(57)【要約】  本発明は、ヒトＴＧＦアルファおよびヒトエピレグリンに結合し、高親和性、選択性、および強い中和特性を有することを特徴とする抗体を提供する。その抗体は糖尿病性腎症の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖および重鎖を含む、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体であって、前記軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲはアミノ酸配列ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲはアミノ酸配列ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は配列番号６であり、ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、ＨＣＤＲ３は配列番号３である、抗体。
【請求項２】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号９または配列番号１０である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７である、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号９であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号１３または配列番号１４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号１２である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号１３であり、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号１２である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖のアミノ酸配列が配列番号１４であり、各重鎖のアミノ酸配列が配列番号１２である、請求項１〜３または請求項５〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
患者における糖尿病性腎症を治療する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
療法に使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
糖尿病性腎症の治療に使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗原結合断片と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
患者における糖尿病性腎症を治療する方法であって、請求項１３に記載の抗原結合断片を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
療法に使用するための請求項１３に記載の抗原結合断片。
【請求項１７】
糖尿病性腎症の治療に使用するための請求項１３に記載の抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンは、損傷後の創傷治癒において正常に機能する上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）の７個のリガンドのうちの２個である。糖尿病性腎症（「ＤＮ」）は、主要な糖尿病性合併症であり、末期腎不全（「ＥＳＲＤ」）の主な原因である。タンパク尿は、ＤＮに伴って起こる腎機能低下の臨床的指標であり、疾患進行および心不全、血管疾患、律動不整などの増加した心血管リスクに関連する。ＤＮについての標準的な治療は、疾患進行を遅延させるだけであり、かなりの残存リスクを残す、ＡＣＥ阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬（「ＡＲＢ」）を含む。
【０００３】
ＥＧＦＲを遮断することは、タンパク尿だけでなく、腎疾患の前臨床動物モデルにおける腎臓病理も軽減する。しかしながら、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）などのＥＧＦＲ阻害剤は、癌のために承認されているが、皮膚における標的阻害に関連する顔面および肩における重症の皮膚発疹などの副作用を伴う。したがって、ＤＮについて代替療法の必要性がまだ存在する。さらに、ＤＮについてのより効果的な治療法の必要性が存在する。
【０００４】
ＴＧＦ−アルファに結合する抗体は記載されている（例えば、特許文献１を参照のこと）。さらに、エピレグリンに結合する抗体が記載されている（例えば、特許文献２を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５１９０８５８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０３２４４９１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＤＮを治療するためのＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに対する抗体を提供する。さらに、本発明は、インビボにおいて標的物と結合し、続いて疾患進行および心血管系リスクの同時減少と共にタンパク尿の減少を引き起こすＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに対する抗体を提供する。
【０００７】
本発明は、多くの望ましい特性を有するＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンの両方に結合する治療的に有用な抗体を提供する。本発明の抗体は高親和性を有し、ヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに対する完全な中和活性に選択的である。投与される場合、本発明の抗体はまた、インビボでのアルブミン尿の減少ならびに尿細管性タンパク質、間質性線維症、メサンギウム基質膨張、および骨盤膨張についての腎臓病理の減少を生じる。さらに、本発明の好ましい抗体は、完全なＥＧＦＲ阻害に関連する観察される皮膚毒性を引き起こさない。
【０００８】
本発明は、軽鎖および重鎖を含む、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体であって、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲはアミノ酸配列ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲはアミノ酸配列ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は配列番号６であり、ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、ＨＣＤＲ３は配列番号３である、抗体を提供する。
【０００９】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、糖尿病性腎症の治療に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体を提供する。
【００１１】
本開示全体にわたって、本発明に記載される本発明の抗体は、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合し、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲはアミノ酸配列ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲはアミノ酸配列ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は配列番号６であり、ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、ＨＣＤＲ３は配列番号３である。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載される抗体であって、ヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに選択的である抗体を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載される抗体であって、ヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに対する完全中和活性を有する抗体を提供する。さらに好ましくは、本発明は、本明細書に記載される抗体であって、ヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに選択的であり、かつヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに対する完全中和活性を有する、抗体を提供する。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載される抗体であって、ヒトＴＧＦ−アルファ（配列番号１８）に対して０．０１×１０−９から１．０×１０−９Ｍの解離平衡定数、Ｋｄを有する、抗体を提供する。さらに好ましくは、本明細書に記載される本発明の抗体は、ヒトＴＦＧ−アルファに対して０．０５×１０−９から０．８×１０−９Ｍの解離平衡定数、Ｋｄを有する。Ｋｄ値は実施例２に記載されるように２５℃での結合平衡により規定される。
【００１４】
本発明はまた、本明細書に記載される抗体であって、ｍｅｔ−ヒトエピレグリン（配列番号２２）に対して０．１×１０−９Ｍから３０×１０−９Ｍの解離平衡定数、Ｋｄを有する、抗体を提供する。さらに好ましくは、本明細書に記載される本発明の抗体は、ヒトエピレグリンに対して０．５×１０−９Ｍから１０×１０−９Ｍの解離平衡定数、Ｋｄを有する。Ｋｄ値は実施例２に記載されるように２５℃での結合平衡により規定される。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載される抗体であって、ヒトＴＧＦ−アルファ（配列番号１８）に対して０．０１×１０−９から１．０×１０−９Ｍの解離平衡定数、Ｋｄおよびｍｅｔ−ヒトエピレグリン（配列番号２２）に対して０．１×１０−９Ｍから３０×１０−９ＭのＫｄを有する、抗体を提供する。さらに好ましくは、本明細書に記載される本発明の抗体は、ヒトＴＦＧ−アルファに対して０．０５×１０−９Ｍから０．８×１０−９Ｍの解離平衡定数、Ｋｄおよびヒトエピレグリンに対して０．５×１０−９Ｍから１０×１０−９ＭのＫｄを有する。Ｋｄ値は実施例２に記載されるように２５℃での結合平衡により規定される。
【００１６】
本発明は、ヒトＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合し、実施例５および実施例６にそれぞれ記載されるように、マウス残存腎臓モデルおよびマウス一側性腎摘出ｄｂ／ｄｂモデルにおいてインビボで、アルブミン尿の用量依存的低下、血清クレアチニンおよび血中尿素窒素（「ＢＵＮ」）の減少を引き起こす抗体を提供する。
【００１７】
本発明は、ヒトＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合し、実施例５および実施例６のそれぞれに記載されるように、マウス残存腎臓モデルおよびマウス一側性腎摘出ｄｂ／ｄｂモデルにおいてインビボで、尿細管性タンパクおよび間質性線維症についての腎臓病理の減少ならびにメサンギウム基質膨張および骨盤膨張の低下を引き起こす抗体を提供する。
【００１８】
本発明は、ヒトＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合し、ヒトにおける疾患進行および心血管系リスクの同時減少と共にタンパク尿の減少を引き起こすと考えられる抗体を提供する。さらに、本発明は、ヒトＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合し、ヒトにおける糖尿病性腎症の治療に有効であると考えられる抗体を提供する。
【００１９】
本発明は、ヒトＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合し、実施例７に記載されるカニクイザルにおける毒性研究において観察される皮膚毒性を生じない、抗体を提供する。
【００２０】
本発明は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲはアミノ酸配列ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲはアミノ酸配列ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は配列番号６であり、ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、ＨＣＤＲ３は配列番号３である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号９または配列番号１０である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２２】
本発明はまた、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列およびＨＣＶＲのアミノ酸配列は、
（ｉ）ＬＣＶＲが配列番号９であり、ＨＣＶＲが配列番号７である配列、および
（ｉｉ）ＬＣＶＲが配列番号１０であり、ＨＣＶＲが配列番号７である配列
からなる群から選択される、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２４】
本発明は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号９であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２５】
本発明は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１３または配列番号１４である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２７】
本発明はまた、軽鎖および重鎖を含み、重鎖のアミノ酸配列は配列番号１２である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、軽鎖および重鎖を含み、重鎖のアミノ酸配列および軽鎖のアミノ酸配列は、
（ｉ）重鎖が配列番号１２であり、軽鎖が配列番号１３である配列、および
（ｉｉ）重鎖が配列番号１２であり、軽鎖が配列番号１４である配列
からなる群から選択される、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００２９】
本発明は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１３であり、各々の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１２である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００３０】
本発明は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１４であり、各々の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１２である、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンに結合する抗体を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片を提供する。
【００３２】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、必要に応じて他の治療成分と共に、本明細書に記載される本発明の抗体を含む、医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の抗体を患者に投与することを含む、患者における糖尿病性腎症を治療する方法を提供する。
【００３５】
さらに、本発明は、療法に使用するための本明細書に記載される本発明の抗体を提供する。好ましくは、本発明は、糖尿病性腎症の治療に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、糖尿病性腎症の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載される、本発明の抗体の使用を提供する。
【００３７】
本発明はまた、標準的な治療と同時または連続した組み合わせで、本明細書に記載される本発明の抗体を患者に投与することを含む、患者における糖尿病性腎症を治療する方法を提供する。
【００３８】
さらに、本発明は、療法に使用するための本明細書に記載される本発明の抗体を提供し、その抗体は標準的な治療と同時または連続した組み合わせで投与される。好ましくは、本発明は、糖尿病性腎症の治療に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体を提供し、その抗体は標準的な治療と同時または連続した組み合わせで投与される。
【００３９】
さらに、本発明は、糖尿病性腎症を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される本発明の抗体の使用を提供し、その抗体は標準的な治療と同時または連続した組み合わせで投与される。
【００４０】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００４１】
さらに、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、必要に応じて他の治療成分と共に、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を含む、医薬組成物を提供する。
【００４２】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を患者に投与することを含む、患者における糖尿病性腎症を治療する方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、療法に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を提供する。好ましくは、本発明は、糖尿病性腎症の治療に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を提供する。
【００４４】
さらに、本発明は、糖尿病性腎症を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片の使用を提供する。
【００４５】
本発明はまた、標準的な治療と同時または連続した組み合わせにおいて、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を患者に投与することを含む、患者における糖尿病性腎症を治療する方法を提供する。
【００４６】
さらに、本発明は、療法に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を提供し、その抗原結合断片は、標準的な治療と同時または連続した組み合わせにおいて投与される。好ましくは、本発明は、糖尿病性腎症の治療に使用するための、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片を提供し、その抗原結合断片は、標準的な治療と同時または連続した組み合わせにおいて投与される。
【００４７】
さらに、本発明は、糖尿病性腎症を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される本発明の抗体の抗原結合断片の使用を提供し、その抗原結合断片は、標準的な治療と同時または連続した組み合わせにおいて投与される。
【００４８】
ＤＮのための標準的な治療としては、限定されないが、ＡＣＥ阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
「抗体」の一般構造は当該技術分野において非常によく知られている。ＩｇＧ型の抗体に関して、鎖内および鎖間ジスルフィド結合により架橋される４つのアミノ酸鎖（２つの「重」鎖および２つの「軽」鎖）が存在する。特定の生体系において発現される場合、修飾されていないヒトＦｃ配列を有する抗体はＦｃ領域においてグリコシル化される。抗体は同様に他の位置においてグリコシル化されてもよい。抗体のサブユニット構造および３次元構造は当該技術分野において周知である。各々の重鎖はＮ末端重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）および重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）からなる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡについて３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）、ならびにＩｇＭおよびＩｇＥについて４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」）および軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）からなる。
【００５０】
各々の軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存される領域が散在している、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超可変性領域にさらに細分され得る。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３」と称され、軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３」と称される。ＣＤＲは抗原と特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含有する。各ドメインに対するアミノ酸の割当は周知の慣例［例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］に従う。
【００５１】
本発明の抗体は免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）のいずれかから選択される重鎖定常領域を有し得る。さらに、本発明の抗体は、他のＩｇＧサブタイプと比較して、補体因子に結合するその低い能力のために、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域から誘導されるＦｃ部分を含有する。
【００５２】
抗体は、例えば任意の真核、原核、またはファージクローンを含む、単一のコピーまたはクローンから誘導されてもよい。好ましくは、本発明の抗体は、抗体分子の均質または実質的に均質の集団中に存在する。完全長の抗体は、Ｆｃ領域を含む、完全長または実質的に完全長の定常領域を含む。このような抗体の「抗原結合断片」は、抗原結合部分を含み、抗原結合能力を保有する完全長の抗体の任意の短縮形態である。このような短縮形態としては、例えば、開示された抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。さらに、このような短縮抗体形態は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードするＤＮＡをリンカー配列と結合することにより産生され得る一本鎖Ｆｖ断片であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ２６９−３１５，１９９４を参照のこと）。「抗体」という用語は、他に示さない限り、このような断片を含まない。本発明の抗体は、当該技術分野において周知の技術、例えば組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術またはそのような技術の組み合わせまたは当該技術分野において容易に知られている他の技術を使用して産生され得る。
【００５３】
本発明の抗体は、ヒトゲノム配列由来のフレームワークおよび定常領域と同一または実質的に同一（実質的にヒト）であるヒト起源のフレームワーク、ヒンジ領域および定常領域を有するように設計された操作された抗体である。完全なヒトフレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域は、それらのヒト生殖細胞配列および天然に生じる体細胞変異を有する配列ならびに操作された変異体を有する配列である。本発明の抗体は、その抗体に１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含有する完全なヒトフレームワーク、ヒンジ、または定常領域由来のフレームワーク、ヒンジ、または定常領域を含んでもよい。さらに、本発明の抗体はヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００５４】
種々の異なるヒトフレームワーク配列は、本発明の抗体を基礎として単一または組み合わせて使用されてもよい。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域はヒト起源または実質的にヒト（ヒト起源の少なくとも９５％、９７％または９９％）である。ヒト起源のフレームワーク領域の配列は、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌａｆｒａｎｃ，Ｇｅｒａｒｄ  ＬｅｆｒａｎｃによるＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１，ＩＳＢＮ  ０１２４４１３５１から得られ得る。
【００５５】
本発明の抗体についてのフレームワーク配列は、「ドナー」可変フレームワーク領域として機能し、当該技術分野において公知の方法を使用して本明細書で特定した同じＣＤＲを有するさらなる抗体を作製するために使用され得る。さらに、本発明の抗体についてのフレームワーク配列は、さらなる抗体を生成するために他の公知のヒトフレームワーク配列と比較され得る。したがって、この情報は、別の選択された相同ヒトフレームワーク領域を、これらの位置におけるドナーアミノ酸残基に「逆突然変異する」ために使用され得る。さらに、任意の「まれな」アミノ酸がさらなるヒトフレームワークにおいて検出され得るので、コンセンサスまたはドナーアミノ酸残基が関連位置において使用され得る。
【００５６】
「ＴＧＦ−アルファ」または「ヒトＴＧＦ−アルファ」とは、ヒトＴＧＦ−アルファタンパク質（配列番号１８）を指す。
【００５７】
「エピレグリン」または「ヒトエピレグリン」とは、ヒトエピレグリンタンパク質（配列番号３３）を指す。Ｍｅｔ−ヒトエピレグリン（配列番号２２）は本明細書においてインビトロ実験に使用される。ヒトエピレグリンに結合または中和する、本明細書に記載される本発明の抗体の能力への言及はまた、インビトロ実験においてヒトｍｅｔ−エピレグリンに結合および中和するそれらの能力にも関連する。
【００５８】
「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００５９】
「治療している」（または「治療する」もしくは「治療」）という用語は、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度の遅延、停止、減少、または反転を意味する。
【００６０】
「治療有効量」という用語は、所望の治療を提供する、患者への単回または複数回用量投与の際の本発明の抗体の量または用量を指す。
【００６１】
以下の実施例が以下に記載するように本質的に実施され得る。
【実施例】
【００６２】
実施例１：抗体の産生
抗体ＩおよびＩＩを以下のように作製し、精製できる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞を、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比または配列番号１５などのＨＣ、および配列番号１６もしくは配列番号１７などのＬＣの両方をコードする単一のベクター系を使用して抗体をスクリーニングするための発現系を用いて一過的または安定的のいずれかでトランスフェクトする。抗体が分泌される清浄培地を、多くの商業的に使用される技術のいずれかを使用して精製する。例えば、培地は適合緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４））で平衡化したプロテインＡまたはＧカラムに簡便に適用できる。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合した抗体を、例えばｐＨ勾配（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８〜０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ２．５など）により溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどにより抗体画分を検出し、次いでプールする。さなる精製は、目的とする使用に応じて任意である。一般的な技術を使用して、抗体を濃縮および／または滅菌濾過できる。サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって、可溶性凝集体および多量体を効果的に除去できる。これらのクロマトグラフィー工程の後、抗体の純度は９９％超である。生成物は−７０℃ですぐに凍結できるか、または凍結乾燥できる。これらの抗体についてのアミノ酸配列を以下に提供する。
【００６３】
【表１】
2014515743.tif 000002
【００６４】
実施例２：抗体Ｉについての表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）による親和結合測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，スウェーデン）、試薬およびＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２０００評価ソフトＶｅｒ４．１を表面プラズモン共鳴分析のために使用する。製造業者のＥＤＣ／ＮＨＳアミノカップリング法を使用してＣＭ５チップを調製する。４つ全てのフローセルの表面を、１０μＬ／分にて７分間、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を注入することにより活性化する。ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体を、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．０緩衝液中で５０μｇ／ｍｌに希釈し、１０μＬ／分の流速での７分の注入により、４つ全てのフローセル上で約１００００ＲＵについて固定する。１０μＬ／分でのエタノールアミンの７分の注入により、未反応部位を遮断する。３０μＬ／分での３×２０秒のグリセリンｐＨ１．５の注入を使用して、非共有結合タンパク質を除去する。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ［１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のポリソルベート２０］である。
【００６５】
研究１において、抗体Ｉをランニング緩衝液中で５０μｇ／ｍＬに希釈し、約４００〜６００ＲＵをフローセル２に捕捉する。ヒトＴＧＦ−アルファ（配列番号１８）、ラットＴＧＦ−アルファ（配列番号２０）、ｍｅｔ−ヒトエピレグリン（配列番号２２）、およびカニクイザルエピレグリン（配列番号２４）をランニング緩衝液中で１００μｇ／ｍＬから２００ｎＭまで希釈し、次いでランニング緩衝液中で６．２５ｎＭまで２倍連続希釈する。マウスエピレグリン（配列番号２３）をランニング緩衝液中で１００μｇ／ｍＬから４μＭまで希釈し、次いでランニング緩衝液中で１２５ｎＭまで２倍連続希釈する。各リガンド濃度の複製注入を、３００秒間、３０μＬ／分にて注入し、続いて、相を分離する。相分離はヒトおよびラットＴＧＦ−アルファについて１８００秒、ヒトおよびカニクイザルエピレグリンについて１２００秒、およびマウスエピレグリンについて１２０秒である。全てのフローセルにわたって、３０μＬ／分にて３×２０秒間、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を注入することにより複製を実施する。
【００６６】
研究２において、抗体ＩＩＩをランニング緩衝液中で１００μｇ／ｍＬまで希釈し、約４００〜６００ＲＵをフローセル２中で捕捉する。マウスＴＧＦ−アルファ（配列番号１９）をランニング緩衝液中で１００μｇ／ｍＬから２００ｎＭまで希釈し、次いでランニング緩衝液中で６．２５ｎＭまで２倍連続希釈する。マウスエピレグリン（配列番号２３）をランニング緩衝液中で１００μｇ／ｍＬから４μＭまで希釈し、次いでランニング緩衝液中で１２５ｎＭまで２倍連続希釈する。各リガンド濃度の複製注入を、３００秒間、３０μＬ／分にて注入し、続いて、相を分離する。相分離はマウスＴＧＦ−アルファについて１８００秒、およびマウスエピレグリンについて１２０秒である。全てのフローセルにわたって、３０μＬ／分にて３０秒間、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を注入することにより複製を実施する。
【００６７】
基準を差し引いたデータをＦｃ２−Ｆｃ１として回収する。測定は２５℃で得る。「１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合」結合モデルを使用して、各リガンドについてのオンレート（ｋｏｎ）およびオフレート（ｋｏｆｆ）を評価する。関係：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎに従って結合キネティクスから親和性（ＫＤ）を算出する。
【００６８】
【表２】
2014515743.tif 000003
【００６９】
【表３】
2014515743.tif 000004
【００７０】
抗体Ｉは、約９８ｐＭおよび１．３ｎＭの親和性で、それぞれヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに結合する。抗体Ｉはまた、約７０ｐＭおよび３４０ｎＭの親和性で、それぞれラットＴＧＦ−アルファおよびマウスエピレグリンに結合する。さらに、抗体Ｉは約１ｎＭの親和性でカニクイザルエピレグリンに結合する。抗体ＩＩＩは、約３８ｐＭおよび２２０ｎＭの親和性で、それぞれマウスＴＧＦ−アルファおよびマウスエピレグリンに結合する。したがって、本発明の抗体Ｉおよび抗体ＩＩＩはヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに対して高い親和性を有する。
【００７１】
実施例３：ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９におけるＥＧＦ標的リガンドの内在化
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の抗体に対するコンジュゲーション
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）を製造業者のプロトコルに従って抗体Ｉおよび対照ＩｇＧにコンジュゲートする。タンパク質をＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍＬに希釈する。この２ｍｇ／ｍＬ溶液の０．５ｍＬに、５０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ９を加える。次いでタンパク質溶液を染料のバイアルに移し、室温にて１時間攪拌する。標識キットと共に含まれるＢｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−３０樹脂を使用して標識タンパク質を精製する。
【００７２】
インビトロ内在化アッセイ
研究１において、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンを発現することが知られている結腸腺癌細胞株である、１０，０００個のＨＴ−２９細胞を、９６ウェルプレートのウェルにつき播種し、完全培地［Ｌ−グルタミン、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）、１×抗生物質、および２．４３８ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含有するダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（Ｈａｍ）培地（１：１）（「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」）］中で一晩インキュベートする。翌日、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで、組織培養インキュベータ内で、３７℃にて２時間、０〜８８μｇ／ｍＬの範囲の濃度にて、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８がコンジュゲートした抗体Ｉまたは対照ＩｇＧと共にインキュベートする。インキュベーション期間の後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で細胞を数回洗浄し、次いで分析のために４％ホルムアルデヒドで固定する。内在化の定量を以下のように行う：Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ  ＶＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５００個の細胞／ウェルを収集する。システムの「コンパートメント分析」生物学的応用を用いて画像分析を実施する。ヘキスト染色（青）を用いて細胞核を識別する。対象の２つの領域（ＲＯＩ）を設定して、マスクした画像から得た細胞内スポット（赤）および全緑色蛍光（赤および青の両方）から蛍光信号を収集する。各スポットおよび細胞から数、面積および蛍光強度を算出する。抗体Ｉにより誘導された内在化を測定するために細胞内スポット（赤）の平均スポット全強度を選択する。
【００７３】
研究２において、１０，０００個のＨＴ−２９細胞を上記のように調製し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８がコンジュゲートした抗体Ｉまたは対照ＩｇＧを４０μｇ／ｍＬにて細胞に加える。０〜１２０分の範囲の様々な時間、組織培養インキュベータ内で、３７℃にて細胞をインキュベートし、次いで０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで数回洗浄し、分析のために４％ホルムアルデヒドで固定する。信号の定量化を実質的に上記のように実施する。
【００７４】
【表４】
2014515743.tif 000005
【００７５】
【表５】
2014515743.tif 000006
【００７６】
研究１の画像化分析からの結果により、蛍光信号が細胞内に内在化し、抗体Ｉに用量依存性であったが、対照ＩｇＧに用量依存性ではなかったことが実証された（表３ａおよび表３ｂ）。
【００７７】
【表６】
2014515743.tif 000007
【００７８】
研究２からの結果により、抗体Ｉが迅速に内在化し、細胞添加の２時間後に内在化は完了したことが実証された（表４）。抗体Ｉは、時間依存的にインビトロでＨＴ−２９細胞における標的の内在化を誘導した（表４）。
【００７９】
実施例４：筋線維芽細胞株中でのＥＧＦＲリガンド刺激性細胞増殖の中和の測定
クローンマウス筋線維芽細胞株（「ＭＦｃ７」）を使用して、ＥＧＦＲリガンドの増殖活性を遮断する本発明の抗体の能力を試験する。ＥＧＦＲを活性化し得る７個のリガンドは、ＴＧＦ−アルファ（ＴＧＦＡ）、エピレグリン（ＥＲＥＧ）、ＥＧＦ、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、エピゲン（ＥＰＧＮ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）およびベタセルリン（ＢＴＣ）である。ＥＧＦＲリガンドは、６個の同様に間隔を空けた保存システイン残基により形成される３つの分子内ジスルフィド結合により特徴付けられる、構造モチーフ、ＥＧＦ様ドメインを共有する。増殖活性を、ブロモデオキシウリジン（「ＢｒＤＵ」）組み込みにより決定し、製造業者の指示書に従って比色分析ＢｒＤＵ  ＥＬＩＳＡキットを用いて測定する。
【００８０】
まず、２，０００個のＭＦｃ７細胞／ウェルを、Ｌ−グルタミン、１０％の加熱不活性化したＦＢＳ、１×抗生物質、および２．４３８ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含有する０．１ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（Ｈａｍ）培地（１：１）（「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」）を含む、組織培養物で処理した９６ウェルマイクロプレート中で播種する。細胞を６時間付着させ、次いで培地を除去し、一晩、血清飢餓のために０．１％ＢＳＡを含有する０．１ｍＬの無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２と置き換える。翌日、ＥＧＦＲリガンドの連続希釈を、０．００１〜３０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度から０．１２ｍＬ／ウェルの体積にて、９６ウェルポリプロピレンプレート中で０．１％ＢＳＡを含有する無血清培地で行う。希釈後、培地を血清飢餓細胞から除去し、次いで２４時間、ＥＧＦＲリガンドで刺激する。刺激後、４時間、ＢｒＤＵを用いて細胞をパルスし、次いで製造業者の指示書に従って比色分析ＢｒＤＵ  ＥＬＩＳＡキットを用いて分析する。
【００８１】
抗体ＩのＥＧＦＲリガンドに対する特異性を試験する際に、２×または３×の抗体の連続希釈を、３０００ｎＭ〜０．０５９ｎＭの範囲の濃度から０．０６ｍＬ／ウェルの体積にて、９６ウェルポリプロピレンプレート中で行う。抗体の連続希釈後、０．０６ｍＬのＥＧＦＲリガンドをウェルごとに加える。次いでプレートを、３０分間、加湿した組織培養インキュベータ内で、３７℃にてインキュベートする。インキュベーション後、０．１ｍＬの溶液をウェルごとに細胞に移す。細胞を２４時間刺激する。刺激後、４時間、ＢｒＤＵを用いて細胞をパルスし、次いで比色分析ＢｒＤＵ  ＥＬＩＳＡキットを用いて分析する。吸光度値（４５０ｎＭ〜６９０ｎＭ）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で生成し、データを分析する。
【００８２】
【表７】
2014515743.tif 000008
【００８３】
エピゲンおよびアンフィレグリンを除いてマウスエピレグリンおよびラットＴＧＦ−アルファ、同様にヒトＥＧＦＲリガンドの全ては、アッセイにおいて細胞増殖の有効な刺激因子であると見出した（表５）。抗体Ｉおよび抗体ＩＩＩは、ヒトおよびラットＴＧＦ−アルファに対する高い親和性ならびにヒトエピレグリン活性を有する（表５）。
【００８４】
表５は、試験したＥＧＦＲリガンドについての算出したＥＣ５０値およびこれらのリガンドに対する抗体についての絶対ＩＣ５０値をまとめる。抗体Ｉについての算出した平均ＩＣ５０は、ヒトＴＧＦ−アルファに対して０．４６±０．０３ｎＭであり、ヒトエピレグリンに対して３．１５±１．０４ｎＭであった。抗体ＩＩＩについての算出したＩＣ５０平均は、ヒトＴＧＦ−アルファに対して０．５２±０．０４ｎＭであり、ヒトエピレグリンに対して１．１２±０．３６ｎＭであった。抗体ＩＩＩについての算出した平均ＩＣ５０値は、ラットＴＧＦ−アルファに対して０．１３±０．０１ｎＭであり、マウスエピレグリンに対して２１４±４９ｎＭであった。したがって、抗体Ｉおよび抗体ＩＩＩは、高い親和性を有し、ヒトＴＧＦ−アルファおよびヒトエピレグリンに対する完全な中和活性に選択的である。
【００８５】
実施例５：高血圧性腎疾患のマウス残存腎臓モデルにおける腎機能および病理
全腎臓質量の７５％の外科的減少に関与するマウス残存腎臓モデルを、高血圧性腎疾患の前臨床モデルとして使用する［Ｍａ  ＬＪ，Ｆｏｇｏ  ＡＢ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００３年７月；６４（１）：３５０−５］。腎臓質量の外科的減少または偽手術は９〜１０週齢のオスの１２９Ｓｖｅｖマウスで行う。１２匹のマウスの群への無作為化は、尿中アルブミンクレアチニン比（「ＡＣＲ」）および体重によって、外科手術の２週間後に行う。無作為化後、アイソタイプ対照ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）または抗体ＩＩＩ（１および１０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与し、外科手術後１６週まで週に一度継続する。この研究についてのエンドポイントは、生存、最大血圧、アルブミン尿、血清クレアチニン、血清ＢＵＮ、尿ＴＧＦ−アルファ、尿ＭＩＰ−２および腎臓病理である。
【００８６】
研究の終わりに、対照ＩｇＧ群において３匹が死に（２５％致死率）、抗体ＩＩＩ処置群において死はなかった。
【００８７】
最大血圧の測定
テイルカフ（ｔａｉｌ  ｃｕｆｆ）法により、外科手術後１２週に血圧を得る。各群（群当たりＮ＝３〜４）から選択したマウスを、実際の測定の３〜５日前に、毎日５分間、取り付けたテイルカフと共にマウスホルダに入れることによって拘束に慣らす。機器室の温度を２４℃まで増加させて、血圧取得プロセスの間にさらなる暖かさを与える。マウスをマウス静止器に入れ、温めたパッドユニット（３１〜３３℃）の上部に設定して、尾血管系に膨張を与える。尾をテイルカフを通して置き、各マウスを４５分を超えずに約３０分間、拘束する。この時間は初期の加温および圧力測定を含み、その後すぐに通常の住居に戻す。麻酔は使用しない。テイルカフを膨張させ、動脈血流を一瞬止めるのに十分にきつく尾を圧縮し、次いで収縮により徐々に緩めて動脈拍動の戻りを観察する。動脈拍動が戻ると、カフを完全に収縮する。
【００８８】
アルブミン尿の測定
２４時間にわたってＮａｌｇｅｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃケージユニットにおいて４週間ごとに尿を採取する。２４時間の採取プロセスの間、各マウス（個々に収容する）に食物および水を与える。２４時間の終わりに、採取した尿を氷上に置き、遠心分離し、アルブミンおよびクレアチニン分析に供する。アルブミン尿は尿中アルブミン対クレアチニンの比（μｇ／ｍｇ）と定義する。
【００８９】
血清クレアチニンおよびＢＵＮ
研究終了時に、心穿刺により得た血清をＢＵＮおよびクレアチニンについて分析する。
【００９０】
ＴＧＦ−アルファおよびＭＩＰ−２ＥＬＩＳＡ
２４時間の採取により得た尿は、３０分間、１４，０００×ｇで回転する３Ｋ  ＭＷカットオフ膜を使用して遠心分離により５倍濃縮する。マウスＴＧＦアルファについてサンドイッチ型酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）を確立する。ラットＴＧＦ−アルファを基準物として使用する。ポリスチレン９６ウェルプレートを、４℃にて一晩、３μｇ／ｍＬの抗体ＩＩＩでコーティングする。プレートを洗浄し、遮断緩衝液で遮断し、再び洗浄し、次いで濃縮した尿試料を加える。室温にて２時間後、プレートを洗浄し、次いで二次ビオチン化ポリクローナル抗ｈＴＧＦアルファを加える。室温にて２時間後、プレートを洗浄し、３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共にインキュベートする。信号をＴＭＢ基質で生成し、反応を２ＮのＨ２ＳＯ４で停止する。マウスマクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２、ヒトＩＬ−８の等価物）についての市販のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）サンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の指示書に従って尿ＭＩＰ−２を検出する。両方のＥＬＩＳＡアッセイについての吸光度データを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で得、データを分析する。
【００９１】
腎臓病理
残存腎臓を研究の終わりに除去し、ホルマリンで固定し、標準的な方法に従ってパラフィン切片化のために処理する。病理学者により腎臓障害について腎臓片を評価する。尿細管性タンパク質、増加したメサンギウム基質および間質性線維症を、以下のスケールを用いて半定量的にスコア付けする：なし（０）、最小（１）、僅か（２）、中（３）、顕著（４）および重症（５）。糸球体メサンギウム基質膨張および基底膜肥厚を、ヘマトキシリンおよびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）ならびに過ヨウ素酸−シッフ（「ＰＡＳ」）染色切片を用いてスコア付けする。腎臓のマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）の三重染色切片を評価して、線維症（間質および糸球体）の程度を決定する。
【００９２】
統計的方法
全てのデータはＪＭＰ  ｖ８．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で分析する。病理スコアを偶発的分析およびフィッシャーの直接確率検定により統計的に評価する。全ての他のデータは対数変換データおよびスチューデント不対ｔ検定を用いてＡＮＯＶＡにより評価する。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなす。
【００９３】
【表８】
2014515743.tif 000009
【００９４】
抗体ＩＩＩでは対照ＩｇＧ群と比べてアルブミン尿が用量依存的に減少した（表６）。１０ｍｇ／ｋｇでの抗体ＩＩＩでの処置により、対照ＩｇＧ群と比べて、外科手術後、８週および１２週においてアルブミン尿が有意に減少したが、２、４または１６週では減少しなかった（表６）。
【００９５】
【表９】
2014515743.tif 000010
【００９６】
抗体ＩＩＩは、外科手術後１２週において全ての群で高血圧が実証されたので、最大血圧に対する効果がないことが実証された（表７）。さらに、１０ｍｇ／ｋｇでの抗体ＩＩＩでの処置の結果、対照ＩｇＧ群と比べて、血清クレアチニンおよびＢＵＮの有意な減少により示されるように腎機能の改善が生じた（表７）。
【００９７】
【表１０】
2014515743.tif 000011
【００９８】
対照ＩｇＧ群と比較して、１０ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩの用量では、外科手術後８週および１２週のそれぞれにおいて尿ＴＧＦ−アルファおよび尿ＭＩＰ−２は統計的に有意に減少した（表８）。さらに、対照ＩｇＧと比較して、１０ｍｇ／ｋｇ用量の抗体ＩＩＩでは、尿細管性タンパク質および間質性線維症およびメサンギウム基質膨張についての腎臓病理は統計的に有意に減少した（表８）。
【００９９】
実施例６：糖尿病性腎疾患のマウス一側性腎摘出ｄｂ／ｄｂモデルにおけるアルブミン尿および腎臓病理
一側性腎摘出ｄｂ／ｄｂマウスモデルは糖尿病性腎症のモデルを表す［Ｎｉｎｉｃｈｕｋら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．２００７年８月１６日；１２（８）：３５１−５］。一側性腎摘出ｄｂ／ｄｂモデルを使用して、糖尿病に起因する腎疾患パラメータに対する抗体ＩＩＩの効果を決定する。Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊバックグランドでｄｂ／ｄｂマウスにおける一側性腎摘出（「ＵｎｉＮｘ」）手術を、右腎を除去した４週齢で実施する。１２匹のマウスの群への無作為化を、尿ＡＣＲ、血糖および体重により８週齢で行う。全てのマウスは各研究の開始時に高血糖である。アイソタイプ対照ＩｇＧまたは抗体ＩＩＩを９週齢で開始して皮下投与し、２５週齢まで１週間に１回継続する。研究１は、０．３および１０ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩの用量ならびに１０ｍｇ／ｋｇ用量のアイソタイプ対照ＩｇＧで実施する。研究１についてのエンドポイントは生存、％ＨｂＡ１ｃ、アルブミン尿、尿ＴＧＦ−アルファ、腎臓重量および腎臓病理である。研究２は、３０ｍｇ／ｋｇ用量のアイソタイプ対照ＩｇＧと共に３０、１０、３および０．３ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩの用量群を含む。研究２についてのエンドポイントは生存およびアルブミン尿である。
【０１００】
研究１の対照ＩｇＧ群において１匹のみが死んだ。研究２において死はなかった。
【０１０１】
採尿およびアルブミン尿の測定
２〜４時間の間、尿を採取するために、尿をスポット採取法により採取する。個々のマウスを９６ウェルポリプロピレンマイクロプレートの上部に置き、次いで呼吸のための穴を有するが、食物または水へのアクセスがない、プレキシガラスチャンバにより覆う。その時間の終わりに、マイクロピペットを用いて尿をプレートから除去し、氷上に置き、遠心分離し、アルブミンおよびクレアチニン分析に供する。アルブミン尿は、尿中アルブミン対クレアチニンの比（μｇ／ｍｇ）と定義する。
【０１０２】
％ＨｂＡ１ｃの決定
研究の終わりに高血糖の測定として％ＨｂＡ１ｃを使用する。心穿刺による解剖でＥＤＴＡ血漿を得る。血液試料を２０００ｇにて２０分間回転させて、血球を除去し、血漿を得る。ヘモグロビンＡ１ｃおよび全ヘモグロビンについて血漿試料を分析する。これらのデータから、％ＨｂＡ１ｃを算出する。
【０１０３】
腎臓重量
腎臓を解剖で除去してそれらの重量を決定する。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡによる尿ＴＧＦ−アルファの決定
スポット採取により得た尿を、ウルトラセル３Ｋ  ＭＷカットオフ膜を含有する０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルタで５倍濃縮する。その装置を、３０分間、１４，０００×ｇで回転させ、次いで濃縮した尿試料を採取する。マウスＴＧＦアルファについてのサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを確立する。ラットＴＧＦ−アルファをＴＧＦ−アルファＥＬＩＳＡについての基準物として使用する。ポリスチレン９６ウェルプレートを３μｇ／ｍＬの抗体ＩＩＩで一晩４℃にてコーティングする。プレートを洗浄し、遮断緩衝液で遮断し、再び洗浄し、次いで濃縮した尿試料を加える。室温にて２時間後、プレートを洗浄し、次いで二次ビオチン化ポリクローナル抗ｈＴＧＦ−アルファを加える。室温にて２時間後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に３０分間インキュベートする。ＴＭＢ基質を用いて信号を生成し、２ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で吸光度データを得、分析のためにデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２００７およびＳｉｇｍａｐｌｏｔ  ｖ．９．０１にインポートする。
【０１０５】
腎臓病理
腎臓を研究の終わりに除去し、被膜を除去し、次いでホルマリンで固定し、標準的な方法に従ってパラフィン切片化のために処理する。病理学者により腎臓障害について腎臓片を評価する。メサンギウム基質、骨盤膨張および糸球体線維症を、以下のスケールを用いて半定量的にスコア付けする：なし（０）、最小（１）、僅か（２）、中（３）、顕著（４）および重症（５）。Ｈ＆ＥおよびＰＡＳ染色部分を用いて糸球体メサンギウム基質膨張および基底膜肥厚をスコア付けする。腎臓のマッソン三重染色部分を評価して、線維症（糸球体）の程度を決定する。
【０１０６】
統計的方法
全てのデータはＪＭＰ  ｖ８．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて分析する。病理スコアを偶発的分析およびフィッシャーの直接確率検定により統計的に評価する。アルブミン尿（ＡＣＲ）の統計的分析を、共変量として８週に非変換データおよびベースラインＡＣＲを用いて適合モデルにより行う。ＡＮＯＶＡおよびスチューデント不対ｔ検定により各群内で２４週のデータと１６週のデータを比較することによりＡＣＲ進行を分析する。群にわたる１６週から２４週のＡＣＲ変化はＡＮＯＶＡおよびスチューデントの不対ｔ検定により行う。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなす。対数変換データおよびスチューデント不対ｔ検定を用いてＡＮＯＶＡにより全ての他のデータを評価する。
【０１０７】
【表１１】
2014515743.tif 000012
【０１０８】
研究１において、抗体ＩＩＩでは、対照ＩｇＧ群と比べてアルブミン尿は用量依存的に減少した（表９）。少なくとも２ヶ月の間、抗体ＩＩＩ群の両方について、対照ＩｇＧ群と比較してアルブミン尿の進行はほとんどなかった。この研究の少なくとも２ヶ月にわたる群内のアルブミン尿の変化により、１６週から２４週まで対照ＩｇＧ群が有意に増加するが、抗体ＩＩＩ群は増加しないことが示される（表９）。研究２において、対照ＩｇＧと比較して抗体ＩＩＩでは、経時的にアルブミン尿の進行は用量依存的に減少した（表９）。
【０１０９】
【表１２】
2014515743.tif 000013
【０１１０】
研究２の最後の２ヶ月にわたるアルブミン尿の変化により、３０ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩが、この研究の最後の２ヶ月にわたってアルブミン尿の有意な減少を生じたが、対照ＩｇＧは同じ期間にわたって増加したことが示された（表１０）。
【０１１１】
【表１３】
2014515743.tif 000014
【０１１２】
左腎重量は、１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧおよび０．３ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩ群と比べて、１０ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩ群において有意に低かった（表１１）。抗体ＩＩＩの１０ｍｇ／ｋｇ用量群においてこの研究の過程の期間、尿ＴＧＦ−アルファは有意に減少した（表１１）。さらに、全ての治療群についての％ＨｂＡ１ｃは、対照のリーンマウスより有意に増加した（表１１）。抗体ＩＩＩでの治療は対照ＩｇＧ群と比較して％ＨｂＡ１に影響を与えなかった（表１１）。さらに、対照ＩｇＧと比較して１０ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩＩでは、メサンギウム基質膨張および骨盤膨張について腎臓病理スコアが有意に減少した（表１１）。
【０１１３】
実施例７：６週間、週に１回、静脈内ボーラス注射を与えたカニクイザルにおける毒性および毒物動態学研究
６週の毒物学研究を、ＴＧＦ−アルファおよびエピレグリンの阻害が皮膚毒性を生じるかどうかを評価するためにサルにおいて実施する。６週間、週１回を基準として、サルに、ビヒクル、１０または１００ｍｇ／ｋｇの抗体Ｉを静脈注射（ＩＶ）により投与する。注射部位は右伏在静脈と左伏在静脈との間で交互にする。餌を毎日２回与える（午前に１回および午後に１回）。午前の餌の配給は投与日での投与後すぐに与える。多量のカルシウムの補足および処置はこの研究の間、与えなかった。小児用のマルチビタミン剤を土曜日に１週間に１回与える（適用可能な場合、投与後の血液採取の９６時間後）。
【０１１４】
この研究にわたって、サルを「分割した対」のステンレス鋼スラット／メッシュケージ内に収容する。最初の３週間の間、動物を個々に収容する。研究の残りの間、社会化についてのさらなる機会を与えるために、各々、午後から開始して、翌朝まで継続して、動物を処置群内にて対で収容する。
【０１１５】
この研究について無毒性量（「ＮＯＡＥＬ」）は１００ｍｇ／ｋｇの抗体Ｉであった。処置した動物において皮膚変化は観察されなかった。他の病理変化は観察されなかった。
【０１１６】
配列表
重鎖ＣＤＲ
配列番号１            ＧＹＴＦＴＤＡＹＩＮ
配列番号２            ＷＩＷＰＧＰＶＩＴＹＹＮＰＫＦＫＧ
配列番号３            ＲＥＶＬＳＰＦＡＹ
軽鎖ＣＤＲ
配列番号４            ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥ
配列番号５            ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号６            ＦＨＧＴＨＶＰＹＴ
重鎖可変領域
配列番号７（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＡＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＷＰＧＰＶＩＴＹＹＮＰＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＥＶＬＳＰＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号８（抗体ＩＩＩ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＡＹＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＷＰＧＰＶＩＴＹＹＮＰＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＬＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＦＹＦＣＡＲＲＥＶＬＳＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
軽鎖可変領域
配列番号９（抗体Ｉ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＦＨＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１０（抗体ＩＩ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＨＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１１（抗体ＩＩＩ）
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＨＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
完全重鎖
配列番号１２（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＡＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＷＰＧＰＶＩＴＹＹＮＰＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＥＶＬＳＰＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
完全軽鎖
配列番号１３（抗体Ｉ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＦＨＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１４（抗体ＩＩ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＨＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヌクレオチド配列
重鎖可変領域
配列番号１５
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＴＴＡＴＴＡＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＴＡＣＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ヌクレオチド配列
軽鎖可変領域
配列番号１６
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
配列番号１７
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
成熟ヒトＴＧＦアルファ
配列番号１８
ＶＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡＲＣＥＨＡＤＬＬＡ
成熟マウス（Ｍｕｓ筋肉）ＴＧＦアルファ
配列番号１９
ＶＶＳＨＦＮＫＣＰＤＳＨＴＱＹＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＥＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＶＲＣＥＨＡＤＬＬＡ
成熟Ｒａｔ（ドブネズミ）ＴＧＦアルファ
配列番号２０
ＶＶＳＨＦＮＫＣＰＤＳＨＴＱＹＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＥＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＶＲＣＥＨＡＤＬＬＡ
成熟Ｃｙｎｏ（カニクイザル）ＴＧＦアルファ
配列番号２１
ＶＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡＲＣＥＨＡＤＬＬＡ
成熟ヒトエピレグリン−Ｎ末端メチオニンの付加
配列番号２２
ＭＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬ
成熟マウス（Ｍｕｓ筋肉）エピレグリン−Ｎ末端メチオニンの付加
配列番号２３
ＭＶＱＩＴＫＣＳＳＤＭＤＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＲＥＫＦＣＲＣＥＶＧＹＴＧＬＲＣＥＨＦＦＬ
成熟Ｃｙｎｏ（カニクイザル）エピレグリン
配列番号２４
ＶＳＩＴＫＣＮＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＹＬ
成熟ヒトエピゲン
配列番号２５
ＡＶＴＶＴＰＰＩＴＡＱＱＡＤＮＩＥＧＰＩＡＬＫＦＳＨＬＣＬＥＤＨＮＳＹＣＩＮＧＡＣＡＦＨＨＥＬＥＫＡＩＣＲＣＦＴＧＹＴＧＥＲＣＥＨＬＴＬＴＳＹＡ
成熟マウス（Ｍｕｓ筋肉）エピゲン
配列番号２６
ＬＫＦＳＨＰＣＬＥＤＨＮＳＹＣＩＮＧＡＣＡＦＨＨＥＬＫＱＡＩＣＲＣＦＴＧＹＴＧＱＲＣＥＨＬＴＬＴＳＹＡ
成熟ヒトＥＧＦ−Ｎ末端メチオニンの付加
配列番号２７
ＭＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＲ
成熟ヒトＨＢＥＧＦ
配列番号２８
ＤＬＱＥＡＤＬＤＬＬＲＶＴＬＳＳＫＰＱＡＬＡＴＰＮＫＥＥＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧＥＲＣＨＧＬＳＬ
成熟ヒトベタセルリン
配列番号２９
ＤＧＮＳＴＲＳＰＥＴＮＧＬＬＣＧＤＰＥＥＮＣＡＡＴＴＴＱＳＫＲＫＧＨＦＳＲＣＰＫＱＹＫＨＹＣＩＫＧＲＣＲＦＶＶＡＥＱＴＰＳＣＶＣＤＥＧＹＩＧＡＲＣＥＲＶＤＬＦＹ
成熟ヒトアンフィレグリン
配列番号３０
ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫＳＭＫＴＨＳＭＩＤＳＳＬＳＫ
完全重鎖抗体ＩＩＩ−マウス抗体
配列番号３１
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＡＹＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＷＰＧＰＶＩＴＹＹＮＰＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＬＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＦＹＦＣＡＲＲＥＶＬＳＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ
完全軽鎖抗体ＩＩＩ−マウス抗体
配列番号３２
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＴＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＨＧＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
成熟ヒトエピレグリン
配列番号３３
ＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬ
【配列表】
2014515743000001.app
【国際調査報告】
2014515743.tif 000015
2014515743.tif 000016
2014515743.tif 000017