(57)【要約】  本発明は、ヘパリンの構成多糖の一般構造を有し、８０００ダルトン未満の分子量を有する硫酸化多糖であって、式（Ｉ）：2014511929.tif 000016（式中Ｒ１は、式（Ｉ）の六糖が多糖の還元末端に位置する場合にＯＨ基を表し、さもなければＲ１は、多糖の別の糖単位との結合を表し、Ｒ２は、式（Ｉ）の六糖が多糖の非還元末端に位置する場合に水素原子を表し、この場合には、六糖の第１の糖単位の炭素原子４および５の間の結合は二重結合であり、さもなければＲ２は、多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、六糖の第１の糖単位の炭素原子４および５の間の結合は単結合である。）に相当するアンチトロンビンＩＩＩ結合六糖配列を２個含む、硫酸化多糖に関する。これの調製、抗血栓性薬剤としてのこれの使用、およびまたヘパリン誘導体の試料を分析する方法でのこれの使用。
2014511929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンの構成多糖の一般構造を有し、８０００ダルトン未満の分子量を有する硫酸化多糖であって、アンチトロンビンＩＩＩ親和性部位を２個含むことを特徴とする、硫酸化多糖。
【請求項２】
請求項１に記載の多糖であって、アンチトロンビンＩＩＩ結合六糖配列を２個含むことを特徴とする、多糖。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の多糖であって、式（Ｉ）：
【化１】
2014511929.tif 000011
に相当するアンチトロンビンＩＩＩ結合六糖配列（式中：
第一の糖単位の炭素原子４および５の間の点線で表される結合は、単結合または二重結合のどちらかであり、
波線は、Ｒ１が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上下どちらかに位置する結合を示し、
Ｒ１は、式（Ｉ）の六糖が多糖の還元末端に位置する場合にＯＨ基を表し、さもなければＲ１は、多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、結合はＲ１が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上に位置し、
Ｒ２は、式（Ｉ）の六糖が多糖の非還元末端に位置する場合に水素原子を表し、この場合には、六糖の第１の糖単位の炭素原子４および５の間の結合は二重結合であり、さもなければＲ２は、多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、六糖の第１の糖単位の炭素原子４および５の間の結合は単結合である。）を２回含み、
多糖が酸形または塩形であることを特徴とする、多糖。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の多糖であって、１２から２２個の糖単位を含むことを特徴とする、多糖。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の多糖であって、式（ＩＩ）：
（Ａ）ｄ−（Ｉ）−（Ｂ）ｆ−（Ｉ）−（Ｃ）ｇ    （ＩＩ）
に相当し、
式中：
Ａ、ＢおよびＣ単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表し、
式（Ｉ）の単位は、請求項３で定義した通りの、六糖配列を表し、
下付文字ｄ、ｆおよびｇはそれぞれ、０に等しいかまたは１から５の間に含まれる整数を表し、整数ｄ、ｆおよびｇの和が０から５の間に含まれることが条件である
ことを特徴とする、多糖。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の多糖であって、式（ＩＩ  ｂｉｓ）：
（Ａ）ｎ−（Ｉ）−（Ｂ）ｍ−（Ｉ）−（Ｃ）ｋ      （ＩＩ  ｂｉｓ）
に相当し、
式中：
Ａ、ＢおよびＣ単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表し、
式（Ｉ）の単位は、請求項３で定義した通りの、六糖配列を表し、
下付文字ｎ、ｍおよびｋはそれぞれ、下付文字ｎ、ｍまたはｋのうち１つが１に等しい場合には、他の２つの下付文字が０に等しいという条件で、０または１に等しい整数を表す
ことを特徴とする、多糖。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の多糖であって、１２個の糖単位を含み、および式（ＩＩＩ）：
【化２】
2014511929.tif 000012
に相当し、多糖が酸形または塩形であることを特徴とする、多糖。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の多糖であって、１４個の糖単位を含むことを特徴とする、多糖。
【請求項９】
請求項８に記載の多糖であって、式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）：
【化３】
2014511929.tif 000013
2014511929.tif 000014
2014511929.tif 000015
に相当し、
式中、波線は、Ｒ１が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上下どちらかに位置する結合を示し、
多糖が酸形または塩形であることを特徴とする、多糖。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の多糖であって、ナトリウム塩の形である、多糖。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の多糖であって、単離形である、多糖。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の多糖であって、他の多糖との混合物としての、多糖。
【請求項１３】
低分子量または超低分子量ヘパリンであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の１つ以上の多糖を含むことを特徴とする、低分子量または超低分子量ヘパリン。
【請求項１４】
請求項１３に記載の低分子量または超低分子量ヘパリンであって、請求項７に記載の式（ＩＩＩ）の多糖を、ＡＴＩＩＩに親和性を有する十二糖画分に対するパーセンテージ面積として表される、優先的には１から２．５％の間の含有率で含むことを特徴とする、低分子量または超低分子量ヘパリン。
【請求項１５】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の多糖を調製する方法であって、低分子量または超低分子量ヘパリンからの多糖の直交型分離ステップを含み、前記ステップがゲル透過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、およびＡＴＩＩＩ親和性クロマトグラフィーを相互に組合させて行うことを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、以下のステップ：
−ゲル透過クロマトグラフィー、次に
−ＡＴＩＩＩ親和性クロマトグラフィー、次に
−ＣＴＡ−ＳＡＸカラムでの高速液体クロマトグラフィー、次に
−アニオン交換クロマトグラフィーによる精製およびゲル濾過による脱塩
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の方法であって、超低分子量ヘパリン、特にセムロパリンを使用することを特徴とする、方法。
【請求項１８】
薬剤であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多糖または医薬として許容される酸によるこの化合物の付加塩を含むことを特徴とする、薬剤。
【請求項１９】
医薬組成物であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多糖またはこの化合物の医薬として許容される塩、および少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物であって、抗血栓性オリゴ糖類から選ばれる少なくとも１つの他の活性成分も含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の多糖または医薬として許容される酸によるこの化合物の付加塩であって、静脈および動脈血栓症、深部静脈血栓症ならびに肺塞栓症を含む血栓症の処置および予防でのこれの使用のための、多糖または医薬として許容される酸によるこの化合物の付加塩。
【請求項２２】
ヘパリン誘導体の、特にセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下のステップ：
ａ）試験試料を、前記試料の十二糖画分および／または十四糖画分を単離するステップを含む、請求項１５から１７に記載の直交型分離ステップに掛けるステップ、
ｂ）前記十二糖および／または十四糖画分中の、請求項７および９に記載の式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
ｃ）場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の１つ以上の含有量を定量するステップ、
ｄ）ステップｂ）により式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の硫酸化多糖の１つ以上の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップｃ）により標準セムロパリン試料の事前に規定された含有率で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が標準試料に一致することを結論付けるステップ、さもなければ、ステップｂ）により式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の硫酸化多糖の１つ以上の存在を検出することが可能にならない場合、および場合により、ステップｃ）により標準試料の事前に規定した含有量外で多糖の定量が行われる場合、試験試料が標準試料に一致しないことを結論付けるステップ
を含む方法。
【請求項２３】
ヘパリン誘導体の、特にセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下のステップ：
ａ）試料の十二糖画分を単離するステップを含む、試験試料に請求項１５から１７に記載の直交型分離ステップに掛けるステップ、
ｂ）前記十二糖画分中の、請求項７に記載の式（ＩＩＩ）の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
ｃ）場合により、試験試料中の前記多糖（ＩＩＩ）の含有量を定量するステップ、
ｄ）ステップｂ）により多糖（ＩＩＩ）の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップｃ）によりＡＴＩＩＩ親和性十二糖画分に対するパーセンテージ面積として、１から２．５％の範囲内で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が標準試料に一致することを結論付けるステップ、さもなければ、ステップｂ）により同じ多糖（ＩＩＩ）の存在を検出することが可能にならない場合、および場合によりステップｃ）により上の１％から２．５％の範囲外で前記多糖が定量される場合、試験試料が標準試料に一致しないことを結論付けるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ結合部位を２個含む多糖、これの調製方法および抗血栓薬剤としてのこれの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、生理学的凝固阻害物質であるアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の活性化が介在する、これの抗凝固特性によって周知である。ヘパリンは、静脈血栓症を予防および処置するために、１９３０年代より臨床的に使用されてきた。
【０００３】
１９７０年代末期より、解重合および分画によって得られたヘパリンの構成要素の構造的研究を通じて、ヘパリンの活性がより明瞭に理解されてきた。このため、ヘパリン中に存在する多糖鎖の幾つかがアンチトロンビン結合部位を有すること、およびアンチトロンビン結合部位が六糖類を含有するオリゴ糖配列ＣＤＥＦＧＨから成ることを示すことが可能となった（Ｍ．Ｐｅｔｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２００３，ｖｏｌ．８５，ｐ．８３−８９）：
【０００４】
【化１】
2014511929.tif 000003
【０００５】
アンチトロンビンへの結合を可能にする糖５個の最小配列ＤＥＦＧＨの仮説も提案され、第Ｘａ因子の選択的阻害物質である合成五糖である、フォンダパリヌクス（以下の構造）の開発および販売につながっている：
【０００６】
【化２】
2014511929.tif 000004
【０００７】
さらに、ヘパリンから誘導された生成物である、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）が１９
７０年代以来開発されてきた。これらの生成物は、ヘパリンの化学的または酵素的解重合
によって得られる。これらは多糖の複合混合物であり、凝固カスケードに関与する多様な因子に対してヘパリンよりも大きい作用特異性を有し、特にヘパリンに固有の出血のリスクを低下させることを可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍ．Ｐｅｔｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２００３，ｖｏｌ．８５，ｐ．８３−８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明者らは今や、抗血栓特性を有する化合物を同定するための新規手法を見出している。独自の分離技法により、ヘパリン誘導体から出発して、優れた抗血栓特性を有し、従って治療的に使用することができる、糖化学において現在までに知られていない特定の構造を有する多糖を単離することが可能となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主題は、ＡＴＩＩＩ親和性部位を２個含むことを特徴とする、ヘパリンの構成多糖の一般構造を有し、８０００ダルトン未満の分子量を有する硫酸化多糖である。
【００１１】
本発明による多糖は、２個のＡＴＩＩＩ結合六糖配列を有利に含む。このため、本発明による多糖は、本文の残りの部分では「二重部位」化合物と記すことがある。
【００１２】
「ヘパリンの構成多糖の一般構造を有する硫酸化多糖」という表現は、ヘパリン中に存在するものなど、一連の糖単位を含む化合物を意味するものである。このため、本発明による多糖は、同じであってもよく、または互いに異なっていてもよい、１→４位置で結合したＤ−グルコサミンおよびウロン酸を含む、一連の二糖単位で構成されている。
【００１３】
「ＡＴＩＩＩ結合六糖配列」という表現は、さらに詳細には、式（Ｉ）に相当する六糖を意味するものであり：
【００１４】
【化３】
2014511929.tif 000005
式中：
第一の糖単位の炭素原子４および５の間の点線で表される結合は、単結合または二重結合のどちらかであり、
波線（Ｒ１基の場合）は、Ｒ１が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上下どちらかに位置する結合を示し、
Ｒ１は、式（Ｉ）の六糖が多糖の還元末端に位置する場合にＯＨ基を表し、さもなければＲ１は、前記多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、結合はＲ１が結合しているグルコサミン単位のピラノース環平面の上に位置し、
Ｒ２は、式（Ｉ）の六糖が多糖の非還元末端に位置する場合に水素原子を表し、この場合には、前記六糖の第１の糖単位の炭素原子４および５の間の結合は二重結合であり、さもなければＲ２は、前記多糖の別の糖単位との結合を表し、この場合には、前記六糖の第１の糖単位の炭素原子４および５の間の結合は単結合である。
【００１５】
本発明による多糖は、酸形または塩形、特にこれの医薬として許容される塩のいずれか１つの形である。酸形において、−ＣＯＯ−および−ＳＯ３−官能基はそれぞれ−ＣＯＯＨおよび−ＳＯ３Ｈ形である。「本発明の化合物の医薬として許容される塩」という表現は、−ＣＯＯ−および／または−ＳＯ３−官能基の１つ以上が医薬として許容されるカチオン、例えばＮａ＋カチオンにイオン結合されている化合物を意味するものである。
【００１６】
本発明による多糖の構造は、２個のＡＴＩＩＩ親和性部位を含むこのサイズの多糖構造が現在までに文献で報告されていないという意味で、驚くべきである。
【００１７】
当業者にとっては、前述の特異的親和性配列ＣＤＥＦＧＨが巨大分子中に存在する場合に、多糖鎖がアンチトロンビンと相互作用することが十分に確立されている。この分野のすべての説明によって、鎖長が糖１８個を超える場合には、ヘパリン鎖とアンチトロンビンタンパク質との相互作用およびこの複合体による第Ｘａ因子の阻害が、または第ＩＩａ因子の阻害さえ示されている（例えばＬ’ａｃｔｕａｌｉｔｅ  Ｃｈｉｍｉｑｕｅ［Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｗｓ］，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９９，ｐａｇｅｓ  １８−２１の、Ｍ．Ｐｅｔｉｔｏｕによる論文を参照のこと。）。
【００１８】
高分子量の、即ちおよそ１８０００から２２０００ダルトンのヘパリン画分中に２個のアンチトロンビン結合部位が存在することは、Ｒ．Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８２，ｖｏｌ．２５７，ｎｏ．１，ｐ．４００−４０６）によって示されている。これに対して、低分子量画分（およそ６０００から８０００ダルトン）の分析により、アンチトロンビンと相互作用する単一の部位が存在することが示されている。
【００１９】
このため、低分子量多糖が少なくとも２個のアンチトロンビンタンパク質と相互作用することが可能であり、結果として第Ｘａ因子を阻害する少なくとも２つの可能性を有するという概念そのものが全く予測できないのは、続いての生物学的影響がこれらの新規配列に関連しているためである。
【００２０】
本発明による「二重部位」オリゴ糖類の独自の構造はこのため、続いて詳細に述べるようなこれの強力な抗血栓特性のために、治療用途への新たな可能性を切り開いている。
【００２１】
本発明による化合物の中でも、１２から２２個の間の糖単位を含む多糖を挙げることができる。これらは式（ＩＩ）によって表すことができ：
（Ａ）ｄ−（Ｉ）−（Ｂ）ｆ−（Ｉ）−（Ｃ）ｇ    （ＩＩ）
式中：
Ａ、ＢおよびＣ単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表す。二糖配列は有利には、場合により置換されている（例えば硫酸化またはアシル化された）ウロン酸およびＤ−グルコサミンを含む。Ａ、ＢおよびＣ二糖単位は、存在するか、または存在しないかのどちらかであり、これは下付文字ｄ、ｆおよびｇによって示される；
式（Ｉ）の単位は、先に定義したように（上の式（Ｉ）を参照のこと。）、六糖単位を表し、
下付文字ｄ、ｆおよびｇはそれぞれ、０に等しい（この場合、これら下付文字が示すＡ、ＢまたはＣ単位は存在しない。）かまたは１から５の間に含まれる整数を表し、整数ｄ、ｆおよびｇの和が０から５の間に含まれることを条件とする。
【００２２】
本発明による化合物の中でも、より詳細には、１２または１４個の糖単位を含む多糖を挙げることができ；これらは式（ＩＩ  ｂｉｓ）によって表すことができ：
（Ａ）ｎ−（Ｉ）−（Ｂ）ｍ−（Ｉ）−（Ｃ）ｋ    （ＩＩ  ｂｉｓ）
式中：
Ａ、ＢおよびＣ単位は、同じであってもまたは相互に異なっていてもよく、二糖配列を表す。二糖配列は有利には、場合により置換されている（例えば硫酸化またはアシル化された）ウロン酸およびＤ−グルコサミンを含む。Ａ、ＢおよびＣ二糖単位は、存在するか、または存在しないかのどちらかであり、これは下付文字ｎ、ｍおよびｋによって示される；
式（Ｉ）の単位は、先に定義したように（上の式（Ｉ）を参照のこと。）、六糖単位を表し、
下付文字ｎ、ｍおよびｋはそれぞれ、下付文字ｎ、ｍまたはｋの１個が１に等しい場合には、他の２個の下付文字が０に等しいという条件で、０に（この場合、これら下付文字が示すＡ、ＢまたはＣ単位は存在しない。）、または１に（この場合、これら下付文字が示すＡ、ＢまたはＣ単位は存在する。）等しい整数を表す。
【００２３】
本発明による化合物の中でも、１２個の糖単位を含む多糖（十二糖）を挙げることができる。十二糖は、ｎ＝ｍ＝ｋ＝０である上の式（ＩＩ  ｂｉｓ）の化合物である。該化合物は、有利には以下の図１による式（ＩＩＩ）に相当し、前述したように酸形または塩形である。
【００２４】
本発明による他の多糖は、１４個の糖単位を含んでもよい（十四糖類）。これらは、上の式（ＩＩ  ｂｉｓ）の化合物である。ｎ、ｍおよびｋの中の下付文字の１つは１に等しく、他の２つの下付文字は０に等しい。下付文字は例えば、図２、３および４による式（ＩＶ）、（Ｖ）および（ＶＩ）にそれぞれ相当し、式中、波線は、グルコサミン単位のピラノース環平面の上下どちらかに位置する結合を示す。このような多糖は、前述したように、酸形または塩形である。
【００２５】
本発明による多糖は、これらの混合物の構成多糖をこれのサイズ、これの電荷およびこれのＡＴＩＩＩに対する親和性に従って分離するための直交型（複合型）分離技法を使用して、ヘパリン誘導体から得ることができる。従って、ゲル透過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよびＡＴＩＩＩ親和性クロマトグラフィー技法が使用される。これらの技法は、いずれの考えられる順序でも相互に組合せられる。
【００２６】
ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、バイオゲルＰ３０（バイオラッド）を充填したカラムで溶離液として０．２Ｍ  ＮａＣｌＯ４を優先的には８０から１００ｍｌ／時の間の流速で溶離させて行うことができる。画分はセファデックスＧ１０を充填したカラムで脱塩される。
【００２７】
ＡＴＩＩＩ親和性クロマトグラフィーは、ＡＴ−セファロースを充填したカラムで行うことができる。固定相は、ヒトＡＴ（アンチトロンビン）（１ｇ、バイオメッド）をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（シグマ）にカップリングすることによって調製される。ＡＴカラムを調製するために使用される方法は、Ｈｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９７６，６６（１），９０−３）および親出願ＷＯ  ２００７／０１２７５４の教示に基づいている。親和性カラムは、ＮａＣｌ勾配を使用して溶離する。低親和性画分は、１ｍＭトリスを用いてｐＨ７．４に緩衝された０．２５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を用いて、カラムから溶離する。高親和性画分は、ＮａＣｌ濃度のステップ勾配を使用して溶離する。溶離液は、導電度測定およびＵＶ範囲内の２３２ｎｍにおける吸光光度分析法によって監視する。
【００２８】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ＣＴＡ−ＳＡＸ技法（セチルトリメチルアンモニウムを用いた動的または強アニオン交換クロマトグラフィー）を使用する。半分取ＣＴＡ−ＳＡＸカラム（例えば２５０×２２ｍｍ）は、Ｍｏｕｒｉｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｊ，ａｎｄ  Ｖｉｓｋｏｖ，Ｃ．によってＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，３３２，２９９−３１３に記載されているように、ハイパーシル・ベータベーシックＣ１８（５μｍ）を充填したカラムにグラフトする。カラムのグラフト化は、分析カラムでは、水／メタノール混合物による硫酸水素セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ）の溶液を注入することによって行う。移動相は、０から２．５Ｍに及ぶ濃度のメタンスルホン酸ナトリウムの水溶液である。メタンスルホン酸を添加することにより、ｐＨを２．５に調整する。
【００２９】
本発明による多様な多糖は、液体クロマトグラフィーにて溶離される順序に従って単離することができる：同じサイズの多糖は、該多糖の化学的性質に従って異なる保持時間にて溶離させることが可能であり、多糖主鎖に沿った多様な電荷および置換基の存在がクロマトグラフィーの終了時に該多糖が出る順序に影響を及ぼしている。ヘパリナーゼによる部分解重合後のオリゴ糖類の配列決定を使用する、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｉｂｉｄ）に記載された技法を使用して、当業者に公知の他のいずれの方法、例えばプロトンＮＭＲによる同定によって可能であるように、ＣＴＡ−ＳＡＸの終了時に溶離された多糖を同定することができる。
【００３０】
ＣＴＡ−ＳＡＸの終了時に収集された画分を、メガボンドエルートＣ１８カートリッジ（バリアン）上での予備処理後に、例えばセファデックスＧ１０でのゲル濾過によって中和、精製および脱塩する。
【００３１】
より困難な分離の場合、上記のようにＣＴＡでグラフトしたハイパーシル・ベータベーシックＣ１８（３μｍ）を充填したより小型のカラム（１５０×１０ｍｍ）を使用することができる。移動相は、０から２Ｍの間の濃度のメタンスルホン酸アンモニウム水溶液である、分析系で使用される移動相に相当する。速度は例えば４ｍｌ／分である。
【００３２】
最終分離ステップは、半分取アニオン交換カラム、例えばＡＳ１１カラム（ディオネックス）で行うことができる。移動相は例えば、以下のように構成される：溶媒Ａ：水；溶媒Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌＯ４。溶離勾配は、下記でもよい：Ｔ＝０分：％Ｂ＝１；Ｔ＝６０分：％Ｂ＝２０ｍｌ／分の流速で８０。検出は、ＵＶ範囲内の２３２ｎｍにて行われる。選択した画分は、ゲル濾過、例えばセファデックスＧ１０カラムでのゲル濾過によって脱塩される。
【００３３】
本発明による多糖を得るために、上述の分離技法は、ホスファゼン塩基によるヘパリンのベンジルエステルの４級アンモニウム塩の解重合によって得られる、非常に特殊なＬＭＷＨに適用される。このようなＬＭＷＨは現在、静脈血栓症の予防のために臨床開発中である：これは新世代の半合成ＬＭＷＨに相当するセムロパリンであり、２０００から３０００ダルトンの平均分子量ならびに高い抗第Ｘａ因子（抗ＦＸａ）活性および残留抗ＩＩａ因子（抗ＦＩＩａ）活性から生じる新たな抗血栓プロフィールを有する。セムロパリンの特性およびこれの調製例は、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００９，ｖｏｌ．７，１１４３−１１５１に記載されている。セムロパリンの詳細な特性、特にこれのかなり低い平均分子量に関して、セムロパリンは超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）のカテゴリで定義されている。
【００３４】
驚くべきことに、本発明による多糖は、例えば出願ＷＯ  ２００４／０３３５０３に記載されているようなＵＬＭＷＨから、特にセムロパリンから得られている：現在までに、このような多糖は同定されたこともなく、現在公知の他の低分子量もしくは超低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリンから単離されてもいない。従って二重ＡＴＩＩＩ結合部位を含むこれらの構造は、当業者にとっては完全に予想外であり、ヘパリン誘導体の分野では革新的である。
【００３５】
本発明の主題は、単離形の先に記載した多糖である。
【００３６】
本発明の主題は、他の多糖が何であっても、他の多糖との混合物の形の先に記載した多糖でもある。特に、本発明の主題は、ヘパリンの構成多糖の一般構造を有し、２個のアンチトロンビンＩＩＩ親和性部位を含む１つの多糖または硫酸化多糖、例えば先に記載した多糖（Ｉ）を含む、低分子量または超低分子量ヘパリンである。
【００３７】
本発明により、「低分子量ヘパリン」（ＬＭＷＨ）という用語は、ヘパリンから得られ、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ６．０）（０１／２００８：０８２８，２０４１−２０４３）で定義されているような８０００ダルトン未満の平均分子量を有する、硫酸化多糖の混合物である。「超低分子量ヘパリン」（ＵＬＭＷＨ）または「極低分子量ヘパリン」（ＶＬＭＷＨ）という用語は、４０００ダルトン未満の、より詳細には３０００ダルトン以下の平均分子量を有する混合物である。
【００３８】
本発明の主題は、ＡＴＩＩＩ−親和性十二糖画分に対するパーセンテージ面積として表される、優先的には１から２．５％の間の含有率にて上で定義したような、式（ＩＩＩ）の多糖（十二糖）を含む低分子量ヘパリンまたは超低分子量ヘパリン、特にセムロパリンでもある。「パーセンテージ面積」という用語は、ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析によって得た曲線下面積（ＡＵＣ）のパーセンテージを意味するものである。
【００３９】
セムロパリンの十二糖画分における式（ＩＩＩ）の二重部位十二糖の含有率をアッセイするために、使用した方法は優先的に、前述したような３つのクロマトグラフィーステップを含んでいる。一例として、アッセイは以下の３つのシーケンスを使用して行った：第１のステップは、ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）による十二糖画分の単離である；第２のステップは、親和性画分と非親和性画分に分割するための、先に単離した十二糖画分をＡＴＩＩＩ−親和性クロマトグラフィーに流下させることを含む；最後に、最終ステップにおいて、二重部位化合物のパーセンテージをＡＴＩＩＩ−親和性十二糖画分に対するパーセンテージ面積として概算するために、親和性画分にＨＰＬＣによりクロマトグラフィーを行う。
【００４０】
本発明による式（Ｉ）の多糖の特殊性により、多糖を含有し得るＬＭＷＨおよびＵＬＭＷＨのトレーサとして多糖をキャラクタリゼーションすることが可能となる。より詳細には、本発明による式（Ｉ）の多糖はセムロパリン中に検出されているため、ヘパリン誘導体の試料を分析すること、他の関連する試験の中でもこの分析から、前記式（Ｉ）の多糖の存在または非存在を検証することによって、これが実際にセムロパリンであるか否かを結論付けること、および場合により、前記多糖の含有率が予想される量と一致するか否かを検証することが可能である。従って、ヘパリン誘導体（セムロパリンまたはセムロパリンではない。）の試料の性質およびこの試料がセムロパリンの標準試料に適合するかどうか（トレーサ化合物が必要量で存在すること）を検証するためのステップは、本発明の範囲に含まれている。
【００４１】
このため、本発明の主題は、ヘパリン誘導体、特にセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下の：
ａ）前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖画分および／または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
ｂ）十二糖および／または十四糖画分中の上で定義したような式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
ｃ）場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の１つ以上の含有量を定量するステップ
を含む方法でもある。
【００４２】
このような方法は、試験試料がＬＭＷＨまたはＵＬＭＷＨ、特にセムロパリンの標準試料に一致するか否かを検証する目的を有し得る。このため前記方法は、ステップｂ）によりステップｂ）で言及した硫酸化多糖の１つ以上の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップｃ）により前記標準試料の事前に規定された含有率の範囲内で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が前記標準試料に一致することを結論付けられるようにするステップｄ）をさらに含んでもよい。逆に、ステップｂ）によりステップｂ）で言及した硫酸化多糖の少なくとも１つの存在を検出することが可能にならない場合、またはステップｃ）により標準試料の事前に規定した含有量の範囲外で前記多糖の定量が行われる場合、ここで試験試料が標準試料に一致しないことが結論付けられる。
【００４３】
このため、本発明の主題は、ヘパリン誘導体、特にセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下の：
ａ）前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖画分および／または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
ｂ）十二糖および／または十四糖画分中の上で定義したような式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
ｃ）場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の１つ以上の含有量を定量するステップ、
ｄ）ステップｂ）により式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の硫酸化多糖の１つ以上の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップｃ）により標準試料の事前に規定された含有率の範囲内で前記多糖の含有量を定量することが可能になる場合、試験試料が前記標準試料に一致することを結論付けるステップ
を含む方法でもある。
【００４４】
本発明の別の主題は、ヘパリン誘導体、特にセムロパリンの試料を分析する方法であって、以下の：
ａ）前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖および／または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
ｂ）十二糖および／または十四糖画分中の上で定義したような式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
ｃ）場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の１つ以上の含有量を定量するステップ、
ｄ）ステップｂ）により式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の硫酸化多糖の少なくとも１つの存在を検出することが可能にならない場合、および場合により、ステップｃ）により標準試料の事前に規定した含有量の範囲外で前記多糖の定量が行われる場合、試験試料が標準試料に一致しないことを結論付けるステップ
を含む方法である。
【００４５】
上で言及した標準試料は有利には、セムロパリンの試料である。
【００４６】
上に記載したヘパリン誘導体の試料を分析する方法のステップｂ）において、これは有利には、求められている式（ＩＩＩ）の硫酸化多糖であり、式（ＩＩＩ）の硫酸化多糖は試料の十二糖画分中に存在する。このためステップａ）は有利には、試験試料から単離された十二糖画分を提供するステップを含み、従って、試験試料を、前記試料の十二糖画分を単離するステップを含む、先に定義したような直交型分離ステップに掛けることに存する。結果として、ステップｂ）は有利には、試験試料の前記十二糖画分における式（ＩＩＩ）の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するためのステップを含む。ステップｃ）に関して、従ってステップｃ）は有利には、試験試料中の多糖（ＩＩＩ）の含有量を定量するためのステップを含む。次に、ステップｂ）により多糖（ＩＩＩ）の存在を検出することが可能になる場合、および場合により、ステップｃ）によりＡＴＩＩＩ親和性十二糖画分に対するパーセンテージ面積としての、１から２．５％の範囲内で前記多糖（ＩＩＩ）の含有量を定量することが可能になる場合、従ってステップｄ）により試験試料が一致することを結論付けることが可能になる。反対の状況により、即ちステップｂ）により多糖（ＩＩＩ）の存在を検出することが可能にならない場合、および場合により、ステップｃ）により上の含有率で前記多糖（ＩＩＩ）を定量することが可能にならない場合、試験試料がセムロパリンの標準試料に一致しないことを結論付けることが可能になる。
【００４７】
上に記載したヘパリン誘導体の試料を分析する方法は、前の分析ステップａ）、ｂ）、場合によりｃ）およびｄ）の結果としてバッチを選択するためのステップｅ）を含むこともできる。このようなバッチ選択は、例えば特にヒトでのこれを臨床使用する目的から、バッチのリリースに必要な多くの試験の中に含めることができるという点で、ヘパリン誘導体の臨床開発の間で、またはこのような製品の販売の間で有用である。このため、本発明による分析の方法は、ヘパリン誘導体の、特にセムロパリンのバッチの生成を監視または試験する方法であってもよい。
【００４８】
本発明の別の主題は、ヘパリン誘導体、特にセムロパリンの試料を分析するための方法であって、以下の：
ａ）前記試料を先に定義したような、試験試料の十二糖画分および／または十四糖画分を単離するステップを含む、直交型分離ステップに掛けるステップ、
ｂ）十二糖および／または十四糖画分中の上で定義したような式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１つ以上の硫酸化多糖の存在または非存在を検出するステップ、
ｃ）場合により、試験試料中の前記硫酸化多糖の１つ以上の含有量を定量するステップを含み、
ステップｂ）において式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の硫酸化多糖の１つ以上の存在が検出されること、および場合により、ステップｃ）において定量された前記多糖の量が標準セムロパリン試料の前記多糖の事前に規定した含有量の範囲内であることにより、試験試料が標準試料に一致することが示され；
ならびにステップｂ）において式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の硫酸化多糖の１つ以上の非存在が検出されること、および場合により、ステップｃ）において定量された前記多糖の量が標準試料の事前に規定した含有量の範囲外であることにより、試験試料が標準試料に一致しないことが示される、方法である。
【００４９】
以下の実施例では、本発明によるある化合物の調製およびアッセイについて詳細に記載する。これらの実施例は、限定的でなく、本発明を示すだけである。
【００５０】
添付図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明による化合物（ＩＩＩ）の構造を示す。
【図２】本発明による化合物（ＩＶ）の構造を示す。
【図３】本発明による化合物（Ｖ）の構造を示す。
【図４】本発明による化合物（ＶＩ）の構造を示す。
【図５】ＧＰＣ、ＡＴＩＩＩクロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーの後に得た、十四糖画分の分析ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラム（下の実施例３、４および５）を示す。
【図６】セムロパリンの試料のＧＰＣクロマトグラム（下の実施例６．１）を示す。
【図７】セムロパリンの試料の十二糖画分のアンチトロンビン親和性のクロマトグラム（下の実施例６．２）を示す。
【図８】セムロパリンの試料の親和性十二糖画分の、ウォーターズアクイティＢＥＨ  Ｃ１８  ＵＰＬＣカラムでのクロマトグラム（下の実施例６．３）を示す。
【図９】図８によるクロマトグラフィーを行った十二糖画分の２３２ｎｍにおけるクロマトグラフでの二重部位化合物（ＩＩＩ）の定量（下の実施例６．３）を示す。
【実施例】
【００５２】
［実施例１］
出発ＵＬＭＷＨの調製
セムロパリン（国際一般名）という名称で、およびラボラトリーコードＡＶＥ５０２６（サノフィ）でも公知である超低分子量ヘパリンを、本発明による多糖を調製するための出発生成物として使用する。前記ヘパリンは、ホスファゼン塩基（ＢＥＭＰ）による有機媒体中でのヘパリンのベンジルエステルの第４級塩の解重合、解重合されたヘパリンのベンジルエステルの第４級アンモニウム塩のナトリウム塩への変換、残留エステルの鹸化および最終精製によって調製される。
【００５３】
ヘパリンのベンジルエステルの第４級アンモニウム塩は、有利にはベンゼトニウム塩である。
【００５４】
このためＡＶＥ５０２６を調製する方法は、以下の：
ａ）ベンゼトニウムヘパリナートを得るための、ベンゼトニウムクロリドの作用によるヘパリンナトリウムの塩交換、
ｂ）ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩を得るための、ベンジルクロリドの作用によるベンゼトニウムヘパリナートのエステル化、次に酢酸ナトリウムのアルコール性溶液による処理
ｃ）ベンゼトニウム塩を使用する、ヘパリンのベンジルエステルの、第４級アンモニウム塩への塩交換、
ｄ）上で定義したような方法による、ヘパリンのベンジルエステルの第４級アンモニウム塩の解重合、
ｅ）第４級アンモニウム（ベンゼトニウム）塩のナトリウム塩への変換、
ｆ）塩基、例えば水酸化ナトリウムの作用による鹸化、
ｇ）特に酸化剤、例えば過酸化水素水溶液などの作用による精製を含む。
【００５５】
ステップａ）の反応は、過剰なベンゼトニウムクロリドの作用により、ヘパリンナトリウムに対して、１５から２５℃の領域の温度にて有利に行われる。このステップの間に、ヘパリン塩／ナトリウムのモル比は、有利には３から４の間である。
【００５６】
使用した出発ヘパリンは、好ましくはブタヘパリンである。ブタヘパリンは、特許ＦＲ２６６３６３９に記載の方法に従ってこの硫酸デルマタン含有量を低減するために事前に精製することができる。
【００５７】
ステップｂ）のエステル化は好ましくは、塩素化有機溶媒、例えばジクロロメタン中で２５から４５℃の間の、好ましくは３０から４０℃の間の温度にて行われる。次にベンゼトニウム塩の形のエステルを、アルコール、例えばメタノール中で１０重量％の酢酸ナトリウムを用いた沈殿によってナトリウム塩の形で回収する。反応媒体の体積１につき、およそ体積１のアルコールを一般に使用する。ベンジルクロリドの量および反応時間は、５０から１００％の間の、好ましくは７０から９０％の間のエステル化度を得るように調整される。優先的には、ヘパリンのベンゼトニウム塩１重量部につき０．５から１．５重量部のベンジルクロリドが使用される。反応時間については、有利には１０から３５時間の間である。
【００５８】
ステップｃ）の塩交換は、水性媒体中でベンゼトニウムクロリドによって行われる。有利には、ヘパリンのベンジルエステルのベンゼトニウムクロリド／ナトリウム塩のモル比は２から３の間である。
【００５９】
解重合ステップは有利には、０．６重量％未満の含水率の非プロトン性溶媒、例えばジクロロメタン中で行われる。好ましくは、反応媒体中の含水率は０．３％未満、より詳細には０．２％未満である。
【００６０】
有利には、ホスファゼン塩基／エステルモル比は、０．２から５の間、好ましくは０．６から２の間、より詳細には０．８から１．２の間である。等モル比の使用が好ましい。
【００６１】
ステップｅ）は一般に、反応媒体を酢酸ナトリウムのアルコール溶液によって、好ましくはメタノール中にて１５から２５℃の温度において処理することによって行う。添加した酢酸塩の重量による当量は優先的に、解重合反応で使用したヘパリンのベンジルエステルの第４級アンモニウム塩の重量より３倍大きい。
【００６２】
鹸化（ステップｆ）は一般に、アルカリ金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムによって、水性媒体中で０から２０℃の、好ましくは０から１０℃の温度にて行う。一般に、１から５モル当量のアルカリ金属水酸化物を使用する。好ましくは、鹸化は１から２モル当量のアルカリ金属水酸化物の存在下で行う。
【００６３】
精製（ステップｇ）は、過酸化水素によって、水性媒体中で１０から５０℃の温度にて行うことができる。好ましくは、この操作は２０から４０℃の間で行う。
【００６４】
この方法によって、以下の特徴：２０００−３０００ダルトンの平均分子量、およそ１６０Ｕ／ｍｇの抗ＦＸａ活性およびおよそ２Ｕ／ｍｇの抗ＦＩＩａ活性を有するセムロパリンを得ることが可能となる。このような生成物は、これの特に低い平均分子量のために、超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）と呼ばれる。
【００６５】
セムロパリンについて上述した抗ＦＸａおよび抗ＦＩＩａ活性は、再構成用緩衝液としての、アルブミンの代わりにＰＥＧ  ６０００（ポリエチレングリコール６０００）を含有するトリス−ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、ならび１５９Ｕ／ｍｇの抗ＦＸａ活性および２．９Ｕ／ｍｇの抗Ｆｌｌａ活性を有する基準ＵＬＭＷＨ物質を使用して、有効な欧州薬局方のＬＭＷＨのモノグラフから改変されている発色性基質に対するアミド分解法によって測定する。活性は、ＵＬＭＷＨ内部標準を使用するため、ｍｇ当たりの単位で表す。実際に、濃度／希釈度に応じて、ＵＬＭＷＨをＬＭＷＨ標準に対して較正する場合、抗ＦＩＩａ活性の通常の測定の際に非平行性が見られることがある。基準ＵＬＭＷＨの抗ＦＸａおよび抗ＦＩＩａ活性を、平行性が得られる希釈範囲内において、低分子量ヘパリンの標準国際規格を基準として定義する。アッセイの結果を有効な欧州薬局方の§５．３（「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｓ」）に従って利用する。
【００６６】
［実施例２］
十二糖（ＩＩＩ）の調製
第一のステップにおいて、バイオゲルＰ３０（２００×５ｃｍ）（注入１回につき２ｇ）を充填したカラムによるＧＰＣによって、ＡＶＥ５０２６を分画した。生成物のおよそ６から１１％に相当する十二糖画分を収集して、セファデックスＧ１０（１００×７ｃｍ）を充填したカラムで脱塩した。この時点では、開始ベースとして、少なくとも５ｇの十二糖画分を有することが推奨される。第二のステップにおいて、ＮａＣｌ濃度のステップ勾配（１ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、０．７；１．１５；１．６；２．０５；２．６５および３Ｍ  ＮａＣｌ）を使用して、画分をすべてＡＴＩＩＩ親和性カラム（３０×５ｃｍ）に注入する。２００ｍｇ、即ちＡＴＩＩＩカラムに対する過剰容量を各流下時に注入する。式（ＩＩＩ）の十二糖が濃縮された、８０から１３０ｍＳ／ｃｍの間の導電率で溶離した画分を共に集める。これらの画分を脱塩して、次のステップで半分取ＣＴＡ−ＳＡＸカラム（２５０×２２ｍｍ）により精製する。画分を分析ＡＳ１１またはＣＴＡ−ＳＡＸによって試験する。ｐＨの中和後、収集した画分をメガボンドエルートＣ１８カートリッジ（バリアン）に流下させてから、半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で最終精製する。純粋な十二糖（ＩＩＩ）を含有する画分を共に収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。
【００６７】
１Ｈ  ＮＭＲ  ｉｎ  Ｄ２Ｏ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：２．０５（６Ｈ，ｓ）、３．２５（２Ｈ，ｄｄ）、３．３９（２Ｈ，ｔ，８Ｈｚ）、３．４５（２Ｈ，ｄ，１０Ｈｚ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ３．６０  ａｎｄ  ４．５５（４９Ｈ，ｍ）、４．６１（２Ｈ，ｄ，７Ｈｚ）、４．７５（１Ｈ，ｓ）、４．８０（１Ｈ，ｓ）、４．８４（１Ｈ，ｓ）、５．０２（１Ｈ，ｓ）、５．１８（３Ｈ，ｍ）、５．３５（１Ｈ，ｂｒｏａｄ  ｄ）、５．４０（１Ｈ，ｄ，２Ｈｚ）、５．４２（１Ｈ，ｄ，２Ｈｚ）、５．４６（１Ｈ，ｄ，２Ｈｚ）、５．５５（２Ｈ，ｍ）、５．８１（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００６８】
［実施例３］
十四糖（ＩＶ）の調製
ＧＰＣによる分画の第１のステップを実施例２と同様に行う。分画の終了時に収集した十四糖画分は、出発生成物のおよそ３から７％に相当し、次に実施例２で示すように脱塩する。第２のステップにおいて、画分全体を実施例２に示すようにＡＴＩＩＩ親和性カラムに注入する。式（ＩＶ）の十四糖が濃縮された、１００から１３０ｍＳ／ｃｍの間の導電率で溶離した画分を収集する。次のステップにおいて、流下１回につき２０ｍｇを注入することによって、画分を半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で脱塩および精製する。画分を分析ＣＴＡ−ＳＡＸにより試験する。純粋な十四糖（ＩＶ）を含有する画分を収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。画分を次にＣＴＡ−ＳＡＸカラム（１５０×１０ｍｍ）（３μｍ）に注入する。画分を試験して、中和し、次にメガボンドエルートＣ１８カートリッジ（バリアン）に流下させてから、半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で最終精製する。純粋な十四糖（ＩＶ）を含有する溶離液を収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。
【００６９】
１Ｈ  ＮＭＲ  ｉｎ  Ｄ２Ｏ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：２．０４（３Ｈ，ｓ）、２．０５（３Ｈ，ｓ）、３．２７（３Ｈ，ｍ）、３．３７（２Ｈ，ｔ，８Ｈｚ）、３．４４（２Ｈ，ｄ，１０Ｈｚ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ３．６０  ａｎｄ  ４．５５（５７Ｈ，ｍ）、４．６０（２Ｈ，ｄ，７Ｈｚ）、４．７６（１Ｈ，ｍ）、４．７９（３Ｈ，ｍ）、５．００（１Ｈ，ｓ）、５．１５（１Ｈ，ｄ，６Ｈｚ）、５．１８（２Ｈ，ｍ）、５．２１（１Ｈ，ｍ）、５．３３（１Ｈ，ｂｒｏａｄ  ｄ）、５．３９（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．４１（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．４３（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．４４（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．５１（２Ｈ，ｍ）、５．８０（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００７０】
［実施例４］
十四糖（Ｖ）の調製
ＧＰＣによる分画の第１のステップを実施例２と同様に行う。分画の終了時に収集した十四糖画分は、出発生成物のおよそ３から７％に相当し、次に実施例２で示すように脱塩する。第２のステップにおいて、画分全体を実施例２に示すようにＡＴＩＩＩ親和性カラムに注入する。式（Ｖ）の十四糖が濃縮された、１００から１３０ｍＳ／ｃｍの間の導電率で溶離した画分を収集する。次のステップにおいて、流下１回につき２０ｍｇを注入することによって、これらの画分を半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で脱塩および精製する。画分を分析ＣＴＡ−ＳＡＸにより試験する。純粋な十四糖（Ｖ）を含有する画分を収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。画分を次にＣＴＡ−ＳＡＸカラム（１５０×１０ｍｍ）（３μｍ）に注入する。画分を試験して、中和し、次にメガボンドエルートＣ１８カートリッジ（バリアン）に流下させてから、半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で最終精製する。純粋な十四糖（Ｖ）を含有する溶離液を収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。
【００７１】
１Ｈ  ＮＭＲ  ｉｎ  Ｄ２Ｏ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：２．０４（３Ｈ，ｓ）、２．０５（３Ｈ，ｓ）、３．２７（３Ｈ，ｍ）、３．３７（２Ｈ，ｔ，８Ｈｚ）、３．４４（２Ｈ，ｄ，１０Ｈｚ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ３．６０  ａｎｄ  ４．５５（５７Ｈ，ｍ）、４．６０（２Ｈ，ｄ，７Ｈｚ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ４．７５  ａｎｄ  ４．８０（４Ｈ，ｍ）、５．０１（１Ｈ，ｓ）、５．１５（１Ｈ，ｄ，６Ｈｚ）、５．１８（２Ｈ，ｍ）、５．２２（１Ｈ，ｍ）、５．３３（１Ｈ，ｂｒｏａｄ  ｄ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ５．３８  ａｎｄ  ５．４２（３Ｈ，ｍ）、５．４４（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．５０（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．５２（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．８０（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００７２】
［実施例５］
十四糖（ＶＩ）の調製
ＧＰＣによる分画の第１のステップを実施例２と同様に行う。分画の終了時に収集した十四糖画分は、出発生成物のおよそ３から７％に相当し、次に実施例２で示すように脱塩する。第２のステップにおいて、画分全体を実施例２に示すようにＡＴＩＩＩ親和性カラムに注入する。式（ＶＩ）の十四糖が濃縮された、１００から１３０ｍＳ／ｃｍの間の導電率で溶離した画分を収集する。次のステップにおいて、流下１回につき２０ｍｇを注入することによって、これらの画分を半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で脱塩および精製する。画分を分析ＣＴＡ−ＳＡＸにより試験する。純粋な十四糖（ＶＩ）を含有する画分を収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。画分を次にＣＴＡ−ＳＡＸカラム（１５０×１０ｍｍ）（３μｍ）に注入する。画分を試験して、中和し、次にメガボンドエルートＣ１８カートリッジ（バリアン）に流下させてから、半分取ＡＳ１１カラム（ディオネックス）で最終精製する。純粋な十四糖（ＶＩ）を含有する溶離液を収集して、セファデックスＧ１０で脱塩する。
【００７３】
１Ｈ  ＮＭＲ  ｉｎ  Ｄ２Ｏ（δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：２．０３（３Ｈ，ｓ）、２．０４（３Ｈ，ｓ）、２．０５（３Ｈ，ｓ）、３．２６（２Ｈ，ｍ）、３．３７（２Ｈ，ｔ，８Ｈｚ）、３．４４（２Ｈ，ｄ，１０Ｈｚ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ３．６０  ａｎｄ  ４．５５（５８Ｈ，ｍ）、４．６０（２Ｈ，ｄ，７Ｈｚ）、ｂｅｔｗｅｅｎ  ４．７５  ａｎｄ  ４．８０（４Ｈ，ｍ）、５．００（１Ｈ，ｓ）、５．０２（１Ｈ，ｓ）、５．１５（１Ｈ，ｄ，６Ｈｚ）、５．１８（２Ｈ，ｍ）、５．２０（１Ｈ，ｍ）、５．３３（２Ｈ，ｍ）、５．３８（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．４１（１Ｈ，ｄ，３Ｈｚ）、５．５１（２Ｈ，ｍ）、５．８０（１Ｈ，ｄ，４Ｈｚ）。
【００７４】
実施例２から５において、ＧＰＣステップにより、十二糖および十四画分を分離すること（鎖長による分画）が可能となる。次にＣＴＡ−ＳＡＸステップにより、標的とされる多糖を単離して、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，３３２，２９９−３１３に記載された方法による分析ＨＰＬＣに監視による、さもなければ１Ｈ  ＮＭＲ監視による溶離化合物の同定を通じて、同一サイズの多糖を識別することが可能になる。特に図５は、上の実施例３、４および５によるＧＰＣ、ＡＴＩＩＩクロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーの後に得た十四糖画分の分析ＣＴＡ−ＳＡＸによるクロマトグラフィー分離を表す。細線のシグナルは２３４ｎｍにおけるＵＶ検出に相当し、太線のシグナルは二重波長２０２−２４２ｎｍにおける検出に相当する。ｘ軸は時間（分）を表し、ｙ軸はＵＶ吸収（ｍＡＵ：１０００分の１吸収単位）を表す。クロマトグラフィー分離および溶離液の分析は、Ｍｏｕｒｉｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｊ，ａｎｄ  Ｖｉｓｋｏｖ，Ｃ．によってＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，３３２，２９９−３１３に記載された条件下で行う。
【００７５】
［実施例６］
十二糖（ＩＩＩ）の定量
本発明による十二糖（ＩＩＩ）定量をセムロパリンの多様な試料について行った。ＡＴＩＩＩに親和性を有するすべての十二糖画分の含有率および式（ＩＩＩ）の十二糖の含有率を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2014511929.tif 000006
【００７７】
これらの十二糖（ＩＩＩ）の定量は、以下に続く詳細なプロトコルに従って計算した。
【００７８】
６．１：ＧＰＣによる十二糖画分の単離
カラム：１００×２．６ｃｍ、固定相  バイオゲルＰ３０ファイン（バイオラッド）。
【００７９】
移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌＯ４；流速：０．６ｍｌ／分。
【００８０】
ＵＶ検出：２３２ｎｍおよび２０２ｎｍにおける二重検出を備えた島津ＳＰＤ２０Ａ検出装置。
【００８１】
注入：移動相およそ１から２ｍｌで希釈したセムロパリン１６５ｍｇ。注入のために、５ｍｌループを有するレオダインバルブを使用する。
【００８２】
分離全体はおよそ７００分間続く。各バッチでは１６５ｍｇの注入を３回行う。島津収集装置で収集を行う。試料Ｎ°３（表１を参照。）の分離のクロマトグラムを図６に表す（細線：２３２ｎｍにて検出；太線：２０２ｎｍにて検出）。十二糖画分のピークを矢印によって示す。
【００８３】
３回の分離の十二糖画分を収集して、セファデックスＧ１０カラム（４０×５ｃｍ）で脱塩する。こうして２５から５０ｍｇの間の十二糖画分が単離される。
【００８４】
６．２：十二糖画分のアンチトロンビン（ＡＴ）親和性クロマトグラフィー
この第２のステップは２つの目的：単離された画分から二重部位の定量を行うのに十分な量の親和性十二糖画分を精製すること、およびさらに、精製した十二糖画分中の親和性画分のパーセンテージを測定することを有する。
【００８５】
親和性画分を精製することに存する分取部分は、ヒトアンチトロンビン２ｇをグラフトしたセファロースＡＴカラム（３０×７ｃｍ）で行う。このクロマトグラフィーカラムは、特許出願ＷＯ  ２００７／０１２７５４の教示に従って調製する。親和性カラムを４℃にて貯蔵する。二重検出：２３２ｎｍにおけるＵＶ波長およびＮａＣｌ溶離を監視するための導電率測定検出を使用して分離を監視する。溶離勾配は、単純なステップ勾配である。使用した移動相は以下の通りである：
溶媒Ａ：０．２５Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭトリス、ｐＨ７．４
溶媒Ｂ：３．５Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭトリス、ｐＨ７．４
勾配：ｔ０分，％Ｂ＝０；ｔ１００分、％Ｂ＝１００；ｔ１３０分、％Ｂ＝１００；ｔ＞１９６分、％Ｂ＝０
流速：１２ｍｌ／分
分析時間：３１０分。
【００８６】
前の段階で精製した十二糖画分に分取親和性カラムで２回の注入によりクロマトグラフィーを行う。試料Ｎ°２に相当する、十二糖画分のクロマトグラムの実施例を図７に示す（表１を参照）。細線は２３２ｎｍにおけるＵＶ検出に相当し、太線は導電率（ｍＳ／ｃｍ）に相当する。
【００８７】
２回の注入から生じた親和性および非親和性画分を収集して、次に脱塩する。非親和性画分をＱセファロース・ファスト・フロー・カラム（２０×２．６ｃｍ）に流下させて、水ですすぐ。非親和性画分はカラムに完全に保持される。溶離は１Ｎ  ＮａＣｌＯ４溶液によって行う。２３２ｎｍのＵＶ下にて導電率測定により検出を行う。親和性画分を事前に水５リットルで希釈し、次にＱセファロース・ファスト・フロー・カラム（２０×１．６ｃｍ）に注入することにより、親和性画分を同じ方法で再濃縮する。最終脱塩は、セファデックスＧ１０カラム（２５×５ｃｍ）で、溶離液として水を１０ｍｌ／分にて注入して行う。脱塩画分を回転蒸発器で再濃縮して、１．６ｍｌ  ＨＰＬＣバイアル内に希釈する。ｐＨを検査し、５から７の間に調整する。
【００８８】
十二糖画分中でＡＴＩＩＩに対して親和性を有する構成要素のパーセンテージを決定するために、ブランクランを引いた後に、親和性クロマトグラフィー上の親和性化合物のピークのパーセンテージ表面（面積）を測定する。このパーセンテージは、分取親和性クロマトグラフィーによって得た２つのクロマトグラムで決定されるが、分析セファロースＡＴ親和性カラムでの同じ画分の注入による３つのクロマトグラムでも決定される。
【００８９】
分析カラムは分取カラムと同じ相が充填され、４０×１．５ｃｍの形状寸法を有する。分析条件は以下の通りである：
溶媒Ａ：０．２５Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭトリス、ｐＨ７．４
溶媒Ｂ：３Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭトリス、ｐＨ７．４
勾配：ｔ０分  ％Ｂ＝０；ｔ７５分  ％Ｂ＝１００；ｔ９０分  ％Ｂ＝１００；ｔ＞９１分  ％Ｂ＝０
流速：１ｍｌ／分。
【００９０】
注入量は、通例、十二糖１ｍｇの分取カラムよりもはるかに少ない。親和性化合物のパーセンテージは、分取クロマトグラフィーについて記載されているのと同じ方法に従って、クロマトグラム上で２３２ｎｍにて決定する。
【００９１】
各サンプルについて得られたパーセンテージは、分取（×２）および分析（×３）カラムで行った５回の決定の平均である。得られた結果は、上の表１にまとめられている。
【００９２】
６．３：親和性画分中の二重部位の定量
式（ＩＩＩ）の二重部位十二糖は、高分解能ＨＰＬＣ法により、即ちウォーターズアクイティＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ（２．１×１５０ｍｍ）ＵＰＬＣ（超高性能液体クロマトグラフィー）カラムにより、ペンチルアミンおよびＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）移動相を用いて定量する。カラム温度を６０℃に調整する。溶離液相は以下の通りである：
相Ａ：５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＦＩＰ、１５ｍｍｏｌ／ｌ  ペンチルアミン水溶液
相Ｂ：５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＦＩＰおよび１５ｍｍｏｌ／ｌ  ペンチルアミンを含む２５−７５体積／体積Ｈ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ
流速：０．２２ｍｌ／分
ＵＶ検出：２３２ｎｍおよび２４５分
セムロパリン試料Ｎ°５（表１を参照のこと。）の親和性画分のクロマトグラムを図８に示す（細線：２３２ｎｍにて検出；太線２４５ｎｍにて検出）。二重部位十二糖（ＩＩＩ）のピークを矢印で示す。このピークは、上の実施例２に従って単離形で得た本生成物の内部標準の使用により、十二糖（ＩＩＩ）に割り当てることができる。または、十二糖（ＩＩＩ）ピークの同定は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，Ｖｏｌ．８１，３４８５−３４９９のＣ．Ｄｏｎｅａｎｕ  ｅｔ  ａｌ．による教示に従って、アクイティカラムを質量分析法と連結することによって決定できる。質量分析法では、十二糖（ＩＩＩ）は、３２２６Ｄａ（プロトン化形）のこれの分子量により同定される。
【００９３】
二重部位十二糖（ＩＩＩ）の定量は、ブランクランを引いた後に、画分全体に対する対応するクロマトグラフィーピークのパーセンテージ表面積を計算することにより行う。１、２、３および４によって示されるピークの表面積がそれぞれ１１．７８３、３０６．９３４、４６５．６２５および３８７１．６５である積分の例を、図９（試料Ｎ°５、表１を参照のこと。）に示す。一例として、セムロパリンの１２の試料で得られた結果を上の表１で報告している。
【００９４】
［実施例７］
薬理学
本発明による多糖は、これの抗血栓特性および治療活性物質としてのこれの値を決定するための薬理学的試験の主題であった。
【００９５】
−アンチトロンビン親和性：
基準物質としての十二糖（ＩＩＩ）およびフォンダパリヌクスのアンチトロンビンとの相互作用を、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，２８３（３９），２６６６２−２６６６７５に記載されている方法に従って、蛍光滴定法によって試験した。結果を表２にまとめる。
【００９６】
【表２】
2014511929.tif 000007
【００９７】
これらの結果は、アンチトロンビンＩＩＩに対して、五糖のフォンダパリヌクス（第Ｘａ因子に対して特異的活性を有する合成五糖）よりも、高い親和性を有することを示している。試験を行った濃度により、十二糖（ＩＩＩ）は、フォンダパリヌクスの２．１から３．２倍の親和性を有する。これらの結果は、現在の知識を考慮すると、単一の親和性部位がアンチトロンビンＩＩＩと結合することが予想されたかもしれず、従って十二糖（ＩＩＩ）が、フォンダパリヌクスで見られたのと同程度の親和性レベルを示すことが予想されたかもしれないという点で驚くべきである。たまたまこれらの結果は、２つの親和性部位のどちらもＡＴＩＩＩに結合すること、または一方の部位だけが結合して、第２の部位が結合を補強することを示唆している。いずれにしても、十二糖（ＩＩＩ）は、アンチトロンビンＩＩＩに対する強い親和性を示す。
【００９８】
−血漿中または緩衝媒体中での抗ＦＸａ活性：
十二糖（ＩＩＩ）の抗ＦＸａ活性は、凝固を測定するためのＡＣＬ  ７０００自動化装置（インスツルメンテーションラボラトリー）により、アンチトロンビンＩＩＩ、第Ｘａ因子および発色性基質Ｓ−２７６５を含有するヘパリン（登録商標）キットプリパレーション（インスツルメンテーションラボラトリー）を使用して決定した。測定は、メーカーの勧告に従って行った。第２低分子量ヘパリン国際標準（国立生物学的製剤研究所、ロンドン、英国、２００３年に制定、コード番号０１／６０８）を使用して、較正曲線を作成した。エノキサパリン（クレキサン（登録商標））およびフォンダパリヌクス（アリクストラ（登録商標））を内部標準化合物として使用した。
【００９９】
試験試料または第２ＬＭＷＨ国際標準を最初に、標準ヒト血漿（インスツルメンテーションラボラトリー）または緩衝剤（０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１５４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）で希釈した。血漿または緩衝媒体中に試料を含有する試験溶液を次にアンチトロンビンを含有する緩衝溶液で１：２０に希釈して、この目的のために設けられた装置の箇所に２つずつ配置する。第Ｘａ因子試薬および発色性基質を、この目的のためにＡＣＬ  ７０００装置内に設けられたリザーバ中に導入する。抗ＦＸａ活性試験を、ＡＣＬ  ７０００のユーザインタフェース（「ソフトウェア」）中に組み込まれている「ヘパリン」プログラムに従って行う。アッセイの間に、緩衝剤で希釈した試料５０μｌを第Ｘａ因子試薬５０μｌと混合する。３７℃にて６０秒間のインキュベーション時間の後、発色性基質５０μｌ（１．１ｍＭ）を添加して、吸光の変化を波長４０５ｎＭにおける時間の関数として測定する。試験を行った試料の抗ＦＸａ活性は、第２ＬＭＷＨ内部標準（コード番号０１／６０８）を用いて作成した較正曲線を使用して決定した。
【０１００】
結果を表３にまとめる。
【０１０１】
【表３】
2014511929.tif 000008
【０１０２】
これらの結果は、十二糖（ＩＩＩ）と五糖のフォンダパリヌクスとの間の比較可能な抗ＦＸａ活性を重量によって示す。しかし、モルベースでは、本発明による十二糖は、表４に示すように、フォンダパリヌクス基準の２倍強力である（ナトリウム塩の形のフォンダパリヌクスおよび十二糖（ＩＩＩ）のそれぞれのモル質量：１７２８および３６６８ｇ／ｍｏｌ）。
【０１０３】
【表４】
2014511929.tif 000009
【０１０４】
六糖配列単独（上で定義した配列）について同じ結論を導くことができる：本発明による十二糖は、これの抗ＦＸａ活性が約８００ＩＵ／ｍｇであるため、この活性がモルベースで報告される場合には、２倍の高さの抗ＦＸａ活性を示す。
【０１０５】
同様に、本発明の十四糖類では、モルでの抗ＦＸａ活性は、五糖のフォンダパリヌクスと比較して、約２倍高い（表５を参照のこと。）。
【０１０６】
本発明による十四糖類では、抗ＦＸａ活性を測定するためのプロトコルは、アンチトロンビンＩＩＩによる第Ｘａ因子の阻害を加速する化合物の能力を決定するアッセイによって試験管内で決定された。抗ＦＸａ活性の国際単位は、被験物質の国際標準の所与の量の活性に相当する。第２国際標準（上を参照のこと。）との比較により国際単位で較正された、欧州薬局方に収載されている低分子量ヘパリン（ＢＲＰ：生物学的基準調製品（Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ））は、基準調製品として作用する。基準溶液および被験物質の、２つの独立した系列の４つの希釈物を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩化ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ  ７．４で調製する。吸光度が濃度の対数の関数として表される場合に線形応答が得られるように、希釈度を選ぶ。基準調製品および被験物質の希釈物２０μｌをマイクロプレートに配置して、アンチトロンビンＩＩＩ溶液２０μｌと混合する。６０秒のインキュベーション時間の後、ウシ第Ｘａ因子溶液４０μｌを添加する。６０秒のインキュベーションの後、発色性基質１００μｌを添加する。反応を４分後に酢酸１００μｌによって停止させる。４０５ｎｍの波長にて吸光度を測定する。抗ＦＸａ活性は、欧州薬局方の§５．３に記載されている並行オンライン滴定ための統計解析の通例の条件を使用して計算する。被験物質の活性は、未修正ベース（含水量損失についての補正なし）での１グラム当たりの抗ＦＸａ活性の国際単位で表される。
【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
さらに、現在まで治療で最も広範に使用されているＬＭＷＨであるエノキサパリン（サノフィ−アベンティスによるロベノックス（登録商標）またはクレキサン（登録商標））と比較して、本発明による十二糖（ＩＩＩ）ならびに十四糖類（ＩＶ）、（Ｖ）および（ＶＩ）は、第Ｘａ因子に対してはるかに強力である（表３および５を参照のこと。）。本発明による多糖が誘導される出発ＵＬＭＷＨであるＡＶＥ５０２６について、同じことが当てはまる（上の実施例１を参照のこと。）。
【０１０９】
従って本発明による化合物は、これの化学構造（２個のＡＴＩＩＩ結合部位の存在）およびこれの薬理学的特性（非常に高い抗ＦＸａ活性、ＡＴＩＩＩに対して、基準化合物のフォンダパリヌクスよりも強い親和性）の両方の観点から、驚くべきである。
【０１１０】
従って発明による多糖は、これの強力な抗血栓特性のために、薬剤、特に抗血栓薬の調製に使用できる。従って本発明の別の主題は、本発明による多糖を酸形またはこれの医薬として許容される塩の形で含む薬剤である。
【０１１１】
このような薬剤は、特に、静脈および動脈血栓症、深部静脈血栓症ならびに肺塞栓症を含む血栓症を処置および予防するための療法において有用である。
【０１１２】
これの別の態様により、本発明は、本発明による多糖を活性成分として含む医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、本発明による少なくとも１つの化合物または前記化合物の医薬として許容される塩の有効用量および少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤も含有する。前記賦形剤は、望ましい製薬形および投与方法に従って、当業者に公知である通常の賦形剤から選ばれる。
【０１１３】
本発明による医薬組成物は、抗血栓オリゴ糖類から選ばれる少なくとも１つの他の活性成分をも、これらが合成であるか（単糖またはオリゴ糖中間体からの化学合成によって得られる。）またはヘパリンまたはＬＭＷＨ源からの単離によって得られるかにかかわらず、含むことができる。
【０１１４】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、外用、局所、気管内、鼻内、経皮または経直腸投与のための本発明の医薬組成物において、上の式（Ｉ）の活性成分またはこれの塩は、上述の病状を予防または処置するために、動物またはヒトに従来の医薬賦形剤との混合物として単位投薬形で投与できる。
【０１１５】
これの別の態様により、本発明は、本発明による化合物またはこれの医薬として許容される塩の有効用量の患者への投与を含む、上で指摘した病状を処置および処置する方法にも関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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