(57)【要約】  本出願はヒト免疫学、特に単純ヘルペスウイルス（HSV）ワクチンの分野に関する。サブユニットワクチン組成物は、強力な免疫エンハンサーであるナノエマルジョンと様々な組み合わせで混合した、単純ヘルペスウイルスからの単離された表面糖タンパク質、融合タンパク質またはそれらの断片を含むものである。【選択図】図１
2014524474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ナノエマルジョンが水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物を含む免疫増進性ナノエマルジョン；および
(b)単純ヘルペスウイルス（HSV）抗原が全HSVウイルス、単離されたHSV抗原、またはそれらの組み合わせでありかつHSV抗原が該ナノエマルジョン内に存在する、少なくとも１つのHSV抗原
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
HSV抗原がナノエマルジョン中への組み込み前に不活化される、および／または、HSV抗原がナノエマルジョンにより不活化される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
HSV抗原がHSV由来でありかつ少なくとも１つの単離されたHSV gB、HSV gC、HSV gDまたはHSV gE糖タンパク質またはそれらの免疫原性断片を含む、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
1以上のHSV表面抗原がさらに弱毒表現型を示すヌクレオチド改変を含む、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのHSV表面抗原が融合タンパク質中に存在する、請求項１〜４のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのHSV表面抗原がHSV gB、HSV gC、HSV gDまたはHSV gE糖タンパク質の免疫原性ペプチド断片またはそれらの免疫原性誘導体中に存在する、請求項３〜５のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
免疫増進性ナノエマルジョンがTh1、Th2および／またはTh17免疫応答を誘導することができる、請求項１〜６のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ナノエマルジョン粒子径が約300nm〜約600nmである、請求項１〜７のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
さらにアジュバントを含む、請求項１〜８のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
さらに製薬上許容される担体を含む、請求項１〜９のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ワクチン組成物を非経口、膣内、経口または鼻腔内に投与する、請求項１〜１０のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
非経口投与が皮下、腹腔内または筋肉内注入によるものである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
有効量のナノエマルジョンHSVワクチン組成物を個体に投与するステップを含むものである、単純ヘルペスウイルスにより引き起された疾患に対する免疫の増進を誘導するための、請求項１〜１２のいずれか1項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項１４】
ヒトのHSV感染を治療または予防するために有用なナノエマルジョンHSVワクチンを調製する方法であって、
(a)真核生物宿主において1以上の全長または免疫原性断片のHSV表面抗原を組換えDNA遺伝子ベクターおよび構築物を利用して合成するステップであって、HSV表面抗原がHSV gB、HSV gC、HSV gD、および HSV gEから成る群より選択される前記ステップ；
(b)1以上の表面抗原またはその免疫原性断片を真核生物宿主から単離するステップ；および
(c)1以上の表面抗原を水中油ナノエマルジョンと共に製剤するステップ
を含むものである前記方法。
【請求項１５】
真核生物宿主が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
真核生物宿主が酵母細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
HSVがHSV-1である、請求項１４〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
HSVがHSV-2である、請求項１４〜１６に記載の方法。
【請求項１９】
1以上の多価単純ヘルペスウイルス（HSV）表面抗原と組み合わせた免疫増進性ナノエマルジョンを含むサブユニットワクチン組成物であって、ナノエマルジョンがさらに水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物および好ましくはナノエマルジョン内に含有される単離されたウイルス抗原を含む前記ワクチン組成物。
【請求項２０】
1以上の多価表面抗原がHSV由来でありかつ単離されたHSV gB、gC、gDまたはgE糖タンパク質またはそれらの免疫原性断片を含む、請求項１９に記載のサブユニットワクチン組成物。
【請求項２１】
さらにアジュバントを含む、請求項１９または２０に記載のサブユニットワクチン組成物。
【請求項２２】
さらに少なくとも1種の製薬上許容される担体を含む、請求項１９〜２１のいずれか1項に記載のサブユニットワクチン組成物。
【請求項２３】
ワクチン組成物を非経口、経口、膣内、または鼻腔内に投与する、請求項１９〜２２のいずれか1項に記載のサブユニットワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願はヒト免疫学、特に、単純ヘルペスウイルス（HSV）ワクチンの分野に関する。本ワクチン組成物は単離された全HSVウイルス、未変性体もしくは突然変異体、および／または単純ヘルペスウイルスから単離された表面糖タンパク質、例えば、gB、gC、gDおよびgE糖タンパク質、融合タンパク質またはそれらの断片を含む。全ウイルスおよび／または単離された表面糖タンパク質は、強力な免疫エンハンサーであるナノエマルジョンと色々な組み合わせで混合される。水中油ナノエマルジョンとHSV抗原を含有するワクチンは中和化抗体、免疫応答のTh1、Th2およびTh17手法の誘導を含む活性化されたかつ広範囲にわたる体液性および細胞性免疫応答を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス1型および2型は主に経口〜顔、眼または生殖器粘膜域の感染を引き起こし一生にわたる感染を確立する主要なヒト病原体であって、最初の感染が始まった各粘膜部位において再発しうる（Roizman and Spears, 1996）。HSV-1は特に神経系を侵しアルツハイマー病発症のリスクを増加する。HSVウイルスはリポタンパク質の成分および受容体と相互作用してアルツハイマー病発症に導きうる（Dobson and Itzhaki、1999）。この研究はアルツハイマーの確立に最も明確に連結した病原体としてHSVを同定している（Pyles RB、November 2001）。伝染のサイクルを壊す主な戦略は、HSV蔓延を抑制する予防法の選択として有効なワクチンの使用の可能性である。
【０００３】
HSV複製と病理発生について、特に動物モデルにおいて、広範な研究が行われてきた。様々なワクチン戦略が色々な動物モデルで試験されていて、それにはサブユニットおよび全ウイルスワクチンが含まれ、有望な結果が得られている（Awasthiら、2011；Bernsteinら、2011；Chanら、2011）。しかし、ヒトにおけるHSVワクチンによる臨床試験の成功は限られている（Coreyら、1999； Ashleyら、1985； Zarlingら、1988）。最適なワクチンについてのコンセンサスは、免疫応答の各手段（Th1、Th2およびTh17ならびに中和抗体、および粘膜抗体（IgA）の存在を含む）の関与を必要とする。
【０００４】
サブユニットワクチンは個々のHSV表面抗原（gB（Allenら、2010）、gC（Awasthiら、2009；Changら、2005）、gD（Bernsteinら、2010）およびgE（Ghiasiら、2992）を含む）を用いて試験された。さらに、全HSV弱毒ワクチンおよびサブユニットワクチンは、ヒトで試験した場合に十分な粘膜抗体（IgA）を適当な表面に産生しなかったし、加えて、HSV感染および潜在的再活性化に重要であるT細胞応答は粘膜表面より低かった（ParrおよびParr、1999）。
【０００５】
様々なHSV免疫化研究において、Th1免疫応答は潜在的再感染およびウイルス再活性化に対する保護に重要な成分であるので、自然の病原プロセスを複製する適当な動物モデルの使用が重要である（Dasguptaら、2011）。
【０００６】
充分なヒト用のワクチンが欠乏するので、本発明者らは抗原に対する免疫エンハンサーとしてのナノエマルジョンの新しい特徴に関する従来の知見の詳しい調査を促した。伝統的なアジュバントの使用としてHSVサブユニットワクチンに加えたが、臨床環境で効力が見られなかった（Bernsteinら、2011； Coreyら、1999； Dasguptaら、2011； Ashleyら、1985）。しかしナノエマルジョンはアジュバント効果を与える一方、適当な細胞型を引き付けかつ免疫応答の複数の手段を活性化することにより抗原提示も助ける（Hamoudaら、210； Bielinskaら、2010； Makidonら、2008）。
【０００７】
ほとんどのワクチンのように、ヒトにおける高い効力と相関がある高い免疫原性も求められる。先行技術は典型的には、免疫原性を増加するために、組換えタンパク質（例えば、米国特許7,192,595；6,194,546；5,962,298）の使用、ならびにアルミニウム（米国特許6,861,244）およびムラミルジペプチド（米国特許4,826,687）などのアジュバントの組成物への添加の使用を開示している。しかし、それでもなお、改良された貯蔵安定性を備えかつ投与が容易で高度に有効なHSVワクチンを開発する必要があり、これに応えるのが本発明のナノエマルジョンワクチンの特徴である。
【０００８】
ナノエマルジョンに関する従来の教示は米国特許6,015,832に記載されており、グラム陽性菌、細菌胞子、またはグラム陰性菌を不活化する方法に関する。この方法は、グラム陽性菌、細菌胞子、またはグラム陰性菌を細菌不活化（または細菌胞子不活化）乳濁液と接触させるステップを含むものである。米国特許6,506,803は微生物（例えば、ヒトに関わる細菌、ウイルス、胞子、真菌）を殺滅または中和化する薬剤を用いる方法に関する。米国特許6,559,189はサンプル（ヒト、動物、食物、医療機器など）をナノエマルジョンと接触させるステップを含むものであるサンプルを除染する方法に関する。ナノエマルジョンは細菌、ウイルス、真菌、原生動物または胞子と接触させると、それらの病原体を殺滅または無能化する。抗微生物ナノエマルジョンは四級アンモニウム化合物、エタノール／グリセリン／PEGの1つおよび界面活性剤を含む。米国特許6,635,676は2つの異なる組成物および、前記組成物のいずれかを用いる処理によりサンプルを除染する方法に関する。組成物1は細菌、ウイルス、真菌、原性動物、および胞子に対して抗微生物性であるエマルジョンを含む。エマルジョンは油および四級アンモニウム化合物を含む。米国特許7,314,624は、被験者を粘膜表面を介して免疫原とナノエマルジョンの組み合わせで処理するステップを含むものである免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。ナノエマルジョンは油、エタノール、界面活性剤、四級アンモニウム化合物、および蒸留水を含有する。US-2005-0208083およびUS-2006-0251684は好ましいサイズの液滴を有するナノエマルジョンに関する。US-2007-0054834はハロゲン化四級アンモニウムを含有する組成物および、前記組成物を用いて感染症状を治療する方法に関する。四級アンモニウム化合物は乳濁液の一部分として提供してもよい。US-2007-0036831およびUS2011-0200657は抗炎症剤を含有するナノエマルジョンに関する。ナノエマルジョンを記載する他の開示物には、米国特許8,226,965「真菌、酵母およびかび感染を治療する方法」；US 2009-0269394「爪甲真菌症を治療する方法および組成物」；US 2010-0075914「ヘルペスウイルス 感染を治療する方法」； US 2010-0092526「ナノエマルジョン治療の組成物および前記組成物を用いる方法」；US 2010-0226983「にきびを治療および予防する組成物および前記組成物を作製する方法、ならびにその使用の方法」；
US 2012-0171249「病原性微生物を不活化する組成物、前記組成物を作製する方法、およびそれらの使用方法」；ならびに、US 2012-0064136「ナノエマルジョン組成物を用いる老化防止および抗しわ治療法」が含まれる。しかし、これらの参照はいずれも本発明の方法、組成物およびキットを教示するものでない。
【０００９】
特に、米国特許7,314,624はナノエマルジョンワクチンを記載している。しかし、この参考文献は本発明の免疫原を用いてHSVに対する保護免疫応答を誘導できることを教示していない。
【００１０】
ワクチンに関する先行技術には、例えば、米国特許7,731,967「免疫応答を誘導する組成物」（Novartis）が含まれ、これは少なくとも2つのアジュバントを含む抗原／アジュバント複合体を記載している。米国特許7,357,936「アジュバント系とワクチン」（GSK）はアジュバントと抗原のある組み合わせを記載している。米国特許7,323,182「サポニンを含有する水中油乳濁液」（GSK）は油／水製剤によるワクチン組成物を記載している。米国特許6,867,000「ヘルペスに対する免疫応答を増進する方法」（Wyeth）はウイルス抗原とサイトカイン（IL12）の組み合わせを記載している。米国特許6,692,752「HSV感染に感受性のヒト雌性を治療する方法」（GSK）は単純ヘルペスウイルス（HSV）感染に感受性のHSV 1/2型雌性ヒト被験者を治療する方法を記載している。その方法は被験者にアジュバントと抗原を含むワクチン製剤の有効量を投与するステップを含むものであって、前記抗原はHSV-1糖タンパク質D、HSV-2糖タンパク質Dおよびそれらの免疫学的断片から成る群より選択されるかまたは誘導される。米国特許6,623,739、6,372,227、および6,146,632は全て「ワクチン」（GSK）の特許であって、抗原および／または抗原組成物およびアジュバントを含む免疫原性組成物に関するものであって、前記アジュバントは水中油乳濁液の剤形の代謝可能な油とαトコフェロールから成る。米国特許6,451,325「サブミクロン油滴乳濁液を含むアジュバント製剤」（Chiron）は代謝可能な油、乳濁化剤、および抗原性物質を含むアジュバント組成物に関し、ここで油と乳濁化剤は水中油乳濁液の形態で存在する。アジュバント組成物はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーを含有せず；そして抗原性物質がアジュバント組成物の内部相に存在しない。米国特許6,027,730「HSV gDおよび3-脱アシル化モノホスホリル脂質A」（GSK）は単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Dまたは単純ヘルペスウイルスDの免疫学的断片、3-脱アシル化モノホスホリル脂質Aおよび担体を含むものであるワクチン製剤を記載している。担体はミョウバンまたは水中油乳濁液である。米国特許5,747,039「組換え単純ヘルペスgB-gDワクチン」（Chiron）はヒトを単純ヘルペスウイルス（HSV）感染に対して免疫化する方法であって、アジュバントと本質的にHSVポリペプチドから成るワクチン製剤でヒトにワクチン接種するステップを含む前記方法である。そのHSVポリペプチドは免疫原性であり、グリコシル化されていて、かつ(i)HSV糖タンパク質Bポリペプチドまたは膜貫通アンカー領域の全てもしくは一部分の欠失を有するHSV糖タンパク質Bポリペプチド；および(ii)HSV糖タンパク質Dポリペプチドまたは膜貫通アンカー領域の全てもしくは一部分の欠失を有するHSV糖タンパク質Dポリペプチドから成る。米国特許5,648,079「HSV gBワクチン」（Chiron）は、組換えにより作製した、膜貫通アンカー領域の全てまたは一部分の欠失を有する単純ヘルペスウイルス（HSV）のグリコシル化糖タンパク質B（gB）ポリペプチドを、薬理学的に許容される担体およびアジュバントと組み合わせて含むワクチン組成物を記載している。米国特許5,612,041「組換えHSV gDワクチン」（Chiron）は、HSV感染後のヒトにワクチン接種するステップを含むヒトにおける再発性単純ヘルペスウイルス（HSV）感染を軽減する方法であって、本質的にアジュバ��トならびにHSVの糖タンパク質D（gD）およびアンカー配列コード領域の全てまたは一部分を欠くHSV gDのC-末端切断型から成る群より選択されるタンパク質から成るワクチンを用いる前記方法を記載している。米国特許5,171,568「組換えHSV gB-gDワクチン」（Chiron）は本質的に単純ヘルペスウイルス（HSV）ポリペプチドから成るワクチン製剤であって、ここで、HSVポリペプチドは免疫原性であり、グリコシル化されていて、かつ(i)HSV糖タンパク質Bポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片；および(ii)HSV糖タンパク質Dポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片から成るものである前記ワクチン製剤を記載している。US 2011-0177125「HSV結合サブユニットワクチンおよびその使用方法」（U Penn-Friedman）は、組換えHSV-2 gDタンパク質またはそれらの免疫原性断片、組換えHSV-2 gCタンパク質断片、およびアジュバントを含むワクチンを記載している。HSV-2 gCタンパク質断片はそのC3b-結合ドメイン、そのプロパージン妨害ドメイン、そのC5妨害ドメインまたはC3b-結合ドメイン、プロパージン妨害ドメイン、またはC5-妨害ドメインの断片を含む。最後に、US 2004-0151734「ワクチンおよび使用の方法」（GSK）は、1以上の性的に移された疾患（STD）を患うまたは感受性のある雌性ヒト被験者を治療する方法を記載している。その方法は、その必要がある雌性被験者にSTDを引き起す病原体から誘導したまたは結合した1以上の抗原とアジュバントを含むワクチン製剤の有効量を投与するステップを含むものである。
【００１１】
当技術分野において、有効なHSVワクチンおよび前記ワクチンを作製しかつ用いる方法の必要性は残存する。本発明はこれらの必要性を満たすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許7,192,595
【特許文献２】米国特許6,194,546
【特許文献３】米国特許5,962,298
【特許文献４】米国特許6,861,244
【特許文献５】米国特許4,826,687
【特許文献６】米国特許6,015,832
【特許文献７】米国特許6,506,803
【特許文献８】米国特許6,559,189
【特許文献９】米国特許6,635,676
【特許文献１０】US-2005-0208083
【特許文献１１】US-2006-0251684
【特許文献１２】US-2007-0054834
【特許文献１３】US-2007-0036831
【特許文献１４】US2011-0200657
【特許文献１５】米国特許8,226,965
【特許文献１６】US 2009-0269394
【特許文献１７】US 2010-0075914
【特許文献１８】US 2010-0092526
【特許文献１９】US 2010-0226983
【特許文献２０】US 2012-0171249
【特許文献２１】US 2012-0064136
【特許文献２２】米国特許7,314,624
【特許文献２３】米国特許7,731,967
【特許文献２４】米国特許7,357,936
【特許文献２５】米国特許7,323,182
【特許文献２６】米国特許6,867,000
【特許文献２７】米国特許6,692,752
【特許文献２８】米国特許6,623,739
【特許文献２９】米国特許6,372,227
【特許文献３０】米国特許6,146,632
【特許文献３１】米国特許6,451,325
【特許文献３２】米国特許6,027,730
【特許文献３３】米国特許5,747,039
【特許文献３４】米国特許5,648,079
【特許文献３５】米国特許5,612,041
【特許文献３６】米国特許5,171,568
【特許文献３７】US 2011-0177125
【特許文献３８】US 2004-0151734
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Roizman, B, Spears P. Herpes simplex viruses and their replication. In Fields, B. et al. Fields Virology. 1996. 2231-2296. Lippincott. NY.
【非特許文献２】Dobson CB, Itzhaki RF (1999). "Herpes simplex virus type 1 and Alzheimer's disease". Neurobiol. Aging 20 (4): 457-65.
【非特許文献３】Pyles RB (November 2001). "The association of herpes simplex virus and Alzheimer's disease: a potential synthesis of genetic and environmental factors" (PDF). Herpes 8 (3): 64-8.
【非特許文献４】Awasthi, S, Lubinski, J, Shaw, C, Barett, S, et al. HSV-2 glycoprotein C subunit immunization with glycoprotein D improves the protection of dorsal root ganglia in mice and reduces the frequency of recurrent vaginal shedding of HSV-2 DNA in guinea pigs compared to glycoprotein D alone. J. Virol. 2011. 1128/00849-11
【非特許文献５】Bernstein D, Earwood J, Bravo F, et al. Effects of herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccines and CLDC adjuvant on genital herpes infection in the guinea pig. Vaccine. 2011. 29:2071-2078.
【非特許文献６】Chan T, Barra N, et al. Innate and adaptive immunity against herpes simplex virus type 2 in the genital mucosa. J Repro Immunol. 2011. 88:210-218.
【非特許文献７】Corey, L, Langenberg A, Ashley R, et al. Recombinant glycoprotein vaccine for the prevention of genital HSV-2 infection; two randomized controlled trials. JAMA.1999. 281:331-340.
【非特許文献８】Ashley, R, Mertz, G, Clark H, et al. Humoral immune response to herpes simplex virus type 2 glycoproteins in patients receiving a glycoprotein subunit vaccine. J Virol. 1985. 56:475-481.
【非特許文献９】Zarling, J, Moran P, et al. Herpes Simplex Virus (HSV)-specific proliferative and cytotoxic T-cell responses in humans immunized with an HSV type 2 glycoprotein subunit vaccine. J Virol. 1988. 62:4481-4485.
【非特許文献１０】Allen S, Mott K, Zandian M., Immunization with different viral antigens alters the pattern of T cell exhaustion and latency in herpes simplex virus type-1 infection mice. J Virol. 2010. 84:12315-12324.
【非特許文献１１】Awasthi, S, Lubinski J, Friedman, H. Immunization with HSV-1 glycoprotein C prevents immune evasion from complement and enhances the efficacy of an HSV-1 glycoprotein S subunit vaccine. Vaccine. 2009. 27:6845-6853.
【非特許文献１２】Chang, YJ, Jiang M, Lubinski, J., et al. Implication for herpes simplex virus strategies based on antibodies produced to herpes simplex virus type 1 glycoprotein gC immune evasion domains. Vaccine. 2005. 23:4658-4665.
【非特許文献１３】Ghiasi, H, Kaiwar R., et al. Baculovirus-expressed glycoprotein E (gE) of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) protects mice from lethal intraperitoneal and lethal ocular HSV-1 challenge. 1992. Virol. 188:469-476.
【非特許文献１４】Parr E, Parr M. Immune response and protection against vaginal infection after nasal or vaginal immunization with attenuated herpes simplex virus type-2. Immunol. 1999. 98:639-645.
【非特許文献１５】Dasgupta, G, BenMohamed, L. Of mice and humans: how reliable are animal models for evaluation of herpes CD8+-T cells epitopes-based immunotherapeutic vaccine candidates. Vaccine. 2011. 29:5824-5836.
【非特許文献１６】Hamouda T, Chepurnov A, Mank N, et al. Efficacy, immunogenicity and stability of a novel intranasal nanoemulsion adjuvanted influenza vaccine in a murine model. Hum Vaccine. 2010. 6:585-594.
【非特許文献１７】Bielinska, A, Gerber M, Blanco L, et al. Induction of Th17 cellular immunity with a novel nanoemulsion adjuvant. 2010. Crit Rev Immunol. 30:189-199.
【非特許文献１８】Makidon, P, Bielinska, A, Nigavekar, S, et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLOS-One. 2008. 3:e2954.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明はHSV感染に対する保護免疫応答を誘導する新規の手段を提供する。本ワクチンはHSV-1とHSV-2の両方（本出願では「HSV」をHSV-1とHSV-2の総称として用いる）に対して有用でありうる。ナノエマルジョンを全HSVウイルス（未変性または突然変異体）および／または複数のHSV表面抗原と組み合わせることはヒト用ワクチン開発の合理的な基礎となる新規の組み合わせを提示する。本発明の一実施形態において、本発明は被験者におけるHSVに対する免疫応答を誘導する組成物、方法およびキットを提供する。好ましくは、本発明のワクチン組成物はTh1、Th2およびTh17免疫応答を誘導することができる。
【００１５】
本発明の一実施形態においては、免疫応答を増進するナノエマルジョンと全HSVウイルス（未変性または突然変異体のいずれも）を含むワクチン組成物が包含され、ナノエマルジョンはさらに水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物を含むものでありかつHSVウイルスは好ましくはナノエマルジョン内に存在する。
【００１６】
本発明の他の実施形態において、免疫応答を増進するナノエマルジョンおよび少なくとも1つの単純ヘルペスウイルス（HSV）表面抗原を含むワクチン組成物が包含され、ナノエマルジョンはさらに水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物を含むものでありかつHSV抗原は好ましくはナノエマルジョン内に存在する。例えば、HSV表面抗原はHSV由来であってもよく、少なくとも１つの単離されたHSV gB、gC、gDまたはgE糖タンパク質またはそれらの免疫原性断片を含むものである。さらに、1以上のHSV表面抗原はさらに弱毒表現型を示すヌクレオチド改変を含んでもよい。少なくとも１つのHSV表面抗原がまた、融合タンパク質中に存在してもよい。例えば、少なくとも１つのHSV表面抗原がHSV gB、gC、gDまたはgE糖タンパク質またはそれらの誘導体の免疫原性ペプチド断片中に存在してもよい。
【００１７】
本発明のHSVワクチンは全HSVウイルスを1以上のHSV表面抗原と組み合わせて含むものであってもよい。
【００１８】
一実施形態において、本発明に包含されるのは、(1)少なくとも１つのHSV免疫源（例えば、全HSVウイルスまたは単離されたHSV表面抗原）、(2)水相、(3)少なくとも１種の油、(4)少なくとも１種の界面活性剤、(5)少なくとも1種の有機溶媒、および(6)任意に少なくとも1種のキレート剤を含むワクチン組成物である。さらに本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンは有機溶媒を含まない。さらに、追加のアジュバントをナノエマルジョンHSVワクチンに加えてもよい。HSV免疫原は好ましくは、単純ヘルペスウイルス由来の少なくとも2つの単離された表面糖タンパク質、例えば、gB、gC、gDおよびgE糖タンパク質、融合タンパク質またはそれらの断片の組み合わせである。あるいは、HSV免疫源は未変性または突然変異体いずれかの全HSVウイルスであってもよい。
【００１９】
他の実施形態において本発明に包含されるのは、多価単純ヘルペスウイルス（HSV）表面抗原と組み合わせて免疫を増進するナノエマルジョンを含むサブユニットワクチン組成物であって、ここでナノエマルジョンはさらに水中油ナノエマルジョンもしくはその希釈物と好ましくはナノエマルジョン内に含有される単離されたウイルス抗原を含む前記ワクチン組成物である。特に、多価表面抗原はHSVから誘導することができ、そして単離されたHSV gB、gC、gDまたはgE糖タンパク質またはそれらの免疫原性断片を含むものである。
【００２０】
本発明のワクチン組成物は、例えば、約300nm〜約600nmのナノエマルジョン粒子径を有してもよい。他のナノエマルジョン粒子径、例えば、1000nm未満の粒子径も本発明により包含される。
【００２１】
加えて、本発明のワクチン組成物はさらに、アジュバントおよび／または1以上の製薬上許容される担体を含んでもよい。
【００２２】
ナノエマルジョンHSVワクチンは、いずれの製薬上許容される投与剤形、例えば、分散液、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、経鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、または固体剤形で製剤してもよい。さらに、本発明のワクチン組成物はいずれかの製薬上許容される方法で投与することができる。例えば、本発明のワクチン組成物は非経口、経口、膣内、または鼻腔内のいずれかで投与することができる。さらに、非経口投与は皮下、腹腔内または筋肉内注射によることができる。
【００２３】
本発明の方法は単純ヘルペスウイルスにより引き起された疾患に対する免疫の増進を誘導する方法であり、被験者に本発明によるナノエマルジョンHSVワクチンの有効量を投与するステップを含むものである。特に、本発明の方法は被験者にナノエマルジョンを含むナノエマルジョンHSVワクチンを投与するステップを含む方法であって、前記ナノエマルジョンはさらに水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物ならびにHSV全ウイルス（未変性または突然変異体）および／または少なくとも1つの単純ヘルペスウイルス（HSV）表面抗原を含み、HSV全ウイルスおよび／または1以上のHSV抗原はナノエマルジョン内に存在する前記方法である。
【００２４】
さらに本発明の他の実施形態において、本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは、薬物耐性であるHSV感染を治療および／または予防するのに有用である。例えば、感染は抗ウイルス薬物、例えば、アシクロビルに対して耐性のHSV株によるものであってもよい。
【００２５】
本発明の他の実施形態においては、ヒトのHSV感染の治療または予防用のワクチンを調製する方法が包含される。本方法は、組換えDNA遺伝子ベクターおよび構築物を利用する真核生物宿主において1以上のHSV抗原を合成するステップ、真核生物宿主から1以上の表面抗原を単離するステップ、および表面抗原を水中油ナノエマルジョンと共に製剤化してナノエマルジョンHSVワクチンを形成するステップを含むものであってもよい。本方法は真核生物宿主において全長または断片のHSV表面抗原を合成するステップを含むものであってもよく、そして抗原は例えば、HSV gB、HSV gC、HSV gD、および／または HSV gEであってもよい。真核生物宿主は、例えば、哺乳動物細胞または酵母細胞であってもよい。
【００２６】
以上の一般的な記載および次の図面の簡単な説明と詳細な説明は例示および説明であって、請求項に記載の本発明のさらなる説明を提供することを意図する。他の目的、利点および新規の特徴は、続く本発明の詳細な説明から、当業者には容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】合計30μgのHAを含むおよび含まない20％W805ECナノエマルジョンのTEM断面画像を示す。図1Aは添加抗原なしの20％ナノエマルジョンを示す。図1B（右側パネル）は30μgフルゾン(登録商標)と組み合わせた20％ナノエマルジョンを示し、HA抗原が油滴中に位置することを図解する。暗く染色された抗原はナノエマルジョン粒子の外側に位置する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
HSV感染に対する保護免疫応答を誘導するための新規の手段を提供する。ナノエマルジョンをHSV全ウイルスおよび／または複数のHSV表面抗原と組み合わせると、ヒトにおけるワクチン開発の合理的な基礎を提供する新規の組み合わせが提示される。
【００２９】
Ａ．定義
本明細書で用いる用語「ナノエマルジョン」には、水に混和しない油相を水相と混合したときに、非極性残基（すなわち長い炭化水素鎖）を水から遠ざけかつ極性頭部基を水へ押しやる疎水力の結果として形成しうる小さい水中油分散物または液滴、ならびに他の脂質構造が含まれる。これらの他の脂質構造は、限定されるものでないが、単層、少数層、多層脂質小胞、ミセルおよびラメラ相を含む。本発明は、当業者が本明細書に開示した特定の実施形態の理解が必要なときに、この区別を理解しうると考えている。ナノエマルジョン粒子径は一般に300〜600ナノメートルである。
【００３０】
本明細書で用いる「約」は当業者であれば理解しうるものであって、文脈に応じてある範囲で変化しうる。使用される文脈で当業者に明らかではない語の使用があれば、「約」は、特定の用語のプラス10％またはマイナス10％までを意味する。
【００３１】
本明細書で用いる「抗原」は、1以上の免疫応答を誘発しうるエピトープを含有するタンパク質、糖タンパク質または誘導体または断片（線形、コンフォメーション、配列、T-細胞）を意味する。抗原は単離されたウイルスタンパク質またはペプチド誘導体に分離することができる。
【００３２】
本明細書で用いる用語「単離された」はその自然の位置から独立しているウイルス、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド誘導体または断片またはポリヌクレオチドを意味する。遺伝子組換え技法を通して独立して得られるウイルス成分は、典型的には、比較的精製された産物を生じる。
【００３３】
本明細書で用いる用語「アジュバント」は抗原（例えば、HSV表面抗原）に対する免疫応答を増加する薬剤を意味する。本明細書で用いる用語「免疫応答」は、被験者の免疫系が異物と認識する免疫原（すなわち、抗原）に対する免疫系による被験者（例えば、ヒトまたは他の動物）の応答を意味する。免疫応答は細胞介在性免疫応答（免疫系の抗原特異的T細胞と免疫系の非特異的細胞-Th1、Th2、Th17が介在する応答）と液性免疫応答（抗体が介在する応答）の両方を含む。用語「免疫応答」は免疫原（例えば、HSV表面抗原）に対する最初の「生得免疫応答」ならびに「獲得免疫」の結果である記憶応答を包含する。
【００３４】
本明細書で用いる用語「免疫増進性」は本発明のワクチン投与後における所与の病原体に対する生得および獲得免疫のレベルおよび活力の有意な上昇を、本発明のワクチンを投与しなかった場合の生得および獲得免疫のレベルと比較して意味するものである。
【００３５】
本明細書で用いる用語「HSV全ウイルス」は未変性、組換え、および突然変異体全HSVウイルスを意味し、HSV-1およびHSV-2を含む。
【００３６】
本明細書で用いる用語「HSV表面抗原」はHSV-1およびHSV-2ウイルスのエンベロープ由来のタンパク質、糖タンパク質およびペプチド断片を意味する。好ましいHSV表面抗原はHSV-1またはHSV-2いずれか由来の糖タンパク質gB、gC、gDおよびgEである。HSV表面抗原は一般に、感染細胞培養由来のウイルス単離物から抽出されるかまたは合成によりもしくは組換えDNA技法を用いて生産される。HSV表面抗原を化学的、遺伝的または酵素的技法により改変して、融合タンパク質、ペプチド、または断片を得ることができる。
【００３７】
本明細書で用いる「gB」はUL27遺伝子がコードするHSVエンベロープ糖タンパク質Bを意味する。この110kD糖タンパク質は複数の膜貫通セグメントを含有し、宿主細胞中へのウイルス侵入に必須である。本明細書で用いるgBは、gBおよび他のペプチドまたはタンパク質成分で形成される単離された成熟糖タンパク質、ペプチド断片および融合タンパク質を包含しうる。
【００３８】
本明細書で用いる用語「gC」は、UL44遺伝子がコードするHSVエンベロープ糖タンパク質Cを意味する。HSV gC糖タンパク質はウイルスの宿主細胞との結合に介在する機能を持ち、かつ生得免疫応答において補体活性化を調節する作用がある。本明細書で用いるgCは、単離された成熟糖タンパク質、ペプチド断片およびgCと他のタンパク質またはペプチド成分により形成される融合タンパク質を包含しうる。
【００３９】
本明細書で用いる用語「gD」は、US6遺伝子がコードするHSVエンベロープ糖タンパク質を意味する。HSV gD糖タンパク質はウイルスの宿主細胞向性（トロピズム）を規定するのを助ける多機能タンパク質である。本明細書で用いるgDは、単離された成熟糖タンパク質、ペプチド断片およびgDと他のタンパク質またはペプチド成分により形成される融合タンパク質を包含しうる。
【００４０】
本明細書で用いる用語「gE」は、US8遺伝子がコードするHSVエンベロープ糖タンパク質を意味する。HSV gE糖タンパク質はgIとヘテロ二量体を形成し、ビリオン輸送および宿主防衛モジュレーションに機能することが示されている。本明細書で用いるgEは、単離された成熟糖タンパク質、ペプチド断片およびgEと他のタンパク質またはペプチド成分により形成される融合タンパク質を包含しうる。
【００４１】
本明細書で使用する用語「不活化」HSVは宿主細胞に感染する能力がなくかつ妥当な動物モデルにおいて非感染性であるビリオン粒子を意味する。
【００４２】
本明細書で用いる用語「多価ワクチン」は1以上の抗原性決定因子を含有する単一ウイルス剤または複数株を含むワクチンを意味する。本明細書で用いる、多価ワクチンはHSV全ウイルスおよび／または複数のHSVウイルス表面抗原（ウイルス糖タンパク質gB、gC、gCおよびgEを含む）を含むものである。多価ワクチンはHSV-1およびHSV-2の両方由来の抗原で構築することができる。
【００４３】
本明細書で用いる用語「サブユニット」は単離されかつ一般に精製されたHSV糖タンパク質であって、個々に存在するかまたはさらにワクチン組成物を含有するナノエマルジョンと混合されたHSV糖タンパク質を意味する。サブユニットワクチン組成物は成熟ビリオン、細胞または細胞もしくはビリオンの溶解物を含まない。サブユニットワクチンに含まれるウイルス表面抗原を得る方法は、標準の遺伝子組換え技法および合成法を用いて標準精製プロトコルにより行うことができる。
【００４４】
Ｂ．本発明の一般的説明
本発明は、HSVウイルスに対する免疫応答を増進する組成物および方法を提供する。具体的に、本発明はナノエマルジョンを免疫エンハンサーおよびアジュバントとして用いて、HSV全ウイルスおよび／または表面抗原に対する免疫応答の効力をブーストしかつ増加する組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態においては、gB、gC、gDおよび／またはgEのリストからの少なくとも１つの単離されたHSV表面抗原を様々な割合でナノエマルジョンと混合する。
【００４５】
本発明に先立って、ナノエマルジョンの新規の広汎な免疫増進機能が他のウイルス病原体および抗原（インフルエンザ、B型肝炎表面抗原および呼吸器合胞体ウイルスを含む）に対する複数の免疫応答手法の活性化をもたらすことが観察された。しかしヒト用の認可ワクチンが存在するインフルエンザおよびB型肝炎ウイルスと異なり、HSVに対する現行ワクチンは存在しない。さらに、複数の研究は、HSV表面抗原を用いる伝統的なアジュバントの使用はヒトにおける有効なワクチンとして不十分であることを示している（Bernsteinら、2011；Coreyら、1999；Dasguptaら、2011；Ashleyら、1985）。
【００４６】
本発明はナノエマルジョンと組み合わせたHSV全ウイルスおよび／またはHSV表面抗原の新規の組み合わせに基づくものであって、免疫応答のTh1、Th2およびTh17手法を誘導することによりロバストかつ広範な免疫応答を提供することを意図し、HSVに対する最適な予防ワクチンをもたらしうる。
【００４７】
インフルエンザおよびB型肝炎ウイルス（HBV）を用いて行った実験は、単一ウイルス抗原と結合したナノエマルジョンは保護免疫応答の誘導が可能であることを実証した（Makidonら、2008；Hamoudaら、2010）。
【００４８】
本発明はHSVワクチンの従来のヒト臨床試験で観察された不十分な免疫応答に対処するために、ナノエマルジョンと組み合わせた全HSVウイルスおよび／または複数HSV表面抗原の新規製剤を提供する。HSVに対する最適なワクチンは急性ウイルス感染を予防しうるだけでなく、潜伏を阻止しかつ再発と二次感染の源となるウイルスの再活性化を減じうる。
【００４９】
本発明の開発過程で実施した実験は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）に加えて鼻腔内投与したナノエマルジョンは安全かつ有効なB型肝炎ワクチンであることを実証した。この粘膜ワクチンはTh1関連細胞免疫応答を誘導し、同時に中和化抗体を産生した。HBsAgナノエマルジョン混合物の単一経鼻免疫化は血清抗体の急速な誘導を産生し、これは現在投与される筋肉内ワクチンと比較し得た。さらに、抗体応答におけるアフィニティ成熟の実証があって、これはワクチンの潜在的な効力を予測させる（Makidonら、2008）。
【００５０】
他の新しく出現したワクチン保護効力の成分はT-ヘルパー-17（Th17）サイトカイン応答の誘導である。IL-17が病原体に対する通常の免疫応答に寄与するという実証をさらに利用してワクチン戦略との関連性が示されている（DeLyricaら、2009；Contiら、2009）。本発明の開発において、ナノエマルジョンによる粘膜の免疫化はTh1およびTh17免疫の活性化におけるアジュバント効果を産生しうる。ナノエマルジョンによる粘膜免疫化は生得免疫応答の活性化をもたらし、これが直接、Th1およびTh17細胞の誘導を助ける。この結果はさらに病原体、例えば単純ヘルペスウイルスに対する細胞免疫誘導のためのワクチン接種分野における、ナノエマルジョンの免疫を増進する特性の重要性を明らかにする（Bielinskaら、2010）。
【００５１】
本発明は免疫応答を増進する組成物と方法を提供する。具体的に、本発明はナノエマルジョンをHSVワクチン組成物にアジュバント効果を与える免疫エンハンサーとして使用する組成物と方法を開示する。
【００５２】
本発明の一実施形態においては、免疫増進性ナノエマルジョンと全HSVウイルス（未変性、組換え、または突然変異体のいずれか）を含むワクチン組成物が包含され、前記ナノエマルジョンはさらに水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物を含み、かつ前記HSVウイルスは好ましくはナノエマルジョン内に存在する。
【００５３】
他の実施形態においては、サブユニットワクチンをナノエマルジョンと混合した1以上のHSV表面抗原によって構築してもよい。得られるワクチン組成物中に一緒に加えてナノエマルジョンと混合した全4つの表面抗原、gB、gC、gDおよびgE、ならびにHSV全ウイルスを有することも全く可能である。他の実施形態においては、提示したワクチン用のナノエマルジョンと混合したgB、またはgDまたはそれらの抗原の組み合わせ、ならびにHSV全ウイルスを有してもよい。HSV表面抗原のいずれかの組み合わせ、ならびにHSV全ウイルスをナノエマルジョンと混合して得られるワクチン組成物を生産しうることも考えられる。ワクチン組成物は鼻腔内、膣内、または他の製薬上許容される経路（他の粘膜経路を含む）を経由して送達してもよい。
【００５４】
一実施形態において、ナノエマルジョンと混合した表面糖タンパク質、例えば、HSV-1およびHSV-2由来のgB、gC、gDおよびgE、および／またはHSV全ウイルスを利用して、多価サブユニットワクチンを構築することができる。抗原を様々な組み合わせで組み合わせて両方の型のヘルペスウイルスに対する有効なワクチンを作製することができる。
【００５５】
本発明のHSVワクチンは1以上のHSV表面抗原と組み合わせた全HSVウイルスを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明はHSV表面抗原とナノエマルジョンを含む組成物を提供する。
【００５６】
本発明の一実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンは少なくとも１つのHSV免疫源（HSV全ウイルスおよび／または単離されたHSV表面抗原）ならびに、約1000nm未満の平均径および(a)水相；(b)約1％油〜約80％油；(c)約0.1％〜約50％有機溶媒；(d)約0.001％〜約10％の界面活性剤もしくは洗剤；または(e)それらのいずれかの組み合わせを有する液滴を含むものである。本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンは有機溶媒を欠く。
【００５７】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンは少なくとも１つのHSV免疫源（HSV全ウイルスおよび／または単離されたHSV表面抗原）ならびに(a)水相；(b)約1％油〜約80％油；(c)約0.1％〜約50％有機溶媒；(d)約0.001％〜約10％の界面活性剤もしくは洗剤；および(e)少なくとも１つのHSV免疫原を含むものである。
【００５８】
ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンワクチン中に存在する各成分の量は治療用ナノエマルジョンおよび／またはナノエマルジョンHSVワクチンを意味する。
【００５９】
なおさらなる実施形態において、ナノエマルジョンはさらに四級アンモニウムを含有する化合物を含む。本発明は特定の四級アンモニウムを含有する化合物に限定されるものではない。様々な四級アンモニウムを含有する化合物を意図しており、限定されるものでないが、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化n-アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化n-アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、および塩化n-アルキルジメチルベンジルアンモニウムが含まれる。
【００６０】
特定の実施形態において、ナノエマルジョンはさらにカチオン系ハロゲン含有化合物を含む。本発明は特定のカチオン系ハロゲン含有化合物に限定されるものでない。様々なカチオン系ハロゲン含有化合物を意図しており、限定されるものでないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスホニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化およびハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。本発明は特定のハロゲン化物に限定されるものでない。様々なハロゲン化物を意図しており、限定されるものでないが、塩化物、フッ化物、臭化物、およびヨウ化物から成る群より選択されるハロゲン化物が含まれる。
【００６１】
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは、いずれかの製薬上許容される方法、例えば、鼻腔内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口(静脈内、皮内、筋肉内、皮下、嚢内、腹腔内)、肺、膣内、局部投与、局所投与、犠牲後に局所投与、粘膜投与、エアロゾル経由、または頬側経由または経鼻噴霧製剤を用いて被験者に投与することができる。
【００６２】
さらに本発明の他の実施形態において、本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは薬物耐性のあるHSV感染を治療および／または予防するのに有用である。例えば、感染は抗ウイルス薬、例えば、アシクロビルに耐性のHSV株であってもよい。一般に使われる抗ヘルペスウイルス薬に耐性のウイルス株の出現は臨床環境における、特に免疫無防備状態の患者における1つの問題である。本発明はこの当技術分野に存在する問題の対策となりうる。HSVは主に、チミジンキナーゼ（TK）をコードする遺伝子の突然変異の結果として耐性を生じるが、耐性はDNAポリメラーゼの突然変異からも生じうる。
【００６３】
さらに、ナノエマルジョンHSVワクチンは、いずれかの製薬上許容される投与剤形、例えば、分散液、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体投与剤形、または懸濁液に製剤することができる。さらにナノエマルジョンHSVワクチンは制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。さらに、ナノエマルジョンHSVワクチンは経皮送達系、例えばパッチであってもよくまたは加圧式もしくは空気式デバイス（すなわち、「遺伝子銃」）により投与してもよい。
【００６４】
被験者の免疫応答は、ナノエマルジョンHSVワクチンの投与後にHSV免疫源（例えば、HSV全ウイルスおよび／またはHSV表面抗原）に対する抗体の力価および／または存在を確定することにより測定して、前記免疫原に対する液性免疫応答を評価することができる。セロコンバージョンは免疫原に対する特異的抗体の発生を意味し、これを用いて保護免疫応答の存在を評価することができる。かかる抗体に基づく検出はしばしば、ウェスタンブロットまたは 酵素結合免疫吸着（ELISA）アッセイまたは赤血球凝集阻害アッセイ（HAI）を用いて測定される。当業者は適当な検出方法を容易に選択することができよう。
【００６５】
被験者の免疫応答を決定する他の方法は、細胞の免疫応答、例えば、免疫原特異的細胞応答、例えば、免疫原特異的細胞応答を通して、例えば、細胞傷害性Tリンパ球、または免疫原特異的リンパ球増殖アッセイを通して決定する方法である。さらに、病原体によるチャレンジを用いて、被験者における、またはよくやるのは、動物モデルにおける免疫応答を決定してもよい。当業者は被験者の免疫応答を決定する方法に精通していて、本発明はいずれかの特定の方法に限定されるものでない。
【００６６】
1. ウイルス不活化
ワクチンは、特にワクチンが全ウイルスから成る場合、治療および／または予防しようとする疾患を引き起こさないことを確実にするために不活化ウイルスから成る必要がある。換言すれば、ウイルスの不活化はそのワクチンが感染性粒子を含まないことを確実にする。手法にはウイルスのホルマリンによる不活化が含まれてきた。しかし、ホルマリン不活化ワクチンは疾患増進を示し、それには、疾患増進を阻止するために重要である免疫反応のゆがみ（skewed）を示すこと、および保護免疫反応に必須である成熟樹状細胞による初回刺激が含まれる。生弱毒ワクチンの使用はワクチンが最小の免疫原性しか無いことが示されているので成功が限られている。
【００６７】
本発明の方法と組成物において、ナノエマルジョンは全ウイルスおよび／またはウイルス抗原を不活化しかつアジュバント機能を果たすので非感染性かつ免疫原性のウイルスを提供する。代わりに、ウイルス（全または抗原）を不活化した後にナノエマルジョンと組み合わせてもよい。ウイルス不活化の化学的方法の例には、限定されるものでないが、ホルマリンまたはβ-プロピオラクトン（β-PL）が含まれ、ウイルス不活化の物理的方法の例には、熱もしくは照射を用いるもの、または非感染性粒子を作製する分子遺伝学的手法によるものが含まれる。ナノエマルジョンのワクチン候補との単純な混合は粘膜と全身性両方の免疫応答を生じることが示されている。HSVビリオン粒子のナノエマルジョンとの混合は液滴の油コア中に明確な抗原粒子を生じる。抗原はコア内に組込まれ、これにより抗原はフリーな形になることができて正常な抗原コンフォーメーションを促進するのである。
【００６８】
C. ナノエマルジョンHSVワクチン
1. HSV免疫源
本発明のナノエマルジョンHSVワクチン中に存在するHSV免疫原は全HSVウイルス（HSV-1またはHSV-2）であってもよく、HSV-1およびHSV-2の未変性、組換え、および突然変異株が含まれる。本発明の一実施形態において、そのHSVウイルスは1以上の抗ウイルス薬に耐性、例えばアシクロビルに耐性であってもよい。いずれの公知のHSV株を本発明のワクチンに用いてもよい。
【００６９】
有用なHSV株の例には、限定されるものでないが、ATCCに受託されたHSV株、例えば、(1) HSV株HF（ATCCVR-260；ヒトヘルペスウイルス1）；(2) HSV株MacIntyre（ATCC VR-539；ヒトヘルペスウイルス1）；(3) HSV株MS（ATCC VR-540；ヒトヘルペスウイルス2）；(4) HSV株F（ATCC VR-733；ヒトヘルペスウイルス1）；(5) HSV株G（ATCC VR-734；ヒトヘルペスウイルス2）；(6) HSV株MP（ATCC VR-735；ヒトヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス1型の突然変異株）；(7) HSVの突然変異株（ATCC VR-1383；ヒトヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス1型の突然変異株）；(8) HSVステインKOS（ATCC VR-1493；ヒトヘルペスウイルス1；MRAの存在のもとでの継代により誘導してマイコプラズマ汚染物を除去したATCC VR-1487）； (9) HSV株 ATCC-2011-1（ATCC VR-1778；ヒトヘルペスウイルス1）；(10) HSV株ATCC-2011-2（ATCC VR-1779；ヒトヘルペスウイルス2）；(11) HSV株ATCC-2011-4（ATCC VR-1781；ヒトヘルペスウイルス2）；(12) HSV株 A5C（ATCC VR-2019；ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）；供給源：HSV-1（17ts）とHSV-2（GPG）の親株の交雑）；(13) HSV株D4E3 （ATCC VR-2021；ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）； 供給源：HSV-1 （KOStsE6）とHSV-2 （186tsB5）の親株の交雑）；(14) HSV株 C7D（ATCCVR-2022；ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）； 供給源：HSV-1（HFEMtsN102）とHSV-2（186）の親株の交雑）；(15) HSV株 D3E2（ATCC VR-2023； ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）；供給源：HSV-1（KOStsE6）とHSV-2（186tsB5）の親株の交雑）；(16) HSV株 C5D（ATCC VR-2024；ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）；供給源：HSV-1（HFEMtsN102）とHSV-2（186）の親株の交雑）；(17) HSV株D5E1（ATCCVR-2025；ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）；供給源：HSV-1（KOStsE6）とHSV-2（186tsB5）の親株の交雑）；および(18) HSV株 D1E1（ATCCVR-2026；ヒトヘルペスウイルス1 x 2（組換え）；供給源：HSV-1（KOStsE6）とHSV-2（186tsB5）の親株の交雑）が含まれる。
【００７０】
本発明のナノエマルジョンHSVワクチン中に存在するHSV免疫原は1以上のHSV表面抗原であって、表面抗原はHSV-1およびHSV-2ウイルスのエンベロープ由来のタンパク質、糖タンパク質およびペプチド断片であってもよい。好ましいHSV表面抗原はHSV-1またはHSV-2いずれか由来の糖タンパク質sgB、gC、gDおよびgEである。HSV表面抗原は一般に感染細胞培養から単離されたウイルスより抽出されるか、または合成によりもしくは組換えDNAの方法を用いて作製される。このHSV表面抗原を化学的、遺伝的または酵素的技法により改変して融合タンパク質、ペプチド、または断片を得ることができる。HSV表面抗原は公知のHSV株から得ることができ、それには限定されるものでないが上に掲げたウイルス株が含まれる。
【００７１】
本発明のワクチン中に存在するHSV免疫原はまた、1以上のHSV表面抗原と組み合わせた全HSVウイルスであってもよい。
【００７２】
いずれの好適量のHSV免疫源を本発明のナノエマルジョンHSVワクチンに用いてもよい。例えば、ナノエマルジョンHSVワクチンは約100μg未満のHSV免疫源（全HSV免疫源であって、HSV免疫源当たりではない）を含んでもよい。本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンは約90μg未満、約80μg未満、約70μg未満、約60μg未満、約50μg未満、約40μg未満、約30μg未満、約20μg未満、約15μg未満、約10μg未満、約9μg未満、約8μg未満、約7μg未満、約6μg未満、約5μg未満、約4μg未満、約3μg未満、約2μg未満、または約1μg未満のHSV免疫源（合計HSV免疫源であってHSV免疫源当たりではない）を含んでもよい。
【００７３】
本発明の他の実施形態において、本発明のHSVワクチンは約1.0 x 105pfu（プラーク形成ユニット）〜約1.0 x 108pfu、およびそれらの間のいずれかの量のHSVウイルスまたは抗原を含む。このHSVウイルスまたは抗原はナノエマルジョンアジュバントの存在により不活化される。例えば、HSVワクチンは約1.0x105、1.1x105、1.2x105、1.3x105、1.4x105、1.5x105、1.6x105、1.7x105、1.8x105、1.9x105、2.0x105、2.1x105、2.2x105、2.3x105、2.4x105、2.5x105、2.6x105、2.7x105、2.8x105、2.9x105、3.0x105、3.1x105、3.2x105、3.3x105、3.4x105、3.5x105、3.6x105、3.7x105、3.8x105、3.9x105、4.0x105、4.1x105、4.2x105、4.3x105、4.4x105、4.5x105、4.6x105、4.7x105、4.8x105、4.9x105、5.0x105、5.5x105、6.0x105、6.5x105、7.0x105、7.5x105、8.0x105、8.5x105、9.0x105、9.5x105、1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106、7.0x106、7.5x106、8.0x106、8.5x106、9.0x106、9.5x106、1.0x107、1.5x107、2.0x107、2.5x107、3.0x107、3.5x107、4.0x107、4.5x107、5.0x107、5.5x107、6.0x107、6.5x107、7.0x107、7.5x107、8.0x107、8.5x107、9.0x107、9.5x107、1.0x108pfuのHSVウイルスを含みうる。
【００７４】
本発明の他の実施形態において、本発明のHSVワクチンはこのワクチン中に存在しない他の少なくとも１つのHSV株に対して交差反応性（または1以上のHSV株に対して交差反応性）である。例えば、本発明によるナノエマルジョンHSVワクチンはHSV-1ウイルスまたはウイルス粒子を含むものであってかつHSV-2に対して交差反応性であってもよい。当業者には公知であるように、交差反応性は、1）ELISAの方法を用いて、ワクチン接種した動物または個人からの血清が投与したワクチンに使われなかった株に対する抗体を生産しうるかを見ること；2）免疫細胞が投与したワクチンに使われなかった株を用いてin vitroで刺激された場合にサイトカインを生産しうることにより測定することができる。交差保護は、1つの株でワクチン接種した動物の血清中の抗体が、投与されたワクチンに使われてない他のウイルスの感染性を中和しうるときに、in vitroで測定することができる。
【００７５】
2.ナノエマルジョン 
以上記載したように、本発明によるナノエマルジョンHSVワクチンを作るために少なくとも１つのHSV免疫原と組み合わせるナノエマルジョンは、少なくとも１種の溶媒、少なくとも１種の油、および少なくとも１種の界面活性剤を含むものである。
【００７６】
i.水相
水相は、限定されるものでないが、水（例えば、H2O、蒸留水、精製水、注射用水、脱イオン水、水道水）および溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液）を含むいずれの型の水相を含んでもよい。特定の実施形態において、水相は約4〜10、好ましくは約6〜8のpHの水を含む。水は脱イオン水（以下「DiH2O」と記す）であってもよい。いくつかの実施形態において、水相はリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。水相はさらに無菌でかつパイロジェンを含まないものであってもよい。
【００７７】
ii.溶媒
本発明のナノエマルジョンはまた、特定の溶媒、例えば、有機溶媒に限定されるものでない。様々な溶媒が意図されていて、限定されるものでないが、アルコール（例えば、限定されるものでないが、メタノール、エタノール、プロパノール、および オクタノール）、グリセリン、ポリエチレングリコール、および有機リン酸系の溶媒が含まれる。
【００７８】
本発明のナノエマルジョンHSVワクチン中の有機溶媒には、限定されるものでないが、C1〜C12アルコール、ジオール、トリオール、ジアルキルリン酸、トリアルキルリン酸、例えば、トリ-n-ブチルリン酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明の一態様において、有機溶媒は、非極性溶媒、極性溶媒、プロトン溶媒、または非プロトン溶媒から選択されるアルコールである。
【００７９】
ナノエマルジョンHSVワクチンに好適な有機溶媒には、限定されるものでないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、中鎖トリグリセリド、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸、n-ブタノール、ブチレングリコール、調香用アルコール、イソプロパノール、n-プロパノール、ギ酸、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、工業用変性アルコール、トリアセチン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ギ酸、それらの半合成誘導体、およびそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００８０】
iii.油相
本発明のナノエマルジョンHSVワクチン中の油はいずれの化粧上または製薬上許容される油であってもよい。油は、揮発性または不揮発性であってよく、動物油、植物油、天然油、合成油、炭化水素油、シリコーン油、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせから選んでもよい。
【００８１】
本発明のナノエマルジョンは特定の油に限定されるものでない。様々な油を意図しており、限定されるものでないが、ダイズ、アボカド、スクワレン、オリーブ、キャノーラ、トウモロコシ、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、魚、香料、および水溶性ビタミンが含まれる。好適な油には、限定されるものでないが、鉱油、スクアレン油、香油、シリコンオイル、精油、水不溶性ビタミン、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、アントラニル酸メチル、オクタン酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール・セトールズ（neopentyl glycol dicarpate cetols）、Ceraphyls(登録商標)、オレイン酸デシル、アジピン酸ジイソプロピル、乳酸C12〜15アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ネオペンタン酸イソステアリル、乳酸ミリスチル、ステアロイルステアリン酸イソセチル、ステアロイルステアリン酸オクチルドデシル、炭化水素油、イソパラフィン、液状パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガン(Argan)油、アブラナ油、チリ(Chile)油、ココナツ油、コーン油、綿実油、アマニ油、グレープ種子油、カラシ油、オリーブ油、ヤシ油、パーム核油、ラッカセイ油、パイン種子油、ポピー種子油、パンプキン種子油、米ぬか油、ベニバナ油、茶油、トリュフ油、植物油、アプリコット(核)油、ホホバ油(simmondsia chinensis種子油)、グレープ種子油、マカダミア油、麦芽油、アーモンド油、ナタネ油、ヒョウタン油、ダイズ油、ゴマ油、へーゼルナッツ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大麻油、ボア(Bois)油、クキナット(Kuki nut)油、アボカド油、クルミ油、魚油、ベリー油、全てのスパイス油、ジュニパー油、種子油、アーモンド種子油、アニス種子油、セロリ種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、葉油、バジル葉油、ベイ葉油、シナモン葉油、コモンセージ葉油、ユーカリ葉油、レモングラス葉油、メラレウカ葉油、オレガノ葉油、パチュリ葉油、ペパーミント葉油、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント葉油、ティーツリー葉油、タイム葉油、ウインターグリーン葉油、花油、カモミール油、クラリーセージ油、チョウジ油、ゼラニウム花油、ヒソップ花油、ジャスミン花油、ラベンダー花油、マヌカ花油、マーホラム(Marhoram)花油、オレンジ花油、ローズ花油、イランイラン花油、樹皮油、桂皮油、シナモン樹皮油、サッサフラス樹皮油、木油、クスノキ木油、セダーウッド木油、シタン木油、ビャクダン木油、根茎(ショウガ)木油、樹脂油、オリバナム油、ミルラ油、果皮油、ベルガモット果皮油、グレープフルーツ果皮油、レモン果皮油、ライム果皮油、オレンジ果皮油、タンジェリン果皮油、根茎油、吉草油、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、それらの半合成誘導体、およびそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００８２】
油はさらに揮発性シリコーン成分などのシリコーン成分を含んでもよく、これはシリコーン成分中の唯一の油であってもよく、または他のシリコーンおよび非シリコーン、揮発性および非揮発性油と組み合わせであってもよい。好適なシリコーン成分には、限定されるものでないが、メチルフェニルポリシロキサン、シメチコン、ジメチコン、フェニルトリメチコン(またはその有機修飾されたバージョン)、ポリマーシリコーンのアルキル化誘導体、セチルジメチコン、ラウリルトリメチコン、ポリマーシリコーンのヒドロキシル化誘導体、例えば、ジメチコノール、揮発性シリコーン油、環状および直鎖シリコーン、シクロメチコン、シクロメチコンの誘導体、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、揮発性直鎖ジメチルポリシロキサン、イソヘキサデカン、イソエイコサン、イソテトラコサン、ポリイソブテン、イソオクタン、イソドデカン、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００８３】
揮発性油が有機溶媒であってよく、または他の有機溶媒に加えて揮発性油が存在してもよい。好適な揮発性油には、限定されるものでないが、テルペン、モノテルペン、セスキテルペン、駆風薬、アズレン、メントール、カンファー、ツジョン、チモール、ネロール、リナロール、リモネン、ゲラニオール、ペリリルアルコール、ネロリドール、ファルネソール、イランゲン、ビサボロール、ファルネセン、アスカリドール、ケノポジ油、シトロネラール、シトラール、シトロネロール、カマズレン、セイヨウノコギリソウ、グアイアズレン、カモミール、半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００８４】
本発明の一態様において、シリコーン成分中の揮発性油は油相中の油と異なる。
【００８５】
iv.界面活性剤
いくつかの実施形態において、ナノエマルジョンはさらに界面活性剤を含む。本発明は、特定の界面活性剤に限定されるものでない。様々な界面活性剤を意図しており、それには、限定されるものでないが、非イオンおよびイオン界面活性剤（例えば、TRITONX-100；TWEEN20；およびTYLOXAPOL）が含まれる。
【００８６】
本発明中のナノエマルジョンHSVワクチン中の界面活性剤は、製薬上許容されるイオン界面活性剤、製薬上許容される非イオン界面活性剤、製薬上許容されるカチオン界面活性剤、製薬上許容されるアニオン界面活性剤、または製薬上許容される両性イオン界面活性剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００８７】
一実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンは塩化セチルピリジニウム（CPC）であるカチオン界面活性剤を含む。ナノエマルジョンHSVワクチン中のCPCは約 5.0％未満かつ約0.001％超の濃度を有してもよく、またはさらに、約5％未満、約4.5％未満、約4.0％未満、約3.5％未満、約3.0％未満、約2.5％未満、約2.0％未満、約1.5％未満、約1.0％未満、約0.90％未満、約0.80％未満、約0.70％未満、約0.60％未満、約0.50％未満、約0.40％未満、約0.30％未満、約0.20％未満、約0.10％未満、約0.001％超、約0.002％超、約0.003％超、約0.004％超、約0.005％超、約0.006％超、約0.007％超、約0.008％超、約0.009％超、または約0.010％超の濃度を有してもよい。
【００８８】
さらなる実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンは非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート界面活性剤を含み、これはポリソルベート80またはポリソルベート20であってもよく、そして約0.01％〜約5.0％、または約0.1％〜約3％の濃度のポリソルベート80を有してもよい。ナノエマルジョンHSVワクチンはさらに少なくとも１種の保存剤を含んでもよい。本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンはキレート剤を含む。
【００８９】
例示の有用な界面活性剤は、特に参照により組み込まれる"Applied Surfactants： Principles and Applications", Tharwat F. Tadros、Copyright 8 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA、Weinheim ISBN： 3-527-30629-3に記載されている。
【００９０】
さらに、界面活性剤は、製薬上許容されるイオンポリマー界面活性剤、製薬上許容される非イオンポリマー界面活性剤、製薬上許容されるカチオンポリマー界面活性剤、製薬上許容されるアニオンポリマー界面活性剤、または製薬上許容される両性イオンポリマー界面活性剤であってよい。ポリマー界面活性剤の例には、限定されるものでないが、複数種（少なくとも1種）のポリエチレンオキシド（PEO）側鎖を有するポリ（メチルメタクリレート）主鎖のグラフト共重合体、ポリヒドロキシステアリン酸、アルコキシル化したアルキルフェノールホルムアルデヒド縮合物、脂肪酸疎水性物質を有するポリアルキレングリコール修飾されているポリエステル、ポリエステル、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００９１】
界面活性の薬剤または界面活性剤は、極性またはイオンの親水性部分と結合した、炭素原子8〜18個を含有する非極性疎水性部分（通常、直鎖または分枝鎖の炭化水素またはフッ化炭素鎖）から成る両親媒性分子である。親水性部分は、非イオン、イオン、または両性イオンであってよい。水中において炭化水素鎖は水分子と弱く相互作用し、極性またはイオン性の頭部基は双極子または水分子とイオン-双極子相互作用を介して強く相互作用する。親水基の性質に基づいて、界面活性剤はアニオン、カチオン、両性イオン、非イオン、およびポリマー界面活性剤に分類される。
【００９２】
好適な界面活性剤には、限定されるものでないが、9〜10ユニットのエチレングリコールを含むエトキシ化ノニルフェノール、8ユニットのエチレングリコールを含むエトキシ化ウンデカノール、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、エトキシ化水素化リシン油、ラウリル硫酸ナトリウム、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのジブロック共重合体、エチレンオキシド-プロピレンオキシドブロック共重合体、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとをベースにした四官能性ブロック共重合体、グリセリルモノエステル、カプリン酸グリセリル、カプリル酸グリセリル、コカ酸グリセリル、エルカ酸グリセリル、ヒドロキシステアリン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、ラノリン脂肪酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、PABAグリセリル、パルミチン酸グリセリル、リシノール酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、チオグリコール酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジオレイン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、セスキオレイン酸グリセリル、ステアリン酸乳酸グリセリル、ポリオキシエチレンセチル/ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンコレステロールエーテル、ポリオキシエチレンラウレートもしくはジラウレート、ポリオキシエチレンステアレートもしくはジステアレート、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ステロイド、コレステロール、β-シトステロール、ビサボロール、アルコールの脂肪酸エステル、イソプロピルミリステート、アリファチ(Aliphati)-イソプロピルn-ブチレート、n-ヘキサン酸イソプロピル、n-デカン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化酸、アルコキシル化アミド、アルコキシル化糖誘導体、天然油およびワックスのアルコキシル化誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、ノノキシノール-14、PEG-8ラウレート、PEG-6コカミド、PEG-20メチルグルコースセスキステアレート、PEG40ラノリン、PEG-40ヒマシ油、PEG-40硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪エーテル、グリセリルジエステル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、およびポリオキシエチレンラウリルエーテル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、またはそれらの混合物が含まれる。
【００９３】
さらなる好適な界面活性剤には、限定されるものでないが、非イオン脂質、例えば、ラウリン酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、ジラウリン酸グリセリル、ジミリスチン酸グリセリル、それらの半合成誘導体、およびそれらの混合物が含まれる。
【００９４】
さらなる実施形態において、界面活性剤は、約2〜約100基のポリオキシエチレン頭部基を有するポリオキシエチレン脂肪エーテル、または構造R5-(OCH2CH2)y-OH［式中、R5は、炭素原子約6〜約22個を有する分枝または非分枝のアルキル基であり、yは、約4〜約100であり、好ましくは約10〜約100である］を有するアルコキシル化アルコールである。好ましくは、アルコキシル化アルコールはR5がラウリル基であり、yが23の平均値を有する種である。
【００９５】
異なる一実施形態において、界面活性剤は、ラノリンアルコールのエトキシ化誘導体であるアルコキシ化アルコールである。好ましくは、ラノリンアルコールのエトキシ化誘導体は、平均エトキシ化値が10であるラノリンアルコールのポリエチレングリコールエーテルであるラネス-10である。
【００９６】
非イオン界面活性剤には、限定されるものでないが、エトキシ化界面活性剤、エトキシ化アルコール、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシ化脂肪酸、エトキシ化モノアルコールアミド、エトキシ化ソルビタンエステル、エトキシ化脂肪アミノ、エチレンオキシド-プロピレンオキシド共重合体、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、ノノキシノール9、ビス(ポリエチレングリコールビス[イミダゾイルカルボニル])、Brij(登録商標) 35、Brij(登録商標) 56、Brij(登録商標) 72、Brij(登録商標) 76、Brij(登録商標) 92V、Brij(登録商標) 97、Brij(登録商標)、58P、クレモフォール(登録商標)EL、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デシルα-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデカノイル-N-メチルグルカミド、n-ドデシルα-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、n-ヘキサデシルβ-D-マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal CA-630、Igepal CA-630、メチル-6-O-(N-ヘプチルカルバモイル)-α-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、N-ノナノイル-N-メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-β-D-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルW-1、ポリオキシエチレン10トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン100ステアレート、ポリオキシエチレン20イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン20オレイルエーテル、ポリオキシエチレン40ステアレート、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシエチレン8ステアレート、ポリオキシエチレンビス(イミダゾリルカルボニル)、ポリオキシエチレン25プロピレングリコールステアレート、キラヤ樹皮からのサポニン、Span(登録商標) 20、Span(登録商標)40、Span(登録商標)60、Span(登録商標)65、Span(登録商標)80、Span(登録商標)85、タージトール15-S-12型、タージトール15-S-30型、タージトール15-S-5型、タージトール15-S-7型、タージトール15-S-9型、タージトールNP-10型、タージトールNP-4型、タージトールNP-40型、タージトールNP-7型、タージトールNP-9、タージトール型、タージトールTMN-10型、タージトールTMN-6型、テトラデシル-β-D-マルトシド、テトラエチレングリコー���モノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、TritonX-207、Triton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-114、Triton(登録商標)X-165、Triton(登録商標)X-305、Triton(登録商標)X-405、Triton(登録商標)X-45、Triton(登録商標)X-705-70、TWEEN(登録商標)20、TWEEN(登録商標)21、TWEEN(登録商標)40、TWEEN(登録商標)60、TWEEN(登録商標)61、TWEEN(登録商標)65、TWEEN(登録商標)80、TWEEN(登録商標)81、TWEEN(登録商標)85、チロキサポール、n-ウンデシルβ-D-グルコピラノシド、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００９７】
さらに、非イオン界面活性剤はポロキサマーであってよい。ポロキサマーはポリオキシエチレンのブロック、次いでポリオキシプロピレンのブロック、次いでポリオキシエチレンのブロックから作られたポリマーである。ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのユニットの平均数はポリマーの番号に基づいて変化する。例えば、最も小さいポリマーであるポロキサマー101は、平均2ユニットのポリオキシエチレンによるブロック、平均16ユニットのポリオキシプロピレンによるブロック、次いで平均2ユニットのポリオキシエチレンによるブロックから成る。ポロキサマーは無色の液およびペーストから白色固体の範囲にある。化粧品およびパーソナルケア製品において、ポロキサマーは皮膚クレンザー、入浴製品、シャンプー、ヘアコンディショナー、うがい液、アイメーキャップ除去剤、ならびに他の皮膚および毛髪製品の製剤に用いられる。ポロキサマーの例には、限定されるものでないが、ポロキサマー101、ポロキサマー105、ポロキサマー108、ポロキサマー122、ポロキサマー123、ポロキサマー124、ポロキサマー181、ポロキサマー182、ポロキサマー183、ポロキサマー184、ポロキサマー185、ポロキサマー188、ポロキサマー212、ポロキサマー215、ポロキサマー217、ポロキサマー231、ポロキサマー234、ポロキサマー235、ポロキサマー237、ポロキサマー238、ポロキサマー282、ポロキサマー284、ポロキサマー288、ポロキサマー331、ポロキサマー333、ポロキサマー334、ポロキサマー335、ポロキサマー338、ポロキサマー401、ポロキサマー402、ポロキサマー403、ポロキサマー407、ポロキサマー105ベンゾエート、およびポロキサマー182ジベンゾエートが含まれる。
【００９８】
好適なカチオン界面活性剤には、限定されるものでないが、四級アンモニウム化合物、塩化アルキルトリメチルアンモニウム化合物、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム化合物、カチオンハロゲン含有化合物、例えば、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨウ素酸塩、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、グリニャール試薬T、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、N,N',N'-ポリオキシエチレン(10)-N-タロウ-1,3-ジアミノプロパン、臭化トンゾニウム、臭化トリメチル(テトラデシル)アンモニウム、1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール、1-デカナミニウム、N-デシル-N,N-ジメチル-クロリド、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化2-(2-(p-(ジイソブチル)クレゾスキシ(cresosxy))エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化2-(2-(p-(ジイソブチル)フェノキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキル1または3ベンジル-1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリニウム、塩化アルキルビス(2-ヒドロキシエチル)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルデメチル(demethyl)ベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチル 3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(100％ C12)、塩化アルキルジメチル3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(50％ C14、40％ C12、10％ C16)、塩化アルキルジメチル 3,4-ジクロロベンジルアンモニウム(55％ C14、23％ C12、20％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(100％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(100％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(41％ C14、28％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(47％ C12、18％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(55％ C16、20％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(58％ C14、28％ C16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(60％ C14、25％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(61％ C11、23％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(61％ C12、23％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(65％ C12、25％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(67％ C12、24％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(67％ C12、25％ C14)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(90％ C14、5％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(93％ C14、4％ C12)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(95％ C16、5％ C18)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジデシルジメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(C12-16)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム(C12-18)、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルベンジルアンモニウム、���化アルキルジメチルジメチベンジルアンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム(90％ C14、5％ C16、5％ C12)、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム(ダイズ油の脂肪酸中としてのアルキル基およびアルケニル基の混合)、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム(60％ C14)、塩化アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウム(50％ C12、30％ C14、17％ C16、3％ C18)、塩化アルキルトリメチルアンモニウム(58％ C18、40％ C16、1％ C14、1％ C12)、塩化アルキルトリメチルアンモニウム(90％ C18、10％ C16)、塩化アルキルジメチル(エチルベンジル)アンモニウム(C12-18)、塩化ジ-(C8-10)-アルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキルメチルベンジルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジイソデシルジメチルアンモニウム、塩化ジオクチルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルビス(2-ヒドロキシエチル)オクチル水素アンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ドデシルカルバモイルメチルジネチル(dinethyl)ベンジルアンモニウム、塩化ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウム、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリス(2-ヒドロキシエチル)-s-トリアジン、塩化ミリスタルコニウム(および)クアット(Quat) RNIUM 14、塩化N,N-ジメチル-2-ヒドロキシプロピルアンモニウムポリマー、塩化n-テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム一水和物、塩化オクチルデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルドデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウム、オキシジエチレンビス(塩化アルキルジメチルアンモニウム)、塩化トリメトキシシリプロピルジメチルオクタデシルアンモニウム、トリメトキシシリルクアット、塩化トリメチルドデシルベンジルアンモニウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００９９】
例示のカチオン系ハロゲン含有化合物には、限定されるものでないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスホニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム、またはハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。いくつかの特定の実施形態において、好適なカチオンハロゲン含有化合物には、限定されるものでないが、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルベンジルジメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム(CPB)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム、臭化セチルトリブチルホスホニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、および臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムが含まれる。特に好ましい実施形態において、カチオンハロゲン含有化合物はCPCであるが、本発明の組成物は、特定のカチオン含有化合物との製剤に限定されるものではない。
【０１００】
好適なアニオン界面活性剤には、限定されるものでないが、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、ウシまたはヒツジ胆汁、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンN-オキシド、ドキュセートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、合成グリココール酸ナトリウム塩水和物、合成グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム、グリコリトコール酸3-サルフェート二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシン溶液、N-ラウロイルサルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール溶液、Niaproof 4、Type 4、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、1-ブタンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-ドデカンスルホン酸ナトリウム、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム無水物、1-ノナンスルホン酸ナトリウム、1-プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、2-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム無水物、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム無水物、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸3-硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、Trizma(登録商標)ドデシル硫酸、TWEEN(登録商標)80、ウルソデオキシコール酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１０１】
好適な両性イオン界面活性剤には、限定されるものでないが、N-アルキルベタイン、ラウリルアミンド(amindo)プロピルジメチルベタイン、アルキルジメチルグリシネート(glycinate)、N-アルキルアミノプロピオネート、CHAPS、最小98％(TLC)、CHAPS、Sigma Ultra、最小98％(TLC)、CHAPS、電気泳動用、最小98％(TLC)、CHAPSO、最小98％、CHAPSO、Sigma Ultra、CHAPSO、電気泳動用、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、Sigma Ultra、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホネート、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホネート分子内塩、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホネート、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンはカチオン界面活性剤を含み、カチオン界面活性剤は塩化セチルピリジニウムであってよい。本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンはカチオン界面活性剤を含み、カチオン界面活性剤の濃度は、約5.0％未満でありかつ約0.001％を超える。本発明のさらに他の一実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチンはカチオン界面活性剤を含み、カチオン界面活性剤の濃度は、約5％未満、約4.5％未満、約4.0％未満、約3.5％未満、約3.0％未満、約2.5％未満、約2.0％未満、約1.5％未満、約1.0％未満、約0.90％未満、約0.80％未満、約0.70％未満、約0.60％未満、約0.50％未満、約0.40％未満、約0.30％未満、約0.20％未満、約0.10％未満からなる群から選択される。さらにナノエマルジョンワクチン中のカチオン薬剤の濃度は、約0.002％超、約0.003％超、約0.004％超、約0.005％超、約0.006％超、約0.007％超、約0.008％超、約0.009％超、約0.010％超、または約0.001％超である。一実施形態において、ナノエマルジョン中のカチオン薬剤の濃度は、約5.0％未満であり、約0.001％超である。
【０１０３】
本発明の他の実施形態において、ナノエマルジョンワクチンは少なくとも1種のカチオン界面活性剤および少なくとも1種の非カチオン界面活性剤を含んでいる。非カチオン界面活性剤は、非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート（Tween）、例えば、ポリソルベート80またはポリソルベート20である。一実施形態において、非イオン界面活性剤は約0.01％〜約5.0％の濃度で存在する、または非イオン界面活性剤は約0.1％〜約3％の濃度で存在する。本発明のさらに他の一実施形態において、ナノエマルジョンワクチンは、非イオン界面活性剤と組み合わせて約0.01％から約2％までの濃度で存在するカチオン界面活性剤を含むものである。
【０１０４】
3. さらなる成分
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンにおける使用に好適なさらなる化合物には、限定されるものでないが、1種または複数種の溶媒、例えば、有機リン酸ベースの溶媒、増量剤、着色剤、製薬上許容される賦形剤、保存剤、pH調整剤、バッファー、キレート剤などが含まれる。さらなる化合物を予め乳化したナノエマルジョンワクチン中に混合してもよく、またはさらなる化合物を乳化すべき元の混合物に加えてもよい。ある特定のこれらの実施形態においては、その使用直前に、1種または複数種のさらなる化合物を既存のナノエマルジョン組成物中に混合する。
【０１０５】
本発明のナノエマルジョンHSVワクチン中の好適な保存剤には、限定されるものでないが、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン、イミダゾリジニル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、ブロノポール、クロロクレゾール、パラベンエステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、α-トコフェロール、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。他の好適な保存剤には、限定されるものでないが、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン(ビス(p-クロロフェニルジグアニド)ヘキサン)、クロルフェネシン(3-(4-クロロフェノキシ)-プロパン-1,2-ジオール)、カトンCG(メチルおよびメチルクロロイソチアゾリノン)、パラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルヒドロベンゾエート)、フェノキシエタノール(2-フェノキシエタノール)、ソルビン酸（ソルビン酸カリウム、ソルビン酸）、フェノニップ(フェノキシエタノール、メチル、エチル、ブチル、プロピルパラベン)、Phenoroc(フェノキシエタノール0.73％、メチルパラベン0.2％、プロピルパラベン0.07％)、Liquipar油（イソプロピル、イソブチル、ブチルパラベン）、Liquipar PE(70％フェノキシエタノール、30％liquipar油)、Nipaguard MPA（ベンジルアルコール（70％）、メチルおよびプロピルパラベン）、Nipaguard MPS(プロピレングリコール、メチルおよびプロピルパラベン)、Nipasept(メチル、エチル、およびプロピルパラベン)、Nipastat(メチル、ブチル、エチル、およびプロピルパラベン)、Elestab388（プロピレングリコール中のフェノキシエタノール＋クロルフェネシンおよびメチルパラベン）、ならびに、Killitol（7.5％クロルフェネシン、および7.5％メチルパラベン）が含まれる。
【０１０６】
ナノエマルジョンHSVワクチンはさらに、少なくとも1種のpH調節剤を含んでもよい。本発明のナノエマルジョン中の好適なpH調整剤には、限定されるものでないが、ジエタノールアミン、乳酸、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、それらの半合成誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１０７】
さらに、ナノエマルジョンHSVワクチンはキレート剤を含んでもよい。本発明の一実施形態において、キレート剤は約0.0005％〜約0.72％の量で存在する。キレート剤の例には、限定されるものでないが、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、フィチン酸、ポリリン酸、クエン酸、グルコン酸、酢酸、乳酸、およびジメルカプロールが含まれ、好ましいキレート剤はエチレンジアミン四酢酸である。
【０１０８】
ナノエマルジョンHSVワクチンは、バッファー剤、例えば、製薬上許容されるバッファー剤を含みうる。バッファー剤の例には、限定されるものでないが、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、≧99.5％（NT）、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、≧99.0％（GC）、L-(＋)-酒石酸、≧99.5％（T）、ACES、≧99.5％（T）、ADA、≧99.0％（T）、酢酸、≧99.5％（GC/T）、酢酸、発光用、≧99.5％（GC/T）、酢酸アンモニウム溶液、分子生物学用、H2O中約5M、酢酸アンモニウム、発光用、99.0％（T）（乾燥物質に対して計算、T）、重炭酸アンモニウム、≧99.5％（T）、クエン酸二アンモニウム、≧99.0％（T）、ギ酸アンモニウム溶液、H2O中10M、ギ酸アンモニウム、≧99.0％（T）（乾燥物質に対して計算、NT）、シュウ酸アンモニウム一水和物、≧99.5％(RT)、リン酸二アンモニウム、H2O中2.5M、リン酸二アンモニウム、≧99.0％（T）、リン酸一アンモニウム溶液、H2O中2.5M、リン酸一アンモニウム≧99.5％（T）、リン酸水素アンモニウムナトリウム四水和物、≧99.5％（NT）、硫酸アンモニウム溶液、分子生物学用、H2O中3.2M、酒石酸二アンモニウム溶液、H2O中2M(20℃で無色の溶液)、酒石酸二アンモニウム、≧99.5％（T）、BES緩衝食塩水、分子生物学用、2×濃度、BES、≧99.5％（T）、BES、分子生物学用、≧99.5％（T）、BICINEバッファー溶液、分子生物学用、H2O中1M、BICINE≧99.5％（T）、BIS-TRIS、≧99.0％（NT）、重炭酸塩バッファー溶液、>0.1M Na2CO3、>0.2M NaHCO3、ホウ酸、≧99.5％（T）、ホウ酸、分子生物学用、≧99.5％（T）、CAPS、≧99.0％(TLC)、CHES、≧99.5％（T）、酢酸カルシウム水和物、≧99.0％（乾燥物質に対して計算、KT）、炭酸カルシウム、沈降物、≧99.0％（KT）、クエン酸三カルシウム四水和物、≧98.0％（乾燥物質に対して計算、KT）、クエン酸濃縮液、分子生物学用、H2O中1M、クエン酸、無水、≧99.5％（T）、クエン酸、発光用、無水、≧99.5％（T）、ジエタノールアミン、≧99.5％（GC）、EPPS、≧99.0％（T）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物、分子生物学用、≧99.0％（T）、ギ酸溶液、H2O中1.0M、Gly-Gly-Gly、≧99.0％（NT）、Gly-Gly、≧99.5％（NT）、グリシン、≧99.0％（NT）、グリシン、発光用、≧99.0％（NT）、グリシン、分子生物学用、≧99.0％（NT）、HEPES緩衝食塩水、分子生物学用、2×濃度、HEPES、≧99.5％、HEPES、分子生物学用、≧99.5％（T）、イミダゾール緩衝溶液、H2O中1.0M、イミダゾール、≧99.5％（GC）、イミダゾール、発光用、≧99.5％（GC）、イミダゾール、分子生物学用、≧99.5％（GC）、リポタンパク質リフォールディングバッファー、酢酸リチウム二水和物、≧99.0％（NT）、クエン酸三リチウム四水和物、≧99.5％（NT）、MES水和物、≧99.5％（T）、MES一水和物、発光用、≧99.5％（T）、MES溶液、分子生物学用、H2O中0.5M、MOPS、≧99.5％（T）、MOPS、発光用、≧99.5％（T）、MOPS、分子生物学用、≧99.5％（T）、酢酸マグネシウム溶液、分子生物学用、H2O中約1M、酢酸マグネシウム四水和物、≧99.0％（KT）、クエン酸三マグネシウム九水和物、≧98.0％（乾燥物質に対して計算、KT）、ギ酸マグネシウム溶液、H2O中0.5M、リン酸二マグネシウム三水和物、≧98.0％（KT）、in situハイブリダイゼーション用in situハイブリダイゼーション用中和溶液、分子生物学用、シュウ酸二水和物、≧99.5％(RT)、PIPES、≧99.5％（T）、PIPES、分子生物学用、≧99.5％（T）、リン酸緩��食塩水、溶液(高圧滅菌済み)、リン酸緩衝食塩水、ウエスタンブロッティングにおけるペルオキシダーゼコンジュゲート用洗浄バッファー、10倍濃度、ピペラジン、無水、≧99.0％（T）、D-酒石酸一カリウム、≧99.0％（T）、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、H2O中5M、酢酸カリウム溶液、分子生物学用、H2O中約1M、酢酸カリウム、≧99.0％（NT）、酢酸カリウム、発光用、≧99.0％（NT）、酢酸カリウム、分子生物学用、≧99.0％（NT）、重炭酸カリウム≧99.5％（T）、炭酸カリウム、無水、≧99.0％（T）、塩化カリウム、≧99.5％（AT）、クエン酸一カリウム、≧99.0％(乾燥物質、NT)、クエン酸三カリウム溶液、H2O中1M、ギ酸カリウム溶液、H2O中14M、ギ酸カリウム、≧99.5％（NT）、シュウ酸カリウム一水和物、≧99.0％(RT)、リン酸二カリウム、無水、≧99.0％（T）、リン酸二カリウム、発光用、無水、≧99.0％（T）、リン酸二カリウム、分子生物学用、無水、≧99.0％（T）、リン酸一カリウム、無水、≧99.5％（T）、リン酸一カリウム、分子生物学用、無水、≧99.5％（T）、リン酸三カリウム一水和物、≧95％（T）、フタル酸一カリウム、≧99.5％（T）、酒石酸カリウムナトリウム溶液、H2O中1.5M、酒石酸カリウムナトリウム四水和物、≧99.5％（NT）、四ホウ酸カリウム四水和物、≧99.0％（T）、四シュウ酸カリウム二水和物、≧99.5％(RT)、プロピオン酸溶液、H2O中1.0M、STEバッファー溶液、分子生物学用、pH7.8、STETバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、5,5-ジエチルバルビツール酸ナトリウム、≧99.5％（NT）、酢酸ナトリウム溶液、分子生物学用、H2O中約3M、酢酸ナトリウム三水和物、≧99.5％（NT）、酢酸ナトリウム、無水、≧99.0％（NT）、酢酸ナトリウム、発光用、無水、≧99.0％（NT）、酢酸ナトリウム、分子生物学用、無水、≧99.0％（NT）、重炭酸ナトリウム、≧99.5％（T）、重酒石酸ナトリウム一水和物、≧99.0％（T）、炭酸ナトリウム十水和物、≧99.5％（T）、炭酸ナトリウム、無水、≧99.5％（乾燥物質に対して計算、T）、クエン酸一ナトリウム、無水、≧99.5％（T）、クエン酸三ナトリウム二水和物、≧99.0％（NT）、クエン酸三ナトリウム二水和物、発光用、≧99.0％（NT）、クエン酸三ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.5％（NT）、ギ酸ナトリウム溶液、H2O中8M、シュウ酸ナトリウム、≧99.5％(RT)、リン酸二ナトリウム二水和物、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム二水和物、発光用、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム十二水和物、≧99.0％（T）、リン酸二ナトリウム溶液、H2O中0.5M、リン酸二ナトリウム、無水、≧99.5％（T）、リン酸二ナトリウム、分子生物学用、≧99.5％（T）、リン酸一ナトリウム二水和物、≧99.0％（T）、リン酸一ナトリウム二水和物、分子生物学用、≧99.0％（T）、リン酸一ナトリウム一水和物、分子生物学用、≧99.5％（T）、リン酸一ナトリウム溶液、H2O中5M、ピロリン酸二ナトリウム、≧99.0％（T）、ピロリン酸四ナトリウム十水和物、≧99.5％（T）、酒石酸二ナトリウム、≧99.0％（NT）、酒石酸二ナトリウム溶液、H2O中1.5M(20℃で無色の溶液)、四ホウ酸ナトリウム十水和物、≧99.5％（T）、TAPS≧99.5％（T）、TES≧99.5％(乾燥物質に基づく計算、T)、TMバッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、TNTバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、TRISグリシンバッファー溶液、10倍濃度、TRIS酢酸-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、TRIS緩衝食塩水、10×濃度、TRISグリシンSDSバッファー溶液、電気泳動用、10倍濃度、TRISリン酸-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、濃度、10倍濃度、トリシン、≧99.5％（NT）、トリエタノールアミン、≧99.5％（GC）、トリエチルアミン、≧99.5％（GC）、酢酸トリエチルアンモニウムバッファー、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、リン酸トリエチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、酢酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、リン酸トリメチルアンモニウム溶液、揮発性バッファー、H2O中約1.0M、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、濃度、100×濃度、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、Tris-EDTAバッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、Trizma(登録商標)酢酸塩、≧99.0％（NT）、Trizma(登録商標)塩基、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)塩基、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)塩基、発光用、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)塩基、分子生物学用、≧99.8％（T）、Trizma(登録商標)炭酸塩、≧98.5％（T）、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH7.2、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH7.4、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH7.6、Trizma(登録商標)塩酸バッファー溶液、分子生物学用、pH8.0、Trizma(登録商標)塩酸、≧99.0％（AT）、Trizma(登録商標)塩酸、発光用、≧99.0％（AT）、Trizma(登録商標)塩酸、分子生物学用、≧99.0％（AT）、ならびにTrizma(登録商標)マレイン酸塩、≧99.5％（NT）が含まれる。
【０１０９】
ナノエマルジョンHSVワクチンはエマルジョンの形成を助ける1以上の乳化剤を含んでもよい。乳化剤には、油／水界面で凝集して2つの隣接した液滴間の直接接触を阻止する一種の連続膜を形成する化合物が含まれる。本発明の特定の実施形態は、所望の特性を損なうことなく水もしくは他の水相によって所望の濃度に直ぐ希釈しうるナノエマルジョンワクチンを特徴とする。
【０１１０】
4.液滴サイズ
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは、約1,000nm未満の平均直径サイズを有する液滴を含むものである。本発明の他の実施形態において、前記液滴サイズは、約950nm未満、約900nm未満、約850nm未満、約800nm未満、約750nm未満、約700nm未満、約650nm未満、約600nm未満、約550nm未満、約500nm未満、約450nm未満、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、またはそれらのいずれかの組み合わせの平均直径サイズを有する液滴を含むものである。一実施形態において、液滴は約125nm超、および約600nm以下の平均直径サイズを有する。色々な実施形態において、液滴は約50nm超または約70nm超、および約125nm以下の平均直径サイズを有する。
【０１１１】
一実施形態において、ナノエマルジョンHSVワクチン液滴は約1000nm未満、約950nm未満、約900nm未満、約850nm未満、約800nm未満、約750nm未満、約700nm未満、約650nm未満、約600nm未満、約550nm未満、約500nm未満、約450nm未満、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満、約50nm超、約70nm超、約125nm超、およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される平均直径を有する。
【０１１２】
D. 医薬組成物
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは、治療有効量のナノエマルジョンHSVワクチンおよび製薬上許容される送達のための製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物に製剤することができる。かかる賦形剤は、当技術分野では公知である。
【０１１３】
表現「治療上有効な量」は、ナノエマルジョンHSVワクチンを含む組成物中の投与された免疫原に関連するHSV病原体により引き起される疾患を予防、治療または改善するのに有効であるナノエマルジョンHSVワクチンの量を意味する。「保護免疫応答」は、その免疫応答が疾患の予防、治療または改善に関連することを意味する。完全な予防は必要でないが、これも本発明に包含される。免疫応答は、本明細書に考察した方法を用いてまたは当業者に公知のいずれかの方法により評価することができる。
【０１１４】
鼻腔内投与は、投与中に同時吸入を伴うまた伴わない鼻経由の投与を含む。かかる投与は典型的には、ナノエマルジョンHSVワクチンを含む組成物による経鼻粘膜、経鼻甲介、または副鼻腔との接触を介して行われる。吸入による投与は、鼻腔内投与を含むものであるか、または経口吸入を含んでもよい。かかる投与はまた、口腔粘膜、気管支粘膜、および他の上皮との接触を含んでもよい。
【０１１５】
医薬品投与の投与剤形の例は本明細書に記載されている。例には、限定されるものでないが、液体、軟膏、クリーム、エマルジョン、ローション、ゲル、生体粘着性ゲル、噴霧、エアロゾル、ペースト、フォーム、日焼け止め、カプセル、ミクロカプセル、懸濁液、膣座薬、粉末、半固体投与剤形などが含まれる。
【０１１６】
医薬品ナノエマルジョンHSVワクチンは、即時放出、徐放、制御放出、遅延放出またはそれらのいずれかの組み合わせで、表皮または真皮中に投与するよう製剤してもよい。いくつかの実施形態において、製剤は浸透促進剤を含んでもよい。好適な浸透促進剤には、限定されるものでないが、アルコール、例えば、エタノール、トリグリセリドおよびアロエ組成物が含まれる。浸透促進剤の量は、製剤の重量値で約0.5％〜約40％を含むものであってよい。
【０１１７】
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは電気泳動送達／電気泳動を利用して施用および／または送達することができる。さらに、本組成物は経皮送達系、例えば、パッチであってもよく、または加圧式もしくは空気力デバイス（すなわち「遺伝子銃」）により投与してもよい。電流の応用を含むかかる方法は当技術分野では周知である。
【０１１８】
投与用の医薬品ナノエマルジョンHSVワクチンは単回投与または複数回投与で施用することができる。
【０１１９】
局所施用であれば、ナノエマルジョンHSVワクチンを密封または半密封にしてもよい。密封または半密封は包帯、ポリオレフィンフィルム、衣料、不浸透性バリヤー、または半不浸透性バリヤーで局所調製物を覆うことによって行うことができる。
【０１２０】
本発明によるナノエマルジョンアジュバント組成物の例は「W805EC」と指定したアジュバントである。W805ECアジュバントの組成物を下表（表1）に示す。W805ECアジュバントの平均液滴サイズは約400nmである。ナノエマルジョンの全成分は認可医薬品向けの認可不活性成分のFDAリストに含まれる。
【表１】
2014524474.tif 000003
【０１２１】
ナノエマルジョンアジュバントは、油、精製水、非イオン洗剤、有機溶媒および界面活性剤、例えば、カチオン界面活性剤の乳化により作ることができる。ナノエマルジョンアジュバントの具体例は「60％W805EC」と指定したものである。60％W805EC-アジュバントは下表2に示した成分：精製水、USP；ダイズ油、USP；脱水アルコール、USP；(無水エタノール)；ポリソルベート80、NF；ならびに塩化セチルピリジニウム、USP（CPC）から構成される：この例示のナノエマルジョンの全成分は、認可済み医薬品の認可済み不活性成分のFDAリストに含まれている。
【表２】
2014524474.tif 000004
【０１２２】
E.本発明のナノエマルジョンHSVワクチンの安定性
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは約40℃および約75％相対湿度にて、少なくとも約2日まで、少なくとも約2週間まで、少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間、少なくとも約2.5年まで、または少なくとも約3年迄安定でありうる。
【０１２３】
本発明の他の実施形態において、本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは約25℃および約60％相対湿度にて少なくとも約2日まで、少なくとも約2週間まで、少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月まで、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月まで、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間まで、少なくとも約2.5年間まで、または少なくとも約3年間まで、少なくとも約3.5年間まで、少なくとも約4年間まで、少なくとも約4.5年間まで、または少なくとも約5年間までの期間は安定でありうる。
【０１２４】
さらに、本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは約4℃にて少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月まで、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月まで、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間まで、少なくとも約2.5年間まで、少なくとも約3年間まで、少なくとも約3.5年間まで、少なくとも約4年間まで、少なくとも約4.5年間まで、少なくとも約5年間まで、少なくとも約5.5年間まで、少なくとも約6年間まで、少なくとも約6.5年間まで、または少なくとも約7年間までの期間は安定でありうる。
【０１２５】
本発明のナノエマルジョンHSVワクチンは約-20℃にて少なくとも約1か月まで、少なくとも約3か月まで、少なくとも約6か月まで、少なくとも約12か月まで、少なくとも約18か月まで、少なくとも約2年間まで、少なくとも約2.5年間まで、少なくとも約3年間まで、少なくとも約3.5年間まで、少なくとも約4年間まで、少なくとも約4.5年間まで、少なくとも約5年間まで、少なくとも約5.5年間まで、少なくとも約6年間まで、少なくとも約6.5年間まで、または少なくとも約7年間までの期間は安定でありうる。
【０１２６】
これらの安定性パラメーターはまた、ナノエマルジョンアジュバントおよび／またはナノエマルジョンHSVワクチンにも適用可能である。
【０１２７】
F. 製造方法
本発明のナノエマルジョンは、古典的なエマルジョン形成技術を用いて形成することができる。例えば、U.S.2004/0043041を参照されたい。例示の一方法においては、比較的高いせん断力の下で（例えば、高い水力および機械力を用いて）油を水相と混合して、約約1％油の平均直径を有する油滴を含むナノエマルジョンを得る。本発明のいくつかの実施形態は、エタノールなどのアルコールを含む油相を有するナノエマルジョンを使用する。油相および水相を、エマルジョンを形成するのに十分なせん断力を生じうるいずれかの装置、例えば、フレンチプレスまたは高せん断ミキサーを用いてブレンドしてもよい（例えば、Admix社、Manchester、N.H.などのFDA認可済み高せん断ミキサーが利用可能である）。かかるエマルジョンを生成する方法は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第5,103,497号および同第4,895,452号に記載されている。
【０１２８】
例示の一実施形態において、本発明の方法で用いるナノエマルジョンは、連続水相、例えば、水またはPBS中に分散された不連続油相の油滴を含むものである。本発明のナノエマルジョンは安定であって、長い貯蔵期間の後でも分解しない。本発明の特定のナノエマルジョンは、飲み込んだ場合、吸入した場合、または被験者の皮膚に接触した場合、無毒であり安全である。
【０１２９】
本発明の組成物は大量に生産することができ、かつ広範囲の温度で数ヵ月間安定である。本ナノエマルジョンは半固形クリームから希薄なローションまで、液体までの範囲にわたる生地を有しうるのであって、いずれかの製薬上許容される上記の方法、例えば、手、または点鼻滴／噴霧により局所に施用することができる。
【０１３０】
上記のように、エマルジョンの少なくとも一部分は、限定されるものでないが、単層、多層、および少数層の脂質小胞、ミセルおよびラメラ相を含む脂質構造の形態であってよい。
【０１３１】
本発明は、記載したナノエマルジョンの多くの変形が本発明の方法において有用でありうると意図する。候補ナノエマルジョンが本発明での使用に好適であるかを決定するために、3つの判定基準を解析する。本明細書に記載した方法と標準を用いて候補エマルジョンを試験し、これらが適切であるか否かを容易に決定することができる。第一に、本明細書に記載する方法を用いて所望の成分を調製して、ナノエマルジョンが形成されうるかどうかを確認する。もしナノエマルジョンを形成できなければ、その候補を却下する。第二に、候補ナノエマルジョンは安定なエマルジョンを形成しなければならない。ナノエマルジョンがその意図する使用を可能にするのに十分な期間エマルジョンの形態のままであれば、ナノエマルジョンは安定である。例えば、貯蔵、輸送などをするナノエマルジョンにとって、ナノエマルジョンが数ヵ月間から数年間、エマルジョンの形態のままであることが所望されうる。比較的不安的である典型的なナノエマルジョンは、1日以内にその形態を失う。第三に、候補ナノエマルジョンは、その意図する使用に対して効力を有しなければならない。例えば、本発明のエマルジョンは、HSVウイルスを検出可能なレベルまで殺滅または不能化するか、または保護免疫応答を検出可能なレベルまで誘導しなければならない。本発明のナノエマルジョンは多くの色々なタイプの容器と送達システムで提供することができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態においては、ナノエマルジョンをクリーム剤または他の固体もしくは半固形の形態で提供する。本発明のナノエマルジョンをヒドロゲル製剤に組み入れてもよい。
【０１３２】
ナノエマルジョンを任意の好適な容器で（例えば、被験者に、または顧客に）送達することができる。所望の施用に対する1以上の単回使用または複数回使用の用量のナノエマルジョンを提供する好適な容器を用いることができる。本発明のいくつかの実施形態においては、ナノエマルジョンを懸濁液または液体の形態で提供する。かかるナノエマルジョンを、噴霧ボトルおよびいずれかの好適な加圧噴霧デバイスを含むいずれかの好適な容器で送達することができる。かかる噴霧ボトルはナノエマルジョンを鼻腔内にまたは吸入経由で送達するのに好適でありうる。
【０１３３】
ヒトのHSV感染を治療または予防するために有用なナノエマルジョンHSVワクチンを調製する本発明の例示の方法において、前記方法は、(a)真核生物宿主において1以上の全長または免疫原性断片HSV表面抗原を組換えDNA遺伝子ベクターおよび構築物を利用して合成するステップであって、HSV表面抗原がHSV gB、HSV gC、HSV gD、および HSV gEから成る群より選択される前記ステップ；(b)1以上の表面抗原またはその免疫原性断片を真核生物宿主から単離するステップ；および(c)1以上の表面抗原を水中油ナノエマルジョンで製剤するステップを含むものである。真核生物宿主は、例えば、哺乳動物細胞または酵母細胞であってもよい。本発明の他の実施形態において、その方法は(a)単離された全HSVウイルスを得るステップ；および(b)HSVウイルスを水中油ナノエマルジョンと共に製剤するステップを含むものである。さらに他の実施形態においては、全HSVウイルスおよび単離されたHSV抗原の両方を本発明のナノエマルジョンHSVワクチンに利用することができる。HSVはHSV-1またはHSV-2であってもよい。
【０１３４】
これらのナノエマルジョンを含有する容器をさらに、使用のための取扱説明書と共に包装してキットにしてもよい。
【０１３５】
本発明を実施例を参照することによってさらに説明するが、これらは説明のためにのみ提供されるものである。本発明は実施例に限定されるものではなく、むしろ本明細書に提供される教示から明らかである変形を全て含むものである。限定されるものでないが、米国特許を含む本明細書に参照される公的に入手可能な文書は全て、参照により具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１３６】
（実施例１）
本実施例の目的はナノエマルジョンHSVワクチンに用いるナノエマルジョンの調製を記載することであった。
【０１３７】
ナノエマルジョンを製造するために、水溶性成分を最初に水に溶解した。
【０１３８】
次いでダイズ油を加え、その混合物を高せん断ホモジナイズおよび／またはミクロ流動化を用いて粘稠な白色乳濁液が形成されるまで混合した。その乳濁液を水でさらに希釈して所望濃度の乳濁液またはカチオンの界面活性剤を得ることができる。
【０１３９】
ナノエマルジョン（NE）組成物を表3に従って製剤した。
【表３】
2014524474.tif 000005
【０１４０】
ナノエマルジョンを次いで1以上のHSV免疫源と組み合わせて、本発明によるナノエマルジョンHSVワクチンを形成することができる。
【０１４１】
（実施例２）
本実施例の目的はHSVワクチン用のアジュバントとして有用な例示のナノエマルジョンを記載することであった。
【０１４２】
合計10種のナノエマルジョン製剤を調製した：W805EC単独、6種のW805EC＋ポロキサマー407およびポロキサマー188（P407およびP188）製剤、ならびに2種のW805EC＋キトサンおよび1種のW805EC＋グルカン製剤を作製して2週間40℃の加速条件のもとで安定性を評価した（表4）。全10種のナノエマルジョンは少なくとも2週間40℃にて安定であった。
【表４】
2014524474.tif 000006
【０１４３】
次の製剤は本発明のHSVワクチンに有用な例示のナノエマルジョンである：(1)製剤1、W805EC（NE80）：(a)CPC/Tween 80（比1：6）を含み、(b)粒子径  約500nm（表5）；ならびに、(2)製剤2、W80P1885EC（NE188）：(a)CPC/Tween 80/P188（比1：1：5）を含み、(b)粒子径  約300nm（表6）。
【表５】
2014524474.tif 000007
【表６】
2014524474.tif 000008
【０１４４】
（実施例３）
本実施例の目的はナノエマルジョンのウイルス抗原との結合を立証する
ことであった。
【０１４５】
材料と方法：透過型電子顕微鏡写真と切片化技法：20mLのナノエマルジョンアジュバントを単独でまたはフルゾン(登録商標)と共に、1％(w/v)四酸化オスミウム溶液を用いて固定した。固定した調製物をヒストゲルと1:10比で混合し、固体塊を形成した。固体混合物を薄い1mmスライスに切片化して、二重蒸留した脱イオン水で漱いだ。切片化サンプルを、二重蒸留した脱イオン水中でDurcupan(登録商標)キット（Fluka、EM #14020）の成分Aの上昇する濃度（30％、50％、70％、90％、100％）で脱水した。これらのサンプルをDurcupan(登録商標)キットの包埋溶液（成分A、B、CおよびDの混合物）中に移した。包埋したサンプルを、75nm厚さに切片化して300メッシュ炭素コーティングした銅グリッドの上に置いた。グリッド上の切片を蒸留および脱イオンした水（pH 7）中の飽和酢酸ウラニルで10分間、次いでクエン酸鉛で5分間、染色した。そのサンプルを計算機制御したコンピュステージ、高解像（2K x 2K）デジタルカメラを備えたPhilips CM-100 TEMにより観察し、X-Stream画像ソフトウエア（SEM Tech Solutions, Inc., North Billerica, MA）を用いてデジタル画像を得た。
【０１４６】
結果：電子顕微鏡写真：20％ W805ECナノエマルジョンのTEM断面は均一な内部コア物質を持つナノエマルジョン液滴を示した。30μgのHA（ヘマグルチニン）を含有するナノエマルジョンワクチンは油コアの液滴内にフルゾン(登録商標)抗原液滴を表す明確な抗原物質／粒子を示す。抗原はコア内に組込まれ、かつコア物質により囲まれているので、濃密な電子染色から保護される。その結果、コア内に白色の逆染色効果を示す。抗原をコア内に局在することによって、エマルジョン中の抗原感受性タンパク質サブユニットを遮蔽し、抗原を分解から保護しかつ安定性を増進することができる。NE粒子の外側には極くわずかのフルゾン(登録商標)粒子しか存在せず、これらは暗色に染色されている（図1aおよび1b）。
【０１４７】
* * * *
様々な改変と変法が本発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明の方法および組成物においてなすことができるのは当業者に明らかでありうる。従って、本発明は、本発明の改変と変法が添付せる請求項およびその同等体の範囲内にあることを条件として、前記改変と変法を含むものであることを意図している。
【０１４８】
全てを引用した本明細書の参考文献
2014524474.tif 000009
2014524474.tif 000010
2014524474.tif 000011
【図１】
2014524474.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月21日(2014.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物を含む免疫増進性ナノエマルジョン；および
(b)単純ヘルペスウイルス（HSV）抗原が全HSVウイルス、単離されたHSV抗原、またはそれらの組み合わせでありかつHSV抗原が該ナノエマルジョン内に存在する、少なくとも１つのHSV抗原
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
(a)水中油ナノエマルジョンまたはその希釈物を含む免疫増進性ナノエマルジョン；および
(b)該ナノエマルジョン内に存在する、1以上の単離された多価単純ヘルペスウイルス（HSV）表面抗原
を含むサブユニットワクチン組成物。
【請求項３】
HSV抗原がナノエマルジョン中への組み込み前に不活化される、および／または、HSV抗原がナノエマルジョンにより不活化される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
(a)HSV抗原がHSV-1 gB、HSV-2 gB、HSV-1 gC、HSV-2 gC、HSV-1 gD、HSV-2 gD、HSV-1 gE、HSV-2 gEおよびそれら糖タンパク質のいずれかの免疫原性断片からなる群から選択されるHSV表面抗原である、ならびに／あるいは、
(b)少なくとも１つのHSV抗原がHSV-1 gB、HSV-2 gB、HSV-1 gC、HSV-2 gC、HSV-1 gD、HSV-2 gD、HSV-1 gE、またはHSV-2 gE糖タンパク質の免疫原性ペプチド断片およびそれら糖タンパク質のいずれかの免疫原性誘導体中に存在する、請求項１〜３のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
HSV抗原がHSV-2 gDである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
HSV抗原がHSV-2 gDおよびHSV-2 gBの組合せである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
1以上のHSV抗原がさらに弱毒表現型を示すヌクレオチド改変を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのHSV抗原が融合タンパク質中に存在する、請求項１〜７のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
HSV抗原が組換え抗原である、請求項１〜８のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
免疫増進性ナノエマルジョンがTh1、Th2および／またはTh17免疫応答を誘導することができる、請求項１〜９のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
ナノエマルジョンが約10000nm未満の平均粒子径を有する液滴を含む、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
ナノエマルジョンが約300nm〜約600nmの平均粒子径を有する液滴を含む、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
さらにアジュバント、製薬上許容される担体またはそれらの組合せを含む、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
(a)組成物が非経口、膣内、経口または鼻腔内投与用に処方される、あるいは
(b) 組成物が非経口投与用に処方され、かつ非経口投与が皮下、腹腔内または筋肉内注入によるものである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が鼻腔内投与用に処方される、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１６】
有効量の請求項１〜１５のいずれか1項に記載の組成物を個体に投与するステップを含むものである、単純ヘルペスウイルス（HSV）により引き起された疾患に対する免疫の増進を誘導するための、該組成物の使用。
【請求項１７】
ヒトのHSV感染を治療または予防するために有用なナノエマルジョン単純ヘルペスウイルス（HSV）ワクチンを調製する方法であって、
(a)真核生物宿主において1以上の組換え、全長または免疫原性断片のHSV表面抗原を合成するステップであって、HSV表面抗原がHSV-1 gB、HSV-2 gB、HSV-1 gC、HSV-2 gC、HSV-1 gD、HSV-2 gD、HSV-1 gE、およびHSV-2 gEから成る群より選択される前記ステップ；
(b)1以上の表面抗原またはその免疫原性断片を真核生物宿主から単離するステップ；ならびに
(c)1以上の表面抗原を水中油ナノエマルジョンと共に製剤するステップ
を含むものである前記方法。
【請求項１８】
真核生物宿主が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
2014524474.tif 000013
2014524474.tif 000014