(57)【要約】【課題】Ｂ型肝炎の予防及び治療のためのＤＮＡワクチン組成物の提供。【解決手段】本発明は、Ｂ型肝炎の治療に用いるＤＮＡワクチン組成物を提供した。該ワクチン組成物は、Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミド、Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミド、及び組換え助剤プラスミドを含む。Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミドは、好ましくはＢ型肝炎ウイルスエンベロープの中タンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子またはＢ型肝炎ウイルスエンベロープの小タンパク質Ｓをコードする遺伝子を含む。本発明はさらに、該ＤＮＡワクチン組成物のＢ型肝炎ウイルス感染の予防及び／または治療における使用を提供した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミド、
Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミド、及び組換え助剤プラスミドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎を治療するためのＤＮＡワクチン組成物。
【請求項２】
上記Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする遺伝子を含み、上記Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子またはＢ型肝炎のスモールタンパク質Ｓをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項３】
上記Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質をコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチド酸の配列と少なくとも７０％の相同性を有し、且つ天然Ｂ型肝炎表面抗原Ｓ２Ｓタンパク質と同じ免疫原性を有するＢ型肝炎表面抗原Ｓ２Ｓタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項４】
上記Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３又はＮｏ．４が示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項５】
上記Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９が示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項６】
上記Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項７】
上記Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５が示すヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、且つ天然Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質と同じ免疫原性を有するＢ型肝炎コア抗原タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項６に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項８】
上記Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７またはＮｏ．８が示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項７に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項９】
上記Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０が示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１０】
上記組み換え助剤プラスミドは、チモシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γからなるグループから選ばれるいずれか一つ又はその任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物の哺乳類動物Ｂ型肝炎の予防及び治療薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢ型肝炎を予防及び／または治療するためのＤＮＡワクチン組成物に係るものである。具体的には、Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミド、Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミド、及び組換え助剤プラスミドを含むものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は人類の健康を大きく害し、現時点では特効的な治療手段がない。Ｂ型肝炎が慢性化する主な原因はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染後の人体が、持久的な特異性細胞免疫及び体液免疫に欠けるからである。
【０００３】
ＨＢＶエンベロープタンパク質は、ラージタンパク質（ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＬＳ（Ｓ１Ｓ２Ｓ抗原、プレＳ１−プレＳ２−Ｓ遺伝子によってコードされる）、ミドルタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＭＳ（Ｓ２Ｓ抗原、プレＳ２−Ｓ遺伝子によってコードされる）、スモールタンパク質（ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｓ（Ｓ抗原、Ｓ遺伝子によってコードされる）の三種類の分子によって構成され、ここにおいて、プレＳ２抗原分子量は小さく、抗原性は強く、Ｂ型肝炎ウイルスの宿主細胞に対する吸着に係るものである。
【０００４】
ＨＢｃＡｇはＢ型肝炎ウイルス遺伝子Ｃ区域遺伝子によってコードされ、第二のＡＴＧから翻訳を開始し、１８３〜１８５個のアミノ酸を含むペプチドであり、分子量は約２１ＫＤであり、そのＣ端には、アルギニン及び複数のプロテアーゼ作用部位に富み、ＲＮＡを結合する能力を有し、さらにはＢ型肝炎コア顆粒を組み立てることに密接に関連している。ＨＢｃＡｇ顆粒は複数のコアタンパク質亜基によって構成され、二十面体の対称の顆粒状構造を呈し、個別のコアタンパク質亜基（１８３〜１８５個のアミノ酸のポリペプチド鎖を含む）は、先にホモ二量体（Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）を形成し、ホモ二量体をさらに凝集することでＨＢｃＡｇ顆粒を形成する。
【０００５】
Ｍａｎｃｉｎｉら（非特許文献１）は、ｐｒｅＳ２／Ｓ  ＨＢＶエンベロープタンパク質をコードする組換えプラスミドによりＨＢＶ遺伝子組換えたマウスを免疫し、ＤＮＡワクチンの慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染者の治療における潜在的なメリットを証明している。Ｍａｎｃｉｎｉ−Ｂｏｕｒｇｉｎｅ  Ｍら（非特許文献２）は、ｐｒｅＳ２／Ｓ  ＨＢＶエンベロープタンパク質をコードする組換えプラスミドにより、１０名の慢性的なＢ型肝炎感染者を免疫させ、これらの１０名の感染者は、いかなる抗ウイルス治療も受けていない。結果的には、以下について見出した。彼らはワクチンに対する耐性に優れ、ここにおいて２件の感染者のＰＢＭＣは抗原特異性Ｔリンパ細胞増殖反応を起こし、且つＨＢＶ特異性的にＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞は、免疫後に大幅に増加し、５名の感染者の血清のＨＢＶ  ＤＮＡレベルは低下し、しかしこのような低下は一時的なものである。この研究は、ＨＢＶ  ＤＮＡワクチンの安全性、及び一部の慢性Ｂ型肝炎感染者体内で特異的なＴ細胞免疫応答を誘導した。
【０００６】
ＨＢｃＡｇは優勢抗原として、Ｂ型肝炎ワクチンの研究において広く応用され、Ｖｅｒｅｍｅｉｋｏ  ＴＡら（非特許文献３）は、ＨＢＶエンベロープタンパク質エピトープをＨＢｃＡｇに挿入し、成功的にＨＢｃＡｇ−ＨＢｓＡｇ融合タンパク質を構築し、さらにこの融合タンパク質により、Ｂａｌｂ／ｃｘｉａｏｓｈｉマウスを免疫させ、高滴定量の挿入エピトープＨＢｓＡｇ及びベクタータンパク質ＨＢｃＡｇに対する抗体を生成した。ＺｈａｎｇＷｅｉら（非特許文献４）は、組換えＨＢｃＡｇ真核発現プラスミドｐＨＢｃｌ４４のＣ５７ＢＬ／６マウスに対する免疫作用について研究した。結果的に、ｐＨＢｃｌ４４免疫後の抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は徐々に多くなり、初回免疫の１４日目に第一の免疫応答のピークが出現し、その後この抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞数量は徐々に低下し、免疫記憶期に入り、さらに１年以内に安定的なレベルを維持する。
【０００７】
特許文献１は、組み換え真核発現プラスミドｐＳ２Ｓを開示し、該プラスミド中には細胞コロニー刺激因子を含み、さらには組換えワクチンプラスミドと、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを含む組換え助剤プラスミドと共に使用し、組換え助剤プラスミドは、組換え免疫プラスミドの免疫及び治療作用を向上させることができる。特許文献２は、治療性のＨＢＶ  ＤＮＡワクチンを開示し、該ワクチンはダブルプラスミドＨＢＶ  ＤＮＡワクチンであり、組換えワクチンプラスミドｐＳ２．Ｓと組換え助剤プラスミドｐＩＩＦを含み、これらの治療性のダブルプラスミドワクチンは、Ｔｇ−ＨＢＶマウスに対して効果を有し、このような治療性のダブルプラスミドは、Ｔｇ−ＨＢＶマウスに対して、マウス体内のＨＢＶ  ＤＮＡの複製を抑制でき、且つ血清ＨＢｓＡｇ及び血清ＡＬＴのレベルを下げ、現在この二のプロジェクトはすでに臨床研究段階にある。
【０００８】
周陶友ら（非特許文献５）は、融合発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＣを構築し、１００μｇＣ５７ＢＬ／６  ＨＢＶ  ＤＮＡを筋肉接種により遺伝子組換えマウスに接種し、２、４週間後にそれぞれ一回免疫を強化する。Ｂ型肝炎コアＣタンパク質遺伝子をプラスミド中に融合させた後、該融合発現プラスミドはマウスの血清に抗−ＨＢｓの生成を促進するのみでなく、抗−ＨＢｃの生成も促進するが、抗−ＨＢｃのプラス転換率は非常に低く、その陽性転換率は２０％より低い。Ｓ−Ｈ  Ｙａｎｇら（非特許文献６）は遺伝子組換えマウスに対して、注射によりＨＢ−１００ワクチンを提供し（該ワクチンは５種類の異なるプラスミドを含み、それぞれはｐＧＸ１０  Ｓ、ｐＧＸ１０  Ｓｌ／Ｓ２／Ｘ、ｐＧＸ１０  ｃｏｒｅ、ｐＧＸ１０  Ｐｏｌ、ｐＧＸ１０  ＭＬ−１２Ｎ２２２Ｌである）、これによりＢ型肝炎マウス体内の血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルを低下させ、さらに血清のＨＢｃ−Ａｂの生成を促進する。
【０００９】
従来のＤＮＡワクチンの研究はすでに一定の成果を取得しているものの、その免疫治療効果は人々を満足させられるものではなく、予防及び治療効果がさらに高めたＢ型肝炎ワクチン製品を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】中国特許出願公開第１３１６５１８号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１０９５９５１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｎｃｉｎｉ  Ｍ，Ｈａｄｃｈｏｕｅｌ  Ｍ，Ｄａｖｉｓ  ＨＬ，ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｓｔａｔｅ．Ｐｒｏ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６，９３：１２４９６〜１２５０１
【非特許文献２】Ｍａｎｃｉｎｉ−Ｂｏｕｒｇｉｎｅ  Ｍ，Ｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｈ，Ｓｃｏｔｔ−Ａｌｇａｒａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｅ  ｂｙ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ＤａｎＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ＨＢＶ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００４，４０：８７４−８８２
【非特許文献３】Ｖｅｒｅｍｅｉｋｏ  ＴＡ，Ｌｅｂｅｄｅｖ  ＬＲ，Ｃｈｉｋａｅｖ  ＮＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｂａｌｂ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒ  ＨＢｃＡｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｏｐｒ  ｖｉｒｕｓｏｌ，２００７，５２：４０−４５
【非特許文献４】ＺｈａｎｇＷｅｉ、Ｄｏｎｇ  Ｓｈｅｎｇｆｕ、Ｓｕｎ  Ｓｈｕｈｕｉら、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原  ＤＮＡワクチンはマウス抗原特異性  ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するのダイナミック変化及びダイナミック分布、中国免疫学雑誌、２００４、２０（６）：３７９−３８３
【非特許文献５】周陶友、趙連三、陳敏ら、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ融合発現プラスミドのＨＢＶ遺伝子組換えマウスに対する体液免疫治療効果、中華伝染病雑誌［Ｊ］．２００５，２３（６）：３７２−３７４
【非特許文献６】Ｓ−Ｈ  Ｙａｎｇ，Ｃ−Ｇ  Ｌｅｅ，Ｓ−Ｈ  Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｂｏｕｎｄ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｃａｒｒｉｅｒｓ：ａ  ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．２００６，１３：１１１０−１１１７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、Ｂ型肝炎を予防及び／または治療する新規のＤＮＡワクチン組成物を提供し、具体的には、三つのプラスミドにより構成されるＨＢＶ  ＤＮＡワクチン組成物である。該ワクチン組成物は、Ｔｇ−ＨＢＶマウスに対し明らかな治療効果を有し、ＨＢＶマウスの血清ＨＢＶ  ＤＮＡ、血清ＨＢｓＡｇレベル、及び血清ＡＬＴレベルを低下させ、且つ一部のマウス個体のＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ  ＤＮＡを陰性に転換させ、血清ＡＬＴは正常レベルに戻された。本発明のワクチン組成物は、同時に比較的強いＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ免疫効果を有し、Ｂ型肝炎に対し顕著な予防及び治療効果を有する。
【００１３】
具体的には、本発明は以下に係る。
【００１４】
１、Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミド、Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミド、及び組換え助剤プラスミドを含む、Ｂ型肝炎を治療するためのＤＮＡワクチン組成物。
【００１５】
２、上記Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする遺伝子を含み、上記Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子またはＢ型肝炎表面抗原のスモールタンパク質Ｓをコードする遺伝子であることが好ましい、前記１に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００１６】
３、上記Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質をコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチドの配列と少なくとも７０％の相同性を有し、且つそれがコードするＢ型肝炎表面抗原Ｓ２Ｓタンパク質は天然Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質Ｓ２Ｓと同じ免疫原性を有する、前記２に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００１７】
４、上記Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３又はＮｏ．４が示すヌクレオチド配列を有する、前記３に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００１８】
５、上記Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９が示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする、前記１〜４のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００１９】
６、上記Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子を含む、前記１〜５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００２０】
７、上記Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５が示すヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、且つそれがコードするＢ型肝炎コア抗原タンパク質は天然Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質と同じ免疫原性を有する、前記６に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００２１】
８、上記Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７またはＮｏ．８が示すヌクレオチド配列を有することを特徴とする、前記７に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００２２】
９、上記Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０が示すヌクレオチド配列を有する、前記６〜８のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００２３】
１０、上記組み換え助剤プラスミドは、チモシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γからなるグループから選ばれるものをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、前記１〜９のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００２４】
１１、上記組換え助剤プラスミドは、ＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、前記１０に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【００２５】
１２、前記１〜１１のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物のＢ型肝炎の予防及び／又は治療薬の製造における使用。
【００２６】
１３、Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミド、Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミド、及び組換え助剤プラスミド、及び薬学上許容できるベクターを含む医薬品組成物であって、上記Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質は、好ましくはＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓであり、上記助剤はＩＬ−１２が好ましいことを特徴とする、医薬品組成物。
【００２７】
１４、Ｂ型肝炎を予防及び／又は治療する方法であって、哺乳動物に有効量の前記１〜１１のいずれかに記載の上記ＤＮＡワクチン組成物または前記１３の医薬品組成物を投与することを含む前記方法。
【００２８】
１５、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療のためのワクチン組成物及び／又は医薬品組成物であって、該組成物は、Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えプラスミド、Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えプラスミド、及び組換え助剤プラスミドを含み、上記Ｂ型肝炎表面抗原は、好ましくはＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎スモールタンパク質Ｓであることを特徴とする、ワクチン組成物または医薬品組成物。
【００２９】
１６、製品及びキットであり、本発明のワクチン組成物または医薬組成物を入れた容器、及び上記ワクチン組成物または医薬組成物を、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いることが記載された説明書を含む。
【００３０】
１７、微生物であって、その寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．３２７６、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．３７２７、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４１７０及びＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４１８１である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】組換えワクチンプラスミドｐＲｅｃ２．０−Ｓ２Ｓ（略称はｐＳ２Ｓ）の構造模式図である。
【図２】組換えワクチンプラスミドｐＲｅｃ２．０−Ｃ（略称はｐＣ）の構造模式図である。
【図３】組換え助剤プラスミドｐｈＩＬ１２の構造模式図である。
【図４】組換え助剤プラスミドｐｍＩＬ１２の構造模式図である。
【図５】組換えワクチンプラスミドｐＳ２Ｓの制限性酵素切断−電気泳動図であり、ここにおいて、レーン１はプラスミドｐＳ２Ｓの、Ｎｄｅｌ＋Ｐｓｔｌの二種類の酵素により切断したものの図であり、２３５ｂｐ、１２９４ｂｐ及び３６０７ｂｐの三つのバンドを得て、そのうち２３５ｂｐサイズのバンドはスミアである。レーン２はプラスミドｐＳ２ＳがＰｖｕＩＩ＋Ｘｂａｌの二種類の酵素により切断されたものの図であり、サイズが１０３５ｂｐ、４１０１ｂｐのバンドを得る。レーン５は、プラスミドｐＳ２ＳがＥｃｏＲＩという一種類の酵素によって切断されたサイズが５１３６ｂｐのバンドであり、レーン６は、制限性酵素切断をおこなっていない組換えプラスミドｐＳ２Ｓであり、レーン３はＤＬ１５０００の分子量基準であり、レーン４はＤＬ２０００の分子量基準である。
【図６】組換えワクチンプラスミドｐＣの制限性酵素切断−電気泳動図であり、そのうち、レーン１はプラスミドｐＣがＮｄｅｌ＋Ｐｓｔｌという二種類の制限性酵素によって切断された二本の、サイズがそれぞれ１２９４ｂｐ、３５４８ｂｐのバンドである。レーン２はプラスミドｐＣがＰｓｔｌ＋Ｘｂａｌという二種類の制限性酵素によって切断された二本のサイズがそれぞれ５７７ｂｐ、４２６５ｂｐのバンドであり、レーン５はプラスミドｐＣがＰｖｕＩＩという一種類の制限性酵素によって切断されたサイズが４８４ｂｐ、４３５８ｂｐの二本のバンドであり、レーン６は、プラスミドがＥｃｏＲＩという一種類の制限性酵素によって切断されたサイズが４８４２ｂｐのバンドであり、レーン７は制限性酵素切断を行っていない組換えワクチンプラスミドｐＣであり、レーン３はＤＬ１５０００の分子量基準であり、レーン４はＤＬ２０００の分子量基準である。
【図７】組換え助剤プラスミドｐｍＩＬ１２の制限性酵素切断−電気泳動図であり、そのうち、レーン１はＰｓｔＩという一種類の制限性酵素に切断されて得られた三つのバンドであり、そのサイズはそれぞれ２７５ｂｐ、２１６４ｂｐ、３２８６ｂｐであり、２７５ｂｐのサイズのバンドはスミアである。レーン２は、Ｎｄｅｌという一種類の制限性酵素に切断されて得られた二本のバンドであり、そのサイズはそれぞれ１８７０ｂｐ、３８５５ｂｐである。レーン３は、ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩという二種類の制限性酵素に切断され得られた二本のバンドであり、そのサイズはそれぞれ１７４０ｂｐ、３９８５ｂｐであり、レーン６はプラスミドがＥｃｏＲＩという一種類の制限性酵素に切断されて得られた、サイズが５７２５ｂｐのバンドであり、レーン７は制限性酵素切断をされていない組換え助剤プラスミドｐｍＩＬ１２である。レーン４、５はそれぞれＤＬ１５０００、ＤＬ２０００の分子量基準である。
【図８】組換え助剤プラスミドｐｈＩＬ１２の制限性酵素切断−電気泳動図であり、そのうち、レーン１、２はそれぞれＤＬ２０００、ＤＬ１５０００分子量基準であり、レーン３はＨｉｎｄＩＩＩの一種類の制限性酵素に切断されて得られる３本のバンドであり、そのサイズはそれぞれ１４９６ｂｐ、１８８２ｂｐ、２３４３ｂｐであり、レーン４はＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩの二種類の制限性酵素に切断されて得られた二本のバンドであり、そのサイズはそれぞれ１７５２ｂｐ、３９４２ｂｐであり、レーン５はＥｃｏＲＩという一種類の制限性酵素に切断された線形フラグメントであり、サイズは５６９４ｂｐであり、レーン６は制限性酵素切断をされていない組換え助剤プラスミドｐｈＩＬ１２である。
【図９】図９（ａ）は異なる形式のコア抗原ＨＢｃＡｇ特異性抗体価をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図であり、１はＢ型肝炎コア抗原をコードする遺伝子と、Ｂ型肝炎ミドルタンパク質をコードする遺伝子を一つのプラスミド中に融合したものであり、２はＢ型肝炎コア抗原の全長をコードする遺伝子を含むプラスミドであり、３は切断後のＢ型肝炎コア抗原をコードする遺伝子を含むプラスミドであり、４はネガテイブコントロールである。図９（ｂ）は異なる形式のＢ型肝炎コア抗原のＨＢｃＡｇ特異性細胞免疫反応をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴにより検測した結果を示した図であり、１はＢ型肝炎コア抗原をコードする遺伝子及びＢ型肝炎ミドルタンパク質をコードする遺伝子を一つのプラスミド上に融合させたものであり、２は全長のＢ型肝炎コア抗原をコードする遺伝子を含むプラスミドであり、３は切断後のＢ型肝炎コア抗原をコードする遺伝子を含むプラスミドであり、４はネガテイブコントロールである。
【図１０】各プラスミドにより、健康なＢａｌｂ／ｃマウスに免疫した後に、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにより特異性細胞免疫（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する免疫反応）反応を測定した結果を示した図である。棒グラフは左から右に順次にプラスミドｐＲｅｃ２．０、ｐＳ２Ｓ、ｐＣ、ｐＳ２Ｓ−Ｃ、及びｐＳ２Ｓ＋ｐＣである。
【図１１】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにより特異性細胞免疫（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する細胞免疫）反応を測定した結果を示した図であり、助剤プラスミドｐｍＩＬ１２を添加する前後の健康なＢａｌｂ／ｃマウスに対する免疫作用を示したものである。棒グラフは左から右に順次にｐＳ２Ｓ、ｐＳ２Ｓ＋ｐｍＩＬ１２、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２である。
【図１２】図１２（ａ）はＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにより特異性細胞免疫（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する細胞免疫）反応を測定した結果を示した図であり、図１２（ｂ）はＥＬＩＳＡにより各免疫方案のＨＢｃＡｇ特異性抗体価を測定した結果を示したグラフであり、カラム１は筋肉内注射免疫のものであり、カラム２は電気穿孔による免疫のものである。
【図１３】図１３（ａ）〜（ｂ）及び図１３（ｃ）の１〜６は、各グループのマウスの免疫後の肝臓組織スライス写真である。図１３（ａ）は正常なマウス肝臓組織スライス写真である。図１３（ｂ）はＴｇ−ＨＢＶマウスのポジティブコントロールのスライス写真であり、図１３（ｃ）の１〜６は、Ｔｇ−ＨＢＶマウスに三つのプラスミドワクチンｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２により治療した後のマウス肝臓組織スライス写真であり、そのうち、マウス三匹の肝臓組織スライスは正常グループと似ている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の目的の一つは、Ｂ型肝炎を治療するためのＤＮＡワクチン組成物を提供するものであって、該ＤＮＡワクチン組成物は、Ｂ型肝炎表面抗原をコードするポリヌクレオチド、Ｂ型肝炎コア抗原をコードするポリヌクレオチド、及び助剤（例えばサイトカイン、例えばチモシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ。最も好ましくは、ＩＬ−１２である）をコードするポリヌクレオチドを含む。そのうち、上記Ｂ型肝炎表面抗原、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓであり、もっとも好ましくは、Ｂ型肝炎表面抗原がＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓである。上記ポリヌクレオチドは、本分野に公知の遺伝子組換え方法により、組換え発現プラスミド中に挿入され、個体において発現される。
【００３３】
用語の「ベクター」は、本文に用いる場合は、それと接続するその他のポリヌクレオチドの核酸分子を運送できるものをいう。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であって、その他のＤＮＡフラグメントを接続できる環状二重鎖ＤＮＡ環である。もう一つのタイプはファージベクターである。もう一つのタイプのベクターはウイルスベクターである。これらのベクターは、それを導入した宿主細胞中において、自主的に複製することが可能である（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクター及び付加型哺乳動物ベクターである）。その他のベクター（例えば非付加型哺乳動物ベクター）は、宿主細胞を導入してから、宿主細胞のゲノムに整合でき、これは宿主ゲノムと共にコピーされる。また、これらのベクターは、それと操作可能に接続している遺伝子を発現することを指導する。このタイプのベクターは本文中において、「組換え発現ベクター」と称し（略称としては「組換えベクター」である）。通常は、組換えＤＮＡ技術中での有用な発現ベクターは、プラスミド形式である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は交換できるように使用でき、プラスミドはベクターの最もよく使用される形式である。
【００３４】
本発明はさらに、Ｂ型肝炎表面抗原をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、Ｂ型肝炎コア抗原をコードするヌクレオチドを含むベクター、及び助剤をコードするヌクレオチドのベクターに係る。本発明はさらに、これらのベクターの、Ｂ型肝炎を予防及び／または治療するワクチン組成物の製造における使用に係るものである。また、本発明はさらに、上記ベクターの、本発明の教示に従ってＢ型肝炎ウイルスに対する免疫反応の誘導における使用に係るものである。用語「ベクター」は、当業者が熟知するいかなるベクターでも良い。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＲｅｃ２．０、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐＵＣ系ベクターのようなプラスミドベクターである。一つの好ましい実施例において、上記ポリヌクレオチドを含むベクターＤＮＡをワクチンとして使用する。該ＤＮＡワクチンは筋肉注射により哺乳類動物に注射され、例えば人の体内に注射され、該発現ユニットのコードするタンパク質の発現をもたらす。発現されたタンパク質は免疫システム中に露出され、Ｂ型肝炎ウイルスに対する特異性免疫反応をもたらしてしまう。
【００３５】
本発明において、「個体」とは脊髄動物である。いくつかの実施形態において、脊髄動物は哺乳類動物である。哺乳類動物とは、以下を含むが、これらに限られない。これらは、家畜（例えば牛）、運動用動物、ペット（例えば猫、犬、馬）、霊長類動物、マウス及びラットである。一部の実施形態において、哺乳動物は人を意味する。
【００３６】
用語「Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓ」、「Ｂ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓ」及び「Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質」は、天然Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓ、Ｂ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓ及びＢ型肝炎コア抗原タンパク質、及びそれらの誘導物または変異体である。上記誘導体は、上記天然タンパク質中において、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠損及び／または挿入することで得られるタンパク質である。例えば１〜１０個、１〜２５個、１〜１０個、１〜５個のアミノ酸を保存置換して得られた誘導体であり、且つ該誘導体は上記天然タンパク質と同じ、Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗原性及び免疫原性を有することになる。
【００３７】
本発明において、上記のＢ型肝炎表面抗原の組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドであり、ここにおいて、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子のヌクレオチド配列またはＢ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓをコードする遺伝子のヌクレオチド配列であり、さらに好ましくはＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子のヌクレオチド配列である。Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子、またはＢ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓをコードする遺伝子は、全長Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓの天然ヌクレオチド配列であってもよく、さらには、該天然ヌクレオチド配列の誘導体または変異体であってもよい。該誘導体と該天然Ｓ２Ｓタンパク質またはスモールタンパク質Ｓをコードする遺伝子とは、ヌクレオチド配列において、少なくとも７０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも７５％の相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも８０％の相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも８５％の相同性を有し、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、さらに好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。上記ヌクレオチド配列がコードするタンパク質は、天然Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎表面コアスモールタンパク質Ｓと同じ免疫原性を有する。
【００３８】
本発明において、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子は、好ましくは、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．１、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．２、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．３またはＳｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示されるヌクレオチド配列を含み、好ましくはＳｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．１、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．２、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．３またはＳｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示されるヌクレオチド酸からなる。
【００３９】
本発明において、用語「Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質」、「Ｂ型肝炎コアタンパク質」、「Ｂ型肝炎コア抗原」及び「Ｂ型肝炎コアタンパク質抗原」は変換して使用することができる。
【００４０】
本発明において、前記Ｂ型肝炎コアタンパク質抗原を発現する組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドであり、上記Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子は、天然の全長コア抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよく、さらには、切断されたＢ型肝炎コア抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよい。例えば、上記切断されたＢ型肝炎コアタンパク質は、Ｎ末端の１４４ａａのみを含むものであってもよい。さらには、該天然遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも７５％の相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも８０％の相同性を有し、さらに好ましくは、少なくとも８５％の相同性を有し、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有し、さらに好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有し、且つそれがコードするタンパク質は天然Ｂ型肝炎コアタンパク質と同じ免疫原性を有る上記ヌクレオチド配列の誘導体または変異体であってもよい。
【００４１】
本発明において、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳｅｑＩＤ  Ｎｏ．５、ＳｅｑＩＤ  Ｎｏ．６、ＳｅｑＩＤ  Ｎｏ．７、ＳｅｑＩＤ  Ｎｏ．８に示されたヌクレオチド配列を含むものであってよく、また、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．５、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．６、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．７、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．８に示されるヌクレオチド配列からなるものであってもよい。
【００４２】
上記Ｂ型肝炎抗原タンパク質またはそのヌクレオチド配列の誘導体または変異体は、本分野で知られる方法によって生成することができ、例えばオリゴヌクレオチド介在の（部位特異的）突然変異誘導、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ変異誘導である。クローンしたＤＮＡに対して部位特異的突然変異誘導を行うことができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘導（Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５））、制限性選択変異誘導（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５（１９８６））またはその他のすでに知られた技術により、Ｂ型肝炎抗原タンパク質変異体またはＤＮＡ変異体を生成する。
【００４３】
本発明中に含まれる、Ｂ型肝炎表面抗原ミドルタンパク質Ｓ２Ｓ、Ｂ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓ、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質またはそれらをコードする遺伝子と関連する「誘導体」及び「変異体」は、天然の対応物と比較した場合、そのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は有限の形で改変される。これは点変異を含み、タンパク質の性質を変えることができ、例えば原核システム中で発現し、または希望しない活性、例えば、希望しない酵素活性を除去することが含まれる。しかし、該抗原は天然抗原と十分に類似し、このように、ワクチン中の所望の抗原性質を保留し、且つこれらが天然抗原に対する免疫反応を引き起こすことができ、即ち天然抗原と同じ抗原性及び免疫原性を有する。具体的に、「誘導物」または「変異体」が、このタイプの免疫反応を引き起こすことができるかは、本分野のすでに知られた免疫学測定法によるものであり、例えばＥＬＩＳＡ（抗体に対して反応）または細胞マーカー及びサイトカインを用いた適切なフローサイトメトリー（細胞に対して反応）で測定する。
【００４４】
本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原ミドルタンパク質Ｓ２Ｓ、Ｂ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓ、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質に係るが、これらの「免疫原性フラグメント」も含む。上記免疫原性フラグメントは、上記抗原の少なくとも一つのエピトープを有し、且つＢ型肝炎表面抗原ミドルタンパク質Ｓ２Ｓタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓ、またはＢ型肝炎コアタンパク質抗原の免疫原性を示し、且つ適切な構築体として存在する場合、天然抗原に対する免疫反応を引き起こすことができる。通常は、免疫抗原フラグメントは少なくとも２０個、好ましくは５０個、さらに好ましくは１００個の上記抗原タンパク質アミノ酸配列を含む連続アミノ酸である。
【００４５】
上記Ｂ型肝炎抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、その天然ヌクレオチド配列と、ストリンジェント条件でハイブリッドするポリヌクレオチド配列である。
【００４６】
ハイブリッド反応の「ストリンジェント度」は、当業者によって容易に確定することができ、且つ通常はプローブの長さ、洗浄条件、及び塩濃度は経験に基づいて計算される。通常は、比較的長いプローブは、比較的高い温度で正確にアニーリングすることが必要であり、比較的短いプローブは比較的低い温度を必要とする。ハイブリッドは通常、相補鎖はその解離温度より低い環境中における、変性ＤＮＡが新たにアニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリッド可能な配列の間の期待相同性が高ければ高いほど、使用できる相対温度も高くなる。結果的に、比較的高い相対温度は、反応条件をさらにストリジェントにすると推測でき、比較的低い温度ではストリンジェントではない。ハイブリッド反応のストリンジェント度に対するその他の詳細と解釈は、Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５を参照することができる。
【００４７】
「ストリンジェント条件」または「ハイストリンジェント条件」は、文中で定義するように、以下のように判断できる。（１）低イオン強度及び高温にて洗浄を行う、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％トデシル硫酸ナトリウム、５０℃である。（２）ハイブリッド過程において、変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド及び０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐＨ６．５は、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、４２℃であり、または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウムであり、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ氏溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸右旋性のグリコシド溶液中において、４２℃においてハイブリッドして一夜置き、及び４２℃において０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中において１０分間洗浄し、それからＥＤＴＡを含む０．ｌｘＳＳＣ中において５５℃にて１０分間でハイストリジェントに洗浄される。
【００４８】
本発明のワクチン組成物は、組換え助剤プラスミドを含み、該組換え助剤プラスミド、好ましくはサイトカイン組換え助剤プラスミドである。本発明の製剤中において、好ましくは助剤が優先的にＴｈｌ反応を誘導し、即ちＴｈｌ−型助剤である。例えば、Ｔｈｌ−型助剤は、インビトロにて抗原を使用して再度刺激する場合、刺激により分離されたＴ細胞群が、高レベルのＴｈｌ−型サイトカインを生成し、さらにはＴｈｌ−型と同タイプの関連の抗原特異性免疫グロブリンと反応する助剤を誘導する。通常において、Ｔｈｌ−型反応とＩＮＦ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２などのサイトカインの生成と関連する。よって、本発明組換え助剤プラスミド、好ましくはＩＮＦ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２の組換え助剤プラスミドから選ばれるものであり、コロニー刺激因子とチモシンの組換え助剤プラスミドから選ばれるものであり、または上記助剤のいかなる組み合わせを発現する組換えプラスミドである。
【００４９】
本分野の標準的な方法により、本発明のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質をコードする遺伝子を携帯する組換えプラスミド（組換えワクチンプラスミド）、及び助剤をコードする遺伝子を携帯する組換えプラスミド（組換え助剤プラスミド）を構築する。一つの好ましい実施形態において、本発明が構築する組換えプラスミドは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質をコードする遺伝子を含み、さらには大腸菌複製開始点ＣｏｌＥｌ、カナマイシン抗性遺伝子配列Ｋａｎｒ、ＳＶ４０からに由来するエンハンサーエレメントＥｎｈａｎｃｅｒ、転写制御エレメントインテロンＩｎｔｒｏｎｌ及びエクソンＥｘｏｎｌ、ＨＢＶから由来する転写後の調整ユニットＨＰＲＥ及び免疫調整配列ＣｐＧ等のエレメントを含み、ここにおいてＢ型肝炎ウイルスタンパク質因子は、エンハンサー、巨大細胞ウイルスプロモーター、転写制御エレメントＩｎｔｒｏｎｌ及びＥｘｏｎｌ及び転写後調整エレメントＨＰＲＥ及び牛成長ホルモン遺伝子の、ポリアデニンヌクレオチド信号によって制御される。
【００５０】
上記構築した組換えプラスミドにおいて、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする及びＢ型肝炎コア抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここにおいて、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする及びＢ型肝炎コア抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、それぞれ二つの異なる組換えプラスミド中に挿入し、これによりそれぞれ、組換えワクチンプラスミドｐＲｅｃ２．０−Ｓ２Ｓ及び組換えワクチンプラスミドｐＲｅｃ２．０−Ｃを得る。
【００５１】
本発明の一つの実施形態において、構築された組換え助剤プラスミドは、インターロイキン１２をコードする遺伝子配列（マウスまたは人から由来する天然ヌクレオチド配列）を含み、さらには大腸菌複製開始点ＣｏｌＥｌ、カナマイシン抗性遺伝子配列Ｋａｎｒ及び二つの目的タンパク質を発現するカセット、及びＳＶ４０から由来するエンンサーエレメントＥｎｈａｎｃｅｒ、免疫調整配列ＣｐＧ等のエレメントを含む。ここにおいて、インターロイキン１２をコードする遺伝子は、それぞれ、インターロイキン１２ｐ３５タンパク質をコードする遺伝子及びインターロイキン１２ｐ４０タンパク質をコードする遺伝子を同じ組換え助剤プラスミドの異なる位置に挿入する。
【００５２】
本発明のＤＮＡワクチン組成物中において、上記Ｂ型肝炎表面抗原を発現する組換えワクチンプラスミドは、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子またはＢ型肝炎表面抗原スモールタンパク質Ｓをコードする遺伝子を含むワクチンプラスミドであり、上記組換えＢ型肝炎コア抗原プラスミドは、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子を含むワクチンプラスミドであり、上記組換え助剤プラスミドはインターロイキン１２助剤プラスミドである。
【００５３】
本発明は一つの実施形態において、本発明の組換えワクチンプラスミドｐＳ２Ｓを構築する方法を提供し、先に空白のベクタープラスミドを構築し、且つ空のベクタープラスミド中に、調整エレメント及び複数の制限性酵素切断部位を設け、それから、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓをコードする遺伝子を空白のベクタープラスミド中に挿入し、構築により組換えワクチンプラスミドｐＳ２Ｓを得る。
【００５４】
本発明はもう一つの実施形態において、本発明の組換えワクチンプラスミドｐＣを構築する方法を提供し、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子を、予め構築された空白のベクタープラスミド中に挿入し、構築により組換えワクチンプラスミドｐＣを得る。
【００５５】
本発明はもう一つの実施形態において、本発明の組換え助剤プラスミドｐＩＬ１２を構築する方法を提供し、ヒトまたはマウスのインターロイキン１２ｐ３５タンパク質をコードする遺伝子及びｐ４０タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ、空白のベクターｐｃＤＮＡ３．１中に挿入し、ヒトまたはマウス遺伝子のｐｃＤＮＡ３．１−ｐ３５及びｐｃＤＮＡ−ｐ４０を得る。構築により得られるプラスミドを組換えプラスミドｐＳ２Ｓにクローンし、制限性酵素切断により、順方向クローンの目標物を選択し、組換え助剤プラスミドを得る。
【００５６】
本発明において、用語「ｐＲｅｃ２．０−Ｓ２Ｓ」は「ｐＳ２Ｓ」と簡略化することができる。「ｐＲｅｃ２．０−Ｃ」は「ｐＣ」に簡略化することができる。
【００５７】
本発明はもう一つの実施形態において、さらにプラスミドの製造方法を提供する。各プラスミド（ｐＳ２Ｓ、ｐＣ及びｐＩＬ１２）の製造方法は同じであり、分けて生産し、組換えプラスミドｐＳ２Ｓ、ｐＣ、ｐｍＩＬ１２とｐｈＩＬ１２でそれぞれ大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、陽性クローンをスクリーニングし、組換えプラスミドを含む陽性モノクローンを発酵培養、増幅し、それから分解及びカラム精製により、精製された組換えプラスミドを得る。具体的には以下である。
【００５８】
＜発酵＞−７０℃において、プラスミドを含む大腸菌ＤＨ５ａを取り出し、接種リングにより少量の菌液を取り、プレート上において、モノクローンを５−１０ｍｌの、対応する抗生物質を含むＬＢ液体培地中に置き、３７℃、２００ｒｐｍにて１０〜１２ｈ培養し、及び１：１０００の比例で、培養液を２．５Ｌの対応する抗生物質を含むＬＢ培地中に添加し、３７℃、２００ｒｐｍにて１２〜１６ｈ培養した後、培養物に対して遠心処理を行い、菌体を収集し、プラスミドを含む発酵培養物を得る。
【００５９】
＜分解＞菌体に分解バッファを加え、静かに遠心チューブを数回逆さまにし、室温において放置し、充分に分解させる。
【００６０】
＜カラムクロマトグラフィー＞分解した菌体をＤＮＡ製造カラムに通し、離脱分離する。プラスミドを収集して有機溶媒で沈殿させ、生理食塩水でプラスミドＤＮＡを溶解して得る。
【００６１】
より便利に効率高く本発明に記載の組換えプラスミド及び組換え助剤プラスミドを発現させるために、さらに組換えプラスミドの大腸菌を構築し、組換え大腸菌を応用すれば、より便利に各プラスミドを製造できる。
【００６２】
大腸菌菌株ＤＨ５ａ／ｐｍＩＬ１２は、組換え助剤プラスミドｐｍＩＬ１２を含み、事前に構築した組換えｐｍＩＬ１２により、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した後に、カナマイシン抗性を含むＬＢプレート中でスクリーニングすることで得られ、中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに寄託している（住所：北京市朝陽区大屯路中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）、寄託日：２０１０年０４月１３日、推奨される分類名は大腸エイシス氏菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．３７２６である。
【００６３】
大腸菌菌株ＤＨ５ａ／ｐｈＩＬ１２は、組換え助剤プラスミドｐｈＩＬ１２を含み、事前に構築した組換えプラスミドｐｈＩＬ１２により、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した後に、カナマイシン抗性を含むＬＢプレート中でスクリーニングすることで得られ、中国微生物菌種寄託委員会普通微生物センターに寄託している（住所：北京市朝陽区大屯路中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）、寄託日：２０１０年０４月１３日、推奨される分類名は大腸エイシス氏菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．３７２７である。
【００６４】
大腸菌菌株ＤＨ５ａ／ｐＲｅｃ２．０−Ｓ２Ｓは、組換えワクチンプラスミドｐＳ２Ｓを含み、事前に構築した組換えプラスミドｐＳ２Ｓにより、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した後に、カナマイシン抗性を含むＬＢプレート中でスクリーニングすることで得られ、中国微生物菌種寄託委員会普通微生物センターに寄託している（住所：北京市朝陽区大屯路中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）、寄託日：２０１０年９月１５日、推奨される分類名は大腸エイシス氏菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４１８１である。  
【００６５】
大腸菌菌株ＤＨ５ａ／ｐＲｅｃ２．０−Ｃは、組換えワクチンプラスミドｐＣを含み、事前に構築した組換えプラスミドｐＣにより、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した後に、カナマイシン抗性を含むＬＢプレート中でスクリーニングすることで得られ、中国微生物菌種寄託委員会普通微生物センターに寄託している（住所：北京市朝陽区大屯路中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）、寄託日：２０１０年９月１５日、推奨される分類名は大腸エイシス氏菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４１７０である。
【００６６】
本分野は常規的な方法により核酸を、いかなるベクター中に含まれる核酸を、動物個体細胞に導入する。例えば、核酸を直接患者体内に筋肉注射し、またはそれを多孔膜内に入れて患者体内に移植し（米国特許４，８９２，５３８及び５，２８３，１８７参照）、または脂質システム（脂質介在の遺伝子移転に用いる脂質は例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｉである）。核酸を脂質体によりカプセル化する技術は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ４２３５８７７に記載されている。
【００６７】
本発明はＢ型肝炎ウイルス感染疾病を治療及び予防する方法に係るものであり、動物個体に上記の三つのプラスミド組成物を使用する。同時に、本発明はさらに、上記三つのプラスミド組成物の、Ｂ型肝炎ウイルス感染疾病の治療及び予防における用途に係る。
【００６８】
本発明のワクチン組成物を使用する量は、一般ワクチン接種者中において免疫保護反応を誘導し、顕著な不良な副作用が発生しない量である。このような使用量は選択できる接種方法に従って変化する。具体的なワクチンの最適使用量は標準化研究によって確定でき、治療を受ける者の抗体価及びその他の免疫反応に対する観察を含む。最初の接種後において、治療を受ける者は４週間以内に強化免疫を受けることができ、それから二回目の免疫を強化する。
【００６９】
上記に記載されるように、本発明に係る組成物は、Ｂ型肝炎抗原タンパク質、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎スモールタンパク質Ｓと、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクター（プラスミドＤＮＡ）を含むＢ型肝炎ワクチン組成物である。好ましくは、該ワクチン組成物中には、さらに助剤をコードするポリヌクレオチド配列の発現ベクター（プラスミドＤＮＡ）を含む。好ましくは、上記エンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓを発現するプラスミドまたはＢ型肝炎スモールタンパク質Ｓを発現するプラスミドと、Ｂ型肝炎コア抗原タンパク質を発現するプラスミドは異なるものであり、即ちＢ型肝炎表面タンパク質（例えばＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２ＳまたはＢ型肝炎スモールタンパク質Ｓ）をコードするポリヌクレオチド配列、及びＢ型肝炎コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドを異なるベクター中に挿入し、それぞれ発現させる。よって、本発明の好ましい実施形態は三つのプラスミドを含むワクチン組成物に係り、即ちＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓを発現する組換えプラスミドまたはＢ型肝炎スモールタンパク質Ｓを発現する組換えプラスミドと、Ｂ型肝炎コアタンパク質を発現する組換えプラスミド及び組換え助剤プラスミドである。
【００７０】
本発明はさらに、異なるＢ型肝炎コアタンパク質形式をコードする遺伝子を含む三つのプラスミド組成物のＢ型肝炎に対する予防及び治療効果について検証した。上記三つのプラスミド組成物は、全長の天然Ｂ型肝炎コアタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、または切断された天然Ｂ型肝炎コアタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、または天然Ｂ型肝炎コアタンパク質とＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓのポリヌクレオチド配列融合体を含む。健康なマウスに対する免疫効果の比較実験から、天然Ｂ型肝炎コアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む三つのプラスミド組成物の免疫効果は、短く切断された、または融合したＢ型肝炎コアタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む三つのプラスミド組成物の免疫効果より優れている。
【００７１】
研究において、発明者は、Ｂ型肝炎コアタンパク質と、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質をコードする遺伝子の融合体を構築する場合、幾種類かの異なる構築方式を試し、即ち、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質Ｓ２Ｓを優先的に発現した後に、Ｂ型肝炎コアタンパク質を発現する方式（Ｓ２Ｓ−Ｃ結合モデル）であり、またはＢ型肝炎コアタンパク質を優先的に発現した後に、Ｂ型肝炎エンベロープのミドルタンパク質を発現する方式（Ｃ−Ｓ２Ｓモデル）である。構築により得られたプラスミドを動物体内に注射し、どのような形式にせよ、二種類のタンパク質は互いに干渉し、後に発現したタンパク質が宿主体内で得られた免疫作用は弱いが、発明者はＢ型肝炎コアタンパク質及びＢ型肝炎ウイルスエンベロープのミドルタンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ二つのベクターに分け、構築によりそれぞれ二つのＢ型肝炎ウイルスタンパク質を発現するプラスミドを得て、それから両者を宿主体内に注射する場合、顕著にこの二種類のタンパク質の体内における互いの干渉を明らかに低下させ、これにより良好な免疫効果が得られることを見出した。
【００７２】
本発明のもう一つの実施形態において、組換えワクチンプラスミドを単独、融合または併用した場合の健康なマウスに対する免疫治療効果を提供した。即ちｐＳ２Ｓ単独使用、ｐＣ単独使用、ｐＳ２Ｓ−Ｃ融合形式単独使用及びｐＳ２Ｓ＋ｐＣ併用の四つの方式を用いて免疫反応を行う。結果からわかることは、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ併用形式はマウス体内において、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する細胞及び体液免疫効果を同時に得られるものであり、且つ両者の相互影響は最低限に抑えることができる。単独でｐＳ２ＳまたはｐＣを使用する場合、表面抗原またはコア抗原、一種類の免疫効果しか得られない。ｐＳ２Ｓ−Ｃ融合形式を使用する場合、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する免疫効果が得られるものの、ＨＢｃＡｇに対する免疫反応レベルは、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ併用形式に比べて大きく低下した。
【００７３】
本発明のもう一つの実施形態において、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ組み合わせ方式を用いた場合、組換え助剤プラスミドｐｍＩＬ１２を添加するのと添加しない場合の、抗マウスの免疫効果について比較した場合、組換え助剤プラスミドを添加した場合、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇの免疫効果はさらに強いものとなった。
【００７４】
本発明のもう一つの実施形態において、三つのプラスミドの組み合わせは異なる免疫形式による、健康なマウスに対する免疫影響を提供し、即ちそれぞれ筋肉注射方式及び、筋肉注射方式と電気穿孔を組み合わせて免疫反応を行った場合、電気穿孔方式を用いて免疫を行い、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する免疫効果を大幅に向上させることができる。
【００７５】
本発明は一つの実施形態において、本発明の三つのプラスミドワクチン組成物の、Ｔｇ−ＨＢＶマウスに対する治療効果を提供し、三つのプラスミドワクチン組成物は、ＨＢＶマウス血清ＨＢＶ  ＤＮＡ、血清ＨＢｓＡｇのレベル、及び血清ＡＬＴのレベルを低下させ、且つ一部のＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ  ＤＮＡを陰性に変化させ、血清ＡＬＴを正常レベルに回復させ、ＨＢＶマウスに対して比較的良い治療効果を有する。
【００７６】
本発明はさらに、上記プラスミドを含む、Ｂ型肝炎を予防及び／または治療するＢ型肝炎ワクチン組成物または医薬品組成物に係り、具体的には、該ワクチン組成物または医薬組成物は、以上に記載のＢ型肝炎表面抗原を発現する組換えワクチンプラスミド、Ｂ型肝炎コア抗原を発現する組換えワクチンプラスミド、及び組換え助剤プラスミド、及び製薬上許容できるベクターを含む。一つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、さらにその他の抗ウイルス医薬品を含み、好ましくは、抗Ｂ型肝炎ウイルス類医薬品または有機体の免疫反応調節類医薬品である。
【００７７】
本発明のワクチン組成物または医薬組成物は、その他の抗ウイルス類医薬品、好ましくは抗Ｂ型肝炎ウイルス類医薬品及び／または有機体の免疫反応調整類医薬品と同時にまたは順番に使用でき、例えば本発明のワクチン組成物または医薬組成物は、上記抗ウイルス類医薬品及び／または有機体の免疫反応調整類医薬品を使用する前、同時に及び／または後に使用し、これにより全面的な治療効果を得る。
【００７８】
本発明はさらに、上記プラスミド、上記三つのプラスミドを含む組成物、ワクチン組成物または医薬組成物の、Ｂ型肝炎ウイルス感染の予防及び／または治療薬の製造における使用に係る。うち、該医薬品はその他の抗ウイルス類医薬品、好ましくは抗Ｂ型肝炎ウイルス類医薬品及び／または有機体の免疫反応調節類医薬品と同時にまたは順番に使用でき、例えば該医薬品は上記抗ウイルス類医薬品及び／または有機体の免疫反応調整類医薬品の前に、同時に及び／またはその後に使用する。
【００７９】
本発明はさらに、製品及びキットに係り、該製品及びキット中には、本発明のワクチン組成物または医薬組成物の容器、及び本発明ワクチン組成物または医薬品組成物の、Ｂ型肝炎ウイルス感染の予防及び／または治療における使用説明書を含む。一つの実施形態において、上記製品及びキット中の第一の容器中には、初回接種（次回免疫）で使用する本発明のワクチン組成物または医薬品組成物を含み、第二の容器中には、次回接種（免疫強化）において使用する本発明のワクチン組成物または医薬品組成物を含む。上記適切な容器は例えば、瓶、チューブ、注射器などを含む。容器は各種材料で作ることができ、例えばガラスまたはプラスチックである。上記使用説明書は、上記組成物をＢ型肝炎ウイルス感染疾病の予防及び／または治療に用いることを指示する。また、上記製品またはキットはさらに、他の容器を含め、中には薬学上許容できるバッファを含み、例えば注射用細菌抑制水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩バッファ、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液及びグルコース溶液を含む。さらには、ビジネス及びユーザー立場から見た必要なその他の物質、その他の緩衝材、希釈剤、フィルター、針及び注射器などを含むことができる。
【００８０】
一つの実施形態において、本発明の製品及びキットはさらにその他の抗ウイルス類医薬品を含み、好ましくは抗Ｂ型肝炎ウイルス類医薬品及び／または有機体の免疫反応調整類医薬品の容器を含み、及び本発明のワクチン組成物または医薬組成物を上記抗ウイルス類医薬品及び／または有機体の免疫反応調製類医薬品を使用する前、同時に、及び／またはその後に使用する際を指導する使用説明書を含む。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］本発明の組換えワクチンの製造
＜プラスミドの構築＞
使用試薬及び材料：大腸菌ＤＨ５ａはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入されたものである。転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）を有するＤＮＡプラスミドｐＩｎＨ、プラスミドｐＤＲＶＩＳＶｌ．０は中国疾病予防制御センター性病エイズ予防制御センターウイルス免疫室から贈呈を受けたものである（該プラスミドの構築プロセス及び詳細な資料は、中国特許文献ＣＮ１５６０２５９Ａにおいて完全に開示されている）。真核発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したものである。真核発現ベクターｐＨＰＲＥ（即ちｐｌｎＨプラスミド）は、中国疾病予防制御センター性病エイズ予防制御センターウイルス免疫室によって構築されたものである（該プラスミドの構築プロセス及び詳細な資料は、文献ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ｍａｙ：２８（５）：２３３−４０において開示されている）。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む２シストロン性発現プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入し、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７細胞はＡＴＣＣから購入し、マウス脾臓細胞は１６４０完全培地によって培養される（１０％胎児ウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。各種制限性酵素、ｐｆｕポリメラーゼ、ＤＮＡ接続試薬ＳｏｌＩはいずれもＮＥＢ社から購入したものであり、プラスミド抽出精製試薬キットは、ＴＩＡＮＧＥＮ社から購入したものであり、Ｂ型肝炎表面抗原及び表面抗体定量ＥＬＩＳＡ測定キット（化学発光法）は北京源徳バイオ科学技術有限会社から購入したものである。マウスＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴ測定キットは、ＢＤ社から購入したものである。抗原刺激ペプチドは北京賽百盛バイオ技術有限会社が合成したものである。遺伝子合成及び遺伝子配列決定の仕事は、北京英駿バイオ科学技術有限会社によって行われた。
【００８２】
１、組換えＨＢＶ  ＤＮＡワクチンプラスミドｐＲｅｃ２．０−ｐｒｅＳ２Ｓの構築
（１）まず、組換えプラスミドベクター骨格ｐＯＥ−ＥＫＳを構築する。
ｐＤＲＶＩＳＶ１．０をテンプレートとして、プライマーｌ及びプライマー２（プライマー２は５’末端リン酸化のプライマーである）をプライマーとして、増幅によりサイズが７４８ｂｐのレプリコン区域（Ｏｒｉ）を得て、同時にＥｃｏＲｌ．Ｋｐｎｌ及びＳｗａｌ酵素切断部位を導入する。
【００８３】
プライマー１：
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＡＡｔＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣ−３’
プライマー２：
５’−ＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＡＡＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧ−３’
【００８４】
ｐＤＲＶＩＳＶ１．０をテンプレートとして、プライマー３（ここにおいてプライマー３は５’末端リン酸化したプライマーである）及びプライマー４をプライマーとして、増幅して大きさが１０５６ｂｐのカナマイシン抗性マーク遺伝子（Ｋａｎｒ）を得た。同時に、ＥｃｏＲＩ酵素切断部位を導入する。
【００８５】
プライマー３：
５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇＴＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＡＡｔＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣ−３’
プライマー４：
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴ−３’
【００８６】
上記二つのフラグメントをそれぞれＥｃｏＲＩにより単種類の酵素切断を行い、接続した後に、組換えクローンｐＯＫ−ＥＫＳを構築した。
【００８７】
（２）組換えプラスミドＤＮＡワクチンｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２．Ｓを構築する
合成遺伝子ＰｒｅＳ２ＳをＸｈｏｌ＋Ｘｂａｌ二種類の酵素で切断したものと、Ｓａｌｌ＋Ｘｂａｌの二種類の酵素で切断したベクターｐＨＰＲＥとを接続し、組換えクローンｐＨＰＲＥ−ＰｒｅＳ２Ｓを構築した。
【００８８】
使用する合成遺伝子ＰｒｅＳ２Ｓは、北京雷黙バイオ科学技術有限会社に委託して合成し、ヌクレオチド配列Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．２は最適化したＳ２Ｓタンパク質をコードする遺伝子配列であり、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示されたヌクレオチド配列中では、その開始位置の酵素切断部位配列及び末端の酵素切断部位及びターミネーターについて示してなく、合成遺伝子ＰｒｅＳ２Ｓの完全な配列は、Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示すヌクレオチド配列の開始端にはＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣの１７つのヌクレオチドを含み、その末端にはＴＴＣＴＡＧＡＧＣという９つのヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
ｐＤＲＶＩＳＶ１．０をテンプレートとして、プライマー５とプライマー６をプライマーとして、増幅してサイズが２７１ｂｐのＢＧＨｐｏｌｙＡエリアを得て、同時に上流に、ＢａｍＨＩ酵素切断部位を導入し、下流にＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ−Ｋｐｎｌ酵素切断部位を導入し、ＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩという二種類の酵素により切断した後、ＢｇｌＩＩ＋ＫｐｎＩ二種類の酵素で切断したｐＨＰＲＥ−ＰｒｅＳ２Ｓベクターに導入し、組換えプラスミドｐＨＰＲＥ’−ＰｒｅＳ２Ｓを得た。
【００９０】
プライマー５：
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣｇｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇ−３’
プライマー６：
５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＡＣＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣ−３’
【００９１】
ＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩにより、組換えプラスミドｐＨＰＲＥ’−ＰｒｅＳ２ＳのＰｒｅＳ２Ｓ発現カセットをベクターｐＯＫ−ＥＫＳ中に導入して、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓを構築した。
【００９２】
２、組換えＨＢＶ  ＤＮＡワクチンプラスミドｐＲｅｃ２．０−Ｃの構築
合成遺伝子ＣＰｒｅＳ１（ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）をＸｈｏＩ＋ＸｂａＩ二種類の酵素で切断したものと、ＳａｌＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断されたベクターｐＨＰＲＥとを接続し、組換えクローンｐＨＰＲＥ−ＣＰｒｅＳ１を構築した。
【００９３】
ｐＤＲＶＩＳＶ１．０をテンプレートとして、プライマー５とプライマー６をプライマーとして、増幅してサイズが２７１ｂｐのＢＧＨｐｏｌｙＡエリアを得て、同時に上流に、ＢａｍＨＩ酵素切断部位を導入し、下流にＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ酵素切断部位を導入し、ＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩという二種類の酵素により切断した後、ＢｇｌＩＩ＋ＫｐｎＩ二種類の酵素で切断したｐＨＰＲＥ−ＣＰｒｅＳ１ベクターに導入し、組換えプラスミドｐＨＰＲＥ’−ＣＰｒｅＳ１を得る。
【００９４】
ＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩにより、組換えプラスミドｐＨＰＲＥ’−ＣＰｒｅＳ１のＣＰｒｅＳ１発現カセットをベクターｐＯＫ−ＥＫＳ中に導入して、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＣＰｒｅＳ１を構築する。
【００９５】
ｐＲｅｃ２．０−ＣＰｒｅＳｌをテンプレートとして、プライマー７及びプライマー８をプライマーとして、増幅してサイズが５９６ｂｐのＢ型肝炎コアタンパク質遺伝子（Ｃ）を得て、さらにＰｓｔＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素により切断後に、ＰｓｔＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素に切断されたｐＲｅｃ２．０−ＣＰｒｅＳｌベクターにクローンし、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−Ｃを得た。その配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０に示す。
【００９６】
プライマー７：
５’−ｇｔｃｔｔｔｔｃｔｇｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｇＴＣＧＡＧ−３’
プライマー８：
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＧ−３’
【００９７】
組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−Ｃの構築
ｐＲｅｃ２．０−Ｃをテンプレートとして、プライマー９とプライマー８をプライマーとして、増幅してサイズが５７９ｂｐのＢ型肝炎コアタンパク質遺伝子（Ｃ）を得た。ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断したものと、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断したベクターｐｃＤＮＡ３．１とを接続し、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｃを構築した。
【００９８】
プライマー９：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧ−３’
プライマー８：
５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＧ−３’
【００９９】
ＢｇｌＩＩ＋Ｐｖｕｌｌの二種類の酵素切断により、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＣからＢ型肝炎コアタンパク質（Ｃｏｒｅ）発現カセットを得て、ＢｇｌＩＩ＋ＥｃｏＲＶの二種類の酵素に切断されて得られたｐＲｅｃ２．０−ｐｒｅＳ２Ｓ中にクローンし、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−Ｃを構築した。
【０１００】
３、組換え助剤プラスミドｐｍＩＬ１２の構築
（１）合成遺伝子ｍＰ３５（Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．１２に示すヌクレオチド配列を有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩ二種類の酵素で切断したベクターｐｃＤＮＡ３．１と接続し、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｍＰ３５を構築した。
【０１０１】
（２）ＢｇｌＩＩ＋ＰｖｕＩＩの二種類の酵素で切断することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｍＰ３５からｍＰ３５発現カセットを得て、ＢｇｌＩＩ＋ＥｃｏＲＶの二種類の酵素に切断されて得られたｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓにクローンし、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｍＰ３５を構築した。
【０１０２】
（３）合成遺伝子ｍＰ４０（Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に示すヌクレオチド配列を有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩ二種類の酵素で切断したベクターｐｃＤＮＡ３．１と接続し、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｍＰ４０を構築した。
【０１０３】
（４）ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩＩの二種類の酵素で切断することにより、ｍＰ４０遺伝子発現カセットを切り出し、ＳａｌＩ＋ＳｗａＩ二種類の酵素で切断したプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｍＰ３５にクローンし、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｍＩＬ１２を得た。
【０１０４】
（５）Ｎｄｅｌ酵素でプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｍＩＬｌ２を切断することにより、全部で３つのバンド（１８７０ｂｐ＋３４４８ｂｐ＋３８５５ｂｐ）を得て、１８７０ｂｐフラグメント及び３８５５ｂｐフラグメントを回収し、回収した３８５５ｂｐフラグメントをＣＩＰ脱燐酸化し、１８７０ｂｐフラグメントと接続し、順方向クローンの組換えプラスミドｐｍＩＬ１２をスクリーニングした。そのヌクレオチド配列はＳｅｑ  ＩＤ  Νο．１６に示すものである。
【０１０５】
４、組換え助剤プラスミドｐｈＩＬ１２の構築
（１）合成遺伝子ｍＰ３５（Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．１４に示すヌクレオチド配列を有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩ二種類の酵素で切断したベクターｐｃＤＮＡ３．１と接続し、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰ３５を構築した。
【０１０６】
（２）ＢｇｌＩＩ＋ＰｖｕＩＩの二種類の酵素で切断することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰ３５からｈＰ３５遺伝子発現カセットを得て、ＢｇｌＩＩ＋ＥｃｏＲＶの二種類の酵素に切断されて得られたプラスミドｐＲｅｃ２．０−ｐｒｅＳ２Ｓにクローンし、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｈＰ３５を構築した。
【０１０７】
（３）合成遺伝子ｈＰ４０（Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．１５に示すヌクレオチド配列を有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩの二種類の酵素で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩ二種類の酵素で切断したベクターｐｃＤＮＡ３．１と接続し、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰ４０を構築した。
【０１０８】
（４）ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩＩの二種類の酵素で切断することにより、ｈＰ４０遺伝子発現カセットを切り出し、ＳａｌＩ＋ＳｗａＩの二種類の酵素で切断したプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｈＰ３５中にクローンし、組換えプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｈＩＬ１２を得た。
【０１０９】
（５）ＮｄｅＩ酵素でプラスミドｐＲｅｃ２．０−ＰｒｅＳ２Ｓ−ｈＩＬｌ２を切断することにより、全部で３つのバンド（１８８２ｂｐ＋３４４８ｂｐ＋３８１２ｂｐ）を得て、１８８２ｂｐフラグメント及び３８１２ｂｐフラグメントを回収し、回収した３８１２ｂｐフラグメントを、ＣＩＰにより脱燐酸化を行ってから、１８８２ｂｐフラグメントと接続し、順方向クローンの組換えプラスミドｐｈＩＬ１２をスクリーニングした。そのヌクレオチド配列はＳｅｑ  ＩＤ  Νｏ．１７に示すものである。
【０１１０】
５、プラスミドワクチンの製造
ワクチンプラスミド（ｐＳ２Ｓ、ｐＣ）及び助剤プラスミド（ｐｍＩＬ１２、ｐｈＩＬ１２）の製造方法は同じであり、各プラスミドはそれぞれ生産される。具体的なステップは以下である。
【０１１１】
１）プレート上でモノクローンを選出して５〜１０ｍｌの対応の抗生物質を含むＬＢ液体培地中に置き、３７℃、２００ｒｐｍにて１０〜１２ｈ培養した。
【０１１２】
２）１：１０００の比例で、得られた培養液を２．５Ｌの対応の抗生物質を含むＬＢ培地中に添加し、３７℃、２００ｒｐｍにて１２〜１６ｈ培養した。
【０１１３】
３）４°Ｃにおいて、６０００ｒｐｍにて１５ｍｉｎ遠心し、上澄みを除去して、沈殿を５００ｍｌの氷により冷やされたＳＴＥ溶液中に浮かせ、４℃、６０００ｒｐｍにて１５ｍｉｎ遠心して、上澄みを除去した。
【０１１４】
４）菌体沈殿を１２５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｐ１中に浮かせ、沈殿の塊が出なくなるまで振とうする。１２５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｐ２を添加し、優しく数回遠心チューブを上下逆さまにし、室温下において５ｍｉｎ置く。分解が十分に進んだ後、１２５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｐ３を添加し、遠心用チューブを数回逆さまにし、充分に混合させた。
【０１１５】
５）均一に混合した後の分裂生成物をろ過器（Ｍｅｇａ−Ｇｉｇａ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）に入れ、室温下において２０ｍｉｎ以上静置し、真空ポンプをオンにして加圧抽出ろ過を行い、液体の抽出ろ過を完了してから、５０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  ＦＷＢ２を得て、無菌ガラス棒で軽く沈殿の固まりを攪拌して、抽出ろ過を続けた。
【０１１６】
６）分解液中に３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  ＥＲを添加し、逆さまにし均一に混合して、３０ｍｉｎ氷浴を行い、溶液を澄ませてから、予め７５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  ＱＢＴで平衡化したカラムに添加した。
【０１１７】
７）分解液体を完全にＤＮＡ製造用カラムに通してから、６００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  ＱＣにより不純物を溶出させ、液体を全部カラムに通してから、１００ｍｌの洗脱液Ｂｕｆｆｅｒ  ＱＮによりＤＮＡを溶出させた。
【０１１８】
８）ＤＮＡ溶出液を収集し、７０ｍｌのイソプロパノールを添加し、均一に混合した後、１２℃において、１００００ｒｐｍにて５０ｍｉｎ遠心した。
【０１１９】
９）丁寧に上澄みを除去して、１０ｍｌの７０％エタノールで沈殿を洗浄し、エタノール洗浄液を除去し、遠心チューブを倒置して、ティッシュ上において自然乾燥した。
【０１２０】
１０）５ｍｌ〜１０ｍｌの生理塩水を添加してプラスミドＤＮＡを溶解した。
【０１２１】
１１）分光光度計により、製造したプラスミドＤＮＡの濃度を測定し、測定したプラスミドの濃度に対応して希釈を行い、最終濃度が１μｇ／μｌ（または０．４μｇ／μｌ，４０ｎｇ／μｌ）になるように希釈し、−２０℃において保存した。
【０１２２】
［実施例２］異なる形式のＨＢｃＡｇを発現する核酸ワクチンの免疫効果の比較
【０１２３】
切断、全長、全長融合などの三種類の異なる形式のＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）核酸ワクチンのマウス体内における体液及び細胞免疫原性を比較することにより、好ましい免疫原の設計案を得た。コドンの最適化により、異なる形式のＢ型肝炎ウイルスＨＢｃＡｇ核酸ワクチンを構築した。それぞれ（１）ｐＲｅｃ２．０−Ｃｔ：１４４ａａに切断されたＢ型肝炎コアタンパク質を発現する、（２）ｐＲｅｃ２．０−Ｃ：全長１８３ａａのＢ型肝炎コアタンパク質を発現する、（３）ｐＲｅｃ２．０−ＣｐｒｅＳｌ：全長Ｂ型肝炎コアタンパク質（Ｃｏｒｅ）とＰｒｅＳｌとの融合タンパク質である。上記ワクチンプラスミドにより、２９３Ｔ細胞を形質転換させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔにより目的抗原遺伝子の発現を測定した。筋肉注射法により、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して免疫接種を行い、ＥＬＩＳＡ方法により、マウス血清抗体−ＨＢｃの抗体レベルを測定し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ方法により、マウス体内ＨＢｃＡｇ特異性Ｔ細胞免疫応答を測定した。
【０１２４】
マウスのグループ分け及び免疫：６〜８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスは、軍事医学科学院実験動物センターから購入したものであり、ランダムに以下４つのグループに分ける。（１）ネガテイブコントロールグループ、マウス６匹；（２）ｐＲｅｃ２．０−Ｃｔグループ、マウス１２匹；（３）ｐＲｅｃ２．０−Ｃグループ、マウス１２匹；（４）ｐＲｅｃ２．０−Ｃ−ｐｒｅＳｌグループ、マウス１２匹。ネガテイブコントロールグループはｐＲｅｃ２．０空白ベクタープラスミドを注射し、実験グループは相応の核酸ワクチンを接種する。それぞれのマウスは、毎回プラスミドＤＮＡ５０μｌ（１００μＬ）を免疫注射する。それぞれのマウスは二つの後脚の前脛骨筋にそれぞれ５０μ１注射する。免疫は、０、２、４週目にそれぞれ一回免疫を行い、４、６週目にそれぞれ各グループの半数のマウスを殺処分し、血清を採集し、且つ脾臓リンパ細胞を収集した。
【０１２５】
結果からわかることは、ネガテイブコントロールグループのマウス以外に、ワクチンにより免疫した後の各グループのマウスはいずれもＨＢｃ抗原特異性抗体及びＴ細胞応答を産生した。ここにおいてｐＲｅｃ２．０−ＣグループのＡｎｔｉ−ＨＢｃ抗体（１１０．８６±８７．０３Ｕ／ｍｌ）及びＴ細胞免疫反応レベル（ＩＦＮ−γ：４７１．３±８８．０ｓｐｏｔｓ／百万細胞）はいずれも明らかにｐＲｅｃ２．０−ＣｐｒｅＳｌＡｎｔｉ−ＨＢｃ：３４．５６±２９．５１Ｕ／ｍｌ，ＩＦＮ−γ：７０．８±４８．２ｓｐｏｔｓ／百万細胞）及びｐＲｅｃ２．０−Ｃｔグループ（Ａｎｔｉ−ＨＢｃ：３８．６０±４１．８７Ｕ／ｍｌ，ＩＦＮ−γ：２０３．５±１２６．７ｓｐｏｔｓ／百万細胞）より高い（Ｐ＜０．０５）。結論：ＨＢｃＡｇを１４４個アミノ酸に短く切断し、またはｐｒｅＳｌと融合することで、その体液及び細胞免疫効果を低減させる。
【０１２６】
［実施例３］組換えワクチンプラスミドｐＳ２Ｓ、ｐＣ、ｐＳ２Ｓ−Ｃ．ｐＳ２Ｓ＋ｐＣの、健康なＢａｌｂ／ｃマウスに対する体液及び細胞免疫の比較
【０１２７】
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃメスマウスは中国医学科学院動物繁殖センターから購入し、清潔水準で飼育される。５０匹のマウスは５つのグループに分け、それぞれはｐＲｅｃ２．０空白プラスミドグル−プ、四つの免疫グループとしての組換えプラスミドＤＮＡワクチンｐＳ２Ｓグループ、組換えプラスミドｐＣグループ、組換えプラスミドｐＳ２Ｓ−Ｃグループ、組換えプラスミドｐＳ２Ｓ＋ｐＣグループである。各グループに対し、それぞれ５０μｇを用いて免疫を行い、それぞれのマウスはプラスミドの使用量に従いプラスミドＤＮＡを注射し、体積は１００μｌである。それぞれのマウスは二つの後脚の前脛骨筋にそれぞれ５０μ１注射する。組換えプラスミドｐＳ２Ｓ＋ｐＣグループへの投与は、プラスミドｐＳ２ＳとプラスミドｐＣをそれぞれ左右二本の後脚に注射する。免疫は、０、２、４週目にそれぞれ一回免疫を行い、６週目にマウスを殺処分し、血清を採集し、且つリンパ細胞を分離した。
【０１２８】
（１）体液免疫測定：マウス血清を採り、厳格に北京源徳バイオ科学技術会社キットを使用して、説明書の方法を使用して操作した。
【０１２９】
（２）細胞免疫測定：マウスリンパ細胞は次のように製造された。頚部脱臼法によりマウスを殺処分し、７５％のエタノールを入れているビーカー中において、マウス体毛を完全に湿らせて、約３分間以上湿らせる。それからマウスの腹部を切開し、脾臓を取り出し、分離した脾臓を無菌ビーカーの２００目網上に放置し（培養液滴を有する）、軽く脾臓組織を破壊し、脾臓細胞を研磨して取り出し、５ｍｌの無血清１６４０培養液により、ゆっくり細胞をビーカー中に流し入れ、５ｍｌ脾臓細胞懸濁液を徐々に、２．５ｍｌリンパ細胞分離液を有する１５ｍｌ遠心チューブに入れて、２０００〜２５００ｒ／ｍｉｎにて２０ｍｉｎ遠心処理を行い、分離したリンパ細胞を収集した後、ＩＣ遠心により細胞を二回洗浄し、毎回１５００ｒ／ｍｉｎにて６ｍｉｎ遠心し、適量の５％ＦＣＳ−１６４０完全培養液により、分離した脾臓リンパ細胞を懸濁する。トリパンブルー染色により、それぞれのマウス分離リンパ細胞活細胞総数を計数し、細胞濃度を３×ｌ０５／ｍｌに調整し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養を行い、ＥＬＩＳＰＯＴ測定に供した。
【０１３０】
（３）ＥＬＩＳＰＯＴ測定：厳格にＢＤ社キットが使用する説明書方法に従って操作し、以下の条件を満たす両者はＥＬＩＳＰＯＴにより測定したＨＢｓＡｇ特異性細胞陽性であると認定する：（１）一定の細胞密度下において、ＥＬＩＳＰＯＴ測定板中の、同じサンプルについて、ＨＢｓＡｇと非ＨＢｓＡｇによりそれぞれ三つの複数孔を刺激し、斑点平均数（ＳＦＣ）の比は２以上である、（２）免疫実験グループサンプルのリンパ細胞密度は３×ｌ０５／ｍｌ孔場合、ＨＢｓＡｇと非ＨＢｓＡｇによりそれぞれ三つの複数孔を刺激し、ＳＦＣ平均数の差は５以上である。
【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
表１及び図１０の結果からわかるように、１）プラスミドｐＳ２Ｓ免疫グループにおいて、誘導により得られた、ＨＢｓＡｇ抗原に対する体液免疫値は３２７．４±１４６．５ｍＩＵ／ｍｌであり、細胞免疫値は２７１．６±７３．９Ｓｐｏｔｓ／百万細胞であり；２）プラスミドｐＣ免疫グループにおいて、誘導により得られた、ＨＢｃＡｇ抗原に対する体液免疫値は１１０．８±３０．０Ｕ／ｍｌであり、細胞免疫値は４７１．３±８８．０Ｓｐｏｔｓ／百万細胞であり；３）プラスミドｐＳ２Ｓ−Ｃ免疫グループにおいて、誘導により得られたＨＢｓＡｇ抗原に対する細胞免疫及び体液免疫レベルと、ｐＳ２Ｓプラスミドのみで免疫する場合とは、顕著な差異がないが、誘導により得られたＨＢｃＡｇにたいする体液及び細胞免疫反応は明らかに低下した（Ｐ＜０．０５）。ここにおいて、細胞免疫測定結果は陰性である；４）プラスミドｐＳ２ＳとプラスミドｐＣで両方の足に対して別々に免疫を行うことにより、二つの抗原の互いの干渉を空間上に避ける。該案は同時に、効果的にＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する細胞免疫及び体液免疫反応を誘導することができる。５）空白ベクタープラスミドのＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ細胞免疫及び体液免疫結果はいずれも陰性である。
【０１３３】
［実施例４］組換えワクチンプラスミドｐＳ２Ｓ＋ｐ−ＣとｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２の、健康なＢａｌｂ／ｃマウスに対する体液及び細胞免疫の比較
【０１３４】
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃメスマウスは中国医学科学院動物繁殖センターから購入し、清潔水準で飼育される。４０匹のマウスは４つのグループに分け、それぞれはｐＳ２Ｓグル−プ、ｐＳ２Ｓ＋ｐｍＩＬ１２グループ、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣグループ、及びｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２グループである。ワクチンプラスミド及び助剤プラスミドの使用量はいずれも５０μｇである。ここにおいて、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣグループはそれぞれ、マウスの両側の足にプラスミドｐＳ２Ｓ及びｐＣを注射し、ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２グループは、マウス両方の足にそれぞれｐＳ２Ｓ＋ｐｍＩＬ１２（５０＋２５）μｇ、ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２（５０＋２５）μｇを注射する。それぞれのマウスは各グループの量に従い、プラスミドＤＮＡを注射し、体積は１００μｌであり、それぞれのマウスの二つの後ろ足の前脛骨筋に、それぞれ５０μ１を注射する。免疫は、０、２、４週にそれぞれ一回免疫を行い、６週目にマウスを殺処分して、リンパ細胞を分離した。
【０１３５】
体液免疫測定、細胞免疫測定及びＥＬＩＳＰＯＴ測定方法は、実施例３中の方法と同じである。結果は表２に示すとおりである。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
図２及び図１１の結果からわかるように、１）ｐＳ２Ｓプラスミド単独での免疫に対して、助剤プラスミドｐｍＩＬ１２の添加は、マウスにおいて誘導されたＨＢｓＡｇ特異性の細胞免疫反応を顕著に高められた（Ｐ＜０．０５）；２）実施例３に記載の通り、プラスミドｐＳ２ＳとプラスミドｐＣを二本の足に分けて免疫を行い、二つの抗原の互いの干渉を空間上に隔離することによって、同時に、効果的にＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対する細胞免疫及び体液免疫反応を誘導することができ、さらに助剤プラスミドｐｍＩＬ１２との組み合わせでマウスに対して免疫を行うことによって、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原に対する細胞免疫反応をさらに向上させた。３）助剤プラスミドｐｍＩＬ１２を組み合わせて使用することは、ＨＢｓＡｇ及び（または）ＨＢｃＡｇ特異性の体液免疫反応レベルの向上に明らかな影響をもたらさなかった。
【０１３８】
［実施例５］電気穿孔により投与した場合の、健康なＢａｌｂ／ｃマウスに対する体液及び細胞免疫反応への影響
【０１３９】
６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃメスマウスは、中国医学科学院動物繁殖センターから購入したもので、清潔水準にて飼育される。２０匹のマウスを２つのグループに分け、いずれもプラスミド組成物ｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２（５０＋５０＋５０）μｇを与えて免疫を行う。一つのグループは従来の筋肉注射グループであって、実施例４に記載のように、マウスの両足にそれぞれｐＳ２Ｓ＋ｐｍＩＬ１２（５０＋２５）μｇ、ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２（５０＋２５）μｇを注射し、注射部位はマウスの二つの後ろ足の前脛骨筋にそれぞれ５０μ１を注射する。もう一つのグループは電気穿孔グループであり、前期の免疫注射方式及び薬剤量は筋肉注射と同じであり、筋肉に投与した後に、ＷＪ−２００５電気穿孔機（寧波新芝社製品）により、マウス注射部位に対して電撃を行った。電気穿孔用パラメータは以下である：電圧１００Ｖ、衝撃時間６０ｍｓ、刺激間隔２５５ｍｓ、全部で１０回電撃した。マウスの免疫は０、２、４週目にそれぞれ一回免疫を行い、６週目にマウスを殺処分してリンパ細胞を分離した。体液免疫測定、細胞免疫測定及びＥＬＩＳＰＯＴ測定方法は、実施例３中の方法と同じであり、実験結果は表３に示すとおりである。
【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
表３と図の結果からわかるように、三つのプラスミドワクチンｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２で電気穿孔方式により免疫を行った場合、顕著にＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異性細胞免疫反応を高められ（Ｐ＜０．０５）、且つ顕著にＨＢｃＡｇ抗原特異性の体液免疫反応（Ｐ＜０．０５）を高められた。電気穿孔投与方法の免疫強化方面における有効な効果を実現した。
【０１４２】
［実施例６］三つのプラスミドワクチンｐＳ２Ｓ＋ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２のＴｇ−ＨＢＶマウスに対する治療効果
【０１４３】
実験動物：ＨＢＶ遺伝子組換えマウスは北京大学医学部実験動物学部から購入したものであり、該遺伝子組換えマウスの全称はＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＴｇＮ（ＡｌｂｌＨＢＶ）４４Ｂｒｉであり、アメリカＪａｃｋｓｏｎ実験室から導入し、移転した遺伝子は、ＨＢＶ  Ｓ、Ｐｒｅ２Ｓ及びＸ遺伝子を含み、導入したＨＢＶ遺伝子はａｙｗサブ型であり、血清Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は陽性であり、安定的に垂直遺伝することができる。１０匹の４〜６週齢の清潔水準遺伝子組換えマウスは全部北京大学医学部実験動物科学部にて無菌飼育されるものである。
【０１４４】
遺伝子組換えマウスのグループ分け及び免疫プロセス：１２匹Ｔｇ−ＨＢＶマウスをランダムに二つのグループにわけ、そのうち、６匹はＴｇコントロールグループであり、１００μｌ  ＰＢＳ溶液を注射し、さらに電気穿孔による免疫投与も併用した。６匹はＴｇ実験グループであり、足を分けてＢ型肝炎治療プラスミド（ｐＣ＋ｐｍＩＬ１２／ｐＳ２Ｓ＋ｐｍＩＬ１２、薬剤量はいずれも５０μｇ＋２５μｇ）を注射し、電気穿孔方式も併用して投与を行う。Ｔｇ−ＨＢＶマウスは２週間ごとに１回免疫を行い、全部で４回注射する。最終回に投与後２週間で、眼窩採血を行い、且つ血清を分離した。Ｔｇ−ＨＢＶマウスを殺処分してから解剖により肝臓を取り出し、固定液中において固定し、肝臓組織をスライスしてから免疫組織化学測定を行った。
【０１４５】
（１）血清中のＨＢｓＡｇ抗原測定結果（ＥＬＩＳＡ）：
実験方法：Ｍｅｒｉｅｕｘキット説明書を参照する。ストライプ状支持棚上に、必要とされる数量のマイクロプレートを設置し、且つ指定の孔中に２５μＬサンプル希釈液を入れて、１００μＬサンプルまたはコントロールを添加する。それぞれのストライプ支持棚上には、三つの陰性コントロールと、一つの陽性コントロールがあり、３７℃において約６０分間インキュベートして、それからそれぞれの孔中に５０μＬ酵素結合物溶液を入れて、３７℃において６０分間インキュベーションし、それからリン酸塩緩衝液でそれぞれの孔を６回にわたり洗浄及び漬け、それぞれの孔中に１００μｌΤΜΒを添加する。第五に、ストライプを１５〜３０℃条件下において、遮光にて、約３０分間インキュベーションする。それからそれぞれの孔中に１００μｌ  ｌｍｏｌ／ｌ硫酸を添加して反応を中止し、６２０〜７００ｎｍを参考波長として（二波長）を参考として、１５分以内に４５０ｎｍ時の吸光度を観察し、そのＯＤ値を記録し、ＯＤ値が０．１より小さい結果は陰性と認定する。結果は表４に示すとおりである。
【０１４６】
【表４】
2014500875.tif 000005
【０１４７】
実験結果からわかるように、Ｔｇ実験グループ中で、３つのマウスの抗原が陰性に転換した。
【０１４８】
（２）血清中ＨＢｓＡｂ、ＰｒｅＳ２及びＨＢｃＡｂ抗体測定結果
１、ＨＢｓＡｂ、ＰｒｅＳ２血清抗体レベルの測定
【０１４９】
実験方法：間接ＥＬＩＳＡ法、化学発光定量測定により、Ｂ型肝炎コア抗体を測定する。
サッカロマイセス・セレビシエ精製化発現により、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ粒子を精製し、それから被覆Ｅｌｉｓａマイクロプレートを被覆し、ＨＢｓＡｂ抗体レベルを測定する。大腸菌発現システムにより発現を行い、ＰｒｅＳ２抗原タンパク質を精製し、それからＥｌｉｓａマイクロプレートを被覆し、ＰｒｅＳ２抗体レベルを測定した。結果は表５に示すとおりである。
【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
２、血清ＨＢｃＡｇ抗体レベルの測定
北京源徳バイオ医学工程有限会社のＢ型肝炎コア抗体（ＨＢｃＡｂ）測定キット（化学発光法）を用いて、ＨＢｃＡｂ抗体レベルを測定した。マウス血清を採り、キットの説明書の操作ステップに従って測定を行い、その結果は表６に示すとおりである。
【０１５２】
【表６】
2014500875.tif 000007
【０１５３】
実験結果：表５及び表６の結果からわかるように、Ｔｇ実験グループにおいて、６つの遺伝子組換えマウスには、３匹のマウスのＨＢｓＡｂ抗体が陽性になり、５匹のマウスのＰｒｅＳ２抗体及びＨＢｃＡｂは陽性となり、５匹のマウスＨＢｃＡｇ抗体が陽性になった。
【０１５４】
（３）血清中におけるＤＮＡレベルの測定
Ｂ型肝炎ウイルス核酸増幅（ＰＣＲ）蛍光定量測定キットは、深セン匹基バイオ工学有限会社から購入したものであり、詳細な測定方法はキット説明書を参照すること。
【０１５５】
結果判断は以下である。
【０１５６】
測定サンプル中において、５．０×ｌ０２ＩＵ／ｍｌ≦ＨＢＶ  ＤＮＡ≦５．０×ｌ０７ＩＵ／ｍｌである場合、測定結果は有効的で、対応の濃度値を直接報告することができる。
【０１５７】
測定サンプル中において、ＨＢＶ  ＤＮＡ＞５．０×ｌ０７ＩＵ／ｍｌの場合、＞５．０×ｌ０７ＩＵ／ｍｌと直接報告することができる。
【０１５８】
測定サンプル中において、ＨＢＶ  ＤＮＡ＜５．０×ｌ０２ＩＵ／ｍｌの場合、最小検出限度より少ないと報告し、陰性に転換したと判断できる。測定結果は表７に示すとおりである。
【０１５９】
【表７】
2014500875.tif 000008
【０１６０】
実験結果は以下を示している。Ｔｇ実験グループ中において、３つのマウスのＨＢＶ  ＤＮＡ濃度は、測定ライン以下であり、ＨＢＶ  ＤＮＡが陰性に転換したことを示す。
【０１６１】
（４）血清ＡＬＴレベルの測定
アラニン転移酵素キット：北京金豪製薬株式会社から購入した。
【０１６２】
血清ＡＬＴ測定方法：（１）９６ウェルマイクロプレート上において、試薬空白ウェル、二つの標準ウェルを設け、空白ウェル中に蒸留水２０μを添加し、標準ウェル内にそれぞれ標準血清（血漿）２０μを添加し、それから各ウェル中に加工液１００μＬを添加し、均一に３７℃において１５分間インキュベーションする。（２）それぞれのウェルに終止液１００μＬを入れ，均一に混合し、マイクロプレートリーダーにより色を比較し、主波長は４９２ｎｍであり、副波長は６３０ｎｍであり、試薬空白ウェル、標準ウェル、及び測定ウェルに入れ、標準濃度を入力し、試薬空白孔ウェルを０にして測定を行い、測定した結果を下式にしたがって、ＡＬＴ活性はについて計算する。
【０１６３】
血清ＡＬＴ活性（Ｕ／Ｌ）＝測定ウェル吸光度／標準ウェル吸光度×５６。結果は表８に示すとおりである。
【０１６４】
【表８】
2014500875.tif 000009
【０１６５】
実験結果：表中の結果からわかるように、Ｔｇ実験グループ中には３匹のマウスのＡＴＬレベルが正常レベルに回復した。
【０１６６】
（５）肝臓組織免疫組織化学測定
１  実験材料
１．１  Ｔｇマウス肝臓組織
１．２  抗体由来：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇモノクローン抗体（ＺＭ−０１２２）：Ｚｈｏｎｇｓｈａｎｊｉｎｑｉａｏバイオ科学技術有限会社
１．３  測定キット：ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＫ５００７０５）ＤＡＫＯ
１．４  濃縮型ＤＡＢキット（ＺＬＩ−９０３２）：Ｚｈｏｎｇｓｈａｎｊｉｎｑｉａｏバイオ科学技術有限会社
１．５  ３０％Ｈ２Ｏ２、規格５００ｍｌ／瓶、メーカー：北京化学試薬会社
１．６  ０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）実験室にて自作したものである。
【０１６７】
２  実験方法
２．１  ワックススライスに対して、常軌的にワックスと水を除去し、脱イオン水で洗浄する。
２．２  ３％Ｈ２Ｏ  ２ｍｉｎ  室温
２．３  ０．０１ＭＰＢＳを用いて３ｍｉｎ×３回洗浄する。
２．４  第一抗原を滴下し（１：２００）、４℃冷蔵庫で終夜インキュベーションする。
２．５  ０．０１ＭＰＢＳで３ｍｉｎ×３回洗浄する。
２．６  Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎを滴下して、室温にて３０ｍｉｎインキュベーションする。
２．７  ０．０１ＭＰＢＳにて３ｍｉｎ×３回洗浄する。
２．８  ＤＡＢで３〜５ｍｉｎ発色し、脱イオン水で発色を終了させる。
２．９  ヘマトキシリンで核を複染色し、分化、藍色に戻し、脱水、透明化、スライス封入
【０１６８】
肝臓組織ＨＢｓＡｇの免疫組織化学の結果（図１３）は以下について示している。Ｔｇ−ＨＢＶ陽性コントロールマウス細胞漿内に大粒の顆粒状を呈し、本発明の三つのプラスミドワクチンを用いて治療した後、陰性に転換したマウス細胞漿内には、少量の顆粒があり、正常のマウスの肝臓組織スライスと類似し、陰性転換効果は明らかである。
【０１６９】
以上の研究結果からわかることは、本発明の治療性三つのプラスミドＨＢＶ  ＤＮＡワクチンは、５０％のＨＢＶ遺伝子組換えマウス血清ＨＢｓＡｇ及び血清ＨＢＶ  ＤＮＡを陰性に転化させ、半数のマウス血清ＡＬＴを正常レベルに回復させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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