(57)【要約】  本発明は、細菌感染症の治療法及び／又は予防法に対するワクチン成分として有用なエンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックスに由来するラムノ多糖抗原に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
→２）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→
（式中、Ｒｈａはラムノースから選択され、任意に少なくとも１つの−ＯＨ基が−ＯＷに置き換えられ、Ｗはアセチル、分岐又は直鎖Ｃ１〜Ｃ１２アルキル及び分岐又は直鎖Ｃ１〜Ｃ１２アルケニルから選択される）の抗原構造を含む、エンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックスに由来するラムノ多糖抗原及びその塩又は溶媒和物。
【請求項２】
Ｒｈａがラムノースである、請求項１に記載のエンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックスに由来するラムノ多糖抗原及びその塩又は溶媒和物。
【請求項３】
１個〜２０個若しくは１個〜１０個若しくは２個〜１０個若しくは２個〜５個の三糖反復単位を含む、請求項１又は２に記載のラムノ多糖抗原。
【請求項４】
少なくとも１つのリンカー基Ｌを更に含み、Ｌは前記抗原の鎖の末端の一方及び／又は糖部分に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原と、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項６】
ワクチンである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのサイトカインを更に含む、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ワクチンが筋肉内経路、皮下経路又は吸入経路による投与用に配合される、請求項６〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
疾患の治療に使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原又は医薬組成物。
【請求項１０】
グラム陽性細菌に起因する疾患又は病態、例えば細菌感染症、腸球菌感染症、尿路感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、並びに髄膜炎又は肺炎の予防的治療又は治療的治療用であり、前記グラム陽性細菌が腸球菌、ブドウ球菌又は連鎖球菌、又はエンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックス１７、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌又は化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、クロストリジウム・ディフィシル、又はそれらの抗生物質耐性株から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原又は医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原を作製する方法であって、該分子を固相材料上で合成することを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、好適な動物を請求項１〜４のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原で免疫化することと、前記動物から前記抗体を単離することとを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の作製された抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ（anti-idiotypic）抗体を作製する方法であって、好適な動物を請求項１２に記載の作製された抗体で免疫化することと、前記動物から前記抗イディオタイプ抗体を単離することとを含む、方法。
【請求項１４】
細菌に起因する疾患又は病態、例えば細菌感染症、腸球菌感染症、尿路感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、並びに髄膜炎又は肺炎の予防的治療又は治療的治療用の薬剤の製造に対する請求項１〜８のいずれか一項に記載のラムノ多糖抗原若しくは医薬組成物又は請求項１２若しくは１３に記載の作製された抗体の使用であって、前記薬剤がワクチンである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染症の治療法及び／又は予防法に対するワクチン成分として有用なエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）クローナルコンプレックス１７に由来するラムノ多糖抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸球菌は、院内感染症に関連する最も重要な病原体の１つである。とりわけエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）は多抗生物質耐性を獲得しており、多剤耐性グラム陽性細菌に対する最終手段の抗生物質であるバンコマイシンに耐性を示すことが多い。さらに、バンコマイシン耐性の決定因子がエンテロコッカス・フェシウムからはるかに毒性の強い黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）へと伝達され得ることが示されている（非特許文献１）。「クローナルコンプレックス」１７等の特定の系統が世界的なバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウムの院内感染発生に関連しており（非特許文献２）、これらの株は院内環境に特によく適応しているようである。
【０００３】
エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）の莢膜多糖類の存在及び組成に関しては幾らかの限られた情報があるが、エンテロコッカス・フェシウムの表面炭水化物については殆ど知られていない。Huebner et al.（非特許文献３）は、一部のエンテロコッカス・フェシウム株が無莢膜型（unencapsulated）のようであり、リポタイコ酸に対して産生される血清によって効果的に死滅することを示すことができた。しかしながら、大半の株は莢膜を有するようであり、腸球菌リポタイコ酸（ＬＴＡ）に対して産生される抗体による死滅に耐性を示す（未発表記録）。
【０００４】
Ristlet al.（非特許文献４）は概して、グラム陽性細菌の細胞表面Ｓ層糖タンパク層について記載している。Ｓ層糖タンパク層は、２Ｄ格子に自己集合し、ナノメートル規模の周期性を有するグリカンの提示マトリックスをもたらすという独自の特徴を有する。典型的には、細菌Ｓ層グリカンはセリン残基、トレオニン残基又はチロシン残基にＯ−グリコシド結合し、対応する真核生物（eukaryotic counterparts）よりもはるかに多様な構成要素、グリコシド結合方式及び構造に依存する。Ristl et al.は、これまでに正確な機能を細菌Ｓ層糖タンパク層グリカンに帰属させることができていないと報告している。非特許文献４は、Ｓ層タンパク質グリコシル化を支配する生合成機構についてのごく最近のデータを示すものとして、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）ＮＲＳ  ２００４／３ａ及びパエニバチルス・アルベイ（P. alvei）ＣＣＭ  ２０５１ＴのＳ層糖タンパク層グリカンについても記載している。記載のゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのＳ層糖タンパク層グリカンは、単一のα２−ラムノース−α３−ラムノース−α３−ラムノース単位を含有する。抗体又は病原性細菌については記載されてない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Changet al. Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containingthe vanA resistance gene. N Engl J Med (2003) vol. 348 (14) pp.1342-7
【非特許文献２】Willemset al. Global spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium fromdistinct nosocomial genetic complex. Emerging Infect Dis (2005)vol. 11 (6) pp. 821-8
【非特許文献３】Huebneret al. Isolation and chemical characterization of a capsular polysaccharideantigen shared by clinical isolates of Enterococcus faecalis andvancomycin-resistant Enterococcus faecium. Infect Immun (1999) vol. 67 (3) pp.1213-9
【非特許文献４】Ristl R, Steiner K, Zarschler K, Zayni S, Messner P, Schaeffer C. The s-layerglycome-adding to the sugar coat of bacteria. Int J Microbiol. 2011;2011. pii:127870. Epub 2010 Aug 10
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多くの場合、ＶＲＥ感染症患者の治療に利用可能な抗生物質は殆どないため、代替的な治療選択肢の開発が非常に重要である。したがって、本発明の一目的は、細菌、特に腸球菌の能動免疫療法又は受動免疫療法に対する新規の有望なワクチンを開発するために、新規の効果的な抗原、特に多糖（ＰＳ）抗原を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の式：
→２）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→
（式中、Ｒｈａはラムノースから選択され、任意に少なくとも１つの−ＯＨ基が−ＯＷに置き換えられ、Ｗはアセチル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル及びＣ１〜Ｃ１２アルケニルから選択される）の抗原構造を含む、エンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックスに由来するラムノ多糖抗原及びその塩又は溶媒和物を提供することによってこれらの必要性を満たす。Ｒｈａはラムノースから選択されるのが好ましい。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのＳ層糖タンパク質グリカンのα２−ラムノース−α３−ラムノース−α３−ラムノース単位が除外されるのが好ましい。
【０００８】
エンテロコッカス・フェシウムにおけるオプソニン抗体の標的を同定するために、本発明者らは、加熱処理し（heat-killed）（６５℃で４５分間）、ウサギに注射した、クローナルコンプレックス１７（ＣＣ１７）に属する臨床分離株（エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５、Leavis et al. Insertion sequence-driven diversification creates a globallydispersed emerging multiresistant subspecies of E. faecium. PLoS Pathog (2007)vol. 3 (1) pp. e7）を使用した。得られた血清を、細菌性病原体に対する防御免疫応答の最良の代用指標（surrogate）であるオプソニン作用アッセイで試験した。得られた血清は同種株に対して２０倍の希釈率で７２％の死滅を示した（図２を参照されたい）。
【０００９】
本発明のラムノ多糖抗原は、少なくとも部分的に腸球菌又は他のグラム陽性細菌に起因する脊椎動物における感染症を効果的に治療及び／又は予防するより効率的な戦略の開発に対する新規の効果的な抗原性標的をもたらし、改善されたワクチン接種戦略を可能にし、複合糖質ワクチン等の各種ワクチンの開発及び作製を可能にする。
【００１０】
エンテロコッカス・フェシウムの多糖の本発明のラムノ多糖抗原は、上記の式による三糖反復単位からなる。このため、１個〜２０個の三糖反復単位、好ましくは１個〜１０個の単位、例えば少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は少なくとも６個、最も好ましくは１個〜３個の単位を含む本発明のラムノ多糖抗原が更に好ましい。２個〜２０個の単位、例えば２個〜５個又は２個〜１０個の単位が更に好ましい。
【００１１】
上記のラムノ多糖抗原は、他の化学物質に連結又は共役するために、好ましくは反復単位（複数の場合もあり）の鎖の末端の一方及び／又は糖部分に結合した少なくとも１つ（が好ましい）のリンカー基Ｌを更に含み得る。これらのリンカー基は現行の技術水準で既知であり、通常は免疫学的に不活性であり、すなわちラムノ多糖抗原の免疫学的特性を妨げない。好ましいリンカーとしては、任意に他の基で置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキルアミノリンカー又はペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。他の修飾としては、キレート基又は酵素基等の検出可能な標識を担持するためのラムノ多糖抗原への化学部分の付加（同様に「Ｌ」に含まれる）が挙げられる。さらに、例えば診断アッセイにおけるラムノ多糖抗原の精製及び／又は使用を可能にするために、ペプチド（例えばＨｉｓ）又は他の「標識」若しくは「タグ」を付加することができる。
【００１２】
上記分子の免疫学的活性はそのラムノ多糖抗原単位の長さとともに増大すると考えられているが、本発明者らはより短い分子であっても免疫応答に極めて効果的であり得ると仮定する。
【００１３】
本発明の別の態様は次に、少なくとも１つの本発明によるラムノ多糖抗原及び／又は少なくとも１つの下記の本発明による抗体を少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は希釈剤とともに含む医薬組成物に関する。
【００１４】
本明細書に記載のラムノ多糖抗原を含む本発明による医薬組成物が特に好ましい。
【００１５】
特に腸球菌、特に抗生物質耐性腸球菌、例えば好ましくはエンテロコッカス・フェカリス又はエンテロコッカス・フェシウム、例えばエンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックス１７のＶＲＥ株に起因する感染症に対するワクチンとして配合される本発明による医薬組成物が更に好ましい。本発明による上記ラムノ多糖抗原が複合糖質ワクチン中に存在する本発明による医薬組成物が最も好ましい。
【００１６】
本発明によるラムノ多糖抗原（抗原単独として又は細菌抽出物若しくは細胞壁画分中に存在する）は、能動免疫化又は受動免疫化用の腸球菌ワクチン、ブドウ球菌ワクチン又は肺炎球菌ワクチンに使用するのが好ましい。
【００１７】
このため、本発明は、少なくとも１つの本発明によるラムノ多糖抗原を任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は希釈剤とともに含む脊椎動物における腸球菌感染症の予防用の医薬組成物、特にワクチンを更に提供する。好ましい担体としては、ＣＲＭ（ＣＲＭ１９７）、カブトガニ（Tachypleus tridentatus）ヘモシアニン（ＴＴＨ）、アメリカカブトガニ（Limulus polyphemus）ヘモシアニン（ＬＰＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＥｘｏＵタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
典型的には、ワクチンは少なくとも１つの腸球菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェシウムの無傷の生細胞又は死細胞を本発明のラムノ多糖抗原とともに更に含み得る。より典型的には、ワクチンは少なくとも１つの腸球菌株に由来する細胞溶解物を含む。腸球菌ラムノ多糖抗原を含有する選択した細菌画分を精製する方法は、当業者に既知である。別の態様は、含まれるラムノ多糖抗原が少なくとも部分的に化学合成によって作製された医薬組成物又はワクチンに関する。
【００１９】
典型的には、脊椎動物は単胃動物、草食動物若しくは反芻動物又はヒト被検体である。更により典型的には、脊椎動物はヒト、非ヒト霊長類、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウサギ、トリ、ネコ及びイヌからなる群から選択される。より典型的には、脊椎動物はヒト、ヒツジ、ラクダ、ブタ、ウシ、ウマ又はイヌからなる群から選択される。
【００２０】
医薬組成物は筋肉内経路、皮下経路、局所経路又は他の非経口経路による投与用に配合することができる。概して、本発明の微生物は天然で片利共生的である。このため、経口投与は概して効果的なワクチン接種経路ではなく、結果として筋肉内経路、皮下経路、局所経路又は他の非経口経路による投与が好ましい。ワクチンは筋肉内経路、皮下経路又は吸入経路による投与用に配合されるのが好ましい。ワクチンは、単独又は組み合わせて使用されるＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン又は腫瘍壊死因子α等のサイトカインも含み得る。
【００２１】
医薬組成物はアジュバントも含み得る。より典型的には、アジュバントはフロイント完全／不完全アジュバント、Ｍｏｎｔｅｎｉｄｅ  Ｍａｃｒｏｌアジュバント、リン酸緩衝生理食塩水及びマンナン油エマルション（Mannan oil emulsions）、サポニン（ＱｕｉＬＡ）、デキストラン（硫酸デキストラン、ＤＥＡＥ−デキストラン）、アルミニウム化合物（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル（acetylglucosaminyl）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｇｅｒｂｕアジュバント）からなる群から選択される。より典型的には、アジュバントはVaccine 1995, vol 13, page 1203、1993 vol 11page 293及び1992 vol 10 page 427（その開示が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の群から選択される。
【００２２】
本発明の更に別の重要な態様は次に、医薬に使用される、並びに特にグラム陽性細菌による細菌感染症等の疾患、例えば細菌感染症、腸球菌感染症、尿路感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、並びに髄膜炎又は肺炎、並びに異物感染症の治療用の本発明によるラムノ多糖抗原、本発明による抗体又は本発明による医薬組成物に関する。上記グラム陽性細菌は好ましくは腸球菌、ブドウ球菌又は連鎖球菌、例えばエンテロコッカス・フェシウム、例えばエンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックス１７、エンテロコッカス・フェカリス、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、肺炎球菌又は化膿連鎖球菌（S.pyogenes）、特にそれらの抗生物質耐性株、例えばＶＲＥ耐性株から選択することができる。
【００２３】
本発明の別の態様は次に、本発明のラムノ多糖抗原を作製する方法であって、該抗原を例えば液相化学及び／又は固相化学を含む化学合成によって合成することを含む、方法に関する。
【００２４】
本発明によるラムノ多糖抗原を作製する方法であって、該分子を固相材料上で合成することを含む、方法が好ましい。本発明の方法はより好ましくは自動固相合成形式である。
【００２５】
本発明の別の態様は、本発明によるラムノ多糖抗原を特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗原断片に関する。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体の両方、組換え抗体又はそれらの断片、例えばＦａｂ等、及びヒト抗体若しくはヒト化抗体を含むものとする。
【００２６】
本発明の別の態様は次に、本発明による抗体を作製する方法であって、哺乳動物、好ましくはウサギを、本発明によるラムノ多糖抗原又は本発明による医薬組成物又は好ましくは本発明によるワクチンで免疫化することと、任意に上記動物から上記抗体を単離することとを含む、方法に関する。各方法は当業者に既知であり、現行の技術水準で開示されている。
【００２７】
本発明の更に別の態様は次に、本発明によるラムノ多糖抗原に特異的な本発明によるモノクローナル抗体を作製する方法であって、該抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマ細胞を生成すること、又は宿主細胞における該抗体の組換え産生を含む、方法に関する。各方法は当業者に既知であり、現行の技術水準で記載されている。
【００２８】
本発明の更に別の態様は次に、上記の本発明による抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を作製する方法に関する。本発明の別の態様は次に、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、組換え抗体又はそれらの断片、例えばＦａｂ等、及びヒト抗体若しくはヒト化抗体でもあり得る、上記抗イディオタイプ抗体に関する。
【００２９】
本発明のまた別の重要な態様は次に、上記ラムノ多糖抗原に特異的な抗体の作製における抗原としての本発明によるラムノ多糖抗原の使用に関する。
【００３０】
本発明の更に別の重要な態様は次に、細菌感染症の治療、又は特に抗生物質耐性腸球菌、例えばＶＲＥ株、例えばエンテロコッカス・フェカリス、更にはブドウ球菌及び連鎖球菌に起因する細菌感染症、特に腸球菌感染症、例えば院内感染症、菌血症、心内膜炎、尿路感染症、手術創感染症、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、髄膜炎、肺炎並びに異物感染症等の疾患若しくは病態の予防的治療若しくは治療的治療用の薬剤の作製に対する本発明によるラムノ多糖抗原、本発明による抗体若しくは抗イディオタイプ抗体又は本発明による医薬組成物の使用に関する。上記薬剤は本明細書に記載のワクチンであるのが好ましい。&#8232;
【００３１】
本発明の更に別の好ましい実施の形態によると、脊椎動物において本発明のラムノ多糖抗原を含む少なくとも１つのグラム陽性細菌株、例えば腸球菌株に対する免疫応答を誘導する方法であって、上記脊椎動物に免疫学的に効果的な量の本発明によるワクチン又は本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００３２】
本発明の更に別の好ましい実施の形態によると、脊椎動物における細菌感染症を治療又は予防する方法であって、上記脊椎動物に治療的に効果的な量の本発明によるラムノ多糖抗原、本発明による抗体又は本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【００３３】
上記細菌感染症、特に腸球菌感染症が特に抗生物質耐性腸球菌、例えばＶＲＥ株、例えばエンテロコッカス・フェカリス、ブドウ球菌又は連鎖球菌に起因する院内感染症、菌血症、心内膜炎、尿路感染症、手術創感染症、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、髄膜炎、肺炎又は異物感染症である、本発明による方法が好ましい。
【００３４】
ここで、本発明を以下の好ましい非限定的な実施例において添付の図面を参照して更に説明する。本発明の目的上、本明細書に引用される全ての参考文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明によるＰＳの反復単位：→２）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→の構造を示す図である。
【図２】全加熱処理細菌に対して産生されたウサギ血清によるエンテロコッカス・フェシウム１５５のオプソニン死滅、及び種々の量の精製Ｅ１５５ラムノ多糖による死滅の阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３６】
エンテロコッカス・フェシウムにおけるオプソニン抗体の標的を同定するために、本発明者らは、加熱処理し（６５℃で４５分間）、ウサギに注射したＣＣ１７に属する臨床分離株（エンテロコッカス・フェシウムＥ１５５、Leavis et al. Insertion sequence-driven diversification creates aglobally dispersed emerging multiresistant subspecies of E. faecium. PLoSPathog (2007) vol. 3 (1) pp. e7）を使用した。得られた血清を、細菌性病原体に対する防御免疫応答の最良の代用指標であるオプソニン作用アッセイで試験した。得られた血清は、同種株に対して２０倍の希釈率で７２％の死滅を示した（図２を参照されたい）。
【００３７】
細菌を、０．５％グルコースを添加したコロンビアブロス（Columbia broth）中、３７℃で２４時間増殖させた。細菌細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞壁をムタノリシン（mutanolysin）及びリゾチーム（各々、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．０５％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ）の添加によって３７℃で２４時間消化した。不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清をヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ  Ｉ及びＲＮａｓｅ  Ａ、１００μｇ／ｍｌ）によって３７℃で６時間処理し、その後プロテイナーゼＫ（１００μｇ／ｍｌ）を５９℃で２４時間添加した。上清を脱イオンＨ２Ｏに対して透析し、凍結乾燥した。サイズ排除クロマトグラフィーのために、物質をＨ２Ｏに再溶解し、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−１００のカラム（１．０×９０ｃｍ）にアプライした。得られた高分子画分を透析し、凍結乾燥し、２０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ８．０）に再懸濁し、陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）にアプライした。結合抗原を１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ８．０）の勾配によってカラムから溶出させ、画分をヘキソース含量についてアッセイした後、プールし、１Ｈ  ＮＭＲ分光分析によって制御した。勾配開始時に溶出した画分を更なる化学分析及びＮＭＲ分析に供した。
【００３８】
得られた多糖の糖分析からＲｈａのみの存在が明らかになった。単糖の絶対配置を（Ｓ，Ｒ）−ブタ−２−イルグリコシド及び（Ｓ）−ブタ−２−イルグリコシドのＧＬＣによって確定した。本実験によりＲｈａ残基のＬ配置が実証された。
【００３９】
ＰＳの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、δ５．１６５（残基Ａ、３ＪＨ１，Ｈ２＜２Ｈｚ）、δ４．９８０（残基Ｂ、３ＪＨ１，Ｈ２＜２Ｈｚ）及びδ４．９０６（残基Ｃ、３ＪＨ１，Ｈ２＜２Ｈｚ）に３つのアノマーシグナル、並びに６−デオキシ糖のメチル基のプロトンに特徴的なシグナル（δ１．２６８、δ１．２６９及びδ１．２３２）を示した。これらのシグナルから、糖分析の結果により特定されるＲｈａの存在が確認された。
【００４０】
ＴＯＣＳＹスペクトルは３つの異なるスピン系を示し、全ての残基に属する全てのプロトンシグナルの特定を可能にした。全てのスピン系におけるプロトン秩序を、ＣＯＳＹスペクトルを用いて割り当てた。全ての１Ｈ化学シフト及び１３Ｃ化学シフト（表１を参照されたい）を１Ｈ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ実験、相関１Ｈ，１Ｈ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ実験（ＣＯＳＹ及びＴＯＣＳＹ）及び相関１Ｈ，１３Ｃ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ実験を用いて確定した。
【００４１】
単糖のアノマー配置を、１Ｈ，１３Ｃ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲ実験によって得られた１ＪＣ−１，Ｈ−１カップリング定数（デカップリングせずに記録した）に基づいて決定した。１ＪＣ−１，Ｈ−１の値は約１７３Ｈｚであり、これにより全ての残基のα−アノマー配置が明らかになった。全ての単糖の６員環が、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのδ約８３〜８８における炭素原子シグナルの欠如によって割り当てられた。
【００４２】
１Ｈ，１３Ｃ  ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルは、δ１００．６９（Ａ）、δ１０２．０６（Ｂ）及びδ１０１．８５（Ｃ）に３つのアノマー炭素シグナルを示した。このスペクトルには残存糖炭素共鳴も含まれていた。炭素原子の低磁場シフトシグナルから、ＡのＣ−２残基（δ７８．０４）、ＢのＣ−３残基（δ７７．７３）及びＣのＣ−３残基（δ７８．０４）での置換が実証された。
【００４３】
ＰＳの三糖反復単位内の糖配列は、以下のアノマープロトンと対応するグリコシド結合プロトンとの間の残基間ＮＯＥ接触を示したＲＯＥＳＹ実験から割り当てられた：Ａ１／Ｂ３（δ５．１６５／３．８５３）、Ｂ１／Ｃ３（δ４．９８０／３．７９２）及びＣ１／Ａ２（δ４．９０６／４．０３７）。
【００４４】
組成分析及びＮＭＲデータから、図１に示されるようなＰＳの反復単位の構造：→２）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→が明らかになった。
【００４５】
表１．エンテロコッカス・フェシウムＥ−１５５から単離したＰＳの１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲデータの化学シフト
【表１】
2014517866.tif 000002
【００４６】
上記のオプソニン血清を種々の濃度のラムノ多糖で吸収させた。死滅の用量依存的な阻害を観察することができ、ラムノＰＳがエンテロコッカス・フェシウムＥ１５５に対するオプソニン抗体の標的であることが示された。
【図１】
2014517866.tif 000003
【図２】
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【国際調査報告】
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