(57)【要約】  官能基化された磁性粒子が、バイオマクロ分子（タンパク質及び核酸）の精製における信頼性の高い便利な技法として出現している。我々は、抗体のアフィニティー精製用に、タンパク質Ａでコーティングされた安定な強磁性ニッケル粒子を作製するのに利用できる、新しい結合手順を開示する。このタンパク質精製手順は、穏やかであり、スケーラブルで、自動化可能、効率的かつ経済的である。タンパク質コーティング中のアミノ酸の官能基を修飾することによって、ニッケル粒子はアフィニティー精製に使用できるだけでなく、他のサンプル調製、及び、核酸分離を含むクロマトグラフィー用途にも利用できる。この方法は、研究室及び臨床前研究における小規模及び中規模の抗体精製向けに容易に改変できる。
2014524567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
ａ．金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
ｂ．安定化タンパク質を含む架橋試薬を加えることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属粒子がニッケルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記安定化タンパク質が、前記吸収分子と同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記安定化タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分子が、カチオンクロマトグラフィーに使用するための塩基性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記塩基性タンパク質が、ヒストンタンパク質又はプロタミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子が、アニオンクロマトグラフィーに使用するための酸性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性タンパク質が、トリプシン阻害物質又はペプシンＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
ａ．タンパク質に結合した金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
ｂ．前記金属粒子を安定化させるのに十分な量の架橋試薬を加えることと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属粒子がニッケルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質を、粒子の金属／金属酸化物表面に共有結合させる方法であって、
ａ．前記粒子の金属／金属酸化物表面にタンパク質を吸着させて、非共有結合性のタンパク質／粒子複合体を形成することと、
ｂ．結合していないタンパク質を除去することと、
ｃ．前記複合体を十分な温度に加熱して、前記吸着したタンパク質と前記粒子表面の酸化物との間に共有結合を形成することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属粒子がニッケルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記共有結合したタンパク質が、標準共有結合手順により、第２の分子に更に結合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の分子が、タンパク質、核酸及び化学物質からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
米国特許仮出願第６１／５１５，３４８号（２０１１年８月５日出願）に対し優先権が主張され、この開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質などの分子を、金属／金属酸化物表面に結合させるための改善された手順に関する。より具体的には、本発明は、磁性でありかつ稠密であるニッケル粒子にタンパク質を結合させるための方法に関する。これらの粒子は、タンパク質精製（親和性及びイオン交換）、核酸の分離、及び化学物質の富化又は検出を含む、分離手順に使用される。
【背景技術】
【０００３】
固体支持体に対するタンパク質の不動化（架橋）は、クロマトグラフィー、バイオセンサー、及び診断における用途のため、バイオテクノロジー分野で実際に用いられている。タンパク質は、共有結合反応又は非共有結合により、選択された支持体又はマトリックスに不動化することができる。支持マトリックスの性質及び用途の目的に応じて、適切な不動化方法を選択することができる。一般に、支持マトリックスは、有機支持体と無機支持体とに分類することができる。有機支持体には、天然ポリマー（多糖類、タンパク質、及び炭素）、並びに合成ポリマー（ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリアミド、ビニル等）が挙げられる。無機支持体には、天然鉱物（ベントナイト、シリカ）、及び加工された材料（ガラス、金属、金属酸化物）が挙げられる。非共有結合は、静電気又は疎水性相互作用などの非特異的な相互作用によって生じる。これらの物理的な相互作用は、ｐＨ及びイオン条件に依存して可逆的である。よって、非共有結合相互作用によるタンパク質不動化は、支持マトリックスからのタンパク質の溶脱を引き起こし得る苛酷な条件には適していない可能性がある。
【０００４】
マトリックス上の利用できる官能基にタンパク質を架橋させるためには、様々な反応が開発されている。利用できるタンパク質の官能基は、カルボキシル、アミン、チオール、及びヒドロキシル基である。翻訳後修飾されたタンパク質は、架橋のための化学基（例えば糖）を所有し得る。活性化された官能基を供給するよう、支持マトリックスも修飾する必要がある。共有結合架橋は、放射的（radial）重合（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ））、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、付加反応（例えばジビニルスルホン）、縮合反応（例えばカルボジイミド（ＥＤＣ））、高エネルギー放射線、及び酵素媒介反応（例えばトランスグルタミナーゼ）により実施することができる。
【０００５】
タンパク質架橋にポリマーの官能基を利用するのは容易である。しかしながら、無機金属粒子（例えば金及びニッケル）、並びに金属酸化物（例えばマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４、酸化ニッケル））については、利用できる明瞭な化学官能基はない。マグネタイトに対してタンパク質又はリガンドを架橋させる一般的アプローチでは、最初にマグネタイトをポリマーでコーティングし、次に、コーティングされたポリマーの官能基に、タンパク質を不動化する。磁性ポリマーミクロスフェアを構成するにはいくつかの方法がある：１）単独磁性粒子をポリマーでコーティングする、２）複数の磁性粒子をポリマーで封入する、３）複数の磁性粒子をポリマー粒子に接合する。これらの技法は、開発が進んでいる。加えて、一部のアプローチでは、マグネタイトの化学合成中に、望ましい官能基を備えた化学物質を加えている。このアプローチの後、均一寸法で沈殿させたマグネタイトを取得し、タンパク質コーティングした、ナノスケールの磁性粒子を形成することが可能である。しかしながら、上記のアプローチはすべて、高度な化学処理が必要であり、工業用途にスケールアップするのは難しい。
【０００６】
タンパク質コーティングされたニッケル又は金属粒子は、様々なクロマトグラフィー用途、特に抗体アフィニティー精製に適用することができる。抗体治療はバイオ療法分子の主要な治療分野となっており、生命にかかわる数多くの疾患治療に使用されている［Ｈ．Ｓａｍａｒａｎａｙａｋｅ，Ｔ．Ｗｉｒｔｈ，Ｄ．Ｓｃｈｅｎｋｗｅｉｎ，Ｊ．Ｋ．Ｒａｔｙ，Ｓ．Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ４１（２００９）３２２］。しかしながら、治療用抗体の製造は、資本コストと変動コストの両方において非常に高価である。抗体精製の下流処理が、抗体治療の高コストに大きく寄与している［Ｄ．Ｌｏｗ，Ｒ．Ｏ’Ｌｅａｒｙ，Ｎ．Ｓ．Ｐｕｊａｒ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８４８（２００７）４８；Ｓ．Ｓ．Ｆａｒｉｄ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８４８（２００７）８；Ｕ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２４（２００８）４９６］。この問題に取り組むため評価された技術の中で、磁気吸着によるバイオ分離が有望性を示しているが、経済的に実現可能であることの証明はまだなされていない。磁気によるタンパク質分離は、生物学研究、イムノアッセイ、及び診断のための普通の慣例となっている。磁性吸収性粒子は通常、ナノメートル〜マイクロメートルサイズの磁性粒子（酸化鉄超常磁性粒子）をポリマー（ポリスチレン、メチルメタクリレート、シリカ等）の中に封入した後、ポリマー表面上で共有結合修飾（タンパク質Ａ及びリガンド）することによって作製される［Ａ．Ａ．Ｎｅｕｒａｕｔｅｒ，Ｍ．Ｂｏｎｙｈａｄｉ，Ｅ．Ｌｉｅｎ，Ｌ．Ｎｏｋｌｅｂｙ，Ｅ．Ｒｕｕｄ，Ｓ．Ｃａｍａｃｈｏ，Ｔ．Ａａｒｖａｋ，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０６（２００７）４１；Ｏ．Ｏｌｓｖｉｋ，Ｔ．Ｐｏｐｏｖｉｃ，Ｅ．Ｓｋｊｅｒｖｅ，Ｋ．Ｓ．Ｃｕｄｊｏｅ，Ｅ．Ｈｏｒｎｅｓ，Ｊ．Ｕｇｅｌｓｔａｄ，Ｍ．Ｕｈｌｅｎ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７（１９９４）４３；Ｒ．Ｘ．Ｒｕｉ  Ｈａｏ，Ｚｈｉｃｈｕａｎ  Ｘｕ，Ｙａｎｇｌｏｎｇ  Ｈｏｕ，Ｓｏｎｇ  Ｇａｏ、及びＳｈｏｕｈｅｎｇ  Ｓｕｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２（２０１０）２７２９］。抗体アフィニティー精製に磁性吸着剤を使用することにより、操作時間を短縮し、タンパク質／細胞採取の工程をなくすことが可能になる［Ｍ．Ｆｒａｎｚｒｅｂ，Ｍ．Ｓｉｅｍａｎｎ−Ｈｅｒｚｂｅｒｇ，Ｔ．Ｊ．Ｈｏｂｌｅｙ，Ｏ．Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７０（２００６）５０５］。パイロット研究では、抗体の分取精製において、従来のクロマトグラフィーを上回る磁気分離の利点が示されている［Ｋ．Ｈｏｌｓｃｈｕｈ，Ａ．Ｓｃｈｗａｍｍｌｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００５）３４５；Ｊ．Ｊ．Ｈｕｂｂｕｃｈ，Ｄ．Ｂ．Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ，Ｔ．Ｊ．Ｈｏｂｌｅｙ，Ｏ．Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  １０（２００１）９９］。数多くの方法が磁性吸���剤の製造に適用されているが、第１世代の磁性ビーズの物理的特性の悪さと高い製造コストにより、このアプローチの工業用途は制限されてきた。
【０００７】
当該技術分野において、タンパク質はニッケル粒子表面に直接付着し、タンパク質のニッケルに対する共有結合なしに、比較的安定した複合体を形成できることが示されている［Ｄ．Ｌｉｕ，Ｙ．ｗａｎｇ，Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ５（１９９５）２５；Ｗ．−Ｙ．Ｃ．Ｈｗａｉ−Ｓｈｅｎ  Ｌｉｕ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ５（１９９５）３５；Ｋ．Ｓｗｉｎｎｅｎ，Ａ．Ｋｒｕｌ，Ｉ．Ｖａｎ  Ｇｏｉｄｓｅｎｈｏｖｅｎ，Ｎ．Ｖａｎ  Ｔｉｃｈｅｌｔ，Ａ．Ｒｏｏｓｅｎ，Ｋ．Ｖａｎ  Ｈｏｕｄｔ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８４８（２００７）９７］。これらの複合体が形成されるメカニズムは完全には理解されていない。（高ｐＨ緩衝液又は低ｐＨ緩衝液を用いて）ニッケル粒子からの標的タンパク質の溶出中に起こる、コーティングされたタンパク質（すなわちタンパク質Ａ）の溶脱によって、分離された標的タンパク質が汚染される可能性があり、プロセス工程のいずれかで起こる溶脱が、時間が経つにつれて粒子の容量をゆっくりと低減させ、よってその半減期を低減させる可能性がある。本開示の方法は、抗体捕捉、洗浄、及び溶出中の、タンパク質溶脱を最小限に抑えることができる。コーティングされ不動化されたタンパク質Ａの抗体結合アフィニティーは影響を受けない。加えて、タンパク質コーティングされたニッケル粒子は、抗体結合機能を失うことなく、少なくとも２年間、４℃で保存することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質又はペプチドでニッケル粒子をコーティングするのは迅速かつ効率的なプロセスであるが、この複合体が、タンパク質Ａから抗体を放出する溶出条件に耐えるのに十分なだけの安定性を有しているかどうかを判定する必要があった。我々は、標的タンパク質の溶出中の溶脱を防ぐための、ニッケル結合タンパク質リガンドの架橋方法を開示する。本明細書において開示される下記の発明は、当該技術分野の超常磁性粒子及び当該技術分野の裸のニッケル粒子の限界を克服する方法を詳述する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
新しい磁性粒子（米国特許出願第１１／１５９，９５７号、参照により本明細書に組み込まれる）が、本明細書に開示される結合手順の開発に使用された。この中実の金属粒子（例えばニッケル粒子が挙げられるがこれに限定されない）は非常に高密度（約９ｇ／ｃｍ３）かつ強磁性であり、ニッケル粒子に金属酸化物コーティングを生じさせる温度まで加熱することができる。この粒子は不規則な表面を有し、これが表面積を増大させ、潜在的に結合能を増大させる。加えて、この粒子は様々な用途用に幅広い範囲の寸法で製造することができる。他の磁性粒子より顕著に高い密度であることにより、混合性が強化され、よって、未希釈の粘稠な溶液中での対象物捕捉が強化される。リガンド官能基化ニッケル粒子は、標的タンパク質に対する迅速な結合反応速度を有し、更に、これらは強磁性であるため、分離時間も非常に迅速である。この分離技術は小さな研究室規模の容積で実施することができ、あるいは、製造規模のタンパク質精製に必要な容量にスケールアップすることができる。この粒子の物理的特性、密度、急速な結合、及び強磁性モーメントにより、全体のサンプル曝露時間が最小限に抑えられ、ダウンストリーム処理中の非特異的なタンパク質変性又は分解の可能性を低減する。
【００１０】
安定なマトリックスなしでは、金属粒子にタンパク質を共有結合的に不動化するのは不可能である。しかしながら、タンパク質は、非特異的な静電又は疎水性相互作用により、金属粒子と非共有結合による相互作用を形成することができる。この非共有結合によりコーティングされたタンパク質は、上述の技法で架橋させることができ、粒子を均一に覆うネットとして、安定した（sable）マトリックスを形成することができる。これらのタンパク質マトリックスは、アミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル、及びアルデヒド等の官能基を有する。このことは、粒子にコーティングされるタンパク質マトリックスに架橋するタンパク質又はリガンドに関して、様々な選択肢をもたらす。このアプローチに従って、金属粒子（安定化されたタンパク質マトリックスを介して間接的に）及びその他の、修飾のための化学官能基を欠いた粒子又は材料（カーボンナノチューブ）を、ポリマーコーティング及び化学合成を伴わずに、共有結合により修飾することが可能である。アルブミンの他に、適切なタンパク質、ペプチド、及びリガンドを、強い非共有結合に関してスクリーニングすることができ、次にこれらを架橋させ、安定したマトリックスとして利用することができる。これらのタンパク質は、強い結合と架橋の容易さのために、富システインタンパク質、塩基性タンパク質、酸性タンパク質、疎水性タンパク質、又は選択された特性の組み合わせ（例えば、これらの特性すべてを備えた、遺伝子組み換えされたタンパク質及び合成ペプチド）であり得る。
【００１１】
本発明の一実施形態には、タンパク質のアフィニティー精製又はカチオン／アニオン交換クロマトグラフィーが組み込まれる。我々は、より活性で安定な、望ましい分子と結合したニッケル粒子が、望ましいタンパク質（例えば、アフィニティー精製によりモノクローナル抗体が挙げられるがこれに限定されない）、関心対象の核酸、又は標的化学物質を捕捉でき、これらはすべて当該技術分野の標準架橋手順に従って作製することができることを見出した。粒子にすでに結合したタンパク質、又は無関係なタンパク質（すなわちウシ血清アルブミン）を含めることによる改善が、この架橋反応に組み入れられる（incorporated）。塩基性タンパク質（例えばヒストンタンパク質及びプロタミン）は、インキュベーションして直接架橋させ、カチオン交換クロマトグラフィーに使用することができる。酸性タンパク質（例えばトリプシン阻害物質又はペプシンＡ）は、インキュベーションして直接架橋させ、アニオン交換クロマトグラフィーに使用することができる。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、タンパク質（すなわちアルブミン、ただしこれに限定されない）が結合した粒子を、高温に加熱して、タンパク質と金属表面との間の相互作用を強化し、表面の金属酸化物とタンパク質の活性基との間の共有結合を介した安定なタンパク質金属／金属酸化物表面結合を実現することができる。よって、化学修飾のための安定なマトリックスを形成するのに、架橋は必ずしも必要ではない。結合タンパク質の反応性基は、この後、関心対象の他の分子（すなわち、タンパク質、核酸、又は化学物質）をこの粒子に共有結合させるのに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】酸及びアルカリ溶出におけるニッケル粒子からのＢＳＡの溶脱。溶脱したＢＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって可視化された。
【図２】タンパク質Ａコーティングされたニッケル粒子は、抗体を捕捉することができる。溶脱したタンパク質Ａと溶出した抗体が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く銀染色によって可視化された。
【図３】架橋したタンパク質結合ニッケル粒子を用いたアフィニティー精製のフローチャート。
【図４】ニッケル結合したＢＳＡとタンパク質Ａの架橋によって、酸又はアルカリ溶出中の粒子からのタンパク質溶脱を最小限に抑えることができる。
【図５】ニッケル粒子に結合した架橋タンパク質Ａは、溶脱したタンパク質Ａがほとんど検出されない状態で、ＩｇＧアフィニティー精製に使用することができる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色）。
【図６】タンパク質Ａコーティングされたニッケル粒子は、血清から抗体を迅速に分離することができる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ニッケル粒子（約３μｍ）は、Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から供給された。ＢＳＡ及びグルタルアルデヒドは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。タンパク質ＡはＢｉｏｖｉｓｏｎから購入した。精製マウスＩｇＧ及びマウス血清は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。ブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬は、ＢｉｏＲａｄから購入した。ＢＣＡタンパク質アッセイキットは、ＰＩＥＲＣＥから購入した。
【００１５】
タンパク質コーティングされたニッケル粒子の調製：
ニッケル粒子（１ｇ）（総容積０．４〜０．５ｍＬ）をＰＢＳ  ３ｍＬずつで３回、５分間洗った。平衡させた粒子を、４℃で一晩、２ｍＬの０．１％  ＢＳＡ又はタンパク質Ａ（１ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベーションした。タンパク質Ａコーティングについては、一晩のインキュベーション後にタンパク質Ａ溶液を除去し、次に室温で２時間、０．１％  ＢＳＡ  ２ｍＬを用いてブロックした。タンパク質コーティングされたニッケル粒子を次に、ＰＢＳ  ３ｍＬずつで３回、５分間洗い、使用まで４℃で保存した。
【００１６】
タンパク質コーティングされたニッケル粒子の架橋：
ＢＳＡ又はタンパク質Ａで一晩インキュベーションした後、タンパク質／ニッケル混合物に、１％グルタルアルデヒドを、タンパク質とグルタルアルデヒドとの間のモル比が１：６０となるように加えた。この混合物を２５０ＲＰＭで２時間、３７℃で振盪した。これに１／１０容の１Ｍトリス塩酸（ｐＨ  ８．０）を加えることにより反応を停止させ、この粒子をＰＢＳ  ３ｍＬで３回洗った。
【００１７】
ＩｇＧ結合及び溶出
タンパク質Ａコーティングされたニッケル粒子（１ｇ）を、０．１％マウスＩｇＧ又は１ｍｇ  ＩｇＧ／ｍＬマウス血清と共に、室温で、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間及び５０分間、インキュベーションした。インキュベーション後、ニッケル粒子を磁気的に溶液から除去した。ニッケル粒子を消磁し、１Ｘ  ＰＢＳずつで３回、５分間洗った。５００μＬの酸性緩衝液（クエン酸１００ｍＭ、ｐＨ  ２．２）又はアルカリ性緩衝液（トリエタノールアミン１００ｍＭ、ｐＨ  １２．８）を加え、更に室温で５分間２０ｒｐｍで回転させることによって、タンパク質Ａ結合ＩｇＧを溶出させた。溶出後、粒子を磁気的に溶液から除去し、上澄み液に１Ｍトリス塩酸（ｐＨ  ８．０）を７５μＬ加えることによって中和した。溶出したＩｇＧの濃度は、ブラッドフォード法及びＢＣＡ法によって取得した。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、銀又はクマシーブルーＧ−２５０染色によって可視化した。
【００１８】
ニッケル粒子に吸着したＢＳＡの溶脱
メカニズムは不明であるが、タンパク質はニッケル粒子に吸着し、ニッケル表面に共有結合的に付着することなく、比較的安定な複合体を形成する。ニッケルからのタンパク質の溶脱はクロマトグラフィー利用には制限があるため、我々は、様々なインキュベーション条件下で粒子から放出されたタンパク質の量を試験した。溶脱の評価には、モデルタンパク質としてＢＳＡを使用した（図１）。ＢＳＡ結合ニッケル粒子を、それぞれ、酸性緩衝液（レーン２、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ  ２．２）及びアルカリ性緩衝液（レーン３、１００ｍＭトリエチルアミン、ｐＨ  １２．８）でインキュベーションした。上澄み液を回収し、溶出したＢＳＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色で同定した。ニッケル粒子に結合したＢＳＡが計算され、溶出緩衝液に溶脱したＢＳＡが測定された。これらの測定により、酸性緩衝液に溶出したニッケル結合ＢＳＡは２％未満、アルカリ性緩衝液に溶出したのは約２〜５％であることが示された。
【００１９】
抗体精製中のタンパク質Ａの溶脱
タンパク質Ａは、ＢＳＡと同様、ニッケル粒子表面で非共有結合複合体を形成する。ニッケル結合タンパク質Ａ粒子は、溶脱が最小限であれば、抗体の磁気精製に有用であり得るため、我々は様々な条件下でタンパク質Ａの溶脱を試験した。タンパク質Ａニッケル粒子を、１ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧと共に２０分間インキュベーションした。タンパク質Ａ−ＩｇＧ複合体を含む粒子を、溶液から磁気的に除去した。図２のデータは、タンパク質Ａ結合ニッケル粒子が精製ＩｇＧを捕捉可能であることを示している。しかしながら、ＩｇＧ溶出中に（レーン２及び４）、顕著な量のタンパク質Ａが粒子から溶脱した。更に、タンパク質Ａは、酸性条件とアルカリ性条件の両方において（レーン３及び５）、ＢＳＡよりも容易に、ニッケル表面から溶出した。
【００２０】
ニッケル結合タンパク質の架橋
タンパク質ＡとＢＳＡの両方とも、標的タンパク質の溶出中にニッケル粒子から溶脱することが見出されたため、ニッケルに対するこれらのタンパク質のより安定した複合体が必要となった。ニッケル表面には明らかな官能基はないため、現在当該技術分野で行われている（currently the art）ポリマーコーティングされた磁性粒子によってなされ得るような、タンパク質Ａをニッケル粒子に共有結合させるのは実践的ではない。我々は、ニッケル結合タンパク質を架橋させることにより、タンパク質結合を安定化させ、溶脱を防止又は少なくとも最小限に抑えることが可能になるかどうかを試験した（図３）。ニッケル結合タンパク質／ポリマーを架橋させることによって、タンパク質／ポリマーにより提示される化学官能基に更なる化学修飾を行うための、安定なマトリックスを提供することが示された場合は、タンパク質精製、及びリガンド／化学物質検出において、ニッケル粒子の適用が劇的に拡大することになろう。
【００２１】
ニッケル結合ＢＳＡ及びタンパク質Ａをニッケル粒子表面に架橋させるには、グルタルアルデヒドが使用された（図４）。ＢＳＡ（レーン２〜７）又はタンパク質Ａ（レーン９〜１４）のいずれも、ニッケル粒子に結合された。タンパク質Ａ粒子は次に、ＢＳＡで２時間ブロックされた。０．１％  ＢＳＡ（レーン２及び５）若しくはタンパク質Ａ（レーン９及び１２）の存在下、又はＰＢＳのみ（レーン３、６、１０、及び１３）の存在下で、グルタルアルデヒド架橋が実施された。溶液中のタンパク質の存在下での架橋により、現在当該技術分野でなされているものとは異なり、溶出緩衝液（レーン２、５、９、及び１２）において最も少ない溶脱が示されている。アルカリ性溶出液（レーン６、７、１３及び１４）では、酸性溶出液（レーン２、３、９及び１０）よりも多い溶脱を生じた。前に述べたように、同じ条件下において、ニッケル粒子からのＢＳＡの溶脱は、タンパク質Ａの場合よりもはるかに少なかった。
【００２２】
金属表面に対する吸収後の加熱
本発明の別の態様は、ＢＳＡ又は他のタンパク質が結合したニッケル粒子を、今日の磁気分離技術では不可能な温度まで加熱することができ、これによって、（特に上述のようにネッティング後に）安定した、タンパク質、核酸、又は化学物質の直接的な共有結合付着に使用できる、変性ポリペプチド及び化学官能基（ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨ等）を得ることができる。官能基化されたニッケル粒子は、あらゆる種類のクロマトグラフィー分離に利用することができる。
【実施例】
【００２３】
１．マウス血清からの抗体分離
タンパク質Ａ結合ニッケル粒子は、非常に急速な混合及び捕捉反応速度を有する。ゆえに、他の磁性ビーズよりも迅速に、未希釈のマウス血清から抗体を分離するのに使用することもできる。マウス血清を、図６に示す時間、架橋したタンパク質Ａ結合ニッケル粒子と共にインキュベーションした。わずか５分で、タンパク質Ａ結合ニッケル粒子は血清から抗体を効率的に分離した。５０分までのインキュベーション時間で、追加で捕捉された抗体はごくわずかであった。インキュベーションが短かったため、抗体の純度及び収率は損なわれなかった。加えて、粒子抗体複合体を血清から磁気的除去するのは、１分未満で完了した。このプロセスは、例えばアガロースビーズなどの、他のタンパク質Ａ系修飾クロマトグラフィー基質よりも、顕著に迅速である。この反応速度増加は、非多孔質ニッケル表面によるものであるか、又は、粘稠な溶液中で稠密な粒子を急速に混合したことによるものであり得る。
【００２４】
優れた純度、単純な手順、及び高収率は、粗血清又は細胞抽出物からの抗体精製にスケールアップするのに、魅力的な特性である。加えて、短いインキュベーション時間により、抗体精製中の汚染を顕著に減少させ得る。
【００２５】
２．カーボンナノチューブのコーティング
本開示の結合手順は、望ましい分子でカーボンナノチューブをコーティングするのに使用される。様々な寸法及び形状のカーボンナノチューブは、適切な緩衝液中の吸収によって、望ましい分子と非共有結合する。このカーボンナノチューブを次に、遠心分離及び緩衝液での再懸濁によって洗う。架橋剤、グルタルアルデヒド、又は別の適切な架橋剤を、吸収によりカーボン（crabon）ナノチューブに結合している分子が存在する溶液に加える。反応は室温で、様々な時間実施する。当該技術分野に従い、グリシンを加えることによって反応を止める。関心対象の分子、例えばタンパク質（抗体及びリガンド）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は化学修飾したＤＮＡ若しくはＲＮＡ誘導体）、又は化学物質（薬剤若しくは化学プローブ）を備えた、ナノチューブコーティングされたタンパク質の官能基の修飾について調べる。
【００２６】
３．金属酸化物の形成
ニッケル粒子は、２５０℃で３〜７２時間加熱し、金属酸化物層を形成する。この粒子を室温（ＲＴ）まで冷ます。５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ８．０）中０．１％〜２％の範囲の様々なＢＳＡ溶液を、３２〜６４ｍｇ／ｍＬのニッケル粒子と混合し、室温で一晩転倒混和する。粒子をトリス緩衝液で３回すすぎ、５６℃以上に加熱して、安定な共有結合ＢＳＡ−ニッケル粒子を形成するのに最適な温度を判定する。安定性を判定するために測定されるパラメーターは、酸性及び塩基性溶出であり、ＢＳＡが酸又は塩基によって溶出しない温度を調べる。このＢＳＡ−ニッケル粒子を、当該技術分野で既知の標準手順により、ＢＳＡの反応性側鎖に、関心対象の分子（すなわち抗体が挙げられるがこれに限定されない）を共有結合させるのに使用する。
【００２７】
本発明は具体的な実施形態を参照して記述されているが、当業者には、ここから数多くのバリエーションをなし得ることが理解されよう。本発明によるこの発見は、当業者により想到し得る数多くのその他の潜在的なバリエーションの例示によってのみ理解及び評価されるものであり、ゆえに、本発明をいかなる意味でも制限するものではない。したがって、本発明の他の目的及び利点は、特許請求の範囲及び本明細書より、当業者には明らかとなろう。
【００２８】
〔実施の態様〕
（１）  分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
ａ．金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
ｂ．安定化タンパク質を含む架橋試薬を加えることと、を含む、方法。
（２）  前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記金属粒子がニッケルである、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記安定化タンパク質が、前記吸収分子と同じである、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記安定化タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、実施態様１に記載の方法。
【００２９】
（６）  結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記分子が、カチオンクロマトグラフィーに使用するための塩基性タンパク質である、実施態様１に記載の方法。
（８）  前記塩基性タンパク質が、ヒストンタンパク質又はプロタミンである、実施態様７に記載の方法。
（９）  前記分子が、アニオンクロマトグラフィーに使用するための酸性タンパク質である、実施態様１に記載の方法。
（１０）  前記酸性タンパク質が、トリプシン阻害物質又はペプシンＡである、実施態様９に記載の方法。
【００３０】
（１１）  分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
ａ．タンパク質に結合した金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
ｂ．前記金属粒子を安定化させるのに十分な量の架橋試薬を加えることと、を含む、方法。
（１２）  前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、実施態様１１に記載の方法。
（１３）  前記金属粒子がニッケルである、実施態様１１に記載の方法。
（１４）  結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、実施態様１１に記載の方法。
（１５）  タンパク質を、粒子の金属／金属酸化物表面に共有結合させる方法であって、
ａ．前記粒子の金属／金属酸化物表面にタンパク質を吸着させて、非共有結合性のタンパク質／粒子複合体（non-covalent protein/particle complex）を形成することと、
ｂ．結合していないタンパク質を除去することと、
ｃ．前記複合体を十分な温度に加熱して、前記吸着したタンパク質と前記粒子表面の酸化物との間に共有結合を形成することと、を含む、方法。
【００３１】
（１６）  前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  前記金属粒子がニッケルである、実施態様１５に記載の方法。
（１８）  前記共有結合したタンパク質が、標準共有結合手順により、第２の分子に更に結合される、実施態様１５に記載の方法。
（１９）  前記第２の分子が、タンパク質、核酸及び化学物質からなる群から選択される、実施態様１８に記載の方法。
（２０）  前記タンパク質が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、実施態様１５に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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