(57)【要約】本明細書において、ｉ）例えば抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合部位と、ｉｉ）少なくとも一つの薬学的活性化合物とを含む融合ポリペプチドであって、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が、同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値よりも高い融合ポリペプチド、ならびに血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するためのその使用が報告される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するための、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つ結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む有効量の融合ポリペプチドを個体に投与することを含む、該個体での血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達する方法であって、その際、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、該レセプターへの該結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が１０以上である、方法。
【請求項２】
血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するための、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つ結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドの使用であって、その際、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、該レセプターへの該結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が１０以上である、使用。
【請求項３】
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つ結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドを対象に投与することを含む、該対象の上皮細胞にトランスサイトーシスする方法であって、その際、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、該レセプターへの該結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が１０以上である、方法。
【請求項４】
医薬の製造への、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つ結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドの使用であって、その際、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、該レセプターへの該結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が１０以上である、使用。
【請求項５】
医薬がＣＮＳ関連疾患の処置のためのものであることを特徴とする、請求項４記載の使用。
【請求項６】
比が、１５以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法又は使用。
【請求項７】
比が約１５であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法又は使用。
【請求項８】
インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が１０００ng/ml以上であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、少なくとも一つの結合部位及び少なくとも一つの薬学的活性化合物を含む融合ポリペプチドであって、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が、同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値よりも高い融合ポリペプチド、ならびに血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するためのその使用が報告される。
【０００２】
発明の背景
タイトジャンクションによって相互に結合する内皮細胞層又は上皮細胞層は、これらの関門の向こう側の組織への大型極性分子、特にタンパク質の拡散にとって主要なハードルとなる。小型分子は、特殊なチャネルタンパク質によってこれらの関門を通過して輸送することができるが、タンパク質についての輸送メカニズムは、まだ完全には理解されておらず、生理学的に最も重要なメカニズムは、レセプター介在性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）であると考えられる。
【０００３】
ＲＭＴの際に、タンパク質性リガンドは、関門細胞の管腔側に発現されたレセプターに結合し、次に、そのレセプターがエンドサイトーシスによってインターナリゼーションされる。エンドソーム内容物のソーティングは、特殊な小胞区画内で行われ、レセプター配列によってコードされるシグナルに依存する。それらのシグナルは、リサイクリング経路、分解経路、又はトランスサイトーシス経路へのレセプターの輸送を仲介する。ＲＭＴの最もよく知られた例の一つは、げっ歯類での新生児型Ｆｃレセプターによる、腸上皮細胞を通過したＩｇＧの輸送である。
【０００４】
周皮細胞及び星状細胞に囲まれた、密着した脳内皮細胞から成る血液脳関門（ＢＢＢ）についても、いくつかのＲＭＴ経路が、特にトランスフェリン、インスリン、又は低密度リポタンパク質に対するレセプターが、記載されている。これらのレセプターのリガンドは、トランスサイトーシスを促進する性質をもつことが示されており、これらの性質の一つは、それらのレセプターへのｐＨ依存性結合である。例えば、インスリンは、インターナリゼーション後にエンドソーム内容物が酸性化されるとそのレセプターから放出される。
【０００５】
研究者らは、治療薬をレセプターに対する抗体と結合させることによって、血液脳関門を通過して治療分子を送達するためにこれらのレセプターのトランスサイトーシスを利用することを試みている。しかし、おそらくこれらの抗体の不十分な輸送能のせいで、これらの抗体は、まだどれも市販薬に使用されていない。実際、一つを超える薬力学モデルで独立して示された、ＢＢＢを通過した機能性治療用タンパク質のトランスサイトーシスは、まだ明白には実証されていない。
【０００６】
ヒト腎近位尿細管上皮細胞での免疫グロブリンＧのＦｃＲｎ介在性トランスサイトーシスは、Kobayashiらによって報告されている（Kobayashi, N., et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 282 (2002) F358-F365）。Weksler, B.B.らは、FASEB J. 19 (2005) 1872-1874にヒト成体脳内皮細胞系の血液脳関門に特異的な性質を報告している。
【０００７】
米国特許第６，０３０，６１３号に、免疫原のレセプター特異的経上皮輸送が報告されている。国際公開公報第０２／０６０９１９号に、半減期が延長した分子、その組成物及び使用が報告されている。トランスフェリンレセプター特異的抗体神経医薬品又は診断用薬剤コンジュゲートの製造方法は、国際公開公報第９３／０１０８１９号に報告されている。国際公開公報第２００８／１１９０９６号にトランスサイトーシス性免疫グロブリンが報告されている。ヒト血液脳関門モデルは、国際公開公報第２００６／０５６８７９号に報告されている。
【０００８】
EP 1 975 178にトランスサイトーシス性モジュラー抗体が報告されている。血液脳関門ターゲティング抗体は、US2008/019984に報告されている。Friden, P.M.らは、ヒトトランスフェリンレセプターに対する抗体の特徴づけ、レセプターマッピング及び血液脳関門トランスサイトーシスを報告している（J. Pharmacol. Exp. Therap. 278 (1996) 1491-1498）。Pardridgeら（Pharm. Res. 12 (1995) 807-816）は、ヒトインスリンレセプターのモノクローナル抗体がヒト脳毛細血管にin vitroで高親和性結合され、霊長類においてin vivoで血液脳関門を通過して迅速にトランスサイトーシスされることを報告している。
【０００９】
発明の概要
本明細書において、ｐＨ依存性結合モードは、インターナリゼーション性細胞表面レセプター、特にトランスサイトーシスレセプターに対する抗体が、関門細胞の密着層を、特に血液脳関門を、効率的に通過できるようにすることを報告する。ｐＨ５．５での結合親和性（高ＥＣ５０値）の方がｐＨ７．４でのその親和性（低ＥＣ５０値）よりも低い抗体、例えばインターナリゼーション性細胞表面レセプターの一例としてのヒトトランスフェリンレセプターに結合する抗体は、血液脳関門内皮細胞を通過してトランスサイトーシスされるが、一方、どちらのｐＨ値でもほぼ等しい親和性（結合効率、したがってＥＣ５０値）を示す別の抗体は、細胞内で分解される。したがって、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、同じ結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値よりも高い（大きい）。インターナリゼーション性細胞表面レセプター及び／又はトランスサイトーシスレセプターに対する抗体であって、それらのレセプターに対するｐＨ依存性で可逆的な結合によって起こる改変ソーティング挙動のおかげで内皮関門細胞又は上皮関門細胞で細胞内分解されない抗体の発生及び選択を、この基準は可能にする。
【００１０】
本明細書において、一局面として、
−  インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合部位、及び
−  少なくとも一つのエフェクター部分
を含む融合ポリペプチドであって、
インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値よりも高い融合ポリペプチドが報告される。
【００１１】
全ての局面の一態様では、融合ポリペプチドは、ｉ）インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、ｉｉ）同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が少なくとも５であることを特徴とする。一態様では、その比は１０以上である。一態様では、その比は１５以上である。一態様では、その比は約１５である。
【００１２】
全ての局面の一態様では、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の少なくとも５倍である。一態様では、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の少なくとも１０倍である。一態様では、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の約１５倍である。
【００１３】
全ての局面の一態様では、エフェクター部分は、ラベル、又は細胞毒、又は酵素、又は成長因子、又は転写因子、又は薬物、又は放射性核種、又はリガンド、又は抗体、又は抗体フラグメント、又はリポソーム、又はナノパーティクル、又はウイルス粒子、又はサイトカインである。
【００１４】
全ての局面の一態様では、エフェクター部分は、薬学的活性化合物である。一態様では、薬学的活性化合物は、抗Ａβ抗体、又は抗タウ抗体、又は抗αシヌクレイン抗体である。
【００１５】
全ての局面の一態様では、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位は、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が１００ng/ml以上、又は５００ng/ml以上、又は１０００ng/ml以上である。
【００１６】
全ての局面の一態様では、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値が１００ng/ml以下、又は８５ng/ml以下、又は７０ng/ml以下である。
【００１７】
全ての局面の一態様では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含む結合ペアである。一態様では、結合ペアは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー（diabody）、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメント、完全長重鎖、完全長軽鎖、完全抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、又は六重特異性抗体から形成される多重特異性抗体より選択される。一態様では、結合ペアは、完全モノクローナル抗体である。一態様では、結合ペアは、その抗原に結合特異性をもつ、完全抗体の少なくとも一つのフラグメント、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、又は免疫グロブリン様構造のポリペプチドである。
【００１８】
全ての局面の一態様では、結合部位は、フィブロネクチン、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、１本鎖抗原レセプター（例えばＴ細胞レセプターに関係するもの）、抗体模倣体、トランスフェリン、アポリポタンパク質、アドネクチン（adnectin）、アンチカリン（anticalin）に基づく分子、フィロマー（phylomer）、アビマー（avimer）、アフィボディー（affibody）、アンキリンリピート、クニッツ（Kunitz）ドメイン、ＰＤＺドメイン、サソリ毒免疫タンパク質、ノッティン（Knottin）、バーサボディー（Versabody）、緑色蛍光タンパク質、及び抗原結合性を有する他の非抗体性タンパク質骨格より選択される。
【００１９】
一局面として、本明細書報告の融合ポリペプチドをコードする核酸が、本明細書に報告される。
【００２０】
一局面として、本明細書報告の核酸を含むホスト細胞が、本明細書に報告される。
【００２１】
一局面として、融合ポリペプチドが産生されるように本明細書報告のホスト細胞を培養することを含む、融合ポリペプチドを産生する方法が、本明細書に報告される。
【００２２】
一局面として、本明細書報告の融合ポリペプチド及び場合により薬学的に許容されうる担体を含む薬学的処方が、本明細書に報告される。
【００２３】
一局面として、医薬として使用するための本明細書報告の融合ポリペプチドが、本明細書に報告される。
【００２４】
一局面として、ＣＮＳ関連疾患の処置に使用するための本明細書報告の融合ポリペプチドが、本明細書に報告される。
【００２５】
一局面として、血液脳関門を通過した薬学的活性化合物の送達に使用するための本明細書報告の融合ポリペプチドが、本明細書に報告される。
【００２６】
一局面として、医薬の製造への本明細書報告の融合ポリペプチドの使用が、本明細書に報告される。
【００２７】
一態様では、その医薬は、ＣＮＳ関連疾患を処置するためのものである。
【００２８】
一局面として、ＣＮＳ関連疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書報告の融合ポリペプチドをその個体に投与することを含む方法が、本明細書に報告される。
【００２９】
一局面として、個体での血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達する方法であって、血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するために有効な量の本明細書報告の融合ポリペプチドをその個体に投与することを含む方法が、本明細書に報告される。
【００３０】
一局面として、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアに融合した薬学的活性化合物を投与することを含む、個体での血液脳関門を通過して、又は対象の脳に、薬学的活性化合物を送達する方法が本明細書に報告され、その際、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が、同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値よりも高い。
【００３１】
全ての局面の一態様では、融合ポリペプチドは、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が、少なくとも５であることを特徴とする。一態様では、その比は、１０以上である。
【００３２】
本明細書報告の一局面は、血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するための、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドの使用であり、その際、
インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比は、１０以上である。
【００３３】
本明細書報告の一局面は、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドを対象に投与することを含む、その対象の上皮細胞にトランスサイトーシスする方法であり、その際、
インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比は、１０以上である。
【００３４】
個体での血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達する方法であって、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む、有効量の融合ポリペプチドをその個体に投与することを含む方法が、本明細書に報告され、その際、
融合ポリペプチドが血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を送達するように、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比は、１０以上である。
【００３５】
本明細書報告の一局面は、医薬の製造への、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドの使用であり、その際、
インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比は、１０以上である。
【００３６】
本明細書報告の一局面は、
−  抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含み、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合ペア、ならびに
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む有効量の融合ポリペプチドを個体に投与することを含む、その個体での血液脳関門を通過した一つ又は複数の薬学的活性化合物の非コンジュゲーション型の輸送に比べて、血液脳関門を通過した少なくとも一つの薬学的活性化合物の輸送を増加させる方法であり、その際、
融合ポリペプチドが血液脳関門を通過して薬学的活性化合物を輸送するように、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比は、１０以上である。
【００３７】
本明細書報告の一局面は、インターナリゼーション性細胞表面レセプターへの一つ又は複数の結合ペアの結合についてのｐＨ５．５でのＥＣ５０値のｐＨ７．４でのＥＣ５０値に対する比を測定すること、及びその比が１０以上の一つ又は複数の結合ペアを選択することを含む、一つ又は複数の薬学的活性化合物の効率的な血液脳関門輸送に使用するための結合ペアを選択する方法である。
【００３８】
全ての局面の一態様では、融合ポリペプチドは、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が１５以上であることを特徴とする。同様に一態様では、その比は約１５である。
【００３９】
全ての局面の一態様では、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合ペアのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、同レセプターへの同結合ペアのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の少なくとも５倍である。一態様では、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の少なくとも１０倍である。一態様では、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の約１５倍である。
【００４０】
一局面として、血液脳関門を通過した薬学的活性化合物の送達のための、本明細書報告の融合ポリペプチドの使用が、本明細書に報告される。
【００４１】
一局面として、本明細書報告の融合ポリペプチドを対象に投与することを含む、その対象の上皮細胞にトランスサイトーシスする方法が、本明細書に報告される。
【００４２】
一局面として、少なくとも一つの結合部位を含む抗体又は融合ポリペプチドを選択するための方法が本明細書に報告され、その際、インターナリゼーション性細胞表面レセプターへの結合についての抗体又は融合ポリペプチドのｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、同レセプターへの同抗体又は同融合ポリペプチドのｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値よりも高い。
【００４３】
全ての局面の一態様では、抗体又は融合ポリペプチドは、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比が、少なくとも５であることを特徴とする。一態様では、その比は１０以上である。一態様では、その比は１５以上である。一態様では、その比は約１５である。
【００４４】
全ての局面の一態様では、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の少なくとも５倍である。一態様では、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の少なくとも１０倍である。一態様では、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値は、ｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値の約１５倍である。
【００４５】
本明細書報告の全ての局面の一態様では、ＣＮＳ関連疾患は、（ｉ）パーキンソン病、アルツハイマー病、もしくはハンチントン病などの神経変性疾患もしくは神経変性障害、又は（ｉｉ）うつ、不安障害、統合失調症のような精神病、又は（ｉｉｉ）多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自閉症、もしくは疼痛のような神経炎症障害及び他の神経障害、又は（ｉｖ）ＣＮＳ腫瘍、又は（ｖ）ＣＮＳのウイルス感染及び細菌感染より選択される。
【００４６】
発明の詳細な説明
ｐＨ依存性結合モードは、少なくとも一つの結合部位及びトランスサイトーシスレセプターに対する抗体を含む融合ポリペプチドが関門細胞の密着層を効率的に通過できるようにすることを、本発明は実証する。例えば、ｐＨ５．５での結合親和性がｐＨ７．４でのその親和性に比べて低い、ヒトトランスフェリンレセプターに対する抗体は、血液脳関門内皮細胞を通過してトランスサイトーシスされることが示され、一方、両方のｐＨ値でトランスフェリンレセプターに対して等しく効率的な結合を示す別の抗体は、細胞内で分解される。本発明は、トランスサイトーシスレセプターに対するｐＨ依存性で可逆的な結合によって起こる改変ソーティング挙動により内皮関門細胞又は上皮関門細胞での細胞内分解を回避する、それらのレセプターに対する抗体の選択及び発生を可能にする。
【００４７】
Ｉ．  定義
「親和性」という用語は、分子（例えばポリペプチド又は抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えばターゲット又は抗原）との間の非共有結合性相互作用の全体の強度を意味する。特に示さない限り、本明細書に使用する「結合親和性」は、結合ペアのメンバー間の（例えばポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体での、又はポリペプチドとそのターゲットとの間の、又は抗体とその抗原との間の）１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を表す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、表面プラズモン共鳴及びまた本明細書報告の方法などの、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。分子Ｘのその結合パートナーＹに対するより高い親和性は、より低いＫｄ及び／又はＥＣ５０値によって知ることができる。
【００４８】
「抗体」という用語は、抗体全体及び抗体フラグメントなどの様々な形態の抗体構造を包含する。本明細書に報告及び使用される抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はＴ細胞抗原枯渇抗体でありうる。「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる一つ又は複数のポリペプチドから成るタンパク質を表す。認知された免疫グロブリン遺伝子には、種々の定常領域遺伝子及び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、例えばＦｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）又はダイアボディーなどの多様な形状で存在しうる。一般に、完全長抗体は、２本のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）及び２本のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、抗原と相互作用できる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）食細胞のようなＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）を担持する細胞への、又はｉｉ）ブランベル（Brambell）レセプターとしても知られている新生児型Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）を担持する細胞への、抗体の結合を仲介する。重鎖の定常領域は、また、補体（Ｃ１ｑ）のような古典的補体系の因子などのいくつかの因子への結合を仲介する。
【００４９】
そして次に、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、異なるセグメントを、すなわち４個のフレームワーク領域（ＦＲ）及び３個の超可変領域（ＣＤＲ）を含む。
【００５０】
「結合ペア」という用語は、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを意味する。可変ドメインは、ペプチド結合、リンカー、又は連結性非ペプチド成分のような任意の適切な手段によって相互に結合させることができる。一態様では、結合ペアは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメント、完全長重鎖、完全長軽鎖、完全抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、又は六重特異性抗体から形成された多重特異性抗体より選択される。一態様では、結合ペアは、モノクローナル抗体である。一態様では、結合ペアは、抗原に対して結合特異性をもつ、完全抗体の少なくとも一つのフラグメント、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、又は免疫グロブリン様構造を有するポリペプチドである。
【００５１】
「結合部位」という用語は、別のポリペプチドに特異的に結合できるポリペプチドを意味する。一態様では、結合部位は結合ペアである。一態様では、結合部位は、フィブロネクチン、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、１本鎖抗原レセプター、例えばＴ細胞レセプター及び抗体に関係するもの、抗体模倣体、トランスフェリン、アポリポタンパク質、アドネクチン、アンチカリンに基づく分子、フィロマー、アビマー、アフィボディー、アンキリンリピート、クニッツドメイン、ＰＤＺドメイン、サソリ毒免疫タンパク質、ノッティン、バーサボディー、緑色蛍光タンパク質、及び抗原結合性を有する他の非抗体性タンパク質骨格から成る群より選択することができる、免疫グロブリン様モジュラー構造を有するポリペプチドである。
【００５２】
「ＣＮＳ関連疾患」という用語は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患又は障害を意味する。ＣＮＳ関連疾患は、非限定的に、特に（ｉ）パーキンソン病、アルツハイマー病、もしくはハンチントン病のような神経変性疾患もしくは神経変性障害、（ｉｉ）うつ、不安障害、統合失調症のような精神病、（ｉｉｉ）多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自閉症、もしくは疼痛のような神経炎症障害及び他の神経障害；（ｉｖ）ＣＮＳ腫瘍、又は（ｖ）ＣＮＳのウイルス感染及び細菌感染である。
【００５３】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（CYTOXAN（商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、及びウレドーパ（uredopa）のようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミンなどのエチレンイミン及びメチルアミルアミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵのようなピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎薬；フロリン酸（frolinic acid）のような葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン（diaziquone）；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２''−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標）, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−ＩＩ；３５トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記の任意の薬学的に許容されうる塩、酸又は誘導体が含まれる。この定義には、また、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Fareston）などの抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンのような抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容されうる塩、酸又は誘導体のような、腫瘍に対するホルモンの作用をレギュレーション又は阻害するように作用する抗ホルモン剤が含まれる。
【００５４】
「抗血管新生薬」は、血管の発生をブロッキング又はある程度妨害する化合物を表す。抗血管新生薬は、例えば、血管新生の促進に関与する成長因子又は成長因子レセプターに結合する小分子又は抗体でありうる。抗血管新生因子は、一態様では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【００５５】
「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、一細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般名である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中に、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−ａ及び−Ｐ；ミューラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ｐのような神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−ａ及びＴＧＦ−ｐのような形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−ａ、−Ｐ、及び−ｙのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（ＧＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１Ｏ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−Ｐのような腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）などの他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書に使用するサイトカインという用語には、天然起源又はリコンビナント細胞培養由来のタンパク質、及びネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００５６】
「ｆＭＬＰ」という用語は、Ｎ−ホルミルメチオニン、ロイシン及びフェニルアラニンから成るトリペプチドを意味する。一態様では、エフェクター部分は、ｆＭＬＰ又はその誘導体である。
【００５７】
「融合ポリペプチド」という用語は、自然界では一つのポリペプチド中にこのように一緒に見出されない少なくとも２個の異なるペプチド又はポリペプチドを含むか、又はそれから成るポリペプチドを意味する。すなわち、これらの部分は、自然界では同じポリペプチド中に存在せず、同じ順序でも存在しない。融合ポリペプチドの部分は、ペプチド結合によって連結している。
【００５８】
「ペプチドリンカー」という用語は、ペプチド結合を介して相互に結合しているアミノ酸残基を含む、天然起源及び／又は合成起源のリンカーを意味する。それらは、２０個の天然アミノ酸がモノマー性構成要素である、直鎖アミノ酸鎖から成る。鎖は、１〜５０ミノ酸残基長、一態様では３〜２８アミノ酸残基長、さらなる一態様では４〜２０アミノ酸残基長である。リンカーは、繰り返しアミノ酸配列又は天然ポリペプチドの配列を含有する場合がある。リンカーは、リンカーを介して結合している２個の構成要素が立体の自由及び回転の自由のせいで正しくフォールディングでき、適切に提示されうることを保証する機能をもつ。一態様では、リンカーは、グリシン、グルタミン、及び／又はセリン残基に富むことが意味される「合成ペプチドリンカー」である。これらの残基は、例えば（Ｇ）ＧＧＧＳ、（Ｑ）ＱＱＱＧ、又は（Ｓ）ＳＳＳＧ（配列番号１、２、及び３）のような最大５個のアミノ酸の小型反復ユニットに配置される。この小型反復ユニットが２〜５回反復して多量体ユニットを形成してもよい。他の合成ペプチドリンカーは、例えばリンカーＧＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＧ（配列番号４）中のセリンのように、１０〜２０回反復される単一のアミノ酸から構成される。一態様では、リンカーは、［ＧＱ４］３ＧＮＮ（配列番号５）、ＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６）、ＬＳＰＮＲＧＥＣ（配列番号７）、ＬＳＬＳＧＧ（配列番号８）、ＬＳＬＳＰＧＧ（配列番号９）、Ｇ３［ＳＧ４］２ＳＧ（配列番号１０）、又はＧ３［ＳＧ４］２ＳＧ２（配列番号１１）より選択される。
【００５９】
「プロドラッグ」という用語は、腫瘍細胞に対する細胞毒性が親薬物よりも小さく、より活性の高い親形態に酵素的に活性化又は変換できる、前駆体型又は誘導体型の薬学的活性物質を表す。例えばWilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions、14, pp. 375-382、615th Meeting Belfast (1986)及びStella, et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery、Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照されたい。エフェクター部分として使用できるプロドラッグには、非限定的に、活性がより高い細胞毒性フリーな薬物に変換できるホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は場合により置換されているフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。本発明に使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化できる細胞毒性薬の例には、非限定的に、本明細書記載の化学療法剤が含まれる。
【００６０】
「細胞毒性部分」という用語は、細胞機能を阻害もしくは抑制し、かつ／又は細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を表す。細胞毒には、非限定的に、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素のような酵素及びそのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の小型分子毒素又は酵素活性毒素のような毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）；ならびに本明細書開示の様々な抗腫瘍剤又は抗ガン剤が含まれる。
【００６１】
薬剤、例えば薬学的処方の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な用量及び／又は期間での有効量を表す。
【００６２】
「ＥＣ５０値」という用語は、判定システム、例えばＥＬＩＳＡでベースライン値と最大値の間の５０％応答を誘導する、ポリペプチド、例えば抗体の最大半量有効濃度を意味する。これは、治療薬の効力の尺度である。したがって、ＥＣ５０値は、５０％の効果を生じる薬物物質の濃度に対応する実験データに基づき計算される濃度である。ＥＣ５０値の減少は、薬物のより高い親和性及び効力を意味する。
【００６３】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列、又はヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、特異的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００６４】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を表す。ある態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を表す。
【００６５】
「免疫コンジュゲート」は、非限定的に、結合ペア、核酸、又はエフェクター部分のメンバーなどの、一つ又は複数の非抗体由来分子にコンジュゲーションした抗体又は抗体フラグメントである。
【００６６】
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、非限定的に、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。ある態様では、個体又は対象はヒトである。
【００６７】
「インターナリゼーション性細胞表面レセプター」という用語は、少なくとも以下のメンバーを含む細胞表面レセプターの群を意味する：アシアロ糖タンパク質レセプター、α（２，３）シアロ糖タンパク質レセプター、ジフテリア毒素レセプター（ＤＴＲ、ヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の膜結合型前駆体である）、葉酸レセプター、グルタミン酸レセプター、グルタチオンレセプター、インスリンレセプター、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）レセプター、レプチンレセプター、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、ＬＤＬ関連タンパク質１レセプター（ＬＲＰ１、Ｂ型）、ＬＲＰ２レセプター（メガリン又は糖タンパク質３３０としても知られている）、ＬＲＰ４レセプター、ＬＲＰ５レセプター、ＬＲＰ６レセプター、ＬＲＰ８レセプター、マンノース６−リン酸レセプター、スカベンジャーレセプター（クラスＡ又はＢ、Ｉ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型、又はＣＤ３６もしくはＣＤ１６３）、サブスタンスＰレセプター、チアミン輸送体、トランスフェリン−１レセプター及びトランスフェリン−２レセプター、ならびにビタミンＢ１２レセプター。
【００６８】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表し、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、例えば自然突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体製剤の産生時に生じた、ありうる変異型抗体（そのような変異体は、一般に少量存在する）を除き同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の性質を、抗体の実質的に均一な集団から得られるものと意味するのであって、任意の特定方法により抗体を産生する必要があると解釈すべきでない。例えば、本明細書報告の融合ポリペプチドに使用されるべきモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体フラグメントは、非限定的にハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリンローカスの全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などの多様な技法によって製造することができ、モノクローナル抗体を製造するためのそのような方法、及び他の例示的な方法を本明細書に記載する。
【００６９】
「薬学的処方」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態の製剤であって、その処方が投与される対象に容認できないほどの毒性を有する追加的成分を含有しない製剤を表す。
【００７０】
「薬学的に許容されうる担体」は、薬学的処方中の活性成分以外の、対象に無毒な成分を表す。薬学的に許容されうる担体には、非限定的に、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存料が含まれる。
【００７１】
「経細胞輸送」という用語は、分子が、特に抗体のような高分子又はバイオポリマーが、細胞のサイトゾルを通過して輸送される多段階過程を意味する。経細胞輸送の第一段階では、細胞外間隙又は細胞表面関連分子もしくは細胞表面結合分子の物質／分子が小胞内に封入される。この段階は、エンドサイトーシスと呼ばれる。小胞は、細胞のサイトゾルを通過して拡散する。その後、エンドサイトーシスの段階は逆になり、すなわち、小胞は細胞膜と融合し、小胞の内容物は細胞外間隙に放出される。経細胞輸送は、例えば上皮細胞、血液脳関門の細胞、ニューロン又は腸細胞内で起こる。
【００７２】
本明細書に使用する「処置」（及び「処置する」又は「処置すること」のようなその文法的変形）は、処置される個体の自然経過を変化させようする臨床的介入を表し、予防のため、又は臨床病態の経過中のいずれかで行うことができる。処置の望ましい効果には、非限定的に、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接又は間接的な病的影響の減少、転移の予防、疾患の進行速度の減少、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が含まれる。いくつかの態様では、本明細書報告の融合ポリペプチドは、疾患の発生を遅延させる又は疾患の進行を減速するために使用される。
【００７３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体からその抗原への結合に関与する、抗体重鎖又は軽鎖のドメインを表す。ネイティブな抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似した構造をもち、各ドメインは、４個の保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３個の超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えばKindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体由来のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる（例えばPortolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887、Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628参照）。
【００７４】
本明細書使用の「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を増やす
ことができる核酸分子を表す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター及びそれが導入されたホスト細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある種のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を指令できる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００７５】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、その冠詞の一つの又は複数（すなわち少なくとも一つ）の文法的対象を表すために使用される。例として、「抗体」は、一つの抗体又は複数の抗体を意味する。
【００７６】
「ポリペプチド」は、自然に産生されようと合成的に産生されようと、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から成るポリマーである。アミノ酸残基約２０個未満のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれることがあり、一方で、２個以上のポリペプチドから成る分子又はアミノ酸残基が１００個よりも多い一つのポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」と呼ばれることがある。ポリペプチドは、また、糖質基、金属イオン、又はカルボン酸エステルのような非アミノ酸構成要素を含みうる。非アミノ酸構成要素は、ポリペプチドが発現される細胞により付加される場合があり、細胞の種類に応じて異なりうる。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸主鎖構造又はそれをコードする核酸の面から定義される。糖質基などの付加は、一般に特定されないが、それでもなお存在しうる。
【００７７】
「特異的に結合」という用語は、結合部位又はポリペプチド又は抗体又は抗体フラグメントが、１０−５Ｍ以下、一態様では１０−７Ｍ〜１０−１３Ｍ、さらなる一態様では１０−７Ｍ〜１０−９Ｍの解離定数（Ｋｄ）でそのターゲットに結合することを意味する。この用語は、さらに、そのポリペプチドが、存在する他の生体分子に結合しないこと、すなわち、それが他の生体分子と１０−４Ｍ以上、一態様では１０−４Ｍ〜１Ｍの解離係数（Ｋｄ）で結合することを示すために使用される。
【００７８】
「薬学的活性化合物」という用語は、活性を作用部位に送達することが望まれる任意の分子又は分子の組み合わせを意味する。薬学的活性化合物には、非限定的に、薬物（例えばポリペプチド、抗体）、ラベル、細胞毒（例えばPseudomonas外毒素、リシン（ricin）、アブリン、ジフテリア毒素など）、酵素、成長因子、転写因子、放射性核種、リガンド、リポソーム、ナノパーティクル、ウイルス粒子、サイトカインなどが含まれる。
【００７９】
ＩＩ．  組成物及び方法
本明細書では、細胞膜、特に血液脳関門を通過して、ポリペプチド、抗体、又は毒素のような治療薬（生物学的活性化合物）を輸送することが可能な融合ポリペプチドが報告される。したがって、本明細書報告の融合ポリペプチドは、一般的な輸送メカニズム、すなわち、レセプター介在性エンドサイトーシス及びインターナリゼーション性細胞表面レセプターを用いたトランスサイトーシスを採用する。
【００８０】
一態様として、本明細書では、
−  インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する少なくとも一つの結合部位、及び
−  少なくとも一つの薬学的活性化合物
を含む融合ポリペプチドが報告され、その際、
インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する結合部位のｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値の、同レセプターへの同結合部位のｐＨ７．４で決定されたＥＣ５０値に対する比は、１０以上である。
【００８１】
一態様では、その比は１５以上である。
【００８２】
一態様では、その比は１００以下である。
【００８３】
一態様では、その比は１０〜１００である。
【００８４】
一態様では、結合部位は、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が７００ng/ml以上である。一態様では、結合部位は、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が８５０ng/ml以上である。一態様では、結合部位は、ｐＨ５．５で決定されたＥＣ５０値が１０００ng/ml以上である。
【００８５】
一態様では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含む結合ペアである。一態様では、結合ペアは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメント、完全長重鎖、完全長軽鎖、完全抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、又は六重特異性抗体から形成された多重特異性抗体より選択される。一態様では、結合ペアはモノクローナル抗体である。一態様では、結合ペアは、その抗原に対して結合特異性を有する、完全抗体の少なくとも一つのフラグメント、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、又は免疫グロブリン様構造をもつポリペプチドである。
【００８６】
一態様では、結合部位は、フィブロネクチン、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、１本鎖抗原レセプター、例えばＴ細胞レセプター及び抗体に関連するもの、抗体模倣体、トランスフェリン、アポリポタンパク質、アドネクチン、アンチカリンに基づく分子、フィロマー、アビマー、アフィボディー、アンキリンリピート、クニッツドメイン、ＰＤＺドメイン、サソリ毒免疫タンパク質、ノッティン、バーサボディー、緑色蛍光タンパク質ならびに結合性をもつ他の非抗体性タンパク質骨格より選択される。
【００８７】
一態様では、結合部位は、トランスフェリンレセプターに特異的に結合する完全長抗体又は抗体フラグメントである。
【００８８】
理論に縛られるわけではないが、図１に、ｐＨ依存性トランスサイトーシスのメカニズムの概略図を示す。鉄をロードされたホロ−トランスフェリン（中央の欄）は、トランスフェリンレセプターと共に脳内皮細胞の頂端膜からエンドサイトーシスされる。エンドソームが酸性化されると、ホロ−トランスフェリンから鉄が放出され、これは、レセプターのトランスフェリン結合ドメインにおけるコンフォメーション変化によって開始される。アポ−トランスフェリンは、レセプターに結合したままである。ソーティングエンドソームを通過後、レセプターは、頂端膜にリサイクルされるか、又は側底膜にトランスサイトーシスされるかのいずれかである。小胞−膜融合後に、ｐＨ７．４でレセプターに対して親和性をもたないアポトランスフェリンは、レセプターから解離し、細胞を離れる。対照的に（左欄）、ｐＨ７．４及びｐＨ５．５でレセプターと高親和性結合する、すなわちＥＣ５０値の比が５未満（１．３）である、トランスフェリンレセプター抗体ｍＡｂ １２８．１は、エンドソーム内のｐＨ値でも安定なレセプターと緊密な複合体を形成する。ｐＨ安定性複合体の存在は、リサイクリング及びトランスサイトーシスを防止するが、むしろＣＤ６３陽性後期エンドソームへのレセプターのルート変更を誘導する。ｐＨ依存性結合プロファイルを有する抗トランスフェリンレセプター抗体（エンドソームのｐＨのような低下した（酸性）ｐＨ値でレセプター結合性の低下を示す抗体ＭＥＭ−１８９によって例示される；右欄、１０よりも大きなＥＣ５０値比（１５．６））は、理論に縛られるわけではないが、おそらくエンドソーム区画内のトランスフェリンレセプターとの可逆的な低親和性相互作用によって、トランスサイトーシス及びリサイクリングを受けることができる。
【００８９】
図３に、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３脳内皮細胞を通過した１２５Ｉ−トランスフェリンのトランスサイトーシスによる、本明細書使用のトランスサイトーシスアッセイの検証を示す。コラーゲンコーティングされたフィルターインサート上のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞に１２５Ｉラベル化トランスフェリンを１時間ロードした。その後、インサートを洗浄し、３７℃（図３Ａ）又は４℃（図３Ｂ）の新規プレートに移した。表示した時点に、細胞溶解物（黒四角）中、頂端側（灰色棒線）及び側底側（白棒線）の培地区画中の放射能を、ＴＣＡ沈殿後にγ線計測（ＣＰＭ）によって測定した。各時点についての放射能値のまとめを白三角で示す。トランスフェリンは、３７℃で細胞層を離れ、等しい量で頂端側培地区画又は側底側培地区画に入る一方で（Ａ）、４℃では細胞内に留まり（Ｂ）、輸送過程がエネルギー依存性であることを実証している。
【００９０】
図４に、ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １２８．１がｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞から離れないことを示す。１２５Ｉラベル化ｍＡｂ １２８．１をｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞によって取り込ませ、上記のように細胞区画、頂端側培地区画及び側底側培地区画内の放射能を決定した（図３）。細胞から離れて頂端側区画又は側底側区画に入るインタクトな抗体はない。むしろ細胞内放射能は、ゆっくりと漸減し、抗体の細胞内分解を解く手掛かりを与える。
【００９１】
図５に、トランスフェリンとは異なり、ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １２８．１がインターナリゼーション後に後期エンドソームマーカーＣＤ６３と共局在することを示す。コラーゲンコーティングされたカバーグラス上に成長したｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ｍＡｂ １２８．１又はＦＩＴＣラベル化トランスフェリンと共に１０分間インキュベーションし、次に免疫蛍光検査用に加工した。Ａｌｅｘａ−４８８ラベル化二次抗体を用いてｍＡｂ １２８．１を検出し（Ａ）、Ｃ欄にトランスフェリン−ＦＩＴＣ蛍光を示す。後期エンドソームマーカーＣＤ６３に対する抗体及びＡｌｅｘａ−５９４ラベル化二次抗体を用いて、両方のプレパラートを対比染色した（Ｂ、Ｄ）。ｍＡｂ １２８．１はＣＤ６３との共局在を示すが、トランスフェリンは、後期エンドソーム／リソソーム区画内には見出されず、ｍＡｂ １２８．１によるリサイクリング／トランスサイトーシスから分解輸送経路へのトランスフェリンレセプターのルート変更を示している。
【００９２】
図６に、ヒトＩＧＦ−１レセプターに対する抗体（抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）がトランスサイトーシスされず、細胞外媒質にリサイクルされることを示す。抗体の定量を放射能計測ではなく、高感度ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて行ったことを除き、トランスサイトーシス実験を上記のように行った（図２及び３参照）。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体はトランスサイトーシスされず、頂端側区画にリサイクルされ、ＩＧＦ−１レセプターが専ら血液脳関門内皮細胞内でリサイクルされると実証していることを示すことができる。
【００９３】
図７に、ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ ＭＥＭ−１８９が、ｍＡｂ １２８．１と異なり、リサイクリング及びトランスサイトーシスされることを示す。この実験は、定量のためにマウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて上記のように行った（図６参照）。頂端側区画又は側底側区画から見出されなかったｍＡｂ １２８．１とは対照的に（上記図４参照）、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９は、トランスフェリンよりもわずかに低い輸送速度で等量にリサイクリング及びトランスサイトーシスされる（図３Ａも参照）。
【００９４】
図８に、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９がトランスフェリンレセプターにｐＨ依存的に結合し、一方、ｍＡｂ １２８．１はｐＨ依存性結合を示さないことを示す。ｐＨ７．４（細胞外ｐＨ）又はｐＨ５．５（エンドソームｐＨ）におけるヒトトランスフェリンレセプター細胞外ドメインへの抗体１２８．１及びＭＥＭ−１８９の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。ｍＡｂ １２８．１は、両方のｐＨ値でレセプターに類似の親和性で結合するが（三角印：ｐＨ７．４、×印：ｐＨ５．５）、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９は、ｐＨ７．４（丸印）よりもｐＨ５．５（逆三角印）で大きく減少した結合を示す。ｐＨ７．４で、レセプターへのｍＡｂ ＭＥＭ−１８９の結合は、ｍＡｂ １２８．１の結合よりも弱い（下表のＥＣ５０値参照）。下表に、細胞表面レセプターに対する様々な抗体についてのＥＣ５０値及びそれらの該当するＥＣ５０値の比を示す。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
図９に、ｍＡｂ １２８．１及びｍＡｂ ＭＥＭ−１８９がトランスフェリンレセプター上の同じエピトープを求めて競合することを示す。トランスフェリンレセプターの細胞外ドメインをマクロタイタープレートにコーティングし、ｍＡｂ １２８．１又はｍＡｂ ＭＥＭ−１８９と共に予備インキュベーションしてから、それぞれのもう一方のｍＡｂの結合を検出した。ｍＡｂ １２８．１不在下での結合（丸印）に比べて、レセプターへのｍＡｂ ＭＥＭ−１８９の結合は、ｍＡｂ １２８．１の予備インキュベーションによって完全にブロッキングされる（逆三角印）。対照的に、レセプターへのｍＡｂ １２８．１の結合は、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９との予備インキュベーションによって阻害されない（それぞれ三角印及び×印）。結論として、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９及びｍＡｂ １２８．１は、ヒトトランスフェリンレセプター上の同じエピトープを求めて競合する。ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９がｍＡｂ １２８．１の結合を阻止できないという事実は、ｍＡｂ １２８．１の方が有意に高い親和性であることによって説明することができる。
【００９７】
図１０に、ヒトトランスフェリンレセプターに対する抗体Ｍ−Ａ７１２及び１３Ｅ４（どちらもｐＨ依存性結合を示さない）は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を通過してトランスサイトーシスされないことを示す。
【００９８】
上に示したデータは、抗体のトランスサイトーシスの不可欠な特徴が、レセプターのエピトープではなく、レセプターに対する結合親和性及び結合親和性のｐＨ依存的変化であることをはっきりと実証している。
【００９９】
１．  親和性
ある態様では、本明細書提供の融合ポリペプチドの結合部位は、解離定数（Ｋｄ）が≦１０μM、≦１μM、≦１００μM、≦１０nM、又は≦１nMである（例えば、一態様では約１０−５Ｍ〜約１０−９Ｍ、又は別の態様では約１０−７Ｍ以下、例えば１０−７Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）。
【０１００】
一態様では、Ｋｄは、行われた放射性ラベル化抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定され、その際、結合部位は、以下のアッセイに記載の、抗体のＦａｂフラグメント及びその抗原である。抗原に対するＦＡＢの溶液結合親和性は、漸増系列の非ラベル化抗原の存在下で最小濃度の（１２５Ｉ）ラベル化抗原とＦａｂを平衡化し、次に抗Ｆａｂ抗体をコーティングされたプレートを用いて、結合している抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照）。アッセイ条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific)に、５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μg/ml抗Ｆａｂ捕捉抗体（Cappel Labs）を一晩コーティングし、続いてＰＢＳ中の２％(w/v)ウシ血清アルブミンで室温（約２３℃）にて２〜５時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Nunc #269620）内で１００pM又は２６pMの［１２５Ｉ］−抗原を、関心対象のＦａｂの系列希釈液と混合する（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の判定と一致する、Presta, L.G., et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599）。次に、関心対象のＦａｂを一晩インキュベーションするが、確実に平衡に達するように、より長い時間インキュベーションを続けてもよい（例えば約６５時間）。その後、その混合物を、室温で（例えば１時間）インキュベーションするために、捕捉プレートに移す。次に、その溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（TWEEN-20（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）; Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）で１０分間プレートを計測する。競合結合アッセイに使用するために、最大結合の２０％以下を示す各Ｆａｂの濃度を選択する。
【０１０１】
別の態様によると、Ｋｄは、約１０反応単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを備えるBIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE（登録商標）-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡潔には、供給業者の説明書にしたがって、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIACORE, Inc.）をＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μg/ml（約０．２μM）に希釈してから、流速５μl/分でインジェクションし、約１０反応単位（ＲＵ）の結合型タンパク質を獲得する。抗原のインジェクション後に、１Ｍエタノールアミンをインジェクションして未反応の基をブロッキングする。動態測定のために、０．０５％ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に２倍系列希釈したＦａｂ（０．７８nM〜５００nM）を２５℃において流速約２５μl/minでインジェクションする。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純１対１ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標） Evaluation Software version 3.2）を用いて、会合及び解離センサーグラムを同時にあてはめることによって計算する。平衡の解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881参照）。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによりｏｎ−速度が１０６M-1s-1を超えるならば、ｏｎ速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベット（stirred cuvette）を備える8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）のような分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に２０nMの抗抗原性抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nm帯域通過）における増加又は減少を２５℃で測定する蛍光消光技法を使用することによって決定することができる。
【０１０２】
２．  抗体フラグメント
ある態様では、本明細書報告の融合ポリペプチドは、結合部位として抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントには、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメントならびに下記の他のフラグメントが含まれる。ある種の抗体フラグメントの総説については、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントの総説については、例えば、Plueckthun, A.（出典:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York(1994), pp. 269-315)を参照されたい。また、国際公開公報第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含み、in vivo半減期が増加したＦａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの論考については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１０３】
ダイアボディーは、二価又は二重特異性でありうる２個の抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、EP 0 404 097；国際公開公報第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;及びHolliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい。トリアボディー（triabody）及びテトラボディー（tetrabody）も、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134に記載されている。
【０１０４】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号参照）。
【０１０５】
抗体フラグメントは、非限定的に、インタクトな抗体のタンパク質分解消化及び本明細書記載のリコンビナントホスト細胞（例えばE. coli又はファージ）による産生などの様々な技法によって製造することができる。
【０１０６】
３．  多重特異性抗体
ある態様では、本明細書報告の融合ポリペプチドは、多重特異性融合ポリペプチド、例えば二重特異性融合ポリペプチドである。多重特異性融合ポリペプチドは、少なくとも２個の異なる部位に対して結合特異性を有する。ある態様では、結合特異性の一方は、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに対し、もう一方は治療ターゲットに対する。ある態様では、二重特異性融合ポリペプチドは、インターナリゼーション性細胞表面レセプターの２個の異なるエピトープに結合しうる。二重特異性融合ポリペプチドは、完全長融合ポリペプチド又は融合ポリペプチドフラグメントとして調製することができる。
【０１０７】
一態様では、融合ポリペプチドの結合部位は、完全抗体である。
【０１０８】
多重特異性抗体を製造するための技法には、非限定的に、異なる特異性を有する２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアのリコンビナント共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540）、国際公開公報第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659参照）、及び「ノブ−イン−ホール」技術（例えば米国特許第５，７３１，１６８号参照）が含まれる。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を製造するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開公報第２００９／０８９００４Ａ１号）；２個以上の抗体又はフラグメントをクロスリンクすること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生させること（例えばKostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照）；二重特異性抗体フラグメントを製造するために「ダイアボディー」技法を使用すること（例えば、Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448参照）；及び１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M., et al., J. Immunol., 152 (1994) 5368-5374参照）；及び例えばTutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載の三重特異性抗体を調製することによって製造することができる。
【０１０９】
「オクトパス抗体」などの、機能性抗原結合部位が３個以上の操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えばUS2006/0025576A1参照）。
【０１１０】
抗体又はフラグメントは、インターナリゼーション性細胞表面レセプターに結合する抗原結合部位及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二作用性ＦＡＢ」または「ＤＡＦ」でありうる（例えばUS2008/0069820参照）。
【０１１１】
本明細書における抗体又はフラグメントには、また、国際公開公報第２００９／０８０２５１号、国際公開公報第２００９／０８０２５２号、国際公開公報第２００９／０８０２５３号、国際公開公報第２００９／０８０２５４号、国際公開公報第２０１０／１１２１９３号、国際公開公報第２０１０／１１５５８９号、国際公開公報第２０１０／１３６１７２号、ＰＣＴ出願PCT/EP2010/003559、又はＰＣＴ出願PCT/EP2010/003560に記載された多重特異性抗体が含まれる。
【０１１２】
４．  誘導体
ある態様では、本明細書報告の融合ポリペプチドは、当技術分野において公知で容易に入手可能な、追加的な非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変することができる。融合ポリペプチドの誘導体化に適切な部分には、非限定的に、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例には、非限定的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性のせいで製造に有利でありうる。ポリマーは、任意の分子量の場合があり、分岐又は非分岐型でありうる。抗体に結合しているポリマーの数は、多様な場合があり、一つよりも多いポリマーが結合している場合、それらは同じ分子又は異なる分子でありうる。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、非限定的に、改善されるべき抗体の特定の性質又は機能、抗体誘導体が所定の条件で治療に使用されるかどうかなどの考慮に基づき決定することができる。
【０１１３】
別の態様では、放射線曝露によって選択的に加熱できる、融合ポリペプチドと非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は任意の波長であってよく、その波長には、非限定的に、通常の細胞を損傷しないが、抗体の非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれる。
【０１１４】
５．  アッセイ
本明細書報告の融合ポリペプチド又はその構成要素は、当技術分野において公知の様々なアッセイによりそれらの物理／化学的性質及び／又は生物学的活性を同定、スクリーニング、又は特徴づけすることができる。
【０１１５】
５．１．  結合アッセイ及び他のアッセイ
一局面では、本明細書報告の融合ポリペプチドの結合部位は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどのような公知の方法によってその細胞表面レセプター結合活性について試験される。
【０１１６】
別の局面では、トランスフェリンレセプターへの結合をｍＡｂ ＭＥＭ−１８９と競合するさらなる結合部位、特に抗体及び抗体フラグメントを同定するために、競合アッセイを使用することができる。ある態様では、そのような競合抗体は、ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９によって結合される、まさにそのエピトープと同じエピトープ（例えば、線状エピトープ又はコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris, G.E., (ed.), "Epitope Mapping Protocols,"出典:Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供されている。
【０１１７】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイで参照抗体からその抗原への結合を５０％以上ブロッキングする抗体を表し、又は逆に参照抗体は、競合アッセイでその抗体からその抗原への結合を５０％以上ブロッキングする。
【０１１８】
例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに連結したヒトトランスフェリンレセプター細胞外ドメインの融合タンパク質は、１μg/mlＰＢＳ溶液５０μlをＲＴで１時間インキュベーションすることによって、９６ウェルプレートにコーティングすることができる。ＰＢＳ／１％(w/v)ＢＳＡで１時間ブロッキングし、ＰＢＳ／０．１％(w/v) Tweenで４回洗浄後に、対象となる抗体を、ｐＨ７．４又はｐＨ５．５に調製したＰＢＳ／０．１％(w/v)ＢＳＡ中の異なる濃度でプレートに加え、ＲＴで１．５時間インキュベーションすることができる。ＰＢＳ／０．１％(w/v) Tweenで４回洗浄後に、ＨＲＰ結合型二次抗体（３０分、ＲＴ）及びＴＭＢ基質５０μlを使用して、結合型抗体を検出することができる。発色は、１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）５０μlの添加により停止することができ、吸光度は、プレートリーダーを用いて４５０nmで測定することができる。
【０１１９】
５．２．  活性アッセイ
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３用の培地及び補助物質（国際公開公報第２００６／０５６８７９号及びWeksler, B.B., et al., FASEB J. 19 (2005) 1872-1874参照）は、Lonzaから得ることができる。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（２６〜２９回継代）は、２．５％ＦＢＳ、供給された成長因子の４分の１を含有し、供給されたヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン及びアスコルビン酸が完全に補完されたＥＢＭ２培地中に入れて、コラーゲンコーティングされたカバーグラス上（顕微鏡）又はフラスコ上で集密状態になるまで培養することができる。
【０１２０】
全てのトランスサイトーシスアッセイについて、高密度細孔（１×１０８個/cm2）のＰＥＴメンブランフィルターインサート（孔径０．４μm、直径１２mm）を１２ウェル細胞培養プレート中で使用することができる。培地体積は、頂端側区画及び側底側区画について、それぞれ４００μl及び１６００μlと計算される。フィルターインサートの頂端側区画をラット尾コラーゲンＩ（７．５μg/cm2）に続きフィブロネクチン（５μg/ml）でコーティングすることができ、各インキュベーションをＲＴで１時間継続する。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞は、集密な単層（約２×１０５個/cm2）になるまでＥＢＭ２培地中で１０〜１２日間成長させることができる。空のフィルターは、アッセイ前に、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で１時間又は一晩（ｏ／ｎ）ブロッキングし、次に、アッセイ前にＥＢＭ２中で少なくとも１時間較正することができる。
【０１２１】
アッセイ（アッセイの模式図については図２参照）は、他の点では本明細書記載のように再構成された無血清ＥＢＭ２培地中で行うことができる。アッセイの日に、対象となるインターナリゼーション性細胞表面レセプターの天然リガンドを枯渇させるために、細胞から血清を６０分間欠乏させた。フィルターインサートを、細胞の存在下又は不在下（しかし完全培地中で一晩ブロッキング）で、インターナリゼーション性細胞表面レセプターの放射性ラベル化天然リガンド、対象となる１２５Ｉラベル化モノクローナル抗体又は非ラベル化モノクローナル抗体と共に頂端側を３７℃で１時間インキュベーションした。その後、頂端側及び側底側の全量を採取した。傍細胞流動は、決定された値から計算することができる。その単層の頂端側及び側底側を、ＲＴの無血清培地（それぞれ４００μl及び１６００μl）中で３回それぞれ３〜５分間洗浄した。未結合のリガンド又は抗体の除去効率をモニタリングするために、洗浄液の全量を採取した。予備加温した培地を頂端側区画に添加し、予備加温した培地１６００μlが入った新鮮な１２ウェルプレート（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳと共に一晩ブロッキング）にフィルターを移した。この時点で、特異的リガンド又は抗体の取り込みを決定するために、細胞が存在するフィルター又は存在しないフィルターをＲＩＰＡ緩衝液５００μlで溶解させた。残りのフィルターを３７℃又は４℃でインキュベーションし、試料を様々な時点で採取して、リガンド又は抗体の頂端側及び／又は側底側放出を決定した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿を用いて、インタクト型及び分解型の１２５Ｉラベル化天然リガンド又は１２５Ｉラベル化抗体を判定した。上清又は溶解液中の放射性天然リガンド又は抗体の量は、ガンマ線計測によって決定することができる。高感度ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて試料中の非ラベル化抗体の含量を定量することができる（実施例３参照）。各時点について、２枚の空のフィルター及び三つのフィルター細胞培養物からデータを生成すべきである。
【０１２２】
６．  リコンビナント方法及び組成物
融合ポリペプチドは、リコンビナント方法及び組成物を用いて産生することができる。一態様では、本明細書報告の融合ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。さらなる一態様では、そのような核酸を含む一つ又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる一態様では、そのような核酸を含むホスト細胞が提供される。そのような一態様では、ホスト細胞は、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む一つ又は複数のベクターを含む（例えば、そのベクターでトランスフォーメーションされている）。一態様では、ホスト細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞）である。一態様では、本明細書報告の融合ポリペプチドを製造する方法であって、上記に提供の融合ポリペプチドをコードする核酸を含むホスト細胞を、融合ポリペプチドの発現に適した条件で培養すること、及び場合によりホスト細胞（又はホスト細胞の培養液）から融合ポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。
【０１２３】
本明細書報告の融合ポリペプチドのリコンビナント産生のために、本明細書報告の、例えば上記の、融合ポリペプチドをコードする核酸が単離され、一つ又は複数のベクターに挿入され、ホスト細胞でのさらなるクローニング及び／又は発現に供される。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定することができる。
【０１２４】
ポリペプチドをコードするベクターのクローニング又は発現に適したホスト細胞には、本明細書記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要ない場合、細菌から産生させることができる。細菌での抗体フラグメント及びポリペプチドの発現について、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（E. coliでの抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, K.A.、出典:Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C., (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい。）発現後に、ポリペプチドは、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、さらに精製することができる。
【０１２５】
原核生物以外に、糸状真菌又は酵母のような真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに適したクローニングホスト又は発現ホストであり、それには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全ヒトグリコシル化パターンを有する融合ポリペプチドの産生を招く真菌株及び酵母株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414、及びLi, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０１２６】
グリコシル化ポリペプチドの発現に適したホスト細胞は、また、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と共に、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために使用することができる多数のバキュロウイルス株が、同定されている。
【０１２７】
植物細胞培養物は、また、ホストとして利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生させるためのPLANTIBODIES（商標）技法を記載している）を参照されたい。
【０１２８】
脊椎動物細胞もホストとして使用することができる。例えば、懸濁状態での成長に順化された哺乳動物細胞系が、有用でありうる。有用な哺乳動物ホスト細胞系の他の例は、ＳＶ４０によってトランスフォーメーションされたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）；ヒト胎仔腎臓系（例えば、Graham, F.L., et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74に記載されたような２９３又は２９３細胞）；幼ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されたようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されたようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物ホスト細胞系には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０のような骨髄腫細胞系が含まれる。抗体の産生に適した、ある種の哺乳動物ホスト細胞系の総説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M.、出典:Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ(2004) pp. 255-268を参照されたい。
【０１２９】
７．  免疫コンジュゲート
本明細書には、また、エフェクター部分のような構成要素の少なくとも一つが、例えば、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体のような細胞毒である融合ポリペプチドが提供される。
【０１３０】
一態様では、エフェクター部分は、非限定的に、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号、EP 0 425 235)、モノメチルアウリスタチン（monomethyl auristatin）薬部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第７，４９８，２９８号参照）のようなアウリスタチン、ドラスタチン、カリケアミシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号、米国特許第５，８７７，２９６号、Hinman, L.M., et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342、Lode, H.N., et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928参照）、ダウノマイシンもしくはドキソルビシンのようなアントラサイクリン（Kratz, F., et al., Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523、Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362、Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721、Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97 (2000) 829-834、Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 1529-1532、King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343、及び米国特許第６，６３０，５７９号参照）、メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（larotaxel）、テセタキセル、及びオルタタキセルのようなタキサン、トリコテセン、ならびにＣＣ１０６５などの薬物又は薬学的活性化合物である。
【０１３１】
別の態様では、エフェクター部分は、非限定的に、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecene）などの、酵素活性毒素又はそのフラグメントである。
【０１３２】
別の態様では、エフェクター部分は、放射性原子である。放射性コンジュゲートの産生のために、多様な放射性同位体が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。検出のために放射性コンジュゲートが使用される場合、その放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍもしくはＩ１２３、又はＩ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄のような、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）としても知られている）のためのスピンラベルを含みうる。
【０１３３】
エフェクター部分は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド構成要素（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素構成要素（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような、多様な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、本明細書報告の融合ポリペプチド中の結合部位に融合させることができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されているように調製することができる。炭素１４ラベル化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、融合ポリペプチドに放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である（国際公開公報第９４／１１０２６号参照）。本明細書報告の融合ポリペプチドに毒性部分をコンジュゲーションするためのリンカーは、細胞内での細胞毒性薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V., et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０１３４】
エフェクター部分は、本明細書報告の融合ポリペプチド中の結合部位にリンカーを介して融合させることができ、それは、例えば、非限定的に、（例えばPierce Biotechnology、Inc., Rockford, IL., USAから）市販のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）などのクロスリンカー試薬を用いて調製されたようなコンジュゲートである。
【０１３５】
エフェクター部分は、ペプチドリンカーを介して結合部位に融合することができる。一態様では、ペプチドリンカーは、４〜２０個のアミノ酸残基を有する。一態様では、リンカーは、リピートモチーフ分子の間で同じであり、別の態様では、コンジュゲートは、２個以上の異なるアミノ酸配列を有するリンカーを含有する。さらなる一態様では、リンカーは、（Ｇ３Ｓ）、（Ｇ３Ｓ）２、（Ｇ３Ｓ）３、（Ｇ３Ｓ）４、（Ｇ３Ｓ）５、（Ｇ４Ｓ）、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）５（配列番号１及び配列番号１２〜２０）より、特に（Ｇ４Ｓ）３及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１８及び配列番号１９）より選択される。
【０１３６】
８．  診断及び検出用の方法及び組成物
ある態様では、本明細書提供の任意の融合ポリペプチドは、生物学的試料中の融合ポリペプチド中の結合部位によって特異的に結合されるターゲットの存在を検出するために有用である。本明細書に使用される「検出する」という用語は、定量検出又は定性検出を包含する。
【０１３７】
一態様では、診断又は検出の方法に使用するための融合ポリペプチドが提供される。さらなる一局面では、本明細書報告の融合ポリペプチドの結合部位又はエフェクター部分のターゲットの存在を生物学的試料中から検出する方法が提供される。ある態様では、その方法は、結合部位（一つもしくは複数）又はエフェクター部分からそのターゲット（一つもしくは複数）への結合を許容する条件で、生物学的試料を本明細書報告の融合ポリペプチドと接触させること、及び融合ポリペプチドとターゲットとの間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、in vitro法又はin vivo法でありうる。一態様では、例えば、ターゲットが患者の選択のためのバイオマーカーである場合、本明細書報告の融合ポリペプチドは、融合ポリペプチド中に含まれる単離されたポリペプチドを用いた治療に的確な対象を選択するために使用される。
【０１３８】
ある態様では、ラベル化融合ポリペプチド、すなわちエフェクター部分がラベルである融合ポリペプチドが提供される。ラベルには、非限定的に、直接検出されるラベル（蛍光ラベル、発色団ラベル、高電子密度ラベル、化学発光ラベル、及び放射性ラベルなど）、ならびに間接的に、例えば酵素反応又は分子相互作用により検出される酵素又はリガンドのようなラベルが含まれる。例示的なラベルには、非限定的に、放射性同位体Ｐ３２、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｈ３、及びＩ１３１、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンのような蛍光団、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を採用する酵素と結合された、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカルなどが含まれる。
【０１３９】
ＩＩＩ．  薬学的処方
本明細書報告の融合ポリペプチドの薬学的処方は、所望の純度を有するそのような融合ポリペプチドを一つ又は複数の随意の薬学的に許容されうる担体と共に、凍結乾燥処方又は水溶液の形態で混合することによって調製される（Osol, A., (ed.) Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)）。薬学的に許容されうる担体は、一般に、採用された用量及び濃度でレシピエント無毒であり、その担体には、非限定的に、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン（lysine）のようなアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどの単糖、二糖、及び他の糖質、ＥＤＴＡのようなキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖、ナトリウムのような塩形成対イオン、金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、ならびに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤が含まれる。本明細書における例示的な薬学的に許容されうる担体には、さらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）のようなヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質のような間質薬物分散剤（interstitial drug dispersion agent）が含まれる。ｒｈｕＰＨ２０などの、ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、US 2005/0260186及びUS 2006/0104968に記載されている。一局面では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼのような一つ又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０１４０】
例示的な凍結乾燥抗体処方は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体処方には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開公報第２００６／０４４９０８号に記載された処方が含まれるが、後者の処方は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１４１】
本明細書における処方は、また、処置される特定の適応症についての必要に応じて、１種以上の活性成分を、特に相互に不利に作用しない相補的活性を有する活性成分を、含有しうる。そのような活性成分は、適切には、意図される目的に有効な量で組み合わせて存在する。
【０１４２】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたミクロカプセル中に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンミクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）ミクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノパーティクル及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルション中に封入することができる。そのような技法は、Osol, A., (ed.) Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)に開示されている。
【０１４３】
徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、造形品、例えばフィルム又はミクロカプセルの形態である。
【０１４４】
in vivo投与のために使用されるべき処方は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、無菌ろ過メンブランを通すろ過によって容易に達成することができる。
【０１４５】
ＩＶ．  治療法及び組成物
エフェクター部分が治療活性化合物又は検出可能なラベルである、本明細書報告の任意の融合ポリペプチドは、治療方法に使用することができる。
【０１４６】
一局面では、医薬として使用するための本明細書報告の融合ポリペプチドが提供される。さらなる局面では、ＣＮＳ関連疾患の処置に使用するための融合ポリペプチドが提供される。ある態様では、処置方法に使用するための融合ポリペプチドが提供される。ある態様では、本発明は、ＣＮＳ関連疾患を有する個体を処置する方法であって、その個体に有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む方法に使用するための融合ポリペプチドを提供する。そのような一態様では、その方法は、さらに、その個体に有効量の少なくとも１種の追加的な治療剤を投与することを含む。さらなる態様では、本発明は、ＣＮＳ関連疾患の後退又は安定化に使用するための本明細書報告の融合ポリペプチドを提供する。ある態様では、本発明は、個体に有効量の融合ポリペプチドを投与してＣＮＳ関連疾患を後退又は安定化することを含む、その個体におけるＣＮＳ関連疾患の後退又は安定化に使用するための融合ポリペプチドを提供する。任意の上記態様による「個体」は、特にヒトである。
【０１４７】
ＣＮＳ関連疾患には、例えば、ウイルス疾患又は細菌疾患（脳炎、髄膜炎など）、ガン（悪性脳腫瘍など）、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症など）、急性疾患（脳卒中、身体外傷、脊髄損傷など）、精神病（不安、うつ、てんかん、発作性障害、統合失調症、睡眠障害など）、認知疾患（記憶疾患、認知疾患など）、脳血管障害（虚血性脳卒中、脳内出血、クモ膜下出血）、疼痛関連疾患、プリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症など）、又は嗜癖疾患（アルコール依存症など）が含まれる。
【０１４８】
本明細書報告の融合ポリペプチドは、それがＣＮＳ関連疾患の後退又は安定化を招くならば、治療的に有効である。
【０１４９】
一態様では、エフェクター部分は、脳由来向神経性因子（ＢＤＮＦ）、毛様体向神経性因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来向神経性因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、又は神経成長因子（ＮＧＦ）に結合性の、又はその活性を改変する治療活性化合物である。
【０１５０】
一態様では、エフェクター部分は、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ドーパミン、エンドルフィン、エンケファリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ニューロペプチドＹ、サブスタンスＰ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、又は血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）より選択される治療活性化合物である。
【０１５１】
一態様では、エフェクター部分は、抗痙攣薬、抗不安薬、サイトカイン、又はｓｉＲＮＡのようなポリヌクレオチドより選択される治療活性化合物である。
【０１５２】
本明細書報告のさらなる一局面では、医薬の製造又は調製への本明細書報告の融合ポリペプチドの使用が提供される。一態様では、その医薬は、ＣＮＳ関連疾患の処置用である。さらなる一態様では、その医薬は、ＣＮＳ関連疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、ＣＮＳ関連疾患を処置する方法に使用するためのものである。さらなる一態様では、その医薬は、ＣＮＳ関連疾患を後退又は安定化するためのものである。さらなる一態様では、その医薬は、個体でのＣＮＳ関連疾患を後退又は安定化する方法であって、その個体にＣＮＳ関連疾患を後退又は安定化するために有効な量の医薬を投与することを含む方法に使用するためのものである。任意の上記態様による「個体」は、ヒトでありうる。
【０１５３】
本明細書報告のさらなる一局面では、ＣＮＳ関連疾患を処置するための方法が提供される。一態様では、その方法は、そのような疾患を有する個体に有効量の本明細書報告の融合ポリペプチドを投与することを含む。任意の上記態様による「個体」は、ヒトでありうる。
【０１５４】
本明細書報告のさらなる一局面では、個体でのＣＮＳ関連疾患を後退又は安定化する方法が提供される。一態様では、その方法は、個体に有効量の本明細書報告の融合ポリペプチドを投与してＣＮＳ関連疾患を後退又は安定化することを含む。一態様では、「個体」はヒトである。
【０１５５】
本明細書報告のさらなる一局面では、例えば任意の上記治療方法に使用するための、本明細書提供の融合ポリペプチドの任意の一つを含む薬学的処方が提供される。一態様では、その薬学的処方は、本明細書提供の融合ポリペプチドの任意の一つ及び薬学的に許容されうる担体を含む。別の態様では、その薬学的処方は、本明細書報告の融合ポリペプチドの任意の一つ及び少なくとも一つの追加的な治療剤を含む。
【０１５６】
本明細書報告の融合ポリペプチドは、単独で、又は他の薬剤と組み合わせてのいずれかで治療に使用することができる。例えば、本明細書報告の融合ポリペプチドは、少なくとも一つの追加的な治療剤と同時投与することができる。
【０１５７】
そのような上述の組み合わせ療法は、併用投与（２種類以上の治療剤が同一又は別個の処方中に含まれる）、及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加的な治療剤及び／又は佐剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後に起こりうる。本明細書報告の融合ポリペプチドは、また、放射線療法と組み合わせて使用することができる。
【０１５８】
本明細書報告の融合ポリペプチドは、非経口、肺内、及び鼻腔内などの任意の適切な手段によって、ならびに局所処置を望むならば、病巣内投与によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、一部には投与が短期であるか慢性であるかに応じて、任意の適切な経路、例えば静脈内注射又は皮下注射のような注射による場合がある。非限定的に、単回投与又は様々な時点にわたる多回投与、ボーラス投与及びパルス注入などの様々な投薬スケジュールが、本明細書において考えられる。
【０１５９】
本明細書報告の融合ポリペプチドは、良好な医療行為に一致する方法で処方、用量設定、及び様式で投与される。この状況での考慮要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュールの設定、及び医師に公知の他の要因が含まれる。融合ポリペプチドは、対象となる障害を予防又は治療するために現在使用される一つ又は複数の薬剤と共に処方される必要はないが、場合により処方される。そのような他の薬剤の有効量は、処方中に存在する融合ポリペプチドの量、障害又は処置の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載したものと同じ用量及び投与経路で使用されるか、又は本明細書記載の用量の約１％〜９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると判定された任意の用量及び経路で使用される。
【０１６０】
疾患の予防又は治療のために、本明細書報告の融合ポリペプチドの適切な用量（単独で、又は一つもしくは複数の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合）は、処置されるべき疾患の種類、融合ポリペプチドの種類、疾患の重症度及び経過、融合ポリペプチドが予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び融合ポリペプチドに対する応答、及び担当の医師の判断に依存する。融合ポリペプチドは、適切には患者に一度に、又は一連の処置にわたり投与される。疾患の種類及び重症度に依存して、例えば１回又は複数回の別個の投与又は連続注入によるにせよ、融合ポリペプチド約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば０．１mg/kg〜１０mg/kg）が患者への初回投与用量の候補でありうる。一つの典型的な１日用量は、上記の要因に応じて約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲でありうる。数日以上にわたる繰り返し投与について、条件に応じて、処置は、所望の疾患症状の抑制が起こるまで一般に継続される。融合ポリペプチドの用量の一例は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲である。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はその任意の組み合わせ）を１回又は複数回、患者に投与することができる。そのような投与は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に（例えば、患者が融合ポリペプチドの投与を約２〜約２０回、又は例えば約６回受けるように）投与することができる。より高い初回負荷投与量に続き、より低い投与量を１回又は複数回投与することができる。この治療の進展は、従来の技法及びアッセイによって容易にモニタリングすることができる。
【０１６１】
製品
本明細書報告の別の局面では、上記障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器及びその容器上又はその容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ用溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのような多様な材料から形成されうる。容器は、それ自体で又は別の組成物との組み合わせで、状態の治療、予防及び／又は診断に有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有する場合がある（例えば、その容器は、静脈用溶液バッグ又は皮下針によって刺通することができるストッパーを有するバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は、本明細書報告の融合ポリペプチドである。ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。そのうえ、製品は、（ａ）本明細書報告の融合ポリペプチドを含む組成物がその中に入っている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞毒又は別の治療剤を含む組成物がその中に入っている第２の容器を含みうる。本発明のこの態様において、製品は、さらに、その組成物が特定の状態を処置するために使用できることを示す添付文書を含みうる。又は、もしくは追加的に、製品は、さらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液のような薬学的に許容されうる緩衝液を含む第２（又は第３）の容器を含みうる。それは、さらに、商業的観点及び使用者の観点から望ましい、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、及びシリンジなどの他の物質を含みうる。
【０１６２】
以下の実施例、配列リスト及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱せずに、示された手順に変更を加えることができることが理解されている。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ｐＨ依存性トランスサイトーシスメカニズムの概略図である。
【図２】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３トランスサイトーシスアッセイの設定を示す図である。
【図３ａ】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３脳内皮細胞を通過する１２５Ｉ−トランスフェリンのトランスサイトーシスによるアッセイの検証を示す図である。
【図３ｂ】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３脳内皮細胞を通過する１２５Ｉ−トランスフェリンのトランスサイトーシスによるアッセイの検証を示す図である。
【図４】ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １２８．１がｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞から離れないことを示す図である。
【図５】トランスフェリンとは異なり、ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １２８．１がインターナリゼーション後に後期エンドソームマーカーＣＤ６３と共局在することを示す図である。
【図６】ヒトＩＧＦ−１レセプターに対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がトランスサイトーシスされず、リサイクルされることを示す図である。
【図７】ｍＡｂ １２８．１とは異なり、ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ ＭＥＭ−１８９が、リサイクル及びトランスサイトーシスされることを示す図である。
【図８】ｍＡｂ ＭＥＭ−１８９が、ｐＨ依存的にトランスフェリンレセプターに結合するが、ｍＡｂ １２８．１は結合しないことを示す図である。
【図９】ｍＡｂ １２８．１及びｍＡｂ ＭＥＭ−１８９が同じエピトープを求めて競合することを示す図である。
【図１０ａ】ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １３Ｅ４及びＭ−Ａ７１２がトランスサイトーシスされないことを示す図である。
【図１０ｂ】ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １３Ｅ４及びＭ−Ａ７１２がトランスサイトーシスされないことを示す図である。
【０１６４】
配列の説明
配列番号０１〜２０  リンカーポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号２１  ｍＡｂ １２８．１重鎖可変ドメインのアミノ酸配列
配列番号２２  ｍＡｂ １２８．１可変ドメイン軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２３  ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列
配列番号２４  ヒトＩｇＧ４定常領域のアミノ酸配列
配列番号２５  ヒトκ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列
配列番号２６  ヒトλ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列
【０１６５】
実施例
実施例１
トランスサイトーシスアッセイ又は蛍光顕微鏡検査のためのｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の培養
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３用の培地及び補助物質（国際公開公報第２００６／０５６８７９号及びWeksler, B.B., et al., FASEB J. 19 (2005) 1872-1874参照）を、Lonzaから得た。２．５％ＦＢＳ、供給された成長因子の４分の１を含有し、供給されたヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン及びアスコルビン酸が完全に補完されたＥＢＭ２培地中でｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（２６〜２９回継代）を、コラーゲンコーティングされたカバーグラス上（顕微鏡検査）又はフラスコ上で集密になるまで培養した。
【０１６６】
全てのトランスサイトーシスアッセイについて、高密度細孔（１×１０８孔/cm2）ＰＥＴメンブランフィルターインサート（孔径０．４μm、直径１２mm）を１２ウェル細胞培養プレートに使用した。培地体積は、頂端側区画及び側底側区画について、それぞれ４００μl及び１６００μlと計算された。フィルターインサートの頂端側区画をラット尾コラーゲンＩ（７．５μg/cm2）に続きフィブロネクチン（５μg/ml）でコーティングし、各インキュベーションをＲＴで１時間継続した。ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、集密な単層（約２×１０５個/cm2）になるまでＥＢＭ２培地中で１０〜１２日間成長させた。空のフィルターは、アッセイ前に、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で１時間又は一晩（ｏ／ｎ）ブロッキングし、次に、ＥＢＭ２培地中で少なくとも１時間較正した。
【０１６７】
実施例２
１２５Ｉ−トランスフェリン及びモノクローナル抗体のトランスサイトーシスアッセイ
１２５Ｉ−トランスフェリン（Ｔｆｎ）をPerkin Elmer（Perkin Elmer、Rodgau、Germany、#NEX212050UC）から得た。ヒトトランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ １２８．１及びマウストランスフェリンレセプターに対するｍＡｂ８Ｄ３を、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及び軽鎖定常領域、ならびにマウス抗ヒトトランスフェリンレセプター抗体１２８．１の可変領域（可変領域配列については、国際公開公報第９３／１０８１９号ならびに配列番号２１及び２２参照）又はラット抗マウストランスフェリンレセプター抗体８Ｄ３（Boado et al. (2009), Biotechnol. Bioeng. 102, 1251-1258）の可変領域のコード配列の連続オープンリーディングフレームを含むベクターをトランスフェクションされたＨＥＫ細胞に一過性発現させ、上記に報告のように精製した。ｍＡｂ １２８．１も１２５Ｉでラベルした。ヒトＩＧＦ−１レセプターに対するモノクローナル抗体を発現させ、米国特許第７，５７２，８９７号に記載のように精製した。ヒトトランスフェリンレセプターに対するマウスモノクローナルｍＡｂであるＭＥＭ−１８９及び１３Ｅ４をAbcam（Cambridge, England、それぞれ#ab1086及び#ab38171）から、ｍＡｂ Ｍ−Ａ７１２をBD Biosciences（Heidelberg, Germany, #555534）から得た。アッセイ全体（アッセイスキームに関しては図２参照）は、その他の点では実施例１に記載のように再構成した無血清ＥＢＭ２培地中で行った。アッセイの日に、細胞から血清を６０分間枯渇させてトランスフェリンを欠乏させた（トランスフェリントランスサイトーシスのためだけ）。細胞が存在する又は存在しない（しかし完全培地中で一晩ブロッキングされた）フィルターインサートの頂端側を、放射性トランスフェリン、１２５Ｉラベル化モノクローナル抗体又は非ラベル化モノクローナル抗体と共に３７℃で１時間インキュベーションした。その後、頂端側及び側底側液の全量を採取した。傍細胞流及び放射性ヨウ化リガンドの安定性を、測定値から計算した。単層の頂端側及び側底側をＲＴで無血清培地（それぞれ４００μl及び１６００μl）中でそれぞれ３回、３〜５分間洗浄した。洗浄液の全量を採取して未結合のリガンド又は抗体の除去効率をモニタリングした。予備加温した培地を頂端側チャンバーに加え、予備加温した培地１６００μlが入った新しい１２ウェルプレート（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで一晩ブロッキングした）にフィルターを移した。この時点で、リガンド又は抗体の特異的取り込みを決定するために、細胞を有するフィルター又は有さないフィルターを、ＲＩＰＡ緩衝液（Sigma, Munich, Germany, #R0278）５００μl中で溶解させた。残りのフィルターを３７℃又は４℃でインキュベーションし、試料を様々な時点で採取してリガンド又は抗体の頂端側及び／又は側底側放出を決定した。インタクト型及び分解型の１２５Ｉ−トランスフェリン又は１２５Ｉ−ｍＡｂ １２８．１を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿を用いて判定した。上清又は溶解液中の放射性トランスフェリン又はｍＡｂ １２８．１の量は、ガンマ放射線計測によって決定した。試料中の非ラベル化抗体の含量は、高感度ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて定量した（実施例３参照）。各時点で、２枚の空のフィルター及び３個のフィルター細胞培養物からデータを生成した。
【０１６８】
実施例３
トランスサイトーシスアッセイ後の高感度ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
洗浄ステップのために自動洗浄機を使用してＲＴで手順全体を行った。３８４ウェルプレートに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１μg/ml Ｆｃγ特異的抗ヒト／マウスＩｇＧ（Dianova, Hamburg, Germany、それぞれ#109-005-098又は#115-005-164）を３０μl/ウェルとなるように２時間コーティングし、続いてヒトＩｇＧアッセイ及びマウスＩｇＧアッセイのために、それぞれ１％(w/v)ＢＳＡ（Sigma, Munich, Germany, #A2153）を含有するブロッキング緩衝ＰＢＳ中で１時間インキュベーションした。トランスサイトーシスアッセイからの系列希釈した試料及びトランスサイトーシスアッセイに使用される標準濃度の抗体をプレートに添加し、２時間インキュベーションした。４回洗浄後に、ブロッキング緩衝液（上記）中の５０ng/ml抗ヒト／マウス−Ｆ（ａｂ）２−ビオチン−コンジュゲート（Dianova, Hamburg, Germany、それぞれ#109-066-097又は#115-066-072）を３０μl/ウェルとなるように添加し、さらに２時間インキュベーションした。６回洗浄後に、５０ng/ml（ｈｕＩｇＧアッセイ）又は１００ng/ml（ｍＩｇＧアッセイ）のポリＨＲＰ４０−ストレプトアビジン（Fitzgerald, Acton (MA), USA, #65R-S104PHRPx；１％(w/v)ＢＳＡ及び０．０５％(w/v)Tween-20を含有するＰＢＳ中）を３０μl/ウェルとなるように添加し、３０分間インキュベーションした。４回洗浄後に、３０μl/ウェルのＢＭ化学ルミネセンス用基質（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）の添加によって免疫複合体を検出した。ルミネセンス用プレートリーダーを用いてルミネセンスシグナルを測定し、あてはめた標準曲線を用いて濃度を計算した。アッセイの範囲は、１０pg/ml〜１０ng/mlであった。
【０１６９】
実施例４
共焦点蛍光顕微鏡法
１２８．１抗体及びホロ−トランスフェリンの局在を検討するために、コラーゲンコーティングされたカバーグラス上に集密になるまで成長したｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の単層を、５μg/ml ＦＩＴＣ−タグ付きホロ−トランスフェリン（Invitrogen, Darmstadt, Germany, #T-2871）又は１μg/ml ｍＡｂ １２８．１と共に１０分間インキュベーションした。その後、培地を除去し、新鮮培地に交換した。３７℃で１時間後に、その単層を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に入れてＲＴで１５分間固定し、１０分間透過処理し（ＰＢＳ／０．１％(w/v)Triton X-100（Sigma, Munich, Germany, #93443）、後期エンドソーム／リソソームマーカーＣＤ６３に対する抗体（R&D Systems, Wiesbaden, Germany, #MAB5417）と共にＲＴで４５分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳ／０．１％(w/v)Triton X−100中で１５分間洗浄に供し、必要ならば二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Alexa Fluor 488及び／又はニワトリ抗マウスＩｇＧ−Alexa Fluor 594（Invitrogen, Darmstadt, Germany、それぞれ#A11013又は#A21201）と共にＲＴで４５分間連続的にインキュベーションした。細胞をＰＢＳ／０．１％(w/v)Triton X-100中で３０分間洗浄した。その後、カバーグラスをマウンティング媒質中でマウントした。共焦点顕微鏡を用いて蛍光イメージを得た。全ての共焦点像は、細胞全体にわたり取得されたＺシリーズの単一の代表的切片を示す。
【０１７０】
実施例５
ｐＨ依存性結合及び競合ＥＬＩＳＡ
ヒトＩｇＧ１のＦｃに結合したヒトトランスフェリンレセプター細胞外ドメインの融合タンパク質（R&D Systems, Wiesbaden, Germany, # 2474-TR-050）又はマウストランスフェリンレセプター（SinoBiological, Beijing, China, #50741-M07H）もしくはヒトインスリンレセプター（R&D Systems, Wiesbaden, Germany, #1544-IR/CF）の細胞外ドメインを、１μg/mlのＰＢＳ溶液５０μlをＲＴで１時間インキュベーションすることによって９６プレートにコーティングした。ＰＢＳ／１％(w/v)ＢＳＡで１時間ブロッキングし、ＰＢＳ／０．１％(w/v)TWEEN 20で４回洗浄後に、抗体ＭＥＭ−１８９、１２８．１、１３Ｅ４、Ｍ−Ａ７１２、ＬＴ−７１、ＭＥＭ−７５（どちらもAbcam、それぞれ#ab9179及び#ab38446）、ＯＫＴ−９（eBioscience, Frankfurt, Germany, #16-0719；全てヒトＴｆＲに対する）、８Ｄ３、Ｒ１７２１７（Santa Cruz, Heidelberg, Germany, #sc-52504；どちらもマウスＴｆＲに対する）、８３−１３（Invitrogen, Darmstadt, Germany, #AHR0221）及び２４３５２４（R&D Systems, #MAB1544；どちらもヒトインスリンレセプターに対する）を、ｐＨ７．４又はｐＨ５．５に調整されたＰＢＳ／０．１％(w/v)ＢＳＡ中の異なる濃度でプレートに添加し、ＲＴで１．５時間インキュベーションした。又は、５μg/mlの一定濃度のブロッキング抗体としてのｍＡｂ ＭＥＭ１８９又はｍＡｂ １２８．１と共にウェルをインキュベーションし、４回洗浄し、その後ブロッキングに使用しなかった方の、種々の濃度の抗体と共にＲＴで３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．１％(w/v)TWEEN 20でさらに４回洗浄後に、結合している抗体を、ＨＲＰ結合型二次抗体（Dianova, Hamburg, Germany, #109-036-097又はGE Healthcare, Freiburg, Germany, #NA9310V）（３０分、ＲＴ）及びＴＭＢ（１０分、ＲＴ）基質５０μlを用いて検出した。１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）５０μlの添加によって発色を停止し、プレートリーダーを用いて吸光度を４５０nmで測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
2014514313.tif 000005
【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014514313.tif 000010
【図８】
2014514313.tif 000011
【図９】
2014514313.tif 000012
【図１０ａ】
2014514313.tif 000013
【図１０ｂ】
2014514313.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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