(57)【要約】 【課題】ピラゾール誘導体化合物およびその薬学的に許容される塩を提供する。【解決手段】本発明の化合物は、優れた骨粗しょう症予防および治療効果がある。【選択図】図７
2014506920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表される化合物。
【化１】
2014506920.tif 000025
（式中、Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｘが−ＣＨ−であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３は置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、Ｘが窒素原子であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３はニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。）
【請求項２】
下記化学式１で表される化合物の薬学的に許容される塩。
【化２】
2014506920.tif 000026
（式中、Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、または置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。）
【請求項３】
前記薬学的に許容される塩が塩酸塩である、請求項２に記載の化学式１で表される化合物の薬学的に許容される塩。
【請求項４】
下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはそれらの薬学的に許容される塩：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［２−（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、または
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【請求項５】
下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはそれらの薬学的に許容される塩：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、または
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩。
【請求項６】
下記化学式２で表される化合物、および下記化学式３で表される化合物を極性有機溶媒に滴加する段階と、
前記化学式２および前記化学式３で表される化合物を含む前記極性有機溶媒を加熱する段階とを含んでなる、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法：
【化３】
2014506920.tif 000027
【化４】
2014506920.tif 000028
【化５】
2014506920.tif 000029
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
ＲａはＣ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、または置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【請求項７】
前記有機溶媒の下で、前記化学式２で表される化合物と前記化学式３で表される化合物とを反応させることにより、下記の化学式４で表される化合物を製造する、請求項６に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法：
【化６】
2014506920.tif 000030
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ２が水素原子であれば、Ｒ３はフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【請求項８】
前記化学式４で表される化合物を、塩基存在下に、イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルヨージド、イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルクロライド、およびイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルブロマイドよりなる群から選ばれた少なくとも１種のハロゲン化化合物と反応させる段階をさらに含む、請求項７に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項９】
前記化学式４で表される化合物と、前記ハロゲン化化合物とは相間移動触媒の下で反応させる、請求項８に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１０】
前記極性有機溶媒がＣ１〜Ｃ４のアルコール、酢酸およびこれらの混合物の中から選ばれる、請求項６に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１１】
前記滴加が−４℃〜１０℃で行われる、請求項６に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１２】
前記加熱が９０℃〜１３０℃で行われる、請求項６に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１３】
前記塩基が、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ピリジン、トリエチルアミン、イミダゾールおよび炭酸塩よりなる群から選ばれた少なくとも１種である、請求項８に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１４】
前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩が、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［２−（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、または
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールである、請求項６に記載の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１５】
下記化学式１で表される化合物を含む、骨粗しょう症予防または治療用組成物：
【化７】
2014506920.tif 000031
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｘが−ＣＨ−であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３は置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、Ｘが窒素原子であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３はニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【請求項１６】
下記化学式１で表される化合物の薬学的に許容される塩を含む、骨粗しょう症予防または治療用組成物：
【化８】
2014506920.tif 000032
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【請求項１７】
下記の列挙された化合物およびそれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を含む、骨粗しょう症予防または治療用組成物：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［２−（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、および
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【請求項１８】
下記化学式１で表される化合物を哺乳類に投与して骨粗しょう症を予防または治療する方法：
【化９】
2014506920.tif 000033
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｘが−ＣＨ−であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３は置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、Ｘが窒素原子であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３はニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【請求項１９】
下記化学式１で表される化合物の薬学的に許容される塩を哺乳類に投入して骨粗しょう症を予防または治療する方法：
【化１０】
2014506920.tif 000034
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３はフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【請求項２０】
下記の列挙された化合物およびそれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を哺乳類に投入して骨粗しょう症を予防または治療する方法：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［２−（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、および
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素抑制活性に優れる新規なピラゾール誘導体、その製造方法、並びにそれを含む骨粗しょう症予防および治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の発生、成長および代謝過程には、骨のモデリング（ｂｏｎｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）とリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）過程が重要な役割を果たす。骨のモデリングは、胎生期から始まり、骨格が成熟して成長が終わる青壮年期まで持続して２０代〜３０代初めに最大骨量に達する。以後約３年間は、骨を除去しさらにこれを補充する骨リモデリング過程を繰り返し行うが、この際には骨形成と骨吸収が対を成してバランスを取る。この時期を経た後は、骨吸収による骨消失を骨形成が十分に追従できないため、年間０．３〜０．５％程度の骨量減少を示し、特に女性の場合には閉経初期に年間２〜３％の相当な骨損失を示す。
【０００３】
骨は大きく骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）、ライニング細胞（ｌｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ）および骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）の４つの細胞から構成されている。この際、骨髄間質細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）に由来する骨芽細胞は、骨基質を合成する分化細胞として骨形成を主導し、造血幹細胞に由来する破骨細胞は骨吸収を主導する。
【０００４】
骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は、骨組織の石灰が減少して骨の緻密質が薄くなり、それにより骨髄腔が広くなる状態であって、症状が進むにつれて骨が脆くなるため、小さい衝撃でも骨折し易い。骨量は、様々な要因、例えば、遺伝的要因、栄養摂取、ホルモンの変化、運動および生活習慣の違いなどにより影響を受ける。骨粗しょう症の原因としては老齢、運動不足、低体重、喫煙、低カルシウム食餌、閉経、卵巣切除などが知られている。一方、個人差はあるものの、白人より黒人が骨再吸収水準（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）が低くて骨量がさらに高く、おおよそ骨量は１４〜１８歳に最も高く、老後には１年に約１％ずつ減少する。特に、女性の場合、３０歳以後から骨減少が持続的に進み、閉経期に達すると、ホルモンの変化により骨減少が急激に進む。すなわち、閉経期に達すると、エストロゲン濃度が急速に減少するが、この際、まるでＩＬ−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７）によるかのように、Ｂ−リンパ球（Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が多量生成されて骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）にＢ細胞前駆体（ｐｒｅ−Ｂ ｃｅｌｌ）が蓄積され、これによりＩＬ−６の量が増加して破骨細胞の活性を増加させるので、結果として骨量が減少する。
【０００５】
このように、骨粗しょう症は、程度の差はあるものの、老年層、特に閉経期以後の女性においては回避できない症状であって、先進国では人口が老齢化するにつれて骨粗しょう症およびその治療剤に対する関心が益々増加しつつある。また、全世界的に骨疾患の治療に関連して約１３００億ドルの市場が形成されているものと知られており、これからさらに増加するだろうと予想されるため、世界的な各研究機関と製薬会社では骨疾患治療剤の開発に多くの投資を行っている。韓国内でも、近来、平均寿命が８０歳に達することにより、骨粗しょう症の有病率が急激に増加しているが、最近、地域住民を対象として行われた研究によれば、全国人口を標準人口とした場合、男性の４．５％、女性の１９．８％が骨粗しょう症にかかっていると報告されたことがある。これは、骨粗しょう症が糖尿病または心血管系疾患よりありふれた疾患であり、骨折による患者の苦痛または治療費用を推定するとき、骨粗しょう症が非常に重要な保健問題であることを示唆する。
【０００６】
今まで様々な物質が骨粗しょう症の治療剤として開発された。その中でも、骨粗しょう症の治療剤として最も多く使われるエストロゲンは、その実際的な効能が未だ検証されていない状態であり、一旦開始したら、これから一生服用し続けなければならないという欠点があり、長期間投与する場合、乳癌や子宮癌が増加するという副作用がある。
【０００７】
アレンドロネート（ａｌｒｅｎｄｒｏｎａｔｅ）も、その効能が明確でなく、消化管における吸収が遅く、胃腸と食道粘膜に炎症を誘発するという問題がある。カルシウム製剤は、副作用が少なく、優れた効果を示すものと知られているが、治療剤というよりは予防剤に該当する。その他に、カルシトニンなどのビタミンＤ製剤が知られているが、それも未だ効能および副作用に関する研究が十分に行われていない状態である。よって、副作用が少なくかつ効果が優れる新規な代謝性骨疾患治療剤が求められている。
【０００８】
一方、最近では、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）から誘発されたＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）が骨の代謝に関わっているという研究結果が報告されている(Darden, A.G., et al., J. Bone Miner, Res., 11:671-675, 1996; Yang, S., et al., J. Biol. Chem., 276:5452-5458, 2001; Fraser, J.H., et al., Bone 19:223-226, 1996; Yang, S., et al., Clacif. Tissue Int., 63:346-350, 1998)。しかも、骨のリモデリング（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）は、骨を形成する（ｂｏｎｅ ｆｏｒｍｉｎｇ）骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）と、骨を吸収する（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ）破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ、ＯＣ）の相対的な作用によって行われるものと知られている。多核（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ）破骨細胞は、多核化された巨細胞（ｍｕｌｔｉ−ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ）を形成するための細胞粘着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、細胞間接触（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）および末端融合（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ）の多段階過程による造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の単球マクロファージ系（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｌｉｎｅａｇｅ）から分化される。この過程は、ＮＦ−ｋＢの受容体活性因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋＢ、以下「ＲＡＮＫ」と略記する）と呼ばれる受容体と、ＮＦ−ｋＢの受容体活性因子リガンド（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−ＫＢ ｌｉｇａｎｄ、以下「ＲＡＮＫＬ」と略記する）と呼ばれるＲＡＮＫＬとが結合しながら開始し、次いで、幾つかのシグナル伝達系（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ）の活性化により伝達される。活性化されたシグナル経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）は、ＴＮＦ受容体関連因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ）６（以下「ＴＲＡＦ６」と略記する）によるＮＦ−ＫＢ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ、以下「ＥＲＫ」と略記する）、ｃ−Ｊｕｎ、Ｎ−末端キナーゼ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ、以下「ＪＮＫ」と略記する）およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）を含む。このようなシグナル伝達現象は破骨細胞の分化および作用の調節に直接的な影響を及ぼす(Boyle, N.J., et al., Nature, 423:337-342, 2003)。一旦、破骨細胞が分化すると、骨の吸収はＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）により発生したＲＯＳによって促進される。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの抑制剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はＲＯＳおよび骨吸収の減少を誘導する(Yang, S., et al., Clacif. Tissue Int., 63:346-350, 1998)。このような結果は、破骨細胞におけるＲＯＳの発生がＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性に依存的であり、破骨細胞の機能に直接的な連関があるという理論と一致する。
【０００９】
そこで、本発明者は、活性酸素（ＲＯＳ）の生成を抑制する分子的メカニズムを用いて骨粗しょう症の治療剤を開発することができるということに着目し、鋭意研究を重ねた結果、本発明のピラゾール誘導体が活性酸素生成抑制活性に優れることを見出し、それらが骨粗しょう症の予防または治療に使用できることを確認することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、活性酸素生成抑制活性に優れる新規なピラゾール誘導体、その製造方法、およびそれらを含む骨粗しょう症治療用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明の新規なピラゾール誘導体を投与して骨粗しょう症を予防または治療する方法、および骨粗しょう症予防または治療のための薬学的製剤を製造するための本発明の新規なピラゾール誘導体の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記化学式１で表される化合物およびその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１３】
【化１】
2014506920.tif 000003
【００１４】
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【００１５】
本発明の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩において、好ましくは、Ｒ２は水素原子、プロピルまたはベンジルであり、Ｒ３はフェニル、ニトロフェニルまたは１，２−ジフェニルエテニルであってもよい。
【００１６】
前記化学式１で表される化合物は、好ましくは、Ｘが−ＣＨ−であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３は置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、Ｘが窒素原子であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３はニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、前記化学式１で表される化合物の塩は、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよい。
【００１７】
本発明の化合物は、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物およびそれらの薬学的に許容される塩であってもよい。
【００１８】
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、または
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【００１９】
本発明の化合物は、好ましくは、下記列挙された化合物およびそれらの薬学的に許容される塩であってもよい。
【００２０】
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩。
【００２１】
本発明において、薬学的に許容される塩は、医薬業界で通常使用される塩を意味し、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、臭素酸、ヨウ素酸、過塩素酸、スズ酸、および硫酸などから製造された無機酸塩、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などから製造された有機酸塩、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などから製造されたスルホン酸塩などであってもよく、列挙されたこれらの塩によって、本発明で意味する塩の種類が限定されるものではない。好ましくは、前記薬学的に許容される塩は塩酸塩であってもよい。
【００２２】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩は、活性酸素の生成を抑制して骨粗しょう症を予防または治療することができる。例えば、本発明の化学式１の化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制することにより、活性酸素の生成を抑制することができる。マクロファージの破骨細胞への分化に重要な物質であるＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制することにより、破骨細胞の生成を抑制することができる。
【００２３】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、活性酸素の生成を抑制して骨粗しょう症を予防または治療することができる。例えば、本発明の化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害することにより、活性酸素の生成を抑制することができる。
【００２４】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、マクロファージの破骨細胞への分化に重要な物質であるＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制することにより、破骨細胞の生成を抑制することができる。
【００２５】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、骨の破壊を防いで骨粗しょう症を治療または予防することができる。
【００２６】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、毒性が低くかつ安定性に優れて血液内で長時間分解されないため、高い体内血中濃度を長時間維持することができる。すなわち、本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩は、韓国登録特許第０９４２３８２号に開示された化合物より毒性が著しく低く、安定性は著しく高いため、骨粗しょう症の治療または予防に極めて優れた効果を示すことができる。
【００２７】
本発明は、下記化学式２で表される化合物、および下記化学式３で表される化合物を極性有機溶媒に滴加する段階と、前記化学式２および前記化学式３で表される化合物を含む前記極性有機溶媒を加熱する段階とを含んでなる、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法を提供する。
【００２８】
【化２】
2014506920.tif 000004
【００２９】
【化３】
2014506920.tif 000005
【００３０】
【化４】
2014506920.tif 000006
【００３１】
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
ＲａはＣ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【００３２】
本発明の前記製造方法によって、下記の化合物またはその薬学的に許容される塩が製造できる。
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−
オルの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、または
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【００３３】
本発明の製造方法において、好ましくは、下記の化合物またはその薬学的に許容される塩が製造できる。
【００３４】
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩。
【００３５】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法において、出発物質として用いられる、化学式２で表される化合物であるα−置換−β−ケトエステルは、商業的に販売されるものを使用することができる。または、文献「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１０，１９７８，２０８７−２０８８」に記載された方法によって製造することができ、具体的に説明すると、商業的に販売されるアシルクロライド誘導体をメルドラム酸（Ｍｅｌｄｒｕｍ’ｓ  ａｃｉｄ）と反応させて生成した生成物をメタノールまたはエタノールなどの有機溶媒の下に加熱還流させてβ−ケトエステルを製造することができる。α−置換−β−ケトエステルは、文献「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１９８６，１１３９−１１４３」に記載された方法によって製造することができ、具体的に説明すると、炭酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）または炭酸セシウム（ｃｅｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）の存在下でβ−ケトエステルとハロゲン化アルキルとの反応によって容易に製造することができる。
【００３６】
本発明の製造方法において、反応物質としての化学式３で表される化合物は、市販のものを使用することができ、出発物質としての化学式２で表される化合物１モル当量に対して、前記化学式３で表される化合物約１〜３モル当量使用することができ、好ましくは約１〜１．３モル当量使用することができる。
【００３７】
本発明の製造方法において、極性有機溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４のアルコール、または酢酸、またはこれらの混合物であってもよく、好ましくはエタノールまたは酢酸であってもよい。
【００３８】
本発明の製造方法において、前記化学式１で表される化合物を酸性物質と反応させ、前記化学式１で表される化合物の塩を製造することができる。前記酸性物質は、前記化学式１で表される化合物と反応して塩を形成することが可能な物質であれば、その種類が特に限定されない。例えば、前記酸性物質は、塩酸、硝酸、リン酸、臭素酸、ヨウ素酸、過塩素酸、スズ酸および硫酸などの無機酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などの有機酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などから製造されたスルホン酸などを挙げることができ、好ましくは塩酸を挙げることができる。
【００３９】
本発明の製造方法において、前記化学式２で表される化合物、および前記化学式３で表される化合物を極性有機溶媒に−４℃〜１０℃で滴加できる。
【００４０】
本発明の製造方法において、前記化学式２で表される化合物と、前記化学式３で表される化合物とを含む有機溶媒は、溶媒を還流させることが可能な温度で加熱し、好ましくは約１００〜約１３０℃で加熱することができる。
【００４１】
本発明の製造方法において、前記化学式２で表される化合物と、前記化学式３で表される化合物とを含む有機溶媒は、約１０分〜７２時間加熱することができる。
【００４２】
本発明の製造方法において、前記化学式２で表される化合物と、前記化学式３で表される化合物とを有機溶媒の下で反応させて、下記化学式４で表される化合物が製造できる。
【００４３】
【化５】
2014506920.tif 000007
【００４４】
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ２が水素原子であれば、Ｒ３はフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
本発明の化学式１で表される化合物の製造方法において、前記化学式４で表される化合物を、塩基の存在下に、イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルヨージド、イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルクロライド、またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルブロマイドなどのハロゲン化化合物と反応させ、前記化学式１で表される化合物においてピラゾールの５位の炭素位置にイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ基が結合した、化学式１で表される化合物を製造することができる。
【００４５】
前記化学式４で表される化合物と、前記ハロゲン化化合物との反応において、前記塩基は、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ピリジン、トリエチルアミン、イミダゾール、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩の金属塩、またはこれらの混合物であってもよい。前記塩基は、前記化学式２で表される化合物１モル当量に対して約０．０５〜約３モル当量、好ましくは約２〜約３モル当量使用することができる。
【００４６】
前記化学式４で表される化合物と、前記ハロゲン化化合物との反応において、前記反応溶媒は、水と有機溶媒との混合物であってもよく、好ましくは水と塩化メチレン、エチルエーテル、酢酸エチル、ＴＨＦ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）およびＤＭＦ（Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）の中から選ばれた少なくとも１種の有機溶媒との混合物であってもよく、さらに好ましくは水と塩化メチレンとの混合物であってもよい。
【００４７】
前記化学式４で表される化合物と前記ハロゲン化化合物との反応は、相間移動触媒の下で行われ得る。このような場合、ピラゾール基の２位のアミン基が、アルキル化された不純物の生成を抑制することにより、より高い純度で、前記化学式１で表される化合物を得ることができる。前記相間移動触媒は、その種類が特に限定されるものではないが、好ましくはＢｕ４ＮＨＳＯ４を使用することができる。
【００４８】
前記化学式４で表される化合物と前記ハロゲン化化合物との反応において、反応温度は約０〜約４０℃が好ましく、１５〜３０℃がさらに好ましく、反応時間は１０〜１２時間程度が好ましいが、反応速度に応じて反応温度をさらに高めることができ、反応時間をさらに増加させることができる。
【００４９】
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、骨粗しょう症予防または治療用薬学組成物を提供する：
【００５０】
【化６】
2014506920.tif 000008
【００５１】
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【００５２】
前記化学式１で表される化合物は、好ましくは、Ｘが−ＣＨ−であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３は置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、Ｘが窒素原子であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３はニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、前記化学式１で表される化合物の塩は、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３がフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよい。
【００５３】
また、本発明は、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物およびそれらの薬学的に許容される塩を含む、骨粗しょう症予防または治療用組成物を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、または
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【００５４】
本発明は、好ましくは、下記列挙された化合物の中から選ばれた１種以上の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を含む、骨粗しょう症予防または治療用組成物を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、または
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩。
【００５５】
本発明において、「骨粗しょう症」は、骨全体において骨髄腔などの空いた部分を除いた骨の絶対量が減少した状態であって、老人性骨粗しょう症、閉経後骨粗しょう症、内分泌性骨粗しょう症、先天性骨粗しょう症、不動性骨粗しょう症または外傷性骨粗しょう症が含まれ得る。
【００５６】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、活性酸素の生成を抑制して骨粗しょう症を予防または治療することができる。例えば、本発明の化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害することにより、活性酸素の生成を抑制することができる。本発明の組成物は、マクロファージの破骨細胞への分化に重要な物質であるＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制することにより、破骨細胞の生成を抑制することができる。
【００５７】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、骨の破壊を防いで骨粗しょう症を治療または予防することができる。
【００５８】
本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、毒性が低くかつ安定性に優れるため、血液内で長時間分解することなく維持できて高い体内血中濃度を示すことができる。すなわち、本発明の前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、韓国登録特許第０９４２３８２号に開示された化合物を含む組成物より毒性が著しく低く、安定性は著しく高いため、骨粗しょう症の治療または予防に卓越した効果を示すことができる。
【００５９】
本発明の組成物は、本発明の効果を阻害しない範囲内で薬学的に許容される希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、ｐＨ調節剤、酸化防止剤、溶解補助剤などの添加剤を含むことができる。
【００６０】
希釈剤は、砂糖、澱粉、微結晶セルロース、乳糖（乳糖水和物）、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、アルギン酸塩、アルカリ土金属類塩、クレイ、ポリエチレングリコール、無水リン酸水素カルシウム、またはこれらの混合物などを使用することができ、結合剤は、澱粉、微結晶セルロース、高分散性シリカ、マンニトール、Ｄ−マンニトール、ショ糖、乳糖水和物、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ポリビニルピロリドン共重合体（コポビドン）、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天然ガム、合成ガム、コポビドン、ゼラチン、またはこれらの混合物などを使用することができる。
【００６１】
崩壊剤は、澱粉グリコン酸ナトリウム、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉または前糊化澱粉などの澱粉または変性澱粉；ベントナイト、モンモリロナイトまたはビーガム（ｖｅｅｇｕｍ）などのクレイ；微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースなどのセルロース類；アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸などのアルギン類；クロスカルメロースナトリウムなどの架橋セルロース類；グアーガム、キサンタンガムなどのガム類；架橋ポリビニルピロリドンの架橋重合体；重炭酸ナトリウム、クエン酸などの沸騰性製剤、またはこれらの混合物を使用することができる。
【００６２】
潤滑剤は、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水素化植物性オイル、安息香酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ベヘン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、コロイド性二酸化ケイ素、またはこれらの混合物などを使用することができる。
【００６３】
ｐＨ調節剤は、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、エーテル酸ナトリウム、リンゴ酸、コハク酸、スズ酸、フマル酸、クエン酸などの酸性化剤や、沈降炭酸カルシウム、アンモニア水、メグルミン、炭酸ナトリウム、酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、三塩基カルシウムリン酸塩などの塩基性化剤などを使用することができる。
【００６４】
酸化防止剤は、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、酢酸トコフェロール、トコフェロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウムなどを使用することができる。本発明の先放出性区画において、溶解補助剤はラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベートなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ドキュセートナトリウム、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）などを使用することができる。
【００６５】
また、遅延放出性製剤を作るために、腸溶性高分子、水不溶性重合体、疎水性化合物および親水性高分子を含むことができる。
【００６６】
前記腸溶性高分子とは、ｐＨ５未満の酸性条件の下で不溶性のまたは安定なものであって、ｐＨ５以上の特定のｐＨ条件下で溶解または分解される高分子のことを意味し、例えば、ヒプロメロースアセテートスクシネート、ヒプロメロースフタレート（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、ヒドロキシメチルエチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートマレート、セルロースベンゾエートフタレート、セルロースプロピオネートフタレート、メチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロースおよびエチルヒドロキシエチルセルロースフタレート、メチルヒドロキシエチルセルロースなどの腸溶性セルロース誘導体；スチレン−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチルメタクリル酸共重合体（例えば、アクリル−ＥＺＥ）、アクリル酸ブチル−スチレン−アクリル酸共重合体、およびアクリル酸メチル−メタクリル酸−アクリル酸オクチル共重合体などの前記腸溶解性アクリル酸系共重合体；ポリ（メタクリル酸メチルメタクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、エボニック、ドイツ）、ポリ（メタクリル酸エチルアクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＬ１００−５５）などの腸溶性ポリメタクリレート共重合体；酢酸ビニル−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸モノエステル共重合体、ビニルメチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、エチレン−マレイン酸無水物共重合体、ビニルブチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、アクリロニトリル−クリル酸メチル・マレイン酸無水物共重合体、およびアクリル酸ブチル−スチレン−マレイン酸無水物共重合体などの腸溶性マレイン酸系共重合体；およびポリビニルアルコールフタレート、ポリビニルアセタールフタレート、ポリビニルブチレートフタレートおよびポリビニルアセトアセタールフタレートなどの腸溶性ポリビニル誘導体がある。
【００６７】
前記水不溶性重合体は、薬物の放出を制御する、薬学的に許容される水に溶解しない高分子のことをいう。例えば、水不溶性重合体は、ポリビニルアセテート（例えば、コリコートＳＲ３０Ｄ）、水不溶性ポリメタクリレート共重合体［例えば、ポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＮＥ３０Ｄ、ポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート−トリメチルアミノエチルメタクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＲＳＰＯ）など）］、エチルセルロース、セルロースエステル、セルロースエーテル、セルロースアシレート、セルロースジアシレート、セルローストリアシレート、セルロースアセテート、セルロースジアセテートおよびセルローストリアセテートなどがある。
【００６８】
前記疎水性化合物とは、薬物の放出を制御する、薬学的に許容される水に溶解しない物質のことをいう。例えば、グリセリルパルミトステアレート、グリセリルステアレート、グリセリルベヘネート、セチルパルミテート、グリセリルモノオレートおよびステアリル酸などの脂肪酸および脂肪酸エステル類；セトステアリルアルコール、セチルアルコールおよびステアリルアルコールなどの脂肪酸アルコール類；カルナウバワックス、蜜蝋および微結晶ワックスなどのワックス類；タルク、沈降炭酸カルシウム、リン酸一水素カルシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、カオリン、ベントナイト、モンモリロナイトおよびビーガムなどの無機質物質などがある。
【００６９】
前記親水性高分子とは、薬物の放出を制御する、薬学的に許容される水に溶解する高分子物質のことをいう。例えば、デキストリン、ポリデキストリン、デキストラン、ペクチンおよびペクチン誘導体、アルギン酸塩、ポリガラクツロン酸、キシラン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、アミロースおよびアミロペクチンなどの糖類；ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体；グアーガム、ローカストビーンガム、トラガカント、カラギナン、アカシアガム、アラビアガム、ジェランガムおよびキサンタンガムなどのガム類；ゼラチン、カゼインおよびゼインなどのタンパク質；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアセタールジエチルアミノアセテートなどのポリビニル誘導体；ポリ（ブチルメタクリレート−（２−ジメチルアミノエチル）メタクリレート−メチルメタクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＥ１００、エボニック、ドイツ）、ポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート−トリエチルアミノエチル−メタクリレートクロライド）共重合体（例えば、オイドラギットＲＬ、ＲＳ、エボニック、ドイツ）などの親水性ポリメタクリレート共重合体；ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシドなどのポリエチレン誘導体；カーボマーなどがある。
【００７０】
この他にも、着色剤および香料の中から選ばれた多様な添加剤として、薬学的に許容される添加剤を選択使用して本発明の製剤を製剤化することができる。
本発明において添加剤の範囲が前記添加剤を使用するものと限定されるものではなく、前記添加剤を選択によって通常の範囲の用量で含有して製剤化することができる。
【００７１】
本発明に係る薬学的組成物は、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップおよびエアロゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。
また、本発明は、本発明の化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物を、哺乳類を含む対象体に投与し、骨粗しょう症を予防または治療する方法を提供する。本発明において、用語「投与」は、いずれかの適切な方法で患者に本発明の骨粗しょう症予防および治療用組成物を導入することを意味し、本発明の骨粗しょう症予防および治療用組成物の投与経路は、目的の組織に到達することができる限り、いずれかの一般的な経路を介して投与できる。経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、内皮投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、または経膜内投与が可能であり、これに限定されない。
本発明は、下記化学式１で表される化合物を哺乳類に投与して骨粗しょう症を予防または治療する方法を提供する。
【００７２】
【化７】
2014506920.tif 000009
【００７３】
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｘが−ＣＨ−であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３は置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであってもよく、Ｘが窒素原子であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子である場合、Ｒ３はニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
本発明は、下記化学式１で表される化合物の薬学的に許容される塩を哺乳類に投入して 骨粗しょう症を予防または治療する方法を提供する。
【００７４】
【化８】
2014506920.tif 000010
【００７５】
式中、
Ｘは−ＣＨ−または窒素であり、
Ｒ１は水素原子またはイソプロピルオキシカルボニルオキシメチルであり、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐鎖のアルキル、置換もしくは無置換のベンジルであり、
Ｒ３はフェニル、ニトロフェニル、置換もしくは無置換のフェニルエテニル、または置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素原子であれば、Ｒ３はフェニル、ニトロフェニルまたは置換もしくは無置換のジフェニルエテニルであり、前記置換基はニトロ、ヒドロキシまたはメトキシである。
【００７６】
下記の列挙された化合物およびそれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれた少なくとも１種の化合物を哺乳類に投入して骨粗しょう症を予防または治療する方法を提供する。
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
３−（４−ニトロフェニル）−３−［２−（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル、
１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩、
３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール、および
４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【００７７】
本発明に係る骨粗しょう症予防または治療用組成物は、１日１回または一定の時間間隔をおいて１日２回以上投与できる。
【００７８】
本発明の化学式１で表される化合物、前記列挙された化合物またはその薬学的に許容される塩の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が様々である。０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、１０〜４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙがより好ましいが、これは患者の重症程度、年齢、性別などによって変化できる。
【００７９】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を、哺乳類を含む対象体に投与し、活性酸素の生成を抑制する方法を提供する。
【００８０】
本発明は、前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を、哺乳類を含む対象体に投与し、破骨細胞の生成を抑制する方法を提供する。
【００８１】
また、本発明は、骨粗しょう症治療または予防用薬学的製剤を製造するための前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の骨粗しょう症治療または予防用途を提供する。
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩を含む健康食品を提供する。好ましくは、骨強化のための健康食品である。
【００８２】
本発明は、前記化学式１で表される化合物、前記に列挙された化合物またはそれらの薬学的に許容される塩が活性酸素の生成を阻害する活性酸素抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００８３】
本発明の化合物は、活性酸素生成抑制活性に優れるうえ、従来の治療剤のような特別の副作用なしに骨粗しょう症の治療または予防に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明に係る化合物の破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図２】本発明に係る化合物の破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図３】本発明に係る化合物の破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図４】本発明に係る化合物の破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図５】本発明に係る化合物の破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図６】本発明に係る化合物の破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図７】本発明に係る化合物がＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導された骨破壊抑制効果を示す図である。
【図８】本発明に係る化合物がＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導された骨破壊抑制効果を示す図である。
【図９】本発明に係る化合物の卵巣除去による骨損失抑制効果を示す図である。
【図１０】本発明に係る化合物の卵巣除去による骨損失抑制効果を示す図である。
【図１１】本発明に係る化合物の卵巣除去による骨損失抑制効果を示す図である。
【図１２】本発明に係る化合物の卵巣除去による骨損失抑制効果を示す図である。
【図１３】本発明に係る化合物の卵巣除去による骨損失抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
以下、下記実施例および実験例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例および実験例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８６】
また、以下で言及される試薬および溶媒は、別に言及しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｋｏｒｅａ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、またはＴｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（ＴＣＩ）から購入したものであり、１Ｈ−ＮＭＲデータはＪＥＯＬ社のＥｃｌｉｐｓｅ ＦＴ ３００ＭＨｚ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した値であり、１３Ｃ−ＮＭＲデータはＪＥＯＬ社のＥｃｌｉｐｓｅ ＦＴ ３００ＭＨｚ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した値であり、ＭａｓｓデータはＪＥＯＬ社のＭＳｔａｔｉｏｎ ＪＭＳ ７００ ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した値である。
【００８７】
実施例１：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【００８８】
【化９】
2014506920.tif 000011
【００８９】
丸底フラスコに２−プロピル−３−オキソ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（２．５２ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）とエタノール１０ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（１．２９ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）をエタノール３ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液を３日間１００℃で加熱還流させた。反応物を減圧蒸留して溶媒を除去した後、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、しかる後に、真空乾燥させて標題の目的化合物を８２％の収率で得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 12.50 (1H, s), 8.27-8.25 (1H, m), 8 .01 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H, m), 7.69 (2H, m), 7.48-7.34 (3H, m), 7.14-7.10 (1H, m), 2.54 (2H,  d, J = 7.5 Hz), 1.64 (2H, m), 0.93 (3H, t, J = 7.3 Hz); 
EIMS (70 eV) m/z (rel intensity) 279 (M +, 37), 250 (100).
【００９０】
実施例２：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【００９１】
【化１０】
2014506920.tif 000012
【００９２】
丸底フラスコに２−ベンジル−３−オキソ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（５３０ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）とエタノール７ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（２０４ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）をエタノール３ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液を２日間１００℃で加熱還流させた。反応物を減圧蒸留して溶媒を除去した後、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、しかる後に、真空乾燥させて標題の目的化合物を９２％の収率で得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 12.66 (1H, s), 8.27-8.25 (1H, m), 8.01 (1H, d, J = 8.5  Hz), 7.81 (1H, m), 7.63 (2H, m), 7.35-7.12 (9H, m), 3.93 (2H, s); 
EIMS (70 eV) m/z (rel intensity) 327 (M+, 100), 250 (75), 222 (32), 206 (20), 195 (15).
【００９３】
実施例３：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−（４−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【００９４】
【化１１】
2014506920.tif 000013
【００９５】
マイクロウェーブ反応器用バイアルに２−（４−ニトロベンジル）−３−オキソ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（１４２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）とエタノール５ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（４７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をエタノール３ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液をマイクロウェーブ反応器で２日間１２０℃で加熱し、標題の目的化合物を２９％の収率で得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 12.82 ( 1H, s), 8.30 (1H, d, J = 4.4 Hz), 8.12-7.48 (4H, m), 7.71-7.17 (8H, m), 3.01 (2H, s); EIMS (70 eV) m /z (rel intensity) 372 (M+, 0.01), 250 (15), 222 (12), 189 (11), 147 (20), 121 (78), 105 (89).
【００９６】
実施例４：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌの合成
【００９７】
【化１２】
2014506920.tif 000014
【００９８】
丸底フラスコで、実施例１で製造した１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール２８０ｍｇをエチルエーテル４ｍＬに溶解させた。ここに、２ＭのＨＣｌが溶解したエチルエーテル０．５５ｍＬを０℃でゆっくり滴加した。前記反応溶液で生成された固体を減圧濾過して溶媒を除去した後、ヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、しかる後に、真空乾燥させて標題の目的化合物２７０ｍｇを得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.44 (1H, d, J = 4.2 Hz), 8.08-8.03 (2H, m), 7.66-7.64 (2H, m), 7.48-7.42 (3H, m), 7.34 -7.30 (1H, m), 2.49 (2H, brs), 2.43 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.48 (2H, m), 0.48 (3H, t, J = 7.3 Hz).
【００９９】
実施例５：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−５−（イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルオキシ）ピラゾールの合成（１８−３０６）
【０１００】
【化１３】
2014506920.tif 000015
【０１０１】
水８ｍＬとジクロロメタン８ｍＬとの混合溶媒に、実施例１で製造した１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール４３８ｍｇ、Ｋ２ＣＯ３６５０ｍｇ、Ｂｕ４ＮＨＳＯ４５３２ｍｇを添加した後、イソプロピルオキシカルボニルオキシメチルヨージド４９７ｍｇを２ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液を添加した。その後、前記溶液を激烈に一晩攪拌して化合物を反応させた。反応物をジクロロメタンで抽出して得た有機層を水と塩水で洗浄し、濃縮した残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１０／１）して標題の目的化合物（３６１ｍｇ、収率５８％）を得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 8.48-8.46 (1 H, m), 7.89 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.80 (1H, m), 7.78-7.68 (2H, m), 7.57-7.34 (3H, m), 7.23-7.1 6 (1H, m), 5.84 (2H, s), 4.86 (1H, m), 2.55 (2H, d, J = 7.7 Hz), 1.58 (2H, m), 1.25 (6H, d, J = 6.3  Hz), 0.91 (3H, t, J = 7.5 Hz)
13C NMR(75 MHz, CDCl3) δ 153.6, 152.0, 150.8, 149.3, 147.9, 138.3, 134.0, 128.4, 128.0, 127.6, 121.3, 115.9, 110.0, 92.6 , 72.7, 24.7, 22.9, 21.6, 14.1.
【０１０２】
実施例６：１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌの合成
【０１０３】
【化１４】
2014506920.tif 000016
【０１０４】
丸底フラスコに２−ベンジル−３−オキソ−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］プロピオン酸エチルエステル（３．５５ｇ、１０ｍｍｏｌ）と酢酸１０ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（１．１ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を酢酸３ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液を２日間１００℃で加熱還流させた。反応物を減圧蒸留して溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１５／１）して１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールを１．３２ｇ得た。
【０１０５】
丸底フラスコに、上記で得た１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール１．１０ｇをエチルエーテル１５ｍＬに溶解させた。ここに、２ＭのＨＣｌが溶解したエチルエーテル１．５ｍＬを０℃でゆっくり滴加した。４０℃で２４時間攪拌した後、前記反応溶液で生成された固体を減圧濾過して溶媒を除去し、しかる後に、ヘキサンと酢酸エチルで洗浄した後、真空乾燥させて標題の目的化合物１．１ｇを得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.47-8.45 (1H,  m), 8.30 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.98-7.93 (2H, m), 7.32-6.83 (10H, m), 3.82 (3H, s), 2.72 (2H, s).
【０１０６】
実施例７：３−（４−ニトロフェニル）−３−［（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエーテルの合成
【０１０７】
【化１５】
2014506920.tif 000017
【０１０８】
丸底フラスコでエチル４−ニトロベンゾイルアセテート３５６ｍｇと２−ヒドラジノピリミジン１８２ｍｇをエタノール１５ｍＬに溶解させた。反応混合物を３日間１００℃で加熱還流させた。反応物を酢酸エチルで抽出して得た有機層を水と塩水で洗浄し、濃縮した残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１／１）して標題の化合物（１１８ｍｇ、収率２４％）を得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 9.79 (1H, s),  8.56 (2H, d, J = 4.8 Hz), 8.26 (2H, d, J = 7.2 Hz), 8.09 (2H, d, J = 7.0 Hz), 6.89 (1H, t, J = 4.9 H z), 4.28 (2H, q, J =7.2 Hz), 3.89 (2H, s), 1.28 (3H, t, J = 7.2 Hz).
【０１０９】
実施例８：１−（ピリミジン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【０１１０】
【化１６】
2014506920.tif 000018
【０１１１】
丸底フラスコで、実施例７で製造された３−（４−ニトロフェニル）−３−［２−（ピリミジン−２−イル）ヒドラゾノ］プロピオン酸エチルエステル１００ｍｇを酢酸１５ｍＬに溶解させた。反応混合物を２日間約１５０℃で加熱還流させた。溶媒を除去して得た濃縮液に酢酸エチルを添加した後、有機層を薄いＮａＨＣＯ3水溶液と水で洗浄した。濃縮した残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１／１）して標題の化合物（６１ｍｇ、収率７２％）を得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 11.9 (1H, s), 8.83 (2H, d, J = 4.8 Hz), 8.27 (2H, d, J= 7.2 Hz), 8.08 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.30 (1H, t, J = 4.7 Hz), 6.09 (1H, s).
【０１１２】
実施例９：１−（ピリジン−２−イル）−３−［（１，２−ジフェニル−Ｅ−エテニル］−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【０１１３】
【化１７】
2014506920.tif 000019
【０１１４】
丸底フラスコで、４，５−ジフェニル−３−オキソ−４−ペンテノン酸エチルエステル２９４ｍｇと２−ヒドラジノピリジン１２０ｍｇを酢酸５ｍＬに溶解させた。反応混合物を５時間約１５０℃で加熱還流させた。溶媒を除去した反応物を酢酸エチルで抽出して得た有機層を水と塩水で洗浄した。濃縮した残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１０／１）して標題の化合物（１３０ｍｇ、収率３８％）を得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 12.7 (1H, s), 8.26-7.81 (3H, m), 8.43-7.03 (12H, m), 5.46 (1H, s); 
EIMS (70 eV) m/z (rel intensity) 339 (M+, 100), 310 (6), 262 (23), 217 (21), 202 (24), 178 (18), 121 (48).
【０１１５】
実施例１０：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌの合成
【０１１６】
【化１８】
2014506920.tif 000020
【０１１７】
丸底フラスコにエチルベンゾイルアセテート（１．９２ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）とエタノール１０ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（１．１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をエタノール１０ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液を８時間１００℃で加熱還流させた。反応物を減圧蒸留して溶媒を除去した後、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥させて１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールを８７％の収率で得た。
【０１１８】
丸底フラスコに、前記製造された１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール２３７ｍｇとエチルエーテル４ｍＬを添加し、ここに、２ＭのＨＣｌが溶解したエチルエーテル０．５５ｍＬを０℃でゆっくり滴加した。前記反応溶液で生成された固体を減圧濾過して溶媒を除去した後、ヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、しかる後に、真空乾燥させて標題の目的化合物を８７％の収率で得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.48-8.46 (m, 1H), 8.08 (t, 1H, J = 8.3 Hz), 7.96 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 7.87 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.46-7.35 (m, 4H), 6.64 (br, 4H), 6.14 (s, 1H). 
【０１１９】
実施例１１：４−ヘキシリデン−３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【０１２０】
【化１９】
2014506920.tif 000021
【０１２１】
丸底フラスコにエチルベンゾイルアセテート（１．９２ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）とエタノール１０ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（１．１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をエタノール１０ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液を８時間１００℃で加熱還流させた。反応物を減圧蒸留して溶媒を除去した後、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥させて１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールを得た。
【０１２２】
前記製造された１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール２．３７ｇを丸底フラスコに仕込み、ヘキサナール５０ｍＬを加えた。反応溶液を１５０℃で１２時間加熱還流させた後、減圧蒸留して溶媒を除去し、しかる後に、生成された赤褐色の固体をエタノールで再結晶して標題の目的化合物を７６％の収率で得た。
1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 8.26-7.80 (3H, m), 7.43-7.03 (6H, m), 6.18 (1H, brs), 2.01 (2H, m),  1.34-1.25 (6H, m), 0.97 (3H, t, J = 7.6Hz).
【０１２３】
実施例１２：３−（４−メトキシフェニルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【０１２４】
【化２０】
2014506920.tif 000022
【０１２５】
丸底フラスコに３−アミノ−５−ヒドロキシピラゾール９．９１ｇ（１００ｍｍｏｌ）、ｐ−アニソール１５．４０ｇ（１２５ｍｍｏｌ）および酢酸２００ｍＬを仕込み、４時間１４０℃で加熱還流させた。減圧蒸留して溶媒を除去した後、氷水７０ｍＬを添加し、しかる後に、生成された固体を濾過してメタノールで再結晶し、標題の目的化合物を２３％の収率で得た。
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 10.23 (1H, s), 8.49 (1H, s), 7.40 (2H, d, J = 9.0 Hz), 6.82 (2H, d, J = 9.0 Hz),  3.67 (3H, s), 3.31 (1H, s); 
EIMS (70 eV) m/z (rel intensity) 205 (M+, 100 ), 190 (53), 174 (42), 148 (50), 121 (50), 104 (6), 92 (9), 77 (15).
【０１２６】
実施例１３：１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【０１２７】
【化２１】
2014506920.tif 000023
【０１２８】
丸底フラスコに２−ベンジル−３−オキソ−３−[（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル]プロピオン酸エチルエステル（３．５５ｇ、１０ｍｍｏｌ）と酢酸１０ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（１．１ｇ、１０．1ｍｍｏｌ）を酢酸３ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。反応溶液を２日間１００℃で加熱還流させた。反応物を減圧蒸留して溶媒を除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１５／１）して１−（ピリジン−２−イル）−３−［（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−Ｅ−エテニル］−４−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールを１．３２ｇ得た。
1H NMR (300 MH z, CDCl3) δ 8.26 (1H, m), 7.98 (1H, m), 7.83 (1H, m), 7.37-7.13 (8H, m), 7.11 (1H, d,  J = 12.1 Hz), 6.91(1H, m), 6.81 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.93 (2H, s), 3.90 (3H, s).
【０１２９】
比較例１：３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
【０１３０】
【化２２】
2014506920.tif 000024
【０１３１】
前記３−フェニル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールは、韓国登録特許第０９４２３８２号に開示された方法を用いて合成した。
【０１３２】
丸底フラスコにエチルベンゾイルアセテート（１当量）とエタノール４ｍＬを仕込み、ここに、２−ヒドラジノピリジン（１．１当量）をエタノール３ｍＬに希釈させて０℃でゆっくり滴加した。２０分間加熱還流させた、減圧蒸留して溶媒を除去した後、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄し、しかる後に、真空乾燥させて標題の化合物を８７％の収率で得た。
【０１３３】
<実験例１>破骨細胞への分化抑制効果の確認
生後４週〜５週目の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）から骨髄細胞を採取した。具体的に、マウスを頚椎脱骨させて犠牲させた後、骨の周辺に付いている筋肉をハサミで除去し、大腿骨と頚骨を抽出してＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に浸した。αＭＥＭ（α−ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）を充填した容量１ｍＬの注射器を前記大腿骨と頚骨の一端に刺して前記大腿骨または頚骨から骨髄細胞を採取した。
【０１３４】
前記骨髄細胞を培養してマクロファージを得た。具体的に、前記で得た骨髄細胞を５０ｍＬのチューブに入れて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、ゲイ溶液（Ｇｅｙ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とＰＢＳを３：１の比率で混合した混合液を添加し、２〜３分間常温に維持した。その後、さらに遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）を行った後、上澄み液を除去し、αＭＥＭを添加して攪拌した後、１０ｃｍの細胞培養皿で３７℃で２４時間培養した。その後、３番目の遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）を行った後、上澄み液を除去し、培養液とマクロファージ分化因子としてのｒｈＭ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、１０ｃｍの細胞培養皿で３日間３７℃の温度で培養した。３日後、皿に付いているマクロファージを掻き出してチューブに集めた後、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）を行った。
【０１３５】
前記マクロファージを培養して破骨細胞への細胞分化を誘導した。具体的に、前記で得たマクロファージを４８ｗｅｌｌ細胞培養皿に２×１０４／ｗｅｌｌに分けて２４時間培養した。培養液にｒｈＭ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）と破骨細胞分化因子ＲＡＮＫＬ（２００ｎｇ／ｍＬ）を添加した後、培養して破骨細胞への細胞分化を誘導した。この際、前記培養液に、上述の実施例で合成した化合物（実施例２、３、７、８、９および１１）をそれぞれ様々な濃度で添加した。対照群として比較例１の化合物を上述の実施例の化合物と同一の濃度で添加して比較した。
【０１３６】
２４時間後、４８ｗｅｌｌ細胞培養皿に入っている培養液を除去し、新しい培養液で取り替えた後、２日に１回ずつ培地を取り替えながら３７℃で培養した。
【０１３７】
前記培地で、本発明の実施例で合成した化合物を添加した日から５日間さらに培養した後、本発明の実施例で合成した化合物を添加した培地および対照群の培地を３．７％ホルマリン溶液で固定した後、ＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色し、光学顕微鏡で観察した。具体的に、前記ＴＲＡＰ染色は、細胞を３．７％のホルムアルデヒドで１５分間室温で固定し、蒸留水で２回洗浄した後、酸ホスファターゼ（Ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ）ｋｉｔＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）の使用説明書に記載された比率でアセテート、Ｆａｓｔ Ｇａｒｇｎｅｔ ＧＢＣ塩基、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸、硝酸ナトリウム、酒石酸塩を混ぜて作った染色液を、２００μＬ／ウェルで入れて３７℃で２０分間反応させることにより行われた。
【０１３８】
前記実験結果を図１〜図６に示した。図１〜図６から分かるように、比較例１の化合物を添加した対照群の場合、マクロファージが破骨細胞に多く分化したが、本発明の実施例で合成した化合物（実施例２、３、７、８、９および１１）を添加した培地のマクロファージは、破骨細胞への正常的な分化が行われないか或いは破骨細胞への分化が少なく行われた。よって、本発明の化合物が破骨細胞への分化を抑制することが分かった。
また、本発明の実施例で合成した化合物の濃度が０．１μＭまたは０．１１μＭ、０．３３μＭ、１μＭおよび３μＭに増加するほど、破骨細胞への分化が抑制された。よって、本発明の化合物はマクロファージの破骨細胞への分化を濃度依存的に抑制することが分かった。
【０１３９】
<実験例２>炎症誘発因子による骨破壊作用抑制効果の確認
骨損失マウスモデルでＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）によって誘導される骨破壊作用の抑制効能を確認するために、生後６週目のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを、いずれも３匹ずつのマウスを含むように、対照群１〜３および実験群１〜３に区分した。
【０１４０】
マウスを麻酔して頭蓋骨の正中央部分の皮膚を１ｃｍ程度切開し、縦横各０．５ｍｍのコラーゲンスポンジを入れた。
【０１４１】
前記スポンジに、対照群１および２ではＰＢＳとＤＭＳＯのみをそれぞれ注入し、対照群３ではＬＰＳ１２．５ｍｇ／Ｋｇを注入し、実験群１ではＬＰＳ１２．５ｍｇ／Ｋｇ及び実施例４の化合物２０ｍｇ／Ｋｇ、実験群２ではＬＰＳ１２．５ｍｇ／Ｋｇおよび実施例５の化合物２０ｍｇ／Ｋｇ、実験群３ではＬＰＳ１２．５ｍｇ／Ｋｇおよび実施例６の化合物２０ｍｇ／Ｋｇを注入した。
その後、切開された皮膚を縫合し、５日後にマウスの頭蓋骨を摘出して、４％のホルムアルデヒドが添加されたＰＢＳに入れて２４時間固定し、０．５Ｍ ＥＤＴＡが添加されたＰＢＳを用いてカルシウムを除去した後、ＴＰＡＰ染色を行って頭蓋骨の表面を顕微鏡で観察した。その結果を図７に示した。
前記ＴＲＡＰ染色は、酸ホスファターゼ（Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ） ｋｉｔ ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）の使用説明書に記載された比率でアセテート、Ｆａｓｔ Ｇａｒｇｎｅｔ ＧＢＣ塩基、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸、硝酸ナトリウム、酒石酸塩を混ぜて作った染色液を、２００μＬ／ウェルで入れて３７℃で２０分間反応させることにより行われた。
【０１４２】
また、カルシウムが除去された頭蓋骨をパラフィンに浸してブロックを製作し、このブロックをミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて０．４μｍの厚さに切断した後、パラフィンを除去し、水和した。前記切断されたブロックをヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）およびＴＲＡＰ染色して顕微鏡で観察した。その結果を図８に示した。
【０１４３】
図７および図８から確認できるように、実験群１〜３はＬＰＳのみを投与した対照群３に比べてＴＲＡＰによる染色の程度が少なかった。よって、本発明の化合物は、ＬＰＳによる炎症の程度を減少させて破骨細胞の形成を抑制することにより、骨の破壊を効果的に防ぐことができることが分かった。
【０１４４】
<実験例３>卵巣の除去による骨損失抑制効果の確認
卵巣除去マウスモデルにおける、卵巣除去により誘導される骨損失抑制効能を確認するために、生後８週目の雌マウスを、５匹のマウスを含むように対照群１、２および実験群１に区分した。
【０１４５】
前記対照群１および実験群１のマウスは開腹手術を介して卵巣を切除した。対照群２のマウスは、対照群１および実験群１のマウスと同様に開腹手術を行ったが、卵巣は除去しないことにより、ｓｈａｍ対照群として用いた。
【０１４６】
前記手術後７日間の回復期間を経た後、２日間隔で３週間、実施例１３の化合物を実験群１のマウスに腹腔投与した。マウスの卵巣切除を確認し、実験群１、対照群１および２から両側の頚骨を採取した後、μ−ＣＴ（ｓｋｙｓｃａｎ１０７６、ＳＫＹＳＣＡＮ Ｎ．Ｖ．）およびＶ−ｗｏｒｋｓ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｃｙｂｅｒｍｅｄ製）を用いて各断面のイメージを連続撮影して３次元イメージとして再構成し、これを分析プログラムを用いて骨体積、骨密度および骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）を定量化した。その結果を図９〜図１１に示した。前記実験結果はＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）を用いて統計処理した。その結果、有意性が認められる場合、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ Ｔｅｓｔを用いてｐ＜０．１（＊）またはｐ＜０．１５（＊＊）水準以下で有意性の検定を行った。 
【０１４７】
図９において、骨体積（％）は骨組織体積（ＴＶ）に対する、採取した頚骨の体積（ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ、ＢＶ）の百分率（ＢＶ／ＴＶ（％））で表示し、図１１において、骨梁数は１ｍｍ当たりの骨梁数で表示した。
【０１４８】
また、前記採取した頚骨を、ホルムアルデヒドが添加されたＰＢＳに入れて２４時間固定し、０．５Ｍ ＥＤＴＡが添加されたＰＢＳを用いてカルシウムを除去した。その後、前記頚骨をパラフィンに入れてブロックを製作し、このブロックをミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて０．４μｍの厚さに切断した後、パラフィンを除去し、水和した。前記切断されたブロックをヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）およびＴＲＡＰ染色して顕微鏡で観察した。その結果を図１２に示した。また、破骨細胞数はＯｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅソフトウェアプログラム（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．、米国）を用いて顕微鏡の下で分析した。その結果を図１３に示した。前記破骨細胞の定量は骨表面（ｂｏｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ）１ｍｍ当たりの破骨細胞数で表示し、ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）を用いて統計処理した。その結果、有意性が認められる場合、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌ Ｔｅｓｔを用いてｐ＜０．１（＊）水準以下で有意性の検定を行った。
【０１４９】
図９〜図１１から確認できるように、本発明の実験群１３の化合物を注入した実験群１の場合、同様に卵巣が除去された対照群１に比べて、頚骨の体積減少がさらに少なかったうえ、さらに高い骨密度を示した。また、骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）数もさらに高い値を示した。よって、本発明の化合物が骨損失を抑制して骨粗しょう症を効果的に治療することができることを確認することができた。
【０１５０】
また、図１２から分かるように、実験群１は対照群１に比べてＴＲＡＰによる染色の程度がさらに少なかった。これは破骨細胞が少なく形成されたことを示唆する。図１３から分かるように、実験群１は、卵巣を除去していない対照群２と比較して破骨細胞数が類似の数値を示し、卵巣が除去されている対照群１と比較して約６０％程度破骨細胞の生成が抑制された。よって、本発明の化合物が破骨細胞の生成を抑制して骨粗しょう症を効果的に予防および治療することができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明の化合物は、活性酸素生成抑制活性に優れるうえ、従来の治療剤のような特別の副作用なしに骨粗しょう症の治療または予防に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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