(57)【要約】  白斑を検出、予防および治療するための、ＭＩＡ活性（黒色腫阻害活性）を阻害するペプチド、改変ペプチド、および抗体または抗体断片が開示される。【選択図】図１
2014514285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白斑を検出、予防および治療するための、配列番号１〜配列番号４９からなる群より選択されるペプチドの使用。
【請求項２】
白斑が、非分節型白斑である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号４９の前記ペプチドにおいて、１個以上のアミノ酸が、天然または非天然アミノ酸で置換されていてもよい、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
配列番号１〜４９の前記ペプチドが、さらなるアミノ酸を含んでいてもよい、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号４９の前記ペプチドにおいて、１個のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
配列番号１〜４９の前記ペプチドが、グリコシル化、アセチル化、水酸化（ヒドロキシプロリン）、カルボキシル化（ガンマ−カルボキシグルタメート）、リン酸化、アルキル化、ミリストイル化（Ｎ末端）、パルミトイル化、およびプレニル化）によって改変された少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
配列番号１〜４９の前記ペプチドが、ｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロトレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンからなる群より選択される天然に存在しないアミノ酸によって改変された少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
白斑を検出、予防および治療するための抗ＭＩＡ抗体またはその断片の使用。
【請求項９】
白斑が、非分節型白斑である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗ＭＩＡ抗体が、抗アルファ４−インテグリン、抗アルファ４−インテグリン、抗アルファ５−インテグリン、抗アルファ５−インテグリンからなる群より選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか一項に記載の少なくとも１種のペプチドおよび／または請求項８〜１０に記載の少なくとも１種の抗ＭＩＡ抗体と、医薬的に許容される賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野、特に、白斑を検出、予防および治療するための調製物に関する。
【発明の概要】
【０００２】
白斑は、一般的な全身性白斑とも名付けられ、後天性の皮膚および粘膜の色素異常症であり、限局性の脱色した斑点および斑を特徴とする。白斑は、罹患した皮膚におけるメラニン細胞の一部または全部が選択的に破壊されたように見える進行性の障害である。白斑患者は世界人口の０．５〜２％を占め、発症の平均年齢は２０歳である。
【０００３】
非分節型白斑は、白斑の最も一般的なサブタイプである。非分節型白斑は、しばしば対称的な白色の斑を特徴とする後天性の慢性の色素異常症であり、このような斑は通常、時間が経つにつれて大きくなり、これは、表皮、場合によっては毛包のメラニン細胞が実質的に損失することに相当する（Taieb A、Picardo M;VETF Members.The definition and assessment of vitiligo:白斑欧州対策委員会(Vitiligo European Task Force)のコンセンサスレポート。Pigment Cell Res 2007;20:27-35)。
白斑の皮膚に対して多くの研究がなされたが、この皮膚疾患の正確な病因は明らかになりつつあり、ここ数年にわたり、自己免疫、細胞毒性の代謝産物、神経性および遺伝学的な構成要素が関与する数種の発症メカニズムが提唱されているが、これら全ての寄与因子の相互作用を説明する説得力のあるモデルは明確に述べられていない（Schallreuter KU、Bahadoran P、Picardo Mら、Vitiligo pathogenesis:autoimmune disease,genetic defect,excessive reactive oxygen species,calcium imbalance,or what else? Exp Dermatol 2008;17:139-40）。これまでに、白斑には、２つの主な特徴、すなわち組織学的には炎症がないこと、および、臨床的には他の自己免疫障害の併発があることが解明できている。近年、白斑の発生における主要かつ可能性のある一次的な素因が、不十分なメラニン細胞の付着であり得ること、加えて、インビボおよびインビトロでの観察に基づいて（Gauthier Y、 Cario-Andre M、 Lepreux S、 Pain C、Taieb A. Melanocyte detachment after skin friction in non lesional skin of patients with generalized vitiligo.Br J Dermatol 2003;148:95-101;Cario-Andre M、Pain C、Gauthier Y、Taieb A. The melanocytorrhagic hypothesis of vitiligo tested on pigmented, stressed, reconstructed epidermis. Pigment Cell Res 2007;20:385-393）、物理的外傷および様々な化学的なストレス要因が、主な沈着事象の典型であり得ることが示唆されている。この理論は、白斑を、慢性的な剥離と、白斑の皮膚が色素を排除する無症状な様式と推測されるメラノサイト流出（melanocytorrhagy）と称されるメラニン細胞の経表皮損失とによって引き起こされる疾患とみなしている（Gauthier Y、 Cario-Andre M、 Lepreux S、 Pain C、 Taieb A. Melanocyte detachment after skin friction in non lesional skin of patients with generalized vitiligo. Br J Dermatol 2003;148:95-101;Cario-Andre M、 Pain C、 Gauthier Y、 Taieb A. The melanocytorrhagic hypothesis of vitiligo tested on pigmented, stressed, reconstructed epidermis. Pigment Cell Res 2007;20:385-393; Gauthier Y、 Cario Andre M、 Taieb A. A critical appraisal of vitiligo etiologic theories. Is melanocyte loss a melanocytorrhagy? Pigment Cell Res 2003;16:322-32）。
【０００４】
白斑治療において、数々の療法を考慮することができる（Sehgal VN、 Srivastava G. Vitiligo treatment options: an evolving scenario. J Dermatolog Treat 2006;17:262-75）。
【０００５】
画一的な白斑療法では、全ての患者において予想通りに優れた結果は得られず、画一的な療法に対する応答は非常に様々である。一般的に、治療は個別化されなければならず、患者は療法に伴うリスクについて知らされるべきである。非分節型白斑の最も一般的な治療は、以下の通りである。
【０００６】
狭帯域紫外線Ｂ（ＵＶＢ−ＮＢ）光線療法：これは、広く用いられており、優れた臨床結果を示し、３１０〜３１５ｎｍの発光スペクトルおよび３１１ｎｍの最大波長を有する狭帯域の蛍光灯に基づく。治療の頻度は、週に２〜３回であり、毎日連続して行われない。この治療は、子供、妊婦、および授乳婦において安全に用いることができる。短期の有害作用としては、そう痒、および、乾燥症が挙げられる。ＵＶＢの発癌可能性は明らかになりつつあるので、長期の有害作用は明確に定義されていない。この療法は、顔および胴体の白斑状の斑には最良の結果を達成したが、一般的に、手および足の白斑には極めて不良な結果しか達成されない。
【０００７】
コルチコステロイド療法：コルチコステロイドは、局所、全身または病巣内に使用され、局所ステロイドは、局所型白斑を治療するのに最初に選択されることが多いが、療法の結果は、特に、局所型白斑を有する患者、および／または、炎症が無症状だとしても白斑に対して炎症性の要素を有する患者において、ある程度成功したと報告されている。局所、全身または病巣内ステロイドの使用は、副作用、たとえば毒性（全身）または皮膚の萎縮（局所または病巣内）を有する可能性があり、加えて、一般的に、手および足の白斑に対しては極めて不良な結果しか達成されない。
【０００８】
局所カルシニューリン阻害剤（タクロリムスおよびピメクロリムス）：タクロリムスおよびピメクロリムスを使用して、顔および頚部の白斑状の斑の治癒を成功させることができた。近年、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、局所カルシニューリン阻害剤の軽微な全身吸収による理論上の腫瘍形成のリスクのために、局所カルシニューリン阻害剤に対して「黒色の枠で囲まれた警告」を課している。加えて、一般的に、手および足の白斑に対しては極めて不良な結果しか達成されない。
【０００９】
白斑治療のための外科的な代替法がある。しかしながら、外科的療法は時間がかかる性質があるために、これらの治療レジメンは、分節型または局所型白斑に限定される。
【００１０】
これまで、これらの療法では、全ての患者において白斑の斑の十分な再色素沈着をどうしても達成することはできなかった。
【００１１】
これらの療法の正確な作用機序は未だわかっていないが、一般的にはそれらの免疫抑制活性に起因すると考えられている。しかしながら、驚くべきことに、メラニン細胞は、ＵＶＢ−ＮＢ放射線に曝露された後、アルファ５ベータ１インテグリンの発現を増加させる（Neitmann M、 Alexander M、 Brinckmann J、 Schlenke P、 Tronnier M. Attachment and chemotaxis of melanocytes after ultraviolet irradiation in vitro. Br J Dermatol 1999;141:794-801）。
【００１２】
アルファ５ベータ１と名付けられたインテグリンの特定のサブグループは、メラニン細胞の付着、および、白斑療法に関連しているようである（Swope VB、 Supp AP、 Schwemberger S、 Babcock G、 Boyce S. Increased expression of integrins and decreased apoptosis correlate with increased melanocyte retention in cultured skin substitutes. Pigment Cell Res 2006;19:424-33）。メラニン細胞と基底膜との相互作用には、インテグリンが介在しており（Hara M、 Yaar M、 Tang A、 Eller MS、 Reenstra W、 Gilchrest BA. Role of integrins in melanocyte attachment and dendricity. J Cell Sci 1994;107:2739-48）、この皮膚疾患において有用な多くの療法は、これらの分子の発現に有効なようである（Neitmann M、 Alexander M、 Brinckmann J、 Schlenke P、 Tronnier M. Attachment and chemotaxis of melanocytes after ultraviolet irradiation in vitro. Br J Dermatol 1999;141:794-801）。
【００１３】
活発な剥離およびアルファ５ベータ１インテグリンは、その他のより重度のメラニン形成障害、たとえば悪性黒色腫においても極めて興味深い特徴である。悪性黒色腫は、最も重度の皮膚癌であり、その転移性の形態は最も不良な予後を伴う（Thompson JF、 Scolyer RA、 Kefford RF. Cutaneous melanoma. Lancet 2005;365:687-701）。
【００１４】
近年、悪性黒色腫（メラニン細胞由来の腫瘍）の転移性播種は、腫瘍細胞の活発な剥離が介在している可能性があり、加えて、この剥離は、黒色腫阻害活性、すなわちＭＩＡと呼ばれる、悪性黒色腫細胞から分泌された低分子量タンパク質によって引き起こされる可能性があるようである（Bosserhoff AK、 Stoll R、 Sleeman JP、 Bataille F、 Buettner R、 Holak TA. Active detachment involves inhibition of cell-matrix contacts of malignant melanoma cells by secretion of melanoma inhibitory activity. Lab Invest 2003;83:1583-94）。ＭＩＡは、インテグリンアルファ５ベータ１と相互作用することが実証されている（Bauer R、 Humphries M、 Fassler R、 Winklmeier A、 Craig SE、 Bosserhoff AK. Regulation of integrin activity by MIA. J Biol Chem 2006;281:11669-77）。したがって、悪性黒色腫において、悪性メラニン細胞で自己生産されたタンパク質（ＭＩＡ）と自己のメラニン細胞の接着分子（アルファ５ベータ１インテグリン）との相互作用は、腫瘍性メラニン細胞の活発な剥離に関与するようである。
【００１５】
ＷＯ０３／６４４５７は、ＭＩＡ活性を阻害するペプチド、改変ペプチド、および抗体または抗体断片、ならびに、固形腫瘍、白血病、および変性性障害を治療するためのそれらの使用を開示している。
【００１６】
本発明の技術的な課題は、既知の療法の副作用、たとえば、そう痒および乾燥症または皮膚の萎縮、毒性、ならびに起こり得る発癌現象または腫瘍形成を回避する化合物を提供することである。
【００１７】
同時に、治療しようとする領域に関わりなく十分な再色素沈着をもたらす化合物、したがって、一般的には十分に回復しない手および足でも優れた結果を示す化合物を提供することが大いに所望される。
【００１８】
さらなる技術的な課題は、疾患の早期検出およびさらなる経過観察に使用できるマーカーを提供することである。
【００１９】
また、疾患に罹りやすい患者において疾患の発症を抑制することができる活性物質への必要性も強い関心が寄せられている。
【００２０】
本発明者は、驚くべきことに、かつ意外なことに、ＭＩＡタンパク質は、白斑に罹患した患者には存在するが、正常な人には存在せず、さらに、ＭＩＡタンパク質は、白斑の斑の形成を引き起こす実際の病原性メカニズムに関与することを見出した。
【００２１】
ＭＩＡの存在は、なぜ白斑の斑では明白な臨床的な炎症がないのかを説明する。メラニン細胞の剥離は、基底膜付近における細胞壊死またはアポトーシスがないために炎症経路を活性化しない。
【００２２】
現在、標的分子が見出されていないため、標的療法は白斑には利用できない。
【００２３】
ＭＩＡ阻害剤は、非分節型白斑のための標的療法となる。
【００２４】
ＭＩＡ阻害剤はＭＩＡに特異的に結合するため、これらの分子は、実際の療法に関して一般的に報告されている副作用、たとえば皮膚の萎縮、そう痒、毒性、または腫瘍形成の可能性を起こさない。
【００２５】
さらに、ＭＩＡの阻害は、メラニン細胞への損傷を回避することにより、治療されるあらゆる解剖学的領域において再色素沈着をもたらし、したがって、難しい領域、たとえば手および足の治療が達成される。
【００２６】
白斑治療耐性部位、たとえば手および足は、これらの部位にはメラニン細胞を貯めるところがないことに起因すると言われている。恐らくこれらのゾーンの連続的な摩擦のために、これらの部位のメラニン細胞に対して多くのＭＩＡが存在することが我々のデータから示される。ＭＩＡ阻害剤は、全てのＭＩＡ分子を除去することにより、これらの領域の治療を成功させる。
【００２７】
それゆえに、ＭＩＡ活性を阻害するペプチド、改変ペプチド、および抗体または抗体断片は、再色素沈着を誘発することにより、白斑治療に使用することができる。
【００２８】
また前記化合物は、白斑発生の初期マーカーとして、および、白斑患者の経過観察のためのツールとして、および、白斑の斑の出現を予防するためにも有用に使用することもできる。
【００２９】
また前記化合物は、すでに知られている療法をより有効にするために使用することもできる。
【００３０】
したがって、本発明の目的は、白斑を検出、予防および治療するための、配列番号１〜４９を有する少なくとも１種のペプチドの使用である。
【００３１】
本発明のさらなる目的では、前記ペプチドにおいて、１個以上のアミノ酸が、天然アミノ酸、または、非天然アミノ酸で置換されている。
【００３２】
本発明のさらなる目的では、非天然アミノ酸は、改変された天然アミノ酸であり、ここで改変は、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｏ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｅから選択される１〜１２個の原子を含む官能基での、１個以上の原子の置換である。
【００３３】
本発明のさらなる目的では、上記ペプチドは、さらなるアミノ酸を含むか、または、１個のアミノ酸が欠失している。
【００３４】
本発明のさらなる目的では、配列番号１〜４９を有するペプチドのアミノ酸の改変は、グリコシル化、アセチル化、水酸化（ヒドロキシプロリン）、カルボキシル化（ガンマ−カルボキシグルタメート）、リン酸化、アルキル化、ミリストイル化（Ｎ末端）、パルミトイル化、および、プレニル化）を意味し、加えて、天然に存在しないアミノ酸、たとえばｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロトレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４アザフェニルアラニン、および、４−フルオロフェニルアラニンを意味する。
【００３５】
本発明の目的はさらに、白斑を検出、予防および治療するための、少なくとも１種の抗ＭＩＡ抗体またはその断片の使用でもある。
【００３６】
好ましい抗ＭＩＡ抗体は、抗アルファ４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗アルファ４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン（Chemicon））、抗アルファ５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、抗アルファ５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン）からなる群より選択される。
【００３７】
本発明のさらなる特徴は、実験による実施例および添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】白斑をもたらすメラニン細胞におけるアルファ５ベータ１インテグリンおよびＭＩＡの作用機序を示す図。パネルＡにおいて、アルファ５ベータ１インテグリンが介在するメラニン細胞と基底膜との正常な付着が示される。パネルＢにおいて、アルファ５ベータ１インテグリンに結合するＭＩＡによって攻撃された白斑のメラニン細胞が示される。パネルＣにおいて、ＭＩＡとアルファ５ベータ１インテグリンとが結合した後、他の沈着要因、たとえば酸化ストレス、身体の外傷または自己抗体の存在により、メラニン細胞の部分的な剥離が起こることが示される。パネルＤにおいて、メラニン細胞の十分な剥離、および、皮膚上での白斑状の斑の形成（メラノサイト流出）が示される。パネルＥにおいて、ＭＩＡに結合してそれを不活性化する抗ＭＩＡ薬が示される。パネルＦにおいて、沈着要因の存在下でも基底膜との付着を保っている白斑のメラニン細胞が示される。
【発明の詳細な説明】
【００３９】
定義
本発明の意味において、白斑は、限局性の脱色した斑点および斑を特徴とする、皮膚および粘膜の後天性の進行性色素異常症を意味する。
【００４０】
本発明の意味において、ペプチドは、ＭＩＡに結合することによってＭＩＡ活性を阻害する。
【００４１】
本発明の意味において、天然アミノ酸は、天然タンパク質およびペプチドに存在する２０種のアミノ酸である。
【００４２】
本発明の意味において、非天然アミノ酸は、天然に存在するかまたは化学合成された、遺伝学的にコードされていないアミノ酸である。
【００４３】
本発明の意味において、改変されたアミノ酸は、グリコシル化、アセチル化、水酸化（ヒドロキシプロリン）、カルボキシル化（ガンマ−カルボキシグルタメート）、リン酸化、アルキル化、ミリストイル化（Ｎ末端）、パルミトイル化、および、プレニル化によって改変されたアミノ酸を意味する。
【００４４】
本発明の目的は、白斑を検出、予防および治療するための、ＭＩＡ活性を阻害するペプチド、改変ペプチド、および抗体または抗体断片の使用である。
【００４５】
ＭＩＡ活性を阻害する前記ペプチドは、以下の通りである。
【００４６】
配列番号０１  ＶＰＨＩＰＰＮ
配列番号０２  ＭＰＰＴＱＶＳ
配列番号０３  ＱＭＨＰＷＰＰ
配列番号０４  ＱＰＰＦＷＱＦ
配列番号０５  ＴＰＰＱＧＬＡ
配列番号０６  ＩＰＰＹＮＴＬ
配列番号０７  ＡＶＲＰＡＰＬ
配列番号０８  ＧＡＫＰＨＰＱ
配列番号０９  ＱＱＬＳＰＬＰ
配列番号１０  ＧＰＰＰＳＰＶ
配列番号１１  ＬＰＬＴＰＬＰ
配列番号１２  ＱＬＮＶＮＨＱＡＲＡＤＱ
配列番号１３  ＴＳＡＳＴＲＰＥＬＨＹＰ
配列番号１４  ＴＦＬＰＨＱＭＨＰＷＰＰ
配列番号１５  ＶＰＨＩＰＰＮＳＭＡＬＴ
配列番号１６  ＲＬＴＬＬＶＬＩＭＰＡＰ
（ＷＯ０３０６４４５７；Ｓｔｏｌｌら、３０  ２００１、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：３４０〜３４９）。
【００４７】
配列番号１７  ＹＮＬＰＫＶＳＳＮＬＳＰ
配列番号１８  ＭＰＰＴＱＶＳＫＦＲＬＩ
配列番号１９  ＡＮＩＤＡＴＰＬＦＬＲＡ
配列番号２０  ＬＬＲＴＴＥＴＬＰＭ  ＦＬ
配列番号２１  ＳＡＬＥＰＬＶ
配列番号２２  ＧＳＰＴＰＮＡ
配列番号２３  ＡＰＳＨＡＴＨ
配列番号２４  ＴＴＶＧＨＳＤ
配列番号２５  ＴＨＦＳＴＦＴ
配列番号２６  ＳＬＬＬＤＴＳ
配列番号２７  ＳＶＡＭＫＡＨＫＰＬＬＰ
配列番号２８  ＮＴＩＰＧＦＡＳＫＳＬＤ
配列番号２９  ＶＳＮＹＫＦＹＳＴＴＳＳ
配列番号３０  ＶＳＲＨＱＳＷＨＰＨＤＬ
配列番号３１  ＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲ
配列番号３２  ＨＮＡＳＰＳＷＧＳＰＶＭ
配列番号３３  ＳＨＰＷＮＡＱＲＥＬＳＶ
配列番号３４  ＨＨＷＰＦＷＲＴＬＰＬＳ
配列番号３５  ＷＨＴＫＦＬＰＲＹＬＰＳ
配列番号３６  ＮＮＴＳＦＴＶＶＰＳＶＰ
配列番号３７  ＳＨＬＳＴＷＫＷＷＱＮＲ
配列番号３８  ＦＨＷＨＰＲＬＷＰＬＰＳ
配列番号３９  ＷＨＷＴＹＧＷＲＰＰＡＭ
配列番号４０  ＦＨＷＲＹＰＬＰＬＰＧＱ
配列番号４１  ＷＨＷＰＬＦＩＰＮＴＴＡ
配列番号４２  ＷＨＮＧＩＷＷＨＹＧＶＲ
配列番号４３  ＨＨＬＮＹＬＷＰＷＴＲＶ
配列番号４４  ＦＷＨＲＷＳＴＦＰＥＱＰ
配列番号４５  ＷＨＭＳＹＦＷＴＲＰＰＱ
配列番号４６  ＦＨＬＮＷＰＳＲＡＤＹＬ
配列番号４７  ＷＨＫＮＴＮＷＰＷＲＴＬ
配列番号４８ＡＬＳＰＳＱＳＨＰＶＲＳ
配列番号４９  ＧＴＱＳＴＡＩＰＡＰＴＤ
（ＷＯ０３０６４４５７）
配列番号１〜４９のペプチドにおいて、１個以上のアミノ酸が、天然または非天然アミノ酸で置換されていてもよい。
【００４８】
配列番号１〜４９のペプチドが、さらなるアミノ酸を含んでいてもよいか、または、１個のアミノ酸が欠失している。
【００４９】
配列番号１〜４９のペプチドは、グリコシル化、アセチル化、水酸化（ヒドロキシプロリン）、カルボキシル化（ガンマ−カルボキシグルタメート）、リン酸化、アルキル化、ミリストイル化（Ｎ末端）、パルミトイル化、および、プレニル化）で改変された少なくとも１個のアミノ酸、加えて、天然に存在しないアミノ酸、たとえばｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロトレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４アザフェニルアラニン、および、４−フルオロフェニルアラニンを含んでもよい。
【００５０】
本発明の目的はさらに、白斑を検出、予防および治療するための、少なくとも１種の抗ＭＩＡ抗体またはその断片の使用でもある。
【００５１】
好ましい抗ＭＩＡ抗体は、抗アルファ４−インテグリン（Ａ４−ＰＵＪ１、ＵＢＩ）、抗アルファ４−インテグリン（Ｐ１Ｈ４、ケミコン）、抗アルファ５−インテグリン（Ａ５−ＰＵＪ５、ＵＢＩ）、抗アルファ５−インテグリン（Ｐ１Ｄ６、ケミコン）からなる群より選択される。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、医薬的に許容される賦形剤および／または希釈剤により可溶化されたかまたはビヒクルである少なくとも１種の上記ペプチドおよび／または少なくとも１種の上記抗ＭＩＡ抗体を含む医薬組成物である。
【実施例】
【００５３】
生検試料
１０個の生検試料を、非分節型白斑と認められた患者の損傷領域の縁部から回収し、さらに対照の皮膚の試料も回収した。
【００５４】
５人の健康な被験者の前腕の手のひらの表面上における目で見て正常な色素沈着した皮膚を実験用に対照試料として選択した。
【００５５】
全ての患者は、黒色腫の病歴はなく、さらに皮膚に黒色腫の腫瘍形成がないことについて皮膚試験で選別された。
【００５６】
組織病理学および免疫組織化学
病的な検体および正常な検体に、肉眼での解析および顕微鏡での解析を行った。全ての試料を、０．１ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ＝７．４）リン酸緩衝液中の１０％ホルマリン中で固定し、濃度を連続的に高めたアルコールで脱水し、次に光学顕微鏡用にパラフィン中に埋め込んだ。厚さ４マイクロメートルの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン、Ｈｅｉｄｅｎｈｅｉｍの改変アザン・マロリー法で染色し、２人の別々の病理学者によって試験した。
【００５７】
白血球（ＣＤ４５、クローン２Ｂ１１＋ＰＤ７／６．、希釈率１／２００、ＤＡＫＯ）、リンパ球（ＣＤ４３クローンＤＦ−Ｔ１、希釈率１／２００：ＤＡＫＯ、ＣＤ４５ＲＯクローンＣＬＢ−ＵＣＨＬ１、希釈：モノサン（Monosan）、ＣＤ２０クローンＬ２６、希釈率１／２００ＤＡＫＯ）、および、マクロファージ（ＣＤ６８クローンＫＰ１、希釈率１／２００ＤＡＫＯ）に対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を行った。
【００５８】
各皮膚生検から得た切片を、標準的手法に従って免疫組織化学用に調製し、処理し、染色した。
【００５９】
プレメラノソームおよび成熟したメラノソームの検出のために、我々は、Ｓ１００ポリクローナルウサギ抗体、および、ＨＭＢ４５（クローンＨＭＢ４５、希釈率１／１００ＤＡＫＯ）を使用した。
【００６０】
簡単に言えば、スライドを、メタノール中の０．３％過酸化水素で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、次に、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、非特異的な抗体結合を防ぐために緩衝化した正常ウマ血清中でインキュベートした。切片を、一次抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識二次抗体を適用し、続いてアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを適用した。クロモゲンとしてジアミノベンジジンを使用した。
【００６１】
患者および対照の２種の異なる連続切片中の２種の抗体を、抗ヒトインテグリンアルファ５ベータ１（ケミコン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、米国マサチューセッツ州、クローンＪＢ１／５０）、および、黒色腫阻害活性（ＭＩＡ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州、ポリクローナル抗体ＩｇＧ、希釈率１／２０）を用いて試験し、ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で可視化した。同じ切片に、抗ヒトインテグリンアルファ５ベータ１と黒色腫阻害活性とを用いた連続的な免疫染色技術によって、スライド上でＭＩＡタンパク質とインテグリンアルファ５ベータ１とが共に局在化していることを説明するための二重の免疫染色を同時に行い、抗マウスまたは抗ウサギフルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンコンジュゲート二次抗体（ケミコン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、米国マサチューセッツ州）によって結果を可視化した。核を、ＴＯ−ＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、イタリア、ミラノによって販売）で染色した。
【００６２】
ＴＣＳ−ＳＬレーザースキャナ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ、ヴェッツラー）を用いてマイクロ写真を撮った。
【００６３】
結果
１０個の生検試料のうち９個がＭＩＡ陽性であった（表１）。ＭＩＡ陰性試料だけが分節型白斑に罹った患者由来であり、それに対して、その他全てのＭＩＡ陽性試料が非分節型白斑に罹った患者由来であった。対照として使用された全ての皮膚試料はＭＩＡの存在について陰性であった。
【００６４】
抗アルファ５ベータ１抗体は、完全に抗ＭＩＡ抗体と共に局在化しており、この特徴は、すでに基底膜から剥離したメラニン細胞においても示され、上面表皮でも見出された。
【表１】
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【００６５】
正常メラニン細胞はＭＩＡに関して陰性の結果を示すことがすでに調査されていたため、良性のメラニン細胞におけるＭＩＡの存在はまったく予想外であった。
【００６６】
データから、ＭＩＡは、非分節型白斑の病原性メカニズムに関与することが実証される。白斑の斑の形成は、白斑の皮膚において色素の除去を引き起こすＭＩＡとアルファ５ベータ１インテグリンとの相互作用に起因するメラノサイト流出の結果である。
【００６７】
ＭＩＡの作用をブロックするための標的療法としてＭＩＡ阻害剤を使用することにより、あらゆる解剖学的な領域において十分な再色素沈着がもたらされる。
【００６８】
ＭＩＡ阻害剤は、すでにこの皮膚疾患に罹っている患者、および、臨床的寛解の状態にある患者において白斑の発生を予防する。
【００６９】
白斑のメラニン細胞におけるＭＩＡの存在は、皮膚検体において疾患を組織学的に定義するための有効なマーカーである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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