(57)【要約】  本発明は、改善された医薬特性を有する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の新規ポリペプチドおよびタンパク質変異体の同定に関する。また、ＦＧＦ２１関連障害、例えば、代謝状態を処置するための方法を記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１における配列の群から選択される配列を有するポリペプチド変異体。
【請求項２】
１つ以上の以下の修飾：（ａ）最大８個のアミノ酸残基のアミノ末端切断；および（ｂ）最大１２個のアミノ酸残基のカルボキシル末端切断をさらに含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリシアル酸に共有結合している、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
変異体のシステインに共有結合した分岐状４０ｋＤａ  ＰＥＧ基をさらに含む、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
以下：ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメント；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；およびアルブミン結合ポリペプチドの１つからなる異種アミノ酸配列に融合している、請求項１に記載の変異体。
【請求項６】
異種アミノ酸配列が変異体のアミノ末端に融合している、請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
異種アミノ酸配列が変異体のカルボキシ末端に融合している、請求項５に記載の変異体。
【請求項８】
少なくとも１つの請求項１に記載の変異体からなる多量体。
【請求項９】
多量体がホモ二量体である、請求項８に記載の多量体。
【請求項１０】
変異体７６（Ｖ７６）を含む、ポリペプチドまたはタンパク質変異体。
【請求項１１】
位置１５４のシステイン残基でペグ化を有する、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
位置１５４で分岐状４０ｋＤａ  ＰＥＧ基をさらに含む、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
表１における配列からなる群から選択される変異体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
位置１５４のシステイン残基でペグ化を有する変異体７６（Ｖ７６）をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
治療有効量の線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）ポリペプチドまたはタンパク質変異体を患者に投与することを含む該患者を処置するための方法であって、該患者はＦＧＦ２１関連障害の１つ以上を示す、方法。
【請求項１６】
ＦＧＦ２１関連障害が、１つ以上の以下：肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドロームおよび他の代謝障害からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＧＦ２１関連障害が１型糖尿病からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＦＧＦ２１関連障害が２型糖尿病からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
治療有効量の線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）ポリペプチドまたはタンパク質変異体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む該患者を処置するための方法であって、該患者はＦＧＦ２１関連障害の１つ以上を示す、方法。
【請求項２０】
治療有効量の線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）ポリペプチドまたはタンパク質変異体を患者に投与することを含む該患者を処置するための方法であって、該患者はＦＧＦ２１関連障害の１つ以上を示し、該変異体は位置１５４のシステイン残基でペグ化を有する変異体７６（Ｖ７６）をさらに含む、方法。
【請求項２１】
ＦＧＦ２１関連障害が、１つ以上の以下：肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドロームおよび他の代謝障害からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＦＧＦ２１関連障害が１型糖尿病からなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＦＧＦ２１関連障害が２型糖尿病からなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
必要とする患者における高血糖、高インスリン血症、肝臓脂質および体重増加の１つ以上を減少させるための方法であって、治療有効量の線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）ポリペプチドまたはタンパク質変異体を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
変異体が、位置１５４のシステイン残基でペグ化を有する変異体７６（Ｖ７６）をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、改善された医薬特性を有する線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の新規ポリペプチドに関する。また、ＦＧＦ２１関連障害、例えば、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドロームおよび他の代謝障害を処置するための、および重症患者の死亡率および罹患率を減少させることにおける方法も記載する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーは、７つのサブファミリーにグループ分けされる、２２個の遺伝的に異なる同種リガンドにより特徴付けられる。公開文献によると、ＦＧＦファミリーは、現在、少なくとも２３メンバー、ＦＧＦ−１からＦＧＦ−２３からなる（Reussら Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)。
【０００３】
ＦＧＦ−２１は、マウス胚から単離され、ＦＧＦ−１９およびＦＧＦ−２３に非常に近い。このＦＧＦサブファミリーは、古典的ＦＧＦに珍しい種々の生理学的プロセス、すなわちエネルギーおよび胆汁酸ホメオスタシス、グルコースおよび脂質代謝およびリン酸塩ならびにビタミンＤホメオスタシスを制御する。さらに、古典的ＦＧＦとは違って、該サブファミリーは、内分泌腺様式において作用する（Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8）。線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、肝臓において優先的に発現されることを報告されている（Nishimuraら Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206, (2000)；特許公報ＷＯ０１／３６６４０；および特許公報ＷＯ０１／１８１７２）、虚血性血管疾患、創傷治癒、および、肺、気管支または肺胞細胞機能の喪失と関連する疾患、および、多数の他の障害に対する処置として記載されている。
【０００４】
ＦＧＦ２１は、強力な代謝レギュレーターとして同定されている。食餌性または遺伝性肥満および糖尿病を有する齧歯動物およびアカゲザルへのＦＧＦ２１の全身投与は、強い抗高血糖性およびトリグリセリド−低下効果ならびに体重減少を与える。（Coskun,Tら (2008) Endocrinology 149:6018-6027; Kharitonenkov,Aら (2005) Journal of Clinical Incestigation 115:1627-1635; Kharitonenkov,Aら (2007) Endocrinology 148:774-781; Xu, Jら (2009) Diabetes 58:250-259）。ＦＧＦ２１は、２８個のアミノ酸リーダー配列を含む２０９個のアミノ酸ポリペプチドである。ヒトＦＧＦ２１は、マウスＦＧＦ２１と約７９％アミノ酸同一性、およびラットＦＧＦ２１と約８０％アミノ酸同一性を有する。
【０００５】
ＦＧＦ−２１がＦＧＦ受容体および下流シグナル伝達分子、例えば、ＦＲＳ２ａおよびＥＲＫを活性化するが、ＦＧＦＲおよびＦＧＦ−２１の直接的相互作用は検出されていない。さらに、種々の非脂肪細胞は、多数のＦＧＦＲアイソフォームを発現するけれども、ＦＧＦ−２１に応答しない。全てのこれらのデータは、補因子がＦＧＦＲを介してＦＧＦ−２１シグナル伝達を媒介するはずであることを示唆する。最近の試験は、ＦＧＦ−２１に対する細胞性応答の決定因子として、肝臓、脂肪細胞および膵臓において高度に発現されるβ−クロトー(klotho)を同定した（Kurosu, Hら (2007) J Biol Chem 282, 26687-95）。β−クロトーは、ＦＧＦＲ１ｃおよびＦＧＦＲ４に優先的に結合する。ＦＧＦＲ単独ではないβ−クロトー−ＦＧＦＲ複合体は、インビトロでＦＧＦ−２１に結合する（Kharitonenkov, Aら (2008) J Cell Physiol 215, 1-7）。同様のメカニズムは、ＦＧＦ−２３−クロトー−ＦＧＦＲシステムにおいて同定されている（Urakawa, Iら (2006) Nature 444, 770-4）。
【０００６】
ＦＧＦ−２１の生物活性は、最初に、マウス３Ｔ３−Ｌ１  脂肪細胞グルコース摂取アッセイにおいて同定された（Kharitonenkov, Aら (2005) J Clin Invest 115, 1627-35）。次に、ＦＧＦ−２１は、インスリン−依存性グルコース摂取およびＧＬＵＴ１発現を誘導することを示した。ＦＧＦ−２１はまた、種々の糖尿病齧歯動物モデルにおいて高血糖を改善することを示した。加えて、ＦＧＦ−２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、食餌性代謝異常、例えば、体重減少および脂肪塊に対する耐性、ならびにインスリン感受性の増強となることを見出された（Badman, M.Kら (2007) Cell Metab 5, 426-37）。糖尿病非ヒト霊長類へのＦＧＦ−２１の投与は、空腹時血漿グルコース、トリグリセリド、インスリンおよびグルカゴンレベルの減少を引き起こし、リポタンパク質プロフィールにおける有意な改善、例えば、ＨＤＬコレステロールの約８０％の増加をもたらした（Kharitonenkov, Aら (2007) Endocrinology 148, 774-81）。重要なことには、低血糖は、ＮＨＰ試験中にいずれの時点でも観察されなかった。さらに、最近の試験は、ＦＧＦ−２１を、空腹時状態への適応をコントロールすることを手助けする重要な内分泌腺ホルモンとして同定した。これは、ＰＰＡＲαの下流に、以前に失われたリンクを提供しそれにより、肝臓が生物学的エネルギーホメオスタシスの制御において身体の他の部位と連絡する。
【０００７】
ＦＧＦ−２１が脂肪（脂肪分解）、肝臓（脂肪酸酸化およびケトン生成）、および脳（けん怠感）を制御するという組合せた観察は、ＦＧＦ−２１を空腹時の応答の主要な内分泌腺レギュレーターとして確立する（Kharitonenkov, A. & Shanafelt, A.B. (2008) BioDrugs 22, 37-44）。しかしながら、生物学的薬物として直接的にＦＧＦ−２１を使用する問題は、その半減期が非常に短いことである。マウスにおいて、ヒトＦＧＦ２１の半減期は０．５から１時間であり、カニクイザルにおいて、半減期は２から３時間である。
【０００８】
１型および２型糖尿病および他の代謝状態の処置における治療剤として使用するためのＦＧＦ２１タンパク質を開発することにおいて、半減期および安定性における増加が望ましい。増強された半減期および安定性を有するＦＧＦ２１タンパク質は、該タンパク質を投与される患者のより少ない投与頻度を可能にする。明らかに、治療タンパク質ＦＧＦ２１に対する安定な水性タンパク質製剤を開発する必要性が存在する。
【０００９】
ＦＧＦ２１は、多目的の滅菌医薬製剤として利用され得る。しかしながら、防腐剤、すなわち、ｍ−クレゾールが、これらの条件下でその安定性に対する有害な効果を有することが決定されている。本発明は、医薬製剤条件下で野生型ＦＧＦ２１よりも、より安定で、タンパク質分解および酵素分解されにくく、複合体を凝集および形成する可能性が低い、本発明のＦＧＦ２１の変異体にて、物理的不安定の重大な障害を克服する。
【００１０】
したがって、本発明のＦＧＦ２１の変異体は、ＦＧＦ２１関連障害、例えば、肥満、２型糖尿病、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひおよび他の代謝障害の処置のための、ならびに重症患者の死亡率および罹患率を減少させることにおいて有用な安定な薬理学的タンパク質製剤を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明は、改善された医薬特性を有する、例えば、医薬製剤条件下で野生型ＦＧＦ２１よりも、より安定で、タンパク質分解および酵素分解されにくく、複合体を凝集および形成する可能性が低い、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の新規ポリペプチドおよびタンパク質変異体の同定に関する。また、記載されているものは、ＦＧＦ２１関連障害、例えば、代謝状態を処置するための方法である。
【００１２】
本発明のＦＧＦ２１タンパク質変異体は、単独で、または１型および２型糖尿病患者の血糖コントロール、体重および脂質プロフィールを改善する経口抗糖尿病剤と組み合わせて、週に１回で注射可能用として使用され得る。第１の局面において、本発明は、表１に記載されている配列の１つ以上、およびさらに本明細書に記載されている配列を含むが、これらに限定されない、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）のポリペプチドおよびタンパク質変異体を提供する。表１の該ＦＧＦ２１変異体は、種々の部位特異的内部修飾を有する４個のアミノ酸Ｎ−末端切断成熟ＦＧＦ２１野生型タンパク質（すなわち、成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号：３）の４個の残基Ｎ−末端切断バージョン）を含む。表１の変異体は、全長ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列番号  ＮＰ＿０６１９８６．１）と比較して番号付けされている；例えば、変異体１（配列番号：５）の位置１におけるアスパラギン酸残基は、配列番号：１の残基数３３（および成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号：３）の残基数５）に対応する。
【００１３】
表１．野生型ＦＧＦ２１（配列番号：１）と比較したＦＧＦ２１変異体、アミノ酸配列およびアミノ酸変化の表
【表１−１】
2014500880.tif 000002
【表１−２】
2014500880.tif 000003
【００１４】
【表１−３】
2014500880.tif 000004
【表１−４】
2014500880.tif 000005
【００１５】
【表１−５】
2014500880.tif 000006
【表１−６】
2014500880.tif 000007
【表１−７】
2014500880.tif 000008
【００１６】
他の態様は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび該ベクターを有する宿主細胞を記載している。
【００１７】
本明細書において提供されるものは、該ポリペプチドおよびタンパク質変異体を作製するために使用される方法であって、例えば、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の切断および野生型ＦＧＦ２１タンパク質内の興味ある位置でのアミノ酸の部位特異的取り込みを介して、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の修飾を含む方法である。該修飾は、野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して本発明の変異体の生物学的特性を増強し、ならびに、いくつかの場合において、固体支持体の表面へ該変異体を付着させる目的のために、例えば、標識およびタンパク質半減期延長剤に対する、付着点として役割を果たす。本発明の関連態様は、該ポリペプチドおよびタンパク質変異体を、ならびに該変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを生産することができる細胞を生産する方法である。
【００１８】
種々の態様において、本明細書に記載されているポリペプチドおよびタンパク質変異体は、（ａ）哺乳動物において血糖を低下させることができる最大８個のアミノ酸残基のアミノ末端切断（ｂ）哺乳動物において血糖を低下させることができる最大１２個のアミノ酸残基のカルボキシル末端切断；または（ｃ）哺乳動物において血糖を低下させることができる最大８個のアミノ酸残基のアミノ末端切断および最大１２個のアミノ酸残基のカルボキシル末端切断を含むことができる。
【００１９】
いくつかの態様において、本明細書に記載されているポリペプチドおよびタンパク質変異体は、野生型ＦＧＦ２１と比較して作製される部位特異的アミノ酸修飾の位置にて、または一般的に野生型ＦＧＦ２１と共有されるアミノ酸の位置にて、１つ以上のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリシアル酸に共有結合させることができる。他の態様において、本発明のポリペプチドは、異種アミノ酸配列に、所望によりリンカーを介して、例えば、ＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：４）に融合することができる。異種アミノ酸配列は、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメント（例えば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合ポリペプチドであり得る。本明細書に記載されているこのような融合ポリペプチドもまた、多量体を形成することができる。
【００２０】
いくつかの態様において、融合異種アミノ酸配列（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃなど）は、本発明のタンパク質変異体のアミノ末端に融合される。他の態様において、融合異種アミノ酸配列（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃ、など）は、本発明のタンパク質変異体のカルボキシル末端に融合される。
【００２１】
さらに別の態様は、１つ以上のＦＧＦ２１関連障害、例えば、肥満、２型糖尿病、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひおよび他の代謝障害を示す患者を処置する方法であって、治療有効量の１つ以上の本発明のヒトＦＧＦ２１ポリペプチドおよびタンパク質変異体またはそれらの医薬組成物を処置の必要な該患者に投与することを含む、方法を記載している。
【００２２】
本発明はまた、本明細書に記載されているポリペプチドおよびタンパク質変異体および薬学的に許容される製剤を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、代謝障害を処置するための方法、および本発明の医薬組成物を必要とするヒト患者に投与することを含む方法において使用することができる。処置することができる代謝障害の非限定的な例は、１型および２型糖尿病および肥満を含む。
【００２３】
これらのおよび本発明の他の局面は、以下の発明の詳細な説明において解明される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ペグ化野生型ＦＧＦ２１および本発明のＦＧＦ２１変異体で１２日間、ｏｂ／ｏｂマウスを処置後の、肝臓トリグリセリドレベルにおける低下を示すグラフ表示である。肝臓サンプル（＜５０ｍｇ）を、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒ（１つの５−ｍｍビーズを有する）を使用して、１０００：５の比率でイソプロパノール：ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴまたは２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）中でホモジェナイズした。均質化後、サンプルを室温で４５分間穏やかに震盪し、次に、６０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠沈した。上清を回収し、Ｗａｋｏトリグリセリドアッセイキットを使用してトリグリセリド数に対してアッセイした。
【００２５】
【図２】図２は、１２日間処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＦＧＦ２１−ＷＴ−Ｒ１５４Ｃ−ＰＥＧおよびＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧの血漿暴露を示すグラフ表示である。ＦＧＦ２１−ＷＴ−Ｒ１５４Ｃ−ＰＥＧおよびＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧを、１、４、８および１１日目の０時の時点で皮下に与えた。
【００２６】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、野生型ＦＧＦ２１（パネルＡ）およびＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧ（パネルＢ）のｏｂ／ｏｂマウス血漿安定性を示す。ｐＥＲＫ活性（「背景活性」）に対する平均血漿寄与は、野生型ＦＧＦ２１サンプルに対して２８％（１２−４９％の範囲）およびＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧサンプルに対して５８％（４６−７５％の範囲）である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
タンパク質医薬、例えば、ＦＧＦ２１、例えば、本発明のＦＧＦ２１タンパク質変異体の開発における重要な挑戦は、それらの物理化学的不安定性に対処することである。タンパク質の組成変化および特性は、特定の性質、例えば、フォールディング、立体配座安定性およびアンフォールディング／変性を定義する。このような特性は、タンパク質水溶液を利用する医薬製剤条件を開発するとき、タンパク質を安定化する必要がある（Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)）。興味ある治療タンパク質、例えば、本発明のＦＧＦ２１タンパク質変異体を安定化する所望の効果は、タンパク質分解および酵素分解に対する耐性を増加させ、それにより、タンパク質安定性を改善し、タンパク質凝集を減少させる。
【００２８】
具体的には、医薬タンパク質開発において、抗−微生物保存剤、例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、レゾルシノールおよびベンジルアルコールが、滅菌多目的製剤を意図している非経口医薬製剤において必要である。残念ながら、これらの化合物は、しばしば、タンパク質産物の安定性に悪影響を及ぼし、会合および凝集を引き起こす、特に（Maaら Int. J. of Pharmaceutics 140:155-168 (1996); Lamら Pharm. Res. 14(6):725-729 (1997)）。
【００２９】
本発明のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびタンパク質変異体は、当分野で知られている全長野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの修飾バージョンを示す。例えば、ＦＧＦ２１野生型配列とタンパク質変異体との間の比較が必要であるとき、ＦＧＦ２１野生型配列は、参照配列（配列番号：１）となる。ＦＧＦ２１野生型配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１を有し、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＵＳ６，７１６，６２６Ｂ１のような発行済み特許において見いだすことができる。
【表２】
2014500880.tif 000009
【００３０】
全長ＦＧＦ２１ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）をコードする対応するｃＤＮＡ配列は以下（配列番号：２）に示される。
【表３】
2014500880.tif 000010
【００３１】
成熟ＦＧＦ２１配列は、リーダー配列を欠いており、また、当業者により理解されるポリペプチドの他の修飾、例えば、アミノ末端（リーダー配列を有する、または該配列を有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解プロセッシング、より大きな前駆体からより小さいポリペプチドの開裂、Ｎ−連結および／またはＯ−連結グリコシル化および他の翻訳後修飾を含み得る。成熟ＦＧＦ２１配列の典型的な例は、以下の配列（全長ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸位置２９−２０９を示す配列番号：３）を有する：
【表４】
2014500880.tif 000011
【００３２】
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（配列番号：３）をコードする対応するｃＤＮＡ配列は、以下（配列番号：４７）に示される：
【表５】
2014500880.tif 000012
【００３３】
タンパク質の発現の分野の当業者は、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が、大腸菌における発現のために、ＦＧＦ２１タンパク質変異体のいずれかのＮ−末端に導入することができることを認識しており、本発明の文脈内に考慮される。
【００３４】
「ＦＧＦ２１タンパク質変異体」。「ヒトＦＧＦ２１変異体」、「ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはタンパク質変異体」、「変異体」、「ＦＧＦ２１突然変異体」などの用語は、天然（すなわち、野生型）ＦＧＦ２１アミノ酸配列が修飾されている、例えば、野生型タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、および／または除去されているヒトＦＧＦ２１を含むように定義される。さらに、変異体は、野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較してＮ−および／またはＣ−末端切断を含み得る。一般的に言えば、変異体は、野生型タンパク質のいくつかの修飾された特性、構造または機能を有する。例えば、変異体は、濃縮液中の増強または改善された物理的安定性（例えば、低い疎水性媒介凝集）、血漿とインキュベートしたとき増強または改善された血漿安定性、または好ましい生物活性プロフィールを維持して増強または改善された生物活性を有し得る。
【００３５】
本発明のＦＧＦ２１ポリペプチドおよびタンパク質変異体と野生型ＦＧＦ２１との間の違いを構成する許容されるアミノ酸置換および修飾は、１つ以上のアミノ酸置換、例えば、非天然アミノ酸アナログとの置換、および切断を含むが、これらに限定されない。したがって、ＦＧＦ２１タンパク質変異体は、本明細書に記載されている部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体、切断ＦＧＦ２１ポリペプチド、タンパク質分解−耐性ＦＧＦ２１突然変異体、凝集減少ＦＧＦ２１突然変異体、ＦＧＦ２１組合せ突然変異およびＦＧＦ２１融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
変異体は、医薬防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との増加した互換性を有し得、したがって、保存中にタンパク質の生理化学特性および生物学的活性を維持する保存された医薬製剤の調製を可能にする。したがって、野生型ＦＧＦ２１と比較して増強された医薬安定性を有する変異体は、生理学的および保存された医薬製剤条件下で濃縮液中の改善された物理的安定性を有し、生物学的効力を維持している。非限定的な例のために、本発明の変異体は、それらの野生型対応物よりも、タンパク質分解および酵素分解に対してさらに耐性であり得；改善された安定性を有し得；凝集する可能性が低いかもしれない。本明細書において使用される、これらの用語は、相互排他的または限定的ではなく、全体に、挙げられた変異体が野生型タンパク質の１つ以上の修飾された特性を有することを可能にする。
【００３７】
本発明はまた、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはタンパク質変異体、または、ＦＧＦ２１タンパク質変異体に対する望ましい特性、例えば、タンパク質分解−耐性、増加した半減期または凝集−減少特性およびそれらの組合せを与える特定の残基がさらに修飾されていない、配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％（代替的に９６％、代替的に９７％、代替的に９８％、代替的に９９％）同一であるアミノ酸配列を含む変異体をコードする核酸分子を含む。言い換えれば、タンパク質分解−耐性、凝集−減少または他の特性を与えるために修飾されているＦＧＦ２１突然変異体配列における残基を除いて、ＦＧＦ２１突然変異体配列における全ての他のアミノ酸残基の約５％（代替的に４％、代替的に３％、代替的に２％、代替的に１％）を修飾させることができる。このようなＦＧＦ２１突然変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。
【００３８】
本発明はまた、コードされたＦＧＦ２１タンパク質変異体のタンパク質分解−耐性、凝集−減少または他の特性を与えるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドがさらに修飾されていない、配列番号：４７のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％（代替的に９６％、代替的に９７％、代替的に９８％、代替的に９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。言い換えれば、タンパク質分解−耐性、凝集−減少または他の特性を与えるために修飾されているＦＧＦ２１突然変異体配列における残基をコードするヌクレオチドを除いて、ＦＧＦ２１突然変異体配列における全ての他のヌクレオチドの約５％（代替的に４％、代替的に３％、代替的に２％、代替的に１％）を修飾させることができる。このようなＦＧＦ２１突然変異体ポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。
【００３９】
本明細書において提供されるものは、ＦＧＦ２１ポリペプチドおよび本発明のタンパク質変異体を作製するために使用される方法であって、野生型ＦＧＦ２１タンパク質、例えば、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の切断および野生型ＦＧＦ２１タンパク質の興味ある位置でのアミノ酸の部位特異的取り込みを介して、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の部位特異的修飾を含む方法である。該修飾は、野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して本発明の変異体の生物学的特性を増強し、ならびに、いくつかの場合において、固体支持体の表面へ該変異体を付着させる目的のために、例えば、標識およびタンパク質半減期延長剤に対する、付着点として役割を果たす。本発明の関連態様は、該ポリペプチドおよびタンパク質変異体を、ならびに該変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを生産することができる細胞を生産する方法である。
【００４０】
１つの態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドにポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を結合させるために使用される。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドにＰＥＧ−コレステロール抱合体（ミセルおよびリポソームを含む）を結合させるために使用される。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに糖（グリコシル化）を結合させるために使用される。
【００４１】
他の態様において、このような部位特異的修飾は、ＦＧＦ２１野生型および／または変異体多量体、例えば、二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）または三量体の生産のための結合手段として使用される。これらの多量体ＦＧＦ２１分子は、さらに、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、他のタンパク質、例えば、Ｆｃ、ＨＳＡなどに結合または融合された基、例えば、ＰＥＧ、糖、および／またはＰＥＧ−コレステロール抱合体を有し得る。
【００４２】
他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを生産するために使用され、部位特異的に組み込まれたピロリジンまたはピロリジン類似体の位置が、制御配向および固体支持体の表面上へのこのようなタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの結合を可能にするか、または結合される基、例えば、ＰＥＧ、糖および／またはＰＥＧ−コレステロール抱合体を有することを可能にする。
【００４３】
他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを部位特異的に架橋するために使用され、それにより、ヘテロ二量体およびヘテロ三量体を含むが、これらに限定されないヘテロ−オリゴマーを形成する。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを部位特異的に架橋するために使用され、それにより、タンパク質−タンパク質抱合体、タンパク質−ポリペプチド抱合体、タンパク質−ペプチド抱合体、ポリペプチド−ポリペプチド抱合体、ポリペプチド−ペプチド抱合体またはペプチド−ペプチド抱合体を形成する。
【００４４】
定義
種々の定義が、本明細書を通して使用される。多数の用語は、当業者がそれらの用語に帰属すると考える意味を有する。下記で、または本明細書の他の場所で具体的に定義された用語は、全体として、本発明の文脈で提供される意味を有し、一般的には、当業者により理解されるものである。
【００４５】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１」なる用語は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーメンバーを示す。ＦＧＦ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸配列は配列番号：１として記載されており、これと対応するポリヌクレオチド配列は配列番号：２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）として記載されている。
【００４６】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１受容体」なる用語は、ＦＧＦ２１に対する受容体を示す（Kharitonenkov,Aら (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,Hら (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Yら (2007) PNAS 104:7432-7437）。
【００４７】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」なる用語は、ヒトにおいて発現される天然ポリペプチドを示す。この記載の目的のために、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」なる用語は、あらゆる全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば、２０９アミノ酸残基からなり、配列番号：２のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号：１；全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端で２８アミノ酸残基（すなわち、これはシグナルペプチドを構成する）が除去されている１８１アミノ酸残基からなるあらゆる該ポリペプチドの成熟形態、およびそれらの変異体を互換的に示すために使用することができる。
【００４８】
「単離された核酸分子」なる用語は、（１）全核酸が供給源細胞から単離されるとき、天然に見出される少なくとも約５０パーセントのタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質から分離されている、（２）「単離された核酸分子」が天然に連結されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部に連結されていない、（３）天然に連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に起こらない本発明の核酸分子を示す。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチド生産における使用または治療、診断、予防または研究の使用を妨げるでろう、天然環境において見られるあらゆる他の汚染核酸分子または他の汚染を実質的に含まない。
【００４９】
「ベクター」なる用語は、コード情報を宿主細胞に伝達するために使用されるあらゆる分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を示すために使用される。
【００５０】
「発現ベクター」なる用語は、宿主細胞の形質転換のために適当であり、挿入された異種核酸配列の発現を指向および／またはコントロールする核酸配列を含むベクターを示す。発現は、プロッセシング、例えば、転写、翻訳およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在するとき）を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
「作動可能に連結した」なる用語は、フランキング配列が通常の機能を行うように構成されるか、または集合される、フランキング配列の配置を示すために本明細書において使用される。したがって、コード配列に作動可能に連結したフランキング配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を指向することができるとき、プロモーターに作動可能に連結している。正確に機能する限り、フランキング配列はコード配列と隣接する必要はない。したがって、例えば、介在するまだ翻訳されていない転写配列が、プロモーター配列とコード配列間に存在することができ、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結している」と考えることができる。
【００５２】
「宿主細胞」なる用語は、形質転換されているか、または核酸配列で形質転換され、次に、選択された興味ある遺伝子を発現することができる細胞を示すために使用される。該用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が元の親と構成される形態または遺伝子において同一であるがなかろうと、親細胞の子孫に含む。
【００５３】
本明細書において使用される「アミノ酸」なる用語は、それらの構造がこのような立体異性体形態を可能にするときＤおよびＬ立体異性体における全てにおいて、天然アミノ酸と同様の様式において機能する、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体およびアミノ酸模擬物を示す。アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される、それらの名前、それらの一般的に知られる３文字記号または１文字記号のいずれかにより示す。
【００５４】
生物学的物質、例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などに関連して使用されるときの「天然」なる用語は、天然において見出され、ヒトにより操作されていない物質を示す。同様に、本明細書において使用される「非天然」は、天然において見出されないか、またはヒトにより構造的に修飾または合成されている物質を示す。ヌクレオチドに関連して使用されるとき「天然」なる用語は、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を示す。アミノ酸に関連して使用されるとき「天然」なる用語は、２０の慣用のアミノ酸（すなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ））、ならびにセレノシステイン、ピロリジン（ＰＹＬ）およびピロリン−カルボキシ−リジン（ＰＣＬ）を示す。
【００５５】
ピロリジン（ＰＹＬ）は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａファミリーのメタン生成古細菌のメチルアミンメチルトランスフェラーゼ内に天然に見出されるアミノ酸である。ピロリジンは、それぞれのｍＲＮＡにおいてインフレームのＵＡＧコドンで共翻訳的に組み込まれるリジン類似体であり、２２番目の天然アミノ酸と考えられる。
【００５６】
ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１０／４８５８２（出願人ＩＲＭ、ＬＬＣ）において少なくとも記載されているとおり、大腸菌においてピロリジン（ＰＹＬ）を生物合成する試みは、ピロリン−カルボキシ−リジンまたはＰＣＬとして本明細書において称される「脱メチル化ピロリジン」の形成をもたらした。本明細書において使用される「ＰＣＬ」は、ＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂのいずれかを示す。
【００５７】
本明細書において使用される「非天然アミノ酸」および「非天然アミノ酸」なる用語は、互換的に、同じか、または異なっている任意生物体からの修飾されていない、または修飾された遺伝子を使用して、任意の生物体において生合成的に産生することができないアミノ酸構造を示すことが意図される。該用語は、天然（野生型）ＦＧＦ２１タンパク質配列または本発明のＦＧＦ２１変異体の配列に存在しないアミノ酸残基を示す。これらは、限定はしないが、２０天然アミノ酸の１つではない修飾されたアミノ酸および／またはアミノ酸類似体、セレノシステイン、ピロリジン（ＰＹＬ）またはピロリン−カルボキシ−リジン（ＰＣＬ）を含むが、これらに限定されない。このような非天然アミノ酸残基は、天然アミノ酸の置換、および／または天然（野生型）ＦＧＦ２１タンパク質配列または本発明のＦＧＦ２１変異体の配列への非天然アミノ酸の挿入により導入することができる。非天然アミノ酸残基はまた、所望の機能性をＦＧＦ２１分子に与えるように組み込むことができる、例えば、機能性部分に連結する能力（例えば、ＰＥＧ）。
【００５８】
加えて、このような「非天然アミノ酸」は、タンパク質への取り込みのために、修飾されたｔＲＮＡおよび修飾されたｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を必要とすることが理解される。これらの「選択された」直交ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、Ｓｃｈｕｌｔｚらにより開発された選択プロセスまたはランダムもしくは標的化突然変異により作製される。一例として、ピロリン−カルボキシ−リジンは、ある生物体から宿主細胞に移動させられた遺伝子により生合成的により産生されるため、および天然ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を使用することによりタンパク質に組み込まれるため、「天然アミノ酸」であるが、ｐ−アミノフェニルアラニン（Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9参照）は、生合成的に産生されるが、「選択された」直交ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼペアによりタンパク質に組み込まれるため、「非天然アミノ酸」である。
【００５９】
修飾されたコードアミノ酸は、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン(naphthalanine)、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンを含むが、これらに限定されない。「アミノ酸」なる用語はまた、特定の生物体における代謝産物であるが、タンパク質への取り込みのために遺伝子コードによってコードされない天然アミノ酸を含む。このようなアミノ酸は、オルニチン、Ｄ−オルニチンおよびＤ−アルギニンを含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書において使用される「アミノ酸類似体」なる用語は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、一例のみとして、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されるα−炭素を有する化合物を示す。アミノ酸類似体は、可逆的にまたは不可逆的に、化学的にブロックされている天然および非天然アミノ酸、または化学的に修飾されているそれらのＣ−末端カルボキシ基、それらのＮ−末端アミノ基および／またはそれらの側鎖官能基を含む。このような類似体は、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホン、アスパラギン酸−（ベータ−メチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシンおよびメチオニンメチルスルホニウムを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書において使用される「アミノ酸模擬物」なる用語は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なるが天然アミノ酸と同様の様式において機能する構造を有する化合物を示す。
【００６２】
「生物学的に活性なＦＧＦ２１変異体」なる用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に導入されている修飾の型または数にかかわらず、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールを低くする；体重を減少する；および、グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を有する本明細書に記載されているあらゆるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を示す。野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較して若干減少したレベルのＦＧＦ２１活性を有するＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、それでもなお、生物学的に活性なＦＧＦ２１ポリペプチド変異体と考えることができる。
【００６３】
「有効量」および「治療有効量」なる用語はそれぞれ、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低くする；肝臓トリグリセリドもしくは脂質レベルを減少する；体重を減少する；または、グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力の観察できるレベルをサポートするために使用されるＦＧＦ２１タンパク質変異体の量を示す。例えば、ＦＧＦ２１関連障害（例えば、１型もしくは２型糖尿病、肥満またはメタボリック・シンドローム）を示す、該障害に罹患している、または該障害に罹患しやすい患者に投与される「治療有効量」は、上記障害と関連するか、または該障害で死ぬ病理学的症状、疾患進行、生理学的状態における改善を誘導する、改善する、さもなければ引き起こす量である。本発明の目的のために、「対象」または「患者」は、好ましくはヒトであるが、動物、さらに具体的には、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００６４】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」なる用語は、ＦＧＦ２１タンパク質変異体の送達を成し遂げるか、または増強するために適当な１つ以上の製剤物質を示す。
【００６５】
「抗原」なる用語は、抗体により結合することができ、さらに抗原のエピトープに結合することができる抗体を生産するように動物において使用することができる分子または分子の一部を示す。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００６６】
「天然Ｆｃ」なる用語は、単量体または多量体形態のいずれでも、全抗体の消化から得られる、または他の手段により生産される非抗原結合フラグメントの配列を含み、ヒンジ領域を含むことができる分子または配列を示す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源であり、任意の免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ分子は、共有（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合により二量体または多量体形態に連結することができる単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１およびＩｇＧＡ２）に依存して１から４の範囲である。天然Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合二量体である（Ellisonら 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9参照）。本明細書において使用される「天然Ｆｃ」なる用語は、単量体、二量体および多量体形態の総称である。「Ｆｃ変異体」なる用語は、天然Ｆｃから修飾されるが、サルベージ(salvage)受容体、ＦｃＲｎ（新生児のＦｃ受容体）に対する結合部位をまだ含む分子または配列を示す。国際公開ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８は、典型的なＦｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載しており、出典明示により包含させる。したがって、「Ｆｃ変異体」なる用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含むことができる。さらに、天然Ｆｃは、本発明のＦＧＦ２１突然変異体の融合分子に対して必要ではない構造的特徴または生物学的活性を提供するため、除去することができる領域を含む。したがって、「Ｆｃ変異体」なる用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ−末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響するか、またはこれらと関与する、１つ以上の天然Ｆｃ部位または残基を欠いているか、または、１つ以上のＦｃ部位または残基が修飾されている、分子または配列を含む。Ｆｃ変異体は、以下にさらに詳細に記載されている。
【００６７】
「Ｆｃドメイン」なる用語は、上記定義のとおりの天然ＦｃおよびＦｃ変異体および配列を含む。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」なる用語は、全抗体から消化されるか、または他の手段により生産される単量体または多量体形態における分子を含む。本発明のいくつかの態様において、Ｆｃドメインは、例えば、ＦｃドメインとＦＧＦ２１配列間の共有結合を介して、ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１突然変異体（ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１突然変異体の切断形態を含む）に融合することができる。このような融合タンパク質は、Ｆｃドメインの結合を介して多量体を形成することができ、これらの融合タンパク質およびこれらの多量体の両方が本発明の局面である。
【００６８】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」なる用語は、カップリングまたは活性化部分に対してカップリング剤または誘導体化の有無にかかわらず、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を示す。
【００６９】
「ＦＧＦ２１関連障害」なる用語および本明細書において同様に使用される用語は、肥満、１型および２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひおよび他の代謝障害を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
「２型糖尿病」は、インスリンの利用可能性にかかわらず過剰なグルコース生産により特徴付けられる状態であり、循環グルコースレベルが、不十分なグルコースクリアランスの結果として、過剰に高く維持される。
【００７１】
「１型糖尿病」は、インスリンの完全な欠乏により引き起こされる高い血糖レベルにより特徴付けられる状態である。これは、身体の免疫系が膵臓におけるインスリンを生産するベータ細胞を攻撃し、それらを破壊するときに起こる。その結果、膵臓は、ほとんどあるいは全くインスリンを生産しない。
【００７２】
「膵炎」は膵臓の炎症である。
【００７３】
「脂質異常症」は、リポタンパク質過剰生産または欠乏を含むリポタンパク質代謝の障害である。脂質異常症は、血液中の、総コレステロール、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の減少により明らかにされ得る。
【００７４】
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」は、アルコール消費と関連せず、小葉内炎症および線維症を伴う肝細胞の脂肪変化により特徴付けられる肝臓疾患である。
【００７５】
「耐糖能障害」または耐糖能異常（ＩＧＴ）は、心臓血管病理学の危険性の増加と関連する血糖異常症の前糖尿病状態である。前糖尿病状態は、対象の、グルコースの細胞への効率的な移動およびそれを効率的な燃料源としての利用を防ぎ、血液中のグルコースレベルの上昇およびある程度のインスリン耐性を引き起こす。
【００７６】
「高血糖」は、血中の糖（グルコース）の過剰として定義される。
【００７７】
低い血糖とも称される「低血糖」は、血糖レベルが、身体の活性のために十分なエネルギーを提供するためにはあまりにも低く低下したときに起こる。
【００７８】
「高インスリン血症」は、正常レベルよりも高い血液中のインスリンとして定義される。
【００７９】
「インスリン耐性」は、正常量のインスリンが、正常以下の生物学的応答を生じる状態として定義される。
【００８０】
「肥満」は、ヒト対象に関して、体重が２０パーセント、所定の集団に対する標準体重を超えるとして定義され得る（R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916）。
【００８１】
「メタボリック・シンドローム」は、少なくとも３つの以下の兆候のクラスターとして定義することができる：腹部脂肪−−ほとんどの男性において、４０インチ以上のウエスト；空腹後、高い血糖−−少なくとも１１０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）；血流中の高いトリグリセリド−−少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低いＨＤＬ−−４０ｍｇ／ｄｌ未満；および、１３０／８５ｍｍＨｇまたはそれ以上の血圧。
【００８２】
「高血圧」または「高い血圧」、すなわち、心臓血管損傷または他の悪影響を誘導する可能性のあるレベルへの全身動脈血圧の一時的または持続的上昇。高血圧は、１４０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧または９０ｍｍＨｇを超える拡張期血圧として独断的に定義されている。
【００８３】
「心臓血管疾患」は、心臓または血管に関連する疾患である。
【００８４】
「末梢動脈疾患」は、プラークが頭、臓器および手足へ血液を運ぶ動脈においてを構築するときに起こる。時間とともに、プラークは、動脈を硬化し狭め、臓器および身体の他の部分への酸素を豊富に含む血液の流量を制限し得る
【００８５】
「アテローム性動脈硬化症」は、大および中動脈の内膜における不規則に分散された脂質沈着により特徴付けられる血管疾患であり、動脈内腔の狭窄を引き起こし、結局は線維症および石灰化が始まる。病変は、通常病巣であり、ゆっくり、断続的に進行する。血流の制限は、病変の分布および重症度によって異なる多くの臨床症状の原因となる。
【００８６】
「卒中」は、２４時間以上続く脳循環の損傷に関連するあらゆる急性臨床事象である。卒中は、循環が危険にさらされている脳組織の位置および程度に依存して、不可逆性脳損傷、症状の型および重症度に関連する。
【００８７】
鬱血性心不全とも称される「心不全」は、心臓がもはや身体の他の部分へ血液を十分に供給することができない状態である。
【００８８】
冠動脈疾患とも称される「冠動脈性心臓疾患」は、心臓へ血液および酸素を供給する少量の血管の狭窄である。
【００８９】
「腎臓疾患」またはネフロパシーは、腎臓のあらゆる疾患である。糖尿病性腎症は、１型または２型糖尿病を有する人々における罹患率および死亡率の主な原因である。
【００９０】
「糖尿病性合併症」は、高い血糖レベルにより引き起こされる他の身体機能での問題、例えば、腎臓、神経（ニューロパシー）、足（足部潰瘍および循環不良）および眼（例えば網膜症）である。糖尿病はまた、心臓疾患および骨関節障害に対する危険性を増加させる。糖尿病の他の長期合併症は、皮膚問題、消化問題、性機能障害および歯と歯茎との問題を含む。
【００９１】
「ニューロパシー」は、脳神経または末梢もしくは自律神経系と関連するあらゆる疾患である。
【００９２】
「胃不全まひ」は、腸の排出遅延をもたらす胃蠕動の低下である。
【００９３】
本発明によって包含される重症患者は、一般的に、不安定な代謝亢進状態を経験する。該不安定な代謝状態は、いくつかの栄養素における相対的な欠乏を引き起こし得る基質代謝における変化による。一般的に、脂肪および筋肉の両方の酸化の増加が存在する。
【００９４】
さらに、重症患者は、好ましくは、全身性炎症反応症候群または呼吸困難を経験する患者である。罹患率における減少は、重症患者がさらなる病気、状態または症状を発症する可能性を減少すること、または、さらなる病気、状態または症状の重症度を減少することを意味する。例えば、罹患率を減少することは、菌血症もしくは敗血症または多臓器不全と関連する合併症の発症の減少に対応し得る。
【００９５】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他の意味を示さない限り、複数の表示を含む。したがって、例えば、「抗体」に対する表示は、２つ以上のこのような抗体の混合物を含む。
【００９６】
本明細書において使用される「約」なる用語は、値の＋／−２０％、＋／−１０％または＋／−５％を示す。
【００９７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、互換的に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができるあらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態を示す。該用語は、融合タンパク質を含み、Ｎ−末端メチオニン残基を有していろうとなかろうと、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種および同種リーダー配列との融合；免疫学的タグ化タンパク質などを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」なる用語は、互換的に使用され、診断、処置または治療が望まれるあらゆる対象、特にヒトを示す。他の対象は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含み得る。いくつかの好ましい態様において、対象はヒトである。
【００９９】
本明細書において使用される「サンプル」なる用語は、患者由来の生物学的材料を示す。本発明によりアッセイされるサンプルは、何ら特定の型に限定されない。サンプルは、限定的な例として、単一の細胞、複数の細胞、組織、腫瘍、生物学的液体、生物学的分子もしくは上清または前記のいずれかの抽出物を含む。例えば、生検のために取り出される組織、切除中に取り出される組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘液および糞便サンプルを含む。使用されるサンプルは、アッセイフォーマット、検出方法ならびにアッセイされる腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質に基づいて変化する。サンプルを調製するための方法は、当分野でよく知られており、容易に適合させ、利用される方法に適合するサンプルを得ることができる。
【０１００】
本明細書において使用される「生物学的分子」なる用語は、ポリペプチド、核酸および糖類を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
本明細書において使用される「調節」なる用語は、遺伝子、タンパク質または細胞の内部、外部または表面に存在するあらゆる分子の質または量における変化を示す。該変化は、該分子の発現またはレベルにおける増加または減少であり得る。「調節する」なる用語はまた、限定はしないが、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する；肝臓脂質もしくは肝臓トリグリセリドレベルを減少する；体重を減少する；および、グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力を含む生物学的機能／活性の質または量の変化を含む。
【０１０２】
本明細書において使用される「モジュレーター」なる用語は、ＦＧＦ２１関連障害、例えば、１型もしくは２型糖尿病または代謝状態様肥満と関連する１つ以上の生理学的または生化学的事象を調節する組成物を示す。該事象は、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する；肝臓脂質もしくは肝臓トリグリセリドレベルを減少する；体重を減少する；および、グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
「遺伝子産物」は、遺伝子により発現または生産されるバイオポリマー産物である。遺伝子産物は、例えば、つなぎ合わされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス変異体ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライス変異体ポリペプチドなどであり得る。また、該用語により含まれるものは、鋳型（すなわちＲＮＡのｃＤＮＡ）としてＲＮＡ遺伝子産物を使用して作製されるバイオポリマー産物である。遺伝子産物は、酵素的に、組換え的に、化学的に、または遺伝子が生来の細胞内で作製され得る。いくつかの態様において、遺伝子産物がタンパク性であるとき、それは生物学的活性を示す。いくつかの態様において、遺伝子産物が核酸であるとき、それは生物学的活性を示すタンパク性遺伝子産物に翻訳され得る。
【０１０４】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１活性の調節」は、例えば、ＦＧＦ２１ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの薬剤の相互作用、ＦＧＦ２１転写および／または翻訳の阻害（例えば、ＦＧＦ２１遺伝子またはＦＧＦ２１転写産物とのアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ相互作用を介して、ＦＧＦ２１発現を促進する転写因子の調節を介して）などの結果であり得るＦＧＦ２１活性における増加または減少を示す。例えば、生物学的活性の調節は、生物学的活性における増加または減少を示す。ＦＧＦ２１活性は、限定はしないが、対象において血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベルをアッセイすること、ＦＧＦ２１ポリペプチドレベルを評価すること、ＦＧＦ２１転写レベルを評価することを含む方法により評価することができる。ＦＧＦ２１活性の比較はまた、例えば、ＦＧＦ２１下流バイオマーカーのレベルを測定すること、およびＦＧＦ２１シグナル伝達における増加を評価することにより成し遂げることができる。ＦＧＦ２１活性はまた、細胞シグナル伝達；キナーゼ活性；脂肪細胞へのグルコース摂取；血液インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベル変動；肝臓脂質または肝臓トリグリセリドレベル変化；ＦＧＦ２１とＦＧＦ２１受容体間の相互作用；またはＦＧＦ２１受容体のリン酸化を測定することにより評価することができる。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１受容体のリン酸化はチロシンリン酸化であり得る。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１活性の調節は、ＦＧＦ２１−関連表現型の調節を引き起こすことができる。
【０１０５】
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１下流バイオマーカー」は、遺伝子もしくは遺伝子産物または遺伝子もしくは遺伝子産物の測定可能な徴候である。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１の下流マーカーである遺伝子または活性は、血管組織において発現の改変されたレベルを示す。いくつかの態様において、下流マーカーの活性は、ＦＧＦ２１モジュレーターの存在下で改変される。いくつかの態様において、下流マーカーは、ＦＧＦ２１が本発明のＦＧＦ２１モジュレーターでかき乱されるとき、発現の改変されたレベルを示す。ＦＧＦ２１下流マーカーは、グルコースまたは２−デオキシ−グルコース摂取、ｐＥＲＫおよび他のリン酸化またはアセチル化タンパク質またはＮＡＤレベルを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
本明細書において使用される「上方調節する」なる用語は、活性または量の増加、活性化または刺激を示す。例えば、本発明の文脈において、ＦＧＦ２１モジュレーターは、ＦＧＦ２１受容体の活性を増加させ得る。１つの態様において、ＦＧＦＲ−１ｃまたはＦＧＦＲ−４の１つまたは両方が、ＦＧＦ２１モジュレーターに応答して上方調節され得る。上方調節はまた、ＦＧＦ２１−関連活性、例えば、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する；肝臓脂質もしくはトリグリセリドレベルを減少する；体重を減少する；グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する；またはＦＧＦ２１受容体のリン酸化を引き起こす；またはＦＧＦ２１下流マーカーを増加する能力を示すことができる。ＦＧＦＲ２１受容体は、ＦＧＦＲ−１ｃまたはＦＧＦＲ−４の１つまたは両方であり得る。上方制御は、コントロールと比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも４００％または少なくとも５００％であり得る。
【０１０７】
本明細書において使用される「Ｎ−末端」なる用語は、タンパク質の少なくとも最初の１０個のアミノ酸を示す。
【０１０８】
本明細書において使用される「Ｎ−末端ドメイン」および「Ｎ−末端領域」なる用語は、互換的に使用され、タンパク質の第１のアミノ酸で始まり、タンパク質のＮ−末端半分における任意のアミノ酸で終わるタンパク質のフラグメントを示す。例えば、ＦＧＦ２１のＮ−末端ドメインは、配列番号：１のアミノ酸１から配列番号：１のほぼアミノ酸１０から１０５の間の任意のアミノ酸までである。
【０１０９】
本明細書において使用される「Ｃ−末端」なる用語は、タンパク質の少なくとも最後の１０個のアミノ酸を示す。
【０１１０】
本明細書において使用される「Ｃ−末端ドメイン」および「Ｃ−末端領域」なる用語は、互換的に使用され、タンパク質のＣ末端半分における任意のアミノ酸で始まり、タンパク質の最後のアミノ酸で終わるタンパク質のフラグメントを示す。例えば、ＦＧＦ２１のＣ末端ドメインは、配列番号：１のアミノ酸１０５から約アミノ酸２００の間から任意のアミノ酸で始まり、配列番号：１のアミノ酸２０９で終わる。
【０１１１】
本明細書において使用される「ドメイン」なる用語は、生体分子の知られているまたは疑われる機能に寄与する該生体分子の構造部を示す。ドメインは、領域またはその一部と同一であってよく、領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と異なる生体分子の一部を組み込まれていてもよい。
【０１１２】
本明細書において使用される「シグナルドメイン」（「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とも称される）なる用語は、前駆体タンパク質（しばしば、膜結合または分泌タンパク質）のＮ−末端領域で一続きのアミノ酸配列にて存在するペプチドドメインを示し、翻訳後タンパク質輸送に関与する。多くの場合、シグナルドメインは、選別プロセスが完了した後、特異的シグナルペプチダーゼにより全長タンパク質から除去される。それぞれのシグナルドメインは、細胞中の前駆体タンパク質の特定の目標を指定する。ＦＧＦ２１のシグナルドメインは、配列番号：１のアミノ酸１−２８である。
【０１１３】
本明細書において使用される「受容体結合ドメイン」なる用語は、膜結合受容体タンパク質と接触し、細胞性応答、例えば、シグナル伝達事象を引き起こすタンパク質の任意の位置または領域を示す。
【０１１４】
本明細書において使用される「リガンド結合ドメイン」なる用語は、ＦＧＦ２１の対応する天然配列の少なくとも１つの定性結合活性を保持するタンパク質の任意の位置または領域を示す。
【０１１５】
「領域」なる用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を示す。タンパク質の場合、領域は、タンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分により定義される。いくつかの態様において、「領域」は、生体分子の機能と関連する。
【０１１６】
本明細書において使用される「フラグメント」なる用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を示す。タンパク質の場合、部分は、タンパク質のアミノ酸配列隣接する部分により定義され、少なくとも３−５アミノ酸、少なくとも８−１０アミノ酸、少なくとも１１−１５アミノ酸、少なくとも１７−２４アミノ酸、少なくとも２５−３０アミノ酸および少なくとも３０−４５アミノ酸を示す。オリゴヌクレオチドの場合、部分は、オリゴヌクレオチドの核酸配列の隣接する部分により定義され、少なくとも９−１５ヌクレオチド、少なくとも１８−３０ヌクレオチド、少なくとも３３−４５ヌクレオチド、少なくとも４８−７２ヌクレオチド、少なくとも７５−９０ヌクレオチドおよび少なくとも９０−１３０ヌクレオチドを示す。いくつかの態様において、生体分子の部分は、生物学的活性を有する。本発明の文脈において、ＦＧＦ２１ポリペプチドフラグメントは、配列番号：１に記載されている全ＦＧＦ２１ポリペプチド配列を含まない。
【０１１７】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成手段により生産することができる。したがって、天然配列ポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチドまたは任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
【０１１８】
本明細書において使用される「同種ヌクレオチド配列」もしくは「同種アミノ酸配列」またはそれらの変異なる句は、少なくとも特定のパーセントのヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列を示し、「配列同一性」と互換的に使用される。同種ヌクレオチド配列は、タンパク質のアイソフォームをコードする配列を含む。このようなアイソフォームは、例えば、ＲＮＡの代替スプライシングの結果として、同じ生物体の異なる組織において発現させることができる。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。同種ヌクレオチド配列は、限定はしないが哺乳動物を含む、ヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。同種ヌクレオチド配列はまた、限定はしないが、本明細書に記載されているヌクレオチド配列天然対立遺伝子変異および突然変異を含む。同種アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含み、ポリペプチドが同じ結合および／または活性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するとき、同種である。いくつかの態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、１−１０、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０または５０−６０個のヌクレオチド／アミノ酸置換、付加または欠失を有するとき、同種である。いくつかの態様において、同種アミノ酸配列は、最大５または最大３個の保存アミノ酸置換を有する。
【０１１９】
相同性または同一性パーセントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用する、デフォルト設定を使用してＧａｐプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）により決定することができる。いくつかの態様において、プローブと標的間の相同性は、約７５％から約８５％である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号：２またはその部分と少なくとも約９５％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％同種であるヌクレオチドを有する。
【０１２０】
相同性はまた、ポリペプチドレベルであり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号：１またはその部分と約９５％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％同種である。本発明のＦＧＦ２１変異体（「本発明配列」、例えば、変異体１または配列番号：５）および異なるアミノ酸配列（「外来配列」、例えば、Ｐ１７４へ変化したＬ１７４を有する配列番号：１）の同一性程度またはパーセントは、「本発明配列」または「外来配列」のどちらか小さい方の長さで割った２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数として計算する。結果は、同一性パーセントとして示される。例えば、変異体１（配列番号：５）は、Ｐ１７４へ変化したＬ１７４（Ｌ１７４を有する配列番号：１がＰ１７４に変化した）を有する野生型ＦＧＦ２１と９４．９％同一性を有する。これらの２つの配列に関して、１６８個の同一のアミノ酸が存在し、全長は１７７個のアミノ酸である。したがって、同一性パーセントは、（１６８／１７７）×１００＝９４．９％である。
【０１２１】
本明細書において使用される「混合」なる用語は、同じ領域中で１つ以上の化合物、細胞、分子などを互いに合わせるプロセスを示す。これは、例えば、試験チューブ、ペトリ皿または１つ以上の化合物、細胞または分子を混合することが可能であるあらゆる容器中で行われ得る。
【０１２２】
本明細書において使用される「実質的に精製される」なる用語は、天然環境から取り出されており、天然に関連する他の成分を少なくとも６０％、少なくとも７５％、および少なくとも９０％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体のいずれか）を示す。
【０１２３】
「薬学的に許容される担体」なる用語は、治療剤、例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療剤の投与のための担体を示す。該用語は、組成物を受ける個体に有害な抗体の生産をそれ自体誘導せず、過度の毒性なく投与することができるあらゆる医薬担体を示す。適当な担体は、大型のゆっくり代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物および不活性ウイルス粒子であり得る。このような担体は、当業者によく知られている。治療組成物における薬学的に許容される担体は、液体、例えば、水、塩水、グリセロールおよびエタノールを含むことができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などもまた、このようなビヒクル中に存在することができる。
【０１２４】
システイン残基により提供される天然ジスルフィド結合は、一般的に、タンパク質の熱力学的安定性を増加させる。融解温度の増加において測定されるとき、熱力学的安定性の増加の成功例は、酵素Ｔ４リゾチーム（Matsumuraら PNAS 86:6562-6566 (1989)）およびバルナーゼ（Johnsonら J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997)）の多数のジスルフィド結合された突然変異体である。本発明の局面は、野生型ＦＧＦ２１の柔軟性を抑制し、それにより、タンパク質の疎水性コアへの保存剤のアクセスを制限する、変異体内のジスルフィド結合の存在によりなし遂げられた、保存剤の存在下でのＦＧＦ２１の物理的安定性の増強である。
【０１２５】
したがって、本発明の第２の局面は、例えば、システイン残基を野生型ＦＧＦ２１タンパク質または本発明のポリペプチドおよびタンパク質変異体に組み込む、または置換することを介する、さらなるジスルフィド結合の取り込みにより生じる増強された医薬安定性を有するヒトＦＧＦ２１の変異体またはその生物学的に活性なペプチドを提供する。当業者は、本明細書において記載されている提案された態様に加えて、天然システイン、システイン１０３およびシステイン１２１を、改善された特性を与え得る新規ジスルフィド結合を導入するために遺伝子座として利用することができることを認識している。
【０１２６】
これらは、２つ以上のいかのもの：グルタミン４６、アルギニン４７、チロシン４８、ロイシン４９、チロシン５０、スレオニン５１、アスパラギン酸５２、アスパラギン酸５３、アラニン５４、グルタミン５５、グルタミン５６、スレオニン５７、グルタミン酸５８、アラニン５９、ヒスチジン６０、ロイシン６１、グルタミン酸６２、イソロイシン６３、バリン６９、グリシン７０、グリシン７１、アラニン７２、アラニン７３、ロイシン１４４、ヒスチジン１４５、ロイシン１４６、プロリン１４７、グリシン１４８、アスパラギン１４９、リジン１５０、セリン１５１、プロリン１５２、ヒスチジン１５３、アルギニン１５４、アスパラギン酸１５５、プロリン１５６、アラニン１５７、プロリン１５８、アルギニン１５９、グリシン１６０、プロリン１６１、アラニン１６２、アルギニン１６３、フェニルアラニン１６４（ここで、アミノ酸の番号は、全長２０９アミノ酸ｈＦＧＦ２１配列の配列番号：１に基づく）に対してシステインでの置換を有するＦＧＦ−２１を含む。
【０１２７】
さらに、ヒトＦＧＦ２１の変異体またはその生物学的に活性なペプチドは、Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１２１の天然の１つに加えて、操作されたジスルフィド結合を提供され、以下のとおりである：Ｇｌｎ４６Ｃｙｓ−Ａｌａ５９Ｃｙｓ、Ｇｌｎ４６Ｃｙｓ−Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ、Ｇｌｎ４６Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ、Ｇｌｎ４６Ｃｙｓ−Ｇｌｕ６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ４６Ｃｙｓ−Ｉｌｅ６３Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｌａ５９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｇｌｕ６２Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｉｌｅ６３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｌａ５９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｇｌｕ６２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｉｌｅ６３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｌａ５９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｇｌｕ６２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｉｌｅ６３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｌａ５９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｌｕｅ６１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｇｌｕ６２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｉｌｅ６３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４４Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４４Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４４Ｃｙｓ−Ｐｈｅ１６４Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１４５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１４５Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１４５Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１４５Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１４５Ｃｙｓ−Ｐｈｅ１６４Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４６Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４６Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４６Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４６Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１４６Ｃｙｓ−Ｐｈｅ１６４Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１４７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１４７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１４７Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１４７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１４７Ｃｙｓ−Ｐｈｅ１６４Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ−Ｐｈｅ１６４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｖａｌ６９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７１Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｌａ７２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｌａ７３Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｖａｌ６９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｇｌｕ７０Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｇ７１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｌａ７２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｌａ７３Ｃｙｓ、Ａｌａ５９Ｃｙｓ−Ｖａｌ６９Ｃｙｓ、Ａｌａ５９Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７０Ｃｙｓ、Ａｌａ５９Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７１Ｃｙｓ、Ａｌａ５９Ｃｙｓ−Ａｌａ７２Ｃｙｓ、Ａｌａ５９Ｃｙｓ−Ａｌａ７３Ｃｙｓ、Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ−Ｖａｌ６９Ｃｙｓ、Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７０Ｃｙｓ、Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ−Ａｌａ７２Ｃｙｓ、Ｈｉｓ６０Ｃｙｓ−Ａｌａ７３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ−Ｖａｌ６９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７０Ｃｙｓ、Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ７１Ｃｙｓ、Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ−Ａｌａ７２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ６１Ｃｙｓ−Ａｌａ７３Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１４８Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｓｎ１４９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１５０Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１５１Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５２Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１５３Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５４Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｓｐ１５５Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５６Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｌａ１５７Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１５８Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｒｇ１５９Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｇ１６０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｇ１６０Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｇ１６０Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１６０Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１６１Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｌａ１６２Ｃｙｓ、Ａｒｇ４７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ４８Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｌｅｕ４９Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｔｙｒ５０Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５１Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ａｓｐ５２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ａｓｐ５３Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ａｌａ５４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５５Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５６Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ５７Ｃｙｓ−Ａｒｇ１６３Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５８Ｃｙｓ−Ａｒｇ
１６３Ｃｙｓ。
【０１２８】
本発明の第３の局面は、本発明の第２の態様において示される２つ以上のアミノ酸位置でのシステインの置換と共に、本発明の第１の態様において示される任意のアミノ酸位置で任意の荷電アミノ酸および／または極性であるが非荷電アミノ酸の置換を含むヒトＦＧＦ２１の変異体またはその生物学的に活性なペプチドを提供する。
【０１２９】
タンパク質医薬の開発における重要な挑戦が、タンパク質の物理化学的不安定性に取り組むことであることは、当分野でよく知られている。このことは、タンパク質医薬製剤が多数の使用を意図されるとき、さらになおさら明らかであり、注射製剤は、安定な濃縮された保存溶液を必要とすると同時に、好ましい生物活性プロフィールを維持する。野生型ＦＧＦ２１の詳細な生物物理学特性化は、濃縮タンパク質溶液（＞５ｍｇ／ｍｌ）は、ストレス条件、例えば、高い温度または低いｐＨに暴露されたとき、加速された会合および凝集（すなわち、乏しい物理的安定性および生物医薬特性）を引き起こすことを確立した。医薬防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール）へのＦＧＦ２１の濃縮タンパク質溶液の暴露はまた、物理的安定性に対するネガティブな影響を有した。
【０１３０】
したがって、本発明の態様は、生理学的および保存製剤の両方の条件下で、化学安定性および生物学的効力を維持するが、濃縮溶液の物理的安定性を増強することである。所定のタンパク質濃度で、温度およびイオン強度が物理的安定性に対して大きな影響を有するため、会合および凝集が疎水性相互作用によって生じ得ることが考えられる。ほとんど、非保存的と推測される表面暴露アミノ酸残基を標的とした。これらの残基の局所環境を分析し、構造的に重要であると思われないものを突然変異誘発のために選択した。特定の変化を開始する１つの方法は、グルタミン酸残基を導入することにより、タンパク質のｐＩをさらに減少させることである（「グルタミン酸スキャン」）。電荷置換の導入が電荷−電荷反発を介して疎水性媒介凝集を阻害し、保存剤相溶性を改善する可能性があるという仮説を立てられる。加えて、当業者はまた、十分な程度の突然変異誘発で、負電荷の同時減少有りまたは無しでの正電荷の導入により、ｐＩを塩基性(basic)ｐＨ範囲にシフトさせ、したがって電荷−電荷反発を起こすことができることを認識している。
【０１３１】
本発明の態様は、生理学的および保存医薬製剤の両方の条件下で物理化学的安定性に関与するが、野生型ＦＧＦ２１と比較して変異体の生物学的効力の維持が、同様に考慮される重要な因子である。したがって、本発明の変異体の生物学的効力は、インビトロで３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞  ２−ＤＯＧ摂取細胞アッセイにおいて測定されるとき、グルコース摂取（実施例３）および／または、インビボでｏｂ／ｏｂマウスアッセイにおいて測定されるとき、血漿グルコースレベルならびに血漿トリグリセリドの低下（実施例５）に影響する変異体の能力により定義される。
【０１３２】
本発明にしたがって投与されるＦＧＦ２１の変異体は、当分野で知られている任意の手段により作製および／または単離され得る。変異体を生産するための最も好ましい方法は、組換えＤＮＡ方法論を介することであり、当業者によく知られている。このような方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（John Wiley & Sons, Inc.）のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されており、これを出典明示により本明細書に包含させる。
【０１３３】
さらに、好ましい態様は、本明細書に記載されている変異体に由来する生物学的に活性なペプチドを含む。このようなペプチドは、記載されている少なくとも１つの置換を含み、該変異体は、生物学的活性を有する。ペプチドは、当業者に知られているあらゆる、および全ての手段により生産され得、この例は、酵素消化、化学合成または組換えＤＮＡ方法論を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
特定の線維芽細胞増殖因子のペプチドのフラグメントが生物学的に活性であることが当分野で確立されている。例えば、Bairdら Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988)およびJ. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987)参照。したがって、変異体のフラグメントまたはペプチドの選択は、当分野で知られている基準に基づく。例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）が、神経ペプチド、内分泌腺ペプチドおよびサイトカインの不活性化に関与するセリン型プロテアーゼであることが知られている（Dammeら Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)）。ＦＧＦ２１のＮ−末端（ＨｉｓＰｒｏＩｌｅＰｒｏ）は、ＤＰＰ−ＩＶに対する基質となる可能性がある２つのジペプチドを含み、４個のアミノ酸によってＮ−末端で切断されたＦＧＦ２１のフラグメントをもたらし得る。予想外に、野生型ＦＧＦ２１の該フラグメントは、生物学的活性保持することが証明されており（表２）、したがって、最大４個のアミノ酸によってＮ−末端で切断された本発明の変異体は、本発明の態様である。
【０１３５】
本発明はまた、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってよい上記変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよい。本発明の変異体をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複または縮重の結果として変化し得る。
【０１３６】
本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、以下のものを含み得る：変異体に対するコード配列のみ、変異体に対するコード配列およびさらなるコード配列、例えば、機能性ポリペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列または前駆タンパク質配列；変異体に対するコード配列および非コード配列、例えば、イントロンまたは変異体に対するコード配列の５’および／または３’の非コード配列。したがって、「変異体をコードするポリヌクレオチド」なる用語は、さらなるコードおよび／または非コード配列を含む、変異体に対するコード配列だけでなく、ポリヌクレオチドもまた含み得るポリヌクレオチドを含む。
【０１３７】
本発明はさらに、示される置換を含む、ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする記載されているポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ヒトＦＧＦ２１配列の天然対立遺伝子変異体、非天然変異体、または上記切断変異体であり得る。したがって、本発明はまた、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに記載されている変異体のフラグメント、誘導体またはアナログをコードするこのようなポリヌクレオチドの変異体を含む。このようなヌクレオチド変異体は、第１または第２の態様の少なくとも１つの示されたアミノ酸置換が存在するかぎり、欠失変異体、置換変異体、切断変異体、および付加または挿入変異体を含む。
【０１３８】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現コントロール配列に作動可能に連結した（すなわち、発現コントロール配列の機能を保証するように位置する）後、宿主において発現する。これらの発現ベクターは一般的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物中で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを含み得る。ＦＧＦ２１変異体は、適当なプロモーターのコントロール下で、哺乳動物細胞、昆虫、酵母、細菌または他の細胞において発現させることができる。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を生産するために使用することができる。
【０１３９】
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするために特に有用な原核生物宿主である。使用のために適当な他の微生物宿主は、枯草菌(Bacillus subtilus)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ならびにセラチア、シュードモナス、連鎖球菌およびブドウ球菌の様々な種を含むが、他のものも当然選択肢として使用され得る。これらの原核生物宿主において、１つはまた、一般的に宿主細胞と適合性のある発現コントロール配列（例えば、複製起点）を含む発現ベクターを作ることができる。加えて、多くのよく知られているプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系またはファージラムダもしくはＴ７由来のプロモーター系が存在し得る。プロモーターは、一般的に、所望によりオペレーター配列にて、発現をコントロールし、転写および翻訳を開始および完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
【０１４０】
タンパク質の発現の当業者は、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が大腸菌における発現のために成熟配列（配列番号：３）のＮ−末端に導入され得ることを認識し、本発明の文脈において考慮される。したがって、特記されない限り、大腸菌において発現される本発明の変異体は、Ｎ−末端に導入されたメチオニン配列を有する。
【０１４１】
他の微生物、例えば、酵母または真菌もまた、発現のために使用され得る。メタノール資化酵母、出芽酵母、分裂酵母およびピチア・アングスタ(Pichia angusta)は、所望の、発現コントロール配列、例えば、プロモーター、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、および複製起点、終始配列などを有する適当なベクターと共に、好ましい酵母宿主の例である。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)；およびスエヒロタケ(Schizophyllum commune)は、真菌宿主の例であるが、他のものも当然選択肢として使用され得る。
【０１４２】
哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現および生産するために使用され得る。無傷な変異体を分泌することができる多くの適当な宿主細胞系が、当分野で開発されているため、真核細胞が実際に好ましく、ＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＮＳＯ細胞、Ｓｙｒｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ卵巣細胞系、ＨｅＬａ細胞またはヒト胚腎臓細胞系（すなわちＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ）を含む。
【０１４３】
これらの細胞のための発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現コントロール配列は、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、Ｒａｕｓ肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位は、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモンに由来する配列を含む。
【０１４４】
興味あるポリヌクレオチド配列（例えば、ＦＧＦ２１の変異体および発現コントロール配列）を含むベクターは、よく知られている方法により宿主細胞に移動させることができ、これは細胞性宿主の型に依存して変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞のために一般的に利用され、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞性宿主のために使用され得る。
【０１４５】
タンパク質精製の種々の方法が使用され得、このような方法は、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)において、当分野で知られており、記載されている。選択される精製工程は、例えば、ＦＧＦ２１の変異体のために使用される生産プロセスの性質に依存する。
【０１４６】
ＦＧＦ２１変異体含有組成物は、患者の臨床状態、ＦＧＦ２１変異体組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび専門家に知られている他の因子を考慮して、良い医療行為と一致する様式において処方および投与されるべきである。したがって、本明細書における目的のためにＦＧＦ２１変異体の「治療有効量」は、このような考えにより決定される。
【０１４７】
ＦＧＦ２１変異体の医薬組成物および本発明の医薬組成物は、一般的に意図される目的をなし遂げる任意の手段により、１型および２型糖尿病、肥満、メタボリック・シンドロームまたは重症患者を処置するために投与され得る。本明細書において使用される「非経口」なる用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む投与様式を示す。投与される用量は、年齢、健康状態およびレシピエントの体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物は、ＦＧＦ２１変異体が、１型または２型糖尿病、肥満またはメタボリック・シンドロームの処置のために所望の医療効果をなし遂げるために有効である量において存在する全ての組成物を含む。個々の必要性はある患者から別の患者で変化し得るが、全ての成分の有効量の最適範囲の決定は、通常の臨床医の能力の範囲内である。
【０１４８】
本発明のＦＧＦ２１の変異体は、薬学的に有用な組成物を調製するために、既知の方法にしたがって製剤化することができる。所望の製剤は、任意の薬学的に許容される担体、防腐剤、賦形剤または安定剤を有する高い純度の適当な希釈剤または水溶液で再構成された安定な凍結乾燥された産物である［Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)］。本発明の変異体は、薬学的に許容されるバッファーと組み合わされて、ｐＨを、許容される安定性および投与のために許容されるｐＨを提供するために調整され得る。
【０１４９】
非経口投与において、１つの態様において、ＦＧＦ２１変異体は、一般的に、単位用量の注射可能形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン）における所望の純度の程度の１つ以上の該変異体を、薬学的に許容される担体、すなわち、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性であるものと混合することにより製剤化される。好ましくは、１つ以上の薬学的に許容される抗微生物剤を加えてもよい。フェノール、ｍ−クレゾールおよびベンジルアルコールは、好ましい薬学的に許容される抗微生物剤である。
【０１５０】
所望により、１つ以上の薬学的に許容される塩は、イオン強度または緊張力(tonicity)を調整するために加えられ得る。１つ以上の賦形剤は、製剤の等張性をさらに調整するために加えられ得る。グリセリン、塩化ナトリウムおよびマンニトールは、等張性を調整する賦形剤の例である。
【０１５１】
当業者は、良い医療行為および個々の患者の臨床状態により決定されるとき、ＦＧＦ２１変異体を含む治療組成物に対する薬学的に有効な用量および投与レジメンを容易に最適化することができる。本発明のＦＧＦ２１変異体に対する典型的な用量範囲は、成体に対して約０．０１ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約０．０５ｍｇ／週から約５０００ｍｇ／週）の範囲である。好ましくは、用量は、約０．１ｍｇ／日から約１００ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約０．５ｍｇ／週から約５００ｍｇ／週）、さらに好ましくは約１．０ｍｇ／日から約１０ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約５ｍｇ／週から約５０ｍｇ／週）の範囲である。より好ましくは、用量は、約１−５ｍｇ／日（または週に１回の投与にて約５ｍｇ／週から約２５ｍｇ／週）である。投与されるＦＧＦ２１変異体の適当な用量は、より速く、より効率的なグルコース利用により血糖レベルの低下およびエネルギー消費の増加をもたらし、したがって、１型および２型糖尿病、肥満およびメタボリック・シンドロームの処置のために有用である。
【０１５２】
加えて、高血糖およびインスリン耐性が栄養補給を与えられた重症患者において一般的であるため、いくつかのＩＣＵは、食事を与えられた重症患者において過剰高血糖を処置するためにインスリンを投与する。実際に、最近の試験は、糖尿病の病歴を有するか否かにかかわらず、デシリットルあたり１１０ｍｇよりも高くないレベルで血糖を維持するための外因性インスリンの使用が、外科的集中治療単位における重症患者中の罹患率および死亡率を減少させることを立証している（Van den Bergheら N Engl J Med., 345(19):1359, (2001)）。したがって、本発明のＦＧＦ２１の変異体は、ユニークに、代謝的に不安定な重症患者において代謝安定性を回復させるための手助けに適している。ＦＧＦ２１の変異体は、グルコース摂取を刺激し、インスリン感受性を増強するが、低血糖を誘導しないという点でユニークである。
【０１５３】
本発明の別の局面において、１型および２型糖尿病、肥満、メタボリック・シンドロームまたは重症患者の処置のための医薬として使用するためのＦＧＦ２１の変異体が考慮される。
【０１５４】
本発明は詳細に今回記載されており、これは、以下の実施例を参照することによりさらに明白に理解されるが、実施例は、説明のみの目的のためにここに含まれ、本発明を限定されることを意図しない。
【０１５５】
本発明の実施は、他に記載のない限り、当分野の技術内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の慣用の方法を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.);および Handbook of Experimental Immunology, Vols. I IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications);および Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)参照。
【０１５６】
部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体
「部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体」または「置換ＦＧＦ２１突然変異体」なる用語は、天然ＦＧＦ２１ポリペプチド配列のアミノ酸配列、例えば、配列番号：１と異なるアミノ酸配列を有するＦＧＦ２１突然変異体ポリペプチドおよびその変異体を示す。部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体は、ＦＧＦ２１ポリペプチドの特定の位置にて、保存または非保存のいずれかでのアミノ酸置換を導入し、天然または非天然アミノ酸を使用することにより作製することができる。
【０１５７】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどあるいは全く効果がない位置で、天然アミノ酸残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所定の位置に見出される残基）の非天然残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所定の位置に見出されない残基）での置換を含むことができる。保存的アミノ酸置換はまた、一般的に生物学的システムにおける合成よりもむしろ化学的ペプチド合成により組み込まれる非天然アミノ酸残基を含む。これらは、ペプチド模擬物およびアミノ酸部分の他の逆(reversed)または反転(inverted)形態を含む。
【０１５８】
天然残基は、一般的な側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；ならびに
（７）セレノシステイン、ピロリジン（ＰＹＬ）およびピロリン−カルボキシ−リジン（ＰＣＬ）。
【０１５９】
保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。
【０１６０】
所望のアミノ酸置換（保存または非保存のいずれか）は、このような置換が望ましいとき、当業者により決定することができる。
【０１６１】
切断ＦＧＦ２１ポリペプチド
本発明の１つの態様は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（配列番号：３）の切断形態である。本発明のこの態様は、優れた場合によっては、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの非切断形態と同様の活性を提供することができる切断ＦＧＦ２１ポリペプチドを同定する努力から生じた。
【０１６２】
本明細書において使用される「切断ＦＧＦ２１ポリペプチド」なる用語は、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（またはＮ−末端）から除去されているか、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのカルボキシル末端（またはＣ−末端）から除去されているか、または、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から除去されているＦＧＦ２１ポリペプチドを示す。本明細書に記載されている種々の切断は、本明細書に記載されているとおりに調製された。
【０１６３】
Ｎ−末端切断ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＣ−末端切断ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、インビトロ  ホスホ−ＥＲＫアッセイを使用してアッセイすることができる。切断ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を試験するために使用することができるインビトロアッセイの特定の詳細は、実施例において見いだすことができる。
【０１６４】
本発明の切断ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性はまた、インビボアッセイ、例えば、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて評価することができる。一般的に、切断ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ活性を評価するために、切断ＦＧＦ２１ポリペプチドを試験動物の腹腔内に投与することができる。所望のインキュベーション期間（例えば、１時間またはそれ以上）後、血液サンプルを取り、血糖レベルを測定することができる。
【０１６５】
ａ．Ｎ−末端切断
本発明のいくつかの態様において、Ｎ−末端切断は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ−末端からの１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基を含む。９個未満のアミノ酸残基のＮ−末端切断を有する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、個体において血糖を低下させる成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力を保持する。したがって、特定の態様において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のＮ−末端切断を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの切断形態またはＦＧＦ２１タンパク質変異体を含む。
【０１６６】
ｂ．Ｃ−末端切断
本発明のいくつかの態様において、Ｃ−末端切断は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ−末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基を含む。１３個未満のアミノ酸残基のＣ−末端切断を有する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、インビトロ  ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイ（Yie Jら FEBS Letts 583:19-24 (2009)）において野生型ＦＧＦ２１の有効性の少なくとも５０％の有効性を示し、これらのＦＧＦ２１突然変異体が個体において血糖を低下させる成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力を保持することを示した。したがって、特定の態様において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基のＣ−末端切断を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの切断形態またはＦＧＦ２１タンパク質変異体を含む。
【０１６７】
ｃ．Ｎ−末端およびＣ−末端切断
本発明のいくつかの態様において、切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ−末端およびＣ−末端切断の組合せを有することができる。Ｎ−末端およびＣ−末端切断の組合せを有する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ−末端またはＣ−末端切断単独のいずれかを含む対応する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を共有する。言い換えれば、９個未満のアミノ酸残基のＮ−末端切断および１３個未満のアミノ酸残基のＣ−末端切断の両方を有する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、９個未満のアミノ酸残基のＮ−末端切断を有する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは１３個未満のアミノ酸残基のＣ−末端切断を有する切断ＦＧＦ２１ポリペプチドと同様またはそれ以上の血糖降下活性を有する。したがって、特定の態様において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のＮ−末端切断および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基のＣ−末端切断の両方を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの切断形態またはＦＧＦ２１タンパク質変異体を含む。
【０１６８】
本発明の全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、所望により、特異的突然変異により、または細菌発現プロセスの結果として導入され得るアミノ末端メチオニン残基を含むことができる。
【０１６９】
本発明の切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本明細書に記載されている実施例に記載されているとおりに調製することができる。標準分子生物学技術をよく知っている当業者は、本明細書の記載と組み合わせて、本発明の切断ＦＧＦ２１ポリペプチドを作製および使用する知識を使用することができる。標準技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に関して使用することができる。例えば、あらゆる目的のために出典明示により本明細書に包含させる、上記、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual、参照。酵素反応および精製技術は、一般的に当分野で成し遂げられている、または本明細書に記載されているとおりに、製造業者の記載にしたがって行うことができる。特定の定義が提供されている場合を除いて、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および薬学および医薬化学のの実験室的処理および技術と関連して利用される命名法が、よく知られており、当分野で一般的に使用されるものである。標準技術は、化学合成；化学分析；医薬品、製剤および送達；および患者の処置のために使用することができる。
【０１７０】
本発明の切断ＦＧＦ２１ポリペプチドはまた、切断ＦＧＦ２１ポリペプチドにさらなる特性を与えることができる別のエンティティ(entity)に融合することができる。本発明の１つの態様において、切断ＦＧＦ２１ポリペプチドは、ＩｇＧ定常ドメインまたはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはアルブミン結合ポリペプチドに融合することができる。このような融合は、本明細書において提供される既知の分子生物学的方法および／または案内を使用して成し遂げることができる。このような融合ポリペプチドの利益ならびにこのような融合ポリペプチドを作製する方法は、本明細書においてより詳細に記載されている。
【０１７１】
ＦＧＦ２１融合タンパク質
本明細書において使用される「ＦＧＦ２１融合ポリペプチド」または「ＦＧＦ２１融合タンパク質」なる用語は、本明細書に記載されているいずれかのＦＧＦ２１タンパク質変異体のＮ−末端またはＣ−末端にて１つ以上のアミノ酸残基（例えば、異種タンパク質またはペプチド）の融合を示す。
【０１７２】
異種ペプチドおよびポリペプチドは、ＦＧＦ２１タンパク質変異体；膜貫通受容体タンパク質またはその部分、例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通および細胞内ドメイン；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその部分；触媒的に活性である酵素またはその部分；オリゴマー形成を促進するポリペプチドまたはペプチド、例えば、ロイシンジッパードメイン；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド、例えば、免疫グロブリン定常領域；機能性もしくは非機能性抗体またはそれらの重鎖もしくは軽鎖；ならびに、本発明のＦＧＦ２１タンパク質変異体と異なる活性、例えば、治療活性を有するポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープを含むが、これらに限定されない。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合されたＦＧＦ２１突然変異体もまた、本発明により包含される。
【０１７３】
ＦＧＦ２１融合タンパク質は、ＦＧＦ２１タンパク質変異体のＮ−末端またはＣ−末端のいずれかにて異種配列を融合することにより作製することができる。本明細書に記載されているとおり、異種配列は、アミノ酸配列または非アミノ酸含有ポリマーであり得る。異種配列は、ＦＧＦ２１タンパク質変異体に直接、またはリンカーもしくはアダプター分子を介して融合することができる。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基（または−ｍｅｒ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の残基（または−ｍｅｒ）、好ましくは１０から５０個のアミノ酸残基（または−ｍｅｒ）、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の残基（または−ｍｅｒ）、およびさらに好ましくは１５から３５個のアミノ酸残基（または−ｍｅｒ）であり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合分子の分離を可能にするように、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位にて設計することができる。
【０１７４】
ａ．Ｆｃ融合
本発明の１つの態様において、ＦＧＦ２１タンパク質変異体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的依存性部分、抗原に結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインおよびエフェクター機能、例えば、補体活性化に関与し、食細胞により攻撃する「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは長期血清半減期を有するが、Ｆａｂは寿命が短い（Caponら 1989, Nature 337: 525-31）。治療タンパク質と連結されるとき、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供するか、または、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合および胎盤通過さえも含むような機能を組み込むことができる（Caponら 1989）。
【０１７５】
インビボ薬物動態学分析は、ヒトＦＧＦ２１が、迅速なクリアランスおよびインビボ分解によってマウスにおける約．５から１時間の短い半減期を有することを示した。したがって、ＦＧＦ２１の半減期を延長するために、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ−もしくはＣ−末端に融合された。野生型ＦＧＦ２１へのＦｃ領域の融合、特に、野生型ＦＧＦ２１のＮ−末端に融合されたＦｃは、予期されたとおり半減期が延長されなかったが、しかしながら、インビボでのＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解およびかかる分解に耐性があったＦＧＦ２１突然変異体の同定の研究につながった。
【０１７６】
本明細書中、Ｆｃ−ＦＧＦ２１は、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＮ−末端に融合されている融合タンパク質を示す。同様に、本明細書中、ＦＧＦ２１−Ｆｃは、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ−末端に融合されている融合タンパク質を示す。
【０１７７】
得られるＦＧＦ２１融合タンパク質は、例えば、プロテインＡアフィニティーカラムの使用により精製することができる。Ｆｃ領域に融合されるペプチドおよびタンパク質は、非融合対応物よりも実質的に良いインビボ半減期を示すことを見出した。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多重合を可能する。Ｆｃ領域は天然Ｆｃ領域であってよく、また、特定の質、例えば、治療的質、循環時間または凝集の減少を改善するように改変することができる。
【０１７８】
抗体の「Ｆｃ」ドメインとの融合によるタンパク質治療剤の有用な修飾は、国際公開ＷＯ００／０２４７８２において詳細に記載されており、これを出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。この文献は、「ビヒクル」、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストランまたはＦｃ領域への連結を記載されている。
【０１７９】
ｂ．融合タンパク質リンカー
本発明の融合タンパク質を形成するとき、リンカーは必要ではないが、使用することができる。存在するとき、スペーサーとして主に働くため、リンカーの化学構造は重要ではないかもしれない。リンカーは、ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸からなり得る。本発明のいくつかの態様において、リンカーは、ペプチド結合により連結される１から２０個のアミノ酸からなり、該アミノ酸は２０個の天然アミノ酸から選択される。種々の態様において、１から２０個のアミノ酸は、アミノ酸グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。いくつかの態様において、リンカーは、立体的障害のない大多数のアミノ酸、例えば、グリシンおよびアラニンからなる。いくつかの態様において、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンおよびアラニンの組合せ（例えば、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ））またはグリシンおよびセリンの組合せ（例えば、ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ））である。１５個のアミノ酸残基のリンカーがＦＧＦ２１融合タンパク質に対して特に良く働くことが見出されたが、本発明は、任意の長さまたは組成物のリンカーを考慮する。
【０１８０】
本明細書に記載されているリンカーは典型的であり、より長く他の残基を含むリンカーが、本発明により考慮される。非ペプチドリンカーもまた、本発明により考慮される。例えば、アルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２またはフェニルを含む任意の非立体的障害基によりさらに置換され得る。典型的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカーであり、該リンカーは、１００から５０００ｋＤ、例えば、１００から５００ｋＤの分子量を有する。
【０１８１】
化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体
本明細書に記載されているＦＧＦ２１の切断形態を含む本明細書に記載されているＦＧＦ２１タンパク質変異体の化学的に修飾された形態は、本明細書に記載されている記載を考慮して、当業者により調製することができる。このような化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体は、化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体が、修飾されていないＦＧＦ２１突然変異体と、ＦＧＦ２１突然変異体に結合された分子の型または位置のいずれかにおいて異なるように改変される。化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体は、１つ以上の天然に結合された化学基の欠失により形成される分子を含むことができる。
【０１８２】
１つの態様において、本発明のＦＧＦ２１タンパク質変異体は、１つ以上のポリマーの共有結合により修飾することができる。例えば、選択されるポリマーは、一般的に、結合するタンパク質が水性環境、例えば、生理学的環境下で沈殿しないように、水溶性である。適当なポリマーの範囲内に含まれるものは、ポリマーの混合物である。好ましくは、最終産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容される。本発明のＦＧＦ２１タンパク質変異体に結合した非水溶性ポリマーもまた、本発明の局面を形成する。
【０１８３】
典型的なポリマーはそれぞれ、あらゆる分子量であってよく、分岐状または非分岐状であってよい。ポリマーはそれぞれ、一般的に、約２ｋＤａから約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」なる用語は、水溶性ポリマーの調製において、いくつかの分子が規定された分子量以上および未満の重さであることを示す）。それぞれのポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、さらに好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａ、より好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａである。
【０１８４】
適当な水溶性ポリマーまたはその混合物は、Ｎ−連結もしくはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの、例えば低分子量デキストラン）、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。共有的に結合されたＦＧＦ２１タンパク質変異体多量体を調製するために使用することができる二機能性架橋分子もまた、本発明により包含される。ポリシアル酸に共有結合されるＦＧＦ２１突然変異体もまた、本発明により包含される。
【０１８５】
本発明のいくつかの態様において、ＦＧＦ２１突然変異体は、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む１つ以上の水溶性ポリマーを含むように共有的または化学的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２；および４，１７９，３３７号、参照。本発明のいくつかの態様において、ＦＧＦ２１突然変異体は、限定はしないが、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコールまたはこのようなポリマーの混合物を含む１つ以上のポリマーを含む。
【０１８６】
本発明のいくつかの態様において、ＦＧＦ２１突然変異体は、ＰＥＧサブユニットで共有的に修飾される。いくつかの態様において、１つ以上の水溶性ポリマーは、ＦＧＦ２１突然変異体の１つ以上の特定の位置（例えば、Ｎ−末端）で結合される。いくつかの態様において、１つ以上の水溶性ポリマーは、ＦＧＦ２１突然変異体の１つ以上の側鎖にランダム的に結合される。いくつかの態様において、ＰＥＧは、ＦＧＦ２１突然変異体の治療的能力を改善するために使用される。特定のこのような方法は、例えば、ｉｎ  米国特許第６，１３３，４２６号に記載されており、これを、あらゆる目的のために本明細書に出典明示により包含させる。
【０１８７】
ポリマーがＰＥＧである本発明の態様において、ＰＥＧ基はあらゆる適当な分子量であってよく、直線状または分岐状であってよい。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは、約２ｋＤから約１００ｋＤａ、さらに好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、例えば、１０、２０、３０、４０または５０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、一般的に、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオ−ルまたはエステル基）からＦＧＦ２１突然変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）へ、アシル化または還元的アルキル化を介して、ＦＧＦ２１突然変異体に結合される。
【０１８８】
「Ｙ−形」ＰＥＧ誘導体としても知られている分岐状ＰＥＧ誘導体は、中核に結合される２つの直線状メトキシＰＥＧ鎖を含む。これらの「Ｙ形」ＰＥＧ誘導体の立体的バルキー(bulky)構造は、修飾分子の一点結合を容易にする。一例として、３つの種類の「Ｙ形」ＰＥＧ誘導体は、Ｙ−ＮＨＳ−４０Ｋ（アミンペグ化のために有用）；Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ（チオールペグ化のために有用）；およびＹ−ＡＬＤ−４０Ｋ（例えば、Ｙ−ＡＡＬＤ−４０ＫおよびＹ−ＰＡＬＤ−４０Ｋ）（Ｎ−末端ペグ化のために有用）である。アミンペグ化のために、「Ｙ形」ＮＨＳエステルは、生物学的活性分子におけるリジンまたはＮ−末端アミンのアミノ基と反応し、安定なアミド結合を生産する。該ＮＨＳエステルは、ｐＨ７−８で標的分子と結合する。チオールペグ化のために、「Ｙ形」マレイミドは、生物学的活性分子におけるチオール基と反応し、安定な３−チオスクシンイミジルエーテル結合を産生する。該マレイミドは、他の官能基の存在下でｐＨ５．０−６．５で標的分子と結合する。Ｎ−末端ペグ化のために、「Ｙ形」アルデヒドは、好ましくは、生物学的活性分子におけるＮ−末端アミンと反応し、還元試薬、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で安定なアミン結合を生産する。該アルデヒドは、ｐＨ５−８で標的分子のＮ−末端アミンと結合する。分岐状ペグ化を再形成するための試薬は、例えば、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを介して利用できる。
【０１８９】
本発明のＦＧＦ２１突然変異体を含むポリペプチドのペグ化は、当分野で知られているペグ化反応のいずれかを使用して特異的に行うことができる。このような反応は、例えば、以下の文献：Francisら 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10；欧州特許第０  １５４  ３１６および０  ４０１  ３８４号；および米国特許第４，１７９，３３７号において記載されている。例えば、ペグ化は、本明細書に記載されている反応性ポリエチレングリコール分子（または類似反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行うことができる。アシル化反応のために、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化のために、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水安定でありポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドまたはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはそのアリールオキシ誘導体（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）である。
【０１９０】
本発明のいくつかの態様において、ポリペプチドへのＰＥＧ基の結合のために有用な戦略は、溶液中の抱合体結合の形成を介して、それぞれが他方に対して相互に反応性の特別な機能性を有する、ペプチドおよびＰＥＧ部分を結合することを含む。ペプチドは、慣用の固相合成で容易に調製することができる。ペプチドは、特定の部位で適当な官能基で「前活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分での反応の前に、精製および完全に特性化される。ＰＥＧとペプチドのライゲーションは、通常、水相で行い、逆相分析ＨＰＬＣにより容易にモニタリングすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製し、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特徴付けることができる。
【０１９１】
多糖類ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる別の型の水溶性ポリマーである。したがって、多糖類ポリマーに融合された本発明のＦＧＦ２１突然変異体は、本発明の態様を形成する。デキストランは、アルファ１−６結合により主に連結されるグルコースの個々のサブユニットからなる多糖類ポリマーである。デキストランそれ自体は、広い分子量範囲において利用でき、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量において容易に利用できる。デキストランは、ビヒクルそれ自体または別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせての使用のための適当な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開ＷＯ９６／１１９５３参照。治療または診断免疫グロブリンへ結合されるデキストランの使用が報告されている。例えば、欧州特許公報第０  ３１５  ４５６号参照、これを出典明示により本明細書に包含させる。本発明はまた、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランの使用を含む。
【０１９２】
一般的に、化学修飾は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の適当な条件下で行うことができる。化学的に修飾されたポリペプチドを調製するための方法は、一般的に、（ａ）条件下でポリペプチドを活性化ポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、それによって、ＦＧＦ２１タンパク質変異体が１つ以上のポリマー分子と結合するようになること、および（ｂ）反応産物を得ることの工程を含む。最適な反応条件は、既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比率が高くなれば、結合されるポリマー分子のパーセントが高くなる。本発明の１つの態様において、化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体は、アミノ−末端に単一のポリマー分子部分を有し得る（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号参照）。
【０１９３】
本発明の別の態様において、ＦＧＦ２１タンパク質変異体は、ビオチンと化学的に結合させることができる。次に、ビオチン／ＦＧＦ２１タンパク質変異体はアビジンに結合し、四価アビジン／ビオチン／ＦＧＦ２１タンパク質変異体をもたらすことができる。ＦＧＦ２１タンパク質変異体はまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）と共有的に結合させ、得られる抱合体を抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿させ、１０の価数で十量体抱合体を形成させることができる。
【０１９４】
一般的に、本発明の化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体の投与により緩和または調節することができる条件は、ＦＧＦ２１タンパク質変異体に対して本明細書に記載されているものを含む。しかしながら、本明細書に記載されている化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体は、非修飾ＦＧＦ２１突然変異体と比較して、さらなる活性、生物学的活性の増強または減少、または他の特性、例えば、半減期の延長または短縮を有し得る。
【０１９５】
ＦＧＦ２１突然変異体の治療組成物およびその投与
ＦＧＦ２１突然変異体を含む治療組成物は、本発明の範囲内であり、具体的には、増強された特性を示すいくつかの突然変異体ＦＧＦ２１配列の同定を踏まえて考慮される。このようなＦＧＦ２１突然変異体医薬組成物は、投与経路との適合性に対して選択される薬学的または生理学的に許容される製剤との混合物中に治療有効量のＦＧＦ２１タンパク質変異体を含むことができる。
【０１９６】
許容される製剤は、好ましくは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
【０１９７】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透性、粘性、明瞭さ、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、分解もしくは放出速度、吸着性または浸透を修飾、維持または保存するための製剤物質を含むことができる。適当な製剤物質は、限定はしないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、バッファー（例えば、ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、香味剤および賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパール(チロキサパール(tyloxapal))）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、緊張力増強剤（例えば、アルキル金属ハロゲン化物；好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム；またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバント（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)、およびこれの後版、参照、あらゆる目的のために出典明示により本明細書に包含させる）を含む。
【０１９８】
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式および所望の用量に依存して、当業者により決定される（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記、参照）。このような組成物は、ＦＧＦ２１タンパク質変異体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。
【０１９９】
医薬組成物における主なビヒクルまたは担体は、実際、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のために適当なビヒクルまたは担体は、恐らく非経口投与のための組成物によく見られる他の物質を補った、水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な医薬組成物は、ソルビトールまたは適当な代替物をさらに含むことができる、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓバッファーまたは約ｐＨ４．０−５．５の酢酸バッファーを含む。本発明の１つの態様において、ＦＧＦ２１タンパク質変異体組成物は、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態にて、所望の純度の程度を有する選択される組成物を任意の製剤と混合することにより（Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記）、保存用に調製することができる。さらに、ＦＧＦ２１タンパク質変異体産物は、適当な賦形剤、例えば、スクロースを使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０２００】
ＦＧＦ２１タンパク質変異体医薬組成物は、非経口投与のために選択することができる。あるいは、組成物は、消化管を介する、例えば、経口的な、吸入または送達のために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当分野の技術の範囲内である。
【０２０１】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、バッファーは、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨで、一般的に約５から約８のｐＨ範囲内で、組成物を維持するために使用される。
【０２０２】
非経口投与が考慮されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＦＧＦ２１タンパク質変異体を含むピロゲン無し非経腸的に許容される水溶液の形態においてであり得る。非経口注射のために特に適当なビヒクルは、ＦＧＦ２１タンパク質変異体が適当に保存される滅菌等張液として製剤化される滅菌蒸留水である。さらに別の調製物は、デポー注射を介して送達される産物の制御または持続放出を提供する、薬剤を有する所望の分子の製剤、例えば、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームを含むことができる。ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環の持続期間を増進する効果を有することができる。所望の分子の導入のための他の適当な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２０３】
１つの態様において、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。例えば、ＦＧＦ２１タンパク質変異体は、吸入のための乾燥粉末として製剤化することができる。ＦＧＦ２１タンパク質変異体吸入溶液もまた、エアロゾル送達のために高圧ガスで製剤化することができる。さらに別の態様において、溶液は噴霧状にすることができる。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載している国際公開ＷＯ９４／２００６９にさらに記載されている。
【０２０４】
特定の製剤は経口的に投与することができることも考慮される。本発明の１つの態様において、この様式において投与されるＦＧＦ２１タンパク質変異体は、固体投与形態、例えば、錠剤およびカプセルの合成において習慣的に使用される担体の有無にかかわらず製剤化することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティを最大化そ、前全身性分解を最小限にするとき、胃腸管部位に製剤の活性部分を放出するように設計することができる。さらなる薬剤を、ＦＧＦ２１タンパク質変異体の吸収を容易にするために含むことができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた、使用することができる。
【０２０５】
別の医薬組成物は、錠剤の製造のために適当である非毒性賦形剤との混合物中に有効な量のＦＧＦ２１タンパク質変異体を含むことができる。錠剤を滅菌水または別の適当なビヒクルに溶解することにより、溶液は単位用量形態において調製することができる。適当な賦形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；または滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクを含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
持続もしくは制御送達製剤においてＦＧＦ２１タンパク質変異体を含む製剤を含む、さらなるＦＧＦ２１タンパク質変異体医薬組成物が、当業者に明らかである。種々の他の持続もしくは制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた、当業者に知られている（例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー性微粒子の制御放出を記載している国際公開ＷＯ９３／１５７２２、およびミクロスフェア／微粒子調製および使用を記載しているWischke & Schwendeman, 2008, Int. J Pharm. 364: 298-327、およびFreiberg & Zhu, 2004, Int. J Pharm. 282: 1-18、参照）．
【０２０７】
持続放出調製物のさらなる例は、造形品の形態における半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルを含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０  ０５８  ４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidmanら 1983, Biopolymers 22: 547-56）、ポリ（２−メタクリル酸ヒドロキシエチル）（Langerら 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105）、エチレン酢酸ビニル（Langerら、上記）またはポリ−Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０  １３３  ９８８号）を含むことができる。持続放出組成物はまた、当分野で知られているいくつかの方法のいずれかにより調製することができるリポソームを含むことができる。例えば、Epsteinら 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92；および欧州特許第０  ０３６  ６７６、０  ０８８  ０４６および０  １４３  ９４９号、参照。
【０２０８】
インビボ投与のために使用されるＦＧＦ２１タンパク質変異体医薬組成物は、一般的に、滅菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を介する濾過により成し遂げることができる。組成物が凍結乾燥されるとき、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前、または後のいずれかに行うことができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液において保管することができる。加えて、非経口組成物は、一般的に、皮下注射針により貫通できるストッパーを有する滅菌点検口を有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたはバイアルに分類される。
【０２０９】
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または無水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保管することができる。このような製剤は、すぐに使える形態、または、投与前に再構成する必要なる形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保管することができる。
【０２１０】
特定の態様において、本発明は、単回投与単位を生産するためのキットである。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含む。単一および多チャンバー型の充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジ(lyosyringe)）を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０２１１】
治療に使用されるＦＧＦ２１タンパク質変異体医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に依存する。当業者は、したがって、処置に対して適当な用量レベルが、一部分において、送達される分子、ＦＧＦ２１タンパク質変異体が使用される適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的な健康状態）に依存することを理解している。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために用量を滴定し、投与経路を修飾することができる。典型的な用量は、上記因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。他の態様において、用量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。さらなる他の態様において、用量は、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、２０００μｇ／ｋｇ、３０００μｇ／ｋｇ、４０００μｇ／ｋｇ、５０００μｇ／ｋｇ、６０００μｇ／ｋｇ、７０００μｇ／ｋｇ、８０００μｇ／ｋｇ、９０００μｇ／ｋｇｏｒ１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０２１２】
投与の頻度は、使用される製剤におけるＦＧＦ２１タンパク質変異体の薬物動態パラメーターに依存する。一般的に、臨床医は、用量が所望の効果をなし遂げるように達するまで、組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、時間とともに２またはそれ以上の投与として（同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、または、移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与することができる。適当な用量のさらなる改善は、当業者により日常的に行われており、当業者により日常的に行われる活動の範囲内である。適当な用量は、適当な用量−応答データの使用を介して確認することができる。
【０２１３】
医薬組成物の投与経路は、既知の方法にしたがって、例えば、経口的；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内経路による注射を介して；持続放出系（注射もされ得る）により；または、移植デバイスによりである。所望により、組成物は、ボーラス注射により、または連続的に注入により、または移植デバイスにより投与することができる。
【０２１４】
あるいは、またはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたは他の適当な物質の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスを使用するとき、デバイスは、任意の適当な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、定時放出ボーラスまたは連続的投与を介する送達であり得る。
【０２１５】
ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の治療的使用
ＦＧＦ２１タンパク質変異体は、限定はしないが代謝障害を含む、多くの疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用することができる。１つの態様において、処置される代謝障害は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。別の態様において、代謝障害は肥満である。他の態様は、代謝状態または障害、例えば、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひおよび他の代謝障害を含む。
【０２１６】
適用において、障害または状態、例えば、１型または２型糖尿病または肥満は、治療有効用量において本明細書に記載されているＦＧＦ２１タンパク質変異体を必要とする患者に投与することにより処置することができる。投与は、本明細書に記載されているとおり、例えば、ＩＶ注射、腹腔内注射、筋肉内注射または錠剤または液体製剤の形態における経口的に行うことができる。多くの場合、所望の用量は、本明細書に記載されているとおりに、臨床医により決定することができ、ＦＧＦ２１突然変異体ポリペプチドの治療有効用量を示すことができる。治療有効用量のＦＧＦ２１突然変異体ポリペプチドが、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の投与単位、核酸分子またはポリペプチドが他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、レシピエントの免疫状態および健康状態に依存することは当業者に明白である。本明細書において使用される「治療有効用量」なる用語は、処置される疾患または障害の症状の緩和を含む、研究者、医師または他の臨床医により探求される組織系、動物またはヒトにおける生物学的または医学応答を引き起こすＦＧＦ２１突然変異体ポリペプチドの量を意味する。
【０２１７】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載されているＦＧＦ２１変異体または突然変異体の１つ以上および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで注射用として製造され；注射前に、液体ビヒクルでの溶液または懸濁液に対して適当な固体形態もまた製造することができる。リポソームは、薬学的に許容される担体の定義に含まれる。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸エステル塩などもまた、医薬組成物に存在することができる。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkinsで利用できる。
【０２１８】
融合タンパク質およびＦＧＦ２１由来ペプチド化合物
別の態様において、本発明のＦＧＦ２１変異体は、ＦＧＦ２１変異体アミノ酸配列に由来する融合タンパク質またはペプチド化合物に作り替えることができる。このような融合タンパク質およびペプチド化合物は、当分野で知られている標準技術を使用して作製することができる。例えば、ペプチド化合物は、標準ペプチド合成技術を使用する化学合成により作製し、次に、ペプチドを細胞（例えば、リポソームなど）に導入するための当分野で知られている種々の手段により細胞に導入することができる。
【０２１９】
本発明の融合タンパク質またはペプチド化合物のインビボ半減期は、ペプチド修飾、例えば、ＦＧＦ２１変異体へＮ−連結グリコシル化部位を付加させること、または例えば、リジン−モノペグ化またはシステイン−モノペグ化を介する、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ；ペグ化）にＦＧＦ２１変異体を結合することにより改善することができる。このような技術は、治療タンパク質薬物の半減期を延長することにおいて有益であることが証明されている。本発明のＦＧＦ２１変異体のペグ化が同様の医薬的利点をもたらし得ることが予期される。
【０２２０】
加えて、ペグ化は、本発明のポリペプチドの任意の部分における非天然アミノ酸の導入によりなし遂げることができる。特定の非天然アミノ酸は、Deitersら J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wangら Science 292:498-500, 2001; Zhangら Science 303:371-373, 2004または米国特許第７，０８３，９７０号に記載されている技術により導入することができる。簡潔には、これらの発現系いくつかは、ナンセンス・コドン、例えば、アンバーＴＡＧを本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入するための部位特異的突然変異誘発を含む。次に、このような発現ベクターは、導入されるナンセンス・コドンに特異的なｔＲＮＡを利用することができる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸が負荷される(charged with)。本発明のポリペプチドへ部分を結合する目的のために有益である特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものを含む。次に、これらの新規アミノ酸を含むＦＧＦ２１変異体は、タンパク質中のこれらの選択される部位でペグ化することができる。
【０２２１】
実施例
実施例１：ＦＧＦ２１変異体タンパク質の調製およびペグ化
ＦＧＦ２１変異体に対する発現構築物：ＦＧＦ２１変異体を、Achmullerら (2007) (Nature Methods 4:1037-1043)に記載されている修飾された大腸菌発現ベクターｐＥＴ３０ａにクローニングし、ＦＧＦ２１のＮ−末端（ａａ３３−２０９）にヘキサ−ヒスチジンタグ、次に、Ｎｐｒｏ−ＥＤＤＩＥタグのインフレーム融合物を産生した。
【０２２２】
ＦＧＦ２１変異体の発現および精製：ｐＥＴ３０ａ−Ｈｉｓ−Ｎｐｒｏ−ＥＤＤＩＥ−ＦＧＦ２１発現プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換した。新たに形質転換された細胞の単一コロニーの一晩培養を、３７℃で５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）で行った。前培養物をカナマイシンを有する１ＬのＴＢ培地に移し、２５０ｒｐｍで浸透しながら３７℃でバッフル付フラスコ中で培養した。６時間培養後、１ｍＭの最終濃度でのＩＰＴＧの添加によりＦＧＦ２１の発現を誘導し、培養物を３７℃で一晩培養した。次に、細胞を回収し、５０ｍＬの氷冷溶解バッファー；５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁し、次に、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒＴＭを使用して溶解した。
【０２２３】
封入体（ＩＢ）を、４℃で１時間３０，０００×ｇで遠心分離により沈殿させた。ＩＢを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、次に、３０ｍＬの溶解バッファー；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、６ＭのＧｎＨＣｌに溶解させた。溶解されたＩＢは、２５℃で１時間３０，０００×ｇで遠心分離により浄化した。ＩＢ溶液を、溶解バッファーで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ高性能樹脂（GE Healthcare）の５ｍＬのカラム上に負荷した。樹脂に結合したタンパク質を、ｐＨ４．５に低下させることにより溶離した。溶出液を、ｐＨを調整し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２０ｍＭの濃度で添加することに調整した。調整された溶出液を、１Ｌのリフォールディングバッファー；５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５Ｍのアルギニン、２０ｍＭのＤＴＴにゆっくり希釈し、次に、４℃で２日間インキュベーションした。希釈されたサンプルを濃縮し、限外ろ過方法を使用して２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９にバッファー交換した。濃縮したサンプルを、２０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で平衡化されたＱセファロース高速流樹脂（GE Healthcare）の１０ｍＬカラムに負荷した。
【０２２４】
平衡バッファーで樹脂を洗浄後、樹脂に結合したタンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９、５００ｍＭのＮａＣｌで溶離した。リフォールディングされたＦＧＦ２１タンパク質から開裂されたＨｉｓ−Ｎｐｒｏ融合フラグメントおよびあらゆる開裂されていない融合タンパク質を除去するために、溶出液を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのイミダゾールで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ高性能樹脂の５ｍＬカラムに負荷し、ＦＧＦ２１を含むフロースルー画分を回収した。エンドトキシンレベルを減少させるために、ＦＧＦ２１画分を、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２で平衡化されたＥｎｄｏＴｒａｐ  ＨＤ樹脂（Hyglos）で処理した。低エンドトキシンサンプルをＰＢＳに対して透析し、次に、０．２２μｍフィルターで滅菌した。精製されたＦＧＦ２１タンパク質を液体窒素でスナップ凍結させ、−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、ＦＧＦ２１に対するモル吸光係数として９３６２  Ｍ−１  ｃｍ−１を使用して２８０ｎｍでの吸光度により決定した。タンパク質純度および完全性を、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび液体クロマトグラフィー−質量分析により決定した。
【０２２５】
ＦＧＦ２１変異体のシステインペグ化：ｈｓＦＧＦ２１（Ｒ１５４Ｃ）変異体は、操作されたシステインを介して二量体化する傾向を有する；したがって、ペグ化前に、タンパク質溶液（一般的に、Ｔｒｉｓ  バッファー中５ｍｇ／ｍｌ）を、氷上で３０分間、５ｍＭのメルカプトエチルアミンで穏やかに還元し、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７で即座に脱塩した。次に、新たに還元されたタンパク質（一般的に３ｍｇ／ｍｌ）を、氷上で３時間、１．５当量の４０ｋＤａの分岐状マレイミド−ＰＥＧ試薬（ＳｕｎｂｒｉｇｈｔシリーズのＮＯＦ  カタログ  ＃  ＧＬ２−４００ＭＡ）で即座にペグ化した。最後に、ペグ化タンパク質を、約２５％の全収率で陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ）により精製した。
【０２２６】
ＦＧＦ２１変異体のＮ−末端ペグ化：ＦＧＦ２１変異体および４０ｋＤａの分岐状ＰＥＧ試薬（ＳｕｎｂｒｉｇｈｔシリーズのＮＯＦ  カタログ  ＃  ＧＬ２−４００ＡＬ３；ＦＧＦ２１に対して３：１モル比）の最終濃度はそれぞれ、３−４ｍｇ／ｍＬおよび９−１２ｍｇ／ｍＬであった。バッファーは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２５ｍＭの塩化ナトリウムおよび４０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムであった。反応混合物を４℃で４４時間、穏やかにタンブル(tumbled)し、反応変換物をいくつかの時点にわたってモニタリングした。２０時間でおよそ変換は５０％であり、４４時間で７０％であった。
【０２２７】
実施例２：ヒトＦＧＦ２１ジスルフィド変異体の作製
クローニングライブラリー：ベクターｐＧＡＰＺアルファＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、ベクターのユニークなＢａｍＨＩ部位においてβ−ラクタマーゼ発現カセットを付加することにより修飾した。β−ラクタマーゼ発現カセットは、Hribarら (2008) BioTechniques 44:477-84により記載されているとおりに作製した。アルファ接合因子分泌シグナル配列、６個のヒスチジンアフィニティー精製ｔａｇ、およびタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列を含むＮ−末端配列を有するインフレームにおけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターの後に、アミノ酸３３から２０９をコードするヒトＦＧＦ２１  ｃＤＮＡを、修飾ｐＧＡＰＺアルファＡベクターにクローンした。ｈＦＧＦ２１構築物のライブラリーを、野生型配列においてＣｙｓ１０３およびＣｙｓ１２１ならびにシステインに突然変異された２つの野生型アミノ酸を有するそれぞれの構築物で作製した。ライブラリーは、野生型アミノ酸の代わりにシステインをコードするプライマーでｈＦＧＦ２１アミノ酸３３−２０９コード領域のＰＣＲフラグメントを作製することにより作った。ＰＣＲフラグメントを、互いに同一の配列の１６個の塩基対を共有することができるように、または、直線状修飾ｐＧＡＰＺアルファＡベクターを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素（Takara Bio Co USA）を使用して結合することができるように設計した。それぞれの構築物を配列確認し、酵母株作製のために使用した。
【０２２８】
酵母株の作製：メタノール資化酵母酵母株ＳＭＤ１１６８Ｈ（Invitrogen）を、Yaoら (2009) J Biotechnol. Jan 15;139(2):131-6により記載されているＹＰＳ１遺伝子を破壊することにより修飾した。修飾株（ＳＭＤ１１６８ＨデルタＹＰＳ１）は、３００μｇ／ｍＬのブラストサイジンに対する耐性を有した。約５−１０μｇの配列確認されたプラスミドＤＮＡをＡｖｒ  ＩＩで消化し、ｐＧＡＰＺα−Ａに対するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアルにしたがって調製されたＳＭＤ１１６８ＨデルタＹＰＳ１細胞と混合した。細胞を、０．２ｃｍキュベット（Bio-Rad, Hercules, CA）において直線状プラスミドと混合した。細胞および直線状プラスミドを有するキュベットを、氷上で５分間インキュベートした。キュベットに、１．５ｋＶに合わせたボルト数、２５μＦに合わせたコンデンサー、および４００Ｏｈｍに合わせたパルスコントローラーを備えたＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ−ＩＩ（Bio-Rad）を使用して、パルスを発した。
【０２２９】
パルス後即座に、１ｍＬの氷冷１Ｍのソルビトールをキュベットに加え、その内容物を滅菌１５ｍＬチューブに移した。チューブを、２時間震盪することなく、３０℃でインキュベートした。電気穿孔された細胞を、１００μｇ／ｍＬのゼオシン(zeocin)（zeo）を含むＹＰＤＳ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース、１Ｍのソルビトールおよび２％の寒天）プレート上に広げた。プレートを３０℃で３−１０日間インキュベートし、コロニー形成した。それぞれの構築物の２４コロニーを取り出し、９６−ウェル  ディープ−ウェルプレートにおいて１００μｇ／ｍＬのゼオシンを含む１ｍＬのＹＰＤ増殖培地に植菌するために使用した。プレートを、９００ＲＰＭで震盪器（Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR）で３０℃で一晩インキュベートした。それぞれの培養物の１０μＬのアリコートを取り出し、９６−ウェル  ディープ−ウェルプレートにおいて９９０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した。
【０２３０】
β−ラクタマーゼ活性の比色定量のために、５０μＬの１：１００希釈培養物を９６−ウェル  マイクロタイタープレートに移した。ニトロセフィン（１ｍｇ；EMD Chemicals, Gibbstown, NJ）を１００μＬのＤＭＳＯに溶解させ、１．９ｍＬのＰＢＳに希釈し、１ｍＭの希釈標準溶液を得た。ニトロセフィン希釈標準溶液（５０ｕＬ）を、５００ｕＭの最終濃度のためにそれぞれのウェルに加えた。ニトロセフィンの添加後、プレートを暗闇下で室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。４９２ｎｍの吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  マイクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）にて測定し、β−ラクタマーゼ活性を決定した。それぞれの構築物に対して最も高いβ−ラクタマーゼ活性を有する２つの株のグリセロール貯蔵物を作り、−８０℃で貯蔵した。
【０２３１】
ｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体の小規模発現および精製：それぞれの構築物に対して最も高いβ−ラクタマーゼ比活性を有する２つの株からのｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体グリセロール貯蔵物を、９６−ウェル  ディープ−ウェルプレートにおいて１ｍＬのＢｕｆｆｅｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％のＹＮＢ、４×１０−５％のビオチン、２％のグルコースおよび２％のカザミノ酸）に植菌するために使用した。細胞増殖が飽和に達するまで、培養物を約４８時間、９００ＲＰＭ（Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR）で震盪しながら３０℃で培養した。飽和培養物のアリコート（２５ｕＬ）を、２４−ウェル  ディープ−ウェルプレートにおいて５ｍＬのＢｕｆｆｅｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍに植菌するために使用した。プレートを、３５０ＲＰＭで震盪器（Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR）で３０℃で一晩インキュベートした。約２４時間後、プレートを１５分間２５００×ｇで遠心した。培地をペレット化細胞から吸引し、１０ｋＤカットオフ膜を備えたＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５  遠心フィルターユニット（Millipore, Billerica, MA）に加えた。１０ｍＭのイミダゾールおよび１Ｘ  Ｈａｌｔ  ＥＤＴＡ無しプロテアーゼインヒビターカクテルを含む１０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４（Thermo, Rockford, IL）を濃縮器において培地に加え、全容量を１５ｍＬにした。
【０２３２】
フィルターユニットを、３０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ  プラス  遠心機（Thermo）において４０００ＲＭＰで遠心した。濃縮器フロースルー(flow through)を捨て、約１３ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４を遠心された培地に加えた。フィルターユニットを、再び４０００ＲＭＰで３０分間遠心した。濃縮バッファー交換されたサンプルを、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）スピンカラム（Qiagen, Valencia, CA）上に負荷した。カラムを、５分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  Ｍｉｃｒｏ  ２１Ｒ  遠心機（Thermo）において２７０×ｇ（１６００ｒｐｍ）で遠心し、次に１０ｍＭのイミダゾールを含む６００ｕＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で２回洗浄した。６ＨＩＳタグ化ｈＦＧＦ２１変異体を、３００ｍＭのイミダゾールを含む２００ｕＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶離した。
【０２３３】
ｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体の中規模発現および精製：２点ｐＥＲＫ細胞性アッセイ（１０および１００ｎＭ）において試験したとき、最も高い活性でｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体を発現した株からのｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体グリセロール貯蔵物を、５０ｍＬの滅菌チューブにおいて１００μｇ／ｍＬのゼオシンを含む５ｍＬのＢｕｆｆｅｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％のＹＮＢ、４×１０−５％のビオチン、２％のグルコースおよび２％のカザミノ酸）に植菌するために使用した。細胞増殖が飽和に達するまで、培養物を約４８時間、２５０ＲＰＭで震盪しながら３０℃で培養した。飽和培養物のアリコート（５０ｕＬ）を、２５０ｍＬのＵｌｔｒａ  Ｙｉｅｌｄフラスコ（Thomson Instrument Co, Oceanside, CA）において１００ｍＬのＢｕｆｆｅｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍに植菌するために使用した。フラスコを３００ＲＰＭで震盪器で３０℃で一晩インキュベートした。約２４時間後、細胞を１５分間２５００×ｇで遠心した。培地（８０ｍＬ）をペレット化細胞から吸引し、１０ｋＤカットオフ膜を備えたＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−７０  遠心フィルターユニット（Millipore, Billerica, MA）に加えた。フィルターユニットを、３０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ  プラス  遠心機（Thermo）において４０００ＲＭＰで遠心した。残っている浄化された培地（約２０ｍＬ）をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−７０  遠心フィルターに加え、フィルターにおける全容量は、１０ｍＭのイミダゾールおよび１Ｘ  ＥＤＴＡ無し  Ｈａｌｔ  プロテアーゼインヒビターカクテルを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４を加えることにより８０ｍＬに増加した。フィルターユニットを、再び、４０００ｒｐｍで３０分間遠心した。フィルターユニットにおける濃縮培地の容量は、１０ｍＭを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４を加えることにより８０ｍＬに増加した。フィルターユニットを、再び、４０００ｒｐｍで３０分間遠心した。
【０２３４】
濃縮バッファー交換されたサンプルを、１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４で前平衡化された１ｍＬのＨｉｓ−Ｇｒａｖｉｔｒａｐカラム（GE Lifesciences, Piscataway, NJ）上に負荷した。カラムを２０ｍＭのイミダゾールを含む１０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。６ＨＩＳタグ化ｈＦＧＦ２１変異体を、３００ｍＭのイミダゾールを含む２．５ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶離した。２．５ｍＬの溶離バッファーを、１０ｍＭのイミダゾールを含む２５ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で前平衡化された１０ｍＬのＰＤ−１０脱塩カラムに適用した。６ＨＩＳタグ化ジスルフィド変異体を、１０ｍＭのイミダゾールを含む３．５ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で脱塩カラムから溶離した。
【０２３５】
６ＨＩＳタグを、ＰｒｏＴＥＶプロテアーゼ（２５０ユニット；Promega, Madison, WI）を加え、サンプルを室温で２時間および４℃で一晩インキュベートすることにより、脱塩アフィニティー−精製ｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体から除去舌。タグ開裂ｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体を、１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４で前平衡化された１ｍＬのＨｉｓ−Ｇｒａｖｉｔｒａｐカラム上に負荷した。タグ開裂ｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体を含むフロースルーを回収した。Ｈｉｓ−Ｇｒａｖｉｔｒａｐカラムを、１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４、５ｍＬで洗浄した。カラムフロースルーを回収し、タグ開裂反応からのフロースルーに加えた。混合フロースルーサンプル（約８．５ｍＬ）を、１０ｋＤａカットオフ膜を備えたＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５  遠心フィルターで約１ｍＬに濃縮した。ｐＥＲＫ細胞性アッセイにおいてアッセイされるまで、濃縮されたｈＦＧＦ２１ジスルフィド変異体を−８０℃で凍結した。
【０２３６】
実施例３：２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）摂取測定
最近、ＦＧＦ２１は、インスリンの存在および非存在下でマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてグルコース摂取を刺激する、およびｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂマウスならびに８週齢ＺＤＦラットにおいて用量依存的に食餌および空腹時血糖、トリグリセリドおよびグルカゴンレベルを減少させることを示し、したがって、糖尿病および肥満を処置するための治療としてのＦＧＦ２１の使用の基礎を提供する（例えば、特許公報ＷＯ０３／０１１２１３、およびKharitonenkovら (2005) Jour. of Clinical Invest. 115:1627-1635参照）。また、ＦＧＦ２１は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−２のチロシンリン酸化を刺激することを観察した。
【０２３７】
３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ  ＃  ＣＬ１７３）から購入した。該細胞を１５０ｃｍペトリ皿においてコンフルエンシーにまで増殖させ、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補った高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃  １１９９５０６５）を有するＤＭＥＭにおいて、さらに４日間維持した。次に、細胞を３日後、４μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ  カタログ  ＃  Ｉ−５５００）、１１５μｇ／ｍｌのＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ  カタログ  ＃  Ｉ５８７９）および０．０９７５μｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ  カタログ  ＃  Ｄ１７５６）を補った上記培地で分化し、その後、分化培地を完全ＤＭＥＭと置き換えた。１つのプレートの分化された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、培地置換えの次の日に、４つの９６−ウェルプレート上に播種した。
【０２３８】
次に、脂肪細胞を完全培地において、一晩ＦＧＦ２１−ＷＴおよびＦＧＦ２１変異体で処理した（変異体のリストに関して表２参照；３０ｐＭから１００ｎＭが使用される典型的な濃度範囲である）。ＦＧＦ２１サンプルで処理される脂肪細胞は、ウェルあたり５０μｌのＫＲＨバッファー（０．７５％のＮａＣｌ；０．０３８％のＫＣｌ；０．０１９６％のＣａＣｌ２；０．０３２％のＭｇＳＯ４；０．０２５ＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５；０．５％のＢＳＡ；２ｍＭのピルビン酸ナトリウム）において２時間血清飢餓である。ブランクのためのウェルに、１５分間１μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）サイトカラシンＢを加えた。［３Ｈ］−２−ＤＯＧ（２０．６ｍｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍｃｉ／ｍｌ）を、５．１ｍＭの冷２−ＤＯＧにおいて１：２０希釈し、ウェルあたり１μｌの希釈２−ＤＯＧを細胞に加え、５分間インキュベートした。細胞を１００μｌ／ウェルのＫＲＨバッファーで３回洗浄した。４０μｌ／ウェルの１％ＳＤＳを細胞に加え、細胞を少なくとも１０分間震盪した。２００μｌ／ウェルのシンチレーション液体を加え、プレートを一晩震盪し、ベータ−マイクロプレートリーダーで読んだ。サイトカラシンＢで処理された全カラム／列から得られた値を平均し、全ての他の値から引いた。データをＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍ  ソフトウェアにより分析し、該結果は表２に要約される
【０２３９】
表２．３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞  ２−デオキシ−グルコース（２−ＤＯＧ）摂取アッセイにおけるＦＧＦ２１ＷＴおよびＦＧＦ２１変異体のＥＣ５０値および相対的効力（Ｆｏｌｄ−ＷＴ）の要約
【表６−１】
2014500880.tif 000013
【表６−２】
2014500880.tif 000014
（１）「Ｆｏｌｄ−ＷＴ」は、同じ実験において「直接的」で行われたＦＧＦ２１−ＷＴに対するＦＧＦ２１変異体のＥＣ５０値の比率である。
【０２４０】
実施例４：細胞ウェスタン（ＩＣＷ）アッセイにおけるｐＥＲＫ。ヒトβ−クロトーで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ高グルコース、１０％のＦＢＳ、１％のＰＳおよび６００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８において培養し、ウェルあたり３０，０００個の細胞で一晩でポリ−Ｄ−リジン被覆９６−ウェルプレート（BD bioscience, 356640）に播種した。細胞は、４時間、ＤＭＥＭ高グルコース、０．５％のＢＳＡおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳにおいて血清飢餓した。ＷＴ  ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１変異体（変異体のリストに関して表３参照）を、飢餓培地において、種々の濃度に希釈した（１００ｐＭから３００ｎＭが使用される典型的な濃度範囲である）。細胞を１０分間、ＦＧＦ２１で刺激した。ＦＧＦ２１刺激後、培地をウェルから吸引し、細胞を１００μｌの冷ＰＢＳで１回洗浄し、次に、ＲＴで１５分間１００μＬの４％ホルムアルデヒドで固定し、次に、１００μｌの氷冷メタノールでさらに１０分間インキュベーションした。
【０２４１】
固定後、細胞をＰＢＳ中の０．３％のトリトンＸ−１００で４回、それぞれ５分洗浄した。１５０μｌのＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファーを、室温で１．５時間、透過処理した細胞に加えた。ホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）抗体を０．１７μｇ／ｍｌの濃度（１：２００希釈、または示された希釈）に希釈し、全−ＥＲＫ（ｔＥＲＫ）抗体をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  バッファーにおいて２．２μｇ／ｍｌの濃度（１：２００希釈、または示された希釈）に希釈した。５０μｌを、バックグラウンドのために標準化する二次抗体で処理されたのみである１つのカラムを含めない全てのウェルに加えた。プレートを湿紙タワー(tower)で被覆し、蒸発を防止するために蓋をし、次に４℃で一晩インキュベートした。
【０２４２】
その後、一次抗体を吸引し、細胞を、ＰＢＳ中の０．３％のＴｗｅｅｎ  ２０でそれぞれ５分間４回洗浄した。洗浄中、二次抗体反応混合物は、１：１０００−希釈（または示された希釈）ヤギ抗−マウスＡｌｅｘａ  ６８０および１：１０００−希釈（または示された希釈）ＩＲＤｙｅ８００  ヤギ抗−ウサギ抗体を含むＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファーにおいて調製した。洗浄が完了したら、４０μＬの反応混合物をそれぞれのウェルに加えた。プレートに黒色の蓋を被せ、光から二次抗体を保護し、プレートを震盪器上でＲＴで１時間インキュベートした。最後に、細胞を再び、ＰＢＳ中の０．３％のＴｗｅｅｎ  ２０でそれぞれ５分間４回洗浄し、次に７００ｎｍ（赤）および８００ｎｍ（緑）チャンネルにおいてＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE）にてスキャンした。Ａｌｅｘａ  ６８０は近赤外蛍光（発光波長６６８ｎｍ）でｔＥＲＫを染色したが、ＩＲＤｙｅ８００は緑色蛍光（発光波長８００ｎｍ）でｐＥＲＫを染色した。蛍光バックグラウンドを除去するために、二次抗体のみで処理された全体の段／列から得られた値を平均し、プレートから得られた全ての他の値から引いた。それぞれのサンプルに存在するｐＥＲＫの量の標準化のために、それぞれのウェルにおけるｐＥＲＫに対する値を、ｔＥＲＫの値で割った。データはＧｒａｐｈＰａｄ  プリズム  ソフトウェアにより分析し、該結果は表３に要約される。
【０２４３】
表３．ヒトβ−クロトーで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用するｐＥＲＫ細胞性アッセイにおけるＦＧＦ２１ＷＴおよびＦＧＦ２１変異体のＥＣ５０値および相対的効力（Ｆｏｌｄ−ＷＴ）の要約
【表７−１】
2014500880.tif 000015
【表７−２】
2014500880.tif 000016
【表７−３】
2014500880.tif 000017
（１）「Ｆｏｌｄ−ＷＴ」は、同じ実験において「直接的」で行われたＦＧＦ２１−ＷＴのＥＣ５０値に対するＦＧＦ２１変異体のＥＣ５０値の比率である。
【０２４４】
実施例５：ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１変異体のインビボ試験−薬物動力学および血漿暴露。ｏｂ／ｏｂマウスは、２型糖尿病のマウスモデルである。該マウスは、機能性レプチンを欠いており、高血糖、インスリン耐性、過食症、肝臓脂肪症および肥満により特徴付けられる。オスｏｂ／ｏｂマウス（１０−１３週齢）を使用し、以下：（１）野生型ＦＧＦ２１、（２）ＦＧＦ２１変異体、（３）ペグ化野生型ＦＧＦ２１、および（４）ペグ化ＦＧＦ２１変異体の血糖に対する効果を評価した。
【０２４５】
野生型ＦＧＦ２１、変異体ＦＧＦ２１またはＰＢＳビヒクルを、１ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｌ／ｋｇで１日に１回５日間ｓ．ｃ．投与した。試験の最初の日に、尾の血糖および体重を測定し、マウスを、グループ間で平均グルコースおよび体重を合わせて、異なるグループ（グループあたりｎ＝８）に配分した。１、３および５日の投与前、ならびに投与後２および４時間で、ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（OneTouch）を使用して血糖を測定した。これらの試験の結果は、表４に要約される。
【０２４６】
表４。ｏｂ／ｏｂマウスにおける５日間スクリーニング試験中の、ＦＧＦ２１変異体による全グルコースＡＵＣの減少パーセント。
【表８−１】
2014500880.tif 000018
【表８−２】
2014500880.tif 000019
（１）「ＷＴに対する倍異数変化」は、同じ実験において「直接的」で行われたＦＧＦ２１−ＷＴの「グルコースＡＵＣ減少」に対するＦＧＦ２１変異体の「グルコースＡＵＣ減少」の比率である。
【０２４７】
マウスに、ペグ化ＦＧＦ２１野生型を１ｍｇ／ｋｇで、ペグ化ＦＧＦ２１変異体を０．３、１または３ｍｇ／ｋｇで、またはＰＢＳビヒクルを４ｍｌ／ｋｇで、週に２回を２週間ｓ．ｃ．投与した。試験の最初の日に、尾の血糖および体重を測定し、マウスを、グループ間で平均グルコースおよび体重を合わせて、異なるグループ（グループあたりｎ＝８）に配分した。１、４、８および１１日目の投与前に、ならびに投与後４時間で、ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒを使用して血糖を測定した。さらなる血糖測定を、それぞれの投与後２４時間で、２、５、９および１２日目に行った。１日目の投与前および最後の投与後２４時間で１２日目に血漿インスリンを測定した。１日目の投与前および第２の投与後２４時間で５日目に血漿トリグリセリドを測定した。これらの試験の結果は、表５に要約される。
【０２４８】
表５。ｏｂ／ｏｂマウスにおける１２日間試験中の、ペグ化ＦＧＦ２１野生型（ＷＴ）および変異体による血漿グルコース、インスリン、トリグリセリド（ＴＧ）、体重（ＢＷ）増加、肝臓ＴＧ／脂質のビヒクルに対する％変化。
【表９】
2014500880.tif 000020
【０２４９】
Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧ変異体は、表５に示されるとおり、優れたインビボ代謝プロフィールを示す。Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧもまた、ＦＧＦ２１−ＷＴ−Ｒ１５４Ｃ−ＰＥＧ（−７％肝臓トリグリセリド変化、ビヒクルコントロールグループと有意に異ならない；図１）と比較して、優れた肝臓トリグリセリド低下特性（−２５％肝臓トリグリセリド変化、ビヒクルコントロールグループと有意に異なる；図１）を示す。両方が１ｍｇ／ｋｇで同じ試験において投与されたとき（ＷＴ−Ｒ１５４Ｃ−ＰＥＧ、ｅｘｐ３）、両方の化合物に対する血漿暴露（図２）は当量であり、他の有効性終点（全グルコースＡＵＣ、血漿インスリン、体重増加および血漿トリグリセリド）は有意に異ならなかった。
【０２５０】
実施例６：野生型ＦＧＦ２１およびペグ化ＦＧＦ２１変異体での血漿安定性アッセイ
ペグ化ＦＧＦ２１変異体と比較して野生型ＦＧＦ２１（ＦＧＦ２１−ＷＴ）の血漿安定性を測定するために、血漿安定性アッセイを実行した。十（１０）μＬのＦＧＦ２１−ＷＴ（４．８４ｍｇ／ｍｌ）および３５．５μＬのＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧ（２．１２ｍｇ／ｍｌ）を９０μｌおよび２６４．５μＬのｏｂ／ｏｂマウス血漿（９０％および８８％血漿）に加えた。それぞれのサンプルから５つのアリコートを作り、１時間、４時間、２４時間、４８時間および７２時間インキュベートした。全ての時点からのサンプルを回収するまで、血漿処理サンプルを４℃で貯蔵した。九（９）μＬの血漿処理ＦＧＦ２１−ＷＴおよび２７μＬの血漿処理ＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧを、７５０μＬの培地（１．２％血漿で３００ｎＭのＦＧＦ２１−ＷＴおよび３．６％血漿で４５０ｎＭのＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧ）に加え、培地で１：３に８回連続希釈された。ヒトβ−クロトーで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、１０分間タンパク質で処理、次にｐＥＲＫ  ＩＣＷの標準プロトコールをした。未処理ＦＧＦ２１−ＷＴ、ＦＧＦ２１−Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧならびに１．２％および３．６％マウス血漿もまた、コントロールとして含まれる。これらの実験の結果は、図３Ａおよび３Ｂにより描写されるグラフである。
【０２５１】
ＦＧＦ２１−ＷＴは、３７℃でマウス血漿とインキュベートしたとき、短い期限（１−４時間）で活性を失ったが、Ｖ７６−１５４Ｃ−ＰＥＧは、対照的に、３７℃でマウス血漿とインキュベートしたとき、少なくとも７２時間その完全活性を保持した。
【０２５２】
本発明は、それらの特定の態様を基準にして記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変化が作られ得、均等が置き換えられ得ることを当業者により理解されるべきである。加えて、多数の修飾が、本発明の対象、精神および範囲に対して、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程を採用され得る。全てのこのような修飾は、本発明の範囲内であると意図される。
【図１】
2014500880.tif 000021
【図２】
2014500880.tif 000022
【図３】
2014500880.tif 000023
【配列表】
2014500880000001.app
【国際調査報告】
2014500880.tif 000024
2014500880.tif 000025
2014500880.tif 000026
2014500880.tif 000027
2014500880.tif 000028