(57)【要約】HIVの治療のための組成物および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象におけるHIV 感染を治療または阻害するための方法であって、該方法は、該対象に、少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストおよび少なくとも一つの医薬用担体を含む組成物を投与することを含む。
【請求項２】
HIV 再活性化を誘導するための方法であって、該方法は、少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストをHIVに潜在的に感染している細胞に送達することを含む。
【請求項３】
HIVによる細胞の感染を阻害するための方法であって、該方法は、少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストを該細胞に送達することを含む。
【請求項４】
該BETアンタゴニストがブロモドメイン含有タンパク質4 (Brd4) アンタゴニストである、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項５】
該BETアンタゴニストが小分子である、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項６】
該BETアンタゴニストが、該 BETのアセチル化リジン結合ドメインに特異的に結合する、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項７】
該BETアンタゴニストがJQ1(+)またはI-BETである、請求項1から3のいずれかの方法。 
【請求項８】
少なくとも一つのさらなる抗-HIV 化合物の投与をさらに含む、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項９】
高活性抗レトロウイルス剤療法の該対象への投与をさらに含む、請求項8の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つのさらなる活性化剤の投与をさらに含む、請求項1から3のいずれかの方法。
【請求項１１】
該さらなる活性化剤が、プロテインキナーゼC 活性化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、TNFα、PHA、Tat、およびIL-7からなる群から選択される請求項10の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストおよび少なくとも一つのさらなる抗-HIV 化合物および/または活性化剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で2011年7月29日出願の米国仮特許出願第61/513,200号からの優先権を主張する。前記出願を引用により本明細書に含める。
【０００２】
発明の分野
本発明は、HIV 治療(therapy)の分野に関する。より具体的には、本発明は、HIV 感染の治療、阻害、予防、および/または治癒のための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
HIV 感染を治療するための一つの持続している障壁は、現在の抗レトロウイルス(ARV) 療法には近づきがたい、潜伏状態にウイルスが入る能力である。どのようにしてHIVが潜伏感染状態に入り、潜在性を維持するのかは、部分的にしか理解されていない。一つの理論は、クロマチン構造における変化、例えば、ヒストン脱アセチル化が、HIV 末端反復配列 (LTR)からの転写を抑制し、その結果、潜伏感染状態が確立されるというものである。IL-7、プロストラチン、およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、潜在的に感染した保有宿主(reservoir)からHIVを追放するために試験されてきた。しかしながら、潜在性保有宿主のはっきりと認識できる低下は、これらの薬物がARVと組み合わされた場合に観察されていない。潜在性プロウイルスの再活性化(reactivating)とは対照的に、細胞の活性化をブロックする薬物が、ウイルス血症の初期バーストを低下させ、潜在性ウイルス保有宿主の確立を制限する可能性がある。免疫抑制剤であるシクロスポリン A (CSA)が、ウイルス複製を抑制し、正常 CD4 T-細胞レベルを回復させることが示されている。しかしながら、CSAの有害作用が、HIV 疾患におけるその使用に対して反論を与えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
HIV 保有宿主を追放し、潜伏感染状態の確立を防止するための新しいアプローチの開発が、重要な治療上の挑戦である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明の一つの側面によると、動物におけるレトロウイルス感染 (例えば、HIV)を、治療する、阻害する、および/または防止するための方法が提供される。特定の態様において、該方法は、対象に(例えば、医薬上許容される担体中における)少なくとも一つの BET アンタゴニスト/阻害剤を投与することを含む。特定の態様において、BET アンタゴニストは、Brd4 アンタゴニストである。さらに別の態様において、BET アンタゴニストは、小分子(small molecule)、特に、BETのアセチル化リジン認識ポケット/結合部位に特異的に結合するものである(例えば、Filippakopoulos et al. (2010) Nature 468:1067-1073を参照されたい)。該方法はさらに、BET アンタゴニストの前、後、および/またはBET アンタゴニストと同時に少なくとも一つのさらなる抗レトロウイルス (例えば、抗-HIV) 化合物を投与することを含みうる。
【０００６】
本発明の別の側面によると、レトロウイルス (例えば、HIV) 感染を阻害する、および/または防止するための方法が提供される。特定の態様において、該方法は、細胞に少なくとも一つの BET アンタゴニストを送達することを含む。特定の態様において、BET アンタゴニストは、Brd4 アンタゴニストである。さらに別の態様において、BET アンタゴニストは、小分子、特に、BETのアセチル化リジン認識ポケットに特異的に結合するものである。該方法はさらに、BET アンタゴニストの前、後、および/またはBET アンタゴニストと同時に少なくとも一つの抗レトロウイルス (例えば、抗-HIV) 化合物を送達することを含みうる。
【０００７】
本発明のさらに別の側面によると、レトロウイルス (例えば、HIV) 再活性化(reactivation)を誘導するための方法が提供される、特定の態様において、該方法は、少なくとも一つの BET アンタゴニストを潜在的に感染した細胞に送達する (例えば、接触させる)ことを含む。特定の態様において、BET アンタゴニストは、Brd4 アンタゴニストである。さらに別の態様において、BET アンタゴニストは、小分子、特に、BETのアセチル化リジン認識ポケットに特異的に結合するものである。該方法はさらに、BET アンタゴニストの前、後、および/またはBET アンタゴニストと同時に少なくとも一つのさらなる抗レトロウイルス (例えば、抗-HIV) 化合物を送達することを含みうる。
【０００８】
本発明の別の側面によると、少なくとも一つの BET アンタゴニスト、少なくとも一つのさらなる抗レトロウイルス (例えば、抗-HIV) および/または 活性化剤、および少なくとも一つの医薬上許容される担体を含む組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面の簡単な説明
【００１０】
【図１】図 1は、JQ1が、初代 CD4 T-細胞においてHIV 感染を阻害することを示すグラフを提供する。初代 CD4 T-細胞を抗-CD3/28により活性化し、NL43、SG3、BAL1、またはBL2 (図1A)またはNL43 (図1Bおよび1C)で感染させ、BET アンタゴニスト JQ1(+)または対照エナンチオマー JQ1(-)の存在下で培養した。図 1Aは、フローサイトメトリーにより決定した、細胞におけるp24Gag の発現を提供する。 図1Bおよび1Cは、ELISAにより培養上清において測定した、ウイルス産生を示す。図 1Cは、様々な量の JQ1(+)、JQ1(-)、または担体であるジメチルスルホキシド (DMSO)によるウイルス産生を示す。
【図２】図 2Aは、JQ1が、HIV LTRの活性化を駆動することを示す。CEMss LTR-GFP 細胞にNL43を感染させ、BET アンタゴニストであるJQ1(+) (1μM)または対照エナンチオマー JQ1(-)の存在下で培養した。細胞におけるGFP 発現をフローサイトメトリーにより調べた。3回の実験の代表を示す。図 2Bは、フローサイトメトリーにより決定した、様々な量の JQ1とともに培養された場合の細胞におけるGFP 発現を示すグラフを提供する。0.25 μMのJQ1(+)は、NL43 に感染した CEMss LTR-GFP 細胞におけるGFPの発現を劇的に上昇させるために十分であった。図2Cおよび2Dは、JQ1(+)またはJQ1(-) (1 μM)、および様々な量の HIV-1 Tatの存在下で培養したCEMss LTR-GFP 細胞におけるGFP 発現の％(図2C)およびGFPの平均蛍光(MFI; 図2D)を示す。
【図３】図 3Aは、JQ1(+)が、潜在的に感染した細胞株におけるHIV LTRの再活性化(reactivation)を駆動することを示す。潜在的に感染した細胞株、J-Lat クローン A2を、不活性 JQ1(-)または活性 JQ1(+) (0.5 μM) の存在下で16 時間TNFαまたはPHAにより再活性化した。GFP 発現をフローサイトメトリーにより測定した。図3Bおよび3Cは、JQ1(+)またはJQ1(-)の存在下で培養物にTNFαまたはPHAを添加した16 時間後の、潜在的に感染した細胞株である、J-Lat クローン82、A72、A7、A2、および A1における、GFPについて陽性の％ 細胞(図3B)およびGFPの平均 MFI (図3C)を示す。
【図４】図 4は、GSK525762A (I-BET) (図 4A)、JQ1 (tert-ブチル 2-((6S)-4-(4-クロロフェニル)-2,3,9-トリメチル-6H-チエノ[3,2-f][1,2,4]トリアゾロ[4,3-a][1,4]ジアゼピン-6-イル)アセテート) (図 4B)、およびGW841819X (図 4C)の化学構造を提供する。
【図５】図 5Aは、 HIV-1 NL43によりウイルス接種され(spinoculate)、次いで1μMのJQ1(+)またはJQ1(-)および、所望により、IL-7 (20 ng/ml; 感染後3日目) の存在下で培養した、初代休止 CD4 T-細胞の百万細胞あたりのp24 レベルを示す。3回の実験の代表 を示す。図 5Bは、 SG3またはSG3ΔVif (SG3dVif)によりウイルス接種され(spinoculate)、次いで1 μMのJQ1(+)またはJQ1(-)および、所望により、IL-7 (20ng/ml; 感染後3日目) の存在下で培養した、初代休止 CD4 T-細胞の百万細胞あたりのp24 レベルを示す。AZT (100 μM) をびまん性(spreading)感染を防止するために感染後1日目に添加した。培地におけるp24のレベルを感染後3日目 (d3)および5日目 (d5)にELISAにより測定した。
【図６】図 6Aは、JQ1(+) (1 μM)またはJQ1(-)の存在下で培養した、NL43によるCEMss LTR-GFP 細胞の感染の後の様々な時点でのp24Gag レベルのグラフを提供する。3回の実験の代表を示す。図 6Bは、GFP+ 集団におけるP24+ 細胞の％の比のグラフを提供する。2回の実験の代表を示す。図 6Cは、感染の3日後の細胞のGFP対(versus) p24 染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞 BET (ブロモドメインおよびエキストラ末端(Bromodomains and Extra Terminal)) タンパク質ファミリーのアンタゴニスト(例えば、細胞-透過性小分子)を用いて、レトロウイルス感染を治療する、制御する、および/または治癒させるための方法を提供する。HIV Vif (ウイルス感染性因子(viral infectivity factor))は、２つの細胞タンパク質、Brd4およびCdk9と相互作用して、細胞を細胞周期のG1からS期へと駆動する(Wang et al. (2011) Blood 117:1260-1269)。Cdk9は、ヘテロ二量体 p-TEFb (陽性転写伸長因子 b)の成分である。BET ファミリーメンバーであるBrd4は、ヒストンおよびその他の核内因子上のアセチル化リジンに結合することによって作用して、遺伝子発現を調節する。Brd4は、p-TEFbを活性遺伝子のプロモーターへと動員し、遺伝子転写を変化させ、したがって、G1からSへの進行を刺激する。HIV Tat タンパク質はまた、p-TEFbをウイルス LTRへと動員し、これはHIVの効率的な転写伸長のために重要な工程である。Brd4の過剰発現は、Tat とp-TEFbとの間の相互作用を破壊し、TatがHIV プロモーターをトランス活性化する能力を抑制する(Bisgrove et al. (2007) PNAS 104:13690-13695)。
【００１２】
BET アンタゴニストの抗-HIV 活性が本明細書において以下に示される。具体的には、BET 拮抗作用がウイルス複製を阻害し、HIV LTRの活性化を駆動することが示される。BET アンタゴニストは、BET をクロマチンから、それらのアセチル化リジン結合部位に競合的に結合することにより、外す(displace)。それ自体、Brd4 およびその他のBET タンパク質の(例えば、小分子アンタゴニストとの) 拮抗作用は、HIV 感染を制御し、治癒させる。その他の系 (例えば、骨髄由来マクロファージ)における研究に基づくと、BET アンタゴニスト、例えば、JQ1はまた、感染の存在下または非存在下での、活性化(activated)T-細胞による炎症性サイトカイン発現を阻害することができる。したがって、理論に拘束されるわけではないが、BET 拮抗作用 (即ち、サイトカイン発現の阻害およびBrd4 機能の破壊)の両方の効果が、ウイルス複製の阻害を導き得る。
【００１３】
本発明は、動物におけるレトロウイルス感染を、防止する、阻害する、および/または治療するための方法を包含する。特定の態様において、該方法は、少なくとも一つの BET アンタゴニストおよび少なくとも一つの医薬上許容される担体を含む少なくとも一つの組成物を動物に投与することを含む。動物は哺乳類であってよく、特に、霊長類またはヒトでありうる。特定の態様において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。レンチウイルスには、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス (HIV) (例えば、HIV-1、HIV-2)、ウシ免疫不全ウイルス (BIV)、ネコ免疫不全ウイルス (FIV)、サル免疫不全ウイルス (SIV)、およびウマ伝染性貧血ウイルス (EIA)が含まれる。該方法はさらに、少なくとも一つの抗レトロウイルス (例えば、抗-HIV) 化合物を、 BET アンタゴニストの前、後、および/またはBET アンタゴニストと同時に送達することを含みうる。該方法はさらに、少なくとも一つのその他の活性化 (例えば、HIV 活性化) 剤 (例えば、プロテインキナーゼC 活性化剤(例えば、プロストラチン、ブリオスタチン)、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(例えば、トリコスタチン A、バルプロ酸、酪酸ナトリウム、ボリノスタット、ロミデプシン)、TNFα、PHA、Tat、および/または IL-7)を送達することを含みうる。
【００１４】
本発明はまた、レトロウイルス (例えば、HIV) 感染、複製、および/またはウイルス産生を、阻害する および/または防止するための方法を包含する。特定の態様において、該方法は、細胞に少なくとも一つの BET アンタゴニストを(例えば、レトロウイルスの前またはレトロウイルスと同時に)送達することを含む。該方法はさらに、BET アンタゴニストの前、後、および/またはBET アンタゴニストと同時に少なくとも一つの抗レトロウイルス (例えば、抗-HIV) 化合物を送達することを含みうる。該方法はさらに、少なくとも一つのその他の活性化剤を送達することを含みうる。該方法は、インビトロ (例えば、細胞培養物) で行ってもインビボで行ってもよい。
【００１５】
本発明はまた、レトロウイルス (例えば、HIV) 活性化を誘導するための方法も包含する。特定の態様において、該方法は、少なくとも一つの BET アンタゴニストを、レトロウイルスに潜在的に感染している細胞に送達することを含む。該方法は、インビトロ (例えば、細胞培養物)で行ってもインビボで行ってもよい。該方法はさらに、少なくとも一つのその他の活性化剤を送達することを含みうる。該方法はまた、細胞と被験化合物とをさらに接触させ、レトロウイルスレベル/クリアランスを(例えば、被験化合物の非存在下と比較して)モニターすることにより、HIV 治療薬(例えば、BET アンタゴニストと相乗効果を有するもの) をスクリーニングするためにも使用され得る。
【００１６】
本発明のBET アンタゴニストは、 BET タンパク質 (例えば、Brd2、Brd3、Brd4)の機能を破壊する(disrupt)。特定の態様において、BET アンタゴニストは、Brd4 (ブロモドメイン含有タンパク質(bromodomain containing protein)4; 例えば、遺伝子番号23476を参照されたい)の機能を特異的に破壊する。特定の態様において、BET アンタゴニストは、(例えば、アセチル化ヒストンの)アセチル化リジン認識ポケット (例えば、ブロモドメイン内のもの)に特異的に結合する。特定の態様において、BET アンタゴニストは小分子阻害剤である。最近開発された３つの合成 BET アンタゴニストは、JQ1、I-BET、およびGW841819X である(Nicodeme et al. (2010) Nature 468:1119-1123; Filippakopoulos et al. (2010) Nature 468:1067-1073; Gamsjaeger et al. (2011) Mol. Cell. Biol.、31:2632-2640)。別の態様において、BET アンタゴニストは、阻害性核酸分子、例えば、アンチセンスまたはsiRNAである(例えば、Dharmacon (Chicago、IL)からのbrd4 siRNA; Chung et al.、J. Med. Chem. (2011) 54:3827-3838 (page S20)からのbrd4 siRNA;およびNicodeme et al. (2010) Nature 468:1119-1123にて提供されるマウス brd4 siRNAのヒト類似体を参照されたい)。小分子 BET アンタゴニストの例としては、限定されないが、JQ1 (図 4)、I-BET (GSK525762A) (図 4)、GW841819X (図 4; Chung et al.、J. Med. Chem. (2011) 54:3827-3838)、チエノトリアゾロジアゼピン化合物、米国特許出願公開第2010/0286127号に提供されるもの (例えば、式 (I)のものおよび化合物 1-18を含む)、米国特許出願公開第2010/0286127号における式 (I)の化合物の誘導体 (例えば、式中、R3 は水素であり、ここでチオフェン環が6員環 (例えば、所望により一以上の R1 および/または R2 基により置換されている、アリールまたはベンジル基)により置換されており、および/または、ここで、R4 は、-(CH2)a-CO-O-R9である)、およびそれらの医薬上許容される塩が挙げられる。 特定の態様において、BET アンタゴニストは、JQ1またはI-BETである。特定の態様において、BET アンタゴニストは、JQ1(+) エナンチオマーである。JQ1(+) エナンチオマーは、鏡像異性的に純粋である必要はなく、JQ1(-) エナンチオマーとの混合物におけるものであってもよいが、実質的に純粋な JQ1(+) エナンチオマーを含む組成物を有することが好ましい。
【００１７】
本発明の組成物は、レトロウイルス感染を治療する/阻害する/防止するために、動物、特に、哺乳類、より具体的にはヒトに投与されることができる (例えば、組成物は、レトロウイルス感染の前、最中または後に投与され得る)。本発明の医薬組成物はまた、少なくとも一つのその他の抗レトロウイルス剤 (例えば、抗-HIV 剤)も含みうる。さらなる抗レトロウイルス剤はまた、本発明のBET アンタゴニストから分離された(separate) 組成物において投与され得る。組成物は、同時にまたは異なる時間に投与され得る(例えば、順次に (例えば、BET アンタゴニストは、抗レトロウイルス剤の前、後、または抗レトロウイルス剤と同時に投与され得る))。本発明の特定の態様において、BET アンタゴニストは、高活性抗レトロウイルス剤療法 (highly active antiretroviral therapy)(HAART)とともに投与される(例えば、高活性抗レトロウイルス剤療法の前、最中、および/または後に)。
【００１８】
本発明の組成物は、治療上有効量にて、それを必要とする患者に投与され得る。本発明の医薬組成物は、あらゆる好適な経路により、例えば、注射により(例えば、非経口的、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与)、経口的、肺 (例えば、気管内(intratraechially))、経鼻、局所的、またはその他の投与様式、例えば、制御放出デバイスにより投与され得る。一般に、本発明の医薬組成物および担体は、とりわけ、医薬上許容される希釈剤、保存料、安定化剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および/または担体を含む。かかる組成物は、様々なバッファー内容物(例えば、生理食塩水、Tris HCl、アセテート、ホスフェート)、pH およびイオン強度の希釈剤;および、添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤(例えば、Tween(商標) 80、ポリソルベート 80)、抗酸化剤 (例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム)、保存料 (例えば、チメロソール(Thimersol)、ベンジルアルコール)および増量(bulking)物質 (例えば、ラクトース、マンニトール)を含みうる。組成物は、重合体化合物、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の粒状調製物に、またはリポソームに組み込まれうる。かかる組成物は、本発明の医薬組成物の成分の、物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボ除去速度に影響しうる。例示的な医薬組成物および担体は、例えば、引用により本明細書に含める、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 by E.W. Martin (Mack Pub. Co.、Easton、PA)および「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」 by Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams ＆ Wilkins)に提供されている。本発明の医薬組成物は、例えば、液体形態、エアロゾル(aerosolized)形態において調製することができるし、あるいは丸剤または乾燥粉末形態 (例えば、凍結乾燥されている)におけるものであってもよい。選択された媒体における剤(agent)の濃度は、変動し得、媒体は、医薬調製物の所望の投与経路に基づいて選択すればよい。あらゆる常套の媒体または剤が、投与されるべき剤と不適合性でない限り、その医薬調製物における使用が考慮される。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明の医薬組成物は、放出制御製剤において、例えば、静脈内注入、植え込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、またはその他の投与様式を用いて送達され得る。 特定の態様において、ポンプを使用することができる(Medical Applications of Controlled Release、Langer and Wise (eds.)、CRC Press; Sefton、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. (1987) 14:201; Buchwald et al.、Surgery (1980) 88:507; Saudek et al.、N. Engl. J. Med. (1989) 321:574を参照されたい)。別の態様において、重合体物質を用いることができる (Medical Applications of Controlled Release、Langer and Wise (eds.)、CRC Press; Controlled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance、Smolen and Ball (eds.)、Wiley:  New York (1984); Ranger and Peppas、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. (1983) 23:61を参照されたい; Levy et al.、Science (1985) 228:190; During et al.、Ann. Neurol. (1989) 25:351; Howard et al.、J. Neurosurg. (1989) 71:105もまた参照されたい)。
【００２０】
本発明の剤を有効成分として医薬上許容される担体との本質的な(intimate) 混合物にて含有する医薬組成物は、常套の医薬配合技術にしたがって調製することができる。担体は、投与に望まれる調製物の形態、例えば、静脈内、に応じて多様な形態をとりうる。
【００２１】
本発明の医薬調製物は、投与の容易さおよび用量(dosage)の均一性のために、用量単位形態(dosage unit form)にて処方されうる。本明細書において用いる場合、用量単位形態は、治療を受ける患者に適当な、医薬調製物の物理的に別々の単位をいう。各用量は、選択した医薬用担体と関連して所望の効果を生み出すように計算された量の有効成分を含有すべきである。適当な用量単位を決定するための手順は当業者に周知である。用量単位は、患者の重量に基づいて比例して上昇または低下されうる。特定の病態の軽減のための適当な濃度は、当該技術分野において公知のように、用量濃度曲線計算によって決定されうる。本発明の組成物の投与のための用量範囲は、所望の効果 (例えば、疾患、障害、または感染および/またはそれらに関連する症候を、治癒させる、軽減する、治療する、および/または防止する)を生じるために十分に大きなものである。用量は、有害な副作用、例えば、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応等を引き起こすほど大きなものであるべきではない。一般に、用量は、年齢、症状、性別および患者における疾患の程度によって変動し、当業者により決定され得る。用量は、いずれかの反対の兆候(counter indication) の場合には個々の医師によって調整されうる。
【００２２】
本発明にしたがって、本発明の組成物の投与のための適当な用量単位が、動物モデルにおいて分子または細胞の毒性を評価することによって決定され得る。医薬調製物における様々な濃度の剤が動物に投与され得、最小および最大用量は、治療の結果として観察される有利な結果および副作用に基づいて決定され得る。適当な用量単位はまた、その他の標準的薬物と組み合わせての剤による治療の有効性を評価することによっても決定されうる。組成物の用量単位は、個々に、または、検出される効果にしたがってそれぞれの治療と組み合わせて、決定され得る。
【００２３】
本発明の剤を含む医薬調製物は、適当な間隔にて、例えば、少なくとも一日一回または二回またはそれ以上にて投与され得る。特定の症例における適当な間隔は、通常は、患者の症状に依存するであろう。
【００２４】
定義
「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも 50-60重量％の所与の物質 (例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等)を含む調製物をいう。より好ましくは、調製物は、少なくとも 75重量％、もっとも好ましくは 90-95重量％の所与の化合物を含む。純度は、所与の化合物のために適当な方法(例えば、クロマトグラフィー方法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC 分析等)によって測定される。
【００２５】
「単離された」という用語は、その他の化合物または物質とともにある人工または合成混合物、または基本的活性に干渉せず、例えば、不完全な精製、または安定剤の添加に起因して存在しうる不純物の存在を排除する意味ではない。
【００２６】
「医薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局による、または、動物における使用、およびより具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方またはその他の一般に認識されている薬局方に列挙されている承認を示す。
【００２７】
「治療する」という用語は、本明細書において用いる場合、疾患に罹患している患者に利益を与えるあらゆるタイプの治療をいい、患者の症状(condition)における(例えば、一以上の症候における) 改善、症状の進行における遅延等が含まれる。 特定の態様において、レトロウイルス感染の治療は、感染した細胞の数の少なくとも阻害/低下をもたらす。
【００２８】
「有効量」という表現は、患者の症状の改善をもたらす治療薬の量をいう。
【００２９】
HIV 感染の阻害の文脈における「阻害する」という用語は、治療すべきHIV 感染の発生率または症候(symptom)の低下または治療すべきHIV 感染の存在または程度の低下をいいうる。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「防止する(prevent)」という用語は、症状を発症する危険にある対象の、対象が症状を発症する確率の低下 (例えば、少なくとも有意な低下)をもたらす、予防的処置をいう。
【００３１】
「担体」は、本発明の活性剤がともに投与される、例えば、希釈剤、補助剤(adjuvant)、賦形剤、補助剤(auxilliary agent)または媒体をいう。かかる医薬用担体は、無菌液体、例えば、水および油であり得、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等が挙げられる。水または水性生理食塩水溶液および水性ブドウ糖(dextrose)およびグリセロール溶液が、好ましくは特に注射用溶液のための、担体として用いられる。好適な医薬用担体は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」(Ed. Gennaro; Mack Publishing、Easton、PA)および「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(Ed. Troy; Lippincott Williams ＆ Wilkins、Baltimore、MD) に記載されている。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「小分子」という用語は、比較的に低分子量 (例えば、4,000未満、2,000未満、特に 1 kDaまたは800 Da未満)を有する物質または化合物をいう。典型的には、小分子は有機のものであり、アミノ酸またはジペプチドであってもよいが、タンパク質、ポリペプチド、または核酸ではない。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「抗-HIV 化合物」は、HIVを阻害する化合物である。 抗-HIV 化合物の例としては、限定されないが、以下が挙げられる:
(I) ヌクレオシド類似体(nucleoside-analog) 逆転写酵素阻害剤(NRTI; 例えば、AZT (ジドブジン、レトロビル(登録商標))、ラミブジン (3TC、エピビル(登録商標))、エムトリシタビン (エムトリバ(登録商標))、ジデオキシシチジン (ddC、ザルシタビン、ハイビッド(登録商標))、2',3'-ジデオキシイノシン (ddI、ヴァイデックス(登録商標))、テノホビル DF (ビリアード(登録商標))、スタブジン (d4T、ゼリット(登録商標))、アバカビル (1592U89; ザイアジェン(登録商標))、アデホビルピボキシル (ビス(POM)-PMEA; プレヴォン(PREVON)(登録商標))、ロブカビル(lobucavir) (BMS-180194)、BCH-10652、エミトリシタビン(emitricitabine)、エルブシタビン(elvucitabine)、およびロデノシン(lodenosine) (FddA; 2'-ベータ-フルオロ-2',3'-ジデオキシアデノシン))、トリジビル (アバカビル、ジドブジン、およびラミブジン)、
(II) 非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤 (NNRTI; 例えば、デラビルジン (BHAP、U-90152; レスクリプター(登録商標))、エファビレンツ (DMP-266、サスティバ(登録商標))、ネビラピン (ビラミューン(登録商標))、PNU-142721、カプラビリン (S-1153、AG-1549)、エミビリン(emivirine) (+)-カラノリド(calanolide) A (NSC-675451)およびB、エトラビリン (TMC-125)、DAPY (TMC120)、BILR-355 BS、PHI-236、およびPHI-443 (TMC-278))、
(III) プロテアーゼ阻害剤(PI; 例えば、アンプレナビル (141W94、アジェネラーゼ(AGENERASE)(登録商標))、チプラニビル(tipranivir) (PNU-140690、アプティバス(登録商標))、インジナビル (MK-639; クリキシバン(登録商標))、サキナビル (インビラーゼ(登録商標)、フォートベイス(登録商標))、ホスアンプレナビル (レクシヴァ(登録商標))、ロピナビル (ABT-378)、リトナビル (ABT-538、ノービア(登録商標))、アタザナビル (レイアタッツ(登録商標))、ネルフィナビル (AG-1343、ビラセプト(登録商標))、ラシナビル(lasinavir) (BMS-234475/CGP-61755)、BMS-2322623、GW-640385X (VX-385)、AG-001859、およびSM-309515)、カレトラ(商標)(ロピナビルおよびリトナビル)、および、
(IV) 融合阻害剤(FI;例えば、T-20 (DP-178、フゼオン(登録商標))およびT-1249)。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤」(NRTI)という用語は、HIV-1 逆転写酵素の活性を阻害する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドおよびそれらの類似体をいう。本明細書において用いる場合、NNRTIは、HIV 逆転写酵素の非基質(nonsubstrate)-結合部位に可逆的に結合し、それにより、活性部位の形状を変化させる、またはポリメラーゼ活性をブロックする、アロステリック阻害剤である。本明細書において用いる場合、「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、HIV-1 プロテアーゼの阻害剤をいう。本明細書において用いる場合、「融合阻害剤」は、HIV エンベロープタンパク質に結合し、ウイルスが宿主細胞と融合するために必要な構造変化をブロックすることによって作用する、化合物、例えば、ペプチドである。
【００３５】
抗-HIV 化合物にはまた、HIV ワクチンが含まれ、例えば、限定されないが、ALVAC(登録商標) HIV (vCP1521)、AIDSVAX(登録商標)B/E (gp120)、およびそれらの組み合わせが挙げられる。抗-HIV 化合物にはまた、HIV 抗体 (例えば、gp120またはgp41に対する抗体(例えば、VCR01 (Zhou et al. (Science (2010) 329:811-7)、PG9およびPG16 (Doores et al. (J. Virol. (2010) 84:10510-21)、および、Walker et al. (Science (2009) 326:285-9)も参照されたい)、特に広く、中和抗体も含まれる。その他の抗-HIV 剤には、限定されないが、組換え可溶性 CD4 (rsCD4)、抗-CD4 抗体 (例えば、Tanox、Inc.からのもの)、抗-CCR5 抗体 (例えば、Pro 140); CXCR4 遮断薬 (例えば、AMD 3100)、HIV 侵入(entry)阻害剤 (例えば、Pro-542; Progenies)、およびCCR5 遮断薬 (例えば、SCH-C、SCH-D; Schering Plough)が含まれる。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「高活性抗レトロウイルス剤療法」(HAART)という用語は、治療(therapeutics)の様々な組み合わせ(例えば、少なくとも三つ)、例えば、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、HIV プロテアーゼ阻害剤、および融合阻害剤、によるHIV 治療(therapy)をいう。例えば、HAART は、二つの逆転写酵素阻害剤および一つのプロテアーゼ阻害剤を含みうる。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「活性化剤」または「HIV 活性化剤」という用語は、感染性ウイルスおよび/または細胞表面抗原の転写、複製、および/または産生を開始させるためにプロウイルス潜在性 DNAを刺激する化合物をいう。
【００３８】
「低分子干渉RNA (siRNA)」という表現は、短い (典型的には、30 ヌクレオチド長未満、特に、12-30または20-25 ヌクレオチド長) 二本鎖 RNA 分子をいう。典型的には、siRNAは、siRNAが標的にする遺伝子の発現を調節する。siRNA 分子を同定および合成する方法は当該技術分野において公知である(例えば、Ausubel et al. (2006) Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、Incを参照されたい)。本明細書において用いる場合、siRNAという用語は、短いヘアピン(short hairpin) RNA 分子(shRNA)を含みうる。典型的には、shRNA 分子は、小さいループ配列によって分けられる短い相補的配列からなり、ここで、配列の一方は遺伝子標的に相補的である。shRNA 分子は典型的には、エンドヌクレアーゼによって細胞内でsiRNAへとプロセシングされる。例示的なsiRNA 分子に対する修飾は、米国特許出願公開第20050032733号に提供されている。siRNA 分子の発現のための発現ベクターは、好ましくは、構成的であっても調節性(regulated)であってもよい強いプロモーターを用いる。かかるプロモーターは当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、RNA ポリメラーゼ II プロモーター、T7 RNA ポリメラーゼプロモーター、およびRNA ポリメラーゼ III プロモーターU6 およびH1 が含まれる(例えば、Myslinski et al. (2001) Nucl. Acids Res.、29:2502 09を参照されたい)。
【００３９】
「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」には、目的のタンパク質の発現を阻害するために選択された配列 (例えば、翻訳開始点および/またはスプライス部位) を標的にする(相補的な) 核酸分子(例えば、一本鎖分子) が含まれる。かかるアンチセンス分子は典型的には約 15から約 50 ヌクレオチド長であり、より具体的には約 15から約 30 ヌクレオチドであり、しばしばmRNA 分子の翻訳開始部位に及ぶ(span)。アンチセンスコンストラクトはまた、逆方向にて標的核酸分子の全配列を含有するよう作成されうる。あらゆる公知のヌクレオチド配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標準的方法にしたがってオリゴヌクレオチド合成により調製することができる。
【００４０】
以下の実施例は本発明を実施するための例示的方法を記載するものであり、いかなるようにしても本発明の範囲を限定するように意図されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例
本実施例において、HIV 感染を、細胞 BET ファミリータンパク質の細胞-透過性小分子アンタゴニストを用いて阻害する、制御する、および/または治癒させることができることが示される。BET 拮抗作用がウイルス産生を阻害し (図 1)、HIV LTRの活性化を駆動する (図2 ＆ 3)ことが本実施例中以下に実証される。
【００４２】
BET アンタゴニストは、初代活性化CD4 T-細胞においてウイルス感染を阻害する。具体的には、ウイルス複製に対するBET アンタゴニスト JQ1(+)の効果をHIV-感染T-細胞にて試験した。初代活性化CD4 T-細胞を、JQ1(+) (1 μM) の存在下または非存在下でX4-指向性ウイルス (NL43またはSG3)または R5-指向性ウイルス (BAL1またはBL2)で感染させた。ウイルス感染を感染後様々な日数にてフローサイトメトリーまたはELISAによって測定した。感染のレベルは、BET アンタゴニストの存在下で低下したが、DMSO または対照エナンチオマー JQ1(-)によっては低下しないことが判明した (図 1)。JQ1は、感染後3および6日目に初代 CD4 T-細胞におけるHIV 感染を有意に阻害した(*p<0.05) (図 1B)。ウイルス感染の阻害はまた、0.1 μMのJQ1によっても観察された(図1C)。これらのデータは、 BET アンタゴニストがHIV 感染を阻害することを示す。
【００４３】
BET アンタゴニストはまた、HIV LTRの活性化を駆動する。具体的には、HIV LTRからの転写に対するJQ1の効果を試験した。CEMss LTR-GFP 細胞(HIV-1 LTR プロモーターの制御下でGFP により安定にトランスフェクトされたレポーター細胞株)を、BET アンタゴニストまたは対照の存在下で、NL43に感染させた。GFP 発現を感染後0、1、2、3、および 6日目に測定した。GFP 発現は、対照と比較してBET 阻害剤 (JQ1) の存在下でより高かった(図 2A)。さらに、JQ1の量を変動させることにより、0.25 μM のJQ1(+)が劇的にTat-駆動HIV-1 転写を上昇させるために十分であることが決定された(図 2B)。CEMss LTR-GFP 細胞をまた、JQ1(+)またはJQ1(-) (1 μM)および様々な量の HIV-1 Tat (0 - 32 μg/ml) の存在下で培養した。図2C および2Dは、 8 μg/mlのHIV-1 Tatが単独で GFPの発現(express)を活性化したが(図2C)、一方GFPの平均蛍光強度 (MFI)は、JQ1(+)の存在下で、8、16、または32 μg/mlのTatにて劇的に増強したことを示す(図2D)。
【００４４】
次に、HIV LTRの活性化に対するJQ1の効果を、潜在的に感染した Jurkat-由来細胞クローンである、J-Lat クローン A2を用いて試験した。J-Lat クローン A2におけるGFP 発現は、腫瘍壊死因子-アルファ (TNFα)またはフィトヘマグルチニン (PHA)による再活性化によって誘導される。 GFP 発現 (％ 陽性細胞および平均蛍光強度)は、TNFα またはPHA+JQ1(+)とともに培養した細胞において、JQ1(-) 対照化合物とともに培養した細胞と比べて高かったことが決定され(図 3A)、これはJQ1が潜在的に感染した細胞におけるHIV LTRの再活性化を駆動することを示している。図3Bおよび3Cはまた、GFP 発現 (％ 陽性細胞 (図3C)および平均蛍光強度 (図3D))によって決定した場合、JQ1(+)が潜在的に感染した細胞株である、J-Lat クローン82、A72、A7、A2、およびA1において、HIV LTR の再活性化を駆動することを示す。
【００４５】
図 5は、JQ1(+)が、潜在的に感染した初代休止 CD4 T-細胞においてHIV LTRの再活性化を駆動することを示す。図 5Aについて、初代休止 CD4 T-細胞を精製し、HIV-1 NL43または偽(mock)対照によりウイルス接種(spinoculate)した。感染した細胞を次いで1 μMのJQ1(+)またはJQ1(-)の存在下で培養した。感染後3日目、IL-7 (20 ng/ml) を培養物のいくつかに添加した。細胞を計数し、細胞上清を感染後5日目に収集した。培地中のp24GagのレベルをELISAにより測定し、百万細胞あたりのp24 レベルを図5Aに示す。図 5Bについて、初代 CD4 T-細胞をSG3またはSG3deltaVifによりウイルス接種(spinoculate)し、1 μMのJQ1(+)またはJQ1(-)の存在下で培養した。AZT (100 μM)を感染後1日目にびまん性感染を防止するために添加した。IL7 (20 ng/ml)を感染後3日目にいくつかの培養物に添加し、培地中のp24のレベルを感染後3日目および5日目にELISAにより測定した。示されるデータは、三連を用いて要約されている。図 5Bは、JQ1(+)が、野生型のSG3 に潜在的に感染した細胞におけるHIV LTRの再活性化を駆動するが、SG3deltaVif に感染した細胞においては駆動しないことを示す。
【００４６】
JQ1(+)が初代休止 CD4 T-細胞におけるウイルス組込みに影響するかを決定するために、細胞を精製し、HIV-1 NL43または偽対照により感染させた。感染した細胞を次いで1 μMのJQ1(+)またはJQ1(-)の存在下で48 時間培養した。細胞ペレットを感染後0 時間および48 時間に収集した。DNAを単離し、休止 CD4 T-細胞におけるウイルス組込みをAlu-PCRにより測定した。表 1にみられるように、JQ1(+)は、初代休止 CD4 T-細胞におけるウイルス組込みに有意に影響しない。
【００４７】
【表１】
2014524409.tif 000002
【００４８】
図 6にみられるように、Brd4 アンタゴニストである、JQ1(+)は、活性化(activated) 初代 CD4 T-細胞またはCEMss LTR-GFP 細胞株における感染の後期(later)時点においてHIV-1のウイルス産生を低下させる。理論に拘束されず、このウイルス産生の低下は以下に起因にしうる：1) JQ1(+)が細胞周期におけるG1 停止(arrest)をもたらし、その結果、細胞死が起こるか、または、全体的に低下したウイルス産生に寄与する細胞適応度(fitness)に影響を与える; および/または 2) JQ1(+)がその他のウイルスまたは宿主細胞タンパク質の転写に影響し、それによりウイルス粒子のパッケージングの低下が導かれる。
【００４９】
図 6Aは、ウイルス産生がJQ1(+)の存在下で感染後6日目に低下したことを示す。具体的には、CEMss LTR-GFP 細胞をNL43により感染させ、BET アンタゴニストである、JQ1(+) (1 μM)または対照 JQ1 エナンチオマーである、JQ1(-)の存在下で培養した。感染後様々な時点において、細胞上清を収集し、p24GagのレベルをELISAにより測定した。図6B および6Cは、感染した細胞におけるp24Gagの発現が感染後3日目に低下したことを示す。実験は図 6A に示す通りに行い、細胞をGFPおよびp24-PEの発現について感染後1、2、3、および6日目に染色した。図 6Bは、GFP+ 集団におけるp24+の比のグラフを提供する。２つの実験の代表を示す。図 6Cは、感染後3日目のGFPおよびp24-フィコエリトリン (PE) 染色の代表を示す。
【００５０】
多数の刊行物および特許文献が本発明が属する技術水準を説明するために上記明細書にわたって引用される。これらの引用文献のそれぞれの全体の開示を引用により本明細書に含める。
【００５１】
本発明の好適な態様のいくつかを記載し、具体的には上記に例証してきたが、本発明はかかる態様に限定される意図ではない。様々な修飾が以下の請求項に示す通りの本発明の枠と精神を逸脱することなくそれらに対して行うことができる。
【図１Ａ】
2014524409.tif 000003
【図１Ｂ】
2014524409.tif 000004
【図１Ｃ】
2014524409.tif 000005
【図２Ａ】
2014524409.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2014524409.tif 000011
【図３Ｃ】
2014524409.tif 000012
【図４】
2014524409.tif 000013
【図５Ａ】
2014524409.tif 000014
【図５Ｂ】
2014524409.tif 000015
【図６Ａ】
2014524409.tif 000016
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月31日(2014.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストおよび少なくとも一つの医薬用担体を含む、HIV感染を治療または阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストを含む、HIVに潜在的に感染している細胞におけるHIV再活性化を誘導するための組成物。
【請求項３】
少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストを含む、HIVによる細胞の感染を阻害するための組成物。
【請求項４】
該BETアンタゴニストがブロモドメイン含有タンパク質4(Brd4)アンタゴニストである、請求項1から3のいずれかの組成物。
【請求項５】
該BETアンタゴニストが小分子である、請求項1から3のいずれかの組成物。
【請求項６】
該BETアンタゴニストが、該 BETのアセチル化リジン結合ドメインに特異的に結合する、請求項1から3のいずれかの組成物。
【請求項７】
該BETアンタゴニストがJQ1(+)またはI-BETである、請求項1から3のいずれかの組成物。
【請求項８】
少なくとも一つのさらなる抗-HIV化合物をさらに含む、請求項1から3のいずれかの組成物。
【請求項９】
高活性抗レトロウイルス剤療法をさらに含む、請求項8の組成物。
【請求項１０】
少なくとも一つのさらなる活性化剤をさらに含む、請求項1から3のいずれかの組成物。
【請求項１１】
該さらなる活性化剤が、プロテインキナーゼC活性化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、TNFα、PHA、Tat、およびIL-7からなる群から選択される請求項10の組成物。
【請求項１２】
少なくとも一つのブロモドメインおよびエキストラ末端(BET)タンパク質アンタゴニストおよび少なくとも一つのさらなる抗-HIV化合物および/または活性化剤を含む組成物。
【国際調査報告】
2014524409.tif 000019