(57)【要約】  模倣薬としてもアンタゴニストとしても作用する小型分子、ペプチド性肝細胞増殖因子模倣体を作成した。これらの分子には、認知症、神経変性疾患、糖尿病、メタボリック症候群、癌などの多数の病変の治療可能性、ならびに創傷治癒作用が有ることが分かっているか、あるいは有ると予測されている。
2014511858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式を有する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）模倣体であって：
2014511858.tif 000019
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、ノルロイシン基およびアミノ酸のうちの１つであり、前記アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから成る群より選択され；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシンであり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とするＨＧＦ模倣体。
【請求項２】
Ｒ１がＮ‐アシル基であり、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイル（ａｃｅｔａｎｏｙｌ）およびベンゾイルから成る群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のＨＧＦ模倣体。
【請求項３】
Ｒ１がノルロイシン基であり、Ｄ型ノルロイシンであることを特徴とする請求項１に記載のＨＧＦ模倣体。
【請求項４】
Ｒ１がチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載のＨＧＦ模倣体。
【請求項５】
Ｒ２がチロシンであることを特徴とする請求項１に記載のＨＧＦ模倣体。
【請求項６】
前記ＨＧＦ模倣体がヘキサン‐チロシン‐イソロイシン‐（６）‐アミノ‐ヘキサンアミドであることを特徴とする請求項１に記載のＨＧＦ模倣体。
【請求項７】
以下を含む治療組成物であって：
下記一般式を有する少なくとも１種の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）模倣体：
2014511858.tif 000020
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシンであり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択される；ならびに、
担体、前記担体に溶解または分散した前記ＨＧＦ模倣体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種のＨＧＦ模倣体とは異なる少なくとも１種の他の生物活性剤をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の治療組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種の他の生物活性剤が抗鬱剤、向精神薬および鎮痛薬から成る群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の治療組成物。
【請求項１０】
必要とする被験体において認知機能を促進するか、または認知機能不全を治療もしくは予防するための方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000021
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
全時間帯にわたって前記投与工程を多数回行うことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記時間帯の間、前記被験体の認知を試験し、試験結果に基づいて投与する前記ＨＧＦ模倣体の量を調整する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＧＦ模倣体がヘキサン‐チロシン‐イソロイシン‐（６）‐アミノ‐ヘキサンアミドであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
必要とする被験体においてシナプス接続を拡張し、および／またはニューロン置換をもたらす方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000022
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記被験体が脊髄損傷を受けた後に前記投与工程が実行されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
必要とする被験体において認知症を治療する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000023
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
必要とする被験体において神経保護をもたらすか、または神経再生を誘導する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000024
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
正常な認知能力を持つ個体において認知機能を向上させる方法であって、下記一般構造式を有する促進的量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000025
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
必要とする被験体において癌を治療する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000026
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
必要とする被験体において糖尿病を治療する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000027
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
必要とする被験体において心線維症、肺線維症、腎線維症および肝線維症などの線維症を治療する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000028
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
必要とする被験体において深遠静脈血栓、冠状動脈閉塞などの血管不全を治療する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000029
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
必要とする被験体において創傷治癒を促進する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000030
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
必要とする被験体において糖尿病性網膜症、黄斑変性症などの疾患での眼血管過多を遅延または改善する方法であって、下記一般構造式を有する治療量の１種以上の肝細胞増殖因子模倣体を前記被験体に投与する工程を含み
2014511858.tif 000031
式中、
Ｒ１はＮ‐アシル基、置換または非置換フェニル、ノルロイシン基、ならびにチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジン、ノルバリン、オルニチンおよびｓ‐ベンジルシステインから選択されるアミノ酸のうちの１つであり；
Ｒ２はチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リジンおよびバリンから成る群より選択される群より選択されるアミノ酸であり；
Ｒ３はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選択されるアミノ酸であり；
ｎは３〜６であり；
式中、共有結合１、２および３はペプチド結合または還元ペプチド結合から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【発明の分野】
【０００１】
連邦政府委託研究開発の報告書
本発明は、ＮＩＨの認可番号第ＭＨ０８６０３２号に基づき、部分的に政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に特定の権限を有する。
配列リスト
本出願は「配列リスト」として、２０１２年４月２日に作成された１０２２バイトの添付テキストファイル「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」の全内容を包含しており、これは参照することにより本明細書に含まれる。
本発明は概括的には、模倣薬（アゴニスト）またはアンタゴニストとして作用し得る肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）模倣体の開発に関するものである。模倣薬は、認知機能を促進するために；一般的な神経保護／神経再生薬として；創傷修復を容易にするために；インスリン感受性およびグルコース輸送を改善するために；ならびに神経変性疾患を予防または改善し、神経系への外傷の修復を容易にし、組織および器官の血管新生を増強させ、傷害された創傷の治癒を向上し、心臓、肺、腎臓および肝臓などの器官において線維性変化を減少または改善させるために認知症の徴候を予防または改善する目的で組織または器官の線維症を減少させるために、作用する。アンタゴニストは例えば、抗血管新生剤および抗癌剤として；血管過多に関連する黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの多様な悪性病変および疾患を治療するために作用する。
【０００２】
模倣薬：
認知症：認知症と診断された患者は米国だけでも約１千万人存在し、その数は老年人口になるにつれ毎年増加し続けている。これらの患者の治療およびケアにかかる費用は年間７００億ドルを越え、急速に増加している。不運にも現在、認知症の管理のための治療選択肢は非常に限定的であり、ほとんど効果がない。健康上の問題がこの規模で急激に増加していることに対して治療選択肢が不足している状況では、新たな革新的治療アプローチをできるかぎり早急に開発することが必要である。
【０００３】
根本的に、認知症は嗅内皮質、海馬および新皮質においてニューロン間のシナプス接続低下およびニューロン死が組み合わされて起こるものである。したがって、シナプス接続を増進すること、潜在的な細胞死誘導因子からニューロンを保護すること、および失ったニューロンを神経幹細胞の既存プールから補充することを促すことが効果的な治療であると予測される。これらの臨床エンドポイントは、神経発生、ニューロン新生、神経保護およびシナプス形成を媒介する神経栄養因子の治療的利用を支持する。当然に、神経栄養因子はアルツハイマー病など多くの神経変性疾患の治療選択肢と考えられている（ＮａｇａｈａｒａおよびＴｕｓｚｙｎｓｋｉ、２０１１年；Ｃａｌｉｓｓａｎｏら、２０１０年のレビュー参照）。特に興味深いにもかかわらずほとんど見落とされている１つの神経栄養因子としてＨＧＦがあり、これはニューロン新生（Ｓｈａｎｇら、２０１１年、Ｗａｎｇら、２０１１年）およびシナプス形成（下記の予備調査を参照）の両方を刺激する能力があることが証明されている。ＨＧＦの適用が認知症に実行できる治療選択肢になり得ることは驚くことではない。多くの脳領域においてＨＧＦは強力な神経栄養因子であり（Ｋａｔｏら、２００９年；Ｅｂｅｎｓら、１９９６年）、他方で多様な神経細胞型に影響を及ぼすものである。
神経保護／神経再生：ＨＧＦおよびｃＭｅｔは成長期および成人期の脳および神経の両方で活発に発現する。Ｍｅｔ系は中枢神経系および末梢神経系の両方を適切に機能させるために必須である。認知に重要な領域である前頭皮質、上衣、視床、小脳皮質、深部灰白質および海馬を含む脳の複数の領域でＨＧＦおよびｃ‐Ｍｅｔが発現することは多数の研究で示されている。
上述の生物学的活性はまた、ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔシグナル伝達が神経栄養性であり（Ｈｏｎｄａら、１９９５年）保護的である（Ｚｈａｎｇら、２０００年；Ｔａｋｅｏら、２００７年；ＴｙｎｄａｌｌおよびＷａｌｉｋｏｎｉｓ、２００７年；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、２００８年）脳内Ｍｅｔ機能を特徴づける。他の組織におけるその活性と同様に、脳内Ｍｅｔは発生に関与し、分化、運動性および神経突起生成中の誘導要素として作用する（Ｅｂｅｎｓら、１９９６年；Ｓｕｎら、２００２年；ＴｙｎｄａｌｌおよびＷａｌｉｋｏｎｉｓ、２００７年）。ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔシグナル伝達はまた、特に虚血脳損傷後の（Ｔａｋｅｏら、２００７年）ニューロン損傷の治癒を促進することが分かっている（Ｔｒａｐｐら、２００８年）。ＨＧＦはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患の動物モデルに対して神経保護効果を示した。ＨＧＦの多様な機能に、非常に高い神経栄養活性を加えると、神経系の多様な疾患を治療するための可能性ある治療薬としてＨＧＦが促進される。    
【０００４】
筋萎縮性側索硬化症：ＡＬＳは脊髄内の運動ニューロンおよび運動皮質や脳幹内の遠心性ニューロンの変性に特徴付けられる致死性かつ急速に発症する神経変性疾患である。この変性の影響は結果として筋肉機能不全が進行し、全身麻痺に至る。ＡＬＳの約９０％の症例は病因が分からない孤発性症例に分類され、一方、残りの１０％は家族性であり、部分的に銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）欠損に起因するものであり、酸化ストレスや小胞体ストレス応答の拡大につながる。ＡＬＳのその２種の形態が共通して有することは、現在、利用可能な効果的治療法がないということである。
【０００５】
効果的な治療選択肢が不足してはいるが、治療薬として肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を使用する上で有効な利点に着目している研究がいくつかある。これらの調査から、家族性ＡＬＳのマウスまたはラットモデルにおいて肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の応用により、運動ニューロン変性が有意に減速し（Ａｏｋｉら、２００９年）；変性過程を促進する神経膠症が減少し（Ｋａｄｏｙａｍａら、２００７年）；麻痺の開始が遅延し（Ｋａｄｏｙａｍａら、２００９年）；寿命が延びた（Ｓｕｎら、２００２年）ことが明らかになった。
【０００６】
しかし、ＨＧＦの適用がＡＬＳに実行できる治療選択肢になり得ることは予想外のことである。タイプＩチロシンキナーゼ受容体、ｃ‐ＭｅｔとＨＧＦとの併用は、管状構造の発生におけるその役割（Ｓａｎｔｏｓら、１９９３年）や、肝細胞や上皮起源細胞上の全身増殖作用、抗アポトーシス作用、運動源性作用および形態形成作用により、以前から認識されている。しかし、ほとんどの添付文書で、ＨＧＦが多数の脳内領域で強力な神経栄養因子となること（ＭａｉｎａおよびＫｌｅｉｎ、１９９３年；Ｋａｔｏら、２００９年）、またそれは運動ニューロンの生存促進性／再生性因子として特に有効であること（Ｅｂｅｎｓら、１９９６年；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７年；Ｈａｙａｓｈｉら、２００６年；Ｅｌｓｅｎら、２００９年）が、比較的最近認識されている。
パーキンソン病：パーキンソン病（ＰＤ）などの多くの神経変性疾患のために以前から考えられてきた治療選択肢は、疾患の進行を停止させ、機能不全を修復し、あるいは運良くその両方を行うことを意図する増殖因子の応用であった（Ｒａｎｇａｓａｍｙら、２０１０年のレビュー）。しかしこの夢は、脳内送達や費用の限界から臨床医学レベルでは十分に果たされていない。増殖因子は一般的に、代謝的に変化しやすく、かつ巨大なため血液‐脳関門（ＢＢＢ）を通過できない巨大タンパク質である。このように、増殖因子が適正な位置で、十分に高い濃度で、また臨床的緩和をもたらす十分に長い期間発現することを期待し、ほとんどの送達アプローチが遺伝子療法を利用してきた。ＧＤＮＦのような増殖因子を脳へ送達させるため、動物モデルにおける多数の創造的かつ良好なアプローチが採用されてきたが（Ｗａｎｇら、２０１１年）、これらの方法は多くの患者に実行するには技術的に複雑であり、非常に困難である。
【０００７】
多くの増殖因子系がＰＤのための可能性ある治療標的として試験されてきた一方で、本発明者らが誤って大幅に見落してきたと考えるものの１つに肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／ｃ‐Ｍｅｔ（そのＩ型チロシンキナーゼ‐受容体）系がある。にもかかわらず、ＰＤ治療としてＨＧＦが有用である可能性がＫｏｉｋｅらによる研究（２００６年）で注目された。ここでは、ＨＧＦプラスミドを黒質（ＳＮ）に直接注入したところＨＧＦが局所的に過剰発現し、６‐ヒドロキシドパミン（６‐ＯＨＤＡ）ＰＤラットモデルにおいて神経細胞死を予防し、正常運動機能を保持することに劇的に作用した。この観察されたドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン上のＨＧＦの神経保護効果は、ドーパミン作動性前駆体細胞の増殖および遊走を増強する能力と一致する（Ｌａｎら、２００８年）。
【０００８】
しかし、黒質線条体経路上のＨＧＦの神経保護効果は当然ながら、肝細胞および上皮起源細胞などの多くの細胞型における幹細胞調節、管状構造の発生（Ｓａｎｔｏｓら、１９９３年）ならびに全身増殖作用、抗アポトーシス作用、運動源性作用および形態形成作用（Ｇｈｅｒａｒｄｉら、１９９３年）における役割が認識されている。Ｍａｉｎａらの論文、特に添付文書は、ＨＧＦが、運動ニューロン（Ｅｌｓｅｎら、２００９年；Ｈａｙａｓｈｉら、２００６年）、海馬ニューロン（Ｌｉｍら、２００８年）、小脳顆粒細胞（Ｉｅｒａｃｉら、２００２年）、および交感神経ニューロン（１９９９年）などの多くの神経細胞型（Ｋａｔｏら、２００９年）の強力な神経栄養因子であることを説明している。さらに、ＨＧＦは神経幹細胞増加および分化の重要な調節因子であることが明らかになっており（Ｎｉｃｏｌｅａｕら、２００９年）、このことは神経細胞のみならず多様な末梢血幹細胞がＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系の制御下にあることを示唆するものである。
外傷性脳損傷／脊髄損傷：ＴＢＩはしばしば認知機能に悪影響を与え、知能の一時的低下を伴う軽度から長期化した衰退認知機能不全を伴う重度まで影響が及び得る（Ｋａｎｅら、２０１１年）。不安、攻撃性、抑うつ：など他の神経学的障害を伴う認知困難は結果として生活の質が大幅に低下することになる（ＭａｓｅｌおよびＤｅＷｉｔｔ、２０１０年）。イラクに続いてアフガニスタンにも及んだ軍事行動により、ＴＢＩは全戦闘犠牲者の２８％を占める主要な戦闘傷害となっている（Ｏｋｉｅ、２００５年；米国、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６年５月、第４２号）。２００１年から２０１０年の間にＴＢＩになった軍人の総推定人数は１８０，０００から３２０，０００人である（米国、防衛・退役軍人脳外傷センター調べ）。
【０００９】
潜在性ＴＢＩは、ニューロン間のシナプス接続の減少を起こす脳への物理的損傷、ニューロンの損失および死滅、虚血／低酸素誘導型損傷を起こす脳血管への損傷、および二次的なグリア瘢痕である。このニューロン損失およびシナプス接続減少はとくに海馬で顕著であり（Ｇａｏら、２０１１年；Ｚｈａｎｇら、２０１１年ａ；Ｚｈａｎｇら、２０１１年ｂ）、欠陥の長期増強（Ｓｃｈｗａｒｚｂａｃｈら、２００６年）や認知障害（例えばＤｉｋｍｅｎら、２００９年；Ｐａｔｅｌら、２０１０年）につながる。神経損失やシナプス接続減少をまねくＴＢＩ関連損傷の有病率はニューロン修復および／または置換を支援する療法の必要性を意味する。これらの臨床エンドポイントは、ＴＢＬを治療するため、神経発生、ニューロン新生、神経保護およびシナプス形成を媒介する神経栄養因子の治療的利用を支持する。当然に、神経栄養因子はＴＢＩの治療選択肢と考えられている（Ｋａｐｌａｎら、２０１０年；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、２０１０年；Ｑｉら、２０１１年）。特に興味深いにもかかわらずほとんど見落とされている１つの神経栄養因子としてＨＧＦがあり、これはニューロン新生（Ｓｈａｎｇら、２０１１年、Ｗａｎｇら、２０１１年）およびシナプス形成（下記の予備調査を参照）の両方を刺激する能力があることが証明されている。ＨＧＦの応用がＴＢＩの実行可能な治療選択肢となり得ることは、ＨＧＦが多くの脳領域で強力な神経栄養因子となり（Ｋａｔｏら、２００９年；Ｅｂｅｎｓら、１９９７年）、多様な神経細胞型に影響を与える（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７年；Ｈａｙａｓｈｉら、２００６年；Ｅｌｓｅｎら、２００９年）という近年の認識に起因している。
【００１０】
ＨＧＦおよび創傷治療：過剰な瘢痕は創傷内のＥＣＭ成分の不要な蓄積が特徴であり、これは合成と変性とのバランス異常に起因するものである。病的瘢痕の治療はＥＣＭの合成を阻害し、変性を促進することを目的とする場合もある。皮膚内でＨＧＦは創傷治療を以下のような方法で効果的に促進する：真皮血管内皮細胞の増殖および運動性を高める；表皮角化細胞の運動性を刺激する；局所血液供給を促進する；創傷の再上皮化を促進する（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、２００２年）。再上皮化は瘢痕形成を阻害する。血管新生および再上皮化を刺激することでＨＧＦ遺伝子輸送は皮膚創傷治療を促進することを示す研究がある（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、２００２年）。ＨＧＦ／ＳＦを増強する治療アプローチは創傷治療を促進し、瘢痕形成を予防することが期待される。
【００１１】
メタボリック症候群および糖尿病の治療選択肢としてのＨＧＦ：近年、グルコース処理、インスリン分泌および組織インスリン感受性の調節におけるＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系の重要な役割を示唆する研究もいくつかある。これらの調査は一致して、２型糖尿病およびメタボリック症候群の治療にＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系を増強する治療可能性に注目している（Ｆａｆａｌｉｏｓら、２０１１年；Ｆｌａｑｕｅｒら、２０１２年）。これらの調査は以下のことを示している：１）ｃ‐Ｍｅｔ、ＨＧＦ受容体はインスリン受容体と複合体を形成する；２）ｃ‐Ｍｅｔは肝臓グルコース恒常性に深く関与している；３）ＨＧＦは、マウス糖尿病マウスモデルにおいてインスリン応答性を修復する；４）そのＨＧＦ遺伝子療法は、一般的に糖尿病に伴う腎臓損傷を予防する、および５）ＨＧＦは糖尿病の血管合併症を改善する（Ｐｅｎｇら、２０１１年）。
【００１２】
血管新生を増強するＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔシグナル伝達経路：血管新生は既存の血管床からの新たな血管の形成であると定義される。それは創傷治癒および月経周期などの生理学的過程で主要な要件であり、他方、癌、黄斑変性症、アテローム動脈硬化症、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬および関節リウマチなどの複数の病態に不可欠な過程である。したがって、血管新生の調節が治療的血管新生の促進によるか、あるいは病的血管新生の停止によるかは現代医学を活気づけるものとして期待されている。生理学的血管新生と病理学的血管新生との間の平衡は多数の内因性血管新生調節因子および抗血管新生調節因子の伝達により媒介される。
【００１３】
多数の研究から、ＨＧＦは新血管形成の強力な誘導因子であることが分かっている。さらに、ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ阻害因子は抗血管新生剤に臨床的に関連している。（Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２０１２年）。これはおそらく、複数の経路を経て得られ、内皮細胞上での直接または間接的作用のいずれかで達成される。
抗線維化薬としてのＨＧＦ：線維症は多様な形態をとり、心筋梗塞、糖尿病およびアルコール依存症などの多くの病態に続発する心臓、腎臓および肝臓の機能不全の主な要因である。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は広範な動物モデルにおいて組織線維症を改善する際に著しい有効性をもって強力な抗線維症効果を示している。ＨＧＦは広範な動物モデルおよび組織において組織線維症を改善する注目に値する強力な抗線維症効果を発揮する（ＬｉｕおよびＹａｎｇ、２００６年）。根拠として、慢性炎症および進行性組織瘢痕のモデルである慢性同種移植腎障害ラットにおいて外因性ＨＧＦの治療効果を実証してきた。ヒトＨＧＦ遺伝子の筋肉内投与により、死亡率が減少し、炎症および浸潤が抑制され、腎線維症が減少した（ＬｉｕおよびＹａｎｇ、２００６年）。
【００１４】
西欧諸国では冠動脈疾患（ＣＡＤ）虚血イベントおよび心筋梗塞は心不全の主要な原因である。重篤な冠動脈閉塞およびアテローム動脈硬化症の選択肢はバイパス手術しかない。ＣＡＤにおける病理学的イベントはＣＡＤに見られる心臓機能低下の主要な役割：１）心臓への血液灌流を減少させる冠動脈閉塞；および２）心室リモデリングおよび心室コンプライアンス低下をまねく心臓発作後の線維症組織の形成：を担っている。急性心筋梗塞後に血流内でＨＧＦレベルが上昇したことが報告されている（Ｚｈｕら、２０００年；Ｊｉｎら、２００３年）。血流内ＨＧＦのこの上昇は心臓損傷の生物学的マーカーとして利用することが可能であり、その保護的役割に関する手掛かりとなる（Ｕｅｄａら、２００１年）。ＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達を促進する薬剤は心筋梗塞治療に使用して、酸化ストレスおよびアポトーシスに起因する細胞死に対して保護し、線維症組織の形成を減少させる可能性がある（Ａｈｍｅｔら、２００２年；Ｋｏｎｄｏら、２００４年；Ｐｉｅｔｒｏｎａｖｅら、２０１０年）。さらに、心筋梗塞後のＨＧＦの他の有益な効果はその血管新生の誘導能にあり、これは心筋の再灌流を改善する新たな心血管形成を支持する可能性があった。
【００１５】
ＨＧＦは外因性発作に対して肝臓を保護することが公知であるが、ＨＧＦ産生はまた数種の肝疾患および肝臓外疾患とも関連している。実験的および臨床的根拠から、ＨＧＦが肝臓再生における重要な役割を担っていることが示されている。肝硬変は線維性瘢痕および肝細胞再生の不可逆的結末であり、世界的に見て罹患率および死亡率の主要な原因であり、有効な治療法が無い。この疾患には特定の病因がないにもかかわらず、硬変は、損傷が分散し、肝臓実質細胞が再生し、結合組織の拡散により小葉および血管構造の構築が不十分になる肝臓の慢性的疾患と定義されている（ＦｕｊｉｍｏｔｏおよびＫａｎｅｄａ、１９９９年；Ｋａｉｂｏｒｉら、２００２年）。理想的には、肝硬変治療のアプローチには線維形成の減弱、肝細胞有糸分裂の促進および組織構造の再形成が含まれていることが好ましい。
【００１６】
特に硬変した肝臓の場合、組み換えＨＧＦの外部投与により、肝切除後に肝臓再生する可能性が高まることが研究から分かっている（ＢｏｒｏｓおよびＭｉｌｌｅｒ、１９９５年；Ｋａｉｂｏｒｉら、２００２年；Ｂｏｒｏｗｉａｋら、２００４年）。逆に言えば、ＨＧＦ／ＳＦレベルを高めるクロフィブレート関連化合物により肝腫脹、肝臓ペルオキシソーム増殖、および肝細胞癌が誘導され得ることが研究から分かっている（ＸｕおよびＷｕ、１９９９年）。ポジティブにもネガティブにも結び付けられる肝臓疾患とＨＧＦ／ＳＦとの関連性により、薬品開発の注目される分野であるＨＧＦ関連治療法が実行されている。
【００１７】
ＨＧＦの直接使用の制限：治療薬としてのＨＧＦまたは任意の他のタンパク質神経栄養因子の直接使用には２つの重要な制限がある：１）血液‐脳関門透過性（ＢＢＢ）の無い大型かつ親水性特性；および２）高コストの組み換え法が必要となる製造工程：よってその広範な用途は制限を受ける。
これらの障害は、本明細書に記載された小分子ＨＧＦ模倣薬の広範なライブラリーの中の１種以上を使用して克服することが可能であり、このうちの数種は経口で有効であり、深い認識促進／抗認知症／神経保護活性を示し、低価格で合成される。
【００１８】
アンタゴニスト：遺伝子活性化変異、転写上方制御により、またはリガンド依存性自己分泌もしくはパラ分泌メカニズムにより、ｃ‐Ｍｅｔ受容体の不適切な活性が促進され得る。
癌におけるｃ‐Ｍｅｔ活性化：癌は遺伝子変異の蓄積に起因する疾患の異種群である。これらの変異は癌原遺伝子の機能を改変し、ＤＮＡ修復の異常調節、増殖およびアポトーシスシグナル伝達を引き起こす（Ｔａｎｎｏｃｋ、２００５年）。細胞群内のシグナルの異常調節は非制御増殖をまねき、浸潤は隣接組織に直接侵入して破壊するか、あるいは転移してリンパ系もしくは血流を経て体の他の部分に広がる。
【００１９】
機能障害を起こしているＭｅｔおよびＨＧＦ系は多数のヒト悪性腫瘍の重要な特徴であることが明らかになっている。マウスおよびヒト細胞株においてＨＧＦおよび／またはｃ‐Ｍｅｔが異所性過剰発現すると、それらは無胸腺ヌードマウスにおいて腫瘍形成性および転移性表現型を生じるようになる（Ｒｏｎｇら、１９９４年）。ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ経路は、膀胱、胸部、頚部、結腸直腸、子宮内膜、食道、胃、頭頚部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、卵巣、膵臓、前立腺および甲状腺の癌などのヒト悪性腫瘍の大半の非制御経路の中の１つであることは多数の研究から分かっているが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ／）、これらに限定するものではない。最後に、ｃ‐Ｍｅｔの活性化変異はヒト乳頭状腎細胞癌の散発性遺伝型において発見されている（Ｄａｎｉｋｏｖｉｔｃｈ‐ＭｉａｇｋｏｖａおよびＺｂａｒ、２００２年）。キナーゼドメイン内の配列を変更するこれらの変異は  固形腫瘍および転移病変の他のタイプにも見られる。この時点で、ＨＧＦ過剰発現または誤発現が予後不良に関連していることが多いこと、またヒト腫瘍細胞内のｃ‐ＭｅｔまたはＨＧＦ発現の下方制御が腫瘍原性を低下させることは言及する価値がある（Ａｂｏｕｎａｄｅｒら、２００２年）。
癌におけるＭｅｔの活性化はリガンドの自己分泌またはパラ分泌の活性化を経て起こることが最も多い。ｃ‐ＭｅｔおよびＨＧＦの両方を発現する骨肉腫および神経膠芽細胞腫多形性は機能不全の自己分泌制御の例である。パラ分泌制御が卓越している他の例では、ヒト原発腫瘍でｃ‐Ｍｅｔが過剰発現することが報告されており、一方ＨＧＦは腫瘍自体ではなく間質細胞により提供される（Ｈｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈら、１９９０年；Ｋｕｎｉｙａｓｕら、１９９２年；Ｈａｒａら、１９９８年；Ｔｏｎｇら、２００４年、Ｍｉｌｌｅｒら、２００６年；Ｂｅａｎら、２００７年）。
【００２０】
ｃ‐Ｍｅｔ過剰発現が検出されている新生物のリストは絶えず増えている。癌の場合、ほぼすべての悪性腫瘍で過剰レベルのｃ‐Ｍｅｔ発現が見られている（Ｄａｎｉｋｏｖｉｔｃｈ‐ＭｉａｇｋｏｖａおよびＺｂａｒ、２００２年）。受容体の過剰発現は閾値以下のリガンド濃度に反応する細胞を生成する局所受容体オリゴマー形成を可能にする。ＨＧＦ自体はｃ‐Ｍｅｔの転写を開始させることが可能であり（Ｂｏｃｃａｃｃｉｏら、１９９４年）、したがってそれは、全身で間質細胞により広く発現するＨＧＦであり、通常ｃ‐Ｍｅｔの腫瘍過剰発現を操作する（Ａｇｕｉｒｒｅ  Ｇｈｉｓｏら、１９９９年；Ｐａｒｒら、２００４年）。ＨＧＦのこの独自性により、癌細胞の増殖や転移を支援するパラ分泌陽性フィードバックループに関与する重要な役割をＨＧＦが担えるようになる。興味深いことにこの考えは、ｃ‐Ｍｅｔ活性化変異がＨＧＦによる触媒効果の促進を必要としているという所見と一致する（Ｍｉｃｈｉｅｌｉら、１９９９年）。ＨＧＦは神経膠芽細胞腫（Ｗｅｉｄｎｅｒら、１９９０年）、乳癌（ＰｏｔｅｍｐａおよびＲｉｄｌｅｙ、１９９８年）、横紋筋肉腫（Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９４年）および骨肉腫（Ｒｉｄｌｅｙら、１９９５年）で述べられているように、自己分泌方式でｃ‐Ｍｅｔを異常に刺激する可能性もある。複数の活性化メカニズムにより、ＭｅｔおよびＨＧＦは共に、大半のヒト癌の進行の主要な要因であることが明らかになっている。また、増殖、侵入、血管新生および抗アポトーシスの際のｃ‐ＭｅｔおよびＨＧＦの明らかになっている活性（Ｗｅｉｄｎｅｒら、１９９０年；Ｒｏｎｇら、１９９４年；Ｋｉｔａｍｕｒａら、２０００年；Ｘｉａｏら、２００１年；Ｗａｎｇら、２００２年；Ｄｅｒｋｓｅｎら、２００３年）は、これらの分子が腫瘍成長に関与する異なるステージを明確に区別している。
【００２１】
ｃ‐Ｍｅｔは癌の一般的なマーカーとして使用しているが、予後不良と相関するレベルが高いことから、悪性腫瘍および患者予後に関する生物学的有意性の指標でもある。したがってｃ‐ＭｅｔおよびＨＧＦを阻害する分子は多くの癌の分子要因に干渉することが期待され、有効な抗癌／抗血管新生薬としてＨＧＦアンタゴニストの使用可能性を確認してきたＨａｒｄｉｎｇ  ｌａｂの近年の研究を軽減することに有意に役立つはずである（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年、Ｋａｗａｓら、２０１１年；Ｋａｗａｓら、２０１２年）。
黄斑変性症／糖尿病性網膜症：加齢に伴う黄斑変性症（ＡＲＭＤ）は６０歳を超える米国人の不可逆的失明の最も多い原因である。退職後に、ある程度の加齢に伴う視覚損傷を患う米国人が１千万人になることが予想される。正常かつ健常な眼では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は光受容体に隣接した偏光単層を形成し、網膜恒常性および視覚機能に必須の多様な活性を含む。黄斑変性症の場合、不都合にも、炎症があるためにＲＰＥ細胞間の結合および伝達が喪失している。炎症が起こると、ＲＰＥ細胞はＨＧＦ／ＳＦを含む多くの増殖因子を分泌し、これはＲＰＥの分裂および遊走、ならびに既存の血管からの新たな血管の形成（血管新生）を刺激するものである。ＨＧＦは他の増殖因子（例えばＶＥＧＦ）の産生も刺激し、近隣間質に侵入する新血管の形成をさらに促進する（Ｊｕｎら、２００７年）。したがって、ＨＧＦブロッカーは、予防的に使用するか、または疾患の進行およびそれに続く失明を遅らせる治療として使用することが可能である。
【００２２】
硝子体腔に血管が侵入することが特徴的な網膜特有の血管新生を伴う増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）は、増殖性チャネルの周囲に出血および瘢痕を併発する（Ｋａｔｓｕｒａら、１９９８年）。通常でも、ＰＤＲに特異的にも、多数の増殖因子が血管新生過程の開始および進行に関与しているという十分な根拠がある。これらには、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ‐Ｉ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＨＧＦが挙げられる。これらのうち、ＨＧＦは内皮増殖およびマイトジェン活性に最も顕著な効果を示す（Ｂｏｕｌｔｏｎ、１９９９年）。ＰＤＲ患者における硝子体液中のＨＧＦレベルが非糖尿病患者より大幅に高いこと、またＨＧＦレベルはＰＤＲの活動期で特に高いことを示す研究もある（Ｋａｔｓｕｒａら、１９９８年）。このことはＨＧＦがＰＤＲの血管新生を刺激しているか、または持続させることを示唆するものである。したがって、ＨＧＦアンタゴニストは予防的処置として期待される選択肢、あるいはＰＤＲの進行を改善するものと考えることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−Ｃ】水迷路中の空間学習に対するジヘキサ（Ｄｉｈｅｘａ）の効果。Ａ：試験開始３０分前に、ラット脳室内に（ＩＣＶ）スコポラミンを直接投与し、１０分後にＩＣＶでジヘキサを１０ｐｍｏｌ（低量）または１００ｐｍｏｌ（高量）投与した。これを第１の訓練試験の前に毎日行った。１日当たり５回の試験を８日間行った。基台を見つけるまでの時間を学習と記憶の尺度とした。高量のジヘキサを投与されたラットはスコポラミン不足を完全に克服し、対照と何ら変わらなかった。Ｂ．試験開始３０分前に、ラット脳室内に（ＩＣＶ）スコポラミンを直接投与し、１０分後に経口でジヘキサを１．２５ｍｇ／ｋｇ／日（低量）および２ｍｇ／ｋｇ／日（高量）投与した。これを第１の訓練試験の前に毎日行った。１日当たり５回の試験を８日間行った。基台を見つけるまでの時間を学習と記憶の尺度とした。高量のジヘキサを投与されたラットはスコポラミンによる失敗を完全に克服し、対照と何ら変わらなかった。Ｂ：雌雄および年齢（２２〜２６月齢）が混在した老齢ラットを無作為に、対照／非投与群またはジヘキサ投与群（２ｍｇ／ｋｇ／日）に割り振った。ラットは事前にスクリーニングしなかった。なお通常、老齢ラットの５０％以下で失敗が見られ、よってエラーを出す群は多い。ジヘキサ群は非投与対照群より有意に良好に遂行できた。
【図２Ａ−Ｂ】ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは用量依存的にスパイン形成を刺激する。Ａ）ジヘキサおよびＢ）Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶはｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入された海馬ニューロン内のスパイン密度を用量依存的に上昇させる。広範な濃度で５日間、ニューロンをジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで刺激した。個々の培養物から得られたデータ；固定の時点で培養物は１２日間経ていた。代表として５０μｍの樹状突起断片上の樹状突起スパインの数を手動で計数した。＊＊＝ｐ＜０．０５、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ｎ＝５０；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ξ＝対照と有意差。
【図３Ａ−Ｅ】Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサ投与ニューロンのスパイン形成に対する時間依存的効果。培養物中で５日間、あるいはインビトロ１２日目（ＤＩＶ１２）の固定前の３０分間、ｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入した海馬ニューロンに１０−１２ＭのジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶを投与し、スパイン形成を促進する。Ａ）５日目の賦形剤投与海馬ニューロンの樹状枝の典型的な画像。Ｂ）１０−１２Ｍのジヘキサで５日間刺激したニューロンから得た樹状枝の典型的な画像。Ｃ）１０−１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで５日間刺激したニューロンの樹状枝の典型的な画像。Ｄ）５日間のインビトロ処理後の治療条件別の５０μｍ樹状突起長当たりスパイン数を示す棒グラフ。＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ＝２００。Ｅ）急激な３０分間の処理後の治療条件別の５０μｍ樹状突起長当たりスパイン数を示す棒グラフ。＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ＝６０。＊個々の培養物から得られたデータ；固定の時点で培養物は１２日間経ているものであった。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ後知恵検定において平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．
【図４】Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサはスパイン頭幅を広げる。シナプス強度の指標としてスパイン頭の幅を測定した。表面積が大きいスパイン頭は、より多くの神経伝達物質受容体に適合し、機能的シナプスを形成しやすい。ＡｎｇＩＶ類似体投与で誘導したスパイン頭幅の増加は神経伝達の促進を示唆している。＊＊＊＝ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝１００。
【図５Ａ−Ｇ】Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサで刺激したニューロンの神経伝達物質パターン。ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶを投与したニューロンを一般的なシナプス前マーカーであるシナプシンおよびグルタミン酸作動性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１に対して免疫染色した。シナプス後スパイン（赤）およびシナプス前の染色点（緑）との割合相関性を機能的シナプスの指標として測定した。Ａ）賦形剤Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサ投与後のスパイン数の増加を示す棒グラフ。これはニューロン内の活性的表現型を確保する（＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）。Ｂ）グルタミン酸作動性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１に対する投与誘導型シナプス後スパインの割合相関性を示す棒グラフ。シナプス前マーカーとシナプス後スパインとの割合相関性が高いことは機能的結合が形成されていることを示唆している（Ｐ＞０．０５；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）。Ｃ）ニューロンの健全性を確保する賦形剤、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサ投与後のスパイン数の増加を示す棒グラフ（＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）。Ｄ）一般的なシナプス前マーカーシナプシンに対する投与誘導型シナプス後スパインの割合相関性を示す棒グラフ。刺激されたニューロンと賦形剤対照を投与されたニューロンとの間には有意差は見られず（Ｐ＞０．０５；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）、大部分のシナプス前入力がグルタミン酸作動性であることを示唆している。Ｅ）活性的表現型を確保する賦形剤Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサ投与後のスパイン数の増加を示す棒グラフ（＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）。Ｆ）シナプス後マーカーＰＳＤ‐９５に対する投与誘導型シナプス後スパインの割合相関性を示す棒グラフ。Ｇ）シナプス後マーカーＰＳＤ‐９５とシナプス後スパインとの間に有意差（Ｐ＞０．０５；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）が無いことを示す棒グラフであり、新たに形成されたスパインが機能的シナプス後要素を有することを示唆している。
【図６Ａ−Ｂ】解離した海馬ニューロン内の微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）。Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサ投与は微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）の周波数を高める。記録の前に５日間、賦形剤、１０−１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサを投与した解離海馬ニューロンで記録を行った。ストリキニーネ、ピクロトキシンおよびテトロドトキシンの存在下で、運ばれる活動電位が無い場合、記録した電流はＡＭＰＡ媒介シナプス伝達の自然発生バーストであった。Ａ）Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサ投与した海馬ニューロンから得たｍＥＰＳＣ記録の典型的な波形である。Ｂ）Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサ投与した海馬ニューロンに起因するＡＭＰＡ媒介周波数増加を示す棒グラフ。周波数の増加はＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサにより誘導されたスパインが機能的シナプスを支持していることを示す。＊＊＊＝ｐ＜０．００１；±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５。
【図７Ａ−Ｂ】器官型海馬スライス培養物からのＣＡ１海馬ニューロンにおけるＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサ依存性スパイン形成の評価。Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサはＣＡ１海馬ニューロンにおけるスパイン形成を支持することが分かった。より無傷の環境を示す器官型海馬スライス培養物（４００μｍ厚）に微粒子銃で溶解性赤色蛍光タンパク質Ｔｏｍａｔｏを形質移入した。学習中、その公知の塑性応答のために、評価にはＣＡ１海馬ニューロンを選択した。出生後５日ラットからスライスを得た。Ａ）Ｔｏｍａｔｏを形質移入した海馬スライスからのＣＡ１ニューロン樹状突起の典型的な画像。画像は１０〜１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサの投与の２日目である。Ｂ）ＣＡ１錐体海馬ニューロンで投与誘発型スパイン形成が見られる。対照スライスで測定したスパイン数は５０μｍの樹状突起長当たり７個であり、それに対してＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサ投与したニューロンでは５０μｍの樹状突起長当たり、スパインは１１個であった；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝１７；＊＊＝Ｐ＜０．０１一元配置ＡＮＯＶＡ、その後のＴｕｋｅｙ多重比較試験での統計学的有意性；実験は少なくとも３回繰り返した。
【図８】ＨＧＦは用量依存的にスパイン形成を促進する。解離海馬ニューロンのスパイン形成に対するＨＧＦの効果。１または２日齢のラット由来の解離海馬ニューロンにｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入し、５日間ＨＧＦで刺激した。２．５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ投与は基部スパイン数に影響せず、閾値以下と考えられた。賦形剤対照投与ニューロンと比較して、５、１０および２０ｎｇ／ｍｌ用量は５０μｍ樹状突起長当たりのスパイン数を有意に増加させた。＊＊＊Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝５０／投与群。
【図９Ａ−Ｂ】器官型海馬スライス培養物中のスパイン形成に対するジヘキサおよびＨＧＦの効果。ＤＩＶ３に、海馬スライス培養物に微粒子銃で赤色溶解性タンパク質Ｔｏｍａｔｏを形質移入し、ＤＩＶ５にジヘキサまたはＨＧＦで刺激した。器官型海馬スライス培養物はより多くの無傷貫通路を維持し、よって無傷環境がより広いことを意味する。Ａ）ＣＡ１ニューロンの典型的な画像、学習関連性シナプス可塑性を示す海馬の神経細胞型。海馬スライスを賦形剤、１０−１２Ｍのジヘキサまたは１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで２日間刺激した。Ｂ）各投与群における５０μｍの樹状突起長当たりのスパイン数を表す棒グラフ。対照投与ニューロンと比較して、ジヘキサおよびＨＧＦはＣＡ１海馬ニューロン上のスパイン数を有意に増加させる。＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；対照ではｎ＝２０、ジヘキサ刺激ニューロンでは２６、ＨＧＦ刺激ニューロンでは３８.
【図１０Ａ−Ｄ】解離海馬ニューロンにおけるシナプス形成に対するＨＧＦ投与の効果。シナプス後スパイン（赤）とシナプス前活性領域（緑）のマーカーとの高い相関性で示されるように、ＨＧＦ投与は機能的シナプス形成を支持する。Ａ）ＤＩＶ６にｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入し、インビトロで５日間１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦまたは賦形剤投与した海馬ニューロンの典型的な画像。ニューロンを一般的なシナプス前マーカーであるシナプシンおよびグルタミン酸作動性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１に対して染色した。Ｂ）ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の刺激後の５０μｍの樹状突起長当たりのスパイン数の有意な増加に示されるような、活性的表現型を表す棒グラフ。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ多重比較試験ではスパインの平均数＝３３、対して対照＝２３；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝２５）。Ｃ）一般的なシナプス前マーカーであるシナプシン（緑）と対比させた富アクチンシナプス後スパイン（赤）の割合相関性。高い割合相関性は機能的シナプスが形成されたことを示唆している。Ｄ）グルタミン酸作動性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１（緑）と対比させた富アクチンスパイン（赤）の割合相関性。９５％超の相関性は、これらの入力の多くがグルタミン酸作動性であることを示唆している。
【図１１】解離海馬ニューロンにおけるｍＥＰＳＣの周波数に対するジヘキサおよびＨＧＦ投与の効果。ｍＥＰＳＣの記録前の５日間、ｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入した解離海馬ニューロンを１０−１２Ｍのジヘキサまたは１０ｎｇ／ｍｌで刺激した。テトロドトキシン、ピクロトキシンおよびストリキニーネをニューロンに投与し、活動電位、ＧＡＢＡ依存性阻害およびグリシン依存性阻害を抑制した。賦形剤投与したニューロンと比較して、両アゴニスト投与はＡＭＰＡ媒介電流を有意に促進した（一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＮｅｗｍａｎ‐Ｋｅｕｌｓ後知恵検定では、＊＊Ｐ＜０．００２；±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；それぞれｎ＝９，９および１１）。
【図１２Ａ−Ｂ】最大および閾値以下用量のアンジオテンシンＩＶ類似体およびＨＧＦのスパイン形成に対する効果。Ａ）閾値以下レベルのＨＧＦ、ジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは基部スパイン数に影響を及ぼさない。閾値以下レベルのジヘキサ（１０−１３Ｍ）およびＨＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）の併用は、生物学的有効量のジヘキサ単独での効果を表現型模写する；＃＝１０−１３Ｍおよび＄＝２．５ｎｇ／ｍｌ。閾値以下量の親化合物Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（１０−１３Ｍ）はまた、基部スパインレベルに影響を及ぼすこともない。閾値以下レベルのジヘキサ（１０−１３Ｍ）およびＨＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）の併用は、生物学的有効量のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ単独での効果を表現型模写する；＃＝１０−１３Ｍおよび＄＝２．５ｎｇ／ｍｌ。閾値以下量のアゴニストの組み合わせが最大の応答をもたらす能力は受容体経路の共有を示唆している。＊＊＊Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝５０。
【図１３Ａ−Ｄ】アンジオテンシンＩＶリガンドおよびＨＧＦ媒介スパイン形成に対する新規ＨＧＦアンタゴニストＨｉｎｇｅの効果。Ａ）スパイン形成に対するＨＧＦアンタゴニストＨｉｎｇｅ（１０−１２Ｍ）の効果を評価した。広範な用量でＨｉｎｇｅはニューロン内のスパイン形成に影響を及ぼさない；ニューロンが治療に応答することを確実にするためにジヘキサを含有させた。Ｂ）ＨｉｎｇｅはＨＧＦ誘導型スパイン形成を阻害し、Ｃ）ＨｉｎｇｅはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ誘導型スパイン形成を阻害し、Ｄ）Ｈｉｎｇｅはジヘキサ誘導型スパイン形成を阻害する。＃＝１０−１２Ｍおよび＄＝１０ｎｇ／ｍｌ。上記データはさらに、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサの作用がＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系に媒介されていることを示している。＊＊＊Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝５０。
【図１４Ａ−Ｄ】解離海馬ニューロンにおけるＨＧＦおよびジヘキサ媒介ｍＥＰＳＣ促進に対するＨＧＦアンタゴニストＨｉｎｇｅの効果。活動電位の非存在下でＥＰＳＣを記録した後５日間、解離海馬ニューロンにＨｉｎｇｅ（１０−１２Ｍ）、ＨＧＦ、ジヘキサ（１０−１２Ｍ）またはＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を投与した。Ａ）Ｈｉｎｇｅ投与ニューロンの典型的な波形。Ｂ）賦形剤投与したニューロンの典型的な波形。Ｃ）対照を投与したニューロンと比較してＨＧＦはＡＭＰＡ媒介周波数を有意に増強する。この効果はＨｉｎｇｅにより弱まり、Ｈｉｎｇｅ単独では効果が表れない。Ｄ）自然発生ＡＭＰＡ媒介周波数はジヘキサ投与後では有意に増加し、単独ではベースライン周波数に効果を示さないＨｉｎｇｅの前処理後では有意に減少した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＮｅｗｍａｎ‐Ｋｅｕｌｓ後知恵検定では、＊Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．
【図１５Ａ−Ｂ】成体ラット脳におけるｃ‐Ｍｅｔタンパク質の分布。成体Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットから全脳領域を得て、液体窒素で急速冷凍した。資料を均質化し、電気泳動で分離し、ｃ‐Ｍｅｔタンパク質およびアクチンに対して免疫ブロッティングした。Ａ）棒グラフは認知にとって重要な明確な脳領域におけるｃ‐Ｍｅｔ（非特異性単位）の量を表す。ＨＧＦが産生される肝臓と脳試料を比較した。Ｂ）試料の典型的なウエスタンブロッティングにより、ｃ‐Ｍｅｔタンパク質（バンドは１４５ｋＤａ）および負荷コントロールとして作用するアクチンを調べた。ＢＣＡタンパク質決定に基づいて、等量のタンパク質を各レーンにロードした。
【図１６】ラット海馬スライスでのＨＧＦおよびジヘキサによるｃ‐Ｍｅｔリン酸化の刺激。成体ラット脳でジヘキサはｃ‐Ｍｅｔ受容体を活性化するかを試験するために、海馬スライスをＨＧＦ、ジヘキサまたは賦形剤（ａＣＳＦ）で３０分間強く刺激した。ウエスタンブロットでｃ‐Ｍｅｔ受容体のリン酸化により受容体活性化を測定した。賦形剤投与スライスと比較して、飽和量のＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびジヘキサ（１０−１０Ｍ）は、強く刺激した成体海馬スライス内でｃ‐Ｍｅｔのリン酸化を効果的に増強する。対照と比較して、閾値以下量のＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびジヘキサ（１０−１２Ｍ）はｃ‐Ｍｅｔのリン酸化を有意に増加させることはなかった。しかし、閾値以下量のＨＧＦおよびジヘキサの併用は、飽和量のＨＧＦおよびジヘキサを表現型模写した。
【図１７】ｃ‐Ｍｅｔ活性化に対するＨＧＦ模倣薬ジヘキサの効果。ＨＥＫ２９３細胞に様々な用量のＨＧＦ＋／−ジヘキサを投与し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、免疫ブロッティングによりリン酸化（活性化）ｃ‐Ｍｅｔについて分析した。結果により、相乗的に作用してｃ‐Ｍｅｔを活性化するＨＧＦとジヘキサとの能力が明確に示された。
【図１８】ＨＧＦ模倣薬、ジヘキサ、ＨＧＦ依存性細胞散乱の効果。細胞散乱をＭＤＣＫ細胞で評価した。カバースリップ上で、集密になるまで細胞を増殖させ、その後、清潔なプレートに移した。４日間処理した後、カバースリップ外に散乱した細胞の数を定量した。ＨＥＸ＝１０−１０Ｍのジヘキサ。
【図１９】ｃ‐Ｍｅｔ受容体ノックダウンの検証。ｍＲＦＰ‐β‐アクチン（未形質移入）、タンパク質の存在を検証するために作用する６Ｍｙｃタグ化ｃＭｅｔ遺伝子生成物、ｓｈＲＮＡ（ｃ‐Ｍｅｔ）配列（ｓｈ１のみノックダウン実験で使用した）、および両ｓｈＲＮＡの複合体をＨＥＫ細胞に形質移入して受容体ノックダウンを確認した。形質移入された細胞をさらに２４時間培養し、その後、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、ゲル電気泳動用に調製した。ウエスタンブロッティングでＭｙｃに対して試料を調べた。陰性対照として作用する未形質移入細胞はシグナルを示さず、６‐Ｍｙｃタグ化ｃＭｅｔ遺伝子生成物が陽性対照であり、強いシグナルを示した。ｓｈＭｅｔ１およびｓｈＭｅｔ２配列は両方ともシグナルを大幅に減弱化し、複合体は受容体の効果的なノックダウンを表すシグナルを示さなかった。
【図２０】ｓｈＲＮＡを使用したスパイン形成に対するｃ‐Ｍｅｔノックダウンの効果。写真はＭｙｃについて調べたウエスタンブロッティングを示す。ｃ‐Ｍｅｔ受容体をノックダウンするためにｍＲＦＰ‐β‐アクチン単独またはｓｈＭｅｔを形質移入した海馬ニューロンをＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ジヘキサ（１０〜１２Ｍ）またはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（１０〜１２Ｍ）で４８時間刺激した。ｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入し、ＨＧＦ、ジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで刺激したニューロンはスパイン形成を有意に増加させた（＊Ｐ＜０．０５；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝１００）。ｍＲＦＰ‐β‐アクチンおよびｓｈＭｅｔを形質移入したこれらのニューロンはＨＧＦ、ジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与での刺激に反応することなく、ＨＧＦおよびｃ‐Ｍｅｔが標的であることが確認された（Ｐ＞０．０５；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝１００）。
【図２１】ＨＧＦおよびｃ‐Ｍｅｔは空間学習および記憶に関する機能を有する。学習と記憶に対するＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔの効果を解明するために、空間学習と記憶の課題であるモリス水迷路に沈めた基台に到着するまでの時間をラットで試験した。ラットに健忘症薬またはＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ受容体アゴニストを脳室内注射した。スコポラミン→スコポラミンを投与したラットは逃避時間で測定されたように課題を学習できない。訓練１日目では、ａＣＳＦ→ａＣＳＦを投与したラット群の時間は、スコポラミン投与群より有意に短かった。スコポラミン→ジヘキサ投与したラットおよびＨｉｎｇｅ→Ｈｉｎｇｅ投与したラットは訓練１日目ではスコポラミン投与群と有意差は無いが、課題の急速な円滑化が見られる。スコポラミン＋Ｈｉｎｇｅ→ジヘキサを投与した群はスコポラミン投与動物との有意差は見られず、逃避時間が長かった。空間学習と記憶の課題であるモリス水迷路に沈めた基台に到着するまでの群内での時間。Ｈｉｎｇｅ単独では学習効果は見られず；しかし、スコポラミンに加えたＨｉｎｇｅは課題の円滑化を妨げる。
【図２２】Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２と比較したラット血液におけるノルレウアル（Ｎｏｒｌｅｕａｌ）の安定性。  −▲−  ノルレウアルおよび−■−  Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２を、ヘパリン投与したラット血液中、３７℃でインキュベートした；図は経時的な回収率の割合を示す（平均±ＳＤ）。ノルレウアルの単相指数関数的減衰に基づいて計算した安定性ｔ１／２は４．６分であり、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の安定性ｔ１／２は７９．９７分であった。
【図２３】Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体とＨＧＦの結合。ＨＧＦに結合するＤ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体と３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅとの競合を示す典型的な曲線。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体および３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅ（１３．３ｘ１０−１２Ｍ）を０．２５ｍｌの緩衝液中、３７℃で４０分間、１．２５ｎｇのＨＧＦと共にインキュベートした。異なる濃度のＤ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体（１０−１３〜１０−７Ｍ）を添加した後、ＨＧＦ結合ＨｉｎｇｅをＢｉｏ‐ＧｅｌＰ６カラムから溶出した。溶出した溶液の放射活性をシンチレーション計測により定量した。これらのデータから、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＨＧＦに対する広範な親和性を示すことが明らかになった。Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、ＣｙｓおよびＴｙｒ類似体についてのＫＩｓを測定し、それぞれ１．３７５×１０−０７Ｍ、３．３７２×１０−０９Ｍ、１．３３０×１０−１０Ｍ、および２．４２６×１０−１０Ｍであった；Ｎ＝９．−△−  Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２、−●−  Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２、−□−  Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２、−▽−  Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２。
【図２４】Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体によるＨＧＦ二量体化の阻害。ＨＧＦはヘパリン存在下でＰＢＳ中でインキュベートすると  自発的に二量体化する。１０−１０Ｍの様々な候補薬の非存在下（対照）または存在下で、ＨＧＦをインキュベートした。これらには、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミドの誘導体、ＡｎｇＩＶをベースにした類似体ファミリーが含まれ、ここではＸ＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ＴｒｐおよびＭｅｔである。３０分のインキュベート後に、試料をＢＳ３と架橋し、ゲル電気泳動で分離し、銀色染色した。バンド密度を定量し、各群のＨＧＦ二量体化レベルを測定するために使用した。治療群（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ）はＨＧＦ治療群と統計的に差があった（Ｐ＜０．０５；Ｎ＝８）（Ａ）典型的なゲル。（Ｂ）蓄積され、定量されたデータ。
【図２５】Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体によるＭｅｔリン酸化の阻害。ＨＥＫ２９３細胞を指示濃度のＨＧＦ＋／−Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミド類似体で１０分間処理した。ＨＥＫ２９３細胞溶解物を抗ホスホ‐Ｍｅｔおよび抗Ｍｅｔ抗体で免疫ブロッティングした。ＨＧＦ治療群と比較して指示治療群（Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミド類似体）間のＭｅｔリン酸化の平均値の差は、偶然を期待するよりさらに大きいものであった（Ｐ＜０．０５；Ｎ＝６）。Ｍｅｔ群はＨＧＦ群と差はなかった（Ｐ＞０．０５；Ｎ＝６）。
【図２６】ＭＤＣＫ細胞増殖に対するＤ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体の効果。ＰＢＳ賦形剤（陰性対照）、１０−１０Ｍ濃度のＨＧＦまたはＨＧＦとＮｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミド類似体（Ｘ＝Ｌ‐アミノ酸）の複合体をＭＤＣＫ細胞に処理した。ＨＧＦの二量体化ドメインの代表であるＨｉｎｇｅペプチド（ＫＤＹＩＲＮ）を陽性対照とした。細胞を４日間培養した。４日目に細胞数をＭＴＴアッセイにより、５９０で吸光度を測定して算出した。％ＨＧＦ依存性増殖：数値すべてから対照の数値を差し引き、ＨＧＦに誘導された細胞増殖の増加を判定した。Ｎ＝６。＊＊＊ｐ＜０．００１。＊＊ｐ＜０．００１。＊ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意差なし。
【図２７】ＭＤＣＫ細胞のＨＧＦ依存性散乱に対するＤ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体の効果。細胞が細胞同士で接触できなくなり、その後急速に遊走する細胞散乱はＨＧＦに対する典型的な応答である。ＨＧＦ／Ｍｅｔ系を研究するための優れた標準細胞モデルであるＭＤＣＫ細胞をカバースリップ上で、１００％集密になるまで増殖させ、その後、清潔なプレートに載せた。培地単独、またはＮｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミド類似体（Ｘ＝Ｌ‐アミノ酸）を組み合わせた培地に２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを添加して、細胞を刺激し、カバースリップ外に散乱させた。散乱の４８時間後に、細胞をメタノールで固定し、Ｄｉｆｆ‐Ｑｕｉｋで染色した。カバースリップを除去し、カバースリップ外に散乱してプレート上にある細胞のリングを露呈させた。（Ａ）散乱に対するＨＧＦの効果は、散乱した細胞から得たデジタル画像での濃度測定で定量した。ＡＮＯＶＡ分析により、Ｔｒｙ＋ＨＧＦ、Ｃｙｓ＋ＨＧＦ、およびＴｒｐ＋ＨＧＦを投与した群はＨＧＦ単独投与群と差があったが、対照群とは差がないことが示された。ＨＧＦ群およびＨＧＦ＋Ｍｅｔ群に差はなかった。Ｎ＝８、ｐ＜０．０５（Ｂ）カバースリップ外に散乱しているＭＤＣＫ細胞の典型的な写真。
【図２８】ＭＤＣＫ細胞散乱の阻害と二量体化への干渉とＨＧＦへの結合親和性との間の相関。二量体化阻害の割合および各化合物とＨＧＦとの結合親和性がインビトロ細胞活性、すなわちＭＤＣＫ細胞散乱の阻害と相関しているか否かを判定するために、ＸがＣｙｓ、ＴｒｐまたはＭｅｔであるＤ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミドの誘導体を試験した。図は、ＨＧＦへの結合親和性（−●−；ＫＩ値；Ｒ２＝０．９９０３）にも関するＨＧＦ二量体化（−◆−；Ｒ２＝０．９８０９）の阻害割合と、ＨＧＦ依存性細胞散乱の阻害割合との間の強い相関関係を示す。
【図２９】Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２によるＢ１６‐Ｆ１０メラノーマ肺コロニー形成の阻害。４００，０００個のマウスメラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾に静脈注射した。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミド（１０μｇ／ｋｇ／日または１００μｇ／ｋｇ／日）またはＰＢＳ賦形剤を腹腔内注射でマウスに毎日投与した。（Ａ）１４日後、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミドを投与したマウスから得た肺は、未投与の対照と比較して、メラノーマコロニーが顕著に減少していた。（Ｂ）切除後に、肺を均質化し、総メラニン量を分光光度により測定し、賦形剤投与およびＤ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノ‐ヘキサンアミド投与した肺メラノーマコロニー形成の全量を定量するために使用した。移植していない年齢適合対照群の肺では、４１０ｎｍでバックグラウンド吸光度を示した。Ｎ＝１５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
治療の用途が多様であるＨＧＦのペプチド類似体または模倣体（「増殖因子模倣体」または「類似体」とも称する）は以下の一般構造式を有する：
2014511858.tif 000003
式中、
Ｒ１は、例えばヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイル（ａｃｅｔａｎｏｙｌ）またはベンゾイルなどのＮ‐アシル基、
置換または非置換フェニル、
ＤまたはＬ型ノルロイシン、
例えばリジン、アルギニン、ノルバリン、オルニチンまたはＳ‐ベンジルシステインアミノ酸残基などのアミノ酸（ＤまたはＬ型）であり；
Ｒ２は例えばチロシン、システイン、フェニアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、トリプトファン、リジン、ホモシステイン、ホモセリン、ホモフェニルアラニンなどのアミノ酸（ＤまたはＬ型）であり；
Ｒ３はＤまたはＬイソロイシン、ロイシンまたはバリンアミノ酸残基であり；
ｎは３〜６の範囲にあり；
また式中、共有結合１、２および３はペプチド結合（例えば、‐ＣＯ‐ＮＨ‐、または還元ペプチド結合（ＣＨ２‐ＮＨ２）のいずれかである。
【００２５】
例としてペプチド結合および還元ペプチド結合を下記に表す：
ペプチド結合                        還元ペプチド結合
2014511858.tif 000004
【００２６】
一般構造式内の化合物は下記の手順にしたがって合成し、分析している。
【００２７】
標準的合成法：
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を使用して、ＡＡＰＰＴＥＣ  Ｅｎｄｅａｖｏｒ９０ペプチド合成装置により固相法で全化合物を合成した。  すべてのペプチドアミドをＲｉｎｋ樹脂上で合成した。樹脂はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で事前に発泡させ、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３０分間脱保護した。その後、ピペリジン／ＤＭＦをろ過により除去した。脱保護後、Ｎ‐αＦｍｏｃ保護アミノ酸を乾燥粉末として反応器に添加した（３当量）。次いで、ＤＭＦを容器の２／３まで入れ、乾燥ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；３．５〜４当量）を添加した。次に、Ｎ‐［（１Ｈ‐ベンゾトリアゾール‐１‐イル）（ジメチルアミノ）メチレン］‐Ｎ‐メチル‐メタンアミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ‐オキシド（ＨＢＴＵ；２．９当量）を添加し、懸濁液を３０分間混合した。その後、溶液をろ過により除去した。次いで、樹脂をＤＭＦで２回、メタノールで２回、ジクロロメタンで２回洗浄し、最後にＤＭＦでさらに２回洗浄した。各洗浄後、溶液をろ過により除去した。遊離アミンについてＫａｉｓｅｒテストを行いカップリング効率をモニターした。試験が陽性であれば、アミノ酸を樹脂または増殖ペプチド鎖に再カップリングさせた。試験が良好な結合を示したなら、樹脂をＤＭＦでもう１度洗浄し、上記のように２０％ピペリジン／ＤＭＦで３０分間脱保護し、再度ＤＭＦで洗浄した。その後、上記のようにカップリングを進めた。
【００２８】
ペプチドＮ末端のアシル化：
最終の脱保護後、２０％の適当なアシル無水物を含むＤＭＦおよびＤＩＰＥＡ（１．５当量）と共に、ペプチド樹脂を３０分間室温でインキュベートする。次に樹脂をＤＭＦで２回、メタノールで２回、ジクロロメタンで２回洗浄し、最後にＤＭＦでさらに２回洗浄した。溶液をろ過により除去し、Ｋａｉｓｅｒテストを行いキャッピングの完全性を検証した。遊離アミンが検出されたら、キャッピング手順を繰り返した。
【００２９】
Ｎ末端還元ペプチド結合の挿入：
脱保護後、ヘキサナール（３当量）ＤＭＦを樹脂に添加し、５分間混合した。次に、３当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに２時間、懸濁液を混合した。標準的洗浄手順（上記参照）を行った後、Ｋａｉｓｅｒテストを再度行い、反応の完全性を検証した。カップリングが不完全と見なされれば、手順を繰り返した。
【００３０】
Ｒｉｎｋ樹脂からのペプチドの切断：
最後のアミノ酸を脱保護し、洗浄した後、樹脂を焼結ガラス漏斗（有孔度４）に移し、ＤＭＦを真空除去した。その後、スカベンジャーとして２．５％トリイソプロピル‐シランを含む２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に半乾燥樹脂を懸濁し、室温で１５分、インキュベートし、ろ過した。樹脂をさらにＤＭＦで３回洗浄し、ろ過した。１０容量の氷冷ジエチルエーテルを混合ろ過物に添加し、混合物を４℃で一晩、硬化させた。沈殿したペプチドをろ過で回収し、氷冷エーテルで３回洗浄した。強い疎水性のペプチド用に、混合エーテル洗浄液をＤＭＦで再抽出し、ペプチドを沈殿させ、ろ過し、さらにペプチドを回収した。
【００３１】
ペプチド精製および分析：
初めに、Ｃ１８カラムを使用して勾配溶離により、粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。典型的な勾配は、１０％〜４０％の成分Ｂにおいて３７℃で３０分間、流速１ｍｌ／分であり、ここでは成分ＡはｐＨ３．０の８０ｍＭのリン酸トリエチアミンであり、成分Ｂはアセトニトリル（ＡＣＮ）であった。全ての例で、２１５ｎｍでの吸光の単一ピークのみを検出し、回収した。回収した化合物を凍結乾燥し、２０％メタノール中に再溶解し、第２のＣ１８カラムに投入した。使用のＨＰＬＣ／ＭＳ系はＳｈｉｍａｄｚｕ（日本国、京都）社製であり、ＣＢＭ‐２０Ａ伝達手段、バスモジュール、ＬＣ‐２０ＡＤポンプ、ＳＩＬ‐２０ＡＣ自動サンプラー、ＳＰＤ‐Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器およびＬＣＭＳ‐２０１０ＥＶ質量分析計から構成されている。データ収集および統合はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳソリューションソフトウェアを使用して行った。使用した分析カラムはＧｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（米国、イリノイ州、ディアフィールド）製のＥｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（１００ｍｍ×２．１ｍｍ）であった。移動相はＨＰＬＣグレードのメタノール、およびトリフルオロ酢酸０．１％水溶液から構成されていた。非イソクラティック法（２０％〜５０％メタノール、３０分間）により３７℃、０．３ｍＬ／分の流速で分離を行った。ＭＳ分析では、陽性イオンモード（Ｓｃａｎ社）を利用し、予測したｍ／ｚでピークを分析した。一般的なピーク純度分析によりピーク純度指数が＞０．９５であることが明らかになった。ダイオードアレイ検出器での波長比演算によりピーク純度がさらに確認された。
【００３２】
下記の表１は模倣薬に挙げられるファミリー１およびアンタゴニストに挙げられるファミリー２〜５の化合物のリストであり、これらすべては上述の手順にしたがって合成および分析されている。
ファミリー１（模倣薬）およびファミリー２〜５（アンタゴニスト）の一般構造
2014511858.tif 000005
矢印１〜３はｐｂ＝ペプチド結合を意味する；Ψ＝還元ペプチド結合（ＣＨ２‐ＮＨ２）ｎ＝５
【表１】
2014511858.tif 000006
2014511858.tif 000007
【００３３】
表１に関し、合成された多数の化合物はそれぞれＲ２およびＲ３にチロシンおよびイソロイシンを有する一方で、発明の実施態様の実行では、これらの他の位置で、広範なアミノ酸および他の残基が模倣薬またはアゴニスト（それぞれファミリー１およびファミリー２〜５）として使用可能であり、これらにはチロシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、トリプトファン、リジン、ロイシン、バリン、ホモシステイン、ホモセリンおよびホモフェニアラニンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、模倣薬には表１（ファミリー１）に特定されている特定のＮ‐アシル基が含まれる一方で、発明の多様な実施態様の実行では、他のＮ‐アシル基または置換もしくは非置換フェニル基もＲ１において使用し得る。また、表１（ファミリー２〜５）の多数のアゴニストはＲ１にノルロイシンまたはアミノ酸残基を有する一方で、発明の多様な実施態様の実行では、多数のアミノ酸残基（ＤまたはＬ型）も残基Ｒ１において使用可能であり、これらにはチロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、セリン、ヒスチジン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、ノルバリン、オルニチン、Ｓ‐ベンジルシステインアミノ酸残基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。最後に、表１の合成および試験された化合物すべては５回のメチル反復配列を含み、そのメチル反復配列（回数）は、本発明のいくつかの実施態様を実行する際に３〜６回の範囲となり得る。
【００３４】
表１内の化合物は以下のようにも評価している：
ＨＧＦ模倣薬活性の評価：
【００３５】
ＨＧＦ模倣薬活性を、典型的に以下の２つの方法の１つまたは両方により評価した：ＨＥＫ２９３細胞でのＨＧＦ依存性ｃ‐Ｍｅｔリン酸化の増強、または２）ＭＤＣＫ細胞でのＨＧＦ依存性細胞散乱の増強。ｃ‐Ｍｅｔリン酸化アッセイにより、１つのファミリー内の全化合物を試験した。Ｎ‐ヘキサノイル‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐（６）アミノヘキサミド（ａｍｉｎｏｈｅｘａｍｉｄｅ）をさらに評価し、ＨＧＦ依存性ＭＤＣＫ細胞散乱を良好に増強していることが分かった。表２はその結果をまとめたものである。
【表２】
2014511858.tif 000008
【００３６】
細胞培養．ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）およびＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞をＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した。使用に先だって、細胞を９０〜１００％集密になるまで増殖させた。すべてではないがほとんどの研究では、薬物治療の開始前の２４時間、ＨＥＫおよびＭＤＣＫ細胞を血清欠乏させた。
ウエスタンブロッティング．ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルの組織培養プレートに播種し、ＦＢＳを１０％含有するＤＭＥＭ中で９５％集密になるまで増殖させた。治療前の２４時間、細胞を血清欠乏させ、ホスホ‐Ｍｅｔの基礎レベルを低下させた。血清を欠乏させた後、賦形剤およびＨＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）から成り、試験化合物を含有する／含有しない反応混液を調製し、室温で３０分間、事前にインキュベートした。その後、反応混液を細胞に添加し、１０分間、Ｍｅｔ受容体および下流タンパク質を刺激した。リン酸塩阻害剤反応混液１および２（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社；ミズーリ州、セントルイス）で強化されたＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ社）を使用して細胞を回収した。１５，０００ｇで１５分間遠心分離し、溶解物を清澄にして、ＢＣＡ総タンパク質アッセイによりタンパク質濃度を測定し、次いで、適度な量の溶解物を２×還元レムリ緩衝液で希釈し、９５℃で１０分間加熱した。同一量のタンパク質を含む試料を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により溶解し、ニトロセルロースに転写し、ミルクを５％含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中、室温で１時間ブロックした。ホスホ‐Ｍｅｔ抗体をブロッキング緩衝液に、最終濃度が１：１０００になるように添加し、弱めに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。その後、水およびＴＢＳ（ＰＢＳ、０．０５％ＴｗｅｅＮ‐２０）で膜を数回洗浄し、１：５０００希釈したセイヨウワサビ過酸化酵素結合型ヤギ抗ウサギ抗血清を添加し、膜をさらに、室温で１時間インキュベートした。タンパク質をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅシステム（Ｐｉｅｒｃｅ社、ミズーリ州、フェントン）を使用して可視化し、分子量をタンパク質ラダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；およびＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ、ＢｉｏＲａｄ社）との比較によって測定した。画像をデジタル化し、ＵＶＰホスホイメージャーを使用して分析した。
散乱アッセイ．ＭＤＣＫ細胞を６ウェルプレートのカバースリップ上で１００％集密になるまで培養し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、集密になっているカバースリップを無菌状態で、９００μｌの無血清ＤＭＥＭを含む新たな６ウェルプレートに移した。ノルレウアル、Ｈｉｎｇｅペプチド、および／またはＨＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）を適当なウェルに添加した。対照ウェルにＰＢＳ賦形剤を添加した。プレートを５％ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をメタノールで固定した。細胞をＤｉｆｆ‐Ｑｕｉｋ  Ｗｒｉｇｈｔ‐Ｇｉｅｍｓａ（Ｄａｄｅ‐Ｂｅｈｒｉｎｇ社、デラウェア州、ニューアーク）で染色し、デジタル画像を得た。カバースリップをピンセットで取り除き、さらなるデジタル画像を得た。画像の画素をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて定量し、Ｐｒｉｓｍ５およびＩｎＳｔａｔ  ｖ．３．０５を用いて統計を行った。
【００３７】
上記で説明し、下記で参照の便宜上再現した一般構造式では、上記の合成手順に従って調製して下記の治療法に使用可能な数種の異なる化合物が存在する。表３は多様なファミリーの例を、そのファミリー内の様々な化合物のリストをもって特定している（一般式内の一部を置換することにより特定される）。
表３
一般構造：
2014511858.tif 000009
矢印１〜３はｐｂ＝ペプチド結合を意味する；Ψ＝還元ペプチド結合（ＣＨ２‐ＮＨ２）
【表３】
2014511858.tif 000010
2014511858.tif 000011
2014511858.tif 000012
2014511858.tif 000013
１３〜１６  Ｒ２＝Ｓであるファミリー１〜４と同様のパターン
１７〜２０  Ｒ２＝Ｔであるファミリー１〜４と同様のパターン
２１〜２４  Ｒ２＝Ｄであるファミリー１〜４と同様のパターン
２５〜２８  Ｒ２＝Ｅであるファミリー１〜４と同様のパターン
２９〜３２  Ｒ２＝Ｙ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
３３〜３６  Ｒ２＝Ｆ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
３７〜４０  Ｒ２＝Ｃ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
４１〜４４  Ｒ２＝Ｓ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
４５〜４８  Ｒ２＝Ｔ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
４９〜５２  Ｒ２＝Ｄ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
５３〜５６  Ｒ２＝Ｅ、Ｒ３＝Ｖであるファミリー１〜４と同様のパターン
５７〜８５  Ｒ３＝Ｌであるファミリー２９〜５６と同様のパターン
８６〜１７０  ｎ＝３であるファミリー１〜８５と同様のパターン
１７１〜２５６  ｎ＝４であるファミリー１〜８５と同様のパターン
２５７〜３４１  ｎ＝６であるファミリー１〜８５と同様のパターン
2014511858.tif 000014
３４６〜３４９    Ｒ３＝Ｖであるファミリー３４２〜３４５と同様のパターン
３５０〜３５３    Ｒ３＝Ｌであるファミリー３４２〜３４５と同様のパターン
３５４〜３６５    Ｒ１＝Ｄノルバリンであるファミリー３４２〜３５３と同様のパターン
３６６〜３７７    Ｒ３＝Ｄ‐リジンであるファミリー３４２〜３４５と同様のパターン
３７８〜３８９    Ｒ３＝Ｄ‐アルギニンであるファミリー３４２〜３４５と同様のパターン
３９０〜４０１    Ｒ３＝Ｄ  Ｓ‐メチルシステインであるファミリー３４２〜３４５と同様のパターン
４０２〜４５７    ｎ＝３であるファミリー３４２〜４０１と同様のパターン
４５８〜５１３    ｎ＝４であるファミリー３４２〜４０１と同様のパターン
５１４〜５６９    ｎ＝６であるファミリー３４２〜４０１と同様のパターン
【００３８】
あるいは、本発明の類似体または増殖因子模倣体はまた、共有ペプチド結合または還元ペプチド結合によって結合した４つの構成要素から成っていることが以下のように表されている：
Ｉ‐ＩＩ‐ＩＩＩ‐ＩＶ
式中、
Ｉ＝ヘプタン酸、ヘキサン酸、ペンタン酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、安息香酸もしくは置換安息香酸、およびこれらのイソ型；あるいはＤまたはＬ型ノルロイシン、リジン、アルギニン、ノルバリン、オルニチンまたはＳ‐ベンジルシステインなどの酸
ＩＩ＝ＤまたはＬ型システイン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、チロシン、グリシン、ホモシステイン、ホモセリンまたはホモフェニルアラニンアミノ酸残基；
ＩＩＩ＝ＤまたはＬ型イソロイシン、ロイシンまたはバリンアミノ酸残基；および
ＩＶ＝アミノヘキサン酸、アミノペンタン酸、またはアミノ酪酸；式中、構成要素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶはペプチドまたは還元ペプチド結合により結合される。
【００３９】
１つの実施態様では、類似体は：ヘキサン‐チロシン‐イソロイシン‐（６）‐アミノ‐ヘキサンアミドである。一般式として式Ｉを利用して、この特定の類似体では、Ｒ１はヘキサノイルであり；Ｒ２はＴｙｒであり；Ｒ３はＩｌｅであり；ｎ＝５である。あるいはＩ‐ＩＩ‐ＩＩＩ‐ＩＶの用語を用いると、本実施態様では、Ｉ＝ヘキサン酸、ＩＩ＝Ｔｙｒ；ＩＩＩ＝Ｉｌｅ；およびＩＶ＝ヘキサンアミドである。
【００４０】
本発明の実施態様は、１種以上のＨＧＦ模倣体を必要に応じて被験体に投与することを含む。本明細書に記載の１種以上のＨＧＦ模倣体の投与などの治療から利益が得られる被験体または患者の例は一般的に哺乳動物や、通常ヒトであるが、獣医学および研究に関連する技術の応用も考えていることから、これは常にそのケースである必要はない。一般的に、治療が必要である適格な被験体または患者は、公知の試験、測定または基準により例えば医療専門家（単数または複数）に特定される。例えば、認知症の治療では、すでに認知症の症状があるか、あるいは認知症の症状を発症するリスクがある被験体が特定される。類似の特定プロセスは他の疾患および／または障害についても調査するものである（例えば癌治療、他の認知機能不全治療等）。その後、好適な治療プロトコルを、患者、疾患および／または障害およびその進行段階、ＨＧＦ模倣体およびその用量および送達形態、ならびに他の関連する要素に基づいて開発する。その後被験体はＨＧＦ模倣体での治療を受ける。例えば投薬の用量の増減、投与する模倣体の特定の型の変更、または投与回数もしくは投与経路の変更等により、必要に応じて、あるいはより利益がもたらされる可能性のある方法で、治療プロトコルを評価および／またはプロトコルを調整するために、本発明の実施態様は投与の効果または結果のモニタリングに関する１つ以上の工程も含む。特に認知の促進がもたらされる実施態様に関し、例えばいくつかのケースでは、認知の改善（または認知喪失の防止）が十分であり、例えば患者の機能が回復し、または正常のままである（好適な対照被験体またはそれから得られた標準的な数値と比較して評価した）ことがあるが、これは常にそのケースである必要はない。完全な治癒とはいかないが疾患の進行が緩徐になることから、認知の改善レベルが低い場合でさえ患者に非常に有益なものとなることを当業者は認識する。
【００４１】
本発明の方法は、本明細書に開示されたＨＧＦ模倣体を含む組成物を必要とする患者に投与する工程を含む。したがって本発明は、通常薬理学的に好適な担体または希釈剤と一緒に、本明細書に記載のＨＧＦ類似体／模倣体を含む組成物も提供する。１種の十分に精製したＨＧＦ模倣体が組成物に存在する実施態様もあれば；複数のＨＧＦ模倣体が存在し、各ＨＧＦ模倣体は組成物中での混合に先だって十分に精製してある実施態様もある。薬剤として使用するための薬理学的に好適な組成物の調製は当業者に周知である。通常、このような組成物は溶液または懸濁液のいずれかで調製するが、タブレット、丸薬、粉末等の固形も考えられる。液体に溶液または懸濁液として入れる好適な固形を投与前に調整してもよい。製剤は乳化してもよい。主成分は薬学的に許容可能であり、主成分と適合する賦形剤と混合してもよい。好適な賦形剤は例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、またはこれらの混合物である。また、組成物は湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の低量の助剤を含んでもよい。経口剤型の組成物を投与することが必要であれば、様々な増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤等を添加してもよい。本発明の組成物は、投与に好適な形態の組成物を提供するためのこのような付加成分ならどのようなものでも含み得る。製剤中のＨＧＦ模倣体の最終量は多様である。しかし概括的には、製剤の量は約１％〜約９９％である。
【００４２】
本発明のＨＧＦ模倣体組成物（製剤）は当業者に周知の多数の好適な手段：限定するものではないが注射、吸入、経口、膣内、経鼻、模倣体を含む食品または製品の摂取、局所、点眼薬、噴霧等の中のどのような手段で投与してもよい。好ましい実施態様では、投与形態は経口または注射である。また本組成物は、例えば認知症または患者に認知症を起こす状態を治療するために使用する他の薬剤といった他の治療様式と組み合わせて投与してもよく、例えば抗鬱剤および精神活性薬の投与、ドーパミンおよび類似薬の投与が挙げられるが、これらに限定するものではない。同様に、癌治療様式では、ＨＧＦ模倣体は鎮痛剤および他の好適な薬物と共に投与してもよい。したがって本発明の実施態様では、１種以上のＨＧＦ模倣体と、１種以上の異なる生物活性薬とを組み合わせて使用してもよい。
【００４３】
投与されるＨＧＦ阻害剤の量は約０．１〜約１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲にあるが、的確な量は薬の服用者における１つ以上の特質：限定するものではないが体重、健康全般、性別、年齢、国籍、遺伝歴、治療の他の条件等により変えることが可能であり、用量の増減は本発明の実行の範囲内にあることは当業者には認識されている。投薬は一定期間、定期的に行ってもよく、用量は経時的に変えてもよい（増量または減量）。
【００４４】
本発明のＨＧＦ模倣体は多様な認知機能障害（認識機能障害）ならびにＨＧＦ活性またはその欠乏に関する他の障害を治療するために使用し得る。本明細書で使用している「認知機能」または「認知」は広範な高度脳機能を意味し、限定するものではないが以下のものが挙げられる：情報を学習および記憶する能力；整理、計画および問題解決する能力；必要に応じて留意点に着目し、維持し、変更する能力；言語を理解し、使用する能力；環境を正確に知覚する能力；計算を実行する能力。このような機能には、限定するものではないが以下のものが挙げられる：記憶（例えば、新たな情報の習得 、保持および引き出し）；注意および集中（特に分割的注意）；情報処理（例えば五感により集められた情報の操作）；経営的機能（例えば計画および優先順位付け）；視空間機能（例えば視覚認識および構成能力）；発話流ちょう性および言語能力（例えば単語発見）；全般的知性（例えば「知能」）；長期（遠隔）記憶；会話技術；読解力；等。逆に言えば、「認知機能障害」というのは、このような能力の喪失を意味する。喪失は、当業者に公知の多くの方法のいずれかにより測定、検出および／または診断され得る。このような方法には、限定するものではないが以下のものが挙げられる：専門家により課された標準的試験（パズル、言葉遊びまたは問題等）の利用；自己報告および／または罹患した個人の介護者、友人および家族による報告；専門家または一般人による個人の活動、ライフスキル、習慣および対処メカニズムの観察；罹患した個人に課したアンケートの結果；等。
【００４５】
このような障害は、例えば多様な要因に起因するシナプス接続および／またはニューロン密度の減少により生じ得る。いくつかの実施態様では、脳損傷、例えば外傷性脳損傷により喪失が起こる。戦争やスポーツ活動の結果として記録的規模で起こる外傷性脳損傷はニューロン接続の減少が特徴的である。したがってＨＧＦ模倣薬の使用は実行可能な治療選択肢である。このような脳損傷は、例えば強い衝撃の事故（例えば自動車事故、落下等）、銃撃事件、スポーツによる損傷（例えばボクサーおよびフットボール選手の経験といった頭部衝撃）；戦争での損傷等による脳への外傷の結果である場合もある。あるいは、このような損傷は、例えば脳卒中、動脈瘤、手術手技、腫瘍等または脳もしくは脳の一部への酸素欠乏を起こす他のタイプの状態の結果；毒ガスの吸引による損傷；脳の老化；多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、統合失調症などの脳障害等の神経系および／または脳への有害作用を示す疾患および障害などの内部脳障害の結果である場合もある。
【００４６】
本発明の実施態様で考えられている療法の特定の例として、ＨＧＦ模倣体は認知症治療に使用してもよい。「認知症」とは、正常な加齢からの予想を上回る、損傷を受けたことのない人の認知能力の重篤な喪失を意味する。それは独自の全脳損傷の静的な結果であるか、身体の障害または疾患による長期減退に起因する進行性のものである。認知症は老齢者に非常に好発的であるが、成人期のどの段階でも起こり得る。本発明の実施態様の目的では、用語「認知症」には以下が挙げられ、および／または以下により発症する：例えばアルツハイマー病、血管性認知症、レヴィー小体認知症等またはこれらの合併。本発明の他の実施態様では、アルツハイマー病はこの定義から除外する場合もある。本明細書に記述した治療し得る認知症の他の原因には甲状腺機能低下症および正常圧水頭症が挙げられるがこれらに限定されるものではない。本明細書に記載された治療し得る認知症の原因となる、またはそれに併発する疾患の遺伝型は：前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、血管性認知症、ボクサー認知症等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。若年層では、進行性認知障害は精神病、アルコールまたは他の薬物依存症、または代謝障害により発症し得る。特定の遺伝病は若年層（例えば４５歳以下）で真性神経変性認知症を発症させる可能性がある。これらには家族性アルツハイマー病、ＳＣＡ１７（優性遺伝）；副腎白質ジストロフィー（Ｘ連鎖性）；３型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン‐ピック病Ｃ型、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、テイ‐サックス病およびウィルソン病が挙げられる。ビタミン欠乏症および慢性感染症も、場合により変性認知症に似た症状を呈する場合がある。これらにはビタミンＢ１２、葉酸またはナイアシンの欠乏が含まれ、感染原因にはクリプトコッカス髄膜炎、ＨＩＶ、ライム病、進行性多巣性白質脳症、亜急性硬化性全脳炎、梅毒およびウィップル病が挙げられる。急激に進行する認知症に関し、クロイツフェルト‐ヤコブ病は通常、プリオンが原因で数週間から数カ月かけて悪化する認知症を発症させる。緩徐進行性認知症の一般的な原因はまた、急激な進行、例えばアルツハイマー病、レヴィー小体型認知症および前頭側頭葉変性症（皮質基底核変性症および進行性核上性麻痺など）を併発することもある。
【００４７】
また、脳症またはせん妄は比較的緩徐に発症し、認知症に帰結する場合もある。起こり得る原因には、脳感染（脳炎、亜急性硬化性全脳炎、ウィップル病）または炎症（辺縁系脳炎、橋本脳症、脳血管炎）；リンパ腫または神経膠腫などの腫瘍；薬物毒性（例えば抗痙攣薬）；肝不全または腎不全などの代謝的原因；および慢性硬膜下血腫が挙げられる。本発明の方法にしたがって治療する認知症は他の状態または疾患の結果でもある。例えば、疾患の中で認知症のみが遅延するか、あるいは軽度の症状となる多くの医学的および神経学的状態も存在する。例えばパーキンソン病患者の一部は認知症を発症し、パーキンソン病を伴う進行性核上麻痺および大脳皮質基底核変性症（同様の潜在性病因は前頭側頭葉変性症の臨床的症状を発症し得る）の症候群において認知機能障害も発症する。脳の慢性炎症症状は長期的に認知に影響を及ぼし、ベーチェット病、多発性硬化症、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡が挙げられる。また、遺伝条件も認知症を発症する場合があり、以下を含む他の症状も併発する：アレキサンダー病、カナバン病、脳腱黄色腫症、脆弱性Ｘ関連手足運動失調症候群、グルタル酸尿症１型、クラッベ病、メープルシロップ尿症、ニーマン‐ピック病Ｃ型、クッフス病、神経有棘赤血球症、有機酸血症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、尿素回路障害、サンフィリポ症候群Ｂ型および脊髄小脳失調症２型。
【００４８】
認知症治療の他に、本発明のＨＧＦ模倣体は神経保護、および／または上述のような認知症が含まれる場合もある神経変性疾患の治療に使用可能である。神経保護には、ＨＧＦ模倣体は予防的に、すなわち被験体が強い神経危害に遭遇するか、あるいは曝される前に投与することが可能である。例えば、神経損傷を起こすことが知られている、あるいは起こす可能性のある薬物、化学物質または医療行為を受ける前に模倣薬は投与することができる。神経変性疾患の治療に関し、ＨＧＦの一般的な生存促進抗アポトーシス活性は神経変性疾患、限定するものではないがパーキンソン病、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等を治療するＨＧＦ模倣薬の使用を支持する。
【００４９】
また模倣体は、大鬱病性障害（ＭＤＤ）を意味する「鬱病」（再発鬱病性障害、臨床的鬱病、大鬱病、単極性鬱病または単極性障害としても公知である）および双極性障害の特徴である鬱、等の治療に使用できる。結局、鬱病とは海馬におけるニューロンおよびシナプスの接触が喪失している疾患である。新たなシナプス接続を誘導し、海馬の神経発生を刺激するＨＧＦの能力は鬱病を治療するためのＨＧＦ模倣薬の使用を支持する。
【００５０】
また、認知機能障害に移行する特定の遺伝的素因に苦しむ人の認知能力も上昇させる可能性があり、例えばダウン症候群などの遺伝性疾患、例えば出生前または出生中の酸素欠乏による適切な脳発生の欠如、脳発生を干渉する多様な先天性異常の人が挙げられる。    
【００５１】
以下の実施例で説明するように、ＨＧＦ模倣体はＨＧＦ／Ｍｅｔ系を阻害し、よって抗癌剤として使用可能である。ＨＧＦ模倣体は悪性腫瘍および転移性形質転換を減弱するために使用可能である。
【００５２】
ＨＧＦ模倣体は線維性疾患の治療に応用される。本明細書で言う老齢層では、肝臓、腎臓、心臓および肺の線維症の問題は増加しつつある。不運にも、線維変化に伴う機能変性は治療が困難である。組織線維症を阻害または改善するＨＧＦの劇的な能力は、経口投与が有効であるＨＧＦ模倣体により治療選択肢が提供されることを意味する。
【００５３】
ＨＧＦ模倣体は末梢血管疾患：下肢動脈疾患の治療に応用される。かん流低下を起こす血管疾患は糖尿病、肥満およびアテローム性動脈硬化症の後遺症としてよく見られる。１つの治療選択肢は、影響を受けた器官および組織中に新たな側副血管を誘導することである。ＨＧＦおよびＨＧＦ模倣体の強力な血管新生活性は血管機能不全治療の臨床的有用性を提供し得る。
【００５４】
ＨＧＦ模倣体は「創傷治癒」にも使用し得る。創傷治癒不全は糖尿病や火傷の被害者の顕著な特徴である。血管新生活性およびマイトジェン活性により創傷治癒を促進できるＨＧＦの能力は、創傷治癒過程を促進するためのＨＧＦ模倣体の使用を支持する。データにより、数種のＨＧＦ模倣体は、健常者でも糖尿病患者においても有効な創傷回復の促進物質であることが示されている。
【００５５】
理論で制約されることもなく、この際立った認知促進活性に基づく期待し得るメカニズムはシナプス接続の増加であると考えられている。このことはおそらく、樹状突起スパイン密度の増加およびシナプス後スパインの形態学的表現型の変更によってもたらされる微小シナプス活性の増加に起因する。
【００５６】
前述の例は本発明の多様な実施態様を説明するために提供されているものであるが、いかなる場合でも本発明を制限するように解釈してはならない。
【実施例１】
【００５７】
ジヘキサおよびＮｌe１‐ＡｎｇＩＶによるシナプス形成の調節
ＡｎｇＩＶのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ類似体のテトラペプチド（Ｎｌｅ１‐ＹＩＨ）およびトリペプチド（Ｎｌｅ１‐ＹＩ）フラグメントは、空間学習演習中のスコポラミン誘導型認知機能不全を解決し得る最小の活性フラグメントであることが事前に分かった。新たなテンプレートとしてトリペプチドを使用し、代謝安定性、血液脳関門透過性および経口有効性を向上させて付加的な活性類似体を合成した。本実施例では、新規かつ経口投与で有効なアンジオテンシンＩＶ類似体であるジヘキサの特徴を示す。
材料と方法
動物と手術．体重３９０〜４５０ｇの雄ＳｐｒａＧｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（ＴａＣｏｎｉＣ社）を、自由に摂水および摂食（Ｈａｒｌａｎｄ  Ｔｅｋｌａｎｄ社、Ｆ６齧歯類食餌、ウィスコンシン州、マディソン）できるようにしながら飼育した。ただし手術前夜には給餌しなかった。各動物を塩酸ケタミンおよびキシラジン（それぞれ１００および２ｍｇ／ｋｇを筋肉内注射；Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；ミズーリ州、セントジョゼフ、およびＭｏｂｙ社；カンザス州、ショーニー）で麻酔した。脳室内（ｉｃｖ）ガイドカニューレ（ＰＥ‐６０、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ社；ニューヨーク州、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）を、後部１．０ｍｍおよび側部１．５ｍｍから前頂部という平面的頭蓋座標で右脳半球に定位的に設置した（モデル９００、Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；カリフォルニア州、タハンガ）（Ｗｒｉｇｈｔら、１９８５年を参照）。ガイドカニューレは全長２．５ｃｍであり、傾斜した先端から２．５ｍｍの場所に設置したヒートバルジで調節し、よって貫通深さを調節するための止め具として働いた。いったん適切な位置に、２つのステンレス鋼スクリューおよび歯科用セメントで頭蓋にカニューレを固定した。術後、２２±１℃に維持した米国認定Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ承認の飼育器にて動物を個別に収容し、１２時間交代の明暗周期を０６：００時に開始した。術後回復期の５〜６日間、全動物に１日につき５分間、穏和に手に載せた。行動試験の完了後、ガイドカニューレを介して、５μｌのファストグリ‐ン染色を注射してカニューレ設置の組織学的検証を行った。本試験で使用したラットすべてにおいて明らかにカニューレは正しく設置されていた。
行動試験．水迷路は黒く塗られた循環タンク（直径１．６ｍ；高さ：０．６ｍ）から構成され、２６〜２８℃の水で満たし、深さ２６ｃｍにした。黒色循環プラットホーム（直径：１２ｃｍ；高さ：２４ｃｍ）を壁から３０ｃｍの場所に設置し、水面から下２ｃｍの場所に沈めた。迷路を、操作上、４等分に４つに区切り、ＮＷ、ＮＥ、ＳＷおよびＳＥとした。各ラットに対してプラットホームの設置を無作為に４分の１に割り振り、訓練期間を通して固定したままにした。入口部を４つのコーナー（すなわちＮ、Ｓ、ＥおよびＷ）に設置し、前回の試験とは異なる入口部で各試験を開始するように疑似的に無作為に割り振った。４つの試験室の壁のうち３つを、異なる形（円、四角、三角）および色から成る付加的な迷路空間記号で覆った。コンピュータビデオ追跡システム（Ｃｈｒｏｍｏｔｒａｃｋ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州）を使用して動物の水泳経路を記録した。コンピュータには総水泳時間および水泳距離が表示された。水泳速度をこれらの値から求めた。
【００５８】
試験の３０分前、スコポラミン研究における投与群の各メンバーに臭化水素酸スコポラミン（２μｌのａＣＳＦ中、７０ｎｍｏｌ、２０秒間）を脳室内注射し、次いで試験の１０分前にジヘキサを注射した。対照群には、試験２０分前にスコポラミンまたはａＣＳＦを投与し、次いで試験１０分前にａＣＳＦを投与した。行動試験プロトコルは以前に詳細に記述してある（Ｗｒｉｇｈｔら、１９９９年）。老齢ラット試験でのラットにはａＣＳＦのジヘキサを投与した（対照群）。つまり、習得試験を連続８日間、５試験／日で行った。訓練の初日、１回目の試験に先だって３０秒間動物をプラットホームに置いた。割り当てられた入口部の１つにラットを迷路の壁に向けるように置いて試験を開始した。プラットホームに到着するまでの時間を最大１２０秒ラットに与えた。動物がプラットホームに到着すると、プラットホームでの休憩時間を３０秒間与えた。ラットがプラットホームを見つけ出さなければ、実験者は動物をプラットホームに置き、３０秒間休憩させた。休憩時間の後、直ぐに次の試験を開始した。
【００５９】
習得試験の８日目の後、プラットホームを取り除いた１つの追加的試験を行った（プローブ試験）。学習した応答の持続性を判定するために動物が全１２０秒間泳ぐことが必要であった。習得中にプラットホームが置かれていた標的の四半部内で使われた総時間、およびその四半部の交差の数を記録した。試験における各毎日のセットの終了時に、動物をタオルで乾燥させ、１００ワットのランプの下に１０〜１５分間置き、その後自身のケージに戻した。
【００６０】
海馬細胞培養物調製．Ｐ１  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、海馬ニューロン（１ｃｍ２当たり２×１０５細胞個）をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州、セントルイス；分子量３００，０００）製ポリ‐Ｌ‐リジンで被覆したプレート上で培養した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州、カールズバッド）製のＢ２７を添加したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ培地で海馬ニューロンを保存し、２日目にＳｉｇｍａ社製の０．５ｍＭのＬ‐グルタミンおよび５ｍＭのシトシン‐Ｄ‐アラビノフラノシドをインビトロで添加した。その後、海馬ニューロンをさらに３〜７日間培養し、そのときにそれらを（Ｗａｙｍａｎ，Ｄａｖａｒｅら、２００８年）に記載の様々な薬学的試薬で形質移入するか、あるいは投与した。
形質移入．メーカーのプロトコルにしたがって、インビトロ６日目（ＤＩＶ６）にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、ｍＲＦＰ‐β‐アクチンをニューロンに形質移入した。このプロトコルでは望ましい３〜５％の形質移入効率が生じ、したがって個々のニューロンの可視化が可能となった。さらに高い効率は個々のニューロンの樹状枝を不明瞭にした。樹状突起スパインはアクチン内で豊富であることから、蛍光タグ化アクチンの発現により樹状突起スパインの可視化が明瞭になった。ＤＩＶ７に、賦形剤（Ｈ２Ｏ）または（本文書に記載の）ペプチドが添加された培地で細胞を処理した。ＤＩＶ１２に、ニューロンを室温で２０分間固定し（４％のパラホルムアルデヒド、３％のスクロース、６０ｍＭのＰＩＰＥＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）、設置した。４℃で少なくとも２０時間スライドを乾燥し、ＮＡ１．４で解像度０．２８０μｍの６０Ｘ油浸レンズを持つＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８１倒立共焦点顕微鏡を作動するＳｌｉｄｅｂｏｏｋ４．２  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより蛍光画像を得て、体細胞から少なくとも１５０μｍ離れた１次および２次樹状突起上の樹状突起スパイン密度を測定した。１つのデータ点当たり少なくとも１０ニューロンから、５０μｍ長の５つの樹状突起断片を、各データ点について分析し、報告した。個々の培養調製物を使用して、各実験を少なくとも３回反復した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ’ｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．４ｌｏプログラム（ＮＩＨ社、メリーランド州、ベセスダ）および神経突起追跡プログラムＮｅｕｒｏｎ  Ｊ（Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ社、Ｊｏｃｏｂら、２００４年）を使用して樹状突起長を測定した。スパインを手動で計数した。        
器官型海馬スライス培養物調製および形質移入．上述のようにＰ４  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット由来海馬を培養した（Ｗａｙｍａｎ、Ｉｍｐｅｙら、２００６年）。つまり、４００μｍのスライスを（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州、ビルリカ）上で３日間培養し、その後、樹状枝を可視化するため、メーカーのプロトコルにしたがって、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎ  Ｇｕｎ（ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州、ヘラクレス）を使用してｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質（ＴＦＰ）で微粒子銃により形質移入した。２４時間の修復期間後に、賦形剤（Ｈ２Ｏ）、１ｐＭのＮｌｅ‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサで２日間、スライスを刺激した。スライスを固定し、設置した。海馬ＣＡ１ニューロン過程を画像化し、上述のように測定した。
免疫細胞化学．形質移入したニューロンを処理し、固定し、染色した。つまり、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００洗浄剤（Ｂｉｏ‐ＲａＤ社；カリフォルニア州、ヘラクレス）で１０分間透過処理した。８％のウシ血清アルブミン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社；マサチュセッツ州、バーリントン）を含むＰＢＳを使用し、室温で１時間、非特異的結合を抑制した；一次抗体のインキュベーションは１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：２５００希釈（下記参照）で、４℃で一晩行った。二次抗体、１：３０００のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カリフォルニア州、カールズバッド）を使用し、室温で２時間置いた。ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ抗フェード試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カリフォルニア州、カールズバッド）と共にカバースリップを設置し、洗浄はすべてＰＢＳで行った。画像および分析を上述と同様に行った。シナプス前興奮性伝達には、ＶＧＬＵＴ１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）マーカーを使用し（Ｂａｌｓｃｈｕｎ、Ｍｏｅｃｈａｒｓら）、通常のシナプス前伝達には、シナプシン１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、２００２年）を使用した。ＰＳＤ‐９５（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州、ビルリカ）によりシナプス後機能を確立した（Ｅｌ‐Ｈｕｓｓｅｉｎｉ、Ｓｃｈｎｅｌｌら、２０００年）。各事例において、投与群、対照、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサについてスパインの総数を計数し、活性的表現型を確実にした。ＶＧＬＵＴ１またはシナプシンに隣接する富アクチンスパインの総数を計数し、百分率に変換した。何故ならシナプス前マーカーに対する投与誘発性スパインの割合相関は興奮シグナルの伝達能の強い指標になるからである。本出願では、相関の数値は、緑色ＰＳＤ‐９５免疫陽性染色点に対する赤色蛍光タグ化アクチンスパインから構成されており、これらが融合するとオレンジ色のスパインになる。
全細胞記録．５日間の前処理としてｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入した培養海馬ニューロン（賦形剤対照）、および１ｐＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサで形質移入した海馬ニューロンでパッチクランプ実験を行った。形状が錐体様（〜２０μｍの細胞体、および非対称樹状突起分布）のニューロンから記録をとった。形質移入後の時間は６日間であった。培地は（ｍＭで）１４０のＮａＣｌ、２．５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ２，３のＣａＣｌ２、２５のグルコース、および５のＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液；ｐＨはＫＯＨで７．３に調整した；オスモル濃度は３１０ｍＯＳｍに調整した：と交換した。倒立顕微鏡（ＩＸ‐７１；Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ社、東京）を備えた記録チャンバ中で記録前に３０分間、培養液を平衡化した。形質移入細胞を蛍光で可視化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ社）。フィラメントのない標準的壁ホウケイ酸ガラス（ＯＤ＝１．５ｍｍ；Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）から記録ピペットを引き抜いた（Ｐ‐９７  Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー；Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、カリフォルニア州、ナヴァト）。ピペットから槽へのパッチ電極のＤＣ抵抗は４．０〜５．２ＭΩの範囲であり、以下の組成の内部溶液を充填した（単位はｍＭ）：２５のＣｓＣｌ、１００のＣｓＣＨ３Ｏ３Ｓ、１０のクレアチンリン酸、０．４のＥＧＴＡ、１０のＨＥＰＥＳ、２のＭｇＣｌ２、０．４のＭｇ‐ＡＴＰ、および０．０４のＮａ‐ＧＴＰ；ｐＨはＣｓＯＨで７．２に調整した；オスモル濃度は２９６〜３００ｍＯｓｍに調整した。ピクロトキシン（１００μＭ；Ｓｉｇｍａ社）を含むＧＡＢＡ受容体塩化物チャンネルを遮断し、ストリキニーネ（１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）でグリシン受容体を遮断し、テトロドトキシン（ＴＴＸ、５００ｎＭ；Ｔｏｃｒｉｓ社）で活動電位生成を遮断することで薬理学的に微小ＥＰＳＣ（ｍＥＰＳＣ）を単離した。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、サニーベール）を使用して記録を得た。アナログ信号は２ｋＨｚで低域のベッセルフィルターにかけ、Ｄｉｇｉｄａｔａｌ４４０Ａインターフェース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を介して１０ｋＨｚでデジタル化し、Ｃｌａｍｐｅｘ１０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用してコンピュータに保存した。インキュベーターから培養物を取り出してから０．５〜２時間、膜電位を室温（２５℃）で−７０ｍＶで保持した。液界電位は修正しなかった。Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）およびＭｉｎｉ‐Ａｎａｌｙｓｉｓ６．０ソフトウェア（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ社；ニュージャージー州、フォートリー）を使用してデ−タ分析を行った。記録を良好にするために、基準には記録ピペットの外面と付着細胞との間のシールの電気抵抗＞２ＧΩ、ニューロン入力抵抗＞２４０ＭΩが含まれた。ｍＥＰＳＣの記録時間は５分であった。
結果
【００６１】
Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは強力な認知促進剤であることが以前から公知であるが（ＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｄｉｎｇ、２００８年）、代謝が不安定（ラット血清中Ｔ１／２＝１．４０分）であることから臨床応用に関しては限定的である。分子のなどのＡｎｇＩＶの認知促進特性を有効利用するために、より代謝的に安定した類似体を開発することが必要であった。この開発過程の一部として、ジヘキサ（Ｎ‐ヘキサン‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐（６）‐アミノヘキサンアミド）を合成し、特徴付けた（ラット血清中Ｔ１／２＝３３０分）。安定化した類似体であるジヘキサに依然として認知促進／抗認知症活性が存在するかを判定するために、２種の認知症モデル‐スコルポラミン健忘症および老齢ラットモデルで試験した。これらの研究から、ジヘキサは両モデルにおいて見られる認知障害を改善できることが明らかになった。ジヘキサを脳室内投与または強制経口投与したところ、水迷路行動が若年健常ラットに見られる行動レベルに達するまでに改善した。図１Ａでは、１０ｐｍｏｌではなく１００ｐｍｏｌ（ｎ＝８、ｐ＜．０１）で投与したジヘキサにより、逃避時間からも明らかなように、スコポラミン依存型学習欠陥が非スコポラミン投与対照と同等になるまでに改善した。低量（１．２５ｍｇ／ｋｇ／日）および高量（２ｍｇ／ｋｇ／日）の両方でジヘキサを経口投与したところ（図１Ｂ）、同様の結果が見られた。高量群の行動は対照と何ら変わらなかった（ｎ＝８、ｐ＜．０１）。両性を含む無作為に群別された老齢ラット（２０〜２４週齢）に８日間の試験期間中（ｎ＝８）、ジヘキサを経口投与し、非投与対照群と比較した（図１Ｃ）。結果から、投与ラットは非投与ラットより水迷路で大幅に良好に行動できたことが示された（ｐ＜．０５）。
【００６２】
Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサの認知促進効果を説明するために挙げられた１つの仮説は、樹状突起スパインの成長および多数の新たなシナプスの確立を誘導することによりそれらは肝細胞増殖因子模倣薬として作用し、ニューロン接続の拡大を支持するように作用するということである。高密度のスパイン形成およびシナプス形成に対するジヘキサの影響を判定するため、ｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入した海馬ニューロン培養物をアッセイした。富アクチンスパインは用量依存的にジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与に応答して増加した（図２ＡおよびＢ）。１０‐１２Ｍのジヘキサの適用（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；５０μｍの樹状突起長当たり３０個のスパイン、対して対照では１９；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；それぞれｎ＝５０および１００）により明確な天井効果が生まれ、一方、１０‐１３Ｍの用量の結果は対照で処理したニューロンと有意差はなかった（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；５０μｍの樹状突起当たり２１個のスパイン、対して対照では１９；＊＝Ｐ＜０．０５；それぞれｎ＝９５および１００）。しかしそれらは統計的に１０‐１２Ｍのジヘキサ量と異なっていた。１０‐１０Ｍ量のジヘキサを投与されたニューロンのスパイン数は賦形剤を投与されたニューロンより少なかった（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；５０μｍの樹状突起長当たり１１個のスパイン、対して対照では１９；＃＝Ｐ＜０．０１；それぞれｎ＝５０および１００）。同様にＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは１０‐１０Ｍ用量で顕著な差を示してスパイン密度の用量依存的増加を誘発し、スパイン形成を促進した（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；５０μｍの樹状突起長当たり２２個のスパイン、対して対照では１７；＊＊＝Ｐ＜０．０１；ｎ＝５０）。１０‐１２Ｍの用量の投与後、スパイン密度の最大増加が再度観察された（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；５０μｍの樹状突起長当たりそれぞれ２５および２６個のスパイン、対して対照では１７；＊＊＝Ｐ＜０．０１；ｎ＝５０）。１０‐１３Ｍ用量のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶも基部スパイン数に影響は無かった（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；５０μｍの樹状突起長当たり１７個のスパイン、対して対照で１７；＊＊＝Ｐ＜０．０１；ｎ＝５０）。
【００６３】
ＡＴ４アゴニストであるジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの長期投与（５日間）の効果を、生物学的有効量の１０‐１２Ｍを急性投与（３０分）したアゴニストと比較した（図３Ａ〜Ｅ）。結果から、ジヘキサにより刺激されたスパイン数は３倍近く増加し、５日間の投与後のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで刺激されたスパインは２倍超増加したことが明らかになった（図３Ｄ）。両治療群で、５０μｍの樹状突起長当たりスパイン平均数が１５である賦形剤対照群とは有意に差があった。ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与群のスパイン平均数は、５０μｍの樹状突起長当たりそれぞれ４１および３２であった（一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ後知恵検定で平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝２００；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１）。行動データから（データは記載なし）、空間記憶演習の習得中に行動の迅速なメカニズムが起こることが示唆されている。したがって培養の最終日に、スパイン形成を促進するジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの能力を３０分間の急性投与により測定した（図３Ｅ）。ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの３０分間の急性投与では、インビトロ１２日目（ＤＩＶ１２）に、３０分間の賦形剤投与ニューロンと比較してスパインが有意に増加することが分かった（一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＴｕｋｅｙ後知恵検定で、５０μｍの樹状突起長当たりのジヘキサでの平均スパイン数＝２３．９±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶでの平均スパイン数＝２．６±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；賦形剤対照投与ニューロンの平均スパイン数＝１７．４±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝６０；＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。
【００６４】
スパインの寸法、スパインの持続性、ＡＭＰＡ受容体数およびシナプス有効性の間には強い相関性がある。長期記憶の存在とスパインの量との間の相関性も示唆されている（Ｋａｓａｉ、Ｆｕｋｕｄａら、２００１年；Ｙａｓｍａｔｓｕ、Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、２００８年）。これらを考慮して、スパイン頭の寸法を測定した。結果から、１０‐１２Ｍの量のジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶはスパイン頭の幅を広げたことが示された（図４）。Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの平均スパイン頭幅＝０．８７μｍ（＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）およびジヘキサ＝０．８０μｍ（＊＊＝Ｐ＜０．０１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）をそれぞれ対照の頭寸法（０．６７μｍ）と比較した。
ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ媒介シナプス形成
【００６５】
シナプス伝達を定量するために、シナプスマーカーに対してｍＲＦＰ‐β‐アクチン形質移入ニューロンを免疫染色した。１０‐１２ＭのジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶでインビトロで５日間海馬ニューロンを刺激した（図５Ａ〜Ｆ）。グルタミン酸作動性シナプス前マーカー小胞性グルタミン酸輸送体１（ＶＧＬＵＴ１）に対して染色することにより、興奮性シナプス伝達についてＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサの神経伝達物質パターンを調査した（Ｂａｌｓｃｈｕｎ、Ｍｏｅｃｈａｒｓら、２０１０年）。新たに形成されたスパインとシナプス前神経繊維末端とを対比させて測定するために、一般的なシナプス前マーカーであるシナプシンを採用した（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、２００２年）。ＰＳＤ‐９５はシナプス後密度のマーカーとして使用できる（Ｅｌ  Ｈｕｓｓｅｉｎｉ、Ｓｃｈｎｅｌｌら、２０００年）。
【００６６】
ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与ニューロンはスパイン形成を有意に増強した；Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶでの５０μｍの樹状突起長当たりの平均スパイン数＝３９．４；ジヘキサでの５０μｍの樹状突起長当たりの平均スパイン数＝４４．２；賦形剤投与したニューロンでの５０μｍの樹状突起長当たりの平均スパイン数＝２３．１（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１）（図３Ｂ、ＤおよびＦおよび表４）。シナプスマーカーに対する新たに形成されたスパインの割合相関性を機能的シナプスの形成の尺度として算出した。ＶＧＬＵＴ１、シナプシンまたはＰＳＤ‐９５との割合相関性では、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与誘発型スパインは対照投与ニューロンと何ら変わりはなかった（Ｐ＞０．０５）（図５Ａ、ＣおよびＥおよび表４）。
【００６７】
表４．シナプス成分のマーカーに対する割合相関、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与に誘発されたスパイン数の要約
2014511858.tif 000015
各投与群のスパインの総数は５０μｍ樹状突起長当たりのスパイン数で示している。シナプス前マーカーのシナプシン、グルタミン酸作動性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１またはシナプス後化合物ＰＳＤ‐９５の割合相関性は直接下記に報告している。各投与群ではＮ＝２５。
【００６８】
上記の結果はジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与により新たに生成された樹状突起スパインが機能的シナプスを形成していることを示唆している。この結論をさらに支持するために、ｍＲＦＰ‐β‐アクチン形質移入海馬ニューロンから微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）および機能的シナプス数に対応する周波数を記録した。１０〜１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサ（図６ＡおよびＢ）を投与した後、ＡＭＰＡ媒介電流の２倍近い増加が測定された（図６ＡおよびＢ）。賦形剤投与ニューロンから記録されたＡＭＰＡ媒介ｍＥＰＳＣの平均周波数は、３３個の細胞で３．０６±０．２３Ｈｚであった。対照群と比較してＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは対照周波数の百分率を越えて１．７倍の増加を誘導し（２５個の細胞で５．２７±０．４３Ｈｚ；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、ジヘキサでは対照群に対して１．６倍増加し（２９個の細胞で４．８２±０．３４Ｈｚ；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、機能的シナプスの増幅が確認された。振幅、増加時間または減少時間の差異はみられず（データは記載なし）、シナプスの個々の特性は変化しないことが示唆された。
【００６９】
解離した新生児海馬ニューロンで証明されたスパイン誘発の生理学的有意性をさらに評価するため、器官型海馬スライス培養物でのスパイン形成に対するジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの効果を評価した。新生児由来であるこれらの標本は解離したニューロンと比べて無傷な３次元環境を多く示す。海馬柔軟性および学習／記憶に機能的に関連した海馬ＣＡ１ニューロンは形態学に基づき容易に識別可能であり、分析用に選ばれた。賦形剤投与したニューロンと比較したところ、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは器官型海馬スライス培養物のスパイン形成を有意に増強した。ジヘキサ投与群とＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与群との間にスパイン数の差は無かった（図７ＡおよびＢ）。対照スライス用に測定したスパイン数は５０μｍの樹状突起長当たり７個で、対してＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサ投与ニューロンでは５０μｍの樹状突起長当たりスパインは１１個であった；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝１３〜２０；＊＊＝Ｐ＜０．０１。
考察
【００７０】
本研究では、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶのようにジヘキサはＩＣＶまたは経口のいずれかで投与すると強力な認知促進剤となった。予測通り、培養ラット海馬ニューロンにおいてジヘキサもＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶもスパイン形成を促進し、シナプス形成を増強した。アンジオテンシンＩＶ類似体であることから予測できるように、ジヘキサはサブナノ分子濃度でスパイン誘導効果を示し（Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｃｏｏｋら、１９９２年；Ｋｒｅｂｓ、Ｈａｎｅｓｗｏｒｔｈら、２０００年）、刺激から３０分後という早期にジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶによりいくつかのスパインが形成された（図３Ｄ）。しかし、効果を最大にするにはかなり長期の投与期間が必要である（図３Ｃ）。
【００７１】
スパイン頭の寸法をシナプス増強の指標として測定した。より広い表面積を有する大きめのスパインは大きめのシナプスを有し、大きめのＰＳＤが足場タンパク質および多数のグルタミン酸作動性受容神経伝達物質受容体を形成する（Ｋｅｎｎｅｄｙ、１９９７年）。両者間で差は無いが（Ｐ＞０．０５）、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与群ではスパイン頭の寸法が拡大したことが示された。スパインの形態および数の変化は、短期シナプス変化が高度に安定した長期変化に変わるメカニズムであると考えられる（ＨｅｒｉｎｇおよびＳｈｅｎｇ、２００１年）。
【００７２】
これらのスパインの変化の機能的有意性を評価するため、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサで刺激した海馬ニューロンを、グルタミン酸作動性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１（Ｂａｌｓｃｈｕｎ、Ｍｏｅｃｈａｒｓら、２０１０年）、標準的なシナプス前マーカーのシナプシン（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、２００２年）およびシナプス後マーカーＰＳＤ‐９５（Ｋｅｎｎｅｄｙ、１９９７年；ＨａｎおよびＫｉｍ、２００８年）に対して免疫染色し、神経伝達物質表現型を解読した。投与樹状突起および対照樹状突起の両方におけるＶＧＬＵＴ１、シナプシンおよびＰＳＤ‐９５間の高度かつ不変の相関性から、新たに形成されたスパインが機能的シナプスを支持することが示唆される（図５および表４）（ＨａｎおよびＫｉｍ、２００８年；Ｙａｓｕｍａｔｓｕ、Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、２００８年）。さらに、興奮性グルタミン酸作動性シナプスを識別するｍＲＦＰ‐β‐アクチン標識スパインおよび標準的シナプス前マーカーのシナプシンおよびＶＬＧＵＴ１染色の間の完全に近い相関性から、海馬スパインに対するＡｎｇＩＶ‐依存性効果の大部分が興奮性シナプスに制限されることが示唆されている。これらの所見は、天然のアンジオテンシンＩＶによる阻害性神経伝達物質ＧＡＢＡに対する効果が見られなかったＤｅ  Ｂｕｎｄｅｌらの所見（Ｄｅ  Ｂｕｎｄｅｌ、Ｄｅｍａｅｇｄｔら、２０１０年）とよく一致する。
【００７３】
ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ投与調製で観察されたｍＥＰＳＣ周波数の増加から、新規なスパインが機能的シナプスを形成することがさらに裏付けられる（ＭａｌｇａｒｏｌｉおよびＴｓｉｅｎ、１９９２年；ＨｅｒｉｎｇおよびＳｈｅｎｇ、２００１年；ＴｙｌｅｒおよびＰｏｚｚｏ‐Ｍｉｌｌｅｒ、２００３年）。ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶにより開始された神経伝達の一貫した強化は神経伝達物質の放出または代謝機械的影響の内因的変動が原因であるとは思えなかった（Ｙａｓｕｍａｔｓｕ、Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、２００８年）。本明細書に記載されたデータから、樹状突起スパイン密度を増加させ、インビトロでシナプス後スパインの形態学的表現型を変更することでＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサは微小シナプス活性を増加し、また、ＡｎｇＩＶ類似体に見られる学習促進の基礎となるメカニズムをもたらすことが示唆されている（Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓｔｕｂｌｅｙら、１９９９年；Ｌｅｅ、Ａｌｂｉｓｔｏｎら、２００４年）。
【００７４】
成体の行動データとインビトロでの機械的な理論を結び付けるために、無傷の海馬を表す環境を維持する器官型海馬スライス培養物を使用し、投与誘発型スパイン形成について評価した。１０‐１２ＭのＮｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサを弾道運動的に海馬スライスに形質移入したものを使用すると、スパイン密度が有意に増加し（図７）、実際、このような変化が無傷の海馬で発生し得ることが示唆されている。
【００７５】
したがって、ジヘキサは効果的な抗認知症薬に必要な以下の基準に適している：１）消化管経路で存続し、脳に進入することから経口投与が有効である；２）ニューロン接続、およびニューロン接続の喪失に直面したときに必要な特性を増強する；および３）安価に合成可能で、患者に提供しやすい。
【実施例２】
【００７６】
ＡｎｇＩＶ類似体の標的は肝細胞増殖因子である
本実施例は、新規なアンジオテンシンＩＶリガンドであるジヘキサおよびその親分子のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶがＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ受容体系を経て作用することを説明するものである。
材料と方法
動物と手術
【００７７】
体重３９０〜４５０ｇの雄ＳｐｒａＧｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（ＴａＣｏｎｉＣ社）を、自由に摂水および摂食（Ｈａｒｌａｎｄ  Ｔｅｋｌａｎｄ社、Ｆ６齧歯類食餌、ウィスコンシン州、マディソン）できるようにしながら飼育した。ただし手術前夜には給餌しなかった。各動物を塩酸ケタミンおよびキシラジン（それぞれ１００および２ｍｇ／ｋｇを筋肉内注射；Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；ミズーリ州、セントジョゼフ、およびＭｏｂｙ社；カンザス州、ショーニー）で麻酔した。脳室内（ｉｃｖ）ガイドカニューレ（ＰＥ‐６０、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ社；ニューヨーク州、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）を、後部１．０ｍｍおよび側部１．５ｍｍから前頂部という平面的頭蓋座標で右脳半球に定位的に設置した（モデル９００、Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；カリフォルニア州、タハンガ）（Ｗｒｉｇｈｔら、１９８５年）。ガイドカニューレは全長２．５ｃｍであり、傾斜した先端から２．５ｍｍの場所に設置したヒートバルジで調節し、よって貫通深さを調節するための止め具として働いた。いったん適切な位置に、２つのステンレス鋼スクリューおよび歯科用セメントで頭蓋にカニューレを固定した。術後、２２±１℃に維持した米国認定Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ承認の飼育器にて動物を個別に収容し、１２時間交代の明暗周期を０６：００時に開始した。術後回復期の５〜６日間、全動物に１日につき５分間、穏和に手に載せた。
行動試験
【００７８】
水迷路は黒く塗られた循環タンク（直径１．６ｍ；高さ：０．６ｍ）から構成され、２６〜２８℃の水で満たし、深さ２６ｃｍにした。黒色循環プラットホーム（直径：１２ｃｍ；高さ：２４ｃｍ）を壁から３０ｃｍの場所に設置し、水面から下２ｃｍの場所に沈めた。迷路を、操作上、４等分に４つに区切り、ＮＷ、ＮＥ、ＳＷおよびＳＥとした。各ラットに対してプラットホームの設置を無作為に４分の１に割り振り、訓練期間を通して固定したままにした。入口部を４つのコーナー（すなわちＮ、Ｓ、ＥおよびＷ）に設置し、前回の試験とは異なる入口部で各試験を開始するように疑似的に無作為に割り振った。４つの試験室の壁のうち３つを、異なる形（円、四角、三角）および色から成る付加的な迷路空間記号で覆った。コンピュータビデオ追跡システム（Ｃｈｒｏｍｏｔｒａｃｋ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州）を使用して動物の水泳経路を記録した。コンピュータには総水泳時間および水泳距離が表示された。水泳速度をこれらの値から求めた。
【００７９】
試験の２０分前に投与群の各メンバーに臭化水素酸スコポラミン（２μｌのａＣＳＦ中、７０ｎｍｏｌ、２０秒間）を脳室内注射し、次いで試験の５分前にジヘキサ（２μｌのａＣＳＦ中、３００ｐｍｏｌ）、Ｈｉｎｇｅ（２μｌのａＣＳＦ中、３００ｐｍｏｌ）またはＨｉｎｇｅ＋ジヘキサ（４μｌのａＣＳＦ中、３００ｐｍｏｌ）        を注射した。このスコポラミン標本は認知症に伴う空間記憶機能障害の一般的な動物モデルである（Ｆｉｓｈｅｒら、２００３年）。対照群には、試験２０分前にスコポラミンまたはａＣＳＦを投与し、次いで試験５分前にａＣＳＦを投与した。行動試験プロトコルは以前に詳細に記述してある（Ｗｒｉｇｈｔら、１９９９年）。つまり、習得試験を連続８日間、５試験／日で行った。訓練の初日、１回目の試験に先だって３０秒間動物を基台に置いた。割り当てられた入口部の１つにラットを迷路の壁に向けるようにして置いて試験を開始した。プラットホームに到着するための時間を最大１２０秒ラットに与えた。動物がプラットホームに到着すると、プラットホームでの休憩時間を３０秒間与えた。
【００８０】
ラットがプラットホームを見つけ出さなければ、実験者は動物をプラットホームに置き、３０秒間休憩させた。休憩時間の後、直ぐに次の試験を開始した。試験における各日のセットの終了時に、動物をタオルで乾燥させ、１００ワットのランプの下に１０〜１５分間置き、その後自身のケージに戻した。
統計学的分析
【００８１】
一元配置ＡＮＯＶＡを利用して樹状突起スパインの結果を分析し、有意な効果をＴｕｋｅｙ後知恵検定により分析した。５試験の各日のブロック中にプラットホームを見つけ出すまでのモリス水迷路のデータセットの平均時間を各動物ごと、習得の日ごとに計算した。訓練の１、４および８日目に一元配置ＡＮＯＶＡを利用して群間の時間を比較した。Ｐ＜０．０５に設定した有意水準で、Ｎｅｗｍａｎ‐Ｋｅｕｌｓ後知恵検定により有意効果を分析した。
散乱アッセイ．ＭＤＣＫ細胞を６ウェルプレートのカバースリップ上で１００％集密になるまで培養し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、集密になっているカバースリップを無菌状態で、９００μｌの無血清ＤＭＥＭを含む新たな６ウェルプレートに移した。ノルレウアル、Ｈｉｎｇｅペプチド、および／またはＨＧＦ（２０）を適当なウェルに添加した。対照ウェルにＰＢＳ賦形剤を添加した。プレ‐トを５％ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をメタノールで固定した。細胞をＤｉｆｆ‐Ｑｕｉｋ  Ｗｒｉｇｈｔ‐Ｇｉｅｍｓａ（Ｄａｄｅ‐Ｂｅｈｒｉｎｇ社、デラウェア州、ニューアーク）で染色し、デジタル画像を得た。カバースリップをピンセットで取り除き、さらなるデジタル画像を得た。画像の画素をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて定量し、Ｐｒｉｓｍ５およびＩｎＳｔａｔ  ｖ．３．０５を用いて統計を行った。
解離海馬神経細胞培養物調製
【００８２】
Ｐ１‐２  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、海馬ニューロン（１ｃｍ２当たり２×１０５細胞個）をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州、セントルイス；分子量３００，０００）製ポリ‐Ｌ‐リジンで被覆したプレート上で培養した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州、カールズバッド）製のＢ２７を添加したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ培地で海馬ニューロンを保存し、２日目にＳｉｇｍａ社製の０．５ｍＭのＬ‐グルタミンおよび５ｍＭのシトシン‐Ｄ‐アラビノフラノシドをインビトロで添加した。その後、海馬ニューロンをさらに３〜７日間培養し、そのときにそれらを本文書または図の説明に記載の様々な薬学的試薬で形質移入するか、あるいは投与した。
解離海馬ニューロン細胞培養物の形質移入
【００８３】
メーカーのプロトコルにしたがって、インビトロ６日目（ＤＩＶ６）にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、ｍＲＦＰ‐β‐アクチンをニューロンに形質移入した。このプロトコルでは望ましい３〜５％の形質移入効率が生じ、したがって個々のニューロンの可視化が可能となった。さらに高い効率は個々のニューロンの樹状枝を不明瞭にした。樹状突起スパインはアクチン内で豊富であることから、蛍光タグ化アクチンの発現により樹状突起スパインの可視化が明瞭になった。ＤＩＶ７に、賦形剤（Ｈ２Ｏ）または（本文書に記載の）ペプチドが添加された培地で細胞を処理した。ＤＩＶ１２に、ニューロンを室温で２０分間固定し（４％のパラホルムアルデヒド、３％のスクロース、６０ｍＭのＰＩＰＥＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）、設置した。４℃で少なくとも２０時間スライドを乾燥し、ＮＡ１．４で解像度０．２８０μｍの６０Ｘ油浸レンズを持つＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８１倒立共焦点顕微鏡を作動するＳｌｉｄｅｂｏｏｋ４．２  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより蛍光画像を得て、体細胞から少なくとも１５０μｍ離れた１次および２次樹状突起上の樹状突起スパイン密度を測定した。１つのデータ点当たり少なくとも１０ニューロンから、５０μｍ長の５つの樹状突起断片を、各データ点について分析し、報告した。個々の培養調製物を使用して、各実験を少なくとも３回反復した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ’ｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．４ｌｏプログラム（ＮＩＨ社、メリーランド州、ベセスダ）および神経突起追跡プログラムＮｅｕｒｏｎ  Ｊ（Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ社、Ｊｏｃｏｂら、２００４年）を使用して樹状突起長を測定した。スパインを手動で計数した。
器官型海馬スライス培養物調製および形質移入．
【００８４】
上述のようにＰ４  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット由来海馬を培養した（Ｗａｙｍａｎ、Ｉｍｐｅｙら、２００６年）。つまり、４００μｍのスライスを（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州、ビルリカ）上で３日間培養し、その後、樹状枝を可視化するため、メーカーのプロトコルにしたがって、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎ  Ｇｕｎ（ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州、ヘラクレス）を使用してｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質（ＴＦＰ）で微粒子銃により形質移入した。２４時間の修復期間後に、１ｐＭのＮｌｅ‐ＡｎｇＩＶまたはジヘキサで２日間、スライスを刺激した。スライスを固定し、設置した。海馬ＣＡ１ニューロン過程を画像化し、上述のように測定した。
急性海馬スライス
【００８５】
Ｈａｒｌａｎ研究所（米国、カリフォルニア州）から入手した成体Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ＋）をイソフルオラン（Ｖｅｔ  ＯｎｅＴＭ、ＭＷＩ、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社、米国、アイダホ州）で麻酔し、頭部除去した。脳を迅速に除去し、氷冷した人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中に約３０秒間入れた。正中矢状切断により両脳半球を離し、両海馬を切除した。薬物の浸透性を確保するために、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ社、英国、ＧｏｍＳｈａｌｌ）を使用してスライスを横および縦方向に切断し（４００μｍ）、ａＣＳＦを収容したガス充填（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）恒温チャンバに移し、室温で９０分間置いた。スライスを新たなチューブに移し、注意深く吸引してａＣＳＦを除去し、賦形剤（ａＣＳＦ＋ａＣＳＦ）１００ｎｇ／ｍｌを含むａＣＳＦ、無担体成体組み換え肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、ミネソタ州）を含むａＣＳＦ、１０−１０ＭのＨｉｎｇｅ（Ｈａｒｄｉｎｇ  ｌａｂ社）５０ｎｇ／ｍｌを含むａＣＳＦ、１０−１０Ｍのジヘキサ（Ｈａｒｄｉｎｇ  ｌａｂ社）を含むａＣＳＦ、１０−１２Ｍのジヘキサを含むａＣＳＦ、または５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ＋１０−１２Ｍのジヘキサを含むａＣＳＦと置き換え、穏和に振動させながら３７℃で３０分間置いた。ａＣＳＦを除去し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州、ビルリカ）および阻害剤Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ  ＩおよびＩＩ（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）によりスライスを溶解し、氷上で超音波分解し、４℃で３０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行い清澄にした。ペレットから上清を除去し、−８０℃で保存するか、または直後にゲル電気泳動で処理した。
ｓｈＲＮＡ
【００８６】
ｃ‐Ｍｅｔの標的配列を、ＲＮＡｉセントラルデザインプログラム（アドレスｃａｎｃａｎ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／のウェブサイト参照）により設計した。Ｈ１プロモーター下でｓｈＲＮＡの体内生産を誘導するｐＳＵＰＥＲベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社、ワシントン州、シアトル）に標的配列ＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧ（配列番号：２）を挿入した。上述のリポフェクタミン法によりｓｈＲＮＡを細胞に形質移入した。Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｃ‐Ｍｅｔ‐６‐Ｍｙｃタグ化遺伝子生成物を作成し、受容体ノックダウンを検証した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のプライマーを使用し、ラット全脳ｃＤＮＡからＭｅｔタンパク質コード配列をクローニングした。増幅した生成物をゲル精製し、１９０ｋＤａバンドに相当するバンドを励起させ、ＰＣＡＧＧＳ‐６‐Ｍｙｃ行きベクター（Ｇａｔｅｗａｙ社）にクローニングした。
ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
【００８７】
メーカーのプロトコルにしたがってＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロックフォード）により試料のタンパク質濃度を定量した。試料をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ緩衝液に添加し、１０分間沸騰させ、その後、電気泳動用の４〜１２％Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）にロードした。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社、カリフォルニア州、ヘラクレス）に移し、室温（ＲＴ）で１時間、ＡｑｕａＢｌｏｃｋ（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチュセッツ州、Ｉｐｓｗｉｃｈ）でブロックした。ウサギ抗Ｍｅｔおよび抗ウサギホスホ‐Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチュセッツ州、ダンバーズ）を使用し、ＡｑｕａＢｌｏｃｋ（商標）中、４℃で一晩、一次抗体をインキュベートした。交互にＰＢＳとＰＢＳＴとで洗浄を行った。ＡｑｕａＢｌｏｃｋ（商標）中、室温で１時間、二次抗体（ＩＲＤｙｅ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、ペンシルベニア州、ギルバートヴィル）をインキュベートした。ＬＩ‐ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ‐ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ネブラスカ州、リンカーン）によりブロットを画像化した。
免疫細胞化学
【００８８】
２章で前述したように、形質移入したニューロンを処理し、固定し、染色した。つまり、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００洗浄剤（Ｂｉｏ‐ＲａＤ社；カリフォルニア州、ヘラクレス）で１０分間透過処理した。８％のウシ血清アルブミン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社；マサチュセッツ州、バーリントン）を含むＰＢＳを使用し、室温で１時間、非特異的結合を抑制した；一次抗体のインキュベーションは１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：２５００希釈（下記参照）で、４℃で一晩行った。二次抗体、１：３０００のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：カリフォルニア州、カールズバッド）を使用し、室温で２時間置いた。ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ抗フェード試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カリフォルニア州、カールズバッド）と共にカバースリップを設置し、洗浄はすべてＰＢＳで行った。画像および分析を上述と同様に行った。シナプス前興奮性伝達には、ＶＧＬＵＴ１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）マーカーを使用し（Ｂａｌｓｃｈｕｎ、Ｍｏｅｃｈａｒｓら）、通常のシナプス前伝達には、シナプシン１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、２００２年）を使用した。ＰＳＤ‐９５（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、マサチュセッツ州、ビルリカ）によりシナプス後機能を確立した（Ｅｌ‐Ｈｕｓｓｅｉｎｉ、Ｓｃｈｎｅｌｌら、２０００年）。各事例において、投与群、対照、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサについてスパインの総数を計数し、活性的表現型を確実にした。ＶＧＬＵＴ１またはシナプシンに隣接する富アクチンスパイン（赤）の総数を計数し、百分率に変換した。何故ならシナプス前マーカーに対する投与誘発性スパインの割合相関は興奮シグナルの伝達能の強い指標になるからである。本出願では、相関の数値は、緑色ＰＳＤ‐９５免疫陽性染色点に対する赤色蛍光タグ化アクチンスパインから構成されており、これらが融合するとオレンジ色のスパインになる。
全細胞記録．
【００８９】
５日間の前処理としてｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入した培養海馬ニューロン（賦形剤対照）、および１ｐＭのＨｉｎｇｅもしくはジヘキサ、または１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で形質移入した海馬ニューロンでパッチクランプ実験を行った。形状が錐体様（〜２０μｍの細胞体、および非対称樹状突起分布）のニューロンから記録をとった。形質移入後の時間は６日間であった。培地は（ｍＭで）１４０のＮａＣｌ、２．５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ２，３のＣａＣｌ２、２５のグルコ‐ス、および５のＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液；ｐＨはＫＯＨで７．３に調整した；オスモル濃度は３１０ｍＯＳｍに調整した：と交換した。倒立顕微鏡（ＩＸ‐７１；Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ社、東京）を備えた記録チャンバ中で記録前に３０分間、培養液を平衡化した。形質移入細胞を蛍光で可視化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ社）。フィラメントのない標準的壁ホウケイ酸ガラス（ＯＤ＝１．５ｍｍ；Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）から記録ピペットを引き抜いた（Ｐ‐９７  Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー；Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、カリフォルニア州、ナヴァト）。ピペットから槽へのパッチ電極のＤＣ抵抗は４．０〜５．２ＭΩの範囲であり、以下の組成の内部溶液を充填した（単位はｍＭ）：２５のＣｓＣｌ、１００のＣｓＣＨ３Ｏ３Ｓ、１０のクレアチンリン酸、０．４のＥＧＴＡ、１０のＨＥＰＥＳ、２のＭｇＣｌ２、０．４のＭｇ‐ＡＴＰ、および０．０４のＮａ‐ＧＴＰ；ｐＨはＣｓＯＨで７．２に調整した；オスモル濃度は２９６〜３００ｍＯｓｍに調整した。ピクロトキシン（１００μＭ；Ｓｉｇｍａ社）を含むＧＡＢＡ受容体塩化物チャンネルを遮断し、ストリキニーネ（１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）でグリシン受容体を遮断し、テトロドトキシン（ＴＴＸ、５００ｎＭ；Ｔｏｃｒｉｓ社）で活動電位生成を遮断することで薬理学的に微小ＥＰＳＣ（ｍＥＰＳＣ）を単離した。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、サニーベール）を使用して記録を得た。アナログ信号は２ｋＨｚで低域のベッセルフィルターにかけ、Ｄｉｇｉｄａｔａｌ４４０Ａインターフェース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を介して１０ｋＨｚでデジタル化し、Ｃｌａｍｐｅｘ１０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用してコンピュータに保存した。インキュベーターから培養物を取り出してから０．５〜２時間、膜電位を室温（２５℃）で−７０ｍＶで保持した。液界電位は修正しなかった。Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）およびＭｉｎｉ‐Ａｎａｌｙｓｉｓ６．０ソフトウェア（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ社；ニュージャージー州、フォートリー）を使用してデータ分析を行った。記録を良好にするために、基準には記録ピペットの外面と付着細胞との間のシールの電気抵抗＞２ＧΩ、ニューロン入力抵抗＞２４０ＭΩが含まれた。ｍＥＰＳＣの記録時間は５分であった。
結果
肝細胞増殖因子は樹状構造を増強し、シナプス形成を支持する
【００９０】
ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶがｍＲＦＰ‐β‐アクチン形質移入海馬ニューロンにおいてスパイン形成を誘導することは前記に示した（実施例１参照）；しかしこの作用の基礎となるメカニズムは未知であった。ノルレウアル、他のＡｎｇＩＶ類似体にはｃ‐ＭｅｔへのＨＧＦの作用をブロックする能力があることから（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年）、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶにより開始したスパイン密度の増加はＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系に媒介されると本発明者らは仮説を立てた。このように、解離海馬培養物内でのスパイン形成に対するＨＧＦの効果を評価した。インビトロ（ＤＩＶ）６日目に、海馬ニューロンをｍＲＦＰ‐β‐アクチンで形質移入し、５日間、ＨＧＦで刺激した。
【００９１】
ＨＧＦ刺激後にスパイン数の用量依存的増加が観察され、最も低い有効量は５ｎｇ／ｍｌであった（平均スパイン数＝２４．７；＊＊＝対照に対してｐ＜０．０１；ＨＧＦ１０および２０ｎｇ／ｍｌに対して；ｎｓ）。最も著しい効果は１０および２０ｎｇ／ｍｌにより生じた（それぞれ平均スパイン数＝２７．５および２７．０；投与群当たりｎ＝５０；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ｄｆ＝４／２４５；Ｆ＝１３．５）。しかし、２．５ｎｇ／ｍｌ用量のＨＧＦは基部スパイン数に効果はなく（平均スパイン数＝１８．６、対して対照＝１８．０）（図８）、したがって閾値以下であると考えられた。
【００９２】
より生理学的に関連性のある環境でスパイン形成を増強するＨＧＦの能力を評価するため、器官型海馬スライスを使用した。溶解性赤色蛍光タンパク質Ｔｏｍａｔｏを微粒子銃で形質移入した海馬スライスを１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０−１２Ｍのジヘキサまたは賦形剤で４８時間刺激した。学習に応じて柔軟に変化することが知られているＣＡ１海馬ニューロンを、形態学に基づいて分析するために簡単に選択した。ＣＡ１海馬ニューロンにおいて、５０μｍ樹状突起長当たりのスパイン数をジヘキサおよびＨＧＦは有意に増加させた（それぞれ平均スパイン数＝１５．０および１８．５、これに対して対照の平均スパイン数＝６．１；投与群間で＊＊＊＝Ｐ＜０．００１および＊＊＝Ｐ＜０．０１；ｄｆ＝２／８１；Ｆ＝４１．５）（図９ＡおよびＢ）。    
【００９３】
ニューロンにジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶを投与した過去の研究から、誘導された樹状突起スパインのほとんどはシナプス前およびシナプス後マーカーの両方で共局在化することが示され、これらの新たなスパインが機能的シナプスを支持することが示唆された。また、シナプス入力の大部分はグルタミン酸作動性であることが分かった。ジヘキサ、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ、およびＨＧＦはすべて一般的なメカニズムを通じて作用すると提起されていることから、ＨＧＦ誘導型スパインの機能的特性を評価した。シナプス前活性領域の一般的なマーカーであるシナプシン（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＲａｐｏｐｏｒｔ；２００２年）ならびにグルタミン酸作動性シナプスに特異的なマーカーである小胞性グルタミン酸輸送体１（ＶＧＬＵＴ１）（Ｂａｌｓｃｈｕｎ、Ｍｏｅｃｈａｒｓら、２０１０年）用に、ｍＲＦＰ‐β‐アクチン形質移入海馬ニューロンを免疫染色した。ＨＧＦ刺激はシナプス後スパインの数を大幅に増強し（一元配置ＡＮＯＶＡでは、ＨＧＦでの５０μｍ樹状突起長当たりの平均スパイン数＝３３、対して対照では２３；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）、よってＨＧＦ投与により活性的表現型を確保した（図１０ＡおよびＢ）。ＶＧＬＵＴ１に隣接したシナプス後スパイン、またはシナプシン陽性染色点の数を計数し、総スパイン数の百分率に変換した。シナプシン１に対して免疫染色したＨＧＦ投与ニューロン（１０ｎｇ／ｍｌ）では、シナプス前マーカーとシナプス後のアクチン豊富なスパインとの間に９８％の相関性が観察された（図９Ｃ）。ＶＧＬＵＴ１とシナプス後スパインの９５％相関性から、ＨＧＦに誘導されたスパインはほとんどグルタミン酸作動性のものだけであることが示された（図１０Ｄ）。緑色染色点と赤色スパインとの相関性はシナプシンおよびＶＧＬＵＴ１と９４％相同であった（図１０ＣおよびＤ）。
【００９４】
上記データから、ＨＧＦ投与に応答して生成されたスパインが機能的シナプスを形成することが示唆されている。さらに、ＶＧＬＵＴ１との高い相関性から、これらのインプットの多くは本来、興奮性であることが示唆される。さらにこの結論を評価するために本発明者らは、ＨＧＦ投与後のニューロンから自然発生ＡＭＰＡ媒介微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）の周波数を測定し、これらのデータを、ｍＥＰＳＣ周波数の増加のために事前に確立されたジヘキサで得られたデータと比較した。記録は、ｍＲＦＰ‐β‐アクチンで形質移入し、１０−１２Ｍのジヘキサ、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、または当量の賦形剤で５日間処理した解離海馬ニューロンで行った。ＨＧＦ（平均周波数＝７．０９±０．５３；ｎ＝１１）およびジヘキサ投与（平均周波数＝６．７５±０．９９；ｎ＝９）は両者とも、対照（一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＮｅｗｍａｎ‐Ｋｅｕｌｓ後知恵検定では、平均周波数＝３．５５±０．６０；ｎ＝９；＊＊＝Ｐ＜０．００２；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を投与したニューロンの２倍近く興奮性シナプス伝達を増加させ（図１１）、ＨＧＦ投与がシナプス形成増加を促進するという仮定が確認された。
【００９５】
アンジオテンシンＩＶリガンド作用がＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔに媒介されるかどうかを解明するために、相乗効果実験を行った。閾値以下量のジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで増強した閾値以下量のＨＧＦがスパイン形成を促進することは以前に示してあり、これは作用の共通のメカニズムを示唆するものである。ｍＲＦＰ‐β‐アクチンを形質移入した解離海馬ニューロンを、閾値以下濃度のＨＧＦおよびジヘキサ（それぞれ２．５ｎｇ／ｍｌ＋１０−１３Ｍ）、生物学的に活性的量のＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ジヘキサもしくはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（１０−１２Ｍ）または２．５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ＋１０−１２Ｍのジヘキサもしくは２．５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ＋１０−１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの閾値以下量の併用で、５日間刺激した。結果を図１２ＡおよびＢに示す。閾値以下濃度のＨＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（１０−１３Ｍ）は基部スパイン形成に影響は無く、対照投与ニューロンと何ら変わりなかった（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．５０μｍ樹状突起長当たりのスパイン数は、対照＝１７．４、ＨＧＦ＝１６．５、ジヘキサ＝１７．１およびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ＝１６．５；ｐ＞０．０５）。生物学的活性量のＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（１０−１２Ｍ）は対照投与スパインより有意に効果を示した（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．５０μｍ樹状突起当たりのスパイン数は、ＨＧＦ＝２９．３、ジヘキサ＝２６．４およびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ＝２９．８）。ＨＧＦの２．５ｎｇ／ｍｌ＋１０−１３Ｍのジヘキサおよび、２．５ｎｇ／ｍｌ＋１０−１３ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶの閾値以下量の併用は、生物学的に活性的量のＨＧＦ単独での各アゴニストの効果を表現型模写した（；一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＴｕｋｅｙ後知恵検定で；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、５０μｍの樹状突起長当たりのスパイン数は、ＨＧＦ＋ジヘキサは２８．８、ＨＧＦ＋Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶは２６．２、比較として対照投与ニューロン＝１７．４；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１；平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【００９６】
アンジオテンシンＩＶリガンドおよびＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ媒介相互作用をさらに実証するために、新規のＨＧＦアンタゴニストＨｉｎｇｅ（ＤＹＩＲＮＣ、配列番号：３）を利用した（Ｋａｗａｓら、２０１１３。ｃ‐Ｍｅｔ媒介活性を評価するための優れた基準であるＭａｄｉｎ‐Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞の散乱を阻害する能力により、ＨｉｎｇｅはＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ受容体アンタゴニストであることが確認された。細胞散乱には、細胞接着特性の喪失、細胞遊走および分化、ＨＧＦの顕著な特徴、およびｃ‐Ｍｅｔ作用が挙げられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｅｌｉａｓら、２０１０年；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９９３年）。解離海馬ニューロンに対するＨｉｎｇｅの効果を試験したところ、幅広い用量でスパイン形成に効果がないことが分かり、ＨｉｎｇｅおよびＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系は培養ニューロンに見られる基部スパイン形成にさほど重要に関わっていないことが示された（図１３Ａ）。しかしＨｉｎｇｅは、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（図１３Ｂ）、１０−１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（図１３Ｃ）または１０−１２Ｍのジヘキサ（図１２Ｄ）で刺激したニューロン内のスパイン形成を効果的に阻害し、これらの作用はＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系に媒介されるという論点がさらに支持された。
【００９７】
興奮性シナプス伝達に対するＨｉｎｇｅの効果を評価するため、Ｈｉｎｇｅ（１０−１２Ｍ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ジヘキサ（１０−１２Ｍ）、Ｈｉｎｇｅ＋ＨＧＦ（それぞれ１０−１２Ｍ＋１０ｎｇ／ｍｌ）またはＨｉｎｇｅ＋ジヘキサ（各１０−１２Ｍ）を５日間投与したｍＲＦＰ‐β‐アクチン形質移入海馬ニューロンから、ｍＥＰＳＣを記録した。賦形剤投与ニューロン（平均周波数＝５．３１±０．３５；図１４ＡおよびＢ）と比較して、Ｈｉｎｇｅ単独はシナプス伝達に影響を与えない（平均周波数＝４．５１±０．４７）。Ｈｉｎｇｅおよび賦形剤の両方を投与したニューロン（平均周波数は、ＨＧＦ＝９．６６±０．２０、ジヘキサ＝８．２５±０．５６）と比較して、ＨＧＦおよびジヘキサの周波数は有意に増加した。しかし、これらの効果はＨｉｎｇｅの存在下の刺激により有意に減弱される（ＨＧＦ＋Ｈｉｎｇｅの平均周波数＝５．２５±０．２７、およびジヘキサ＋Ｈｉｎｇｅ＝５．５７±０．６５；図１４ＡおよびＢ）。これらの結果から、新たに形成されたスパインは機能的シナプスを形成し、またＨｉｎｇｅはシナプス伝達に影響を及ぼさず、それはＡＭＰＡ媒介周波数を減少させるスパイン形成を阻害するその能力に起因していることが示唆されている。    
【００９８】
提起されたアンジオテンシンＩＶ受容体ＨＧＦはチロシンキナーゼ受容体ｃ‐Ｍｅｔのリガンドである。脳内のｃ‐ＭｅｔおよびＨＧＦのｍＲＮＡの局在は多く記録されているが（Ｊｕｎｇ、Ｃａｓｔｒｅｎら、１９９４年；Ｈｏｎｄａ，Ｋａｇｏｓｈｉｍａら、１９９５年；ＴｈｅｗｋｅおよびＳｅｅｄｓ、１９９６年；Ａｃｈｉｍ、Ｋａｔｙａｌら、１９９７年）、ｃ‐Ｍｅｔタンパク質の存在および分布は試験されていない。したがって、ｃ‐Ｍｅｔの存在について、いくつか脳領域を調査したが、有効な抗体が無いためにＨＧＦについては調査ができなかった。脳の大半の領域にわたって高レベルのｃ‐Ｍｅｔタンパク質を観察した。具体的には、海馬でｃ‐Ｍｅｔタンパク質の最大シグナルが見られ、ＨＧＦ産生の重要部分である肝臓よりも多かった。認知に重要な領域である前頭前皮質および中脳でも強いシグナルが見られ、一方、新皮質ではシグナルはやや減少し、小脳ではシグナルは最低であった（図１５ＡおよびＢ）。
【００９９】
ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系に対するジヘキサの作用の明らかな依存性から、閾値以下レベルのＨＧＦ存在下のジヘキサはｃ‐Ｍｅｔのリン酸化および活性化を刺激できることが予想された。したがって単独、および併用の飽和濃度および不飽和濃度のＨＧＦ、ジヘキサで急性成体ラット海馬スライスを刺激し、ホスホ‐Ｍｅｔについて調査した。ｃ‐Ｍｅｔ受容体のリン酸化は受容体が活性化したことを示す。図１６は賦形剤投与から３０分後のｃ‐Ｍｅｔ受容体のリン酸化、および様々な濃度のＨＧＦまたはジヘキサを示す。飽和量のＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびジヘキサ（１０−１０Ｍ）ジヘキサは両方とも、対照（ａＣＳＦ）投与スライスと比較して、ｃ‐Ｍｅｔリン酸化を増加させた；（ｐ＜０．００７）。不飽和量のＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびジヘキサ（１０−１２Ｍ）は対照を投与したスライスとは統計的に差は無く（ｐ＞０．０５）、したがって閾値以下であると考えられた。しかし、閾値以下量のＨＧＦとジヘキサとの併用は、飽和量のＨＧＦおよびジヘキサと類似した効果が得られることが分かった（ｐ＜０．００７）。このように用量依存的ではあるが、ジヘキサは単独でも、ＨＧＦと併用しても、成体ラット脳のＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系を独立して活性させ得ることは明らかである。これらの所見と一致して、ＨＥＫ２９３細胞のリン酸化によりｃ‐Ｍｅｔを活性化し（図１７）、ＭＤＣＫ細胞散乱を刺激する（図１８）ＨＧＦの能力をジヘキサは劇的に増強させることが可能である。
【０１００】
ＡｎｇＩＶ類似体がＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系を介して作用することを確証するため、ｃ‐ＭｅｔのｓｈＲＮＡを使用し、受容体をノックダウンした。解離海馬ニューロンをｍＲＦＰ‐β‐アクチンおよびｓｈＭｅｔＲＮＡで形質移入し、４８時間かけて受容体をノックダウンさせ、その後、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（両方とも１０−１２Ｍ）を（１ウェル当たり）０．５μｇ使用して刺激した。より長期の曝露はニューロンにとって有害または有毒であることが分かった。（０．１μｇ）６‐Ｍｙｃタグ化ｃ‐Ｍｅｔ、（０．１μｇ）ｓｈＭｅｔまたはｍＲＦＰ‐β‐アクチン単独でヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を形質移入することで、効果的なｃ‐Ｍｅｔ受容体ノックダウンを検証した。抗Ｍｙｃ抗体を使用してＭｙｃタグ化ｃ‐ｍｅｔを免疫ブロッティングすることで、良好なノックダウンを確認した（図１９）。
【０１０１】
対照として働くｍＲＦＰ‐β‐アクチン単独を形質移入したニューロンに１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０−１２ＭのジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶを投与した。対照投与ニューロンと比較してスパイン数の大幅な増加が観察された（一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＴｕｋｅｙ後知恵検定で、５０μｍの樹状突起長当たりの平均スパイン数＝１３．２、対してＨＧＦ＝２０．６；ジヘキサ＝２１．８およびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ＝２０．０；Ｐ＜０．０５）。図２０に示すように、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０−１２ＭのジヘキサまたはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで刺激したｍＲＦＰ‐β‐アクチンおよびｓｈＭｅｔを形質移入したニューロンのスパイン数は対照と差は無かった（一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＴｕｋｅｙ後知恵検定で、５０μｍの樹状突起長当たりの平均スパイン数＝１３．５、対してＨＧＦ＝１２．４；ジヘキサ＝１２．０およびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ＝１２．１；Ｐ＞０．０５）。順番を入れ替えたＲＮＡ配列を陰性対照として使用し、基部スパイン形成または刺激後スパイン形成に何ら影響は無かった（データの記載なし）。これらの結果から、ＡｎｇＩＶ類似体の効果はＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系により媒介されることが分かる。
【０１０２】
自分自身で迷路外の目印に向かうことによりラットが水表面下に隠された基台に辿り着くことを要求する海馬依存空間学習演習であるモリス水迷路を採用し、ジヘキサの認知促進効果に対するＨＧＦアンタゴニスト、Ｈｉｎｇｅの影響を評価した。試験群には以下のものが挙げられる：ａＣＳＦおよびその後にａＣＳＦを投与する群、スコポラミン（７０ｎＭ）およびその後にａＣＳＦを投与する群、スコポラミンおよびその後にジヘキサ（３００ｐＭ）を投与する群、ａＣＳＦおよびその後にＨｉｎｇｅ（３００ｐＭ）を投与する群、ならびにスコポラミン＋Ｈｉｎｇｅおよびその後にジヘキサを投与する群。図２１は水迷路の訓練で１〜８日で隠された基台を見つける平均時間を示している。訓練１日目、基台を見つけ出す時間に有意な差を示す群は無かった。平均時間は、賦形剤対照（ａＣＳＦ→ａＣＳＦ）群＝８９．３ｓ；スコポラミン投与群＝１１４．７ｓ；スコポラミン＋Ｈｉｎｇｅ→ジヘキサ投与群での時間＝１０７．９ｓ；Ｈｉｎｇｅ群平均時間＝１１１．１ｓ；およびスコポラミン→ジヘキサ群＝１１５．２ｓであった。訓練の４日目までが重要な日と考えられ、この間に訓練が最も向上し、神経可塑性が起こり（Ｍｅｉｇｈａｎら、２００６年）、スコポラミン群（基台を見つけ出す平均時間＝１０２．４ｓ）およびスコポラミン＋Ｈｉｎｇｅ→ジヘキサ群（平均時間＝１０５．２ｓ）は、賦形剤対照群（平均時間＝４３．０ｓ）、Ｈｉｎｇｅ群（平均時間＝７８．３ｓ）およびスコポラミン→ジヘキサ群（平均時間＝６３．０ｓ）と比較して改善の兆候は見られなかった。学習が最大になる訓練の最終日に（Ｍｅｉｇｈａｎ、Ｍｅｉｇｈａｎら、２００６年）、スコポラミン群（基台を見つけ出すまでの平均時間＝８４．８ｓ）およびスコポラミン＋Ｈｉｎｇｅ→Ｄｉｈｅｘａ群（平均時間＝９３．６ｓ）の平均時間は、賦形剤対照群（平均時間＝４３．０ｓ）、Ｈｉｎｇｅ群（平均時間＝４６．１ｓ）およびスコポラミン→ジヘキサ群（平均時間６２．３ｓ）と比較して学習の向上はほとんど無かった。これらの結果から、ＨＧＦおよびｃ‐Ｍｅｔは海馬依存型認知過程において重要な役割を担っていることが示唆されている。
考察
【０１０３】
アンジオテンシンＩＶ類似体の認知促進効果から、この系に基づく抗認知症薬が開発可能であることが示唆されている（Ｂｒａｓｚｋｏ、Ｋｕｐｒｙｓｚｅｗｓｋｉら、１９８８年；Ｓｔｕｂｌｅｙ‐Ｗｅａｔｈｅｒｌｙ、Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９６年；Ｐｅｄｅｒｓｏｎ、Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９８年；Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓｔｕｂｌｅｙら、１９９９年）。しかし、アンジオテンシンＩＶおよび多数のＡｎｇＩＶ類似体の代謝安定性は低く、初期の類似体は血液脳関門を透過できず、ＡＴ４受容体の同定が不可能であったため、その開発を推進する製薬会社は無かった。本発明者らの研究所で合成した新規アンジオテンシンＩＶ類似体であるジヘキサは安定的であり、経口投与で効果があり、よって開発を妨げる主な薬物動態学的障害を克服している。ジヘキサは５時間以上、血液中で安定的であり（図示なし）、消化管を経て血液脳関門を透過する経路中で存続し、認知症の急性および慢性モデルにおける認知障害を克服している（図示なし）。水迷路演習を促進するために確立した一般的なメカニズムには、新規に開発したシナプス後スパインの形態で、かつシナプス形成に随伴した樹状枝の拡張が挙げられる。開発のための最後に残る障害は分子メカニズムの欠如であった。
【０１０４】
本明細書では、ＡｎｇＩＶ類似体の作用がＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系に依存していることを説明している。両系は類似の生理学的効果を媒介することが分かっている。アンジオテンシンＩＶ／ＡＴ４系は脳保護効果を有し（Ｗｒｉｇｈｔ、Ｃｌｅｍｅｎｓら、１９９６年；Ｄａｔｅ、Ｔａｋａｇｉら、２００４年）、長期増強を強化し（Ｋｒａｍａｒ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００１年；Ｗａｙｎｅｒ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００１年；Ａｋｉｍｏｔｏ、Ｂａｂａら、２００４年；Ｄａｖｉｓ、Ｋｒａｍａｒら、２００６年）、認知促進効果を良好に確立しており（ＷｒｉｇｈｔおよびＨａｒｄｉｎｇ、２００８年）、神経幹細胞の発生を調節すると推測される。ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系も認知促進効果を有し（Ａｋｉｍｏｔｏ、Ｂａｂａら、２００４年；ＴｙｎｄａｌｌおよびＷａｌｉｋｏｎｉｓ、２００６年；ＴｙｎｄａｌｌおよびＷａｌｉｋｏｎｉｓ、２００７年）、幹細胞調節に関与していることが公知である（Ｕｒｂａｎｅｋ、Ｒｏｔａら、２００５年；Ｎｉｃｏｌｅａｕ、Ｂｅｎｚａｋｏｕｒら、２００９年）。機能的類似性の他に、アンジオテンシンＩＶとＨＧＦのリンカー領域「ヒンジ」との間に配列相同性がある（Ｗｒｉｇｈｔ、Ｙａｍａｍｏｔｏら、２００８年）。この考えは、周知のＡＴ４アゴニスト、ノルレウアルがＭＤＣＫ細胞散乱などの多くのＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ調節機能を遮断できることを観察したことによって、さらに確固たるものとなった（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｅｌｉａｓら、２０１０年）。
【０１０５】
水迷路演習の促進は、樹状枝の同化を介して発生する神経伝達の増強により、ジヘキサおよび親アンジオテンシンＩＶリガンド、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶにより達成される。ＡｎｇＩＶ類似体の作用とＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系との間の仮説の関連性により、ジヘキサとＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶのようにＨＧＦが解離海馬ニューロン内で樹状突起スパイン増殖を刺激し得るということが予想された。予想通り、ＨＧＦは解離海馬ニューロン内でスパイン形成の用量依存的増加を促進した（図７）。その後、最も有効濃度のＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）はジヘキサに類似したさらに無傷の調製物である器官型海馬スライス培養物内で海馬ニューロンを刺激することが分かり（図８ＡおよびＢ）、さらにジヘキサとＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ間の機械的結合を確立している。これらの新規なスパインの生理学的関連性を評価し、常在するシナプスの神経伝達物質特性を判定するために、シナプス前活性部に配置した一般的シナプス前マーカーであるシナプシン（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、２００２年）ならびにグルタミン酸作動性シナプス前シナプスで見られる興奮性シナプス前マーカーＶＧＬＵＴ１（Ｂａｌｓｃｈｕｎ、Ｍｏｅｃｈａｒｓら）に対してｍＲＦＰ‐β‐アクチンで標識したＨＧＦ投与誘導型スパインを免疫染色した。シナプシンまたはＶＧＬＵＴ１スパインと対比させたシナプス後ｍＲＦＰ‐β‐アクチン標識スパインの比率は対照投与ニューロンと差は無く、投与誘導型スパインが機能的シナプスを形成していることが示唆された（図９Ａ〜Ｄ）。ＨＧＦおよびジヘキサ投与したニューロンにおいて、活動電位とは無関係の自然発生したシナプス前バースト、ｍＥＰＳＣを記録することでシナプス形成のさらなる確証を得た。周波数増加に示されるようにＨＧＦおよびジヘキサ投与に応答してＡＭＰＡ媒介伝達が増幅された（図１０）。
【０１０６】
アンジオテンシンＩＶリガンドであるジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶならびにＨＧＦは同一のシグナル伝達カスケードに影響を及ぼすのか、あるいは１つの受容体（ｃ‐Ｍｅｔ）に作用するのかを判定するために、閾値以下濃度のジヘキサとＨＧＦ、またはＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶとＨＧＦを使用し、インビトロで海馬ニューロンを刺激した。ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶが同一のシグナル伝達カスケードに関与しているのかを判定するため、閾値以下濃度のＡｎｇＩＶリガンドと閾値以下量のＨＧＦとを併用した。閾値以下濃度の各リガンド単独では基底スパイン形成を変化させることはなかったが、１０−１３Ｍのジヘキサと２．５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、または１０−１３ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶと２．５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの閾値以下濃度の併用では天井効果に近い効果が生じ、生物学的に応答性のある用量の各リガンド単独と類似していた（図１１ＡおよびＢ）。ＡｎｇＩＶ類似体およびＨＧＦに対する樹状突起の応答の類似性は、作用の一般的メカニズムと一致している。
【０１０７】
メカニズムのこの認識された共通性をさらに強化するために、新規のＨＧＦアンタゴニストＨｉｎｇｅが採用され、ＡｎｇＩＶ類似体およびＨＧＦで刺激した海馬ニューロンにおける効果について評価した。ＨＧＦ依存性ｃ‐Ｍｅｔリン酸化をブロックし、ＭＤＣＫ上皮細胞株においてＨＧＦによる散乱を防止するＨｉｎｇｅの能力により、アンジオテンシンＩＶアンタゴニストであるノルレウアルのようにＨｉｎｇｅをｃ‐Ｍｅｔアンタゴニストとして確立した。ＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ相互作用の顕著な特徴である細胞散乱により、接着接着特性が喪失し、細胞が遊走する（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｅｌｉａｓら；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９９３年）。Ｈｉｎｇｅは培養した海馬ニューロンに悪影響を与えず、スパイン形成の促進も阻害もしないことが分かった（図１２Ａ）。しかし、ピコモル濃度では、Ｈｉｎｇｅは、ＨＧＦ、Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶおよびジヘキサに誘導されたスパイン形成を阻止し（図１２Ｂ〜Ｄ）、本発明者らのアンジオテンシンＩＶリガンドに見られる効果がＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ媒介性であることがさらに示唆された。シナプス形成に対するＨｉｎｇｅの効果は培養海馬ニューロンにおけるｍＥＰＳＣの周波数を記録することで評価した。ＡＭＰＡ‐周波数では、Ｈｉｎｇｅ単独はベースラインのシナプス伝達を変え、ＨＧＦおよびジヘキサでの増加を減弱させた（図１３ＡおよびＢ）。Ｈｉｎｇｅの拮抗作用が無く各アゴニストが微小ＡＭＰＡ周波数（図１３Ａ〜Ｂおよび図１０）を増加させ、機能的シナプス結合を形成することから、この効果はＨＧＦおよびジヘキサ投与に促進されたスパイン形成の減弱に起因している可能性があった。まとめると、これらのデータから、ＨＧＦを阻害しても賦形剤投与ニューロン内の機能的シナプス数は変わらないが、シナプス後スパイン数を減少させることによりシナプス形成に対するＨＧＦおよびジヘキサの効果は減弱することが示唆される。
【０１０８】
アゴニストであるジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶはＨＧＦおよびその受容体ｃ‐Ｍｅｔを介して作用するという論点をさらに支持するため、海馬ニューロンをｃ‐Ｍｅｔ受容体をノックダウンするｓｈＲＮＡで形質移入した。受容体のノックダウンはＭｙｃでタグ化したｃ‐Ｍｅｔ遺伝子産物に対する免疫ブロッティングで検証した（図１６）。予想通り、ＲＦＰ‐β‐アクチンで形質移入した海馬ニューロンを、ＨＧＦ、ジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶで刺激すると、樹状枝が有意に促進され、一方、追加的にｓｈｃ‐Ｍｅｔ  ＲＮＡも形質移入した海馬ニューロンは対照投与ニューロンと変わらなかった（図１７）。これらのデータは、アンジオテンシンＩＶリガンドであるジヘキサおよびＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶがＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系を介して作用するという本発明者らの意見の決定的な根拠をもたらすものである。
【０１０９】
新規に開発したアンジオテンシンＩＶアゴニストリガンドであるジヘキサはスコポラミン投与ラットでの空間学習および記憶演習の習得を促進することが分かっている（データ記載なし）。水迷路でＨＧＦを試験することは非常に費用がかかることから、本発明者らは代わりに、ジヘキサの作用を遮断するためにＨＧＦアンタゴニストであるＨｉｎｇｅを使用して認知へのその関与を評価した。ムスカリン性コリン受容体アンタゴニストであるスコポラミンの投与によりラットは急性健忘症となり、よって演習が学習不能となる。スコポラミンの前投与の後にジヘキサを投与されたラットにおいて補助効果が観察される。これらのラットでは演習が急速に促進され、賦形剤投与ラットと変わらない行動を示した。スコポラミンおよびＨｉｎｇｅを投与したラット群はスコポラミン製剤におけるジヘキサで見られたような補助効果を示さなかった（図１４ＡおよびＢ）。これらのデータから、学習および記憶に関するＨＧＦおよびｃ‐Ｍｅｔ系の機能が明らかになり、また、ＨＧＦの作用を模倣した薬剤は、それが必要な被験体の学習および記憶を向上させるために使用可能であることが明らかになった。
【実施例３】
【０１１０】
肝細胞増殖因子／Ｍｅｔ修飾因子としてのアンチオテンシンＩＶ類似体の開発
アンジオテンシンＩＶ類似体の６‐ＡＨファミリー［Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２；式中Ｘ＝様々なアミノ酸］は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に直接結合し、機能的二量体を形成するＨＧＦの能力を阻害する。代謝的に安定した６‐ＡＨファミリーメンバー、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２は、血中ｔ１／２が＜５分である親化合物ノルレウアル（Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ψ‐（ＣＨ２‐ＮＨ２）３‐４‐Ｈｉｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ、配列番号：１）と比較して、８０分の血中ｔ１／２であった。６‐ＡＨファミリーメンバーはＨＧＦ（ヒンジ領域）の二量体化ドメインの模倣体として作用し、その受容体Ｍｅｔを活性化するＨＧＦの能力を減弱させる３Ｈ‐ヒンジ領域ペプチドとのＨＧＦ分子の相互作用を阻害することが分かった。この干渉は、低いピコモル範囲に減少した濃度で、多種の細胞においてＨＧＦ依存シグナル伝達、増殖および散乱の阻害に変わった。本発明者らはまた、ＨＧＦ二量体化をブロックする６‐ＡＨファミリーメンバーの能力と細胞活性の阻害との有意な相関性も特記しておく。さらに、２位にシトシンを有する６‐ＡＨファミリーメンバーはＨＧＦ依存細胞活性の特に有効なアンタゴニストであった。この化合物は、過剰活性ＨＧＦ／Ｍｅｔ系により特徴づけられたＢ１６‐Ｆ１０マウスメラノーマ細胞により肺定着を抑制した。これらをまとめると、ＡｎｇＩＶ類似体の６‐ＡＨファミリーはＨＧＦ／Ｍｅｔ系の活性を変更することでその生物活性を発揮し、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系の過剰活性に依存しているか、あるいはその活性を有している障害の治療薬としての可能性を提供することがデータから示されている。
緒言
【０１１１】
多機能増殖因子である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびその受容体Ｍｅｔは、上皮（Ｋａｋａｚｕら、２００４年）、内皮（Ｋａｎｄａら、２００６年）、造血細胞（Ｒａｔａｊｃｚａｋら、１９９７年）、ニューロン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００４年）、メラニン細胞（Ｈａｌａｂａｎら、１９９２年）、幹細胞（Ｂｏｒｏｗｉａｋら、２００４年）などの広範な細胞タイプ（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、２００３年）での有糸分裂、運動性、形態形成の重要なメディエータである。さらに、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系の調節不全は、腫瘍形成、腫瘍転移および腫瘍血管形成を促進する腫瘍性変化や癌（ヒトおよび動物にも及ぶ）を招くことが頻繁にある（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００５年；Ｌｉｕら、２００８年）。このシグナル伝達系の過剰活性化は通常、患者の予後不良に関わっている（Ｌｉｕら、２０１０年）。したがって、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系を阻害する分子は抗癌活性を発揮し、悪性腫瘍および転移性形質転換を減弱することが期待できる。
【０１１２】
ＨＧＦは  プラスミノーゲンファミリーのタンパク質分解酵素に非常によく似たドメイン構造を有する脊椎動物異種ポリペプチド増殖因子である（Ｄｏｎａｔｅら、１９９４年）。ＨＧＦは７つのドメイン：アミノ末端ドメイン、二量体化リンカードメイン、４つのクリングルドメイン（Ｋ１〜Ｋ４）、およびセリンタンパク質分解酵素相同（ＳＰＨ）ドメインから成る（Ｌｏｋｋｅｒら、１９９２年；Ｃｈｉｒｇａｄｚｅら、１９９９年）。単鎖プロポリペプチドは転換酵素によりタンパク質分解処理され、ジスルフィド結合により互いに結合する成熟α（重鎖５５ＫＤａ）およびβ（軽鎖３４ＫＤａ）ヘテロ二量体を産生する（ＳｔｅｌｌａおよびＣｏｍｏｇｌｉｏ、１９９９年；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、２００３年；Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００６年）。タンパク質分解処理以外に、ＨＧＦは二量体化が完全に活性化されることを必要とする（Ｌｏｋｋｅｒら、１９９２年；Ｃｈｉｒｇａｄｚｅら、１９９９年；Ｙｏｕｌｅｓら、２００８年）。ＨＧＦはＭｅｔとの相互作用に先だって、頭尾配向で配置された二量体および／または多量体を形成することを示す報告がいくつかある（Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００６年）。ドメイン間リンカーのアミノ酸（Ｋ１２２、Ｄ１２３、Ｙ１２４、Ｉ１２５、Ｒ１２６およびＮ１２７）を包含する二量体界面は、ヒンジ領域と呼ばれている（Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００６年；Ｙｏｕｌｅｓら、２００８年）。プレ‐プロＨＧＦおよび活性的ジスルフィド結合したヘテロ二量体は両方とも、高親和性でＭｅｔと結合するが、それはＭｅｔを活性化し得るヘテロ二量体のみである（Ｌｏｋｋｅｒら、１９９２年；Ｓｈｅｔｈら、２００８年）。
【０１１３】
本発明者らの研究所による最近の研究（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年）から、ピコモル濃度のＡｎｇＩＶ類似体ノルレウアル（Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ψ‐（ＣＨ２‐ＮＨ２）３‐４‐Ｈｉｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ）はＨＧＦ／Ｍｅｔ系を強力に阻害することが可能であり、その二量体化をブロックするＨＧＦのヒンジ領域に直接結合することが示された（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。さらに、実際のヒンジ領域を表すヘキサペプチドはノルレウアルと同じ生化学的および薬理学的特性を有していた（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。これらの研究の主要な意味は、ＨＧＦの二量体化ドメインを標的にする分子が新規かつ実行可能な抗癌治療法となり得るということである。またこれらのデータは、合成テンプレートとしてノルレウアルおよび／またはＨｉｎｇｅペプチドを使用するこのような分子の開発を支持している。
【０１１４】
その顕著な抗癌特性にもかかわらず、ノルレウアルは非常に不安定であり、その変化は臨床応用上の問題となっている。代謝的に安定しているＡｎｇＩＶ関連類似体のファミリーは本発明者らの研究所で開発したものであり、これは６‐アミノヘキサンアミドがＣ末端部位で置換されていることから、本明細書では６‐ＡＨファミリーと称することとする。Ｎ末端でＤ‐ノルロイシンと一緒にこのように置換するとファミリーメンバーの代謝抵抗性が促進される。
【０１１５】
本実施例３では、６‐ＡＨファミリーメンバー（すなわちＨＧＦ模倣体）はノルレウアルと比較して代謝安定性が優れており、高親和性でＨＧＦと結合し、ヒンジ領域模倣体として作用し；よってＨＧＦ二量体化および活性化を防止するということを説明する。この干渉はピコモル範囲の濃度で、多種の細胞においてＨＧＦ依存シグナル伝達、増殖および散乱の阻害に変わる。二量体化の遮断能とＨＧＦ活性化の細胞成果の阻害との間には、明白に正の相関関係がある。６‐ＡＨファミリーのメンバーであるファミリー、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２は、過剰活性ＨＧＦ／Ｍｅｔ系として特徴的であるＢ１６‐Ｆ１０マウスメラノーマ細胞による肺定着を抑制した。本実施例では、ＨＧＦに結合し、ＨＧＦ二量体化をブロックし、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系を阻害するＡｎｇＩＶ様分子の能力に焦点を当てることとする。さらに、これらのＨＧＦ模倣体はＡｎｇＩＶ関連薬として用途があり、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系の阻害が臨床的に有利である障害において治療薬として機能することが可能である。
材料と方法
【０１１６】
動物．肺定着研究にＴａｃｏｎｉｃ  ｆａｒｍｓ社製のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。薬物動態研究に使用するため、雄Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（２５０＋ｇ）をＨａｒｌａｎ研究所（米国、カリフォルニア州）から入手した。「実験動物の管理と使用に関する指針」に記載のＮＩＨガイドラインにしたがって動物を収容し、飼育した。
【０１１７】
化合物．Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＯＨ；式中、Ｘ＝様々なアミノ酸およびノルレウアル（Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ψ‐（ＣＨ２‐ＮＨ２）３‐４‐Ｈｉｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ、配列番号：１）；を、Ｈａｒｄｉｎｇ研究所のＦｍｏｃに基づく固相法により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。純度および構造をＬＣ‐ＭＳにより検証した。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入した。
【０１１８】
抗体．抗ＭｅｔをＣｅｌl  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（マサチュセッツ州、ベバリー）から購入し、ホスホ‐Ｍｅｔ抗体をＡｂＣａｍ社（マサチュセッツ州、ケンブリッジ）から購入した。
【０１１９】
細胞培養．ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２３９）およびＭａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）をＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した。使用に先だって、細胞を１００％集密になるまで増殖させた。薬物治療の開始前の２〜２４時間、ＨＥＫおよびＭＤＣＫ細胞を血清欠乏させた。
【０１２０】
血液安定性研究．ノルレウアルと、６‐ＡＨファミリーの代表的なメンバー、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２との血液安定性を比較するため、２０μＬの化合物含有賦形剤（水［ノルレウアル］または３０％エタノール［Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２］）を１８０μＬのヘパリン処理した血液に添加し、３７℃、様々な時間でインキュベートした。ノルレウアルでは、３７℃でのインキュベーションを０、２０、４０および６０分で停止し、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２では、インキュベーションを０、１、３および５時間で停止した。
【０１２１】
各インキュベートの終了時に、２０μＬのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（１００μｇ／ｍＬ）を内部標準として各試料に添加した。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の試料を４℃、２３００ｘｇで５分間遠心分離し、赤血球をペレット化し、血漿を無菌チューブに移した。３容の氷冷アセトニトリル（ＡＣＮ）を添加することでノルレウアルおよびＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の試料を沈殿させ、試料を強くボルテックスした。全試料を４℃、２３００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を無菌チューブに移した。その後、Ｓａｖａｎｔ  ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチュセッツ州、ウォルサム）で試料を乾燥するまで蒸発させ、残渣を２２５μｌの３５％メタノールで戻し、短くボルテックスし、ＨＰＬＣオートサンプラーバイアルに移し、１００μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。
【０１２２】
その後、Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（イリノイ州、ディアフィールド）製のＥｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（１００ｍｍ×２．１ｍｍ）でＨＰＬＣにより試料を分離した。ピークを検出し、ＬＣＭＳ‐２０１０ＥＶ質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本国、京都）を使用して質量分光学法により分析した。移動相は０．１％のトリフルオロ酢酸または０．１％のヘプタフルオロ酪酸（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）および様々な濃度のＡＣＮまたはメタノールを含むＨＰＬＣ水（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）から構成された。大気温度、０．３ｍＬ／分の流速で勾配法により分離を行った（詳細な情報は下記参照）。Ｐｒｉｓｍ５グラフィク／統計プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して、通常の単相指数関数的減衰を推測して安定性半減期を測定した。
ＩＶ薬物動態学．
外科的手技．本発明者らのＡＡＡＬＡＣ公認動物使節において雄Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（２５０＋ｇ）を自由に摂食（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ社、ラット食餌）および摂水できるようにした。１２時間の明暗周期の温度管理された室内にラットを収容した。ケタミン（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社、米国、アイオワ州、フォートドッジ）およびイソフルラン（Ｖｅｔ  Ｏｎｅ（商標）、ＭＷＩ社、米国、アイダホ州、メリディアン）麻酔下で、ラットの右頸静脈に滅菌ポリウレタンＨｙｄｒｏｃｏａｔ（商標）カテーテル（Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、イリノイ州、スコーキー）をカテーテル挿入した。背部皮膚からカテーテルを露出させた。採血の前後にヘパリン処理した生理食塩水でカテーテルを洗い流し、８時間以上使用しない場合はヘパリン‐グリセロールのロック液（６ｍＬのグリセロール、３ｍＬの生理食塩水、０．５ｍＬのゲンタマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、０．５ｍＬのヘパリン（１０，０００ｕ／ｍＬ））で満たしておいた。何らかの実験に使用する前には、動物を数日間外科処置から解放し、薬物動態実験の前の一晩、絶食させた。
【０１２３】
薬物動態研究．試験開始前には、カテーテル挿入したラットを代謝ケージに収容し、０時間目の血液試料を採取した。その後、頚静脈カテーテルを経て、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２（２４ｍｇ／ｋｇ）を含む３０％エタノールを動物に静脈内投与した。投与後、血液試料を以下のように採取した（時間と採取した血液体積を昇順に列挙している）：
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各血液試料を採取した後、カテーテルを生理食塩溶液で洗い流し、採取した血液と同量の生理食塩水を注射した（総血液量を維持した）。
【０１２４】
血液試料調製．ヘパリンを含まないポリプロピレン遠心分離チューブに入った採取物について、即座に４℃、２３００ｘｇで５分間血液試料を遠心分離し、細胞と血餅を分離し、血清を無菌の微小遠心チューブに移した。試料血清量の０．１倍の量の内部標準（Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ、１００μｇ／ｍＬ）を添加した。その後、試料血清量の４倍の量の氷冷アセトニトリルを添加し、試料を３０秒間強くボルテックスした。上清を無菌チューブに移し、その後、実験の終了まで氷上で保持し、その後、次の工程まで４℃で保存した。
【０１２５】
原液から、３０％エタノールでのＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の段階希釈物を調製し、標準曲線を得るために動物に投与して使用した。２０μＬの各段階希釈物を、最終濃度０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬで１８０μＬの血液に氷上で添加した。試料を４℃、２３００ｘｇで５分間遠心分離し、血清をポリプロピレン微小遠心チューブに移した。試料血清量の０．１倍の量の内部標準（Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ、１００μｇ／ｍＬ）を添加した。その後、試料血清量の４倍の量の氷冷アセトニトリルを添加し、試料を３０秒間強くボルテックスした。上清を無菌チューブに移し、試料を４℃で保存し、薬物動態試験用試料と並行して処理した。Ｓａｖａｎｔ  ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）濃縮器で全試料を乾燥するまで蒸発させた。残渣を２２５μｌの３５％メタノールで戻し、短くボルテックスした。その後、試料をＨＰＬＣオートサンプラーのバイアルに移し、１００μｌをＨＰＬＣシステムに注入し、各試料で全２回（２回のＨＰＬＣ／ＭＳ分析）行った。
【０１２６】
クロマトグラフシステムおよび条件．使用のＨＰＬＣ／ＭＳシステムはＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本国、京都）製であり、ＣＢＭ‐２０Ａ伝達手段バスモジュール、ＬＣ‐２０ＡＤポンプ、ＳＩＬ‐２０ＡＣ自動サンプラー、ＳＰＤ‐Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器およびＬＣＭＳ‐２０１０ＥＶ質量分析計から構成されている。データ収集および統合はＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳソリューションソフトウェアを使用して行った。使用した分析カラムはＧｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（米国、イリノイ州、ディアフィールド）製のＥｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（１００ｍｍ×２．１ｍｍ）であった。移動相はＨＰＬＣグレードのメタノール、およびトリフルオロ酢酸０．１％水溶液から構成されていた。非イソクラティック法（４０％〜５０％メタノール、１０分以上）により大気温度、０．３ｍＬ／分の流速で分離を行った。ＭＳ分析では、陽性イオンモード（Ｓｃａｎ社）を利用し、５４２でのＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２のｍ／ｚ、および３９５でのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ（内部標準に使用）のｍ／ｚをモニターした。血液内でＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２と内部標準との高精度の分離が良好に行われた。分析物または内部標準と共溶出する干渉ピークは無かった。ピーク純度分析ではＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２のピーク純度指数は０．９５、内部標準では０．９４であることが分かり、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２は５．０６分時点で溶出し、内部標準は４．３１分であった。内部標準の修正に基づいてデータを標準化した。
【０１２７】
薬物動態分析．個々のラットから得たデータを使用して薬物動態分析を行った。群ごとに平均および標準偏差（ＳＤ）を計算した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）により、血清中薬剤濃度‐時間プロファイルから、非区画薬物動態パラメータを計算した。可能であれば以下の関連パラメータを測定した：０時点から最終時点まで（ＡＵＣ０〜ｌａｓｔ）または推定される無限遠まで（ＡＵＣ０〜∞）の濃度‐時間曲線下の面積、０時点で推定される血漿中Ｃｍａｘ濃度（Ｃ０）、終末相排出半減期（ｔ１／２）、分布容積（Ｖｄ）、およびクリアランス（ＣＬ）。
【０１２８】
ミクロソーム代謝．雄ラット肝臓ミクロソームをＣｅｌｓｉｓ社（米国、メリーランド州、ボルチモア）から入手した。ミクロソーム依存薬物代謝を評価するためＣｅｌｓｉｓ社のプロトコルを用い、その後、微調整した。ＮＡＤＰＨ再生システム（ＮＲＳ）を以下のように調製した：１．７ｍｇ／ｍＬのＮＡＤＰ、７．８ｍｇ／ｍＬのグルコース６リン酸、および６単位／ｍＬのグルコース６リン酸脱水素酵素を１０ｍＬの２％重炭酸ナトリウムに添加し、直ぐに使用した。ノルレウアル、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２、ならびにピロキシカム、ベラパミルおよび７‐エトキシクマリン（それぞれ、低度、中程度、高度に代謝された対照）の５００μＭ溶液をアセトニトリルで調製した。ミクロソームを０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．３８）中に、０．５ｍｇ／ｍＬで懸濁し、１００μＬのミクロソーム懸濁液を、氷上で、事前に冷蔵した微小遠心チューブに添加した。各試料に、６４０μＬの０．１Ｍトリス緩衝液、１０μＬの５００μＭ試験化合物、および２５０μＬのＮＲＳを添加した。回転式（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）ハイブリダイゼーションオーブン内で、３７℃、適当な恒温時間（１０、２０、３０、４０または６０分）で試料をインキュベートした。各試料から５００μＬを取り、１つのインキュベーション試料当たり、５００μＬの氷冷アセトニトリルおよび内部標準を含んだチューブに移した。インキュベーション緩衝液中で標準曲線試料を調製し、５００μＬを、内部標準を含んだ５００μＬの氷冷アセトニトリルに添加した。その後、全試料を高性能液体クロマトグラフィー／質量分析により分析した。薬剤濃度を測定し、ミクロソームを含まない陰性対照試料に対する親損失を計算した。ｋｅおよびｔ１／２を求める非線形回帰分析ならびに式Ｃｌｉｎｔ＝ｋｅＶｄによりクリアランスを求めた。インビトロ‐インビボ相関性について、Ｓｐｒａｎｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット：肝臓１ｇ当たりタンパク質４４．８ｍｇ、体重１ｋｇ当たり肝臓４０ｇ：で、以下の測定法を利用して体重ｋｇ当たりのＣｌｉｎｔを計算した。
【０１２９】
ＨＧＦ結合．溶解結合アッセイを利用した競合により、ＨＧＦへの６‐ＡＨ類似体の結合を評価した。１０−１３Ｍ〜１０−７Ｍ（半対数希釈）の範囲で６‐ＡＨ類似体の濃度を変化させ、３７℃で４０分間、ＨＧＦの中心的二量体化ドメインである３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅと共に、ヒトＨＧＦ（１．２５ｎｇ）を含む２５０μｌのＰＢＳをインキュベートした。その後、培養物をＢｉｏ‐Ｇｅｌ  Ｐ６スピンカラム（４００μｌピーク量）により１分間スピンし、遊離３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅと結合３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅとを分離し、溶離液を回収した。ＨＧＦ結合３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅを含んだ溶離液に、５ｍｌのシンチレーション液を添加し、その後、シンチレーションカウンターにより計数した。機械計数効率に基づいて、結合３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅの１分間当たりの全崩壊を計算した。Ｐｒｉｓｍ５を使用してペプチドの結合のＫｉ値を求めた。競合結合曲線は３重線で描いた。予備速度論研究から、３７℃、４０分のインキュベーションにより平衡結合に達することが示された。近年、３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅは高親和性でＨＧＦと結合するということが分かっている（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。
【０１３０】
ＨＧＦ二量体化．ＰＡＧＥおよびその後の銀色染色によりＨＧＦ二量体化を評価した（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。６‐ＡＨ類似体を含む、または含まない０．０８ｎｇ／μｌの濃度のヒトＨＧＦを、最終濃度５μｇ／ｍｌでヘパリンと共にインキュベートした。その後、ローディング緩衝液を各試料に添加し、勾配Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴプレキャストゲル（４〜１２％のＢｉｓ‐トリス；Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州、ヘラクレス）を使用して、未変性のＰＡＧＥにより混合物を分離した。次に、ＨＧＦ単量体および二量体を検出するためにゲルを銀色染色した。ＵＶＰホスホイメージャー（Ｕｐｌａｎｄ社、カリフォルニア州）を使用したデジタル画像からバンドを定量した。
【０１３１】
ウエスタンブロッティング．ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルの組織培養プレートに播種し、ＦＢＳを１０％含有するＤＭＥＭ中で９５％集密になるまで増殖させた。治療前の２４時間、細胞を血清欠乏させ、ホスホ‐Ｍｅｔの基礎レベルを低下させた。血清を欠乏させた後、賦形剤およびＨＧＦから成り、６‐ＡＨ類似体を含有する／含有しない反応混液を調製し、室温で３０分間、事前にインキュベートした。その後、反応混液を細胞に添加し、１０分間、Ｍｅｔ受容体および下流タンパク質を刺激した。リン酸塩阻害剤反応混液１および２（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社；ミズーリ州、セントルイス）で強化されたＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；マサチュセッツ州、ビルリカ）を使用して細胞を回収した。１５，０００ｎｘｇで１５分間遠心分離し、溶解物を清澄にして、ＢＣＡ総タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）によりタンパク質濃度を測定し、次いで、適度な量の溶解物を２×還元レムリ緩衝液で希釈し、９５℃で１０分間加熱した。同一量のタンパク質を含む試料を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により溶解し、ニトロセルロースに転写し、ミルクを５％含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中、室温で１時間ブロックした。ホスホ‐Ｍｅｔ抗体をブロッキング緩衝液に、最終濃度が１：１０００になるように添加し、弱めに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。その後、水およびＴＢＳ（ＰＢＳ、０．０５％ＴｗｅｅＮ‐２０）で膜を数回洗浄し、１：５０００希釈したセイヨウワサビ過酸化酵素結合型ヤギ抗ウサギ抗血清を添加し、膜をさらに、室温で１時間インキュベートした。タンパク質をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅシステム（Ｐｉｅｒｃｅ社、ミズーリ州、フェントン）を使用して可視化し、分子量をタンパク質ラダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；およびＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ、ＢｉｏＲａｄ社）との比較によって測定した。フィルム画像をデジタル化し、ＵＶＰホスホイメージャーを使用して分析した。
【０１３２】
細胞増殖．５０００個のＭＤＣＫ細胞を、ＦＢＳを１０％含有するＤＭＥＭ中の９６ウェルプレートのウェルに播種した。細胞休止を誘発するために、治療開始前の２４時間、細胞を血清欠乏させた。血清欠乏の後、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ単独のもの、および様々な濃度の６‐ＡＨ類似体を含有したもの、またはＰＢＳ賦形剤を培地に添加した。これらの条件下で、６‐ＡＨ類似体を毎日添加しながら４日間、細胞を増殖させた。４日目、ＰＢＳで調製した１ｍｇ／ｍｌの１‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）３，５‐ジフェニルホルマザン試薬（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）を細胞に添加し、４時間インキュベートした。０．０１Ｍのグリシン緩衝液に希釈したジメチルスルホキシドを添加し、細胞膜を可溶化し、プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ社のＳｙｎｅｒｇｙ２、バーモント州、ウィヌースキー）を使用して５９０ｎｍで、緩衝液中の還元ＭＴＴの吸光度を定量した。ＨＧＦを含む群の総増殖率から基礎増殖度（ＨＧＦなし）を差し引いてＨＧＦ依存増殖度を求めた。
【０１３３】
散乱アッセイ．ＭＤＣＫ細胞を６ウェルプレートのカバースリップ上で１００％集密になるまで培養し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、集密になっているカバースリップを無菌状態で、９００μｌの無血清ＤＭＥＭを含む新たな６ウェルプレートに移した。ノルレウアル、Ｈｉｎｇｅペプチド、および／またはＨＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）を適当なウェルに添加した。対照ウェルにＰＢＳ賦形剤を添加した。プレートを５％ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をメタノールで固定した。細胞をＤｉｆｆ‐Ｑｕｉｋ  Ｗｒｉｇｈｔ‐Ｇｉｅｍｓａ（Ｄａｄｅ‐Ｂｅｈｒｉｎｇ社、デラウェア州、ニューアーク）で染色し、デジタル画像を得た。カバースリップをピンセットで取り除き、さらなるデジタル画像を得た。画像の画素をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて定量し、Ｐｒｉｓｍ５およびＩｎＳｔａｔ  ｖ．３．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ；カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて統計を行った。
【０１３４】
肺コロニー形成．４００，０００個のＢ１６‐Ｆ１０細胞を含む２００μｌのＰＢＳを６〜８月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾に静脈注射し、次いで、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｃｙｓ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２（１０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ賦形剤対照のいずれかを毎日腹腔内注射した。２週間後、マウスを麻酔し、ＰＢＳで肺を灌流させ、切除した。写真を撮り、１％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ‐１００、２０ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％のアジ化ナトリウム中に肺を溶解させた。超音波処理（Ｍｉｘｏｎｉｘ社、ニューヨーク州、ファーミンデール）により試料を破壊し、スピンした。上清を９６ウェルプレートに移し、プレートリーダーを使用して４１０ｎｍでのメラニン吸光度を測定した。
【０１３５】
統計学．独立一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ＩｎＳｔａｔ  ｖ．３．０５およびＰｒｉｓｍ５）を使用し、群間差を判定した。必要に応じてＴｕｋｅｙ‐ＫｒａｍａｒまたはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較後知恵検定を行った。両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ‐検定（ＩｎＳａｔ  ｖ．３．０５およびＰｒｉｓｍ５）により２つの群の統計学的比較を判定した。｛ぶんさんぶんせき｝
結果
【０１３６】
ＡｎｇＩＶ類似体Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２はノルレウアル（Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ψ‐（ＣＨ２‐ＮＨ２）３‐４‐Ｈｉｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ（配列番号：１）より代謝的に安定している：ＡｎｇＩＶ関連ペプチド模倣薬ノルレウアルには、抗ＨＧＦ／Ｍｅｔ活性、抗血管形成活性および抗癌活性があることは以前から分かっていた（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年）。ＮおよびＣ末端結合の両方で非保護ペプチド結合が存在するということから、ノルレウアルは代謝安定性に乏しく、血液循環でのクリアランスが速く、臨床応用は限られているという性質を有することが予測される。この制限を克服しようと、６‐ＡＨファミリーである化合物のファミリーを、エキソペプチダーゼに対して防御するように設計し、合成した。図２２では、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の安定性は改善したが、予想どおりノルレウアルはハイブリダイズ血液中で不安定であることが示されている。
【０１３７】
ＡｎｇＩＶ類似体Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２はノルレウアル（Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ψ‐（ＣＨ２‐ＮＨ２）３‐４‐Ｈｉｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ（配列番号：１））より血中半減期が大幅に長い：
インビトロでの血液安定性データから予想されるように、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２では、ラットへのＩＶ注射後、インビボ排出半減期が１０１２分に延長していることが示された。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の単回ＩＶボーラス投与後の他の関連する薬物動態パラメータを表５にまとめてある。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアを使用して血清データをモデル化し、非区画分析を実行した。その分布容積（Ｖｄ）が大きいことで裏付けられるように、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２は、組織内の中心血液隔壁および／または境界の外部に広く分布していることが明らかになった。定量的構造‐活性相関（ＱＳＡＲ）モデリング（下記に記載）にしたがえば、また血清からの総回収率が３５％超であったことから、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２が血漿タンパク質に高度に結合することは期待できない。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２が比較的疎水性である可能性が高いことを示唆するこれらの結果は、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２ではオクタノール：水分配係数が２８．１８と算出されたＡＤＭＥＴ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（登録商標）によるＱＳＡＲモデリングの推定結果と一致している（表６）。
【０１３８】
その安定性、疎水特性および微小寸法から驚くことではないが、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２は経口投与で生物学的に利用可能であると予想された。Ｐｅｆｆ値は、分子の予測される有効ヒト空腸透過性を表す。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の予測Ｐｅｆｆ値（１．５３）は経口投与で生物学的に利用可能な薬物であるエナラプリル（１．２５）とピロキシカム（２．１４）の予測Ｐｅｆｆ値の中間にある。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２はまた、血液循環中の血漿タンパク質に結合しないものは４２．６８％であると推定され、よって組織に分散させるために利用できる。
【０１３９】
また、それが血液から緩徐に排除される理由は、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２のＩ相代謝が欠如していたからである。ラット肝臓ミクロソームを使用したインビトロ代謝アッセイでは、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の検出可能な代謝は９０分以上現れなかった（データの記載なし）。これらのデータの集約から、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２はノルレウアルより代謝的に安定しており、血液循環中の半減期は延長され、組織を有効に透過することが示唆されている。これらの好ましい薬物動態特性全体はＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２および関連分子の機械的および治療的評価を裏付けるものである。
【０１４０】
Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＨＧＦに結合し、ＨＧＦ結合では３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅペプチドと競合する：
ＨＧＦへの３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅの結合に対して競合する能力について、６‐ＡＨファミリー、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２のいくつかのメンバーを分析した。下記で根拠となっているように、６‐ＡＨファミリーのメンバーは、ＨＧＦの生物学的作用をブロックする多様な能力を示している。このように、多様な生物学的活性を有する類似体の選択に関わるＨＧＦ結合特性を評価し、ＨＧＦに対する阻害活性と親和性との間に関連性があるかどうかを判定した。類似体はＨＧＦに直接結合し、不活性形態でＨＧＦの隔離に影響を与えるという仮説が浮上した。この考えの評価の初めに、本発明者らはプローブとして３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅペプチドを使用し、ペプチドの直接的ＨＧＦ結合を評価した。その相互作用を調べるための３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅの使用は高親和性をもってＨＧＦに特異的に結合する３Ｈ‐Ｈｉｎｇｅの能力に基づいていた（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。競合試験はＤ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２ファミリーのいくつかの誘導体を用いて開始した。本試験から、様々な類似体が多様なＨＧＦ結合能を有し、ＨＧＦに拮抗作用を示す類似体はＨｉｎｇｅ模倣体として作用することが明らかになった。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２誘導体はＨＧＦ結合でＨｉｎｇｅと競合することが分かり、１．３７×１０−７〜１．３３×１０−１０ＭのＫｉｓでＨＧＦへの親和性の範囲が示された（図２３）。予想通り、ＨＧＦへ結合する化合物の能力と、二量体化をブロックしてＨＧＦ依存活性を阻害するその能力との間に関連性があることが分かる（図２５、２６および２７参照）。
【０１４１】
Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＨＧＦ二量体化をブロックする：Ｍｅｔの活性化に先だって、ＨＧＦはホモ二量体および／または多量体を形成する必要があることを示す報告がいくつかある（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅら、１９９９年；Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００６年）。この二量体は頭尾配向で配置されている；二量体界面は適切な二量体の形成および配向に重要な中心領域、ヒンジ領域を含む。ＡｎｇＩＶへの類似性を探索するアンギオテンシノーゲンと無関係でありアンギオテンシノーゲン由来ではない候補転写産物すべてに対して行った相同配列保存スクリーンは、プラスミノーゲン、抗血管形成分解産物、アンジオスタチン、およびタンパク質ホルモン肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびマクロファージ刺激タンパク質（ＭＰＳ）などのタンパク質のプラスミノーゲンファミリーのヒンジ領域との部分的相同性を同定した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年）。さらに、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系の強力な阻害物質であるＡｎｇＩＶ類似体ノルレウアルはＨＧＦに結合し、その二量体化をブロックすることが示された（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。この知識と、６‐ＡＨファミリーのいくつかのメンバーは高親和性でＨＧＦのヒンジ領域に結合するという説明とを合わせると、６‐ＡＨファミリーメンバーのような他の活性ＡｎｇＩＶ類似体はＨＧＦ二量体化を阻害することが期待されること、またＨＧＦに結合してＨＧＦ依存プロセスを阻害する個々の類似体の能力は二量体化を減弱させるその能力に反映される可能性があることが予測される。図２４のデータからこの予測は、高親和性でＨＧＦに結合し（図２３）効果的にＨＧＦ依存プロセスを減弱させる（図２５、２６、２７）Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２およびＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２が完全にＨＧＦ二量体形成をブロックすることを明らかにすることで確認される。逆に言えば、ＨＧＦへの親和性が低く（図２３）抗ＨＧＦ／Ｍｅｔ活性が弱いＤ‐Ｎｌｅ‐Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２は試験濃度で二量体化をブロックすることができない。二量体化の中間体阻害を示すＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体は予想通り、ＨＧＦへの適度な親和性およびＨＧＦ依存プロセスへの適度な阻害能を有している（図２５、２６および２７）。これらのデータを合わせると、活性的６‐ＡＨ類似体は二量体化をブロックし、さらに類似体の二量体化阻害能が少なくとも定量的にＨＧＦ依存プロセスをブロックする能力に変わるという予測が確認される。
【０１４２】
Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＨＧＦ依存型Ｍｅｔシグナル伝達を減弱する：
６‐ＡＨファミリーメンバーは広範なＨＧＦ結合および二量体化阻害プロファイルを示すことを確立した後、本発明者らは次に、これらの特性が化合物のＭｅｔシグナル伝達阻害能に対応しているか否かを判定した。Ｍｅｔのようなチロシンキナーゼ関連増殖因子受容体の特徴は必須のチロシン残基自己リン酸化過程であり、これは様々なＳＨ２ドメインシグナル伝達タンパク質の最終的な動員に不可欠なものである。よって、本発明者らはいくつかの６‐ＡＨ類似体のＭｅｔチロシンリン酸化誘導能を評価した。予想通り、図２５のデータから、高親和性でＨＧＦに結合し（図２３）、その二量体化を効果的にブロックする（図２４）Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２およびＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２はＭｅｔ自己リン酸化をブロックし得ることが明らかになっている。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｒｐ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体は中間体阻害活性を有し、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＭｅｔ活性化に効果的な能力を示さなかった。まとめると、これらのデータから、ＨＧＦ依存Ｍｅｔ活性化を阻害する６‐ＡＨ類似体の能力はそのＨＧＦ結合親和性および二量体化をブロックする能力に対応していることが示されている。
【０１４３】
Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＨＧＦ／Ｍｅｔに刺激されたＭＤＣＫ細胞増殖に影響を与える：
Ｍｅｔ活性化は増殖および運動性の増加、生存の促進および分化など複数の細胞応答を開始する（ＺｈａｎｇおよびＶａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ、２００３年）。ＨＧＦ依存細胞活性を変える６‐ＡＨファミリーメンバーの能力に関する初期試験として、本発明者らは、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系を研究するための標準的細胞モデルＭａｄｉｎ‐Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の増殖活性を改変するいくつかのファミリーメンバーの能力を評価した（ＳｔｅｌｌａおよびＣｏｍｏｇｌｉｏ、１９９９年）。図２６に見られるように、ＨＧＦ依存細胞増殖への広範囲な阻害活性がある。結合および二量体化実験の結果と同様に、Ｃｙｓ２およびＴｙｒ２類似体は顕著な阻害活性を示した。初期の研究では評価されてこなかったＡｓｐ２類似体も明白な阻害活性を示した。最も強力な類似体で観察されたものよりは低いが、Ｔｒｐ２、Ｐｈｅ２およびＳｅｒ２類似体はすべて阻害活性を示した。数種の化合物でＨＧＦ‐依存ＭＤＣＫ増殖の低下が基準レベル以下になることは驚くに当たらない。何故なら実験は一定量のＨＧＦを含む可能性のある２％血清中で行われたからである。ＨＧＦの二量体化ドメインの代表としてＨｉｎｇｅペプチド（ＫＤＹＩＲＮ）を陽性対照とした。近年の研究から、Ｈｉｎｇｅは高親和性でＨＧＦに結合し、その二量体化をブロックし、ＭＤＣＫ増殖などのＨＧＦ依存細胞活性の強力な阻害剤として作用することが明らかになっている（Ｋａｗａｓら、２０１１年）。
【０１４４】
Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２類似体はＭＤＣＫ細胞でのＨＧＦ／Ｍｅｔ媒介細胞散乱を改変する：
細胞散乱はＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達；細胞接着低下、運動性増加、および増殖増加が特徴的な過程；の顕著な効果である。ＨＧＦをＭＤＣＫ細胞に投与すると、２段階で起こる散乱応答が開始される。第１に、細胞が細胞間接着を喪失し、偏光する。第２に、細胞らは完全に分離し、互いに離れて遊走する。６‐ＡＨファミリーメンバーがＨＧＦ／Ｍｅｔ系を阻害できるのであれば、それらはＨＧＦ依存ＭＤＣＫ細胞散乱を改変できる可能性が高いことが予想される。
【０１４５】
図２７ＡおよびＢでは、ＨＧＦ二量体化をブロックすることが事前に分かっていたこれらの類似体はＭＤＣＫ細胞中のＨＧＦ／Ｍｅｔ媒介細胞散乱の効果的な阻害物質であるが、これらの類似体はＨＧＦへの親和性は低く、無効であったことが示されている。図２８はＨＧＦ二量体化の封鎖と、ＨＧＦ結合親和性と、ＭＤＣＫ細胞散乱阻害能との間の相関性を示している。
【０１４６】
Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２はＢ１６‐Ｆ１０マウスメラノーマ細胞遊走および肺コロニー形成を阻害する：
可能性のある治療法として６‐ＡＨファミリーメンバーの有望な用途を評価するため、ＨＧＦ依存Ｍｅｔ活性化に対する強力な阻害プロファイルを示しＢ１６‐Ｆ１０マウスメラノーマ細胞の移動および肺コロニー形成能を抑制する類似体である［Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２］の能力を本発明者らは試験した。Ｂ１６メラノーマ細胞はＭｅｔを過剰発現するものであり（Ｆｅｒｒａｒｏら、２００６年）、Ｍｅｔシグナル伝達はその遊走、侵入および転移に重要であることからＢ１６メラノーマ細胞をこれらの研究のために選択した。Ｍｅｔ依存細胞の治療成績に関する６‐ＡＨファミリー封鎖の生理学的有意性についての最終試験として、本発明者らはマウスの尾静脈注射後のＢ１６‐Ｆ１０細胞による肺コロニー形成を阻害するＤ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の能力を評価した。図２９ａは［Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２］の２種の用量（１０μｇ／ｋｇ／日および１００μｇ／ｋｇ／日）で毎日腹腔内注射しながら観察した阻害応答を説明している。図２９ｂはメラノーマ定着のレベルを反映するメラニン量を測定することで肺定着の定量的評価を提供している。これらをまとめると、データから、Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｃｙｓ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２のメラノーマ細胞への投与は肺定着を根本的に防止し、抗癌剤として６‐ＡＨ類似体の用途を際立たせていることが分かる。
考察：
【０１４７】
近年、ＨＧＦ／Ｍｅｔ系を標的とする治療法の開発に関心が高まっている。現在、この関心はＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系の過剰な活性化は多くのヒト癌での共通の特徴であるという認識により主に取り組まれている（Ｃｏｍｏｇｌｉｏら、２００８年；Ｅｄｅｒら、２００９年）。しかし、抗ＨＧＦ／Ｍｅｔ薬の可能性ある用途は抗癌剤としての使用以上に効果が挙げられるものである。例えば、認識された血管形成調節へのＨＧＦ／ｃ‐Ｍｅｔ系の関与（引用文献参照‐は、組織血管形成の制御が臨床的に有益である障害を治療するためのＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニストの可能性ある用途を支持している。これらの障害には糖尿病性網膜症や湿性黄斑変性症などの眼血管過多疾患が挙げられる。両症例で、抗血管形成療法が現在利用されている（引用文献‐Ｊｅｇａｎａｔｈａｎ、２０１１年参照）。抗血管新生薬はまた、脂肪組織血管形成を標的とした肥満（Ｄａｑｕｉｎａｇら、２０１１年）から、慢性肝疾患（Ｃｏｕｌｏｎら、２０１１年）や抗血管新生薬の局所投与が検討されている乾癬（Ｃａｎａｖｅｓｅら、２０１０年）まで多様な他の障害にも治療選択肢として試験されている。
【０１４８】
現在、製薬産業では、Ｍｅｔ依存細胞活性をブロックする２つの一般的なアプローチが採用されている（Ｅｄｅｒら、２００９年；Ｌｉｕ  Ｘら、２０１０年）。第１にＨＧＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓら、２００６年；Ｓｔａｂｉｌｅら、２００８年）またはＭｅｔ（Ｍａｒｔｅｎｓら、２００６年）に対する単腕ヒト化抗体の開発が挙げられる。第２のアプローチは細胞内でのＭｅｔ活性化の継続をブロックする「キナーゼ阻害物質」を利用するものである。これらの「キナーゼ阻害物質」はＭｅｔのキナーゼドメインに対してＡＴＰの結合について競合し、受容体自己リン酸化を阻害するように細胞内で働く小型の疎水性分子である、２００２年；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００３年；Ｓａｔｔｌｅｒら、２００３年）。現在臨床試験で示されている生物学的アプローチおよびキナーゼ阻害物質アプローチが有望であるにもかかわらず、両アプローチには毒性または特異性の概念および／またはコストから発生する制限がある（Ｈａｎｓｅｌら、２０１０年；Ｍａｙａ、２０１０年）。
【０１４９】
本発明者らの研究所が追求している第３のアプローチは、ＨＧＦ‐Ｍｅｔ系の活性化プロセスの過程を有効に利用するもので；すなわちＨＧＦがＭｅｔを活性化できるようになる前に事前に二量体化する必要があるということである。したがって、ドミナントネガティブ置換体として作用し得るという考えから二量体化ドメイン、ヒンジ領域を模倣する分子を開発することにより、本発明者らは二量体化プロセスを標的にしてきた。近年の研究により、アンジオテンシンＩＶ（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年）またはそのヒンジ配列（Ｋａｗａｓら、２０１１年）の周辺に設計した分子はＨＧＦに結合し、その二量体化をブロックし、ＨＧＦ依存細胞活性を減弱させ得ることを説明するこの一般的なアプローチが立証されてきている。本明細書に記述している研究はＨＧＦ二量体化において標的にされている有用な治療法の考案を目指した第１段階である。本研究の主な焦点は、生物活性を維持しつつ親化合物ノルレウアルの薬物動態特性を改良することである（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０１０年）。この目標に向かって、本発明者らは新規な分子ファミリー、６‐ＡＨファミリー［Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＯＨ］を合成し、評価することに成功した。これらの分子のサブセットは改善された代謝安定性および血液循環ｔ１／２を有するだけでなく、優れたインビトロおよびインビボ活性を示す。
【０１５０】
ＨＧＦ／Ｍｅｔアンタゴニストの新規なファミリーの特徴付け以外に、本実施例では、ＨＧＦに結合してＨＧＦ二量体化をブロックする化合物の能力と、その観察されたインビトロ生物活性との間の定性的関係が明らかになっている。さらに、これらの研究は初期構造活性データを提供し、さらに拡大した評価法を可能にする。ＡｎｇＩＶ分子のＮおよびＣ末端でなされた化学修飾ならびに代謝安定性の結果として得られた改善はＡｎｇＩＶ誘導型分子の代謝においてエキソペプチダーゼが担った重要な役割を際立たせている。薬物動態特性に対して末端を保護する明らかになった重要性から、利用可能な多数の他の合成アプローチがあることが示唆され、これには第１および第２アミノ酸間の非ペプチド結合の挿入（Ｓａｒｄｉｎｉａら、１９９４年参照）、Ｎ末端アミノ酸と非αアミノ酸との置換、ならびにＮ末端アシル化が挙げられる。
【０１５１】
つまり、これらの研究はさらに、ＨＧＦ二量体化ドメインを標的にすることはＨＧＦ／Ｍｅｔ系を阻害する効果的な手段であるという考えを立証している。さらにそれらにより、好ましい薬物動態特性を有する分子が生成され、よってその臨床的有用性を際立たせていることが明らかになっている。
【０１５２】
表５．ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）は成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈投与後のＤ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の薬物動態パラメータを評価した。平均＋／−ＳＥＭ；ｎ＝５.  ＡＵＣ０〜∞＝曲線下面積．Ｖｄ＝分布容積．Ｃｐ０＝初期の血清中薬物濃度．ｔ１／２＝生物学的半減期．ＫＥ＝排出速度．ＣＬ＝クリアランス速度．
2014511858.tif 000017
表６．Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の予測される生理化学特性。Ｄ‐Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｉｌｅ‐ＮＨ‐（ＣＨ２）５‐ＣＯＮＨ２の生理化学特性をＡＤＭＥＴ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（登録商標）ソフトウェアによるモデリングにしたがって評価した。ＬｏｇＰはオクタノール：水分配係数である。Ｐｅｆｆは予測される有効ヒト空腸透過性である。Ｐａｖｇはヒト全腸管に沿ったおよその平均腸透過性である。ＰｒＵｎｂｎｄは血漿タンパク質に結合していない割合である。
2014511858.tif 000018
【０１５３】
本発明をその好ましい実施態様について述べてきたが、付属の請求項の真意および範囲内で改変を加えて本発明を実施し得ることは当業者に理解されよう。したがって、本発明は上述の実施態様に限定されるものではなく、本明細書に記載の真意および範囲内であらゆる変形例およびその同等物をさらに含むことを意図するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
認知症、神経変性疾患、糖尿病、メタボリック症候群、癌など多数の病変の治療可能性を備える薬剤の低コスト生産を可能にする。
【符号の説明】
【０１５５】
（各図中の用語の対応訳）
（図１）
Figure 1A                          図１Ａ
(1) Latency (sec)               時間（秒）
(2) CSF                              ＣＳＦ
(3) Scopolamine                スコポラミン
(4) Dihexa-low                  ジヘキサ‐低量
(5) Dihexa-high                             ジヘキサ‐高量
(6) Acquisition (days)       習得（日）
Figure 1B                          図１Ｂ
(1) Latency (sec)               時間（秒）
(2) CSF                              ＣＳＦ
(3) Scopolamine                スコポラミン
(4) Dihexa-low                  ジヘキサ‐低量
(5) Dihexa-high                             ジヘキサ‐高量
(6) Acquisition (days)       習得（日）
Figure 1C                          図１Ｃ
(1) Latency (sec)               時間（秒）
(2) Non-treated                 投与なし
(3) Dihexa                         ジヘキサ
(4) Acquisition (days)       習得（日）
（図２）
Figure 2A                          図２Ａ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) Dihixa                          ジヘキサ
Figure 2B                          図２Ｂ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) 10-10M Nle1-AngIV      １０−１０Ｍ のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) 10-12M Nle1-AngIV      １０−１２Ｍ のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) 10-13M Nle1-AngIV      １０−１３Ｍ のＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
（図３）
Figure 3D                          図３Ｄ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) Nle1-AngIV                 Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) Dihexa                         ジヘキサ
(5) 5 day stimulation        ５日間の刺激
Figure 3E                          図３Ｅ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) Nle1-AngIV                 Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) Dihexa                         ジヘキサ
(5) 30 day stimulation      ３０日間の刺激
（図４）
Figure 4                                          図４
(1) Control                         対照
(2) Nle1-AngIV                 Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(3) Dihexa                         ジヘキサ
（図５）
Figure 5A                          図５Ａ
(1) MRFP-b-Actin                           ＭＲＦＰ‐β‐アクチン
(2) VGLUT1                      ＶＧＬＵＴ１
(3) Merged                        融合後
(4) Control                         対照
(5) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(6) Dihexa                         ジヘキサ
(7) Synapsin                     シナプシン
(8) PSD-95                        ＰＳＤ‐９５
Figure 5B                          図５Ｂ
(1) Percent Correlation     割合相関性
(2) Percent                        パーセント
(3) Control                         対照
(4) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) Dihexa                         ジヘキサ
(6) Synapsin                     シナプシン
Figure 5C                          図５Ｃ
(1) Number of Spines       スパイン数
(2) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(3) Control                         対照
(4) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) Dihexa                         ジヘキサ
(6) Synapsin                     シナプシン
Figure 5D                          図５Ｄ
(1) Percent Correlation     割合相関性
(2) Percent                        パーセント
(3) Control                         対照
(4) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) Dihexa                         ジヘキサ
(6) VGLUT1                      ＶＧＬＵＴ１
Figure 5E                          図５Ｅ
(1) Number of Spines       スパイン数
(2) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(3) Control                         対照
(4) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) Dihexa                         ジヘキサ
(6) VGLUT1                      ＶＧＬＵＴ１
Figure 5F                          図５Ｆ
(1) Percent Correlation     割合相関性
(2) Percent                        パーセント
(3) Control                         対照       
(4) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) Dihexa                         ジヘキサ
(6) PSD-95                        ＰＳＤ‐９５
Figure 5G                          図５Ｇ
(1) Number of Spines       スパイン数
(2) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(3) Control                         対照
(4) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) Dihexa                         ジヘキサ
(6) PSD-95                        ＰＳＤ‐９５
（図６）
Figure 6A                                        図６Ａ
(1) Frequency of mEPSC (pA)        ｍＥＰＳＣ（ｐＡ）の周波数
(2) Control                                       対照
(3) Nle1-AngIV                                Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) Dihexa                                       ジヘキサ
Figure 6B                                        図６Ｂ
(1) Control                                       対照
(2) 250 msec                                    ２５０ｍ秒
(3) Nle1-AngIV                                Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) 100 msec                                     １００μ秒
(5) Dihexa                                       ジヘキサ
（図７）
Figure 7A                          図７Ａ
(1) Control                         対照
(2) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(3) Dihexa                         ジヘキサ
Figure 7B                          図７Ｂ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) Dihexa                         ジヘキサ
（図８）
Figure 8                                          図８
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
（図９）
Figure 9A                          図９Ａ
(1) Control                         対照
(2) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(3) Dihexa                         ジヘキサ
Figure 9B                          図９Ｂ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) Nle1-AngIV                  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(4) Dihexa                         ジヘキサ
（図１０）
Figure 10A                        図１０Ａ
(1) Percent Correlation     割合相関性
(2) Control                         対照
(3) Synapsin                     シナプシン
Figure 10B                        図１０Ｂ
(1) Percent Correlation     割合相関性
(2) Control                         対照
(3) VGLUT1                      ＶＧＬＵＴ１
Figure 10C                                      図１０Ｃ
(1) Number of spines/50 mm                         スパイン数／５０μｍ
(2) Control                                       対照
(3) Number                                     数
Figure 10D                        図１０Ｄ
(1) Control                         対照
(2) Synapsin                     シナプシン
(3) VGLUT1                      ＶＧＬＵＴ１
（図１１）
Figure 11                                         図１１
(1) Frequency of mEPSC (Hz)        ｍＥＰＳＣの周波数（Ｈｚ）
(2) Control                                       対照
(3) Dihexa                                       ジヘキサ
（図１２）
Figure 12A                        図１２Ａ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) 10-13M Dihexa                           １０−１３Ｍのジヘキサ
(4) 10-12M Dihexa                           １０−１２Ｍのジヘキサ
(5) # Dihexa + HGF$        ＃ジヘキサ＋ＨＧＦ＄
Figure 12B                        図１２Ｂ
(1) # of Spines/50 mm        スパイン数／５０μｍ
(2) Control                         対照
(3) Nle-1-AngIV 10-13M      Ｎｌｅ‐１‐ＡｎｇＩＶ  １０−１３Ｍ
(4) Nle-1-AngIV 10-12M      Ｎｌｅ‐１‐ＡｎｇＩＶ  １０−１２Ｍ
(5) Nle-1-AngIV# +
HGF$   Ｎｌｅ‐１‐ＡｎｇＩＶ＃＋ＨＧＦ＄

（図１３）
Figure 13A                                      図１３Ａ
(1) # of Spines/50 mm                      スパイン数／５０μｍ
(2) Control                                       対照
(3) 10-8M Hinge                              １０−８ＭのＨｉｎｇｅ
(4) 10-10M Hinge                             １０−１０ＭのＨｉｎｇｅ
(5) 10-12M Hinge                             １０−１２ＭのＨｉｎｇｅ
(6) 10-12M Dihexa                                         １０−１２Ｍのジヘキサ
Figure 13B                                      図１３Ｂ
(1) # of Spines/50 mm                      スパイン数／５０μｍ
(2) Control                                       対照
(3) 10-12M Hinge                             １０−１２ＭのＨｉｎｇｅ
(4) Hinge # + HGF$                       Ｈｉｎｇｅ＃＋ＨＧＦ＄
Figure 13C                                      図１３Ｃ
(1) # of Spines/50 mm                      スパイン数／５０μｍ
(2) Control                                       対照
(3) 10-12M Hinge                             １０−１２ＭのＨｉｎｇｅ
(4) Hinge + Nle1-AngIV #               Ｈｉｎｇｅ＋Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ＃
(5) 10-12M Nle1-AngIV                    １０−１２ＭのＮｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
Figure 13D                                      図１３Ｄ
(1) # of Spines/50 mm                      スパイン数／５０μｍ
(2) Control                                       対照
(3) 10-12M Hinge                             １０−１２ＭのＨｉｎｇｅ
(4) 10-12M Hinge + Dihexa                           １０−１２ＭのＨｉｎｇｅ＋ジヘキサ
(5) 10-12M Dihexa                                         １０−１２Ｍのジヘキサ
（図１４）
Figure 14A                                      図１４Ａ
(1) Frequency of mEPSC (Hz)        ｍＥＰＳＣの周波数（Ｈｚ）
(2) Control                                       対照
(3) Hinge                                                       Ｈｉｎｇｅ
(4) HGF + Hinge                                          ＨＧＦ＋Ｈｉｎｇｅ
Figure 14B                                      図１４Ｂ
(1) Frequency of mEPSC (Hz)        ｍＥＰＳＣの周波数（Ｈｚ）
(2) Control                                       対照
(3) Dihexa                                       ジヘキサ
(4) Hinge                                                       Ｈｉｎｇｅ
(5) Dihexa + Hinge                         ジヘキサ＋Ｈｉｎｇｅ
Figure 14C                                      図１４Ｃ
(1) Hinge                                                       Ｈｉｎｇｅ
(2) 1 Sec                                                        １秒
(3) 5 msec                                        ５ｍ秒
Figure 14D                                      図１４Ｄ
(1) Control                                       対照
(2) 1 Sec                                                        １秒
(3) 5 msec                                        ５ｍ秒
（図１５）
Figure 15                          図１５
(1) Met
140 kDa               Ｍｅｔ  １４０ｋＤａ
(2) Actin
43 kDa                            アクチン４３ｋＤａ
(3) Total area density       総面密度
（図１６）
Figure 16                                        図１６
(1) % phosphorylatlon                    ％リン酸化
(2) Control                                       対照
(3) Dehexa 10-12M                                         ジヘキサ  １０−１２Ｍ
(4) HGF 50ng/ml + Dihexa 10-12M ＨＧＦ５０ｎｇ／ｍｌ＋ジヘキサ１０−１２Ｍ
(5) Dihexa 10-10M                                         ジヘキサ  １０−１０Ｍ
(6) Treatment Groups                     投与群
（図１７）
Figure 17                          図１７
(1) Dihexa 10-12M                           ジヘキサ  １０−１２Ｍ
(2) Dihexa 10-10M                           ジヘキサ  １０−１０Ｍ
（図１８）
Figure 18                          図１８
(1) Coverslip Edge                          カバースリップ縁
(2) Control                         対照
（図１９）
Figure 19                          図１９
(1) Non-transfected          非形質移入
（図２０）
Figure 20                                        図２０
(1) # of Spines/50 mm                      スパイン数／５０μｍ
(2) Control                                       対照
(3) Dihexa                                       ジヘキサ
(4) Nle1-AngIV                                Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ
(5) shMet Control                                         ｓｈＭｅｔ  対照
(6) shMet HGF Spines                   ｓｈＭｅｔ  ＨＧＦ  スパイン
(7) shMet Dihexa Spines                ｓｈＭｅｔ  ジヘキサ  スパイン
(8) shMet Nle1-AngIV Spines         ｓｈＭｅｔ  Ｎｌｅ１‐ＡｎｇＩＶ  スパイン
（図２１）
Figure 21                                        図２１
(1) Latency to find platform (sec)   プラットホームを見つけ出すまでの時間（秒）
(2) Scopolamine > aCSF                 スコポラミン→ａＣＳＦ
(3) Scopolamine > Dihexa                            スコポラミン→ジヘキサ
(4) Scopolamine/Hinge > Dihexa   スコポラミン／Ｈｉｎｇｅ→ジヘキサ
(5) aCSF > Dihexa                                        ａＣＳＦ→ジヘキサ
(6) Hinge > aCSF                                         Ｈｉｎｇｅ→ａＣＳＦ
(7) Acquisition (days)                     習得（日）
（図２２）
Figure 22                                        図２２
(1) Recovery (% zero time)                            回収率（０時点に対する％）
(2) Time (min)                                 時間（分）
（図２３）
Figure 23                          図２３
(1) Total binding (DPM)   総結合量（ＤＰＭ）
(2) Log [M]                        Ｌｏｇ［Ｍ］
（図２４）
Figure 24A                        図２４Ａ
(1) Dimer                           二量体
(2) Monomer                     単量体
(3) Nle-X-I-6AHA                           Ｎｌｅ‐Ｘ‐Ｉ‐６ＡＨＡ
Figure 24B                        図２４Ｂ
(1) % HGF Dimerization   ％  ＨＧＦ二量体化
(2) [compound]                  ［化合物］
（図２５）
Figure 25                                        図２５
(1) Control                                       対照
(2) Met Phosphorylation (%HGF)  Ｍｅｔリン酸化（％ＨＧＦ）
(3) [compound]                                ［化合物］
（図２６）
Figure 26                                        図２６
(1) % HGF-dependent proliferation             ％  ＨＧＦ依存増殖
(2) negative control                         陰性対照
(3) Hinge 10-10 M                                          Ｈｉｎｇｅ  １０−１０Ｍ
(4) Treatment groups                      投与群
（図２７）
Figure 27A                                      図２７Ａ
(1) Tretment Group                         投与群
(2) Control                                       対照
(3) Cell Scattering (%HGF)                          細胞散乱（％ＨＧＦ）
Figure 27B                                      図２７Ｂ
(1) Control                                       対照
（図２８）
Figure 28                                        図２８
(1) % HGF Dimerization                 ％ＨＧＦ二量体化
(2) Binding Affinity Ki                          結合親和性Ｋｉ
(3) Cell Scattering
(%HGF)                          細胞散乱（％ＨＧＦ）
（図２９）
Figure 29A                                     図２９Ａ
(1) Control                                       対照
Figure 29B                                      図２９Ｂ
(1) Lung colonization (% B16F10) 肺定着（％Ｂ１６Ｆ１０）
【０１５６】
References（引用文献）
Ａｃｈｉｍ，  Ｃ．  Ｌ．，  Ｓ．  Ｋａｔｙａｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７年）．  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＧＦ  ａｎｄ  ｃＭｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ．”  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １０２（２）：  ２９９−３０３．
Ａｂｏｕｎａｄｅｒ  Ｒ，  Ｌａｌ  Ｂ，  Ｌｕｄｄｙ  Ｃ，  Ｋｏｅ  Ｇ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｂ，  Ｒｏｓｅｎ  ＥＭ  ａｎｄ  Ｌａｔｅｒｒａ  Ｊ  （２００２年）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＳＦ／ＨＧＦ  ａｎｄ  ｃ−ｍｅｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  Ｕ１ｓｎＲＮＡ／ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｉｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  ＦＡＳＥＢ  ＪＯＵＲＮＡＬ  １６：１０８−１１０．
Ａｇｕｉｒｒｅ  Ｇｈｉｓｏ  ＪＡ，  Ａｌｏｎｓｏ  ＤＦ，  Ｆａｒ&Atilde;ｆ&Acirc;−ａｓ  ＥＦ，  Ｇｏｍｅｚ  ＤＥ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｋｉｅｒ  Ｊｏｆｆ&Atilde;ｆ&Acirc;&#776;  ＥＢ  （１９９９年）  Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ／  ＦＥＢＳ  ２６３：２９５−３０４．
Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ａ．  Ｂａｂａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４年）．  ”Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｎｍｄａ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．”  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２８（１）：  １５５−６２．
Ａｏｋｉ  Ｍ，  Ｗａｒｉｔａ  Ｈ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，  Ｉｔｏｙａｍａ  Ｙ．  （２００９年）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｒｉｎｓｈｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉｇａｋｕ  ４９：  ８１４−８１７．
Ａｈｍｅｔ  Ｉ，  Ｓａｗａ  Ｙ，  Ｉｗａｔａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ  （２００２年）  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｈｅａｒｔ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２４：９５７−９６３．
Ｂａｌｓｃｈｕｎ，  Ｄ．，  Ｄ．  Ｍｏｅｃｈａｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＶＧＬＵＴ１  ｈａｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ．”  Ｃｅｒｅｂ  Ｃｏｒｔｅｘ  ２０（３）：  ６８４−９３．
Ｂｅａｎ  Ｊ，  Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｃ，  Ｓｈｉｈ  Ｊ−Ｙ，  Ｒｉｅｌｙ  Ｇ，  Ｖｉａｌｅ  Ａ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｃｈｉｔａｌｅ  Ｄ，  Ｍｏｔｏｉ  Ｎ，  Ｓｚｏｋｅ  Ｊ，
Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ  Ｓ，  Ｂａｌａｋ  Ｍ，  Ｃｈａｎｇ  Ｗ−Ｃ，  Ｙｕ  Ｃ−Ｊ，  Ｇａｚｄａｒ  Ａ，  Ｐａｓｓ  Ｈ，  Ｒｕｓｃｈ  Ｖ，  Ｇｅｒａｌｄ  Ｗ，  Ｈｕａｎｇ  Ｓ−Ｆ，  Ｙａｎｇ  Ｐ−Ｃ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｖ，  Ｌａｄａｎｙｉ  Ｍ，  Ｙａｎｇ  Ｃ−Ｈ  ａｎｄ  Ｐａｏ  Ｗ  （２００７年）  ＭＥＴ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｔ７９０Ｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＥＧＦＲ  ｍｕｔａｎｔ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｏｒ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  １０４：２０９３２．
Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｃ，  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｗ，  Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦ  （２００３年）  ＭＥＴ，ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ，  ＭＯＴＩＬＩＴＹ  ＡＮＤ  ＭＯＲＥ，  ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｐ  ９１５−９２５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．
Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，  Ｃ．，  Ｅ．  Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３年）．  ”Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １５（３）：  １８５−９０．
Ｂｏｃｃａｃｃｉｏ  Ｃ，  Ｇａｕｄｉｎｏ  Ｇ，  Ｇａｍｂａｒｏｔｔａ  Ｇ，  Ｇａｌｉｍｉ  Ｆ  ａｎｄ  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ  （１９９４年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＨＧＦ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：１２８４６−１２８５１．
Ｂｏｒｏｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ＣＭ  （１９９５）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：  Ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：２９３．
Ｂｏｒｏｗｉａｋ  Ｍ，  Ｇａｒｒａｔｔ  ＡＮ，  Ｗ&Atilde;ｆ&Acirc;１／４ｓｔｅｆｅｌｄ  Ｔ，  Ｓｔｒｅｈｌｅ  Ｍ，  Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ，  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｃ  ａｎｄ  Ｗｉｇｌｅｒ  ＭＨ  （２００４年）  Ｍｅｔ  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１：１０６０８−１０６１３．
Ｂｏｕｌｔｏｎ  Ｍ  （１９９９年）  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ？  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．  ８３：７６３．
Ｂｒａｓｚｋｏ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｇ．  Ｋｕｐｒｙｓｚｅｗｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８年）．  ”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−（３−８）−ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｍｏｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．”  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７（３）：  ７７７−８３
Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｔ，  Ｃｏｘｏｎ  Ａ，  Ｍｅｙｅｒ  Ｓ，  Ｓｕｎ  Ｊ，  Ｒｅｘ  Ｋ，  Ｔｓｕｒｕｄａ  Ｔ，  Ｃｈｅｎ  Ｑ，  Ｈｏ  ＳＹ，  Ｌｉ  Ｌ，  Ｋａｕｆｍａｎ  Ｓ，  ＭｃＤｏｒｍａｎ  Ｋ，  Ｃａｔｔｌｅｙ  ＲＣ，  Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｇ，  Ｚｈａｎｇ  Ｋ，  Ｆｅｎｇ  Ｘ，  Ｊｉａ  ＸＣ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｌ，  Ｒａｄｉｎｓｋｙ  Ｒ  ａｎｄ  Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｒ  （２００６年）  Ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｃ−Ｍｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６：１７２１−１７２９．
Ｃａｌｉｓｓａｎｏ  Ｐ，  Ｍａｔｒｏｎｅ  Ｃ，  Ａｍａｄｏｒｏ  Ｇ  （２０１０年）  Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ７０：３７２−３８３．
Ｃａｎａｖｅｓｅ  Ｍ，  Ａｌｔｒａｄａ  Ｆ，  Ｒｕｚｉｃｋａ  Ｔ，  ａｎｄ  Ｓｃｈａｕｂｅｒ  Ｊ  （２０１０年  Ｂａｒｋｍｅｉｅｒ  Ａ．  Ｊ  ＆  Ｃａｒｖｏｕｎｉｓ  Ｐ  Ｅ  （２０１１年）  Ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｅａｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２６：  ９４−１０３．
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＧ  Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｊ  ａｎｄ  Ｓａｌｇｉａ  Ｒ  （２００５年）  ｃ−Ｍｅｔ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２５：１−２６．
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＧ，  Ｓｃｈｒｅｃｋ  Ｒ，  Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｊ，  Ｋｕｒｕｇａｎｔｉ  Ｐ，  Ｃｈａｎ  Ｅ，  Ｌｅ  Ｐ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｒｕｓｌｉｍ  Ｌ，  Ｂｌａｋｅ  Ｒ，  Ｌｉｐｓｏｎ  ＫＥ，  Ｒａｍｐｈａｌ  Ｊ，  Ｄｏ  Ｓ，  Ｃｕｉ  ＪＪ，  Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＪＭ  ａｎｄ  Ｍｅｎｄｅｌ  ＤＢ  （２００３年）  Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃ−Ｍｅｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃ−Ｍｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：７３４５−７３５５．
Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ  ＤＹ，  Ｈｅｐｐｌｅ  ＪＰ，  Ｚｈｏｕ  Ｈ，  Ｂｙｒｄ  ＲＡ，  Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ  ａｎｄ  Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ  （１９９９年）  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＫ１  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＧＦ／ＳＦ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｅ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：７２−７９．
Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ，  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｏｌｉｎｏ  Ｌ  （２００８年）  Ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＥＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｄｉｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ７：５０４−５１６．
Ｃｏｕｌｏｎ  Ｓ，  Ｈｅｉｎｄｒｙｃｋｘ  Ｆ，  Ｇｅｅｒｔｓ  Ａ，  Ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅ，  Ｃ  Ｃｏｌｌｅ  Ｉ，  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅ  Ｈ  （２０１１年）  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３１：  １４６−１６２．
Ｄａｎｉｌｋｏｖｉｔｃｈ−Ｍｉａｇｋｏｖａ  Ａ  ａｎｄ  Ｚｂａｒ  Ｂ  （２００２年）  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０９：８６３−８６７．
Ｄａｑｕｉｎａｇ  Ａ  Ｃ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｎｉｎ  Ｍ  Ｇ  （２０１１年）  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３２：３００−３０７．
Ｄａｔｅ，  Ｉ．，  Ｎ．  Ｔａｋａｇｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４年）．  ”Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｅｍｂｏｌｉｚｅｄ  ｒａｔｓ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ７８（３）：  ４４２−５３．
Ｄａｖｉｓ，  Ｃ．  Ｊ．，  Ｅ．  Ａ．  Ｋｒａｍａｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６年）．  ”ＡＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｆｌｕｘ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｎｏｎ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３７（４）：  １３６９−７９．
Ｄｅ  Ｂｕｎｄｅｌ，  Ｄ．，  Ｈ．  Ｄｅｍａｅｇｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０年）  ”Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  ａｎｄ  ＬＶＶ−ｈａｅｍｏｒｐｈｉｎ  ７  ｏｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １１２（５）：  １２２３−３４
Ｄｅｒｋｓｅｎ  ＰＷ，  ｄｅ  Ｇｏｒｔｅｒ  ＤＪ，  Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＰ，  Ｂｅｎｄｅ  ＲＪ，  ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  Ｍ，  Ｌｏｋｈｏｒｓｔ  ＨＭ，  Ｂｌｏｅｍ  ＡＣ，  Ｓｐａａｒｇａｒｅｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｐａｌｓ  ＳＴ  （２００３年）  Ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／Ｍｅｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄ，  Ｕ．Ｋ  １７：７６４−７７４．
Ｄｉｋｍｅｎ  ＳＳ，  Ｃｏｒｒｉｇａｎ  ＪＤ，  Ｌｅｖｉｎ  ＨＳ，  Ｍａｃｈａｍｅｒ  Ｊ，  Ｓｔｉｅｒｓ  Ｗ，  Ｗｅｉｓｓｋｏｐｆ  ＭＧ  （２００９年）  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊ  Ｈｅａｄ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｈａｂｉｌ．  ２４：４３０−４３８．
Ｄｏｎａｔｅ  ＬＥ，  Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ，  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ｎ，  Ｓｏｗｄｈａｍｉｎｉ  Ｒ，  Ａｐａｒｉｃｉｏ  Ｓ  ａｎｄ  Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ  （１９９４年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  （ＨＧＦ／ＳＦ  ａｎｄ  ＨＧＦ１／ＭＳＰ）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：２３７８−２３９４．
Ｅｂｅｎｓ  Ａ，  Ｂｒｏｓｅ  Ｋ，  Ｌｅｏｎａｒｄｏ  ＥＤ，  Ｈａｎｓｏｎ  ＭＧ，  Ｊｒ．，  Ｂｌａｄｔ  Ｆ，  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｃ，  Ｂａｒｒｅｓ  ＢＡ  ａｎｄ  Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ  Ｍ  （１９９６年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ａｘｏｎａｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ａｎｄ  ａ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ  １７：１１５７−  １１７２．
Ｅｄｅｒ  ＪＰ，  Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦ，  Ｂｏｅｒｎｅｒ  ＳＡ  ａｎｄ  ＬｏＲｕｓｓｏ  ＰＭ  （２００９年）  Ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−Ｍｅｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２２０７−２２１４．
Ｅｌ−Ｈｕｓｓｅｉｎｉ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｅ．  Ｓｃｈｎｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００年）．  ”ＰＳＤ−９５  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０（５４９５）：  １３６４−８．
Ｅｌｓｅｎ  ＧＥ，  Ｃｈｏｉ  ＬＹ，  Ｐｒｉｎｃｅ  ＶＥ，  Ｈｏ  ＲＫ．  （２００９年）  Ｔｈｅ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ｍｅｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆａｃｉａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３３５：  ７８−９２．
Ｆａｆａｌｉｏｓ  Ａ，  Ｍａ  Ｊ，  Ｔａｎ  Ｘ，  Ｓｔｏｏｐｓ  Ｊ，  Ｌｕｏ  Ｊ，  Ｄｅｆｉａｎｃｅｓ  ＭＣ，  Ｚａｍｅｇａｒ  Ｒ．（２０１１年）  Ａ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （Ｍｅｔ）−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １７：１５７７−８４．
Ｆｅｒｒａｒｉｏ  Ｄ，  Ｃｏｒｓｏ  Ｓ，  Ｆａｓａｎｏ  Ｅ，  Ｐａｎｉｅｒｉ  Ｅ，  Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ  Ｒ，  Ｂｏｒｒｅｌｌｏ  Ｓ，  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ，  Ｐａｎｉ  Ｇ  ａｎｄ  Ｇａｌｅｏｔｔｉ  Ｔ  （２００６年）  Ｐｒｏ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｍｅｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＲＡＣ−１  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  （ＲＯＳ）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：３６８９−３６９８
Ｆｅｒｒｅｉｒａ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｒａｐｏｐｏｒｔ  （２００２年）．  ”Ｔｈｅ  ｓｙｎａｐｓｉｎｓ：  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ．”  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５９（４）：  ５８９−９５．
Ｆｉｓｈｅｒ，  Ａ．，  Ｚ．  Ｐｉｔｔｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３年）．  ”Ｍ１  ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｃａｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｓｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０（３）：  ３４９−５６．
Ｆｌａｑｕｅｒ  Ｍ，  Ｆｒａｎｑｕｅｓａ  Ｍ，  Ｖｉｄａｌ  Ａ，  Ｂｏｌａ&ntilde;ｏｓ  Ｎ，  Ｔｏｒｒａｓ  Ｊ，  Ｌｌｏｂｅｒａｓ  Ｎ，  Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｆｒｅｓｎｅｄａ  Ｉ，  Ｇｒｉｎｙ&oacute;  ＪＭ，  Ｃｒｕｚａｄｏ  ＪＭ．（２０１０年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｄｂ／ｄｂ  ｍｉｃｅ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．  Ｍａｒ  ３０．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｊ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｙ  （１９９９年）  Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ−ＢＡＳＩＮＧＳＴＯＫＥ−  ６：３０５−３０６．
Ｇａｏ  Ｘ，  Ｄｅｎｇ  Ｐ，  Ｘｕ  ＺＣ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ  （２０１１年）  Ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｃａｕｓｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ．．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ６：ｅ２４５６６
Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ，  Ｓａｎｄｉｎ  Ｓ，  Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ  ＭＶ，  Ｆｉｎｃｈ  Ｊ，  Ｙｏｕｌｅｓ  ＭＥ，  &Atilde;”Ｆｖｅｒｓｔｅｄｔ  Ｌ−Ｇｒ，  Ｍｉｇｕｅｌ  ＲＮ，  Ｂｉｕｎｄｅｌｌ  ＴＬ，  Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦ，  Ｓｋｏｇｌｕｎｄ  Ｕ  ａｎｄ  Ｓｖｅｒｇｕｎ  ＤＩ  （２００６年）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＭＥＴ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，  ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ｐｐ  ４０４６−４０５１．
Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ，  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｗ，  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｃ，  Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  Ｇ  （２０１２）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＭＥＴ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  １２：８９−１０３．
Ｈａｌａｂａｎ  Ｒ，  Ｒｕｂｉｎ  ＪＳ，  Ｆｕｎａｓａｋａ  Ｙ，  Ｃｏｂｂ  Ｍ，  Ｂｏｕｌｔｏｎ  Ｔ，  Ｆａｌｅｔｔｏ  Ｄ，  Ｒｏｓｅｎ  Ｅ，  Ｃｈａｎ  Ａ，  Ｙｏｋｏ  Ｋ，  Ｗｈｉｔｅ  Ｗ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２年）  Ｍｅｔ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７：２１９５−２２０６．
Ｈａｎ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｅ．  Ｋｉｍ  （２００８年）．  ”Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ＰＳＤ−９５．”  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ８４（３）：  ２６３−８３．
Ｈａｎｓｅｌ  ＴＴ，  Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒ  Ｈ，  Ｓｉｎｇｅｒ  Ｔ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ  ＡＪ  （２０１０年）  Ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９：３２５−３３８．
Ｈａｒａ  Ｔ，  Ｏｏｉ  Ａ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｍａｉ  Ｍ，  Ｙａｎａｇｉｈａｒａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｉ  （１９９８年）  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｍｙｃ，  Ｋ−ｓａｍ，  ａｎｄ  ｃ−ｍｅｔ  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒｓ：  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  ７８：１１４３．
Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｖ．  Ｉ．  Ｃｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２年）．  ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＡＩＩ（３−８）  ［ＡＩＶ］  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．”  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ５８３（１−２）：  ３４０−３．
Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｇ，  Ｗｅｉｄｎｅｒ  ＫＭ，  Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｈ  ａｎｄ  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｗ  （１９９４年）  Ｔｈｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｏｆ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ／ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｅｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：２１９３６−２１９３９．
Ｈａｙａｓｈｉ  Ｙ，  Ｋａｗａｚｏｅ  Ｙ，  Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｏｊｉｍａ  Ｍ，  Ｗａｎｇ  Ｗ，  Ｔａｋａｚａｗａ  Ｔ，  Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｄ，  Ｏｈｙａ  Ｗ，  Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｈ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｗａｔａｂｅ  Ｋ．  （２００６年）  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ａｖｕｌｓｉｏｎ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２１：  １８７−１９５．
Ｈｅｒｉｎｇ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｓｈｅｎｇ  （２００１年）．  ”Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２（１２）：  ８８０−８．
Ｈｏｎｄａ  Ｓ，  Ｋａｇｏｓｈｉｍａ  Ｍ，  Ｗａｎａｋａ  Ａ，  Ｔｏｈｙａｍａ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ  （１９９５年）  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ＨＧＦ  ａｎｄ  ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１９７−  ２１０．
Ｈｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈ  Ｊ，  Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，  Ｌａｄａｎｙｉ  Ｍ，  Ｋｅｌｓｅｎ  ＤＰ  ａｎｄ  Ｃｈａｇａｎｔｉ  ＲＳ  （１９９０年）  Ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：６４１７−  ６４２２．
Ｉｅｒａｃｉ  Ａ，  Ｆｏｒｎｉ  ＰＥ，  Ｐｏｎｚｅｔｔｏ  Ｃ．  Ｖｉａｂｌｅ  ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  （２００２年）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９９：１５２００−５．
Ｊｅｇａｎａｔｈａｎ，  Ｖ．  Ｓ．  Ｅ．  （２０１１年）  Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：３６９−３７２．
Ｊｉｎ  Ｈ，  Ｙａｎｇ  Ｒ，  Ｌｉ  Ｗ，  Ｏｇａｓａｗａｒａ  ＡＫ，  Ｓｃｈｗａｌｌ  Ｒ，  Ｅｂｅｒｈａｒｄ  ＤＡ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚ，  Ｋａｈｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｐａｏｎｉ  ＮＦ  （２００３年）  Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  ３０４：６５４−７０５．
Ｊｕｎ  ＥＪ，  Ｋｉｍ  ＨＳ  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ＹＨ  （２００７年）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ  ＡＲＰＥ−１９  ｃｅｌｌｓ．  Ｋｏｒｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ：  ＫＪＯ  ２１：２４４−２５０．
Ｊｕｎｇ，  Ｗ．，  Ｅ．  Ｃａｓｔｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４年）．  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃ−ｍｅｔ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ．”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２６（２）：  ４８５−９４．
Ｋａｄｏｙａｍａ  Ｋ，  Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｈ，  Ｏｈｙａ−Ｓｈｉｍａｄａ  Ｗ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ  Ｓ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．（２００９年）  Ｄｉｓｅａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＬＳ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．  ６５：１９４−２００．
Ｋａｄｏｙａｍａ  Ｋ，  Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｈ，  Ｏｈｙａ  Ｗ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．  （２００７年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ）  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｇｌｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎｓｔｅｍ  ｍｏｔｏｒ  ｎｕｃｌｅｉ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＬＳ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ５９：  ４４６−４５６．
Ｋａｉｂｏｒｉ  Ｍ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｔ，  Ｏｄａ  Ｍ，  Ｎａｋａ  Ｄ，  Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｔ，  Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｎ，  Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｋ，  Ｋｗｏｎ  ＡＨ，  Ｋａｍｉｙａｍａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｔ  （２００２年）  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ＨＧＦ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＨＧＦ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２９０：４７５−４８１．
Ｋａｎｅ  ＭＪ，  Ａｎｇｏａ−Ｐ&eacute;ｒｅｚ  Ｍ，  Ｂｒｉｇｇｓ  ＤＩ，  Ｖｉａｎｏ  ＤＣ，  Ｋｒｅｉｐｋｅ  ＣＷ，  Ｋｕｈｎ  ＤＭ  （２０１１年）．Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｓｅｐ  １２．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
Ｋａｐｌａｎ  ＧＢ，  Ｖａｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＪＪ，  Ｖｅｄａｋ  ＰＣ  （２０１０年）  Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ，  ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｏｒｂｉｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｂｅｈａｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２１：４２７−４３７．
Ｋａｓａｉ，  Ｈ．，  Ｍ．  Ｆｕｋｕｄａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１年）”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３（３）：  １２１−９．
Ｋａｋａｚｕ  Ａ，  Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈｅｒ  Ｇ，  ａｎｄ  Ｂａｚａｎ  ＨＥ  （２００４年）  ＨＧＦ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ−１／Ｂａｄ−  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ＥＲＫ１／２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４５：３４８５−３４９２．
Ｋａｎｄａ  Ｓ，  Ｋａｎｅｔａｋｅ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｔａ  Ｙ  （２００６年）  ＨＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｒｃ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３４４：６１７−６２２．
Ｋａｔｏ  Ｎ，  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ，  Ｎｅｍｏｔｏ  Ｋ．  （２００９年）  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＨＧＦ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｃｅｎｔ  Ｎｅｒｖ  Ｓｙｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ９：  ３００−３０６．
Ｋａｔｓｕｒａ  Ｙ，  Ｏｋａｎｏ  Ｔ，  Ｎｏｒｉｔａｋｅ  Ｍ，  Ｋｏｓａｎｏ  Ｈ，  Ｎｉｓｈｉｇｏｒｉ  Ｈ，  Ｋａｄｏ  Ｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｔ  （１９９８年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｃａｒｅ  ２１：１７５９−１７６３．
Ｋａｗａｓ  ＬＨ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＢＪ，  Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＷ，  Ｈａｒｄｉｎｇ  ＪＷ．  （２０１１年）  Ｍｉｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｅｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ３３９：  ５０９−５１８．
Ｋａｗａｓ  ＬＨ，  ＭｃＣｏｙ  ＡＴ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＢＪ，  Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＷ，  Ｈａｒｄｉｎｇ  ＪＷ．  （２０１２年）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  Ａｎａｌｏｇｓ  ａｓ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｍｅｔ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  （Ｎｏｖ  ３０  Ｅｐｕｂ  ａｈａｅｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）．
Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｍ．  Ｂ．  （１９９７年）．  ”Ｔｈｅ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０（６）：  ２６４−８．
Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｓ，  Ｋｏｎｄｏ  Ｓ，  Ｓｈｉｎｏｍｕｒａ  Ｙ，  Ｋａｎａｙａｍａ  Ｓ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｙ，  Ｋｉｙｏｈａｒａ  Ｔ，  Ｈｉｒａｏｋａ  Ｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｚａｗａ  Ｙ  （２０００年）  Ｍｅｔ／ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｂｃ１−ｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３：６６８−６７３．
Ｋｏｉｋｅ  Ｈ，  Ｉｓｈｉｄａ  Ａ，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｍｉｚｕｎｏ  Ｓ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｏｇｉｈａｒａ  Ｔ，  Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  （２００６年）  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  １３：１６３９−１６４４．
Ｋｏｎｄｏ  Ｉ，  Ｏｈｍｏｒｉ  Ｋ，  Ｏｓｈｉｔａ  Ａ，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｈ，  Ｆｕｋｅ  Ｓ，  Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  Ｋ，  Ｎｏｍａ  Ｔ，  Ｎａｍｂａ  Ｔ  ａｎｄ  Ｋｏｈｎｏ  Ｍ  （２００４）  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ”ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ”  ｇｅｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ４４：６４４−６５３．
Ｋｒａｍａｒ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｄ．  Ｌ．  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１年）．  ”Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＣＡ１  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．”  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８９７（１−２）：  １１４−２１．
Ｋｒｅｂｓ，  Ｌ．  Ｔ．，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈａｎｅｓｗｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００年）．  ”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ａｎａｌｏｇ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９３（１）：  ２６０−７．
Ｋｕｎｉｙａｓｕ  Ｈ，  Ｙａｓｕｉ  Ｗ，  Ｋｉｔａｄａｉ  Ｙ，  Ｙｏｋｏｚａｋｉ  Ｈ，  Ｉｔｏ  Ｈ  ａｎｄ  Ｔａｈａｒａ  Ｅ  （１９９２年）  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−ｍｅｔ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｓｃｉｒｒｈｏｕｓ  ｔｙｐｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １８９：２２７−２３２．
Ｌａｎ  Ｆ，  Ｘｕ  Ｊ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｗｏｎｇ  ＶＷ，  Ｌｉ  Ｘ，  Ｌｕ  Ａ，  Ｌｕ  Ｗ，  Ｓｈｅｎ  Ｌ，  Ｌｉ  Ｌ．  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  （２００８年）  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．  １９：７６５−９．
Ｌｅｅ，  Ｊ．，  Ａ．  Ｌ．  Ａｌｂｉｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４年）．  ”Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｉ．Ｃ．Ｖ．  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ，  ＮＬＥ１−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  ａｎｄ  ＬＶＶ−ｈｅｍｏｒｐｈｉｎ  ７，  ｏｎ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．”  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２４（２）：  ３４１−９．
Ｌｉｍ  ＣＳ  ａｎｄ  Ｗａｌｉｋｏｎｉｓ  ＲＳ．  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｃ−Ｍｅｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  （２００８年）  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２０：  ８２５−  ３５．
Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｎｅｗｔｏｎ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｌｅ  ＰＡ  （２００９年）  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃ−ＭＥＴ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：３７−４５．
Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｙａｏ  Ｗ，  Ｎｅｗｔｏｎ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｌｅ  ＰＡ  （２００８年）  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃ−ＭＥＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇｓ  １７：９９７−１０１１．
Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｎｅｗｔｏｎ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｌｅ  ＰＡ  （２０１０年）  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｍｅｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：３７−４５．
Ｌｉｕ  Ｙ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  Ｊ  （２００６年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：  Ｎｅｗ  ａｒｓｅｎａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｇｈｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ？  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ７０：２３８−２４０．
Ｌｏｋｋｅｒ  ＮＡ，  Ｍａｒｋ  ＭＲ，  Ｌｕｉｓ  ＥＡ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＧＬ，  Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＫＡ，  Ｂａｋｅｒ  ＪＢ  ａｎｄ  Ｇｏｄｏｗｓｋｉ  ＰＪ  （１９９２年）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｙｅｔ  ｒｅｔａｉｎ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  １１：２５０３−２５１０．
Ｍａｉｎａ  Ｆ，  Ｋｌｅｉｎ  Ｒ．（１９９９年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２：２１３−７．
Ｍａｌｇａｒｏｌｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗ．  Ｔｓｉｅｎ  （１９９２年）．  ”Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７（６３７４）：  １３４−９．
Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｔ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｎ−Ｏ，  Ｅｃｋｅｒｉｃｈ  Ｃ，  Ｆｉｌｌｂｒａｎｄｔ  Ｒ，  Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ｍ，  Ｓｃｈｗａｌｌ  Ｒ，  Ｗｅｓｔｐｈａｌ  Ｍ  ａｎｄ  Ｌａｍｓｚｕｓ  Ｋ  （２００６年）  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｏｎｅ−Ａｒｍｅｄ  Ａｎｔｉ−ｃ−Ｍｅｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １２：６１４４．
Ｍａｓｅｌ  ＢＥ，  ＤｅＷｉｔｔ  ＤＳ  （２０１０年）  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ：  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ，  ｎｏｔ  ａｎ  ｅｖｅｎｔ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．  ２７：１５２９−１５４０
Ｍａｙａ  ＢＬ  （２０１０年）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ−ａｃｔｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  １７：２３３−２４４．
Ｍｅｉｇｈａｎ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｐ．  Ｃ．  Ｍｅｉｇｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６年）．  ”Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ３  ａｎｄ  ９  ｏｎ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ９６（５）：  １２２７−４１．
Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ，  Ｅ．，  Ｍ．  Ｊａｃｏｂ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４年）．  ”Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｔｒａｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｍａｇｅｓ．”  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ  ５８（２）：  １６７−７６．
Ｍｉｃｈｉｅｌｉ  Ｐ，  Ｂａｓｉｌｉｃｏ  Ｃ，  Ｐｅｎｎａｃｃｈｉｅｔｔｉ  Ｓ，  Ｍａｆｆｅ  Ａ，  Ｔａｍａｇｎｏｎｅ  Ｌ，  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ，  Ｂａｒｄｅｌｌｉ  Ａ  ａｎｄ  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ  （１９９９年）  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｅｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｌｉｇａｎｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ＨＧＦ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＣＴ，  Ｌｉｎ  Ｌ，  Ｃａｓｐｅｒ  ＡＭ，  Ｌｉｍ  Ｊ，  Ｔｈｏｍａｓ  ＤＧ，  Ｏｒｒｉｎｇｅｒ  ＭＢ，  Ｃｈａｎｇ  ＡＣ，  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＡＦ，  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ＴＪ  ａｎｄ  Ｇｌｏｖｅｒ  ＴＷ  （２００６年）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＥＴ  ｗｉｔｈ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｆｒａｇｉｌｅ  ｓｉｔｅ  ＦＲＡ７Ｇ  ａｎｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＥＴ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  ＯＮＣＯＧＥＮＥ−ＢＡＳＩＮＧＳＴＯＫＥ−  ２５：４０９−４１８．
Ｍｏｒｏｔｔｉ  Ａ，  Ｍｉｌａ  Ｓ，  Ａｃｃｏｍｅｒｏ  Ｐ，  Ｔａｇｌｉａｂｕｅ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｐｏｎｚｅｔｔｏ  Ｃ  （２００２年）  Ｋ２５２ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔ，  ｔｈｅ  ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：４８８５−４８９３
Ｎａｇａｈａｒａ  ａｎｄ  Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ  （２０１１年）  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ＢＤＮＦ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １０：２０９−１９．
Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ，  Ｕｅｎｏｙａｍａ  Ｍ，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｎ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，  Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，  Ｏｇｉｈａｒａ  Ｔ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｍａｒｕｔａ  Ａ，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ  Ｓ，  Ｋａｗａｉ  Ｔ，  Ａｕｒａｅｓ  Ｔ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ  Ｔ  （２００２年）  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｔｏ  Ｒａｔ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｔｈｅ  Ｓｅｎｄａｉ  Ｖｉｒｕｓ  （Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  １６１：１７６１．
Ｎｉｃｏｌｅａｕ  Ｃ，  Ｂｅｎｚａｋｏｕｒ  Ｏ，  Ａｇａｓｓｅ  Ｆ，  Ｔｈｉｒｉｅｔ  Ｎ，  Ｐｅｔｉｔ  Ｊ，  Ｐｒｅｓｔｏｚ  Ｌ，  Ｒｏｇｅｒ  Ｍ，  Ｊａｂｅｒ  Ｍ，  Ｃｏｒｏｎａｓ  Ｖ．  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｎｉｃｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．  （２００９年）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２７：４０８−１９．
Ｐａｒｒ  Ｃ，  Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｇ，  Ｍａｎｓｅｌ  ＲＥ  ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ  ＷＧ  （２００４年）  Ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：２０２−２１１．
Ｐａｔｅｌ  ＡＤ，  Ｇｅｒｚａｎｉｃｈ  Ｖ，  Ｇｅｎｇ  Ｚ，  Ｓｉｍａｒｄ  ＪＭ．  （２０１０年）  Ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ６９；  １１７７−１１９０．
Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，  Ｅ．  Ｓ．，  Ｊ．  Ｗ．  Ｈａｒｄｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８年）．  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  ａｎａｌｏｇ．  Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ７４：  ９７−１０３．
Ｐｅｎｇ  ＫＹ，  Ｈｏｍｇ  ＬＹ，  Ｓｕｎｇ  ＨＣ，  Ｈｕａｎｇ  ＨＣ，  Ｗｕ  ＲＴ．（２０１１年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｈａｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：  Ｄｉｓｐｏ８５Ｅ，  ａｎＨＧＦ  ｉｎｄｕｃｅｒ，  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｏｔａｎｉｃａｌ  ｄｒｕｇ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  ６０：８８８−９２．
Ｐｉｅｔｒｏｎａｖｅ  Ｓ，  Ｆｏｒｔｅ  Ｇ，  Ｌｏｃａｒｎｏ  Ｄ，  Ｍｅｒｌｉｎ  Ｓ，  Ｚａｍｐｅｒｏｎｅ  Ａ，  Ｎｉｃｏｔｒａ  Ｇ，  Ｉｓｉｄｏｒｏ  Ｃ，  Ｄｉ  Ｎａｒｄｏ  Ｐ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ  Ｍ  （２０１０年）  Ａｇｏｎｉｓｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  ２９８：Ｈ１１５５．
Ｐｏｔｅｍｐａ  Ｓ  ａｎｄ  Ｒｉｄｌｅｙ  ＡＪ  （１９９８年）  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  Ｒａｓ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｄｈｅｒｅｎｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ／  ９：２１８５．
Ｑｉ  Ｌ，  Ｃｕｉ  Ｘ，  Ｄｏｎｇ  Ｗ，  Ｂａｒｒｅｒａ  Ｒ，  Ｎｉｃａｓｔｒｏ  Ｊ，  Ｃｏｐｐａ  ＧＦ，  Ｗａｎｇ  Ｐ，  Ｗｕ  Ｒ．  （２０１１年）  Ｇｈｒｅｌｉｎ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｈｏｃｋ  ｉｎ  Ｒａｔｓ．  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  （Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）．
Ｒａｎｇａｓａｍｙ  ＳＢ，  Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｋ，  Ｂａｋａｙ  ＲＡＥａｎｄ，Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  ＪＨ．  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  （２０１０年）  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８４：  ２３７−２６４．
Ｒａｔａｊｃｚａｋ  ＭＺ，  Ｍａｒｌｉｃｚ  Ｗ，  Ｒａｔａｊｃｚａｋ  Ｊ，  Ｗａｓｉｋ  Ｍ，  Ｍａｃｈａｌｉｎｓｋｉ  Ｂ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｇｅｗｉｒｔｚ  ＡＭ  （１９９７年）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｅａｒｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９９：２２８−２３６．
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＲＭ，  Ｓｉｎｇｈ  Ａ，  Ｓｕｎ  Ｄ，  Ｆｉｌｌｍｏｒｅ  ＨＬ，  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ＤＷ  ３ｒｄ，  Ｂｕｌｌｏｃｋ  ＭＲ  （２０１０年）  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  １１２：１１２５−１１３８．
Ｒｉｄｌｅｙ  ＡＪ，  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  Ａ  （１９９５年）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ／ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  Ｒａｓ，  Ｒａｃ，  ａｎｄ  Ｒｈｏ  ｉｎ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１１１０−１１２２．
Ｒｏｎｇ  Ｓ，  Ｓｅｇａｌ  Ｓ，  Ａｎｖｅｒ  Ｍ，  Ｒｅｓａｕ  ＪＨ  ａｎｄ  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦＶ  （１９９４年）  Ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｔ−Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９１：４７３１−４７３５．
Ｓａｎｔｏｓ  ＯＦ，  Ｍｏｕｒａ  ＬＡ，  Ｒｏｓｅｎ  ＥＭ，  Ｎｉｇａｍ  ＳＫ．  （１９９３年）  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ
ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １５９：  ５３５−５４８．
Ｓａｔｔｌｅｒ  Ｍ，  Ｐｒｉｄｅ  ＹＢ，  Ｍａ  Ｐ，  Ｇｒａｍｌｉｃｈ  ＪＬ，  Ｃｈｕ  ＳＣ，  Ｑｕｉｎｎａｎ  ＬＡ，  Ｓｈｉｒａｚｉａｎ  Ｓ，  Ｌｉａｎｇ  Ｃ，  Ｐｏｄａｒ  Ｋ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＧ，  ａｎｄ  Ｓａｌｇｉａ  Ｒ  （２００３年）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｅｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＴＰＲ−ＭＥＴ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：５４６２−５４６９．
Ｓｃｈｗａｒｚｂａｃｈ  Ｅ，  Ｂｏｎｉｓｌａｗｓｋｉ  ＤＰ，  Ｘｉｏｎｇ  Ｇ，  Ｃｏｈｅｎ  ＡＳ  （２００６年）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｒｅａ  ＣＡ１  ＬＴＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．  １６：５４１−５５０．
Ｓｈａｎｇ  Ａ，  Ｌｉｕ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｈａｎｇ  Ｘ，  Ｙａｎｇ  Ｙ，  Ｗａｎｇ  Ｚ，  Ｚｈａｎｇ  Ｃ，  Ｚｈｏｕ  Ｄ  （２０１１年）  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．  Ｓｅｐ  １４．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］．
Ｓｈｅｔｈ  ＰＲ，  Ｈａｙｓ  ＪＬ，  Ｅｌｆｅｒｉｎｋ  ＬＡ  ａｎｄ  Ｗａｔｏｗｉｃｈ  ＳＪ  （２００８年）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｗｉｔｃｈ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｐｐ  ４０２８−４０３８．
Ｓｔａｂｉｌｅ  ＬＰ，  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ＭＥ，  Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ  Ｐ，  Ｊｉｎ  Ｊ，  Ｙｉｎ  Ｊ，  Ｌａｎｄ  ＳＲ，  Ｄａｃｉｃ  Ｓ，  Ｌｕｏｎｇ  ＴＭ，  Ｋｉｍ  ＫＪ，  Ｄｕｌａｋ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  ＪＭ  （２００８年）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ７：１９１３−１９２２．
Ｓｔｅｌｌａ  ＭＣ  ａｎｄ  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ  （１９９９年）  ＨＧＦ：  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  ３１：１３５７−１３６２．
Ｓｔｕｂｌｅｙ−Ｗｅａｔｈｅｒｌｙ，  Ｌ．，  Ｊ．  Ｗ．  Ｈａｒｄｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６年）．  ”Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｋａｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｎ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．”  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７１６（１−２）：  ２９−３８
Ｓｕｎ  Ｗ，  Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｈ  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ  （２００２年）  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ）  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃ−ｍｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０３．
Ｔａｋｅｏ  Ｓ，  Ｔａｋａｇｉ  Ｎ  ａｎｄ  Ｔａｋａｇｉ  Ｋ  （２００７年）  ［Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ］，  Ｙａｋｕｇａｋｕ  ｚａｓｓｈｉ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  １２７：１８１３−  １８２３．
Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｄ，  Ｓａｔｏ  Ｎ，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｋｕｒｉｎａｍｉ  Ｈ，  Ｔａｋｅｄａ  Ｓ，  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｍ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓ，  Ｋｏｊｉｍａ  Ｍ，  Ｏｇｉｈａｒａ  Ｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ  （２００８年）  Ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＨＧＦ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １５：５６１−５７１．
Ｔａｎｎｏｃｋ  Ｉ  （２００５年）  Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂ．  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
Ｔｈｅｗｋｅ，  Ｄ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｎ．  Ｗ．  Ｓｅｅｄｓ  （１９９６年）．  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ，  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｃ−ｍｅｔ，  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６（２１）：  ６９３３−４４．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ，  Ｄｏｌｃｅｔ  Ｘ，  Ｈｉｌｔｏｎ  Ｍ，  Ｔｏｌｃｏｓ  Ｍ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  ＡＭ  （２００４年）  ＨＧＦ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｉｎｇ  ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ＰＩ−３  ｋｉｎａｓｅ−  ａｎｄ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７：４４１−４５２．
Ｔｏｎｇ  ＣＹ，  Ｈｕｉ  ＡＢ，  Ｙｉｎ  ＸＬ，  Ｐａｎｇ  ＪＣ，  Ｚｈｕ  ＸＬ，  Ｐｏｏｎ  ＷＳ  ａｎｄ  Ｎｇ  ＨＫ  （２００４年）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  １００：１８７−１９３．
Ｔｒａｐｐ  Ｔ，  Ｋ&ouml;ｇｌｅｒ  Ｇ，  Ｅｌ−Ｋｈａｔｔｏｕｔｉ  Ａ，  Ｓｏｒｇ  ＲＶ，  Ｂｅｓｓｅｌｍａｎｎ  Ｍ，  Ｆ&ouml;ｃｋｉｎｇ  Ｍ，  Ｂ&uuml;ｈｒｌｅ  ＣＰ，  Ｔｒｏｍｐｅｔｅｒ  Ｉ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＪＣ  ａｎｄ  Ｗｅｍｅｔ  Ｐ  （２００８年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／ｃ−ＭＥＴ  Ａｘｉｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  ｏｆ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３．
Ｔｙｌｅｒ，  Ｗ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｌ．  Ｐｏｚｚｏ−Ｍｉｌｌｅｒ  （２００３年）．  ”Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｆｏｒｍ  ｉｎ  ｒａｔ  ＣＡ１  ｎｅｕｒｏｎｅｓ．”  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５５３（Ｐｔ  ２）：  ４９７−５０９．
Ｔｙｎｄａｌｌ，  Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓ．  Ｗａｌｉｋｏｎｉｓ  （２００６年）．  ”Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｍｅｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｒｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ａｔ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５（１４）：  １５６０−８．
Ｔｙｎｄａｌｌ  ＳＪ  ａｎｄ  Ｗａｌｉｋｏｎｉｓ  ＲＳ  （２００７年）  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｓｙｎａｐｓｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）  ６１：１９９−２０４．
Ｕｅｄａ  Ｈ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｓａｗａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ  （２００１年）  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：４１−５０．
Ｕｒｂａｎｅｋ，  Ｋ．，  Ｍ．  Ｒｏｔａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５年）．  ”Ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｏｓｓｅｓｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｈａｔ  ａｆｔｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ，  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．”  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９７（７）：  ６６３−７３．
Ｗａｎｇ  ＴＷ，  Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  Ｇｙｅｔｋｏ  ＭＲ，  Ｐａｒｅｎｔ  ＪＭ．  （２０１１年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ−ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ４８：  ３８−５０．
Ｗａｎｇ  Ｘ，  ＤｅＦｒａｎｃｅｓ  ＭＣ，  Ｄａｉ  Ｙ，  Ｐｅｄｉａｄｉｔａｋｉｓ  Ｐ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃ，  Ｂｅｌｌ  Ａ，  Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＫ  ａｎｄ  Ｚａｍｅｇａｒ  Ｒ  （２００２年）  Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｅｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：４１１−４２１．
Ｗａｙｍａｎ，  Ｇ．  Ａ．，  Ｍ．  Ｄａｖａｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８年）．  ”Ａｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐ２５０ＧＡＰ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５（２６）：  ９０９３−８
Ｗａｙｍａｎ，  Ｇ．  Ａ．，  Ｓ．  Ｉｍｐｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６年）．  ”Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｒｂｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣａＭ−ｋｉｎａｓｅ  Ｉ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＲＥＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ−２．”  Ｎｅｕｒｏｎ  ５０（６）：  ８９７−９０９
Ｗａｙｎｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｄ．  Ｌ．  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１年）．  ”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＬＴＰ  ｉｎ  ｒａｔ  ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２（９）：  １４０３−１４．
Ｗｅｉｄｎｅｒ  ＫＭ，  Ｂｅｈｒｅｎｓ  Ｊｒ，  Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ  Ｊ  ａｎｄ  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｗ  （１９９０年）  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１１  ：２０９７−２１０８．
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｊ．  Ａ．  Ｃｌｅｍｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６年）．  ”Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＬＹ２３１６１７  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  ｏｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ  ａｎｄ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．”  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７１７（１−２）：  １−１１．
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｗ．  Ｈａｒｄｉｎｇ  （１９８５年）  ”Ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ＲＡＳ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２２３（２）：  ３２６−３３．
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｗ．  Ｈａｒｄｉｎｇ  （２００８年）．  ”Ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＡＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｊ  Ｒｅｎｉｎ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｓｙｓｔ  ９（４）：  ２２６−３７．
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｌ．  Ｓｔｕｂｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９年）．  ”Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ−ＡＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９（１０）：  ３９５２−６１．
Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｂ．  Ｊ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８年）．  ”Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ：  ｎｅｗ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ．”  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ８４（２）：  １５７−８１．
Ｘｉａｏ  Ｇ−Ｈ，  Ｊｅｆｆｅｒｓ  Ｍ，  Ｂｅｌｌａｃｏｓａ  Ａ，  Ｍｉｔｓｕｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦＶ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔａ  ＪＲ  （２００１年）  Ａｎｔｉ−Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｍｅｔ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８：２４７−２５２．
Ｘｕ  Ｗ  ａｎｄ  Ｗｕ  ＳＧ  （１９９９年）  Ｔｈｅ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＨＧＦ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ，  ｉｎ．
Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＢＪ，  Ｅｌｉａｓ  ＰＤ，  Ｍａｓｉｎｏ  ＪＡ，  Ｈｕｄｓｏｎ  ＢＤ，  ＭｃＣｏｙ  ＡＴ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＺＪ，  Ｖａｍｕｍ  ＭＤ，  Ｓａｒｄｉｎｉａ  ＭＦ，  Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＷ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ  ＪＷ  （２０１０年）  Ｔｈｅ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶ  Ａｎａｌｏｇ  Ｎｌｅ−  Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−＆＃９６８；−（ＣＨ２−ＮＨ２）３−４−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ  （Ｎｏｒｌｅｕａｌ）  Ｃａｎ  Ａｃｔ  ａｓ  ａ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／ｃ−Ｍｅｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ３３３：１６１．
Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｌｉｖｅｔ  Ｊ，  Ｐｏｌｌｏｃｋ  ＲＡ，  Ｇａｒｃｅｓ  Ａ，  Ａｒｃｅ  Ｖ，  ｄｅＬａｐｅｙｒｉ&egrave;ｒｅ  Ｏ，  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＣＥ．  （１９９７年）Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ／ＳＦ）  ｉｓ  ａ  ｍｕｓｃｌｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ａ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：  ２９０３−２９１３．
Ｙａｓｕｍａｔｓｕ，  Ｎ．，  Ｍ．  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８年）．  ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅｓ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８（５０）：  １３５９２−６０８．
Ｙｏｕ  ＷＫ，  ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＤＭ  （２００８年）  Ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｃ−Ｍｅｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ＢＭＢ  Ｒｅｐ．  ４１：８３３−８３９．
Ｙｏｕｌｅｓ  Ｍ，  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｏ，  Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ  ＭＶ，  Ｎｅｓｓｅｎ  ＭＡ，  Ｓｔｉｖａｌａ  Ｓ，  Ｓｖｅｒｇｕｎ  ＤＩ  ａｎｄ  Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ  （２００８年）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＫ１  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ＭＥＴ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，  ｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｐ  ６１６−６２２．
Ｚｈａｎｇ  Ｂ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｌｉｎ  Ｙ，  Ｔａｎ  Ｔ，  Ｙａｎｇ  Ｚ，  Ｄａｙａｏ  Ｃ，  Ｌｉｕ  Ｌ，  Ｊｉａｎｇ  Ｒ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ  （２０１１年）Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｉｓ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．；１３８２：１６５−１７２．
Ｚｈａｎｇ  ＢＬ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｔａｎ  Ｔ，  Ｙａｎｇ  Ｚ，  Ｃａｒｌｏｓ  Ｄ，  Ｊｉａｎｇ  ＲＣ，  Ｚｈａｎｇ  ＪＮ  （２０１１年）  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ  （Ｅｎｇｌ）．  １２４：７４０−  ７４５．
Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｈｉｍｉ  Ｔ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ｉ  ａｎｄ  Ｍｕｒｏｔａ  Ｓ  （２０００年）  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３  ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：４８９−４９６．
Ｚｈａｎｇ  ＹＷ  ａｎｄ  Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦ  （２００３年）  ＨＧＦ／ＳＦ−ｍｅｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８８：４０８−４１７．
Ｚｈｕ  Ｙ，  Ｈｏｊｏ  Ｙ，  Ｉｋｅｄａ  Ｕ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ  （２０００年）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｈｅａｒｔ  （Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）  ８３：４５０−４５５．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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