(57)【要約】  ウイルス抵抗性トランスジェニックカイコおよびその作製の方法が、本明細書で提供される。本明細書で開示するトランスジェニックカイコは、少なくとも2つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAの同時および構成的発現を示す。本発明のトランスジェニックカイコは、バキュロウイルスのウイルス遺伝子のRNA干渉(RNAi)媒介抑制によって作製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、
a.配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、
b.スペーサー配列、および
c.センスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖
を含む、shRNA。
【請求項２】
断片が、少なくとも15の連続したヌクレオチドを含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項３】
センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片を含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項４】
センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片を含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項５】
センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片を含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項６】
センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片を含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項７】
センスRNA鎖が、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片を含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項８】
スペーサー配列が、配列番号15を含む、請求項1に記載のshRNA。
【請求項９】
a.配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
b.配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
c.配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
d. プロモーターに作動可能に連結している、請求項1に記載のshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む組換えDNA構築物。
【請求項１０】
プロモーターが、構成的プロモーターまたは組織特異的なプロモーターである、請求項9に記載の組換えDNA構築物。
【請求項１１】
構成的プロモーターが、カイコ細胞質アクチン(Bmactin)プロモーターである、請求項10に記載の組換えDNA構築物。
【請求項１２】
組織特異的なプロモーターが、Pax(3XP3)プロモーターである、請求項10に記載の組換えDNA構築物。
【請求項１３】
shRNAをコードするポリヌクレオチドが、
a.配列番号16、配列番号17、配列番号18、および配列番号19から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、
b.スペーサー配列、および
c.センス鎖に相補的なアンチセンス鎖
を含む、請求項9に記載の組換えDNA構築物。
【請求項１４】
レポーター遺伝子をさらに含む、請求項9に記載の組換えDNA構築物。
【請求項１５】
請求項1に記載の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするポリヌクレオチドまたは請求項9に記載の組換え構築物を含む、組換えベクター。
【請求項１６】
請求項1に記載の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするポリヌクレオチドまたは請求項9に記載の組換え構築物または請求項15に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
E. coliまたは昆虫細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
昆虫が、カイコである、請求項17に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニック昆虫の作製の方法であって、請求項9に記載の組換え構築物で昆虫を形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法。
【請求項２０】
昆虫が、カイコである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
カイコが、ボンビックス・モリである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
請求項1に記載の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)または請求項9に記載の組換えDNA構築物を発現する、バキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫。
【請求項２３】
請求項1に記載の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)または請求項9に記載の組換えDNA構築物を発現する、バキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫子孫。
【請求項２４】
昆虫が、カイコである、請求項22に記載のバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫または請求項23に記載のバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック昆虫、家畜化されたカイコ、ボンビックス・モリ(Bombyx mori L.)におけるバキュロウイルス感染の抑制のためのRNA干渉(RNAi)の使用に関する。PiggyBacトランスポゾンベースのベクターによって、我々は、4つの必須ウイルス遺伝子、すなわち、前初期-1(immediate early-1; ie-1)、後期エフェクター因子(late effector factors; lef1および3)およびp74に対する二本鎖RNAを構成的に産生するトランスジェニックカイコの18のホモ接合系統を得た。
【背景技術】
【０００２】
家畜化されたカイコ、ボンビックス・モリは、重大な経済的重要性を有する主要な鱗翅目の昆虫であり、ゲノム解析のための理想的な鱗翅目モデル系ともみなされている(Nagaraju J and Goldsmith MR (2002) Silkworm genomics - progress and prospects. Current Science 83: 415-425; Nagaraju J, Klimenko V and Couble P (2000) The silkworm Bombyx mori, a model genetic system. In Encyclopedia of Genetics, ed. Reeves E. (Fitzroy Dearborn, London), pp. 219-239)。経済的昆虫および遺伝的ツールとしてのその有用性に加えて、カイコの産業的適用が、PiggyBacトランスポゾンベースのベクターを使用した、成功的な生殖系列遺伝子導入によって、増大している(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84)。この鱗翅目は、インドにおける何百万の農家に生計を提供するのだが、農家の収入は、ウイルスボンビックス・モリ核多角体病ウイルス(BmNPV)によって引き起こされる重度のバキュロウイルス病害のために影響される。作物の損失のほと
んど50%が、バキュロウイルスによって占められている。バキュロウイルス感染サイクルの最後に産生される多角ウイルス体(polyhedral viral body)の頑強な性質は、特に夏および暑く湿った季節において広く蔓延したウイルス感染を助長する。したがって、BmNPV抵抗性カイコ株の開発は、絹繭収穫高を安定化し、絹生産高を改善し、その結果、養蚕の経済を改善するための最大の優先事項である。
【０００３】
BmNPVは、バキュロウイルス科のメンバーであり、節足動物、主に昆虫に感染する無脊椎動物ウイルスの14の主要なファミリーの1つである(van Regenmortel MH, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR and Wickner RB (2000) Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Academic Press, San Diego, Wien New York.; Murphy FA, Fauquet CM, Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA and Summers MD (1995) Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Virus. (Springer Verlag, Wien, New York)。バキュロウイルスの大部分のように、BmNPVは、宿主特異的であり、ボンビックス・モリN(BmN)細胞に対して高い感染性であるが、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf21)細胞において複製しない(Kondo A and Maeda S (1991) Host range expansion by recombination of the baculoviruses Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of Virology 65: 3625-3632)。バキュロウイルスの生活環は、カイコが、多角封入体(Polyhedral Inclusion Body; PIB、封入体由来ウイルス(occlusion derived virus)としても知られている)として葉上に残された環境に抵抗性のウイルス粒子を食べた場合に生じ、中腸のアルカリ性の環境に入った時に、受容体を通しての中腸細胞中への侵入を獲得する遊離ウイルス粒子(free virion)を放出する。細胞内で、ウイルス遺伝子は、宿主RNAポリメラーゼIIによって、前初期-1 (ie-1)、ie-2などの初期遺伝子が、初期プロモーターから転写され、一時的な様式で転写を開始する(Huh NE and Weaver RF (1990a) Categorizing some early and late transcripts directed by the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 2195-2200)。これに、アマニチン抵抗性ウイルスRNAポリメラーゼが、極後期遺伝子(very late gene)の転写を開始する間、他の後期エフェクター因子(lef)の発現が続く(Huh NE and Weaver RF (1990b) Identifying the RNA polymerases that synthesize specific transcripts of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 195-201)。最後に、多角外被内に被包されたウイルス粒子が、細胞溶解および感染した幼虫の完全な分解によって、環境に放出される。PIBと対照的に、多角カバーなしで細胞内で形成される遊離ウイルス(free virus)(発芽型ウイルス(Budded Virus-BV)として知られている)は、個体内感染(intra-individual infection)を開始する。幼虫の気管系は、バキュロウイルスが、基底層を通過し、感染を蔓延させるための主要なチャネルを提供する(Engelhard E, Kam-Morgan L, Washburn J and Volkman L (1994) The insect tracheal system: A conduit for the systemic spread of Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 3224-3227)。
【０００４】
プラスミドDNA複製を使用することによって、ie-1、lef-1、lef-2およびlef-3などのlef遺伝子は、複製に必須であることが示された(Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982)。バキュロウイルス前初期-1 (ie-1)遺伝子は、ウイルス複製に必要な5つの必須遺伝子の1つである(Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982; Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216)。IE-1は、ie-2、39Kおよびp35を含めた初期遺伝子のプロモーターを活性化することが示唆され(Carson D, Summers M and Guarino L (1991) Molecular analysis of a baculovirus regulatory gene. Virology 182: 279-286; Guarino LA and Summers MD (1986) Functional mapping of a trans-activating gene required for expression of a baculovirus delayed-early gene. Journal of Virology 57: 563-571; Nissen MS and Friesen PD (1989) Molecular analysis of the transcriptional regulatory region of an early baculovirus gene. Journal of Virology 63: 493-503)、直接的または間接的に後期遺伝子の発現に関与する(Passarelli A and Miller L (1993) Three baculovirus genes involved in late and very late gene expression: ie-1, ie-n, and lef-2. Journal of Virology 67: 2149-2158)。DNA複製に重要な後期発現因子の1つは、後期および極後期遺伝子発現に関与する遺伝子lef-1である(Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216)。LEF-1は、DNA複製の開始に必須であるDNAプライマーゼである(Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940)。しかしながら、lef-1単独のRNAi媒介ノックダウンは、バキュロウイルス増殖の完全な抑止を示さなかった(Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940)。
【０００５】
Lef-3遺伝子は、DNA複製に必要な、バキュロウイルスによってコードされる遺伝子の別の必須の初期クラスである(Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982; Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216; Li Y, A L Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. Journal of Virology 67: 5260-5268)。LEF-3は、推定上のDNAヘリカーゼ、P143の核局在化を媒介する(Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40, Chen Z and Carstens EB (2005) Identification of domains in Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus late expression factor 3 required for nuclear transport of P143. Journal of Virology 79: 10915-10922)ホモ三量体を形成する、一本鎖DNA結合タンパク質である(Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40)。
【０００６】
P74は、病原性に必須である(Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies. Virology 173: 759-763)が、DNA複製に関連していない、ウイルス粒子のODV型において発見される外被タンパク質である(Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies. Virology 173: 759-763; Faulkner P, Kuzio J, Williams GV and Wilson JA (1997) Analysis of P74, a PDV envelope protein of Autographa californica nucleopolyhedrovirus required for occlusion body infectivity in vivo. Journal of General Virology 78: 3091-310)。それは、バキュロウイルスの生活環において後期に転写され、経口的接種の間、中腸へのウイルス粒子の付着を助けると考えられている(Haas-Stapleton EJ, Washburn JO and Volkman LE (2004) P74 mediates specific binding of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothis virescens larvae. Journal of Virology 78: 6786-6791)。
【０００７】
RNA干渉(RNAi)は、遺伝子ノックダウンにつながる選択的mRNA破壊の現象である(Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S and Mello C (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811)。RNAiは、現在、古代の抗ウイルス戦略であると考えられており(Lindenbach B and Rice C (2002) RNAi targeting an animal virus: news from the front. Molecular Cell 9: 925-927; Downward J (2004) RNA interference. British Medical Journal 328: 1245-1248)、その一部を細胞機械が遺伝子調節機構にも利用している(Denli AM and Hannon GJ (2003) RNAi: an ever-growing puzzle. Trends in Biochemical Sciences 28: 196-201; Agrawal N, Dasaradhi PV, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK and Mukherjee SK (2003) RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and Molecular Biology Review 67: 657-685)。RNAiは、カイコB. moriを含めた多くの節足動物種において働くことが示され(Riu HL, Li W-X and Ding S-W (2004) RNA-based immunity in insects. In SGM symposium 63: Microbe-vector interactions in vector-borne diseases, ed. S. H. Gillespie, G. L. S. A. O. (Cambridge University Press) pp. 63-74)、スポドプテラ・フルギペルダにおけるAcNPV増殖を抑止することが実証された(Valdes VJ, Sampieri A, Sepulveda J and Vaca L (2003) Using double-stranded RNA to prevent in vitro and in vivo viral infections by recombinant baculovirus. Journal of Biological Chemistry 278: 19317-19324)一方、lef-1単独およびie-1単独を標的とするRNAiは、B. moriにおけるBmNPV増殖を効率的に抑制するために効果的ではなかった(Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940; Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms, Insect Molecular Biology 16: 635-644)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nagaraju J and Goldsmith MR (2002) Silkworm genomics - progress and prospects. Current Science 83: 415-425
【非特許文献２】Nagaraju J, Klimenko V and Couble P (2000) The silkworm Bombyx mori, a model genetic system. In Encyclopedia of Genetics, ed. Reeves E. (Fitzroy Dearborn, London), pp. 219-239
【非特許文献３】Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84
【非特許文献４】van Regenmortel MH, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR and Wickner RB (2000) Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Academic Press, San Diego, Wien New York.
【非特許文献５】Murphy FA, Fauquet CM, Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA and Summers MD (1995) Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Virus. (Springer Verlag, Wien, New York)
【非特許文献６】Kondo A and Maeda S (1991) Host range expansion by recombination of the baculoviruses Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of Virology 65: 3625-3632
【非特許文献７】Huh NE and Weaver RF (1990a) Categorizing some early and late transcripts directed by the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 2195-2200
【非特許文献８】Huh NE and Weaver RF (1990b) Identifying the RNA polymerases that synthesize specific transcripts of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 195-201
【非特許文献９】Engelhard E, Kam-Morgan L, Washburn J and Volkman L (1994) The insect tracheal system: A conduit for the systemic spread of Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 3224-3227
【非特許文献１０】Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982
【非特許文献１１】Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216
【非特許文献１２】Carson D, Summers M and Guarino L (1991) Molecular analysis of a baculovirus regulatory gene. Virology 182: 279-286
【非特許文献１３】Guarino LA and Summers MD (1986) Functional mapping of a trans-activating gene required for expression of a baculovirus delayed-early gene. Journal of Virology 57: 563-571
【非特許文献１４】Nissen MS and Friesen PD (1989) Molecular analysis of the transcriptional regulatory region of an early baculovirus gene. Journal of Virology 63: 493-503
【非特許文献１５】Passarelli A and Miller L (1993) Three baculovirus genes involved in late and very late gene expression: ie-1, ie-n, and lef-2. Journal of Virology 67: 2149-2158
【非特許文献１６】Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940
【非特許文献１７】Li Y, A L Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. Journal of Virology 67: 5260-5268
【非特許文献１８】Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40
【非特許文献１９】Chen Z and Carstens EB (2005) Identification of domains in Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus late expression factor 3 required for nuclear transport of P143. Journal of Virology 79: 10915-10922
【非特許文献２０】Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies. Virology 173: 759-763
【非特許文献２１】Faulkner P, Kuzio J, Williams GV and Wilson JA (1997) Analysis of P74, a PDV envelope protein of Autographa californica nucleopolyhedrovirus required for occlusion body infectivity in vivo. Journal of General Virology 78: 3091-310
【非特許文献２２】Haas-Stapleton EJ, Washburn JO and Volkman LE (2004) P74 mediates specific binding of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothis virescens larvae. Journal of Virology 78: 6786-6791
【非特許文献２３】Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S and Mello C (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811
【非特許文献２４】Lindenbach B and Rice C (2002) RNAi targeting an animal virus: news from the front. Molecular Cell 9: 925-927
【非特許文献２５】Downward J (2004) RNA interference. British Medical Journal 328: 1245-1248
【非特許文献２６】Denli AM and Hannon GJ (2003) RNAi: an ever-growing puzzle. Trends in Biochemical Sciences 28: 196-201
【非特許文献２７】Agrawal N, Dasaradhi PV, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK and Mukherjee SK (2003) RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and Molecular Biology Review 67: 657-685
【非特許文献２８】Riu HL, Li W-X and Ding S-W (2004) RNA-based immunity in insects. In SGM symposium 63: Microbe-vector interactions in vector-borne diseases, ed. S. H. Gillespie, G. L. S. A. O. (Cambridge University Press) pp. 63-74
【非特許文献２９】Valdes VJ, Sampieri A, Sepulveda J and Vaca L (2003) Using double-stranded RNA to prevent in vitro and in vivo viral infections by recombinant baculovirus. Journal of Biological Chemistry 278: 19317-19324
【非特許文献３０】Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644
【非特許文献３１】Thomas JL, Da Rocha M, Besse A, Mauchamp B and Chavancy G (2002) 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the embryonic stage onwards. Insect Biochemistry Molecular Biology 32: 247-253
【非特許文献３２】Van der Linden AM and Plasterk RH (2004) Shotgun cloning of transposon insertions in the genome of Caenorhabditis elegans. Computational and Functional Genomics 5:225-229
【非特許文献３３】Nagaraja GM and Nagaraju J (1995) Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using random arbitrary primers. Electrophoresis 16:1633-1638
【非特許文献３４】http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKO/
【非特許文献３５】Sambrook J and Russel DW (2001) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)に関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、組換えDNA構築物であって、
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
・プロモーターに作動可能に連結している、本発明において開示するshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む、組換えDNA構築物に関する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、バキュロウイルスに対する抵抗性のあるトランスジェニック昆虫の作製の方法であって、昆虫を、本発明において開示する組換え構築物で形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法に関する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、本発明において開示する低分子ヘアピン型RNA(shRNA)または本発明において開示する組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、本発明において開示する低分子ヘアピン型RNA(shRNA)または本発明において開示する組換えDNA構築物を発現するトランスジェニックバキュロウイルス抵抗性昆虫子孫に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】トランスジェニックカイコを得るために使用したPiggyBacベースのRNAiベクターpPiggy-Sense-3XP3-GFP、pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2を示す図である。Left ITRおよびRight ITRは、piggyBac転移因子の左および右末端逆方向反復を示す。各構築物は、4つのウイルス遺伝子すなわち、ie-1(310bp)、lef-1(326bp)、lef-3(316bp)、p74(310bp)、マーカー遺伝子gfp(800bp)および200bp SV40ポリアデニル化部位のセグメントを含む。A)pPiggy-Sense-3XP3-GFP構築物(9677bp)は、広範に発現するカイコ細胞質アクチン(A3)プロモーターの下でセンス鎖として転写される4つのウイルス標的遺伝子のセグメントから成る。緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子は、3XP3プロモーターの下にあるが、3XP3は、個眼および他の神経組織において発現し、後期胚期およびガ期の間、トランスジェニックカイコを同定するためのマーカー遺伝子として使用されている。B)pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2構築物(10097bp)は、広範に発現するカイコ細胞質アクチン(A3)プロモーターの下でアンチセンス鎖として転写される4つのウイルス標的遺伝子のセグメントから成る。赤色蛍光タンパク質(DsRed2)をコードする遺伝子は、3XP3プロモーターの下に置かれているが、3XP3は、個眼および他の神経組織において発現し、後期胚期およびガ期の間、トランスジェニックカイコを同定するためのマーカー遺伝子として使用される。C)広範に発現するカイコ細胞質アクチン(A3)プロモーターによって駆動される、スペーサー(323bp)によって分離された、センス方向およびアンチセンス方向にある必須バキュロウイルス遺伝子のそれぞれの部分を有するpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2構築物(12422bp)。赤色蛍光タンパク質(DsRed2)をコードする遺伝子は、3XP3プロモーターの下にあるが、3XP3は、個眼および他の神経組織において発現し、後期胚期およびガ期の間、トランスジェニックカイコを同定するためのマーカー遺伝子として使用されている。D)広範に発現するカイコ細胞質アクチン(A3)プロモーターによって駆動される、スペーサー(323bp)によって分離された、gfpセグメントを有さない、センス方向およびアンチセンス方向にある必須バキュロウイルス遺伝子(gfpセグメントを有さない)のそれぞれの部分を有するpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2構築物。赤色蛍光タンパク質(DsRed2)をコードする遺伝子は、3XP3プロモーターの下にあるが、3XP3は、個眼および他の神経組織において発現し、後期胚期およびガ期の間、トランスジェニックカイコを同定するためのマーカー遺伝子として使用されている。E)広範に発現するカイコ細胞質アクチン(A3)プロモーターによって駆動される、スペーサー(323bp)によって分離された、センス方向およびアンチセンス方向にある3つの必須バキュロウイルス遺伝子(p74およびgfpセグメントを有さない)のそれぞれの部分を有するpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2構築物。赤色蛍光タンパク質(DsRed2)をコードする遺伝子は、3XP3プロモーターの下にあるが、個眼および他の神経組織において発現し、後期胚期およびガ期の間、トランスジェニックカイコを同定するためのマーカー遺伝子として使用されている。
【図２Ａ】カイコトランスジェニック体の分子特徴分析を示す図である。転移因子ディスプレー(Transposable Element Display)(TED)方法。
【図２Ｂ】カイコトランスジェニック体の分子特徴分析を示す図である。トランスジェニック系統における導入遺伝子の挿入のコピー数および部位を、TEDアッセイを使用して、特徴付けた。7つのNistariトランスジェニック系統(170A、170B、164C、164B、154C、154Dおよび118A)は、単一コピー挿入を示した。
【図２Ｃ】カイコトランスジェニック体の分子特徴分析を示す図である。piggyBacの左腕に関して、導入遺伝子のpiggyBac媒介組込みに特徴的であるシグネチャ配列(signature sequence)TTAAの存在。piggyBac媒介転移に特徴的であるTTAA配列を、赤色で示す。
【図２Ｄ】カイコトランスジェニック体の分子特徴分析を示す図である。必須バキュロウイルス遺伝子に関するdsRNAを発現する種々のトランスジェニック系統における染色体位置に対する導入遺伝子のマッピング。
【図３】カイコのトランスジェニックおよび非トランスジェニックNistari(NM)系統におけるBmNPV抵抗性を示す図である。四齢の幼虫に、12000PIB/幼虫の用量で、BmNPVP10-GFPを与えた。死亡率を、出現したガの数に基づいて、計算した。棒は、標準偏差を示す。TAFib6-非標的dsRNAを発現するトランスジェニック系統;IE-1 FF-単一ウイルス遺伝子標的を有するトランスジェニックNistari系統;MFF-センスおよびアンチセンス方向において発現する4つの必須バキュロウイルス標的遺伝子を有するトランスジェニック系統;Sense(ABS)-センス方向において転写される4つのウイルス標的遺伝子のセグメントを有するNistariトランスジェニック系統;Antisense(AS)-アンチセンス方向において転写される4つのウイルス遺伝子のセグメントを有するNistariトランスジェニック系統;およびHybrid-Sense×AS-SenseおよびAS系統を交雑させることによって得られたトランスジェニック系統。
【図４】純系またはトランスジェニックおよび非トランスジェニック(CSR2)系統のハイブリッドにおけるBmNPV誘発死亡率を示す図である。死亡率は、導入遺伝子を有する系統において減少した。棒は、標準偏差を示す。TAFib6-非標的dsRNAを発現するトランスジェニック系統;IE-1 FF(E)-単一ウイルス遺伝子標的を有するトランスジェニックNistari系統;Multiple gene FF(MFF)-センスおよびアンチセンス方向において発現する4つの必須バキュロウイルス標的遺伝子を有するトランスジェニック系統;Sense(ABS)-センス方向において転写される4つのウイルス標的遺伝子のセグメントを有するNistariトランスジェニック系統;Antisense(AS)-アンチセンス方向において転写される4つのウイルス遺伝子のセグメントを有するNistariトランスジェニック系統;Hybrid-Sense×AS-SenseおよびAS系統を交雑させることによって得られたトランスジェニック系統。
【図５】種々のトランスジェニック虫における多角封入体(PIB)力価を示す図である。多角封入体形成の数は、非トランスジェニック対照系統と比較して、トランスジェニック系統においてはるかに少ない。CSR2-対照CSR2系統、NM-対照Nistari系統;IE-1 FF(E)-単一ウイルス遺伝子標的を有するトランスジェニックNistari系統;Sense(ABS)-センス方向において転写される4つのウイルス標的遺伝子のセグメントを有するNistariトランスジェニック系統;Antisense(AS)-アンチセンス方向において転写される4つのウイルス遺伝子のセグメントを有するNistariトランスジェニック系統;Hybrid(ABS×AS)-センスおよびアンチセンス系統を交雑させることによって得られたトランスジェニック系統;およびMultiple gene FF(MFF)-センスおよびアンチセンス方向において発現する4つの必須バキュロウイルス標的遺伝子を有するトランスジェニックNistari系統。
【図６】pCRII TOPOベクター(Invitrogen)中に最初にクローニングされた4つのバキュロウイルス遺伝子ie-1、lef-1、lef-3およびp74を示す図である。生じたプラスミドを、Topo-ie-1、Topo-lef-1、Topo-lef-3、およびTopo-p74と名付けた。正しい挿入断片を有するこれらのベクターを、クローニングステップにおける後の使用のために、制限消化およびDNA配列決定によって、確認した。
【図７ａ】pPiggysense-3XP3-GFP、pPiggyantisense-3XP3-DsRed2およびpPiggyMultigene flip-flop-3XP3-DsRed2の構築に関係する様々なステップを示す図である。段階的な説明を、文書で提供する。
【図７ｂ】図7a参照。
【図７ｃ】図7a参照。
【図７ｄ】図7a参照。
【図７ｅ】図7a参照。
【図７ｆ】図7a参照。
【図７ｇ】図7a参照。
【図７ｈ】図7a参照。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の目的
本発明の主要な目的は、ウイルス感染に対する改善された抵抗性を示すトランスジェニックカイコを作製することである。
【００１６】
本発明の目的の1つは、初期バキュロウイルス増殖に必須である適切なウイルス遺伝子の注意深い選択である。
【００１７】
本発明の別の目的は、かかるウイルス遺伝子のDNAセグメントの同定である。
【００１８】
本発明の別の目的は、すべての組織における導入遺伝子の発現を保証するための、広範に活性のあるプロモーターの下にある、センス方向およびアンチセンス方向の両方における必須ウイルス遺伝子の同定されたDNAセグメントを有する複合ベクターの構築である。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、初期または後期胚期ならびに成虫期において発現してトランスジェニック同腹の容易なスクリーニングを可能にする、プロモーターの制御下にある適切な選択マーカー遺伝子の包含である。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は多重必須ウイルス遺伝子の同時のRNAi媒介抑制およびトランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス増殖に及ぼすその効果の評価である。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、トランスジェニック特徴を、トランスジェニックカイコ株×非トランスジェニックカイコ株のF1ハイブリッド子に移入することの実行可能性の研究である。
【００２２】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書において、「アンチセンス」という用語は、本明細書で定義する標的遺伝子との50%を超える、好ましくは80%を超える相同性を有し、標的遺伝子に関して逆の5'から3'方向においてプロモーターに連結している遺伝子またはそれ由来のヌクレオチド配列を表す。
【００２３】
本明細書において、「RNAi」(RNA干渉)という用語は、標的遺伝子の全体または部分に相当し、二本鎖RNAを生成し、標的遺伝子特異的遺伝子サイレンシング(抑止)をもたらす配列の導入および発現による、標的遺伝子の発現の抑止を表す。一般に、かかるRNAi配列は、その発現が、RNA干渉を形成する、部分的なセンスおよびアンチセンスDNA配列の直線状の配置を含む。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、複数の重合したヌクレオチド、例えば、少なくとも約15の連続した重合したヌクレオチドを含む核酸分子である。ポリヌクレオチドは、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはその任意の断片とすることができる。多くの場合において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド(またはタンパク質)またはそのドメインもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに、ポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、5'または3'非翻訳領域、レポーター遺伝子、選択マーカーなどを含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAとすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾主鎖を任意選択で含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムDNAまたはRNA、転写物(mRNAなど)、cDNA、PCR産物、クローン化DNA、合成DNAまたはRNAなどとすることができる。ポリヌクレオチドは、炭水化物、脂質、タンパク質、または他の材料と組み合わせて、形質転換などの特定の活性を行うことまたはペプチド核酸(PNA)などの有用な組成物を形成することができる。ポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向にある配列を含むことができる。「オリゴヌクレオチド」は、アンプライマー、プライマー、オリゴマー、エレメント、標的、およびプローブという用語と実質的に等しく、好ましくは一本鎖である。
【００２５】
「遺伝子」または「遺伝子配列」は、遺伝子、その相補物、およびその5'または3'非翻訳領域の部分的または全コード配列を表す。遺伝子は、遺伝の機能単位でもあり、物理的見地において、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNA(またはRNAウイルスの場合、RNA)の分子に沿ったヌクレオチドの特定のセグメントまたは配列である。後者を、化学修飾または折り畳みなどの後のプロセッシングに供して、機能タンパク質またはポリペプチドを得ることができる。遺伝子は、単離されているか、部分的に単離されているか、または生物のゲノムとともに見出すことができる。一例として、転写因子遺伝子は、転写因子ポリペプチドをコードし、これは、転写のイニシエーターとして、機能的であるか、または機能するためにプロセッシングを必要とし得る。
【００２６】
作動上、遺伝子は、シス-トランス検定によって定義することができる。シス-トランス検定は、2つの変異が同じ遺伝子において起こるかどうかを決定し、遺伝的に活性のある単位の限界を決定するために使用することができる遺伝子検査である。遺伝子は、コード領域の前にある領域(「リーダー」;上流)およびコード領域に続く領域(「トレーラー」;下流)を一般に含む。遺伝子は、「エキソン」と称される個々のコードセグメント間に位置する、「イントロン」と称される、介在、非コード配列も含むことができる。大部分の遺伝子は、関連プロモーター領域、転写開始コドンの5'にある調節配列を有する(同定可能なプロモーターを有さないいくつかの遺伝子がある)。遺伝子の機能は、エンハンサー、オペレーター、および他の調節エレメントによっても調節され得る。
【００２７】
構築物:特に明記しない限り、「構築物」という用語は、本発明の1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝的分子を表す。
【００２８】
宿主生物における導入遺伝子発現に使用する遺伝的構築物は、オープンリーディングフレームに作動可能に連結している遺伝子プロモーター配列および任意選択でオープンリーディングフレームの3'下流にある遺伝子終止配列を含む。オープンリーディングフレームは、遺伝子配列の意図された使用次第で、センス方向またはアンチセンス方向に向けることができる。構築物は、選択マーカー遺伝子および遺伝子発現のための他の調節エレメントも含むことができる。
【００２９】
ベクター:宿主細胞における複製の能力があるかつ/または別のDNAセグメントが付いたセグメントの複製をもたらすために作動可能に連結することができるDNA分子。プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、YAC、およびBACは、すべて典型的なベクターである。
【００３０】
「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞中に導入するために使用し、それによって形質転換宿主細胞を作製する核酸分子を表す。「ベクター」は、上記の遺伝的構築物に加えて、遺伝的材料、例えば、複製の開始点、選択マーカー遺伝子および当技術分野で既知の他の遺伝的エレメント(例えば、遺伝的材料を宿主細胞のゲノム中に組み込むための配列など)などの、それが1つまたは複数の宿主細胞において複製することを可能にする1つまたは複数の核酸配列を含むことができる。
【００３１】
本発明は、1つを超える、好ましくは2つを超える、より好ましくは3つを超える、最も好ましくは4つを超えるウイルス遺伝子を同時に標的とすることによる、トランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス増殖のRNA干渉(RNAi)媒介抑制を提供する。本発明は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの作製のための方法であって、トランスジェニックカイコが、少なくとも2つのウイルス遺伝子、好ましくは3つのウイルス遺伝子、より好ましくは4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAの同時発現を示す方法も提供する。さらに、本発明は、ハイブリッドカイコ子中へのウイルス抵抗性特徴の移入のための方法を提供する。
【００３２】
本発明は、1つを超える、好ましくは2つを超える、より好ましくは3つを超える、最も好ましくは4つを超えるウイルス遺伝子を同時に標的とすることによる、トランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス増殖のRNA干渉(RNAi)媒介抑制であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるRNA干渉(RNAi)媒介抑制を特に提供する。
【００３３】
本発明は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの作製のための方法であって、トランスジェニックカイコが、少なくとも2つのウイルス遺伝子、好ましくは3つのウイルス遺伝子、より好ましくは4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAの同時発現を示し、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される方法も提供する。
【００３４】
本発明は、少なくとも2つのウイルス遺伝子、好ましくは3つのウイルス遺伝子、より好ましくは4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫をさらに提供する。
【００３５】
さらに、本発明は、ハイブリッドカイコ子中へのウイルス抵抗性特徴の移入のための方法を提供する。
【００３６】
本発明は、配列番号11に記載のヌクレオチド配列を有する初期-1遺伝子(ie-1)、配列番号12に記載のヌクレオチド配列を有する後期エフェクター因子遺伝子(lef-1)、配列番号13に記載のヌクレオチド配列を有するlef-3遺伝子および配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するp74遺伝子のポリヌクレオチドも提供する。
【００３７】
本発明は、スペーサーのポリヌクレオチドであって、スペーサーのヌクレオチドが、配列番号15に記載されているスペーサーのポリヌクレオチドをさらに提供する。
【００３８】
本研究において、我々は、ie-1、lef-1、lef-3およびp74遺伝子という多重必須ウイルス遺伝子セグメントを選んで、二本鎖RNA(dsRNA)を産生し、複合ベクターを生成した。我々は、複合ベクターを導入して、トランスジェニックカイコのすべての組織においてdsRNAを発現するトランスジェニックカイコを構築した。我々は、選択された遺伝子に関するdsRNAが、広範に活性のあるプロモーターの下ですべての組織において発現されるように、複合構築物ならびに幼虫および成虫の眼細胞(個眼)において発現されて、トランスジェニック個体の容易なスクリーニングを可能にするマーカー遺伝子を作った。我々は、トランスジェニック特性を、F1ハイブリッド子に移入することにも成功した。
【００３９】
本発明に従って、本発明の実施形態の1つにおいて、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドおよびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４０】
本発明の一実施形態において、センス方向およびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４１】
本発明の一実施形態において、センス方向およびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される少なくとも3つのポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、およびlef-3遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、およびlef-3遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)および後期エフェクター因子lef-1遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、および後期エフェクター因子lef-1遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1およびp74遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)およびp74遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態において、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの産生の方法であって、前記方法が、センス方向およびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを導入するステップを含み、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている方法が提供される。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも2つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫が提供される。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施形態において、少なくとも3つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫が提供される。
【００５０】
本発明の別の好ましい実施形態において、4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫が提供される。
【００５１】
本発明において開示するトランスジェニックカイコは、バキュロウイルス感染に対する高いレベルのRNA干渉媒介抵抗性を示す。
【００５２】
本発明の実施形態の1つは、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続したヌクレオチドを含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５７】
本発明のさらに別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。
【００５９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のshRNAであって、配列番号15に記載のスペーサー配列を含む、shRNAを提供する。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、組換えDNA構築物であって、
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
・プロモーターに作動可能に連結している、本発明において開示するshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む、組換えDNA構築物を提供する。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明において開示する組換えDNA構築物であって、プロモーターが、カイコ細胞質アクチン(Bmactin)プロモーターなどの構成的プロモーターまたはPax(3XP3)プロモーターなどの組織特異的なプロモーターである、組換えDNA構築物を提供する。
【００６２】
本発明において開示する組換えDNA構築物は、2つのプロモーターであって、一方のプロモーターが、カイコ細胞質アクチンタンパク質(Bmactin)をコードする遺伝子の広範に発現する構成的プロモーターを含み、他方が、Paxタンパク質(3XP3)をコードする遺伝子の組織特異的なプロモーターを含む、2つのプロモーターを含む。
【００６３】
本発明の一実施形態は、化学的にコンピテントな株であるE. coli株one shot INV110(Invitrogen)である宿主細胞を提供する。
【００６４】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明のshRNAをコードするポリヌクレオチドを含む組換えDNA構築物であって、shRNAをコードするポリヌクレオチドが、
a.配列番号16、配列番号17、配列番号18、および配列番号19から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、
b.スペーサー配列、および
c.センス鎖に相補的なアンチセンス鎖
を含む組換えDNA構築物を提供する。
【００６５】
本発明において開示する組換えDNA構築物は、レポーター遺伝子をさらに含む。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態は、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、shRNAが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、組換えベクターを提供する。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態は、組換え構築物を含む組換えベクターであって、組換え構築物が、
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
・プロモーターに作動可能に連結している、本発明において開示するshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む、組換えベクターを提供する。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、本発明において開示する低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするポリヌクレオチド、または本発明の組換え構築物もしくは本発明の組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、E. coliなどの宿主細胞またはカイコなどの昆虫細胞を提供する。
【００７０】
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニック昆虫の産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、昆虫を形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００７１】
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、カイコを形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニックカイコを選択するステップとを含む方法を提供する。
【００７２】
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックボンビックス・モリの産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、ボンビックス・モリを形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法を提供する。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックボンビックス・モリの産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、ボンビックス・モリを形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含み、カイコが、ボンビックス・モリNistari株である方法を提供する。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫を提供する。
【００７５】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫を提供する。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコを提供する。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコを提供する。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫子孫を提供する。
【００７９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫子孫を提供する。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコ子孫を提供する。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコ子孫を提供する。
【００８２】
本発明は、RNAiおよび遺伝子導入によって産生される、高いレベルのバキュロウイルス抵抗性を有する家畜化されたカイコ株(ボンビックス・モリ)の産生を特に提供する。piggyBacトランスポゾンベースのベクターを構築することによって、我々は、4つのバキュロウイルス遺伝子、すなわち前初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子に対する二本鎖RNAを構成的に産生するトランスジェニックカイコのいくつかのホモ接合系統を得た。これらのホモ接合系統は、非トランスジェニック対照と比較した場合に、トランスジェニック虫における低い死亡率によって示されるように、B. mori核多角体病ウイルス(BmNPV)感染の抑制を示した。ウイルス増殖における減少も、ウエスタンブロット分析および他の従来の方法によって確認された。この抗ウイルス特性を、B. moriの非トランスジェニック株と交雑させたトランスジェニックカイコ系統のF1ハイブリッド子に移入することに成功した。これらの結果は、我々が、カイコ遺伝子導入と連結して多重必須バキュロウイルス遺伝子を同時に標的とすることによって、高いレベルの抵抗性を有するカイコ株を構築することに成功したことを実証した。
【００８３】
RNAi機構は、鱗翅目におけるバキュロウイルス感染を抑制することに関する対照的な結果とともに使用されてきた。IE-1の一過性のRNAi媒介ターゲティングによる、Sf9細胞系およびスポドプテラ・フルギペルダにおけるAcNPV増殖の成功したほぼ完全な抑止を示唆する最初の報告があった(Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644)。Isobeら(Li Y, A L Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. Journal of Virology 67: 5260-5268)は、lef-1遺伝子を標的とすることによる、トランスジェニックカイコB. moriにおける中程度のウイルス抑制であるが、完全な保護ではない同様の観察を報告した。標的遺伝子/領域が、RNAi媒介遺伝子抑止の成功を決定するであろうことが既知であるので、これらの対照的な結果は、標的遺伝子における相違によるであろう。遺伝性の、RNAi誘発バキュロウイルス抑止を得ることを考慮して、我々は、必須バキュロウイルス遺伝子ie-1、lef-1、lef-3およびp74を標的とすることによる、トランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス抑止の有効性を観察するための研究を開始した。
【００８４】
トランスジェニックカイコを得るために、我々は、選択マーカー3XP3-GFPおよび3XP3-DsRed、4つのウイルス遺伝子のセンス、アンチセンスおよび多重遺伝子フリップフロップの二本鎖RNAを発現させるためのDNAを有するpiggyBacトランスポゾンベースのベクターを構築した(図1)。3XP3-GFP選択遺伝子マーカーは、胚において発現されるので、それは、発生の初期でのトランスジェニックカイコの容易なスクリーニングを可能にした。さらに、3XP3-GFPからのGFPの発現は、特定の組織に制限されている。我々は、3XP3-GFP構築物のこの特性を活用して、トランスジェニック体およびバキュロウイルス感染の進行の両方の容易なスクリーニングを促進した。Nistari株の新鮮に産まれた卵にdsRNAを産生するためのプラスミドおよびヘルパープラスミドを同時注入することによって、我々は、トランスジェニックカイコのいくつかの系統を得た。制御された繁殖によって、我々は、18のホモ接合トランスジェニック系統を得、我々は、組換えGFP発現BmNPV、BmNPV-P10GFPを使用して、それらの抗ウイルス活性に関してこれらを試験した。我々は、ウイルスを投与し、死亡率を計算することによって、経口的感染力を試験した。
【００８５】
我々の結果は、感染の経路に関係なく、トランスジェニックカイコは、非トランスジェニックカイコ系統よりも、はるかに多く耐性があったことを示す。ウエスタンブロット分析および顕微鏡観察は、ウイルス増殖が、非トランスジェニック体よりもトランスジェニック体において少なかったことを確認する。
【００８６】
結論として、我々は、ここで、RNAi媒介バキュロウイルス抵抗性が、家畜化されたカイコB. moriを特に強調して、鱗翅目において可能であり、感染のRNAi媒介ウイルス抑制のための導入遺伝子を有するカイコのトランスジェニック株を、piggyBac媒介生殖系列遺伝子導入によって、産生することに成功することができたことを示した。種々の必須バキュロウイルス遺伝子が標的とされる、多重遺伝子ターゲティングの効果を理解することは興味深いであろう。より良い普遍的なプロモーター、特にバキュロウイルスによって活性化されるものの使用が、標的RNAの二本鎖の駆動体として調査される必要がある。我々は、この方向におけるさらなる研究が、感染のバキュロウイルス抑制のためのツールとしてRNAiを使用することを我々に教えるであろうことを示唆する。
【００８７】
本発明を、以下の実施例の助けで、詳しく述べる。しかしながら、実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００８８】
(実施例)
ここで記載する以下の実施例は、例示的目的のみのためであり、考慮される様々な変更形態または変更が当業者に示唆されることになり、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解されよう。
【００８９】
(実施例1)
ベクター
pPIG3XP3GFP-FF
ベクターpPIGA3GFP-FFは、ほとんど普遍的なプロモーターである、カイコ細胞質アクチンプロモーターの下で、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。このプロモーターによって駆動されるgfpは、広範に発現し、したがって組み込まれていなくてさえも、ベクターを含有しているG0胚または細胞は、蛍光を発し、トランスジェニック体をスクリーニングすることを困難にする。この問題を克服するために、我々は、以前、組込みのためのpiggyBacエレメントの逆方向反復および選択マーカーとして合成の眼特異的プロモーター(3XP3)の制御下にあるGFP遺伝子を有する、遺伝子導入のための3XP3ベースのベクターを開発した(Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644)。この合成のプロモーターは、Paxタンパク質によって、インビボで認識され、下流遺伝子は、組織特異的に発現される。プラスミドpPIG3XP3GFP-FFは、pPIGA3GFP-FFのA3GFPカセットを、Thomasら(Thomas JL, Da Rocha M, Besse A, Mauchamp B and Chavancy G (2002) 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the embryonic stage onwards. Insect Biochemistry Molecular Biology 32: 247-253)の3XP3GFPカセットで置き換えることによって構築した。このために、3XP3-GFP断片を、PCRで増幅し、TAベクター中にクローニングし、そこからそれを、制限消化し、NgoMIVおよびSfiI部位間でpPIGA3GFP-FFに動員した。構築物pPIG3XP3GFP-FFを、選択的制限消化および配列決定によって再び確認した。
【００９０】
センス、アンチセンス、および多重遺伝子フリップフロップベクター
ウイルス抵抗性を有するトランスジェニックカイコ株を得るために、我々は、多重必須ウイルス遺伝子を標的とする作業を開始した。ベクターを、piggyBacベクター主鎖を使用して構築した。これらの構築物は、pPiggysense-3XP3-GFP、pPiggyantisense-3XP3-DsRed2およびpPiggymultigene flip-flop-3XP3-DsRed2である。使用するベクターの図表示を、図1において示す。ベクターを、特異的な制限酵素部位を有するプライマーを使用して、それぞれ前初期1遺伝子、後期発現因子 1、3およびB. mori核多角ウイルスの外被タンパク質をコードする、ie-1、lef-1、lef-3およびp74遺伝子およびpPIGA3GFPのgfp遺伝子の領域を増幅することによって構築した(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84)。単位複製配列を、pCR II Topoベクター(Invitrogen)のT-オーバーハング中にクローニングした(図6)。生じたプラスミドを、Topo-gfp、Topo-ie-1、Topo-lef-1、Topo-lef-3、およびTopo-p74と名付けた。正しい挿入断片を有するこれらのベクターを、制限消化およびDNA配列決定によって確認した。これらの遺伝子は、ウイルス特異的タンパク質を産生し、既知のヒトまたは昆虫遺伝子といかなる相同性も共有しない。ie-1、lef-1、lef-3、p74の標的領域は、ie-1遺伝子に関して配列番号11に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション141から450であり、lef-1遺伝子に関して配列番号12に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション80から405であり、lef-3遺伝子に関して配列番号13に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション391から706であり、p74遺伝子に関して配列番号14に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション1243から1552である。
【００９１】
BmNPVのie-1、lef-1、lef-3およびp74ならびにgfpのDNAを、配列番号1〜10に記載のプライマーを使用して、PCRで増幅した。
【００９２】
典型的なPCR反応は、順方向および逆方向プライマーのそれぞれ25ピコモルを有する50μl最終体積から成った。PCR増幅を、反応毎に、10mM Tris-HCl、(50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%ゼラチンおよび0.01%Triton X-100を含有するpH8.3)、1mM dNTPおよび5UのTaq DNAポリメラーゼ(NEB、US)において行った。温度サイクリングを、以下の条件を使用して、サーマルサイクラー(PE9700、Applied Biosystems)において行った:95℃で5分の最初の変性; 95℃で30秒;50℃で30秒および72℃で2分の35サイクル、および72℃で10分の最終伸長。PCR産物を、2.0%アガロースゲル上で定量化し、製造業者のプロトコールに従って、Qiagen PCR精製カラムを使用して精製した。精製した産物を、上記のTopoベクター中にクローニングした。
【００９３】
pTopoクローンを、one shot INV110 chemically competent E. coli(Invitrogen)に形質転換した(それは、dam-およびdcm-感受性制限酵素での制限消化を可能にするdamおよびdcm欠損を含有するので。damおよびdcm欠損は、これらの部位でメチル化されていないDNAの産生を可能にする)。ブルー/ホワイトスクリーニングを、40μlのX-Gal(40mg/ml)および40μlのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG、100mM)を含有するLB寒天板上で行った。白いコロニーを、消化を通しての挿入断片分析のために採取した。期待されたサイズの正しい挿入断片を与えたコロニーを採取した。
【００９４】
DNA配列決定のために、250ngのプラスミドを、8μlのReady reaction mix(BigDye terminator、BDTv 3.0、Applied Biosystems、Foster City、CA)および5ピコモルのM13配列決定プライマーを含む配列決定反応において使用した。使用したサイクリング条件は、以下であった:96℃で10秒、50℃で5秒、60℃で4分の25サイクル。試料を、エタノールで沈殿させ、70%エタノールで洗浄し、Hi-Di(商標)ホルムアミド(Applied Biosystems)に再懸濁した。配列決定を、ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)において行い、各遺伝子断片の無傷さを確認した。
【００９５】
構築物pPiggysense-3XP3-GFP、pPiggyantisense-3XP3-DsRed2およびpPiggyMultigene flip-flop-3XP3-DsRed2を、以下の一連のクローニングステップ(図7)において得た:
1.lef-3の316bp断片(配列番号18)を、SalI-NheI部位を使用して、pA3DS-FSGベクター主鎖(7624bp)中にクローニングして、単一遺伝子構築物、pA3ΔS-lef3(6057bp)を生成した。形質転換体を、XmnI(lef-3の内部部位)制限消化およびXmnI/ScaI二重消化によって、検証した。XmnI消化は、1遺伝子構築物の6.05kb断片に直線化し、ScaI(主鎖における部位)での二重消化は、DNAストライダー地図パターン(DNA strider map pattern)に従って、323bp産物または挿入断片サイズおよび5.73kb断片を遊離した。
2.ie-1の310bp断片(配列番号16)を、BspEI-SalI部位を使用して、pA3ΔS-lef3ベクター中にクローニングして、pA3ΔS-ie1lef3SG、2つの遺伝子構築物(5929bp)を生成した。形質転換体を、XmnI/HpaI制限系を使用して、連続消化で調べた。2遺伝子構築物のXmn I直線化は、5929bp断片を生じさせ、XmnI/Hpa I連続消化は、339bp、1071bpおよび4519bp断片の期待された3つのバンドを生じさせた。
3.gfpの800bp断片を、PvuI-BamHI部位を使用して、pA3ΔS-ie1lef3ベクター主鎖中にクローニングして、pA3ΔS-gfpie1lef3、3つの遺伝子構築物(6665bp)を生成した。形質転換体を、834bp挿入断片および5834bp主鎖を生じさせたPvuI/EcoRI制限分析で調べた。
4.lef-1クローンの326bp断片(配列番号17)を、BspEI/BamHIを使用して、pA3ΔS-gfpie1lef3ベクター主鎖に加えて、pA3ΔS-gfplef1ie1lef3(6650bp)、4つの遺伝子産物を生成した。形質転換体を、それぞれ、期待された長さ188bp、1410bp、5040bpの3つの断片ならびに期待された長さ1361bpおよび5289bpの2つの断片を生じさせた、HpaIおよびNdeI制限消化を通して確認した。
5.p74の310bp断片(配列番号19)を、AgeI-XbaI部位を使用して、pA3ΔS-gfplef1ie1lef3ベクター主鎖中にクローニングして、5つの遺伝子構築物、pA3ΔS-gfple1ie1lef3p74(6160bp)を生成した。形質転換体を、SalI制限消化を通して確認した。それは、520bp挿入断片および5640bp主鎖を生じさせた。
5つの遺伝子センスに向けられた構築物、pA3ΔS-gfplef1ie1lef3p74を、内部NheI-XbaI部位で消化して、5つの遺伝子の断片のセンスおよびアンチセンスに向けられたプールを生成した。形質転換体を、アンチセンスに向けられたプラスミドに関してスクリーニングした。これを、HindIII/XmnI消化によって確認し、ここで、アンチセンスコロニーは、1.3kb断片を生じさせた一方、センスに向けられたコロニーは、2.2kb断片を生じさせた。
センス構築物-A3:4つの遺伝子およびpoly Aテールとともにgfpが融合したプロモーターを、BglII-NheIおよびBglII-XbaI部位を使用して、pPiggyP25il2-(3XP3-GFP)TQ中にクローニングして、pPiggy-Sense-3XP3-GFPベクター(図1A)を生成した。
アンチセンス構築物-上記のように得られたアンチセンス断片を、pPiggyP25il2-(3XP3-DsRed2)TQ中にクローニングして、pPiggy-Antisense-3XP3.DsRed2ベクター(図1B)を生成した。
6.Multigene Flip-Flop構築物-上記A3:4つの遺伝子とともにgfpが融合したプロモーターを、BglII-AgeI部位を使用して、pP25(sp*)DsRedベクター主鎖中にクローニングして、スペーサー領域(配列番号15)を有するセンス断片、中間ベクター型pP25(sp*)DsRed-A3ΔS Sense.Spacerを生成した。
7.5つの遺伝子のアンチセンス断片を、Sse8337I-AflII部位を使用して、sense-spacerベクター主鎖の中間型中にクローニングして、多重遺伝子構築物のフリップフロップ型、pP25(sp*)DsRed-A3ΔS Sense.Spacer.Antisense.Poly A領域を生成した。
8.中間シャトルベクター、pP25(sp*)Sense-Spacer-Antisenseベクターを、BglIIおよびSfiI部位で消化して、挿入断片のフリップフロップ型を生成した。この挿入断片を、BglII/SfiI部位を使用して、PiggyP25IL2-(3XP3-DsRed2)TQ中にクローニングして、選択マーカー遺伝子としてDsRed2を有するpPiggyA3gfplef1ie1lef3p74.spacer.p74lef3ie1lef1gfp.3XP3-DsRed2ベクター(図1C)を生成した。
【００９６】
したがって、本発明のshRNAをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、shRNAをコードするポリヌクレオチドが、異なる順序で並べられた2つ以上のヌクレオチドの断片を含む組換えベクターを、ベクターの必要条件および機能性に従って、構築することができる。
【００９７】
(実施例2)
B. moriの生殖系列遺伝子導入
生殖系列遺伝子導入を、本質的にTamuraら、(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84)に従って、行った。
【００９８】
約1000のカイコ卵に、1μg/μlのpPiggy-Sense-3XP3-GFP、および等モル比のヘルパープラスミドを微量注入した。同じ方法で他の構築物、すなわちpPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2も、ヘルパープラスミドとともに注入して、卵を分離し、トランスジェニック体の種々の系統を生成した。生じた卵を、インキュベートし、眼における蛍光の発現によって、それぞれの構築物の組込みに関して分析した。制御した繁殖によって、トランスジェニックカイコの18のホモ接合系統を得た。pPiggy-Sense-3XP3-GFP、pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2を使用することによって得られたトランスジェニック系統を、それぞれ、Sense(S)、Antisense(AS)およびMultigene flip-flop(MFF)系統と呼ぶ。得られたトランスジェニック系統は、3つのSense、2つのAntisense、5つのSense×Antisenseハイブリッドおよび8つのMFFを含む。
【００９９】
(実施例3)
トランスジェニック体の分子特徴分析
4つの必須バキュロウイルス遺伝子に関する二本鎖RNAを産生する導入遺伝子を有するMFFトランスジェニック系統を、カイコゲノムにおける導入遺伝子の挿入断片の部位、それらのコピー数およびそれらの物理的な位置に関して以下のように特徴付けた:
3.1転移因子ディスプレー(TED)方法
転移因子ディスプレー(TED)方法を、van der LindenおよびPlasterk 2004(Van der Linden AM and Plasterk RH (2004) Shotgun cloning of transposon insertions in the genome of Caenorhabditis elegans. Computational and Functional Genomics 5:225-229)の修正プロトコールに従って挿入の部位および挿入のコピー数を同定するために使用した(図2A)。簡潔に述べると、トランスジェニック系統由来のゲノムDNAを、NagarajaおよびNagaraju 1995(Nagaraja GM and Nagaraju J (1995) Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using random arbitrary primers. Electrophoresis 16:1633-1638)に従って、抽出し、Sau 3Aで消化した。生じた消化されたDNAを、Sau 3Aオーバーハング(Oligo 503および504)を有するベクターカセットにライゲートした。2ラウンドのPCRを、左逆方向反復(LIR)付近のpiggyBac導入遺伝子内に設計したトランスポゾン特異的LIRアウター(outer)(配列番号20-5'-CTCACGCGGTCGTTATAGTT)およびLIRインナー(inner)(配列番号21-5'-GGCGACTGAGATGTCCTAAA)プライマーならびにvan der LindenおよびPlasterkのアダプター特異的505および337NEWプライマーを使用して、行った。PCRの最初のラウンドを、LIRアウターおよび505プライマーを使用して行い、PCRの第2のラウンドを、MBI taqを使用して、LIRインナーおよび337NEWプライマーを使用して行った。第2ラウンドPCR後、単位複製配列の期待されたサイズは、導入遺伝子部分の120bpおよび未知の長さのゲノムDNAを含む120bpを超えた。第2の増幅ステップからのPCR産物を、配列決定のために使用した。第2のPCR反応後、単一PCR増幅産物の形成は、トランスジェニック系統における導入遺伝子の単一コピー挿入の存在を示した(図2B)。TEDを使用して、piggyBacトランスポゾンの左腕を標的とした。
3.2トランスジェニック系統の異なる染色体上での導入遺伝子の位置
挿入の位置を確認するために、PCR産物を、配列決定し、B. moriのゲノム配列全体に対してブラスト探索した。すべてのトランスジェニック系統において、図2Cにおいて示すpiggyBac媒介組込みに特徴的なシグネチャ配列TTAAの存在によって証明されるように、導入遺伝子のゲノム組込みが、piggyBacによって媒介されたことが発見された。これらの配列を、配列のカイコ物理地図アセンブリーに対してブラストし(http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKO/)、染色体位置および染色体上での導入遺伝子の相対ポジションを、トランスジェニック系統のそれぞれに関して決定した(Table 1(表1)および図2D)。
【０１００】
【表１】
2014505480.tif 000002
【０１０１】
(実施例4)
トランスジェニックメスと非トランスジェニックオスのハイブリッド
Nistariの非休眠変種は、バキュロウイルス感染に対して比較的抵抗性であり(幼虫あたりLD50〜4000の多角封入体(PIB))、CSR2の休眠変種は、ウイルス感染に対してより影響を受けやすい(LD50〜250PIB/幼虫)。ウイルス感染の抑制を明確に実証するために、我々は、トランスジェニックNistariメスを、カイコの非トランスジェニックBmNPV感受性CSR2変種と交雑した。したがって、我々は、7つのS-As×CSR2系統、4つのMFF×CSR2系統ならびに実験対照系統TAFib6×CSR2およびNM×CSR2のそれぞれ1つを含む13のハイブリッド系統を得た。ハイブリッドを、以下のように経口的に、ウイルス抵抗性に関して試験した。
【０１０２】
(実施例5)
トランスジェニックカイコにおけるウイルス接種および死亡率分析
経口接種
我々は、四齢の幼虫あたり12000PIBで、トランスジェニック系統および対照非トランスジェニックNMカイコの経口的BmNPV感染を行った。それぞれの系統の100の健康な幼虫に、BmNPV-P10GFPのPIBを与え、すべてのウイルス粒子を消費した幼虫のみを、保持し、生き残った幼虫がガ期に達するまで、新鮮なクワの葉上で飼育した。
【０１０３】
組換えBmNPVウイルス(BmNPV-P10GFP)を使用して、PIBを生成した。バキュロウイルスを、BmN細胞において増幅し、細胞培養培地における遊離ウイルスを、実験目的のために使用した。BmNPV-P10GFP PIBを得るために、細胞培養培地における遊離ウイルスを、CSR2株の幼虫の血体腔に注入し、感染後5から6日で、血リンパを、感染した幼虫から採取した。蛍光PIBを、頻回の洗浄によって精製し、血球計を使用して、計数した。野生型BmNPVを、養蚕農家から回収した感染したカイコの血リンパから収集した。血リンパを、遊離ウイルスを得るために使用した。遊離ウイルスのタイターを、プラークアッセイによって、計算し、希釈して、1×107BV/mlの最終濃度を得た。PIBを、カイコの経口的接種を伴う実験において使用した。
【０１０４】
(実施例6)
GP64に対する抗体を使用することによるウエスタンブロット
バキュロウイルスのGP64コートタンパク質に対する市販の抗体を、Novagenから得た。これらの抗体を、BmNPVのGP64と交差反応させた。トランスジェニックおよび対照系統由来の感染した蛹を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有する溶解緩衝液(50mM Tris-Cl、pH8.0、120mM NaCl、0.5%(v/v)NP-40、0.2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、100mM NaF)中ですりつぶした。(Sambrook J and Russel DW (2001) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York)に従って、等量のタンパク質を、SDS-Loading色素において変性させ(ローディング対照としてチューブリンを使用した)、10%SDS-PAGEによって分離し、Hybond P+膜上にブロットした。ウエスタンブロットを、マウス抗GP64抗体で行い、一次抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートした適切な二次抗体を使用して、検出した。タンパク質バンドを、製造業者のプロトコールに従って、化学発光検出試薬(ECL検出キット、Amersham)によって可視化した。展開したバンドを、BioRad gel documentation systemのQuantityOneソフトウェアを使用することによって、濃度測定的に定量化した。
【０１０５】
(実施例7)
RNAi導入遺伝子でのカイコの成功的な生殖系列遺伝子導入
カイコ生殖系列遺伝子導入を、すべての3つの構築物、すなわち、pPiggy-Sense-3XP3-GFP、pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2を使用して、達成した。3XP3プロモーターによって駆動された眼におけるGFP/RFPの蛍光の強度に基づいて、いくつかの系統を、Table 2(表2)において示すように選択した。それらを、兄妹交配して、Table 2(表2)において記載したトランスジェニックカイコのいくつかのホモ接合系統を得た。
【０１０６】
ハイブリッドSense×ASと称される、pPiggySense-3XP3-GFP、pPiggyAntisense-3XP3-DsRed2のトランスジェニック系統間のハイブリッドも得て、ウイルスアッセイにおいて使用した。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
(実施例8)
BmNPV食餌実験は、トランスジェニック体における減少した死亡率を示す
我々は、四齢である幼虫あたり12000PIBで、トランスジェニック系統および対照非トランスジェニック(NM)カイコの経口的BmNPV感染を行った。このウイルス用量は、Nistari株に関する既知のLD50(三齢でのLD50約4000PIB/幼虫)を超えているので、我々は、研究を、この用量で開始した。TAFib6、非標的dsRNAを発現するトランスジェニック系統も、対照として使用した。多角体を、1cm直径の新鮮な葉の小片上に広げた。各系統の100の幼虫に、PIBを与え、すべての葉の小片を消費した幼虫のみを保持し、幼虫生活の最後まで新鮮なクワの葉上で飼育した。カイコの死亡率を、出現したガの数を計数することによって、推定した。ウイルスが誘発した死亡率を、感染に屈した幼虫/蛹またはガを分析することによって確認した。各系統の死亡率を、図3において示す。
【０１０９】
経口的アッセイの顕著な特徴は、四齢のPIBを与えた群において、100%の死亡率が、非トランスジェニックNistari(NM)およびCSR2対照系統において観察された一方で、2つの多重遺伝子フリップフロップ系統(MFF154Cおよび170B)は、わずか20%の死亡率を示したことを示す。結果は、死亡率が、MFF系統において25%未満であり、センスおよびアンチセンスハイブリッドにおける25〜35%の間がそれに続いたことを示唆している。これらの結果は、多重遺伝子ターゲティングが、ウイルス感染負荷が高い場合、特に効果的であることおよびRNAiノックダウンが、ウイルス増殖を抑止するために有益であることも示す。Kanginakudruら、(Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644)の単一ウイルス遺伝子標的構築物と比較して、本多重ウイルス遺伝子標的トランスジェニック体は、経口的ウイルス接種後、少なくとも2倍増加した生存性を示した。
【０１１０】
(実施例9)
トランスジェニックメスおよび非トランスジェニックオスのハイブリッドもウイルス抵抗性を示す
トランスジェニック系統の保護効果が、トランスジェニックおよび非トランスジェニック系統のハイブリッドにおいて観察されるかどうかを試験するために、我々は、トランスジェニックNistari株および非トランスジェニックCSR2のハイブリッドを得て、上記のようにハイブリッドに接種した。ウイルスが誘発した死亡率の傾向および死亡率を抑止する導入遺伝子の能力は、ハイブリッドにおいて親株と同様であった(図4)。生存性は、CSR2のセンス-アンチセンスハイブリッドでの交雑種における(40〜70%)よりも、MFF系統のCSR2交雑種においてより多く(≦75%)、NMおよびCSR2の非トランスジェニックハイブリッドにおいて最も少なかった(<20%)。これらのデータは、バキュロウイルス複製のRNAi媒介抑止が、トランスジェニックおよび非トランスジェニックカイコのハイブリッドを益するであろうという仮説を支持する。
【０１１１】
トランスジェニック体におけるバキュロウイルス抵抗性を、血リンパのマイクロリットルあたりのPIBの数によって決定されるように測定し、PIBの数は、図5において示すように、単一ウイルス遺伝子標的トランスジェニック体および非トランスジェニック対照系統と比較して、多重ウイルス遺伝子標的トランスジェニック系統においてはるかに低いことが発見された。
【数１】
2014505480.tif 000004
【０１１２】
配列番号11は、ie-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す(1755bp、NCBI参照番号:AY048770.1、ボンビックス・モリ核多角体病ウイルスK1前初期タンパク質(ie-1)遺伝子、全コード領域)
【数２】
2014505480.tif 000005
【０１１３】
配列番号12は、lef-1遺伝子全配列のヌクレオチド配列を示す(813bp;NCBI参照番号:NC_001962.1;ボンビックス・モリNPV、全ゲノム)
【数３】
2014505480.tif 000006
【０１１４】
配列番号13は、lef-3遺伝子全配列のヌクレオチド配列を示す(1158bp;NCBI参照番号:NC_001962.1;ボンビックス・モリNPV、全ゲノム)
【数４】
2014505480.tif 000007
【０１１５】
配列番号14は、p74遺伝子全配列のヌクレオチド配列を示す(1938bp;NCBI参照番号:NC_001962.1;ボンビックス・モリNPV、全ゲノム)
【数５】
2014505480.tif 000008
【０１１６】
配列番号15は、dsRed(赤色蛍光タンパク質)の部分から成るスペーサーのヌクレオチド配列(323bp)を示す
【数６】
2014505480.tif 000009
【０１１７】
配列番号16:shRNA構築物において使用されるie-1遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのie1全体は、1755bpであり、標的領域は141〜450bp(310bp)ie1である(受託番号AY048770)
【数７】
2014505480.tif 000010
【０１１８】
配列番号17:shRNA構築物において使用されるlef 1遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのlef1全体は、813bpであり、標的領域は、80〜405bp(326bp)lef1である(受託番号L33180)
【数８】
2014505480.tif 000011
【０１１９】
配列番号18:shRNA構築物において使用されるlef 3遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのlef3全体は、1158bpであり、標的領域は、391〜706bp(316bp)lef3である(受託番号L33180)
【数９】
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【０１２０】
配列番号19:shRNA構築物において使用されるp74遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのp74全体は、1938bpであり、標的領域は、1243〜1552bp(310bp)p74である(受託番号L33180)
【数１０】
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｄ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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