(57)【要約】本発明は、一般に、生殖医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＭＩＩ卵母細胞から生じたヒト卵丘細胞の発達ステージを決定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法であって、卵丘細胞において
−  表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子、または
−  表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子
の発現レベルを測定するステップを含み、
ここで、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現が、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示し、
表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現が、該卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す方法。
【請求項２】
卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるかどうかを決定するための方法であって、卵丘細胞において、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、
ここで、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現が、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示す方法。
【請求項３】
卵丘細胞が未熟卵丘細胞であるかどうかを決定するための方法であって、卵丘細胞において、表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現が、該卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す方法。
【請求項４】
卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法であって、卵丘細胞において、表Ａおよび表Ｂの２５種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、
ここで、表Ａの遺伝子の過剰発現が、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示し、
表Ｂの遺伝子の過剰発現が、該卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す方法。
【請求項５】
不死化されている、請求項１〜４のいずれか記載の方法によって決定された成熟卵丘細胞。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の方法によって決定された、少なくとも７０％の成熟卵丘細胞を含む卵丘細胞集団。
【請求項７】
不死化されている、請求項６記載の卵丘細胞集団。
【請求項８】
−  卵丘細胞集団からどの卵丘細胞が請求項１〜４のいずれか記載の成熟卵丘細胞であるかを決定するステップ、
−  成熟卵丘細胞を選択するステップ、および
−  選択された成熟卵丘細胞の存在下で胚を共培養するステップ
を含む、胚を発生の胚盤胞ステージに成長させる方法。
【請求項９】
胚が、成熟卵丘細胞層で被覆された細胞培養表面上で培養される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
成熟卵丘細胞が、胚と接触する前に、その増殖を停止するために予め処理される、請求項８または９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
胚が、卵母細胞と精子との単純な混合または卵母細胞への細胞質内精子注入によって行われる体外受精（ＩＶＦ）を含めた体外受精（ＩＶＦ）、および核移植から成る群より選択される任意の技法によってin vitro産生される、請求項８〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
受精すると胚盤胞ステージに到達する胚を生じる高い確率を有する卵母細胞を選択するための方法であって、
ｉ）複数の卵母細胞を提供すること、
ｉｉ）該卵母細胞を包囲する少なくとも１個の卵丘細胞を単離すること、
ｉｉｉ）請求項１〜４のいずれか記載の方法にしたがって、ステップｉｉ）の該少なくとも１個の卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるかどうかを決定すること、および
ｉｖ）成熟卵丘細胞によって包囲された卵母細胞を選択すること
から成るステップを含む方法。
【請求項１３】
表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルおよび／または表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するための手段を含む、請求項１〜４のいずれか記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、一般に、生殖医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＭＩＩ卵母細胞から生じたヒト卵丘細胞の発生ステージを決定する方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
卵母細胞と隣接卵丘細胞（ＣＣ）との間の双方向交換は、卵母細胞のコンピテンス獲得、初期胚発生およびＣＣのエクスパンションに重要である（Cha and Chian, 1998; Goud et al., 1998; Salustri et al., 1989）。卵母細胞の成熟は、第１減数分裂過程の再開と共に開始し、核成熟および細胞質成熟に区分される。核成熟の間に、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）によって特徴づけられる、第一減数分裂前期から第二減数分裂中期（ＭＩＩ）への進行がある（Cha and Chian, 1998; Wang and Sun, 2007）。この過程が終われば、卵母細胞は成熟しており、受精可能と見なすべきである。
【０００３】
しかし、体外受精（ＩＶＦ）および卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）の成功を阻む主な問題は、胚発生および着床にコンピテントな卵母細胞を選択する方法である。ＣＣの遺伝子発現プロファイルは胚発生および妊娠結果を予測することが示唆されている（Adriaenssens et al., 2010; Assou et al., 2008; Assou et al., 2010; Feuerstein et al., 2007; Hamel et al., 2008; Van Montfoort et al., 2008; Zhang et al., 2005）。しかし、これらの研究の大多数で、ＣＣ遺伝子発現プロファイルが卵母細胞の核成熟ステージに応じて変動しうる可能性は考慮されず、したがって、主にＭＩＩステージなどの単一の特定の卵母細胞成熟期に焦点が当てられた（Feuerstein et al., 2007）。
【０００４】
ＩＶＦは、不妊症の処置のための、強力で広く使用されている技法である。この手順では、ヒトの卵が回収され、培養皿内で精子と混合されて受精過程が可能にされる。次に、それぞれ４個から６〜８個の間の細胞を有する第２／３日または第５もしくは６日の胚盤胞ステージに胚が子宮に移植される。この技法は、例えば、ファロピウス管の損傷または不在、子宮内膜症、男性側要因不妊症および原因不明不妊症を有する女性のために使用される。しかし、胞胚形成率は適応症および男性側要因の影響に応じて変動し、このことは、なぜ着床率が５％から３０％の間で変動するかを説明している。
【０００５】
in vivo受胎下では、胚は、発生の胚盤胞ステージに子宮に到達する。したがって、動物においてうまく利用される胚共培養技法は、着床および妊娠率を改善するために、より大きな比率の胚が胚盤胞ステージに到達するように胚用培養培地を改善する努力を表している。加えて、共培養がより高い着床率を招くならば、各周期で、より少数の胚を移植することができ、その結果、多胎妊娠の発生率が減少するであろう。したがって、ヒト生殖組織（すなわち子宮内膜）の使用を含めた一連の組織から得られたフィーダー細胞層の使用、および卵丘細胞との共培養を伴う多様な共培養技法が検討されている（OMAR Farouk and Vlad, 2008; Quinn and Margalit, 1996およびEP0340934）。しかし、胚を発生の胚盤胞ステージに成長させる標準化法、および胞胚形成率を増加させるために胚と卵丘細胞とを共培養する標準化法は明らかになっておらず、着床前ヒト胚培養のための至適システムはまだ決定されていない。
【０００６】
発明の概要：
本発明は、卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法に関する。
【０００７】
本発明は、また、成熟卵丘細胞、不死化成熟卵丘細胞、成熟卵丘細胞集団および成熟卵丘細胞系に関する。
【０００８】
本発明は、また、ヒト胚成長をin vitroで改善する結果として、ＩＶＦまたはＩＣＳＩ処置を受けている不妊女性での妊娠率を増加させるための、新規なヒト胚共培養システムに関する。
【０００９】
本発明は、また、受精した際に胚盤胞ステージに到達する胚を生じる高い確率を有する卵母細胞を選択するための方法に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、ヒト成熟卵丘細胞およびヒト未熟卵丘細胞においてディファレンシャルに発現される２５種の遺伝子のセットを決定した。
【００１１】
本発明者らは、実際に、卵母細胞を包囲する卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルがそれらの発達ステージと相関すること、および卵丘細胞の発達ステージ自体が胞胚形成率と相関し、胚盤胞ステージに向けて発達している卵母細胞の特異的発現シグネチャーの同定を可能にすることを実証した。それらの結果によって、卵母細胞を包囲する卵丘細胞の分析が、胚選択のために胞胚形成率を予測する非侵襲アプローチであることが示される。
【００１２】
本発明に関係する全ての遺伝子は、本質的に公知であり、それらを下表Ａに挙げる。表Ａは、ヒト卵丘細胞が成熟しているか、または未成熟であるかを決定するために発現プロファイルが有益であることが示された遺伝子のセットを表す。
【００１３】
【表１】
2014518081.tif 000002
【００１４】
【表２】
2014518081.tif 000003
【００１５】
本発明の目的は、卵丘細胞において表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子および表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法に関し、ここで、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示し、表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現は、卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す。
【００１６】
「卵丘細胞」という用語は、卵母細胞を包囲する細胞塊中に含まれる細胞を指す。これらの細胞は、受精の際に生存可能な胚を生じるために必要な、栄養、エネルギーおよび／または他の要件のいくつかをその卵母細胞に提供することに関与すると考えられる。ヒト卵丘細胞（ｈＣＣ）は、卵胞内で発達中の卵母細胞と密接に関連して見出される体細胞である。ｈＣＣは、エンドクリン因子、パラクリン因子およびオートクリン因子によって刺激されて、成長、分化および黄体形成する。ｈＣＣの主な機能には、ステロイド、および卵胞内で卵母細胞が発達する間に卵母細胞と相互作用する無数の成長因子の産生が含まれる。しかし、排卵後にｈＣＣは、潜在的な妊娠を維持しうるプロゲステロンを産生する。
【００１７】
本明細書において、卵母細胞は、Feuersteinら（2007）に開示されたように、核の状態に基づき以下の３種類に分類される：
（ｉ）卵核胞（ＧＶ）ステージの未熟卵母細胞、
（ｉｉ）任意に第一減数分裂中期（ＭＩ）と呼ばれる、第一極体もＧＶも有さない未熟卵母細胞、および
（ｉｉｉ）第一極体を有する成熟卵母細胞（第二減数分裂中期、ＭＩＩ）。
これらの分類は、卵母細胞の三つの異なる発達ステージに相当する。
【００１８】
本発明者らは、これらの３種類の卵母細胞を包囲する卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルを研究した。まず、本発明者らは、卵母細胞ＭＩＩを包囲する卵丘細胞の大集団の遺伝子発現プロファイルを研究した。これらの大集団の中で、卵母細胞ＭＩＩを包囲する卵丘細胞の大部分は、特異的遺伝子発現プロファイルを表すことが示された。これらの卵丘細胞は、本明細書において卵丘細胞ＭＩＩ（ＣＣＭＩＩ）または成熟卵丘細胞または「コンピテント」卵丘細胞と呼ばれる。
【００１９】
次に、同じように、本発明者らは、卵母細胞ＭＩおよび正常卵母細胞ＧＶを包囲する卵丘細胞の大集団の遺伝子発現プロファイルを研究した。これらの２種類の卵丘細胞のそれぞれについて、特異的遺伝子発現プロファイルを表す大多数の卵丘細胞がある。卵母細胞ＭＩを包囲するＣＣの遺伝子発現プロファイルの大多数を表す卵丘細胞は、本明細書において卵丘細胞ＭＩ（ＣＣＭＩ）と呼ばれ、卵母細胞ＧＶを包囲するＣＣの遺伝子発現プロファイルの大多数を表す卵丘細胞は、本明細書において卵丘細胞ＧＶ（ＣＣＧＶ）と呼ばれる。ＣＣＭＩまたはＣＣＧＶである卵丘細胞は、本明細書において未熟卵丘細胞または非コンピテント卵丘細胞と呼ばれる。
【００２０】
さらに、本発明者らは、異なる卵母細胞ＭＩＩを包囲する個別の卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルを研究した。本発明者らは、卵母細胞ＭＩＩがＣＣＭＩＩ、ＣＣＭＩまたはＣＣＧＶによって包囲されうること、および大多数の集団である成熟卵丘（ＣＣＭＩＩ）によって包囲された卵母細胞ＭＩＩが、未熟卵丘細胞、すなわちＣＣＭＩまたはＣＣＧＶによって包囲された卵母細胞ＭＩＩよりも高い胞胚形成率を表すことを見出した。したがって、たとえ卵母細胞が受精の際に胚盤胞に発達するために必要な発達ステージにあるとしても、それが未熟卵丘細胞によって包囲されているならば、胞胚形成率は低い。
【００２１】
国際公開公報第２０１０／１１８９９１号に開示された以前の研究では、本発明者らは、卵丘細胞と卵母細胞との間の双方向交換が原因で、卵丘細胞が卵母細胞のコンピテンスの指標であることを示した。したがって、コンピテント卵母細胞（すなわち、受精すると妊娠に至る高い着床率を有する生存可能な胚を産生することができる卵母細胞）は、該卵母細胞を包囲する卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルを測定することによって選択することができる。
【００２２】
本発明において、本発明者らは、卵母細胞自体のコンピテンスおよびその発達ステージに加えて、卵母細胞を包囲する卵丘細胞の発達ステージが、受精した卵母細胞から胚への発達のための追加的な要因であることを示した。したがって、成熟卵丘細胞は、特異的発達ステージにある未熟卵丘細胞に対立するＣＣの１種類である。そのような成熟ＣＣは、卵母細胞ＭＩＩを包囲する場合、該卵母細胞が受精すると胚盤胞ステージに到達する胚を生じる確率を増加させる。したがって、本明細書においてＣＣＭＩＩとも呼ばれる成熟卵丘細胞は、該卵母細胞が受精すると胚盤胞ステージに到達する胚を生じる確率を増加させる発達ステージにある卵丘細胞である。
【００２３】
「胚」という用語は、受精した卵母細胞または接合体を指す。当該受精は、古典的体外受精（ｃＩＶＦ）または卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）手順の下で介入しうる。「古典的体外受精」または「ｃＩＶＦ」という用語は、卵母細胞が体外で精子によってin vitro受精されるプロセスを指す。ＩＶＦは、in vivo受胎が失敗した場合の不妊症における主要な処置である。「卵細胞質内精子注入」または「ＩＣＳＩ」という用語は、精子１個だけが卵母細胞に直接注入される体外受精手順を指す。この手順は、男性側不妊症要因を克服するために最も一般的に使用されているが、また、卵母細胞に精子が容易には貫通できない場合に、および場合により、特に精子提供に関連する体外受精の一方法として、使用することができる。
【００２４】
本明細書に使用される「胚盤胞」という用語は、桑実胚形成後の哺乳類胚形成初期に形成された構造を指す。それは、後に胚を形成する内部細胞塊（ＩＣＭ）または胚結節、および後に胎盤を形成する細胞外層または栄養膜を有する。栄養膜は、内部細胞塊、および割腔として知られている、液体で満たされた胚盤胞腔を包囲している。ヒト胚盤胞は、７０〜１００個の細胞を含む。胚盤胞の形成は、ヒトでは受精後第５日に開始し、そのとき割腔は桑実胚内で拡大する。
【００２５】
本発明によると、卵母細胞は、自然周期、改変された自然周期、またはｃＩＶＦもしくはＩＣＳＩのために刺激された周期の結果生じうる。「自然周期」という用語は、雌または女性が卵母細胞を産生する自然周期を指す。「改変された自然周期」という用語は、雌または女性がリコンビナントＦＳＨまたはｈＭＧに付随するＧｎＲＨアンタゴニストを用いた軽度の卵巣刺激下で１または２個の卵母細胞を産生するプロセスを指す。「刺激された周期」という用語は、雌または女性がリコンビナントＦＳＨまたはｈＭＧに付随するＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストを用いた刺激下で１個または複数の卵母細胞を産生するプロセスを指す。
【００２６】
本明細書に使用される「遺伝子の過剰発現」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、参照レベルよりも高レベルの核酸（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質の発現を指す。
【００２７】
本発明によると、参照レベルは、卵丘細胞ＧＶ、ＭＩまたはＭＩＩについて以前に決定された発現レベルでありうる。「過剰発現」という用語は、参照レベルの少なくとも２倍、好ましくは参照レベルの少なくとも５倍、好ましくは参照レベルの少なくとも１０倍の遺伝子発現レベルを指す。典型的には、卵丘細胞が卵丘細胞ＭＩＩであるかどうかを決定するために、表Ａの遺伝子の発現レベルが、卵丘細胞ＧＶまたはＭＩについて以前に決定された参照レベルと比較される。逆に、卵丘細胞がＧＶまたはＭＩであるかどうかを決定するために、表Ｂの遺伝子の発現レベルが、卵丘細胞ＭＩＩについて以前に決定された参照レベルと比較される。
【００２８】
本発明は、また、卵丘細胞において、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子または表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘であるかを決定するための方法に関し、ここで、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示し、表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す。
【００２９】
本発明は、また、卵丘細胞において、表Ａより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法に関し、ここで、表Ａより選択される遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示す。
【００３０】
本発明は、また、卵丘細胞において、表Ｂより選択される少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法に関し、ここで、表Ｂより選択される遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す。
【００３１】
表Ａより選択される１種または複数の遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が成熟していることを示す。表Ｂより選択される１種または複数の遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が未熟であることを示す。該１種または複数の遺伝子は、例えば、表Ａ単独または表Ｂ単独より選択することができる。典型的には、１〜１１種の遺伝子が表Ａより選択されうる。典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種の遺伝子が表Ａより選択されうる。典型的には、１〜１４種の遺伝子が表Ｂより選択されうる。典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４種の遺伝子が表Ｂより選択されうる。または、該遺伝子は、例えば、表ＡおよびＢより選択されうる。典型的には、１〜１１種の遺伝子を表Ａより選択することができ、０〜１４種の遺伝子が表Ｂより選択されうる。典型的には、０〜１１種の遺伝子を表Ａより選択することができ、１〜１４種の遺伝子が表Ｂより選択されうる。
【００３２】
特定の一態様では、本発明は、卵丘細胞において、表Ａおよび表Ｂの２５種の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるか、または未熟卵丘細胞であるかを決定するための方法に関し、ここで、表Ａの遺伝子の過剰発現は、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であることを示し、表Ｂの遺伝子の過剰発現は、卵丘細胞が未熟卵丘細胞であることを示す。
【００３３】
本発明の方法は、好ましくは女性に適用可能であるが、他の哺乳類にも適用可能である（例えば霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、マウスなど）。
【００３４】
本発明の方法は、特に、体外受精処置の有効性を評価するために適する。したがって、本発明は、また、
ｉ）雌対象から少なくとも１個の卵母細胞にその卵丘細胞を提供すること；
ｉｉ）本発明の方法によって、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるかどうかを決定すること
を含む、該雌対象における調節卵巣過剰刺激（ＣＯＳ）プロトコールの有効性を評価するための方法に関する。
【００３５】
次に、そのような方法の後に、発生学者は、成熟卵丘細胞に包囲された卵母細胞を選択し、古典的体外受精（ｃＩＶＦ）プロトコールによって、または卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）プロトコール下で、それらを体外受精させることができる。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、
ｉ）該女性から、自然周期、改変周期または刺激された周期下で少なくとも１個の卵母細胞をその卵丘細胞と共に単離すること；
ｉｉ）本発明の方法によって、該卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるかどうかを決定すること；および
ｉｉｉ）成熟卵丘細胞によって取り囲まれた卵母細胞を生じるかどうかに基づいて、ＣＯＳ処置の有効性をモニタリングすること
を含む、調節卵巣過剰刺激（ＣＯＳ）プロトコールの有効性をモニタリングするための方法に関する。ＣＯＳ処置は、リコンビナントＦＳＨまたはｈＭＧに付随するＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストから成る群より選択される少なくとも１種の活性成分に基づきうる。
【００３７】
本発明は、また、ｉ）複数の卵母細胞を提供すること、ｉｉ）該卵母細胞を包囲する少なくとも１個の卵丘細胞を単離すること、ｉｉｉ）本発明の方法にしたがって、ステップｉｉ）の該少なくとも１個の卵丘細胞が成熟しているかどうかを決定すること、およびｉｖ）成熟卵丘細胞によって取り囲まれた卵母細胞を選択することから成るステップを含む、受精すると胚盤胞ステージに到達する胚を生じる高い確率を有する卵母細胞を選択するための方法に関する。
【００３８】
上記表Ａおよび表Ｂのような遺伝子の発現レベルの決定は、多様な技法によって行うことができる。一般に、決定される発現レベルは相対発現レベルである。
【００３９】
より好ましくは、決定は、試料をプローブ、プライマーまたはリガンドなどの選択試薬と接触させること、およびそれによって、本来試料中の、関心が持たれるポリペプチドまたは核酸の存在を検出またはその量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイター皿、試験管、ウェル、ガラス器具、カラムなどの任意の適切な装置内で行うことができる。特定の態様では、接触は、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイなどの試薬で被覆された基材上で行われる。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体などの、固体または半固体の基材でありうる。基材は、スライド、メンブラン、ビーズ、カラム、ゲルなどの様々な形状およびサイズでありうる。接触は、試薬と試料の核酸またはポリペプチドとの間に形成されるべき、核酸ハイブリッドまたは抗体−抗原複合体などの検出可能な複合体に適切な任意の条件下で行うことができる。
【００４０】
好ましい一態様では、発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定することができる。
【００４１】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、試料（例えば、患者から調製された細胞または組織）中に含有される核酸が、最初に、例えば溶解酵素もしくは化学溶液を使用して標準法により抽出されるか、または製造業者の説明書にしたがって核酸結合樹脂によって抽出される。次に、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。好ましくは、定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが好まれる。リアルタイム定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００４２】
他の増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅（transcription-mediated amplification）（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００４３】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、本明細書において関心が持たれるｍＲＮＡに配列相補性または相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用である。そのような核酸は同一である必要はないが、典型的には比較可能なサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、いっそうより好ましくは９０〜９５％同一であると理解されている。ある態様では、ハイブリダイゼーションを検出するための、検出可能なラベルなどの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）を含めた多種多様な適切な指示薬が、当技術分野において公知である。
【００４４】
プローブは、典型的には、１０から１０００ヌクレオチド長の間、例えば１０から８００ヌクレオチド長の間、より好ましくは１５から７００ヌクレオチド長の間、典型的には２０から５００ヌクレオチド長の間の１本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅されるべき関心対象の核酸と完全に、またはほぼ完全にマッチするように設計された、１０から２５ヌクレオチド長の間の、より短い１本鎖核酸である。プローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする核酸に「特異的」であり、すなわちそれらは、好ましくは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下（最高融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応、ＳＣＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａである）でハイブリダイゼーションする。
【００４５】
上記の増幅および検出法に使用される核酸プライマーまたはプローブは、キットとして組み立てられうる。そのようなキットは、コンセンサスプライマーおよび分子プローブを含む。好ましいキットは、また、増幅が起こったかどうかを決定するために必要な構成成分を含む。キットは、また、例えば，ＰＣＲ緩衝液および酵素；陽性対照配列、反応対照プライマー；ならびに特異的配列を増幅および検出するための説明書を含みうる。
【００４６】
特定の一態様では、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された総ＲＮＡを提供するステップ、およびより詳細には定量または半定量ＲＴ−ＰＣＲによって、ＲＮＡを増幅および特異的プローブへのハイブリダイゼーションに供するステップを含む。
【００４７】
別の好ましい態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ解析によって決定される。そのようなＤＮＡチップまたは核酸マイクロアレイは、基材に化学的に結合した異なる核酸プローブから成り、基材は、マイクロチップ、ガラススライドまたはマイクロスフェアサイズのビーズでありうる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースから構成されうる。プローブは、約１０〜約６０塩基対でありうる、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドなどの核酸を含む。発現レベルを決定するには、場合により最初に逆転写に供された被験対象由来試料がラベルされ、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触され、マイクロアレイ表面に結合したプローブ配列と相補性のターゲット核酸との間に複合体が形成するに至る。次に、ラベルされたハイブリダイゼーション後の複合体が検出され、定量または半定量されうる。ラベルは、様々な方法によって、例えば放射性ラベルまたは蛍光ラベルを用いることによって行うことができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技法の様々な変形が、当業者に利用可能である（Hoheisel, 2006)。
【００４８】
これに関連して、本発明は、さらに、表Ａに挙げられた遺伝子に特異的な核酸を担持する固体支持体を含むＤＮＡチップを提供する。
【００４９】
該遺伝子の発現レベルを決定するための他の方法には、該遺伝子によってコードされるタンパク質の量の決定が含まれる。そのような方法は、試料を、試料中に存在するマーカータンパク質と選択的に相互作用する能力がある結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、一般に、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルでありうる抗体である。
【００５０】
タンパク質の存在は、標準的な電気泳動技法、および競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含めた免疫診断技法を用いて検出することができる。そのようなアッセイには、非限定的に、ウエスタンブロット；凝集検査；ＥＬＩＳＡなどの酵素標識および酵素介在性イムノアッセイ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などが挙げられる。反応には、一般に、蛍光ラベル、化学発光ラベル、放射性ラベル、酵素ラベルもしくは色素分子などのラベルを顕示すること、または抗原と、それと反応した１種または複数の抗体との複合体の形成を検出するための他の方法が含まれる。
【００５１】
上述のアッセイは、一般に、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から未結合のタンパク質を液相中に分離することを伴う。本発明の実施に使用することができる固体支持体には、ニトロセルロース（例えばメンブランまたはマイクロタイターウェルの形状のもの）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロンメンブラン；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどの基材が挙げられる。
【００５２】
より詳細には、ＥＬＩＳＡ法を用いることができ、その方法では、マイクロタイタープレートのウェルが被験タンパク質に対する抗体で被覆される。次に、マーカータンパク質を含有する、または含有する疑いのある生物学的試料が、被覆後のウェルに添加される。抗体−抗原複合体を形成させるために十分なインキュベーション時間の後に、プレート（１個または複数）を洗浄して未結合の部分を除去し、検出可能にラベルされた二次結合分子を添加することができる。二次結合分子は、捕捉された任意の試料マーカータンパク質と反応させられ、プレートが洗浄され、当技術分野で周知の方法を用いて、二次結合分子の存在が検出される。
【００５３】
または、免疫組織化学（ＩＨＣ）法が好ましい場合がある。ＩＨＣは、特異的に、試料または組織標本中のターゲットをin situ検出する方法を提供する。ＩＨＣでは試料の全体的な細胞完全性が維持されるので、関心が持たれるターゲットの存在および位置の両方を検出することが可能になる。典型的には、試料がホルマリンで固定され、パラフィン中に包埋され、切片に切り出され、染色およびその後の光学顕微鏡検査に供される。ＩＨＣの現行法は、直接ラベルまたは二次抗体ベースもしくはハプテンベースのラベルのいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例には、例えば、EnVision（商標）（DakoCytomation）、Powervision（登録商標）（Immunovision, Springdale, AZ）、NBA（商標）キット（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA）、HistoFine（登録商標）（Nichirei Corp, Tokyo, Japan）が挙げられる。
【００５４】
特定の態様では、組織切片（例えば、卵丘細胞を含む試料）は、関心が持たれる遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体と共にインキュベーションされた後に、スライドまたは他の支持体上にマウントすることができる。次に、適切な固体支持体上にマウントされた試料の顕微鏡検査を行うことができる。顕微鏡写真を撮影するには、試料を含む切片をガラススライドまたは他の平面支持体上にマウントして、関心が持たれるタンパク質の存在を選択的染色によってハイライトすることができる。
【００５５】
したがって、試料のＩＨＣは、例えば：（ａ）卵丘細胞を含む調製物、（ｂ）該細胞の固定および包埋、ならびに（ｃ）該細胞試料中の関心が持たれるタンパク質を検出することを含みうる。いくつかの態様では、ＩＨＣ染色手順は、組織を切断および整形すること、固定、脱水、パラフィン浸潤、薄切片への切断、ガラススライド上へのマウント、焼成、パラフィン除去（deparaffination）、再水和、抗原賦活化、ブロッキングステップ、一次抗体の適用、洗浄、二次抗体の適用（場合により適切な検出可能ラベルと結合したもの）、洗浄、対比染色、および顕微鏡観察などのステップを含みうる。
【００５６】
本発明は、また、上記方法を行うためのキットに関し、ここで、該キットは、表Ａの遺伝子の発現レベルおよび／または表Ｂの遺伝子の発現レベルを測定するための手段を含む。
【００５７】
本発明は、また、本発明の方法によって成熟卵丘細胞として決定された卵丘細胞に関する。したがって、該卵丘細胞は、表Ａの少なくとも１種の遺伝子を過剰発現し、好ましくは、表Ｂからの遺伝子を発現せず、いっそうより好ましくは、表Ａの全ての遺伝子を過剰発現する。
【００５８】
本発明は、また、本発明の方法によって決定された、少なくとも７０％の成熟卵丘細胞を含む卵丘細胞集団に関する。
【００５９】
したがって、そのような集団の卵丘細胞の少なくとも７０％は、表Ａの少なくとも１種の遺伝子を過剰発現し、好ましくは表Ｂからの遺伝子を発現せず、いっそうより好ましくは表Ａの全ての遺伝子を過剰発現する。
【００６０】
典型的には、本発明の卵丘細胞の集団は、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の成熟卵丘細胞を含みうる。
【００６１】
特定の一態様では、本発明は、不死化成熟卵丘細胞または本発明の卵丘細胞の集団に関する。細胞を不死化するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、ヒト卵丘細胞の不死化は、ヒト卵丘細胞初代培養物へのｈＴＥＲＴおよびＳＶ４０の大型Ｔ抗原（large T antigen）の連続レンチウイルストランスダクションを介して行うことができる（Jiang et al.、2010; Liu et al., 2010; Voglauer et al., 2005）。
【００６２】
特定の一態様では、本発明は、成熟卵丘細胞系に関する。
【００６３】
成熟卵丘細胞（「ＭＣＣ」）は、胚を成長させるための方法に有用でありうる。その概念は、これらの細胞が成長因子を追加することによって初期胚発生または何か他の有益効果を刺激するというものである。したがって、胚を胚盤胞ステージまで培養し、次に第５または６日に胚盤胞移植を行うＩＶＦプログラムに、ＭＣＣを使用することができる。これによって、胞胚形成率を増加させることができ、発生第１週の初期卵割段階を経て生存可能な最良の胚の選択ができるようになる。一般に、単純培養培地中で培養する場合、十分な数の高品質な胚盤胞を得ることが、非常に困難である。したがって、本発明は、ヒト成熟卵丘細胞（ＭＣＣ）上でヒト胚をin vitro共培養するための方法に関する。
【００６４】
したがって、本発明のさらなる一局面は、胚を本発明による成熟卵丘細胞の集団の存在下で共培養するステップを含む、該胚を発生の胚盤胞ステージに成長させる方法に関する。一態様では、胚を胚盤胞ステージに成長させる方法は、さらに、本発明により、卵丘細胞の集団からどの卵丘細胞が成熟卵丘細胞であるかを決定するステップ、および成熟卵丘細胞を選択するステップを含みうる。胚は、着床前に胚盤胞（blastocyt）ステージまで成長される。特定の一態様では、成熟卵丘細胞は、成熟卵丘細胞系から得られる。
【００６５】
典型的には、胚は、成熟卵丘細胞によって包囲された、または包囲されていない卵母細胞から生じうる。したがって、この方法は、任意の起源の卵母細胞を用いて実施することができる。
【００６６】
本発明は、また、本発明による方法に関し、ここで、該胚は、卵母細胞と精子との単純な混合または卵母細胞への細胞質内精子注入によって行われる体外受精（ＩＶＦ）を含めたＩＶＦ、および核移植から成る群より選択される任意の技法によってin vitro産生されたものである。
【００６７】
本発明は、また、本発明による成熟卵丘細胞の層で被覆された細胞培養表面上で胚を共培養するステップを含む、該胚を発生の胚盤胞ステージに成長させる方法であって、方法に関する。
【００６８】
「細胞培養表面」または「細胞培養マトリックス」という用語は、細胞培養に適切なあらゆる種類の表面またはマトリックスを指す。「細胞培養表面」という用語には、非限定的に、組織培養プレート、皿、ウェルまたはボトルが挙げられる。特定の一態様では、培養表面は、培養プレート、皿、ウェルまたはボトルのプラスチック表面である。細胞培養表面は、成熟卵丘細胞の被覆と適合性であるべきである。本発明の一態様によると、細胞培養表面は、その上に成熟卵丘細胞が自然に接着できるように選択される。様々な材料の細胞培養表面を選択することができる。そのような材料の例には、非限定的に、組織培養皿またはコラーゲンで被覆された皿が挙げられる。
【００６９】
典型的には、細胞培養表面上に成熟卵丘細胞の層を得るために、最初に、コラーゲンを含有する培養培地を用いて、細胞培養表面上に成熟卵丘細胞が被覆される。細胞培養表面上に成熟卵丘細胞を接着させるために十分な時間の後に、コラーゲン含有培養培地が除去され、該成熟卵丘細胞をエクスパンションさせる培地と置換される。
【００７０】
本発明は、また、成熟卵丘細胞が、胚と接触する前に、それらの増殖を停止するために予め処理される、本発明による方法に関する。したがって、成熟卵丘細胞は、γ線照射によって、または細胞周期ブロッキング剤を用いて不活性化される。
【００７１】
本発明によると、培養条件もまた、胚を発生の胚盤胞ステージに成長させるために重要である。培養時に、温度およびＣＯ２レベルなどの変数をコントロールして胚の成長を最大化することができる。例えば、胚の発生のための至適温度は、約３２℃〜約４０℃、好ましくは約３５℃〜３９℃であり、温度３７℃が、いっそうより好ましい。胚の発生のための培養環境における至適ＣＯ２レベルは、約１％ＣＯ２〜約１０％ＣＯ２、より好ましくは約３％ＣＯ２〜約８％ＣＯ２、いっそうより好ましくは約５％ＣＯ２である。
【００７２】
胚を成長させるために適切な培地は、当技術分野において周知である。例えば、子宮内で発生している速度に匹敵する速度で胚を胚盤胞に進行させる培養培地が、今や利用可能であり（Summers and Biggers, 2003）、このことは、in vitro培養のストレスの結果として導入されるエピジェネティックマークがそのような胚に存在しないという期待を抱かせる。これらの培地の多くは、卵子の放出、受精、および発生の時点に雌の生殖器系内に見出されるイオン、アミノ酸、および糖の濃度にかなり大まかに基づいている（Gardner and Lane, 1998）。典型的には、インキュベーター外での配偶子の取扱い、卵胞のフラッシングおよびマイクロマニピュレーションを伴う手順のために、リン酸緩衝液またはヘペス有機緩衝液を含有する培養培地が使用される。大部分の培養培地は、ＰＨを７．２〜７．４の範囲に保つために重炭酸塩／ＣＯ２緩衝系を利用する。培養培地の浸透圧は、２７５〜２９０mosmol/kgの範囲でなければならない。胚は、パラフィンオイル下でも培養することができよう。そのことで、培地の蒸発が防止され、一定の浸透圧が保たれる。顕微鏡評価のために胚がインキュベーターから取り出されたとき、パラフィンオイルは、ｐＨおよび温度の変動も最小限にする。パラフィンオイルは、配偶子および胚に有毒なおそれがあることから、ヒト胚培養に使用する前に、オイルのバッチをスクリーニングし、マウス胚で検査しなければならない。
【００７３】
培地は９９％の水から構成される。水の純度は重大であり、限外濾過によって実現される。
【００７４】
培養培地は、また、アルブミンまたは合成血清などのタンパク質源を含有し、それらは、５〜２０％（それぞれｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の濃度で添加される。塩の供給源として、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、またはＮａＨＣＯ３なども培地に添加される。糖質がメスの生殖器系に存在することから、培養培地は、糖質源も含有する。アミノ酸と共に、糖質は胚の主要エネルギー源である。８細胞までの接合子の発生を支援する培養培地は、ピルビン酸塩および乳酸塩を含有する。グルコース不含の市販培地もあれば、従来の受精時に精子の要求を満たすために非常に低濃度のグルコースを加えた培地もある。胚盤胞ステージまでの８細胞胚の発生を支援する培地は、低濃度のピルビン酸塩および乳酸塩ならびにより高濃度のグルコースを含有する。培養培地へのアミノ酸の補充も、胚発生にとって必要である。８細胞までの接合子の発生を支援する培地は、プロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、およびグルタミン酸などの非必須アミノ酸が補充される。胚盤胞ステージまでの８細胞胚の発生を支援する培地は、シスチン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、バリン、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンなどの必須アミノ酸が補充される。培養培地は、ビタミンも含有しうる。
【００７５】
培養培地は、抗生物質も含有しうる。実際に、ＡＲＴ研究室の大部分は、微生物の成長リスクを最小限にするために、抗生物質を含有する培養培地を使用している。最も一般的に使用される抗生物質は、ペニシリン（グラム陽性細菌の細胞壁の完全性を障害するβ−ラクタム）およびストレプトマイシン（グラム陰性菌のタンパク質合成を障害するアミノグリコシド）である。
【００７６】
胚発生のためのシーケンシャルな培地の三つの例は、Ｇ１／Ｇ２（Gardner et al, 1998）、ユニバーサルＩＶＦ培地／ＭＳ、およびＰＩ／胚盤胞培地である。興味が持たれることに、培地Ｍ３は、ＨａｍのＦ−１０およびＦ−１２の変法であり、一方で胚盤胞培地はＨａｍのＦ−１０の変法である。胚を培養するための培地は、Origio（Denmark）、Vitrolife（Sweden）、Sage Biopharma（USA）、Irvine Scientific（USA）から市販されている。
【００７７】
同じく、本発明のある態様により提供されるのは、体外受精胚のin vivo着床能を増加させる方法である。「着床能」は、胚が子宮内に着床する能力である。この方法は、培養された胚の完全な孵化が果たされるか、または他のＩＶＦ法に比べて孵化が増強されるように、胚を発生の胚盤胞ステージに成長させるために上記態様の一つを実施することを含む。本方法のある態様によると、次に、胚の着床増強が達成されるように、胚盤胞が哺乳類ホストの子宮内に導入される。いくつかの態様では、胚のin vitro完全孵化は、生存可能妊娠の樹立と相関する。
【００７８】
本発明のいくつかの態様では、体外受精した哺乳類胚の生仔出生能を増加させる方法が提供される。「生仔出生能」は、胚が生仔出生をもたらす能力を指す。その方法は、培養胚の孵化能増強または完全な孵化が達成されるように、上記のように、胚を発生の胚盤胞ステージに成長させることを含む。次に、胚盤胞は、哺乳類ホストの子宮に移植され；胚が生仔出生をもたらす能力が、本発明にしたがって培養されなかった胚のそれに相対して増強されるように、胚は着床およびin vivo成長を可能にさせられる。
【００７９】
本発明の方法は、また、上記のようにより高い着床率を提供でき、したがってより少数の胚を各サイクルで移植でき、多胎妊娠の発生率の減少が生じうることから、特に多胎妊娠の制限に適している。
【００８０】
本発明のさらなる一局面は、多能性幹細胞集団を本発明による成熟卵丘細胞集団の存在下で共培養するステップを含む、該多能性幹細胞集団の培養において未分化状態を維持する方法に関する。
【００８１】
本明細書に使用される「ヒト多能性幹細胞」という用語は、任意の成人細胞（adult cell）を形成する能力を有する任意のヒト前駆細胞を指す。特定の一態様では、ヒト多能性幹細胞には、非限定的に、胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）またはヒト誘導多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）が挙げられる。
【００８２】
本明細書に使用される「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳ細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、任意の成人細胞を形成する能力を有するヒト前駆細胞を指す。ｈＥＳ細胞は、１週齢未満の受精した胚から得られる。本発明の一態様によると、ｈＥＳ細胞は、任意のｈＥＳ細胞系より選択することができる。ｈＥＳ細胞系の例には、非限定的に、ＳＡ−０１、ＶＵＢ−０１、Ｈ１（Thomson et al., 1998）、およびＨ９（Amit et al., 2000）が挙げられる。本発明によると、ｈＥＳ細胞は、国際特許出願である国際公開公報第２００２／０９７０６８号に記載されたようなＬＩＦの存在下で予め培養されない。そのうえ、本発明によると、ｈＥＳ細胞は予め胚様体に分化されないことを理解されたい。
【００８３】
本明細書に使用される「ヒト誘導多能性幹細胞」または「ヒトｉＰＳ細胞」または「ヒトｉＰＳＣ」という用語は、ヒト非多能性細胞（例えば成人体細胞）から人工的に得られたヒト多能性幹細胞の１種を指す。ヒト誘導多能性幹細胞は、任意の成人細胞を形成する能力がヒト胚性幹細胞と同一であるが、胚から得られたものではない。典型的には、ヒト誘導多能性幹細胞は、任意の成人体細胞（例えば線維芽細胞）におけるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子の誘導発現により得ることができる。例えば、ヒト誘導多能性幹細胞は、Takahashiら（2007）、Yuら（2007）などによって記載されたようなプロトコールにしたがって、またはさもなければ、これらの本来のプロトコールにおいて細胞を再プログラミングするために使用される１種もしくは他の薬剤が、ｉＰＳ系の起源の体細胞に作用するもしくは移植される任意の遺伝子もしくはタンパク質に置換される、任意の他のプロトコールによって得ることができる。基本的に、成人体細胞に、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含む、レトロウイルスなどのウイルスベクターがトランスフェクションされる。本発明の一態様によると、ヒトｉＰＳ細胞は、任意のヒトｉＰＳ細胞系より選択することができる。ヒトｉＰＳ細胞系の例には、非限定的に、クローン２０１Ｂ（Takahashi et al., 2007）およびｉＰＳ（ForeskinまたはＩＭＲ９０）−１−ＭＣＢ−１（Yu et al., 2007）が挙げられる。
【００８４】
本発明の一態様は、該多能性幹細胞集団の培養において未分化状態を維持する方法であって、成熟卵丘細胞層で被覆された細胞培養表面上で多能性幹細胞集団を培養するステップを含む、方法に関する。
【００８５】
該成熟卵丘細胞層は、胚を発生の胚盤胞ステージに成長させる方法（上記参照）について記載されたように得ることができる。
【００８６】
本発明によると、培養条件は、また、多能性幹細胞集団の培養において未分化状態を維持することに重要である。培養時に、細胞密度、温度およびＣＯ２レベルなどの変数をコントロールして、多能性幹細胞集団の発生を最大限にすることができる。例えば、多能性幹細胞培養物中の細胞密度は、該集団の自然分化に作用することができる。そのように、多能性幹細胞集団の成長に至適な細胞密度は、多能性幹細胞約１〜約１０，０００個/cm2、より好ましくは多能性幹細胞約１〜約２０００個/cm2、いっそうより好ましくは多能性幹細胞約１００〜約１０００個/cm2である。一態様では、多能性幹細胞は、単一細胞懸濁物として培養される。多能性幹細胞集団の発生のための至適温度は、約３２℃〜約４０℃．、好ましくは約３５℃〜３９℃であり、温度３７℃がいっそうより好ましい。多能性幹細胞集団の発生のための培養環境での至適ＣＯ２レベルは、約１％ＣＯ２〜約１０％ＣＯ２、より好ましくは約３％ＣＯ２〜約８％ＣＯ２、いっそうより好ましくは約５％ＣＯ２である。
【００８７】
多能性幹細胞を培養するために適した培地には、ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen, Carlsbad, Calif）が挙げられる。当業者は、多能性幹細胞をin vitro培養するために適切な広範囲に及ぶ培地、例えば、Specialty Media（Millipore Corporation, Billerica, Mass.）；Resgro（商標）（Millipore Corporation, Billerica, Mass.）；StemXvivo（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）が入手可能であることを認識している。培地に、血清、例えばウシ胎仔血清、ＥＳ適格血清（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）、抗生物質、例えばPen Strep（Invitrogen, Carlsbad, Calif）、非必須アミノ酸（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）およびグルタミン、例えばGlutamax-1（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, Calif）を補充することができる。一部のＥＳＣ培養物に、さらに、白血病抑制因子、例えばEsgro（登録商標）（Millipore Corporation, Billerida, Mass.）を補充することができる。
【００８８】
本発明は、さらに、以下の図面および実施例によって例証される。しかし、これらの実施例および図面が本発明の範囲を限定するものとして、決して解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】マイクロアレイのデータの定量ＲＴ−ＰＣＲによる確認を示す図である。異なる核成熟ステージの卵母細胞から得られたＣＣにおいてディファレンシャルに発現された遺伝子の定量。各遺伝子についてのシグナル強度を、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定された任意の単位でｙ軸上に示す。＊は、ＣＣ群間で遺伝子発現に有意差があることを示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。結果を各ＣＣ群におけるｍＲＮＡレベルの平均±ＳＥＭとして表現した。
【図１Ｂ】マイクロアレイのデータの定量ＲＴ−ＰＣＲによる確認を示す図である。異なる核成熟ステージの卵母細胞から得られたＣＣにおいてディファレンシャルに発現された遺伝子の定量。各遺伝子についてのシグナル強度を、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定された任意の単位でｙ軸上に示す。＊は、ＣＣ群間で遺伝子発現に有意差があることを示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。結果を各ＣＣ群におけるｍＲＮＡレベルの平均±ＳＥＭとして表現した。
【図１Ｃ】マイクロアレイのデータの定量ＲＴ−ＰＣＲによる確認を示す図である。異なる核成熟ステージの卵母細胞から得られたＣＣにおいてディファレンシャルに発現された遺伝子の定量。各遺伝子についてのシグナル強度を、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定された任意の単位でｙ軸上に示す。＊は、ＣＣ群間で遺伝子発現に有意差があることを示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。結果を各ＣＣ群におけるｍＲＮＡレベルの平均±ＳＥＭとして表現した。
【００９０】
実施例１：ヒト成熟卵丘細胞および未熟卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルによる胞胚形成率の予測のための非侵襲的検査
方法：
卵丘細胞の処理：
卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）のために本発明者らのセンターに照会された正常なレスポンダー患者（年齢＜３６歳）を本研究に算入した。書面のインフォームドコンセントの後に患者を算入し、このプロジェクトは研究所審査会（ＩＲＢ）によって承認された。患者を、ＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストのプロトコールと、リコンビナントＦＳＨまたはＨＰ ｈＭＧとの組み合わせで刺激した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（５０００ＵＩ、ｈＣＧ）投与の３６時間後に超音波エコーのガイド下でＣＯＣを回収した。以前に記載されたように（Hamel et al., 2008）、ＣＣを対応する卵母細胞から機械的に分離した。同じＣＣコホートから患者１人あたり１〜３個のＣＣ試料をランダムに選択した。患者４０人から得られた合計１１１個のＣＣ試料を本研究に使用した。
【００９１】
マイクロアレイ分析のために、患者１６人から得られた２４個の個別のＣＣ試料を、卵母細胞の核成熟ステージに応じて、以下の異なる３群に分割した：（ｉ）卵核胞（ＣＣＧＶ）ステージ、（ｉｉ）第一減数分裂中期ステージ（ＣＣＭＩ）、および（ｉｉｉ）第二減数分裂中期ステージ（ＣＣＭＩＩ）のＣＯＣから得られた試料。三つのＣＣ群におけるディファレンシャルな遺伝子発現プロファイルを検討した。逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）のために、患者１９人から得られた２４個のＣＣ試料（各核成熟ステージについて試料８個）を使用した。候補遺伝子の信頼度を検査するために、成熟（ＭＩＩ）卵母細胞から得られ、患者５人から入手された６３個のＣＣ試料をマイクロアレイによって分析した。
【００９２】
相補的ＲＮＡの調製およびマイクロアレイのハイブリダイゼーション：
RNeasy Micro Kit（Qiagen）を使用して、ＣＣ試料からの総ＲＮＡを抽出した。Nanodrop ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA）を使用してＲＮＡを定量した。Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent, Palo Alto, CA, USA）でＲＮＡの完全性および品質を評価した。マイクロアレイ分析までＲＮＡ試料を−８０℃で保存した。Affymetrix 3' IVT expressプロトコール（参照番号９０１２２９）を使用して、総ＲＮＡ１００ngの出発濃度でｃＲＮＡを調製した（１サイクル増幅）。Ｔ７プロモーター配列を組み入れているオリゴ−ｄＴプライマーを用いて第１鎖ＤＮＡを合成した。次に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたin vitro転写（ＩＶＴ）によってｃＤＮＡを増幅した。ＲＮＡの増幅（ａＲＮＡ）時に、メッセージ用のラベルとして使用するためにビオチン化ヌクレオチドアナログを組み入れた。フラグメント化後に、以前に記載されたように（Tusher et al., 2001）、ラベルされたアンチセンスａＲＮＡをHG-U133 Plus 2.0アレイ（Affymetrix（商標））にハイブリダイズした。
【００９３】
データ処理：
Affymetrix GCOS 1.4ソフトウェアを使用して、スキャン後のGeneChipイメージを処理した。Affymetrix Expression Console（商標）ソフトウェアを用いて、マイクロアレイのデータを解析し、MAS5.0アルゴリズムを用いて基準化を行い、各プローブセットについてシグナル強度および検出コール（存在、マージナル、または不在）を得た。このアルゴリズムは、遺伝子が規定の信頼水準で発現されているかどうかを決定する（「検出コール」）。この「コール」は、「存在」（完全マッチのプローブがミスマッチのプローブよりも有意に大きくハイブリダイゼーションされる場合、ＦＤＲ＜０．０４）、「マージナル」（０．０４≦ＦＤＲ≦０．０６について）または「不在」（ＦＤＲ＞０．０６）のいずれかでありうる。ＦＤＲは偽発見率である。
【００９４】
マイクロアレイデータの解析：
２４個のＣＣ試料の遺伝子発現プロファイルを卵母細胞の成熟ステージにしたがって比較するために、本発明者らは、まず、「検出コール」（すなわち不在／存在）に基づき試料をフィルタリングした。２４個のうち少なくとも７個の試料中にプローブセットが存在した場合、そのプローブセットを使用した。全試料の間の変動係数（４０％）を使用する第２フィルターも適用した。変動係数は、各プローブセットのシグナル強度の標準偏差（ＳＤ）と平均との間の比をパーセンテージで表現した比である。２４個のＣＣ試料の遺伝子発現プロファイルを卵母細胞の成熟ステージにしたがって比較するために、本発明者らは、まず、「検出コール」（すなわち不在／存在）に基づき試料をフィルタリングした。２４個のうち少なくとも７個の試料中にプローブセットが存在した場合、そのプローブセットを使用した。全試料の間の変動係数（４０％）を使用する第２フィルターも適用した。変動係数は、各プローブセットのシグナル強度の標準偏差（ＳＤ）と平均との間の比をパーセンテージで表現した比である。異なる卵母細胞核成熟ステージのＣＣ群を比較するために、多クラスマイクロアレイの有意性解析（Significance Analysis of Microarrays-Multi-class）（ＳＡＭ−Ｍ）（Eisen et al., 1998）を行った。このアルゴリズムは、データの順列に基づき、スコア値および偽発見率（ＦＤＲ）の信頼パーセンテージを提供する。ＳＡＭ−Ｍは、発現がＣＣＧＶ、ＣＣＭＩおよびＣＣＭＩＩ群の間で有意に異なる遺伝子の同定を可能にした。
【００９５】
ＳＡＭ−Ｍの結果を用いて、プローブセット（多クラス遺伝子セット）の発現レベルに基づき、監督された階層的クラスタリングを行い、Tree Viewソフトウェア（Adriaenssens et al., 2009）を用いてクラスターを視覚化した。Ingenuity Pathways Analysis（ＩＰＡ）システム（Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA）を用いて、三つのＣＣ群の間でディファレンシャルに発現していた２５種の遺伝子に関係するネットワークを同定した。
【００９６】
逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）：
本発明者らは、Superscript First Strand Synthesis System（Invitrogen）を製造業者の推奨にしたがって使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲを行い、候補遺伝子の発現を検証した。独立したコホートのＣＣ試料を検証のために使用した。第一鎖ｃＤＮＡを、各試料からの総ＲＮＡ３００ngから開始して産生し、それを使用して（希釈１：１０）、３８４ウェルプレート内でLight Cycler 480（Roche）を用いたｑＰＣＲによって遺伝子発現を評価した。各ウェルは、Master SYBRグリーン（Roche）ミックス合計８μLおよび各プライマー（Sigma）の終濃度１．６２５μMの希釈ＤＮＡ ２μLを含有した。再現性をチェックするために、各ＲＴ−ｑＰＣＲ反応を二つ組で実施し、水を陰性対照として使用した。増幅は、アニーリング温度６０℃で４５サイクルの運転（run）であった。ＰＣＲ産物をＳＹＢＲグリーンプローブでモニタリングした。使用されたプライマーの詳細を、補足の表１に報告する。試料間で発現レベルを基準化するために、本発明者らは、発現が三つのＣＣ群で安定なことから、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を使用した。  標準スケールのｃＤＮＡの連続希釈を用いて、ＰＣＲ効率を評価した。サイクル数（サイクル閾値についての「Ｃｔ」）の値を使用して、ｍＲＮＡ転写物の相対量を計算した。本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲのデータを解析するために次式を使用した：Ｅｔｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒΔＣｔ／ＥＧＡＰＤＨΔＣｔ（Ｅ＝１０−１／ｓｌｏｐｅ）（式中、ΔＣｔ＝Ｃｔ（対照）−Ｃｔ（未知＋対照）＝１個のＣＣ試料である）。３群の内部対照として、ＣＣＧＶ試料を選択した。
【００９７】
統計解析：
GraphPad Instatソフトウェア（http://www.graphpad.com/instat/instat.htm）およびKruskal-Wallisノンパラメトリック検定を用いて、ＲＴ−ｑＰＣＲによって得られたデータを解析した。ｐ値が＜０．０５のときに３群間の差を有意と見なした。
【００９８】
結果
各ステージの卵母細胞核成熟度に応じてＣＣに過剰発現された遺伝子のセットの同定：
本発明者らは、ＳＡＭ−Ｍを用いて、３群を有意に識別した、ＦＤＲ≦３．３０を有する合計２５個の遺伝子（多クラス遺伝子セット）を同定した。これら２５個の遺伝子は、関連する卵母細胞の核成熟度ステージに応じてディファレンシャルに過剰発現された。より正確には、ＣＣＧＶ、ＣＣＭＩおよびＣＣＭＩＩ群において、それぞれ１０、４および１１個の遺伝子が特異的に過剰発現されていた（表Ｉ）。所与のＣＣ群に特異的な遺伝子の数は、３群のＣＣにわたり有意な変動があることを示し、このことは、また、この２５個の遺伝子のリストに基づきＣＣ試料の明確な分離が示された監督された階層的クラスタリングによって実証される通りである。
【００９９】
【表３】
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【０１００】
以下の１０種の遺伝子がＣＣＧＶ群において過剰発現された：プロスタグランジンレセプター（ＰＴＧＥＲ２）、Ｇタンパク質共役レセプター（Ｆ２ＲＬ１）、構造結合タンパク質（ＲＡＩ１４）、二つの核成分（ＣＢＸ３およびＱＫＩ）、接着に関与する遺伝子（ＴＨＢＳ１、ＬＩＭＳ１）、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する遺伝子（ＡＮＫＲＤ５７）またはヘパラン硫酸生合成に関連する遺伝子、ＴＥＴファミリーのメンバー（ＴＥＴ３）およびＥＸＴ１。以下の４種の遺伝子がＣＣＭＩ群において過剰発現されることが分かった：アミノ酸輸送体（ＳＬＣ３８Ａ２）、シグナル伝達因子（ＹＴＨＤＦ１）含有Ａｌｕリッチドメイン、スルファターゼ活性化因子（ＳＵＭＦ１）および伸長因子（ＥＥＦ１Ａ１）。ＣＣＭＩＩ試料において、本発明者らは、以下の１１種の過剰発現された遺伝子を見出した：４種の転写因子（ＩＤ２、ＣＨＣＨＤ１、ＵＢＲ３、ＢＲＤ３）、転写レギュレーションに関与する２種の遺伝子（Ｃ１４ｏｒｆ４およびＡＯＣ２）、ならびにＰＬＥＫＨＡ５、ＰＴＧＥＳ、およびＣＯＸ１７（プロスタグランジン生合成に関与）、ＰＷＷＰ２ＡおよびＣ５ｏｒｆ２５。次に、マイクロアレイの結果を強力に検証するために独立コホートのＣＣ試料を使用して、２５種の遺伝子をＲＴ−ｑＰＣＲによってスクリーニングした。これら３群において１５種の遺伝子がディファレンシャルに発現されると統計的に検証された（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）。
【０１０１】
成熟ＭＩＩ卵母細胞は、それらの周辺のＣＣにおいて異なる発現パターンを有する：
患者５人から入手された成熟ＭＩＩ卵母細胞からの６３個のＣＣ試料の独立コホートに関してマイクロアレイ解析を行い、ＣＣ中の関心が持たれる遺伝子転写物の相対存在量を測定した。監督なし階層的クラスタリングを用いて、１５種の検証済みＣＣ遺伝子の発現プロファイルをチェックすることによって（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）、本発明者らは、受精した成熟卵母細胞のそれぞれ３１、２４および４５％がＣＣＧＶ、ＣＣＭＩ、およびＣＣＭＩＩの分子シグネチャーを発現することを見出した。
【０１０２】
この結果から、成熟ＭＩＩ卵母細胞が、それぞれＣＣＧＶまたはＣＣＭＩまたはＣＣＭＩＩ段階に対応するいずれかのＣＣによって包囲されうることが実証された。実際に、成熟ＭＩＩ卵母細胞は、異なる発現パターンによって包囲されうる。卵母細胞とＣＣとの間の卵胞形成時の同期化された成熟の概念は、動物モデルにおいて十分に立証されているが、それは、ヒトではまだ明確には実証されていなかった（Russell and Robker, 2007）。本研究では、本発明者らは、成熟卵母細胞の５０％未満がＣＣＭＩＩによって包囲されていたことを観察した。
【０１０３】
「成熟」ＣＣまたは「未熟」ＣＣのいずれかによって包囲された成熟卵母細胞：
成熟（ＭＩＩ）卵母細胞から得られた６３個のＣＣ試料のうち、５３個が受精し、それらを胚の転帰を評価するために算入した。１５種の検証済み遺伝子のリストの信頼性を検査するために、本発明者らは、受精率、第３日の胚卵割および胚盤胞形成率を評価した。ＣＣＭＩＩ特異的分子シグネチャーまたはＣＣＧＶおよびＣＣＭＩ分子シグネチャーのいずれかにしたがって２群を産生した。群ＩおよびＩＩをそれぞれ「ＣＣＭＩＩ」および「ＣＣＧＶ−ＭＩ」と名付けた。２群間の比較から、受精率および第３日の胚卵割に有意差がないことが明らかとなった（表ＩＩ）。興味深いことに、ｔ検定から、胚盤胞形成について群Ｉと群ＩＩとの間に有意差があることが明らかとなった（ｐ＝０．０４）。胚盤胞形成率は、群ＩＩ（１７．２％）よりも群Ｉ（７０．８％）の方が高値であった。したがって、成熟卵母細胞は、増加した成熟遺伝子発現（ＣＣＭＩＩ）を有する成熟ＣＣおよび増加した未熟遺伝子発現（ＣＣＧＶ−ＭＩ）を有する未熟ＣＣを有した。
【０１０４】
これらの結果は、成熟卵母細胞が成熟卵丘細胞または未熟卵丘細胞のいずれかによって包囲されうるというモデルにしたがう、本発明者らの新規モデルの検証を提供している。臨床的展望では、本発明者らは、マイクロアレイまたはｑ−ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫蛍光を用いた成熟卵母細胞ステージでのＣＣのスクリーニングが、成熟ＣＣを検出するための正確なツールである見込みがあり、ＩＶＦサイクル時に胚の潜在性を同定する（成熟ＣＣを有する成熟卵母細胞から得られた胚を優先的に移植する）助けになりうることを示唆する。
【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
実施例２：ヒト卵丘細胞の単離：
連続的な（consentive）患者からそのインフォームドコンセントと共に卵丘細胞を得る。卵丘塊の外観の検査後に、２本の針を使用することによってヒト卵丘細胞（ｈＣＣ）を卵母細胞から機械的に分離する。一方の針は、卵母細胞を定位置に置くためにｈＣＣ層上に置き、もう一方の針は、卵母細胞に接触させずに細胞層をできるだけ素早く切り離すために使用する。できるだけ少量の培地と共に細胞を吸引し、これらの細胞を調製済み培地内に移植する。
【０１０７】
実施例３：ヒト成熟卵丘細胞（ＨＭＣＣＳ）の培養および増幅：
最初の実験では、ゼラチン（０．１％）被覆されたプレートを用いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１０ng/ml線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でｈＭＣＣを培養する。この培養プロトコールを用いると、インキュベーションの４時間後にｈＭＣＣは表面に接着する。８０％集密に達するまで１週間に３回培地を交換する。０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を酵素的に５〜７日毎に継代する。ＭＣＣ系列はこの条件で成長に適応する（継代＞１２回）。
【０１０８】
血清（ＦＣＳ）は、細胞の機能に影響を与えうる複数の因子を有する不明確な物質であり、動物産物への依存は臨床応用を制限する。この理由から、動物を含まない含条件でｈＭＣＣを長期培養するために、培養プロトコールを最適化する。本発明者らは、ヒトコラーゲンＩ〜ＩＩＩを含有するＨＰ０１培地で１０μg/cm2となるように培養プレートを２時間被覆する。本発明者らは、慎重に接着溶液を除去し、それを限定ＳＰＥ−ＩＶエクスパンション培地（臨床等級ヒトアルブミン、合成鉄担体、ｒｈ−インスリン、ヌクレオシド、Ｌ−グルタミン、モノチオグリセロール、合成脂質、α−ＭＥＭ）と置換する。この培養培地は、成長因子（ｒｈＩＧＦ−Ｉ：２５ng/mlおよびｒｈ−ｂ−ＦＧＦ：０．３３ng/ml）を含有する。細胞濃度は１，０００個/cm2に固定する。本発明者らは、集密度が７０〜８０％に達するまで培地を１週間に４回完全に交換する。
【０１０９】
本発明者らは、染色体安定性を有する新規ｈＭＣＣ系列を発生させ、分析した。これらのｈＭＣＣ系列を、ヒトコラーゲン基材上の動物不含限定培地中で成長に適応させる（継代＞１０回）。この成長システムは、動物成分へのｈＭＣＣの曝露を減少させることによって、病原体の混入リスクを制限する。
【０１１０】
実施例４：ＭＣＣフィーダー層の調製
ｈＭＣＣ単層（継代５回目）を集密になるまで培養し、１０μg/mlマイトマイシンＣで２時間処理するか、または照射処理した。処理後に細胞をTrypleで剥離させ、培養皿上に播種した。
【０１１１】
実施例５：ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）はＨＭＣＣフィーダー層上で成長した
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系列の増殖および多能性を、ｈＭＣＣ上の長期培養で研究する。本発明者らは、ｈＭＣＣ上で培養したｈＥＳＣが、線維芽細胞フィーダー層上で培養されたｈＥＳＣと複数の基準（形態、多能性マーカー）で区別不能であったと報告した。本発明者らは、ｈＣＣ上で成長したｈＥＳＣが細胞表面タンパク質（ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）の発現などの多能性マーカーを維持することを示す。細胞の形態および分子特性は、線維芽細胞フィーダー細胞上で培養されたｈＥＳＣに類似している。
【０１１２】
結論として、ｈＭＣＣは未分化ｈＥＳＣの成長を支援する。ｈＥＳＣ系列は、これらのフィーダーに容易に適応し、未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態を維持する。ｈＥＳＣは、また、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−８１およびＣＤ２４などの多能性マーカーを発現し続ける。
【０１１３】
実施例６：全般的遺伝子発現解析は「胚」増殖（propagation）についてＨＭＣＣを検証する
ＨＦＦフィーダー細胞およびｈＭＣＣのゲノムワイド遺伝子発現プロファイルは、６２％の遺伝子発現類似性を表す。二つの試料間の相関係数は高く、少数の遺伝子だけが統計的に有意な、ディファレンシャルな発現を示す。
【０１１４】
参考文献：
本出願にわたり、本発明が属する技術の現状を様々な参考文献が説明している。これらの参考文献の開示は、これによって参照により本開示に組み入れられる。
【０１１５】
【表５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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