(57)【要約】  本明細書は、マウスＥＳ細胞でＺｓｃａｎ４活性化の頻度を増加させることが、長期的な細胞培養での発生能を増大させるだけでなく、維持するという所見を記載する。特に、本明細書は、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の構成存在が、その通常の活性因子であるタモキシフェンの存在下でさえ、ＥＳ細胞における内因性Ｚｓｃａｎ４活性化の頻度を高め、結果として、ＥＳ細胞の発生能の増加をもたらすという所見を開示する。従って、本明細書には、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質及び核酸分子及びＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードするベクターが提供される。さらに、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子及び融合タンパク質を用いて、幹細胞の多能性を持続させ及び／又は増大させる方法が提供される。
2014514919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
Ｚｓｃａｎ４が、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ、マウスＺｓｃａｎ４ｆ若しくはヒトＺＳＣＡＮ４又はそれらの機能的断片若しくは改変体を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
Ｚｓｃａｎ４が、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４を含む、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
（ｉ）配列番号１９のヌクレオチド２４６５〜４９３６と少なくとも９５％同一である核酸配列；又は（ｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド２４７９〜４７３１と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１９のヌクレオチド２４６５〜４９３６の核酸配列；又は（ｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド２４７９〜４７３１の核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
配列番号１９又は配列番号２０と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
配列番号１９又は配列番号２０の核酸配列を含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項９】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質が少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣが、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ、マウスＺｓｃａｎ４ｆ若しくはヒトＺＳＣＡＮ４又はそれらの改変体を含む、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣが、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４を含む、請求項９又は１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号２４のヌクレオチド２４６５〜３６４９と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号２４のヌクレオチド２４６５〜３６４９の核酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
配列番号２４と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
配列番号２４の核酸配列を含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又はベクターを含む単離された細胞。
【請求項１８】
幹細胞である、請求項１７に記載の単離された細胞。
【請求項１９】
胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２０】
誘導された多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２１】
幹細胞が、マウス、ラット、ヒト又はヒト以外の霊長類の幹細胞である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の単離された細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又はベクター、医薬として許容される担体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子又はベクターによってコードされるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質。
【請求項２４】
組換えＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質。
【請求項２５】
Ｚｓｃａｎ４が、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｆ若しくはヒトＺＳＣＡＮ４又はそれらの機能的断片若しくは改変体を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
Ｚｓｃａｎ４が、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４を含む、請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
配列番号２２又は配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２２又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項９〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子又はベクターによってコードされるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質。
【請求項３０】
組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質。
【請求項３１】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質が、少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含むマウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ、マウスＺｓｃａｎ４ｆ又はヒトＺＳＣＡＮ４を含む、請求項３０に記載のＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質。
【請求項３２】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣが、少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含むマウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４を含む、請求項３１に記載のＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質。
【請求項３３】
配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質。
【請求項３４】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質。
【請求項３５】
請求項２３〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質を含む単離された細胞。
【請求項３６】
幹細胞である、請求項３５に記載の単離された細胞。
【請求項３７】
ＥＳ細胞である、請求項３６に記載の単離された細胞。
【請求項３８】
ｉＰＳ細胞である、請求項３６に記載の単離された細胞。
【請求項３９】
幹細胞が、マウス、ラット、ヒト又はヒト以外の霊長類の幹細胞である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の単離された細胞。
【請求項４０】
請求項２３〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質及び医薬として許容される担体を含む組成物。
【請求項４１】
幹細胞又は幹細胞集団を請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子若しくはベクター、請求項２２若しくは４０に記載の組成物、又は請求項２３〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質と接触させることを含む、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続させるための方法。
【請求項４２】
幹細胞集団を請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子若しくはベクター、請求項２２若しくは４０に記載の組成物、又は請求項２３〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質と接触させることを含む、幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４陽性細胞の頻度を増加させる方法。
【請求項４３】
幹細胞又は幹細胞集団を請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子若しくはベクター、請求項２２若しくは４０に記載の組成物、又は請求項２３〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質と接触させることを含む、幹細胞又は幹細胞集団におけるゲノム安定性を促進させる若しくはテロメア長を増加させる又はそれらの両方を行う方法。
【請求項４４】
幹細胞がＥＳ細胞である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
幹細胞が、マウス、ラット、ヒト又はヒト以外の霊長類の幹細胞である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
Ｚｓｃａｎ４を一過性に発現させることを含む、幹細胞又は幹細胞集団の発生能を増加させる方法。
【請求項４８】
過剰発現されたＺｓｃａｎ４がマウスＺｓｃａｎ４ｃである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続させる方法であって、幹細胞又は幹細胞集団を、Ｚｓｃａｎ４タンパク質をコードする単離された核酸分子又はＺｓｃａｎ４タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターと接触させることを含む方法。
【請求項５０】
ベクター、誘導性プロモーターをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／４６６，６６７号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、幹細胞の多能性を高める又は持続させる組成物及び方法、並びにこのような多能性幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来のプロトタイプ多能性細胞である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：７６３４−７６３８，１９８１；Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６，１９８１）。ＥＳ細胞は、それらのゲノムの完全性と核型を失うことなしに長時間増殖するという異常な能力を有し（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３３：１９７−２０１，１９８７）、マウスの胚盤胞への注射により動物のすべての細胞型へ貢献することができる（Ｎｉｗａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３４：６３５−６４６，２００７）。その潜在力の最も印象的な証拠は、完全にＥＳ細胞（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８４２４−８４２８，１９９３）から、健康な子イヌを作り出す四倍体（４Ｎ）胚盤胞の中にＥＳ細胞を注入することによって実証されている。究極の試験は、成功率が極めて低いものであったにもかかわらず（０．５％）、単一のＥＳ細胞が全体の健全な子イヌを形成することができるかどうかを確認することであった（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７５：１９２−２０１，２００４）。
【０００４】
最近、  Ｚｓｃａｎ４（ジンクフィンガー及び走査ドメイン含有タンパク質４）が、２細胞段階の胚とＥＳ細胞において特異的に発現され（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）、ゲノム安定性及びＥＳ細胞における正常な核型の維持に必要とされることが示された（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。未分化ＥＳ細胞のごく一部の画分（約５％）が所定時間でＺｓｃａｎ４を発現するが、（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）、培養中の本質的に全てのＥＳ細胞は、９継代内に一過性のＺｓｃａｎ４＋状態を受ける（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）媒介性のＺｓｃａｎ４抑制により、約８継代後に、ＥＳ細胞は大規模な核型劣化を受ける。従来の研究はまた、Ｚｓｃａｎ４＋状態のＥＳ細胞が、テロメア伸長に関連付けられることを示している（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。  ＥＳ細胞は培養中のそれらのゲノムの完全性を維持するための最良の能力を有するが、また、ＥＳ細胞でさえ、長期培養中にそれらの発生能（すなわち、キメラマウスの組織に寄与する能力）を徐々に失うことが広く認識されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
マウスＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４活性化の頻度を増加させることは、長期的な細胞培養においてそれらの発生能を増大させるだけでなく、該発生能を維持するという所見が本明細書に開示される。特に、本明細書は、特定のＺｓｃａｎ４タンパク質切断型及び融合タンパク質が、Ｚｓｃａｎ４＋細胞数を増加させ、及び／又は幹細胞におけるＺｓｃａｎ４の再発活性化を促進するという所見を開示する。
【０００６】
本明細書は、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸bunsi 
（ベクターを含む）を提供する。組換えＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質もまた提供される。Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子及び融合タンパク質を含む組成物及び細胞（例えば、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞）もまた本明細書に提供される。
【０００７】
さらに、本明細書においてＺｓｃａｎ４−ΔＣと呼ばれる、少なくとも１つのジンクフィンガードメインのＣ−末端切断を有するＺｓｃａｎ４タンパク質をコードする核酸分子（ベクターを含む）が提供される。組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質もまた提供される。Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子及びタンパク質を含む組成物及び細胞（例えば、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞）もまた本明細書に提供される。
【０００８】
幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続させる方法；幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４陽性細胞の頻度を増加させる方法；幹細胞又は幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４活性化の頻度を増加させることによって、幹細胞又は幹細胞集団において、ゲノム安定性を促進する若しくはテロメア長を増加させる方法、又はその両方がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子、融合タンパク質又は組成物と幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子、タンパク質又は組成物と幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
【０００９】
開示の上記及び他の目的及び特徴は、以下の詳細な説明からより明らかになるであろうし、続いて添付の図面を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質の構成的発現がＺｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞数を増加させる。図１Ａは、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質の構造を示す概略図である。Ｚｓｃａｎ４ｃは、１つのＳＣＡＮドメインと４つＣ２Ｈ２ジンクフィンガードメインを含む。図１Ｂは、ＭＣ１−ＺＥ３細胞の蛍光顕微鏡像であり、そこでは、Ｚｓｃａｎ４プロモーターは、エメラルドマーカー（左）、ＭＣ１−ＺＥ３ＺＥＲＴ２クローン＃１５細胞の発現を駆動し、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質は構成的に発現され、Ｔｍｘ（中央）の不存在下で培養され、ＭＣ１−ＺＥ３−ＺＥＲＴ２クローン＃１５細胞は、３日間、Ｔｍｘの存在下で培養された（右）。図１Ｃは、１μＭのＴｍｘの不存在下又は存在下で、ＭＣ１−ＺＥ３  ＥＳ細胞（左、対照）及びＭＣ１−ＺＥ３−ＺＥＲＴ２＃１５ＥＳ細胞（右）のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。Ｅｍ蛍光レベル（平均＋ＳＥＭ；ｎ＝６）が示されている。Ｔｍｘなしでさえ、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質の構成的発現によって、Ｅｍ＋細胞の３倍増加に留意されたい。図１Ｄは、１μＭのＴｍｘの不存在下又は存在下で、ＭＣ１−ＺＥ３  ＥＳ細胞（左、対照）とＭＣ１−ＺＥ３−ＺＥＲＴ２＃１５ＥＳ細胞において、Ｚｓｃａｎ４の３’−ＵＴＲに特異的なＰＣＲプライマー対を用いることによって測定された内因性Ｚｓｃａｎ４発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。対照のＭＣ１−ＺＥ３と比較した内因性Ｚｓｃａｎ４発現レベルの誘導倍率（平均＋ＳＥＭ；ｎ＝６）を示す。Ｔｍｘなしでさえ、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質の構成的発現によって、ＲＮＡレベルで内因性Ｚｓｃａｎ４の６倍増加に留意されたい。図１Ｅは、内因性と外因性Ｚｓｃａｎ４  ＲＮＡの両方（上段パネル）を検出するＺｓｃａｎ４の全長プローブ、又は内因性Ｚｓｃａｎ４  ＲＮＡ（下のパネル）のみを検出するＺｓｃａｎ４  ３’−ＵＴＲプローブの全量ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション後のＶ６．５親ＥＳ細胞（継代数１４）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃２（ｐ．２０）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃７（ｐ．２１）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１０（ｐ．２０）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８（ｐ．２２）のＥＳ細胞コロニーの一連の画像である。図１Ｆは、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞とＥｍ＋ＥＳ細胞（上段パネル）の間、及びＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞のＴｍｘ−とＴｍｘ＋条件の間（下段パネル）の全体的な発現プロフィールの比較を示す図である。Ｚｓｃａｎ４関連遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ｃ、ＢＣ０６１２１２、Ｔｍｅｍｅ９２、及びＴｃｓｔｖ１／３）は、既に、Ｔｍｘなしでさえ、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞において情報制御されることに留意されたい。
【００１１】
【図２】図２Ａ〜２Ｇ：Ｃ末端を欠損しているＺｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４＋細胞数を増加させる。図２Ａは、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＥＲＴ２、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣ及びＺｓｃａｎ４ｃ−ΔＮタンパク質の構造を示す模式図である。Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣは、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質のＣ末端で４つのジンクフィンガードメインを削除することによって作製された。Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＮは、Ｎ末端でＳＣＡＮドメインを削除することによって作製された。これらの変異遺伝子は強力かつ構成的なＣＡＧプロモーター下に置かれた。各ベクターは、ＭＣ１ＺＥ１６  ＥＳ細胞（ＭＣ１−ＺＥ３の姉妹クローン）にトランスフェクトされた。複数の独立したクローンを単離した：Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣについて、ＺＤＣ−ＭＣ１−ＺＥ１６＃３、＃４、＃２０；Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＮについて、ＺＤＮ−ＭＣ１−ＺＥ１６＃５、＃８、＃１５。図２Ｂ〜２Ｇは、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣについて、ＺＤＣ−ＭＣ１−ＺＥ１６＃３、＃４、＃２０、及びＺｓｃａｎ４ｃ−ΔＮについて、＃５、＃８、＃１５の蛍光顕微鏡像である。結果は、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣの発現が、Ｚｓｃａｎ４＋細胞数を増加させ、一方、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＮの発現は、Ｚｓｃａｎ４ｃ＋細胞数を変化させないことを実証する。
【００１２】
【図３】図３Ａ〜３Ｂ：Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質の構成的発現はＥＳ細胞の発生能を増大させ、持続させる。図３Ａは、胚盤胞に様々なＥＳ細胞を注入することによって生成されたキメラマウスの代表的なコート色を示す。より高いキメラ化は、マウスに注入されたＥＳ細胞のより高い寄与を表し、これはＥＳ細胞のより高い発生能を示す。図３Ｂは、種々のＥＳ細胞株から生まれたマウスの「ｎ」数のうちのキメラ化レベルの割合分布を示すグラフである。
【００１３】
【図４】図４Ａ〜４Ｅ：４倍体（４Ｎ）相補アッセイは、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質を発現するＥＳ細胞の高い潜在力を確認する。図４Ａは、複数のＥＳ細胞（１０〜１５  ＥＳ細胞）：Ｖ６．５親ＥＳ細胞（継代１８）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃７（継代２２）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１０（継代２２）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８（継代１９）、及び新たに単離されたＴＡ１  ＥＳ細胞（継代３）を注射された４Ｎ胚盤胞の発生を示す表である。図４Ｂは、単一のＥＳ細胞：Ｖ６．５親ＥＳ細胞（継代１８）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃２（継代２１）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８、及び新たに単離されたＴＡ１  ＥＳ細胞（継代４）を注入された４Ｎ胚盤胞の発生を示す表である。図４Ｃは、検査された胚の画像である：唯一適切に発生された胚をカウントした（右側のグループ）。図４Ｄは、図４Ａに示される単一のＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞由来の２つの生きた胚の一対の画像である。図４Ｅは、ＥＳ細胞の潜在力についての提案モデルを示す。
【００１４】
【図５Ａ】図５Ａは、Ｅｍ−細胞と比較した、ＭＣ１−ＺＥ７  Ｅｍ細胞において上方制御された遺伝子リストを提供する表である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｅｍ−細胞と比較した、ＭＣ１−ＺＥ７  Ｅｍ細胞において上方制御された遺伝子リストを提供する表である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｅｍ−細胞と比較した、ＭＣ１−ＺＥ７  Ｅｍ細胞において上方制御された遺伝子リストを提供する表である。
【００１５】
【図６】図６Ａ〜６Ｃ：Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＥＳ細胞クローンの作製と特徴付け。図６Ａは、内因性Ｚｓｃａｎ４と外因性Ｚｓｃａｎ４（ｐＣＧＡ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２からの転写物）の両方から、ＲＮＡを検出するプライマー対によるＺｓｃａｎ４発現レベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。プライマー配列は、５’−ＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣ  −３’（配列番号１５）と５’−ＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１６）である。データは、プライマー５’−ＴＴＧＣＡＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１７）と５’−ＴＧＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＧＡＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１８）を用いて、Ｈ２Ａの発現により正規化された。発現レベルは、親Ｖ６．５  ＥＳ細胞のＺｓｃａｎ４発現レベルに対する倍数変化として示される。図６Ｂは、タモキシフェンの存在下（Ｔｍｘ＋）又は不存在下（Ｔｍｘ−）におけるＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞の増殖曲線のグラフである。Ｔｍｘの存在は、ＥＳ細胞の増殖を劇的に減少させ、これは、Ｔｍｘを用いた長期培養後でさえ、培地からＴｍｘを除くことによって回復された（ＴＭｍｘ  ＋＞−）。図６Ｃは、各培養条件における細胞の形態を示す一連の画像である。
【００１６】
【図７】図７Ａは、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞と対照Ｖ６．５  ＃２ＥＳ細胞の間で差次的に発現している遺伝子を示すスキャッタープロットである。図７Ｂは、Ｔｍｘの存在下で２日間培養されたＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞と対照Ｖ６．５  ＃２ＥＳ細胞の間で差次的に発現している遺伝子を示すスキャッタープロットである。
【００１７】
【図８】図８は、Ｖ６．５  ＃２ＥＳ細胞と比較したＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞において上方制御された上位５０遺伝子を列挙した表である。
【００１８】
【図９】図９は、Ｖ６．５  ＃２ＥＳ細胞と比較した、２日間、Ｔｍｘの存在下で培養されたＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞において上方制御された上位５０遺伝子を列挙する表である。
【００１９】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂ：新しいＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）ハイブリッドＥＳ細胞株の誘導。図１０Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌と１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ雄を交配させて得られた胚盤胞を示す表である。胚盤胞は、５０ｎＭ  ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）が補足された１５％ＫＳＲ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上にインビトロで培養された。＊増殖物は、未分化（Ｕ）、分化（Ｄ）、及び混合（Ｕ／Ｄ）の細胞表現型を示した。図１０Ｂは、ＥＳ誘導化の結果の概要を提供する表である。
【００２０】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂ：４倍体相補アッセイによる新たに誘導されたＦ１ハイブリッドＥＳ細胞株の発生能の試験。図１１Ａは、４倍体（４Ｎ）マウスの胚盤胞に注入されたとき、未分化細胞表現型を示す６つＥＳ細胞株の表である。ＥＳ細胞株のうちで変化したＥ１３．５での生存胚を得た成功率は１５％〜６０％の範囲であった。クローニング＃１０は、その最も高い成功率（ＴＡ１  ＥＳ細胞株と命名された）として選択され、その後の研究に使用された。図１１Ｂは、ＴＡ１  ＥＳ細胞株由来の４Ｎ胎盤とＥ１３．５胚の代表的な一連の画像である。これらの胚から解剖された雌と雄の生殖腺の正常な外観は、それらの生殖能力を示している。
【００２１】
【図１２】図１２：Ｚｓｃａｎ４の一過性過剰発現の試験（すなわち、未修飾Ｚｓｃａｎ４）。図１２は、Ｚｓｃａｎ４の一過性過剰発現がＥＳ細胞の発生能を増大することができたことを示すグラフを含む。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、３７ＣＦＲ１．８２２で定義されるようなヌクレオチド塩基の標準的な文字の略語、及びアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖への任意の参照によって含まれるものとして理解される。添付の配列表においては以下の通りである：
配列番号１及び２は、ヒトＺＳＣＡＮ４のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号３及び４は、マウスＺｓｃａｎ４ａのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号５及び６は、マウスＺｓｃａｎ４ｂのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号７及び８は、マウスＺｓｃａｎ４ｃのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号９及び１０は、マウスＺｓｃａｎ４ｄのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号：１１及び１２は、マウスＺｓｃａｎ４ｅのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号：１３及び１４は、マウスＺｓｃａｎ４ｆのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列である。
配列番号１５〜１８は、Ｚｓｃａｎ４とＨ２ＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析に使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、プラスミドｐＰｙＣＡＧｍＺｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２のヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、プラスミドｐＰｙＣＡＧ−ｈＺｓｃａｎ４ＥＲＴ２のヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ヒトＥＲＴ２のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、マウスＺｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ヒトＺＳＣＡＮ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、プラスミドｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ΔＣのヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、マウスＺｓｃａｎ４ｃ−ΔＣ（４つ全てのジンクフィンガードメインを欠損している）のアミノ酸配列である。
【００２３】
発明の詳細な説明
Ｉ．省略形
ａ．ａ．  アミノ酸
ｃＤＮＡ  相補デオキシリボ核酸
Ｅｍ  エメラルド
ＥＳ  胚性幹
ｈＣｇ  ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ＩＣＭ  内部細胞塊
ＬＩＦ  白血病抑制因子
ＭＥＦ    マウス胎児線維芽細胞
ＯＲＦ  オープンリーディングフレーム
ＰＦＡ  パラホルムアルデヒド
ｑＰＣＲ  定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ｑＲＴ−ＰＣＲ  定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ｓｈＲＮＡ  短ヘアピンリボ核酸
Ｔｍｘ  タモキシフェン
【００２４】
ＩＩ． 用語及び方法
特記しない限り、技術用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版のＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（１９９４）（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．出版のＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．出版のＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９５）（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出され得る。本開示の様々な態様の概説を容易にするため、特定の用語の以下の説明を提供する。
【００２５】
投与：被験体に薬剤（例えば、ＥＳ細胞又はＥＳ細胞集団）を任意の有効な経路によって提供すること又は与えること。例示的な投与経路としては、注入（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内又は動脈内）が挙げられるがこれに限定されない。
【００２６】
薬剤：任意のタンパク質、核酸分子、化合物、細胞、小分子、有機化合物、無機化合物又は関心対象のその他の分子。接触させる：直接的な物理的結合に置くこと；固体と液体の両方の形態を含む。本明細書において使用するとき、「接触させる」は、「暴露する」と交換可能に使用される。いくつかの場合において、「接触させる」は、細胞に核酸分子をトランスフェクトすることなどのトランスフェクトすることを含む。
【００２７】
縮重改変体：遺伝コードの結果として縮重である配列を示す、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドなどのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０個の天然アミノ酸が存在、その大部分は、１を超えるコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【００２８】
分化：細胞が特定の型の細胞（例えば、筋細胞、皮膚細胞等）へと発生するプロセスを指す。胚性幹細胞の分化とは、特定の細胞系統に向けた細胞の発生を指す。細胞は、より分化するにつれて、細胞は、潜在力、又は複数の異なる細胞型になる能力を失う。
【００２９】
胚性幹（ＥＳ）細胞：発生中の胚盤胞の内部細胞塊から単離された多能性細胞。ＥＳ細胞は、哺乳動物などの任意の生物に由来し得る。一実施形態において、ＥＳ細胞は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒト以外の霊長類及びヒトから作製される。ヒト及びマウスに由来するＥＳ細胞が例示的である。ＥＳ細胞は、多能性細胞であり、このことは、それらが、体内に存在する細胞の全て（骨細胞、筋肉細胞、脳細胞など）を生じ得ることを意味する。マウスＥＳ細胞を作製するための方法は、例えば、米国特許第５，６７０，３７２号に認め得る。ヒトＥＳ細胞を作製するための方法は、例えば、米国特許第６，０９０，６２２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／７００２１及びＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２７９９５に見られ得る。いくつかのヒトＥＳ細胞系が、当該技術分野で公知であり、公的に入手可能である。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙは、開発されたいくつかのヒトＥＳ細胞系のリストを提供している（リストは、ＮＩＨ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｍｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｇｒａｎｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ．ｈｔｍにてオンラインで閲覧できる）。
【００３０】
カプセル化：本明細書において使用するとき、ナノ粒子に「カプセル化」された分子とは、ナノ粒子内に含まれているか、もしくはナノ粒子の表面に付着されているか、又はそれらの組み合わせである、分子（例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質）を指す。
【００３１】
ＥＲＴ２：生理的濃度で天然リガンド（１７Ｐ−エストラジオール）に結合しないが、ナノモル濃度のタモキシフェン又はその代謝物４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４０ＨＴ）に非常に感受性であるヒトエストロゲン受容体の変異したリガンド結合ドメインを含むタンパク質（Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７（３）：７５２−７５７，１９９７）。ＥＲＴ２の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２１として本明細書に記載され、対応するコード配列は、配列番号１９のヌクレオチド３９８９〜４９３６として本明細書に記載されている。
【００３２】
ＥＳ細胞治療：ＥＳ細胞を被験体に投与することを含む治療。特定の例において、ＥＳ細胞は、Ｚｓｃａｎ４＋ＥＳ細胞である。
【００３３】
（Ｚｓｃａｎ４の）機能的断片又は改変体：開示されたＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド及びポリペプチド（例えば、配列番号１〜１４として記載されているもの）は、Ｚｓｃａｎ４の生物学的活性を保持するＺｓｃａｎ４の機能的断片及び改変体を含む。Ｚｓｃａｎ４の機能的断片及び／又は改変体は、一般に、配列番号１〜１４に記載されるＺｓｃａｎ４配列の１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を含む。全体未満の配列を配列同一性について比較されているとき、断片は、典型的には、断片の長さにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％配列同一性を有することができる。
【００３４】
融合タンパク質：核酸配列の発現によって生じたタンパク質は、２種（異種）のタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列から遺伝子操作された。融合タンパク質を作成するために、核酸配列は、同一のリーディングフレームになければならず、内部の終止コドンを含まなければならない。本明細書におけるいくつかの実施形態において、融合タンパク質はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である。いくつかの例において、融合タンパク質は、２つの異なるタンパク質間にリンカーを含む。
【００３５】
ゲノム安定性：細胞がＤＮＡを正確に複製し、ＤＮＡ複製機構の完全性を維持する能力。安定なゲノムを有するＥＳ細胞は、一般に、細胞老化に抗し、クライシス又は形質転換を起こすことなく２５０回を超す倍加により増殖し得て、低変異頻度及び低頻度の染色体異常を有し（例えば、胎児性癌腫細胞と比べて）、ゲノム完全性を維持する。長いテロメアは、細胞老化に対する緩衝を提供すると考えられており、一般に、ゲノム安定性及び全体的な細胞の健康状態を示すと考えられている。染色体の安定性（例えば、変異がほとんどないこと、染色体再配列や染色体数の変化がないこと）もまた、ゲノム安定性に関連する。ゲノム安定性の喪失は、癌、神経障害及び早期老化に関連する。ゲノム不安定性の徴候としては、変異率の上昇、甚だしい染色体再配列、染色体数の変化、及びテロメアの短縮が挙げられる。
【００３６】
異種：異種ポリペプチド又はポリヌクレオチドとは、異なる供給源又は種に由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。例えば、ヒトＥＳ細胞において発現するマウスＺｓｃａｎ４ペプチドは、そのＥＳ細胞にとって異種である。
【００３７】
宿主細胞：ベクターが伝搬され得る及びそのＤＮＡが発現され得る細胞。この用語はまた、被験体の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に起きる変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一でない可能性があることが理解される。しかしながら、「宿主細胞」という用語が使用されるとき、そのような子孫は含まれる。
【００３８】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞：ある特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞から人工的に得られるあるタイプの多能性幹細胞。ｉＰＳ細胞は、哺乳動物などの任意の生物に由来し得る。一実施形態において、ｉＰＳ細胞は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒト以外の霊長類及びヒトから作製される。ヒト及びマウスに由来するｉＰＳ細胞が例示的である。
【００３９】
ｉＰＳ細胞は、多くの点（例えば、ある特定の幹細胞遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、ならびに分化能（ｐｏｔｅｎｃｙ）及び分化能力（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ））においてＥＳ細胞と似ている。ｉＰＳ細胞を作製するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ｉＰＳ細胞は、代表的には、成体の線維芽細胞などの非多能性細胞への、ある特定の幹細胞関連遺伝子（例えば、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）及びＳｏｘ２）のトランスフェクションによって得られる。トランスフェクションは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス又はアデノウイルス）によって達成され得る。例えば、細胞は、レトロウイルス系を用いてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃでトランスフェクトされ得るか、又はレンチウイルス系を用いてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８でトランスフェクトされ得る。３〜４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が、多能性幹細胞と形態学的に及び生化学的に類似し始め、そして代表的には、形態学的選択、倍加時間、又はレポーター遺伝子及び抗生物質選択によって単離される。一つの例において、成体ヒト細胞からのｉＰＳは、Ｙｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５４）：１２２４，２００７）又はＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−７２，２００７）の方法によって作製される。
【００４０】
単離された：単離された核酸は、他の核酸配列、及びその核酸が天然に存在している生物の細胞、即ち、他の染色体及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡから実質的に分離又は精製されている。従って、「単離された」という用語には、標準的な核酸精製法により精製された核酸が包含される。その用語には、宿主細胞における組み換え発現により調製された核酸も、化学的に合成された核酸も包含される。同様に、「単離された」タンパク質は、そのタンパク質が天然に存在している生物の細胞の他のタンパク質から実質的に分離又は精製されており、宿主細胞における組み換え発現により調製されたタンパク質も、化学的に合成されたタンパク質も包含する。同様に、「単離された」細胞は、他の細胞型とは区別され、実質的に分離されている。
【００４１】
リンカー：２つの核酸分子又は２つのペプチド（例えば、融合タンパク質）間などの２つの分子間のスペーサーとして機能する１以上のヌクレオチド又はアミノ酸。いくつかの例において、リンカーは、１〜１００アミノ酸、例えば１〜５０又は５〜１０アミノ酸である。
【００４２】
ナノ粒子：直径が約１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の粒子。本明細書に提供される方法とともに使用するための例示的なナノ粒子は、生体適合性及び生分解性ポリマー材料で作製される。いくつかの態様において、ナノ粒子は、ＰＬＧＡナノ粒子である。本明細書において使用するとき、「ポリマーナノ粒子」は、特定の物質（単数又は複数）の反復サブユニットで構成されているナノ粒子である。「ポリ（乳酸）ナノ粒子」は、反復された乳酸サブユニットを有するナノ粒子である。同様に、「ポリ（グリコール酸）ナノ粒子」は、反復されたグリコール酸サブユニットを有するナノ粒子である。
【００４３】
非ヒト動物：ヒト以外の全ての動物を含む。非ヒト動物には、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、及び家禽などの家畜、イヌ、ネコ、ウマ、ハムスターなどの競技動物もしくはペット、マウスなどのげっ歯動物、又はライオン、トラ、もしくはクマなどの動物園動物が含まれるが、これらに限定はされない。一例において、非ヒト動物は、トランスジェニックのマウス、ウシ、ヒツジ、又はヤギなどのトランスジェニック動物である。非限定的な一つの具体例において、トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。
【００４４】
作動可能に連結された：第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、その第一の核酸配列はその第二の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列と作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結された核酸配列は、連続しており、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
【００４５】
医薬として許容され得る担体：有用な薬学的に許容され得る担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５）には、Ｚｓｃａｎ４タンパク質（融合タンパク質を含む）、Ｚｓｃａｎ４核酸分子又は本明細書に開示される細胞の薬学的送達に適した組成物及び製剤が記載されている。
【００４６】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的かつ生理学的に許容される液体を媒体として含んでいる注入可能な液体を含む。固形組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤）の場合、従来の非毒性の固形担体には、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。  生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及びｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートのような微量の非毒性の補助物質を含有することができる。
【００４７】
多能的／多能性：「多能性」細胞は、生殖細胞を含む、生物の細胞系統（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の全てを形成することができるが、完全な生物を自律的に形成することはできない細胞である。本明細書で使用するとき、多能性を高める又は持続することは、幹細胞の多能的能力又は多能性の持続時間を増加させることをいう。
【００４８】
ポリペプチド：単量体がアミド結合を通して接合されているアミノ酸残基である重合体。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれかが使用され得るが、Ｌ−異性体が好ましい。本明細書において使用するとき、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの修飾された配列を含むものとする。「ポリペプチド」という用語には、特に、天然に存在するタンパク質、及び組み換え又は合成により作製されたものも内含されるものとする。
【００４９】
「ポリペプチド断片」という用語は、少なくとも１つの有用なエピトープを示すポリペプチドの部分をさす。「ポリペプチドの機能的断片」という用語は、Ｚｓｃａｎ４などのポリペプチドの活性を保持しているポリペプチドの断片全てをさす。生物学的に機能的な断片は、例えば、抗体分子に結合することができるエピトープのような小さいポリペプチド断片から、細胞内の表現型変化の特徴的な誘導又はプログラミングに関与することができる、例えば、細胞の増殖又は分化に影響することができる大きなポリペプチドまで、様々なサイズであり得る。「エピトープ」とは、抗原との接触に応答して生成した免疫グロブリンに結合することができるポリペプチドの領域である。従って、Ｚｓｃａｎ４又はＺｓｃａｎ４の保存的改変体の生物学的活性を含有している、より小さいペプチドは、有用なものとして含まれる。
【００５０】
本明細書において使用されるとき、「実質的に精製されたポリペプチド」という用語は、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はその他の材料が実質的に除去されているポリペプチドを指す。一実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はその他の材料が少なくとも５０％、例えば、少なくとも８０％除去されている。別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はその他の材料が少なくとも９０％除去されている。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、又はその他の材料が少なくとも９５％除去されている。
【００５１】
保存的置換は、あるアミノ酸をサイズ、疎水性等が類似している別のアミノ酸に交換する。保存的置換の例は、以下に示される：
【００５２】
【表１】
2014514919.tif 000003
【００５３】
保存的であっても保存的でなくても、アミノ酸変化をもたらすｃＤＮＡ配列の改変は、コードされたタンパク質の機能的及び免疫学的な同一性を保存するために、最小限に抑えられるべきである。従って、いくつかの非限定的な例において、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド（Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２などのＺｓｃａｎ４融合タンパク質）又は本明細書に開示されたその他のポリペプチドは、高々２個、高々５個、高々１０個、高々２０個、又は高々５０個の保存的置換を含む。タンパク質の免疫学的同一性は、それが抗体により認識されるか否かを決定することにより査定され得て；そのような抗体により認識される改変体は、免疫学的に保存されている。ｃＤＮＡ配列改変体は、好ましくは、２０個以下、好ましくは１０個以下のアミノ酸置換をコードされたポリペプチドへ導入する。改変体のアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列（例えば、天然のＺｓｃａｎ４配列又はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２配列、例えば配列番号２２又は２３）と、例えば、少なくとも８０％、９０％、又はさらには９５％もしくは９８％同一であり得る。
【００５４】
プロモーター：核酸の転写を指向する核酸調節配列。プロモーターは、必要な核酸配列を転写開始部位付近に含む。プロモーターには、必要に応じて、遠位のエンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントも含まれる。「構成的プロモーター」は、継続的に活性であり、かつ外部のシグナル又は分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナル又は分子（例えば、転写因子）によって調節される。
【００５５】
組換え：組換え核酸又はポリペプチドは、天然に発生していない配列を有するか、又は配列２つの他に分離したセグメントの人工的な組み合わせによって作られる配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成によって、又は核酸の単離されたセグメントの人為的操作によって、例えば、遺伝子工学技術によって達成される。
【００５６】
配列同一性／類似性：２つ以上の核酸配列間又は２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、それらの配列間の同一性又は類似性に関して表される。配列同一性は、同一性のパーセンテージに関して測定され得る；このパーセンテージが高いほど、配列がより同一である。配列類似性は、類似性のパーセンテージ（保存的アミノ酸置換を考慮に入れたもの）に関して測定され得る；このパーセンテージが高いほど、配列がより類似である。核酸配列又はアミノ酸配列のホモログ又はオルソログは、標準的な方法を用いてアラインメントされるとき、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質又はｃＤＮＡがより密接な関係のある種に由来するとき（例えば、ヒト配列とマウス配列）、より遠縁の種（例えば、ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比べて、より顕著である。
【００５７】
比較するための配列のアラインメント方法は、当該技術分野で周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２；及びＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０には、配列のアラインメント方法及び相同性の計算に関する詳細な考慮すべき事柄が示されている。
【００５８】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）をはじめとしたいくつかの供給源から入手可能であり、また、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、インターネット上で利用可能である。追加情報は、ＮＣＢＩウェブサイトに見出し得る。
【００５９】
幹細胞：変更のない娘細胞を生じる独特の能力（自己複製；細胞分裂によって、親細胞と同一の少なくとも１つの娘細胞がもたらされること）及び特殊化された細胞型を生じる独特の能力（潜在力）を有する細胞。幹細胞としては、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＧＳ細胞、ＭＡＰＣ、ｍａＧＳＣ、ＵＳＳＣ及び成体幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、幹細胞は、１つより多い所与の細胞型の完全に分化した機能的な細胞を生じ得る。インビボにおける幹細胞の役割は、動物の通常の生存中に破壊される細胞を交換することである。一般に、幹細胞は、無制限に分裂することができる。幹細胞は、分裂後、幹細胞として残留する場合もあり、前駆細胞になる場合もあり、最終分化へ進む場合もある。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の完全に分化した機能的な細胞を生じ得る細胞である。一般に、前駆細胞は、分裂することができる。前駆細胞は、分裂後、前駆細胞のままであり得るか、又は最終分化へ進むこともある。
【００６０】
被験体：生存している多細胞脊椎動物生物、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含むカテゴリ。
【００６１】
部分集団：集団の同定可能な一部。本明細書において使用するとき、Ｚｓｃａｎ４を発現しているＥＳ細胞の「部分集団」は、Ｚｓｃａｎ４を発現していると同定された所与の集団内のＥＳ細胞の一部である。
【００６２】
テロメア：染色体の複製及び安定性に関わる特殊化された構造である、真核生物の染色体の末端をさす。テロメアは、特定の配向の短いＤＮＡ配列の多くの反復からなる。テロメアの機能には、染色体の末端が接合されないように染色体の末端を保護すること、及び染色体のもっとも末端の複製を可能にすること（テロメラーゼによって）が含まれる。染色体の末端におけるテロメアＤＮＡの反復の数は、加齢に伴って減少する。
【００６３】
トランスフェクトする又はトランスフェクション：核酸を細胞又は組織に導入するプロセスをさす。トランスフェクションは、いくつかの方法（例えば、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション及び注入であるがこれらに限定されない）のうちのいずれか１つによって達成され得る。
【００６４】
ベクター：宿主細胞に導入されることにより、形質転換された宿主細胞をもたらす核酸分子。ベクターは、複製起点（ＤＮＡ合成の開始に関与するＤＮＡ配列）などの、宿主細胞内でそのベクターが複製することを可能にする核酸配列を含み得る。例えば、発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数又は複数）の転写及び翻訳を可能にするのに必要な制御配列を含む。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び当該技術分野で公知のその他の遺伝エレメントも含み得る。ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター及びプラスミドベクターが挙げられる。
【００６５】
Ｚｓｃａｎ４：以前に２細胞特異的発現及びＥＳ細胞特異的発現（ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１８９５７）を示すとして同定され、テロメア伸長及びゲノム安定性を促進するもの（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａl.，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４（７２９０）：８５８−８６３，２０１０）として示されている遺伝子群を指す。本開示の文脈において、「Ｚｓｃａｎ４」は、ヒトＺＳＣＡＮ４及びマウスＺｓｃａｎ４の両方を含む。マウスでは、用語「Ｚｓｃａｎ４」は、３つの偽遺伝子（Ｚｓｃａｎ４−ｐｓｌ、Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ２及びＺｓｃａｎ４−ｐｓ３）及び６つの発現遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ及びＺｓｃａｎ４ｆ）を含む遺伝子の集合体を指す。６つのパラログのうち、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、及びＺｓｃａｎ４ｆのオープンリーディングフレームは、ＳＣＡＮドメインと同様にすべての４つのジンクフィンガードメインをコードし、これは、転写因子としてのそれらの潜在的な役割を果たすことを示唆する。Ｚｓｃａｎ４は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド、及びＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを指す。例示的な配列は、本明細書に提供されている（配列番号１〜１４参照）。
【００６６】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ：本開示の文脈において、「Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ」は、少なくとも一つのジンクフィンガードメインのＣ末端欠失を有する任意のマウス又はヒトＺｓｃａｎ４タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、少なくとも２つ、例えば３つの又は４つ全てのジンクフィンガードメインの欠失を含む。配列番号２及び配列番号８は、それぞれ、ヒトＺＳＣＡＮ４及びマウスＺｓｃａｎ４ｃのアミノ酸配列を提供し、Ｎ−末端のＳＣＡＮドメインとＣ末端のジンクフィンガー（Ｃ２Ｈ２型）ドメインを描く。さらに、ヒトＺＳＣＡＮ４及びマウスＺｓｃａｎ４ｃの各ドメインのヌクレオチド及びアミノ酸領域を以下に列挙する。
【００６７】
【表２】
2014514919.tif 000004
【００６８】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２：Ｚｓｃａｎ４アミノ酸配列とＥＲＴ２アミノ酸配列から構成される融合タンパク質。「Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２」はまた、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸配列を指すことができる。Ｚｓｃａｎ４の例示的なアミノ酸配列（配列番号２、８、１０及び１４を含む）及びＥＲＴ２（配列番号２１）は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４配列は、既知のＺｓｃａｎ４配列（例えば、配列番号２、８、１０又は１４）の機能的断片又は改変体であり、及び／又はＥＲＴ２配列は、既知のＥＲＴ２配列（例えば、配列番号２１）の機能的断片又は改変体である。Ｚｓｃａｎ４又はＥＲＴ２の任意の断片又は改変体は、その断片又は改変体が活性を保持する限り、意図される。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質は、Ｚｓｃａｎ４とＥＲＴ２の間にリンカー（又はスペーサー）を含む。リンカーは、当該技術分野において周知であり、適切なリンカーは、当業者によって選択することができる。特定の例において、リンカーは、ヌクレオチド配列ＧＣＴＡＧＣによってコードされる。
【００６９】
他に説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語が、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明白に示さない限り、複数の対象を含む。同様に、「又は」という単語は、文脈がそうでないことを明白に示さない限り、「及び」を含むものとする。従って、「Ａ又はＢを含む」とは、Ａ、又はＢ、又はＡ及びＢを含むことを意味する。核酸又はポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ及び全ての分子量又は分子量値が、近似であり、説明のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書に記載されたものと類似しているか又は等価である方法及び材料が、本発明の実施又は試行において使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書中に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考資料が、参照により完全に組み入れられる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が適用される。さらに、材料、方法、及び例は、例示的なものであり、限定するためのものではない。
【００７０】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
幹細胞の多能性を調べるための判断基準は、細胞が、動物の生体全体に寄与することができるかどうかを確認することである。本明細書においては、マウスＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４活性化の頻度が増加するだけでなく、長期的な細胞培養においてそれらの発生能を維持することも開示される。潜在力が増大するにつれて、さらに動物全体が、予想外に高い成功率で４Ｎ胚盤胞に注入された単一のＥＳ細胞から製造することができる。Ｚｓｃａｎ４活性化された細胞は、２細胞段階のマウス胚で発現される遺伝子も発現するが、ＥＳ細胞の一過性のＺｓｃａｎ４活性化状態は、ＥＳ細胞の高い潜在力に関連付けられていない。理論に束縛されるものではないが、これらの知見は、ＥＳ細胞が、通常の状態よりも頻繁に一過性のＺｓｃａｎ４活性化状態を経由することによって、より高い潜在力を取得することを示している。まとめると、これらの結果は、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化は、多能性幹細胞を若返らせることができることを示す。
【００７１】
特に本明細書に開示されているのは、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の構成的存在が、その通常の活性化剤であるタモキシフェンの存在下でさえ、ＥＳ細胞における内因性Ｚｓｃａｎ４活性化の頻度を高めることができ、結果として、ＥＳ細胞の発生能を増大させるという知見である。加速されたＺｓｃａｎ４活性化サイクルで培養されたＥＳ細胞は、キメラマウスと単一のＥＳ細胞からの全マウスの効率的な生成への高い貢献度によって証明される、改善されたキメラ化と潜在力を示した。さらに、本明細書に開示されているは、Ｃ末端で切断されたＺｓｃａｎ４（ジンクフィンガードメインを欠損している）の発現が、Ｚｓｃａｎ４＋細胞数を増加させ、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２と同様の効果を有するという所見である。
【００７２】
従って、本明細書では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。特定の例では、Ｚｓｃａｎ４はマウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４である。さらに、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２コード配列を含むベクター、このようなベクターを含む細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は他の幹細胞）、及びＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２をコードする核酸分子又はベクターを含む組成物が提供される。さらに、組換えＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質を含む細胞、及びＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質を含む組成物が提供される。
【００７３】
さらに、本明細書では、Ｚｓｃａｎ４ΔＣタンパク質（少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を有するＺｓｃａｎ４タンパク質）をコードする単離された核酸分子が提供される。特定の例では、Ｚｓｃａｎ４は、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４である。さらに、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣコード配列を含むベクター、このようなベクターを含む細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は他の幹細胞）、及びＺｓｃａｎ４−ΔＣをコードする核酸分子又はベクターを含む組成物が提供される。さらに、組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を含む細胞、及びＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を含む組成物が提供される。
【００７４】
また、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２又はＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子及びタンパク質を使用する方法が本明細書に提供される。例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子又は融合タンパク質と幹細胞又は幹細胞集団を接触させることにより、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続する方法が本明細書に開示されている。他の例では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子又はタンパク質と幹細胞又は幹細胞集団を接触させることにより、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続する方法が提供される。同様に、幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４陽性幹細胞の頻度を増加させる方法、並びにゲノム安定性を促進させ及び／又は幹細胞又は幹細胞集団におけるテロメア長を増加させる方法が提供される。
【００７５】
Ａ．Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２を含む組成物、ベクター及び細胞
本明細書は、融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、ここで、融合タンパク質は、ＥＲＴ２タンパク質に融合したＺｓｃａｎ４タンパク質を含むＥＲＴ２は、ヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインの突然変異型である。ＥＲＴ２は、生理学的濃度ではその天然のリガンド（１７Ｐ−エストラジオール）を結合しないが、タモキシフェン又はその代謝物４−ヒドロキシ（４０ＨＴ）のナノモル濃度に非常に感受性である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子は、ヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ若しくはマウスＺｓｃａｎ４ｆ、又はその機能的断片若しくは改変体を含む。Ｚｓｃａｎ４の機能性断片及び改変体は、例えば、幹細胞の多能性を増大させ、ゲノム安定性を促進し、又はテロメアの長さを増加させる能力などのＺｓｃａｎ４の１つ以上の生物学的活性を保持している任意のＺｓｃａｎ４断片又は改変体を含む。
【００７７】
様々なＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドについての典型的な核酸配列は、当該技術分野において知られ（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１１８９５７）、本明細書に記載され、例えば、配列番号１（ヒトＺＳＣＡＮ４）、配列番号７（マウスＺｓｃａｎ４ｃ）、配列番号９（マウスＺｓｃａｎ４ｄ）及び配列番号１３（マウスＺｓｃａｎ４ｆ）などが挙げられる。当業者は、これらの配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、Ｚｓｃａｎ４活性を保持する配列が企図され、本明細書で提供される組成物及び方法において使用することができることを承認するであろう。
【００７８】
他の種由来のＺｓｃａｎ４核酸配列もまた公に利用可能であり、例えば、イヌＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ ５４１３７０及びＸＭ ８４８５５７）；ウシＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ ００１７８９２５０）；及びウマＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ ００１４９３９４４）を含む。上記で列挙されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の各々は、２０１１年２月２２日にＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られるものとして、参照により本明細書に援用される。
【００７９】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの断片及び改変体は、分子技術を用いて当業者によって容易に調製することができる。一実施形態では、Ｚｓｃａｎ４核酸配列の断片は、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、又は少なくとも２０００のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの連続した核酸を含む。さらなる実施形態では、Ｚｓｃａｎ４の断片は、限定されないが、例えば、多能性を高めること、ゲノム安定性を増大させること、及び／又はテロメア長を増加させることなどの、対象とする細胞において発現し場合のＺｓｃａｎ４の機能を付与する断片である。本明細書において意図されたＺｓｃａｎ４核酸配列は、遺伝コードの結果として縮重している配列を含む。２０種の天然アミノ酸が存在し、その大部分は、１を超えるコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によりコードされるＺｓｃａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４核酸配列部分は、配列番号１、７、９又は１３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％である９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４核酸配列は、配列番号１、７、９又は１３に記載される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４核酸配列は、配列番号１、７、９又は１３に記載の核酸配列からなる。
【００８１】
いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分は、マウスＺｓｃａｎ４ｃを含む。したがって、特定の実施例では、Ｚｓｃａｎ４核酸配列は、配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。他の例では、Ｚｓｃａｎ４は、ヒトＺＳＣＡＮ４を含む。特定の例において、Ｚｓｃａｎ４核酸配列は、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＥＲＴ２部分をコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド３９８９〜４９３６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％と少なくとも９９％同一である。いくつかの例では、ＥＲＴ２をコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド３９８９〜４９３６を含む又はそれからなる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子は、Ｚｓｃａｎ４とＥＲＴ２のコード配列の間にリンカー配列を含む。リンカーは当該技術分野において周知であり、適切なリンカーの選択は、当業者の能力の範囲内である。いくつかの例では、リンカーは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０、又は少なくとも１００個のアミノ酸、例えば２〜５０個又は２〜１０個のアミノ酸である。本明細書に開示されている特定の例において、リンカーは、核酸配列ＧＣＴＡＧＣ（配列番号１９のヌクレオチド３９８３〜３９８８）を含む。
【００８４】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子がマウスＺｓｃａｎ４ｃをコードするいくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１９のヌクレオチド２４６５〜４９３６に対して、少なくとも少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である配列を含む。特定の例において、核酸分子は含み、又は配列番号１９のヌクレオチド２４６５〜４９３６の配列を含む又はそれからなる。
【００８５】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子がヒトＺＳＣＡＮ４をコードする他の実施形態において、核酸分子は、配列番号２０のヌクレオチド２４７９〜４７３１と少なくとも少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。特定の例において、核酸分子は、配列番号２０のヌクレオチド２４７９〜４７３１の配列を含む又はそれからなる。また、本明細書に開示されているＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。任意の適した発現ベクター、例えば、発現（プラスミド）ベクター（例えば、ｐＰｙＣＡＧ−ＢｓｔＸＩ−ＩＰ）、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスベクター）が意図される。多数の発現ベクター及びウイルスベクターは、当該技術分野において知られ、適切なベクターの選択は当業者の能力の範囲内に十分にある。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１９又は配列番号２０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、ベクターは、配列番号１９又は配列番号２０に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。特定の非限定的な実施形態では、ベクターの核酸配列は、配列番号１９又は配列番号２０を含む又はそれからなる。
【００８７】
さらに、本明細書に記載されるようなＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子又はベクターを含む単離された細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。特定の例において、幹細胞は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。幹細胞の起源は、任意の適切な種に由来することができる。いくつかの例において、幹細胞は、マウス、ラット、ヒト又は非ヒト霊長類の幹細胞である。
【００８８】
また、Ｚｓｃａｎ４ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターを含む組成物が本明細書において提供される。組成物は、さらに、医薬として許容される担体又は希釈剤などの担体又は希釈剤を含んでもよい。本明細書に開示されている核酸分子及びベクターによってコードされるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質がさらに提供される。
【００８９】
また、本明細書は、組換えＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質は、ヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ若しくはマウスＺｓｃａｎ４ｆ、又はその機能的断片若しくは変改変体を含む。Ｚｓｃａｎ４の機能性断片及び改変体は、例えば、幹細胞の多能性を増大させ、ゲノム安定性を促進し、又はテロメア長を増加させる能力として、Ｚｓｃａｎ４の１つ以上の生物学的活性を保持しているＺｓｃａｎ４の任意の断片又は改変体を含む。
【００９０】
様々なＺｓｃａｎ４タンパク質についての例示的なアミノ酸配列は、当該技術分野において知られ（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／１１８９５７）、本明細書に開示され、例えば、配列番号２（ヒトＺＳＣＡＮ４）、配列番号８（マウスＺｓｃａｎ４ｃ）、配列番号１０（マウスＺｓｃａｎ４ｄ）及び配列番号１４（マウスＺｓｃａｎ４ｆ）が挙げられる。当業者は、これらの配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列が意図され、本明細書に提供される方法において使用され得ることを承認する。
【００９１】
他種由来のＺｓｃａｎ４アミノ酸配列もまた公に利用可能であり、例えば、イヌＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ ５４１３７０及びＸＭ ８５３６５０）；ウシＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ ００１７８９３０２）；及びウマＺＳＣＡＮ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ ００１４９３９９４）を含む。上記で列挙されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の各々は、２０１１年２月２２日にＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られるものとして、参照により本明細書に援用される。
【００９２】
Ｚｓｃａｎ４タンパク質の断片及び改変体は、分子技術を用いて当業者によって容易に調製することができる。一実施形態では、Ｚｓｃａｎ４タンパク質の断片は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドの少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、又は少なくとも５００の連続アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、Ｚｓｃａｎ４の断片は、限定されないが、多能性を高めること、ゲノム安定性を増大させること、又はテロメア長を増加させることなどのＺｓｃａｎ４の機能を付与する断片である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分は、配列番号２、８、１０又は１４に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は配列番号９９％同一であるアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、Ｚｓｃａｎ４タンパク質は、配列番号２、８、１０又は１４の保存的改変体であり、そのため、配列番号２、８、１０又は１４において、５０未満の保存アミノ酸置換基、例えば、２未満、５未満、１０未満、２０未満、又は５０未満の保存アミノ酸置換基を含む。別の実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４ペプチド部分は、配列番号２、８、１０又は１４に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるアミノ酸配列を有する。
【００９４】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４は、マウスＺｓｃａｎ４ｃを含む。いくつかの例では、Ｚｓｃａｎ４ｃアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。
【００９５】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質の他の実施形態では、Ｚｓｃａｎ４部分は、ヒトＺＳＣＡＮ４を含む。いくつかの例では、ＺＳＣＡＮ４アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＥＲＴ２部分のアミノ酸配列は、配列番号２１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。いくつかの例において、ＥＲＴ２のアミノ酸配列は、配列番号２１を含む又はそれからなる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質は、Ｚｓｃａｎ４とＥＲＴ２配列の間にリンカーを含む。リンカーは当該技術分野において周知であり、適切なリンカーの選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書に開示された特定の例では、リンカーは、アミノ酸配列のＡｌａ−Ｓｅｒを含む。
【００９８】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質がマウスＺｓｃａｎ４ｃを含むいくつかの実施形態では、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。特定の例において、Ｚｓｃａｎ４ＥＲＴ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番２２のアミノ酸配列を含み又はそれからなる。
【００９９】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質がヒトＺＳＣＡＮ４を含む他の実施形態では、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。特定の例において、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み又はそれからからなる。
【０１００】
さらに、本明細書においては、本明細書に開示されているＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質を含む単離された細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。特定の例において、幹細胞はＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。幹細胞の起源は、任意の適切な種に由来することができる。いくつかの例において、幹細胞は、マウス、ラット、ヒト又は非ヒト霊長類幹細胞である。
【０１０１】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質を含む組成物もまた、本明細書において提供される。組成物は、さらに、担体又は希釈剤、例えば、医薬として許容される担体又は希釈剤、例えば生理食塩水を含んでもよい。
【０１０２】
Ｂ．Ｚｓｃａｎ４−ΔＣを含む組成物、ベクター及び細胞
また、本明細書では、Ｃ−末端が切断されたＺｓｃａｎ４タンパク質（Ｚｓｃａｎ４−ΔＣと呼ばれる）をコードする単離された核酸分子が提供される。Ｃ−末端切断型Ｚｓｃａｎ４は、少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。したがって、いくつかの実施形態において、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、１つ、２つ、３つ又は４つのジンクフィンガードメインの欠失を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子は、Ｃ末端切断型ヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ又はマウスＺｓｃａｎ４ｆを含む。特定の実施例では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、４つすべてのジンクフィンガードメインの欠失を有するヒトＺＳＣＡＮ４又はマウスＺｓｃａｎ４ｃのいずれかである。一つの非限定的な例では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、及び／又は配列番号２４のヌクレオチド２４６５〜３６４９によってコードされる。
【０１０４】
本明細書で意図されたＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸配列は、遺伝コードの結果として縮重している配列を含む。２０種の天然アミノ酸が存在し、その大部分は、１より多くのコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるＺｓｃａｎ４−ΔＣポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸配列は、配列番号２４のヌクレオチド２４６５〜３６４９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸配列は、配列番号２４のヌクレオチド２４６５〜３６４９として記載される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸配列は、配列番号２４のヌクレオチド２４６５〜３６４９として記載される核酸配列からなる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子である。特定の実施例では、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、配列番号１の少なくともヌクレオチド１６３０〜１９５０、ヌクレオチド１７１４〜１９５０、ヌクレオチド１７９８〜１９５０又はヌクレオチド１８８２〜１９５０の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１〜１６２９、ヌクレオチド１〜１７１３、ヌクレオチド１〜１７９７又はヌクレオチド１〜１８８１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。いくつかの例では、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１〜１６２９、ヌクレオチド１〜１７１３、ヌクレオチド１〜１７９７又はヌクレオチド１〜１８８１を含む又はそれからなる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、マウスＺｓｃａｎ４ΔＣ核酸分子である。特定の例では、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、配列番号７の少なくともヌクレオチド１３８３〜１７０９、ヌクレオチド１４７０〜１７０９、ヌクレオチド１５５４〜１７０９又はヌクレオチド１６３８〜１７０９の欠失を含む。いくつかの実施形態では、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子は、配列番号７のヌクレオチド１〜１３８２、ヌクレオチド１〜１４６９、ヌクレオチド１〜１５５３又はヌクレオチド１〜１６３７に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。
【０１０８】
いくつかの例では、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号７のヌクレオチド１〜１３８２、ヌクレオチド１〜１４６９、ヌクレオチド１〜１５５３、又はヌクレオチド１〜１６３７を含む又はそれからなる。また、本明細書において開示されているＺｓｃａｎ４−ΔＣをコードする核酸分子を含むベクターが提供される。任意の適した発現ベクター、例えば発現（プラスミド）ベクター（例えば、ｐＰｙＣＡＧ−ＢｓｔＸＩ−ＩＰ）、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスベクター）が企図される。多数の発現ベクター及びウイルスベクターは、当該技術分野で知られ、適切なベクターの選択は、当業者の能力の範囲内に十分にある。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの例において、ベクターは、配列番号２４に対して、少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。特定の非制限的な実施形態では、ベクターの核酸配列は、配列番号２４を含む又はそれからなる。
【０１１０】
さらに、本明細書には、本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子又はベクターを含む単離された細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。特定の例において、幹細胞は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。幹細胞の起源は、任意の適切な種に由来することができる。いくつかの例において、幹細胞は、マウス、ラット、ヒト又は非ヒト霊長類幹細胞である。
【０１１１】
Ｚｓｃａｎ４ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はベクターを含む組成物はまた、本明細書で提供される。組成物は、さらに、医薬として許容される担体又は希釈剤などの担体又は希釈剤を含んでもよい。
【０１１２】
本明細書に記載の核酸分子及びベクターによってコードされるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質がさらに提供される。
【０１１３】
また、組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、Ｃ末端切断型ヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ又はマウスＺｓｃａｎ４ｆを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２５の保存的改変対であり、例えば、それは、配列番号２５において、５０未満の保存的アミノ酸置換、例えば２未満、５未満、１０未満、２０未満又は５０未満の保存的アミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む又はそれからなるアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である。特定の例では、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２の少なくともアミノ酸３１２〜４１８、アミノ酸３４０〜４１８、アミノ酸３６８〜３９０、又はアミノ酸３９６〜４１８の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜３１１、アミノ酸１〜３３９、アミノ酸１〜３６７、又はアミノ酸１〜３９５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。いくつかの例において、ヒトＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜３１１、アミノ酸１〜３３９、アミノ酸１〜３６７、又はアミノ酸１〜３９５のアミノ酸を含む又はそれからなる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である。特定の例では、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号８の少なくともアミノ酸３９５〜５０３個、アミノ酸４２４〜５０３、アミノ酸４５２〜５０３、又はアミノ酸４８０〜５０３の欠失を含む。いくつかの実施形態では、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号８のアミノ酸１〜３９４、アミノ酸１〜４２３、アミノ酸１〜４５１、又はアミノ酸１〜４７９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。いくつかの例では、マウスＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、配列番号８のアミノ酸１〜３９４、アミノ酸１〜４２３、アミノ酸１〜４５１、又はアミノ酸１〜４７９を含む又はそれからなる。
【０１１７】
さらに、本明細書に開示されているＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を含む単離された細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。特定の例において、幹細胞はＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。幹細胞の起源は、任意の適切な種に由来することができる。いくつかの例において、幹細胞は、マウス、ラット、ヒト又は非ヒト霊長類幹細胞である。
【０１１８】
また、Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を含む組成物は、本明細書において提供される。組成物は、さらに、担体又は希釈剤、例えば医薬として許容される担体又は希釈剤、例えば生理食塩水を含んでもよい。
【０１１９】
Ｃ．幹細胞におけるＺｓｃａｎ４の再発活性化及びその使用方法
本明細書には、Ｚｓｃａｎ４の再発活性化が幹細胞の多能性を高めるという所見が開示されている。特に、ＥＳ細胞でＺｓｃａｎ４活性化の頻度を増加させることは、長期培養中に発生能を高め、維持することが本明細書に開示されている。以下の実施例に記載の結果は、ＥＳ細胞は、通常の状態よりも頻繁に、一過性Ｚｓｃａｎ４活性化状態を経由することによって、より高い潜在力を獲得することを示している。
【０１２０】
従って、本明細書においては、幹細胞又は幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４の頻繁な活性化を誘導することによって、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は維持する方法が提供される。Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を誘導することによって、幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４陽性細胞の頻度を増加させる方法も提供される。さらに、幹細胞又は幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４の再発活性化を促進することによって、幹細胞又は幹細胞集団において、ゲノム安定性を促進する、若しくはテロメア長を増加させる、又はその両方を施す方法が提供される。
【０１２１】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、本方法は、幹細胞又は幹細胞集団を（ｉ）Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はその組成物、（ｉｉ）Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードするベクター又はその組成物、又は（ｉｉｉ）Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質又はその組成物と接触させることを含む。
【０１２２】
本明細書に開示される方法の他の実施形態において、本方法は、幹細胞又は幹細胞集団を（ｉ）Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はその組成物、（ｉｉ）Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードするベクター又はその組成物、又は（ｉｉｉ）Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質又はその組成物と接触させることを含む。
【０１２３】
他の実施形態では、幹細胞又は幹細胞集団は、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を促進する作用因子と接触させる。薬剤は、例えば、任意の核酸分子、ポリペプチド、小分子、又は細胞内のＺｓｃａｎ４の再発活性化をもたらす他の化合物であってもよい。
【０１２４】
いくつかの例において、幹細胞は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。方法は、任意の種の幹細胞、例えば、マウス、ラット、ヒト又は非ヒト霊長類幹細胞に適用され得る。
【０１２５】
１．幹細胞の多能性を高めること又は持続すること
本明細書では、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターと幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ融合タンパク質と幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
【０１２６】
さらに他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質で幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
【０１２７】
細胞に核酸分子を送達させる方法は、当該技術分野において周知である。いくつかの例では、幹細胞を核酸分子又はベクターで「接触させること」は、トランスフェクション（例えば、リポソーム媒介トランスフェクション）、エレクトロポレーション、注射又は細胞に核酸分子を導入させるための任意の他の適切な技術を含む。
【０１２８】
細胞にタンパク質を送達させるための方法もまた、当該技術分野で周知である。いくつかの例において、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は、細胞への送達を助けるためにナノ粒子によってカプセル化される。開示された方法で使用するのに適したナノ粒子は、当該技術分野において知られ、以下に簡単に説明される。
【０１２９】
本明細書に記載される方法とともに使用するためのナノ粒子は、任意のタイプの生体適合性ナノ粒子、例えば、生分解性ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子（ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルケン、ポリビニルエーテル類およびセルロースエーテルナノ粒子が挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、生体適合性かつ生分解性の材料で作製される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子には、ポリ（乳酸）もしくはポリ（グリコール酸）、またはポリ（乳酸）とポリ（グリコール酸）の両方を含むナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である。
【０１３０】
他の生分解性のポリマー材料（例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリグリコリド（ＰＧＡ））が、本明細書に記載される組方法とともに使用するために意図される。さらなる有用なナノ粒子としては、生分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子（Ｖａｕｔｈｉｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５５：５１９−４８，２００３）が挙げられる。
【０１３１】
様々なタイプの生分解性および生体適合性のナノ粒子、そのようなナノ粒子（ＰＬＧＡナノ粒子を含む）を作製する方法、ならびに種々の合成化合物、タンパク質および核酸をカプセル化する方法は、当該技術分野において十分に報告されている（例えば、米国特許出願公開番号２００７／０１４８０７４；米国特許出願公開番号２００７００９２５７５；米国特許出願公開番号２００６／０２４６１３９；米国特許第５，７５３，２３４号；米国特許第７，０８１，４８９号；およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００６／０５２２８５を参照のこと）。
【０１３２】
細胞の多能性を評価する方法は、当該技術分野で知られている。以下の実施例２は、ＥＳ細胞の潜在力を評価するために使用され得る例示的な方法を記載する。一例では、ＥＳ細胞は、マウスの胚盤胞に注入され、子宮に移され、ＥＳ細胞の潜在力の程度は毛色に基づいて仔イヌのキメラ化率によって決定される。別の例では、４Ｎの相補アッセイが行われる。このアッセイでは、ＥＳ細胞を４倍体（４Ｎ）胚盤胞に注入される。ＥＳ細胞の潜在力は、生きた胚を生成するＥＳ細胞の能力によって決定される。
【０１３３】
いくつかの例では、幹細胞又は幹細胞集団の多能性は、増加したＺｓｃａｎ４活性化頻度の不存在下で（例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質の発現がない場合において）の幹細胞又は幹細胞集団の多能性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％増加している７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％増加させる。
【０１３４】
また、本明細書には、Ｚｓｃａｎ４を一過性に過剰発現させることによって、幹細胞又は幹細胞集団の発生能を増加させる方法が提供される。一実施形態では、過剰発現されたＺｓｃａｎ４は、マウスＺｓｃａｎ４ｃである。
【０１３５】
さらに、本明細書には、Ｚｓｃａｎ４タンパク質をコードする単離された核酸分子又はＺｓｃａｎ４タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで幹細胞又は幹細胞集団を接触させることによって、幹細胞又は幹細胞集団の多能性を高める又は持続する方法が提供される。ベクターを用いる実施形態において、ベクターは誘導性プロモーターを含む。
【０１３６】
２．集団におけるＺｓｃａｎ４＋細胞の頻度を増加させる
また、本明細書では、幹細胞集団におけるＺｓｃａｎ４陽性細胞の頻度を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書で開示されているＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞集団を接触させることを含む。
【０１３７】
他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ融合タンパク質で幹細胞集団を接触させることを含む。さらに他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質と幹細胞集団を接触させることを含む。
【０１３８】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣをコードする核酸分子、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を幹細胞に送達させるための方法は、当該技術分野において知られ、上記に記載されている。
【０１３９】
細胞集団においてＺｓｃａｎ４＋細胞を検出する方法は、日常的であり、従前に（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１１８９５７、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、Ｚｓｃａｎ４（これは市販されている又は標準的な手順に従って製造することができる）に特異的な抗体は、Ｚｓｃａｎ４＋細胞を検出するための免疫学に基づくアッセイで使用することができる。例えば、蛍光活性化細胞選別は、集団においてＺｓｃａｎ４＋の細胞を検出及び定量するために使用することができる。別の例として、Ｚｓｃａｎ４レポーター構築物は、Ｚｓｃａｎ４の発現を検出するために使用することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１１８９５７に記載されているｐＺｓｃａｎ４−エメラルドベクターなど）。
【０１４０】
特定の例においては、集団におけるＺｓｃａｎ４＋細胞の頻度の増加は、少なくとも５％増加し、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％である、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である。増加は、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸若しくは融合タンパク質、又はＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸若しくはタンパク質と接触させていない（したがって、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を受けていない）細胞集団に相対的である。
【０１４１】
３．ゲノムの安定性を促進し、テロメア長を増加させる
幹細胞又は幹細胞集団において、ゲノム安定性を促進し、又はテロメア長を促進する方法、又はその両方がさらに提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書で開示されたＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ融合タンパク質を幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
【０１４２】
さらに他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はベクターで幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態において、本方法は、本明細書に開示されたＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質で幹細胞又は幹細胞集団を接触させることを含む。
【０１４３】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２又はＺｓｃａｎ４−ΔＣをコードする核酸分子、及びＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を幹細胞に送達させる方法は、当該技術分野において知られ、上述されている。
【０１４４】
特定の例において、ゲノム安定性は、幹細胞において、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質又はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸と接触されていない幹細胞と比較して（又はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の頻繁な活性化を受けていない幹細胞において期待される値又は値の範囲と比較して）、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％高められる。ゲノム安定性およびテロメア長を測定する方法は、当該技術分野において日常的なものであり、本開示は、特定の方法に限定されない。本明細書に提供される特定の例は、例示的なものである。
【０１４５】
いくつかの例において、幹細胞におけるＥＳ細胞におけるゲノム安定性は、細胞増殖を検出することによって測定される。ゲノム安定性は、例えば、対照細胞（例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質又は核酸と接触されていない幹細胞）と比較して、増加される。例えば、ＥＳ細胞の増殖は、培養でＥＳ細胞を増殖させ、各継代後にそれらの細胞の倍加時間を測定することによって検出され得る。一つの例において、ゲノム安定性は、継代８代目又はそれ以前の継代においてクライシス（例えば、細胞死）が起きない場合に、高められている。
【０１４６】
いくつかの例において、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞などの幹細胞のゲノム安定性は、核型解析を行うことによって測定される。ゲノム安定性は、核型の異常（例えば、染色体の融合および断片化）の存在が、例えば、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を受けていない細胞と比べて、減少しているかまたはさらには存在しない場合に、高められている。例えば、核型解析は、分裂中期での停止を誘導し、次いで、分裂中期の染色体スプレッドを調製することによって、幹細胞において行われ得る。
【０１４７】
いくつかの例において、幹細胞におけるゲノム安定性は、テロメア姉妹染色分体交換（Ｔ−ＳＣＥ）を測定することによって測定される。ゲノム安定性は、Ｔ−ＳＣＥの存在が、対照（例えば、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を受けていない幹細胞）と比べて、増加している場合に、高められている。例えば、Ｔ−ＳＣＥは、テロメア染色体配向ＦＩＳＨ（ＣＯ−ＦＩＳＨ）を使用することによって、幹細胞において測定され得る。
【０１４８】
いくつかの例において、幹細胞におけるゲノム安定性は、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）を測定することによって測定される。ゲノム安定性は、ＳＣＥの存在が、対照、例えば、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を受けていない幹細胞と比べて、減少している場合に、高められている。例えば、ＳＣＥは、分裂中期スプレッドにおいてＳＣＥを検出することによって、幹細胞において測定され得る。
【０１４９】
いくつかの例において、テロメア長は、幹細胞において測定される。テロメア長は、テロメアの長さが、例えば、Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を受けていない対照細胞（例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質又は核酸と接触されていない細胞）におけるテロメア長と比べて長い場合に、幹細胞において長くなっている。例えば、テロメア長は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ＦＩＳＨ（Ｑ−ＦＩＳＨ）またはテロメアｑＰＣＲによって、幹細胞において検出され得る。
【０１５０】
以下の実施例は、ある特定の特徴及び／又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、記載された特定の特徴又は実施態様に本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５１】
実施例１：材料と方法
この実施例は、実施例２に記載の研究に使用される実験手順を記載する。
【０１５２】
ＥＳ細胞培養
１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ由来のＭＣ１  ＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／６Ｊ由来のＥＣ２  ＥＳ細胞（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：６６０２−６６０６，２００３）は、ジョンズホプキンス大学医学部のトランスジェニック・コア研究所（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から購入した。Ｆ１ハイブリッド菌株（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９／Ｓｖ）由来のＶ６．５  ＥＳ細胞（Ｅｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４，２００１）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した。全てのＥＳ細胞株は、ＴＡ１  ＥＳ細胞株（下記参照）を除き、３７℃、５％ＣＯ２にて、以前(Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０)に記載の完全にＥＳ培地：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及びペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／５０μｇ／ｍｌ）中で培養された。上述したように、ＴＡ１  ＥＳ細胞株を培養した。全ての細胞株について、培地は毎日交換し、細胞を２〜３日毎に日常的に継代した。
【０１５３】
ＴＡ１  ＥＳ細胞株の誘導
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）と１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃオス（Ｔａｃｏｎｉｃ）は、自然に交配させ、２細胞期胚を回収し、次に、ＫＳＯＭ培地中で３日間、３７℃、５％ＣＯ２にて培養させた得られた胚盤胞は、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で処理されたマウス胚線維芽フィーダー細胞（ＭＥＦ）に移され、１５％ＦＢＳを１５％ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置換し、５０ｎＭのＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）を添加した後、完全なＥＳ培地（上記）中で７日間培養された。内部細胞塊（ＩＣＭ）をピッキングし、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でそれらを解離させた後、それらを新鮮なフィーダー細胞上に播種し、さらに７日間同じ条件で培養した。新たに誘導されたＥＳ細胞株は、直接、４Ｎ−相補性（下記参照）によってその発生能について試験された。
【０１５４】
ｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２ベクター構築
遺伝子は、第７染色体の約８５０ｋｂ領域上にクラスター化された６つのパラログ遺伝子と３つ偽遺伝子からなる、総称Ｚｓｃａｎ４と呼ばれる（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）。Ｚｓｃａｎ４ａ〜Ｚｓｃａｎ４ｆとして命名された６つのパラログのうち、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、及びＺｓｃａｎ４ｆのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は互いに非常に類似し、ＳＣＡＮドメインと４つのジンクフィンガードメインをコードする（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９５５０，２００７）。ｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２プラスミドを構築するために、マウスＺｓｃａｎ４ｃ遺伝子（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）の全ＯＲＦ（５０６ａ．ａ．）をＥＲＴ２（Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１０８８７−１０８９０，１９９６）と融合させ、ｐＰｙＣＡＧ−ＢｓｔＸＩ−ＩＰ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−１９９，１９９１）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドベクターは、強力なＣＡＧプロモーター下で、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質−ＩＲＥＳ−ピューロマイシン耐性タンパク質を発現する。
【０１５５】
ＺＥとＺＥＲＴ２  ＥＳ細胞クローンの生成
６ウェルプレートにおいてＥＳ細胞を増殖させた。ＺＥ  ＥＳ細胞クローンについて、懸濁液中の５×１０５ＥＳ細胞は、製造業者のプロトコールに従って、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、１μｇの線状化されたｐＺｓｃａｎ４−エメラルドベクター（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）でトランスフェクトされ、１００ｍｍディッシュに播種された。８日間の５μｇ／ｍｌブラストサイジンによる選択後、得られたＥＳ細胞コロニーをピックアップし、増殖させ、さらなる分析のために凍結した。ＺＥＲＴ２  ＥＳ細胞クローンについて、懸濁液中の５×１０５ＥＳ細胞は、製造業者のプロトコールに従って、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、線状化されたｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２ベクターと０．５μｇのＰＬ４５２（ＰＧＫプロモーター−Ｎｅｏ）でコトランスフェクションされ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １３：４７６−４８４，２００３）、１００ｍｍディッシュに播種された。８日間のＧ４１８による選択後、得られたＥＳ細胞コロニーをピックアップし、増殖させ、さらなる分析のために凍結した。
【０１５６】
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡは、生物学的に３点測定において、ＴＲＩＺＯＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞から単離された。１μｇの総ＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写された。反応あたり１００ｎｇのオリゴｄＴプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ｑＰＣＲについて、ＳＹＢＲ（商標）グリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用した。２５μｌの総反応体積を有する９６ウェルの光学プレートを用い、１０ｎｇのｃＤＮＡをウェルあたりに使用した。プレートは、７３００又は７５００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行された。誘導倍率は、正規としてＨ２Ａを用いて、ＡＡＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８，２００１）によって計算された。
【０１５７】
マウス着床前胚におけるＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製及びｑＰＣＲ分析
４〜６週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１雌マウスは、５ＩＵのＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ）と５ＩＵのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて過剰排卵された。ｑＲＴ−ＰＣＲ実験のための卵や胚は、それぞれ、ＭＩＩ（未受精卵卵母細胞）、１細胞、初期及び後期の２細胞、４細胞、８細胞、桑実胚と胚盤胞の胚について、ｈＣＧ注射の２０、２３、３０、４３、５５、６６、８０及び１０２時間後に回収された。１０個の同期化された卵や胚の３セットを液体窒素中に保存し、ｃＤＮＡ調製鋳型のために凍結／融解ステップによって機械的に破裂させた。オリゴｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用した。分析は、ＡＢＩ７３００ファーストリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行われた。データは、ＡＡＣｔ法（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８，２００１）を用いるＣｈｕｋ（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ  １３：３９４−４０３，２００６）によって正規化された。
【０１５８】
ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション
全量インサイチュハイブリダイゼーションは、従前（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ８：１８１−１９８，２００８）に記載のように行われた。簡潔には、３点測定のＥＳ細胞は、３日間増殖させ、４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定された。プロテイナーゼＫで消化した後、細胞を６２℃にて、一晩、１μｇ／ｍｌジゴキシゲニン標識リボプローブでハイブリダイズさせた。次に、細胞を洗浄し、ブロッキングし、アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体とともにインキュベートし、３０分間又は一晩、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出緩衝液中でインキュベートした。
【０１５９】
二重蛍光ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＲＮＡプローブ及びビオチン（ＢＩＯ）標識ＲＮＡプローブを、ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＰＣＲ産物の鋳型から転写した。エタノール沈殿させたプローブを水に再懸濁し、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＲＮＡ ６０００  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙによって定量した。細胞（１０５細胞／ウェル）をガラスチャンバースライドに播き、３日間培養し、ＰＦＡで固定し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。細胞を洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液中、６０℃において１２時間にわたって１μｇ／ｍｌのＤＩＧプローブ及びＢＩＯプローブとともにインキュベートした。プローブをマウス抗ＤＩＧ抗体及びヒツジ抗ＢＩＯ抗体によって検出し、フルオロフォアをコンジュゲートした二次抗体によって可視化した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。
【０１６０】
マイクロアレイ分析
ＤＮＡマイクロアレイ分析は、報告されているように（Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１６：７３−８０，２００９）行った。簡潔には、ユニバーサルマウス参照ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＣｙ５色素で標識し、Ｃｙ３標識試料と混合し、ＮＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ４４Ｋ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｖ２．２（Ｃａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．６：Ｒ６１，２００５）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる製造、＃０１４１１７）におけるハイブリダイゼーションのために使用した。各遺伝子特徴の強度をＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ９．５．１．１ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、スキャンされたマイクロアレイ画像から抽出した。ＡＮＯＶＡ及び他の分析を行うために開発されたアプリケーション（ＮＩＡ  Ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア；ｌｇｓｕｎ．ｇｒｃ．ｎｉａ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＡＮＯＶＡ／を参照のこと）（Ｓｈａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２５４８−２５４９，２００５）を使用することによって、マイクロアレイデータの分析を行った。全てのＤＮＡマイクロアレイデータは、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に寄託されており、ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓアクセッション番号（ＧＳＥ＃１５６０４）及びＮＩＡ  Ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアウェブサイト（オンラインｌｇｓｕｎ．ｇｒｃ．ｎｉａ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＡＮＯＶＡ／）（Ｓｈａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２５４８−２５４９，２００５）を介してアクセス可能である。ＧＥＯの校閲リンクについては、下記の通りである：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ｔｏｋｅｎ＝ｆｈａｘｔｍｉｕｅｙｋｉｇｖｍ＆ａｃｃ＝ＧＳＥ２６２７８。
【０１６１】
２Ｎ又は４倍体（４Ｎ）胚盤胞へのＥＳ細胞の注入
ＣＤ１雌（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、８〜１２週齢）は、ｈＣＧ（Ｓｉｇｍａ）投与による４８時間後、ＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ）により過剰排卵のために使用された。ｈＣＧ投与後、雌を同系統の雄と交配させ、２細胞胚を卵管のフラッシングによって回収した。回収された胚を３７℃で３日間、５％ＣＯ２にてＫＳＯＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）培地において培養した。回収された２細胞胚を直接０．３Ｍマンニトール溶液中に移し、電気融合チャンバー内で交流（ＡＣ）パルスによって自動的に整列させた。その後、１４０Ｖ／ｍｍの２つの直流（ＤＣ）のパルスを４０μｓ間、ＬＦ１０１電気細胞融合発生装置を用いて適用した。１つの割球を有する融合した胚（４Ｎ）は、培養６０分にて回収され、それらは胚盤胞期に達するまでＫＳＯＭ培地中で培養が続けられた。単一のＥＳ細胞又は１０〜１５個のＥＳ細胞は、それらの発生能を評価するために２Ｎ又は４Ｎの胚盤胞に注入され、次にＥ２．５レシピエント雌に移された。ＥＳ細胞に対するＴｍｘの効果を研究するために、ＥＳ細胞は、注射前の２〜３日間、２００ｎＭのＴｍｘの存在下で培養された。
【０１６２】
実施例２：Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化による多能性幹細胞の若返り
この実施例は、マウスＥＳ細胞のＺｓｃａｎ４活性化の頻度を増加させることが、長期的な細胞培養での発生能を増加させるだけでなく、維持もするという知見を記載する。
【０１６３】
一過性Ｚｓｃａｎ４＋状態と２細胞状態の胚の間の共通性
ＥＳ細胞のＺｓｃａｎ４＋状態を特徴付けるための最初のステップとして、全体的な遺伝子発現プロフィールは、Ｚｓｃａｎ４＋とＥＳ細胞のＺｓｃａｎ４＋の間で比較された。先の研究においては、レポーター細胞株、ｐＺｓｃａｎ４−エメラルド細胞（以下「ＭＣＩＺＥ」と呼ぶ）を確立し、ここでは、Ｚｓｃａｎ４ｃ−プロモーター駆動のリポーター緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ−エメラルド（Ｅｍ）が、内因性Ｚｓｃａｎ４の発現を再現した（Ｚａｌｚｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。ＦＡＣＳソートされたＥｍ＋及びＥｍ−細胞のＤＮＡマイクロアレイ分析を行った。Ｅｍ＋細胞は、たった１６１個の示差的に発現された遺伝子を有するＥｍ−細胞と、非常に類似した発現プロフィールを示した（図５；ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／１１８９５７及びＦａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７も参照）。多能性関連マーカーは、Ｅｍ細胞と比較してＥｍ細胞では変わらなかったが、ＴｃｓｔｖｌとＴｃｓｔｖ３（２細胞特異的転写産物改変体１と３）遺伝子（Ｓｔｒｕｗｅ及びＳｏｌｔｅｒ，ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＦ０６７０５７．１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：４７８０−４７９０，２００６）は、最も非常に上方制御された遺伝子に含まれた（図５）。ＲＮＡ全量インサイチュハイブリダイゼーションは、リスト中の７つの他の遺伝子について「Ｚｓｃａｎ４様」発現を示した（Ｔｃｓｔｖｌ／３、Ｅｉｆｌａ、Ｐｉｆｌ、ＡＦ０６７０６３、ＥＧ６６８７７７、ＲＰ２３−１４９Ｄ１１．５、ＢＣ０６１２１２、及びＥＧ６２７４８８；ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１８９５７を参照されたい。参照により本明細書に援用される）。
【０１６４】
さらに、二重標識蛍光ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションは、これらの遺伝子とＺｓｃａｎ４の共発現を確認した。Ｚｓｃａｎ４は２細胞胚マーカーであるため（Fａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）、６つの遺伝子は、着床前胚における付加的な遺伝子発現情報に基づくリスト（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：１７３７−１７４９，２０００；Ｓｈａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  １：Ｅ７４，２００３）から選択され、ｑＲＴ  −ＰＣＲによってそれらの発現プロフィールを調べた。試験した全ての６つの遺伝子は、２細胞期胚において高い発現ピークを示した：２つの遺伝子はＺｓｃａｎ４として後期２細胞状態で最大ピークを示し、一方、他の４つは、Ｚｓｃａｎ４として早期２細胞状態でそれらの最大ピークを示した（参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１８９５７参照）。全量インサイチュハイブリダイゼーションによる約２５０個の転写因子遺伝子の大規模スクリーニングがたった２つの他の遺伝子（Ｒｈｏｘ９及びＷｈｓｃ２）を同定し、「Ｚｓｃａｎ４様」発現パターンを有するという事実（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐ  ｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ８：１８１−１９８，２００８）を考慮して、ＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４様発現パターンを有する２細胞遺伝子の発見の高い発生率は、初期段階の肺における遺伝子の発現プログラムのいくつかがＥＳ細胞のＺｓｃａｎ４段階において再活性化される。
【０１６５】
一過性Ｚｓｃａｎ４＋状態はより高い発生能と関連付けられない
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）中の細胞と同等であると考えられる（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８：３−８，２０１１；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ６：２１３−２２４，２００６）。Ｚｓｃａｎ４＋状態と２細胞胚の間の共通性は、標準的な細胞培養条件において、ＥＳ細胞は、２細胞様の細胞の約５％とＩＣＭ様の細胞の約９５％の混合集団であることを示唆する。核移植（クローニング）によって、２細胞核はＩＣＭ核よりも高い発生能を有するため（Ｔｓｕｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０７：４０７−４１１，１９８９；Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  ９３：１６５−１７２，１９９１）、Ｚｓｃａｎ４＋状態は、通常のＥＳ細胞集団のうち高い潜在的な真の幹細胞を表す可能性がある。
【０１６６】
この概念を試験するために、Ｖ６．５  ＺＥ細胞（クローン＃１７）を生成し、それらの発生能は、ＦＬハイブリッド株（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９／ＳＶ）由来のＶ６．５  ＥＳ細胞にｐＺｓｃａｎ４−エメラルドベクターをトランスフェクトすることにより評価した。これは、発生能を試験するために広範囲に使用されている（Ｅｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４，２００１；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７５：１９２−２０１，２００４）。細胞選別又は長期ＵＶ曝露によって引き起こされる細胞損傷を避けるために、Ｅｍ＋又はＥｍ−細胞をピペッティングにより手動で分離し、単一のＥＳ細胞は２Ｎ胚盤胞に注入され、その後の胚発生を観察した。コート色に基づいて、Ｅｍ−ＥＳ細胞は、相対的に高い割合（３１％）でキメラマウスの組織に貢献することができたのに対し、Ｅｍ＋ＥＳ細胞は貢献しなかった（０％）ことがわかった。結果は、予想に反して、Ｚｓｃａｎ４＋細胞はＺｓｃａｎ４−細胞と比較して高い発生能に関連付けられていないことを示している。
【０１６７】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２はＴｍｘの不存在において内因性Ｚｓｃａｎ４＋細胞の頻度を増加させる
Ｚｓｃａｎ４の断続的及び一過性の活性化は、ＥＳ細胞培養の長期的な維持のために必要とされる（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４６４：８５８−８６３、２０１０）。したがって、Ｚｓｃａｎ４のより頻繁な活性化は、さらに、それらの発生能を含むＥＳ細胞の品質を改善すると仮定された。Ｚｓｃａｎ４の一過性の発現を模倣するシステムが求められていた。この目的のために、ＥＲＴ２、タモキシフェン（Ｔｍｘ）誘導システムを選択した（Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１０８８７−１０８９０，１９９６）。このシステムは、Ｔｍｘの不存在下でトランス遺伝子をオフにしておき、Ｔｍｘの存在下で随意にそれをオンにすることができる（Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１０８８７−１０８９０，１９９６）。第一に、プラスミド構築物のｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２を作製し、そこでは、ＥＲＴ２ドメインと融合されたＺｓｃａｎ４ｃオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なユビキタスなプロモーターＣＡＧによって駆動することができる（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−１９９，１９９１）（図１Ａ）。
【０１６８】
ｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２プラスミドをＭＣ１−ＺＥ３細胞にトランスフェクトした場合、ＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の構成的発現は、Ｔｍｘ−条件においてさえ、Ｅｍ＋細胞の分画を増加させた（図１Ｂ）。培養培地へのＴｍｘの添加によって、Ｅｍ＜＋＞細胞の分画をさらに増加させたが、ＥＳ細胞（Ｅｍ＜＋＞細胞とＥｍ＜−＞細胞の両方）をより平坦なものにし、典型的な多能性ＥＳコロニー形態学からの逸脱であるＥＳ細胞コロニーの平坦化をもたらした。結果は、さらに、５つの独立したクローンについて定量的アッセイによって確認された：Ｔｍｘの不存在下でさえＺｓｃａｎ４−ＥＲＴの構成的発現は、フローサイトメトリー分析により、Ｅｍ＋細胞の３倍増加をもたらし（図１Ｃ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、５倍増加をもたらした（図１Ｄ）；培地へのＴｍｘの添加は、さらに、それぞれ２倍及び１．２倍の増加を引き起こした（図１Ｃ〜１Ｄ）。
【０１６９】
さらに、この予想外の結果を調べるために、ｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２プラスミドをＶ６．５  ＥＳ細胞にトランスフェクションし（Ｅｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４，２００１）、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２と命名された複数の細胞クローンを単離した。Ｚｓｃａｎ４  ＯＲＦのｑＲＴ−ＰＣＲ分析に基づいて、クローン＃１８は、最高Ｚｓｃａｎ４発現レベルについて選択され、クローン＃７と＃１０は、第二と第三の発現レベルについて選択され、クローン＃２は、バックグラウンドＺｓｃａｎ４レベルで選択された（図６Ａ）。ＰＣＲによる遺伝子型に基づいて、クローン＃２は、ｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４ＥＲＴ２プラスミドのいずれのコピーも有しておらず、したがって、対照（Ｖ６．５＃２）として使用された。予想通り、Ｔｍｘ＋条件は、ＥＳ細胞の増殖を鈍化し（図６Ｂ）、ＥＳ細胞を平坦化した（図６Ｃ）。Ｔｍｘは、Ｔｍｘ＋条件で１０継代後、培地から除去された場合、細胞増殖及び形態学は正常に戻り（図６Ｂ〜６Ｃ）、これはＶ６．５  ＺＥＲＴ２細胞に対するＴｍｘの効果は可逆的であることを示唆した。
【０１７０】
Ｚｓｃａｎ４＋細胞の頻度がＴｍｘ状態でさえ増加するかどうかを調べるために、全量インサイチュハイブリダイゼーションが、内因性及び外因性コピーのＺｓｃａｎ４を検出する全長Ｚｓｃａｎ４ｃプローブ、ならびに内因性Ｚｓｃａｎ４のみを検出する３’−ＵＴＲ  Ｚｓｃａｎ４ｃプローブを用いて行われた。結果は、対照細胞（Ｖ６．５とＶ６．５＃２）におけるＺｓｃａｎ４＜＋＞細胞の通常レベルと比較して、Ｔｍｘの不存在下でのＶ６．５  ＺＥＲＴ２  ＥＳ細胞クローン（＃７、＃１０、及び＃１８）におけるＺｓｃａｎ４＋細胞数の約３倍増加を示した（図１Ｅ）。ＤＮＡマイクロアレイによる全体的な遺伝子発現プロフィールのさらなる比較は、Ｚｓｃａｎ４の発現が、Ｔｍｘ−条件でさえ、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞において３．６倍に上方制御されたことを確認した（図７及び８）。同様に、Ｆａｌｃｏら（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）において同定された他の主要なＺｓｃａｎ４関連遺伝子、例えば、Ｔｃｓｔｖｌ、Ｔｃｓｔｖ３、Ｔｍｅｍ９２、ＲＰ２３−１４９Ｄ１１．５、及びＢＣ０６１２１２はまた、Ｔｍｘ−条件において、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１８ＥＳ細胞において上方制御された（図１Ｆ、図７、図８）。Ｔｍｘの添加は、ほんのわずかにＺｓｃａｎ４及びＺｓｃａｎ４関連遺伝子の発現を増加させたが、Ｚｓｃａｎ４と無関係な遺伝子の発現を有意に増加させた（図１Ｇ、図７、図９）。まとめると、Ｔｍｘを用いないで構成的に発現するＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の使用は予期しないものであったが、内因性Ｚｓｃａｎ４＋細胞の数を増加させることによって、天然に存在するＺｓｃａｎ４効果を高めるための魅力的な戦略となった。
【０１７１】
Ｃ末端を欠損しているＺｓｃａｎ４タンパク質（Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣ）はＺｓｃａｎ４＋細胞数を増加させる
上述の結果に基づくと、ＥＲＴ２の効果は、タンパク質のＣ末端でＺｓｃａｎ４ジンクフィンガードメインの機能をブロックしたことによるものと仮定された。従って、Ｃ末端が切断されたＺｓｃａｎ４がＺｓｃａｎ４の再発活性化を誘導するＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２と同様の効果を有するか否かを評価するために、Ｃ末端切断型（４つすべてのジンクフィンガードメインを欠損している）又はＮ末端切断型（ＳＣＡＮドメインを欠損している）Ｚｓｃａｎ４のいずれかをコードするベクターを構築した。図２Ａは、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣ、及びＺｓｃａｎ４ｃ−ΔＮタンパク質の構造の概略を示す。Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣのアミノ酸配列は、配列番号２５として本明細書に記載されている。
【０１７２】
突然変異したＺｓｃａｎ４ｃ遺伝子を強力かつ構成的なＣＡＧプロモーター下に置いた。ｐＣＡＧ−Ｚｓｃａｎ４−ΔＣベクターの配列は配列番号２４として本明細書に記載されている。各ベクターは、ＭＣ１−ＺＥ１６  ＥＳ細胞（ＭＣ１−ＺＥ３の姉妹クローン）にトランスフェクトされた。複数の独立したクローンを単離した：Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣについて、ＺＤＣ−ＭＣ１−ＺＥ１６＃３、＃４、＃２０；Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＮについて、ＺＤＮ−ＭＣ１−ＺＥ１６＃５、＃８、＃１５。蛍光顕微鏡観察は、それぞれの細胞クローンについて行われた。ＺＤＣ−ＭＣ１−ＺＥ１６＃３、＃４、＃２０及びＺＤＮ−ＭＣ１−ＺＥ１６  ＃５、＃８、＃１５の画像は、図２Ｂ〜２Ｇに示されている。結果は、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣの発現がＺｓｃａｎ４＋細胞数を増加させ、一方、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＮの発現がＺｓｃａｎ４＋細胞数を頒価させないことを明らかに示す。結果は、Ｚｓｃａｎ４ｃ−ΔＣがＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２（Ｔｍｘ−条件）と同様に機能することを示す。
【０１７３】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２はＴｍｘの不存在下でＥＳ細胞の発生能を増大及び維持した
ＥＳ細胞の発生能に対してＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の効果を評価するために、種々のＥＳ細胞をマウス胚盤胞に注入し、子宮に移し、それらを発生させた。ＥＳ細胞能力の程度は、コート色に基づいて、イヌにおけるキメラの割合によって評価された：高い（＞７０％キメラ化）、中等度（４０％〜７０％）、低い（＜４０％）、及びアルビノ（０％）（図３Ａ）。
【０１７４】
その初期の継代（ｐ１５）におけるＶ６．５親ＥＳ細胞株は、ＦｌハイブリッドＥＳ細胞株のための基準範囲内にある、１８％高い、２９％中等度、及び４１％低いキメラ化を示した。ＥＳ細胞の発生能は、一般に、複数回の継代及び／又はプラスミドトランスフェクション／薬物選択後に低くなることが知られている。予期した通り、Ｖ６．５親ＥＳ細胞株と比較して、対照Ｖ６．５  ＃２  ＥＳ細胞株は、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２を担持しないが、トランスフェクション及び薬剤選択後に生成され、僅かに低い全体的な潜在力を示し、複数回の継代中（ｐ２１、ｐ２３、及びｐ３０）にさらに減少した（図３Ｂ）。これとは対照的に、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８  ＥＳ細胞は、親Ｖ６．５と対照Ｖ６．５＃２ＥＳ細胞よりも非常に高い発生能を示した：継代１９での７３％高い、２７％中等度の適度なキメラ化（図３Ｂ）。さらに驚くべきことは、潜在力のこのような高いレベルは、長期の時間と継代について維持された：例えば、継代３０でされ、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞由来の４０％を超えるイヌは、「高い」キメラ化を示し、一方、対照Ｖ６．５  ＃２ＥＳ細胞由来のイヌは「高い」キメラ化を示さなかった（図３Ｂ）。異なる遺伝的背景及びトランス遺伝子の他の５つのＥＳ細胞株が試験され、新たに単離されたＥＳ細胞（ＴＡ１）からの非常に初期の継代株を含む。潜在力について、これらのＥＳ細胞株は、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１８細胞株に近づくことができなかった（図３Ｂ）。
【０１７５】
興味深いことには、２〜３日間のＴｍｘへの暴露は、Ｔｍｘ−状態と比較して、Ｖ６．５  ＃２とＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞の両方の潜在力を低下させたが、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞は、依然として、Ｖ６．５＃２ＥＳ細胞よりも高い潜在力を示し（図３Ｂ）。これらの結果は、全体的な発現プロファイリングによってなされた観察と一致しているようである（図１Ｆ）：Ｔｍｘ＋条件は、Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞において天然に生じるＺｓｃａｎ４＋（すなわち、Ｅｍ＋）と無関係な遺伝子発現を増加させた。
【０１７６】
４Ｎ相補アッセイによってＥＳ細胞の発生能を試験すること
発生能についての最終試験は、単独で４倍体（４Ｎ）胚盤胞に注射されたＥＳ細胞が、全マウスになっている（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０：８１５−８２１，１９９０）かどうかを確認することであるが広く認識されている。期間終了時に生存していた１５〜２５％のイヌを達成している、従前（Ｅｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４，２００１）に報告されている初期継代Ｖ６．５  ＥＳ細胞と比較して、継代１８のＶ６．５  ＥＳ細胞だけが、２％の生存胚を生成した（図４Ａ）。対照的に、継代１９のＶ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１８ＥＳ細胞は、非常に高い成功率を示し、４３％が生存胚であった（図４Ａ及び４Ｃ）。同様に、他の２つの独立したクローン（Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃７；Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１０）は、１０〜１５個のＥＳ細胞が４Ｎの胚盤胞に注入した場合、高い成功率の生存胚の生成を示した（図４Ａ）。
【０１７７】
高い成功率のＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８細胞と考えられる最良のＥＳ細胞とを比較するために、新たに単離されたＥＳ細胞は、同じ遺伝的背景を有する胚盤胞−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃのＦｌハイブリッドから樹立さ、現在入手可能な最良の条件で培養された（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４７６：２６５−２８３，２０１０）（図１０及び図１１）。２０個の胚盤胞のうち、１９個は、インビトロで増殖物を形成し、そのうちの１３個は、さらに７日間培養を継続し、ＥＳ細胞コロニーを形成させた。これは、新たに樹立されたＥＳ細胞株をもたらした（図１０）。最先の継代（ｐ１３）の１３個のＥＳ細胞株のうち６個のクローンは、４Ｎ胚盤胞に１０〜１５個のＥＳ細胞を注入することによって、それらの潜在力を試験した。１つのＥＳ株は「ＴＡ１」と命名され、Ｅ１３．５で生存胚生成の最高効率（６０％）を示した（図４Ａ及び図１１）。全体的に、４Ｎ相補アッセイによって得られたこれらの結果は、より高い継代数のＶ６．５  ＺＥＲＴ２＃１８ＥＳ細胞の発生能が、新たに単離された初期継代のＥＳ細胞に匹敵することを示している。
【０１７８】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２がＦ１ハイブリッドＥＳ細胞株にのみ影響を及ぼすという可能性を排除するために、ＭＣ２  ＺＥＲＴ２  ＃６ＥＳ細胞は、ＭＣ２  ＥＳ細胞株（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：６６０２−６６０６，２００３）にＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２プラスミドをトランスフェクトすることによって生成させた。報告されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ由来のＥＳ細胞の低い潜在力（Ｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：５７０９−５７１２，１９９７；Ｅｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６２０９−６２１４，２００１）と一致して、継代１７のＭＣ２  ＥＳ細胞と継代１２〜１３の遺伝的に修飾されたＭＣ２  ＥＳ細胞は、いずれの生存胚を生じさせなかった（図４Ａ）。これとは対照的に、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の構成的発現を伴う１０回を超える継代で培養されたＭＣ２  ＺＥＲＴ２  ＃６ＥＳ細胞は、首尾よく６％の生存胚の生産を達成した（図４Ａ）。したがって、結果は、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２構築物が、多能性幹細胞の発育能を高めるための普遍的なツールとして使用され得ることを示唆している。
【０１７９】
Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１８細胞の異常に高い発生能は、単一のＥＳ細胞の潜在力のさらなる検討を促した。単一のＥＳ細胞でさえ生きたイヌを形成することができることを以前に示されたが、成功率は非常に低い（１匹のマウス／１９２個の注射された胚盤胞：０．５％）（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７５：１９２−２０１，２００４）。同じ細胞株が先の研究のために使用されたという事実（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７５：１９２−２０１，２００４）から予測されるように、４Ｎ胚盤胞への継代１８の単一の親Ｖ６．５  ＥＳ細胞の注入は１個の生存胚（１％）を生じさせた（図４Ｂ）。さらに、単一の対照Ｖ６．５  ＃２ＥＳ細胞は、７７個の４倍体胚盤胞にそれらを注入後、いずれの生存胚を生じさせなかった（図４Ｂ）。これとは対照的に、単一のＶ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１８細胞を受け入れた４４個の４倍体胚盤胞のうち、３個（７％）は完全な胚になり、そのうち２個（５％）は、解剖の時点で生存していた。Ｖ６．５  ＺＥＲＴ２  ＃１８ＥＳ細胞についてこの異常に高いレベルの潜在力は、４％の生存胚をともなう初期継代のＴＡ１  ＥＳ細胞に確かに匹敵していた（図４Ｂ）。
【０１８０】
検討
本明細書では、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の構成的存在は、通常の活性化因子ＴＭＸなしに、内因性Ｚｓｃａｎ４活性化の頻度を増加させることができ、結果としてＥＳ細胞の発生能の増加をもたらすことが開示されている。加速されたＺｓｃａｎ４活性化サイクルにおいて培養されたＥＳ細胞は、改善されたキメラ化と潜在力を示し、これらは、キメラマウス及び単一のＥＳ細胞からの全マウスの効率的な生成における高い寄与によって実証される。
【０１８１】
Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化は、ＥＳ細胞の発生能をどのように増大させ、持続させるのか？従前に、ＥＳ細胞の不死性は、Ｚｓｃａｎ４の間欠的な活性化によって維持されることが示された（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。Ｚｓｃａｎ４のｓｈＲＮＡ媒介性連続抑制は、複数回の細胞継代後にＥＳ細胞を培養危機に被るようにする（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。したがって、通常の増殖条件においてでさえ、ＥＳ細胞は、徐々にそれらの潜在力を喪失し、それは、Ｚｓｃａｎ４の一過性活性化によって急速に回復されることが考えられる（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）。テロメア姉妹染色分体交換による急速テロメア伸長（Ｚａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：８５８−８６３，２０１０）を含む劇的な変化がＺｓｃａｎ４＋状態におけるＥＳ細胞において発生しているという考えと一致して、Ｚｓｃａｎ４＋細胞（本明細書に記載の実験におけるＥｍ＋細胞））は、胚盤胞に注入された場合、キメラ動物を生成しなかった。標準的なＥＳ細胞において、一過性Ｚｓｃａｎ４活性化の間隔は理想よりも長い場合がある；従って、ＥＳ細胞は、着実に、Ｚｓｃａｎ４の偶発的な活性化にも関わらずに、それらの平均潜在力を喪失する（図４Ｅ、上段パネル）。Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の存在によるＺｓｃａｎ４のより頻繁な活性化は維持され、又はＥＳ細胞の潜在力を高めさえする可能性がある（図４Ｅ、下段パネル）。
【０１８２】
ＥＲＴ２融合タンパク質は、通常、それらの活性化のためにＴｍｘを必要とするため、ＴｍｘなしでＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２による内因性Ｚｓｃａｎ４の活性化は予想外であった。これはＺｓｃａｎ４機能の部分的ブロッキングに関連し得て、それは、ＥＲＴ２ドメインが４つのジンクフィンガー（Ｃ２Ｈ２）ドメイン近傍でＺｓｃａｎ４のＣ末端に融合され、一方、ＳＣＡＮドメインはＮ末端に位置している（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３０７：５３９−５５０，２００７）ためであることが推測される。Ｚｓｃａｎ４がＥＳ細胞において構成的に活性でないはずであるという事実を考慮すると、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２機能の予想外の発見は、内因性Ｚｓｃａｎ４発現の断続的な活性化を増加させる理想的な手段を提供する。メカニズムに関係なしに、ＥＳ細胞におけるＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２の存在は、長期培養中のＥＳ細胞の潜在力に対して有益な効果を有する。
【０１８３】
本開示の原理が適用されてもよい多くの可能な実施形態を考慮して、図示された実施形態は、本開示の単なる例であり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本開示の範囲は、特許請求の範囲によって定義される。本出願人は、これらの請求の範囲及び精神に含まれるすべてを請求する。
【０１８４】
実施例３：Ｚｓｃａｎ４ｃ単独の過剰発現はＥＳ細胞を活性化させ得る
Ｚｓｃａｎ４自体（すなわち、未修飾のＺｓｃａｎ４タンパク質）の一過性の過剰発現が、ＥＳ細胞の発生能を増加させ得るかどうかを試験するために、本出願人は、ＰＢ−ｔｅｔＺｓａｎ４ｃ−ＩＲＥＳ−ベータ−ジオベクターを作製し、そこでは、Ｚｓｃａｎ４ｃ  ＯＲＦの発現は、Ｄｏｘ誘導性ｔｅｔＯプロモーターによって駆動される（図１２）。また、ベクターは、ベータ−ジオ、Ｇ４１８耐性遺伝子を含み、その結果、Ｄｏｘ誘導性Ｚｓｃａｎ４ｃベクターを含むＥＳ細胞だけが、Ｇ４１８の存在下で選択することができる。このｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、ＰＢ−ＣＡＧ−ｒｔＴＡベクター（ｔｅＯプロモーターのＤｏｘ消失性に必要なＤｏｘトランス活性化因子）とＰｃｙＬ４３トランスポザーゼベクター（ゲノムにｐｉｇｇｙＢａｃベクターの統合を促進する酵素）でトランスフェクトされた。トランスフェクション後、細胞を６日間、Ｇ４１８及びＤｏｘ＋の存在下で培養し、次に、実質的にＤｏｘの不存在下で培養した。これらの細胞は、Ｖ６．５  ｔｅｔＺｓｃａｎ４  ＥＳＣと命名された。対照として、親Ｖ６．５  ＥＳ細胞を用いた。  Ｚｓｃａｎ４の発現は、培地中にＤｏｘを添加することによって、一過性に増加させた（青色ボックスで示される；図１２）。
【０１８５】
これらの細胞を培養し、３日ごとに継代した。特定の継代では、これらの細胞は、これらの細胞がＥ１３．５で生存マウス胚を形成することができるかどうかを確認するために、４倍体（４Ｎ）胚盤胞に注入された。注入された胚盤胞数のうちの生存胚のパーセント分画は、ＥＳ細胞の発生能を表す（図１２のｙ軸）。
【０１８６】
予期されたように、対照Ｖ６．５  ＥＳ細胞は、初期継代（継代１２）で最大の発生能を示し（３％）、複数回の継代で徐々に減少した（図１２）。継代２４では、対照Ｖ６．５  ＥＳ細胞は完全にそれらの潜在力を喪失した。対照的に、Ｖ６．５  ｔｅｔＺｓｃａｎ４ｃ  ＥＳ細胞は、３％（継代１２）から９％（継代１８）の一過性のＺｓｃａｎ４過剰発現後、発生能の増加を示した。細胞がそれらの発生能を喪失し始めたとき、本出願人らは、培養培地にＤｏｘを添加し、一過性にＺｓｃａｎ４を過剰発現させた。図１２に示すように、Ｚｓｃａｎ４の一過性過剰発現は、ＥＳ細胞の発育能を増加させることができた。その後、本発明者は、時折Ｚｓｃａｎ４を過剰発現させることによって、ＥＳ細胞は、長期の細胞培養（最大３７回の継代まで試験された）後でされ、それらの発生能を維持することができることを示すことができた。
【０１８７】
これらのデータは、Ｚｓｃａｎ４単独の一過性過剰発現が、ＥＳ細胞において、発生能を増加する（すなわち、若返らせる）ができることを明らかに実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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