(57)【要約】  本発明は、改良された放出プロファイルを有する、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のペプチドアナログ又はそれらの塩を含む、医薬組成物、及び該組成物を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ４．４〜４．６の範囲のｐＨを有する持続放出性液体医薬組成物であって、以下を含む：
・液体溶媒、
・次式を有するペプチドアナログ：
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＧＬＰ−１Ｐ−１（７−３６）ＮＨ2  （Ｉ）、
・二価金属塩（ただし、二価金属に対するペプチドアナログのモル比の範囲は、１．５〜１である）、
・随意に、酢酸及び／又は酢酸塩（ただし、ペプチドに対する酢酸及び／又は酢酸塩のモル比の範囲は、３．２〜１よりも小さい）、
ただし、ｐＨ４．４〜４．６の範囲にある最終的なｐＨは、塩酸の添加によって調整されたものであることを特徴とする。
【請求項２】
液体溶媒が、水である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
二価金属塩が、塩化亜鉛である、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
塩化亜鉛の濃度が、２．７２  ｍｇ／ｍｌ  （２０  ｍＭ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
ペプチドアナログの濃度が、１００  ｍｇ／ｍｌ  （３０  ｍＭ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
酢酸及び／又は酢酸ナトリウム三水和物の最大濃度が、９５  ｍＭである、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物であって、以下を含む：
・水、
・１００  ｍｇ／ｍｌ  （３０  ｍＭ）の［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  、
・２．７２  ｍｇ／ｍｌ  （２０  ｍＭ）の濃度の塩化亜鉛
・酢酸及び／又は酢酸ナトリウム三水和物（ただし、酢酸は０ｍＭ〜７５ｍＭの範囲の濃度で添加される）、
ただし、ｐＨ４．４〜４．６の範囲にある最終的なｐＨは、塩酸の添加によって調整されたものであることを特徴とする。
【請求項８】
酢酸が、０ｍＭ〜４７．５ｍＭの範囲の濃度で添加される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
酢酸が、２０ｍＭの濃度で添加される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
組成物が、５℃の温度で、少なくとも１年の間、安定である、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
組成物は、式Ｉのペプチドアナログが、対象内で、少なくとも約１週間、好ましくは２週間、放出されるように、製剤されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
式Ｉのペプチドアナログが、２．５％よりも小さい濃度で、リン酸バッファーｐＨ７．４での沈殿とそれに続く遠心分離の後の上清中に、検出可能である、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
修飾ＨＢＳＳバッファーｐＨ７．４の中で溶解させて５分後に、式Ｉのペプチドアナログが０．０１５  ｍｇ／分よりも小さく放出される、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物を製造する方法であって、以下のステップを含む：
ａ）  酸性化された溶液を得るために、液体溶媒と、酢酸及び／又は酢酸塩とを、組み合わせるステップ、
ｂ）  酸性化された溶液中にペプチドアナログを溶解するステップ、
ｃ）  塩化亜鉛、さらに随意に塩化ナトリウムを、添加するステップ、
ｄ）  ｐＨ４．４〜４．６の範囲となるように、塩酸を滴下して、最終溶液のｐＨを調整するステップ。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、さらに、次のステップを含む：
ｅ）  ステップｄ）で得られた組成物をろ過殺菌するステップ、
ｆ）  組成物を容器に充填するステップ。
【請求項１６】
容器中に、好ましくはプレフィルドシリンジ中に保管されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物を含む、プレフィルドシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された放出プロファイルを有する、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のペプチドアナログ又はそれらの塩を含む、持続放出性液体医薬組成物、及び該組成物を製造する方法に関する。
【０００２】
本発明は、特に、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2を含む、改良された持続放出性液体医薬組成物に関する。［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2は、ＧＬＰ−１アナログであり、次のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  １のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−  Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−ＮＨ2 
（ただし、これらのアミノ酸の２６個は天然のＬ型配置をとり、一方で４個はキラルでない）。
天然のアミノ酸残基の８番目（Ａｌａ）及び３５番目（Ｇｌｙ）の位置は、アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）によって置換されている。［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2は、タスポグルチド（ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅ）としても、知られている。
【０００３】
改良された持続放出性液体医薬組成物は、さらに、二価金属塩、好ましくは塩化亜鉛（ただし、二価金属に対するペプチドアナログのモル比の範囲は、１．５〜１である）、液体、例えば水、さらに任意に、酢酸及び／又は酢酸塩（ただし、ペプチドに対する酢酸及び／又は酢酸塩のモル比の範囲は、３．２〜１よりも小さい）を含み、ｐＨ４．４〜４．６の範囲にある組成物の最終ｐＨは、塩酸を添加することによって調節されることを特徴とする。
【背景技術】
【０００４】
ＧＬＰ−１は、腸Ｌ細胞から体内に、消化管ホルモンとして分泌される。ＧＬＰ−１の生物学的に活性な形態は、ＧＬＰ−１  （７−３７）及びＧＬＰ−１  （７−３６）ＮＨ2である。これらのペプチドは、プログルカゴンの選択的な切断によって生じる。いったん循環されると、ＧＬＰ−１は半減期が２分よりも小さい。これはジペプチジラーゼ−４（ＤＰＰ−４）酵素による急速な分解のためである。これは潜在的な抗高血糖ホルモンであり、インスリン分泌のグルコース依存性刺激を誘導し、グルカゴン分泌を抑制する。そのためＧＬＰ−１とそのアナログは、インスリン非依存性糖尿病を有する対象（患者）において有用であり、妊娠糖尿病の治療にも有用である。
【０００５】
加えて、数多くの治療用途が、ＧＬＰ−１とそのアナログには示唆されており、これには以下が含まれる：神経保護を高めること、及び／又は中枢神経系の疾患又は障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神性の症候群）の症状を、例えば、神経組織発生の調節を介して緩和すること；肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換すること；β細胞の悪化及びβ細胞増殖の刺激を防ぐこと；肥満を治療すること；食欲を抑制して満腹感を誘発すること；過敏性腸症候群を治療すること；心筋梗塞及び卒中に関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること；Ｑ波心筋梗塞の非存在を特徴とする急性冠症候群を治療すること；術後の異化変化を弱めること；冬眠心筋又は糖尿病性心筋症を治療すること；ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制すること；尿ナトリウム排出を増加させ、尿カリウム濃度を減少させること；有毒な血液量過多症に関連した状態又は障害（例えば、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）を治療すること；変力応答を誘発して、心収縮を増加させること；多房性卵巣症候群を治療すること；呼吸窮迫を治療すること；非消化管経路を介した、即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入を介した栄養摂取を改善すること；腎障害を治療すること；左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）を治療すること；例えば、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群等の胃腸障害の治療又は予防のために、そして内視鏡手技の前投薬として十二指腸洞の運動を阻害すること；重症疾患多発ニューロパシー（ＣＩＰＮ）及び全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を治療すること；トリグリセリドレベルを調節して、異常脂質血症を治療すること；虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷を治療すること；冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群を治療すること。
【０００６】
しかし、ＧＬＰ−１の医療用途の潜在的可能性は、インビボでの血漿内半減期（ｔ1/2）が１〜２分に過ぎないという代謝的な不安定性によって制限されている。配合物（製剤）の改良によって、ＧＬＰ−１及びそのアナログの医療用途の潜在的可能性を改善しようという試みが数多くなされている。
【０００７】
ＥＰ出願公開ＥＰ  ０  ６１９  ３２２  Ａ２は、ｐＨ７〜８．５のバッファ中で上記タンパク質の溶液を、特定の塩と低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の組み合わせを混合して、ＧＬＰ−１  （７−３７）ＯＨのミクロクリスタリン形態を製造する方法を記載している。
【０００８】
同様に、生分解性ポリマー、例えばポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）  （ＰＬＧＡ）、及びポリ［（ｄｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）−  β−エチレングリコール−／３−（−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）］のトリブロックコポリマー、を、同様に、ＧＬＰ−１ペプチドの持続送達性配合物（製剤）において使用することが示唆されている。しかし、このような生分解性ポリマーの使用は、この技術分野において好まれてはいない。それは、これらのポリマーが、一般に、水への溶解度が低く、水に混和しない有機溶媒、例えば塩化メチレン、を必要とし、及び／又は製造時に過酷な条件を必要とするためである。このような有機溶媒、及び／又は過酷な製造条件は、対象となるタンパク質又はペプチドの構造（コンフォメーション）の変化を誘導して、構造的な完全性を損ない、生物学的活性が十分に発揮されないという結果になるリスクを増大させると考えられている。
【０００９】
より容易かつ確実に製造できて、より容易かつ再現性よく患者に投与できるＧＬＰ−  １配合物（製剤）が、求められている。
【００１０】
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2、液体、亜鉛及び／又は塩化亜鉛、及び酢酸塩／エステル及び／又は酢酸を含む、持続放出性液体医薬組成物であって、ただし、亜鉛に対するペプチドのモル比の範囲が、約６：  １〜１：  １、ペプチドに対する酢酸塩／エステル及び／又は酢酸のモル比の範囲が、約１：  １〜６：  １、ただし、医薬組成物のｐＨが、ｐＨ４〜５の範囲にある、持続放出性液体医薬組成物が、ＷＯ  ２０１０／０８９６７２に開示されている。
【００１１】
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2及び二価金属塩（例えば亜鉛塩）の持続放出性製剤の皮下投与は、固体デポ（貯留部）を皮下に形成して、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出することを目的としている。これらの組成物は、皮下注射すると皮下に固体デポを形成して、少なくとも１週間から２週間の時間範囲にわたって上記ペプチドを放出することができるという利点を有している。しかし、イヌに対して、１回の（ｓ．ｃ．）投与をした後に得られる血漿プロファイル（ＷＯ  ２０１０／０８９６７２の図１〜３、５、６参照）は、明らかに、上記組成物が、初期バーストによって、すなわち投与直後の高い初期血漿中濃度によって、特徴付けられるものであることを示しており、つまり、嘔吐のような、濃度依存性の副作用の発生を要因となりうることが想定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０６１９３２２  Ａ２号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０８９６７２号
【発明の概要】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、望まれない副作用を排除するために初期バースト効果（すなわち初期血漿中濃度）が低減された、改善された持続放出プロファイルを有する、医薬組成物を得るために、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のオリジナルな医薬組成物を改変することにある。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
上記目的が、後述する持続放出性医薬組成物によって達成できることが見いだされた。
【００１５】
本発明は、以下を含む、ｐＨ４．４〜４．６の範囲のｐＨを有する、持続放出性液体医薬組成物にある：
・液体溶媒、
・次の式を有するペプチドアナログ：
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  （Ｉ）、
・二価金属塩、ただし、二価金属に対するペプチドアナログのモル比の範囲は、１．５〜１であり、
・随意に、酢酸及び／又は酢酸塩、ただし、ペプチドに対する酢酸及び／又は酢酸塩のモル比の範囲は、３．２〜１よりも小さく、
ただし、ｐＨ４．４〜４．６の範囲にある最終ｐＨは、塩酸の添加によって調整されたものであることを特徴とする。
【００１６】
特に、本発明は、以下を含む、ｐＨ４．４〜４．６の範囲のｐＨを有する持続放出性液体医薬組成物に関する：
・水
・次の式を有するペプチドアナログ：
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  （Ｉ）
・二価金属塩、ただし、二価金属塩に対するペプチドアナログのモル比の範囲は、１．５〜１にあり、
・随意に、酢酸及び／又は酢酸塩、ただし、ペプチドに対する酢酸及び／又は酢酸塩のモル比の範囲は、３．２〜１よりも小さく、
ただし、最終ｐＨは塩酸の添加によってｐＨ４．４〜４．６の範囲に調整されている。
【００１７】
特に、酢酸塩は酢酸ナトリウム三水和物である。
【００１８】
二価金属塩は、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2）、酢酸亜鉛二水和物、塩化銅（Ｃｕ  Ｃｌ2）、及び酢酸銅、からなる群から選択される。特に、二価金属塩は、塩化亜鉛である。
【００１９】
そこで、本発明は、以下を含む、ｐＨ４．４〜４．６の範囲のｐＨを有する持続放出性液体医薬組成物に関する：
・水
・次の式を有するペプチドアナログ：
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  （Ｉ）
・塩化亜鉛、ただし、塩化亜鉛に対するペプチドアナログのモル比の範囲は、１．５〜１にあり、
・随意に、酢酸及び／又は酢酸ナトリウム三水和物、ただし、ペプチドに対する酢酸及び／又は酢酸塩のモル比の範囲は、３．２〜１よりも小さく、
ただし、最終ｐＨは塩酸の添加によってｐＨ４．４〜４．６の範囲に調整されている。
【００２０】
特に、塩化亜鉛の濃度は、２．７２  ｍｇ／ｍｌ  （２０  ｍＭ）である。
【００２１】
特に、ペプチドアナログ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  の濃度は、１００  ｍｇ／ｍｌ  （３０  ｍＭ）  である。
【００２２】
本発明は、さらに、酢酸及び／又は酢酸ナトリウム三水和物の最大濃度が９５  ｍＭである、上記液体医薬組成物に関する。
【００２３】
特に、本発明は、以下を含む、ｐＨ４．４〜４．６の範囲のｐＨを有する持続放出性液体医薬組成物に関する：
・水
・１００  ｍｇ／ｍｌ  （３０  ｍＭ）の濃度の  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・２．７２  ｍｇ／ｍｌ  （２０  ｍＭ）の濃度の塩化亜鉛、
・酢酸及び／又は酢酸塩、ただし、酢酸は０  ｍＭ〜７５  ｍＭの濃度範囲で添加されている、
ただし、最終ｐＨは塩酸の添加によってｐＨ４．４〜４．６の範囲に調整されている。
【００２４】
特に、酢酸は、０  ｍＭ〜４７．５  ｍＭの範囲の濃度で、添加される。特に、酢酸は、２０  ｍＭの濃度で、添加される。
【００２５】
本発明は、さらに、組成物が０  ｍＭ〜５０  ｍＭの範囲の濃度で塩化ナトリウムを含む、上記液体医薬組成物に関する。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、さらに、少なくとも１年の期間、５℃の温度で安定であることを特徴とする。
【００２７】
本願で用語「持続放出性」（「持続放出」）とは、少なくとも１週間、さらに好ましくは少なくとも２週間の間、式Ｉの生物学的活性ペプチドアナログが測定可能な血清レベルとなる放出（性）を意味する。
【００２８】
そこで、本発明は、組成物が、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2が、ヒト対象（ヒト患者）において、少なくとも約１週間、好ましくは２週間の間、放出されるように製剤されている、医薬組成物に関する。
【００２９】
初期バースト効果の低減を示す、本発明の医薬組成物の持続放出プロファイル及び能力は、インビトロの沈殿及び溶解アッセイを使用して、調査した。
【００３０】
沈殿アッセイにおいて、所定の量の医薬組成物をｐＨ７．４のリン酸バッファー溶液に添加した（実施例３．１参照）。この混合物を次に、遠心分離して、上清中に残った、溶解した式Ｉのペプチドアナログ（［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2）を、ＨＰＬＣ分析によって測定した。溶液中に多量のペプチドがあることは、初期バースト効果に対応する。
【００３１】
特に、本発明の医薬組成物は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー中での沈殿とそれに続く遠心分離の後に、上清中に検出される式Ｉのペプチドアナログ（［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2）の濃度が、２．５％よりも小さいものとできる。
【００３２】
溶解アッセイにおいて、沈殿したデポ（貯留物）から連続的に流れる放出溶媒へのペプチドの放出を、検討できる（実施例３．２参照）。０．２ｍｌの医薬組成物を、ガラスビーズで満たしたセルへ添加した。放出溶媒は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−ｌ−エタンスルホン酸）バッファでｐＨ７．４として修飾したハンクス液（ＨＢＳＳ）である。これをセルに流した。サンプルは、５，１０，１５，３０及び６０分後に回収し、溶解／放出されたペプチドの量を、分析した。
【００３３】
本発明において、特に好ましい医薬組成物は、修飾ＨＢＳＳバッファーｐＨ７．４に溶解させて５分後に、放出される式Ｉのペプチドアナログが、０．０１５  ｍｇ／分未満であるものである。
【００３４】
本発明は、さらに、次のステップを含む、上記規定した医薬組成物の製造方法に関する：
ａ）  液体溶媒及び酢酸及び／又は酢酸塩を組み合わせて、酸性溶液を得るステップ、
ｂ）  酸性溶液中に、ペプチドアナログを溶解するステップ、
ｃ）  塩化亜鉛、及び随意に塩化ナトリウム、を添加するステップ、
ｄ）  最終溶液のｐＨを、塩酸によって、ｐＨ４．４〜４．６の範囲に、調整するステップ。
【００３５】
塩化亜鉛及び塩化ナトリウムは、溶液として添加することもでき、あるいは、固体状態で添加して酸性溶液中で溶解させることもできる。
【００３６】
さらに、本発明は、上述の方法であって、さらに次のステップを含む方法にも関する：
ｅ）  ステップｄ）によって得られた組成物を、フィルター殺菌するステップ、及び、
ｆ）  組成物を容器に充填するステップ。
【００３７】
上述のように、上記の医薬組成物は、皮下投与、すなわち皮膚への注射に、特に適している。したがって、本発明は、本発明の医薬組成物であって、容器中に保存された、好ましくはプレフィルドシリンジ中に保存された、医薬組成物にも関する。
【００３８】
したがって、本発明は、本発明の医薬組成物を含むプレフィルドシリンジにも関する。特に、本発明の医薬組成物を０．２ｍｌ含む、プレフィルドシリンジにもある。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、２型糖尿病、あるいは妊娠糖尿病の治療における使用に、特に好適である。これらは、その他の代謝疾患、例えば、肥満、中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病）、腎不全、心血管系疾患、例えば、鬱血性心不全、心筋梗塞、卒中、急性冠症候群、多房性卵巣症候群、ネフローゼ症候群の治療にも有用である。
【実施例】
【００４０】
［実施例１：  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  （医薬物質）の調製］
［ペプチドの製造：］
クルードな［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  ペプチドを、ＷＯ  ２００７／１４７８１６  及び  ＷＯ  ２００９／０７４４８３に記載された方法によって、３つのフラグメントを調製して、これらのフラグメントを溶液中でカップリングさせることによって、調製できる。
【００４１】
［ＲＰ−ＨＰＬＣ  精製：］
クルードなペプチドの精製は、ＲＰ（逆相）固定相上で行った。そこで、溶媒は、ＲＰ材料、例えばシリカゲル（例えばＫｒｏｍａｓｉｌ  １００−１６−Ｃ  １８）、又はアクリル酸エステルマクロ網状吸着剤（例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ７１Ｍ）、である。精製は、約ｐＨ２での第１回目通過クロマトグラフィー精製と、それに続く約ｐＨ９での第２回目通過とを含む。
【００４２】
第１回目クロマトグラフィー：
クルードな［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2を、水／アセトニトリル／酢酸（例えば９０／９／１  ｖ／ｖ／ｖ）中に溶解して、ＨＰＬＣカラム（２０  ｇ／Ｌまでロード、ベッド深さ約２５ｃｍ）上にロードして、精製プログラム（水性リン酸アンモニウム（約ｐＨ２）／アセトニトリル（８０／２０  ｖ／ｖ）から、水性リン酸アンモニウム（約ｐＨ２）／アセトニトリル（６０／４０  ｖ／ｖ）までのグラディエント）で開始した。フラクションは、回収して、水又は水酸化アンモニウム溶液で希釈した。
【００４３】
第２回目クロマトグラフィー：
クロマトグラフィー１から、プールされて希釈された、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のフラクションを、ＨＰＬＣカラム上にロードして、精製プログラム（水性酢酸アンモニウム（約ｐＨ９〜１０）／アセトニトリル（８５／１５  ｖ／ｖ）から、水性酢酸アンモニウム（約ｐＨ９〜１０）／アセトニトリル（３５／６５  ｖ／ｖ）までのグラディエント）を開始した。フラクションは、回収して、随意に、水、希釈した酢酸、又は酢酸アンモニウムで、希釈した。次にこれらを、次の濃縮ステップのために、ＨＰＬＣカラム上に、直接にロードした。
【００４４】
濃縮ステップ：
クロマトグラフィー２から、プールされて希釈されたフラクションを、同じＨＰＬＣカラム上にロードして、異なった移動相を使用して、単離されるペプチドの濃縮のために、迅速に溶出した。移動相として、水性酢酸アンモニウム（約ｐＨ９）／メタノール（８５／１５  ｖ／ｖ）から、水性酢酸アンモニウム（約ｐＨ９）／メタノール（２０／８０  ｖ／ｖ）へのグラジエントを、使用した。ペプチドを含むフラクションは、単離のためにプールした。
【００４５】
単離：
医薬製剤に適した、乾燥医薬物質を得るために、上記溶液を、沈殿、凍結乾燥、又は噴霧乾燥の手法に供することができる。
【００４６】
ペプチドの沈殿：
上記ペプチド溶液は、２０℃〜２５℃の温度で、イソプロパノール（ＩＰＡ）へゆっくりと添加した。混合物は、濁ったものとなった。２０〜２５℃での一晩のスターリングの後に、沈殿した生成物［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2を、ろ過して、ＩＰＡで洗浄して、次に、２５℃で真空下で、質量が一定となるまで乾燥した。
【００４７】
あるいは、その代わりに、上記ペプチドを、ＷＯ  ２０１０／０７２６２１に記載されたように、噴霧乾燥によって、単離することもできる：
ペプチドを含むフラクションは、Ｎｉｒｏ  ＳＤ−４−Ｒ−ＣＣ（噴霧チェンバー０  １．２  ｘ  ０．７５  ｍ、容量８  ｋｇ  Ｈ2ＯＺｈ）に、直接に供給した。数時間後に、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の微細な粉末が、サイクロンから回収された。
【００４８】
［実施例２：  製剤手順］
Ａ）  材料：
塩化亜鉛、塩化ナトリウム、及び１Ｍ塩酸を、Ｍｅｒｃｋから入手した。酢酸（９９．５％）は、Ｆｌｕｋａから入手した。酢酸ナトリウム三水和物は、Ｈａｎｓｅｌｅｒ  ＡＧから入手した。注射のための水は、２回蒸留によって内部で調製した。
【００４９】
Ｂ）  ストック溶液の調製：
塩化亜鉛：５．２３６ｇ塩化亜鉛を１００ｍＬの注射用水に溶解した。
塩化ナトリウム：５．８４４ｇ塩化ナトリウムを１００ｍＬの注射用水に溶解した。
酢酸ナトリウム三水和物：１０．４７８ｇ酢酸ナトリウム三水和物を１００ｍＬの注射用水に溶解した。
【００５０】
Ｃ）  液体配合物（製剤）の調製：
目標体積の約７０％の注射用水で、配合容器を満たし、次に、酸性の酸、１Ｎ塩酸、又はその組み合わせで、酸性化した。酸性の酸／酢酸ナトリウムの混合物の場合には、酢酸ナトリウム三水和物ストック溶液を、溶液に添加した。次いで、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2を、スターリングしながら、酸性化した溶液へ、添加した。全ての固体の［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2が溶解した後に、塩化亜鉛及び／又は塩化ナトリウムストック溶液を、この配合物（製剤）に添加した。さらにスターリングした後に、ｐＨを測定して、１Ｎ塩酸を添加することによって、それぞれ調整した。最後に、注射用水を、目標体積に達するまで、配合物（製剤）に添加した。
【００５１】
最終バルク配合物（製剤）を、０．２２  μｍ  ＰＶＤＦフィルターを使用して、ろ過殺菌して、清潔で無菌の容器に入れた。殺菌バルク製剤を、フィル体積５ｍＬの加熱殺菌した６ｍＬのガラスバイアルに入れて満たした。これらのバイアルを、テフロン加工した血清ストッパーでストップして、アルミニウムキャップでクリンプした。ろ過殺菌とバイアル充填は、層流エアフローベンチを使用して無菌条件下で行った。
【００５２】
2014505042.tif 000002
【００５３】
2014505042.tif 000003
【００５４】
組成物Ａ（オリジナル配合物（製剤）、比較例）
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・９５  ｍＭ酢酸
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・ｐＨ４．５
・注射用水（十分量）
【００５５】
組成物Ｂ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・０ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・５０ｍＭ塩化ナトリウム
・ｐＨ４．５の調整に十分量の塩酸
・注射用水（十分量）
【００５６】
組成物Ｃ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・４７．５ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・２５ｍＭ塩化ナトリウム
・ｐＨ４．５の調整に十分量の塩酸
・注射用水（十分量）
【００５７】
組成物Ｄ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・７５ｍＭ酢酸  
・２０ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・５０ｍＭ塩化ナトリウム
・ｐＨ４．５
・注射用水（十分量）
【００５８】
組成物Ｅ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・０ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・５０ｍＭ塩化ナトリウム
・ｐＨ４．４の調整に十分量の塩酸
・注射用水（十分量）
【００５９】
組成物Ｆ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・７５ｍＭ酢酸  
・２０ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・ｐＨ４．６０
・注射用水（十分量）
【００６０】
組成物Ｇ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・０ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・ｐＨ４．４の調整に十分量の塩酸
・注射用水（十分量）
【００６１】
組成物Ｈ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・９５ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・５０ｍＭ塩化ナトリウム
・ｐＨ４．５
・注射用水（十分量）
【００６２】
組成物Ｉ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・０ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・ｐＨ４．５の調整に十分量の塩酸
・注射用水（十分量）
【００６３】
組成物Ｊ
・１００  ｍｇ／ｍＬ  （３０ｍＭ）  ［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 
・２０ｍＭ酢酸  
・２．７２  ｍｇ／ｍＬ  （２０ｍＭ）  塩化亜鉛
・ｐＨ４．５の調整に十分量の塩酸
・注射用水（十分量）
【００６４】
実施例３（分析手順）
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2  の持続放出プロファイルへの配合物（製剤）修飾の影響を、インビトロでの沈殿及び溶解アッセイを使用して、検討した。
さらに、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2配合物（製剤）を、バッファー容量、粘度（粘性）及び濁度について分析した。
【００６５】
［実施例３．１  （沈殿アッセイ）］
沈殿アッセイで、（ＵＳＰ）  ５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４中で、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2製剤の沈殿後に、残余の可溶性活性成分を、測定した。
【００６６】
２００μｌの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2製剤を、２５０μｌリン酸バッファーに混合した。この混合物を、遠心分離して、透明な上清について、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の濃度を分析した。
【００６７】
2014505042.tif 000004
【００６８】
改変（修飾）した製剤（配合物）は、オリジナルな製剤（Ａ）と比較して、リン酸バッファーｐＨ７．４中での［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の溶解性が、有意に減少していた。
【００６９】
［実施例３．２  （ＨＢＳＳ溶媒中での溶解アッセイ）］
溶解アッセイでは、沈殿したデポ（貯留物）から放出溶媒の連続した流れへの、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の放出を、時間の関数として測定した。
【００７０】
２００μｌの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2製剤を、ガラスビーズで満たしたＵＳＰ  ＩＶパウダーセル中へ入れた。この溶解アッセイは、オープン配置で、２ｍＬ／ｍｉｎで６０分間、流して行った。試料は、５，  １０，  １５，  ３０  及び６０分後に、回収した。放出溶媒は、Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｎａｌ．  （２００６），  ｐａｇｅｓ  １１９−１２５、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ,,ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ“ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎａｌｔｒｅｘｏｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔ，  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＨＰＬＣ  ｍｅｔｈｏｄ」にしたがって、ｐＨ  ７．４で２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳをバッファとして添加した修飾ハンクス液（ＨＢＳＳ）を使用した。
【００７１】
2014505042.tif 000005
【００７２】
修飾製剤は、オリジナル製剤（Ａ）と比較して、修飾ＨＢＳＳｐＨ７．４中での［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の溶解が、有意に低減していた。
【００７３】
［実施例３．３（バッファー容量の検討）］
バッファー容量（キャパシティ）アッセイによって、所定量の［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2製剤をｐＨ７．４へ滴定するために必要なＮａＯＨ量を、決定した。
【００７４】
５ｍＬの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2製剤を、２０ｍＬガラスビーカーに満たした。０．１Ｍ水酸化ナトリウムを、連続的にスターリングしながら、この溶液に滴下した。ｐＨは、ｐＨ７．４になるまでガラス電極を使用したポテンシオメーターで記録した。バッファー容量（キャパシティ）は、試験溶液１Ｌあたりの水酸化ナトリウムのミリモル（ｍｍｏｌ）として示す。
【００７５】
2014505042.tif 000006
【００７６】
修飾製剤Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｉ及びＪは、オリジナル製剤（Ａ）及び製剤Ｄ及びＨと比較して、バッファーキャパシティが明らかに減少していた。
【００７７】
［実施例３．４  （粘度の測定）］
粘度は、プレート型及びコーン型レオメータによって、２０００ｓ-1の剪断速度、２０℃の温度で、測定した。粘度は、注射針を通じて製剤を皮下に送達させるシリンジの能力を評価する相対的なパラメータであり、粘度が１０ｍＰａｓよりも小さければ、手動で非常に容易に注射するために、適している（Ｗ．  Ｒｕｎｇｓｅｅｖｉｊｉｔｐｒａｐａ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂｏｄｍｅｉｅｒ；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．．  ３６  （２００９），  ５２４−５３１，  「Ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＩＳＭ）」）。
【００７８】
2014505042.tif 000007
【００７９】
製剤Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｉ及びＪの粘度は、製剤Ｂ，Ｄ，Ｅ及びＨと比較して、明らかに低かった。製剤Ｂ，Ｄ，Ｅ及びＨにおける５０ｍＭの塩化ナトリウムの存在は、粘度を明らかに増大させた。
【００８０】
［実施例３．５  （濁度の測定）］
［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2製剤の濁度は、Ｈａｃｈ２１９９  ＡＮ濁度計によって測定した。濁度は、液体溶液の物理的安定性を示すものであり、濁度の上昇は、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の溶解性の低減と、沈殿が生じる潜在的なリスクとを、示す。
【００８１】
2014505042.tif 000008
【００８２】
製剤Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｉ及びＪの濁度は、製剤Ｂ，Ｄ，Ｅ及びＨよりも、明らかに低かった。製剤Ｂ，Ｄ，Ｅ及びＨの５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在は、濁度を明らかに増大させた。
【国際調査報告】
2014505042.tif 000009
2014505042.tif 000010
2014505042.tif 000011