(57)【要約】  本発明は、ヘッジホッグ経路に拮抗するスムーズンド受容体リガンド、その医薬組成物および治療用途、この化合物を得るための方法およびこれらの方法において有用な新規な中間体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物
【化１】
2014505028.tif 000016
および薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
医薬として使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
がんの治療において、詳細には非小細胞肺癌；小細胞肺がん；乳がん；卵巣腫瘍；消化管腫瘍；脳がん；前立腺がん；膵臓がん；基底細胞癌；ゴーリン症候群；悪性黒色腫；扁平上皮細胞癌；多発性骨髄腫；リンパ腫；間葉性がん；慢性骨髄性白血病；子宮内膜癌；肝細胞癌から選択されるがんの治療において使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
脳がんの治療において使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
脳内のがん転移の治療において使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
脳に転移するがんの治療において使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｓｍｏ受容体アンタゴニストとして使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
医薬を製造するための、詳細にはがんを治療するための医薬を製造するための請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を調製する方法であって、
ａ）パラジウム触媒作用下および適切な塩基の存在下で、化合物Ｄ
【化２】
2014505028.tif 000017
を少なくとも１当量のイソニペコテートで処理して、化合物Ｘ１
【化３】
2014505028.tif 000018
［式中、ＬＧは適切な脱離基である］を得るステップと、
ｂ）化合物Ｘ１を化合物Ｘ２
【化４】
2014505028.tif 000019
に変換するステップと、
ｃ）化合物Ｘ２をＮ−メチル−ピペラジンとカップリングさせて、請求項１に記載の化合物を得るステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
化合物Ｄを調製するために、
ａ）適切な溶媒中で、化合物Ｘ３
【化５】
2014505028.tif 000020
を少なくとも等モル量のヨウ素および過剰のピリジンで処理して、化合物Ｘ４
【化６】
2014505028.tif 000021
を得るステップと、
ｂ）極性溶媒中で、化合物Ｘ４を少なくとも１当量のメタクロレインならびに過剰のＡｃＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の等モル混合物で処理して、化合物Ｄ
【化７】
2014505028.tif 000022
を得るステップと、をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物Ｄを調製するために、
ａ）酸性ｐＨで、化合物Ｘ３
【化８】
2014505028.tif 000023
を少なくとも等モル量の臭素で処理して、化合物Ｘ５
【化９】
2014505028.tif 000024
を得るステップと、
ｂ）化合物Ｘ５を当量のピリジンで処理して、化合物Ｘ６
【化１０】
2014505028.tif 000025
を得るステップと、
ｃ）極性溶媒中で、Ｘ６を少なくとも１当量のメタクロレインならびに過剰のＡｃＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の等モル混合物で処理して、化合物Ｄ
【化１１】
2014505028.tif 000026
を得るステップと、をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＧが直鎖、分枝または環式のＣ１〜６アルコキシ基である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
【化１２】
2014505028.tif 000027
の化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物を調製する際の中間体または出発材料としての請求項１２に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な脳透過薬(Brain penetrant)、ヘッジホッグ経路に拮抗するスムーズンド(Smoothened)受容体リガンド、その薬学的用途、この化合物を得るための方法およびこれらの方法において有用な新規な中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
スムーズンド受容体（Ｓｍｏ）アンタゴニストによるヘッジホッグ経路の阻害は今や、様々ながん種を治療するためによく知られている手法であり：ＧＤＣ４４９、ＬＤＥ２２５、ＩＰＩ９２６およびＸＬ１３９として知られている化合物が、様々ながんの状況で臨床試験を受けている（これらの試験についての概観は、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖから得ることができる）。
【０００３】
さらに、ピアレビューされる科学文献には、下記のより具体的ながんの状況におけるＳｍｏ拮抗活性を有する化合物の広い適用範囲を裏付ける証拠が掲載されている：髄芽細胞腫（ＲｏｍｅｒおよびＣｕｒｒａｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５(１２)４９７５〜４９７８(２００５)）(非特許文献１)および神経膠芽細胞腫（Ｂａｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５(１０)：２５２４〜３３(２００７)）などの脳がん；前立腺がん（Ｓａｎｃｈｅｚら、ＰＮＡＳ  １０１(３４)１２５６１〜１２５６６(２００４)）；膵臓がん（Ｔｈａｙｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３  ８５１〜８５６(２００３)）；非小細胞肺癌（Ｙｕａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６  １０４６〜１０５５(２００７)；小細胞肺がん（Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２２  ３１３〜３１７(２００３)）；乳がん（Ｋｕｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４  ６０７１〜６０７４(２００４)）；様々な消化管腫瘍（Ｂｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２５  ８４６〜８５１(２００３)）および（Ｌｅｅｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９(５)１６９６〜１７１０(２００６)）；基底細胞癌（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ  １００(８)４６１６〜４６２１(２００３)）およびゴーリン症候群（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ、８、７４３、２００８）；悪性黒色腫（ＰｏｎｓおよびＱｕｉｎｔａｎｉｌｌａ、Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓ  Ｏｎｃｏｌ.８(７)４６６〜４７４(２００６)）；扁平上皮細胞癌（Ｘｕａｎら、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ.１９(８)１１３９〜４７(２００６)）；多発性骨髄腫およびリンパ腫などのＢ細胞悪性病変（Ｄｉｅｒｋｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３(８)９４４〜９５１(２００７)；Ｐｅａｃｏｃｋら、ＰＮＡＳ  １０４(１０)４０４８〜４０５３(２００７））；軟骨肉腫などの間葉性がん（Ｔｉｅｔら、Ａｍ.Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ.、１６８(１）３２１〜３３０(２００６)）、腎臓の明細胞肉腫（Ｃｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.１１(２２)：７９８６〜９４(２００５)）および横紋筋肉腫（Ｔｏｓｔａｒら、Ｊ.Ｐａｔｈｏｌ.２０８(１)１７〜２５(２００６)）；慢性骨髄性白血病（Ｓｅｎｇｕｐｔａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１(５）９４９〜９５５(２００７)）；子宮内膜癌（Ｆｅｎｇら、Ｃｌｉｎ.Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.１３(５)１３８９〜１３９８(２００７)；肝細胞癌（Ｈｕａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２７(７)１３３４０１３４０(２００６)）；卵巣腫瘍（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ.９８(１)６８〜７６(２００７））。
【０００４】
脳腫瘍については、抗腫瘍薬の効力はまた、血流中を循環している多数の物質が進入して接触することから脳細胞を保護する複雑な生体系であるいわゆる血液脳関門(ＢＢＢ)を、その薬剤が通過する能力に依存し得ることが知られている。この増大した効力は、抗腫瘍薬が、そうでなければＢＢＢによって保護される、侵襲性の腫瘍細胞の亜集団に達することに起因し得る(Ｅｈｔｅｓｈａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２６、５７２１、２００７およびｃａｌａｂｒｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、１１、６９、２００７)。
【０００５】
腫瘍学の分野では、大抵の原発性腫瘍は続発部位に転移し、多くの原発性がんは脳に転移する可能性が高いことも知られている。多くの場合にがんの診断は、原発性腫瘍が脳に広がり、脳で検出可能になった後に初めて成される(Ａｇａｚｚｉら、Ａｃｔａ  ＮｅｕｒｏＣｈｉｒｕｒｇｉｃａ、１４６(２)、１５３〜１５７、２００４)(非特許文献２)。大規模な検死研究によって、転移性がんの患者全体の２０％から４０％が脳転移を有することが示唆されている(Ｗｅｉｌら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ.；１６７、９１３〜９２０、２００５)。
【０００６】
転移性脳腫瘍の頻度は、比較的初期の検出およびより有効な治療の直接的な結果である、原発性がん診断後の生存期間の延長によって上昇していると考えられている(Ｂａｒｎｈｏｌｔｚ−Ｓｌｏａｎら、Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２２、２８６５(２００４))。原発性の肺腫瘍、乳房腫瘍、皮膚腫瘍または胃腸管腫瘍を有する個人が、脳転移を有すると診断される人の大部分を占めている：ニューヨークにあるＭｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒからの２７００症例のうち、原発性がんの分布は次のとおりであった：肺４８％、乳房１５％、黒色腫９％、リンパ腫１％(主に非ホジキン)、胃腸３％(結腸３％および膵臓２％)、尿生殖器１１％(腎臓２１％、精巣４６％、子宮頸５％、卵巣５％)、骨肉腫１０％、神経芽細胞腫５％および頭頸部腫瘍６％。
【０００７】
このような点から、腫瘍の治療は、この腫瘍に由来し得る転移の治療も伴うことが予想される。脳転移の上記の高い発生率を考えると、血液脳関門を通過する能力の高い抗腫瘍薬が有利である。
【０００８】
特許出願ＷＯ２００６０２８９５８(特許文献１)およびＷＯ２００９１２６８６３は、がんを治療するために有用なヘッジホッグ経路のＳｍｏ受容体リガンド阻害薬であるピリジル誘導体を開示している。
【０００９】
同じ出願人名での特許出願ＷＯ２００９０７４３００(特許文献２)は、がんを治療するためのＳｍｏ受容体アンタゴニストとしてベンゾイミダゾール誘導体を開示している。詳細には、この特許は、化合物ＡおよびＢを開示している。
【００１０】
【化１】
2014505028.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００６／０２８９５８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００９／０７４３００号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＲｏｍｅｒおよびＣｕｒｒａｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５(１２)４９７５〜４９７８(２００５)
【非特許文献２】Ａｇａｚｚｉら、Ａｃｔａ  ＮｅｕｒｏＣｈｉｒｕｒｇｉｃａ、１４６(２)、１５３〜１５７、２００４
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の説明
意外にも、例２に示されているとおりのＳｍｏ受容体アンタゴニストである化合物Ｃは、例３において示されているとおり、詳細にはＷＯ２００９０７４３００に開示されているその近似類似体ＡおよびＢの２種について、例外的に高い脳透過特性を有することが判明した。
【００１４】
【化２】
2014505028.tif 000003
【００１５】
一実施形態では、化合物Ｃおよび薬学的に許容されるその塩を提供する；
別の実施形態では、医薬として使用するための化合物Ｃを提供する；
特定の実施形態では、がんの治療において使用するための、詳細には非小細胞肺癌；小細胞肺がん；乳がん；卵巣腫瘍；消化管腫瘍；脳がん；前立腺がん；膵臓がん；基底細胞癌；ゴーリン症候群；悪性黒色腫；扁平上皮細胞癌；多発性骨髄腫；リンパ腫；間葉性がん；慢性骨髄性白血病；子宮内膜癌；肝細胞癌から選択されるがんを治療するための化合物Ｃを提供する；
さらなる実施形態では、脳がんの治療において使用するための化合物Ｃを提供する；
まださらなる実施形態では、脳内のがん転移の治療において使用するための化合物Ｃを提供する；
別の実施形態では、脳に転移するがんの治療において使用するための化合物Ｃを提供する；
本発明の別の実施形態は、Ｓｍｏ受容体アンタゴニストとして使用するための化合物Ｃに関する。
【００１６】
別の実施形態では、化合物Ｃもしくは薬学的に許容されるその塩、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される補助物質を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、医薬を製造するための、詳細にはがんを治療するための医薬を製造するための化合物Ｃの使用に関する。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、非小細胞肺癌；小細胞肺がん；乳がん；卵巣腫瘍；消化管腫瘍；脳がん；前立腺がん；膵臓がん；基底細胞癌；ゴーリン症候群；悪性黒色腫；扁平上皮細胞癌；多発性骨髄腫；リンパ腫；間葉性がん；慢性骨髄性白血病；子宮内膜癌；肝細胞癌から選択されるがんを治療するための医薬を製造するための化合物Ｃの使用に関する。本発明の他の実施形態は、ヘッジホッグ経路の阻害によって利益を得る疾患、状態または機能不全を治療する方法に関し、その方法は、それを必要とする対象に、有効量の化合物Ｃを投与することを含む。
【００１９】
療法で使用される化合物Ｃの投薬量は、例えば投与経路、疾患の性質および重症度に応じて変動し得る。一般に、ヒトにおいて許容される薬理学的効果は、０．０１から２００ｍｇ／ｋｇまでの範囲の一日投薬量で得ることができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、固体、半固体または液体の調製物の形態、好ましくは液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、エアロゾル剤または制御送達システムの形態であってよい。組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、直腸および鼻腔内を包含する様々な経路で投与することができ、かつ好ましくは単位剤形で製剤化する。経口単位剤形は、本発明の化合物を約１ｍｇから約１０００ｍｇ含有してよい。
【００２１】
本発明はまた、化合物Ｃの酸付加塩、好ましくは薬学的に許容される酸との塩を包含する。
【００２２】
化合物Ｃは、下記のスキーム１に概説されているとおり（式中、「ＬＧ」は適切な脱離基である）かつ例１において十分に詳述されているとおりの、本発明のさらなる実施形態である新規な重要な中間体Ｄまたは平均的な当業者の技能の範囲内であるその変異形から出発して得ることができる。
【００２３】
【化３】
2014505028.tif 000004
【００２４】
特定の実施形態では、ＬＧは直鎖、分枝または環式Ｃ１〜６アルコキシ基である。
【００２５】
したがって、中間体または出発材料としての化合物Ｄの使用を含む、化合物Ｃを得る方法を提供する。
【００２６】
より具体的には、
ａ）パラジウム触媒作用下および適切な塩基の存在下で、化合物Ｄを少なくとも１当量の適切なイソニペコテート誘導体で処理して、化合物Ｘ１を得るステップと、
ｂ）化合物Ｘ１を化合物Ｘ２に変換するステップと、
ｃ）化合物Ｘ２をＮ−メチル−ピペラジンとカップリングさせて、化合物Ｃを得るステップとを含む、化合物Ｃを得る方法を提供する。
【００２７】
上記のステップｂ）およびｃ）を行う方法についての例は、限定ではないが、Ｍａｒｃｈによって（「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、第６版、Ｗｉｌｅｙ編、ＩＳＢＮ  ９７８０４７１７２０９１１において）記載されている方法を包含する。
【００２８】
化合物Ｄは、市販の化合物から出発して、下記のスキーム２に概説されていて、かつ例１に十分に詳述されている３つの選択的合成経路または平均的な当業者の技能の範囲内であるその変異形を使用して得ることができる。
【００２９】
【化４】
2014505028.tif 000005
【００３０】
中間体Ｄに至るまでが最も長い経路（スキーム２の「方法１」）の主な欠点は、５−メチル−２−ピリジル亜鉛ブロミドの費用が高いこと、およびステップｂで必要とされる反応時間が長いこと（収率４４％に達するために３０時間）にある。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態である第２の方法（スキーム２の「方法２」）の利点は、比較的安価で、容易に入手可能で、取扱いが容易な試薬を使用すること、および反応時間がはるかに短いことであり、それらによってこの手順はスケールアップにより適している。
【００３２】
別法では、本発明のさらなる実施形態である第３の方法（スキーム２の「方法３」）は、結晶質で、容易に単離することができるＸ５の形成を伴う。さらに、許容される収率に達するためには、ステップａにおいて過剰のピリジンが必要な第２の方法とは逆に、この第３の方法は、第２のステップにおいて等モル量のピリジンの使用を含意する。さらに、Ｘ６を化合物Ｄに変換する第３のステップは、Ｘ６を反応混合物から単離することなく行うことができる。しかしながら、必要な純度のグレードに応じて、Ｘ６を反応混合物から単離することが簡便であることがある。これは例えば、Ｘ６を反応混合物から沈殿させることによって行うことができる。
【００３３】
方法３はまた、方法２に対して、完了させるために必要な(ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４／ＡｃＯＨ)緩衝液の量が半分である(２．５当量対５当量)という利点を有する。
【００３４】
したがって、
ａ）適切な溶媒中で、化合物Ｘ３を少なくとも等モル量のヨウ素および過剰のピリジンで処理して、化合物Ｘ４を得るステップと、
ｂ）極性溶媒中で、化合物Ｘ４を少なくとも１当量のメタクロレインならびに過剰のＡｃＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の等モル混合物で処理して、化合物Ｄを得るステップと、を含む、化合物Ｄを得る方法を提供する。
【００３５】
化合物Ｘ３は、市販されているか、または市販の化合物から当業者に知られている方法および反応によって容易に調製することができる。
【００３６】
さらなる実施形態では、
ａ）酸性ｐＨで、化合物Ｘ３を少なくとも等モル量の臭素で処理して、化合物Ｘ５を得ることと、
ｂ）化合物Ｘ５を当量のピリジンで処理して、化合物Ｘ６を得ることと、
ｃ）極性溶媒中で、Ｘ６を少なくとも１当量のメタクロレインならびに過剰のＡｃＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の等モル混合物で処理して、化合物Ｄを得ること、
とによって、化合物Ｄを調製する。
【００３７】
さらなる研究努力によって、上記の方法２のステップｂ）を行うための理想の反応条件は、５当量のＡｃＯＨ、５当量のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４および溶媒としてのエタノールであることが決定されている。アセトニトリルを溶媒として使用すると、さらに良好な結果を達成することができる。さらに我々は、方法３のステップｂ／ｃを行うための最良の条件は、２．５当量のＡｃＯＨ、２．５当量のＣＨ３ＣＯＯＮＨ４および溶媒としてのアセトニトリルであることを決定している。
【００３８】
アセトニトリルを溶媒として使用すると、水を加え、シクロヘキサンなどのアセトニトリル不混和性溶媒で抽出することによって、化合物Ｄを容易に単離することができる。試行錯誤によって、生成物の回収を最大にするためにどの程度の量の水を加えるかを決定することは、平均的な化学者の技能の範囲内である。
【００３９】
したがって、さらなる本発明の実施形態では、
ａ）適切な溶媒中で、化合物Ｘ３を少なくとも等モル量のヨウ素および過剰のピリジンで処理して、化合物Ｘ４またはａ）を得ることと、
ｂ）極性溶媒中で、化合物Ｘ４を少なくとも１当量のメタクロレインならびに過剰のＡｃＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の等モル混合物で処理して、化合物Ｄを得ることと、
ｃ）パラジウム触媒作用下および適切な塩基の存在下で、化合物Ｄを少なくとも１当量のイソニペコテートで処理して、化合物Ｘ１を得ることと、
ｄ）化合物Ｘ１を化合物Ｘ２に変換することと、
ｅ）化合物Ｘ２をＮ−メチル−ピペラジンとカップリングさせて、化合物Ｃを得ることとによって、化合物Ｃを調製する。
【００４０】
さらなる実施形態では、
ａ）酸性ｐＨで、化合物Ｘ３を少なくとも等モル量の臭素で処理して、化合物Ｘ５を得ることと、
ｂ）化合物Ｘ５を当量のピリジンで処理して、化合物Ｘ６を得ることと、
ｃ）極性溶媒中で、Ｘ６を少なくとも１当量のメタクロレインならびに過剰のＡｃＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４の等モル混合物で処理して、化合物Ｄを得ることと、
ｄ）パラジウム触媒作用下および適切な塩基の存在下で、化合物Ｄを少なくとも１当量のイソニペコテートで処理して、化合物Ｘ１を得ることと、
ｅ）化合物Ｘ１を化合物Ｘ２に変換することと、
ｆ）化合物Ｘ２をＮ−メチル−ピペラジンとカップリングさせて、化合物Ｃを得ることとによって、化合物Ｃを調製する。
【実施例】
【００４１】
例１：合成経路
化合物Ｄの合成
【００４２】
【化５】
2014505028.tif 000006
【００４３】
１−クロロ−２−ヨード−４−ニトロ−ベンゼン
方法１  ステップａ
３Ｌの四つ口丸底フラスコ内で、２−クロロ−５−ニトロフェニラミン(nitrophenilamine)(５０．０ｇ、２８９．７ｍｍｏｌ)をＨ２Ｏ(８００ｍｌ)および濃Ｈ２ＳＯ４(４１．０ｍｌ、４０５．６ｍｍｏｌ)の溶液に加えた。暗黄色の懸濁液を０℃に冷却し、ＮａＮＯ２(２４．０ｇ、３４７．６ｍｍｏｌ)のＨ２Ｏ(１００ｍｌ)中の溶液を滴加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで、ＫＩ(６７．３ｇ、４０５．６ｍｍｏｌ)のＨ２Ｏ(３００ｍｌ)中の溶液を、温度を１０℃未満に維持しながら滴加した。混合物を室温で２時間撹拌し、次いでＬＣ−ＭＳによってチェックした。懸濁液をＥｔＯＡｃ(４×８００ｍｌ)で抽出し、有機抽出物を収集し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ５(２×１Ｌ)およびブライン(２×１Ｌ)で洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、粗製の茶色の固体７４．８ｇを得た。これをｉＰｒ−ＯＨ(２００ｍｌ)から結晶化させて、中間体(１)５８．１ｇ(２０４．９ｍｍｏｌ、収率７１％)を赤茶色の結晶質固体として得た(ＬＣ−ＭＳアッセイ  ＞９５％）。
ＭＳ：イオン化可能なピークはなし。
ＦＴＩＲ(ｃｍ−１)：３０８６、１５２２、１３４２、８６９、７３８。
【００４４】
２−（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−５−メチル−ピリジン
方法１  ステップｂ
１Ｌの四つ口丸底フラスコ内で、Ａｒ流下で十分に乾燥させた１−クロロ−２−ヨード−４−ニトロ−ベンゼン（１）(３０．０ｇ、１０５．８ｍｍｏｌ)を無水ＤＭＡ(３０ｍｌ)に溶かし、次いで５−メチル−２−ピリジル亜鉛ブロミド(２９６．２ｍｌ、１４８．１ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン(５．６ｇ、２１．２ｍｍｏｌ)およびテトラキス(トリフェニル−ホスフィン)パラジウム（０）(６．１ｇ、５．３ｍｍｏｌ)を加えた。溶液を６０℃に３０時間加熱し、ＬＣ−ＭＳによって進行する変換をチェックした。反応混合物を室温に冷却し、１：１：１のＥｔＯＡｃ：２ＭのＮａＯＨ：破砕氷混合物(９００ｍｌ）に加えた。生じた混合物を１時間撹拌し、次いで１時間３０分にわたって放置した。茶色の懸濁液を、固体をＥｔＯＡｃ(３００ｍｌ)で洗浄しながらグーチ(gooch)で濾過した。濾液を分離し、水性相をＥｔＯＡｃ(３×４００ｍｌ)で抽出した。収集した有機抽出物を水(２×６００ｍｌ)およびブライン(２×６００ｍｌ)で洗浄し、濃縮して湿潤な茶色の固体を得た。これを１ＭのＨＣｌ(１Ｌ)で溶解し、ＥｔＯＡｃ(２×５００ｍｌ)で洗浄した。有機層を１ＭのＨＣｌ(２×５００ｍｌ)で逆抽出し、次いで、合わせた酸性水性抽出物を０℃に冷却し、１０ＭのＮａＯＨ(４５０ｍｌ)で塩基性にした。茶色の固体が形成し、これを濾過し、水(５００ｍｌ)で洗浄し、真空下(５０℃)で乾燥させて、中間体（２）１１．６ｇ(４６．６ｍｍｏｌ、収率４４％)を茶色の固体として得た(ＬＣ−ＭＳアッセイ  ９０％）。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２４９／２５０［Ｍ＋Ｈ＋］＋；２６６／２６７［Ｍ＋ＮＨ４＋］＋
ＦＴＩＲ(ｃｍ−１)：１５３０、３４６，１０３３，８８６，８３７，７３９。
【００４５】
４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−フェニルアミン
方法１  ステップｃ
５００ｍｌの四つ口丸底フラスコ内で、２−(２−クロロ−５−ニトロ−フェニル)−５−メチル−ピリジン(１１．６ｇ、４６．６ｍｍｏｌ)をＥｔＯＨ(２５０ｍｌ)に懸濁させ、次いで、ＳｎＣｌ２(３１．８ｇ、１６７．８ｍｍｏｌ)および３７％ＨＣｌ(３７ｍｌ)を加えた。溶液を６０℃に加熱し、この温度で３時間撹拌し、ＬＣ−ＭＳによってチェックした。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を１ＭのＨＣｌ(５００ｍｌ)で溶解し、懸濁液を得、これをＥｔＯＡｃ(３×３００ｍｌ)で洗浄した。水性層を０℃に冷却し、１０ＭのＮａＯＨ(１２０ｍｌ)で塩基性にし、ＥｔＯＡｃ(２×６００ｍｌ)で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＣＯ３(２×５００ｍｌ)、水(２×５００ｍｌ)およびブライン(２×５００ｍｌ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、所望の化合物７．８ｇ(３５．７ｍｍｏｌ、収率７６％)を茶色のオイルとして得た(ＬＣ−ＭＳアッセイ  ＞９５％)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２１９／２２１［Ｍ＋Ｈ＋］＋。
【００４６】
２−（５−ブロモ−２−クロロ−フェニル）−５−メチル−ピリジン（化合物Ｄ）
方法１  ステップｄ
５００ｍｌの四つ口丸底フラスコ内で、ＮａＮＯ２(２．７ｇ、３８．７ｍｍｏｌ)の水(１２．２ｍｌ)中の溶液を、予め０℃に冷却しておいた４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル)−フェニルアミン(７．７ｇ、３５．２ｍｍｏｌ)の４８％ＨＢｒ(１２．３ｍｌ)中の溶液に滴加し、次いで、その系を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を−５℃に冷却し、次いでＣｕＢｒ(５．６ｇ、３８．７ｍｍｏｌ)の４８％ＨＢｒ(８．４ｍｌ)中の溶液を滴下しながら添加した(added dropwising)（１）。その系を室温にし、１時間撹拌し、次いでＬＣ−ＭＳによってチェックした。反応混合物を−５℃に冷却し、５ＮのＮａＯＨ(１００ｍｌ）で塩基性にし、ＥｔＯＡｃ(５×１５０ｍｌ)で抽出した。収集した有機層を水(３×２００ｍｌ)およびブライン(３×２００ｍｌ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗製の生成物８．５ｇを茶色のオイルとして得た。これを自動のカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物６．４ｇ(２２．６ｍｍｏｌ、収率６４％)を白色の固体(ＬＣ−ＭＳアッセイ  ＞９５％）として得た。
【００４７】
【数１】
2014505028.tif 000007
【００４８】
１−［２−（５−ブロモ−２−クロロ−フェニル）−２−オキソ−エチル］−ピリジニウムヨージド
方法２  ステップａ
５Ｌの四つ口丸底フラスコ内の１０℃で冷却されているヨウ素(２７７ｇ、１．１ｍｏｌ)のｉＰｒＯＡｃ(４００ｍＬ)中の懸濁液にピリジン(４３３ｍＬ、５．３５ｍｏｌ)を、滴下漏斗を介して５分で加えた（ΔＴ＝＋５℃）。
【００４９】
添加の完了の後に、１−（５−ブロモ−２−クロロ−フェニル）−エタノン(２５０ｇ、１．０７ｍｏｌ)のｉＰｒＯＡｃ(６００ｍＬ)中の溶液を、滴下漏斗を介して一度に加えた（発熱は観察されなかった）。さらなるｉＰｒＯＡｃ３００ｍＬを加えて、ガラス器具を洗浄し、最終反応体積を５体積にした。アセトフェノンが完全に変換するまで、生じた混合物を還流加熱した（ＨＰＬＣ分析から１８時間）。
【００５０】
次いで、氷浴を使用して、反応混合物を１５℃に冷却し、濾過し、形成した固体をＨ２Ｏ(１Ｌ)およびＥｔＯＨ(４５０ｍＬ)で洗浄した。濾過し、恒量まで乾燥させた後に、黄色の固体３３０ｇを得た。収率：７０％。
【００５１】
【数２】
2014505028.tif 000008
【００５２】
２−（５−ブロモ−２−クロロ−フェニル）−５−メチル−ピリジン（化合物Ｄ）
方法２  ステップｂ
５Ｌの四つ口丸底フラスコ内の１−［２−（５−ブロモ−２−クロロ−フェニル）−２−オキソ−エチル］−ピリジニウムヨージド(３３０ｇ、０．７５ｍｏｌ)のＥｔＯＨ(２．２Ｌ)中の懸濁液に、ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４(２８９ｇ、３．７５ｍｏｌ)を少量ずつ加えた（ΔＴ＝−４℃）。次いで順番に、ＡｃＯＨ(２１５ｍＬ、３．７５ｍｏｌ)およびメタクロレイン(９３ｍＬ、１．１３ｍｏｌ)のＥｔＯＨ(１００ｍＬ)中の溶液を滴下し（発熱は検出されなかった）、ピリジニウム塩が完全に消費されるまで、生じた混合物を還流加熱した（ＨＰＬＣ分析から５時間）。
【００５３】
反応溶液を真空下で濃縮し、粗製物をＤＣＭ(１．２Ｌ)に溶かし、有機相をＮａＨＣＯ３  ｓｓ(５００ｍＬ)、１５％ＮａＯＨ(２００ｍＬ)およびＨ２Ｏ(４００ｍＬ)で洗浄し、次いで、溶媒を蒸発させた。５Ｌ四つ口丸底フラスコ内で粗製物をｉＰｒＯＨ(１Ｌ)に溶かし、４５℃で加熱し、内部温度を約３６℃に維持しながらＨ２Ｏを徐々に加えたが、その間、種結晶を加えることで結晶化を惹起することによって、精製の第１の試験を行った。懸濁液を１５℃で冷却し、４０分間撹拌し、濾過し、固体をＨ２Ｏ(５００ｍＬ)で洗浄した。固体のＮＭＲ分析によって、９８％の純度が判明した。粗製物(約１６５ｇ)をシクロヘキサン(２Ｌ)に懸濁させ、生じた懸濁液を濾過し、固体をシクロヘキサン(１００ｍＬ)で洗浄した。母液を５Ｌ四つ口丸底フラスコに移し、活性炭８ｇを加え、生じた懸濁液を室温で３時間撹拌し、濾過し、溶媒を蒸発させた。最後に、黄色の固体１５２ｇが得られた。収率７１％。
【００５４】
【数３】
2014505028.tif 000009
【００５５】
方法３  ステップａ
２−ブロモ−１−（２−クロロ−５−メチル−フェニル）−エタノン
１−Ｃｌ−５−Ｂｒ−アセトフェノン(１．３４５Ｋｇ、５．７ｍｏｌ、１当量)を１０Ｌの反応器に窒素流下で装入し：ＤＣＭ２．５Ｌ、続いてＡｃＯＨおよび他のＤＣＭ２．５Ｌを加えた。混合物を＋５℃で２０分間撹拌した。
【００５６】
Ｂｒ２(４５８．８ｇ、６ｍｏｌ、１．０５当量)のＤＣＭ５Ｌ中の溶液を２時間で滴加したが、その際、温度を０℃から５℃の間に維持した：添加の終了時に、ＨＰＬＣチェックによって変換の完了が示されるまで、混合物を２０℃で１時間撹拌した。
【００５７】
後処理：減圧下での蒸留によって、ＤＣＭを部分的に除去し(４Ｌ、６００ｍｂａｒ、Ｔ＝７０℃)、生じた混合物をチオスルフェート(２重量％溶液、０．５体積)、水(２×０．５体積)、０．２ＭのＮａＯＨ溶液(０．５体積)および水(２×０．５体積)で洗浄した。
【００５８】
ＤＣＭ１Ｌを真空下で除去し、次いでシクロヘキサン２．５Ｌを加え：残りのＤＣＭを減圧下で蒸留して(３５℃、４００ｍｂａｒ)、透明な黄色の溶液を得た。
【００５９】
黄色の溶液を０℃で冷却し、白色の沈殿物の形成が観察されるまで１時間撹拌し：白色の懸濁液の濾過をブフナー漏斗で濾過して、白色の結晶質固体１．２２４Ｋｇ(ＨＰＬＣ純度＞９０％、２５４ｎｍにて)を得、これを真空下、室温で一晩乾燥させた。
【００６０】
母液を真空下で濃縮し、残渣を０℃で冷却し、ブフナーで濾過し、フィルター上で一晩乾燥させ：所望の生成物の第２の収量を収集し(１４０ｇ、淡黄色の結晶質固体。所望の生成物１３６４ｇ(４．３７ｍｏｌ)を得た。収率：７６．６％。
ＨＰＬＣ純度＞９９％
【００６１】
【数４】
2014505028.tif 000010
【００６２】
方法３  ステップｂ
２−（２−クロロ−５−メチル−フェニル）−５−メチル−ピリジン
２−ブロモ−１−（２−クロロ−５−メチル−フェニル）−エタノン(１．２Ｋｇ、３．８ｍｏｌ、１当量)を１０Ｌの反応器に窒素流下で装入し：ＡＣＮ８Ｌを加え、生じた混合物を室温で２０分間撹拌した後に、ピリジン(３０７ｍＬ、３．８ｍｏｌ、１当量)を１回で加えた。ＨＰＬＣチェックが変換の完了を示すまで、混合物を６０℃で３時間撹拌し、生じた懸濁液をそのまま、次のステップで使用した（ＨＰＬＣ純度＞９８％）。
【００６３】
方法３  ステップｃ
２−（５−ブロモ−２−クロロ−フェニル）−５−メチル−ピリジン（化合物Ｄ）
懸濁液を５℃で冷却し、次いで、ＡｃＯＨ(５４４ｍＬ、９．５ｍｏｌ、２．５当量)、ＮＨ４ＯＨ(７３２ｇ、９．５ｍｏｌ、２．５当量)およびメタアクロレイン(３４５ｍＬ、４．１８ｍｏｌ、１．１当量)をそれぞれ１回で加えた。
【００６４】
撹拌しながら混合物を３０℃にし(１時間)、次いで７５℃で一晩加熱すると：ＨＰＬＣは、変換の完了、明白な反応プロファイルを示す。
【００６５】
後処理：反応混合物を５０℃で冷却し、次いでＡＣＮ３Ｌを真空下で蒸留し；残った混合物を１０℃で冷却し、次いで、ＮａＯＨ溶液(Ｈ２Ｏ３Ｌ中にＮａＯＨ５７７ｇ)を加えることによって、ｐＨ＝７に調節した。
【００６６】
生じた水溶液をシクロヘキサン(３×１．５Ｌ)で抽出し、次いで、収集した有機相をＨ２Ｏ(３×１．５Ｌ)で洗浄し、次いで、真空下で３Ｌ体積まで濃縮した。生じた混合物を０℃で一晩機械的に撹拌させ、次いで、ブフナーで濾過して、淡黄色の固体４１０ｇを得た(シクロヘキサンへの固体の部分的な溶解性によって、新たな溶媒での洗浄は行われていない）。
【００６７】
固体１３０ｇの第２の収量を回収すると、所望の生成物の全体量は５７０ｇになった（ＨＰＬＣ純度＞９９％）。
【００６８】
ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ相の第２の抽出を行った：水２．５Ｌを加え、次いで混合物をシクロヘキサン(３×１．５Ｌ)で抽出し；有機相を水(３×２Ｌ)で洗浄し、次いでシクロヘキサン４Ｌを減圧下で留去した。
【００６９】
撹拌しながら残った溶液を５℃で冷却し、次いで、ブフナーで濾過し：オレンジ色の固体１０９ｇを回収した。
【００７０】
母液をシクロヘキサン２００ｍＬに溶かし、撹拌しながら５℃で冷却し、次いで濾過して、所望の生成物を他に７０ｇ得た。
【００７１】
得られた全ての生成物を集め、真空下で一晩乾燥させた。
【００７２】
所望の化合物７２７ｇを回収した(２．５７ｍｏｌ、２ステップにわたる収率：６７．８％)。
【００７３】
ＨＰＬＣ純度＞９９％
【００７４】
【数５】
2014505028.tif 000011
【００７５】
【化６】
2014505028.tif 000012
【００７６】
４−｛１−［４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−フェニル］−ピペリジン−４−カルボニル｝−１−メチル−ピペラジン−１−イウムクロリド
１−［４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−フェニル］−ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル
Ｐｄ(ＯＡｃ)２(１２．４ｇ、５５．３ｍｍｏｌ)、ＢＩＮＡＰ(３５．３ｇ、５５．３ｍｍｏｌ)およびトルエン(２．６Ｌ)を１０Ｌのジャケット付き反応器に窒素流下で装入し、懸濁液を４５℃で２０分間撹拌した。次いで、イソニペコチン酸エチル(１５５ｍＬ、１ｍｏｌ)、２−(５−ブロモ−２−クロロ−フェニル)−５−メチル−ピリジン(２６０ｇ、０．９２ｍｏｌ)およびＣｓ２ＣＯ３(９００ｇ、２．７ｍｏｌ)をそれぞれ加え、変換が完了するまで、生じた混合物を１１０℃で加熱した（ＨＰＬＣ分析から２時間）。
【００７７】
反応混合物を室温に冷却し、ブフナー漏斗で濾過し、固体をＥｔＯＡｃ(１．４Ｌ)で洗浄した。母液をＨ２Ｏ(２×２Ｌ)およびＮＨ４Ｃｌ  ｓｓ(２Ｌ)で洗浄し、溶媒を蒸発させて、茶色のオイル(３６０ｇ)を得、これをさらに精製することなく、次のステップのために使用した。
ｍ／ｚ  ３５９（Ｍ＋Ｈ）＋；保持時間＝１．５６（ＵＰＬＣ）。
【００７８】
１−［４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−フェニル］−ピペリジン−４−カルボン酸
５Ｌ四つ口丸底フラスコ内のエステル７(３３０ｇ、０．９２ｍｏｌ)の１,４−ジオキサン(２Ｌ)中の懸濁液に、１５％ＮａＯＨ(３７６ｍＬ、１．６６ｍｏｌ)を滴下漏斗を介して５分で滴加し（ΔＴ＝−４℃）、加水分解が完了するまで、生じた溶液を８０℃で加熱した（ＨＰＬＣ分析から３時間）。
【００７９】
溶媒を蒸発させ、粗製物をＨ２Ｏ(２Ｌ)に溶かし、水溶液をｉＰｒＯＡｃ(３×８００ｍＬ)で洗浄し、ｐＨ４．９まで酸性化させ（ｐＨメーターによって測定）、形成した懸濁液をブフナー漏斗で濾過した。形成した固体をＨ２Ｏ(１Ｌ)で洗浄し、オーブンで乾燥させて(１０ｍｂａｒ、６０℃で４時間)、黄色の固体２８０（Ｋａｒｌ  ＦｉｓｈｅｒによりＨ２Ｏ含有率１６．５％）を得た。次いで、５Ｌ四つ口丸底フラスコ内で固体をＥｔＯＨ(２．２Ｌ)に懸濁させ、生じた懸濁液を１時間還流加熱し、室温に冷却し、ブフナー漏斗で濾過し、固体をＥｔＯＨ(４００ｍＬ)で洗浄し、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで乾燥させて(４ｍｂａｒ、６０℃で１時間)、薄黄色の固体２１０ｇを得た。２ステップでの全体収率６９％。
【００８０】
【数６】
2014505028.tif 000013
【００８１】
｛１−［４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−フェニル］−ピペリジン−４−イル｝−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン（化合物Ｃ）
５Ｌ四つ口丸底フラスコ内の窒素流処理されているＣＤＩ(１３５ｇ、８２８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ(２．１Ｌ）中の懸濁液に、１−［４−クロロ−３−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−フェニル］−ピペリジン−４−カルボン酸(２１０ｇ、６３６ｍｍｏｌ）を少量ずつ１０分で加えた。激しいガスの発生は観察されたが、発熱は観察されなかった。酸の活性化が完了するまで、混合物を室温で撹拌した（ＨＰＬＣ分析から１時間、ブチルアミンでクエンチ）。
【００８２】
次いで、Ｎ−メチル−ピペラジン(７１ｇ、７００ｍｍｏｌ)のＤＣＭ(８０ｍＬ)中の溶液を１０分で滴加し（ΔＴ＝＋４℃）、生じた混合物を室温で３日間撹拌した（変換率９８．５％）。反応溶液を０．９ＭのＮａＯＨ(４×１Ｌ)で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、表題化合物を茶色のオイル(２７０ｇ、６．２％Ｗ／Ｗ、ＤＣＭ、ＨＰＬＣ純度９８％)として得て、これをさらに精製することなく、塩化ステップで使用した。
【００８３】
【数７】
2014505028.tif 000014
【００８４】
材料および方法
方法１
ＬＣ−ＭＳクロマトグラムをＳｐｅｃｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＣＭ１００クロマトグラフで、Ｚｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ  ＲＰ(３．０×５０ｍｍ、内径１．８μｍ)および２５４ｎｍでのＵＶ検出を使用して記録した。移動相は、ＮＨ４Ａｃ９５％(ＨＡｃでｐＨ４にされている１０ｍＭ)と有機調整剤としてのＭｅＯＨ５％とからなった。流速は１ｍｌ／分に維持する。調整剤の濃度を７分かけて５％から９５％へと直線状に上げ、水性緩衝液の濃度を７分かけて９５％から５％へと直線状に下げた。次いで、定組成でＭｅＯＨ９５％を７分間。流速は１ｍｌ／分に維持する。ＬＣピークの質量スペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｅｇａｎ  ＡＱＡ単一四重極分光計を使用して記録した。ＨＰＬＣは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＰＬＣ−ＤＡＤシステムでＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  ｃ１８カラム(４．６×１５０ｍｍ、内径３．０μｍ)および２５４ｎｍでのＵＶ検出を使用して記録した。移動相は、酢酸アンモニウム緩衝液１５％(ＨＡｃでｐＨ４．２にされている１０ｍＭ)と有機調整剤としてのＭｅＯＨ８５％からなった。流速は１ｍｌ／分に維持する。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００ＭＨｚ分光計を使用して記録した。ＦＴＩＲは、Ｊａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ−４２０フーリエ変換赤外分光計で記録した。
【００８５】
自動カラムクロマトグラフィーは、Ｂｕｃｈｉ  ＭＰＬＣシステムでシリカゲルＶｅｒｓａｆｌａｓｈカートリッジを使用して行い、約１ｇ／３０ｇの生成物−シリカ比によって、溶離剤としてＥＤＰおよび酢酸エチルの９／１混合物を用いて特性決定した。流速０．５ＣＶ／分。
【００８６】
方法２および３ならびに最終化合物の合成
報告されている収率は、生成物の純度および水／溶媒含有率について補正されていない。一般に、反応はＨＰＬＣによってモニタリングし、引用されている純度／変換率は、２５４ｎｍでのＨＰＬＣ面積％を指す。ＨＰＬＣ条件：
カラム  Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ(登録商標)Ｃ１８  ３．５μｍ  ４．６×７５ｍｍ
流速  ０．８ｍＬ／分
移動相Ａ  ０．７６％Ｋ２ＨＰＯ４水性緩衝液または０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ  アセトニトリル
勾配  １０分で９５：５のＡ／Ｂから２０：８０のＡ／Ｂへ、次いで３分平衡化
３／５分にわたって
分析ＵＰＬＣ−ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  ＳＱＤ（ＥＳイオン化）およびＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＰＤＡ検出器を備えたＡｃｑｕｉｔｙ  Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣを使用し、カラムＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×５．００を使用して作動させた
勾配  ０．１％ギ酸／水および０．１％ギ酸／ＣＨ３ＣＮを流速：０．６ｍｌ／分で３分かけて９５／５から５／９５に勾配させる。
【００８７】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＰＦＧ  ＡＴＢ  Ｂｒｏａｄｂａｎｄプローブを備えたＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００ＭＨｚ分光計を使用して記録した。水分測定はＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｖ２０で記録した。
【００８８】
例２：化合物ＣはＳｍｏ受容体アンタゴニストである
Ｓｍｏ受容体との化合物Ｃの結合親和性を、競合結合アッセイを使用して、ＷＯ２００９０７４３００に記載されている蛍光標識されたＢｏｄｉｐｙ−シクロパミンに代えて評価すると、１００ｎＭ未満のＫｉ値が生じた。
【００８９】
この結合から生じるＨｈ経路の不活性化のレベルを、ＷＯ２００９０７４３００に記載されているアルカリホスファターゼをベースとするアッセイを使用して決定すると、３０ｎＭ未満のＩＣ５０値が生じた。
【００９０】
例３：化合物Ｃは優れた脳透過特性を有する
実験の設計は、３匹のＣＤ−１マウスを、適切に製剤化され、遊離塩基５ｍｇ／ｋｇで経口投与される研究中の化合物で処置することにある。各採取時間（０．５、１．０および４．０時間）で、血漿および脳を同じ動物から収集し、生じた濃度データを使用して、（ＡＵＣ０−ｔ(最終)）脳／（ＡＵＣ０−ｔ(最終)）血漿比を算出することによって、ＣＮＳ分配についての情報を得る［式中、ＡＵＣは曲線下面積、即ち、濃度対時間プロットによって描かれる台形の幾何面積である］。
【００９１】
血漿（７つのレベル、２回注入、１〜５０００ｎｇ．ｍＬ−１の範囲）では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく分析を抽出後に行った。血漿試料をタンパク質沈殿(ＰＰ)によってのみ処理した。有機溶媒、アセトニトリル(ＡＣＮ)を加えることによって、タンパク質を沈殿させた［体積比：１１(有機溶媒)：１(生物マトリックス)］。生じた懸濁液を３２２０ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を適切な９６ウェルプレートに校正物質および品質対照物質と共に移し、次いで、Ｈ２Ｏ  ＨＣＯＯＨ０．１％で希釈し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
【００９２】
脳（８つのレベル、２回注入、１から２０００ｎｇ．ｇ−１の範囲）では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく分析を解体(dismembration)およびＭｅＯＨでの抽出の後に行った。脳組織の均質化は、Ｍｉｋｒｏ−Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  Ｓ(Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ)で行った。＋４℃でまだ凍結している脳をメスで、ペトリ皿内で切断し、ステンレス鋼製の振盪フラスコに移した。液体窒素に７分間浸漬した後に、炭化タングステン製の研磨ボールを加え、冷室をＭｉｋｒｏ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒに素速く移して、組織を均質化した(３０００ｒｐｍで２分)。得られた粉末５０ｍｇ(±０．５ｍｇ、１％の誤差は許容)をエッペンドルフ管に移し、有機溶媒のＭｅＯＨを加えることによって抽出した［体積比：１１(有機溶媒)：１(生物マトリックス)］。５分間ボルテックス処理した後に、試料を２３７５５ｇで＋４℃で３０分間遠心分離した。上清を校正物質および品質対照物質と共に９６ウェルプレートに移して、直接注入した。
【００９３】
ＬＣ分離を血漿および脳試料の両方についてＵＰＬＣ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍで急速な勾配で行った。ＥＳＩ＋−ＭＳ／ＭＳ測定をＱＴｒａｐ  ５５００質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって多重反応モニタリング(ＭＲＭ)モードで行う。Ａｎａｌｙｓｔ  １．５を使用して、データを収集した。Ｑ１およびＱ３は両方とも、単位導出で操作していた。
【００９４】
上記の条件下で試験すると、化合物Ａ、ＢおよびＣは、下表に挙げられている脳と血漿との分配値を示す
【００９５】
【表１】
2014505028.tif 000015
【国際調査報告】
2014505028.tif 000028
2014505028.tif 000029