(57)【要約】  本発明は、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも４つのドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインはリンカーアミノ酸配列により分離されており、それにより、各ドメインには別個のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなポリペプチドの発現のための宿主細胞、そのようなポリペプチドを含む医薬組成物、及び本発明の少なくとも２種のポリペプチドを含むキットオブパーツに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも４つのドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインはリンカーアミノ酸配列により分離されており、それにより、各ドメインには別個のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチド。
【請求項２】
エフェクター機能を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
６つのＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインを有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも１つは免疫グロブリン断片を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの免疫グロブリン断片は、天然の、突然変異した及び／又は合成のＶＨである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも１つは一本鎖Ｔ細胞受容体ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記特異的結合ドメインはＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体に結合できる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記特異的結合ドメインは、腫瘍関連抗原由来のペプチドを含むＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体、特に種々のＭＡＧＥペプチドを含むＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体に結合できる、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも１つは、
ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ又はＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記リンカーのうちの少なくとも１つは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）Ｎ、（ＧＳＴＳＧＳ）ｎ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ、ＥＦＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＬＥＳＳＧＳＧ、若しくはタンパク質フォールディングに対する柔軟性を付与する他の任意のリンカー、又はＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（ＩｇＧ１）、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（ＩｇＧ３）若しくはＥＳＫＹＧＰＰ（ＩｇＧ４）に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｈｅｘａ−ＡＨ５：ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；又は
Ｈｅｘａ−１１ＨＣＨ１：ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ；又は
Ｈｅｘａ−１１ＨＡＨ５：ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＰＧＳＧＥＧＴＫＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＦＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＬＥＳＳＧＳＧＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＰＧＳＧＥＧＴＫＧＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記特異的結合ドメインは、本質的にもっぱら前記ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する能力を有し、前記ペプチド自体、別のＭＨＣ−ペプチド複合体又は空のＭＨＣには結合しない、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸を宿主細胞のゲノムに組み込むための手段をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１３に記載の核酸に作動可能に連結された分泌シグナルをさらに含む、請求項１４又は１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現のための宿主細胞であって、請求項１１、１２又は１３に記載の核酸が組み込まれた宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を培養するステップと、請求項１３に記載の核酸を発現させるステップと、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを採取するステップと、を含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドと、適切な希釈剤及び／又は賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項２０】
従来の細胞増殖抑制及び／又は殺腫瘍剤をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌の治療において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
癌のアジュバンド治療において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
癌の組合せ化学療法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
異なるＨＬＡ対立遺伝子を対象とする本発明の少なくとも２種の異なるポリペプチドを含むキットオブパーツ。
【請求項２５】
異なるＭＨＣ−ペプチド複合体を対象とする本発明の少なくとも２種の異なるポリペプチドを含むキットオブパーツ。
【請求項２６】
エクスビボ又はインビボ画像処理における検出のための手段をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドと、細胞増殖抑制又は殺腫瘍剤と、のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は生物学的療法の分野に関する。本発明は腫瘍生物学の分野にも関する。特に、本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する特異的結合分子に関する。より具体的には、細胞上のＭＨＣ−ペプチド複合体に架橋結合することによって細胞死を誘導するものと思われる、ヒト抗体可変（重）断片の一本鎖の多価（好ましくは四価以上、特に六価）のリピートが提供される。本発明はまた、癌細胞及び他の異常細胞を選択的に死滅させる際のこれらの結合分子の使用に関する。
【背景】
【０００２】
[0002]前世紀６０年代以降、患者の体内において腫瘍細胞を選択的に死滅させ、正常細胞はそのままにしておくために、免疫系の特異的結合力（Ｔ細胞及び抗体）を使用することが提唱されてきた。特に抗体の標的となり得る多くの腫瘍抗原（例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ））が当時から提案されてきたが、これらの抗原の実質的にすべてにおいて発現は正常組織にも同様に関連している。そのため、これまでそれは達成困難な目標であった。
【０００３】
[0003]我々は、先願のＷＯ２００７／０７３１４７（アポトーシス誘導タンパク質複合体及びその治療的使用）（参照により本明細書に組み込まれる）において、少なくとも６つのポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、ポリペプチドは、翻訳後の共有又は非共有非ペプチド結合をベースとするリンカー化学を介して組み立てられて複合体を形成する、ポリペプチド複合体を開示した。そのような複合体は、例えば、腫瘍細胞を（特異的に）死滅させるという目的を、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することによって達成する（理論に縛られるものではないが、現在のところ、それは架橋結合の結果であると我々は考えている）。しかし、そのような複合体を作製するのはかなり困難である。その理由は、発現後にポリペプチドを翻訳後組み立てによって機能的複合体にする必要があるからである。さらに、そのような複合体のインビボでの安定性が問題になる可能性がある。
【開示】
【０００４】
[0004]本願では、アポトーシスにより異常（腫瘍）細胞を死滅させるという目的は、特定の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも４つのドメインを含む一本鎖ポリペプチドであって、前記ドメインは、好ましくは、該ポリペプチドのペプチド骨格に組み込まれたペプチド骨格を有するリンカーアミノ酸配列によって分離されており、それにより、各ドメインには別個のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチドを提供することによって達成できることが開示される。より具体的には、本発明は、ＤＮＡレベルで一本鎖に組み立てられ、ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する複数の組換え抗体断片であって、複数のＭＨＣ−ペプチド複合体が架橋結合すると細胞死、特にアポトーシスを誘導できる断片に関する。本発明は特に、それらの組換え多価一本鎖ポリペプチドを用いて癌を診断及び治療する方法に関する。
【０００５】
序論：
[0005]ＭＨＣ分子の主要な免疫機能は、抗原ペプチドに結合して「提示」し、リンパ球の抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識及び結合のために細胞の表面にＭＨＣ−ペプチド（ＭＨＣ−ｐ）複合体を形成することである。その機能に関しては、次の２つのクラスのＭＨＣ−ペプチド複合体が区別できる。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体は、ほとんどすべての有核細胞により発現されて、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を引き付けることが可能である。
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体は、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ））上でのみ構成的に発現される。
【０００６】
[0008]ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体は、可変重鎖、不変βミクログロブリン及び抗原ペプチドで構成されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、結合して成熟ＭＨＣクラスＩＩ分子に特徴的なαβヘテロ二量体を形成する特有のα及びβポリペプチドサブユニットによって特徴付けられる。ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子の差次的な構造特性は、Ｔリンパ球の異なる集団を活性化する各々の役割を説明する。細胞傷害性ＴＣリンパ球（ＣＴＬ）は、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される抗原ペプチドに結合する。ヘルパーＴＨリンパ球は、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原ペプチドに結合する。ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子はＣＤ８及びＣＤ４細胞接着分子に差次的に結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞傷害性ＴＣリンパ球上で発現されるＣＤ８分子によって特異的に結合される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴＨリンパ球上で発現されるＣＤ４分子によって特異的に結合される。
【０００７】
[0009]ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合ポケットのサイズは異なる。クラスＩ分子は小さい抗原ペプチド（典型的には８〜１０アミノ酸残基長）に結合する。クラスＩＩ分子は大きい抗原ペプチド（典型的には１３〜１８アミノ酸残基長）に結合する。
【０００８】
[0010]ヒトでは、ＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。ＨＬＡ会合ペプチドは短く、典型的には９〜２５アミノ酸を包含する。ヒトは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃという３種の異なるクラスＩ分子を合成する。ヒトクラスＩＩ分子はＨＬＡ−Ｄ（例えばＨＬＡ−ＤＲ）と命名されている。
【０００９】
[0011]ヒトの及び動物細胞のすべての有核細胞上で発現されるＭＨＣは、病原体及び癌に対する免疫防御において決定的に重要な役割を果たしている。正常細胞の異常癌細胞への形質転換は遺伝子発現のいくつかの重要な変化を伴う。これは、細胞の抗原組成の大きな変化をもたらす。新たな抗原性実体がＭＨＣ拘束性腫瘍関連抗原として提示されるということは確立されている。そのため、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ系は、絶えず細胞内タンパク質を処理し、細胞表面上での提示のための抗原ペプチドを生み出している天然のプロテオミクス走査チップと見なすことができる。これらの抗原ペプチドが免疫反応性を誘発すれば、形質転換された細胞は細胞免疫系により死滅させられる。しかし、形質転換された細胞が免疫媒介性細胞死滅に抵抗すれば、癌が発症する可能性がある。
【００１０】
[0012]種々の細胞型上のＭＨＣクラスＩ分子に結合する抗体は、その作用様式について詳細に研究されてきた。ＭＨＣクラスＩα鎖のＭＨＣクラスＩα１ドメインに結合するマウスモノクローナル抗体は活性化Ｔ細胞ではアポトーシスを誘導するものの、静止Ｔ細胞では誘導しない。他の報告では、例えばＭＨＣクラスＩのα３ドメインに特異的で、Ｂ細胞由来癌細胞において増殖阻害及びアポトーシスを誘導する抗体に言及されている。しかし、ここでは、アポトーシスの誘導に二次架橋抗体が必要である（Ａ．Ｅ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９年、２５１：１２８〜３４頁）。
【００１１】
[0013]ＭＨＣクラスＩ分子の不可欠な成分であるβ２−ミクログロブリン（β２−Ｍ）に結合する抗体もアポトーシスを誘導する。抗β２Ｍ分子で処理された血液癌細胞は、インビトロ及びインビボのいずれでも効率的に死滅させられた（Ｙ．Ｃａｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１１年、１５４：１１１〜１２１頁）。
【００１２】
[0014]このように、抗ＭＨＣ抗体によるＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子への結合がアポトーシス誘導を惹起し得ることは知られている。しかし、現在利用可能な抗ＭＨＣ抗体の治療的適用は標的細胞特異性の欠如に妨げられている。公知の抗体は主にＭＨＣ分子自体（例えばＨＬＡ−ＤＲ）のエピトープを対象とするため、細胞がアポトーシスを受けるようにすることができるかどうかは、ＭＨＣエピトープの細胞表面での発現に左右される。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子は正常細胞上でも疾患細胞上でも発現されるため、これらの抗体が正常細胞と正常でない細胞（例えば、腫瘍細胞及び／又は異常細胞）を区別することができないことは明らかである。その結果、これらの抗体の治療的価値は、健常な細胞の望ましくないアポトーシスにより引き起こされる副作用によって、無になることはないにしても著しく低下する。そのため、異常細胞の表面上で癌抗原由来のＭＨＣ提示ペプチドを特異的に認識する本発明の抗体は、抗癌細胞活性を有することが明らかになれば、治療レパートリーを劇的に拡大し、癌の根絶をもたらすであろう。また、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩを介してアポトーシスを誘導するための本発明の方法は、抗ＭＨＣ抗体の外部の架橋結合に依拠するものであってもよい。
【００１３】
[0015]ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する抗体を入手するのは依然として骨の折れる仕事であり、数件の失敗が報告されている。利用可能な抗体は、最初は、組換えＭＨＣ−ペプチド複合体又はペプチド負荷ＴＡＰ欠損抗原提示細胞でのマウスの免疫化の後に得ていたが、最近では、免疫されたトランスジェニックマウスから作製されたファージ抗体ライブラリーからの選択によって、あるいは完全ヒト抗体ファージライブラリーからの選択によって得ている。ＭＨＣ−ペプチド複合体での免疫化は極めて時間がかかる。さらに、マウス起源の抗体は、ヒト抗マウス抗体応答（いわゆる抗薬物抗体（ＡＤＡ））が発生する可能性があることから患者において繰り返し使用できない。ファージディスプレイ由来の抗体は、一般に抗原に対する親和性が低く、そのため、効率的に使用できるようになるにはさらなる修正が必要であろう。本発明において、抗体特異性は、好ましくは、癌関連ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子がライブラリーに提示されるファージ（又は酵母）ディスプレイを通じて選択される。詳細は実験パートで説明される。（トランスジェニック）マウスを用いて、ＭＨＣ−ペプチド複合体を特異的に認識するドメインを得ることも可能である。一本鎖ＭＨＣ−ペプチド分子はペプチドＭＨＣ複合体を模倣して作製できることが報告されている。例えば、ヒト免疫系の一部を有するマウスはそのような一本鎖分子で免疫することができる。本発明における抗体特異性はＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異性について調べられており、空のＭＨＣ（少なくとも空のＭＨＣ−１は安定ではないため、それほど関係がない）又は無関係なペプチドが負荷されたＭＨＣ又はペプチドそれ自身を（有意な程度には）認識しないはずである。
【００１４】
[0016]本発明の目的は、上記限界を少なくとも部分的に克服すること、そして、細胞死（特にアポトーシス）を特異的かつ効率的に誘導する薬学的活性分子であって、同時にそれほど厄介ではない方法で（すなわち多価一本鎖タンパク質として）製造される分子を提供することである。本発明の目的は特に、関心対象の細胞（例えば、腫瘍細胞のような異常細胞及び／又は腫瘍抗原を発現している自己免疫疾患関連異常細胞）のアポトーシスを特異的かつ選択的に誘導し、健常な細胞は本質的に影響を受けないままにしておくことである。ＭＨＣ−１ペプチド複合体はほとんどいかなる起源の腫瘍に関しても有用な標的であるが、ＭＨＣ−２ペプチド複合体は造血性起源の腫瘍に関して有用な標的である。腫瘍に加えて、ＭＡＧＥ発現は関節リウマチに関与する細胞においても明らかにされている（Ｄ．Ｋ．ＭｃＣｕｒｄｙら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００２年、２９：２２１９〜２２２４頁）。
【００１５】
発明の実施形態：
[0017]すなわち、本発明は、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも４つのドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインはリンカーアミノ酸配列により分離されており、それにより、各ドメインには別個のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチドを提供する。本発明によれば、典型的には、アミノ酸配列により分離されているすべての必要なＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインを含む１個のポリペプチドが提供される。このことは、本発明のすべての分子がＭＨＣ−ペプチドのみに結合する単一ポリペプチド鎖のみからなり得るということではない。例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチド上に、非ＭＨＣ−ペプチド特異性のある他の結合ドメインを付与することが可能である。第２の結合ドメインは、典型的には第１のドメインのような抗体由来結合ドメインを含まないが、結合ポリペプチドに他の望ましい特性（例えば、改良された半減期）を付与する。例えば、結合ポリペプチド上にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を付加すれば、半減期の延長等のために有用になり得る。本発明の分子は、後にＨＳＡに結合することができるように、ＨＳＡ等の分子に対する結合ドメインを含むこともできる。
【００１６】
[0018]理論に縛られるものではないが、ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインは、細胞膜上でいくつかのＭＨＣ−１分子（本明細書では、ほとんどの場合ＭＨＣ−１について説明することになる。本発明は、ＭＨＣ−２についても等しく適用可能である。）の近接した共局在（本明細書では架橋（結合）という。）を生じ、これが今度は細胞死をもたらすと思われる。共局在させる必要のあるＭＨＣ−１分子の数は変動し得るが、我々は、結合分子中の４つ以上のＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインに関して一貫した結果を得ている。
【００１７】
[0019]ポリペプチド上のＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインは同一でも異なっていてもよいが、特異性のためにはその大半は関連ペプチドの負荷されたＭＨＣ−１の複合体を認識しなければならない。この要件は機能上のものである。本発明のポリペプチドは、腫瘍細胞上のＭＨＣ−１負荷分子と架橋結合できなければならないが、異なる非腫瘍関連ペプチドが負荷されたＭＨＣ−１分子とも正常細胞上のＭＨＣ−１とも有意な程度には架橋結合すべきでない。すなわち、ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインはすべて、同じＭＨＣ−１−ペプチド複合体を（本質的には腫瘍関連ペプチド負荷の形態でのみ）認識するのが好ましい。選択及び産生が容易であるように、ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインは好ましくは同一である。同一でない場合は、ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインは好ましくは同じエピトープ又は少なくとも同じＭＨＣ−１−ペプチド複合体を認識する。結合ドメインは少なくとも、本質的にＭＨＣ−１ペプチド複合体のみに結合することになる程度の十分な親和性でＭＨＣ−１−ペプチド複合体に特異的に結合できなければならない。多くのＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインは当業者には周知である。免疫系由来のＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメイン（例えば、一本鎖Ｔ細胞受容体ドメイン、免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリンの断片）はすぐに分かる。好ましくは、上記ドメイン及び断片は１００〜１５０アミノ酸長である。好ましくは、ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインは抗体の可変重ドメイン又は軽ドメイン（Ｖｈ又はＶｌ）に類似する。そのようなＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインの良好な供給源はファージディスプレイライブラリーである。他の実施形態において、特異的結合ドメインのうちの少なくとも１つは一本鎖Ｔ細胞受容体ドメインを含む。
【００１８】
[0020]明細書全体を通じて、「断片」とは、タンパク質ドメインの一部であるアミノ酸配列、又はインタクトなタンパク質ドメインを構築するアミノ酸配列のことである。本発明の断片はそれぞれの標的に対して結合特異性を有していなければならない。
【００１９】
[0021]１個の分子内でタンパク質性ドメインを接続する技術は数多くあり、また周知である。ＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメイン（以下、明細書全体を通じて「結合ドメイン」とも呼ばれる。）が実際にライブラリーから物理的に選択されているかどうか又は情報（配列）のみが使用されているかどうかはほとんど無関係である。
【００２０】
[0022]ポリペプチド上の結合ドメインは、典型的にはリンカーアミノ酸配列により分離されている。ただし、境界上のいくつかのアミノ酸が標的への結合に関与していない結合ドメインが存在する場合（隣接配列）は、リンカーを必要としないことがある。結合ドメイン間のリンカーは同じでも異なっていてもよい。多くの場合、４〜１５アミノ酸の単純なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーで十分であるが、柔軟性のより大きなアミノ酸鎖が望ましい場合はより長い又はより複雑なリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）Ｎ、（ＧＳＴＳＧＳ）ｎ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ、ＥＦＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＬＥＳＳＧＳＧ、又はタンパク質フォールディングに対する柔軟性及びプロテアーゼに対する安定性をもたらす他の任意のリンカーである。他のグループの好ましいリンカーは、免疫グロブリンのヒンジ領域に基づくリンカーである。これらのリンカーは極めて柔軟性に富み、プロテアーゼに対して抵抗力が大きい傾向がある。例は実験パートに記載されている。最も好ましいリンカーは、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（ＩｇＧ１）、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（ＩｇＧ３）及びＥＳＫＹＧＰＰ（ＩｇＧ４）である。結合ドメインはリンカーのみによって分離されていてもよいが、他の有用なアミノ酸配列を、結合ドメイン間に又は最初若しくは最後の結合ドメイン配列のＮ末端若しくはＣ末端に導入してもよい。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドであって、さらなる機能（好ましくはエフェクター機能）を有するアミノ酸配列をさらに含むポリペプチドを提供する。本発明の利点の１つは産生の容易さ及び本発明の分子の単純さであるが、それだけで必要な機能すべてをコードする１個の核酸を選択すれば、こうして得られたポリペプチドに他の機能性を（選択された発現ベクター等に余地がある限度で）比較的簡単に追加することが可能になる。可能性は数多くある。エフェクター分子（例えば、毒素、アポトーシス誘導分子等のペイロード）を導入することが可能である。アポトーシスを導入するのに細胞当たり何個の架橋ＭＨＣ−１ペプチド複合体が必要かは現在のところ分かっていない。架橋複合体が１個だけで十分であるとすれば、ペイロードは実際には有用ではないかもしれない。架橋複合体が１個よりも多く必要であれば、本発明の分子が細胞に到達してはいるが十分な架橋複合体が形成されないような場合に、ペイロードが役に立つ可能性がある。その場合、（予想通りに）架橋複合体が内部に取り込まれるならば、ペイロードはその（細胞傷害）機能を発揮することができる。そのようなペイロードは細胞傷害効果の特異性に寄与することが好ましい。すなわち、異常細胞では細胞死を誘導するが、正常細胞では細胞死を誘導しないポリペプチドをペイロードとして使用するのが好ましい。そのようなポリペプチドは、アポプチン（ａｐｏｐｔｉｎ）又はその断片及び／又は誘導体である。細胞傷害性ポリペプチドとしては他に、例えば、コレラ毒素、リシンＡが挙げられる。導入し得る他の機能は、改良された半減期（ＨＳＡが含まれ得る）又は補体活性化（免疫グロブリンのＦｃ部分、この場合、本発明の分子は二量体化してもよい）に関連するものであってもよい。組み込むことができる他の機能性は、サイトカイン、ホルモン、トール様受容体リガンド等である。
【００２１】
[0023]十分な架橋結合をもたらすのに必要な結合ドメインの数は、結合ドメインが標的にする腫瘍によって変わり得る。腫瘍が異なれば、ＭＨＣ−１／ＭＨＣ−２発現のレベルも異なり、ペプチド提示のレベル等も異なることになる。ポリペプチド鎖当たり４〜１２結合ドメインが最適になると予想される。しかし、組織透過、発現及び産生の問題を除いて実際には上限はない。産生の容易さの点では、六量体（動物モデルにおいて優れた結果が証明されている。）が好ましい。すなわち、本発明は、６つのＭＨＣ−ペプチド複合体結合ドメインを有する本発明のポリペプチドを提供する。
【００２２】
[0024]上述のように、結合ドメインは、好ましくは免疫グロブリンドメイン又はドメインの断片（又は同等の一本鎖Ｔ細胞受容体ドメイン又は他の結合タンパク質）に基づくか由来する。免疫グロブリンドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ様ドメイン又は少なくとも１つのＣＤＲ様ループを含む少なくとも１つのドメイン、好ましくは３つのドメインを有するべきである。これらのＣＤＲ様ドメインは、適切な方法でＣＤＲ様領域を提示する（フレームワーク）ドメインにより分離されるべきである。適切なドメインはヒト抗体のＶｈドメインである。このドメインは「ラクダ化」されていてもよい。「ラクダ化」とは、複数のアミノ酸残基がラクダ科由来の（例えばラマＶｈ中の）アミノ酸残基に置き換えられることを意味する。好ましい置換は、Ｅ６Ａ、Ａ３３Ｃ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｇ、Ｓ７４Ａ、Ｒ８３Ｋ、Ａ８４Ｐ又はＬ１０８Ｑである。すなわち、本発明は、特異的結合ドメインのうちの少なくとも１つが、好ましくはすべてが免疫グロブリン断片を含む本発明のポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにおいて使用される免疫グロブリン断片の起源又は選択方法及び産生方法は実際には関連はない。本発明の一実施形態によれば、ポリペプチドは、天然の、突然変異した及び／又は合成のＶＨである少なくとも１つの（好ましくは１つよりも多い）免疫グロブリン断片を含む。
【００２３】
[0025]本発明はＭＨＣとペプチドとの多くの異なる組合せを企図しているが、最も好ましいのは、ＭＨＣ−１と、ＭＨＣ−１により提示される腫瘍関連抗原由来のペプチドと、の組合せである。ＨＬＡ拘束性のために、ＭＨＣにおけるペプチド提示の規則に基づいて設計可能なＭＨＣ−１ペプチド複合体及びＭＨＣ−２ペプチド複合体の組合せは多く存在する。これらの規則には、ＭＨＣに関連して提示することができるペプチドに対するサイズ制限、細胞における抗原の処理のために存在する必要がある制限部位、提示されるペプチド上に存在する必要があるアンカー部位等が含まれる。ＨＬＡクラス又はＭＨＣクラスが異なれば、正確な規則は異なる。ＭＡＧＥペプチドはＭＨＣ関連での提示に非常に適していることを我々は見出した。ＭＡＧＥ−Ａに配列Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ（配列番号７）を有するＭＨＣ−１提示可能ペプチドが同定された。このペプチドは、ほぼすべてのＭＡＧＥ−Ａバリアント（ＭＡＧＥ−Ａ１〜ＭＡＧＥ−Ａ１２）に存在するものであり、また、白人人口において最も広く認められるＭＨＣ−１対立遺伝子の１つ（ＨＬＡ−Ａ０２０１）によって提示されるものである。他のＭＨＣ−１対立遺伝子（ＨＬＡ−ＣＷ７）により提示され、多くのＭＡＧＥバリアント（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ６、−Ａ１２）に存在する第２のＭＡＧＥペプチドは、Ｅ−Ｇ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｅ−Ｋ（配列番号８）である。ＭＨＣ−１とＭＡＧＥペプチドとのこれら２つの組合せは白人人口の８０％に及ぶと考えられる。正しいＨＬＡ対立遺伝子が存在する腫瘍細胞株は本発明の分子により効率的に死滅させられることを我々はインビトロで明らかにした。他のＭＨＣ分子、他のＨＬＡ拘束性及び他の腫瘍関連抗原についても同じアプローチに従うことができる。重要なのは、応答を誘発するために選択されるペプチドはＭＨＣ分子との関連で提示され、その関連でのみ認識されなければならないことである。さらに、ペプチドは十分に腫瘍特異的な抗原に由来していなければならず、ＨＬＡ拘束性は人口のかなりの部分で存在していなければならない。本発明の重要な利点の１つは、その標的ＭＨＣ−ペプチド複合体を下方制御する腫瘍を、同じ抗原に基づく異なるＭＨＣ−ペプチド複合体に対する第２の結合分子で処理することができる点である。この結合分子が下方制御された場合、第３の結合分子が利用可能になる。ヘテロ接合体では、ＭＨＣ上の６つの異なる標的が利用可能になり得る。細胞は時折免疫系により「検査を受ける」必要があるため、すべてのＭＨＣ分子の下方制御を通じた逃避は実現可能な逃避経路とは思われない。ＭＡＧＥが、ペプチドが由来する抗原である場合には、抗原の下方制御を通じた逃避も可能ではない。その理由は、ＭＡＧＥは腫瘍の生存にとって重要と思われるからである（Ｌ．Ｍａｒｃａｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０年、７０：１０３６２〜１０３７０頁）。このように、本発明は、腫瘍が依然として治療可能であるという意味において、治療からの腫瘍の逃避を低減又は防止する。
【００２４】
[0026]本発明はＭＨＣ分子を標的として使用し、個人によりＭＨＣ標的の利用能が異なるために、本発明は個人のＨＬＡ組成を決定するためのいわゆるコンパニオン診断も提供する。本発明は好ましくは多かれ少なかれ普遍的（ＭＡＧＥ）ペプチドを使用するが、本発明は、腫瘍による特定の抗原の発現を判定するための診断も提供する。このようにして、本発明の療法は、特に上述の逃避を妨げる状況においても患者に適合させることが可能である。アジア人口及び黒人人口のＨＬＡ拘束性パターンは白人人口とは異なることが知られている。これらの人口では、詳細な説明において記載されるように、異なるＭＨＣ−ペプチド複合体を標的にすることが可能である。
【００２５】
[0027]本明細書は腫瘍に関するより詳細な開示をするが、本発明の分子により他の異常細胞も標的にすることが可能であることは理解されなければならない。これらの他の異常細胞は、典型的には、十分な制御なしで増殖する細胞である。これは自己免疫疾患において起こる。これらの細胞は腫瘍抗原の発現を示し始めるのが典型的である。特に、ＭＡＧＥポリペプチドは関節リウマチにおいて同定された。すなわち、本発明は、好ましい実施形態において、その特異的結合ドメインがＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体に結合することができる本発明のポリペプチドを提供する。さらに好ましい実施形態において、本発明は、その特異的結合ドメインが、腫瘍関連抗原由来のペプチドを含むＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体、特に種々のＭＡＧＥペプチドを含むＭＨＣ−Ｉ−ペプチド複合体に結合することができるポリペプチドを提供する。
【００２６】
[0028]「異常細胞」とは、その通常の健康な正常対応物から逸脱し、制御されない増殖特性を示す細胞と定義される。
【００２７】
[0029]本明細書に例示されるポリペプチドの１つは、アミノ酸配列が
ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１、ＡＨ５）
に本質的に一致する結合ドメインを有する。
【００２８】
[0030]別のポリペプチドは、アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１２、１１Ｈ）
を含む結合ドメインを有する。
【００２９】
[0031]本発明の好ましいポリペプチドは、
ＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４、Ｈｅｘａ−ＡＨ５）；又は
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ（配列番号１３、Ｈｅｘａ−１１ＨＣＨ１）；又は
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＰＧＳＧＥＧＴＫＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＦＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＬＥＳＳＧＳＧＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＰＧＳＧＥＧＴＫＧＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７、Ｈｅｘａ−１１ＨＡＨ５）
に本質的に一致するアミノ酸配列を有する。
【００３０】
[0034]本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む。本発明の分子は、原核生物及び真核生物において産生することが可能である。原核生物のコドン使用頻度は真核生物のコドン使用頻度とは異なることがある。本発明の核酸はこれらの点で適合させることが可能である。さらに、分泌に必要なエレメント、及びプロモーター、ターミネーター、エンハンサー等を加えてもよい。さらに、単離及び／又は精製に有用又は必要なエレメントを加えてもよい。典型的には、本発明の核酸は、その核酸が産生されることになる宿主に適した発現ベクターの形で提供される。産生プラットフォームの選択は、分子のサイズ、フォールディングを巡る予想される問題、グリコシル化が必要なさらなる配列が存在するかどうか等に依拠することになり、そのため、典型的には、本発明の核酸は、本発明のポリペプチドが産生される産生プラットフォームに適合している。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、及びそのような核酸を含む発現ベクターを提供する。真核生物における安定した発現のためには、本発明のポリペプチドをコードする核酸は（発現停止されない適切な部位で）宿主細胞ゲノムに組み込まれるのが好ましい。すなわち、特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞のゲノムに核酸を組み込むための手段を含むベクターを含む。
【００３１】
[0035]本発明は、ポリペプチドコード核酸が存在し、本発明のポリペプチドを産生することができる宿主細胞又は生物をさらに含む。
【００３２】
[0036]本発明はまた、本発明のポリペプチドを製造するための方法であって、本発明の核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、核酸を発現させるステップと、本発明のポリペプチドを採取するステップと、を含む方法を含む。
【００３３】
[0037]本発明のポリペプチドを個体に投与するには製剤化される必要がある。典型的には、これらのポリペプチドは非経口的に与えられる。製剤化のためには、注射用水（生理食塩水）だけで十分であり得る。安定性の理由で、さらに複雑な製剤が必要になることがある。本発明では、通常の添加剤と一緒に供給される凍結乾燥組成物及び液体組成物が企図されている。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドと適切な希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
[0038]本発明のポリペプチドの投与量は、いわゆる用量漸増実験における動物研究及び臨床研究を通じて確立されなければならない。我々の動物実験では、現在のところ有効投与量での関連毒性は全く示されていない。典型的には、用量は今日の抗体投与量と同程度になる（モルレベルでは本発明の分子の重量は抗体の重量とは異なり得る）。典型的には、そのような投与量は３〜１５ｍｇ／ｋｇ体重、又は用量当たり２５〜１０００ｍｇである。
【００３５】
[0039]単一薬物では患者から腫瘍を根絶することがほとんどできないことは腫瘍治療の分野では確定している。特に治療がさらに困難な腫瘍では、本発明のポリペプチドの最初の適用は（少なくとも最初は）おそらく他の治療（標準的ケア）と組み合わせて行われることになる。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチドと従来の細胞増殖抑制及び／又は殺腫瘍剤とを含む医薬組成物も提供する。本発明はまた、癌のアジュバンド治療において使用するための本発明のポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、癌の組合せ化学療法において使用するための本発明のポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
[0040]本発明の医薬組成物は、典型的には、癌の治療において、特に、好ましい一本鎖ポリペプチド（ＭＨＣとＭＡＧＥ−Ａペプチドとの複合体）の標的が腫瘍により提示されるタイプの癌においてその使用を見出すことになる。表１は、それらの標的が見つかった腫瘍の一覧表である。本発明の結合ドメインを用いて、標的ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する腫瘍を同定するのは容易である。これはインビトロ又はインビボ（画像処理）で行うことが可能である。
【００３７】
[0041]「リピート」という語は、明細書全体を通じて「ドメイン」と同じ意味である。「結合する」という語は、バックグラウンド相互作用とは区別できる分子間の相互作用と定義される。「特異的」とは、例えば「特異的結合（ドメイン）」の場合、分子間のバックグラウンド相互作用よりも高い結合親和性で分子が他の分子と相互作用できることを意味する。典型的には、本発明のポリペプチドは、いわゆるアビディティー効果の恩恵を受けることから高親和性結合ドメインを必要としない。同様に、「特異性」とは、例えば、分子間のバックグラウンド相互作用よりも高い結合親和性を有する２分子間又は細胞・分子間の相互作用のことである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】大きなヒト非免疫抗体Ｆａｂファージライブラリーから単離されたＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ特異的ファージクローンの特異的結合。ビオチン化されたＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａに対して選択された個々の抗体Ｆａｂ発現ファージを、関連ペプチド／ＭＨＣ複合体のみに結合する能力についてＥＬＩＳＡにより解析した。ストレプトアビジン被膜９６ウェルプレートを、可溶性ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ（Ａ２／ＭｕｌｔｉＭａｇｅ）又はＨＬＡ−Ａ０２０１／ＪＣＶ（Ａ２／ＪＣ）ペプチド／ＭＨＣ複合体（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした。そして、洗浄して非結合複合体を取り除き、個々のファージクローンと一緒にインキュベートした。ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ（登録商標）での３回の洗浄により非結合ファージを取り除き、続いて室温で１時間、抗Ｍ１３抗体（１μｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と一緒にインキュベートした。最後に、ウェルをＨＲＰ−標識二次抗体と一緒にインキュベートし、結合ファージを検出した。
【図２】ファージＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１は、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチドを提示している細胞に特異的に結合する。関連ＨＬＡ−Ａ２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体及びＪＣＶペプチドが負荷された無関係なＨＬＡ−Ａ２０１複合体を使用するＥＬＩＳＡにおいて特異的結合を示したファージＡＨ５、ＣＢ１、ＣＧ１、ＢＤ５及びＢＣ７を、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子においてマルチＭＡＧＥ−Ａペプチドを提示する細胞に結合する能力について解析した。この目的のために、ヒトＢ−ＬＣＬ（ＢＳＭ）に、３７℃で３０分間、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチド（１００μｌ  ＰＢＳ中１０μｇ）を負荷し、続いてＦａｂファージＡＨ５、ＣＢ１、ＣＧ１、ＢＤ５及びＢＣ７と一緒にインキュベートし、抗ファージ抗体及び蛍光標識された二次抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析した。
【図３】ＨＬＡ−Ａ２／マルチＭＡＧＥ−Ａ特異的Ｆａｂを発現しているファージは、組織学的起源の異なる腫瘍細胞に結合する。ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａに特異的なファージＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１、並びにＨＡ−０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１に特異的な陽性対照ファージを用いて、異なる腫瘍細胞株の染色を行った。この目的のために、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、多発性骨髄腫細胞株ＭＤＮ、黒色腫細胞株ＭＺ２−ＭＥＬ４３及びＧ４３、並びに乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＤ１５７を異なるファージと一緒にインキュベート（４℃で３０分間）し、次いで、結合ファージを抗ファージ抗体及び蛍光標識された二次抗体を用いてフローサイトメトリーにより検出した。
【図４】ファージＡＨ５は、ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体のみに特異的に結合する。ファージＡＨ５の特異性を決定するために、関連の及び無関係なペプチド／ＭＨＣ複合体を用いてＥＬＩＳＡを実施した。マルチＭＡＧＥ−Ａ、ｇｐ１００、ＪＣＶ及びＭＡＧＥ−Ｃ２ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ０２０１、並びにＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ１をストレプトアビジン９６ウェルプレート上に被膜し、ファージＡＨ５と一緒にインキュベートした。
【図５】Ｈｅｘａ−ＡＨ５は細菌により発現される。ＩＰＴＧをＳＥ−１細菌に添加した後、ｐＳｔａｂｙ１．２におけるＨｅｘａ−ＡＨ５遺伝子の発現を誘導した。細菌をＯＤ６００＝０．８まで３０℃でＴＹＡＧ培地において増殖させた。その時点で、培地をＩＰＴＧが補充されたＴＹ培地に置き換え、細菌を４時間増殖させた。培地及びペリプラズムを収集し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【図６】Ｈｅｘａ−ＡＨ５処理Ｄａｊｕ細胞の顕微鏡分析によりアポトーシスが明らかにされる。ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、グルタミン及び非必須アミノ酸が補充されたＤＭＥＭ培地において培養されたＤａｊｕ細胞を４時間、Ｈｅｘａ−ＡＨ５タンパク質（１０μｇ／ｍｌ総量）で処理し、アポトーシスの徴候について顕微鏡法により検査した。
【図７】Ｈｅｘａ−ＡＨ５での処理により活性カスパーゼ−３が誘導される。Ｄａｊｕ細胞を４時間、１０μｇ／ｍｌのＨｅｘａ−ＡＨ５タンパク質で処理した。次いで、カスパーゼ−３阻害剤を添加し（ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）、１時間後、細胞を蛍光顕微鏡法により解析した。
【図８】Ｈｅｘａ−ＡＨ５の腫瘍内注射により、移植可能なヒト腫瘍モデルにおいてアポトーシスが誘導される。ヒト前立腺腫瘍細胞株ＰＣ３４６ＣをＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの前立腺に注射し、超音波検査により可視化するまで増殖させた。そして、マウスに、Ｈｅｘａ−ＡＨ５（２０μｌ容量中１０μｇ総量）又は対照としてＰＢＳの腫瘍内注射を行った。次の日、マウスを屠殺し、腫瘍を取り除いてパラフィン包埋した。腫瘍切片を断片化ＤＮＡについて染色し、顕微鏡法により解析した。結果は、Ｈｅｘａ−ＡＨ５での処置後のみ広範囲のアポトーシス細胞（黒く染色されている）を示している。ＰＢＳ処置マウスではアポトーシスの徴候は検出されなかった。
【図９】Ｈｅｘａ−ＡＨ５の静脈内注射により、同所性マウス腫瘍モデルにおいてアポトーシス性前立腺腫瘍細胞が生じる。同所性ＰＣ３４６Ｃ前立腺腫瘍を有するＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに２５μｇのＨｅｘａ−ＡＨ５（１００μｌ総容量中）を１回注射した。次の日、マウスを屠殺し、腫瘍を取り除いた。パラフィン包埋腫瘍切片を断片化ＤＮＡについて染色し、顕微鏡法により解析した。結果は、処置マウスにおいてのみ広範囲のアポトーシス細胞を示している。
【図１０】同所性前立腺癌を有するマウスのＨｅｘａ−ＡＨ５での静脈内処置によりカスパーゼが活性化される。同所性ＰＣ３４６Ｃ前立腺腫瘍を有するＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに２５μｇのＨｅｘａ−ＡＨ５（１００μｌ総容量中）を１回注射した。次の日、マウスにユニバーサルカスパーゼ阻害剤（ＦＬＩＶＯ）の静脈内注射を行い、阻害剤を１時間循環させた。そして、マウスを屠殺し、腫瘍を取り除いた。パラフィン包埋腫瘍切片を蛍光顕微鏡法により解析した。これにより、Ｈｅｘａ−ＡＨ５処置マウスにおいてのみ活性カスパーゼが明らかにされた。
【図１１】Ｈｅｘａ  ＡＨ５−Ｆｃ及びＡＨ５−ＨＳＡでの処理により活性カスパーゼ−３が誘導される。ｐｃＤＮＡ−３．１／Ｈｅｘａ  ＡＨ５−Ｆｃ（Ａ）又は／Ｈｅｘａ  ＡＨ５−ＨＳＡ（Ｂ）構築物をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から得られた上清と一緒に２４時間インキュベートされた黒色腫６２４細胞は、活性カスパーゼ−３の存在を示している。黒色腫６２４細胞中の活性カスパーゼ−３は、ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫと一緒のインキュベーションの４時間後、蛍光顕微鏡法により検出した。
【図１２】六量体ＡＨ５タンパク質での静脈内（ｉ．ｖ．）処置後のマウスの生存及び腫瘍増殖。黒色腫Ｄａｊｕ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。触知可能な腫瘍が存在する場合に、マウスに六量体ＡＨ５を静脈内注射した（２．５μｇ／２×週）。腫瘍増殖及び生存を判定した。
【図１３】考えられる六量体タンパク質の略図。六量体タンパク質は、異なる構成要素（例えば、１）異なるリンカー配列、２）異なるＶＨドメイン）で構成され得る。いくつかの考えられる組合せが示されている。
【図１４】２５℃での六量体ＡＨ５の発現。六量体ＡＨ５構築物を含有するＳＥ−１細菌を２５℃で増殖及び誘導した。図Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色：レーン１：誘導されたＳＥ−１  ｐＳｔａｂｙ  １．２−Ｈｅｘａ−ＡＨ５のペリプラズム；レーン２：タンパク質マーカー（Ｍ）。図Ｂ：抗ｃＭｙｃ抗体でのウェスタンブロット：レーン１：Ｈｅｘａ−ＡＨ５；レーン２：タンパク質マーカー（Ｍ）。
【発明の詳細な説明】
【００３９】
[0056]ＷＯ２００７／０７３１４７において概説されたように、アポトーシス機序を介した異常細胞の所望の特異的及び選択的死滅は、複数の抗原特異的ＭＨＣ拘束性一本鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はＭＨＣ拘束性抗原特異的抗体（これらの抗原は、標的異常細胞により発現され、ＭＨＣ分子に関連して提示される。）を含む多価単一特異性タンパク質複合体にこれらの細胞を接触させることによって実現することが可能である。この発見は当時、関心対象のＭＨＣ−ペプチド複合体に対して陽性である細胞（例えば、腫瘍関連抗原由来のペプチドと複合体をなすＨＬＡクラスＩ分子を発現している腫瘍細胞）の集団を選択的に死滅させる可能性を開いた。
【００４０】
[0057]理論に縛られるものではないが、現時点で開示される本発明に基づけば、多価（例えば六価）単一特異性タンパク質は、標的細胞の細胞表面上の複数の（同一の）ＭＨＣ−ｐ複合体のクラスター形成を介してアポトーシスを誘導すると考えられる。ＷＯ２００７／０７３１４７で示されたデータによれば、３つのＭＨＣ−ｐ複合体のクラスター形成ではアポトーシス誘導に十分ではないことがあるが、六価複合体はアポトーシスを誘導するのに十分であることが示唆される。すなわち、アポトーシス誘導には、１つの多価一本鎖タンパク質による、少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも６つのＭＨＣ−ｐ複合体の結合が必要であることがこの時点で開示される。
【００４１】
[0058]「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本出願の明細書全体を通じてほぼ同じ意味を有し、２つ以上の連結されたアミノ酸残基を含む線形タンパク質性配列のことである。ＭＨＣ−ｐ複合体に特異的に結合するタンパク質及びタンパク質複合体との関係では、「結合分子」及び「ポリペプチド」は「タンパク質」及び「タンパク質複合体」と同じ意味を有する。「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死のプロセスのことである。
【００４２】
[0059]一実施形態において、多価一本鎖タンパク質は、ドメイン又はドメインのクラスターの各々が特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識してこれに結合することができる、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のドメイン又はドメインのクラスターを包含する。抗ＭＨＣ抗体を使用するアポトーシス誘導のための公知の方法とは対照的に、本明細書に開示される多価一本鎖単量体タンパク質はアポトーシス自体を誘導することができ、いかなる外部の翻訳後架橋結合も必要としない。複数のドメイン又はドメインの複数のクラスターは接続されてＤＮＡレベルでは線形配列を形成し、タンパク質レベルでは、通常のペプチド結合を介した線形一本鎖単量体ポリペプチドになる。
【００４３】
[0060]すなわち、本発明は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識してこれに結合することができる少なくとも４つ（好ましくは６つ）のドメイン又はドメインのクラスターを含む多価一本鎖タンパク質に関する。少なくとも４つ、好ましくは６つのドメイン又はドメインのクラスターは、好ましくは同じＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する、すなわち、好ましい多価一本鎖タンパク質はＭＨＣ−ｐ複合体に関して単一特異性である。ＭＨＣ−ｐ複合体を特異的に認識してこれに結合する多価一本鎖タンパク質のドメインは、ＴＣＲドメイン若しくはその機能的断片（共に本明細書ではＴＣＲと呼ばれる）、及び／又はＴＣＲ特異性を模倣する抗体（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体の重鎖Ｈの可変ドメインＶ（明細書全体を通じてＶＨ、Ｖｈ又はＶＨという。）等の遺伝的に操作された抗体）であり得る。また、本発明の多価一本鎖タンパク質は、ＴＣＲドメイン及びＭＨＣクラス拘束性抗体ドメインを包含することができる。ただし、ここで、両タイプのドメインは本質的に同じＭＨＣ−ペプチド抗原を認識する。本明細書において、「ＭＨＣ−ペプチド複合体」及び「ＭＨＣ−ペプチド抗原」は同じ意味を有する。ＭＨＣ分子により提示され、ＭＨＣ−ｐ複合体を形成するペプチドとの関係では、「ペプチド」、「ペプチド抗原」「抗原エピトープ」及び「抗原ペプチド」とは複合体中の同じペプチドのことである。
【００４４】
[0061]多価ＴＣＲドメイン複合体及びその治療的適用は当分野では公知である。ＷＯ２００４／０５０７０５では、少なくとも２つのＴＣＲドメインを含み、非タンパク質性ポリマー鎖又はアミノ酸残基で構成されているリンカー配列により連結されている多価ＴＣＲドメイン複合体が開示されている。ＴＣＲ複合体の開示された使用は、ＴＣＲ複合体に結合することができる治療薬（例えば細胞傷害性薬物）のターゲティング細胞送達にある。二、三及び四価ＴＣＲ複合体が開示されているが、二価ＴＣＲ複合体が好ましい。重要なことであるが、４つよりも多いＴＣＲの複合体は記載されていない。さらに、ＷＯ２００４／０５０７０５は、治療薬（例えば、細胞死滅のための毒性部分）の標的細胞への送達のための多価ＴＣＲ複合体の使用のみに焦点を合わせている。この文献は、多価ＴＣＲ複合体自体のアポトーシス誘導能を教示も示唆もしていない。本発明の多価単量体一本鎖タンパク質の抗原特異的ＭＨＣ拘束性結合能は、関連抗原を発現している標的細胞のアポトーシスを誘導するのに十分である。すなわち、本発明の単一のタンパク質の使用のみで所望の効果を得るのに十分である。例えばＷＯ２００４／０５０７０５では、例えば追加の又は結合された細胞傷害性薬物又は毒性部分の追加的使用が必要である。
【００４５】
[0062]ＷＯ２００７／０７３１４７において、我々は、一緒になって発明の多価複合体（抗原特異的ＭＨＣ拘束性ＴＣＲかＴＣＲ様抗体かその組合せかを問わない）を構築する個々のポリペプチド単量体が、所望のアポトーシス促進性活性を実現するために、標準ポリペプチド連結化学を用いて翻訳後に適切に相互に連結又は接続される（共有結合的か非共有結合的かを問わない）ことを開示している。
【００４６】
[0063]本発明によれば、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩタンパク質のいずれかを含むＭＨＣ−ペプチド複合体を特異的に認識してこれに結合することができる任意のタンパク質性ドメイン又はドメインのクラスターは、多価アポトーシス誘導一本鎖タンパク質において適切に使用される。一実施形態において、本発明のこのタンパク質は、多価ポリペプチドを構築しているドメイン又はドメインのクラスターのペプチド骨格間で通常のペプチド結合を通じて接続され、ヒト抗体のＶＨドメインに対応するアミノ酸配列を含む、少なくとも４つ（例えば６つ又はさらにそれ以上）のドメイン又はドメインのクラスターを含む。
【００４７】
[0064]本発明は、主に、腫瘍抗原に特異的な六価単一特異性一本鎖単量体タンパク質の作製により例示される。この六価一本鎖タンパク質は癌の治療において治療的価値を有する。さらに、当業者であれば、本発明がいかなる種類の抗原にも限定されないこと、任意の抗原を発現している標的細胞（例えば、選択された異常細胞）を選択的に死滅させることができる六価一本鎖タンパク質が提供されることを認識するであろう。
【００４８】
[0065]好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＭＨＣに関連するあらゆる例について、癌特異的エピトープ又は自己免疫障害に関連するエピトープ又は他の任意の異常細胞により提示されるエピトープを特異的かつ効率的に認識してこれに結合することができる。癌細胞は、「癌精巣抗原」（ＣＴ）と呼ばれる群の抗原を発現することがある。これらのＣＴはＭＨＣ分子により抗原ペプチドとして（ＭＨＣ−ｐ複合体として）ＣＴＬに提示される。実際、これらのＣＴは、抗癌応答を誘発し得るので癌患者においては免疫原性である。これらのＣＴは高度に組織限定された発現を示し、癌ワクチン及び他の免疫介入戦略のための有望な標的分子と見なされている。
【００４９】
これまで、４４を超えるＣＴ遺伝子ファミリーが同定されており、その発現が数多くの癌種において研究されてきた。例えば、膀胱癌、非小肺癌、前立腺癌、黒色腫及び多発性骨髄腫はＣＴ遺伝子を高レベルまで発現する。実験によって、これらのＣＴ遺伝子の発現は実際健康な個人では精巣限定されていることが明らかにされている。癌患者において免疫応答を誘発することが明らかにされている他の抗原には、分化抗原（例えば、黒色腫抗原ｇｐ１００、Ｍａｒｔ−１、チロシナーゼ）、又は癌細胞において過剰発現されている抗原（例えば、ｐ５３、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＷＴ−１）が含まれる。両グループの抗原はこれら異常細胞に特異的ではなく、健常な組織でも発現されており、そのため、標的にされると自己免疫疾患を誘発することがある。好ましい実施形態において、六価一本鎖タンパク質は、特に腫瘍細胞でＭＨＣクラスＩ−又はＭＨＣクラスＩＩ−腫瘍抗原複合体、特に黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）を認識してこれに結合することができ、健常な細胞及び組織は本質的に変化しないままにしておき、精巣はＨＬＡに関連して抗原を提示しないことに注意されたい。抗原は、例えば、ＣＴ遺伝子ファミリーのメンバー由来のペプチドである。抗原は、一連の腫瘍抗原から、及び／又は癌細胞に侵された組織又は器官で発現する一連の抗原から選択することも可能である。これについては、例えば、ｇｐ１００、Ｍａｒｔ−１、チロシナーゼ、ｐ５３、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＷＴ−１について知られているように、その発現が腫瘍特異的でないこと、又は癌細胞を有する組織又は器官に特異的でないことは公知である。ＭＨＣと複合体化した抗原ペプチドを標的にする六価一本鎖タンパク質を用いた治療の有益な成績に関係している場合、これらの抗原は有害作用の危険が容認できる場合には治療標的として選択される。本発明の一般的利益は、これまで細胞表面の標的が主な目標であった場合に、細胞内標的が今やＭＨＣ−１及び／又はＭＨＣ−２による提示を通じて利用できるようになることである。これは、本発明における標的として使用するに値するほど腫瘍特異的である細胞内抗原を同定するために、細胞内抗原の新たな調査が実施されることになることを意味する。そのようなスクリーニングは、腫瘍ワクチン計画との関連で既に実施されている。腫瘍ワクチン候補として価値のある（必ずしも有効性ではなく、十分な特異性という理由で）標的、すなわち、ＭＡＧＥ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、−Ａ４、−Ａ５、−Ａ６、−Ａ７、−Ａ８、−Ａ９、−Ａ１０、−Ａ１１、−Ａ１２、−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＡＧＥ、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＧＡＧＥ、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、及びＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬは本発明にとっても価値があることになる。
【００５０】
[0067]ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されるヒト腫瘍抗原は記載されており、そのほぼすべてが多発性骨髄腫又は悪性黒色腫に関連している。見出された黒色腫特異的抗原に関連する第１の抗原ペプチドはＭＡＧＥ−１由来のペプチドであった。さらに、３つの黒色腫エピトープはＭＡＧＥファミリーのタンパク質に由来することが見出されＨＬＡ−ＤＲ１１及びＨＬＡ−ＤＲ１３により提示された。黒色腫抗原の別の組は、ＭＨＣクラスＩ腫瘍抗原も含有することが知られているが、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００及びチロシナーゼを含む。本発明に有用であるＴ細胞エピトープの概説は、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍも参照されたい。
【００５１】
[0068]最初に発見されたＣＴは、ＭＡＧＥ−Ａ抗原のグループに属するが、癌細胞及び精巣細胞に一意的に限定されている発現プロファイルを有する。しかし、精巣細胞は、ＭＨＣ分子の発現を欠くために、免疫系により標的にされることはない。ＭＡＧＥ−Ａ抗原は高い相同性を示す１２の遺伝子のファミリーに属する。その発現は、悪性細胞形質転換及び癌細胞の転移拡散における初期イベントに関連付けられてきた。さらに、ＭＡＧＥ−Ａ発現が下方制御されると癌細胞にアポトーシスを誘導することがある。ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子内ではいくつかの抗原エピトープが当分野で知られている。抗原ペプチドは通常、ＭＨＣクラスＩ分子により８−又は９−ｍｅｒアミノ酸ペプチドとして提示される。さらに、異なるＭＡＧＥ−Ａ遺伝子間の高い相同性のせいで複数のＭＡＧＥ−Ａ遺伝子に存在する抗原エピトープが知られている。これらの抗原エピトープはマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープと見なすことができ、種々の組織学的起源の癌細胞上で提示される。そのため、これらの抗原エピトープは抗癌療法の普遍的な標的として役立つ可能性がある。
【００５２】
[0069]ＭＨＣ分子は、免疫応答を調節するシグナル伝達分子としても重要である。ＭＨＣクラスＩ分子がＢ−及びＴ細胞上で架橋結合すると、アネルギー若しくはアポトーシス、又は細胞増殖及びサイトカイン産生をもたらし得るシグナルが惹起される。ＭＨＣクラスＩ架橋結合により誘導されるいくつかの細胞内シグナル伝達経路が同定されている。これらの伝達経路には、１）チロシンキナーゼのリン酸化（細胞内カルシウムイオンのレベルの増強をもたらす）、２）ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化、及び３）ＰＩ３Ｋの阻害（ＪＮＫ活性化の活性化を生じる）が含まれる。結合後に内部移行されるＭＨＣに対して極めて高度な親和性抗体がアポトーシスを誘導することがある。念のために、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞由来腫瘍の場合は、本発明の分子の効果は療法を開始する前にインビトロで試験してもよい。
【００５３】
[0070]本発明のさらなる態様は、本発明の六価一本鎖単量体タンパク質を提供するための方法に関する。上述のように、この方法は典型的には、所望の六価ポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供することを伴う。この核酸は好ましくはプラスミド又は発現ベクターを介して、構築物を発現することができる原核宿主細胞に及び／又は真核宿主細胞に導入することが可能である。一実施形態において、六価一本鎖アポトーシス誘導タンパク質を提供する本発明の方法は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識してこれに結合することができる六価タンパク質をコードする１つ又は複数の核酸を宿主細胞に供給し、宿主細胞により核酸を発現させるステップを含む。
【００５４】
[0071]好ましい宿主細胞は、細菌（例えば、細菌株ＢＬ２１、株ＳＥ１）、又は哺乳動物宿主細胞、より好ましくはヒト宿主細胞である。適切な哺乳動物宿主細胞には、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれ、これらの細胞は市販されている。バキュロウイルス又は昆虫細胞発現ベクターを用いて昆虫細胞（例えばＳ２又はＳ９細胞）を使用してもよいが、本発明のポリペプチドがグリコシル化を伴うエレメントを含む場合にはこれらの細胞はそれほど適切ではない。産生される六価一本鎖ポリペプチドは宿主細胞から又は分泌される場合は宿主細胞の培養培地から抽出する又は単離することが可能である。すなわち、一実施形態において、本発明の方法は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識してこれに結合することができる六価一本鎖ポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸を宿主細胞に供給し、宿主細胞により核酸を発現させるステップを含む。（哺乳動物）宿主細胞における（哺乳動物）タンパク質の組換え発現のための方法は当分野では周知である。
【００５５】
[0072]後述のように、本発明の六価一本鎖タンパク質は、多くの治療的適用及び非治療的適用（例えば診断学的又は科学的適用）においてその使用を見出す。アポトーシスを誘導するのに効果的な量で本発明の六価一本鎖タンパク質に細胞を接触させるステップを含む、標的細胞のエクスビボ又はインビボアポトーシスを誘導するための方法が本明細書では提供される。標的細胞は、六価一本鎖タンパク質の組換え産生のために使用される宿主細胞の培養培地に都合よく接触させることができる。一実施形態では、インビトロアポトーシス研究（例えば、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ誘導アポトーシスに関与する分子経路の解明を目的とする研究）のために使用することができる。本発明の六価一本鎖タンパク質は、（循環している）腫瘍細胞の検出のため、細胞傷害性化合物の標的細胞特異的送達のため又は免疫刺激性分子の送達のためにも使用することができる。
【００５６】
[0073]好ましくは、六価一本鎖タンパク質は、個体（より好ましくはヒト個体）において異常細胞のアポトーシスを始動させるために使用される。ヒトにおける治療的適用では、六価一本鎖タンパク質は非哺乳動物起源のアミノ酸配列を含有しないことが好ましい。ヒトアミノ酸配列のみを含有する六価一本鎖タンパク質がさらに好ましい。疾患特異的エピトープを認識してこれに結合することができる治療的有効量の六価一本鎖タンパク質を患者に投与して、疾患特異的エピトープ（例えば、ＭＨＣに関連して提示されるペプチド抗原）を発現していない（正常）細胞の生存能に影響を与えることなく、エピトープを発現している異常細胞のアポトーシスを刺激することが可能である。本発明の方法は、抗原特異的でＭＨＣ拘束された態様で細胞を死滅させることを可能にすることが本明細書において実証されている。特定の実施形態において、疾患特異的エピトープは癌エピトープ（例えば黒色腫特異的エピトープ）である。正常細胞の死を最小限に抑える又は全面的に回避しつつ異常（腫瘍）細胞を死滅させると、一般的には六価一本鎖タンパク質の投与に続く患者の治療成績は改善されることになる。
【００５７】
[0074]すなわち、薬物としての本発明の六価一本鎖タンパク質も提供される。他の態様において、本発明は、癌の治療を目的とする薬物の製造のための六価一本鎖タンパク質の使用を提供する。例えば、本発明の一本鎖タンパク質は、黒色腫の治療のための薬物の製造のために有利に使用される。
【００５８】
[0075]ヒト起源の抗体断片は、ファージにより表示される大きな抗体レパートリーから単離することが可能である。本発明の一態様は、癌精巣抗原ペプチドを提示しているＭＨＣクラスＩ分子に特異的なヒトＦａｂ断片の選択のための、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの使用である。マルチＭＡＧＥ−Ａエピトープを提示しているＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に特異的な抗体Ｆａｂ断片が（本質的にはＲ．Ａ．Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．、２００８年、７３：１０９３〜１０９９頁に記載のようにして）選択され、関連抗原のみに結合することが明らかにされている。これらの抗体Ｆａｂ断片の親和性は通常低いため、ＭＨＣ拘束性ペプチドに特異的な態様でアポトーシスを誘導できる相対的に高アビディティーの抗体鎖の作製を可能にする方法が提供される。本発明の一態様は、ＭＨＣ−ペプチド結合親和性を増強する複数の抗原結合モチーフを含む一本鎖タンパク質分子であって、ＭＨＣ−ペプチド複合体の架橋結合をもたらしてアポトーシスを誘導する分子を開発することである。
【００５９】
[0076]本発明の多価一本鎖単量体タンパク質形のＭＨＣ−ｐ複合体特異的ポリペプチドは、例えば、発現すると一本鎖ポリペプチド構築物を得られるようにＤＮＡレベルで多量体化されているＭＨＣ拘束性抗原特異的ＴＣＲ様抗体（Ａｂ）又はその機能的断片である。
【００６０】
[0077]ヒトＶＨドメインは通常は当分野で必要とされる安定性及び効率的発現の基準を満たしていない。それらは不安定で発現も不十分となる傾向がある。「ラクダ化」と呼ばれるプロセスを用いてヒトＶＨをより安定した抗体断片に変換してもよい。
【００６１】
[0078]ヒト抗体生殖系列領域ＶＨ−３はラマの抗体ＶＨ断片と高い相同性を示す。ラマは重鎖及び軽鎖で構成された抗体、重鎖のみを含有する抗体の２種類の抗体を有する。これらの重鎖のみの抗体は、重鎖及び軽鎖で構成された古典的抗体に類似する抗原に結合する。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とも呼ばれる最小の機能的ラマ抗体結合ドメインであるＶＨＨドメインはよく発現されることが明らかにされており、高親和性で抗原に結合することができる。また、ラマｓｄＡｂの発現の容易さ及び安定性などの特徴のいくつかは、例えば、ヒトＶＨ中の数個のアミノ酸をラマＶＨのアミノ酸に置き換えることによってヒトＶＨに移すことができることが明らかにされている。そして、高アビディティー抗体分子は、いくつかの「ラクダ化」ヒトＶＨドメインをライゲートして１つの分子にすることによって作製できる。
【００６２】
[0079]本発明の好ましい分子は、ＶＨドメイン間に柔軟性を付与する短いリンカーにより分散された最大６つの「ラクダ化」又は非「ラクダ化」ヒトＶＨドメインを含み、その結果、単一エピトープに特異的な６つの本質的に同一の結合ドメインを生み出すことができる（例えば、配列番号４及び配列番号１３参照）。例えば、「一本鎖タンパク質」又は「一本鎖ポリペプチド」又は「単量体タンパク質」又は「単量体ポリペプチド」と呼ばれる単一ポリペプチド内のＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性マルチＭＡＧＥ−Ａエピトープに特異的である六価単一特異性タンパク質が作製される。さらに詳細は、下に概説された実施例を参照されたい。この技術は、任意の数の同じ又は異なる単一ドメイン抗体を含む多価一本鎖タンパク質の作製を可能にすることは認識され得る。いくつかの理由（例えば、産生の容易さ）によりリピートは必ずしも最良の選択肢ではない。すなわち、本発明ではまた、図１３に示されるように、複数の異なるリンカーにより分離された異なる結合ドメイン（本質的に同じ標的を認識する）を使用することが企図されている。
【００６３】
[0080]６つの直線的に連結されたヒトＶＨドメインを含む本発明の六価一本鎖単量体タンパク質は、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子とＨＬＡ−Ａ０２０１の両方を発現する癌細胞にアポトーシスを誘導するために使用される。注目に値するのは、このＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異性は、ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現しない又はＭＡＧＥ−Ａを発現しない細胞は死滅させないような方法でもたらされる点である。さらに詳細は、実施例のセクションを参照されたい。癌細胞におけるアポトーシスは、当分野で公知のいくつかのアッセイ（例えば、細胞傷害アッセイ、タネルアッセイ、及び活性カスパーゼを検出するアッセイ）によりインビトロで検出される。動物研究では、アポトーシスは、例えば、減少した腫瘍増殖のモニタリング、活性カスパーゼの検出、又は単離された腫瘍材料に対するタネルアッセイの実施により明らかにされる。
【００６４】
[0081]文献では、ＭＡＧＥ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ４、−Ａ６、−Ａ１０及び−Ａ１２に存在する単一９アミノ酸（Ａ．Ａ．）ペプチドは腫瘍細胞上でＨＬＡ−Ａ０２０１により提示され、細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されることが可能であることが明らかにされている（１）。配列Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ（配列番号７）を有するこの９Ａ．Ａ．ペプチドは、９位でのアンカー残基を除いてＨＬＡ−Ａ０２０１提示ＭＡＧＥ−Ａ１ペプチドＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｄ（配列番号９）とほぼ同一である。アンカー残基をバリンに置き換えると、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子への結合能が増強された９Ａ．Ａ．ペプチドが生じる（１）。ＨＬＡ−０２０１により提示されるＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖ（配列番号１０）ペプチドを認識するヒト及びマウスＴリンパ球は、起源の異なる腫瘍上に提示される元のＭＡＧＥ−Ａ  Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ及びＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｄペプチドも認識する。多様な腫瘍はそれぞれが少なくとも１つのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子を発現することができるので、このいわゆるマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープのターゲティングには大多数の腫瘍が含まれる。例えば、ヒト前立腺腫瘍細胞株及びヒト異種移植片におけるＭＡＧＥ−Ａ発現が解析され、極めて多様であることが明らかにされたが、試験された個々のサンプルでは少なくとも１種のＭＡＧＥ−Ａ遺伝子が発現していた（表２）。このことは、このマルチＭＡＧＥ−Ａエピトープのターゲティングは、本質的に普遍的なＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性治療標的として働くことを裏付けるものである。
【００６５】
[0082]他のマルチＭＡＧＥ又はマルチ標的エピトープを設計してもよい。原理的には、本発明では、異常細胞においてアポトーシスを誘導するために、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩの双方の異なるＨＬＡ拘束性を有し、多量体（４以上の）結合ドメインの標的となる、腫瘍特異的抗原由来のＭＨＣ提示エピトープの組合せが企図されている。標的となり得るＭＨＣ−ペプチドの組合せとしては、例えば、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＹＬＥＹＲＱＶＰＧ／Ｄ、ＨＬＡ−ＣＷ７／ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ、ＨＬＡ−Ａ２４／ＴＦＰＤＬＥＳＥＫ又はＩＭＰＫＡＧＬＬＩ及びＨＬＡ−ＤＰ４又はＨＬＡ−ＤＱ６／ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹが挙げられる。
【００６６】
[0083]一実施形態では、ＨＬＡ−Ａ０２０１提示マルチＭＡＧＥ−ＡエピトープＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖに特異的なヒト抗体断片が同定され、ヒトファージディスプレイライブラリーから単離される。選択されたヒト抗体断片はその特異性及び結合親和性に関して最適化され、Ｈｅｘａ−ＡＨ５と呼ばれるＨＬＡ−Ａ０２０１−ＭＡＧＥ−Ａ  Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ複合体の効率的結合に特異的である六価一本鎖ポリペプチドの設計及び産生のために使用されるアミノ酸配列を提供する。他の実施形態では、Ｃ末端ヒト抗体Ｆｃドメインアミノ酸配列を含むＨｅｘａ−ＡＨ５が産生され、Ｈｅｘａ−ＡＨ５と比べて本質的に同じないし同等の結合特性を有するＨｅｘａ−ＡＨ５Ｆｃをもたらす。さらに別の実施形態では、Ｃ末端ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）アミノ酸配列を含むＨｅｘａ−ＡＨ５が産生され、Ｈｅｘａ−ＡＨ５と比べて本質的に同じないし同等結合特性を有するＨｅｘａ−ＡＨ５ＨＳＡをもたらす。
【００６７】
[0084]一実施形態において、Ｈｅｘａ−ＡＨ５及び／又はその等価物であるＨｅｘａ−Ｈ５Ｆｃ及び／又はＨｅｘａ−Ｈ５ＨＳＡは医薬組成物の製造において使用される。さらに別の実施形態において、Ｈｅｘａ−ＡＨ５構築物は、Ｈｅｘａ−ＡＨ５、Ｈｅｘａ−ＡＨ５Ｆｃ及びＨｅｘａ−ＡＨ５ＨＳＡについてのＨＬＡ−Ａ０２０１−ＭＡＧＥ−Ａ  Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ複合体を含むエピトープを曝露する異常細胞の存在に関連する疾患又は健康問題の治療を目的とする医薬組成物の製造のために使用される。異常細胞は例えば腫瘍細胞である。さらなる実施形態では、Ｈｅｘａ−ＡＨ５及び／又はその等価物であるＨｅｘａ−ＡＨ５Ｆｃ及び／又はＨｅｘａ−ＡＨ５ＨＳＡは癌の治療のために使用される。さらに別の実施形態では、Ｈｅｘａ−ＡＨ５及び／又はその等価物は、例えば、前立腺癌、乳癌、多発性骨髄腫又は黒色腫の治療のために使用される。
【００６８】
[0085]本発明を以下の実施例により説明する。
【００６９】
略語：
[0086]Ａ．Ａ．：アミノ酸；Ａｂ：抗体；ＡＤＡ：抗薬物抗体；ＡＦＰ：アルファフェトプロテイン；ＡＰＣ：抗原提示細胞；β２−Ｍ：β２−ミクログロブリン；ＣＤＲ：相補性決定領域；ＣＥＡ：癌胎児性抗原；ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣；ＣＴ：癌精巣抗原；ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球；ＤＣ：樹状細胞；ＥＢＶ：エプスタインバーウイルス；ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ；ＨＥＫ：ヒト胎児腎臓；ＨＬＡ：ヒト白血病抗原；ｉ．ｖ．：静脈内に；ｋＤａ：キロダルトン；ＭＡＧＥ：黒色腫関連抗原；ＭＨＣ：主要組織適合遺伝子複合体；ＭＨＣ−ｐ：ＭＨＣ−ペプチド；ＰＢＳＭ：２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳ；ｓｃ−Ｆｖ：一本鎖可変断片；ＶＨＨ又はｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体；ＶＨ、Ｖｈ又はＶＨ：抗体重ドメインの可変アミノ酸配列。
【実施例】
【００７０】
実施例１：  ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａに特異的なヒト抗体断片の選択
[0087]ＨＬＡ−Ａ０２０１提示マルチＭＡＧＥ−ＡエピトープＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇに特異的なヒト抗体断片（配列番号５）を得るために、以前ｄｅ  Ｈａａｒｄら（２）により記載された手順に従ってヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーが構築され、本質的にＣｈａｍｅｓら（３）により記載されたようにして、選択のために使用された。ヒトＦａｂファージ（１０１３コロニー形成単位）はまず２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＭ）中室温で１時間プレインキュベートされた。並行して、２００μｌのストレプトアビジン被膜ビーズ（Ｄｙｎａｌ）はＰＢＳＭ中１時間平衡化された。それに続くラウンドでは、１００μｌのビーズが使用された。パンＭＨＣバインダーを枯渇させるため、それぞれの選択ラウンドでは、無関係なペプチドを含有するビオチン化ＭＨＣクラスＩ−ペプチド（ＭＨＣ−ｐ）複合体（Ｓａｎｑｕｉｎ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）２００ｎＭがファージに添加され、回転下３０分間インキュベートされた。平衡化されたビーズが添加され、その混合物は回転下１５分間インキュベートされた。ビーズは磁力を用いてチューブの側面に引き付けられた。枯渇されたファージ画分に、それに続いて減少する量のビオチン化ＭＨＣ−ｐ複合体（第１ラウンドでは２００ｎＭ、第２及び第３ラウンドでは２０ｎＭ）が添加され、連続回転させながら室温で１時間インキュベートされた。同時に、パンＭＨＣクラスＩ結合可溶性Ｆａｂ（Ｄ３）がファージＭＨＣ−ｐ複合体混合物に添加された（それぞれ１〜３ラウンドで５０、１０及び５μｇ）。平衡化されたストレプトアビジン被膜ビーズが添加され、その混合物は回転下１５分間インキュベートされた。ファージは磁力により選択された。非結合ファージは、ＰＢＳＭを用いた５回洗浄ステップ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）を含有するＰＢＳを用いた５ステップ及びＰＢＳを用いた５ステップにより取り除かれた。ファージは、５００μｌの新たに調製されたトリエチルアミン（１００ｍＭ）と一緒の１０分間インキュベーションによりビーズから溶出された。溶液のｐＨは、５００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の添加により中和された。溶出されたファージは、３７℃で３０分間、対数増殖するイーコリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（０．５のＯＤ６００ｎｍ）と一緒にインキュベートされた。細菌は２×ＴＹＡＧプレート上で一晩増殖させた。次の日、コロニーは採取され、５０ｍｌの２×ＴＹＡＧにおいて１０μｌの接種材料が使用された。細胞は０．５のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、５ｍｌのこの懸濁液にＭ１３ｋ０７ヘルパーファージ（５×１０１１コロニー形成単位）を感染させた。３７℃での３０分間のインキュベーション後、細胞は遠心分離され、２５ｍｌの２×ＴＹＡＫに再懸濁され、３０℃で一晩増殖させた。ファージは既に記載された通りに培養上清から回収され、次のラウンドのパニングのために使用された。３回の選択ラウンド後、２６１倍の濃縮が得られ、解析された２８２クローンのうち４６がＨＬＡ−Ａ２−マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体に特異的であることが明らかにされた（図１）。ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体及びＪＣウイルス由来ペプチドとのＨＬＡ−���０２０１複合体を使用するＥＬＩＳＡを用いて、選択されたＦａｂの特異性が決定された。
【００７１】
１．２    ＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａエピトープに特異的なヒトＦａｂは抗原陽性細胞に結合する
[0088]選択されたＦａｂファージは、マルチＭＡＧＥ−ＡペプチドＹ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖが負荷されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬに結合する能力について解析された。Ｂ−ＬＣＬ株ＢＳＭ（０．５×１０６）は、３７℃で３０分間、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチド（１００μｌ  ＰＢＳ中１０μｇ）を負荷され、続いてＦａｂファージＡＨ５、ＣＢ１、ＣＧ１、ＢＤ５及びＢＣ７と一緒にインキュベートされ、フローサイトメトリーにより解析された。図２に示されるように、Ｆａｂ  ＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１はペプチド負荷細胞のみに特異的に結合するが、Ｆａｂ  ＢＤ５及びＢＣ７は、マルチＭＡＧＥ−Ａペプチドが負荷されていないＢＳＭに対して非特異的結合を示した。ＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１による非ペプチド負荷細胞への結合は観察されなかった。
【００７２】
[0089]次いで、ＡＨ５、ＣＢ１及びＣＧ１を提示しているファージ、並びにＨＬＡ−Ａ０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＦａｂファージＧ８（４）を用いて、組織学的起源の異なる腫瘍細胞株が染色された。この目的のために、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）、多発性骨髄腫細胞（ＭＤＮ）、黒色腫細胞（ＭＺ２−ＭＥＬ４３及びＧ４３）及び乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ１５７）は染色されフローサイトメトリーにより解析された（図３）。Ｆａｂ  ＡＨ５は多発性骨髄腫細胞ＭＤＮに特異的に結合したが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性黒色腫及び乳癌細胞には結合しなかった。ＣＢ１とＣＧ１の両方は黒色腫細胞株Ｇ４３上で非特異的結合を示した。陽性対照Ｆａｂ  Ｇ８は試験されたすべての細胞株への結合を示した。
【００７３】
１．３    Ｆａｂ  ＡＨ５はＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａ複合体のみに結合する
[0090]複数のペプチド／ＭＨＣ複合体を使用するＥＬＩＳＡによってＦａｂ−ＡＨ５の特異性が確認された。この目的のために、ペプチド  マルチＭＡＧＥ−Ａ、ｇｐ１００、ＪＣＶ及びＭＡＧＥ−Ｃ２を提示するＨＬＡ−Ａ０２０１複合体、並びにＨＬＡ−Ａ１／ＭＡＧＥ−Ａ１複合体は９６ウェルプレート上に固定され、Ｆａｂ  ＡＨ５及び対照Ｆａｂ  Ｇ８を表示するファージと一緒にインキュベートされた。図４に示されるように、ＡＨ５はＨＬＡ−Ａ０２０１／マルチＭＡＧＥ−Ａのみに結合し、無関係な複合体ＨＬＡ−Ａ０２０１／ｇｐ１００、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＪＣＶ及びＨＬＡ−Ａ０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１には結合しない。陽性対照Ｆａｂ  Ｇ８はその関連標的ＨＬＡ−Ａ０１０１／ＭＡＧＥ−Ａ１のみに結合する。
【００７４】
実施例２：  ラクダ化単一ドメインＡＨ５  ＶＨドメインを含む六量体タンパク質の産生
２．１    六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質の産生のための遺伝子の設計
[0091]ヒト抗体生殖系列遺伝子ＶＨ３はラマ単一ドメインＶＨＨに高い相同性を示す。ヒトＶＨ３遺伝子におけるアミノ酸４４、４５及び４７をラマＶＨＨに存在するこれらの位置のアミノ酸で交換すると、ヒトＶＨ３遺伝子の安定性及び発現が増強されることが明らかにされている（５）。ＡＨ５  ＶＨは生殖系列遺伝子ＶＨ３−３３＊０１に対して低い相同性（ＩＭＧＴ相同性サーチにより決定された場合７１％）を示すが、その発現及び安定性は、ラクダ化と呼ばれるプロセスである、アミノ酸４４、４５及び４７をラマＶＨＨアミノ酸で交換することから利益を得る可能性がある。さらに、発現すると６つのＡＨ５  ＶＨドメインを含むことになる遺伝子が収集された。この目的のために、６つのコドン最適化ラクダ化ＡＨ５  ＶＨドメイン（これは、各ＡＨ５  ＶＨドメイン間にＧＳＴＳＧＳリンカーを有する。）に作動可能に連結されたｐｅｌＢ分泌シグナルを含む遺伝子（Ｈｅｘａ−ＡＨ５と呼ぶ。）が設計された（ＤＮＡ配列は配列番号１、アミノ酸配列は配列番号４参照）。この遺伝子は「Ｇｅｎｅａｒｔ」（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成され、イーコリにおける発現のためにｐＳｔａｂｙ１．２ベクター（Ｄｅｌｐｈｉ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）にクローニングされた。
【００７５】
２．２    六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質の産生及び精製
[0092]六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質（Ｈｅｘａ−ＡＨ５）（ＤＮＡ配列は配列番号１、アミノ酸配列は配列番号４参照）の発現のために、ｐＳｔａｂｙ−Ｈｅｘａ−ＡＨ５ベクターはエレクトロポレーションを介してＳＥ１細菌に導入された。陽性クローンは、ＯＤ６００＝０．８まで３０℃、２％グルコースの存在下で増殖させた。次いで、細菌ＴＹＡＧ培地は、発現を誘導するために、１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＴＹ培地に置き換えられた。３０℃で一晩の培養後、細菌及び培地は採取された。ペリプラズム画分は、氷上での３０分間のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＣｌと一緒の細菌のインキュベーション後に収集された。次いで、タンパク質発現がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。図５に示されるように、Ｈｅｘａ−ＡＨ５タンパク質は培地に分泌され、細菌ペリプラズムに存在していた。
【００７６】
[0093]六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質は、Ｎｉ親和性精製を用いて培地及び細菌から単離された。この目的のために、培地はＮｉ結合セファロースビーズと一緒にインキュベートされ、穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートされた。細胞内タンパク質を得るために、細菌は溶解され細胞残渣は遠心分離により取り除かれた。ＰＢＳを用いた一晩の透析後、六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質はＮｉ−セファロースを用いて精製された。六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認され、タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定された。
【００７７】
実施例３：  六量体ＡＨ５  ＶＨタンパク質は多様な腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する
[0094]パンＭＨＣクラスＩ及びβ２Ｍ特異的抗体によるＭＨＣクラスＩ分子の架橋結合によりアポトーシスの誘導が生じる（６）。このプロセスはカスパーゼ９依存性であることが明らかにされており、インビトロ及びインビボでＭＨＣクラスＩ陽性腫瘍細胞の根絶をもたらす。パンＭＨＣクラスＩ抗体及び抗β２Ｍ特異的抗体によるアポトーシスの誘導は、腫瘍特異的抗原を発現している腫瘍に特異的ではない。これとは対照的に、特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合するＴ細胞受容体に似ている分子の相互作用を通じてペプチド／ＭＨＣ分子が架橋結合すると、腫瘍特異的アポトーシス誘導が生じることになる。効率的架橋結合は、同時に治療分子が結合するペプチド／ＭＨＣ複合体の数に依拠することになる。
【００７８】
３．１    六量体ＡＨ５タンパク質は多様な腫瘍細胞を死滅させる
[0095]六量体ＡＨ５−ＶＨタンパク質は、ＨＬＡ−Ａ０２０１とＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の両方を発現することが知られている多様な腫瘍細胞と一緒にインキュベートすることによりアポトーシスを誘導する能力について解析された。細胞株、Ｄａｊｕ、Ｍｅｌ６２４（黒色腫）、ＰＣ３４６Ｃ（前立腺癌）及びＭＡＧＥ−Ａ陰性細胞（９１１及びＨＥＫ２９３Ｔ）は、１０μｇ／ｍｌのＨｅｘａ−ＡＨ５タンパク質と一緒にインキュベートされた（ＤＭＥＭ培地中、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、グルタミン及び非必須アミノ酸が補充されている）。４時間後、細胞は、組織培養プレートからの細胞の剥離及び膜小疱形成などのアポトーシスの古典的徴候について目視で検査された。図６に示されるように、Ｄａｊｕ細胞は実際、Ｈｅｘａ−ＡＨ５タンパク質と一緒のインキュベーション後にのみ組織培養プレートから剥離する。これは、Ｍｅｌ６２４及びＰＣ３４６Ｃ細胞でも見られた。インキュベーションが一晩まで延長されると、Ｄａｊｕ、Ｍｅｌ６２４及びＰＣ３４６Ｃ細胞は分解され、処理された培養物に特に不在であった。Ｈｅｘａ−ＡＨ５タンパク質で処理されなかった細胞、並びにＨＬＡ−Ａ０２０１（ＨＥＫ２９３Ｔ）及びＭＡＧＥ−Ａ遺伝子（９１１及びＨＥＫ２９３Ｔ）を発現しない細胞は影響を受けなかった。
【００７９】
３．２    六量体ＡＨ５タンパク質は活性カスパーゼ−３を誘導する
[0096]アポトーシスに対する古典的な細胞内の顕著な特徴は活性カスパーゼ−３の存在である。六量体ＡＨ５タンパク質が活性カスパーゼ−３を誘導するかどうかを判定するために、Ｄａｊｕ細胞は１０μｇ／ｍｌのＨｅｘａ−ＡＨ５タンパク質と一緒にインキュベートされた。４時間後、カスパーゼ−３／７に対する蛍光的に標識された阻害剤であるＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫが組織培養培地に添加された。この物質は細胞膜を通過することができる。そして、活性カスパーゼ−３が存在する場合のみ、明るい蛍光シグナルが例えば蛍光顕微鏡法により検出されることになる。
【００８０】
[0097]図７に示されるように、Ｈｅｘａ−ＡＨ５タンパク質で処理されたＤａｊｕ細胞は、活性カスパーゼ−３の存在を示す蛍光シグナルを放射している。処理されなかった細胞は蛍光を示さず、カスパーゼ−３阻害剤の特異性を実証している。
【００８１】
実施例４：  六量体ＡＨ５タンパク質は移植可能なヒト腫瘍モデルにおいてアポトーシスを誘導する
[0098]三次元ヒト腫瘍におけるＨｅｘａ−ＡＨ５タンパク質のアポトーシス活性を実証するために、同所性前立腺癌モデルが使用された。この目的のために、ヒトＰＣ３４６Ｃ前立腺癌細胞がオスＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの前立腺に注射され、超音波誘導検査により腫瘍が検出可能になるまで増殖させた。
【００８２】
４．１    Ｈｅｘａ−ＡＨ５の腫瘍内注射はアポトーシスを誘導する
[0099]ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのヒトＰＣ３４６Ｃ前立腺腫瘍に１０μｇのＨｅｘａ−ＡＨ５タンパク質（２０μｌ総容量中）が１回直接注射された。次の日、腫瘍は取り除かれ、固定化されパラフィン包埋された。パラフィン包埋腫瘍からスライドが調製され、アポトーシスの古典的マーカーである断片化ＤＮＡを検出するアッセイのＴｕｎｎｅｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌアポトーシス検出キット（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を用いて染色された。手短に言えば、スライドは６０℃で３０分間加熱され、ＰＢＳで３回洗浄され、プロテイナーゼＫ溶液と一緒に１時間インキュベートされた。次いで、スライドはブロッキング溶液（メタノール中３％Ｈ２Ｏ２）と一緒に１０分間インキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、タネル反応混合液（平衡バッファー、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ及びＴｄＴ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートされた。３回洗浄後、スライドは、３７℃で３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液と一緒にインキュベートされ、最後にＤＡＢ基質（ＤＡＢバッファー、ＰＢＳ中Ｈ２Ｏ２）と一緒にインキュベートされた。
【００８３】
[00100]Ｈｅｘａ−ＡＨ５で処理された腫瘍材料の顕微鏡解析により、広範囲のアポトーシス細胞が示されている（図８参照）。非処理の腫瘍はＤＮＡ損傷のいかなる徴候も示していない。
【００８４】
４．２    Ｈｅｘａ−ＡＨ５の静脈内注射は同所性前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導する
４．２．１    前立腺腫瘍細胞はＨｅｘａ−ＡＨ５の静脈内注射後ニックの入ったＤＮＡを示す
[00101]次の実験では、同所性ヒトＰＣ３４６Ｃ前立腺腫瘍を有するＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスは、２５μｇのＨｅｘａ−ＡＨ５（１５０μｌ総容量中）を尾部静脈を介して１回注射された。次の日、腫瘍は取り除かれ、パラフィン包埋され、腫瘍スライドはタネルアッセイを用いてニック入りのＤＮＡについて染色された。
【００８５】
[00102]図９に示されるように、Ｈｅｘａ−ＡＨ５処置マウスには広範囲のアポトーシス細胞が存在するが、非処置マウスはアポトーシスのいかなる徴候も示さなかった。
【００８６】
４．２．２    前立腺腫瘍細胞は、Ｈｅｘａ−ＡＨ５の静脈内注射後活性カスパーゼを示す
[00103]同所性ＰＣ３４６Ｃ腫瘍を有するＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスは、２５μｇのＨｅｘａ−ＡＨ５（１５０μｌ総容量中）を尾部静脈から１回注射された。次の日、これらのマウスは、蛍光的に標識されたカスパーゼ阻害剤であるＦＬＩＶＯ（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ）の注射を受けた。この阻害剤は１時間循環し細胞膜を通過するままにされた。次いで、腫瘍は取り除かれ、固定され、パラフィン包埋された。
【００８７】
[00104]蛍光顕微鏡法によるＨｅｘａ−ＡＨ５処理腫瘍の解析により、カスパーゼ基質に陽性染色する数多くの細胞の存在が示された（図１０参照）。未処置マウスでは蛍光的に標識された細胞は検出されなかった。
【００８８】
実施例５：  循環及び腫瘍浸潤を改善するためのＨｅｘａ−ＡＨ５遺伝子の構築
[00105]治療タンパク質の薬物動態特性（例えば、分布、代謝、排出）は、形状、電荷及びサイズなどの要因に依存する。大半の小血漿分子（ＭＷ＜５０〜６０ｋＤａ）の有する半減期は非常に短いが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）などのもっと大きな血漿タンパク質は半減期が非常に長い（ＨＳＡで１９日間、Ｉｇで１〜４週間）。実際、ＩｇＧ−Ｆｃ又はヒト血清アルブミンを添加すると、治療タンパク質に連結した場合、循環時間、腫瘍浸潤及び抗腫瘍効果を伸ばすことが示されている。
【００８９】
５．１    ＩｇＧ１−Ｆｃ及びヒト血清アルブミンを用いた六量体ＡＨ５の構築
[00106]六量体ＡＨ５構築物はＩｇＧ１−Ｆｃ領域に又はヒト血清アルブミンに連結され、真核細胞での発現のためにコドン最適化され、ｐｃＤＮＡ−３．１＋ベクター（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングされた（Ｈｅｘａ−ＡＨ５Ｆｃについては配列番号２のＤＮＡ配列及び配列番号５のアミノ酸配列、Ｈｅｘａ−ＡＨ５ＨＳＡについては配列番号３のＤＮＡ配列及び配列番号６のアミノ酸配列参照）。
【００９０】
５．２    六量体ＡＨ５−Ｆｃ及びＡＨ５−ＨＳＡは活性カスパーゼ−３を誘導する
[00107]六量体ＡＨ５−Ｆｃ及びＡＨ５−ＨＳＡ構築物は、ｐｃＤＮＡ−３．１＋にクローニングされて、２９３Ｔ細胞において発現された。トランスフェクションの４日後に得られた上清を用いて、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＭＡＧＥ−Ａ遺伝子を発現することが知られている黒色腫６２４細胞においてアポトーシスを誘導した。この目的のために、黒色腫６２４細胞は２４ウェルプレートに播種され（０．２５×１０６細胞／ウェル）、一晩付着させておいた。次の日、培地は、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から得られた培地に置き換えられた。結果は、Ｈｅｘａ−ＡＨ５−ＦｃとＨｅｘａ−ＡＨ５−ＨＳＡの両方で処理された６２４黒色腫細胞について陽性カスパーゼ−３染色を示した。単純な培地と一緒にインキュベートされた６２４細胞又はＨＬＡ−Ａ０２０１陽性、ＭＡＧＥ−Ａ陰性９１１細胞では染色は観察されなかった（図１１）。
【００９１】
５．３    六量体ＡＨ５で処置されたマウスの延長された生存及びマウスの遅延された腫瘍増殖
[00108]黒色腫細胞株Ｄａｊｕ（ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＭＡＧＥ−Ａ陽性）を接種されたマウスは、六量体ＡＨ５タンパク質の静脈内注射で処置された（２．５μｇ／２回／週）。１）腫瘍なしマウス、及び２）腫瘍増殖が示されている（図１２）。
【００９２】
５．４    二量体六量体ＡＨ５ＣＨ１及び１１ＨＣＨ１によるアポトーシスの増強された誘導
[00109]真核細胞における発現のために、ＡＨ５ＣＨ１及び１１ＨＣＨ１配列は、ｐＭＳｅｃ  ＳＵＭＯＳＴＡＲベクターに導入された（六量体ＡＨ５ＣＨ１及び１１ＨＣＨ１はＣａＰＯ４を用いたトランスフェクション後２９３Ｔ細胞の上清中で産生された）。２９３Ｔ上清（ＤＭＥＭ中に１対１で希釈された、５％ＦＣＳ）と一緒のＤａｊｕ及びＭＥＬ６２４黒色腫細胞のインキュベーション１時間後、膜小疱形成及び細胞の剥離が観察された。
【００９３】
５．５    ２５℃での六量体ＡＨ５の改良された発現
振盪フラスコにおける３０℃又は３７℃でのＳＥ１における六量体ＡＨ５の発現は、多くの望ましくない比較的小さな産物を生じることが示された。増殖及び産生中に２５℃まで温度を下げると、産生の著しい改善が生じた。タンパク質の収率が上がっただけでなく、得られた副産物は少なくなるか、全くなくなった（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
【００９４】
【表１】
2014505471.tif 000002
【００９５】
【表１Ｂ】
2014505471.tif 000003
【００９６】
【表２】
2014505471.tif 000004
【００９７】
参考文献：
（１）Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｇｒａｆｆ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｏｌｉｖｉｅｒ  Ｆａｕｒｅ，Ｄａｖｉｄ−Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  Ｇｒｏｓｓ，Ｐｅｄｒｏ  Ａｌｖｅｓ，Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｓｃａｒｄｉｎｏ，Ｓａｌｅｍ  Ｃｈｏｕａｉｂ，Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ａ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｓｔａｓ  Ｋｏｓｍａｔｏｐｏｕｌｏｓ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＬ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｎ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ＭＡＧＥ−Ａ１，−Ａ２，−Ａ３，−Ａ４，−Ａ６，−Ａ１０，ａｎｄ  −Ａ１２  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｂｒｏａｄ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，  １６９：５７５−５８０．
（２）Ｈａｎｓ  Ｊ．ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｎｉｃｏｌｅ  ｖａｎ  Ｎｅｅｒ，Ａｎｎｅｋｅ  Ｒｅｕｒｓ，Ｓｉｍｏｎ  Ｅ．Ｈｕｆｔｏｎ，Ｒｏｂ  Ｃ．Ｒｏｏｖｅｒｓ，Ｐａｕｌａ  Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ，Ａｄｒｉａａｎ  Ｐ．ｄｅ  Ｂｒｕｉｎｅ，Ｊａｎ−Ｗｉｌｌｅｍ  Ａｒｅｎｄｓ，ａｎｄ  Ｈｅｎｎｉｅ  Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ．  Ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｔｈａｔ  Ｐｅｒｍｉｔｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，  ２７４：１８２１８−１８２３０．
（３）Ｐ．Ｃｈａｍｅｓ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｉｔｋｅｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，  １７８：１４７−１５９．
（４）Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｓｉｍｏｎ  Ｅ．Ｈｕｆｔｏｎ，Ｐｉｅｒｒｅ  Ｇ．Ｃｏｕｌｉｅ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｕｃｈａｎｓｋａ−Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｈｅｎｎｉｅ  Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ−Ａ１  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｐｈａｇｅ−Ｆａｂ  ｌｉｂｒａｒｙ．  ＰＮＡＳ，２０００，  ９７：７９６９−７９７４．
（５）Ｌｕｔｚ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｓｅｒｇｅ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ．  Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃａｍｅｌ  ＶＨ  ａｎｄ  ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，  ２３１：２５−３８．
（６）Ｊｉｎｇ  Ｙａｎｇ，ＰｈＤ  ａｎｄ  Ｑｉｎｇ  Ｙｉ．  Ｋｉｌｌｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｂ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｏｒ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，  １１６：１６３８−１６４５．
【００９８】
配列識別子：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１．  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｘａ−ＡＨ５：
１          ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣ  ＴＧＣＡＡＧＡＡＡＧ  ＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴ  ＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣ  ＣＴＧＧＴＣＧＴＡＧ  ＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧ
６１        ＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧ  ＣＡＡＧＣＧＧＴＴＴ  ＴＡＣＣＴＴＴＡＧＣ  ＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡ  ＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴ  ＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡ
１２１      ＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧ  ＡＡＣＧＴＧＡＡＧＧ  ＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴ  ＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧ  ＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡ  ＣＡＡＡＴＡＴＴＡＴ
１８１      ＧＣＣＧＡＴＡＧＣＧ  ＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧ  ＣＴＴＴＡＣＣＡＴＴ  ＡＧＣＣＧＴＧＡＴＡ  ＡＴＡＧＣＡＡＡＡＡ  ＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴ
２４１      ＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡ  ＡＴＡＧＣＣＴＧＣＧ  ＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴ  ＡＣＣＧＣＡＧＴＴＴ  ＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣ  ＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣ
３０１      ＴＡＴＴＡＴＧＴＴＣ  ＣＧＧＡＴＴＡＴＴＧ  ＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣ  ＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡ  ＣＣＧＴＴＡＧＣＡＧ  ＣＧＧＴＡＧＣＡＣＣ
３６１      ＡＧＣＧＧＴＡＧＣＡ  ＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴ  ＧＣＡＡＴＴＡＣＡＡ  ＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧ  ＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴ  ＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴ
４２１      ＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣ  ＧＴＣＴＧＴＣＡＴＧ  ＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡ  ＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴ  ＴＣＡＧＴＴＣＡＴＡ  ＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣ
４８１      ＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣ  ＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧ  ＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣ  ＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧ  ＣＣＧＴＴＡＴＴＴＣ  ＡＴＡＣＧＡＴＧＧＣ
５４１      ＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴ  ＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡ  ＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡ  ＧＧＣＣＧＴＴＴＴＡ  ＣＣＡＴＴＴＣＡＣＧ  ＣＧＡＴＡＡＣＡＧＴ
６０１      ＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴ  ＴＡＴＡＣＣＴＧＣＡ  ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡ  ＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧ  ＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣ  ＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣ
６６１      ＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧ  ＧＴＴＣＡＴＡＴＴＡ  ＣＧＴＧＣＣＴＧＡＴ  ＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣ  ＡＡＧＧＴＡＣＡＣＴ  ＧＧＴＧＡＣＡＧＴＴ
７２１      ＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡ  ＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧ  ＴＴＣＡＡＴＧＧＣＣ  ＣＡＧＴＴＡＣＡＡＣ  ＴＧＣＡＡＧＡＡＴＣ  ＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴ
７８１      ＧＴＴＧＴＧＣＡＡＣ  ＣＧＧＧＴＣＧＣＴＣ  ＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧ  ＡＧＴＴＧＣＧＣＴＧ  ＣＡＴＣＡＧＧＴＴＴ  ＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡ
８４１      ＡＧＣＴＡＣＧＧＡＡ  ＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴ  ＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴ  ＣＣＣＧＧＴＡＡＧＧ  ＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧ  ＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴ
９０１      ＡＴＣＡＧＴＴＡＴＧ  ＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡ  ＴＡＡＧＴＡＴＴＡＴ  ＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧ  ＴＴＡＡＧＧＧＴＣＧ  ＴＴＴＴＡＣＡＡＴＴ
９６１      ＴＣＴＣＧＧＧＡＣＡ  ＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡ  ＴＡＣＡＣＴＧＴＡＣ  ＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡ  ＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧ  ＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴ
１０２１    ＡＣＡＧＣＣＧＴＡＴ  ＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣ  ＡＧＧＣＧＧＴＡＧＴ  ＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣ  ＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧ  ＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡ
１０８１    ＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡ  ＣＣＧＴＧＡＧＴＡＧ  ＣＧＧＴＴＣＡＡＣＣ  ＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡ  ＴＧＧＣＧＣＡＡＣＴ  ＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡ
１１４１    ＧＡＧＴＣＴＧＧＴＧ  ＧＣＧＧＴＧＴＧＧＴ  ＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣ  ＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣ  ＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧ  ＣＧＣＡＧＣＣＴＣＴ
１２０１    ＧＧＴＴＴＴＡＣＧＴ  ＴＴＴＣＡＴＣＴＴＡ  ＴＧＧＡＡＴＧＣＡＴ  ＴＧＧＧＴＡＣＧＣＣ  ＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧ  ＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴ
１２６１    ＧＡＧＧＧＣＧＴＡＧ  ＣＡＧＴＧＡＴＣＴＣ  ＴＴＡＴＧＡＴＧＧＴ  ＴＣＧＡＡＣＡＡＡＴ  ＡＴＴＡＣＧＣＧＧＡ  ＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡ
１３２１    ＧＧＡＣＧＣＴＴＴＡ  ＣＡＡＴＣＴＣＴＣＧ  ＴＧＡＴＡＡＣＴＣＡ  ＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣ  ＴＧＴＡＴＣＴＴＣＡ  ＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣ
１３８１    ＴＴＡＣＧＴＧＣＧＧ  ＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣ  ＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣ  ＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧ  ＧＴＴＣＴＴＡＣＴＡ  ＴＧＴＡＣＣＡＧＡＴ
１４４１    ＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣ  ＡＧＧＧＧＡＣＣＴＴ  ＡＧＴＴＡＣＡＧＴＴ  ＡＧＣＴＣＡＧＧＴＡ  ＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧ  ＴＴＣＴＡＴＧＧＣＴ
１５０１    ＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴ  ＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧ  ＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＴＣＣＡＡＣ  ＣＴＧＧＣＣＧＴＡＧ  ＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧ
１５６１    ＴＣＴＴＧＣＧＣＡＧ  ＣＧＡＧＣＧＧＣＴＴ  ＴＡＣＡＴＴＴＴＣＴ  ＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡ  ＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴ  ＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴ
１６２１    ＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧ  ＡＧＣＧＣＧＡＡＧＧ  ＧＧＴＴＧＣＧＧＴＧ  ＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧ  ＡＣＧＧＣＡＧＴＡＡ  ＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣ
１６８１    ＧＣＡＧＡＴＡＧＴＧ  ＴＧＡＡＡＧＧＴＣＧ  ＴＴＴＣＡＣＡＡＴＴ  ＡＧＴＣＧＣＧＡＴＡ  ＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡ  ＣＡＣＡＴＴＡＴＡＴ
１７４１    ＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡ  ＡＣＡＧＴＴＴＧＣＧ  ＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣ  ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴ  ＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣ  ＡＧＧＧＧＧＴＴＣＣ
１８０１    ＴＡＣＴＡＴＧＴＧＣ  ＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧ  ＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧ  ＡＣＣＴＴＡＧＴＧＡ  ＣＣＧＴＴＴＣＡＡＧ  ＣＧＧＴＡＧＴＡＣＣ
１８６１    ＴＣＴＧＧＴＡＧＴＡ  ＴＧＧＣＴＣＡＡＣＴ  ＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡ  ＧＡＧＴＣＡＧＧＣＧ  ＧＡＧＧＣＧＴＴＧＴ  ＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡ
１９２１    ＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣ  ＧＣＴＴＡＡＧＴＴＧ  ＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴ  ＧＧＣＴＴＴＡＣＧＴ  ＴＴＡＧＣＴＣＴＴＡ  ＣＧＧＧＡＴＧＣＡＴ
１９８１    ＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣ  ＡＧＧＣＧＣＣＴＧＧ  ＧＡＡＧＧＡＡＣＧＣ  ＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧ  ＣＴＧＴＧＡＴＴＡＧ  ＴＴＡＣＧＡＴＧＧＣ
２０４１    ＡＧＴＡＡＴＡＡＧＴ  ＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡ  ＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡ  ＧＧＴＣＧＣＴＴＣＡ  ＣＧＡＴＴＴＣＧＣＧ  ＴＧＡＴＡＡＴＴＣＴ
２１０１    ＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣ  ＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡ  ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧ  ＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧ  ＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣ  ＴＧＴＡＴＡＣＴＡＣ
２１６１    ＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧ  ＧＡＴＣＡＴＡＴＴＡ  ＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣ  ＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣ  ＡＧＧＧＴＡＣＴＣＴ  ＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴ
２２２１    ＡＧＣＴＣＴ
【００９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２．  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｘａ−ＡＨ５Ｆｃ：
１          ＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣ  ＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧ  ＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣ  ＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣ  ＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧ  ＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧ
６１        ＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧ  ＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴ  ＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣ  ＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡ  ＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴ  ＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣ
１２１      ＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧ  ＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧ  ＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧ  ＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧ  ＡＣＧＧＣＡＧＣＡＡ  ＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣ
１８１      ＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧ  ＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧ  ＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣ  ＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡ  ＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡ  ＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣ
２４１      ＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡ  ＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧ  ＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣ  ＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴ  ＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣ  ＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣ
３０１      ＴＡＣＴＡＣＧＴＧＣ  ＣＣＧＡＣＴＡＴＴＧ  ＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣ  ＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡ  ＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧ  ＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣ
３６１      ＡＧＣＧＧＣＴＣＣＡ  ＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴ  ＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧ  ＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧ  ＧＣＧＧＡＧＴＣＧＴ  ＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡ
４２１      ＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣ  ＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧ  ＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴ  ＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴ  ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡ  ＴＧＧＡＡＴＧＣＡＴ
４８１      ＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣ  ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧ  ＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧ  ＧＡＡＧＧＧＧＴＣＧ  ＣＡＧＴＧＡＴＣＴＣ  ＣＴＡＣＧＡＴＧＧＣ
５４１      ＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴ  ＡＴＴＡＴＧＣＣＧＡ  ＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧ  ＧＧＧＣＧＣＴＴＴＡ  ＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧ  ＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣ
６０１      ＡＡＧＡＡＣＡＣＡＣ  ＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡ  ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣ  ＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧ  ＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣ  ＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣ
６６１      ＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧ  ＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡ  ＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴ  ＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣ  ＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴ  ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧ
７２１      ＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴ  ＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧ  ＣＡＧＴＡＴＧＧＣＡ  ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣ  ＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣ  ＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧ
７８１      ＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣ  ＣＡＧＧＡＣＧＣＴＣ  ＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧ  ＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧ  ＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴ  ＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣ
８４１      ＴＣＴＴＡＴＧＧＧＡ  ＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴ  ＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡ  ＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧ  ＡＡＣＧＣＧＡＧＧＧ  ＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧ
９０１      ＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧ  ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡ  ＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣ  ＧＣＴＧＡＣＴＣＣＧ  ＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧ  ＣＴＴＣＡＣＡＡＴＣ
９６１      ＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡ  ＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡ  ＴＡＣＴＣＴＧＴＡＣ  ＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡ  ＡＴＴＣＴＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣ
１０２１    ＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴ  ＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣ  ＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣ  ＴＡＴＴＡＣＧＴＣＣ  ＣＣＧＡＴＴＡＣＴＧ  ＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧ
１０８１    ＡＣＡＣＴＣＧＴＣＡ  ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧ  ＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣ  ＴＣＣＧＧＣＴＣＴＡ  ＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴ  ＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧ
１１４１    ＧＡＡＴＣＣＧＧＧＧ  ＧＡＧＧＴＧＴＣＧＴ  ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧ  ＡＧＡＴＣＣＣＴＧＣ  ＧＣＣＴＧＡＧＴＴＧ  ＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣ
１２０１    ＧＧＣＴＴＣＡＣＴＴ  ＴＴＴＣＣＴＣＴＴＡ  ＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴ  ＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣ  ＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧ  ＣＡＡＧＧＡＡＣＧＡ
１２６１    ＧＡＧＧＧＣＧＴＣＧ  ＣＣＧＴＧＡＴＴＴＣ  ＣＴＡＴＧＡＣＧＧＡ  ＴＣＴＡＡＣＡＡＧＴ  ＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡ  ＣＴＣＣＧＴＧＡＡＡ
１３２１    ＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡ  ＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧ  ＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴ  ＡＡＡＡＡＣＡＣＴＣ  ＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡ  ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡ
１３８１    ＣＴＣＣＧＧＧＣＣＧ  ＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣ  ＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣ  ＴＧＴＧＣＡＧＧＣＧ  ＧＧＴＣＴＴＡＴＴＡ  ＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣ
１４４１    ＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣ  ＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴ  ＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣ  ＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴ  ＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧ  ＡＡＧＴＡＴＧＧＣＣ
１５０１    ＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣ  ＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＡ  ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＣ  ＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧ  ＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧ
１５６１    ＴＣＴＴＧＣＧＣＴＧ  ＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴ  ＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣ  ＡＧＴＴＡＣＧＧＡＡ  ＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴ  ＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴ
１６２１    ＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧ  ＡＡＣＧＣＧＡＡＧＧ  ＴＧＴＣＧＣＴＧＴＣ  ＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧ  ＡＣＧＧＧＴＣＣＡＡ  ＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴ
１６８１    ＧＣＴＧＡＴＡＧＴＧ  ＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧ  ＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣ  ＴＣＴＣＧＣＧＡＴＡ  ＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡ  ＴＡＣＣＣＴＣＴＡＴ
１７４１    ＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡ  ＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧ  ＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴ  ＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴ  ＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣ  ＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡ
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１９２１    ＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡ  ＧＡＣＴＧＴＣＡＴＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴ  ＧＧＧＴＴＴＡＣＡＴ  ＴＣＡＧＣＴＣＣＴＡ  ＣＧＧＧＡＴＧＣＡＴ
１９８１    ＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣ  ＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧ  ＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡ  ＧＡＡＧＧＣＧＴＣＧ  ＣＡＧＴＣＡＴＴＡＧ  ＣＴＡＣＧＡＴＧＧＡ
２０４１    ＡＧＴＡＡＣＡＡＧＴ  ＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡ  ＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧ  ＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡ  ＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧ  ＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣ
２１０１    ＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣ  ＴＣＴＡＣＣＴＧＣＡ  ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣ  ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧ  ＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣ  ＴＧＴＣＴＡＴＴＡＴ
２１６１    ＴＧＣＧＣＣＧＧＡＧ  ＧＡＴＣＴＴＡＣＴＡ  ＣＧＴＣＣＣＡＧＡＴ  ＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣ  ＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴ  ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣ
２２２１    ＡＧＣＡＧＣＧＧＡＴ  ＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧ  ＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣ  ＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡ  ＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧ  ＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣ
２２８１    ＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧ  ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧ  ＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣ  ＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴ  ＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡ  ＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣ
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【０１００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３．  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｘａ−ＡＨ５ＨＳＡ：
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１６２１    ＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧ  ＡＡＣＧＣＧＡＡＧＧ  ＴＧＴＣＧＣＴＧＴＣ  ＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧ  ＡＣＧＧＧＴＣＣＡＡ  ＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴ
１６８１    ＧＣＴＧＡＴＡＧＴＧ  ＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧ  ＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣ  ＴＣＴＣＧＣＧＡＴＡ  ＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡ  ＴＡＣＣＣＴＣＴＡＴ
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１８６１    ＴＣＣＧＧＡＴＣＡＡ  ＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴ  ＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧ  ＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧ  ＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴ  ＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣ
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４０２１    ＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣ  ＡＧＧＣＣＧＣＴＣＴ  ＧＧＧＡＣＴＧ
【０１０１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｅｘａ−ＡＨ５：
１          ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
５１        ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
１０１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
１５１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
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３０１      ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
３５１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
４０１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
４５１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡ
５０１      ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
５５１      ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
６０１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
６５１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
７０１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳ
【０１０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｘａ−ＡＨ５Ｆｃ：
１          ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
５１        ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
１０１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
１５１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
２０１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡ
２５１      ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
３０１      ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
３５１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
４０１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
４５１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡ
５０１      ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
５５１      ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
６０１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
６５１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
７０１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＧＡ
７５１      ＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣ  ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ  ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ
８０１      ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ  ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ  ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ  ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ
８５１      ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ  ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ  ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴ  ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ
９０１      ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ  ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ  ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ  ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ
９５１      ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ  ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ  ＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｘａ−ＡＨ５ＨＳＡ：
１          ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
５１        ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
１０１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
１５１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
２０１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡ
２５１      ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
３０１      ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
３５１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
４０１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
４５１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＭＡ
５０１      ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶ
５５１      ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳ
６０１      ＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴ  ＳＧＳＭＡＱＬＱＬＱ  ＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧ  ＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
６５１      ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ  ＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲ  ＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧ  ＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ  ＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳ
７０１      ＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳ  ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹ  ＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤ  ＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ  ＳＳＧＳＴＳＧＳＧＡ
７５１      ＡＧＧＧＳＧＧＲＡＳ  ＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥ  ＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥ  ＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡ  ＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦ
８０１      ＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶ  ＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤ  ＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬ  ＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴ  ＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥ
８５１      ＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰ  ＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫ  ＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶ  ＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡ  ＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫ
９０１      ＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨ  ＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦ  ＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴ  ＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡ  ＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲ
９５１      ＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱ  ＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦ  ＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶ  ＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡ  ＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴ
１００１    ＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣ  ＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤ  ＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥ  ＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫ  ＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫ
１０５１    ＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤ  ＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡ  ＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣ  ＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦ  ＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲ
１１０１    ＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬ  ＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴ  ＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰ  ＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥ  ＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮ
１１５１    ＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥ  ＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡ  ＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰ  ＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶ  ＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫ
１２０１    ＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭ  ＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶ  ＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫ  ＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣ  ＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰ
１２５１    ＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴ  ＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴ  ＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬ  ＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱ  ＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫ
１３０１    ＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡ  ＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥ  ＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴ  ＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶ  ＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【０１０４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−１  ＨＬＡ−Ａ０２０１  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−Ａ：
Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｇ
【０１０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−１  ＨＬＡ−ＣＷ７  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−Ａ：
Ｅ−Ｇ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｅ−Ｋ
【０１０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−１  ＨＬＡ−Ａ０２０１  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−Ａ１：
Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｄ
【０１０７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−１  ＨＬＡ−Ａ０２０１  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−Ａ１，ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＨＬＡ−Ａ０２０１：
Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−Ｒ−Ｑ−Ｖ−Ｐ−Ｖ
【０１０８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｈ−ＡＨ５：
ＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１０９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｈ−１１Ｈ：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０１１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｘａ−１１ＨＣＨ１：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
【０１１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−１  ＨＬＡ−Ａ２４  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−３：
Ｔ−Ｆ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−Ｅ−Ｓ−Ｅ−Ｆ
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−１  ＨＬＡ−Ａ２４  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−３：
Ｉ−Ｍ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｉ
【０１１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＭＨＣ−２  ＨＬＡ−ＤＰ４  ａｎｄ  ＨＬＡ−ＤＱ６  ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＭＡＧＥ−３：
Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｈ−Ｆ−Ｖ−Ｑ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｙ
【０１１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７．  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｘａ−１１ＨＡＨ５：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＰＧＳＧＥＧＴＫＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＥＦＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＬＥＳＳＧＳＧＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＹＩＳＳＤＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＶＳＰＲＧＹＹＹＹＧＬＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＰＧＳＧＥＧＴＫＧＱＬＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＳＹＹＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【図１】
2014505471.tif 000005
【図２】
2014505471.tif 000006
【図３】
2014505471.tif 000007
【図４】
2014505471.tif 000008
【図５】
2014505471.tif 000009
【図６】
2014505471.tif 000010
【図７】
2014505471.tif 000011
【図８】
2014505471.tif 000012
【図９】
2014505471.tif 000013
【図１０】
2014505471.tif 000014
【図１１ａ】
2014505471.tif 000015
【図１１ｂ】
2014505471.tif 000016
【図１２】
2014505471.tif 000017
【図１３】
2014505471.tif 000018
【図１４ａ】
2014505471.tif 000019
【図１４ｂ】
2014505471.tif 000020
【配列表】
2014505471000001.app
【国際調査報告】
2014505471.tif 000021
2014505471.tif 000022