(57)【要約】本発明は、酵素補充療法薬および抗ＴＮＦα療法薬を投与すること、ポリ硫酸ペントサン療法を実施すること、または基質抑制療法および抗ＴＮＦα療法を実施することによって、リソソーム障害を有する対象を治療する方法に関する。本発明はさらに、酵素補充療法によって治療しているリソソーム障害を有する対象において、抗ＴＮＦα療法薬を投与することによって炎症性サイトカインを低減させる方法に関する。2014518222.tif 000004
2014518222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、リソソーム蓄積障害を有する対象を治療する方法：
リソソーム蓄積障害を有する対象を選択すること、ならびに
前記選択した対象において前記リソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、前記選択した対象に、酵素補充療法薬および抗ＴＮＦα治療薬を投与すること。
【請求項２】
前記酵素補充療法薬が、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、ラロニダーゼ、アガルシダーゼベータ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ、およびイデュルスルファーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＴＮＦα療法薬が、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、およびナタリズマブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＴＮＦα療法薬がポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
追加の療法を実施すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記追加の療法が、骨髄移植、シャペロン療法、および遺伝子療法からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リソソーム蓄積障害が、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖蓄積症（ムコ多糖症）、糖タンパク症（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｏｓｅｓ）、ムコリピドーシス、糖原病ＩＩ型、セロイドリポフスチン沈着症、およびその他のリソソームタンパク質機能異常からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リソソーム蓄積障害がスフィンゴリピドーシスであり、前記スフィンゴリピドーシスがニーマンピック病である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リソソーム蓄積障害がムコ多糖症であり、前記ムコ多糖症がＭＰＳ  Ｉ型（ハーラー／シャイエ症候群）、ＭＰＳ  ＩＩ型（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）、ＭＰＳ  ＩＩＩ型（サンフィリッポ症候群）、ＭＰＳ  ＩＶ型（モルキオ症候群）、またはＭＰＳ  ＶＩＩ型（スライ病）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与することを、経口的に、吸入により、鼻腔内滴下により、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋内注射により、胸膜内に（ｉｎｔｒａｐｌｕｒａｌｌｙ）、腹腔内に、または粘膜への塗布により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与することを繰り返すこと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が乳児または年少者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が成人である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
以下を含む、酵素補充療法によって治療しているリソソーム蓄積障害を有する対象において炎症性サイトカインを低減させる方法：
前記対象において前記炎症性サイトカインを低減させるのに有効な条件の下で、前記対象に抗ＴＮＦα治療薬を投与すること。
【請求項１６】
前記投与を受ける、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を選択すること
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素補充療法のための薬剤が、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、ラロニダーゼ、アガルシダーゼベータ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ、およびイデュルスルファーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＴＮＦα療法薬が、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、およびナタリズマブからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＴＮＦα療法薬がポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
追加の療法を実施すること
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記追加の療法が、骨髄移植、シャペロン療法、および遺伝子療法からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リソソーム蓄積障害が、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖蓄積症（ムコ多糖症）、糖タンパク症、ムコリピドーシス、糖原病ＩＩ型、セロイドリポフスチン沈着症、およびその他のリソソームタンパク質機能異常からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記リソソーム蓄積障害がスフィンゴリピドーシスであり、前記スフィンゴリピドーシスがニーマンピック病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記リソソーム蓄積障害がムコ多糖症であり、前記ムコ多糖症がＭＰＳ  Ｉ型（ハーラー／シャイエ症候群）、ＭＰＳ  ＩＩ型（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）、ＭＰＳ  ＩＩＩ型（サンフィリッポ症候群）、ＭＰＳ  ＩＶ型（モルキオ症候群）、またはＭＰＳ  ＶＩＩ型（スライ症候群）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与することを、経口的に、吸入により、鼻腔内滴下により、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋内注射により、胸膜内に、腹腔内に、または粘膜への塗布により行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与することを繰り返すこと
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が乳児または年少者である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が成人である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
以下を含む、リソソーム蓄積障害を有する対象を治療する方法：
リソソーム蓄積障害を有する対象を選択すること、および
前記選択した対象において前記リソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、前記選択した対象にポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）を投与すること。
【請求項３０】
追加の療法を実施すること
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記追加の療法が、骨髄移植、シャペロン療法、および遺伝子療法からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リソソーム蓄積障害が、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖蓄積症（ムコ多糖症）、糖タンパク症、ムコリピドーシス、糖原病ＩＩ型、セロイドリポフスチン沈着症、およびその他のリソソームタンパク質機能異常からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記リソソーム蓄積障害がスフィンゴリピドーシスであり、前記スフィンゴリピドーシスがニーマンピック病である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記リソソーム蓄積障害がムコ多糖症であり、前記ムコ多糖症がＭＰＳ  Ｉ型（ハーラー／シャイエ症候群）、ＭＰＳ  ＩＩ型（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）、ＭＰＳ  ＩＩＩ型（サンフィリッポ症候群）、ＭＰＳ  ＩＶ型（モルキオ症候群）、またはＭＰＳ  ＶＩＩ型（スライ病）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与することを、経口的に、吸入により、鼻腔内滴下により、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋内注射により、胸膜内に、腹腔内に、または粘膜への塗布により行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与することを繰り返すこと
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が乳児または年少者である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が成人である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
以下を含む、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を治療する方法：
リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を選択すること、ならびに
前記対象においてリソソーム蓄積障害と関連する前記骨格病変を治療するのに有効な条件の下で、前記選択した対象に、基質抑制療法薬および抗ＴＮＦα治療薬を投与すること。
【請求項４１】
前記基質抑制療法薬が、ミグルスタットおよびエリグルスタットからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗ＴＮＦα療法薬が、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、およびナタリズマブからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗ＴＮＦα療法薬がポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
追加の療法を実施すること
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記追加の療法が、酵素補充療法、骨髄移植、シャペロン療法、および遺伝子療法からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記リソソーム蓄積障害が、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖蓄積症（ムコ多糖症）、糖タンパク症、ムコリピドーシス、糖原病ＩＩ型、セロイドリポフスチン沈着症、およびその他のリソソームタンパク質機能異常からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記リソソーム蓄積障害がスフィンゴリピドーシスであり、前記スフィンゴリピドーシスがニーマンピック病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記リソソーム蓄積障害がムコ多糖症であり、前記ムコ多糖症がＭＰＳ  Ｉ型（ハーラー／シャイエ症候群）、ＭＰＳ  ＩＩ型（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）、ＭＰＳ  ＩＩＩ型（サンフィリッポ症候群）、ＭＰＳ  ＩＶ型（モルキオ症候群）、またはＭＰＳ  ＶＩＩ型（スライ症候群）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与することを、経口的に、吸入により、鼻腔内滴下により、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋内注射により、胸膜内に、腹腔内に、または粘膜への塗布により行う、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与することを繰り返すこと
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が乳児または年少者である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象が成人である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年６月２０日に出願した米国特許仮出願第６１／４９８，９４６号、および２０１１年１２月１２日に出願した米国特許仮出願第６１／５６９，４５２号に基づく利益を主張するものであり、これらの仮出願のいずれも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号１Ｒ０１ＤＫ０８７１８５の下、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ムコ多糖症およびその他のリソソーム障害に対する抗ＴＮＦα療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
リソソーム蓄積障害とは、４０種超の異なる遺伝性疾患の群を表し、リソソームに存在する酵素の異常を原因とする。リソソーム蓄積障害に罹患した者は、特有の障害および関係する特定の遺伝子型に応じて、広範な臨床症状を呈する。リソソーム蓄積障害と関連する臨床症状は、罹患者とその家族に甚大な影響を及ぼし得る。例えば、細網内皮疾患、中枢神経系機能障害、行動異常、および深刻な精神遅滞は、多くのリソソーム蓄積障害の特徴である。ムコ多糖症（ＭＰＳ）という特有のリソソーム蓄積障害群では、その他の臨床症状として、骨格異常、臓器肥大症、角膜混濁、および身体的形態異常を挙げ得る。
【０００５】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）とは、１１種類の異なる酵素欠損症の群であり、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の異化の障害が生じる（Ｎｅｕｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．"Ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｉｎ：ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＩＮＨＥＲＩＴＥＤ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ３４２１−３４５２（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（２００１））。これらの遺伝性の酵素欠損により、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が、ＭＰＳ患者のリソソームおよびその他の細胞内区画、ならびに、細胞外結合組織マトリックスに徐々に蓄積する。予想されるとおり、上記の酵素欠損の主な臨床的帰結は、軟骨、皮膚、および骨を含む結合組織器官で最も顕著に現れる。主な臨床像としては、粗く異常な顔貌および頭蓋発達、短脚、変形性関節症、気管および心臓弁欠陥、ならびに、場合によって神経障害が挙げられる。患者では通常、出生時にはＭＰＳの明白な臨床像は認められないが、進行性の臨床的障害を示し得る。重篤なケースでは、罹患児は、持続的な医療的管理を要する場合があるが、青年期を迎える前に死亡することが依然として多い。
【０００６】
別のタイプのリソソーム蓄積障害であるニーマンピック病（スフィンゴミエリンリピドーシスとしても知られる）は、細網内皮系の泡沫細胞浸潤によって特徴づけられる障害群を含む。ニーマンピック病における泡沫細胞には、スフィンゴミエリンと、それほどではないものの、コレステロールを含む他の膜脂質がうっ積する。ニーマンピック病は、Ａ型およびＢ型では、酸性スフィンゴミエリナーゼという酵素の不活性化を原因とし、Ｂ型の方が、残存酵素活性が高い（Ｋｏｌｏｄｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，"ｉｎ  ＮＡＴＨＡＮ  ＡＮＤ  ＯＳＫＩ'Ｓ  ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＩＮＦＡＮＣＹ  ＡＮＤ  ＣＨＩＬＤＨＯＯＤ  ５ｔｈ  ｅｄ．，ｖｏｌ．２，１４６１−１５０７（Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｎａｔｈａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈ．Ｏｒｋｉｎ，Ｅｄｓ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．）（１９９８）を参照されたい）。ニーマンピック病における主な器官系の病態生理は、以下のように簡潔にまとめることができる。脾臓は、Ａ型およびＢ型患者で最も甚大な障害をきたす器官である。肺も、程度の差はあるものの、影響を受け、Ｂ型患者における肺病変は、慢性気管支肺炎によって死に至る主な原因である。肝臓への影響はさまざまであるが、重症患者は、生命にかかわる肝硬変、門脈圧亢進、および腹水を有する場合がある。リンパ節への影響は、疾患の重症度によってさまざまである。中枢神経系障害によって、ニーマンピック病の主要な型が区別される。大半のＢ型患者では中枢神経系への影響は見られないが、中枢神経系障害は、Ａ型患者において特徴的に見られる。腎臓への影響はニーマンピック病ではそれほど大きくない。
【０００７】
これらのリソソーム蓄積障害の治療については、骨髄移植および酵素補充療法を含むいくつかのアプローチが評価されている。骨髄移植は、程度の差はあるものの、有効であるのが分かっているが、単独で実施する場合、骨組織および関節への効果は限られる（Ｃｌａｒｋｅ，ＬＡ，"Ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ：Ａ  Ｓｕｃｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，"Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：ｅ１（２００８））。免疫抑制剤および骨髄破壊薬の有害な副作用、ならびに、移植片対宿主病の発生も障害となる。臍帯血の使用は、これらの複雑な因子を部分的に弱めるが、それらの因子は重大であり続ける場合が多い。酵素補充療法は、遺伝子組み換え酵素の静脈内注入（通常毎週または隔週）を伴う（Ｃｌａｒｋｅ，ＬＡ，"Ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ：Ａ  Ｓｕｃｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，"Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：ｅ１  （２００８））。主に、酵素補充療法の有効性は、細網内皮器官（例えば肝臓、脾臓）には容易に送達されるが他の器官には容易には送達されないという、注入された酵素の体内分布に依存する。ＭＰＳの障害に対しては、酵素補充療法は以下の３つの型に対して利用可能である：ＭＰＳ  Ｉ型（ハーラー／シャイエ症候群）（Ｗｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）：Ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｒａ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１６７：２６７−７７（２００８）、Ｃｏｘ−Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  Ｉ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，"Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：１２６−３２（２０１０）、Ｃｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ６  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  Ｕｒｉｎｅ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＭＰＳ  Ｉ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，"Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１２５９−７３（２０１０））、ＭＰＳ  ＩＩ型（ハンター症候群）（Ｇｌａｍｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）Ｗｉｔｈ  Ｉｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ：Ｔｈｅ  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｅｎｄ  Ｐｏｉｎｔｓ，"Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．（２０１１））、およびＭＰＳ  ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）（Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ：Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｐｕｂｅｒｔａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ４−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ，"Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｍｅｄ．３：８９−１００（２０１０）、Ｖａｌａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ  Ｏｒｐｈａｎｅｔ，"Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．１２：５（２０１０）、ＭｃＧｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ  Ｆｒｏｍ  ８  Ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  Ａｇｅ−Ａ  Ｓｉｂｌｉｎｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｕｄｙ，"Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．７７：４９２−４９８（２０１０））。可動性、呼吸、および関節の柔軟性の改善を含め、酵素補充療法後のクオリティオブライフの有意な改善が指摘されている。しかしながら、ＭＰＳ患者の軟骨疾患および骨疾患に酵素補充療法が直接影響を及ぼすという証拠は少ないか、またはまったくないので、これらのプラスの臨床効果は、主に軟組織（例えば腱）の変化に由来すると考えられる。遺伝子療法（Ｃｏｔｕｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２１：５５５−６９（２０１０）、Ｈｅｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＶＩＩ  Ｄｏｇｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９５：１４２−５１（２００８））、および、細胞特異的標的配列に融合させた遺伝子組み換え酵素の使用（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＣＨＯ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ−Ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，"Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１１）、Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｅｒｍｉｔｓ  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  α−Ｌ−Ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｗｉｔｈ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  Ｉ，"Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：４５０−６０（２０１１））を含め、他の実験的療法も、ＭＰＳの障害について評価中である。
【０００８】
ポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）は、ＦＤＡに認可された経口薬であって、リソソーム蓄積障害、さらに具体的にはＭＰＳの障害（本願）、ならびに、関節炎、糖尿病、椎間板変性、および加齢性神経変性を含むいくつかの疾患の動物モデルにおいて、強力な抗炎症効果と臨床効果を有する経口薬である。ＰＰＳは現在、間質性膀胱炎患者への使用が認められており、臨床試験によってその安全性が示されている。ＰＰＳは、白血球の動員を阻害し、ケモカイン、サイトカイン、および増殖因子のいくつかの機能に干渉し、それにより、炎症および活性酸素種（ＲＯＳ）を低減する。
【０００９】
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、例えば、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症などの炎症性障害を含むさまざまな障害で重要な役割を果たすと考えられている。ＴＮＦαと受容体ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂのいずれについても、非常に詳細な調査が行われてきた。生理活性型のＴＮＦαは三量体であり、隣接するサブユニットによって形成される溝は、サイトカイン受容体との相互作用にとって重要である。サイトカインの作用に拮抗するいくつかの方策が開発されており、現在、これらの方策は、さまざまな病状の治療に用いられている。
【００１０】
ＴＮＦαに対して充分な特異性と選択性を有するＴＮＦα阻害剤は、ＴＮＦαが原因物質とされている障害を予防または治療するのに効率的な予防用または治療用医薬化合物でありうる。ＴＮＦαに対する抗体による、毒素性ショックを治療する方法（Ｒａｔｈｊｅｎらの欧州特許第０４８６５２６号）、腫瘍退縮、細胞毒性の阻害の方法（Ｒａｔｈｊｅｎらの米国特許第６，４４８，３８０号、Ｒａｔｈｊｅｎらの米国特許第６，４５１，９８３号、Ｒａｔｈｊｅｎらの米国特許第６，４９８，２３７号）、ＲＡおよびクローン病などの自己免疫疾患を治療する方法（Ｆｅｌｄｍａｎｎらの欧州特許第０６６３８３６号、Ａｇｇａｒｗａｌらの米国特許第５，６７２，３４７号、Ｌｅらの米国特許第５，６５６，２７２号）、移植片対宿主反応を治療する方法（Ａｇｇａｒｗａｌらの米国特許第５，６７２，３４７号）、細菌性髄膜炎を治療する方法（Ｈｅｃｔｏｒらの欧州特許第０５８５７０５号）が説明されてきた。過去の研究では、ＭＰＳ動物モデルにおいて炎症が軟骨疾患および骨疾患に及ぼす重大な影響も明らかにされ、ノックアウトマウスでＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）のシグナル伝達を遺伝的に阻害するか、または、ＴＮＦ阻害剤をＮａｇｌａｚｙｍｅと併用すると、軟骨疾患および骨疾患が著しく改善されることが示されている。ただし、リソソーム蓄積障害、特にムコ多糖症およびニーマンピック病の治療に完全に有効な薬剤は、現在入手できない。ＴＮＦ阻害剤は、動物モデルでは有効であるが、重大な副作用を引き起こし得る静注薬であり、ＭＰＳ患者への長期間の使用は、実現困難である場合がある。
【００１１】
本発明は、上記および当該技術分野におけるその他の欠点の克服に注力するものである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第一の態様は、リソソーム蓄積障害を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、リソソーム蓄積障害を有する対象を選択すること、および選択した対象においてリソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、選択した対象に、酵素補充療法薬と抗ＴＮＦα治療薬を投与することを含む。
【００１３】
本発明の第二の態様は、酵素補充療法によって治療しているリソソーム蓄積障害を有する対象において炎症性サイトカインを低減させる方法に関する。この方法は、対象において炎症性サイトカインを低減させるのに有効な条件の下で、対象に抗ＴＮＦα治療薬を投与することを含む。
【００１４】
本発明の第三の態様は、リソソーム蓄積障害を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、リソソーム蓄積障害を有する対象を選択すること、および選択した対象においてリソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、選択した対象にポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）を投与することを含む。
【００１５】
本発明の第四の態様は、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を選択すること、および対象においてリソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、選択した対象に、基質抑制療法薬と抗ＴＮＦα治療薬を投与することを含む。
【００１６】
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、いくつかのリソソーム蓄積障害に利用可能であるが、骨格系に対するこの治療の利点は非常に限られている。過去の研究によって、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の骨格病変におけるＴｏｌｌ様受容体４／ＴＮＦα炎症経路の重要性が示されており、したがって、本発明では、ＭＰＳ  ＶＩ型のラットモデルにおいて、抗ＴＮＦα療法をＥＲＴと組み合わせることの付加的な利点について考察した。その際、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットを８カ月間、Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標）（遺伝子組み換えヒトＮ−アセチル−ガラクトサミン−４−スルファターゼ）で処置するか、または、Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標）とラット特異的抗ＴＮＦα薬ＣＮＴＯ１０８１とを用いる併用プロトコールによって処置するかした。いずれのプロトコールでも、ＴＮＦαと核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）の血清レベルが著しく低下し、併用処置では、関節軟骨におけるＴＮＦαが低減した。培養した関節軟骨細胞の分析により、上記の併用療法において、コラーゲンＩＩＡ１型の発現が回復し、アポトーシスマーカーＰＡＲＰの発現が低減したことも示された。運動活性および可動性はＥＲＴによって改善し、これらは、併用療法によって有意に向上した。ＭＰＳ  ＶＩ型動物における気管変形は併用療法によって改善し、骨の長さがやや改善した。気管のセラミドレベルも著しく低下した。マイクロＣＴ分析では、いずれの治療によっても骨微細構造に対する有意なプラス効果はまったく示されず、骨成長板の組織学的改善も見られなかった。本発明の結果から、ＥＲＴと抗ＴＮＦα療法の併用により、治療転帰が改善し、臨床上の重要な利点が得られたこと、および、改善した治療転帰に従って、抗ＴＮＦα療法が改善し、臨床上の重要な利点が得られたことも示されている。さらに、本発明の結果から、ＭＰＳの障害を含むリソソーム蓄積障害用バイオマーカーとして、ＴＮＦα、ＲＡＮＫＬ、およびその他の炎症分子が有用であることも立証された。
【００１７】
この数年間、本発明の研究者は、単独またはＥＲＴ、ＢＭＴ、もしくは遺伝子療法と併用する形の改良された療法の開発を長期的な目標として、ＭＰＳ動物モデルにおける関節および骨の病変について研究してきた（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｒａｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ，"Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３：１３８６−９３（１９９７）、Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｄｅｒｍａｔａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｕｎｄｅｒｇｏ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｔｅ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔｉ．８１：１３１９−１３２８（２００１）、Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｊｏｉｎｔ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ  ａｎｄ  ＶＩＩ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ，"Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．５７：７０１−７０７  （２００５）、これら参照文献のいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この継続中の研究の一部として、ＭＰＳ関節軟骨細胞死（アポトーシス）の増加、ＭＰＳ滑膜線維芽細胞の過剰増殖、およびＭＰＳ成長板の組織崩壊を含め、ＭＰＳ動物モデルにおける多くの異常を同定した。正常関節軟骨細胞の培養培地にＧＡＧを加えたところ、アポトーシスと炎症マーカーの放出が誘発されたことも研究者は発見し、これは、ＧＡＧの貯蔵自体が、ＭＰＳの障害において炎症誘発事象であり得ることを示している（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂｏｎｅ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ＆Ｏｔｈｅｒ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１７２：１１２−１２２（２００８）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＭＰＳ細胞におけるＧＡＧの貯蔵によって、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）シグナル伝達経路も活性化され、その結果、ＴＮＦαとその他の炎症性サイトカインが放出された。
【００１８】
したがって、本発明では、ＭＰＳマウス（ＭＰＳ  ＶＩＩ型、スライ病）がＴＬＲ４ノックアウトマウスとなるように交配したところ、ダブルノックアウトＭＰＳ動物において、ＴＮＦα、ＩＬ１−β、ＲＡＮＫＬ、およびその他のサイトカインが著しく低減し、骨の成長が改善し、骨成長板がより組織化され、軟骨細胞の細胞死が低減したことを発見した（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。これにより、研究者は、関節炎およびその他の炎症性疾患に用いられるＦＤＡ認可の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）のラット特異的等価物である、ＣＮＴＯ１０８１を用いて、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおいて抗ＴＮＦα療法の予備的な分析を行うに至った（Ｗｅａｖｅｒ，ＡＬ，"Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，"Ｍｏｄ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４：１０１−１１２  （２００４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。この研究では、ＣＮＴＯ１８１処置により、ＭＰＳ  ＶＩ型動物における炎症性サイトカインのレベルが低下し、アポトーシスを起こした関節軟骨細胞の数も低減したことが分かった。しかしながら、骨の成長に対する効果、または運動活性の臨床的改善は見られなかった。本発明では、これらの発見を拡張し、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおいて、抗ＴＮＦαアプローチと、ＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用アプローチを評価した。抗ＴＮＦαアプローチと、ＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用アプローチでは、ＥＲＴ単独よりも、いくつかの利点が得られることが分かった。これらの利点には、歩行および運動活性の改善、気管の薄化および変形の減少、ならびに骨のわずかな伸長が含まれていた。関節軟骨においてコラーゲンＩＩＡ１型の発現も回復し、アポトーシスも低減した。
【００１９】
本願は、（ａ）ＭＰＳなどのリソソーム蓄積障害に対する新たな療法であって、軟骨および骨（脊椎を含む）の治療を改善する療法が必要とされているという前提、（ｂ）これらの療法が、ヒトに使用する前に、適切な動物モデルで立証されなければならないという前提、ならびに（ｃ）治療時における疾患の重症度が効能に大きな影響を及ぼすであろうという前提に基づくものである。
【００２０】
本発明は、ＰＰＳがＭＰＳ用の初めての経口薬であり得るとともに、これらの障害における軟骨疾患および骨疾患に大きな影響を及ぼす初めての治療であり得るということも提案する。この仮説は、（ａ）ＭＰＳの軟骨疾患および骨疾患の病態生理における炎症の重要な役割を実証している過去の研究、（ｂ）ＰＰＳの炎症および軟骨形成に対する既知の効果、ならびに（ｃ）ＭＰＳの１つ（ＭＰＳ  ＶＩ型、マロトー・ラミー病）のラットモデルにおいてＰＰＳを用いた初期の予備データに基づいている。ＰＰＳがすでに安全性試験を経ており、ＦＤＡから認可を受けていることを考慮すると、ＭＰＳ患者への使用も、本発明で提案されている動物モデル実験に基づき、「急速に拡大」し得る。ちなみに、ＰＰＳは残存酵素活性を高めたり、ＭＰＳ患者におけるＧＡＧの低減を導くとは期待されないので、ＰＰＳは、これらの障害においてＥＲＴと併用してよい。ＰＰＳを単独で用いて、リソソーム蓄積障害を治療してもよい。ＰＰＳはヘパリン様ＧＡＧ分子である。したがって、ＧＡＧ蓄積疾患であるＭＰＳ障害またはその他のリソソーム蓄積障害に良い効果をもたらすとは期待されていなかった。実際、本発明の教示以前には、ＰＰＳは、これらの障害を悪化させるとみられていた可能性がある。ＰＰＳはＧＡＧ様分子であるにもかかわらず、ＭＰＳおよびその他のリソソーム蓄積障害に実質的に良い効果をもたらすことを本発明は初めて教示する。
【００２１】
要約すると、軟骨疾患および骨疾患の治療は、ＭＰＳなどのリソソーム蓄積障害における満たされない重要な医療ニーズの代表であり、本発明は、リソソーム蓄積障害患者、特にＭＰＳ患者の治療および看護に甚大かつ迅速な影響を及ぼし得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ａ〜Ｃは、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおけるＥＲＴとＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用療法の抗炎症効果を示す図である。図１Ａでは、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットに対して、ＥＲＴ処置（黒色）またはＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用処置（灰色）を８カ月間行った（ｎ＝８匹／群）。抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαに対する抗体（ＣＮＴ０１０８１）を用いて実施した。最後の注射の２日後に、これらのラットを安楽死させ、血清を採取した。週齢をマッチさせた（３７週）正常ラットの血清（薄灰色）および未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの血清（白色）も採取し、免疫測定キットを用いてＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬのレベルを決定した（下記の実施例を参照されたい）。すでに示されているように、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型動物では、これらの２つの炎症マーカーのレベルが著しく上昇しており、いずれも、ＥＲＴまたは併用処置によって有意に低下した（＊ｐ＜０．００５）。これらの２つの処置プロトコールの間に有意差は見られなかった。図１Ｂでは、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットで、関節軟骨におけるＴＮＦα免疫染色（赤色）が、正常ラットと比べて著しく上昇し、これは、ＥＲＴによってわずかに低下し、併用処置によって正常化した。図１Ｃでは、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型およびＥＲＴ処置済の滑膜において、絨毛（ＳＶ）の形成を伴う滑膜（＊）の増生、ならびに、滑膜の肋軟骨下骨への浸潤（矢尻、ＳＢ）が明らかに見られた。併用療法で処置したラットでは、関節炎症が著しく少なかったが、貯蔵細胞は依然として存在していた。
【図２】Ａ〜Ｂは、未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける運動活性および歩行の分析結果を示す図である。図２Ａでは、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットにＥＲＴ処置（四角）またはＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用処置（丸）を８カ月間行った（ｎ＝８匹／群）。抗体ＣＮＴ０１０８１を用いて抗ＴＮＦα療法を実施した。最後の注射の２日後、ラットに対して、３種類の速度で加速ロータロッド分析を行い、年齢と性別をマッチさせた未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット（三角）とパフォーマンスを比較した。１０ＲＰＭでは、いずれの処置済みのラット群も、最大期間（１８０秒間）回転ロッド上に留まり、未処置のラットよりも有意に長かった（ｐ＜０．００５）。この傾向は、より速い速度では顕著になり、ＥＲＴ群と併用群との間の差も有意であった（ｐ＊＜０．００５）。個々のラットにおける時間をプロットし、各群の平均値を横線で示している。図２Ｂでは、処置後、ラットに対して歩行分析も行った。２種類の異なる色の食用着色剤を用いて、管の中を歩くラットの前足と後足をマーキングし、足跡から歩幅と足の運びの角度を測定した。各ラットを少なくとも３回試験した。足跡の平均値の概要は図２Ａ〜２Ｂに示されている。見てとれるように、後足の動作角度は、６０°（未処置）から、ＥＲＴ処置ラットでは４５°に縮小し（未処置ラットとの比較、ｐ＝０．００４）、併用処置ラットでは３０°（未処置ラットとの比較、ｐ＝０．０００１）に縮小した。加えて、ラットが１歩で前足を動かすことができる距離は、２．８ｃｍ（未処置）から４．２ｃｍに伸びたとともに、併用処置群では５．１ｃｍに有意に伸びた（ｐ＝０．０３）。ラットが後足で進むことができる距離は、ＥＲＴ群では変わらず、併用群でわずかに（４．９ｃｍから５．１ｃｍに）伸びたに過ぎなかった。
【図３】Ａ〜Ｃは、未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける骨の長さおよび微細構造を示す図である。図３Ａでは、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットに対して、ＥＲＴ処置（黒色）またはＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用処置（灰色）を８カ月間行った（ｎ＝８匹／群）。ＴＮＦα療法は、抗体ＣＮＴ０１８１で実施した。最後の注射の２日後にラットを安楽死させ、マイクロＣＴ分析用に大腿骨と脛骨を採取した。その結果を、年齢と性別をマッチさせた未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット（白色）と比較して、その値を正常な対照の割合（％）として表した。ＥＲＴでは、大腿骨または脛骨の長さは伸びなかったが、併用プロトコールでは、大腿骨は約６％、脛骨は約１４％長くなった。ちなみに、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型群の脛骨は平均で正常の７４％、大腿骨は平均で正常の７７％であったのに対して、併用処置群の脛骨は平均で正常の約８８％、大腿骨は平均で正常の約８４％であった。図３Ｂは、冠状断像によるマイクロＣＴ分析結果を示す図である。未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおいて、骨幹端部の骨の骨梁密度は低下し、骨端軟骨成長板は、形成が異常で崩壊しており、骨端の骨梁は、正常な大腿骨と比べて組織崩壊していた。併用処置による多少の改善が検出された。図３Ｃは、大腿骨の骨幹部中央領域のマイクロＣＴ分析結果であり、軸方向像を示しており、皮質下の骨梁が骨髄空間内に浸潤している。処置後、骨梁の浸潤がいくらか低減したが、これは定量測定値によって確認することはできなかった。
【図４】Ａ〜Ｂは、未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける気管の欠陥を示す図である。図４Ａでは、（抗体ＣＮＴ０１０８１で）処置済みおよび未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットおよび正常ラットから、実験の最後（３７週齢時）に気管を採取した。この代表的な図によって示されているように、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、著しく肥厚し、異常な、虚脱した気管であるとともに、その内腔は狭くて扁平であった。これらの異常は、ＥＲＴによっては変わらなかったが、併用処置によって明らかに改善し、併用処置の結果、円形の気管が得られ、断面積は統計上ほぼ正常な値となった。図４Ｂは、気管の免疫組織化学分析結果であり、未処置およびＥＲＴ処置済みのラット（赤色）の上皮細胞において、炎症誘発性およびアポトーシス促進性のスフィンゴリピドであるセラミドの発現が増大したことが示されており、これは、炎症性疾患の発生と合致している。併用処置群から採取した気管では、セラミドのほぼ正常な発現が見られた。
【図５】Ａ〜Ｂは、未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットから採取した関節軟骨細胞におけるタンパク質の発現を示す図である。図５Ａでは、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットに対して、ＥＲＴ処置またはＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用処置を８カ月間行った（ｎ＝８匹／群）。抗ＴＮＦα療法は、抗体ＣＮＴ０１０８１を用いて実施した。最後の注射の２日後にラットを安楽死させ、関節軟骨細胞を単離して、ウエスタンブロット用に処理した（図５Ａ）。この代表的な実験で示されているように、ＥＲＴ単独では、コラーゲンＸ型の発現が増大し、コラーゲンＩＩＡ１型は、より緩やかな程度で発現が増大した。併用処置群では、コラーゲンＩＩＡ１型の発現レベルがさらにより顕著であったことを除き、同様の観察結果が見られた。これらの観察結果を確かめるために、未処置ラット、ＥＲＴ処置ラット、および併用処置ラットから採取した関節軟骨切片で、コラーゲンＩＩＡ１型の免疫蛍光顕微鏡分析を行った（図５Ｂ）。図５Ｂで明らかなように、併用処置群において、コラーゲンＩＩＡ１型の発現（赤色）がより高く、正常ラットと類似していた。処置済みラットおよび対照ラットにおいて、ウエスタンブロットによってアポトーシスマーカーＰＡＲＰの発現についても調べたところ、併用処置によってのみ低下した。加えて、ＭＰＳ  ＶＩ型で上昇するアグリカナーゼＡＤＡＭＴＳ５のレベルは、いずれの処置プロトコールによっても低下した。
【図６】Ａ〜Ｄは、ＰＰＳで処置したＭＰＳ  ＶＩ型ラットの結果を示す図である。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットは、通常の給水で（図６Ａ）、または２５ｍｇ／日のＰＰＳを含む水で（図６Ｂ）飼育した（ｎ＝６匹／群）。処置開始時のラットの月齢は６カ月で、処置は３カ月間実施した。処置の最後に、頭蓋と鼻の画像を撮った。代表的な画像が示されている。鼻の長さが図６Ｃに示されており、頭蓋の長さが図６Ｄに示されている。頭蓋の長さと幅の測定値は、各ラットについて、Ｘ線写真からも決定した。そのデータは棒グラフで示されている（図６Ｃ、６Ｄ）。白色は正常な９カ月齢ラット、灰色は、通常の給水を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット、青色は、ＰＰＳを摂取したＭＰＳ  ＶＩ型ラット、＊はｐ＜０．０１である。
【図７】Ａ〜Ｆは、正常ラット（図７Ａ、７Ｄ）、ＰＰＳ処置を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図７Ｃ、７Ｆ）、およびＰＰＳ処置を行っていないＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図７Ｂ、７Ｅ）の頭蓋のＸ線写真（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ）とマイクロＣＴ画像（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ）を示す図である。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットは、通常の給水で、または２５ｍｇ／日のＰＰＳを含む水で飼育した（ｎ＝６匹／群）。処置開始時のラットの月齢は６カ月で、処置は３カ月間実施した。上方の画像はＸ線写真を示しており（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ）、下方の画像はマイクロＣＴ画像である（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ）。ＰＰＳで処置したＭＰＳ  ＶＩ型ラットの方が、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットよりも鼻が長く、頭蓋が細いことが分かった。Ｘ線写真中の線は参考のためのものである。図６Ａ〜６Ｄに示されている、頭蓋の長さおよび幅に関する定量データは、これらのＸ線写真から測定した。
【図８】Ａ〜Ｆは、正常ラット（図８Ａ、８Ｂ）、ＰＰＳ処置を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図８Ｅ、８Ｆ）、およびＰＰＳ処置を行っていないＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図８Ｃ、８Ｄ）のマイクロＣＴ画像を示す図であり、歯列の変化を示している。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットは、通常の給水で、または２５ｍｇ／日のＰＰＳを含む水で飼育した（ｎ＝６匹／群）。処置開始時のラットの月齢は６カ月齢で、処置は３カ月間実施した。未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは切歯が過剰成長し（囲み部分）、これにより、正常ラットに比べて、異常な歯並びとなる。下顎骨と歯並びの悪さはＰＰＳ処置によって矯正された。
【図９】ＰＰＳ処置を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラットとＰＰＳ処置を行っていないＭＰＳ  ＶＩ型ラットのロータロッド分析結果を示す図である。６カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットをＰＰＳ処置しながら、またはＰＰＳ処置せずに３カ月間飼育し（ｎ＝６匹／群）、殺処分前に、加速ロータロッド装置を用いて分析した。灰色は通常の給水を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット、青色はＰＰＳを摂取したＭＰＳ  ＶＩ型ラットである。処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの方が、未処置のラットの２倍超長く回転ロッド上に留まることができたことに留意されたい。＊はｐ＜０．０２である。
【図１０】Ａ〜Ｂは、ＰＰＳ処置済みおよび未処置のラットの免疫組織化学分析結果を示す図である。図１０Ａは、ＰＰＳ処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの肝臓および脾臓の免疫組織化学分析結果であり、年齢をマッチさせた未処置の９カ月齢ＭＰＳラットと比べると、ＴＮＦαの発現が低下したことが示されている。図１０Ｂでは、ＰＰＳ処置済みのラットにおいて血清中のＴＮＦレベルも低下していた。
【図１１】Ａ〜Ｃは、処置済みおよび未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける血清炎症マーカーを示す図である。３群のＭＰＳ  ＶＩ型ラットに、６カ月齢（薄灰色）、１カ月齢（濃灰色）、または出生前（黒色）からＰＰＳ処置を開始した。いずれのラットも９カ月齢で殺処分した。したがって、処置期間はそれぞれ３カ月、８カ月、９．７５カ月であった。ＥＬＩＳＡアッセイによっていくつかの炎症マーカーの血清レベルを測定し、正常ラット（斜線）または未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット（白色）と比較した。Ｎは６匹／群であった。炎症マーカーＭＩＰ−１αの血清レベルは図１１Ａに示されており、マーカーのランテスのレベルは図１１Ｂに、ＴＮＦαのレベルは図１１Ｃに示されている。いずれの処置群でも、これらの炎症マーカーのレベルは、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットよりも有意に（＜０．００１）低かった。
【図１２】Ａ〜Ｃは、１カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの処置結果を示す図である。図１２Ａおよび１２Ｂでは、１カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットを通常の水で、または２５ｍｇ／日のＰＰＳを含む水で８カ月間飼育した（ｎ＝６匹／群）。代表的な画像が示されている。矢印は、未処置のラットにおける眼のポルフィリン分泌、幅広い頭蓋および鼻、ならびに小さい耳を示しているとともに、処置済みのラットでは、顕著な改善がみられる。図１２Ｃでは、ラットを加速ロータロッド装置で試験した。処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの方が、２０ＲＰＭにおいて、未処置のラットの２倍超長く回転ロッド上に留まることができた。加えて、正常および処置済みのラットのみが、３５ＲＰＭの速度まで回転ロッド上に留まることができた（正常ラットの６０％）。
【図１３】ＰＰＳで処置したＭＰＳ  ＶＩ型ラットの気管を示す図である。群１、２、および３のラットは、６カ月から、１カ月から、および出生前からＰＰＳ処置を開始した。ラットは９カ月で殺処分し、気管を単離した。画像は、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、正常ラットよりも気管が虚脱していること、およびこの虚脱が、すべてのＰＰＳ処置群で改善したことを示している。
【図１４】Ａ〜Ｃは、処置済み（６カ月齢）および未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける脊椎疾患の評価を示す図である。図１４Ａは、正常対照ラット（左）とＭＰＳ  ＶＩ型ラット（右）のサフラニンＯ／ファストグリーン染色の結果を示している。図１４Ｂは、腰椎の運動分節の生体力学的な結果を示しており、ＭＰＳラットの方が、ニュートラルゾーンの剛性が低く、圧縮クリープの時定数が低かったことが示され、コラーゲンの完全性とＧＡＧの機能が低下していることが示唆された。図１４Ｃは、対照群、ＭＰＳ群、処置済み（Ｔ）群のサジタルＸ線写真を示しており、ＭＰＳの椎間板の高さ指数（ＤＨＩ、２つの隣接する椎骨の高さの平均によって規格化した椎間板の高さとして定義される）が対照よりも大きく、痩せ細った成熟ラット（６カ月齢）のＰＰＳ処置がこのパラメーターに影響を及ぼさなかったことが示され、より早い段階での介入の動機となった。
【図１５】ＰＰＳ処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける関節軟骨細胞の分析結果を示す図である。群１、２、および３のラットは、６カ月から、１カ月から、および出生前からＰＰＳ処置を開始した。ラットは、９カ月で殺処分し、関節軟骨細胞を単離し、３週間増殖させた。続いて、増殖した細胞をウエスタンブロットによって分析した。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットの軟骨細胞の方が正常細胞よりも、炎症マーカーである、ＴＮＦα、ｐ３８、およびＣｏｘ−２が高かったこと、ならびに処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、これらのレベルが正常レベルまで低下したことに留意されたい。ＡＤＡＭＴＳ−５は、プロテオグリカンを分解するアグリカナーゼであって、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの軟骨細胞で増大するが、ＭＰＳ  ＶＩ型処置群において低下した。
【図１６】ＰＰＳで処置したニーマンピック病マウスのロータロッド分析結果を示す図である。１カ月齢のニーマンピック病マウス（酸性スフィンゴミエリナーゼノックアウト）を、１カ月齢から３か月間、ＰＰＳで処置した（２５ｍｇ／ｋｇ／日）。続いて、２０ＲＰＭに設定した加速ロータロッド装置を用いてマウスを分析した。ＰＰＳで処置したＮＰＤマウスは、未処置のマウスよりも有意に高いパフォーマンスを見せた（ｐ＜０．０１）。いずれの群も、滞留時間は野生型マウスよりも有意に短かった。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の第一の態様は、リソソーム蓄積障害を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、リソソーム蓄積障害を有する対象を選択すること、および選択した対象においてリソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、選択した対象に、酵素補充療法薬と抗ＴＮＦα治療薬を投与することを含む。
【００２４】
本発明によるリソソーム蓄積障害は、リソソーム酵素の欠損により、リソソーム酵素基質の存在または蓄積が生じ、その結果、望ましくない作用（例えば、基質の異常蓄積、または異常基質の産生）が生じる任意の障害である。リソソーム酵素が異常な量で産生されたり（例えば、リソソーム酵素が対象においてまったく発現していなかったり、低レベルで発現していたり、高レベルで発現していたり）、または、例えば突然変異もしくはタンパク質の不適切なフォールディングにより、異常な機能を呈したりする場合がある。本発明によるリソソーム酵素は、細胞のリソソーム区画に含まれる加水分解酵素であって、リソソーム区画に含まれる細胞副生成物を代謝する任意の加水分解酵素である。本明細書で使用する場合、基質とは、１種以上のリソソーム酵素に対するリソソーム基質を指す。本発明の方法による治療の対象となるリソソーム蓄積障害は、当該技術分野においてリソソーム蓄積障害と認識される障害であれば、特に限定されない。
【００２５】
本発明のリソソーム蓄積障害は、以下の病状に細分される：スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、糖タンパク症（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｏｓｅｓ）、ムコリピドーシス、糖原病ＩＩ型、セロイドリポフスチン沈着症、および「その他」のカテゴリーに入る病状（Ｃａｉｌｌａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５４：５０５−１２（２０００）、Ｎａｔｈａｎ  ａｎｄ  Ｏｓｋｉ，ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＩＮＦＡＮＣＹ  ＡＮＤ  ＣＨＩＬＤＨＯＯＤ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３５，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ（２００３）（いずれの文献も参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ほぼすべてのリソソーム蓄積障害は常染色体劣性疾患である。これに対する２つの留意すべき例外は、Ｘ染色体連鎖性であるファブリー病とハンター症候群である（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００２６】
本発明のリソソーム蓄積障害としては、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖蓄積症（ムコ多糖症）、糖タンパク症（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｏｓｅｓ）、ムコリピドーシス、糖原病ＩＩ型、セロイドリポフスチン沈着症、およびその他のリソソームタンパク質機能異常を挙げることができるが、これらに限らない。さらに具体的には、前記障害としては、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ランディング病）、ＧＭ２ガングリオシドーシスＢ／Ｂ１異型（テイ・サックス病）および０異型（サンドホッフ病）、異染性白質萎縮症、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマンピック病（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ファーバー病、ウォルマン病、オースティン病、ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー病またはハーラー症候群）、シャイエ病、ハーラー・シャイエ病、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター病）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（サンフィリッポ病、ムコ多糖症ＩＩＩ  Ａ〜Ｄ型、ムコ多糖症ＩＶ型（モルキオ病）、ムコ多糖症ＩＶ  ＡおよびＢ型、ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー・ラミー病）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（スライ病）、ムコ多糖症ＩＸ型、濃化異骨症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、シンドラー病、神崎病、ムコリピドーシスＩ型（シアリドーシス）、ムコリピドーシスＩＢ型（ガラクトシアリドーシス）、ムコリピドーシスＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ型（ムコリピドーシス）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病によって特徴づけられる）、サンタヴォリ・ハルティア病（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ヤンスキー・ビールショースキー病（Ｊａｎｓｋｙ−Ｂｉｅｌｓｈｏｗｓｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、バッテン病、クーフス病、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、およびＣＬＮ８遺伝子座の突然変異によって特徴づけられる病状、ならびに／または、シアル酸蓄積症（乳児型、サラ病）、およびメチルマロン酸性尿症などのその他のリソソーム蓄積症を挙げることができるが、これらに限らない（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号、Ｏｋａｍｕｒａらの米国特許第７，９５１，５４５号（いずれの特許文献も参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００２７】
本発明の一実施形態では、リソソーム蓄積障害はスフィンゴリピドーシスであり、前記スフィンゴリピドーシスは、スフィンゴミエリンが蓄積される疾患であるニーマンピック病である。ニーマンピック病Ｂ型は、酸性スフィンゴミエリナーゼの障害によるものであり、ニーマンピック病Ｃ型は、コレステロールのエステル化異常によるものである。スフィンゴリピドーシスのその他の例としては、以下の疾患が挙げられるが、これらに限らない：ＧＭ１ガングリオシドーシス（ランディング病、β−ガラクトシダーゼ欠損）、ＧＭ２ガングリオシドーシスＢ／Ｂ１異型（テイ・サックス病、ヘキソサミニダーゼＡ欠損）および０異型（サンドホッフ病、ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ欠損）、異染性白質萎縮症（アリールスルファターゼＡ欠損）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ欠損）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ欠損）、ゴーシェ病（β−グルコシダーゼの欠損）、ニーマンピック病（Ａ、Ｂ、Ｃ、スフィンゴミエリナーゼ欠損）、ファーバー病（セラミダーゼの欠損）、ウォルマン病（酸性リパーゼの欠損）、およびオースティン病（多数のスルファターゼの欠損）（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、リソソーム蓄積障害はムコ多糖症である。ムコ多糖症（ＭＰＳ）という用語は、本明細書で使用する場合、ＧＡＧのリソソーム内での蓄積および貯蔵によって特徴づけられる、リソソーム蓄積障害のサブグループを指す。一つの特定の実施形態では、本発明によるムコ多糖症は、ＭＰＳ  Ｉ型（ハーラー／シャイエ症候群）、ＭＰＳ  ＩＩ型（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）、ＭＰＳ  ＩＩＩ型（サンフィリッポ症候群）、ＭＰＳ  ＩＶ型（モルキオ症候群）、および／またはＭＰＳ  ＶＩＩ型（スライ病）を含んでもよい。ムコ多糖症Ｉ型〜ＩＸ型の分類および欠損酵素の追加の例は表１に列挙されており、本発明の方法によって治療され得る疾患としては、下記の表１に列挙されているものが挙げられる（Ｏｋａｍｕｒａらの米国特許第７，９５１，５４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００２９】
（表１）ムコ多糖症の分類
2014518222.tif 000003
【００３０】
本発明による糖タンパク症（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｏｓｅｓ）としては、以下の疾患が挙げられるが、これらの疾患に限らない：アスパルチルグルコサミン尿症（Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼの欠損）、フコシドーシス（α−フコシダーゼの欠損）、α−マンノシドーシス（α−マンノシダーゼ欠損）、α−マンノシドーシス（β−マンノシダーゼ欠損）、シンドラー病および神崎病（シンドラー病および神崎病のいずれについても、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼまたはα−ガラクトシダーゼＢ）（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３１】
本発明のムコリピドーシスとしては、以下の疾患が挙げられるが、これらに限らない：Ｉ型（シアリドーシス、α−ノイラミニダーゼ欠損）、ＩＢ型（ガラクトシアリドーシス、カテプシンＡ欠損）、ならびに、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型（ムコリピドーシス、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ）。糖原病ＩＩ型は、例えばポンペ病（α−１，４−グルコシダーゼまたは酸性マルターゼの欠損）によって特徴づけられる（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３２】
本発明のセロイドリポフスチン沈着症としては、サンタヴォリ・ハルティア病（パルチミトイルタンパク質チオエステラーゼ欠損）、ヤンスキー・ビールショースキー病（トリペプチジルペプチダーゼＩ欠損）、バッテン病（ＣＬＮ３タンパク質欠損）、クーフス病、ならびに、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、およびＣＬＮ８遺伝子座の突然変異によって特徴づけられる病状が挙げられるが、これらに限らない（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３３】
その他のリソソーム蓄積症としては、シアル酸蓄積症（乳児型、サラ病、シアル酸輸送体の欠損）、およびメチルマロン酸性尿症（ビタミンＢ１２輸送体タンパク質の欠損）が挙げられるが、これらに限らない（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３４】
酵素補充療法という用語は、本明細書で使用する場合、リソソーム蓄積障害を有する対象における欠損または欠陥酵素を補充する任意の薬剤または療法を指す。
【００３５】
本発明による酵素補充療法（「ＥＲＴ」）は、体外で産生された天然の酵素または遺伝子組み換え酵素の投与、好ましくは静脈内投与を伴う。投与後、補充酵素は、肝臓によって体循環中に分泌される。近接する細胞および遠方の細胞のいずれも、主にマンノース−６−リン酸受容体（事実上すべての細胞の表面上に存在する）を通じて、分泌された酵素を再取り込みする（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．"Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"ｉｎ：ＧＲＥＥＮＦＩＥＬＤ'Ｓ  ＮＥＵＲＯＰＡＴＨＯＬＯＧＹ  ６５３−７３５（Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｉ．，Ｌａｎｔｏｓ，Ｐ．Ｋ．ｅｄｓ．，Ａｒｎｏｌｄ：Ｌｏｎｄｏｎ）（２００２）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。酵素の局所投与により、欠損細胞中の酵素集団の少なくとも一部を補充できる。しかしながら、これらの酵素の循環血中の半減期と細胞内の半減期は通常短く、療法では、比較的多量の当該酵素を定期的に非経口投与しなければならない（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。酵素補充療法の原理証明は、ハーラー症候群動物モデルで立証されている（Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｒｌｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２９３７−１２９４１（１９９４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。他の研究者は、治療用に回収するために、充分な量の遺伝子組み換え酵素を細胞培養で発現させる有効な方法を開発してきた（Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  α−Ｌ−Ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５：２２５−２３２（１９９４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。本発明の一実施形態では、酵素補充療法薬として、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、ラロニダーゼ、アガルシダーゼベータ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ、およびイデュルスルファーゼを挙げられるが、これらに限らない。
【００３６】
ある特定のリソソーム蓄積症を治療する場合に、酵素補充療法は特に有効である。例えば、ゴーシェ病およびファブリー病の治療における酵素補充は、これらの疾患の非神経障害性症状を逆転させるのに有効とされている（Ｗｅｉｎｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  １０２８  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  １  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｆｔｅｒ  ２  ｔｏ  ５  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，"Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１１３：１１２−１１９（２００２）、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ，"ＪＡＭＡ  ２８５：２７４３−２７４９（２００１）（いずれの文献も参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、ムコ多糖症Ｉ型（すなわちＭＰＳ−１Ｈ、ハーラー症候群）などの多くのリソソーム蓄積症では、酵素の補充により、注入したドナータンパク質に対する強力な免疫原性反応が生じる場合がある。さらに、全身に投与された酵素は、ＣＮＳおよび骨格系などの、後に発生に至る部位には到達できない。したがって、酵素補充療法は、これらの代謝性蓄積症の多くと関連する神経学的症状と骨格欠陥を治療するのに有効ではない（Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３７】
抗ＴＮＦα療法という用語は、本明細書で使用する場合、リソソーム蓄積障害を有する対象における欠損または欠陥ＴＮＦαを補充する任意の薬剤または療法を指す。本発明の一実施形態では、抗ＴＮＦα療法薬は、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、およびナタリズマブからなる群から選択される。別の実施形態では、抗ＴＮＦα療法薬はポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）である。
【００３８】
本発明の上記およびその他の態様の目的のための、標的となる対象は、任意の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを包含する。治療を受けているリソソーム蓄積障害患者に対して予防を行う目的で本発明の組成物を投与する状況においては、標的となる対象は、リソソーム蓄積障害に罹患するリスクがある任意の対象を包含する。特に、罹患しやすい対象として、乳児および年少者、ならびに免疫不全状態の成人が挙げられる。対象においてリソソーム蓄積障害を治療する目的で本発明の組成物を投与する状況においては、標的となる対象集団は、任意のタイプのリソソーム蓄積障害に罹患した任意の対象を包含する。特に好適な対象としては、ＭＰＳ  Ｉ型、ＭＰＳ  ＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＶ型、ＭＰＳ  ＶＩ型、またはＭＰＳ  ＶＩＩ型に罹患するリスクがあるか、または罹患した対象が挙げられる。とりわけ、ムコ多糖症は通常、新生児（すなわち乳児）では無症候性であるが、その発症は、身長発育の遅滞、骨の発達異常、ならびに、顔貌、皮膚、および毛髪の発達異常を含む症状によって、乳児期または小児期に明白になる。場合によっては、対象は新生児期においては正常であるが、年月とともに精神遅滞が徐々に進行する。したがって、臨床症状が現れない新生児期の初期および乳児期におけるムコ多糖症などの診断および治療はおそらく、早期の酵素補充療法、遺伝子治療、または骨髄移植により、精神遅滞などを予防するであろう。したがって、ムコ多糖症の診断および治療は、新生児および乳児に対して行ってもよい（Ｏｋａｍｕｒａらの米国特許第７，９５１，５４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。本発明の一実施形態では、対象は乳児または年少者であってもよい。別の実施形態では、対象は成人であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、有効な量とは、所望の局所的または全身的効果をもたらす量を意味する。例えば、有効な用量とは、有益なまたは所望の臨床的または非臨床的成果をもたらすのに充分な量である。酵素補充療法薬および抗ＴＮＦα療法薬の治療上有効な量は、標準的な手順（例えば、その組成物中の有効物質の濃度、投与の方法および頻度、治療（または予防）対象のリソソーム蓄積障害の重症度、対象の詳細（年齢、体重、ならびに全体的な健康状態および免疫状態など）を含む多くの要因を考慮する手順）に従って決定することができる。一般的な手引きは例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎの刊行物および  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。臨床医学者であれば、所望のまたは所要の予防または治療効果をもたらす投与量に達するまで、酵素補充療法薬または抗ＴＮＦα療法薬を投与できる。その療法の経過は、従来のアッセイによって容易にモニタリングできる。
【００４０】
酵素補充治療薬および抗ＴＮＦα治療薬の治療上有効な量は典型的には、１回の投与につき、または１日ベースで、体重１キログラム当たり少なくとも１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ）、たとえば、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２００、少なくとも２５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７５０ｍｇ／ｋｇ、および少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇの組成物である。酵素補充療法および抗ＴＮＦα療法は、通常、何回にもわたって実施される。個々の投与の間隔は、週に１回、月に１回、または年に１回であってよい。間隔は、対象における抗体の血中レベルを測定することによって示されるのに応じて不規則にすることもできる。あるいは、酵素補充療法薬および抗ＴＮＦα療法薬は、徐放性製剤として投与することもでき、その場合には、投与頻度を低くする必要がある。その治療が予防目的か治療目的かによって、投与量および投与頻度を変えることができる。予防用途においては、比較的少ない投与量を比較的低頻度な間隔で、長期間にわたって投与する。治療用途においては、疾患の進行が遅延または停止するまで、好ましくは、対象が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔による比較的多い投与量が必要となる場合がある。本発明の一実施形態では、投与を繰り返す。
【００４１】
本発明の酵素補充治療薬および抗ＴＮＦα治療薬は、治療を受けるリソソーム蓄積障害の性質に応じて、併用療法の一部として、別の有効物質と併せて投与できる。本発明の一実施形態では、本方法は、追加の療法を実施することを含む。本発明による追加の療法の例示的な形態としては、骨髄移植、シャペロン療法、および遺伝子療法が挙げられるが、これらに限らない。特に、骨髄移植が、リソソーム蓄積障害の治療のための治療アプローチである。骨髄移植は、免疫的に適合する健常なドナーから採取した幹細胞によって患者の造血系を再構築して、生涯の酵素供給源を確立する（Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｃ．Ｇ．，"Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"ｉｎ：ＢＬＯＯＤ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．ＶＯＬＵＭＥ  ８：ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＳＩＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  １３−５６（Ｆａｉｒｂａｉｒｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｔｅｓｔａ，Ｎ．Ｇ．ｅｄｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｋｌｅｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（１９９９）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。長年にわたり、数百人のリソソーム蓄積障害患者が移植によって治療されている。例えば、非神経障害性ゴーシェ病の骨髄移植による治療により、症状がほぼ完全に逆転したことが報告されている（Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，"Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：１３９８−１４０２（１９９５）。Ｂｌａｚａｒらの米国特許出願公開第２００７／０００９５００号も参照されたい（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００４２】
本発明による遺伝子療法は、遺伝子の外因性投与によって、内因性遺伝子の発現を変化させる方法を指す。本明細書で使用する場合、遺伝子療法は、治療を必要としている者の体細胞または幹細胞に、欠陥または欠損遺伝子に対応する機能遺伝子を導入することによって、欠陥タンパク質をコードする欠陥遺伝子の補充、または欠損遺伝子の補充を行うことも指す。遺伝子療法は、分化細胞または体性幹細胞を対象者の身体から取り出した後、ウイルスベクターを遺伝子送達ビヒクルとして用いて、欠陥遺伝子の正常なコピーを外植された細胞に導入するエキソビボの方法によって行うことができる。加えて、インビボの直接的な遺伝子導入技術では、治療転帰を得るために、広範なウイルスベクター、リポソーム、タンパク質・ＤＮＡ複合体、または裸のＤＮＡを用いて、対象者の細胞にインサイチューで遺伝子を導入する。Ｆａｎの米国特許第７，４４６，０９８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００４３】
本発明で用い得る遺伝子療法の種類および方法は、当該技術分野において周知である（Ｆａｉｒｂａｉｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ｌ−Ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｈｕｒｌｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２０２５−２０３０（１９９６）、Ｋｏｌｏｄｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，"Ｉｎ：ＮＡＴＨＡＮ  ＡＮＤ  ＯＳＫＩ'Ｓ  ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＩＮＦＡＮＣＹ  ＡＮＤ  ＣＨＩＬＤＨＯＯＤ，５ｔｈ  ｅｄ．，ｖｏｌ．２，ｐａｇｅｓ１４６１−１５０７（Ｎａｔｈａｎ  ａｎｄ  Ｏｒｋｉｎ，Ｅｄｓ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．）（１９９８）、Ｍｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓ  ｆｏｒ  Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  α−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｉｔｅｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７９１７−７９２２（１９９６）、Ｐａｕｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｉｄ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｒａｔ  Ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｄ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ，"Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：４７３−４８０（１９９８）、Ｚａｒｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ａｃｉｄ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｔｏ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｏｔｈ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｓｉｏｎ，"Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１５５５−１５６３（１９９７）（これらの文献のいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。国際公開第１９９８／０４１２４０号（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。本発明による遺伝子療法をインビボおよびエキソビボのいずれかで実施する方法で、頻繁に用いられる方法は、遺伝子送達にウイルスベクターを用いるものである。多くのウイルス種が知られており、遺伝子療法目的で、多くのウイルスについて広く研究されている。非常によく用いられるウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレンチウイルスを含むレトロウイルスに由来するベクターが挙げられる。国際公開第９９／５７２９６号、国際公開第９９／４１３９９号、およびＭｅｅｋｅｒらの米国特許出願公開���２０１１／０１４２８１８号（これらのいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明による遺伝子療法は、グルコセレブロシダーゼなどの補充遺伝子によるものまたはＳＮＣＡ遺伝子に対する抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるものの両方を意図する。Ｆａｎの米国特許第７，４４６，０９８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００４４】
本発明の酵素補充療法および抗ＴＮＦα療法は、単回投与で、または複数回投与プロトコールに従って実施してよい。例えば、１回または２回投与といった比較的少ない投与数の治療用組成物を投与する。通常、数日または数週間にわたり複数回の投与を伴う従来の療法を含む実施形態では、酵素補充療法薬または抗ＴＮＦα療法薬は、少なくとも５日間、１０日間、またはさらには１４日間以上などの期間にわたり、１日に１回、２回、または３回以上服用され得る。しかしながら、異なる投与回数、投与タイミング、ならびに、治療用組成物および抗生物質の相対量を当業者は選択および調節できる。一実施形態では、投与を繰り返す。
【００４５】
本発明の薬剤は、経口的に、吸入により、鼻腔内滴下により、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋内注射により、胸膜内に（ｉｎｔｒａｐｌｕｒａｌｌｙ）、腹腔内に、または粘膜への塗布により投与することができる。最も典型的な投与経路は静脈内注射である。
【００４６】
本発明の医薬剤は、非経口投与用に調合してよい。本発明の薬剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの油中混合物で分散液を調製することもできる。例示的な油は、石油由来、動物由来、植物由来、または合成の油、例えば、落花生油、ダイズ油、または鉱油である。通常、水、食塩水、デキストロースおよび関連する糖の水溶液、ならびに、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。通常の保管および使用条件では、これらの調製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。
【００４７】
注射用に適する医薬製剤としては、滅菌した水溶液または分散液、および滅菌した注射用溶液または分散液の用時調製用滅菌粉末が挙げられる。いずれのケースにおいても、その剤形は無菌でなければならず、注射器に容易に注入できる程度に流動性を有さなければならない。剤形は、製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を抑えながら保存できなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの好適な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。
【００４８】
本発明の医薬剤を全身に送達するのが望ましい場合、本発明の医薬剤は、注射、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与用に調合してよい。注射用製剤は、保存剤が添加された単位用量の剤形、例えばアンプルまたは複数回投与量容器の状態であってよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態であってもよく、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。
【００４９】
本発明の薬剤の腹腔内または髄腔内投与は、カリフォルニア州ノースリッジのＭｅｄｔｒｏｎｉｃによって説明されているような注入ポンプ装置を用いて行うこともできる。このような装置により、頻回注射と多数の操作を回避しつつ、所望の化合物を持続注入できるようになる。
【００５０】
上記の製剤に加えて、本薬剤は、デポー剤として調合してもよい。このような長時間作用性の製剤は、好適なポリマー物質もしくは疎水性物質とともに（例えば許容可能な油中の乳濁液として）もしくはイオン交換樹脂とともに、またはやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として調合してよい。
【００５１】
当業者に知られている任意の方法を用いて、ムコ多糖症の状態および本発明の療法の効果をモニタリングしてよい。病状の臨床的モニタリングとしては、器官の体積（例えば肝臓、脾臓）、ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、血小板減少、悪液質（るいそう）、および血漿キチナーゼレベル（例えばキトトリオシダーゼ）を挙げることができるが、これらに限らない。キチナーゼファミリーの酵素であるキトトリオシダーゼは、リソソーム蓄積症を有する対象において、マクロファージによって高いレベルで産生されることが知られている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．１８，７１７−７２２（１９９５）、ｄｅｎ  Ｔａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍａｒｋｅｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−ｔｅｔｒａ−Ｎ−ａｃｅｔｈｙｌｃｈｉｔｏｔｅｔｒａｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｆｒｏｍ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，"Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．１９，３４４−３５０（１９９６）、Ｄｏｄｅｌｓｏｎ  ｄｅ  Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｌａｓｍａ  Ｃｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ａｒｇｅｎｔｉｎｉａｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｍｅｄｉｃｉｎａ（Ｂｕｅｎｏｓ  Ａｉｒｅｓ）５７，６７７−６８４（１９９７）、Ｃｚａｒｔｏｒｙｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｗｉｔｈ  Ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３，１４７−１４９（２０００）、Ｃｚａｒｔｏｒｙｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｅｒｕｍ  Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＥＲＴ），"Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１，４１７−４２０（１９９８）、Ｍｉｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇａｕｃｈｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０，８１７−８３８（１９９７）、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｈｏ  Ｈａｖｅ  Ｂｅｅｎ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｅｉｔｈｅｒ  ｂｙ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｂｙ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ，"Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２０，５９５−６０２（１９９７）、Ｈｏｌｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍａｒｋｅｄ  Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈａｌｌｍａｒｋ  ｏｆ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１２８８−１２９２（１９９４）（これらの文献のいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００５２】
本発明の一実施形態では、対象は、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する。リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変としては、骨の長さ、骨幹幅の拡大、骨成長板の幅、組織のミネラル密度、気管の周径、運動機能、関節軟骨細胞、歩行分析、ならびにセラミドレベル、ＴＮＦαレベル、ＲＡＮＫＬレベル、およびコラーゲンの発現などの炎症マーカーによるものが挙げられるが、これらに限らない。軽度の骨格病変として、関節の硬直および肝脾腫大症が挙げられる。骨格病変のこれらの例をマーカーとして用いて、上記のリソソーム蓄積障害の進行または後退の状態をモニタリングしてよい。
【００５３】
マーカーを測定し、リソソーム蓄積障害の状態をモニタリングする方法は、当該技術分野において周知であり、免疫組織化学的方法、イムノブロット分析法、血清免疫測定法、およびウエスタンブロット分析法が挙げられるが、これらに限らない。
【００５４】
本発明の第二の態様は、酵素補充療法によって治療しているリソソーム蓄積障害を有する対象において炎症性サイトカインを低減させる方法に関する。この方法は、対象において炎症性サイトカインを低減させるのに有効な条件の下で、対象に、抗ＴＮＦα治療薬を投与することを含む。
【００５５】
本発明の方法によって低減させ得る炎症性サイトカインとしては、ＴＮＦα、ＲＡＮＫＬ、およびＩＬ１−βが挙げられるが、これらに限らない。特に、本発明の方法によって、ＴＮＦαを低減させることができる。ＴＮＦαは、主に活性化マクロファージおよびリンパ球によって産生されるが、内皮細胞およびその他の細胞種でも発現する多面性サイトカインである。ＴＮＦαは、炎症反応、免疫反応、および病態生理学的反応の主要メディエーターである（Ｇｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ８０  ｋＤａ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，"Ｃｅｌｌ  ８３：７９３−８０２（１９９５）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＴＮＦには、２６ｋＤａの膜発現型と、この２６ｋＤａ型のタンパク質切断から生じる１７ｋＤａの可溶性サイトカインという二種類の異なる形態が存在する。可溶性ＴＮＦのポリペプチドは、１５７アミノ酸長であり、主な生物活性分子である。ＴＮＦαは、高親和性の細胞表面受容体との相互作用を通じて、生物学的作用を発揮する。２種類の異なる膜ＴＮＦα受容体がクローニングおよび特徴づけされている。これらは、ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒという５５ｋＤａの種と、ｐ７５  ＴＮＦ−Ｒという７５ｋＤａの種である（Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ｐ５５  Ｔｕｍｏｕｒ−Ｎｅｃｒｏｓｉｓ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｒｅｐｅａｔｓ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：８３１−８４０（１９９４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。これらの２種類のＴＮＦ受容体は、アミノ酸レベルで２８％の類似性を示す。これは、細胞外ドメインに限定され、システインに富む４つの繰り返しモチーフ（それぞれ約４０個のアミノ酸を有する）からなる。各モチーフは、保存位置に４〜６個のシステインを含む。Ｄａｙｈｏｆｆ分析により、各受容体の最初の３つの繰り返し部分において、サブユニット間類似性が最も大きいことが示されている。この特徴的な構造は、ＴＮＦ−Ｒ／神経成長因子受容体スーパーファミリーを含む多くの他の受容体および細胞表面分子と共有されている（Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ｐ５５  Ｔｕｍｏｕｒ−Ｎｅｃｒｏｓｉｓ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｒｅｐｅａｔｓ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：８３１−８４０（１９９４）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００５６】
一実施形態では、上記の方法は、上記の投与を受ける、上記のようなリソソーム障害と関連する骨格病変を有する対象を選択することを含む。
【００５７】
この第二の態様は、上記の態様に従って実施する。本発明のこの態様に関する投与方法および治療上有効な投与量は、上述されている。
【００５８】
本発明の第三の態様は、リソソーム蓄積障害を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、リソソーム蓄積障害を有する対象を選択すること、および選択した対象においてリソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、選択した対象にポリ硫酸ペントサン（ＰＰＳ）を投与することを含む。
【００５９】
本発明によるポリ硫酸ペントサンとしては、分子量が１，５００〜６，０００ダルトンの範囲のβ−Ｄ−キシロピラノース残基から構成される硫酸化半合成多糖、およびその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。この化合物は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｅｌｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（１９８９），ｐｇ．７０９３、Ｐａｒｓｏｎｓの米国特許第５，１８０，７１５号、Ｓｔｒｉｋｅｒらの米国特許第５，６４３，８９２号、およびＣａｒｔｔらの米国特許出願公開第２００１／００３４３２８号（これらのいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００６０】
当然のことながら、ポリ硫酸ペントサンは、例えばペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントサンポリ硫酸カルシウム、またはペントサンポリ硫酸カリウムなどの塩として調合されることが多い。ペントサンは、植物、微生物から天然の形で得ても、合成してもよい。したがって、本願全体を通じて、ポリ硫酸ペントサンについて言及する際には、天然、合成、または半合成の形で得るかにかかわらず、適宜、ポリ硫酸ペントサンおよびそのさまざまな塩を指し得る。
【００６１】
本発明によるポリ硫酸ペントサンは、例えばカルシウムもしくはナトリウム塩を含むアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、または銅および亜鉛などの遷移金属、ならびにプラチナなどの貴金属として入手可能である。したがって、特定の錯化イオンは、アルカリ金属、例えばＮａ＋およびＫ＋、アルカリ土類金属、例えばＣａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、ならびにＡｇ＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ａｕ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｄ４＋、Ｐｄ４＋、Ｐｄ２＋、三価金属イオン、および四級アンモニウム化合物錯体からなる群から選択してよい。四級アンモニウム化合物の例は、ピリジニウムクロライド、テトラアルキルアンモニウムクロライド、コリンクロライド、セチルピリジニウムクロライド、Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアンモニウムクロライド、またはこれらの誘導体である。これらの中でも最も好ましいのは、二価のアルカリ土類金属、好ましくはカルシウムおよびマグネシウムであり、最も好ましいのはカルシウム錯体である。ポリ硫酸多糖・金属錯体の調製は、米国特許第５，６６８，１１６号に詳細に説明されている。Ｃｕｌｌｉｓ−ｈｉｌｌらの米国特許出願公開第２００９／０１１１７７１号も参照されたい。これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６２】
この第三の態様は、上記の態様に従って実施する。本発明のこの態様に関する投与方法および治療上有効な投与量は、上述されている。
【００６３】
本発明の第四の態様は、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、リソソーム蓄積障害と関連する骨格病変を有する対象を選択すること、および対象においてリソソーム蓄積障害を治療するのに有効な条件の下で、選択した対象に、基質抑制療法薬と抗ＴＮＦα治療薬を投与することを含む。
【００６４】
基質抑制療法は、本明細書における定義では、細胞における基質の合成を低減させることによって、リソソーム蓄積症において利用可能な低下した酵素活性との平衡状態をもたらすことを目指す治療アプローチである。
【００６５】
現時点では、基質抑制療法薬のＺａｖｅｓｃａ（登録商標）（ミグルスタット）は、米国および欧州諸国でゴーシェ病用として認可されており、同じ代謝経路におけるその他のリソソーム蓄積症を治療する潜在能力を有する。Ｃｙｓｔａｇｏｎ（登録商標）（システアミン）も、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症向けの基質抑制療法薬として研究されている。ＺａｖｅｓｃａおよびＣｙｓｔａｇｏｎは、血液脳関門を通過すると考えられている小分子である。このタイプの療法は、多少の残存酵素活性を有する患者に適用可能であり、合成プロセスと異化プロセスとの優れたバランスを必要とする（Ｋｅｉｍｅｌらの米国特許出願公開第２００５／０２０８０９０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。一実施形態では、基質抑制療法薬はミグルスタットまたはエリグルスタットである。
【００６６】
一実施形態では、上記の態様に従って追加の療法を実施するが、その追加の療法は、上記のような酵素補充療法であってもよい。
【００６７】
この第四の態様は、上記の態様に従って実施する。本発明のこの態様に関する投与方法および治療上有効な投与量は、上述されている。
【００６８】
本発明について広く説明してきたが、下記の実施例を参照すれば、本発明はさらに容易に理解されるであろう。下記の実施例は、実例として示されており、別段の定めのない限り、本発明を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【００６９】
下記の実施例は、本発明の実施形態を例示する目的で示されているが、本発明の範囲を限定するように意図されたものではない。
【００７０】
実施例１  材料および方法
動物−ＭＰＳ  ＶＩ型ラットについては過去に記述されており、本発明の研究者および他の研究者に広く使われている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ  Ｂ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１０９９−１１０４（１９９３）、Ｋｕｎｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ｉｎ  Ｒａｔｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＮＡｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ  Ｂ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，"Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９：５８２−５８７（１９９５）（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。繁殖コロニーは、ヘテロ接合体の交配対から確立し、確立された方法を用いて、尾部クリップＤＮＡで遺伝子型の決定を行った（Ｋｕｎｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ｉｎ  Ｒａｔｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＮＡｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ  Ｂ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，"Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９：５８２−５８７（１９９５）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ラットの安楽死は、二酸化炭素の吸入によって行った。いずれの動物プロトコールも、Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されたものであり（許可番号０８−０１０８）、ＮＩＨのガイドラインに従って行った。
【００７１】
ＭＰＳ  ＶＩ型ラットの処置−Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標）（遺伝子組み換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ）をＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から得たとともに、ＣＮＴＯ１０８１をＣｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た。２１日齢（発症前）のＭＰＳ  ＶＩ型ラットを２つの群に分け（ｎ＝８匹／群）、ＥＲＴまたはＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用療法を実施した。ＥＲＴのみを受けるラットには、週に１度、１ｍｇ／ｋｇのＮａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標）を静脈（尾静脈）内注射した。併用療法を受けるラットにも、３ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ１０１８１を週に２度（３日ごとに）、静脈内注射した。処置は、合わせて３２週間実施した。ＴＮＦαとＲＡＮＫＬの分析のために、血清を２週ごとに採取した（下記を参照されたい）。各群について、最後の注射から２週間後（３７週齢時）に、処置済みのラットを殺処分した。実験を通じて、年齢をマッチさせた正常ラットおよび未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットを対照として用いた。
【００７２】
対照および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットから気管、大腿骨、および脛骨を採取し、線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）および関節軟骨細胞の単離のためにリン酸緩衝生理食塩水に入れるか、または、組織学的分析、マイクロＣＴ分析、および免疫組織化学分析のために、１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中で固定した（下記を参照されたい）。その後の染色のために、固定した骨を８％ギ酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中で５日間脱灰し、パラフィン包埋し、切片化した（５μｍ）。過去に記述されているようにして、初代ＦＬＳおよび関節軟骨細胞の培養物を確立して（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｊｏｉｎｔ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ  ａｎｄ  ＶＩＩ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ，"Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．５７：７０１−７０７（２００５）、Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂｏｎｅ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ＆Ｏｔｈｅｒ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１７２：１１２−１２２（２００８）（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、ウエスタンブロットによって炎症マーカーおよびアポトーシスマーカーの発現を評価した。
【００７３】
マイクロＣＴ画像の取得−ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＳＰ  ＰｒｅＣｌｉｎｉｃａｌ  ＳｐｅｃｉｍｅｎというマイクロＣＴシステム（カナダ、オンタリオ州ロンドンのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、年齢をマッチさせた正常ラット、未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの３７週齢時の大腿骨の三次元画像を得た。１４．４μｍのボクセルサイズでスキャンを行った。スキャンプロトコールは、５時間にわたるスキャンで３６００枚の画像を取得することから構成されていた（取得パラメーター：８０ｋＶｐ、８０ｕＡ、３秒の露出時間［約６９ｋＪ］、０．０１０インチのアルミニウムビームフィルター）。空気、水、およびヒドロキシアパタイト（ＳＢ３、米国ウィスコンシン州ミドルトンのＧａｍｅｘ  ＲＭＩ）を含むキャリブレーションファントムをすべてのスキャンにおいて含めて、個々のスキャンセッションに固有のＸ線減弱の変動に対して調節した。
【００７４】
骨の長さおよび気管の測定−実験の最後（３７週齢時）に、肢および気管の測定を行った。Ｍｉｃｒｏｖｉｅｗというソフトウェアを用いて、マイクロＣＴ画像から各大腿骨の長さを測定した。大転子を大腿骨の近位端として用い、遠位顆の部分を遠位端とした。したがって、各大腿骨の長さは、おおむね骨の垂直軸に沿って算出した。確認のために、実体の大腿骨と脛骨の長さ、および気管の幅をデジタルカリパスで測定した。標準的なスチューデントｔ検定分析を用いて、２つの処置群（ＥＲＴ処置群およびＥＲＴ／ＣＮＴＯ１０８１併用処置群）の平均値を比較した。
【００７５】
皮質骨の分析−分析のために、各大腿骨のマイクロＣＴ画像の代表的な骨幹部中央領域を切り出した。関心体積（ＶＯＩ）は、近位端を、第三転子が最初に現れる部分により、遠位端を、骨幹端（海綿骨の形成および骨幹幅の拡大によって示される）が現れる部分により、限定した。骨の長さの違いに適応するため、分析領域は、測定サイズによって制限しなかった。皮質骨は、残りの海綿骨から手動でセグメント化し、それぞれ閾値処理して、骨と骨でないボクセルを区別した。ＭｉｃｒｏＶｉｅｗというソフトウェアを用いて、形態学的特徴を定量化した。
【００７６】
マイクロＣＴ画像をさらに処理して、各試料内の皮質骨の組織ミネラル密度（ＴＭＤ）を定量化した。骨でないボクセルも含む骨ミネラル密度（ＢＭＤ）に対して、ＴＭＤは、骨ボクセルのみの平均ミネラル値を表し、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）密度と同等の値で表される。ＴＭＤは、空気、水、およびＨＡ（米国ウィスコンシン州ミドルトンのＧａｍｅｘ  ＲＭＩ）を含むキャリブレーションファントムを用いて、骨ボクセルのグレースケール値をハウンズフィールド単位（ＨＵ）からミネラル値（ｍｇ／ＨＡ１ｃｃ）に変換することによって計算した。ＴＭＤは、骨ボクセルの平均ＨＵ値をＨＡファントムの平均ＨＵ値によって除し、その値に１１３０ｍｇ／ｃｃ（ＨＡの密度）を乗じた値として定義する。
【００７７】
海綿骨の分析−骨梁のＶＯＩは、画像処理ソフトウェアＭｉｃｒｏＶｉｅｗを用いて、大腿骨の遠位骨幹端の４ｍｍの領域から切り出した。遠位端は、骨端軟骨が最初に現れる部分として定義した。明白な近位の目印の代わりに、骨梁のＶＯＩを包含するように、標準的な距離（４ｍｍ）を選択した。海綿骨を皮質骨から連続的なアキシャル断面でセグメント化し、骨梁のＶＯＩの三次元描写を生成した。各骨梁ＶＯＩを閾値処理し、骨でないボクセルから骨を区別した。皮質骨と同様の方法で、皮質骨と同じキャリブレーションファントムを各スキャンにおいて含めて、海綿骨のＴＭＤをマイクロＣＴスキャンから算出した。Ｍｉｃｒｏｖｉｅｗソフトウェアを用いて、海綿骨の体積率、海綿骨の表面積体積比、および骨梁の数、厚み、および間隔を含む微細構造の特徴を測定した。いずれの値も、ＶＯＩ全体で平均化した。
【００７８】
運動機能−過去に記述されているような評価を行うために、年齢をマッチさせた３７週齢の正常ラット、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット、および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットを、加速ロータロッドｓｅｒｉｅｓ  ８（ＩＩＴＣ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に置いた（Ｃｏｔｕｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２１：５５５−６９（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。実際に記録する前に、ラットを２日連続でロッド上にてプライミングした。ロータロッドは、３分間で１０ｒｐｍから３０ｒｐｍまで速度が上昇するように設定し、ロッドから落下するまでの時間の平均を記録した。変数群による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、結果を分析した。
【００７９】
運動性分析−非毒性色素を用いて、処置済みのラットと対照ラットの前足および後足を２種類の異なる色で染色した。トンネルを歩いて通って、ブロッティングペーパーに足跡を残すように、ラットを２日連続で訓練した。３日目にいくつかのパラメーターを測定した：長手方向における左および右の前足間の距離、形成された角度、ならびに右前足と右後足との距離。統計的分析のために、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）を用いて、群間差を評価してから、その後に、試験を行ったすべての時点について、事後ボンフェローニ法による調整を行った。
【００８０】
関節軟骨、滑膜、および成長板の組織学的および免疫組織化学的分析−３７週齢の正常ラット、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット、および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットから採取した大腿骨を、固定、包埋、切片化し、トルイジンブルーおよびＨ＆Ｅで染色した。免疫組織化学的調査も行った。免疫組織化学的分析では、切片を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過処理し、ブロッキングし、一晩４℃にて、一次ウサギポリクローナル抗マウスコラーゲンＩＩＡ１型抗体（ウサギポリクローナル抗体ｓｃ−２８８８７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＴＮＦα抗体（ヤギポリクローナル抗体ｓｃ−１３４８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とインキュベートした。ＰＢＳで数回すすいだ後、蛍光二次抗体のロバ抗ヤギＩｇＧ−Ｃｙ−３（７１１−１６５−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて可視化した。核を１ｍｇ／ｍｌのビスベンズイミド色素Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間染色し、すすぎ、切片を退色防止性マウント液とともにマウントした。共焦点レーザ走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ５１０  Ｍｅｔａ）で、スライドを可視化および撮影した。
【００８１】
気管の免疫組織化学的分析−３７週齢の正常ラット、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット、および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットから採取した気管を上記のように固定し、包埋し、切片化し、調製した。切片を一晩、一次マウスモノクローナル抗セラミド抗体（ＭＩＤ１５Ｂ４、Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とインキュベートし、蛍光二次抗体のロバ抗ヤギＩｇＧ−Ｃｙ−３（７１１−１６５−１５２，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて可視化した。共焦点レーザ走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ５１０  Ｍｅｔａ）で、スライドを可視化および撮影した。
【００８２】
イムノブロット分析−過去に記述されているようなイムノブロット分析のために、軟骨の連続した酵素消化を用いて、３７週齢の正常ラット、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット、および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの関節軟骨細胞を採取し、ペレット状にし、溶解させた（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂｏｎｅ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ＆Ｏｔｈｅｒ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１７２：１１２−１２２（２００８）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。メンブレンを、ウサギポリクローナル抗コラーゲンＩＩＡ１型（ｓｃ−８７８４−Ｒ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗コラーゲンＸ型（ＡＢ５８６３２、Ａｂｃａｍ）、ウサギポリクローナル抗ＡＤＡＭＴＳ５（ｓｃ−２８８８７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＰＡＲＰ（ｓｃ−７１５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびローディングコントロールとしてのウサギポリクローナル抗ＧＡＰＤＨ（ｓｃ−２５７７８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とインキュベートした。ＨＲＰに結合させた二次抗体（ＮＡ９３４Ｖ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、結合した抗体を認識した。高感度化学発光検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、抗体複合体の検出を行った。
【００８３】
血清免疫測定−ラット超高感度Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｅｌｉｓａキット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、免疫測定によって、年齢をマッチさせた正常ラット、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット、および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける血清ＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬを評価した。いずれのアッセイも３つ組で実施した。
【００８４】
データの表示および統計的分析−いずれの実験も、それぞれ少なくとも３回反復した。２つの群間のデータに対して、スチューデントｔ検定分析、変数群による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）を行ってから、その後に、事後ボンフェローニ法による調整を行った。結果は、Ｐ＜０．０５で有意とみなした。Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ３．１（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計を行った。グラフは、３つ組実験のデータを合わせた平均±平均標準誤差（ＳＥＭ）を表している。
【００８５】
実施例２  ムコ多糖症における抗ＴＮＦα療法の酵素補充療法に対する作用
２１日齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットをＥＲＴ（１ｍｇ／ｋｇ、週に１度）、またはＥＲＴと抗ＴＮＦα療法（３ｍｇ／ｋｇ、週に２回）との併用プロトコールのいずれかによって処置した。いずれも、静脈（尾静脈）内に投与した。ラットは、合わせて８カ月間処置した（すなわち３２回のＥＲＴ投与および６４回の抗ＴＮＦα投与）。対照として、正常な同腹ラットと未処置のＭＰＳ  ＶＩ型同腹ラットを用いた（ｎ＝８匹／群）。抗ＴＮＦα療法は、ＴＮＦαに対するラット特異的モノクローナル抗体ＣＮＴＯ１０８１（Ｃｅｎｔｏｃｏｒから提供）を用いて行った。Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標）（ＢｉｏＭａｒｉｎから提供）は、ヒト型の遺伝子組み換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＭＰＳ  ＶＩ型における欠損酵素）であり、ＥＲＴで用いた。最後の処置から２週間後（すなわち３７週齢時）に、ラットを殺処分した。
【００８６】
図１Ａは、実験終了時のＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬの血清レベルを要約したものである。いずれの炎症マーカーも、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの方が正常ラットよりも非常に高く、いずれの処置プロトコールによっても、有意に低下した。この効果は、併用処置群の方がやや高かったが、統計的な差は見られなかった。図１Ｂは、ＴＮＦαに対する関節軟骨の免疫組織化学的染色の結果を示している。未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、軟骨のＴＮＦαが増大し、これは、ＥＲＴによってやや低減し、併用処置によってさらに低減した。図１Ｃは、対照および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットからの膝の断面画像を示している。未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、滑膜（＊）が過形成されており、それにより、滑膜絨毛（ＳＶ）が形成されていた。ＥＲＴでは滑膜炎症が低減しなかったのに対して、併用処置では、炎症および絨毛の形成が著しく低減した。いずれの処置群の関節軟骨（ＡＣ）および肋軟骨下骨（ＳＢ）においても、貯蔵が依然として明らかに認められたことに留意されたい。ＥＲＴ画像中の太い矢尻は、炎症を示す、ＳＢへの滑膜の浸潤を示している。
【００８７】
実施例３  酵素補充療法および抗ＴＮＦα療法の運動活性、歩行、骨疾患、および関節疾患に対する作用
上記の処置の運動活性および歩行に対する作用も評価した。加速ロータロッド装置において（図２Ａ）、最低速度（１０ＲＰＭ）では、ＥＲＴ処置ラットも併用処置ラットも、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット（平均７０秒）とは対照的に、回転するバーの上に最大期間（１８０秒間）留まった。より速い速度（２０および３０ＲＰＭ）では、併用処置群の方がＥＲＴ群よりも有意に改善したことが観察された。図２Ｂは、これらのラットの歩行パターンの代表的な図を示している。全体的に、ＥＲＴ処置ラットの方が未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットよりも長く、揃った足取りで速く歩行しており、これは、併用療法によって改善された。例えば、後足の動作の角度は、６０°（未処置のＭＰＳ  ＶＩ型）から４５°（ＥＲＴ）、３０°（併用）に縮小し、前足の距離は２．８ｃｍ（未処置）から４．２ｃｍ（ＥＲＴ）、５．１ｃｍ（併用）に改善した。
【００８８】
マイクロＣＴ分析を用いて、処置済みおよび未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラット、ならびに正常ラットにおける大腿骨および脛骨の長さを評価した。図３Ａに示されているように、３７週齢時において、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの大腿骨は平均で、正常な同腹ラットの約７７％にすぎなかった。ＥＲＴ群では改善は見られなかったが、併用処置を行ったラットでは、大腿骨は約６％長くなった（正常ラットの約８３％）。同様に、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの脛骨は正常ラットの約７４％であり、併用療法によって正常ラットの約８８％まで、約１４％改善された。ＥＲＴ群では改善は見られなかった。併用処置による骨の長さの改善は一貫して観察されたが、雄ラットにおいて、より顕著であったとともに、すべての処置済みマウス（雄および雌）を併せてグループ化したところ、統計的有意性には達しなかった。
【００８９】
骨の長さに対するこれらのプラスの作用にもかかわらず、いずれの処置群においても、骨微細構造の変化はさほど明白ではなかった。図３Ｂおよび３Ｃは、遠位大腿骨のマイクロＣＴ画像を示している。未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、骨幹端部の骨の骨梁密度は低下し、骨端軟骨成長板は、形成が異常で崩壊しており、骨端の骨梁は、正常な大腿骨よりも組織崩壊していた（図３Ｂ）。併用処置によるわずかな改善が検出された。
【００９０】
定量分析を行って、未処置および処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの海綿骨の形態変化をさらに調べた。骨端軟骨のすぐ近くに位置する遠位骨幹端の代表的な関心体積（ＶＯＩ）を収集し、群間で比較した。骨梁構造の三次元画像を生成して、海綿骨のみが含まれるようにした。各ＶＯＩから、ＴＭＤ（骨梁ミネラル密度）およびＢＶ（骨体積）／ＴＶ（骨梁体積）を抽出した。いずれの処置プロトコールも、統計的に関連した影響を海綿骨ＴＭＤまたはＢＶ／ＴＶに及ぼさなかった。
【００９１】
大腿骨の骨幹部中央領域のマイクロＣＴ画像も収集した。第三転子の遠位出現時のアキシャル断面を抽出し、比較のために、代表的な試料を並べた（図３Ｃ）。肉眼による検査により、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの方が、皮質下骨梁の骨髄空間への浸潤が大きいことが示された。骨梁密度の明らかな上昇は、定量測定値によっては確認されなかったが、この肉眼による所見は、試料の全体にわたって一貫していた。いずれの処置でも、骨梁の成長の顕著な逆転は見られなかった。
【００９２】
骨幹部中央のＶＯＩについて、皮質骨形態の定量測定値を計算した。皮質の平均断面積、総面積、および皮質骨のＴＭＤの値を収集し、サイズおよび鉱化を示した。皮質面積は、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットの方が正常ラットよりも２２％低く（ｐ＝０．００２）、総面積またはＴＭＤへの影響は見られなかった。結果的に、皮質の相対面積は１５％低いこととなり（ｐ＝０．０１５）、これは、大腿骨骨幹部の総厚または鉱化への影響なしに、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける皮質骨の厚みが実質的に喪失されたことを示している。ちなみに、ＥＲＴ処置または併用処置済みのラットの大腿骨は、皮質面積および皮質相対面積がより大きく、総面積またはＴＭＤの有意な変化も見られなかった。抗ＴＮＦα療法を加えても、ＥＲＴ療法のプラスの効果は増大しなかった。全体的には、これらの所見では、統計的有意性に達しなかった。
【００９３】
大腿骨構造の最後の測定値として、頑健性を計算した。頑健性は、長さに対する断面の大きさとして定義されており、水平方向の成長と垂直方向の成長との間の関係を得るものである。ＭＰＳ  ＶＩ型の大腿骨は、正常ラットよりも頑健であることが明らかとなり、これは、「体長が短く太っている」外観と合致していた。処置による有意な改善は示されなかったが、併用療法では頑健性が５％低下し（ｐ＝０．２５）、わずかな（有意ではないが）改善が見られた。
【００９４】
未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおいて虚脱および肥厚した気管が明らかに認められ（図４Ａ）、これは、ＭＰＳ患者で観察される気管異常と合致していた（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６７：２０９−１９（１９８８）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。肉眼による検査により、併用処置後、気管の顕著な改善が観察されたが、ＥＲＴでは観察されなかった。未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットから採取した気管では、正常ラットよりも断面積が統計上小さかった（７．５±０．８ｍｍ２に対して２．９±０．６ｍｍ２、ｐ＝０．０００２）。ＥＲＴ処置ラットから採取した気管は、わずかではあるが有意に改善したが（３．６±０．５ｍｍ２、ｐ＝０．０２、未処置ラットと比較）、併用処置群では、断面積が２倍近くの６．０±０．８ｍｍ２であった（ｐ＝０．００３、未処置群と比較）。
【００９５】
実施例４  ムコ多糖症関節軟骨細胞のセラミド染色
セラミドは、炎症、アポトーシス、および感染の誘発に関与するシグナル伝達スフィンゴリピドであり、ＭＰＳ関節軟骨細胞に蓄積することが示されている（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。セラミドは、呼吸合併症を伴ういくつかの疾患から得られる気管にも蓄積し、軟骨のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすので（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒａｃｈｅａ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７：３６８−７４（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットの気管のセラミドについて調べるに至った。図４Ｂに示されているように、未処置およびＥＲＴ処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの気管の上皮細胞において、強いセラミド染色が観察され、併用処置を行ったラットの気管では、正常な状態まで低下した。
【００９６】
実施例５  骨の成長板の組織学的分析
上記の療法の効果をさらに調べるために、骨の成長板の組織学的分析を行った。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットの成長板は、空胞のある大きい細胞により、野生型同腹ラットの成長板よりも厚い。加えて、ＭＰＳラットでは、成長板の正常な柱構成が崩壊しており、これが異常な骨の形成の一因となっている（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）、Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ  Ｂｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩＩ，"Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９７：２０２−２１１（２００９）（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。いずれの処置プロトコールでも、ＭＰＳ  ＶＩ型の成長板の組織学的分析結果に対する顕著な作用は見られなかった。
【００９７】
実施例６  関節軟骨細胞におけるコラーゲンの発現
最後に、処置済みおよび未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットから関節軟骨細胞を採取して、コラーゲンの発現とアポトーシスマーカーの変化を評価した。コラーゲンＩＩＡ１型およびＸ型のレベルは、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは正常よりも低く、それぞれ、処置済みのラットでは未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットよりも高かった（図５Ａ）。このウエスタンブロットで明らかに認められたように、併用処置によって、コラーゲンＩＩＡ１型の発現が増大し、この所見は、軟骨切片の免疫組織学的染色によって確認された（図５Ｂ）。これは、抗ＴＮＦα療法により、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットの関節軟骨細胞におけるＴＵＮＥＬ染色が低減されたことを示した過去の研究と合致している（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＥＲＴ処置および併用処置のいずれによっても、マトリックス分解酵素のアグリカナーゼであるＡＤＡＭＴＳ５の発現が低下したが、一方で、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットから採取した軟骨細胞で増大しているアポトーシスマーカーＰＡＲＰ（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｄｅｒｍａｔａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｕｎｄｅｒｇｏ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｔｅ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔｉ．８１：１３１９−１３２８（２００１）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））は、併用処置プロトコールによってのみ低下した。
【００９８】
実施例７  ムコ多糖症における酵素補充療法の効果
ＥＲＴは、関節の可動性、運動性、および呼吸の改善を含め、明らかな臨床上の利点をＭＰＳ患者にもたらすが（Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ：  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｐｕｂｅｒｔａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ４−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ，"Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｍｅｄ．３：８９−１００（２０１０）、Ｍｉｅｂａｃｈ，Ｅ，"Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  Ｉ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ｗｉｔｈ  Ｉｎｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ：Ｔｈｅ  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｅｎｄ  Ｐｏｉｎｔｓ，"Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｐｐｌ．９４：５８−６０（２００５）（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、ＥＲＴの軟骨および骨に対する効果は非常に限られている。これは、注入した遺伝子組み換え酵素の体内分布（注入した遺伝子組み換え酵素は、その血管への供給不足により、上記の組織に到達しにくい）、および、薬物の送達を遅らせるマトリックス内に標的細胞（例えば軟骨細胞）が埋め込まれている事実に起因し得る。したがって、ＥＲＴ後のＭＰＳ患者における関節の可動性の改善は、軟骨および骨に対する直接的な作用よりも、軟組織（例えば腱）の変化に関係していると考えられる。加えて、遺伝子組み換え酵素を極めて低年齢のＭＰＳ動物の関節空間に直接注射したときでも、骨および軟骨への作用は非常に限られていた（Ａｕｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｉｎｔｒａ−Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ４−Ｓｕｌｆａｔａｓｅ  ｉｎ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＶＩ，"Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｍｅｔａｂ．９１：３５２（２００７）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。したがって、上記の組織におけるＥＲＴの転帰を改善するという重要なニーズが依然として存在する。
【００９９】
実施例８  ムコ多糖症における抗ＴＮＦα療法の効果
本願出願人による過去の研究によって、ＭＰＳ動物モデルでの軟骨および骨の病因におけるＴＬＲ４炎症経路の重要性が示された（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。直接的なＴＬＲ４阻害剤は臨床用としては認可されていないので、ＭＰＳ  ＶＩ型のラットモデルにおけるＴＬＲ４経路の下流産物によって抗ＴＮＦα療法の効果を評価した。ヒトにおいては、関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病を含むいくつかの一般的な炎症性疾患の治療に、抗ＴＮＦα抗体（例えばＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ））が用いられている（Ｋｌａａｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６３：３５９−６４（２０１１）、Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ａｎｄ  Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，"Ｈｅａｌｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｓｓｅｓｓ．１５：１−３２９（２０１１）、Ｒｕｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｒｏｈｎ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ（２０１１）（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。この抗ＴＮＦα療法によるＭＰＳ  ＶＩ型ラットの処置により、炎症および関節軟骨のアポトーシスは低減したが、骨の成長または可動性では有意な改善が見られなかったことが見出された（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０１００】
実施例９  ムコ多糖症における酵素補充療法と抗ＴＮＦα療法の併用効果
この実験では、ＥＲＴと抗ＴＮＦα療法との併用効果を評価して、ＥＲＴ単独の場合よりも何らかの臨床的／病理学的利点があるかを判断した。ＴＮＦαに対してはラット特異的モノクローナル抗体を用い（ＣＮＴＯ１０８１）、ＥＲＴではヒト遺伝子組み換えＮ−アセチル−ガラクトサミン−４−スルファターゼ  （Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標））を用いた。このヒト酵素に対する免疫応答は、静脈内注射後、ＭＰＳ  ＶＩ型ラットおよびネコで生じることが知られているが、これらの反応は通常、重篤ではない。免疫抑制を用いて、この応答を最小限にできるが（Ｃｏｎｎｏｒ，Ｖ，"Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．３１：３２７−３７（２０１１）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、この実験では、すでに抗ＴＮＦα療法を実施済みであるので、本発明の実験設計には、既知の免疫抑制剤、追加の複合処置は加えなかった。いくつかのＥＲＴ療法では、注入した酵素に対する免疫応答により、その効果が著しく限定される場合があり、抗ＴＮＦα療法とＥＲＴを併用する潜在的利点の１つは、この応答を最小限にして、追加の免疫抑制の必要性をなくす点であり得る。しかしながら、この潜在的利点は、感染の増大という潜在的リスクとのバランスを慎重に得なければならないので、比較臨床試験において慎重に評価しなければならない。
【０１０１】
興味深いことに、本実験の初回観察結果の１つは、ＥＲＴ単独で、ＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬを含むいくつかの炎症マーカーの血清レベルが実質的に低下した点である。これらのサイトカインの血清レベルは、いずれかの特定の器官または組織ではなく、その動物の全身的な炎症状態を反映しており、ＥＲＴ後のこれらの分子の循環血中レベルの低下は、遺伝子組み換え酵素について容易に評価可能であることが知られている器官（例えば肝臓）における療法の効果によるものである可能性が高いという仮説が立てられた。ＭＰＳにおける炎症性疾患は主にＧＡＧの貯蔵によるものであることが過去に示されており、ＥＲＴ後に、上記の器官中のＧＡＧが低減することにより、ＴＮＦαの全身放出が低減された可能性がある（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＥＲＴ後の動物において、ＴＮＦα（およびその他の炎症分子）の循環血中レベルが実質的に低下したことにより、本療法は、その酵素が到達できない他の器官（例えば軟骨）に対して、二次的なプラスの抗炎症効果を有する場合があり、付加的な利点がもたらされることを示されている。リソソーム蓄積障害患者に対する酵素補充療法治療を通じて、炎症、毒性などの血清マーカーを定期的に測定する。Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素補充療法を受けたＭＰＳ患者では、ＴＮＦαのレベルが正常またはほぼ正常であると期待できる。サイトカインの血清の結果に基づいていたら、酵素補充療法単独で有効であると考えたであろう。したがって、本発明の結果が出る以前は、リソソーム蓄積障害患者を酵素補充療法で治療する当業者は、ＴＮＦαを治療レジメに加えることは考えなかったであろう。
【０１０２】
運動活性、つまり加速ロータロッド装置上におけるパフォーマンス、および歩行分析の２つの測定値によって、処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの臨床的改善を評価した。ＥＲＴはこれらのエンドポイントを改善したが、ＥＲＴを抗ＴＮＦα治療と併用する明らかな付加的な利点が見られた。ＥＲＴの上記の表現型に対するプラスの効果は、軟骨または骨への酵素の直接的送達によるものではなく、関節における軟組織の変化による可能性が高いという仮説が立てられた。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、著しい肝臓および脾臓の肥大は見られないので、ＥＲＴ後の運動活性および歩行の改善は、器官の縮小によるものでもあり得ないが、これは明らかに、ＥＲＴによって治療されるＭＰＳ患者におけるプラスの利点である。
【０１０３】
重要なことに、上記の臨床的エンドポイントに関する、ＥＲＴ／ＣＴＮＯ１０１８併用処置の付加的な利点は顕著であり、両方の処置群における血清ＴＮＦαおよびＲＡＮＫＬの低減が同程度であったにも関わらず、これらの利点が生じた。実際、併用処置を受けたラットの軟骨において、ＥＲＴ群では観察されなかった変化がいくつか観察された。例えば、併用療法を受けたＭＰＳ  ＶＩ型ラットの気管は、未処置またはＥＲＴ処置ラットよりも有意に薄く、かつ幅が広く、関節コラーゲンにおいてコラーゲンＩＩＡ１型の発現が増大した。セラミドも気管において低減して炎症の低減を示し、関節軟骨細胞においてＰＡＲＰの発現（アポトーシスを示す）が低減した。
【０１０４】
加えて、併用療法によって滑膜の炎症が著しく低減し、その結果、絨毛が減少し、滑膜組織の下層骨への浸潤が低減した。これらの変化が、ＣＴＮＯ１０１８の上記組織への直接的な作用によるものなのか、全身におけるＴＮＦαの低減に起因する間接的な作用によるものなのかは依然として分からない。気管形態に対する効果は特に顕著で、これにより、ＭＰＳ患者における気管の病変と関連する呼吸合併症では、ＥＲＴ／抗ＴＮＦα併用療法のプラス効果が有効であり得ることが示された（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６７：２０９−１９（１９８８）、Ｓｈｉｎｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｉｒｗａｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１３０：２３３−２３７  （２００４）（いずれの文献も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＣＴＮＯ１０１８は、ＴＮＦαに対する抗体である。したがって、ＣＴＮＯ１０１８の分子量と体内分布は、気管などの、主に無血管性の軟骨組織に達するとは思われなかったであろう。
【０１０５】
処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットの関節および気管におけるこれらのプラスの変化にもかかわらず、骨において明白な効果はあまり見られなかった。併用処置によって、大腿骨および脛骨の長さがわずかに改善したが、成長板の組織学的分析結果は改善しなかった。これらの骨の長さの変化は、ＭＰＳ  ＶＩＩ型／ＴＬＲ４ダブルノックアウト動物で過去に観察された変化（骨の有意な伸長とともに、成長板組織の明らかな改善がはっきりと見られた）よりも非常に小さかった（Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ−Ａｌｐｈａ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：２２２−７  （２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、これら２つの実験間では、げっ歯類モデルおよび疾患の違い、ならびに、ＭＰＳ  ＶＩＩ型のマウス実験では、発育全体を通じて、ＴＬＲ４経路を完全にノックアウトしたが、本発明の実験では、ラットに、約３週齢から全身に抗ＴＮＦα療法による処置を行ったことを含めて、いくつかの重要な違いを認識しなければならない。
【０１０６】
全体としては、これらの結果により、抗ＴＮＦα療法とＥＲＴの併用により、ＭＰＳ動物の軟骨および骨において、付加的な予想外な利点が得られ、その結果、臨床転帰が改善したことが示されている。いくつかの抗ＴＮＦα薬（例えばＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）など）が、他の炎症状態において臨床用として利用可能であるということから、この療法のＭＰＳ患者への実施が促進され得る。しかしながら、ＭＰＳ患者に上記の療法を慢性的に使用すると、有害な影響が生じる場合もあり、併用治療プロトコールの安全性と効能を判断するには、慎重な比較臨床試験が必要となる。第二の重要な所見は、ＥＲＴ単独によって、ＴＮＦαに関連する炎症が低減し、ＭＰＳ疾患におけるＧＡＧの貯蔵が直接この経路を活性化させているという追加の証拠が得られた点である。実際に、ＥＲＴの一般的な抗炎症効果により、酵素が到達できない器官に、二次的なプラスの利点がもたらされる可能性が高い。最後に、この実験で報告されたデータにより、ＴＮＦα、ＲＡＮＫＬ、およびその他の炎症マーカーをバイオマーカーとして用いて、ＭＰＳ疾患における療法の効果をモニタリングできることがさらに確認されている。現時点では、上記の障害で広く用いられている唯一のバイオマーカーは、尿におけるＧＡＧの放出量であり、上記の簡潔な血清アッセイは、注目に値する付加的な利点を有し得る。
【０１０７】
実施例１０  ポリ硫酸ペントサンにおける抗ＴＮＦα療法の酵素補充療法に対する作用に関する予備的実験
「原理を証明する」データを得るために、６カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラット６匹をＰＰＳで３カ月間処置した。６カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットは、骨疾患、軟骨疾患、および炎症性疾患を起こしており、したがって、この初期実験における具体的な目的は、ＰＰＳが、進行疾患を有するＭＰＳ動物において臨床的または病理学的所見のいずれかを遅延または逆転できたかを評価することであった。図６Ａ〜６Ｄで見てとれるように、処置済みの９カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの顔貌は、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型対照ラットと大きく異なっていた。図７Ａ〜７Ｆによって示されているように、正常ラット（図７Ａ、７Ｄ）、ＰＰＳ処置を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図７Ｃ、７Ｆ）、およびＰＰＳ処置を行っていないＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図７Ｂ、７Ｅ）の頭蓋のＸ線写真およびマイクロＣＴ画像を撮影した。処置済みのラット（図７Ｃ、７Ｆ）の方が、頭蓋が長く、眼（ＭＰＳ  ＶＩ型では通常、眼窩の異常により隆起している）は、正常のように凹所に置かれており、眼のポルフィリン分泌は著しく少なかった。示されている画像は、上記の動物における一般的な観察結果の代表的なものである。頭蓋Ｘ線写真により、これらの観察結果が確認され、処置群（すなわちＰＰＳ処置群）において、処置開始時の年齢が高かったにもかかわらず、有意に頭蓋および鼻がより長かったことが明らかになった（図７Ａ〜７Ｆ）。
【０１０８】
図８Ａ〜８Ｆに示されているように、マイクロＣＴ画像によって、これらの観察結果がさらに裏付けられた。ＰＰＳ処置を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図８Ｅ、８Ｆ）、およびＰＰＳ処置を行っていないラット（図８Ｃ、８Ｄ）では、歯列の変化が見られた。ＰＰＳ処置を行っていないＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図８Ｃ、８Ｄ）は、ＰＰＳ処置を行ったＭＰＳ  ＶＩ型ラット（図８Ｅ、８Ｆ）よりも、切歯が過剰成長し（囲み部分）、これにより、正常ラットに比べて、異常な歯並びとなっている（図８Ａ−８Ｆ）。正常ラットのマイクロＣＴ画像は図８Ａ、８Ｂに示されている。未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは、切歯が過剰成長しており（囲み部分）（図８Ｃ、８Ｄ）、これにより、正常ラットに比べて、異常な歯並びとなっている。下顎骨および歯並びの悪さは、ＰＰＳ処置によって矯正された（図８Ｅ、８Ｆ）。
【０１０９】
殺処分の直前に、加速ロータロッド装置上でラットを実験した。図９で見てとれるように、ＰＰＳで３カ月間処置したＭＰＳ  ＶＩ型ラットは、未処置の対照ラットよりも有意に長くロータロッド上に留まった。これは、処置群における関節可動性の増大ならびに／または炎症および疼痛の低減のいずれかを反映しているという仮説が立てられた。加えて、免疫組織化学分析により、肝臓および脾臓におけるＴＮＦレベルが低下したとともに、血中でも同様に、このサイトカインのレベルが低下したことが示された（図１０Ａ−１０Ｂ）。ＥＬＩＳＡアッセイによって、処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける血清炎症マーカーが、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける炎症マーカーレベルよりも有意に低かったことが示された（図１１Ａ〜１１Ｃ）。炎症マーカーであるＭＩＰ−１αの血清レベルは図１１Ａに示されており、マーカーのランテスのレベルは図１１Ｂに示されており、ＴＮＦαのレベルは図１１Ｃに示されている。
【０１１０】
１カ月齢のＭＰＳ  ＶＩ型ラットへのＰＰＳ処置も開始し、月齢のより高いラットで観察されたのと同様に、顔貌、頭蓋の長さ、眼、鼻分泌物、およびロータロッドパフォーマンスによって評価される運動性への有意な効果が見られた（図１２Ａ〜１２Ｃ）。ＰＰＳで処置しなかったＭＰＳ  ＶＩ型ラットの気管では、正常な気管よりも虚脱した気管が見られ、これは、ＰＰＳ処置群の全てで改善した（図１３）。
【０１１１】
最後に、処置済み（６カ月齢）および未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの脊椎疾患を評価した。これらの実験では、ＰＰＳ処置中に追跡できるいくつかの重要かつ臨床的に関連するエンドポイントが示された。組織学的には、ＭＰＳ  ＶＩ型の椎間板では、対照の椎間板と比較して、豊富な、肥大かつ空胞化した核および環状細胞、ならびに、肥厚した輪状層、髄核の局所的欠陥、および、椎間板の高さの増大が見られた（図１４Ａ）。生体力学的には、引っ張り・圧縮の繰り返し（クリープ）試験によって、正常な脊髄分節よりも、ＭＰＳ  ＶＩ型の運動分節の方が、ニュートラルゾーンが有意に減少し（４４７．９％、図１４Ｂ）、引張剛性も有意に減少した（１１０．０％）ことが示された。クリープ試験では、ＭＰＳ  ＶＩ型試料の方が、時定数が有意に短かったことも示された（８２．８％、図１４Ｂ）。ＰＰＳで処置しなかったＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおける関節軟骨細胞では、正常ラットよりもＴＮＦα、ｐ３８、およびＣｏｘ−２が上昇したが、これらのレベルは、処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型ラットでは正常まで低下した（図１５）。ＡＤＡＭＴＳ−５は、プロテオグリカンを分解するアグリカナーゼであって、未処置のＭＰＳ  ＶＩ型ラットの軟骨細胞で増大もするアグリカナーゼであるが、ＭＰＳ  ＶＩ型処置群において低下した（図１５）。ロータロッド分析によって、ＰＰＳで３カ月間処置した１カ月齢のニーマンピック病マウス（酸性スフィンゴミエリナーゼノックアウト）の方が、未処置のニーマンピック病マウスよりも有意に高いパフォーマンスを見せたことが示された（図１６）。
【０１１２】
全体的には、ＭＰＳ  ＶＩ型動物では、ＭＰＳ集団で観察される脊椎病変の発生と進行に関連し得る、脊椎運動分節の生体力学的機能と椎間板構造が実質的に変化した。髄核および線維輪の完全性は、脊椎分節の正常な生体力学的機能を維持するのに重要である。ＭＰＳ  ＶＩ型ラットにおけるこれらの構造のかなりの大きさの欠陥は、ニュートラルゾーンの剛性の低下によって表されるような生体力学的機能の低下と関連し得る。時定数（クリープ時間）の低下によって、椎骨間の水の輸送および保水能力が変化したことも明らかになり、この変化は、ＧＡＧの機能異常に関連すると思われるが、ＭＰＳ  ＶＩＩ型イヌモデルについて報告されているように、終板の透過性およびコラーゲンの機能の変化とも部分的に関連し得る。
【０１１３】
ちなみに、頭蓋および鼻の長さ、ロータロッドパフォーマンス、ならびに炎症に対するプラスの効果があるにも関わらず（図６Ａ〜６Ｄ、９、１０Ａ〜１０Ｂ、１２Ａ−１２Ｃ）、ＰＰＳによっては、進行疾患を有する処置済みのＭＰＳ  ＶＩ型動物では、椎間板の高さ指数（ＤＨＩ）の上昇は回復しなかった（図１４Ｃ）。この所見により、ＭＰＳにおける上記（およびおそらくその他の）のパラメーターについての早期のスクリーニングおよび治療の介入の重要性、ならびに、年齢および疾患の進行度の関数として、薬物治療の効果を慎重に評価する必要性が明らかになっている。
【０１１４】
ＰＰＳはＧＡＧ様多糖であるので、ＭＰＳのＧＡＧ蓄積障害の治療に有用であるとは考えられなかったであろう。したがって、ＭＰＳ  ＶＩ型動物におけるプラスの結果は、驚くほど予想外であった。加えて、ＰＰＳは、血液脳関門を通過することは知られていないので、ニーマンピック病マウスモデルにおいてプラスの神経学的効果（図１６に示されているような効果）があるとは考えられなかったであろう。
【０１１５】
本明細書では、好ましい実施形態を詳細に描写および説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱しなければ、さまざまな修正、追加、置換などを行えることは当業者には明らかであろうし、したがって、そのような修正、追加、置換などは、添付の特許請求の範囲で定義されているような本発明の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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