Ｌ−Ｇｌｙ）、（ポリＬ−グリシンリンカー）；ポリ（Ｌ−Ｇｌｕ）、（ポリＬ−グルタミンリンカー）；ポリ（Ｌ−Ｌｙｓ）、（ポリＬ−リジンリンカー）が挙げられる。一実施形態において、ペプチドリンカーは、式（アミノ酸）ｎ（式中、ｎは２〜１００の整数である）を有し、好ましくは、ペプチドは、１つ以上のアミノ酸のポリマーを含む。
【００９４】
化学リンカーおよびペプチドリンカーは、コンジュゲート合成に関する当技術分野において既知の技術によって、すなわち、遺伝子操作を用いてまたは化学的に、抗体とコンジュゲートとの間に結合させることができる。コンジュゲート合成は、適切な官能基における他の部分へのタンパク質の古典的カップリング反応によって、適切な抗体を介して化学的に達成することができる。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）等の、ポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、文脈に適合する場合または記載される実施形態に適用できる場合、一本鎖ポリヌクレオチド（アンチセンス等）および二本鎖ポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ等）の両方を含むと理解されるべきである。
【００９６】
「タンパク質コード配列」または特定のポリペプチドもしくはペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定されないが、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含むことができる。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、それが結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに統合され得る、ゲノム統合ベクターまたは「統合ベクター」である。別の種類のベクターは、エピソームベクター、例えば、染色体外複製が可能な核酸である。作動可能に結合した遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、文脈からそうではないことが明らかでない限り、交換可能に使用される。発現ベクターにおいて、転写を制御する調節要素は、一般的に、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来し得る。通常は複製起点によって付与される宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子が、さらに組み入れられてもよい。レトロウイルス、アデノウイルス等のウイルスに由来するベクターが用いられてもよい。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、タンパク質を生成する方法を提供する。この方法は、発現構築物で宿主細胞を形質転換することと、コンジュゲートを生成するのに好適な条件下で宿主細胞を培養することとを含む。
【００９９】
タンパク質および／またはタンパク質コンジュゲートの調製に使用するのに好適なベクターは、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌の人工染色体、ウイルスＤＮＡ、Ｐｌ系の人工染色体、酵母プラスミド、および酵母の人工染色体から選択されるものを含む。例えば、ウイルスＤＮＡベクターは、ワクチニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびＳＶ４０の誘導体から選択することができる。本発明の方法の実施において使用するのに好適な細菌ベクターは、ｐＱＥ７０（商標）、ｐＱＥ６０（商標）、ｐＱＥ−９（商標）、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ＳＫ、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ＫＳ、ｐＴＲＣ９９ａ（商標）、ｐＫＫ２２３−３（商標）、ｐＤＲ５４０（商標）、ＰＡＣ（商標）、およびｐＲＩＴ２Ｔ（商標）を含む。本発明の方法の実施において使用するのに好適な真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ（商標）、ｐＸＴＩ（商標）、ｐＳＧ５（商標）、ｐＳＶＫ３（商標）、ｐＢＰＶ（商標）、ｐＭＳＧ（商標）、およびｐＳＶＬＳＶ４０（商標）を含む。本発明の方法の実施において使用するのに好適な真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ（商標）、ｐＸＴＩ（商標）、ｐＳＧ５（商標）、ｐＳＶＫ３（商標）、ｐＢＰＶ（商標）、ｐＭＳＧ（商標）、およびｐＳＶＬＳＶ４０（商標）を含む。
【０１００】
当業者は、そのようなベクターに含まれるべき好適な調節領域を、例えば、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ａｐｔ、λＰＲ、ＰＬ、ｔｒｐ、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉ調節領域から選択することができる。
【０１０１】
タンパク質コンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを発現することができる宿主細胞は、例えば、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞を含む。例えば、大腸菌、桿菌、ストレプトマイセス、ピキアパストリス、サルモネラチフィリウム、ショウジョウバエＳ２、スポドプテラＳＪ９、ＣＨＯ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、またはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞は、全て、本発明の方法の実施において使用するのに好適な宿主細胞である。
【０１０２】
送達される発現構築物は、典型的には、プロモーター等の調節要素が対象とする核酸に作動可能に結合されたベクターの一部である。プロモーターは、構成的または誘導的であり得る。構成的プロモーターの非限定的な例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターが挙げられる。本明細書において使用される場合「誘導的」は、上方制御および下方制御の両方を指す。誘導的プロモーターは、誘導因子に応答して１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することができるプロモーターである。誘導因子が存在しない場合、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。誘導因子は、タンパク質、代謝産物、増殖調節因子、フェノール化合物等の化学物質、あるいは、例えば、熱によって直接的に、またはウイルス等の病原体もしくは病因物質の作用を通して間接的に課せられる生理的ストレスであり得る。誘導因子は、波長、強度、蛍光、方向、および持続時間を含む、光および光の種々の態様等の照射因子であり得る。
【０１０３】
誘導的プロモーターの一例は、核酸の転写を調節するために使用することができるテトラサイクリン（Ｔｅｔ）−Ｏｎプロモーター系である。この系において、変異Ｔｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスＶＰ１６（転写活性化タンパク質）の活性化ドメインに融合し、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって調節されるテトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を作製する。抗生物質が存在しない場合、転写は最小限であり、ｔｅｔまたはｄｏｘが存在する場合、転写が誘導される。代替の誘導系は、エクダイソンまたはラパマイシン系を含む。エクダイソンは、エクダイソン受容体のヘテロ二量体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物によってその発現が制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクダイソンまたはムリステロンＡ等のエクダイソンの類似体を用いた処理によって誘導される。
【０１０４】
ベクターにおいて有用であり得るさらなる調節要素、限定されないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム進入部位、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、またはイントロンを含む。そのような要素は、必要ではないかもしれないが、それらは、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率等に影響を及ぼすことによって発現を増加させる可能性がある。細胞（複数可）において核酸の最適な発現を得るために、そのような要素を、必要に応じて核酸構築物に含めることができる。しかしながら、時として、そのようなさらなる要素なしでも十分な発現を得ることができる。
【０１０５】
ベクターはまた、他の要素を含むこともできる。例えば、ベクターは、コードされるポリペプチドが特定の細胞の位置（例えば、細胞にタンパク質を分泌させるためのシグナル分泌配列）に誘導されるようにシグナルペプチドをコードする核酸、または選択可能なマーカーをコードする核酸を含むことができる。選択可能なマーカーの非限定的な例として、ピューロマイシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。そのようなマーカーは、培養物中で安定な形質転換体を選択するために有用である。
【０１０６】
ウイルスベクターは、コンジュゲートを形成するために使用することができ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、およびウシ乳頭腫ウイルスのベクターを含む（ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの概説については、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２７４４−１２７４６（１９９７）を参照のこと）。ウイルスベクターは、ウイルスの天然の指向性および病原性が変化または除去されているように修飾される。ウイルスのゲノムはまた、その感染性を高めるため、および対象となるポリペプチドをコードする核酸のパッケージングに対応するために修飾することもできる。
【０１０７】
非ウイルスベクターもまた、主題のコンジュゲートにおいて使用することができる。さらに例示するために、一実施形態において、ベクターによってコードされる哺乳動物血清タンパク質は、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子の受容体、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、および凝固因子からなる群から選択される。本発明はまた、組換え発現、および、例えば、形質導入筋細胞から血液への分泌を引き起こす、治療有効量の哺乳動物血清タンパク質のコンジュゲートをそのような哺乳動物に投与するステップを含む、その循環系における血餅の形成に関連するものを処理するための方法を提供する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片と、任意選択的に薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、試料中のＣＤ４４タンパク質を検出するための方法を提供する。この方法は、試料を、標識したＣＤ４４抗体または抗体断片と接触させることと、試料中で検出可能に標識された抗体とＣＤ４４との間の免疫反応性を検出することとを含む。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体を使用してヒト対象における血液悪性腫瘍を治療するための方法を提供する。この方法は、有効量の本発明の抗体または抗体断片を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、本発明のＣＤ４４抗体を、それを必要とする対象に投与することにより、ＣＬＬ細胞上のＣＤ４４に結合する抗体がそれに生存優位性を付与する、ＣＬＬを治療または予防するための方法を提供する。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象における血液悪性腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は、有効量のＣＤ４４に対する抗体を対象に投与することを含み、対象の血液悪性腫瘍は、化学療法および／または生物学的療法に不応である。一実施形態において、対象の血液悪性腫瘍は、治療法に不応であり、該治療法は、（ｉ）プリンヌクレオシド類似体および／もしくはアルキル化剤を含む化学療法、ならびに／または（ｉｉ）モノクローナル抗体療法を含む生物学的療法を含む。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、白血病、好ましくはリンパ性白血病である。もう１つの実施形態において、リンパ性白血病は、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。
【０１１３】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＢ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を治療する方法を提供し、該方法は、有効量のＣＤ４４に対する抗体を対象に投与することを含み、対象のＣＬＬは、化学療法および／または生物学的療法に不応である。一実施形態において、対象のＣＬＬは、治療法に不応であり、該治療法は、（ｉ）プリンヌクレオシド類似体および／もしくはアルキル化剤を含む化学療法、ならびに／または（ｉｉ）モノクローナル抗体療法を含む生物学的療法を含む。
【０１１４】
さらなる態様において、本発明は、薬物の製造または調製における抗ＣＤ４４抗体の使用を提供する。一実施形態において、薬物は、対象における血液悪性腫瘍のためのものであり、血液悪性腫瘍は、化学療法および／または生物学的療法に不応である。別の実施形態において、薬物は、血液悪性腫瘍を有する対象に有効量の薬物を投与することを含む、血液悪性腫瘍を治療する方法において使用するためのものであり、血液悪性腫瘍は、化学療法および／または生物学的療法に不応である。特定の実施形態において、血液悪性腫瘍は白血病である。他の実施形態において、白血病はリンパ性白血病である。さらなる実施形態において、リンパ性白血病はＢ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。
【０１１５】
もう１つの実施形態において、本発明は、血液悪性腫瘍を治療する方法において使用するためにＣＤ４４に結合する抗体を提供し、抗体は、血液悪性腫瘍に関連するＣＤ４４を発現する細胞によって内在化され、その成長を阻害する。別の実施形態において、本発明は血液悪性腫瘍を治療するための薬物の製造のためにＣＤ４４に結合する抗体の使用を提供し、抗体は、血液悪性腫瘍に関連するＣＤ４４を発現する細胞によって内在化され、その成長を阻害する。さらなる実施形態において、抗体は、別の分子、例えば、治療分子とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、抗体は、リンカーを介して別の分子とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍はＣＬＬである。別の実施形態において、ＣＤ４４を発現する細胞はＢ細胞である。好ましい実施形態において、Ｂ細胞はＣＬＬ細胞である。別の実施形態において、抗ＣＤ４４抗体は、ＣＤ４４に特異的に結合する。
【０１１６】
種々の実施形態において、血液悪性腫瘍を予防または治療する方法は、さらなる治療剤をさらに含んでもよい。そのような治療剤は、プリン類似体、アルキル化剤、モノクローナル抗体、および他の化学療法剤を含み得る。プリン類似体の例として、フルダラビン、ペントスタチン、アザチオプリン、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、およびクラドリビンが挙げられる。アルキル化剤の例として、シクロホスファミド、メクロレタミンまたはムスチン、ウラムスチンもしくはウラシル、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ニトロソウレア、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、およびブスルファンが挙げられる。
【０１１７】
モノクローナル抗体の例として、限定されないが、抗ＥＧＦｒ抗体（例えば、パニツムマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、マツズマブ、ＩＭＣ−ＩＩＦ  ８、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３）、デノスマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、抗ＨＧＦ抗体、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、抗Ａｎｇ−２抗体、ハーセプチン（トラスツズマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン），Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリキシマブ）、ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ（テクネチウム（．ｓｕｐ．９９ｍＴｃ）ファノレソマブ）、トシリズマブ、ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（インジウム−Ｉｌｌ標識カプロマブペンデチド）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イットリウム９０とコンジュゲートしたイブリツモマブチウキセタン）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、ＬｅｕｋｏＳｃａｎ（スレソマブ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（アルシツモマブ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（ノフェツモマブ）、Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ）、アレムツズマブ、ＣＤＰ  ８７０、ナタリズマブ、オファツムマブ、およびＧＡ１０１が挙げられる。
【０１１８】
他の化学療法剤の例として、限定されないが、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、ウレドーパ；エチレンイミン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド，トリメチロロメラミン；ブラタシン、ブラタシノンδ−９−テトラヒドロカンナビノール、β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；トポテカン、ＣＰＴ；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９、およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１）；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン／ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；男性ホルモン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタ���；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、ドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン、オキサリプラチン、ベンダムスチン、フラボピリドール、レナリドマイド、シスプラチン、シタラビン、ミトキサントロン、デキサメタゾンが挙げられる。
【０１１９】
本発明の別の態様において、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；フルダラビンおよびシクロホスファミドの略称ＦＣ；フルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキサンの略称であるＦＲＣ、ならびに、５−ＦＵおよびロイコボリンとオキサリプラチンとを組み合わせた治療計画の略称であるＦＯＬＦＯＸが、血液悪性腫瘍を治療または予防するために使用されてもよい。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、抗体に、ＣＤ４４受容体を有する細胞を標的とさせる方法を提供する。この方法は、細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。
【０１２１】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体を使用して、血液悪性腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を治療するために治療計画または疾患の進行を監視する方法を提供する。さらなる実施形態は、ＣＤ４４の対照レベルと比較してＣＤ４４タンパク質の量に増加または減少が生じたかどうかを判定することに関し、該増加または減少は、本発明の抗体を対象に投与したことまたは疾患の進行の結果である。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、血液悪性腫瘍細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる対象からの試料においてＣＤ４４タンパク質の存在を検出するためのキットを提供する。キットは、本発明の抗体と、アッセイ環境においてそれを使用するための指示とを含む。
【０１２３】
本明細書で論じられるように、本発明の抗体または抗体断片は、ヒト化抗体を含んでもよく、例えば、従来の薬学的に許容される担体または希釈剤中で、例えば、免疫原性アジュバント等のさらなる活性または不活性成分と、また任意選択的に、抗炎症性および抗線維素溶解性の薬剤等の補助的または組み合わせ的に活性な分子と、治療用途のために組み合わせることができる。
【０１２４】
他の実施形態において、本明細書に記載される抗体または抗体断片は、組み合せ治療剤、例えば、放射性核種、分化誘導因子、薬物、または毒素と、協調的に投与されるか、同時処方されるか、または連結される（例えば、共有結合的な結合）。当該技術分野において周知である種々の既知の放射性核種を用いることができる。そのような組み合せ治療の製剤および方法における使用に有用な薬物は、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリン類似体を含む。好適な分化は、分化誘導因子は、ホルボールエステルおよび酪酸を含む。好適な毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
【０１２５】
本発明の種々のアッセイ、診断方法、および治療方法を実行する際には、本明細書に記載されるような抗体または抗体断片と他の材料との組み合わせを含むキットを予め調製しておくことが望ましい。例えば、サンドイッチ酵素イムノアッセイの場合、本発明のキットは、任意選択的に適切な担体に結合させたＣＤ４４に特異的に結合する抗体；モノクローナル抗体と一緒に同じ抗原に結合することができる酵素標識モノクローナル抗体、もしくは同じ様式において酵素で標識したポリクローナル抗体の凍結乾燥剤または溶液；精製したＣＤ４４の標準溶液；緩衝液；洗浄液；ピペット；反応容器等を含んでもよい。さらに、キットは、任意選択的に、標識材料、および／または、アッセイ環境において本明細書に記載される方法を実施するための指示（すなわち、プロトコル）を提供する説明資料を含む。説明資料は、典型的には書面または印刷資料を含むが、これらはその限りではない。そのような指示を格納し、エンドユーザにそれらを伝えることができる任意の媒体が企図される。そのような媒体は、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等を含む。そのような媒体は、そのような説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０１２６】
組換え法
本明細書に記載される抗ＣＤ４４抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換え法および組成物を用いて生成することができる。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ４４抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードすることができる。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターとを含む（例えば、これらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核細胞であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはリンパ球系細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ＣＤ４４抗体を作製する方法が提供され、該方法は、抗体の発現に好適な条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することとを含む。
【０１２７】
抗ＣＤ４４抗体の組換え生成のために、例えば、本明細書に記載されるような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離および配列決定することができる。
【０１２８】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合、細菌中で生成されてもよい。細菌中での抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、および同第５，８４０，５２３号を参照のこと（また、大腸菌における抗体断片の発現について記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分として細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。
【０１２９】
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌および酵母株を含む糸状菌または酵母等の真核微生物が、抗体をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主であり、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体が生成される。例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４  （２００４），ａｎｄ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照のこと。
【０１３０】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞および昆虫細胞を含む。特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞の遺伝子導入のために、昆虫細胞とともに使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている
【０１３１】
植物細胞も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９（トランスジェニック植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載している）を参照のこと。
【０１３２】
脊椎動物細胞も、宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換させたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるようなＴＲ１細胞；ＭＲＣ  ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＤＨＦＲ．ｓｕｐ．−ＣＨＯ細胞を含む）（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ならびにＹＯ、ＮＳＯ、およびＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株である。抗体生成に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照のこと。
【０１３３】
アッセイ
本明細書で提供される抗ＣＤ４４抗体は、当該技術分野で既知の種々のアッセイによって、それらの物理的／化学的特性および／または生物学的活性について、同定、スクリーニング、または特徴付けすることができる。同定、スクリーニング、および特徴付けには、結合アッセイおよび他のアッセイが用いられてもよい。
【０１３４】
一態様において、本発明の抗ＣＤ４４抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット等の既知の方法によって、ＣＤ４４結合活性について調べられる。抗ＣＤ４４抗体が他の抗体と競合するかどうかを判定するために、例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ９：２４２−２５３を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、；固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）；１−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照のこと）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）等の多くの種類の競合結合アッセイを用いることができる。典型的には、そのようなアッセイは、これらの非標識試験抗原結合タンパク質および標識参照抗原結合タンパク質のうちのいずれかを担持する固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用を伴う。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合する抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質、および、参照抗原結合タンパク質によって結合されたエピトープに立体障害が生じるのに十分なほど近接した隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書に記載される実施例に提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは共通の抗原に対する参照抗原結合タンパク質の特異的な結合を、少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、もしくは７５％、またはそれ以上阻害する（例えば、減少させる）。特定の実施形態において、結合は、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、もしくは９７％、またはそれ以上阻害される。
【０１３５】
本発明の一態様において、競合アッセイは、ＣＤ４４への結合について、本明細書に（例えば、実施例４に）記載されるＲＧ７３５６抗ＣＤ４４抗体と競合する抗体を同定するために使用されてもよい。特定の実施形態において、そのような競合する抗体は、ＲＧ７３５６抗ＣＤ４４によって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線形または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．）のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供される。
【０１３６】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＣＤ４４は、ＣＤ４４に結合する第１の標識抗体（例えば、ＲＧ７３５６抗ＣＤ４４抗体）と、ＣＤ４４への結合について第１の抗体と競合する能力について調べられる第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＣＤ４４が、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＣＤ４４への結合を可能にする条件下でインキュベーションした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化ＣＤ４４と会合した標識の量が測定される。対照試料と比較して、試験試料中の固定化ＣＤ４４と会合した標識の量が実質的に減少した場合、それは、第２の抗体がＣＤ４４への結合について第１の抗体と競合していることを意味する。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。
【０１３７】
別の態様において、好適な抗ＣＤ４４抗体が、血液悪性腫瘍と関連する細胞の生存を阻害する能力について、同定、スクリーニング、および特徴付けされる。一実施形態において、血液悪性腫瘍は、白血病であり、好ましくはリンパ性白血病である。好ましい実施形態において、リンパ性白血病はＣＬＬである。抗ＣＤ４４抗体が血液悪性腫瘍と関連する細胞（例えば、ＣＬＬ細胞）の生存を阻害する能力は、本明細書に、例えば、実施例４に記載されるプロトコルおよびアッセイを用いて検証することができる。
【０１３８】
製造物品
本発明の別の態様において、上述の血液悪性腫瘍の治療、予防、および／または診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連付けられた表示または添付文書を含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器、点滴液袋等を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、単独であるか、または血液悪性腫瘍を治療、予防、および／もしくは診断するのに効果的な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下用注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗ＣＤ４４抗体である。表示または添付文書は、選択された状態を治療するために組成物が使用されることを示唆する。さらに、製造物品は、（ａ）本発明の抗ＣＤ４４抗体を含む組成物を中に収容する第１の容器と、（ｂ）さらなる治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器とを含み得る。特定の実施形態において、第２の容器は、本明細書に記載されるさらなる治療剤のうちの１つ等の第２の治療剤を含む。
【０１３９】
本発明のこの実施形態における製造物品は、特定の状態を治療するために組成物を使用できることを示唆する添付文書をさらに含んでもよい。代替的にまたは付加的に、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液等の薬学的に許容される緩衝液を収容する第２の（または第３の）容器をさらに含んでもよい。製造物品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、および注射器を含む、商業的およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０１４０】
特許出願および公開を含む、本明細書に引用した全ての参考文献は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
本発明を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修正、変更、および均等な実施形態が可能であることは明白であろう。さらに、本開示における全ての例は、非限定的な例として提供されることを認識されたい。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
この実施例は、抗ＣＤ４４抗体の毒作用がＣＬＬ細胞に特異的であることを示している。
【０１４３】
３２人のＣＬＬ患者と４人の健常ボランティアからリンパ球を採取した。これらの細胞を標準条件下で培養した。１マイクログラム未満の量のＣＤ４４抗体を細胞に投与した。抗体は、ＣＬＬ患者からのリンパ球に対して直接細胞傷害性を示したが、健常ボランティアからのリンパ球には何の影響も及ぼさなかった。
【０１４４】
実施例２
この実施例は、ＣＬＬ細胞に対する抗ＣＤ４４抗体の毒作用が間葉系細胞との共培養による影響を受けないことを示している。
【０１４５】
３２人のＣＬＬ患者と４人の健常ボランティアからリンパ球を採取した。これらの細胞を間葉系細胞とともに標準条件下で培養した。１マイクログラム未満の量のＣＤ４４抗体を細胞に投与した。抗体は、ＣＬＬ患者からのリンパ球に対して直接細胞傷害性を示したが、健常ボランティアからのリンパ球には何の影響も及ぼさなかった。通常、間葉系細胞は、ＣＬＬ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存を支持することができるが、ＣＤ４４抗体の存在下ではそれは起こらなかった。
【０１４６】
実施例３
この実施例は、免疫不全マウスに移植したＣＬＬ細胞のクリアランスを示している。
【０１４７】
ＣＬＬ細胞を免疫不全ＲＡＧ−２−／−／ｙｃ−／−マウスに移植した。次いで、マウスにＣＤ４４抗体を投与した。結果は、わずか１ｍｇ／ｋｇほどのこのｍＡｂが、移植されたＣＬＬ細胞の完全クリアランスをもたらし、対照処理動物には影響が認められなかったことを示した。
【０１４８】
実施例４
この試験では、表面ＣＤ４４の発現レベルを評価し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＣＬＬ細胞の生存を阻害する能力について、新しく開発されたヒト化抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（ＲＧ７３５６、Ｒｏｃｈｅ）の有効性を調べた。抗ＣＤ４４抗体の作用機序についても調査した。
【０１４９】
材料および方法
ヒト試料    インフォームドコンセントの後にＣＬＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＲＣ）によって試料が採取され、ＣＬＬの診断基準を満たす患者から得られた。これらの試料は、フローサイトメトリーにより９５％を超えるＣＤ１９＋／ＣＤ５＋細胞を有していた。ＺＡＰ−７０の発現およびＩｇＶＨ遺伝子の突然変異の状態を以前に記載されているように評価した（Ｒａｓｓｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４，３５１：８９３−９０１）。健常ドナーからのバフィーコート試料をＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた密度遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、液体窒素中での生存保存のために９０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁した。
【０１５０】
試薬    ヒト化抗ＣＤ４４  Ｍａｂ（ＲＧ７３５６）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｃａｎａｄａ）から贈られたものであった。対照ヒトＩｇＧは、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。高分子量（＞９５０ｋＤａ）のヒアルロン酸（ＨＡ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍから購入した。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、ＢＤから購入した。製造者の指示に従ってＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＧ７３５６をＡｌｅｘ６４７とコンジュゲートし、ＢＤから抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣを購入し、フローサイトメトリー分析のために、Ｃａｌｔａｇ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＡｌｅｘ４８８とコンジュゲートしたＺａｐ７０を購入した。
【０１５１】
ウェスタンブロット分析および免疫沈降    原発性ＣＬＬ細胞と、健常ドナーからのＰＢＭＣを、次に示すように処理した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶解緩衝液（１％  ＮＰ４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してタンパク質濃度を決定した。各試料からの等しい量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、続いて、ＣＤ４４に特異的な抗体（Ｒｏｃｈｅ）、ＺＡＰ−７０（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ）、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＡＲＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅ）、およびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫ブロットを行った。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。化学発光システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により膜を発色させ、オートラジオグラフィーにより確認した。
【０１５２】
免疫沈降のために、各試料からの細胞溶解物を、最初に、プロテインＡセファロースビーズ（５０％スラリ）とともに４℃で３時間インキュベートし、次いで、指定された抗体を加え、４℃で１時間さらにインキュベートした。結合したビーズを溶解緩衝液中で４回洗浄してからＳＤＳ試料緩衝液を加え、上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットに供した。
【０１５３】
ホスホ−ＡＫＴ／総ＡＫＴＥＬＩＳＡ    製造者の指示に従ってｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）およびＡＫＴサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ｐ−ＡＫＴおよび総ＡＫＴのレベルを測定した。端的に述べると、９６ウェルプレートのウェルに細胞を固定化して透過処理し、異なる種に由来する２つの一次抗体でインキュベートした。異なる種を認識する２つの二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のいずれかで標識し、ＨＲＰまたはＡＰのいずれかのための２つのスペクトル的に異なる蛍光発生基質を用いて検出した。未処理対照に対する総ＡＫＴの蛍光強度で除したｐ−ＡＫＴの蛍光強度に基づいて、ｐ−ＡＫＴレベルの倍数変化を計算した。
【０１５４】
細胞生存率アッセイ    ３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド（ＤｉＯＣ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したミトコンドリア膜貫通電位（ΔΨｍ）の分析、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）に対する細胞膜透過性により、細胞生存率を決定した。原発性ＣＬＬ細胞を採取し、６０ｎＭ  ＤｉＯＣ６および１０μｇ／ｍＬ  ＰＩとともに１００μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液を含むＦＡＣＳチューブに移した。細胞を３７℃で２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーにより３０分以内に分析した。５２５ｎｍ（ＦＬ−１）でＤｉＯＣ６について、また６００ｎｍ（ＦＬ−３）でＰＩについて蛍光を記録した。ＦｌｏｗＪｏ  ７．２．２ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用してデータを分析した。ＰＩ−／ＤｉＯＣ６ｈｉ集団の割合を計算することにより生存細胞を決定した。
【０１５５】
ＣＬＬ細胞と骨髄間質細胞（ＭＳＣ）との共培養    必要があれば、記載されているように（Ｆｅｃｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ：Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１２，１８：１９−２８））ＣＬＬ患者の骨髄からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導したＭＳＣの層上でＣＬＬ細胞を共培養した。１×１０６ＣＬＬ細胞／ｍＬ（２ｘ１０５細胞／ウェル）およびＲＧ７３５６またはアイソタイプ対照抗体（Ｓｉｇｍａ）を指定された濃度で加える２〜３日前に、継代２代目〜６代目のＭＳＣを９６ウェル平底組織培養プレートに１０００細胞／ｃｍ２で播種した。ＰＩおよびＤＩＯＣ６による染色を用いてＣＬＬ細胞の生存率を決定した。
【０１５６】
ＣＤ４４内在化の検出    氷上で２０分間、Ａｌｅｘ６４７とコンジュゲートしたヒト化抗ＣＤ４４抗体でＣＬＬ細胞をインキュベートした。２回洗浄した後、細胞を氷上に放置するか、または、内在化を促進するために、指定された時間３７℃でインキュベートした。フローサイトメトリー分析により平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
【０１５７】
カルシウム流の測定    Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないハンクス液（ＨＢＳＳ）に２×１０６ＣＬＬ細胞を２ｕＭ  Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（分子プローブ）とともに負荷し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、次いで、１ｍＬの不完全ＲＰＭＩに懸濁した。フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により細胞懸濁液の蛍光を記録した。ＩｇＭ刺激のために、細胞を３７℃で維持した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０１５８】
ヒトＣＬＬ異種移植片動物試験    ６〜８週齢のＲＡＧ２−／−γｃ−／−マウス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＤｒ．Ｃａｔｒｉｏｎａ  Ｊａｍｉｅｓｏｎより調達）を、無菌条件下の層流キャビネット内で飼育し、自由に摂食させた。マウスに関する全ての実験は、米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ））の動物実験に関する指針に従って行われた。試験プロトコルは、ＵＣＳＤおよびＭｅｄｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＵＳＡ）によって承認された。原発性ＣＬＬ患者からのＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ無血清培地中で調製し、２×１０７生存細胞を各マウスの腹腔に注射した。翌日、種々の用量の抗体を腹腔内に注射した。７日後、合計体積１２ｍＬのＤＰＢＳを腹腔に注射することにより腹腔洗浄液（ＰＬ）を抽出した。Ｇｕａｖａカウンティングを使用してＰＬ細胞の総回収率を決定した。続いて、マウスおよびヒト両方のＦｃブロッカーで細胞を３０分間４℃でブロックし、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ４５等の種々のヒト細胞表面メーカーで染色し、ＦＡＣＳ分析のために処理した。ＰＬ中の最終的な残留ＣＬＬ細胞の数を計算するために、ＦＡＣＳ分析によって検出されたＣＬＬ細胞の割合を得られた生存イベントまで逆算し、次いで総ＰＬ細胞カウントで乗じた。ヒトＩｇＧで処理したマウスからの残留ＣＬＬ細胞を１００％とし、ベースラインとして設定した。各処理群は、少なくとも３匹のマウスを含み、データは平均値±ＳＥＭとして表した。
【０１５９】
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイ    チオグリコレート注射の４日後、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスの腹腔からマクロファージを採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＰアッセイに使用した。端的に述べると、生存可能な状態で凍結したＣＬＬ  ＰＢＭＣを、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁し、指定された濃度の抗ＣＤ４４抗体、リツキシマブ、またはアイソタイプ対照とともに、３×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分配した。エフェクター対標的の比率が５：１になるように、マクロファージ（１．５×１０５細胞／ウェル）を付加する前にプレートを氷上で３０分間インキュベートした。５％ＣＯ２、３７℃で３時間インキュベーションした後、細胞を採取し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ）を用いたフローサイトメトリーにより分析した。ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを用いて残留する生ＣＬＬ細胞のどの分画が決定されるかに基づいて、ＣＬＬ細胞のみおよびマクロファージのみを含む試料を、生ＣＬＬ細胞の適切なゲーティングを設定するために用いた。
【０１６０】
補体媒介細胞毒性アッセイ（ＣＤＣ）    ＺＡＰ−７０−ＣＬＬ細胞を単離し、洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁し、１×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分配した。氷上で１０μｇ／ｍＬの抗体とともに１時間インキュベーションした後、細胞を採取し、ＰＢＳで１回洗浄して未結合抗体を除去し、３〜４週齢ウサギからの２０％補体とともに５％ＣＯ２中３７℃で２時間インキュベートした。ＣＬＬ細胞の生存率は、上述のように、ＤｉＯＣ６およびＰＩ染色の後、フローサイトメトリーにより決定した。
【０１６１】
統計分析    非対応もしくは対応スチューデントｔ検定または一方向ＡＮＯＶＡの後にダネットの多重比較検定を用いて、統計的有意性を決定した。ピアソン相関係数を用いて、ＺＡＰ−７０の発現と抗ＣＤ４４抗体で処理した細胞の生存率との相関関係を分析した。別途指示のない限り、データは、平均値±ＳＥＭまたは中央値±ＳＥＭのいずれかとして表される。
【０１６２】
結果
ＣＤ４４は、ＣＬＬ細胞、特にＺＡＰ−７０＋細胞において高度に発現される
フローサイトメトリーのためにＡｌｅｘａ６４７とコンジュゲートされているか、または免疫ブロット分析のためにコンジュゲートされていないヒト化抗ＣＤ４４ｍＡｂ（ＲＧ７３５６）を用いて、ＣＬＬに罹患する５９人の患者からの白血病Ｂ細胞と、８人の健常ドナーからの正常Ｂ細胞をＣＤ４４タンパク質の発現について分析した。図１Ａは、ヒト化ＣＤ４４  ｍＡｂ（白抜きのヒストグラム）または対照ｍＡｂ（斜線のヒストグラム）で染色した、ヒトリンパ腫Ｂ細胞株（ＥＷ３６）、正常Ｂ細胞、およびＣＬＬ細胞の蛍光ヒストグラムを示す。フローにより、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＬＬ  Ｂ細胞およびＣＤ１９＋正常Ｂ細胞の両方に高レベルのＣＤ４４の発現が検出されたが、リンパ腫Ｂ細胞株ＥＷ３６では検出できなかった（図１Ａ）。図１Ｂは、ヒトＣＤ４４に特異的なヒト化ＣＤ４４  ｍＡｂまたはβアクチンに対するＡｂを用いた、ＥＷ３６からの可溶化物、健常成人またはＣＬＬ患者からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の免疫ブロット分析を示す。ウェスタンブロット分析において、種々のＣＤ４４アイソフォームおよび標準ＣＤ４４タンパク質は全て、ＲＧ７３５６によって正常な末梢血単核（ＰＢＭＣ）またはＣＬＬ  Ｂ細胞のいずれかにおいて検出された（図１Ｂ）。ＣＬＬ細胞および正常リンパ球の両方において、標準ＣＤ４４が優勢であるように見える（図１Ｂ）。図１Ｃは、パネルＡに示すように、ヒト化抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたは対照ｍＡｂで染色した健常成人（ｎ＝８）またはＣＬＬに罹患する患者（ｎ＝５９）からのＰＢＭＣを示す。ＣＤ４４  ｍＡｂの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を対照ｍＡｂのＭＦＩで除すことによりＭＦＩＲ（平均蛍光強度比）を得る。各点は、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋Ｂ細胞にゲートをかけた個々のＣＬＬ患者試料、またはＣＤ１９＋Ｂ細胞にゲートをかけた健常成人試料（左）からのＣＤ４４の発現を表している。ＣＤ４４の発現レベルは、記載されている（Ｃｈｉｏｒａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００５，３５２：８０４−８１５）ように、ＩｇＶＨ遺伝子における体細胞突然変異の程度（中央）またはＺＡＰ−７０の発現レベル（右）に従ってＣＬＬの臨床特性と相関していた。線は、各群ごとに、ＣＤ４４の発現レベルの中央値を示す。Ｐ＜０．０５は、スチューデントｔ検定を用いて計算した２群間の集合的なＣＤ４４の発現における差の統計的有意性を意味する。正常Ｂ細胞（平均蛍光強度比（ＭＦＩＲ）の中央値＝１１１．７）およびＣＬＬ  Ｂ細胞（ＭＦＩＲ＝１３１．９）（図１Ｃ、右パネル）において同様のレベルのＣＤ４４が検出されたが、未変異ＩＧＶＨ遺伝子を有するＣＬＬ  Ｂ細胞におけるＣＤ４４の発現レベルは、変異ＩＧＶＨ遺伝子の発現レベルよりも有意に高かった（図１Ｃ、中央パネル；ＭＦＩＲ中央値＝それぞれ、１６１．２対１１８．５；ｐ＝０．０１３）。さらに、ＺＡＰ−７０の発現を伴うＣＬＬ  Ｂ細胞もまた、ＺＡＰ−７０の発現が低いかまたは発現されない細胞と比較して有意に高いＣＤ４４の発現レベルを示した（図１Ｃ、左パネル）；ＭＦＩＲ中央値＝それぞれ、１６１．２対１１８．７；ｐ＝０．０１９）。
【０１６３】
ＲＧ７３５６によって誘導された直接アポトーシスに対するＣＬＬ細胞の感受性
ＣＤ４４の発現レベルは、ＣＬＬ細胞におけるＺＡＰ−７０の発現と相関しているため、高レベルのＺＡＰ−７０発現を伴う患者は、ＲＧ７３５６による治療により反応を示すかもしれない。この仮説を検証するために、合計２８人の患者からの原発性ＣＬＬ細胞（ＺＡＰ−７０＋、ｎ＝１６；ＺＡＰ−７０−、ｎ＝１２）と、６人の健常ドナーからのＰＢＭＣを、濃度を増加させたＲＧ７３５６とともに２４時間インキュベートした。ＤｉＯＣ６／ＰＩ染色に基づくフローサイトメトリーによりアポトーシスの誘導を分析した。
【０１６４】
図２に示すように、指定された濃度および期間、抗ＣＤ４４またはｈＩｇＧ対照ｍＡｂの存在下で、ＣＬＬ細胞または正常ＰＢＭＣを培養した。細胞を採取し、フローサイトメトリーにより生存率を測定するためにＤｉＯＣ６／ＰＩで染色した。正常ＰＢＭＣもＣＤ１９の発現について染色し、Ｂ細胞集団における細胞死を評価した。図２Ａは、５０ｕｇ／ｍｌ  ｍＡｂで２４時間インキュベートした２つの代表的なＣＬＬ試料の等高線を表す。相対的なＤｉＯＣ６およびＰＩの蛍光強度を、それぞれＸ軸およびＹ軸上に示す。ＤｉＯＣ６強陽性およびＰＩ弱陽性である右下象限の細胞は生存能力があり、図示されるプロットの作成にこれらの数を用いた。図２Ｂは、濃度を増加させたｍＡｂの存在下で培養し、上記のような生存率の分析のために２４時間後に採取した、ＺＡＰ−７０の発現に従って分けたＣＬＬ細胞または正常ＰＢＭＣを示す。示されるデータは、３通りの代表的な試料の平均値＋／−ＳＥＭである。＊はＰ＜０．０５を意味し、＊＊はＰ＜０．０１を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する（スチューデントｔ検定）。図２Ｃは、（５０ｕｇ／ｍｌ）ｍＡｂの存在下または非存在下で培養し、上記のような生存率の分析のために、指定された時間に採取した細胞を示す。示されるデータは、３通りの代表的な試料の平均値＋／−ＳＥＭである。＊はＰ＜０．０５を意味し、＊＊はＰ＜０．０１を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する（スチューデントｔ検定）。図２Ｄにおいて、各点は、５０ｕｇ／ｍｌ  抗ＣＤ４４  ｍＡｂとともに２４時間培養した、１人の患者からの細胞の相対生存率を表す。生存細胞パーセントを、対照ｍＡｂで処理した細胞の生存率に正規化した。線は、各群ごとに、抗ＣＤ４４  ｍＡｂで処理した細胞の中央生存率を示す（正常細胞Ｎ＝６、ＣＬＬ細胞ｎ＝２８）。図２Ｅは、標準的な２０％の発現をカットオフとして用いてＺＡＰ−７０の状態の関数で表した、Ｄに示されるＣＤ４４  ｍＡｂの曝露の後に残った生存細胞パーセントを示す。抗ＣＤ４４  ｍＡｂで処理したＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞の生存率（ｎ＝１２）は、抗ＣＤ４４  ｍＡｂで処理したＺＡＰ−７０−  ＣＬＬ細胞の生存率（ｎ＝１６）よりも有意に低かった（Ｐ＝０．００１（スチューデントｔ検定））。図２Ｆは、各試料ごとにＺＡＰ−７０を発現する細胞のパーセントの関数で表した、Ｄに示される抗ＣＤ４４  ｍＡｂの曝露の後に残った生存細胞パーセントを示す。ＺＡＰ−７０の発現レベルは、抗ＣＤ４４  ｍＡｂで処理した細胞の生存率と関連している。ピアソンＲ＝−０．５３４５、Ｐ＝０．００３４、ｎ＝２８。
【０１６５】
わずか２μｇ／ｍｌのＲＧ７３５６がＣＬＬ細胞においてアポトーシスを誘導したのに対し、５０μｇ／ｍｌという高濃度のＲＧ７３５６またはヒトＩｇＧ対照抗体で処理した正常Ｂ細胞にはほとんど影響が見られなかった（図２Ａ−Ｂ）。また、ＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞におけるアポトーシスの誘導は用量依存性であった。これらの結果は、ＲＧ７３５６が、特に高レベルのＺＡＰ−７０を発現する細胞において、ＣＬＬ細胞に選択的な細胞毒性を有することを示唆している。
【０１６６】
ＲＧ７３５６によって誘導される細胞毒性の速度論を調べるために、細胞を５０μｇ／ｍｌのＲＧ７３５６で処理し、種々の時点で分析した。処理を行わなかった細胞または対照ｈＩｇＧで処理した細胞と比較して、ＣＬＬ試料中におけるＲＧ７３５６処理から早ければ３時間後に細胞死の増加が生じ、経時的に持続した（図２Ｃ）。異なるＣＬＬ試料の中でも、ＣＤ４４の発現レベルが同等であるにもかかわらず、ＺＡＰ−７０＋細胞は、ＲＧ７３５６によって誘導されたアポトーシスに対する感受性がＺＡＰ−７０−細胞よりも有意に高かった（図２Ｅおよび図９）。さらに、２４時間の時点でＲＧ７３５６で処理したＣＬＬ細胞の生存率と、個々の試料の各々によって発現されたＺＡＰ−７０のレベルとの間に、著しい逆の関連性が観察された（図２Ｆ、ピアソンＲ＝−０．５３４５、Ｐ＝０．００３４）。対照的に、４８時間までは、処理にもかかわらず正常Ｂ細胞には相違が観察されなかった（図２Ｃ−Ｄ）ことから、この特異的ＣＤ４４  Ｍａｂは、ＣＬＬ細胞に対する選択性を示すこと、および正常Ｂ細胞に対して比較的安全であることが示唆される。
【０１６７】
ＲＧ７３５６媒介性アポトーシスはカスパーゼ依存性である    抗ＣＤ４４  ｍＡｂによって媒介される細胞死はミトコンドリア膜貫通電位を特徴とするという最近の報告（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００９，１３：１００４−１０３３）に一致して、我々のデータもＣＬＬ細胞におけるＲＧ７３５６によるアポトーシスの誘導を裏付けている。ＲＧ７３５６がＣＬＬ細胞死を誘導する機序をさらに調査するために、ＦＡＣＳ分析のためにアネキシンＶおよび７ＡＡＤで処理および染色するか、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥのために溶解させて、ウェスタンブロットによりＰＡＲＰの切断を評価した。
【０１６８】
図３に示すように、５０ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたはｈＩｇＧ対照Ａｂの存在下で、ＣＬＬ  Ｂ細胞を４８時間培養した。図３Ａは、アネキシンＶおよび７ＡＡＤで染色し、フローサイトメーターにより分析した細胞を示す。相対蛍光強度を、それぞれＸ軸およびＹ軸に示す。左下象限および左上象限の細胞は、アポトーシス細胞である。図３Ｂにおいて、細胞可溶化物を採取し、ウェスタンブロットによりＰＡＲＰの切断断片について分析した。負荷対照としてβアクチンを使用した。（Ｃ）種々の濃度の汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの非存在下または不在化で、細胞を抗ＣＤ４４  ｍＡｂとともに４８時間培養した。ＤＩＯＣ６およびＰＩ染色の後、フローサイトメーターにより細胞を分析した。処理を行わなかった試料を１００％の生存率としてデータを比較した。示される結果は、３つの異なるＣＬＬ試料からの平均±ＳＥＭである。ダネットの多重比較検定を用いて、統計的有意性を決定した。＊はＰ＜０．０５を意味し、＊＊はＰ＜０．０１を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
【０１６９】
ＲＧ７３５６で処理したＣＬＬ細胞には、対照ｈＩｇＧと比較して少なくとも２倍のアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の増加が見られた（図３Ａ）。また、これらのＲＧ７３５６で処理した試料には、ＰＡＲＰ切断の誘導も検出された（図３Ｂ）。最後に、汎カスパーゼ阻害剤阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫにより、用量依存性の様式で細胞歯がレスキューされた（図３Ｃ）ことから、ＲＧ７３５６によって誘導されたアポトーシスは、ＣＬＬ細胞においてカスパーゼ依存性であることが示唆される。
【０１７０】
ＣＬＬ微小環境の影響    微小環境の細胞が、自発的および薬物誘導性のアポトーシスからＣＬＬ細胞を保護することが報告されている（Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９，１１４：３３６７−３３７５；Ｍｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９，９：６６５−６７４）。ＣＬＬ微小環境がＲＧ７３５６によって誘導されるアポトーシスに与える影響を調べるために、患者の骨髄由来ＭＳＣと共培養したＣＬＬ細胞に対する細胞生存率アッセイを実行した。
【０１７１】
図４は、指定された濃度で２４または４８時間、抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたはｈＩｇＧ対照抗体でインキュベートした、単独でまたは間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の存在下で培養したＣＬＬ細胞を示す。生存率は、染色およびフローサイトメトリーにより測定した。０時を１００％の生存率として、ＰＩｎｅｇ／ＤｉＯＣ６ｈｉの集団にデータを正規化した。示される結果は、各群の３人の異なる患者からの平均値＋／−ＳＥＭである。＊は、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ処理とｈＩｇＧ処理との間の統計的に有意な差を示す（対応スチューデントｔ検定）。
以前の観察と一致して、ＲＧ７３５６で処理したＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞は、ＭＳＣの存在に関係なく、迅速かつ著しい生存率の減少を示し、４８時間までには細胞の約５０％が死滅した（図４）。対照的に、ＺＡＰ−７０−ＣＬＬ細胞は、ＭＳＣの存在にもかかわらず影響を受けなかった。
【０１７２】
抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（ＲＧ７３５６）は、ヒアルロン酸（ＨＡ）によって誘導されるシグナル伝達およびＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの生存をブロックする    健常な個人に由来するＭＳＣおよび多発性骨髄腫に罹患する患者に由来するＭＳＣが、ＨＡシンターゼ、およびＣＤ４４の主なリガンドであるＨＡを発現することが示されているため（Ｃａｌａｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００２，１００：２５７８−２５８５；Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１１，４０４：４６３−４６９）、我々は、ＨＡがＣＬＬ細胞の生存およびシグナル伝達に与える影響を調査した。５０μｇ／ｍｌ  ＨＡの非存在下または存在下においてＣＬＬ細胞を２４時間培養し、フローサイトメトリー分析とともにＤｉＯＣ６／ＰＩ染色を用いて生存率を評価した。
【０１７３】
図５Ａは、ＨＡ（５０ｕｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに２４時間インキュベートした、ＺＡＰ−７０ｎｅｇ  ＣＬＬ試料（ｎ＝５）またはＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ試料（ｎ＝７）からの精製ＣＬＬ細胞を示す。ＣＬＬ細胞を採取し、ＤｉＯＣ６／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。示されるデータは、調べた各患者についてのＤｉＯＣ６＋  ＰＩ−生存細胞のパーセントを示す。図５Ｂは、ＨＡ（５０ｕｇ／ｍｌ）で刺激したＣＬＬ試料（ｎ＝３、ＺＡＰ−７０ｎｅｇまたはＺＡＰ−７０＋）から異なる時点に採取し、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）／総ＡＫＴ（ｔ−ＡＫＴ）特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより分析した細胞可溶化物を示す。示される結果は、処理前（０分）のレベルと比較して異なる時点でｔ−ＡＫＴに正規化したｐ−ＡＫＴのレベルの平均値＋／−ＳＤである。Ｐ＜０．０５は、対応スチューデントｔ検定を用いて分析した差の統計的有意性を示す。図５Ｃにおいて、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずにＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ試料を２０分間前処理し、次いでＨＡ（５０ｕｇ／ｍｌ）で５分間刺激した。細胞を溶解し、ｐ−ＡＫＴおよびｔ−ＡＫＴの発現についてウェスタンブロットにより分析した。図５Ｄにおいて、抗ＣＤ４４  ｍＡｂを用いてまたは用いずに、およびＨＡを用いてまたは用いずに、２４時間ＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ試料をインキュベートした。細胞を採取し、ＤｉＯＣ６／ＰＩ染色の後、フローサイトメトリーにより分析した。ＤｉＯＣ６＋／ＰＩｎｅｇ生存細胞のパーセントを示した。チューキーの多重比較検定の後、一方向ＡＮＯＶＡにより統計的有意性を決定した。
【０１７４】
ＨＡで処理したＺＡＰ−７０＋患者試料に軽度から中程度の細胞生存率の増加が観察された（図５Ａ、右パネル）。対照的に、大部分のＺＡＰ−７０−症例に対して、ＨＡ処理はほとんど影響を与えなかった。ＣＬＬ細胞においてＨＡによって誘導され得る可能性のあるシグナル伝達経路を調べたとき、我々は、ｐＡＫＴ／総ＡＫＴ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＨＡ処理の５〜１０分後に、ＡＫＴのリン酸化が急速に増加したことを発見した（図５Ｂ）。調べた全ての試料が同様のＣＤ４４の発現レベルを有していたが（データは図示せず）、生存率の結果と一致して、ＺＡＰ−７０＋症例において、ＡＫＴシグナル伝達のリン酸化は、ＨＡによって選択的に誘導される。ＲＧ７３５６がＨＡによって誘導されるシグナル伝達および細胞の生存に与える影響を評価するために、ＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞をＲＧ７３５６で前処理し、次いでＨＡで刺激した。ＨＡ処理後にｐ−ＡＫＴシグナル伝達または生存のいずれかの誘導が消失したことから（図５Ｃ−Ｄ）、ＲＧ７３５６は、微小環境に蓄積され得るＣＤ４４とＨＡとの相互作用をブロックするのに非常に効果的であることが示唆される。
【０１７５】
ＲＧ７３５６は、ＺＡＰ−７０下流ＢＣＲシグナル伝達カスケードを抑制する    ＲＧ７３５６がＣＬＬ細胞の生存を阻害する機序をさらに調査するために、我々は内在化アッセイを行った。
【０１７６】
図６Ａは、ＣＬＬ細胞による抗ＣＤ４４  ｍＡｂの内在化を示す。ＣＬＬ細胞をＡｌｅｘａ−６４７とコンジュゲートした抗ＣＤ４４  ｍＡｂで染色し、４℃または３７℃のいずれかでインキュベートし、フローサイトメトリーにより指定された時点で分析した。データは、０時で１００％として細胞の平均蛍光強度に正規化したＣＤ４４の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。図６Ｂは、ＣＤ４４  ｍＡｂ処理後のＣＤ４４タンパク質レベルの減少を示す。ＣＬＬ試料をｈＩｇＧ対照Ａｂまたは抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）のいずれかで４８時間処理し、細胞可溶化物を免疫ブロットにより分析した。図６Ｄは、ＣＤ４４  ｍＡｂ処理後のＺＡＰ−７０タンパク質レベルの減少を示す。ＣＬＬ細胞を抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたはｈＩｇＧ対照Ａｂで指定された期間インキュベートし、Ａｌｅｘａ−４８８とコンジュゲートした抗ＺＡＰ−７０抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＺＡＰ−７０＋であった２つの代表的なＣＬＬ試料を示す。図６Ｄにおいて、代表的なヒストグラムが、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（白抜き）またはＩｇＧ対照（斜線）で４８時間処理した２つのＺａｐ−７０＋  ＣＬＬ試料（ＣＬＬ１およびＣＬＬ２）におけるＺＡＰ−７０の蛍光強度を示している。ＣＤ１９＋正常Ｂ細胞におけるＺＡＰ−７０のレベルが、陰性対照としての役割を果たす（点線で示した白抜きのヒストグラム）。図６Ｅは、ＣＤ４４が、ＣＬＬ細胞中のＺａｐ−７０と物理的に会合することを示している。異なる患者からのＣＬＬ細胞のタンパク質可溶化物を、抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたは抗ＺＡＰ−７０  Ａｂのいずれかで免疫沈降（ＩＰ）させた。結合生成物または全細胞可溶化物（ＷＣＬ）を、ＷＢカラムに示される抗体を用いて免疫ブロットにより精査した。図６Ｆは、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ処理後のＣＤ４４およびＺＡＰ−７０タンパク質複合体の発現低下を示している。ＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞を抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）またはｈＩｇＧ対照Ａｂで処理し、タンパク質可溶化物を抗ＣＤ４４  ｍＡｂで免疫沈降（ＩＰ）させ、指定された抗体を用いて免疫ブロットに供した。図６Ｇは、抗ＣＤ４４  ｍＡｂの処理が、ＣＬＬ細胞においてＩｇＭによって誘導されるカルシウム流を減少させることを示している。Ｚａｐ−７０＋  ＣＬＬ試料を、最初に蛍光カルシウム指示薬Ｆｌｕｏ−４ＡＭで標識し、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（５０ｕｇ／ｍｌ）またはｈＩｇＧ対照Ａｂのいずれかで１２時間プレインキュベートし、次いで抗−ＩｇＭで刺激し、ＦＡＣＳにより経時的に蛍光強度を記録した。線は、対照ＣＬＬ細胞（黒線）または抗ＣＤ４４  ｍＡｂでプレインキュベートした細胞（グレー線）の経時的な（ｘ軸）蛍光強度における変化（Ｙ軸上）を表している。矢印は、抗ＩｇＭを加えた時間を示す。図６Ｈは、抗ＣＤ４４  ｍＡｂが、ＣＬＬ細胞においてＩｇＭによって誘導される生存を低減させることを示す。抗ＩｇＭ（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、５０ｕｇ／ｍｌ  抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたはＩｇＧ対照Ａｂを用いてまたは用いずに、ＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ試料を４８時間インキュベートした。細胞を採取し、ＤｉＯＣ６／ＰＩで染色し、生存率測定のためにフローサイト���トリーにより分析した。調べた３つの患者試料のうちの１つから代表的なデータを示した。各棒は、３通りの試料からのＤｉＯＣ６ｈｉ／ＰＩｎｅｇ生存細胞の平均比率を示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊は、チューキーの多重比較検定の後に一方向ＡＮＯＶＡを用いて分析した差の統計的有意性を示す。
【０１７７】
Ａｌｅｘ６４７とコンジュゲートしたＲＧ７３５６に結合すると、３７℃のインキュベーションから１０分後には細胞表面ＣＤ４４の迅速な内在化が検出され、２時間までには４０％を超える平均蛍光強度（ＭＦＩ）の減少が表示された（図６Ａ）。２４時間までは、処理に関係なく表面ＩｇＭの減少が観察されなかったことから（データは図示せず）、ＲＧ７３５６がＣＤ４４に特異的であることが証明される。ＲＧ７３５６で処理したＣＬＬ細胞における総ＣＤ４４タンパク質レベルのウェスタンブロット分析からも、著しい減少が明らかになった（図６Ｂ）。興味深いことに、ＲＧ７３５６処理の６時間にはＺＡＰ−７０の発現レベルも著しく減少し、１２時間までにはＺＡＰ−７０のレベルは少なくとも３０〜５０％減少した（図６Ｃ〜Ｄ）。免疫沈降分析の結果は、ＺＡＰ−７０およびＣＤ４４は、検査した全てのＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞において複合体を形成したが、ＺＡＰ−７０−症例では形成しなかったことを示し（図６Ｅ）、ＺＡＰ−７０がＣＬＬ細胞におけるＣＤ４４生存シグナルに恐らく関与していることが示唆される。実際、図６Ｆに示すように、ＲＧ７３５６による処理は、ＺＡＰ−７０／ＣＤ４４複合体を妨害した。続いて、ＢＣＲ下流のシグナル伝達、例えば、細胞内カルシウム流も阻害された（図６Ｇ）。さらに、対照抗体による処理と比較して、ＲＧ７３５６処理によって抗ＩｇＭ刺激の生存促進性効果が抑制された（図６Ｈ）。
【０１７８】
異種移植片動物モデルにおいて、ＲＧ７３５６がＣＬＬ細胞の生存を妨げる    ＲＧ７３５６Ｔのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、我々は、高度に免疫不全なＲＡＧ２／γ鎖ノックアウトマウス（Ｒａｇ２−／−γｃ−／−）を用いて異種移植片ＣＬＬのパーキング動物モデルを確立し、残留するＣＬＬ細胞を定量的に決定することを可能にした。
【０１７９】
図７に示すように、ｍＡｂ注射の１日前に、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスの腹腔にＣＬＬ細胞を注射した。細胞の注射から７日後に腹腔洗浄液を回収し、ヒト特異的なＣＤ５、ＣＤ１９、およびＣＤ４５の染色の後、細胞カウントおよびＦＡＣＳ分析による残留ＣＬＬの測定に供した。図７Ａは、低用量または高用量のいずれかのｍＡｂで処理した２つの代表的なＣＬＬ試料の等高線プロットを示す。右下ゲートの細胞はヒトＣＬＬ細胞であり、図７Ｂに示す棒グラフを作成するためにこれらの数を用いた。図７Ｂのグラフ中の各棒は、異なる濃度の抗ＣＤ４４  ｍＡｂで処理した後にマウスから採取し、１００％としての対照ｈＩｇＧで処理したマウスからのものに正規化した、残留ＣＬＬ細胞の割合を表す。示されるデータは、３人の異なる患者からの平均値＋／−ＳＥＭである（各群ｎ＝３）。Ｐは、スチューデントｔ検定によって計算した抗ＣＤ４４  ｍＡｂ処理とｈＩｇＧ処理との間の統計的に有意な差を示す。
【０１８０】
用量漸増試験は、ＺＡＰ−７０＋  ＣＬＬ細胞が、わずか０．０１ｍｇ／体重Ｋｇの単回低用量でＺＡＰ−７０−細胞よりもＲＧ７３５６処理により高い反応を示すという、我々の以前の観察を支持した（図７Ａ）。それにもかかわらず、ＺＡＰ−７０の発現レベルに関係なく、回収率１００％としての対照ｈＩｇＧと比較して、９０％を超えるＣＬＬ細胞が１ｍｇ／ＫｇのＲＧ７３５６で処理したマウスから除去された（図７Ｂ）ことから、患者の疾患の特徴に関係なく、ＲＧ７３５６は、ニッチ依存性様式でＣＬＬ細胞を除去する上で非常に効率的であることが示唆される。
【０１８１】
ＲＧ７３５６の作用機序は、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）である    Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスはＢ、Ｔ、およびＮＫ細胞を欠損するが、残留マクロファージは腹腔内になおも存在する。ＺＡＰ−７０−  ＣＬＬ細胞でＲＧ７３５６によって媒介される細胞毒性における腹腔マクロファージの役割をさらに評価するために、チオグリコレート誘発マウス腹腔マクロファージの存在下または非存在下で細胞を処理し、食作用アッセイおよび細胞生存率アッセイに供した。
【０１８２】
図８は、氷上で３０分間、指定された濃度の抗ＣＤ４４  ｍＡｂ、対照ｈＩｇＧ  Ａｂ、またはリツキシマブでプレインキュベートしたＣＬＬ試料を示す。単独で（白抜きの棒）、または１：５の比率のマクロファージの存在下で（グレーの棒）、またはウサギ補体（右）で、３時間以上３７℃で細胞をさらにインキュベートした。細胞を回収し、染色し、フローサイトメトリーにより生存ＣＬＬ細胞（ＰＩｎｅｇＤｉＯＣ６ｈｉ）について分析した。示されるデータは、群当たり５人の異なる患者からの平均＋／−ＳＥＭを、１００％の生存率としての対応する対照試料に正規化したものである。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す（チューキーの多重比較検定の後、一方向ＡＮＯＶＡ）。
【０１８３】
ＲＧ７３５６またはリツキシマブのいずれかで３時間インキュベーションした後、細胞生存率は、腹腔マクロファージと共培養した細胞においてのみ約５０％顕著に減少したが（図８、グレーの棒）、細胞単独においては減少しなかったことから（白抜きの棒）、システムに活性な食作用が生じたことが示唆される。しかしながら、陽性対照としてリツキシマブで処理した細胞と比較して、ＲＧ７３５６で処理した細胞には補体媒体性の細胞毒性は観察されなかった（図８、塗りつぶした棒）。
【０１８４】
抗ＣＤ４４  ｍＡｂまたはリツキシマブで処理したＣＬＬ細胞の生存率
ＣＬＬ細胞における表面ＣＤ４４タンパク質の高レベルの発現によって自信を得た我々は、新たに開発されたヒト化抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（ＲＧ７３５６）のＣＬＬ細胞に対する細胞毒性活性を評価した。
【０１８５】
図９において、左のグラフ上の各点は、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋  Ｂ細胞にゲートをかけた個々のＣＬＬ患者からのＢ細胞によるＣＤ４４の発現レベル（ＭＦＩＲ）を表している。線は、各群ごとに、ＣＤ４４の発現レベルの中央値を示す。右のグラフ上の各点は、５０ｕｇ／ｍｌ  抗ＣＤ４４  ｍＡｂとともに２４時間培養した１人の患者からの細胞の相対生存率を表す。生存細胞パーセントを、対照ｍＡｂで処理した細胞の生存率に正規化した。線は、各群ごとに、抗ＣＤ４４  ｍＡｂで処理した細胞の中央値または生存率を示す。スチューデントｔ検定を用いて統計的優位性を決定した。
【０１８６】
わずか１０ｕｇ／ｍｌのＲＧ７３５６が、高い直接殺細胞効果を示し、それは、アポトーシス促進活性を誘導しない同様の用量のリツキシマブと比較して明らかにより優れていた（図１０Ａ）。しかしながら、高い用量のこのＲＧ７３５６で処理した正常Ｂ細胞の生存にはほとんど影響が観察されなかったことから、この抗ＣＤ４４  ｍＡｂは、正常Ｂ細胞に対して比較的安全であることが示唆される。さらに、抗ＣＤ４４  ｍＡｂによるアポトーシス性殺細胞は、ＩｇＧの架橋を必要としないため、抗ＣＤ４４  ｍＡｂによって誘導される直接細胞死誘導の様式は、いわゆるＩＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂの様式に類似する。
【０１８７】
ＩＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂは、Ｉ型ｍＡｂと比較して、ＣＤＣ活性を媒介する能力の低さによって特徴付けられるが、それらのＢ細胞枯渇活性に関してはＩ型ｍＡｂよりも優れていることが証明されている（Ｍｏｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０，１１５：４３９３−４４０２；Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１２：４１７０−４１７７）。これに関連して、抗ＣＤ４４  ｍＡｂも同様にＣＤＣ活性が欠落していることは興味深い。
【０１８８】
図１０Ａは、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ、リツキシマブ、または抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートしたＣＬＬ試料（ｎ＝４）を示す。ＣＬＬ細胞を採取し、ＤｉＯＣ６／ＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。示されるデータは、ＤｉＯＣ６＋  ＰＩ−生存細胞のパーセントを表している。Ｐは、ダネットの多重比較検定を用いて分析した差の統計的有意性を意味する。図１０Ｂは、ＣＬＬ細胞に対するｍＡｂ処理の表現型分析を表す。細胞培養培地中で、５０ｕｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ４４、リツキシマブ、またはヒトＩｇＧ対照抗体とともに３７℃で原発性ＣＬＬ細胞をインキュベートし、指定された時点で顕微鏡写真を記録した（２０×位相差対物レンズ）。
【０１８９】
抗ＣＤ４４  ｍＡｂでインキュベーションした後の急速な同型凝集（図１０Ｂ）は、抗ＣＤ４４  ｍＡｂが、ＩＩ型ｍＡｂと見なされてもよく、非常に効果的な直接殺細胞と関連しているという証拠を提供する（Ａｌｄｕａｉｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１１，  １１７：４５１９−４５２９）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2014534221.tif 000013
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2014534221.tif 000017
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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