(57)【要約】  本発明は、マイクロアレイ上への核酸の効率的な結合のための装置に関し、当該装置は、マイクロアレイを含む反応ゾーン及び多孔性膜基板を含む捕獲ゾーンを含み、捕獲ゾーンは、標的分子のセンス鎖を特異的に捕獲する能力を持つ一方、相補的なアンチセンス鎖は、反応ゾーンにおいて捕獲され、逆もまた同様である。本発明は、装置内の温度調節ユニットをさらに構想し、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成又は結合を可能にしない温度、又は、核酸ハイブリダイゼーションに適した温度まで捕獲を導く又は該温度にて維持するのを可能にする。本発明は、マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させる方法にも関し、当該方法は、変性された形状の１つ又は複数の標的分子を含有する培養液を、本発明の装置の捕獲ゾーン内に導入するステップ、標的分子と前記捕獲ゾーン内の固定化された捕獲分子との相互作用反応を行うステップ、及び、結合していない標的分子鎖を、マイクロアレイを含む反応ゾーンまで輸送し、その結果、標的分子鎖とマイクロアレイ上の固定化された捕獲分子との相互作用を可能にするステップを含む。さらなる態様において、本発明は、標的分子を濃縮するため、標的分子を特異的に選択するため、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＳＮＰの検出のため、又は、マイクロアレイベースのゲノム選択に基づくシーケンシングのための、そのような装置の使用に関する。
2014518639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ上への核酸の効率的な結合のための装置であって、
（ａ）マイクロアレイを含む少なくとも１つの反応ゾーンであり、前記マイクロアレイが、１種又は複数種の捕獲分子が固定化される基板を含む、反応ゾーン、及び
（ｂ）多孔性膜基板を含む少なくとも１つの捕獲ゾーンであり、前記基板上には、１種又は複数種の捕獲分子が固定化され、前記反応ゾーンと流体接続した捕獲ゾーン、
を含み、
前記捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ一方、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部は、前記反応ゾーンにおいて捕獲することができる、或いは、前記捕獲ゾーンは、前記１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ一方、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部は、前記反応ゾーンにおいて捕獲することができる、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、少なくとも２つの捕獲ゾーンを含み、１つの捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、さらに、もう一方の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ、装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の装置であって、当該装置内の温度を制御及び／又は調節するための、好ましくは捕獲ゾーン内に置かれる、さらに、任意で前記反応ゾーン内にも置かれる少なくとも１つの温度制御及び／又は調節ユニットを含む、装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置であって、前記少なくとも２つの捕獲ゾーンのうち１つは、好ましくは約８５℃から９８℃の温度の融解温度、又は、前記捕獲分子への前記１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度で保たれるか又は該温度に導かれる一方で、別の捕獲ゾーンは、好ましくは約４５℃から６５℃の温度の、前記捕獲分子への前記１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度で保たれるか又は該温度に導かれる、装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置であって、前記反応ゾーンは、前記１つ又は複数の標的分子の前記１つ又は複数のセンス鎖及びアンチセンス鎖若しくはその一部に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含むか、或いは、前記１つ又は複数の標的分子の前記１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部のみに相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含むか、或いは、前記１つ又は複数の標的分子の前記１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部のみに相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む、装置。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置であって、前記捕獲ゾーンは、前記反応ゾーン内の前記１つ又は複数の捕獲分子若しくはその一部に相補的な少なくとも１つの捕獲分子を含むか、或いは、前記反応ゾーン内の前記１つ又は複数の捕獲分子若しくはその一部に相補的な捕獲分子のサブセットを含む、及び／又は、１つ又は複数の干渉配列に結合する能力を持つ１つ又は複数の捕獲分子を含む、並びに／或いは、当該装置は、少なくとも２つの反応ゾーンを含み、１つの反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部に特異的に結合する能力を持ち、さらに、もう一方の反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部に特異的に結合する能力を持つ、装置。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の装置であって、１つ又は複数の前記反応ゾーン及び前記捕獲ゾーンは、閉ループで配置され、好ましくは、統合装置内に配置され、前記１つ又は複数の反応ゾーン及び捕獲ゾーンは、接続されたマイクロ流体システム内にある、或いは、当該装置は、２つの反応ゾーン及び２つの捕獲ゾーンを含み、１つの反応ゾーンと１つの捕獲ゾーンとの組み合わせは、第２の反応ゾーンと第２の捕獲ゾーンとの組み合わせとは流体接続されておらず、各反応ゾーン及び各捕獲ゾーンは、もう一方の反応ゾーン又は捕獲ゾーンの１つ又は複数の捕獲分子に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む、
装置。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の装置であって、前記捕獲分子は、約２０から８０ヌクレオチド、好ましくは約４０から６５ヌクレオチド、より好ましくは約６０ヌクレオチドの長さを有する、装置。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の装置であって、前記多孔性膜基板は、ファブリック若しくはフェルトである、並びに／又は、異方的にエッチングされたアルミニウムオキシド若しくはエレクトロスパンファイバー等の、好ましくは三次元及び／若しくは二次元のポア構造を有した、ナイロン等のランダムな多孔性構造を含むか若しくは規則的な多孔性構造を含み、或いは、前記多孔性膜基板は、好ましくは重合により引き起こされる相分離によって、インサイツで作られる、装置。
【請求項１０】
マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させる方法であって、
（ａ）変性された形状の１つ又は複数の標的分子を含有する培養液を、請求項１乃至９のうちいずれか一項に記載の装置の捕獲ゾーン内に導入するステップ、
（ｂ）前記１つ又は複数の標的分子若しくはその一部と、前記捕獲ゾーン内の１つ又は複数の固定化された捕獲分子との相互作用反応を行うステップであり、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部が、前記１つ又は複数の捕獲分子に結合される一方で、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部が、前記捕獲ゾーン内で捕獲されないか、或いは、前記１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部が、前記１つ又は複数の捕獲分子に結合される一方で、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部が、前記捕獲ゾーン内で捕獲されないステップ、及び、
（ｃ）結合していない１つ又は複数の標的分子鎖を、マイクロアレイを含む反応ゾーンまで輸送し、その結果、前記１つ又は複数の標的分子鎖若しくはその一部とマイクロアレイ上の固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用を可能にするステップ、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ステップ（ｄ）として、好ましくは光学的な読取りシステムを介して、前記１つ又は複数の標的分子鎖若しくはその一部と前記マイクロアレイ上の固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用を検出するステップをさらに含む方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法であって、前記１つ又は複数の標的分子と固定化された１つ又は複数の捕獲分子との前記相互作用反応は、少なくとも２つの捕獲ゾーン内で行われ、１つの捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、さらに、もう一方の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、１つの捕獲ゾーンは、好ましくは約８５℃から９８℃の温度の融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度で保たれるか又は該温度まで導かれる一方で、別の捕獲ゾーンは、好ましくは約４５℃から６５℃の温度の、前記１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度で保たれるか又は該温度まで導かれる、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記少なくとも２つの捕獲ゾーン間で温度を切りかえるステップをさらに含み、前記捕獲分子への前記核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度を有する前記捕獲ゾーンの温度は、前記捕獲分子への前記核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度、好ましくは約４５℃から６５℃の温度まで下げられ、さらに、前記捕獲分子への前記１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度を有する前記捕獲ゾーンの温度は、前記捕獲分子への前記核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度、好ましくは約８５℃から９８℃の温度まで上げられる、方法。
【請求項１４】
請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の方法であって、
（１）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子の増幅、
（２）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子のラベリング、
（３）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子の別の核酸への連結、
（４）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子を用いた一塩基伸長の実行、及び
（５）別の核酸へ連結される前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子のシーケンシング、
を含む群から選択される活動をステップ（ｅ）としてさらに含む方法。
【請求項１５】
１つ又は複数の標的分子を濃縮するため、又は、１つ又は複数の標的分子を特異的に選択するため、好ましくは、１つ又は複数のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の定量的及び／若しくはマルチプレックスな検出のため、又は、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、一塩基多型の検出のため、又は、マイクロアレイベースのゲノム選択に基づくシーケンシングのための、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のマイクロアレイ上に１つ又は複数の標的分子を効率的に結合させるための装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させるための装置に関し、当該装置は、マイクロアレイを含む反応ゾーン、及び、多孔性膜基板を含む捕獲ゾーンを含み、捕獲ゾーンは、標的分子のセンス鎖を特異的に捕獲する能力を持つ一方、相補的なアンチセンス鎖は反応ゾーンにおいて捕獲され、逆もまた同様に生じる。本発明は、さらに、当該装置において温度調節ユニットを構想し、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成又は結合を可能にしない温度まで、又は、核酸ハイブリダイゼーションに適した温度まで捕獲を導く又は該温度にて捕獲を維持するのを可能にする。本発明は、マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させる方法にも関し、当該方法は、変性された形状の１つ又は複数の標的分子を含有する培養液を本発明の装置の捕獲ゾーン内に導入するステップ、標的分子と、前記捕獲ゾーン内の固定化された捕獲分子との相互作用反応を行うステップ、及び、結合していない標的分子鎖を、マイクロアレイを含む反応ゾーンまで輸送し、その結果、標的分子鎖とマイクロアレイ上の固定化された捕獲分子との相互作用を可能にするステップを含む。さらなる態様において本発明は、そのような装置の、標的分子を濃縮するため、標的分子を特異的に選択するため、発現分析のため、比較ゲノムハイブリダイゼーションのため、ＳＮＰの検出のため、又は、マイクロアレイベースのゲノム選択に基づくシーケンシングのための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年代の終わりのヒト全ゲノムのシーケンシングを開始するためのＮＩＨのプロジェクト以降、シーケンシング技術は急速に発展してきている。特に、２００５年における第二世代のシーケンシングマシンの導入以降、シーケンシングの費用は、２００８年の初めには、ヒトゲノムあたり約１００万米国ドルまで、すなわち１０分の１まで減らされてきた。シーケンシング産業は、現在、ＤＮＡシーケンシングの費用を減らすことを目標としており、さらには、近い将来においてヒトゲノムあたり約１０００米国ドルの費用を達成することを目指している。これらの見込み及び予想に基づき、ＤＮＡシーケンシング、特にゲノムＤＮＡのシーケンシングだけでなく、ＤＮＡ配列のマルチプレックスな検出又は定量化も、重大な診断及び研究ツールとして考えられ、遺伝的変異の分析、疾病の検出、又は、疾病に対する素因の解明に利用することができる。これらのアプローチ全ての必要条件は、標的ＤＮＡの効率的な単離又は捕獲である。
【０００３】
標的ＤＮＡの結合は、標的配列に相補的な配列を有する捕獲プローブへのハイブリダイゼーションによって実行することができる。一般的に、捕獲プローブは、適した基板表面に付着するか又は適した基板表面上で固定化される。ハイブリダイゼーションによる捕獲の効率は、いくつかのパラメータ次第であり、最も重要なのは、標的の濃度である。多くの場合、標的物質の量及び／又は濃度は、ある程度制限されるか、又は、増幅は困難であるか若しくは望まれていない。そのような状況において、結合の効率の重要性は高まり、検出の限度、動的範囲、及び分析の正確さを決定する。
【０００４】
ヒトゲノムのような複雑な真核生物ゲノムは大きすぎて直接調査できないため、計算量削減法が必要とされる。これらは、例えば、ＰＣＲ法、フォスミドライブラリ構築、ＴＡＲクローニング、又は、複雑な真核生物ゲノムからユーザ定義のユニークなゲノム配列を単離するために開発されてきたマイクロアレイベースのゲノム選択（ＭＧＳ）による特異的配列の直接増幅に基づいている（ＷＯ２００８／０９７８８７号）。この方法は、約３００ｂｐの平均サイズのランダムな断片を生じるためのゲノムＤＮＡの物理的な剪断、断片の末端修復、相補的なＴヌクレオチドオーバーハングを有したユニークなアダプターへのライゲーション、並びに、参照ゲノム配列から同定された相補的な配列の高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイへの断片のハイブリダイゼーション、後のアダプター配列を使用したＰＣＲを介した断片の溶出及びその増幅を包含する（ＷＯ２００８／０９７８８７号）。しかし、現在のＭＧＳプロトコルを用いて、約８０〜９０％のみの標的領域を回収することができる。従って、１０％から２０％の標的配列が見逃されており、さらに、いくつか他の領域を低いレベルでのみ回収することができ、例えばリシーケンシングアプローチにおいて、信頼できる変異の発見を妨げるかもしれない。この知見は、典型的なハイブリダイゼーション混合物において、どちらの相補鎖も高いコピー数で存在し、従って、捕獲プローブへの結合の代わりに相補鎖への逆ハイブリダイゼーション（ｂａｃｋ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を支持しているという事実によって説明することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、信頼でき且つ定量的な標的分子の回収を可能にする、標的核酸分子、特にゲノム核酸等の標的ＤＮＡ分子の効率的な捕獲のための改善された手段及び方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、この必要性に取り組み、マイクロアレイ上での標的核酸分子の効率的な捕獲を可能にする手段及び方法を提供する。目的は、特に、マイクロアレイ上への核酸の効率的な結合のための装置によって成し遂げられる。
【０００７】
マイクロアレイ上への核酸の効率的な結合のための装置は、
（ａ）マイクロアレイを含む少なくとも１つの反応ゾーンであって、前記マイクロアレイが、１種又は複数種の捕獲分子が固定化される基板を含む、反応ゾーン、及び
（ｂ）多孔性膜基板を含む少なくとも１つの捕獲ゾーンであって、前記基板上には、１種又は複数種の捕獲分子が固定化され、前記反応ゾーンと流体接続した捕獲ゾーン、
を含み、
前記捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ一方、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部は、前記反応ゾーンにおいて捕獲することができる、或いは、前記捕獲ゾーンは、前記１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ一方、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部は、前記反応ゾーンにおいて捕獲することができる。
【０００８】
この装置の型式及びその使用は、核酸の捕獲の効率を、核酸の鎖分離によって徹底的に上げることができるという利点を提供する。従って、標的分子の１つの鎖が当該装置の捕獲ゾーンにおいて特異的に捕獲された場合、対応する鎖は自由になり、隣接する反応ゾーンにおけるマイクロアレイ上の特異的な捕獲分子に結合する。その結果、反応ゾーンでのハイブリダイゼーション液内の核酸分子の鎖及び対応する鎖のリハイブリダイゼーションを防ぐことができる。従って、一本鎖の標的分子の効果的な濃度が徹底的に減少し、次に、ハイブリダイゼーション及び総捕獲率を増やす。ハイブリダイゼーションステップは、従って、何十倍も速くなり得る。特に、試料と密に接触して大きな表面積及び過剰量の捕獲プローブを１つ又は複数の捕獲ゾーン内に有することによって、結合平衡は短時間にシフトすることができる。その結果、ハイブリダイゼーション液は、溶液において逆ハイブリダイゼーションが発生する前に使い尽くすことができる。多孔性膜基板上に捕獲される核酸の鎖は、非常に迅速に溶液から枯渇するため、反応ゾーン内のマイクロアレイへの対応する鎖のハイブリダイゼーションは、溶液における競合ハイブリダイゼーションによって邪魔されない。この種類の反応は、捕獲プローブの濃度が低く且つ到達性が小さい領域に制限されるため、マイクロアレイ上では可能ではない。従って、多孔性膜基板上への効率的な捕獲とマイクロアレイ上への高分解能の捕獲とを組み合わせることによって、新しく且つ非常に効率的な捕獲及び分離アプローチが生じる。捕獲した分子は、引き続き、異なる目的のため、とりわけ、増幅反応、ラベリング反応、ライゲーション、塩基伸長の実行のため、又は、シーケンシング活動のために使用することができる。
【０００９】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記の装置は、少なくとも２つの捕獲ゾーンを含み、１つの捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、さらに、もう一方の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ。
【００１０】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、当該装置は、装置内の温度を制御及び／又は調節するための少なくとも１つの温度制御及び／又は調節ユニットを含む。特に好ましい実施形態において、前記温度を制御及び／又は調節するための温度制御及び／又は調節ユニットは、前記捕獲ゾーン内の温度を制御及び／又は調節するために捕獲ゾーン内に置かれる。さらなる好ましい実施形態において、前記温度を制御及び／又は調節するための温度制御及び／又は調節ユニットは、前記捕獲ゾーン又は反応ゾーン内の温度を制御及び／又は調節するために、それぞれ捕獲ゾーン内及び反応ゾーン内に置かれる。
【００１１】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、当該装置は、少なくとも２つの捕獲ゾーンを含み、該少なくとも２つの捕獲ゾーンのうち１つは、融解温度、又は、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度で保たれるか又はその温度に導かれる一方で、別の捕獲ゾーンは、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度で保たれるか又はその温度に導かれる。特に好ましい実施形態において、前記融解温度、又は、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度は、約８５℃から９８℃の温度である。別の特に好ましい実施形態において、前記捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度は、約４５℃から６５℃の温度である。
【００１２】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖及びアンチセンス鎖若しくはその一部に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む。或いは、前記反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部のみに相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む。さらなる別の実施形態において、前記反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部のみに相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよい。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記捕獲ゾーンは、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子若しくはその一部に相補的な少なくとも１つの捕獲分子を含む。或いは、前記捕獲ゾーンは、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子若しくはその一部に相補的な捕獲分子のサブセットを含んでもよい。さらに別の好ましい実施形態において、前記捕獲ゾーンは、１つ又は複数の干渉配列に結合する能力を持つ１つ又は複数の捕獲分子を含むか又は該捕獲分子をさらに含んでもよい。さらに別の好ましい実施形態において、本発明による装置は、特に本明細書において先に記載された装置は、少なくとも２つの反応ゾーンを含んでもよく、１つの反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部に特異的に結合する能力を持ち、もう一方の反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部に特異的に結合する能力を持つ。
【００１４】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された１つ又は複数の前記反応ゾーン及び前記捕獲ゾーンは、閉ループで配置される。特に好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された１つ又は複数の前記反応ゾーン及び前記捕獲ゾーンは、統合装置内に配置され、１つ又は複数の前記反応ゾーン及び前記捕獲ゾーンは、接続されたマイクロ流体システム内にある。本発明の別の実施形態において、前記装置は、２つの反応ゾーン及び２つの捕獲ゾーンを含んでもよく、１つの反応ゾーンと１つの捕獲ゾーンとの組み合わせは、第２の反応ゾーンと第２の捕獲ゾーンとの組み合わせとは流体接続されておらず、各反応ゾーン及び各捕獲ゾーンは、もう一方の反応ゾーン又は捕獲ゾーンの１つ又は複数の捕獲分子に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む。
【００１５】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された前記捕獲分子は、約２０から８０ヌクレオチドの長さを有する。特に好ましい実施形態において、前記捕獲分子は、約４０から６５ヌクレオチドの長さを有する。さらに別の特に好ましい実施形態において、前記捕獲分子は、約６０ヌクレオチドの長さを有する。
【００１６】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された前記多孔性膜基板は、ファブリック又はフェルトである。さらなる実施形態において、前記多孔性膜基板は、ランダムな多孔性構造を含むか又は該構造をさらに含んでもよい。好ましいランダムな多孔性構造はナイロンであるだろう。さらなる別の実施形態において、前記多孔性膜基板は、規則的な多孔性構造を含んでもよい。さらなる好ましい実施形態において、前記多孔性膜基板は、三次元及び／又は二次元のポア構造を含んでもよい。特に好ましいのは、異方的にエッチングされたアルミニウムオキシド又はエレクトロスパンファイバーである。別の好ましい実施形態において、前記多孔性膜基板は、インサイツで作ることができる。特に好ましいのは、重合により引き起こされる相分離によるインサイツ生成プロセスである。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させる方法に関し、当該方法は、
（ａ）変性された形状の１つ又は複数の標的分子を含有する培養液を、本明細書において先に記載された装置の捕獲ゾーン内に導入するステップ、
（ｂ）前記１つ又は複数の標的分子若しくはその一部と、前記捕獲ゾーン内の１つ又は複数の固定化された捕獲分子との相互作用反応を行うステップであって、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部が、前記１つ又は複数の捕獲分子に結合される一方で、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部が、前記捕獲ゾーン内で捕獲されないか、又は、前記１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部が、前記１つ又は複数の捕獲分子に結合される一方で、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部が、前記捕獲ゾーン内で捕獲されないステップ、及び、
（ｃ）結合していない１つ又は複数の標的分子鎖を、マイクロアレイを含む反応ゾーンまで輸送し、その結果、前記１つ又は複数の標的分子鎖若しくはその一部とマイクロアレイ上の固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用を可能にするステップ、
を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、当該方法は、ステップ（ｄ）として、前記１つ又は複数の標的分子鎖若しくはその一部とマイクロアレイ上の固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用を検出するステップをさらに含む。特に好ましい実施形態において、前記相互作用の検出は、光学的な読取りシステムの使用を介して又は該使用に基づき実行される。
【００１９】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された前記１つ又は複数の標的分子と固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用反応は、少なくとも２つの捕獲ゾーン内で行われ、１つの捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、もう一方の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、１つの捕獲ゾーンは、融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度で保たれるか又はその温度まで導かれる一方で、別の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度で保たれるか又はその温度まで導かれる。本発明の特に好ましい実施形態において、前記融解温度、又は、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度は、約８５℃から９８℃の温度である。別の特に好ましい実施形態において、前記捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度は、約４５℃から６５℃の温度である。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された方法は、前記少なくとも２つの捕獲ゾーン間で温度を切りかえるステップをさらに含み、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度を有する捕獲ゾーンの温度は、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度、好ましくは約４５℃から６５℃の温度まで下げられ、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度を有する捕獲ゾーンの温度は、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度、好ましくは約８５℃から９８℃の温度まで上げられる。
【００２１】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された方法は、
（１）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子の増幅、
（２）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子のラベリング、
（３）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子の別の核酸への連結、
（４）前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子を用いた一塩基伸長の実行、及び
（５）別の核酸へ連結される前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合される１つ又は複数の標的分子のシーケンシング、
を含む群から選択される活動をステップ（ｅ）としてさらに含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、１つ又は複数の標的分子を濃縮するため、又は、１つ又は複数の標的分子を特異的に選択するため、好ましくは、１つ又は複数のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の定量的及び／若しくはマルチプレックスな検出のため、又は、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、一塩基多型の検出のため、又は、マイクロアレイベースのゲノム選択に基づくシーケンシングのための、本明細書において先に規定された、マイクロアレイ上に１つ又は複数の標的分子を効率的に結合させるための装置の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】捕獲分子（Ｃｐ）に結合する一本鎖核酸（Ｔ）がジッピング（ｚｉｐｐｉｎｇ）反応によって相補的な一本鎖核酸（Ｔｃ）により置換される状況を描写した図である。
【図２】ナイロン膜であって、膜の表面上の固定化された捕獲プローブによってフロースルーの仕組みにおいて核酸を捕獲するために使用することができる膜を示した図である。
【図３】上面図において及び断面で本発明の実施形態による装置を描写した図である。基板の下の加熱要素が、温度と共に下に例として示されている。参照番号（１）は基板を示しており、参照番号（２）は捕獲アレイを描写しており、参照番号（３）は核酸鎖Ａに対する膜を示しており、参照番号（４）は核酸の対応する鎖を捕獲するための膜を示しており、参照番号（５）は、サンプルポート、流体作動、及び、閉ループ循環のためのチャネルを示している。
【図４】図３に示された装置と類似の、上面図において及び断面で本発明の実施形態による装置を描写した図であるが、膜の温度設定は逆である。
【図５】アレイのスポット上の捕獲された標的分子の密度に対するマイクロアレイ内の変性と注入との間の試料の保有時間の効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者等は、特にマイクロアレイ上への核酸の効率的な結合のための装置によるマイクロアレイ上への標的核酸分子の効率的な捕獲を可能にする手段及び方法を開発してきた。
【００２５】
本発明は特定の実施形態に関して記載されるけれども、この記載は、限定的なセンスで解釈されることにはならない。
【００２６】
本発明の例証的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するために重要な定義が与えられる。
【００２７】
本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の不定冠詞は、その前後で何か他に明確に指示していない限り、それぞれの複数形も含む。
【００２８】
本発明と関連して、「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的に、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、及び、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を示している。
【００２９】
「含む」という用語は限定的ではないと理解すべきである。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう規定される場合、これは、好ましくはこれらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。
【００３０】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された順序以外の順序で操作できることが理解されたい。
【００３１】
「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語が方法又は使用のステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において上記又は下記に定められたように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。
【００３２】
本発明は、本明細書において記載される特定の器具、方法論、プロトコル、試薬等は変わり得るためこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されたい。定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３３】
先に述べたように、本発明は、一態様において、マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させるための装置に関係し、当該装置は、
（ａ）マイクロアレイを含む少なくとも１つの反応ゾーンであって、前記マイクロアレイが、１種又は複数種の捕獲分子が固定化される基板を含む、反応ゾーン、及び
（ｂ）多孔性膜基板を含む少なくとも１つの捕獲ゾーンであって、前記基板上には、１種又は複数種の捕獲分子が固定化され、前記反応ゾーンと流体接続した捕獲ゾーン、
を含み、
前記捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ一方、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部は、前記反応ゾーンにおいて捕獲することができ、或いは、前記捕獲ゾーンは、前記１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ一方、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部は、前記反応ゾーンにおいて捕獲することができる。
【００３４】
「装置」という用語は、本明細書において使用される場合、分子反応若しくは相互作用の実行を可能にするか又はそれらに適した、特に、相互作用並びに後の関連する若しくは関連づけられる分子反応を結合させるか又は捕獲するための、例えば入れ物、チャンバー、若しくは容器等の構造体、又は、そのような構造体のアセンブリー、或いは、機器を意味する。当該装置は、１つ又は複数の入口及び／若しくは出口要素が対応して備わっていてもよく、例えば反応性の表面又は特定の機能性を有した表面等、１つ又は複数の表面を含んでもよく、例えば反応若しくは結合部門、洗浄部門、混合部門、待機部門、測定部門、廃棄部門、貯蔵部門、又は、そのいかなるサブポーション若しくは組み合わせ等、１つ又は複数の機能的部門を含んでもよい。当該装置は、例えばチューブ若しくはジョイント等、これらの要素間の接続をさらに含んでもよく、並びに／又は、液体、流体、化学物質、成分、試料のためのリザーバー及び貯蔵所、又は、装置内で使用されることになるいかなる他の実在物を含んでもよい。
【００３５】
本発明による装置は反応ゾーンを含む。そのような「反応ゾーン」は、ゾーンのサイズと比較して小さいサイズの入口及び／又は出口の構造体のみを含む閉じられた存在であってもよいか、或いは、装置内にあるさらなる実在物とは接続していない開放性の構造体であってもよい。
【００３６】
反応ゾーンは典型的にマイクロアレイを含む。「マイクロアレイ」という用語は、本明細書において使用される場合、アレイ内の捕獲分子と、例えば培養液、反応液、好ましくはハイブリダイゼーション液等の周囲の環境における可能な相互作用物質との相互作用のために与えられる規則正しい又はランダムなアレイを意味する。マイクロアレイは、アドレス可能な領域のいかなる二次元又は三次元配置、好ましくは、二次元配置を含んでもよい。典型的なマイクロアレイは、多数のスポット、特徴、個々の固定化の領域、又は、個々の分子認識の領域を含有してもよい。例えば、アレイは、２、５、１０、５０、１００、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００、１０，０００、２０，０００４０，０００、５０，０００、７０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、７５０，０００、８００，０００、１，０００，０００、１，２００，０００、１，５００，０００、１，７５０，０００、２，０００，０００、又は２，１００，０００を超えるスポット、特徴、捕獲分子、又は、個々の固体化の領域、若しくは、個々の分子認識の領域を含有してもよい。これらの領域は、約２０ｃｍ２未満、約１０ｃｍ２未満、約５ｃｍ２未満、約１ｃｍ２未満、約１ｍｍ２未満、約１００μｍ２未満の領域内に含んでもよい。さらなる実施形態において、マイクロアレイ内のスポットサイズは、約１から３００μｍの範囲内にあってもよく、例えば、１０、５０、１００、１５０、２００、若しくは２５０μｍのサイズを有するか、又は、上記の値間のいかなる適した値を有する。さらなる実施形態において、プローブの密度は、必要に応じて変わり得る。プローブ密度の例は、例えば平方μｍあたり２０００、１０，０００、５０，０００、又は７５，０００個のプローブというプローブ密度等、平方μｍあたり１０００から１００，０００個のプローブという密度である。
【００３７】
特定の実施形態において、そのようなスポット、特徴、又は、個々の固定化の領域は、例えば１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の１つ又は複数の特定の配列又はゲノム若しくはゲノムの一部の被覆度等、いかなる適した被覆度を含んでもよい。従って、マイクロアレイは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の同じ捕獲分子のコピーを含んでもよい。或いは又は加えて、例えば不適正バリアント等の捕獲分子の異形、単一若しくは多数のヌクレオチド多型を有した異形、異なるバージョンの単一若しくは多数のヌクレオチド多型、例えばタグ、プライマー結合部位、エンドヌクレアーゼ認識部位等の異なる開始若しくは終結配列を有するが同じコア部分を有する捕獲分子等を含んでもよい。
【００３８】
「培養液」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明による捕獲分子と標的分子との相互作用に適した、すなわち、本明細書において以下で規定されるいかなる液体も意味する。好ましくは、培養液は、ストリンジェントな条件下での核酸の、例えば捕獲プローブ等の特定のさらなる核酸への二本鎖形成又はハイブリッド形成を可能にする溶液又は液体である。例えば、培養液は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含む緩衝液、又は、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む緩衝液、又は、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣＩ、及び１％ＳＤＳの緩衝液、又は、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ、４．７％ＳＤＳ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液、又は、３ｘＳＳＣ（４５０ｍＭ塩化ナトリウム／４５ｍＭクエン酸ナトリウム）の緩衝液、又は、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣＩ、０．５％サルコシンナトリウム、及び５０ｍＭ  ＭＥＳ、ＰＨ６．５を含有する溶液を含むか若しくは該液から本質的に成る若しくは該液から成ってもよい。特定の実施形態において、培養液は、本明細書において使用される場合、反応ゾーン又は捕獲ゾーンを洗浄するのに必要な成分を含んでもよい。例えば、そのような培養液は、ｐＨ７にて約０．０２モルの塩濃度、又は、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度、又は、約０．２ｘＳＳＣの塩濃度、又は、０．１％ＳＤＳ含有約２ｘＳＳＣの塩濃度、又は、０．１％ＳＤＳ含有約０．１ｘＳＳＣの塩濃度を有してもよい。或いは、洗浄培養液は、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ又は０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含んでもよい。さらに、いかなる適した商業的に入手可能なハイブリダイゼーション及び／又は洗浄及び／又はインキュベーション緩衝液等を、本発明による装置内の培養液として使用することができる。
【００３９】
本発明による装置内で使用されることになる培養液は、例えば分子のカルボキシル基の塩又はアミノ基の酸付加塩等の特定の塩をさらに含んでもよい。カルボキシル基の塩は、当技術分野において既知の方法によって形成することができ、且つ、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩、又は亜鉛塩等の無機塩、及び、例えばトリエタノールアミン等のアミン、アルギニン、又はリジン、ピペリジン、プロカイン等で形成されたもの等の有機塩基を有する塩を含む。酸付加塩は、例えば、例えば塩酸又は硫酸等の鉱酸を有する塩、及び、例えば酢酸又はシュウ酸等の有機酸を有する塩を含む。
【００４０】
当該マイクロアレイは、典型的に、１種又は複数種の捕獲分子が固定化される基板を含む。「基板」という用語は、本明細書において使用される場合、当業者には既知のいかなる適した基板も意味する。当該基板は、いかなる適した形状又は型式を有してもよく、例えば、平らで、例えば凸状又は凹状に向かって曲がる等、曲がっていてもよく、カールさせるか又は波状の型式を含んでもよい。基板は、円形状の構造で、ビーズ様の要素又はビーズ又はマイクロキャリアの形状で構築してもよく、例えば、アレイに配置してもよい。ビーズは、基板の下地の上に重ねるか、又は、ロッドのような連結要素等によって反応領域内に固定させてもよい。アレイは、さらに、捕獲分子を含む磁性粒子から構成してもよい。
【００４１】
典型的に、反応ゾーンの基板は固体の支持体であり、すなわち、支持材を含み、主に非流動性で高い耐久性のものであり、その結果、支持材上の捕獲分子の正確且つ追跡可能な位置決めを可能にする。そのような基板の例は、例えばアミン基若しくはアミンで官能性を持たせる基等の化学的官能基を含む固体材料又は基板である。相当する支持材又は基板は、例えば、非多孔性の基板であってもよい。非多孔性基板の中でも好ましいのは、ポリエチレングリコール、アミン、エポキシド、イソチオシアン酸等の官能性を持った基を有するシラン層で被覆されたガラス、シリコン、石英ガラス、ポリ−Ｌ−リジン被覆材料、ニトロセルロース、ポリスチレン、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、及びポリカーボネートである。例えば、ガラス又はポリスチレンを使用してもよい。ポリ−Ｌ−リジンを用いた被覆又は表面処理に加えて、バルク材料、特にガラスは、例えばエポキシシラン若しくはアミノシランを用いたシラン処理によって、又はシリル化によって、又はポリアクリルアミドを用いた処理によって処理してもよい。特に好ましいのは、シランの利用である。
【００４２】
本発明による装置は、本明細書において規定される反応ゾーンに加えて、捕獲ゾーンを含む。そのような「捕獲ゾーン」は、ゾーンのサイズと比較して小さいサイズの入口及び／又は出口の構造体のみを含む閉じられた存在であってもよいか、或いは、装置内にあるさらなる実在物とは、好ましくは本明細書において記載される反応ゾーンとは接続していない開放性の構造体であってもよい。
【００４３】
捕獲ゾーンは、典型的に、１種又は複数種の捕獲分子が固定化される多孔性膜基板を含む。「多孔性膜基板」という用語は、本明細書において使用される場合、固体の柔軟な膜支持体を意味し、すなわち、主に非流動性で柔軟な高い耐久性のものであり、且つ、かなりの割合若しくは相当な割合の孔、空洞、又は３次元のでこぼこを含む支持材を含む。多孔性基板は、典型的に、非多孔性基板と比較して猛烈に増えた表面を有する。本発明は、いかなる適した形状、厚さの多孔性膜基板、又は、いかなる適したサイズの孔も含む多孔性膜も構想する。例えば、多孔性膜基板は、平らで、例えば凸状又は凹状に曲がる等、曲がっていてもよく、カールさせるか又は波状の型式を含んでもよい。多孔性膜基板は、円形状の構造で、ビーズ様の要素の形状で構築してもよく、例えば、アレイに配置してもよい。ビーズは、基板の下地の上に重ねるか、又は、ロッドのような連結要素等によって反応領域内に固定させてもよい。好ましいのは、約１００から１０００μｍの厚さ、より好ましくは約５０から１５０μｍの厚さを有する膜である。本発明と関連して、すなわち、効率的な捕獲に対して、及び、捕獲分子の濃度を上げる又はその量を増やすために、高特異的な表面を含む膜を使用することが好ましい。従って、小さい孔を有する膜を使用することが好ましい。特定の実施形態において、孔径は、０．１から１０μｍ、より好ましくは０．５から５μｍである。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態において、多孔性膜基板は、ファブリック又はフェルトである。さらなる特に好ましい実施形態において、多孔性膜基板は、ランダムな多孔性構造を含む。或いは、多孔性膜基板は、規則的な多孔性構造を含んでもよい。さらに構想されるのは、三次元のポア構造及び／若しくは二次元のポア構造、又は、その混合の存在である。
【００４５】
特に好ましい多孔性膜基板はナイロンである。適したナイロン膜の例として、Ｎｙｔｒａｎ  Ｎ（登録商標）、Ｎｙｔｒａｎ  ＳＰＣ（登録商標）、及びＢｉｏｄｙｎｅ  Ｃ（登録商標）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４６】
そのような膜の産出のための技術は当業者には既知である。好ましい例は、異方的にエッチングされたアルミニウムオキシドの産出又はエレクトロスパンファイバーの生成である。従って、得られた産出物、すなわち、異方的にエッチングされたアルミニウムオキシド又はエレクトロスパンファイバーは、本発明と関連して多孔性膜基板として使用することができる。
【００４７】
本発明のさらなる特定の実施形態において、多孔性膜基板は、インサイツで作ることができる。そのようなインサイツでの創造の例は、重合体−単量体混合物（例えばアクリル酸エステル−ＰＭＭＡ等）を用いた重合により誘発される相分離、又は、重合体−溶媒混合物の熱的に誘発される相分離である。
【００４８】
捕獲ゾーン及び反応ゾーンは、単独で本発明による装置内に存在し得るか、或いは、捕獲ゾーン若しくは反応ゾーンのうちどちらか又はその両方が、二度以上本発明による装置内に存在し得る。例えば、本発明による装置は、１つの捕獲ゾーン及び１つの反応ゾーンを含んでもよく、又は。２つの捕獲ゾーン及び１つの反応ゾーンを含んでもよく、又は、２つの捕獲ゾーン及び２つの反応ゾーンを含んでもよく、又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上の捕獲ゾーン、及び、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上の反応ゾーンを含んでもよい。１つ又は複数の捕獲ゾーン及び１つ又は複数の反応ゾーンは、さらに、いかなる適したスキームに従っても本発明の装置内に配置することができる。例えば、１つ又は複数の捕獲ゾーン及び１つ又は複数の反応ゾーンは、互いに流体接続させることができ、例えば、当該装置のたった１つの反応ゾーンを、当該装置のたった１つの捕獲ゾーンと流体接続させることができる。或いは、装置は、２つ以上の捕獲ゾーン及び２つ以上の反応ゾーンを含んでもよく、少なくとも１つの捕獲ゾーン及び１つの反応ゾーンが流体接続している。しかし、さらなる捕獲ゾーン及びさらなる反応ゾーンは、前記１つの捕獲ゾーン及び前記１つの反応ゾーンとは流体接続していなくてもよい。例えば、装置は、１つの捕獲ゾーンと１つの反応ゾーンとの組み合わせの二重、三重、又は幾重にも折りたたんだ仕組みを含んでもよく、それらは互いに流体接続しているが、さらなる捕獲ゾーンと反応ゾーンの組とは流体接続していない。さらなる実施形態において、これらのゾーンは、本明細書において規定されるマイクロ流体デバイスの形状に統合させることができる。
【００４９】
「流体接続」という用語は、本明細書において使用される場合、上記要素又はゾーン間での例えばハイブリダイゼーション溶液又はいかなる他の適した培養液の液体の流れ及び／又は交換を可能にする上記要素又はゾーン間の接続の存在を意味する。流体接続は、例えばゾーン間での並列等の直接接続であってもよく、又は、そのような機能性を可能にするチューブ、ジョイント、若しくは結合の存在を含んでもよい。これらの構造的要素は、いかなる適した長さ、直径、コーティング、又は構造を有してもよい。例及びさらなる詳細が当業者には既知である。さらに、本明細書において規定される輸送手段が、流体若しくは液体の輸送又は移動を可能にするために存在してもよい。
【００５０】
本発明は、装置内の独立した分離可能及び／若しくは除去可能な反応ゾーン並びに／又は捕獲ゾーンも構想する。例えば、装置は、捕獲ゾーンと反応ゾーンとの接続、及び／又は、さらなる可能なゾーン間若しくは要素間の接続を装置内に含んでもよく、該接続を解体して、装置の反応ゾーン若しくは捕獲ゾーンのうちどちらか又はその両方、或いは、全ゾーン又は要素の除去を可能にすることができる。このオプションは、さらに又或いは、１つ又は複数の接続点での適したシール形成能力の存在、適した機械的結合要素の存在等を含む。特定の実施形態において、捕獲ゾーンは、さらなる又は異なる捕獲ゾーンと置換してもよく、又は、反応ゾーンは、さらなる又は異なる反応ゾーンと置換してもよい。当該装置のそのような除去される要素又はゾーンは、例えば、種々の装置において又は種々の状況において、例えば、結合した要素の後の分析ステップ等のために使用することができる。従って、本発明の装置は、例えば本明細書に記載される１つ又は複数のゾーン若しくは要素の置換によって、最初の利用後、再利用可能又は再使用可能であり得る。さらに、効率的な操作のため、少量使用することが好ましい。
【００５１】
「捕獲分子」は、本明細書において使用される場合、本明細書において先に規定されたように、本発明による装置において環境又は培養液からの標的分子、特に、核酸標的分子との特異的相互作用を可能にするいかなる適した分子であってもよい。装置内で環境、培養液、又は反応液から標的分子を選択する能力を持つ捕獲分子の例は、核酸、タンパク質、ペプチド、いかなる形状及び型式のリガンド、抗体、例えば炭水化物若しくは糖等の有機若しくは無機構造体、重合体、又は、上記の例のいかなる誘導体、変形、類似体、若しくは組み合わせである。特に好ましいのは、核酸の捕獲分子である。
【００５２】
「核酸」という用語は、本明細書において使用される場合、当業者には既知のいかなる核酸も意味し、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、又はＡＮＡを意味する。ＤＮＡは、例えばＡ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、又はＺ−ＤＮＡの形状であってもよい。ＲＮＡは、例えばｐ−ＲＮＡ、すなわちピラノシルＲＮＡの形状、又は、ヘアピンＲＮＡ若しくはステムループＲＮＡのような構造的に修飾された形状であってもよい。「ＰＮＡ」という用語は、ペプチド核酸、すなわち、生物学的研究及び医学的処置において使用されるが自然に発生するとは知られていないＤＮＡ又はＲＮＡに類似の人工的に合成した重合体に関する。ＰＮＡの主鎖は、典型的に、ペプチド結合によって連結した反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。種々のプリン及びピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によって主鎖に連結する。ＰＮＡは、一般的に、第１（左側）の位置にてＮ末端を有し且つ右側にＣ末端を有したペプチドのように描かれる。「ＣＮＡ」という用語は、アミノシクロヘキシルエタン酸核酸に関する。さらに、当該用語は、シクロペンタン核酸、すなわち、例えば２’−デオキシカルバグアノシンを含む核酸分子に関する。「ＨＮＡ」という用語は、ヘキシトール核酸、すなわち、標準的な核酸塩基及びリン酸化１，５−アンヒドロヘキシトール主鎖から構築されるＤＮＡ類似体に関する。「ＬＮＡ」という用語は、ロックド核酸に関する。典型的に、ロックド核酸は、修飾された、従って隔絶されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’炭素と４’炭素とを接続する余分なブリッジで修飾することができる。そのようなブリッジは、３’−ｅｎｄｏ構造においてリボースをロックする。ロックされたリボース構造は、塩基スタッキング及び主鎖の予めの組織化を高める。これは、オリゴヌクレオチドの熱安定性、すなわち融解温度を有意に増加させることができる。「ＡＮＡ」という用語は、アラビノ核酸又はその誘導体に関する。本発明に関連した好ましいＡＮＡ誘導体は、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノヌクレオシド（２’Ｆ−ＡＮＡ）である。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、及びＡＮＡのうちいずれの組み合わせ、例えば、ＬＮＡヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ塩基との混合物を含んでもよい。本明細書において先に規定された核酸分子は、短鎖オリゴヌクレオチド、長鎖オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの形状であってもよい。
【００５３】
本発明の特定の実施形態において、核酸は、二本鎖の形状で存在してもよく、すなわち、核酸分子の鎖間での塩基対形成によって結合させられた核酸分子の鎖及び相補的又は逆平行の対応する鎖、又は、核酸分子のセンス若しくはアンチセンス鎖を含んでもよい。「センス鎖」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質に翻訳されるか又は翻訳することができるメッセンジャーＲＮＡコピーの配列と同じ配列を含む分子を意味する。当該用語は、本発明に関連して、メッセンジャーＲＮＡコピー又はそのタンパク質への発現の存在にもかかわらず、その相補的な対応する鎖とは同じではない二本鎖核酸分子の１つの鎖を含む分子をさらに意味する。本発明によるセンス鎖は、従って、例えば派生する転写物又はタンパク質配列が既知である遺伝子等の遺伝子単位の規定に基づき規定することができるか、又は、センス鎖は、ゲノム配列の鎖１若しくは鎖Ａとしてゲノム配列情報に従って規定することができ、ゲノム配列の鎖１若しくは鎖Ａは、その対応する鎖（鎖２若しくは鎖Ｂ）とは同じではない。ゲノム配列に対して、センス鎖の完全なる同一性、すなわち、転写されたｍＲＮＡ配列とのその同一性の疑問は、センス鎖がアンチセンス鎖の相補的配列として、その逆もまた同様に理解される限り無関係であり得る。機能的情報又は遺伝子単位若しくは発現単位に対する情報が入手可能ではない核酸フラグメント又はゲノムのサブゲノム部分に対して、二本鎖核酸分子のセンス鎖は、２つの鎖のいずれであってもよく、アンチセンス鎖は、その反対の鎖又は相補的な鎖である。従って、「アンチセンス鎖」という用語は、本明細書において使用される場合、先に規定されたセンス鎖に対して相補的な鎖又は反対の鎖を含む分子を意味する。
【００５４】
「相補的」という用語は、本明細書において使用される場合、反対の核酸鎖と対応する塩基対の存在を意味する。例えば、センス鎖におけるヌクレオチド又は塩基Ａに対して、相補鎖又はアンチセンス鎖はヌクレオチド又は塩基Ｔに結合し、又はその逆も同様であり、同じように、センス鎖におけるヌクレオチド又は塩基Ｇに対して、相補鎖又はアンチセンス鎖はヌクレオチド又は塩基Ｃに結合し、又はその逆も同様である。この完全又は完璧な相補性のスキームは、本発明の特定の実施形態において、１つ若しくは複数のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖内の単一若しくは多数の非相補的な塩基又はヌクレオチドの広がりの存在の可能性によって変わり得る。従って、センス鎖とアンチセンス鎖との対の概念において論ずるためには、どちらの鎖も完全に相補的であり得るか、又は、部分的にのみ相補的であってもよく、例えば、両方の鎖の全ヌクレオチド間で約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の相補性を示してもよい。非相補的な塩基は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのうち１つを含んでもよく、すなわち、例えばＡとＧ若しくはＴとＣ間で不適正塩基対を示してもよく、又は、例えばＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）、Ａｐｐｅｎｄｉｘ２、Ｔａｂｌｅ２において記載の修飾された塩基を含むいかなる修飾されたヌクレオシド塩基を含んでもよい。さらに、本発明は、例えばＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖とＰＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖とＣＮＡ鎖との相補性等、同一でない核酸分子間の相補性、又は、核酸分子と有機ポリマーとの相補性も予想する。
【００５５】
他の実施形態において、核酸分子は、一本鎖の形状で存在してもよい。「一本鎖の形状」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸分子が２つの核酸分子間の塩基対形成を示さないことを意味する。一本鎖形状の核酸は、二本鎖核酸分子の、例えばそのような分子を約８５℃から９８℃、好ましくは９５℃の温度まで加熱することによる融解又は変性によって得ることができる。温度条件は、核酸の配列、その長さ、又は、塩、界面活性剤等の存在等、培養液の性質に応じてさらに設けることができる。或いは、一本鎖形状の核酸は、例えば当業者には既知の適した合成方法に従った核酸分子の新規合成によって、又は、本発明によって構造される方法を含む適したフィルタリング若しくは濃縮プロセスによって得ることができる。
【００５６】
本発明に関連した「ペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸を含むいかなる種類のアミノ酸配列、特に、４０又は５０のアミノ酸長までの短配列を意味する。当該用語は、特定の実施形態において、タンパク質構造体又はその機能的誘導体も意味する。さらに、ペプチドは、さらなる化学的部分又は機能性と組み合わせることができる。「ポリペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、中間又は長いアミノ酸配列を意味し、好ましくは、４０又は５０のアミノ酸を含む。当該用語は、特定の実施形態において、タンパク質構造体又はその機能的誘導体も意味する。さらに、ポリペプチドは、さらなる化学的部分又は機能性と組み合わせることができる。「炭水化物」という用語は、本明細書において使用される場合、実験式Ｃｍ（Ｈ２Ｏ）ｎを有した有機化合物を意味し、すなわち、炭素、水素、及び酸素のみから成り、水素：酸素の原子比は２：１である。当該群は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、及び多糖類を含む。好ましくは、砂糖、すなわち単糖類及び二糖類が参照される。本発明によるポリペプチド、タンパク質、又はペプチドの「修飾」は、アセチル化、ペグ化、ＨＥＳ化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、ホルミル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、特定の化学的切断、タンパク質切断、細胞リガンド若しくは他のタンパク質への連鎖、又は、ＨＡＰ化（ｈａｐｙｌａｔｉｏｎ）、すなわち、グリシンリッチなホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）との融合等であってもよい。そのような修飾は、当業者には既知の適した技術によって実行することができる。さらに、ポリペプチド、ペプチド、又は変異体は、１つ又は複数の非古典的なアミノ酸を含有してもよい。
【００５７】
本明細書において規定される１種又は複数種の捕獲分子を含む本発明による捕獲ゾーンは、典型的に、本明細書において先に規定されるように、標的分子、特に一本鎖標的分子、すなわち核酸分子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖を特異的に捕獲する又は該標的分子に特異的に結合する能力を持つ。従って、本明細書において規定される１種又は複数種の捕獲分子を含む本発明による反応ゾーンは、典型的に、本明細書において先に規定されるように、標的分子、特に一本鎖標的分子、すなわち核酸分子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖を特異的に捕獲する又は該標的分子に特異的に結合する能力を持つ。従って、本発明の典型的な実施形態において、前述の捕獲ゾーンは、本発明の装置に関連して、二本鎖核酸標的分子のうちの１つの鎖を捕獲することができてもよい一方で、前述の反応ゾーンは、前記二本鎖核酸標的分子の対応する鎖を捕獲することができる。例えば、捕獲ゾーンが、本明細書において先に規定されるように、核酸標的分子のセンス鎖を特異的に捕獲するか又は該センス鎖に特異的に結合する能力を持つ場合、対応する反応ゾーンは、前記核酸標的分子のアンチセンス鎖を特異的に捕獲するか又は該アンチセンス鎖に特異的に結合する能力を持つ。或いは、捕獲ゾーンが、本明細書において先に規定されるように、核酸標的分子のアンチセンス鎖を特異的に捕獲する能力を持つ場合、対応する反応ゾーンは、前記核酸標的分子のセンス鎖を特異的に捕獲する能力を持つ。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書において規定される１種又は複数種の捕獲分子を含む本発明による捕獲ゾーンは、典型的に、本明細書において先に規定されるように、標的分子の一部、特に一本鎖標的分子の一部、すなわち核酸分子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する又は該一部に特異的に結合する能力を持つ。従って、本明細書において規定される１種又は複数種の捕獲分子を含む本発明による反応ゾーンは、典型的に、本明細書において先に規定されるように、標的分子の一部、特に一本鎖標的分子の一部、すなわち核酸分子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する又は該一部に特異的に結合する能力を持つ。「標的分子の一部」、「一本鎖標的分子の一部」、及び「核酸分子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖の一部」という用語は、本明細書において使用される場合、標的分子全体、典型的には一本鎖分子全体が捕獲分子に結合するか又は該捕獲分子に相補的であるのではないが、その一部のみが相補的である及び／又は結合することができる状況を意味する。この前記標的分子の一部又は一部分は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ヌクレオチドという最小の長さを有してもよい。さらに、標的分子の一部のみに結合する捕獲分子は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ヌクレオチドという最小の長さを有してもよい。さらなる追加又は別の実施形態において、どちらの相互作用分子、すなわち先に規定された捕獲分子も先に規定された標的分子も、その全体の長さに対して、約３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の相補性を示すことができる。非相補的な領域又は部分は、リンカー配列、人工プライマー結合部位、人工エンドヌクレアーゼ認識部位、タグ、同定目的のためのバーコード配列等を含んでもよい。そのような非相補的な区分の存在は、例えば、温度、ハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、装置内の流速又は流量、相互作用時間等の結合パラメータの調整によって考慮することができる。そのようなパラメータ及びその仕組みは当業者には既知である。さらに構想されるのは、装置が少なくとも２つの捕獲ゾーン及び／又は少なくとも２つの反応ゾーンを含む場合におけるセンス鎖及びアンチセンス鎖に対する相互排他的な結合能力の混合である。
【００５９】
典型的に、捕獲分子、特に核酸は、例えば、本明細書において先に記載されるように、マイクロアレイの形状の基板の上、又は、本明細書において規定される多孔性膜基板上に固定化される。「固定化」という用語は、本明細書において使用される場合、基板の特定の領域に分子を置く、及び、例えば洗浄、水洗、又は相互作用のステップ等の間の捕獲分子の剥離を同時に妨害する分子相互作用を介した支持的基板への１つ又は複数の捕獲分子の結合を意味する。典型的に、そのような分子相互作用は、当業者には既知のように、支持材料の構造要素又は官能基と、例えば対応する核酸の官能基等の固定化されることになる捕獲分子との共有化学結合に基づく。固定化は、例えば、熱又は光によって捕獲分子を架橋させることによって、すなわち、熱又は光のようなエネルギー源によって提供されるエネルギーの影響下で又は該エネルギーによって駆り立てられてどちらの構造要素も共に結びつける分子相互作用又は結合を形成することによって、又は、化学的固定化を介して実行することができる。
【００６０】
吸着相互作用と関連した「捕獲分子のサイズ」という用語は、存在する結合部位の数に関する。いずれの結合部位も原則としていかなる時も基板の表面から分離することができるけれども、多数の結合部位による効果は、捕獲分子が全体として結合したまま残るということである。例えば約４０から１５０℃、好ましくは５０から１２０℃、より好ましくは６０から１１０℃の温度で、熱の形状のエネルギーを加えることによって、支持材料への捕獲分子の物理的吸着を高めることができ、効率的な固定化に必要とされる時間は短くすることができる。熱による架橋は、例えば２分から１２時間、好ましくは１０分から８時間、より好ましくは３０分から６時間、さらにより好ましくは４５分から４時間、さらにより好ましくは１時間から３時間、さらに、最も好ましくは２時間等、当業者には既知のいかなる適した時間で実行することができる。熱又はベーキングによる架橋は、例えば乾燥チャンバー又はオーブン等、当業者には既知のいかなる適した手段によっても実行することができる。温度に加えて、湿度、通気、又は換気のような他のパラメータも、当業者には既知の適した値まで調整することができる。熱又はベーキングによる架橋は、光による架橋のような他の形状の固定化又は化学的固定化と組み合わせることもできる。
【００６１】
光による架橋は、典型的に、例えば１５０から５５０ｎｍの範囲、好ましくは２００から５００ｎｍの範囲の典型的な波長の光を捕獲分子に加えて、捕獲分子と支持材料との相互作用を誘発することによって行われる。典型的に、捕獲分子と支持材料との誘発される相互作用は、その材料に対する核酸の共有結合である。光による架橋は、例えば、ＵＶ光を使用することによって実行することができる。ＵＶ架橋は、プローブに対する支持材料の共有結合を確実にする最もシンプルな方法の１つである。核酸の場合において、連鎖は、核酸分子の塩基、例えばチミン、グアニン、アデニン、シトシン、又はウラシル残基等を介して進み、それらの塩基は、当業者には既知のように、支持材料上の対応する且つ適した化学的官能基と反応する。支持材料上又は内部の化学的官能基の存在及びその数は、適した化学活性化プロセスを介して制御及び調整することができる。そのような活性化プロセスは、例えば、支持材料上又はその内部に特異的に局在している官能基を提供し、さらに、これらの局在している官能基に関連して、捕獲分子と材料との特異的相互作用を促進することができる。支持材料上又はその内部の官能基の存在及びその数は、固定化される捕獲分子の方向及び自由度に影響を与えることもできる。例えば、より多い数の官能基の存在は、捕獲分子内の種々の点における固定化をもたらし得る。さらに、捕獲分子内の対応する反応性要素の存在は、支持材料上の捕獲分子の方向の制御に使用することができる。
【００６２】
「化学的固定化」は、本明細書において述べられる場合、化学反応に基づく支持材料と捕獲分子との相互作用であり得る。そのような化学反応は、典型的に、熱又は光を介したエネルギーの入力には頼らないが、例えば化学反応にとって特定の最適な温度等の熱、又は、特定の波長の光を加えることによって高めることができる。例えば、化学的固定化は、支持材料上の官能基と捕獲分子上の対応する官能性要素との間で発生してもよい。そのような捕獲分子内の対応する官能性要素は、化学的な分子の目録の一部、又は、さらに紹介されてもよい。そのような官能基の例はアミン基である。典型的に、例えば核酸等の固定化されることになる捕獲分子は、アミン官能基を含むか、又は、アミン官能基を含むために化学的に修飾される。そのような化学的修飾のための手段及び方法は、当業者には既知であり、例えば、Ｈａｒｔ等によるＯｒｇａｎｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ（２００７）Ｗｉｌｅｙ−Ｖｃｈ、又は、Ｖｏｌｌｈａｒｄｔ等によるＯｒｇａｎｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ（２００５）Ｗｉｌｅｙ−Ｖｃｈのような有機化学のテキストから得ることができる。固定化されることになる捕獲分子内の前記官能基の局在化を利用して、捕獲分子の結合行為及び／又は方向を制御及び形作ることができ、例えば、官能基は、捕獲分子の末端若しくは尾部、又は、捕獲分子の中心に置くことができる。固定化されることになる捕獲分子に対する典型的な反応パートナーは、例えばアミンにより官能性を持った核酸等の核酸に結合する等、そのような捕獲分子に結合する能力を持つ部分を含む。そのような支持材料の例は、アルデヒド、エポキシ、又はＮＨＳ基板である。そのような材料は、当業者には既知である。アミン基の導入によって化学的に反応性になる捕獲分子との接続反応を分け与える官能基及び支持材料は、当業者には既知である。固定化されることになる捕獲分子に対する別の反応パートナーは、例えば支持材料上で利用可能な官能基の活性化によって等、化学的に活性化しなくてはならない場合がある。「活性化される支持材料」という用語は、相互作用するか若しくは反応性の化学的官能基が、当業者には既知の化学的修飾手順によって確立されるか又は可能になる材料に関する。例えば、カルボキシル基を含む基板は、使用する前に活性化させなくてはならない。さらに、核酸内にすでに存在する特異的部分と反応することができる官能基を含有する利用可能な基板がある。これらの反応の一部は、熱又はＵＶによって高められる。例は、ＤＮＡ内の特異的塩基に結合させることができる基板の表面上のアミン基である。
【００６３】
或いは、捕獲プローブは、インサイツで、又は、直接基板上で合成することができる。そのようなアプローチに対する適した方法は当業者には既知である。例は、Ａｇｉｌｅｎｔ社、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ社、又はＦｌｅｘｇｅｎ  ＢＶ社によって開発された製造技術である。典型的に、ヌクレオチドの添加が発生することになるスポットを特異的に活性化するレーザー及び鏡のセットが使用される。そのようなアプローチは、例えば、約３０μｍ以上のスポットサイズを提供することができる。捕獲プローブは、従って、約８０ヌクレオチドまでの長さを有してもよい。さらに構想される異なる技術において、捕獲プローブは、非接触インクジェット印刷プロセスを使用することによって堆積させてもよく、そこでは、オリゴヌクレオチドモノマーが、特別に用意したガラススライド上へ均一に堆積される。このインサイツの合成プロセスは、典型的に、例えばデジタル配列ファイルから、６０ｍｅｒ長のオリゴヌクレオチドプローブを塩基ずつ生成することができる。
【００６４】
本明細書において規定されるマイクロアレイを含む反応ゾーン内の基板に対して、好ましくはインサイツ合成又は化学的固定化に基づく固定化技術を、好ましくは使用することができる。本明細書において規定される捕獲ゾーン内の多孔性膜基板に対しては、化学的固定化技術又は熱若しくは光、特にＵＶによる架橋を介した固定化を、好ましくは使用することができる。
【００６５】
本明細書において述べられる反応ゾーン及び／又は捕獲ゾーンは、「１種又は複数種」の捕獲分子を含んでもよく、すなわち、核酸及びタンパク質、核酸及び炭水化物等、１つ又は複数の異なる種の分子がマイクロアレイ内又は多孔性膜基板上に存在してもよい。或いは、「１種又は複数種」という用語は、例えば核酸等、同じカテゴリーの捕獲分子又は同じ形状若しくは型式を有するが、例えば核酸の場合にはその配列等、その分子の同一性において同じ又は類似の捕獲分子にも関する。従って、本発明による反応ゾーン又は捕獲ゾーンは、種々の核酸、若しくは種々のタンパク質、若しくは種々の炭水化物、若しくは種々の抗体、若しくは種々のリガンド、又は、種々の核酸と種々のタンパク質とのいかなる組み合わせ等を含んでもよく、好ましくは種々の核酸を含む。異なる分子同一性の捕獲分子、特に核酸が本発明による反応ゾーン又は捕獲ゾーン内に存在する場合、これらの捕獲分子は、部分的に同一又は部分的に類似であってもよく、すなわち、特に核酸の場合においては、配列という点で重複部分を有してもよく、又は、重複を有さなくてもよい。本発明による核酸捕獲分子は、例えば、生物のゲノム、好ましくは哺乳動物のゲノム、より好ましくはヒトゲノムの少なくとも約０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、又は３０％等、ゲノムの約０．００００１％から約３０％等、ゲノムのうちいかなる適した領域又割合の配列を含む、網羅する、又は表してもよく、及び／又は、そのような領域に相補的であってもよい。そのような領域又は割合は、例えば、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、３５０、５００、７５０、１０００、１２００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００等、約２から５０００の遺伝子、又は５０００を超える遺伝子の群を含んでもよい。そのような遺伝子は、隣接するゲノム領域内に局在化していてもよく、又或いは、ゲノム中に分散していてもよい。サブグループ化、組み合わせ、例えば遺伝子の発現データ等から得られるパターン等のパターンも構想される。
【００６６】
「捕獲」は、本明細書において述べられる場合、本発明による装置の捕獲分子と、例えば培養液若しくは試料溶液内に存在するか又はハイブリッド形成溶液内に提供される分子等の核酸標的分子との相互作用を意味する。そのような相互作用は、例えば親和相互作用、ファンデルワールス力に基づく相互作用、水素結合に基づく相互作用、及び／又は、例えば異なる電荷をもつ分子間等の電荷に基づく相互作用等、当業者には既知のいかなる適した分子、サブ分子、又はマクロ分子の相互作用であってもよい。そのような相互作用の典型的及び好ましい例は、核酸を巻き込むハイブリダイゼーション反応である。さらに構想されるのは、例えば、炭水化物構造体との核酸の相互作用である。相互作用に基づき、相互作用するパートナーは、本発明による装置の１つ又は複数の捕獲分子に結合させることができ、その結果、周囲環境、試料溶液、又はハイブリダイゼーション若しくは反応溶液から除去することができる。標的分子の捕獲は、特異的であることが好ましい。「特異的に捕獲する」という用語は、本発明による装置に関連して使用される場合異なる意味を有し、それは、標的分子の同一性及び／又は相互作用の種類に大きく依存し、且つ、一般に、当技術分野において既知の適したルール及び規定に従う。例えば、核酸−核酸の相互作用は、核酸標的分子が相互作用する場合に、互いに対して完全に若しくは部分的に相補的であるか、又は、互いに対してその全長に対して若しくは全長の一部に対して少なくとも約３０％から９９％相補的である場合に、特異的であるとみなすことができる。核酸と炭水化物との相互作用は、当技術分野において既知の基準に従って特異的であるとみなすことができる。
【００６７】
「標的分子」は、本明細書において使用される場合、標的分子と捕獲分子との特異的相互作用又は本明細書において記載される捕獲ゾーン若しくは反応ゾーン内の相互作用を可能にするいかなる適した分子、特に核酸分子であってもよい。標的分子は、典型的に、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、若しくは増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ産物、又は、例えばオリゴヌクレオチド等の合成的に生成された核酸、或いは、そのいかなるグループ化又は組み合わせとして本明細書において先に規定される核酸であってもよい。さらに、標的分子は、法医学的同定において有用である、例えば変異体若しくは疾患と付随した形状、又は対立遺伝子のバリアント等、これらの分子の特異的な対立遺伝子のバリアントであってもよい。本発明に関連して、特に本明細書において規定される装置に関連して使用されることになる標的遺伝子は、単一の種類の標的分子（例えば、特異的なヌクレオチド配列を有する核酸等）であってもよく、又は、分子のクラス（例えば、特異的なヌクレオチド配列を含む長さが変わる核酸、又は特定の遺伝子の種々の対立遺伝子に対応する核酸、又は特異的な配列及びリンカー配列若しくは共通のプライマー結合部位配列を含む核酸等）を含んでもよい。
【００６８】
標的分子は、試料から得る又は取得することができる。本発明は、従って、本明細書において規定される標的分子を含むいかなる試料も構想する。そのような試料は、例えば、便、全血、血清、血漿、涙、唾液、鼻からの液体、痰、耳からの液体、生殖器液、乳房からの液体、母乳、初乳、胎盤からの液体、羊水、汗（ｐｅｒｓｐｉｒａｔｅ）、滑液、腹水、脳脊髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸水、心膜液、精液、上気道液、腹水、免疫応答の部位から収集した液体、プールされた回収部位から収集した液体、気管支肺胞洗浄液、尿、例えば肺、筋肉、脳、肝臓、皮膚、膵臓、胃等、例えば全ての適した臓器からの生検材料、有核細胞試料、粘膜表面、髪、又は皮膚と付随する液体から得られる又はそれらを含む試料を含んでもよい。さらに、例えば水の試料、肉又は家禽の試料、あり得る汚染源からの試料等、環境源からの試料を使用することができる。
【００６９】
一部の実施形態において、標的分子は、試料から直接得ることができる。他の状況において、例えば標的分子を結合するパートナーにより近づける部分的精製を含む例えば標準的なプロトコルに基づく試料調製技術を、試料に受けさせることができる。
【００７０】
例えば、血液試料を遠心分離して、血清から細胞又は膜全体を含む部分を分けることができ、糞便試料は、生理学的に容認できる緩衝液及び洗剤を用いて区分及びホモジナイズすることができ、痰試料は、液化及び分別することができる。さらに、抗生物質又は殺菌剤を試料に添加して、存在するいかなる生物体のさらなる成長も防ぐことができる。細胞全体は、除去することもできるか、又は、溶解してその内容物を放出させることもできる。
【００７１】
好ましくは、核酸含有試料の調製に対して、ＤＮＡ及びＲＮＡ分解酵素及びプロテイナーゼの抑制剤を添加することができる。さらに、核酸標的分子は、例えば、当業者には既知であろう適したＰＣＲ反応又はリガーゼ連鎖反応を介して、検出に先立ち増幅させることもできる。
【００７２】
さらなる実施形態において、試料内の核酸は、（例えば機械的剪断又は制限酵素消化によって）より小さな断片に剪断又は切断することができる。好ましいのは、５０から５００ヌクレオチド、好ましくは２００ヌクレオチドのサイズの核酸分子を生じる剪断プロセスである。典型的に、集束超音波による剪断技術を、例えばＣｏｖａｒｉｓ社によって販売されている機器等のいかなる適した装置に基づいても使用することができる。不均一試料は、試料を装置内に添加する前に、さらに精製して、実質的に全ての非核酸分子を除去することができる。さらに、又或いは、不均一試料は、キャピラリー電気泳動等の分離技術によって処理して、例えば、所望の長さの範囲外の分子、好ましくは、５０から５００ヌクレオチドの範囲外のサイズを有する分子を除くことができる。
【００７３】
本発明の特定の実施形態において、標的分子、特に核酸分子が、例えば二本鎖分子のセンサ若しくはアンチセンス鎖として、又は、合成オリゴヌクレオチド等の合成一本鎖分子として一本鎖形状で提供される。さらなる実施形態において、標的分子は、部分的に一本鎖の形状でも提供することができ、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％、又は、その間のいかなる値の割合で一本鎖である。さらなる実施形態において、標的分子は二本鎖であってもよい。標的分子が二本鎖又は部分的に一本鎖の形状で提供される場合に、標的分子を、本明細書において規定される変性ゾーン若しくはセクターの上に通すか又は特定の時間そこに留めておくことが必要とされ得る。本発明の一実施形態において、標的分子は、変性した形状で提供される。「変性した形状」という用語は、本明細書において使用される場合に、核酸標的分子の一本鎖形状、又は、例えば少なくとも約７５％の一本鎖分子を含む本質的に一本鎖の形状を意味する。一本鎖形状は、例えば、核酸融解又は変性プロセスによって得ることができる。好ましい実施形態において、前記プロセスは、例えば約５分、１０分、１５分、２０分、又は、これらの値の間のいかなる時間以上の適した時間の、約８５℃から９８℃、好ましくは９５℃の温度での、本明細書において規定される試料プローブの加熱ステップを含む。そのような変性した試料は、従って、装置の捕獲ゾーン及び反応ゾーン内で結合した捕獲分子との相互作用を可能にするために装置内に提供することができる。本発明のさらなる実施形態において、変性した形状の標的分子又は試料は、例えば、本明細書において規定される１つ又は複数の捕獲及び／又は反応ゾーンに接続される変性ゾーン若しくはセクターにおいて等、装置自体の内部で得ることができる。従って、二本鎖試料又は標的分子は、前記変性ゾーン若しくはセクター内に導入され、さらに、一本鎖又は実質的に一本鎖の分子に変えられ得る。特定の実施形態において、前記変性ゾーンは、１つ又は複数の反応若しくは捕獲ゾーン内に、又は、装置のいかなる他の部分の内部に位置付けることができる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、本発明による装置は、少なくとも２つの捕獲ゾーンを含み、１つの捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、さらに、もう一方の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、逆もまた同様である。さらに構想されるのは、少なくとも２つの捕獲ゾーンにおけるセンス鎖及びアンチセンス鎖に対する相互排他的な結合能力の混合である。これらの実施形態において、二本鎖標的分子のうちどちらの鎖も、本明細書において先に規定されるように捕獲ゾーン内で捕獲することができる。これらの捕獲ゾーンは、好ましくは、第１のこれらの捕獲ゾーンの後に、本明細書において規定される反応ゾーンが装置の液体又は培養液流路内に置かれるか又は位置付けられるように、配置される。従って、第１の前記捕獲ゾーンにおける１つ又は複数のセンス鎖分子の結合後、残りの対応する鎖は、その残りの対応する鎖に相補的な捕獲分子を有する反応ゾーンへ動かされ得るか又は動き得る。その結果、第１の捕獲ゾーンに結合したセンス鎖分子の一本鎖の対応する鎖の、反応ゾーンに対する結合を高めることができる。反応ゾーンに続く第２の捕獲ゾーンは、同様に、反応ゾーンに結合しなかった前記対応する鎖を捕獲することができる。最初に第１の捕獲ゾーンに結合したセンス鎖が装置の培養液又は環境において利用可能になることを引き続き可能にすることによって、特定の実施形態において標的分子のセンス鎖に相補的な捕獲分子を含み得る反応ゾーンに対するこれらの鎖の結合を誘発することができる。この仕組みのさらなる変異形、例えば第２又はさらなる反応ゾーンの包含、１つ又は複数のさらなる捕獲ゾーンの包含、又は、さらなる機能性との組み合わせ等も、本発明によって構想することができる。本発明の特定の実施形態において、反応ゾーンが標的分子の両方の鎖に対する捕獲分子を含む場合に、１つの反応ゾーンは、２つの捕獲ゾーンと組み合わせることができ、これらのうち１つは、センス鎖標的分子を特異的に捕獲し、もう一方は、アンチセンス鎖標的分子を特異的に捕獲する。特定の詳細なバージョンのこの好ましい装置の形状は、図３及び４において描かれている。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態において、本明細書において先に規定された装置は、装置内の温度を制御及び／又は調節するための少なくとも１つの温度制御及び／又は調節ユニットを含む。「温度制御及び／又は調節ユニット」という用語は、本明細書において使用される場合、約０．５℃から１２０℃の範囲、好ましくは約２０℃から１００℃の範囲、より好ましくは約３５℃から９５℃の範囲の温度を提供及び／又は維持する能力を持つ機械的、電気的（抵抗性の）、放射線、マイクロ波、又はいかなる他の適した加熱装置又は要素を意味する。温度制御及び／又は調節ユニットは、従って、装置内又は装置のゾーン若しくはセクター内の環境温度が特定の予め規定された値より低い場合にヒーターとして、又は、装置内又は装置のゾーン若しくはセクター内の環境温度が特定の予め規定された値よりも高い場合にクーラーとして機能することができる。温度制御及び／又は調節ユニットは、従って、環境温度を測定するためのセンサ、及び、測定された温度が予め規定された値でない場合に冷却又は加熱活動の開始を可能にする要素を含んでもよい。予め規定された値は、いかなる適した値であってもよく、好ましくは約０．５℃から１２０℃、好ましくは約２０℃から１００℃の範囲、より好ましくは約３５℃から９５℃の範囲の温度値である。温度制御及び／又は調節ユニットは、例えばユーザに対してその独自のインターフェースを介して独立してアドレス可能であってもよく、又は、類似のユニットのネットワーク内に統合させてもよく、又は、調節電子装置等に接続させてもよい。当該装置は、好ましくは、１から１５の温度制御及び／又は調節ユニットを含んでもよい。２つ以上のそのようなユニットがある場合に、その温度は、他のユニットに対して異なっていてもよく、又は、同じか若しくは類似していてもよい。装置内又は装置のゾーン内のそのようなユニットを異なる温度に設定することによって、例えば、前記セクター内の温度勾配を生じることができる。好ましくは、反応ゾーンは、核酸分子の融解を好むか又は捕獲及び反応ゾーン内の標的分子と捕獲分子との相互作用を好む温度に設定することができる。本発明の特に好ましい実施形態において、前記温度制御及び／又は調節ユニットは、金属ブロックの抵抗性のヒーター、例えば金属若しくは高伝導ガラス等の優れた熱導体に取り付けられる抵抗性ヒーター、又は、ガラス基板上の薄膜抵抗性ヒーターであってもよい。或いは、例えばマイクロアレイセクターの下等、装置の基板内に統合された薄膜ヒーターであってもよい。
【００７６】
本発明の特に好ましい実施形態において、前記温度制御及び／又は調節ユニットは、本明細書において規定される装置の捕獲ゾーン内に位置付けることができる。そのようなスキームにおいて、捕獲ゾーンは、捕獲分子と標的分子の相補鎖との相互作用を可能にする温度に導くか又はその温度で維持することができる。そのようなスキームにおいて、二本鎖標的分子の一本鎖は、捕獲ゾーンに結合させることができ、相補鎖が捕獲ゾーンを通過して反応ゾーンに入ることを可能にし、両方の実在物間での相互作用を可能にする。或いは、捕獲ゾーンは、捕獲分子と標的分子の相補鎖との相互作用が可能でない温度に導くか又はその温度で維持することができ、その結果、以前に結合した一本鎖分子を放出するか、又は、前記標的分子の鎖が捕獲ゾーンを離れて反応ゾーンに入るのを可能にし、両方の実在物間での相互作用を可能にする。
【００７７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、前記温度制御及び／又は調節ユニットは、さらに、本明細書において規定される反応ゾーン内に位置付けることができる。そのようなスキームにおいて、反応ゾーン内で、例えばマイクロアレイにおいて捕獲分子に対する標的分子の定量的、半定量的、若しくは特異的な結合、又は、高特異的な結合を可能にする温度を設定することができる。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態において、前記温度制御及び／又は調節ユニットは、本発明による装置のいかなる他の特定な点、セクター、又は一部にも位置付けることができる。
【００７９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、例えば２、３、４、５、６、又はそれ以上の捕獲ゾーン等、少なくとも２つの捕獲ゾーンのうちの１つは、核酸融解温度、又は、捕獲分子に対する１つ又は複数の核酸の標的分子のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度にて維持されるか又はその温度に導かれる一方で、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の他の捕獲ゾーンは、捕獲分子に対する１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度にて維持されるか又はその温度に導かれる。本発明のさらに特定の実施形態において、例えば２、３、４、５、６、又はそれ以上の捕獲ゾーン等、少なくとも２つの捕獲ゾーンのうちの１つは、約８５℃から９８℃の温度にて維持されるか又はその温度に導かれる一方で、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の他の捕獲ゾーンは、４５℃から６５℃の温度にて維持されるか又はその温度に導かれる。特定の実施形態において、温度は、装置の非ハイブリッド形成セクターにおいて、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、若しくはそれ以上、又は、示した温度値間のいかなる値であってもよい。さらなる実施形態において、温度は、装置のハイブリッド形成セクターにおいて、例えば１つ又は複数の捕獲ゾーン又は反応ゾーンにおいて、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、若しくはそれ以上、又は、示した温度値間のいかなる値であってもよい。さらなる実施形態において、装置内の温度は、適したスキームに従って調節することができ、例えば、捕獲分子に対する１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成又は結合を可能にする１つ又は複数の捕獲ゾーンと、捕獲分子に対する１つ又は複数の核酸の標的分子のハイブリッド形成又は結合を可能にしない１つ又は複数の捕獲ゾーンとの間で温度勾配があってもよい。さらなる実施形態において、前記１つ又は複数の捕獲ゾーンと、例えば反応ゾーン、又は、任意の洗浄、変性、貯蔵のゾーン若しくはセクター等の装置のさらなるセクターとの間の温度勾配が構想される。さらなる実施形態において、３つ以上の捕獲ゾーンが使用される場合に、捕獲分子に対する１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする１つ又は複数の捕獲ゾーン間、及び／又は、捕獲分子に対する１つ又は複数の核酸の標的分子のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない１つ又は複数の捕獲ゾーン間で温度差があってもよい。温度及び／又はいかなる温度勾配も、依存型にすることができ、近接している捕獲ゾーン、又は、捕獲されることになる分子の温度、捕獲されることになる分子の長さ、捕獲されることになる分子の量、試料の複雑さ、捕獲分子と標的分子との不適正塩基対若しくは推定不適正塩基対の存在等に依存して制御することができる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、本明細書において先に記載された装置は、反応ゾーン内に異なる種類、量、濃度、又は形状の捕獲分子を含んでもよい。例えば、反応ゾーンは、先に規定された標的分子のセンス鎖に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよく、同時に、先に規定された標的分子のアンチセンス鎖に相補的な捕獲分子を含んでもよい。そのようなスキームにおいて、反応ゾーンは、二本鎖核酸標的分子の両方の鎖に結合する能力を持つ。
【００８１】
さらなる実施形態において、反応ゾーンは、先に規定された標的分子のセンス鎖に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよく、同時に、先に規定された標的分子のアンチセンス鎖に相補的な捕獲分子を含んでもよい。そのようなスキームにおいて、反応ゾーンは、二本鎖核酸標的分子の両方の鎖若しくは本質的に二本鎖核酸標的分子の両方の鎖、又は、二本鎖核酸標的分子の両方の鎖の約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％、又は９９．５％に結合する能力を持つ。
【００８２】
さらなる実施形態において、反応ゾーンは、さらに又或いは、先に規定された標的分子のセンス鎖の１つ又は複数の部分に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよく、同時に、先に規定された標的分子のアンチセンス鎖の１つ又は複数の部分に相補的な捕獲分子を含んでもよい。前記標的分子のセンス鎖又は前記標的分子のアンチセンス鎖に相補的な捕獲分子のこの一部又は一部分は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ヌクレオチドという最小の長さを有してもよい。さらに、センス鎖又はアンチセンス鎖の一部のみに結合する捕獲分子は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ヌクレオチドという最小の長さを有してもよい。さらなる追加又は別の実施形態において、どちらの相互作用分子、すなわち先に規定された捕獲分子も先に規定された標的分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖も、その全体の長さに対して、約３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．５％、又は、その間のいかなる値の相補性を示すことができる。非相補的な領域又は部分は、リンカー配列、人工プライマー結合部位、人工エンドヌクレアーゼ認識部位、タグ、同定目的のためのバーコード配列等を含んでもよい。そのような非相補的な区分の存在は、例えば、温度、ハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、装置内の流速等の結合パラメータの調整によって考慮することができる。そのようなパラメータ及びその仕組みは当業者には既知である。そのようなスキームにおいて、反応ゾーンは、二本鎖核酸標的分子の両方の鎖若しくは本質的に二本鎖核酸標的分子の両方の鎖、又は、二本鎖核酸標的分子の両方の鎖の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％に結合する能力を持つ。
【００８３】
さらなる実施形態において、反応ゾーンは、先に規定された標的分子のセンス鎖のみに相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよい。さらに又或いは、反応ゾーンは、先に規定された標的分子のセンス鎖の１つ又は複数の部分に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよい。そのようなスキームにおいて、反応ゾーンは、先に規定された二本鎖核酸標的分子のセンス鎖若しくは本質的に二本鎖核酸標的分子のセンス鎖、又は、二本鎖核酸標的分子のセンス鎖の約３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％又は９９．５％に結合する能力を持つ。
【００８４】
さらなる実施形態において、反応ゾーンは、先に規定された標的分子のアンチセンス鎖のみに相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよい。さらに又或いは、反応ゾーンは、先に規定された標的分子のアンチセンス鎖の１つ又は複数の部分に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含んでもよい。そのようなスキームにおいて、反応ゾーンは、二本鎖核酸標的分子のアンチセンス鎖若しくは本質的に二本鎖核酸標的分子のアンチセンス鎖、又は、二本鎖核酸標的分子のアンチセンス鎖の約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％又は９９．５％に結合する能力を持つ。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書において先に記載された装置は、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子又はその一部に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む捕獲ゾーンを少なくとも含んでもよい。従って、本明細書において規定される捕獲ゾーン内に捕獲分子が存在する場合に、相補的な捕獲分子が、本明細書において規定される反応ゾーン内に存在する。同様に、本明細書において規定される捕獲ゾーン内に２つ以上の捕獲分子が存在する場合に、同じ数の相補的な捕獲分子が、本明細書において規定される反応ゾーン内に存在する。さらなる実施形態において、捕獲ゾーン内の捕獲分子及び反応ゾーン内のその相補的な対応物は、同じ長さを有するか若しくは実質的に同じ長さのものであってもよく、又は、長さにおいて７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％程度又はそれ以上の同一性を示してもよい。捕獲分子は、捕獲ゾーン内又は反応ゾーン内、好ましくは捕獲ゾーン内でより長くてもよい。捕獲分子のうち非オーバーラップの領域、すなわち捕獲分子のうち、それぞれ他のゾーン内で表されない部分は、好ましくは、分子の一つの末端又は両方の末端にて位置付けることができ、特定の実施形態において、分子の中心に位置付けるか又は分子中に分散させることもできる。これらの領域は、１つ又は２つ以上のユニットとして、好ましくは１つのユニットとして、分子の末端にて存在してもよい。
【００８６】
さらに別の実施形態において、対応する捕獲分子、すなわちセンス鎖及びアンチセンス鎖等の数並びに／又は長さは、さらに又或いは、１つ又は複数の反応ゾーン内及び１つ又は複数の捕獲ゾーン内で同じであるか、若しくは、本質的に同じであってもよい。例えば、捕獲ゾーンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０、又はそれ以上の捕獲分子のコピーの被覆度等、いかなる適した被覆度を含んでもよい。これらのコピーは、異なる長さを有するか、又は、同じ長さのものであってもよい。反応ゾーンは、従って、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０、又はそれ以上の前記捕獲分子の対応する相補的な鎖のコピーの被覆度等、いかなる適した被覆度を含んでもよい。これらのコピーは、異なる長さを有するか、又は、同じ長さのものであってもよい。或いは、対応する捕獲分子、すなわちセンス鎖及びアンチセンス鎖等の数は、１つ又は複数の反応ゾーン内及び１つ又は複数の捕獲ゾーン内で異なっていてもよい。従って、反応ゾーン内の捕獲分子の被覆度は、１つ、２つ以上、又は全ての捕獲ゾーンにおける相補的な捕獲分子の被覆度の約１０％未満、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であってもよい。さらなる実施形態において、１つ、２つ以上、又は全ての捕獲ゾーンにおける捕獲分子の被覆度は、１つ又は複数の反応ゾーン内の相補的な捕獲分子の被覆度の約１０％未満、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であってもよい。被覆度は、特定の実施形態において、固定化の種類、分子が固定化される材料、適用の種類、構想される用途等に依存し得る。好ましいのは、１つ又は複数の捕獲ゾーン内の高い、過度の、又は少なくともより高い被覆度である。本発明の特に好ましい実施形態において、捕獲分子のプールは、捕獲ゾーンの特定の領域にて位置付け、後に、そこで混合物として、多孔性の捕獲ゾーン膜材料に対して固定化させることができる。これらの領域内の捕獲分子の総数は、適用に依存し、従って、調整することができる。さらに、本明細書において規定される１つ又は複数の捕獲ゾーン内で捕獲分子の局所的超過を有することが好ましい。
【００８７】
さらなる実施形態において、２つ以上の反応ゾーンと２つ以上の捕獲ゾーンとの間の長さ又は被覆度のパラメータは異なるか又は変わってもよく、すなわち、被覆度に関して装置内で増加するか、又は、被覆度は、適したパラメータに従って、及び／若しくは、例えば温度条件等の他の特徴の存在に依存して徹底的に増加若しくは減少させてもよい。
【００８８】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書において先に記載された装置は、反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子若しくはその一部に相補的な捕獲分子のサブセットを含む捕獲ゾーンを含んでもよい。従って、本明細書において規定される捕獲ゾーン内に捕獲分子が存在する場合に、相補的な捕獲分子が、本明細書において規定される反応ゾーン内に存在する。しかし、本明細書において規定される反応ゾーン内に捕獲分子が存在する場合に、相補的な捕獲分子は、本明細書において規定される捕獲ゾーン内に存在しなくてもよい。本発明のさらに別の特定の実施形態において、本明細書において先に記載される装置は、捕獲ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子若しくはその一部に相補的な捕獲分子のサブセットを含む反応ゾーンを含んでもよい。従って、本明細書において規定される反応ゾーン内に捕獲分子が存在する場合に、相補的な捕獲分子が、本明細書において規定される捕獲ゾーン内に存在する。しかし、本明細書において規定される捕獲ゾーン内に捕獲分子が存在する場合に、相補的な捕獲分子は、本明細書において規定される反応ゾーン内に存在しなくてもよい。
【００８９】
「捕獲分子のサブセット」という用語は、本明細書において使用される場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、又は９９．８％という数の本明細書に規定される捕獲分子の対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味する。両方のゾーンに存在する捕獲分子だけでなく、１つのゾーンのみに存在する捕獲分子も、いかなる適した被覆度、又は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０、又はそれ以上のコピー等、いかなる適したコピー数でも存在し得る。さらに、捕獲分子は、本明細書において先に述べたように、異形又は長さ又は配列の差を含んでもよい。
【００９０】
別の実施形態において、捕獲ゾーンは、１つ又は複数の干渉配列に結合する能力を持つ１つ又は複数の捕獲分子を含む。「干渉配列」という用語は、本明細書において使用される場合、例えばトランスポゾン逆方向反復等のゲノム内の短い反復、Ａｌｕ若しくはＡｌｕ様配列、トランスポゾンレムナント等を意味する。
【００９１】
特に好ましい実施形態において、本発明による装置は、少なくとも２つの反応ゾーンを含み、１つの反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部に特異的に結合する能力を持ち、さらに、もう一方の反応ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部に特異的に結合する能力を持つ。このスキームにおいて、少なくとも２つの反応ゾーンは、１つの流路内に提供することができるか、又は、装置の別の部分に提供することができる。本明細書において規定される２つの反応ゾーンを含む装置には、１つ、２つ、又はそれ以上の捕獲ゾーン、好ましくは少なくとも２つの捕獲ゾーンが提供されてもよい。１つの捕獲ゾーンが構想される実施形態において、捕獲ゾーンは、除去可能、又は、第１の捕獲ゾーンと比較して相補的若しくは異なる配列の捕獲を可能にするさらなる若しくは異なる捕獲ゾーンと置換可能であってもよい。少なくとも２つの捕獲ゾーンが存在する実施形態において、これらの捕獲ゾーンは、相補的な標的分子の鎖に結合する能力を持っていてもよい。さらに、捕獲ゾーンには、標的核酸鎖の選択加熱又は融解を可能にする温度制御及び／又は調節ユニットが備わっていてもよい。
【００９２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において先に規定された１つ又は複数の反応ゾーン及び１つ又は複数の捕獲ゾーンは、閉ループで装置内に配置されてもよい。「閉ループ」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば液体等の、１つのゾーンから次のゾーンまでの材料の一方向性の流れ、及び、開始ゾーンへの材料の対応する戻りを可能にする前述のゾーンの配置を意味する。そのような配置は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の回数、特定のゾーンを通した材料の反復又は通過を介して、例えば１つ又は複数の反応ゾーン等、同じゾーンに渡る材料の連続的なリサイクリングの動きを可能にする。反復は、特に、これらの分子間で近接する機会を繰り返すことによって、標的分子と捕獲分子との相互作用の数を増やすことを可能にする。接続は、例えばチューブ、パイプ、パイプラインを介して等、いかなる適した接続であってもよい。そのような仕組みにおいて、装置の種々の部分の流量を、必要な流量まで調整することができる。例えば、１つ又は複数の捕獲ゾーン内及び／若しくは１つ又は複数の反応ゾーン内、又は、１つ又は複数の捕獲ゾーン内のみ、若しくは、１つ又は複数の反応ゾーン内のみで減少させられる流量を使用することができ、例えば、標的分子に対する延長したか又は個々に調整した相互作用ウインドウを可能にする。閉ループは、さらに、例えば１、２、３、４、又は５個の入口又は出口等、１つ又は複数の入口及び出口のポイント又はポートを有してもよい。これらのポートにおいて、捕獲分子に結合することになる標的分子を含む培養液又は試料液は、導入又は除去することができる。特定の実施形態において、前記標的分子を含む培養液又は試料は、本明細書において先に規定されたように、変性又は融解した形状の標的分子を含んでもよい。さらなる実施形態において、これらのポート又は入口は、１つ又は複数の調製若しくは変性ゾーン又はチャンバーに接続させてもよく、該ゾーン又はチャンバーでは、試料液又は標的分子を、約８５℃から９８℃、好ましくは９５℃の温度まで加熱させ、一本鎖核酸分子を提供することができる。特定の実施形態において、閉ループは、例えば１つ又は複数の反応若しくは捕獲ゾーン等、特定のゾーンの連絡切断を可能にするショートカット構造を含んでもよい。さらに、当該装置は、例えば、さらなる捕獲及び／又は反応ゾーン等、さらなるゾーンの追加を可能にする追加の出口を含んでもよい。さらなる実施形態において、ループ構造体の特定の配置が存在してもよい。
【００９３】
本発明の別の特定の実施形態において、本明細書において先に規定された１つ又は複数の反応ゾーン及び１つ又は複数の捕獲ゾーンを、装置内で１つの流路において配置することができる。「１つの流路」という用語は、本明細書において使用される場合、ルーピング要素が存在しないゾーンの直線的な配置を意味する。接続は、例えばチューブ、パイプ、パイプライン等を介した、本明細書において先に規定された接続であってもよい。そのような配置において、反応ゾーン及び捕獲ゾーンを渡る、並びに／又は、本明細書において先に規定された１つ又は複数の温度制御及び／又は調節ユニットを渡る材料又は培養液の前後の輸送が構想される。或いは、ゾーンは、その直線的な配置が維持される限り、いかなる他の組み合わせでも配置することができる。１つの流路が使用される場合、培養液、例えばハイブリダイゼーション溶液の流速は、例えば捕獲分子と標的分子又は鎖との適した結合相互作用を可能にするために減少させる等、調整することができる。
【００９４】
本発明の特定の実施形態において、本明細書において先に規定された装置は、１つ又は複数の輸送手段を含んでもよい。「輸送手段」という用語は、本明細書において使用される場合、装置の１つのゾーンから装置の別のゾーンまで、又は同様に逆の、すなわち、少なくとも１つの捕獲ゾーンから少なくとも１つの反応ゾーンまでの培養液、又は、ハイブリダイゼーション溶液等の試料若しくは試料の一部分の移動及び／又は輸送を可能にするいかなる適した要素、装置、又はユニットも意味する。そのような輸送手段の例は、例えば３弁ポンプ、蠕動ポンプ、又はシリア（ｃｉｌｉａ）ポンプ等のポンプである。しかし、本発明による装置内に適切に統合させることができるいかなる他の種類又は形状のポンプも構想される。そのような輸送手段は、捕獲ゾーンと反応ゾーンとの間に位置付けることができ、及び／又は、装置の末端にて位置付けることができる。さらに、輸送手段は、装置の１つ又は複数のゾーン内に統合させることができる。輸送手段は、好ましくは、装置内の液体の流れを調節することができる。当該調節は、流れの流量若しくは流速を特定の値に設定及び／又は調整することによって達成することができる。そのような値は、輸送されることになる材料、使用される温度、標的分子又は捕獲分子、標的分子と捕獲分子との間で発生する相互作用の種類等に関して設定する、及び、それらに応じて生じさせることができる。輸送手段は、種々の機能の間隔でさらに使用することができる。例えば、輸送手段は、例えば約１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、３分、５分、７分、１０分、１５分、３０分、４０分、６０分間等、特定の期間使用することができ、後に、例えば約１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、３分、５分、７分、１０分、１５分、３０分、４０分、６０分間等、特定の期間スイッチオフすることができ、後に、例えば約１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、３分、５分、７分、１０分、１５分、３０分、４０分、６０分間等、再度スイッチオンすることができる。前記間隔は、先行する間隔又は相互作用反応の段階に従って変えるか又は変更することができ、すなわち、後のステップにおいてより長く又はより短くなってもよい。２つ以上の輸送手段が装置内に存在する場合、全ての輸送手段が機能してもよく、又は、そのサブポーション（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）のみが機能してもよい。能動的である輸送手段の数及び位置は、反応ゾーン及び／又は第２のゾーンの存在並びに局在化に従って決定及び設定することができる。
【００９５】
特定の実施形態において、反応ゾーンは、１つの側において、例えばポンピングゾーン又はチャンバー等の輸送手段と組み合わせてもよく、さらに、もう一方の側で捕獲ゾーンと接続させ、次に、例えばポンピングゾーン又はチャンバー等の輸送手段が続いてもよく、逆もまた同様である。さらなる選択肢において、先に規定された輸送手段又はゾーンを含む二股に分けられた末端枝を使用することができる。特定の詳細なバージョンの好ましい構想された輸送手段の位置及び形状は、図３及び４において描かれている。
【００９６】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、本明細書において先に述べられた装置は、マイクロ流体デバイスであるか、又は、マイクロ流体装置の形状で実行され、前記１つ又は複数の反応ゾーン及び１つ又は複数の捕獲ゾーンは、好ましくは閉ループで接続されるか、又は、先に規定された１つの流路を介して接続される。「マイクロ流体デバイス」という用語は、本明細書において使用される場合、小さな、好ましくはｍｍ未満のスケールに制限される液体の正確な制御及び操作を可能にする装置を意味する。典型的に、マイクロ流体デバイスは、例えばｎｌ、ｐｌ、若しくはｆｌの範囲の少量を実行し、及び／又は、小さい全体的なサイズを実行してもよい。さらに、本発明によるマイクロ流体デバイスは、より少ない量のエネルギーを消費することができる。マイクロ流体デバイスにおいて、層流、特定の表面張力、エレクトロウェッティング、高速の熱緩和、表面電荷の存在、及び拡散効果等の効果を実行することができる。特定の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、外部源又は外部要素との接続を有してもよく、例えば、再利用目的のための分離、又は貯蔵所若しくは容器が可能であり得る。さらに、マイクロ流体デバイスは、装置内の活動の制御及び操作、並びに／又は、反応の結果若しくは生成物の検出又は決定を可能にする電子若しくはコンピュータインターフェースを含んでもよい。
【００９７】
本発明の別の特定の実施形態において、前記マイクロ流体デバイスは、統合したマイクロ流体カートリッジであってもよい。「統合したマイクロ流体カートリッジ」という用語は、本明細書において使用される場合、例えばチャンバー又は容器様の形状を用いた、全ての必要な接続、ゾーン、及び、任意で必要な成分も含むマイクロ流体デバイスのコンパクト化（ｃｏｍｐａｃｔａｔｉｏｎ）及びリサイジングを意味する。カートリッジは、例えば、完全に閉じて、又は、部分的に閉じて、何度でも封ができる入口を介した試料、成分等の導入を可能にしてもよい。カートリッジには、さらに、例えばスキャナーに対する認識部分、提供された成分、製造日等を示すバーコード又はマトリックスコード等、走査又は検出装置に対する整列構造体、又は、例えば本明細書において述べられる装置の反応ゾーン内の標的分子と捕獲された分子との相互作用の電子的又は光学的検出を可能にする検出ユニットに対するインターフェースが備わっていてもよい。さらなる好ましい実施形態において、前記カートリッジは、相互汚染を回避することを可能にする例えば臨床適用における頓用目的のために、１つ又は複数のオンボード試薬液を含んでもよい。
【００９８】
本発明によるマイクロ流体デバイス内で、特定の輸送手段が存在していてもよい。例えば、輸送手段は、蠕動発動を実行することができる。従って、柔軟な接続又はチューブ類が、装置内に存在してもよく、又は、装置には、１つ又は複数の柔軟若しくは可動性の側又は中隔が提供されて、蠕動移動を可能にしてもよい。蠕動活動は、前記柔軟なチューブ類若しくは中隔上の例えば回転装置又はアクチュエータ等、いかなる適した手段によって、逆方向の様式の２つのそのようなチューブ類若しくは中隔の組み合わせによって、例えば、本発明による前記チューブ類若しくは中隔と直接接触する水で満たされたチューブ類の提供等、前記チューブ類若しくは中隔に対する液体媒介圧力の適用によって、及び／又は、蠕動ポンプの使用によっても行うことができる。この技術のさらなる詳細及び異形は、当業者には既知であるか、又は、適したテキストから得ることができる。さらなる実施形態において、輸送手段は、例えば、装置又は該装置の特定の領域の少なくとも１つの可動性表面の利用によって、ピストン及び発動される膜の推進力を実行することができる。この可動性表面は、従って、柔軟な膜の形状であってもよく、さらに、前記装置内又は前記装置の前記ゾーン内の量を減らすピストンとして使用して、前記ゾーン又は領域の外側にある隣接する材料を輸送してもよい。可動性表面又はピストン構造は、適した拡大貯蔵所又はゾーンと組み合わせて、装置の内側の液体の移動を可能にしてもよい。この技術のさらなる詳細及び異形は、当業者には既知であるか、又は、適したテキストから得ることができる。適した輸送手段のさらなる例は、例えば、本発明による装置の１つ又は複数のゾーン内、又は、特定の方向に液体を吸い込む適したベクタードバキューム（ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｖａｃｕｕｍ）ポンプの使用によって、ベクタードバキュームを実行し、例えば装置内のハイブリダイゼーション溶液等の培養液を移動させる。本発明の特定の実施形態において、結合速度を改善するために使用することができる約１ｓ−１以上という平均剪断速度を有することが好ましい。この剪断速度は、当業者には既知である適した輸送又はポンピング能力によって実行することができる。この技術のさらなる詳細及び異形は、当業者には既知であるか、又は、適したテキストから得ることができる。
【００９９】
本発明の好ましい特定の実施形態において、本明細書において先に規定された装置は、２つの反応ゾーン及び２つの捕獲ゾーンを含み、１つの反応ゾーンと１つの捕獲ゾーンとの組み合わせは、第２の反応ゾーンと第２の捕獲ゾーンとの組み合わせとは流体接続せず、各反応ゾーン及び各捕獲ゾーンは、もう一方の反応ゾーン又は捕獲ゾーンの１つ又は複数の捕獲分子に相補的な１つ又は複数の捕獲分子を含む。そのようなスキームにおいて、装置のＡ部分の対応する捕獲ゾーン内のセンス鎖捕獲分子と、反応ゾーン内のアンチセンス鎖捕獲分子との組が存在してもよい一方で、装置のＢ部分は、捕獲ゾーン内のアンチセンス鎖捕獲分子と、反応ゾーン内のセンス鎖捕獲分子との組を含む。この形状のＡ部分及びＢ部分の装置は、１つの流路の装置として、又は、閉ループで配置することができる。典型的に、当該装置には、本質的に同じ部分又はいかなる他の適した割合で釣りあわせた核酸標的分子を含有又は含む試料を添加することができる。さらに、試料は、変性させておいてもよく、又は、一本鎖形状で存在してもよい。或いは、当該装置は、核酸試料の融解又は変性を可能にする、及び、任意でその本質的に同じ部分への分離を可能にするさらなる加熱チャンバー並びに任意で分離チャンバーを含んでもよい。先に記載された装置のＡ部分及びＢ部分は、互いに流体接続していなくてもよい。
【０１００】
本発明の別の好ましい実施形態において、本明細書において先に規定された捕獲分子、すなわち、捕獲ゾーン内及び／又は反応ゾーン内の捕獲分子は、例えば２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又はそれ以上のヌクレオチドの長さ等、約２０から８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。より好ましい実施形態において、捕獲分子は、約４０から６５ヌクレオチドの長さを有してもよい。構想される捕獲分子の長さの例として、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０ヌクレオチドの長さを有する捕獲分子が挙げられる。特に好ましいのは、例えば５９、６０、又は６１ヌクレオチド等、約６０ヌクレオチドの長さである。反応ゾーン内及び捕獲ゾーン内の捕獲分子及びその相補的な対応物の長さは、例えば、本明細書において先に規定されたパラメータ及び詳細に従い、同じ、本質的に同じ、又は異なっていてもよい。長さの差は、標的分子又はその配列の性質、形状、及び長さ等に応じて生じさせてもよい。
【０１０１】
さらなる態様において、本発明は、マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させる方法に関し、当該方法は、
（ａ）変性された形状の１つ又は複数の標的分子を含有する培養液を、本明細書において先に規定された装置の捕獲ゾーン内に導入するステップ、
（ｂ）前記１つ又は複数の標的分子若しくはその一部と、前記捕獲ゾーン内の１つ又は複数の固定化された捕獲分子との相互作用反応を行うステップであって、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部が、前記１つ又は複数の捕獲分子に結合される一方で、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部が、前記捕獲ゾーン内で捕獲されないか、又は、前記１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部が、前記１つ又は複数の捕獲分子に結合される一方で、前記１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部が、前記捕獲ゾーン内で捕獲されないステップ、及び、
（ｃ）結合していない１つ又は複数の標的分子鎖を、マイクロアレイを含む反応ゾーンまで輸送し、その結果、前記１つ又は複数の標的分子鎖若しくはその一部とマイクロアレイ上の固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用を可能にするステップ、
を含む。
【０１０２】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法に関連して、反応ゾーン、捕獲ゾーン、マイクロアレイ、捕獲分子、センス鎖、アンチセンス鎖、標的分子、その一部、培養液、又は、捕獲分子の固定化は、本発明による装置の説明に関連して本明細書において先に提供されたこれらの用語の定義に一致する。従って、本発明による装置に関連して記載される全ての前述の実施形態、変異形、変更、又は利用は、本明細書において先又は以下に記載される本発明の方法に適用可能であるとしても理解されることになる。
【０１０３】
「培養液を捕獲ゾーン内に導入する」という用語は、本明細書において使用される場合、本明細書において先に規定された培養液の、先に述べられた装置の捕獲ゾーン内の提供を意味する。この提供は、装置内に前記培養液を注入することによって実行することができる。例えば、装置の捕獲ゾーン自体において、又は、隣接する混合ゾーンにおいて、培養液を、貯蔵所の外側若しくは内側から、又は、注射器若しくはいかなる他の適した容器からも注入することができる。「変性した形状で導入する」という用語は、本明細書において使用される場合、本明細書において先に記載されたように、本質的に一本鎖形状の核酸標的分子の捕獲ゾーン内への導入を意味する。従って、培養液は、融解又は変性温度まで導いていてもよく、従って、高い割合の一本鎖分子を生じる。さらなる好ましい実施形態において、本発明による装置内に導入された培養液は、変性した形状でなくてもよい。これらの実施形態において、１つ又は複数の標的分子を含有する培養液は、捕獲ゾーン内への導入に先立ち、本明細書において先に記載された装置内、例えば前述の特定の融解若しくは加熱チャンバー又は変性ゾーン若しくはセクター内で加熱し、例えば、変性又は融解することができる。加熱は、或いは、本明細書において先に記載された温度制御及び／又は調節ユニットを使用することによって、捕獲ゾーン自体の内部で実行することもできる。
【０１０４】
本発明のさらなる別の実施形態において、１つ又は複数の標的分子を含有する培養液は、さらに、本明細書に記載される装置の異なるゾーン内、例えば反応ゾーン内に導入することができる。従って、前記ゾーン又は異なるゾーンにおいて適した熱を加えることによって、培養液は、変性した形状の標的分子を含む培養液に変えることができる。
【０１０５】
「前記１つ又は複数の標的分子若しくはその一部と、前記捕獲ゾーン内の１つ又は複数の固定化された捕獲分子との相互作用反応を行う」という用語は、本明細書において使用される場合、ハイブリダイゼーション反応、好ましくは特異的ハイブリダイゼーション反応の実行を意味する。「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書において使用される場合、ストリンジェントな条件下での核酸の、例えば捕獲プローブ等の特定のさらなる核酸に対する結合、二本鎖形成、又はハイブリッド形成を意味する。「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して、当業者には既知のように、配列及び配列の長さに依存しており、異なる実験的パラメータ下で異なってもよい。本発明に関連して利用することができるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃での５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含む緩衝液におけるハイブリダイゼーション、又は、６５℃での５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む緩衝液におけるハイブリダイゼーションである。好例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、及び１％ＳＤＳの緩衝液におけるハイブリダイゼーションも含み得る。或いは、ハイブリダイゼーションは、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ、４．７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて実行することができる。さらなる追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６０℃以上及び３ｘＳＳＣ（４５０ｍＭ塩化ナトリウム／４５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、又は、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５を含有する溶液における４２℃でのインキュベーションを含む。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態において、前記相互作用は、洗浄又は水洗ステップをさらに含んでもよい。このステップは、例えば、約１５分間加えられることになるｐＨ７での約０．０２モル濃度の塩濃度及び少なくとも約５０℃若しくは約５５℃から約６０℃の温度、又は、７２℃で約１５分間加えられることになる約０．１５Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度、又は、少なくとも約５０℃若しくは約５５℃から約６０℃の温度で約１５から約２０分間加えられることになる約０．２ｘＳＳＣの塩濃度を含む、本発明に関連して使用されることになる特定の洗浄条件下で実行することができる。さらなる選択肢において、ハイブリダイゼーション複合体は、１５分間室温にて０．１％ＳＤＳ含有約２ｘＳＳＣの塩濃度を有した溶液で２度洗浄し、次に、１５分間６８℃にて０．１％ＳＤＳ含有０．１ｘＳＳＣ、又は等価の条件によって２度洗浄してもよい。或いは、洗浄は、約１５分間６８℃にて０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおいて実行してもよい。洗浄に対するストリンジェントな条件は、例えば、４２℃での０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでもあり得る。
【０１０７】
本明細書において先に規定されたステップ（ｂ）の相互作用に引き続いて、培養液内の結合していない標的分子、好ましくは一本鎖標的分子、より好ましくは相補鎖がない一本鎖標的分子は、本明細書において先に規定された反応ゾーンまで輸送することができる。典型的に、反応ゾーンは、本明細書に記載されるマイクロアレイを含む。１又は複数の結合していない標的分子の「輸送」は、本明細書において先に規定された輸送手段の助けをかりて実行することができる。例えば、本明細書において先に規定されたポンプは、連続又は不連続な培養液及びその中に含有される結合していない標的分子の流れをもたらす液体流を装置内で生じることができる。例えば、輸送活動は、約０．２ｍｍという高さを有するチャネル又はチューブ内の約０．１から０．３ｍｍ／ｓという速度の連続する液体の流れを含んでもよい。従って、速度は、装置のゾーン、チャネル、チューブ、又はセクターの寸法、例えばその高さ、直径等に依存して変わる又は変更されてもよい。或いは、輸送活動は、液体移動の期、それに続く非移動の期で構成されてもよく、例えば、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０分、又はそれ以上の移動の期に続いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分、又はそれ以上の非移動の期があってもよい。さらに、流速は、例えば、当該方法の実行の間に減らされるか又は増やされる等、変えられる又は変更されてもよい。特に好ましいのは、遅い流体輸送プロセスである。さらに、特に好ましいのは、約１から３ｓ−１以上の平均剪断速度である。この剪断速度は、本明細書に記載される、又は、当業者には既知である適した輸送又はポンピング能力によって実行することができる。
【０１０８】
後に、本発明の装置の反応ゾーンにおいて、前記結合していない標的分子は、本明細書において規定される固定化された捕獲分子、すなわち、本明細書において先に記載された相補的な分子又はその一部と相互作用するのを可能にしてもよい。「相互作用するのを可能にする」という用語は、本明細書において使用される場合、相互作用の条件、好ましくはハイブリダイゼーション条件を意味する。当該用語は、本発明による装置の反応ゾーン内の標的分子と捕獲分子との相互作用に対する影響を有するさらなるパラメータも意味する。これらのパラメータは、本明細書において先に規定された流量又は流速、反応ゾーンの温度、先に述べられた塩又はさらなる緩衝液成分の濃度、利用可能な捕獲分子の量、溶液内の干渉分子の存在、及び、相互作用の時間等を含む。本発明のさらなる特に好ましい実施形態において、相互作用、すなわち、マイクロアレイに対する結合は、例えば本明細書において規定される輸送手段を介した、例えばいかなる種類のポンピング又は流体移動若しくは輸送等、流体作動を伴ってもよい。
【０１０９】
特に好ましい実施形態において、相互作用ステップは、例えば３０分、６０分、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間等、約３０分から５時間、より好ましくは１時間から３時間という相互作用の時間の間実行することができる。マイクロアレイ上に核酸を効率的に結合させる方法は、典型的なハイブリダイゼーション方法と比較して減少した時間で実行することができるという利点を本発明は提供するということが強調される。特に、現在主張している方法は、例えば一晩のハイブリダイゼーション又は結合手順等、５、１０、１５、又は２４時間を超える相互作用の実行を回避する。
【０１１０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前述の方法は、少なくとも１つの追加のステップである、前記１つ又は複数の標的分子鎖若しくはその一部とマイクロアレイ上の固定化された１つ又は複数の捕獲分子との相互作用を検出するステップ（ｄ）を含む。マイクロアレイ上の相互作用の検出は、当業者には既知のいかなる適した方法又は手順に従っても実行することができる。例えば、ラベリングステップを含んでもよく、さらに、ラベルされた又はラベルされていない分子の存在、溶液内の色若しくは色素の有無、ｐＨの変化、及び、後の核酸の濃度が測定されてもよい。或いは、電気コンダクタンス、又は、いかなる他の適したパラメータを測定することができる。この測定は、本明細書において先に記載された装置の反応ゾーン内で実行することができる。或いは、前記検出は、本発明による装置の特定の測定若しくは検出チャンバー又はゾーン内、例えば、先に記載された除去可能な反応ゾーンを移すことができるセクター内で実行することができる。測定の部位は、例えば、基板上の固定化された実在物内若しくはその上で反応が発生してその検出可能な変更が生じる場合、又は、試薬液内で発生してその検出可能な変更が生じる場合等、例えば反応の種類に依存し得る。特に好ましいのは、インサイツでの測定である。特に好ましい実施形態において、前記検出は、第１のハイブリダイゼーション期の後、すなわち、第２の捕獲ゾーンが加熱されて、本明細書において先又は以下に規定される標的分子の相補鎖を放出する前に実行することができる。特に好ましい実施形態において、前記検出は、第２の捕獲ゾーンが加熱されて前記相補鎖を放出した後にさらなる追加の検出活動を含んでもよく、さらに、又は、任意で、第１及び第２の検出ステップの結果の比較、すなわち、第１のハイブリダイゼーション後に得られた結果と、第２のハイブリダイゼーション後に得られた結果との比較を含んでもよい。
【０１１１】
相当する検出又は測定を、例えば光学的読取りシステムを介して等、光学手段によって実行することができる。例えば、ＣＣＤカメラ又は他の適した光学機器を使用して、溶液内又は、例えば反応ゾーン内若しくはマイクロアレイ内等の基板での光学的変化を検出する、及び／又は、そのような光学的変化の質を決定することができる。或いは、又は、さらに、相当する測定を、例えば、本発明による装置の部位での又はゾーン内の伝導率、容量、若しくはイオン強度、ｐＨ、及び／又は、電気泳動パラメータの決定に基づき、電気手段によって実行することができる。対応する測定モジュールは、例えばコンピュータ、コンピュータ化モジュール、又はマイクロ電子デバイス等の統合ステーションに接続させて、結合段階、結合した核酸の濃度、結合の特異性、特異的配列又は分子への結合等の評価を可能にしてもよい。そのような統合ステーションには、さらに、適したソフトウェア又はプログラムが備わって、いかなる制御活動及び評価を可能にしてもよい。例えば速度若しくは流れパラメータの増加又は減少、さらなる試薬液成分の導入、反応温度の上昇又は低下、結合ステップに割り当てられた時間の増加又は減少等のそのような評価は、訂正ステップを適用するためにさらに使用することができる。
【０１１２】
本発明の方法のさらなる特に好ましい実施形態において、前記１つ又は複数の標的分子と、装置の捕獲ゾーン内の１つ又は複数の固定化された捕獲分子との前記相互作用反応は、少なくとも２つの捕獲ゾーン内で行われ、１つの捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の１つ又は複数のセンス鎖若しくは１つ又は複数のセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持ち、さらに、もう一方の捕獲ゾーンは、１つ又は複数の標的分子の相補的な１つ又は複数のアンチセンス鎖若しくは１つ又は複数のアンチセンス鎖の一部を特異的に捕獲する能力を持つ。方法は、従って、本明細書において先に規定された装置のサブタイプ又は変異形内、すなわち、２つの捕獲ゾーンを含む装置内で実行することができる。
【０１１３】
操作可能であるために、相当する方法は、示差的なハイブリダイゼーション／結合及び変性／融解ステップを含むべきである。好ましくは、当該方法は、１つの捕獲ゾーンが、融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度まで導かれる一方で、別の捕獲ゾーンが、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度まで導かれるステップを含む。本発明の特定の実施形態において、当該方法は、さらに、又或いは、１つの捕獲ゾーンが融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度にて維持される一方で、別の捕獲ゾーンが、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度まで導かれるか若しくはその温度にて維持されるステップを含む。本発明のさらなる特定の実施形態において、当該方法は、さらに、又或いは、１つの捕獲ゾーンが融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度にて維持されるか若しくはその温度まで導かれる一方で、別の捕獲ゾーンが、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度にて維持されるステップを含む。本発明のさらなる特定の実施形態において、当該方法は、さらに、又或いは、１つの捕獲ゾーンが融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度にて維持される一方で、別の捕獲ゾーンが、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度にて維持されるステップを含む。当該温度は、例えば、装置の実施形態に関連して規定される温度制御及び／又は調節ユニットを介して等、いかなる適した手段の助けをかりて設定してもよい。捕獲ゾーンを前述の温度にて維持する又はその温度まで導く時間は、１つ又は複数の標的分子、使用される培養液、使用される捕獲分子の長さ、マイクロアレイのサイズ及び種類等に依存して変わり得る。さらなる詳細及びパラメータは、当業者には既知であり、並びに／又は、既知の方法論、及び、テキスト若しくは認定された文献から得られる適した情報に適応し得る。
【０１１４】
示された温度は、相補的な一本鎖核酸分子のリハイブリダイゼーションを回避するために、本質的に同じ時間に、すなわち、本質的に同時に装置の前述のゾーンに達する又は該ゾーン内に存在するということが重要である。
【０１１５】
本発明の特に好ましい実施形態において、１つの捕獲ゾーンが、約８５℃から９８℃、より好ましくは約９５℃という融解温度、又は、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度にて維持されるか若しくはその温度まで導かれる一方で、別の捕獲ゾーンが、約４５℃から６５℃、より好ましくは約５０℃という、１つ又は複数の捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度まで導かれるか若しくはその温度にて維持される。
【０１１６】
３つ以上の捕獲ゾーンが使用される場合、相当する活動は、全ての捕獲ゾーン内で実行することができる。
【０１１７】
上記温度ステップは、いかなるさらなるステップ、若しくは、核酸分子の結合に適した反応ステップのつながりと組み合わせるか又はその中に挿入してもよい。例えば、１つ又は複数の反応ゾーンは、マイクロアレイの捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度にて維持するか若しくはその温度まで導くことができる。本発明の特に好ましい方法は、前述のステップに続いて、本明細書において記載される適した検出手順に従った、本発明の装置の反応ゾーン内、すなわちマイクロアレイ上の結合した核酸標的分子の検出を構想する。
【０１１８】
別の特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、先に述べられた特定の温度にて維持されたか若しくはその温度まで導かれた前記少なくとも２つの捕獲ゾーン間での温度スイッチングという追加のステップを含み、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度を有した捕獲ゾーンの温度は、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度まで下げられ、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度を有した捕獲ゾーンの温度は、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度まで上げられる。特定の実施形態において、本発明の方法は、先に述べられた特定の温度にて維持されたか若しくはその温度まで導かれた前記少なくとも２つの捕獲ゾーン間での温度スイッチングという追加のステップを含み、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度を有した捕獲ゾーンの温度は、約４５℃から６５℃、好ましくは約５０℃という、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度まで下げられ、捕獲分子への１つ又は複数の核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にする温度を有した捕獲ゾーンの温度は、約８５℃から９８℃、好ましくは約９５℃という、捕獲分子への核酸のハイブリッド形成若しくは結合を可能にしない温度まで上げられる。この温度スイッチングは、好ましくは、今までに結合した一本鎖標的分子を１つの捕獲ゾーンから放出し、相補的な一本鎖分子をもう一方の捕獲ゾーンに結合させる。この活動は、好ましくは、本明細書において先に規定された輸送ステップ、又は、本発明の装置内の連続する流れ活動と付随させて、本発明のマイクロアレイ内の１つ又は複数の標的分子への前記今までに結合した一本鎖標的分子の相互作用を可能にしてもよい。このスイッチング活動の異形及び変更も、例えば装置内に存在するマイクロアレイ、１つ又は複数の反応ゾーンの性質及び数等に依存して等、本発明によって構想される。本発明の特に好ましい方法は、前述のステップに続いて、本明細書に記載される適した検出手順に従った、本発明の装置の反応ゾーン内、すなわちマイクロアレイ上の結合した核酸標的分子の検出を構想する。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態において、以下の活動ステップのつながりを実行することができる。すなわち、（１）本明細書において先に規定された第１の捕獲ゾーンが、先に記載された融解温度まで導かれ、（２）一本鎖標的分子は、本明細書において先に規定された別の第２の捕獲ゾーンと相互作用させられ、（３）相補的な一本鎖標的分子は、本明細書において先に規定された反応ゾーンと相互作用させられ、（４）前記第１の捕獲ゾーンは、冷却され、（５）本明細書において先に規定された第２の捕獲ゾーンは、先に記載された融解温度まで導かれ、（６）その結果、前に相互作用させられた一本鎖標的分子は放出され、（７）ステップ（３）の相補的な一本鎖標的分子が、前記第１の捕獲ゾーンと相互作用させられ、さらに、（８）ステップ（２）の前記一本鎖標的分子が、本明細書において先に規定された前記反応ゾーンと相互作用させられる。
【０１２０】
描かれたつながりは、本明細書において先に述べられたように変える又は変更することができる。例えば、第２の反応ゾーンがあってもよく、捕獲ゾーンは分けられていてもよく、ステップは繰り返してもよく、他のステップは回避されてもよい。
【０１２１】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本明細書において先に規定される方法は、ステップ（ｅ）として、本発明による反応ゾーン、例えばマイクロアレイに対して核酸が効率的に結合させられると、後の又は二次的な活動をさらに含んでもよい。そのような活動は、例えば、反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合した１つ又は複数の標的分子の増幅を含む。そのような増幅は、当業者には既知のいかなる適した手段に従っても実行することができる。例えば、増幅は、認定されたテキスト又は文献から得られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順に基づき行うことができる。或いは、ＮＡＳＢＡ又はＲＣＡ等の等温増幅プロセスを使用することができる。
【０１２２】
さらなる好ましい活動は、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合した１つ又は複数の標的分子のラベリングである。そのようなラベリング活動は、例えばアルデヒド、カルボン酸、又はアミンの反応等、種々の化学的性質を使用した結合反応に基づいてもよい。核酸標的分子に結合させることができるラベルの例として、（例えばフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン等の）蛍光色素又は金属、（例えばロドプシン等の）発色団の色素、（例えばルミノール、イミダゾール等の）化学発光化合物、及び、（例えばルシフェリン、ルシフェラーゼ等の）生物発光タンパク質、（例えばビオチン等の）ハプテンが挙げられる。本発明に関連して使用することができるさらなるラベルは、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ若しくはＲｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２を含む。標的分子は、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、６８Ｇａ、又は１８Ｆ等の放射性同位元素でラベルしてもよい。
【０１２３】
さらなる好ましい活動は、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合した１つ又は複数の標的分子のライゲーションである。ライゲーションプロセスは、１つ又は複数の捕獲分子に結合した１つ又は複数の標的分子と、例えばアダプター分子、タグを含む核酸、ラベルを含む核酸、ＰＣＲ結合部位を含む核酸、同定目的のためのバーコード配列、制限ヌクレアーゼ認識部位を含む核酸、酵素若しくはタンパク質の機能性を含むか又はコード化する核酸等、いかなる適したさらなる核酸分子との間で実行することができる。ライゲーションプロセスのために、例えば二本鎖核酸分子を得るための分子の相補鎖の添加、及び／又は、制限ヌクレアーゼによる制限等、結合した標的分子に対する調製ステップを実行することができる。ライゲーションは、例えば原核生物又は真核生物源から得られるＤＮＡリガーゼ等、ＤＮＡリガーゼ等の酵素活動の助けをかりて行ってもよい。
【０１２４】
さらなる好ましい活動は、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合した１つ又は複数の標的分子を用いた一塩基伸長の実行である。一塩基伸長は、核酸又は標的核酸分子に沿った特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性の決定に使用することができる。当該方法は、典型的に、一塩基多型を同定するために使用される。一塩基伸長は、オリゴヌクレオチドプライマーを、捕獲分子に結合した核酸に沿った相補的な領域とハイブリッド形成させ、従って、同定されることになるヌクレオチド塩基にプライマーの末端３’末端が直接隣接した二本鎖構造を形成することによって実行することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、後に、同定されるヌクレオチドに相補的な一塩基ヌクレオチドターミネーターによって酵素的に伸長することができる。さらなる実施形態において、ターミネーターの同一性は、例えば蛍光ラベリング、マススペクトロメトリーに対するマスラベリング、タンパク質部分を使用した酵素活動の測定、又は、同位体ラベリングを介して、決定することができる。さらなる詳細及び適した手順は、当業者には既知であるか、又は、適したテキスト又は認定された文献から得ることができる。相当する方法又は手順を、従って、結合した標的分子における一塩基多型の決定に使用することができる。
【０１２５】
別の好ましい活動は、前記反応ゾーン内の１つ又は複数の捕獲分子に結合した１つ又は複数の標的分子を用いたシーケンシング反応の実行である。そのようなシーケンシング反応は、当業者には既知である配列決定の方法に使用される１つ又は複数の反応に基づいていてもよい。当該方法は、結合した１つ又は複数の標的分子の放出、二本鎖核酸分子の調製、対応する特定の調製ステップを含んでいてもよく、又或いは、インサイツで実行されてもよい。本発明の方法によって構想されるシーケンシング反応は、例えば４５４Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒに対するＲｏｃｈｅ社によって提供される技術に基づくピロシーケンス等、特に次世代のシーケンシング法又はハイスループットシーケンシング法を含む。この方法は、油剤中の水滴の内部のＤＮＡを増幅し、各液滴は、１つのプライマーでコートされたビーズに付着した１つの鋳型ＤＮＡを含有しており、１つのプライマーでコートされたビーズは従ってクローンのコロニーを形成する。ピロシーケンスは、ルシフェラーゼを使用して、新生ＤＮＡに添加された個々のヌクレオチドの検出のための光を生じ、さらに、組み合わされたデータを使用して、配列読取りを生じる。別の例は、可逆的なダイターミネーターに基づくＩｌｌｕｍｉｎａ社又はＳｏｌｅｘａ社のシーケンシングの方法論である。ＤＮＡ分子は、典型的に、スライド上のプライマーに付着し、さらに、局所的なクローンのコロニーが形成されるように増幅する。後に、一度に１つの種類のヌクレオチドを添加することができ、さらに、取り込まれていないヌクレオチドは洗い流される。後に、蛍光でラベルしたヌクレオチドの画像を撮ることができ、色素は、ＤＮＡから化学的に除去され、次のサイクルを可能にする。さらなる例は、ライゲーションによるシーケンシングを利用するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＯＬｉｄ技術である。この方法は、配列決定された位置に従ってラベルされる、固定された長さの全てのあり得るオリゴヌクレオチドのプールの使用に基づいている。そのようなオリゴヌクレオチドは、アニール及び連結される。後に、対応する配列のためのＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションは、典型的に、その位置にあるヌクレオチドの情報を提供するシグナルを生じる。ＤＮＡは典型的にエマルジョンＰＣＲによって増幅されるため、結果として生じるビーズは、それぞれ同じＤＮＡ分子のコピーのみを含有して、ガラススライド上で堆積させ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のシーケンシングに匹敵する量及び長さの配列を生じることができる。さらに別の例は、アレイに繋ぎ止められたポリＴオリゴマーによって断片が捕獲されるＨｅｌｉｃｏｓ社のＨｅｌｉｓｃｏｐｅ技術である。各シーケンシングサイクルにて、ポリメラーゼ及び単一の蛍光でラベルされたヌクレオチドが添加され、さらに、アレイは画像形成される。蛍光タグは後に除去され、サイクルは繰り返される。本発明に包含されるシーケンシング技術のさらなる例は、マイクロ流体Ｓａｎｇｅｒシーケンシングである。本発明は、例えば配列決定の正確さ又は生物のゲノム配列の決定に必要とされる時間のさらなる改善等、これらの技術のさらなる発展も構想する。これらのシーケンシング法は、��在提供されている方法論において適応させ、非常に増加した読取り長さ、並びに、反応の実行の間の酵素及び／又はオリゴマー及び／又はヌクレオチドの量を増やすという可能性による減少した費用を可能にしてもよい。当該方法のさらなる変異形及び詳細が当業者には既知であり、さらに、例えばＭｅｔｚｇｅｒ、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ  １１等の適した刊行物から得ることができる。
【０１２６】
さらに別の態様において、本発明は、マイクロアレイ上に１つ又は複数の標的分子を効率的に結合させるための、本明細書において先に規定された装置、又は、本明細書において先に規定された方法の使用に関する。「効率的な結合」という用語は、この状況において使用される場合、本明細書において規定される反応ゾーン内の捕獲分子と標的分子との相互作用反応の実行を意味する。
【０１２７】
或いは、本明細書において先に規定された装置又は方法は、１つ又は複数の標的分子を濃縮させるために使用することができる。「濃縮」という用語は、本明細書において使用される場合、標的核酸の濃度の増加を意味する。さらに構想されるのは、標的核酸の２つ以上のコピーの捕獲である。
【０１２８】
さらに、本明細書において先に規定された装置又は方法は、１つ又は複数の標的分子を特異的に選択するために使用することができる。「特異的に選択する」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明による装置の要素又は実在物と、本明細書において規定される標的分子との相互作用、特に、水素結合に基づく相互作用、及び／又は、例えば異なる電荷を持つ分子間の電荷に基づく相互作用を意味する。標的分子を特異的に選択することによって、単一又は多数の不適正塩基対、又は、捕獲分子と標的分子との差を検出することができる。このアプローチは、一塩基多型の検出、又は、変異したか若しくは修飾された核酸標的分子の検出に使用することができる。
【０１２９】
さらに、本明細書において先に規定された装置又は方法は、１つ又は複数のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の定量的及び／又は多重の検出に使用することができる。適した増幅及び／又はラベリングステップの実行を含む相当する手順が、当業者には既知である。ＲＮＡ分子が含まれる場合、リボヌクレアーゼ抑制剤の存在が構想される。さらに、ＤＮＡ分子を生成する増幅ステップを追加することができる。
【０１３０】
さらに構想されるのは、発現分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、一塩基多型の検出に対する、又は、マイクロアレイベースのゲノム選択に基づくシーケンシングに対する、本明細書において先に規定された装置又は方法の使用である。対応する分子技術は、当業者には既知である。これらの技術は、適したテキスト又は認定された文献から得ることができる。手順は、さらに、捕獲された分子の状況に適応させてもよく、すなわち、特定の放出若しくは調製ステップを含ませてもよく、又は、方法論を、本明細書において規定されるマイクロアレイ上でのインサイツでの実行に適応させてもよい。
【０１３１】
さらに構想されるのは、本明細書において述べられるか又は当業者には既知のいかなる他の種類の適した分子反応に対する、本明細書において先に規定された装置の使用である。
【０１３２】
以下の実施例及び図が、例示目的のために提供される。従って、実施例及び図は限定的であると解釈されることはないということに理解されたい。当業者は、本明細書において提示される原理のさらなる変更を明確に構想することができる。
【実施例１】
【０１３３】
マイクロアレイ上の変性と注入との間の保有時間の効果
ヒトゲノムの短配列のＰＣＲ増幅によって得た試料を、ハイブリダイゼーション緩衝液において１ｎＭまで希釈し、５分間９５℃までバス内で加熱し、次に、氷の上に置いて５０℃にて保有した。保有時間として示した時間の後、ＰＣＲ産物の２つの相補鎖のうちの１つに相補的な捕獲プローブを有したマイクロアレイを含有する装置内に溶液を注入した。プローブの長さは、７６ｂｐであった。ＵＶ架橋によって捕獲プローブを表面に固定化した。基板は、アミノシラン表面層を有したガラスであった。シリンジポンプを用いて６μｌ／ｍｉｎの速度で、マイクロアレイを覆うマイクロ流体チャネル内に試料を導入した。チャネルの寸法は、１２００ｘ１００μｍであった。この速度で流れを３０分間続けた。ハイブリダイゼーションのために、マイクロアレイを５０℃の温度に設定した。流れの休止の後、５分間６μｌ／ｍｉｎの速度で洗浄緩衝液をポンプで汲み出した。次に、マイクロアレイを共焦点蛍光スキャナー上に置き、さらに、スポットの強度を測定した。
【０１３４】
図５は、異なる保有時間を使用した異なる実験に対する、測定されたスポットの強度を示している。わかるように、強度は、保有によって１０分の一下落している。これは、マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖分子の効果的な濃度が少なくとも１０分の一減っている（シグナルの濃度依存性はほぼ直線である）ことを示している。
【０１３５】
各ハイブリダイゼーション実験の間、溶液内のリハイブリダイゼーションが変性後の直接注入を用いても発生するため、捕獲の効率は損なわれる。低濃度の標的の捕獲に対して、典型的に一晩及び（図５において最も右の点に相当する）３日までの長いハイブリダイゼーション時間が慣例である。結果的に、本明細書において先に記載された溶液内の相補鎖を除去することによって、１０倍までマイクロアレイの捕獲の効率を改善することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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