(57)【要約】本発明の態様は、生得的多能性体細胞（ＳＣＩＰＰ）の組成物に関する。ＳＣＩＰＰは、主要な胚葉（すなわち、外胚葉、内胚葉および中胚葉）それぞれの機能的な誘導体に分化する能力を有する。また、当該体細胞を対象から同定および単離するための方法およびキット、並びにＳＣＩＰＰを研究目的または治療目的で使用するための方法およびキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のうち少なくとも８％が生得的多能性体細胞（ＳＣＩＰＰ）である、単離された細胞集団。
【請求項２】
ＣＤ７３＋／ＣＤ９０−／細胞系マーカー陰性（Ｌｉｎ−）細胞が富化された細胞を含む、請求項１に記載の単離された集団。
【請求項３】
細胞系マーカーが、Ｔ細胞、胸腺細胞、ＮＫ細胞、好中球、Ｂ細胞、骨髄性細胞、マクロファージ、単球、血小板、顆粒球、Ｂ細胞、顆粒球、および樹状細胞のうちの一つまたは複数に特異的なマーカーを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項４】
細胞系マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４およびＣＤ１４０ｂの任意の組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項５】
ＳＣＩＰＰが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および成体間葉系細胞（ＭＳＣ）と比較して増加したレベルのＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＰＴＧＳ２、またはそれらの任意の組み合わせを発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項６】
ＳＣＩＰＰが、ＭＳＣと比較して増加したレベルで、且つＥＳＣと同等のレベルで、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ２４、ＥＰＣＡＭ、またはそれらの任意の組み合わせを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項７】
ＳＣＩＰＰが、ＥＳＣと比較して減少したレベルで、且つＭＳＣと同等のレベルで、ＣＥＣＲ１、ＤＮＭＴ３Ｂまたは両方を発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項８】
ＳＣＩＰＰが無病の乳腺組織に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項９】
ＳＣＩＰＰがヒトＳＣＩＰＰである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項１０】
単離された集団中の細胞のうち少なくとも５０％がＳＣＩＰＰである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項１１】
ＳＣＩＰＰが遺伝的に改変されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された集団。
【請求項１２】
生得的多能性体細胞（ＳＣＩＰＰ）が富化された試料を生産する方法であって、ＳＣＩＰＰの分化の維持および増殖を促進する条件下で対象由来の細胞試料を培養する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記培養工程の前に、対象由来の細胞試料を、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陰性、且つ細胞系マーカー陰性の細胞に関して選択する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞系マーカーが、Ｔ細胞、胸腺細胞、ＮＫ細胞、好中球、Ｂ細胞、骨髄性細胞、マクロファージ、単球、血小板、顆粒球、Ｂ細胞、顆粒球、および樹状細胞のうちの一つまたは複数に特異的なマーカーを含む、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞系マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４およびＣＤ１４０ｂの任意の組み合わせを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象由来の細胞試料が乳腺細胞を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞試料がヒト対象由来である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＣＩＰＰが富化された試料が、少なくとも５０％のＳＣＩＰＰを含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＳＣＩＰＰが富化された試料が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および成体間葉系細胞（ＭＳＣ）と比較して増加したレベルのＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＰＴＧＳ２、またはそれらの任意の組み合わせを発現するＳＣＩＰＰを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＣＩＰＰの分化の維持および増殖を促進する前記条件が、胎盤線維芽細胞フィーダー細胞上での増殖およびＡＴＡＬＡ培地での増殖から選択される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞分化に影響を与える因子をスクリーニングする方法であって、
候補分化因子と、生得的多能性体細胞（ＳＣＩＰＰ）を少なくとも１％含む細胞集団とを混合する工程；および
ＳＣＩＰＰからの分化細胞の形成に対する該候補分化因子の影響をモニタリングする工程
を含む、方法。
【請求項２２】
ＳＣＩＰＰが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および成体間葉系細胞（ＭＳＣ）と比較して増加したレベルのＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＰＴＧＳ２、またはそれらの任意の組み合わせを発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記モニタリングする工程が、遺伝子発現アッセイ；インビトロ発生アッセイ；インビボ発生アッセイ；機能的細胞アッセイ；またはそれらの任意の組み合わせを行うことを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１１年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／４３４，２６４号の利益を主張し、その出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（ＮＣＩ）により授与された助成金Ｒ０１  ＣＡ０９７２１４の基、政府支援を受けて為された。政府は本発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
緒言
幹細胞生物学への理解は、生物医学研究のいくつかの側面に対して重要である。再生医療において、幹細胞は欠損した組織を修復または置換する可能性を秘めている。がん等の病態では、幹細胞の性質は、悪性転換の重要なステップに関係している。
【０００４】
現在、再生医療は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞を利用することに労力の大部分を費やしている。それぞれには欠点がある。胚性幹細胞は倫理的な問題を提起し、入手が困難である。誘導多能性幹細胞は、ヒト細胞に外来遺伝子を導入する方法によって非常に低い頻度で生じる。この方法は非常に困難であり、そのため、ＦＤＡの認可を受けて使用することができない。
【０００５】
相対的に豊富で、増殖可能であり、胚性幹細胞に付随する同様の倫理的問題を伴わずに入手可能である、幹細胞の新しい供給源を発見することは、再生医療の分野を進展させるための重要な目標となる。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明の態様は、主要な胚葉（すなわち、外胚葉、内胚葉および中胚葉）のそれぞれの機能的派生体に分化する能力を有する、生得的多能性体細胞（Somatic Cells with Innate Potential for Pluripotency、ＳＣＩＰＰ；本明細書では単一の内因性多能性体細胞（ｅＰＳ細胞）とも称される）の組成物に関する。また、対象から体性幹細胞を同定および単離するための方法およびキット、並びに、それらの遺伝子改変の方法および組織再生における使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】パネルＡ〜Ｃ：単離および細胞特性の評価。（Ａ）無病の乳房縮小術から得られたＲ１〜Ｒ４亜集団の代表的な散布図。挿入値：１０個の試料から得られた各亜集団の平均値。個々の数値については図３３を参照されたい。（Ｂ）分取されたＲ１〜Ｒ４亜集団の自己複製能および分化能を評価するための実験デザイン。（Ｃ）全上皮集団に占める平均割合±ＳＥＭとして表されているＲ１〜Ｒ４亜集団。平均％±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として表されている、Ｒ１〜Ｒ４亜集団の１個の細胞または１，０００個の細胞から形成されたマンモスフィア。
【図２】パネルＡ〜Ｄ：Ｒ１サブセットはＡＬＤ＋細胞に富み、複数回継代に対して、インビトロにおける自己複製能および乳腺系統への分化能を有する。（Ａ）Ｒ１〜Ｒ４サブセットの、並びにＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性（ＡＬＤ＋）またはＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性（ＡＬＤ−）である全集団並びに分取されたＲ１、Ｒ２およびＲ３サブセットの、マンモスフィア形成能（％マンモスフィア）。第１継代については１０，０００個の播種された生細胞を使用し、その後の継代については１０００個の播種された生細胞を使用して、マンモスフィア誘発能を評価した。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されているデータは、図９、パネルＡの図の説明に提供される。（Ｂ）３回継代のＲ１〜Ｒ３  ＡＬＤ＋マンモスフィアから分離され、分化条件下で増殖した細胞の、ＦＡＣＳ分析。細胞系特異的なマーカーであるα−６−インテグリン／ＣＤ４９ｆ（筋上皮）およびＭＵＣ−１（管腔）に対して、細胞を染色した。（Ｃ）分離され、分化条件で１４日間増殖し、α−６−インテグリン／ＣＤ４９ｆおよびＭＵＣ−１に対して免疫染色された、第一継代のＲ１−ＡＬＤ＋マンモスフィアの代表的な画像。Ｒ１−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は、α−６−インテグリンに対して免疫染色される単一系統の筋上皮コロニー、ＭＵＣ−１に対して免疫染色される単一系統の管腔上皮コロニー、並びにα−６−インテグリンおよびＭＵＣ−１の両方に対し免疫染色される細胞を含む二分化能コロニーを生成する。（Ｄ）Ｒ１〜Ｒ３  ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞およびＲ１〜Ｒ３  ＡＬＤ−マンモスフィア由来細胞における、抗ヒトβカゼインに関するウェスタンブロット解析。ローディング対照：アクチン。陽性対照：ＢＴ−２０細胞株。
【図３】パネルＡ〜Ｆ：ヒト化された、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのクリアリングされた（cleared）脂肪パッドにおける、Ｒ１−ＡＬＤ＋上皮サブセットから生じた管増殖物の特徴決定。（Ａ〜Ｂ）マウス脂肪パッド中に形成された腺房構造および管‐腺房構造がヒト由来であることを示す、ヒト特異的抗ＣＫ８／１８抗体および抗αＳＭＡ抗体による陽性染色。管は、ＣＫ８／１８を発現する管腔層およびαＳＭＡを発現する筋上皮層から成る。（ＣおよびＥ）腺房および管がヒト由来であることを示す、ヒトＣＫ８／１８に対する特異的染色。（ＤおよびＦ）分泌上皮細胞および腺胞腔で検出されるヒトβカゼイン乳タンパク質に対する特異的染色。
【図４】パネルＡ〜Ｆ：Ｒ１上皮細胞は、外胚葉系に沿って、ドーパミン作動性神経細胞（ＤＡ神経細胞）に分化することができる。電気生理学に用いられた、単一のＲ１−ＡＬＤ＋に由来するＤＡ神経細胞（Ａ）および単一のｈＥＳＣに由来するＤＡ神経細胞（Ｂ）の、ＤＩＣ画像および対応する免疫蛍光画像。ＤＡＰＩ（青）；チロシン水酸化酵素（ＴＨ、赤）；小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２、緑）；マージ（黄）。（Ｃ）パネルＡに示されたＲ１−ＡＬＤ＋由来ＤＡ神経細胞における電圧応答、（Ｄ）パネルＢに示されたｈＥＳＣ由来ＤＡ神経細胞における電圧応答。挿入図：注入電流の関数としての偏向電圧のピーク振幅。（Ｅ）Ｒ１−ＡＬＤ＋由来ＤＡ神経細胞膜およびｈＥＳＣ由来ＤＡ神経細胞膜の特性を要約している表。いずれのパラメーターも２群間で有意差を示さなかった（それぞれ、対応のないｔ検定、ｎ＝５で、ｐ＞０．０５）。（Ｆ）Ｒ１由来ＤＡ神経細胞における単一の一過性活動電位の、テトロドトキシン（ＴＴＸ）の介在による遮断。
【図５】パネルＡ〜Ｅ：Ｒ１上皮細胞は多能性を有し、胚体内胚葉系および中胚葉系に分化することができる。（Ａ〜Ｂ）胚体内胚葉に向かう分化の３日後における、Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２およびブラキュリに対する、並びに、（Ｃ〜Ｄ）心筋分化の６日後における、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２、Ｎｋｘ２．５およびトロポニンＩに対する、Ｒ１−ＡＬＤ＋細胞およびＲ１−ＡＬＤ−細胞の免疫蛍光分析。（Ｅ）３つの胚葉（外胚葉、内胚葉および中胚葉）に向かう、Ｒ１細胞の分化能の略図。Ｒ１多能性上皮サブセットに対応するＳＣＩＰＰ：ヒト生得的多能性体細胞（human Somatic Cells with an Innate Potential for Pluripotency）。
【図６】パネルＡ〜Ｃ：個々のＲ１細胞は、多能性マーカーを発現するコロニーを生じる；Ｒ１細胞は表現型の可変性を示す。（Ａ）上部および中央のパネル：多能性マーカーであるＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を示す、照射された線維芽細胞フィーダー上の、代表的なＨ７コロニーおよびＲ１由来コロニーの位相差画像および免疫蛍光画像。下部パネル：ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４の発現は欠如しているが、上皮マーカーＥｐＣＡＭの発現を示している、照射された線維芽細胞フィーダー上の、Ｒ４細胞の位相差画像および免疫蛍光法画像。Ｓｏｘ２タンパク質は、Ｈ７細胞およびＲ１由来コロニーでは一様に発現されるが、Ｒ４細胞では発現されない（データ未記載）。（Ｂ）上部パネル：乳腺組織から単離されたＲ１およびＲ４上皮細胞サブセット（それぞれ、９５．６％および９５．５％純粋）の分取後分析。下部パネル：未分化状態での細胞の増殖を可能にする培養下で４週間後の、Ｒ１の、Ｒ１〜Ｒ４の４つ全ての上皮サブセットへの動的再分布（Ｒ１＝５５％、Ｒ２＝２６％、Ｒ３＝１５％およびＲ４＝４％）。Ｒ４サブセットは、８週間の延長された培養の後でさえ、その初期分布にほとんど限定される（Ｒ１＝０．１４％、Ｒ２＝１．９９％、Ｒ３＝１０．７０％およびＲ４＝８８．０７％）。（Ｃ）内在性転写物特異的プライマーを用いた、Ｈ７  ｈＥＳＣ、Ｒ１−ＡＬＤ＋およびＲ１−ＡＬＤ−上皮サブセットにおける、多能性マーカー、再プログラムマーカーおよびストレス関連マーカーについての、定量的リアルタイムＰＣＲ分析。転写物発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化され、Ｈ９ヒトＥＳ細胞と比較される。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を表す。
【図７】パネルＡ〜Ｂ：細胞表面マーカーに基づくＦＡＣＳ分取を用いた、ヒト乳腺上皮亜集団の単離および分画。（Ａ）単一細胞にゲートをかけた集団（single-cell gated population）に対する、ヒト乳腺組織における、細胞系細胞表面マーカーであるＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４およびＣＤ１４０ｂの発現の、ＦＡＣＳ分析。上記マーカーについて陰性または陽性である細胞を、細胞系マーカー陰性（Ｌｉｎ−）集団および細胞系マーカー陽性（Ｌｉｎ＋）集団と定義した。（Ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ９０（Ｒ１〜Ｒ４）に対するゲートを確立するための、Ｌｉｎ−未染色単一細胞の代表的なＦＡＣＳ分析。
【図８】パネルＡ〜Ｂ：ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ発現を有する、または有さないＲ１〜Ｒ４サブセットのＦＡＣＳ分布のための実験デザイン。（Ａ）Ｒ１〜Ｒ４サブセットおよびそれらに対応するＡＬＤＥＦＬＵＯＲ発現対応物のＦＡＣＳに基づいた単離の概要。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイを用いるＬｉｎ−細胞の代表的なＦＡＣＳ分析。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ基質（ＢＡＡＡ）および特異的なＡＬＤＨ阻害剤ＤＥＡＢと一緒にインキュベートされた細胞を使用して、これらの細胞のベースライン蛍光を確立し（Ｒ５）、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性領域を決定した（Ｒ６）。ＤＥＡＢ非存在下で、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ基質と一緒に細胞をインキュベートすることにより、ＢＡＡＡ蛍光において変化を起こし、ＡＬＤ＋集団に対応する細胞亜集団が同定される。ＡＬＤ−領域（Ｒ５）およびＡＬＤ＋領域（Ｒ６）内の、ＤＥＡＢ非存在下での、Ｒ１〜Ｒ４の分布。（Ｂ）ＤＥＡＢ存在下およびＤＥＡＢ非存在下での、Ｌｉｎ−のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４集団における、ベースライン蛍光領域（Ｒ５）およびＡＬＤ＋領域（Ｒ６）の代表的なＦＡＣＳ分析。データは、１０の乳房縮小術の代表である。
【図９】パネルＡ〜Ｂ：Ｒ１〜Ｒ４ヒト乳腺上皮サブセットについての、インビトロにおける自己複製能およびヒト乳腺の管−腺胞構造を再現する能力。（Ａ）Ｒ１〜Ｒ４サブセット（ａ〜ｄ）；Ｒ１〜Ｒ３ＡＬＤ＋サブセット（ｅ〜ｇ）；および懸濁液中で増殖できなかったＲ１〜Ｒ３ＡＬＤサブセット（ｈ〜ｊ）についての、マンモスフィア形成能の代表的な画像。マンモスフィアの発生頻度は、継代１〜４のＲ１については、３．８６±０．１３、３．４４±０．１６、３．５４±０．１４および３．４６±０．１９；継代１〜３のＲ２については、０．４７±０．０１、０．５６±０．０５および０．５４±０．０５；継代１〜２のＲ３については、０．５８±０．０１および０．４８±０．０４；継代１〜４のＲ１−ＡＬＤ＋については、５．５６±０．０７、６．３±０．２６、６．１２±０．２４および５．９±０．１８；継代１〜３のＲ２−ＡＬＤ＋については、０．６４±０．０２、０．７４±０．０９および０．５８±０．０７；継代１〜２のＲ３−ＡＬＤ＋については、０．５６±０．０３および０．５８±０．０４；継代１〜４の未選別の細胞については、０．３５±０．０２、０．４４±０．０５、０．３８±０．０４および０．４±０．０５であった。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。（Ｂ）コロニー形成性三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養における、Ｒ１−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞およびＲ２−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞から生じた、管−腺房構造および腺房構造。これらの条件下では、Ｒ３−ＡＬＤ＋およびＲ１〜Ｒ３  ＡＬＤ−は、管−腺房構造または腺房構造を生じることができない。
【図１０】パネルＡ〜Ｍ：クリアリングおよびヒト化されたマウス乳腺脂肪パッドに移植されたヒト乳腺上皮サブセットの、インビボでの増殖能。Ｒ１  ＡＬＤ＋／ＡＬＤ−サブセットおよびＲ３  ＡＬＤ＋／ＡＬＤ−サブセットにより生じた管のヘマトキシリン‐エオシン染色。各サブセットについて、注入された細胞数は、以下の通りである：Ｒ１：１５，０００個；Ｒ１−ＡＬＤ＋：５，０００個；Ｒ１−ＡＬＤ−：３０，０００個；Ｒ３：３００，０００個；Ｒ３−ＡＬＤ＋：３０，０００個；およびＲ３−ＡＬＤ−：２００，０００個。Ｒ２サブセットおよびＲ４サブセットは、マウス乳腺脂肪パッドに移植された場合、いかなる増殖物も生じなかった（データ未記載）。データは、Ｒ１〜Ｒ４、並びに３つの乳房縮小術から単離されたＲ１およびＲ３  ＡＬＤ＋／ＡＬＤ−サブセットに対して行われた実験の代表的なものである。
【図１１】パネルＡ〜Ｄ：Ｒ１およびＲ２サブセットの神経分化能。神経分化後の、ネスチン、ＧＦＡＰおよびＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリンに対する、Ｒ１−ＡＬＤ＋細胞（Ａ）およびＲ２−ＡＬＤ＋細胞（Ｂ）の免疫蛍光分析。（Ｃ）神経分化後の、ＧＦＡＰおよびＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリン染色された、ｈＥＳＣ、Ｈ７細胞の免疫蛍光分析。（Ｄ）Ｒ１−ＡＬＤ＋（上部パネル）およびｈＥＳＣ、Ｈ７（下部パネル）の、ドーパミン作動性（ＤＡ）神経細胞への分化を示す、代表的なＤＩＣ画像。対応する免疫蛍光画像が示される：ＤＡＰＩ（青）；チロシン水酸化酵素（ＴＨ、赤）；小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２、緑）；マージ（黄）。
【図１２】単一のＲ１細胞に由来するサブクローンの完全な系統分化能。（Ａ）神経分化後の外胚葉系：ネスチン、Ｐａｘ６、ＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリン、ＴＨおよびＮＣＡＭ；（Ｂ）胚体内胚葉分化後の内胚葉系：Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７およびブラキュリ、並びに（Ｃ）心筋細胞分化後の中胚葉系：ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２およびＮｋｘ２．５についての免疫蛍光分析。
【図１３】乳腺上皮における、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲを発現する、または発現しない、Ｒ１〜Ｒ４サブセットの分布を示す表。Ｒ１〜Ｒ４サブセットにおける全Ｌｉｎ−集団の平均分布；全ＡＬＤ＋集団におけるＲ１〜Ｒ４サブセットの平均分布、およびＲ１〜Ｒ４サブセットにおけるＡＬＤ＋集団の平均分布の要約。データは、１０個の個々の試料からの、パーセント（平均値±ＳＥＭ）として表されている。
【図１４】短いタンデム反復（ＳＴＲ）分析。乳房縮小術オルガノイドから分離された親乳腺細胞、および対応する親ＣＤ７３＋ＣＤ９０−（Ｒ１）細胞集団由来の拍動する心筋性培養物から、ゲノムＤＮＡを抽出した。２つのそれぞれの組織試料（試料１および２）について分析を行い、試料２は、２つの異なる独立した分化実験から分析された。継代５６でのＨ７  ＥＳＣ、およびＫ５６２細胞から得られたＤＮＡ試料は、遺伝子型同定反応のための内部標準として含められた。Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ｖＷＡ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸ、ＣＳＦ１Ｐ０および性染色体マーカーのアメロゲニンを含む遺伝子座を、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１．２またはＣｅｌｌＩＤ遺伝子型同定キット（プロメガ社）を用いて分析した。分析された９個全ての遺伝子座の対立遺伝子の割当ては、それぞれの親乳腺細胞集団と、それに対応する中胚葉系分化型（心筋）Ｒ１誘導体との間で、全ての場合で同一であったが、いくつかの遺伝子座で、提供者間で異なり、Ｈ７およびＫ５６２のそれと異なっていた。
【図１５】Ｒ１−ＡＬＤ＋、Ｒ１−ＡＬＤ−およびＲ４上皮サブセット、Ｈ７およびＨ９ヒトＥＳＣの間で分析された、遺伝子の制御倍率。遺伝子の発現変化は全て、Ｈ９、ｈＥＳＣに対して正規化された。分析は、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（キアゲン社、米国、メリーランド）サポートオンラインにより提供されたソフトウェアで実行された。
【図１６】パネルＡ〜Ｄ：Ｒ１細胞は自己複製能および乳腺多分化能（mammary multilineage capacity）を有する。（Ａ）Ｒ１〜Ｒ４亜集団のマンモスフィア誘導能を、１０，０００細胞（第一継代）および１，０００細胞（後の継代）を用いて評価した。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されているマンモスフィア％については、図２３、パネルＡを参照されたい。（Ｂ）連続継代のマンモスフィアから分離され、α−６−インテグリン／ＣＤ４９ｆ（筋上皮）およびＭＵＣ−１（管腔）マーカーに対して染色された細胞のＦＡＣＳ分析。Ｐは継代数である。（Ｃ）Ｒ１〜Ｒ３マンモスフィア由来細胞における抗ヒトβカゼインについてのウェスタンブロット解析。ローディング対照：アクチン。陽性対照：ＢＴ−２０細胞株。（Ｄ）ヒト特異的抗体を用いて染色された、ＣＫ８／１８（緑）を発現する管腔層、およびαＳＭＡ（赤）を発現する筋上皮層から成る管は、マウス脂肪パッド中に形成された構造がヒト由来であることを示している。スケール＝１００μｍ。
【図１７】パネルＡ〜Ｄ：Ｒ１上皮細胞は中内胚葉系に分化する。（Ａ）膵臓分化の１２日後のＰＤＸ１、ＳＯＸ１７およびＮＫＸ６．１、並びに（Ｂ）心筋性分化の６日後のＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２．５、ＭＥＦ２およびトロポニンＩに対する、Ｒ１細胞の免疫染色。スケール＝１００μｍ。（Ｃ）脂肪細胞分化の９日後のＲ１およびヒトＭＳＣのオイルレッド０染色。（Ｄ）直接分取されたＲ１、増殖培地中のＲ１（Ｒ１−対照）、脂肪細胞用分化培地中のＲ１（Ｒ１−分化）、増殖培地中のＭＳＣ（ＭＳＣ−対照）、脂肪細胞用分化培地中のＭＳＣ（ＭＳＣ−分化）、およびＲ４における、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）、レプチンおよびＰＰＡＲγの転写レベル（グルクロニダーゼＢ（ＧＵＳＢ）に対し正規化）。
【図１８】パネルＡ〜Ｂ：Ｒ１細胞は奇形腫を形成する。乳房縮小術から直接的に単離されたＲ１細胞（Ａ）または培地中で単一細胞から増殖したＲ１クローン（Ｂ）を、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥマウスの腎被膜下に移植した。注射の１６週間後に奇形腫を採取し、パラフィン包埋し、切片化し、汎ヒト（pan-human）特異的マーカーであるラミンＡ／Ｃに対して染色して、これらの構造がヒト由来であることを示し（上部パネル）、系統特異的マーカー（下部パネル）：グリア（外胚葉）マーカー、ＧＦＡＰ（２５０×）；膵臓（内胚葉）マーカー、ＰＤＸ１（１５０×）；または軟骨（中胚葉）マーカー、ＨＡＰＬＮ１（２５０×）に対して、染色した。挿入図：ＧＦＡＰ陽性細胞の５００×画像。
【図１９】パネルＡ〜Ｄ：単一細胞に由来するＲ１コロニーは多能性マーカーを発現する。（Ａ〜Ｃ）Ｈ７  ｈＥＳＣ、新しく分取したＲ１上皮亜集団、フィーダー細胞層上の個々のＲ１単一細胞由来コロニー、増殖培地中のＲ１サブクローン、およびヒトＭＳＣ中の、多能性マーカー、ストレスマーカーおよび再プログラムマーカーの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。転写レベルは、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化され、Ｈ９  ｈＥＳＣと比較された。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。（Ｄ）ｅＰＳ細胞（ヒト内因性多能性体細胞（human endogenous Pluripotent Somatic cell））の、外胚葉、内胚葉および中胚葉へと分化する能力の略図。
【図２０】パネルＡ〜Ｅ：Ｒ１由来クローンは不死性ではない。（Ａ）単一細胞から培地中で増殖したＲ１細胞は老化を開始する。黒矢印：核型が二倍体４６、ＸＸ（正常）であることが確認されたＰＤ（４３、５０および５６）；（Ｂ）ＰＤ５０での核型解析。（Ｃ）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色後のＤＮＡ含量を示し、後期継代数でのＧ１アレストを示す、早期（ＰＤ５１）および後期（ＰＤ５８）継代数の細胞のフローサイトメトリー（赤丸）。（Ｄ〜Ｅ）示された細胞株中の、ＧＵＳＢに対して正規化されたｈＴＥＲＴの発現、およびＴＲＡＰｅｚｅ  ＸＬテロメラーゼ検出キットを用いて評価されたテロメラーゼ活性。ＴＰＧ：総生産物。
【図２１】パネルＡ〜Ｂ：ｐ１６ＩＮＫ４ａの抑制、並びに細胞表面マーカーであるＣＤ７３およびＣＤ９０の発現調節。（Ａ）ハウスキーピング遺伝子であるグルクロニダーゼＢ（ＧｕｓＢ）に対し正規化された、Ｍｏｃｋ（初代乳腺上皮細胞）、ｐｌＫＯ−ｐＧｌ３（対照ベクターを形質導入した細胞）、およびｐｌＫＯ−ｓｈｐ１６ＩＮＫ４ａ（ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する低分子ヘアピンを形質導入した細胞）中の、ｐ１６ＩＮＫ４ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）の転写レベル。（Ｂ）３つの独立した形質導入から得られた、（Ａ）におけるＦＡＣＳ分析によって測定された集団における、ＣＤ７３＋ＣＤ９０−（Ｒ１）細胞の平均割合のグラフ。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図２２】乳房縮小術の試料の核型解析。本研究で使用された、６つの個々の乳房縮小術試料の代表的な核型解析は、一貫した二倍体４６、ＸＸ（正常）状態を示す。
【図２３】パネルＡ〜Ｃ：Ｒ１〜Ｒ４ヒト乳腺上皮亜集団についての、インビトロにおける、自己複製能、並びに管腔構造、筋上皮構造、および管−腺胞構造を再現する能力。（Ａ）Ｒ１〜Ｒ４亜集団に関する、マンモスフィア形成能の代表的な画像（ａ〜ｄ）。マンモスフィアの発生頻度は、継代１〜４のＲ１については、３．８６±０．１３、３．４４±０．１６、３．５４±０．１４および３．４６±０．１９；継代１〜３のＲ２については、０．４７±０．０１、０．５６±０．０５および０．５４±０．０５；継代１〜２のＲ３については、０．５８±０．０１および０．４８±０．０４；継代１〜４の未選別の細胞については、０．３５±０．０２、０．４４±０．０５、０．３８±０．０４および０．４±０．０５であった。データは、５つの組織試料（ｎ＝５）から得られた平均値±ＳＥＭとして表されている。（Ｂ）分化誘導条件下で１４日間増殖させ、α−６−インテグリン／ＣＤ４９ｆおよびＭＵＣ−１について免疫染色した、第１継代の分離されたＲ１マンモスフィアの代表的な画像。Ｒ１−マンモスフィア由来細胞は、α−６−インテグリン対し免疫染色された単一系統の筋上皮コロニー、ＭＵＣ−１に対し免疫染色された単一系統の管腔コロニー、およびα−６−インテグリンおよびＭＵＣ−１の両方に対し免疫染色された二分化能コロニーを生じた。（Ｃ）コロニー形成三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ培地中で、Ｒ１およびＲ２マンモスフィア由来の細胞から生じた、管−腺房構造および腺房構造。Ｒ３は、これらの条件下で、管−腺房構造または腺房構造を生じなかった。スケール＝１００μｍ。
【図２４】パネルＡ〜Ｆ：クリアリングされ、ヒト化されたマウス乳腺脂肪パッドに移植されたヒト乳腺上皮亜集団の、インビボにおける増殖能。（Ａ）それぞれＲ１亜集団およびＲ３亜集団から得られた、５，０００個および３００，０００個の細胞を注射した後に生じた管のヘマトキシリン‐エオシン染色。Ｒ２亜集団およびＲ４亜集団は、マウス乳腺脂肪パッドに移植された際に、いかなる増殖物も生じなかった（データ未記載）。（Ｂ）ヒト特異的抗ＣＫ８／１８抗体を用いた管腔層の免疫蛍光染色、および抗αＳＭＡ抗体を用いた筋上皮層の免疫蛍光染色であり、マウス脂肪パッドに形成された腺房構造および管−腺房構造がヒト由来であることを示している。（ＣおよびＤ）ヒトＣＫ８／１８に対する特異的染色であり、腺房および管がヒト由来であることを示している。（ＥおよびＦ）分泌上皮細胞および腺胞腔において検出された、ヒトβカゼイン乳タンパク質に対する特異的染色。データは、３つの乳房縮小術から単離されたＲ１〜Ｒ４亜集団に対して行われた実験の代表的なものである。
【図２５】パネルＡ〜Ｄ：Ｒ１細胞の神経分化能。（Ａ）：培地中のＲ１（ＣＤ７３＋ＣＤ９０−）由来ニューロスフィアまたはＨ７由来ニューロスフィアの位相差画像；（Ｂ）：神経分化後にネスチン、ＧＦＡＰおよびＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリンに対して染色されたＲ１細胞の免疫蛍光分析；（Ｃ）：神経分化後にＧＦＡＰおよびＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリンに対して染色されたＨ７  ｈＥＳＣの免疫蛍光分析；（Ｄ）：推定ドーパミン作動性（ＤＡ）神経細胞への分化後にチロシン水酸化酵素（ＴＨ、赤）および小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２、緑）に対して染色されたＲ１およびＨ７  ｈＥＳＣの免疫蛍光分析。ＤＡＰＩ（青）；マージ（黄）。
【図２６】パネルＡ〜Ｃ：Ｒ１細胞の中内胚葉分化能。Ｒ１細胞の、（Ａ）胚体内胚葉への分化の３日後の、内胚葉系（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７およびブラキュリ）発現に対する、免疫蛍光分析、並びに（Ｂ）脂肪細胞分化の１９日後の、中胚葉（脂肪細胞）系統（ＦＡＢＰ４）発現に対する免疫蛍光分析。ヒトＭＳＣを陽性対照として使用した。スケール＝１００μｍ。（Ｃ）（ａ）Ｒ１、（ｂ）ＨＵＶＥＣ、（ｃ）初代ヒト乳腺上皮細胞について、内皮のＭａｔｒｉｇｅｌ分化アッセイにおいて２４時間後に、または、（ｄ）陰性対照としての初代乳腺上皮細胞について、基礎増殖培地において２４時間後に、位相差顕微鏡観察により評価されたコード形成能。
【図２７】パネルＡ〜Ｄ：直接分取されたＲ１細胞集団からの、または単一細胞由来Ｒ１サブクローンからの、奇形腫の形成。乳房縮小術の組織から直接単離されたＲ１細胞（Ａ〜Ｂ）、または単一細胞由来Ｒ１サブクローン（Ｃ〜Ｄ）を、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥマウスの腎被膜下に移植した。注射の１６週間後に奇形腫を採取した。パラフィン包埋した奇形腫から得た連続切片を、これらの構造がヒト由来であることを示すために、汎ヒト特異的マーカーであるラミンＡ／Ｃに対して染色し（Ａ〜Ｃ、左パネル）、系統特異的マーカーであるＨＡＰＬＮ１に対して染色した（Ａ〜Ｃ、右パネル）。奇形腫全体の代表的な４０倍像を示す。（Ｂ〜Ｄ）内胚葉マーカーであるＡＦＰおよびＴＦＦ３を発現している構造のさらなる８０倍像、並びにヒトラミンＡ／Ｃに対する対応する染色。ＴＦＦ３を発現する細胞は、腸杯細胞が生じたことを示している。
【図２８】パネルＡ〜Ｂ：Ｈ７  ＥＳＣ由来の奇形腫およびＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍の形成。（Ａ）Ｈ７  ＥＳＣ、または（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳がん細胞を、ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥマウスの腎被膜下に移植した。Ｈ７  ＥＳＣ由来奇形腫およびＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍を、注射の８週間後に採取した。パラフィン包埋したＨ７  ＥＳＣ由来奇形腫またはＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍から得た連続切片を、これらの構造がヒト由来であることを示すために汎ヒト特異的マーカーであるラミンＡ／Ｃに対して（上部パネル）、および系統特異的マーカーに対して（下部パネル）、染色した。これらのマーカーには、グリア（外胚葉）マーカーであるＧＦＡＰ、膵臓（内胚葉）マーカーであるＰＤＸ１、または軟骨（中胚葉）マーカーであるＨＡＰＬＮ１が含まれる。（Ａ）Ｈ７  ＥＳＣ由来奇形腫の代表的な視野の８０倍像、（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍の代表的な視野の３倍像（左カラム）および１２０倍像（右カラム）。
【図２９】パネルＡ〜Ｄ：単一細胞由来Ｒ１サブクローンの、インビトロにおいて外胚葉、内胚葉および中胚葉系へと分化する能力。単一細胞を培地中で増殖させ、分化能についてアッセイした。（Ａ〜Ｂ）外胚葉系についての免疫蛍光分析：（Ａ）乳腺分化後のα−６−インテグリン（筋上皮）およびＭＵＣ−１（管腔）発現。矢印は、両方のマーカーを発現する大部分の細胞（二分化能前駆細胞）とは対照的に、１つのマーカーのみを発現している細胞を示している；（Ｂ）神経分化後のＮＣＡＭ、ネスチン、ＰＡＸ６、ＴＨおよびＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリン発現；（Ｃ）内胚葉系についての免疫蛍光分析：膵臓分化後のＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１発現（ブラキュリの発現の欠如は内胚葉系統へと向かう完全な制限を示していることに注意）、並びに（Ｄ）中胚葉系についての免疫蛍光分析：心筋細胞分化後のＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２およびＮＫＸ２．５発現。スケール＝１００μｍ。
【図３０】パネルＡ〜Ｂ：単一細胞由来Ｒ１コロニーにおける、多能性マーカーであるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧの発現。Ｌｉｎ陰性、ＥＰＣＡＭ陽性上皮細胞を、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧの発現について評価した。（Ａ）フィーダー細胞層上での培養の１４日後にフローサイトメトリーで評価された、個々の細胞における、多能性マーカーであるＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧの発現。左パネル：アイソタイプ対照、中央パネル：Ｒ１由来コロニー；右パネル：Ｈ７  ｈＥＳＣ。ＳＯＸ−２のデータは未記載。Ｒ１集団の９６％が、３種のマーカー全てについて陽性に染色された。（Ｂ）１４日後の、フィーダー細胞上の単一細胞由来Ｒ１コロニーにおける、多能性マーカーであるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧのウェスタンブロット分析。Ｈ７（陽性対照）、ＲＭＦ（乳房縮小術の線維芽細胞（reduction mammary fibroblast））およびＲ４細胞（陰性対照）。ローディング対照：γチューブリン。
【図３１】パネルＡ〜Ｄ：外胚葉誘導体および内胚葉誘導体を染色するのに使用された抗体の特異性。外胚葉誘導体（Ａ〜Ｂ）および内胚葉誘導体（Ｃ〜Ｄ）の免疫蛍光染色のために選択された抗体を、生物学的陽性対照として使用された、Ｈ７由来神経細胞誘導体および胚体内胚葉誘導体（Ａ〜Ｄ、上段）に対して、試験した。ヒト初代線維芽細胞（Ａ〜Ｄ、段）を、生物学的陰性対照として使用した。スケール＝１００μｍ。
【図３２】奇形腫内の系統誘導体を染色するのに使用された抗体の特異性。奇形腫分析のために選択された抗体を、抗体特異的陽性対照として使用された種々のヒト組織に対して試験した（抗ＬＡＭＩＮ  Ａ／Ｃ抗体については睾丸、抗ＧＦＡＰ抗体については脳、抗ＰＤＸ１抗体については膵臓、抗ＨＡＰＬＮ１抗体については軟骨、抗ＴＦＦ３抗体については結腸、および抗ＡＦＰ抗体については肝臓腫瘍）。奇形腫の切片を、実施例セクションに記載の一次抗体が、無しの場合（−Ａｂ；上段）、または有りの場合（＋Ａｂ；中段）で染色した。抗体を、マウス腎臓切片（下段）に対しても試験して、抗体がマウス組織との交差反応性の欠如を示すことができなかったことを示した。抗ＴＦＦ３抗体のみが、マウス腎臓との最小の反応性を示したが、Ｒ１由来奇形腫およびＨ７由来奇形腫におけるＴＦＦ３を発現する構造がヒト由来であることは、高度にヒト特異的である抗ラミン  Ａ／Ｃ抗体を用いて示された（図２７、パネルＢ）。拡大率：１２０倍。
【図３３】１０人の無病女性についてのＣＤ７３およびＣＤ９０の分布特性を示す表。１０の乳房縮小術試料からの様々な組み合わせにおける、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現している細胞系マーカー陰性細胞の割合。組織提供者の年齢および民族性を提供する。
【図３４】Ｒ１〜Ｒ４亜集団、Ｈ７およびＨ９  ｈＥＳＣおよびヒトＭＳＣにおける多能性遺伝子、ストレス応答遺伝子および再プログラム遺伝子の相対的発現。Ｈ７  ｈＥＳＣ（ｎ＝１）、Ｈ９  ｈＥＳＣ（ｎ＝１）、ヒトＭＳＣ（ｎ＝１）、４人の組織提供者から単離されたＲ１〜Ｒ４細胞（ｎ＝４）、フィーダー細胞層上で増殖した単一細胞由来Ｒ１コロニー（ｎ＝３）、増殖条件下で増殖した単一細胞由来Ｒ１クローン（ｎ＝３）に対して、Ｃｕｓｔｏｍ  ｑＰＣＲアレイ（キアゲン社）を行った。各試料を、２つの異なる実験において、技術的２回反復（technical duplicate）としてプローブした。ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙオンラインソフトウェア（キアゲン社、米国、メリーランド）を用いて、分析を行った。ｐ値を伴う、Ｈ９  ｈＥＳＣにおけるものと比較した平均遺伝子発現レベルが提供されている。
【図３５】パネルＡ〜Ｂ：（Ａ）細胞表面マーカーであるＣＤ７３およびＣＤ９０に従ってセットアップされたゲートを示す、ヒト膵臓から単離された未染色単一細胞。細胞系マーカー陰性画分における、Ｒ１〜Ｒ４細胞集団の分布を示す、ヒト膵臓から単離された染色された単一細胞。（Ｂ）パネルＡから得られたＲ１細胞のインビトロにおける乳腺系統分化。α−６−インテグリン＝筋上皮細胞マーカー；ＭＵＣ１＝管腔細胞マーカー。スケール＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
実質的に富化された、哺乳類の生得的多能性体細胞（Somatic Cells with an Innate Potential for Pluripotency，ＳＣＩＰＰ）を提供する。ＳＣＩＰＰは、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、外胚葉系、内胚葉系および中胚葉系の分化細胞を生み出すのに有用である。ＳＣＩＰＰは、実験的評価のための移植、並びに系統および細胞に特異的な産物の供給源としての移植に有用である。
【０００９】
一部の実施形態では、前記細胞は、細胞系マーカー陰性（Ｌｉｎ−）、ＣＤ７３＋、且つＣＤ９０−であると定義される。Ｌｉｎ−細胞の判定は、細胞に結合して、それによりその細胞が特異的な細胞系統（例えば、血液細胞系統、例えば、マクロファージ、リンパ球等）に属していると同定する、系統マーカー特異的試薬（例えば、抗体）を使用することを含む、いかなる好都合な様式でも行うことができる。ある実施形態では、系統パネルには、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４および／またはＣＤ１４０ｂに対する結合試薬が含まれ得る。他の系統マーカーも、Ｌｉｎ−細胞を判定するのに使用され得る。
【００１０】
以下に詳細に記載される通り、ＳＣＩＰＰは、神経細胞および心筋細胞を含む機能的な分化細胞になることができ、それ故、組織が再生または置換されることにより恩恵がもたらされる種々の傷害、外傷または病状（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、変形性関節症、創傷修復、化学療法後の回復、加齢等）を治療するのに使用することができる。
【００１１】
幹細胞の機能はいくつかの病状（例えば、がん）においても重要であるため、これらの細胞は、いくつかの疾患経過に対する予防および治療介入のための薬剤および生物マーカーの、治療目的でのスクリーニングおよび開発に使用される可能性も有している。ＳＣＩＰＰには、悪性形質転換並びに細胞の確率的転換（例えば、安定な表現型状態から可塑的な状態への転換）を研究するためのモデルとしての用途もある。
【００１２】
ある対象からＳＣＩＰＰを単離するための系およびキットも提供される。さらに、本発明の態様は、エンドユーザーを対象とする、研究用および治療目的でのＳＣＩＰＰの単離および提供のサービスに関する。
【００１３】
本発明についてさらに詳細に記述する前に、本発明が、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、それ自体、当然のことながら変化し得るものであることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲にのみ限定されるものであるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００１４】
値の範囲が提供されたとき、その範囲の上限と下限の間の、文脈によって特に明示されない限り下限の１０分の１の単位までの、間に挟まれた各値、およびその記載範囲内のあらゆる他の記載された、または間に挟まれた値は、本発明に包含されることを理解されたい。記載範囲に具体的に除外される境界値がある場合は、これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してそのより小さい範囲内に含まれてよく、これもまた本発明に包含もされる。記載範囲が一方または両方の境界値を含む場合、含まれる境界値のどちらかまたは両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１５】
ある範囲は、「約」という用語に先行された数値を用いて、本明細書で提供される。本明細書において「約」という用語は、それに続くまさにその数値、並びにその用語に続く数値に近いまたは近似した数値のための字義通りのサポートを提供するのに使用される。ある数値が具体的に記載された数値に近いまたは近似しているかどうかを決定する際、近いまたは近似している未記載の数値は、それが提示された文脈において、具体的に記載された数値の実質的な等価物を提供する数値であり得る。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の技量を有する者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験に、本明細書に記載されるものと同様または等価であるいかなる方法および材料も使用可能ではあるが、本明細書には、代表的な実例となる方法および材料が記載されている。
【００１６】
本明細書で引用する全ての文献および特許は、個々の公報または特許が、あたかも具体的且つ個別的に参照により組み入れられることを指示されたかの如く、参照により本明細書に組み入れられ、引用された文献と関連した方法および／または材料を開示・説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。あらゆる文献の引用は、出願日前の文献の開示のためのものであって、本発明が先願発明によってかかる文献に先行しないと解されるべきではない。さらに、提供される文献の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立に確認される必要があり得る。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。さらに、特許請求の範囲が、いかなる随意的な要素をも除外するよう記述され得ることに注意されたい。従って、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙と関連して、「単に」、「唯一の」などのような排他的専門用語を使用するための、または「消極的な」限定を使用するための先行詞として働くように意図される。
【００１７】
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書で記述され説明される個々の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離することができる、またはそれらと容易に組み合わせることができる、別々の構成要素および特徴を有する。記載されるいかなる方法も、記載された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で、実行され得る。
【００１８】
定義
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に記載の細胞を単離または同定するための、および／または診断、処置、または治療が望まれるもの、特にヒトのための、いずれかの組織の供給源である、あらゆる哺乳類対象を意味する。
【００１９】
「遺伝子産物」は、ペプチドまたはタンパク質等の、遺伝子によって発現または産生される、生体高分子産物である。遺伝子産物は、例えば、スプライシングされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライスバリアントポリペプチド等であり得る。また、ＲＮＡ遺伝子産物を鋳型として用いて生成される生体高分子産物（すなわち、ＲＮＡのｃＤＮＡ）もこの用語に包含される。遺伝子産物は、酵素によって、組換えによって、化学作用によって、またはその遺伝子を産する細胞内で、生成され得る。多くの実施形態では、遺伝子産物は、タンパク質性である場合、生物活性を示す。多くの実施形態では、遺伝子産物は、核酸である場合、生物活性を示すタンパク質性遺伝子産物に翻訳され得る。
【００２０】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸の多量体型を意味し、それには、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、並びに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。前記用語には、融合タンパク質、例えば、限定はされないが、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない、異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質、異種および相同リーダー配列を含む融合物；免疫学的に標識されたタンパク質等が含まれる。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さの、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの多量体型を意味し、例えば、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または複数本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む重合体が含まれる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド等の修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体、並びに一つまたは複数の非ヌクレオチド成分を含み得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、ペプチド核酸も包含する（ＰＮＡ；Pooga et al Curr Cancer Drug Targets. (2001) 1:231-9）。
【００２２】
「特異的結合」という用語は、様々な標的分子から成る均一混合物中に存在する特定の標的分子（例えば、ある細胞の表面上に存在するある特定のタンパク質）に選択的に結合する親和性試薬の能力を意味する。
【００２３】
特異的結合試薬（「親和性試薬」とも称される）には、例えば、抗体、抗体の抗原結合性断片；抗体のエピトープ結合性断片；または標的分子（例えば、ポリペプチド）上のエピトープに特異的に結合する他のタンパク質が含まれる。特異的な結合試薬には、標的分子に対する特異的結合を示す非抗体試薬も含まれる。
【００２４】
「抗体」、「抗体タンパク質」、「抗体試薬」等の用語は、抗体のエピトープ結合ドメインを少なくとも有する親和性試薬を意味するように、本明細書では使用される。これらの用語は、当業者により十分に理解されるものであり、抗原に特異的に結合する一つまたは複数のポリペプチドを含有するタンパク質を意味する。抗体の種類としては、限定はされないが、抗体アイソタイプ、モノクローナル抗体およびその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体等）、人工抗体（例えば、インビトロで生産および選択された抗体および抗体断片）が挙げられる。一部の実施形態では、抗体試薬は、不溶性の、または固体の、担体（例えば、プレート、ビーズ、膜等）上に固定化される。一部の実施形態では、抗体のパネルが提供される。ここで、抗体のパネルは２つ以上の異なる抗体であり、それぞれは、ＳＣＩＰＰの特徴（signature）を構成するポリペプチドに対し特異的である。抗体試薬は、選択された標的ポリペプチドまたは選択された標的ポリペプチドの集合体に特異的に結合する。
【００２５】
一部の実施形態では、抗体試薬は、直接的または間接的に、検出可能に標識される。直接標識としては、放射性同位元素；検出可能な産物を有する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等）；蛍光ラベル（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン等）；蛍光放出金属；化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩等；生物発光化合物、例えば、ルシフェリン、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）等が挙げられる。他の適切な検出可能な標識としては、蛍光色素、例えば、フルオレセイン（Fluorescein）、ローダミン（Rhodamine）、テキサスレッド（Texas Red）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、アレクサ（Alexa）色素ファミリー、ＢＯＤ１ＰＹ、ホウ素ジピロメテンジフルオリド（boron dipyrromethene difluoride）、オレゴン（Oregon Green）、フィコエリトリン（Phycoerythrin）、フィコビリンタンパク質等が挙げられる。間接標識としては、抗体試薬に特異的な二次抗体（二次抗体は上記のように標識されている）；および特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン−アビジン等が挙げられる。
【００２６】
「特異的に結合する」という用語は、特異的結合試薬の文脈、例えば、抗体結合の文脈においては、特定のポリペプチド、すなわち、ポリペプチドのエピトープ、例えば、細胞表面に発現されたポリペプチド（例えば、ＣＤ７３、ＣＤ９０等）に対する、高結合活性および／または高親和性結合を意味する。例えば、特定の標的タンパク質（またはその断片）上のエピトープに対する抗体結合は、他のいかなるエピトープ（とりわけ、同じ試料中に存在し得るエピトープ）に対する同じ抗体の結合よりも、より強力である。ポリペプチドに特異的に結合する特異的結合試薬（例えば、抗体）は、微弱ではあるが検出可能なレベルで、他のポリペプチドに結合し得る（例えば、特異的なポリペプチドに対して示される結合の１０％以下）。そのような微弱な結合、つまりバックグラウンドの結合は、例えば適切な対照を用いることで、標的ポリペプチドに対する特異的な抗体結合と分けて、容易に識別可能である。
【００２７】
「単離された」または「実質的に単離された形態にある」組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または細胞の組成物）（「富化された」または「精製された」試料と称される場合もある）は、その組成物が自然に発生する環境、またはそれが発生した環境とは異なる環境にある、組成物を意味する。例えば、実質的に単離された形態にある細胞は、その細胞が自然に発生した宿主中の場所の外側にある、またはそこから離れている。実質的に単離された形態にある組成物は、通常、実質的に精製されているか、または富化されている。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「対象」、「宿主」、「患者」、および「個体」は、同義的に使用されて、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウマ等を意味する。
【００２９】
「評価する」という用語には、あらゆる形態の測定が含まれ、ある成分が存在するかどうかを決定することが含まれる。「決定する」、「測定する」、「評価する（evaluating、assessing）」、および「アッセイする」という用語は、同義的に使用され、定量的測定および定性的測定が含まれる。評価は相対的または絶対的なものであり得る。「〜の存在を評価する」には、存在する何かの量を決定すること、および／または存在するかしないかを決定することが含まれる。本明細書で使用される場合、「決定する」、「測定する」、「評価する」、および「アッセイする」という用語は、同義的に使用され、定量的測定および定性的測定の両方を含む。
【００３０】
ＣＤ７３（エクト−５'−ヌクレオチダーゼとも称される）は、中性ｐＨでＡＭＰの生理活性アデノシンへの変換を触媒し；その酵素活性とは無関係な機能も有する、膜結合型酵素である。ＣＤ７３は、内皮細胞、周皮細胞、濾胞樹状細胞、およびＴ細胞サブセット等を含む、種々の細胞上で発現される。ヒトＣＤ７３のアミノ酸配列が知られており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ６５９３７、ＮＰ＿００２５１７、およびＡＩ４０１６８に存在する。
【００３１】
ＣＤ９０は、Ｔｈｙ−１としても知られており、２５〜３７ｋＤで、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型の、多くの細胞型に見られる細胞表面糖タンパク質である。ヒトＣＤ９０のアミノ酸配列が知られており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０４２１６、ＡＡＧ１３９０４、ＡＡＨ６５５５９、およびＮＰ＿００６２７９に存在する。Seki et al. (1985) Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 82:6657-6661も参照されたい。
【００３２】
当業者であれば、本明細書に記載の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ抗原）の発現レベルは、細胞表面上のマーカータンパク質の検出量を反映することは理解するであろう。従って、染色に対し「陰性」である細胞（例えば、マーカー特異的抗体の結合レベルが、アイソタイプ適合対照と検出可能な程違わない）は、そのマーカーが少量であることを表している場合がある。細胞を特定のマーカーに対して「陽性」または「陰性」と称することは当該技術分野では一般的なことであるが、実際の発現レベルは量的形質である。細胞表面上の分子数は、数対数単位で異なり得るが、それでも、「陽性」と特徴付けられる。
【００３３】
一部の実施形態では、細胞のマーカー特異的染色強度は、例えば当該技術分野において既知の蛍光標識された抗体を用いるフローサイトメトリーによってモニタリングされ得る。フローサイトメトリーでは、単一細胞に結合している蛍光色素（例えば、マーカー特異的抗体に結合された蛍光色素）の量的レベルを、レーザーを使用して検出する。蛍光色素の検出レベルは、特異的試薬（例えば標識された抗体）が結合した細胞表面マーカーの量に比例する。フローサイトメトリーは、複数の異なる蛍光色素のレベルを同時に検出するのに使用することができ、従って、単一細胞に結合した、複数種の異なる標識をされたマーカー特異的試薬（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０種またはそれ以上の異なる蛍光色素／マーカー）の結合のレベルを検出することができる。フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳは、特異的試薬への結合の強度、並びに細胞サイズおよび光散乱等の他のパラメーターに基づいて細胞集団を分離するのにも使用することができる。染色の絶対レベルは特定の蛍光色素および試薬調製によって異なり得るが、データは対照に対して正規化することができる。
【００３４】
分布を対照に対して正規化するために、各細胞は、所望の各パラメーター（例えば、蛍光色素、光分散等）について、特定の染色強度を有するデータ点として記録される。これらのデータ点は対数スケールによって表され、そこでの測定の単位は任意の染色強度である。一例では、試料中で最も明るく染色された細胞が、未染色の細胞より４対数ほどもより強度が高い場合がある。この様式で表す場合、最も高い対数の染色強度にある細胞が高陽性（bright）で、一方で最も低い強度にある細胞が陰性であることは明らかである。「低」陽性に染色された細胞は、アイソタイプ適合対照の明るさを超える染色レベルを有するが、集団中に通常見出される最も明るく染色される細胞ほど強い染色レベルは有しない。代替的な対照は、表面に規定密度のマーカーを有する担体（例えば、組み立てビーズまたは細胞株）を利用し得、これにより強度についての陽性対照が提供される。
【００３５】
ある遺伝子の遺伝子発現レベルが、本明細書で開示される（例えば、図１５、図３４を参照）。遺伝子の特定は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＰｕｂＭｅｄデータベース［www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov /sites/entrez?cmd=Pager&db=pubmed］を「Ｇｅｎｅ」検索を用いて検索することにより、見出され得る。ＰｕｂＭｅｄから得られたある種の代表的な遺伝子ＩＤは、以下に提供される（全てヒトについてのものである）：
ＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４）：遺伝子ＩＤ９３１４
ｃＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））：遺伝子ＩＤ４６０９
ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：遺伝子ＩＤ５４６０
ＮＡＮＯＧ（Ｎａｎｏｇホメオボックス）：遺伝子ＩＤ７９９２３
ＣＤ２４：遺伝子ＩＤ１００１３３９４１
ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）：遺伝子ＩＤ４０７２
ＣＥＣＲ１（ネコ眼症候群染色体領域、候補１）：遺伝子ＩＤ５１８１６
ＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３β）：遺伝子ＩＤ１７８９
ＰＴＧＳ２（プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２）：遺伝子ＩＤ５７４３。
【００３６】
生得的多能性体細胞（ＳＣＩＰＰ）のマーカー
生得的多能性体細胞が提供され、本明細書では、ＳＣＩＰＰと称される。ＳＣＩＰＰは、本明細書において、内因性多能性体細胞（endogenous Pluripotent Somatic cell、ｅＰＳ細胞）とも称され得る。「生得的多能性体細胞」、「ＳＣＩＰＰ」、「内因性多能性体細胞」、および「ｅＰＳ」という用語は、本明細書では同義的に使用され得る。ＳＣＩＰＰ集団は、種々の研究および治療目的、例えば、移植、組織再生（例えば、対象の損傷した細胞／組織の置換または修復のための）、インビトロ発生アッセイ、薬物スクリーニング、細胞の分化および相互作用の実験モデル；増殖因子および分化因子の定義、並びに特定の系統の発生に関わる遺伝子の特徴付けのためのスクリーニングインビトロアッセイ等のいずれかにおいて有用である。天然の細胞をこれらの目的に使用してもよく、またはそれらは変化した能力を提供するために遺伝的に改変されていてもよい。
【００３７】
一部の実施形態では、ＳＣＩＰＰは、細胞表面上に存在するマーカーを特異的に認識する試薬を使用することにより、細胞の混合物から富化されうる。ＳＣＩＰＰは、検出可能なレベルのマーカーＣＤ７３を発現している、つまりマーカーＣＤ７３「陽性」であり、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）の発現の欠如について選択される、つまりＴｈｙ−１（ＣＤ９０）「陰性」である。ＳＣＩＰＰ細胞はさらに、系統特異的マーカーの発現欠如の表現型を有する。染色を目的として、結合試薬の混合物（本明細書では「Ｌｉｎ」と命名）が使用され得る。Ｌｉｎのパネルは、２つ以上の系統マーカーを認識する結合試薬、例えば、抗体およびその機能的結合断片、リガンド、ペプチド模倣薬等を含む。Ｌｉｎパネル用に適切なマーカーは、成熟細胞上で典型的に発現されるものであるが、多系統、または幹細胞および前駆細胞上には存在しない。系統パネルマーカーには、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ１４０ｂ、およびそれらの任意の組み合わせが非限定的に含まれる。
ＳＣＩＰＰは、それらの遺伝子発現パターンに基づいて、さらに特徴付けられ得る。図１５および３４は、ＳＣＩＰＰ細胞集団（図１５ではＲ１−ＡＬＤ＋およびＲ１−ＡＬＤ−；図３４ではＲ１）ならびに他の非ＳＣＩＰＰサブセット（Ｒ３−ＡＬＤ＋、Ｒ３−ＡＬＤ−、ヒトＭＳＣ、およびヒトＥＳ細胞株Ｈ７）において分析された、ある遺伝子の制御倍率を示している。図１５および３４における各細胞集団において、ある遺伝子が増加／減少した発現を示しているかどうかを決定するための対照として、ヒトＥＳ細胞株Ｈ９における遺伝子発現が使用されている。ＳＣＩＰＰは、図１５または３４に示されている任意の１以上の遺伝子、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、５以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、または全ての遺伝子の発現について類似した遺伝子発現パターンを有し得る。簡潔のために図１５または３４に記載されている、本発明の態様によるＳＣＩＰＰの遺伝子発現パターンは、その表中に記載されている全ての遺伝子発現の組み合わせを含み、従って、ありとあらゆる遺伝子発現の組み合わせが個々に且つ明示的に開示されるかの如く開示されることを、出願人は強調する。
【００３８】
例えば、本明細書に記載のＳＣＩＰＰは、多能性維持に関わる遺伝子、および／または分化細胞を多能性に再プログラムするために使用される遺伝子を発現し得る（多能性因子および再プログラム因子の例示的な記述としては、米国特許出願公開第ＵＳ２００９００６８７４２号（Yamanaka et al.）；同第ＵＳ２００９０１９１１５９号（Sakurada et al.）；同第ＵＳ２００８０２３３６１０号（Thomson et al.）；および同第ＵＳ２００８０２８０３６２号（Jaenish et al.）を参照されたい；それぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ＳＣＩＰＰにおいて発現される、この分類の遺伝子には、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ２４およびこれらの任意の組み合わせが含まれる。ＳＣＩＰＰは、ある種のエピジェネティックな可塑性マーカー（例えば、ＣＥＣＲ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、または両方）、ストレスマーカー（例えば、ＰＴＧＳ２／ＣＯＸ２）、細胞接着分子（例えば、ＥＰＣＡＭ）、またはそれらの任意の組み合わせを発現し得る。図１５および図３４に示すように、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、およびＰＴＧＳ２遺伝子のそれぞれの発現レベルは、ＥＳＣまたはＭＳＣのいずれかにおいて観察される遺伝子発現レベルと比較した場合、ＳＣＩＰＰ（Ｒ１−ＡＬＤ＋およびＲ１−ＡＬＤ−）において増加している。ＳＣＩＰＰにおけるＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ２４およびＥＰＣＡＭ遺伝子のそれぞれの発現レベルは、ＭＳＣと比較して増加しており、ＥＳＣで検出されるそれと同等のレベルである。ＳＣＩＰＰにおけるＣＥＣＲ１およびＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子のそれぞれの発現レベルは、ＥＳＣと比較して減少しており、ＭＳＣで検出されるそれと同等のレベルである。
【００３９】
従って、ある実施形態では、ＳＣＩＰＰは、ＥＳＣまたはＭＳＣのいずれかと比較して増加したレベルの、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、およびＰＴＧＳ２遺伝子のうちのいずれか一つまたは複数を発現する。ある実施形態では、ＳＣＩＰＰは、ＭＳＣと比較して増加したレベルで、且つ、ＥＳＣで検出されるそれと同等のレベルで、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ２４およびＥＰＣＡＭ遺伝子のうちのいずれか一つまたは複数を発現する。ある実施形態では、ＳＣＩＰＰは、ＥＳＣと比較して減少したレベルで、且つ、ＭＳＣで検出されるそれと同等のレベルで、ＣＥＣＲ１およびＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子のいずれか１つまたは両方を発現する。
【００４０】
ある実施形態では、ＳＣＩＰＰの集団は、ＡＬＤ＋細胞およびＡＬＤ−細胞の両方を含有する。
【００４１】
対象中に存在するとき、ＳＣＩＰＰは、上皮マーカーを発現しており、定常状態では他の細胞と容易には識別されない。しかし、ある条件下では、ＳＣＩＰＰは、増加したレベルのある種の多能性遺伝子、例えば、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ等の発現を開始する。そのような条件には、組織の損傷（例えば、創傷治癒条件下）、アクチビンＡの存在、およびｄｓＤＮＡ切断発生時が含まれる。
【００４２】
ＳＣＩＰＰは培地中で増殖し得るが、不死ではない、すなわち、ＳＣＩＰＰは制限された増殖能を有する。他の幹細胞（例えばＥＳ細胞）とは対照的なこの特徴は、前記細胞またはその誘導体を、組織の再生または修復のための治療剤として使用する際に、ある利点を与える。具体的には、ＳＣＩＰＰは、対象における制御されない増殖について低減した能力を有する。
【００４３】
ＳＣＩＰＰは、ある種の培養基上またはある種の培地製剤中での増殖能に基づいてさらに特徴付けられ得る。ＳＣＩＰＰは、インビトロ培養において独特な増殖特徴を示す。例えば、ＳＣＩＰＰは、胎盤線維芽細胞フィーダー細胞上およびＡＴＡＬＡ培地中で増殖することができる（以下の実施例の項を参照）。この独特な増殖特性は、ＳＣＩＰＰが体細胞組織から増殖することを可能とし、それによって、ＣＤ７３、ＣＤ９０および／または系統マーカーの発現に基づく培養前ソーティングの使用さえなしに、高度に富化されたＳＣＩＰＰ培養物を生産するための頑強な（robust）方法を可能にする。
【００４４】
ヒト乳腺組織を対象にした初期研究に基づくと、およそ５％の管上皮細胞（以下および図ではＲ１と称する）は、典型的には、ＣＤ７３＋／ＣＤ９０−細胞サブセットに含まれる。この５％のＣＤ７３＋／ＣＤ９０−管上皮細胞サブセットのうち、およそ３％が典型的な無病個体におけるＳＣＩＰＰ細胞である。これは、ＣＤ７３＋／ＣＤ９０−サブセットの増殖および発生的特徴の分析に基づいている。例えば、およそ３％のＣＤ７３＋／ＣＤ９０−細胞は、（１）培地中でマンモスフィアまたはニューロスフィアを形成し、（２）多能性を有するコロニーを生じる（例えば、胎盤性フィーダー細胞上またはＡＴＡＬＡ培養条件中で）。
【００４５】
ＳＣＩＰＰの単離／富化方法
ＳＣＩＰＰの単離／富化方法が提供される。単離／富化されたＳＣＩＰＰ試料は、ＳＣＩＰＰ表現型の単一細胞を含み得るか、または、選択された表現型のうち１％以上（例えば、前記細胞のうち２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、１００％まで）のＳＣＩＰＰを含有する細胞集団を含み得、例えば、選択された表現型のうち１％〜１００％、５％〜１００％、８％〜１００％、１０％〜１００％、１５％〜１００％のＳＣＩＰＰを含有する細胞集団であり得る。
【００４６】
上記で言及したように、ＳＣＩＰＰは、いずれかの親和性試薬（例えばモノクローナル抗体）を用いて同定される特異的マーカーに基づいて、および／または、分化（differential）培養技術によって、例えば、対象から得られた細胞試料を胎盤線維芽細胞フィーダー細胞上もしくはＡＴＡＬＡ培地中で培養することによって、対象から得られた細胞試料中の他の細胞から分離することができる。従って、以下に詳細に記載されるように、単離方法には、対象由来の細胞の集団を、ＣＤ７３＋／ＣＤ９０−／Ｌｉｎ−細胞に関して富化し、続いて、ＳＣＩＰＰ増殖促進条件下で、それらの細胞を培養することが含まれ得る。他の実施形態では、対象由来の細胞試料は、最初のＣＤ７３＋／ＣＤ９０−／Ｌｉｎ−細胞の富化無しで、ＳＣＩＰＰ増殖促進条件に暴露され得る。富化／分化増殖のいかなる組み合わせも、本明細書に詳細に記載されるＳＣＩＰＰを得るのに使用され得ることに注目されたい。さらに、ＣＤ７３＋細胞、ＣＤ９０−細胞、またはＬｉｎ−細胞のうち１つのみについての富化も使用され得る（３つ全てに対立するものとして）。
【００４７】
ＳＣＩＰＰ細胞の供給源として有用な、エクスビボおよびインビトロにおける細胞集団には、種々の体細胞組織のいずれか（例えば、乳腺組織、膵臓組織等）に由来する、新しく採取または凍結された細胞が含まれ得、ある実施形態では、これらの組織は「正常」（すなわち、腫瘍性でなく、腫瘍細胞を含有しない等）または「無病」である。「無病」とは、組織が、がんに関して無症候性であるか、もしくは実質的に無症候性であること、または組織が由来する対象が、がんに関して無症候性である、もしくは臨床的寛解期にあることを意味する。「寛解」または「臨床的寛解」とは、同義的に使用され得るが、がん性細胞は未だ体内に存在している可能性があるが、臨床診断に基づいて、がんの臨床徴候、放射線学的徴候、および症状が、有意に減少した、または完全に消失したことを意味する。従って、寛解には部分的寛解および完全な寛解が包含されることが意図される。「正常」および「無病」という用語は、本明細書で同義的に使用され得る。ある実施形態では、ＳＣＩＰＰの供給源は、例えば乳房縮小術から得られるような、無病または正常な乳腺組織である。前駆細胞は、あらゆる哺乳類種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター）、霊長類等から得られ得る。組織は、生体ドナーから生検によって採取されるか、または死後約９６時間以内の、死亡したもしくは瀕死のドナーから採取されるか、または新しく凍結された組織、死後最大７２時間以内に凍結され、約−２０℃未満で、通常はおよそ液体窒素温度（−１８０℃）で無期限に維持された組織であり得る。
【００４８】
本細胞は、ある細胞表面マーカーを発現するが、ある細胞特異的マーカーは欠如している細胞を富化する技術によって、細胞の混合物から分離される。例えば、ＳＣＩＰＰについて富化された試料を生産する方法には、細胞試料（例えば、体細胞試料）を、ＣＤ７３に特異的な親和性試薬、およびＣＤ９０に特異的な親和性試薬と接触させ、その後ＣＤ７３陽性且つＣＤ９０陰性である細胞に関して選択することが含まれる。一部の実施形態では、細胞試料は、系統マーカー（Ｌｉｎ）陰性である細胞に関しても選択される（上記の通りに；例えば、試料を、Ｌｉｎマーカーに特異的な親和性試薬と接触させ、Ｌｉｎ陰性である細胞に関して選択すること；細胞は同時にまたは順次にＣＤ７３＋  ＣＤ９０−である細胞に関して選択され得る）。従って、選択は、全てのマーカーに対して、同時に、またはあらゆる適切な順序過程でなされ得る（例えば、Ｌｉｎマーカーおよび／またはＣＤ９０のうちの一つまたは複数に対して、陰性選択が行われ、続いてＣＤ７３に対して陽性選択が行われる）。
【００４９】
本細胞はさらに、上記の（および図１５および図３４に示される）一つまたは複数の遺伝子の発現レベルに基づいて単離され得る。
【００５０】
組織から細胞を単離するために、適切な機械的処理工程および／または酵素処理工程が使用され得、細胞は、分散または懸濁に適切な溶液中に置かれる。そのような溶液は、一般的には、低濃度（一般的には５〜２５ｍＭ）の許容できる緩衝液と併せて、ウシ胎仔血清または他の天然の因子が好都合に添加された、平衡塩類溶液（例えば生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液等）である。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。細胞単離のための酵素には、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン、ディスパーゼ−ＤＮａｓｅＩ等のうちのいずれか一つまたは複数が含まれ得る。例示的な組織処理工程は、以下の実施例に記載される。
【００５１】
本細胞集団の分離では、アフィニティー分離が使用されて、実質的に富化された集団を提供し得る。アフィニティー分離の技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に連結された、もしくはモノクローナル抗体と併せて使用される細胞傷害性薬物（例えば補体および細胞毒）、並びに固体マトリックス（例えばプレート）に付着した抗体での「パニング」、または他の好都合な技術が含まれ得る。正確な分離を提供する技術には、様々な程度の精巧さ（例えば、複数のカラーチャネル、低角および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等）を有し得る蛍光活性化セルソーターが含まれる。細胞は、死細胞に結合する色素（例えばヨウ化プロピジウム）を用いることで、死細胞に対して選択され得る。選択された細胞の生存能に対し過度に有害でない技術であれば全て使用することができる。
【００５２】
ある実施形態では、使用される親和性試薬は、上記の細胞表面分子に対する特異的な受容体またはリガンドであり得る。抗体試薬に加えて、ペプチド−ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体対が使用され得る；ペプチドリガンドおよび受容体；エフェクター分子および受容体分子、ファージディスプレイ断片等。抗体およびＴ細胞受容体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、遺伝子導入動物、免疫動物、ヒトまたは動物の不死化されたＢ細胞、抗体またはＴ細胞受容体をコードするＤＮＡベクターをトランスフェクションされた細胞等によって産生され得る。抗体の調製、および特異的結合メンバーとしてのそれらの使用適合性の詳細は、当業者には周知である。
【００５３】
親和性試薬としての抗体の使用が特に重要である。これらの抗体に分離用の標識が結合されていると好都合である。標識には、直接分離を可能にする磁気ビーズ、担体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンで取り除くことができるビオチン、蛍光活性化セルソーター等と一緒に使用して特定の細胞型の分離を容易にし得る蛍光色素が含まれる。好都合な蛍光色素は全て使用することができ、上記のもの、並びに以下の実施例に記載されるもの、例えば、フィコビリンタンパク質（例えばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）、フルオレセインおよびテキサスレッド（Texas red）が含まれる。しばしば、それぞれの異なるマーカーに特異的な抗体は、各マーカーに関する独立的な選別を可能とするために、他と区別して検出できる、異なる蛍光色素で標識される。しかし、複数の異なるマーカーがネガティブ選択マーカーとして使用される場合、それぞれの異なるマーカーに特異的な抗体は、同じ蛍光色素で標識されてもよい（例えば、全ての系統マーカー特異的抗体は同じ蛍光色素で標識されてもよい）。
【００５４】
抗体は細胞の懸濁液に加えられ、結合可能な細胞表面抗原と結合するのに十分な時間（例えば、５分間〜１時間；ただし、この時間は変動する可能性があり、使用者の所望および使用される抗体によって決まる）だけ、インキュベートされる。分離の効率が抗体の欠如によって制限されないように、反応混合物中で十分な抗体濃度を有することが通常望ましい。適切な濃度は、タイトレーションによって決定することができる。細胞が後の工程（すなわち、富化過程の後）で培養、増殖、増幅または移植される場合、細胞が分離される培地は、その細胞の生存能を維持するあらゆる培地である。種々の培地が市販されており、細胞の性質によって使用することができ、例えば、ウシ胎仔血清、ＢＳＡ、ＨＳＡ等がしばしば添加されている、ダルベッコ変法イーグル培地（ｄＭＥＭ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコフ培地（Iscove's medium）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ等が含まれる。しかし、富化されたＳＣＩＰＰが培養および増殖を必要としないアッセイで使用される場合（例えば、遺伝子発現解析（例えば、マイクロアレイアッセイ）で即座に使用される場合）、細胞は生存能を必ずしも維持しない培地中に置かれ得る。
【００５５】
ある実施形態では、分離された細胞は、細胞の生存能および多能性を維持するあらゆる適切な培地中に収集され得る。種々の培地が市販されており、細胞の性質によって使用することができ、例えば、ウシ胎仔血清がしばしば添加されている、ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地等が含まれる。
【００５６】
上記で言及したように、対象から得られた細胞は、（細胞表面マーカー富化の有無にかかわらず）ＳＣＩＰＰ選択条件下で培養され得る。当該ＳＣＩＰＰ培養条件では、試料中に存在するＳＣＩＰＰの多能性が維持され、同時に、当該細胞は、系統の制限された細胞への有意な分化無しに増殖する。
【００５７】
ＳＣＩＰＰが富化された組成物は、このようにして達成される。ＳＣＩＰＰ富化細胞集団は、１％以上のＳＣＩＰＰ細胞を含有する可能性があり、例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のＳＣＩＰＰ細胞を含有する細胞集団が含まれ（上記の通り）、一部の実施形態では、細胞組成の９５％以上であり得る。上記の通り、ＳＣＩＰＰは、それらの表面の表現型によって、および多能性を維持しつつ特定の培養条件下で増殖させるそれらの能力によって、同定される。さらに、ＳＣＩＰＰは、適切なインビトロまたはインビボ条件下で、外胚葉系、内胚葉系および中胚葉系へと発達する。富化された細胞集団は即座に使用されてもよく、または液体窒素温度で凍結されて長期間保存されてもよく、解凍によって再利用することができる。例えば、細胞は、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ １６４０培地の中で保存することができる。
【００５８】
インビトロ培養および遺伝子操作
富化された細胞集団は、種々の培養条件下、インビトロで増殖させることができる。培養培地は液体でも半固体でもよく、例えば寒天、メチルセルロース等が含まれる。細胞集団は、ウシ胎仔血清（約５〜１０％）、Ｌ-グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、および抗菌剤（例えばペニシリンおよびストレプトマイシン）が通常添加された、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０等の適切な栄養培地中に懸濁されることが好都合であり得る。
【００５９】
培地は、細胞が応答性である増殖因子を含有していてもよい。増殖因子は、本明細書で定義される通り、培養液またはインタクトな組織のいずれかにおいて、例えば、膜貫通受容体に対する特異的効果を通じて、細胞の生存、増殖および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子には、ポリペプチド因子および非ポリペプチド因子が含まれる。増殖因子に加えて、あるいはその代わりに、本細胞は、間質細胞またはフィーダー層細胞との共培養下で増殖してもよい。
【００６０】
本培養細胞は、種々様々な方法にて使用され得る。例えば、条件培地である栄養培地を様々な段階で分離してよく、その成分を分析してもよい。分離は、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、または他の非分解性の技法で達成することができ、それらは、分子量、分子容、電荷、それらの組み合わせ等による分離を可能にする。これらの技法のうち１つまたは複数を組み合わせて、特定の画分に関してさらに富化してもよい。
【００６１】
ＳＣＩＰＰは遺伝的に改変（alter）または改変（modify）されてもよい。例えば、ＳＣＩＰＰ細胞に遺伝子を導入してもよく、または、種々の目的（例えば、機能喪失型変異を有する遺伝子を置き換えるため、有害な遺伝子の発現を遮断するため、またはマーカーもしくはレポーター遺伝子として使用するための遺伝子を発現するため等）のために、遺伝子が欠失／不活化されてもよい。従って、いかなる適切なベクターもＳＣＩＰＰに導入することができ、例えば、遺伝子発現ベクター；遺伝子ターゲティングベクター（例えば、ＥＳ細胞における相同組換えに基づく方法で使用されるもの、例えば、遺伝子ノックアウトした細胞株および動物を作製する際に使用される）；アンチセンスｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム等を発現し、それによって遺伝子の発現を遮断するベクター；等が含まれる。遺伝子治療の他の方法は、薬物耐性遺伝子（例えば、多数の薬物耐性遺伝子（ＭＤＲ）、またはｂｃｌ-２などの抗アポトーシス遺伝子）を導入して、正常な前駆細胞が優位性を有することを可能にし、選択圧にかけることである。当該技術分野で知られる様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム沈降ＤＮＡ、融合、トランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション等を、標的細胞のトランスフェクションに使用することができる。ＤＮＡを導入する具体的な様式は、本発明の実施には重大ではない。
【００６２】
標的哺乳類細胞に外来遺伝子を導入するのに有用な多くのベクターを利用することができる。ベクターは、エピソーム性（例えばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルス由来ベクター）であり得、または相同組換えまたはランダムな組込みによって標的細胞ゲノムに組み込まれ得る（例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ等のレトロウイルス由来ベクター）。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは「不完全」である。すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができないため、ベクターの複製はパッケージング細胞株中での増殖を必要とする。ＨＩＶまたはＦＩＶ  ｇａｇ配列に基づいたもの等のレンチウイルスベクターは、非分裂細胞のトランスフェクションに使用することができる。
【００６３】
ＳＣＩＰＰまたはそれに由来する細胞／組織を遺伝的に改変するために使用されるベクターは、例えばＣｒｅ／Ｌｏｘ等のリコンビナーゼ系などを用いることによって後に取り除かれなければならない遺伝子を含んでもよく、または、例えばヘルペスウイルスＴＫ、ｂｃｌ−ｘｓ等の選択毒性を与える遺伝子を含むことによって、該遺伝子を発現する細胞が破壊されてもよい。
【００６４】
ＳＣＩＰＰで遺伝子を発現させるために使用されるベクターは、ベクター中の重要な遺伝子に機能的に連結された適切なプロモーターを含む。「適切なプロモーター」とは、トランスフェクトされた細胞（ＳＣＩＰＰ）、またはその子孫のいずれかにおいて、使用者によって所望の通りに（例えば、所望の標的細胞型で、および／または所望の時間で）プロモーターが活性化されることを意味する。プロモーターは、当該技術分野で知られているような、恒常的活性型、条件的活性型、誘導型、または抑制可能なプロモーターであり得る。
【００６５】
遺伝的に組み換えられた前駆細胞を有することを証明するのに、様々な技術を使用することができる。細胞のゲノムは、制限されてもよく、増幅されてまたは増幅されずに使用されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応；ゲル電気泳動；制限分析；サザンブロット、ノーザンブロット、およびウェスタンブロット；配列決定；等、全て使用することができる。細胞は、その細胞が、利用者の所望の通りに、導入されたＤＮＡを発現しつつ、所望の細胞系統に成熟可能であることを保証する種々の条件下で、増殖することができる。
【００６６】
処置および治療におけるＳＣＩＰＰの使用
ＳＣＩＰＰ細胞（それに由来する細胞または組織も含む）は、単独で、または増殖因子、系統拘束因子（lineage-commitment factor）、もしくは対象の遺伝子、ＲＮＡもしくはタンパク質と組み合わせて、細胞／組織の損傷を有する対象に対するいくつかの処置法において使用することができる。例示的な処置／治療には、細胞または組織移植、先天性奇形、待期的手術、疾患、および遺伝性疾患が含まれる。処置に使用されるＳＣＩＰＰ、またはそれに由来する細胞／組織は、自己由来（対象由来）であっても同種由来（ドナー由来）であってもよい。
【００６７】
ＳＣＩＰＰ細胞またはそれに由来する細胞／組織は、組織／細胞の再生を必要としている対象の部位に、生理学的に許容されるあらゆる培地中で、投与することができる。細胞は、注射、外科的手段等を含む、いかなる好都合な方法によっても導入することができる。ＳＣＩＰＰまたはそれに由来する細胞／組織は、液体窒素温度で凍結して長期間保存することができ、解凍すると使用可能である。解凍後、細胞を直接使用してもよく、または所望の増殖および／もしくは分化に適切な増殖因子および／もしくは間質細胞を使用して増殖させてもよい。
【００６８】
処置法には、移植用にＳＣＩＰＰを直接提供して、そこで組織がインビボで再生し、欠損した組織をＳＣＩＰＰからインビトロで再現し、その後その組織を移植すること、または、エクスビボもしくはインビボ遺伝子治療のためのトランスフェクションもしくは形質転換に適切な十分な数のＳＣＩＰＰを提供することが含まれる。従って、本発明には、本発明のＳＣＩＰＰの移植；ＳＣＩＰＰ由来の系統の制限された細胞集団の移植；ＳＣＩＰＰ由来の組織および臓器の移植；等を含む、いくつかの治療法が含まれる。そのような方法は、そのような治療から恩恵を受けるであろう状態、疾患、傷害、細胞の衰弱または欠乏症の処置または軽減に使用することができる。
【００６９】
そのような処置法で使用されるＳＣＩＰＰ細胞は、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件を用いて、ｈＥＳＣおよび／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化を促進せずに増殖を促進するのに有用であると当該技術分野で知られている方法を用いて、培地中で継続的に増殖させることができる。ＳＣＩＰＰ細胞は、そのような細胞が分化した後に、そのような処置法において、使用することができる。ＳＣＩＰＰ細胞は、幹細胞（例えばｈＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣ）を分化させるのに有用であると当該技術分野において既知の方法を用いて、所望の系統を有する細胞を富化する増殖環境において、分化させることができ、その手引きは本明細書で提供される。
【００７０】
本明細書に記載されるように、本発明のＳＣＩＰＰは、外胚葉系、中胚葉系、および内胚葉系のいずれかの細胞に分化する能力を有する。従って、本発明のＳＣＩＰＰは、中胚葉、外胚葉および／または内胚葉由来の細胞、組織、臓器がインビボ、エクスビボもしくはインビトロで誘導される、移植、細胞置換療法、組織再生、遺伝子治療、臓器組織の置換または再生、および細胞治療で利用することができる。例示的な内胚葉細胞系統には、気道および胃腸管の上皮内層、咽頭、食道、胃、腸、および唾液腺を含む多くの関連する腺、肝臓、膵臓並びに肺が含まれる。例示的な中胚葉細胞系統には、平滑筋層、結合組織、並びに組織および臓器に関連する血管および心血管系の置換／治療用の血管、心臓、心筋、心血管、他の血管、血液細胞、骨髄、骨格、横紋筋、並びに生殖器および排出器が含まれる。例示的な外胚葉細胞系統には、表皮（皮膚の表皮層）、感覚器、並びに、脳、脊髄、および神経系の全末梢性要素（outlying component）を含む、神経系全体が含まれる。本発明のＳＣＩＰＰの重大な利点は、任意の特定の組織系統（外胚葉、内胚葉または中胚葉）への拘束の前に自己再生し、その後拘束されてからさらなる増殖をする、その潜在能力である。これらの増殖特性および分化特性は、移植に利用できる適切な細胞および組織の量が制限されている場合に、非常に重要であり、有用である。
【００７１】
ＳＣＩＰＰは、欠損組織、損傷組織、または患部組織の機能的能力および／または寿命を維持または増加させる治療において、これらの細胞を有用にする性質を有する。これらの性質には、限定はされないが、単離および分取が可能な点、多能性を保持したままの顕著な増殖能、並びに操作されて複数の別々の組織系統に拘束される能力が含まれる。
【００７２】
ある実施形態では、治療（例えば、宿主への移植）に使用されるＳＣＩＰＰは、（上記のような）外来遺伝子を含有する。例えば、本発明の多能性胚様幹細胞に、目的のタンパク質または遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターをトランスフェクションすることによるものである。
【００７３】
ある実施形態では、本明細書に参照される治療法は、増殖因子、系統拘束／分化因子、薬剤または他の治療化合物等を含む医薬組成物中の、ＳＣＩＰＰおよび／またはそれに由来する細胞、組織または臓器の投与を含み得る。
【００７４】
ある実施形態では、ＳＣＩＰＰ細胞に由来する細胞、組織、または臓器は、それらが由来したＳＣＩＰＰ細胞と同じゲノムを有し得る。これが意味することは、いかなる核型の変化が加えられても、ＳＣＩＰＰ細胞とそれに由来する細胞または組織との間で、染色体ＤＮＡが少なくとも９０％同一であるということである。操作されていない遺伝因子の全てが保存されているため、組換え法により処置されて、導入遺伝子を導入された、または内在性遺伝子をノックアウトされた細胞または組織であっても、それらが由来したＳＣＩＰＰ細胞と同じゲノムを有すると考えられる。ＳＣＩＰＰ細胞およびそれに由来する細胞または組織は、標準的な遺伝的フィンガープリント法技術により、同じゲノムを有することを確認することができる。細胞または組織が、正常な有糸分裂を通じて未分化のＳＣＩＰＰ細胞から得られる場合も、同じゲノムを有していることが推測される。
【００７５】
スクリーニング法
本細胞は、特定の系統または分化細胞系統または種類（例えば、神経細胞、心筋細胞、乳腺細胞等）への細胞の分化または発生を促進する因子を検出するための、インビトロアッセイおよびスクリーニングに有用である。この目的のために、タンパク質結合に関するイムノアッセイ；細胞の増殖、分化および機能活性の決定（インビボおよびインビトロの両方）；細胞形態の評価等を含む種々様々なアッセイを使用することができる。
【００７６】
例示的な実施形態では、スクリーニング法は、候補分化因子を、生得的多能性体細胞（ＳＣＩＰＰ）の集団（例えば、少なくとも５０％のＣＤ７３＋／ＣＤ９０−／Ｌｉｎ−を含有する集団；上で詳細に記載されている通り）と混合する工程、およびＳＣＩＰＰ由来の分化細胞の形成に対する該候補分化因子の効果をモニタリングする工程が含まれる。当該モニタリングする工程は、いかなる好都合なアッセイまたはアッセイの組み合わせをも含むことができ、その多くは、当該技術分野において既知であり、例えば、遺伝子発現アッセイ（タンパク質または核酸いずれかの発現）、インビトロおよびインビボ発生アッセイ、機能的細胞アッセイ等が含まれる。モニタリングには、使用される候補因子が既知の活性を有する対照細胞集団（当該技術分野において一般に使用されるような、陽性対照または陰性対照のいずれか）との比較を行うことも含まれ得る。従って、スクリーニング検査に関する制限は何も意図されていない。
【００７７】
核酸に基づく遺伝子発現アッセイでは、特定のｍＲＮＡを検出するための、当該技術分野において既知のいかなる適切な定性的または定量的方法も、使用することができる。ｍＲＮＡは、例えば、マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションによって、組織切片におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、逆転写酵素−ＰＣＲによって、または、ポリＡ＋ｍＲＮＡを含むノーザンブロットにおいて、検出することができる。当業者は、２つの試料間のｍＲＮＡ転写物のサイズまたは量における差異を決定するのに、これらの方法を容易に使用することができる。例えば、ＳＣＩＰＰにおける特定のｍＲＮＡのレベルは、標準試料、例えば、ＭＳＣ、ＥＳ、分化細胞、および／または腫瘍性細胞もしくはがん細胞（例えば、乳腺腫瘍細胞）におけるｍＲＮＡの発現と比較される。
【００７８】
ある実施形態では、遺伝子発現は、細胞またはその分泌物中のタンパク質またはポリペプチドのレベルを検出することによって、アッセイされ得る。例えば、検出では、従来の方法に従って行われる、標識抗体を用いた細胞の染色が利用され得る。細胞は、細胞質タンパク質を染色するために、透過処理され得る。通常、発現量に差がある本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、試料に添加され、エピトープへの結合が可能となるのに十分な時間インキュベートされる。抗体は、直接検出用に検出可能に（例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤（chemiluminescer）等を用いて）標識することができ、または、結合を検出するための第二段階における抗体または試薬（例えば、ビオチンと西洋わさびペルオキシダーゼ結合アビジン、蛍光化合物（例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Texas red）等に結合された二次抗体）と組み合わせて使用することができる。抗体結合の有無は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡観察、Ｘ線検査、シンチレーション測定等を含む、種々の方法により検出することができる。発現量に差があるポリペプチドのレベルまたは量の定性的または定量的な検出のための、いかなる適切な代替法も使用することができる（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ等）。
【００７９】
候補分化因子の作用をモニタリングするための機能アッセイは、動物モデル（例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、霊長類等）を使用することも含み得る。そのような動物モデルは、動物宿主が免疫無防備状態または免疫障害性であるもの（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）を含み、細胞における潜在的な分化因子の作用を決定することを含む、細胞の発生能を決定するのに有用な系であることが分かっている（インビトロまたはインビボのいずれかで適用）。スクリーニング検査を可能にする例示的なアッセイは、以下の実施例にも記載される。
【００８０】
キット、系およびサービス
上記のような、本方法を実施するためのキットおよび系も、本発明によって提供される。例えば、対象（または対象から得られた組織／細胞試料）（例えば、ヒト対象）からＳＣＩＰＰを単離するよう構成された試薬および構成要素を含有するキットが提供される。キットの種々の構成要素は、別々の容器の中に存在していてもよく、または適合性のある特定の構成要素を必要に応じて単一の容器内に予め混合しておいてもよい。試薬には、一つまたは複数の、溶媒、組織／試料を収集および調製するための試薬、緩衝液、酵素試薬、特異的結合試薬、標準試薬または対照試薬（例えば、アイソタイプ対照抗体）、培地等が含まれていてもよい。従って、キットは、バイアルまたはビン等の、一つまたは複数の容器を含み、各容器は、試料の処理または調製の工程を行うための、および／または、対象からＳＣＩＰＰを単離するための一つまたは複数の工程を行うための、別々の構成要素を含有していてもよい。
【００８１】
上記の構成要素に加えて、本キットは通常、本方法を実施するために、例えば、対象（または対象から得られた組織／細胞試料）からＳＣＩＰＰを単離するために、キットの構成要素を使用するための説明書をさらに含む。本方法を実施するための説明書は、通常、適切な記録媒体上に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等の基材上に印刷されてもよい。従って、説明書は、キットまたはその構成要素（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングと関連して）等の容器の標識の添付文書としてキットの中に存在していてもよい。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピューター可読の記憶媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット等）に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットの中に存在していないが、遠隔ソースから（例えばインターネットを介して）説明書を入手するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を見ることができる、および／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書を伴っている場合と同様に、説明書を入手するためのこの手段は、適切な基材上に記録される。
【００８２】
上記で言及したように、本明細書に記載のＳＣＩＰＰ細胞を特異的に同定／単離するのに十分な染色試薬を含むキットが提供され得る。目的の組み合わせは、本発明のマーカーまたはマーカーの組み合わせに特異的な一つまたは複数の試薬を含んでもよく、さらに、系統パネル（上記と同様、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ６４およびＣＤ１４０ｂ）、ＣＤ７３、およびＣＤ９０に特異的な抗体を含んでもよい。ある実施形態では、染色試薬は抗体であり、いくつかのキットでは、抗体は検出可能に標識されている（例えば、上記と同様、蛍光ラベルで異なる様式で標識されている）。
【００８３】
一部の実施形態では、本キットは、ＳＣＩＰＰ中に存在するポリヌクレオチド遺伝子発現産物（例えばｍＲＮＡ）の検出用の試薬を含む。例えば、キットは、ＰＣＲプライマー対、一つまたは複数の核酸プローブ、または両方を含んでもよく、該プライマー対およびプローブは、ＳＣＩＰＰにおいて発現される遺伝子に対し特異的である（例えば、図１５に列挙された遺伝子、および上記遺伝子を参照されたい）。例えば、遺伝子ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＰＴＧＳ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ２４、ＥＰＣＡＭ、ＣＥＣＲ１、およびＤＮＭＴ３Ｂ（またはこれらの任意の組み合わせ）のうちのいずれか一つまたは複数に対するＰＣＲプライマー対が、本キットに含まれていてもよい。核酸は、一部の実施形態では、適切な貯蔵媒体（例えば緩衝液）中に存在し、典型的には適切な容器の中に存在する。キットは、プライマーおよび／またはプローブを含み、さらに、緩衝液；試薬（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のための（例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ連鎖反応に適切な緩衝液、Ｍｇ２＋イオン（例えば、ＭｇＣｌ２）を含有する溶液、およびポリメラーゼ連鎖反応を行うための当業者に周知である他の構成要素））を含んでいてもよい。キットは、生物試料からのＤＮＡ（またはｍＲＮＡ）の抽出に必要な試薬をさらに含んでいてもよい。キットは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製するために、ｍＲＮＡの逆転写に必要な試薬をさらに含んでいてもよい。キットは、一部の実施形態では、標準物質に対する標的ポリヌクレオチドのレベルを正規化するための標準物質、例えば、あるレベルのグルコース−６−リン酸脱水素酵素ポリヌクレオチド（例えば、Ｇ６ＰＤＨ  ｍＲＮＡまたはＧ６ＰＤＨ  ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）を提供する。
【００８４】
ある実施形態では、キットは、研究または治療を目的とする使用者に対して、単離された生きたＳＣＩＰＰを含んでいてもよい。これらの実施形態のうちのいくつかでは、対象からＳＣＩＰＰを単離するためのサービス（利用者の選択またはサービス提供者の選択のいずれか）が提供され、単離されたＳＣＩＰＰは、（例えば、研究または治療を目的とした）利用者に配達される。そのようなサービスは、品質管理評価、例えば、細胞純度、細胞分類（例えば、ＨＬＡ分類、遺伝子分類等）、病原体評価等を含み得る。提供されるＳＣＩＰＰは、新しく単離されるか、または培地中で増殖し得る。ＳＣＩＰＰに由来する細胞または組織（例えば、分化細胞、系統特異的前駆細胞等）も提供され得る。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために記載され、発明者が自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が、実施された全実験または実施された実験のみであることを表すものでもない。使用される数字（例えば量、温度等）に関して正確性を確実にするための努力は為したが、幾らかの実験誤差および偏差は考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれ付近である。
【００８６】
材料および方法
以下は、以下の実施例で使用された一般的な材料およびプロトコールである。
【００８７】
乳腺上皮の分離
乳腺組織を、施設内で承認されたＩＲＢプロトコールに従って乳房縮小術を受けている無病の女性から得た。S. R. Romanov et al., Nature 409, 633 (2001)で先に述べられている通りに（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）、組織を機械的および酵素的に分離した。簡潔に説明すると、組織を細かく切り刻み、１０％ウシ胎児血清（ＪＲサイエンティフィック社（JR Scientific, Inc）、カタログ番号４３６０３）、１００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンＳＯ４、０．２５μｇ／ｍｌ  ファンギゾン、ゲンタマイシン（ロンザ社（Lonza）、カタログ番号ＣＣ４０８１Ｇ）、０．８８ｍｇ／ｍｌ  コラゲナーゼ（ワージントン（Worthington）、カタログ番号ＣＬＳ−２）および０．４０ｍｇ／ｍｌ  ヒアルロニダーゼ（シグマ社、カタログ番号Ｈ３５０６−ＳＧ）を添加した、Ｌ−グルタミンおよび２５ｍｍ  ＨＥＰＥＳ（フィッシャー社（Fisher）、カタログ番号ＭＴ１００４１ＣＶ）を含有するＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃で１６時間、分離させた。細胞懸濁液を１４００ｒｐｍで１０分間遠心し、続いて、ＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＢＳで一回洗浄した。１５０μｍナイロンメッシュ（フィッシャー社、カタログ番号ＮＣ９４４５６５８）、および４０μｍナイロンメッシュ（フィッシャー社、カタログ番号ＮＣ９８６０１８７）を通じた連続的な濾過の後、上皮細胞に富んだ集団（オルガノイドと称される）を回収した。最終濾液は主に線維芽細胞および内皮細胞から成る乳腺間質細胞を含んでいた。１２００ｒｐｍ、５分間の遠心分離の後、上皮オルガノイドおよび濾液を長期保存のために凍結した。単一細胞懸濁液を作製するために、上皮オルガノイドを、０．５ｇ／Ｌ  トリプシン−０．２ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ−０．５８ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３中で５分間、ディスパーゼ−ＤＮＡｓｅ  Ｉ（ステムセルテクノロジーズ社（StemCell technologies）、それぞれ、カタログ番号７９１３およびカタログ番号７９００）中で１分間さらに消化し、その後、４０μｍ  セルストレーナー（フィッシャー社、カタログ番号０８７７１１）を通して濾過した。
【００８８】
以下は、以下の実施例９〜１４で使用された材料およびプロトコールに関する。マイコプラズマ試験を、バイオニック・テスティング・ラボラトリーズ社（Bionique Testing Laboratories Inc.）（ニューヨーク州サラナックレーク）でのＰＣＲ分析により行った。濾液画分から、またはＲ１細胞培養物から得られた細胞の核型分析を、モレキュラー・ダイアグノスティックス・サービス社（Molecular Diagnostic Services Inc.）（カリフォルニア州サンディエゴ）で、中期染色体に対して行った。分析された全ての試料は、二倍体の４６、ＸＸの核型を生じた（図２２および図２０、パネルＡ〜Ｅを参照）。
【００８９】
細胞分取のためのフローサイトメトリー用染色およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイ
以下は、以下の実施例１〜８で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【００９０】
上記と同様に得た単一細胞懸濁液を、細胞分取用に、ヒト特異的一次抗体である、ＰＥ標識型抗ＣＤ７３抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５５０２５７）およびＡＰＣ標識型抗ＣＤ９０抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５５９８６９）の２種類、並びに系統マーカーに対するビオチン化抗体である、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ６４抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５５５３２５、５５５３３８、５５５４０５および５５５５２６）、抗ＣＤ３１抗体（インビトロジェン社、カタログ番号ＭＨＣＤ３１１５）、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１４０ｂ抗体（バイオレジェンド社（BioLegend）、カタログ番号３０４００３および３２３６０４）を用いて染色して、造血系細胞、内皮系細胞および白血球系細胞（Ｌｉｎ＋細胞）を特異的に取り除いた。順次的な一次抗体とのインキュベーションを、室温で２０分間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で行い、続いて、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で洗浄した。ビオチン化一次抗体を、ストレプトアビジン−パシフィックブルー（Pacific Blue）標識抗ヒト二次抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ｓ１１２２２）を用いて検出した。
【００９１】
インキュベートの後、細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で一回洗浄し、高いＡＬＤＨ酵素活性を有する亜集団を単離するために、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲキット（ステム・セル・テクノロジーズ社、カタログ番号１７００）を用いて処理した。上記で得られた細胞を、ＡＬＤＨ基質（ＢＡＡＡ、１×１０６細胞１μｍｏｌ／ｌ）を含有するＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイ緩衝液中に懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。特異的なＡＬＤＨ阻害剤である、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）で処理した一定分量を、陰性対照として使用した。細胞分取を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて行った。
【００９２】
フローサイトメトリー用染色および細胞分取
以下は、以下の実施例９〜１４で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【００９３】
上記と同様に得た単一細胞懸濁液を、細胞分取用に、ヒト特異的一次抗体である、ＰＥ標識型抗ＣＤ７３抗体（ＢＤバイオサイエンス社）およびＡＰＣ標識型抗ＣＤ９０抗体（ＢＤバイオサイエンス社）の２種類、並びに系統マーカーに対するビオチン化抗体である、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ６４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、抗ＣＤ３１抗体（インビトロジェン社）、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１４０ｂ抗体（バイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））を用いて染色して、造血系細胞、内皮系細胞および白血球系細胞を特異的に取り除いた。順次的な一次抗体とのインキュベーションを、室温で２０分間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で行い、続いて、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で洗浄した。ビオチン化一次抗体を、ストレプトアビジン−パシフィックブルー（Pacific Blue）標識抗ヒト二次抗体（インビトロジェン社）を用いて、検出した。インキュベートの後、細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で一回洗浄し、細胞分取をＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて行った。
【００９４】
マンモスフィア培養
G. Dontu et al., Genes Dev 17, 1253 (2003)（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）に先に記述されている通りに、マンモスフィア培養を行った。単一細胞を、初代培養では１０，０００生細胞／ｍｌの密度で、後の継代では１０００細胞／ｍｌの密度で、超低接着表面プレート（ultra-low attachment plate）（コーニング社（Corning））に播種した。マンモスフィア培養のために、細胞を、Ｂ２７（インビトロジェン社、カタログ番号１７５０４０４４）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ロンザ社）、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（シグマ社、カタログ番号Ｆ０２９１−２５ＵＧ）、および４μｇ／ｍｌ  ヘパリン（シグマ社、カタログ番号Ｈ１０２７）を添加した無血清の乳腺上皮基礎培地（ＭＥＢＭ）（ロンザ社）中で増殖させた。７〜１０日後に、マンモスフィアを、穏やかな遠心分離（７００ｒｐｍ）により収集し、０．５ｇ／Ｌ  トリプシン−０．２ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ−０．５８ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３中で５〜１０分間、酵素的に分離させた。分離した細胞を４０μｍの篩に通し、０．４％トリパンブルー溶液（シグマ社、カタログ番号Ｔ８１５４）で染色して、細胞生存率を評価し、顕微鏡分析で細胞分離の完了を確認した。
【００９５】
分化培養条件
上記の通りに分離されたマンモスフィアから得られた単一細胞懸濁液を、２０００生細胞／直径１０ｃｍディッシュの密度で、コラーゲンコートされたカバーガラスまたは細胞培養プレートに播種した。細胞を、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌ  インスリン（ロンザ社）、１μｇ／ｍｌ  ヒドロコルチゾン（ロンザ社）、１０μｇ／ｍｌ  コレラ毒素（シグマ社、カタログ番号Ｃ８０５２−２ＭＧ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ロンザ社）、およびゲンタマイシン（ロンザ社、カタログ番号ＣＣ４０８１Ｇ）を含有するハムＦ-１２培地中で増殖させた。５日後、腺胞分化（alveolar differentiation）についてのアッセイの場合には、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号３５６２３０）の層を１μｇ／ｍｌ  プロラクチン（シグマ社、カタログ番号Ｌ４０２１−５０ＵＧ）と共に加えた。１２日後、細胞を固定し、免疫染色のために収集した。J. Debnath, et al., Methods 30, 256 (2003)（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）に先に記述されている通りに、三次元培養を行った。簡潔に説明すると、上記の増殖培地中に再懸濁した単一細胞を、増殖因子を減らしたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号３５６２３０）の１〜２ｍｍ厚に凝固した層上に、コロニー形成密度（colonogenic density）で、播種した。１４日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける腺房構造および分岐した腺房構造の形成を撮影し、ウェスタンブロット解析を行った。
【００９６】
免疫染色および免疫ブロット
コロニーの系統構成を評価するために、カバーガラス上で増殖させた細胞を、ＰＢＳ＋２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で、室温で２０分間固定し、次に、それぞれ筋上皮マーカーおよび管腔上皮マーカーとして使用される、ＦＩＴＣ共役型の抗ＣＤ４９ｆ一次抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５５５７３５）および抗ＭＵＣ−１抗体（ミリポア社、カタログ番号０５−６５２）を用いて染色した。抗ＭＵＣ−１抗体の結合は、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５６８（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ−１１０３１）で標識された二次抗体を使用して検出した。ＤＡＰＩ／蛍光退色防止剤（antifade）（インビトロジェン社、カタログ番号Ｐ３６９３５）を用いて、核の対比染色および封入を行った。２０倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＮＬＯ）を用いて、カバーガラスを観察した。また、細胞をトリプシンでカバーガラスから剥がし、ＰＢＳ中２％ＰＦＡ溶液の中で室温で２０分間固定した後、系統構成を分析した。試料を、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、上記の抗ＣＤ４９ｆ−ＦＩＴＣ一次抗体および抗ＭＵＣ−１一次抗体を用いて、室温で２０分間染色し、その後、Ｔｒｉｃｏｌｏｒ標識型ヤギ−抗マウス−ＩｇＧ１二次抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ｍ３２００６）と一緒にインキュベートした。インキュベートした後、細胞を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで一回洗浄した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いるフローサイトメトリー分析は、後の継代における、マンモスフィア由来細胞由来の異なる乳腺上皮細胞型の分布（％）を決定することを可能にした：Ｒ１−ＡＬＤ＋（継代１〜３）：筋上皮（ＭＵＣ−１−／ＣＤ４９ｆ＋）：１１．４３±０．４８、１．０２±０．１８および１．４２±０．１９；管腔（ＭＵＣ−１＋／ＣＤ４９ｆ−）：６０．２２±１．５７、６２．５７±１および２３．６２±０．９１；二分化能（ＭＵＣ−１＋／ＣＤ４９ｆ＋）：２０．３２±０．６３、３１．８１±０．７６および６５．５４±１．０８；Ｒ２−ＡＬＤ＋（継代数１〜２）：筋上皮：１５．４５±０．９４および２０．３４±０．９４；管腔：８１．２３±０．４９および７５．９９±０．５７；二分化能：０．２６±０．０７および０．１１±０．０７；Ｒ３−ＡＬＤ＋（継代数１〜２）：筋上皮：０．０７±０．０２および０．０４±０．０７；管腔：９４．９２±０．５７および９６．６±０．６９；二分化能：４．０１±０．６９および２．３２±０．１８。Ｒ１〜Ｒ３  ＡＬＤ−分取細胞は管腔細胞のみを生じた：Ｒ１−ＡＬＤ−：９６．４±０．５７、Ｒ２−ＡＬＤ−：９６．８±０．９４およびＲ３−ＡＬＤ−：９７．７７±０．４９）。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌおよびプロラクチンと共に層にされていた細胞の可溶化液において、腺胞系統への分化を評価した。簡潔に説明すると、細胞を４℃で３分間、１５００ｒｐｍでペレットにし、氷冷した洗浄緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  スクロース、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ベンズアミジン、１０ｍＭ  ＮＡＦ、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ  アプロチ��ン、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で一回洗浄した。ペレットを、溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２５０ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、２５μｇ／ｍｌ  アプロチニン、２．５μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭ  ベンズアミジンおよび２０ｍＭ  ＮａＦ）中に再懸濁させ、加圧型細胞破砕装置で処理した（Dounce homogenized）細胞抽出物のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ピアス・バイオテクノロジー社（Pierce Biotechnology）、イリノイ州ロックフォード）を用い、標準物質としてＢＳＡ（シグマ社）を用いて、決定した。細胞抽出物を、５％β−メルカプトエタノールを含有するローディング緩衝液中で加熱変性させ、勾配（４〜２０％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（キャンブレックス社（Cambrex））によって分離した。
【００９７】
タンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレン（ＧＥヘルスケア・バイオ社（GE Healthcare Bio）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に転写した。メンブレンを、マウス抗ヒトβカゼインモノクローナル抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology）、カタログ番号ＳＣ−５３１８９）、またはマウス抗β−アクチン抗体（シグマ社、カタログ番号ＡＣ−１５）、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗マウス抗体（バイオメダ社（Biomeda Corp.）、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、プローブした。β−アクチンを正規化用ローディング対照として使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光検出キット（ピアス社）を用いて、染色を現像した。
【００９８】
動物モデル
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用して、３つの無病乳腺組織試料から分取されたＲ１〜Ｒ４上皮亜集団の幹細胞の特性を、インビボで評価した。正常乳腺上皮細胞の異種移植に使用された動物モデルは、D. A. Proia, et al., Nat Protoc 1, 206 (2006)（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）に先に記述されている。脂肪パッドを春機発動期前にクリアリングし、照射（４Ｇｙ）された、および非照射の、不死化初代ヒト乳腺線維芽細胞（合計５００，０００細胞／脂肪パッド）の１：１混合物を３５ｕｌ注射することにより、ヒト化した。ヒトテロメアおよびＧＦＰを有する不死化された線維芽細胞（ＲＭＦ／ＥＧ）は、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒ博士（タフツ医科大学（Tufts University School of Medicine）、マサチューセッツ州ボストン）から贈与されたものである。クリアリングおよびヒト化から２〜４週間後に、分取された上皮細胞を、３５ｕｌのＭａｔｒｉｇｅｌ−コラーゲンＩ（ＢＤバイオサイエンス社）の１：３混合物中で、５００，０００個のＲＭＦ／ＥＧ線維芽細胞と混合し、脂肪パッドに移植した。細胞を注射してから１２週間後に、安楽死させた動物における管の成長を分析した。分取された細胞を注射し、交配させ、妊娠１８日目に安楽死させた動物において、ヒトβカゼイン産生をモニタリングした。組織学的分析のために、脂肪パッドをホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。各細胞集団の増殖能の評価を、Ｈ＆Ｅ染色で分析した。動物研究は、施設内で承認された動物プロトコールに従って実施された。
【００９９】
免疫組織化学および免疫蛍光
ホルマリンで固定されパラフィン包埋された組織に対して、免疫組織化学を行った。５ミクロン厚の切片からパラフィンを除去し、段階的なアルコールにより再水和し、免疫組織化学のために抗原回復させた。切片を、１：８０に希釈した抗ヒト平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）マウスモノクローナル抗体（ダコ社（Dako）、カタログ番号Ｍ０８５１）および抗ヒトＣＫ８／１８マウスモノクローナル抗体（ライカ・マイクロシステムズ社（Leica Microsystems）、カタログ番号ＲＴＵ−５Ｄ３）、並びに抗ヒトβカゼインウサギポリクローナル抗体（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓｔｒｅｕｌｉ博士、マンチェスター大学、英国マンチェスターからの贈与）と一緒にインキュベートした。免疫複合体をＡＢＣペルオキシダーゼ法で可視化し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。蛍光二重染色のために、試料を、１／５００に希釈された、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１０２０）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ２１１２１）標識型二次抗体と一緒に、室温で２時間インキュベートした。核をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ−ＤＡＰＩで対比染色し、カバーガラスをかけた。切片を蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＮＬＯ）で観察した。
【０１００】
外胚葉系分化：神経：
以下は、以下の実施例１〜８で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１０１】
分取されたＲ１〜Ｒ４サブセットおよびそれら各々のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性亜集団およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陰性亜集団を、浮遊状態で、２０，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェル低接着表面プレート（low-attachment plate）（コーニング社）において、３週間、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５／ＣＦ）および５００ｎｇ／ｍｌ  ノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３３４４−ＮＧ−０５０）を含有する神経前駆体用培地（neural precursor medium）（ＮＰＭ）中で、培養した。培養の３週間後、培地を、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加したＮＰＭに変更し、さらに一週間培養した。得られた分化型神経系細胞（ニューロスフィア）の表現型分析を行う前に、ＮＰＭ（分裂促進因子を含まない）中に再懸濁したニューロスフィアを、ポリ−Ｄ−リジン（シグマ社、カタログ番号Ｐ７８８６）およびラミニン（シグマ社、カタログ番号Ｌ２０２０）でコートされたカバーガラス上に、２４時間（ネスチン発現について免疫染色するため）または２１日間（完全に分化させるため）植えた。ウサギ抗ヒトネスチン抗体（ミリポア社、カタログ番号ＡＢ５９２２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合型マウス抗ヒトβ−ＩＩＩ−チューブリン抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５６０３３９）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型マウス抗ヒトＧＦＡＰ抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５６０２９７）を含む一次抗体を用いて、免疫蛍光分析を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６結合型抗ウサギ二次抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１００４０）を使用して、抗ネスチン一次抗体を標識した。ドーパミン作動性細胞への分化をもたらす二段階誘導を引き起こすために、第一に、Ｒ１−ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陽性細胞を、８日間、Ｎ２およびＢ２７添加剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ並びにペニシリン／ストレプトマイシンから成る神経用基礎培地（neural basal medium）中で、ニューロスフィアとして、培養した。新しいｂＦＧＦを一日おきに添加した。８日後、ニューロスフィアを、ポリ−Ｄ−リジン（１００ｕｇ／ｍｌ、シグマ社）およびラミニン（２０ｕｇ／ｍｌ、シグマ社）でコートされたカバーガラスに移し、ＳＤＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＰＴＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−ＩＩ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＥＦＮＢ１（２００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、それぞれ、カタログ番号３５０−ＮＳ／ＣＦ、２５２−ＰＬ、２９２−Ｇ２および４７３−ＥＢ）の存在下、神経基礎培地中で培養して、ドーパミン作動性神経細胞に向けた特異的な分化を誘導した（２７）。培地の半分を、分化の４日目およびその後２１日目まで２〜３日毎に、増殖因子を含有する新しい培地と置き換えた。免疫蛍光分析を、マウス抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ）（シグマ社、カタログ番号Ｔ１２９９）一次抗体およびウサギ抗小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）（ミリポア社、カタログ番号ＡＢ１５９８Ｐ）一次抗体、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合型ヤギ−抗ウサギ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１００８）二次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５結合型ヤギ抗マ���ス（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ２１１２７）二次抗体を用いて行い、ドーパミン作動性神経細胞への分化を確認した。
【０１０２】
Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（モレキュラーデバイス社、カリフォルニア州サニーベール）を用いて、ホールセル電流クランプ記録を得た。シグナルを、ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａアナログ・デジタル変換器（モレキュラーデバイス社）を用いて、１ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚでサンプリングした。３Ｍ  ＫＣｌを用いて液間電位差を測定し、調整した。カバーガラス上で増殖させた細胞を、約３００ｍＯｓｍ（ｐＨ７．４）で、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ  グルコースを含有する浴溶液（bath solution）中に置いて、微分干渉光学系を有するＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡（オリンパス社、日本、東京）を用いて、４０倍の拡大率で、可視化した。パッチ電極（３〜４ＭΩ）は、約２９０ｍＯｓｍ（ｐＨ７．４）で、１１５ｍＭ  Ｋ−グルコン酸塩、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２リン酸塩、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｍｇ３ＡＴＰ、０．３ｍＭ  Ｎａ２ＧＴＰを含有していた。電圧応答を記録するため、電流を手動でインジェクトして、膜電位を約−７０ｍＶに維持した。テトロドトキシン（ＴＴＸ）をトクリス社（Tocis）（ミズーリ州、ミズーリ）から入手し、重力送りの灌流系を介して適用した。全データを記録し、ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェア（モレキュラーデバイス社）を用いて解析した。
【０１０３】
インビトロにおける神経系誘導体への外胚葉系分化
以下は、以下の実施例９〜１４で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１０４】
分取したＲ１〜Ｒ４亜集団およびＨ７  ｈＥＳＣを、浮遊状態で、２０，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェル低接着表面プレート（コーニング社）中で、３週間、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５／ＣＦ）および５００ｎｇ／ｍｌ  ノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３３４４−ＮＧ−０５０）を含有する神経前駆体用培地（ＮＰＭ）中で、培養した。培養の３週間後、培地を、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加したＮＰＭに変更し、さらに１週間培養した。得られた分化型神経系細胞（ニューロスフィア）の表現型分析を行う前に、ＮＰＭ（分裂促進因子を含まない）中に再懸濁したニューロスフィアを、ポリ−Ｄ−リジン（シグマ社、カタログ番号Ｐ７８８６）およびラミニン（シグマ社、カタログ番号Ｌ２０２０）でコートされたカバーガラス上に、２４時間（ネスチン発現について免疫染色するため）または２１日間（さらなる分化を可能とさせるため）植えた。ウサギ抗ヒトネスチン抗体（ミリポア社、カタログ番号ＡＢ５９２２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合型マウス抗ヒトＴＵＪ１／β−ＩＩＩ−チューブリン抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５６０３３９）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型マウス抗ヒトＧＦＡＰ抗体（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５６０２９７）を含む一次抗体を用いて、免疫蛍光分析を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６結合型抗ウサギ二次抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１００４０）を使用して、抗ネスチン一次抗体を標識した。染色の対照を図３１、パネルＡ〜Ｄ（上段）に示す。
【０１０５】
内胚葉系分化：胚体内胚葉：
以下は、以下の実施例１〜８で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１０６】
分取したＲ１〜Ｒ４サブセット、およびそれら各々のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陽性亜集団およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陰性亜集団を、胚体内胚葉への分化を誘導すると先（E. Kroon et al., Nat Biotechnol 26, 443 (2008）；この開示は参照により本明細書に組み入れられる）に報告された条件下で、培養した。簡潔に説明すると、カバーガラスに播種された分取細胞を、以下の通りに３日間分化させた：一日目：グルコース、Ｇｌｕｔａｍａｘペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡ、および２５ｎｇ／ｍｌ  Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、それぞれ、カタログ番号３３８−ＡＣ−０２５および５０３６−ＷＮ−０１０／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ中での培養；２日目および３日目：Ｗｎｔ３ａが０．２％ＦＢＳに置き換えられた以外は同じ培地での培養。ウサギ抗ヒトＳｏｘ１７（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カタログ番号ＳＣ−２００９９）一次抗体、ヤギ抗ヒトＨＮＦ−３β／Ｆｏｘａ２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＡＦ２４００）一次抗体およびヤギ抗ヒトブラキュリ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＡＦ２０８５）一次抗体、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６結合型ロバ抗ウサギ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１００４０）二次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合型ロバ抗ヤギ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１０５５）二次抗体を用いて免疫蛍光分析を行い、胚体内胚葉への分化を確認した。
【０１０７】
インビトロにおける胚体内胚葉および膵臓誘導体への内胚葉系分化
以下は、以下の実施例９〜１４で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１０８】
分取したＲ１〜Ｒ４亜集団を、ヒトＥＳＣにおいて膵臓系統を誘導するとKroon et al.により先に報告された条件下で培養した（E. Kroon et al., Nat Biotechnol 26, 443 (2008)）。カバーガラスまたはフィーダー細胞層上に播種された分取細胞を、３日間（胚体内胚葉）または１２日間（膵臓系統）の分化にかけた。ウサギ抗ヒトＳOX１７（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カタログ番号ＳＣ−２００９９）一次抗体、ヤギ抗ヒトＨＮＦ−３β／ＦOXA２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＡＦ２４００）一次抗体、ヤギ抗ヒトブラキュリ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＡＦ２０８５）一次抗体、ヤギ抗ヒトＰＤＸ１（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カタログ番号ＳＣ１４６６２）一次抗体およびヤギ抗ヒトＮＫＸ６．１（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カタログ番号ＳＣ１５０３０）一次抗体、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６結合型ロバ抗ウサギ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１００４０）二次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合型ロバ抗ヤギ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１０５５）二次抗体を用いて免疫蛍光分析を行い、内胚葉系への分化を確認した。染色の対照を図３１、パネルＡ〜Ｄ（上段）に示す。
【０１０９】
中胚葉系分化：心筋系：
以下は、以下の実施例１〜８で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１１０】
分取したＲ１〜Ｒ４サブセット、およびそれら各々のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陽性亜集団およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陰性亜集団を、J. Bartunek et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 292, H1095 (2007)（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）によって、心筋系の分化を誘導すると先に記述された条件下で培養した。分取した細胞（１２，０００細胞／集団）を、３週間、２０％ＦＢＳ、１００μＭ  Ｌ−アスコルビン酸（シグマ社、カタログ番号Ａ５９６０）および２０ｎＭ  デキサメタゾン（シグマ社、カタログ番号Ｄ４９０２）を添加したＤＭＥＭ中で、増殖させた。次に、細胞をコラーゲンコート４ウェルチャンバースライドに播種し、２％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３５５−ＢＭ−０１０）および２ｎｇ／ｍｌ  インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−Ｉ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９１−Ｇ１−０５０）を含有する心臓分化用培地中で、６日間、増殖させた。分化した細胞を氷冷したメタノール中で固定し、１／２００希釈のマウス抗ヒトＧＡＴＡ−４モノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）（カタログ番号ＳＣ−２５３１０）、１／２００希釈のヤギ抗ヒトＭＥＦ−２ポリクローナル抗体（カタログ番号ＳＣ−１３９１７）、１／１００希釈のウサギ抗ヒトＮｋｘ２．５ポリクローナル抗体（カタログ番号ＳＣ−１４０３３）、および１／１００希釈のヤギ抗ヒトトロポニンＩポリクローナル抗体（カタログ番号ＳＣ−８１１８）を含む、サンタクルーズバイオテクノロジーズ社から入手した一次抗体を用いて、免疫蛍光法で分析した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ２１１３１）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１０５５）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１００８）を含む二次抗体を用いて、染色を完了させた。
【０１１１】
分取したＲ１サブセットを、自然に拍動する心筋細胞に分化させるため、まず、分取細胞を、ヒト胎盤線維芽細胞フィーダー細胞（Ｓｕｓａｎ博士（フィッシャー社、カリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコ）からの贈与）上で、上記と同様の無血清乳腺基礎培地中で、増殖させた。１４日後、胎盤フィーダー細胞に現れたコロニーを手動で切り分け、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、２０％ＦＢＳ、可欠アミノ酸、グルタミンおよびβ−メルカプトエタノールを含有する心臓分化用培地中の懸濁液中で、胚様体（ＥＢ）を形成させた。懸濁液中で４日後、ＥＢをゼラチンコート２４ウェルプレートに播種し、新しい培地を毎日与えた。拍動するＥＢのモニタリングを、コマ撮りのビデオ顕微鏡法を用い、インプロビジョン社（Improvision）製Ｏｐｅｎ  ｌａｂソフトウェアにより制御される環境チャンバ中、リアルタイムで、実行した。５〜１０％のＥＢが、培養の１２〜１４日後に、拍動を開始した。
【０１１２】
インビトロでの心筋細胞、脂肪細胞および内皮細胞誘導体への中胚葉系分化
以下は、以下の実施例９〜１４で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１１３】
分取したＲ１〜Ｒ４亜集団を、J. Bartunek et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 292, H1095 (2007)（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）により、心筋性分化を誘導すると先に記述された条件下で、培養した。分取細胞（１２，０００細胞／集団）を、３週間、２０％ＦＢＳ、１００μＭ  Ｌ−アスコルビン酸（シグマ社、カタログ番号Ａ５９６０）および２０ｎＭ  デキサメタゾン（シグマ社、カタログ番号Ｄ４９０２）を添加したＤＭＥＭ中で、増殖させた。次に、細胞を、コラーゲンコート４ウェルチャンバースライドに播種し、２％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３５５−ＢＭ−０１０）および２ｎｇ／ｍｌ  インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−Ｉ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９１−Ｇ１−０５０）を含有する心臓分化用培地中で、６日間増殖させた。分化した細胞を氷冷したメタノール中で固定し、サンタクルーズバイオテクノロジーズ社から入手した、マウス抗ヒトＧＡＴＡ−４モノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）（カタログ番号ＳＣ−２５３１０）、ヤギ抗ヒトＭＥＦ−２ポリクローナル抗体（カタログ番号ＳＣ−１３９１７）、ウサギ抗ヒトＮｋｘ２．５ポリクローナル抗体（カタログ番号ＳＣ−１４０３３）およびヤギ抗ヒトトロポニンＩポリクローナル抗体（カタログ番号ＳＣ−８１１８）を含む一次抗体を用いて、免疫蛍光法により分析した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ２１１３１）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１０５５）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１００８）を含む二次抗体を用いて、染色を完了した。
【０１１４】
分取したＲ１亜集団を自然に拍動する心筋細胞に分化させるため、まず、分取細胞を、ヒト胎盤線維芽細胞フィーダー細胞（Ｓｕｓａｎ博士（フィッシャー社、ＵＣＳＦ）からの贈与）上で、無血清乳腺基礎培地（上記と同様）中で、増殖させた。１４日後、フィーダー細胞層に現れたコロニーを手動で切り分け、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、２０％ＦＢＳ、可欠アミノ酸、グルタミンおよびβ−メルカプトエタノールを含有する心臓分化用培地中の懸濁液中で、胚様体（ＥＢ）を形成させた。懸濁液中で４日後、ＥＢをゼラチンコート２４ウェルプレートに播種し、新しい培地を毎日与えた。拍動するＥＢ由来細胞のモニタリングを、コマ撮りのビデオ顕微鏡法を用い、インプロビジョン社（Improvision）製Ｏｐｅｎ  ｌａｂソフトウェアにより制御される環境チャンバ中、リアルタイムで、実行した。５〜１０％のＥＢ由来細胞が、培養の１２〜１４日後に、拍動を開始した。
【０１１５】
脂肪細胞分化：分取細胞を、２週間、１５％ＥＳ−ＦＢＳ（オメガ・サイエンティフィック社（Omega Scientific Inc.）、カタログ番号ＦＢ−０５）、１８％Ｃｈａｎｇ  Ｂおよび２％Ｃｈａｎｇ  Ｃ（イルビン・サイエンティフィック社（Irvine Scientific）、それぞれ、カタログ番号Ｃ−１００およびＣ−１０６）並びに１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したグルタミン含有α−ＭＥＭ培地中で、増殖させた。次に、細胞を２４ウェルチャンバースライドに播種し、増殖条件（増殖培地）または分化条件（ギブコ社製ＳｔｅｍＰｒｏ脂肪生成分化キット、カタログ番号Ａ１００７０−０１）下に、９日間（オイルレッド０染色、定量的リアルタイムＰＣＲ分析のため）または１８日間（ＦＡＢＰ４の免疫蛍光法分析のため）、置いた。培地を３〜４日毎に交換した。染色前に、細胞を２％ＰＦＡで固定した。ウサギ抗ヒトＦＡＢＰ４一次抗体（ケイマン・ケミカル社（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、カタログ番号１０００４９４４）、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社、カタログ番号Ａ１１００８）を用いて、免疫蛍光分析を行った。ヒトＭＳＣを分化対照として使用した。
【０１１６】
定量的リアルタイムPCRを、標準方法を用いて行った。ＦＡＢＰ４（Ｈｓ０１０８６１７７＿ｍ１）、レプチン（Ｈｓ００１７４８７７＿ｍ１）およびＰＰＡＲγ（Ｈｓ０１１１５５１１＿ｍ１）用のプライマープローブセットを、ＡＢＩ社から入手した。グルクロニダーゼＢ（ＧｕｓＢ；ＩＤＴ）発現を、インプットｃＤＮＡにおける変動を正規化するのに利用した。
【０１１７】
分取したＲ１〜Ｒ４亜集団を、内皮細胞分化を誘導するとLevenberg, et al.により先に記述された条件下で、培養した（S. Levenberg, J. S. Golub, M. Amit, J. Itskovitz-Eldor, R. Langer, Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 4391 (2002)；これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）。簡潔に説明すると、細胞を前述の内皮用培地中で培養し、２週間後、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１細胞表面マーカーの発現について、フローサイトメトリーで分析した。Ｒ１細胞は、これらの条件下で培養された場合に、２％のＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１＋細胞を生じた。ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１＋細胞をフローサイトメトリーで単離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ分化アッセイにおいて、５０，０００細胞／培地５００μｌで、播種した。細胞播種の２４時間後に、位相差顕微鏡観察で、コード形成を評価した。ＨＵＶＥＣおよび初代乳腺上皮細胞を、それぞれ陽性分化対照および陰性分化対照として使用した。
【０１１８】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養
１０継代毎に凍結したストックの置換を伴う培養で通例維持された、Ｈ７およびＨ９  ｈＥＳＣ（Ｓｕｓａｎ博士（フィッシャー社、ＵＣＳＦ）からの贈与）を、フィーダー細胞層として使用されるマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ；ミリポア社、カタログＰＭＥＦ−ＣＦＬ）上で、増殖させた。ＭＥＦを、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９（インビトロジェン社、カタログ番号１１１５０−０５９）および１０％ＦＢＳ中で、増殖させた。フィーダー細胞に５，１００ｒａｄのガンマ線を照射し、長期保存用に凍結した。使用前に、フィーダー細胞を３７℃で解凍し、洗浄し、ゼラチンコート６ウェル組織培養プレート上に播種した。Ｈ７細胞およびＨ９細胞を解凍し、洗浄し、コンフルエントなフィーダー細胞上に播種し、継代培養前に最大１週間、増殖させた。ｈＥＳＣ培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ギブコ社、カタログ番号１０８２８−０２８）、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ  可欠アミノ酸、グルタミン、β−メルカプトエタノールおよびペニシリン／ストレプトマイシンから成った。培養物を毎日モニタリングして、ｈＥＳＣの集団がフィーダー細胞に接着し、典型的なｈＥＳＣコロニーを形成していたことを確認した。コロニーの平均サイズが３００〜４００細胞に達したら、コロニーを手動で切り分け、継代した。
【０１１９】
奇形腫形成アッセイ
６〜７週齢の雌ＳＣＩＤ／ＢＥＩＧＥマウス（チャールス・リバー社）を使用して、施設内で承認された動物プロトコールＡＮ０７９９９７／ＡＮ０８６７５７に従って、直接分取したＲ１細胞、培養増殖したＲ１サブクローンおよびＨ７ヒトＥＳＣの奇形腫形成能を試験した。簡潔に説明すると、T. A. Prokhorova et al., Stem cells and development 18, 47 (2009)（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）の公開されたプロトコールに従って、腎被膜下に細胞を移植した。マウスを、注入の８週間後（Ｈ７細胞）または１２週間後（Ｒ１細胞）に安楽死させた。奇形腫を外科的に採取し、上記の通りに、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、免疫組織化学用に処理した。
【０１２０】
奇形腫分析のための組織化学および免疫組織化学
組織は、奇形腫、乳腺腫瘍、陽性対照として使用された種々のヒト組織、または陰性対照として使用されたマウス腎臓を含んでいた。標準的な手順を用いて、パラフィン包埋組織を４μｍの連続切片に切り、脱パラフィン処理し、再水和した。全ての工程は、記載がある場合以外は、室温で行われた。クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間マイクロ波照射することにより抗原回復させた後、切片を、抗ヒト  ラミンＡ／Ｃ一次抗体（エピトミクス社（Epitomics Inc.）、カタログ番号２９６６−１、クローンＥＰＲ４１００）、抗ＧＦＡＰ一次抗体（ダコ社、カタログ番号Ｍ０７６１）、抗ＨＡＰＬＮ１一次抗体（シグマ・アルドリッチ社、カタログ番号ＨＰＡ０１９１０５）、抗ＰＤＸ１一次抗体（エピトミクス社、カタログ番号３４７０−１、クローンＥＰＲ３３５８）、抗ＡＦＰ一次抗体（ダコ社、カタログ番号ＩＲ５００）および抗ＴＦＦ３一次抗体（エピトミクス社、カタログ番号３１７８−１、クローンＥＰＲ３９７３）と一緒に、１時間インキュベートした。ＨＲＰ  ｐｏｌｙｍｅｒキット（Ｕｌｔｒａｖｉｓｉｏｎ  ＬＰキット、サーモサイエンティフィック社）と一緒に１５分間、ジアミノベンジジン基質（ジェンメッド社（Genemed）、カタログ番号５２００１７）と一緒に５分間、インキュベートした後に、染色を可視化した。マウス抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体により染色されたマウス腎臓切片について、抗原回復前にさらなるペルオキシダーゼブロッキング工程（３％Ｈ２０２、１０分間）を加え、Ｍｏｕｓｅ  ｏｎ  Ｍｏｕｓｅキット（ベクター・ラボラトリーズ社（Vector Laboratories Inc.）、カタログ番号ＢＭＫ２２０２）をＵｌｔｒａｖｉｓｉｏｎ  ＬＰキットの代わりに使用した。染色した切片を、ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｌｉｄｅ  ｓｃａｎｎｅｒ（アペリオ社（Aperio Inc.)）で、２０倍で、スキャンした。Ｉｍａｇｅｓｃｏｐｅソフトウェア（Aperio Inc.）を用いて、画像の収集および処理を行った。染色対照を図３２に示す。
【０１２１】
単一細胞由来Ｒ１クローン細胞の培養条件
単一Ｒ１細胞およびＨ７  ｈＥＳＣを、フィーダー細胞層として使用されたヒト胎盤線維芽細胞（Ｓｕｓａｎ博士（フィッシャー社、ＵＣＳＦ）からの贈与）上で、増殖させた。ヒト胎盤（妊娠６．４週目）から得られた線維芽細胞を、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９（インビトロジェン社、カタログ番号１１１５０−０５９）および１０％ＦＢＳを含有する培地中で増殖させ、５，１００ｒａｄでγ線照射し、長期保存用に凍結した。使用前に、フィーダー細胞を３７℃で解凍し、洗浄し、ゼラチンコート２４ウェル組織培養プレートに播種した。フィーダー細胞を播種した２４〜４８時間後に、単一Ｒ１細胞およびＨ７細胞をフィーダー細胞上に播種し、Ｒ１細胞に関しては最大１４日間、またはＨ７細胞に関しては７日間、培養した。ｈＥＳＣ培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ギブコ社、カタログ番号１０８２８−０２８）、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、可欠アミノ酸、グルタミン、β−メルカプトエタノールおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有していた。Ｒ１細胞用培地は、Ｂ２７（インビトロジェン社、カタログ番号１７５０４０４４）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ロンザ社）、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（シグマ社、カタログ番号Ｆ０２９１−２５ＵＧ）、および４μｇ／ｍｌ  ヘパリン（シグマ社、カタログ番号Ｈ１０２７）を添加した、無血清乳腺上皮基礎培地（ＭＥＢＭ）（ロンザ社）を含有した。培養物を毎日モニタリングして、単一Ｒ１細胞からコロニーが生じたこと、およびｈＥＳＣのクラスターがフィーダー細胞に接着して典型的なｈＥＳＣコロニーに展開していることを確認し、継代（passaging）を決定した。単一コロニーおよびＨ７細胞を、製造業者の取扱説明書に従って、抗ヒトＯＣＴ３／４一次抗体（サンタクルーズ・バイオテック社（Santa Cruz Biotech）、カタログ番号ＳＣ−９０８１）、抗ヒトＮＡＮＯＧ一次抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＡＦ１９９７）、抗ヒトＳＯＸ２一次抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＭＡＢ２０１８）、抗上皮細胞表面マーカーＥＰＣＡＭ一次抗体（ステム・セル・テクノロジーズ社、カタログ番号１０１０９）および抗γチューブリン一次抗体（シグマ社、カタログ番号Ｔ６５５７）、並びにそれぞれの二次抗体を用いて、ＰＣＲ（以下の項を参照）、フローサイトメトリー分析、免疫蛍光法およびウェスタンブロット解析によって、多能性マーカーについてプローブした。個々のＲ１細胞から得られた対応する単一コロニーを、手動で分離し、トリプシン処理し、３つに分割して、上記手順に従って、各系統に向けたサブクローンの分化能についてプローブした。
【０１２２】
多能性関連遺伝子についての定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、分取したＲ１〜Ｒ４亜集団、フィーダー細胞層上に増殖したＲ１コロニー、増殖培地中で増殖したＲ１コロニー、未分化のＨ７およびＨ９  ｈＥＳＣ、またはヒトＭＳＣから、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（モレキュラーデバイス社、カタログ番号ＫＩＴ０２０４）を用いて、抽出した。ＲＮＡの純度および濃度を、２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジーズ社）を用いて決定した。定量的リアルタイＰＣＲを、７ｎｇのインプットＲＮＡを用いて、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｈｕｍａｎ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（キアゲン社、米国、メリーランド）で、製造業者の取扱説明書に従って行った。ｐ値を、スチューデントｔ検定を用いて、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（キアゲン社）オンラインサポートにより提供されるソフトウェアで、作成した。
【０１２３】
ヒト間葉系幹細胞の培養条件
ヒト間葉系幹細胞（ロンザ社；カタログ番号ＰＴ−２５０１）を、製造業者の取扱説明書に従って、推奨される５，０００〜６，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、播種の３〜４日後に、ＭＳＣＧＭ培地（ロンザ社、カタログ番号ＰＴ−３００１）を与え、継代培養した。
【０１２４】
プラスミドおよびレトロウイルス遺伝子の導入
低分子ヘアピンｐ１６ＩＮＫ４ａに対するレンチウイルスの浮遊液および何も標的としない対照（non-targeting control）を、J. Zhang, C. R. Pickering, C. R. Holst, M. L. Gauthier, T. D. Tlsty, p16INK4a modulates p53 in primary human mammary epithelial cellsにより先に公開されたように、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞から回収した。Cancer Res 66、 10325 (2006)；この開示は参照により本明細書に組み入れられる。乳腺細胞をレンチウイルスの浮遊液に曝すことにより、４μｇ／ｍＬ  ポリブレン（シグマ・アルドリッチ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）の存在下で、５時間、乳腺細胞に形質導入した。この工程を２４時間後に繰り返して、導入効率を高めた。最初の形質導入後、細胞を適切な培地中に７２時間維持し、その後、２μｇ／ｍＬ  ピューロマイシン（シグマ社）の存在下で選択した。細胞を初代乳腺上皮用培地中でさらに７２時間増殖させ、トリプシン処理し、全ＲＮＡおよび細胞ペレットの両方を、それぞれ、ｑ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリー分析のために単離した。ｑ−ＰＣＲを、ＡＢＩ社から入手した１６ＩＮＫ４ａに対するプライマープローブセット（カスタムプローブＩＤ：４３３１３４８）を用いて、行った。グルクロニダーゼＢ（ＧｕｓＢ；ＩＤＴ）発現を利用して、インプットｃＤＮＡにおける分布を正規化した。細胞ペレットを、上記の抗体を用いるフローサイトメトリーによって、ＣＤ７３およびＣＤ９０細胞表面マーカーの発現について分析した。
【０１２５】
単一細胞由来Ｒ１クローンの増殖および細胞周期分析
Ｒ１分取細胞を、１５％ＥＳ−ＦＢＳ（オメガ・サイエンティフィック社、カタログ番号ＦＢ−０５）、１８％Ｃｈａｎｇ  Ｂおよび２％Ｃｈａｎｇ  Ｃ（イルビン・サイエンティフィック社、それぞれ、カタログ番号Ｃ−１００およびＣ−１０６）並びに１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したグルタミン含有α−ＭＥＭ培地中で、２週間増殖させた。次に、細胞をトリプシン処理し、限界希釈法で播種して、単一細胞由来サブクローンを作製した。培地中で２週間後に得られた単一細胞由来コロニーを、クローニングリングを用いてトリプシン処理し、増殖させて、増殖曲線（図２０、パネルＡ）を作成した。集団倍加を、式：ＰＤ＝ｌｏｇ（Ａ／Ｂ）／ｌｏｇ２を用いて算出し、式中、Ａは収集した細胞の数であり、Ｂは最初に播種された細胞の数である。
【０１２６】
回収前に４時間、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を代謝させて、細胞を標識した。細胞を、標準的なトリプシン処理で単離し、ＰＢＳ中に再懸濁し、氷冷した７０％エタノールを添加して固定した。核を単離し、ヨウ化プロピジウムおよびＦＩＴＣ結合型抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤバイオサイエンス社）で染色した。フローサイトメトリーをＬＳＲＩＩ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。解析した全事象をゲートにかけて、デブリおよび凝集塊を除去した。各分析について最小でも２０，０００の事象が収集された。
【０１２７】
テロメラーゼ逆転写酵素の発現測定およびテロメラーゼ活性アッセイ
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現レベルを、ｑ−ＰＣＲで、ＡＢＩ社から入手したｈＴＥＲＴに対するプライマープローブセット（Ｈｓ００１６２６６９＿ｍ１）を用いて、評価した。グルクロニダーゼＢ（ＧｕｓＢ；ＩＤＴ）の発現を利用して、インプットｃＤＮＡにおける分散を正規化した。テロメラーゼ活性を、高感度且つ非同位バージョンのテロメア反復増幅プロトコール（Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ＴＲＡＰ）アッセイ、すなわち蛍光に基づくＴＲＡＰｅｚｅ ＸＬテロメラーゼ検出キット（ミリポア社）を用いて、評価した。１８４Ａ１（ヒト乳腺細胞株）、Ｗｉ−３８（ヒト線維芽細胞株）、Ｈｅｌａ、Ｈ７  ｈＥＳＣ並びにＰＤ４４．５および５５．２からの単一細胞由来Ｒ１サブクローンから得られた溶解物（１０００細胞相当）を、Ａｍｐｌｉｆｕｏｒプライマーを含有するＴＲＡＰｅｚｅ ＸＬ反応混合物と混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。増幅した蛍光標識テロメラーゼ産物を、蛍光プレートリーダーで定量化した。ＴＰＧ（総生産物）単位として表される、テロメラーゼ活性を、製造業者が記述しているように、各溶解物について、内部標準に対するテロメラーゼ産物の比を比較して算出した。
【０１２８】
ＤＮＡフィンガープリント法
ＤＮＡフィンガープリント法（ＳＴＲ分析）を、モレキュラー・ダイアグノスティックス・サービス社（カリフォルニア州サンディエゴ）で行った。各細胞集団から単離した３ナノグラムのゲノムＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １．２またはＣｅｌｌＩＤ短いタンデム反復遺伝子型同定システム（プロメガ社）を用いて、増幅した。ＤＮＡ増幅を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０サーモサイクラーで行った。増幅後、反応物をＨｉ−Ｄｉホルムアミドで変性し、得られた断片を、ＰＯＰ７ポリマーを備えたＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１３０キャピラリー電気泳動プラットフォーム（アプライドバイオシステムズ社）で、分離および検出した。それぞれの遺伝子座の解析および対立遺伝子の割り当てを、ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）およびＰｏｗｅｒＴｙｐｅｒ  １２  ｍａｃｒｏ（プロメガ社）ソフトウェアパッケージを用いて行った。
【０１２９】
核型解析
核型分析をモレキュラー・ダイアグノスティックス・サービス社（カリフォルニア州サンディエゴ）で行った。簡潔に説明すると、初代乳腺細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。細胞を７５ｎｇ／ｍＬコルセミドで１８．５時間処理して、有糸分裂を静止させた。処理後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、低張液で処理し、メタノール／酢酸中で固定した。固定した細胞から分裂中期スプレッドを調製し、染色して染色体Ｇバンドを観察した。各組織試料について、２０個の中期染色体をカウントし、そのうち５つを分析および核型決定した。いくつかの乳腺組織試料について、代表的な核型分析を示す。
【０１３０】
定量的リアルタイムＰＣＲ
以下は、以下の実施例１〜８で使用された材料およびプロトコールを記載している。
【０１３１】
分取したＲ１〜Ｒ４サブセット、並びに対応するＲ１およびＲ３のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陽性亜集団およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陰性亜集団、未分化のＨ７およびＨ９  ヒトＥＳＣ、またはヒト間葉系幹細胞から、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（モレキュラーデバイス社、カタログ番号ＫＩＴ０２０４）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジーズ社）を用いて、ＲＮＡの純度および濃度を決定した。定量的リアルタイＰＣＲを、７ｎｇのインプットＲＮＡを用いて、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｈｕｍａｎ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（キアゲン社、米国、メリーランド）で、製造業者の取扱説明書に従って、行った。スチューデントｔ検定を用いて、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（キアゲン社、米国、メリーランド）サポートオンラインにより提供されたソフトウェアで、Ｐ値を作成した。
【０１３２】
実施例１：負の増殖シグナルを回避するヒト上皮細胞の同定および特徴付け
体性幹細胞の重要な表現型は、負の増殖シグナルを回避し、創傷治癒に参加する能力である。この前提に基づき、培地中で細胞の大部分がアレスト状態にあるときに増殖を続ける、ヒト乳腺内細胞の小さな亜集団が同定された。比較遺伝子発現プロファイリングを用いて、増殖の障壁を回避する、細胞における遺伝子の劇的な発現差異を同定したところ、最も顕著であったのは、細胞表面マーカーＣＤ７３／ＮＴ５Ｅの過剰発現およびＣＤ９０／ＴＨＹ１の発現低下であった。この細胞表面マーカーであるＣＤ７３／ＣＤ９０の組み合わせを利用し、ＦＡＣＳを用いて、細胞系マーカー陽性（Ｌｉｎ＋）細胞を枯渇させ、造血系細胞、内皮系細胞および白血球系細胞を取り除いた後に、乳房縮小術に由来する新しく単離した単一細胞懸濁液から上皮亜集団を単離した（図７、パネルＡ）。得られた細胞系マーカー陰性（Ｌｉｎ−）集団（図７、パネルＡ）を、４つの別々の亜集団、ＣＤ７３＋ＣＤ９０−（Ｒ１）、ＣＤ７３＋ＣＤ９０＋（Ｒ２）、ＣＤ７３−ＣＤ９０−（Ｒ３）およびＣＤ７３−ＣＤ９０＋（Ｒ４）（図７、パネルＢおよび図１、パネルＡ）に分割したところ、それぞれ、全Ｌｉｎ−集団の５．３％、１．９％、８４．６％および８．２％であった（図１、パネルＡ、Ｃ）。
【０１３３】
これらの発見の普遍性を確認するために、乳房縮小術を受けた１０人の無病女性から得られたこれらの亜集団を分析した。平均値からの標準誤差を含む全ての値は、図の説明に提供される。組織提供者は、２４歳〜４９歳であり、コーカサス人またはアフリカ系アメリカ人のいずれかであった。全ての細胞集団が正常な（４６ＸＸ）核型を示した。
【０１３４】
アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ１）は、正常なヒト乳腺幹細胞のマーカーであるため、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイを使用して、上記４つの上皮サブセットにおいて、ＡＬＤＨ酵素活性を有する集団の存在および大きさを評価した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性（ＡＬＤ＋）細胞はまれであり、全乳腺上皮細胞の４％しか占めていなかった（図１３および図８、パネルＡ）。ＡＬＤ＋細胞はＲ４で検出されなかった。Ｒ１中のＡＬＤ＋細胞の大プール（４０％）は、Ｒ１区画の３１％に相当する。対照的に、Ｒ３は全ＡＬＤ＋細胞の約半分を占めているが（５２％）、このＡＬＤ＋プールは全Ｒ３細胞集団の非常に小さな割合にしか相当しない（２．４％）。最後に、Ｒ２中のＡＬＤ＋細胞の小プール（８％）は、Ｒ２区画の１６％を占める（図１３および図８、パネルＢ）。
【０１３５】
従って、ＡＬＤ＋細胞は、Ｒ１およびＲ２亜集団において最も高度に富化されるが、以下に記載する通り、全幹細胞活性がＲ１に含まれる。
【０１３６】
実施例２：Ｒ１  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は標準的なマンモスフィア自己複製能を示す
ＡＬＤを発現するまたはしないＲ１〜Ｒ４乳腺上皮サブセットがマンモスフィア形成能を有するかどうかを試験するために、先に確立されたインビトロアッセイ法を使用した。マンモスフィアとして培養され、連続継代された単一細胞のスフィア開始効率（sphere initiation efficiency）を評価することにより、細胞自己複製能を評価した（図１、パネルＢ）。Ｒ４集団におけるＡＬＤ＋細胞の欠如と一貫して、このサブセットは懸濁液中でマンモスフィアを生成しなかった（図２、パネルＡ；および図９、パネルＡ、ｄ）。対照的に、Ｒ１〜Ｒ３集団は、９６ウェルプレートに１細胞／ウェルで播種された場合でも、懸濁液中でマンモスフィアを生成することができた（第１継代）。Ｒ１はマンモスフィア形成の最大の発生頻度を示し（３．９％）、一方Ｒ２およびＲ３は、それぞれ０．４７％および０．５８％の発生頻度を示した（図２、パネルＡ；９、パネルＡ、ａ〜ｃ）。３継代までは、細胞を１０００細胞／ｍｌで培養した場合、同様の結果が得られた。
【０１３７】
先の乳腺細胞研究と一致して、インビトロにおける自己複製能は、Ｒ１〜Ｒ３中のＡＬＤ＋細胞に限定された（図２、パネルＡ；９、パネルＡ、ｅ〜ｇ  対  ｈ〜ｊ）。Ｒ１−ＡＬＤ＋については、強固（robust）且つ持続的なマンモスフィア生成が観察され（４継代に亘って５〜６％）、Ｒ２−ＡＬＤ＋およびＲ３−ＡＬＤ＋については、この表現型は最小であった（図２、パネルＡ）。従って、インビトロにおける自己複製能は、ＣＤ７３／ＣＤ９０発現プロファイルによって十分に定義され、そこで、Ｒ１は、未選別の細胞と比較して、懸濁液中でのコロニー形成能アッセイにおいて、１０倍（４％対０．４％）富化された（図２、パネルＡ）。
【０１３８】
実施例３：Ｒ１  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ−陽性細胞は、３種の乳腺系統全てに沿ったインビトロ分化能を有する
多系統に分化する能力は、幹細胞の機能的な特徴である。細胞が幹細胞または前駆細胞の特性を有しているかどうかを試験するために、Ｒ１〜Ｒ３ＡＬＤ＋から得られたマンモスフィア由来細胞を、３種のインビトロ乳腺系統アッセイ（ＭＬＡ  ａ〜ｃ；図１、パネルＢ）およびインビボ乳腺再生アッセイ（図１、パネルＢ）を用いて評価した。
【０１３９】
インビトロでの系統分化能を評価するため、類似のアッセイを、連続継代した細胞に対して行った。Ｒ１〜Ｒ３  ＡＬＤ＋由来のマンモスフィアを単一細胞へと解離させ、コラーゲンコートのカバーガラス上にコロニー形成密度で播種し（ＭＬＡ  ａ；図１、パネルＢ）、一定分量を浮遊培養して、自己複製能について試験した（図１、パネルＢ）。各Ｒ１〜Ｒ３のＡＬＤ＋（およびＡＬＤ−）の連続集団（serial population）の分化能を、フローサイトメトリー分析およびコロニー形態分析によって評価した。
【０１４０】
分化を促進するコロニー形成性培養条件の後に生じた細胞の子孫において、系統特異的マーカーの発現をモニタリングした。管腔上皮系統または筋上皮系統への拘束を、それぞれＭＵＣ−１およびＣＤ４９ｆ（α−６−インテグリン）という２種の乳腺上皮系統特異的マーカーについての免疫染色により決定した。予想通り、Ｒ１〜Ｒ３  ＡＬＤ−は、多分化能を示さず（図２、パネルＢ）、管腔上皮細胞（ＭＵＣ−１＋／ＣＤ４９ｆ−）について高度に富化されていた（９６〜９７％）。
【０１４１】
多分化能を示した唯一のＡＬＤ＋集団は、Ｒ１であった。第一継代では、全３種の系統が生じた。後の継代で、分化した子孫を使って、二分化能前駆細胞が富化された（図２、パネルＢ）。実際に、二分化能（ＭＵＣ−１＋／ＣＤ４９ｆ＋）を有するＲ１−ＡＬＤ＋細胞の割合は、継代１〜３に渡って増加した：それぞれ２０％、３２％および６６％（図２、パネルＢ）。対照的に、Ｒ２−ＡＬＤ＋およびＲ３−ＡＬＤ＋は、ごくわずかな割合の二分化能前駆細胞しか含まなかった：継代１および２において、それぞれ、０．３〜０．１％および４〜２％（図２、パネルＢ）。さらに、Ｒ２は管腔細胞および筋上皮細胞の両方を生じたが、Ｒ３は主に管腔細胞に限定された。
【０１４２】
単一細胞の系統分化能を評価する形態学的コロニー形成アッセイにおいて、Ｒ１−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は、３種のコロニーに分化した：筋上皮細胞のみを含むコロニー（図２、パネルＣ、上段パネル）、もしくは管腔上皮細胞のみを含むコロニー（図２、パネルＣ、中段パネル）、または両系統の細胞、並びに両方の系統マーカーの共発現を有する二分化能細胞（図２、パネルＣ、下段パネル）。この分化能は後の継代で維持された（データ未記載）。上記のフローサイトメトリーの結果からの予想通り、Ｒ２−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は筋上皮コロニーおよび管腔上皮コロニーにのみ分化し、一方、Ｒ３−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は、主に管腔上皮コロニーに分化した（データ未記載）。特に注目すべきことに、Ｒ３−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞から生じた管腔上皮コロニーは、Ｒ１−ＡＬＤ＋由来のものと比べ、両方ともＭＵＣ−１を発現していたにもかかわらず、形態的に異なっていた（より大型）（データ未記載）。
【０１４３】
腺胞上皮細胞系統（ＭＬＡ  ｂ）に沿って分化する能力を試験するために、Ｒ１〜Ｒ３  ＡＬＤ＋マンモスフィアに由来する細胞を、コラーゲン基質上で７日間分化させ、次に、プロラクチンを添加した、増殖因子を欠いた再構成基底膜ゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で覆い、さらに７日間培養した。腺胞分化の獲得をβカゼインの細胞内産生によって評価した（図２、パネルＤ）。これらの条件下で、Ｒ１−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は、管腔系統、筋上皮系統および腺胞系統に沿って分化することができた唯一の細胞であったが、このことは、唯一の真に多分化能を有する集団であることを示している。
【０１４４】
最後に、先に記述された三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ細胞培養系（ＭＬＡ  ｃ）を用いて、Ｒ１−Ｒ３  ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞の機能的な管−腺胞構造を形成する能力を比較することにより、インビトロでの分化能を評価した（図１、パネルＢ）。この系は、インビボで観察された乳腺管系（mammary tree）の空間定位および複雑な構造を、インビトロで再現する能力を試験する。初代ヒト乳腺上皮細胞は、２種の多細胞性構造（管腔上皮由来の小腺房様構造および筋上皮由来の固体球状（solid spherical）コロニー）に組織化される。Ｒ１〜Ｒ３  ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞の、分岐した、管−腺房構造および機能的腺胞細胞を作り出す能力を試験するために、分離されたマンモスフィアから得られた単一細胞を、三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ培地にコロニー形成密度で播種し、３週間培養した。それらの増殖を毎日モニタリングして、それぞれの構造が単一細胞から生じること、および個々の構造が合体しないということを確実にした。Ｒ１〜ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は、２つの形態学的に異なる構造を有するコロニーを生じた：２６％は分岐した、管−腺房構造を有するコロニーで、残りは腺房様構造を形成するコロニー（図９、パネルＢ）。対照的に、Ｒ２−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞は、腺房様構造のみを生じた（図９、パネルＢ）。Ｒ３−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞、並びにＡＬＤ−細胞は、いかなる構造も生じなかった（図９、パネルＢ）。プロラクチンを分化培地に添加した場合、Ｒ１−ＡＬＤ＋は、腺房構造の中心管腔（central lumen）で分泌されるβカゼインを生成したが、Ｒ２−ＡＬＤ＋マンモスフィア由来細胞培養物は生成しなかった（データ未記載）。これらのデータにより、Ｒ１−ＡＬＤ＋集団がインビトロにおいて真の多系統分化能を有し、一方で、Ｒ２−ＡＬＤ＋集団およびＲ３−ＡＬＤ＋集団が、それらの分化能に著しい制限があることが、再度示された。
【０１４５】
実施例４：Ｒ１  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、３種全ての乳腺系統に沿って、インビボにおいて分化することが可能である
インビボでの分化能を評価するため、Kuperwasser et al.により記述されたマウスモデルを利用して、インビボでの乳腺再生活性を高める、Ｒ１〜Ｒ４の能力を評価した。Ｒ１〜Ｒ４を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの、クリアリングされヒト化された乳腺脂肪パッドに移植した（図１０、パネルＡ〜Ｍ）。１５，０００個の細胞を移植した後の管形成によって示されたように、Ｒ１のみが増殖能を有した（図１０、パネルＡ〜Ｂ）。重要なことは、この増殖能はそのＡＬＤ＋画分の中に備わっており、わずか５，０００個の細胞を移植することで示されたということである（図１０、パネルＥ〜Ｆ）。Ｒ１−ＡＬＤ−画分は、３０，０００個の細胞を移植した後でさえ、いかなる管も生じることができない（図１０、パネルＪ〜Ｋ）。Ｒ３も、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ活性を有するが、３００，０００個の細胞を移植した後でさえ、乳腺を再構成することができなかった（図１０、パネルＣ〜Ｄ）。従って、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ活性は単独では増殖能を決定づけない。
【０１４６】
上皮増殖物がヒト由来であることを、ＣＫ８／１８（管腔上皮細胞）およびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）（筋上皮細胞）に対するヒト特異的抗体を用いる免疫染色で確認した。ヒト乳腺管系の場合と同様に、動物宿主中で２種類の管構造（腺房および複雑な管−小葉増殖物）が生じた。両方とも、管腔上皮層、および外側の筋上皮細胞層から構成された（図３、パネルＡ〜Ｂ）。移植から生じた管構造が完全な機能的分化を経ているかどうかを試験するために、移植細胞を有するマウスを交配させ、妊娠１８日目まで発生させた。腺房を裏打ちしている管腔細胞内、およびＲ１−ＡＬＤ＋増殖物のみにおけるヒト管構造の管腔中の分泌物内で、ヒトβカゼイン発現が観察された（図３、パネルＤおよびＦ）。これらの観察によって、Ｒ１  ＡＬＤ＋細胞の多分化能が、インビトロおよびインビボの両方において、さらに実証された。
【０１４７】
実施例５：Ｒ１  ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性多能性細胞は、さらなる外胚葉系統に、インビトロで分化することができる
ＣＤ７３およびＣＤ９０は、他の幹細胞集団で発現されるため、乳腺系統以外の外胚葉系統、すなわち神経系統、に分化するＲ１〜Ｒ４サブセットの能力を決定した。ニューロスフィア形成は、Ｒ１およびＲ２  ＡＬＤ＋画分に限定され、３継代まで維持された。ニューロスフィア由来の自発的に分化した神経系統細胞の表現型を、上記の通りに分析した。Ｒ１−ＡＬＤ＋ニューロスフィアおよびＲ２−ＡＬＤ＋ニューロスフィアから得られた細胞は両方とも、神経特異的マーカー、ネスチンに対して陽性に染色されるが、それらは、成熟神経細胞（β−ＩＩＩ−チューブリン／ＴＵＪ−１陽性細胞）またはグリア細胞（ＧＦＡＰ陽性細胞）を生じる能力において、顕著に異なる。Ｒ２−ＡＬＤ＋ニューロスフィア由来細胞は、グリア系統、特に、アストロサイトにのみ分化する。対照的に、Ｒ１−ＡＬＤ＋ニューロスフィア由来細胞は、神経細胞およびアストロサイトの両方に分化し、分化した神経細胞の割合は、アストロサイトよりもさらにより高い（それぞれ、８９％対１１％）（図１１、パネルＡ〜Ｂ）。これは、ヒトＨ７、ＥＳＣの場合も同様であった（図１１、パネルＣ）。
【０１４８】
機能的ドーパミン作動性（ＤＡ）神経細胞に分化する、Ｒ１−ＡＬＤ＋細胞の能力を、さらに評価した。分化の２１日後、Ｒ１  ＡＬＤ＋細胞の８０％は、ＤＡ特異的マーカーである、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）および小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）について陽性染色を有する、明確な錐体形態となった（図１１、パネルＤ、上段パネル）。その後、これらの細胞が、神経細胞の特徴である電気的膜特性（たとえば、負の静止膜電位（ＲＭＰ）および活動電位発火）を示すかどうかを調べた。これを試験するために、Ｒ１−ＡＬＤ＋由来ＤＡ神経細胞およびｈＥＳＣ由来ＤＡ神経細胞におけるホールセルパッチクランプ記録を行った（図４、パネルＡ〜Ｂ）。両方の神経細胞集団が、同様の負のＲＭＰ（それぞれ、−３７および−３６ｍＶ）を示し、その値は、未成熟ｈＥＳＣ由来神経細胞で既に報告されたものと同等であったが、インビボにおいて典型的に観察されるもの（−５８ｍＶ）よりもより高かった。これは、本物の（bona fide）神経細胞のイオンチャネルの発現および細胞膜を挟んだイオン勾配の効率的な制御を反映している。
【０１４９】
Ｒ１−ＡＬＤ＋由来ＤＡ神経細胞およびｈＥＳＣ由来ＤＡ神経細胞が活動電位を発生させることができるかどうかを試験するために、一連の脱分極電流工程を導入することにより、両グループの細胞を脱分極させた。予想通り、脱分極した膜電位では、試験された５種全てのｈＥＳＣ由来ＤＡ神経細胞は、閾膜電位が全か無かの様式で達成された後、活動電位を発射した（図４、パネルＤ）。脱分極後、Ｒ１−ＡＬＤ＋由来ＤＡ神経細胞において、同様の全か無かの偏向電圧が観察された（図４、パネルＣ）。活動電位が発射された閾値は、両方の場合で同様であり、それぞれ、５２±１２ｐＡおよび８４±２７．９ｐＡであった。重要なことに、活動電位の自発的反復発射を示す成熟神経細胞と異なり、ｈＥＳＣ由来ＤＡ神経細胞およびＲ１  ＡＬＤ＋由来ＤＡ神経細胞の両方において、閾値を越えて、各電流工程の間に、１つだけの活動電位が発射され、潜時はより高い電位でより短くなった。この知見は、それらの高い入力抵抗（それぞれ、１．６および１．１ＧΩ）によって示されるように、これらＤＡ神経細胞の未熟な状態を再度裏付ける（図４、パネルＥ）。重要なことに、偏向電圧はテトロドトキシンによって除去することができ（ＴＴＸ；図４、パネルＦ）、このことは、神経細胞についての予想通り、この偏向電圧がＮａ＋チャネルに介在されたことを示している。これらの結果は、ｈＥＳＣおよびＲ１  ＡＬＤ＋細胞が、非常に類似した特徴を共有する機能的神経細胞に分化することができるという、生理学的証拠を提供する。
【０１５０】
実施例６：Ｒ１多能性細胞は、インビトロにおいて、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ発現とは無関係に、内胚葉および中胚葉系統に沿って分化することができる
Ｒ１−ＡＬＤ＋が外胚葉系統に沿った種々の細胞型に分化できることが確認されたため、内胚葉および中胚葉を含む他の体細胞系統に沿ったＲ１の分化能を調べた。
【０１５１】
内胚葉への分化能を決定するために、ヒトＥＳＣが胚体内胚葉に分化するのを可能にする条件下で、Ｒ１〜Ｒ４を培養した。分化の３日後、胚体内胚葉であることを示すマーカー（転写因子ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２）を、免疫染色で評価した。Ｒ３およびＲ４はこれらの分化条件下では生存できなかった。Ｒ２は生存したが、増殖ができず、細胞質においてＳＯＸ１７の非常に弱い発現を示したが、ＦＯＸＡ２は発現しなかった（データ未記載）。胚体内胚葉へ向かう分化を経た唯一の集団はＲ１であり、Ｒ１細胞の４０％がその核中でＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の両方を発現した（図５、パネルＡ〜Ｂ）。どの細胞も中内胚葉マーカーであるブラキュリを発現しなかったが、このことは、混入した中内胚葉系統からの寄与無しに、胚体内胚葉に向かう分化が完了したことを示している。驚くべきことに、その分化能はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ発現とは無関係であり、Ｒ１−ＡＬＤ＋細胞およびＲ１−ＡＬＤ−細胞の両方が、胚体内胚葉を生じた（図５、パネルＡ〜Ｂ）。
【０１５２】
中胚葉への分化能を決定するために、Ｒ１〜Ｒ４を、成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を心筋細胞系統に向かって誘導すると以前に報告された増殖因子に曝した。これらの条件下では、Ｒ１およびＲ２は、それらのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ活性に関係なく、生存し、一方で、Ｒ３およびＲ４は死滅した。分化後、心筋分化を示すマーカー（転写因子ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２およびＮｋｘ２．５、およびトロポニンＩ）を、免疫染色で評価した。Ｒ１−ＡＬＤ−細胞は、全ての心筋マーカーを一様に発現した（図５、パネルＤ）。Ｒ１−ＡＬＤ＋細胞は、４種のマーカーのうち３種：ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５およびトロポニンＩの発現を示したが、ＭＥＦ−２は発現しなかった（図５、パネルＣ）。Ｒ２の分化能はさらにもっと低減されており、Ｒ２細胞はＮｋｘ２．５のみを発現した（データ未記載）。以前の報告から予想されたように、これらの条件下では、心筋細胞の収縮は観察されなかった。重要なことに、Ｒ１細胞は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ活性の有無に関わらず、ヒト胎盤線維芽細胞フィーダー細胞上で培養され、ｈＥＳＣの心筋細胞への分化を促進する条件下で増殖したとき（１７）、自発的な拍動が観察された（データ未記載）。
【０１５３】
ＣＤ７３＋ＣＤ９０−（Ｒ１）細胞は、多能性、上皮系統および間葉系系統への機能的分化を示したため、ヒト生得的多能性体細胞（ｈＳＣＩＰＰ）である。
【０１５４】
実施例７：個々のＲ１細胞は胚性幹細胞の特定の表現型特性を発現する
単一Ｒ１細胞は、一次組織から単離され、多能性ヒトＥＳ細胞の増殖を可能にする条件下に播種された場合（２３）、１４日目までに、ＥＳ細胞において以前に記述された多能性遺伝子、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２を強く発現するコロニーを形成する（図６、パネルＡ）。これはＲ２〜Ｒ４では観察されなかった。これらの単一細胞由来サブクローンの子孫を３つに分割し、上記の、神経細胞、心筋細胞および胚体内胚葉を生じることが示された分化条件に置いた（図１２）。短いタンデム反復分析を用いて、親乳腺細胞集団およびその中胚葉に分化したＲ１誘導体について、由来および個々のアイデンティティを確認した（図１４）。従って、これらの体細胞は、適当な条件に置かれた場合、生得的な多能性を示す（ＳＣＩＰＰ）。
【０１５５】
最新の研究により、幹細胞表現型の一般的特徴には、強い動的不均一性の発生が含まれることが示されている。この表現型の流動性は、フローサイトメトリーを用い、無数の発現変化の分布をモニタリングすることで、測定することができる。ＥＳ細胞では、これは、分化の確率の分布と相関するＮａｎｏｇ発現の変動によって示される。造血前駆細胞では、Ｓｃａｌ発現がこの機能を果たす。細胞表面マーカーＣＤ７３およびＣＤ９０の発現を使用して、Ｒ１集団の劇的な可塑性を示した（図６、パネルＢ）。実際に、Ｒ１集団は、Ｒ１〜Ｒ４の４つの初期状態へと向かう動的な再分布を示す。元のＲ１集団の再分布と関連するのは、分化能の制限の獲得である（データ未記載）。
【０１５６】
実施例８：ｈＳＣＩＰＰは、それらをｈＥＳＣから区別する遺伝子発現特性を示す
ｈＳＣＩＰＰは３種の胚系統に沿った多能性表現型を示すことができるため、この新しく特徴付けられたｈＳＣＩＰＰ集団と、よく特徴付けられたｈＥＳＣ集団の間の分子の共通点および差異を評価した。この目的のため、４つの乳房縮小術から単離されたＲ１集団およびＲ４集団における、重要な多能性マーカー遺伝子および既知の再プログラム因子を含む、４３遺伝子の転写産物発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて測定した。この分析により、Ｒ１−ＡＬＤ＋およびＲ１−ＡＬＤ−が同様の発現プロファイルを示すこと、並びにこのプロファイルが、ｈＥＳＣといくつかの共通点を共有しているが、明らかにそれらをｈＥＳＣと区別するものでもあること、が明らかにされた。ｈＳＣＩＰＰとｈＥＳＣの間で共有される１つの特徴は、分化細胞と比較した場合の、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ等の多能性遺伝子の高発現である（図６、パネルＡ〜Ｃおよび図１５）。ｈＥＳＣと異なり、ｈＳＣＩＰＰは、大きく減少したレベルの特定のエピジェネティックな可塑性マーカー（Ｄｎｍｔ３ｂ等）を発現するが、非常に重要な再プログラム因子であるＫｌｆ４およびＭｙｃ、並びにストレスマーカーであるＰｔｇｓ２１Ｃｏｘ２を強発現する（図６、パネルＡ〜Ｃおよび図１５）。従って、ｈＳＣＩＰＰは、それらの多能性を裏付け、それらをｈＥＳＣから明確に区別する、独特な発現プロファイルを示す。
【０１５７】
実施例９：ｐ１６ＩＮＫ４ａによって制御される細胞表面マーカー
ｐ１６ＩＮＫ４ａの抑制は重要な幹細胞表現型である。ｐ１６ＩＮＫ４ａの転写および活性を阻害するポリコーム抑制タンパク質であるＢＭＩ−１のノックアウトのために操作されたマウスは、造血幹細胞および神経幹細胞を生じることができない。機能的には、幹細胞におけるｐ１６ＩＮＫ４ａの抑制は、ストレス応答性の細胞周期停止を不活化するだけでなく、さらには、分化のためのエピジェネティックな可塑性を可能にする。ｐ１６ＩＮＫ４ａの抑制は、幹細胞特性を有する細胞を将来的に単離するのに使用され得る細胞表面マーカーの発現も調節する可能性がある。自然に抑制されたｐ１６ＩＮＫ４ａを有する、または有さないヒト乳腺上皮細胞の比較遺伝子発現プロファイリングにより、ＣＤ７３の劇的な過剰発現およびＣＤ９０の劇的な発現低下が同時に起こることが同定された。これらのタンパク質の調節におけるｐ１６ＩＮＫ４ａの因果的役割を確かめるため、フロー活性化細胞分取（flow activated cell sorting）（ＦＡＣＳ）を用いて、ｓｈｐ１６を有するヒト乳腺上皮細胞を、ＣＤ７３およびＣＤ９０の発現について評価した。ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の基底発現における６１〜７７％の減少に伴い、ＣＤ７３−ＣＤ９０＋画分からＣＤ７３＋ＣＤ９０−画分へと劇的に移行し、結果としてＣＤ７３＋ＣＤ９０−細胞が平均して１００倍超増加した（図２１）。
【０１５８】
ＣＤ７３＋ＣＤ９０−を乳腺幹細胞の分化能サインと同定したため、１９の無病ヒト乳腺組織（乳房縮小術）を、ＣＤ７３＋ＣＤ９０−細胞の存在について分析した。全ての組織は、目に見える疾患、細菌、真菌またはウイルスの混入を持たず、正常な二倍体４６、ＸＸ核型を示した（実施例、および図２２）。新しく単離した単一細胞は、最初に、細胞系マーカー陽性（Ｌｉｎ＋）画分（造血細胞、内皮細胞および白血球細胞）が枯渇した（図７、パネルＡ）。結果として生じた、上皮細胞表面マーカーであるＥＰＣＡＭを発現する細胞系マーカー陰性（Ｌｉｎ−）集団を、図７、パネルＢに示されるゲーティングを使用して、４つの亜集団、ＣＤ７３＋ＣＤ９０−（Ｒ１）（５．３％）、ＣＤ７３＋ＣＤ９０＋（Ｒ２）（１．９％）、ＣＤ７３−ＣＤ９０−（Ｒ３）（８４．６％）およびＣＤ７３−ＣＤ９０＋（Ｒ４）（８．２％）に分画した（図１、パネルＡおよびＣ、並びに図３３）。次に、Ｒ１〜Ｒ４画分を、下記と同様に、乳腺幹細胞自己複製および多分化能について、標準的なアッセイで試験した。
【０１５９】
実施例１０：乳腺の多分化能を示す細胞はほとんどない
マンモスフィアとして培養され、連続継代された単一細胞のスフィア開始効率を評価することにより、自己複製能を評価した（図１、パネルＢ）。多くの細胞集団は、９６ウェルプレート中に１細胞／ウェルで播種された場合であっても初期マンモスフィアを生成することができたが、連続的なマンモスフィア形成を示した細胞のみが幹細胞特性を有していた。強く持続的なマンモスフィア生成は、Ｒ１内の細胞に対してのみ観察され、８継代目まで及んだ（図１、パネルＣ；図１６、パネルＡ；および図２３、パネルＡ）。重要なことに、稀な幹細胞集団についての予想通りに、全上皮細胞の０．１６％のみを占める、ＣＤ７３＋ＣＤ９０−細胞（Ｒ１細胞）の小さな分画（約３％）のみが、インビトロにおいて、この完全で持続的なクローン原性乳腺自己複製能を示した。
【０１６０】
どの乳腺細胞が幹細胞特性または前駆細胞特性を有するかをさらに試験するために、Ｒ１〜Ｒ３由来のマンモスフィア由来細胞を、３つのインビトロ乳腺系統アッセイ（Mammary Lineage Assay）（ＭＬＡ  ａ〜ｃ；図１、パネルＢ）および１つのインビボ乳腺再生アッセイ（図１、パネルＢ）を用いて評価した。
【０１６１】
第一のアッセイでは、フローサイトメトリーおよびコロニー形態分析によって、マンモスフィア由来細胞の連続継代に対して、インビトロにおける系統分化能を評価した。Ｒ１〜Ｒ３に由来するマンモスフィアを単一細胞に分離させ、懸濁液中で増殖させて、自己複製能および多分化能について試験し、一定分量をコロニー形成密度でコラーゲンコートのカバーガラスに播種した（ＭＬＡ  ａ；図１、パネルＢ）。乳腺管腔マーカーであるＭＵＣ−１、および筋上皮マーカーであるＣＤ４９ｆ（α−６−インテグリン）の発現に対して細胞を染色することにより、分化をモニタリングした（図２３、パネルＢ）。フローサイトメトリーにより、Ｒ１が多分化能を有する唯一の集団であることが確認された。最初のマンモスフィア継代により、３種全ての系統が生じた。継代を続けることで、分化型の子孫を消費して、二分化能前駆細胞（ＭＵＣ−１＋／ＣＤ４９ｆ＋）が、継代１〜３にわたって増加した：それぞれ２０％、３２％および６６％（図１６、パネルＢ）。補足的な形態学的コロニー生成アッセイ（complementary morphologic colony-producing assay）を用いて、Ｒ１マンモスフィア由来（単一）細胞は、３種のコロニーに分化した：筋上皮細胞のみを含有するコロニー（図１６、パネルＢおよび図２３、パネルＢ：頂部）、管腔上皮細胞のみを含有するコロニー（図１６、パネルＢ；および図２３、パネルＢ：中央）、または両系統の細胞、並びに両系統マーカーの共発現を有する二分化能細胞（図１６、パネルＢおよび図１８、パネルＢ；底部）。この分化能は後の継代で維持された（データ未記載）。対照的に、フローサイトメトリー（図１６、パネルＢ）および形態学的解析（データ未記載）の両方により、Ｒ２マンモスフィア由来細胞およびＲ３マンモスフィア由来細胞が、それぞれ、主に筋上皮コロニーおよび管腔コロニーに、または管腔コロニーのみに、分化したことが示された。
【０１６２】
第二のアッセイ（ＭＬＡ  ｂ；図１、パネルＢおよび図１６、パネルＣ）において、βカゼインの細胞内産生により、機能的腺胞分化の獲得を評価した。Ｒ１〜Ｒ３マンモスフィアに由来する細胞を、コラーゲン基質上で分化させ、プロラクチンを添加した増殖因子を欠く再構成基底膜ゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で覆い、さらに培養した。これらの条件下で、Ｒ１マンモスフィア由来細胞のみが、腺胞分化と合致した、βカゼインを産生した。Ｒ２〜Ｒ３は、プロラクチンの存在下では分化できない管腔細胞を生じた。これらの細胞は、Lim et. al.によって報告された、乳腺刺激性の指示（cue）に応答することができず、並びに三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養において管／小葉を形成できない、成熟管腔細胞に似ている可能性がある。
【０１６３】
第三のインビトロ分化アッセイ（ＭＬＡ  ｃ；図１、パネルＢ）により、Ｒ１〜Ｒ３マンモスフィア由来細胞の、インビボで観察された２種の多細胞性構造（管腔起源の小腺房様構造および筋上皮起源の固体球状コロニー）に組織化する能力を比較した。分離されたマンモスフィア（Ｒ１〜Ｒ３）からの単一細胞を、三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ中にてコロニー生成密度で培養した。Ｒ１マンモスフィア由来細胞のみが、両方の構造（２６％の分岐した管−腺房構造および７４％の腺房様構造）を生じた（図２３、パネルＣ）。プロラクチンを分化培地に添加した際、Ｒ１マンモスフィア由来細胞培養物はβカゼインを産生したが、Ｒ２マンモスフィア由来細胞培養物は産生しなかった（データ未記載）。従って、Ｒ１集団はインビトロにおいて真の多系統分化能を示し、一方、Ｒ２集団およびＲ３集団は、分化能が著しく束縛されていた。
【０１６４】
最後に、Ｒ１〜Ｒ４の、インビボにおける乳腺再生能を強化する能力を、上記と同様に評価した。Ｒ１〜Ｒ４を分取し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの、クリアリングされヒト化された乳腺脂肪パッドに直接移植した。わずか５，０００個の細胞を移植した後の管形成によって示されたように、Ｒ１のみが増殖能を有した（図２４、パネルＡ〜Ｂ）。Ｒ２、Ｒ３（図２４、パネルＡ）およびＲ４は、最大３００，０００個の細胞を移植した後でさえ、乳腺を再構成することができなかった。ヒト乳腺管系において観察されたように、宿主の中に生じた腺房生成物および管−小葉生成物は、管腔層および外側の筋上皮細胞層から成っていた（図１６、パネルＤ）。これらの上皮生成物がヒト由来であることを、ＣＫ８／１８（管腔細胞）およびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）（筋上皮細胞）に対するヒト特異的抗体を用いて確認した。これらのヒト管構造が完全な機能的分化を経たかどうかを試験するために、マウスを交配させ、妊娠１８日目に乳腺を採取した。ヒトβカゼインは、腺房を裏打ちしている管腔細胞内で発現され、Ｒ１生成物のみにおけるヒト管構造の管腔に分泌された（図２４、パネルＣ〜Ｆ）。これらの結果により、インビトロおよびインビボの両方における、Ｒ１細胞の乳腺多分化能が確立された。
【０１６５】
実施例１１：さらなる系統への分化
ｑＰＣＲアレイによるＲ１〜Ｒ４亜集団の分析により、Ｒ１集団において、多能性（multi- and pluripotency）を与える遺伝子の特有の発現が明らかにされた（図１９、パネルＡ）。従って、Ｒ１〜Ｒ４亜集団の、他の外胚葉系および中内胚葉系に分化する能力を試験した。
【０１６６】
持続的なニューロスフィア自己複製能を、以前に確立されたインビトロアッセイ２２を用いて評価した。ニューロスフィア形成は、Ｒ１画分（７連続継代まで；図２５、パネルＡ〜Ｄ）およびＲ２画分（２連続継代まで）に束縛されており、マンモスフィア形成の発生頻度（Ｒ１の約４％、または全Ｌｉｎ−集団の約０．２％）に類似した発生頻度を示した。神経前駆細胞マーカーであるネスチンの発現を、Ｒ１およびＲ２ニューロスフィアから自発的に分化した神経系統細胞において確認した。しかし、Ｒ１ニューロスフィア由来細胞の８９％および１１％が、それぞれ、神経細胞分化マーカー（β−ＩＩＩ−チューブリン／ＴＵＪ−１）およびグリア分化マーカー（ＧＦＡＰ）を発現した一方で（図２５、パネルＡ〜Ｄ）、Ｒ２ニューロスフィア由来細胞は、ＧＦＡＰのみを発現した。
【０１６７】
内胚葉系に分化するＲ１〜Ｒ４亜集団の能力を試験するために、Ｒ１〜Ｒ４を、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）が胚体内胚葉に分化するのを可能にする条件下で培養し、転写因子であるＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の発現について、免疫染色により評価した。Ｒ３およびＲ４はこれらの条件下で生存できなかった。Ｒ２は生存したが、増殖できず、ＳＯＸ１７の非常に弱い細胞質発現を示し、ＦＯＸＡ２の発現を示さなかった（データ未記載）。Ｒ１細胞のみが胚体内胚葉表現型を示し、細胞の４０％がＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２の核発現を示した（図２６、パネルＡ）。どの細胞も中内胚葉マーカーであるブラキュリを発現せず、このことは、中内胚葉系統からの寄与無しの、胚体内胚葉へと向かう完全な拘束を示している（図２６、パネルＡ）。適当な条件下で、Ｒ１細胞は、膵臓分化マーカーであるＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の発現によって示されるように、膵臓系統に向かってさらに分化することができる（図１７、パネルＡ）。
【０１６８】
中胚葉分化能（mesodermal potential）を決定するために、Ｒ１〜Ｒ４を、成体ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびｈＥＳＣを脂肪細胞系統、内皮細胞系統または心筋細胞系統へと向かって誘導すると以前に報告された分化培地に曝した。脂肪細胞化条件下では、Ｒ１細胞のみが付着および増殖した。内皮細胞化条件および心筋細胞化条件の下では、Ｒ１およびＲ２は生存し、一方でＲ３およびＲ４は死滅した。Ｒ１細胞のみが、脂肪細胞のレプチン、ＰＰＡＲγおよびＦＡＢＰ４、内皮細胞のＣＤ３１およびＣＤ３４、並びに、心筋細胞のＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２、ＮＫＸ２．５、およびトロポニンＩ等の細胞型特異的マーカーを、均一に共発現した（図１７、および図２５、パネルＡ〜Ｄ）。Ｒ２細胞はＮＫＸ２．５のみを発現した（データ未記載）。機能アッセイによって、Ｒ１からの脂質で満たされた脂肪細胞および細管形成内皮細胞の生成が示された（図１７、パネルＣおよび２５、パネルＡ〜Ｄ）。以前の報告から予想された通り、心筋細胞の自発的拍動は、Ｒ１細胞が、ヒト胎盤線維芽細胞フィーダー細胞上で培養され、心筋細胞へのｈＥＳＣ分化を促進する条件下で増殖した場合に観察されるのみであった。従って、ヒト体細胞集団由来のＣＤ７３＋ＣＤ９０−細胞のごく一部（３％）が、マーカーの機能的発現、並びに外胚葉系、内胚葉系および中胚葉系の表現型を示す。
【０１６９】
実施例１２：奇形腫の形成
奇形腫形成能を試験するために、Ｒ１〜Ｒ４細胞を、免疫無防備状態マウスの腎被膜下に移植した。乳腺組織から直接分取したＲ１集団（図１８、パネルＡおよび図２７、パネルＡ〜Ｃ）および陽性対照ｈＥＳＣ  Ｈ７（図２８、パネルＡ）の両方が、３種全ての胚葉の提示を伴って、奇形腫を生じた。Ｒ２〜Ｒ４の集団、並びに前癌状態の乳腺細胞（１８４Ａ１）は、細胞塊（cell mass）も形成できなかったが、一方で、転移性乳腺細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の注射によって、分化型の構造を持たない悪性腫瘍が形成された（図２８、パネルＢ）。これらのデータをまとめると、一部分のＲ１集団が、３種全ての発生系統の誘導体を生じることができること、およびそれらが悪性ではないこと、が示される。
【０１７０】
実施例１３：クローンの多能性の証拠
ヒト組織から直接単離された無培養のＲ１細胞を、奇形腫アッセイにおいて分化能について評価することによって、分化能が培養下の細胞増殖に起因し得ないということが分かる。しかし、このアプローチを用いても、Ｒ１細画分が、それぞれ３種全ての胚系統を生じる能力を有する単一の細胞（すなわち多能性細胞）から成ることを確認することはできない。実際には、その代わりとして、このＲ１集団は、それぞれが単一の胚系統への制限された能力を有する細胞の集団に相当し得る。
【０１７１】
これら２つの可能性を見分けるために、多能性ヒトＥＳ細胞の増殖を可能にする条件下で増殖した、Ｒ１単一細胞由来サブクローンの子孫を、手動で３つに分割し、上記のインビトロ分化アッセイおよびインビボ分化アッセイのそれぞれにかけて、多能性について評価した。これらの単一細胞由来のＲ１サブクローンは、前述の系統誘導体全てを生じた（図２９、パネルＡ〜Ｄ）。それらは、３種全ての胚系統に対する寄与を有する奇形腫も形成した（図１８、パネルＢおよび図２７、パネルＣ〜Ｄ）。従って、直接分取したＲ１細胞および単一細胞由来Ｒ１サブクローンは、３種全ての生殖細胞系列誘導体をインビトロおよびインビボで生成するのに、並びに多能性を示すのに、等しく強力である。
【０１７２】
一次組織から単離した稀なＲ１細胞の多能性が、当該細胞を、ｈＥＳＣの増殖を可能にすることが知られている条件下に置いた場合に、明らかになった。Ｒ１集団のおよそ３％が、１４日目までに単一細胞由来コロニーを形成した（図１９、パネルＡ〜Ｂ）。幹細胞状態の獲得は、４つの方法によって評価される、これらのコロニーにおける基準となる多能性遺伝子であるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２の強い誘導によって説明され得る。フローサイトメトリー分析によって、各コロニー内の細胞の９５％超が、上皮細胞表面マーカーであるＥＰＣＡＭと同時に、前記３つの多能性遺伝子を共発現したことが示された（図３０、パネルＡ）。コロニーの免疫細胞化学的染色は、発現レベルだけでなく、細胞内局在および集団内分布も提供した（図６、パネルＢ）。多能性マーカーの発現を、ｑＰＣＲ（図１９、パネルＡ）およびウェスタンブロット解析（図３０、パネルＢ）を用いて、それぞれ転写物レベルおよびタンパク質レベルで確認した。Ｒ２〜Ｒ４亜集団内では、多能性マーカーの発現が観察されなかった。
【０１７３】
Ｒ１細胞の起源および個々のアイデンティティを確認するために、法医学的分析と同様に、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を、２つの乳腺組織に由来する、ＦＡＣＳで単離した細胞におけるマーカーと、中胚葉に分化したＲ１誘導体（拍動する心筋細胞）におけるマーカーを比較した。親試料および分化した試料の各対は、所与の提供者について同一の遺伝子マーカーを示し、それぞれは、代表的な対照ｈＥＳＣ集団またはＫ５６２対照細胞株からのマーカーと異なっていた（図１４）。まとめると、これらのデータは、単一の内因性多能性細胞（endogenous Pluripotent Somatic Cell：ｅＰＳ細胞）が、適当な条件に曝された場合に、多能性機能を示し、３種全ての胚系統を生じることが可能であることを示している（図１９、パネルＤ）。
【０１７４】
実施例１４：ｅＰＳ細胞はｈＥＳＣおよびＭＳＣと異なる
新規に特徴が示された多能性ｅＰＳ細胞集団と、よく特徴が示されているｈＥＳＣ集団との間の分子的な共通点および差異点を評価した。さらに、ＣＤ７３はＭＳＣの細胞表面マーカーであるため、ＭＳＣもその比較に含めた。この目的のため、４つの乳房縮小術から分取されたＲ１集団において、４３遺伝子の転写物レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて測定し、それらを、ｈＥＳＣおよびＭＳＣの２つから得られた特性と比較した（図３４）。これらの遺伝子には、多能性遺伝子、ストレス遺伝子および再プログラム遺伝子が含まれている。分析によって明らかになったのは、Ｒ１が、ｈＥＳＣと多少の共通点を共有していたが（図１９、パネルＡ）、ＭＳＣとの明確な他の共通点を示したこと（図１９、パネルＢ）である。ｅＰＳ細胞とｈＥＳＣの間で共有され、それらを分化細胞またはＭＳＣと区別する１つの特徴は、多能性遺伝子であるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧの高発現であった（図１９、パネルＡおよび図３４）。ｈＥＳＣと異なり、そしてＭＳＣと同様に、ｅＰＳ細胞は、さらに減少したレベルの、エピジェネティックな可塑性マーカーであるＤＮＭＴ３ｂを発現した（図１９、パネルＢおよび図３４）。さらに、Ｒ１細胞はＣＤ９０の発現減少を明らかに示したが、この後者の表現型は、Ｒ１細胞をｈＥＳＣおよびＭＳＣの両方と区別するものである（図１９、パネルＣ）。単一細胞由来クローン集団または直接分取した無培養集団を用いて、同様の結果が得られた（図１９、パネルＡ〜Ｃおよび図３４）。従って、ｅＰＳ細胞は、それらの多能性を支持し、それらをｈＥＳＣおよびＭＳＣから区別する、独特な発現プロファイルを示した。最後に、不死なｈＥＳＣと対照的に、ｅＰＳ細胞は不死ではなく、Ｇ１アレスト状態になる前に、最大５８回の集団倍加にわたって増殖し、二倍体核型を維持した（図２０、パネルＡ〜Ｃ）。ｅＰＳ集団は、分化細胞において観察されたものと比較して非常に低いレベルのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）およびテロメラーゼ活性を示し、ｈＥＳＣまたは悪性細胞において観察されるものよりさらにより低いレベルのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）およびテロメラーゼ活性を示した（図２０、パネルＤ〜Ｅ）。
【０１７５】
実施例１５：膵臓および包皮から得られたｅＰＳ細胞
膵臓：ＣＤ７３＋ＣＤ９０−集団を、膵臓の管画分から単離した。細胞を単一細胞単離物として回収し、系統特異的マーカー並びにＣＤ７３およびＣＤ９０で染色した。系統陰性細胞は１％のＲ１細胞を生じた（図３５、パネルＡ）。これらの細胞を新しく分取し、マンモスフィア形成アッセイ用に播種した場合、膵臓から得られたＲ１細胞は、３継代目まで継代され、筋上皮コロニーおよび管腔コロニーに向かって分化したマンモスフィアを生じた。βカゼイン産生はインビトロの条件では見られなかった。ＣＤ４９ｆおよびＭＵＣ−１の染色を用いるマンモスフィアアッセイによって、膵臓におけるＲ１細胞に由来する２種のコロニーの存在が示された（図３５、パネルＢ）。使用された試料：２
【０１７６】
包皮：Ｒ１の単離は上記と同じ。包皮を表皮と真皮に分けた。真皮由来のＲ１は、ヒト化した脂肪パッド実験において、乳腺−管様構造を生じた。３つの包皮試料をこのアッセイに使用した。表皮および真皮由来のＲ１を使用した。真皮由来のＲ１は、ヒト化モデルにおいて、インビボで乳腺を与えた。表皮および真皮の両方におけるＲ１の割合は、およそ１％であった。
【０１７７】
考察
注目すべき表現型可塑性を示す、無病ヒト乳腺組織から単離された体細胞の独特な集団が、本明細書に記載された。これらの細胞は以下の多能性の基準を満たした：（ａ）細胞培養無しでの多能性の表示、（ｂ）クローンの多能性の証拠、（ｃ）細胞型特異的遺伝子発現の表示、（ｄ）３種全ての系統誘導体の機能性（外胚葉：移植マウスにおける人乳の分泌、中胚葉：脂質蓄積脂肪細胞、細管形成内皮細胞および拍動する心筋細胞、並びに内胚葉：腸杯細胞）、並びに最後に、（ｅ）細胞−細胞融合または混入現象の排除（複数の細胞集団の、分化前後のＳＴＲ分析および核型分析を通じて）。
【０１７８】
上で詳細に記載されたように、細胞がＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性であることは、完全な分化能を有する細胞（または「幹細胞表現型」）と普遍的に関連しているわけではない。例えば、ＣＤ７３を欠いているＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞は、完全な多能的分化能を有さなかった。対照的に、ＣＤ７３を発現する細胞は、完全な分化能を示し、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性であることは、外胚葉系統へと向かう分化的利点のみを与える。ＣＤ７３を発現する細胞は、それらのＡＬＤＥＦＬＵＯＲステータスに関わらず、胚体内胚葉および中胚葉に向かって、等しく十分に分化する。
【０１７９】
遺伝子発現データは、これらのｅＰＳ細胞が、ｈＥＳＣおよびｈＭＳＣと多少の共通点を共有しているが、独特な特性を示すという結論を裏付けている。
【０１８０】
この独特なヒト体細胞集団の単離は、２つのグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー細胞表面タンパク質の発現差異に基づいており、その２つのタンパク質とは、細胞外ＡＴＰのアデノシンへの変換に関与する細胞外ラフト関連酵素である、エクト−５'−ヌクレオチダーゼＮＴ５Ｅ／ＣＤ７３、および細胞接着分子であるＣＤ９０／ＴＨＹ−１である。ＣＤ７３およびＣＤ９０は、ＭＳＣの細胞表面マーカーとして以前使用されていた。しかし、ＭＳＣにおけるＥＰＣＡＭ発現の欠如およびＣＤ９０の強い発現によって、これらはｅＰＳと容易に区別される。ＣＤ７３は、酵素的機序および非酵素的機序を通じて細胞の運命に影響を与えることができ、微小環境の変化および細胞−間質相互作用の制御がもたらされる。ＣＤ９０発現は、筋線維芽細胞表現型および腫瘍関連線維芽細胞表現型に関連があるとされている。
【０１８１】
複数の個体から得られたｅＰＳ細胞が悪性状態ではないことが示された。ヒト組織から直接単離された、または培地中で増殖したｅＰＳ細胞は、正常な二倍体４６、ＸＸ核型、テロメラーゼの低発現および低活性を示し、最終的に複製老化を開始するが、これによりｅＰＳ細胞は、不死の、ゲノム的に不安定な腫瘍細胞から区別される。さらに、前癌状態の細胞は増殖物を形成せず、一方、転移性細胞は頑健な悪性増殖物を生じるが、ｅＰＳ細胞で見られた分化型誘導体の発現は無い。
【０１８２】
上記の発明は理解を明確にするための説明および例として多少詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の精神または精神から逸脱することなく、それに対して、ある変更および修正がなされ得ることは、本発明の教示に照らし合わせて、当業者には容易に明白である。
【０１８３】
従って、上記は単に本発明の原理を説明するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記載されないまたは示されないが、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲に含まれる、種々の構成を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載される全ての例および条件についての用語は、主に、読者が、本発明の原理および発明者によって与えられた概念を理解して、技術を促進することを補助することを目的としており、そのような具体的に記載された例および条件への限定がないものとして解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態並びにその具体例を記載する本明細書の全ての記述は、その構造的均等物および機能的均等物の両方を包含することが意図されている。
【０１８４】
さらに、そのような均等物は、現在知られている均等物および将来開発される均等物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行するように開発されたあらゆる要素の両方を含むことが意図されている。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載された例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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