(57)【要約】  ヒト様Ｏ−グリコシル化を有する糖タンパク質を製造するために、下等真核宿主細胞を組換え操作した。該糖タンパク質は、ヒト治療用物質の製造に関する利点を有する糖タンパク質組成物の製造に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下等真核宿主細胞における、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌまたはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａを主要Ｏ−グリカンとして有する組換え糖タンパク質の製造方法であって、
（ａ）（ｉ）機能的ベータ−マンノシルトランスフェラーゼ酵素Ｂｍｔ１、２、３および４ならびにホスホ−マンノーストランスフェラーゼ酵素Ｍｎｎ４ａ、Ｍｎｎ４ｂおよびＰｎｏ１を発現せず、
（ｉｉ）機能的タンパク質Ｏ−結合マンノースβ−１，２−Ｎ−結合アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（「ＰＯＭＧｎＴ１」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体およびα−１，２−マンノシダーゼ酵素を発現する下等真核宿主細胞を準備し、
（ｂ）関心のある糖タンパク質をコードする核酸で該下等真核宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、
（ｃ）該宿主細胞を培養して、該組換え糖タンパク質を産生させることを含む製造方法。
【請求項２】
工程（ａ）の細胞が更に、Ｋｔｒ１を発現しない、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
工程（ａ）（ｉｉ）の酵素が更に、
（ａ）β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体およびＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；
（ｂ）β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体、ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；α２，６ＳｉａｌＴ；ＧＮＥ；ＳＰＳ；ＳＰＰ；ＣＳＳ；およびＣＳＴ；または
（ｃ）β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体、ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；α２，３ＳｉａｌＴ；ＧＮＥ；ＳＰＳ；ＳＰＰ；ＣＳＳ；およびＣＳＴの、酵素の組合せの１つを含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
工程（ａ）（ｉｉ）のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体がクライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体またはマウスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
該α−１，２−マンノシダーゼがトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、コクシディオデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に由来する、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
工程（ａ）（ｉｉ）のＰＯＭＧｎＴ１酵素が配列番号１１０、配列番号１１２または配列番号１１８を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
工程（ａ）（ｉｉ）からのＰＯＭＧｎＴ１酵素がヒト、マウスまたはカエルＰＯＭＧｎＴ１配列に由来する、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
工程（ａ）（ｉｉ）からのＰＯＭＧｎＴ１酵素をコードする核酸が該下等真核宿主細胞における発現に関してコドン最適化されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはクライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）のリーダー配列のものである又は該リーダー配列に由来するＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列に機能的に連結されたＰＯＭＧｎＴ１をコードする核酸配列により、工程（ａ）（ｉｉ）のＰＯＭＧｎＴ１がコードされている、請求項１記載の製造方法。
【請求項１０】
該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列が、タンパク質ＳｃＭＮＳ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＰｐＫｒｅ−２ｓ；Ｋ１Ｇｎｔ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ５−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−ｓの１つに配列に由来する、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
ＰＯＭＧｎＴ１をコードする核酸配列が、配列番号１〜１０８から選択される配列に機能的に連結されている、請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
ＰＯＭＧｎＴ１をコードする核酸配列が、配列番号３（または配列番号４をコードする配列）、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号３３（または配列番号３４をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号４５（または配列番号４６をコードする配列）、配列番号５１（または配列番号５２をコードする配列）、配列番号９３（または配列番号９４をコードする配列）、配列番号８７（または配列番号８８をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択される配列に機能的に連結されている、請求項９記載の製造方法。
【請求項１３】
ＰＯＭＧｎＴ１をコードする核酸配列が、以下の組合せ：
（ａ）ＰｐＳＥＣ１２−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のものである又は該タンパク質のものに由来するリーダー配列に機能的に連結されているヒトＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列、
（ｂ）配列番号９（または配列番号１０をコードする配列）、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号７３（または配列番号７４をコードする配列）、配列番号８７（または配列番号８８をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択される配列に機能的に連結されているヒトＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列、
（ｃ）ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＰｐＫＲＥ２−ｓ、ＳｃＫＴＲ２−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ５−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＳｃＰＭＴ６−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｓ、ＰｐＰＭＴ２−ｓ、ＰｐＰＭＴ４−ｓまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のものである又は該タンパク質のものに由来するリーダー配列に機能的に連結されているマウスＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列、
（ｄ）配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号３３（または配列番号３４をコードする配列）、配列番号３７（または配列番号３８をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号４５（または配列番号４６をコードする配列）、配列番号５１（または配列番号５２をコードする配列）、配列番号７３（または配列番号７４をコードする配列）、配列番号７５（または配列番号７６をコードする配列）、配列番号７７（または配列番号７８をコードする配列）、配列番号７９（または配列番号８０をコードする配列）、配列番号８１（または配列番号８２をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択される配列に機能的に連結されているマウスＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列、
（ｅ）ＳｃＭＮＳ１−ｓ、ＳｃＳＥＣ１２−ｍ、ＰｐＳＥＣ１２−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＳｃＡＮＰ１−ｓ、ＳｃＨＯＣ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ１０−ｓ、ＳｃＭＮＮ１１−ｓ、ＰｐＫＲＥ２−ｓ、ＳｃＫＴＲ２−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のものである又は該タンパク質のものに由来するリーダー配列に機能的に連結されているカエルＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列、または
（ｆ）配列番号３（または配列番号４をコードする配列）、配列番号７（または配列番号８をコードする配列）、配列番号９（または配列番号１０をコードする配列）、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号１７（または配列番号１８をコードする配列）、配列番号１９（または配列番号２０をコードする配列）、配列番号２１（または配列番号２２をコードする配列）、配列番号２３（または配列番号２４をコードする配列）、配列番号３３（または配列番号３４をコードする配列）、配列番号３７（または配列番号３８をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号４９（または配列番号５０をコードする配列）、配列番号５１（または配列番号５２をコードする配列）、配列番号７３（または配列番号７４をコードする配列）、配列番号８７（または配列番号８８をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択される配列に機能的に連結されているカエルＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列
の１つにおけるＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列に機能的に連結されている、請求項９記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ａ）（ｉｉ）からのＰＯＭＧｎＴ１酵素をコードする核酸配列が、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＴＥＦまたはＰＭＡプロモーターに機能的に連結されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項１５】
工程（ａ）（ｉｉ）からのＰＯＭＧｎＴ１酵素をコードする核酸配列が、ＳｃＣＹＣ１転写終結配列に機能的に連結されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項１６】
工程（ａ）（ｉｉ）のＰＯＭＧｎＴ１酵素をコードする核酸配列がプロモーターおよびリーダー配列に機能的に連結されており、ここで、使用される該プロモーター、リーダーおよびＰＯＭＧｎＴ１配列が、ＡＯＸ１−ＰｐＫＲＥ２ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−Ｋ１ＧＮＴ１ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−Ｋ１ＧＮＴ１ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−Ｋ１ＧＮＴ１ｓ−カエルＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−ＳｃＭＮＮ２ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−ＳｃＭＮＮ５ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−ＳｃＭＮＮ５ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−ＳｃＭＮＮ６ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−ＳｃＰＭＴ５ｍ−マウスＰＯＭＧｎＴ１またはＧＡＰ−ＳｃＭＮＮ６ｓ−ヒトＰＯＭＧＮＴ１のプロモーター−リーダー−ＰＯＭＧｎＴ１の組合せの１つである、請求項１記載の製造方法。
【請求項１７】
該下等真核宿主細胞がピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である、請求項１記載の製造方法。
【請求項１８】
該下等真核宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１記載の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の下等真核宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）機能的ベータ−マンノシルトランスフェラーゼ酵素Ｂｍｔ１、２、３および４ならびにホスホ−マンノーストランスフェラーゼ酵素Ｍｎｎ４ａ、Ｍｎｎ４ｂおよびＰＮＯ１を発現せず、
（ｂ）ＰＯＭＧｎＴ１、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、α−１，２−マンノシダーゼおよび関心のある糖タンパク質をコードする外因性核酸で形質転換またはトランスフェクトされた、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌまたはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａを主要Ｏ−グリカンとして有する組換え糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞であって、
該主要Ｏ−グリカンが、５０％を超えるレベルで存在し、Ｏ−Ｍａｎ２が３０％未満のレベルで存在する、下等真核宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、ヒト化Ｏ−グリコシル化を有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された下等真核細胞、例えば酵母株、および組換え発現系からのその製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
下等真核生物（すなわち、酵母および糸状菌）と哺乳動物（特にヒト）とのＯ−グリコシル化経路およびパターンには有意な構造的相違が存在する。ヒト免疫系は下等真核生物の別のグリコシル化を外来物として認識しうるため、真菌系で産生される、タンパク質に基づく治療用物質はいずれも、ヒトに注入された場合に免疫原性応答を誘発する可能性を有する。この応答は、複数の投与にわたる治療法の有効性を制限する可能性があり、最も深刻な場合には、患者に有害な影響を及ぼしうる。
【０００３】
実際、真菌グリコシル化の存在は先天性ヒト免疫系によるクリアランスのための共通シグナルである。例えば、Ｂａｌｌｏｕ，Ｃ．Ｅ．，１９９０  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：４４０を参照されたい。これは、酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されヒトに注入された治療用タンパク質（限定的なものではないが、酵母に典型的なＮおよびＯグリカンを有するタンパク質を含む）の急速なクリアランスまたは免疫原性の可能性についての懸念をもたらす。
【０００４】
酵母において産生された治療用タンパク質の免疫原性を軽減するこれまでの試みは、大部分が、Ｎグリカンの免疫原性の軽減に焦点を合わせたものであった（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，米国特許第７，０２９，８７２号）。より最近の試みは、この応答を軽減または排除するために、真菌Ｏ−グリコシル化を軽減または完全に排除することに焦点を合わせている。例えば、Ｔａｎｎｅｒ，米国特許第５，７１４，３７７号およびＢｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ２００７／０１６３１を参照されたい。これとは対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、天然ヒト糖タンパク質上で見られるＯ−グリコシル化に類似した、または哺乳類細胞において産生される組換え糖タンパク質上で見られるＯ−グリコシル化に、より近い、あるＯ−グリコシル化パターンを有するタンパク質の製造における予想外の利点を見出した。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概括
本発明は、ヒト治療用または獣医学的治療用製品の開発において有用な改良された特性を有する組換え糖タンパク質の製造のための方法および材料を提供する。ある実施形態においては、本発明は、主要ヒト様Ｏ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作された下等真核宿主細胞（酵母および糸状菌を含む）を含む。好ましい実施形態においては、該宿主細胞は、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌまたはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａから選択されるヒト様Ｏ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する。
【０００６】
第１の態様として、本発明は、Ｏ−グリコシル化に関与する１以上の遺伝子、例えばベータ−マンノシルトランスフェラーゼ（ｂｍｔｓ；例えば、ＵＳ  ２００６／０２１１０８５を参照されたい）、ホスホマンノーストランスフェラーゼをコードするもの（これに限定されるものではない）またはＯ−グリコシル化に関与する１以上の追加的遺伝子のノックアウトおよび／または不活性化により修飾された、本発明の方法で使用するための下等真核宿主細胞を提供する。
【０００７】
第２の態様として、本発明は、Ｏ−グリコシル化に関与する外因性遺伝子、特にタンパク質Ｏ−マンノースβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（「ＰｏｍＧｎＴ１」）またはその触媒ドメインをコードする遺伝子およびヒトまたは哺乳類Ｏ−グリコシル化経路における１以上の工程をコードする１以上の追加的遺伝子でのトランスフェクションまたは形質転換により、ヒトまたは哺乳類Ｏ−結合グリコシル化経路に関与する外因性（非天然）遺伝子を発現するように修飾された、本発明の方法で使用するための下等真核宿主細胞（例えば、前記のもの）を提供する。特定の実施形態においては、これらの１以上の追加的遺伝子は、限定的なものではないが、以下の酵素またはその触媒ドメインをコードする：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体；α−１，２−マンノシダーゼ；β−１，４−ガラクトーストランスフェラーゼ（「β１，４ＧａｌＴ」）；ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＵＧＴ）；ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；α−２，６−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，６ＳｉａｌＴ」）；α−２，３−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，３ＳｉａｌＴ」）；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（「ＧＮＥ」）；Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（「ＳＰＳ」）；シアリラート−９−Ｐホスファターゼ（「ＳＰＰ」）；ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（「ＣＳＳ」）；およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）。
【０００８】
第３の態様として、本発明は、関心のある組換え糖タンパク質を発現するように、該糖タンパク質をコードする外因性遺伝子での宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換により修飾された、本発明の方法で使用するための下等真核宿主細胞（例えば、前記のもの）を提供する。それにより、発現のための適当な条件下で培養されると、本明細書に記載されている宿主細胞は、特定のヒト様Ｏ−グリコシル化を含む改良された組換え糖タンパク質を発現し、分泌するであろう。
【０００９】
本発明は更に、ヒト様Ｏ−グリカンを主に有する組換え糖タンパク質の製造方法であって、ａ）下等真核宿主細胞を選択し、ｂ）該宿主細胞における１以上の内因性グリコシル化酵素を弱化させ（工程（ａ）の宿主細胞がそのようには弱化されていない場合）、ｃ）Ｏ−結合マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＧｎＴ１）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、アルファ−１，２−マンノシダーゼおよび該糖タンパク質をコードする核酸配列で該宿主細胞を形質転換し、ｄ）該核酸配列の発現に適した条件下で該細胞を培養して、ヒト様Ｏ−グリカンを主に有する組換え糖タンパク質を産生させることを含む製造方法を含む。特定の実施形態においては、該宿主細胞は、以下の酵素またはそれらの触媒ドメイン（それらに限定されるものではない）をコードする核酸で更に形質転換される：β−１，４−ガラクトーストランスフェラーゼ（「β１，４ＧａｌＴ」）；ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＵＧＴ）；ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；α−２，６−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，６ＳｉａｌＴ」）；α−２，３−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，３ＳｉａｌＴ」）；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（「ＧＮＥ」）；Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（「ＳＰＳ」）；シアリラート−９−Ｐホスファターゼ（「ＳＰＰ」）；ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（「ＣＳＳ」）；およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）。
【００１０】
他の実施形態においては、本発明は、本発明の下等真核宿主細胞から製造された組換え糖タンパク質組成物を含む。
【００１１】
本発明の下等真核宿主細胞は、所望により、主要ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作されうる。好ましい実施形態においては、該宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＳｉａＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＳｉａＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＳｉａＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＳｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択される主要Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する。
【００１２】
特定の実施形態においては、本発明において提供する糖タンパク質組成物は、二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）および多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）種を含むフコシル化および非フコシル化ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンを含むが、これらに限定されるものではない）を有する糖タンパク質を含む。
【００１３】
特定の実施形態においては、本発明において提供する糖タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは、該組成物中のハイブリッドＮ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
【００１４】
特定の実施形態においては、本発明において提供する糖タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つの複合Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様においては、該複合Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中の複合Ｎ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
【００１５】
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンはフコシル化されている。一般に、該フコースは、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，６−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧａｌとのα１，２−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、または該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，４−結合で存在する。
【００１６】
したがって、前記の糖タンパク質組成物の特定の態様においては、該グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，６−結合フコース；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，４−結合フコース；あるいはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，２−結合フコースで存在する。
【００１７】
前記の更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは更に、フコシル化および非フコシル化二分岐および多アンテナ種を含む。
【００１８】
他の態様においては、該糖タンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（これに限定されるものではない）を含む高マンノースＮ−グリカン、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造からなるＮ−グリカンを含む。
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号１〜１０８は種々のＥＲおよび／またはゴルジ局在化リーダー配列を示す。
【００２０】
配列番号１０９〜１１８はＰＯＭＧｎＴ１配列を示す。
【００２１】
配列番号１１９〜１２０、１２２〜１２３、１２５〜１２６、１３３〜１３４、１３５〜１３６および１４１〜１４８は、実施例において使用したＰＣＲプライマーを示す。
【００２２】
配列番号１２１および１２４は、それぞれ、ＰｐＨＩ３  ＯＲＦおよび３’非翻訳断片を示す。
【００２３】
配列番号１２７は、ＰｐＡＬＧ３転写終結配列を含むＤＮＡ断片を示す。
【００２４】
配列番号１２８はＰｐＧＡＰプロモーター配列を示す。
【００２５】
配列番号１２９はＳｃＣＹＣ１転写終結配列を示す。
【００２６】
配列番号１３０はＰｐＡＯＸ１プロモーター配列を示す。
【００２７】
配列番号１３１〜１３２および１３８〜１４０は、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ１配列を含む配列を示す。
【００２８】
配列番号１３７は、ＨＳＡプレシグナルペプチドをコードする配列を示す。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＯ−グリコシル化合成および転移装置を本来は有さない下等真核生物、例えば酵母（限定的なものではないが、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む）または糸状菌において、ヒトＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を製造するための方法および材料に関する。開示する方法および材料を用いて製造された組換え糖タンパク質は、ヒトまたは哺乳類で産生されるタンパク質と共通のグリコシル化パターンを含有し、したがって、免疫原性応答の可能性が著しく低減または排除されてヒトに注入されうる。
【００３０】
本出願人は更に、Ｏ−グリカンのヒト化が、例えば薬物動態学的特性を改善して、インビボ薬物活性の、より良好な制御を促進することにより、治療用タンパク質、特にシアル酸化Ｏ−グリカンの生物活性（例えば、バイオアベイラビリティおよび血清半減期）を増強しうることを見出した。
【００３１】
したがって、本発明は、改良されたベクター、新規核酸、宿主細胞系に基づく、酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のためのタンパク質発現系の開発、ならびに低減された免疫原性および／またはより良好な薬物動態学的特性を有する組換え糖タンパク質の製造における前記の使用方法に関する。
【００３２】
本発明者らは、下等真核細胞内に存在する糖タンパク質装置を修飾することにより、組換え下等真核宿主細胞において、改良された糖タンパク質治療用物質が得られうることを見出した。本明細書に記載される該細胞は、あるヒト様Ｏ−グリコシル化を有する組換え糖タンパク質を特異的に産生するように遺伝的に修飾される又はされている。より詳しくは、本出願人は、（ｉ）下等真核宿主細胞の内因性Ｏ−グリコシル化経路を弱化し（またはそのように弱化された宿主細胞を利用し）、（ｉｉ）特定のＯ−グリコシル化酵素をコードする異種遺伝子を発現させる工程により、該宿主細胞が、天然の下等真核生物免疫原性Ｏ−グリカンの代わりに特定のヒト様Ｏ−グリカンを有するタンパク質を産生しうることを見出した。記載されている変化および関心のある外因性遺伝子でのトランスフェクションの後、本出願人は、該修飾下等真核宿主細胞が、特定のヒト様Ｏ−グリコシル化を（そして特定の実施形態においてはヒト様Ｎ−グリコシル化をも）有する糖タンパク質（治療用糖タンパク質を含む）を産生しうることを見出した。図９および１０は、本発明で開示されている糖タンパク質のＯ−シアル酸化の増加がＢ６マウスにおけるバイオアベイラビリティの増加ならびにラットにおけるバイオアベイラビリティおよび血清半減期の両方の増加をどのように引き起こすのかを示している。また、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような下等真核宿主細胞は治療用糖タンパク質を高力価で産生することが可能であり、糖タンパク質の主要種は、哺乳類細胞において又は内因性グリコシル化装置を保有する下等真核宿主細胞において産生される治療用糖タンパク質と比較して改善された効力を示すヒトＯ−グリカン（および所望によりＮ−グリカン）を有する。
【００３３】
Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ２００７／０６１６３１の先行発明は、真菌Ｏ−グリカンを単一のＯ−結合マンノースへと還元するための方法を記載しているが、哺乳類細胞培養から観察される又はヒト由来の或るＯ−グリコフォームと類似または同一のＯ−グリコシル化を有するタンパク質を製造することが有利かもしれない。本発明の目的においては、哺乳類細胞から観察される又はヒト由来の或るＯ−グリコフォームと類似または同一のＯ−グリコシル化（本発明の目的においては「ヒト様」Ｏ−グリカン）を有するそのようなタンパク質は、（１）該タンパク質上のセリンまたはトレオニン残基に結合した単一マンノース残基に結合した末端ＧｌｃＮＡｃ（すなわち、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）、（２）該タンパク質上のセリンまたはトレオニン残基に結合した単一マンノース残基に結合した末端ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ（すなわち、前記の末端ＧｌｃＮＡｃに結合したガラクトース）（すなわち、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）、または（３）該タンパク質上のセリンまたはトレオニン残基に結合した単一マンノース残基に結合した末端ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ（すなわち、（２）に記載の末端ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌに結合したシアル酸）（すなわち、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ）を含むグリカンを主要Ｏ−グリカン種として有するタンパク質である。これらの構造は、神経細胞および他の脳関連または神経関連細胞上で典型的に観察されるＯ−グリカン構造と密接に関連している（Ｚａｍｚｅら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ；９：８２３−８３１（１９９９）を参照されたい）。哺乳類シアル酸化Ｏ−マンノースグリカンの最もよく研究されている一例はアルファ−ジストログリカン（「アルファ−ＤＧ」）である（Ｃｈｉｂａら，１９９７  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２：２１５６；Ｓａｓａｋｉら，１９９８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４２５：５９９）。アルファ−ＤＧは、成熟アルファ−ＤＧのＮ末端に位置するムチン様ドメイン内のＳｅｒ／Ｔｈｒ上にＯ−グリカン（シアル酸−アルファ−２，３−Ｇａｌ−ベータ−１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ベータ−１，２−マンノース）を「高い存在量」で含有する。Ｍａｎｙａら，２００７  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：２０２００はＯ−マンノシル化残基の少なくとも幾つかを特定した。
【００３４】
本発明は、ヒト様Ｏ−グリカン構造（本明細書中で定義されているもの）を主に含有する組換え糖タンパク質を下等真核生物発現系において製造するのに有用な方法および材料を提供する。酵母のような下等真核生物が糖タンパク質の発現に好ましい。なぜなら、それらは経済的に培養され、高い収率を示し、適当に修飾されると適当なグリコシル化が可能だからである。種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が細胞培養に特に適している。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。特定の実施形態においては、該下等真核生物はピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）またはピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）である。同様に、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などが、本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために使用されうる。
【００３５】
第１の態様として、本発明は、Ｏ−グリコシル化に関与する１以上の遺伝子、例えばベータ−マンノシルトランスフェラーゼ（ｂｍｔｓ；例えば、ＵＳ  ２００６／０２１１０８５およびＴｒｉｍｂｌｅ  Ｂら，２００３  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：２６５−２７４を参照されたい）、ホスホマンノーストランスフェラーゼ（例えば、Ｔｒｉｍｂｌｅ  ＲＢら，２００３  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：２６５−２７４を参照されたい）をコードするもの（これに限定されるものではない）またはＯ−グリコシル化に関与する１以上の追加的遺伝子のノックアウトおよび／または不活性化により修飾された、本発明の方法で使用するための下等真核宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、ノックアウトおよび／または不活性化されている、Ｏ−グリコシル化に関与するそのような１以上の遺伝子は、ベータ−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＢＭＴ１、２、３および４遺伝子；例えば、Ｍｉｌｌｅら，２００８  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６；ＵＳ  ２００６／０２１１０８５を参照されたい）またはホスホ−マンノーストランスフェラーゼ（例えば、ＭＮＮ４Ａ［ＭＮＮ４としても公知である］、ＭＮＮ４Ｂ［ＭＮＮ４Ｌ１またはＭＮＮＳとしても公知である；例えば、ＵＳ  ７，２５９，００１を参照されたい］およびＰＮＯ１［例えば、ＵＳ  ７，１９８，９２１を参照されたい］遺伝子；Ｌｉら，２００６  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５）から選択される酵素をコードする。特定の実施形態においては、ＫｔｒおよびＫｒｅ２／Ｍｎｔ１マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、Ｋｔｒ１およびＫｔｒ３をコードする遺伝子（ＫＴＲ１およびＫＴＲ３遺伝子）、ならびにアルファ１，２−マンノシルトランスフェラーゼＫｒｅ２をコードする遺伝子（ＫＲＥ２遺伝子；例えば米国特許第７，２１７，５４８号を参照されたい）は無傷なままであり、あるいはそれらが機能的タンパク質を産生するのを可能にする状態である。他の実施形態においては、Ｋｔｒ１をコードする遺伝子は欠失または不活性化されており、その他のＭＮＴ遺伝子は、それらが機能的タンパク質を産生するのを可能にする状態のままである。ＫＴＲ１の不活性化はＯ−Ｍａｎ１のレベルを２倍増加させることが見出された。特定の実施形態においては、Ｍｎｎ４ａ、Ｍｎｎ４ｂおよびＰｎｏ１をコードする遺伝子の少なくとも１つは欠失されている。他の実施形態においては、Ｋｔｒ１、Ｋｔｒ３およびＫｒｅ２をコードする遺伝子は欠失または不活性化されている。
【００３６】
遺伝子の破壊は、該遺伝子を破壊するのに、および／またはコード化タンパク質への翻訳を破壊するのに適した当技術分野のいずれかの方法により行われることが可能であり、該遺伝子のオープンリーディングフレームの破壊、オープンリーディングフレームの発現の破壊、または意図されるタンパク質をコードするＲＮＡの翻訳の阻止、および干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡの使用など（これらに限定されるものではない）を含む。適当な方法には、例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９９１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：２８１−３０１の方法、Ｂａｕｄｉｎら，１９９３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３３２９−３３３０のＰＣＲ媒介アプローチが含まれる。特定の実施形態においては、前記において具体的に記載されていない前記ファミリーの代替遺伝子は無傷（すなわち、未破壊）のままである。
【００３７】
第２の態様として、本発明は、ヒトまたは哺乳類Ｏ−結合グリコシル化経路に関与する組換え外因性（非天然）遺伝子を発現するように修飾された、本発明の方法で使用するための宿主細胞（特に、前記の第１の態様に記載されているもの）を提供する。特定の実施形態においては、該宿主細胞は、ヒトまたは哺乳類Ｏ−結合グリコシル化経路に関与する外因性遺伝子のそれぞれの剰余コピーを発現する。該細胞は、Ｏ−グリコシル化に関与する外因性遺伝子、特にタンパク質Ｏ−マンノースβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（「ＰｏｍＧｎＴ１」）またはその触媒ドメインをコードする遺伝子およびヒトまたは哺乳類Ｏ−グリコシル化経路における１以上の工程をもたらす酵素をコードする１以上の追加的遺伝子での細胞のトランスフェクションまたは形質転換により得られうる。該酵素には、以下の酵素またはそれらの触媒ドメインが含まれるが、それらに限定されるものではない：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体；α−１，２−マンノシダーゼ（例えば、ＷＯ  ２００７／０６１６３１を参照されたい）；β−１，４−ガラクトーストランスフェラーゼ（「β１，４ＧａｌＴ」）；ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＵＧＴ）；ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；α−２，６−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，６ＳｉａｌＴ」）；α−２，３−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，３ＳｉａｌＴ」）；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（「ＧＮＥ」）；Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（「ＳＰＳ」）；シアリラート−９−Ｐホスファターゼ（「ＳＰＰ」）；ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（「ＣＳＳ」）；およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）。追加的な実施形態においては、Ｏ−フコシル化の遺伝子をコードする核酸が付加されうる。Ｏ−フコースグリカンは、特定の実施形態においては、単糖Ｆｕｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒから、四糖ＮｅｕＡｃα２，３／６Ｇａｌβ１，３Ｆｕｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒならびにジ（二糖）−およびトリ（三糖）−中間体までの範囲のものでありうる。特定の実施形態においては、該宿主細胞は、フコース、ＮｅｕＡｃα、３／６  Ｇａｌβ１もしくはＦｕｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＧＤＰ−フコースタンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ；ＰＯＦＵＴ１）を付加するための遺伝子、および／またはＦｕｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／ＴｈｒにＧｌｃＮＡｃをβ１，３で付加するための１以上の遺伝子（マニック（Ｍａｎｉｃ）、ラジカル（Ｒａｄｉｃａｌ）および／またはルナチック・フリンジ（Ｌｕｎａｔｉｃ  Ｆｒｉｎｇｅ））をコードする核酸で形質転換される。導入される核酸は、真菌由来プロモーターおよび転写ターミネーター、ならびに小胞体（「ＥＲ」）−またはゴルジ−局在化膜貫通ドメインおよびシグナル配列を有する真菌由来リーダー配列に機能的に連結されうる。ＰｏｍＧｎｔ１、ベータ１，４ＧａｌＴ、α２，６ＳｉａｌＴおよびα２，３ＳｉａｌＴをコードする遺伝子は、特定の実施形態においては、真菌由来（特定の実施形態においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈ���ａｐａｓｔｏｒｉｓ）またはクライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ））プロモーターおよび転写ターミネーター、ならびに小胞体（「ＥＲ」）−またはゴルジ−局在化膜貫通ドメインおよびシグナル配列を有する真菌由来リーダー配列に機能的に連結されている。該シグナル配列は、新生タンパク質をＥＲへと導くように働く。該膜貫通ドメインは、該タンパク質をＥＲまたはゴルジ膜に局在化し、固着（ａｎｃｈｏｒ）するために利用される。α−１，２−マンノシダーゼをコードする遺伝子は、真菌に基づく（特定の実施形態においてはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）由来の）プロモーターおよび転写ターミネーターならびに真菌由来シグナル配列（特定の実施形態においては、該シグナル配列はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）アルファＭＡＴプレシグナル配列である）に機能的に連結されている。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ、ＧＮＥ、ＳＰＳ、ＳＰＰ、ＣＳＳおよびＣＳＴをコードする遺伝子は、真菌に基づく（特定の実施形態においてはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）由来の）プロモーターおよび転写ターミネーターに機能的に連結されている。特定の実施形態においては、使用されるプロモーターはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＯＸ１プロモーターまたはＧＡＰプロモーターである。他の実施形態においては、使用されるプロモーターはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＴＥＦプロモーターまたはＰＭＡプロモーターである。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１４４１−１４４３を参照されたい。特定の実施形態においては、α２，６ＳｉａｌＴ遺伝子はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＴＥＦプロモーターに機能的に連結されている。特定の実施形態においては、ＣＳＴ遺伝子はＰＭＡプロモーターに機能的に連結されている。
【００３８】
特定の実施形態においては、コードされるＰＯＭＧｎＴ１酵素または触媒ドメインはヒト、マウスまたはカエルのものであるか、あるいはそれらに由来する。
【００３９】
特定の実施形態においては、ＰＯＭＧｎＴ１酵素は配列番号１１０、配列番号１１２または配列番号１１８の配列を含む。特定の実施形態においては、該ＰＯＭＧｎＴ配列は配列番号１０９、配列番号１１１または配列番号１１７から選択される。配列番号１０９、１１１および１１７、ＰＯＭＧｎＴ１酵素をコードするコドン最適化配列は、本発明の特定の実施形態を構成する。
【００４０】
特定の実施形態においては、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体は、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはマウスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のものであるか、あるいはそれらに由来する。
【００４１】
本発明の細胞系および方法のアルファ１，２−マンノシダーゼはＯ−結合アルファ１，２−マンノース上で活性であるに違いない。特定の実施形態においては、該アルファ１，２−マンノシダーゼは真菌アルファ１，２−マンノシダーゼであり、特定の実施形態においては、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ−１，２−マンノシダーゼ、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、コクシディオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、コクシディオイデス・イミチス（Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓ）、例えば、受託番号ＥＡＳ３２２９０に記載されているもの、またはコクシディオイデス・ポサダシイ（Ｃ．ｐｏｓａｄａｓｉｉ）マンノシダーゼ、例えば、受託番号ＡＢＡ５４９１１に記載されているもの；例えば、２０１０年７月３０日付け出願の米国出願第６１／３６９１５７号［Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＧＦ２０１０．７１５８Ｌ０１ＵＳ］を参照されたい）、またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（例えば、Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ２００７／０６１６３１を参照されたい）アルファ−１，２−マンノシダーゼのものであるか、あるいはそれらに由来するものである。特定の実施形態においては、該アルファ−１，２−マンノシダーゼはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある。したがって、メタノール培地の交換に際して、該マンノシダーゼが発現されて、単一マンノース構造を与える。
【００４２】
本発明の細胞は、本明細書に記載されている刊行物における、および本明細書に記載されている、当技術分野で利用可能な方法を用いて製造されうる。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１４４１−１４４３およびＷＯ  ０７／１３６７５２を参照されたい。
【００４３】
宿主における外因性遺伝子の発現は、そのような宿主において機能的である調節領域の使用を要し、該調節領域は、天然であるのか又は非天然であるのか、あるいは使用される細胞系に導入されるのか又は該細胞系に存在するのかに無関係である。多種多様な転写、翻訳、局在化および他の調節配列が使用されうる。特定の実施形態においては、該調節配列は他の酵母または糸状菌のものである。特定の実施形態においては、該調節配列は、カエル、マウスまたはヒト配列（これらに限定されるものではない）を含む脊椎動物配列である。
【００４４】
前記のとおり、特定の場合には、該外因性遺伝子は、小胞体（「ＥＲ」）またはゴルジ局在化配列に機能的に連結されている。例えば、Ｃｈｏｉら，２００３  ＰＮＡＳ  １００：５０２２およびＵＳ  ７，４４９，３０８を参照されたい。使用されたＥＲまたはゴルジリーダー／局在化配列は、それに機能的に連結されている配列を小胞体または初期ゴルジへと標的化する。特定の実施形態においては、該ＥＲ／ゴルジリーダー配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）の、ＥＲおよび／またはゴルジに存在する膜タンパク質からの膜標的化領域である。特定の実施形態においては、該ＥＲ／ゴルジリーダー配列は、新生タンパク質をＥＲに導くためのシグナル配列と、以下のものから実質的になる局在化シグナルとを含む：（ｉ）所望の機能を可能にする期間にわたり、機能的に連結されたタンパク質をＥＲおよび／またはゴルジ内に保持しうる膜貫通ドメインのセグメントおよび細胞質尾部、（ｉｉ）全基部領域の一部または全部、あるいは（ｉｉｉ）全基部領域および所望により触媒ドメインの一部。特定の実施形態においては、ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ＳｃＭＮＳ１−ｓ、ＳｃＳＥＣ１２−ｍ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＳｃＫＲＥ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓまたはＳｃＭＮＮ６−ｓから選択されるタンパク質のＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列に由来するか、あるいはＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列である。特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ＳｃＭＮＳ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＰｐＫＲＥ２−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ５−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列に由来する。この範疇に含まれる或るリーダーは先行技術に開示されている。例えば、Ｃｈｏｉら，２００３  ＰＮＡＳ  １００：５０２２およびＵＳ  ７，４４９，３０８を参照されたい。開示されているリーダー、および転写ターミネーター配列を所望により含有する本明細書に記載の外因性遺伝子と該リーダーとを含むそれらの組合せは、その特定の実施形態を構成する。特定の実施形態はＰＭＴ、ＢＥＴ１、ＢＯＳ１およびＳＥＣ２２リーダーならびにリーダーの組合せ（本明細書に記載のもの）に関する。特に、本発明は、表１に開示されているリーダーおよびそれらの対応配列番号、特定の実施形態においては、リーダー＃３３〜３４、２７〜３２および３５〜５４、ならびに前記リーダーと外因性遺伝子とを含む組合せに関する。
【００４５】
特定の実施形態においては、ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ＧＬＳ１によりコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ−グルコシダーゼＩ、ＭＮＳ１によりコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ−１，２−マンノシダーゼ、ＥＲとゴルジとを循環するＳＥＣ１２によりコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ヌクレオチド交換因子、内在性ＥＲ膜伸長ドメインをコードするＰＭＴ１、２、３、４、５および６によりコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ、ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのＢＯＳ１、ＢＥＴ１およびＳＥＣ２２によりコードされるＳＮＡＲＥタンパク質から選択されるタンパク質のリーダー配列のものであるか、あるいは該リーダー配列のものに由来する。該領域は、典型的には、アミノ末端シグナル配列およびそれに続く膜貫通または他の固着（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）ドメインである。特定の実施形態においては、直前に挙げられている配列はＥＲ局在化配列として使用される。
【００４６】
特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｏｃｈ１ｐ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ９ｐ、Ｖａｎ１ｐ、Ａｎｐ１ｐ、Ｈｏｃ１ｐ、Ｍｎｎ１  ０ｐまたはＭｎｎ１  １ｐ（そして特定の実施形態においては、そのアミノ末端断片である）から選択されるタンパク質のリーダー配列のものであるか、あるいは該リーダー配列のものに由来する。特定の実施形態においては、直前に挙げられている配列は初期またはシス−ゴルジ局在化配列として使用される。
【００４７】
特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ１ｐまたはＭｎｎ６ｐ（そして特定の実施形態においては、そのアミノ末端断片である）から選択されるタンパク質のリーダー配列のものであるか、あるいは該リーダー配列のものに由来する。特定の実施形態においては、直前に挙げられている配列は後期ゴルジ局在化配列として使用される。
【００４８】
表１は、本発明において想定されるＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列の特定の実施形態を示す。追加的配列（配列番号を伴う）も本明細書中に示されている。配列番号１〜１０８のいずれかの使用が本発明において想定される。表２は、特定の開示リーダー配列をヒト「Ｈｓ」、マウス「Ｍｍ」またはカエル「Ｘｅｎ」ＰＯＭＧｎＴ１触媒ドメイン配列に融合し、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターからそれらを発現させた際に得られた結果を示す。本発明は、ヒト、マウスまたはカエルＰＯＭＧｎＴ１配列（該触媒ドメイン配列を含むが、これらに限定されるものではない）を使用し、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターまたはＧＡＰプロモーター（これらに限定されるものではない）を含む適当なプロモーターからそれらを発現させることを想定している。
【００４９】
特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、表１または２、配列番号１〜１０８から選択されるものであるか、あるいはＳｃＭＮＮ６−ｓｓ、ＳｃＰＭＴ１−ｓ、ＳｃＰＭＴ２−ｓ、ＳｃＰＭＴ３−ｓ、ＳｃＰＭＴ４−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｓまたはＳｃＰＭＴ６−ｓのリーダー配列に由来する。
【００５０】
特定の実施形態においては、ヒトＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列はリーダー配列に融合されており、該リーダー配列は、ＰｐＳＥＣ１２−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−Ｓから選択されるタンパク質のものであるか、あるいは該タンパク質のものに由来する。特定の実施形態においては、ヒトＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列は、配列番号３（または配列番号４をコードする配列）、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号７３（または配列番号７４をコードする配列）、配列番号８７（または配列番号８８をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択されるリーダー配列に融合されている。
【００５１】
特定の実施形態においては、マウスＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列はリーダー配列に融合されており、該リーダー配列は、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＰｐＫＲＥ２−ｓ、ＳｃＫＴＲ２−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ５−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＳｃＰＭＴ６−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｓ、ＰｐＰＭＴ２−ｓ、ＰｐＰＭＴ４−ｓまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のものであるか、あるいは該タンパク質のものに由来する。特定の実施形態においては、マウスＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列は、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号３３（または配列番号３４をコードする配列）、配列番号３７（または配列番号３８をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号４５（または配列番号４６をコードする配列）、配列番号５１（または配列番号５２をコードする配列）、配列番号７３（または配列番号７４をコードする配列）、配列番号７５（または配列番号７６をコードする配列）、配列番号７７（または配列番号７８をコードする配列）、配列番号７９（または配列番号８０をコードする配列）、配列番号８１（または配列番号８２をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択されるリーダー配列に融合されている。
【００５２】
特定の実施形態においては、カエルＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列はリーダー配列に融合されており、該リーダー配列は、ＳｃＭＮＳ１−ｓ、ＳｃＳＥＣ１２−ｍ、ＰｐＳＥＣ１２−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＳｃＡＮＰ１−ｓ、ＳｃＨＯＣ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ１０−ｓ、ＳｃＭＮＮ１１−ｓ、ＰｐＫＲＥ２−ｓ、ＳｃＫＴＲ２−ｓ、Ｋ１ＧＮＴ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のものであるか、あるいは該タンパク質のものに由来する。特定の実施形態においては、カエルＰＯＭＧｎＴ１配列またはその触媒ドメイン配列は、配列番号３（または配列番号４をコードする配列）、配列番号７（または配列番号８をコードする配列）、配列番号９（または配列番号１０をコードする配列）、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号１７（または配列番号１８をコードする配列）、配列番号１９（または配列番号２０をコードする配列）、配列番号２１（または配列番号２２をコードする配列）、配列番号２３（または配列番号２４をコードする配列）、配列番号３３（または配列番号３４をコードする配列）、配列番号３７（または配列番号３８をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号４９（または配列番号５０をコードする配列）、配列番号５１（または配列番号５２をコードする配列）、配列番号７３（または配列番号７４をコードする配列）、配列番号８７（または配列番号８８をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択されるリーダー配列に融合されている。
【００５３】
特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ＳｃＭＮＮ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＰｐＫｒｅ２−ｓ、Ｋ１Ｇｎｔ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ５−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍまたはＰｐＢＥＴ１−ｓから選択されるタンパク質のものであるか、あるいは該タンパク質のものに由来する。特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、配列番号４９（または配列番号５０をコードする配列）、配列番号１３（または配列番号１４をコードする配列）、配列番号３３（または配列番号３４をコードする配列）、配列番号３９（または配列番号４０をコードする配列）、配列番号４１（または配列番号４２をコードする配列）、配列番号４３（または配列番号４４をコードする配列）、配列番号４５（または配列番号４６をコードする配列）、配列番号５１（または配列番号５２をコードする配列）、配列番号９３（または配列番号９４をコードする配列）、配列番号８７（または配列番号８８をコードする配列）または配列番号１０５（または配列番号１０６をコードする配列）から選択される。
【００５４】
特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ＰｐＳＥＣ１２、ＳｃＭＮＮ９、ＰｐＫＲＥ２、ＳｃＫＴＲ２、Ｋ１ＧＮＴ１、ＳｃＭＮＮ２、ＳｃＭＮＮ６、ＳｃＰＭＴ５、ＰｐＰＭＴ１またはＰｐＢＥＴ１から選択されるタンパク質のものであるか、あるいは該タンパク質のものに由来する。
【００５５】
特定の実施形態においては、該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列は、ＳｃＭＮＮ９、Ｋ１ＧＮＴ１、ＳｃＭＮＮ２、ＳｃＰＭＴ５またはＰｐＢＥＴ１から選択されるタンパク質のものであるか、あるいは該タンパク質のものに由来する。
【００５６】
該ＥＲおよび／またはゴルジリーダー配列に融合されている外因性遺伝子はプロモーターに機能的に連結されている。該プロモーターは、それが融合されている外因性遺伝子の発現を駆動するいずれかのプロモーター要素、例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＯＸ１プロモーターまたはＧＡＰプロモーター（これらに限定されるものではない）でありうる。該リーダーがＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＰＭＴ５−ｍまたはＰｐＰＭＴ１−ｍである特定の好ましい実施形態においては、該プロモーターはＡＯＸ１である。
【００５７】
特定の実施形態は以下のプロモーター−リーダー−ＰＯＭＧｎＴ１配列の組合せを含む：ＡＯＸ１−ＰｐＫＲＥ２ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−Ｋ１ＧＮＴ１ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−Ｋ１ＧＮＴ１ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−Ｋ１ＧＮＴ１ｓ−カエルＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−ＳｃＭＮＮ２ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−ＳｃＭＮＮ５ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＡＯＸ１−ＳｃＭＮＮ５ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１、ＧＡＰ−ＳｃＭＮＮ６ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１またはＡＯＸ１−ＳｃＰＭＴ５ｍ−マウスＰＯＭＧｎＴ１。
【００５８】
特定の実施形態はＧＡＰ−ＳｃＭＮＮ６ｓ−ヒトＰＯＭＧｎＴ１プロモーター−リーダー−ＰＯＭＧｎＴ１配列の組合せを含む。
【００５９】
該外因性遺伝子はまた、ＳｃＣＹＣ１およびＰｐＡＯＸ１の転写終結配列（これらに限定されるものではない）を含む転写終結配列に機能的に連結されうる。
【００６０】
該外因性遺伝子はまた、所望により、シグナル配列（これに限定されるものではない）を含む追加的調節配列に機能的に連結されうる。
【００６１】
これらのリーダーは、例えば遊離Ｏ−グリカンのレクチン染色（レクチンＧＳ−ＩＩ）およびＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）分析による、Ｏ−Ｍａｎ１へのＧｌｃＮＡｃ転移を測定するように設計されたアッセイにおいて、良好に機能した。
【００６２】
第３の態様として、本発明は、関心のある組換え糖タンパク質を発現するように、該糖タンパク質をコードする外因性遺伝子での宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換により修飾された、本発明の方法で使用するための宿主細胞（特に、第１および第２態様において記載されているもの）を提供する。それにより、発現のための適当な条件下で培養されると、該宿主細胞は、特定のヒト様Ｏ−グリコシル化を含む改良された組換え糖タンパク質を発現し、分泌するであろう。
【００６３】
本発明の下等真核宿主細胞は、所望のヒト糖タンパク質、例えばヒト用治療薬または獣医用薬をコードする核酸を含む組換えベクターで形質転換されうる。該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、典型的にはＤＮＡでありうる。該糖タンパク質をコードする核酸は、該糖タンパク質の発現および分泌を可能にする調節配列に機能的に連結される。そのような調節配列は、該融合タンパク質をコードする核酸の上流、すなわち５’側のプロモーターおよび所望により使用されるエンハンサー、ならびに該糖タンパク質をコードする核酸の３’側、すなわち下流の転写終結部位を含む。分泌性糖タンパク質の場合、該核酸は、典型的には、シグナルペプチドを含む。該シグナルペプチドはグリコシル化および分泌のための分泌経路（典型的には小胞体）への該タンパク質の標的化をもたらす。該核酸は、典型的には、リボソーム結合部位を有する５’非翻訳領域および３’非翻訳領域をもコードする。該核酸は、しばしば、該糖タンパク質が発現される細胞において複製可能なベクターの成分である。該ベクターは、形質転換細胞の認識を可能にするマーカーをも含有しうる。しかし、幾つかの細胞型、特に酵母は、外来性ベクター配列を欠く核酸で成功裏に形質転換されうる。
【００６４】
所望の糖タンパク質をコードする核酸は幾つかの起源から得られうる。ｃＤＮＡ配列は、保存領域に対するプライマーを使用して、該糖タンパク質を発現することが知られている細胞系から増幅されうる（例えば、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５８１−５９６（１９９１）を参照されたい）。また、核酸は、科学文献中の配列に基づいて、新たに合成されうる。核酸は、所望の配列にわたる重複オリゴヌクレオチドの伸長によっても合成されうる（例えば、Ｃａｌｄａｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００）を参照されたい）。本発明において使用される核酸配列は、本発明の宿主細胞における、より良好な発現のために、公知技術を用いてコドン最適化されうる。好ましくは、遺伝暗号の縮重を用いれば、該治療用糖タンパク質をコードするいずれかのＤＮＡ配列によりコードされる一次アミノ酸配列は、そのようなコドン最適化によっても不変であろう。所望により、該組換え糖タンパク質の一次アミノ酸配列を発現させるために使用されるキメラＤＮＡ配列を改変することにより、１以上のＮ−グリコシル化部位を付加および／または除去することが可能である。好ましい実施形態においては、該宿主細胞は、可溶性ＴＮＦ−受容体融合分子（ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ）、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）またはヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードする核酸を含むベクターで形質転換される。
【００６５】
本発明において製造される組換え糖タンパク質は、好ましくは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＴＮＦ−受容体、または可溶性ＴＮＦ−受容体融合分子、例えばＥｎｂｒｅｌ（Ａｍｇｅｎ）（これらに限定されるものではない）を含むヒト治療用糖タンパク質を含む。ヒト治療用物質の場合、該組換え糖タンパク質は、好ましくは、ヒトまたは近縁種に由来する。組換え糖タンパク質は獣医学的適応症のために製造されることが可能であり、この場合、該組換え糖タンパク質配列は、好ましくは、意図される獣医対象のものと同一または近縁の種に由来する。
【００６６】
本発明の特定の実施形態は図１に一般的に例示されている。
【００６７】
他の実施形態においては、本発明は更に、ヒト様Ｏ−グリカンを主に有する組換え糖タンパク質の製造方法を含み、該製造方法は、ａ）下等真核宿主細胞を選択し、ｂ）該宿主細胞における１以上の内因性グリコシル化酵素の活性を弱化させ（工程（ａ）の宿主細胞がそのようには弱化されていない場合）、ｃ）Ｏ−結合マンノースβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＧｎＴ１）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体、アルファ−１，２マンノシダーゼおよび該糖タンパク質をコードする核酸配列で該宿主細胞を形質転換し、ｄ）該核酸配列の発現に適した条件下で該細胞を培養して、ヒト様Ｏ−グリカンを主に有する組換え糖タンパク質を産生させることを含む製造方法を含む。特定の実施形態においては、該宿主細胞は、以下の酵素またはそれらの触媒ドメイン（それらに限定されるものではない）をコードする核酸で更に形質転換される：β−１，４−ガラクトーストランスフェラーゼ（「β１，４ＧａｌＴ」）；ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＵＧＴ）；ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ；α−２，６−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，６ＳｉａｌＴ」）；α−２，３−シアル酸トランスフェラーゼ（「α２，３ＳｉａｌＴ」）；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（「ＧＮＥ」）；Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（「ＳＰＳ」）；シアリラート−９−Ｐホスファターゼ（「ＳＰＰ」）；ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（「ＣＳＳ」）；およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＳＴ）。特定の実施形態においては、該宿主細胞は、以下の酵素またはそれらの触媒ドメインをコードする核酸で更に形質転換される；β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体およびＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ。他の実施形態においては、該宿主細胞は、以下の酵素またはそれらの触媒ドメインをコードする核酸で更に形質転換される：β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ、α２，６ＳｉａｌＴ、ＧＮＥ、ＳＰＳ、ＳＰＰ，ＣＳＳおよびＣＳＴ。他の実施形態においては、該宿主細胞は、以下の酵素またはそれらの触媒ドメインをコードする核酸で更に形質転換される：β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ、α２，３ＳｉａｌＴ、ＧＮＥ、ＳＰＳ、ＳＰＰ、ＣＳＳおよびＣＳＴ。特定の実施形態においては、該宿主細胞は、シアル酸化に要する以下の５つの遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸の余剰コピーで形質転換される：α２，３ＳｉａｌＴ（またはα２，６ＳｉａｌＴ）、ＧＮＥ、ＳＰＳ、ＳＰＰ、ＣＳＳおよび／またはＣＳＴ。これらの５つの遺伝子をゲノム内の異なる遺伝子座内に組込む場合に、本出願人は、該剰余コピーの供与がより高い比率の所望のシアル酸化Ｏ−グリカンを与えることを見出した。更に詳細な実施形態は、前記細胞のいずれもがＫＴＲ１を更に発現しない場合である。該組換え糖タンパク質は単離され、精製され、医薬上許容される賦形剤で製剤化されて、治療用糖タンパク質組成物を与えうる。特定の実施形態においては、主要Ｏ−グリカンはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇ��ｌまたはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａである。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、下等真核宿主細胞におけるヒトまたは哺乳類Ｏ様グリコシル化を有する組換え糖タンパク質の製造方法に関する。該製造方法は、（１）（ａ）機能的な（ｉ）ベータ−マンノシルトランスフェラーゼ酵素ＢＭＴ１、２、３および４ならびに（ｉｉ）ホスホ−マンノーストランスフェラーゼ酵素Ｍｎｎ４ａ、Ｍｎｎ４ｂおよびＰｎｏ１を発現しない、ならびに（ｂ）機能的な（ｉ）ＰＯＭＧｎＴ１、（ｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体および（ｉｉｉ）α−１，２−マンノシダーゼ酵素を発現しない下等真核宿主細胞を準備し、（２）関心のある糖タンパク質をコードする外因性核酸で該下等真核宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、（３）該外因性核酸が発現され該組換え糖タンパク質が産生されるのを可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む。特定の実施形態においては、前記方法の細胞は、工程（１）（ｂ）の酵素をコードする外因性核酸を含む。特定の実施形態においては、該細胞は更に、β１，４ＧａｌＴ、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体およびＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼをコードする核酸を発現する。これらの追加的遺伝子は末端ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌの産生を可能にする。他の特定の実施形態においては、該細胞は更に、（ｉ）β１，４ＧａｌＴ、（ｉｉ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、（ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ、（ｉｖ）α２，６ＳｉａｌＴ、（ｖ）ＧＮＥ、（ｖｉ）ＳＰＳ、（ｖｉｉ）ＳＰＰ、（ｖｉｉｉ）ＣＳＳおよび（ｉｘ）ＣＳＴをコードする核酸を発現する。これらの追加的遺伝子は末端ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａの産生を可能にする。他の特定の実施形態においては、該細胞は更に、（ｉ）β１，４ＧａｌＴ、（ｉｉ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、（ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ、（ｉｖ）α２，３ＳｉａｌＴ、（ｖ）ＧＮＥ、（ｖｉ）ＳＰＳ、（ｖｉｉ）ＳＰＰ、（ｖｉｉｉ）ＣＳＳおよび（ｉｘ）ＣＳＴをコードする核酸を発現する。更に詳細な実施形態は、前記細胞のいずれもがＫｔｒ１を更に発現しない場合である。
【００６９】
細胞が「機能的」酵素を発現するかどうかの決定は、所望のＯ−グリコシル化工程に影響を及ぼしうるレベルで該酵素がその予想される機能を発揮しているかどうかに基づく。該活性が検出可能でない場合には、該細胞は機能的酵素を発現しない、と本発明においては理解される。前記工程（１）（ａ）の特定の実施形態においては、該細胞は該酵素または酵素活性を全く発現しない。該細胞が機能的酵素を発現する工程（１）（ｂ）の特定の実施形態においては、該細胞は該酵素の天然の又は予想される活性を発現する。（１）（ｂ）の特定の実施形態においては、該細胞は、全酵素をコードする核酸、または該活性を可能にするのに十分な該酵素の触媒ドメインをコードする核酸でトランスフェクトされる。
【００７０】
該方法は、特定の実施形態においては、本明細書に開示されている細胞系、核酸およびベクターを使用する。したがって、特定の実施形態においては、工程（ａ）の細胞は、該酵素をコードする核酸でトランスフェクトされる。これらの実施形態においては、ＰＯＭＧｎＴ１、β１，４ＧａｌＴ、α２，６ＳｉａｌＴおよびα２，３ＳｉａｌＴをコードする核酸は、真菌由来（特定の実施形態においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）に由来する）プロモーターおよび転写ターミネーター、ならびにシグナル配列と小胞体（「ＥＲ」）−またはゴルジ−局在化膜貫通ドメインとを有する真菌由来リーダー配列に機能的に連結される。該シグナル配列は、新生タンパク質をＥＲへと導くように働く。膜貫通ドメインは該タンパク質をＥＲまたはゴルジ膜に局在化し、固着する。α−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸は、真菌に基づく（特定の実施形態においては、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）由来の）プロモーターおよび転写ターミネーター、ならびに真菌由来のシグナル配列（特定の実施形態においては、該シグナル配列はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）アルファＭＡＴプレシグナル配列である）に機能的に連結されるべきである。ＵＤＰ−Ｇａｌエピメラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＧＮＥ、ＳＰＳ、ＳＰＰ、ＣＳＳおよびＣＳＴをコードする核酸は、真菌に基づく（特定の実施形態においては、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）由来の）プロモーターおよび転写ターミネーターに機能的に連結されるべきである。特定の実施形態においては、使用されるプロモーターはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＯＸ１プロモーターまたはＧＡＰプロモーターである。他の実施形態においては、使用されるプロモーターはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＴＥＦプロモーターまたはＰＭＡプロモーターである。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１４４１−１４４３を参照されたい。特定の実施形態においては、α２，６ＳｉａｌＴ遺伝子はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＴＥＦプロモーターに機能的に連結される。特定の実施形態においては、ＣＳＴ遺伝子はＰＭＡプロモーターに機能的に連結される。特定の実施形態は、本開示内に記載されている細胞系を使用する。本明細書に記載されている具体的な細胞系は本発明の特定の実施形態を構成する。
【００７１】
生じた細胞系におけるグリコシル化は、所望により、真菌Ｏ−グリコシル化の１以上の化学的インヒビターでの処理により調節（例えば、低減または排除）されうる。該化学的インヒビターには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、３−ヒドロキシ−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド、３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）−ベンズアルデヒド、５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸（ＷＯ  ２００７／０６１６３１を参照されたい；その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）。特定の実施形態においては、該インヒビターはタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（「Ｐｍｔ」）のインヒビターである。Ｏｒｃｈａｒｄら，ＥＰ  １３１３４７１を参照されたい。特定の実施形態においては、該インヒビターはＰＭＴｉ−３である（ＷＯ  ２００７／０６１６３１）。特定の実施形態においては、Ｐｍｔインヒビターは、ＷＯ  ０９／１４３０４１または米国出願第６１／３６９１５７（２０１０年７月３０日付け出願）［Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＧＦ２０１０．７１５８Ｌ０１ＵＳ］に記載されているものである。特定の実施形態においては、Ｐｍｔインヒビターは、シアル酸化Ｏ−グリカンの全レベルを制御し及び／又は種々のＯ−グリカン種の比率を変化させてシアル酸化Ｏ−グリカンの産生を有利にするために、開示されている方法において使用され、開示されている細胞（例えば、培地内のもの）に供給される。特定の実施形態においては、Ｐｍｔインヒビターは、例えばＢｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ  ０７／０６１６３１に記載されているとおり、誘導期に加えられる。特定の実施形態においては、Ｐｍｔインヒビターは、増殖している酵母に加えられ、メタノール誘導期に最高用量が加えられる。Ｐｍｔインヒビターの投与は、あるレベルのＯ−シアル酸化を引き起こすことにより該糖タンパク質組成物の薬動力学的特性に影響を及ぼすために用いられうる。望まれる個々のレベルは、当業者が認識するとおり、具体的な糖タンパク質に左右される。例えば、ある治療用糖タンパク質では、余りにも多数のシアル酸化Ｏ−グリカンが活性を妨げうるであろう。この場合、シアル酸化Ｏ−グリカンの総数の減少が活性を改善しうるであろう。特定の糖タンパク質の場合、末端ＧｌｃＮＡｃまたはガラクトースを有するＯ−グリカンはタンパク質活性および／または血清半減期を低減する。この後者の場合には、非常に高い比率のシアル酸化Ｏ−グリカンの達成が要求されうる。あるいは、最適な半減期には、最大数のシアル酸化Ｏ−グリカンが望まれることもあり、したがって、Ｐｍｔインヒビターをほとんど又は全く加えなくてもいいであろう。当業者は、所望の状況において適宜、これらの教示を利用す���ことが可能である。
【００７２】
本発明は更に、前記の修飾された下等真核細胞の製造方法、ならびに開示されている核酸ならびにそれを含むベクターおよび宿主細胞、組換え糖タンパク質を製造するための、該製造方法の使用を含む。
【００７３】
他の実施形態においては、本発明は、本発明の下等真核宿主細胞から製造される組換え糖タンパク質組成物を含む。これらの組換え糖タンパク質組成物は、ヒト様Ｏ−グリカンを主に含み、これは、好ましくは、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、またはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａから選択されうる。特定の実施形態においては、本発明は、５０％を超える（好ましくは、それぞれ、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および９７％を超える）前記のヒト様Ｏ−グリカン、および１５％未満（好ましくは、１０％未満および５％未満）のＯ−Ｍａｎ２グリカン（これは、Ｏ−グリコシル化セリン／トレオニン残基に結合した２個のマンノースを有するグリカンである）を含む組換え糖タンパク質組成物を製造する。特定の実施形態においては、本発明は、３０％を超える（好ましくは、それぞれ、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％および８３％を超える）Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌを含む組換え糖タンパク質組成物を製造する。特定の実施形態においては、本発明は、３０％を超える（好ましくは、それぞれ、４０％、５０％または５５％を超える）Ｏ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａを含む組換え糖タンパク質組成物を製造する。特定の実施形態においては、本発明は、記載されているとおりの前記組成物、そしてまた、３０％、２０％または１５％未満（好ましくは、１０％未満および５％未満）のＯ−Ｍａｎ２グリカンを含む実施形態、および本明細書に開示されている組成物の製造方法に関する。Ｏ−グリカンの決定は、関心のあるタンパク質に応じて、Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）または他の適当な方法（これらに限定されるものではない）を含む、当技術分野で容易に利用可能な方法を用いて行われうる。本明細書に開示されている方法および材料（ベクター、宿主細胞など）を用いて製造される組換え糖タンパク質および該糖タンパク質を含む組成物は、他の医薬上許容される活性物質および／または不活性賦形剤と共に製剤化されて、糖タンパク質組成物を与える。
【００７４】
本発明は更に、本明細書に記載されている細胞系、および本明細書に開示されている方法において使用される細胞系に関する。
【００７５】
本発明はまた、下等真核宿主生物、酵母および糸状菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒト様Ｎ−グリコシル化を有する治療用糖タンパク質の製造を可能にする最近の開発と組合せて使用されうる（例えば、Ｇｅｒａｇｒｏｓｓ，米国特許第７，０２９，８７２号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。下等真核生物、特に酵母は、Ｎ−グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように、遺伝的に修飾されうる。選択された内因性グリコシル化酵素を除去し、および／または外因性酵素を供給することにより（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，４４９，３０８号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり）、これは達成されうる。所望により、該糖タンパク質が、コアフコシル化を伴って又は伴わないで産生されうるように、該グリコシル化の追加的な遺伝的操作が行われうる。酵母のような下等真核宿主細胞の使用は更に有利である。なぜなら、これらの細胞は比較的均一な糖タンパク質組成物を産生して、該糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％以上で存在しうるようにするからである。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％以上、最も好ましくは、８０モル％以上で存在しうる。選択された内因性グリコシル化酵素を除去し、および／または外因性酵素を供給することにより（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり）、これは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカンにマンノース残基を付加するα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が激減するように選択または操作されうる。
【００７６】
特定の実施形態においては、本明細書に記載されている宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩまたはＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００７７】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，６２５，７５６号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００７８】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩまたはＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００７９】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生させることが可能である。
【００８０】
更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生する。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌の場合、該宿主細胞が、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。
【００８１】
前記宿主細胞はいずれも、米国特許第７，５９８，０５５号および米国公開特許出願第２００７／００３７２４８号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ  ＩＩＩ）および／または多アンテナ（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩおよびＧｎＴ  ＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。
【００８２】
更に詳細な実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生する。
【００８３】
更に詳細な実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生する。
【００８４】
更に詳細な態様においては、前記宿主細胞のいずれか、該宿主細胞は、フコシルトランスフェラーゼと、フコースを産生しフコースをＥＲまたはゴルジに輸送するための経路とを含むように更に修飾される。有するＮ−グリカンの１以上がフコシル化されている糖タンパク質をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が産生しうるようにするために、それを修飾するための方法の例は、公開国際出願番号ＷＯ  ２００８１１２０９２（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。本発明の特定の態様においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ、ＧＤＰ−フコース輸送体およびフコシルトランスフェラーゼを含むフコシル化経路を含むように更に修飾される。特定の態様においては、該フコシルトランスフェラーゼは、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，６−フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００８５】
種々の前記宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体）、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含みうる。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。
【００８６】
特定の実施形態においては、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカンにマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が激減するように選択され又は操作されうる。例えば、完全シアル酸化ヒト様Ｎ−グリカンを代替産生するように典型的な酵母型Ｎ−グリコシル化が修飾されている糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母株が作製されうる。第１に、酵母遺伝子ＯＣＨ１の欠失は、「外鎖」グリコシル化をもたらす酵素活性を排除する（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ；１００：５０２２−７（２００３））。ついでマンノシダーゼＩ（ＭＮＳＩ）遺伝子およびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）遺伝子が該株内に導入操作され、分泌経路に適切に局在化されて、哺乳類ハイブリッド型Ｎ−グリカンを効率的に産生しうる（Ｃｈｏｉら，２００３）。もう１つの工程において、マンノシダーゼＩＩ（ＭＮＳＩＩ）遺伝子およびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）遺伝子が次いで、該株内に導入操作れ、分泌経路に適切に局在化されて、哺乳類複合型Ｎ−グリカンを効率的に産生しうる（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３０１：１２４４−６．（２００３））。更に、ＵＤＰ−ガラクトースのプールを得るための酵素、適当なゴルジ膜輸送体、およびガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードする遺伝子を、この株内に導入操作することにより、末端β−１，４−ガラクトースを有する複合型ヒトＮ−グリカンを転移しうる酵母株が得られうる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ；１４：７５７−６６（２００４））。最後に、シアル酸のインビボ合成および転移に要する酵素を導入することにより（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３（５７９２）：１４４１−３（２００６））、シアル酸化グリカンが得られうる。前記で引用されている参考文献のそれぞれの開示を参照により本明細書に組み入れることとする。該組換えタンパク質上にグリコシル化が存在しない場合には、下等真核宿主細胞のグリコシル化装置をこのように操作する必要はない。更に、当業者は、該組換え糖タンパク質をコードする配列から１以上のＮ−グリコシル化部位を付加および／または除去することが可能である。そのような実施形態においては、本発明の糖タンパク質組成物は哺乳類様Ｎ−グリカンまたはヒト様Ｎ−グリカンを主に含む。本発明の下等真核宿主細胞は、所望により、ヒト様Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生するように操作されうる。好ましい実施形態においては、該宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＳｉａＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｉｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＳｉａＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＳｉａＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；またはＳｉａ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｇ��ｃＮＡｃ２から選択される主要Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する。好ましい実施形態においては、該主要Ｎ−グリカンは、該組成物中に存在する糖タンパク質上に存在する前記Ｎ−グリカンの少なくとも３０モル％、好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは少なくとも５０モル％を構成する。
【００８７】
したがって、本明細書に開示されている方法は、該主要Ｎ−グリカンが、複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択される、糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾されたいずれかの宿主細胞を使用することが可能であり、ここで、複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２かららなる群から選択されることが可能であり、ハイブリッドＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されることが可能であり、高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されることが可能である。更に、Ｎ−グリカン構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、例えば、米国公開出願第２００５０１７０４５２号に示されているものからなるＮ−グリカンを有する糖タンパク質が含まれる。
【００８８】
本発明は、下等真核宿主生物における既に記載されているＮ−グリコシル化のものと同様に、組換え糖タンパク質組成物の工業的規模の製造に使用されうる。また、本発明の方法および材料は獣医用途にも使用されうる。
【００８９】
本明細書に記載されているとおり、開示されている組換え製造された糖タンパク質、宿主細胞、核酸、ベクターおよび発現方法に関する、従前公知の発現方法と比較した場合の非自明な利点をもたらす、本発明の方法および材料の多数の属性が存在する。
【００９０】
最も顕著なことに、本発明は、現在の最先端の組換え製造された糖タンパク質治療用製品を改良するために使用されうる。本発明により製造されたグリコシル化タンパク質は、野生型酵母または他の下等真核宿主細胞から製造された糖タンパク質より低い免疫原性をヒトに対して示すと予想されうる。本発明により製造された組換え糖タンパク質のグリコシル化は、哺乳類細胞から製造された糖タンパク質組成物のグリコシル化より遥かに均一であると予想されうる。更に、前記のとおり、Ｏ−グリカンのヒト化は、薬物動態学的特性を改善してインビボ薬物活性のより良好な制御を促進することにより、治療用タンパク質の生物活性を増強しうる。
【００９１】
本明細書中に特に定められていない限り、本発明に関して用いられている全ての科学技術用語は、当業者に一般に理解されている意義を有する。更に、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる用語ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示されていない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書の全体にわたって引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００９２】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００９３】
以下の用語は、特に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００９４】
本明細書中で用いる「Ｏ−グリカン」および「Ｏ−グリコフォーム」なる語は互換的に用いられ、Ｏ−結合オリゴ糖、例えば、セリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基を介してペプチド鎖に結合したグリカンを意味する。真菌細胞においては、天然Ｏ−グリコシル化は、小胞体内のタンパク質にドリコールモノホスファートマンノース（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ）から転移された第１マンノシル残基の結合により生じ、ゴルジ装置におけるＧＰＤ−Ｍａｎからの転移により追加的なマンノシル残基が結合しうる。高等真核細胞、例えばヒトまたは哺乳類細胞は、セリンまたはトレオニン残基へのＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧｌｃＮａｃ）の共有結合によりＯ−グリコシル化を受けて、ムチン型グリカンを形成する。これは前記のα−ジストログリカン型グリカンに追加的なものである。
【００９５】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「Ｎグリコフォーム」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ−結合オリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、ゴルジ装置内で継続する。
【００９６】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。
【００９７】
本明細書中で用いる「ヒト様Ｏ−グリコシル化」なる語は、真菌特異的リン酸化およびベータ結合マンノース構造が減少し又は除去されて、電荷およびベータ−マンノース構造の減少または除去がもたらされること、あるいは糖タンパク質上または糖タンパク質の組成物中に存在する主要Ｏ−グリカン種が、ＧｌｃＮａｃ、ＧａｌまたはＳｉａから選択される末端残基でキャップ化（ｃａｐｐｅｄ）されたグリカンを含むことを意味すると理解されるであろう。このように、主にヒト様Ｏ−グリコシル化を含有する組換え糖タンパク質は、それが天然産生糖タンパク質であるかのように、ヒトまたは哺乳類細胞により認識されうる。このことは該組換え糖タンパク質の治療特性の改善をもたらす。
【００９８】
本明細書中で用いる略語は、当技術分野で一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
【００９９】
「単離（された）」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの種々の誘導体（例えば、ｃＤＮＡ）または混合重合体）は、天然ポリヌクレオチドにその天然宿主細胞において天然で付随する他の細胞成分（例えば、それに天然で付随するリボソーム、ポリメラーゼおよびゲノム配列）から実質的に分離されているものである。該用語は、（１）その天然に存在する環境から取り出された、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部を伴わない、（３）それが天然で結合しているポリヌクレオチドに機能的に連結されている、または（４）天然に存在しない核酸またはポリヌクレオチドを含む。「単離（された）」または「実質的に純粋」はまた、組換え若しくはクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体に関して用いられうる。
【０１００】
しかし、「単離（された）」は、そのように記載されている核酸またはポリヌクレオチド自体がその天然環境から物理的に取り出されていることを、必ずしも要しない。例えば、生物のゲノム内の内因性核酸配列は、この内因性核酸配列の発現が改変されるように該内因性核酸配列に隣接して異種配列が配置されている場合には、本明細書においては「単離されている」とみなされる。この場合、異種配列は、該異種配列自体が内因性である（同じ宿主細胞またはその後代に由来する）または外因性である（異なる宿主細胞またはその後代に由来する）か否かにかかわらず、該内因性核酸配列に天然で隣接していない配列である。例えば、宿主細胞のゲノム内の遺伝子の天然プロモーターは、あるプロモーター配列で（例えば、相同組換えにより）置換されて、改変された発現パターンをこの遺伝子が示すようにされうる。この遺伝子は今や「単離されている」であろう。なぜなら、それは、それに天然で隣接している配列の少なくとも一部から分離されているからである。
【０１０１】
核酸はまた、それが、ゲノム内の対応核酸に天然で見出されないいずれかの修飾を含有する場合に、「単離されている」とみなされる。例えば、内因性コード配列は、それが、例えばヒトにより介入により人工的に導入された挿入、欠失または点突然変異を含有する場合に、「単離されている」。「単離された核酸」はまた、非相同部位における宿主細胞染色体内およびエピソームとしての核酸構築物内に組込まれた核酸を含む。更に、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含有せず、または組換え技術により製造された場合には培地を実質的に含有せず、または化学合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含有しない。
【０１０２】
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸分子を運搬しうる核酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結されうるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。
【０１０３】
本明細書中で用いる「関心のある配列」または「関心のある遺伝子」なる語は、宿主細胞内で通常は産生されない、典型的にはタンパク質をコードする核酸配列を意味する。本明細書に開示されている方法は、宿主細胞ゲノム内に安定に組込まれた１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子の効率的発現を可能にする。関心のある配列の非限定的な例には、酵素活性を有する１以上のポリペプチド、例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする配列が含まれる。そのようにして製造されたタンパク質は「組換え」タンパク質と称される。
【０１０４】
「由来（する）」（「誘導された」）なる語は、該配列またはタンパク質が、それが由来するもの（「参照配列またはタンパク質」）と同じである、あるいはそれが、該参照配列またはタンパク質と比較してその機能に負の影響を及ぼさない若干の相違を有することを意味する。
【０１０５】
「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」なる語は、宿主細胞内の配列の存在または非存在に関する正または負の選択を可能にする活性を発現しうる核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されうるからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得ないことによっても選択されうる。マーカー配列または遺伝子は、正および負の両方の選択性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子の場合、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般に使用される。
【０１０６】
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するように、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびに関心のある遺伝子を制御するように、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
【０１０７】
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
【０１０８】
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。後の世代においては突然変異または環境の影響により或る修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
【０１０９】
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
【０１１０】
「下等真核細胞」なる語は、酵母、真菌、カラー（ｃｏｌｌａｒ）有鞭毛類、微胞子虫類、胞状虫類（ａｌｖｅｏｌａｔｅ）（例えば、渦鞭毛虫類）、ストラメノピル（ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ）（例えば、褐藻類、原虫類）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ）および他の原生生物を含む。酵母および糸状菌は、限定的なものではないが、以下のものを含む：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）。
【０１１１】
本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチドを意味する。本明細書中で用いる該用語は、構造的な、ひいては生物学的な機能を模倣した類似体および模倣体を含む。
【０１１２】
「ポリペプチド」なる語は、天然で生じるタンパク質および非天然で生じるタンパク質の両方、ならびにそれらの断片、突然変異体、誘導体および類似体を含む。ポリペプチドは単量体または重合体でありうる。さらに、ポリペプチドは、１以上の異なる活性をそれぞれが有する幾つかの異なるドメインを含みうる。
【０１１３】
「単離（された）タンパク質」または「単離（された）ポリペプチド」なる語は、その由来または誘導の起源に基づいて、（１）その天然状態でそれに付随する天然で結合している成分に結合していない、（２）天然で見出されない純度（純度は他の細胞物質の存在に関して判断されうる）で存在する（例えば、同一種の他のタンパク質を含有しない）、（３）異なる種の細胞により発現される、または（４）天然に存在しない（例えば、それは、天然で見出されるポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは、天然で見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の連結を含む）タンパク質またはポリペプチドを意味する。したがって、化学合成されたポリペプチド、または天然における産生由来細胞とは異なる細胞系内で合成されたポリペプチドは、その天然で付随する成分から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野でよく知られたタンパク質精製技術を用いる単離により、天然で付随する成分を実質的に含有しないものにされることが可能である。このような定義においては、「単離（された）」は、そのように示されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも要さない。
【０１１４】
本明細書中で用いられる「主に」なる語、またはその派生語、例えば「主要」または「主要である」は、用いられる文脈に応じて、糖タンパク質を酵素で処理し、遊離グリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した後で特定されうる、全Ｏ−グリカンまたはＮ−グリカンに対する最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関するものであると理解される。言い換えると、「主要（主に）」なる語は、他のいずれの個々の実体より大きなモル％で特定の「主要」グリコフォームが存在するような個々の実体として定められる。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、該組成物は種Ａを「主に」含む。
【０１１５】
特に定められていない限り、本明細書中で用いられている全ての科学技術用語は、本発明が関連する当業者に一般に理解されている意義を有する。以下に典型的な方法および材料を記載するが、本明細書に記載されているものに類似または均等な方法および材料も本発明の実施において用いられることが可能であり、当業者に明らかであろう。全ての刊行物および本明細書に記載されている他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先する。材料、方法および具体例は例示に過ぎず、いずれの様態においても限定的ではないと意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるシアル酸化Ｏ−マンノシルグリカンの製造方法の概要を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、株ＧＦＩ  ＳＯ−１由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを、株ＧＦＩ  ２．０由来のものと比較して示す。示されているのは、ＰＯＭＧｎＴ１を有さない株ＹＧＬＹ６４２８（パネルＡ）、およびマウスＰＯＭＧｎＴ１−ＳｃＭＮＮ６−ｓ融合体を含有する株ＹＧＬＹ７８７９（パネルＢ）において発現されたレポータータンパク質（ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ）上のＯ−グリカンに関するＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（方法に関しては後記を参照されたい）からのトレースである。結果は、アラビトール標準物と共移動するＹＧＬＹ７８７９におけるＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンを示している。アラビトールは、ＰＯＭＧｎＴ１を欠く株において〜１００ナノクーロン（ｎＣ）の最大測定値を典型的に与える濃度でサンプルに加えられる。しかし、相加効果を有するアラビトールとＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃとの両方の共溶出により、ＰＯＭＧｎＴ１を含有する株においては、その大きさは約４５０ｎＣまで増加する。大きさのこの増加は、Ｙ軸上に位置する丸印により示されている。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＧｌｃＮＡｃを除去するためのヘキソサミニダーゼ処理後の株ＧＦＩ  ＳＯ−１（ＹＧＬＹ７８７９［マウスＰＯＭＧｎＴ１−ＳｃＭＮＮ６−ｓ］）由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを示す。示されているのは、末端ＧｌｃＮＡｃを除去するためのヘキソサミニダーゼ処理の非存在下（パネルＡ）および存在下（パネルＢ）の株ＹＧＬＹ７８７９由来のグリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースである。該処理は推定アラビトール＋Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃピークの低下、遊離ＧｌｃＮＡｃであるＴ＝２３．９０９における新たなピークの出現、およびマンニトール（ｍａｎ１）ピークの増大をもたらす。これは、ＰＯＭＧｎＴ１含有ＧＦＩ  ＳＯ−１株におけるアラビトールと共移動する糖がＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃであることを証明している。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、株ＧＦＩ  ＳＯ−２由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを、株ＧＦＩ  ２．０由来のものと比較して示す。示されているのは、ＰＯＭＧｎＴ１を含有しないＧＦＩ  ２．０株ＹＧＬＹ６４２８由来（パネルＡ）ならびにガラクトース転移遺伝子およびヒトＰＯＭＧｎＴ１−ＳｃＭＮＮ２−ｓを含有するＧＦＩ  ＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０由来（パネルＢ）のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースである。結果は、Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌである〜Ｔ＝２１．３８において移動するＹＧＬＹ７８８０における新たなＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンを示している。Ｔ＝２１．３８において溶出するピークが該装置によりソルビトールのピークとして示されていることに注目されたい。これは、このピークが、検量中に定められたソルビトール標準ピークの範囲内で溶出するからである。このピークがＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌである（ガラクトシダーゼおよびヘキソサミニダーゼ処理でのその加水分解によるものである）ことが図５から明らかである。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ガラクトシダーゼおよびヘキソサミニダーゼで処理されたＧＦＩＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを示す。示されているのは、末端ガラクトースを除去するガラクトシダーゼおよび末端ＧｌｃＮＡｃを除去するヘキソサミニダーゼでの処理に付されていない（パネルＡ）または該処理に付された（パネルＢ）、ＧＦＩ  ＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースである。該処理は、推定Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌピークの消失、Ｔ＝２３．９０９における遊離ＧｌｃＮＡｃのピークの出現、マンニトール（ｍａｎ１）ピークの増大、およびＴ＝３８．３５におけるガラクトースピークの出現をもたらす。これらの結果は、〜Ｔ＝２１．３８において移動するＧＦＩ  ＳＯ−２株におけるＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンがＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌであることを示している。Ｔ＝２１．３８において溶出するピークは該装置によりソルビトールピークとして表示されていることに注目されたい（図４を参照されたい）。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼおよびヘキソサミニダーゼで処理されたＧＦＩ  ＳＯ−３株ＹＧＬＹ８７５０（ｍｕｓＰＯＭＧｎＴ１−ＳｃＭＮＮ６−ｓ）由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを示す。示されているのは、末端シアル酸を除去するノイラミニダーゼ、末端ガラクトースを除去するガラクトシダーゼ、および末端ＧｌｃＮＡｃを除去するヘキソサミニダーゼでの処理に付されていない（パネルＡ）または該処理に付された（パネルＢ）、ＹＧＬＹ８７５０由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースである。全ての可能な種を得るために、酵素の亜最適用量を加えた。該処理は、Ｔ＝４５．８における推定Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸ピークの低下、Ｔ＝２１．７におけるＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌピークの低下、Ｔ＝２３．５における遊離ＧｌｃＮＡｃのピークの出現、マンニトール（ｍａｎ１）ピークの増大、およびＴ＝３７．９におけるガラクトースピークの出現をもたらす。これらの結果は、〜Ｔ＝４５．８において移動するＧＦＩ  ＳＯ−３株におけるＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンがＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸であることを示している。
【図７】図７は、末端シアル酸を検出するためのレクチンＳＮＡ−１−ＡＰでのウエスタンブロッティングを示す。示されているのは、サンプル１〜１２におけるＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質レベルを示すクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（下）、およびアルカリホスファターゼ結合レクチンＳＮＡ−１による検出を用いるウエスタンブロット（上）である。レーン１〜９は、シアル酸化ベクターｐＧＬＹ１７５８で形質転換されたＧＦＩ  ＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０の３つの別々のコロニーからの上清（２、６および１０μＬ／株）であり、レーン１０〜１２は未形質転換ＹＧＬＹ７８８０からのものである。レクチンＳＮＡ−１は末端シアル酸に結合して、シアル酸の合成および転移のための遺伝子を含有する株ＧＦＩ  ＳＯ−３におけるＯ−グリカン上の末端シアル酸を検出するであろう。結果は、ＧＦＩ  ＳＯ−３株由来のサンプル１〜９からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃへの強力なレクチン結合を示しているが、シアル酸を転移する能力を欠くＧＦＩ  ＳＯ−２株由来のサンプル１０〜１２からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃへの結合を全く示していない。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、本明細書に記載されているとおりにＯ−シアル酸化のために最適化されたＧＦＩ  ＳＯ−３株ＹＧＬＹ１１６０３（ｍｕｓＰＯＭＧｎＴ１−ＳｃＭＮＮ６−ｓ）由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを示す。パネルＡはＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースを示す。パネルＢは各主要Ｏ−グリカン種の比率を一覧している。
【図９】図９は、糖タンパク質のＯ−グリコシル化の増加がＢ６マウスにおけるバイオアベイラビリティの増加をどのように引き起こすかを示す。種々の用量のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの皮下投与の４８時間後のマウスの血清濃度が示されている。全シアル酸含量（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は以下のとおりであった：形態５−Ａ：２１；形態５−Ｂ：１６；および形態５−Ｃ：１１。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、糖タンパク質のＯ−シアル酸化の増加がラットにおける血清半減期の増加をどのように引き起こすかを示す。１ｍｇ／ｋｇでの静脈内（「ＩＶ」）［図１０Ａ］および皮下（「ＳＣ」）［図１０Ｂ］投与後の血清時間−濃度曲線が示されている。全シアル酸含量（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は以下のとおりであった：形態５−Ａ：２１；形態５−Ｂ：１６；および形態５−Ｃ：１１。
【図１１】図１１はＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１発現／組込みベクターｐＧＬＹ３１３６を示す。  以下の実施例は、ある好ましい実施形態に関して本発明の実施を例示するものであり、いかなる点においても、本明細書および特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。当業者により容易に理解されるとおり、本明細書を読めば、本明細書に記載され特許請求されている本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法および材料に対する多数の修飾が可能である。
【０１１７】
実施例
以下の実施例においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）種の宿主細胞において組換え糖タンパク質を発現させる。該宿主細胞は、ヒト様Ｏ−グリコシル化およびヒト様Ｎ−グリコシル化を有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。これらの実施例は本発明の特定の好ましい実施形態に関して本発明を実証するものであり、いかなる様態においても限定的なものではない。
【０１１８】
当業者により容易に理解されるとおり、本明細書における開示および実施例を読めば、本明細書および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当技術分野の技量の範囲内の多数の修飾、置換、適合化および改良が施されうる。したがって、該実施例は非限定的であり、本明細書に記載されている方法および材料は、適当な修飾を伴って、他の下等真核生物における本発明の実施のために使用されうる。
【０１１９】
実施例１
ＥＲおよびゴルジ標的化配列のクローニング
哺乳類および酵母のＥＲおよびゴルジにおけるグリコシルトランスフェラーゼのほとんどは、短いアミノ末端細胞質尾部およびそれに続く膜貫通ドメイン［ＴＭＤ］、短いステム領域ならびに大きなカルボキシ末端触媒ドメイン（ＥＲルーメンまたはゴルジにおけるもの）からなるＩＩ型膜タンパク質である（Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｐ．Ａ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｏｌｇｉ  ａｐｐａｒａｔｕｓ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９，５１７−５３２（１９９８））。Ｐｍｔ（タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ；Ｓｔｒａｈｌ−Ｂｏｌｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏ−ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２６：２９７（１９９９）；Ｔａｎｎｅｒら，米国特許第５，７１４，３７７号）により代表されるグリコシルトランスフェラーゼのもう１つの群は複数の膜伸長ドメインを含有する。非常に多様な標的化配列を試験したかったため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＥＲおよびゴルジに存在する種々の長さの膜タンパク質の膜標的化領域をコードするＤＮＡ断片を増幅した。ＩＩ型膜タンパク質の場合、最短断片（「−ｓ」で示される）は細胞質尾部およびＴＭＤのみを含有していた。中間的な長さの断片（「−ｍ」で示される）はまた、ステム領域の一部または全部を含有していた。最長断片（「−ｌ」で示される）は、全ステム領域、そしてまた、触媒ドメインの一部を含有していた。ＩＩ型膜タンパク質由来の標的化ドメイン（ＴＤ）の詳細な説明はＧｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ  ７，４４９，３０８（例えば、表５）およびＣｈｏｉら，２００３  ＰＮＡＳ  １００：５０２２に見出されうる。他の内在性膜タンパク質に関しては、最短膜伸長領域（「−ｓ」で示される）、または複数の膜伸長ドメインを含む領域（「−ｍ」で示される）を選んだ。
【０１２０】
本実施例においては、使用したＥＲ標的化ドメインは、ＧＬＳ１によりコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ−グルコシダーゼＩ、ＭＮＳ１によりコードされるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ１，２−マンノシダーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ヌクレオチド交換因子ＳＥＣＩ２（これはＥＲとゴルジとの間を循環する）の断片、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のＢＯＳ１、ＢＥＴ１およびＳＥＣ２２によりコードされるＳＮＡＲＥタンパク質からのドメインおよび内在性ＥＲ膜伸長ドメインをコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＴ１、２、３、４、５および６からの断片であった。
【０１２１】
初期またはシス−ゴルジに対する標的化ドメインとして、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｏｃｈ１ｐの、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）マンナンポリメラーゼＭ−Ｐｏｌ  ＩおよびＭ−Ｐｏｌ  ＩＩを構成するタンパク質、すなわち、Ｍｎｎ９ｐ、Ｖａｎ１ｐ、Ａｎｐ１ｐ、Ｈｏｃ１ｐ、Ｍｎｎ１０ｐおよびＭｎｎ１１ｐのアミノ末端断片を選択した。中期ゴルジに対する標的化シグナルを、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｋｒｅ２ｐ、Ｋｔｒ１ｐ、Ｍｎｎ２ｐ、Ｍｎｎ５ｐおよびＹｕｒ１ｐから、クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）Ｇｎｔ１ｐから、ならびにＫｔｒ１ｐ、Ｋｔｒ３ｐおよびＫｒｅ２ｐに対する相同性を有するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）タンパク質から誘導した（未公開の結果）。
【０１２２】
後期ゴルジに対する標的化ドメインとして、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ１ｐおよびＭｎｎ６ｐのアミノ末端領域を加えた。標的化ドメインの完全な一覧を表１に示し、ＤＮＡおよびタンパク質配列を配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）として示す。
【０１２３】
【表１】
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ＥＲ／ゴルジ膜貫通ドメイン（リーダー）の配列
ＤＮＡおよびそれに続くアミノ酸配列
【０１２４】
【化１】
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実施例２
標的化ドメイン（「ＴＤ」）ライブラリーの構築
全てのＴＤを、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）および鋳型としてのそれぞれの真菌ゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、配列決定した。該５’−オリゴはＮｏｔＩ部位およびＣＡＣＣコザックコンセンサス配列を天然ＡＴＧの直上流に導入した。ＰｐＳＥＣ１２またはＳｃＳＥＣ１２に由来するリーダーの場合、ＴＤの第１アミノ酸のコドンをＡＴＧに変化させた。該３’−オリゴはＡｓｃＩ部位および追加的なＣ（これは、ＧｌｙＡｒｇＡｌａをコードする融合リンカーを与えた）を導入した。標的化ドメイン含有プラスミドの増幅の後、３６μｇのそれぞれを５０単位のＡｓｃＩで４時間消化した。ついで該線状化ＤＮＡをエタノール沈殿させ、６０単位のＮｏｔＩで１５時間消化し、生じたインサートをアガロースゲル上の２つの連続的なラウンドの分離により精製した。８７〜２１９ヌクレオチドの範囲の断片の場合、２％アガロースを使用し、２４０〜４２６ヌクレオチドの断片の場合、１．５％アガロースを使用し、４３５〜１０９８ヌクレオチドの場合、１．０％アガロースを使用した。１．２ｐｍｏｌのそれぞれを１００μｌまで希釈し、９６ウェルプレート内に配置し、−８０℃で保存した。
【０１２５】
実施例３
ＰＯＭＧｎＴ１発現ベクターの作製
ヒト、マウス、ニワトリ、魚類およびカエルＰＯＭＧｎＴ１タンパク質の触媒ドメインをコードする核酸（ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関してコドン最適化）が、後記に一覧されているＧｅｎＢａｎｋ寄託物から得られたアミノ酸配列を使用してＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。ヒト、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびゼノプスＰＯＭＧｎＴ１の非コドン最適化配列は先行技術において開示されている。例えば、ヒトに関してはＱ８ＷＺＡ１、マウスに関してはＮＰ ０８０９２７、ニワトリに関してはＸＰ ４２６６５３、ゼブラフィッシュに関してはＮＰ ００１０３６１５２、およびゼノプスに関してはＡＡＨ８４７４７を参照されたい。ＰＯＭＧｎＴ１のＣ末端触媒ドメインをコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１０９〜１１８）が示されている。該配列は天然Ｎ末端シグナル配列および膜貫通固着領域を欠く。該核酸配列はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されている。全ての場合において、インフレームＡｓｃＩ部位を５’末端に付加し、そしてＰａｃ１部位を終止コドンの３’側に直接隣接して付加した。
【０１２６】
【化２】
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実施例４
ｐＧＬＹ５７９およびｐＧＬＹ４８６３の作製
ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体を受容するベクターはｐＧＬＹ５７９（ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーター（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））下に配置する）およびｐＧＬＹ４８６３（ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））下）であった。ｐＧＬＹ５７９は、ＰｐＨＩＳ３  ＯＲＦ、およびそれとは別に、該ＰｐＨＩＳ３  ＯＲＦの３’側に直接隣接して位置するヌクレオチドを含有する二重交差組込みベクターである。プライマーＰｐＨＩＳ３  １（配列番号１１９）およびＰｐＨＩＳ３  ２（配列番号１２０）を使用するＰＣＲにより、ＰｐＨＩＳ３  ＯＲＦ（５’アーム）を作製した。得られたＤＮＡを示す（配列番号１２１）。プライマーＰｐＨＩＳ３  ３（配列番号１２２）およびＰｐＨＩＳ３  ４（配列番号１２３）を使用するＰＣＲにより、ＰｐＨＩＳ３  ３’断片（３’アーム）を作製した。得られたＤＮＡを示す（配列番号１２４）。該鋳型は野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ）からのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡであった。該ＰＣＲ断片を、まず、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、配列決定した。ついでＰｐＨＩＳ３組込みアームを、５’アームの場合には酵素ＦｓｅＩおよびＳａｃＩを、そして３’アームの場合にはＳｗａＩおよびＳａｌＩを使用して、ｐＧＬＹ５６６内に連続的にサブクローニングして、ｐＧＬＹ５７９を得た。例えば、ＷＯ  ０７／１３６８６５を参照されたい。ＰｐＨＩＳ３  ５’アームの直下流に位置しているのは、ＰｐＡＬＧ３転写ターミネーター（ＴＴ）配列を含むＤＮＡ断片であり、これを、プライマーＰｐＡＬＧ３ＴＴ−ｆ（配列番号１２５）およびＰｐＡＬＧ３ＴＴ−ｒｅｖ（配列番号１２６）を使用するＰＣＲによりクローニングして、示されているＤＮＡ断片（配列番号１２７）を得た。該ＰｐＡＬＧ３ＴＴを、フランキングＦｓｅ１およびＰｍｅ１制限部位を使用してサブクローニングした。ｐＧＬＹ５７９内のＰｐＨＩＳ３断片間に位置しているのは、ＵＲＡ５マーカー（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３））、ならびにＮｏｔ１およびＰａｃ１制限部位により隔てられたＰｐＧＡＰプロモーターおよびＳｃＣＹＣ１転写ターミネーターからなる発現カセットである。ＰｐＧＡＰプロモーター配列（配列番号１２８）およびＳｃＣＹＣ１転写ターミネーター配列（配列番号１２９）が示されている。該ＰｐＧＡＰプロモーターを、ＸｈｏＩおよびＮｏｔ１部位を使用してメタノール誘導性ＰｐＡＯＸ１プロモーターで置換して、ｐＧＬＹ４８６３を得た。該ＰｐＡＯＸ１プロモーター配列を示す（配列番号１３０）。
【０１２７】
【化３】
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実施例５
ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ライブラリーの作製
ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１発現／組込みベクターの構築を後記のとおりに行った。ＰＰＭＧｎＴ１触媒ドメインをＡｓｃＩおよびＰａｃＩでの消化の後のＧｅｎＡｒｔベクターから単離し、組込みプラスミドｐＧＬＹ５７９（ＧＡＰｐ駆動性発現の場合）およびｐＧＬＹ４８６３（ＡＯＸ１ｐ駆動性発現の場合）内にクローニングした。ついで、アガロースゲルで精製された標的化ドメイン（ＴＤ）断片をハイスループット形態でこれらのプラスミド内にインフレームで連結して、融合ライブラリーを得た。３０μｇの各ＰＯＭＧｎＴ１触媒ドメイン含有ベクターを１０単位のＡｓｃＩで一晩消化した。午前中に、別の１０単位を加え、インキュベーションを更に１時間継続した。線状化ＤＮＡをエタノール沈殿させ、５０単位のＮｏｔＩと共に４時間インキュベートした。ついで２０単位のウシ腸アルカリホスファターゼを加え、インキュベーションを更に１時間継続した。アガロースゲル抽出による精製の後、該ＤＮＡを３ｎＭに希釈し、２．５μｌを９６ウェルＰＣＲプレート内にローディングした。ついで、単離された標的化ドメインＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ断片（前記を参照されたい）の１２ｎＭ溶液２．５μｌを加えた。５μｌの２×連結バッファーおよび０．５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ（ＮＥＢ）の添加の後、該連結を室温（「ＲＴ」）で５分間進行させ、２μｌの該連結混合物を、９６ウェルプレート内に配置された、Ｈａｎａｈａｎら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０４：６３−１１３（１９９１））の方法に従いコンピテントにされた５０μｌの大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)株ＤＨ５αに加えた。該混合物を氷上で２０分間インキュベートし、４２℃で１分間の熱ショックに付し、カタボライト抑制を伴うＳｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌブロス（「ＳＯＣ」）の２００μｌを該９６ウェルプレートの各ウェルに加え、該細胞を３７℃で１時間回収した。ついで各形質転換混合物のうちの２００μｌを単一ＬＢ  Ａｍｐプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートした。本発明者らは、常套的に、プレート当たり１０〜１０００コロニーを得た（これに対して、インサート非含有対照上では０〜１０コロニーであった）。該連結反応がインフレーム融合体を与えたかどうかを評価するために、プラスミドＤＮＡを単離し、ＡｓｃＩ制限消化を行った。これは、ＡｓｃＩ部位が再生さていれれば、真正なインフレーム融合体が生じていることに基づくものであった。これは全ての場合の９９％以上に当てはまることが判明した。ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１発現／組込みベクターｐＧＬＹ３１３６の一例を図１１に示す。
【０１２８】
酵母株内への形質転換の前に、該プラスミドをＳｆｉＩで消化した。これは、ＨＩＳ３配列に隣接する部位で切断して、プロモーター−ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１−転写ターミネーター＋ＵＲＡ５マーカー（ＨＩＳ３  ５’および３’組込み配列に隣接する）を含有するＤＮＡ断片を遊離させる。
【０１２９】
実施例６
株ＧＦＩ２．０の作製
株ｙＧＬＹ１４（ｏｃｈｌΔ：：ｌａｃＺ，ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２，ｍｎｎ４ｂΔ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３，ｐｎｏｌΔｍｎｎ４ａΔ：：ｌａｃＺ）から誘導され、既に記載されている方法（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４（２００３）ならびにＷＯ  ０７／１３６７５２）を用いて構築された株ＹＧＬＹ７８７７（ＧＦＩ２．０、図１）内に、エレクトロポレーション（後記の方法）により、ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ライブラリーを形質転換した。簡潔に説明すると、ホスホマンノーストランスフェラーゼＰｎｏ１、Ｍｎｎ−４ａおよびＭｎｎ４ｂ（Ｌｉら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２４：２１０−５（２００６））ならびにベータ−マンノーストランスフェラーゼＢＭＴ２（Ｍｉｌｌｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−３６（２００８））をコードする遺伝子を野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０において欠失させて、ＹＧＬＹ−１４（株ＧＦＩ  １．０、図１）を得た。本発明者らの糖操作方法における下流工程の数を最小にするために、２つのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体を該ノックアウトベクター内に含めた。クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体をＢＭＴ２欠失ベクター内に挿入し、マウスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体をＭＮＮ４Ｂ欠失ベクター内に挿入した。これは遺伝子欠失の部位におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体遺伝子の安定な組込みを可能にした。初期工程において、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３））を使用してＹＧＬＹ１４を対抗選択して、ウラシル栄養要求性株ＹＧＬＹ−１６を得た。これはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ−１，２−マンノシダーゼ（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ  ２００７／０６１６３１）発現ベクターｐＧＬＹ１８９６の受容物であった。得られた株ＹＧＬＹ６３６１を５−ＦＯＡで再び対抗選択して、ウラシル栄養要求性ＹＧＬＹ２００４を得た。ついで、ベータ−マンノーストランスフェラーゼＢＭＴ１、３、４（Ｍｉｌｌｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−３６（２００８））をコードする遺伝子を、再循環可能なＵＲＡ５マーカー（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３）を参照されたい）を使用して欠失させて、ＹＧＬＹ７８２７（ＧＦＩ２．０、図１）を得た。ついでＹＧＬＹ７８２７を、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃレポータータンパク質をコードする発現ベクターｐＧＬＹ３４６５で形質転換して（後記の方法）、ＹＧＬＹ７８７７を得た。前記形質転換、そしてまた、ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ライブラリーでの形質転換の場合、ＵＲＡ５マーカーの組込みに関して選択するために、ウラシルを欠く最少培地上で形質転換体を選択した。
【０１３０】
実施例７
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ発現ベクターｐＧＬＹ３４６５の作製
発現プラスミドベクターｐＧＬＹ３４６５は、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ１融合タンパク質をコードするメタノール誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターの制御下で発現カセットを含有する。該ＴＮＦＲ−ＩｇＧ１断片は、ＧｅｎｅＡｒｔにより、５’ＰｖｕＩＩおよび３’ＦｓｅＩクローニング部位でコドン最適化された（配列番号１３１）。該ＧｅｎｅＡｒｔベクターをｐＧＬＹ３４３１と命名した。ｐＧＬＹ３４３１からのＴＮＦＲドメインをｐＧＬＹ１４７７（同様にＧｅｎｅＡｒｔにより合成されたもの）からの代替的ＩｇＧ１  ＦｃドメインにＰＣＲにより融合させて、ＤＮＡ配列（配列番号１３２）を得た。特に、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１３３および１３４を有するプライマーを使用して、ｐＧＬＹ３４３１から該ＴＮＦＲドメインを増幅し、配列番号１３５および１３６を有するプライマーを使用して、ｐＧＬＹ１４７７から該ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを増幅した。ついでこれらの断片の両方を、配列番号１３３および１３６を使用するプライマーを使用するＰＣＲにより互いに融合させた。該ＴＮＦＲ−ＩｇＧ１をＮ末端において、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）プレシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１３７）に融合させた。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入したオリゴヌクレオチドを使用して、ＨＳＡシグナル配列（ｓｓ）をコードするＤＮＡを作製した。ＨＳＡｓｓへのＴＮＦＲ−ＩｇＧ１の融合は、ユニーク５’ＥｃｏＲ１および３’Ｆｓｅ１部位を有するＤＮＡ断片（配列番号１３９を有するタンパク質をコードする配列番号１３８）を与えた。ＨＳＡｓｓ−ＴＮＦＲ−ＩｇＧ１融合タンパク質をコードする核酸断片を、５’ＥｃｏＲ１および３’Ｆｓｅ１ユニーク部位を使用して、発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２１９８（これはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２標的化核酸およびゼオシン耐性マーカーを含有し、ＡＯＸ１プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣターミネーターの制御下の発現カセットを与える）内にサブクローニングして、プラスミドｐＧＬＹ３４６５を得た。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）内へのｐＧＬＹ３４６５の形質転換の後、メタノール誘導は、配列番号１４０のタンパク質配列を有するＴＮＦＲ−ＩｇＧ１の分泌をもたらす。ゼオシンを含有する豊富な培地上で形質転換体を選択した。
【０１３１】
【化４】
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実施例８
酵母形質転換
全ての酵母形質転換は以下のとおりであった。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を５０ｍLのＹＰＤ培地（酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））内で約０．２〜６の光学密度（「ＯＤ」）まで一晩増殖させた。氷上の３０分間のインキュベーションの後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。培地を除去し、該細胞を氷冷無菌１Ｍ  ソルビトールで３回洗浄した後、０．５ｍｌの氷冷無菌１Ｍ  ソルビトールに再懸濁させた。１０μＬの線状化ＤＮＡ（５〜２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット内で一緒にし、氷上で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、予め定められたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００オーム）に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌにおいて行い、その直後に、１ｍＬのＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍ  ソルビトール）を加えた。該形質転換細胞を室温（２６℃）で４時間〜一晩回収した後、該細胞を選択培地上でプレーティングした。
【０１３２】
実施例９
陽性形質転換体の単離
ＵＲＡ５（配列番号１４１）、ＰｐＡＬＧ３ＴＴ（配列番号１４２）、ならびに組込みアームの５’側（配列番号１４３）および３’側（配列番号１４４）のＰｐＨＩＳ３配列にマッチするＰＣＲプライマーを使用して、ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体の二重交差組込みを確認するために、ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間の１サイクル、９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で１分間の３０サイクルならびにそれに続く７２℃で７分間の１サイクルであった。ＰＣＲ産物を標準的な方法に従いアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１３３】
【化５】
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実施例１０
レクチンＧＳ−ＩＩ染色によるＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体のスクリーニング
グリカン上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に結合するアルカリホスファート結合ＧＳ−ＩＩレクチン（グリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）由来，ＥＹ  Ｌａｂｓ）による染色を用いて、該ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体を９６ウェル形態でスクリーニングした。株ＹＧＬＹ７８７７（ＧＦＩ  ２．０）における該ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ライブラリーの形質転換体を０．６ｍＬのＢＭＧＹ培地（１％  酵母エキス、２％  ペプトン、１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％  酵母窒素ベース、４×１０〜５％  ビオチンおよび１％  グリセロール）内で、強く振とうしながら４８時間増殖させ、ペレット化し、ＢＭＭＹ培地（１％メタノールがグリセロールに取って代わっていること以外はＢＭＧＹと同じ）内で１回洗浄し、ついで０．２ｍＬのＢＭＭＹ内で４８時間増殖させた。ついで上清を遠心分離により集め、ＥＬＩＳＡ形態におけるＧＳ−ＩＩ染色により、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃレポータータンパク質上の末端ＧｌｃＮＡｃのレベルに関して試験した。
【０１３４】
実施例１１
９６ウェルレシチン染色アッセイ
９６ウェルプレートをコーティングバッファー（Ｖｉｒｏｌａｂｓ：ＲＥ−ＣＯＡＴ−７−１００  ｐＨ７．２）中の１μｇ／ｍｌ  モノクローナルＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍの抗ｈｓ  ＴＮＦ  ＲＩＩ：ＭＡＢ７２６）の１００μｌ／ウェルでコーティングした。室温で１時間のインキュベーションの後、ウェル当たり１００μｌの洗浄バッファー（Ｖｉｒｏｌａｂｓ：ＲＥ−ＷＡＳＨ−Ｔ−１００）を使用して、プレートを３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの１×Ｔｒｉｓ  ＥＬＩＳＡ希釈／ブロッキングバッファー（Ｖｉｒｏｌａｂｓ：ＲＥ−ＤＩＬＵ−Ｔ−１００）を使用して、ウェルをブロッキングし、ついで室温で１時間インキュベートし、ついで前記のとおりに洗浄した。１：１０に希釈された１００μｌのサンプルを各ウェルに加え、ついで室温で１時間インキュベートし、ついで、前記のとおりにプレートを洗浄した。ＧＳ−ＩＩレクチン（グリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）由来，ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ＬＡ−２４０２）溶液を１×Ｔｒｉｓ  ＥＬＩＳＡ希釈／ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈度で調製した。１００μｌのこのレクチン溶液を該プレートの各ウェルに加え、ついで室温で１時間インキュベートした。前記のとおりにプレートを洗浄した。１００μｌのＳｕｐｅｒＰｈｏｓ（商標）４−ＭＵＰ溶液（Ｖｉｒｏｌａｂｓ：Ｘ−ＰＨＯＳ−１００）を各ウェルに加え、ついで暗室中、室温で４５分間インキュベートした。Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェアと共にＴｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｇｅｎｉｕｓ  Ｐｒｏプレートリーダーにおいて３６０ｎｍの励起および４５０ｎｍの発光波長を用いて、プレートを読取った。
【０１３５】
ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１発現がＰｐＡＯＸ１プロモーターにより駆動される場合の該ライブラリーからのデータは、ＰｐＧＡＰプロモーター駆動性発現を示すライブラリーのデータと必ずしも相関しなかった。強力なＧＳ−ＩＩ結合を示すＡＯＸ１ｐ駆動性ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体の幾つかはＰｐＧＡＰプロモーターへの弱い結合を示した。また、ＰｐＧＡＰプロモーターに連結されている場合の最も活性なＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体は該細胞に対して毒性であり、および／またはタンパク質分泌を抑制した。これらは、ＳｃＭＮＮ２−ｓおよび−ｍ、ＳｃＰＭＴ５−ｍおよびＰｐＰＭＴ１−ｍに融合したヒト、マウスまたはカエルＰＯＭＧｎＴ１を含んでいた。類似した知見が他の酵素、例えばＭＮＳ１で得られている［Ｃｈｏｉら，ＰＮＡＳ  １００：５０２２（２００３）］。当業者は、本開示の助けにより、最良の組合せを、所望の結果に関して評価し、本明細書に記載されているのと同様に使用することが可能であろう。本出願の場合と同様に、評価されるべき結果はＯ−結合ＧｌｃＮＡｃのレベル（レクチンＧＳ−ＩＩ染色により決定されるもの）、関心のある個々のタンパク質の発現レベル、および／または該産生細胞の細胞増殖である。該グリコフォームがＯ−結合ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌまたはＯ−結合ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａである場合、前記のレクチンに基づくアッセイにおけるレクチンＧＳ−ＩＩの代わりに、それぞれＥＣＡまたはＳＮＡ１が使用されるべきである。
【０１３６】
本発明者らは該ＡＯＸ１ｐ−ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ライブラリーに関するデータを初期分析に使用した。本発明者らは、該ニワトリＰＯＭＧｎＴ１触媒ドメインが不活性であり、ゼブラフィッシュＰＯＭＧｎＴ１が非常に弱い活性を示すことを確認した。該ＡＯＸｐ−ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ライブラリースクリーニングに関する結果を表２に示す。最も活性なＰＯＭＧｎＴ１触媒ドメインはヒト、マウスおよびカエル由来であり、最も活性なＴＤはＳｃＭＮＳ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ９−ｓ、ＰｐＫｒｅ２−ｓ、Ｋ１Ｇｎｔ１−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｓ、ＳｃＭＮＮ２−ｍ、ＳｃＭＮＮ５−ｓ、ＳｃＭＮＮ６−ｓ、ＳｃＰＭＴ５−ｍ、ＰｐＰＭＴ１−ｍおよびＰｐＢＥＴ１−ｓであることを、該データは示した。
【０１３７】
【表２】
2014518608.tif 000038
実施例１２
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによるＯ−グリカン分析
本発明者らは次に、最も活性なＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体を発現するＧＦＩ  ＳＯ−１株（ＰＯＭＧｎＴ１を更に発現するＧＦＩ  ２．０株；例えば、ＷＯ  ０７／１３６７５２を参照されたい）におけるＯ−グリカンを分析した。強力なＧＳ−ＩＩ染色を示す株を、１００ｍＬのＢＭＧＹを含有する振とうフラスコ内で４８時間にわたって増殖させ、ペレット化し、ＢＭＭＹで１回洗浄し、ついで５０ｍＬのＢＭＭＹ内で更に４８時間増殖させた後、遠心分離により採取した。プロテインＡクロマトグラフィー（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−５（２００６））を用いて、分泌性ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを清澄化上清から精製し、アルカリ脱離（ベータ脱離）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８：３４９−４５１（１９９９），Ｓｔａｄｈｅｉｍら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：１０２６−３１（２００６））により、該Ｏ−グリカンをタンパク質から遊離させ、分離した。この方法はまた、該遊離Ｏ−グリカンの、新たに形成された還元性末端（オリゴマンノースまたはマンノース）を、マンニトールへと還元する。したがって、該マンニトール基は各Ｏ−グリカンの特有の指標として役立つ。体積１００μＬのＰＢＳバッファー中に含有されている０．５ｎｍｏｌ以上のタンパク質がベータ脱離に必要であった。該サンプルを２５μＬのアルカリ性ボロヒドリド試薬で処理し、５０℃で１６時間インキュベートした。約２０μＬのアラビトール内部標準を加え、ついで１０μＬの氷酢酸を加えた。ついで該サンプルを、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳおよびＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂の両方を含有するミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターに通して遠心分離し、水で洗浄した。洗液を含む該サンプルをプラスチック・オートサンプラー・バイアルに移し、遠心エバポレーター内で蒸発乾固させた。１５０μＬの１％  ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨを該サンプルに加え、該サンプルを遠心エバポレーター内で蒸発乾固させた。この最終工程を更に５回繰返した。２００μＬの水を加え、パルス電気化学的検出−ＨＰＬＣに接続された高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を製造業者（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に従い使用して、１００μＬの該サンプルを分析した。
【０１３８】
結果：ＰｐＧＡＰｐ駆動性ＳｃＭＮＮ６ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１融合体を含有する株ＹＧＬＹ７８７９からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃグリカンに関するＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースを図２、パネルＢに示す。比較は、ＰＯＭＧｎＴ１を欠くＧＦＩ  ２．０株ＹＧＬＹ６４２８（パネルＡ）に対するものである。結果は、該アラビトール標準と共移動した、ＹＧＬＹ７８７９におけるＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンを示した。ＰＯＭＧｎＴ１を欠く株においては〜１００ナノクーロン（ｎＣ）、そして、ＰＯＭＧｎＴ１を含有するＧＦＩ  ＳＯ−１株においては４５０ｎＣまでの最高測定値を典型的に示す濃度で、アラビトールを該サンプルに加えた。図３に示されているのは、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を除去するヘキソサミニダーゼ処理を伴わない（パネルＡ）および伴う（パネルＢ）株ＹＧＬＹ７８７９からのグリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースである。ヘキソサミニダーゼ（β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ，ＮＥ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）処理は、該製造業者により記載されているとおりに行った。簡潔に説明すると、ベータ脱離により遊離したＯ−グリカンを５０ｍＭ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ６．０）中にバッファー交換し、３７℃で一晩インキュベートした。該処理は、推定アラビトール＋Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃピークの低下、遊離ＧｌｃＮＡｃであるＴ＝２３．９０９における新たなピークの出現、およびマンニトール（ｍａｎ１）ピークの増大をもたらす。これは、ＰＯＭＧｎＴ１含有株におけるアラビトールと共移動する糖がＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃであることを証明している。
【０１３９】
図４および５は、ガラクトースをＯ−結合Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃへと効率的に転移する株の作製を示す。最も活性なＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１融合体を、グリカン上の末端ガラクトース残基に結合するアルカリホスファート結合ＥＣＡレクチン（エリシナ・クリスタガリ（Ｅｒｙｔｈｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）由来，ＥＹ  Ｌａｂｓ  ＬＡ−５９０１）による染色を用いて、９６ウェル形態においてスクリーニングした。該スクリーニングは、ガラクトース合成および転移に要求される酵素を含有する株ＹＧＬＹ７８７５内に該ＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１ベクターを形質転換した以外は、レクチンＧＳ−ＩＩに関して前記に記載されているのと厳密に同じ方法で行った。ＹＧＬＹ７８７５は、前記のとおりにＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ発現ベクターｐＧＬＹ３４６５でＹＧＬＹ５８５８を形質転換することにより構築した。ＹＧＬＹ５８５８の作製は、それが、前記で改変されたウラシル栄養要求体であること以外は、ＹＧＬＹ１７０３に関して記載されているのと同様であった（例えば、ＷＯ  ０７／１３６７５２を参照されたい）（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，２００４．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：７５７−６６．Ｌｉら，２００６  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：２１０−２１５，Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＷＯ  ０４／０７４４９９およびＷＯ  ０７／１３６７５２を参照されたい）。レクチンスクリーニングにより特定された最も活性な株の１つは、ＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ２ｓ−ヒトＰＯＭＧｎＴ１融合体を含有するＹＧＬＹ７８８０であった。ＹＧＬＹ７８８０を振とうフラスコ内で培養し、上清をプロテインＡ精製に付した（図２および３に関して記載されているとおり）。図４は、ＰＯＭＧｎＴ１を含有しないＧＦＩ  ２．０株ＹＧＬＹ６４２８由来（パネルＡ）およびＧＦＩ  ＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０由来（＋ＰＯＭＧｎＴ１）（パネルＢ）のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースを示す。結果は、Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌである〜Ｔ＝２１．３８において移動するＹＧＬＹ７８８０における新たなＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンを示している。図５は、末端ガラクトースを除去するガラクトシダーゼおよび末端ＧｌｃＮＡｃを除去するヘキソサミニダーゼでの処理に付されていない（パネルＡ）または該処理に付された（パネルＢ）、ＧＦＩ  ＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースを示す。ヘキソサミニダーゼ（前記）およびガラクトシダーゼ（β１，４−ガラクトシダーゼ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）処理は、ヘキソサミニダーゼに関して前記に記載されているとおりであった。該処理は、推定Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌピークの消失、Ｔ＝２３．９０９における遊離ＧｌｃＮＡｃのピークの出現、マンニトール（ｍａｎ１）ピークの増大、およびＴ＝３８．３５におけるガラクトースピークの出現をもたらす。これらの結果は、〜Ｔ＝２１．３８において移動するＧＦＩ  ５．０株におけるＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンがＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌであることを示している。
【０１４０】
図６は、シアル酸化グリカンを生成するのに必要な５つの遺伝子を含有するベクターｐＧＬＹ１７５８で形質転換されたＧＦＩ  ＳＯ−２株ＹＧＬＹ７８８０であるＧＦＩ  ＳＯ−３株ＹＧＬＹ８７５０（図１）におけるＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンを示す（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３：１４４１（２００６））。示されているのは、末端シアル酸を除去するノイラミニダーゼ、末端ガラクトースを除去するガラクトシダーゼ、および末端ＧｌｃＮＡｃを除去するヘキソサミニダーゼでの処理に付されていない（パネルＡ）または該処理に付された（パネルＢ）、ＹＧＬＹ８７５０由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースである。ヘキソサミニダーゼ（前記）、ガラクトシダーゼ（前記）およびノイラミニダーゼ（ＮＥ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）処理は、ヘキソサミニダーゼに関して前記に記載されるとおりであった。全ての可能な種を得るために、酵素の亜最適用量を加えた。該処理は、Ｔ＝４５．８における推定Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸ピークの低下、Ｔ＝２１．７におけるＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌピークの低下、Ｔ＝２３．５における遊離ＧｌｃＮＡｃのピークの出現、マンニトール（ｍａｎ１）ピークの増大、およびＴ＝３７．９におけるガラクトースピークの出現をもたらす。これらの結果は、〜Ｔ＝４５．８において移動するＧＦＩ  ＳＯ−３株におけるＰＯＭＧｎＴ１依存性Ｏ−グリカンがＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸であることを示している。
【０１４１】
図７は、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ上の高レベルの末端シアル酸を可視化するためのアルカリホスファターゼ結合レクチンＳＮＡ−１でのウエスタンブロッティングを示す。示されているのは、サンプル１〜１２におけるＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質レベルを示すクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（下）、およびアルカリホスファターゼ結合レクチンＳＮＡ−１による検出を用いるウエスタンブロット（上）である。レクチンＳＮＡ−１は末端シアル酸に結合して、シアル酸の合成および転移のための遺伝子を含有する株ＧＦＩ  ＳＯ−３におけるＯ−グリカン上の末端シアル酸を検出するであろう。結果は、ＧＦＩ  ＳＯ−３株由来のサンプル１〜９からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃへの強力なレクチン結合を示しているが、シアル酸を転移する能力を欠くＧＦＩ  ＳＯ−２株由来のサンプル１０〜１２からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃへの結合を全く示していない。
【０１４２】
実施例１３
アルカリホスファターゼ結合レクチンＳＮＡ−１でのウエスタンブロット法
シアル酸化ベクターｐＧＬＹ１７５８で形質転換されたＹＧＬＹ７８８０の３つの別々のコロニーをＢＭＧＹ内で増殖させ、ＢＭＭＹにおいて誘導した（前記のとおりに行った）。２、６および１０μＬの上清を、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５に従う還元性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ついでニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，現在ではＷｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）上にエレクトロブロッティングした。ＴＢＳ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中で希釈されたブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ  ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  １−２１０−２３８）中、該膜を室温で３０分間インキュベートし、ついでレクチン結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＣａＣ１２，０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中の３回の５分間の洗浄に付した。２０マイクログラム／ｍＬのレクチンＳＮＡ−１（サンブクス・ニグラ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ）由来，ＥＹ  Ｌａｂｓ．ＬＡ−６８０２）をレクチン結合バッファー（合計容量２．５ｍＬ）中で希釈し、室温で１時間、該膜に加えた。レクチン結合バッファー中の３回の１０分間の洗浄の後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）中のＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ  ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  １−２１０−２３８）を、バンドが視認可能になるまで加えた。
【０１４３】
図８は、Ｏ−シアル酸化グリカンの生成を最適化する努力の結果を示す。本発明者らは、最も活性なＴＤ−ＰＯＭＧｎＴ１株の本発明者らの組合せを、シアル酸化に必要な全遺伝子を含有するがＰＯＭＧｎＴ１を欠くＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ発現株ＹＧＬＹ１１７３１内に形質転換した。また、ＹＧＬＹ１１７３１は、シアル酸化に必要な５つの遺伝子のそれぞれの剰余コピーをコードするプラスミドを含有する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３：１４４１  （２００６））。前記の９６ウェルレクチン染色アッセイにおいてレクチンＳＮＡ−１を使用して、ＰＯＭＧｎＴ１形質転換体をスクリーニングした。最強のＳＮＡ−１染色を示したコロニーを振とうフラスコ発現研究のために選択した。増殖およびメタノール誘導は、記載されているとおり（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ２００７／０  １６３１）に誘導期中にタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）の合成インヒビター（Ｏｒｃｈａｒｄら，ＥＰ  １  ３１３  ４７１  Ｂ１）を加えたこと以外は前記のとおりであった。簡潔に説明すると、インヒビターＰＭＴｉ−３（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，ＷＯ２００７／０６１６３１）を、該誘導期の開始時に、２μＭの最終濃度までＢＭＭＹと共に加えた。Ｐｍｔインヒビターはセリンおよびトレオニンへのマンノースの転移を減少させて、Ｏ−結合マンノシル化の全体的レベルを減少させる。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの場合、Ｐｍｔインヒビターは、Ｏ−マンノースグリカンを伴うセリンおよびトレオニンの数をタンパク質分子当たり〜８０個から〜２０個へと減少させる。したがって、Ｏ−結合グリカンの全体的レベルは該薬物により有意に低下する。重要なことに、これは、より望ましくないＯ−Ｍａｎ−Ｍａｎ（Ｏ−Ｍａｎ２）またはアシアリル化Ｏ−ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃまたはＯ−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌより高い比率の所望のシアル酸化Ｏ−グリカンを与える。図８に示されているのは、最適化ＧＦＩ  ＳＯ−３株ＹＧＬＹ１１６０３（ＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ６ｓ−マウスＰＯＭＧｎＴ１）からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ  Ｏ−グリカンに関するＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレース（パネルＡ）である。パネルＢは、製造業者（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により記載されているとおりにＨＰＡＥＣ−ＰＡＤトレースから定量された各主要Ｏ−グリカン種の比率を一覧している。結果は、主要Ｏ−グリカンが、ＴＮＦＲＩＩ−ＦＣ  Ｏ−グリカンの５６％を占めるＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸であることを示している。
【０１４４】
実施例１４
全シアル酸の決定
次に、タンパク質１モル当たりのシアル酸のモルの比として糖タンパク質上の全シアル酸含量を検出するアッセイを用いた。シアル酸を酸加水分解により糖タンパク質サンプルから遊離させ、以下の方法を用いてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。１０〜１５μｇのタンパク質サンプルをリン酸緩衝食塩水中にバッファー交換した。４００μＬの０．１Ｍ  塩酸を加え、該サンプルを８０℃で１時間加熱した。ＳｐｅｅｄＶａｃにおける乾燥の後、該サンプルを５００μＬの水で再構成（還元）した。ついで１００μＬをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析に付した。ＧＦＩ  ＳＯ−３株ＹＧＬＹ１１６０３からのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質の全シアル酸含量を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生されたＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃのもの、そしてまた、ＰＯＭＧｎＴ１を欠く親株ＹＧＬＹ１１７３１からのものと比較した。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ上の全シアル酸はＮ−およびＯ−グリカンの両方に由来し、したがって、ＣＨＯ産生体および株ＹＧＬＹ１１６０３に関するＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃシアル酸はＮ−およびＯ−グリカンの両方に由来し、一方、株ＹＧＬＹ１１７３１由来のものは完全にＮ−グリカンに由来する。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃは二量体当たり６個の潜在的Ｎ−グリカン部位を有する。結果を表３に示す。該データは、ＣＨＯ細胞において産生されたものにほぼ類似したレベルのシアル酸化Ｏ−グリカンが生じたことを示している。
【０１４５】
【表３】
2014518608.tif 000039
実施例１５
修飾糖タンパク質のバイオアベイラビリティおよび血清半減期
株ＹＧＬＹ１４２５２由来のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ。ＹＧＬＹ１４２５２を、より高いＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ発現に関してそれを選択したこと以外はＹＧＬＹ１１６０３に関して前記に記載されているとおりに、構築した。これは、前記の９６ウェル・レクチンＳＮＡ−１染色アッセイを用いる、株の徹底的なスクリーニングにより達成された。強力なＳＮＡ−１染色により特定された株を、５０ｍＬ  振とうフラスコ内での増殖の後、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により更にスクリーニングした。最高比率のシアル酸化Ｏ−グリカンおよび最高の全シアル酸レベル（前記のとおりに測定されたもの）を有することに基づいて、ＹＧＬＹ１４２５２を選択した。ＹＧＬＹ１４２５２からの部分精製ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離した。洗浄および結合画分を集め、ｍｏｌシアル酸／ｍｏｌ  ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃとしての全シアル酸含量（「ＴＳＡ」）を決定した。プールされた洗浄画分（形態５−Ａ）に関してはＴＳＡ＝２１、そして溶出結合画分（形態５−Ｃ）に関してはＴＳＡ＝１１。また、形態５−Ａおよび５−Ｃを等比率で混合して、中間的なＴＳＡ＝１６を示した形態５−Ｂを得た。
【０１４６】
バイオアベイラビリティ研究のために、Ｂ６マウスに糖変異体（ｇｌｙｃｏｖａｒｉａｎｔ）を皮下投与した。４８時間後、血清サンプルを集めた。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度をＧｒｏ系イムノアッセイ（抗ＴＮＦＲＩＩ捕捉および抗ｈＦｃ検出）により決定した。図９は、糖タンパク質のＯ−グリコシル化の増加がＢ６マウスにおけるバイオアベイラビリティの増加をどのように引き起こすかを示す。種々の用量のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃの皮下投与の４８時間後のマウスの血清濃度が示されている。全シアル酸含量（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は以下のとおりであった：形態５−Ａ：２１；形態５−Ｂ：１６；および形態５−Ｃ：１１。
【０１４７】
血清半減期の研究のために、ラットに糖変異体を皮下または静脈内投与した。注射後に数回の時間間隔で血清サンプルを集めた。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ濃度をＧｒｏ系イムノアッセイ（抗ＴＮＦＲＩＩ捕捉および抗ｈＦｃ検出）により決定した。図１０Ａ〜Ｂは、糖タンパク質のＯ−シアル酸化の増加がラットにおける血清半減期の増加をどのように引き起こすかを示す。１ｍｇ／ｋｇでの静脈内（「ＩＶ」）［図１０Ａ］および皮下（「ＳＣ」）［図１０Ｂ］投与後の血清時間−濃度曲線が示されている。全シアル酸含量（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は以下のとおりであった：形態５−Ａ：２１；形態５−Ｂ：１６；および形態５−Ｃ：１１。
【０１４８】
形態Ａ〜Ｃは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーによりＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを分離することにより得られた。形態Ａは、洗浄と共にＨＡカラムから溶出する画分に相当し、形態Ｃは結合画分に相当する。形態Ｂは形態ＡとＣとの１：１混合物である。
【図１】
2014518608.tif 000040
【図２】
2014518608.tif 000041
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014518608.tif 000047
【図９】
2014518608.tif 000048
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2014518608000001.app
【国際調査報告】
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