(57)【要約】  本発明は、高分子ナノスフェアと１つ以上の検出剤とを含む、治療剤の送達用ナノ粒子を提供し、前記検出剤はナノ粒子の局在検出に用いられる。本発明はさらに、前述のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を提供する。
2014500266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子ナノスフェアと１つ以上の検出剤とを含むナノ粒子であって、前記１つ以上の検出剤が前記ナノ粒子の局在検出に用いられるナノ粒子。
【請求項２】
前記高分子ナノスフェアが、エポキシ官能基を含有するポリマーを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ポリマーがポリ（メタクリル酸グリシジル）（ＰＧＭＡ）を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記１つ以上の検出剤が１つ以上の表面改質剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記表面改質剤がポリカチオンである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記ポリカチオンが、ポリ（ケチミン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（グアニジニウム）、ポリ（アルキルアミン）、ポリ（アリールアミン）、ポリ（アルケニルアミン）、及びポリ（アルキニルアミン）、例えばポリ（イミダゾール）、ポリ（ピリジン）、ポリ（ピリミジン）、ポリ（ピラゾール）、ポリ（リジン）、分枝状又は線状ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（アスパルギニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（トリプトファン）、ポリ（ビニルピリジン）、カチオン性グアーガム、又は共重合体、又はこれらの混合物から選択される、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記表面改質剤がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記表面改質剤がＰＥＧ及びＰＥＧ共重合体の一方又は双方である、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記検出剤が、蛍光及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；蛍光及び陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）；蛍光及びＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；又は蛍光及びＭＲＩ及びＰＥＴ及びＣＴを用いて検出することができる１つ以上のイメージング用標識を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記イメージング用標識が酸化鉄ナノ粒子である、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記イメージング用標識がローダミンＢ（ＲｈＢ）である、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、酵素、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチド及びタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、有機小分子、有機金属小分子、核酸及びオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物、又はそのいずれかに対する抗体を含む群から選択される１つ以上の治療剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記治療剤が薬物である、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記薬物が徐放性薬物である、請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子の作製方法。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、細胞に核酸をトランスフェクトするためのトランスフェクション剤。
【請求項１７】
前記核酸が、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、小オリゴヌクレオチド又は合成オリゴヌクレオチド  核酸及びオリゴヌクレオチドが遺伝子を含む、ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡミミック、ｍｉＲＮＡインヒビター、ｐｉＲＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ断片、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖及び二本鎖核酸、天然及び合成核酸を含む群から選択される１つ以上である、請求項１６に記載のトランスフェクション剤。
【請求項１８】
前記ナノ粒子と核酸との比が約１：２０である、請求項１７に記載のトランスフェクション剤。
【請求項１９】
前記ナノ粒子と核酸との比が約１：４である、請求項１７に記載のトランスフェクション剤。
【請求項２０】
細胞、組織又は対象における表現型の変化を調節するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用。
【請求項２１】
請求項２０に記載のトランスフェクション剤の使用であって、前記トランスフェクション剤が、内因性ｍｉＲＮＡの機能を増加させることで細胞、組織又は対象における表現型の変化の検出を支援するｍｉＲＮＡミミック；又は内因性ｍｉＲＮＡの機能を低下又は消失させ、標的遺伝子の発現を増加させることにより、細胞、組織又は対象における表現型の変化を調節するｍｉＲＮＡインヒビターを含む、トランスフェクション剤の使用。
【請求項２２】
細胞、組織又は対象における遺伝子の発現を調節するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用。
【請求項２３】
請求項２２に記載のトランスフェクション剤の使用であって、前記遺伝子の発現の調節により、前記細胞、組織、又は対象における前記遺伝子のポリペプチド産物のレベルが、前記細胞、組織、又は対象内での正常な前記ポリペプチドレベルと比較して上昇、低下、又は消失する、トランスフェクション剤の使用。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載のトランスフェクション剤の使用であって、前記トランスフェクション剤が、前記対象の血液脳関門を通過して中枢神経系での遺伝子発現を調節することができる、トランスフェクション剤の使用。
【請求項２５】
請求項２３に記載のトランスフェクション剤の使用であって、前記遺伝子の発現により、腫瘍又は癌細胞における前記遺伝子のポリペプチド産物のレベルが、前記腫瘍又は癌細胞内での正常な前記ポリペプチドレベルと比較して低下又は消失する、トランスフェクション剤の使用。
【請求項２６】
細胞、又は対象の組織における望ましくないポリペプチドレベルに関連する疾患の治療用医薬の調製における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項２７】
細胞、又は対象の組織における望ましくないポリペプチドレベルに関連する疾患の治療用医薬の調製における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用。
【請求項２８】
中枢神経系における遺伝子発現を調節する医薬の調製における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用。
【請求項２９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用を含む、細胞のトランスフェクション方法。
【請求項３０】
細胞、組織又は対象における遺伝子の発現を調節する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を前記細胞、組織又は対象に導入するステップを含む方法。
【請求項３１】
前記遺伝子の発現の調節により、前記細胞、組織、又は対象における前記遺伝子のポリペプチド産物のレベルが、前記細胞、組織、又は対象内での正常な前記ポリペプチドレベルと比較して上昇、低下、又は消失する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記トランスフェクション剤が、前記遺伝子と相補的なｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含み、及び前記遺伝子のポリペプチド産物の発現が低下又は消失する、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を調製する方法。
【請求項３４】
実質的に以上に実施例３を参照して記載されるとおりの、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を調製する方法。
【請求項３５】
実質的に以上に実施例３を参照して記載されるとおりの、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むトランスフェクション剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーナノ粒子の分野に関する。より詳細には、本発明は、マルチモーダルイメージング向けの特性を備え、且つ診断剤及び治療剤の送達に適合したポリマーナノ粒子、及びトランスフェクション剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子技術は急速に現れつつある分野であり、ここ数年間で臨床応用にまで進んでいる。より効果的で個別化された治療のための新規の高分解能診断及び薬物ナノキャリアの開発に対する大きな期待が高まっている。
【０００３】
ドラッグデリバリーでは、体内の特定の場所における、且つ所定の期間にわたるバイオアベイラビリティを最大化することに焦点が置かれる。この点で、ナノ粒子のドラッグデリバリーにおける使用及び他の治療剤を送達するための使用は、薬物及び他の薬剤が目標とされる正確さで、且つ調節可能な放出時間で送達されることから、様々な疾患の実行可能な予防及び治療手段として極めて有望である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在の多機能性ナノ粒子は、概して、メソ多孔質シリカなどの非分解性生体適合性マトリックス、又はペイロードを封入するポリマーからなる。しかしながら、ドラッグデリバリーを含む応用に対して：特定の組織への制御された送達、薬物の安定性、標的到達性、組織透過性及び浸透性、免疫原性、及び標的課題（ｉｓｓｕｅ）にナノ粒子だけが蓄積することによる毒性が、現在、その幅広い臨床応用を制限する大きな課題となっている。これは、ナノ粒子により細胞毒性物質が送達される場合、特に重要である。
【０００５】
前述の背景技術の考察は、本発明の理解を促進することを目的としているに過ぎない。この考察は、参照される任意の資料が本願の優先日時点での周知の一般的知識である、又はそうであったという認識、又はその承認を示すものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
多機能性ナノ粒子の設計、特に細胞内送達又はセンシングが求められる場合のその設計において、エンドサイトーシス機構を理解することの重要性は、これまで見過ごされてきた。従って本発明者らは、これらの機構についてより深い理解を得ることにより、その設計ゆえに多機能性であり、且つマルチモーダルイメージング、薬剤送達において、並びに毒性課題を軽減する一方での細胞及び組織へのその取込みにおいて有利な本発明のナノ粒子を作製した。
【０００７】
本発明は、高分子ナノスフェアと１つ以上の検出剤とを含むナノ粒子を提供し、前記検出剤はナノ粒子の局在検出に用いられる。
【０００８】
本発明の好ましい形態において、高分子ナノスフェアのポリマーはエポキシ官能基を含む。好ましい実施形態において、ポリマーはポリ（メタクリル酸グリシジル）（ＰＧＭＡ）である。
【０００９】
ナノ粒子の検出剤は、好ましくは１つ以上の表面改質剤を含む。表面改質剤はポリカチオンを含んでもよい。ポリカチオンは、以下から選択されるポリカチオンであってもよい：ポリ（ケチミン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（グアニジニウム）（ｐｏｌｙ（ｇｕａｎｉｄｉｒｉｉｕｍ））、ポリ（アルキルアミン）、ポリ（アリールアミン）、ポリ（アルケニルアミン）、及びポリ（アルキニルアミン）、例えばポリ（イミダゾール）、ポリ（ピリジン）、ポリ（ピリミジン）、ポリ（ピラゾール）、ポリ（リジン）、分枝状又は線状ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（アスパルギニン）（ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｇｉｎｉｎｅ））、ポリ（グルタミン）、ポリ（トリプトファン）、ポリ（ビニルピリジン）、カチオン性グアーガム、又は共重合体、又はこれらの混合物。他の好ましい表面改質剤には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及び／又はＰＥＧ共重合体が含まれ得る。
【００１０】
本発明のナノ粒子の追加的又は代替的な検出剤には、１つ以上のイメージング用標識が含まれ得る。これには、以下のイメージング技術を用いて検出することのできるイメージング用標識が含まれる：蛍光及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）；蛍光及び陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）；蛍光及びＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；蛍光及びＭＲＩ及びＰＥＴ及びＣＴ。好ましいイメージング用標識は酸化鉄ナノ粒子である。別の好ましいイメージング用標識は蛍光色素であり、その非限定的な例はローダミンＢ（ＲｈＢ）である。
【００１１】
本発明の好ましい形態において、ナノ粒子は治療剤を含む。ナノ粒子は、以下を含む群から選択される１つ以上の治療剤を含み得る：ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、酵素、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、徐放性薬物を含む薬物、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチド及びタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、有機小分子、有機金属小分子、核酸及びオリゴヌクレオチド、上記の物質のいずれかの代謝産物又はそのいずれかに対する抗体。
【００１２】
本発明はさらに、細胞に核酸をトランスフェクトするためのトランスフェクション剤であって、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を提供する。トランスフェクトされ得る核酸は、以下を含む群からの１つ以上であってもよい：プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、小オリゴヌクレオチド又は合成オリゴヌクレオチド  核酸及びオリゴヌクレオチドが遺伝子を含む、ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡミミック、ｍｉＲＮＡインヒビター、ｐｉＲＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ断片、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖及び二本鎖核酸、天然及び合成核酸。本発明の好ましい形態において、トランスフェクション剤中におけるナノ粒子と核酸との比は約１：２０である。別の形態では、トランスフェクション剤中におけるナノ粒子と核酸との比は約１：４である。
【００１３】
本発明は、細胞、組織又は対象における表現型の変化を調節するための、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用を提供する。トランスフェクション剤は、内因性ｍｉＲＮＡの機能を増加させることで細胞、組織又は対象における表現型の変化の検出を支援するｍｉＲＮＡミミック；又は内因性ｍｉＲＮＡの機能を低下又は消失させ、標的遺伝子の発現を増加させることにより、細胞、組織又は対象における表現型の変化を調節するｍｉＲＮＡインヒビターを含み得る。
【００１４】
本発明はまた、細胞、組織又は対象における遺伝子の発現を調節するための、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用も提供する。遺伝子の発現の調節には、細胞、組織、又は対象における遺伝子のポリペプチド産物のレベルを、その細胞、組織、又は対象内での正常なポリペプチドレベルと比較して上昇、低下、又は消失させることが含まれる。本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を用いて遺伝子の発現を低下又は消失させ、ひいては腫瘍又は癌細胞における遺伝子のポリペプチド産物のレベルを、その腫瘍又は癌細胞内での正常なポリペプチドレベルと比較して低下又は消失させることができる。或いは、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を用いて対象の血液脳関門を通過させることにより、中枢神経系での遺伝子発現を調節することができる。
【００１５】
本発明は、細胞、又は対象の組織における望ましくないポリペプチドレベルに関連する疾患の治療用医薬の調製における、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子の使用を提供する。
【００１６】
本発明はまた、細胞、又は対象の組織における望ましくないポリペプチドレベルに関連する疾患の治療用医薬の調製における、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用も提供する。一例において、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤は、癌又は腫瘍の治療用医薬の調製において用いられる。
【００１７】
本トランスフェクション剤を用いてトランスフェクトすることのできる細胞は、対象における、培養物又は個々の細胞における様々な異なる細胞型であり得る。
【００１８】
本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の使用を含む、細胞のトランスフェクション方法も提供する。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞、組織又は対象における遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、細胞、組織又は対象に、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を導入するステップを含む。この方法では、遺伝子の発現の調節により、細胞、組織、又は対象における遺伝子のポリペプチド産物のレベルが、その細胞、組織、又は対象内での正常なポリペプチドレベルと比較して上昇、低下、又は消失し得る。一例において、本発明は、細胞での遺伝子の発現を低下又は消失させる方法を提供し、これは、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を細胞にトランスフェクトするステップを含み、ここでトランスフェクション剤は、遺伝子からのタンパク質産物の発現を低下又は消失させる（別様に周知されるところの「サイレンスする」）ことができる遺伝子と相補的なｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含む。
【００２０】
本発明はさらに、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の調製及び作製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】蛍光超常磁性ナノスフェアをエマルション経路により調製し、ＰＧＭＡの反応性エポキシ基を使用してＰＥＩを固定化した。（ａ）酸化鉄ナノ粒子を含む蛍光ＰＧＭＡ  ＲｈＢナノスフェアに対するＰＥＩの連結の概略図。（ｂ）高温分解により調製した酸化鉄（磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子（スケールバー＝１００ｎｍ）。（ｃ）高分子ナノスフェアの低倍率像（スケールバー＝５００ｎｍ）。（ｄ）ポリマーシェル内の酸化鉄ナノ粒子の分布を示す個々のポリマーナノスフェア（スケールバー＝２０ｎｍ）。（ｅ）ＰＥＩによる修飾前（白色）及び修飾後（黒色）の粒度分布（左側のパネル）及びゼータ電位分布（右側のパネル）。
【図２】（ａ）ＰＣ１２細胞におけるナノスフェアの最大値投影；（ｂ）蛍光により定量化するときの経時的なＰＣ１２培養物におけるナノスフェアの取込み；（ｃ）ＰＣ１２細胞によるナノスフェア取込みの共焦点像、パネルは、時点（左から右に）０、０．５、１、２、３、６、１２、１８、２４時間において記録された、（上から下に）ＤＩＣ、蛍光及びオーバーレイ像を示す（スケールバー２０μｍ）；
【図３】ＰＥＩ修飾高分子ナノスフェア（１０μｇ  ｍＬ−１）は急速にインターナライズされる。（ａ）ＰＣ１２細胞における７２時間後のナノスフェアの共焦点最大値投影（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；青色（グレースケールでは灰色）＝ヘキスト、核；ＤＩＣオーバーレイ；４０×／１．２５、スケールバー＝２０μｍ）。（ｂ）ｒＭＣ−１細胞における２４時間後のナノスフェア取込みの落射蛍光像（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；青色（グレースケールでは灰色）＝ヘキスト、核；２０×／０．５０、スケールバー＝１００μｍ）。（ｃ）共焦点顕微鏡法で見た、ナノスフェアと２４時間インキュベートした後の海馬ニューロン（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；緑色（グレースケールでは濃い灰色）＝β−ＩＩＩ−チューブリン／Ａｌｅｘａ  ４８８、ニューロン；青色（グレースケールでは薄い灰色）＝ヘキスト、核；６０×／１．４９、スケールバー＝５μｍ）。（ｄ）ナノスフェアと２４時間インキュベートした後の皮質ニューロンの共焦点像（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；緑色（グレースケールでは濃い灰色）＝β−ＩＩＩ−チューブリン／Ａｌｅｘａ  ４８８、ニューロン；青色（グレースケールでは薄い灰色）＝ヘキスト、核；６０×／１．４９、スケールバー＝５μｍ）。（ｅ）ＰＣ１２細胞によるナノスフェアのインターナリゼーションを示す共焦点タイムラプス実験の一領域のフレーム（０、０．５、１、２、３、６、９、１２、１８、２４時間）（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；ＤＩＣオーバーレイ；２０×／０．７５、スケールバー＝１０μｍ）。（ｆ）ＲｈＢ蛍光により定量化した経時的なＰＣ１２細胞におけるナノスフェア取込み。
【図４】細胞試料中の鉄を特定するＥＦＴＥＭによる元素マッピング、ナノスフェアの局在が明らかになる；
【図５】ＰＥＩ修飾ポリマーナノスフェア（全調製で１０μｇ  ｍＬ−１）を様々な時間点でＴＥＭにより可視化し、インターナリゼーション及び区画化における段階を示す。（ａ）マクロピノサイトーシス様経路によるナノスフェアのエンドサイトーシス（ナノスフェアは矢印で指示される；スケールバー＝１００ｎｍ）。（ｂ）見かけ上クラスリン非依存性及びカベオリン非依存性であるエンドサイトーシス（ナノスフェアは矢印で指示され、及びインターナライズされた粒子が矢印の頭で指示される；スケールバー＝２００ｎｍ）。（ｃ）細胞内輸送における段階を示す時系列。左から右に、３時間目、ナノスフェアがインターナライズされている；６時間目、ナノスフェアは緩いクラスターを形成する；１２時間目、他の膜結合小胞と連係するようになる；及び２４時間目、多重膜に拘束されてクラスター状に局在している（見やすいようにナノスフェアの輪郭を描いている；矢印は、ナノスフェアを取り囲む多重膜を示す；スケールバー＝１００、１００、２００、１００ｎｍ）。（ｄ）７２時間後、ナノスフェアは離散したクラスター状に配置され、その多くが多重膜によって取り囲まれている（矢印は、ナノスフェアクラスターを取り囲む多重膜を指示する；矢印の頭は、見かけ上融合過程にある膜を指示し、挿入図に拡大している；スケールバー＝２００ｎｍ）。（ｅ）ナノスフェアと７２時間インキュベートした後の３画像から作成した全細胞断面。断面全体にわたり、細胞表面にあるナノスフェア（矢印の頭）、及びクラスター状のナノスフェア（矢印）を確認できる（擬似カラー像；スケールバー＝１μｍ）。
【図６】ナノスフェア中の鉄含量の関数としての蛍光の線形フィット、遊離ナノスフェアの標準試料（白色記号）及び細胞試料中のナノスフェア（黒色記号）を含む。
【図７】蛍光超常磁性ナノスフェアをエマルション経路により調製し、ＰＧＭＡの反応性エポキシ基を使用してＰＥＩを固定化した。（ａ）酸化鉄ナノ粒子を含む蛍光ＰＧＭＡ  ＲｈＢナノスフェアに対するＰＥＩの連結の概略図。（ｂ）高温分解により調製した酸化鉄（磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子（スケールバー＝１００ｎｍ）。（ｃ）高分子ナノスフェアの低倍率像（スケールバー＝５００ｎｍ）。（ｄ）ポリマーシェル内の酸化鉄ナノ粒子の分布を示す個々のポリマーナノスフェア（スケールバー＝２０ｎｍ）。（ｅ）ＰＥＩによる修飾前（白色）及び修飾後（黒色）の粒度分布（左側のパネル）及びゼータ電位分布（右側のパネル）。
【図８】ＰＥＩ修飾高分子ナノスフェア（１０μｇ  ｍＬ−１）は急速にインターナライズされる。（ａ）７２時間後のＰＣ１２細胞におけるナノスフェアの共焦点最大値投影（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；青色（グレースケールでは灰色）＝ヘキスト、核；ＤＩＣオーバーレイ；４０×／１．２５、スケールバー＝２０μｍ）。（ｂ）ｒＭＣ−１細胞における２４時間後のナノスフェア取込みの落射蛍光像（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；青色（グレースケールでは灰色）＝ヘキスト、核；２０×／０．５０、スケールバー＝１００μｍ）。（ｃ）共焦点顕微鏡法で見た、ナノスフェアと２４時間インキュベートした後の海馬ニューロン（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；緑色（グレースケールでは濃い灰色）＝β−ＩＩＩ−チューブリン／Ａｌｅｘａ  ４８８、ニューロン；青色（グレースケールでは薄い灰色）＝ヘキスト、核；６０×／１．４９、スケールバー＝５μｍ）。（ｄ）ナノスフェアと２４時間インキュベートした後の皮質ニューロンの共焦点像（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；緑色（グレースケールでは濃い灰色）＝β−ＩＩＩ−チューブリン／Ａｌｅｘａ  ４８８、ニューロン；青色（グレースケールでは薄い灰色）＝ヘキスト、核；６０×／１．４９、スケールバー＝５μｍ）。（ｅ）ＰＣ１２細胞によるナノスフェアのインターナリゼーションを示す共焦点タイムラプス実験の一領域のフレーム（０、０．５、１、２、３、６、９、１２、１８、２４時間）（赤色（グレースケールでは白色）＝ＲｈＢ、ナノスフェア；ＤＩＣオーバーレイ；２０×／０．７５、スケールバー＝１０μｍ）。（ｆ）ＲｈＢ蛍光により定量化した経時的なＰＣ１２細胞におけるナノスフェア取込み。
【図９】リラクソメトリーは、ＰＣ１２細胞におけるＰＥＩ修飾高分子ナノスフェアの区画化の効果を示す。全てのパネルにおいて、黒色の点は遊離ナノスフェアを表し、白色の点は細胞が結合したナノスフェアを表す。（ａ）遊離ナノスフェアと比較したときの細胞が結合したナノスフェアのｒ２の低下。（ｂ）ナノスフェアのインターナリゼーション後のｒ１の低下。（ｃ）Ｒ２緩和率に対するエコー間隔（ＴＥ）の効果。上側のパネル：短いＴＥ（三角）及び長いＴＥ（星）を用いる遊離ナノスフェアについて同様のｒ２値。下側のパネル：細胞内で区画化されたナノスフェアは、短い（三角）及び長い（星）エコー時間計測間でｒ２の倍加を示す。（ｄ）区画化された粒子（白色）は、遊離粒子（黒色）と比較してｒ１の磁場に対する依存が低下。
【図１０】ＰＥＩ修飾を有する及び有しないナノスフェア（ＬＮＰ±ＰＥＩ）からの経時的なロメリジン放出。黒色記号はｐＨ５における放出を示し、白色記号はｐＨ６における放出を示す。いずれの場合にも、ｐＨ７．４ではＨＰＬＣによりロメリジンの放出は検出できなかった（図示せず）。ａ）修飾を有しないナノスフェアからの放出（ＬＮＰ−ＰＥＩ）。ｂ）ＰＥＩ修飾を有するナノスフェアからの放出（ＬＮＰ＋ＰＥＩ）。エラーバーは標準誤差を示す。
【図１１】グルタミン酸塩誘発後、ナノスフェアを用いて送達されるロメリジンで処理した細胞では細胞内カルシウム濃度が低下する。ａ）ＰＥＩで修飾されたナノスフェア（ＬＮＰ＋ＰＥＩ）を用いて送達されるロメリジン及び１μＭ遊離薬物はいずれも、グルタミン酸塩に曝露後（１０ｍＭ、２４時間）、同程度の細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの低下を生じた。ロメリジンを負荷したＰＥＩ修飾のないナノスフェア（ＬＮＰ−ＰＥＩ）はロメリジンを放出せず、従ってグルタミン酸傷害後の［Ｃａ２＋］ｉの低下はない。統計的有意性はいずれも対ＥＮＰ（ビヒクル）である；＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの事後補正を使用。ｂ）ＬＮＰ＋ＰＥＩ又はＥＮＰのいずれかでナノスフェアを処理し、且つグルタミン酸塩に２４時間曝露した後の単一のＰＣ１２細胞において記録されたＦｕｒａ−２蛍光比（Ｒ＝Ｆ３４０／Ｆ３８０）の差を示す代表的なトレース；５分でイオノマイシンを添加し、続く［Ｃａ２＋］ｉの上昇からＲｍａｘを決定した。
【図１２】ＤＮＡ結合及び遅延アッセイ。様々な濃度のＰＥＩＮＰを含む一定濃度のオリゴ及びベクターＤＮＡを、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２と室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ−（ＰＧＭＡ−ＰＥＩ−ナノ粒子）（ＰＥＩＮＰ）を０．８％アガロースゲルで分析した。ＤＮＡ対照及びＰＥＩＮＰ対照と比較したときのそれぞれ１：０．４及び１：２５における（ａ）はオリゴを表し、及び（ｂ）はベクターＤＮＡの遅延を表す。
【図１３】付着、半付着及び非付着細胞株におけるリポフェクタミン（ａ〜ｆ）のＰＥＩＮＰ（ｇ〜ｌ）によるトランスフェクション効率の比較。ＰＥＩＮＰ−ＤＮＡ（１：２０）及びリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体を使用して、上述の細胞株をトランスフェクトした。ローダミン及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を蛍光顕微鏡下に倍率６３倍で観察した。
【図１４】ＰＥＩＮＰのトランスフェクション効率を、ＦＡＣＳを用いてＨＥＫ２９３細胞株で確認した。ローダミンを有する及び有しないＰＥＩＮＰを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、４８時間後に細胞と連結したローダミン並びにＧＦＰ発現を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により分析した。（ａ）は、対照細胞のヒストグラムプロットを表す。（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれローダミンを有する及び有しないＰＥＩＮＰをトランスフェクトした細胞の密度プロットを表す。
【図１５】ＰＥＩＮＰ−マイクロＲＮＡトランスフェクション後の種々の細胞株（ａ．ＨＥＫ２９３、ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びｃ．ジャーカット）における標的遺伝子ノックダウン及び回復の分析。４８時間後、トランスフェクト細胞を、免疫細胞化学、ｑ−ｐｃｒ及びウエスタン分析用に処理した。β−アクチンを負荷対照として使用した。抗ウサギａｌｅｘａ  ４８８を使用し、共焦点顕微鏡法を用いて６３倍で撮像した。
【図１６】ＰＥＩＮＰ−ｓｈＲＮＡトランスフェクション後の種々の細胞株（ａ．ＨＥＫ２９３、ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びｃ．ジャーカット）におけるハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）ノックダウンの分析。４８時間後、トランスフェクト細胞を、免疫細胞化学、ｑ−ｐｃｒ及びウエスタン分析用に処理した。β−アクチンを負荷対照として使用した。抗ウサギａｌｅｘａ  ６３３を使用し、共焦点顕微鏡法を用いて６３倍で撮像した。
【図１７】ＰＥＩＮＰ−ｓｈＲＮＡトランスフェクション後の種々の細胞株（ａ．ＨＥＫ２９３、ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びｃ．ジャーカット）における癌遺伝子（Ｃ−ｍｙｃ）ノックダウンの分析。４８時間後、トランスフェクト細胞を、免疫細胞化学、ｑ−ｐｃｒ及びウエスタン分析用に処理した。β−アクチンを負荷対照として使用した。抗ウサギａｌｅｘａ  ４８８を使用し、共焦点顕微鏡法を用いて６３倍で撮像した。
【図１８】ＰＥＩＮＰ及びＰＥＩＮＰ−ｃ−ｍｙｃ−ｓｈＲＮＡを注入したマウスのイメージング。（ａ）マルチスペクトルイメージング（Ｘ線像と合成）は、ローダミンが注入された腫瘍に封じ込められ、他のいかなる臓器にもないことを示す。（ｂ）ＰＥＩＮＰの注入４８時間後における腫瘍の生体内軸方向及び矢状方向イメージング（赤色の丸印は、腫瘍の中心部壊死に対するＰＥＩＮＰの浸透を指示する）。（ｃ）腫瘍の中心部及び辺縁部の全体にわたるＰＥＩＮＰの体内分布を示す共焦点イメージング。
【図１９】乳癌マウスモデルの腫瘍退縮及び生存：腫瘍にＰＥＩＮＰ−Ｃ−Ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡ複合体を注入したところ、未処置マウスモデルと比較して腫瘍サイズの縮小及び生存の延長が有意に生じた。Ｃ−Ｍｙｃ転写物及びタンパク質レベルをそれぞれＱ−ＰＣＲ及び免疫組織化学で定量化し、ここでＣ−Ｍｙｃのレベルは、未処置の腫瘍マウスモデルと比較したとき、極めて有意な低さであった。
【図２０】結腸癌マウスモデルにおけるＰＥＩＮＰの経口送達及び滞留。経口送達の４８時間後、結腸癌マウスモデルの腸におけるＰＥＩＮＰ及びＰＥＩＮＰ＋ＤＮＡ（ＧＦＰ）の局在を特定するため、共焦点顕微鏡法を実施した。これに伴い、結腸で９５％のＰＥＩＮＰ蓄積が観察された。この図のＤＮＡ−ＧＦＰパネルに示されるとおり、ＧＦＰ発現もまた観察された。
【図２１】ヘキスト染色した線状ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡのエンブリオフェクション（ｅｍｂｒｙｏｆｅｃｔｉｏｎ）を、マウス胚においてＰＥＩＮＰを使用して実施した。ＰＥＩＮＰと複合体化したヘキストサテン（ｓａｔｉｎ）で染色したこれらのＤＮＡを、単細胞の段階のマウス胚と共に、胚がエキソビボで４細胞段階に成長するまでインキュベートし、共焦点顕微鏡下に観察した。これらの実験は、インキュベートしていない胚と比較したヘキストパネル及びＧＦＰパネルで明らかなとおり、ＤＮＡが送達された胚にＰＥＩＮＰが効率的に結合できたことを示している。これらの画像は１０倍で取得し、３倍で精査して胚内部へのＰＥＩＮＰ及びＤＮＡの局在化を確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
概要
当業者は、本明細書に記載される発明が、具体的に記載されるもの以外の変形例及び改良例を許容することを理解するであろう。本発明は、かかる変形例及び改良例を全て包含する。本発明はまた、本明細書で参照又は指示される全てのステップ、特徴、配合及び化合物を、個々に、又はまとめて包含し、並びにステップ又は特徴のあらゆる組み合わせ又は任意の２つ以上を包含する。
【００２３】
本発明が、本明細書に記載される具体的な実施形態のいずれかによって範囲を限定されることはない。これらの実施形態は、あくまでも例示を目的としたものであることが意図される。機能的に等価な生成物、配合及び方法は、明らかに本明細書に記載されるとおりの本発明の範囲内にある。
【００２４】
本明細書に記載される発明は、値（例えばサイズ、濃度等）の範囲を１つ以上含み得る。値の範囲は、その範囲を定義する値を含め、その範囲内の全ての値、及びその範囲の境界を定義する当該の値の直近の値と同じ又は実質的に同じ結果をもたらすその範囲に近接する値を含むことが理解され得る。
【００２５】
本明細書全体を通じて、文脈上特に必須でない限り、語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、示される完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）又は完全体群の包含を含意し、しかし任意の他の完全体又は完全体群の除外を含意するものではないことが理解されるであろう。
【００２６】
本明細書で使用される特定の用語に関する他の定義は、本発明の詳細な説明の中に見出すことができ、全体を通じて適用され得る。特に定義しない限り、本明細書で使用される他の科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００２７】
本文に含まれる情報に対する参照は、その資料又は情報が周知の一般的知識の一部であったこと、又はオーストラリア若しくは任意の他の国において公知であったことを認めるものとして理解されてはならない。
【００２８】
ここで、以下の非限定的な説明及び例を参照しながら、本発明の特徴を考察する。
【００２９】
本発明の第１の態様において、本発明は、高分子ナノスフェアと１つ以上の検出剤とを含むナノ粒子を含み、ここで前記１つ以上の検出剤は、ナノ粒子の局在検出に用いることができる。好ましい実施形態において、高分子ナノスフェアは、エポキシ官能基を含有するポリマーを含む。さらに好ましい実施形態において、ポリマーはポリ（メタクリル酸グリシジル）（ＰＧＭＡ）である。
【００３０】
複数のエポキシ基を含み、且つ少なくとも約２０００の分子量を有するポリマーを使用して本発明のナノ粒子を調製することができる。加えて、ポリマーを架橋して、粒子全体にわたりさらなるエポキシ官能性を含む架橋ポリマーナノ粒子を形成することができる。一実施形態において、ポリマーは、ポリマー上のエポキシ基と架橋することができる。例えば、ポリマー上のエポキシ基の約１０％〜約４０％を利用してポリマーを架橋することができる。好ましくは、ナノスフェアの調製に用いるポリマーは、Ｍｗ２００〜３００ｋＤａ（公称２５０ｋＤａ）を有する。
【００３１】
好ましくは、ナノスフェアの直径は９０ｎｍ〜２６０ｎｍであり、Ｚ平均直径が約１７０ｎｍである。
【００３２】
本発明のナノ粒子は、同じ種類の１つ以上の検出剤を含む。ナノ粒子はまた、１つ以上の異なる検出剤を含んでもよい。本発明の一実施形態において、１つ以上の検出剤は表面改質剤である。
【００３３】
ナノ粒子の表面特性は、有効な治療法を開発するための、ナノ粒子の細胞との相互作用の結果を決定する重要な役割を果たす。粒子表面に存在するエポキシ基は、多種多様な条件下で高度な反応性を有し得る。例えば、エポキシは、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、又は無水物官能基のいずれとも、様々な条件下で反応することができる。そのため、本発明のエポキシ含有ポリマーは、利用可能な官能性を介して他の表面に容易に結合することができる。本発明のナノ粒子の表面は、例えば、とりわけ、治療剤、標的リガンド又はペイロード、例えば抗体、酵素、ペプチド、核酸、葉酸、細胞取込みに合わせて調整するための特異的ポリマー、及び特定の官能基を導入する特異的分子を固定化するための汎用的なプラットフォームとして機能する。
【００３４】
一実施形態において、ナノスフェア表面改質剤はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩは、高分子ナノスフェアの表面特性を変えて正電荷を誘導することができる。第２の実施形態において、ナノスフェア表面改質剤はＰＥＧである。ＰＥＧは、高分子ナノスフェアの表面特性を変えて、それによりナノ粒子の、例えばヒトなどの生物の体内における循環時間がインビボで延長され得るようにすることができる。
【００３５】
本発明のナノ粒子の１つ以上の検出剤は、１つ以上のイメージング用標識を含み得る。前記イメージング用標識はイメージング技術を用いて認識し得る。前記イメージング技術は医用イメージング技術を含み、とりわけ、Ｘ線撮影及び検査放射線科学、核医学、内視鏡検査、医用サーモグラフィー、医用写真撮影、顕微鏡法、及びより具体的には、いくつかの非限定的な例として、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、電子顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、Ｘ線断層撮影、ルミネセンス（光学イメージング）、超音波、及び脳磁図（ＭＥＧ）を挙げることができる。
【００３６】
多くの場合に、診断、前臨床研究及び治療モニタリングを改善するため、２つ以上のイメージング技術を用いることにより各々の長所を統合すると同時に、個々の技術の制約を克服することが必要である。しかしながら、これらの技術はそれぞれ、追跡を可能にし、又はコントラストを改善するために、典型的には異なる薬剤を投与する必要があるため、２つ以上のイメージング技術を用いると、それに要する時間、費用が増し、診断プロセスが複雑化し得る。従って、本明細書に記載されるとおり、本発明のナノ粒子を、１つ以上のイメージング用標識を含み得るように作製した。これらのイメージング用標識により、イメージング技術を用いて、例えば細胞、生物組織における、又は生体内におけるナノ粒子の局在を決定することが可能になる。かかるイメージング技術は、本発明のナノ粒子に組み込まれるイメージング用標識に従い選択され得る。複数のイメージング用標識の利点は、個々の技術によって提供される利点を活用することにより、異なる長さスケールのデータに加えて、画像のより高い分解能がもたらされることである。
【００３７】
本発明のナノ粒子に組み込まれ得るイメージング用標識としては、とりわけ、磁性種、放射性核種又は放射標識化合物、放射性ナノ粒子、タンパク質、抗体、抗原、蛍光色素、量子ドット、又は治療剤を挙げることができる。
【００３８】
一実施形態において、イメージング用標識は、酸化鉄、その例として磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）であり、特に酸化鉄のナノ粒子である。酸化鉄は、ＭＲＩのＴ２強調像で陰性造影剤として用いられ得る。従って、本発明のナノ粒子が酸化鉄のイメージング用標識を含む場合、ＭＲＩを用いてインビボで（すなわち、例えば生物体内にある間に）ナノ粒子の局在を決定又は追跡することができる。
【００３９】
本発明のナノ粒子におけるイメージング用標識として使用される酸化鉄ナノ粒子は、オレイン酸、オレイルアミン、及び１，２−テトラデカンジオール又は１，２−ヘキサデカンジオールの存在下におけるＦｅ（ａｃａｃ）３の高温分解によって生成されてもよい。
【００４０】
本発明のナノ粒子に複数の酸化鉄ナノ粒子を組み込むことは、それによりナノ粒子の緩和特性（Ｒ２）を高め、ＭＲＩを用いた医用イメージングのより高いコントラスト及びより良好な感度をもたらすことができる点で有益であり得る。本発明の目的上、酸化鉄ナノ粒子の好ましいサイズは直径約４〜１２ｎｍである。
【００４１】
別の実施形態において、イメージング用標識はローダミンＢ（ＲｈＢ）である。ＲｈＢは、反応性カルボン酸基を含む蛍光色素であり、反応性カルボン酸基は、本発明のポリマーナノ粒子への色素の結合を可能にする重要な構造的特徴である。
【００４２】
ＲｈＢは、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光相関分光法及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む技法を用いて検出し得る。ＲｈＢは、本発明のポリマーナノ粒子に共有結合的に結合する。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書に記載されるナノ粒子は、ナノスフェア表面改質剤ＰＥＩ及びＰＥＧと、イメージング用標識ＲｈＢ及び酸化鉄ナノ粒子とを含む。かかるナノ粒子は、生物学的センシング及び分離において有用であり、特にそうしたナノ粒子が抗体などの結合性タンパク質の結合により修飾される場合には、さらに高い標的特異性が得られる。
【００４４】
本発明は、薬剤を送達するように適合された本明細書に記載されるナノ粒子をさらに含む。前記薬剤は様々な治療剤又は診断剤を含み得る。治療剤には薬物が含まれてもよく、従って本発明のナノ粒子はドラッグデリバリーシステムとして用いられ得る。これには徐放性ドラッグデリバリーシステムが含まれてもよく、又はナノ粒子は、細胞、生物組織又は生体内の特定の標的部位に薬物を送達するように適合されてもよい。従って、本発明のナノ粒子は、ヒト及び動物における疾患の治療的処置に用いられ得る。これは、薬物による治療的処置が治療効果を生じるために高い常用量を必要とする場合、特に有益であり得る。本発明のナノ粒子を使用すると、標的とする治療部位において長期間の制御された薬物放出を提供することができる。
【００４５】
本発明のナノ粒子により送達され得る他の薬剤には、一部の非限定的な例では、小分子薬物、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及び／又は腫瘍の熱治療用ナノ粒子が含まれる。
【００４６】
ナノ粒子の高分子的性質により、治療剤及び薬物の捕捉が可能になる。薬物は、ナノスフェアの作製に用いられる混合物中に含められ、乳化中にポリマーが沈殿するに従い、薬物が緩く凝集した高分子鎖の内部に捕捉されるようになる。しかしながら、薬物は構造に永久的には結合せず、続いて捕捉された薬物がナノスフェアから周囲媒体中に拡散することにより放出され得る。
【００４７】
本発明はさらに、表面改質剤による表面修飾、イメージング技術を用いて認識することができる１つ以上の標識を含む本明細書に記載されるナノ粒子を提供し、これは薬剤を送達するように適合され、従って、イメージングと治療とに同時に用いることができるポリマーナノ粒子が提供される。
【００４８】
本発明の一形態において、本明細書に記載されるナノ粒子は、ナノスフェア表面改質剤ＰＥＩ及び／又はＰＥＧと、イメージング用標識ＲｈＢ及び酸化鉄ナノ粒子とを含み、且つ治療剤を送達するように適合される。好ましくは、治療剤は薬物である。
【００４９】
本発明はさらに、本明細書に記載されるナノ粒子の作製方法を提供する。この方法は、乳化剤又は界面活性剤の存在下で非水溶性成分を含有する有機相を水で乳化することを含む。好ましくは、この方法は改良型の非自発的ナノ沈殿であり、溶媒又は溶媒混合物が有機相として使用される。
【００５０】
本発明はさらに、本明細書に記載されるナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。
【００５１】
本発明はまた、本明細書に記載される前記ナノ粒子を使用して製造される医薬及び前記医薬を介して投与される本明細書に記載される前記ナノ粒子の治療有効量を使用した、ヒトを含む動物の治療方法にも関する。
【００５２】
本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子は、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリア、並びに任意の所望の賦形剤又は医薬の調製に一般的に使用される他の同様の作用剤と組み合わされてもよい。
【００５３】
本発明はさらに、好ましくはトランスフェクション効率が高く、導入される細胞に対するナノ粒子の細胞毒性が全く又は最小限しかない、本明細書に記載されるとおりの本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を提供する。この点で、本発明のナノ粒子を含む前記トランスフェクション剤は、細胞への生体分子の送達に用いることができる。より具体的には、本発明のナノ粒子を含む前記トランスフェクション剤は、様々な核酸、とりわけ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、小オリゴヌクレオチド又は合成オリゴヌクレオチド  核酸及びオリゴヌクレオチドが遺伝子を含む、ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡミミック、ｍｉＲＮＡインヒビター、ｐｉＲＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ断片、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖及び二本鎖核酸、天然及び合成核酸などを細胞に送達することができる。
【００５４】
一つの非限定的な例では、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤において、ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの比は好ましくは約１：２〜１：６である。より好ましくは、ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの比は約１：４である。別の例では、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤において、ナノ粒子と核酸との比は好ましくは約１：１５〜１：２５である。より好ましくは、ナノ粒子と核酸との比は約１：２０である。
【００５５】
本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤は、前述の核酸を、付着細胞、半付着細胞、非付着細胞、組織、又は対象へと、特にウイルス形質導入と同等のトランスフェクション効率で送達するのに用いられ得る。
【００５６】
従って本発明は、細胞、組織又は対象における遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を細胞、組織又は対象に導入するステップを含む。遺伝子の発現の調節には、遺伝子の下方制御又は「サイレンシング」により、細胞、組織、又は対象における遺伝子のポリペプチド産物の発現を、その細胞、組織、又は対象内での正常なポリペプチドレベルと比較して低下させること、又は阻止することが含まれ得る。細胞、組織又は対象における表現型の変化をより容易に検出するため、ｍｉＲＮＡミミックを使用して特定の内因性ｍｉＲＮＡの機能を増加させてもよい。或いは、ｍｉＲＮＡインヒビターを使用して、特定の内因性ｍｉＲＮＡの機能を低下又は消失させ（抑制し）、標的遺伝子の発現を増加させ、及び細胞、組織又は対象における表現型の発現を低下又は減弱させてもよい。
【００５７】
一つの非限定的な例では、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤は適切な作用部位に特異的であってもよく、これには治療利益等を有する核酸の腫瘍細胞又は固形腫瘍への送達が含まれ得る。従って、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤は、対象における癌又は腫瘍などの特定の場所への、又は結腸などの臓器への核酸の輸送、それによる他の組織又は臓器の損傷の回避、制御された濃度−時間送達プロファイルによる特定の場所での核酸の放出を提供し得るとともに、標的遺伝子のさらなる発現を効率的に停止させることができる。
【００５８】
さらに、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤はまた、機能性遺伝子を標的化してサイレンシングするためのｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡなどの核分子のキャリアとしても用いられ得る。一つの非限定的な例では、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤及び遺伝子ｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡなどの核酸を使用することにより、当該技術分野において特定の癌で発現が制御されない又は発現が過剰であることが知られるｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を下方制御することができた。本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を使用することの利益は、ナノ粒子の超常磁性コアによりもたらされるハイパーサーミアであり、これはトランスフェクション効力の増加及び腫瘍の中心部壊死への効率的な核酸送達に役立ち得る。別の例では、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤が胚に送達され、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスが作り出され得る。
【００５９】
或いは、遺伝子の発現の調節には、細胞、組織、又は対象内での正常なポリペプチドレベルと比較したときの、遺伝子の発現増加によるその細胞、組織、又は対象での遺伝子のポリペプチド産物の発現増加が含まれ得る。一つの非限定的な例では、これは、細胞へのｍｉＲＮＡミミック及びインヒビターの使用による特定の表現型の誘導又は阻害を含み得る。この点で、ｍｉＲＮＡミミックは、表現型の変化の検出を容易にするため、内因性ｍｉＲＮＡの機能を増強する。逆にｍｉＲＮＡインヒビターは、内因性ｍｉＲＮＡの機能の抑制し、標的遺伝子の発現を増加させ、及び表現型の発現を減弱させる。別の例では、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤を用いて血液脳関門を通過させることにより、中枢神経系における遺伝子発現を調節し得る。
【００６０】
本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤は、これらのナノ粒子を例えば共焦点イメージングを用いて可視化する目的で、ローダミンなどのマーカー、又は本明細書に記載されるとおりの別のマーカーで標識され、又はそれと「連結」されてもよい。
【００６１】
本発明はさらに、本発明のナノ粒子を含むトランスフェクション剤の調製方法を提供する。
【実施例】
【００６２】
実施例１．本発明のナノ粒子の調製及び特性決定
結果及び考察
共有結合反応及び非自発乳化によるナノスフェアの調製
磁気蛍光ポリマーナノスフェアの調製では、高温分解により合成した酸化鉄ナノ粒子（図１ｂ）及び予成形されたポリマーを使用した。ナノ粒子合成では静電引力が用いられ得るが、かかる結合は可逆で、結像部分が脱離する可能性がある。従って、表面改質剤及び色素は共有結合によって結合することが好ましかった。ＰＧＭＡは親油性ポリマーで、そのエポキシ基は様々な求核試薬に対して反応性を有するため、単純な開環反応を用いることでポリマーとの共有結合が可能であった。反応性エポキシ基の大部分は、ナノスフェアの形成後には接触できなくなると思われるため、ＲｈＢは液相反応でポリマーに連結してもよい。ＲｈＢは、上記に記載したとおりの反応性カルボン酸基を含むキサンテン色素であり、反応性カルボン酸基は色素のポリマーへのグラフトを可能にする重要な特徴である。修飾ポリマーを使用して、ポリマーナノ粒子をナノ沈殿技術の改良法を用いて調製し（図１ｃ、図１ｄ）、ここでは色素修飾ポリマーと酸化鉄ナノ粒子との有機溶液を界面活性剤の存在下で水中に乳化した。酸化鉄ナノ粒子及び修飾ポリマーが存在するということは、すなわち自発乳化が起こり得ないことを意味した。従って、水と非混和性の溶媒（ＣＨＣｌ３）を部分的に水溶性の溶媒（ＭＥＫ）と併せて使用した。これによりＭＥＫが水相中に拡散し、有機相の過飽和が確実となることで、乳化プロセスが促進されるものと思われた。
【００６３】
次にナノ粒子に表面修飾を加えた。一般に、正の表面を有するナノ粒子は非特異的に取り込まれ、これは、カチオン性ポリマーが細胞膜の負電荷種と相互作用し、液相性又は受容体介在性エンドサイトーシスによる細胞取込みを促進するためである。従って、次にナノスフェアを水中のＰＥＩと反応させると、ここでもエポキシ基の開環により、ＰＥＩとナノ粒子表面との共有結合が生じた。ポリマーの架橋はある程度までは合成手順中に起こると予想されるが、残存するエポキシ基の加水分解が可能であり、しかしながらそれは行わなかった。過剰なポリマー及び全ての非磁性ナノスフェアを除去するため、修飾したポリマーナノスフェアを、被覆された鉄ビーズを充填した磁気分離カラムに通すことによって回収した。
【００６４】
ポリマーナノスフェアの特性決定
調製したポリマーナノスフェアを、動的光散乱（ＤＬＳ）、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、蛍光分光光度法及び磁気測定を含む様々な技法を用いて特徴付けた。サイズ及び表面特性はナノ粒子に対する生物学的反応に強く影響するため、ナノスフェアのサイズ、表面電荷、並びに磁気及び蛍光特性を決定した。この結果から、調製された粒子の性質及びマルチモーダルイメージングツールとしての利用可能性が示される。
【００６５】
ＤＬＳは、ナノスフェアの流体力学的大きさを計測する技法である。表面修飾前及び修飾後の分析から、ＰＥＩのナノスフェア表面との連結が確認された；平均サイズが僅かに増加し、ゼータ電位分布が大きく正にシフトした（図１ｅ）。ＰＥＩ修飾ナノスフェアの９５％は直径が９０〜２６０ｎｍで、ゼータ平均値が１７１ｎｍであった。ＴＥＭはＤＬＳの結果を裏付けた。エネルギーフィルタ型ＴＥＭ（ＥＦＴＥＭ）による元素マッピングから、各ポリマーナノスフェア中に多数の酸化鉄ナノ粒子が含まれることが示され、全般的に酸化鉄粒子はスフェアの片側に集まる傾向があった。ＭＲＩの目的上、このような配置によって粒子集合のＲ２緩和率は大幅に増加し、プローブの感度が向上する。この酸化鉄ナノ粒子の凝集は、酸化鉄の親油性表面とポリマーとの間の弱い相互作用によるものと推測され、しかしながら乳化プロセスで用いられる溶媒混合物もまた、酸化鉄ナノ粒子がナノスフェアにおいてどの程度分散するかを左右した。
【００６６】
超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）を使用した磁気計測から、ナノスフェアが酸化鉄ナノ粒子の超常磁性の特性を維持し、固有飽和磁化（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍａｇｎｅｔｉｓａｔｉｏｎ）は５．７ｅｍｕ  ｇ−１であったことが示された（図２）。ナノ粒子の蛍光励起及び発光スペクトルは本質的にＲｈＢのものと変わらず、約５９０ｎｍで最大発光を示した。ＲｈＢの最大発光波長はｐＨに依存するため、試料はｐＨ７．４に緩衝した。
【００６７】
粒度分布は調製に用いたポリマーの分子量に敏感であったことが分かり、Ｍｗの増加或いは減少によって粒度分布が大きく広がり、平均サイズが増加した。
【００６８】
ナノスフェアは酸化鉄ナノ粒子及び有機色素の双方を含み、従って蛍光性且つ磁気性であったため、ナノスフェアをＴＥＭ、光学顕微鏡法、及びＭＲＩによって可視化し得ると予想された。さらに、ナノスフェアは比較的狭いサイズ分布を示し、ＰＥＩが連結していることによって正電荷の表面を有した。
【００６９】
細胞によるナノスフェアの高速のインターナリゼーション
ＰＧＭＡナノスフェアをラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞と最長７２時間の期間にわたりインキュベートした。７２時間を選ぶ合理的理由は、２４時間を超えると量子ドットのエンドリソソームエスケープが起こるという報告があったことであった。アミノ化された（すなわちＰＥＩで修飾された）表面を有する粒子は急速に、実に最初の数分間で取り込まれたが、一方ＰＥＩ修飾を有しない粒子は３日後も細胞と連係しなかった。インターナライズされた粒子は細胞全体にわたり点状分布（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を呈したが、しかし核に入り込むものはなかった（図３）。
【００７０】
ＰＥＩはトランスフェクション剤として作用することが知られ、また正の表面電荷を有する粒子も、むしろ細胞膜に付着する傾向がある負電荷の粒子と比べ、より容易に細胞によってインターナライズされることが知られる。しかしながら、ＰＥＩはインビトロで毒性作用を有することが示されているため、次のステップは、様々な神経細胞型及び非神経細胞型を使用して粒子の毒性を評価することであった。
【００７１】
ナノスフェアは細胞培養モデルにおいて毒性を示さない
ラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）、網膜ミュラー（ｒＭＣ−１）、ラット海馬及びラット皮質ニューロン培養物において、２４〜７２時間のインキュベーション後、結果の尺度として生存率及び生細胞数を用いてポリマーナノスフェアの毒性を調べた。不死化した培養物について、細胞を播いて２４時間後にナノスフェアを加え、全実験を通して完全培地に維持した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞生死判別キットを使用して実施した計測から、試験した濃度間で不死化培養物の生存率（図４ａ）、及び生細胞数にも、また死細胞数にも、統計的に有意な差はないことが明らかとなった（ｐ＞０．０５）。同様の結果が初代ニューロン培養物でも観察され（図４ｂ）、しかしながら極めて高い粒子濃度（≧０．５ｍｇ  ｍｌ−１）では毒性作用のエビデンスがいくらか示された。粒子濃度は細胞が完全に覆い隠されて見えなくなるほど高かったため、これは意外ではなかった。ＰＣ１２培養物についてのトリパンブルーアッセイから、２４時間或いは７２時間のインキュベーション後の生細胞数が減少しなかったことが確認された。また、これらの実験では、生存率の結果が偽上昇となり得る非付着死細胞の廃棄がされていなかったことも確認された。
【００７２】
遊離ＰＥＩは毒性作用によって細胞膜を損ない得るが、ここで過剰な未結合ＰＥＩを取り除くと毒性が軽減されることが示された。以下に示すとおり、ナノスフェアはエンドリソソーム小胞から脱出しないように見え、このことから、ナノスフェアが膜を透過せず、続いてミトコンドリアと相互作用できないことが示唆された。これらのナノスフェアで毒性作用が観察されなかった理由として考え得るのは、磁気ナノスフェアがカラムで洗浄され、それにより過剰なＰＥＩが全て取り除かれたことである。或いは、その短い鎖長、又はその比較的大きい粒度（例えば、ＤＮＡ／ＰＥＩトランスフェクションコンストラクトと比べて）が、ＰＥＩと細胞膜との間の相互作用の効果を制限することがあり得る。
【００７３】
ナノスフェアの取込みは、ＴＥＭにより可視化することができる
ナノスフェアの取込み及び細胞内運命をさらに詳しく調べるため、ＴＥＭによってＰＣ１２細胞を分析した。細胞を上記のとおりナノスフェア（１０μｇ  ｍｌ−１）とインキュベートし、但しポリ（Ｌ−リジン）及びコラーゲン被覆Ａｃｌａｒ基材上で成長させて試料調製を促進し、３、６、１２、２４及び７２時間のインキュベーション後に固定した。画像（図５）を調べることにより、以下の観察が得られた。
【００７４】
第一に、活性なエンドサイトーシスは、粒子が細胞に侵入する主要経路であるものと見られた。特に、マクロピノサイトーシス並びにクラスリン及びカベオラと独立した取込みが起こっているものと思われた。粒子の取込みは、これらのいわゆる非受容体介在性経路を通じて起こるように思われたが、粒子は初めに細胞表面に連係し、次に膜陥入後にインターナライズされた。第二に、ナノスフェアは、単一のナノスフェアしか見えなかった場合にも、主として細胞内部の膜内に含まれ、一部のナノスフェアは多重膜によって取り囲まれていた。時間が経つにつれ、複数の小胞が組み合わさった；すなわち、ナノスフェアが細胞内でクラスターを形成するレベルが増加した。これは、エンドリソソームエスケープ率が低いこと、及び粒子が膜破壊による毒性作用をほとんど有しないことを示唆している。第三に、あらゆる溶媒ベースのＴＥＭ試料調製ステップを経ても、細胞に遊離酸化鉄ナノ粒子はないように見え、従って酸化鉄ナノ粒子はポリマーに結合していたか、又はその親油性によって粒子に保持されていたかのいずれかである。
【００７５】
ＥＦＴＥＭを用いてナノスフェア内に鉄が存在することを実証したのとまさに同じとおりに、固定した組織試料内の鉄の同定にＥＦＴＥＭを用いて、細胞内におけるナノスフェアの局在を明らかにした（図６）。鉄の電子密度が比較的高いため、ＴＥＭによるその同定は単純となったが、本出願者は、鉄が存在したこと、及び鉄がナノスフェアから脱出したことを示すものはなかったことを確認できた。
【００７６】
ナノスフェアは、リソソーム又は後期エンドソーム中にはないように見える
上記のＴＥＭ実験と同じ時間点を用いてＰＣ１２細胞をナノスフェアとインキュベートし、免疫組織化学的に分析して、ナノスフェアがリソソーム内に局在するかどうかを決定した。全ての標本が、ＬＡＭＰ−１（リソソーム膜タンパク質１、これは後期エンドソーム及びリソソームの双方の膜に存在する）が陽性の細胞内区画とのナノ粒子の共局在化について否定的な結果を示した。これから、ＴＥＭ像に見られる膜結合型のナノスフェア凝集体が、細胞によって能動的に分解される過程にはまだなく、初期エンドソームに含まれていた可能性があることが示唆された。エンドソームは、小胞を破ってナノスフェアを細胞質に放出させるには酸性度が不十分である可能性がある。また、ナノスフェアが、膜破壊を実現するのに十分なＰＥＩ密度（又は十分に長いＰＥＩ鎖）で機能化されていないこともあり得る。
【００７７】
カベオリン依存性及び脂質ラフト依存性エンドサイトーシスの抑制は、ナノスフェアのインターナリゼーションに影響を及ぼさない
カベオリン依存性又は脂質ラフト依存性エンドサイトーシスが粒子取込みの機構であったかどうかを決定するため、ＰＣ１２細胞におけるナノスフェアに起因する蛍光レベルを定量化し、ここでこれらの取込み機構は抑制された。ナイスタチン及びプロゲステロンを細胞培養物に添加すると、コレステロールの隔離及びその合成の阻害が生じ、それにより脂質ラフト及びカベオラによる取込みが不能になった。細胞をナイスタチン（２５μｇ  ｍｌ−１）及びプロゲステロン（１０μｇ  ｍｌ−１）に曝露したとき、粒子取込みの変化は（細胞内蛍光により計測するとき）観察されなかった（図７）。この結果からは、脂質ラフト又はカベオラがナノスフェアエンドサイトーシスに関与しなかったと結論付けることはできなかったが、粒子をインターナライズした他の機構が少なくとも１つ存在した。可視的な（ｖｉｓａｂｌｅ）クラスリンピット及びカベオリン陥入が存在せず、仮足状（ｐｓｕｅｏｄｏｐｏｄ−ｌｉｋｅ）構造が存在することから、マクロピノサイトーシスが考え得る機構であったものと示唆された。従って、取込みは主に、マクロピノサイトーシス並びにクラスリン非依存的及びカベオリン非依存的取込みを介して起こると結論付けられた。これは、より小さい正電荷粒子（≦１００ｎｍサイズ）と対照的で、このような粒子は見かけ上クラスリン経路により取り込まれた。
【００７８】
磁気共鳴を用いてＰＣ１２細胞内の区画化を追跡することができる
ポリマーナノスフェアのマルチモーダルイメージング特性により、生体内系における粒子の性質を特徴付けるさらなる試験を実施することができた。粒子の緩和特性を計測して、そのＭＲＩ造影剤としての有用性を決定した。同時に、ＴＥＭ試験の結果から、時間の経過に伴い粒子が、おそらくは能動的な選別により、細胞内でクラスターを形成するようになったことが示された。クラスターの形成は磁性種の緩和率に影響を及ぼすため、粒子が十分に分散した状態にあった場合と比較した、細胞内で互いに近接していた場合の粒子の緩和特性を計測した。
【００７９】
初めにポリマーナノスフェアを水に懸濁し、ｒ１及びｒ２緩和能を計測した。これは、Ｂｒｕｋｅｒ  ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑシリーズの機器を使用して実施した。本出願者によれば、６０ＭＨｚ（１．４Ｔ）で計測して、ナノスフェアの鉄含量に基づきｒ１＝７．０２ｓ−１ｍＭ−１及びｒ２＝３３８ｓ−１ｍＭ−１が明らかとなった。
【００８０】
緩和率が十分に定義される場合、すなわち粒子が別々のまま同じ環境内に留まる場合、細胞内の鉄の取込みを追跡することが可能である。ナノスフェアは蛍光プローブも含んだことに伴い、試料の鉄含量を観察される蛍光と関係付けたことで、その鉄含量を決定することができた。強い相関関係（ｒ＝０．９９）の鉄含量に対する蛍光の標準曲線を作成し、これを用いて１０％誤差までで細胞試料の鉄含量を決定することが可能となった（図８）。
【００８１】
ナノスフェアがクラスターを形成したときの挙動の変化、及び緩和率が上がるか下がるかは、粒度及び磁化に依存する。ここで、粒子が区画化された場合、Ｒ２は低下するはずであると決定した。アガロースゲルに懸濁した、ナノ粒子と共に７２時間インキュベートした細胞の試料の緩和能を計測した。細胞内の粒子についてＲ１及びＲ２の双方の低下が観察され、これは細胞においてクラスター形成が起こったことの最初の兆候であった。クラスター形成の兆候は他にもいくつかあった；第一に、Ｒ２は細胞内ナノスフェアについてエコー計測時間（ＴＥ）に依存したが、十分に分散したナノスフェアについては依存せず、及び第二に、細胞内ナノスフェアと比較して遊離ナノスフェアについては磁場に対するＲ１の依存性が異なった（図９）。
【００８２】
エンドサイトーシス及び細胞内輸送を蛍光及び磁気ポリマーナノスフェアを使用して直接イメージングする手法を開発した。ポリマーナノスフェアを、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子の封入に用いたポリ（メタクリル酸グリシジル）（ＰＧＭＡ）（ローダミンＢ（ＲｈＢ）色素で修飾したもの）から調製した。ＰＧＭＡ上のエポキシ基により、単純な開環反応を用いてＰＥＩ鎖を固定化することができた（図１ｂ）。これらのナノスフェアにより、相関リラクソメトリー、蛍光分光法及び顕微鏡法、及び透過電子顕微鏡法を用いて、ＰＥＩがどのようにナノ粒子の細胞輸送を媒介するかをマルチモーダル手法で直接評価することが可能となった。非自発的乳化方法を用いてポリマーナノ粒子を合成し、ここでは不混和性成分及び可溶性成分の双方を含む二成分溶媒混合物を分散相として用いた。酸化鉄ナノ粒子も含むこの色素修飾ポリマーの有機溶液を（図１ｃ）、界面活性剤の存在下で水と乳化した。透過電子顕微鏡法（図１ｄ）、動的光散乱（図１ｅ）、蛍光分光光度法、及び磁気測定を用いてポリマーナノ粒子を特徴付けた。ＰＥＩ連結前及び連結後のナノスフェアの分析から、平均サイズが僅かに増加し、ゼータ電位分布が大きく正にシフトしたことが明らかとなった（図１ｅ）。ＰＥＩ連結後の平均粒子直径は１６０ｎｍ（分布９０〜２６０ｎｍ）であり、粒子は約３重量％のＰＥＩを含んだ。ナノスフェアは過剰な未結合ＰＥＩと磁気分離した。
【００８３】
ナノスフェアの毒性
ＰＥＩの毒性及びトランスフェクション効力は、その分子量及び構造（すなわち線状又は分枝状）の双方に依存する。この点で、分枝状及び線状のいずれの形態も細胞膜プロテオグリカンに結合し、膜の完全性を損ない、且つ３０分以内に初期壊死様の変化を誘導し得るため、遊離ＰＥＩの存在が細胞機能障害の誘導において役割を果たし得る。別の点では、ＰＥＩの誘導による細胞毒性が、２４時間以内のミトコンドリア外膜におけるチャネル形成が関わるミトコンドリア介在性アポトーシスプログラムの活性化と関係付けられている。本研究では、ＰＥＩ鎖を磁気ＰＧＭＡコアと共有結合的にグラフトすることにより、磁気分離を用いて遊離ＰＥＩを取り除くことが可能となり、ＰＥＩ修飾ナノスフェアが毒性か否かの明確な判断が促進された。
【００８４】
修飾ナノスフェアの毒性を、ラット褐色細胞腫神経前駆細胞（ＰＣ１２）及び網膜ミュラーグリア細胞株（ｒＭＣ−１）、並びに初代ラット海馬及び皮質ニューロン培養物において、２４時間及び／又は７２時間インキュベートした後に調べた。不死化培養物は、試験濃度（最大２５０μｇ  ｍＬ−１）のいずれに関しても生細胞数の減少はなかった（ｐ＞０．０５）。初代ニューロン培養物においても同様の結果が認められ、ここで、治療上は妥当でないと思われる極めて高いナノスフェア濃度（１０００μｇ  ｍＬ−１）においてのみ、毒性作用（ｐ≦０．０５）が観察された。アッセイは、ＰＣ１２細胞においてトリパンブルー色素排除を評価することにより検証した。先に提言したＰＥＩ毒性機構を踏まえ、本出願者は、試験した細胞株及び初代培養物において観察された毒性の欠如に関して２つの理由を示す。第一に、ＰＥＩ鎖長（１．２ｋＤａ）が、先行研究で使用されたもの（２５及び７５０ｋＤａ）と比べて短かったとともに、第二に、ＰＥＩがナノスフェアに結合し、結果としてミトコンドリア膜と相互作用することができなかった可能性がある。この研究は、既知の経時的細胞毒性変化を包含した。
【００８５】
蛍光により観察されるナノスフェアの取込み
ナノスフェアの取込みについてさらに詳しく調べることで、細胞内輸送をさらに分析し、ＰＥＩ修飾ナノスフェアがなぜ毒性でなかったのかについて研究した。ナノスフェアをＰＣ１２細胞とインキュベートすると、ＰＥＩ修飾を有するナノスフェアは急速に、数分以内に取り込まれ、一方、ＰＥＩ修飾を有しないナノスフェアは、３日が経っても細胞と連係しなかった。インターナライズされたナノスフェアは点状分布を呈し、核に入り込むものはなかった（図３ａ〜図３ｄ）。エンドサイトーシスの動態を調べるため、本出願者は生細胞共焦点イメージングを用いて、２４時間及び７２時間の期間にわたりＰＣ１２細胞におけるナノスフェアの蛍光を観察した（図３ｅ）。タイムラプス実験において、本出願者は細胞に沿った単一の共焦点スライスを使用することにより、細胞あたりの蛍光が時間とともに線形的に増加することを観察した（図３ｆ）。初代皮質及び海馬ニューロン培養物によっても同様の結果が得られ、細胞あたりの蛍光強度は皮質細胞でより大きかった。ナノスフェアの取込みを示す蛍光強度と処理後の様々な細胞培養物の生存率との間に明らかな相関はなかった。ＰＣ１２細胞における結果はまた、分光蛍光プレートリーダーを使用した多量の細胞試料に関する強度の計測によっても確認された。
【００８６】
薬物阻害及び電子顕微鏡法により決定されるナノスフェアのエンドサイトーシス
哺乳動物細胞においては、イオンから巨大分子、病原体、及び薬物に至る広範囲の異なるサイズの部分の侵入を調節する多くの異なるエンドサイトーシス経路が共存している。従って、ポリマーナノ粒子ドラッグデリバリーシステムもまた同じ選択性を対象とすることになる。エンドサイトーシスによるナノ粒子の取込みは、細胞型及びカーゴの性質（ナノ粒度及び表面電荷）に応じた数多くの異なる経路を介して起こり得る。ピノサイトーシス、すなわち液相取込みは、多くの場合に、マクロピノサイトーシス（＞１μｍの粒子について）、クラスリン介在性エンドサイトーシス（≦１２０ｎｍ）、及びカベオリン介在性エンドサイトーシス（≦９０ｎｍ）を含め、正電荷の巨大分子を取り込む共通の経路として報告されている。ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスの場合、エンドサイトーシスはポリプレックスがシンデカンに結合すると惹起される。シンデカンは、細胞膜における負電荷のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）である。粒子の周りにクラスターを形成するシンデカンが、このような膜貫通タンパク質とアクチン線維とのリンカータンパク質を介した細胞質結合を誘発し、続いてこれがエンドサイトーシス小胞によるポリプレックスの取込みを補助する。最近になって、クラスリン及びカベオリンと独立した、サイズ≧１５０ｎｍのＰＥＩ−２５／ＤＮＡポリプレックスの取込みに寄与する特徴的な液相経路が特定されており、重要なことには、マクロピノソームはエンドソームと比べてＰＥＩ−２５／ＤＮＡカーゴを送達する傾向がより強いことが報告されている。結果的に、本発明者らのナノスフェアのＰＥＩ介在性エンドサイトーシスを分析するにおいては、マクロピノサイトーシスを含む複数の細胞内輸送経路を考慮しなければならない。ナノスフェアのインターナリゼーションについて、クラスリン介在性エンドサイトーシス（クロルプロマジン）、脂質ラフト介在性及びカベオリン介在性エンドサイトーシス（ナイスタチン／プロゲステロン）、及びマクロピノサイトーシス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミロライド）の公知のインヒビターで処理した後のＰＣ１２細胞で研究した。本出願者はこれらの薬物のいずれにおいても、個別にも、或いは組み合わせでも、取込みの統計的に有意な減少は認めなかった（ｐ＞０．０５）。選択された薬物で処理したことによってＰＥＩ修飾ナノスフェアの取込みが有意に阻害されることはなかったため、ポリマーナノスフェアの取込みにマクロピノサイトーシス並びにクラスリン介在性及びカベオリン介在性エンドサイトーシス経路は必要でないと推測される。さらに、この結果は、これらのナノ粒子の他の可能な侵入方法が少なくとも１つ存在することを含意している。インヒビターを使用した取込み経路の特定は、かかる処理によって通常サイレントな経路が上方制御され得るため、確証的なものではない点に留意することは重要である。新生経路の上方制御は、シグナル伝達、脂質及びタンパク質分布、膜張力、及びストレス応答の点で細胞全体に及ぶ影響を与える。従って、エンドサイトーシス並びにインターナライズされたＰＥＩ修飾ナノスフェアの細胞内巡回路を評価するさらなる手段として、電子顕微鏡法を用いた。
【００８７】
ナノスフェアに３、６、１２、２４、及び７２時間曝露した後、エンドサイトーシス及び細胞輸送が関わる細胞過程を透過電子顕微鏡法を用いて画像化した（図５）。これらの画像では、図１ｅに示されるとおり、ポリマーナノスフェアは明色の丸として見え、一方、封入された酸化鉄ナノ粒子は大幅に小さく、且つ電子密度が高い。ＰＥＩ介在性エンドサイトーシスは、細胞表面に対するナノスフェアの吸着を伴ったことから、おそらくは、カチオン性ポリプレックスに関する限りでは、細胞膜上のシンデカンとの相互作用によってエンドサイトーシスが開始されることが示唆された。細胞表面と連係するナノスフェアの数は、時間とともに増加した。ナノスフェアの取込みは、マクロピノサイトーシスに特徴的な細胞膜の突出及び陥入を伴い（図５ａ）、また、クラスリン及びカベオリン非依存性エンドサイトーシスに特徴的な、ＰＣ１２細胞の中に０．５〜２μｍ延びるチューブ状の陥入も伴った（図５ｂ）。マクロピノサイトーシス並びにクラスリン依存性及びカベオリン依存性エンドサイトーシスが阻害された場合にもナノスフェア取込みは抑制されなかったとおり、これらの観察は化学的阻害実験の結果と一致する。
【００８８】
３時間以内にＰＣ１２細胞の細胞質全体にわたり個別的なナノスフェアが観察された（図５ｃ）。６時間後、ナノスフェアは互いにより近接し、膜結合型であることもある緩いクラスターを形成しているように見えた。１２時間後、多重膜によって囲い込まれた小胞の近傍に緩いクラスターが高頻度で観察され、２４時間までには、それらのクラスターのほとんどが膜結合型であるものと見られた。膜結合型ナノスフェアクラスターそれ自体が互いにまとまることが多く、ある場合には膜が見かけ上融合過程にあった（図５ｄ）。７２時間までにクラスターは大きくなり（２００〜５００ｎｍ）、共にまとまって１つ以上の膜によって囲い込まれたいくつかのより小さい膜結合型パッケージを含んだ（図５ｄ、図５ｅ）。これらの観察は、ナノスフェアがエンドソーム内に捕捉されたことを示唆し、及び多胞体の存在からエンドソームの成熟化が示された。
【００８９】
免疫組織化学から、ナノスフェアがリソソームにないことが示される
リソソームは、エンドサイトーシスの行程における最終的な分解段階を構成し、サイズ及び外観が様々であり、通常、超微細構造で観察されるものと同様の渦巻き状の膜を伴う。ＴＥＭ実験と同じ時間点を用いて、ＰＣ１２細胞をナノスフェアとインキュベートし、後期エンドソーム及びリソソームの双方のマーカーであるリソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）について免疫組織化学的に分析した。本発明者らは、ＬＡＭＰ−１免疫陽性細胞内区画とのナノスフェアの共局在化を認めなかった。
【００９０】
ナノスフェアの毒性が観察されなかったことは、浸透圧膨潤よりむしろ、ナノスフェアの区画化（及びそれらの凝集体のサイズの増加）の観察と整合するように見える。ポリプレックスの場合、ポリアミンによるエンドソーム区画の緩衝によりＨ＋の侵入が増加し、それに伴いＣｌ−の取込みが増加して、ひいては浸透圧膨潤及びエンドソームからの流出又はその溶解が促進される。この破壊的な過程は、ＤＮＡポリプレックスがリソソームの捕捉を逃れ、そうして核に到達し、遺伝子を送達して発現を生じさせる機構である。この過程は急速で、浸透圧膨潤を介した放出は４時間以内に起こり、ＤＮＡ発現は２４時間で最大となる。浸透圧膨潤又はエンドソームエスケープの徴候は観察されなかったが、これは２４時間以内の毒性の欠如と関係付けられる。これは、より小さいナノスフェアクラスターが融合して大きい凝集体を形成したが、７２時間以内にリソソームに包含されることはなかったという一連の流れを示唆している。
【００９１】
リラクソメトリーを用いてナノスフェアエンドサイトーシスを追跡することができる
個々のＰＣ１２細胞におけるナノスフェアの区画化のＴＥＭによる観察を、より大きい細胞集団でリラクソメトリーを用いて確認した。この分析は、ナノスフェアの中に含まれる超常磁性酸化鉄ナノ粒子によって可能となった。超常磁性ナノ粒子は、大きい磁気モーメントを有し、且つ自由に印加磁場と整列させることができるため、磁気共鳴（ＭＲ）イメージングに有効な造影剤である。得られる微視的な磁場勾配により近接プロトンの位相がずれ（ｄｉｐｈａｓｅ）、縦緩和時間Ｔ１及び横緩和時間Ｔ２の双方が短くなる。Ｔ１は他の緩和機構によっても短縮される。対応する緩和率Ｒ１及びＲ２は、ナノ粒子の局所濃度、印加された磁場強度、及びナノ粒子が周囲のプロトンと相互作用する環境の影響を受ける。特に、酸化鉄ナノ粒子によりもたらされる緩和は、マクロファージ、リンパ球、オリゴデンドロサイト、ヒト神経幹細胞、及び間葉系幹細胞におけるその区画化に依存することが知られている。
【００９２】
本出願者は、７２時間曝露した後のＰＣ１２細胞における緩和率を分析した。ＰＥＩ修飾ナノスフェアはこの７２時間までに細胞内区画の中に結合した。本発明者らは、ＰＣ１２細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれたナノスフェアの緩和率を遊離ナノスフェアと比較した。いずれのナノスフェアもアガロースゲルに保持した。１．４Ｔでの遊離ナノスフェアの横緩和能はｒ２ｆｒｅｅ＝３２２±２６ｍＭ−１ｓ−１であり、ＰＣ１２細胞において１９倍低下した（ｒ２ｃｅｌｌ＝１６．７±１．２ｍＭ−１ｓ−１；図９ａ）。縦緩和能ｒ１は２倍下がった（ｒ１ｆｒｅｅ＝４．７０±０．０５ｍＭ−１ｓ−１、ｒ１ｃｅｌｌ＝２．７０±０．２６ｍＭ−１ｓ−１；図９ｂ）。本出願者は、ナノスフェアが区画化されたときのｒ２の低下が、測微的ナノスフェアとしての凝集体の挙動に起因すると予想する。有効直径が大きくなると、区画化されたナノ粒子はエコーが限られたプロトン緩和レジームにシフトする。このエコーが限られた環境では、水のプロトンが受ける磁場の摂動が事実上静的になる。従って、再焦点パルスが効率的となり、分散したナノ粒子と比較してｒ２が低下し、エコー間隔に対する有意な依存が生じる（図９ｃ）。さらに、ｒ１の磁場強度に対する著しい依存（図９ｄ）もまた、ナノ粒子のクラスター形成と整合し、理論的予測及び観察と同様である。本発明者らは、ｒ１の低下が、細胞内部での水分子の内圏交換が低速であること、並びに「膜遮蔽」効果によりバルク水との分子交換が低下したことに起因すると考える。
【００９３】
本出願者は、鉄含量の尺度として蛍光強度を用いることにより、細胞内でのクラスター形成状態をリラクソメトリーを用いて経時的に計測し得ると予想する。マルチモーダルナノスフェアのこの利点は、エンドリソソーム選別の追跡において、インビトロのみならず、ＭＲＩと連動するライブ蛍光イメージングを用いて大規模にインビボでも役立ち得る。強い相関関係（ｒ＝０．９９７０）の鉄含量に対する蛍光の標準曲線を作成し、これから本発明者らは、細胞試料の鉄含量を１０％誤差までで決定することができた。
【００９４】
結論
ポリマーナノ粒子のエンドサイトーシスの経路の理解、及びその状況を追跡できる能力は、ほとんど注目されてこなかった重要な分野である。本研究では、約１７０ｎｍのサイズのポリマーナノスフェアがＰＣ１２細胞により取り込まれる方法についての洞察が得られた。これらの粒子には、持続放出用の薬物を負荷し得る。これらの粒子は神経細胞及び関連する細胞系において毒性がほぼなく、且つ２つのイメージングモダリティを組み込むことにより、いずれかの技法単独と比べ、粒子挙動のさらなる特性決定が可能になることが示された。
【００９５】
本例で用いられるナノスフェアは、電子及び蛍光顕微鏡法による直接的な可視化、並びにエンドサイトーシス後の区画化をリラクソメトリーによって調べる能力をもたらす。また磁気特性により過剰なＰＥＩの除去が可能となり、遊離ＰＥＩの毒性の交絡因子なしにＰＥＩ介在性エンドサイトーシスを調べることが可能になった。エンドサイトーシスは明らかな一連のイベントを含んだ：ナノ粒子が細胞膜と相互作用して、それぞれ制御されない／非選択的なマクロピノサイトーシス並びにクラスリン非依存性及びカベオリン非依存性エンドサイトーシスに特徴的な膜ラッフリング及びチューブ状陥入が起こり、続いて層状の外被内において時間依存的に細胞内クラスターが形成された。従ってこのナノスフェア設計は、広範囲にわたる多種多様な薬剤の細胞内区画への送達を提供する。本発明者らが提示した知見は、部位特異的ドラッグデリバリー用の次世代ナノ粒子の設計及び合成を促進し得る。
【００９６】
材料及び方法
材料
化学物質は全て、特に指定されない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した：ベンジルエーテル（９９％）、塩酸クロルプロマジン（９８％）、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド塩酸塩、鉄（ＩＩＩ）アセチルアセトネート（９７％）、ナイスタチン、オレイン酸（ＢＤＨ、９２％）、オレイルアミン（７０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１０８、ポリエチレンイミン（５０％溶液、Ｍｎ  １２００、Ｍｗ  １３００）、プロゲステロン（９９％）、ローダミンＢ（Ｋｏｄａｋ（登録商標）、９５％）、及び１，２−テトラデカンジオール（９０％）を、受け取り時のまま使用した。全ての組織培養試薬は、特に指定されない限り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から購入した：Ｂ２７、ウシ血清アルブミン（Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、ＤＭＥＭ、ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸ１００×、ウマ血清、ＭＥＭ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）１０×、ペニシリン／ストレプトマイシン、ポリ（Ｌ−リジン）（Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、ＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム１００×、及びトリプシン／ＥＤＴＡ。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（登録商標））を使用して、試料を光学顕微鏡にマウントした。
【００９７】
酸化鉄の調製
オレイン酸、オレイルアミン、及び１，２−テトラデカンジオールの存在下、ベンジルエーテル中３００℃でＦｅ（ａｃａｃ）３を有機分解することによりＦｅ３Ｏ４を合成した。
【００９８】
ＲｈＢ修飾ＰＧＭＡの合成
アゾビスイソブチロニトリルを開始剤として使用して、メタクリル酸グリシジルをメチルエチルケトン（ＭＥＫ）中で重合してＰＧＭＡ（Ｍｗ＝２５０，０００ｇ  ｍｏｌ−１）を得た。ＭＥＫ溶液からのジエチルエーテルを使用した複数回の沈殿により、ポリマーを精製した。ポリマーに色素を連結するため、ＭＥＫ（２０ｍＬ）中ローダミンＢ（ＲｈＢ、２０ｍｇ）及びＰＧＭＡ（１００ｍｇ）の溶液を、Ｎ２下に１８時間加熱還流した。この溶液を減圧下で減少させた後、修飾ポリマーをジエチルエーテル（２０ｍＬ）で沈殿させた。ポリマーをＭＥＫ中に再溶解し、エーテルで２回沈殿させて、グラフトされなかったＲｈＢを除去した。
【００９９】
ポリマーナノスフェアの調製
非自発的乳化経路を用いてナノ粒子を調製した。酸化鉄ナノ粒子（２０ｍｇ）を分散させ、及びＰＧＭＡ−ＲｈＢ（７５ｍｇ）をＣＨＣｌ３とＭＥＫとの１：３混合物（６ｍＬ）に溶解することにより、有機相を調製した。この有機相をＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１０８（１．２５％ｗ／ｖ、３０ｍＬ）の水溶液に高速で撹拌しながら滴下して加え、プローブ型超音波処理器により低出力で１分間、エマルションを均質化した。有機溶媒を低速のＮ２流下に一晩蒸発させた。３０００ｇで４５分間遠心し、酸化鉄の大きい凝集体及び過剰なポリマーを除去した。ＰＥＩ（５０ｗｔ％溶液、１００ｍｇ）が入った５０ｍＬフラスコに上清を取り出し、８０℃に１８時間加熱した。磁気高分子ナノスフェアを磁気分離カラム（ＬＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（登録商標））で回収し、水（２×１．５ｍＬ）で洗浄し、次にろ液の流れが透明になるまで水でフラッシュした。得られた濃縮粒子懸濁液をアリコートに分け（約１０×５００μＬ）、凍結乾燥による定量化、分析、及び続く使用のために４℃で保存した。ナノスフェアは紫外線照射により滅菌した。
【０１００】
細胞培養
ラット褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）をミシシッピ・メディカル・センター（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＭＳ）から入手し、３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、ポリ−（Ｌ−リジン）被覆ポリスチレンフラスコにおいて培養し、ウマ血清（１０％ｖ／ｖ）、ウシ胎仔血清（５％ｖ／ｖ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ  ｍＬ−１、１００μｇ  ｍＬ−１）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸（１００μＭ）、及びピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。実験のため、細胞を、ポリ−（Ｌ−リジン）で被覆した２４ウェル又は９６ウェルプレート内又はカバーガラス上に（０．５〜２）×１０５ｍＬ−１の細胞密度で播種し、実験前に２４時間インキュベートした。細胞は分化しなかった。網膜ミュラー細胞（ｒＭＣ−１）を、被覆していないポリスチレン皿において、ウシ胎仔血清（１０％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ  ｍＬ−１、５０μｇ  ｍＬ−１）、及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地中で培養した。細胞を１×１０５ｍＬ−１で播種し、実験前に２４時間インキュベートした。海馬及び皮質ニューロン培養物を以下のとおり調製し、実験前に７〜１４日間維持した。
【０１０１】
仔ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｐ１；又はＰＶＧ、Ｐ１〜Ｐ３）を、ＣＯ２雰囲気下に置いて速やかに断頭するか、又はキシラジン／ケタミン（Ｉｌｉｕｍ  ｘｙｌａｚｉｌ及びＫｅｔａｍｉｌ，Ｔｒｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、それぞれ１０及び５０ｍｇ  ｋｇ−１、ｉｐ）で麻酔し、Ｅｕｔｈａｌ（ペントバルビトンナトリウム８５０ｍｇ  ｋｇ−１、フェニトインナトリウム１２５ｍｇ  ｋｇ−１；ｉｐ）で安楽死させた。脳を、解離用培地［ＤＭ：Ｈ２Ｏ中；ＭｇＣｌ２、５．８ｍＭ；ＣａＣｌ２、２．５ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、１．６ｍＭ；フェノールレッド、８ｍｇ  Ｌ−１；Ｎａ２ＳＯ４、９０ｍＭ；Ｋ２ＳＯ４、１８．７５ｍＭ］が入った氷上の皿に摘出し、そこから海馬及び皮質組織を単離し、氷上のＤＭに取り出した。ＤＭを除去し、及び予熱した酵素溶液［ＥＳ：ＤＭ、１０ｍＬ；パパイン、２００Ｕ；Ｌ−システイン、１．６ｍｇ］を組織に添加して、それを３７℃で２５分間、５分毎に穏やかに撹拌しながらインキュベートした。上清を濃いインヒビター［ＨＩ：ＤＭ、１２ｍＬ；トリプシンインヒビター、１２０ｍｇ；ウシ血清アルブミン、１２０ｍｇ］と２分間、次に薄いインヒビター［ＬＩ：ＤＭ、９ｍＬ；ＨＩ、１ｍＬ］と２分間交換し、次にプレーティング培地［ＰＭ：最小必須培地中；ウシ胎仔血清、１０％ｖ／ｖ；グルコース、２０ｍＭ；ペニシリン／ストレプトマイシン、２０Ｕ  ｍＬ−１、２０μｇ  ｍＬ−１；ＧｌｕｔａＭＡＸ、２ｍＭ；ピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ］と、細胞カウントに好適な希釈度に交換した。均一な細胞懸濁液が得られるまで組織を粉砕し、細胞をさらに希釈して、ポリ−（Ｌ−リジン）（１０μｇｍＬ−１）で被覆したカバーガラス上に３７℃で一晩置いた。４時間後、ＰＭを供給用培地［ＦＭ：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ中；グルコース、１２ｍＭ；ペニシリン／ストレプトマイシン、２０Ｕ  ｍＬ−１、２０μｇ  ｍＬ−１；ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．５ｍＭ；Ｂ２７、２％ｖ／ｖ；２−メルカプトエタノール、２５μＭ］と交換した。培養培地の半分を週２回交換した。初代培養物の形態学的評価から、最初の無血清条件に起因して約９５％の細胞が神経細胞であったことが示された（ｎ＝１０００細胞を評価）。
【０１０２】
細胞生存度の計測
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を使用して生存率を計測した。細胞を２４時間インキュベートした後、細胞培養液を、培地中種々の濃度のナノ粒子懸濁液と交換した。さらに２４時間又は７２時間後、ナノ粒子懸濁液を除去し、細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬（カルセインＡＭ、１μＭ；エチジウムホモ二量体−１、３μＭ）を添加した。３０分後、２０倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−８１）を用いて画像を記録した。全てのウェル及び全ての実験について、各ウェルにつき４画像を定位置で記録し、生細胞及び死細胞をカウントした。細胞生存度のさらなる尺度として、同様の処理手順に従いトリパンブルー色素排除アッセイを用いた。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを使用して剥離し、１００〜２００μＬの細胞培養液に再懸濁し、トリパンブルーと合わせ、血球計算器又は自動細胞計数器（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｅｓｓ）を使用してカウントした。
【０１０３】
エンドサイトーシス阻害試験
ＰＣ１２細胞を、上記のとおり９６ウェルプレートに播いた。クロルプロマジン（１０μｇ  ｍＬ−１）、ナイスタチン、及びプロゲステロン（それぞれ２５及び１０μｇ  ｍＬ−１）、又は５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミロライド（５０μＭ）の溶液を、完全培地に調製した；ＥｔＯＨ中２ｍｇ  ｍＬ−１ストックからプロゲステロンを希釈した。細胞をインヒビターと共に１時間インキュベートし、次に薬物をナノスフェア（１０μｇ  ｍＬ−１）と合わせて置いた。３時間後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、蛍光を定量化した（ＢＭＧ（登録商標）ＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ）。
【０１０４】
免疫組織化学的分析
ＰＣ１２細胞を上記のとおり成長させて、ナノスフェア（１〜１０μｇ  ｍＬ−１）と共に３時間、６時間、１２時間、２４時間、又は７２時間インキュベートし、パラホルムアルデヒド（４％）に固定した。固定した細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．２％）を含有するＰＢＳ中でインキュベートし、１０分間ブロック（７．５％）し、次に、抗ＬＡＭＰ１（Ａｂｃａｍ（登録商標）、１：１０００）、抗β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｔｕｊ−１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（登録商標）、１：５００）、及び／又は抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ（登録商標）、１：１０００）を含有する同じ溶液中で一晩インキュベートした。抗体及び核を、Ａｌｅｘａ  ４８８及び／又はＡｌｅｘａ  ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、１：４００）及びヘキスト  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ（登録商標）、１μｇ  ｍＬ−１）と共に１〜２時間インキュベートすることにより可視化した。共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ（登録商標）ＴＣＳ  ＳＰ２、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）Ａ１Ｓｉ）により画像をキャプチャした。
【０１０５】
ＴＥＭ試料の調製
ＰＣ１２細胞を８ｍｍ２又は１．２ｍｍ直径の５０．８μｍ  Ａｃｌａｒフィルム上で、それぞれ化学的固定又は凍結保存用に成長させた。フィルムをスポット溶接によって１２ウェル培養プレートの表面に貼り付け、次に紫外線滅菌した後、細胞を添加した。ＰＣ１２細胞を上記のとおり播き、ナノスフェア（１０μｇ  ｍＬ−１）で３時間、６時間、１２時間、２４時間、又は７２時間処理してから固定又は凍結保存した。化学的固定後（ＰＢＳ中２．５％グルタルアルデヒド、ｐＨ７．４）、試料をＰＢＳでリンスし、後固定（１％ＯｓＯ４）した後、エタノールの段階系列で脱水した。或いは、試料ディスクを凍結保護物質（３７℃の細胞培養液中２ｍｇ  ｍＬ−１低ゲルアガロース）に浸漬した後、高圧凍結（Ｌｅｉｃａ（登録商標）ＥＭ  ＰＡＣＴ２）により凍結保存を実現した。凍結試料を凍結置換培地（アセトン中１％四酸化オスミウム、０．２％酢酸ウラニル、及び３％水）に入れ、凍結置換装置（Ｌｅｉｃａ（登録商標）ＥＭ  ＡＦＳ２）において徐々に室温に至らせた。全ての標本をＰｒｏｃｕｒｅ−Ａｒａｌｄｉｔｅで包埋してから切片（８０〜１２０ｎｍ）を切り出し、被覆していない２００メッシュ銅グリッド上に収集した。従来法で処理した標本のグリッドを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した後観察し、一方で高圧凍結標本のグリッドは染色しなかった。炭素被覆銅グリッド上の析出によりＴＥＭ用の酸化鉄及びナノスフェア試料を調製した。全てのＴＥＭ像は１２０ｋＶで取得した（ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−２１００）。
【０１０６】
リラクソメトリー
０．２３Ｔ、０．４６Ｔ、０．９２Ｔ、及び１．４１Ｔで動作する４つのＭｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑシリーズ機器（Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標））を使用して、緩和能データを計測した。カー・パーセル・マイボーム・ギル（Ｃａｒｌ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ）（ＣＰＭＧ）スピンエコーシーケンスを使用してＴ２を計測した。エコー間隔は短いＴＥ計測（１０００エコー）について２ｍ秒、及び長いＴＥ計測（２００エコー）について１０ｍ秒であり、いずれも繰り返し時間は１０秒であった。反転回復（ＩＲ）シーケンスを使用して、５０〜５０００ｍ秒の間で対数的に間隔を置いた１０反転時間（ＴＩ）を用いてＴ１を計測した。ＰＣ１２細胞の一つの７５ｃｍ２フラスコを、５０μｇ  ｍＬ−１の濃度でポリマーナノスフェアと７２時間インキュベートした。細胞を基材から剥離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、及びカウントした後、リラクソメトリー計測用の希釈物を調製した。この試料を０．５％アガロースゲルに懸濁し、３７．５℃でデータを記録した。試料の鉄含量を酸分解後にＩＣＰＡＥＳにより決定した（５ｍＬ）。
【０１０７】
実施例２．マルチモーダルナノ粒子からのカルシウムチャネル遮断薬の細胞内放出
結果及び考察
神経外傷に続発する損傷から脆弱なニューロン及びグリアを保護することは、治療を奏効させるためのいくつかの要件のうちの一つである。カルシウムイオン恒常性の調節解除は、興奮性アミノ酸の二次変性及び放出と関連し、活性酸素種のミトコンドリア生成及び細胞死の増加をもたらすカスケードを惹起する。カルシウムチャネル遮断薬は、インビトロでカルシウム流入を防止し、及びインビボで二次的な傷害効果を防ぐことが示されている。本研究では、水溶解度が限られたカルシウムチャネル遮断薬であるロメリジンを、多機能性ポリマーナノスフェアに封入した。ロメリジンの保護作用、すなわちカルシウム流入の防止を、グルタミン酸塩に曝露したＰＣ１２細胞における細胞内カルシウム濃度を計測することにより実証した。この結果から、標識ナノ粒子を使用したロメリジンの標的化された細胞内送達は、持続性のロメリジン用量をＣＮＳ傷害部位に送達するための実現可能な手法であり得ることが示される。
【０１０８】
神経外傷は、ＣＮＳの物理的な傷害を指し、通常は急性で、及び機械的な損傷によって引き起こされる。最初の衝撃及び力により組織が変形し、限局性であることも、又はびまん性であることもある直接的なニューロン傷害及び血管傷害が生じる。一次傷害に加え、外傷後の浮腫、虚血、炎症、神経伝達物質蓄積（特に興奮性アミノ酸グルタミン酸塩の蓄積）及び細胞内イオン濃度の変化（［Ｃａ２＋］を含む）が、神経細胞及びグリア細胞にとって毒性であり得る。これらの間接的な効果及びそれに伴う細胞死（合わせて二次変性と称される）は、二次的な脳損傷及び外傷後てんかん、並びに感覚、運動及び自律神経機能のさらなる喪失をもたらし得る。一次傷害の重症度は、事象後は薬物によって調節できないため、神経外傷の合併症は傷害そのものよりも治療に適していると考えられる。従って、主な目的は、二次損傷の様々な原因を予防し、又は最小限に抑えることである。二次変性は傷害から数分以内に始まり、初期損傷後数週間にわたり展開する。この時間の間に、初期事象を免れた脆弱な細胞を保護する重要な治療好機がある。救出するニューロンが小さい割合であっても、機能の維持に大きい利益があり得る。
【０１０９】
二次変性は、ニューロン及びグリアにおける細胞内カルシウムの流束の変化と関係付けられる。Ｃａ２＋恒常性が失われると、ミトコンドリアによる活性酸素種の生成が増加し、カルパイン及びカスパーゼを活性化し得る生化学的カスケードが開始される。これらの酵素が活性化すると、タンパク質、脂質、及び核酸の分解が起こり、これはアポトーシス及び遅発性細胞死に寄与する。［Ｃａ２＋］ｉの増加は、緩衝タンパク質からの放出、細胞内ストアからの放出を含むいくつかの機構によって、又は細胞膜に存在するＣａ２＋チャネルを介した流入の結果として生じ得る。Ｃａ２＋流入経路のなかでもＮ−メチル−ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体は、最も重要な侵入機構のうちの一つをなし、なぜなら、グルタミン酸活性化ＮＭＤＡ受容体のＣａ２＋に対する透過性が極めて高いためである。従ってＮＭＤＡ受容体拮抗薬が、神経保護の治療標的として同定されている。これらの薬物は神経外傷の動物試験において当初有望であることが示されたが、その結果が臨床治験に読み換えられることはなかったとともに、グルタミン酸受容体の遮断は正常な脳機能に影響を及ぼし、副作用を引き起こす。ＮＭＤＡ受容体を介した侵入に加えて、カルシウムはまた、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体、Ｐ２Ｘ７プリン受容体、又は電位作動性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）を介してもニューロン又はグリアに侵入し得る。これらの経路を介したカルシウム流入を防止する薬物は、広範な傷害モデルにおいて神経保護性を示す。
【０１１０】
ロメリジン（ＫＢ−２７９６、１−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−４−（２，３，４−トリメトキシベンジル）ピペラジンジヒドロクロリド）は、Ｌ型及びＴ型Ｃａ２＋チャネルを選択的に遮断するが、Ｎ型チャネルは遮断しないカルシウムチャネル遮断薬である。ロメリジンのＮＭＤＡ、カイニン酸又はＡＭＰＡ結合部位に対する親和性については報告がなく、従ってこの薬物の神経保護の有益性は、グルタミン酸受容体拮抗作用というよりむしろ、特異的にＶＧＣＣ遮断に起因するものと思われる。加えて、ロメリジンは解離した小脳ニューロンにおいて活性酸素種の形成を低減し得る。そのカルシウムチャネル遮断能に基づき、ロメリジンは、ラット海馬ニューロン培養物においてＨ２Ｏ２誘導性死、グルタミン酸誘導性毒性、及びグルタミン酸誘導性細胞死を防ぎ；ラット網膜神経節細胞培養物において低酸素症を防ぎ；ウサギにおいて虚血性脊髄損傷後の回復を改善し；マウスにおいてＮＭＤＡの硝子体内注射による網膜損傷後の脳の視覚中枢のニューロンを保護し；ラットにおいて脳低酸素／脳虚血及び網膜虚血／再灌流を防ぎ；及びラットにおいて部分的視神経損傷後の二次変性の一定限度の保護を提供する。
【０１１１】
神経保護のためのロメリジンの投与には、いくつか欠点がある。最適な治療期間と比べて薬物の半減期が短いため（ヒトでの消失半減期１０８時間）、定期的なロメリジン投与が必要である。また、ラットにおけるロメリジンの経口投与後２４時間で、用量の５１．７％が糞便中に排泄され、及び４．１％が尿中に排泄されたことから、胃腸系によるロメリジンの取込みはそれほど効率的でないことが示唆される。従って、神経保護の先行するインビボ研究では、ロメリジンは、ラット及びウサギにおいて１０〜３０ｍｇ  ｋｇ−１の用量で少なくとも１日１回経口投与された。ナノ粒子を使用した送達系は、薬物のバイオアベイラビリティの向上を促進し、また、時間をかけた持続放出も可能にし得る。
【０１１２】
本報告では、本発明者らは、ロメリジンの細胞内送達に磁気蛍光ポリマーナノスフェアを使用する。図１ｃに示される、これらのナノスフェアの取込みは、ＰＣ１２ラット神経前駆細胞で実証されている。ＰＥＩ機能化は、ＰＣ１２細胞におけるこれらのナノスフェアの細胞取込みに必須である（図３ａ、図５ｄ）。ナノスフェアの調製については補足情報に詳述される。非修飾ナノスフェアの平均流体力学的径は、動的光散乱により計測するとき２１０ｎｍ（ＦＷＨＭ  １２０ｎｍ）であり（図１ｅ）、ＰＥＩの連結に付随する僅かなサイズ増加があった。ナノスフェアにおけるロメリジンの封入効率は、（７．１±１．３）％であった。ナノスフェアからのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中への薬物放出を、生理学的ｐＨ及び弱酸性ｐＨで評価した（図１０）。ポリマーナノスフェアから放出されたロメリジンの速度及び量は、ｐＨの上昇に伴い低下した；通常の生理学的ｐＨ（７．４）では、ロメリジンの放出は全ての時間点で検出可能限界未満であった。これらの実験では、シンク内のロメリジンの濃度は数時間後に最高値に達した；これは、生体内で起こるとは考え難いシンク溶液の飽和を反映するものであり得る。修飾ナノスフェアからのロメリジンの放出程度は、粒子表面上のＰＥＩにより低下した。これはおそらく、薬物とＰＥＩとの間の（これらは双方とも酸性溶液中で正電荷を有する）立体障害又は静電相互作用の結果と思われた。
【０１１３】
本発明者らは、先に、ＰＥＩ修飾ポリマーナノスフェアが２４時間以内にエンドソームに局在化することを実証した（図１ｄ）。初期エンドソームのｐＨは弱酸性であり、エンドソームが成熟するにつれて５未満に降下するため、ナノスフェアからのロメリジンの放出はこれらの条件下で引き起こされ得る。ここで本発明者らは、ナノスフェアを使用してＰＣ１２細胞にロメリジンを投与し、グルタミン酸塩誘発後の細胞内カルシウム濃度を計測することにより、ロメリジンの細胞内放出が神経保護に用いられ得るかどうかを調べた。ＰＣ１２細胞はＮ型及びＬ型の双方のＶＧＣＣを発現するが、Ｔ型チャネルは発現せず、及び未分化のＰＣ１２細胞では、２４時間にわたるグルタミン酸塩曝露（１〜１０ｍｍ）により酸化的ストレス及び［Ｃａ２＋］ｉの増加が生じる。ＰＣ１２におけるグルタミン酸塩関連毒性は、典型的なＮＭＤＡ受容体とは無関係であることが示されており、従ってＰＣ１２細胞株は、ロメリジンによるＬ型カルシウムチャネル遮断の評価に好適である。
【０１１４】
ナノスフェア処理を受ける細胞を、ＰＥＩによる修飾を有する又は有しないロメリジン含有ナノスフェア（それぞれＬＮＰ＋ＰＥＩ及びＬＮＰ−ＰＥＩ）、又はロメリジンは含有しないがＰＥＩ修飾を有するナノスフェア（ＥＮＰ）とインキュベートした。これらの処理群を、１μｍのロメリジンのみで処理した細胞（すなわち遊離薬物）と比較した。いずれの場合にも、ナノスフェアは２５μｇ  ｍＬ−１で添加し、これは、図１０のデータに基づけば、遊離薬物と同等か又はそれ以下のロメリジン濃度をもたらすと推定された。結果を図１１に示す。
【０１１５】
静止細胞（「未処理」）と比較して、［Ｃａ２＋］ｉは、空のナノスフェア（ＥＮＰ）で処理してグルタミン酸塩に曝露した細胞において有意に増加した（ｐ≦０．０１）。ＰＥＩ修飾ナノスフェア（ＬＮＰ＋ＰＥＩ）を使用して送達されたロメリジン、又は０．０１％ＤＭＳＯ中に溶解した遊離薬物として加えられたロメリジンは、グルタミン酸塩の存在下で［Ｃａ２＋］ｉの有意な（ｐ≦０．００１）低下を生じた；双方の経路とも同等に有効であった。ロメリジンを含有するがＰＥＩ修飾は有しないナノスフェア（ＬＮＰ−ＰＥＩ）では、空のナノスフェアで処理した細胞と比較して［Ｃａ２＋］ｉは低下しなかった（ｐ＞０．０５）。これはおそらく、こうしたＬＮＰ−ＰＥＩナノスフェアが細胞によってインターナライズされず、酸性のエンドソーム環境に曝露されなかったためと推定された。まとめると、これらの結果は、ナノスフェアからのロメリジン放出にはｐＨの降下が必要であること、及びＰＥＩ修飾ナノスフェアがこの薬物の細胞内放出に好適な媒体であり得ることを示唆している。
【０１１６】
しかしながら、薬物の放出はｐＨの低下に伴い任意の環境で起こり得るため、ポリマーナノスフェアのインターナリゼーションはロメリジン放出に必須ではない。ＣＮＳ傷害後、血管の離断により脳において嫌気的解糖への切換えが起こる；この結果、アシドーシスとして知られる細胞間隙におけるｐＨの低下が生じる。ｐＨは虚血中に約１単位下がり、重度の虚血中又は高血糖状態下ではｐＨ６．０未満に降下し得る。この状況で、本発明者らは、用量が傷害の程度に依存するナノスフェアからのロメリジン放出を予想し得た。従って、本発明者らは、記載したナノスフェアがそのＰＥＩ修飾形態でも、又は非修飾形態でも有用であり得ること、及び細胞内送達又は細胞間隙への放出を実現し得ることを示唆する。
【０１１７】
結論
多機能性ポリマーナノ粒子の使用は、インビトロでカルシウムチャネル遮断薬の細胞内送達を促進することが実証された。ナノスフェアからのロメリジンの放出は、この薬物のバイオアベイラビリティの向上を促進すると思われ、且つ弱酸性条件下における持続放出手段を提供し得る。ロメリジン単独では、神経外傷の結果として生じる二次損傷を予防するには不十分であり、神経化学的に誘導される変化を標的とするのみならず、軸索の再成長を許容する環境を惹起及び提供するためには、組み合わせの治療が必要になるものと思われる。ナノ粒子ベースの手法は、このような目的上、複数の治療ストラテジーを同時に送達する潜在力があり、有益であり得る。
【０１１８】
材料及び方法
薬物負荷ポリマーナノスフェアの調製
非自発乳化経路を用いてナノ粒子を調製した。酸化鉄ナノ粒子（１５ｍｇ）を分散させ、ＣＨＣｌ３とＭＥＫとの１：３混合物（６ｍＬ）にＰＧＭＡ（７５ｍｇ）及びロメリジンジヒドロクロリド（１０ｍｇ）を溶解することにより、有機相を調製した。この有機相を、トリス緩衝液（１０ｍｍ）中Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１０８（１．２５％ｗ／ｖ、３０ｍＬ）、ｐＨ９．０の水溶液に、高速で撹拌しながら滴下して添加した。得られたエマルションをプローブ型超音波処理器により低出力で１分間均質化した。有機溶媒を低速のＮ２流下に一晩蒸発させた。遠心（３０００ｇ、４５分）により、酸化鉄の大きい凝集体及び過剰なポリマーを除去した。ＰＥＩ修飾を有する試料について、上清をＰＥＩ（５０ｗｔ％溶液、１００ｍｇ）が入った５０ｍＬフラスコに取り出し、８０℃に１８時間加熱した。磁気高分子ナノスフェアを磁気分離カラム（ＬＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で回収し、トリス緩衝液（２×１．５ｍＬ）で洗浄し、次にろ液の流れが透明になるまでトリス緩衝液でフラッシュした。得られた濃縮粒子懸濁液を、凍結乾燥による定量化及び続く使用のためにアリコートに分けた。ナノスフェアは、組織培養実験で使用する直前に、遠心し、ＰＢＳに再懸濁し、紫外線照射により滅菌した。
【０１１９】
薬物放出
ｐＨ５．０、６．０及び７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、３７±０．１℃で実験を実施した。ナノスフェア（１０ｍｇ）をＰＢＳ（１０ｍＬ）に分散させ、このシンクから、試料を以下のとおり１０時間にわたりデュプリケートでサンプリングした。１５０μＬのアリコートをろ過管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−０．５、５０ｋＤａカットオフ）に移し、遠心し（１７，０００ｇ、５分）、Ｈ．Ｗａｋｉ，ａｎｄ  Ｓ．Ａｎｄｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  １９８９，４９４，４０８と同様の手順を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。計測は、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９紫外／可視検出器及びＣ１８カラム（１５０×４．６０ｍｍ、５μｍ、２５±５℃）と組み合わせたＷａｔｅｒｓ  ２６９５分離モジュールで、１０．０ｍＬ  ｍｉｎ−１の６９：３１アセトニトリル／０．１％リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）による均一濃度溶離を用いて実行し、２１０ｎｍで溶離液を観察した。各試料は１３分間流動化し、滞留時間９〜１０分の間の積分した最大ピーク面積を使用してロメリジン濃度を計算した。シンクに新鮮なＰＢＳは導入しなかった。標準曲線からロメリジン濃度を決定し、平均値±標準誤差として報告した。２１０ｎｍでの水中におけるロメリジンの検出限界は０．１μｇ  ｍＬ−１であった。
【０１２０】
細胞培養
ミシシッピ・メディカル・センター（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＭＳ）からラット褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）を入手し、３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、ポリ（ｌ−リジン）被覆ポリスチレンフラスコにおいて培養し、ウマ血清（１０％）、ウシ胎仔血清（５％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ  ｍＬ−１、１００μｇ  ｍＬ−１）、ｌ−グルタミン（２ｍｍ）、非必須アミノ酸（１００μｍ）及びピルビン酸ナトリウム（１ｍｍ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ＮＧＦによる細胞分化はなかった。
【０１２１】
細胞内カルシウムの定量化
実験のため、ポリ（ｌ−リジン）で被覆された１０ｍｍカバーガラスを含む２４ウェルプレートに、細胞を５．０×１０４ｍＬ−１の細胞密度で播種した。細胞を１２時間結合させた後、成長培地を、培地（ロメリジン、１μｍ；空のＰＧＭＡナノ粒子＋ＰＥＩ（ＥＮＰ）、２５μｇ  ｍＬ−１；ロメリジンを含むナノ粒子±ＰＥＩ（ＬＮＰ±ＰＥＩ）、２５μｇ  ｍＬ−１）で処理することにより交換した。０．０１％の非毒性終濃度でロメリジンをＤＭＳＯに溶解した。２４時間インキュベートした後、グルタミン酸塩を１０ｍｍの終濃度となるように添加した。さらに２４時間後、［Ｃａ２＋］ｉを以下のとおり定量化した。カバーガラスを、（ｍｍ単位で）ＮａＣｌ  １４０、ＫＣｌ  ５．４、ＣａＣｌ２  ２．５、ＭｇＣｌ２  ０．５、ＨＥＰＥＳ  ５．５及びグルコース  １１を含み、ｐＨを７．４に調整し、Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（１μｍ）を補足したＨＢＳ溶液に移し、３７℃で２時間インキュベートした。次に細胞を撮像した（励起３４０／３８０ｎｍ、発光５１０ｎｍ）。２波長の放出比はＲ＝Ｆ３４０／Ｆ３８０で表される。蛍光データを、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｕ倒立顕微鏡に取り付けたＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲデジタルカメラで計測し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ｖ６．３を用いて分析した。８細胞で較正を実施した。細胞を５μｍイオノマイシンに曝露し、定常状態最大値（Ｒｍａｘ）を得た。次に培地を、３ｍｍ  ＥＧＴＡを含有するＣａ２＋不含ＨＢＳと交換し、定常状態最小値（Ｒｍｉｎ）を得た。［Ｃａ２＋］ｉを以下の式に従い計算した：
【数１】
2014500266.tif 000003
式中、Ｒｍｉｎ＝０．６１±０．０２、Ｒｍａｘ＝１．５７±０．２１、ｂ＝１．０９は、０ｍｍＣａ２＋及び２．５ｍｍＣａ２＋で３８０ｎｍで照射する間の蛍光強度の比であり、及びＫｄ＝２２４ｎｍは解離定数である。
【０１２２】
実施例３．乳房及び結腸の自所性腫瘍の退縮：マルチモーダルナノ粒子を用いた生体ドラッグデリバリー
本発明のマルチモーダルナノ粒子（ＰＥＩＮＰ）は、超常磁性（ｓｕｐｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）コア；高い正電荷のＰＥＩ分枝を有し、且つｓｈＲＮＡ、小オリゴ及びｍｉＲＮＡの高いトランスフェクション効率を示したが、これをインビトロ及びインビボ条件下で調べた。ＰＥＩベースのナノ粒子は、共焦点イメージング及びこうしたナノ粒子の可視化を目的として、ローダミンと連結される。本出願者は、さらに、ナノ粒子上に負荷した機能性遺伝子ｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡがその適切な自所性腫瘍部位に送達され、腫瘍退縮を有効に促進した可能性があることを示した。超常磁性（ｓｕｐｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）コアにより生じるハイパーサーミアが、トランスフェクション効率の増加及び腫瘍の中心部壊死に対する効率的なドラッグデリバリーに有効であった。
【０１２３】
結果
マルチモーダルナノ粒子の合成及び特性決定
多くの場合に、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの生物学的薬物を産生することが可能なより大きい分子又はより小さい分子を、正しい濃度でその適切な１つ又は複数の標的に送達することが不可欠である。そのような場合、分子は、送達用の適切な薬物キャリアに負荷されることになる。ＰＥＩＮＰとベクターＤＮＡとの、並びにより小さいオリゴとの適切な結合比を評価するため、材料及び方法に記載されるとおり様々な濃度のナノ粒子及びＤＮＡにより予備実験を実施した。これらの実験から、オリゴがナノ粒子と結合するには１：４（ＰＥＩＮＰ−ＤＮＡ（Ｐ：Ｎ））の比が理想的であり（図１２ａ）、ベクターＤＮＡのナノ粒子との結合には１：２０（Ｐ：Ｎ）が最適であった（図１２ｂ）ことが示され、これらをさらなる実験の全てにおいて使用した。
【０１２４】
付着、半付着及び非付着細胞株におけるＰＥＩＮＰによるトランスフェクション
一般に、利用可能なトランスフェクション剤を使用した遺伝子サイレンシング及びノックダウン実験は、技術上の固有の限界が妨げとなって１００％の成功率を達成できない。この点で、現在利用可能なトランスフェクション試薬の大多数は、ＨＥＫ２９３及びＮＩＨ３Ｔ３などの通常の付着細胞株で６０〜７０％の最大効率（図１３ａ、図１３ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ７などのトランスフェクトが困難な癌細胞株で約４０〜５０％の最大効率（図１３ｃ、図１３ｄ）を促進する。ｃｏｌｏ２０５などの半付着細胞株（図１３ｅ）及びジャーカットなどの非付着細胞株（図１３ｆ）は、任意の種類のトランスフェクション試薬を使用する際に今なお扱い難く、且つ利用し難いままである。電気穿孔が、効率は低いものの、半付着及び非付着細胞をトランスフェクトする唯一のトランスフェクション代替法と考えられる。従来のトランスフェクション試薬によると相当な割合の細胞がトランスフェクトされないまま残るため、遺伝子効果の完全なノックダウンを達成するのは不可能であるように思われた。
【０１２５】
新規に開発したマルチモーダルナノ粒子のトランスフェクション効率を、緑色蛍光タンパク質を発現するベクターＤＮＡと連結されたナノ粒子を使用することにより、一組の付着、半付着及び非付着癌細胞株で独立して評価した。ＤＮＡを担持するナノ粒子のトランスフェクション効率は、２つのタイプのヒト付着細胞株ＨＥＫ２９３及びＮＩＨ３Ｔ３（図１３ｇ、図１３ｈ）、乳癌細胞株ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１（図１３ｉ、図１３ｊ）の全てにおいて完全であった。ｃｏｌｏ２０５及びジャーカットを含む不応性細胞株における有意なトランスフェクション効率もまた実証された（図１３ｋ、図１３ｌ）。ＦＡＣＳ分析により、付着、半付着及び非付着細胞を含む任意の種類の細胞株をトランスフェクトするトランスフェクション剤としてのナノ粒子の効力がさらに裏付けられた（図１４）。
【０１２６】
ＰＥＩＮＰと連結されたマイクロＲＮＡオリゴを使用した標的タンパク質のノックダウン及び回復
マイクロＲＮＡは２２〜２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子であり、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲと優位に結合し、翻訳阻害又は完全分解のいずれかを引き起こすことにより、標的遺伝子の発現をシャットダウンする。Ｈｓａ−ｍｉＲ−２１は、種々の癌型の発症に関与する重要な腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３の負の調節因子であることが知られている。ナノ粒子によって担持されたより小さいＲＮＡの機能性を裏付けるものとして、ｍｉＲ２１ノックダウンプローブを使用してトランスフェクション試験を実施した。標的遺伝子の回復効率を、ｍｉＲ−２１を線状ＰＥＩＮＰと連結することによりＨＥＫ２９３並びにＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株で試験し、ｑ−ＰＣＲ、免疫蛍光法及びウエスタンブロッティングを用いてｐ５３遺伝子及びタンパク質の発現をアッセイした。双方の細胞株においてｐ５３遺伝子の効率的な回復が認められた（図１５ａ、図１５ｂ）。同様に、ジャーカット細胞株に対し、ＰＥＩＮＰと連結した後にｍｉＲ２００Ｃ及びｍｉＲ１０５ミミックをトランスフェクトし、ｑ−ＰＣＲ及びウエスタンブロッティングにより標的タンパク質ｂ−カテニンのノックダウンについてアッセイした（図１５ｃ）。ジャーカットなどのこれらの非付着細胞株における標的タンパク質の完全なシャットダウンから、生体内で使用される新規トランスフェクション剤としてのＰＥＩＮＰの効率が示された。
【０１２７】
機能性遺伝子はＰＥＩＮＰ介在性トランスフェクションによってサイレンシングされる
ＰＥＩＮＰによる大型ベクターＤＮＡコンストラクトのより高いトランスフェクション効率を改めて確認するため、標的遺伝子ＧＡＰＤＨに対するｓｈＲＮＡの形成をもたらし、それによりそのシャットダウンをもたらすものと思われるｐＧＩＰＺベクターにクローニングした陽性対照遺伝子ＧＡＰＤＨ  ｓｈＲＮＡを、ナノ粒子と１：２０の比（Ｐ：Ｎ）で連結し、トランスフェクションに使用した。ＨＥＫ２９３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びジャーカット細胞株などの３つの異なる細胞株におけるＧＡＰＤＨのシャットダウン効率を、免疫細胞化学、ｑ−ＰＣＲ分析及び免疫ブロット法を用いて確認した（図１６ａ、図１６ｂ、図１６ｃ）。これらのＧＡＰＤＨシャットダウン実験から、大きいＤＮＡベクターを担持し、種々のトランスフェクションが困難なトランスフェクト細胞型をトランスフェクトし、細胞においてＤＮＡを送達して、ひいては標的遺伝子を効率的にシャットダウンするＰＩＥＮＰの能力のエビデンスが提供された。
【０１２８】
ＰＥＩＮＰを使用したインビトロでの癌遺伝子ｃ−ｍｙｃの機能シャットダウン
ｃ−ｍｙｃは、癌遺伝子と腫瘍抑制遺伝子との間の中心的な発癌スイッチである。その遺伝子変異は米国の癌による死亡の７分の１を占め、そのため多くの研究が、癌生物学におけるｃ−ｍｙｃの役割の理解に向け、新規治療手法を求めて進められている。適切なベクターｐＧＩＰＺ（Ｏｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にクローニングしたｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡを、インビトロで機能性遺伝子シャットダウンを明らかにするため選択した。ナノ粒子と連結したｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡ（１：２０）を、材料及び方法に記載されるとおり、３つ全ての細胞株にトランスフェクトした。免疫細胞化学実験から、対照と比較して数倍のｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡによる標的遺伝子ｃ−ｍｙｃのシャットダウンが示された。これは、全ての細胞株でｑ−ｐｃｒ及びウエスタン法によりさらに裏付けられた（図１７ａ、図１７ｂ、図１７ｃ）。従って、ＰＥＩＮＰは、種々の細胞株における生物学的薬物の有用なキャリアを提供する。
【０１２９】
乳癌モデルにおける体内分布及び浸透ｃ−ｍｙｃ−ｓｈＲＮＡ−ＰＥＩＮＰ並びに自所性腫瘍の退縮
インビボでＰＥＩＮＰの体内分布を理解するため、６〜８ヶ月齢の、天然の腫瘍を生じるＢｒｃａ２／ｐ５３ノックアウトマウス乳癌モデルを選択した。腫瘍辺縁部への腫瘍内注射を、ＰＥＩＮＰと結合したｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡ（１：２０）を使用して、各３〜４匹マウスの６コホートで実施した。ｃ−ｍｙｃ  ＤＮＡ、ＰＥＩＮＰ単独及びアレスチンと結合したＤＮＡを、同様の反復試験で対照として使用し、腫瘍の中心部へのナノ粒子の浸透性及び分布を試験した。注射を受けたマウスを磁場下に置き、浸透及び局在化を可能にした。ライブイメージングから、腫瘍のみに限定されたローダミンの蓄積が示され、強度は中心部領域で最大であった（図１８ａ）。注射は腫瘍辺縁部に行ったが、腫瘍中心部及び辺縁部の全体にわたり均等なＰＩＥＮＰ分布が認められ、これは共焦点顕微鏡法によっても確認された（図１８ｃ）。ＰＥＩＮＰの鉄コアが、核磁気イメージングによりＮＰ分布を腫瘍の中心部壊死までトレースした（図１８ｂ）。ｃ−ｍｙｃ−ｓｈＲＮＡ−ＰＥＩＮＰにより処理した腫瘍は、成長が止まり、また、対照と比較して退縮の徴候も示し始めた（図１８ｄ、図１８ｅ）。処理したマウスコホートの生存率は、未処理コホートと比較して２０日延長された（図１８ｆ）。処理した腫瘍のｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学から、未処理腫瘍と比較してｃ−ｍｙｃレベルの有意な低下が示された（図１８ｇ、図１８ｈ）。ＰＥＩＮＰの体内分布は腫瘍のみに限定され、他の臓器にはなく、腫瘍の中心部壊死までＰＥＩＮＰが標的化して送達されたことが示された。
【０１３０】
ＰＥＩＮＰ−ｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡは結腸に選択的に滞留した
タモキシフェン及びｂ−ナフトフラボン注射により誘導した結腸癌モデル（Ａｐｃ  ｆｌ／ｆｌ）は腸に重篤な病変を来たし、マウスは通常、７日の期間内に死亡する。レポーター遺伝子としてのｔｕｒｂｏ−ＦＰを有するｃ−ｍｙｃ−ｓｈＲＮＡを、ナノ粒子を使用してこれらのモデルに経口送達した。ＰＥＩＮＰを経口投与したマウスの共焦点イメージングから、結腸に優位なローダミンの存在が示され、これは結腸領域におけるＰＩＥＮＰの滞留を示していた（図１９ａ）。食道、胃、小腸及び大腸などの他の臓器では、極微量のローダミンが観察された（図１９ａ）。ｔｕｒｂｏ−ＦＰ  ＤＮＡもまた腸においてのみ検出され、これは、ＤＮＡの放出を伴うナノ粒子の選択的な滞留を示していた（図１９ｂ）。ネイキッドＤＮＡ又はＤＮＡ単独をアレスチンと共に経口投与した場合、腸領域にｔｕｒｂｏ−ＦＰ  ＤＮＡは認められなかったことから、ネイキッドＤＮＡは消化管に滞留しないことが示された。これにより、生物学的薬物を選好的に結腸に送達する理想的なキャリアとしてＰＥＩＮＰを用い得ることが明確となった。
【０１３１】
マウス胚におけるＰＥＩＮＰ−ＤＮＡのエンブリオフェクション
トランスジェニック技術及びターゲッティング技術は、高等動物における低いトランスジェニック産生率によって制約されている。マウスは、生体内で様々なヒト疾患状態を反映する理想的なモデル系である。これらのモデル系は、癌を含む様々な疾患の惹起及び進行をモニタするのに理想的なプラットフォームを形成する。しかしながら、トランスジェニックマウスの産生率は、その技術によりわずか４〜６％に制限されている。これは、基本的には、マイクロインジェクションによって外傷を受ける胚の生存率の低さに起因する。手作業での取り扱いを最小限に抑えることによってより良好なトランスジェニック産生頻度を達成する可能性を探るため、ＰＩＥＮＰを使用して遺伝子を導入することが可能かどうかを調べた。ＤＮＡをヘキスト染料で染色し、洗浄した後、それを使用して、胚内部における導入したＤＮＡの可視化用にナノ粒子と連結した。胚をＰＩＥＮＰ−ＤＮＡ複合体と共にインキュベートし、磁気プラットフォーム上に維持した。４８時間後、胚内部にＧＦＰ発現も見えた（図２０）。これは、ナノ粒子がインキュベーション中に胚内部へのＤＮＡの送達を完遂できたことを示していた。これを、胚におけるこのＰＥＩＮＰ介在性ＤＮＡデリバリー用のエンブリオフェクションと称した。この技術を用いてトランスジェニックマウスの産生を確立するには、これらの胚を代理母に移し替える必要がある（図２１）。
【０１３２】
結論
本発明は、生物学的分子をその適切な目標地点に送達することが可能なポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｌｅｉｍｉｎｅ）ベースのｐＨ感受性マルチモーダルナノ粒子を提供する。このような粒子を薬物キャリアとして用い得るかどうかを決定するため、付着細胞及び非付着細胞の双方について、ＰＥＩＮＰをウイルス形質導入と等しい効率でｓｈＲＮＡ、小オリゴ及びｍｉＲＮＡの送達に用い得るかどうかを試験した。ＰＥＩＮＰは、機能性遺伝子の標的サイレンシング用ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのキャリアとして、例えばマウスにおける癌の退縮をもたらしたｃ−ｍｙｃ遺伝子の下方制御において使用できることが実証された。従って、本発明のＰＥＩＮＰは、癌及び他の疾患及び障害に対抗するための、及び無数の薬物標的のバリデーションのための、非毒性であるとともに非侵襲性である治療手法において用いられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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