(57)【要約】  本発明は、ＩｇＧ抗体を生産する方法であって、前記抗体のうちの少なくとも８０％が、該抗体のＦｃドメインに結合された２つのシアル酸残基を含有する複合二分岐オリゴ糖を含む方法に関する。前記方法は、該抗体のＦｃドメイン内に変異を導入するステップ、およびその変異抗体を、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞内で発現させるステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ抗体を生産する方法であって、前記抗体のうちの少なくとも８０％が、前記抗体の各Ｆｃドメインに結合された２つのシアル酸残基を含有する複合二分岐オリゴ糖を含み、前記方法が、
ａ）前記抗体の前記Ｆｃドメイン内に変異を導入するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた変異抗体を、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞株において発現させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
β−ガラクトシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、シアリルトランスフェラーゼがα−２，６−シアリルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、配列番号３５によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされ、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼが、配列番号３３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シアル酸残基が、α−２，６−結合によって抗体に連結されている、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗体がヒト化抗体である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記変異が、Ｆ２４３、Ｖ２６４およびＤ２６５からなる群から選択されるアミノ酸に影響を及ぼす、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記変異が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択されるアミノ酸による前記アミノ酸の置換である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記変異が、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５ＫおよびＤ２６５Ａからなる群から選択される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインを含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する前記細胞株が、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼをコードする１種または２種のベクターが安定にトランスフェクトされた細胞株である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する前記細胞株が、前記抗体をコードする１種または２種のベクターが安定にトランスフェクトされた細胞株である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の方法によって生産された抗体。
【請求項１５】
請求項１４の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
ＩｇＧ抗体を含む組成物であって、前記抗体のうちの少なくとも８０％が、前記抗体の各Ｆｃドメインに結合された複合二分岐オリゴ糖を含み、前記オリゴ糖が、２つのシアル酸残基を含み、前記Ｆｃドメインが、天然配列のヒトＩｇＧのＦｃドメインと異なるアミノ配列を含む、組成物。
【請求項１８】
前記シアル酸残基が、α−２，６−結合によって抗体に連結されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
本発明の組成物の抗体が、アミノ酸２４３、２６４および２６５位のうちのいずれか１つ以上におけるアミノ酸置換を含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記置換が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択されるアミノ酸による前記アミノ酸の置換である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記置換が、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５ＫおよびＤ２６５Ａからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高い割合の老齢人口に影響を及ぼしている進行性の神経変性疾患である。ベータ−アミロイド（Ａβ）ペプチドは、不溶性Ａβペプチド原線維の形成およびこれらの原線維の沈着によってアミロイド斑を形成する原因物質であると考えられている（ＴａｎｚｉおよびＢｅｒｔｒａｍ、Ｃｅｌｌ、１２０：５４５−５５５、２００５）。記憶および他の認知機能にきわめて重要な脳の領域内でのこうしたプラークの形成は、この疾患に伴う認知症をもたらすと考えられている（Ｓｅｌｋｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：４３８−４４７、１９９４を参照されたい。）。Ａβは、ニューロンの膜を貫通する膜貫通タンパク質である、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きなタンパク質からの断片である。ＡＤの場合、正常な可溶性Ａβ（ｓＡβ）ペプチドが、オリゴマー／原線維のＡβに変換される。したがって、ニューロンの毒性は、不溶性原線維内へのｓＡβの凝集および、その後の、アミロイド斑への原線維の組み込みを介して形成される、大きい分子量の原線維に存在し得る。
【０００２】
Ａβペプチドの形成を予防するための試みにおいて多様な治療が進められてきた。現在、疾患進行に多大な影響を及ぼす介入のへの最も大きな希望は、免疫療法によってもたらされる（ＢｒｏｄｙおよびＨｏｌｔｚｍａｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１：１７５−１９３、２００８；ＷｉｎｉｅｗｓｋｉおよびＫｏｎｉｅｔｚｋｏ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ、７：８０５−８１１、２００８；ＷｉｎｉｅｗｓｋｉおよびＢｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ、Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ、２１４：２０１−２１８、２０１０）。免疫療法の治療は、特定の型のＡβを認識する抗体の投与（例えば、ＷＯ２００７／０６８４１２、ＷＯ２００９／０６５０５４、ＷＯ２００９／０４８５３８、ＷＯ２００９／０５２１２５、ＷＯ２００９／０７４５８３、ＥＰ２  ２２４  ０００  Ａ１を参照されたい。）、ならびにＡβペプチド抗原での免疫（例えば、ＥＰ２  ２２６  ０８１  Ａ１を参照されたい。）の双方を包含する。例えば、ＡβのＮ末端に対して指向される抗体が記載されており（米国特許第６，７６１，８８８号および第６，７５０，３２４号；ＢｒｏｄｙおよびＨｏｌｔｚｍａｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１：１７５−１９３、２００８）、これらの抗体は、Ａβ原線維の凝集を予防または回復させることができる。米国特許第７，１７９，４６３号は、Ａβペプチドコード領域内のＡｒｃｔｉｃ型変異からなる前原線維に対して産生された抗体を投与することによってアルツハイマー病を治療する方法を開示している。該明細書中に、産生された抗体の実例は示されておらず、低分子量型のＡβペプチドに対する親和性についての比較も示されていない。さらに、前臨床試験または臨床試験のいずれにおいても、いくつかのこれらの抗体を用いた治療の後に、微小出血および血管原性浮腫などの有害事象が報告されている（ＷｉｎｉｅｗｓｋｉおよびＫｏｎｉｅｔｚｋｏ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ、７：８０５−８１１、２００８；Ｗｅｌｌｅｒら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ、１（２）：６）。
【０００３】
Ａβペプチドの前原線維の型に特異的な新しいヒト化抗体が最近記載されている（ＷＯ２０１０／１３０９４６）。これらの抗体は、アルツハイマー病患者の脳の試料における免疫化学によって実証されたように、老人斑のみを認識するが、Ａβペプチドの散在性の沈着物は認識しない。さらに、前記ヒト化抗体は、アミロイド斑の減少を誘導することができる。
【０００４】
過去１５年間に、ＡＤを有する患者の死後の脳内で様々な炎症性タンパク質が同定されてきた。ＡＤにおいてアミロイド−β（Ａβ）タンパク質の沈着は、最終的に局所的な「脳炎症反応」をもたらす一カスケードの事象に先行するという考慮すべき証拠が現在ある。したがって、ＡＤを治療するための治療用抗体がさらなる炎症反応を誘発しないことは特に重要である。
【０００５】
プールされたヒト血漿から精製された高用量の単量体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、いわゆる静脈注射用免疫グロブリンまたはＩＶＩＧが、そのＦｃ断片によって媒介される相互作用を通して抗炎症活性を与えることは、十分に立証されている（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１：４８４−４８６、２００１；Ｋａｎｅｋｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：７８９−７９７、２００６）。したがって、Ｆｃ−ＦｃｙＲ相互作用は免疫複合体および細胞傷害性抗体の炎症誘発性の原因となる一方で、ＩＶＩＧおよびそのＦｃ断片は抗炎症性であり、炎症性疾患を抑制するために広範に使用される。ＩｇＧのグリコシル化、およびより詳細にはシアリル化（Ｋａｎｅｋｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１３：６７０−６７３、２００６）は、ＩｇＧの細胞傷害性および炎症性の潜在可能性の調節にきわめて重要なようである：組換えヒトＩｇＧのシアリル化されたＦｃ部分は、ＩＶＩＧの抗炎症作用に十分である（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：３７３−３７６、２００８；ＷＯ２００７／１１７５０５）。末端のシアル酸と末位から２番目のガラクトースとの間の結合は、前記抗炎症活性にきわめて重要なようである（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：３７３−３７６、２００８；Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：１９５７１−１９５７８、２００８；ＷＯ２００７／１１７５０５）。
【０００６】
したがって、治療用抗体のシアリル化を最適化することは、ＡＤの治療を改良するのに重要な因子である。実際に、こうした治療において均一に完全にシアリル化された抗体を使用することは、有害な炎症反応を誘発するリスクを最小限にするのに役立つはずである。したがって、均一に完全にシアリル化された組換え治療用抗体を生産する方法を有することは有利なはずである。さらに、組換え抗体の生産において業界にとって鍵となる特徴および課題は、生産性、コスト、均一性、および抗体活性の最適化である。特に、グリコシル化は、組換え治療用抗体の生産のためのきわめて重要な一連の問題を提起する、均一で効力のある組換え治療用抗体の高収率の生産において鍵となる論点であることが知られている。現在の産生細胞株はいずれも、グリコシル化の複雑性および種、組織および部位の特異性を主因とする種々の一連の課題および問題を提示している（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ、２１（１）：１１−１６、２００５を参照されたい。）。したがって、前記方法が、前臨床試験および臨床試験を確実にするのに十分高い生産性を有する、均一に完全にシアリル化された組換え治療用抗体の生産を確実にすることが必要である。
【０００７】
しかし、従来技術の方法は、不均一にもしくは部分的にシアリル化されている抗体および／または臨床試験において使用されるにはあまりに少ない量の抗体を生産するのみである。例えば、糖タンパク質を生産するために、外因性のガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞株が使用された。しかし、好適なレベルのシアリル化を達成するために、高い発現レベルのこれらの酵素が必要である。しかし、この場合には、該細胞株の生産性は劇的に低下され、これは、該細胞株が組換え治療用抗体の生産のための宿主細胞としての使用に不適であることを意味する。ガラクトシル化および／またはシアリル化反応は、インビトロでも行われてきた。しかし、この収率は、インビボ試験に十分な完全にシアリル化された抗体の調製を可能にするにはあまりに低すぎた。これは、レクチンアフィニティーカラム上でのシアリル化抗体の選択的濃縮によって改善されなかった。代替的に、生産される抗体のＦｃドメイン内に変異が導入されてきた。したがって、ＩｇＧ３抗体のＦｃドメイン内の多様な部位にアラニン残基が導入されていた。しかし、結果として生じるシアリル化の増加はわずかであって、最高の場合においてわずか３０％のジシアリル化されたＮ−グリカンしか得られなかった（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：４９６３−４９６９、１９９６；Ｗｅｉｋｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１１１６−１１２１、１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（１）：６５９１−６６０４、２００１；Ｊａｓｓａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２８６（２）：２４３−２４９、２００１；Ｓｃａｌｌｏｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：１５２４−１５３４、２００７；Ｂａｕｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８１：６６６４−６６６９、２００８；Ｈｏｓｓｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９（９）：９３６−９４９、２００９；ＷＯ２００７／０４８１２２；ＷＯ２００８／０５７６３４；ＷＯ２００８／０６５５４３；ＷＯ２００９／０７９３８２；ＷＯ２０１０／１０９０１０）。
【０００８】
したがって、完全にシアリル化されたＮ−グリカンを示す抗体の高レベルの生産のための方法に対する必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／０６８４１２号
【特許文献２】国際公開第２００９／０６５０５４号
【特許文献３】国際公開第２００９／０４８５３８号
【特許文献４】国際公開第２００９／０５２１２５号
【特許文献５】国際公開第２００９／０７４５８３号
【特許文献６】欧州特許出願公開第２２２４０００号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第２２２６０８１号明細書
【特許文献８】米国特許第６，７６１，８８８号明細書
【特許文献９】米国特許第６，７５０，３２４号明細書
【特許文献１０】米国特許第７，１７９，４６３号明細書
【特許文献１１】国際公開第２０１０／１３０９４６号
【特許文献１２】国際公開第２００７／１１７５０５号
【特許文献１３】国際公開第２００７／０４８１２２号
【特許文献１４】国際公開第２００８／０５７６３４号
【特許文献１５】国際公開第２００８／０６５５４３号
【特許文献１６】国際公開第２００９／０７９３８２号
【特許文献１７】国際公開第２０１０／１０９０１０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＴａｎｚｉおよびＢｅｒｔｒａｍ、Ｃｅｌｌ、１２０：５４５−５５５、２００５
【非特許文献２】Ｓｅｌｋｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：４３８−４４７、１９９４
【非特許文献３】ＢｒｏｄｙおよびＨｏｌｔｚｍａｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１：１７５−１９３、２００８
【非特許文献４】ＷｉｎｉｅｗｓｋｉおよびＫｏｎｉｅｔｚｋｏ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ、７：８０５−８１１、２００８
【非特許文献５】ＷｉｎｉｅｗｓｋｉおよびＢｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ、Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ、２１４：２０１−２１８、２０１０
【非特許文献６】Ｗｅｌｌｅｒら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ、１（２）：６
【非特許文献７】Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１：４８４−４８６、２００１
【非特許文献８】Ｋａｎｅｋｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：７８９−７９７、２００６
【非特許文献９】Ｋａｎｅｋｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１３：６７０−６７３、２００６
【非特許文献１０】Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：３７３−３７６、２００８
【非特許文献１１】Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：１９５７１−１９５７８、２００８
【非特許文献１２】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ、２１（１）：１１−１６、２００５
【非特許文献１３】Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：４９６３−４９６９、１９９６
【非特許文献１４】Ｗｅｉｋｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１１１６−１１２１、１９９９
【非特許文献１５】Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（１）：６５９１−６６０４、２００１
【非特許文献１６】Ｊａｓｓａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２８６（２）：２４３−２４９、２００１
【非特許文献１７】Ｓｃａｌｌｏｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：１５２４−１５３４、２００７
【非特許文献１８】Ｂａｕｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８１：６６６４−６６６９、２００８
【非特許文献１９】Ｈｏｓｓｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９（９）：９３６−９４９、２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要旨）
従来技術の方法では、医薬製品の開発に見合った量で広範囲にシアリル化された抗体を生産することが可能ではない。βガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはシアリルトランスフェラーゼを過剰発現する細胞株におけるＩｇＧ抗体の発現は、きわめて低い生産性の条件においてのみシアリル化抗体をもたらすことが本発明者らによって観察された。同様に、通常の細胞株における、Ｆｃドメイン内で変異された抗体の発現は、きわめて不均一なシアリル化パターンを有する抗体組成物をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、βガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する宿主細胞においてＦｃドメイン内に変異を有する抗体を発現させることによって高収率の広範囲にシアリル化されたＩｇＧ抗体を得ることが可能であることをいまや示した。本発明の方法によって得られる抗体は、均一なグリコフォームを示し、前記グリコフォームは、本質的に複合二分岐型（ｃｏｍｐｌｅｘ，ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｆｏｒｍ）であるＮ−グリカンを含み、このとき、オリゴ糖の枝は双方とも１つのシアル酸残基を有する。
【００１３】
本発明によれば、「広範囲にシアリル化された」とは、該抗体のＦｃドメインが有するＮ−グリカンのうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９７％または最も好ましくは少なくとも９９％が、オリゴ糖鎖によって２つのシアル酸残基を含むことを意味する。
【００１４】
本発明の第１の態様は、ＩｇＧ抗体を生産する方法に関し、ここで、前記抗体のうちの少なくとも８０％は、該抗体の各Ｆｃドメインに結合された、２つのシアル酸残基を含有する、複合二分岐オリゴ糖を含み、前記方法は、以下のステップ、
ａ）前記抗体の前記Ｆｃドメイン内に変異を導入するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた変異抗体を、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞株において発現させるステップ
を含む。
【００１５】
特定の一実施形態において、β−ガラクトシルトランスフェラーゼはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、シアリルトランスフェラーゼはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼである。別の特定の一実施形態において、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号３５によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされ、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、配列番号３３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の一実施形態において、前記シアル酸残基は、α−２，６−結合によって抗体に連結されている。
【００１６】
別の特定の一実施形態において、該抗体はモノクローナル抗体である。別の特定の一実施形態において、該抗体はヒト化抗体である。
【００１７】
別の特定の一実施形態において、前記変異は、Ｆ２４３、Ｖ２６４およびＤ２６５からなる群から選択されるアミノ酸に影響を及ぼす。別の特定の一実施形態において、前記変異は、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４ＡおよびＤ２６５Ａからなる群から選択される。別の特定の一実施形態において、前記変異はＤ２６５Ａである。
【００１８】
別の特定の一実施形態において、前記抗体は、ＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。
【００１９】
別の特定の一実施形態において、前記抗体は、前原線維型のペプチドＡβを特異的に結合する。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９から選択される配列と同一の配列を有するポリヌクレオチドによって、または配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のうちの１つである前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドによって異なる配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つのＣＤＲを有する。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０から選択される１つの配列と同一の配列を示す少なくとも１つのＣＤＲを有する。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、その結合特異性を保持したままで、前記配列と１または２つのアミノ酸残基によって異なる少なくとも１つのＣＤＲを有する。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のヌクレオチド配列によって、または配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９の前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドのみによって異なっている配列によって、コードされるＣＤＲを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０によって表される配列と同一の配列を有する６つのＣＤＲを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９のヌクレオチド配列によって、または配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９の前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドのみによって異なっている配列によって、コードされるＣＤＲを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１０、１２、１４、３２、１８および２０によって表される配列と同一の配列を有する６つのＣＤＲを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９のヌクレオチド配列によって、または配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９の前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドのみによって異なっている配列によって、コードされるＣＤＲを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１０、１２、３０、３２、１８および２０によって表される配列と同一の配列を有する６つのＣＤＲを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号５によって表される配列または配列番号２７によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列によってコードされるＶＨを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号６によって表される配列または配列番号２８によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するＶＨを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号７によって表される配列または配列番号２３によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列によってコードされるＶＬを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号８によって表される配列または配列番号２４によって表される配列と少なくとも８０％の同���性を有する配列を有するＶＬを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号５によって表されるポリヌクレオチド配列または配列番号２７によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされるＶＨを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号６によって表される配列または配列番号２８によって表される配列を有するＶＨを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号７によって表されるポリヌクレオチド配列または配列番号２３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされるＶＬを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号８によってまたは配列番号２４によって表される配列を有するＶＬを含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号５および７のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号６および８によって表されるアミノ酸配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号５および２３のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号６および２４によって表されるアミノ酸配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２７および２３のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２８および２４によって表されるアミノ酸配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１または配列番号２５によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２または配列番号２６によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号３または配列番号２１によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号４または配列番号２２によって表される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１および３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２および４によって表されるアミノ酸配列を有する。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号１および２１によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２および２２によって表されるアミノ酸配列を有する。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２５および２１によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。別の特定の一実施形態において、前記抗体は、配列番号２６および２２によって表されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明の第２の態様は、上記の方法によって生産される抗体に関する。
【００２１】
本発明の第３の態様は、上記の抗体を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
本発明の第４の態様は、医薬としての使用のための上記の抗体に関する。
【００２３】
本発明の第５の態様は、アルツハイマー病のような、アミロイド斑形成を伴う疾患の治療における使用のための上記の抗体に関する。
【００２４】
本発明の第６の態様は、ＩｇＧ抗体を含む組成物に関し、ここで、前記抗体のうちの少なくとも８０％は、前記抗体の各Ｆｃドメインを結合された複合二分岐オリゴ糖を含み、前記オリゴ糖は、２つのシアル酸残基を含み、このとき、該Ｆｃドメインは、天然配列のヒトＩｇＧのＦｃドメインと異なるアミノ配列を含む。
【００２５】
特定の一実施形態において、前記シアル酸残基は、α−２，６−結合によって抗体に連結されている。
【００２６】
別の特定の一実施形態において、該組成物の抗体は、アミノ酸２４３、２６４および２６５位のうちのいずれか１つ以上におけるアミノ酸置換を含み、例えば、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４ＡおよびＤ２６５Ａからなる群から選択される１つの置換など、特にＤ２６５Ａ置換を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】２種のＮ−グリカンの構造、Ｇ０ＦおよびＧ２Ｆ＋２ＮｅｕＮＡｃを示した図である。各単糖、すなわち、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトースおよびＮ−アセチルノイラミン酸ごとに標準的なピクトグラムを使用して、Ｎ−グリカンの単糖組成物が示されている。
【図２Ａ】ＳＩＡＴ１をコードする発現プラスミドｐＸＬ４５５５のマップを示した図である。
【図２Ｂ】Ｂ４ＧＴ１をコードする発現プラスミドｐＸＬ４５５１のマップを示した図である。
【図３Ａ】発現プラスミドｐＸＬ４５５５からの発現のためのＳＩＡＴ１の核酸配列（配列番号３３）を示した図である。
【図３Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ４５５５からの発現のためのＳＩＡＴ１のアミノ酸配列（配列番号３４）を示した図である。
【図４Ａ】発現プラスミドｐＸＬ４５５１からの発現のためのＢ４ＧＴ１の核酸配列（配列番号３５）を示した図である。
【図４Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ４５５１からの発現のためのＢ４ＧＴ１のアミノ酸配列（配列番号３６）を示した図である。
【図５Ａ】ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）をコードする発現プラスミドｐＸＬ４８０８のマップを示した図である。
【図５Ｂ】ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂの重鎖（ＨＣ）をコードする発現プラスミドｐＸＬ４７９２のマップを示した図である。
【図５Ｃ】ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの改変ＨＣをコードする発現プラスミドｐＸＬ５１０５のマップを示した図である。
【図５Ｄ】ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｆ２３５Ａ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードする発現プラスミドｐＸＬ５１１１のマップを示した図である。
【図５Ｅ】ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｖ２５６Ａ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードする発現プラスミドｐＸＬ５１３２のマップを示した図である。
【図６Ａ】発現プラスミドｐＸＬ４８０８からの発現のためのＬＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂの核酸配列（配列番号３９）を示した図である。
【図６Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ４８０８からの発現のためのＬＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂのアミノ酸配列（配列番号４０）を示した図である。
【図７Ａ】発現プラスミドｐＸＬ４７９２からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂの核酸配列（配列番号３７）を示した図である。
【図７Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ４７９２からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂのアミノ酸配列（配列番号３８）を示した図である。
【図８Ａ】発現プラスミドｐＸＬ５１０５からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂの核酸配列（配列番号４５）を示した図である。
【図８Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ５１０５からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂのアミノ酸配列（配列番号４６）を示した図である。
【図９Ａ】発現プラスミドｐＸＬ５１１１からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｆ２３５Ａ  ｍＡｂの核酸配列（配列番号４１）を示した図である。
【図９Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ５１１１からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｆ２３５Ａ  ｍＡｂのアミノ酸配列（配列番号４２）を示した図である。
【図１０Ａ】発現プラスミドｐＸＬ５１３２からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｖ２５６Ａ  ｍＡｂの核酸配列（配列番号４３）を示した図である。
【図１０Ｂ】発現プラスミドｐＸＬ５１３２からの発現のためのＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｖ２５６Ａ  ｍＡｂのアミノ酸配列（配列番号４４）を示した図である。
【図１１Ａ】グリコシルトランスフェラーゼの異なる発現レベルにおいて産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂについての質量分析データを示した図である。バッチＬＰ１００８１。
【図１１Ｂ】グリコシルトランスフェラーゼの異なる発現レベルにおいて産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂについての質量分析データを示した図である。バッチＬＰ１００８２。
【図１１Ｃ】グリコシルトランスフェラーゼの異なる発現レベルにおいて産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂについての質量分析データを示した図である。バッチＬＰ１００８４。
【図１１Ｄ】グリコシルトランスフェラーゼの異なる発現レベルにおいて産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂについての質量分析データを示した図である。バッチＬＰ１００８６。
【図１２Ａ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３（バッチＬＰ１００８８）のスペクトル。
【図１２Ｂ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｖ２５６Ａ（バッチＬＰ１００９１）のスペクトル。
【図１２Ｃ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１００９４）のスペクトル。
【図１２Ｄ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｆ２３５Ａ（バッチＬＰ１００９７）のスペクトル。
【図１２Ｅ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。図１２Ａのズームイン。
【図１３Ａ】Ｎ−グリカン中のα−２，３シアル酸に特異的なレクチンＭＡＡに対するＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂバリアント（バッチＬＰ１００８８、ＬＰ１００９１、ＬＰ１００９４、ＬＰ１００９７）の反応性を示した図である。
【図１３Ｂ】Ｎ−グリカン中のα−２，６シアル酸に特異的なレクチンＳＮＡに対するＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂバリアント（バッチＬＰ１００８８、ＬＰ１００９１、ＬＰ１００９４、ＬＰ１００９７）の反応性を示した図である。
【図１４Ａ】グリコシルトランスフェラーゼであるＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１の存在下でＣＨＯ内で産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂのレクチンＭＡＡに対する反応性を示した図である。
【図１４Ｂ】グリコシルトランスフェラーゼであるＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１の存在下でＣＨＯ内で産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂのレクチンＳＮＡに対する反応性を示した図である。
【図１５】ＳＩＧＮ−Ｒ１に対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの反応性を示した図である。ＳＩＧＮ−Ｒ１：Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ（コーティング：ＳＩＧＮ−Ｒ１：Ｆｃ［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］；２次抗体：抗ｍＫａｐｐａ−ＨＲＰ）。
【図１６Ａ】ＳＩＧＮ−Ｒ１に対するシアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３バリアントの反応性を示した図である。ＳＩＧＮ−Ｒ１：Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ（コーティング：ＳＩＧＮ−Ｒ１：Ｆｃ［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］；２次抗体：抗ｍＫａｐｐａ−ＨＲＰ）。Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１またはＳＩＡＴ６グリコシルトランスフェラーゼなしまたはありで産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３およびＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＶＡ１１１０１８、ＶＡ１１１０１９、ＶＡ１１１０２６、ＶＡ１１１０２７およびＶＡ１１１０３３）。
【図１６Ｂ】ＳＩＧＮ−Ｒ１に対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３バリアントの反応性を示した図である。ＳＩＧＮ−Ｒ１：Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ（コーティング：ＳＩＧＮ−Ｒ１：Ｆｃ［Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ］；２次抗体：抗ｍＫａｐｐａ−ＨＲＰ）。Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１グリコシルトランスフェラーゼなしまたはありで産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿Ｆ２３５ＡおよびＡｎｔｉＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿Ｖ２５６Ａ  ｍＡｂバリアント（バッチＶＡ１１１０１８からＶＡ１１１０２９）。
【図１７Ａ】Ｘ＝Ａ、Ｋ、Ｌ、ＧまたはＳである、ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｘ  ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）をコードする発現プラスミドｐＸＬ４９７３のマップを示した図である。
【図１７Ｂ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４  ｍＡｂの重鎖（ＨＣ）をコードする発現プラスミドｐＸＬ４９７９のマップを示した図である。
【図１８Ａ】Ｘ＝Ａ、Ｋ、Ｌ、ＧまたはＳである、ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｄ２６０Ｘ  ｍＡｂのＬＣの核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示した図である。
【図１８Ｂ】Ｘ＝Ａ、Ｋ、Ｌ、ＧまたはＳである、ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｄ２６０Ｘ  ｍＡｂのＬＣの核酸配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示した図である。
【図１９Ａ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図１９Ｂ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図２０Ａ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ａ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示した図である。
【図２０Ｂ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ａ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号４７）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示した図である。
【図２１Ａ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｋ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示した図である。
【図２１Ｂ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｋ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５４）を示した図である。
【図２２Ａ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｌ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示した図である。
【図２２Ｂ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｌ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示した図である。
【図２３Ａ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｇ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示した図である。
【図２３Ｂ】ヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｇ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号５０）を示した図である。
【図２４Ａ】発現のためのヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｓ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示した図である。
【図２４Ｂ】発現のためのヒト化されたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｓ  ｍＡｂのＨＣの核酸配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示した図である。
【図２５Ａ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４（バッチＶＡ１−１１０５１）のスペクトル。
【図２５Ｂ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｓ（バッチＶＡ１−１１０５２）のスペクトル。
【図２５Ｃ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｇ（バッチＶＡ１−１１０５３）のスペクトル。
【図２５Ｄ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｌ（バッチＶＡ１−１１０５４）のスペクトル。
【図２５Ｅ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｋ（バッチＶＡ１−１１０５５）のスペクトル。
【図２５Ｆ】シアリル化されたｍＡｂについての質量分析データを示した図である。ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ａ（バッチＶＡ１−１１０５６）のスペクトル。
【図２６Ａ】Ｎ−グリカン中のα−２，３シアル酸に特異的なレクチンＭＡＡに対するＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｘ  ｍＡｂバリアント（バッチ）の反応性を示した図である。白ひし形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４（バッチＶＡ１−１１０５１）；黒ひし形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｓ（バッチＶＡ１−１１０５２）；白丸：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｇ（バッチＶＡ１−１１０５３）；白三角形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｌ（バッチＶＡ１−１１０５４）；白正方形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｋ（バッチＶＡ１−１１０５５）；黒三角形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ａ（バッチＶＡ１−１１０５６）；実線：Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１グリコシルトランスフェラーゼありで産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１０１０４）；点線：Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ６グリコシルトランスフェラーゼありで産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＶＡ−１１１０３３）。点線＋黒丸小：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１０１０６）。
【図２６Ｂ】Ｎ−グリカン中のα−２，６シアル酸に特異的なレクチンＳＮＡに対するＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｘ  ｍＡｂバリアント（バッチ）の反応性を示した図である。白ひし形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４（バッチＶＡ１−１１０５１）；黒ひし形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｓ（バッチＶＡ１−１１０５２）；白丸：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｇ（バッチＶＡ１−１１０５３）；白三角形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｌ（バッチＶＡ１−１１０５４）；白正方形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｋ（バッチＶＡ１−１１０５５）；黒三角形：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ａ（バッチＶＡ１−１１０５６）；実線：Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１グリコシルトランスフェラーゼありで産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１０１０４）；点線：Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ６グリコシルトランスフェラーゼありで産生されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＶＡ−１１１０３３）。点線＋黒丸小：ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１０１０６）。
【図２７】ヒトおよびネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）のアイソタイプからのＩｇＧ定常ドメインの配列アライメントを示した図である。Ｆ２４３、Ｖ２６４、およびＤ２６５の部位は、囲み線で強調されている。ｈＩｇＧ１（配列番号５７）は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮに記載されているような、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインに相当する。ｈＩｇＧ２（配列番号５８）は、ヒトＩｇＧ２の定常ドメインに相当する。ｈＩｇＧ４（配列番号５９）は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ登録番号ＩＧＨＧ４＿ＨＵＭＡＮに記載されているような、ヒトＩｇＧ４の定常ドメインに相当する。ｈＩｇＧ４−ＰＥ（配列番号６０）は、２２８位のセリンからプロリンへの置換および２３５位のロイシンからグルタミン酸への置換を有する、ヒトＩｇＧ４の定常ドメインに相当する。ｍＩｇＧ１（配列番号６１）は、ＢＡＬＢｃマウスから生成されたハイブリドーマから単離された、マウスＩｇＧ１の定常ドメインに相当する。ｍＩｇＧ２ａ（配列番号６２）は、マウスＩｇＧ２ａの定常ドメインに相当する。ｍＩｇＧ３（配列番号６３）は、マウスＩｇＧ３の定常ドメインに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ＩｇＧ抗体を生産する方法に関し、ここで、前記抗体のうちの少なくとも８０％は、該抗体の各Ｆｃドメインに結合された、２つのシアル酸残基を含有する、複合二分岐オリゴ糖を含み、前記方法は、以下のステップ、
ａ）前記抗体の前記Ｆｃドメイン内に変異を導入するステップ、および
ｂ）ステップａ）で得られた変異抗体を、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞株において発現させるステップ
を含む。
【００２９】
ＩｇＧ免疫グロブリンは、２本の各重鎖上のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７に単一のＮ−結合型グリカンを含有し、この構造は図１に図示されている。本明細書中で使用される場合、「Ｎ−グリカン」という用語は、Ｎ−結合型オリゴ糖を指し、例えば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に結合されたものを指す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを指す；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す。）の一般的な五糖のコアを有する。
【００３０】
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に結合された末梢の糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、およびシアル酸）を含む枝（分岐（ａｎｔｅｎｎａｅ））の数および性質に関して異なる。Ｎ−グリカンは、枝分かれしたそれらの構成成分によって分類される（例えば、高マンノース型、複合型または混成型）。「複合二分岐」型Ｎ−グリカンは、典型的には、トリマンノースコアの１，３マンノース枝に結合された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃおよび１，６マンノース枝に結合された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合二分岐Ｎ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内の置換も有していてもよい。「バイセクティングＧｌｃＮＡｃ」は、成熟したコア炭水化物構造のβ−１，４−マンノースに結合されたＧｌｃＮＡｃ残基である。
【００３１】
複合二分岐Ｎ−グリカンは、シアル酸を用いて場合によって修飾されるガラクトース（「Ｇａｌ」）残基も有していてもよい。オリゴ糖鎖へのシアル酸付加は、シアリルトランスフェラーゼによって触媒されるが、ガラクトシルトランスフェラーゼによって末端Ｎ−アセチルグルコサミンに１つ以上のガラクトース残基が先に結合されていることを必要とする。本発明による「シアル酸」は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）および５−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＮＧｃ）の双方を包含する。
【００３２】
したがって、分泌されたＩｇＧは、糖残基であるフコース、ガラクトース、シアル酸、およびバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンの多様な付加を示しているグリコフォームの不均一な混合物である。
【００３３】
該シアル酸残基は、ガラクトース残基に、したがって抗体に、α−２，３−結合またはα−２，６−結合を介して連結されていてもよい。Ｆｃドメイン内にα−２，６シアリル化Ｎ−グリカンを有する抗体は抗炎症活性を有することが示されている（Ｋａｎｅｋｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１３：６７０−６７３、２００６；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４（１０）：１２３０−１２３１、２００６；Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：１９５７１−１９５７８、２００８；Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：３７３−３７６、２００８）。本発明の一実施形態において、２つのシアル酸残基は、α−２，６−結合を介して抗体に結合される。
【００３４】
「抗体」という用語は、本明細書中で最も広義に使用され、詳細には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどのあらゆるアイソタイプのモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む。）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体ならびに抗体断片を包含する。特定の抗原と反応性の抗体は、ファージまたは同様のベクター内の組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え法によって、または抗原もしくは抗原をコードする核酸で動物を免疫化することによって、生成され得る。
【００３５】
「ポリクローナル抗体」は、１種以上の他の同一でない抗体の中でまたは存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生している他の数種のＢリンパ球の存在下で１種のＢリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から直接得られる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である、すなわち、この集団を形成している抗体は、少量で存在する可能性がある自然に生じ得る変異を除いて本質的に同一である。これらの抗体は、単一のエピトープに指向され、したがって、高度に特異的である。
【００３７】
「エピトープ」は、抗体が結合する、抗原上の部位である。これは、隣接残基によって、または抗原タンパク質のフォールディングによって近くに連れてこられる非隣接残基によって形成され得る。隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露において典型的には保持されるのに対して、非隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、前記曝露下で典型的には消失する。
【００３８】
好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３９】
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖からなる。それぞれの重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する。それぞれの可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「高頻度可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含有し、これらは、主に、抗原のエピトープを結合するのに役割を果たしている。これらは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順番に番号付けされている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照されたい。）。より高度に保存された可変領域の部分は、「フレームワーク領域」と呼ばれる。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「ＶＨ」は、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、重鎖のＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片を含む。「ＶＬ」に対する言及は、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、軽鎖のＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片を含む。
【００４１】
抗体定常ドメインは、抗体を抗原に結合させることに直接関与しないが、多様なエフェクター機能を示す。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。これらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンは、異なるクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられ得、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ得る（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、１９９３、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。）。
【００４２】
抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有する、Ｆａｂ断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合性断片、および残りの１つの「Ｆｃ」断片を生じる。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの結晶構造は決定されている（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０、２３６１−２３７０、１９８１）。本明細書および特許請求の範囲の中で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ」とは、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分を意味する。本明細書中で使用される場合、「天然配列のＦｃドメイン」は、自然界で見出されるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃドメインは、天然配列のヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（Ａ以外およびＡアロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン；天然配列のヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン；および天然配列のヒトＩｇＧ４のＦｃドメインならびに天然に存在するこれらのバリアントを含む。
【００４３】
免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃドメインは、通常、ヒンジ領域内のＣｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有するそれらのカルボキシル末端までのストレッチと定義される。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、免疫グロブリン重鎖中の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）にあるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１のＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
【００４４】
「ヒンジ領域」という用語は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までのストレッチとして定義される（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：１６１−２０６、１９８５）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同一部位において重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成している最初および最後のシステイン残基を配置することによってＩｇＧ１配列とアライメントされ得る。ヒトＩｇＧのＦｃ部分の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる。）は、通常、アミノ酸２３１付近からアミノ酸３４０付近までに及ぶ。ＣＨ２ドメインは、もう１つのドメインと密接に対にならないことにおいて独特である。むしろ、全長の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に、２本のＮ−結合型分枝状炭水化物鎖が介在している。この炭水化物は、ドメイン−ドメイン対形成のための置換を可能にしてＣＨ２ドメインを安定化するのを補助し得ることが推測されている（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：１６１−２０６、１９８５）。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ部分内のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基３４１付近からアミノ酸残基４４７付近まで）のストレッチを含む。
【００４５】
Ｆｃドメインは、免疫グロブリンの生物学的機能を決定するのに中心的であり、これらの生物学的機能は、「エフェクター機能」と呼ばれる。これらのＦｃドメインを介した活性は、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞および活性化されたマクロファージなどの免疫学的エフェクター細胞、または多様な補体成分によって媒介される。これらのエフェクター機能は、抗体のＦｃドメインが前記受容体にまたは補体成分に結合することを通した、前記エフェクター細胞の表面上の受容体の活性化を必要とする。抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性は、エフェクター細胞のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃ受容体またはＣ１ｑなどの補体成分に対するＦｃドメインの結合を必要とする。多様なヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも有効にＡＤＣＣを媒介する。
【００４６】
本発明による抗体は、Ｆｃドメイン内に変異を含む。有利には、前記変異を有するＦｃドメインは、天然配列のＦｃドメインよりも多いシアル酸残基を含む。好ましくは、前記変異は、Ｆ２４３、Ｖ２６４およびＤ２６５からなる群から選択されるアミノ酸に影響を及ぼす。より好ましくは、前記アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている。さらにより好ましくは、前記変異は、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＬおよびＤ２６５Ｋからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記変異は、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＬおよびＤ２６５Ｋからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記変異は、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５ＫおよびＤ２６５Ｌからなる群から選択される。
【００４７】
上記のアミノ酸部位は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）に記載のＥＵナンバリングに示されている部位と一致する。このＥＵナンバリングは、発明を実施するための形態の全体にわたっておよび特許請求の範囲の全体にわたって使用されている。しかし、実施例において、該アミノ酸部位は、時に、ネズミ１３Ｃ３抗体のまたはヒト化１３Ｃ３抗体の配列上のその位置を参照することによって示されている。全体として本明細書に鑑みて変異の部位は当業者にすぐに明らかであるが、下表および図２７は便宜のために示されている。
【００４８】
【表１】
2014508759.tif 000002
【００４９】
本発明の骨組みにおいて、該Ｆｃドメインは、例えば、（例えば、配列番号５７の）ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、（例えば、配列番号５８の）ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３ドメイン（例えば、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：４９６３−４９６９、１９９６を参照されたい。）、（例えば、配列番号５９のまたは配列番号６０の）ヒトＩｇＧ４のＦｃドメイン、（例えば、配列番号６１の）ネズミＩｇＧ１のＦｃドメイン、（例えば、配列番号６２の）ネズミＩｇＧ２ａのＦｃドメイン、または（例えば、配列番号６３の）ネズミＩｇＧ３のＦｃドメインであってもよい。該Ｆｃドメインは、天然に存在するＦｃドメインと一致していてもよく、または抗体のエフェクター機能を増大または低下させるためおよび／もしくは抗体の半減期を増大させるために遺伝子操作によって変異が導入されているＦｃドメインと一致していてもよい。こうした変異は、当業者によく知られている。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、発現される抗体のＦｃドメイン内に変異を導入する予備的なステップを含む。これは、当業者に知られている任意の好適な方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的変異導入、カセット変異導入、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株などを用いて行われ得る（「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｋａｙら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ中のＶａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６：５３５−５３９、１９９８；Ａｄｅｙら、１９９６、第１６章、２７７−２９１頁）。
【００５１】
一実施形態において、本発明の方法において生産される抗体は、ヒト化抗体である。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体を指す。本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」は、可変領域が、別の種の定常領域、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している定常領域に連結されるように、定常領域、またはこの一部が、変更、置換、または交換された抗体である。「キメラ抗体」は、定常領域が、別の種の可変領域、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している可変領域に連結されるように、可変領域、またはこの一部が、変更、置換、または交換された抗体も指す。
【００５３】
ヒト化の目標は、ヒトに導入するために、抗体の完全な抗原結合親和性および特異性を維持したままで、ネズミ抗体のような、異種の抗体の免疫原性を低下させることである。ヒト化抗体、または他の哺乳動物によって拒絶されないように構成された抗体は、リサーフェシングおよびＣＤＲグラフティングのようないくつかの技術を使用して生産され得る。本明細書中で使用される場合、リサーフェシング技術は、分子モデル化、統計解析および変異導入の組合せを使用して、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を、標的ホストの既知の抗体の表面に似たように変更する。
【００５４】
抗体のリサーフェシングのための戦略および方法、および別の宿主内での抗体の免疫原性を低下させるための他の方法は、参照により本明細書にその全体を組み込む、米国特許第５，６３９，６４１号に開示されている。簡単に説明すると、特定の一方法において、（１）すべての可変領域についてのアライメント部位が少なくとも約９８％同一である一セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク表面露出部位を示すために、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のプールの部位アライメントが生成される；（２）げっ歯動物の抗体（またはこの断片）について、一セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基が定義される；（３）げっ歯動物の表面露出アミノ酸残基の該セットと最も近く同一である一セットの重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基が同定される；（４）げっ歯動物抗体の相補性決定領域のあらゆる残基のあらゆる原子の５Ａ内にあるアミノ酸残基を除いて、ステップ（２）において定義された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットが、ステップ（３）において同定された重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットで置換される；ならびに（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯動物抗体が産生される。
【００５５】
可変的な残基の同定に基づいた、抗体のヒト化のもう１つの方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００９／０３２６６１に記載されている。前記方法は、以下のステップを含む：（１）親モノクローナル抗体の同一性モデルを構築して分子動力学シミュレーションを行うステップ；（２）可変的な残基を分析して、ヒト以外の抗体分子の最も可変的な残基を同定するステップ、ならびに不均一性のまたは分解反応の源である可能性の高い残基またはモチーフを同定するステップ（３）親抗体と最も類似した認識領域の集合を示すヒト抗体を同定するステップ；（４）変異導入される可変的な残基を決定するステップ、不均一性および分解の源である可能性の高い残基またはモチーフも変異導入される；ならびに（５）既知のＴ細胞またはＢ細胞のエピトープの存在を確認するステップ。可変的な残基は、シミュレーションの時間にわたるタンパク質原子との水溶媒の相互作用を説明する、陰溶媒モデルを使用して分子動力学の計算を用いて見出され得る。
【００５６】
抗体は、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ０  ２３９  ４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリングまたはリサーフェシング（ＥＰ０  ５９２  １０６；ＥＰ０  ５１９  ５９６；Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．、１９９１、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  Ｇ．Ｍ．ら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：９６９−９７３）および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む多様な他の技術を使用してヒト化され得る。
【００５７】
一態様において、本発明の抗体は、前原線維型のペプチドＡ−β、すなわち、高分子量のペプチド、に特異的に結合する、ＩｇＧアイソタイプのヒト化抗体である。より好ましくは、本発明の抗体は、２００、３００、４００または５００ｋＤａ以上の分子量を有するペプチドＡ−βに結合する。
【００５８】
本発明は、低下されたエフェクター機能を有するヒト化抗体にも関し、これは、微小出血のような、有害作用の減少を可能にする。一実施形態において、本発明の抗体は、いかなるエフェクター機能も有さない。別の一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。なおさらなる一実施形態において、本発明の抗体のＩｇＧ４のＦｃドメインは、半分の分子の産生を減少させる１つ以上の変異を含有する。別のさらなる一実施形態において、前記抗体のＦｃドメインは、前記抗体のエフェクター機能の低下をもたらす少なくとも１つの変異を有する。
【００５９】
好ましくは、本発明の抗体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９から選択される配列と同一の配列を有するポリヌクレオチドによって、または前記配列のうちの１つと１、２、３、４または５つのヌクレオチドによって異なる配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つのＣＤＲを有するヒト化抗体である。
【００６０】
本発明は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０から選択される１つの配列と同一の配列を示す少なくとも１つのＣＤＲを有するヒト化抗体にも関する。別の一態様において、本発明の抗体は、その結合特異性を保持したままで、前記配列と１つまたは２つのアミノ酸残基によって異なる少なくとも１つのＣＤＲを有する。
【００６１】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９のヌクレオチド配列によって、または前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドのみによって異なっているそのバリアントによって、コードされる６つのＣＤＲを含む。別の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８および２０によって表される配列と同一の配列を有する６つのＣＤＲを含む。
【００６２】
別の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号９、１１、１３、３１、１７および１９のヌクレオチド配列によって、または前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドのみによって異なっているそのバリアントによって、コードされる６つのＣＤＲを含む。さらに別の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、１４、３２、１８および２０によって表される配列と同一の配列を有する６つのＣＤＲを含む。
【００６３】
さらに別の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号９、１１、２９、３１、１７および１９のヌクレオチド配列によって、または前記配列と１、２、３、４または５つのヌクレオチドのみによって異なっているそのバリアントによって、コードされる６つのＣＤＲを含む。別の一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１０、１２、３０、３２、１８および２０によって表される配列と同一の配列を有する６つのＣＤＲを含む。
【００６４】
別の一態様において、本発明は、配列番号５によって表される配列または配列番号２７によって表される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の同一性を示すポリヌクレオチド配列によってコードされるＶＨを含む抗体に関する。一実施形態において、本発明の抗体のＶＨをコードする配列は、配列番号５および配列番号２７の間で選択される。別の一実施形態において、本発明の抗体のＶＨは、配列番号６によって表される配列または配列番号２８によって表される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の同一性を有する配列を有する。さらなる一実施形態において、本発明の抗体のＶＨの配列は、配列番号６または配列番号２８によって表される。
【００６５】
別の一態様において、本発明は、配列番号７によって表される配列または配列番号２３によって表される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の同一性を示すポリヌクレオチド配列によってＶＬがコードされる抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体のＶＬは、配列番号７または配列番号２３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。別の一実施形態において、本発明の抗体のＶＬは、配列番号８によって表される配列または配列番号２４によって表される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の同一性を有する配列を有する。さらなる一実施形態において、本発明の抗体のＶＬの配列は、配列番号８または配列番号２４によって表される。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、配列番号５および７のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む抗体を提供する。さらなる一実施形態において、本発明は、配列番号６および８によって表されるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号５および２３のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む抗体を提供する。さらなる一実施形態において、本発明は、配列番号６および２４によって表されるアミノ酸配列を含む。
【００６８】
さらに別の一実施形態において、本発明は、配列番号２７および２３のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む抗体を提供する。さらなる一実施形態において、本発明は、配列番号２８および２４によって表されるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本発明は、配列番号１または配列番号２５によって表される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖を含む抗体にも関する。本発明は、配列番号２または配列番号２６によって表される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体にも関する。
【００７０】
別の一態様において、本発明は、配列番号３または配列番号２１によって表される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含む抗体を提供する。本発明は、配列番号４または配列番号２２によって表される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体にも関する。
【００７１】
本発明の別の一態様は、配列番号１および３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む抗体に関する。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号２および４によって表されるアミノ酸配列を有する。
【００７２】
本発明の別の一態様は、配列番号１および２１によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む抗体に関する。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号２および２２によって表されるアミノ酸配列を有する。
【００７３】
本発明の別の一態様は、配列番号２５および２１によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む抗体に関する。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号２６および２２によって表されるアミノ酸配列を有する。
【００７４】
本発明の抗体をコードまたは構成している配列は、表１に示されている。
【００７５】
【表２】
2014508759.tif 000003
2014508759.tif 000004
2014508759.tif 000005
【００７６】
「配列同一性」という用語は、２つのペプチド間または２つの核酸間の同一性を指す。配列間の同一性は、比較のためにアライメントされ得る各配列内の部位を比較することによって決定され得る。比較された配列内の一部位が、同一の塩基またはアミノ酸によって占められているとき、これらの配列は、その部位において同一である。核酸配列間の配列同一性の程度は、これらの配列によって共有されている部位における同一のヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列間の同一性の程度は、これらの配列間で共有されている同一のアミノ酸配列の数の関数である。２つのポリペプチドはそれぞれ、（ｉ）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含んでいてもよく、（ｉｉ）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含んでいてもよいので、「比較ウィンドウ」上の２つ以上のポリヌクレオチド間の配列同一性の比較は、少なくとも２０の隣接したヌクレオチド部位の概念上のセグメントに関し、ここで、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０の隣接したヌクレオチドの参照ヌクレオチド配列と比較されてもよく、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない。）参照配列と比較して２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。
【００７７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較でアライメントされる。例えば、ギャップは、第２のアミノ酸配列または第２の核酸配列との最適なアライメントのために、第１のアミノ酸配列または第１の核酸配列の配列内に導入され得る。次いで、対応しているアミノ酸部位またはヌクレオチド部位のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列内の一部位が、第２の配列内の対応している部位と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているとき、これらの分子は、その部位において同一である。これらの２つの配列間のパーセント同一性は、これらの配列によって共有されている同一の部位の数の関数である。したがって、％同一性＝同一の部位の数／重複している部位の総数Ｘ１００。
【００７８】
この比較において、これらの配列は、同一の長さであってもよく、または長さが異なっていてもよい。比較ウィンドウを決定するための最適な配列のアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、９１（２）：３７０−３８０、１９８１）の局所的な同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、４８（３）：４４３−４５３、１９７２）の同一性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５（５）：２４４４−２４４８、１９８８）の方法による類似性の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によってまたは目視検査によって行われてもよい。多様な方法によって生成された最良の（すなわち、比較ウィンドウにわたる同一性の百分率が最も高くなる）アライメントが選択される。
【００７９】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸で）、比較のウィンドウにわたって同一であることを意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、最適にアライメントされた２つの配列を比較のウィンドウにわたって比較し、双方の配列内に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が出現する部位の数を決定して、合致した部位の数を明らかにし、合致した部位の数を比較のウィンドウ内の部位の総数（すなわち、ウィンドウの大きさ）で割り算し、この結果に１００を掛け算して、配列同一性の百分率を求めることによって算出される。同一のプロセスは、ポリペプチド配列に適用されてもよい。核酸配列またはアミノ酸配列の配列同一性の百分率は、ＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９８年９月のバージョン２．０６）を初期設定でまたは使用者によって定められたパラメータで使用して算出されてもよい。
【００８０】
「配列類似性」という用語は、アミノ酸が、同一の機能を保持したまま修飾され得ることを意味する。アミノ酸はそれらの側基の性質によって分類されること、および塩基性アミノ酸のようないくつかのアミノ酸は、それらの基本的な機能が維持されたまま互いに交換され得ることが知られている。
【００８１】
本発明によれば、シアル酸残基は、宿主細胞による発現中に本発明の抗体上に付加される。本発明による宿主細胞は、βガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼを過剰発現する。
【００８２】
本明細書において、「βガラクトシルトランスフェラーゼ」とは、糖タンパク質のＮ−グリカン上のＮ−アセチルグルコサミン残基にガラクトース残基を共有結合的に連結し得る酵素を指す。優先的に、前記酵素は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ＝２．４．１．−）である。例えば、前記酵素は、遺伝子Ｂ４ＧＡＬＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１４９７３）によってコードされる、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１４８８．２）として知られている、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。より優先的に、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号３６によって表されるアミノ酸配列を有し、配列番号３５によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００８３】
本発明による「シアリルトランスフェラーゼ」は、シアリル酸残基を糖タンパク質のＮ−グリカン上のガラクトース残基に連結することが可能な酵素である。特許請求の範囲に記載されている方法において有用なシアリルトランスフェラーゼ酵素の好適な非限定的な例は、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれる、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ、およびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）である。
【００８４】
アルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ−β−１，３ＧＩｃＮＡｃまたはＧａｌ−β−１，４ＧＩｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸残基の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１−２１０１９、１９９２を参照されたい。）、グリコペプチド中のＮ−結合型オリゴ糖のシアリル化に役割を果たしている。該シアル酸残基は、２つの該糖類間にα−結合を形成して、該ガラクトースに連結される。該糖類間の結合形成（結合）は、シアル酸残基の第２位およびガラクトース残基の第３位の間である。この特定の酵素は、ラット肝臓から単離され得る（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１３８４５−１３８５３、１９８２）；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：２２７８２−２２７８７、１９９３；Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３９４−１４０１、１９９４）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：９３１−９３８、１９９６）のＤＮＡ配列は、知られており、組換え発現によってこの酵素の産生を促進する。
【００８５】
α−２，６−シアリルトランスフェラーゼの活性は、α−２，６−シアリル化ガラクトースを含む、α−２，６−シアリル化オリゴ糖をもたらす。「α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ」という名称は、アクセプターである多糖類の第６番目の原子にシアル酸を結合するシアリルトランスフェラーゼのファミリーを指す。様々な型のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼが、様々な組織から単離され得る。例えば、この酵素の１種の特定の型である、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩは、脳および胎児の組織から単離され得る（Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ−Ｒｅｃｃｈｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：９５０−９６１、２００３）。優先的に、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、ＳＩＡＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００３０３２）によってコードされる、βガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００３０２３．１）である。より優先的に、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、配列番号３４によって表されるアミノ酸配列を有し、配列番号３３によって表されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００８６】
したがって、本発明の方法は、広範囲にシアリル化された抗体の獲得を可能にし、ここで、ガラクトースおよびシアル酸の間の共有結合の大部分は、α−２，３またはα−２，６のいずれにおいても、使用される酵素に依存している。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを過剰発現する宿主細胞を使用することは、特に有利である。したがって、結果として生じる抗体が有するオリゴ糖は、α−２，６結合を介してガラクトース残基に結合されたシアル酸残基を主に含む。
【００８７】
したがって、所望の宿主細胞は、これらの酵素のうちの一方または双方を一過的にまたは安定に発現させるためにトランスフェクトされていてもよい。したがって、本発明による方法の特定の一実施形態において、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞株は、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼをコードする１種または２種のベクター（例えば、β−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する第１のベクターおよびシアリルトランスフェラーゼを発現する第２のベクター、または双方の酵素を発現する１種のベクター）を安定にトランスフェクトされている細胞株である。好ましくは、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット、またはヒト由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよび／またはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、発現された抗体にシアル酸残基を付加するために使用される。最も好ましくは、本発明の方法において使用されるα−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよび／またはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヒトの酵素である。本発明の特に有利な一実施形態において、該宿主細胞は、ヒトのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびヒトのα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの双方を過剰発現する。
【００８８】
βガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、当業者に知られているいかなる方法によって宿主細胞内に導入されてもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹに記載の技術を参照されたい。）。これらの方法は、限定されるものではないが、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、例えばリポソームを使用した膜融合移入、（例えば、アデノウイルスベクターを用いた）ウイルス移入およびマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションを含む。
【００８９】
本発明によれば、本発明のＩｇＧ抗体を発現させるために、多様な発現系が使用され得る。一態様において、こうした発現系は、対象のコーディング配列が生成および次いで精製され得るビヒクルであるが、適切なヌクレオチドコーディング配列が一過的にトランスフェクトされたときに、インサイチューで本発明のＩｇＧ抗体を発現し得る細胞でもある。
【００９０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態において、該ベクターは、本発明のＩｇＧ抗体、すなわち、Ｆｃドメイン内に変異を有する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する。別の一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本発明のＩｇＧ抗体の軽鎖をコードする。本発明は、融合タンパク質、修飾された抗体、抗体断片、およびこれらのプローブをコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。
【００９１】
本発明のＩｇＧ抗体の重鎖および／または軽鎖を発現させるために、前記重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、これらの遺伝子が転写配列および翻訳配列に作動可能に連結されるように発現ベクター内に挿入される。
【００９２】
「作動可能に連結された」配列は、対象の遺伝子と隣接した発現制御配列と、トランスでまたは対象の遺伝子を制御するための距離で作用する発現制御配列との双方を含む。本明細書中で使用される場合、「発現制御配列」という用語は、ライゲーションされたコーディング配列の発現およびプロセシングを行うのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化のシグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングのシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増大させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増大させる配列；ならびに所望により、タンパク質分泌を増大させる配列を含む。こうした制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物において、こうした制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む；真核生物において、一般に、こうした制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、発現およびプロセシングに存在が必須なすべての構成要素を、最小限で、含むことが意図され、存在が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送する能力がある核酸分子を指すことが意図される。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡ断片が中にライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう１つの型はウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡ断片は、ウイルスゲノム内にライゲーションされ得る。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、それらが導入される宿主細胞における自律複製の能力がある。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入と同時に宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよく、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。
【００９４】
ある種のベクターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する能力がある。本明細書において、こうしたベクターは、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態なので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、細菌プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来のエピソーム、および本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の発現を確実にするのに好都合であることを当業者が知る他のすべてのベクターのような、こうした型の発現ベクターを含むことが意図される。当業者は、該重鎖および該軽鎖をコードする該ポリヌクレオチドが、異なるベクター内にまたは同一のベクター内にクローニングされ得ることを認識する。一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、２種のベクター内にクローニングされる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドおよびこれらの分子を含むベクターは、好適な宿主細胞の形質転換のために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のＩｇＧ抗体を発現させるために組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。こうした用語は、特定の対象細胞だけでなく、こうした細胞の後代も指すことが意図されると理解されるべきである。後代において変異または環境の影響のいずれかによる特定の改変が生じ得るので、こうした後代は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。
【００９６】
形質転換は、細胞宿主内にポリヌクレオチドを導入するための既知のいかなる方法によっても行われ得る。こうした方法は、当業者によく知られており、デキストラン媒介性形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、バイオリスティックインジェクションおよび核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【００９７】
該宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現するベクターを含む、２種以上の発現ベクターが共トランスフェクトされてもよい。例えば、宿主細胞は、上述のような、ＩｇＧ抗体をコードする第１のベクター、およびグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第２のベクターがトランスフェクトされ得る。代替的に、該宿主細胞は、上述のような、本発明の抗体をコードする第１のベクターおよびグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２のベクター、ならびにもう１つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする第３のベクターがトランスフェクトされ得る。哺乳動物細胞は、組換え治療用免疫グロブリンの発現のために、特に、全組換えＩｇＧ抗体の発現のために、一般的に使用される。ベクターと共に発現シグナルを含有するＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞（例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントを有するもの）は、本発明のＩｇＧ抗体を発現させるために有効な系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【００９８】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、または望ましい特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞が選択される。タンパク質産物のこうした修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシングは、該タンパク質の機能に重要であってもよい。異なる宿主細胞は、タンパク質と遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾についての特徴および特定の機序を有している。発現された対象の抗体の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞または宿主の系が選択される。したがって、転写一次産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）が使用され得る。こうした哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、サル細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、ベビーハムスター細胞（例えば、ＢＨＫ細胞）、ＮＳ／０、Ｙ２／０、３Ｔ３または骨髄腫細胞を含むが、これらに限定されない（すべてのこれらの細胞株は、ｔｈｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ、またはｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．などの公的な保管所から入手可能である。）。代替的に、該酵母細胞は、グリコシル化（特にＮ−グルコシル化）の機序が哺乳動物細胞において生じているものと同様または同一であるように改変されている酵母細胞であってもよい。
【００９９】
組換えタンパク質の長期の高収率の生産のために、安定な発現が好ましい。本発明の一実施形態において、該抗体を安定に発現する細胞株は、改変されていてもよい。したがって、本発明による方法の特定の一実施形態において、β−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ活性を発現する細胞株は、該抗体をコードする１種または２種のベクター（例えば、軽鎖を発現する第１のベクターおよび重鎖を発現する第２のベクター、または双方の鎖を発現する１種のベクター）が安定にトランスフェクトされている。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および当業者に知られている他の適切な配列、ならびに選択可能なマーカーを含む、適切な発現調節エレメントの制御下でＤＮＡで形質転換される。外来ＤＮＡの導入後、改変された細胞は、濃縮培地中で１から２日間増殖できるようにされてもよく、次いで、選択培地に移される。組換えプラスミド上の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与えて、細胞がプラスミドを染色体中に安定に組み込むのを可能にし、細胞株に拡張される。安定な細胞株を構築するための他の方法は、当技術分野において知られている。特に、部位特異的組込みのための方法は、開発されている。これらの方法によれば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および他の適切な配列を含む、適切な発現調節エレメントの制御下で形質転換されたＤＮＡは、予め切断された特定の標的部位で宿主細胞ゲノム内に組み込まれる（Ｍｏｅｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０４（９）：３０５５−３０６０；ＵＳ５，７９２，６３２；ＵＳ５，８３０，７２９；ＵＳ６，２３８，９２４；ＷＯ２００９／０５４９８５；ＷＯ０３／０２５１８３；ＷＯ２００４／０６７７５３）。
【０１００】
ｔｋ細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３、１９７７）、ｈｇｐｒｔ細胞におけるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４８：２０２、１９９２）、メチオニンスルホキシミドの存在下におけるグルタミン酸合成酵素選択（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ、５８：６７１、２００６およびＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．のウェブサイトまたは文献）およびａｐｒｔ細胞におけるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７、１９８０）を含むが、これらに限定されない、いくつかの選択系が本発明に従って使用され得る。さらに、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基準として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を与える、ｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３５７、１９８０）；ミコフェノール酸に対する耐性を与える、ｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：２０７２、１９８１）；アミノグリコシドであるＧ−４１８に対する耐性を与える、ｎｅｏ（Ｗｕら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７、１９９１）；および、ハイグロマイシンに対する耐性を与える、ｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７、１９８４）。組換えＤＮＡ技術の分野において知られている方法は、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用されてもよく、こうした方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９３）において記載されている。抗体の発現レベルは、ベクターの増幅によって上昇する。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能なとき、培養物中に存在する阻害剤のレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は、本発明のＩｇＧ抗体をコードする遺伝子を伴っているので、前記抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７、１９８３）。本発明の遺伝子を発現させる代替法は、存在し、当業者に知られている。例えば、本発明の遺伝子の上流に発現調節エレメントを結合する能力がある改変ジンクフィンガータンパク質が設計されてもよい；本発明の宿主細胞における前記改変ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）の発現は、タンパク質産生における増加をもたらす（例えば、Ｒｅｉｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９７（５）：１１８０−１１８９、２００６を参照されたい。）。さらに、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）は、予め決定されたゲノムの位置へのＤＮＡの組み込みを刺激することができ、高効率の部位特異的遺伝子付加をもたらす（Ｍｏｅｈｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０４：３０５５、２００７）。
【０１０１】
本発明の抗体は、形質転換された宿主細胞の培養物を、所望の抗体を発現させるのに必要な培養条件下で培養することによって調製され得る。結果として得られた発現抗体は、次いで、培地または細胞抽出液から精製され得る。可溶型の本発明の抗体は、培養液上清から回収され得る。これは、次いで、当技術分野において知られている、免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法によって精製されてもよく、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にＦｃに対するプロテインＡアフィニティーによって、など）、遠心分離、示差的な溶解性によってまたはタンパク質の精製のための他の任意の標準的な技術によって精製されてもよい。好適な精製の方法は、当業者に明らかである。
【０１０２】
本発明のＩｇＧ抗体は、未改変および／または未精製の抗体と比較してその増加されたシアル酸の量に基づいてさらに精製され得る。この目的に到達するために、複数の方法が存在する。一方法において、例えば本発明の宿主細胞の培地のような、未精製のポリペプチド源は、シアル酸を結合することが知られている、レクチンを有するカラムに通される。当業者は、異なるレクチンが、ガラクトースおよびシアル酸の間のα−２，６結合対α−２，３結合に対して異なる親和性を示すことを理解する。したがって、特定のレクチンを選択することは、シアル酸およびガラクトースとの間に所望の型の結合を有する抗体の濃縮を可能にする。一実施形態において、該レクチンは、サンブカス・ニグラ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）から単離される。当業者は、サンブカス・ニグラのアグルチニン（ＳＮＡ）が、α−２−６結合によってガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンに連結されたシアル酸に特異的であることを認める（Ｓｈｉｂｕｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：１５９６−１６０１、１９８７）。対照的に、マーキア・アムレンシス（Ｍａａｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）（「ＭＡＡ」）レクチンは、α−２−３結合によってガラクトースに連結されたシアル酸に特異的である（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２６３：４５７６−４５８５、１９８８）。
【０１０３】
少なくとも１種のＩｇＧのＦｃドメインを含むポリペプチド上のグリコシル化の程度を調べるために、これらのポリペプチドは、精製されてもよく、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析されてもよい。グリコシル化は、単離されたポリペプチドを特定のレクチンと反応させることによって決定され得る。または、当業者によって理解されるはずであるように代替的に、ＨＰＬＣを使用することもでき、その後、質量分析でグリコフォームを同定する（Ｗｏｒｍａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３６（６）：１３７０−１３８０、１９９７）。ＩｇＧ抗体中のＮ−グリカンの定量的シアル酸同定（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基）、炭水化物組成分析および定量的オリゴ糖マッピングが、本質的に以前に記載されているように行われてもよい（Ｓａｄｄｉｃら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９４：２３−３６、２００２；Ａｎｕｍｕｌａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、８：６８５−６９４、１９９８）。
【０１０４】
したがって、本発明の方法は、前記抗体のＦｃドメインに結合された、２つのシアル酸残基を含有する、複合二分岐オリゴ糖を含む抗体の生産を高い生産性で可能にする。本明細書中で使用される場合、「高い生産性」とは、前記抗体が、２５ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは４５ｍｇ／Ｌ、または最も好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以上の収率で生産され得ることを意味する。
【０１０５】
本発明は、精製された、広範囲にシアリル化されたＩｇＧ抗体にも関し、これは、上記の方法によって得られ得る。前記抗体は、広範囲にシアリル化された複合二分岐Ｎ−グリカンを各Ｆｃドメイン上に含む、ＩｇＧアイソタイプの抗体であり、前記抗体は、Ｆｃドメイン内に変異を有する。好ましくは、本発明の抗体は、Ｇ２Ｆ型のオリゴ糖を有する、すなわち、前記抗体の各Ｎ−グリカンは、２つのガラクトース残基および１つのフコースを含む。より好ましくは、本発明の抗体の前記Ｎ−グリカンは、２つのシアル酸残基を含む。さらにより好ましくは、該シアル酸残基は、α−２，６結合によってガラクトース残基に連結されている。さらにより好ましくは、該シアル酸残基は、いずれも５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基（ＮｅｕＮＡｃ）である。
【０１０６】
好ましくは、本発明の抗体は、前原線維型のペプチドＡ−βに特異的に結合するヒト化抗体であり、したがって、アミロイド斑形成を伴う疾患を治療するために使用され得る。特に、本発明のヒト化抗体は、ＡＤを治療するために使用され得る。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、低下されたエフェクター機能を有し、したがって、減少された有害作用をもたらす。前記ヒト化抗体は、広範囲にわたってシアリル化されているため、抗炎症特性を示す。したがって、本発明のヒト化抗体は、より高い安全性と組み合わされた治療有効性を示す。
【０１０７】
本発明者らは、ＩｇＧ抗体の組成物を得ることが可能であることを初めて示しており、ここで、きわめて高い割合の前記抗体が広範囲にシアリル化されている（例えば、表３を参照されたい。）。したがって、本発明は、本発明のＩｇＧ抗体を含む組成物も提供し、ここで、前記抗体のうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９７％または最も好ましくは少なくとも９９％は、精製された、広範囲にシアリル化されたＩｇＧ抗体である。したがって、本発明は、ＩｇＧ抗体を含む組成物を提供し、ここで、前記抗体のうちの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも９７％または最も好ましくは少なくとも９９％は、前記抗体の各Ｆｃドメインに結合された複合二分岐Ｎ−グリカンを含み、前記オリゴ糖は２つのシアル酸残基を含み、ここで、前記抗体のＦｃドメインは、天然のヒトＩｇＧのＦｃドメイン配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の組成物の抗体は、アミノ酸２４３、２６４および２６５位のうちのいずれか１つ以上におけるアミノ酸置換を含む。より好ましくは、前記アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）およびリシン（Ｋ）からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている。さらにより好ましくは、該置換は、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＬおよびＤ２６５Ｋを含む群において選択される。さらにより好ましくは、前記変異は、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＬおよびＤ２６５Ｋからなる群から選択される。最も好ましくは、前記変異は、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５ＫおよびＤ２６５Ｌからなる群から選択される。
【０１０８】
実際に、本発明者らは、有利なことに、Ｆ２４３位、Ｖ２６４位およびＤ２６５位のうちの１つにおける変異が、きわめて均一なシアリル化プロファイルを示す抗体種の獲得をもたらすことを示しており（図１２Ｂ、ＣおよびＤを参照されたい。）、前記種は完全に特徴付けおよび定義されている（表３を参照されたい。）。これとは対照的に、こうした変異のないことは、シアリル化されていないまたは不完全にシアリル化されたＮ−グリカンを含有する少なくとも１２異種の混合物の産生をもたらした（図１２Ａ）。
【０１０９】
２６５位のすべての変異が、増加されたシアリル化をもたらすわけではないことに注意することが重要である。例えば、この点において、Ｄ２６５Ｓの置換は、野生型のようにふるまうのに対して、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＬまたはＤ２６５Ｋの変異はすべて、ジシアリル化された抗体分子の割合を増大させ、したがって、本発明の変異体の特異性を強調している（実施例７を参照されたい。）。
【０１１０】
特定の一実施形態において、該変異は、Ｄ２６５位における変異（例えば、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５ＫまたはＤ２６５Ａ変異）である。実際に、本発明者らは、驚くべきことに、この部位における変異が、広範囲にシアリル化された抗体をもたらすだけでなく、その標的に対して増強された結合を示す抗体ももたらすことを見出している（実施例６および図１６Ｂを参照されたい。）。
【０１１１】
別の一態様において、本発明の抗体は、配列番号４８、５０、５２および５４からなる群から選択される配列を有する重鎖を含む。好ましくは、本発明の抗体の重鎖は、配列番号４８、配列番号５２および配列番号５４の間で選択される配列を有する。
【０１１２】
別の有利な一実施形態において、本発明の組成物の抗体は、Ｇ２Ｆ型のオリゴ糖を有する、すなわち、前記抗体の各Ｎ−グリカンは、２つのガラクトース残基および１つのフコースを含む。好ましくは、該シアル酸残基は、α−２，６結合によってガラクトース残基に連結されている。より好ましくは、該シアル酸残基は、いずれも５−Ｎ−アセチルノイラミン酸残基（ＮｅｕＮＡｃ）である。
【０１１３】
該抗炎症特性がＩＶＩＧのＦｃ部分によって決定されることは長い間知られていた。脾臓マクロファージの表面上で発現される、マウスのレクチンであるＳＩＧＮ−Ｒ１（Ｋａｎｇら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５（２）：１７７−１８６、２００３）は、ヒトの樹状細胞において発現されるヒトのレクチンであるＤＣ−ＳＩＧＮがそうであるのと同様に、α−２，６−シアリル化Ｆｃ断片の受容体である（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５（５０）：１９５７１−１９５７８、２００８）。前記受容体とのα−２，６−シアリル酸残基の相互作用は、前記免疫グロブリンの抗炎症活性と関連している。
【０１１４】
有利な一実施形態において、本発明の抗体組成物は、ＳＩＧＮ−Ｒ１またはＤＣ−ＳＩＧＮを結合し、したがって、抗炎症活性を示す。好ましくは、本発明のヒト化抗体組成物は、５％未満の抗体が少なくとも１つのジシアリル化Ｎ−グリカンを有する組成物よりも高い親和性でＳＩＧＮ−Ｒ１またはＤＣ−ＳＩＧＮを結合する。本明細書において、「ＳＩＧＮ−Ｒ１」により、「ＣＤ２０９抗原様プロテインＡ」とも呼ばれる、ＮＰ＿５７３５０１．１にあるようなアミノ酸配列を有するタンパク質が指される。本明細書において、「ＤＣ−ＳＩＧＮ」により、ＡＡＫ２０９９７にあるようなアミノ酸配列を有するタンパク質が意味される。より好ましくは、本発明のヒト化抗体組成物によって結合される受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮである。
【０１１５】
本発明者らは、本発明によって生産され、Ｆｃドメイン内にＤ２６５Ａ変異を有する抗体は、ＳＩＧＮ−Ｒ１に最も高い親和性を示すことを示している。したがって、本発明によって生産され、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＫおよびＤ２６５Ｌからなる群から選択される変異を含有する抗体は、ＳＩＧＮ−Ｒ１に対して最も高い親和性を与えられるはずである。さらにより優先的に、本発明の抗体は、配列番号４８、配列番号５２および配列番号５４の間で選択される配列の重鎖を有する。
【０１１６】
本発明は、したがって、医薬としての本発明の抗体にも関する。
【０１１７】
本発明のもう１つの目的は、アミロイド斑形成を伴う疾患を治療する方法であって、広範囲にシアリル化された複合二分岐Ｎ−グリカンをＦｃドメイン上に含むＩｇＧアイソタイプのヒト化抗体を、これを必要としている患者に投与することを含み、前記ヒト化抗体がＦｃドメイン内に変異を有する、方法を提供することである。本発明は、アミロイド斑形成を伴う疾患の治療における使用のためのＩｇＧアイソタイプのヒト化抗体にも関し、前記ヒト化抗体は、広範囲にシアリル化された複合二分岐Ｎ−グリカンをＦｃドメイン上に含み、前記ヒト化抗体は、Ｆｃドメイン内に変異を有する。本発明は、アミロイド斑形成を伴う疾患の治療用の医薬の製造のためのＩｇＧアイソタイプのヒト化抗体の使用にさらに関し、前記ヒト化抗体は、広範囲にシアリル化された複合二分岐Ｎ−グリカンをＦｃドメイン上に含み、前記ヒト化抗体は、Ｆｃドメイン内に変異を有する。一実施形態において、アミロイド斑形成を伴う該疾患はＡＤである。別の一実施形態において、該シアル酸残基は、α−２，６結合によってガラクトース残基に連結されている。
【０１１８】
別の一態様において、本発明は、アミロイド斑形成を伴う疾患、特にＡＤの治療用の医薬組成物に関し、前記治療用組成物は、治療有効量の本発明のヒト化抗体および医薬として許容される担体を含む。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体に加えて、多様な賦形剤、増量剤、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤および当技術分野においてよく知られている他の材料を含有していてもよい。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、「医薬として許容される担体」は、生理学的に適合するあらゆるすべての溶媒、緩衝液、塩溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体の種類は、意図された投与の経路に基づいて選択され得る。種々の実施形態において、該担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮または経口の投与に好適である。医薬として許容される担体は、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射用の溶液または分散液の即席製剤用の無菌粉末を含む。医薬として有効な物質用の媒質および作用剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。静脈内注入用の典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル溶液、および１００ｍｇの該組合せを含有するように構成されていてもよい。非経口的に投与可能な化合物を調製するための実際の方法は、当業者に既知または明らかであり、例えば、参照により本明細書に組み込む、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８５）、ならびにこれらの第１８版および第１９版においてさらに詳細に記載されている。
【０１２１】
該組成物中のヒト化抗体は、好ましくは、有効量で製剤化される。「有効量」は、投与量および必要な期間で、アミロイド斑形成の予防または治療のような、所望の結果を達成するのに有効な量を指す。「治療有効量」は、特定の疾患状態の治療経過に影響を及ぼすのに十分な量を意味する。治療有効量は、作用剤のあらゆる有毒または不利益な作用が、治療的に有益な作用によって上回られる量でもある。
【０１２２】
治療的適用の場合、本発明のヒト化抗体は、上述したもののような医薬として許容される剤形で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与され、ボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入によって静脈内で、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入の経路によって、ヒトに投与され得るものを含む。
【０１２３】
投与量レジメンは、最適な反応性をもたらすように調整されてもよい。例えば、単回のボーラスが投与されてもよく、数回の分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、または該用量は比例的に減少または増加されてもよい。本発明の組成物は、対象における細胞増殖活性をもたらすために対象に投与され得る。本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、アポトーシスが誘導され得る生物を含むことが意図され、特に、哺乳動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、これらのトランスジェニック種など、好ましくはヒトを含む。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の範囲および本開示の内容の例示的なものにすぎない。当業者は、以下に挙げている実施例に対する多数の改変を、本発明の範囲から逸脱することなく考案および構築することができる。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例において、置換は、図中に示しているような分泌されたポリペプチドのアミノ酸配列上の部位を指し、ＥＵナンバリングによらない。したがって、ＥＵナンバリングにおけるＤ２６５位は、ＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂ上のＤ２５７またはａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ａ  ｍＡｂ、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｋ、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｌ  ｍＡｂ、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｇ  ｍＡｂ、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｓ  ｍＡｂのＨＣ上のＤ２６０に相当する。同様に、ＥＵナンバリングにおけるＦ２４３Ａは、ＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｆ２３５Ａ  ｍＡｂ上のＦ２３５Ａに相当し、ＥＵナンバリングにおけるＶ２６４Ａは、ＨＣ  ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿Ｖ２５６Ａ  ｍＡｂ上のＶ２５６に相当する。
【０１２６】
［実施例１］  グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現させたときの低いｍＡｂ産生能
この実施例において、グリコシルトランスフェラーゼの存在下におけるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の一過的産生は著しく減少することが示されたのに対して、これらのグリコシルトランスフェラーゼをコードするプラスミドの濃度は上昇した。
【０１２７】
ヒトα−２，６シアリルトランスフェラーゼ（ＳＩＡＴ１）（配列番号３３）またはヒトβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＴ１）（配列番号３５）をコードするｃＤＮＡをクローンコレクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から回収し、ＣＭＶプロモーターから発現が引き起こされる哺乳動物発現ベクターｐＸＬ４２１４に挿入してプラスミドｐＸＬ４５５５およびｐＸＬ４５５１を生成した。プラスミドのマップを図２に示しており、ＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１の核酸配列および対応しているアミノ酸配列をそれぞれ図３および４に示している。同一の発現ベクターを、ネズミＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）をコードするｃＤＮＡをクローニングするためにも使用した。プラスミドｐＸＬ４８０８は、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂのＬＣをコードしていた、図５Ａ；プラスミドｐＸＬ４７９２は、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂのＨＣをコードしていた、図５Ｂ。ＬＣはネズミＣｋａｐｐａであり、ＨＣはネズミＩｇＧ１アイソタイプであった。ＬＣおよびＨＣのｍＡｂバリアントの核酸配列および対応しているアミノ酸配列を図６および７に記載した。（配列番号３７から４０）
懸濁培養した２９３−Ｆ細胞（ヒト胚性腎ＨＥＫ２９３細胞由来であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで購入した。）において、異なる比率で２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体形成させた４種のプラスミドｐＸＬ４７９２、ｐＸＬ４８０８、ｐＸＬ４５５１およびｐＸＬ４５５５の共トランスフェクションによってＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂの一過的発現を行った。Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０：ｅ９、２００２）によって報告されているように、ＥＢＮＡをコードするプラスミドも含めた。細胞培養およびトランスフェクションを、供給業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの推奨に従って振とうフラスコ内で１００ｍＬ規模で行った。トランスフェクションの８日後、生存可能な細胞を計数して（Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））、２８０ｎｍにおけるＵＶ検出と連動した分析用ＨＰＬＣ（Ｐｏｒｏｓ  Ｇ／２０）によってｍＡｂ濃度を決定した。表２に示しているように、ｍＡｂ産生は、生存可能な細胞が著しく減少したときに回収された細胞と対応していた。
【０１２８】
ＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１をコードするプラスミドの濃度を４０倍に上昇させたときに、生存可能な細胞の百分率は低下し、産生能は５分の１に低下した（表２を参照されたい。）。
【０１２９】
【表３】
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【０１３０】
６つのｍＡｂバッチを、プロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ、Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での親和性クロマトグラフィーによって精製して、１００ｍＭの酢酸ｐＨ２．８、２０ｍＭのＮａＣｌの緩衝液でカラムから溶出させた。これらを、ＰＢＳ中に製剤化して、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳと併用したナノＬＣ上で質量分析によって分析した。予想されるａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂの質量およびＮ−グリカンの存在を図１１に示している。グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルが上昇したとき、Ｎ−グリカンのシアリル化含有量はより多く、より複合型であった。
【０１３１】
［実施例２］  Ｆｃ内にα−２，６−シアリル化Ｎ−グリカンを有するｍＡｂバリアントの産生。
【０１３２】
この実施例では、Ｆｃ内にα−２，６−シアリル化Ｎ−グリカンを有するｍＡｂバリアントの産生について、小規模の哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３またはＣＨＯにおける一過的発現によって説明している。
【０１３３】
同一の発現ベクターを使用して、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂバリアントのＬＣおよびＨＣをコードするｃＤＮＡをクローニングした。以下のプラスミドを、生成し、図５に示した。プラスミドｐＸＬ４８０８は、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂのＬＣをコードしていた、図５Ａ；プラスミドｐＸＬ４７９２は、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３  ｍＡｂのＨＣをコードしていた、図５Ｂ；プラスミドｐＸＬ５１０５は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの改変ＨＣをコードしていた、図５Ｃ；プラスミドｐＸＬ５１１１は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｆ２３５Ａ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードしていた、図５Ｄ、プラスミドｐＸＬ５１３２は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｖ２５６Ａ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードしていた、図５Ｅ。ＬＣおよびＨＣのｍＡｂバリアントの核酸配列および対応しているアミノ酸配列を図６、７、８、９および１０に記載した。ＨＣのＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｆ２３５Ａ、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｖ２５６ＡおよびＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂバリアントのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４１、４３および４５の配列に該当する。ＨＣのＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｆ２３５Ａ、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｖ２５６ＡおよびＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂバリアントのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４２、４４および４６の配列に該当する。ＥＵナンバリングを使用して、ネズミＩｇＧ１のＦｃドメインの２３５、２５６および２５７位は、それぞれヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン内の２４３、２６４および２６５位に相当する。
【０１３４】
懸濁培養した２９３−Ｆ細胞において、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体形成させた、ＨＣ、ＬＣ、ＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１をコードする４種のプラスミドの一過的共発現によって、各モノクローナル抗体バリアントを産生させた。最適な産生能およびシアル酸含有量を確実にするためにプラスミド比率を最適化した。最適なプラスミド比率は、［ＨＣおよびＬＣプラスミド］／［ＳＩＡＴ１プラスミド］／［Ｂ４ＧＴ１プラスミド］について６／０．５／０．５であった。分泌されたｍＡｂを、トランスフェクションの８日後に回収して、遠心分離した。このｍＡｂを、プロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ、Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での親和性クロマトグラフィーによって精製して、１００ｍＭの酢酸ｐＨ２．８、２０ｍＭのＮａＣｌの緩衝液でカラムから溶出させた。これらを、ＰＢＳ中に製剤化して、０．２２μｍのフィルターに通し、＋５℃で保管した。精製したｍＡｂの濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度の測定によって決定した。
【０１３５】
１５０ｍＬの培養物から合計１．５から１．８ｍｇのｍＡｂが精製された。各バッチを、還元条件および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｕｐａｇｅ  Ｂｉｓｔｒｉｓ／ＭＯＰＳ−ＳＤＳ  ４−１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分析して、９９％を超える純度ならびに各サブユニットおよびこのモノマーの予想される分子量を決定した。各バッチを、ゲル濾過（Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００  ＧＬ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）によっても分析して、９９％のモノマーの均一性および高分子量の種の１．２％未満の少ない含有量を決定した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳと併用したナノＬＣ上で質量分析を行った。これにより、バッチＬＰ１００９１、１００９４およびＬＰ１００９７について、種々のｍＡｂの予想される質量、およびＦｃドメイン内に点変異を含有する各バリアントで本質的にシアリル化されたＮ−グリカンが明らかにされた（図１２および表３を参照されたい。）。
【０１３６】
レクチン・マーキア・アムレンシス（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）（ＭＡＡ）を用いたＮ−グリカン中の末端α−２，３シアル酸の検出またはレクチン・サンブカス・ニグラ（ＳＮＡ）を用いたＮ−グリカン中の末端α−２，６シアル酸の検出の各々のために、２種の酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）が開発された。図１３に示しているように、ＭＡＡに反応性は認められなかったのに対して、ＳＮＡで特異性が観察され、Ｎ−グリカンのシアリル化含有量がより多かったときに反応性がより高かった（バッチＬＰ１００９１、ＬＰ１００９４およびＬＰ１００９７を参照されたい。）。
【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
まとめると、これらの結果により、Ｆｃ内の３つの点変異（Ｖ２５６Ａ、Ｄ２５７Ａ、Ｆ２３５Ａ）のうちの１つで改変されたｍＡｂバリアントが、Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１をコードするプラスミドの存在下のＨＥＫ２９３細胞における一過的発現によって生産されたときに、Ｎ−グリカンは、本質的にα−２，６−シアリル化型からなっていたことが示された。より詳細には、Ｖ２５６Ａ、Ｄ２５７ＡまたはＦ２３５Ａの存在は、きわめて均一なシアリル化プロファイルを示す抗体種の獲得をもたらし（図１２Ｂ、ＣおよびＤを参照されたい。）、前記種は完全に特徴付けおよび定義されている（表３を参照されたい。）。メジャーピークは、他のピークと比較して実際に優位であり、完全にシリル化された（４つのシアル酸残基）種に相当する。これとは対照的に、野生型ｍＡｂとのＢ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１の過剰発現は、シアリル化されていないまたは不完全にシアリル化されたＮ−グリカンを含有する少なくとも１２異種の混合物の産生をもたらした（図１２Ａ）。
【０１３９】
ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂバリアントも、懸濁培養したＣＨＯ細胞において、ＨＥＫ２９３において用いた最適なプラスミド比率を用いた、ＨＣ、ＬＣ、ＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１をそれぞれコードする４種のプラスミドｐＸＬ５１０５、ｐＸＬ４８０８、ｐＸＬ４５５５およびｐＸＬ４５５１の一過的共発現によって産生された。同様の含有量のα−２，６シアル酸を、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３において産生されたバッチでＥＬＬＡアッセイによって検出した。図１４を参照されたい。
【０１４０】
［実施例３］  Ｆｃ内にα−２，６−シアリル化Ｎ−グリカンを有するｍＡｂバリアントの大規模の産生。
【０１４１】
この実施例では、Ｆｃ内にα−２，６−シアリル化Ｎ−グリカンを有するａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂの産生について、大規模の哺乳動物細胞におけるＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１との一過的共発現によって説明している。このｍＡｂの特徴付けおよび結合特異性を、ＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１の共発現なしで産生された同一のａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂと比較した。
【０１４２】
１０ＬのＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ内で懸濁培養した２９３−Ｆ細胞において、実施例１で用いた最適なプラスミド比率を用いて、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）と複合体形成させた、ＨＣ（ｐＸＬ５１０５）、ＬＣ（ｐＸＬ４８０８）、ＳＩＡＴ１（ｐＸＬ４５５５）およびＢ４ＧＴ１（ｐＸＬ４５５１）をコードする４種のプラスミドの一過的共発現によって、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂバリアントを産生させた。このバッチを、トランスフェクションの８日後に回収して、ＬＰ１０１０４と名づけた。ＬＰ１０１１６という名称のもう１種のバッチも、１０ＬのＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ内で懸濁培養した２９３−Ｆ細胞において、ＨＣ（ｐＸＬ５１０５）およびＬＣ（ｐＸＬ４８０８）をコードするプラスミドの一過的共発現によって産生させた。双方のバッチを、実施例１に記載のように精製して特徴付けした。ＬＰ１０１０４およびＬＰ１０１１６の２種のバッチの特徴付けを表５にまとめている。
【０１４３】
該ｍＡｂ中のＮ−グリカンの定量的シアル酸同定、炭水化物組成分析および定量的オリゴ糖マッピングも、本質的に以前に記載されているように行った（Ｓａｄｄｉｃら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９４：２３−３６、２００２；Ａｎｕｍｕｌａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、８：６８５−６９４、１９９８）。第１に、ｍＡｂの穏やかな加水分解後にシアル酸残基を遊離させて、オルト−フェニレンジアミンで蛍光標識し、逆相ＨＰＬＣによって分離した。個々のピークを、蛍光検出（励起、２３０ｎｍ；放出、４２５ｎｍ）によって検出して、Ｎ−アセチルノイラミン（ＮｅｕＮＡｃ）酸およびＮ−グリコリルノイラミン（ＮｅｕＮＧｃ）酸の標準と比較することによって同定および定量した。第２に、ｍＡｂ試料を酸加水分解して個々の単糖を遊離させた後に炭水化物組成物を決定した。加水分解後、これらの単糖（中性糖およびアミノ糖）を、アントラニル酸で誘導体化し、次いで、逆相ＨＰＬＣによって分離して、蛍光検出（励起、３６０ｎｍ；放出、４２５ｎｍ）によって検出した。個々のピークを、単糖の標準と比較することによって同定および定量した。第３に、オリゴ糖を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで酵素的に遊離させて、アントラニル酸で蛍光標識し、その後、Ａｓａｈｉｐａｋ−ＮＨ２Ｐ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラム上での順相−陰イオン交換ＨＰＬＣによってそれらのシアル酸残基の数による分離を行った。標識されたグリカンを、蛍光検出（励起、３６０ｎｍ；放出、４２５ｎｍ）によって検出および定量した。分析データを、表４において報告している。
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
この実施例において示した全体的なデータにより、きわめて高いα−２，６シアリル化Ｎ−グリカンＦｃの含有量を有する、数百ミリグラムものＡｎｔｉＡｂｅｔａ  ｍＡｂを治療的使用に必要とされる質で産生可能なことが示される。以下の実施例において、このｍＡｂを、α−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａと呼んでいる。
【０１４７】
［実施例４］  α−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａのこのリガンドに対する親和性
この実施例において、Ａβ前原線維に対するａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性を試験した。この理由は、元のａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３  ｍＡｂがこのリガンドに特異的に結合するからである。
【０１４８】
前原線維は、可溶性のロッド様構造であり、アミロイドベータペプチドであるＡβ１−４２ペプチドから自己凝集によって生じる。これらは、以前に公表されているように（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２７３：２６１８−３０、２００６）、合成のヒトＡβ１−４２ペプチドを１０ｍＭのＮａＯＨ中に溶解して、ＮａＣｌ／リン酸緩衝液中で３７℃で１６時間インキュベートすることによって得られた。２００ｋＤａより大きい分子量を有する前原線維を、サイズ排除クロマトグラフィーによって１１ｋＤａ程度の分子量を有する小さい分子量型と分離した。親和性をＥＬＩＳＡによって試験した。前原線維を９６ウェルプレート上にコーティングし、一濃度範囲の抗体を適用して、ペルオキシダーゼに結合された抗Ｆｃモノクローナル抗体で検出を行った。
【０１４９】
表６に記載のように、α−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａに対するＡβ前原線維の親和性は、元のａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３および低シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａで得られたＥＣ５０と同程度の、０．０４１５ｍｇ／ＬのＥＣ５０で測定された。
【０１５０】
したがって、α−２，６シアリル化Ｎ−グリカンＦｃによる修飾は、ｍＡｂ／リガンド親和性に干渉しなかった。
【０１５１】
【表７】
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【０１５２】
［実施例５］  Ｆｃγ受容体に対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性
実施例３に記載のα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂは、Ｆｃドメイン内において、広範囲にシアリル化されたＮ−グリカンの存在によってかなり修飾されている。この修飾は、このドメインにおいて結合することが記載されているＦｃγ受容体およびＣ１ｑ成分に対するＦｃ結合に干渉する可能性があった（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：６５９１−６６０４、２００１；Ｍｅｒｓｈｏｎら、３７３−３８２頁、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｒｏｍ  ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃ」、編：Ｚｈｉｑｉａｎｇ  Ａｎ、２００９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）。したがって、ネズミタンパク質ＦｃγＲｓおよびＣ１ｑに対して、α−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性を、Ｆｃによって媒介される強力なエフェクター機能を有するネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ＬＰ０９０７８）と比較して決定した。
【０１５３】
組換えネズミＦｃγＲｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。）に対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器を使用して表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）で決定した。親和性データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。親和性パラメータを、速い解離を用いた低い親和性についての定常状態の分析または遅い解離を用いた高い親和性のための適切なモデルでのグローバルなフィットのいずれかで決定した。
【０１５４】
組換えＣ１ｑに対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性を、ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからの組換えＣ１ｑ（参照２０４８７６）を、９６ウェルプレート上にコーティングし、一濃度範囲の抗体を適用して、ペルオキシダーゼに結合された抗Ｆｃモノクローナル抗体で検出を行った。表７に示した結果により、ＦｃγＲおよびＣ１ｑに対するａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性は、α−２，６シアリル化Ｎ−グリカンＦｃの非存在下および存在下においてきわめて低かったことが示された。
【０１５５】
α−２，６シアリル化Ｎ−グリカンＦｃによる修飾は、Ｆｃγ受容体に対するｍＡｂ親和性にもＣ１ｑ成分に対するｍＡｂ親和性にも干渉しなかった。したがって、このα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａについては、免疫エフェクター細胞または補体カスケードに関与する能力がきわめて低いはずである。
【０１５６】
【表８】
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【０１５７】
［実施例６］  ＳＩＧＮ−Ｒ１に対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性
α−２，６シアリル化Ｆｃは、エフェクターマクロファージを標的とする抗炎症性の可溶性メディエーターの分泌をもたらす細胞プログラムを誘導したレクチンである、ＳＩＧＮ−Ｒ１に関与するという仮説が立てられていた。（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：１９５７１−１９５７８、２００８）。したがって、この実施例において、ＳＩＧＮ−Ｒ１に対するα−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａの親和性を試験した。
【０１５８】
親和性をＥＬＩＳＡによって試験した：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得たＳＩＧＮ−Ｒ１：：Ｆｃを９６ウェルプレート上にコーティングし、一濃度範囲の抗体を適用して、ペルオキシダーゼに結合された抗ネズミＣｋａｐｐａモノクローナル抗体で検出を行った。図１５に示している結果より、α−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１０１０４）は、ＳＩＧＮ−Ｒ１に対する反応性がａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ（バッチＬＰ１０１１６）よりも高いことが示されている。
【０１５９】
ＳＩＡＴ６を発現する細胞株から得られたａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａ  ｍＡｂ（実施例７、バッチＶＡ１＿１１０３３）を用いてこの実験を再現することにより、ＳＩＧＮ−Ｒ１結合がα−２，６結合に特異的であったという確認が得られた。このｍＡｂは、混合されたα−２，６／α−２，３シアリル化Ｎ−グリカンを含有し（図２６を参照されたい。）、Ｂ４ＧＴ１およびＳＩＡＴ１を発現する、したがって、オリゴ糖を有し、ここで、大部分のシアリル残基がα−２，６−結合によってガラクトースに連結されている細胞株において産生されたｍＡｂと（図２６を参照されたい。）、いかなるさらなるグリコシルトランスフェラーゼも発現していない細胞株において産生されたｍＡｂ（図１６Ａ）との間で中程度のレベルの、ＳＩＧＮ−Ｒ１に対する結合をもたらす。
【０１６０】
したがって、α−２，６シアリル化Ｎ−グリカンＦｃは、ＳＩＧＮ−Ｒ１に対するｍＡｂの反応性に関与している。
【０１６１】
最終的に、ＳＩＧＮ−Ｒ１に対する結合が、ＣＨ２ドメイン内の変異の部位、α−２，６シアリル化ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３における２３５位のＦ、２５６位のＶまたはＤ２５７によって影響されたかどうかを調べた。図１６Ｂに示しているように、２５７位における置換により、結合がかなり増強される結果になった。
【０１６２】
したがって、２５７位における変異が特に好ましい。これは、完全にシアリル化された抗体をもたらすだけでなく、その標的に対して増強された結合を示す抗体ももたらすからである。
【０１６３】
［実施例７］  α−２，６シアリル化ヒト化ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｘ（Ｘ＝Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ｇ）の獲得および特徴付け
この実施例は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを有し、Ｆｃ内にＥＵ命名法で２６５位において点変異を含有するα−２，６シアリル化ｍＡｂを生産する方法を示している。これは、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４における対応している部位では、２６０位のアスパラギン酸に相当し、ここで、該残基は、分泌されたｍＡｂ重鎖の第一番目から番号付けされる。
【０１６４】
本発明の方法がヒト化抗体またはヒト抗体に適用され得ることを検証するために、ヒト化ＡｎｔｉＡｂｅｔａ  １３Ｃ３  ｍＡｂのＩｇＧ４のＦｃドメインのＤ２６０位に６つの異なる置換をＰＣＲによって挿入した。導入されたアミノ酸は、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、ＬまたはＧであった。結果として生じる変異抗体のそれぞれを、ＨＥＫ２９３において一過的発現によって産生させて、そのシアル酸含有量およびＳＮＡレクチンを結合するその能力について分析した。
【０１６５】
プラスミドｐＸＬ４９７３は、ヒトＣｋａｐｐａドメインに融合されたヒト化ＶＬ１ドメインをコードしていた（図１７Ａ）のに対して、プラスミドｐＸＬ４９７９は、ａｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ１３＿ＩｇＧ４  ｍＡｂのヒトＩｇＧ４定常ドメインに融合されたヒト化ＶＨ１をコードしていた、図Ａ２。
【０１６６】
同一の発現ベクターを使用して、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２６０Ｘ  ｍＡｂバリアントのヒト化ＬＣおよびＨＣをコードするｃＤＮＡをクローニングした。
【０１６７】
プラスミド５２２７から５２３２は、ｐＸＬ４９７９からＩｇＧ４ドメイン内の点変異によって得られた。プラスミドｐＸＬ５２２７は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ａの改変ＨＣをコードし、プラスミドｐＸＬ５２２８は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｋ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードし、プラスミドｐＸＬ５２２９は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｌ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードし、プラスミドｐＸＬ５２３０は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｇ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードし、プラスミドｐＸＬ５２３２は、ＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿ＩｇＧ４＿Ｄ２６０Ｓ  ｍＡｂの改変ＨＣをコードしていた。ＬＣおよびＨＣのｍＡｂバリアントの核酸配列および対応しているアミノ酸配列を図２０から２４に記載した。
【０１６８】
懸濁培養した２９３−Ｆ細胞において、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体形成させた、ＨＣ、ＬＣ、ＳＩＡＴ１およびＢ４ＧＴ１をコードする４種のプラスミドの一過的共発現によって、各モノクローナル抗体バリアントを産生させた。最適な産生能およびシアル酸含有量を確実にするためにプラスミド比率を最適化した。最適なプラスミド比率は、［ＨＣおよびＬＣプラスミド］／［ＳＩＡＴ１プラスミド］／［Ｂ４ＧＴ１プラスミド］について６／０．５／０．５であった。
【０１６９】
分泌されたｍＡｂは、３９から４３ｍｇ／Ｌまでの範囲に及ぶ産生能で産生され、トランスフェクションの８日後に回収して遠心分離した。ｍＡｂを、プロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ、Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での親和性クロマトグラフィーによって精製して、１００ｍＭの酢酸ｐＨ２．８、２０ｍＭのＮａＣｌの緩衝液でカラムから溶出させた。これらを、ＰＢＳ中に製剤化して、０．２２μｍのフィルターに通し、＋５℃で保管した。精製したｍＡｂの濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度の測定によって決定した。
【０１７０】
５００ｍＬの培養物から約１０−１１ｍｇのｍＡｂが精製された。各バッチを還元条件および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｕｐａｇｅ  Ｂｉｓｔｒｉｓ／ＭＯＰＳ−ＳＤＳ  ４−１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分析して、９７％を超える純度ならびに各サブユニットおよびこのモノマーの予想される分子量を決定した。各バッチを、ゲル濾過（Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００  ＧＬ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）によっても分析して、モノマーの均一性および高分子量の種の１０％未満の含有量を決定した。
【０１７１】
ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳと併用したナノＬＣ上で質量分析を行った。これにより、すべてのバッチについての種々のｍＡｂの予想される質量が明らかにされた。さらに、Ｎ−グリカンは、以下のバッチ（ＶＡ１＿１１０５３からＶＡ１＿１１０５６）で本質的にシアリル化されていた。これらのバッチは、Ｆｃドメイン内に以下の点変異を含有するバリアントにそれぞれ相当する：ＥＵ命名法を使用してＤ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５ＫおよびＤ２６５Ａ（図２５および表８を参照されたい。）。
【０１７２】
レクチン・マーキア・アムレンシス（ＭＡＡ）を用いたＮ−グリカン中の末端α−２，３シアル酸の検出またはレクチン・サンブカス・ニグラ（ＳＮＡ）を用いたＮ−グリカン中の末端α−２，６シアル酸の検出の各々のために、２種の酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）が開発された。α−２，３およびα−２，６シアリル化されたＡｎｔｉＡｂｅｔａ＿１３Ｃ３＿Ｄ２５７Ａを含有する対照バッチ（ＶＡ１＿１１０３３）も含めた。これは、ＨＣ、ＬＣ、ＳＩＡＴ６およびＢ４ＧＴ１をそれぞれコードする４種のプラスミドｐＸＬ５１０５、ｐＸＬ４８０８、ｐＸＬ４５４４およびｐＸＬ４５５１の共発現によって産生させ、上記のように精製した。
【０１７３】
図２６に示しているように、バッチＶＡ１＿１１０５１からＶＡ１＿１１０５６でＭＡＡに反応性は認められなかったのに対して、ＳＮＡで特異性が観察され、Ｎ−グリカンのシアリル化含有量がより多かったときに反応性がより高かった。Ｆｃ内のバッチおよび点変異のランキングは、以下の通りであった：ＶＡ１＿１１０５４〜ＶＡ１＿１１０５６〜ＶＡ１＿１１０５５＞ＶＡ１＿１１０５３＞＞ＶＡ１＿１１０５２〜ＶＡ１＿１１０５１；この翻訳は、点変異について、以下の通りである：Ｌ〜Ａ〜Ｋ＞Ｇ＞＞Ｓ〜Ｄ。このランキングは、互いに異なる変異体のＮ−グリカンのシアル酸含有量と相関している。
【０１７４】
【表９】
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【０１７５】
結論として、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５ＬおよびＤ２６５Ｋの変異はすべて、ジシアリル化された抗体分子の割合を増大させる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
2014508759.tif 000070
【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
2014508759.tif 000072
【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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