(57)【要約】本願は、野生型Ａｍｙｃｏｉａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲと比べてその酵素の改善された活性を示す変異型Ａｍｙｃｏｉａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲに関する。その変異型ＮＡＡＡＲは、その野生型の対応物よりもほぼ５倍活性である。本願は、動的速度論的分割方法によって鏡像異性的に純粋なアミノ酸をそのＮ−アシル誘導体から生成する際の変異型Ａｍｙｃｏｉａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ（ＮＡＡＡＲ）。
【請求項２】
ＮＡＡＡＲが、配列番号１の変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲである、請求項１に記載のＮＡＡＡＲ。
【請求項３】
アミノ酸のアシル誘導体を、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＮＡＡＡＲおよびアシラーゼ酵素で処理する工程を包含する、鏡像異性的に純粋なアミノ酸を調製するためのプロセス。
【請求項４】
前記反応が、約２０℃〜約８０℃において行われる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記反応が、約３０℃〜約７０℃において行われる、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記反応が、約７．５〜約９のｐＨにおいて行われる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項７】
前記反応が、約８のｐＨにおいて行われる、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
アミノ酸のアシル誘導体が、アシル基に１〜４個の炭素原子を含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項９】
前記アシル基が、アセチル基である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
基質濃度が、約３００ｍＭである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１１】
基質濃度が、少なくとも約５０ｍＭである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１２】
アミノ酸が、Ｄ−メチオニン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−バリン、Ｌ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−フェニルグリシン、Ｌ−フェニルグリシン、Ｄ−（４−フルオロフェニル）グリシン、Ｌ−（４−フルオロフェニル）グリシン、Ｄ−２−アミノブチレート、Ｌ−２−アミノブチレート、Ｄ−アリルグリシン、Ｌ−アリルグリシン、Ｌ−セリンおよびＤ−セリンの群から選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１３】
鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するための、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＮＡＡＡＲの使用。
【請求項１４】
アミノ酸の立体反転のための、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＮＡＡＡＲの使用。
【請求項１５】
アミノ酸のラセミ混合物から鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するための、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＮＡＡＡＲの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本願は、アミノアシラーゼ酵素の使用を含む、ラセミＮ−アシルアミノ酸を出発物質とする動的速度論的分割による鏡像異性的に精製されたα−アミノ酸の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
鏡像異性的に純粋なＤ−およびＬ−アミノ酸は、有機合成化学において重要な基本単位である。それらは、非経口栄養のためにも重要である。鏡像異性的に精製されたアミノ酸を生成する多くの方法が文献において知られている。それらのうち、アミノ酸の酵素的調製法が、高い光学純度を有するアミノ酸を生成するので、一般的である。
【０００３】
アミノ酸を高い光学純度で生成する方法の１つは、アミノアシラーゼ酵素を使用したラセミＮ−アシルアミノ酸の脱アシル化を含む。その酵素は、好ましいことに、特定の異性体に対してのみ作用し、その他の異性体に対して作用しないので、その反応によって高い鏡像異性体純度が得られる。鏡像異性的に純粋な化合物を生成するこのプロセスは、速度論的分割として知られている。しかし、この反応の主な欠点は、望まれないエナンチオマーが反応混合物から分離されて再利用されることがない限り、５０％の収率しか可能でない点である。
【０００４】
鏡像異性的に純粋な化合物を生成する動的速度論的分割方法は、望まれない異性体がその反応条件下でラセミ化し得るプロセスと定義される。ゆえに、そのラセミ化が、不可逆反応の速度と比べてかなり速いという条件で、上記反応は、最大約１００％の収率まで進み得る。ゆえに、鏡像異性的に純粋なアミノ酸を合成するための動的速度論的分割方法が、速度論的分割方法にまさって選択される。
【０００５】
動的速度論的分割方法において、ラセミＮ−アシルアミノ酸とアシラーゼ酵素との間の反応は、鏡像異性的に（ｅｎａｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋なアミノ酸の収率を有意に高めるＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ（ＮＡＡＡＲ）生体触媒を使用する。結果として、そのプロセスは、商業規模で工業的に実行可能になる。ＮＡＡＡＲを使用する構想は、スキーム１および２に模式的に表され得、ここで、スキーム１は、アシラーゼに基づくＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の分割を表しており、スキーム２は、アシラーゼとＮＡＡＡＲとを組み合わせた動的速度論的分割を表している。
【０００６】
【化１】
2014511706.tif 000002
従来の速度論的分割方法では、Ｌ−アシラーゼが、ラセミＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸に対して作用し、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を生成する。その反応混合物にＮＡＡＡＲが加えられると、正反応によって生成されたＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸が、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸にラセミ化されるので、その反応は、約１００％完了するまで続く。
【０００７】
特許文献１は、アシラーゼ／ラセマーゼ系の使用による、Ｎ−保護アミノ酸から鏡像異性的に純粋なアミノ酸を調製するためのプロセスに関する。その反応のために使用されるＮＡＡＡＲは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒａｔｕｓ  Ｙ−５３  ＮＡＡＡＲ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲおよびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ亜種ｌｕｒｉｄａＮＡＡＡＲからなる群から選択される。
【０００８】
特許文献２は、ＮＡＡＡＲをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメント、そのＤＮＡフラグメントが挿入されたベクター、およびそのベクターで形質転換され、ＮＡＡＡＲを産生することができる微生物に関する。
【０００９】
特許文献３は、ＮＡＡＡＲを使用してＮ−アシルアミノ酸をラセミ化するための方法、およびさらに、ラセミ化されたＮ−アシルアミノ酸をアシラーゼ酵素と反応させて鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するための方法に関する。ラセミ化のために使用されるＮＡＡＡＲは、Ｓｅｂｅｋｉａ  ｂｅｎｉｈａｎａに由来した。
【００１０】
特許文献４は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ亜種ｌｕｒｉｄａから単離されたＮＡＡＡＲに関する。この特許は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ亜種ｌｕｒｉｄａから単離されたＮＡＡＡＲを使用することによってラセミＮ−アセチルアミノ酸から鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するための方法にも関する。
【００１１】
非特許文献１では、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０から単離されたＮＡＡＡＲの精製および特性が開示されている。
【００１２】
上記文献において知られているＮＡＡＡＲの大部分は、野生型である。これらの野生型ＮＡＡＡＲの活性は、アシラーゼ酵素の活性と似て非常に低い。先に説明したように、ＮＡＡＡＲによるラセミ化反応の速度は、アシラーゼ酵素の反応速度よりもかなり速く、それにより、鏡像異性的に純粋なアミノ酸をそのＮ−アシルラセミアミノ酸誘導体から生成する方法が商業的に実行可能となるはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第６，６５６，７１０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５２５，５０１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，６６４，８０３号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３７２，４５９号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｏｋｕｙａｍａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，４０，８５３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
要旨
本願の態様は、野生型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲと比べて、改善された活性を示す変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲに関する。
【００１６】
本願の態様は、幅広い基質特異性を有する変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲに関する。
【００１７】
本願の態様は、約３００ｍＭまで基質の基質阻害を示さない変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲに関し、その変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲは、より高い濃度レベルにおいて使用できる。
【００１８】
本願の態様は、商業規模でのＮ−アシルアミノ酸のラセミ化のための、変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲの使用に関する。
【００１９】
本願の態様は、Ｎ−アシルアミノ酸とアシラーゼ酵素との反応から鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するための、変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲの使用に関する。
【００２０】
本願の態様は、動的速度論的分割プロセスによって鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するためのプロセスに関し、そのプロセスは、変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲの存在下においてＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸をアシラーゼと反応させる工程を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本願の態様は、野生型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲと比べてその酵素の改善された活性を示す変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲを提供する。野生型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲを、２つの位置、すなわち、Ｇ２９１ＤおよびＦ３２３Ｙにおいて変異させた。驚いたことに、その酵素活性が、野生型の活性のおよそ５倍上昇したことが見出されている。変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲ（ＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ）の配列は、配列番号１としての以下のとおりである：
【００２２】
【化２】
2014511706.tif 000003
２つの変異Ｇ２９１ＤおよびＦ３２３Ｙによって、本質的にはスクシニル側基の結合のために以前に進化させたアシル結合ポケットが再変形（ｒｅ−ｓｃｕｌｐｔｅｄ）された。これらの変化によって、アシルラセマーゼ活性が野生型よりも高レベルに上昇した。変異型酵素のラセマーゼ活性の上昇は、野生型のおよそ５倍であると示されている。
【００２３】
米国特許出願公開第２００３／００５９８１６Ａ１は、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ（ｒｅｃｅｍａｓｅ）活性を有する酵素を微生物遺伝子ライブラリーから特定するための方法に関する。その公報は、関係する酵素活性の指向進化によって新規ラセマーゼを作製する方法にも関する。その公報は、変異型ＮＡＡＡＲを開示しているが、その変異は明確でない。それらのＮＡＡＡＲは、ランダム変異誘発によって生成されている。また、その公報は、鏡像異性的に純粋なアミノ酸をそのＮ−アシル誘導体から生成する動的速度論的分割方法においてそのＮＡＡＡＲの活性を例証していないが、ラセマーゼ活性を有するランダムに変異している酵素および最も活性なラセマーゼを選択するための方法により関する。
【００２４】
本願の態様は、動的速度論的分割方法による、Ｎ−アシルアミノ酸誘導体からの鏡像異性的に純粋なアミノ酸の合成を提供する。その反応では、ラセミＮ−アシルアミノ酸を、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲの存在下においてアシラーゼ酵素で処理することにより、良好な収率で鏡像異性的に純粋なアミノ酸が得られる。その反応全体をスキーム３として示す。
【００２５】
【化３】
2014511706.tif 000004
ここで、
Ｒ１＝天然または合成アミノ酸のα基
Ｒ＝Ｃ１−Ｃ４。
【００２６】
例えば、実施形態において、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および５ｍＭ  ＣｏＣｌ２の存在下、約６０℃において、Ｌ−アシラーゼおよびＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲと反応させる。この反応が完了した後、８５％のＬ−メチオニンが、その反応混合物から単離され得る（実施例７、表２を参照のこと）。ゆえに、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲは、鏡像異性的に純粋なアミノ酸をそのラセミＮ−アシル誘導体から高収率で生成するための工業プロセスにおいて首尾良く使用され得る。
【００２７】
本願の態様は、野生型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲと比べて酵素の改善された活性を示す変異型Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲに関する。
【００２８】
実施例７における表１は、２つの基質（Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンおよびＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン）に関する、種々のＮＡＡＡＲ（すなわち、野生型、Ｇ２９１Ｅ変異型、Ｇ２９１Ｄ変異型、Ｇ２９１Ｄ  Ｐ２００Ｓ  Ｆ３２３Ｙ変異型およびＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型）の比活性を示している。Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型酵素によって最も高い活性が得られることが観察され得る。
【００２９】
表１は、同量の野生型およびＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲ酵素が、同じ時間にわたってＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンと反応するとき、野生型酵素は、２１．０７μモルの活性を示すのに対し、変異型酵素は、９９．８０μモルの活性（４．７４倍高い）を示すことも証明している。同様に、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンに対しては、野生型は、２９．９９μモルの活性を示すのに対し、変異型酵素は、１４３．１１の活性（４．７７倍高い）を示す。これらの結果は、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型酵素が、野生型よりも活性であることを示している。野生型酵素が、たった２箇所、すなわちＧ２９１およびＦ３２３しか変異されていないので、この活性の有意な上昇は、非常に驚くべきことである。
【００３０】
上で述べたように、以前に報告されたＮＡＡＡＲは、アシラーゼ酵素の活性と比べて非常に低い活性を有する。ゆえに、それらは、動的速度論的分割方法によるＮ−アシルアミノ酸からの鏡像異性的に純粋なアミノ酸の工業的生成にとって実用的でない。Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲの比活性の上昇によって、以前のプロセスの課題を克服することが可能である。したがって、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲは、Ｎ−アシル誘導体からの鏡像異性的に純粋なアミノ酸の工業的生成のために首尾良く使用され得る。
【００３１】
変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲの活性の上昇によって、動的速度論的分割方法による、Ｎ−アセチルメチオニン、変異型ＮＡＡＡＲおよびＬ−アシラーゼを含む反応物からのＬ−メチオニンの生成が、Ｎ−アセチルメチオニンおよびアシラーゼを含む反応物からのＬ−メチオニンの生成の従来の速度論的分割方法と比べて約６０％増加した（表２を参照のこと）。ある実験では、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンをＬ−アシラーゼと反応させたとき、わずか５２％のＬ−メチオニンしか得られない。しかし、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンおよびＬ−アシラーゼの反応物にＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲを加えることによって、Ｌ−メチオニンの収率が約８５％まで上昇する。
【００３２】
表２は、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲが、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンからのＬ−メチオニンの収率を改善するだけでなく、対応するＮ−アセチル誘導体からのＬ−アラニン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−フェニルアラニンの収率も上昇させることも示している。これは、変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲが、幅広い基質特異性を有することを明らかに指摘している。それゆえ、変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ酵素は、Ｌ−メチオニンだけでなくＮ−アセチル誘導体からの他のいくつかのアミノ酸の生成にとっても工業的に有用である。
【００３３】
変異型ＮＡＡＡＲのラセマーゼ活性が、商業的に入手可能なラセマーゼ酵素であるＲａｃ１０１よりも高いことが観察されている。表２は、Ｎ−アセチル−ＤＬ−ロイシンをＬ−アシラーゼおよびＲａｃ１０１と反応させるとき、５３％の収率のＬ−ロイシンが得られることを示している。同様の反応において、Ｒａｃ１０１の代わりにＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲを用いると、その収率は、６７％に改善される。Ｌ−メチオニンの場合、収率の上昇は、いっそう有意である。それは、Ｒａｃ１０１にまさって、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲの場合６０％超の収率の上昇を示す。
【００３４】
Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲは、幅広い基質特異性を有する。それは、幅広いＮ−アシルアミノ酸誘導体のラセミ化にとって有用である。それらのアミノ酸は、天然であっても合成であってもよい。アミノ酸基質の例のいくつかとしては、Ｎ−アシル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−アシル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−アシル−Ｄ−アラニン、Ｎ−アシル−Ｌ−アラニン、Ｎ−アシル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アシル−Ｌ−ロイシン、Ｎ−アシル−Ｄ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）、Ｎ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アシル−Ｄ−イソロイシン、Ｎ−アシル−Ｌ−イソロイシン、Ｎ−アシル−Ｄ−バリン、Ｎ−アシル−Ｌ−バリン、Ｎ−アシル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−アシル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アシル−Ｄ−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−Ｄ−フェニルグリシン、Ｎ−アシル−Ｌ−フェニルグリシン、Ｎ−アシル−Ｄ−（４−フルオロフェニル）グリシン、Ｎ−アシル−Ｌ−（４−フルオロフェニル）グリシン、Ｎ−アシル−Ｄ−２−アミノブチレート、Ｎ−アシル−Ｌ−２−アミノブチレート、Ｎ−アシル−Ｄ−アリルグリシン、Ｎ−アシル−Ｌ−アリルグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。そのアシル基は、１〜４個の炭素原子を含む任意の基であり得る。特定の実施形態において、そのアシル基は、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）である。
【００３５】
表３は、幅広いアミノ酸に対するＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲの有効性を示している。すべての反応を、６０℃、３００ｍＭ基質、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＣｏＣｌ２において行った。最低濃度のＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲを加え、８時間後に反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍａｓｓ）を解析した。Ｎ−アセチルＤ−メチオニンまたはＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの場合、その反応物は、８時間後にわずか約４％未満の鏡像体過剰率しか示さないことから、約９６％超の基質がラセミ化されたことが示唆される。これは、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲの有効性を立証するものである。同様に、表３は、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルグリシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルグリシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−２−アミノブチレート、Ｎ−アセチル−Ｌ−２−アミノブチレート、Ｎ−アセチル−Ｄ−（４−フルオロフェニルグリシン）およびＮ−アセチル−Ｄ−アリルグリシンのような他の基質に対するＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ変異型ＮＡＡＡＲの有効性も示している。
【００３６】
これらの結果は、Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲが、動的速度論的分割方法によるＮ−アシル誘導体からの鏡像異性的に純粋なアミノ酸の生成にとって有用であることを示している。
【００３７】
変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲが、約２０℃〜約８０℃、詳細には約３０℃〜約７０℃、より詳細には約３７℃〜約６０℃において活性であることが観察されている。
【００３８】
以前のＮＡＡＡＲは、主に野生型であり、それらは、基質によって阻害されると報告されている。結果として、鏡像異性的に純粋なアミノ酸の収率は、野生型ＮＡＡＡＲを用いたとき、より低い。野生型酵素の報告された基質阻害が、ｐＨが制御されないことに起因することが見出されている。驚いたことに、変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲが、わずかに塩基性のｐＨ値において最も高い活性を示すことが観察されている。変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲは、ｐＨ７．５〜９またはｐＨ７．５〜８．５またはｐＨ８において高い活性を示す。変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲが、ｐＨ８において最大約３００ｍＭの基質を阻害しないことも観察されている。ゆえに、変異型Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．ＴＳ−１−６０  ＮＡＡＡＲは、工業的に許容され得る条件下における動的速度論的分割方法によってラセミＮ−アシルアミノ酸から鏡像異性的に純粋なアミノ酸を生成するために使用され得る。
【００３９】
本願のさらなる態様は、スキーム４に示されているような、「安価な」（または望まれない）エナンチオマーのアミノ酸またはアミノ酸誘導体から「高価な」（または所望の）アミノ酸またはアミノ酸誘導体への立体反転に関する。この態様は、容易に入手可能な天然のＬ−アミノ酸からあまり入手可能でない非天然のＤ−アミノ酸への変換、例えば、Ｌ−セリンからＤ−セリンへの変換にとって、特に有用であり得る。
【００４０】
【化４】
2014511706.tif 000005
一般に、Ｌ−アミノ酸のＮ−アセチル誘導体（鏡像異性的に純粋または鏡像異性的に濃縮されたもの）は、塩基の存在下における無水酢酸との反応によってＬ−アミノ酸から都合良く得ることができる。得られた化合物は、ＮＡＡＡＲ／Ｄ−アシラーゼの組み合わせ加水分解に供され得、それにより、出発アミノ酸のＤ−エナンチオマーが提供される。結果として、そのプロセスは、出発アミノ酸の慣習的な立体反転と見なされ得る。
【００４１】
ある特定の態様および実施形態は、以下の実施例においてさらに説明され、それらは、例証の目的のためだけに提供され、本願の範囲をそれに限定するものではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１：Ｇ２９１におけるＰＣＲベースの点変異
野生型（ＷＴ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ＮＡＡＡＲ遺伝子のＧ２９１位において飽和変異誘発を行った。ＷＴのＧＧＧの代わりに縮重ＮＮＫコドンをコードする変異原性順方向プライマーおよびＮＡＡＡＲ遺伝子の末端をコードする非変異原性逆方向プライマーを使用して、変異誘発を行った。メガプライマーベースの変異誘発ＰＣＲにおいて、約２００ｂｐのＰＣＲ産物をメガプライマーとして使用し、ｐＴＴＱ１８  ＷＴ  ＮＡＡＡＲをベクター鋳型として使用した。鋳型ＤＮＡを除去するために、得られたＰＣＲ産物を３７℃においてＤｐｎ１で４時間消化した。ＳＥＴ２１菌株を使用して、プラスミドをスクリーニングした。１ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン、０．４％グルコース、１００μΜ  ＣａＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールが補充されたＤａｖｉｓ最小寒天プレート上、３７℃においてスクリーニングを行った。エレクトロコンピテント形質転換の後、細胞をＨ２Ｏで３回洗浄して、細胞混合物からすべての富栄養培地を除去した。その細胞混合物の１００％を４枚の寒天プレートに分けて広げた。プレートを一晩インキュベートし、次いで、コロニーのサイズを視覚的に判断した。ＷＴ−３コロニーと比べて成長促進を確認するために、各プレートの最も大きいコロニーをレプリカの１ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンプレート上に再度画線した。これらを配列決定したところ、すべてが、２９１位にアスパラギン酸のＧＡＣコドンを含むことが見出された。
【００４３】
実施例２：Ｆ３２３におけるＰＣＲベースの点変異
鋳型としてｐＥＴ２０ｂ  ＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄを使用するエラープローンＰＣＲを用いて、Ｆ３２３Ｙ変異を発見した。そのＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ遺伝子を、１遺伝子あたり１アミノ酸変異に対応する変異原性率で、市販のエラープローンＰＣＲキット（Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ，Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）を使用して増幅した。最初の変異原性ＰＣＲ産物を、鋳型としてｐＥＴ２０ｂ  ＮＡＡＡＲ（ＷＴ）を用いるメガプライマーベースのＰＣＲを使用してｐＥＴ２０ｂにクローニングした。ＳＥＴ２１のＤＥ３溶原性菌株（ｌｙｓｉｇｅｎｉｃ  ｓｔｒａｉｎ）においてスクリーニングを行った。５００μΜ  Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールが補充されたＤａｖｉｅｓ最小寒天プレート上で、コロニーを選択した。細胞混合物からすべての富栄養培地を除去するために細胞をＨ２Ｏで３回洗浄した後、プレート上に広げた。ＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄと比べて成長促進を確認するために、各プレートの最も大きいコロニーをレプリカの５００μΜ  Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンプレート上に再度画線した。２つのより大きい成長中のコロニーが、３２３位にチロシンのＴＡＣコドンを含むことが見出された。
【００４４】
実施例３：野生型および変異型ＮＡＡＡＲの精製
ＷＴ、Ｇ２９１ＤおよびＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｄ  ＮＡＡＡＲを同じ方法で精製した。対応するｐＥＴ２０ｂ  プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、これ由来のシングルコロニーを使用して、５００ｍＬのＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に接種した。この培養物を、誘導なしで３７℃において２４時間生育した。次いで、細胞を遠心分離（１５分，４０００ｇ）によって回収し、直ちに、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ＲｏｃｈｅコンプリートＥＤＴＡ非含有プロテアーゼインヒビタータブレットおよび２ｍｇ／ｍＬリゾチーム中における１０分間の超音波処理（３０秒オン、次いで３０秒オフ）により溶解させた。次いで、これを遠心分離（１時間，１２０００Ｇ，４℃）により浄化し、上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。次いで、濾過した上清を、ＡＫＴＡシステムに取り付けられたＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＦＦ  Ｑ陰イオン交換カラム上に充填した。このカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００  Ｍ  ＮａＣｌで平衡化した。次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００Ｍ  ＮａＣｌを含む以下のグラジエントを用いてタンパク質を溶出した：１カラム体積にわたって０〜２５％、８カラム体積にわたって２５〜４５％および１カラム体積にわたって４５〜１００％。ＮＡＡＡＲを含む画分（ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより判断）をプールし、約１ｍＬに濃縮した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ３００サイズ排除カラム上に充填した。ＮＡＡＡＲを含むとみられる画分をプールし、Ａｂｓ２８０によりタンパク質濃度を測定した。アッセイする前にタンパク質を４℃で保管した。
【００４５】
実施例４：ＮＡＡＡＲの比活性の測定
精製されたＷＴ、Ｇ２９１ＤおよびＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ酵素をアッセイすることによって、比活性の測定を行った。最大３００ｍＭのＮ−アセチル−メチオニンを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＣｏＣｌ２においてアッセイを行った。その基質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に調製し、基質を加えた後、再度ｐＨを調整したところ、これは、３０ｍＭ超の活性を最適化するために有益であると見出された。反応緩衝液中の最終１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌは、基質溶液から持ち込まれる５０ｍＭを含んで構成されていた。酵素および緩衝液を６０℃で５分間インキュベートした後、その反応物にＮＡＡＡＲを加えた。その反応物を６０℃で３分間放置した後、５０μＬの反応物を９５０μＬの０．０５Ｍ  ＨＣｌに加えることによって反応を終了させた。次いで、これを５分間煮沸することにより、すべてのタンパク質を沈殿させ、遠心分離（３分，１１０００Ｇ）により溶液を浄化した。上清を０．４５μｍで濾過した後、キラルＨＰＬＣにより解析した。４０℃においてＣｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔカラムを使用するＡｇｉｌｅｎｔ  １１００システムにおいてＨＰＬＣを行った。グラジエントは、７５％０．０１％ＴＥＡＡおよび２５％メタノールのアイソクラチック移動相だった。ピークを２１０ｎｍにおいてモニターした。注入量は、５μＬだった。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析を行った。
【００４６】
実施例５：Ｌ−アシラーゼの精製
自己誘導培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）中で２４時間生育させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞における発現により、Ｌ−アシラーゼを精製した。次いで、細胞を遠心分離（１５分，４０００Ｇ）によって回収し、直ちに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、ＲｏｃｈｅコンプリートＥＤＴＡ非含有プロテアーゼインヒビタータブレットおよび２ｍｇ／ｍＬリゾチーム中における１０分間の超音波処理（３０秒オン、次いで３０秒オフ）により溶解させた。この溶液を６０℃で６０分間インキュベートした。次いで、これを遠心分離（１時間，１２０００Ｇ，４℃）により浄化し、上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。次いで、濾過した上清を、ＡＫＴＡシステムに取り付けられたＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＦＦ  Ｑ陰イオン交換カラム上に充填した。このカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した。次いで、５０ｍＭ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌを含む以下のグラジエントを用いてタンパク質を溶出した：１カラム体積にわたって０〜２５％、８カラム体積にわたって２５〜４５％および１カラム体積にわたって４５〜１００％。Ｌ−アシラーゼを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により判断した。
【００４７】
実施例６：生体内変換
Ｌ−アシラーゼと他のアミノ酸の両方とのＮＡＡＡＲ適合性を試験するために、スモールスケールの生体内変換を行った。Ｂ：Ａ２１細胞を、ｐＥＴ２０ｂ  ＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３ＹおよびＬ−アシラーゼをコードするプラスミド（アンピシリン耐性）で形質転換した。単一のＮＡＡＡＲコロニーを使用して５ｍＬのＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に接種し、単一のＬ−アシラーゼコロニーを使用して５ｍＬの自己誘導培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．５％グリセロール、０．０５％グルコース、０．２％ラクトース、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に接種した。両方の培養物を３７℃で２４時間生育した後、１ｍＬの各々を取り出し、８ｍＬの生体内変換反応緩衝液（最終濃度：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＣｏＣｌ２および３００ｍＭ基質）に加えた。基質を加えた後の反応緩衝液のｐＨを、再度、８．０に調整した。その生体内変換物を、特定の時点において取り出された１ｍＬのサンプルとともに６０℃で数時間インキュベートすることにより、反応の進行をモニターした。これらのサンプルを遠心分離（２分，１１０００Ｇ）によって浄化し、５０μＬの上清を９５０μＬの０．０５Ｍ  ＨＣｌに加えた。次いで、実施例４において説明したようにサンプルを調製し、キラルＨＰＬＣにより解析した。
【００４８】
実施例７：ＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙの活性とＲａｃ１０１の活性との比較
商業的に入手可能なＲａｃ１０１の活性とＧ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲの活性を比較するために、精製された酵素を細胞の代わりに使用した。０．１ｍｇの各酵素を１ｍＬの反応物に含めた。サンプルの条件、調製法および解析は、実施例５のそれらと同様だった。
【００４９】
実験の結果を表１および２に示す。表１は、種々のＮＡＡＡＲの比活性を比較しており、表２は、種々の基質を使用してＮＡＡＡＲとＲａｃ１０１とを組み合わせた生体内変換からの収率を示している。
【００５０】
表１：Ｎ−アセチルメチオニンを用いたバリアントＮＡＡＡＲの活性
【００５１】
【表１】
2014511706.tif 000006
表２：ＮＡＡＡＲとＲａｃ１０１とを組み合わせた生体内変換からの収率
【００５２】
【表２】
2014511706.tif 000007
（ａ）いずれの生体内変換においてもＤ−アミノ酸は検出されなかった。
（ｂ）反応条件：２５０ｍＭ基質、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＣｏＣｌ２，６０℃。
【００５３】
実施例８：Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲによる多種多様のＮ−アシルアミノ酸のラセミ化
すべての反応を、６０℃、３００ｍＭ基質、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＣｏＣｌ２において行った。Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲを最低濃度で加え、反応を８時間行った。８時間後、反応物の鏡像体過剰率（％ｅｅ）を解析した。実験の結果を表３に示す。
【００５４】
表３：Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ  ＮＡＡＡＲによる多種多様のＮ−アシルアミノ酸のラセミ化
【００５５】
【表３】
2014511706.tif 000008
実施例９：Ｌ−セリンからＤ−セリンへの立体反転およびワンポットプロセスにおけるＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−セリン誘導体の形成
【００５６】
【化５】
2014511706.tif 000009
Ｌ−セリン（１４２．７ｍｍｏｌ，１５．０ｇ）を、ＮａＯＨ（１４．４ｇ，３６０ｍｍｏｌ）の冷却した水溶液（２５ｍＬ）に溶解させ、冷却した。温度を２５℃未満に維持しながら無水酢酸（１５ｍＬ）を滴下し、次いで、その混合物を１時間撹拌した。１００ｍＬのＥｔＯＨを加え、スラリーを周囲温度で１時間撹拌することにより、未反応Ａｃ２Ｏを分解させた。白色沈殿物（ＡｃＯＮａ，１５ｇ）を濾過により除去した。濾液を真空中で蒸発させることにより、約５６ｇの粗生成物を得た。残渣を１２０ｍＬのＭｅＯＨおよび８０ｍＬのＥｔＯＨに再度溶解させ、氷浴内で冷却しながら濃ＨＣｌでｐＨ４．５に酸性化した。白色沈殿物（ＮａＣｌ，２５ｇ）を濾過により除去した。濾液に１００ｍＬのトルエンを加え、残渣を蒸発させることにより、１：１．２モル比でＡｃＯＨを含む（ＮＭＲにより）生成物を得た。残渣を５００ｍＬのＨ２Ｏに溶解させ、６０９ｍｇのＣｏＣｌ２および３００ｍｇのＭｇＳＯ４を加えた。その混合物を４０℃に温め、ｐＨを８．０に調整した。１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ中の３０ｍＬのＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ細胞非含有抽出物（１５００Ｕ）を加えた。ラセミ化反応をキラルＨＰＬＣでモニターした。３時間後、変換は５０％に達し、２５０μＬのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．Ｄ−アミノアシラーゼを加え（３６０Ｕ）、その混合物を、２Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．８〜８に維持しつつ、４０℃で一晩撹拌した。アシラーゼの添加から１８時間後、変換は約８０％に達した。さらに２５μＬのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．Ｄ−アミノアシラーゼ（３６Ｕ）を加えた。さらに３時間撹拌した後、反応は約９０％変換に達した。その混合物を５℃に冷却し、３Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨを２．３に調整し、次いで、それを遠心分離することにより（３０分，８０００ｒｐｍ）、酵素を除去した。水相を２×１００ｍＬ  ＡｃＯＥｔで洗浄した。次いで、有機相を１００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。合わせた水層を５℃に冷却し、４６％ＮａＯＨを使用してｐＨ１２に調整した。温度を＜１０℃に維持しつつ、冷却された反応混合物に、１００ｍＬのアセトンに溶解されたＢｏｃ２Ｏ（３８．６ｇ，１．２ｅｑ）を滴下した。その混合物を周囲温度で一晩撹拌した。水層を５℃に冷却し、１Ｍ  ＫＨＳＯ４を使用してｐＨ３に酸性化した（気体が発生した）。それを１５００ｍＬのＡｃＯＥｔで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固することにより、粗生成物を得た（約３３ｇ，９４％ｅｅ）。それを、結晶化を補助する５ｍｇの市販のＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−セリンを加えて、ＭＴＢＥ／ヘプタンから再結晶した。１６．４２ｇの純粋な生成物が白色結晶として得られた（９６％ｅｅ，セリンからの３工程に対して５６％の収率）。
【００５７】
実施例１０：Ｎ−アセチル−Ｄ−アリルグリシンからＬ−アリルグリシンへの立体反転
【００５８】
【化６】
2014511706.tif 000010
Ｎ−アセチル−Ｄ−アリルグリシン（５０．０ｇ，３１８ｍｍｏｌ）を４００ｍＬのＨ２Ｏに溶解させた。その溶液を６０℃まで温め、４６％ＮａＯＨを使用してｐＨを８．０に調整した。２３６ｍｇのＣｏＣｌ２および１３６ｍｇのＺｎＣｌ２を加えた。１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ中の１０ｍＬのＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ細胞非含有抽出物（５００Ｕ）を加え、ラセミ化反応をキラルＨＰＬＣでモニターした。１時間後、変換は３０％に達し、さらに２３６ｍｇのＣｏＣｌ２および１３６ｍｇのＺｎＣｌ２を含む７５０ｍｇのＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  Ｌ−アミノアシラーゼ（３０ｋＵ）の水溶液を加えた。その混合物を６０℃で撹拌し、５Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを８〜８．２に維持した。３．５時間後および５．５時間後に、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ中のさらに１０ｍＬのＮＡＡＡＲ  Ｇ２９１Ｄ  Ｆ３２３Ｙ細胞非含有抽出物（５００Ｕ）を加えた（合計３０ｍＬ，１５００Ｕ）。その混合物を一晩撹拌することにより、その基質からＬ−アリルグリシンへの８０％変換に達した（＞９５％ｅｅ）。
【国際調査報告】
2014511706.tif 000011
2014511706.tif 000012
2014511706.tif 000013