(57)【要約】  配列番号１若しくは配列番号２において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び／又は配列番号３若しくは配列番号４において示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含み、詳細には、配列番号１及び配列番号３において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、又は配列番号２及び配列番号４において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。本開示はまた、この抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド、これを含むベクター及びこのポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞にも及ぶ。本開示は、この抗体又は断片を含む医薬組成物及びこれらのいずれかを使用する療法も、さらに含む。
2014534978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２において示される配列を有する重鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
【請求項２】
配列番号３又は配列番号４において示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
【請求項３】
配列番号１において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号３において示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
【請求項４】
配列番号２において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号４に示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
【請求項５】
Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一可変ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価若しくは四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、トライボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ及びＢｉＴＥからなる群より選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の血清アルブミン結合抗体又はその断片。
【請求項６】
Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む重鎖、並びに
Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第２の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号１において示される配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号３において示される配列を有し、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、ジスルフィド結合によって、任意選択で、連結されている、二重特異性抗体融合タンパク質。
【請求項７】
Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む重鎖、並びに
Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第２の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号２において示される配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号４において示される配列を有し、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、ジスルフィド結合によって、任意選択で、連結されている、二重特異性抗体融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の宿主細胞から、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を発現することを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を産生する方法。
【請求項１２】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を含む医薬製剤。
【請求項１３】
医薬の製造における、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片の使用。
【請求項１４】
処置における使用のための、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片。
【請求項１５】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を含む抗体分子の治療有効量を投与する工程を含む、それを必要とする患者を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なアルブミン結合抗体及びその断片に関する。このような抗体は、たとえば、薬物又はそれにコンジュゲートしたタンパク質のインビボ血清半減期を延長するために使用され得る。また、そのような分子及びそれらを含む医薬組成物を生成する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
抗体の高い特異性及び親和性により、これらが、特にタンパク質：タンパク質の相互作用を変調させるための理想的な診断剤及び治療剤となる。組換え抗体技術の分野における進歩により、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片並びに他の抗体断片などの抗体断片の生成がもたらされた。これらのより小さな分子は、完全抗体の抗原結合活性を保持しており、完全免疫グロブリン分子と比較して改善された組織透過及び薬物動態学の特性も示すことができる。実際、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）及びＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）などの製品の最近の成功によって見られるように、抗体断片は多用途の治療剤であることが証明されつつある。そのような断片は完全免疫グロブリンを超えるいくつかの利点を示すように見える一方で、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長い寿命を与えるＦｃドメインを欠くため、増加した血清クリアランス速度の欠点もある（Ｍｅｄａｓａｎら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２２１１〜２２１７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及び他の抗体断片などの抗体断片の半減期を改善させる手段が知られている。一手法は、断片をポリマー分子にコンジュゲートさせることである。したがって、動物におけるＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片の短い循環半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションによって改善されている（たとえば、ＷＯ９８／２５７９１号、ＷＯ９９／６４４６０号及びＷＯ９８／３７２００号を参照）。別の手法は、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する薬剤とのコンジュゲーションによって抗体断片を修飾することである（たとえばＷＯ９７／３４６３１号を参照）。半減期を延長させるためのさらに別の手法は、血清アルブミンと結合するポリペプチドを使用することである（たとえば、Ｓｍｉｔｈら、２００１、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１２：７５０〜７５６、ＥＰ０４８６５２５号、ＵＳ６２６７９６４号、ＷＯ０４／００１０６４号、ＷＯ０２／０７６４８９号、及びＷＯ０１／４５７４６号を参照）。血清アルブミンは、血管及び血管外の区画のどちらにおいても豊富なタンパク質であり、人における半減期は約１９日間である（Ｐｅｔｅｒｓ、１９８５、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．、３７：１６１〜２４５）。これは、約２１日間であるＩｇＧ１の半減期に類似している（Ｗａｌｄｅｍａｎ及びＳｔｒｏｂｅｒ、１９６９、Ｐｒｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１３：１〜１１０）。
【０００４】
抗血清アルブミン結合単一可変ドメインは、ＮＣＥ（化学成分）薬物を含む薬物、タンパク質及びペプチドの、半減期を延長するためのコンジュゲートとしてのその使用と共に、記載されている。たとえば、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ２１，５，ｐｐ２８３−２８８、ＷＯ０４００３０１９、ＷＯ２００８／０９６１５８、ＷＯ０５１１８６４２、ＷＯ２００６／０５９１０５６及びＷＯ２０１１／００６９１５を参照されたい。他の抗血清アルブミン抗体及び多重特異性抗体形式におけるその使用は、ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されている。詳細には、本願において配列番号９及び配列番号１０として示される配列を有する６４５ｇＨ１及び６４５ｇＬ１として公知の２つの可変ドメインもまた、記載されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、これらの配列に由来する、改善されたアルブミン結合抗体を提供する。有益にも、本開示の抗体は、開始抗体に匹敵する親和性を有し、さらに、これらを治療製品における使用のために好適にする１つ又は複数の特性、たとえば、免疫原性の低減、安定性の増大、発現の改善などを有し得る。
【０００６】
好ましくは、本発明の抗体は、ヒト血清アルブミンに結合する。
【０００７】
一実施形態において、本発明の抗体は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）血清アルブミン、マウス血清アルブミン及び／又はラット血清アルブミンに結合する。
【０００８】
一実施形態において、本発明は、配列番号１又は配列番号２において示される配列を有する重鎖可変領域を含むアルブミン結合抗体又はその断片を、提供する。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、配列番号３又は配列番号４において示される配列を有する軽鎖可変領域を含むアルブミン結合抗体又はその断片を、提供する。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、配列番号１又は配列番号２において示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号３又は配列番号４において示される配列を有する軽鎖可変領域を含むアルブミン結合抗体又は断片を、提供する。
【００１１】
一実施形態において、重鎖可変領域は、重鎖の４４位においてシステインを有し、配列番号２において示される配列を有する。
【００１２】
一実施形態において、軽鎖可変領域は、軽鎖の１００位においてシステインを有し、配列番号４において示される配列を有する。
【００１３】
本発明の抗体可変領域は、任意の好適な抗体形式内に組み込まれ得る。このような抗体としては、完全抗体及びその機能的に活性な断片又はその誘導体が挙げられる。したがって、このようなアルブミン結合抗体は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片を含み得、これらに限定されないが、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一可変ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、トリボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＤＡＲＴ、ＢｉＴＥ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であり得る（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作製し製造するための方法は、当該分野で周知である（たとえば、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。多価抗体は、多重特異性を含み得るか、又は一重特異性であってもよい（たとえば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ９９／３７７９１及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。他の多価／多重特異性形式としては、ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されるものが挙げられ、本願においてそれぞれ図１Ａ及び１Ｂに図示されるＦａｂ−Ｆｖ及びＦａｂ−ｄｓＦｖを含む。
【００１４】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、提唱される抗体分子の機能、詳細には、必要とされ得るエフェクター機能を有することに関して選択され得る。たとえば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。詳細には、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソ型のヒトＩｇＧ定常領域ドメインが使用され得る。或いは、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４イソ型が、使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列バリアントもまた使用され得ることが、理解される。たとえば、Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５−１０８に記載されるように、２４１位におけるセリンがプロリンに変えられたＩｇＧ４分子が、使用されてもよい。抗体は、種々の翻訳後修飾を受け得ることもまた、当業者に理解される。これらの修飾の種類及び程度は、しばしば、この抗体を発現するために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化を含み得る。頻繁にある修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４，１９９５に記載されるように）カルボキシペプチダーゼの作用に起因する、カルボキシ末端塩基性残基（たとえば、リシン又はアルギニン）の欠損である。
【００１５】
一実施形態において、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメインを含み、且つ抗体軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
【００１６】
このようなアルブミン結合抗体又はその断片は、所望されるように、任意の他の抗体若しくはその断片、他のタンパク質、たとえば酵素、ホルモン、サイトカイン、ペプチド又は他の分子或いは薬物にコンジュゲートされ得ることが、理解される。本発明のアルブミン結合抗体は、それにコンジュゲートしたこのような成分の血清半減期を延長するために、特に有用である。
【００１７】
一例において、本発明のアルブミン結合抗体は、選択された化合物又は診断化合物と、共有結合するか又は非共有結合する。好適な治療化合物としては、たとえば、受容体アゴニスト又はアンタゴニスト、酵素インヒビター、金属キレーター、抗ウイルス剤、抗真菌剤、心臓血管薬及び化学治療薬物が挙げられ得る。
【００１８】
一実施形態において、本発明に従うアルブミン結合抗体又はその断片は、目的の抗原に結合する二次抗体又はその断片に融合するか又はコンジュゲートする。
【００１９】
一実施形態では、二次抗体又は抗体断片によって結合される対象抗原は、細胞会合タンパク質、たとえば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であり得るか、又は可溶性タンパク質であり得る。また、対象抗原は、疾患又は感染中にアップレギュレーションされるタンパク質などの、任意の医学的に関連性のあるタンパク質、たとえば受容体及び／又はその対応するリガンドであり得る。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、たとえばβ１インテグリンなどのインテグリン、たとえば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＶＥＧＦ、並びに適切な場合はその受容体が含まれる。
【００２０】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、たとえば呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原などのウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α、ＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合はその受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、たとえば、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が含まれる。
【００２１】
一実施形態では、抗体、又はその断片は、対象抗原の活性を機能的に変更させるために使用し得る。たとえば、抗体は、前記抗原の活性を直接又は間接的に中和、拮抗又は刺激し得る。
【００２２】
本発明のアルブミン結合抗体にコンジュゲートした抗体又はその断片は、任意の種に由来するものでもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体、完全ヒト抗体又はヒト化抗体に由来するものである。本発明において使用するための抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＡ）又はサブクラスに由来することができ、たとえば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めた任意の種から得られ得る。
【００２３】
一実施形態では、抗体は、モノクローナル、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体断片であるＦａｂ又はＦａｂ’断片である。一実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、完全にヒトであるか、又はヒト化されたものである。
【００２４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５〜４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３、４、７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ページ７７〜９６、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）などの、当分野で知られている任意の方法によって調製し得る。
【００２５】
また、本発明において使用するための抗体は、たとえば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３（１５）、７８４３〜７８４８、ＷＯ９２／０２５５１号、ＷＯ２００４／０５１２６８号及びＷＯ２００４／１０６３７７号によって記載されている方法によって、特定の抗体の産生について選択された単一のリンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現させることによって、単一リンパ球抗体方法を使用しても、作製し得る。
【００２６】
ヒト化抗体とは、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、非ヒト種からの抗体分子である（たとえばＵＳ５，５８５，０８９号を参照）。
【００２７】
また、本発明において使用するための抗体は、当分野で知られている様々なファージディスプレイ方法を使用して作製することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１〜５０、Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７〜１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２〜９５８、Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７、９〜１８、及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１〜２８０、ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、及びＷＯ９５／２０４０１号、並びにＵＳ５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３、及び第５，９６９，１０８号によって記載されているものが含まれる。また、トランスジェニックのマウス又は他の哺乳動物を含めた他の生物を使用しても、ヒト化抗体を作製し得る。
【００２８】
完全ヒト抗体とは、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、必ずしも同じ抗体からのものではないが、すべてヒト起源である、又はヒト起源の配列と実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例には、たとえば、一般的にＥＰ０５４６０７３  Ｂ１号、ＵＳ５，５４５，８０６号、ＵＳ５，５６９，８２５号、ＵＳ５，６２５，１２６号、ＵＳ５，６３３，４２５号、ＵＳ５，６６１，０１６号、ＵＳ５，７７０，４２９号、ＥＰ０４３８４７４  Ｂ１号及びＥＰ０４６３１５１  Ｂ１号に記載されているように、たとえば上述のファージディスプレイ方法によって産生された抗体、並びにマウス免疫グロブリンの可変及び／又は定常領域の遺伝子がそのヒト対応物によって置き換えられているマウスによって産生された抗体が含まれ得る。
【００２９】
本発明において使用するためのＦａｂ又はＦａｂ’などの抗体断片の出発物質は、任意の適切な酵素切断及び／又は消化技法を使用して、たとえばペプシンを用いた処理によって、任意の完全抗体、特に完全モノクローナル抗体から得られ得る。或いは、又はそれに加えて、抗体の出発物質は、抗体の可変及び／又は定常領域をコードしているＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技法の使用によって調製し得る。標準の分子生物学的技法を使用して、アミノ酸又はドメインを所望に応じて修飾、付加、又は欠失させ得る。可変又は定常領域へ任意の変更を行っても、それらは依然として本明細書中で使用する用語「可変」及び「定常」領域によって包含される。
【００３０】
抗体断片の出発物質は、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めた任意の種から得られ得る。抗体断片の部分を複数の種から得てもよく、たとえば抗体断片はキメラであり得る。一例では、定常領域が１つの種からのものであり、可変領域が別の種からのものである。また、抗体断片の出発物質は改変されていてもよい。別の例では、抗体断片の可変領域は、組換えＤＮＡ操作技法を用いて作製されている。そのような操作されたバージョンには、たとえば、天然抗体の可変領域から、天然抗体のアミノ酸配列への又はそれ中の、挿入、欠失又は変化によって作製されたものが含まれる。この種類の特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲを含有し、任意選択で、１つの抗体からの１つ又は複数のフレームワークのアミノ酸を含有し、可変領域ドメインの残りの部分が第２の抗体からのものである、操作された可変領域ドメインが含まれる。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は当分野で周知である（たとえば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４，８１６，３９７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６，３３１，４１５号、Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１号、Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４、Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３、Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９号、Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７号、Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照）。
【００３１】
一例において、本発明のアルブミン結合可変ドメインは、単一ドメイン抗体又はｄＡｂに融合する。本発明において使用するための、単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られる単一可変ドメインは、当分野で知られている方法を使用して作製することができ、ＷＯ２００５１１８６４２号、Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４〜５４６及びＨｏｌｔら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４〜４９０に開示されているものが含まれる。一実施形態では、本発明において使用するための単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖ドメイン（ＶＬ）である。それぞれの軽鎖ドメインは、カッパ又はラムダ部分群のどちらかであり得る。ＶＨ及びＶＬドメインを単離する方法は当分野で記載されており、たとえば、ＥＰ０３６８６８４号及びＷａｒｄら、上記を参照されたい。そのようなドメインは、任意の適切な種又は抗体出発物質に由来し得る。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、げっ歯類、ヒト又は他の種に由来し得る。一実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト化されている。
【００３２】
一実施形態では、単一ドメイン抗体は、たとえば、ＷＯ２００５／１１８６４２号、Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、１１６１〜１１６５及びＨｏｌｔら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４〜４９０に記載の方法を使用して、ファージディスプレイライブラリから導く。好ましくは、そのような単一ドメイン抗体は完全にヒトであるが、他の種に由来していてもよい。一実施形態では、単一可変ドメインは、フレームワークがヒト又は実質的にヒトの起源であり、ＣＤＲ（単数又は複数）が非ヒト起源のものであるという点で、キメラである。Ｈｏｌｔら、上記に記載のように、単一ドメイン抗体の配列は、単離された後、単一ドメイン抗体の特徴、たとえば溶解度を改善させるために改変し得ることを理解されたい。
【００３３】
本明細書中で用いる実質的にヒトとは、元の材料の免疫原性に関連し得るヒト特徴が保持されていることをいうことを意図する。実質的にヒトの材料には、フレームワーク配列中の１つのアミノ酸が別のアミノ酸によって付加、欠失又は置き換えられているものが含まれる。
【００３４】
一実施形態では、ｄＡｂは、ｓｃＦｖファージディスプレイから、或いはトランスジェニックＨｕｍｏｕｓｅ（商標）若しくはＶｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ（商標）又はヒト化したげっ歯類から得られたヒト配列である。
【００３５】
一実施形態では、ｄＡｂは、ヒト若しくはヒト化したげっ歯類、ラクダ科又はサメから得られる。そのようなｄＡｂは好ましくはヒト化されたものである。一例では、単一ドメイン抗体は、ＥＰ０６５６９４６号に記載のように、ラクダ科免疫グロブリンに基づくＶＨＨドメインである。一例では、ラクダ又はラマを対象抗原で免疫化し、力価が適切となった際に血液を収集する。ｄＡｂをコードしている遺伝子を単一細胞ＰＣＲによってクローニングし得るか、又は、ｄＡｂをコードしているＢ細胞（単数又は複数）を、ＥＢＶ形質転換によって、若しくは不死化細胞系との融合によって不死化させ得る。
【００３６】
一例において、１つ又は複数の本発明の抗体可変ドメインは、ＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２又はＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されるように、多価抗体形式に組み込まれる。このような形式は、一重特異性、二重特異性又は三重特異性であってもよい。したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体融合タンパク質は、翻訳融合タンパク質、すなわち、遺伝子融合体であり、これらのそれぞれの配列は、発現ベクターによってコードされる。或いは、抗体融合タンパク質コンポーネントは、化学的手段、すなわち、化学的コンジュゲーション又は化学的架橋を用いて融合され得る。このような化学的手段は、当該分野で公知である。
【００３７】
ジスルフィド結合を有する、及び有さないこのような翻訳融合タンパク質の例は、図１Ａ及び図１Ｂに図示される。
【００３８】
したがって、一実施形態において、目的の抗原について特異的な抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む多重特異性抗体融合タンパク質が提供され、前記断片は、配列番号１、２、３又は４に示される配列を有するヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一可変ドメイン配列に融合する。
【００３９】
一例において、本発明のアルブミン結合抗体可変ドメインは、天然の又は修飾されたヒンジ領域を有する抗体断片、たとえばＦａｂ’断片に融合する。このような本発明の融合タンパク質の調製の際の使用のための抗体断片がＦａｂ’断片である場合、前記断片は、一般に、１つ又は複数のアミノ酸によって重鎖のＣ末端にて延長される。したがって、本発明の抗体融合体は、アルブミン結合可変領域に、直接的に又はリンカーを介して、翻訳融合した（又は化学的に融合した）Ｆａｂ’断片を含み得る。さらに、好適な抗体Ｆａｂ’断片の例としては、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１において記載されるものが挙げられる。
【００４０】
別の例において、抗体断片は、Ｆａｂ断片である。したがって、本発明の抗体融合体は、リンカー配列に翻訳融合した（又は化学的に融合した）Ｆａｂ断片を含み得、このリンカー配列は、次いで、１つ又は複数のアルブミン結合可変領域に翻訳融合する（又は化学的に融合する）。好ましくは、Ｆａｂ断片は、ＷＯ２００５／００３１６９に記載されるような、鎖内システインにおいて終結するＦａｂ断片である。
【００４１】
本発明では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片と融合されたそれぞれの抗アルブミン可変ドメインは、直接又はリンカーを介して連結されていてよい。
【００４２】
本明細書中で用いる、直接連結されているとは、Ｆａｂ又はＦａｂ’の「最後」のアミノ酸が、ペプチド結合によって、本発明のアルブミン結合抗体の単一可変ドメインの「最初」のアミノ酸と結合していることをいうことを意図する（又は実際にはその逆）。
【００４３】
可変ドメインをＦａｂ又はＦａｂ’と連結させるための適切なリンカー領域の例には、それだけには限定されないが、柔軟なリンカー配列及び強固なリンカー配列が含まれる。柔軟なリンカー配列には、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、ＰＮＡＳ、８５：５８７９〜５８８３、Ｗｒｉｇｈｔ及びＤｅｏｎａｒａｉｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００７、４４（１１）：２８６０〜２８６９、Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９５、８（７）：７２５〜７３１、Ｌｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５、１１８（４）：８２５〜８３１、Ｔａｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（２６）：１５６８２〜１５６８６、並びにＴｕｒｎｅｒら、１９９７、ＪＩＭＭ、２０５、４２〜５４に開示されているものが含まれる（代表的な例には表１を参照）。
【表１−１】
2014534978.tif 000003
【表１−２】
2014534978.tif 000004
【００４４】
配列２３〜２７中の（Ｓ）は任意選択である。
【００４５】
強固なリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６１）、ＰＰＰＰ（配列番号６２）及びＰＰＰが含まれる。
【００４６】
一実施形態では、抗体のヒンジ配列又はその一部、たとえば上部ヒンジ配列をリンカーとして使用する。典型的には、本発明において使用するための抗体Ｆａｂ’断片は、ネイティブ又は改変されたヒンジ領域を保有する。そのようなヒンジ領域は、アルブミン結合可変ドメイン部分に対する天然リンカーとして使用される。ネイティブヒンジ領域とは、通常は抗体分子のＣＨ１ドメインと会合しているヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域とは、長さ及び／又は組成がネイティブヒンジ領域とは異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジには、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域などの、任意の他の種からのヒンジ領域が含まれ得る。他の改変されたヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含み得る。したがって、たとえば、クラスγ１のＣＨ１ドメインは、クラスγ４のヒンジ領域に付着していてもよい。或いは、改変されたヒンジ領域は、天然ヒンジの一部、又は反復中のそれぞれの単位が天然ヒンジ領域に由来する反復単位を含み得る。さらなる代替では、天然ヒンジ領域は、１つ若しくは複数のシステイン若しくは他の残基をアラニンなどの中性残基に変換することによって、又は適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって、変更し得る。そのような手段によって、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を増加又は減少させ得る。さらに、ヒンジのシステイン（単数又は複数）と軽鎖の鎖間システインとの間の距離、ヒンジのシステイン間の距離、及び柔軟性などのヒンジの特性に影響を与え得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成等の、ヒンジの他の特徴を制御することができ、たとえば、回転の柔軟性を増加させるためにグリシンをヒンジ内に取り込ませてもよく、又は柔軟性を減少させるためにプロリンを取り込ませてもよい。或いは、荷電又は疎水性の残基の組合せをヒンジ内に取り込ませて多量体化の特性を与えてもよく、たとえば、荷電又はイオン性テイル、たとえばリンカーとしての酸性テイルの使用にはＲｉｃｈｔｅｒら、２００１、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１４（１０）：７７５〜７８３、及びロイシンジッパー配列にはＫｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５（１）：１５４７〜１５５３を参照されたい。他の改変されたヒンジ領域は完全に合成であってよく、長さ、組成及び柔軟性などの所望の特性を保有するように設計し得る。
【００４７】
いくつかの改変されたヒンジ領域が、たとえば、ＵＳ５，６７７，４２５号、ＵＳ６６４２３５６号、ＷＯ９９１５５４９号、ＷＯ２００５００３１７０号、ＷＯ２００５００３１６９号、ＷＯ２００５００３１７０号、ＷＯ９８２５９７１号及びＷＯ２００５００３１７１号に既に記載されており、これらは本明細書中に参考として組み込まれている。そのようなヒンジは、一般にＣＨ１領域の後に続くが、軽鎖カッパ又はラムダ断片の定常領域の末端上に取り込まれていてもよい。たとえば表３を参照されたい。
【表２】
2014534978.tif 000005
【００４８】
本発明の抗体可変ドメインは、抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、すなわち、これらは同じ結合特異性を有する相補的ＶＨ／ＶＬ対である。これらは実際、同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対である。
【００４９】
一実施形態では、ＶＨドメインは重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合されており、ＶＬドメインは軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合されている。
【００５０】
一実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、ジスルフィド結合によって連結し、構築物にさらなる安定性を提供すると思われ、これは、有利であり得る。
【００５１】
１つ又は複数の実施形態では、ＣＨドメインとＣＬ又はＣＫドメインとの間などのＦａｂなどの重鎖と軽鎖一定領域の間のジスルフィド結合は、たとえば結合を形成する１つ又は複数のシステインが置き換えられているために存在しない。前記１つ又は複数のシステインは、たとえばセリンによって置き換えられていてよい。
【００５２】
１つ又は複数の実施形態では、ＣＨドメインとＣＬ又はＣＫドメインとの間の重鎖と軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合が存在する。
【００５３】
一例において、本発明は、二重特異性抗体融合タンパク質を提供し、このタンパク質は：
Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む重鎖、並びに
Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第２の抗原結合部位によって結合された抗原は、ヒト血清アルブミンであり、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号１において示される配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号３において示される配列を有する。
【００５４】
一実施形態において、アルブミン結合重鎖及び軽鎖可変領域は、ジスルフィド結合によって連結される。したがって、一例において、本発明は、二重特異性抗体融合タンパク質を提供し、このタンパク質は：
Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む重鎖、並びに
Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第２の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号２において示される配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号４において示される配列を有し、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、ジスルフィド結合によって連結される。
【００５５】
一例において、本発明は、多重特異性抗体融合タンパク質を提供し、このタンパク質は：
Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）を含む重鎖、並びに
Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）及び第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３及びＶＬ３が第３の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第２の又は第３の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、
第２の又は第３の重鎖可変ドメインは、配列番号１又は配列番号２において示される配列を有し、第２の又は第３の軽鎖可変ドメインは、配列番号３又は配列番号４において示される配列を有する。
【００５６】
１つ又は複数の上に挙げられたドメインの間にリンカーが存在し得ることが、理解される。詳細には、ＣＬとＶＬ２との間、及びＣＨ１とＶＨ２との間のリンカー、存在する場合、ＶＬ２とＶＬ３との間及びＶＨ２とＶＨ３との間のリンカーが存在し得る。好適なリンカーは、既に、本明細書中、上で記載されている。さらなるリンカーは、図２（ｅ）及び（ｆ）、配列番号５及び６において提供される。
【００５７】
一実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖである。一実施形態において、抗体は、可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）が、配列番号１７において示されるリンカーによって連結されるｓｃＦｖである。
【００５８】
本発明の抗体可変ドメインは、Ｆａｂ又はＦａｂ’のｉｎ  ｖｉｖｏなどのコンジュゲートの半減期を延長させるために十分である結合親和性により、アルブミンと結合する。２．５μＭ以下の親和性であるアルブミンに対する親和性がｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させることが報告されている（Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ．ら（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１９（７）、２９１〜２９７）。一例において、本発明の可変ドメイン抗体対は、たとえば３ｎＭナノモル濃度の、高い結合親和性を有する。一例では、単一ドメイン抗体は、ナノモーラー又はマイクロモーラーである抗原に対する結合親和性を有する。親和性は、天然又は組換えの血清アルブミンを使用した、表面Ｐｌａｓｍｏｎ共鳴を含めた、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して測定し得る。
【００５９】
好ましくは、本発明のアルブミン結合抗体は、ヒト血清アルブミンに対して約１μＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、抗体は、約５００ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態では、抗体は、約２００ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体は、約１００ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体は、約５０ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体は、約２０ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体は、約１０ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体は、約５ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態において、抗体は、約２ｎＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態では、抗体は、約１ｎＭ以下の結合親和性を有する。本発明によって提供される抗体の親和性は、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して変更し得ることを理解されたい。したがって、本発明は、アルブミンに対して改善された親和性を有する、本発明の抗体分子の変異体にも関する。そのような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）及び性的（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含めたいくつかの親和性成熟プロトコルによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）が、これらの親和性成熟の方法を記述している。
【００６０】
また、本発明は、本発明のアルブミン結合抗体又は融合タンパク質をコードしている単離したＤＮＡ配列も提供する。本発明のＤＮＡ配列は、たとえば化学的プロセッシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せによって生成された合成ＤＮＡを含み得る。
【００６１】
本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。たとえば、抗体断片、リンカー及び／又はｄＡｂの一部又は全体をコードしているＤＮＡ配列を、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望に応じて合成し得る。
【００６２】
標準の分子生物学の技法を使用して、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を調製し得る。オリゴヌクレオチド合成技法を使用して、所望のＤＮＡ配列を完全に又は部分的に合成し得る。必要に応じて部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用し得る。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしている１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。好ましい一実施形態では、クローニング又は発現ベクターは、二重特異性抗体融合タンパク質全体をコードしている単一のＤＮＡ配列を含む。したがって、クローニング又は発現ベクターは、ＤＮＡにコードされた転写単位を、翻訳融合タンパク質が産生されるような順序で含む。
【００６４】
実際、当業者には、本発明の融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端にアルブミン結合可変ドメインを有することができ、したがって、アルブミン結合ＤＮＡにコードされた転写単位は、翻訳融合体をコードしているＤＮＡ配列内でそれぞれ最初又は最後となることを理解されよう。したがって、翻訳融合体は、Ｎ末端の可変ドメイン及びＣ末端のＦａｂ又はＦａｂ’を含み得る。さらに、翻訳融合体は、Ｎ末端のＦａｂ又はＦａｂ’及びＣ末端のアルブミン結合可変ドメインを含み得る。
【００６５】
抗体又はその断片の重鎖及び軽鎖を同じ又は異なるベクター内に取り込ませ得ることを理解されたい。一実施形態では、１つのベクターが重鎖を含む翻訳融合体を含んでいてよく、別のベクターが軽鎖を含む翻訳融合体を含んでいてよい。
【００６６】
本発明の翻訳融合体内に含まれる抗体断片のＤＮＡコードは、ベクター内に転写単位として当業者に知られている立体配置で取り込ませることができ、たとえば、転写単位は、軽鎖のコード、次いで重鎖のコード、又はその逆を含むことができる。具体的には、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６：３０９〜３２０を参照されたい。
【００６７】
好ましくは、本発明によるベクターは、抗体リーダー配列などの適切なリーダー配列を含む。そのようなリーダー配列は当分野で周知である。
【００６８】
ベクターを構築し得る一般的な方法、形質移入及び形質転換の方法、並びに培養方法は、当業者に周知である。これに関しては、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって出版されたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【００６９】
また、１つ又は複数の本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしている１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列の発現に使用し得る。細菌、たとえば大腸菌及び他の微生物系を使用し得るか、又は真核、たとえば哺乳動物の宿主細胞発現系も使用し得る。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＮＳ０、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。したがって、一実施形態では、本発明の融合タンパク質は大腸菌中で発現させる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は哺乳動物細胞中で発現させる。
【００７０】
また、本発明は、アルブミン結合抗体又は融合タンパク質を産生する方法であって、本発明のベクターを含む宿主細胞を、前記アルブミン結合抗体をコードしているＤＮＡ配列からのタンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む方法も提供する。本発明は、アルブミン結合抗体を単離する方法をさらに提供する。
【００７１】
産生時に、必要な場合は、本発明のアルブミン結合抗体を、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して精製し得る。たとえば、それだけには限定されないが、イオン交換、サイズ排除、タンパク質Ｇ又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技法を使用し得る。
【００７２】
抗体又は抗体融合タンパク質の大きさは、サイズ排除クロマトグラフィー及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの、当分野で知られている慣用の方法によって確認し得る。そのような技法は、たとえば、タンパク質が二量体化していないこと及び／又はその一部分が失われていないことを確認するために使用することができる。二量体が検出され、均質な単量体の生成物が必要な場合は、単量体の抗体融合タンパク質を、上述のように慣用のクロマトグラフィー技法を使用して、二量体種から精製して取り出し得る。本発明において、改善された可変領域は、配列番号１〜４において提供され、より多くのモノマーの産生をもたらす。
【００７３】
本発明の抗体、コンジュゲート、融合タンパク質は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維性障害並びに癌を含めた疾患及び障害の処置において有用である。
【００７４】
用語「炎症性疾患」又は「障害」及び「免疫疾患又は障害」には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スチル病、マックルウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型真性糖尿病、移植及び移植片対宿主病が含まれる。
【００７５】
用語「線維性障害」には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎臓線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期腎臓病、腹膜線維症（持続的携行式腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、網膜症、心反応性線維症、瘢痕、ケロイド、熱傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠血管バイパス手術、関節形成術及び白内障手術が含まれる。
【００７６】
用語「癌」には、皮膚中、又はより一般的には身体の臓器、たとえば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱若しくは腸の内壁に見つかる、上皮から生じる悪性の新成長が含まれる。癌は、隣接組織に浸潤し、遠位臓器、たとえば、骨、肝臓、肺又は脳へと拡大（転移）する傾向がある。
【００７７】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と会合した本発明の抗体、抗体融合体又はコンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。また、疾患又は障害を処置する医薬品を製造するための、本発明の抗体融合タンパク質の使用も提供される。最も好ましくは、疾患又は障害は炎症性疾患又は障害である。
【００７８】
本発明による医薬組成物は、経口、頬側、非経口、皮下、経鼻、局所、眼若しくは直腸の投与に適した形態、又は吸入若しくはガス注入による投与に適した形態をとり得る。
【００７９】
適切な場合は、たとえば抗体融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）がアルブミンと結合する場合は、二重特異性融合タンパク質を、ヒト又は組換え血清アルブミンを用いて、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して事前に配合することが望ましい場合がある。
【００８０】
医薬配合物が液体、たとえば溶液又は懸濁液である場合は、配合物は、アルブミン、たとえばヒト血清アルブミン、具体的には組換えヒト血清アルブミンなどの組換えアルブミンをさらに含み得る。適切な量は、全配合物の２％ｗ／ｗ未満、具体的には１、０．５、又は０．１％ｗ／ｗ未満の範囲であり得る。これは、配合物中の抗体構成要素の安定化を支援し得る。医薬組成物は、後に水性溶媒を用いて再構成するために凍結乾燥し得る。
【００８１】
一実施形態では、本発明による凍結乾燥した「抗体」を含む、バイアルなどの単位用量容器が提供される。
【００８２】
経口投与には、医薬組成物は、たとえば、慣用の手段によって、結合剤（たとえば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（たとえば、ラクトース、結晶セルロース若しくはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ）、崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプン若しくはグリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）ナトリウム）、又は湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて調製した、錠剤、ロゼンジ又はカプセルの形態をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングし得る。経口投与のための液体調製物は、たとえば、液剤、シロップ若しくは懸濁液の形態をとり得るか、又は、使用前に水若しくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提供し得る。そのような液体調製物は、慣用の手段によって、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル又は保存料などの薬学的に許容される添加剤を用いて調製し得る。また、調製物は、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色剤又は甘味剤も含有し得る。
【００８３】
経口投与のための調製物は、活性化合物の徐放性を与えるために適切に配合し得る。
【００８４】
頬側投与には、組成物は、慣用の様式で配合した錠剤又はロゼンジの形態をとり得る。
【００８５】
本発明の抗体、融合、及び／又はコンジュゲートは、たとえばボーラス注射又は輸液による、注射による非経口投与のために配合し得る。注射用の配合物は、単位剤形で、たとえばガラスアンプル又は複数用量容器、たとえばガラスバイアル中で提供し得る。注射用の組成物は油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液などの形態をとってよく、懸濁剤、安定化剤、保存料及び／又は分散剤などの配合剤を含有し得る。或いは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば無菌的な発熱物質非含有水で構成するための粉末形態であり得る。
【００８６】
上述の配合物に加えて、本発明の抗体はデポー調製物としても配合し得る。そのような長時間作用性配合物は、植込み又は筋肉内注射によって投与し得る。
【００８７】
経鼻投与又は吸入による投与には、本発明による化合物は、加圧パック又は噴霧器のためのエアロゾルスプレー提示の形態で、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス若しくはガスの混合物を使用して、好都合に送達し得る。
【００８８】
所望する場合は、組成物は、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含有し得るパック又は分注装置中で提示し得る。パック又は分注装置には、投与のための指示が添付されていてもよい。
【００８９】
局所投与には、本発明による化合物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解させた活性構成要素を含有する適切な軟膏中で好都合に配合し得る。具体的な担体には、たとえば、鉱物油、液体石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化ワックス及び水が含まれる。或いは、本発明による化合物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体に懸濁又は溶解させた活性構成要素を含有する適切なローション中で適切に配合し得る。具体的な担体には、たとえば、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノール及び水が含まれる。
【００９０】
一実施形態では、配合物は、吸入を含めた局所投与のための配合物として提供される。
【００９１】
適切な吸入用調製物には、吸入用粉末、噴霧用ガスを含有する計量エアロゾル又は噴霧用ガスを含まない吸入用溶液が含まれる。活性物質を含有する、本開示による吸入用粉末は、上述の活性物質のみから、又は上述の活性物質と生理的に許容される賦形剤との混合物からなり得る。
【００９２】
これらの吸入用粉末には、単糖（たとえば、グルコース若しくはアラビノース）、二糖（たとえば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（たとえばデキストラン）、ポリアルコール（たとえば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（たとえば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いとの混合物が含まれ得る。単糖又は二糖、すなわち、ラクトース又はグルコースの、排他的ではないが特にその水和物の形態の使用が適切に使用される。
【００９３】
肺中に堆積させるための粒子は、１０ミクロン未満、たとえば１〜９ミクロン、たとえば０．１〜５μｍ、具体的には１〜５μｍの粒子径を必要とする。活性成分（抗体又は断片など）の粒子径は非常に重要である。
【００９４】
吸入用エアロゾルを調製するために使用することができる噴霧用ガスは、当分野で知られている。適切な噴霧用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンなどの塩素化及び／又はフッ素誘導体等のハロ炭化水素から、とりわけ選択される。上述の噴霧用ガスは、それ自体で又はその混合物中で使用し得る。
【００９５】
特に適した噴霧用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７からとりわけ選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適している。
【００９６】
また、噴霧用ガスを含有する吸入用エアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨを調節する手段などの、他の成分も含有し得る。これらの成分はすべて当分野で知られている。
【００９７】
本発明による噴霧用ガスを含有する吸入用エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含有し得る。本発明によるエアロゾルは、たとえば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【００９８】
或いは、肺への局所投与は、たとえば、噴霧器、たとえばコンプレッサーに接続された噴霧器（たとえば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、バージニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄによって製造された、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーに接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などの装置を用いた、液体の溶液又は懸濁液の配合物の投与によるものであり得る。
【００９９】
本発明の抗体様式は、溶媒中に分散させて、たとえば、溶液又は懸濁液の形態で送達することができる。これは、適切な生理溶液、たとえば、生理食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁させることができる。当分野で知られている緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するために、１ｍｌの水あたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有し得る。懸濁液では、たとえば凍結乾燥した抗体を用いることができる。
【０１００】
また、治療用の懸濁液又は溶液の配合物は、１つ又は複数の賦形剤も含有することができる。賦形剤は当分野で周知であり、緩衝液（たとえば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（たとえば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、並びにグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア中にカプセル封入することができる。配合物は、一般に、無菌的な製造プロセスを用いて実質的に無菌的な形態で提供される。
【０１０１】
これには、当業者が精通した方法による、配合物に使用する緩衝溶媒／溶液の生成及び濾過による滅菌、無菌的緩衝溶媒溶液中への抗体の無菌的懸濁、並びに無菌的容器内への配合物の分注が含まれ得る。
【０１０２】
本開示による噴霧用配合物は、たとえば、箔の包みで梱包した単一用量単位（たとえば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供し得る。それぞれのバイアルは、一定体積、たとえば２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中に１つの単位用量を含有する。
【０１０３】
本開示の抗体様式は、噴霧化を介した送達に適していると考えられている。
【０１０４】
眼の投与には、本発明による化合物は、殺菌剤又は殺真菌剤、たとえば、硝酸フェニル水銀、塩化ベンジルアルコニウム又は酢酸クロルヘキシジンなどの保存料を用いて又は用いない、等張なｐＨ調節した無菌的な生理食塩水中の微小イオン化された懸濁液として、好都合に配合し得る。或いは、眼への投与には、化合物はペトロラタムなどの軟膏中で配合し得る。
【０１０５】
直腸投与には、本発明による化合物は、坐薬として好都合に配合し得る。これらは、活性構成要素を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で融けて活性構成要素を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。そのような材料には、たとえば、カカオ脂、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０６】
特定の状態の予防又は処置に必要な本発明の化合物の量は、選択した化合物及び処置する患者の状態に応じて変動する。しかし、一般に、１日用量は、経口又は頬側の投与には、体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜１０００ｍｇ、典型的には１００ｎｇ〜１００ｍｇ、たとえば約０．０１ｍｇ〜４０ｍｇ、非経口投与には体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜５０ｍｇ、経鼻投与又は吸入若しくはガス注入による投与には、約０．０５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、たとえば約０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。
【０１０７】
本発明のそれぞれの実施形態の好ましい特長は、必要な変更を加えて、他の実施形態のそれぞれと同様である。それだけには限定されないが本明細書中で引用された特許及び特許出願を含めたすべての出版物は、それぞれの個々の出版物が具体的且つ個々に本明細書中に参考として組み込まれていると示されていると記載されたごとく、本明細書中に参考として組み込まれている。
【０１０８】
本明細書のコンテキストにおける含むとは、含まれることを意味することを意図する。
【０１０９】
技術的に適切な場合は、本発明の実施形態を組み合わせ得る。
【０１１０】
実施形態は、特定の特長／要素を含むものとして本明細書中に記載されている。また、本開示は、前記特長／要素からなる、又はから本質的になる個別の実施形態までにも拡張される。
【０１１１】
以下、本発明を以下の実施例を参照して記載するが、これらは単なる例示であり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１ＡはｄＡｂがＣ末端にあるＦａｂ−Ｆｖの図表示である。図１ＢはＦａｂ−ｄｓＦｖの図表示である。
【図２】図２は、本発明の配列である。
【図３】図３は、本発明の配列である。
【図４】図４は、本発明の配列である。
【図５】図５は、本発明の配列である。
【図６】図６は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８標識したＡ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖの活性化ヒトＣＤ４＋ＯＸ４０＋Ｔ細胞への結合を示す。
【図７】図７は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性発現によって産生された抗体構築物のμｇ／ｍｌを示す。
【図８】図８は、Ｆａｂジスルフィド安定化ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図９】図９は、種々の構築物のヒト血清アルブミンに対する結合親和性に関する表にしたデータを示す。
【図１０】図１０は、種々の構築物の親和性Ｆａｂ結合抗原の表にしたデータを示す。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ細胞における一過性発現によって産生された抗体構築物のμｇ／ｍｌを示す。
【図１２】図１２は、種々の構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１３】図１３は、ＣＨＯ細胞において発現される種々の構築物についての熱安定性データを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
ＤＮＡ操作及び一般的方法
コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、形質転換及び慣用的培養物増殖のために用いた。ＤＮＡ制限酵素及び修飾酵素を、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．から得た。プラスミド調製を、Ｍａｘｉプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２１６５）を用いて実施した。ＤＮＡ配列決定反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーター配列決定キット（カタログ番号４３０４１４９）を用いて実施し、ＡＢＩ  ３１００自動化シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。データを、プログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ）を用いて分析した。オリゴヌクレオチドを、Ｓｉｇｍａ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。最初のＶ領域配列をコードする遺伝子を、ＤＮＡ２．０による自動化合成アプローチによって構築し、修飾して、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発によってグラフトバージョンを作製した。Ｆａｂ−Ｆｖの濃度を、タンパク質−ＧベースのＨＰＬＣ方法によって決定した。
【０１１４】
実施例１
（Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖにおける６４５の異なるヒト化グラフトの作製及び分析）
我々は、以前に、ＷＯ２０１０／０３５０１２において、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ抗体形式（図１Ｂ）及び「６４５ｇＨ１ｇＬ１」として公知のヒト化抗アルブミン抗体を記載した。我々はまた、以前に、ＷＯ２０１００９６４１８において、「Ａ２６」として公知のヒト化拮抗性抗ＯＸ４０抗体の産生を記載した。我々は、６４５ｄｓｇＨ５ｇＬ４として公知の抗体「６４５」の新規な改善されたヒト化グラフトの産生、並びにＦｖコンポーネント内にグラフトを及びＦａｂコンポーネント内に「Ａ２６」可変領域を組み込むＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体分子の産生を記載する。６４５ｇＨ１及びｇＬ１の配列は、図３（ａ）及び（ｂ）、配列番号９及び１０に示される。
【０１１５】
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）プラスミドの構築
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ１）軽鎖（配列番号１２）の全コード領域を、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下に、ＵＣＢ哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ１）（配列番号１０）の軽鎖可変領域を、重複ＰＣＲ方法によって、６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ４）（配列番号４）に突然変異した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１）重鎖（配列番号１１）の全コード領域を、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下に、ＵＣＢ哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１）（配列番号９）の重鎖可変領域を、重複ＰＣＲ方法によって、６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５）（配列番号２）に突然変異した。構築物を、配列決定によって確かめた。
【０１１６】
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）の哺乳動物発現
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、２５μｇの重鎖プラスミドと２５μｇの軽鎖プラスミドを、１００μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎと１７００μｌのＯｐｔｉｐｒｏ培地と共に、２０分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を５０ｍＬの懸濁液中の５０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に加え、６日間、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。６日後、上清を１５００×ｇにて１０分間の遠心分離によって回収して細胞を除去し、０．２２μｍの滅菌フィルターで濾過した。
【０１１７】
Ａ２６Ｆａｂ−−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）のタンパク質−Ｇ精製
約５０ｍｌの０．２２μｍフィルター濾過した上清を、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮機を用いて約２ｍｌまで濃縮、４０００×ｇにてスウィングアウトローター内で遠心分離した。１．８ｍｌの濃縮した上清を、１ｍｌ／分にて２０ｍＭホスフェート、４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４中で平衡化した１ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用した。このカラムを、２０ｍＭホスフェート、４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４で洗浄し、結合物質を、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７で溶出した。溶出ピークを回収し、２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５にて約ｐＨ７にまでｐＨを調整した。ｐＨ調整した溶出物を、濃縮し、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮機を用いて、２０ｍＭホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４中に限外濾過し、４０００×ｇにてスウィングアウトローター内で遠心分離して、約０．３ｍｌの最終容量にした。
【０１１８】
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）のサイズ排除分析
タンパク質−Ｇ精製したサンプルを、サイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。このサンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分離し、均一濃度勾配のＰＢＳ  ｐＨ７．４によって、１ｍｌ／分で展開した。ピーク検出は、２８０ｎｍであり、且つ見かけ上の分子量が、既知の分子量のタンパク質対溶出容量の標準曲線と比較することによって計算した。６４５ｄｓＦｖのヒト化グラフトのｇＨ１ｇＬ１からｇＨ５ｇＬ４への変化は、ｄｓＦｖ（データは示さず）の熱安定性において、又はｄｓＦｖのＨＳＡへの結合の親和性において（データは示さず）、何ら変化なしに、発現されたＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのモノマーの５９％から７１％までの百分率での増大（１２％の増大）をもたらした。
【０１１９】
実施例２
２．１  Ａ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）結合ＯＸ４０についてのＢＩＡｃｏｒｅ動態学
この及びすべてのその後の例において、Ａ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖ  ６４５ｇＨ５ｇＬ４は、配列番号７において示される重鎖配列（図２（ｇ））及び配列番号８において示される軽鎖配列（図２（ｈ））を有し、すなわち、この重鎖は、配列番号５において示されたＧ４Ｓ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓリンカーを含んだ（図２（ｅ））。
【０１２０】
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、≒５０００応答単位（ＲＵ）の補足レベルまでのアミン結合化学を介してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１０μＬ／分の流速でランニング緩衝液として使用した。Ａ２６  Ｆａｂ’の０．５μｇ／ｍＬでの１０μＬ注入又は１μｇ／ｍＬでのＡ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖの注入を、固定化抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために使用した。ヒトＯＸ４０を、流速３０μＬ／分で種々の濃度（２５ｎＭ〜１．５６２５ｎＭ）にて捕捉したＡ２６にわたって滴定した。この表面を、１０μＬ／分の流速における５０ｍＭＨＣｌの２×１０μＬ注入、その後の５ｍＭ  ＮａＯＨの５μＬ注入によって、再産生させた。バックグラウンド減算結合曲線を、Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を用い、標準的手段に従って分析した。動態学パラメータを、フィッティングアルゴリズムから決定した。
【表３】
2014534978.tif 000006
【０１２１】
２．２  Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）結合アルブミンについてのＢＩＡｃｏｒｅ動態学
ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、ＣＭ５センサーチップ上に、≒５０００応答単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでのアミン結合化学を介して固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ランニング緩衝液として、１０μＬ／分の流速で使用した。０．７５μｇ／ｍＬにおけるＦａｂ−Ｆｖの１０μＬ注入を、固定化抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために使用した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）及びカニクイザル血清アルブミン（ＣＳＡ）を、３０μＬ／分の流速で、種々の濃度（５０ｎＭ〜６．２５ｎＭ）における捕捉したＦａｂ−Ｆｖにわたって滴定した。表面を、流速１０μＬ／分における５０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬ注入、その後の５ｍＭ  ＮａＯＨの５μＬ注入によって再産生した。バックグラウンド減算結合曲線を、Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を用い、標準的手順に従って分析した。動態学パラメータを、フィッティングアルゴリズムから決定した。
【表４】
2014534978.tif 000007
【０１２２】
２．３  ＯＸ４０及びアルブミンへのＡ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）の同時結合の実証
ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンのＡ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖへの同時結合を、評価した。Ａ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖ構築物を、Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖアルブミンの結合についてのＢｉａｃｏｒｅ動態学についての方法において述べたとおりに、センサーチップ表面に捕捉した。５０ｎＭ  ＨＡＳ、２５ｎＭ  ＯＸ４０又は５０ｎＭ  ＨＳＡ及び２５ｎＭ  ＯＸ４０の終濃度を有する混合溶液を、捕捉したＡ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖにわたって別個に滴定した。合わせたＨＳＡ／ＯＸ４０溶液についての結合応答は、別個の注入の応答の合計と同等であった。このことは、Ｆａｂ−ｄｓＦｖが、ヒトＯＸ４０及びＨＳＡの両方への同時の結合が可能であることを確認した。
【表５】
2014534978.tif 000008
【０１２３】
２．４  Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）の細胞ベースの親和性
方法：
ヒト活性化ＣＤ４＋ＯＸ４０＋Ｔ細胞に対するＡ２６  Ｆａｂ−Ｆｖ結合。
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配上で分離することによって単離し、４μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌによって、３日間３７℃、５％  ＣＯ２、１００％湿度にて活性化させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたネガティブ選択によって単離した。約１×１０５個の細胞を、Ｆａｃｓ緩衝液（ＰＢＳ／０．２％  ＢＳＡ／０．０９％  ＮａＮ３）又は５％  ＨＳＡを補ったＦａｃｓ緩衝液のいずれかにおける抗体の存在下で、４℃にてインキュベートした。抗体の終濃度は、４８ｎＭ〜０．０００５ｎＭの範囲に及んだ。この細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、その後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリによって分析した。２つの滴定データセットを、１つはＡ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖを含み、第２は非特異的結合を決定するために無関係の対照Ｆａｂ−Ｆｖを含む、両緩衝液条件下で作成した。結合抗体のモル数を、種々の、しかし既知の量の蛍光色素を含むビーズの使用により作成された標準曲線から内挿された値を用いることによって、計算した。幾何平均蛍光値を、細胞及びビーズのフローサイトメトリ分析において決定した。非特異的結合を、Ａ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖ値から減算し、こうして作成された特異的結合曲線を、１部位結合等式（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標））を用いた非線形回帰によって分析し、ＫＤを決定した。細胞表面発現抗原についてのＡ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖの親和性を決定するために、活性化ＣＤ４＋ＯＸ４０＋Ｔ細胞及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識Ａ２６  Ｆａｂ−ｄｓＦｖを用いて、飽和結合実験を実施した。非常に小さな画分の抗体のみが、結合曲線の任意の点において受容体に結合したと仮定して、抗体濃度の一定範囲にわたって平衡である抗体の受容体に対する特異的結合を、ＫＤを決定するために使用した。
【０１２４】
平衡結合は、以下の等式を用いて説明される：
【化１】
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抗体の受容体との会合の割合＝Ｋｏｎ×［受容体遊離］×［抗体遊離］
受容体−抗体複合体の解離の割合＝Ｋｏｆｆ×［受容体−抗体］
平衡において、会合率及び解離率は、同等であり、結合等温線を説明する等式が、導かれる；セミログプロット上にて、結合は、Ｓ字である。ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎによって規定され、結合曲線から、最大半量の結合が起こる濃度として計算され得る。
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識Ａ２６  Ｆａｂ−Ｆｖの活性化ヒトＣＤ４＋ＯＸ４０＋Ｔ細胞への結合を、５ログ濃度範囲にわたるフローサイトメトリによって測定した。
Ａ２６  Ｆａｂ−Ｆｖについての代表的結合曲線を、図４に示す。
５の異なるドナー由来の活性化細胞上で得られた平均ＫＤ値は、１４５ｐＭであった。
【０１２５】
実施例３
ｓｃＦｖとしての６４５ｇＬ４ｇＨ５の発現
プラスミド構築
ｓｃＦｖを、２つの近接に関連するＵＣＢ修飾哺乳動物発現プラスミドのうちの１つから発現した；ｐＶＫΔＰｖｕＩＩを、ＨＬ方向におけるｓｃＦｖのクローニング及び発現のために使用し、他方で、ｐＫＨΔＥｃｏＲＶを、ＬＨ方向におけるｓｃＦｖのクローニング及び発現のために使用した。すべてのｓｃＦｖを、２０アミノ酸リンカーペプチド、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１７）及びＣ末端１０×Ｈｉｓタグを含むように設計した。ｓｃＦｖアクセプタープラスミド３６２ＨＬ及び２４０ＬＨは、ｖＨ（ＰｖｕＩＩ及びＸｈｏＩ）及びｖＬ（ＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩ）のＦＷ１−ＦＷ４境界において独自の制限部位をコードし、その後の２工程ライゲーションにおけるｓｃＦｖ可変領域の制限クローニングを可能にした。６４５ｇＨ５  ｖＨ及び６４５ｇＬ４  ｖＬをコードする遺伝子を、ＤＮＡ２．０によって合成し、ジスルフィド安定化（ｄｓ）ｓｃＦｖを産生するために、Ｋａｂａｔ位置ｖＨ４４及びｖＬ１００においてシステイン揺らぎを有した。これらのＶ−領域遺伝子を、ＰｖｕＩＩ及びＸｈｏＩ（ｖＨ）又はＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩ（ｖＬ）を用いてアクセプターｓｃＦｖプラスミド内にクローニングし、首尾よいライゲーションを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２６】
発現及び精製
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（１０６細胞／ｍｌにて５０ｍｌの培養物）を、５０μｇプラスミドＤＮＡによってトランスフェクトし、３７℃にてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地中で培養した。上清を、トランスフェクションの６日後に回収し、ｓｃＦｖを、バッチＮｉ２＋−ＮＴＡ精製によって精製した。精製タンパク質を、濃縮し、その後の生理学的性質決定のために、ＰＢＳに緩衝液交換した。
【０１２７】
熱安定性アッセイ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを実施し、精製分子の熱安定性を評価した。精製タンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、この混合物を、３８４  ＰＣＲ光学ウェルプレート内に４連で分注した。サンプルを、２０℃〜９９℃の温度範囲にわたって、１．１℃／分のランプ速度で、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ウェルあたりの蛍光強度変化を、温度に対してプロットし、得られたスロープの変曲点を使用して、Ｔｍを得た。
【０１２８】
サイズ排除ＨＰＬＣ
精製タンパク質（１０μｇ及び５０μｇ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  Ｔｒｉｃｏｒｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。ＰＢＳ  ｐＨ７．４の均一濃度勾配を流速１ｍｌ／分で使用し、２１４ｎｍ及び２８０ｎｍにおいてＵＶ検出を行った。
【０１２９】
結果のまとめ
６４５ｇＨ５ｇＬ４  ＨＬｄは、９７％のモノマー及び７５．６℃のＴｍを与えた。
６４５ｇＨ５ｇＬ４  ＨＬは、８６％のモノマー及び７５．６℃のＴｍを与えた。
【０１３０】
実施例４
ＦａｂＡ−ｄｓｓｃＦｖ融合物の構築
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミド
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を、ヒト血清アルブミン結合抗体の軽鎖及び重鎖可変領域ドメイン（配列番号１及び３又は２及び４）を、ＨＬ方向における柔軟なリンカー（配列番号１７）を介して連結することにより、構築した。点突然変異を、ＤＮＡ配列内に、Ｆｖの重鎖及び軽鎖の両方のフレームワーク領域中の選択された残基で導入した。突然変異は、Ｆｖの重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入され、ジスルフィド連結されたｓｃＦｖ（ｄｓｓｃＦｖ）を形成した。ＦａｂＡ−ｄｓｓｃＦｖ融合タンパク質を、ｄｓｓｃＦｖを、軽鎖領域（カッパ定常領域のＫｍ３アロタイプを有する）又はＦａｂＡの重鎖（ヒトガンマ−１ＣＨ１定常領域、γ１イソ型）のいずれかの定常領域のＣ末端に融合することによって、構築した。柔軟な（配列番号１８及び５）リンカーを使用し、ｓｃＦｖをｃカッパ領域（配列番号１９）又はＣＨＩ領域（配列番号２０）に、それぞれ連結した。ＦａｂＡ−ｄｓｓｃＦｖ（ＣＬ−ｄｓｓｃＦｖ）、ＦａｂＡ−ｄｓｓｃＦｖ（ＣＨ１−ｄｓｓｃＦｖ）、ＦａｂＡ軽鎖及びＦａｂＡ重鎖を、化学的に製造し、次いで、哺乳動物発現ベクター内に、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下でクローニングした。
【０１３１】
これらの構築物についての種々のデータを、図７〜１３に示す。構築物についての熱安定性データは、それぞれ約８２℃のＴｍを与えた。
【０１３２】
本明細書の文脈に関して、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することが企図される。
【０１３３】
本発明の技術的に適切な実施形態が、組み合わされ得る。実施形態は、特定の特徴／要素を含むように、本明細書中で記載される。本開示はまた、前記特徴／要素から成るか、又は前記特徴／要素から本質的に成る別個の実施形態にも及ぶ。
【０１３４】
本発明は、例としてのみ説明されており、決して限定を意味せず、詳細の改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内でなされ得ることが、無論のこと、理解されよう。本発明の各実施形態の好ましい特徴は、他の実施形態各々について必要な変更を加えたものである。本明細書中で挙げられた特許及び特許出願を含むがこれらに限定されないすべての刊行物は、本明細書中で、個々の刊行物各々が、具体的に且つ別個に本明細書中にその全文が参考として組み込まれることが示されているのと同じく、参考として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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