(57)【要約】  樹脂層が塗布されかつ検知機能を有する少なくとも１つの物質を含む表面を備える血液凝固時間測定センサであって、  樹脂層はラッカーシステムを備え、上記ラッカーシステムは：  i)表面上の、検知機能を有する少なくとも１つの物質の固定化に適しており；  ii)負荷電表面層を提供し；  iii)化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物により、生物学的血液凝固プロモータを置換することを可能とすることを特徴とする、血液凝固時間測定センサ。【選択図】図１
2014514590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂層が塗布されかつ検知機能を有する少なくとも１つの物質を含む表面を備える血液凝固時間測定センサであって、
前記樹脂層はラッカーシステムを備え、前記ラッカーシステムは：
i)前記表面上の、前記検知機能を有する前記少なくとも１つの物質の固定化に適しており；
ii）負荷電表面層を提供し；
iii）化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物により、生物学的血液凝固プロモータを置換することを可能とする
ことを特徴とする、血液凝固時間測定センサ。
【請求項２】
前記負荷電表面層は、前記化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物によりもたらされる、請求項１に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項３】
前記ラッカーシステムは、負荷電アクリル酸系電着ポリマーである、請求項１又は２に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項４】
前記負荷電アクリル酸系電着ラッカーは、Ｒｅｓｙｄｒｏｌのラッカーファミリーから選択される、請求項３に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項５】
前記樹脂層は更に、ベントナイト、珪藻土等の負荷電粘土材料、又は酸化カーボンナノチューブ等の他の負荷電添加物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項６】
前記検知機能を有する前記少なくとも１つの物質は、荷電化合物を与えるために酵素によって切り離すことができる１つの末端結合を有する少なくとも１つの化学物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項７】
荷電化合物を与えるために酵素によって切り離すことができる１つの末端結合を有する前記化学基質試薬は、電流生成トロンビン基質であり、前記酵素はトロンビンである、請求項６に記載の血液凝固時間測定センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主たる生物学的成分を、化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物で置換することによって貯蔵寿命を増大させた、血液凝固時間測定センサに関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、センサ上に堆積させた試薬組成物が、荷電及び／又は酸化還元活性基を放出することにより、トロンビン酵素によって末端断片を選択的に切り離すことができる化学基質を含む場合に、電流測定法等の電気分析法によってプロトロンビン時間（ＰＴ）を決定できる血液凝固時間測定センサに関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固時間、即ち血液成分の、出血のリスクを防止するための凝血塊を形成するための適性を検査することは、通例の実験の一部である。例えば、心臓病の場合の抗凝血剤を用いた処置中には、過剰投与の場合の出血のリスクを回避するために、又は逆に抗凝血剤の投与量が不十分である場合の血栓症のリスクを回避するために、医薬の用量を正確に調製できることが必要である。
【０００４】
血液凝固カスケードは２つの経路、即ち内因系経路及び外因系経路に関わる。両経路は複雑であり、多数の異なる凝固因子と関連する。従って、いわゆる「Ｑｕｉｃｋ」時間を患者の血液凝固時間に関する値として測定するために、経口抗凝血処置が必要とされることが多く、これは一般に複雑な化学的性質である。この化学的性質は通常、負荷電脂質表面を提供する物質及び生物由来のトロンボプラスチン（組織因子）のような血液凝固プロモータを含む。
【０００５】
この決定を実施するために様々なパラメータが使用されてきたが、最も一般的なものは、活性化後のプロトロンビン時間（ＰＴ）、即ち患者から採取した血液サンプルに凝血塊の形成が観察された後の期間を測定することである。このようなインビトロ測定システムでは、負荷電リン脂質と、組織因子を含有する脳の生理食塩水抽出物「トロンボプラスチン」とのエマルジョンを添加することによって凝固時間を短縮でき、これによって測定時間を減少させる。
【０００６】
このタイプの化学的性質は、このような測定システムを使用及び製造する者には公知であり、特に在宅医療用血液凝固測定システムの開発は、より堅牢な化学的性質の開発を促してきた。
【０００７】
従って、本発明の１つの目的は、このような血液凝固時間測定センサに固有の、生化学的血液凝固カスケードに関わる不安定な生物学的成分によるものである不安定性を回避することである。
【０００８】
特許文献１は、全血の１滴の凝固時間を表す値を測定するための電気化学的システムを開示し、ここでは特定の試薬が固定化されており、この試薬は少なくとも１つの化学基質を含み、この化学基質の１つの末端結合をトロンビン酵素によって切り離して酸化還元活基を与えることができる。トロンビンがトロンビン基質を消化すると、荷電基が放出され、作用電極へと移動する。放出された基の酸化又は還元によって生成される電流を作用電極で測定し、これを凝固時間を表す値と互いに関係づける。
【０００９】
特許文献１に記載のセンサシステムには、相当な最適化が必要である。特に、生物学的血液凝固プロモータの使用には、所定の安定した反応環境が必要であり、この環境では媒質が所定のｐＨに維持され、十分なイオン強度を有する。また、生物学的血液凝固プロモータは、特に温度が可変である又は上昇する場合に安定性が制限され、これによって関連するセンサの貯蔵安定性が制限される。更に、生物学的血液凝固プロモータは天然原料から得られるため、バッチ間での特性の変動が確実に発生する。よって、生物学的血液凝固プロモータに関わる再現性を有するセンサの最適化および製造は困難なままである。特許文献１はまた、使用する組織因子のリン脂質成分がプロトロンビン時間の決定に影響を与えることも開示している。反対のＰＳ／ＰＣ比を有する脂質を有する組織因子では、負荷電リン脂質の量が正荷電リン脂質の量より多く、これにより信号（信号の高さ及び信号の線形性）の良好な決定が可能となる。このような複雑な化学的性質、即ちシステムの血液凝固プロモータとして生物学的化合物を有する必要があることの欠点は明らかである。
【００１０】
特に患者の血液凝固時間の測定のための在宅医療用システムの開発には、貯蔵期間等の因子の監視の重要度が下がり、温度及び湿度などの貯蔵条件も重要ではなくなるよう、センサの可能な限り堅牢な化学的性質が必要である。先行技術に記載された血液凝固時間測定システムは一般に、４℃で貯蔵する必要があり、貯蔵期間は通常１年を大きく超えることができない。このような貯蔵条件は当然、このようなセンサを冷却状態を維持したまま流通させることも必要とする。更に、センサ調製中の生物学的血液凝固プロモータの組込みのために、センサ製造プロトコルは、温度上昇、有機溶媒及び迅速な乾燥を回避しなければならない。最後に、生物学的物質はロット毎に同一ではないため、生物学的材料を使用する場合、製造工程中の多数のセンサの個別の較正は絶対に必要となる。生物由来の全材料を完全に除去できる場合、貯蔵のための条件調整の必要及び最大貯蔵時間それ自体の両方の重要性が低下する。
【００１１】
上述の理由から、先行技術に記載された血液凝固時間測定センサの欠点を克服でき、かつ血液凝固時間の測定のための在宅医療用システムに使用するのに適したシステムが必要であった。本発明が対処すべき課題は、貯蔵寿命が増大した血液凝固時間測定センサを提供することであった。
【００１２】
検知要素の表面上での固定化は、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２にそれぞれ開示された、吸収、架橋又はポリマーフィルム内への包含によって実施できる。検知素子は通常、例えば特許文献３に開示されているようなラジカル重合、非特許文献３に開示されているようなリソグラフィ法、又は非特許文献４に開示されているようなプリント法によって表面上に堆積させたマトリクス内に埋め込まれる。
【００１３】
特許文献４は、センサ表面に検知素子を固定化するための、より汎用性の高い電着方法の使用を開示している。特許文献４から、食用缶詰内部の保護層として使用されるタイプの層の電着のための様々なタイプの電気重合性ラッカーを、酵素の固定化のためにも使用でき、これによってこれら酵素の酵素活性を維持できることが公知である。
【００１４】
このような方法の別の例が非特許文献５に挙げられており、ここではエタノール検知のための電流測定センサが開示されている。アルコールオキシダーゼをレジドロールラッカーフィルム内のセンサ表面に電気化学的に堆積させる。非特許文献６は、アニオン電着レジドロールラッカー等の電着ラッカーを用いたフラボシトクロムｂ2の電着を開示している。非特許文献７による別の例では、アクリル酸系ポリマーのライブラリの組合せ合成及び電流測定バイオセンサ用固定化マトリクスとしてのそれらの評価を開示している。
【００１５】
本発明の１つの目的は、特許文献１に開示されたような電流生成トロンビン基質の固定化を可能とする、上述のようなラッカーシステムを開発することであった。
【００１６】
本発明の別の目的は、上記ラッカー材料により、血液凝固カスケードを進行させるための要件として上述したような負荷電表面を同時に提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第６３５２６３０号
【特許文献２】米国特許第３８３９１７５号
【特許文献３】欧州公開特許第０６９１４０８号
【特許文献４】米国公開特許第２００３／０１５３０６１号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｔｒｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１０（１９９５）６１−６６
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１２１（１９９５）１−２９
【非特許文献３】ＭｃＧａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９（１９９７）５０８１
【非特許文献４】Ｇ．Ｆ．  Ｋｈａｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，９（１９９７）３２５−３２９
【非特許文献５】Ｓｈｋｏｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２６，Ｉｓｓｕｅｓ  ２−３，４１１−４１４
【非特許文献６】Ｓｍｕｔｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０，１２８５−１２９０
【非特許文献７】Ｎｇｏｕｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４９，３８５５−３８６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、貯蔵寿命が増大した改良されたセンサを提供することにより、先行技術の血液凝固時間測定システムに存在する欠点を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
従って本発明は、樹脂層が塗布されかつ検知機能を有する少なくとも１つの物質を含む表面を備える血液凝固時間測定センサに関し、樹脂層はラッカーシステムを備え、上記ラッカーシステムは：
i）表面上の、検知機能を有する少なくとも１つの物質の固定化に適しており；
ii）負荷電表面層を提供し；
iii）化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物の組込みにより、生物学的血液凝固プロモータを置換することを可能とする
ことを特徴とする。
【００２１】
本発明によると、血液凝固カスケードの主たる生物学的成分を、化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物で置換することによって、貯蔵寿命の増大が達成される。同時に、このようなシステムの測定時間は、血液凝固プロモータとして機能する生物学的化合物に基づくセンサと比較して、有意に延長されることはない。
【００２２】
本発明によると、センサ表面に固定するのに適した樹脂層により、血液凝固時間の測定におけるセンサの機能を損なうことなく、化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物による主たる生物学的成分の置換が可能となる。
【００２３】
好ましくは、上記化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物は樹脂自体から形成され、適切な負荷電側鎖をポリマー主鎖に導入することにより、それ自身で負電荷を有するように設計できる。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、ラッカーシステムに組込まれた化学的に不活性かつ安定である非生物学的化合物により負荷電表面層を提供する。負荷電材料は樹脂中で、上述のトロンビン基質と共に固定化できる。これらの上述の化学的に不活性かつ安定である非生物学的化合物は、ベントナイト、珪藻土等の負荷電粘土材料、又は酸化カーボンナノチューブ等の他の負荷電添加物からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、上記ラッカーシステムは非伝導性アニオン電着ラッカーを含み、好ましくは上記ラッカーは、可変性モノマー組成物を有する負荷電アクリル酸系電着ポリマーからなる群から選択される。ｐＨ値を変化させると、上記ラッカーシステムの可溶性は低下する。ｐＨ値を上昇させると可溶性が低下するラッカーシステムはカチオン電着ポリマーと呼ばれ、ｐＨ値を低下させると可溶性が低下するラッカーシステムはアニオン電着ポリマーと呼ばれる。
【００２６】
本発明のある実施形態では、検知機能を有する少なくとも１つの物質は、自由拡散酸化還元活性化合物を与えるために酵素によって切り離すことができる１つの末端結合を有する少なくとも１つの化学物質を含む、特定の試薬を含み、好ましくは、酸化還元活性化合物を与えるために酵素によって切り離すことができる１つの末端結合を有する上記化学物質試薬は電流生成トロンビン基質であり、酵素はトロンビンである。
【００２７】
本発明は更に、このような凝固時間センサを製造する方法を包含する。
【００２８】
好ましい実施形態では、本方法はラッカーシステムを含む樹脂層を表面上に堆積させること、及び乾燥によって樹脂層を表面に固定することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明のセンサを用いてサンプルにおける血液凝固時間を測定するための測定装置の斜視図である。
【図２】図２は、センサの電極にわたって電流を生成できる化学反応を描写した、特許文献１に既に示されている概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、センサ表面上の堆積溶液の固定化方法の比較であり、トロンボレル不在下における電着と乾燥との対比を示し、１０回の堆積パルスでのポリマー沈殿を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、センサ表面上の堆積溶液の固定化方法の比較であり、トロンボレル不在下における電着と乾燥との対比を示し、乾燥によるポリマー沈殿を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、センサ表面上の堆積溶液の固定化方法の比較であり、トロンボレル不在下における電着と乾燥との対比を示し、電着に関する測定結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、センサ表面上の堆積溶液の固定化方法の比較であり、トロンボレル不在下における電着と乾燥との対比を示し、乾燥に関する測定結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、センサの１か月貯蔵安定性の比較であり、堆積溶液はセンサ表面に電着により固定化した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、センサの１か月貯蔵安定性の比較であり、堆積溶液はセンサ表面に単純な乾燥により固定化した。
【図５Ａ】図５Ａは、少量のカーボンナノチューブを添加して製造したセンサに関するグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、少量のカーボンナノチューブを添加して製造したセンサに関するグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、より多量の負荷電カーボンナノチューブの存在下で製造したセンサに関するグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、より多量の負荷電カーボンナノチューブの存在下で製造したセンサに関するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、血液凝固時間測定センサに関する。図１に示す測定装置は、サンプルにおける血液凝固時間を測定するために本発明による血液凝固時間測定センサを使用できる機器の一例を示す。この測定装置は特許文献１から公知である。
【００３１】
測定装置１は、２つの成形されたプラスチック部材４ａ、４ｂを組み立てることで構成されるケース３を含み、上側部材４ａは表示パネル５用の窓、及び様々な表示モードへのアクセスを可能とする制御ボタン６用の開口を含む。
【００３２】
ケース３内に含まれる電子回路は、例えば既に示した電流測定によって、グルコース分析に使用される回路を改造したものであり、凝固時間を表示するための異なる電気信号パラメータという点のみがこれと異なっている。
【００３３】
測定装置１はまた、ケース３の２つの部材４ａ、４ｂの間に設けられたスリット７を含み、接触領域８を有するセンサ２の一部がこのスリット７内へと導入される。測定領域９を含むセンサ２の他の部分は、血液サンプルを受容するためのものであり、これは全測定時間中、装置１の外側にある。先行技術の測定装置の大半では、サンプルは装置の内部の、一般に３７℃に温度調節されたエンクロージャ内へと導入され、これは更なる電力消費につながる。
【００３４】
本発明によるシステムでは、サンプルは温度調節されたエンクロージャ内に導入されず、必要であれば、周囲温度に応じて電気信号パラメータを調整するために、装置上のスリット７の近傍に加熱プローブ１０を容易に設けることができ、この場合の電力消費は、エンクロージャの温度調節に必要な電力消費よりも大幅に少ない。
【００３５】
センサ２は、例えばＰＥＴ製である薄板プラスチック支持体１１を含み、これはその全長にわたって２つの集電器１２、１３を支持し、これら２つの集電器１２、１３はこれらを電気的に絶縁する小さな空間１４によって分離されている。
【００３６】
支持体１１及び集電器１２、１３は絶縁コーティング１５でコーティングされており、またこのコーティングには各端部近傍に２つの窓８、９が切り込まれており、これにより集電器１２、１３の一部を露出させることができる。第１の窓８によってセンサ２を測定装置１に電気的に接続でき、その一方で第２の窓９は測定領域を構成し、集電器の目視できる部分はそれぞれ作用電極１６及び基準電極１７を構成する。
【００３７】
作用電極１６は例えば、白金の薄片を積層させることで作製され、基準電極１７は後に塩素処理される銀の薄片を積層することで作製され、これによって基準電極を同時に形成する。測定領域９に作用電極、基準電極及び対電極を別個に設けることもできる。プロトロンビン時間（ＰＴ）を測定できるようにするために、以下に詳細に説明する特定の試薬１８で作用電極をコーティングする。
【００３８】
センサ上に堆積させる本発明の試薬化合物は、荷電及び／又は酸化還元活性基を放出することにより、トロンビン酵素によって末端画分を選択的に切り離すことができる化学基質を含む。
【００３９】
適切な基質及び基質の群は、特許文献１及び特に米国特許第６４９５３３６号に既に記載されている。
【００４０】
特許文献１に記載されているように、適切なオリゴペプチド基質はトロンビン酵素部位の立体特異的構成を有し、これにより、一般に脱離基（ＬＧ）と呼ばれる荷電末端部分を切り離すことができる。使用する基質は、オリゴペプチド誘導体又はその塩のうちの１つが、アルギニンに加えて、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、アラニン（Ａｌａ）、３−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）及びグリシン（Ｇｌｙ）から選択される少なくとも１つの他のラジカルアミノ酸を含むことを特徴とし、上記アミノ酸はＬ型、Ｄ型又はＤＬ型とすることができる。
【００４１】
同様に、本発明の条件下ではアルギニン（Ａｒｇ）の酸基と容易に反応しなければならず、トロンビンによって切り離すことができなければならず、かつ十分な電荷を有さなければならない脱離基（ＬＧ）は、好ましくはアニリン、キノリルアミン及びナフチルアミン誘導体から選択され、これらは場合によってはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、アルカノイル、アニリノ及びアミノフェニルラジカルから選択される１つ又は複数の置換基で置換され、またこれらラジカルも置換され得る。
【００４２】
オリゴペプチドは、その鎖の脱離基ＬＧを含む端部と反対側の端部によって作用電極に固定化される。従ってオリゴペプチド鎖の第１のアミノ酸、好ましくはその末端アミノ官能基の水素は保護基Ｒで置換され、この保護基Ｒは、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｏｓ（ｐ−トルエンスルホン）、ｔ−Ｂｕｐｓ（ｔｅｒｔ−ブチルフェニルスルホニル）、Ｍｅｓ（メチルスルホニル）、Ｎａｐｓ（２−ナフチルスルホニル）、Ｂｚｏ（ベンゾイル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、イソプロピルスルホニル、カンファースルホニル酸から選択される。
【００４３】
好ましい実施形態によると、保護基、α−アミノ酸及びその鎖形成、並びに脱離基は、以下のオリゴペプチド基質：
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３−クロロ−４−ヒドロキシアニリド
Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３−クロロ−４−ヒドロキシアニリド
Ｂｏｃ−（Ｄ）−Ｃｈｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−３−クロロ−４−ヒドロキシアニリド
Ｈ−（Ｄ）−Ｃｈｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−３−クロロ−４−ヒドロキシアニリド
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−２−クロロ−４−ヒドロキシアニリド
及びこれらの相溶性無機又は有機塩
を有するよう選択される。
【００４４】
特定の試薬の組成物中のオリゴペプチドは一般に、例えば塩酸（ＨＣｌ）、酢酸又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて形成されたこれらの塩のうちの１つの形態で使用される。
【００４５】
図２は、特許文献１に既に示されている概略図であり、電子検出回路（図示せず）によって接続された電極１９、２０にわたって電流を生成できる化学反応を描写している。式Ｒ１−ＡＡ２−ＡＡ１−Ａｒｇ−ＬＧ（ＡＡ１及びＡＡ２は既に示したような他のアミノ酸を表す）で概略的に示すことができる基質を、オリゴペプチドの方向を決定する基Ｒ１によって作用電極１９に接続し、この基質の鎖の他端は既に定義したような脱離基ＬＧを含む。この図の左側では、トロンビン酵素がアルギニンと上記脱離基ＬＧとの間の接続を選択的に切り離すことがわかる。この図の右側では、放出された脱離基が電極２０の方へと移動でき、放出された脱離基ＬＧの数に比例する、従ってサンプル中で形成されたトロンビンの量に比例する電流を生成できることがわかる。
【００４６】
米国特許第６４９５３３６号に既に記載されているような、本発明のセンサで使用するのに更に適切なトロンビン基質は、
式（I）
【００４７】
【化１】
2014514590.tif 000003
【００４８】
のオリゴペプチド誘導体及びその塩であり、
ここでＲ1は、
（ａ）水素原子、任意にω位にアミノ基を有するＣ2-8−アルカノイル基、ｐ位のフェニルラジカルがアミノ基で任意に置換されたフェニル−Ｃ2-4−アルカノイル基；又は
（ｂ）４位がアミノメチルラジカルで任意に置換されたシクロヘキシルカルボニル基、ｏ若しくはｐ位がメチル、アミノ若しくはハロゲンで任意に置換されたベンゾイル基、Ｃ1-8−アルコキシカルボニル基、ｐ位がメトキシ、メチル若しくは塩素で任意に置換されたベンジルオキシカルボニル基；又は
（ｃ）Ｒ5がＣ1-6−アルキルラジカル、任意に置換されたアリール若しくはヘテロアリールラジカル、若しくは二環式テルペン誘導体のラジカルであってよい、式−ＳＯ2−Ｒ5のラジカル；又は
（ｄ）Ｒ6が水素、Ｃ1-6−アルキルラジカル、１−若しくは２−ヒドロキシエチルラジカル、メチルメルカプトエチルラジカル、アミノブチルラジカル、グアニジノプロピルラジカル、カルボキシ−Ｃ1-4−アルキルラジカル、カルボキサミド−Ｃ1-4−アルキルラジカル、フェニルラジカルがＯＨで任意に置換されたフェニル−Ｃ1-4−アルキルラジカル、ハロゲン、Ｃ1-4−アルキル若しくはメトキシ、若しくは環がＯＨ、Ｃ1-4−アルキル若しくはメトキシで任意に置換されたシクロヘキシル若しくはシクロヘキシルメチルラジカルハロゲン、若しくは複素環系に３〜８個の炭素原子を有する含窒素ヘテロアリール−Ｃ1-4−アルキルラジカルであり、Ｒ7が（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）のタイプの基であってよい、式−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ6）−ＮＨ−Ｒ7の基（ここで−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ6）−ＮＨ−Ｒ7はラセミであるか若しくはＤ型若しくはＬ型であってよい）；又は
（ｅ）Ｒ7が上述の通りであり、ｍが１又は２であってよく、メチレン基をヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ1-4−アルキル若しくはアリール−Ｃ1-4−アルキルで置換してよい、以下の式
【００４９】
【化２】
2014514590.tif 000004
【００５０】
の基
であり；
Ｒ2は、水素、Ｃ1-6−アルキル、Ｃ1-2−ヒドロキシアルキル、Ｃ1-4−アルコキシ−Ｃ1-6−アルキル、ベンジルオキシ−Ｃ1-2−アルキル、ω−カルボキシ−Ｃ1-3−アルキルラジカル、ω−Ｃ1-4−アルコキシカルボニル−Ｃ1-3−アルキルラジカル、ω−ベンジルオキシカルボニル−Ｃ1-3−アルキルラジカル、又はシクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、４−ヒドロキシシクロヘキシルメチル、フェニル、ベンジル、４−ヒドロキシベンジル若しくはイミダゾリル−４−メチルラジカルであり；
Ｒ3は、
（ａ）水素若しくはＣ1-4−アルキルであり、Ｒ3'が水素である；又は
（ｂ）Ｒ3'と共に、メチレン基のうちの１つをヒドロキシル、カルボニル、Ｃ1-4−アルキル若しくはアリール−Ｃ1-4−アルキルで置換してよいトリ−若しくはテトラメチレン基であり；並びに
Ｒ4は、
（ａ）Ｒ8がヒドロキシル若しくはアミノであってよく、Ｒ9が水素、ハロゲン、アミノ、ニトロ、Ｃ1-4−アルキル、Ｃ1-4−アルコキシ若しくはＣ1-4−アルカノイルであってよい、以下の式
【００５１】
【化３】
2014514590.tif 000005
【００５２】
のアニリン残基；又は
（ｂ）Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12のうち第１のものが−ＮＨ基であり、これによってキノリン残基がＡｒｇ残基に連結され、第２のものがヒドロキシル若しくはアミノであってよく、第３のものが水素、ヒドロキシル若しくはアミノ及びそれらの塩であってよい、以下の式
【００５３】
【化４】
2014514590.tif 000006
【００５４】
のキノリン残基
である。
【００５５】
これらのオリゴペプチド誘導体は、ペプチドヒドロラーゼ酵素クラス（Ｅ．Ｃ．３．４．）、特にプロテイナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１−９９）の酵素及びその阻害物質、血液凝固システムの酵素、線維素溶解システムの酵素、並びに補酵素、特にトロンビン酵素によって開裂される。従ってこれらオリゴペプチド誘導体は、複雑なサンプル液体中、特に毛細管血中の上述の酵素、特にトロンビンの定量的及び定性的決定のための基質として役立つ。
【００５６】
特許文献１に詳細に記載されているように、トロンボプラスチン等の生物学的因子は、トロンビンカスケードを進行させてプロトロンビン時間を測定できるようにするために必要である。
【００５７】
これとは対照的に、本発明は、血液凝固カスケードの主たる生物学的成分を、化学的に不活性かつ安定である非生物学的化合物で置換するという原理に基づいている。従って、本発明の特定の試薬混合物はトロンボプラスチンを含有せず、代わりにラッカー材料を含有し、このラッカー材料は一方で電流生成トロンビン基質を固定化でき、同時に、血液凝固カスケードを進行させるための要件として上述した負荷電表面を提供する。本発明は、血液凝固を開始させるにあたって、このような試薬混合物中に追加の生物学的因子は驚くべきことに全く必要ないことを示す。
【００５８】
好ましくは、上記化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物は樹脂自体から形成され、適切な負荷電側鎖をポリマー主鎖に導入することにより、それ自身で負電荷を有するように設計できる。
【００５９】
このような利点をもたらし、本発明のセンサで使用するのに適しているラッカー材料は、特許文献４に記載されている。本発明の試薬混合物は、基質表面上に堆積されるアニオン電着ラッカーを含む。
【００６０】
本発明の試薬混合物を基質表面上に堆積させるために、様々な方法を使用できる。センサは例えば、マイクロピペットを用いた手動分注、マイクロポンプ及び位置決め可能なシリンジを用いた自動分注、トロンビン基質及び添加物の存在下での電着ラッカーの電気化学的誘導堆積、堆積溶液の滴下コーティング及びそれに続く乾燥、又は圧電スポッティングによって調製できる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、本方法はラッカーシステムを含む樹脂層を表面上に堆積させること、及び乾燥によって樹脂層を表面に固定することを含む。実験により、このような簡単な方法が実施例３及び図３、４に示すような安定性の高いセンサの製造に適していることが示された。主たる利点は、この極めて効果的な方法が、それにも関わらず簡単であることである。
【００６２】
本例で使用されるその他の方法は、電着ラッカー塗布による方法であり、これは自動車シャーシ及び構成部品、ラジエータ並びに飲料用缶の腐食に対する保護のために工業的に使用されている。アニオン電着では、アノードにおける水の分解によって放出された陽子を用いて、カルボキシレート基によって負電荷を有する可溶性ポリマーを中和し、これによって沈殿させる。続いてフィルムを表面に架橋させて不浸透性コーティングを形成するが、このコーティングは極めて高い機械的及び化学的耐性を有する。
【００６３】
電着を実施するために、本発明の試薬混合物は、電着に適した樹脂を含有する。標的電極の表面における陽子の生成によって樹脂の堆積が生成され、これは試薬混合物中に同時に存在するいずれの分子又は化合物と結合してこれらを固定化する。
【００６４】
樹脂エマルジョンとして、アニオン電着に適した任意の公知の樹脂エマルジョンを使用できる。これら樹脂エマルジョンには、３００〜５００００；６００〜３００００；１０００〜２００００；８００〜１００００；１０００〜１５０００といった高い分子量を有する化合物が含まれるが、この高い分子量は、これらが可溶性かつ乳化可能である限りにおいて、上述の値から最高５００００、７００００、１０００００、２５００００、又は１００００００までの値でさえあり、またこれら樹脂エマルジョンには、特にイオン性の電荷を有する樹脂が含まれ、これらは構成モノマー上の官能基によって生成される。その例には、改質ポリスチロール、オレフィン、ポリアミド並びにビニル及びアクリル化合物が含まれるが、タンパク質、官能基を有するポリサッカライド、植物ゴム質、オリゴ及びポリヌクレオチド等の生化学的に興味深いポリマーも含まれる。α、βオレフィン系不飽和カルボン酸はアニオン電着に特に適していることは公知である。
【００６５】
アニオン電着のために使用する樹脂エマルジョンに好ましい樹脂は、アンモニア又は有機塩基との少なくとも部分的な塩の形成により水中に溶解又は分散できる、カルボキシル基、マスクしたイソシアネート基、ヒドロキシル及びエーテル基を含有する共重合物に基づいて調製された樹脂であり、共重合物は以下の
１．３〜５個の炭素原子を有する少なくとも１つのα、βオレフィン系不飽和カルボン酸、又は３〜５個の炭素原子を含有する少なくとも１つのα、βオレフィン系不飽和二カルボン酸；
２．ＣＨ−、ＯＨ−、又はＮＨ−活性マスキング要素でマスクした、１０〜３５重量％のＮ（１−アルキル）イソシアネート；
３．ビスフェノールＡ及び３８０〜３５００の分子量を有するエピクロルヒドリンを基にしたエポキシド樹脂、並びに３〜５個の炭素原子を含有するオレフィン系不飽和アルコールの、２０〜５０重量％の付加物；
４．５〜６４重量％の、１．〜３．に挙げていない１つ又は複数の共重合性オレフィン系不飽和化合物
が重合したものを含有するが、これは、共重合物が１０００〜２００００の平均分子量を有し、共重合物の酸価が３５〜１５０ｍｇＫＨＯ／ｇに達するような量で重合した成分（１）を含み、上記１〜４に挙げたパーセンテージの合計が１００であることが条件である。
【００６６】
上述の共重合物は１０００〜２００００の平均分子量を有する。成分は、共重合物の酸価が３５〜１５０ｍｇＫＨＯ／ｇに達するような量で重合される。前記１〜４に挙げたパーセンテージの合計は１００となる。共重合物中の成分（３）の反応性水素原子とマスクしたイソシアネート基との当量比は好ましくは約１：１であることを強調しておく。更に、好ましくはビニルイソシアネート又はプロペニルイソシアネート及びシクロヘキサノール、テルブタノール、トリアザベンゾール又はε−カプロラクタムの付加物を、イソシアネート／マスキング要素と１：１の分子量比で用いる。特に、共重合物は成分（１）としてアクリル酸又はメタクリル酸、成分（２）としてε−カプロラクタムでマスクしたビニルイソシアネート、成分（３）としてビスフェノールＡ及び平均分子量約９００のエピクロルヒドリンのエポキシド樹脂並びにアリルアルコールの転化生成物、並びに成分（４）として重合２−エチルヘキシルアクリレート又はブチルアクリレートを含有する。
【００６７】
また、水溶性樹脂様材料及び非水溶性樹脂様物質の混合物として使用される樹脂様物質も好ましい。混合物は水が主成分である水性媒質中に分散される。水溶性樹脂様材料はポリマーであり、十分な親水基をポリマー中に組み込むことで水溶性となっている。親水基はイオン性塩基であり、例えばカルボン酸塩基及びスルホン酸塩基等のアニオン塩基、又はアミン塩基及び四価アンモニウム塩基等のカチオン塩基である。好ましい親水基はアニオン基であり、特に好ましいのはカルボン酸基の塩である。ポリマーは通常カルボン酸基を用いて製造され、続いて有機アミン又は水酸化アルカリ金属等の水溶性の塩基性化合物で中和される。
【００６８】
ここでは「水溶性」という概念は、水に溶解するようにした樹脂様材料が、外部から添加する界面活性剤の補助を必要とせずに、樹脂の固体成分が最高２５重量％、通常１〜２０重量％となるよう分散できることを意味する。溶液又は分散液は光学的に透明又は半透明の見た目であることが多く、樹脂は分散相に存在し、０．１２μｍ以下の平均粒径、多くは０．０３μｍ未満の平均粒径を有する。水溶性樹脂様材料の平均粒径は、光散乱法で決定できる。
【００６９】
好ましい低分子量水溶性ポリマーは、陽電荷を有するアクリルコポリマーであり、好ましくはカルボン酸塩基であり、特に好ましくは有機アミンで中和したカルボン酸基である。
【００７０】
低分子アクリルコポリマーには、α、βエチレン系不飽和カルボン酸とメタクリル酸エステル及び／又はアクリル酸エステルとの共重合によって生産されるポリマーが含まれるが、一般に、Ｃ1−Ｃ8アルコールのメタクリレートエステル及び少量のＣ1−Ｃ8アルコールのアクリレートエステルを主成分として含むアクリルポリマーが適切である。以下の化合物は一般的なメタクリレートエステル及びアクリレートエステルである：エチルアクリレート、プロピルアクリレート、イソプロピルアクリレート、ブチルアクリレート、イソブチルアクリレート、二価ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、オクチルアクリレート、メチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、二価ブチルメタクリレート及び三価ブチルメタクリレート。
【００７１】
使用するアクリルポリマーは、０．１〜２０重量％の重合α、βエチレン系不飽和カルボン酸単位を含有する。使用できるα、βエチレン系不飽和カルボン酸モノマーは、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、エタクリル酸、プロピルアクリル酸、イソプロピルアクリル酸、及びこれらの酸の同族体である。メタクリル酸及びアクリル酸が好ましい。酸のパーセンテージは、アクリルポリマー中に所望の酸価が生成されるよう設定する。アクリルポリマーの酸価は通常、樹脂の固体成分の約３０〜１００％となるように調整するのがよい。水溶性アクリルポリマーの数平均分子量は好ましくは１００００〜３００００である。
【００７２】
アクリルポリマーはヒドロキシル側鎖基も含有でき、これらはヒドロキシアルキルアクリレート又はヒドロキシアルキルメタクリレートと上述のアクリル酸エステルとの共重合によって得られる。ヒドロキシル基側鎖基は、アミノプラスト又はマスクしたイソシアネート等との後続の硬化のための場所を提供する。使用されるアクリル酸ポリマーの５〜１５重量％は、好ましくはヒドロキシアルキルアクリレート又はメタクリレートエステル由来である。一般に、使用可能なヒドロキシアルキルアクリレート及びメタクリレートは、アルキル基に１〜８個の炭素原子を含有し、例えばヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシブチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシブチルメタクリレート、ヒドロキシヘキシルメタクリレート及びヒドロキシオクチルメタクリレートである。
【００７３】
更に、使用可能なアクリル酸ポリマーの一部を形成するために、スチロール、ビニルトルオール、アクリルアミド、ビニルキシロール、アリルアルコール及びアクリルニトリル等のビニル共重合性化合物を使用できる。
【００７４】
特に適切なアクリルポリマーでは、ポリマーは基本的に硬い成分、即ちスチロール若しくはアクリル基が１〜２個の炭素原子を含有する低級アルキルメタクリレート、若しくはスチロールとエチルアクリレート等の低級アルキルメタクリレートとの混合物、又は柔らかい成分、即ちアクリル基が３〜８個の炭素原子を有する低級アルキルメタクリレート若しくはアルキル基が２〜８個の炭素原子を有する低級アルキルアクリレート、アルキル基が１〜４個の炭素原子を有するヒドロキシ低級アルキルメタクリレート若しくはアクリレート、及び上述のようなα、β−エチレン系不飽和カルボン酸からなる。
【００７５】
水溶性アクリル樹脂はもちろん、飽和又は芳香族ポリカルボン酸及びポリオールから生産されるポリエステルも、低分子量を有するポリマーとして適切である。典型的な飽和脂肪族二カルボン酸は、コハク酸、アゼライン酸及びアジピン酸等、２〜１０個の炭素原子を有する酸無水物であり、これらは上述のポリエステルの生産に適している。芳香族二塩基酸又はその酸無水物の例は、フタル酸及びトリメリト酸である。ポリエステルに対する酸量は、所望の酸価が達成されるよう設定され、これはポリエステルに対して２０〜８５とするべきである。多くのポリオールを上述の酸で変換して所望のエステルを生産できる。特に適切なジオールは例えばエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、ネオペンチルグリコール、ソルビトール、ペンタエリスリトール及びトリメチロールプロパンである。
【００７６】
グリセリンエチレングリコール等の多価アルコールと亜麻仁油及びトール油等の乾性脂肪酸との縮合によって生産されるポリマーエステル等のアルキド樹脂もまた、水溶性ポリマーとして適切である。所望の酸価を達成するために通常添加される更なる成分は例えば、マレイン酸又はマレイン酸無水物等の、α、β−エチレン系不飽和二カルボン酸又はこの酸の酸無水物である。
【００７７】
これらのアルキド樹脂は好ましくは１０００〜２５００の数平均分子量及び２０〜８５の酸価を有するものとする。
【００７８】
電着の生産に使用できる更なる低分子量カルボン酸ポリマーは、スチロールと、アリルアルコール等の３〜１０個の炭素原子を有するエチレン系不飽和アルコールとのポリマーである。このポリマーを更に乾性脂肪酸及び既に挙げたような酸成分で変換して、通常２０〜８０である所望の酸価を達成できる。スチロール−アリルアルコールポリマーの数平均分子量は通常１０００〜１００００である。
【００７９】
エポキシドエステルもまた、低分子量の水溶性樹脂として適切である。これらの材料は、既に挙げたような通常の乾性脂肪酸でエポキシド樹脂を部分エステル化することで得られ、続いてこの樹脂を、上述のようなα、β−エチレン系不飽和二カルボン酸又はその酸無水物でエステル化する。エポキシド樹脂自体は好ましくは、ビスフェノールＡ等のビスフェノールのポリグリシジルエーテルである。
【００８０】
更に適切な低分子量の樹脂様ポリマーの例は、マレイン酸等の不飽和カルボン酸又は酸無水物と、亜麻仁油等の乾性油との中和産物である。
【００８１】
アニオン電着のための更なる組成物は、（Ａ）１５〜６０重量％の水；（Ｂ）１５〜６０重量％の、１つ又は複数の有機溶媒；（Ｃ）０．１〜２０重量％の、（ａ）１０〜７５重量％の、水と非混合性である又は部分的に混合性である１つ又は複数の共重合性α、β−オレフィン系不飽和化合物と、（ｂ）２５〜９０重量％の、１つ又は複数の水溶性共重合性Ｎ−ビニル化合物とのコポリマー；及び（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の混合物中に分散した、１０〜７９重量％の、１つ又は複数の細かく分割された着色剤又は充填剤又は着色剤と充填剤との混合物；を含み、ここで（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）のパーセンテージの合計は１００である。特に、この組成物中の成分（Ｃ）は、例えば溶媒重合化によって生産できるコポリマーである。これは０．１〜２０重量％、好ましくは３〜８重量％の量で使用され、共重合性単位として（ａ）１０〜７５重量％、好ましくは２０〜４０重量％の、水と非混合性である又は部分的に混合性である１つ又は複数の共重合性α、β−エチレン系不飽和化合物、及び（ｂ）２５〜９０重量％、好ましくは６０〜８０重量％の、１つ又は複数の水溶性共重合性Ｎ−ビニル化合物を含有する。
【００８２】
（ａ）、（ｂ）のパーセンテージの合計は１００である。好ましい水と非混合性である又は部分的に混合性であるα、β−エチレン系不飽和化合物（ａ）は、Ｃ2−Ｃ18−モノカルボン酸のビニルエステル、例えばビニルアセテート、ビニルプロピオネート、ビニルピバレート、ビニル−２−エチルヘキサノエート及びビニルステアレート、並びに／又はＣ4−Ｃ18−アルコールのアクリル酸エステル若しくはメタクリル酸エステル、例えばブチルアクリレート及びブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、オクチルアクリレート及びオクタデシルアクリレートである。特に好ましいモノマーはビニルプロピオネートである。アクリルアミド若しくはメタクリルアミド、ビニルエーテル及び／又はスチロール等のビニル芳香族の誘導体も適切であり、これらは水に不可溶性であるか、ごくわずかしか溶解しない。
【００８３】
好ましい水溶性Ｎ−ビニル化合物（ｂ）の例は、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎービニルピペリドン及びＮ−ビニルイミダゾールである。
【００８４】
本発明による好ましい電着エマルジョンは、Ｒｅｓｙｄｒｏｌラッカー、Ｒｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹ  ４９８ｗ／３５ＷＡ、Ｒｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＭ  ４１０ｗ／６７ＷＡＢＧ、Ｃａｔｈｏｄｉｐ  ＧＹ８３−０２７０  ０００５、ＷＡ−Ｔａｕｃｈｌａｃｋ  ｖｏｎ  ＦｒｅｉＬａｃｋ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｔｈｅｒｍ−Ｅｌｅｋｔｒｏｔａｕｃｈｌａｃｋ  ＫＴＬ  ａｕｔｏｍｏｔｉｖｅ  ”ｕｐｇｒａｄｅ”、ＢＡＳＦ  ＧＹ８０−０６３６−０００１  ＫＭ１から選択される。
【００８５】
任意に、市販の電着ラッカー懸濁液に水を添加でき、ここで水はできる限り純水に近いものとする。ＨＰＬＣ品質の水が好ましい。更に、樹脂層に通常添加されるいずれの他の材料を使用できる。このような材料は例えば、柔軟剤、乳化剤、接着促進剤、疎水性又は親水性材料、架橋剤、消泡剤等である。
【００８６】
電着ラッカー懸濁液の生産及び調製において主に乳化剤又は架橋剤の機能を果たす適切な添加物は、アニオン、カチオン又は両性界面活性剤であり、特に非イオノゲン性界面活性剤である。これに関連して、適切な市販の製品を以下に列挙する。
１．Ｔｒｉｔｏｎ（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−４０５等）：アルキルフェニルポリエチレングリコール（Ｆｌｕｋａ）  
２．Ｔｗｅｅｎ（２０、４０、６０等）：
Ｔｗｅｅｎ  ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｍｅｒｃｋ）  
Ｔｗｅｅｎ  ４０：ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｍｅｒｃｋ
Ｔｗｅｅｎ  ６０：ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｍｅｒｃｋ
Ｔｗｅｅｎ  ６５：ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（Ｍｅｒｃｋ
Ｔｗｅｅｎ  ８０：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｍｅｒｃｋ）  
Ｔｗｅｅｎ  ８５：ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｍｅｒｃｋ）  
３．Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０：オクチル−フェニル−ポリエチレングリコール（Ｆｌｕｋａ）  
４．Ｂｒｉｊ（３５、５６、５８等）：（Ｍｅｒｃｋ）
Ｂｒｉｊ  ３５：ポリオキシエチレンラウリルエーテル
Ｂｒｉｊ  ５６：ポリオキシエチレン−（１０）−セチルエーテル
Ｂｒｉｊ  ５８：ポリオキシエチレン−（２０）−セチルエーテル
５．オクチル−β−グルコシド（Ｐｉｅｒｃｅ）
６．オクチル−β−チオグルコピラノシド（Ｐｉｅｒｃｅ）
７．ＳＤＳ：ラウリル硫酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
８．ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−プロパンスルホネート（Ｆｌｕｋａ）
９．ＣＨＡＰＳＯ：３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホネート（Ｆｌｕｋａ）
【実施例】
【００８７】
実施例１：センサ上への堆積のための樹脂層の調製、及びセンサ表面上の感知成分の固定化
センサの形成のために、以下の溶液（＃１〜＃５）を調製した。
＃１．ＨＥＰＥＳバッファ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＫＣｌ  １００ｍＭ）：脱イオン水９０ｍｌ中にＨＥＰＥＳ１．１９ｇ及びＫＣｌ０．７５ｇ。  ＮａＯＨでｐＨ値を７．４に調整し、脱イオン水で堆積を１００ｍｌまで増大させた。
＃２．デオキシコール酸ナトリウム溶液：ＨＥＰＥＳバッファ（＃１）１５００μｌ中にデオキシコール酸ナトリウム３．８ｍｇ。
＃３．ホスファチジルセリン１０μｌ＋デオキシコール酸ナトリウム溶液（＃２）３５μｌ。
＃４．活性化溶液：＃３の溶液４５μｌ＋ＨＥＰＥＳバッファ（＃１）１０８０μｌ。
＃５．堆積溶液：トロンビン基質０．３ｍｇ＋＃４の活性化溶液８９０μｌ（超音波バス中に５分間）＋スペクトルコール３０ｍｇ、ベントナイトＳＦ４ｍｇ及びＲｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹ１１０μｌ。
【００８８】
追加の化合物をセンサ表面に共に固定化するために、堆積溶液を変化させることができる。このような場合、溶液＃５の組成は、トロンビン基質の量、＃４の活性化溶液の体積及びＲｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹの量に関して一定に維持された。堆積溶液の正確な組成が＃５の溶液と異なる場合は、各実施例について正確な組成を挙げる。
【００８９】
実施例２：電着を用いたセンサ表面上の感知成分固定化
イソプロパノールを用いて、センサを超音波バスで１５分間洗浄し、水ですすいで乾燥させた。ピペットを用いて堆積溶液（＃５）の５０μｌの小滴を、ホルダに水平に固定されたセンサ表面に取った。Ａｇ／ＡｇＣｌ／３Ｍ  ＫＣｌ基準電極及びＰｔワイヤ対電極をこの小滴に挿入した。電着のために、作用電極表面において陽子を局所的に生産しなければならず、これは少なくとも２．２Ｖの電位までの電位パルスによって開始され、水の酸化を引き起こす。析出電位が最大２秒、好ましくは０．５秒の長さであり、これに続いて１Ｖ未満、好ましくは０Ｖの非有効電位が少なくとも２秒、好ましくは５秒続くパルスの数は変更でき、この数によって堆積するラッカーフィルムの厚さを決定する。電位パルスの数は少なくとも１であり、より良好には５であり、好ましくは１０〜５０である。電着後、センサをバッファ溶液（＃１）ですすぐ。
【００９０】
実施例３：分注及び乾燥を用いたセンサ表面上の感知成分固定化
イソプロパノールを用いて、センサを超音波バスで１５分間洗浄し、水ですすいで乾燥させた。堆積溶液（溶液＃５）５μｌをセンサの作用電極上に、ピペットを用いて手動で、又はシリンジ、ポンプによるディスペンサを用いて自動で堆積させた。堆積溶液を作用電極表面に配置した後、このように変更されたセンサを３７℃で３時間乾燥させた。
【００９１】
実施例４：電流測定による血液凝固時間の決定
血液凝固時間の決定のために、センサを定電位装置、好ましくは図１に示すようなメータに接触させた。ピペットを用いて、対照血漿Ｎ（Ｎ）、対照血漿Ｐ（Ｐ）又は血液（Ｂ）７μｌを乾燥したセンサ表面に滴下した。サンプルを添加した瞬間、電子回路は閉状態となり、作用電位＋０．３Ｖが作用電極に印加され、同時に電流が検知される。サンプルの添加時点を測定の零点に設定する。電流を経時的に記録し、血液凝固の流れをトロンビン基質の酸価電流によって監視できる。血液凝固中、トロンビン基質は切断され、これにより、印加した電位で酸価される電極表面に携帯用酸化還元活性タグが到達することができる。電流はこの時に切断されたトロンビン基質分子の数を表し、従って凝固と相関関係にある。
【００９２】
実施例５：固定化方法の比較
センサの製造を簡略化するために、（実施例２に記載したような）電着ステップを削除する代わりに（実施例４に記載したように）、センサ表面上で堆積溶液を乾燥させるのみとすることができるかどうかについて試験した。測定のために、図１に示した機構を使用した。印加される電位パルスプロファイルは、２．２Ｖを０．２秒間及び０Ｖを５秒間であり、これを１０回繰り返した。センサの作用電極と、基質溶液中に浸漬した基準及び対電極とに電位を印加した。図３に、電着ステップを用いて堆積溶液を固定することによって製造したセンサ、及び単純な乾燥によって堆積溶液を固定することによって製造したセンサの両方を用いた測定の結果を示す。
【００９３】
図３は、Ａ）溶液＃５からの１０回の堆積パルスでのポリマー沈殿（生物学的アクティベータであるトロンボレルＳは堆積溶液中に不在である）によって調製されたセンサ（破線（ａ）：血漿Ｎ；点線（ｂ）：全血；実線（ｃ）：血漿Ｐ）、及びＢ）トロンボレルＳが堆積溶液中に存在しない、乾燥によるポリマー沈殿によって調製されたセンサに関する、経時的な電流レスポンスカーブ（破線（ａ）：血漿Ｎ；点線（ｂ）：全血；実線（ｃ）：血漿Ｐ）、並びにＣ）電着を実施したセンサに関する結果をまとめた棒グラフ（２００秒後の電流；１）全血（ｎ＝２）；２）血漿Ｎ（ｎ＝９）；血漿Ｐ（ｎ＝７））；Ｄ）乾燥させたセンサに関する結果をまとめた棒グラフ１）血漿Ｎ（ｎ＝１７）；２）全血（ｎ＝２）；３）血漿Ｐ（ｎ＝１４））を示す。
【００９４】
実施例６：電着（実施例２参照）及び乾燥（実施例３参照）によって製造されたセンサの長期間安定性の比較
このようなセンサを流通させる際に通常使用するようなプラスチックチューブ（ねじ止めキャップで閉鎖した直径２ｃｍのシリンダ）内にセンサを配置した。これら容器をＷＩＰボード上に配置し、このボードを０．１Ｈｚの周波数で処理し、右から左へと巻いて最長３３日間保管できる。同様に製造したセンサの別の組を、３７℃のインキュベータ内に最長３３日間配置した。０日間、３日間及び３３日間インキュベート又は振盪したセンサを、図１に示す機器を用いた、実施例４に記載した測定に使用する。図４は、異なるインキュベーション時間の後にセンサにより測定した電流、並びに２００秒及び３５０秒後に測定した電流及び転送電荷を示す。
【００９５】
Ａ）２００秒後の電流
ａ）センサ調製直後、血漿Ｎ（ｎ＝６）；ｂ）センサ調製直後、血漿Ｐ（ｎ＝６）；ｃ）３日後、血漿Ｎ（ｎ＝８）；ｄ）３日後、全血（ｎ＝１）；ｅ）３日後、血漿Ｐ（ｎ＝６）；ｆ）３３日後、血漿Ｎ（ｎ＝５）；ｇ）３３日後、全血（ｎ＝４）；ｈ）３３日後、血漿Ｐ（ｎ＝２）；ｉ）３３日間の継続的な振盪後、血漿Ｎ（ｎ＝４）；ｊ）  ３３日間の継続的な振盪後、全血（ｎ＝２）；ｋ）３３日間の継続的な振盪後、血漿Ｐ（ｎ＝２）；
・堆積溶液＃５ａ：トロンビン基質０．３ｍｇ＋活性化溶液Ｂ８９０μｌ（超音波バス中に１５分間）＋スペクトルコール２９．９ｍｇ、珪藻土４ｍｇ及びＲｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹ１１０μｌ
【００９６】
Ｂ）２００秒及び３００秒後の電荷
ａ）センサ調製直後、血漿Ｎ（ｎ＝６）；ｂ）センサ調製直後、血漿Ｐ（ｎ＝６）；ｃ）３日後、血漿Ｎ（ｎ＝８）；ｄ）３日後、全血（ｎ＝１）；ｅ）３日後、血漿Ｐ（ｎ＝６）；ｆ）３３日後、血漿Ｎ（ｎ＝５）；ｇ）３３日後、全血（ｎ＝４）；ｈ）３３日後、血漿Ｐ（ｎ＝２）；ｉ）３３日間の継続的な振盪後、血漿Ｎ（ｎ＝４）；ｊ）  ３３日間の継続的な振盪後、全血（ｎ＝２）；ｋ）３３日間の継続的な振盪後、血漿Ｐ（ｎ＝２）；
・堆積溶液＃５ａ：トロンビン基質０．３ｍｇ＋活性化溶液Ｂ８９０μｌ（超音波バス中に１５分間）＋スペクトルコール２９．９ｍｇ、珪藻土４ｍｇ及びＲｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹ１１０μｌ
【００９７】
実施例７：負荷電カーボンナノチューブの存在下で製造したセンサ
溶液＃５ｃを形成する堆積溶液に添加した負荷電カーボンナノチューブの溶液（溶液＃６）を更に用いて、実施例３（分注及び乾燥）に従ってセンサを製造した。
・溶液＃６：カーボンナノチューブ１５．７ｍｇをＨＮＯ3１００ｍｌ中において１１０℃で９０分間撹拌し；溶液を濾過し、ナノチューブを脱イオン水で洗浄し、８０℃で３時間乾燥させた。
・溶液＃５ｃ：トロンビン基質０．４ｍｇ＋＃４の活性化溶液１０００μｌ（超音波バス中に１５分間）。この溶液４４５μｌに、負荷電カーボンナノチューブ１ｍｇ及びＲｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹ５５ｍｇを添加した。溶液を超音波バス中で５分間懸濁した。
【００９８】
図５は、負荷電カーボンナノチューブの存在下で製造したセンサに関して得られた血液凝固時間を示している。Ａ）実線（ａ）：血漿Ｎ；点線（ｃ）：全血；破線（ｂ）：血漿Ｐ。Ｂ）２００秒後の電流：ａ）：血漿Ｎ（ｎ＝４）；ｂ）：血漿Ｐ（ｎ＝２）；ｃ）：全血（ｎ＝１）。
【００９９】
実施例８：より多量の負荷電カーボンナノチューブの存在下で製造したセンサ
実施例７に示した、ただしより多量の負荷電カーボンナノチューブを溶液＃５ｄを形成する堆積溶液に添加した負荷電カーボンナノチューブの溶液（溶液＃６）を更に用いて、実施例３（分注及び乾燥）に従ってセンサを製造した。
・溶液＃５ｄ：トロンビン基質０．４ｍｇ＋＃４の活性化溶液１０００μｌ（超音波バス中に１５分間）。この溶液５１０μｌに、負荷電カーボンナノチューブ６．９ｍｇ及びＲｅｓｙｄｒｏｌ  ＡＹ６３．２μｌを添加した。溶液を超音波バス中で５分間懸濁した。
【０１００】
図６は、負荷電カーボンナノチューブの存在下で製造したセンサに関して得られた血液凝固時間を示している。Ａ）実線（ａ）：血漿Ｎ；点線（ｃ）：全血；破線（ｂ）：血漿Ｐ。Ｂ）２００秒後の電流：ａ）：血漿Ｎ（ｎ＝４）；ｂ）：血漿Ｐ（ｎ＝２）；ｃ）：全血（ｎ＝１）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2014514590.tif 000014
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月28日(2013.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
図３は、Ａ）溶液＃５からの１０回の堆積パルスでのポリマー沈殿（生物学的アクティベータであるトロンボレルＳは堆積溶液中に不在である）によって調製されたセンサ（破線（ａ）：血漿Ｎ；点線（ｂ）：全血；実線（ｃ）：血漿Ｐ）、及びＢ）トロンボレルＳが堆積溶液中に存在しない、乾燥によるポリマー沈殿によって調製されたセンサに関する、経時的な電流レスポンスカーブ（破線（ａ）：血漿Ｎ；点線（ｂ）：全血；実線（ｃ）：血漿Ｐ）、並びにＣ）電着を実施したセンサに関する結果をまとめた棒グラフ（２００秒後の電流）；１）全血（ｎ＝２）；２）血漿Ｎ（ｎ＝９）；３）血漿Ｐ（ｎ＝７）、Ｄ）乾燥させたセンサに関する結果をまとめた棒グラフ；１）血漿Ｎ（ｎ＝１７）；２）全血（ｎ＝２）；３）血漿Ｐ（ｎ＝１４）を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂層が塗布されかつ検知機能を有する少なくとも１つの物質を含む表面を備える血液凝固時間測定センサであって、
前記樹脂層はラッカーシステムを備え、前記ラッカーシステムは：
i)前記表面上の、前記検知機能を有する前記少なくとも１つの物質の固定化に適しており；
ii）負荷電表面層を提供し；
iii）化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物により、生物学的血液凝固プロモータを置換することを可能とする
ことを特徴とする、血液凝固時間測定センサ。
【請求項２】
前記負荷電表面層は、前記化学的に不活性かつ安定である非生物学的合成化合物によりもたらされる、請求項１に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項３】
前記ラッカーシステムは、負荷電アクリル酸系電着ポリマーである、請求項１又は２に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項４】
前記負荷電アクリル酸系電着ポリマーは、Ｒｅｓｙｄｒｏｌのラッカーファミリーから選択される、請求項３に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項５】
前記樹脂層は更に、ベントナイト、珪藻土等の負荷電粘土材料、又は酸化カーボンナノチューブ等の他の負荷電添加物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項６】
前記検知機能を有する前記少なくとも１つの物質は、荷電化合物を与えるために酵素によって切り離すことができる１つの末端結合を有する少なくとも１つの化学物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の血液凝固時間測定センサ。
【請求項７】
荷電化合物を与えるために酵素によって切り離すことができる１つの末端結合を有する前記化学基質は、電流生成トロンビン基質であり、前記酵素はトロンビンである、請求項６に記載の血液凝固時間測定センサ。
【国際調査報告】
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