(57)【要約】本発明は、再生医療及び基礎科学研究用バイオマテリアルを開発するためなど、広範囲の生医学分野の応用に使用するためのハイドロゲルを得るのに適した機能性自己組織化ペプチドの分野に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）：
−以下からなる群から選ばれるヘプタペプチドドメイン：
-FAQRVPP-  配列番号1
-QHLPRDH-  配列番号2
-SSLSVND-  配列番号3
-YIIPMHD-  配列番号4
-SLPKLPP-  配列番号5
-TPLSSHS-  配列番号6
-SASHWQI-  配列番号7
-LQAIPRN-  配列番号8
-YRMPIWP-  配列番号9
-KLPGWSG-  配列番号10
-HAIYPRH-  配列番号11
-GETRAPL-  配列番号12
-ALTPWAF-  配列番号13
-GKPMPPM-  配列番号14
-SILPYPY-  配列番号15
−スペーサー領域；及び
−バックボーン領域。
【請求項２】
前記バックボーン領域はＬＤＬＫ、ＫＦＥＦ、ＲＡＤＡ、ＬＤＬＤ及びＬＫＬＫからなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸繰返し単位を含む、請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３】
前記バックボーン領域は少なくとも１個のＬＤＬＫアミノ酸繰返し単位を含む、請求項２に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項４】
前記バックボーン領域は３個のＬＤＬＫアミノ酸繰返しを含む、請求項３に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項５】
前記バックボーン領域は少なくとも２個のＫＦＥＦアミノ酸繰返し単位を含む、請求項２に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項６】
前記バックボーン領域は３個のＫＦＥＦアミノ酸繰返しを含む、請求項５に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項７】
前記バックボーン領域は少なくとも１個のＲＡＤＡアミノ酸繰返し単位を含む、請求項２に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項８】
前記バックボーン領域は３個のＲＡＤＡアミノ酸繰返しを含む、請求項７に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項９】
前記バックボーン領域は少なくとも１個のＬＤＬＤアミノ酸繰返し単位を含む、請求項２に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１０】
前記バックボーン領域は３個のＬＤＬＤアミノ酸繰返しを含む、請求項９に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１１】
前記バックボーン領域は少なくとも１個のＬＫＬＫアミノ酸繰返し単位を含む、請求項２に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１２】
前記バックボーン領域は３個のＬＫＬＫアミノ酸繰返しを含む、請求項１１に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１３】
前記スペーサー領域は１〜７個のグリシンのアミノ酸単位を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１４】
前記スペーサー領域は３個のグリシンのアミノ酸単位を含む、請求項１３に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１５】
前記ヘプタペプチドドメインは配列番号１、２、３及び１０からなる群から選ばれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１６】
前記ヘプタペプチドドメインは配列番号１である、請求項１４に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１７】
Ｎ末端が修飾される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１８】
前記Ｎ末端の修飾はアセチル化である、請求項１７に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項１９】
Ｃ末端が修飾される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項２０】
前記Ｃ末端はＣＯＮＨ２基を有する、請求項１９に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項２１】
以下からなる群から選ばれる請求項１に記載の自己組織化ペプチド：
X-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-Y;及び
X-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
ただし、ＸはＮＨ２又はＡｃであり、かつ、ＹはＣＯＮＨ２又はＣＯＯＨである。
【請求項２２】
以下を含む、請求項２１に記載の自己組織化ペプチド：
NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号16。
【請求項２３】
以下を含む、請求項２１に記載の自己組織化ペプチド：
Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号17。
【請求項２４】
以下を含む、請求項21に記載の自己組織化ペプチド：
NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号18。
【請求項２５】
以下を含む、請求項21に記載の自己組織化ペプチド：
Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号19。
【請求項２６】
以下を含む、請求項21に記載の自己組織化ペプチド：
NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号20。
【請求項２７】
以下を含む、請求項21に記載の自己組織化ペプチド：
Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号21。
【請求項２８】
以下を含む、請求項21に記載の自己組織化ペプチド：
NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号34。
【請求項２９】
以下を含む、請求項21に記載の自己組織化ペプチド：
Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号35。
【請求項３０】
請求項1〜29のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド及びハイドロゲル化試薬を含むハイドロゲル。
【請求項３１】
請求項1〜29のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む自己組織化ペプチド重合体。
【請求項３２】
請求項1〜29のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む平板状ナノファイバー。
【請求項３３】
請求項32に記載の平板状ナノファイバーを少なくとも２個含む複合織り込み膜。
【請求項３４】
薬剤として使用するための請求項1〜29のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む自己組織化ペプチド重合体。
【請求項３５】
組織再生の足場として使用するための請求項1〜29のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む自己組織化ペプチド重合体。
【請求項３６】
前記組織は中枢神経系の組織である、請求項35に記載の自己組織化ペプチド重合体。
【請求項３７】
バイオマテリアルとして、及び細胞培養支持層として使用するための請求項１〜２９のいずれか１項に記載の自己組織化ペプチド。
【請求項３８】
以下の工程を含む、バイオマテリアル機能化用のヘプタペプチド又はＳＡＰ配列の少なくとも１個を選択及び同定するための方法：
（ａ）複数のペプチドを発現するバクテリオファージライブラリーを細胞と接触させる工程；
（ｂ）非結合バクテリオファージを除去する工程；
（ｃ）結合バクテリオファージによって提示されたペプチドを同定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で同定されたペプチドとスペーサー領域及びバックボーン領域とを連結する工程。
【請求項３９】
前記工程（ａ）の細胞が、神経幹細胞、内皮細胞、ニューロン、骨芽細胞、造血性幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、角化細胞、肝臓前駆細胞、肝細胞、胚性及び体性幹細胞、結腸幹細胞、筋細胞並びに心筋細胞からなる群から選ばれる、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程(a)の細胞は神経幹細胞である、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＳＡＰ配列は以下からなる群から選ばれる、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法：
配列番号16:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号17:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号18:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号19:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号20:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号21:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号22:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号23:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号24:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号25:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号26:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号27:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号28:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号29:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号30:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号31:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号32:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号33:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号34:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号35:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号36:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号37:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号38:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号39:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号40:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号41:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号42:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号43:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号44:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号45:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号46:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号47:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号48:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号49:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号50:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号51:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号52:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号53:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号54:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号55:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号56:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号57:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号58:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号59:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号60:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号61:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号62:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号63:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号64:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号65:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号66:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号67:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号68:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号69:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号70:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号71:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号72:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号73:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号74:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号75:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH。
【請求項４２】
神経幹細胞用マーカーとして使用するための請求項１に記載のヘプタペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療用バイオマテリアルを開発するためなど、広範囲の生医学分野の応用に使用するためのハイドロゲルを得るのに適した機能性自己組織化ペプチドの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞置換は、内因的な再生メカニズムによって欠損した細胞の機能を取って代えることができない中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を再生するための重要な工程である。再生医療の最も重要な目的のうちの１つは、移植及びインビトロ培養中で表現型及び生物活性を維持する標準化され、かつ、生存した細胞個体群を得ることにある。様々な細胞が組織工学に使用されている。
【０００３】
初期細胞は患者の組織に由来し、免疫拒絶を回避する場合がある。しかし、一般に、それらは有糸分裂後のものであり、したがって限定的な増殖可能性を特徴とする；さらに、培養中の増殖期間中に、該細胞は脱分化し、及び不適当な表現型の特性を獲得し得る（非特許文献１）。これらの限定により、幹細胞は、成熟初期細胞に典型的なほとんどの欠点を解決する点でそれらの潜在能力について研究されている。
【０００４】
成長中の成人の脳における神経性能力を有する神経幹細胞（ＮＳＣ）（非特許文献２）の発見は、損傷を受けた神経系を修復する新しい可能性を高めている（非特許文献３−５）。それらの潜在能力に係わらず、細胞移植治療の成功は、幹細胞の単離及び分化に対するプロトコールによって影響を受けるだけではなく、影響を受けた組織に機能的に統合するために細胞を移植し、及び誘導する方法にも依存する。
【０００５】
細胞は自然にインビボで三次元（３Ｄ）微環境に位置し、そこでは細胞は、他の細胞や細胞間マトリックス（ＥＣＭ）によって囲まれる。その成分：コラーゲン、エラスチン又はラミニンは細胞ホメオスタシスを制御する特異的生物活性モチーフと共にナノ構造体（すなわち、ファイバー、トリプルへリックスなど）中で組織化される。
【０００６】
幹細胞移植の成功潜在性は、創造される微環境によってのみ保証され得る。また、最適なモチーフを有する３Ｄ足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）のある状態は、該足場に播かれる特定種の幹細胞の分化及び生存を刺激することができ、及び組織再生を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ポラック，Ｊ．Ｍ．；ビショップ，Ａ．Ｅ．，幹細胞及び組織工学：過去，現在，及び未来．ＡｎｎＮ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００６，１０６８，３５２−６６．
【非特許文献２】ワイス，Ｓ．；レイノルズ，Ｂ．Ａ．；ヴェスコーヴィ，Ａ．Ｌ．；モルシード，Ｃ．；クレイグ，Ｃ．Ｇ．；ヴァン  デル  クーイ，Ｄ．，哺乳類の前脳に神経幹細胞はあるか？  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９６，１９，３８７−９３．
【非特許文献３】カン，Ｈ．Ｃ．；キム，Ｄ．Ｓ．；キム，Ｊ．Ｙ．；キム，Ｈ．Ｓ．；リム，Ｂ．Ｙ．；キム，Ｈ．Ｄ．；リー，Ｊ．Ｓ．；イユン，Ｂ．Ｌ．；キム，Ｄ．Ｗ．，思春期ラットの全体的な虚血脳内への胚性幹細胞に由来する神経前駆体の移植後の行動改善．Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ  ２００９．
【非特許文献４】チャン，Ｐ．；リ，Ｊ．；リウ，Ｙ．；チェン，Ｘ．；カン，Ｑ．；チャオ，Ｊ．；リ，Ｗ．，ヒト神経幹細胞移植はアポトーシスを減じ、かつ、ラットの脳虚血後の神経学的機能を改善する．Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００９，５３，１１８４−９１．
【非特許文献５】プルチノ，Ｓ．；クアットリニ，Ａ．；ブランビラ，Ｅ．；グリッティ，Ａ．；サラニ，Ｇ．；ディナ，Ｇ．；ガリ，Ｒ．；デル  カロ，Ｕ．；アマディオ，Ｓ．；ベルガミ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，成人神経球の注入は多発性硬化症の慢性モデルの回復を誘導する．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２２，６８８−９４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
必要性及び重要性は、特異的な細胞−支持層相互作用を制御し、及び仕向けることができ、かつ、宿主組織内の幹細胞の、移植での、適切な統合を保証する、３Ｄ支持体を提供する合成微環境を作成する足場の開発についてますます感じられる。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、改善された自己組織化ペプチドの開発並びにバイオマテリアル及び組織再生用足場としてのそれらの使用であり、それらは移植中の細胞置換療法に関連する不利益を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下を含む自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）に関する：
−以下を含む群から選ばれるヘプタペプチドドメイン：
-FAQRVPP-  配列番号1
-QHLPRDH-  配列番号2
-SSLSVND-  配列番号3
-YIIPMHD-  配列番号4
-SLPKLPP-  配列番号5
-TPLSSHS-  配列番号6
-SASHWQI-  配列番号7
-LQAIPRN-  配列番号8
-YRMPIWP-  配列番号9
-KLPGWSG-  配列番号10
-HAIYPRH-  配列番号11
-GETRAPL-  配列番号12
-ALTPWAF-  配列番号13
-GKPMPPM-  配列番号14
-SILPYPY-  配列番号15
−スペーサー領域；及び
−バックボーン領域。
【００１１】
したがって、本発明は、自己組織化ペプチド（ＳＡＰ又はＳＡＰｅｐｔｉｄｅ）の新規な群に関する。ここで、前記ＳＡＰは、ヘプタペプチドドメイン、スペーサー領域及びバックボーン領域を含むペプチドであり、かつ、任意にアセチル化（Ａｃ）され、及びアセチル化されていない。
【００１２】
本発明に係るＳＡＰの好ましい態様は、以下からなる群から選ばれるＳＡＰである：
X-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-Y;及び
X-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-Y。
（式中、ＸはＮＨ２又はアセチル化されており（Ａｃ）、及びＹはＣＯＮＨ２又はＣＯＯＨである。）
【００１３】
本発明の目的について、各ＳＡＰは対応する配列番号を有し、下記の詳細な説明で示されているとおりである。
【００１４】
有利なことに、より好ましい実施態様では、本発明は以下からなる群から選ばれるＳＡＰに関する：
配列番号16:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号17:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号18:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号19:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号20:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号21:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号22:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号23:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号24:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号25:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号26:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号27:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号28:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号29:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号30:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号31:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号32:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号33:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号34:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号35:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号36:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号37:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号38:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号39:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号40:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号41:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号42:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号43:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号44:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号45:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号46:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号47:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号48:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号49:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号50:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号51:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号52:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号53:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号54:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号55:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号56:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号57:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号58:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号59:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号60:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号61:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号62:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号63:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号64:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号65:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号66:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号67:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号68:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号69:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号70:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号71:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号72:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号73:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号74:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号75:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明に係る自己組織化ペプチド及びハイドロゲル化試薬を含むハイドロゲルである。
【００１６】
本発明のさらなる別の態様は、本発明に係る自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む自己組織化ペプチド重合体である。
【００１７】
別の実施態様では、本発明は、本発明に係る自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む平板状ナノファイバーを提供する。
【００１８】
さらなる別の実施態様では、本発明は、少なくとも２個の本発明に係る平板状のナノファイバーを含む複合織り込み膜を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様は、薬剤として使用するための、本発明に係る自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む自己組織化ペプチド重合体である。
【００２０】
本発明の別の態様は、組織再生の足場として使用するための、本発明に係る自己組織化ペプチドを少なくとも２個含む自己組織化ペプチド重合体である。
【００２１】
本発明のさらなる別の態様は、バイオマテリアルとして使用するための、本発明に係る自己組織化ペプチドである。
【００２２】
本発明のさらなる別の態様は、神経幹細胞（ＮＳＣ）用マーカーとして使用するための、本発明に係るヘプタペプチドである。
【００２３】
本発明のさらなる別の態様は、以下の工程を含む、バイオマテリアル機能化用のヘプタペプチド又はＳＡＰ配列の少なくとも１個を選択及び同定するための方法を提供する：
（ａ）複数のペプチドを発現するバクテリオファージライブラリーを細胞と接触させる工程；
（ｂ）非結合バクテリオファージを除去する工程；
（ｃ）結合バクテリオファージによって提示されたペプチドを同定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で同定されたペプチドとスペーサー領域及びバックボーン領域とを連結する工程。
【発明の効果】
【００２４】
有利なこと、本発明に係る方法は、ある配列番号、配列番号１６から配列番号７５までによって上記された機能性ＳＡＰを選択及び同定するための方法である。
【００２５】
さらに、本発明に係る方法は、バイオマテリアルに対してアドホックな機能化、特に再生されるべき特定の組織や移植されるべき特定の細胞に対するＳＡＰを開発することを可能にする。
【００２６】
本発明の詳細な説明においてさらに述べられるように、本発明の自己組織化ペプチドは、バイオマテリアルの開発に有用であるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の特性及び利点は、以下に報告されている詳細な説明、実例的かつ非限定的な目的のために挙げられた実施例及び添付された図１−９から明らかになる。図１−９は以下のとおりである：
【００２８】
【図１Ａ】図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、ＮＳＣ分化に関して選択されたヘプタペプチドへの暴露の効果を示す。図１（Ａ）において、ニューロン個体群の増加が定量される。
【図１Ｂ】図１（Ｂ）は、実施例３において記載されたヘプタペプチドへ暴露したときのカルトレックス及びラミニン支持層上で培養したＮＳＣから得られたβＩＩＩチューブリンに対する分化ニューロンマーカーを示す。
【図２】図２：実施例５で記載されているとおりの試験されたＳＡＰの選択性の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。すべての合成されたペプチドは、ＬＤＬＫ１２ペプチドのみの標準的なクロス−β−シート構造を保存するＮ末端において有効な機能化の仮説と一致する平板状のナノファイバー形態を特徴とする。
【図３Ａ】図３Ａ：実施例６に記載されているとおりの本発明に係る自己組織化ハイドロゲルの選択性の保存（Ｇ’）及び損失（Ｇ’’）モジュールを評価する周波数掃引試験を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例６に記載されているとおりの異なる濃度（１％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ）で選択されたＳＡＰの保存（Ｇ’）及び損失（Ｇ’’）モジュールを評価する周波数掃引試験を示す。
【図４】図４：実施例７に記載されているとおりのＳＡＰの選択性の円偏光二色性による二次構造特性化。スペクトルは各試料当たり３つの走査で平均化されている。
【図５Ａ−Ｂ】図５（Ａ）及び図５（Ｂ）は、それぞれマウス及びヒトＮＳＣの形態を示す；実施例８で記載されているように、インビトロで７日（ＤＩＶ）、合成ＳＡＰの選択性に関して培養した。
【図５Ｃ−Ｄ】図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）は、実施例８で記載されているように、それぞれマウス及びヒトＮＳＣに対する増殖アッセイのグラフである。
【図６Ａ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｂ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｃ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｄ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｅ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｆ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｇ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図６Ｈ】図６：マウス（Ａ、Ｄ）及びヒト神経幹細胞（Ｅ、Ｈ）の神経分化。ニューロン（Ａではマウス；Ｅではヒト）、星状細胞（Ｂではマウス；Ｆではヒト）及び乏枝神経膠細胞（Ｃではマウス；Ｇではヒト）の定量化が示される；実施例８に記載されているように、統計的な有意差は各グラフの隣の表中に示される。
【図７Ａ】図７：以下の強度を特徴とする、Ａｃ−ＦＡＱ自己組織化足場に関してのマウスＮＳＣの神経分化：１００Ｐａ、５００Ｐａ及び１０００Ｐａ。実施例８で記載されているように、ニューロン性及び星状膠性個体群は、図７（Ａ）及び図７（Ｂ）においてそれぞれ定量及び表わされている。
【図７Ｂ】図７：以下の強度を特徴とする、Ａｃ−ＦＡＱ自己組織化足場に関してのマウスＮＳＣの神経分化：１００Ｐａ、５００Ｐａ及び１０００Ｐａ。実施例８で記載されているように、ニューロン性及び星状膠性個体群は、図７（Ａ）及び図７（Ｂ）においてそれぞれ定量及び表わされている。
【図８Ａ】図８（Ａ）バイオマテリアルの移送：脊髄はＴ９−Ｔ１０レベルに暴露され、次いで実施例７で記載されているとおりに、損傷（Ａ１）後直ちに、ハミルトン注射器（Ａ２）を使用して、動物にＡｃ−ＦＡＱ又は賦形剤単独を注入した。
【図８Ｂ】図８（Ｂ）後肢運動性回復は、実施例９で記載されているとおりに、２１点ＢＢＢスケールを用いて、Ａｃ−ＦＡＱ処理ラット及びコントロールにおいて評価された。６週間後、示されているＡｃ−ＦＡＱで処理された動物は、コントロールにおけるよりも、著しく改善された運動性回復を表わした。
【図８Ｃ】図８（ｃ）食塩水注入（Ｃ１）及びＡｃ−ＦＡＱ処理（Ｃ２）ラットにおける損傷規模の測定は、実施例１０に記載されているとおりにヘマトキシリン／エオシンで染色された縦断面上で行なわれた。スケールバー＝８００μｍ。
【図８Ｄ】図８（Ｄ）食塩水注入（Ｄ１）及びＡｃ−ＦＡＱ処理（Ｄ２）ラットにおけるＧＡＰ４３陽性ファイバーの測定は、実施例１０で記載されているとおりに、免疫蛍光染色後に縦断面上で行なわれた。スケールバー：（Ｄ１）及び（Ｄ２）＝４００μｍ、（Ｄ３）＝２００μｍ。核はＤＡＰＩで逆染色された。
【図８Ｅ】図８（Ｅ）実施例８に記載されているとおりに、免疫染色された縦断面における食塩水注入（１）及びＡｃ−ＦＡＱ処理（２）ラットにおけるマクロファージ浸潤。スケールバー：（１）及び（２）＝４００μｍ、（３）＝１００μｍ。核はＤＡＰＩで逆染色された。値は平均±ＳＥＭを表わす。有意性記号：＊  ｐ＜０．０５，＊＊  ｐ＜０．００５。矢印は、嚢胞中への注入ＳＡＰの推定上の存在を示す。
【図９】図９（Ａ）実施例１０で記載されているとおりに、Ａｃ−ＦＡＱ処理動物の損傷部位中へのＧＡＰ−４３及びβＩＩＩ陽性ファイバーの存在評価。ＧＡＰ−４３（灰色矢）及びβＩＩＩ（白色矢）に対する免疫蛍光法は、全てのＧＡＰ−４３陽性ファイバーもまたβＩＩＩを発現することを示した（図を統合する）。ほとんどのＧＡＰ−４３＋ファイバーは嚢胞内で（＊＝嚢胞）、又は嚢胞境界に密接して（「＋」で印付けされている）検出された。核はＤＡＰＩで逆染色された。図９（Ｂ）注射部位内で発見されたＡｃ−ＦＡＱを浸潤するファイバーは、ＧＡＰ−４３（灰色矢）及びβＩＩＩチューブリン（白色矢）の両方で陽性だった。核はＤＡＰＩで逆染色された。スケールバー：＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明に係る自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）は以下を含む：
以下を含む群から選ばれるヘプタペプチドドメイン：
-FAQRVPP-  配列番号1
-QHLPRDH-  配列番号2
-SSLSVND-  配列番号3
-YIIPMHD-  配列番号4
-SLPKLPP-  配列番号5
-TPLSSHS-  配列番号6
-SASHWQI-  配列番号7
-LQAIPRN-  配列番号8
-YRMPIWP-  配列番号9
-KLPGWSG-  配列番号10
-HAIYPRH-  配列番号11
-GETRAPL-  配列番号12
-ALTPWAF-  配列番号13
-GKPMPPM-  配列番号14
-SILPYPY-  配列番号15
−スペーサー領域；及び
−バックボーン領域。
【００３０】
本発明の目的に対して、ヘプタペプチドドメイン又はヘプタペプチドはあるアミノ酸配列を有し、及び下記のとおりの対応する配列番号を有する：
配列番号１は次のアミノ酸配列に対応する：FAQRVPP;
配列番号２は次のアミノ酸配列に対応する：QHLPRDH;
配列番号３は次のアミノ酸配列に対応する：SSLSVND;
配列番号４は次のアミノ酸配列に対応する：YIIPMHD;
配列番号５は次のアミノ酸配列に対応する：SLPKLPP;
配列番号６は次のアミノ酸配列に対応する：TPLSSHS;
配列番号７は次のアミノ酸配列に対応する：SASHWQI;
配列番号８は次のアミノ酸配列に対応する：LQAIPRN;
配列番号９は次のアミノ酸配列に対応する：YRMPIWP;
配列番号１０は次のアミノ酸配列に対応する：KLPGWSG;
配列番号１１は次のアミノ酸配列に対応する：HAIYPRH;
配列番号１２は次のアミノ酸配列に対応する：GETRAPL;
配列番号１３は次のアミノ酸配列に対応する：ALTPWAF;
配列番号１４は次のアミノ酸配列に対応する：GKPMPPM;
配列番号１５は次のアミノ酸配列に対応する：SILPYPY。
【００３１】
上記定義されたアミノ酸配列は、１文字ＩＵＰＡＣアミノ酸コードを使用する（つまり、Ｇはアミノ酸のグリシンに相当し、Ｐはアミノ酸のプロリンに相当する）。
【００３２】
好ましい実施態様では、本発明は以下を含む自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）に関する：
−以下を含む群から選ばれるヘプタペプチドドメイン：
-FAQRVPP-  配列番号1
-QHLPRDH-  配列番号2
-SSLSVND-  配列番号3
-YIIPMHD-  配列番号4
-SLPKLPP-  配列番号5
-TPLSSHS-  配列番号6
-SASHWQI-  配列番号7
-LQAIPRN-  配列番号8
-YRMPIWP-  配列番号9
-KLPGWSG-  配列番号10
-HAIYPRH-  配列番号11
-GETRAPL-  配列番号12
-ALTPWAF-  配列番号13
-GKPMPPM-  配列番号14
-SILPYPY-  配列番号15
−スペーサー領域；及び
−バックボーン領域。
【００３３】
より好ましい態様によれば、本発明の自己組織化ペプチドのスペーサー領域は、１〜７個のグリシンのアミノ酸単位（Ｇ）を含む。
【００３４】
好ましくは、前記スペーサー領域は３個のグリシンのアミノ酸単位（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ又はＧＧＧ）を含む。スペーサー領域はさらに１〜７個のアラニンのアミノ酸単位（Ａ）を含んでもよいが、グリシンは、他のすべてのアミノ酸の場合のような炭素ではなく、その側鎖として水素を含むことから、そのより高い配座柔軟性のために好ましい。特に、自己組織化核及び機能的モチーフの間のより長いグリシン−スペーサーの挿入によって、ＳＡＰｅｐｔｉｄｅ機能化の有効性は改善され、それにより、細胞生物学のインビトロでの研究やインビボでの再生治療の応用に対する良好なツールが提供される。
【００３５】
バックボーン領域は１個以上の自己組織化アミノ酸繰返し又はアミノ酸繰返し単位又は自己組織化アミノ酸繰返し単位を含む。
【００３６】
いかなる理論に結び付けられないが、本発明者は、本発明に係るＳＡＰが自己組織化であり、したがってバックボーン領域の自己組織化の特徴により、自発的な組織化を受けると信じる。
【００３７】
本発明に係るＳＡＰは、疎水性の非極性アミノ酸の優位を有するペプチドであるという唯一の共通の発明概念によって識別及び結びつけられている。実際に本発明に係るＳＡＰは、ヘプタペプチドドメイン、ＳＡＰの配座柔軟性に寄与するスペーサー領域及びバックボーン領域において上記優位を有し、それは疎水性バランスが強いことによって、安定性に寄与し、及び多くの可能な機能化を有し得るナノ構造体を形成することを可能にする。本発明に係るＳＡＰを結び付け、かつ、先行技術に対して貢献する技術的関係性は、機能的モチーフを発見した方法論、及び現在請求されているＳＡＰの特有の構造において理解し得る。
【００３８】
本発明の好ましい態様は、バックボーン領域がＬＤＬＫ、ＫＦＥＦ、ＲＡＤＡ、ＬＤＬＤ及びＬＫＬＫからなる群から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸繰返し単位を含む、ＳＡＰに関する。
【００３９】
本発明において、用語「ＬＤＬＫアミノ酸繰返し単位」又は「ＬＤＬＫアミノ酸繰返し」については、ＳＡＰのバックボーン領域中で繰返される単位が意図される。１個のＬＤＬＫ繰返し又は繰返し単位はＬｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ又はＬＤＬＫ、２個のＬＤＬＫ繰返し単位は次のアミノ酸である：ＬＤＬＫＬＤＬＫ。
【００４０】
本発明において、用語「ＫＦＥＦアミノ酸繰返し単位」又は「ＫＦＥＦアミノ酸繰返し」については、ＳＡＰのバックボーン領域中で繰返される単位が意図される。２個のＫＦＥＦ繰返し単位は次のアミノ酸である：ＫＦＥＦＫＦＥＦ。
【００４１】
より好ましい態様によれば、バックボーン領域は少なくとも２個のＬＤＬＫ、ＲＡＤＡ、ＬＤＬＤ、ＬＫＬＫ若しくはＫＦＥＦアミノ酸繰返し、又は１個の−GGGPFSSTKT−、-WGGGPFSSTKT、-GGGPFSSTDT、-GGGPFSSTNT、-GGGPFSSTET、-GGGPFSSTQT、-GGGAFSSTKT、-GGGPFSETKT、-GGGAFSSTKTGRGD、-GGGPFSSTRT、-GGGAFASTKT、-GGGGGPFSSTKT、-GGGPWSSTKT、-GGG(プロピルアミン)FSSTKT、-WGGGAFASTKT、-WGGGAFSSTKT、-GGGKFSSTPT、-GGGPKSSTFT、-GGGPFSSKTT、-GGGPFSSTTK-若しくは-PFSSTKT繰返しを含む。
【００４２】
好ましい態様によれば、バックボーン領域は少なくとも２個のＬＤＬＫ（Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ又はＬＤＬＫ）アミノ酸繰返しを含む。
【００４３】
好ましくは、前記バックボーン領域は３個のＬＤＬＫアミノ酸繰返し（ＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬＫ又は（ＬＤＬＫ）３）を含む。
【００４４】
好ましくは、前記バックボーン領域は４個のＬＤＬＫアミノ酸繰返し（ＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬＫ又は（ＬＤＬＫ）４）を含む。
【００４５】
ＬＤＬＫバックボーン領域は、疎水性バランスがより強いことを特徴とし、より短いバックボーン配列の合成（生産コストを低下させ、かつ、合成収率を増加する）及びより安定的な自己組織化ナノ構造体を可能にし、多数の機能化の可能性を可能にさせる。特に、ＬＤＬＫバックボーン領域は、次の代替からなる：１個の非極性アミノ酸、１個の酸性アミノ酸、１個の非極性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を有する末端。
【００４６】
バックボーン領域のこの特有の構造は、ＳＡＰが容易にハイドロゲルを形成することを可能にするという利点を有する。
【００４７】
本発明に係るＳＡＰの好ましい形態は、以下からなる群から選ばれるＳＡＰである：
X-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
X-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-Y;及び
X-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-Y;
（式中、ＸはＮＨ２又はアセチル化されており（Ａｃ）、かつ、ＹはＣＯＮＨ２又はＣＯＯＨである。）
【００４８】
有利なことに、本発明の好ましいＳＡＰは、あるアミノ酸配列を有し、かつ、以下を含む群から選ばれる対応する配列番号を有する：
配列番号16は次に相当する:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号17は次に相当する:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号18は次に相当する:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号19は次に相当する:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号20は次に相当する:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号21は次に相当する:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号22は次に相当する:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号23は次に相当する:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号24は次に相当する:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号25は次に相当する:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号26は次に相当する:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号27は次に相当する:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号28は次に相当する:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号29は次に相当する:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号30は次に相当する:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号31は次に相当する:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号32は次に相当する:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号33は次に相当する:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号34は次に相当する:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号35は次に相当する:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号36は次に相当する:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号37は次に相当する:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号38は次に相当する:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号39は次に相当する:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号40は次に相当する:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号41は次に相当する:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号42は次に相当する:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号43は次に相当する:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号44は次に相当する:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号45は次に相当する:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号46は次に相当する:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号47は次に相当する:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号48は次に相当する:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号49は次に相当する:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号50は次に相当する:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号51は次に相当する:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号52は次に相当する:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号53は次に相当する:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号54は次に相当する:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号55は次に相当する:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号56は次に相当する:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号57は次に相当する:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号58は次に相当する:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号59は次に相当する:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号60は次に相当する:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号61は次に相当する:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号62は次に相当する:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号63は次に相当する:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号64は次に相当する:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号65は次に相当する:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号66は次に相当する:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号67は次に相当する:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号68は次に相当する:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号69は次に相当する:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号70は次に相当する:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号71は次に相当する:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号72は次に相当する:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号73は次に相当する:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号74は次に相当する:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号75は次に相当する:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
【００４９】
上記で示されているとおり、アミノ酸配列は、１文字ＩＵＰＡＣアミノ酸コードを使用する。
【００５０】
これらのＳＡＰは合成起原であり、したがって、大量に製造するのが簡単である。また、これらは、化学的及び生物学的に修飾することが可能である。上記修飾は、超構造促進細胞接着及び組織再生を構築することを可能にする。
【００５１】
本発明のＳＡＰは、組織拒絶、移植中で危険性が高い病原体移送の欠如、これらの三次元構造による選択的かつ緩慢な薬物放出、生物活性モチーフを有する容易な機能化という問題を克服することを可能にする、生体適合性が高いという利点を提供し、したがってこれらのＳＡＰは異なる応用におけるそれらの使用において非常に用途が広がることを可能にする。
【００５２】
さらなる実施態様では、これらのＳＡＰは、柔和な溶解条件において自己組織化し、及び容易にハイドロゲルを形成する、ペプチドに基づく足場である。そのようなハイドロゲル化は、ナノファイバー、ナノチューブ及びナノ粒子を生じさせ得る組織化超分子会合の形成に結びつく、水素結合、疎水性、静電気性及びπ−π相互作用を含む、水中での非共有結合的な相互作用の形成によってもたらされる。
【００５３】
そのようなナノ構造化された材料は、さらに容易な機能化の交差βシート自己組織化ナノ構造体を提供し、及び組織再生を引き起こすことに適した微環境を作り出すことができる、親水性−疎水性残留物を表示する。これらのＳＡＰは、合成起原であるという別の利点があり、したがって、移植に先立つ精製によって除去することができない不確定の要因による炎症反応及び病原体伝播を誘導する傾向、異なるロット間の多様性の有意な程度及び大規模起源の安定供給の難しさのような天然ペプチドで見られる欠点を有していない。
【００５４】
いかなる理論に結び付けられることを望まないが、これらのＳＡＰは、低分子量自己組織化ペプチドであり、したがって組織化かつ合成するのがより簡便かつ迅速であるという利点を有する。
【００５５】
好ましい実施態様では、本発明に係る自己組織化ペプチドは、配列番号１、２及び３からなる群から選ばれるヘプタペプチドドメインを含む。
【００５６】
より好ましい実施態様では、本発明に係る自己組織化ペプチドは、ヘプタペプチドドメインの配列番号１を含む。
【００５７】
別の態様では、本発明は、Ｎ末端が任意に修飾されることを特徴とする自己組織化ペプチドを提供する。
【００５８】
さらなる別の態様では、本発明は、前記Ｎ末端の修飾がアセチル化（Ａｃ）であることを特徴とする自己組織化ペプチドを提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、Ｃ末端が任意に修飾されることを特徴とする自己組織化ペプチドを提供する。
【００６０】
さらなる別の態様では、本発明は、前記Ｃ末端がＣＯＮＨ２基を有することを特徴とする自己組織化ペプチドを提供する。
【００６１】
好ましい態様では、該発明は、次からなる群から選ばれる自己組織化ペプチドを提供する：
NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号16;
Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号17;
NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2   配列番号18;
Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号19;
NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号20;
Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号21;
NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2   配列番号34;
Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号35;
NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号46;
Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号47;
NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号48;
Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号49;
NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号50;
Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号51;
NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号64;及び
Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号65。
【００６２】
より好ましい態様では、該発明は、次からなる群から選ばれる自己組織化ペプチドを提供する:
NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号16;
Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2  配列番号17;
NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号46;及び
Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH  配列番号47。
【００６３】
好ましいＳＡＰは、ＮＳＣ増殖の増強された刺激や、マウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）及びヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）のニューロン及び乏枝神経膠の増強された分化を示した。配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６４及び配列番号６５からなる群から選ばれる好ましいＳＡＰ、より好ましくは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４６及び配列番号４７からなる群から選ばれるＳＡＰ、及びさらに好ましくは、配列番号１６及び配列番号１７からなる群から選ばれるＳＡＰは、激しく損傷したラットの運動回復の改善を示し、及びＳＣＩに続く生理学的炎症反応を変更せず、及びインビボでの軟化した神経組織内の神経再生を増強した。
【００６４】
したがって、本発明に係るＳＡＰは、移植された細胞の生存性を増強し、宿主の組織成長を刺激し、及び再生後のサイトカインの制御された放出を得ることを可能にする。さらに、ＳＡＰは、有利なことに、他の応用中の止血剤溶液として使用することができる。
【００６５】
本発明の別の態様は、本発明に係る自己組織化ペプチド及びゲル化試薬を含むハイドロゲルである。
【００６６】
これらの機能性ハイドロゲルは、余分な細胞内マトリックスの線維性成分に非常に似るようになるという潜在性を有し、該ハイドロゲルを二次元及び三次元の細胞培養を支持し、並びにヒト及びマウスＮＳＣ増殖及び分化を促進する理想的な候補物とする。
【００６７】
本発明の別の態様は、これらの機能性ハイドロゲルがインビトロでのヒト結腸幹細胞及びヒト結腸癌幹細胞の増殖及び／又は分化を増強するために使用される場合があり、適切な物理的柔軟性微環境及び細胞腺窩形成用の化学的機能性を提供する。
【００６８】
本発明のさらなる別の態様は、本発明に係る少なくとも２個の自己組織化ペプチドを含む自己組織化ペプチド重合体である。
【００６９】
別の実施態様では、該発明は、本発明に係る少なくとも２個の自己組織化ペプチドを含む平板状ナノファイバーを提供する。
【００７０】
さらなる別の実施態様では、該発明は、本発明に係る少なくとも２個の平板状ナノファイバーを含む複合織り込み膜を提供する。
【００７１】
本発明の別の態様は、薬剤として使用するための、本発明に係る少なくとも２個の自己組織化ペプチドを含む自己組織化ペプチド重合体である。
【００７２】
本発明の別の態様は、組織再生中の足場として使用するための、本発明に係る少なくとも２個の自己組織化ペプチドを含む自己組織化ペプチド重合体である。
【００７３】
本発明に係るＳＡＰは、有利なことに、効果的な組織工学及び外傷、疾病又は欠陥によって損なわれた運動制御を補助又は増進するバイオマテリアル及び生物学的補綴の開発に対する複合重合体の開発に使用することができる。
【００７４】
本発明に係る自己組織化ペプチド重合体は、前記組織がＣＮＳの組織である組織再生中の足場として使用する。
【００７５】
神経のようなＣＮＳの組織は、卒中、多発性硬化症、糖尿病、脊椎披裂及びポリオのような、神経の断絶又は疾患を引き起こす可能性がある外傷によって損傷を受ける場合がある。最も劇的かつ深刻な神経損傷が脊髄に生じる。
【００７６】
神経損傷に対する治療法はないので、本発明のＳＡＰは、脊髄損傷の再生などの再生医療応用及び神経再生用に適合した足場を開発するのに使用されるという利点がある。
【００７７】
本発明のさらなる別の態様は、バイオマテリアルとして使用するための、本発明に係る自己組織化ペプチドである。
【００７８】
いかなる理論に結び付けられないが、バイオマテリアルは、単独又は複雑系の一部として、生物系の要素との相互作用の制御によって、任意の治療又は診断手順の経過に仕向けるのに使用される態様をとるために設計されている物質又は生物系と相互作用する任意の事項、表面又は構造体である。
【００７９】
本発明のさらなる別の態様は、神経幹細胞（ＮＳＣ）用マーカーとして使用するための本発明に係るヘプタペプチドである。そのようなヘプタペプチドは、以下を含む群から選ばれる：
-FAQRVPP-  配列番号1
-QHLPRDH-  配列番号2
-SSLSVND-  配列番号3
-YIIPMHD-  配列番号4
-SLPKLPP-  配列番号5
-TPLSSHS-  配列番号6
-SASHWQI-  配列番号7
-LQAIPRN-  配列番号8
-YRMPIWP-  配列番号9
-KLPGWSG-  配列番号10
-HAIYPRH-  配列番号11
-GETRAPL-  配列番号12
-ALTPWAF-  配列番号13
-GKPMPPM-  配列番号14
-SILPYPY-  配列番号15。
【００８０】
マーカーは、幹細胞個体群を特徴付けるために頻繁に使用され、及び幹細胞を初めに同定し及び単離するための有用なツールを提供する。本発明に係るヘプタペプチド（機能的モチーフ）は、神経幹細胞個体群を同定し、幹細胞研究や再生医療に対する有用な品質であることが分かっている。
【００８１】
本発明のさらなる別の態様は、以下の工程を含む、バイオマテリアル機能化、配列用の少なくとも１個のＳＡＰ又はヘプタペプチドの選択及び同定のための方法を提供する：
（ａ）複数のペプチドを発現するバクテリオファージライブラリーを細胞と接触させる工程；
（ｂ）非結合バクテリオファージを除去する工程；及び
（ｃ）結合バクテリオファージによって提示されたペプチドを同定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で同定されたペプチドとスペーサー領域及びバックボーン領域とを連結する工程。
【００８２】
本発明に係る方法は、再生されるべき特定の組織又は移植されるべき特定の細胞に対するバイオマテリアル、特にＳＡＰ及びヘプタペプチド用のアドホック機能化を開発することを可能にする。さらに、ＳＡＰは、ファージ標的化再生後サイトカインと混合され、遅滞性ドラッグデリバリー、移植された細胞生着及び増殖中の宿主組織を発展させる相乗的に統合された組織工学アプローチを可能にするかもしれない。
【００８３】
本発明に係る方法は、インビトロで浮遊状態にある、及び／又は接着して培養される細胞の両方と共に使用されてもよい。
【００８４】
本発明に係る技術は、その表面上に短鎖ペプチドを提示するバクテリオファージのライブラリーを使用する。標的細胞とのインキュベーションに続く洗浄後に、特定の細胞表面分子に対して親和性が高い配列を発現するファージは、標的細胞によって捕らえられ、及び回収を通じて選択される。この方法は、腫瘍標的だけでなく、再生医療応用（軟骨、硬骨、皮膚、肝臓などの再生）に対する多数の細胞型（細胞移植及び／又は移植片への増強された宿主組織応答）及びサイトカイン（遅滞性又は誘発型薬剤放出）に対するバイオマテリアル機能化について新規な細胞リガンドを同定するかもしれない。
【００８５】
本発明の好ましい態様は、前記工程（ａ）の細胞が神経幹細胞、内皮細胞、ニューロン、骨芽細胞、造血性（ｈｅｍｏｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞（ｃｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、角化細胞、肝臓前駆（ｐｒｏｇｅｎｔｉｏｒ）細胞、結腸幹細胞、肝細胞、胚性及び体性幹細胞、筋細胞及び心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｉｏｃｙｔｅｓ）からなる群から選ばれる、少なくとも（ａ  ｌｅａｓｔ）１個のＳＡＰ配列の選択及び同定のための方法を提供する。
【００８６】
本発明のより好ましい態様は、前記工程（ａ）の細胞が神経幹細胞である少なくとも１個のＳＡＰ配列の選択及び同定のための方法を提供する。
【００８７】
本発明の好ましい態様は、前記ＳＡＰ配列が次からなる群から選ばれる少なくとも１個のＳＡＰ配列の選択及び同定のための方法を提供する：
配列番号16:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号17:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号18:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号19:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号20:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号21:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号22:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号23:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号24:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号25:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号26:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号27:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号28:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号29:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号30:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号31:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号32:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号33:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号34:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号35:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号36:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号37:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号38:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号39:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号40:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号41:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号42:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;
配列番号43:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2.
配列番号44:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2;及び
配列番号45:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-CONH2
配列番号46:NH2-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号47:Ac-FAQRVPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号48:NH2-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号49:Ac-QHLPRDHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号50:NH2-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号51:Ac-SSLSVNDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号52:NH2-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号53:Ac-YIIPMHDGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号54:NH2-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号55:Ac-SLPKLPPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号56:NH2-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号57:Ac-TPLSSHSGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号58:NH2-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号59:Ac-SASHWQIGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号60:NH2-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号61:Ac-LQAIPRNGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号62:NH2-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号63:Ac-YRMPIWPGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号64:NH2-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号65:Ac-KLPGWSGGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号66:NH2-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号67:Ac-HAIYPRHGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号68:NH2-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号69:Ac-GETRAPLGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号70:NH2-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号71:Ac-ALTPWAFGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号72:NH2-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号73:Ac-GKPMPPMGGGLDLKLDLKLDLK-COOH.
配列番号74:NH2-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH;
配列番号75:Ac-SILPYPYGGGLDLKLDLKLDLK-COOH。
【実施例】
【００８８】
実施例１
神経幹細胞増殖及び分化
マウス及びヒト神経前駆体培養は、以前記載されたとおりに（（６）Ｅｇｆ生成型Ｃｎｓ始原細胞．Ｎｅｕｒｏｎ  １９９３，１１，９５１−６６）確立され、及び展開された。
【００８９】
８週齢のＣＤ−１アルビノマウス線条体の脳室下帯（ＳＶＺ）から単離されたマウス神経前駆細胞は、継代１０で、使用された。ヒトＮＳＣは、以前に記載されたとおりの（４３）概念から、中枢神経系、特にヒト脳１０．５週の大脳皮質及び間脳から単離された。初期組織を得るための手順は、移植に対する欧州ネットワークの指針（ＮＥＣＴＡＲ）に合意している。
【００９０】
細胞増殖（ヒト及びマウス神経幹細胞に対して両方）は、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌである塩基性線維芽細胞増殖因子（ペプロテック、ロッキーヒル、ＮＪからのβ−ＦＧＦ）及び表皮増殖因子（ペプロテックからのＥＧＦ）の存在下で、ＮＳ−Ａ無血清培地（ユーロクローン、アーヴィン、英国）内で達成された。増殖因子を含まない培地は基礎培地として使用された。
【００９１】
マウス及びヒトＮＳＣの大量培養を、神経球を機械的に解離し、及び同じ増殖培地中で、適当な密度（１×１０４細胞／ｃｍ２）で非処理フラスコ中で細胞を４〜５日毎に播くことにより、生成した。細胞数計測及び生存度はトリパンブルー除外を使用して、継代毎に行なわれた。
【００９２】
実施例２
ファージ・バイオパニング
細胞を播く２日前に、マウスＮＳＣを最大の割合の幹細胞を取り除く（ｓｅｅｄ）ために機械的に解離した。
【００９３】
ＮＳＣを、１枚のプレート当たり３００万で、ラミニン被覆１０ｃｍペトリ皿（ファルコン）に播いた。１０ｍｌのβＦＧＦ補充（１０ｎｇ／ｍｌ）神経基礎培地でオーバーナイトでインキュベーションした後、細胞をあらかじめ温めたインキュベーション培地で洗浄した。
【００９４】
Ｐｈ．Ｄ．−７ファージライブラリーが使用され（ニューイングランドバイオラボ）、ＰＩＩＩ、Ｍ１３ファージの小さな外殻タンパク質のＮ末端に融合したランダム７量体ペプチドを有するファージクローンから構成される。
【００９５】
接着しているＮＳＣに対するバイオパニング実験の前に、ラミニン被覆プラスチック表面への親和性を有するファージを除去するために（ネガティブセレクション）、ファージライブラリーをラミニン被覆組織培養ディッシュでインキュベートした。
【００９６】
マウスラミニン（２５μｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＬ）（ロッシュ）を、３７℃で、オーバーナイトでインキュベートした。１０１２ｃｆｕのファージを、ラミニン被覆プラスチック表面（ＮＳＣを接着するために設定）又は単なるプラスチック表面（浮遊状態にあるＮＳＣのために設定）において、あらかじめ温めたインキュベーション培地（０．１％  ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ）において３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、インキュベーション培地及び洗浄バッファー（１％  ＢＳＡ及び０．０５％  ツイーン２０を補充したＤＰＢＳ）の５回洗浄分の全容量を回収し、及び溶出されたファージを、ニューイングランドバイオラボの標準的なプロトコールに述べられているとおりに増幅した。
【００９７】
１０１２ｃｆｕのネガティブ・セレクションされたファージライブラリーを、１０ｍｌのインキュベーション培地中で希釈し、及び接着したＮＳＣ又は浮遊状態のＮＳＣ上にピペットで移した。
【００９８】
３７℃での１時間のインキュベーション後、細胞を、予め温めた洗浄バッファーで５回洗浄し、ファージを結合させた細胞膜（ＭＰ）及び内面化クローン（ＩＰ）を、それぞれ、該細胞を溶出及び／又は溶解することにより、分化産物を独立した複製物から回収した。細胞表面は、室温にて５ｍｌのグリシンバッファー（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを補充した０．２Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ  ２．２））の５分間インキュベーションによりはぎ取った。溶出ファージは、５ｍｌの１Ｍ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ８）で中和し、及び増幅した。
【００９９】
次いで、細胞を、室温で５分間、９ｍｌの溶解バッファー（ＰＢＳ中の０．１％  ＴＥＡ）で溶解した。内面化されたファージを、１ｍｌの１Ｍ  トリス−ＨＣｌバッファーで中和した。
【０１００】
中和したファージを、選択性をモニターするために大腸菌感染によって力価測定した。内面化及び溶出したファージを、別のラウンドの選択に対して別々に増幅した。陽性選択の３つのラウンドを実施した。ラウンド２及び３で、内面化及び溶出したファージのバイオパニングを、関心のあるファージ（つまり、内面化ファージのライブラリーに由来する内面化ファージ）を回収し、及び残存物を廃棄することにより、異なる細胞培養（しかし、同一の培養状態）中で行った。
【０１０１】
バイオパニングの第３ラウンドの後、ファージクローンを、タイタープレートから無作為に選び出し、及びシークエンシングした。ファージの各セット当たり３０のファージプラークを、シーケンシングのために無作為に取り出した。少数のクローンはシークエンシングに成功しなかった。最も高い一致率は、表１Ａで見ることができるとおりに、ＩＰ及びＭＰファージの両方に検出されたＦＡＱＲＶＰＰ（ＩＰに対して５３．５％及びＭＰに対して６２．５％）、ＱＨＬＰＲＤＨ（ＩＰに対して１４．２％及びＭＰに対して８．３％）及びＳＳＬＳＶＮＤ（ＩＰに対して１０．７％及びＭＰに対して４．２％）に対して示された。浮遊状態でＮＳＣに対するパニングの場合には、最も高い一致率は、ＫＬＰＧＷＳＧ（ＭＰに対して４７．３６）、ＧＥＴＲＡＰＬ（ＩＰに対して１４．２８％及びＭＰに対して１０．５２％）及びＨＡＩＹＰＲＨ（ＩＰに対して２８．５７％及びＭＰに対して５．２６％）だった。
【０１０２】
【表１Ａ】
2014514280.tif 000002
【０１０３】
表１Ｂは、浮遊状態で培養されたＮＳＣのバイオパニングの３つのラウンド後に回収したファージの配列を示す。
【０１０４】
【表１Ｂ】
2014514280.tif 000003
【０１０５】
相同性同定については、主要なペプチド配列は、短く、ほぼ正確な一致で整列するＢＬＡＳＴプログラムを使用して、ＮＣＢＩデータベースと比較された。
【０１０６】
完全な相同性のあるタンパク質配列は同定されなかった。しかしながら、いくつかの潜在的に関係性のある相同性は表２Ａ及び表２Ｂにおいて示される：ＦＡＱの場合には、ニューロンの分化に関連がある、微小管−親和性制御キナーゼ１（ＭＡＲＫ１）の一部から、ＱＨＬの場合には、その欠失が初期年齢で致命的な神経学的な異常をもたらす膜間酵素である亜硫酸オキシダーゼのミトコンドリア前駆体にまで、ＳＳＬに対して、いくつかの細胞系中のニューロン分化に影響を及ぼすアクチビンＡタイプ１受容体にまで及ぶ。他方では、ＫＬＰの分画は、主に脳の中で発現され、及び食細胞受容体として機能すると知られているＭＥＧＦ１０タンパク質のいくつかのＦＧＦ様ドメインで見つかり、一方でＧＥＴはカドヘリンＥＧＦ  Ｇ型受容体２用の関連のある相同性を示した。
【０１０７】
【表２Ａ】
2014514280.tif 000004
【０１０８】
【表２Ｂ】
2014514280.tif 000005
【０１０９】
実施例３
インビトロでのＮＳＣ培養物に関する＃ＫＬＰ、＃ＧＥＴ及び＃ＨＡＩ配列の神経効果
ＮＳＣ分化に関するこれらの効果を評価するために、表３にリストされるように、以下の配列が合成された。
【０１１０】
【表３】
2014514280.tif 000006
【０１１１】
本セクションのペプチドは、ＣＥＭリバティー自動化マイクロ波ペプチド合成機を使用して、標準的フルオレニルメトキシカルボニル固相法を用いて０．１ｍｍｏｌ規模で合成された。ＭＢＨＡリンクアミド樹脂（０．５ｍｍｏｌ／ｇ置換）はＣ末端アミドを製造するために使用された；活性化はＤＭＦ中で０．５Ｍ  ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵを用いて行なわれた。次いで、ペプチドを樹脂から切り離し、９５％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％  水及び２．５％  トリイソプロピルシランの９ｍｌを用いて脱保護した。切断したペプチドを沈殿し、冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、及び凍結乾燥し、及び−２０℃で保存する前に、２０〜２５％のアセトニトリル溶液に溶解した。粗ペプチドを分析的及び半調整的なＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ４（サーモ・サイエンティフィック、英国）を装備したウォータース・システムを使用して、逆位相ＨＰＬＣによって分析及び精製した。溶離剤は、水中の０．１％（ｖ／ｖ）  ＴＦＡ（バッファーＡ）及びアセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）  ＴＦＡ（バッファーＢ）だった。ペプチドの同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で確認した。精製後、残留ＴＦＡを抽出するために、０．１Ｍ  ＨＣｌ交換を１：１の容量で実施した。次いで、ペプチドを再び凍結乾燥した。
【０１１２】
本発明の得られたヘプタペプチドがＮＳＣの分化に影響するかどうかを評価するために、以前に記載したとおりに（８）、インビトロ試験を行なった。
【０１１３】
マウス細胞（２ｘ１０４細胞／ｃｍ２の濃度）を、カルトレックス−ＢＭＥ（登録商標）支持層（Ｒ＆Ｄシステムズ）（基礎培地で１：１００に希釈、オーバーナイトでインキュベーション）又はラミニン（ロッシュ）（ＰＢＳ  １ｘ、ｐＨ  ７．４で１：５に希釈、オーバーナイトでインキュベーション）で事前にコートした各ウェル（９６マルチウェルプレート）内に播種した。
【０１１４】
最初に、ニューロンの後代分化を増強するために加えたβＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した基礎培地で細胞を培養した。インビトロでの３日（ＤＩＶ）に、βＦＧＦ培地を白血病抑制因子（ＬＩＦ、ケミコン）（２０ｎｇ／ｍｌ）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ペプロテック）（２０ｎｇ／ｍｌ）で置換した。新鮮培地を３日ごとに加えた。選択したペプチドを、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、すべての細胞培養培地（しかしコーティング中ではない）に溶解した。
【０１１５】
免疫蛍光試験は、分化したマウスのＮＳＣ後代の表現型を分析するために行なわれた。次の抗体が使用された：星状細胞についてウサギポリクローナル抗ＧＦＡＰ（１：５００、ダコ・サイトメーション）及びニューロンについてマウスモノクローナル抗βＩＩＩチューブリン（１：５００、コバンス）。二次Ａｂｓはヤギ抗マウス・アレクサ４８８（１：１０００、モレキュラー・プローブ）、ヤギ抗マウスＣｙ３（１：１０００、ジャクソン・イムノリサーチ）であり、細胞核はＤＡＰＩで逆染色した（モレキュラー・プローブ）。定量分析は、合計３つの独立した実験によって、９つの無作為に選んだフィールドの各々について、１００〜３００細胞を数えることにより行なわれた。
【０１１６】
平均値±平均値の標準誤差として報告された値（図１Ａ）。
【０１１７】
結果：
インビトロでの１２日（ＤＩＶ）に、分化したマウスＮＳＣは、分化した星状膠細胞の割合を転嫁して（ＧＦＡＰ染色）、＃ＫＬＰ、＃ＧＥＴ及び＃ＨＡＩに暴露して、カルトレックス及びラミニンでコートしたウェルの両方において、分化したニューロン（ベータＩＩＩチューブリン染色）の割合の著しい増加を示した。ニューロンの増加はすべての処理ＮＳＣ対未処理ＮＳＣにおいて有意だった（＊  ｐ＜０．０５）。ニューロンの表現型の最も高い増加は両方の場合において＃ＫＬＰに対して検出された。これらの結果は、発見されたペプチドが神経の表現型へのＮＳＣ分化に影響を及ぼす場合があることを示す（図１Ｂ）。
【０１１８】
実施例４
自己組織化ペプチドの機能化及び精製
表４にリストされているとおりに、本発明に係るＳＡＰが合成された：
【０１１９】
【表４】
2014514280.tif 000007
【０１２０】
必須の再現的なクローン配列は、自己組織化ペプチドＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬＫバックボーン配列のＮ末端へ３−グリシン・スペーサーを介して連結された機能性モチーフとして合成され、これにより以下のように中性ｐＨ溶液へさらされるとβ−シートに自発的に折り畳み、注射可能なハイドロゲルをもたらすことが証明される：
Ac-1234567-GGG-LDLKLDLKLDLK-CONH2
NH2-1234567-GGG-LDLKLDLKLDLK-CONH2
式中、Ｎ末端からはじまって：Ａｃは、ペプチドの安定性を改善するためのアセチル基であり、及びＮＨ２は本来の配列のアミン基であり、１２３４５６７はヘプタペプチドであり、ＧＧＧは３つのグリシンペプチドを含むスペーサーであり、ＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬＫ又は（ＬＤＬＫ）３、ＣＯＮＨ２はＣ末端に位置するカルボニル官能基である。
【０１２１】
いかなる理論に結び付けられないが、本発明の自己組織化ペプチドは逆の順番に合成されてもよい：
Ac-LDLKLDLKLDLK-GGG-1234567-CONH2
NH2-LDLKLDLKLDLK-GGG-1234567-CONH2
【０１２２】
本発明の自己組織化ペプチドは、ＣＥＭリバティー自動化マイクロ波ペプチド合成機を使用して、標準フルオレニルメトキシカルボニル固相法を用いて、０．１ｍｍｏｌ規模で合成された。ＭＢＨＡリンクアミド樹脂（０．５ｍｍｏｌ／ｇ置換）はＣ末端アミドを製造するために使用された；活性化はＤＭＦ中で０．５Ｍ  ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵを用いて行なわれた。４７及び４９を、ＤＭＦの２０％  無水酢酸（ａｃｅｔｈｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）溶液を使用してアセチル化した。次いで、ペプチドを樹脂から切り離し、９５％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％  水及び２．５％  トリイソプロピルシランの９ｍｌを用いて脱保護した。切断したペプチドを沈殿し、冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、並びに凍結乾燥し、及び−２０℃で保存する前に、２０〜２５％のアセトニトリル溶液に溶解した。
【０１２３】
粗ペプチドを分析的及び半調整的なＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｃ４（サーモ・サイエンティフィック、英国）を装備したウォータース・システムを使用して、逆位相ＨＰＬＣによって分析及び精製した。溶離剤は、水の０．１％（ｖ／ｖ）  ＴＦＡ（バッファーＡ）及びアセトニトリルの０．１％（ｖ／ｖ）  ＴＦＡ（バッファーＢ）だった。開始条件は、１０％のバッファーＡ及び９０％のバッファーＢであり、バッファーＢを線形増加的に勾配をつけた。１５分間の勾配で、６５％のバッファーＢになった。ペプチドの同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で確認された。精製後、０．１Ｍ  ＨＣｌ交換は、残りのＴＦＡを抽出するために、１：１の容量で行なわれた。次いで、ペプチドを再び凍結乾燥した。ペプチドを合成することに成功し、及び精製した（純度＞９５％）。
【０１２４】
実施例５
原子間力顕微鏡のイメージング及び測定
本発明に係る自己組織化ペプチドを、イメージングの１日前に、１％ｗ／ｖの濃度で、蒸留水（ＧＩＢＣＯ）中に溶解した。ペプチド溶液を希釈した（１：５０の比率）後日、これらの溶液の２ｍｌを、白雲母基板上に置き、２分間室温で維持した。次いで、雲母表面を希釈水で洗浄し、緩やかに結合したペプチドを取り除いた。溶液を３０分間蒸発に供した。ＡＦＭイメージを、単光束方式シリコン・カンチレバー・プローブ（ヴィーコ・ＲＴＥＳＰ：共振周波数３００ｋＨｚ、名目上の先端曲率半径１０ｎｍ、力定数４０Ｎ／ｍ）を用いたマルチモード・ナノスコープ  ＩＩＩａ（デジタル・インストラメンツ）によって構成されるタッピング（商標）で回収した。測定されたファイバー面積は、先端回旋のために補正された。観察された平板状のナノファイバーの高さ（１〜１．５ｎｍ）は先端半径（１０ｎｍ）よりはるかに低いので、観察された幅が式１５で補正された： 
【数１】
2014514280.tif 000008
（式中、△ｘは幅広がり効果であり、ｈはナノファイバー高さであり、及びｒｔは先端半径である。）
【０１２５】
結果は平均値±平均値の標準誤差として示される。
【０１２６】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定は、すべてのペプチドが平板状ナノファイバーを形成することを明らかにした（図２を参照）。デコンボリューション測定は表４で報告される。処理後のデータは、これらの機能性ＳＡＰｅｐｔｉｄｅについて記載された通常の二重層の反並行β−シートモデルと一致しており、これらの配列に対して、〜１２ｎｍの幅及び〜１．６ｎｍの高さのナノファイバーをもたらす。
【０１２７】
本発明のＳＡＰは、類似のナノファイバーへ自己組織化した。これらのＳＡＰの選択は、以下の表５に示される：
【０１２８】
【表５】
2014514280.tif 000009
【０１２９】
実施例６
流動学
本発明の自己組織化ペプチドの流動特性は、制御されたストレス・ＴＡ・インストラメンツ  ＡＲ−２０００ｅｘレオメーター（ＴＡ・インストラメンツ）を使用して測定された。円錐平板幾何学（アクリル酸円錐直径、２０ｍｍ；角度、１°；切断間隔３４μｍ）が使用された。予備歪み掃引（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｒａｉｎ  ｓｗｅｅｐｓ）は線形粘弾性領域を定義するために各試料に対して行なわれ、それにより、係数は歪みに依存しなかったことを保証した。時間掃引は、ＰＢＳ（１ｘ）の添加後に、２５Ｃ（角振動数ω＝１Ｈｚ）で記録され、及びＧ’が安定に達するまで継続された。周波数は、ペプチド水溶液及び自己組織化足場の両方について、１％の制御された歪みでの振動モードにおける計器を用いて２５Ｃで行なわれた。最終歪み掃引は、１Ｈｚの振動周波数及び２５Ｃで行なわれた：損失の開始地点は線形補間及びその後の線形領域内及び材料破壊のそれぞれでの、Ｇ’モードの交差度の決定により算出された。
【０１３０】
合成したペプチドは自己組織化し（１％ｗ／ｖ濃度溶液で）（１ｘ、ｐＨ  ７．４）、及びＰＢＳの添加後に固体足場を形成した。流動学試験では（図３Ａ）、貯蔵弾性率（Ｇ’）は、１−１００Ｈｚの範囲において線形であり（周波数掃引試験）、及び損失モジュール（Ｇ”）を上回っていた：典型的パターンが固体構造で見られた。
【０１３１】
組織化した足場の線形値（１−１００Ｈｚの範囲内）は、７０−４００Ｐａ及び８−２０Ｐａの範囲でそれぞれ存在する。これらの反応は固体の柔軟なハイドロゲルに典型的である。
【０１３２】
特に、ペプチドＡｃ−ＫＬＰについては、我々は、図３Ｂ中で示されるとおりに、異なる濃度（つまり、１％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ及び３％ｗ／ｖ）で、Ｇ’及びＧ”値を評価した。Ｇ値（Ｇ’及びＧ”の両方）は濃度増大につれて増加した。これは再生成される、又は（より柔軟な足場で支持された）ＮＳＣの神経分化に有利に働く組織のものに似た強度を有するハイドロゲルを得るのに有用である場合がある。
【０１３３】
結果：
本発明に係るＳＡＰ（１％ｗ／ｖで溶かされている）の選択のゲル化結果は、表６にリストされる：
【０１３４】
【表６】
2014514280.tif 000010
【０１３５】
表６において、平均Ｇ’値は、ＰＢＳの添加前後で報告される（１〜１００Ｈｚの範囲）。破壊（歪み掃引試験）の開始地点は歪みの１０％−３０％の範囲にある。したがって、Ｎ末端での選択された機能モチーフの追加は、ＬＤＬＫ−１２のハイドロゲルを形成する能力を害さなかった。顕著に、Ｇ’値のすべてが、１００−１０００Ｐａの範囲にあり、神経組織の典型的な強度として報告され、及びインビトロでの間葉性幹細胞の神経分化を支持する。
【０１３６】
実施例７
分子構造特徴付け：円偏光二色性（ＣＤ）分析
本発明のペプチドの各々の遠紫外線ＣＤスペクトルは、Ａｖｉｖ  ６２ＤＳ分光計について室温で１９０ｎｍ〜２６０ｎｍの間で記録される。すべての測定は、蒸留水中の１ｍｍの石英キュベットの中で行なわれた。スペクトルは３つの走査の蓄積に由来する。試料のないバッファーのブランクのスペクトルが引かれる。ＳＡＰｅｐｔｉｄｅ溶液は１％ｗ／ｖで水に溶解され、水中での溶解の１日後に０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で希釈された。スペクトルは２ｎｍ間隔で記録され、４秒間で平均し、及びデルタイプシロン単位で標準化した。タンパク質構造は、既知のタンパク質の３３ベーススペクトルを使用して、ＣＤスペクトル・デコンボリューション・ソフトウェア２．１を使用することによりデコンボリューションした。
【０１３７】
結果：
ＡＦＭの知見は、すべてのＳＡＰｅｐｔｉｄｅが主としてβ−シートに自己組織化することを示唆し、ＣＤスペクトルによって確認される（図４）：実際、β−シートの４５％の最小値を、スペクトル・デコンボリューション後にすべてのＳＡＰｅｐｔｉｄｅにおいて検出した。それにもかかわらず、アセチル化された機能モチーフは、それらの脱アセチル化された（及びより帯電した）相当物に関して、β構造のより高い割合によって特徴づけられるスペクトルを示した（図４）。これは、組織化した分子構造の安定性に関する遊離Ｎ末端での総電荷の明確な影響を示唆する（７）。
【０１３８】
実施例８
インビトロ試験：イメージング及び細胞増殖分析
本発明のＳＡＰで得られたバイオマテリアル（組織化ハイドロゲル）がＮＳＣの接着、生存及び／又は分化に影響を及ぼしたかどうかを評価するために、以前に記載されているとおりに（８）、インビトロ試験を実施した。
【０１３９】
ＳＡＰｅｐｔｉｄｅ（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で各ウェル３０μｌ）を、細胞の２時間前に９６マルチウェル内で組織化した。細胞（２×１０４細胞／ｃｍ２の濃度）は、各組織化した足場の上表面上に播かれた。
【０１４０】
最初に、細胞は、ニューロンの後代分化を増強するために加えられた、βＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した基礎培地で培養された。インビトロでの３日（ＤＩＶ）に、βＦＧＦ培地を白血病抑制因子（ＬＩＦ、ケミコン）（２０ｎｇ／ｍｌ）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ペプロテック）（２０ｎｇ／ｍｌ）に置換した。新鮮培地を３日ごとに加えた。生存性及び分化の両方のアッセイについて、陽性及び陰性コントロールは、それぞれカルトレックス−ＢＭＥ（登録商標）支持層（Ｒ＆Ｄシステムズ）（基礎培地で１：１００希釈）及び未処理ウェル底面で構成された。細胞生存性はプロメガのプロトコールにおいて推奨されるとおりに、７ＤＩＶでセルタイター９６（登録商標）アクオス・プロリファレーション・アッセイ（プロメガ）によって定量された。細胞数及び吸光度値の間の線形反応をキャリブレーションした後、増殖した細胞個体群を、４９０ｎｍの波長でＶｍａｘマイクロプレート・リーダ（モレキュラー・ディバイシズ）を使用することにより定量した（ｎ＝５）。平均値±平均値の標準誤差として報告された値を、同じ支持層及び細胞のない細胞培養培地からなるそれぞれのコントロールにブランクにした。
【０１４１】
結果：
インビトロでの７日後（ＤＩＶ）に、マウスＮＳＣ及びヒトＮＳＣの後代の両方を、ＦＡＱの組織化したハイドロゲル上で培養し、及びＡｃ−ＦＡＱは細胞を広げ、及び枝分かれさせ、足場上面を全体に覆うことを示した（図５Ａ及びＢ）。細胞の広がり又は枝分かれの明らかな差は、アセチル化した、及びアセチル化していないペプチド相当物中に見い出されなかった。マウス及びヒトＮＳＣは同様の結果を与えた。広範な広がりはＦＡＱについて検出された。ＦＡＱ及びＱＨＬ、アセチル化した、及びしていないの両方で、コントロール（マウスＮＳＣに対して＊  Ｐ＜０．００５、及びヒトＮＳＣに対して＊＊  Ｐ＜０．０３；対応のあるｔ−スチューデント検定：ｎ＝５）に関して、細胞生存性を著しく促進した。
【０１４２】
ＭＴＳ細胞の生存性アッセイ（図５Ｃ及びＤ）は、定性形態学的観察を確認した：マウス及びヒトＮＳＣは比較可能な結果を示した、つまり、細胞個体群は、ＱＨＬ及びＡｃ−ＱＨＬが後続するＦＡＱ及びＡｃ−ＦＡＱより大きかった。有意差はアセチル化した、及びアセチル化しなかった相当物間で検出されなかった。一方、ＦＡＱ及びＱＨＬは、コントロールに関してマウス及びヒトＮＳＣの細胞生存性の両方に著しく有利に働いた。ＦＡＱ及びＱＨＬはＮＳＣの生存及び増殖を得るのに有効な機能性ＳＡＰであることを示した。ＫＬＰ機能性ＳＡＰ（アセチル化及び非アセチル化の両方）は固体ハイドロゲルを形成し、及びＦＡＱと同様にＮＳＣの接着及び広がりを促進した。
【０１４３】
免疫蛍光法
免疫蛍光法試験は、分化したヒト及びマウスＮＳＣ後代の表現型をアッセイするために行なわれた。ＫＬＰ及びＡｃ−ＫＬＰの場合には、マウスＮＳＣのみが使用された。Ａｃ−ＫＬＰ及びＫＬＰの足場は３つの異なる強度値（すなわち１００、５００及び１０００Ｐａ）を表示するために、異なる濃度に調製された。これはＮＳＣ分化に関して足場濃度（したがって、その強度）の影響を評価するために行われた。他のすべてのペプチドは、代わりに１％ｖ／ｗ濃度で試験された。次の抗体が使用された：星状細胞に対してウサギポリクローナル抗ＧＦＡＰ（１：５００、ダコサイトメーション）、ニューロンに対してマウスモノクローナル抗βＩＩＩチューブリン（１：５００、コバンス）、乏枝神経膠細胞に対してマウスモノクローナル抗ＧａｌＣ（１：２００、ケミコン）及びＯ４（１：２００、ケミコン）。二次Ａｂｓは、ヤギ抗マウス・アレクサ４８８（１：１０００、モレキュラー・プローブ）、ヤギ抗マウスＣｙ３（１：１０００、ジャクソン・イムノリサーチ）、ヤギ抗ウサギＣｙ３（１：１０００、ジャクソン・イムノリサーチ）だった。細胞核はＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブ）で逆染色された。定量分析は、合計３つの独立した実験について各々９つの無作為に選ばれたフィールドに対して１００〜３００細胞を数えることにより行なわれた。接着細胞の位相コントラスト及び蛍光イメージは、播種の１週間後に、ツァイス顕微鏡アキシオプラン２及びアポトーム・システムによって得られた。
【０１４４】
結果：
マウス及びヒトＮＳＣの両方の分化は、同様の結果を示した（図６）。
【０１４５】
露出したプラスチックウェル上で培養されたＮＳＣは、顕著な枝分かれを示さず、効果的な分化を示さなかった。したがって、培養されたＮＳＣの後代は、分化表現型の点で確実に定量することができなかった。
【０１４６】
該結果は、本発明に係るＳＡＰがニューロン、星状細胞及び乏枝神経膠細胞へのＮＳＣ分化を可能にすることを示す。陽性コントロールであるカルトレックス上で得られた後代と比較した時でさえ、ＦＡＱ又はＡｃ−ＦＡＱ上の細胞を分化することにより得られるニューロン及び乏枝神経膠細胞の数は、著しくより高かった（図６Ａ−６Ｃ−６Ｅ−６Ｇ）。
【０１４７】
乏枝神経膠細胞は、カルトレックス、ＦＡＱ及びＡｃ−ＦＡＱ上のＧａｌＣ／Ｏ４陽性細胞の個別のクラスタの形で検出された（図６Ｄ−６Ｈ）。これらの結果は、ＦＡＱ及びＡｃ−ＦＡＱの両方が効率的にヒト及びマウスＮＳＣ増殖を支持することを示す。
【０１４８】
βＩＩＩチューブリン陽性ニューロン（マウス、Ｄの左欄；ヒト、Ｈの左欄）、ＧＦＡＰ陽性星状細胞（マウス、Ｄの左欄；ヒト、Ｈの左欄）及びＧａｌＣ／Ｏ４二重陽性乏枝神経膠細胞（マウス、Ｄの右欄；ヒト、Ｈの右欄）が、試験された材料の両方で検出される。核はＤＡＰＩで視覚化される。スケールバー＝５０μｍ。
【０１４９】
ＫＬＰ及びＡｃ−ＫＬＰの両方については、試験された異なる濃度は、強度減少に対応して分化ニューロン（βＩＩＩチューブリンの陽性細胞）の顕著な増大を示した（図７Ａ）：これは星状細胞（ＧＦＡＰ陽性細胞）の割合の増大によって埋め合わせられた（＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１）。有意差は同様の足場強度でＫＬＰ及びＡｃ−ＫＬＰの間で検出されなかった。顕著に、５０％を超えるニューロンの割合は、すべての試験された機能化足場において達成された最良の結果である。より柔軟な足場については、ニューロン性及び星状膠性形態学は、足場の至る所で高度に枝分かれし広がった（図７Ｂ）。
【０１５０】
実施例９
脊髄損傷のインビボ再生
外科
急性打撲脊髄損傷（ＳＣＩ）のインビボモデルにおけるＡｃ−ＦＡＱ  ＳＡＰｅｐｔｉｄｅの神経再生潜在能力の結果が下記に述べられる。動物を含むすべての手順は、ＥＣガイドラインによって行なわれた（ＥＣ理事会指令８６／６０９、１９８７年）。
【０１５１】
急性打撲脊髄損傷（ＳＣＩ）のインビボモデルにおけるＡｃ−ＦＡＱ  ＳＡＰｅｐｔｉｄｅの神経再生潜在能力の結果は、ここに記載される。
【０１５２】
２００〜２５０ｇｒの体重の２０匹の雌スピローグ・ドーリー・ラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ）は、２つの群に無作為に分割された：１）Ａｃ−ＦＡＱで処理された脊髄損傷動物、及び２）食塩水で処理された脊髄損傷動物（コントロール群）。ラットを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹膜腔内注射で麻酔をかけた。Ｔ９−Ｔ１０レベルの椎弓切除の後、露出した脊髄を、以前に記載されているとおりに（３３）、ＭＡＳＣＩＳインパクター機器（ＷＭ・ケック・センター・フォー・コラボレイティブ・ニューロサイエンス、ラトガーズ大学）を使用することにより、高さ２５ｍｍから落とされた１０グラムの棒によって損傷させた（図８Ａ１）。損傷直後に、動物は、マイクロマニピュレーターによって保持されたハミルトン注射器を使用して、Ａｃ−ＦＡＱ（１％水溶液）又は食塩水を注入された（図８Ａ２）。バイオマテリアル又は蒸留水を、５００μｍの距離で損傷部位へ移し、及び各インターバルで、各０．５μｌの２つの注射を、合計３μｌの投与量でなした。注射後、筋肉を縫合し、及び皮膚を創傷クリップで閉じた。ラットは、鎮痛薬（カルプロフェン、５ｍｇ／ｋｇ）及び抗生物質（エンロフロキサシン、５ｍｇ／ｋｇ）で１週間毎日処理した。膀胱は、反射性膀胱の回復まで手動で絞り出した。
【０１５３】
行動試験
後肢の回復を、バッソ、ベッティー、ブレスナハン（ＢＢＢ）運動性評価スケールを使用することにより評価した。１週間後損傷から開始して、３〜４日ごとに、各ラットを、オープン・フィールドで４分間のデジタルビデオカメラを用いて観察し、及び記録した。ラットを二重盲検の実験的設定において評価した。
【０１５４】
Ａｃ−ＦＡＱ処理動物は、損傷６、７及び８週後に（１１．９５±０．３０）、コントロールと比較して、後肢運動性回復の徐々の回復及び顕著な改善（ｐ＜０．０５）を示した（図８Ｂ）：時々前肢−後肢が協調して、頻繁に、又は一貫してプランター・ステップを示した。賦形剤処理動物のＢＢＢスコアは５週間後に安定水準に達した（１０．９２±０．２７）。コントロール群のＢＢＢスコアは、注射が損傷動物の運動性機能をさらに害しなかったという事実と一致している。Ａｃ−ＦＡＱ処理動物は、コントロールと比較して、プランター・ステップ及び協調のより良好な回復並びに後肢運動機能及び協調の両方の改善を示した。
【０１５５】
実施例１０
脊髄損傷のインビボ再生
組織学及び形態学的定量
８週間後、損傷動物を、４％  パラホルムアルデヒドを有する経心臓的灌流によって屠殺した。この時に、損傷部位は嚢胞によって占められ、該嚢胞は、時には軸索芽を含む結合組織の索（小柱）によって広げられる場合がある。脊髄を取り除き、ＯＣＴに埋没し、凍結し、及び１６μｍの厚さの縦断面にスライスした。
【０１５６】
組織化学分析については、スライスをヘマトキシリン／エオシンで染色した。免疫蛍光分析については、スライスをＰＢＳで洗浄し、０．１％  トリトンＸ−１００で透過処理し、１０％  通常ヤギ血清で処理した。
【０１５７】
定量分析は、Ｔ７〜Ｔ１２に及び、及び損傷部位（Ｔ９−Ｔ１０）を含む、ラット脊髄の縦断面について行なわれた。Ａｃ−ＦＡＱ処理動物（２８．３０±６．７０ｍｍ２）中の平均累積嚢胞面積は、コントロール（３２．３０±７．６９ｍｍ２）のものに類似しており、これはＡｃ−ＦＡＱの注射が嚢胞形成に著しくは影響しなかったことを示唆した。したがって、バイオマテリアル注射が嚢胞中へ小柱の突起に有利に働き、傷を迂回することに貢献し得るかどうかを評価するために、我々は小柱を除く嚢胞内の空洞のみを測定した。しかしながら、嚢胞内の空洞サイズの測定は、小柱の鎖を除くことにより得られ、Ａｃ−ＦＡＱ及びコントロール群（それぞれ１６．７７±４．５０ｍｍ２及び１９．４６±４．９７ｍｍ２）の間にいかなる有意差を示さなかった（図８Ｃ）。
【０１５８】
嚢胞内のＧａｐ−４３及びβＩＩＩを発現する軸索の存在を調査した。Ｇａｐ−４３陽性ファイバーを定量し、及びＧＡＰ−４３の免疫陽性面積の相対値は総嚢胞面積の割合として表現された。
【０１５９】
食塩水注入動物と比べて、ＳＡＰ注入の損傷部位におけるＧＡＰ−４３のより高いレベルの存在は、ＳＡＰがＧＡＰ−４３によって媒介される神経突起派生物を促進する微環境を提供すること、及び補充的な軸索発芽を可能にすること、及びそれにより神経再生を促進することを示唆する。
【０１６０】
ＧＡＰ−４３に対する平均免疫陽性は、コントロール（全嚢胞面積の６．３３±１．７０％）におけるよりも、ＳＡＰで処理された動物において（全嚢胞面積の１５．４６±１．９４％）顕著に高かった（図８Ｄ）。図５Ｄ２−５Ｄ３はＳＡＰ処理動物を示し、我々は嚢胞（Ｄ３、Ｄ２の高い倍率；＊＝嚢胞）を浸透しているいくつかのＧＡＰ４３陽性ファイバー（白色矢）を観察し、一方で図８Ｄ１は食塩水注入動物の嚢胞を表わす。合計の嚢胞面積の割合として表わされるＧＡＰ−４３陽性面積の相対値は、賦形剤注入動物におけるよりも、ＳＡＰ処理における方が顕著に高かった（Ｄ４）：ｐ＜０．０５。スケールバー：（Ｄ１）及び（Ｄ２）＝４００μｍ、（Ｄ３）＝２００μｍ。核はＤＡＰＩで逆染色された。
【０１６１】
損傷した組織は、嚢胞の範囲に依存して、１匹の動物当たり７〜１６縦断面中で定量された。断面は脊髄の背表面から開始し、及び１６０μｍの間隔で配置された。断面はヘマトキシリン／エオシンで染色され、並びにイメージは×５倍率でキャプチャーされ（アキソプラン２  ツァイス顕微鏡）、次いで単一イメージは２値画像に変換され、統合され、及び損傷部位中の空洞はイメージＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって定量された。我々は損傷組織の全体のサイズも測定した。ピクセル面積はｍｍ２に変換し、損傷した組織又はその内部の空洞の測定は、損傷サイズの相対的測定値として各動物の累積面積を作り出すために付け加えられた。
【０１６２】
マクロファージ浸潤は、損傷部位中で、１匹の動物当たり１６０μｍの間隔で配置された３つの縦断面中で定量された。イメージ（×２０倍率）はＣＤ６８（１：５００、セロテック）及びアレクサ４８８コンジュゲーション抗体（１：５００、インビトロジェン）を用いて免疫染色した組織をキャプチャーした。２．３ｍｍ２の合計面積は各断面（概ね１６イメージ）について定量された。ＣＤ６８陽性細胞の細胞計測はイメージＪでなされた。マクロファージ数／ｍｍ２は、各動物について異なる断面についての３つの測定に関して平均化された（図８Ｅ）。
【０１６３】
嚢胞部位における、軸索再生／出芽は、ＧＡＰ−４３（１：２００、ミリポア）及びＣｙ３コンジュゲーション抗体（１：１０００、ジャクソン）を介して１匹の動物当たり６つの縦断面（１６０μｍの間隔で配置）について定量された。各断面については、我々は、損傷部位の連続するイメージ（×１０倍率）をとった。再度、イメージを２値画像に変換し、統合し、及び陽性ピクセルの容量を、損傷部位内のＧＡＰ−４３陽性面積を定量するために測定した。合計の嚢胞面積の割合として表現された６つの測定値の平均は、各動物の軸索再生／出芽の値を構成した。
【０１６４】
Ａｃ−ＦＡＱ処理動物では、我々はいくつかのファイバーが嚢胞空洞及び小柱の両方に侵入していることを検出した。しかし、食塩水注入動物では、大多数のファイバーは単に小柱中で観察され、これはバイオマテリアルが軸索を成長させるための栄養支持物をさらに構成する場合があることを示している。ＧＡＰ−４３陽性ファイバーはすべてさらにβＩＩＩを発現した（図９Ａ）。Ｇａｐ−４３は、神経発達、軸索再生及びシナプスの機能のモジュレーションに重要な役割を果たすと知られているリンタンパク質である。
【０１６５】
損傷部位内のプロテオグリカン類及びグリコサミノグリカン類を染色するために、我々はトルイジンブルーＯ溶液（シグマ）を使用した。一方、コラーゲン含有量は、三色のハイデンハイン修飾方法キット（バイオ−オプティカ）を使用して評価した。他の一次抗体は星状細胞に対して抗ＧＦＡＰ（１：５００、ミリポア）及びミクログリアに対して抗Ｉｂａ１（１：１０００、ワコー）、抗ラミニン（１：２００、シグマ）を含む。
【０１６６】
さらなる組織学的分析を行ない、及びいくつかの細胞及び神経線維がＳＡＰの足場に侵入したことを見出すことができた。これらの細胞は、Ｉｂａ１、ミクログリアに対するマーカー、βＩＩＩチューブリン、ニューロンに対するマーカー及びＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）、星状細胞に対するマーカーが陽性だった。浸透した神経線維は、ＧＡＰ−４３及びβＩＩＩチューブリンの両方について陽性だった（図９Ｂ）。
【０１６７】
総合すれば、組織学からのデータは、不完全なＳＣＩの後に通常生じる、限定された軸索伸長に比較して、Ａｃ−ＦＡＱはさらなる軸索出芽／再生を促進する場合があることを示唆する。この知見は、我々がバイオマテリアル処理動物の中で観察した運動性回復の改善に従う。
【０１６８】
統計分析
データはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して処理された。値は平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告される。可溶性ＫＬＰＧＷＳＧペプチドの存在下でのｍＮＳＣ分化及びＮＳＣ増殖アッセイの結果は、対応のあるｔ検定によってそれらの統計的有意差について評価された：結果は陰性コントロールと比較された。足場に基づく分化検定の統計的有意差は、一方向ＡＮＯＶＡ分析、次いでテューキー比較検定を使用して評価された。すべての検定において、ｐ値＜０．０５が統計的に有意なものとして考慮された。
【０１６９】
コントロール及び処理動物群の間のＢＢＢスコア有意性検定は、対応のないｔ検定によって行なわれた。空洞サイズ、マクロファージ浸潤及びＧＡＰ４３陽性ファイバーの定量化のために、群比較がマン−ホイットニー検定によってなされた。すべての分析は両側であり、及びｐ値＜０．０５は、統計的に有意なものとして考慮した。
【０１７０】
上記の記載及び上記の実施例から、本発明に係る記載及び得られた生産物が到達した有利な点は明白である。
【０１７１】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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