(57)【要約】  本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型（「ＰＣＳＫ９」）に対する抗体アンタゴニストおよびこのような抗体を使用する方法を提供する。
2014511378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合する抗体であって、ＰＣＳＫ９と低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）との相互作用をブロックし、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を阻害し、
ａ）ヒト重鎖Ｖ−セグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域；ならびに
ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＩＴＴＥＧＧＦＡＹ（配列番号：１７）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＱＱＳＮＹＷＰＬＴ（配列番号：２４）を含む、
抗体。
【請求項２】
約５００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖Ｖ−セグメントが配列番号：２７と少なくとも８５％配列同一性を有し、軽鎖Ｖ−セグメントが配列番号：２８と少なくとも８５％配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖Ｖ−セグメントが配列番号：２５および配列番号：２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を有し、軽鎖Ｖ−セグメントが配列番号：２８と少なくとも８５％配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖ＦＲ４がヒト生殖細胞系列ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖ＦＲ４が配列番号：３５である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖ＦＲ４がヒト生殖細胞系列ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
軽鎖ＦＲ４が配列番号：３９である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
重鎖Ｖ−セグメントおよび軽鎖Ｖ−セグメントがそれぞれ、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１が配列番号：１５のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２が配列番号：１６のアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１が配列番号：２０のアミノ酸配列を含み；そして
ｉｖ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２が配列番号：２３のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１が配列番号：１４を含み；
ｉｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２が配列番号：１６を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：１７のアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１が配列番号：１９を含み；
ｖ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２が配列番号：２２を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：２４を含む、
請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
重鎖可変領域が配列番号：４０の可変領域と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号：４１の可変領域と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
重鎖可変領域が配列番号：４０の可変領域と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号：４１の可変領域と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号：４０を含む重鎖および配列番号：４１を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
重鎖可変領域が配列番号：５および配列番号：９からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号：７および配列番号：１１からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
重鎖可変領域が配列番号：５および配列番号：９からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号：７および配列番号：１１からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
重鎖可変領域が配列番号：５および配列番号：９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号：７および配列番号：１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
ＦＡｂ’フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
ＩｇＧである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒト定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
担体タンパク質に連結している、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
ＰＥＧ化されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１−２２のいずれかに記載の抗体および生理学的に適合できる賦形剤を含む組成物。
【請求項２４】
個体における低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
第２の薬剤がスタチンである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤、甲状腺ホルモン模倣物、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃを低下させる方法であって、治療有効量の請求項１に記載の抗体を個体に投与し、それにより、個体におけるＬＤＬ−Ｃを低下させることを含む方法。
【請求項２９】
個体がスタチン治療に対して低応答性または耐性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
個体がスタチン治療に不耐性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
個体が少なくとも約１００ｍｇ／ｄＬのベースラインＬＤＬ−Ｃレベルを有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
個体が家族性高コレステロール血症を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
総コレステロールをＬＤＬ−Ｃと共に低下させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
個体がトリグリセリド血症を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
個体が機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子突然変異を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
個体が薬剤誘導性脂質異常症を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
ＬＤＬ−Ｃを低下させることにおいて有効な治療有効量の第２の薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
第２の薬剤がスタチンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤、甲状腺ホルモン模倣物、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
抗体および第２の薬剤を混合物として共投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
抗体および第２の薬剤を別々に共投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
抗体を静脈内に投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
抗体を皮下に投与する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、全目的のために参照により組み込んだ２０１１年２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／４４２，１２６号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗体アンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）は、血流中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のクリアランスを介してアテローム性動脈硬化および高コレステロール血症を防止する。ＬＤＬ−Ｒは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型（「ＰＣＳＫ９」）により翻訳後のレベルが調節される。最近、ＰＣＳＫ９のノックアウトがマウスにおいて報告された。これらのマウスは、血漿コレステロールレベルにおいて約５０％の低下を示し、血漿コレステロール低下においてスタチンに対する高い感受性を示した（Rashid Sら (2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379。ヒトの遺伝子データはまた、ＬＤＬホメオスタシスにおけるＰＣＳＫ９の役割をサポートする。おそらくＰＣＳＫ９の「機能損失」突然変異と考えられる２つの変異が最近同定された。これらの突然変異を有する個体は、ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルにおいて約４０％の低下を有し、このことは冠動脈心疾患において約５０〜９０％の減少となることを意味している。考え合わせると、これらの試験は、ＰＣＳＫ９のインヒビターがＬＤＬ−Ｃの血漿濃度およびＰＣＳＫ９により媒介される他の疾患状態を軽減するために有益であり、効率を高めるために、例えば、コレステロールを低下させるために有用である第２の薬剤と共投与することができることを示す。
【発明の概要】
【０００４】
発明の簡潔な概要
本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（例えば、配列番号４３）に結合し、その機能をアンタゴナイズする抗体および、例えば、ＰＣＳＫ９により媒介される疾患状態を処置するためにこのような抗体を使用するための方法を提供する。
【０００５】
１つの局面において、本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合する抗体および抗原結合分子を提供する。いくつかの態様において、抗体は、ＰＣＳＫ９と低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）との相互作用をブロックし、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を阻害し、
ａ）ヒト重鎖Ｖ−セグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域；ならびに、
ｂ）ヒト軽鎖Ｖ−セグメント、軽鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＩＴＴＥＧＧＦＡＹ（配列番号：１７）を含み；そして、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＱＱＳＮＹＷＰＬＴ（配列番号：２４）を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合分子は、ヒトＰＣＳＫ９に、約５００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、いくつかの態様において、抗体または抗原結合分子は、ヒトＰＣＳＫ９に、約４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１９０ｐＭ、１８０ｐＭ、１７０ｐＭ、１６０ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。
【０００７】
いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントは、配列番号：２７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントは、配列番号：２８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。
【０００８】
いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントは、配列番号：２５および配列番号：２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有し、軽鎖Ｖ−セグメントは、配列番号：２８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。
【０００９】
いくつかの態様において、重鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞系列ＦＲ４である。いくつかの態様において、重鎖ＦＲ４は配列番号：３５である。
【００１０】
いくつかの態様において、軽鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞系列ＦＲ４である。いくつかの態様において、軽鎖ＦＲ４は配列番号：３９である。
【００１１】
いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントおよび軽鎖Ｖ−セグメントはそれぞれ、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１は、配列番号：１５のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２は、配列番号：１６のアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含み；そして、
ｉｖ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２は、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１は配列番号：１４を含み；
ｉｉ）重鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２は配列番号：１６を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：１７を含み；
ｉｖ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ１は配列番号：１９を含み；
ｖ）軽鎖Ｖ−セグメントのＣＤＲ２は配列番号：２２を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：２４を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は、配列番号：４０の可変領域と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号：４１の可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有する。
【００１４】
いくつかの態様において、抗体は、配列番号：４０を含む重鎖および配列番号：４１を含む軽鎖を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は、配列番号：５および配列番号：９からなる群から選択される可変領域と少なくとも８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号：７および配列番号：１１からなる群から選択される可変領域と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を有する。
【００１６】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：５および配列番号：９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号：７および配列番号：１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、抗体はＩｇＧである。いくつかの態様において、抗体はＩｇＧ１である。
【００１８】
いくつかの態様において、抗体はＦＡｂ’フラグメントである。いくつかの態様において、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの態様において、抗体はヒト定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体はヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの態様において、ヒトＩｇＧ１定常領域は、細胞または補体のＣ１成分上のエフェクターリガンド、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＦｃガンマＲ１に対する結合親和性が低下されるように突然変異される。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照。いくつかの態様において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５が、Ａｌａ２３４およびＡｌａ２３５に置換させる。重鎖定常領域中の残基の番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けである（Kabatら (1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Dept. Health and Human Services参照）。
【００１９】
いくつかの態様において、抗体は、担体タンパク質、例えば、アルブミンに連結される。
【００２０】
いくつかの態様において、抗体はペグ化される。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合分子および生理学的に適合できる賦形剤を含む組成物を提供する。
【００２２】
いくつかの態様において、組成物は、個体において低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤をさらに含む。
【００２３】
いくつかの態様において、第２の薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択することができる。
【００２４】
いくつかの態様において、第２の薬剤は、フィブラート、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤、甲状腺ホルモン模倣物、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールを低下する方法、本明細書に記載されている抗体または抗原結合分子を個体に治療有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
いくつかの態様において、個体は、スタチン治療に低応答性または耐性である。いくつかの態様において、個体はスタチン治療に不耐性である。いくつかの態様において、個体は、少なくとも約１００ｍｇ／ｄＬ、例えば、少なくとも約１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上のベースラインＬＤＬ−Ｃレベルを有する。いくつかの態様において、個体は、家族性高コレステロール血症を有する。いくつかの態様において、個体は、トリグリセリド血症を有する。いくつかの態様において、個体は、機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子突然変異を有する。いくつかの態様において、個体は、薬剤誘導性脂質異常症を有する。
【００２７】
いくつかの態様において、総コレステロールは、ＬＤＬ−Ｃと共に低下する。
【００２８】
いくつかの態様において、方法は、治療有効量のＬＤＬ−Ｃを低下することにおいて有効な第２の薬剤を個体に投与することをさらに含む。
【００２９】
いくつかの態様において、第２の薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択することができる。
【００３０】
いくつかの態様において、第２の薬剤は、フィブラート、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤、甲状腺ホルモン模倣物、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合分子および第２の薬剤は、混合物として共投与される。
【００３２】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合分子および第２の薬剤は、別々に共投与される。
【００３３】
いくつかの態様において、抗体は、静脈内に投与される。いくつかの態様において、抗体は皮下に投与される。
【００３４】
定義
「抗体」は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドまたは非共有的に、可逆的に、かつ特異的な様式で対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを示す。典型的な抗体構造単位は、テトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、２つの同一の対のポリペプチド鎖から構成され、それぞれの対は、ジスルフィド結合を介して接続される１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、これらは、順に、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。それぞれの鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、それぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を示す。本出願において使用されるとき、「抗体」は、特に、例えば、ＰＣＳＫ９に対して、特定の結合性を有する抗体およびそのフラグメントの変種全てを包含する。したがって、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および同じ結合特異性を有するこれらのフラグメントの多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）は、この概念の範囲内である。
【００３５】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は」、互換的に、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を示す。ＣＤＲは、このような標的タンパク質に対する特異性を提供する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。ヒトＶＬまたはＶＨのそれぞれにおいて３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１−３、Ｎ−末端から連続して番号付けられる）が存在し、可変ドメインの約１５−２０％を構成する。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補的であり、したがって、結合特異性に直接関与する。ＶＬまたはＶＨの残りの部分、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列の変異が少ないことを示す（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
【００３６】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当分野で種々のよく知られた定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  データベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ  imgt.cines.fr/）、およびＡｂＭ（例えば、Johnsonら Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothiaら Nature, 342:877-883 (1989); Chothiaら J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikaniら J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)参照）を使用して決定される。抗原結合部位の定義はまた、以下に記載されている：Ruizら Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000);およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallumら J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996);およびMartin ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martinら Methods Enzymol., 203:121-153 (1991);およびReesら In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００３７】
「結合特異性決定因子」または「ＢＳＤ」なる用語は、互換的に、抗体の結合特異性を決定するために必要である相補性決定領域内の最小の隣接しているか、または隣接していないアミノ酸配列を示す。最小の結合特異性決定因子は、１つ以上のＣＤＲ配列内であり得る。いくつかの態様において、最小の結合特異性決定因子は、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列の一部または完全長内に存在する（すなわち、それによって単独で決定される）。
【００３８】
本明細書において使用される「抗体軽鎖」または「抗体重鎖」はそれぞれ、ＶＬまたはＶＨを含むポリペプチドを示す。内因性ＶＬは、遺伝子セグメントＶ（可変）およびＪ（連結）によってコードされ、内因性ＶＨは、Ｖ、Ｄ（多様性）およびＪによってコードされる。ＶＬまたはＶＨのそれぞれは、ＣＤＲならびにフレームワーク領域を含む。本願において、抗体軽鎖および／または抗体重鎖は、時々、集合的に「抗体鎖」を示し得る。これらの用語は、当業者が容易に理解するように、ＶＬまたはＶＨの基本構造を破壊しない突然変異を含む抗体鎖を含む。
【００３９】
抗体は、無傷な免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生産される多くの良く特徴付けられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合より下で抗体を消化し、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖であるＦａｂ’のダイマーであるＦ（ａｂ）’２を生産する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏和な条件下で還元され、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を破壊し、それによりＦ（ａｂ）’２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換され得る。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂである。Paul, Fundamental Immunology 3d ed. (1993)。種々の抗体フラグメントが無傷な抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、このようなフラグメントは、化学的に、または組換えＤＮＡ方法論を使用することにより、デノボ合成され得ることを理解している。したがって、本明細書において使用される「抗体」なる用語はまた、抗体全体の修飾により生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成される抗体フラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定される抗体フラグメントを含む（例えば、McCafferty ら Nature 348:552-554 (1990)参照）。
【００４０】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、当分野で知られている任意の技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozborら Immunology Today 4:72 (1983); Coleら Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985参照）。一本鎖抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するために採用することができる。また、トランスジェニックマウス、または他の生物体、例えば、他の哺乳動物を、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Ｆａｂフラグメントを同定するために使用することができる（例えば、McCaffertyら 上記; Marksら Biotechnology, 10:779-783, (1992)参照）。
【００４１】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化するための方法は、当分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、移入(import)残基と称され、一般的に移入可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列にて置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（例えば、Jonesら Nature 321:522-525 (1986); Riechmannら Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyenら Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)参照）にしたがって本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、無傷なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際に、ヒト化抗体は、一般的に、いくつかの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）残基および恐らくいくつかのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が、齧歯動物抗体のアナログ部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。
【００４２】
本発明の抗体または抗原結合分子は、化学的に結合されているか、または他のタンパク質と融合タンパク質として発現される１つ以上の免疫グロブリン鎖をさらに含む。それはまた、二重特異性抗体を含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。本発明の他の抗原結合フラグメントまたは抗体部分は、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、単一の結合ドメイン（ｄＡｂ）、およびミニボディ(minibodies)を含む。
【００４３】
本明細書に記載されている種々の抗体または抗原結合フラグメントは、無傷な抗体の酵素もしくは化学修飾により生産する、または組換えＤＮＡ方法（例えば、一本鎖Ｆｖ）を使用してデノボ合成する、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定することができる（例えば、McCaffertyら Nature 348:552-554, 1990参照）。例えば、ミニボディは、当分野で記載されている方法、例えば、Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001を使用して作製することができる。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む種々の方法により生産することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelnyら J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。一本鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリーを使用して同定することができる。このようなライブラリーは、合成、半合成または天然および免疫応答性供給源から構築することができる。
【００４４】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新規特性を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結できるように、定常領域またはその一部が変化、置換または交換されているか、または、（ｂ）可変領域、またはその一部が、異なるかまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置換または交換されている抗体分子である。例えば、以下の実施例に示されるとおり、マウス抗ＰＣＳＫ９抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリン由来の定常領域で置換することにより修飾することができる。ヒト定常領域との置換によって、キメラ抗体は、ヒトＰＣＳＫ９を認識することにおいて特異性を保持することができるが、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性が低下する。
【００４５】
「抗体結合分子」または「非抗体リガンド」なる用語は、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子および抗体様結合ペプチド模倣物を含む、非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドを使用する抗体模倣物を示す。
【００４６】
「可変領域」または「Ｖ−領域」なる用語は、互換的に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を示す。図１参照。内因性可変領域は、免疫グロブリン重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子または軽鎖Ｖ−Ｊ遺伝子によってコードされる。Ｖ−領域は、天然、組換えまたは合成であり得る。
【００４７】
本明細書において使用される「可変セグメント」または「Ｖ−セグメント」なる用語は、互換的に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含む可変領域の部分配列を示す。図１参照。内因性Ｖ−セグメントは、免疫グロブリンＶ−遺伝子によってコードされる。Ｖ−セグメントは、天然、組換えまたは合成であり得る。
【００４８】
本明細書において使用される「Ｊセグメント」なる用語は、ＣＤＲ３およびＦＲ４のＣ−末端部分を含むコードされた可変領域の部分配列を示す。内因性Ｊ−セグメントは、免疫グロブリンＪ−遺伝子によってコードされる。図１参照。Ｊ−セグメントは、天然、組換えまたは合成であり得る。
【００４９】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持するが、ヒトにおける免疫原性が少ない抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残存する部分をヒト対応物と置換することによりなし遂げることができる。例えば、Morrisonら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyenら Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)参照。
【００５０】
「対応するヒト生殖細胞系列配列」なる用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他の既知の可変領域アミノ酸配列全てと比較して、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列と最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を共有するヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を示す。対応するヒト生殖細胞系列配列はまた、他の評価された可変領域アミノ酸配列全てと比較して、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列を示すことができる。対応するヒト生殖細胞系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セグメント（上記定義）、または可変領域を含む配列もしくは部分配列の他の組み合わせであり得る。配列同一性は、本明細書に記載されている方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたは当分野で知られている別のアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をアラインメントさせることにより、決定することができる。対応するヒト生殖細胞系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有することができる。対応するヒト生殖細胞系列配列は、例えば、公式に利用可能な国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ  imgt.cines.fr/）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブ  vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk）を介して決定することができる。
【００５１】
抗原、例えば、タンパク質と抗体または抗体由来の結合剤との間の相互作用を記載する文脈において使用されるとき、「特異的に（または選択的に）結合する」なるフレーズは、タンパク質および他の生物学的物質の不均一な集団、例えば、生物学的サンプル、例えば、血液、血清、血漿または組織サンプルにおける抗原の存在を決定する結合反応を示す。したがって、示された免疫測定条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍で特定の抗原に結合し、サンプル中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。このような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、該抗体または剤が特定のタンパク質に対する特異性にて選択されることが必要であり得る。所望であれば、または適当であれば、該選択は、例えば、他の種（例えば、マウス）由来のＰＣＳＫ９分子または他のＰＣＳＫサブタイプと交差反応する抗体を引くことによりなし遂げられ得る。種々の免疫測定法フォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法は、日常的に、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用される（免疫測定法フォーマットおよび特異的免疫反応を決定するために使用することができる条件の記載のために、例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)参照）。一般的には、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、さらに一般的には、バックグラウンドの少なくとも１０から１００倍のシグナルを生成する。
【００５２】
「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」なる用語は、会合速度定数（ｋａ、時−１、Ｍ−１）によって割った解離速度定数（ｋｄ、時−１）を示す。平衡解離定数は、当分野で既知の任意の方法を使用して測定することができる。本発明の抗体は、一般的に、約１０−７または１０−８Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
【００５３】
本明細書において使用される「抗原結合領域」なる用語は、分子とＰＣＳＫ９との間の特異的結合に関与する本発明のＰＣＳＫ９結合分子のドメインを示す。抗原結合領域は、少なくとも１つの抗体重鎖可変領域および少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域を含む。少なくとも１つのこのような抗原結合領域が、本発明のそれぞれのＰＣＳＫ９結合分子に存在し、抗原結合領域のそれぞれは、他のものと同一であるかまたは異なっていてもよい。いくつかの態様において、本発明のＰＣＳＫ９結合分子の抗原結合領域の少なくとも１つは、ＰＣＳＫ９のアンタゴニストとして作用する。
【００５４】
本明細書において使用される「アンタゴニスト」なる用語は、標的分子に特異的に結合し、標的分子の活性を阻害することができる薬剤を示す。例えば、ＰＣＳＫ９のアンタゴニストは、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を完全に、または部分的に阻害する。本明細書において使用されるＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を阻害することは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合を妨げる。いくつかの場合において、ＰＣＳＫ９アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９に結合し、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する能力により同定することができる。本発明のアンタゴニストに暴露されるとき、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解が生じる阻害は、コントロールの存在下またはアンタゴニストの非存在下で、ＰＣＳＫ９媒介分解と比較して、少なくとも約１０％未満、例えば、少なくとも約２５％、５０％、７５％未満、または完全な阻害である。コントロールは、抗体または抗原結合分子に曝露されないか、別の抗原に特異的に結合する抗体または抗原結合分子、またはアンタゴニストとして機能しないことが知られている抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子であり得る。「抗体アンタゴニスト」は、アンタゴニストが阻害抗体である状況を示す。
【００５５】
「ＰＣＳＫ９」または「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型」なる用語は、互換的に、分泌サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属する天然ヒトプロタンパク質転換酵素を示す。ＰＣＳＫ９は、小胞体において自己触媒的分子内プロセシングを受ける可溶性酵素前駆体として合成され、プロタンパク質転換酵素として機能を果たすと考えられている。ＰＣＳＫ９は、コレステロールホメオスタシスにおいて役割を果たし、皮質ニューロンの分化において役割を担い得る。このＰＣＳＫ９遺伝子における突然変異は、常染色体優性家族性高コレステロール血症の形態と関連づけられている。例えば、Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26参照。ＰＣＳＫ９の核酸およびアミノ酸配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１７４９３６．２およびＮＰ＿７７７５９６．２とそれぞれ公開されている。本明細書において使用されるＰＣＳＫ９ポリペプチドは、ＬＤＬＲに機能的に結合し、ＬＤＬＲの分解を促進する。構造的には、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿７７７５９６．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。構造的には、ＰＣＳＫ９核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１７４９３６．２の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００５６】
「ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異」なるフレーズは、例えば、ＬＤＬＲ分解の増加およびＬＤＬＲレベルの低下による、家族性高コレステロール血症表現型、加速性アテローム性動脈硬化症および若年性冠動脈性心臓疾患に関連した、および／または、これらの原因となるＰＣＳＫ９遺伝子に生じる天然の突然変異を示す。ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異の対立遺伝子頻度は稀である。Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev. (2008) 29(1):11-26参照。典型的なＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異は、Ｄ１２９Ｎ、Ｄ３７４Ｈ、Ｎ４２５ＳおよびＲ４９６Ｗを含む。Fasanoら Atherosclerosis (2009) 203(1):166-71参照。ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異は、例えば、Burnett and Hooper、上記; Fasanoら 上記; Abifadelら J Med Genet (2008) 45(12):780-6; Abifadelら Hum Mutat (2009) 30(4):520-9;およびLiら Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Nov. 1 (PMID 19601924)に概説されている。
【００５７】
本発明のポリペプチドの「活性」は、天然の細胞または組織におけるポリペプチドの構造的、調節的または生化学的機能を示す。ポリペプチドの活性の例は、直接的活性および間接的活性の両方を含む。典型的なＰＣＳＫ９の直接的活性は、ＬＤＬＲへの結合およびＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を含む、ポリペプチドとの直接的相互作用の結果である。ＰＣＳＫ９の文脈において典型的な間接的活性は、ポリペプチドの直接的活性に対する細胞、組織、臓器または対象における表現型の変化または応答、例えば、増加した肝臓ＬＤＬＲの低下、血漿ＨＤＬ−Ｃの低下、血漿コレステロールの減少、スタチンに対する感受性の増加として観察される。
【００５８】
核酸またはタンパク質に適用されるとき「単離」なる用語は、該核酸またはタンパク質が、天然の状態で関連している他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。好ましくは均一な状態である。乾燥または水性溶液であり得る。純度および均質性は、一般的に、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定する。調製物中に存在する優勢な種類であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、興味ある遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製」なる用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを示す。特に、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、さらに好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００５９】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」なる用語は、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを示す。具体的に限定されない限り、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を含む。他に記載のない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明白に示される配列を暗に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択される（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによってなし遂げられ得る（Batzerら Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsukaら J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossoliniら Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用する。
【００６１】
「アミノ酸」なる用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式において機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を示す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合しているα−炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを示す。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化合物を示す。
【００６２】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を示す。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵの全てが、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置にて、該コドンは、コードされるポリペプチドを変化することなく記載されている任意の対応するコドンに変化させることができる。このような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の可能な全てのサイレント変異を示す。当業者は、核酸のそれぞれのコドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を生じるために修飾することができることを認識している。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、記載された配列のそれぞれにおいて暗に含まれる。
【００６３】
アミノ酸配列について、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸またはごく少数のアミノ酸を変化、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、変化が、化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを認識している。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換の一覧は、当分野でよく知られている。このような保存的に修飾された変異体は、加えて、本発明の多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子を排除しない。
【００６４】
以下の８つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)参照）。
【００６５】
「配列同一性のパーセント」は、比較ウインドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に生じる位置の数を測定して、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較ウインドウの位置の全数によって割り、その結果に１００をかけ、配列同一性のパーセントを出すことにより計算する。
【００６６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において「同一の」またはパーセント「同一性」なる用語は、同じ配列である２つ以上の配列または部分配列を示す。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動のアラインメントおよび目視検査により測定されるとき、比較ウインドウまたは設計された領域にわたって最大限対応するように比較し、アラインメントさせたとき、２つの配列は、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセントを有するとき（すなわち、特定の領域にわたって、または特定していないときは、参照配列の全配列にわたって、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性）、「実質的に同一」である。本発明は、本明細書に例示されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１および４０−４１のいずれか１つに例示された可変領域；配列番号：２５−２９のいずれか１つに例示された可変セグメント；配列番号：１３−２４のいずれか１つに例示されたＣＤＲ；配列番号：３０−３９のいずれか１つに例示されたＦＲ；および配列番号：２、４、６、８、１０、１２および４６−４９のいずれか１つに例示された核酸配列）のそれぞれと実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。所望により、同一性は、少なくとも約１５、２５または５０ヌクレオチド長である領域にわたって、またはさらに好ましくは１００から５００または１０００以上のヌクレオチド長である領域にわたって、または、参照配列の全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸長、所望により少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸長、所望により少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸長である領域にわたって、または、参照配列の全長にわたって存在し得る。より短いアミノ酸配列、例えば、２０個以下のアミノ酸のアミノ酸配列に関して、１つまたは２つのアミノ酸残基が、本明細書に定義されている保存的置換にしたがって、保存的に置換されているとき、実質的同一性が存在する。
【００６７】
配列比較のため、１つの配列は、一般的に、試験配列と比較される参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、必要なとき、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、または代替パラメーターを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００６８】
本明細書において使用される「比較ウインドウ」は、２つの配列を最適にアラインさせた後、配列を隣接する位置の同数の参照配列と比較することができる２０から６００、通常、約５０から約２００、さらに通常、約１００から約１５０からなる群から選択される隣接する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Ausubelら Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)参照）により実施することができる。
【００６９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれAltschulら (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402、およびAltschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを介して公式に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードとアラインさせたとき、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら 上記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列において、パラメーターＭ（一対の一致残基に対するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列において、スコアリングマトリックスは、累積スコアを計算するために使用する。累積アラインメントスコアが最高到達値から数量Ｘだけ低下したとき；１つ以上の負のスコアを有する残基アラインメントの蓄積によって、累積スコアが０以下になるとき；またはいずれかの配列の末端に達したときは、それぞれの方向におけるワードヒットの伸長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列において）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列において、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長および１０の期待値（Ｅ）を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
【００７０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率(the smallest sum probability)（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じることによる可能性の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、より好ましくは約０．００１未満であるとき、核酸は、参照配列と類似であると考えられる。
【００７１】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載される第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、一般的に、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換のみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子またはそれらの相補体が、以下に記載されるストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを配列を増幅するために使用することができることである。
【００７２】
「結合(link)」なる用語は、本発明のＰＣＳＫ９結合分子内で抗原結合領域がどのように連結するかを記載する文脈において使用されるとき、領域を物理的に結合するための、全ての可能性のある手段を含む。多数の抗原結合領域は、化学的結合、例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合またはジスルフィド結合）または非共有結合により頻繁に結合され、直接結合（すなわち、２つの抗原結合領域間にリンカーなし）または間接結合（すなわち、２つ以上の抗原結合領域間で少なくとも１つのリンカー分子の手助け）のいずれかであり得る。
【００７３】
「対象」、「患者」および「個体」なる用語は、互換的に、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類哺乳動物を示す。哺乳動物はまた、実験哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであり得る。いくつかの態様において、哺乳動物は、農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）または家庭用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）であり得る。
【００７４】
「治療的に許容される量」または「治療有効用量」なる用語は、互換的に、所望の結果（すなわち、血漿非ＨＤＬ−Ｃ、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心臓疾患における減少）をもたらす十分な量を示す。いくつかの態様において、治療的に許容される量は、望ましくない副作用を誘導しないか、または引き起こさない。治療的に許容される量は、最初に、低用量を投与し、次に、所望の効果がなし遂げられるまで用量を徐々に増加させることにより、決定することができる。本発明のＰＣＳＫ９アンタゴナイズ抗体の「予防有効用量」および「治療有効用量」は、それぞれ、ＰＣＳＫ９の存在と関連する疾患症状（例えば、高コレステロール血症）の発症を防止するか、または該症状の重症度の低下をもたらすことができる。該用語はまた、それぞれ、疾患症状のない頻度および期間を延長または増加することができる。「予防有効用量」および「治療有効用量」はまた、それぞれ、ＰＣＳＫ９の活性から生じる障害および疾患による損傷または能力障害を予防または改善することができる。
【００７５】
「共投与」なる用語は、個体の血液において２つの活性剤の同時存在を示す。共投与される活性剤は、同時に、または連続して送達することができる。
【００７６】
「スタチン」なる用語は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼの競合的阻害剤である薬物の種類を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、親マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ１の重（配列番号：１）および軽（配列番号：３）鎖アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、下線を引き、太字にしている。
【００７８】
【図２】図２は、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２の重（配列番号：５）および軽（配列番号：７）鎖アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、下線を引き、太字にしている。
【００７９】
【図３】図３は、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ３の重（配列番号：９）および軽（配列番号：１１）鎖アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、下線を引き、太字にしている。
【００８０】
【図４Ａ】図４Ａ−Ｂは、いくつかの異なるヒトおよびマウス抗原に対する、ＭＡＢ１と比較した（Ａ）ＭＡＢ２および（Ｂ）ＭＡＢ３の結合のＥＬＩＳＡアッセイ試験を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ−Ｂは、いくつかの異なるヒトおよびマウス抗原に対する、ＭＡＢ１と比較した（Ａ）ＭＡＢ２および（Ｂ）ＭＡＢ３の結合のＥＬＩＳＡアッセイ試験を示す。
【００８１】
【図５Ａ】図５Ａ−Ｃは、（Ａ）ヒトＰｃｓｋ９および（Ｂ）ｃｙｎｏ  Ｐｃｓｋ９へのＭＡＢ２およびＭＡＢ３の結合を説明する。（Ｃ）データは、Piehlerら (1997) J Immunol Methods 201:189-206に記載されているモデルに合わせ、その合わせたものからＫｄ値を計算した。グラフは、少なくとも２つの独立した実験のものを示す。
【図５Ｂ】図５Ａ−Ｃは、（Ａ）ヒトＰＣＳＫ９および（Ｂ）ｃｙｎｏ  Ｐｃｓｋ９へのＭＡＢ２およびＭＡＢ３の結合を説明する。（Ｃ）データは、Piehlerら (1997) J Immunol Methods 201:189-206に記載されているモデルに合わせ、その合わせたものからＫｄ値を計算した。グラフは、少なくとも２つの独立した実験のものを示す。
【図５Ｃ】図５Ａ−Ｃは、（Ａ）ヒトＰＣＳＫ９および（Ｂ）ｃｙｎｏ  Ｐｃｓｋ９へのＭＡＢ２およびＭＡＢ３の結合を説明する。（Ｃ）データは、Piehlerら (1997) J Immunol Methods 201:189-206に記載されているモデルに合わせ、その合わせたものからＫｄ値を計算した。グラフは、少なくとも２つの独立した実験のものを示す。
【００８２】
【図６】図６は、親マウスモノクローナル抗体、ＭＡＢ１が、重水素交換質量分析に基づいて、アミノ酸残基１５９−１８２（ＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥ；配列番号：４２）内のエピトープに恐らく結合することを説明する。自動水素／重水素交換質量分析実験を、Chalmersら Anal Chem 2006, 78, 1005-1014に記載されているものと同様のセットアップおよび同様の様式で行った。簡潔には、ＬＥＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐａｌ  ＨＴＳ液体ハンドラー（LEAP Technologies, Carrboro, NC）を、全ての液体処理操作に対して使用した。液体ハンドラーをＬＥＡＰ  Ｓｈｅｌｌに記載されている自動スクリプトによりコントロールし、２℃に維持された冷蔵庫に置いた。６−ポート注射バルブおよび洗浄場所を液体ハンドラーレール上にマウントし、クロマトグラフィーシステムへのサンプル注射およびシリンジ洗浄を容易にした。オンライン消化のために、酵素カラム（ＡＢＩ固定化ペプシン）を、注射バルブおよびトラッピングカラム間のラインに置いた。２つのさらなるバルブ（15kPSI Valco, Houston, TX）、４μＬのＥＸＰ  Ｈａｌｏ  Ｃ１８逆相トラップカートリッジ（Optiize Technologies Inc., Oregon City, OR）および分析カラム（300μm ID, Halo 2.7μm C18, Michrom Bioresources Inc.）からなるクロマトグラフィーシステムを、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ThermoElectron Corp.）の供給源の前にマウントされた別々の冷蔵庫に置いた。クロマトグラフィーシステムを置く冷蔵庫の温度を、冷蔵庫の上にマウントしたペルチェ冷却器により０℃で維持した。ＰＣＳＫ９の分析のために、サンプル、希釈剤、還元剤およびクエンチ剤を含む４つの９６−ウェルプレートを、液体ハンドラーに負荷し、それぞれの実験順序を開始した。それぞれの注射の前に、２５μＬのタンパク質溶液（〜２ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬの５０ｍＭ  ＴＥＡバッファー（ｐＨ７．４）または〜２１μｇの１３Ｃ１０−ＦＡＢを含む２５μＬの５０ｍＭ  ＴＥＡバッファー（ｐＨ７．４）のいずれかと混合し、３０分間混合させた。交換反応を開始するために、１５０μＬのＤ２Ｏバッファー（Ｄ２Ｏ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）またはＨ２Ｏバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ）を加え、１分間で交換した。次に、２００ｕＬのｒｅｄｕｘバッファー（１Ｍ  ＴＣＥＰ、８Ｍ  ウレア、ｐＨ４．０）を加え、混合物を１分間反応させた。次に、混合物を３００ｕＬのクエンチバッファー（５％  ＴＦＡ）でクエンチし、混合物をｐＨ２．５に還元した。次に、５００ｕＬのサンプルを注射し、オンラインで消化し、得られたペプチドをトラップし、以下に記載されるＬＣ−ＭＳにより分析した。クロマトグラフィーシステムは、２つの別々のＨＰＬＣポンプを使用し、インライン消化を行い、消化されたペプチドをＣ１８トラップカラム上にトラップし、トラップされたペプチドを分析カラムを介して溶離した。「負荷」ポンプは、１２５μＬ／分（０．０５％  ＴＦＡ）の流速で作動し、サンプルをＰＡＬ注射バルブサンプルループ（５００μＬ）からペプシンカラムを介して逆相トラップカートリッジに移した。負荷工程６分後、第１の１５ｋＰＳＩバルブを切り替え、液体を「勾配」ポンプから３分脱塩期間（２５μＬ／分）トラップを介して流れるようにした。脱塩工程���、第２の１５ｋＰＳＩバルブを切り替え、トラップから質量分析計の分析カラムおよびイオン供給源へのペプチドの溶離を促進した。勾配ポンプ（Waters Nano Acquity）は、５μＬ／分で０から４０％の移動相Ｂの勾配に送達し、次に、第２の勾配４０から７５％の移動相Ｂに送達した。勾配のための全時間は７５分であった。勾配ポンプバッファー組成は、Ａ：９９．７５：０．２５％ｖ／ｖ（Ｈ２Ｏ：ギ酸）およびＢ：９９．７５：０．２５％ｖ／ｖ（アセトニトリル：ギ酸）であった。
【００８３】
質量分析のために、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳをＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ThermoElectron, San Jose, CA）にて行った。タンパク質分解により生じたペプチドの配列を同定する目的のために、データ依存性ＭＳ／ＭＳ実験を行い、タンデム質量スペクトルを回収した。これらの獲得のために、ＭＳ／ＭＳをＬＴＱにおいて獲得し、ＭＳスキャンをＯｒｂｉｔｒａｐにおいて獲得した。重水素化レベル決定の目的のために行われた獲得を、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて６０，０００の分解能で獲得した（ｍ／ｚ  ４００−２０００にわたって）。全ての実験に対して使用された装置パラメーターは、３．５ｋＶのスプレーボルテージ、１０００ｍｓの最大注射時間、５０，０００イオンのＭＳに関するＬＴＱ  ＡＧＣターゲットおよび１，０００，０００イオンのＭＳに関するＦＴＭＳ  ＡＧＣターゲットを含んだ。Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ．ＲＡＷファイルを、社内プログラム（RawXtract）を使用する．ｍｚＸＭＬファイルに変換した。次に、．ｍｚＸＭＬファイルを．ｍｚＢＩＮファイルに変換し、タンデムＭＳ獲得をＳＥＱＵＥＳＴ（ThermoElectron）を使用して検索した。ペプチド配列同定を使用して、社内作成プログラム（Deutoronomy）をそれぞれの同定された配列に対する自動抽出クロマトグラムのために使用し、平均スペクトルを作成した。次に、平均スペクトルを平滑化およびセントロイド(centroided)処理し、重水素摂取のレベルを決定した。最初の自動処理後、それぞれの平均スペクトルの質およびセントロイド(centroiding)を、Ｄｅｕｔｏｒｏｎｏｍｙに組み込まれている相互作用データビューアーを使用して手動で確認または補正した。バイオレイヤー干渉法をベースにしたエピトープ競合アッセイを使用して、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３は、ＭＡＢ１と同じエピトープに対して競合することを見出した。
【００８４】
【図７】図７は、ＭＡＢ２およびＭＡＢ３が、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）生化学的アッセイにおいて決定したとき、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ−Ｒの相互作用をブロックすることを示す。Ｐｃｓｋ９へのＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体の結合は、Ｐｃｓｋ９がＬＤＬｒとの複合体を形成する能力を破壊し、したがって下方調節／分解からＬＤＬｒを保護し、ＬＤＬ−摂取を増強し得る。これを試験するため、フルオロフォア（ｈＰＣＳＫ９−ＡＦ）で標識されたヒトＰＣＳＫ９を、アッセイバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．１％のｗ／ｖ  ＢＳＡ）中のＭＡＢ２またはＭＡＢ３と、室温で３０分間インキュベートした。ユーロピウム標識ＬＤＬ−Ｒ（ｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ）を添加し、室温で９０分間さらにインキュベーションし、最終濃度が８ｎＭのｈＰｃｓｋ９−ＡＦおよび１ｎＭのｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕとなった。ＴＲ  ＦＲＥＴシグナル（３３０ｎｍ励起および６６５ｎｍ放射）をプレートリーダー（EnVision 2100, Perkin Elmer）で測定し、Ｐｃｓｋ９抗体の存在下での％阻害を計算した。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（GraphPad）でパーセント阻害値をプロットすることにより計算した。それぞれのデータ点は、平均±ＳＤ（点あたりｎ＝４の反復）を示す。データは、少なくとも２回の独立した実験を示す。ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３はそれぞれ、２０ｎＭおよび２８ｎＭのＩＣ５０値で複合体を崩壊させることができ、親抗体ＭＡＢ１に対して見出された７７ｎＭのＩＣ５０に匹敵する（データは示していない）。
【００８５】
【図８】図８は、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３が、ＨｅｐＧ２細胞による増加したＬＤＬ−ＲレベルおよびＬＤＬ−摂取について、マウス抗体ＭＡＢ１と同等であることを示す。ＬＤＬ−Ｒ測定のため、細胞をＰＣＳＫ９結合抗体とインキュベートし、抗ＬＤＬ−Ｒ抗体で標識した。ＬＤＬ摂取のため、細胞をＰＣＳＫ９結合抗体、ＰＣＳＫ９およびＤｉＩ−ＬＤＬとインキュベートした。ＬＤＬ−Ｒ抗体およびＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光を、フローサイトメトリーにより測定した。反復測定に対する平均＋ＳＥＭを、ＭＡＢ２およびＭＡＢ３のグラフに対して示す。結果は、２回の独立した実験を示す。
【００８６】
ＬＤＬ−取り込みアッセイのため、ＰＣＳＫ９結合抗体を、１０％のウシ胎児リポタンパク質欠乏血清（Intracel）および２００ｎＭのヒトＰＣＳＫ９（Hamptonら PNAS (2007)104:14604-14609）を含むＤＭＥＭ中で室温で３０分間インキュベートし、抗体／ＰＣＳＫ９／培地溶液を９６−ウェルプレート中の細胞に加え、一晩インキュベートした。翌日、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸塩標識ＬＤＬ（DiI-LDL, Biomedical Technologies）を、さらに２時間かけて添加した。次に、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞を０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡで分離した。次に、細胞を、ＦＡＣＳバッファー（５％ウシ胎児血清、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に移し、１０００×ｇで１０分間遠心し、吸引し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＤＬ取り込みは、フローサイトメトリー（Becton Dickinson LSR II）を使用して、細胞性ＤｉＩ蛍光（４８８ｎｍで励起および５７５ｎｍで放出）により測定した。表面ＬＤＬ−Ｒアッセイのため、細胞を、抗体を含む血清非含有培地でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｒｓｉｎｅ（Biowhittaker, 17-771E）およびＦＡＣＳバッファー中に回収した。細胞を新しいプレートに移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、正常ウサギＩｇＧ（MP biomedicals）でブロックした。細胞を、ＦＡＣＳバッファー中のウサギ−抗ｈＬＤＬ−Ｒ−Ａｌｅｘａ  ６４７  ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）標識抗体で標識し、遠心し、洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。表面ＬＤＬ−Ｒを、フローサイトメトリー（４８８ｎｍの励起および６３３ｎｍの放出）により測定した。ＥＣ５０を、Ｐｒｉｓｍ（GraphPad）を使用して計算した。
【００８７】
【図９】図９は、本発明の抗体のコレステロール低下効果を決定するためのヒトＰＣＳＫ９注入マウスモデルに対する試験設計の概要を提供する。ＭＡＢ２およびＭＡＢ３は、マウスＰＣＳＫ９へ検出不可能な結合であるが、ｈＰＣＳＫ９に高親和性で結合するＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗ＰＣＳＫ９抗体である。抗体が非ＨＤＬコレステロールのｈＰＣＳＫ９媒介上昇を阻害し、肝臓ＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９媒介分解を防止することができるか否かを試験するために、ｈＰＣＳＫ９を含む浸透圧ミニポンプ移植（連続的な注入のため）の３時間前に、抗体をそれぞれのマウスに注射した。血漿および肝臓組織回収を、ｈＰＣＳＫ９注射２４時間後に行った。
【００８８】
【図１０】図１０は、抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３での処理が、注入マウスモデルにおいて、ヒトＰＣＳＫ９（「ｈＰＣＳＫ９」）の蓄積を引き起こしたことを示す。血漿ＩｇＧおよびｈＰＣＳＫ９レベルの両方を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイにより定量した。ＩｇＧ  ＭＳＤアッセイにおいて、ＭＳＤ標準９６プレート（Ｌ１１ＸＡ−３）を使用した。簡潔には、プレートを、ＰＢＳ中の２５から２８μｌの捕捉抗原、ＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ、１μｇ／ｍｌ（２５−２８ｎｇ／ウェル）で４℃で一晩でコーティングした。コーティング溶液を除去し、プレートを、室温で１時間振盪しながら、１５０μｌ／ウェルの５％のＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ（Ｒ９３ＡＡ−２）でブロックした。ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３００μｌｘ３回プレートを洗浄後、２５μｌのＩｇＧ比較基準用の希釈物（１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌのＭＳＤ  ＢＬＯＣＫＥＲ  Ａで１０段階希釈物）、未知の血漿サンプル希釈物（ＭＳＤ  ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１０，０００Ｘ）または品質管理サンプルを加え、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、２５μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌの検出抗体（１％のＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で希釈されたＭＳＤヤギ抗マウスＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２ＡＣ−５）（ＭＳＤヤギ抗−ヒトＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２ＡＪ−５）を加え、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄および１５０μｌ／ウェルの１ＸリードバッファーＴの添加後、プレートをＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で即座に読んた。標準曲線および未知のサンプルのプロットを、ＭＳＤデータ分析ソフトウェアを使用して計算した。
【００８９】
血漿ＩｇＧレベルを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイにより定量した。遊離抗体を、捕捉用のｈＰＣＳＫ９を使用して測定した。このアッセイは、「遊離」抗体を測定し、恐らく１：１のＡｂ：ＰＣＳＫ９複合体を測定する。ＩｇＧ  ＭＳＤアッセイにおいて、ＭＳＤ標準９６プレート（Ｌ１１ＸＡ−３）を使用した。簡潔には、プレートを、ＰＢＳ中の２５から２８μｌの捕捉抗原、ＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ、１μｇ／ｍｌ（２５−２８ｎｇ／ウェル）で４℃で一晩でコーティングした。コーティング溶液を除去し、プレートを、室温で１時間振盪しながら、１５０μｌ／ウェルの５％のＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ（Ｒ９３ＡＡ−２）でブロックした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０  ３００μｌで３回洗浄後、２５μｌのＩｇＧ  比較基準用の希釈物（１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌのＭＳＤ  ＢＬＯＣＫＥＲ  Ａで１０段階希釈物）、未知の血漿サンプル希釈物（ＭＳＤ  ＢＬＯＣＫＥＲ  Ａで１０，０００Ｘ）または品質管理サンプルを加え、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、２５μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌの検出抗体（Ｒ３２ＡＣ−５、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で希釈されたＭＳＤヤギ抗マウスＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体）を加え、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄および１５０μｌ／ウェルの１ＸリードバッファーＴの添加後、プレートをＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で即座に読んた。標準曲線および未知のサンプルのプロットを、ＭＳＤデータ分析ソフトウェアを使用して計算した。
【００９０】
ＭＳＤ  ｈＰＣＳＫ９アッセイは、以下を除いて、ＩｇＧアッセイと同様である。プレートを、１μｇ／ｍｌで２５−２８μｌの捕捉抗体（７Ｄ１６．Ｃ３：２．９５ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをブロック後、２５μｌのｈＰＣＳＫ９比較基準用の希釈物（１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌの１０点）および血漿サンプル希釈物（ＭＳＤ  ＢＬＯＣＫＥＲ  Ａで２，０００Ｘ）を室温で１時間振盪しながらインキュベートし、一次検出抗体（ウサギ抗ＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体、Ａｂ４、施設内(in-house)ウサギ  ＩＤ  ＃ＲＢ１１８３５）とインキュベートした。ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で読む前に、二次検出抗体（ＭＳＤヤギ抗ウサギＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２ＡＢ−５）でのさらなるインキュベーション工程を加えた。
【００９１】
【図１１】図１１は、抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３が、ｈＰＣＳＫ９注入マウスモデルにおいて血漿非ＨＤＬ−コレステロールにおける低下を引き起こすことを示す。ＭＡＢ２抗体の前注射は、非ＨＤＬコレステロールにおけるｈＰＣＳＫ９媒介上昇から５２％保護をもたらした。ＭＡＢ３の前注射は、非ＨＤＬコレステロールにおけるｈＰＣＳＫ９媒介上昇から同等の保護をもたらした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ビヒクル単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋２０ｍｇ／ｋｇのＭＡＢ２またはＰＣＳＫ９＋２０ｍｇ／ｋｇのＭＡＢ３で処理した。個々の値を、水平バーとして定められた平均値で示す。血漿総コレステロールレベルを定量するために、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床用分析器（Olympus America Inc.: Olympus AU400）を使用した。血漿サンプルをｄｄＨ２Ｏで１：３に希釈し、４０μｌの希釈された血漿サンプルを、総コレステロールレベルについて、製造業者の指示にしたがって定量した。血漿ＨＤＬおよび非ＨＤＬを定量するため、リポタンパク質コレステロール画分を、Ｓｐｉｆｅ  ３０００  ｆｒｏｍ  Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを使用して得た。サンプル調製、ゲル調製、サンプル適用、ゲル電気泳動、染色、洗浄および乾燥を含む全ての手順は、オペレーターのマニュアルにおいて提供される指示し従った。次に、ゲルをＱｕｉｃｋ  Ｓｃａｎ  ２０００でＳｌｉｔ５を用いて走査し、リポタンパク質コレステロール画分の相対パーセントをＨｅｌｅｎａ濃度計を使用して計算した。最後に、ＨＤＬおよび非ＨＤＬの絶対値は、それぞれの画分のパーセントおよび総コレステロールレベルの積により計算した。
【００９２】
【図１２】図１２は、「典型的」なＩｇＧ１（ＰＫ）プロフィールと比較した、抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３（ヒトＩｇＧ１−サイレント）に対するラット薬物動態学（ＰＫ）プロフィールを示す。標的媒介性体内動態(target mediated disposition(TMD)) の証拠はなく、抗体が齧歯動物ＰＣＳＫ９との交差反応性がないことを示した。それぞれの試験抗体において、３匹のオスＬｅｗｉｓラットに１０ｍｇ／ｋｇで注射した。時＝０、１、６、２４時、２、４、８および１６日に、２５０μｌの血液をサンプリングし、清澄にされた血漿を希釈し、回収された全ヒト抗体を測定するために、捕捉ＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ）において評価した。標準曲線もまた、それぞれの試験抗体に対して作成した。回収されたＩｇＧの量は、ラットにおける典型的なヒトＩｇＧの予測される回収に対してグラフにした。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
詳細な説明
Ｉ．イントロダクション
本発明の抗体および抗原結合分子は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型（「ＰＣＳＫ９」）に特異的に結合する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合し、ＰＣＳＫ９／低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）複合体を破壊させ、それにより、細胞性ＬＤＬ−ＲおよびＬＤＬの更新(update)のＰＣＳＫ９媒介下方調節を防止する。特に、抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに位置するＰＣＳＫ９の残基１５９−１８２内のエピトープ、例えば、アミノ酸配列ＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥ（配列番号：４２）内のエピトープに結合する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９と低密度脂質受容体（ＬＤＬＲ）との相互作用を防止、低下および／または阻害し、ＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９媒介分解を防止、低下および／または阻害し、それにより低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の取り込み増加を促進する、ＰＣＳＫ９のアンタゴニストである。抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子の、例えば、脂質異常症、高コレステロール血症、トリグリセリド血症および他のＰＣＳＫ９媒介病的状態に罹患している対象の処置における使用が見出される。
【００９４】
ＩＩ．改良された抗ＰＣＳＫ９抗体一般論
抗ＰＣＳＫ９抗体フラグメントは、当分野で知られている任意の手段、限定はしないが、例えば、組換え発現、化学合成および抗体テトラマーの酵素消化により生産することができ、完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生産により得ることができる。組換え発現は、当分野で知られている任意の適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞など由来である。存在するとき、抗ＰＣＳＫ９抗体の定常領域は、任意の型またはサブタイプであり得、適当なとき、本発明の方法により処置される対象の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳動物、例えば、農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、家庭用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）または齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ）由来から選択され得る。いくつかの態様において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、ヒト化またはＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭされる。いくつかの態様において、定常領域アイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１である。いくつかの態様において、ヒトＩｇＧ１定常領域は、細胞または補体のＣ１成分上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＦｃガンマＲ１のようなエフェクターリガンドに対する結合親和性を低下させるように変異される。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照。このような突然変異を含む抗体は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の低下または欠如をもたらす。いくつかの態様において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５は、Ａｌａ２３４およびＡｌａ２３５に置換される。重鎖定常領域における残基の番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けである（Kabatら (1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Dept. Health and Human Services参照）。例えば、Woodleら Transplantation (1999) 68(5):608-616; Xuら Cell Immunol (2000) 200(1):16-26;およびHezarehら J Virol 75(24):12161-8も参照。
【００９５】
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はまた、ラクダスカフォールドを有する単一ドメイン抗原結合単位を含む。ラクダ科の動物は、ラクダ、ラマおよびアルパカを含む。ラクダは、軽鎖を欠いている機能性抗体を生産する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自動的に折り畳まれ、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみ含む。ラクダ抗体は、慣用の抗体と同程度の結合親和性を達成することができる。本明細書に例示される抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特異性を有するラクダスカフォールドをベースにした抗ＰＣＳＫ９分子は、当分野でよく知られている方法、例えば、Dumoulinら Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002; Ghahroudiら FEBS Letters 414:521-526, 1997;およびBondら J Mol Biol. 332:643-55, 2003を使用して生産することができる。
【００９６】
本発明の改良された抗ＰＣＳＫ９抗体は、参照抗体の特異性および親和性を保持するが、ヒト生殖細胞系列Ｖ−領域配列と実質的にアミノ酸配列同一性を有するＶ−領域配列を有する操作されたヒト抗体である。米国特許公開第２００５／０２５５５５２号および米国特許公開第２００６／０１３４０９８号（これら両方を出典明示により本明細書に包含させる）参照。改良のプロセスは、参照抗体の可変領域から抗原結合特異性を決定するために必要である最小の配列情報を同定し、その情報をヒトの部分的Ｖ−領域遺伝子配列のライブラリーに移し、ヒト抗体Ｖ領域のエピトープを焦点に当てたライブラリーを作製する。微生物をベースにした分泌系は、抗体Ｆａｂフラグメントとしてライブラリーのメンバーを発現するために使用することができ、例えば、コロニーリフト結合アッセイを使用して、該ライブラリーを抗原結合Ｆａｂについて．スクリーニングする。例えば、米国特許公開第２００７／００２０６８５号参照。陽性クローンはさらに、最も高い親和性を有するものを同定するために特徴付けることができる。得られた操作されたヒトＦａｂは、親、参照抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特異性を保持し、一般的に、親抗体と比較して抗原に対して同等またはより高い親和性を有し、ヒト生殖細胞系列抗体Ｖ−領域と比較して高い程度の配列同一性を有するＶ−領域を有する。
【００９７】
エピトープを焦点とするライブラリーを作製するために必要である最小の結合特異性決定因子（ＢＳＤ）は、一般的に、重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）内の配列および軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）内の配列により示される。ＢＳＤは、ＣＤＲ３の一部または全長を含み得る。ＢＳＤは、隣接する、または隣接しないアミノ酸残基から構成され得る。いくつかの場合において、エピトープを焦点とするライブラリーは、ＢＳＤおよびヒト生殖細胞系列Ｊ−セグメント配列を含む参照抗体由来のユニークなＣＤＲ３−ＦＲ４領域に連結したヒトＶ−セグメント配列から構築する（米国特許公開第２００５／０２５５５５２号参照）。あるいは、ヒトＶ−セグメントライブラリーは、参照抗体Ｖ−セグメントの一部のみが、最初に、ヒト配列のライブラリーにより置換される連続的カセット置換により作製することができる。次に、残った参照抗体アミノ酸配列の文脈において結合を支持する同定されたヒト「カセット」は、第２のライブラリースクリーンに再結合され、完全にヒトＶ−セグメントを作製する（米国特許公開第２００６／０１３４０９８号参照）。
【００９８】
それぞれの場合において、参照抗体由来の特異性決定因子を含む対になった重鎖および軽鎖ＣＤＲ３セグメント、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメントまたはＪ−セグメントは、ライブラリーから得られた抗原結合部が、参照抗体のエピトープ特異性を保持することができるように、結合特異性を拘束するために使用する。最適な結合速度を有する抗体を同定するために、さらなる成熟変化を、ライブラリー構築中に、それぞれの鎖のＣＤＲ３領域に導入することができる。得られる操作されたヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列ライブラリー由来のＶ−セグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内の短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖細胞系列フレームワーク４（ＦＲ４）領域を有する。
【００９９】
したがって、いくつかの態様において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、元の、または参照モノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３内に最小の結合配列決定因子（ＢＳＤ）を含む。重鎖および軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲ）の残存する配列、例えば、Ｖ−セグメントおよびＪ−セグメントは、対応するヒト生殖細胞系列および親和性成熟アミノ酸配列由来である。Ｖ−セグメントは、ヒトＶ−セグメントライブラリーから選択することができる。さらなる配列の改善は、親和性成熟により成し遂げることができる。
【０１００】
別の態様において、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖および軽鎖は、例えば、ヒトＶ−セグメントライブラリーから選択される、対応するヒト生殖細胞系列配列由来のヒトＶ−セグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）および元のモノクローナル抗体由来のＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントを含む。ＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントはさらに、配列セグメントを対応するヒト生殖細胞系列配列で置換することにより、および／または親和性成熟により改善することができる。例えば、ＦＲ４および／またはＢＳＤを取り囲むＣＤＲ３配列は、対応するヒト生殖細胞系列配列で置換することができ、元のモノクローナル抗体のＣＤＲ３由来のＢＳＤは保持される。
【０１０１】
いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントに対する対応するヒト生殖細胞系列配列は、ＶＨ２  ２−０５である。いくつかの態様において、重鎖Ｊ−セグメントに対する対応するヒト生殖細胞系列配列は、ＪＨ１、ＪＨ４またはＪＨ５である。可変領域遺伝子は、免疫グロブリン可変領域遺伝子に対する標準命名法にしたがって示す。現在の免疫グロブリン遺伝子情報は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のワールドワイドウェブ、Ｖ−ｂａｓｅおよびＰｕｂＭｅｄデータベースを介して利用可能である。Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16; Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74; Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54;およびGiudicelliら Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61も参照。
【０１０２】
いくつかの態様において、軽鎖Ｖ−セグメントに対応するヒト生殖細胞系列配列は、ＶＫ１  Ｏ２またはＶＫ１  Ｏ１２である。いくつかの態様において、軽鎖Ｊ−セグメントに対応するヒト生殖細胞系列配列は、ＪＫ２である。
【０１０３】
いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントは、アミノ酸配列Ｑ（Ｉ／Ｖ）ＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴ（Ｅ／Ｑ）ＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＴＳＧ（Ｍ／Ｖ）ＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＮＫＹＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号：２７）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントは、アミノ酸配列ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＴＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＮＫＹＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号：２５）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントは、アミノ酸配列ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＴＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＳＰＧＫＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＮＫＹＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲ配列（配列番号：２６）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【０１０４】
いくつかの態様において、軽鎖Ｖ−セグメントは、アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡ（Ｇ／Ｓ）Ｑ（Ｒ／Ｓ）Ｉ（Ｎ／Ｓ）（Ｈ／Ｎ）ＮＬＨＷＹＱＱＫＰＤＥＳＰＲＬＬＩＮＦＡＳＲＬＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２９）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。いくつかの態様において、重鎖Ｖ−セグメントは、アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＧＱＲＩＳＨＮＬＨＷＹＱＱＫＰＤＥＳＰＲＬＬＩＮＦＡＳＲＬＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：２８）と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【０１０５】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＩＴＴＥＧＧＦＡＹ（配列番号：１７）を含み；そして、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域は、アミノ酸配列ＱＱＳＮＹＷＰＬＴ（配列番号：２４）を含む。
【０１０６】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列ＴＳＧ（Ｍ／Ｖ）ＧＶＧ（配列番号：１５）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＩＷＷＤＤＮＫＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：１６）を含むＣＤＲ２；および、アミノ酸配列ＩＴＴＥＧＧＦＡＹ（配列番号：１７）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列ＲＡ（Ｇ／Ｓ）Ｑ（Ｒ／Ｓ）Ｉ（Ｎ／Ｓ）（Ｈ／Ｎ）ＮＬＨ（配列番号：２０）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＦＡＳＲ（Ｌ／Ｓ）ＩＳ（配列番号：２３）を含むＣＤＲ２；および、アミノ酸配列ＱＱＳＮＹＷＰＬＴ（配列番号：２４）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０８】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＦＲ１；配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＦＲ２；配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＦＲ３；および配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定されたアミノ酸配列は、１つ以上の置換されたアミノ酸（例えば、親和性成熟由来）または１もしくは２つの保存的に置換されたアミノ酸を有し得る。
【０１０９】
いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＦＲ１；配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＦＲ２；配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＦＲ３；および配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定されたアミノ酸配列は、１つ以上の置換されたアミノ酸（例えば、親和性成熟由来）または１もしくは２つの保存的に置換されたアミノ酸を有し得る。
【０１１０】
全長にわたって、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の可変領域は、一般的に、対応するヒト生殖細胞系列可変領域アミノ酸配列と少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の可変領域全体（例えば、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）アミノ酸配列同一性を有する。例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖は、ヒト生殖細胞系列可変領域Ｖｈ２  ２−０５と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有し得る。抗ＰＣＳＫ９抗体の軽鎖は、ヒト生殖細胞系列可変領域Ｖｋ１  Ｏ２と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様において、フレームワーク領域内のアミノ酸のみが付加、欠失または置換されている。いくつかの態様において、配列同一性の比較は、ＣＤ３を除外する。
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号：４０の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号：４１の軽鎖可変領域（すなわち、コンセンサス配列）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１１２】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号：３の軽鎖可変領域（すなわち、マウスＭＡＢ１）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号：５の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号：７の軽鎖可変領域（すなわち、ＭＡＢ２）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１１４】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号：９の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号：１１の軽鎖可変領域（すなわち、ＭＡＢ３）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１１５】
２０未満アミノ酸長の同定されたアミノ酸配列において、１または２つの保存アミノ酸残基置換が許容され得るが、所望の特異的結合および／またはアンタゴニスト活性を保持している。
【０１１６】
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、一般的に、約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ未満、例えば、約１０−１０Ｍまたは１０−１１Ｍ未満、いくつかの態様において、約１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で、ＰＣＳＫ９に結合する。
【０１１７】
抗ＰＣＳＫ９抗体は、所望により、多量体化し、本発明の方法にしたがって使用することができる。抗ＰＣＳＫ９抗体は、完全長テトラマー抗体（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する）、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）または１つ以上の抗原結合部位を形成し、ＰＣＳＫ９−結合特異性を与える抗体フラグメント、例えば、重鎖および軽鎖可変領域（例えば、Ｆａｂ’または他の同様のフラグメント）を含む分子であり得る。
【０１１８】
本発明はさらに、本明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、重鎖または軽鎖可変領域または本明細書に記載されている相補性決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド配列は、発現のために最適化され、例えば、哺乳動物発現のために最適化されるか、または特定の細胞型における発現のために最適化される。いくつかの態様において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：４６および配列番号：４８からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１２、配列番号：４７および配列番号：４９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。
【０１１９】
いくつかの態様において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４のポリヌクレオチド（すなわち、ＭＡＢ１）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。
【０１２０】
いくつかの態様において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：６および配列番号：４６からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：８および配列番号：４７からなる群から選択されるポリヌクレオチド（すなわち、ＭＡＢ２）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。
【０１２１】
いくつかの態様において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１０および配列番号：４８からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１２および配列番号：４９（すなわち、ＭＡＢ３）からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％核酸配列同一性を有する。
【０１２２】
ＩＩＩ．          抗ＰＣＳＫ９抗体を同定するためのアッセイ
アンタゴニスト抗体は、抗ＰＣＳＫ９抗体を作製し、次に、ＰＣＳＫ９媒介事象、例えば、ＬＤＬＲに結合すること、ＬＤＬＲの分解を促進することを減少または阻害する能力について、それぞれの抗体を試験することにより同定することができる。アッセイは、インビトロまたはインビボで行うことができる。典型的な抗体は、ＰＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと複合体を形成することを妨げ、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を減少または阻害する。
【０１２３】
ＰＣＳＫ９への抗体または抗原結合分子の結合は、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅおよびウェスタンブロットを含む当分野で知られている任意の方法を使用して決定することができるが、これらに限定されない。
【０１２４】
ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解はまた、当分野で知られている任意の方法を使用して測定することができる。１つの態様において、ＬＤＬＲ分解を阻害する抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子の能力は、注入マウスモデルを使用して決定することができる。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子を、マウスへ静脈内に（例えば、３μｇ／時間）注入し、肝臓膜調製物中のＬＤＬＲのレベルを、コントロール抗体（例えば、無関連の抗原に結合する）の静脈内注入を受けたマウス由来の肝臓膜調製物中のＬＤＬＲのレベルと比較して決定する。アンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体を受けたマウスは、コントロール抗体を受けたマウスと比較して、検出可能なより高いレベル、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、１００％高いＬＤＬＲを有する。
【０１２５】
抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体はまた、ＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールの血漿レベルを低下することにおける治療効果について試験することができる。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）へ静脈内に（例えば、３μｇ／時間）注入し、ＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールの血漿レベルを、処置前の同じ哺乳動物またはコントロール抗体（例えば、無関連の抗原に結合する）の静脈内注入を受けた哺乳動物由来のＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールの血漿レベルと比較して決定する。アンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体を受けた哺乳動物は、処置前の哺乳動物またはコントロール抗体を受けた哺乳動物と比較して、検出可能なより低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、１００％低いＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールの血漿レベルを有する。
【０１２６】
ＩＶ．抗ＰＣＳＫ９抗体を含む組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。組成物は、さらに、所定の障害を処理または予防するために適当である他の治療剤を含む。薬学的担体は、組成物を増強もしくは安定化するか、または組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は、当分野で知られている種々の方法により投与することができる。投与経路および／または様式は、所望の結果に依存して変化する。静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下に投与すること、または、標的部位の近位に投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、鼻腔内、吸入、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）のために適当であるべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の天然条件から化合物を保護するために、物質でコーティングしてもよい。
【０１２８】
抗体は、単独でまたは他の適当な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（すなわち、「噴霧」することができる）を作ることができる。エアロゾル製剤は、許容される高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに入れることができる。
【０１２９】
いくつかの態様において、組成物は、滅菌されており、流体である。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散媒の場合において必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延する剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことにより、もたらすことができる。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、当分野で知られて、日常的に実施されている方法にしたがって製造することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに、組成物を投与するために使用される特定の方法により、ある程度決定される。したがって、本発明の医薬組成物の多種多様の適当な製剤が存在する。抗体を製剤化する、ならびに適当な用量およびスケジュールを決定するために適用できる方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005); and in Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., and in Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978（これらそれぞれを出典明示により本明細書に包含させる）において見いだすことができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。一般的に、治療有効用量または有効な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体が、本発明の医薬組成物において使用される。抗ＰＣＳＫ９抗体は、当業者に知られている慣用の方法により、薬学的に許容される投与形態に製剤化される。投与レジメンは、所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。治療または予防有効用量を決定することにおいて、低用量を投与し、次に、所望の応答が最小限の望ましくない副作用で、または望ましくない副作用なしでなし遂げるまで、徐々に増加することができる。例えば、単一のボーラスで投与されてもよく、複数回に分けた用量で時間とともに投与されてもよく、または用量を治療状況の緊急性により示されるとおりに、比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投与単位形態において非経口組成物を製剤化することがとりわけ有利な点である。本明細書において使用される投与単位形態は、処置される対象に対する単一用量として適合された物理的に別々の単位を示し；それぞれの単位は、必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。
【０１３１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性でない、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療応答をなし遂げるために有効である活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される用量レベルは、種々の薬物動態学因子、例えば、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および病歴などの因子に依存する。
【０１３２】
いくつかの態様において、薬理学的組成物は、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子および第２の薬物の混合物を含む。例えば、組成物は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子およびコレステロール、例えば、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび総コレステロールを低下させる、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるために有益であると知られている薬剤を含み得る。
【０１３３】
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子と組み合わせて含むための典型的な第２の薬剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（すなわち、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブレート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン模倣物（例えば、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、デュアルペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、Ｎｉｅｍａｎｎ  Ｐｉｃｋ  Ｃ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸を含むが、これらに限定されない。脂質低下剤は、当分野で知られており、例えば、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and Parker, Eds., McGraw-Hill (2006); 2009 Physicians’ Desk Reference (PDR)、例えば、63rd (2008) Eds., Thomson PDRに記載されている。
【０１３４】
本発明の組成物において使用するさらなる脂質低下剤は、例えば、Changら Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70; Sudhopら Drugs (2002) 62(16):2333-47; Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50; Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89; Tenenbaumら Adv Cardiol (2008) 45:127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248; Leeら J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8; Ohら Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birchら J Med Chem (2009) 52(6):1558-68;およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載および／または概説されている。
【０１３５】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、スタチンとの混合物として提供される。典型的なスタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンを含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレステロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬物との混合物として提供される。例えば、第２の薬物は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サクイナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダルナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン（トリジビル）であり得る。いくつかの態様において、第２の薬物はタクロリムスである。
【０１３７】
Ｖ．抗ＰＣＳＫ９抗体を使用する方法
Ａ．抗ＰＣＳＫ９抗体での処置に対する対象状態
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９の活性または過剰活性が介在するあらゆる病的状態の処置における用途が見出される。
【０１３８】
例えば、種々の理由または病因のために脂質異常症または高コレステロール血症を有するか、またはこれらを発症する危険性がある個体は、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子の投与から利益を得る可能性がある。例えば、個体は、機能性ＬＤＬ−Ｒが存在する家族的または遺伝的に伝達されたホモ接合体またはヘテロ接合体高コレステロール血症を有し得る。家族的または遺伝的に受け継がれた高コレステロール血症と関連する、および／または原因となる遺伝子突然変異は、例えば、Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26に要約されている。個体はまた、脂質異常症または高コレステロール血症を発症する危険性に寄与するか、または該危険性を増加する他の病的状態を有するか、または行動をとっていてもよい。例えば、個体は肥満であってよく、または糖尿病もしくはメタボリック・シンドロームを有していてもよい。個体は、喫煙者であってもよく、ほとんど体を動かさないライフスタイルを送っていてもよく、またはコレステロールの高い食事をとっていてもよい。
【０１３９】
ＰＣＳＫ９を標的とすることは、脂質異常症、高コレステロール血症および食後トリグリセリド血症の軽減、逆転、阻害または予防のために有用である。例えば、Le Mayら Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29(5):684-90; Seidah, Expert Opin Ther Targets (2009) 13(1):19-28;およびPoirierら J Biol Chem (2009) PMID 19635789参照。したがって、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子の投与は、必要とする個体における脂質異常症、高コレステロール血症および食後トリグリセリド血症を軽減、逆転、阻害および予防することにおける用途が見出される。
【０１４０】
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、必要とする個体における低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を減少または低下することにおける用途が見出される。個体は、ＬＤＬ−Ｃのレベルが持続的に上昇していてもよい。いくつかの態様において、個体は、一貫して、８０ｍｇ／ｄＬを超える、例えば、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上を超えるＬＤＬ−Ｃ血漿レベルを有する。本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子はまた、必要とする個体における非高密度リポタンパク質コレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）または総コレステロールを減少または低下することにおける用途が見出される。
【０１４１】
個体は、コレステロールを低下させるために別の薬物をすでに摂取していてもよく、該薬物に耐性もしくは不耐性であってもよい。例えば、個体は、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃまたは総コレステロールを許容されるレベルにまで低下することにおいて、該個体において有効でないことが証明されている、スタチンの治療レジメン下にすでにあってもよい。個体はまた、スタチンの投与に不耐性であってもよい。本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子とＬＤＬ−Ｃまたは非ＨＤＬ−Ｃを低下、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇することにおいて有用な第２の薬剤との組合せ投与は、例えば、投与される第２の薬剤の用量をより少なくすることを可能にすることにより、第２の薬剤の有効性および耐性を改善する。
【０１４２】
いくつかの態様において、個体は、例えば、ＬＤＬＲの分解において異常な増加を引き起こす、ＰＣＳＫ９遺伝子における機能獲得型突然変異を有する。
【０１４３】
いくつかの態様において、個体は、脂質異常症または高コレステロール血症を誘導する薬物を受けている、すなわち、個体は、薬剤誘導性脂質異常症または高コレステロール血症を有する。例えば、個体は、例えば、ＨＩＶ感染の処置のための、プロテアーゼ阻害剤の治療レジメンを受けていてもよい。血漿トリグリセリドのレベルを上昇させることが知られている別の薬物は、移植患者に投与される免疫抑制剤であるタクロリムスである。シクロスポリンは、ＬＤＬを有意に増加させることが示されている。例えば、Ballantyneら (1996) 78(5):532-5参照。第２世代抗精神病薬（例えば、アリピプラゾール、クロザピン、オランザピン、クエチアピン、リスペリドンおよびジプラシドン）はまた、脂質異常症と関連している。例えば、Henderson, J Clin Psychiatry (2008) 69(2):e04 and Brooksら Curr Psychiatry Rep (2009) 11(1):33-40参照。
【０１４４】
Ｂ．抗ＰＣＳＫ９抗体の投与
医師または獣医は、医薬組成物において使用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果をなし遂げるために必要であるレベルよりも少ないレベルで開始し、所望の効果がなし遂げられるまで用量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効用量は、多数の異なる因子、例えば、処置される特定の疾患または状態、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、他の投与される薬物、および処置が予防または治療であるかに依存して変化する。処置用量は、安全性および有効性を最適化するように用量設定する必要がある。抗体での投与において、用量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、投与は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。投与は、毎日、毎週、２週間毎、毎月または、必要なとき、または望ましいとき、それより多く、または少なくであり得る。典型的な処置レジメンは、週１回、２週間に１回または月１回または３から６ヵ月に１回の投与を必要とする。
【０１４５】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドが投与される。薬物が核酸である態様において、典型的な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。いくつかの態様において、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４６】
抗体は、単回または複数回投与において投与することができる。抗体は、通常、何度も投与される。１回の投与間の間隔は、必要または所望により、１週間、２週間、１月または１年であり得る。間隔はまた、患者における抗ＰＣＳＫ９抗体の血液レベルを測定することにより示されるとき、不規則であり得る。いくつかの方法において、用量は、１−１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度をなし遂げるように調整され、いくつかの方法において、２５−３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度をなし遂げるように調整される。あるいは、より少ない頻度の投与を必要とする場合、抗体は、持続放出製剤として投与することができる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与の用量および頻度は、処置が予防であるか、または治療であるかに依存して変化し得る。予防適用において、比較的低い用量が、長期間にわたって比較的少ない頻度で投与される。患者によっては、残りの人生において処置を受け続ける。治療的適応において、比較的短い間隔で比較的高い用量が、ときどき、疾患の進行が低下または終了するまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、必要とされる。その後、患者は、予防レジメンを受けることができる。いくつかの態様において、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合剤は、患者における血漿ＬＤＬ−Ｃレベルが、予め決定された閾値レベル、例えば、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ、例えば、少なくとも約９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上、を超えるときに投与される。
【０１４７】
Ｃ．第２の薬剤との共投与
ＰＣＳＫ９抗体アンタゴニストは、コレステロール、例えば、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび総コレステロールを低下させる、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるために有益であることが知られている薬剤と組み合わせて使用することができる。
【０１４８】
活性剤は、抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体との混合物において一緒に投与することができ、またはそれぞれの薬剤を別々に投与することができる。抗体薬剤および他の活性剤は、同時に投与することができるが、同時に投与する必要はない。
【０１４９】
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子との共投与における使用のための典型的な第２の薬剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（すなわち、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブレート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン模倣物（例えば、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、デュアルペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、Ｎｉｅｍａｎｎ  Ｐｉｃｋ  Ｃ１−様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
使用されるさらなる脂質低下剤は、例えば、Changら Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70; Sudhopら Drugs (2002) 62(16):2333-47; Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50; Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89; Tenenbaumら Adv Cardiol (2008) 45:127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248; Leeら J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8; Ohら Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birchら J Med Chem (2009) 52(6):1558-68;およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載および／または概説されている。
【０１５１】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、スタチンと共投与される。典型的なスタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンを含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレステロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬物と共投与される。例えば、第２の薬物は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サクイナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダルナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン（トリジビル）であり得る。いくつかの態様において、第２の薬物はタクロリムスである。
【０１５３】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９またはａｐｏＢ１００を特異的に標的とする阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス配列、リボザイム）と共投与される。
【０１５４】
ＶＩ．キット
本発明の医薬組成物は、キットにおいて提供することができる。１つの態様において、本発明のキットは、本明細書に記載されている本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子を含む。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、一定のまたは様々な用量において提供することができる。
【０１５５】
いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載されている１つ以上の第２の薬物を含む。第２の薬物は、同じ製剤において、または抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子と別々の製剤において提供することができる。第１および第２の薬剤の用量は、独立して一定または様々であり得る。
【０１５６】
いくつかの態様において、キットは、ＰＣＳＫ９抗体アンタゴニストならびにコレステロール、例えば、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび総コレステロールを低下させる、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるために有益であることが知られている１つ以上の薬剤を含む。
【０１５７】
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子と共にキットに含まれる典型的な第２の薬剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（すなわち、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブレート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン模倣物（例えば、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、デュアルペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、Ｎｉｅｍａｎｎ  Ｐｉｃｋ  Ｃ１−様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
キットにおいて使用するためのさらなる脂質低下剤は、例えば、Changら Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70; Sudhopら Drugs (2002) 62(16):2333-47; Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50; Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89; Tenenbaumら Adv Cardiol (2008) 45:127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248; Leeら J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8; Ohら Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birchら J Med Chem (2009) 52(6):1558-68;およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載および／または概説されている。
【０１５９】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、スタチンと共にキットに提供される。典型的なスタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンを含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
いくつかの態様において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレステロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬物と共にキットに提供される。例えば、第２の薬物は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サクイナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダルナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン（トリジビル）であり得る。いくつかの態様において、第２の薬物はタクロリムスである。
【実施例】
【０１６１】
実施例
以下の実施例は、説明するために提供するが、本発明を限定しない。
【０１６２】
実施例１：ＰＣＳＫ９アンタゴニストＭＡＢ１の作製および同定
要約
ＰＣＳＫ９に対する機能性抗体アンタゴニストを作製するために試験を行った。タンパク質のＨｉｓタグ型に結合することができる抗体を分泌する多数のハイブリドーマを同定した。ハイブリドーマからの抗体を、これらの細胞のＬＤＬコレステロールを取り込む増加した能力をもたらすＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬ受容体のＰＣＳＫ９媒介分解を阻害する能力により測定される機能性アンタゴニスト活性について評価した。強力な機能性マウス抗ヒトＰＣＳＫ９  ＩｇＧ１−カッパモノクローナル抗体を同定し、ＭＡＢ１と称した。
【０１６３】
方法
抗原および他のタンパク質
ヒトＰＣＳＫ９タンパク質を分泌する安定な発現細胞系を、ＨＥＫ２９３  ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ細胞（Invitrogen, Carlsbad, Ca）のトランスフェクションにより産生した。簡潔には、ＢｉｏＣｏａｔフラスコ（Becton Dickinson）上に接着様式において、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ培地（Invitrogen）プラス１０％のウシ胎仔血清中で培養された細胞を、リポフェクタミン  ２０００ＴＭトランスフェクション試薬およびメリチン(mellittin)シグナル配列を特徴とする組換えプラスミド、成熟Ｐｃｓｋ９  ｃＤＮＡ（ａａ３１−６９２）および配列のＣ−末端のｈｉｓ６タグ（Ｅ．Ｈａｍｐｔｏｎ、ＧＮＦ、ＮＰＬ  ０１００５１によってクローニング）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、陽性トランスフェクタントの選択を、１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを培養培地に添加することにより開始した。４週間後、Ｐｃｓｋ９−生産細胞の４つの安定な細胞プールが現れた。最も産生が多いプール４を、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ培地中で無血清懸濁条件に適応させ、次に、１０−２０Ｌ生産容量の規模でＷａｖｅＴＭバイオリアクターを使用して大規模生産のためにスケールアップした。
【０１６４】
数回、時間をかけて行い、１２から３０ｍｇ／Ｌ間の割合で生産された組換えタンパク質を得た。細胞上清を収集し、クロスフロー濾過により濃縮した。得られる濃縮物を、２５ｍＬのＮｉＮＴＡ  Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  カラム（５０ｍＭのＴｒｉｓ／３００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＣａＣｌ２／２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４で平衡化）に０．５ｍＬ／分で付した。５０ｍＭのＴｒｉｓ／３００ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４での基本洗浄後、結合した物質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ／３００ｍＭのＮａＣｌ／２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で溶離した。得られる溶出液を、ＰＢＳ、ｐＨ７．３に対して透析し、滅菌濾過し、アリコートした。オリゴマー形成の決定のために、サンプルを分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。精製されたタンパク質から得られたＨＰＬＣクロマトグラムは、２本のピークを示し、主要な１つのピークは８５％を占める。全長タンパク質のＨＰＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ分析は、全てのシステイン残基が酸化したメリチン−ｈｓＰｃｓｋ９  ａａ３１−６９２−Ｈｉｓから予測された質量に一致する５８１７６．０Ｄａの質量を示す。サンプルの一部は、さらにＮ−グリコシル化されている。約１３ｋＤの質量の夾雑タンパク質は、恐らく、タンパク質の遊離プロドメインのようである。マウス、ラットおよびカニクイザルと対応するＰｃｓｋ９のホモログを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地において無血清懸濁液において培養されたＨＥＫ２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を再び使用して、大規模一時的発現アプローチにおいて生産した。組換えプラスミド、天然のリーダー配列およびＣ−末端のｈｉｓ６−タグを特徴とするマウス／ラットＰｃｓｋ９  ｃＤＮＡ、およびＣＤ３３リーダー配列およびＣ−末端  ｈｉｓ６  タグを特徴とするｃｙｎｏ  Ｐｃｓｋ９を、プラスミドＤＮＡの担体としてポリエチレンイミンを１：３（μｇ／ｍＬ：μｇ／ｍＬ  ＤＮＡ：ＰＥＩ）の比率で使用して、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞にトランスフェクトした。生産工程は、ＷａｖｅＴＭバイオリアクターにおいて１０リットル規模で行った；タンパク質精製および特性化は、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質に対する上記プロトコールに準じて行った。
【０１６５】
ＰＣＳＫ９に対する機能性抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマを作製し、融合後１０日間、ハイブリドーマプレートをＰｃｓｋ９特異的抗体の存在についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーニングのため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＃４６４７１８）を、５０μＬのＰｃｓｋ９（ＰＢＳで１５ｎｇ／ウェルに希釈）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。残存するタンパク質を吸引し、ウェルをＰＢＳ中の１％のＢＳＡでブロックした。室温で３０分間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。１５μＬのハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡプレートに移した。ＰＬＮを取り出す時に得た１５μＬのマウス血清を、ＰＢＳで１：１０００希釈し、陽性コントロールとして加えた。ＰＢＳＴ。５０μＬの二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson Immuno Research #115-035-071）、ＰＢＳで１：５０００希釈）を、ＥＬＩＳＡプレート上の全てのウェルに加えた。室温で１時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで８回洗浄した。２５μＬのＴＭＢ（ＫＰＬ  ＃５０−７６−０５）を加え、室温で３０分インキュベーション後、プレートを６０５ｎｍの吸光度で読んだ。陽性ウェルからの細胞を、２４−ウェルプレートにＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋２０％のＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１ｘＮＥＡＡ、１ｘＨＴ、０．５ｘＨＦＣＳ）中で拡大した。
【０１６６】
抗体精製
ＭＡＢ１を含む上清を、プロテインＧ（Upstate # 16-266 (Billerica, MA)）を使用して精製した。上清を負荷する前に、樹脂を１０カラム容量のＰＢＳで平衡化した。サンプルの結合後、カラムを１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、次に、抗体を５カラム容量の０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．０で溶離した。カラム画分を、１／１０の容量のＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ９．０で即座に中和した。ＯＤ２８０の画分を測定し、陽性画分をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．２対して一晩透析した。
【０１６７】
溶液平衡滴定による親和性決定
Ｐｃｓｋ９の連続希釈物を作製し、抗体をそれぞれの抗原濃度に加え、１００ｐＭの抗体定常濃度に達した。１００μＬ／ウェルのそれぞれの希釈物混合物を、９６−ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（Greiner）にデュプリケートで分配した。該プレートを密閉し、室温で一晩インキュベートした。９６−ウェル標準結合マイクロタイタープレート（Meso Scale Discovery）を、ＰＢＳで希釈された２５μＬの１μｇ／ｍＬのＰｃｓｋ９でコーティングした。該プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、抗原被覆標準結合マイクロタイタープレートを、ウェルあたり２００μＬのＰＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。次に、プレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックし、室温で１時間震盪しながらインキュベートした。洗浄工程を繰り返し、ポリプロピレンマイクロタイタープレートからの２５μＬ／ウェルの抗体−抗原調製物を、抗原被覆標準結合プレートに移した。標準結合プレートを、室温で６０分間震盪しながらインキュベートした。３回さらなる洗浄工程後、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０バッファーにおいて希釈された２５μＬの１μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−タグ−標識ヤギ抗マウス検出抗体（R32AC-5, Meso Scale Discovery）を、それぞれのウェルに加え、室温で１時間震盪しながらインキュベートした。プレートを３回洗浄後、１５０μＬの２Ｘ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（R92TC-1, Meso Scale Discovery）をそれぞれのウェルに移した。電気化学発光シグナルを発生させ、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Meso Scale Discovery）により検出した。電気化学発光データを、プリズムソフトウェア(prism software)および以下の式を使用して、エクスポートおよび処理した：
【数１】
2014511378.tif 000003
【０１６８】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを、浅い３８４−ウェル白色プレート（Perkin Elmer, 6008280）において実施した。ｈＰｃｓｋ９−ＡＦ（１０．７ｎＭ）を、１５μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ）中で、標識していないｈＰｃｓｋ９タンパク質およびＭＡＢ１、ＭＡＢ２またはＭＡＢ３抗体の連続希釈物と、室温で３０分間インキュベートした。次に、ｈＰｃｓｋ９および予めインキュベートした抗体複合体へのアッセイバッファー中の５μＬのｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ（４ｎＭ）の添加、ならびに室温で９０分間インキュベートした。これらの標識タンパク質の最終濃度は、８ｎＭのｈＰｃｓｋ９−ＡＦおよび１ｎＭのｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕであった。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを、３３０ｎｍ励起および６６５ｎｍ放出にてＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１００  マルチラベルリーダー（Perkin Elmer）で測定した。データを、以下の式：［（６６５ｎｍ値ｘ１０，０００）／（６１５ｎｍ値）］を使用して正規化値に変換した。パーセント阻害は、以下の式：１００−［（処理サンプルの正規化値／未処理サンプルの平均正規化値）ｘ１００］で計算した。パーセント阻害用量応答曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５を使用して、式、Ｙ＝最小(Bottom)＋（最大(Top)−最小(Bottom)）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））でプロットした（GraphPad Prism Software）。
【０１６９】
ＬＤＬ−Ｒ代謝回転(turnover)アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、１％  ｖ／ｖ  コラーゲンで予めコーティングされた平底９６−ウェルプレート（Corning, 3595）において１００μＬの培養培地にウェルあたり６ｘ１０４個の細胞で播種し、次に、３７℃で５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。一般的に、細胞を、ｈＰｃｓｋ９タンパク質およびＭＡＢ１、ＭＡＢ２またはＭＡＢ３抗体のいずれかを含む１００μＬの無血清培地で処理した。処理後、培地を捨て、細胞を１００μＬのＰＢＳで洗浄した。細胞を回収するために、１００μＬのＶｅｒｓｉｎｅ（Biowhittaker, 17-771E）を加え、３７℃で５％  ＣＯ２で１時間インキュベートし、次に、１００μＬのＦＡＣＳバッファーを加えた。細胞を、Ｖ−底９６−ウェルプレート（Corning, 3894）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞をペレットにした。細胞上の非特異的結合部位をブロックするために、ＦＡＣＳバッファー中の５０μＬの１００μｇ／ｍＬの正常ウサギＩｇＧ（MP biomedicals, 55944）およびマウスＩｇＧ（Sigma, I5381）をそれぞれのウェルに加え、氷中で３０分間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートをたたくことにより、バッファーを除去した。細胞を標識するために、ＦＡＣＳバッファー中の１０μＬのウサギ抗−ｈＬＤＬ−Ｒ−Ａｌｅｘａ  ６４７  ＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ）および１０μＬのマウス抗−トランスフェリン−Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）ＩｇＧ（２μｇ／ｍＬ）（CD71, Becton Dickinson Biosciences, 624048）標識抗体をそれぞれのウェルに加え、氷中で６０分間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートをたたくことにより、バッファーを除去した。結合していない抗体を、ウェルあたり２００μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄することにより、除去した。細胞を、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドで固定し、生存細胞をゲーティングし（５０００）、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して分析した。ＰＥ蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および５７５ｎｍの放出で測定した。Ａｌｅｘａ６４７蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および６３３ｎｍの放出で測定した。特注のウサギ抗ｈＬＤＬ−ＲポリクローナルＩｇＧ５８３を、ＨｅｐＧ２細胞上の表面ｈＬＤＬ−ＲのＦＡＣＳ検出のために、Ｃｏｖａｎｃｅ（Denver, PA, USA）により特別生産した。ウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ  ＩｇＧ５８３は、正常ウサギＩｇＧと比較して、ＨｅｐＧ２細胞の表面上のｈＬＤＬ−Ｒの検出について約７倍のウインドウを示した。ＨｅｐＧ２細胞の表面上のＬＤＬ−Ｒに対する抗ｈＬＤＬ−Ｒ  ＩｇＧ５８３の特異性を決定するために、該ＩｇＧの結合に対する競合相手としてｈＬＤＬ−Ｒタンパク質を使用して実験を行った。ＨｅｐＧ２細胞に対する抗ｈＬＤＬ−Ｒ  ＩｇＧ５８３の平均培地蛍光における用量依存的増加が、ｈＬＤＬ−Ｒタンパク質の濃度増加につれて観察した。これは、ＦＡＣＳにより測定されるとき、抗ｈＬＤＬ−Ｒ  ＩｇＧ  ５８３がＨｅｐＧ２細胞の表面上のＬＤＬ−Ｒを特異的に認識することを証明する。ＨｅｐＧ２細胞の表面上のＬＤＬ−ＲのＦＡＣＳ定量化のために、その後の試験は、直接標識した抗ｈＬＤＬ−Ｒ−５８３−Ａｌｅ���ａ  ６４７  ＩｇＧを使用した。
【０１７０】
ＬＤＬ−Ｃ取り込み
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、平底９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９５、１％のｖ／ｖ  コラーゲンで予めコーティングされている）において１００μＬの培養培地中でウェルあたり６ｘ１０４個の細胞で播種し、次に、３７℃で５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。特に記載がない限り、細胞を、ｈＰｃｓｋ９タンパク質およびＭＡＢ１、ＭＡＢ２またはＭＡＢ３抗体を含む１００μＬの無血清培地で処理した。処理後、それぞれのウェルに、無血清培地中の２０μＬの３０μｇ／ｍＬの３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニン−標識低密度リポタンパク質（ＤｉＩ−ＬＤＬ）（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ、ＲＰ−０７７−１７５）を与え、３７℃で５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。プレートをたたくことにより培地を除去し、細胞を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムまたはマグネシウムなしのＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１４１９０−１４４）で洗浄した。プレートをたたくことによりＰＢＳを除去し、１００μＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡをそれぞれのウェルに加え、３７℃で５％ＣＯ２で５分間インキュベートした。１００μＬのＦＡＣＳバッファー（５％のＦＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）をそれぞれのウェルに加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離によりペレット化した。プレートをたたくことにより培地を廃棄し、ウェルあたりＰＢＳ中の５０μＬの１％パラホルムアルデヒド（Elwctron Microscopy Sciences, 15710）の添加により細胞を固定した。生存細胞をゲーティングし、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して分析した。ＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光の中央値を４８８ｎｍの励起および５７５ｎｍの放出で測定し、５０００個の細胞を分析した。棒グラフを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００２（Microsoft Corporation）を使用して作成した。活性化のパーセントは以下のとおりに計算した、％活性化＝［１−（Ｘ÷Ａ）］ｘ１００、式中、Ｘ＝サンプルウェルから読んだ培地蛍光、およびＡ＝ｈＰｃｓｋ９処理のみでのウェルから読んだ培地蛍光。
【０１７１】
活性化のパーセントを処理に対してプロットし、式Ｙ＝最小(Bottom)＋（最大(Top)−最小(Bottom)）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）ｘＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（GraphPad Software）を使用して作成した用量応答曲線からＥＣ５０を決定した。
【０１７２】
結果
抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の作製
Ｂ細胞を、Ｐｃｓｋ９タンパク質で免疫化した動物の一次リンパ節から回収した。ハイブリドーマを、標準ＰＥＧ媒介融合を使用して作製した。得られた融合物をＥＬＩＳＡによりアッセイし、ヒトＰＣＳＫ９に陽性結合物を同定し、増殖させ、上清を作製した。強力な機能性マウス抗ヒトＰＣＳＫ９  ＩｇＧ１−カッパモノクローナル抗体を同定し、ＭＡＢ１と称した。
【０１７３】
Ｐｃｓｋ９への特異的結合に対するＭＡＢ１のスクリーニング
ＭＡＢ１特異性を、一連の他のタンパク質への結合をＥＬＩＳＡにおいて評価することにより試験した。６つの他のタンパク質へのＭＡＢ１の結合を、Ｐｃｓｋ９−ＨＩＳへの結合と比較した。これは、Ｐｃｓｋ９への結合が特異的であり、該抗体がＨＩＳタグに結合しないことを示す。
【０１７４】
カニクイザルＰｃｓｋ９への結合に対するＭＡＢ１の評価
Ｐｃｓｋ９のカニクイザルホモログへのＭＡＢ１の結合を決定した。このアッセイにおいて、カニクイザルＨＩＳ−タグ付きＰｃｓｋ９を発現する細胞由来の上清を、Ｎｉ捕捉プレートと共に利用し、材料を精製する必要性を回避した。ヒトＰＣＳＫ９を希釈し、また、そのＨＩＳ−タグを介して捕捉した。ＭＡＢ１は、ヒトおよびカニクイザルＰｃｓｋ９の両方に結合することができる。
【０１７５】
ＭＡＢ１の結合速度
ヒトＰＣＳＫ９タンパク質を認識するマウス抗体ＭＡＢ１を、溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を使用することにより、その結合親和性について分析した。ＭＡＢ１は、組換えヒトＰＣＳＫ９にナノモル以下の親和性（Ｋｄ＝２７０ｐＭ）で高親和性で結合することが見出された。
【０１７６】
Ｐｃｓｋ９  ＬＤＬ−Ｒ相互作用のブロックに対するＭＡＢ１のスクリーニング
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを、抗−ｈＰｃｓｋ９抗体ＭＡＢ１がｈＰｃｓｋ９−ＡＦおよびｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ標識タンパク質間の相互作用を破壊させることができるか否かを決定するために使用した。アッセイがｈＬＤＬ−Ｒ−ＥｕおよびｈＰｃｓｋ９−ＡＦ標識タンパク質の相互作用により産生されるＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの破壊を検出することができることを証明するために、非標識ｈＰｃｓｋ９タンパク質またはＥＧＦ−Ａペプチドを評価した。非標識ｈＰｃｓｋ９の濃度を増加させると、ｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕへの結合に対してｈＰｃｓｋ９−ＡＦと競合し、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの減少を引き起こした。ＥＧＦ−Ａペプチドは、２．５μＭのＩＣ５０で、ｈＬＤＬ−Ｒ−ＥｕおよびｈＰｃｓｋ９−ＡＦ間の相互作用を破壊した。ＭＡＢ１は、ＩＣ５０＝７７ｎＭで、ｈＰｃｓｋ９−ＥｕおよびｈＬＤＬ−Ｒ−ＡＦ間のＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを破壊した。
【０１７７】
ＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９媒介分解の阻害に対するＭＡＢ１のスクリーニング
ＬＤＬ−ＲへのＰｃｓｋ９結合は、ＬＤＬ−Ｒ分解を引き起こすことが示されており、これを、ＨｅｐＧ２細胞および組換えヒトＰＣＳＫ９を使用して確認した。ＭＡＢ１がＰｃｓｋ９に結合し、該効果をブロックする能力を決定した。ＭＡＢ１は、外因性ｈＰｃｓｋ９で処理したＨｅｐＧ２細胞における該効果を阻害し、細胞表面ＬＤＬ−Ｒの増加を引き起こした。
【０１７８】
Ｐｃｓｋ９阻害およびＬＤＬ取り込み回復に対するＭＡＢ１のスクリーニング
ＬＤＬ−ＲのＰｃｓｋ９分解の阻害は、ＨｅｐＧ２細胞がＬＤＬ−Ｃを内在化する能力を回復させる。ＭＡＢ１は、外因性ｈＰｃｓｋ９で処理されたＨｅｐＧ２細胞でのＰＣＳＫ９媒介ＬＤＬ−Ｒ分解を防止し、１９４ｎＭのＥＣ５０でＤｉＩ−ＬＤＬ−摂取取り込みを増加させた。
【０１７９】
実施例２：ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３の作製
要約
本実施例は、ヒト生殖細胞系列抗体とより良い配列相同性を有するように、マウスモノクローナルＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＭＡＢ１を操作することによるヒト抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３の作製を示す。ＭＡＢ２およびＭＡＢ３は、親マウス抗体のエピトープ特異性、親和性およびカニクイザルマカクザルＰＣＳＫ９交差反応性を保持する。ＭＡＢ２およびＭＡＢ３は、元のマウス抗体よりもヒト生殖細胞系列配列とより高い相同性を有し、したがって、ヒト免疫系によりより良い耐性であるはずである。
【０１８０】
マウスモノクローナル抗体ＭＡＢ１を、ヒト生殖細胞系列配列とより近いタンパク質配列を持ち、免疫原性を減少させるように、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭした。ＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇＴＭ技術は、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＫａｌｏＢｉｏｓを介して利用できる（ワールドワイドウェブkalobios.com）。抗体ＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇＴＭは、ヒト生殖細胞系列配列と高い相同性を有し、親または参照抗体の特異性および親和性を保持するＶ−領域配列を有する操作されたヒト抗体を作製する（米国特許公開第２００５／０２５５５５２および２００６／０１３４０９８号）。該プロセスは、最初に、参照Ｆａｂの重鎖および軽鎖可変領域における最小の抗原結合特異性決定因子（ＢＳＤ）（一般的には、重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３内の配列）を同定する。これらの重鎖および軽鎖ＢＳＤがＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇＴＭプロセス中に構築された全てのライブラリーにおいて維持されるため、それぞれのライブラリーがエピトープに注目され、最終的な完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体は、元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持する。
【０１８１】
次に、完全長ライブラリー（軽鎖または重鎖可変領域全体が、ヒト配列のライブラリーで置換されている）および／またはカセットライブラリー（マウスＦａｂの重鎖または軽鎖可変領域の一部が、ヒト配列のライブラリーで置換されている）を作製する。細菌分泌系を、抗体Ｆａｂフラグメントとしてライブラリーのメンバーを発現させるために使用し、ライブラリーを、コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）を使用して、抗原に結合するＦａｂに対してスクリーニングする。最も高い親和性を有するものを同定するために、陽性クローンをさらに特徴付ける。次に、残存するマウス配列における結合をサポートする同定されたヒトカセットを、最終ライブラリースクリーンにおいて混合し、完全ヒトＶ−領域を作製する。
【０１８２】
得られたＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭＦａｂは、ヒトライブラリー由来のＶ−セグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内で同定された短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖細胞系列フレームワーク４領域を有する。これらのＦａｂは、重鎖および軽鎖の可変領域をＩｇＧ発現ベクターにクローニングすることにより、完全ＩｇＧに変換される。該プロセスにおいて作製された完全ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体は、親マウス抗体の結合特異性を保持し、一般的に親抗体よりも抗原に対して同等のまたはより高い親和性を有し、タンパク質レベルでヒト生殖細胞系列抗体遺伝子と比較して高い程度の配列同一性を有するＶ−領域を有する。
【０１８３】
方法
マウスＶ−領域のクローニング
マウスモノクローナルＭＡＢ１のＶ−領域ＤＮＡを、標準方法を使用して、ハイブリドーマ細胞系から単離されたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ハイブリドーマｃＤＮＡ由来の重鎖可変領域のＰＣＲ増幅のために成功裏に使用されたプライマーは、ＶＨ８（５’−ＧＴＣＣＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＹＴ−３’；配列番号：５０）（Chardes Tら 1999）およびＨＣ定常部（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’；配列番号：５１）であった。ハイブリドーマｃＤＮＡ由来の軽（カッパ）鎖可変領域のＰＣＲ増幅のために成功裏に使用されたプライマーは、Ｖκ２３（５’−ＣＴＧＧＡＹＴＹＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡ−３’；配列番号：５２）（Chardes Tら 1999）およびＬＣ定常部（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’；配列番号：５３）であった。増幅された重鎖および軽鎖可変領域をシーケンシングした。次に、ＰＣＲを使用して、Ｖ−遺伝子を増幅し、クローニングのために制限酵素部位をＫａｌｏＢｉｏｓベクターに組み込んだ：ＮｃｏＩ（５’）およびＮｈｅＩ（３’）でＶｈをＫＢ１２９２−Ｈｉｓに（Ｃ−末端フレキシブルな(flexible)リンカーおよびＣＨ１上のアミノ酸配列ＡＡＧＡＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号：５４）の６−Ｈｉｓ（配列番号：４５）タグをコードするＫＢ１２９２の修飾バージョン）；ＮｃｏＩ（５’）およびＢｓｉＷＩ（３’）でＶｋをＫＢ１２９６に。次に、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩでの制限消化およびライゲーションにより、これらの別々の重鎖および軽鎖ベクターを、単一の二シストロン性ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｆａｂ  発現ベクターに混合した。Ｆａｂフラグメントを、該ベクターから大腸菌において発現させた。該ＦａｂをＰＣＳＫ９−抗原結合について試験し、参照Ｆａｂ  ＳＲ１０１−Ｂ１と称した。
【０１８４】
Ｆａｂ精製
Ｆａｂフラグメントを、ＫａｌｏＢｉｏｓ発現ベクターを使用して大腸菌からの分泌により発現させた。細胞を、２ｘＹＴ培地で〜０．６のＯＤ６００にまで増殖させた。ＩＰＴＧを１００μＭまで加え、３３℃で４時間振盪することにより、発現を誘導した。アセンブルされたＦａｂを、浸透圧溶解によるペリプラズム画分および標準方法にしたがうＮｉ−ＮＴＡカラム（HisTrap HP columns; GE Healthcare catalog #17-5247-01）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによる精製から得た。Ｆａｂを５００ｍＭのイミダゾールを含むバッファーに溶離し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ  ｐＨ７．４で徹底的に透析した。
【０１８５】
ライブラリー構築
ライブラリーを、ＫａｌｏＢｉｏｓヒトライブラリー配列、親マウス配列およびＢＳＤを含むユニークなＣＤＲ３−ＦＲ４領域を結合させることにより構築した。ＢＳＤを含むヒト生殖細胞系列Ｊ−セグメント配列および最適化された参照Ｆａｂ  ＥＪＳ００５由来のＣＤＲ３を、重複ＰＣＲを使用してヒトＶ−セグメントライブラリーに結合させた。ＫａｌｏＢｉｏｓヒトカセットライブラリーは、ＣＤＲ領域における元のマウスＶｈおよびＶｋ’に最も近いヒト生殖細胞系列配列に基づいた。元のマウスＭＡＢ１  Ｖｈは、ヒト生殖細胞系列配列Ｖｈ２−７０に最も近く、Ｖｈ２サブグループメンバー（ＫＢ１４１２）を含むＫａｌｏＢｉｏｓライブラリーを、Ｖｈカセットライブラリーを作製することにおいて使用した。同様に、ＭＡＢ１  ＶｋがＶｋ１  Ｏ２ヒト生殖細胞系列配列に最も近いため、Ｖｋ１サブグループメンバー（ＫＢ１４１９およびＫＢ１４２０）を含む２つのＫａｌｏＢｉｏｓ  ヒトＶ−セグメントライブラリーの混合物を、Ｖｋカセットライブラリーを作製することにおいて使用した。これらのカセットライブラリーを、重複ＰＣＲによって、親マウス可変領域から完全Ｖ−セグメントへの配列に結合させた。２つの型のカセットをブリッジＰＣＲにより構築した：ＦＲ１、ＣＤＲ１およびＦＲ２の最初の部分においてヒト配列を含むフロントエンドカセットを、鋳型として上記Ｖｈ２ライブラリーの混合物（ＫＢ１４１２）またはＶｋ１ライブラリーの混合物（ＫＢ１４１９およびＫＢ１４２０）から増幅した。ＦＲ２の最後の部分、ＣＤＲ２およびＦＲ３においてヒト配列を含むミドルカセットを、上記完全ヒトＶｈまたはＶｋ領域ライブラリーを鋳型として使用して増幅した。Ｖｈカセットは、アミノ酸位置４５−４９（Ｋａｂａｔ番号付け）でＦＲ２において重複する共通配列を有し；Ｖｋカセットは、アミノ酸残基４２−４７（Ｋａｂａｔ番号付け）でＦＲ２において重複する共通配列を有した。このようにして、フロントエンドおよびミドルヒトカセットライブラリーを、ヒトＶ−重鎖２およびＶ−カッパ１アイソタイプに対するＰＣＲにより構築した。それぞれのＶｈカセットライブラリーを、ＮｃｏＩ（５’）およびＫｐｎＩ（３’）で、ベクターＫＢ１２９２−Ｈｉｓにクローニングし；それぞれのＶｋカセットライブラリーを、ＮｃｏＩ（５’）およびＨｉｎｄＩＩＩ（３’）で、ベクターＫＢ１２９６−Ｂ（ＦＲ４に加えられたサイレントＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＫａｌｏＢｉｏｓベクターＫＢ１２９６の修飾されたバージョン）にクローニングした。次に、得られたＶｈまたはＶｋプラスミドライブラリーを、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩでの消化、次にライゲーションにより、参照Ｆａｂ  ＪＧ０２４由来の相補的鎖と混合し（例えば、Ｖｈフロントエンドライブラリーを、最適化された参照Ｖｋベクターと混合し）、完全Ｆａｂを発現するジシストロニック(dicistronic)ベクターのライブラリーを作製した。
【０１８６】
一般的なＥＬＩＳＡ
組換えヒトまたはカニクイザルマカクザルＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原を、全てのＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。一般的に、ＰＢＳ  ｐＨ７．４にて希釈されたＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原を、４℃で一晩インキュベーションにより３００ｎｇ／ウェルで、９６−ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。プレートを、ＰＢＳ中で３％のＢＳＡの溶液で３７℃で１時間ブロックし、次に、ＰＢＳＴで１回濯いだ。次に、Ｆａｂを含有する誘導細胞培地または希釈された精製Ｆａｂ（５０μＬ）を、それぞれのウェルに加えた。３７℃で１時間インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで３回濯いだ。ＰＢＳ（５０μＬ）にて１：５０００希釈された抗−ヒト−カッパ鎖ＨＲＰ抱合体（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７１６４）をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  ＃５２−００−０３）をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で〜１０分間インキュベートした。プレートを分光光度計にて６５０ｎｍで読んだ。
【０１８７】
精製されたヒトおよびマウスＩｇＧに対する特異性ＥＬＩＳＡにおいて、３８４−ウェルプレートを、ウェルあたり８８ｎｇで精製されたヒトまたはマウス抗原の一群でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを上記のとおりにブロックし、洗浄し、次に、ＰＢＳにて２μｇ／ｍＬに希釈された２２μＬの精製されたマウスまたはヒト抗ＰＣＳＫ９抗体を、それぞれのウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次に、ＰＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰに結合させた抗マウスＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch Labs #115-035-071）または抗ヒトカッパ抗体（Sigma #A7164）を、ＰＢＳ（２５μＬ）にて１：５０００で希釈し、それぞれのウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次に、上記のとおりに洗浄し、進行させた。
【０１８８】
コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）
Ｆａｂフラグメントのｈｕｍａｎｅｅｒｅｄライブラリーのスクリーニングを、１μｇ／ｍＬでＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６でコーティングされているニトロセルロースフィルターを使用して、本質的に（米国特許公開第２００５／０２５５５５２および２００６／０１３４０９８号）記載されているとおりに実施した。抗原コーティングフィルターに結合したＦａｂを、ＰＢＳＴにて１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Sigma #A3813）を使用して検出し、ブロットを、アルカリホスファターゼに対するＤｕｏＬｕｘ化学発光基質（Vector Laboratories #SK-6605）発色させた。
【０１８９】
ビオチン化組換えＰＣＳＫ９の作製および親和性測定
Ｃ−末端にＡｖｉ−（部位特異的ビオチン化のため）およびＨｉｓ６−タグを有するＰＣＳＫ９（ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６）を、ｐＲＳ５ａ／ＰＣＳＫ９プラスミドＣ−末端Ｈｉｓ６（配列番号：４５）タグを有するＰＣＳＫ９  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｑ８ＮＢＰ７のアミノ酸３１−６９２を発現する）におけるＰＣＳＫ９およびＨｉｓ６タグをコードする遺伝子間に、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を挿入することにより作製した。Ａｖｉタグ（アミノ酸配列：ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号：５５）をコードし、ＥｃｏＲＩオーバーハングが隣接するオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Invitrogen）でリン酸化し、アニーリングし、次に、新たに挿入されたＥｃｏＲＩ部位を使用してｐＲＳ５ａ／ＰＣＳＫ９にライゲートした。Ａｖｉタグを含むクローンを、配列分析により確認した。ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６の発現を２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）で行い、分泌された組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（QIAGEN）を使用して精製した。精製後、ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６タンパク質を、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析した。タンパク質を、製造業者のプロトコールにしたがって、ビオチン−タンパク質リガーゼ（Avidity）でインビトロにてビオチン化した。完了後、反応物をＰＢＳ  ｐＨ７．２に対して透析し、ビオチン化を、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンでプローブするウェスタンブロットにより確認した。
【０１９０】
ＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇＴＭプロセス中に生じたＩｇＧおよびＦａｂフラグメントの結合速度は、製造業者の指示にしたがって、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステムを使用して分析した。ビオチン化ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６抗原を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ForteBio #18-0006）に結合させた。抗原へのＦａｂ結合を、バイオレイヤー干渉法分析および製造業者により提供されるソフトウェアを使用して、リアルタイムにおいてモニタリングした。親和性を、決定された結合および解離定数から計算した。最後に選択された候補物の結合速度を、溶液平衡滴定（「ＳＥＴ」）アッセイを使用して分析した。簡潔には、ヒト、ｃｙｎｏ、マウスまたはラットＰｃｓｋ９の連続希釈物を作製し、抗ＰＣＳＫ９  Ａｂをそれぞれの抗原濃度に加え、１００ｐＭの抗体定常濃度に達した。１００μＬ／ウェルのそれぞれの希釈物混合物を、９６−ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（Greiner）にデュプリケートで分配した。該プレートを密閉し、室温で一晩インキュベートした。９６−ウェル標準結合マイクロタイタープレート（Meso Scale Discovery）を、ＰＢＳで希釈された２５μＬの１μｇ／ｍＬのＰｃｓｋ９でコーティングした。該プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、抗原被覆標準結合マイクロタイタープレートを、ウェルあたり２００μＬのＰＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。次に、プレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックし、室温で１時間震盪しながらインキュベートした。洗浄工程を繰り返し、ポリプロピレンマイクロタイタープレートからの２５μＬ／ウェルの抗体−抗原調製物を、抗原被覆標準結合プレートに移した。標準結合プレートを、室温で６０分間震盪しながらインキュベートした。３回さらなる洗浄工程後、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０バッファーにおいて希釈された２５μＬの１μｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−タグ−標識ヤギ抗ヒト−検出抗体（Ｒ３２ＡＪ−５、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、それぞれのウェルに加え、室温で１時間震盪しながらインキュベートした。プレートを３回洗浄後、１５０μＬの２Ｘ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（R92TC-1, Meso Scale Discovery）をそれぞれのウェルに移した。電気化学発光シグナルを発生させ、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Meso Scale Discovery）により検出した。データを、Piehlerら (1997) J Immunol Methods 201:189-206に記載されている抗体に適用可能な適当なモデルを使用して、ｅｘｃｅｌアドインＸＬｆｉｔ  ４．３．２（ID Business Solutions）で処理した。高親和性結合が、溶液中のヒトおよびｃｙｎｏＰＣＳＫ９と抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３間で観察された。
【０１９１】
抗体生産および精製
Ｆｕｌｌｙ  ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭＭＡＢ２およびＭＡＢ３抗体（サイレントＩｇＧ１カッパ）を、製造業者のプロトコールにしたがって２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Invitrogen #51-0031）を使用して、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞へのベクターｐＪＧ０４（重鎖）およびｐＪＧ１０（軽鎖）の共トランスフェクションにより生産した。抗体を、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（GE Healthcare #17-0403-03）を使用して、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞上清から精製された。抗体をＩｇＧ溶離バッファー（Pierce #21004）を使用して溶離し、透析によりＰＢＳにバッファー交換した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーを、ＡＫＴＡＦＰＬＣ液体クロマトグラフィー系（GE Healthcare）にて行った。
【０１９２】
エピトープ競合アッセイ
ＰＣＳＫ９上のエピトープ結合に対する元のマウス抗体ＭＡＢ１とそのＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ誘導体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３間の競合は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ系およびビオチン化ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６でコーティングされたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓを使用してアッセイした。次に、４つの異なる抗体、マウスＭＡＢ１、完全ヒトＭＡＢ２、完全ヒトＭＡＢ３またはｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ抗−ＰＣＳＫ−９抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（ＭＡＢ１と異なるエピトープを有することが知られている）を、飽和になるまで、別々のＰＣＳＫ９被覆センサーに結合させた。次に、第１の抗体がＭＡＢ１結合をブロックすることができるか否かを決定するために、全てのセンサーをＭＡＢ１マウス抗体を含むウェルに浸漬した。
【０１９３】
結果
マウスおよび参照Ｖ−領域アミノ酸配列
ＭＡＢ１を発現するハイブリドーマ細胞からのＲＴ−ＰＣＲ産物をシーケンシングし、該配列は、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ  ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して、タンパク質レベルでほとんど（９５％以上）確認された。次に、ＭＡＢ１の重鎖および軽鎖可変領域をＫａｌｏＢｉｏｓベクターにクローニングし、参照Ｆａｂ  ＳＲ１０１−Ｂ１を作製した。参照Ｆａｂ（ＳＲ１０１−Ｂ１）に加えて、最適化された参照Ｆａｂ、ＪＧ０２４を構築した。ＳＲ１０１−Ｂ１におけるいくつかのフレームワークアミノ酸残基を、ＪＧ０２４におけるヒト生殖細胞系列に変化させた。
【０１９４】
参照および最適化された参照Ｆａｂ親和性分析
ＦＲ１およびＦＲ３中の最適化された参照Ｆａｂ  Ｊ  ＥＪＳ００５に組み込まれたヒト生殖細胞系列残基は、ヒトＶ−セグメントレパートリーを増幅するために使用されたＰＣＲプライマーにより特定されたものであり、したがって、ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄＶ−領域ライブラリーの全てのメンバーに存在する。最適化された参照Ｆａｂを、ヒト生殖細胞系列への変化のいずれかがＦａｂ結合の特性を変化させるか否かを評価するために構築した。精製されたＦａｂを使用する希釈ＥＬＩＳＡにより、組換えＰＣＳＫ９抗原に対するＳＲ１０１Ｂ−１およびＥＪＳ００５の親和性は、実験ノイズ内であると思われ、ＥＪＳ００５におけるアミノ酸変化は耐性があることを示す。
【０１９５】
ライブラリー構築および完全ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭＦａｂの選択
Ｖｈ２またはＶｋ１サブグループに限定された重鎖および軽鎖フロントエンドおよびミドルカセットライブラリーを作製し、ＣＬＢＡによりスクリーニングした。Ｖｈにおいて、ＰＣＳＫ９抗原への結合を支持するフロントエンドカセットはコロニーリフト結合アッセイにより同定されたが、Ｖｈミドルカセットは同定されなかった。Ｖｋにおいても、フロントエンドカセットのみがコロニーリフトにより同定された。それぞれのフロントエンドライブラリーからの多数の結合物が、Ｆａｂ含有細胞上清におけるＥＬＩＳＡアッセイで再確認され、濃度標準化親和性ＥＬＩＳＡによりさらに順位付けされた。
【０１９６】
ＰＣＳＫ９結合を支持するＶ−重鎖ミドルカセットが同定されなかったため、Ｆｒ−３ライブラリーを、最適化された参照Ｆａｂから増幅されたＣＤＲ−２に結合したフロントエンドスクリーンにおいて同定されたカセットおよびＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｖｈ２ライブラリーから増幅されたＦｒ−３ライブラリーを使用して、構築した。したがって、Ｆｒ−３ヒトカセットライブラリーを、抗原結合フロントエンドカセットにおいて構築し、スクリーニングし、抗原結合クローンを同定した。
【０１９７】
Ｖｋミドルは、異なる経路(path)にしたがった。Ｖｋミドルにおいて、Ｆｒ−２からＣＤＲ−２に及ぶ、親マウス残基または最も近いヒト生殖細胞系列残基のいずれかをコードする突然変異ライブラリーを構築した。これを、Ｖｋ１  Ｆｒ−３ライブラリーに結合させた。得られるライブラリーは、Ｆｒ−３ライブラリーに結合したＦｒ−２およびＣｄｒ−２突然変異ライブラリーに結合した抗原結合Ｆｅカセットを有した。
【０１９８】
上記ライブラリーから、ＰＣＳＫ９抗原への結合を支持するフロントエンドおよびミドルヒトカセットを、ＣＬＢＡにより重鎖および軽鎖の両方に対して成功裏に同定した。ＣＬＢＡ陽性クローンがＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ  Ｆａｂを完全に含むことができるように、これらのライブラリーをスクリーニングした。ＣＬＢＡ陽性クローンを、標準化親和性ＥＬＩＳＡにより全て確認し、ランク付けした(rank-ordered)。最も高い親和性および最も高い生殖細胞系列同一性を示す配列を有する６つのＦａｂを精製し、より正確な親和性測定をＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔシステムを使用して行った。
【０１９９】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ分析を使用するＰＣＳＫ９抗原に対する完全ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ  Ｆａｂの親和性試験
次に、６つのヒトＦａｂの結合速度を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔシステムを使用して、参照Ｆａｂ  ＪＧ０２４の速度と比較した（数値データは表１に要約した）。
表１．ＰＣＳＫ９に対する完全ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭＦａｂの親和性
【表１】
2014511378.tif 000004
【０２００】
これらのＦａｂに対するタンパク質濃度決定は困難であった；そのため、解離速度（ｋｄ）データは、結合速度（ｋａ）およびＫＤデータよりもずっと信頼性が高い（解離速度のみが濃度依存的である）。試験されたＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ  Ｆａｂは１つをのぞき全て、参照Ｆａｂよりも大体良い（すなわち、遅い）解離速度を有するようであった。信頼性が低いが、全６つのＦａｂに対するＫａ測定値は、参照Ｆａｂと同程度であるか、またはそれよりも良好（速い）であった。
【０２０１】
抗原結合ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ  Ｆａｂの該選択から、最も高い親和性を有するヒト鎖を選択し、完全ＩｇＧ抗体を作製した。したがって、ＭＡＢ２の可変領域は、クローン４４由来の重鎖を含み、クローン４５由来の軽鎖を含む。ＭＡＢ３の可変領域は、Ｖｈ２  Ｆｒ３ライブラリースクリーンからのクローン３７の重鎖を含み、完全軽鎖ライブラリーからのクローン４５の軽鎖を含む。重鎖および軽鎖の組合せが同じスクリーンから同定されなかったため、それらを発現ベクターにクローニングし、発現させ、親和性をＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔにより測定した。候補Ｆａｂの親和性が参照Ｆａｂの親和性を満たすか、または超えることを確認後、それを完全ＩｇＧベクターにクローニングした。
【０２０２】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）システムを使用するＭＡＢ２およびＭＡＢ３の結合速度の分析
ＳＥＴアッセイを使用して、ヒトＰＣＳＫ９に対するＭＡＢ２およびＭＡＢ３抗体の結合親和性はそれぞれ、表２に示されているとおり、２６０および３００ｐＭであると決定された。これは、溶液中の抗体およびＰＣＳＫ９間の高親和性相互作用を示唆する。
表２．ＭＡＢ２およびＭＡＢ３の結合速度
【表２】
2014511378.tif 000005
【０２０３】
ＥＬＩＳＡによるＭＡＢ２およびＭＡＢ３の抗原特異性の分析
親マウス抗体ＭＡＢ１の抗原特異性が最終ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭＩｇＧｓ、ＭＡＢ２およびＭＡＢ３において保持されているか否かを試験するために、ヒトおよびマウス抗原（ならびにヒトＰＣＳＫ９）の一群に対する抗体の結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。このアッセイの結果（図４Ａ−Ｂ）は、ＭＡＢ２およびＭＡＢ３が、マウス抗体ＭＡＢ１と同様に、ＰＣＳＫ９に対する高い特異性を保持することを示す。
【０２０４】
ＥＬＩＳＡにおけるヒトおよびカニクイザルマカクザルＰｃｓｋ９タンパク質への抗体結合
ＭＡＢ２およびＭＡＢ３を、ヒトおよびカニクイザルマカクザル（ｃｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９に対する特異的結合について評価した。ＥＬＩＳＡアッセイは、親マウス抗体ＭＡＢ１のように、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３が、同様の様式で、ヒトおよびｃｙｎｏＰｃｓｋ９の両方に結合することができることを示す（図５Ａ−Ｃ）。
【０２０５】
バイオレイヤー干渉法をベースにしたエピトープ競合アッセイ
親マウス抗体ＭＡＢ１のエピトープ特異性が最終ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３において保持されているか否かを試験するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔシステムを使用する競合アッセイを開発した。ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３が親マウス抗体ＭＡＢ１の結合をブロックし、ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体が元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持することを示す。抗体の負荷の順番を交換し、すなわち、ＭＡＢ１を最初に、次にＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体を結合させたとき、同様の結果を得た。
【０２０６】
ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体ＭＡＢ２およびＭＡＢ３のアミノ酸配列ならびにヒト生殖細胞系列配列に対する同一性パーセント
最終ＨｕｍａｎｅｅｒｅｄＴＭＩｇＧ  ＭＡＢ２およびＭＡＢ３の可変領域アミノ酸配列をそれぞれ、図２および３に示す；ＣＤＲは下線を引かれ、太字である。ヌクレオチド配列は配列表に含まれている。
【０２０７】
ヒト生殖細胞系列配列とＭＡＢ２およびＭＡＢ３との同一性パーセントは、単一のヒト生殖細胞系列配列に対するＶｈおよびＶｋアミノ酸配列をアラインすることにより決定した（Ｖｈ２  ２−０５  およびＶｋ１  Ｏ２、それぞれ；表３）。ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３における残基を、それぞれの鎖に対する計算から除外した。
表３．ヒト生殖細胞系列配列に対するＭＡＢ２およびＭＡＢ３の同一性パーセント
【表３】
2014511378.tif 000006
【０２０８】
ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ抗体の機能的特性化に関するさらなる情報は、図７−１２において示されている。
【０２０９】
本明細書に記載されている実施例および態様は説明の目的のためのみであり、それらの認識における種々の修飾または変化は、当業者に示唆されており、本出願の精神および範囲ならびに特許請求の範囲内に含まれると理解される。本明細書に引用されている全ての刊行物、特許、特許出願および配列受入登録を、全ての目的のためにそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる。
【図１】
2014511378.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2014511378.tif 000010
【図４Ｂ】
2014511378.tif 000011
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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