(57)【要約】  本明細書では、少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基を含むポリマー骨格を含むナノ構造を開示し、ジェミナルビスホスホネート基は互いに独立して、−Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２｛式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つはポリマー骨格に結合した基であるが、但し、Ｒ３およびＲ４の一方だけがこのような結合した基である場合、Ｒ３およびＲ４の他方は、ポリマー骨格に結合可能な基もしくはこのような基の残基であるか、またはＨ、ＯＨ、ＯＲ５およびＲ５（式中、Ｒ５は低級アルキルである）からなる群から選択される｝として組み込まれている。ポリマー骨格は、マンガンイオンを含んでもよい。また、このようなマンガン含有ナノ構造の製造方法、このようなマンガン含有ナノ構造を含む組成物、およびマンガン含有ナノ構造の使用、とりわけＭＲＩ造影剤としての使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基を含むポリマー骨格に組み込まれたマンガンイオンを含むナノ構造において、前記ジェミナルビスホスホネート基が互いに独立して、
−Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２
｛式中：
Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択され、
Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは前記ポリマー骨格に結合した基であるか、または前記ポリマー骨格の一部を形成する基であるが、但し、Ｒ３およびＲ４の一方だけがこのような結合した基である場合、Ｒ３およびＲ４の他方は、前記ポリマー骨格に結合可能な基もしくはこのような基の残基であるか、またはＨ、ＯＨ、ＯＲ５およびＲ５（式中、Ｒ５は低級アルキルである）からなる群から選択される｝
として組み込まれていることを特徴とするナノ構造。
【請求項２】
請求項１に記載のナノ構造において、前記ポリマー骨格に結合した基、および／または前記ポリマー骨格に結合可能な基またはこのような基の残基が：
（ＣＨ２）ｎＳｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、−は前記ポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝、
（ＣＨ２）ｎＣＯＲｙ｛式中、ＲｙはＯ−、ＮＨ２、ＮＨＲｚ、ＮＲｚ２、または前記ポリマー骨格への結合であり、Ｒｚは低級アルキルであり、ｎは１〜５であり、−は前記ポリマー骨格への結合を示す｝、
（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒｙ｛式中、Ｒｙは、Ｏ−、ＮＨ２、ＮＨＲｚ、ＮＲｚ２、または前記ポリマー骨格への結合であり、Ｒｚは低級アルキルであり、ｎは１〜５であり、−は前記ポリマー骨格への結合を示す｝、
からなる群から選択されることを特徴とするナノ構造。
【請求項３】
請求項１または２に記載のナノ構造において、ケイ素原子を含むことを特徴とするナノ構造。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ構造において、Ｒ３および／またはＲ４が、−（ＣＨ２）ｎ−Ｓｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、−はポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝からなる群から選択されることを特徴とするナノ構造。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記ナノ構造の流体力学的径が３〜７ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記ナノ構造の流体力学的径が１０〜２０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記ポリマー骨格が、ジェミナルビスホスホネート基と２つのオルガノオキシシラン基とを含有するモノマー残基を含むことを特徴とするナノ構造。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記ポリマー骨格がポリエチレンイミンから誘導されることを特徴とするナノ構造。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記Ｐ／Ｍｎモル比が７〜２０であることを特徴とするナノ構造。
【請求項１０】
請求項３に記載の、または請求項３の従属項である場合の請求項４〜７もしくは請求項９のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記Ｓｉ／Ｍｎモル比が５〜２０であることを特徴とするナノ構造。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ構造において、前記ナノ構造が、外側部分に結合した親水性基をさらに含むことを特徴とするナノ構造。
【請求項１２】
請求項１１に記載のナノ構造において、前記親水性基が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３部分（式中、ｎ＝４〜５０である）を含むことを特徴とするナノ構造。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ構造を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子または請求項１３に記載の医薬組成物のＭＲＩ造影剤としての使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ構造を得る方法であって：
ジェミナルビスホスホネートを含むポリマー骨格を有するナノ構造を得る工程、および
前記ナノ構造をマンガンイオンと接触させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基を含むポリマー骨格を含むナノ構造において、前記ジェミナルビスホスホネート基が互いに独立して、
−Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２
｛式中：
Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは前記ポリマー骨格に結合した基であるか、または前記ポリマー骨格の一部を形成する基であるが、但し、Ｒ３およびＲ４の一方だけがこのような結合した基である場合、Ｒ３およびＲ４の他方は、前記ポリマー骨格に結合可能な基もしくはこのような基の残基であるか、またはＨ、ＯＨ、ＯＲ５およびＲ５（式中、Ｒ５は低級アルキルである）からなる群から選択される｝
として組み込まれていることを特徴とするナノ構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、常磁性マンガン（ＩＩ）イオンを組み込むキレート化ポリマーナノ構造、ならびに前記ナノ構造の製造方法および生体物質を可視化または画像化するためのナノ構造の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核磁気共鳴画像法、ＭＲＩは、原子核の磁化を利用することにより身体の軟組織を可視化する医用画像化モダリティである。神経系、血管系の画像化および腫瘍の画像化などの多くの臨床技術用途がある。
【０００３】
通常、豊富に存在する身体の水分子の水素原子核を画像化する。ＭＲＩ信号の強度は、原子核の性質、その存在量、およびその局所的磁場環境に依存する。これらの要因は縦緩和時間（Ｔ１、磁化回復時定数）および横緩和時間（Ｔ２、信号減衰時定数）に影響を及ぼし、これらがまた信号強度に影響を及ぼす。従って、ＭＲＩのコントラスト源は、原子核の局所濃度とそれらの磁場環境との組み合わせである。Ｔ１コントラストまたはＴ２コントラストを強調することにより様々な形態学的特徴の画質を向上させることができる。造影剤の存在により局所的磁場環境を変化させることができ、その磁気特性に応じて信号を上昇（陽性造影剤）または低下（陰性造影剤）させることができる。画像の解釈がより簡単になるため、陽性造影剤の方が好ましいことが多く、その場合、明るいほど多くの造影剤が存在することを示す。陽性造影剤の原理は、各走査後に水分子がどれくらい速く磁化回復するかを表す縦緩和時間、Ｔ１の短縮である。陽性造影剤が存在すると、所定の時間でより多くの信号を収集することができる。
【０００４】
さらに、Ｔ１に対する化合物の影響は緩和度（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）として与えられ、従って、緩和度が高いと、より強い信号増強が得られる。緩和度（ｒ）は、構造に依存した周波数依存性があり、そのため異なる出典からの文献のデータの比較は複雑になる。臨床ＭＲＩ走査装置は、通常、１．５または３テスラの磁場を有し、本発明者らは、妥当な妥協案として、８１．３ＭＨｚのプロトン共鳴周波数に相当する１．９１Ｔで緩和度を測定した。測定は、６０ＭＨｚなどの他の周波数で行ってもよい。市販のガドリニウムベースの造影剤の緩和度は、臨床上適切な磁場で４／ｍＭＧｄ／ｓに近い。
【０００５】
市場は現在、水溶性ガドリニウムキレートに支配されている。それらは物理的サイズが小さい（＜１ｎｍ）ため、それらは細胞外空間（血液プラス組織の細胞間隙）に迅速に分布し、そのためコントラスト効果が幾分制限される。ガドリニウムなどの常磁性金属イオンのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に関する問題は、それらの毒性であり、現在市販されている造影剤中のキレートはこれにかなりうまく対処している。しかし、最近、キレートは少量のガドリニウムを放出することが判明し、それは腎機能が存在しないまたは非常に低い患者では問題となり、腎性全身性線維症、ＮＳＦと称される重篤な副作用が認められた（Ｇｒｏｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００６，２１，１１０４；Ｓｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａジオール．２００８，４３，６５）。
【０００６】
ＮＳＦの問題により、Ｔ１短縮造影剤としてガドリニウム以外のものを使用するという懸案事項が持ち上がった；マンガホジピルは、造影剤として使用されてきたマンガン（ＩＩ）キレートである（Ｅｌｉｚｏｎｄｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１７８，７３，１９９１）。それはｉｎ  ｖｉｖｏで適度の安定性があり、注入後、マンガンの大部分がイオンとして放出され、肝臓に集積し、そのため健常組織と癌組織との十分なコントラストが得られる。マンガンは生物の必須微量元素であり、マンガンを処理する機構があるため、適量のマンガンの放出は大きな問題ではない。マンガホジピルは販売量が少ないため現在は市販されていない。マンガンイオンはガドリニウムよりも磁性が低く、大部分のマンガン化合物の緩和度は低く、マンガンベースの造影剤の能力を示す幾つかの顕著な例がある（Ｐａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＷＩＲＥｓ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３，１６２，２０１１）。化学的に比較的達成可能であり、好適なサイズで且つ比較的生体不活性な構造に、有利な特性を組み込むことができる場合、それは明らかに有利であろう。本発明では、これを達成する材料群を開示する。
【０００７】
当該技術分野で公知のナノ粒子をベースにする造影剤は多数ある。それらの幾つかは、酸化鉄をベースにしており、肝臓特異性造影剤として使用されたが、販売量が少ないため、もはや市販されていない。これらの粒子の実験的使用に関する大きな文献が入手可能である。（例えば、Ｂｕｌｔｅ，Ｊ．Ｗ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍｏｄｏ，Ｍ．Ｍ．Ｊ．Ｅｄｓ．“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００８）。本発明はナノサイズの構造を扱うが、それらは、通常その用語が含意するコアシェル型のものではなく、高架橋ポリマーをベースにするものである。
【０００８】
ＭＲＩに使用されるキレート基および常磁性金属イオンを有するポリマー材料に関する大きな文献がある。一般に、緩和度の堅実な増加が達成されるが、本発明に記載するほど高くはない。本発明者らの知る限り、前記文献のいずれも、本発明のビスホスホネートを有するポリマー骨格を開示していない。
【０００９】
次の文献例は、関連する背景技術の出版物の例であり、これらは決して本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきではない。
【００１０】
Ｒｏｎｇｖｅｄ  Ｐ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ２１４，３１５（１９９１）には、炭水化物主鎖とそれに結合したキレート基を有する一連のポリマー材料が記載されている。本発明に最も近い材料はガドリニウム（ＩＩＩ）−デキストランホスフェートであり、その緩和度は、２０ＭＨｚで１６／ｍＭＧｄ／ｓである。本発明で開示する材料のものよりかなり低い。この材料の安定性は不明である。本発明のホスホネートとは対照的に、リンはリン酸エステルとして結合したリン酸基に組み込まれている。従って、この材料は本発明の範囲外である。
【００１１】
Ｒｏｎｇｖｅｄはまた、１９．２／ｍＭＭｎ／ｓの緩和度を有するマンガン（ＩＩ）−ＥＤＴＡ−ショ糖−エピクロロヒドリン複合体、および１２．８／ｍＭＭｎ／ｓの緩和度を有するマンガン（ＩＩ）−ＥＤＴＡ−アミノエチルデキストラン複合体も開示している。とりわけ２０ＭＨｚの低周波数で測定したため、これらの値は両方とも本発明の材料のものよりかなり低い。これらの材料は、本発明の範囲外である。
【００１２】
国際公開第２０１０１３５１６７号パンフレットには、ポリスチレンベースのビスホスホネート材料が記載されている。これはナノ構造を製造しようとするものではなく、むしろバルク材料を製造しようとするものである。
【００１３】
特定の化学構造（本発明のポリマーベースの構造と対照的）および分子量を有するデンドリマーの使用を記載している文献は非常に大きい。
【００１４】
ＭＲ造影剤として使用されるデンドリマーの最もよく知られている例は、Ｇａｄｏｍｅｒ  １７（Ｔｕｒｅｔｓｃｈｅｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０，１３８（２００４））であるが、これは、臨床で実用されるには至らなかった。ナノサイズの構造を得るこの方法は化学合成のコストが非常に高い。その理由は、一部には化学工程が多いためであり、一部には多くの不純物を含有する可能性があり、その精製および同定が困難なためである。また、本発明者らにより見出されたものほど高い緩和度は、本発明者らの知る限り、この分野では報告されていない。
【００１５】
腫瘍診断のための高い感度と選択性を有するＭＲＩ造影剤として高分子剤を使用すると良好な結果が得られるということの背後にある論拠は、受動的腫瘍ターゲティングとも称される血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果である。それは、健常な組織の毛細血管は３〜４ｎｍより大きい分子を実質的に透過しないが、増殖速度の速い腫瘍組織の毛細血管はずっと漏洩し易いということに基づく。決して確実または限定的ではないが、本発明の好ましい腫瘍画像特性はＥＰＲ効果に基づくものと考えられる。
【００１６】
当該技術分野で公知のガドリニウムのホスホネート含有モノマーキレートは多数あるのに対し、マンガンとリンの組み合わせはあまり一般的ではないが、知られていないわけではない（Ｐａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＷＩＲＥｓ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３，１６２，２０１１）。それらは決してＭＲＩ特性が際立っているわけではなく、報告された緩和度は中程度である。ビスホスホネートを有するものの一例が、Ｖｉｔｈａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｐ  ３２０４（２００９）に記載されている。
【発明の概要】
【００１７】
本開示の第１の態様は、少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２）−を含むもしくはそれで修飾されたポリマー骨格または足場をベースにするナノサイズの構造を含むナノ構造に関し、ジェミナルビスホスホネート基は、本発明に関して、−Ｒ４Ｒ３Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２−に等しく、式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールから独立して選択される。
【００１８】
本開示の第２の態様は、少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２）−を含むもしくはそれで修飾されたポリマー骨格または足場をベースにするナノサイズの構造に組み込まれた常磁性マンガンイオンを含むナノ構造に関し、ジェミナルビスホスホネート基は、本発明に関して、前述のように、−Ｒ４Ｒ３Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２−に等しく、式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールから独立して選択される。
【００１９】
「ナノサイズの」という用語は、一般に、１００ｎｍ未満の任意のものを包含するものと解釈されるが、本発明は、略球状の形状および平均サイズ（流体力学的径）１〜１００ｎｍ、または、幾つかの実施形態では、２〜５０ｎｍ、３〜１０ｎｍまたは３〜７ｎｍの高分岐または架橋構造の成分に重点を置いている。
【００２０】
本開示の第２の態様は、マンガンイオンを含むこのようなナノ構造とマンガンイオンを含まないこのようなナノ構造の両方の製造方法に関する。
【００２１】
本開示の第３の態様は、このようなナノ構造、特に常磁性マンガンイオンを含むナノ構造を含む医薬組成物などの組成物、およびまたこのようなナノ構造、特に、常磁性マンガンイオンを含むナノ構造の臨床用の造影剤としての使用、特に、ＭＲＩ用の造影剤としての使用に関する。
【００２２】
本明細書で開示するナノ構造の従来技術と比較した幾つかの利点には、現在市販されている材料より緩和度が一桁高いことと合わせて、腫瘍組織に選択的に集積するのに好適なサイズであり且つ良好な生物学的忍容性（ｂｉｏｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を示すということの組み合わせがある。このため、本発明のナノ構造、特に、常磁性マンガンイオンを含むナノ構造は、ＭＲＩ用、特に腫瘍画像化用の造影剤として使用するのに好適である。
【００２３】
さらに、常磁性成分としてガドリニウムの代わりにマンガンを使用するため、ガドリニウムに関連する毒性の問題が回避される。
【００２４】
比較的希少なガドリニウムの代わりに豊富に存在するマンガンを使用することも、材料の製造においてコスト的に有利である。
【００２５】
具体的実施形態
１．少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基を含むポリマー骨格に組み込まれたマンガンイオンを含むナノ構造において、ジェミナルビスホスホネート基が互いに独立して
−Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２
（これは−Ｒ４Ｒ３Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２に等しい）
｛式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つはポリマー骨格に結合した基であるが、但し、Ｒ３およびＲ４の一方だけがこのような結合した基である場合、Ｒ３およびＲ４の他方は、ポリマー骨格に結合可能な基もしくはこのような基の残基であるか、またはＨ、ＯＨ、ＯＲ５およびＲ５（式中、Ｒ５は低級アルキルである）からなる群から選択される｝
として組み込まれていることを特徴とするナノ構造。
【００２６】
２．実施形態１に記載のナノ構造において、マンガンイオンがマンガン（ＩＩ）イオンであることを特徴とするナノ構造。
【００２７】
３．実施形態１または２に記載のナノ構造において、Ｒ１およびＲ２が、負電荷、Ｈ、アルキルおよびメチルからなる群から独立して選択されることを特徴とするナノ構造。
【００２８】
４．実施形態１〜３のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格に結合した基、および／またはポリマー骨格に結合可能な基、またはこのような基の残基が：
（ＣＨ２）ｎＳｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは、独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、式中、−はポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝、
（ＣＨ２）ｎＣＯＲｙ｛式中、Ｒｙは、Ｏ−、ＮＨ２、ＮＨＲｚ、ＮＲｚ２、またはポリマー骨格への結合であり、Ｒｚは低級アルキルであり、ｎは１〜５であり、−はポリマー骨格への結合を示す｝、および
（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒｙ｛式中、Ｒｙは、Ｏ−、ＮＨ２、ＮＨＲｚ、ＮＲｚ２、またはポリマー骨格への結合であり、Ｒｚは低級アルキルであり、ｎは１〜５であり、−はポリマー骨格への結合を示す｝、
からなる群から選択されることを特徴とするナノ構造。
【００２９】
５．実施形態１〜４のいずれか１つに記載のナノ構造において、ケイ素原子を含むことを特徴とするナノ構造。
【００３０】
６．実施形態１〜５のいずれか１つに記載のナノ構造において、Ｒ３および／またはＲ４は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｓｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、−はポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝からなる群から選択されることを特徴とするナノ構造。
【００３１】
７．実施形態１〜６のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が２〜５０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００３２】
８．実施形態１〜７のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が３〜１０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００３３】
９．実施形態１〜８のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が３〜７ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００３４】
１０．実施形態１〜７のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が１０〜５０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００３５】
１１．実施形態１〜７または１０のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が１０〜２０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００３６】
１２．実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格がジェミナルビスホスホネート基および２つのオルガノオキシシラン基を含有するモノマー残基を含むことを特徴とするナノ構造。
【００３７】
１３．実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格がポリエチレンイミンから誘導されることを特徴とするナノ構造。
【００３８】
１４．実施形態１３に記載のナノ構造において、Ｐ／Ｎモル比が０．１〜３であることを特徴とするナノ構造。
【００３９】
１５．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のナノ構造において、Ｐ／Ｍｎモル比が７〜２０であることを特徴とするナノ構造。
【００４０】
１６．実施形態５または実施形態５に従属する場合の実施形態６〜１２もしくは実施形態１４〜１５のいずれか１つに記載のナノ構造において、Ｓｉ／Ｍｎモル比が５〜２０であることを特徴とするナノ構造。
【００４１】
１７．実施形態５または実施形態５に従属する場合の実施形態６〜１５のいずれか１つに記載のナノ構造において、Ｓｉ／Ｐモル比が０．７〜１．３であることを特徴とするナノ構造。
【００４２】
１８．実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のナノ構造において、マンガンイオンがホスホネート基に配位していることを特徴とするナノ構造。
【００４３】
１９．実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造が、外側部分に結合した親水性基をさらに含むことを特徴とするナノ構造。
【００４４】
２０．実施形態１９に記載のナノ構造において、親水性基が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３部分（式中、ｎ＝４〜５０である）を含むことを特徴とするナノ構造。
【００４５】
２１．実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格が一般構造
｛（Ｘ７ａＯ）（Ｘ７ｂＯ）ＰＯ｝２−（Ｃ）｛（ＣＨ２）ｎＳｉ（ＯＸ７ｃ）（ＯＸ７ｄ）（ＯＸ７ｅ）｝｛（ＣＨ２）ｏＳｉ（ＯＸ７ｃ）（ＯＸ７ｄ）（ＯＸ７ｅ）｝
｛式中、
Ｘ７ａ、Ｘ７ｂ、Ｘ７、Ｘ７ｅは、Ｈ、Ｃ１〜８アルキルおよびベンジルから独立して選択され；
ｎおよびｏは１〜５から独立して選択される｝
のモノマー残基を含むことを特徴とするナノ構造。
【００４６】
２２．実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のナノ構造を含む組成物。
【００４７】
２３．実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のナノ構造を含む医薬組成物。
【００４８】
２４．実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のナノ粒子または実施形態２２もしくは２３に記載の組成物のＭＲＩ造影剤としての使用。
【００４９】
２５．実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のナノ構造を得る方法において、
ジェミナルビスホスホネートを含むポリマー骨格のナノ構造を得る工程、および
前記ナノ構造をマンガンイオンと接触させる工程、
を含むことを特徴とする方法。
【００５０】
２６．実施形態２５に記載の方法において、ナノ構造を限外濾過により精製する工程をさらに含むことを特徴とする方法。
【００５１】
２７．実施形態１３、または実施形態１３に従属する場合の実施形態１４〜２１のいずれか１つに記載のナノ構造を得る方法において、ジェミナルビスホスホネートをポリエチレンイミンから誘導されたポリマー骨格にグラフトした後、それにマンガンイオンを担持させることを特徴とする方法。
【００５２】
２８．実施形態１２、または実施形態１２に従属する場合の実施形態１３〜２１のいずれか１つに記載のナノ構造を得る方法において、前記シランが、水と、水と混和性を有する他の１種以上の溶媒との溶媒混合物中で提供されることを特徴とする方法。
【００５３】
２９．実施形態２５〜２８のいずれか１項に記載の方法により得ることができる生成物。
【００５４】
３０．少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基を含むポリマー骨格を含むナノ構造において、ジェミナルビスホスホネート基が互いに独立して
−Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２
（これは−Ｒ４Ｒ３Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２に等しい）
｛式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つはポリマー骨格に結合した基であるが、但し、Ｒ３およびＲ４の一方だけがこのような結合した基である場合、Ｒ３およびＲ４の他方は、ポリマー骨格に結合可能な基もしくはこのような基の残基であるか、またはＨ、ＯＨ、ＯＲ５およびＲ５（式中、Ｒ５は低級アルキルである）からなる群から選択される｝
として組み込まれていることを特徴とするナノ構造。
【００５５】
３１．実施形態３０に記載のナノ構造において、Ｒ１およびＲ２が、負電荷、Ｈ、アルキルおよびメチルからなる群から独立して選択されることを特徴とするナノ構造。
【００５６】
３２．実施形態３０または３１に記載のナノ構造において、ポリマー骨格に結合した基、および／またはポリマー骨格に結合可能な基またはこのような基の残基が：
（ＣＨ２）ｎＳｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、−はポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝、
（ＣＨ２）ｎＣＯＲｙ｛式中、ＲｙはＯ−、ＮＨ２、ＮＨＲｚ、ＮＲｚ２、またはポリマー骨格への結合であり、Ｒｚは低級アルキルであり、ｎは１〜５であり、−はポリマー骨格への結合を示す｝、および
（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒｙ｛式中、Ｒｙは、Ｏ−、ＮＨ２、ＮＨＲｚ、ＮＲｚ２、またはポリマー骨格への結合であり、Ｒｚは低級アルキルであり、ｎは１〜５であり、−はポリマー骨格への結合を示す｝
からなる群から選択されることを特徴とするナノ構造。
【００５７】
３３．実施形態３０〜３２のいずれか１つに記載のナノ構造において、ケイ素原子を含むことを特徴とするナノ構造。
【００５８】
３４．実施形態３０〜３３のいずれか１つに記載のナノ構造において、Ｒ３および／またはＲ４が−（ＣＨ２）ｎ−Ｓｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、−はポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝からなる群から選択されることを特徴とするナノ構造。
【００５９】
３５．実施形態３０〜３４のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が２〜５０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００６０】
３６．実施形態３０〜３５のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が３〜１０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００６１】
３７．実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が３〜７ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００６２】
３８．実施形態３０〜３５のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が１０〜５０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００６３】
３９．実施形態３０〜３５または３８のいずれか１つに記載のナノ構造において、ナノ構造の流体力学的径が１０〜２０ｎｍであることを特徴とするナノ構造。
【００６４】
４０．実施形態３０〜３９のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格が、ジェミナルビスホスホネート基と２つのオルガノオキシシラン基とを含有するモノマー残基を含むことを特徴とするナノ構造。
【００６５】
４１．実施形態３０〜４０のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格がポリエチレンイミンから誘導されることを特徴とするナノ構造。
【００６６】
４２．実施形態４１に記載のナノ構造において、Ｐ／Ｎモル比が０．１〜３であることを特徴とするナノ構造。
【００６７】
４３．実施形態３３または実施形態３３に従属する場合の実施形態３４〜４２のいずれか１つに記載のナノ構造において、Ｓｉ／Ｐモル比が０．７〜１．３であることを特徴とするナノ構造。
【００６８】
４４．実施形態３０〜４３のいずれか１つに記載のナノ構造において、前記ナノ構造が、外側部分に結合した親水性基をさらに含むことを特徴とするナノ構造。
【００６９】
４５．実施形態４４に記載のナノ構造において、親水性基が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３部分（式中、ｎ＝４〜５０である）を含むことを特徴とするナノ構造。
【００７０】
４６．実施形態３０〜４５のいずれか１つに記載のナノ構造において、ポリマー骨格が、一般構造
｛（Ｘ７ａＯ）（Ｘ７ｂＯ）ＰＯ｝２−（Ｃ）｛（ＣＨ２）ｎＳｉ（ＯＸ７ｃ）（ＯＸ７ｄ）（ＯＸ７ｅ）｝｛（ＣＨ２）ｏＳｉ（ＯＸ７ｃ）（ＯＸ７ｄ）（ＯＸ７ｅ）｝
｛式中、
Ｘ７ａ、Ｘ７ｂ、Ｘ７ｃ、Ｘ７ｄ、Ｘ７ｅは、Ｈ、Ｃ１〜８アルキルおよびベンジルから独立して選択され；
ｎおよびｏは１〜５から独立して選択される｝
のモノマー残基を含むことを特徴とするナノ構造。
【００７１】
用語の定義
「ナノ構造」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に球状の形状の、即ち、フレーク状、棒状、管状、およびリボン状を除く、全径１〜１００ｎｍの成分に関した。本明細書で使用する場合、この用語は、無機または金属コアと有機コーティングとを有する「コア−シェル型ナノ粒子」または単に「ナノ粒子」と称されることが多い構造を除外する。
【００７２】
「ポリマー骨格」という用語は、本明細書で使用する場合、多分岐樹状構造または複数の架橋を有する網目状構造のいずれかを形成する、原子が共有結合した基に関する。ポリマー骨格は、共有結合によるモノマーおよび／またはオリゴマーおよび／または架橋剤の連結から形成される。典型的なモノマーは、Ｊ．Ｒ．Ｆｒｉｅｄ，“Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  １９９５などの高分子化学の教科書に記載されている。モノマーの幾つかの例としては、スチレン、プロピレン、エチレン、テトラフルオロエチレン、トリフルオロエチレン、ジフルオロエチレン、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリルアミド、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは１〜１０である）、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、Ｎ−ビニルピロリドン、および（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｓｉ（ＣＨ３）２のようなシリコーン前駆体がある。ポリマーの幾つかの例としては、テレフタル酸＋１，４ジアミノベンゼン、テレフタル酸＋エチレングリコール、およびＨＣＯＯ−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ＋Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ２（式中、ｎおよびｍは独立して１〜１０である）のような適合するモノマー対から形成されるポリマーがある。連結した２〜１０個のモノマー単位を有するオリゴマーを前駆体として使用することができる。上記モノマーの連結した基と異なるオリゴマーの幾つかの例としては、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサン、およびデカメチルシクロペンタシロキサンなどの環式または多環式シランがある。典型的な架橋剤は、Ｊ．Ｒ．Ｆｒｉｅｄ，“Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  １９９５などの高分子化学の教科書に記載されている。架橋剤の幾つかの例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）、エピクロロヒドリン、ジビニルベンゼン、１，３−ジビニルテトラメチルジシロキサン、１，３−フェニレンジイソシアネート、３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，４−ブタンジオールジビニルエーテル、テトラエトキシシラン、オリゴシリケート、例えば、メタシリケートなど、またはシルセキオキサン（ｓｉｌｓｅｑｕｉｏｘａｎｅｓ）、オルガノシラン、例えば、ビス（トリエトキシシリル）メタン、ビス（トリエトキシシリル）エタン、ビス（トリエトキシシリル）プロパン、ビス（トリエトキシシリル）ブタン、メチルトリエトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、およびプロピルトリエトキシシランなどがある。
【００７３】
このポリマー骨格は、ナノ構造の骨格となる。当業者は、重合がランダムに進行するため、材料は類似しているが同一ではない多くの分岐パターン、架橋位置、および分子量の混合物となることを認識している。
【００７４】
「ジェミナルビスホスホネート基」という用語は、１個の炭素原子により分離された２つのホスホネート基を指す、即ち、ホスホネート基は同じ炭素に結合している。このようなジェミナルビスホスホネート基を含む化合物は、１，１−ビスホスホネート（または１，１−ジホスホネート）と称されることが多い。ジェミナルビスホスホネート基中のホスホネート基は置換されていてもよい。幾つかの実施形態では、ホスホネート基はそれぞれ、式−Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２）｛式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択される｝を有する。
【００７５】
「ポリマー骨格に結合した基」という用語は、形式的には、共有結合がポリマー骨格の水素原子を置換している化学基を指す。この定義に包含される化学基は、一般に、炭化水素、エーテル、アミドまたはエステルといった短い直鎖状残基である。幾つかの典型例としては、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ−、および−（ＣＨ２）ｎＳｉ（Ｏ−）３がある。この文脈では、「短い」という用語は、ｎが１〜８であることを意味する。
【００７６】
「ポリマー骨格の一部を形成する基」という用語は、２つのホスホネート基がポリマー骨格の同じ炭素原子上に位置している状況を指す。
【００７７】
「ポリマー骨格に結合可能な基」という用語は、ポリマー骨格に結合したと称される上記基の前駆体を指す。幾つかの例としては、−（ＣＨ２）ｎＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＢｒ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＣｌ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２、および（ＣＨ２）ｎＳｉ（ＯＥｔ）３がある。
【００７８】
「生体不活性」という用語は、本明細書で使用する場合、生体適合性である、即ち、生物に無害であると同時に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に対して安定な材料を指す。
【００７９】
「ＤＬＳ」という用語は、本明細書で使用する場合、粒子サイズ測定（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｉｎｇ）法である動的光散乱法の頭字語であり、光子相関分光法または準弾性光散乱法と称することもできる。特記しない限り、テキストおよび特許請求の範囲に記載のように示されたＤＬＳサイズは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに相当するイオン強度を有する中性水溶液中、２５℃で測定したサンプルの体積平均ピークの最大の位置を指す。
【００８０】
「球状」という用語は、本明細書で使用する場合、副軸が主軸の半分以下である、即ち、構造の中心（重心）を通る最長軸が、同じ点を通る最短軸の長さの２倍以下であるような形状を有するナノ構造を表すことを意味する。
【００８１】
「親水性有機残基」という用語は、本明細書で使用する場合、水性溶媒中での溶解性を促進する有機残基を指し、本発明では、それらが生体不活性であることを含意しており、ポリペプチドおよび複合炭水化物はそれから除外される。好適な親水性有機残基の例としては、分子組成（ａＯ＋ｂＮ）／（ｃＣ＋ｄＳ＋ｅＳｉ＋ｆＰ）＞０．３｛式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、炭素（Ｃ）、イオウ（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）およびリン（Ｐ）のｍｏｌパーセンテージである｝を有する任意の炭素含有基がある。
【００８２】
「活性化シラン」という用語は、本明細書で使用する場合、次のタイプ、ＲｎＳｉ（Ｘ）４−ｎ（式中、Ｘはアルコキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン、ジアルキルアミノ基、窒素含有複素環またはアシルオキシ基である）のシランを指す。
【００８３】
「オキシシラン」という用語は、本明細書で使用する場合、ケイ素原子に結合した１個以上の酸素原子を有する任意の有機化合物を指す。その非限定例としては：
2014534277.tif 000002
がある。
【００８４】
「オルガノシラン」という用語は、本明細書で使用する場合、１個以上の炭素ケイ素結合を含有する有機化合物を指す。
【００８５】
「オルガノオキシシラン」という用語は、本明細書で使用する場合、１個以上の炭素原子、およびケイ素原子に結合した１個以上の酸素原子を含有する有機化合物を指す。その非限定例としては：
2014534277.tif 000003
がある。
【００８６】
「炭化水素」および「炭化水素鎖」という用語は、本明細書では水素と炭素とからなる有機残基を示すために使用される。炭化水素は、完全に飽和していてもよく、またはそれは１個以上の不飽和を含んでもよい。炭化水素は、１〜５０の任意の数の炭素原子を含有してもよい。
【００８７】
「アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、炭化水素鎖が完全に飽和している（二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指す。アルキル基は、本テキストでは、１〜１５個の炭素原子を有してもよい。化合物のアルキル基は、「Ｃ１〜１５アルキル」または類似の名称と称することができる。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、およびヘキシル等が挙げられるが、決してこれらに限定されるものではない。
【００８８】
「低級アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、１〜８個の炭素原子を有するアルキルを指す。
【００８９】
「低級アルコール」という用語は、本明細書で使用する場合、１〜８個の炭素原子を有するアルコールを指す。
【００９０】
特記しない限り、本明細書で使用する場合は常に、「１から８」または「１〜８」などの数値範囲は、それぞれ所定の範囲の整数を指し；例えば、「１〜８個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、８個以下の炭素原子からなり得ることを意味する。しかし、幾つかの例外もあり、これは当業者には明らかである。特に、本明細書で、ナノ構造中のＰ／Ｎモル比またはＳｉ／Ｐモル比などのモル比、直径またはサイズ、ｐＨ、時間、濃度、浸透圧モル濃度または温度について範囲を記載する場合、範囲はこの範囲に入る全ての小数も含む。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「アルコキシ」という用語は、式−ＯＲ｛式中、ＲはＣ１〜８アルキル、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、アミルオキシ、およびイソアミルオキシ等である｝を指す。アルコキシは、任意選択により置換されていてもよい。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「アリールオキシ」という用語は、ＲＯ−（式中、Ｒはアリールである）を指し、ここで、「アリール」とは、π電子系が完全に非局在化している環状炭素（全て炭素の）環または２個以上の環が縮合したもの（２個の隣接炭素原子を共有する環）を指す。アリール環は４〜２０員環であってもよい。アリール基の例としては、ベンゼン、ナフタレンおよびアズレンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アリール基は、任意選択により置換されていてもよい、例えば、フェノキシ、ナフタレンオキシ、アズレニルオキシ、アントラセニルオキシ、ナフタレニルチオ、およびフェニルチオ等であってもよい。アリールオキシは、任意選択により置換されていてもよい
【００９３】
本明細書で使用する場合、「アシル」という用語は、カルボニル基、即ち、−Ｃ（＝Ｏ）−を指す。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「アシルオキシ」という用語は、カルボニル基を介して結合した酸素原子、即ち、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−を指す。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「複素環」という用語は、炭素原子と、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなる安定な３〜１８員環を指す。複素環は、単環式、二環式、または三環式であってもよい。
【００９６】
「強塩基」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に関して、水酸基より強く、水性環境と適合性のない塩基を指す。
【００９７】
「流体力学的径」という用語は、本明細書で使用する場合、粒子と同じ速度で拡散する仮想剛体球の直径を指す。水和と形状が球の特性に含まれる。この用語は、「ストークス径」または「ストークス・アインシュタイン径としても知られる。
【００９８】
「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」という用語は、本明細書で使用する場合、蛍光マーカー、色素、スピン標識、放射性マーカー、生物学的受容体に対するリガンド、キレート、酵素阻害剤、酵素基質、抗体または抗体関連構造である分子成分を指す。この題目の背景については、例えば、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２００８，ＩＳＢＮ  ９７８−０−１２−３７０５０１−３を参照されたい。
【００９９】
「結合手（ｈａｎｄｌｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」および「結合点」という用語は、共に、ポリマー網目構造に結合できるまたは組み込むことができる二官能性分子であるが、その反応性基の１つが前述の複合体に連結できる状態にあるものを指す。典型例としては（ＥｔＯ）３ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２があるが、これに限定されるものではない。
【０１００】
ＴＥＯＳという頭字語は、テトラエトキシシランを表す。
【０１０１】
ＤＣＭという頭字語は、ジクロロメタンを表す。
【０１０２】
「ビスビス（ｂｉｓｂｉｓ）」という略語は、実施例１ｂの生成物である、１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンを表す。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
第１の態様では、本発明は、多数のホスホネート基−Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２）｛式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルまたはアリールから独立して選択される｝を含むまたはそれで修飾されたポリマー骨格または足場をベースにするナノサイズの構造（ナノ構造）に組み込まれた常磁性マンガンイオンに関する。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つがＨである場合、得られるホスホン酸は、ｐＨに応じた程度までイオン化される。
【０１０４】
前述のように、「ナノ構造」という用語は、全径１〜１００ｎｍの構造に関する。
【０１０５】
本発明の幾つかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈおよびメチルからなる群から独立して選択される。
【０１０６】
ビスホスホネート基を分離する炭素原子、即ち、介在炭素原子に、ポリマー骨格への１個以上の結合が存在する。従って、介在炭素原子は、ポリマー骨格の一部であっても、またはそれに結合していてもよい。特に重要なのは、（Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２｛式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈまたはアルキルまたはアリールから独立して選択され、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは、材料のポリマー骨格に結合可能な基である｝のタイプの構造である。Ｒ３およびＲ４の１つだけがこのような基である場合、残りの基は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ５（Ｒ５は低級アルキルである）、および低級アルキルからなる群から選択される。
【０１０７】
本発明の幾つかの実施形態では、Ｒ３および／またはＲ４は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｓｉ（Ｒｘ）３｛式中、Ｒｘは独立して低級アルキル、ＯＨ、Ｏ−、またはＯ−であり、−はポリマー骨格への結合を示し、ｎは１〜５である｝からなる群から選択される。
【０１０８】
本発明の幾つかの実施形態では、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎＣＯ−（カルボニル基はポリマー骨格への結合を形成する）であり、Ｒ４はＨであり、ｎ＝１〜５である。これらの実施形態の幾つかでは、ｎ＝１である。
【０１０９】
本発明の幾つかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＳｉＯ３（式中、ｎ＝１〜５である）であり、シランは、後で詳述するようにＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合の形成によりポリマー骨格の一部となっている。
【０１１０】
本発明の幾つかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、共に−（ＣＨ２）ｎ−ＳｉＯ３（式中、ｎ＝３である）であり、シランは、上記のように前記ポリマー骨格の一部となっている。
【０１１１】
ホスホン酸エステルまたはホスホン酸の代わりに、ホスホン酸アミド、ホスホン酸塩化物またはホスホン酸フッ化物を本明細書に記載の化合物の成分または出発物質として使用することも考えられる。ホスホネートは、遊離形態で存在しても、またはエステルとしてもしくはアミドとして存在しても、またはその混合物であってもよい。
【０１１２】
本発明の幾つかの実施形態では、ホスホネートは、遊離ホスホネートと前記ホスホネートのメチルエステルとの混合物である。
【０１１３】
前記ホスホネート基が連結しているポリマー骨格は、高分子化学のいずれかの書籍（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｆｒｉｅｄ，“Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  １９９５）に記載されている多数の周知のモノマーから構成することができる。幾つかの非限定例としては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアミド、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（シリコーン）、ポリオルガノシラン、ポリエチレンイミンなどのポリアミン、または炭水化物；とりわけ高分岐または架橋構造のものがある。
【０１１４】
本開示のナノ構造は、前述のように、略球状の形状および平均サイズ（流体力学的径）１〜１００ｎｍの構造であり；幾つかの実施形態では、平均サイズは２〜５０ｎｍであってもよく、他の実施形態では、平均サイズは、３〜１０ｎｍ、または３〜７ｎｍ、または１０〜５０ｎｍ、または１０〜２０ｎｍであってもよい。
【０１１５】
本発明の幾つかの実施形態では、非限定例として静脈内造影剤としての使用があり、ナノ構造の平均流体力学的径は３〜７ｎｍである。
【０１１６】
本発明の幾つかの実施形態、例えば、材料をリンパ節の画像化に使用する実施形態では、ナノ構造の平均流体力学的径は１０〜５０ｎｍまたは１０〜２０ｎｍである。
【０１１７】
称される流体力学的径は、ストークス・アインシュタインの式により、拡散係数から算出される同等の剛体球の直径である。拡散係数はまた、動的光散乱（ＤＬＳ）法により得られる時間依存光散乱データから算出される。比較として、ウシ血清アルブミンは、水溶液中でＤＬＳにより測定すると流体力学的径６．５ｎｍであり、これは結晶構造と非常によく一致している。数平均を使用するか、体積平均を使用するか、または散乱強度平均を使用するかに応じて、値は幾分異なり得る。体積平均は材料の大部分がどのような粒子サイズを有するかを示すため、一般に体積平均が最も有用である。このテキストで称される平均直径は、体積平均を指す。
【０１１８】
本発明で所望される球状構造を形成するために、分岐または網目状構造を有する構造を使用することが好ましい。網目構造を達成する確立されたの方法１つは、重合プロセスで二官能性モノマーの部分を組み込むことにより架橋を導入する方法である。周知の例としては、ジビニルベンゼンを用いたポリスチレンの架橋がある。
【０１１９】
分岐構造は、モノマー中に反応性部位を２つ以上有することにより形成することができる（“Ｔｈｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｐｅｌｅｓｈａｎｋｏ，Ｓ．，Ｔｓｕｋｒｕｋ，Ｖ．Ｖ．，Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．３３，５２３（２００８））。周知の例としては、アジリジンの重合による高分岐ポリエチレンイミンの形成がある。ポリエチレンイミンは、第一級、第二級および第三級アミノ基の混合物を含有し、それは下記の式中に示すようにランダムな分岐構造を有する。その正確な構造は、単に典型的なものとして解釈されるべきであり、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明に極めて重要なビスホスホネートは、第一級および／または第二級アミノ基に結合していてもよい。
【０１２０】
本発明の幾つかの実施形態では、ポリマー骨格はポリエチレンイミンである。下記に、典型的なポリエチレンイミンの構造断片を示す。破線の結合は、ポリマー網目構造が続いていることを示す。
2014534277.tif 000004
【０１２１】
ビスホスホネートをポリアクリレート骨格に組み込む場合、短いリンカーを介してビスホスホネートをアミド窒素に結合させることが考えられる。このような材料の構造断片の典型例としては、下記の構造（式中、Ｒ１およびＲ２は本テキスト中に前述した通りであり、ｎは１〜５であり、破線の結合は断片がポリマーに属することを示す）があるが、これに限定されるものではない。また、ビスホスホネートを炭素骨格に直接結合することも考えられる。
2014534277.tif 000005
【０１２２】
ポリスチレンまたはポリビニルピリジンのようなポリ芳香族化合物をベースにする骨格も考えることができる。その場合、ビスホスホネートを芳香族系に結合させる。ポリビニルピロリジノンのようなポリアミドも考えられる。
【０１２３】
本発明の球状ナノ構造を形成するために適度の架橋が必要である。二官能性、三官能性、または四官能性架橋剤を１〜１００％組み込むことが好ましい。典型的な架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）、エピクロロヒドリン、ジビニルベンゼン、１，３−ジビニルテトラメチルジシロキサン、１，３−フェニレンジイソシアネート、３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，４−ブタンジオールジビニルエーテル、テトラエトキシシラン、オリゴシリケート、例えば、メタシリケート、またはシルセキオキサン、オルガノシラン、例えば、ビス（トリエトキシシリル）メタン、ビス（トリエトキシシリル）エタン、ビス（トリエトキシシリル）プロパン、ビス（トリエトキシシリル）ブタン、メチルトリエトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、およびプロピルトリエトキシシランが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
当該技術分野で公知のプロセスパラメータを操作することにより、重合度を調節して所望のサイズの生成物を得る。所望のサイズは、流体力学的径として表すことができるだけでなく、重合度（平均モノマー数）としても表すことができる。それは流体力学的径より有用性が低いが、それは構造を概念化する別の方法であり、限定するものとして含まれるのではなく、参照として含まれる。例えば、密度が１ｇ／ｍｌに近いポリマーでは、好ましいサイズは、モノマー２５〜３００００００個または２５〜３７５０００個または８０〜３０００個または８０〜１０００個の範囲である。
【０１２５】
重合前にモノマーを混合することにより、または第２のポリマーを第１のポリマーにグラフトすることにより、任意の化学的に適合性のある組み合わせで前記ポリマー骨格を全て混合することが考えられる。
【０１２６】
特に有利な骨格の１つは、トリアルコキシオルガノシランＲ５−Ｓｉ（ＯＲ６）３（式中、Ｒ５はＨまたは有機残基であり、Ｒ６は独立して低級アルキルまたはアリールである）の縮合重合により形成される。このような骨格は、極性が高く、従って水との相溶性があるという特性を有し、架橋度は製造中のプロセスパラメータで制御することができる。２個以上のトリアルコキシシリル基が存在するモノマーを使用することが有利である。
【０１２７】
本発明の幾つかの実施形態では、モノマー中に２個のアルコキシシラン基が存在する。
【０１２８】
本発明の幾つかの実施形態では、前記アルコキシシランは、１〜１０個の炭素原子または３〜９個の炭素原子により分離されている。
【０１２９】
本発明の幾つかの実施形態では、前記アルコキシシランは、７個の炭素原子により分離されている。
【０１３０】
本発明の幾つかの実施形態では、前記アルコキシシランは３個または５個の炭素原子により分離されている。
【０１３１】
本発明の幾つかの実施形態では、２個のホスホネート基はＲ５基の一部となっている。
【０１３２】
本発明の幾つかの実施形態では、前記２個のシランは７個の炭素原子により分離されており、２個のホスホネート基はＲ５の一部となっている。
【０１３３】
本発明の幾つかの実施形態では、前記シランは一般構造：
｛（Ｘ７ａＯ）（Ｘ７ｂＯ）ＰＯ｝２−（Ｃ）｛（ＣＨ２）ｎＳｉ（ＯＸ７ｃ）（ＯＸ７ｄ）（ＯＸ７ｅ）｝｛（ＣＨ２）ｏＳｉ（ＯＸ７ｃ）（ＯＸ７ｄ）（ＯＸ７ｅ）｝
｛式中、
Ｘ７ａ、Ｘ７ｂ、Ｘ７ｃ、Ｘ７ｄ、Ｘ７ｅは、Ｈ、Ｃ１〜８アルキルおよびベンジルから独立して選択され；
ｎおよびｏは１〜５から独立して選択される｝
を有する。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、ジシランなどの第２のシランンを、第１のジシランによって形成されたポリマー骨格にグラフトする
【０１３５】
重合に対するトリアルコキシシランの反応性は、Ｒ６基の性質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）によって変わる。本発明者らは、これが、製造中の分子サイズの制御に重要な要因であることを見出し、メチルおよびエチル、特に後者が本発明の構造を得るのに好適であることを見出したが、他の任意の低級アルキル基、アリール、シリルアミド、アシル、フッ化シリルまたは塩化シリルを使用することも考えられる。
【０１３６】
本発明の幾つかの実施形態では、Ｒ６はエチル基である。
【０１３７】
トリアルコキシシランがＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合により連結し得る多くの異なる方法がある。ダイマー構成要素ならびに直鎖状、分岐、および環式が知られている（Ｒ．Ｊ．Ｆｅｓｓｅｎｄｅｎ，Ｊ．Ｓ．Ｆｅｓｓｅｎｄｅｎ，“Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏケイ素  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．１８  ｐ．２７５）。また、様々なサイズのケイ素−酸素かご型構造も文献から周知であり（Ｈａｎｓｓｅｎ，Ｒ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ６７５（２００４））、残留アルコキシ基または遊離シラノール基も様々な程度存在し得る。また、本発明にある程度重要な常磁性金属イオンに、Ｓｉ−Ｏ−基が配位することも考えられる。決して限定するものと解釈されるべきではないが、このような構造中に存在し得る幾つかの構成要素を式１に示す。
【０１３８】
式１：本発明に使用され得る幾つかのＳｉ−Ｏ−Ｓｉ構造の図；Ｒは任意の有機残基である
2014534277.tif 000006
2014534277.tif 000007
【０１３９】
本発明の中核にあるジェミナルビスホスホネート構造Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２は、カルシウムのような多価陽イオンに強力に結合することが周知である。本発明の材料の利点は、それらが生理学的濃度でカルシウムおよびマグネシウムよりもマンガンに対する選択性を示す（これはさらに下記の実施例１５で説明する）ということである。
【０１４０】
ホスホネート基は、全部そのエステルの形態で存在しても、全部もしくは部分的にその酸の形態に加水分解された後、周囲媒体のｐＨ値に応じて一部から全部までのある程度イオン化されていても、またはその混合物であってもよい。中性または塩基性ｐＨでマンガンイオンをポリマーに担持させることが最適である。ｐＨ１２〜６またはｐＨ１１〜８、または好ましくは１０．５〜９．５が有用である。これは、それが、少なくとも一部または場合によりもしくはさらには全部、金属イオンの結合に重要な役割を果たす加水分解されたホスホネートのアニオンの形態となっていることを示す。ホスホネートエステルまたは酸だけではなくホスホン酸アミドも材料の一部として考えることができる、または出発物質として使用できるものと考えることができる。
【０１４１】
本発明者らは、ビスホスホネート構造をポリマー骨格、好ましくは親水性ポリマー骨格に組み込み、マンガン（ＩＩ）に結合させると、緩和度の目覚ましい増加が達成されることを見出した。ビスホスホネートゾレドロン酸モノマーのマンガンキレートの緩和度は２．３／ｍＭ  Ｍｎ／ｓ（実施例１７に示す）であり、マンガンとビスホスホネートメチレンジホスホン酸モノマーを合わせたものの緩和度は１／ｍＭ  Ｍｎ／ｓである。本発明のマンガン担持ポリマー材料の緩和度は２４〜４８／ｍＭ  Ｍｎ／ｓの範囲である。
【０１４２】
特に、ポリエチレンイミンを、実施例９に記載のようにジェミナルビスホスホネートの活性化エステルで誘導体化した後、マンガン（ＩＩ）イオンを担持させると、緩和度２４／ｍＭ  Ｍｎ／ｓの材料が得られる。これは、前述のゾレドロン酸錯体の緩和度よりかなり高く、従って、ビスホスホネートをポリマー骨格に組み込むことが有利であることが分かる。このような材料中のリンと窒素とのモル比は０．１〜３の範囲とすることができ、それは好ましくは０．２〜０．８である。
【０１４３】
その緩和度がジェミナルビスホスホネートとポリマーとの組み合わせにより生じることをさらに示すために、対応する「裸」ポリマーの試験も行った。添加剤を含まないポリエチレンイミンのマンガンに対する結合は非常に弱く、ポリマーに結合している僅かなマンガンの緩和度は非常に低い（０．８／ｍＭ／ｓ）。また、（ＥｔＯ）２Ｐ＝Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓｉ（ＯＥｔ）３から生成したポリオルガノシランは、マンガン担持後の緩和度が３．０／ｍＭ  Ｍｎ／ｓとあまり高くない。全て考え合わせると、このことから、本発明の材料に固有の驚くべきほど高い緩和度は、ポリマーであること、ジェミナルビスホスホネートを有すること、およびマンガンなどの常磁性金属が組み込まれていることといった全ての特徴の組み合わせから生じることが分かる。
【０１４４】
実施例２２には、本発明の範囲外であるポリエチレンイミンのポリマー骨格に結合した１，３−ビスホスホネートの緩和度（１８．５／ｍＭ／ｓ）の方が、本発明のジェミナルビスホスホネートの緩和度（＞＝２４／ｍＭ／ｓ）よりどの程度低いかを記載している。また、それは使用したイオン交換試験での安定性も低い。従って、当然、１，２−ビスホスホネート、およびどの１，ｎ−ビスホスホネート（式中、ｎ＞２である）も本発明のジェミナルビスホスホネートより望ましくないと予想される。
【０１４５】
決して本発明を限定するものではないが、常磁性金属イオンは、おそらく、ホスホネート基にキレートしており、リンとマンガンとの比が１０〜１５であることが緩和度と安定性との最良の妥協案であるように思われるが７〜２０も考えられる。実施例１１の表１に、リンとマンガンとの比を変えたときの影響を詳細に記載している。
【０１４６】
好ましいケイ素とマンガンとの比は５〜２０の範囲となり、リンとケイ素との比は約１、例えば、０．７〜１．３とすべきである。
【０１４７】
任意選択により、親水性生体不活性材料を本発明のナノ構造の外側部分にグラフトしてもよい。前記外側部分とは、誘導体化試薬と化学反応し得るナノ構造の部分である。これは材料の生体適合性に有利な可能性があり、炭水化物または親水性合成ポリマーなどの多くの親水性材料を考えることができる。特に重要なのは、ポリエーテル化合物、とりわけポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体である。限定的ではないが、メトキシ末端ＰＥＧ誘導体が好ましい（ｍ−ＰＥＧ）。それらを、任意の化学的に許容される方法で、ポリマー骨格に、例えば、酸素原子、窒素原子または炭素原子に、例えば、残留ホスホン酸基またはシラノール基に、金属キレート化後、あるいは金属非含有ポリマーに直接、グラフトすることができる。直鎖状ＰＥＧの好適な鎖長は、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−単位４〜５０個である。最も望ましいのは、５〜２０個の単位を含み、平均約１０個または１１個の単位を含む混合物である。ナノ構造に最も好都合にカップリングする試薬はアミノ末端であり、残留ホスホネート基にカップリングすることができる。分岐鎖ＰＥＧ誘導体、とりわけ、類似の分子量の直鎖状ＰＥＧ誘導体と比較してコンパクトで、表面の保護に優れている、実施例８のもののような構造も重要である。
【０１４８】
各ナノ構造成分上の生体不活性ポリマー基の数は、１０〜１０００、または１０〜１００、または１０〜５０の範囲であってもよい。
【０１４９】
幾つかの実施形態では、本発明のマンガン担持ビスホスホネートポリマーナノ構造は、アミド結合によりホスホネート基の一部にカップリングした、モノマー残基５〜２０個の鎖長を有する直鎖状ｍ−ＰＥＧ基を含む。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、本発明のマンガン担持ビスホスホネートポリマーナノ構造は、アミド結合によりホスホネート基の一部にカップリングした構造Ｘ１（実施例８ｈ）の分岐鎖ＰＥＧ基を含む。
【０１５１】
バイオマーカーまたはそのレポーター成分などの様々な活性分子成分への本発明のナノ構造の結合手を導入することも考えられる。典型例としては、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ＰＮＡ、断片、蛍光体、キレート、または小分子薬理学的リガンドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５２】
本発明の第２の主要な態様は、前記ナノ構造の製造方法である。その最も広い意味で、それはまず、多数のビスホスホネート基を含むナノサイズの球状ポリマー成分を形成した後、第１の工程の生成物をマンガン（ＩＩ）イオンと接触させる工程を含む。任意選択により、２つの工程は、化学的に異なるが、同じ反応容器内で同時に行ってもよい。本方法の主要な特徴の概要を図１に示す。本方法の１つ以上の事例では、限外濾過によるサイズ選択または精製工程が組み込まれる。
【０１５３】
多数のビスホスホネートを含むナノサイズのポリマー小球体は、既存のポリマー小球体（重合工程００１により得られる）へのグラフト化（００２）によりまたはビスホスホネートを含むモノマー混合物の重合（００３）のいずれかにより得られる。どのようなポリマー骨格を所望するかに応じて、多くの異なる重合開始剤が考えられる。スチレンおよびアクリレートのような不飽和モノマーでは、過酸化ベンゾイルまたはアゾビスイソブチロニトリルなどの様々なラジカル開始剤が好ましい。本発明の好ましい実施形態の１つのトリアルコキシシランベースのモノマーでは、自発的な加水分解および縮合を使用して重合を行うこと、または酸もしくは塩基触媒を使用することが可能である。場合により、炭酸水素塩、特に炭酸水素ナトリウム、または、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、もしくはギ酸テトラメチルアンモニウムのようなカルボン酸塩のようなｐＨ安定化塩を反応混合物に添加して、３〜１０ｎｍのサイズ範囲の生成物の収量を最適化することが有利であることが判明した。
【０１５４】
工程００３には溶媒が望ましいことが多く、当業者により多くの異なるものが考えられるが、毒性溶媒を回避することが望ましく、従って、水、およびプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、または１，３−プロパンジオールなどの低級アルコールが好ましい。溶媒の混合物を使用することにより、生成物の収量および品質を最適化することが望ましいことが多い。
【０１５５】
本方法の幾つかの実施形態では、工程００３で、低級アルコール中に水を５〜２５％含む混合物を使用する。
【０１５６】
本方法の幾つかの実施形態では、工程００３で、エタノール、１−もしくは２−プロパノール、エチレングリコールまたは１，２−もしくは１，３−プロパンジオール中に水を５〜２５％含む混合物を使用する。
【０１５７】
工程００３には、４０〜１３０℃または８０〜１２０℃または１００〜１２０℃の温度などの、室温より高い温度を使用することが有利であることが判明した。低級アルコールを使用する場合、所望の反応温度に達するように、耐圧密閉容器を用いて作業することが必要である。
【０１５８】
工程００３の所要時間はポリマー骨格および開始方法に依存し、数秒から数日または数週間の範囲となり得る。本発明の好ましい実施形態の幾つかのトリアルコキシシランでは、工程００３に６〜２００時間、または６〜４８時間、または１２〜３６時間または約２４時間の時間を使用することが有利であることが判明した。
【０１５９】
本発明の幾つかの実施形態では、工程００３の条件は、温度１０５〜１１５℃および所要時間２０〜３０時間である。
【０１６０】
本発明の幾つかの実施形態では、工程００３の条件は、温度１０５〜１１５℃および所要時間３０〜６０時間である。
【０１６１】
本発明の幾つかの実施形態では、工程００３の条件は、まず９０〜１００℃の温度で４０〜５０時間、次いで、１０５〜１１５℃でさらに２０〜３０時間である。
【０１６２】
工程００３でのモノマーの濃度は、どのようなポリマー骨格を所望するかに依存し、モル濃度から溶媒非含有状態の範囲となり得る。しかし、本発明の好ましい実施形態の１つのトリアルコキシシランでは、１０〜５００ｍＭまたは２０〜１００ｍＭ、特に４０〜８０ｍＭのモノマー濃度にすることが有利であることが判明した。
【０１６３】
本発明の幾つかの実施形態では、工程００３の条件は、まず９０〜１００℃の温度で２０〜５０時間、続いて１０５〜１２５℃で２０〜３０時間、およびモノマー濃度４０〜６０ｍＭである。
【０１６４】
ビスホスホネート試薬をポリマー骨格にグラフトすることを含む工程００２では、条件は幾分異なる。とりわけ、温度および濃度要求は比較的緩い。本発明者らは、水に、任意選択により補助溶媒を、液体の水と相溶する温度、例えば、室温で混和したものにポリエチレンイミンを溶解した溶液から開始して、それを、１〜４８時間、例えば、２０〜２４時間、室温などの温度でＮ−（ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドなどのカップリング剤の存在下でＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩などの反応性エステル中間体を形成できる化合物の存在下で、３，３−ビス（ジメトキシホスホリル）プロピオン酸などの前記ポリエチレンイミンと反応することができるビスホスホネートと接触させると、ポリマー骨格にビスホスホネートがグラフトされた材料が生成することを見出した。
【０１６５】
サイズ選択工程（００４）は、望ましくないほど大きいまたは小さい成分を除去するために、ナノ構造前駆体（Ｘ）の溶液で行われる。反応混合物からの出発物質および溶媒残留物もこの段階で除去される。限界濾過は好ましい精製方法であり、とりわけ、通常標識されている形態で使用する場合、層流濾過またはダイアフィルトレーションが好ましい精製方法である。溶液を、幾分大きい孔を有するフィルタを通過させること、工程００４ａにより、望ましくないほど大きいナノ構造および／または凝集体を除去することが好ましい。このようなフィルタの好ましい公称カットオフ値は、３００ｋＤａ、または１００ｋＤａ、または５０ｋＤａである。工程００４ｂでは、比較的小さい孔径を有するフィルタで所望の材料を回収する。工程００４ｂに好ましい孔径の公称カットオフ値は、５０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または１０ｋＤａである。
【０１６６】
出発物質の粒径分布が狭い場合、サイズ選択工程（００４）を必要としないことがある。
【０１６７】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００２または００３から得られた溶液を、まず１００ｋＤａフィルタを通過させた（工程００４ａ）後、３０ｋＤａフィルタで回収する（工程００４ｂ）。
【０１６８】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００２または００３から得られた溶液を、まず３００ｋＤａフィルタを通過させた（工程００４ａ）後、１００ｋＤａフィルタで回収する（工程００４ｂ）。
【０１６９】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００２または００３から得られた溶液を、まず５０ｋＤａフィルタを通過させた（工程００４ａ）後、３０ｋＤａフィルタで回収する（工程００４ｂ）。
【０１７０】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００２または００３から得られた溶液を、まず１００ｋＤａフィルタを通過させた（工程００４ａ）後、１０ｋＤａフィルタで回収する（工程００４ｂ）。工程００４ｂの後、材料を水で数回洗浄し、工程００１、００２または００３からのモノマーまたは溶媒残留物をさらに除去することが有利である。
【０１７１】
遠心フィルタまたは透析などの他の限界濾過法を使用することもできるが、それらは拡張性が低い。
【０１７２】
所望のサイズ範囲の粒子は、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過とも称される）により選択されてもよい。
【０１７３】
前記ポリマーにマンガン（ＩＩ）を担持させる工程００５は、前記ポリマーの溶液をマンガン（ＩＩ）イオンに曝すことを含む。前記イオンを固体の形態でまたは溶液として反応混合物に添加することができる。フッ化物、塩化物、臭化物、酢酸塩、硝酸塩、または硫酸塩のような可溶性のマンガン（ＩＩ）塩が好ましい。ＭｎＯのような、比較的溶解性の低いマンガン源の使用も考えられる。有用なマンガンイオン濃度は、ポリマー濃度に応じて、０．１ｍＭ〜５Ｍ、例えば、０．１〜６００ｍＭまたは０．１〜１０ｍＭである。前述のように、リンとマンガンとの比は重要である。マンガンイオンをポリマーに中性または塩基性ｐＨで担持させることが最適である。ｐＨ１２〜６またはｐＨ１１〜８または好ましくは１０．５〜９．５が有用である。マンガンの添加は、ｐＨが所望の値に安定した後に行わなければならない。本発明者らは、１０分〜２４時間、例えば、半時間〜２時間の時間で十分であることを見出した。ナノ構造にマンガンを担持させた後、ｐＨを中性（８〜６または７．７〜７）に調節する。担持させる温度は、問題の溶媒または溶媒混合物の凝固点から沸点までの間であってもよく、室温から６０度までの間が好ましい。
【０１７４】
任意選択の工程００６では、所望のサイズ範囲の粒子を望ましくないほど大きいまたは小さい種から分離する。マンガンを添加してもナノ構造のサイズは僅かしか変化しないため、これは必要ではないことが多い。工程００６は、幾つかの部分工程００６ａ、００６ｂなどを有してもよく、または順不同の部分工程の場合、００６ｘを有してもよい。
【０１７５】
限界濾過は、サイズ選択工程００６ｘの好ましい方法であり、とりわけ、通常標識されている形態で使用する場合、層流濾過またはダイアフィルトレーションが好ましい方法である。溶液を、幾分大きい孔を有するフィルタを通過させること、工程００６ａにより、望ましくないほど大きいナノ構造および／または凝集体を除去することが好ましい。このようなフィルタの好ましい公称カットオフ値は、３００ｋＤａ、または１００ｋＤａ、または５０ｋＤａである。工程００６ｂでは、比較的小さい孔径を有するフィルタで所望の材料を回収する。工程００６ｂに好ましい孔径の公称カットオフ値は、５０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または１０ｋＤａである。
【０１７６】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００５から得られた溶液を、まず１００ｋＤａフィルタを通過させた（工程００６ａ）後、３０ｋＤａフィルタで回収する（工程００６ｂ）。
【０１７７】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００５から得られた溶液を、まず３００ｋＤａフィルタを通過させた（工程００６ａ）後、１００ｋＤａフィルタで回収する（工程００６ｂ）。
【０１７８】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００５から得られた溶液を、まず５０ｋＤａフィルタを通過させた（工程００６ａ）後、３０ｋＤａフィルタで回収する（工程００６ｂ）。
【０１７９】
工程００６ｂの後、材料を水で数回洗浄して、工程００５からの残留金属イオン、モノマーまたは溶媒残留物をさらに除去することが有利である。
【０１８０】
工程００６ｘに遠心フィルタまたは透析などの他の限界濾過法を使用することもできる。
【０１８１】
所望のサイズ範囲の粒子は、工程００６ｘでサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過とも称される）により選択されてもよい。
【０１８２】
任意選択により、前記マンガンリッチのホスホネートポリマー生成物を工程００７で精製してもよい。工程００７は、幾つかの部分工程００７ａ、００７ｂなどを有してもよく、または順不同の部分工程の場合、００７ｘを有してもよい。
【０１８３】
精製工程００７ｘの好ましい方法の１つは、スルホン化ポリスチレンなどの陽イオン交換体を少量用いて処理し、過剰のマンガンまたは結合の弱いマンガンを除去する方法である。市販のイオン交換樹脂の容量は１〜２ｍｍｏｌ／ｇ樹脂であることが多く、典型的には、マンガン１モルを含有する工程ｂ）からの粗製物は、ナトリウム型またはカリウム型のイオン交換樹脂１〜１００ｇで処理されるであろう。
【０１８４】
本発明の幾つかの実施形態では、工程００７ｘは、３０ｋＤａフィルタで材料を回収する、さらに別のダイアフィルトレーションを含む。
【０１８５】
本発明の幾つかの実施形態では、工程段階００７ｘは、工程００６からの生成物をナトリウム型のポリスチレンスルホン酸タイプのイオン交換樹脂で処理することを含む。
【０１８６】
極微量の内毒素（死細菌の残渣）などの親油性不純物を除去するための、その後の精製工程００７ｘを追加してもよい。
【０１８７】
本方法の幾つかの実施形態では、工程００６の生成物を活性炭で処理する。
【０１８８】
本方法の幾つかの実施形態では、工程００６の生成物を、ポリエチレンフィルタ、またはポリプロピレンフィルタ、またはＰＶＤＦフィルタを通過させる。
【０１８９】
本方法の幾つかの実施形態では、工程００６の生成物を固定化ポリミキシンＢで処理する。
【０１９０】
任意選択により、図１に示すように、生体不活性表面改質剤をナノ構造の達成可能な部分にグラフトする工程００９を挿入してもよい。
【０１９１】
任意選択により、図１に示すように、本方法の多くの箇所で架橋剤を組み込むことにより架橋（工程０１０）を実施してもよい。工程００１で架橋剤を混入することによる架橋は、標準的な方法である。工程００２で生成する材料が既に架橋されているように、モノマーは、本発明の好ましい実施形態の１つのトリアルコキシシランのように本質的に架橋され易いものであってもよい。
【０１９２】
本発明の第３の主要な態様では、材料を、診断法用の、特に核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の造影剤として使用する。本発明の材料は、低毒性で緩和度が高いという特性を有し、そのため、生体、特に人体のＭＲＩ検査の造影剤として有用である。
【０１９３】
緩和度が高く、流体力学的径が３ｎｍより大きいまたは４ｎｍより大きいまたは５ｎｍより大きい本発明の実施形態に好適なサイズであるという特性を併せ持つため、本発明のナノ構造を含む組成物はＭＲＩによる腫瘍、特に固形腫瘍の画像化に好適である。前記本発明の組成物を一般的な解剖学的画像化、例えば、血管造影法用の造影剤として使用することも考えられ；特に心臓の微細な冠動脈の血管造影法、または頚動脈もしくは腎動脈もしくは大動脈の血管造影法が、本発明の高い緩和度とコントラストにより可能になる。頭部、内臓または四肢の構造の画像化も重要である。内臓のうち、肝臓、膵臓および腸は特に重要である。結腸の画像化は、静脈内投与または浣腸剤としての投与のいずれかにより達成することができる。胃、肝臓および上部消化管の画像化では、造影剤を経口投与することが考えられる。
【０１９４】
本発明の材料は低毒性で緩和度が高いため、それらは細胞標識剤として有用である。患者の体内の診断または治療に使用される幹細胞またはマクロファージのような細胞に本発明のナノ構造をｅｘ  ｖｉｖｏで担持させた後、前記患者に投与し、体内でのそれらの分布をＭＲＩで可視化することができる。
【０１９５】
本発明の幾つかの実施形態では、ナノ構造の溶液は組織に皮内注射または皮下注射されることが多いがこれらに限定されるものではなく、この後、それを使用してＭＲＩで患者のリンパ構造を可視化する。特に重要なのは、転移性腫瘍の好発部位であるリンパ節の画像化である。この目的に特に有用なのは、サイズ約１０ｎｍ、例えば、７〜５０ｎｍまたは７〜２５ｎｍまたは７〜１５ｎｍのナノ構造である。
【０１９６】
本発明の幾つかの実施形態では、８〜１５ｎｍの範囲の平均流体力学的径を有する本発明のナノ構造の製剤を患者に皮内投与し、ＭＲＩ法で前記患者のリンパ節を可視化する。
【０１９７】
本発明のナノ構造は緩和度が高く、低毒性であるという特性を有するため、本材料を細胞標識に使用することが考えられる。その場合、例えば、幹細胞またはマクロファージなどの細胞にナノ構造を哺乳動物の体外で、例えば、人体外で担持させた後、前記哺乳動物に投与し、ＭＲＩ走査により画像を生成する。その場合、細胞が生体内を輸送される時、細胞を追跡することが可能である。
【０１９８】
本発明のナノ粒子をｉｎ  ｖｉｖｏで使用するには、それらを当業者に周知の最良の実施技法に従って薬理学的に許容される方法で製剤化する必要がある。好ましい投与方法は、非経口投与であり、特に静脈内経路が有利であるが、特定の状況下では動脈内経路が有利な場合もある。非経口投与は、液体製剤を必要とすることが多い。水は本発明のナノ構造を溶液にするのに好ましい溶媒であるが、溶液の安定性を改善するために１種以上の補助溶媒または添加剤を０．１〜１０％添加してもよい。許容される補助溶媒としては、エタノールまたはグリセロールのようなアルコール、エチレングリコールもしくはポリビニルアルコールのような生体適合性ポリマー、ジメチルスルホキシド、またはＮ−メチルピロリジノンがある。マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコースまたは他の糖類または糖アルコールのような浸透圧調節剤を１種以上添加することも有利な可能性がある。製剤が体液と等浸透圧であることが望ましい。好ましくは、静脈内用の溶液の浸透圧モル濃度は、２７０〜２０００ｍＯｓｍ、または２８０〜１０００ｍＯｓｍ、または２８０〜５００ｍＯｓｍ、または特に２８０〜３００ｍＯｓｍである。前記添加剤の多くは凍結保護物質の機能も果たし、凍結乾燥後の再構成の効率を向上させることができる。電解質を添加して、注入溶液の生理学的作用を低下させることも有利な場合がある。好ましい電解質は、無毒のナトリウム塩、カルシウム塩またはおよび／またはマグネシウム塩の組み合わせであろう。注射用溶液のｐＨを調節することが好ましく、注射に好適な任意の緩衝液が考えられるが、トリスＨＣｌが好ましい。金属イオン捕捉剤も添加剤として考えられる。幾つかの典型例としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）またはホジピル（ｆｏｄｉｐｉｒ）がある。貯蔵瓶に添加される固相イオン捕捉樹脂の使用も考えられる。
【０１９９】
ナノ構造の濃度は多くの異なる方法で記載することができるが、２つの最も適切なものは、ｇ／ｌ溶液として記載される質量濃度およびｍｍｏｌ／ｌ溶液の単位で記載されるマンガン濃度である。造影剤として投与するのに好適な製剤中のマンガンの濃度範囲は、１〜５００ｍＭ、または１０〜３００ｍＭ、または１０〜２００ｍＭ、または５０〜２００ｍＭ、または１００〜２００ｍＭの範囲である。質量濃度として記載し、リンとマンガンとの比が約６であると仮定すると、造影剤製剤に好適な質量濃度は、０．５〜３００ｇ／ｌ、または５〜２００ｇ／ｌ、または５〜２５０ｇ／ｌ、または５〜１００ｇ／ｌ、または１００〜２５０ｇ／ｌの範囲である。質量濃度は、ｍＭマンガンの単位で記載される濃度と略一致するが、対応関係はポリマー骨格、架橋度および生体不活性被覆層の有無に応じて変わることになる。
【０２００】
本発明の一実施形態は、マンガン濃度１００〜３００ｍＭ、およびリンとマンガンとの比７〜２０の静脈内投与用の薬学的に許容される製剤である。
【０２０１】
本発明の幾つかの実施形態は、マンガン濃度１０〜３００ｍＭおよびリンとマンガンとの比７〜２０の静脈内投与用の薬学的に許容される製剤に関する。
【０２０２】
本発明の代替の実施形態は、少なくとも５つのジェミナルビスホスホネート基を含むポリマー骨格を含むナノ構造であって、ジェミナルビスホスホネート基が互いに独立して
−Ｒ３Ｒ４Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２
（これは−Ｒ４Ｒ３Ｃ（Ｐ＝Ｏ（ＯＲ１）（ＯＲ２））２と同一である）
｛式中、Ｒ１およびＲ２は、負電荷、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つはポリマー骨格に結合した基であるが、但し、Ｒ３およびＲ４の一方だけがこのような結合した基である場合、Ｒ３およびＲ４の他方はポリマー骨格に結合可能な基もしくはこのような基の残基であるか、またはＨ、ＯＨ、ＯＲ５およびＲ５（式中、Ｒ５は低級アルキルである）からなる群から選択される｝
として組み込まれているナノ構造、即ち、マンガンイオンを含有しないこと以外、前述の通りであるナノ構造である。このようなナノ構造は、前述の実施形態によるナノ構造の製造の中間体として有用である。このような構造は、マンガン以外の陽イオンにも結合することができ、その容量が有用となり得る。
【０２０３】
下記の実施例で、添付の図面を参照する：
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、本発明のナノ粒子を得る方法の概略図である。
【図２】図２は、腫瘍を有するマウスに注入して５時間後のコントラスト増強を示す図である。
【図３】図３ａ、図３ｂおよび図３ｃは、実施例２３に記載の電気伝導度滴定実験に関する曲線を示す図である。
【図４】図４ａおよび図４ｂは、免疫前カラム（図４ａ）および免疫カラム（図４ｂ）からの画分１〜１０中のＳＩ０５５の回収を示す図である。
【実施例】
【０２０５】
実施例１：１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの合成の合成
１ａ：１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000008
メカニカルスターラーを備えた２Ｌ反応器を１３０℃、減圧下で乾燥した後、正の窒素圧力下で冷却した。不活性ガス下で管移送により反応器に無水ＴＨＦ（１ｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ無水、９９．９％、ＢＨＴ２５０ｐｐｍ含有）を仕込んだ。テトラメチルメチレンジ（ホスホネート）（９７．４ｇ、４２０ｍｍｏｌ）および臭化アリル（１８３ｍｌ、２５５ｇ、２．１１ｍｏｌ）を添加した（発熱せず、酸性気体検出せず）。ジャケット温度を０℃に設定し、内部温度６℃で、カリウムｔ−ブトキシド（合計１４０．３ｇ、１．２５ｍｏｌ）を（６回に分割して）添加した。各添加後、温度は約１２℃に上昇し、次に添加する前に６℃に戻した（即ち、低下させた）。臭化アリル（９．４ｍｌ、０．１１ｍｏｌ）およびｔ−ブトキシド（７．３ｇ、６５ｍｍｏｌ）の最後の添加を行い、モノアリル化生成物の最後の数パーセントを変換した（発熱は検出せず）。ジャケット内の温度を１５℃に約２時間設定した後、濃厚な白色反応混合物をジャケット温度０℃で終夜撹拌した。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ（水溶液）５０ｍｌで反応停止した（温度は２〜５℃に上昇）後、トルエン（１ｌ）を添加し、１ｌを留去してＴＨＦおよび過剰の臭化アリルを除去した。ジャケット温度７０〜１００度で２時間にわたり６３〜７３℃を回収した。残留物にシリカゲル（１００ｇ）および活性炭（１５ｇ）を添加した。反応混合物を数分間撹拌し、液体をフリット・フィルタ・スティック（ｆｒｉｔ−ｆｉｌｔｅｒ  ｓｔｉｃｋ）でサイフォン式に取り出した（または通常のＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルタで濾過した）。残渣ケーキをトルエン（３×１００ｍｌ）で洗浄した。合わせた濾液をＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルタで濾過して、最後の極微量の活性炭（緑味を帯びた色で示される）を除去し、ロータリーエバポレータ（浴温４０℃）で濃縮し、標題化合物を淡黄色液体として得た。清浄にした反応器に粗生成物を再導入し、トルエン（５０ｍｌ）とヘプタン（３８０ｍｌ）との混合物に溶解した。種結晶を加えることにより内部温度１２〜９℃で結晶化を誘導することができる。ジャケット温度を−２５℃に２時間にわたり低下させ、その温度でさらに２時間保ち、結晶化を完了した。母液をフリット・フィルタ・スティックで除去し、結晶スラリーを、予備冷却したヘプタン（４０ｍｌ）で２回洗浄した。結晶をＥｔＯＡｃに溶解し、底部弁を通して溶液を流出させた。溶媒を減圧留去し、生成物を室温より僅かに高いｍｐを有する固体として７０．０ｇ、２２４ｍｍｏｌ、５３％得た。
【０２０６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；６．３５（ｍ，２Ｈ），５．２０（ｍ，４Ｈ），３．６８（ｄ，１２Ｈ），３．００（ａｂｘ，４Ｈ）．
【０２０７】
生成物を短行程薄膜蒸留装置で蒸留することも可能であった。
【０２０８】
１ｂ：１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000009
温度制御ジャケット、内部温度計およびメカニカルスターラーを備えた２ｌ反応器に、トルエン（３３０ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ無水、ｓｕｒｅ  ｓｅａｌキャップ付）、テトラメチル−１，１−ビスアリル−メチレンビス（ホスホネート）（７０ｇ、２２４ｍｍｏｌ）およびトリエトキシシラン（１２３ｍｌ、６５５ｍｍｏｌ）を仕込んだ。トルエンおよびシランの損失を回避するため、減圧サイクルが短くなるように注意して減圧−窒素サイクルを３回行うことにより反応混合物を脱酸素化した。酸素の除去は重要である。ジャケット温度を３０℃に設定した。Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒（４．５ｍｌ、２％トルエン溶液、０．０５３ｍｍｏｌ）をシリンジで０．５ｍｌずつ３０分間隔で（合計４．５時間）加えた。触媒の添加を完了した後、温度制御ジャケットを３０℃に設定し、混合物を終夜撹拌した。翌朝、ジャケット温度を４０度に設定し、蒸留ヘッドを付け加え、トルエンおよび過剰のシランを６２〜１３ｍｂａｒの圧力で留去した。所要時間２時間。エタノール（８００ｍｌ）および活性炭（１５ｇ）を添加し、スラリーを１０分間撹拌し、底部弁を通して混合物を取り出し、Ｗｈａｔｍａｎガラス繊維フィルタで濾過した。一定の重量になるまで溶媒をロータリーエバポレータで減圧留去し（浴温４５℃）、生成物を淡褐色油状物として１３８ｇ（２１５ｍｍｏｌ、９６％）得た。
【０２０９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；３．９５（ｑ，１２Ｈ），３．７７（ｄ，１２Ｈ），２．３７（ｍ，４Ｈ），２．１２（ｍ，４Ｈ），１．３２（ｔ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，４Ｈ）．
【０２１０】
生成物を１７０℃および０．３ｍｂａｒの短行程薄膜蒸留装置で蒸留することも可能であった。
【０２１１】
実施例２：１，１−ビス（２−トリメトキシシリルエチル）−−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの合成
２ａ：１，１−ビス（２−ｔ−ブトキシエチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000010
氷冷した１，１−ビス（ジメチル）ホスホナト）メタン（５０ｇ、２１５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（５００ｍｌ）に窒素下で、水素化ナトリウム（１８．９ｇ、６０％鉱油分散物、４７４ｍｍｏｌ）を３回に分けて３０分にわたり添加する。混合物を３時間撹拌した後、１−ブロモ−２−ｔ−ブトキシエタン（９０．５ｇ、５００ｍｍｏｌ）を５ｍｌずつ添加する。３時間後、氷浴を取り除き、室温で終夜撹拌し続ける。反応混合物を氷浴で再度冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍｌを添加することにより反応停止する。揮発性物質を減圧留去し、有機物をジクロロメタン（３００ｍｌ）に溶解する。シリカ（１００ｇ）を混入撹拌し、スラリーを濾過し、濾過ケーキを３×２００ｍｌジクロロメタンで洗浄する。溶媒の除去後、生成物を得る。
【０２１２】
２ｂ：１，１−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000011
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、５０ｍｌ）およびジクロロメタン（ＤＣＭ、５０ｍｌ）を、１，１−ビス（２−ｔ−ブトキシエチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（実施例２ａ）２ｇに添加する。混合物を室温で１時間撹拌し、揮発性物質を減圧留去して、生成物を得る。
【０２１３】
２ｃ：１，１−ビス（２−メシルオキシエチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）−メタンの合成
2014534277.tif 000012
実施例２ｂの生成物（１，１−ビス（２−ヒドロキシエチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン）（１０ｍｍｏｌ）を、氷冷したジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解する。ピリジン（４０ｍｍｏｌ、３．２４ｍｌ）およびメタンスルホニルクロライド（３．４４ｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加し、後者は内部温度＜５℃に保ちながら添加する。３時間後、エーテル（３０ｍｌ）および水（７ｍｌ）を添加する。相分離後、有機層を２Ｍ  ＨＣｌ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液および水で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥した後、揮発性物質を蒸発させて生成物を得る。
【０２１４】
２ｄ：１，１−ジビニル−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000013
氷冷した１，１−ビス（２−メシルオキシエチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（５０ｇ、１０４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５００ｍｌ）溶液に窒素下でジエチルイソプロピルハイルアミン（３００ｍｍｏｌ）を添加する。３０分後、氷浴を取り除き、室温で終夜撹拌し続ける。揮発性物質を減圧留去し、有機物をエーテル（３００ｍｌ）で溶解する。シリカ（１００ｇ）および活性炭（１５）を混入撹拌し、スラリーを濾過し、濾過ケーキを３×２００ｍｌエーテルで洗浄する。溶媒の除去後、生成物を得る。
【０２１５】
２ｅ：１，１−ビス（２−トリメトキシシリルエチル）−−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）−メタン
2014534277.tif 000014
１，１−ジビニル−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（実施例２ｄ）（２．０ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２０ｍｌ）溶液に、Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒のトルエン溶液（２％Ｐｔ）８０μｌおよびトリエトキシシラン（６．０ｍｍｏｌ、４．１ｍｌ）を添加する。溶液を室温２日間放置する。揮発性物質を減圧留去し、トルエン添加−減圧サイクルをさらに２回行うことにより残留シランを除去する。残留物をトルエンに溶解し、少量の活性炭で処理し、５μｍＰＴＦＥフィルタを通過させ、ジクロロメタン＋０〜１０％メタノールを溶離液として用いたシリカカラムフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物を得る。
【０２１６】
実施例３：１，１−ビス（トリメトキシシリルメチル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの合成
2014534277.tif 000015
氷冷した１，１−ビス（ジメチル）ホスホナト）メタン（５０ｇ、２１５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５００ｍｌ）溶液に窒素下で水素化ナトリウム（１８．９ｇ、６０％鉱油分散物、４７４ｍｍｏｌ）を３回に分けて３０分にわたり添加する。混合物を３時間撹拌した後、内部温度を５℃未満に維持しながら、クロロメチルトリエトキシシラン（５００ｍｍｏｌ）を複数回に分けて添加する。３時間後に氷浴を取り除き、室温で終夜撹拌し続ける。反応混合物を氷浴で再度冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍｌを添加することにより反応停止させる。揮発性物質を減圧留去し、有機物をジクロロメタン（３００ｍｌ）に溶解する。シリカ（１００ｇ）を混入撹拌し、スラリーを濾過し、濾過ケーキを３×２００ｍｌジクロロメタンで洗浄する。溶媒の除去後、生成物を得る。
【０２１７】
実施例４：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジエチルホスホナト）メタンの合成
４ａ：１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジエチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000016
氷冷した１，１−ビス（ジエチル）ホスホナト）メタン（４．９７ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液に窒素下で臭化アリル（８．７ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）を添加した。２時間にわたりカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６．８ｇ、６０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で終夜撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍｌを添加することにより反応停止させた。揮発性物質を減圧留去し、有機物をジクロロメタンで溶解した。ジクロロメタン＋メタノール（０〜１０％勾配）でのシリカフラッシュクロマトグラフィーにより実質的に純粋な生成物（ＮＭＲ）を得た。
【０２１８】
４ｂ：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジエチルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000017
１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジエチルホスホナト）メタン（実施例２ａ）（４．４ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２５ｍｌ）溶液に、Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒のトルエン溶液（２％Ｐｔ）２１２μｌおよびトリエトキシシラン（４２．７ｍｍｏｌ、７．８ｍｌ）を添加した。溶液を室温で終夜放置した。揮発性物質を減圧留去し、トルエン添加−減圧サイクルをさらに２回行うことにより残留シランを除去した。残留物をトルエンに溶解し、少量の活性炭で処理し、５μｍＰＴＦＥフィルタを通過させ、ジクロロメタン＋０〜１０％メタノールを溶離液として用いたシリカカラムフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：ＮＭＲ純度９０％の材料６．９ｇ。
【０２１９】
実施例５：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジイソプロピルホスホナト）メタンの合成
５ａ：１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジイソプロピルホスホナト）メタン
2014534277.tif 000018
氷冷した１，１−ビス（ジイソプロピル）ホスホナト）メタン（６．４４ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液に窒素下で臭化アリル（８．７ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）を添加した。２時間にわたり、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６．８ｇ、６０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で終夜撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍｌを添加することにより反応停止させた。揮発性物質を減圧留去し、有機物をジクロロメタンで溶解した。ジクロロメタン＋メタノール（０〜１０％勾配）でのシリカフラッシュクロマトグラフィーにより、実質的に純粋な生成物（ＮＭＲ）６．５ｇを得た。
【０２２０】
５ｂ：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジイソプロピルホスホナト）−メタン
2014534277.tif 000019
１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジイソプロピルホスホナト）メタン（実施例２ａ）（０．７３６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２０ｍｌ）溶液に、Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒のトルエン溶液（２％Ｐｔ）８０μｌおよびトリエトキシシラン（６．０ｍｍｏｌ、４．１ｍｌ）を添加した。溶液を室温で終夜放置した。揮発性物質を減圧留去し、トルエン添加−減圧サイクルをさらに２回行うことにより残留シランを除去した。残留物をトルエンに溶解し、少量の活性炭で処理し、５μｍＰＴＦＥフィルタを通過させ、ジクロロメタン＋０〜１０％メタノールを溶離液として用いたシリカカラムフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：ＮＭＲ純度９０％の材料１．０ｇ。
【０２２１】
実施例６：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジ（３−メトキシフェニルイル）ホスホナト）メタンの合成
６ａ：１，１−ビス（ジ（３−メトキシフェニルイル）ホスホナト）メタン
2014534277.tif 000020
氷冷したビス（ジクロロホスホナト）メタンの無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液に、３−メトキシフェノール（１．７６ｍｌ、１６ｍｍｏｌ）を添加した。トリエチルアミン（４．９１ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）の溶液を１時間にわたり添加した。次いで、反応混合物を室温で４時間撹拌した後すぐ、それを氷水（１５０ｍｌ）上に注いだ。ジクロロメタンを添加し、相分離させた（緩徐！）。水相をもう一度ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。蒸発後、粗生成物をシリカフラッシュクロマトグラフィー（カラム高さ１０ｃｍ、直径３ｃｍ）で精製した。生成物を淡褐色油状物として得、ＮＭＲ分光法により高純度であることが分かった。収量０．９３ｇ。
【０２２２】
６ｂ：１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジ（３−メトキシフェニルイル）ホスホナト）メタン
2014534277.tif 000021
水素化ナトリウム（０．６８３ｇ、６０％鉱油分散物、１７．１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１５０ｍｌ）に懸濁し、−３０℃に冷却した。温度を−３０℃に維持しながら、１，１−ビス（ジ（３−メトキシフェニルイル）ホスホナト）メタン（実施例４ａ、２．９２ｇ、４．８７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液を３０分にわたり添加した。臭化アリル（４８．８ｍｍｏｌ、４．２１ｍｌ）を添加し、反応混合物を−１５℃で１時間保持した後、４０℃に５日間加熱した。内容物を飽和塩化アンモニウム水溶液７５ｍｌに添加した。揮発性物質を減圧蒸発させ、固体をジクロロメタンでトリチュレートし、有機物を抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させた後、ヘプタン：酢酸エチル  ６：４を溶離液として用いたシリカフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量１．２８ｇ。
【０２２３】
６ｃ：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジ（３−メトキシフェニルイル）−ホスホナト）メタン。
2014534277.tif 000022
１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジ（３−メトキシフェニルイル）ホスホナト）メタン（実施例４ｂ）（０．７９４ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２０ｍｌ）溶液に、Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒のトルエン溶液（２％Ｐｔ）５０μｌおよびトリエトキシシラン（１．１６ｍｍｏｌ、０．４５９ｍｌ）を添加した。溶液を室温で４日間放置し、毎日、さらにトリエトキシシラン０．７ｇおよび触媒２５μｌを添加した。揮発性物質を減圧留去し、トルエン添加−減圧サイクルをさらに２回行うことにより残留シランを除去した。残留物をトルエンに溶解し、少量の活性炭で処理し、５μｍＰＴＦＥフィルタを通過させ、酢酸エチル：トルエン  １：１を溶離液として用いたシリカカラムフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量１５０ｍｇ。
【０２２４】
実施例７：１，１−ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジ−シクロプロピルメチル）ホスホナト）メタンの合成
７ａ：１，１−ビス（ジ−シクロプロピルメチル）ホスホナト）メタン
2014534277.tif 000023
氷冷したビス（ジクロロホスホナト）メタン（１．００ｇ）の無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液にシクロプロピルメタノール（１．１５ｇ、１６ｍｍｏｌ）を添加した。トリエチルアミン（４．９１ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）の溶液を１時間にわたり添加した。次いで、反応混合物を室温で４時間撹拌した後すぐ、それを氷水（１５０ｍｌ）上に注いだ。ジクロロメタンを添加し、相分離させた（緩徐！）。水相をもう一度ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた。蒸発後、粗生成物をシリカフラッシュクロマトグラフィー（カラム高さ１０ｃｍ、直径３ｃｍ）で精製した。生成物を無色油状物として得、ＮＭＲ分光法により高純度であることが分かった。収量１．０４ｇ、６６％。
【０２２５】
７ｂ：１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジ（シクロプロピルメチル）ホスホナト）メタン
2014534277.tif 000024
氷冷した１，１−ビス（ジ−シクロプロピルメチル）ホスホナト）メタン（実施例５ａ）（０．７９４ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液に窒素下で、臭化アリル（０．８６４ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。２時間にわたり、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．６６ｇ）を添加した。溶液を室温で４時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液３ｍｌを添加することにより反応停止させた。揮発性物質を減圧留去し、有機物をジクロロメタンで溶解した。ヘプタン：酢酸エチル  ３：７でのシリカフラッシュクロマトグラフィーにより純粋な生成物０．４を得た。６４％。
【０２２６】
７ｃ：１，１−ビス（３−トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジ−シクロプロピルメチル）−ホスホナト）メタン
2014534277.tif 000025
１，１−ジアリル−１，１−ビス（ジ（シクロプロピルメチル）ホスホナト）メタン（実施例５ｂ）（０．３７３ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２０ｍｌ）溶液に、Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒のトルエン溶液（２％Ｐｔ）３０μｌおよびトリエトキシシラン（１．５９ｍｍｏｌ、０．２９９ｍｌ）を添加した。溶液を室温で４日間放置し、毎日、さらにシラン０．１５ｍｌおよび触媒１５μｌを添加した。揮発性物質を減圧留去し、トルエン添加−減圧サイクルをさらに２回行うことにより残留シランを除去した。残留物をトルエンに溶解し、少量の活性炭で処理し、５ＰＴＦＥフィルタを通過させ、ジクロロメタン＋５％メタノールを溶離液として用いたシリカカラムフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量３７６ｍｇ。
【０２２７】
実施例８：Ｎ−（２−アミノエチル）−１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸アミドに結合したナノ構造Ｙ１の合成
実施例８ａ：３−（３−ブロモ−２，２−ビス（ブロモメチル）プロポキシ）プロパ−１−エン
2014534277.tif 000026
水素化ナトリウム（１．６７ｇ、４２ｍｍｏｌ）を、無水脱気ＤＭＦ（４０ｍｌ）中の３−ブロモ−２，２−ビス（ブロモメチル）プロパノール（９．７５ｇ、３０ｍｍｏｌ）および臭化アリル（１２．９ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）に窒素下、０℃で慎重に添加した。次いで、温度を室温（２２℃）に上昇させ、反応混合物をさらに３時間撹拌した。次いで、反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５０ｍｌ）に慎重に添加した。次いで、Ｈ２Ｏ相をジエチルエーテル（２×５０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をＨ２Ｏ（５×５０ｍｌ）、次いで飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、濾過した。揮発性物質を減圧留去して、淡黄色油状物（９．７ｇ）を得た。シリカカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：ＥｔＯＡｃ  ９：１）により生成物を透明油状物として６．６ｇ（６２％）得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；５．９３（ｍ，１Ｈ），５．２８（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｄ，２Ｈ），３．５８（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｓ，２Ｈ）．
【０２２８】
実施例８ｂ：１６−（アリルオキシメチル）−１６−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘントリアコンタン
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無水脱気ＤＭＦ（３．５ｍｌ、４ÅＭＳで２４時間乾燥）に溶解したテトラエチレングリコールモノメチルエーテル（１．９１ｍｌ、９ｍｍｏｌ）を、無水脱気ＤＭＦ（１５ｍｌ、４ÅＭＳで２４時間乾燥）中の水素化ナトリウム（３６５ｍｇ、９ｍｍｏｌ）に窒素下０℃でシリンジを使用して慎重に添加した。次いで、温度を室温に上昇させ、反応混合物をさらに３０分間撹拌した。次いで、３−（３−ブロモ−２，２−ビス（ブロモメチル）プロポキシ）プロパ−１−エン（７３０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、温度を１００℃に上昇させた。１４時間後、反応が完了し（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ−Ｃ１８、２５分でＨ２Ｏ／ＡＣＮを９５：５〜５：９５に変化させた、Ｒｔ生成物＝１９．５分）、温度を室温に低下させ、反応混合物をＨ２Ｏ（１５０ｍｌ）に慎重に添加し、Ｈ２Ｏ相をジエチルエーテル（２×５０ｍｌ）で洗浄した。次いで、塩化ナトリウムを飽和するまでＨ２Ｏ相に添加した。Ｈ２Ｏ相をＥｔＯＡｃ（４×５０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相を飽和食塩水（２×３０ｍｌ）で洗浄した。硫酸ナトリウムおよびチャーコールを有機相に添加した。透明な有機相を濾過し、揮発性物質を減圧留去した（８ｍｍＨｇ、４０℃、次いで、０．１ｍｍＨｇ（オイルポンプ）および４０℃、残留ＤＭＦを留去）。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ  ９：１）により生成物１．０５ｇ（７０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；５．９０（ｍ，１Ｈ），５．２０（ｍ，２Ｈ），３．９４（ｄｔ，２Ｈ），３．７０−３．５５（ｍ，４８Ｈ），３．４５（ｓ，６Ｈ），３．４３（ｓ，２Ｈ），３．４０（ｓ，９Ｈ）．
【０２２９】
実施例８ｃ：１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−オール（４）
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ＤＭＳＯ（３ｍｌ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（７４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を２（５００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を１００℃で１５分間振盪した。ＨＰＬＣ分析（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ−Ｃ１８、２５分でＨ２Ｏ／ＡＣＮを９５：５〜５：９５させた）から、生成物に完全に変換されたことが分かった。飽和食塩水（２０ｍｌ）を室温で添加し、水相を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（３×２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、揮発性物質を減圧留去して、１６−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−１６−（（プロパ−１−エニルオキシ）メチル）−２，５，８，１１，１４，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘントリアコンタンを透明油状物として得た。次いで、アセトン（４ｍｌ）に溶解した油状物にＨＣｌ（０．１Ｍ）を添加し、混合物を５５℃で３０分間振盪した。次いで、揮発性物質を減圧留去して、４を透明油状物として４２０ｍｇ（８９％）得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；３．６６−３．５２（ｍ，４８Ｈ），３．４７（ｓ，６Ｈ），３．３７（ｓ，９Ｈ）．
【０２３０】
実施例８ｄ：１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸ｔｅｒｔ−ブチル（５）
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カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（３ｍｌ）中の４（１００ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル−２−ブロモアセテート（１０５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を３０分間振盪した。ジエチルエーテル（１０ｍｌおよび飽和食塩水（５ｍｌ）を添加し、水相を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性物質を減圧留去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール  ９：１）で精製して、５を６０ｍｇ（５２％）得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；３．９１（ｓ，２Ｈ），３．６６−３．５２（ｍ，４８Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．４５（ｓ，６Ｈ），３．３７（ｓ，９Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）．
【０２３１】
実施例８ｅ：１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸（６）
2014534277.tif 000030
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．５ｍｌ）およびジクロロメタン（０．５ｍｌ）を、５、２０ｍｇに添加した。混合物を室温で１時間振盪した後、揮発性物質を減圧留去して、６を黄色油状物として１８ｍｇ得た。
【０２３２】
実施例８ｆ：Ｎ−（２−ｔ−ブトキシカルボニルアミドエチル）−１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸アミド
2014534277.tif 000031
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（９５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍｌ、４ÅＭＳで乾燥し脱気）中の１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸（実施例８ｅ）（１５３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−ＢＯＣ−エチレンジアミン（４０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（８７μｌ、０．５ｍｍｏｌ）に室温で窒素下にて添加した。反応混合物を２０時間振盪した。ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、混合物をＨ２Ｏで３回抽出した。合わせた水相をＮａＣｌ（ｓ）で飽和させた後、ＥｔＯＡｃで４回抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧留去して、生成物を淡黄色油状物として１９０ｍｇ（定量（ｑｕａｎｔ））得た。ＨＰＬＣ分析（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ−Ｃ１８、２０分でＴＦＡの０．１％Ｈ２Ｏ溶液／ＡＣＮを９０：１０〜５：９５に変化させた）は、１４．５分に単一ピークを示した。
【０２３３】
実施例８ｇ：Ｎ−（２−アミノエチル）−１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸アミド
2014534277.tif 000032
ＴＦＡ（２ｍｌ）を、ジクロロメタン（２ｍｌ）中のＮ−（２−ｔ−ブトキシカルボニルアミドエチル）−１６，１６−ジ−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサペンタデシル−２，５，８，１１，１４，１８−ヘキサオキサイコサン−２０−酸アミド（実施例８ｆ、１６０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。揮発性化合物を減圧留去し、残留物を無水トルエン（Ａｌ２Ｏ３）と共に２回共蒸発させた後、オイルポンプを使用して乾燥した。これにより、生成物１３０ｍｇを得た。ＨＰＬＣ分析（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ−Ｃ１８、２０分でＴＦＡの０．１％Ｈ２Ｏ溶液／ＭｅＣＮを９０：１０〜５：９５に変化させた）は１０．７分に単一ピークを示した。ＭＳ（ＥＳＰ＋）［Ｍ］：８０７．５．
【０２３４】
実施例８ｈ：結合
ナノ構造Ｘ１（実施例１０ｃ、１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ  Ｐ  ｅｑ）を音波処理によりＨ２Ｏ（２ｍｌ）に溶解した。６Ｍおよび１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用してｐＨを１．９から１０．４に調節した。次いで、Ｈ２Ｏ（２ｍｌ）に溶解した塩化マンガン（１２．５ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０℃で３０分間振盪した。０．１ＨＣｌ（水溶液）を使用してｐＨを８．５から７．１に調節し、実施例８ｇからの材料（３７ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（９ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２ｍｌ）に添加溶解した。次いで、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２１時間振盪した後、濾過した（５ｕｍチューブフィルタ）。濾液を遠心濾過し（１０ｋカットオフ、３０００Ｇ  ３０分間）、Ｈ２Ｏを使用して濃縮物（４ｍｌ）を１５ｍｌに希釈した。この手順を４回繰り返した。０．１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して濃縮物（４ｍｌ）のｐＨを４．７から７．１に調節した。濾液を遠心濾過し（１０ｋカットオフ、３０００Ｇ  １５分間）、Ｈ２Ｏを使用して濃縮物（０．５ｍｌ）を４ｍｌに希釈した。この手順を４回繰り返した。最終濃縮物を濾過し（シリンジフィルタ０．２ｕｍ）、Ｈ２Ｏを使用して２ｍｌに希釈した。体積粒径分布＝４〜５ｎｍ。ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．３分
【０２３５】
実施例９：ポリエチレンイミン−ビスホスホネートナノ構造Ｚの合成
実施例９ａ：３，３−ビス（ジメトキシホスホリル）プロピオン酸ｔ−ブチルエステル
2014534277.tif 000033
氷冷したビス（ジメトキシホスホリル）メタン（４．６４ｇ、２０ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（７．３５ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（４０ｍｌ）溶液に窒素下でカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．８ｇ、４３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、飽和塩化アンモニウム溶液４ｍｌで反応停止した。揮発性物質を減圧下でおよびトルエン添加と蒸発とからなるサイクルを２回行うことにより留去した。ジクロロメタン：メタノール、９５：５でのフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を油状物として得た。収量４．０ｇ。
【０２３６】
実施例９ｂ：３，３−ビス（ジメトキシホスホリル）プロピオン酸
2014534277.tif 000034
３，３−ビス（ジメトキシホスホリル）プロピオン酸ｔ−ブチルエステル（２．５ｇ）のジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液にトリフルオロ酢酸を添加した。室温で撹拌した後、揮発性物質を減圧蒸発させた。トルエンを５ｍｌ添加し、減圧蒸発させるサイクルを３回行い、生成物２．２ｇを得た。
【０２３７】
実施例９ｃ：ポリエチレンイミン−ビスホスホネートナノ構造Ｚの合成
平均分子量２５ｋＤａの分岐鎖ポリエチレンイミン（１００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ第一級アミノ基）、３，３−ビス（ジメトキシホスホリル）プロピオン酸（１．１ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）に音波処理（１０分）により溶解した。１Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを１．８から６．５に調節した後すぐ、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．０ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２３時間振盪した後、濾過した（５μｍシリンジフィルタ）。濾液を遠心濾過し（１０ｋカットオフ、３０００Ｇ  ３０分間）、Ｈ２Ｏを使用して保持液（２ｍｌ）を１０ｍｌに希釈した。この手順を４回繰り返した。Ｈ２Ｏを使用して最終保持液（２ｍｌ）を６ｍｌに希釈した。ＤＬＳによる体積平均粒径分布：４〜５ｎｍ。ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝９．１分。
【０２３８】
実施例１０：ナノ構造Ｘを得るための１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの重合
１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（ｘｇ、ｙｍｍｏｌ、下記表１参照）を圧力容器内で８０％１−プロパノール水溶液２００ｍｌに溶解した。反応混合物を９５℃で４８時間、次いで１１０℃で２４時間撹拌した。透明溶液を室温に冷却した後、それをＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ（８００ｍｌ）で希釈し、次いで、３００ｋ公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）孔径カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−３００−Ｃ−３ＭＡ）を使用してダイアフィルトレーション濾過した。次いで、回収した透過液（約９８０ｍｌ）を１００ｋ  ＮＭＷＣ孔径ダイアフィルタカラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−１００−Ｃ−３ＭＡ）で回収し、ナノ構造溶液を濃縮した。あるいは、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製フィルタ、具体的にはＣｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ＯＳ０１００Ｔ０２（１００ｋ  ＮＭＷＣ孔径カセット）も使用した。ＭｉｌｌｉＱ水の添加と回収した保持液の濾過を繰り返し行った。回収した保持液（Ｘ１）の最終体積は約５０ｍｌであった。
【０２３９】
さらに、１００ｋダイアフィルタカラムを通過する透過液を回収した後、３０ｋ  ＮＭＷＣ孔径フィルタカートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−３０−Ｃ−３ＭＡ）を使用して濾過した。ＭｉｌｌｉＱ水の添加（×２）と回収した保持液の濾過を繰り返し行った。回収した保持液（Ｘ２）の最終体積は約５０ｍｌであった。
【０２４０】
実施例１０ａ：１００ｍＭ１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの重合
Ｘ１ａ．量：ｘ＝１２．８ｇ、ｙ＝２０ｍｍｏｌ。ダイアフィルトレーション後の回収率＝２６％（Ｐの回収率に基づく）；最終ｐＨ約２；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝９．２分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．９。
【０２４１】
Ｘ２ａ量：ｘ＝１２．８ｇ、ｙ＝２０ｍｍｏｌ。ダイアフィルトレーション後の回収率＝１７％（Ｐの回収率に基づく）；最終ｐＨ約２；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．３分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．９。
【０２４２】
実施例１０ｂ：８０ｍＭ１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの重合
Ｘ１ｂ．量：ｘ＝１０．４ｇ、ｙ＝１６ｍｍｏｌ。ダイアフィルトレーション後の回収率＝３１％（Ｐの回収率に基づく；最終ｐＨ約２；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝９．２分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝１．１。
【０２４３】
Ｘ２ｂ．量：ｘ＝１０．４ｇ、ｙ＝１６ｍｍｏｌ。ダイアフィルトレーション後の回収率＝１９％（Ｐの回収率に基づく）；最終ｐＨ約２；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．４分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝１．１。
【０２４４】
実施例１０ｃ：５０ｍＭ１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの重合
Ｘ１ｃ．量：ｘ＝６．４ｇ、ｙ＝１０ｍｍｏｌ。ダイアフィルトレーション後の回収率＝２１％（Ｐの回収率に基づく）；最終ｐＨ約２；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝９．７分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．９。
【０２４５】
Ｘ２ｃ．量：ｘ＝６．４ｇ、ｙ＝１０ｍｍｏｌ。ダイアフィルトレーション後の回収率＝２５％（Ｐの回収率に基づく）；最終ｐＨ約２；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．５分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．９；
【０２４６】
実施例１０ｄ：様々な溶媒中でのナノ構造Ｘを得るための１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの重合
１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（３．２ｇ、５ｍｍｏｌ）を８０％エチレングリコール水溶液（１００ｍｌ）に溶解した。反応混合物を１１６℃で２１時間撹拌した。重合は、８０％１，２−プロパンジオール水溶液中で、１１１℃で２４時間、次いで１１４℃で４時間撹拌する、または８０％ジエチレングリコール水溶液中で、１０８℃で２０時間、次いで１１４℃で２時間撹拌する、または８０％トリエチレングリコール水溶液中で、１１５℃で２２時間撹拌する、または８０％ジ（エチレングリコール）メチルエーテル水溶液中で、１０６℃で１８時間、次いで１１１℃で１８時間撹拌する、または８０％ジエチレングリコールモノエチルエーテル水溶液中で、１０７℃で３５時間撹拌する、または８０％グリセロール水溶液中で、１１４℃で１９時間撹拌すること以外、上記のように行うこともできる。
【０２４７】
実施例１０ｅ：１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンのＰｔ捕捉
Ｒｅｓｉｎｔｅｃｈにより提供されるＳＩＲ−２００（１００ｇ、キレート化樹脂、チオール、Ｈ型）を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）と共に２回振盪した後、ＭｉｌｌｉＱ水と共に２回振盪した。水を濾別し、無水トルエン（１００ｍｌ）をＳＩＲ−２００に添加した。揮発性物質を減圧留去し、トルエン添加−減圧サイクルをさらに２回行うことにより残留水を留去した。１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（３０ｇ、白金含有量：３９ｐｐｍ）を容器内で無水トルエン（３００ｍｌ）に溶解した。ＳＩＲ−２００（１０ｇ、上記のように処理）を添加した後、終夜振盪した。ＳＩＲ−２００を濾別し、揮発性物質を減圧留去して、白金含有量０．３８ｐｐｍの材料を得た。
【０２４８】
実施例１１．ナノ構Ｙを得るための、ナノ構造Ｘのマンガン担持およびタンジェンシャルフロー濾過による精製
６Ｍおよび１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して、ナノ構造Ｘの溶液のｐＨ（実施例１３）をｐＨ２からｐＨ１０．４に調節し、２時間放置した。次いで、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ｘｘｍｇ、ｙｙｍｍｏｌ）を添加し、溶解した。混合物を３０℃で１時間振盪した。反応後の混合物のｐＨは約ｐＨ７．６であり、１Ｍ  ＨＣｌ（水溶液）を使用してｐＨ７．４にさらに調節した。反応した混合物をＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏで５０ｍｌに希釈した後、１０ｋ  ＮＭＷＣ孔径カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−１０−Ｃ−３ＭＡ）を使用してダイアフィルトレーションを行い、遊離Ｍｎイオンを除去した。あるいは、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のフィルタ、具体的にはＣｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ＯＳ０１０Ｔ０２（１０ｋ  ＮＭＷＣ孔径カセット）も使用する。保持液を回収し、希釈＆ダイアフィルトレーション手順を３回繰り返し行った。
【０２４９】
Ｙ１ａ．使用したナノ構造Ｘ：実施例Ｘ１ａ、１５ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＭｎＣｌ２  ４Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝１０６．７ｍｇ、ｙｙ＝０，５４ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝５．６ｎｍ；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝９．５分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝５．７、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｍｎ＝６．２；ｐＨ５．５でのイオン交換安定性＝４５％およびｐＨ７でのイオン交換安定性＝６２％。
【０２５０】
Ｙ１ｂ．使用したナノ構造Ｘ：実施例Ｘ１ａ、１５ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝１０７ｍｇ、ｙｙ＝０．５４ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝６．５ｎｍ；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．１分＆ショルダー９分、組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝５．４、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｍｎ＝６；ｐＨ５．５でのイオン交換安定性＝４７％およびｐＨ７でのイオン交換安定性＝６６％。
【０２５１】
Ｙ２ａ．使用したナノ構造Ｘ：実施例Ｘ２ａ、１５ｍｌ、２ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＭｎＣｌ２  ４Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝７１ｍｇ、ｙｙ＝０．３６ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝４．１ｎｍ；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．５分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝６．６、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｍｎ＝７．３；ｐＨ５．５でのイオン交換安定性＝４３％およびｐＨ７でのイオン交換安定性＝６０％；８１．３３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝４１ｍＭ−１  Ｍｎ  ｓ−１。
【０２５２】
Ｙ２ｂ．使用したナノ構造Ｘ：実施例Ｘ２ａ、１５ｍｌ、２ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＭｎＣｌ２：ｘｘ＝７１ｍｇ、ｙｙ＝０，３６ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝５．６ｎｍ；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．１分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝５．６、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｍｎ＝６．２；ｐＨ５．５でのイオン交換安定性＝４４％およびｐＨ７でのイオン交換安定性＝６３％。
【０２５３】
実施例１１ａ：ナノ構造Ｘを得るための１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタンの重合
１１ａ’：
１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（０．６４ｇ、１ｍｍｏｌ）を８０％エチレングリコール水溶液（１２ｍｌ）に溶解した。２８ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）または１４０ｍｇ（２．１ｍｍｏｌ）の範囲のギ酸ナトリウムおよび塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（３３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を８０％エチレングリコール水溶液（４ｍｌ）にそれぞれ溶解した後、反応混合物に添加し、それを１１４℃で２２時間撹拌した。
【０２５４】
１１ａ”：
１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（０．６４ｇ、１ｍｍｏｌ）を８０％エチレングリコール水溶液（１２ｍｌ）に溶解した。ギ酸カリウム（５２ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）および塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（３３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を８０％エチレングリコール水溶液（４ｍｌ）にそれぞれ溶解した後、反応混合物に添加し、それを１１６℃で２１時間撹拌した。
【０２５５】
１１ａ’’’：
１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（０．６４ｇ、１ｍｍｏｌ）を８０％エチレングリコール水溶液（１６ｍｌ）に溶解した。その後、ギ酸テトラメチルアンモニウム（３０重量％水溶液、０．２４５ｍｌ、０．６２ｍｍｏｌ）および８０％エチレングリコール水溶液（４ｍｌ）に溶解した塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（３３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、それを１１６℃で２１時間撹拌した。
【０２５６】
実施例１１ｂ．ナノ構造Ｚを得るための、ナノ構造Ｘのマンガン担持、シランの添加による「硬化」、およびダイアフィルトレーションによる精製
ナノ構造Ｘ（実施例１０ｆ）の溶液２ｍｌに、リンとマンガンとのモル比１２を満たす脱気塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（８０％エチレングリコール水溶液に溶解；１００ｍＭ）ｘｍｌを添加した。８０％エチレングリコール水溶液に溶解した脱気ギ酸ナトリウム（１００ｍＭ）ｙｍｌを、ギ酸ナトリウムとマンガンとのモル比５または３を満たすＭｎ担持ナノ構造溶液に添加する。最終ｐＨを確認し、必要に応じてＮａＯＨ（水溶液）またはＨＣｌ（水溶液）を添加することにより約ｐＨ５または３に調節する。混合物を１００℃で１２時間または１８時間振盪した。エタノールに溶解したオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）（１２０ｍＭ）ｚｍｌの添加を混合物に添加して、１００℃で１８時間または２４時間さらに撹拌した。（最初の加熱工程後にＴＥＯＳを後添加する代わりに、ギ酸Ｎａを含有するＭｎ担持ナノ構造溶液に直接ＴＥＯＳ溶液を組み込み、１００℃で１２時間または１８時間振盪する。）
【０２５７】
加熱および振盪後、ＮａＯＨ（水溶液）を添加することによりｐＨをｐＨ７．０±０．５に調節した後、４ｍｌ  １００ｋＤａ遠心式フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標））を使用して限界濾過（ＵＦ）を行った。溶液をまずＭｉｌｌｉ−Ｑで約４ｍｌに希釈し、１０〜１５分間遠心分離した（３０００×ｇ）。濾液を回収し、４ｍｌ  １０ｋＤａ遠心式フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標））に移し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で４ｍｌに希釈し、十分に混合し、遠心濾過し（３０００×ｇ、１０分）、その後、保持液約５００μｌを回収した。希釈およびダイアフィルトレーション手順を３回繰り返した。回収した最終保持液５００μｌをＭｉｌｌｉＱ水で１ｍｌに希釈した。その後、Ｍｎ濃度測定、緩和時間測定法により評価される錯滴定安定性試験（実施例１４ｂ）、ＧＰＣ分析および組成（ＩＣＰ測定）分析を行った。
【０２５８】
Ｚ１ａ．ビスビスに対して３％のＴＥＯＳ］使用したナノ構造Ｘ：２ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ  Ｐ；ｘ＝１６７μＬ；ギ酸Ｎａ−Ｍｎ比：５；ｙ＝８３５μＬ；ｚ＝２５μＬ  加熱前の最終ｐＨ：ｐＨ５；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１２．６分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝１１．６１、Ｐ／Ｓｉ＝１．０１、Ｓｉ／Ｍｎ＝１０．５１；ｐＨ７での錯滴定安定性＝２４％
【０２５９】
Ｚ１ｂ．ビスビスに対して５％のＴＥＯＳ］使用したナノ構造Ｘ：２ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ  Ｐ；ｘ＝１６７μＬ；ギ酸Ｎａ−Ｍｎ比：５；ｙ＝８３５μＬ；ｚ＝４１．７μＬ  加熱前の最終ｐＨ：ｐＨ５；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１２．６分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝１２．０５、Ｐ／Ｓｉ＝１．０２、Ｓｉ／Ｍｎ＝１１．７７；ｐＨ７での錯滴定安定性２３％
【０２６０】
Ｚ１ｃ．ビスビスに対して３％のＴＥＯＳ。使用したナノ構造Ｘ：２ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ  Ｐ；ｘ＝１６７μＬ；ギ酸Ｎａ−Ｍｎ比：５；ｙ＝８３５μＬ；ｚ＝２５μＬ  加熱前の最終ｐＨ：ｐＨ３．５；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１２．６分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝１３．０３、Ｐ／Ｓｉ＝０．９３、Ｓｉ／Ｍｎ＝１３．９６；ｐＨ７での錯滴定安定性＝２７％
【０２６１】
Ｚ１ｄ．ビスビスに対して５％のＴＥＯＳ。使用したナノ構造Ｘ：ＰＬ０４０６４、２ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ  Ｐ；ｘ＝１６７μＬ；ギ酸Ｎａ−Ｍｎ比：５；ｙ＝８３５μＬ；ｚ＝４１．７μＬ  加熱前の最終ｐＨ：ｐＨ３．５；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１２．６分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝１３．３１、Ｐ／Ｓｉ＝０．９２、Ｓｉ／Ｍｎ＝１４．５３；ｐＨ７での錯滴定安定性＝２６％
2014534277.tif 000035
【０２６２】
実施例１２．凍結乾燥し、製剤化したＭｎ担持ナノ構造
１，１−ビス（トリエトキシシリルプロピル）−１，１−ビス（ジメチルホスホナト）メタン（６．４ｇ、０，０１ｍｍｏｌ）を圧力容器内で８０％１−プロパノール水溶液２００ｍｌに溶解した。反応混合物を９５℃で４８時間、次いで、１１０℃で２４時間撹拌した。温度を室温に低下させ、無色透明の溶液を回収した。回収した溶液をＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ（８００ｍｌ）で希釈した後、３００ｋ  ＮＭＷＣ  孔径カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−３００−Ｃ−３ＭＡ）を使用して濾過した。次いで、回収した透過液（約９８０ｍｌ）を１００ｋ  ＮＭＷＣ孔径ダイアフィルタカラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−１００−Ｃ−３ＭＡ）を使用して濾過し、ポリマー溶液を濃縮した。ＭｉｌｌｉＱ水の添加と回収した保持液の濾過を繰り返し行った。回収した保持液の最終体積は約５０ｍｌであった。組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．８４。
【０２６３】
さらに、１００ｋダイアフィルタカラムを通過する透過液を回収した後、３０ｋ  ＮＭＷＣ孔径ダイアフィルタカラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−３０−Ｃ−３ＭＡ）を使用して濾過した。ＭｉｌｌｉＱ水の添加（２×）と回収した保持液の濾過を繰り返し行った。回収した保持液の最終体積は約５０ｍｌであった。組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．８８。
【０２６４】
６Ｍおよび１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して、１００ｋダイアフィルトレーションを通過するナノ構造（２５ｍｌ、２．１ｍｍｏｌ）のｐＨをｐＨ２．２からｐＨ１０．５に調節し、２時間放置した。次いで、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（４５．４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０℃で１６時間振盪した。反応後の混合物のｐＨは９．３であり、その後、１Ｍ  ＨＣｌ（水溶液）を使用してｐＨ７．４に調節した。混合物をＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏで５０ｍｌに希釈した後、１０ｋ  ＮＭＷＣ孔径カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−１０−Ｃ−３ＭＡ）を使用してダイアフィルトレーションを行った。保持液を回収し、希釈およびダイアフィルトレーション手順を３回繰り返した。回収した最終溶液の体積は１０ｍｌであった。
【０２６５】
回収した溶液８．１ｍｌに、マンニトール（０．３６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、２５０ｍＭの濃度に到達させた。その後、１６時間凍結乾燥し、飛散性の白色粉末０．５ｇを回収した。凍結乾燥材料の２０ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製し、分析した。体積加重した粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝４．８ｍ  ｎｍ；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）Ｒｔ＝１０．３分；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝９．８、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｍｎ＝１０．７；ｐＨ５．５でのイオン交換安定性＝７２％およびｐＨ７でのイオン交換安定性＝８９％；６０ＭＨｚ、３７℃でのｒ１＝３９ｍＭ−１  Ｍｎ  ｓ−１。
【０２６６】
実施例１３．イオン交換樹脂を使用したＹのナノ構造の更なる精製
過剰のまたは結合の弱いＭｎイオンをさらに除去するために、サンプルＹ１を陽イオン交換体（スルホン化ポリスチレン）で処理した：Ｍｎ担持ナノ構造（約１０ｍＭ  Ｍｎ）約１０ｍｌをＤｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４（Ｎａ型、水で予洗）１ｇと混合し、０．１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７．０に調節した。混合物を１６時間穏やかに回転させた後、３０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０２６７】
実施例１４．マンガン含有ナノ構造の安定性測定（「イオン交換安定性」とも称される）
まず、ナノ構造溶液の濃度マンガンを測定した後、水で希釈して、マンガン濃度１．５ｍＭおよび最終体積２．２ｍｌに希釈した。希釈サンプル溶液２×１．０００ｍｌに、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４（Ｎａ型、水で予洗）２×１００ｍｇを添加した。２つの溶液のｐＨをそれぞれ０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは０．１Ｍ  ＨＣｌで７．０および５．５に調節した（通常、数マイクロリットルしか要しない）。バイアルをゆっくり回転させることにより、混合物を１６時間十分に混合した。ＩＥＸ粒子を沈殿させ、採取した上清を１００μｌずつ分析した（［Ｍｎ］ＩＥＸ）。サンプル中の初期マンガン濃度を測定するために、上記の残りの溶液を使用して［Ｍｎ］ｓｔａｒｔを測定した。安定性は：［Ｍｎ］ＩＥＸ／［Ｍｎ］ｓｔａｒｔ＊１００（％）として算出した。
【０２６８】
実施例１４ｂ．緩和時間測定法により評価されるマンガン含有ナノ構造の錯滴定安定性試験
１ｍＭ  Ｍｎの濃度を有するナノ構造溶液の縦緩和度（ｒ１（ｎｓ））を測定する。１ｍＭ  Ｍｎを含有する別のナノ構造溶液を調製し、等モル量のＥＤＴＡを添加する。この溶液のｐＨを、必要に応じてｐＨ７±０．５に調節しなければならない。ＥＤＴＡを添加したこのナノ構造溶液の縦緩和度（ｒ１（ｎｓ＋ＥＤＴＡ））を測定する。基準物質として、ＡＡＳ用マンガン標準物質（Ｆｌｕｋａ７７０３６）を使用する１ｍＭ溶液を調製し、等モル量のＥＤＴＡを添加し、ｐＨをｐＨ７±０．５に調節する。縦緩和度を測定すると（ｒ１（Ｍｎ＋ＥＤＴＡ））、その結果、１．６ｍＭ−１ｓ−１の値が得られる。等量のＥＤＴＡを添加した後の、ナノ構造から放出された％Ｍｎを算出するために：
2014534277.tif 000036
注記：緩和（Ｔ１、単位：秒）は、３７℃でＭｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑ６０  ＮＭＲ分析装置（６０ＭＨｚ）を使用して測定し、緩和度ｒ１は：
2014534277.tif 000037
（式中、Ｔ１Ｈ２Ｏ＝０．３２ｓ；ｃ１＝１ｍＭ）
を使用して算出する。
【０２６９】
実施例１５．カルシウムおよびマンガンとの金属交換反応。
血液の無機成分を略模倣するがカルシウムを含まない緩衝液を、ＮａＣｌ（７．１４ｇ）、ＮａＨＣＯ３（１．４ｇ）、ＫＨＣＯ３（０．４３ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．１６５ｇ）、Ｍｇ（ＯＡｃ）２（０．１７ｇ）から混合し、体積１．００ｌに希釈した。以下、「血液緩衝液」と称する。２つのナノ構造サンプル、Ａ、（Ｙ１、３００ｋＤａフィルタと１００ｋＤａフィルタで分離）およびＢ（Ｙ２、１００ｋＤａフィルタと３０ｋＤａフィルタで分離）を試験した。試験管は、次に従って調製した：
サンプル１：水９００μｌ                                  サンプルＡ１００μｌ
サンプル２：水９００μｌ                                  サンプルＢ１００μｌ
サンプル３：血液緩衝液９００μｌ                          サンプルＡ１００μｌ
サンプル４：血液緩衝液９００μｌ                          サンプルＢ１００μｌ
サンプル５：血液緩衝液＋１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２９００μｌ    サンプルＡ１００μｌ
サンプル６：血液緩衝液＋１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２９００μｌ    サンプルＢ１００μｌ
【０２７０】
Ａと混合したサンプルは全Ｍｎ濃度１．３ｍＭ、Ｂと混合したサンプルは全Ｍｎ濃度１．５ｍＭと分析された。溶液を室温で１時間インキュベートした後、１０ｋＤａカットオフ遠心フィルタを通過させた。濾液のマンガンを分析した。結果を表２に示す。
2014534277.tif 000038
【０２７１】
実施例１６．Ｍｎ担持ジメチル−２−（トリエトキシシリル）エチルホスホネートポリマー。
ジメチル−２−（トリエトキシシリル）エチルホスホネート（ＤＴＥＰ、０．９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を圧力容器内で８０％１−プロパノール水溶液３０ｍｌに溶解した。反応混合物を９５℃で４８時間、次いで、１２０℃で２４時間撹拌した。温度を室温に低下させ、無色透明の溶液を回収した。回収した溶液をＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ（４７０ｍｌ）で希釈した後、１００ｋ  ＮＭＷＣ孔径カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−１００−Ｃ−３ＭＡ）を使用して濾過した。次いで、３０ｋ  ＮＭＷＣ孔径ダイアフィルタカラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−３０−Ｃ−３ＭＡ）を使用して、回収した透過液（４８０ｍｌ）を濾過し、ポリマー溶液を濃縮した。ＭｉｌｌｉＱ水の添加と回収した保持液の濾過を繰り返し行った。回収した保持液の最終体積は約７．５ｍｌであった。組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｓｉ＝０．５。
【０２７２】
６Ｍおよび１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して、ＤＴＥＰポリマー溶液（０．４ｍｍｏｌ  Ｐ）７．５ｍｌのｐＨをｐＨ２．６からｐＨ１０．４に調節し、２時間放置した。その後、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（５．９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０℃で１時間振盪した。反応後の混合物のｐＨは約ｐＨ９．４であり、その後、１Ｍ  ＨＣｌ（水溶液）を使用してｐＨ７．４に調節した。反応した混合物を、ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏで５０ｍｌに希釈した後、１０ｋ  ＮＭＷＣ孔径カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ’ｓ  Ｍｉｄｇｅｅ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｍｏｄｅｌ：ＵＦＰ−１０−Ｃ−３ＭＡ）を使用してダイアフィルトレーションを行い、遊離Ｍｎイオンを除去した。保持液を回収し、希釈およびダイアフィルトレーション手順を３回繰り返した。体積加重粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝５．６ｎｍ；ＧＰＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、１００ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３、ｐＨ＝７．４、流量１ｍｌ／分）；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝２．７、Ｐ／Ｓｉ＝０．５、Ｓｉ／Ｍｎ＝５．７；ｐＨ５．５でのイオン交換安定性＝２１％およびｐＨ７でのイオン交換安定性＝２４％；８１．３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝３ｍＭ−１  Ｍｎ  ｓ−１
【０２７３】
実施例１７．Ｍｎ担持ゾレドロン酸。
ゾレドロン酸（２７ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）をＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ１０ｍｌに溶解した。１００ｍＭ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物の水溶液を調製した。Ｍｎ溶液１０μｌをゾレドロン酸溶液４０８μｌおよびＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ５８２μｌと混合した。６Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用してｐＨを７．４に調節した。組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝５．２６。８１．３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝２．３ｍＭ−１  Ｍｎ  ｓ−１
【０２７４】
実施例１８．Ｍｎ担持メチレンジホスホン酸。
メチレンジホスホン酸（９．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ５ｍｌに溶解した。２８ｍＭ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物の水溶液を調製した。Ｍｎ溶液３５μｌをメチレンジホスホン酸溶液２８６μｌおよびＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ６７９μｌと混合した。６Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用してｐＨを７．１に調節した。組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｍｎ＝４．６。８１．３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝１ｍＭ−１  Ｍｎ  ｓ−１。
【０２７５】
実施例１９．ナノ構造Ｘ中に担持された他の金属イオン。
６Ｍおよび１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して、ナノ構造Ｘ２ａのｐＨを２から１０．４に調節し、２時間放置した。次いで、塩化Ｆｅ（ＩＩ）水和物、塩化Ｆｅ（ＩＩＩ）水和物、塩化Ｅｒ（ＩＩＩ）水和物、または塩化Ｄｙ（ＩＩＩ）水和物などの金属塩（ｘｘｍｇ、ｙｙｍｍｏｌ、下記表３参照）を添加した。混合物を３０℃で１時間振盪した。反応後の混合物のｐＨはサンプルにより４．７〜７．２と様々であり、その後、１Ｍ  ＨＣｌ（水溶液）を使用してｐＨ７．４に調節した。混合物を遠心濾過し（１０ｋ  ＭＷＣＯ、１５分間３０００×ｇ）、ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを使用して濃縮物（０．５ｍｌ）を４ｍｌに希釈した。この手順を４回繰り返した。ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを使用して最終濃縮物を４ｍｌに希釈した。
【０２７６】
ａ：前駆体Ｘ２ａ、４ｍｌ、０，１１ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝７．２ｍｇ、ｙｙ＝０．０４ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝８．７ｎｍ；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｆｅ＝４．２、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｆｅ＝４．５；８１．３３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝３．１ｍＭ−１  Ｆｅ  ｓ−１。
【０２７７】
ｂ：前駆体Ｘ２ａ、４ｍｌ、０，１１  ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝９ｍｇ、ｙｙ＝０．０３ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積加重粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝８．７ｎｍ；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｆｅ＝６．５、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｆｅ＝７．２；８１．３３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝８．５ｍＭ−１  Ｆｅ  ｓ−１。
【０２７８】
ｃ：前駆体Ｘ２ａ、４ｍｌ、０，１１  ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＥｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝１２．７ｍｇ、ｙｙ＝０．０３ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積加重粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝５０ｎｍ；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｅｒ＝５．３、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｅｒ＝５．７；８１．３３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝０．４ｍＭ−１  Ｅｒ  ｓ−１。
【０２７９】
ｄ：前駆体Ｘ２ａ、４ｍｌ、０，１１ｍｍｏｌ  Ｐ。使用したＤｙＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：ｘｘ＝１３．６ｍｇ、ｙｙ＝０．０４ｍｍｏｌ。最終ｐＨ７．４；体積加重粒径（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でのＤＬＳ）最大＝１０．１ｎｍ；組成（ＩＣＰ、モル比）：Ｐ／Ｄｙ＝４．４、Ｐ／Ｓｉ＝０．９、Ｓｉ／Ｄｙ＝４．７；８１．３３ＭＨｚ、２５℃でのｒ１＝０．６ｍＭ−１  Ｄｙ  ｓ−１。
【０２８０】
実施例２０．Ｍｎ担持材料の緩和度
幾つかのＭｎ担持材料の緩和度を表３に示す。
2014534277.tif 000039
【０２８１】
実施例２１：Ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化
ＭＲ画像品質およびコントラストを、増殖速度が非常に速いＥＬ−４マウスリンパ腫を有するマウスでｉｎ  ｖｉｖｏにて検査した。マウスリンパ腫細胞株ＥＬ−４は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで誘導したリンパ腫から樹立した。リンパ芽球細胞は、懸濁液中でｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、およびＣ５７ＢＬ／６マウス中の同種異系移植片として容易に増殖する。
【０２８２】
ＥＬ−４細胞（ＥＣＡＣＣ  ８５０２３１０５）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中で同種異系移植腫瘍を発生させた。細胞懸濁液を皮下注射し、数日間にわたり腫瘍を発生させた。注射の６日後〜１０日後の間、腫瘍を画像化に使用した。
【０２８３】
ＭＲプロトコルを最適化して、２匹の動物で試験を行った。ＥＬ−４腫瘍を有する動物７匹でＭＲ画像を取得した；４匹のマウスには３ｍＭ／１７５μｌのＹ２を投与し、３匹のマウスには１７ｍＭ／１７５μｌのＭａｇｎｅｖｉｓｔを投与し、両方とも６秒間注射した。
【０２８４】
Ｔ１加重ＧＥ画像を取得した。マウスを磁石から取り除き、造影剤を含有するカテーテルを接続した。このとき、重要な点は、カテーテルによる動物への拡散を回避するため、造影剤を迅速に注射することであった。造影前（ｐｒｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）Ｔ１加重画像を取得し、その直後に、動的フラッシュ画像を連続的に取得しながら造影剤を注射した（注射前（ｐｒｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）２枚、注射後（ｐｏｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）１４枚、１画像当たり８秒）。
【０２８５】
Ａ、Ｂ、Ｅと標識した実験（下記参照）では、Ｙ２またはＭａｇｎｅｖｉｓｔのいずれかを注射した後、５０×５０ｍｍの視野で１０スライスを取得した。８スライス、視野５０×５０ｍｍ、マトリックスサイズ２５６×２５６、および１データセット当たりの全走査時間１０分強で画像を取得した。造影後（Ｐｏｓｔ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）画像は１５分毎に取得した。造影剤注射後に取得した全データセットから、１０スライスのうち１スライスを増強の代表に選択した、図２を参照されたい。
【０２８６】
実施例２２：マンガン担持１，３−ビスホスホネートを有するポリエチレンイミンベースのナノ構造の合成
２２ａ：プロピレン−１，３−ジホスホン酸
トリメチルシリルブロマイド（１６．８４ｍｌ、２５．３ｍｍｏｌ）およびテトラエチルプロピレン−１，３−ジホスホネート（１０．０８ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）を氷冷したジクロロメタン５ｍｌに溶解した。１０分後、冷却浴を取り除き、混合物を室温で１６時間撹拌した。揮発性物質をロータリーエバポレータで留去した。撹拌し、氷冷しながら残留物に水５０ｍｌを添加した。２０分後、ロータリーエバポレータで水を留去し、残留水分をまずトルエン添加−蒸発のサイクルを２回行った後、終夜オイルポンプで減圧することにより除去した。１Ｈ−ＮＭＲから、エチル基が消失し、メチレン基は依然として存在することが分かった。
【０２８７】
２２ｂ：テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネート
プロピレン−１，３−ジホスホン酸（６００ｍｇ）をオルトギ酸トリメチル（２０ｍｌ）に懸濁し、６時間還流した後すぐ液体１０ｍｌを留去し、残部を終夜放置した。揮発性物質を減圧留去し、生成物を油状物として得た。
【０２８８】
２２ｃ：１−ｔ−ブトキシカルボニルメチル，−Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ−テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネート
テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネート（２０６ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（５ｍｌ）に窒素雰囲気下で溶解し、溶液をドライアイス−アセトン浴中で冷却した。ｔ−ＢｕＬｉ（２．１７Ｍヘプタン溶液、１．６６ｍｍｏｌ）をシリンジで注入し、１０分後、ブロモ酢酸ｔ−ブチル（０．２３ｍｌ、１．６６ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、温度を−１５℃に３０分間上昇させた。飽和塩化アンモニウム水溶液に添加することにより、反応混合物を反応停止した。エーテル（２×２５ｍｌ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させることにより油状残留物を得た。ジクロロメタン＋３％メタノールを用いたシリカフラッシュクロマトグラフィーにより所望の生成物１３４ｍｇを得た。
【０２８９】
２２ｄ：１−カルボキシメチル，−Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ−テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネート
１−ｔ−ブトキシカルボニルメチル，−Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ−テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネート（１５０ｍｇ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ）を添加した。反応混合物を終夜放置し、揮発性物質を除去した。トルエン添加−蒸発のサイクルを３回行うことにより残留トリフルオロ酢酸を留去した。収量１３２ｍｇ。
【０２９０】
２２ｅ：１−カルボキシメチル，−Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ−テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネートのポリエチレンイミンへの結合およびマンガンの担持
１−カルボキシメチル，−Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ−テトラメチルプロピレン−１，３−ジホスホネート（１００ｍｇ）、ポリエチレンイミン（１５ｍｇ、平均分子量３００００）、およびスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドを水（５ｍｌ）に添加し、１０分間音波処理した。０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨを６．６に調節した。ＥＤＣを添加し、溶液を振盪機に１９時間入れた。小分子材料を２０ｋＤａカットオフ遠心フィルタで除去した。残留物を同じフィルタ上で４回洗浄した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解したとき、ナノ構造は直径７．５ｎｍと測定された。上記溶液１ｍｌにＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏを２１ｍｇ添加した。ＮａＯＨ水溶液を添加することにより、ｐＨを７．３に調節した。１０ｋＤａ公称カットオフ遠心フィルタ上でサンプルを水で３回洗浄した。サンプルのＭｎを分析すると、２．４ｍＭであることが判明した。緩和度は、６０ＭＨｚで１８．５／ｍＭ／ｓであることが判明した。実施例１４に従って測定した安定性は：０．２％であった。
【０２９１】
実施例２３．ナノ構造の電気伝導度滴定
電気伝導度滴定を使用して、ナノ構造に吸着され得るＣａ２＋およびＭｇ２＋の量を測定することができる。ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２の混合物を含有する溶液を一定量ずつ添加していき、添加後、ナノ構造の水溶液の電気伝導度を監視する。Ｃａ２＋とＭｇ２＋が粒子に吸着する限り、溶液の電気伝導度（ｍＳ／ｃｍ）はある一定の割合（滴定曲線の傾き）で増加することになる。ナノ構造がＣａ２＋およびＭｇ２＋で飽和すると、電気伝導度は別の割合で増加することになる。終点（ナノ構造がＣａとＭｇで飽和する箇所）の可視化がより明確になるように、Ｃａ／Ｍｇ溶液を同じ増分で水に添加することにより得られる電気伝導度から、ナノ構造の存在下での電気伝導度を引いた。
【０２９２】
実施例１０ｃからの材料のサンプル（［Ｍｎ＝０；［Ｐ］＝１３８ｍＭ）２００μｌを水２３００μｌと混合した。６．５５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および９．６７ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する水溶液を５０μｌずつ添加していき、添加後に電気伝導度を測定した。（この比［Ｃａ］／［Ｍｇ］は血液中に見られるものとほぼ同じである。図３ａの「サンプル（Ｓａｍｐ．）」を参照されたい。電気伝導度の出発値（Ｍｇ／Ｃａ溶液を添加していない）を「サンプル」から引き、図３ａの「補正サンプル（Ｋｏｒｒ  Ｓａｍｐ．）」を得た。また、Ｍｇ／Ｃａ溶液を同量ずつ水に添加していき、添加後に電気伝導度を測定して、図３ａの「ブランク（Ｂｌａｎｋ）」を得た。最後に、「補正サンプル」からの電気伝導度を「Ｂｌａｎｋ」から引き、図３ａの「差（ブランク−補正サンプル）（Ｄｉｆｆ（Ｂｌａｎｋ−Ｋｏｒｒ  Ｓａｍｐ））」を得た。
【０２９３】
図３ｂでは「差（ブランク−補正サンプル）」曲線を拡大し、曲線の異なる部分に２本の直線を適合させた。この２本の線は滴定液４７４μｌのところで交差し、これから［Ｐ］／［Ｍｇ］＝８．８９、［Ｐ］／［Ｃａ］＝６．０２および［Ｐ］／［Ｍｅ］ｔｏｔ＝３．５９が得られる。
【０２９４】
上記と同じナノ構造のバッチを１０ｋＤフィルタでさらに濃縮した（体積を約５分の１に低減した）。
滴定を行い、溶液４０μｌを水２４６０と混合したものを用いて上記と同様の補正を行った。終点は４２２μｌと求められた。以前の滴定と同じ吸着比［Ｐ］／［Ｍｅ］であると仮定すると、これから［Ｐ］＝４２２／４７４×１３８×０．２００／０．０４０＝６１３ｍＭが得られる。図３ｃを参照されたい。
【０２９５】
滴定の主な目的は、ナノ構造を９０％飽和するために添加すべきＣａ／Ｍｇ溶液の量を推定することであった。
【０２９６】
従って、４００ｍＭ  ＭｇＣｌ２および６００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液５０６μｌをサンプル溶液（［Ｐ］＝１３８ｍＭ）１４．５ｍｌに添加した。
【０２９７】
次いで、この溶液を上記のように１０ｋＤフィルタでさらに濃縮し、ほぼ同量が滴定されたが、今回は、その部位の大部分が金属で占有されているはずである。結果を図３ｄに示す。
【０２９８】
実施例２４．製剤：ＣａイオンおよびＭｇイオンでの飽和と、その後のマンニトール添加（バッチＳＩ０５５Ｃ−ＰＥ１２０２０８）
実施例１０ｃからの材料の溶液のサンプル（［Ｍｎ］＝３８ｍＭ、［Ｐ］＝５０８ｍＭおよびＯｓ約２００ｍＯｓ／ｋｇ；バッチＰＥ１２０１３０）２．５ｍｌをまず生理学的ｐＨ７．４に調節した。ＣａおよびＭｇで飽和（９０％）させた後、次の工程を行った。実施例２３（「ナノ構造の電気伝導度滴定」）に記載の方法に従って、溶液１００μｌをＣａおよびＭｇ溶液（［Ｃａ］／［Ｍｇ］＝１．４８）を用いて電気伝導度滴定を行い、終点は、［Ｃａ］／［Ｍｎ］＝１．５９または［Ｍｇ］／［Ｍｎ］＝１．０８のときであると求められた。
【０２９９】
とりわけ滴定の終了時のｐＨが５．５であったため、Ｍｎ２＋の一部がＣａ２＋およびＭｇ２＋で置換されている可能性があるという懸念が幾らかあった。従って、滴定後の溶液を１０ｋＤフィルタで濾過し、濾液中のＭｎの量を測定するとサンプル中に全Ｍｎの約１５％が含有されていた。ナノ構造からのＭｎの損失は、少なくとも部分的に、滴定の終了時のｐＨが低いことにより説明することができる。
【０３００】
対応するＣａおよびＭｇ担持粒子を調製するために、マンニトール溶液（Ｏｓ＝２８０ｍＯｓ／ｋｇ）５００μｌをまず濃縮されたＣａ／Ｍｇ溶液（［Ｃａ］＝６００ｍＭ、［Ｍｇ］＝４００ｍＭ）２１．５μｌと混合した。次いで、この溶液をバッチＰＥ１２０１３０、５８０μｌと混合し、１Ｍ  ＮａＯＨ約８μｌでｐＨを６．０１から７．４０に調節し、浸透圧モル濃度を測定すると２７０ｍＯｓ／ｋｇであった。
【０３０１】
実施例２５．免疫原性の試験
方法
ウサギに、Ｍｎ１０ｍｇ／ｍｌに相当するナノ構造濃度で実施例２４のナノ構造（マグネシウムおよびカルシウムと共に製剤化）２×０．５ｍｌを５回注射した。後肢のそれぞれに１つ、注射を皮下投与した。ナノ構造は、次のようにしてアジュバントと混合した：
１）１：１  ｖ／ｖで、一次免疫用には完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（合計１ｍｌ注射）と混合し、追加免疫注射用には不完全フロイントアジュバントと混合した
２）１：１（ｖ／ｖ）で、一次免疫用と追加免疫注射用の両方とも４０ｍｇ／ｍｌ水酸化アルミニウム（Ｐｉｅｒｃｅ）（合計１ｍｌ注射）と混合した
【０３０２】
注射および血清採取のプロトコル：
・０日目：免疫前血清の採取（２０ｍｌ）
・０日目：一次免疫
・１４日目：１回目の追加免疫
・２８日目：２回目の追加免疫
・４９日目：３回目の追加免疫
・７０日目：４回目の追加免疫
・８４日目：免疫血清の採取（６０ｍｌ）
【０３０３】
分析：
１．プロテインＧクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により免疫前血清および免疫血清から免疫グロブリン画分を精製した。
２．樹脂のアルデヒド基とＩｇＧ分子上に存在する第一級アミン基との間の還元的アミド化により、ＩｇＧ画分２ｍｇを２ｍｌアガロースカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させた。ＩｇＧが結合したカラムを洗浄し、０．９％ＮａＣｌで平衡化させた。
３．１．３５ｍＭマンガンに相当する実施例２４のナノ構造の溶液１００μｌ（Ｓｉ約２１μｇおよびＭｎ７μｇを含有）を各カラムに通液した。
４．素通り液：カラムを０．９％ＮａＣｌ、４×１ｍｌ、次いで２×２ｍｌの画分（画分１〜６）で洗浄した。
５．溶出液：結合したＳＩ０５５を１Ｍ  ＮａＣｌ  ４×１ｍｌ（画分７〜１０）で溶出した。
６．素通り画分および溶出液画分のＭｎおよびＳｉ含有量をＩＣＰ−ＡＥＳで分析した。
【０３０４】
結果
免疫前カラムと免疫カラムの両方で、素通り液中にＳＩ０５５が実質的に全部検出された。カラム間で、溶出液中に検出されたナノ構造の量の差異はなかった。
【０３０５】
免疫プロトコル中、ウサギに刺激または他の問題の徴候は認められなかった。
【０３０６】
免疫前カラムおよび免疫カラムからの素通り液および溶出液中のナノ構造の回収率を表４に示す。
【０３０７】
免疫前カラムおよび免疫カラムからの画分１〜１０中のＳＩ０５５の回収をそれぞれ図４ａおよび図４ｂに示す。
2014534277.tif 000040
【０３０８】
結論
この実施例から、非常にロバストな免疫プロトコルにもかかわらず、ウサギでナノ構造に対する免疫反応が生じないことが分かった。この結果は、ナノ構造が生体不活性であることを実証している。
【図１】
2014534277.tif 000041
【図２】
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【図３−１】
2014534277.tif 000043
【図３−２】
2014534277.tif 000044
【図４】
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【国際調査報告】
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2014534277.tif 000047
2014534277.tif 000048