(57)【要約】  提供されるものは、ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を遮断することを含んでなる、被験者の炎症性又は自己免疫性疾病を治療するための、方法及び組成物である。ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、ＴＬ１Ａの発現を減少させることによって遮断することができる。ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、抗ＤＲ３抗体の投与によって遮断することができる。ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、抗ＴＬ１Ａ抗体の投与によって遮断することができる。炎症性又は自己免疫性疾病を治療する方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、Ｔ細胞成分による自己免疫性疾病であることができる。炎症性又は自己免疫性疾病を治療する方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、喘息、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、１型糖尿病、移植片対宿主病又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を遮断することを含んでなる、被験者の炎症性又は自己免疫性疾病を治療する方法。
【請求項２】
前記ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用が、ＤＲ３の内因性レベルを減少させることによって遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用が、ＴＬ１Ａの内因性レベルを減少させることによって遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用が、ＤＲ３  Ｆｃ融合タンパク質の投与によって遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用が、抗ＤＲ３抗体の投与によって遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用が、抗ＴＬ１Ａ抗体の投与によって遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用が、ＤＲ３プレリガンドアセンブリードメイン（ＰＬＡＤ）を含んでなるペプチドの投与によって遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列Ｒ１−ＤＲ３  ＰＬＡＤ−Ｒ２有し、ここで、ＤＲ３のＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸４３−５８を含んでなり、そしてここで、Ｒ１及びＲ２が、所望によりＨ、アシル、ＮＨ２、アミノ酸又はペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、多発性硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、リウマチ様関節炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、炎症性腸疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、１型糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、移植片対宿主病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症性又は自己免疫性疾病が、Ｔ細胞の成分による自己免疫性疾病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
抗炎症剤を同定するための方法であって、前記方法の工程が、
（ａ）ＤＲ３及びＴＬ１Ａを含んでなる試料を用意し、
（ｂ）試料を、候補薬剤と接触させ、
（ｃ）ＤＲ３／ＴＬ１Ａ結合のレベルを検出し、
（ｄ）結合レベルを対照と比較すること
を含んでなり、対照と比較したＤＲ３／ＴＬ１Ａ結合における減少が抗炎症剤を同定する、前記方法。
【請求項１７】
ＴＬ１Ａに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項１８】
ヒトＴＬ１Ａ及びマウスＴＬ１Ａからなる群に特異的に結合する、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１７又は１８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体がヒト化されており、ここで、前記抗体が、一つのアミノ酸配列を含んでなるヒト化重鎖可変領域、及び一つのアミノ酸配列を含んでなるヒト化軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１８又は１９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、抗ヒトＴＬ１Ａクローン１Ａ９である、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、抗ヒトＴＬ１Ａクローン１Ｃ６である、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、抗マウスＴＬ１Ａクローン１２Ｂ１２．６である、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、抗マウスＴＬ１Ａクローン５Ｇ４．６である、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
前記抗ＴＬ１Ａ抗体が、クローン１Ａ９及びクローン１Ｃ６からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権データ
[001]本出願は、その全ての開示が本明細書中に援用される、２０１１年５月２０日に出願された米国特許仮出願６１／４８８，６７１の利益を主張するものである。上記に言及した出願の審査中に起こり得るいずれもの放棄は、それによって明確に撤回され、そして全ての関連する技術の再考は、敬意を表して要求されるものである。
【０００２】
配列表
[002]ここに添付され、２０１２年３月１３日に作成され、そして “６１３７ＮＩＡＭＳ２ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿２０１２０３１３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”のファイル名でここに提出される、２５キロバイトのサイズの配列表のテキストファイルは、その全てが本明細書中に援用される。
【０００３】
政府の権利の記述
[003]米国政府は、本明細書中に開示され、そして特許請求される本発明（１または複数）を所有する。
【０００４】
発明の分野
[004]本発明は、ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を遮断することを含んでなる、被験者の疾病を治療するための方法及び組成物、並びに同一物を含んでなる組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
[005]ＤＲ３（ＴＲＡＭＰ、ＬＡＲＤ、ＷＳＬ−１、ＴＮＦＲＳＦ２５）は、Ｔ細胞上に特異的に発現する腫瘍壊死受容体ファミリーのメンバーであり、これは、ＴＮＦＲ１に最も類似している。ＤＲ３に対するリガンドは、内皮細胞によって発現されることが報告されているＴＮＦファミリーメンバーのタンパク質であるＴＬ１Ａである。ＴＬ１Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞の活性化を同時刺激することができるが、しかしＴＬ１Ａの生理学的出所及びその末梢Ｔ細胞の生物学におけるｉｎ  ｖｉｖｏの役割は、知られていない。
【０００６】
[006]多くのＴＮＦファミリーのリガンドと受容体との間の相互作用は、Ｔ細胞反応の特異的特徴を形成することにおいて重要な役割を果たす。ＣＤ３０、ＴＮＦＲ２、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、及び４−１ＢＢを含むＴＮＦ受容体のサブファミリーは、Ｔ細胞上に発現し、そして特異的Ｔ細胞サブセットにおける同時刺激の別々の側面を仲介する（Ｃｒｏｆｔ，２００３）。例えば、ＯＸ４０は、活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化後の生存を増強し（Ｃｒｏｆｔ）、ＴＮＦＲ２は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を同時刺激し、そしてＧＩＴＲは、制御性Ｔ細胞において独特の役割を有する（Ｅｘｐａｎｄ，ｒｅｆｓ）。ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５／ＴＲＡＭＰ／ＬＡＲＤ／ＷＳＬ−１）は、デスドメインを含有するＴＮＦファミリー受容体であり、これはその最も近い相同体ＴＮＦＲ１のように、ＴＲＡＤＤをリクルートし、そしてＮＦ−ｋＢ及びＭＡＰ−キナーゼを活性化する能力を有するか、又は別の方法で細胞状況においてカスパーゼ活性化及びプログラム細胞死を引き起こす。ＴＮＦＲ１と異なり、ＤＲ３は、リンパ球中で特異的に発現し、Ｔ細胞において最も高いレベルであるが、然しながら、Ｔ細胞の恒常性維持におけるこの受容体の機能は、特にこの受容体ＴＬ１Ａに対する真正なリガンドが最近になって同定されたされたため、十分に理解されていない。初期の報告は、ＴＬ１Ａが内皮細胞上に排他的に発現することを示唆し、そして内因性ＴＬ１Ａの付加は、ＴＣＲを介して刺激されたヒトＴ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮ−Ｇ産生を同時刺激することが報告されている（Ｐａｐａｄａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｐａｐａｄａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。更に最近になって、ＴＬ１Ａは、炎症性腸疾患のような炎症の部位においても見いだされている（Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｒｏｆｔ，２００３
【非特許文献１】Ｐａｐａｄａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献１】Ｐａｐａｄａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献１】Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献１】Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６
【発明の概要】
【０００８】
[007]本発明の目的によれば、本明細書中に具体化され、そして広く記載されるように、本発明は、ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を遮断することを含んでなる、被験者の炎症性又は自己免疫性疾病を治療するための組成物及び方法に関する。
【０００９】
[008]開示される方法及び組成物の更なる利益は、以下の記載中に一部説明されるものであり、そして一部は、当該記載から理解されるものであるか、又は開示される方法及び組成物の実践によって学習することができる。開示される方法及び組成物の利益は、付属する特許請求の範囲中で特別に指摘される要素及び組合せによって実現され、そして達成されるものである。前記の一般的説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示及び説明のみであり、そして特許請求の範囲に記載された本発明を制限するものではないことは理解されることである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
[009]本明細書中に組込まれ、そしてその一部を構成する付属する図面は、開示される方法及び組成物の幾つかの態様を例示し、そして記載と一緒に、開示される方法及び組成物の原理を説明するために役立つ。
【図１−１】[010]図１は、ＴＬ１ＡのｍＲＮＡ発現が、各種の自然刺激後、骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）中で強く誘導され、そしてＭｙＤ８８依存性であることを示す。図１Ａは、骨髄由来ＤＣ又はＤ１１ｃ＋ＤＣを培養し、そして１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、ＳＥＡ又はＳＴＡｇを伴って、又は伴わずに、示した時間刺激したことを示す。
【図１−２】図１Ｂは、各種のノックアウト（ＫＯ）マウスからの骨髄由来ＤＣ中の、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下又は非存在下で３時間のＴＬ１ＡのｍＲＮＡの発現を示す。ＲＮＡをそれぞれの試料から調製し、そして定量的ＰＣＲにおいて使用した。結果は、それぞれの集団の休止細胞に対して計算されたＴＬ１ＡのｍＲＮＡの量を示す。図１Ｃは、精製されたＴ細胞を培養し、そして５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、示した時間刺激したことを示す。ＲＮＡを、それぞれの試料から調製し、そして定量的ＰＣＲで使用した。結果は、新しく精製されたＴ細胞に対して計算されたＴＬ１ＡのｍＲＮＡの量を示す。
【図１−３】図１Ｄは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によるＴ細胞活性化後の、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中のＴＬ１ＡのｍＲＮＡの誘導を示す。
【図１−４】図１Ｅは、ＴＬ１Ａ誘導の初期のピークが、非Ｔ非Ｂ細胞由来であることを示す。示した細胞型をＰＢＭＣから精製し、そして記載したように刺激した。
【図２−１】[011]図２は、ＤＲ３  ＫＯマウスからの精製されたＴ細胞が、増殖、活性化マーカーの発現を減少させ、そしてＤＣ−Ｔ同時培養におけるサイトカイン産生を変更することを示す。図２Ａは、精製されたＴ細胞を、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、３日間、１０ｎｇ／ｍｌのｒＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で活性化したことを示す。３Ｈを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。
【図２−２】図２Ｂは、精製されたＴ細胞を、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、３日間、１０ｎｇ／ｍｌのｒＴＬ１Ａ及び１０μｇ／ｍｌの３Ｃ７抗体の存在下又は非存在下で活性化したことを示す。３Ｈを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。図２Ｃは、ＣＦＳＥで標識した精製されたＴ細胞を、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、１０ｎｇ／ｍｌのｒＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で活性化したことを示す。細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図２−３】図２Ｄは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されたＴ細胞からの上清を回収し、そして２４時間後の、示されたサイトカインの産生について分析したことを示す。
【図３−１】[012]図３は、ＤＲ３  ＫＯ  Ｔ細胞が、増殖、活性化マーカーの発現を減少させ、そしてＤＣ−Ｔ同時培養におけるサイトカイン産生を変更することを示す。図３Ａは、骨髄ＤＣを、ナイーブなＯＴＩＩ又はＤＲ３  ＫＯ−ＯＴＩＩのＴ細胞と共に、示したＯｖａペプチド濃縮物の存在下で３日間培養したことを示す。３Ｈを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。
【図３−２】図３Ｂは、骨髄ＤＣを、ナイーブなＯＴＩＩ又はＤＲ３  ＫＯ−ＯＴＩＩのＴ細胞と共に、示したＯｖａペプチド濃縮物の存在下で培養したことを示す。細胞を、２４時間、４８時間及び７２時間後に回収し、これを図のために使用したと言われ、そして活性化マーカーに対して染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。同時培養物からの上清を、２４時間、４８時間、及び７２時間で回収し、そしてＩＬ−２産生について試験した。
【図４−１】[013]図４は、ＴＬ１Ａが、Ｔ細胞分化において役割を果たすことができることを示す。図４Ａは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激された精製されたナイーブＴ細胞を、ＴＨ１（抗ＩＬ−４＋ＩＬ−１２）条件下、又はＴＨ２（抗ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−４）条件下で６日間培養したことを示す。次いで細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で５−６時間再刺激し、そして細胞内サイトカインに対して染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ．ソートされたＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、ＯＴＩＩ又はＤＲ３−ＯＴＩＩのＴ細胞と共に、ＳＥＡ、ＳＴＡｇ、又はＩＬ−１２いずれかと共にＯｖａペプチドの存在下で、６日間培養した。次いで細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで６時間再刺激し、そして細胞内サイトカインに対して染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【図４−２】[013]図４は、ＴＬ１Ａが、Ｔ細胞分化において役割を果たすことができることを示す。
【図４−３】[013]図４は、ＴＬ１Ａが、Ｔ細胞分化において役割を果たすことができることを示す。
【図４−４】[013]図４は、ＴＬ１Ａが、Ｔ細胞分化において役割を果たすことができることを示す。
【図５−１】[014]図５は、ＤＲ３  ＫＯマウスが、Ｏｖａ仲介喘息モデルにおける肺の病理組織の減少を有することを示す。マウスを、Ａｌｕｍ＋ＰＢＳ（対照）又はＡｌｕｍ＋Ｏｖａで感作した。次いでマウスを、ＰＢＳ（対照）又はＯｖａでチャレンジした。図５Ａは、肺の組織診断をＰＡＳ染色で行ったことを示す。
【図５−２】図５Ｂは、肺の病理組織診断を採点したことを示す。図５Ｃは、ＲＮＡを肺から調製し、そして定量的ＰＣＲで使用したことを示す。結果は、ＰＢＳで治療された対照マウスの肺（右の図）に対して計算されたサイトカインのｍＲＮＡの量を示す。Ｏｖａ仲介の喘息モデルのマウスの脾臓を回収し、そして脾細胞を、１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのいずれかのＯｖａタンパク質の非存在下又は存在下で３日間培養した。３Ｈを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。５０μｇ／ｍｌで培養された脾細胞の上清を、３日後に回収し、そしてサイトカインについて分析した（左の図）。図５Ｄは、Ｏｖａ仲介の喘息モデルのマウスの血液を回収し、そして血清を、ＩｇＧ１及びＯｖａ特異的ＩｇＧ１レベルについてＥＬＩＳＡによって試験したことを示す。
【図６−１】[015]図６は、ＤＲ３  ＫＯマウスが、ＭＯＧ−ＥＡＥモデルにおいてＥＡＥの減少を有することを示す。図６Ａは、臨床スコアを示す。図６Ｂは、脾臓、非流入及び流入領域リンパ節を培養し、そしてＭＯＧで再刺激したことを示す。
【図６−２】３Ｈを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析するか、又は細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンで６時間再刺激し、そしてＩＬ−１７及びＩＦＮγに対して染色した（図６Ｃ）。
【図６−３】図６Ｓは、脊髄からの細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンで６時間再刺激し、そしてＩＬ−１７及びＩＦＮγに対して染色したことを示す。
【図７】[016]図７は、マウスＴＬ１ＡがヒトＣＤ２  Ｔ細胞特異的制御要素の制御下におかれた、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスにおける、増加したＴ細胞活性化及び自然発生炎症性腸疾患を示す。図７Ａは、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの三つの独立の樹立系統から単離されたＴ細胞における、増加したＣＤ４４発現を示す。図７Ｂは、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウス及び同腹仔の対照（ＷＴ）からの回腸の代表的な全体（上）、低倍率Ｈ＆Ｅ切片（中）、及び高倍率Ｈ＆Ｅ切片（下）の画像を示す。腸壁の肥大、絨毛の破壊、及び炎症細胞の粘膜への浸潤を観察することができる。
【図８−１】[017]図８は、ＴＬ１Ａが、ＤＲ３を介したＣＤ４＋  Ｔ細胞における増殖及びサイトカイン産生を同時刺激することを示す。図８Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−マウスからの精製されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で、３日間、１０ｎｇ／ｍｌのマウスｒＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で、活性化したことを示す。３Ｈ−チミジンを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。エラーバーは、三連の試料のｓ．ｅ．ｍを表す。
【図８−２】図８Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６からの精製されたＴ細胞を、上記のように、しかし更に１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−２Ｒα抗体又はアイソタイプの対照の存在下で、３日間培養したことを示す（左の図）。ＩＬ−２−／−又はＩＬ−２＋／＋からの精製されたＴ細胞を、上記のように、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の非存在下又は存在下で３日間培養した（中及び右の図）。エラーバーは、三連の試料のｓ．ｅ．ｍを表す。
【図８−３】図８Ｃは、図８Ａのように活性化し、そして培養したＣＤ４  ＋Ｔ細胞からの上清を、示した時点で回収し、そして示したサイトカインをサイトカインビーズアレイで測定したことを示す；ｎ．ｄ．＝検出限界以下（４ｐｇ／ｍｌ）である。
【図９−１】[018]図９は、樹状細胞及びＴ細胞中のＴＬ１Ａ発現の特異誘導を示す。図９Ａは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄由来ＤＣ又はＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、２０μｇ／ｍｌのＳＥＡ又は１０μｇ／ｍｌのＳＴＡｇを伴うか又は伴わずに、示した時間培養及び刺激したことを示す。ＲＮＡをそれぞれの試料から調製し、そして逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）中で使用した。
【図９−２】図９Ｂは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６又は示したノックアウト（ＫＯ）マウスからの骨髄由来ＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下又は非存在下で、３時間培養及び刺激したことを示す。ＲＮＡをそれぞれの試料から調製し、そしてＲＴ−ｑＰＣＲで使用した。図９Ｃは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６からの骨髄由来ＤＣを、示した時間、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、又はＩｇ架橋結合を伴い又は伴わずに培養及び刺激し、そしてＲＮＡをそれぞれの試料から調製し、そしてＲＴ−ｑＰＣＲで使用したことを示す。
【図９−３】図９Ｄは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−マウスからの精製されたＴ細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で、示された時間培養及び刺激したことを示す。ＲＮＡをそれぞれの試料から調製し、そしてＲＴ−ｑＰＣＲで使用した。結果は、それぞれの集団の非処理細胞に対して（図９Ａ−Ｃ）、又はそれぞれの遺伝子型の非刺激Ｔ細胞に対して（図９Ｄ）計算されたＴＬ１ＡのｍＲＮＡの量を示す。Ｔ細胞中のＴＬ１Ａ基底ｍＲＮＡレベルは、ＤＣより概略５０倍低かった。エラーバーは、三連の試料のｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図１０−１】[019]図１０は、ＤＲ３−／−Ｔ細胞が、樹状細胞の存在下で培養した場合、増殖が減少し、そしてサイトカイン産生が変わることを示す。図１０Ａは、骨髄ＤＣを、ナイーブなＯＴ−ＩＩ又はＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩのＣＤ４＋  Ｔ細胞で、示した濃度のＯｖａペプチドの存在下で、そしてＣＴＬＡ４Ｉｇの非存在下（左の図）又は存在下（右の図）で３日間培養したことを示す。３Ｈ−チミジンを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。
【図１０−２】図１０Ｂは、上記の培養物からの上清を、７２時間後に回収し、そしてサイトカイン産生について試験したことを示す。ｎ．ｄ．＝検出限界以下（４ｐｇ／ｍｌ）。
【図１１−１】[020]図１１は、ＤＲ３が、ナイーブＴ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７分化のために必要ないことを示す。図１１Ａは、Ｔ枯渇ＡＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−の精製されたナイーブなＣＤ４＋  Ｔ細胞で、可溶性抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の存在下で、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７分極化条件下で４日間培養したことを示す。次いで細胞を、ＰＭＡ及びイオノマイシンで５−６時間再刺激し、そして細胞内サイトカインに対して染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
【図１１−２】図１１Ｂは、ソートされたＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、ＯＴ−ＩＩ又はＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩの精製されたナイーブなＣＤ４＋  Ｔ細胞で、Ｏｖａペプチドの存在下で、Ｔｈ０、Ｔｈ１又はＴｈ２分極化条件下で、又はＳＴＡｇの存在下で６日間培養したことを示す。次いで細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で５−６時間再刺激し、そして細胞内サイトカインに対して染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
【図１２−１】[021]図１２は、ＤＲ３が、Ｔｈ２媒介の肺炎症のために必要であることを示す。マウスを、Ａｌｕｍ＋ＰＢＳ（対照）又はＡｌｕｍ＋Ｏｖａで感作した。次いでマウスを、ＰＢＳ（対照）又はＯｖａでチャレンジした。図１２Ａは、気道（ａｗ）及び浸潤性細胞（矢頭）を示す、ＰＡＳ染色組織診断の例を示すことを示す。
【図１２−２】図１２Ｂは、肺の病理組織診断を採点し（左の図）そしてＢＡＬ中の細胞を計数した（右の図）ことを示す。
【図１２−３】図１２Ｃは、細胞を肺から抽出し、そしてフローサイトメトリーで分析したこと（図１２Ｄ）を示す。ＲＮＡを肺から調製し、そしてＲＴ−ｑＰＣＲで使用した。結果は、ＰＢＳで治療された対照マウスの肺に対して計算されたサイトカインのｍＲＮＡの量を示す。Ｐ値は、ＤＲ３−／−とＯｖａで誘導された対照マウスとの間の、示したサイトカインのｍＲＮＡレベルに対する独立ｔ検定に対するものである。
【図１２−４】図１２Ｃは、細胞を肺から抽出し、そしてフローサイトメトリーで分析したこと（図１２Ｄ）を示す。ＲＮＡを肺から調製し、そしてＲＴ−ｑＰＣＲで使用した。結果は、ＰＢＳで治療された対照マウスの肺に対して計算されたサイトカインのｍＲＮＡの量を示す。Ｐ値は、ＤＲ３−／−とＯｖａで誘導された対照マウスとの間の、示したサイトカインのｍＲＮＡレベルに対する独立ｔ検定に対するものである。
【図１２−５】図１２Ｗは、脾細胞を５０μｇ／ｍｌのＯｖａタンパク質又は培地の対照の存在下で３日間培養したことを示す。上清を、サイトカイン産生について細胞数測定ビーズアレイによって分析した。図１２Ｆは、血清を、Ｏｖａ特異的ＩｇＥ及びＯｖａ特異的ＩｇＧ１レベルについてＥＬＩＳＡによって試験したことを示す。群を独立両側Ｔ検定で比較することによって得られたＰ値を、有意である場合に示す；ｎ．ｓ．＝有意ではない。
【図１３−１】[022]図１３は、ＤＲ３−／−マウスが、欠陥のある局所Ｔ細胞反応及びＥＡＥにおける減少した疾病を有することを示す。図１３Ａは、ＤＲ３−／−マウス及びＣ５７ＢＬ／６対照マウスを、材料及び方法中に記載したように、ＥＡＥのために誘導し、そして臨床スコアを毎日測定したことを示す。図１３Ｂは、ＭＯＧ注射の部位からの流入領域リンパ節を回収し、そして細胞を、示した量のＭＯＧペプチドで再刺激したことを示す。Ｔ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みによって３日後に評価した。
【図１３−２】図１３Ｃは、脊髄から回収された細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で４時間再刺激し、そしてＴ細胞表面マーカーについてフローサイトメトリーによって分析し、そしてゲートした（ｇａｔｅｄ）ＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞を、細胞内サイトカイン産生について分析したことを示す。
【図１３−３】図１３Ｄは、示したマウスの群からの脊髄及び脾臓からのｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによってＩＬ−１７及びＩＦＮ−γのｍＲＮＡについて分析したことを示す。結果をβ２ｍ又はＣＤ３−δに対して正規化した。エラーバーは、三連の試料のｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図１４】[023]図１４は、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに対する正常な全身性反応を示す。示したマウスを、平均２０個の嚢胞／動物でｉ．ｐ．で接種した。７週間後、脾臓細胞を回収し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８と共に、又はＳＴＡｇと共に４８時間培養し、そして上清を、示したサイトカインの産生について試験した。
【図１５−１】[024]図１５は、ヒト及びマウスにおけるＴ細胞特異的ＤＲ３発現を示す。ＳｙｍＡｔｌａｓ（ｓｙｍａｔｌａｓ．ｇｎｆ．ｏｒｇ）（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）からのＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）に対するマイクロアレイ由来の遺伝子発現データを、マウス（図１５Ａ）及びヒト（図１５Ｂ）組織からの各種の細胞型について示す。データは、ｇｃＲＭＡアルゴリズムによって正規化されている。
【図１５−２】[024]図１５は、ヒト及びマウスにおけるＴ細胞特異的ＤＲ３発現を示す。
【図１５−３】[024]図１５は、ヒト及びマウスにおけるＴ細胞特異的ＤＲ３発現を示す。ＳｙｍＡｔｌａｓ（ｓｙｍａｔｌａｓ．ｇｎｆ．ｏｒｇ）（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）からのＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）に対するマイクロアレイ由来の遺伝子発現データを、マウス（図１５Ａ）及びヒト（図１５Ｂ）組織からの各種の細胞型について示す。データは、ｇｃＲＭＡアルゴリズムによって正規化されている。
【図１５−４】[024]図１５は、ヒト及びマウスにおけるＴ細胞特異的ＤＲ３発現を示す。
【図１６】[025]図１６は、ＤＲ３−／−及びＷＴのＴ細胞の活性化後の、表面マーカー発現の動態を示す。Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−マウスからの精製されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で、１０ｎｇ／ｍｌのマウスｒＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で活性化した。細胞を、刺激の前に、並びに２４、４８及び７２時間後に、示した活性化マーカーに対して染色し、そしてフローサイトメトリーによって測定した。
【図１７−１】[026]図１７は、ナイーブＴ細胞に対するＴＬ１Ａの影響を示す。図１７Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−マウスからの精製されたナイーブな（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３で、１０ｎｇ／ｍｌのマウスｒＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で３日間活性化したことを示す。３Ｈ−チミジンを培養物に加え、一晩インキュベートし、そしてチミジン取り込みについて分析した。図１７Ｂは、上記のように培養したナイーブなＣＤ４＋  Ｔ細胞からの上清を、３日後に回収し、そしてサイトカイン産生について分析したことを示す。
【図１７−２】図１７Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−マウスからの脾臓及びリンパ節を、ＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ４４発現を決定することによって記憶集団（ｍｅｍｏｒｙ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）について分析したことを示す。
【図１８】[027]図１８は、ＤＲ３−／−及びＷＴのＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の、ｏｖａペプチドでパルス刺激されたＤＣによる活性化後の表面マーカーの発現を示す。骨髄由来ＤＣを、ナイーブなＯＴ−ＩＩ又はＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩのＣＤ４＋  Ｔ細胞と共に、示した濃度のＯｖａペプチドの存在下で培養した。細胞を、ＣＤ４及び示した表面発現マーカーに対して、２４時間及び４８時間後に染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【図１９】[028]図１９は、Ｏｖａ誘発の肺炎症におけるＴ細胞及びマクロファージの変更された局在化を示す。実験方法中に記載したようなＯｖａで予備刺激及びチャレンジした、示した遺伝子型のマウスからの肺の組織学的切片を、抗ＣＤ３（Ｔ細胞）又は抗Ｆ４／８０（マクロファージ）マーカー抗体及びＨＲＰ結合二次抗体で、免疫組織化学標識に供した。気道（ａｗ）及び血管（ｂｖ）を示す。
【図２０−１】[029]図２０は、機能性抗ＴＬ１Ａ遮断抗体の特徴付けを示す。図２０Ａ−Ｄは、マウスＴＬ１Ａ−ＧＦＰ融合タンパク質で遺伝子導入された細胞のフローサイトメトリー的染色を示す。図２０Ａは、陰性対照のｍＡｂである。図２０Ｂ及び２０Ｃは、二つの陽性抗ＴＬ１Ａクローンである。図２０Ｄは、ＧＦＰ単独で遺伝子導入された細胞と反応した陽性クローンである。
【図２０−２】図２０Ｅは、ＲＰＭＩ８８２６細胞株におけるＴＬ１Ａ誘発アポトーシスの遮断を示す。１００ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ＋シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を、ＲＰＭＩ−８８２６Ｂリンパ腫細胞に加え、そして細胞の生存率を２４時間後ＭＴＴアッセイで測定した。生存率は、培地単独についての１００％に対して正規化した。抗ＴＬ１Ａ抗血清を、１：１０００の希釈で使用した。
【図２１−１】[030]図２１は、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスにおける炎症性腸疾患を示す。図２１Ａは、野生型（ＷＴ）、ＴＬ１Ａ−ＣＤ２株Ｒ６（Ｒ６）及びＴＬ１Ａ  ＣＤ１１ｃ株Ｉ４（Ｉ４）遺伝子導入マウスからの回腸の切片の、全体（上）、低（中）及び高倍率の拡大を示す。図２１Ｂ及び２１Ｃは、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ及びＣＤ１１ｃ−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの、示した領域の病理組織学的ＩＢＤスコアの概要を示す。
【図２１−２】図２１Ｂ及び２１Ｃは、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ及びＣＤ１１ｃ−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの、示した領域の病理組織学的ＩＢＤスコアの概要を示す。図２１Ｄは、示したマウスの群の離乳後３週間の体重増加を示す。
【図２１−３】図２１Ｅは、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定され、そして野生型マウスにおける平均の１に対して正規化された、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスからの回腸における、示したサイトカインについてのＲＮＡの相対レベルを示す。
【図２２−１】[031]図２２は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合されたＴＬ１Ａで遺伝子導入された２９３Ｔ細胞を使用する抗ＴＬ１Ａ抗体に対するスクリーニング戦略を示す。例を、マウスＴＬ１Ａ（ｍＴＬ１Ａ）に対する抗体のスクリーニングから示す。アルメニアハムスターを、マウス組換えＴＬ１Ａで免疫化した。ハイブリドーマを、マウスＴＬ１Ａで遺伝子導入した２９３Ｔ細胞によりフローサイトメトリーによってスクリーニングした。例を、Ａにおける陽性クローンについて示す。Ｂにおいて、更なる分析のために選択された、示した量の二つのクローンによるｍＴＬ１Ａの、例示的染色を示す。ヒトＴＬ１Ａを発現する２９３Ｔ細胞による同じ戦略を、ヒト組換えＴＬ１Ａで免疫化したマウスからのハイブリドーマをスクリーニングするために使用して、ｍＩｇＧ２ａカッパアイソタイプ抗体である抗ヒトＴＬ１Ａクローン１Ａ９及び１Ｃ６を選択した。
【図２２−２】[031]図２２は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合されたＴＬ１Ａで遺伝子導入された２９３Ｔ細胞を使用する抗ＴＬ１Ａ抗体に対するスクリーニング戦略を示す。
【図２２−３】[031]図２２は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合されたＴＬ１Ａで遺伝子導入された２９３Ｔ細胞を使用する抗ＴＬ１Ａ抗体に対するスクリーニング戦略を示す。
【図２３】[032]図２３は、野生型又はＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスのＴ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で２４時間活性化し、次いで説明文に示すように、示した細胞型におけるこのｍＡｂによる表面ＴＬ１Ａの認識を証明するために、抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  ５Ｇ４．６で染色したことを示す。灰色の影付きプロットは、対照染色試薬としてハムスターＩｇを使用した蛍光のバックグラウンドレベルを表す。
【図２４】[033]図２４は、抗ヒトＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  １Ａ９を使用する体液及び培養上清中のヒトＴＬ１Ａの検出のためのビーズベースアッセイについての感受性曲線を示す。
【図２５】[034]図２５は、示したｍＡｂの存在下のマウス（Ａ）又はヒト（Ｂ）ＴＬ１Ａ＋シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で治療されたＴＦ１赤白血病細胞を示す。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ＡＴＰ試薬によって測定した。発光の変化は、これらの細胞におけるＴＬ１Ａ＋ＣＨＸに対する既知の反応である細胞死を示す。発光の変化の減少は、ｍＡｂによるＴＬ１Ａ作用の遮断を示す。これらのｍＡｂが、ヒト及びマウスＴＬ１Ａとの間で交差反応しないことも示された。
【図２６】[035]図２６は、抗マウスＴＬ１Ａ  ｍＡｂによるＴＮＢＳ大腸炎の予防を示す。Ａ）０日目におけるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与によりＴＮＢＳ大腸炎を発症するように誘導されたマウスのコホートにおける体重減少。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  ５Ｇ４．６又は対照のハムスターＩｇＧを、−１及び０日目にｉ．ｐ．で注射した。それぞれの点は、コホートの平均体重を表す。実験の終了の前に死亡したマウスを、矢印で示す。データは、群当たり最低８匹のマウスによる二つの独立の実験の代表である。Ｂ）（Ａ）のように対照又は抗ＴＬ１ＡのｍＡｂで治療された、ＴＮＢＳ大腸炎を発症するように誘導されたマウスからの結腸の代表的Ｈ＆Ｅ切片。矢印は、対照のＡｂで治療されたマウスの重度の炎症の区域を示す。左の図は、同じ切片の５０×であり、そして右の図は２００×拡大である。（Ａ）のマウスの大腸炎の誘導後６日目の平均病態スコアを示す。
【図２７】図２７は、抗マウスＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  ５Ｇ４．６によるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の予防を示す。Ａ．ＣＩＡは、標準的な方法によってＤＢＡ／１マウスにおいて誘導した。２０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  ５Ｇ４．６（治療、ｎ＝５）又はハムスター免疫グロブリン（対照、ｎ＝７）のいずれかの毎週の腹腔内注射を、コラーゲンによる最初の免疫化後２１日目に開始した。三つの独立の実験の代表的実験を示す。各日の臨床スコアを独立ｔ検定を使用して比較し、そして有意性のためのｐ値をそれぞれの時点の上に示し、それぞれの日付の上の星印（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５）によって表す。二元配置ＡＮＯＶＡを更に行って、二つのグラフの傾向を比較し、ｐ値をそれぞれの実験の右に示す。Ｂ．各日の関節炎のないマウスのパーセントの生存率分析を、抗ＴＬ１Ａ治療群と対照群との間で比較する。関節炎は、二つ又はそれより多い組合せた臨床スコアによって定義した。Ｃ．図ＡのようにＣＩＡを発症するように誘導されたそれぞれの群からのマウスからの血清を、示した時点で収集し、そして抗ニワトリコラーゲンＩｇＧレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【図２８】[036]図２８は、抗マウスＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  ５Ｇ４．６によるＴＬ１Ａの遮断が、ＣＩＡにおける関節スコアに関わらず、骨の浸食を減少させることを示す。Ａ）方法中に記載されたようにＣＩＡを発症するように誘導されたマウスからの後足を回収し、そして１０％のホルムアルデヒド中で固定した。足をマイクロ−ＣＴで走査し、そして画像を、方法に記載するように再構成した。例をそれぞれの治療群から示し、最大の臨床スコア及び浸食スコアを、治療群に対してブラインドの二人の別個の観察者によりその足に対して得た。Ｂ）臨床スコアに対してブラインドの二人の別個の観察者によって得られた浸食スコアを、それぞれの試料について平均した。ここに示されるものは、抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  ５Ｇ４．６で治療された群（ｎ＝１８）及び対照の抗体で治療された群（ｎ＝２０）からのスコアの複合であり、ｐ値は、ウエルチの相関（Welch's correlation）を伴う独立ｔ検定からのものである（＊ｐ＝０．０５）。個々の領域の分析は、足首／足根における０．０７８、中足指節（ＭＴＰ）関節における０．０４２、及び爪先における０．０１５のｐ値をもたらした。Ｃ）二つの群からの足のＣＴスコアの比較は、最大臨床スコアに基づいた。抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ治療は、臨床スコアに関係なく浸食を有意に減少させた。二元配置ＡＮＯＶＡを使用してＰ＜０．０００１（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[037]開示される方法及び組成物は、本明細書中に含まれる以下の特定の態様の詳細な説明及び実施例、並びに図面及びその先の及び以下の記載を参照することによって、更に容易に理解することができる。
【００１２】
[0038]開示されるものは、開示される方法及び組成物のために使用することができるか、それらに関連して使用することができるか、それらの調製において使用することができるか、又はそれらの産物である、材料、組成物及び成分である。これらの及び他の材料が本明細書中で開示され、そしてこれらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群、等が開示された場合、これらの化合物のそれぞれの種々の個々の及び集合的組合せ並びに並べ替えの具体的な言及は明確に開示されないかもしれないが、それぞれは、具体的に意図され、そして本明細書中に記載されることは理解される。例えば、ペプチドが開示され、そして考察され、そして当該ペプチドを含む多くの分子に対して行うことができる多くの改変が考察される場合、ペプチドの全ての組合せ及び並べ替え並びに可能な改変は、その逆が具体的に示されない限り、具体的に意図されている。従って、一つのクラスの分子Ａ、Ｂ、及びＣ、並びに一つクラスの分子Ｄ、Ｅ、及びＦが開示され、そして組合せ分子の例Ａ−Ｄが開示されている場合、それぞれが個々に列挙されていないとしても、それぞれは、個々に、そして集合的に意図されている。従って、この例において、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びに例の組合せＡ−Ｄの開示から、組合せＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆのそれぞれは具体的に意図され、そして開示されていると考えるべきである。同様に、これらのいずれものサブセット又は組合せも具体的に意図され、そして開示される。従って、例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びに例の組合せＡ−Ｄの開示から、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅの下位群が具体的に意図され、そして開示されていると考えるべきである。この概念は、制約されるものではないが、開示される組成物の製造及び使用の方法における工程を含む本出願の全ての側面に適用される。従って、行うことができる各種の更なる工程がある場合、これらの更なる工程のそれぞれを、開示される方法のいずれもの具体的な態様又は態様の組合せで行うことができ、そしてそれぞれのこのような組合せが具体的に意図され、そして開示されていると考えるべきであることは理解されることである。
【００１３】
[039]使用される略語の意味は、次のとおりであり、“ＢＳＡ”は、ウシ血清アルブミンを意味し、“ＥＬＩＳＡ”は、酵素結合免疫吸着アッセイを意味し、“ＣＩＨ”は、コラーゲン誘導関節炎を意味し、“ＳＦ”は、滑液を意味し、“マイクロＣＴ”は、マイクロ断層撮影法を意味し、“ＡＰＣ”は、抗原提示細胞を意味し、“ＷＴ”は、野生型を意味し、“ＫＯ”は、ノックアウトを意味し、“ＤＣ”は、樹状細胞を意味し、“ＲＩＡ”は、放射免疫アッセイを意味し、“ＲＩＰＡ”は、放射免疫沈降アッセイを意味し、“ＦＲＥＴ”は、蛍光共鳴エネルギー転移を意味し、“ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ”は、光退色後蛍光回復／局在化を意味し、“ＦＡＣＳ”は、蛍光活性化セルソーティングを意味し、“ＲＴ−ＰＣＲ”は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を意味し、“ＬＰＳ”は、リポポリサッカリドを意味し、“ＦＡＤＤ”は、デスドメインを有するＦａｓ結合タンパク質（Fas-Associated protein with Death Domain）を意味し、“ＢＡＬＦ”は、気管支肺胞洗浄液を意味する。
【００１４】
[040]当業者は、本明細書中に開示される方法及び組成物の具体的態様に対する多くの均等物を、日常的実験を使用するのみで認識するか、又は確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【００１５】
[041]開示される方法及び組成物は変更することができることから、これらが記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬に制約されないことは理解される。本明細書中で使用される用語が、特定の態様を記載する目的のためのみであり、そして付属する特許請求の範囲によってのみ制約されるものである本発明の範囲を制約することを意図するものではないことも理解される。
【００１６】
Ａ．治療の方法
[042]提供されるものは、ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を遮断することを含んでなる、被験者の炎症性又は自己免疫性疾病を治療する方法である。
【００１７】
[043]ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、内因性ＤＲ３レベル、活性、又は利用可能性を減少させることによって遮断することができる。ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、内因性ＴＬ１Ａレベル、活性、又は利用可能性を減少させることによって遮断することもできる。ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、二つの分子間の相互作用を直接妨害する薬剤を使用して遮断することができる。例えば、直接の妨害は、そのＴＬ１Ａに対する結合部位においてＤＲ３に結合する薬剤、又はそのＤＲ３に対する結合部位においてＴＬ１Ａに結合する薬物によって影響を受け得る。典型的には、この結合は、この部位において結合する他の分子の能力を競合的に妨害するものである。
【００１８】
[044]タンパク質レベル、活性、又は利用可能性は、例えば、ペプチドの転写、翻訳、トランスロケーション、ユビキチン化、リン酸化、グリコシル化、又はペプチド切断を調節することによって影響を受け得る。
【００１９】
ｉ．機能性核酸
[045]例えば、ＴＬ１Ａの内因性レベルは、アンチセンス、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、又はアプタマーのような機能性核酸を使用して減少させることができる。
【００２０】
[046]機能性核酸は、標的分子を結合する、又は特異的反応を触媒するような特異的機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は、制約することを意味するものではないが、以下の分類に分けることができる。例えば、機能性核酸は、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、及び外部ガイド配列を含む。機能性核酸分子は、影響因子、阻害剤、調節因子、及び標的分子によって保有される特異的活性の刺激因子として作用することができるか、又は機能性核酸分子は、いずれもの他の分子に関わらない新規な活性を保有することができる。
【００２１】
[047]機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は炭水化物鎖のようないずれもの巨大分子と相互作用することができる。従って、機能性核酸は、ＴＬ１ＡのｍＲＮＡ又はＴＬ１ＡのゲノムＤＮＡと相互作用することができるか、或いはこれらは、ポリペプチドのＴＬ１Ａと相互作用することができる。或いは、機能性核酸は、ＤＲ３のｍＲＮＡ又はＴＲ３のゲノムＤＮＡと相互作用することができるか、或いはこれらは、ＤＲ３ポリペプチドと相互作用することができる。しばしば、機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況において、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づかないが、しかしむしろ特異的認識が起こることを可能にする三次構造の形成に基づく。
【００２２】
[048]アンチセンス分子は、古典的又は非古典的塩基対合のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮアーゼＨ仲介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解による標的分子の破壊を促進するように設計される。或いは、アンチセンス分子は、転写又は複製のような標的分子上で通常起こるものであるプロセシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近可能な領域を見出すことによるアンチセンス効率の最適化のための多くの方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳ及びＤＥＰＣを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択実験及びＤＮＡ修飾研究であるものである。アンチセンス分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２より小さいか、或いはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計及び使用を補助する方法及び技術の代表的サンプルは、米国特許第５，１３５，９１７号、５，２９４，５３３号、５，６２７，１５８号、５，６４１，７５４号、５，６９１，３１７号、５，７８０，６０７号、５，７８６，１３８号、５，８４９，９０３号、５，８５６，１０３号、５，９１９，７７２号、５，９５５，５９０号、５，９９０，０８８号、５，９９４，３２０号、５，９９８，６０２号、６，００５，０９５号、６，００７，９９５号、６，０１３，５２２号、６，０１７，８９８号、６，０１８，０４２号、６，０２５，１９８号、６，０３３，９１０号、６，０４０，２９６号、６，０４６，００４号、６，０４６，３１９号、及び６，０５７，４３７号中に見出すことができる。
【００２３】
[049]アプタマーは、好ましくは特異的方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループ又はＧ四重鎖のような規定された二次及び三次構造に折畳まれた１５−５０個の塩基の長さの範囲の小さい核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）のような小さい分子、並びに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような大きい分子と結合することができる。アプタマーは、１０−１２Ｍより小さい標的分子からのＫｄで非常に堅固に結合することができる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２より小さいＫｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い程度の特異性で標的分子を結合することができる。例えば、標的分子と当該分子上の一つの位置のみで異なるもう一つの分子との間の結合親和性において、１０，０００倍より大きい差を有するアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーが、バックグラウンド結合分子とのＫｄより、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、又は１００，０００倍低い標的分子とのＫｄを有することが好ましい。例えばポリペプチドについて比較する場合、バックグラウンド分子は、異なったポリペプチドであることが好ましい。各種の異なった標的分子を結合するためのアプタマーを、製造し、そして使用するための方法の代表的例は、米国特許第５，４７６，７６６号、５，５０３，９７８号、５，６３１，１４６号、５，７３１，４２４号、５，７８０，２２８号、５，７９２，６１３号、５，７９５，７２１号、５，８４６，７１３号、５，８５８，６６０号、５，８６１，２５４号、５，８６４，０２６号、５，８６９，６４１号、５，９５８，６９１号、６，００１，９８８号、６，０１１，０２０号、６，０１３，４４３号、６，０２０，１３０号、６，０２８，１８６号、６，０３０，７７６号、及び６，０５１，６９８号中に見出すことができる。用語“合成アプタマー”は、天然に存在することがこれまで知られていない、そして生物学的認識部位又はアプタマー複合体として機能するアプタマー或いはアプタマー的配列を意味する。
【００２４】
[050]リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかの化学反応を触媒することが可能な核酸分子である。従って、リボザイムは、触媒性核酸である。リボザイムが、分子間反応を触媒することが好ましい。ヌクレアーゼ型反応又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する多くの異なった種類のリボザイムが存在し、これらは、ハンマーヘッド型リボザイム（米国特許第５，３３４，７１１号、５，４３６，３３０号、５，６１６，４６６号、５，６３３，１３３号、５，６４６，０２０号、５，６５２，０９４号、５，７１２，３８４号、５，７７０，７１５号、５，８５６，４６３号、５，８６１，２８８号、５，８９１，６８３号、５，８９１，６８４号、５，９８５，６２１号、５，９８９，９０８号、５，９９８，１９３号、５，９９８，２０３；Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔによる国際特許出願ＷＯ９８５８０５８、Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  ＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５７、及びＬｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  ＳｐｒｏａｔによるＷＯ９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（例えば、米国特許第５，６３１，１１５号、５，６４６，０３１号、５，６８３，９０２号、５，７１２，３８４号、５，８５６，１８８号、５，８６６，７０１号、５，８６９，３３９号、及び６，０２２，９６２号）、及びテトラヒメナリボザイム（例えば、米国特許第５，５９５，８７３号、及び５，６５２，１０７号）のような天然の系中に見出されるリボザイムに基づく。天然の系中に見出されていない多くのリボザイムも存在するが、しかし、これらは、新規な特異的反応を触媒するように操作されている（例えば、米国特許第５，５８０，９６７号、５，６８８，６７０号、５，８０７，７１８号、及び５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、そしてより好ましくはＲＮＡ基質を切断する。典型的には、リボザイムは、その後の切断を伴う標的基質の認識及び結合によって核酸基質を切断する。この認識は、しばしば殆ど古典的又は非古典的塩基対の相互作用に基づく。この特性は、標的基質の認識が、標的基質の配列に基づくために、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補とする。各種の異なった反応を触媒するためのリボザイムを製造し、そして使用するための方法の代表的な例は、米国特許第５，６４６，０４２号、５，６９３，５３５号、５，７３１，２９５号、５，８１１，３００号、５，８３７，８５５号、５，８６９，２５３号、５，８７７，０２１号、５，８７７，０２２号、５，９７２，６９９号、５，９７２，７０４号、５，９８９，９０６号、及び６，０１７，７５６号中に見出すことができる。
【００２５】
[051]三重鎖形成の機能性核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、そこにはワトソン−クリック及びフーグスティーン塩基対の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの三本鎖が存在する。三重鎖分子が、これらが高い親和性及び特異性で標的領域を結合することができるために好ましい。三重鎖形成分子が、標的分子を１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２より小さいＫｄで結合することが好ましい。各種の異なった標的分子を結合するための三重鎖形成分子を製造し、そして使用するための方法の代表的な例は、米国特許第５，１７６，９９６号；５，６４５，９８５号  ５，６５０，３１６号；５，６８３，８７４号；５，６９３，７７３号；５，８３４，１８５号；５，８６９，２４６号；５，８７４，５６６号及び５，９６２，４２６号中に見出すことができる。
【００２６】
[052]外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子を結合する分子であり、そしてこの複合体は、ＲＮアーゼＰによって認識され、これは標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択されるＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計することができる。ＲＮアーゼＰは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを援助する。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させＥＧＳを使用することによって、細菌のＲＮアーゼＰは、実質的にいずれものＲＮＡ配列を切断するためにリクルートされ得る。（ＹａｌｅによるＷＯ９２／０３５６６、及びＦｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
【００２７】
[053]同様に、真核生物のＲＮＡのＥＧＳ／ＲＮアーゼＰ特異的切断は、真核細胞内の所望の標的を切断するために使用することができる（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＷＯ９３／２２４３４  ｂｙ  Ｙａｌｅ；ＷＯ９５／２４４８９  ｂｙ  Ｙａｌｅ；Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５９−１６８（１９９５），及びＣａｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５））。各種の異なった標的分子の切断を容易にするためのＥＧＳ分子を製造し、そして使用するための方法の代表的な例は、米国特許第５，１６８，０５３号、５，６２４，８２４号、５，６８３，８７３号、５，７２８，５２１号、５，８６９，２４８号、及び５，８７７，１６２号中に見出される。
【００２８】
[054]遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により高度に特異的な様式で効率的にサイレンシングすることもできる。このサイレンシングは、本来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加に伴い観察された（Ｆｉｒｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−１１；Ｎａｐｏｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−８９；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−５１）。ｄｓＲＮＡが細胞に入った後、これは、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素、ダイサーによって、３’末端に２個のヌクレオチドのオーバーハングを含有する２１−２３個のヌクレオチドの長さの二本鎖の小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８−２００；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−６；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３−６）。ＡＴＰ依存性工程において、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般的に知られている多重サブユニットタンパク質複合体に組込まれ、これは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に導く（Ｎｙｋａｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ，１０７：３０９−２１）。ある時点で、ｓｉＲＮＡ二重鎖は巻き戻され、そしてアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣに結合したままで、エンド及びエキソヌクレアーゼの組合せによる相補的ｍＲＮＡ配列の分解を指示するようである（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５６３−７４）。しかしながら、ｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの効果、或いはそれらの使用は、いかなるタイプのメカニズムにも限定されない。
【００２９】
[055]短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができる二本鎖ＲＮＡであり、これによって遺伝子発現を減少させるか、又は阻害さえする。一つの例において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ及び標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡのような相同性ＲＮＡ分子の特異的分解を誘発する。例えば、ＷＯ０２／４４３２１は、３’のオーバーハング末端を伴う塩基対を形成する場合に標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を可能にするｓｉＲＮＡを開示し、本明細書中に参考文献として、これらのｓｉＲＮＡを製造する方法のために援用される。配列特異的遺伝子サイレンシングは、哺乳動物細胞において、酵素ダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する、合成の短い二本鎖ＲＮＡを使用して達成することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４  ４９８）（Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４７９：７９−８２）。ｓｉＲＮＡは、化学的に、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができるか、或いは細胞の内部でｓｉＲＮＡにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であることができる。合成のｓｉＲＮＡは、一般的にアルゴリズム及び慣用的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者は、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、及びＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む。ｓｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ’ｓ  ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットのようなキットを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することもできる。ある例において、ｓｉＲＮＡは、ＴＬ１Ａ遺伝子又はＤＲ３遺伝子のような特定の標的遺伝子に対して向けられる。
【００３０】
[056]ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写により、より一般的に行われる。例えば、Ｉｍｇｅｎｅｘ’ｓ  ＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲＴＭ  構築キット及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  ＢＬＯＣＫ−ＩＴＴＭ  誘導性ＲＮＡｉプラスミド及びレンチウイルスベクターのような、ｓｈＲＮＡを含んでなるベクターの産生のためのキットは入手可能である。本明細書中に開示されるものは、本明細書中に開示される炎症メディエーターに対する配列に基づく、先に記載したように設計されたいずれものｓｈＲＮＡである。
【００３１】
[057]配列番号：１及び３に示した配列、又は配列番号：２及び４に記載したタンパク質をコードする配列の一つ又はそれより多くを認識するアンチセンス配列を含むプラスミド。例えば、ウイルス感染に関係する宿主タンパク質をコードするｃＤＮＡ断片又は変異体は、ＰＣＲ増幅される。ヌクレオチドは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して増幅され、そしてｐｃＤＮＡベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のようなベクター中のアンチセンス配向でクローン化される。挿入断片のヌクレオチド配列及び配向は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する配列決定によって確認することができる。
【００３２】
ｉｉ．ドミナントネガティブペプチド
[058]ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、ドミナントネガティブ変異体の使用によって遮断することもできる。
【００３３】
[0059]例えば、ドミナントネガティブ変異体は、ＦＡＤＤをリクルートする“デスドメイン”を欠く、切断されたＤＲ３の細胞質ドメイン、又はＦＡＤＤ結合を抑制するこの領域の点変異からなることができる。このようなドミナントネガティブ構築物は、Ｆａｓのような関係する受容体によるシグナル伝達を好結果に遮断した。
【００３４】
[060]同様に、ＴＬ１Ａのドミナントネガティブ変異体は、先に記載されているように、ＴＬ１Ａトリマーの野生型サブユニットを結合するが、しかしリガンドを結合しないように操作することができる（Ｓｔｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００３５】
[061]阻害を支配するためのもう一つの戦略は、その全てが参考文献として本明細書中に、ＰＬＡＤの教示のために援用される、米国特許第７，１４８，０６１号中のＴＮＦＲ１及びＦａｓのために記載されているような、プレリガンドアセンブリードメイン（ＰＬＡＤ）を使用することができる。
【００３６】
[062]ＤＲ３に対するＰＬＡＤは、成熟したＤＲ３受容体ポリペプチドのＮ−末端の３８個のように少ないアミノ酸を含んでなることができる。成熟した受容体ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。従って、配列Ｒ１−ＰＬＡＤ−Ｒ２を有するポリペプチドが提供される。ＤＲ３のＰＬＡＤの例は、以下を含む：
【００３７】
【表１】
2014518883.tif 000002
【００３８】
[063]開示されるものは、Ｒ１−ＤＲ３  ＰＬＡＤ−Ｒ２を含んでなるポリペプチドであり、ここで、Ｒ１及びＲ２は任意であり、そして存在する場合、Ｈ、アシル、ＮＨ２、アミノ酸又はペプチドであることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸４３−５８を含んでなることができる。
【００３９】
[0064]従って、ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−８０、２２−８０、２３−８０、２４−８０、２５−８０、２６−８０、２７−８０、２８−８０、２９−８０、３０−８０、３１−８０、３２−８０、３３−８０、３４−８０、３５−８０、３６−８０、３７−８０、３８−８０、３９−８０、４０−８０、４１−８０、４２−８０、４３−８０からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７９、２２−７９、２３−７９、２４−７９、２５−７９、２６−７９、２７−７９、２８−７９、２９−７９、３０−７９、３１−７９、３２−７９、３３−７９、３４−７９、３５−７９、３６−７９、３７−７９、３８−７９、３９−７９、４０−７９、４１−７９、４２−７９、４３−７９からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７８、２２−７８、２３−７８、２４−７８、２５−７８、２６−７８、２７−７８、２８−７８、２９−７８、３０−７８、３１−７８、３２−７８、３３−７８、３４−７８、３５−７８、３６−７８、３７−７８、３８−７８、３９−７８、４０−７８、４１−７８、４２−７８、４３−７８からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７７、２２−７７、２３−７７、２４−７７、２５−７７、２６−７７、２７−７７、２８−７７、２９−７７、３０−７７、３１−７７、３２−７７、３３−７７、３４−７７、３５−７７、３６−７７、３７−７７、３８−７７、３９−７７、４０−７７、４１−７７、４２−７７、４３−７７からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７６、２２−７６、２３−７６、２４−７６、２５−７６、２６−７６、２７−７６、２８−７６、２９−７６、３０−７６、３１−７６、３２−７６、３３−７６、３４−７６、３５−７６、３６−７６、３７−７６、３８−７６、３９−７６、４０−７６、４１−７６、４２−７６、４３−７６からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７５、２２−７５、２３−７５、２４−７５、２５−７５、２６−７５、２７−７５、２８−７５、２９−７５、３０−７５、３１−７５、３２−７５、３３−７５、３４−７５、３５−７５、３６−７５、３７−７５、３８−７５、３９−７５、４０−７５、４１−７５、４２−７５、４３−７５からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７４、２２−７４、２３−７４、２４−７４、２５−７４、２６−７４、２７−７４、２８−７４、２９−７４、３０−７４、３１−７４、３２−７４、３３−７４、３４−７４、３５−７４、３６−７４、３７−７４、３８−７４、３９−７４、４０−７４、４１−７４、４２−７４、４３−７４からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７３、２２−７３、２３−７３、２４−７３、２５−７３、２６−７３、２７−７３、２８−７３、２９−７３、３０−７３、３１−７３、３２−７３、３３−７３、３４−７３、３５−７３、３６−７３、３７−７３、３８−７３、３９−７３、４０−７３、４１−７３、４２−７３、４３−７３からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７２、２２−７２、２３−７２、２４−７２、２５−７２、２６−７２、２７−７２、２８−７２、２９−７２、３０−７２、３１−７２、３２−７２、３３−７２、３４−７２、３５−７２、３６−７２、３７−７２、３８−７２、３９−７２、４０−７２、４１−７２、４２−７２、４３−７２からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７１、２２−７１、２３−７１、２４−７１、２５−７１、２６−７１、２７−７１、２８−７１、２９−７１、３０−７１、３１−７１、３２−７１、３３−７１、３４−７１、３５−７１、３６−７１、３７−７１、３８−７１、３９−７１、４０−７１、４１−７１、４２−７１、４３−７１からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−７０、２２−７０、２３−７０、２４−７０、２５−７０、２６−７０、２７−７０、２８−７０、２９−７０、３０−７０、３１−７０、３２−７０、３３−７０、３４−７０、３５−７０、３６−７０、３７−７０、３８−７０、３９−７０、４０−７０、４１−７０、４２−７０、４３−７０からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６９、２２−６９、２３−６９、２４−６９、２５−６９、２６−６９、２７−６９、２８−６９、２９−６９、３０−６９、３１−６９、３２−６９、３３−６９、３４−６９、３５−６９、３６−６９、３７−６９、３８−６９、３９−６９、４０−６９、４１−６９、４２−６９、４３−６９からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６８、２２−６８、２３−６８、２４−６８、２５−６８、２６−６８、２７−６８、２８−６８、２９−６８、３０−６８、３１−６８、３２−６８、３３−６８、３４−６８、３５−６８、３６−６８、３７−６８、３８−６８、３９−６８、４０−６８、４１−６８、４２−６８、４３−６８からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６７、２２−６７、２３−６７、２４−６７、２５−６７、２６−６７、２７−６７、２８−６７、２９−６７、３０−６７、３１−６７、３２−６７、３３−６７、３４−６７、３５−６７、３６−６７、３７−６７、３８−６７、３９−６７、４０−６７、４１−６７、４２−６７、４３−６７からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６６、２２−６６、２３−６６、２４−６６、２５−６６、２６−６６、２７−６６、２８−６６、２９−６６、３０−６６、３１−６６、３２−６６、３３−６６、３４−６６、３５−６６、３６−６６、３７−６６、３８−６６、３９−６６、４０−６６、４１−６６、４２−６６、４３−６６からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６５、２２−６５、２３−６５、２４−６５、２５−６５、２６−６５、２７−６５、２８−６５、２９−６５、３０−６５、３１−６５、３２−６５、３３−６５、３４−６５、３５−６５、３６−６５、３７−６５、３８−６５、３９−６５、４０−６５、４１−６５、４２−６５、４３−６５からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６��、２２−６４、２３−６４、２４−６４、２５−６４、２６−６４、２７−６４、２８−６４、２９−６４、３０−６４、３１−６４、３２−６４、３３−６４、３４−６４、３５−６４、３６−６４、３７−６４、３８−６４、３９−６４、４０−６４、４１−６４、４２−６４、４３−６４からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６３、２２−６３、２３−６３、２４−６３、２５−６３、２６−６３、２７−６３、２８−６３、２９−６３、３０−６３、３１−６３、３２−６３、３３−６３、３４−６３、３５−６３、３６−６３、３７−６３、３８−６３、３９−６３、４０−６３、４１−６３、４２−６３、４３−６３からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６２、２２−６２、２３−６２、２４−６２、２５−６２、２６−６２、２７−６２、２８−６２、２９−６２、３０−６２、３１−６２、３２−６２、３３−６２、３４−６２、３５−６２、３６−６２、３７−６２、３８−６２、３９−６２、４０−６２、４１−６２、４２−６２、４３−６２からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６１、２２−６１、２３−６１、２４−６１、２５−６１、２６−６１、２７−６１、２８−６１、２９−６１、３０−６１、３１−６１、３２−６１、３３−６１、３４−６１、３５−６１、３６−６１、３７−６１、３８−６１、３９−６１、４０−６１、４１−６１、４２−６１、４３−６１からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−６０、２２−６０、２３−６０、２４−６０、２５−６０、２６−６０、２７−６０、２８−６０、２９−６０、３０−６０、３１−６０、３２−６０、３３−６０、３４−６０、３５−６０、３６−６０、３７−６０、３８−６０、３９−６０、４０−６０、４１−６０、４２−６０、４３−６０からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−５９、２２−５９、２３−５９、２４−５９、２５−５９、２６−５９、２７−５９、２８−５９、２９−５９、３０−５９、３１−５９、３２−５９、３３−５９、３４−５９、３５−５９、３６−５９、３７−５９、３８−５９、３９−５９、４０−５９、４１−５９、４２−５９、４３−５９からなることができる。ＤＲ３  ＰＬＡＤは、配列番号：２のアミノ酸２１−５８、２２−５８、２３−５８、２４−５８、２５−５８、２６−５８、２７−５８、２８−５８、２９−５８、３０−５８、３１−５８、３２−５８、３３−５８、３４−５８、３５−５８、３６−５８、３７−５８、３８−５８、３９−５８、４０−５８、４１−５８、４２−５８、４３−５８からなることができる。
【００４０】
[065]Ｒ１及び／又はＲ２がペプチドである場合、このペプチドは、長さを変更することができる。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれより多いアミノ酸の長さであることができる。
【００４１】
[066]ポリペプチドを含有するＰＬＡＤは、３５−１２５個のアミノ酸の長さであることができる。更なる側面において、単離されたＴＮＦ様ＰＬＡＤを含んでなる全体のポリペプチドは、１２５個より多くないアミノ酸残基であることができ、そして従って、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４又は１２５個のアミノ酸の長さであることができる。Ｒ１及びＲ２は、天然に存在するＤＲ３受容体においてＤＲ３  ＰＬＡＤに通常隣接しない配列であることができる。Ｒ１及びＲ２は、天然に存在するＴＮＦ受容体様受容体においてＤＲ３  ＰＬＡＤに通常隣接するＤＲ３受容体の配列であることもでき、ここで、ＴＮＦ様受容体ＰＬＡＤを含んでなるポリペプチドは、ＴＮＦ受容体様受容体の細胞外ドメインの全部ではない。
【００４２】
ｉｉｉ．ＤＲ３融合タンパク質
[067]ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、ＤＲ３  Ｆｃ融合タンパク質を使用して遮断することもできる。従って、提供されるものは、ＤＲ３  Ｆｃ融合タンパク質を含んでなる組成物である。
【００４３】
[068]ヒトＩｇＧ１の非Ｆｃ受容体結合変異体に融合したＤＲ３の細胞外ドメイン（約１４０−１５０ａａ）を含んでなるか、又はそれからなる融合タンパク質（ＩｇＧ  Ｆｃ（ＤＲ３（ヒト）−ｈｕＩｇ融合タンパク質）が提供される。融合タンパク質は、真核細胞中で発現させ、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用するためにタンパク質Ａを使用して精製することができる。或いは、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡは、マウスの尾の血管への水力学的注射により発現される。この技術は、自己免疫性疾病モデルの誘導中又はその後のＤＲ３  Ｆｃタンパク質の高いレベルの発現を産生することができる（Ｄａｇｎａｅｓ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；  Ｈｏｄｇｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｕｌｅ，２００３；Ｌｅｃｏｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００４４】
[069]ＤＲ３領域を含んでなる、又はそれからなるポリペプチドをコードする核酸は、イムノアドヘシンをコードするように他の核酸に機能的に結合させることもできる。本開示の目的のために、用語“イムノアドヘシン”は、核酸によってコードされるいずれものポリペプチドを含むと定義され、ここで、ＤＲ３細胞外ドメインのような非免疫グロブリン分子をコードする核酸の少なくとも一部は、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、例えばＩｇＧをコードする核酸の少なくとも一部にカップリングされる。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥのＦｃ領域も、イムノアドヘシンを構築するために使用することができる。カップリングは、核酸セグメントの機能的転写及び翻訳、並びにそれから誘導されるメッセージを、それぞれ提供する様式で達成することができる。これらのＩｇＧイムノアドヘシンは、各種の哺乳動物宿主細胞、並びにバキュロウイルス感染細胞中で一過性の又は安定した遺伝子導入によって発現させることができる。抗体と同様に、ＩｇＧイムノアドヘシンは、これらが分泌される培養培地から、一工程タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【００４５】
ｉｖ．抗体
[070]ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、抗ＤＲ３抗体の投与によって遮断することができる。相互作用を遮断するために、抗ＤＲ３抗体は、拮抗的でなければならない。更に、ＤＲ３  Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を阻害することができる。
【００４６】
[071] ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用は、抗ＴＬ１Ａ抗体の投与によって遮断することができる。ＴＬ１Ａ及びＤＲ３に対する遮断抗体は、これらのタンパク質の完全にグリコシル化された哺乳動物細胞外ドメインでマウスを免疫化し、そしてＴＬ１Ａ−ＤＲ３結合及びシグナル伝達についてのバイオアッセイにおける遮断活性について特異的にスクリーニングすることによって産生される。従って、提供されるものは、表面ＴＬ１Ａを特異的に結合し、そして指示細胞系のＴＬ１Ａ誘導細胞死に干渉する抗ＴＬ１Ａ抗体である。例えば、図２０は、機能性抗ＴＬ１Ａ遮断抗体の特徴付けを示す。これらの抗体は、ＴＬ１Ａ誘導アポトーシスを阻害した（図２０Ｅ）。
【００４７】
ｖ．疾病
[072]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、Ｔ細胞成分による自己免疫性疾病であることができる。
【００４８】
[073]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、喘息である。現在のデータは、ＤＲ３ノックアウトマウスが、喘息の動物モデルに対して耐性であることを示し、ＴＬ１Ａ／ＤＲ３相互作用の遮断は、このモデル及びヒトの喘息において有効であることを示唆する。
【００４９】
[074]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、多発性硬化症であることができる。ＭＳにおける活性化されたＴ細胞の役割を支持する豊富な証拠：ＭＳ患者の脳、脊髄及びＣＳＦへの、活性化されたＴ細胞の血管外遊走、ＭＳ及び実験的ＭＳ動物モデルの病変中のＴ細胞によるＩＬ−１７及びインターフェロンガンマのような炎症性サイトカインの産生、が存在する。ＤＲ３は、活性化されたＴ細胞上に発現し、そしてＤＲ３の欠損は、本明細書中に示すように活性化されたＴ細胞による炎症性サイトカインの産生を障害する。従って、ＤＲ３−ＴＬ１Ａの相互作用の遮断は、Ｔ細胞サイトカイン産生を障害し、そしてＭＳを回復することが期待される。
【００５０】
[075]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、リウマチ様関節炎であることができる。活性化されたＴ細胞は、リウマチ様関節炎を持つ患者の滑膜において見出すことができ、そしてＴ細胞機能を遮断する薬剤、例えばＣＴＬＡ４による同時刺激Ｔ細胞の遮断は、この疾病において効果的である。ＤＲ３は、活性化されたＴ細胞上に発現し、そしてＤＲ３の欠損は、本明細書中に示すように、活性化されたＴ細胞による炎症性サイトカインの産生を障害する。従って、ＤＲ３−ＴＬ１Ａの相互作用の遮断は、Ｔ細胞サイトカイン産生を障害し、そしてＲＡを回復することが期待される。
【００５１】
[076]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、１型糖尿病であることができる。１型糖尿病は、膵臓に浸潤し、そしてランゲルハンス島を破壊する、活性化されたＴ細胞によって起こされる。ＤＲ３は、活性化されたＴ細胞上に発現し、そしてＤＲ３の欠損は、活性化されたＴ細胞による炎症性サイトカインの産生を障害する。従って、ＤＲ３−ＴＬ１Ａの相互作用の遮断は、Ｔ細胞サイトカイン産生を障害し、そしてＩ型糖尿病を回復することが期待される。
【００５２】
[077]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法において、炎症性又は自己免疫性疾病は、移植片対宿主病であることができる。ＤＲ３を発現するアロ特異的に活性化されたＴ細胞は、移植片対宿主病に重要なサイトカイン及びエフェクター分子を分泌する。三つのリガンド全てに結合する可溶性デコイ受容体ＤｃＲ３／ＴＲ６の投与によるＴＮＦファミリーメンバーのＴＬ１Ａ、Ｌｉｇｈｔ及びＦａｓＬの遮断は、マウスモデルの移植片対宿主病を下方調節した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＤＲ３の欠損は、活性化されたＴ細胞による炎症性サイトカインの産生を障害することから、先に開示した方法によるＤＲ３／ＴＬ１Ａ相互作用の遮断は、移植片対宿主病を治療又は予防することが期待される。
【００５３】
[078]炎症性又は自己免疫性疾病を治療する開示される方法の幾つかの側面において、炎症性又は自己免疫性疾病は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。従って、幾つかの側面において、この方法の炎症性又は自己免疫性疾病は、クローン病である。
【００５４】
[079]ＴＬ１Ａ及びＤＲ３は、炎症性腸疾患を持つ患者及びＩＢＤのマウスモデルからの組織試料中に発現することが見いだされている（Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。更に、Ｔ細胞又は樹状細胞中で恒常的にＴＬ１Ａを発現する遺伝子導入マウスの多数の系統は、絨毛の破壊、腸壁の肥厚化及び炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴づけられる十二指腸及び回腸を中心とする自然発生的炎症性腸疾患を発症する。従って、先に開示した方法によるＤＲ３−ＴＬ１Ａの相互作用の遮断は、ＩＢＤを治療又は予防することが期待される。
【００５５】
[080]他の側面において、この方法の炎症性又は自己免疫性疾病は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）ではない。従って、幾つかの側面において、この方法の炎症性又は自己免疫性疾病は、クローン病ではない。
【００５６】
２．効力の検証
[081]更に提供されるものは、炎症性又は自己免疫性疾病を治療するための組成物及び方法の効力を検証するための方法である。動物を、炎症性腸疾患及び大腸炎の関連する特徴を示すように誘導することができる。大腸炎が生じる動物は、いずれもの哺乳動物であることができ、そして制約されるものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、サル、及びチンパンジーを含むことができる。大腸炎は、当技術分野において既知のいずれもの方法によって動物中に生じさせることができる。例えば、大腸炎は、有効な量のハプテン試薬を動物の結腸に導入することによって生じさせることができる。例として、ハプテン試薬は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）又はオキサゾロン（４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン）であることができる。
【００５７】
[082]Ｔｈ１媒介大腸炎は、ＴＮＢＳを使用してマウスに誘導することができる。急性ＴＮＢＳ大腸炎は、ＴＮＢＳの一回投与を使用してＳＪＬ又はＣ５７ＢＬ１０マウスに誘導することができる。簡単には、５０％のエタノール中の２．５ｍｇのＴＮＢＳ（ｐＨ１．５−２．０；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、軽く麻酔したマウスに１５０μｌの全体積で直腸内に投与する。ＴＮＢＳ大腸炎の慢性モデルを確立するために、Ｂａｌｂ／ｃに、直腸当たりのＴＮＢＳの毎週投与を、次の様式で投与する。マウスに、１．５ｍｇのＴＮＢＳ（５０％のエタノールベヒクル中で、１５０μｌの全体積で送達）を第１−２週に、２．０ｍｇのＴＮＢＳを第３−４週に、そして２．５ｍｇのＴＮＢＳを第５−６週に投与する。
【００５８】
[083]Ｔｈ２媒介大腸炎は、オキサゾロンでマウスに誘導することができる。簡単には、マウスに、０．２ｍＬの１００％エタノール中の３％オキサゾロンを皮膚に塗ることによって予備感作し；予備感作後５日目に、イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）による全身麻酔下のマウスに、１５０μｌの５０％エタノール中の１％オキサゾロンで直腸内的にチャレンジする。
【００５９】
[084]これらのモデルは、抗ＤＲ３及び抗ＴＬ１Ａ抗体並びに本明細書中に開示されるＤＲ３−Ｆｃ融合タンパク質を試験するために使用することができる。
【００６０】
３．スクリーニングアッセイ
[085]更に本明細書中に提供されるものは、炎症性疾病を治療するために使用することができる薬剤を同定する方法である。この方法は、ＤＲ３とＴＬ１Ａとの結合を可能にする条件下で、結合するＤＲ３及びＴＬ１Ａを含んでなる試料を用意し、試料を候補薬剤と接触させ、ＤＲ３／ＴＬ１Ａ結合のレベルを検出し、結合レベルを対照と比較することを含んでなることができ、対照と比較したＤＲ３／ＴＬ１Ａ結合の減少は、炎症性疾患を治療するために使用することができる薬剤を同定する。
【００６１】
[086]ＤＲ３のＴＬ１Ａに対する結合は、タンパク質結合を妨害しない免疫検出法のような日常的方法を使用して検出することができる。この方法は、細胞ベース又は細胞を使用しないアッセイであることができる。各種の有用な免疫検出法の工程は、例えば、Ｍａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８７）ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７．１−２７．２０（１９８６）のような科学的文献中に記載されており、これらのそれぞれは、本明細書中に参考文献としてその全てが、そして具体的には免疫検出法に関するその教示に対して援用される。免疫アッセイは、その最も簡単なそして直接的な意味において、抗体と抗原との間の結合を含む結合アッセイである。免疫アッセイの多くの種類及び形式は既知であり、そして全ては、開示されるバイオマーカーの検出のために適している。免疫アッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロット、ドットブロット、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、プロテインアレイ、マルチプレックスビーズアレイ、磁気捕捉、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、及び光退色後蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
【００６２】
[087]ＤＲ３のＴＬ１Ａに対する結合は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して検出することができる。例えば、開示されるものは、蛍光タンパク質に融合されたＴＬ１Ａ及びＤＲ３で遺伝子導入された細胞系である。これらの細胞系は、その生理学的形態でＴＬ１Ａ及びＤＲ３に結合する、生物学的に発現された小分子についての、高処理量の選別を容易にすることができる。
【００６３】
[088]一般的に、候補薬剤は、天然の産物又は合成（又は半合成）の抽出物の大きいライブラリー、或いは当技術分野において既知の方法による化学ライブラリーから同定することができる。薬物発見及び開発の当業者は、試験抽出物又は化合物の正確な供給源は、本発明のスクリーニング法（１または複数）に対して重要ではないことを理解するものである。従って、実質的に任意の数の化学抽出物又は化合物を、本明細書中に記載される例示的な方法を使用して選別することができる。このような抽出物又は化合物の例は、制約されるものではないが、植物−、真菌−、原核生物−又は動物−ベースの抽出物、発酵ブロス、及び合成化合物、並びに既存の化合物の修飾を含む。多くの方法が、制約されるものではないが、サッカリド−、脂質−、ペプチド−、ポリペプチド−、及び核酸−ベースの化合物を含む、任意の数の化学化合物のランダムな又は方向性を持った合成（例えば、半合成又は全合成）を産生するために、更に使用可能である。合成化合物のライブラリーは、例えば、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）及びＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から商業的に入手可能である。或いは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｆｌａ．）、及びＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を含む多くの供給源から商業的に入手可能である。更に、天然及び合成的に作成されたライブラリーは、所望する場合、当技術分野において既知の方法に従って、例えば標準的な抽出及び分画法によって、作成される。更に、所望する場合、いずれものライブラリー又は化合物は、標準的な化学的、物理的、又は生化学的方法を使用して、容易に改変される。更に、薬物発見及び開発の当業者は、炎症を減少させる活性に対するこれらの効果に対して既に知られた、脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、及び化学的脱複製、又はいずれものこれらの組合せ）或いは複製物又は物質の繰返しの除去のための方法を、可能な限り使用するべきであること容易に理解する。
【００６４】
[089]粗製の抽出物が所望の活性を有することが見いだされた場合、陽性のリード抽出物の更なる分画が、観察された効果の原因である化学成分を単離するために必要である。従って、抽出、分画、及び精製過程の目標は、ＤＲ３及びＴＬ１Ａの結合を刺激又は阻害する活性を有する粗製の抽出物内の化学的実体の注意深い特徴付け及び同定である。化合物の混合物中の活性の検出のための本明細書中に記載される同じアッセイは、活性な化合物を精製し、そしてその誘導体を試験するために使用することができる。このような不均一な抽出物の分画及び精製の方法は、当技術分野において既知である。所望する場合、治療のために有用な薬剤であることが示された化合物は、当技術分野において既知の方法によって化学的に修飾される。治療価値があると確認された化合物を、その後、本明細書中に開示されるもののような疾病又は症状の動物モデルを使用して分析することができる。
【００６５】
[090]候補薬剤は、多くの化学薬品クラスを包含するが、しかし有機分子、例えば１００より多く、そして約２，５００ダルトンより少ない分子量を有する小さい有機化合物であることが最も多い。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合、のために必要な官能基を含んでなり、そして典型的には、少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、例えば、少なくとも二つの官能性化学基を含む。候補薬剤は、しばしば一つ又はそれより多い上記の官能基で置換された、環状（cyclical）炭素又は複素環構造及び／又は芳香族もしくはポリ芳香族構造を含んでなる。候補薬剤は、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体又はこれらの組合せを含む生体分子中にも見出される。更なる態様において、候補薬剤はペプチドである。
【００６６】
[091]幾つかの態様において、候補薬剤はタンパク質である。幾つかの側面において、候補薬剤は、天然に存在するタンパク質又は天然に存在するタンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、或いはタンパク質性細胞抽出物のランダム又は方向性を持った消化物を使用することができる。この方法において、原核及び真核タンパク質のライブラリーを、本明細書中の方法を使用するスクリーニングのために作成することができる。ライブラリーは、細菌、真菌、ウイルス、及び脊椎動物タンパク質、並びにヒトタンパク質であることができる。
【００６７】
４．投与
[092]投与は、被験者に投与する方法を意味する。このような方法は、当業者にとって周知であり、そして制約されるものではないが：局所、非経口、経口、静脈内、筋肉内、皮下又はエアゾールによる投与を含む。投与は、連続して又は間欠的に行うことができる。
【００６８】
[093]Ｉｎ  ｖｉｖｏの投与のために、医薬組成物は、好ましくは非経口、即ち、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脊髄への注射、筋肉内、動脈内、門脈注射、又は腫瘍内投与される。
【００６９】
[094]用語“非経口的”は、本明細書中で使用する場合、投与のモードを指し、これは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及び動脈内注射及び注入を含む。非経口注射のための医薬組成物は、医薬的に受容可能な滅菌水性又は非水性溶液、分散物、懸濁液又は乳液、並びに使用直前に滅菌注射用溶液又は分散物への再構成のための滅菌粉末を含んでなる。適した水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又はベヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のような）、カルボキシメチルセルロース及び適したこれらの混合物、植物油（オリーブ油のような）、並びにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。例えば、レシチンのような被覆物質の使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、適当な流動性を維持することができる。これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散化剤を含有することもできる。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール  ソルビン酸等のような各種の抗細菌剤及び抗真菌剤の包含によって確実にすることができる。糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を含むことも、好ましいことであり得る。注射用医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような薬剤の包含によってもたらすことができる。注射可能なデポーの形態は、薬物のポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）及びポリ（酸無水物）のような生分解性ポリマー中の薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって製造される。ポリマーに対する薬物の比及び使用される特定のポリマーの特質によって、薬物放出の速度を制御することができる。デポーの注射可能な製剤も、薬物を、身体組織と適合性であるリポソーム又はマイクロ乳液中に捕捉することによって調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、或いは使用直前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体中に溶解若しくは分散することができる滅菌固体組成物の形態において滅菌剤を組込むことによって、滅菌することができる。
【００７０】
[095]他の方法において、医薬製剤は、製剤の組織への直接適用によって標的組織と接触させることができる。適用は、局所的に“開放”又は“閉鎖”法で行うことができる。“局所”によって、これは、皮膚、上咽頭、外部聴覚管、眼、肺への吸入、陰部粘膜等のような環境に暴露された組織への医薬製剤の直接適用を意味する。“開放”法は、患者の皮膚の切開及び医薬製剤が適用される、下にある組織の直接可視化を含む方法である。これは、一般的に肺に接近するための開胸、腹部内臓に接近するための開腹、又は標的組織に対する他の直接の外科的方法のような外科的方法によって達成される。“閉鎖”法は、内部標的組織は直接可視化されないが、皮膚の小さい傷を通して装置を挿入することにより接近する、侵襲的方法である。例えば、製剤は、針穿刺潅流によって腹腔に投与することができる。同様に、医薬製剤は、脊髄麻酔又は脊髄のメトリザミド（ｍｅｔｒａｚａｍｉｄｅ）造影のために一般に実行されるような、腰椎穿刺中の注入とその後の患者の適当な位置決めによって、髄膜又は脊髄に投与することができる。或いは、製剤は、内視鏡を通して投与することができる。
【００７１】
[096]局所投与は、皮膚、粘膜及び肺の表面並びに眼への投与を含む。吸入のためのものを含む局所投与のための組成物は、加圧の又は非加圧であることができる乾燥粉末として調製することができる。非加圧粉末組成物において、微細に分割された形態の活性成分は、例えば、１００マイクロメートルまでの直径のサイズを有する粒子を含んでなる大きいサイズの医薬的に受容可能な不活性の担体との混合物中で使用することができる。
【００７２】
[097]眼への局所投与のために、本発明の化合物は、化合物が、例えば、前房、後房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、光彩／毛様体（ｃｉｌａｒｙ）、レンズ、脈絡膜／網膜及び強膜のような、角膜及び眼の内部領域に化合物が浸透することを可能にするために十分な時間、眼の表面との接触を維持するように、医薬的に受容可能な点眼用ベヒクル中で送達される。医薬的に受容可能な点眼用ベヒクルは、例えば、軟膏、植物油又はカプセル化物質であることができる。或いは、本発明の化合物は、硝子体（ｖｉｔｒｉｏｕｓ）及び房水に直接注射することができる。
【００７３】
[098]直腸及び膣投与のための組成物は、好ましくは座薬であり、これは、本発明の化合物を、室温では固体であるが、しかし体温では液体であり、そして従って直腸又は膣空隙で溶融し、そして活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール又は座薬用ワックスのような適した非刺激性の賦形剤又は担体と混合することによって調製することができる。
【００７４】
[099]徴候に対して効果を有するが、しかし不都合な副作用を回避するための投与量範囲；投与量は、年齢、性別、症状、疾病の程度と共に変化するものである。上記の又は他の治療に使用する場合、治療的に有効な量の本発明の化合物の一つを、純粋な形態で、又はそのような形態が存在する場合には医薬的に受容可能な塩の形態で、そして医薬的に受容可能な賦形剤を伴って、又は伴わずに使用することができる。いずれもの特定の患者のための具体的な治療的に有効な投与量レベルは、治療される疾患及び疾患の重篤度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食事；投与の時間；投与の経路；使用される具体的な化合物の排出の速度；治療の期間；使用される具体的な化合物との組合せ又は同時使用される薬物及び医学技術分野において周知の同様な因子を含む、各種の因子に依存するものである。例えば、化合物の投与を所望の治療効果を達成するために必要なものより低いレベルで開始し、そして投与量を所望の効果を達成するまで徐々に増加させることは、十分当技術分野の技能の範囲内である。所望する場合、有効な日量は、投与の目的のために多数回の投与に分割することができる。従って、一回投与の組成物は、このような量又は日量を構成するその約数を含有することができる。
【００７５】
[0100]投与量は、いずれもの反対表示（counterindications）の場合、個々の医師によって調節することができる。投与量は変更することができ、そして１日又は数日間、毎日投与される一回又はそれより多い投与で投与することができる。指針は、与えられたクラスの医薬産物のための適当な投与量について、文献中に見出すことができる。例えば、抗体のための適当な投与量の選択における指針は、抗体の治療的使用に対する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９中に見出すことができる。他のＦｃ融合タンパク質及び他のＴＮＦファミリーのメンバーに対する遮断抗体による実験に基づけば、使用されるＦｃ融合タンパク質の典型的な日量は、上述の因子によるが、一日当たり、約０．５から約１０ｍｇ／ｋｇ体重まで又はそれより多い範囲である。モノクローナル抗体は、皮下的に約１ないし約５ｍｇ／ｋｇ体重で、ＩＶ注入又は皮下のいずれかとして与えられる。
【００７６】
[0101]例えば、単独で使用される開示される化合物の典型的な日量は、上述の因子によるが、一日当たり約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重まで又はそれより多い範囲であることができる。
【００７７】
[0102]免疫病理を治療、阻害、又は予防するための開示される組成物の投与後、治療剤の効力を、熟練した医師にとって周知の各種の方法で評価することができる。例えば、当業者は、本明細書中に開示される組成物が、免疫病理の更なる増加を減少させるか又は予防することを観察することによって、当該組成物が被験者の免疫病理の治療又は阻害において効果的であることを理解するものである。免疫病理は、当技術分野において既知の方法によって測定することができる。
【００７８】
[0103]本明細書中に開示されるＤＲ３及びＴＬ１Ａの相互作用を阻害する組成物は、免疫病理について危険性があるか、又は免疫病理を持つと新たに診断された患者又は被験者に予防的に投与することができる。
【００７９】
[0104]開示される組成物及び方法は、更に例えば各種の免疫病理に関連する疾病のための新しい薬物候補を単離し、そして試験するための道具として使用することができる。
【００８０】
ｉ．タンパク質の投与
[0105]タンパク質は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の投与の目的のために処方することができる。このような治療的タンパク質薬剤の投与は、当業者にとって周知であり、そしてＰＨＹＳＩＣＩＡＮＳ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．；ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ，ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｕｂｌ．，ＴＨＥ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ  ＳＯＵＲＣＥ  ＢＯＯＫ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓのような医薬大要（ｃｏｍｐｅｄｉａ）中に見出すことができ、そして或いは、例えば、以下の本節の末尾に記載されるような当業者にとって周知の標準的な技術を使用して日常的に決定することができる。
【００８１】
ｉｉ．抗体の投与
[0106]抗体の投与は、本明細書中に開示されるように行うことができる。抗体の送達のための核酸アプローチも存在する。幅広く遮断する抗ＤＲ３又はＴＬ１Ａ抗体及び抗体の断片は、患者又は被験者の自身の細胞が核酸を取込み、そしてコードされた抗体又は抗体の断片を産生し、そして分泌するように、抗体又は抗体の断片をコードする核酸製剤（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）として患者又は被験者に投与することもできる。
【００８２】
[0107]本発明の抗体は、好ましくは、医薬的に受容可能な担体中で被験者に投与される。適した担体及びその処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５中に記載されている。典型的には、適当な量の医薬的に受容可能な塩が製剤を等張にするために製剤中に使用される。医薬的に受容可能な担体の例は、制約されるものではないが、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８までであり、そしてより好ましくは約７から約７．５までである。更なる担体は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような徐放性製剤を含み、このマトリックスは、成形された物品、例えば、フィルム、リポソーム又はマイクロ粒子の形態である。ある種の担体が、例えば、投与の経路及び投与される抗体の濃度によって更に好ましいものであることができることは当業者にとって明白であるものである。
【００８３】
[0108]抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、又は有効な形態での血流へのその送達を確実にする注入のような他の方法によって、被験者、患者、又は細胞に投与することができる。局所又は静脈注射が好ましい。
【００８４】
[0109]抗体を投与するための有効な投与量及び予定は、経験的に決定することができ、そしてこのような決定をすることは、当技術分野の技能の範囲内である。当業者は、投与されなければならない抗体の投与量が、例えば、抗体を受ける被験者、投与の経路、使用される抗体に特定の種類、及び投与される他の薬物によって変化することを理解するものである。抗体に対する適当な投与量の選択における指針は、抗体の治療的使用に対する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２  ａｎｄ  ｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９中に見出される。単独で使用される抗体の典型的な日量は、上述の因子によるが、一日当たり約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重まで又はそれより多い範囲であることができる。
【００８５】
ｉｉｉ.核酸の投与
[0110]被験者の細胞中への外因性核酸の投与及び取込みを含む先に記載した方法において（即ち、遺伝子形質導入又は遺伝子導入）、開示される核酸は、裸のＤＮＡ又はＲＮＡの形態であることができるか、又は核酸は、細胞に核酸を送達するためのベクターであることができ、これによって抗体をコードするＤＮＡ断片は、当業者によって十分に理解されるように、プロモーターの転写制御下にある。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）のような商業的に入手可能な製剤であることができる。核酸又はベクターの細胞への送達は、各種の機構によることができる。一つの例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような商業的に入手可能なリポソーム製剤、並びに当技術分野における標準の方法に従って開発された他のリポソームを使用するリポソームによることができる。更に、開示される核酸又はベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な技術である電気穿孔によって、並びにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ｍａｃｈｉｎｅ（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の手段によって、ｉｎ  ｖｉｖｏに送達することができる。
【００８６】
[0111]一つの例として、ベクターの送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系のようなウイルス系によることができる（例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６を参照されたい）。次いで組換えレトロウイルスを使用して、感染させ、そしてこれによって遮断抗体（又は活性なその断片）をコードする核酸を感染された細胞に送達することができる。変化された核酸を哺乳動物細胞に導入する正確な方法は、勿論レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）の使用を含む他の技術が、この方法のために広く使用可能である。リポソーム送達及び受容体を介した機構及び他のエンドサイトーシス機構（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８７：４７２−４７８，１９９６を参照されたい）のような、物理的形質導入技術も使用することができる。この開示される組成物及び方法は、これらの又は他の普通に使用される遺伝子導入法のいずれかと組合せて使用することができる。
【００８７】
[0112]一つの例として、抗体をコードする核酸が、アデノウイルス中で被験者の細胞に送達される場合、アデノウイルスのヒトへの投与のための投与量は、注射当たり約１０７から１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）までの範囲であることができるが、しかし注射当たり１０１２ｐｆｕのように高いことができる（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１，１９９７；Ａｌｖａｒｅｚ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３，１９９７）。被験者は、一回の注射を受けることができるか、又は、更なる注射が必要な場合、これらを、６ヶ月の間隔で（又は熟練した医師によって決定されるような他の適当な時間間隔で）、不確定な期間及び／又は治療の有効性が確立されるまで繰返すことができる。
【００８８】
Ｂ．組成物
１．抗体
[0113]提供されるものは、ＴＬ１Ａ又はＤＲ３ポリペプチドを結合し、そしてＴＬ１ＡのＤＲ３への結合を遮断する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチド、又はＤＲ３を結合するその断片を結合する抗体の結合特性を有する抗体である。
【００８９】
[0114]更に提供されるものは、ＴＬ１Ａポリペプチドの細胞外ドメインを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２５２を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチド、又はＤＲ３を結合するその断片を結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２５２、７７−２５２、７８−２５２、７６−２５２、７９−２５２、８０  ２５２、８１−２５２、８２−２５２、８３−２５２、８４−２５２、８５−２５２、８６−２５２、８７−２５２、８８−２５２、８９−２５２、９０−２５２、９１−２５２、９２−２５２、９３−２５２、９４−２５２、９５−２５２、９６−２５２、９７−２５２、９８−２５２、９９−２５２、又は１００−２５２を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２５１、７７−２５１、７８−２５１、７６−２５１、７９−２５１、８０−２５１、８１−２５１、８２−２５１、８３−２５１、８４−２５１、８５−２５１、８６−２５１、８７−２５１、８８−２５１、８９−２５１、９０−２５１、９１−２５１、９２−２５１、９３−２５１、９４−２５１、９５−２５１、９６−２５１、９７−２５１、９８−２５１、９９−２５１、又は１００−２５１を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２５０、７７−２５０、７８−２５０、７６−２５０、７９−２５０、８０−２５０、８１−２５０、８２−２５０、８３−２５０、８４−２５０、８５−２５０、８６−２５０、８７−２５０、８８−２５０、８９−２５０、９０−２５０、９１−２５０、９２−２５０、９３−２５０、９４−２５０、９５−２５０、９６−２５０、９７−２５０、９８−２５０、９９−２５０、又は１００−２５０を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２４９、７７−２４９、７８−２４９、７６−２４９、７９−２４９、８０−２４９、８１−２４９、８２−２４９、８３−２４９、８４−２４９、８５−２４９、８６−２４９、８７−２４９、８８−２４９、８９−２４９、９０−２４９、９１−２４９、９２−２４９、９３−２４９、９４−２４９、９５−２４９、９６−２４９、９７−２４９、９８−２４９、９９−２４９、又は１００−２４９を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２４８、７７−２４８、７８−２４８、７６−２４８、７９−２４８、８０−２４８、８１−２４８、８２−２４８、８３−２４８、８４−２４８、８５−２４８、８６−２４８、８７−２４８、８８−２４８、８９−２４８、９０−２４８、９１−２４８、９２−２４８、９３−２４８、９４−２４８、９５−２４８、９６−２４８、９７−２４８、９８−２４８、９９−２４８、又は１００−２４８を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である���従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２４７、７７−２４７、７８−２４７、７６−２４７、７９−２４７、８０−２４７、８１−２４７、８２−２４７、８３−２４７、８４−２４７、８５−２４７、８６−２４７、８７−２４７、８８−２４７、８９−２４７、９０−２４７、９１−２４７、９２−２４７、９３−２４７、９４−２４７、９５−２４７、９６−２４７、９７−２４７、９８−２４７、９９−２４７、又は１００−２４７を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２４６、７７−２４６、７８−２４６、７６−２４６、７９−２４６、８０−２４６、８１−２４６、８２−２４６、８３−２４６、８４−２４６、８５−２４６、８６−２４６、８７−２４６、８８−２４６、８９−２４６、９０−２４６、９１−２４６、９２−２４６、９３−２４６、９４−２４６、９５−２４６、９６−２４６、９７−２４６、９８−２４６、９９−２４６、又は１００−２４６を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２４５、７７−２４５、７８−２４５、７６−２４５、７９−２４５、８０−２４５、８１−２４５、８２−２４５、８３−２４５、８４−２４５、８５−２４５、８６−２４５、８７−２４５、８８−２４５、８９−２４５、９０−２４５、９１−２４５、９２−２４５、９３−２４５、９４−２４５、９５−２４５、９６−２４５、９７−２４５、９８−２４５、９９−２４５、又は１００−２４５を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２４０、７７−２４０、７８−２４０、７６−２４０、７９−２４０、８０−２４０、８１−２４０、８２−２４０、８３−２４０、８４−２４０、８５−２４０、８６−２４０、８７−２４０、８８−２４０、８９−２４０、９０−２４０、９１−２４０、９２−２４０、９３−２４０、９４−２４０、９５−２４０、９６−２４０、９７−２４０、９８−２４０、９９−２４０、又は１００−２４０を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２３０、７７−２３０、７８−２３０、７６−２３０、７９−２３０、８０−２３０、８１−２３０、８２−２３０、８３−２３０、８４−２３０、８５−２３０、８６−２３０、８７−２３０、８８−２３０、、８９−２３０、９０−２３０、９１−２３０、９２−２３０、９３−２３０、９４−２３０、９５−２３０、９６−２３０、９７−２３０、９８−２３０、９９−２３０、又は１００−２３０を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２２０、７７−２２０、７８−２２０、７６−２２０、７９−２２０、８０−２２０、８１−２２０、８２−２２０、８３−２２０、８４−２２０、８５−２２０、８６−２２０、８７−２２０、８８−２２０、８９−２２０、９０−２���０、９１−２２０、９２−２２０、９３−２２０、９４−２２０、９５−２２０、９６−２２０、９７−２２０、９８−２２０、９９−２２０、又は１００−２２０を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２１０、７７−２１０、７８−２１０、７６−２１０、７９−２１０、８０−２１０、８１−２１０、８２−２１０、８３−２１０、８４−２１０、８５−２１０、８６−２１０、８７−２１０、８８−２１０、８９−２１０、９０−２１０、９１−２１０、９２−２１０、９３−２１０、９４−２１０、９５−２１０、９６−２１０、９７−２１０、９８−２１０、９９−２１０、又は１００−２１０を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。従って、提供されるものは、配列番号：４のアミノ酸７６−２００、７７−２００、７８−２００、７６−２００、７９−２００、８０−２００、８１−２００、８２−２００、８３−２００、８４−２００、８５−２００、８６−２００、８７−２００、８８−２００、８９−２００、９０−２００、９１−２００、９２−２００、９３−２００、９４−２００、９５−２００、９６−２００、９７−２００、９８−２００、９９−２００、又は１００−２００を含んでなるＴＬ１Ａポリペプチドを結合する抗体の結合特性を有する抗体である。
【００９０】
[0115]従って、提供されるものは、ヒトＴＬ１Ａポリペプチドに結合する１Ａ９及び１Ｃ６と命名されたハイブリドーマクローン、並びにマウスＴＬ１Ａポリペプチドに結合する１２Ｂ１２．６及び５Ｇ４．６と命名されたハイブリドーマクローンによって産生される抗体の結合特性を有する抗体である。
【００９１】
[0116]抗体の結合特性は、その結合特異性を含む。結合特異性は、抗原に対する特異性であることができるか、又はこれは、抗体によって認識されるエピトープに基づく特異性であることができる。前者及び後者の両方が抗体の固有の特徴であるために、本発明の抗体の開示は、エピトープ及び抗原特異性の両方の定義を提供する。寄託されたモノクローナル抗体の結合特異性に対する言及は、抗体が結合するＤＲ３上の特異的エピトープに対する言及の均等物である。いずれもの個々のモノクローナル抗体の結合特異性は、開示された寄託された抗体によって定義される亜属のいずれもの他のモノクローナル抗体の固有の特性である。与えられた抗体の結合特異性を確認する方法は、当技術分野において周知である。抗体結合の結合活性及び他の特性を測定する更なる方法は、周知である。
【００９２】
ｉ．抗体全般
[0117]用語“抗体”は、広い意味で本明細書中で使用され、そしてポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、用語“抗体”に更に含まれるものは、ＤＲ３がＴＬ１Ａとの相互作用から阻害されるように、ＤＲ３又はＴＬ１Ａと相互作用するその能力についてそれらが選択される限り、これらの免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、及び免疫グロブリン分子又はその断片のヒト又はヒト化バージョンである。ＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用に関係する開示された領域に結合する抗体も開示される。抗体は、本明細書中に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイを使用して、又は類似の方法によって、その所望の活性について試験することができ、その後それらのｉｎ  ｖｉｖｏの治療及び／又は予防的活性を、既知の臨床試験法によって試験する。
【００９３】
[0118]用語“モノクローナル抗体”は、本明細書中で使用する場合、実質的に均一の抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さいサブセット中に存在することができる可能な天然に存在する変異体を除き、同一である。本明細書中のモノクローナルな抗体は、具体的には“キメラ”抗体を含み、ここで、重及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一であるか、又はそれに相同であり、一方、鎖（１または複数）の残りは、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属す抗体中の対応する配列と同一であるか又はそれに相同である、並びにそれらが所望の拮抗活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１-６８５５（１９８４）を参照されたい）。
【００９４】
[0119]開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するいずれもの方法を使用して製造することができる。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されたもののようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法において、マウス又は他の適当な宿主動物は、典型的には、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することが可能なリンパ球を誘発するために、免疫化剤で免疫化される。或いは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。
【００９５】
[0120]遮断抗体を産生する最良の機会を得るために、免疫化剤は、好ましくは真核細胞によって産生される完全にグリコシル化された天然のタンパク質からなる。ＤＲ３について、Ｆｃ融合タンパク質として発現し、そして特異的プロテアーゼによってＦｃ部分から切断されるヒト及びマウス受容体の細胞外断片が、好ましくは使用される：
[0121]ヒト：寄託番号ＮＰ＿６８３８６６．１（配列番号：５）における配列のアミノ酸１−１４１。
【００９６】
[0122]マウス：寄託番号ＮＰ＿１４９０３１．２（配列番号：６）における配列のアミノ酸１−１５９。
【００９７】
[0123]ＴＬ１Ａについて、エピトープ標識融合タンパク質として発現したヒト及びマウスＴＬ１Ａの細胞外断片が、好ましくは使用される：
[0124]マウス：寄託番号ＮＰ＿００５１０９．２（配列番号：７）。
【００９８】
[0125]ヒト：ＮＰ＿７９６３４５（配列番号：８）における配列からのアミノ酸７２−２５１。
【００９９】
[0126]これらの方法が遮断抗体を産生しない場合、これらのタンパク質の細胞表面局在化バージョンを発現する細胞を、マウス、ラット又は他の種を免疫化するために使用する。伝統的には、モノクローナル抗体の産生は、免疫原として使用するための精製されたタンパク質又はペプチドの入手可能性に依存する。更に最近になって、ＤＮＡベースの免疫化が、強力な免疫反応を誘発し、そしてモノクローナル抗体を産生するための方法としての有望さを示している。この方法において、ＤＮＡベースの免疫化を使用することができ、ここで、ヒトＩｇＧ１又はエピトープ標識を伴う融合タンパク質として発現されるＤＲ３及びＴＬ１Ａの細胞外断片をコードするＤＮＡが、当技術分野において既知の方法（例えば、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｌｔ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．１９９８  Ｄｅｃ；７（６）：５６９−７６；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ５  ｍｉｃｒｏｇ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．２０００  Ａｕｇ；１９（４）：２９７−３０２、これらは本明細書中に参考文献としてその全てが抗体産生の方法のために援用される）によって、そして実施例中に記載されるように、宿主動物に注射される。
【０１００】
[0127]精製されたタンパク質又はＤＮＡのいずれかにより免疫化するための別の方法は、バキュロウイルス中に発現された抗原を使用することである。この系の利点は、産生の容易さ、高いレベルの発現、及び哺乳動物の系において見られるものと非常に類似した翻訳後修飾を含む。この系の使用は、シグナル配列断片との融合タンパク質としてのＴＬ１Ａ又はＤＲ３の細胞外ドメインを発現することを含む。抗原は、遺伝子断片を、シグナル配列とＴＬ１Ａ又はＤＲ３ヌクレオチド配列の成熟タンパク質ドメインとの間に、インフレームで挿入することによって産生される。これは、ビリオンの表面上の外来タンパク質の提示をもたらす。この方法は、標的抗原の精製の必要性を排除して、全ウイルスによる免疫化を可能にする。
【０１０１】
[0128]一般的に、ヒト由来の細胞が所望される場合、いずれかの末梢血リンパ球（“ＰＢＬ”）がモノクローナル抗体を産生する方法において使用されるか、或いは非ヒト哺乳動物源が所望される場合、脾細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いでリンパ球は、ポリエチレングリコールのような適した融合剤を使用して不死化細胞系と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞系は、通常、齧歯類、ウシ、ウマ、及びヒト由来の骨髄腫細胞を含む、形質転換哺乳動物細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合の不死化された細胞の増殖又は生存を阻害する一つ又はそれより多い物質を含有する適した培養培地中で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホシホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（“ＨＡＴ培地”）、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。好ましい不死化細胞系は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化細胞系は、マウス骨髄腫系であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．及びｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．から得ることができる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトのヘテロな骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＤＲ３及び／又はＴＬ１Ａに向けられたモノクローナル抗体の存在について分析することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、或いは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合アッセイによって決定される。このような技術及びアッセイは、当技術分野において既知であり、そして以下の実施例又はＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）中に更に記載されている。
【０１０２】
[0129]所望のハイブリドーマ細胞が確認された後、クローンを、限界希釈又はＦＡＣＳ選別法によってサブクローニングし、そして標準的な方法によって増殖させることができる。この目的のために適した培養培地は、例えば、ダルベッコ改良イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。或いは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水のようなｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。
【０１０３】
[0130]サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地又は腹水液から、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、タンパク質Ｇ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的な免疫グロブリン精製法によって単離又は精製することができる。
【０１０４】
[0131]モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）中に記載されるもののような組換えＤＮＡ法によって製造することもできる。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離し、そして慣用的な方法を使用して（例えば、マウス抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。抗体又は活性な抗体の断片のライブラリーを作成し、そして例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，８０４，４４０号  及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第６，０９６，４４１号中に記載されるように、ファージディスプレイ技術を使用して、選別することもできる。
【０１０５】
[0132]Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法も、一価抗体を調製するために適している。その断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、当技術分野において既知の日常的技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８及び米国特許第４，３４２，５６６号中に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、それぞれが一つの抗原結合部位、及び残りのＦｃ断片を伴うＦａｂ断片と呼ばれる、二つの同一の抗原結合性断片を産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有し、そして抗原を架橋することがなお可能である断片を得る。
【０１０６】
[0133]他の配列に接続しているか否かに関わらず、断片は、抗体又は抗体断片の活性が、非修飾抗体又は抗体断片と比較して有意に変更又は障害されていないことを条件に、特定の領域又は特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択された修飾を含むこともできる。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／付加すること、その生体寿命を増加させること、その分泌特性を変更すること等のような幾つかの更なる特性を提供することができる。いずれの場合も、抗体又は抗体の断片は、その同族抗原に対する特異的結合のような生理活性特性を保有しなければならない。抗体又は抗体断片の機能的又は活性な領域は、タンパク質の特異的領域の変異誘発、それに続く発現及び発現されたポリペプチドの試験によって確認することができる。このような方法は、当業者にとって容易に明白であり、そして抗体又は抗体の断片をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【０１０７】
[0134]本明細書中で使用する場合、用語“抗体（antibody）”又は“抗体（複数）（antibodies）”は、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体を指すこともできる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、又はウサギ由来のもの）は、ヒトにおいて当然抗原性であり、そして従って、ヒトに投与された場合、好ましくない免疫反応を起こしうる。従って、この方法におけるヒト又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が好ましくない免疫反応を誘起する機会を少なくするために役立つ。
【０１０８】
ｉｉ．全免疫グロブリン
[0135]本明細書中で使用する場合、用語“抗体”は、制約されるものではないが、いずれものクラスの全免疫グロブリン（即ち、インタクトな抗体）を包含する。天然の抗体は、通常二つの同一の軽（Ｌ）鎖及び二つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、一つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、一方、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。それぞれの重及び軽鎖は、規則正しい間隔の鎖内のジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一つの末端に多くの定常部ドメインが続く可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））を有する。それぞれの軽鎖は、一つの末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））を、そしてその他の末端に定常部ドメインを有する；軽鎖の定常部ドメインは、重鎖の第１の定常部ドメインと整列し、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽及び重鎖の可変ドメイン間にインターフェースを形成すると信じられている。いずれもの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常部ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（ｋ）及びラムダ（ｌ）と呼ばれる一つ又は二つの明確に別個の種類に割り当てることができる。その重鎖の定常部ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは、異なったクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、そしてこれらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２に更に分けることができる。当業者は、マウスの匹敵するクラスを認識するものである。免疫グロブリンの異なったクラスに対応する重鎖定常部ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。
【０１０９】
[0136]用語“可変”は、抗体間の配列で異なる可変ドメインのある部分を記載するために本明細書中で使用され、そしてその特定の抗原に対するそれぞれの特定の抗体の結合及び特異性において使用される。然しながら、可変性は、通常、抗体の可変ドメインを通して均等に分布されていない。典型的には、これは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方中の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる三つのセグメントに集中する。可変ドメインの更に高度な保存部分は、それぞれフレームワーク（ＦＷ）と呼ばれる。天然の重及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主としてｂ−シート配置をとり、三つのＣＤＲによって結合され、これはループ接続を形成し、そしてある場合にはｂ−シート構造の部分を形成する四つのＦＲ領域を含んでなる。それぞれの鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって密接した近位に一緒に保持され、そして他の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）を参照されたい）。定常部ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関係しないが、しかし抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような各種のエフェクター機能を示す。
【０１１０】
ｉｉｉ．抗体断片
[0137]用語“抗体”は、本明細書中で使用する場合、インタクトな分子、並びに例えばエピトープ決定基を結合することが可能な、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２のようなその断片を含むことを意味する。
【０１１１】
[0138]本明細書中で使用する場合、用語“抗体又はその断片”は、二重又は多重抗原或いはエピトープ特異性を有するキメラ抗体及びハイブリッド抗体、並びにハイブリッド断片を含むＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のような断片を包含する。従って、その特異的抗原を結合する能力を保持する抗体の断片が提供される。例えば、ＤＲ３又はＴＬ１Ａ結合活性を維持する抗体の断片は、用語“抗体又はその断片”の意味に含まれる。このような抗体及び断片は、実施例中に記載される方法、並びに抗体を産生するための、及び特異性及び活性について抗体を選別するための一般的方法によって、当技術分野において既知の技術によって製造することができ、そして特異性及び活性について選別することができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい）。
【０１１２】
[0139]更に“抗体又はその断片”の意味に含まれるものは、例えばその内容が本明細書中に参考文献として援用される米国特許第４，７０４，６９２号に記載されるように、抗体断片及び抗原結合性タンパク質（一本鎖抗体）の複合体である。
【０１１３】
[0140]単離された免疫原的に特異なパラトープ又は抗体の断片も、更に提供される。抗体の特異的免疫原性エピトープは、分子の化学的又は機械的破壊によって全抗体から単離することができる。このようにして得られた精製された断片は、本明細書中で教示される方法によってその免疫原性及び特異性を決定するために試験される。抗体の免疫反応性パラトープは、所望により、直接合成される。免疫反応性断片は、抗体アミノ酸配列から誘導される少なくとも約２ないし５個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列として定義される。
【０１１４】
[0141]或いは、非保護ペプチドセグメントは、化学的に結合され、ここで、化学的連結の結果としてのペプチドセグメント間に形成される結合は、非天然の（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体、並びに完全な生物学的活性を伴う大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために使用された（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０１１５】
[0142]更に開示されるものは、生理活性を有する抗体の断片である。ポリペプチド断片は、アデノウイルス又はバキュロウイルス発現系のようなそのポリペプチド断片を産生することが可能な発現系中の、ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質であることができる。例えば、抗体のＴＬ１Ａ又はＤＲ３との相互作用に伴う生物学的効果を起こすことができる特異的ハイブリドーマからの抗体の活性ドメインを決定することができる。例えば、抗体の活性或いは結合特異性又は親和性のいずれにも寄与しないことが見いだされているアミノ酸は、それぞれの活性の喪失を伴わず除去することができる。例えば、各種の態様において、アミノ又はカルボキシ末端のアミノ酸は、天然又は修飾された非免疫グロブリン分子又は免疫グロブリン分子のいずれかから連続して除去され、そしてそれぞれの活性は、利用可能なアッセイの一つで分析される。もう一つの例において、抗体の断片は、修飾された抗体を含んでなり、ここで少なくとも一つのアミノ酸が、特異的位置で、天然に存在するアミノ酸と置換され、そしてアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸のいずれかの部分は、又は抗体の内部領域でさえ、ポリペプチド断片又はビオチンのような他の部分で置換され、これは、修飾された抗体の精製を容易にする。例えば、修飾された抗体は、ペプチド化学、或いは二つのポリペプチド断片を、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドをもたらすように、発現ベクターにコードするそれぞれの核酸をクローニングすることのいずれかによって、マルトース結合タンパク質に融合することができる。ハイブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティーカラムを通過させることによって親和性精製することができ、そして次いで修飾された抗体受容体を、ハイブリッドポリペプチドを特異的プロテアーゼ因子Ｘａで切断することによって、マルトース結合領域から分離することができる（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ，１９９６，ｐｇ．１６４を参照されたい）。類似の精製法は、同様に、真核細胞からハイブリッドタンパク質を単離するために利用可能である。
【０１１６】
[0143]他の配列に接続しているか否かに関わらず、断片は、断片の活性が、非修飾抗体又は抗体断片と比較して有意に変更又は障害されていないことを条件に、特定の領域又は特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択された修飾を含む。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去又は付加すること、その生体寿命を増加させること、その分泌特性を変更すること等のような、幾つかの更なる特性を提供することができる。いずれの場合も、断片は、結合活性、結合ドメインにおける結合の制御、等のような生理活性特性を保有しなければならない。抗体の機能的又は活性な領域は、タンパク質の特異的領域の変異誘発、それに続く発現及び発現されたポリペプチドの試験によって同定することができる。このような方法は、当業者にとって容易に明白であり、そして抗原をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００（１９８２）。
【０１１７】
[0144]技術は、更に、本発明の開示の抗原性タンパク質に特異的な一本鎖抗体の産生に適合させることができる（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。更に、方法は、タンパク質又は誘導体、その断片、類似体又は相同体に対する所望の特異性を伴うモノクローナルなＦ（ａｂ）断片の迅速な、そして有効な確認を可能にする、Ｆ（ａｂ）発現ライブラリーの構築（例えばＨｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照されたい）に適合させることができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体断片は、制約されるものではないが：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されたＦ（（ａｂ’））（２）断片；（ｉｉ）Ｆ（（ａｂ’））（２）断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生されるＦａｂ断片；（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤による抗体分子の処理によって産生されるＦ（ａｂ）断片並びに（ｉｖ）Ｆ（ｖ）断片、を含む当技術分野において既知の技術によって産生することができる。
【０１１８】
[0145]一本鎖抗体の産生のための方法は、当業者にとって公知である。当業者は、このような方法のために、米国特許第５，３５９，０４６号（本明細書中に参考文献として援用される）を参照されたい。一本鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して、重及び軽鎖の可変ドメインを一緒に融合し、これによって単一分子上に抗原結合部位を再構築することによって作成される。一つの可変ドメインのＣ末端が、１５ないし２５個のアミノ酸ペプチド又はリンカーによって他の可変ドメインのＮ末端に繋留されている一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖｓ）は、抗原結合又は結合の特異性を有意に破壊することなく開発されている（Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。リンカーは、重鎖及び軽鎖が、これらの適切な高次構造的配向で一緒に結合することを可能にするように選択される。例えば、本明細書中に参考文献として援用されるＨｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．２０３：４６−１２１（１９９１）を参照されたい。これらのＦｖｓは、天然の重及び軽鎖中に存在する定常部領域（Ｆｃ）を欠く。
【０１１９】
ｉｖ．一価抗体
[0146]Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法も、更に一価抗体を調製するために適している。抗体の、その断片、特にＦａｂ断片を産生するための消化は、当技術分野において既知の日常的技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８、米国特許第４，３４２，５６６号、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）中に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、それぞれが単一の抗原結合部位、及び残りのＦｃ断片を伴うＦａｂ断片と呼ばれる二つの同一の抗原結合性断片を産生する。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれる断片をもたらし、これは、二つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を架橋することが可能である。
【０１２０】
[0147]抗体消化で産生されるＦａｂ断片は、更に軽鎖の定常部ドメイン及び重鎖の第１の定常部ドメインを含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一つ又はそれより多いシステインを含む重鎖ドメインのカルボキシ末端における幾つかの残基の付加によって、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって結合される二つのＦａｂ’断片を含んでなる二価の断片である。Ｆａｂ’ＳＨは、定常部ドメインのシステイン残基（１または複数）が遊離のチオール基を保有するＦａｂ’に対する本明細書中の命名である。抗体断片は、本来その間にヒンジのシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生される。抗体断片の他の化学的カップリングも、更に知られている。
【０１２１】
ｖ．キメラ／ハイブリッド
[0148]ハイブリッド抗体において、一つの重及び軽鎖対は、一つの抗原認識特徴、例えばエピトープ、に対して産生される抗体中に見出されるものと相同であり、一方、他の重及び軽鎖対は、別のエピトープに対して産生される抗体中に見出される対に相同である。これは、多機能性結合価、即ち、少なくとも二つの異なったエピトープに同時に結合する能力の特性をもたらす。本明細書中で使用する場合、用語“ハイブリッド抗体”は、それぞれの鎖が、哺乳動物の抗体の鎖に対して別個に相同であるが、しかし組合せが、二つの異なった抗原が抗体によって認識されるような新規の集合体を表す、抗体を指す。このようなハイブリッドは、それぞれの成分の抗体を産生するハイブリドーマの融合によって、又は組換え技術によって形成することができる。このようなハイブリッドは、勿論、更にキメラ鎖を使用して形成することもできる。
【０１２２】
ｖｉ．抗イディオタイプ
[0149]コードされた抗体は、例えば、米国特許第４，６９９，８８０号中に記載されているような、抗イディオタイプ抗体（他の抗体に結合する抗体）であることができる。このような抗イディオタイプ抗体は、治療される個体において外因性又は外来性抗体を結合することができ、これによって、例えば、自己免疫疾病の文脈における免疫反応に伴う病理学的症状を回復又は予防する。
【０１２３】
ｖｉｉ．複合体又は抗体断片の融合
[0150]抗体の標的化機能は、抗体又はその断片を治療剤とカップリングすることによって治療的に使用することができる。このような抗体又は断片（例えば、少なくとも免疫グロブリン定常部領域（Ｆｃ）の一部）の治療剤とのカップリングは、抗体又は抗体断片及び治療剤を含んでなる免疫複合体を製造することによって、又は融合タンパク質を製造することによって達成することができる。例えば、提供されるものは、ＤＲ３  Ｆｃ融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧ  Ｆｃに融合したＤＲ３細胞外ドメイン（１５０ａａ）（ＤＲ３（ヒト）−ｍｕＩｇ融合タンパク質）である。
【０１２４】
[0151]“抗体又はその断片”の意味に更に含まれるものは、例えば、その内容が本明細書中に参考文献として援用される米国特許第４，７０４，６９２号中に記載されるような抗体断片及び抗原結合性タンパク質（一本鎖抗体）の複合体である。
【０１２５】
[0152]抗体（又はその断片）は、細胞毒、治療剤又は放射性金属イオンのような治療剤分子に結合することができる。細胞毒又は細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害であるいずれもの薬剤を含む。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は相同体を含む。治療剤は、制約されるものではないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含む。
【０１２６】
[0153]開示される複合体は、与えられた生物学的反応を改良するために使用することができる。薬物分子は、古典的化学治療剤に制約されると解釈されるべきではない。例えば、薬物分子は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質又はポリペプチドであることができる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、［ａｇｒ］−インターフェロン、［ｂｇｒ］−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子のようなタンパク質；又は例えばリンフォカイン、インターロイキン−１（“ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（“ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（“ＩＬ−６”）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（“ＧＭ−ＣＳＦ”）、顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）、又は他の成長因子のような生物学的反応変更因子を含むことができる。
【０１２７】
[0154]このような治療分子を抗体に結合させるための技術は公知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。或いは、抗体は、第２の抗体に結合して、米国特許第４，６７６，９８０号中のＳｅｇａｌによって記載されるように抗体ヘテロ結合体を形成することができる。
【０１２８】
ｖｉｉｉ．タンパク質化学を使用する抗体を製造する方法
[0155]抗体を含んでなるタンパク質を産生する一つの方法は、タンパク質化学技術によって二つ又はそれより多いペプチド又はポリペプチドを一緒に結合することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを使用して、現時点で利用可能な研究室機器を使用して、化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。例えば抗体に対応するペプチド又はポリペプチドを、標準的な化学的反応によって合成することができることを当業者は容易に認識することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、そしてその合成用樹脂から切断しないことができ、一方、抗体の他の断片を合成し、そしてその後樹脂から切断し、これによって、他の断片上の機能的に遮断された末端基を暴露することができる。ペプチド縮合反応によって、これらの二つの断片は、それぞれこれらのカルボキシル及びアミノ末端におけるペプチド結合により、抗体又は抗体の断片を形成するために、共有結合的に結合することができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ。或いは、ペプチド又はポリペプチドは、先に記載したようにｉｎ  ｖｉｖｏで独立に合成される。単離した後、これらの独立のペプチド又はポリペプチドは、結合されて、類似のペプチド縮合反応により抗体又はその断片を形成することができる。
【０１２９】
[0156]例えば、クローンされた又は合成ペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチド断片が結合して、大きいペプチド断片、ポリペプチド又は全タンパク質ドメインを産生することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。或いは、合成ペプチドの天然の化学的連結は、短いペプチド断片から大きいペプチド又はポリペプチドを合成的に構築するために使用することができる。この方法は、二工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１の工程は、非保護合成ペプチド−アルファ−チオエーテルの、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有するもう一つの非保護ペプチドセグメントとの、最初の共有結合生成物としてのチオエーテル結合中間体を得る化学選択的反応である。反応条件の変化なしに、この中間体は、自然発生的急速分子内反応を受けて、連結部位に天然のペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成に対するこの天然の化学的連結法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製によって例示されている（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０１３０】
ｉｘ．ヒト及びヒト化
[0157]免疫化により、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーを産生することが可能な遺伝子導入動物（例えば、マウス）を使用することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞系列変異マウス中の抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異マウス中のヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原誘発によるヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照されたい）。ヒト抗体は、更にファージ提示ライブラリーで産生することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に対して更に利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。
【０１３１】
[0158]所望により、抗体は、他の種中で産生し、そしてヒトにおける投与のために“ヒト化”される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含有するキメラな免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、或いは抗体の他の抗原結合性配列のような）である。ヒト化抗体は、受容体抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、更に、受容体抗体又は移入ＣＤＲ或いはフレームワーク配列のいずれにも見いだされない残基を含んでなることができる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、そして典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含んでなり、ここで全ての又は実質的に全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、そして全ての又は実質的に全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体は、最適には、更に免疫グロブリンの定常部領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含んでなるものである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１３２】
[0159]非ヒト抗体のヒト化のための方法は、当技術分野において公知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からのそれに導入された一つ又はそれより多いアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、“移入”残基と呼ばれ、これは、典型的には“移入”可変ドメインから選択される。抗体のヒト化技術は、一般的に抗体分子の一つ又はそれより多いポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する組換えＤＮＡ技術の使用を含む。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列で置換することによって行うことができる。従って、非ヒト抗体（又はその断片）のヒト化形態は、キメラな抗体又は断片であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的にインタクトなヒト可変ドメインより少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及び恐らくは幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似する部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１３３】
[0160]ヒト化抗体を製造することにおいて使用される軽及び重の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少させるために非常に重要である。“最良適合”法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングされる。齧歯類のそれに最も近いヒト配列は、次いでヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう一つの方法は、軽又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なったヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１３４】
[0161]抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性の保持を伴ってヒト化されることが更に重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及び各種の概念的ヒト化産物の、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用する分析の方法によって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、普通に入手可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列のあり得る三次元立体構造を例示し、そして表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の点検は、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、即ち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能にする。この方法において、標的抗原（１または複数）に対する増加した親和性のような所望の抗体の特質が達成されるように、コンセンサス及び移入配列からＦＲ残基を選択し、そして結合することができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響することに直接的及び最も実質的に関係する（１９９４年３月３日に公開されたＷＯ９４／０４６７９を参照されたい）。
【０１３５】
[0162]開示されるものは、ＴＮＦファミリーのサイトカインＴＬ１Ａに特異的に結合する抗原結合性ポリペプチド分子である。ポリペプチドは、ヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域を含む。例えば、ポリペプチドは、親モノクローナル抗体の抗原結合特異性を実質的に保持しながら、ヒト抗体の軽及び重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域を含むことができる。ヒト化重鎖可変領域及び／又はヒト化軽鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を除き、少なくとも約８７％ヒト化され、少なくとも約９０％ヒト化され、少なくとも約９５％ヒト化され、少なくとも約９８％ヒト化されるか、又は少なくとも約１００％ヒト化される。抗原結合性ポリペプチド分子は、モノクローナル抗体供与体（例えば、マウスモノクローナル抗体供与体；ヒトモノクローナル抗体供与体）由来であることができ、そしてモノクローナル抗体からのＣＤＲ（例えば、マウスモノクローナルＣＤＲ；ヒトモノクローナルＣＤＲ）を含むことができる。ポリペプチドは、サイトカイン、ＴＬ１Ａに対してアンタゴニストとして機能することができる。
【０１３６】
[0163]本明細書中で使用する場合、用語“エピトープ”は、開示される抗ＤＲ３又は抗ＴＬ１Ａ抗体との特異的相互作用が可能ないずれもの決定因子を含むことが意味される。エピトープ決定因子は、通常、アミノ酸又は糖側鎖ような分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常、特異的三次元構造特質、並びに特異的電荷特質を有する。
【０１３７】
[0164]“エピトープ標識”は、抗体又は分子の機能に無関係の短いペプチド配列を意味し、これは、抗エピトープ標識抗体又は他の試薬による分子の精製又は架橋のために使用することができる。
【０１３８】
[0165]“特異的結合”によって、抗体が、その同族抗原（例えば、ＤＲ３受容体ポリペプチド又はＴＬ１Ａポリペプチド）を認識し、そして物理的に相互作用し、そして他の抗原を有意に認識及び相互作用しないことが意味される；このような抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることができ、これらは、当技術分野において公知の技術によって産生される。
【０１３９】
[0166]抗体は、基質に結合するか、又は検出可能な部分で標識するか、或いは結合及び標識の両方をすることができる。本発明の組成物について考慮される検出可能な部分は、蛍光、酵素及び放射性マーカーを含む。
【０１４０】
２．核酸
ｉ．配列
[0167]本明細書中に開示されるシグナル伝達経路に関係するタンパク質分子に関連する多くの配列、例えばその全てが核酸によってコードされるか、又は核酸である、ＤＲ３及びＴＬ１Ａが存在する。これらの遺伝子のヒト類似体、並びに他の類似体、及びこれらの遺伝子のアレル、及びスプライス変異体並びに他の種類の変異体に対する配列は、ジェンバンクを含む各種のタンパク質及び遺伝子データベースから入手可能である。本出願の出願の時点においてジェンバンクにおいて入手可能なこれらの配列は、本明細書中に、参考文献としてその全て、並びにそこに含有される個々のサブ配列が援用される。ジェンバンクは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉにおいてアクセスすることができる。
【０１４１】
[0168]当業者は、配列の不一致及び差異を解決し、そして特定の配列に関する組成及び方法を他の関連する配列に対して調節する方法を理解する。プライマー及び／又はプローブは、本明細書中に開示され、当技術分野において既知の情報を前提として、いずれもの与えられた配列に対して設計することができる。
【０１４２】
[0169]ＤＲ３に対する核酸配列は、ジェンバンク寄託番号ＮＭ＿００１０３９６６４．１（ヒト）又は寄託番号Ｑ９３０３８（ヒト；配列番号：１）及びＮＭ＿０３３０４２．３（マウス）により入手することができる。ＴＬ１Ａに対する核酸配列は、ジェンバンク寄託番号ＮＭ＿１７７３７１（マウス）及び寄託番号ＮＭ＿００５１１８．２（ヒト）又は寄託番号Ｑ８ＮＦＥ９（配列番号：３）により入手することができる。ジェンバンク寄託番号ＮＭ＿００１０３９６６４．１（ヒト）及びＮＭ＿０３３０４２．３（マウス）の下でＤＲ３について、又はジェンバンク寄託番号ＮＭ＿１７７３７１（マウス）及びＮＭ＿００５１１８．２（ヒト）の下でＴＬ１Ａについて提供されるいずれもの核酸及びアミノ酸配列を含む全ての情報は、本明細書中にその全てが参考文献として援用される。
【０１４３】
ｉｉ．ヌクレオチド及び関連する分子
[0170]ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、そのリン酸部分及び糖部分を介して、ヌクレオシド間結合を作り、一緒に結合することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、及びチミン−１−イル（Ｔ）であることができる。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。当技術分野において利用可能な、そして本明細書中で利用可能な多くの各種のこれらのタイプの分子が存在する。用語“ヌクレオチド”は、ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体、好ましくはオリゴヌクレオチドを含んでなるヌクレオチドの群を含み、そしてＮ−グリコシル結合によってリン酸化された糖に結合した複素環化合物を含有するいずれもの化合物、又は相補的塩基対形成が可能ないずれものモノマー、或いはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能ないずれものポリマーを指す。
【０１４４】
[0171]用語“ヌクレオチド類似体”は、核酸合成及び加工、好ましくは酵素的、並びに化学的合成及び加工において、天然に存在する塩基の代わりに使用することができる分子、特に塩基対形成が可能な修飾されたヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、又はリン酸部分の一つにある種の修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドの修飾は、当技術分野において周知であり、そして例えば、５メチルシトシン（５ｍｅＣ）、５ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、及び２アミノアデニン、並びに糖又はリン酸部分における修飾を含むものである。
【０１４５】
[0172]この用語は、制約されるものではないが、修飾されたプリン及びピリミジン、微量塩基、転換可能なヌクレオシド、プリン及びピリミジンの構造的類似体、標識され、誘導体化されそして修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド、結合されたヌクレオシド及びヌクレオチド、配列修飾因子、末端修飾因子、スペーサー修飾因子、並びに制約されるものではないが、リボース修飾ヌクレオチド、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホンアミダイト、メチルホスホネート、メチルホスホルアミダイト、メチルホスホンアミダイト、５’−β−シアノエチルホスホルアミダイト、メチレンホスホネート、ホスホロジチオエート、ペプチド核酸、アキラル及び天然のヌクレオチド間結合及びポリエチレングリコールのような非ヌクレオチド架橋、芳香族ポリアミド並びに脂質を含む骨格修飾を伴うヌクレオチドを含む。所望により、ヌクレオチド類似体は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル又は微量塩基を含まない合成塩基である。これらの及び他のヌクレオチド並びにヌクレオシド誘導体、類似体及び骨格修飾は、当技術分野において既知である（例えば、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：３３−３７；Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，（Ｅｄｓ．Ｃ．Ｋ．Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｄ．Ｃ．Ｂａｋｅｒ）  Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１１−３２３；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：１６５−１８７；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５−１９６３）。ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドに類似した機能的特性を有するが、しかしペプチド核酸（ＰＮＡ）のようにリン酸部分を含有しない分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン−クリック又はフーグスティーン様式で核酸を認識する分子であるが、しかしこれは、リン酸部分以外の部分により一緒に結合する。ヌクレオチド代替物は、適当な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に適合することが可能である。当技術分野において利用可能であり、そして本明細書中で利用可能である多くの各種のこれらのタイプの分子が存在する。
【０１４６】
[0173]他の種類の分子（複合体）を、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に結合させ、例えば、細胞取込みを向上させることも可能である。複合体は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学的に結合することができる。このような複合体は、制約されるものではないが、コレステロール部分のような脂質部分を含む（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３-６５５６）。当技術分野において利用可能であり、そして本明細書中で利用可能である多くの各種のこれらのタイプの分子が存在する。
【０１４７】
[0174]例えばＴＬ１Ａ及びＤＲ３、並びに本明細書中に開示されるいずれもの他のタンパク質、並びに各種の機能性核酸をコードする核酸を例えば含む、核酸ベースの本明細書中に開示される各種の分子が存在する。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物から構成される。これらの及び他の分子の非限定的例が本明細書中で考察される。例えば、ベクターが細胞中で発現される場合、発現されるｍＲＮＡは、典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ、及びＵで構成されるものであることは理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達により細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境でアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類似体から構成されることが有利であることは理解される。
【０１４８】
[0175]“単離された核酸”又は“精製された核酸”によって、本発明のＤＮＡが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まないＤＮＡが意味される。従って当該用語は、例えば、自己複製プラスミド又はウイルスのようなベクター中に組込まれた；又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれた（例えば遺伝子導入）；又は別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、或いはＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、又は化学的若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって産生されるゲノム又はｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。これは、更なるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。用語“単離された核酸”は、ＲＮＡ、例えば単離されたＤＮＡ分子によってコードされた、又は化学的に合成された、或いは少なくとも幾つかの細胞成分、例えば、他の種類のＲＮＡ分子又はポリペプチド分子から分離されたか又はこれを実質的に含まない、ｍＲＮＡ分子も指す。
【０１４９】
ｉｉｉ．ヌクレオチドの相互作用
[0176]ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面による少なくとも一つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面は、プリンベースヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１、及びＣ６位、並びにピリミジンベースヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【０１５０】
[0177]フーグスティーン相互作用は、二本鎖ＤＮＡの主溝に暴露されている、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のフーグスティーン面において起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位及び、Ｃ６位における反応性基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
【０１５１】
ｉｖ．オリゴ及びポリヌクレオチド
[0178]用語“オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチドの天然に存在するか又は合成のポリマーを、そして好ましくは少なくとも三つのヌクレオチドを含んでなるポリマーを、そしてより好ましくは、ハイブリダイゼーションが可能なポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、選択された核酸配列、ヘテロ二本鎖、キメラ及びハイブリダイズされたヌクレオチド並びに一つ又はそれより多い非オリゴヌクレオチド分子に結合したオリゴヌクレオチドを含む、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖又は部分的に二本鎖のリボ核酸又はデオキシリボ核酸であることができる。
【０１５２】
[0179]用語“ポリヌクレオチド”は、ホスホジエステル結合によって一緒に結合された二つ又はそれより多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの配列を意味するために本明細書中で幅広く使用される。このように、用語“ポリヌクレオチド”は、遺伝子又はその部分、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列、等であることができるＲＮＡ及びＤＮＡを含み、そして一本鎖又は二本鎖、並びにＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドであることができる。更に、用語“ポリヌクレオチド”は、本明細書中で使用される場合、細胞から単離することができる天然に存在する核酸分子、並びに例えば化学的合成によって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるような酵素的方法によって調製することができる合成分子を含む。各種の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、又はホスホジエステル結合以外の骨格結合を含有することができる。一般的に、ポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチドは、２’−デオキシリボースに結合したアデニン、シトシン、グアニン又はチミンのような天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、或いはリボースに結合したアデニン、シトシン、グアニン又はウラシルのようなリボヌクレオチドである。然しながら、ポリヌクレオチドは、天然に存在しない合成ヌクレオチド又は修飾された天然に存在するヌクレオチドを含む、ヌクレオチド類似体を含有することもできる。このようなヌクレオチド類似体は、このようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドがそうであるように、当技術分野において周知であり、そして商業的に入手可能である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５２２０−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７）、これらのそれぞれは、本明細書中に参考文献として援用される）。
【０１５３】
[0180]一般的に、ポリヌクレオチドのヌクレオチドを結合する共有結合は、ホスホジエステル結合である。然しながら、共有結合は、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合又は合成ポリヌクレオチドを産生するためにヌクレオチドを結合させるために有用であるとして当業者に知られるいずれもの他の結合を含む、多くの他の結合のいずれかであることもできる（例えば、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：９７７−９８６（１９９４）；Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１３６０（１９９５）を参照されたい、これらのそれぞれは、参考文献として本明細書中に援用される）。天然に存在しないヌクレオチド類似体の組込み或いはヌクレオチド又は類似体を連結させる結合は、ポリヌクレオチドが、例えば組織培養培地を含む、核酸分解活性を含有することができる環境に暴露される場合、又は生きた被験者への投与の際に、修飾されたポリヌクレオチドが分解に対してより感受性でなくなることができるため、特に有用であることができる。
【０１５４】
[0181]天然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体は、ＲＮＡ又はＤＮＡに結合することができ、そしてペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。
【０１５５】
[0182]参照核酸の断片は、参照核酸の連続した核酸のみを含有し、そして参照配列より短い、少なくとも一つのヌクレオチドである。
【０１５６】
ｖ．プライマー及びプローブ
[0183]開示されるものは、プライマー及びプローブを含む組成であり、これは、本明細書中に開示されるようにＤＲ３又はＴＬ１Ａのような開示される核酸と相互作用することが可能である。ある態様において、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支持するために使用される。典型的には、プライマーは、配列特異的様式で伸長することが可能である。配列特異的様式のプライマーの伸長は、それにプライマーがハイブリダイズ又は別の方法で会合する核酸分子の配列及び／又は組成が、プライマーの伸長によって産生される生成物の組成又は配列を指示するか又はそれに影響する、いずれもの方法を含む。従って、配列特異的様式のプライマーの伸長は、制約されるものではないが、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、又は逆転写を含む。配列特異的様式でプライマーを増幅する技術及び条件が好ましい。ある態様において、プライマーは、ＰＣＲ又は直接配列決定のようなＤＮＡ増幅反応のために使用される。ある態様において、非酵素技術を使用してプライマーを伸長することもでき、ここで、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、これらがプライマーを配列特異的様式で伸長するように化学的に反応するように修飾されることは理解される。典型的には、開示されるプライマーは、開示される核酸又は核酸の領域とハイブリダイズし、或いはこれらは、核酸の相補物又は核酸の領域の相補物とハイブリダイズする。
【０１５７】
[0184]ある態様における核酸との相互作用のためのプライマー又はプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅のような、プライマーの所望の酵素的操作、或いはプローブ又はプライマーの単純なハイブリダイゼーション、を支持するいずれものサイズであることができる。典型的なプライマー又はプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、又は４０００個のヌクレオチドの長さである。
【０１５８】
[0185]他の態様において、プライマー又はプローブは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、又は４０００個のヌクレオチドの長さより小さいか又はそれに等しいことができる。
【０１５９】
[0186]ＤＲ３又はＴＬ１Ａ遺伝子のためのプライマーは、典型的にはＤＲ３又はＴＬ１Ａ遺伝子の領域或いは完全な遺伝子を含有する増幅されたＤＮＡ産物を産生するために使用されるものである。一般的に、典型的には産物のサイズは、サイズを３個、或いは２又は１個のヌクレオチドの範囲内で正確に決定することができるようなものである。
【０１６０】
[0187]ある態様において、この産物は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、又は４０００個のヌクレオチドの長さである。
【０１６１】
[0188]他の態様において、産物は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、又は４０００個のヌクレオチドの長さより少ないか又はそれに等しい。
【０１６２】
３．ペプチド
ｉ．タンパク質変異体
[0189]本明細書中で考察したように、既知の、そして本明細書中で意図される、ＤＲ３タンパク質及びＴＬ１Ａタンパク質の多くの変異体が存在する。更に、既知の機能的系統の変異体に対して、開示される方法及び組成物中でも機能するＤＲ３又はＴＬ１Ａタンパク質の誘導体が存在する。タンパク質変異体及び誘導体は、当業者にとって十分に理解され、そしてアミノ酸配列修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列の修飾は、典型的には三つのクラス、置換、挿入又は欠失変異体、の一つ又はそれより多くに入る。挿入は、アミノ及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに一つ又は多数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、アミノ又はカルボキシル末端の融合のものより小さい、例えば、概略１ないし４個の残基の挿入である。実施例中に記載されているもののような免疫原性融合タンパク質誘導体は、標的配列に免疫原性を与えるために十分に大きいポリペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの架橋によって融合することによって、又は融合物をコードするＤＮＡにより形質転換された組換え細胞培養によって、製造される。欠失は、タンパク質配列からの一つ又はそれより多いアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。典型的には、約２から６個までより多くない残基が、タンパク質分子内の任意の一つの部位において除去される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、これによって変異体をコードするＤＮＡを産生し、そしてその後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の位置で置換変異を行うための技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発は、周知である。アミノ酸置換は、典型的には一つの残基のものであるが、しかし一度に多くの異なった位置で起こりうる；挿入は、通常、概略１から１０個までのアミノ酸残基である；そして欠失は、約１から３０個までの残基の範囲である。欠失又は挿入は、好ましくは隣接する対において、即ち二つの残基の欠失又は二つの残基の挿入で、行われる。置換、欠失、挿入又はいずれものこれらの組合せは、最終構築物に達するために組み合わせることができる。変異は、配列を読み枠から外してはならず、そして好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を産生することができる相補的領域を作り出さない。置換変異体は、少なくとも一つの残基が除去され、そして異なった残基がその場所に挿入されたものである。このような置換は、一般的に以下の表１及び２によって行われ、そして保存的置換と呼ばれる。
【０１６３】
【表２】
2014518883.tif 000003
【０１６４】
【表３】
2014518883.tif 000004
【０１６５】
[0191]機能及び免疫学的同一性の実質的な変化は、表３中のものより保存的ではない置換を選択すること、即ち（ａ）置換の位置における、例えばシート又はらせん高次構造としてのポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性或いは（ｃ）側鎖の大部分、を維持するためのこれらの効果においてより有意に異なる残基を選択することによって行われる。一般的にタンパク質の特質に最大の変化を生み出すことが期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルで（によって）置換される；（ｂ）システイン又はプロリンは、いずれもの他の残基で（によって）置換される；（ｃ）電気的に正の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、又はヒスチジルは、電気的に負の残基、例えば、グルタミル又はアスパルチルで（により）置換される；或いは（ｄ）大きい側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンは、側鎖を持たないもの、例えば、この場合グリシンで（によって）置換される；（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増加させることによるものである。
【０１６６】
[0192]例えば、一つのアミノ酸残基の生物学的に及び／又は化学的に類似なもう一つのものによる置換は、当業者にとって保存的置換として既知である。例えば、保存的置換は、一つの疎水性残基をもう一つのもので、又は極性残基をもう一つのもので置換するものである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せを含む。それぞれの明確に開示される配列のこのような保存的に置換された変種は、本明細書中に提供されるモザイクポリペプチドの範囲内に含まれる。
【０１６７】
[0193]置換又は欠失変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための部位を挿入するために使用することができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失も、更に好ましいことであり得る。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失又は置換は、例えば塩基性残基の一つを欠失するか、或いはそれをグルタミニル又はヒスチジル残基によって置換することによって達成することができる。
【０１６８】
[0194]ある種の翻訳後誘導は、組換え宿主細胞の発現されたポリペプチドに対する作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後的に対応するグルタミル及びアスパリル残基に脱アミドされる。或いは、これらの残基は、穏和な酸性の条件下で脱アミドされる。他の翻訳後修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ  ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及びある場合には、Ｃ末端カルボキシルのアミド化を含む。
【０１６９】
[0195]本明細書中で開示されるタンパク質の変異体及び誘導体を定義するための一つの方法は、具体的な既知の配列に対する相同性／同一性の面から変異体及び誘導体を定義することによることは理解される。例えば、配列番号：２は、ＤＲ３の特定の配列を明記し、そして配列番号：４は、ＴＬ１Ａタンパク質の特定の配列を明記する。具体的に開示されるものは、記述した配列に対して、少なくとも７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％の相同性を有する本明細書中に開示されるこれらの及び他のタンパク質の変異体である。二つのタンパク質の相同性を決定する方法を、当業者は容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高のレベルであるように二つの配列を整列させた後、計算することができる。
【０１７０】
[0196]相同性を計算するもう一つの方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似法のための探求によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行によって（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又は検査によって行うことができる。
【０１７１】
[0197]同じ種類の相同性は、例えばＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９中に記載されているアルゴリズムによって核酸に対して得ることができ、これらは、本明細書中に参考文献として、少なくとも核酸の整列に関する題材に対する言及のために援用される。
【０１７２】
[0198]保存的変異及び相同性の記載を、変異体が保存的変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する態様のような、いずれもの組合せで一緒に組合せることができることは理解される。
【０１７３】
[0199]本明細書が各種のタンパク質及びタンパク質配列を考察するため、これらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も開示されることは理解される。これは、特異的タンパク質配列に関する全ての縮重配列、即ち、一つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、並びに縮重核酸を含む、開示される変異体及びタンパク質配列の誘導体をコードする全ての核酸、を含むものである。従って、それぞれの特定の核酸配列を本明細書中に書き出すことはできないが、それぞれの、そしてことごとくの配列が、開示されるタンパク質配列によって、本明細書中に事実上開示され、そして記載されることは理解される。生命体内でそのタンパク質をどの特定のＤＮＡ配列がコードするかを、アミノ酸配列は示していないが、開示されるタンパク質の特定の変異体が本明細書中に開示されている場合、そのタンパク質をコードする既知のアミノ酸配列も既知であり、そして本明細書中に開示され、そして記載されることも理解される。
【０１７４】
[0200]開示される組成物中に組込むことができる多くのアミノ酸及びペプチド類似体が存在することは理解される。例えば、多くのＤアミノ酸又は表２及び表３に示したアミノ酸とは異なった機能性置換基を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体、並びにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、部位特異的方法でペプチド鎖にアナログアミノ酸を挿入するために、選択されたアミノ酸をｔＲＮＡ分子に装填し、そして例えばアンバーコドンを使用する遺伝子構築物を操作することによって、ペプチド鎖に容易に組込むことができる（これらの全てが本明細書中に参考文献として、少なくともアミノ酸類似体に関する題材のために援用される、Ｔｈｏｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４  １９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３  １９９４）；Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２  （１９９４））。
【０１７５】
[0201]ペプチドに類似の分子を産生することができるが、しかしこれは、天然のペプチド結合により接続されない。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体に対する結合は、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨＨ２ＳＯ-を含むことができ、（これらの及び他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−，ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−，ｃｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；及びＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）中に見出すことができる；これらのそれぞれは、本明細書中に参考文献として援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似体が、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸、等のように結合原子間に一つより多い原子を有することができることは理解される。
【０１７６】
[0202]アミノ酸類似体及び類似体並びにペプチド類似体は、しばしば、更に経済的な産生、大きい化学的安定性、向上した薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性、等）、変更された特異性（例えば、生物学的活性の広いスペクトル）、減少した抗原性、等のような向上された又は所望する特性を有する。
【０１７７】
[0203]Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼ等によって認識されないことから、Ｄ−アミノ酸をより安定なペプチドを産生するために使用することができる。同じ種類のＤ−アミノ酸を伴うコンセンサス配列の一つ又はそれより多いアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）は、より安定なペプチドを産生するために使用することができる。システイン残基は、二つ又はそれより多いペプチドを一緒に環化又は接続するために使用することができる。これは、ペプチドを特定の高次構造に束縛するために有益である。（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、本明細書中に参考文献として援用される）。
【０１７８】
４．配列の類似性
[0204]本明細書中で考察されるように、用語相同性及び同一性の使用は、類似性と同じことを意味することは理解される。従って、例えば、言語相同性の使用が二つの非天然の配列間で使用された場合、これが、必ずしもこれらの二つの配列間の進化的関係を示すものではなく、しかしこれらの核酸配列間の類似性又は関連性を考察していることは、理解される。二つの進化的に関連する分子間の相同性を決定するための多くの方法は、これらが進化的に関係するか否かに関わらず、配列の類似性を測定する目的のために、いずれもの二つ又はそれより多い核酸或いはタンパク質に日常的に適用される。
【０１７９】
[0205]一般的に、本明細書中に開示される遺伝子及びタンパク質のいずれもの既知の変異体及び誘導体又は生じることができるものを定義するための一つの方法は、具体的な既知の配列との相同性の点から変異体及び誘導体を定義することによることは理解される。この本明細書中に開示される特定の配列の同一性は、更に、本明細書中の他に場所で考察される。一般的に、本明細書中に開示される遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、少なくとも、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの、記述された配列又は天然の配列に対する相同性を有する。二つのタンパク質又は、遺伝子のような核酸の相同性を決定する方法を当業者は容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高のレベルであるように、二つの配列を整列させた後、計算することができる。
【０１８０】
[0206]相同性を計算するもう一つの方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似法のための探求によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行によって（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又は検査によって行うことができる。
【０１８１】
[0207]同じ種類の相同性は、例えばＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９中に記載されているアルゴリズムによって核酸に対して得ることができ、これらは、本明細書中に参考文献として、少なくとも核酸の整列に関する題材に対する言及のために援用される。典型的にはいずれもの方法を使用することができ、そしてある場合には、これらの異なった方法の結果が異なることがあり得ることは理解されるが、しかし当業者は、同一性がこれらの方法の少なくとも一つにおいて見いだされた場合、この配列が記述した同一性を有すると言え、そして本明細書中に開示されるものであることを理解する。
【０１８２】
[0208]例えば、本明細書中で使用する場合、もう一つの配列に対して特定のパーセントの相同性を有すると記載された配列は、先に記載した計算方法のいずれか一つ又はそれより多くによって計算されたような記載された相同性を有する配列を指す。例えば、第１の配列が、Ｚｕｋｅｒの計算法を使用して第２の配列に対する８０パーセントの相同性を有すると計算された場合、第１の配列が、他の計算方法のいずれかによって第２の配列に対する８０パーセントの相同性を持たないと計算されたとしても、第１の配列は、本明細書中で定義したような第２の配列に対する８０％の相同性を有する。もう一つの例として、第１の配列が、Ｚｕｋｅｒの計算法及びＰｅａｓｏｎの両方、並びにＬｉｐｍａｎ計算法を使用して第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算された場合、第１の配列が、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、又は他の計算方法のいずれかによって第２の配列に対する８０パーセントの相同性を持たないと計算されたとしても、第１の配列は、本明細書中で定義したような第２の配列に対する８０％の相同性を有する。なおもう一つの例として、第１の配列が、それぞれの計算法を使用して第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算された場合、第１の配列は、本明細書中で定義したような第２の配列に対する８０％の相同性を有する（実際には、異なった計算法は、しばしば異なった計算された相同性のパーセントをもたらすものであるが）。
【０１８３】
５．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
[0209]用語ハイブリダイゼーションは、典型的には、プライマー又はプローブ及び遺伝子のような、少なくとも二つの核酸分子間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、ヌクレオチド特異的様式で、二つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体或いはヌクレオチド誘導体間で起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、又はＴと相互作用するＡは、配列駆動相互作用である。典型的な配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面又はフーグスティーン面で起こる。二つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者にとって既知の多くの条件及びパラメーターによって影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、及び温度は、二つの核酸分子がハイブリダイズされるものであるか否かに、全て影響する。
【０１８４】
[0210]二つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのためのパラメーターは、当業者にとって公知である。例えば、幾つかの態様において、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のいずれか又は両方の温度及び塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそのハイブリダイゼーションの相手から解離する溶融温度）より約１２−２５℃低い温度における高いイオン強度の溶液（６ＸＳＳＣ又は６ＸＳＳＰＥ）中のハイブリダイゼーション、それに続く洗浄温度がＴｍより約５℃ないし２０℃低い洗浄温度であるように選択される温度及び塩濃度の組合せにおける洗浄を含むことができる。温度及び塩濃度は、フィルター上に固定化された参照ＤＮＡに試料を、標識された対象の核酸とハイブリダイズし、そして次いで異なったストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにおいて高い。ストリンジェンシーを達成するための先に記載したように使用することができる、又はそのような条件は、当技術分野において既知である。（これは本明細書中に参考文献として、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する題材のために援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６ＸＳＳＣ又は６ＸＳＳＰＥ中の約６８℃（水溶液中）、それに続く６８℃における洗浄であることができる。所望する場合、ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が減少されるのに従って、そして更に、変異性が探索されるいずれもの領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さによって、減少させることができる。同様に、所望する場合、ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、所望の相同性が増加されるのに従って、そして更に、高い相同性が所望されるいずれもの領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さによって、全てが当技術分野において既知であるように、増加させることができる。
【０１８５】
[0211]選択的ハイブリダイゼーションを定義するためのもう一つの方法は、他の核酸に結合する核酸の一つの量（パーセント）を考察することによる。例えば、幾つかの態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントの限定的核酸が、非限定的核酸に結合される場合である。典型的には、非限定的プライマーは、例えば、１０又は１００或いは１０００倍過剰である。この種のアッセイは、限定的及び非限定的プライマーの両方が、例えばそのｋｄより１０倍又は１００倍又は１０００倍低い、或いは一方の核酸分子のみが１０倍又は１００倍又は１０００倍である、或いは一方又は両方の核酸分子がそのｋｄより上である、条件下で行うことができる。
【０１８６】
[0212]選択的ハイブリダイゼーションを定義するためのもう一つの方法は、ハイブリダイゼーションが、所望の酵素的操作を促進するために必要である条件下で、酵素的に操作されるプライマーのパーセントを考察することによる。例えば、幾つかの態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマーが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合であり、例えば酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマー分子が、伸長される場合であるものである。好ましい条件は、更に製造業者によって示唆された又は操作を行う酵素のために適当であるとして当技術分野において示されたものを含む。
【０１８７】
[0213]相同性と全く同じように、二つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するために本明細書中に開示される各種の方法が存在することは理解される。これらの方法及び条件は、二つの核酸分子間の異なったパーセントのハイブリダイゼーションを提供しうるが、しかし他に示さない限り、いずれかの方法のパラメーターに合致することで十分であることは理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要である場合、そしてハイブリダイゼーションが、これらの方法のいずれか一つにおいて必要なパラメーターの範囲内で起こる限り、これは、本明細書中に開示されていると考えられる。
【０１８８】
[0214]組成物又は方法が、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか一つに、集合的に又は単一で合致する場合、これは、本明細書中に開示される組成物又は方法であることを、当業者が理解することは理解される。
【０１８９】
６．細胞送達系
[0215]Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで核酸を細胞に送達するために使用することができる多くの組成物及び方法が存在する。これらの方法及び組成物は、大きく二つのクラス：ウイルスベース送達系及び非ウイルスベース送達系に分類することができる。例えば、核酸は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、或いは細胞又はカチオン性リポソームのような担体中の遺伝子物質の移入のような多くの直接送達系により送達することができる。ウイルスベクター、化学的遺伝子移入体、又は電気穿孔のような物理機械的方法及びＤＮＡの直接拡散を含む遺伝子導入のための適当な手段が、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；及びＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）中に記載されている  このような方法は、当技術分野において公知であり、そして本明細書中に記載される組成物及び方法と共に使用するために容易に適合可能である。ある場合には、この方法は、大きいＤＮＡ分子について特異的に機能するように改変される。更に、これらの方法は、担体の標的化特質を使用することによって、ある種の疾病及び細胞集団を標的とするために使用することができる。
【０１９０】
ｉ．核酸ベース送達系
[0216]トランスファーベクターは、遺伝子を細胞に送達するために、又は遺伝子を送達するための一般的戦略の部分として、例えば、組換えレトロウイルス又はアデノウイルスの部分として使用される、いずれものヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であることができる（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））。
【０１９１】
[0217]本明細書中で使用する場合、プラスミド又はウイルスベクターは、ＤＲ３又はＴＬ１Ａのような開示される核酸を、分解を伴わずに細胞に輸送する薬剤であり、そしてそれが送達された細胞中の遺伝子の発現を得るプロモーターを含む。幾つかの態様において、ベクターは、ウイルス又はレトロウイルスのいずれかから誘導される。ウイルスベクターは、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経細胞栄養性ウイルス、シンドビス及びＨＩＶ骨格を持つウイルスを含む他のＲＮＡウイルスである。更に好ましいものは、これらをベクターとして使用するために適したものにするこれらのウイルスの特質を共有するいずれものウイルスのファミリーである。レトロウイルスは、マウスモロニー（ｍａｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、及びベクターとしての所望のＭＭＶＬの特性を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きい遺伝子的負荷量、即ち、導入遺伝子又はマーカー遺伝子を保有することが可能であり、そしてこの理由のために、普通に使用されるベクターである。然しながら、これらは、非増殖性細胞中ではそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、そして作業しやすく、高い力価を有し、そしてエアゾール製剤中で供給することができ、そして非分裂細胞を、遺伝子導入することができる。ポックスウイルスベクターは、大きく、そして遺伝子を挿入するための幾つかの部位を有する；これらは、熱安定性であり、そして室温で保存することができる。好ましい態様は、ウイルス抗原によって誘発された宿主生物体の免疫反応を抑制するために操作されるウイルスベクターである。この種類の好ましいベクターは、インターロイキン８又は１０に対するコード領域を保有するものである。
【０１９２】
[0218]ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための化学的又は物理的方法より高い処理能力（遺伝子を導入する能力）を有することができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びキャプシド形成のために必要な逆方向反復配列、及びウイルスゲノムの転写及び複製を制御するためのプロモーターを含有する。ベクターとして操作された場合、ウイルスは、典型的には一つ又はそれより多い初期遺伝子が除去され、そして除去されたウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入される。この種類の構築物は、約８ｋｂまでの外部遺伝子物質を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をｔｒａｎｓに発現するように操作された細胞株によって供給される。
【０１９３】
ａ．レトロウイルスベクター
[0219]レトロウイルスは、いずれもの種、亜群、属、又は向性を含む、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）によって記載され、これは、本明細書中に参考文献として援用される。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号及び４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６及びＷＯ８９／０７１３６；及びＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））中に記載され；これらの教示は、本明細書中に参考文献として援用される。
【０１９４】
[0220]レトロウイルスは、本質的に核酸の積み荷がその中に詰込まれたパッケージである。核酸の積み荷は、複製された娘分子が、パッケージ被覆内に効率よく詰込まれるものであることを確実にするためのパッケージ化シグナルをそれと共に保有する。パッケージシグナルに加えて、複製されたウイルスの複製及び詰込みのためにｃｉｓに必要な多くの分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質被覆の製造において関係するｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有する。これは、典型的にはそれが標的細胞に移入される外部ＤＮＡによって置換されるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージ被覆への組込みのためのパッケージ化シグナル、ｇａｇ転写単位の開始のシグナルを送る配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写のために必要な要素、ＤＮＡ合成中のＲＮＡストランドの切替えを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２のストランドの合成のためのプライミング部位として役立つ５’から３’ＬＴＲのプリンリッチ配列、及び宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲの末端付近の特異的配列を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外部配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写され、そして複製により新しいレトロウイルス粒子に詰込まれることを可能にする。この核酸の量は、それぞれの転写物のサイズによるが一つないし多くの遺伝子の供給のために十分である。挿入断片中の他の遺伝子と共に正又は負の選択性マーカーのいずれかを含むことが好ましい。
【０１９５】
[0221]殆どのレトロウイルスベクター中の複製機構及びパッケージ化タンパク質が除去されているため（ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）に、ベクターは、典型的にはこれらをパッケージ化細胞系に入れることによって産生される。パッケージ化細胞系は、複製及びパッケージ化機構を含有するが、しかしいずれものパッケージ化シグナルを欠くレトロウイルスで形質移入又は形質転換された細胞系である。選択されたＤＮＡを保有するベクターがこれらの細胞系に形質移入された場合、対象の遺伝子を含有するベクターは、複製され、そして新しいレトロウイルス粒子中に、ヘルパー細胞によってｃｉｓに提供される機構によって詰込まれる。当該機構のためのゲノムは、これらが必要なシグナルを欠くため、詰込まれない。
【０１９６】
ｂ．アデノウイルスベクター
[0222]複製欠損アデノウイルスの構築は、記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用する利点は、これらが最初に感染された細胞内で複製することができるが、しかし新しい感染性ウイルス粒子を形成することが不可能なため、これらが他の細胞種に広がることができる範囲において制約されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質及び多くの他の組織部位への直接のｉｎ  ｖｉｖｏの送達後の高い効率の遺伝子移入を達成することを示している（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；及びＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体に結合することによって遺伝子の形質導入を達成し、その後、ウイルスは野生型又は複製欠損アデノウイルスと同じ様式で受容体仲介のエンドサイトーシスによって内部移行される（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃ��ｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１９７】
[0223]ウイルスベクターは、除去されたＥ１遺伝子を有するアデノウイルスに基づくものであることができ、そしてこれらのビリオン（ｖｉｒｏｎ）は、ヒト２９３細胞系のような細胞系で産生される。もう一つの好ましい態様において、Ｅ１及びＥ３遺伝子の両方がアデノウイルスゲノムから除去される。
【０１９８】
ｃ．アデノ随伴ウイルスベクター
[0224]ウイルスベクターのもう一つの種類は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、これが多くの細胞種を感染することができ、そしてヒトに対して非病原性であるために、好ましいベクターである。ＡＡＶ型のベクターは、約４ないし５ｋｂを輸送することができ、そして野生型ＡＡＶは、１９番染色体に安定して挿入されることが知られている。この部位特異的組込み特性を含有するベクターが好ましい。この型のベクターの特に好ましい態様は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって製造されるＰ４．１Ｃベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、及び／又は緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードする遺伝子のようなマーカー遺伝子を含有することができる。
【０１９９】
[0225]ＡＡＶウイルスのもう一つの型において、ＡＡＶは、異種遺伝子に操作可能に結合された細胞特異的発現を指示するプロモーターを含有する少なくとも一つのカセットに隣接する逆位末端配列（ＩＴＲ）の対を含有する。この文脈における異種は、ＡＡＶ又はＢ１９パルボウイルスに対して天然ではないいずれものヌクレオチド配列又は遺伝子を指す。
【０２００】
[0226]典型的には、ＡＡＶ及びＢ１９コード領域は、除去され、安全な非細胞毒性ベクターをもたらす。ＡＡＶのＩＴＲ、又はその修飾は、感染力及び部位特異的組込みを与えるが、しかし細胞毒性を与えず、そしてプロモーターは、細胞特異的発現を指示する。米国特許第６，２６１，８３４号は、本明細書中に参考文献として、ＡＡＶベクターに関する題材のために援用される。
【０２０１】
[0227]開示されるベクターは、このように実質的に毒性を伴わず哺乳動物の染色体に組込むことが可能なＤＮＡ分子を提供する。
【０２０２】
[0228]ウイルス及びレトロウイルスに挿入される遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御することを援助するプロモーター、及び／又はエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に対して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列又は複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用のために必要な核心的要素を含有し、そして上流要素及び反応要素を含有することができる。
【０２０３】
ｄ．大負荷量ウイルスベクター
[0229]大きいヒトヘルペスウイルスによる分子遺伝子学的実験は、それによって大きい異種ＤＮＡ断片を、クローン化し、増やし、そしてヘルペスウイルスによる感染に対して許容的な細胞中に確立することができる手段を提供する（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大きいＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、特異的細胞にヒト異種ＤＮＡ＞１５０ｋｂの断片を供給する可能性を有する。ＥＢＶ組換え体は、感染されたＢ細胞中のＤＮＡの大きい断片をエピソームＤＮＡとして維持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入断片を保有する個々のクローンは、遺伝子的に安定であるように見受けられる。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染中恒常的に発現する特異的ＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。更に、これらのベクターは、大量のタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで一時的に産生することができる形質移入のために使用することができる。ヘルペスウイルスアンプリコン系は、更に、ＤＮＡ＞２２０ｋｂの断片を積み込み、そしてＤＮＡをエピトープとして安定に維持することができる細胞を感染するために使用される。
【０２０４】
[0230]他の有用な系は、例えば、複製及び宿主限定非複製ワクチンウイルスベクターを含む。
【０２０５】
[0231]宿主細胞のゲノムに組込まれる細胞に供給される核酸は、典型的には、組込み配列を含有する。これらの配列は、特にウイルスベースの系が使用される場合、しばしばウイルス関連配列である。これらのウイルス組込み系は、送達系に含有される核酸が宿主ゲノムに組込まれることができるように、リポソームのような非核酸ベースの送達系を使用して送達される核酸に組込むこともできる。
【０２０６】
[0232]宿主ゲノムへの組込みのための他の一般的技術は、例えば、宿主ゲノムとの相同的組換えを促進するように設計された系を含む。これらの系は、典型的には、送達された核酸が、宿主のゲノムに組込まれることを起こし、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが起こる、宿主細胞のゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、発現される核酸に隣接する配列に依存する。相同な組換えを促進するために必要なこれらの系及び方法は、当業者にとって既知である。
【０２０７】
ｉｉ．非核酸ベース系
[0233]開示される組成物は、各種の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物は、電気穿孔、又はリポフェクション、或いはリン酸カルシウム沈殿によって送達することができる。選択される送達機構は、一部、標的とされる細胞の種類に、そして送達が、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こるかに依存するものである。
【０２０８】
[0234]従って、組成物は、開示される核酸に加えて、ペプチド、又は例えばベクター、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）のような、又はアニオン性リポソームのような、リポソームのような脂質を含んでなることができる。リポソームは、更に、所望する場合、特定の細胞を標的化することを容易にするためのタンパク質を含んでなることができる。化合物及びカチオン性リポソームを含んでなる組成物の投与は、標的器官に対して求心性の血液に投与するか、又は気道の標的細胞に対して気道に吸入することができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５-１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３-７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。更に、化合物は、マクロファージのような特異的細胞種を標的とすることができるマイクロカプセルの成分として投与することができるか、又はマイクロカプセルからの化合物の拡散又は化合物の送達は、特異的速度又は投与量のために設計される。
【０２０９】
[0235]被験者の細胞への外因性ＤＮＡの投与及び取込み（即ち、遺伝子伝達又は形質移入）を含む先に記載した方法において、細胞への組成物の送達は、各種の機構によることができる。一つの例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような商業的に入手可能なリポソーム製剤、並びに当技術分野において標準的な方法によって開発された他のリポソームを使用するリポソームによることができる。更に、開示される核酸又はベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な技術の電気穿孔によって、並びにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によってｉｎ  ｖｉｖｏに送達することができる。
【０２１０】
[0236]物質は、溶液又は懸濁液中（例えば、マイクロ粒子、リポソーム、又は細胞に組込まれる）であることができる。これらは、抗体、受容体、又は受容体リガンドによる特定の細胞種に対して標的化することができる。次の参考文献は、腫瘍組織に対する特異的タンパク質を標的とするこの技術の使用の例であり、その原理は、他の細胞の標的化に適用することができる（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７-４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５-２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００-７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３-９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７-８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２-２０６５，（１９９１））。これらの技術は、各種の他の細胞種に対して使用することができる。“ステルス”及び他の抗体結合リポソーム（結腸癌を標的とする脂質仲介薬物を含む）のようなベヒクル、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体仲介標的化、リンパ球指向腫瘍標的化、及びｉｎ  ｖｉｖｏのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルス標的化。次の参考文献は、腫瘍細胞に対する標的特異的タンパク質に対するこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４-６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９-１８７，（１９９２））。一般的に、受容体は、恒常的又はリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関係する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体のクラスターは、クラスリン被覆小胞により細胞に進入し、その中で受容体が選別される酸性化されたエンドソームを通って通過し、そして次いで細胞表面に再循環され、細胞内に保存されることになるか、又はリソソームに分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養分取込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見性進入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベルの制御のような各種の機能に役立つ。多くの受容体は、細胞種、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド結合価、及びリガンド濃度によって一つより多い細胞内経路に従う。受容体仲介エンドサイトーシスの分子及び細胞機構は、概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０２１１】
[0237]宿主細胞のゲノムに組込まれる細胞に送達される核酸は、典型的には、組込み配列を含有する。これらの配列は、特にウイルスベース系が使用される場合、しばしばウイルス関連配列である。これらのウイルス組込み系は、更に核酸に組込むことができ、送達系に含有された核酸が、宿主ゲノムに組込まれことができるように、これは、リポソームのような非核酸ベースの送達系を使用して供給される。
【０２１２】
[0238]宿主ゲノムへの組込みのための他の一般的技術は、例えば、宿主ゲノムとの相同的組換えを促進するために設計された系を含む。これらの系は、典型的には、送達される核酸が宿主ゲノムに組込まれることを起こす、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが起こる宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、発現される核酸に隣接する配列に依存する。相同的組換えを促進するために必要なこれらの系及び方法は、当業者にとって既知である。
【０２１３】
７．発現系
[0239]細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含有する。例えば、ウイルス及びレトロウイルス系中の挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御することを援助するプロモーター及び／又はエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に対して相対的に固定した位置にある場合に機能するＤＮＡの配列又は複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用のために必要な核心的要素を含有し、そして上流要素及び反応要素を含有することができる。
【０２１４】
ｉ．ウイルスプロモーター及びエンハンサー
[0240]哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、各種の供給源、例えば：ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはサイトメガロウイルスのようなウイルスのゲノムから、又は異種哺乳動物プロモーター、例えばベータアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として都合よく得られる（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として都合よく得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５-３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞又は関連する種からのプロモーターも、更に本明細書中で有用である。
【０２１５】
[0241]エンハンサーは、一般的に、転写開始部位からの固定されていない距離で機能するＤＮＡの配列を指し、そして転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））又は３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであることができる。更に、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））、並びにコード配列それ自体（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））内にあることができる。これらは、通常、１０ないし３００ｂｐ間の長さであり、そしてこれらは、ｃｉｓで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるために機能する。エンハンサーは、更に、しばしば転写の制御を仲介する応答要素を含有する。エンハンサーは、しばしば遺伝子の発現の制御を決定する。哺乳動物の遺伝子からの多くのエンハンサー配列（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−胎児タンパク質及びインスリン）が現在知られているが、典型的には、一般的発現のために、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用するものである。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
【０２１６】
[0242]プロモーター及び／又はエンハンサーは、光又はこれらの機能を引き起こす特異的化学的現象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系は、テトラサイクリン及びデキサメタゾンのような試薬によって制御することができる。ガンマ線照射のような照射に暴露すること、又はアルキル化化学療法薬物によるウイルスベクター遺伝子発現を向上させる方法が存在する。
【０２１７】
[0243]ある態様において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大にするための恒常的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用することができる。ある構築物において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、これが特定の時間に特定の種類の細胞中でのみ発現するとしても、全ての真核細胞種中で活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長のプロモーター）、及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０２１８】
[0244]全ての特異的制御要素を、クローン化し、そしてメラノーマ細胞のような特異的細胞種中に選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用することができることが示されている。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞中で遺伝子を選択的に発現するために使用されている。
【０２１９】
[0245]真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）中で使用される発現ベクターは、更に、ｍＲＮＡ発現に影響することができる転写の終結のために必要な配列を含有することもできる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写される。３’非翻訳領域も、更に転写終結部位を含む。転写単位が、更にポリアデニル化領域を含有することが好ましい。この領域の一つの利点は、これが、転写単位がプロセシングされ、そしてｍＲＮＡのように輸送されるものである可能性を増加させることである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの確認及び使用は、十分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物中で使用されることが好ましい。ある転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、そして約４００塩基からなる。転写された単位が、他の標準的配列を、単独で、又は上記の配列との組合せで含有し、構築物からの発現又はその安定性を改良することも更に好ましい。
【０２２０】
ｉｉ．マーカー
[0246]ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に供給され、そして供給された後、発現したか否かを決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質である。
【０２２１】
[0247]幾つかの態様において、マーカーは、選択可能なマーカーであることができる。哺乳動物細胞に対する適した選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）及びピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが、哺乳動物宿主細胞に好結果で移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択的圧力下に置かれた場合、生存することが可能である。選択的管理の二つの広く使用される別々の分類がある。第１の分類は、細胞の代謝及び補充された培地に関係なく増殖する能力に欠ける変異細胞系の使用に基づく。二つの例は：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＫＴ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養分の付加を伴わずに増殖する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路のために必要なある種の遺伝子を欠くため、これらは、欠損したヌクレオチドが補充された培地中で提供されない限り、生存することができない。培地を補充することに対する別の方法は、インタクトなＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、このようにしてこれらの増殖の必要性を変更することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されない個々の細胞は、非補充培地中の生存が可能ではない。
【０２２２】
[0248]第２の分類は、優性選択であり、これは、いずれもの細胞種において使用され、そして変異細胞系の使用を必要としない選択計画を指す。これらの計画は、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規な遺伝子を有するこれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、そして選択を生き残る。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸、（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））又はハイグロマイシン、（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０-４１３（１９８５））を使用する。三つの例は、適当な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、又はハイグロマイシンのそれぞれに対する耐性を伝達するために、真核生物的制御下で細菌遺伝子を使用する。他は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューロマイシンを含む。
【０２２３】
８．内部移行配列
[0249]提供されるポリペプチドは、更に融合タンパク質を構成するか、或いは他の方法として、更なるＮ末端、Ｃ末端、又は中間体アミノ酸配列、例えば、リンカー又は標識を有することができる。“リンカー”は、本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列又は挿入であり、これは、二つの別々のポリペプチド又はポリペプチド断片を接続又は分離するために使用することができ、ここで、リンカーは、組成物の本質的な機能に他の方法では寄与しない。本明細書中で提供されるポリペプチドは、例えば、アミノ酸ＧＬＳ、ＡＬＳ、又はＬＬＡ含んでなるアミノ酸リンカーを有することができる。“標識”は、本明細書中で使用する場合、提供されるポリペプチドを検出又は精製するために使用することができる別々のアミノ酸配列を指し、ここで、標識は、組成物の本質的機能に他の方法では寄与しない。提供されるポリペプチドは、更にポリペプチドの本質的活性に寄与しない欠失したＮ末端、Ｃ末端、又は中間体アミノ酸を有する。
【０２２４】
[0250]開示される組成物は、有効に細胞に進入するために、内部移行配列又はタンパク質形質導入ドメインに結合することができる。最近の研究は、ＨＩＶウイルスのＴＡＴトランス活性化ドメイン、アンテナペディア、及び細胞膜を通る分子及び小さいペプチドを容易に輸送することができるトランスポーチン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）を含む幾つかの細胞透過性ペプチドを確認している（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。更に最近、ポリアルギニンが、細胞膜を通るペプチド及びタンパク質を輸送することに、なお大きい効率を示し、これをペプチド仲介輸送のための魅力ある道具にしている（Ｆｕｃｈｓ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，２００４）。ノナアルギニン（Ｒ９配列番号：１８）は、ＴＡＴ又はアンテナペディアより有意に大きい最大取込みを伴う最も効率の良いポリアルギニンベースタンパク質形質導入ドメインの一つとして記載されている。ペプチド仲介細胞毒性も、ポリアルギニンベース内部移行配列で、より少ないことを更に示している。Ｒ９仲介の膜輸送は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合及びエンドサイトーシスのパッケージ化によって容易にされる。内部移行された後、ヘパランはヘパラナーゼによって分解され、Ｒ９を放出し、これは細胞質に漏洩する（Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。最近の研究は、ポリアルギニンの誘導体が、全長のｐ５３タンパク質を口腔癌細胞に供給し、その増殖及び転移を抑制し、強力な細胞透過性ペプチドとしてのポリアルギニンを定義することができることを示している（Ｔａｋｅｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０２２５】
[0251]従って、提供されるポリペプチドは、細胞内部移行輸送体又は配列を含んでなることができる。細胞内部移行配列は、既知の、又は当技術分野において新しく発見されたいずれもの内部移行配列、或いはその保存的変異体であることができる。細胞内部移行輸送体及び配列の非限定的例は、ポリアルギニン（例えば、Ｒ９）、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブホリンＩＩ、トタンスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、及びＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロール）を含む（表４を参照されたい）。
【０２２６】
[0252]
【０２２７】
【表４−１】
2014518883.tif 000005
【０２２８】
【表４−２】
2014518883.tif 000006
【０２２９】
[0253]現在既知の又はこれ以後確認されるいずれもの他の内部移行配列は、本発明のペプチドと組合せることができる。
【０２３０】
９．エフェクター
[0254]本明細書中に提供される組成物は、更にエフェクター分子を含んでなることができる。“エフェクター分子”によって、標的細胞（１または複数）又は組織に作用する物質が、所望の効果をもたらすことが意味される。効果は、例えば、標的細胞（１または複数）又は組織の標識化、活性化、抑圧、又は殺戮であることができる。従って、エフェクター分子は、例えば、小分子、医薬物、毒素、脂肪酸、検出可能なマーカー、結合性標識、ナノ粒子、又は酵素であることができる。
【０２３１】
[0255]標的化ペプチドに結合することができる小分子及び医薬物の例は、当技術分野において既知である。エフェクターは、標的細胞を殺戮する細胞毒性小分子又は薬物であることができる。小分子又は薬物は、いずれもの重大な細胞機能又は経路に対して作用するように設計することができる。例えば、小分子又は薬物は、細胞サイクルを阻害し、タンパク質分解を活性化し、アポトーシスを誘導し、キナーゼ活性を調節し、又は細胞骨格タンパク質を修飾することができる。いずれもの既知の又は新しく発見された細胞毒性小分子又は薬物は、標的化ペプチドと共に使用するために意図されている。
【０２３２】
[0256]エフェクターは、標的とされる細胞を殺戮する毒素であることができる。毒素の非限定的例は、アブリン、モデシン、リシン及びジフテリア毒素を含む。他の既知の又は新しく発見される毒素は、提供される組成物と共に使用するために意図されている。
【０２３３】
[0257]提供される組成物に結合することができる脂肪酸（即ち脂質）は、ペプチドのリポソームへの効率の良い組込みを可能にするものを含む。一般的に、脂肪酸は、極性の脂質である。従って、脂肪酸は、リン脂質であることができる。提供される組成物は、天然の又は合成のいずれかのリン脂質を含んでなることができる。リン脂質は、飽和又は不飽和のモノ又はジ置換脂肪酸及びこれらの組合せを含有するリン脂質から選択することができる。これらのリン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジルコリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイル、オレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチックリノレオイルホスファチジルコリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチックリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチックリノレオイルホスファチジン酸であることができる。これらのリン脂質は、更に、ホスファチジルコリン（リゾホスファチジリジルコリン）、ホスファチジルセリン（リゾホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リゾホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（リゾホスファチジルグリセロール）及びホスファチジン酸（リゾホスファチジン酸）のモノアシル化誘導体であることができる。これらのリゾホスファチジル誘導体中のモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイル、ミリストイル又はミリストレオイル、であることができる。リン脂質は、更に、合成であることもできる。合成のリン脂質は、ＡＶＡＮＴＩ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のような各種の供給源から商業的に容易に入手可能である。これらの合成化合物は、変化することができ、そしてその脂肪酸側鎖に、天然に存在するリン脂質中に見いだされない多様性を有することができる���脂肪酸は、ＰＳ又はＰＣのいずれか或いは両方にＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８又はＣ２０の鎖長を持つ不飽和脂肪酸側鎖を有することができる。合成リン脂質は、成分としてジオレオイル（１８：１）−ＰＳ；パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ；ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣ、及びミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを有することができる。
【０２３４】
[0258]検出可能なマーカーは、標的組織又は細胞（１または複数）を標識或いは染色するために使用することができるいずれもの物質を含む。検出可能なマーカーの非限定的例は、放射性同位体、酵素、蛍光色素、及び量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標））を含む。他の既知の又は新しく発見された検出可能なマーカーは、提供される組成物と共に使用するために意図されている。
【０２３５】
[0259]エフェクター分子は、発熱ナノシェルのようなナノ粒子であることができる。本明細書中で使用する場合、“ナノシェル”は、一つ又はそれより多い伝導性シェル層によって包囲された別々の誘電性又は半導体コア部分を有するナノ粒子である。米国特許第６，５３０，９４４号は、本明細書中に参考文献としてその全てが、金属ナノシェルの製造及び使用のその教示において援用される。ナノシェルは、近赤外線（概略８００ないし１３００ｎｍ）のような照射を使用して励起することができる、高い伝導性の金属のような物質で被覆された、ケイ素のような誘電性又は不活性な物質のコアで形成することができる。励起後、ナノシェルは熱を放射する。得られた高熱は、周囲の細胞（１または複数）又は組織を殺戮することができる。ナノシェルのシェル及びコアの組合せた直径は、１０ないし１００ナノメートルの範囲である。その組織に透過する能力のために、近赤外線が好都合である。ナノ粒子の被覆及び標的とされる細胞の選択にもよるが、他の種類の照射も更に使用することができる。例は、Ｘ線、磁場、電場、及び超音波を含む。本明細書中に記載されるように使用される放射のレベルは、エネルギーが誘電体の金属表面によって更に有効に濃縮されるナノ粒子の表面を除き、体温上昇を誘発するために不十分であることから、特に加熱プローブ、マイクロ波、超音波、レーザー、潅流、高周波エネルギー、及び放射加熱の使用のような癌の治療において使用するための高熱療法のための既存の方法に伴う問題は、回避される。粒子は、更に、特に赤外拡散光子画像化法を使用する画像を向上させるために使用することができる。標的化分子は、抗体又はその断片、特異的受容体に対するリガンド、又は標的とされる細胞の表面に特異的に結合する他のタンパク質であることができる。
【０２３６】
[0260]エフェクター分子は、開示されるペプチドに共有的に結合することができる。エフェクター分子は、開示されるペプチドのアミノ末端終端に結合することができる。エフェクター分子は、開示されるペプチドのカルボキシル末端終端に結合することができる。エフェクター分子は、開示されるペプチド内のアミノ酸に結合することができる。本明細書中に提供される組成物は、更に、エフェクター分子及び開示されるペプチドを接続するリンカーを含んでなることができる。開示されるペプチドは、更に、ナノシェルをペプチドで被覆するために使用することができるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような被覆分子（Ｔｋａｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１２５，４７００−４７０１を参照されたい）に結合することができる。
【０２３７】
[0261]エフェクター分子を、開示されるペプチドに架橋するために使用することができるタンパク質架橋剤は、当技術分野において既知であり、そして有用性及び構造に基づき定義され、そしてＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、スルホＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＢＳＯＣＯＥＤ（ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、スルホＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタルタレート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）、スルホＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート））、ＤＰＤＰＢ（１，２−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン）、ＢＳＳＳ（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）、ＳＭＢＰ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、スルホＳＭＢＰ（スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、スルホＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＮＨＳＬＣＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホＮＨＳＬＣＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＮＨＳブロモアセテート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート）、ＮＨＳヨードアセテート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート）、ＭＰＢＨ（４−（Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩）、ＭＣＣＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ヒドラジド塩酸塩）、ＭＢＨ（ｍ−マレイミド安息香酸ヒドラジド塩酸塩）、スルホＥＭＣＳ（Ｎ−（イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（カッパ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ（６−アミドカプロエート））、スルホＧＭＢＳ（Ｎ−（ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（ベータ−マレイミドプロピオンアミドヘキサノエート））、スルホＫＭＵＳ（Ｎ−（カッパ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）、ＤＭＰ（ジメチルピメルイミデート塩酸塩）、ＤＭＳ（ジメチルスベルイミデート塩酸塩）、ＭＨＢＨ（Ｗｏｏｄ’ｓ試薬）（メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデート塩酸塩、９８％）、ＤＭＡ（ジメチルアジピイミデート塩酸塩）を含む。
【０２３８】
１０．コンピューター読取り可能媒体
[0262]開示される核酸及びタンパク質が、ヌクレオチド又はアミノ酸からなる配列として表されることは理解される。これらの配列を提示する各種の方法が存在し、例えば、ヌクレオチドのグアノシンは、Ｇ又はｇによって表される。同様に、アミノ酸のバリンは、Ｖａｌ又はＶによって表すことができる。同業者は、そのそれぞれが本明細書中に開示されると考えられる、存在する各種の方法のいずれか中のいずれもの核酸又はタンパク質配列を提示又は表示する方法を理解する。本明細書中で具体的に意図するものは、商業的に入手可能なフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、及びビデオディスクのようなコンピューターで読取り可能な媒体、又は他のコンピューターで読取り可能な媒体上のこれらの配列の提示である。更に開示されるものは、開示される配列の二進法コードの表示である。当業者は、何がコンピューターで読取り可能な媒体であるかを理解する。従って、核酸又はタンパク質配列がその上に記録され、保管され、又は保存されるコンピューターで読取り可能な媒体。
【０２３９】
[0263]開示されるものは、配列及び本明細書中に明記される配列に関する配列及び情報を含んでなるコンピューター読取り可能媒体である。
【０２４０】
１１．開示される組成物／コンビナトリアルケミストリーによるスクリーニングによって同定される組成物
[0264]開示される組成物は、所望する方法で開示される組成物と相互作用する分子又は巨大分子の分子を確認するためのいずれものコンビナトリアル技術のための標的として使用することができる。本明細書中に開示されるＤＲ３及び／又はＴＬ１Ａ核酸、ペプチド、及び関連する分子は、コンビナトリアルな方法のための標的として使用することができる。更に開示されるものは、配列番号：１、２、３又は４或いはその部分中で開示される組成物が、コンビナトリアル又はスクリーニングのプロトコル中で標的として使用される、コンビナトリアル技術又はスクリーニング技術によって確認される組成物である。
【０２４１】
[0265]コンビナトリアル技術又はスクリーニング法において開示される組成物が使用される場合、巨大分子の分子のような分子は、標的分子の機能の阻害又は刺激のような、特に好ましい特性を有することが確認されることは理解される。配列番号：１、２，３又は４或いはその部分のような開示される組成物を使用する場合に確認され、そして単離される分子が、更に開示される。従って、配列番号：１、２、３又は４或いはその部分中のような開示される組成物を含むコンビナトリアル又はスクリーニング法を使用して産生された産物も、更に本明細書中で開示されたと考えられる。
【０２４２】
[0266]例えばＤＲ３とＴＬ１Ａとの間の相互作用を阻害する分子を確認するために開示される方法は、高処理量の手段を使用して行うことができることは理解される。例えば、推定上の阻害剤は、迅速に相互作用を確認するために、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して確認することができる。技術の根底にある理論は、二つの分子が空間で接近している、即ち、バックグラウンドを超えたレベルで相互作用する場合、シグナルが産生されるか、又はシグナルはクエンチされることができることである。次いで、例えば、推定上の阻害剤を加えることを含む各種の実験を行うことができる。阻害剤が、二つのシグナル伝達分子間の相互作用と競合する場合、シグナルは間隙を介して互いから離れ、そしてこれは、使用されるシグナルの種類によるが、シグナルの減少又は増加を起こすものである。このシグナルの減少又は増加は、推定上の阻害剤の存在又は非存在と相関させることができる。いずれものシグナル伝達手段を使用することができる。例えば、開示されるものは、第１の分子及び第２の分子を、推定上の阻害剤の存在下で一緒に接触させることを含んでなる開示される分子のいずれか二つ間の相互作用の阻害剤を確認する方法であり、ここで、第１の分子又は第２の分子は蛍光供与体を含んでなり、ここで、典型的には提供体を含まない分子である第１又は第２の分子は、蛍光受容体を含んでなり；そして推定上の阻害剤の存在下及び推定上の阻害剤の非存在下で蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定し、ここで、その非存在下におけるＦＲＥＴ測定値と比較した場合の推定上の阻害剤の存在下のＦＲＥＴの減少は、推定上の阻害剤が、二つの分子間の結合を阻害したことを示す。この種の方法は、細胞系でも同様に行うことができる。
【０２４３】
[0267]コンビナトリアルケミストリーは、制約されるものではないが、小分子又はもう一つの巨大分子のいずれかを、典型的には反復性の方法で結合することが可能な小分子又は巨大分子を単離するための全ての方法を含む。タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び糖は、巨大分子の例である。例えば、与えられた機能、触媒性又はリガンド結合性を持つオリゴヌクレオチド分子は、“ｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝学”と呼ばれる無作為なオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離することができる（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ  １９：８９，１９９２）。無作為の及び定義された配列を保有する分子の大きいプールを合成し、そして例えば、１００個のヌクレオチドＲＮＡ中の１００μｇ中の概略１０１５個の個々の配列の複合体の混合物を、幾つかの選択及び濃縮の過程にかける。カラム上のリガンドに結合する分子のアフィニティークロマトグラフィー及びＰＣＲ増幅の繰返しサイクルにより、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、１０１０個のＲＮＡ分子中の１個が、小分子色素を結合するように折畳まれていると推定した。このようなリガンド結合行動を伴うＤＮＡ分子は、同様に単離される（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９２；Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。類似の目標を目指す技術は、小さい有機分子、タンパク質、抗体及び当業者にとって既知の他の巨大分子について存在する。小さい有機物のライブラリー、オリゴヌクレオチド、又は抗体に基づくかに関わらず、所望の活性のための分子の組合せをスクリーニングすることは、広くコンビナトリアルケミストリーと呼ばれる。コンビナトリアル技術は、分子間の結合相互作用を定義し、そして巨大分子が核酸である場合、しばしばアプタマーと呼ばれる特異的結合活性を有する分子を単離するために特に適している。
【０２４４】
１２．担体
[0268]開示される組成物は、阻害剤の投与、供給又は阻害剤及びその使用の他の側面を援助するために、担体及び他の組成物と共に又はそれと組合せて、結合又はカップリングすることができる。便宜上、このような組成物は、本明細書中で、担体と呼ばれるものである。担体は、例えば、小分子、医薬物、脂肪酸、検出可能なマーカー、結合標識、ナノ粒子、又は酵素であることができる。
【０２４５】
[0269]開示される組成物は、医薬的に受容可能な担体との組合せで治療的に使用することができる。“医薬的に受容可能”によって、生物学的に又は他の方法で、好ましい物質が意味され、即ち、物質は、いずれもの好ましくない生物学的効果を、又はこれが含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと、有害な様式で相互作用することを伴わずに組成物と共に被験者に投与することができる。担体は、当業者にとって公知のものであるように、当然、活性成分のいずれもの分解を最小にするように、そして被験者のいずれもの不都合な副作用を最小にするように選択されるものである。
【０２４６】
[0270]適した担体及びその処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５中に記載されている。典型的には、適当な量の医薬的に受容可能な塩が、製剤を等張にするために製剤中に使用される。医薬的に受容可能な担体の例は、制約されるものではないが、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８まで、そして更に好ましくは約７から約７．５までである。更なる担体は、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性基質のような徐放性製剤を含み、この基質は成形物品の形態、例えば、フィルム、リポソーム又はマイクロ粒子である。例えば、投与の経路及び投与される組成物の濃度によって、ある種の担体が、更に好ましいことができることは、当業者にとって明白となるものである。
【０２４７】
[0271]医薬的担体は、当業者にとって既知である。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、及び生理学的ｐＨの緩衝溶液のような溶液を含むヒトへの薬物の投与のための標準的な担体であるものである。組成物は、筋肉内又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な方法によって投与することができる。
【０２４８】
[0272]医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤等を含むことができる。医薬組成物は、更に、抗細菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等のような一つ又はそれより多い活性成分を含むことができる。
【０２４９】
[0273]非経口投与のための製剤は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体は、生理食塩水及び緩衝媒体を含む水、アルコール／水溶液、乳液又は懸濁液を含む。非経口ベヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油を含む。静脈用ベヒクルは、流体及び栄養分補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくもののような）、等を含む。例えば、抗細菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活性ガス等のような保存剤及び他の添加剤も、更に存在することができる。
【０２５０】
[0274]局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、座薬、噴霧剤、液体及び粉末を含むことができる。慣用的な医薬的担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等は、必要であるか又は好ましいものであることができる。
【０２５１】
[0275]経口投与のための組成物は、粉末又は顆粒、水又は非水性媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、サッシェ、或いは錠剤を含む。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、好ましいものであることができる。
【０２５２】
[0276]組成の幾つかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応によって、或いは水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、及びモノ、ジ、トリアルキル及びアリールアミン並びに置換されたエタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成される、医薬的に受容可能な酸又は塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
【０２５３】
[0277]物質は、溶液、懸濁液中にあることができる（例えば、マイクロ粒子、リポソーム、又は細胞に組込まれて）。これらは、抗体、受容体、又は受容体リガンドによって特定の細胞種を標的とすることができる。次の参考文献は、腫瘍組織に対する特異的タンパク質を標的とするこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。“ステルス”及び他の抗体結合リポソーム（結腸癌を標的とする脂質仲介薬物を含む）のようなベヒクル、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体仲介標的化、リンパ球指向腫瘍標的化、及びｉｎ  ｖｉｖｏのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルス標的化。次の参考文献は、腫瘍細胞に対する標的特異的タンパク質に対するこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４-６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９-１８７，（１９９２））。一般的に、受容体は、恒常的又はリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関係する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体のクラスターは、クラスリン被覆ベシクルにより細胞に進入し、その中で受容体が選別される酸性化されたエンドソームを通って通過し、そして次いで細胞表面に再循環され、細胞内に保存されることになるか、又はリソソームに分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養分取込み、活性化されたタンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見性進入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベルの制御のような、各種の機能に役立つ。多くの受容体は、細胞種、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド結合価、及びリガンド濃度によって、一つより多い細胞内経路に従う。受容体仲介エンドサイトーシスの分子及び細胞の機構は、概説されている（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０２５４】
[0278]担体分子は、開示される阻害剤に共有的に結合することができる。担体分子は、開示されるペプチドのアミノ末端終端に結合することができる。担体分子は、開示されるペプチドのカルボキシル末端終端に結合することができる。担体分子は、開示されるペプチド内のアミノ酸に結合することができる。本明細書中で提供される組成物は、更に、担体分子及び開示される阻害剤を接続するリンカーを含んでなることができる。開示される阻害剤は、更に、阻害剤を伴うマイクロ粒子、ナノシェルのナノ粒子を被覆するために使用することができるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような被覆分子（Ｔｋａｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１２５，４７００−４７０１を参照されたい）に結合することができる。
【０２５５】
[0279]開示されるペプチドのような阻害剤に担体分子を架橋するために使用することができるタンパク質架橋剤は、当技術分野において既知であり、そして有用性及び構造に基づき定義され、そしてＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、スルホＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、ＢＳＯＣＯＥＤ（ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、スルホＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタルタレート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）、スルホＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート））、ＤＰＤＰＢ（１，２−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン）、ＢＳＳＳ（ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）、ＳＭＢＰ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、スルホＳＭＢＰ（スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、スルホＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＮＨＳＬＣＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホＮＨＳＬＣＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＮＨＳブロモアセテート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート）、ＮＨＳヨードアセテート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート）、ＭＰＢＨ（４−（Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩）、ＭＣＣＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ヒドラジド塩酸塩）、ＭＢＨ（ｍ−マレイミド安息香酸ヒドラジド塩酸塩）、スルホＥＭＣＳ（Ｎ−（イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（カッパ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ（６−アミドカプロエート））、スルホＧＭＢＳ（Ｎ−（ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（ベータ−マレイミドプロピオンアミドヘキサノエート））、スルホＫＭＵＳ（Ｎ−（カッパ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）、ＤＭＰ（ジメチルピメルイミデート塩酸塩）、ＤＭＳ（ジメチルスベルイミデート塩酸塩）、ＭＨＢＨ（Ｗｏｏｄ’ｓ試薬）（メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデート塩酸塩、９８％）、ＤＭＡ（ジメチルアジピイミデート塩酸塩）を含む。
【０２５６】
ｉ．ナノ粒子、マイクロ粒子、及びマイクロバブル
[0280]用語“ナノ粒子”は、ナノメートルで測定されるサイズを持つナノスケールの粒子、例えば、約１００ｎｍより小さい少なくとも一つの寸法を有するナノスケールの粒子を指す。ナノ粒子の例は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様物質、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有的に接続した金属キレートを伴うような）、ナノファイバー、ナノホーン（ｎａｎｏｈｏｍｓ）、ナノ−オニオン、ナノロッド、ナノロープ及び量子ドットを含む。ナノ粒子は、例えば、光子（高周波及び可視光子を含む）の吸収及び／又は放出、並びにプラスモン共鳴によって、検出可能なシグナルを産生することができる。
【０２５７】
[0281]マイクロスフェア（又はマイクロバブル）を本明細書中に開示される方法と共に使用することもできる。発色団を含有するマイクロスフェアは、光子クリスタル、生物学的標識、及びマイクロ流動チャンネルにおける流れの可視化を含む広範な各種の適用において使用されている。例えば、Ｙ．Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ  Ｌｅｔｔ．２００２，８１，３１３４；Ｄ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００３，１５，２７２４；Ｘ．Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．２００２，７，５３２；Ｍ．Ｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００１，１９，６３１；Ｖ．Ｍ．Ｐａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｇ．＆  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒ．１９９９，１９４，２６２を参照されたく、これらのそれぞれは、参考文献としてその全てが援用される。発色団の光安定性及びマイクロスフェアの単分散度の両方が、重要であり得る。
【０２５８】
[0282]例えば、シリカナノ粒子、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又は半導体ナノ結晶のようなナノ粒子は、マイクロスフェア中に組込むことができる。ナノ粒子の光学、磁気、及び電子的特性は、マイクロスフェアと結合している間にこれらを観察することを可能にすることができ、そしてマイクロスフェアを確認し、そして空間的にモニターすることを可能にすることができる。例えば、コロイド状に合成された半導体のナノ結晶の高い光安定性、良好な蛍光効率及び広い放射同調性は、これらを発色団の優れた選択とする。有機染料とは異なり、異なった色（即ち、異なった波長）を放射するナノ結晶は、単一の光源で同時に励起することができる。コロイド状に合成された半導体ナノ結晶（例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ及びＣｄＳ／ＺｎＳコア−シェルのナノ結晶のような）は、マイクロスフェアに組込むことができる。マイクロスフェアは、単分散シリカマイクロスフェアであることができる。
【０２５９】
[0283]ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又は半導体ナノ結晶であることができる。金属ナノ粒子又は金属酸化物ナノ粒子の金属は、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、マンガン、テクネチウム、レニウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀、金、亜鉛、カドミウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、ランタニド系列又はアクチニド系列元素（例えば、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメシウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、トリウム、プロトアクチニウム、及びウラニウム）、ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、鉛、アンチモン、ビスマス、ポロニウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、及びバリウムを含むことができる。ある態様において、金属は、鉄、ルテニウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銀、金、セリウム又はサマリウムであることができる。金属酸化物は、これらの金属のいずれか又は金属の組合せの酸化物であることができる。例えば、金属は金であることができ、或いは金属酸化物は、酸化鉄、酸化コバルト、酸化亜鉛、酸化セリウム、又は酸化チタンであることができる。金属及び金属酸化物ナノ粒子の調製は、例えば、米国特許第５，８９７，９４５号及び６，７５９，１９９号中に記載され、これらのそれぞれは、参考文献としてその全てが援用される。
【０２６０】
[0284]例えば、開示される（ｓｉｃｌｏｓｅｄ）組成物は、シリカナノ粒子（ＳＮＰ）上に固定化することができる。ＳＮＰは、その好ましい表面積と体積比、簡単な製造及び蛍光標識、磁性ナノ粒子（Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００５）及び半導体ナノ結晶（Ｌｉｎ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．２００６）を接続する可能性のために、バイオセンシング及び触媒的適用に広く使用されている。
【０２６１】
[0285]ナノ粒子は、更に、例えば、発熱ナノシェルであることもできる。本明細書中で使用する場合、“ナノシェル”は、一つ又はそれより多い伝導性シェル層によって包囲された別々の誘電性又は半導体コア部分を有するナノ粒子である。米国特許第６，５３０，９４４号は、本明細書中に参考文献としてその全てが、金属ナノシェルの製造及び使用のその教示において援用される。
【０２６２】
[0286]標的化分子は、開示される組成物及び／又は担体に接続することができる。例えば、標的化分子は、抗体又はその断片、特異的受容体のためのリガンド、又は標的とされる細胞の表面に特異的に結合する他のタンパク質であることができる。
【０２６３】
ｉｉ．リポソーム
[0287]用語が本明細書中で使用される場合、“リポソーム”は、内部の水性空間を包囲する外部の脂質の二重又は多重層の膜を含んでなる構造を指す。リポソームは、細胞への送達のためのいずれもの生物学的に活性な薬剤を詰込むために使用することができる。
【０２６４】
[0288]リポソームを形成するための物質及び方法は、当業者にとって公知である。適当な培地中の分散後、幅広い種類のリン脂質は膨潤し、水和し、そして脂質の二重層を分離する水性媒体の層と共に多重膜の同心円状の二重層ベシクルを形成する。これらの系は、多重膜リポソーム又は多重膜脂質ベシクル（“ＭＬＶ”）と呼ばれ、そして１０ｎｍないし１００μｍの範囲の直径を有する。これらのＭＬＶは、最初Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２（１９６５）によって記載された。一般的に、脂質又は親油性物質は、有機溶媒中に溶解される。真空下又は回転蒸発によるように、溶媒が除去された場合、脂質残留物は容器の壁にフィルムを形成する。次いで、典型的には、電解質又は親水性の生物学的に活性な物質を含有する水溶液を、フィルムに加える。撹拌により、大きいＭＬＶが産生される。小さいＭＬＶが所望される場合、大きいベシクルを、超音波処理、減少させた細孔サイズを持つフィルターを通す連続濾過にかけるか、又は他の形態の機械的剪断によって縮少する。更に、ＭＬＶをサイズ及び層の数の両方で縮小することができる、例えば、加圧押出し（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．９９：２１０−２１４（１９７９））による技術が存在する。
【０２６５】
[0289]リポソームは、更に単層のベシクルの形態をとることもでき、これは、ＭＬＶの更に徹底した超音波処理によって調製され、そして水溶液を包囲する単一の脂質二重層からなる。単層ベシクル（“ＵＬＶ”）は、小さく、２０ないし２００ｎｍの範囲の直径を有することができ、一方、大きいＵＬＶは、２００ｎｍないし２μｍの範囲の直径を有することができる。単層ベシクルを製造するための幾つかの公知の技術が存在する。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５：６２４−２３８（１９６８）において、リン脂質の水性分散物の超音波処理は、水溶液を包囲する脂質二重層を有する小さいＵＬＶを産生する。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒの米国特許第４，０８９，８０１号は、超音波処理によるリポソーム前駆体の形成、それに続いて両親媒性化合物を含有する水性媒体を添加し、そして遠心して、生体分子の脂質層の系を形成することを記載している。
【０２６６】
[0290]小さいＵＬＶは、更に、Ｂａｔｚｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２９８：１０１５−１０１９  １９７３）によって記載されたエタノール注射技術及びＤｅａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４４３：６２９−６３４  １９７６）のエーテル注射技術によって調製することもできる。これらの方法は、緩衝溶液への脂質の有機溶液の急速な注射を含み、これは、単層リポソームの急速な形成をもたらす。ＵＬＶを製造するためのもう一つの技術は、Ｗｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．ｉｎ“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，ｅｄ．Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，ｐｇ．７９−１０７（１９８４）によって教示されている。この界面活性剤除去法は、界面活性剤と共に脂質及び添加剤を撹拌又は超音波処理によって可溶化して、所望のベシクルを産生することを含む。
【０２６７】
[0291]Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，２３５，８７１号は、逆相蒸発技術による大きいＵＬＶの調製を記載し、これは、有機溶媒中の脂質及び水性緩衝溶液中でカプセル化される薬物の油中水乳液の形成を含む。混合物を得るために、有機溶媒を加圧下で除去し、これは、水性媒体中の撹拌又は分散によって、大きいＵＬＶに転換される。Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，０１６，１００号は、単層ベシクル中に薬剤を、薬剤及び脂質の水性リン脂質分散物を凍結／解凍することによってカプセル化するもう一つの方法を記載している。
【０２６８】
[0292]ＭＬＶ及びＵＬＶに加えて、リポソームは多胞体であることもできる。Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７２８：３３９−３４８（１９８３）中に記載されているこれらの多胞体リポソームは、球形であり、そして内部の顆粒状構造を有する。外部の膜は、脂質二重層であり、そして内部領域は、二重層の中隔によって分離される小さい区画を含有する。なお更にもう一つのリポソームの種類は、オリゴ層状ベシクル（“ＯＬＶ”）であり、これは、幾つかの周辺脂質層によって包囲された大きい中央部区画を有する。２−１５μｍの直径を有するこれらのベシクルは、Ｃａｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（３）：２５１−２６７（１９８５）中に記載されている。
【０２６９】
[0293]Ｍｅｚｅｉ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，４８５，０５４号及び４，７６１，２８８号は、更に、脂質ベシクルを調製する方法を記載している。更に最近になって、Ｈｓｕの米国特許第５，６５３，９９６号は、エアゾール化を使用するリポソームを調製する方法を記載し、そしてＹｉｏｕｒｎａｓ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，０１３，４９７号は、高速剪断混合チャンバーを使用するリポソームを調製するための方法を記載している。ＵＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８５３，２２８号）又はＯＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈ，の米国特許第５，４７４，８４８号及び５，６２８，９３６号）を産生するために特異的出発物質を使用する方法も、更に記載されている。
【０２７０】
[0294]全ての前述の脂質ベシクル及びその調製のための方法の総括的概説は、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，ｅｄ．Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ  ＆  ＩＩＩ（１９８４）中に記載されている。これ及び本発明における使用のために適した各種の脂質ベシクルを記載した前述の参考文献は、本明細書中に参考文献として援用される。
【０２７１】
[0295]提供される組成物に結合することができる脂肪酸（即ち脂質）は、プロタンパク質転換酵素阻害剤のリポソームへの効率の良い組込みを可能にするものを含む。一般的に、脂肪酸は、極性の脂質である。従って、脂肪酸は、リン脂質であることができる。提供される組成物は、天然の又は合成のいずれかのリン脂質を含んでなることができる。リン脂質は、飽和又は不飽和のモノ又はジ置換脂肪酸及びこれらの組合せを含有するリン脂質から選択することができる。これらのリン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイル（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌ）オレオイルホスファチジルコリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイル、オレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチックリノレオイルホスファチジルコリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチックリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチックリノレオイルホスファチジン酸であることができる。これらのリン脂質は、更に、ホスファチジルコリン（リゾホスファチジリジルコリン）、ホスファチジルセリン（リゾホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リゾホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（リゾホスファチジルグリセロール）及びホスファチジン酸（リゾホスファチジン酸）のモノアシル化誘導体であることができる。これらのリゾホスファチジル誘導体中のモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイル、ミリストイル又はミリストレオイルであることができる。リン脂質は、更に、合成であることもできる。合成のリン脂質は、ＡＶＡＮＴＩ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のような各種の供給源から商業的に容易に入手可能である。これらの合成化合物は、変化することができ、そしてその脂肪酸側鎖に、天然に存在するリン脂質中に見いだされない多様性を���することができる。脂肪酸は、ＰＳ又はＰＣのいずれか或いは両方にＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８又はＣ２０の鎖長を持つ不飽和脂肪酸側鎖を有することができる。合成リン脂質は、成分としてジオレオイル（１８：１）−ＰＳ；パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ；ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣ、及びミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを有することができる。
【０２７２】
ｉｉｉ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ／Ｅｘ  ｖｉｖｏ
[0296]先に記載したように、組成物は、医薬的に受容可能な担体中で投与することができ、そして当技術分野において公知の各種の機構によってｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ  ｖｉｖｏで被験者の細胞に送達することができる（例えば、裸のＤＮＡの取込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシス等）。
【０２７３】
[0297]Ｅｘ  ｖｉｖｏの方法が使用される場合、細胞又は組織を取出し、そして当技術分野において公知の標準的なプロトコルによって身体外で維持することができる。組成物は、例えば、リン酸カルシウム仲介遺伝子供給、電気穿孔、マイクロ注射又はプロテオリポソームのようないずれもの遺伝子移入機構によって細胞に導入することができる。次いで形質導入された細胞は、注入されるか（例えば、医薬的に受容可能な担体中で）或いは細胞又は組織の種類に対する標準的な方法によって、同位置的に被験者に移植して戻される。被験者への各種の細胞の移植又は注入のための標準的方法は、既知である。
【０２７４】
Ｃ．組成物を製造するための方法
[0298]本明細書中に開示される組成物及び開示される方法を行うために必要な組成物は、他に具体的に記述しない限り、その特定の試薬又は化合物に対する当業者にとって既知の、いずれもの方法を使用して製造することができる。
【０２７５】
１．核酸の合成
[0299]天然に存在するヌクレオチド及びホスホジエステル結合を含んでなるポリヌクレオチドを、化学的に合成することができるか、又は適当なポリヌクレオチドをテンプレートとして使用する組換えＤＮＡ法を使用して産生することができる。比較として、ヌクレオチド類似体又はホスホジエステル結合以外の共有結合を含んでなるポリヌクレオチドは、一般的に、化学的に合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼのような酵素は、ある種のヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組込むことができ、そして従って、適当なテンプレートからこのようなポリヌクレオチドを組換え的に産生するために使用することができる（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５））。
【０２７６】
[0300]例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのような核酸は、標準的な化学的合成法を使用して製造することができるか、又は酵素的方法又はいずれもの他の既知の方法を使用して産生することができる。このような方法は、標準的な酵素的消化と、それに続くヌクレオチド断片の単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５，６を参照されたい）から、例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ又はＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １ＰｌｕｓのＤＮＡ合成機を使用するシアノエチルホスホルアミダイト法による純粋な合成法（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのモデル８７００自動化合成機又はＡＢＩモデル３８０Ｂ）までの範囲であることができる。オリゴヌクレオチドを製造するために有用な合成方法は、更に、Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４），（ホスホトリエステル及びホスファイト−トリエステル法）及びＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）、（ホスホトリエステル法）によって記載されている。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載されているもののような既知の方法を使用して製造することができる。
【０２７７】
２．ペプチドの合成
[0301]配列番号：２３のような開示されるタンパク質を産生する一つの方法は、二つ又はそれより多いペプチド又はポリペプチドを、タンパク質化学技術によって一緒に結合することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを使用する、現時点で使用可能な研究室の機器を使用して化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。開示されるタンパク質に対応するペプチド又はポリペプチドを、例えば標準的な化学反応によって合成することができることを当業者は容易に認識することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを、合成し、そしてその合成樹脂から切断しないことができ、一方、ペプチド及びタンパク質の他の断片を、合成し、そしてその後樹脂から切断し、これによって他の断片上の機能的に遮断された末端基を暴露することができる。ペプチド縮合反応によって、これらの二つの断片を、それぞれそのカルボキシル及びアミノ末端におけるペプチド結合によって共有的に接続して、抗体、又はその断片を形成する（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（これは、本明細書中に参考文献として、少なくともペプチド合成に関する題材のために援用される）。或いは、ペプチド又はポリペプチドは、本明細書中に記載されるようにｉｎ  ｖｉｖｏで独立に合成される。単離後、これらの独立のペプチド又はポリペプチドは、類似のペプチド縮合反応によってペプチド又はその断片を形成するために、結合することができる。
【０２７８】
[0302]例えば、クローン化された又は合成ペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチド断片が接続して、大きいペプチド断片、ポリペプチド又は全てのタンパク質ドメインを産生することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。或いは、合成ペプチドの天然の化学的連結は、短いペプチド断片から大きいペプチド又はポリペプチドを、合成的に構築するために使用することができる。この方法は、二工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６-７７９（１９９４））。第１の工程は、非保護の合成ペプチド−チオエステルの、アミノ末端のＣｙｓ残基を含有するもう一つの非保護のペプチドセグメントとの化学選択的反応であって、最初の共有結合産物としてのチオエステル結合の中間体を得る。反応条件を変化せずに、この中間体は、自然発生的な急速な分子内反応を受けて、連結部位に天然のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ-Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ-Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０２７９】
[0303]或いは、非保護のペプチドセグメントは化学的に結合し、ここで、化学的連結の結果としてのペプチドセグメント間に形成される結合は、非天然の（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体、並びに完全な生物学的活性を伴う大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７-２６７（１９９２））。
【０２８０】
Ｄ．キット
[0304]先に記載された物質、並びに他の物質は、開示される方法の実行を行う、又は援助するために有用なキットとしていずれもの適した組合せで一緒に詰込むことができる。与えられたキット中のキットの構成要素が、開示される方法において一緒に使用するために設計され、そして適合される場合に有用である。例えば、開示されるものは、ＤＲ３又はＴＬ１Ａを結合するペプチド或いは抗体を含んでなるキットである。
【０２８１】
Ｅ．使用
[0305]開示される組成物は、研究の道具として各種の方法で使用することができる。例えば、配列番号：２又は４を含んでなる単離されたポリペプチドのような開示される組成物は、例えば、結合の阻害剤として作用することによってＤＲ３又はＴＬ１Ａ間の相互作用を研究するために使用することができる。開示から明白である及び／又は当業者によって理解されるものである他の使用が開示される。開示から明らかであり及び／又は当業者によって理解されるものである他の使用が開示される。
【０２８２】
Ｆ．定義
[0306]他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、開示される方法及び組成物が属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は均等ないずれもの方法及び材料を、本発明の方法及び組成物の実施又は試験において使用することができるが、特に有用な方法、デバイス、及び材料は、記載されるとおりである。本明細書中に引用される刊行物及びそのためにこれらが引用される材料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書中の記載は、従来の発明の効力によるような開示に先行する権利が本発明に与えられないことを認めるものとして解釈されるものではない。いずれの参考文献が従来技術を構成することも承認しない。参考文献の考察は、その著者が主張するものを記述し、そして本出願人等は、引用される文書の正確さ及び適切性に異議を申し立てる権利を留保する。
【０２８３】
[0307]本明細書及び付属する特許請求の範囲中で使用される場合、単数の形態の“一つ（a）”、“一つ（an）”及び“その（the）”は、文脈が明確に他を示さない限り、複数の言及を含むことは留意されなければならない。従って、例えば“一つの医薬的担体”に対する言及は、複数のこのような医薬的担体を含み、“その医薬的担体”に対する言及は、一つ又はそれより多い医薬的担体及び当業者にとって既知のその均等物に対する言及である、等である。
【０２８４】
[0308]“所望による”又は“所望により”は、その後に記載される現象、状況、又は材料が、起こるか、又は存在することができるか、或いはできないことを意味し、そしてこの記載は、現象、状況、又は材料が起こるか又は存在する事例、及びこれが起こらないか又は存在しない事例を含む。
【０２８５】
[0309]範囲は、本明細書中、“約”一つの特定の数値から、及び／又は“約”もう一つの特定の数値までとして表示することができる。このような範囲が表示された場合、もう一つの態様は、一つの特定の数値から及び／又は他の特定の数値までを含む。同様に、先行する“約”の使用によって数値が近似として表示された場合、特定の数値がもう一つの態様を形成することは理解されるものである。範囲のそれぞれの終点が、他の終点に関連して、及び他の終点に関係なく、の両方で、意味があることも更に理解されるものである。本明細書中に開示される多くの数値が存在し、そしてそれぞれの数値も“約”その特定の数値として、数値それ自体に加えて本明細書中に開示されることも更に理解される。例えば、数値“１０”が開示された場合、“約１０”も更に開示される。数値が、その数値“より小さいか又はそれに等しい”と開示された場合、“その数値より大きいか又はそれと等しい”及び数値間の可能な範囲も、当業者によって適宜に理解されるように開示されることも理解される。例えば、数値“１０”が開示された場合、“１０より小さいか又はそれに等しい”、並びに“１０より大きいか又はそれと等しい”ことも開示される。本出願を通して、データは、多くの異なった書式で提供され、そしてこのデータは、終点及び始点、並びにデータ点のいずれもの組合せのための範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点“１０”及び特定のデータ点１５が開示された場合、１０及び１５より大きい、それらより大きい又はそれらに等しい、それらより小さい、それらより小さい又はそれらに等しい、及びそれらに等しいことが、１０と１５との間と同様に開示されたと考えられることは理解される。二つの特定の単位間のそれぞれの単位も開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示された場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
【０２８６】
[0310]本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、言語“含んでなる（comprise）”、並びに“含んでなること（comprising）”及び“含んでなり（comprises）”のような当該言語の変化は、“含むが、しかしそれに制約されない”を意味し、そして例えば、他の添加剤、成分、整数又は工程を排除することは意図していない。
【０２８７】
[0311]“プローブ”は、標的核酸と、典型的には配列特異的様式で、例えばハイブリダイゼーションによって、相互作用することが可能な分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当技術分野において十分に理解され、そして本明細書中で考察される。典型的には、プローブは、当技術分野において入手可能なヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体もしくは類似体のいずれもの組合せから製造することができる。
【０２８８】
[0312]“プライマー”は、幾つかの種類の酵素操作を支持することが可能なプローブのサブセットであり、そしてこれは、酵素操作が起こることができるように、標的核酸とハイブリダイズすることができる。プライマーは、酵素操作を干渉しない当技術分野において入手可能なヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体もしくは類似体のいずれもの組合せから製造することができる。典型的には、プライマーは、ポリヌクレオチド配列の伸長を支持する。
【０２８９】
[0313]“被験者”は、制約されるものではないが、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫及びいずれもの他の生物体又は核酸を有する実体を含む。被験者は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット又は齧歯類）、魚、鳥、又は爬虫類或いは両生類であることができる。被験者は、無脊椎動物、より具体的には節足動物（例えば、昆虫及び甲殻類）であること（ｔｏ）ができる。この用語は、特定の年齢及び性別を意味しない。従って、成体及び新生仔被験者、並びに胎仔は、オス又はメスを問わず包含されることを意図する。患者は、疾病又は疾患に罹った被験者を指す。用語“患者”は、ヒト及び獣医学の被験者を含む。
【０２９０】
[0314]本明細書中で定義されるように、“試料”は、生物体から得られるいずれもの試料を指す。生物学的試料の例は、体液及び組織検体を含む。試料の供給源は、血液、血清、血漿、母乳、膿汁、組織擦過物、洗液、尿、糞便、涙、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水又は硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門及び膣分泌物、発汗、精液、漏出液、滲出物、及び滑液、並びにリンパ節、脾臓等のような組織、のような生理学的媒体であることができる。
【０２９１】
[0315]本明細書中で使用する場合、“遮断された”は、相互作用、例えばリガンドとその受容体との間の相互作用（例えば、結合）の完全な又は部分的阻害を意味することができる。阻害された結合は、正常な結合の正常な下流への影響の測定によって検出することができる。
【０２９２】
[0316]本明細書中で使用する場合、“治療”又は“治療すること”は、症状を持つ被験者に組成物を投与することを意味し、ここで、症状は、いずれもの病理的疾病、癌、又は炎症性症状であることができる。被験者への投与の影響は、症状の徴候を軽減すること、症状の重篤度の減少、又は症状の完全な休止であることができるが、これに制約されるものではない。
【０２９３】
[0317]“予防する”によって、ＴＬ１ＡのＤＲ３との相互作用に関連する疾病又は症状（例えば、Ｔ細胞成分による自己免疫性疾病）を発症するための素因を有する被験者が、疾病又は症状を発症する機会を最小にすることが意味される。
【０２９４】
[0318]本出願を通して、各種の刊行物が参照される。これらの刊行物のその全体の開示は、これが属する技術の状態をより完全に記載するために、本明細書中に本出願への参考文献として援用される。開示される参考文献は、個々にそして具体的に参考文献として本明細書中に、参考文献が依拠される文章中で考察される、それらに含有されている題材のために援用される。
【実施例】
【０２９５】
Ｇ．実施例
[0319]以下の実施例は、本明細書中で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法を製造し、そして評価する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために出され、そして純粋に例示であることを意図し、そして開示を制約することを意図していない。数値（例えば、量、温度、等）に関する正確さを確実にするための努力を払ったが、然しある程度の誤差及び偏差は考慮されるべきである。他に示さない限り、部は、重量部であり、温度は℃であるか又は周囲温度であり、そして圧力は大気圧か又はほぼ大気圧である。
【０２９６】
実施例１：
[0320]内皮細胞に加えて、ＴＬ１Ａは、ｍｙｄ８８依存的様式で、ＴＬＲ４又はＴＲＬ１１による刺激後、急速に上方制御され、そして樹状細胞から分泌され、そして、部分的にＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用を介して活性化されたＴ細胞によって誘導可能でもある。Ｔ細胞自体は、活性化後、遅延性動態で、ＴＬ１Ａを上方制御する。外因性及び内因性ＴＬ１Ａは、ＤＲ３を介してナイーブＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を同時刺激することができる。分化したエフェクター細胞によるサイトカイン産生は、ＤＲ３欠損Ｔ細胞において不十分であるが、しかし強い刺激又は樹状細胞の存在によって大幅に克服することができる。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＤＲ３欠損マウスは、ＥＡＥ及び喘息のモデルにおけるＴ細胞依存性免疫病理において異常を示すが、しかし全身的Ｔ細胞分極及びエフェクター機能は保存される。従ってＤＲ３は、サイトカイン産生及び炎症性組織の免疫病理の特異的増強物質として機能し、そしてこのように、Ｔ細胞媒介の自己免疫性疾病の治療のための標的を提示する。
【０２９７】
[0321]骨髄ＤＣは、ＴＬＲ及びＭｙｄ８８依存性様式での両方の自然免疫刺激後、可溶性ＴＬ１Ａを急速に産生し、一方、Ｔ細胞は、より低い量のＴＬ１Ａをよりゆっくりと産生し、そしてＴ細胞由来のＴＬ１Ａは、上清中に流れない。外因的に加えられたか、又はＴ細胞単独ではなくＤＣによって産生された、ＴＬ１Ａが、ナイーブＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を同時刺激することができることが決定された。Ｔｈ１及びＴｈ２エフェクター細胞への分化はＤＲ３に依存しないが、最適以下の条件下のサイトカイン産生の効率は影響される。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＤＲ３欠損Ｔ細胞は、エフェクター細胞に分化し、これは、脾臓及びリンパ節でサイトカインを産生することができる。然しながら、ＤＲ３欠損マウスは、Ｔ細胞依存性自己免疫の二つの別々のモデルに対して耐性であり、炎症の部位におけるエフェクターサイトカインの減少した産生を伴う。従って、ＴＬ１Ａ−ＤＲ３の相互作用は、標的組織におけるエフェクターＴ細胞の機能を増強し、Ｔ細胞媒介の免疫病理に寄与する。
【０２９８】
ａ．Ｔ細胞及び樹状細胞におけるＴＬ１Ａの特異誘導
[0322]ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｔ細胞受容体に対する抗体で活性化した場合、ＴＬ１ＡのｍＲＮＡの急速な、そして劇的な上方制御が起こり、６時間で約１０００倍の誘導を伴うピークとなった（図１Ｄ）。然しながら、Ｔ及びＢ細胞が末梢血から精製され、そして孤立して活性化された場合、ＴＬ１Ａの上方制御はずっと遅く、４８時間で１００倍より少ない誘導を伴うピークとなった。これは、非リンパ球性抗原提示細胞が、最初の活性化中、Ｔ細胞のためのＴＬ１Ａの主要な供給源でありうることを示す。精製されたマウス脾臓及び骨髄由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣにおいて、ＴＬ１ＡのｍＲＮＡは、ＬＰＳによって急速に上方制御され、３時間でピークとなり、そして１２時間で基線に戻った（図１Ａ）。ＴＬ１Ａを誘導する刺激を更に詳細に探求するために、トキシプラズマ原虫からのタキゾイト抗体（ＳＴＡｇ）及びマンソン住血吸虫からの住血吸虫卵抗原（ＳＥＡ）の寄生虫（ｐａｒｉｓｉｔｅ）由来免疫賦活性分子を使用し、これは、それぞれＴｈ１及びＴｈ２反応のためにＴ細胞を予備刺激する、示差的ＤＣ活性化プログラムにつながった。ＳＴＡｇで刺激したが、しかしＳＥＡでは刺激していない樹状細胞は、ＬＰＳと類似の動態でＴＬ１ＡのｍＲＮＡを強力に上方制御した（図１Ａの中央の図）。２４時間後まででさえ、ＳＥＡはＴＬ１Ａを誘導しなかった（右の図）。各種のノックアウトマウスからのＤＣによる実験は、ＴＬ１Ａの誘導が、Ｍｙｄ８８及びＴＩＲＡＰに依存し、そしてＴＬ１ＡのＬＰＳ誘導は、ＴＬＲ４依存性であることを示した（図１Ｂ）。高度に精製されたマウスＴ細胞がＴＣＲを介して活性化された場合、類似のＴＬ１Ａ上方制御が、ヒトＴ細胞において見られる遅延性動態を伴って観察された（図１Ｃ）。これらのデータは、他のＴＮＦファミリーのメンバーと同様に、ＴＬＲ及びＭｙｄ８８／ＴＩＲＡＰ依存性シグナル経路により、ＤＣ中でＴＬ１Ａが急性的に上方制御されることができることを示す。ＤＣ由来ＴＬ１Ａは、Ｔ細胞活性化の最初の時期を調節するために使用可能であるものであり、一方、Ｔ細胞は、ＴＬ１Ａを更にゆっくり上方制御し、ここで、これはＴ細胞の増殖及び分化における後の段階に影響することができる。
【０２９９】
ｂ．ＴＬ１Ａは、ＤＲ３を介したＣＤ４＋  Ｔ細胞における増殖及びサイトカイン産生を同時刺激する。
【０３００】
[0323]外因性ＴＬ１ＡがＴ細胞を同時刺激することは従来示されているが、しかしこれがＤＲ３に依存するか、そして成熟したＴ細胞の活性化について内在的に産生されたＴＬ１Ａがどのような役割を果たすかは、調査されていない。これを調査するために、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を野生型（ＷＴ）Ｃ５６７Ｂ１／６又は同質遺伝子的なＤＲ３ノックアウト（ＫＯ）マウスの脾臓及びリンパ節から精製し、そして組換えマウスＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で活性化した。他のＴＮＦファミリーのメンバーによる同時刺激は、ＣＤ２８仲介の同時刺激が遮断された場合に最大であることが示されている（Ｃｒｏｆｔ，２００３）。外因的に加えられたＴＬ１Ａは、Ｔ細胞増殖を一貫して増加させ、そしてこの効果は、ＣＤ２８仲介の同時刺激の非存在下において更に明白であった（図１Ａ）。二重のＣＤ３／ＣＤ２８の架橋において、ＴＬ１Ａのみが抗ＣＤ３の低い投与量で増殖を同時刺激した。重要なことは、ＤＲ３  ＫＯ細胞が、ＴＬ１Ａに対して完全に無反応性であり、ＤＲ３が、ＴＬ１Ａによる同時刺激を仲介する主要な受容体であることを示す。更に、その先に報告されたＣｏｎＡに反応する正常な増殖（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）と同様に、ＷＴ及びＤＲ３  ＫＯマウスから精製されたＴ細胞は、同時刺激を伴うか又は伴わない抗ＣＤ３に反応して同様に増殖した。（図２Ａ）。ＴＬ１Ａによって誘発される増加したチミジン取り込みが、細胞の生存への効果に対比して増加した細胞周期に起因したか否かを決定するために、ＣＦＳＥ希釈実験を、類似の条件下で行った。チミジン取り込みデータに一致して、外因性ＴＬ１Ａは、ＣＦＳＥ希釈を有意に増加させ、これは、特にＣＤ２８シグナル伝達の非存在下における増加した細胞周期を反映した（図２Ｂ）。これらの実験において、ＴＬ１Ａに反応する細胞の生存率の変化は、検出されなかった。
【０３０１】
[0324]ＴＬ１Ａによって同時刺激されることができるサイトカインのスペクトル、及びＤＲ３に対するサイトカイン産生の依存性を調査するために、ＩＬ−２、インターフェロン−γ及びＩＬ−４の産生を、組換えＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で活性化されたＷＴ又はＤＲ３  ＫＯのＴ細胞において測定した。ＴＬ１Ａは、ＣＤ２８を伴い又は伴わないで活性化されたＷＴによるＩＬ−２産生、インターフェロン−γ産生及びＩＬ−４産生を増加させたが、しかしＤＲ３  ＫＯ細胞では増加させなかった。ＩＬ−４は、ＴＬ１Ａによって最も顕著に誘導されたサイトカインであり、概略１０倍増加し、一方、ＩＬ２及びインターフェロン−γは、２倍より少なく増加した（図２Ｄ）。ＤＲ３欠損Ｔ細胞は、ＴＬ１Ａに対して無反応性であったが、しかしサイトカイン産生の欠損はなかった。従って、増殖の反応と同様に、ＤＲ３は、ＴＬ１Ａシグナル伝達の主要なメディエーターであり、そして内因的に産生されたＴ細胞由来のＴＬ１Ａは、これらの条件下で活性化されたＴ細胞によるサイトカイン産生のために必要ではない。ＴＬ１Ａ駆動の増殖が増加したＩＬ−２産生に起因するか否かを決定するために、抗ＣＤ２５遮断抗体を、Ｔ細胞活性化中にＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で加えた。ＣＤ２５遮断は、ＴＬ１Ａによって誘導される増加した増殖の殆どを遮断したが、しかしある程度のＩＬ−２非依存性増殖は、なお観察することができ、このことはＴＬ１Ａ駆動同時刺激が、ＩＬ−２の増加した産生に少なくとも部分的に依存することを示した（図２Ｂ）。
【０３０２】
[0325]精製されたＤＲ３欠損Ｔ細胞が、増殖反応又はサイトカイン産生に主要な異常を持たなかったため、Ｔ細胞によって産生されたＴＬ１Ａは、これらの機能に対して必須ではないように見受けられた。従って、同族のＤＣ−Ｔ細胞の相互作用中に樹状細胞によって産生されるＴＬ１Ａは、Ｔ細胞同時刺激のためのＴＬ１Ａのより関連する出所でありうる。これを試験するために、卵白アルブミン（Ｏｖａ）特異的ＴＣＲ遺伝子導入系ＯＴ−ＩＩと交配したＤＲ３のＷＴ又はＫＯマウスによる実験を行った。精製したＤＲ３欠損細胞を、Ｃ５７Ｂ１／６骨髄由来ＤＣ及び同族のＯｖａペプチドと共に同時培養した。これらの条件下で、ＤＲ３  ＫＯ細胞の増殖は、特にＣＴＬＡ４−Ｉｇ遮断を伴う又は伴わない低い濃度のＯｖａペプチドの存在下で減少した（図３Ａ）。ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生は、抗原の投与量に特徴的に依存し、高い投与量はＩＦＮ−γ産生に好ましく、そして低い投与量はＩＬ−４産生に好ましい。ＤＲ３  ＫＯ  ＯＴ−ＩＩ細胞は、Ｏｖａの低い投与量で概略５０％低いＩＬ−２を、そして試験されたＯｖａの全ての投与量においてより低い量のＩＬ−４を産生した。従って樹状細胞によって産生された内因性ＴＬ１Ａは、この同時刺激性ＴＮＦファミリーメンバーの生理学的に重要な出所である可能性がある。
【０３０３】
ｃ．ＤＲ３  ＫＯ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで極性化された場合、減少されたＴＨ２分化を有する。
【０３０４】
[0326]Ｔ細胞分化における後の段階に対するＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用の結果を調査するために、ＤＲ３欠損Ｔ細胞を二つの種類のＴ細胞極性化アッセイにおけるエフェクターサイトカイン産生について試験した。ＷＴ又はＤＲ３  ＫＯマウスから精製したＴ細胞を、ＴＨ２極性化のためのＩＬ−４及び抗ＩＦＮγ又はＴＨ１極性化のためのＩＬ−１２及び抗ＩＬ−４のいずれかで活性化した。精製したＴ細胞を、活性化及び極性化の５−６日後に再刺激した場合、ＩＦＮγ及びＩＬ−４を産生する細胞のパーセントの有意な異常が、Ｔ細胞をＴＣＲによって再刺激した場合に存在した。然しながら、ＰＭＡ／イオノマイシンの組合せは、これらのサイトカインの正常な産生を可能にした（図４Ａ）。興味あることには、ＴＧＦベータ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ並びにＩＬ−４及びＩＬ−２の遮断の組合せによってこのエフェクター型に極性化された、極性化Ｔ細胞によるＩＬ−１７の産生は、一次活性化後７２時間目、及びＣＤ３／２８による再刺激後に、上清中で不完全であった。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激は、サイトカイン分泌の欠損をバイパスするように見受けられたことから、ＤＲ３  ＫＯ細胞中の欠損は、Ｔ細胞の分化自体よりむしろＴＣＲ誘導サイトカイン分泌において多いかもしれない。Ｔ細胞分化が、ＤＲ３の非存在下でインタクトであったか否かを決定するために、それぞれＴｈ１及びＴｈ２のＴ細胞の分化をプログラムする、古典的転写因子のＴ−ｂｅｔ及びＧＡＴＡ−３のレベルを測定した。図４Ｂに示すように、Ｔｈ１細胞に分化するために極性化されるＤＲ３  ＫＯ  Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔの誘導は正常であり、そしてＴｈ２条件下のＧＡＴＡ−３誘導は、僅かにのみ損なわれていた。従って、ＤＲ３が特定のＴ細胞のサブセットへの分化のためにＴ細胞をプログラムすることにおいてよりも、サイトカイン産生において、より重要であるように見受けられた。ＴＬ１Ａが樹状細胞によって提供される場合にもこれが正しいか否かを決定するために、ＤＲ３  ＫＯ×ＯＴＩＩマウス又はＯＴＩＩ対照からのＴ細胞を、抗原及びＤＣと共に、極性化が、外因性サイトカイン、又は寄生虫由来抗原のＳＥＡ又はＳＴａｇの影響下で産生される内因性因子によって駆動される条件下で培養した。ＤＲ３  ＫＯ  Ｔ細胞が、Ｓｔａｇ又は外因性ＩＬ−１２及び抗ＩＬ４によって極性化された場合、ＩＦＮ−γの異常は、見いだされなかった（図４Ｄ）。然しながら、ＩＬ−４産生における有意な欠損が、ＳＥＡの存在下で活性化されたＴ細胞において観察された。これは、外因性ＩＬ−４の添加によって克服された。Ｔ細胞由来ＩＦＮ−γを必要としないＳＴＡｇ誘導Ｔｈ１極性化とは異なり、ＳＥＡによるＴｈ２極性化は、Ｔ細胞由来ＩＬ−４に依存することが知られている。従って、観察されたＤＲ３  ＫＯ  Ｔ細胞によるＩＬ−４産生の欠損（図３Ｂ）は、外因性ＩＬ−４の非存在下におけるＴｈ２極性化欠損を説明することができる。
【０３０５】
ｄ．ＤＲ３  ＫＯマウスは、Ｏｖａ誘導喘息モデルにおける軽減された肺炎症を有する
[0327]Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ２極性化欠損がＴｈ２媒介疾病の動物モデルにおいて有意であるか否かを決定するために、ＤＲ３  ＫＯマウスがＯｖａ依存性喘息モデルにおいて如何に反応するかを調査した。マウスを、Ａｌｕｍ及びＯｖａタンパク質で、又は対照としてＡｌｕｍ及びＰＢＳで感作し、そして次いでＯｖａタンパク質又はＰＢＳのいずれかでくも膜下腔内及び鼻腔内でチャレンジした。マウスを最後のチャレンジの二日後に犠牲にした。組織診断は、ＤＲ３  ＫＯマウスの肺が、ＷＴマウスより少ないムチン産生を有し、そして気管支周囲肥厚像（peribroncheal cuffing）もより少ないことを示した（図５Ａ）。ＤＲ３  ＫＯの肺に対する組織病理学的スコアもＷＴの肺と比較して減少した（図５Ｂ）。更に、ＤＲ３  ＫＯ肺における炎症は、ＷＴの肺における典型的な好酸球浸潤に対して、ＤＲ３  ＫＯにおいては主にリンパ球性であった。次に、肺中の様々なサイトカインのｍＲＮＡレベルを決定した。ＤＲ３  ＫＯの肺は、ＷＴの肺と比較して、肺中に、粘液産生を反映する減少したＩＬ−１３、及びＩＬ−１５を有する（図５Ｃ）。更に、脾臓のＯｖａ特異的再刺激が影響されたか否かを決定した。興味有ることに、肺で観察されたサイトカインのｍＲＮＡのレベルと対照的に、サイトカイン産生に差はなく、より局所的な影響を示唆した。更に、ＷＴ及びＤＲ３  ＫＯマウスのＴ細胞増殖の間に差はなかった。血清中に存在するＩｇＧ１のレベルも決定した。ＷＴ及びＤＲ３  ＫＯマウスの間のＩｇＧ１、ＩｇＧ２血清レベルにおいて、特にＯｖａ特異的ＩｇＧ１（図５Ｄ）レベルにおいて、差はなく、病態の差のより局所的な影響を示唆した。ＩｇＧ１産生が、ＰＢＳ処置マウスと比較して、ＤＲ３  ＫＯマウスにおいてＯｖａチャレンジ後に上昇した事実は、Ｔ細胞が、より小さい程度であるとしても、反応し、そして分化することができたことを示す（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの極性化からのデータ）。従って、局所的炎症の減少は、免疫反応の後期における欠損に起因しうる。
【０３０６】
ｅ．ＤＲ３  ＫＯマウスは、ＥＡＥに対して感受性が少ない。
【０３０７】
[0328]ＤＲ３  ＫＯマウスが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴＨ２分化の減少に相関する、喘息モデルにおけるＴＨ２−Ｔ細胞媒介病態の減少を有することから、ＤＲ３  ＫＯマウスが、ＴＨ１／ＴＨ１７仲介疾病に対して如何に反応するかを調査した。この目的に対して、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）誘導ＥＡＥマウスモデルを使用した。ＤＲ３  ＫＯマウスは、ＭＯＧ注射後約１週間で、臨床的病態を発症したＷＴマウスと比較して、遅延し、そして減少したＥＡＥ病態を有する（図６Ａ）。これは、ＤＲ３  ＫＯマウスが、完全に異なったサイトカインに依存する疾病モデルにおいて減少した病態を有することを示す。更に、Ｏｖａ−喘息モデルと同様に、脾臓及びリンパ節からのＴ細胞のＭＯＧ再刺激は、損なわれていない（図６Ｂ）。これは、さらに、ＤＲ３／ＴＬ１Ａ異常の全体的効果が、全身的よりも局所的であるように見受けられたことを示す。幾つかの最近の報告は、ＩＬ−１７を産生する細胞のようなエフェクターＴ細胞の更なるサブセットが、免疫反応中に産生されることを示す。このＩＬ−１７産生細胞の集団は、ＴＨ１サイトカインを産生するエフェクター細胞よりむしろＴＨ１媒介疾病の病原性に責任があると考えられた。従って、どの程度のＩＬ−１７産生細胞が脳、脾臓及びリンパ節に存在するかを決定するために、造血細胞を脊髄から採取し、そして６時間、ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激してから、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γに対して細胞内染色した。ＷＴマウスと比較して、減少したＩＬ−１７産生細胞が、ＤＲ３  ＫＯマウスからのＣＮＳ中に存在した。更に、ＤＲ３  ＫＯマウスは、ＷＴマウスより２倍ほど多いＴ細胞をＣＮＳ中に有する。然しながら、脾臓及びリンパ節において差はなかった。
【０３０８】
２．実施例２：
ｉ．結果
ａ．ＴＬ１Ａは、ＤＲ３を介してＣＤ４＋  Ｔ細胞における増殖及びサイトカイン産生を同時刺激する。
【０３０９】
[0329]外因性ＴＬ１Ａは、ヒト及びマウスのＴ細胞を同時刺激することができるが、しかしＤＲ３がＴＬ１Ａに対する唯一の同時刺激性受容体であるか否か、そして内因的に産生されたＴＬ１Ａが成熟Ｔ細胞の活性化においてどのような役割を果たすかは、知られていない。これを調査するために、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの野生型（ＷＴ）、又は年齢及び性別を合わせたＤＲ３ノックアウト（ＤＲ３−／−）マウス（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）の脾臓及びリンパ節から精製し、そして組換えマウスＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で、ＴＣＲを介してこれらを活性化した。他のＴＮＦファミリーのメンバーによる同時刺激は、ＣＤ２８仲介同時刺激が遮断された場合に最大であることが示されている（Ｃｒｏｆｔ，２００３）。ＴＬ１Ａも、ＣＤ２８仲介同時刺激の非存在下においてＴ細胞増殖を最も劇的に増加させた（図８Ａ）。ＣＤ２８仲介同時刺激が存在した場合、ＴＬ１Ａは、より低い投与量の抗ＣＤ３における増殖のみを同時刺激した（図８Ａ）。ＴＬ１Ａによって誘導される増加したＣＦＳＥ希釈が観察され、細胞生存率の有意な変化が観察されないことから、増加したチミジン取り込みは、向上した生存ではなく、増加した細胞分裂に起因した。重要なことに、ＤＲ３−／−細胞は、ＴＬ１Ａに対して無反応であり、ＤＲ３がＴＬ１Ａによる同時刺激を仲介する主要な受容体であることを示す（図８Ａ）。然しながら、内因性Ｔ細胞由来ＴＬ１Ａを介したＤＲ３の刺激は、精製されたＤＲ３−／−Ｔ細胞の培養中の増殖において欠損がなかったことから、Ｔ細胞増殖のために明らかに不要である（図８Ａ）。ＴＬ１Ａ同時刺激は、ＴＬ１Ａ誘導増殖が、ＩＬ−２欠損Ｔ細胞において、又は拮抗性抗ＩＬ−２Ｒα抗体の添加後、大幅に減少したことから、増加したＩＬ−２産生に大きく依存した（図８Ｂ）。
【０３１０】
[0330]ＴＬ１Ａによって同時刺激されることができるサイトカインのスペクトル及びＤＲ３に対するサイトカインの産生の依存性を調査するために、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生を、組換えＴＬ１Ａの存在下又は非存在下で活性化されたＷＴ或いはＤＲ３−／−Ｔ細胞において測定した。ＴＬ１Ａは、ＷＴによるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生を増加させたが、ＤＲ３−／−Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４産生は増加させず、ＩＬ−４が、ＣＤ２８同時刺激の存在下でＴＬ１Ａによって最も顕著に誘導された（図８Ｃ）。ＤＲ３欠損Ｔ細胞は、ＴＬ１Ａに対して無反応であったが、しかし野生型Ｔ細胞と比較してサイトカイン産生において異常はなかった。従って、増殖反応と同様に、ＤＲ３は、ＴＬ１Ａ誘導同時刺激に必要であるが、しかし内因的に産生されたＴ細胞由来ＴＬ１Ａは、これらの条件下で活性化されたＴ細胞によるサイトカイン産生に必要ではない。活性化マーカーＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）及びＣＤ６９の上方制御は、特に活性化後２４時間において、ＴＬ１Ａによって向上するが、活性化マーカー発現における異常は、野生型の対照と比較してＤＲ３欠損Ｔ細胞において観察されなかった（図１６）。ＴＬ１Ａは、記憶Ｔ細胞を同時刺激するが、ナイーブＴ細胞を同時刺激しないことが報告されている（Ｂａｍｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。この問題に対処するために、ＣＤ６２Ｌｈｉ／ＣＤ４４ｌｏナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＷＴ及びＤＲ３欠損マウスから精製し、そして外因性ＴＬ１Ａを伴い又は伴わずにこれらを活性化した。ＴＬ１Ａは、ＣＤ２８同時刺激を伴い又は伴わずに増殖を穏やかに向上させ、そして更にＤＲ３依存性様式でＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生を強力に増加させ（図１７Ａ、１７Ｂ）、ＤＲ３がナイーブＴ細胞中で機能することができることを示した。記憶表現型ＣＤ４４ｈｉＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントも、年齢を合わせたＤＲ３−／−及び対照マウスにおいて同一であり（図１７Ｃ）、非分離Ｔ細胞のＴＬ１Ａ同時刺激が、記憶及びナイーブ細胞のパーセントの差による可能性が低いことを示した。
【０３１１】
ｂ．樹状細胞は、ＴＬＲ及びＦｃγＲ刺激に反応してＴＬ１Ａを産生し、そしてＤＲ３を介してＴ細胞を同時刺激することができる。
【０３１２】
[0331]精製されたＤＲ３欠損Ｔ細胞における増殖又はサイトカイン産生の異常の欠如は、他の細胞種がＴＬ１Ａの生理学的出所でありうることを示唆した。ＴＬ１Ａは、各種の刺激後ヒトＤＣ及び単球によって産生され、そしてＤＣが、Ｔ細胞の同時刺激に対して適当な時期及び場所で産生されるＴＬ１Ａの出所であることが報告されている。これを試験するために、ＴＬ１Ａ遺伝子発現の上方制御を、各種の薬剤で刺激した精製脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞及び骨髄由来ＤＣにおいて、逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定した。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して作用し、そして他のＴＮＦファミリーのメンバーの発現を誘導することができる刺激である、ＬＰＳ及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉからの可溶性タキゾイト抗原（ＳＴＡｇ）は、ＴＬ１Ａの急速な上方制御を誘導し、発現は３時間で基線上１００倍まででピークに達し、その後急速に低下した（図９Ａ）。興味あることに、ＤＣの別の活性化を誘発し、Ｔｈ２分化のためにＴ細胞をプログラムする、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからの住血吸虫卵抗体（ＳＥＡ）は、ＴＬ１ＡのｍＲＮＡをはっきりとは誘導しなかった（図９Ａ、左の図）。ＴＬＲシグナル伝達コンポーネントを欠損する樹状細胞の刺激は、ＴＬ１ＡのＬＰＳ誘導が、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰに依存する様式でＴＬＲ４によって仲介されることを示した（図９Ｂ）。低親和性Ｆｃ受容体を介して作用する免疫複合体は、ＴＬ１Ａ産生に対する強力な刺激であることが最近になって示された（Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｐｒｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。プレート結合架橋マウスＩｇ（ＩＣ）によるマウスＤＣの刺激も、ＬＰＳに匹敵するほどＴＬ１Ａ遺伝子発現を刺激した（図９Ｃ）。従って、他のＴＮＦファミリーのメンバーのように、ＴＬ１Ａは、ＤＣ中で、ＴＬＲ及び免疫複合体を介して急速に誘導されることができる。Ｔ細胞が、ＴＬ１Ａの自己分泌の出所として役立つことができるか否かを試験するために、精製したＴ細胞を、ＴＣＲを介して刺激し、そしてＴＬ１ＡのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。ＴＬ１ＡのｍＲＮＡは、ＴＣＲ刺激後に上方制御されたが、しかしＤＣと比較して遅延した動態を伴った。興味あることに、ＤＲ３欠損Ｔ細胞が、劇的に減少したＴＬ１Ａ誘導を示したが、しかし活性化後にＩＬ−２のｍＲＮＡの正常な上方制御を示したことから、ＴＬ１Ａの上方制御は、ＤＲ３発現に特異的に依存した（図９Ｄ）。まとめれば、これらのデータは、Ｔ細胞が、その発現を継続するために自己分泌様式で作用するＴＬ１Ａを産生することが出来るが、しかしＴ細胞由来のＴＬ１Ａは、増殖又は単離されたＴ細胞によるサイトカインの産生に必要ではないことを示す。
【０３１３】
[0332]Ｔ細胞活性化のより生理学的なモデルにおいてＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用の役割を研究するために、ＤＲ３欠損マウスを、卵白アルブミン（Ｏｖａ）特異的ＴＣＲ遺伝子導入系ＯＴ−ＩＩに戻し交配し、ＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩ及びＯＴ−ＩＩ対照マウスからのナイーブＴ細胞を、Ｏｖａペプチド及び野生型骨髄由来ＤＣと共に培養した。これらの条件下で、ＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩ細胞の増殖は、特に低濃度のＯｖａにおいて減少した（図１０Ａ）。Ｏｖａペプチド及びＤＣで刺激されたＴ細胞のサイトカインプロファイルは、抗原の投与量に特徴的に依存し、高投与量はＩＦＮ−γ産生に好ましく、そして低投与量はＩＬ−４産生に好ましい（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩ細胞は、Ｏｖａの低投与量で少ないＩＬ−２を、そして試験されたＯｖａの全ての投与量で少ない量のＩＬ−４を産生した。対照的に、ＩＦＮ−γの産生は、試験された全ての投与量において対照より高かった（図１０Ｂ）。Ｔ細胞活性化マーカー発現の分析は、ＣＤ２５及びＣＤ７１の最適な上方制御も、低投与量のＯｖａペプチドにおいてＤＲ３に依存することを明らかにした（図１８）。これらのデータは、Ｔ細胞と、同族の抗原を提示する樹状細胞との間の相互作用中に、ＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用は、Ｔ細胞増殖、及びＩＬ−２、ＩＬ−４の、しかしＩＦＮ−γではない産生を同時刺激するために機能することを示す。ＤＲ３の非存在下におけるサイトカイン産生及び増殖におけるこれらの変更は、Ｔ細胞の極性化に影響しうる。これを試験するために、ＤＲ３−／−又は対照マウスからのナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７エフェクターＴ細胞の分化のために最適化された条件下で、又は中立の条件下で、樹状細胞の存在下で活性化し、そして再刺激後のサイトカイン産生を測定した（図１１）。外因性極性化刺激の非存在下において、ＤＲ３−／−Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対して予測されるＴｈ１−ＩＦＮ−γ分泌プロファイルに向かって穏やかなスキューイングを示した。更に、適当なサイトカインは、ＤＲ３−／−細胞を、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１７産生細胞に向かって正常に極性化した。次いでＤＣ及びＯｖａで刺激されたＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩ及び対照ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の培養物を用意し、サイトカイン又は可溶性タキゾイト抗原（ＳＴＡｇ）（これは、ＩＬ−１２に加えて、ＴＬ１Ａ産生を誘導する）で極性化した。これらの条件も、抗原特異的ＤＲ３−／−Ｔ細胞による正常なＴｈ１スキューイングをもたらす（図１１Ｂ）。適当な分化刺激による転写因子Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、又はＲＯＲγの誘導も、ＤＲ３−／−精製Ｔ細胞に影響しなかった。従って、ＤＲ３は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７エフェクター細胞サブタイプへの分化に不必要であるように見受けられる。
【０３１４】
ｃ．ＤＲ３は、一次全身性Ｔ細胞反応のために不必要であるが、しかしＴ細胞媒介の疾病の動物モデルにおける免疫病理に必須である。
【０３１５】
[0333]インタクトな免疫系におけるＴ細胞分化及びエフェクター機能におけるＤＲ３の役割を決定するために、別々のＴ細胞サブセットに依存する疾病モデルを、ＤＲ３−／−マウスにおいて研究した。マウスがＯｖａ及びＡｌｕｍで全身的に予備刺激された肺炎症のＴｈ２依存性モデルを、先ず調査し、そして次いで局所的にＯｖａでチャレンジした（Ｇａｖｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。三つの独立した実験において、組織学的分析は、ＤＲ３−／−マウスの肺の気道が、ムチン産生及び気管支周囲の炎症を含む、より少ない炎症を有することを示した（図１２Ａ）。ＢＡＬにおける標準化された組織病理学的スコア及び細胞数は、ＯＶＡ感作及びチャレンジされたＤＲ３−／−マウスにおいて、ＯＶＡで並行して感作及びチャレンジされたＤＲ３  ＷＴマウスと比較して減少した（図１２Ｂ）。ＣＤ３＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞、スフィンゴ糖脂質／ＣＤ１ｄテトラマーを認識する不変のＶα１４陽性Ｔ細胞、及び好酸球のパーセントは、Ｏｖａ感作及びチャレンジされたＤＲ３−／−マウスからの肺細胞標本において、対照と比較して全て有意に減少した（図１２Ｃ）。免疫組織化学によるＯｖａ感作ＤＲ３欠損マウスからの肺組織中のＣＤ３＋細胞の局在化は、対照と比較してより少ない間質及び気管支周囲のＴ細胞、及び増加した血管周囲の局在化を明らかにし、肺におけるＴ細胞の浸潤又は生存異常を示唆した。血管周囲の浸潤における類似の増加は、マクロファージについて観察された（図１９）。Ｔｈ２媒介の肺の病理に重要なＩＬ−５及びＩＬ−１３に対するｍＲＮＡのレベルは、ＤＲ３−／−のＯｖａ感作肺において顕著に減少し、一方、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γは等しく産生された（図１２Ｄ）。対照的に、これらのマウスからのＤＲ３−／−脾臓細胞を、Ｏｖａで再刺激した場合、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の正常な産性があり、Ｏｖａ特異的Ｔｈ２  Ｔ細胞の全身的予備刺激が、ＤＲ３に非依存的であることを示した（図１２Ｅ）。更に、ＤＲ３−／−脾細胞は、Ｏｖａに反応して正常に増殖した。Ｏｖａ予備刺激後のＯｖａ特異的ＩｇＧ１及びＯｖａ特異的ＩｇＥの産生によって評価されるような全身性Ｔｈ２機能も、ＤＲ３−／−マウスにおいて正常であった（図１２Ｆ）。従って、このＴｈ２媒介の肺炎症のモデルにおいて、ＤＲ３は、Ｔｈ２エフェクター細胞が炎症の部位に蓄積するために必要であるが、しかしＴｈ２  Ｔ細胞の全身性分化のためには必要ではない。肺における減少したＴ細胞は、ＤＲ３−／−の肺において観察されたように、炎症の部位への好酸球及びｉＮＫＴ細胞の不完全な動員をもたらしうる。
【０３１６】
[0334]ＤＲ３が、他のＴ細胞サブセットによって仲介される疾病のために必要か否かを決定するために、Ｔｈ１７及びＴｈ１依存性自己免疫疾病の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を、ＤＲ３−／−マウスで研究した。四つの別個の実験において、ＤＲ３−／−マウスは、臨床スコアによって測定されるように、遅延し、そして劇的に減少した麻痺を示した（図１３Ａ）。ＥＡＥに対する耐性にも関わらず、ＭＯＧ予備刺激ＤＲ３−／−マウスの流入領域リンパ節からのＴ細胞は、ＭＯＧに反応して正常に増殖した（図１３Ｂ）。脊髄ホモジネート中のＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントは、ＤＲ３−／−マウスにおいて顕著に減少した（図１３Ｃ）。Ｔ細胞ゲート内で、ＩＦＮ−γ産生細胞のパーセントも、ＤＲ３−／−マウスの脊髄からのＴ細胞において２倍減少した（図１３Ｃ）。ＩＬ−１７産生細胞のパーセントは、このゲート内でＤＲ３−／−マウスにおいて正常であったが、しかし脊髄中のＣＤ４＋  Ｔ細胞の減少したパーセントに起因して、全体ではなお減少した。炎症を起こした脊髄中のこれらのサイトカインの絶対的レベルを試験するために、脊髄ホモジネート中のＩＬ−１７及びＩＦＮ−γに対するｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。両方のサイトカインは、ハウスキーピング遺伝子β２−マイクログロブリンに対して正規化した場合、ＭＯＧ予備刺激ＤＲ３−／−マウスからの脊髄標本中で減少し、ＩＦＮ−γが最も影響された。然しながら、Ｔ細胞特異的遺伝子ＣＤ３−δの発現に対して正規化した場合、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現は、ＤＲ３−／−の脊髄において減少しなかった（図１３Ｄ）。従って、ＤＲ３は、Ｏｖａ誘導肺炎症モデルと異なったサイトカインの組合せと関連する自己免疫性脱髄性疾患のこのモデルにおいても重要であり、そしてＤＲ３−／−マウスにおける疾病に対する耐性は、標的器官中のエフェクターＴ細胞の減少した数と相関した。
【０３１７】
[0335]自己免疫性疾病におけるその役割に加えて、エフェクターＴ細胞は、感染を制御することにおいて重要である。マウスが急性感染から生存するためにＩＦＮ−γ分泌性Ｔｈ１細胞を必要とする感染であるトキソプラズマ症におけるＤＲ３シグナル伝達の役割を更に調査することを決定した。Ｔ．ｇｏｎｄｉｉによる感染後、ＤＲ３−／−、並びに対照マウスは、７週間１００％の生存率を有した。感染後７週間でＤＲ３−／−感染マウスから単離し、ＳＴＡｇで刺激した脾臓細胞は、対照と比較して、匹敵する量のＴＮＦα、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０を産生した（図１４）。これらのデータは、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉに反応するエフェクターＴｈ１細胞の予備刺激及び維持が、ＤＲ３に依存しないことを示す。
【０３１８】
ｉｉ．実験方法
ａ．試薬及びマウス
[0336]Ｅ．ｃｏｌｉからのＬＰＳをＳｉｇｍａから得た。可溶性タキゾイトＡｇ（ＳＴＡｇ）を超音波処理されたトキソプラズマ原虫タキゾイトから調製し、そしてＳＥＡをマンソン住血吸虫卵から先に記載されたように調製した（Ｇｒｕｎｖａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。先に記載されたように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）産生したＤＲ３−／−マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドと少なくとも８世代戻し交配した。ＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩマウスを、ＤＲ３−／−マウスを、ＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲ遺伝子導入マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  ｆａｒｍｓ）と交配することによって産生した。ＩＬ−２−／−マウスは、ＮＩＡＩＤのＰｕｓｈｐａ  Ｐａｎｄｉｙａｎからの寛大な贈り物であった。全ての抗体は、他に示さない限り、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。Ｖα１４  ｉＮＫＴ  Ｔ細胞を認識するＣＤ１ｄ／ＰＢＳ５７テトラマーを、ＮＩＨテトラマーコア施設によって調製した。
【０３１９】
ｂ．細胞標本及び精製
[0337]脾臓の樹状細胞を、ＣＤ１１ｃ＋の高い発現についてＭｏＦｌｏ  ＦＡＣＳソーター（Ｄａｋｏ  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で、リベラーゼ消化された脾臓から選別した。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ細胞の純度は、少なくとも９７％であった。Ｔ細胞を、脾臓及びリンパ節細胞懸濁物から、ＣＤ１１ｂ、ＰａｎＮＫ、Ｂ２２０、ＮＫ１．１、ＣＤ２４、ＣＤ１６／３２、ＧＲ−１、Ｉ−Ａｂに対するＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及び抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用する、これらの抗原の磁気枯渇（depletion）によって、精製した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を精製するために、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣを上記の抗体に加えた。ナイーブＴ細胞について、ＣＤ４＋精製細胞のＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４−集団を、ＰＥ−Ｃｙ５抗ＣＤ４４及びＰＥ抗ＣＤ６２Ｌによる染色後、選別した。骨髄樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）で補充されたＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで培養することによって産生した。Ｔ枯渇ＡＰＣを、脾臓細胞懸濁物を抗Ｔｈｙ１．１と共に１０分間氷上でインキュベートし、続いてｌｏｗ−ｔｏｘ−Ｍウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に３０分間３７℃でインキュベートすることによって得た。細胞を洗浄し、そして２５μｇ／ｍｌのマイクロマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。
【０３２０】
ｃ．Ｔ細胞の活性化及び極性化
[0338]同時刺激研究のために、ＣＤ４＋又はナイーブＣＤ４＋細胞を、プレート結合抗ＣＤ３  ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ又は示された濃度、１４５−２Ｃ１１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、プレート結合抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）（３７．５１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下又は非存在下で刺激した。組換えマウスＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を、１０ｎｇ／ｍｌで加えた。ＩＬ２−／−マウスによる研究のために、精製したＴ細胞を、上記のように、しかし１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の非存在下又は存在下で培養した。ＤＣ−Ｔ細胞の同時培養研究のために、１０４個の骨髄由来ＤＣを、ウェル当たり１０５個のＯＴ−ＩＩ又はＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞及び示された濃度のＯＶＡ３２３−３３９ペプチドと共に、１０μｇ／ｍｌのマウスＣＴＬＡ４／Ｆｃ（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ）を伴って又は伴わずに培養した。３日目に、培養物の上清を、サイトカイン測定のために収集し、そして細胞を１μＣｉの３Ｈ−チミジンでパルス標識した。更に１６−２０時間後、３Ｈ−チミジン取り込みを、シンチレーションカウンターで測定した。極性化研究のために、８×１０５個のＴ枯渇ＡＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６又はＤＲ３−／−マウスからの２×１０５個のナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞と共に培養した。Ｔｈ１極性化を、ｒＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）で、Ｔｈ２極性化をｒＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、抗ＩＬ−１２（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ）で、Ｔｈ１７極性化をｒｈＴＧＦα（５ｎｇ／ｍｌ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＩＬ−１２（１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）で、Ｔｈ０極性化を抗ＩＬ−１２（１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）で駆動した。培養の４日後、細胞内サイトカイン染色を、以下に記載するように行った。ＳＴＡｇによる極性化研究のために、５×１０４個の脾臓ＤＣを、ウェル当たり１０５個のＯＴ−ＩＩ又はＤＲ３−／−ＯＴ−ＩＩナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞と共に、１μＭのＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを伴って培養した。Ｔｈ１極性化をｒＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）で、Ｔｈ２極性化をｒＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で、そしてＳＴＡｇ極性化を５μｇ／ｍｌのＳＴＡｇで駆動した。７２時間の培養後、上清を、１０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を含有する新鮮な培地で置換し、そして更に２−３日後、細胞内サイトカイン染色を以下に記載するように行った。
【０３２１】
ｄ．実験的アレルギー性脳脊髄炎の誘導
[0339]マウスを、ＣＦＡ中のミエリンオリゴデンドロサイト糖脂質（ＭＯＧ）３５−５５ペプチドで皮下的に免疫化し、百日咳毒素を０及び２日目にＩＰ投与し、ＥＡＥを誘導した。群当たり５ないし８匹のマウスを含め、そして採点した。ＥＡＥの臨床的評価を、次の基準：（０）、疾病無し；（１）、尾の麻痺；（２）、後下肢の脱力；（３）、両後下肢の麻痺；（４）、完全な両後足の麻痺及び前肢の不全対麻痺；（５）、死亡；により毎日行った。ＣＮＳからの細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃからの神経組織解離キットを使用して、製造業者の推奨するプロトコルによって単離した。ＭＯＧ感作動物からの脾臓細胞をＣＤ４ビーズを使用して単離した。細胞をＡＰＣとしての放射線照射されたＴ枯渇脾細胞及び示された濃度のＭＯＧペプチドの存在下で、９６ウェルプレート中で再刺激した。３日目に、細胞を、３Ｈ−チミジンで６時間パルス標識し、そして次いで回収し、そしてシンチレーションカウンターで数えた。
【０３２２】
ｅ．Ｏｖａ誘導の肺炎症
[0340]０及び７日目に、マウスを、ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）との等体積の混合物中で乳化した、１００μｇのニワトリＯｖａ（Ｓｉｇｍａ）又はＰＢＳのいずれかを含有する、２００μｌの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射液によって全身的に感作した。肺炎症の評価のために、マウスを、１００μｇのＯｖａ又はＰＢＳ／３０μｌ接種物で気管内（ｉ．ｔ．）に１４日目に、そして鼻腔内（ｉ．ｎ．）的に１５日目にチャレンジした。マウスを、最後のチャレンジ後４８−７２時間で安楽死させ、細胞浸潤、肺における細胞炎症、並びに血清及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のサイトカインレベルを評価した。ＢＡＬ液を、２０番ゲージの静脈内カテーテル、並びに５００μｌのＰＢＳ中の１％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（サイトカイン分析のため）及び７５０μｌのＰＢＳ中の１％ＦＢＳ（細胞浸潤の分析のため）による洗浄による、肺の直接カニューレ処置によって得た。サイトカイン分析のための試料は、−８０℃で保存した。細胞分析のための試料は、Ｋｗｉｋ−ｄｉｆｆ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｎｄｏｎ）による染色後、差次細胞分析のためにサイトスピン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）として調製し、そして一部は、全細胞数を決定するために使用した。肺の組織診断は、先に記載されているように（ＭｃＣｏｎｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、マスクされた実験条件でリーダー（reader）によって採点された。
【０３２３】
ｆ．トキソプラズマ感染
[0341]ＭＥ−４９株からのＴ．ｇｏｎｄｉｉシストを、感染したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳から調製した。実験的感染のために、マウスを、平均２０個のシスト／動物でｉ．ｐ．で接種した。感染後７週間目に、個々の感染した動物の脳中のシストの数を決定した。脾臓細胞を回収し、培養し、そして抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８又は５μｇ／ｍｌのＳＴＡｇのいずれかで刺激した。上清を７２時間後に回収し、そしてサイトカイン産生について分析した。
【０３２４】
ｇ．サイトカイン及び免疫グロブリン測定
[0342]ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−１７を産生する細胞の検出を、抗ＩＦＮ−γ−ＡＰＣ、抗ＩＬ−４−ＰＥ、抗ＩＬ−１７−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する細胞内サイトカイン染色によって決定した。簡単には、細胞を、５時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８又はホルボールミリステートアセテート及びイオノマイシンで刺激し、２時間後にモネンシンを添加した。細胞を、３％のパラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％のサポニン中で透過処理し、そしてＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。細胞培養上清中のサイトカイン産生を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。血清免疫グロブリンを、ＥＬＩＳＡによって製造業者（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ）の説明書に従って測定し、そしてＯＶＡ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＥを、５０μｌのＯＶＡ（１００μｇ／ｍｌ）で被覆されたプレートを使用するＩｇＧ１又はＩｇＥ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３２５】
ｈ．樹状細胞及びＴ細胞におけるＴＬ１Ａ誘導
[0343]Ｃ５７ＢＬ／６マウス及び示されたノックアウトマウスからの骨髄由来ＤＣ、又は脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを培養し、そして１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、２０μｇ／ｍｌのＳＥＡ又は１０μｇ／ｍｌのＳＴＡｇを伴って又は伴わずに示された時間刺激した。Ｉｇ架橋による刺激を、０．５ｍｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で３７℃で１時間、続いて５０μｇ／ｍｌのヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で３７℃で１時間、プレートを被覆することによって行った。精製したＴ細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で示された時間刺激した。
【０３２６】
ｉ．定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの測定
[0344]全ＲＮＡを、細胞からＴｒｉＺＯＬ及びｐｕｒｅ  ｌｉｎｋＴＭ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ  ｍｉｄｉキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システムを使用して行った。事前設計されたプライマー／プローブのセットは、ＴＬ１Ａを除きＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手し、ＴＬ１Ａは、全長のＴＬ１Ａを認識するように設計したプライマーで検出した（順方向：ＣＣＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＣ；逆方向：ＧＧＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＡ；プローブ：ＴＣＧＧＧＣＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣ）。β２−マイクログロブリン又はＣＤ３−δに対して特異的なプローブを、内部対照として使用した。
【０３２７】
３．実施例３：ＴＬ１Ａ誘導炎症性腸疾患
[0345]ＴＬ１Ａの機能を評価するために、ＴＬ１Ａが、樹状細胞及びＴ細胞上に恒常的に発現する遺伝子導入マウスを産生した。Ｔ細胞のために、ヒトＣＤ２エンハンサー構築物（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．１９９５）の改良バージョンを使用し、そして樹状細胞特異的発現のために、ＣＤ１１ｃプロモーター構築物を使用した（Ｂｒｏｃｋｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．１９９７）。インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ標識を、導入遺伝子由来ＴＬ１ＡのｍＲＮＡ及びタンパク質の確認のために、ＴＬ１ＡのｃＤＮＡのＮ末端に付加した。導入遺伝子発現を、遺伝子導入マウスのそれぞれの樹立系統中で評価した。ＣＤ２−ＴＬ１Ａ構築物について、四つの系統（Ｒ１、Ｒ６、Ｕ８及びＺ９）は、ＣＤ３についてゲートしたＴ細胞中のＨＡ標識に対する細胞内フローサイトメトリーによって分析した脾臓及びリンパ節Ｔ細胞において、類似の検出可能なレベルのＴＬ１Ａ発現を有し、他の免疫細胞サブセットにおいてはＨＡ染色は検出されず、そしてその後の分析に使用した。ＣＤ１１ｃ−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスについて、幅広い範囲の発現があった。内因性ＴＬ１Ａに対する導入遺伝子の発現は、２から５００倍を超えるまでの範囲であり、そして樹立系統（founder）を、８倍の過剰発現のカットオフに基づき、高及び低発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒｓ）に分けた。増加した数のＣＤ６９＋Ｔ細胞が、ＣＤ２及びＣＤ１１ｃ  ＴＬ１Ａ遺伝子導入系統の両方からの脾臓及びリンパ節中に存在した。自然発生的Ｔ細胞活性化は、ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットよりＣＤ４においてより顕著であった。これらの結果は、Ｔ細胞又はＤＣのいずれかにおけるＴＬ１Ａの調節解除が、自然発生的Ｔ細胞活性化及びＴ細胞恒常性の破壊をもたらすことを示す。
【０３２８】
[0346]ＣＤ１１ｃ−ＴＬ１Ａ及びＣＤ２−ＴＬ１Ａ系統の両方からの遺伝子導入マウスの更なる検査において、頻繁な腸浮腫及び小腸の至る所の腸壁の肥厚化の証拠が観察された。これらの特徴の発生率は、研究下のＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの四つの系統中で実質的に１００％であり、そしてＣＤ１１ｃ−ＴＬ１Ａ系統中の導入遺伝子発現のレベルと相関した。腸壁肥厚化、炎症性浸潤、杯状細胞過形成、絨毛の拡大及び正常な構造の歪を観察することができる（図２１）。これらの変化は、炎症性細胞浸潤、絨毛の伸長及び破壊、陰窩膿瘍及び筋層の肥厚化を包含するＴＮＢＳ大腸炎に対して開発された採点計画に従って、マウスの状態に対してブラインドの、経験のある観察者によって定量化された（Ｎｅｕｒａｔｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２０００）（図２１）。回腸末端は、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの両方において全体的検査及び組織病理の両方に最も顕著に関係し、結腸は比較的免れた（図２１Ｂ、Ｃ）。腸の炎症は、これらのマウスの体重減を伴い、これもまた、導入遺伝子の発現のレベルに依存した（図２１Ｃ）。
【０３２９】
[0347]これらの観察は、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスを、経壁性炎症及び回腸末端に対する偏向を含み、ヒトのクローン病と著しく類似した幾つかの特徴を伴う、炎症性腸疾患の新しい動物モデルとして確立する。興味あることに、多くの最近の報告は、潰瘍性大腸炎又はクローン病を持つ患者の生検標本の粘膜固有層中のＴＬ１Ａ及びＤＲ３の増加した発現を記載している。増加したＴＬ１Ａ及びＤＲ３発現は、ＳＡＭＰ１／ＹｉｔＦｃ及びＴＮＦΔＡＲＥ系統のＩＢＤの二つの他の動物モデルにおいても記述されている（Ｂａｍｉａｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｂａｍｉａｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２００６）。調節解除されたＴＬ１Ａ発現が、遺伝子導入マウスにおける自然発生的ＩＢＤを誘発することの発見と合わせれば、ＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用は、ＩＢＤの病変形成において重要でありえ、そしてＩＢＤ及び、リウマチ様関節炎を含むＴ細胞成分を伴う関連する炎症性疾病における、有望な治療標的を構成することができる。
【０３３０】
ｉ．病原性細胞種の特徴づけ及びＴＬ１Ａ駆動ＩＢＤにおける腸管内菌叢の役割。
【０３３１】
[0348]免疫組織化学及び免疫蛍光法による研究を、選択したＣＤ２−ＴＬ１Ａ及びＣＤ１１ｃ−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスからの組織切片について行った。最初の研究は、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスからの腸の冷凍切片を免疫染色することにより、抗ＣＤ３を用いてＴ細胞を、そしてＦ４−８０を用いてマクロファージを、局在化する。ＦＡＣＳ分析を、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスからの腸の関連する領域からの上皮内及び粘膜固有層のリンパ球標本について行う。αβ、γδ、及びＮＫＴ細胞を、ＮＫ細胞及びＢ細胞と共に数え上げ、そして活性化状態を、ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ７１表面マーカーで試験する。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇｓも、これらの試料において数え上げ、Ｔ細胞駆動免疫病理の他のモデルにおいて観察されているようなＴｒｅｇによる免疫逆制御における試みがあるか否かを決定する（Ｔａｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．２００６）。Ｔ細胞は、ＴＬ１Ａ受容体ＤＲ３を発現する主要な細胞種であるが、ＴＬ１Ａ発現は、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞中で見いだされている。従って、強制されたＴＬ１Ａは、これらのマウスにおいてＩＢＤを仲介することができる他の免疫細胞サブセットを拡大することができる。どのリンパ球サブセットがＴＬ１Ａ駆動大腸炎のために必要であるかを決定するために、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスを、異なったリンパ球の亜集団を欠くノックアウトマウスの各種の系統と交配させる。ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスを、先ずＲＡＧ欠損マウスと交配して、Ｔ、Ｂ及びＮＫＴ細胞に対する依存性を決定する。これらのマウスが炎症性腸疾患を欠く場合、ＴＬ１Ａ駆動ＩＢＤの依存性は、適応免疫系にあることを示している。次いで他の交配を行って、αβ  Ｔ細胞（ＴＣＲアルファノックアウト）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ１ｄノックアウト）、ＮＫ細胞（ＩＬ１５ノックアウト）及びＢ細胞（ＩｇＨノックアウト）マウスに対する要求性を決定する。αβ  Ｔ細胞がＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスにおけるＩＢＤに必要であることが見いだされた場合、異なったＴ細胞サブセットの寄与は、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスを、それぞれＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞を欠くクラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ欠損マウスと交配することによって試験することができる。Ｔ細胞が関係する場合、ＩＢＤは、ＴＬ１Ａによる非抗原特異的同時刺激の結果でありえ、又はさもなくば、特異的Ｔ細胞再刺激物質（ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｓ）（即ち、腸由来抗原に対する）が、疾病の誘導のために必要でありうる。これを試験するために、ＴＬ１Ａマウスを、ＯＴ−ＩＩ卵白アルブミン特異的ＴＣＲ遺伝子導入マウスのような関連性のない特異性を保有するＴＣＲ遺伝子導入マウスと交配する。自己反応性又は腸内菌叢反応性Ｔ細胞がＴＬ１Ａ駆動ＩＢＤのために必要な場合、これらのＴＣＲ導入遺伝子は、疾病を回復させることができる。
【０３３２】
ｉｉ．ＴＬ１Ａ駆動ＩＢＤにおける病原性サイトカインの特徴付け。
【０３３３】
[0349]炎症性腸疾患モデルが、幅広い範囲の異なったサイトカインに依存することが見いだされている（Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．２００７）。最初、興味は、インターフェロンγ及びＩＬ−１２に集中し、そして事実、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに対する抗体が、ヒト炎症性腸疾患及びマウスＩＢＤモデルにおいて有効である。更に最近、ｐ４０が、炎症性腸疾患において重要であることが示されているＩＬ−１２ファミリーのサイトカインであるＩＬ−２３の構成成分であることが発見されている。ＩＬ−２３は、好中球及び単球を強力に誘引し、そして活性化するサイトカインであるＩＬ−１７を産生するＴ細胞の分化及び／又は生存を向上させることによって少なくとも部分的に作用する（Ｆｕｓｓ  ＩＪ，ｅｔ  ａｌ．２００６；  Ｈｕｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．２００６；ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．２００６）。実験は、ＴＬ１Ａ誘導ＩＢＤにおいて発現する主なサイトカインを決定して、どのエフェクター細胞の集団がこの疾病において重要であるかを決定し、そして慢性のＴＬ１Ａ刺激の効果をよりよく理解するために行った。ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの回腸及び腸の他の領域から抽出したＲＮＡからのサイトカインの定量は、ＩＬ−１７及びＩＬ−１３の一致した上昇を明らかにした（図２１Ｅ）。興味あることに、Ｔ細胞のＴｈ１７サブセットによって産生されるもう一つのサイトカインであるＩＬ−２２は、検出可能ではなく、そしてＴｈ１細胞の特徴的産物であるＩＦＮ−γも、対照を超えて上昇しなかった。腸間膜のリンパ節中のＴ細胞の試験は、ＩＬ−１７を産生するＴ細胞が、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４と比較して、対照を超えて最も上昇したことを明らかにした。次いで、抗サイトカイン抗体を遮断すること又は特定のＴ細胞サブセットの発生のために重要であることが知られた遺伝子（例えば、ＩＬ−１７、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＲＯＲ−γ）のノックアウトマウスを、サイトカイン及びＴｈ細胞のサブセットのどれが、ＴＬ１Ａ駆動ＩＢＤの発生のために必要であるかを決定するために使用することができる。
【０３３４】
ｉｉｉ．ＴＬ１Ａが制御性Ｔ細胞機能を遮断するか、又はＴ細胞をＴｒｅｇに対して耐性を与えるかの決定。
【０３３５】
[0350]ＴＬ１Ａが、天然のＴｒｅｇの産生又は機能に影響するか否かは知られていない。リウマチ様関節炎において、関連するサイトカインＴＮＦは、ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の機能をその数によらず障害することが示された（Ｎａｄｋａｒｎｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．２００６）。Ｆｏｘｐ−３陽性Ｔｒｅｇは、ＤＲ３ノックアウトマウス中に正常な数で存在し、そして興味あることに、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの腸間膜リンパ節中に増加した数で存在する。増加した数の活性化されたＣＤ２５＋Ｔ細胞を有するＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスからのＴｒｅｇの単離を援助するために、ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスの選択された系統を、ＦＯＸＰ３−ＧＦＰレポーターマウスと交配して、ＦＯＸＰ３陽性Ｔｒｅｇのみがこれらの実験で研究されることを確実にする。ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウスから単離されたＴｒｅｇを、その機能について分析し、そしてＴＬ１Ａが、正常なＴｒｅｇの抑制機能を遮断することができるか否かも、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入レスポンダー細胞（Ｔｒｅｓｐ）の使用、及びＴｒｅｇ／Ｔｒｅｓｐ培養物へのＴＬ１Ａの添加によって試験する。Ｔｒｅｇ機能のｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイも行い、ここで、Ｔｒｅｇは、ナイーブＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞と共に免疫不全宿主に移植される（Ｐｏｗｒｉｅ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．１９９３）。双方向実験を、ＣＤ２−ＴＬ１Ａ遺伝子導入マウス由来のＴｒｅｇ又はナイーブＴ細胞のいずれかを用いて行い、ＩＢＤを起こすＴｒｅｇ機能又はナイーブＴ細胞の能力が、ＴＬ１Ａによって影響されるか否かを決定する。
【０３３６】
ｉｖ．ＩＢＤの発症におけるＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用の必要性。
【０３３７】
[0351]ＤＲ３が、導入遺伝子由来ＴＬ１Ａの非存在下における大腸炎の発症のために必要であるか否かも決定する。ハプテンＴＮＢＳの直腸内投与によって誘導された大腸炎は、徹底的に特徴づけされている。大腸炎がＴ細胞を必要とし、そしてＴＮＦ及びＩＬ−１２ｐ４０にも依存することが知られている（Ｎｅｕｒａｔｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ，ｅｔ  ａｌ．１９９７）。最近の証拠は、更に、ＩＬ−２３標的サイトカインＩＬ−１７を、この実験的疾病の病理に関係づけている（Ｚｈａｎｇ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＥＡＥ及びＯｖａ誘導喘息に対する耐性は、ＤＲ３欠損マウスが、同腹仔の対照と比較して、ＴＮＢＳ大腸炎に耐性でありうることを示す。これらの実験を行うために、ＤＲ３  ＫＯマウスを、感受性のＣ５７Ｂｌ／１０系統に戻し交配する。或いは、戻し交配が進行している間に、感受性マウスを、ＴＮＢＳ大腸炎の誘導の前又は後にＴＬ１Ａ遮断抗体で処理する。ＤＲ３欠損Ｔ細胞を、大腸炎の移植モデルにおいて免疫不全宿主に更に移植し、Ｔ細胞上のＤＲ３がこの大腸炎のモデルに必要であるか否かを決定する。
【０３３８】
実施例３
[0352]ＴＬ１Ａは、リウマチ滑膜中で検出されている。本発明者等は、ヒトＴＬ１Ａに対する新規なモノクローナル抗体を使用し、他のリウマチ性疾病に対してＲＡについて、ＴＬ１Ａを誘導する因子、及び滑液（ＳＦ）又は血液中の上昇したＴＬ１Ａレベルの特異性を決定した。マウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて、本発明者等は、ＴＬ１Ａに対する中和抗体でＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用を遮断し、そして抗コラーゲン抗体、臨床的関節炎症、及び浸食に対するＴＬ１Ａ遮断の効果をマイクロＣＴによって測定した。ＴＬ１Ａは、Ｆｃ受容体架橋によって、そしてより少ない程度で、ヒト単球中の細胞膜ＴＬＲによって誘導された。他のリウマチ性疾病と比較して、ＴＬ１Ａの有意に高い血液及びＳＦレベルが、ＲＡを持つ患者において観察された。血漿ＴＬ１Ａは、ＳＦのＴＬ１Ａレベルの予測的なものであった。然しながら、ＳＦのＴＬ１Ａは、ＲＡ患者のＴＮＦ及び疾病の活動性とは独立に上昇した。ＴＬ１Ａの遮断は、ＣＩＡにおける臨床的関節スコアの減少において有効であり、そして足の膨潤に対する効果とは独立に骨の浸食を劇的に減少させた。ＴＬ１Ａは、ヒト及びマウスの自己免疫性関節炎の両方において、特に浸食の病変形成において重要である。本発明者等は、ＴＬ１Ａ遮断を、ＴＮＦとは独立に作用する、ＲＡのための強力な疾患修飾治療として開示する。
【０３３９】
[0353]単球細胞培養及び刺激    正常なドナーからの水簸された単球を、ＮＩＨ輸血治療部門からＮＩＨのＩＲＢ認可臨床プロトコル下で得た。単球を、１０％ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ培地中の１×１０６細胞／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で培養した。規定された時点で、培養上清をＴＬ１Ａの測定のために収集し、そして細胞をＴＬ１ＡのｍＲＮＡの測定のためのｑＲＴ−ＰＣＲのために回収した。ＬＰＳ（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒ５９５，Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）を、示された濃度で加えた。免疫複合体による刺激を、先に記載したように行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ｑＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ，Ｌｏｗ  ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システムを使用して行った。事前設計されたプライマー／プローブのセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手し、そして全長のＴＬ１Ａを検出するために設計された配列は、順方向：５’−ＣＣＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＣ−３’；逆方向：５’ＧＧＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＡ３’；プローブ：５’−ＴＣＧＧＧＣＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣ−３’）である。それぞれの測定値を、β２−マイクログロブリンの発現に対して正規化した（デルタＣｔ）。次いで、２＾デルタＣｔを、遺伝子発現のレベルとして使用した。遺伝子発現レベルは、非刺激細胞中に存在するレベルに対して正規化した。
【０３４０】
[0354]ヒトの試料    同時の滑液及び血漿試料を、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｃｏｕｎｔｙ  ＋  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＩＲＢ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＨＳ−０５−００２７０）で得た。関節浸出の根底にある原因を、病歴、身体検査、及び滑液の分析によって決定した。治療データは、入手不可能であった。骨関節炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎、痛風及び偽性痛風を持つ患者からの滑液を、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙクリニックで得た、廃棄された確認不能（ｄｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）の匿名の臨床試料から得た。治療データは入手不可能であった。ＨＳＳにおける全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者からの血清は、他の研究から先に収集していた。人口統計データ及びＳＬＥ疾患活動性データ（ＳＥＬＥＮＡ−ＳＬＥＤＡＩ）は、その臨床訪問時に記録した。全てのデータは、確認不能にし、そして全ての患者は、採血の前に、ＩＲＢ認可のインフォームドコンセントに署名した。シェーグレン病の患者の血清試料を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  （ＮＩＨ）のＤｒ．Ｇａｂｏｒ  Ｉｌｌｅｉから、ＩＲＢ認可プロトコル番号９９−Ｄ−００７０及び８４−Ｄ−００５６下で得た。ＲＡ患者からの血清試料は、ＮＩＨのＤｒ．Ｒａｐｈａｅｌａ  Ｇｏｌｄｂａｃｈ−Ｍａｎｓｋｙによって、ＩＲＢ認可プロトコル番号００−ＡＲ−０２２２下で提供された。強直性脊椎炎（ＡＳ）患者の血清試料は、ＮＩＨのＤｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗａｒｄによって、ＩＲＢ認可プロトコル番号０３−ＡＲ−０１３１下で提供された。
【０３４１】
[0355]ＥＬＩＳＡによるＴＬ１Ａの測定    商業的に入社可能なヒトＴＬ１ＡのＥＬＩＳＡキット（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ｃａｔ  ｎｏ．９００−Ｋ２９０）を、細胞培養上清中のＴＬ１Ａを測定するために使用した。適合血漿及び滑液試料中のヒトＴＬ１Ａを測定するために、次のようにＥＬＩＳＡを行った：９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中の１ｕｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＴＬ１Ａ（クローン１Ａ９）で、一晩４℃で被覆した。プレートを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で、１時間ブロッキングした。２２５ｕＬの試料希釈液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０倍に希釈された２５ｕＬの試料を、それぞれのウェルに入れ、そしてプレートを、２時間３７℃でインキュベートした。ＴＬ１Ａを、ポリクローナルなビオチン化ウサギ抗ヒトＴＬ１Ａ  Ａｂで、続いて０．５ｕｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）によって、１時間３７℃で検出した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を基質として使用した。反応を、１００ｕＬの１Ｎの硫酸で停止させ、そしてＯＤ４５０ｎｍを測定した。標準曲線を、標準希釈液（加えられた１０％のプールされた正常なヒト血清を伴う試料希釈液）中で希釈された組換えヒトＴＬ１Ａ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を使用して作成した。独立のビーズベースアッセイ系を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＣＯＯＨビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に結合した抗ヒトＴＬ１Ａ抗体（クローン１Ａ９）を使用して開発した。３０００個の抗ＴＬ１Ａ結合ビーズを、続いて５０ｕＬの血清又は滑液を、９６ウェルのフィルタープレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＴＳＴＭ  ｂｙ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ．ＭＳＢＶＮ１２５０）のそれぞれのウェルに加えた。滑液を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ  ｎｏ．１７１−３０５０００）を使用して２倍に希釈した。試料及び標準を、３０分間インキュベートし、続いて２５ｕＬの１ｕｇ／ｍＬのビオチン化ポリクローナル抗ヒトＴＬ１Ａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｃａｔ  ｎｏ．５００−Ｐ２４０Ｂｔ）、及び５０ｕＬの１：１００に希釈されたＳＡ−ＰＧ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１７１−３０４００１）と共に３０分間インキュベートした。それぞれのウェルを１２５ｕＬのアッセイ緩衝液で再懸濁し、そしてサイトカインレベルを、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。データを、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）ソフトウェアを使用して解析した。ＴＮＦアッセイのために、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＴＮＦ−αセットを、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ  ｎｏ．１７１−Ｂ５０２６Ｍ）の説明書に従って使用した。
【０３４２】
[0356]コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の誘導及び遮断試薬の投与    Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得たオスのＤＢＡ／１Ｊマウス（生後８−１０週）に、完全フロイントアジュバント中の１００μｇのニワトリコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ）（１：１、容量／重量）を、尾の付け根に０日目に皮内注射し、そして２１日目に不完全フロイントアジュバント中の１００μｇのＣＩＩ（１：１、容量／重量）の皮内注射でブーストした。次いでマウスを、対照又は治療のいずれかを受けるために２１日目に無作為化した。治療群のマウスには、２１日目に開始される７日毎の２０ｍｇ／ｋｇのハムスター抗マウスＴＬ１Ａ抗体（クローン５Ｇ４．６）をｉ．ｐ．注射した。対照群のマウスは、２０ｍｇ／ｋｇのハムスター免疫グロブリンを受けた。マウスを４９日目に安楽死させた。後足を膝の上で切断し、そして１０％ホルムアルデヒドで固定した。動物は、ＮＩＡＭＳのＡＣＵＣによって認可されたプロトコル下で使用した。
【０３４３】
[0357]ＣＩＡ中の関節炎の臨床重篤度の評価    関節炎の発症を、先に記載した０−４の尺度で、それぞれの足の肉眼的採点によって評価した。採点は無作為化に対してブラインドの二人の別個の研究者によって行われ、そしてそれぞれのマウスの平均スコアを使用した。
【０３４４】
[0358]抗ニワトリコラーゲンＩｇＧを測定するためのＥＬＩＳＡ    ９６ウェルの平底プレートを、１００ｕＬの０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ−０．２Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解させた５０ｕｇ／ｍＬのニワトリコラーゲンで、一晩４℃で被覆した。プレートを、２００ｕＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）で、３０分間室温でブロッキングした。試料希釈液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）により１：１００から１：１２５００までの５倍連続希釈された血清の５０ｕＬの試料を、二連でウェルに入れ、そしてプレートを２時間室温でインキュベートした。抗体を、５ｎｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ．ｎｏ．１８５８４１３）で、１時間室温で検出し、そして基質検出キット（Ｒ＆Ｄ  ｃａｔ．ｎｏ．ＤＹ９９９）で検出し、５０ｕＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４によって停止させ、ＯＤ４５０を測定した。
【０３４５】
[0359]マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロ−ＣＴ）及び浸食の評価    ＣＩＡ実験からの足を、これらが走査されるまで１０％ホルムアルデヒド中で保存した。マウスの解剖のマイクロ−ＣＴを、４４ｋＶ／２２マイクロアンペアにバイアスされたＸ線源（焦点サイズ４マイクロメートル、エネルギー範囲２０−１００ｋＶ）を伴い、そしてビーム硬化を減少させるために０．５ｍｍのアルミニウムフィルターを伴う、ＳｋｙＳｃａｎ  １１７２  Ｍｉｃｒｏ  Ｘｒａｙ  ＣＴスキャナー（ＭｉｃｒｏＰｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ  ＰＡ，ＵＳＡ，ＳｋｙＳｃａｎ，Ｋｏｎｔｉｃｈ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で行った。画像は、カメラと線源の距離２２０ｍｍ及び対象物と線源の距離１１６ｍｍで、１２．１７マイクロメートルのボクセルサイズで取得した。４５０の投射を、１８０度の回転により、０．４度の角分解能で取得した。フレーム当たり２９５ｍｓの暴露時間でそれぞれの投射Ｘ線画像について、平均８フレームを平均した。走査期間は概略４０分であった。断層画像を、フェルトカムプコーンビームアルゴリズムに基づく業者供給のソフトウェアを使用して再構築した。次いで再構築した画像を、ＣＴＡｎ（ｖ．１．１０）を使用して三次元画像に作成し、次いでＣＴＶｏｌ（ｖ．２．１）（ＳｋｙＳｃａｎ）を使用して可視化した。三次元画像を、記載した採点系に基づいて二人の別個の研究者によって、確認不能な３−Ｄ再構築物で採点した。
【０３４６】
[0360]Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）架橋及びＴＬＲリガンドは、ヒト単球中のＴＬ１Ａ発現を誘導する。ＲＡにおいて、免疫複合体によるＦｃＲ架橋及び内因性リガンドによるＴＬＲの刺激は、関節中の単球及び他の自然免疫細胞を刺激することによって炎症を持続しうる。従って、本発明者等は、ヒト単球によるＴＬ１Ａの発現を誘導するための免疫複合体及びＴＬＲリガンドの能力を試験した。ＦｃＲ架橋及びＬＰＳの両方は、１８時間でピークとなり、そして次いで急速に減退するレベルを伴って、ｍＲＮＡレベルでＴＬ１Ａを誘導し、これはＴＬ１ＡのｍＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在するＡＵリッチ領域によって支配されるＴＬ１ＡのＲＮＡの分解と一致した。ＴＬ１Ａ誘導のピークは、ＬＰＳの最適濃度後より、ＦｃＲ架橋後が約６倍高かった。タンパク質レベルで、ＦｃＲ架橋は、１８時間で検出可能となる高いレベルのＴＬ１Ａを誘導し、一方、ＬＰＳ誘導ＴＬ１Ａは、４８時間で検出可能であるのみであり、ＴＬ１Ａ産生は、ＦｃＲ架橋によるより、ＬＰＳの最適投与量による方が概略１０倍低い。ＴＬＲは、これらがアダプタータンパク質ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、又は両方に接続するシグナル伝達経路を活性化するか否かによってサブクラスに分けることができる。これらのシグナル伝達経路のどれがＴＬ１Ａ発現の誘導において重要であるかを決定するために、本発明者等は、ヒト単球を、それぞれの受容体に対して特異的なＴＬＲリガンドの一団で刺激した。ＴＬＲ１、２、４、及び６による刺激は、ＴＬ１Ａを誘導することにおいて最も効率的であり；ＴＬＲ５及び９は中間であり；そしてＴＬＲ３、７、及び８による刺激は、ＴＬ１Ａ産生に対して効果がなかった。これらの結果は、ＴＬＲ３、７及び８がＭｙＤ８８を十分に活性化しないことから、ＭｙＤ８８依存性の急速なＮＦ−ｋＢ上方制御がＴＬ１Ａ誘導において重要であることと一致する。これらの結果は、ＬＰＳに反応するＴＬ１Ａ産生が主としてＭｙＤ８８に依存するマウスＤＣで得られたものとも一致する。
【０３４７】
[0361]ＴＬ１Ａは、滑液又は血液中のリウマチ様関節炎に対するバイオマーカーである    Ｉｎ  ｖｉｖｏのＴＬ１Ａ産生を促進する免疫複合体の強力な能力を仮定して、本発明者等は、このサイトカインが、ＲＡ中で優先的に上昇することができ、ここで、リウマトイド因子（ＲＦ）及び他の免疫複合体が、自然免疫細胞を刺激すると推論した。この目標のために、本発明者等は、ＲＡ（３１人の患者からの３９個の試料）又は乾癬性関節炎、結晶性関節炎、反応性関節炎、骨関節炎、非特異的炎症性関節炎、若年性炎症性関節炎、又は感染性関節炎を含む他の種類の関節炎（３１人の患者から３７個の試料）を持つ患者のコホートからの血漿及びＳＦの適合試料中のＴＬ１Ａレベルを測定した。ＲＡ患者からのＳＦ試料の大部分（３９個中の２７個）は、０．１ｎｇ／ｍＬより上のＴＬ１Ａレベルを有しており、平均０．５９ｎｇ／ｍＬ、そして３．２５ｎｇ／ｍＬまでが検出された。対照的に、３７個の非ＲＡ試料のうち２個（反応性関節炎を持つ患者及び乾癬性関節炎を持つ患者から一人ずつ）のみが、０．１ｎｇ／ｍＬより多いＴＬ１Ａを含有していた。血漿中では、より少ないが、しかしなお有意なパーセントのＲＡ患者が、上昇したＴＬ１Ａレベルを有し、一方、他の関節炎を持つ患者からの試料は、検出可能なＴＬ１Ａレベルを有していなかった。５人のＲＡ及び５人の非ＲＡ患者は、このコホートに対して一つより多い試料を寄与した。ＳＦ中では、ＴＬ１Ａレベルは、ＳＦ収集の日によって変動した。然しながら、血漿中では、患者のＴＬ１Ａレベルは、繰返し測定でかなり一定のままであり、高く上昇する（＞２ｎｇ／ｍＬ）か、又は０．１ｎｇ／ｍＬより低いかの何れかであった。これは、繰返し滑液吸引にかけられる患者の中の関係する関節の間での、炎症の可変性を反映している可能性がある。上昇したＴＬ１Ａは、試料収集の時点における疾病活動性より、より重度の疾病及び浸食を予測する抗ＣＣＰのようなマーカーとより良く相関した。抗ＣＣＰ抗体について試験したＲＡ患者中で、陽性の抗ＣＣＰを持つもの（ｎ＝１５）は、ＳＦ中の有意に高いレベルのＴＬ１Ａを有し（ｐ＝０．０３９）、そして持たないもの（ｎ＝４）よりも高い血漿中のＴＬ１Ａに向かう傾向を有していた（ｐ＝０．１２９）。ＲＦを持つ又は持たないＲＡ患者間のＳＦ及び血漿中のＴＬ１Ａレベルを比較することは、このコホートの患者の殆どが、血清陽性であったことから、実行可能ではなかった。更に、血清陰性の患者（ｎ＝２）は、ＳＦ及び血漿中の両方に殆ど検出不可能なＴＬ１Ａを有し、ＴＬ１Ａが、ＲＦを持つ患者において優先的に上昇しうることを示唆した。然しながら、ＲＦ又は抗ＣＣＰの定量的レベルは、血漿又はＳＦ中のＴＬ１Ａレベルと相関しなかった。更に、ＳＦ又は血漿中のＴＬ１Ａレベルは、ＤＡＳ−２８スコア、ＥＳＲ、ＣＲＰ、又は圧痛／膨張関節の数を含む臨床的重篤度の測定値と相関せず、ＳＦのＴＬ１Ａレベルも、ＳＦのＷＢＣ数と相関しなかった。ＳＦ（びらん性で平均０．６８ｎｇ／ｍＬに対して非びらん性で０．５５ｎｇ／ｍＬ）及び血漿（びらん性で平均１．０９ｎｇ／ｍＬに対して非びらん性で０．２５ｎｇ／ｍＬ）の両方においてより高いＴＬ１Ａ（ｎ＝９）に向かう傾向があった。注目すべきことに、３９個の適合ＲＡ血漿及びＳＦ試料中の血漿及びＳＦのＴＬ１Ａレベル間に直線的相関が存在し（Ｒ２＝０．５２、ｐ＜０．０００１）、血清ＴＬ１Ａが、関節中のＴＬ１Ａに対する代替でありうることが示された。これらの発見の一般化の可能性を決定するために、本発明者等は、ＲＡ又は他の関節炎疹を持つ患者の独立のコホートからのＳＦ試料において、ビーズベース蛍光ＴＬ１Ａアッセイにより、ＴＬ１Ａを測定した。このアッセイ及び使用されたものの間のアッセイ間の変動性は、１００ｐｇ／ｍｌより上の値を持つ試料について１０％より小さく、そしてこのビーズベースアッセイは、１０ｐｇ／ｍｌのように低いＴＬ１Ａレベルを検出する更なる性能を有していた。この二番目のコホートにおいて、ＳＦのＴＬ１Ａレベルは、骨関節炎（ＯＡ）、痛風又は偽性痛風、或いは乾癬性関節炎（ＰｓＡ）を持つ患者よりＲＡにおいて有意に高かったが、他の炎症性関節炎疹におけるＳＦのＴＬ１Ａのレベルも、ＯＡより有意に高かった。ＲＡにおける重要な病原性サイトカインであるＴＮＦは、内皮細胞、軟骨細胞、および滑膜繊維芽細胞中のＴＬ１Ａ発現を誘導することができるが、ＴＮＦ及びＴＬ１ＡのＳＦレベルは、１７個の試験されたＲＡ試料中で相関しなかった。従って、ＳＦ中のＴＬ１Ａ発現に対する、ＴＮＦに無関係な成分があるように見受けられる。ＲＡは、循環している免疫複合体に関連する唯一のリウマチ性疾患ではない。クロマチンの成分と複合した抗核抗体（ＡＮＡ）は、ＳＬＥ及びシェーグレン症候群に関連する。血清ＴＬ１Ａレベルがこれらの疾患においても上昇しているか否かを決定するために、本発明者等は、シェーグレン症候群及びＳＬＥを持つ患者からの血清を、幅広い範囲の疾患活動性に対して試験し、そして健康な志願者からの血清に対するＲＡ患者の独立のコホートからの血清のものと比較した。血清ＴＬ１Ａレベルは、正常な対照と比較して、ＲＡを持つ患者において有意に上昇し、彼らの誰も検出可能な血清ＴＬ１Ａを有していなかった。このＲＡ患者のコホートにおいて、抗ＴＮＦ治療状態は、ＴＬ１Ａ値と相関しなかった。血清ＴＬ１Ａレベルは、シェーグレン症候群において上昇したが、しかしＲＡにおいて観察される程度ではなかった（ＲＡ対シェーグレン、ｐ＝０．０００６）。更に、ＴＬ１Ａは、３人のＳＬＥ患者を除く全ての血清中で検出不可能であった。それぞれのこれらの３人のＳＬＥ患者は、高いＳＬＥＤＡＩレベル（８−１２）を有し、そしてこれらのうち二人は、試料収集の時点で関節炎性紅斑を有していた。更なる対照として、本発明者等は、循環免疫複合体と関連しない、強直性脊椎炎（ＡＳ）を持つ患者の血清中のＴＬ１Ａのレベルを測定した。ＡＳ血清の少数部分のみが、１００ｐｇ／ｍｌより高いレベルでＴＬ１Ａを含有していた。ＴＬ１Ａは、ＲＡより有意に少なく上昇していた（ＲＡ対ＡＳのｔ検定、ｐ＝０．０００３）。然しながら、シェーグレン症候群のように、ＴＬ１Ａは、健康な対照と比較して、ＡＳ患者の血清中でなお有意に上昇していた。ＴＬ１Ａレベルと、ＡＳにおける影響された末梢関節の数、脊椎強直症の程度、抗ＴＮＦ治療又は全体的疾患活動性との相関はなかった。まとめれば、これらの結果は、ＲＡが、他のリウマチ性疾病がそうであるより、増加したＴＬ１Ａレベルとより強力に関連し、そして上昇した血清ＴＬ１Ａは、炎症性関節炎の状況における血清陽性ＲＡに対するバイオマーカーと考えることができることを示す。
【０３４８】
[0362]ＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用を遮断することは、ＣＩＡにおける臨床的結果及び骨の浸食を改善する。従来の研究は、マウスＣＩＡにおけるＴＬ１Ａの有益な効果を見出しているが、しかしＴＬ１Ａ遮断の骨の浸食に対する影響は、定量化されていない。これらの目標のために、本発明者等は、拮抗性抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体を、ＤＢＡ／１マウスに、ＣＩＡにおいて抗原でブーストする時点で投与した。全関節スコアの有意な減少が、続く２８日間に、特に初期の時点で観察された。関節炎の測定可能な臨床徴候の開始は、抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂによって有意に遅延された。興味あることに、抗ＴＬ１Ａで治療されたマウスの臨床重篤度の減少は、抗コラーゲン抗体の力価の減少と関連しなかった。まとめれば、これらのデータは、ＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用を遮断することは、コラーゲン免疫原に対する全身性免疫反応に影響せずに、ＣＩＡの臨床的炎症性の徴候を強力に減少させることを示す。ＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用を遮断することは、ＣＩＡの臨床重篤度を明白に改善することから、本発明者等は、これらの治療が、骨浸食も防止するか否かを評価した。本発明者等は、浸食の定量的及び包括的評価を得るために、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロ−ＣＴ）を使用した。抗ＴＬ１Ａ治療は、ＣＩＡを発症するように誘導されたマウスの後足における浸食を劇的に減少させた。後足のそれぞれの関節における関節周囲の浸食及び変形を考慮した採点法による後足の浸食の定量化は、ＴＬ１Ａ治療マウスにおける平均及び最大浸食スコアの有意な減少を示した。減少は、ＭＴＰ関節（＊ｐ＝０．０４２）及び爪先（＊ｐ＝０．０１５）において特に顕著であった。更に、全身性の変形は、対照群においてのみ起こった（治療群における０％に対して２０％）。印象的なことに、抗ＴＬ１Ａで治療されたマウスにおける浸食は、同様な最大臨床スコアを伴って、足で有意に減少した（最大臨床スコアに関係ない治療効果に対する二元配置ＡＮＯＶＡのｐ＜０．０００１、治療に対してｐ＜０．０００１、そして最大臨床スコアに対してｐ＜０．０００１）。これは、抗ＴＬ１Ａ抗体治療は、臨床的な関節炎の阻害によって浸食を減少させるだけでなく、臨床的関節スコアによって測定されるように炎症に無関係な浸食に対する保護も提供することを示す。
【０３４９】
Ｈ．参考文献
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[0367]Ｂａｄｏｕｒ  Ｋ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｓｈｉ  Ｆ，Ｌｅｎｇ  Ｙ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ，Ｓｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ  ＫＡ．Ｆｙｎ  ａｎｄ  ＰＴＰ−ＰＥＳＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＷＡＳｐ）ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ＷＡＳｐ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００４；１９９（１）：９９−１１２．
[0368]Ｂａｍｉａｓ，Ｇ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．，３ｒｄ，Ｍａｒｉｎｉ，Ｍ．，Ｈｏａｎｇ，Ｓ．，Ｍｉｓｈｉｎａ，Ｍ．，Ｒｏｓｓ，Ｗ．Ｇ．，Ｓａｃｈｅｄｉｎａ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｉｅｌ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｉｚｅ，Ｊ．，Ｂｉｃｋｓｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＴＬ１Ａ，ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｔｈ１−ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１，４８６８−４８７４．
[0369]Ｂａｍｉａｓ，Ｇ．，Ｍｉｓｈｉｎａ，Ｍ．，Ｎｙｃｅ，Ｍ．，Ｒｏｓｓ，Ｗ．Ｇ．，Ｋｏｌｌｉａｓ，Ｇ．，Ｒｉｖｅｒａ−Ｎｉｅｖｅｓ，Ｊ．，Ｐｉｚａｒｒｏ，Ｔ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｏｍｉｎｅｌｌｉ，Ｆ．（２００６）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＴＬ１Ａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＲ３  ｉｎ  ｔｗｏ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｌｅｉｔｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．
[0370]Ｂａｕｍ  Ｗ，Ｋｉｒｋｉｎ  Ｖ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ（ＦａｓＬ）ｄｏｍａｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＳＴＰＩＰ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦａｓＬ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５；２８０（４８）：４００１２−２４．
[0371]Ｂｌｏｔｔ  ＥＪ，Ｂｏｓｓｉ  Ｇ，Ｃｌａｒｋ  Ｒ，Ｚｖｅｌｅｂｉｌ  Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＧＭ．Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ  ｖｉａ  ａ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００１；１１４（Ｐｔ  １３）：２４０５−１６．
[0372]Ｂｒｏｃｋｅｒ  Ｔ，Ｒｉｅｄｉｎｇｅｒ  Ｍ，Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ  Ｋ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９７；１８５（３）：５４１−５０．
[0373]Ｂｒｕｉｊｎ  ＬＩ，Ｂｅｃｈｅｒ  ＭＷ，Ｌｅｅ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．ＡＬＳ−ｌｉｎｋｅｄ  ＳＯＤ１  ｍｕｔａｎｔ  Ｇ８５Ｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＳＯＤ１−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  １９９７；１８（２）：３２７−３８．
[0374]Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ，Ｍ．Ａ．，ｄａ  Ｓｉｌｖａ，Ｇ．Ｐ．，Ｔｉｎａｚｚｉ，Ｉ．，Ｆａｃｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｓｃａｐｉｎｉ，Ｐ．，Ｃａｌｚｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｔａｍａｓｓｉａ，Ｎ．，Ｗｅｉ，Ｐ．，Ｎａｒｄｅｌｌｉ，Ｂ．，Ｒｏｓｃｈｋｅ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦ−ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＴＬ１Ａ）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，７３２５−７３３３．
[0375]Ｃｈａｋｒａｂａｎｄｈｕ  Ｋ，Ｈｅｒｉｎｃｓ  Ｚ，Ｈｕａｕｌｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆａｓ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２００７；２６（１）：２０９−２０．
[0376]Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．，Ｙｕ，Ｇ．Ｌ．，Ｌｙｏｎｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｇａｒｇ，Ｍ．，Ｄｕａｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｘｉｎｇ，Ｌ．，Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．，Ｎｉ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．（１９９６）．Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＲ３，ａ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＴＮＦＲ−１  ａｎｄ  ＣＤ９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９０−９９２．
[0377]Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．（２００３）．Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦＲ  ｆａｍｉｌｙ：ｋｅｙｓ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，６０９−６２０．
[0378]Ｄａｇｎａｅｓ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｆ．，Ｈｏｌｓｔ，Ｈ．Ｕ．，Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｍ．，Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．，Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ａ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｕ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｇ．（２００２）．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）８０，６６５−６７０．
[0379]Ｄｅｒｒｙ  ＪＭ，Ｏｃｈｓ  ＨＤ，Ｆｒａｎｃｋｅ  Ｕ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  １９９４；７９（５）：ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ９２２．
[0380]Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｐ，Ｋｉｎｇ  ＩＬ，Ｓｅｇａｌ  ＢＭ．ＩＬ−１２  ｄｒｉｖｅｎ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｔｅｐ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６；１７３（１−２）：３５−４４．
[0381]Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ＳＳ，Ａｎｇｋｅｏｗ  Ｐ，Ｈｕａｎｇ  Ｊ，Ｏｚａｋｉ  Ｍ，Ｉｒａｎｉ  Ｋ．Ｒａｃ１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：  ｄｕａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２０００；１４（１２）：１７０５−１４．
[0382]Ｄｅｖａｄａｓ  Ｓ，Ｄａｓ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００６；２５（２）：２３７−４７．
[0383]Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ＮＡ，Ｂａｋｅｒ  Ａ，Ｊｅｆｆｒｉｅｓ  Ｎ，Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ  ＫＨ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｄｅｂｅｎｏｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００７；６（１０）：８７８−８６．
[0384]Ｄｕｐｕｉｓ−Ｇｉｒｏｄ  Ｓ，Ｍｅｄｉｏｎｉ  Ｊ，Ｈａｄｄａｄ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｎｔｅｒ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ５５  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２００３；１１１（５  Ｐｔ  １）：ｅ６２２−７．
[0385]Ｆａｕｒｅ  Ｓ，Ｓａｌａｚａｒ−Ｆｏｎｔａｎａ  ＬＩ，Ｓｅｍｉｃｈｏｎ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．ＥＲＭ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ＡＰＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；５（３）：２７２−９．
[0386]Ｆｅｉｇ  Ｃ，Ｔｃｈｉｋｏｖ  Ｖ，Ｓｃｈｕｔｚｅ  Ｓ，Ｐｅｔｅｒ  ＭＥ．Ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ９５  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＤＳ−ｓｔａｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｉｔｉａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２００７；２６（１）：２２１−３１．
[0387]Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＲＤ，Ｓｈｅｎ  Ｘ，Ｉｌｌｅｉ  ＧＧ，ｅｔ  ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００６；５４（７）：２１８４−９７．
[0388]Ｆｒｉｔｚｓｃｈｉｎｇ  Ｂ，Ｏｂｅｒｌｅ  Ｎ，Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ＣＤ９５  ｌｉｇａｎｄ−ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｏ  ＴＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１７５（１）：３２−６．
[0389]Ｆｕｓｓ  ＩＪ，Ｂｅｃｋｅｒ  Ｃ，Ｙａｎｇ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｔｈ  ＩＬ−１２ｐ７０  ａｎｄ  ＩＬ−２３  ａｒｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＩＬ−１２  ｐ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００６；１２（１）：９−１５．
[0390]Ｇａｕｄｅｔ  Ｓ，Ｊａｎｅｓ  ＫＡ，Ａｌｂｅｃｋ  ＪＧ，Ｐａｃｅ  ＥＡ，Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ  ＤＡ，Ｓｏｒｇｅｒ  ＰＫ．Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５；４（１０）：１５６９−９０．
[0391]Ｇａｖｅｔｔ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｍ．（１９９４）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，５８７−５９３．
[0392]Ｇｏｕｔ  Ｓ，Ｍｏｒｉｎ  Ｃ，Ｈｏｕｌｅ  Ｆ，Ｈｕｏｔ  Ｊ．Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３，ａ  ｎｅｗ  Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｔｏ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｐ３８  ａｎｄ  ＥＲＫ  ＭＡＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６（１８）：９１１７−２４．
[0393]Ｇｒｕｎｖａｌｄ，Ｅ．，Ｃｈｉａｒａｍｏｎｔｅ，Ｍ．，Ｈｉｅｎｙ，Ｓ．，Ｗｙｓｏｃｋａ，Ｍ．，Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｇ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｓ．Ｎ．，Ｇａｚｚｉｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒ，Ａ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４，２０１０−２０１８．
[0394]Ｈａｏ，Ｚ．，Ｈａｍｐｅｌ，Ｂ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．（２００４）．Ｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９，１３５５−１３６５．
[0395]Ｈｅ  Ｌ，Ｗｕ  Ｘ，Ｍｅｙｌａｎ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；１６４（６）：１９０１−１３．
[0396]Ｈｏｄｇｅｓ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｅｕｌｅ，Ｒ．Ｋ．（２００３）．Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ３，９１１−９１８．
[0397]Ｈｕｅ  Ｓ，Ａｈｅｒｎ  Ｐ，Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２３  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００６；２０３（１１）：２４７３−８３．
[0398]Ｈｕｍｂｌｅｔ−Ｂａｒｏｎ  Ｓ，Ｓａｔｈｅｒ  Ｂ，Ａｎｏｖｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；１１７（２）：４０７−１８．
[0399]Ｊｏｎｅｓ  ＲＧ，Ｅｌｆｏｒｄ  ＡＲ，Ｐａｒｓｏｎｓ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．ＣＤ２８−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ／Ａｋｔ  ｂｌｏｃｋｓ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００２；１９６（３）：３３５−４８．
[0400]Ｋａｍａｔａ  Ｈ，Ｈｏｎｄａ  Ｓ，Ｍａｅｄａ  Ｓ，Ｃｈａｎｇ  Ｌ，Ｈｉｒａｔａ  Ｈ，Ｋａｒｉｎ  Ｍ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ＴＮＦａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ＪＮＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  ２００５；１２０（５）：６４９−６１．
[0401]Ｋｉｍ  ＹＳ，Ｍｏｒｇａｎ  ＭＪ，Ｃｈｏｋｓｉ  Ｓ，Ｌｉｕ  ＺＧ．ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｘ１  ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００７；２６（５）：６７５−８７．
[0402]Ｋｉｍ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｌ．（２００５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ＴＬ１Ａ，ａ  ＴＮＦ−ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９８，１−８．
[0403]Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ＦＣ，Ｌｏｂｉｔｏ  ＡＡ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＭ，Ｓｃｒｅａｔｏｎ  ＧＲ．Ｆａｌｌｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ＴＲＡＰＳ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  ｔｈｅｒａｐｙ  ２００７；９（４）：２１７．
[0404]Ｌａｍｂｅｔｈ  ＪＤ．ＮＯＸ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；４（３）：１８１−９．
[0405]Ｌｅｃｏｃｑ，Ｍ．，Ａｎｄｒｉａｎａｉｖｏ，Ｆ．，Ｗａｒｎｉｅｒ，Ｍ．Ｔ．，Ｗａｔｔｉａｕｘ−Ｄｅ  Ｃｏｎｉｎｃｋ，Ｓ．，Ｗａｔｔｉａｕｘ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｊａｄｏｔ，Ｍ．（２００３）．Ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｔａｉｌ  ｖｅｉｎ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｏｒ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｖｏｌｕｍｅ．Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，１４２−１５６．
[0406]Ｌｉ  ＱＪ，Ｃｈａｕ  Ｊ，Ｅｂｅｒｔ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．ｍｉＲ−１８１ａ  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ２００７；１２９（１）：１４７−６１．
[0407]Ｌｏｂｉｔｏ  ＡＡ，Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ＦＣ，Ｍｕｐｐｉｄｉ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ＥＲ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ＴＮＦＲ１  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ＴＮＦＲ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＴＲＡＰＳ）．Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８（４）：１３２０−７．
[0408]Ｍａｉｌｌａｒｄ  ＭＨ，Ｃｏｔｔａ−ｄｅ−Ａｌｍｅｉｄａ  Ｖ，Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）Ｆｏｘｐ３（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００７；２０４（２）：３８１−９１．
[0409]Ｍａｎ  Ｓ，Ｕｂｏｇｕ  ＥＥ，Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ  ＲＭ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｆｅｗ  ｎｅｗ  ｔｗｉｓｔｓ  ｏｎ  ａｎ  ｏｌｄ  ｔａｌｅ．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００７；１７（２）：２４３−５０．
[0410]Ｍａｒｓｔｅｒｓ  ＳＡ，Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ＪＰ，Ｄｏｎａｈｕｅ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｏ−３，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ，ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９６；６（１２）：１６６９−７６．
[0411]Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｏｒｅｎｚｏ  ＭＪ，Ａｎｅｌ  Ａ，Ｇａｍｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ＡＰＯ２  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１６３（３）：１２７４−８１．
[0412]ＭｃＣｏｎｃｈｉｅ，Ｂ．Ｗ．，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｈ．Ｈ．，Ｂｕｎｄｏｃ，Ｖ．Ｇ．，Ｔｒｉｖｅｄｉ，Ｓ．，Ｂｏｅｓｅｎ，Ａ．，Ｕｒｂａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｋｅａｎｅ−Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｍ．（２００６）．Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ  ｖｉａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７４，６６３２−６６４１．
[0413]ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＭＦ，Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈ  Ｉ，Ｇａｌｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５５  ｋＤａ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＮＦＲ１，ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ａｕｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ  １９９９；９７（１）：１３３−４４．
[0414]ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＢＳ，Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ，Ｃｕａ  ＤＪ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ＩＬ−２３−ＩＬ−１７  ｉｍｍｕｎｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；２７（１）：１７−２３．
[0415]Ｍｉｃｈｅａｕ  Ｏ，Ｔｓｃｈｏｐｐ  Ｊ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｗｏ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃｅｌｌ  ２００３；１１４（２）：１８１−９０．
[0416]Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｌｕｏ，Ｘ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｈｕ，Ｂ．，Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｊ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．ＴＬ１Ａ  ｉｓ  ａ  ＴＮＦ−ｌｉｋｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＤＲ３  ａｎｄ  ＴＲ６／ＤｃＲ３  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６，４７９−４９２．
[0417]Ｍｉｓｕｌｏｖｉｎ  Ｚ，Ｙａｎｇ  ＸＷ，Ｙｕ  Ｗ，Ｈｅｉｎｔｚ  Ｎ，Ｍｅｆｆｒｅ  Ｅ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１；２５７（１−２）：９９−１０５．
[0418]Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｔｉｒａｄｏ  Ｖ，Ｊｏｈａｎｎｓｏｎ  Ｓ，Ｈａｎｓｏｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７３（２）：７２６−３０．
[0419]Ｍｕｐｐｉｄｉ  ＪＲ，Ｌｏｂｉｔｏ  ＡＡ，Ｒａｍａｓｗａｍｙ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ  ＦＡＤＤ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＲＸＤＬＬ  ｍｏｔｉｆ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２００６；１３（１０）：１６４１−５０．
[0420]Ｍｕｐｐｉｄｉ  ＪＲ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＭ．Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ（ＣＤ９５）ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；５（２）：１８２−９．
[0421]Ｎａｄｋａｒｎｉ  Ｓ，Ｍａｕｒｉ  Ｃ，Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ  ＭＲ．Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−｛ａｌｐｈａ｝ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｖｉａ  ＴＧＦ−｛ｂｅｔａ｝．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００７．
[0422]Ｎａｋａｊｉｍａ，Ａ．，Ｏｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｎｏｈａｒａ，Ｃ．，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｓ．，Ｋｏｂａｔａ，Ｔ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ．（２０００）．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ７０−ＣＤ２７  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０９，１８８−１９６．
[0423]Ｎｅｕｒａｔｈ  Ｍ，Ｆｕｓｓ  Ｉ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ．ＴＮＢＳ−ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０００；１９（１）：５１−６２．
[0424]Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ，Ｆｕｓｓ  Ｉ，Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；２７（７）：１７４３−５０．
[0425]Ｎｏｈａｒａ，Ｃ．，Ａｋｉｂａ，Ｈ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ａ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｋｏｈ，Ｃ．Ｓ．，Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ．（２００１）．Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６，２１０８−２１１５．
[0426]Ｏｓａｗａ，Ｋ．，Ｔａｋａｍｉ，Ｎ．，Ｓｈｉｏｚａｗａ，Ｋ．，Ｈａｓｈｉｒａｍｏｔｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｏｚａｗａ，Ｓ．（２００４）．Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３（ＤＲ３）ｇｅｎｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｇｉｏｎ  １ｐ３６．３：ｇｅｎｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｍｏｒｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５，４３９−４４３．
[0427]Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｋ．Ａ．，Ｐｒｅｈｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ｈａｎ，Ｑ．，Ｌｕｏ，Ｘ．，Ｃｈａ，Ｓ．Ｃ．，Ｗｅｉ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｔａｒｇａｎ，Ｓ．Ｒ．（２００４）．ＴＬ１Ａ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ＩＬ−１２  ａｎｄ  ＩＬ−１８  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，７００２−７００７．
[0428]Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｋ．Ａ．，Ｚｈｕ，Ｄ．，Ｐｒｅｈｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，Ａｖａｎｅｓｙａｎ，Ａ．，Ｌａｆｋａｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｔａｒｇａｎ，Ｓ．Ｒ．（２００５）．Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＬ１Ａ／ＤＲ３  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ＩＬ−１２  ｐｌｕｓ  ＩＬ−１８−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ＣＣＲ９＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４，４９８５−４９９０．
[0429]Ｐａｒｌａｔｏ  Ｓ，Ｇｉａｍｍａｒｉｏｌｉ  ＡＭ，Ｌｏｇｏｚｚｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｎ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｚｒｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ９５  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０００；１９（１９）：５１２３−３４．
[0430]Ｐｉｖｎｉｏｕｋ  ＶＩ，Ｓｎａｐｐｅｒ  ＳＢ，Ｋｅｔｔｎｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩｇＥ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１５（１２）：１４３１−４０．
[0431]Ｐｏｗｒｉｅ  Ｆ，Ｌｅａｃｈ  ＭＷ，Ｍａｕｚｅ  Ｓ，Ｃａｄｄｌｅ  ＬＢ，Ｃｏｆｆｍａｎ  ＲＬ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ．  Ｂ−１７  ｓｃｉｄ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９３；５（１１）：１４６１−７１．
[0432]Ｐｒｅｈｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｙｕ，Ｑ．Ｔ．，Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔａｒｇａｎ，Ｓ．Ｒ．（２００７）．Ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ＴＬ１Ａ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＦｃｇａｍｍａＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，４０３３−４０３８．
[0433]Ｒａｍａｓｗａｍｙ  Ｍ，Ｄｕｍｏｎｔ  Ｃ，Ｃｒｕｚ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｅｄｇｅ：Ｒａｃ  ＧＴＰａｓｅｓ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｄｉｅ  ｖｉａ  Ｆａｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；１７９（１０）：６３８４−８．
[0434]Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  ＲＬ，Ｋｈｏｒｕｔｓ  Ａ，Ｍｅｒｉｃａ  Ｒ，Ｚｅｌｌ  Ｔ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＭＫ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；４１０（６８２４）：１０１−５．
[0435]Ｒｉｏｕ  Ｃ，Ｙａｓｓｉｎｅ−Ｄｉａｂ  Ｂ，Ｖａｎ  ｇｒｅｖｅｎｙｎｇｈｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＣＲ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ＦＯＸＯ３ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ４＋  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００７；２０４（１）：７９−９１．
[0436]Ｓａｌｅｋ−Ａｒｄａｋａｎｉ，Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．，Ｈａｌｔｅｍａｎ，Ｂ．Ｓ．，Ｊｅｍｂｅｒ，Ａ．Ｇ．，Ａｋｉｂａ，Ｈ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．（２００３）．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ２  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｄｒｉｖｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，３１５−３２４．
[0437]Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍ．Ｒｈｏ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｔ  ａ  ｇｌａｎｃｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００４；１１７（Ｐｔ  ２３）：５４５７−８．
[0438]Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｘｕ，Ｘ．Ｎ．，Ｏｌｓｅｎ，Ａ．Ｌ．，Ｃｏｗｐｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｔａｎ，Ｒ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｉ．（１９９７）．ＬＡＲＤ：ａ  ｎｅｗ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，４６１５−４６１９．
[0439]Ｓｈａｎｅｒ  ＮＣ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＲＥ，Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ  ＰＡ，Ｇｉｅｐｍａｎｓ  ＢＮ，Ｐａｌｍｅｒ  ＡＥ，Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｄ，ｏｒａｎｇｅ  ａｎｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００４；２２（１２）：１５６７−７２．
[0440]Ｓｈｅｌｌ  Ｓ，Ｐａｒｋ  ＳＭ，Ｒａｄｊａｂｉ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｔ−７  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００７；１０４（２７）：１１４００−５．
[0441]Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＭ，Ｃｈａｎ  ＦＫ，Ｃｈｕｎ  ＨＪ，Ｌｅｎａｒｄｏ  ＭＪ．Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１（６）：４６９−７４．
[0442]Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＭ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ  ＪＫ，Ｚａｃｈａｒｉａｓ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｆａｓ  ｐｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２８８（５４７５）：２３５４−７．
[0443]Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＭ，Ｍｕｐｐｉｄｉ  ＪＲ，Ｓａｒｋｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＳＰＯＴＳ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｒｅ  ｅａｒｌｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００４；１６７（４）：７３５−４４．
[0444]Ｓｏｒｏｏｓｈ，Ｐ．，Ｉｎｅ，Ｓ．，Ｓｕｇａｍｕｒａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．（２００６）．ＯＸ４０−ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ−Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６，  ５９７５−５９８７．
[0445]Ｓｔｅｅｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｔａｎｓｅｙ，Ｍ．Ｇ．，Ｚａｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．，Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，Ｅ．Ａ．，Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｚｙｍｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｅ．，Ａｂｂｏｔｔ，Ｃ．，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｄ．，Ｃｈａｎ，Ｃ．，Ｃｈｅｒｒｙ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＮＦ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，１８９５−１８９８．
[0446]Ｓｔｏｒｅｙ  Ｈ，Ｓｔｅｗａｒｔ  Ａ，Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ  Ｐ，Ｌｕｚｉｏ  ＪＰ．Ｔｈｅ  ｐ５５  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲ１  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２００２；３６６（Ｐｔ  １）：１５−２２．
[0447]Ｓｔｒａｎｇｅｓ  ＰＢ，Ｗａｔｓｏｎ  Ｊ，Ｃｏｏｐｅｒ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆａｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００７；２６（５）：６２９−４１．
[0448]Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ，Ｆｕｓｓ  Ｉ，Ｍａｎｎｏｎ  Ｐ．Ｔｈｅ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；１１７（３）：５１４−２１．
[0449]Ｓｕ，Ａ．Ｉ．，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，Ｔ．，Ｂａｔａｌｏｖ，Ｓ．，Ｌａｐｐ，Ｈ．，Ｃｈｉｎｇ，Ｋ．Ａ．，Ｂｌｏｃｋ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｓｏｄｅｎ，Ｒ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｍ．，Ｋｒｅｉｍａｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ａ  ｇｅｎｅ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１，６０６２−６０６７．
[0450]Ｓｕｋｉｔｓ  ＳＦ，Ｌｉｎ  ＬＬ，Ｈｓｕ  Ｓ，Ｍａｌａｋｉａｎ  Ｋ，Ｐｏｗｅｒｓ  Ｒ，Ｘｕ  ＧＹ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１；３１０（４）：８９５−９０６．
[0451]Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＫＥ，Ｍｕｌｌｅｎ  ＣＡ，Ｂｌａｅｓｅ  ＲＭ，Ｗｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＪＡ．Ａ  ｍｕｌｔｉｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １９９４；１２５（６  Ｐｔ  １）：８７６−８５．
[0452]Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ＭＴ，Ｏｈｔｅｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｐｔｅｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００１；１４（５）：５２３−３４．
[0453]Ｔａｎｇ  Ｑ，Ａｄａｍｓ  ＪＹ，Ｔｏｏｌｅｙ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；７（１）：８３−９２．
[0454]Ｔａｏ，Ｘ．，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｓ．，Ｊｏｒｒｉｔｓｍａ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｋ．（１９９７）．Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９，５９５６−５９６３．
[0455]Ｔｏｕｉｔｏｕ  Ｉ，Ｌｅｓａｇｅ  Ｓ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｖｅｒｓ：ａｎ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｈｕｍａｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ２００４；２４（３）：１９４−８．
[0456]Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｘ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｇ，Ｇｏｌｄｂａｃｈ−Ｍａｎｓｋｙ  Ｒ，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｍ，Ｓｈｅｖａｃｈ  ＥＭ，Ｌｉｐｓｋｙ  ＰＥ．ＴＮＦ  ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８（１）：２５３−６１．
[0457]ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ  ＵＨ，Ｍａｃｋａｙ  ＣＲ．Ｔ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｔｗｏ  ｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃｏｉｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００；３４３（１４）：１０２０−３４．
[0458]Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｃ．，Ｔｈｅｒｎ，Ａ．，Ｄｅｎｚｅｌ，Ａ．，Ｋｉｔｓｏｎ，Ｊ．，Ｆａｒｒｏｗ，Ｓ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｊ．（２００１）．ＤＲ３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１，３４５１−３４６１．
[0459]Ｗａｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．（２００５）．ＴＮＦ／ＴＮＦＲ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３，２３−６８．
[0460]Ｗｅｎ，Ｌ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｌｕｏ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｗｅｉ，Ｐ．（２００３）．ＴＬ１Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃ−ＩＡＰ２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ＤＲ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＴＦ−１  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，  ３９２５１−３９２５８．
[0461]Ｗｉｓｅ  ＣＡ，Ｇｉｌｌｕｍ  ＪＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＣＤ２ＢＰ１  ｄｉｓｒｕｐｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＰＴＰ  ＰＥＳＴ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ＰＡＰＡ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ａｎ  ａｕｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００２；１１（８）：９６１−９．
[0462]Ｘｉａｏ，Ｑ．，Ｈｓｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｍａ，Ｘ．，Ｘｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｍ．（２００５）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８８，９１３−９２０．
[0463]Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｋ．，ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｄ．，Ｒａｇｏｕｓｓｉｓ，Ｊ．，Ｐａｏｌｕｃｃｉ，Ｍ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｈ．，Ｊｅｗｅｌｌ，Ｄ．，Ｃａｒｄｏｎ，Ｌ．，Ｔａｋａｚｏｅ，Ｍ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ＴＮＦＳＦ１５  ｃｏｎｆｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４，３４９９−３５０６．
[0464]Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｚｈｅｎｇ  Ｍ，Ｂｉｎｄａｓ  Ｊ，Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ，Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−１７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ＴＮＢＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００６；１２（５）：３８２−８．
[0465]Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｔ．Ｗ．，Ｗａｎ，Ｘ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｓ．，Ｈｕ，Ｂ．，Ｇｒｅｇｏｒｉｏ，Ｔ．，Ｆｅｎｇ，Ｐ．，Ｑｉ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｃｈｏ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ＴＲ６／ＤｃＲ３．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０７，１４５９−１４６８．
[0466]Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖ  Ｔ，Ｃｏｒｂｅｌｌａ  Ｐ，Ｔｏｌａｉｎｉ  Ｍ，Ｋｉｏｕｓｓｉｓ  Ｄ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ２  ｍｉｎｉｇｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５；１８５（１）：１３３−４０．
Ｉ．配列
１．配列番号：１（ヒトＤＲ３核酸配列）
【０３５０】
【化１】
2014518883.tif 000007
【０３５１】
２．配列番号：２（ヒトＤＲ３アミノ酸配列）
【０３５２】
【化２】
2014518883.tif 000008
【０３５３】
３．配列番号：３（ヒトＴＬ１Ａ核酸配列）
【０３５４】
【化３】
2014518883.tif 000009
【０３５５】
４．配列番号：４（ヒトＴＬ１Ａアミノ酸配列）
【０３５６】
【化４】
2014518883.tif 000010
【０３５７】
５．配列番号：５（ＮＰ＿６８３８６６．１）
【０３５８】
【化５】
2014518883.tif 000011
【０３５９】
６．配列番号：６（ＮＰ＿１４９０３１．２の１−１５９）
【０３６０】
【化６】
2014518883.tif 000012
【０３６１】
７．配列番号：７（ＮＰ＿００５１０９．２）
【０３６２】
【化７】
2014518883.tif 000013
【０３６３】
８．配列番号：８（ＮＰ＿７９６３４５からの７２−２５１）
【０３６４】
【化８】
2014518883.tif 000014
【０３６５】
９．配列番号：９
ＧＡＲＡＱＧＧＴＲＳＰＲＣＤＣＡＧＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫＡＰＣＴＥＰＣＧＮＳＴＣＬＶＣＰＱＤＴＦＬＡ
１０．配列番号：１０
ＧＡＲＡＱＧＧＴＲＳＰＲＣＤＣＡＧＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫＡＰＣＴＥＰＣＧＮＳＴＣ
１１．配列番号：１１
ＧＡＲＡＱＧＧＴＲＳＰＲＣＤＣＡＧＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫＡＰ
１２．配列番号：１２
ＧＡＲＡＱＧＧＴＲＳＰＲＣＤＣＡＧＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫ
１３．配列番号：１３
ＰＲＣＤＣＡＧＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫＡＰＣＴＥＰＣＧＮＳＴＣＬＶＣＰＱＤＴＦＬＡ
１４．配列番号：１４
ＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫＡＰＣＴＥＰＣＧＮＳＴＣＬＶＣＰＱＤＴＦＬＡ
１５．配列番号：１５
ＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹＬＫＡＰＣＴＥＰＣＧＮＳＴＣＬＶＣＰＱＤＴＦＬＡ
１６．配列番号：１６
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ
１７．配列番号：１７
ＲＱＰＫＩＷＦＰＮＲＲＫＰＷＫＫ
１８．配列番号：１８
ＧＲＫＫＲＲＱＲＰＰＱ
１９．配列番号：１９
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
２０．配列番号：２０
ＲＱＩＡＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＡＡ
２１．配列番号：２１
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
２２．配列番号：２２
ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ
２３．配列番号：２３
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ
２４．配列番号：２４
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ
２５．配列番号：２５
ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ
２６．配列番号：２６
ＶＰＭＬＫ−ＰＭＬＫＥ
２７．配列番号：２７
ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ
２８．配列番号：２８
ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ
２９．配列番号：２９
ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ
３０．配列番号：３０
ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ
３１．配列番号：３１
ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ
３２．配列番号：３２
ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ
【図１−１】
2014518883.tif 000015
【図１−２】
2014518883.tif 000016
【図１−３】
2014518883.tif 000017
【図１−４】
2014518883.tif 000018
【図２−１】
2014518883.tif 000019
【図２−２】
2014518883.tif 000020
【図２−３】
2014518883.tif 000021
【図３−１】
2014518883.tif 000022
【図３−２】
2014518883.tif 000023
【図４−１】
2014518883.tif 000024
【図４−２】
2014518883.tif 000025
【図４−３】
2014518883.tif 000026
【図４−４】
2014518883.tif 000027
【図５−１】
2014518883.tif 000028
【図５−２】
2014518883.tif 000029
【図６−１】
2014518883.tif 000030
【図６−２】
2014518883.tif 000031
【図６−３】
2014518883.tif 000032
【図７】
2014518883.tif 000033
【図８−１】
2014518883.tif 000034
【図８−２】
2014518883.tif 000035
【図８−３】
2014518883.tif 000036
【図９−１】
2014518883.tif 000037
【図９−２】
2014518883.tif 000038
【図９−３】
2014518883.tif 000039
【図１０−１】
2014518883.tif 000040
【図１０−２】
2014518883.tif 000041
【図１１−１】
2014518883.tif 000042
【図１１−２】
2014518883.tif 000043
【図１２−１】
2014518883.tif 000044
【図１２−２】
2014518883.tif 000045
【図１２−３】
2014518883.tif 000046
【図１２−４】
2014518883.tif 000047
【図１２−５】
2014518883.tif 000048
【図１３−１】
2014518883.tif 000049
【図１３−２】
2014518883.tif 000050
【図１３−３】
2014518883.tif 000051
【図１４】
2014518883.tif 000052
【図１５−１】
2014518883.tif 000053
【図１５−２】
2014518883.tif 000054
【図１５−３】
2014518883.tif 000055
【図１５−４】
2014518883.tif 000056
【図１６】
2014518883.tif 000057
【図１７−１】
2014518883.tif 000058
【図１７−２】
2014518883.tif 000059
【図１８】
2014518883.tif 000060
【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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