(57)【要約】  本発明は、ワクチンのための分子アジュバントとしての脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）の使用に関する。他の用途に加えて、該ワクチンは、ウイルス、細菌並びに哺乳動物、鳥類及び水生生物に影響を及ぼす外寄生生物などの感染性因子に対する防御に使用することができる。ＰＡＣＡＰは、特異的抗原と組み合わせると、該抗原に対する宿主の免疫応答を高め、アジュバントとしてのその有効性を示す。ＰＡＣＡＰを含むワクチン組成物又は組み合わせが経口、注射、又は水生生物の場合には浸漬浴により投与される場合に、このタイプの応答を観察することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン抗原の分子アジュバントとしての「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」（ＰＡＣＡＰ）の使用。
【請求項２】
前記ペプチドがペプチド又は核酸として投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＰＡＣＡＰペプチドがａ）その天然源からの単離により、ｂ）化学合成により、又はｃ）組換えＤＮＡ技術により得られる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ワクチン抗原が感染性因子により引き起こされる疾患の予防に使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記疾患が哺乳動物、魚類、又は鳥類において発生する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記感染性因子がウイルス、細菌又は外寄生生物である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」（ＰＡＣＡＰ）、少なくとも１つのワクチン抗原及び薬学的に許容可能な媒体又は希釈剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項８】
感染性因子により引き起こされる疾患の予防のために使用される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
経口、注射又は浸漬浴により投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
ＰＡＣＡＰがａ）その天然源からの単離により、ｂ）化学合成により、若しくはｃ）組換えＤＮＡ技術により得られたペプチド；又は核酸として投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＡＣＡＰが、配合食料として与えられる場合には５０〜７５０μｇ／Ｋｇ食料の濃度で、注射により与えられる場合には０．１〜１０μｇ／ｇ体重の濃度で、又は浸漬浴により与えられる場合には５０〜１０００μｇ／リットル水の濃度で使用される、請求項９及び１０に記載の組成物。
【請求項１２】
「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」（ＰＡＣＡＰ）及び少なくとも１つのワクチン抗原を含む、ワクチンの組み合わせ。
【請求項１３】
前記ＰＡＣＡＰ及び前記抗原が同じ免疫化スケジュール間において同時、個別又は連続的に投与される、請求項１２に記載の組み合わせ。
【請求項１４】
ＰＡＣＡＰが、配合食料として与えられる場合には５０から７５０μｇ／ｋｇ食料の濃度で、注射により与えられる場合には０．１〜１０μｇ／ｇ体重の濃度で、浸漬浴により与えられる場合には５０〜１０００μｇ／リットル水の濃度で使用される、請求項１３に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
ワクチン抗原への免疫応答を上昇させる方法であって、「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」（ＰＡＣＡＰ）を前記抗原のアジュバントとして含む組成物の使用を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１６】
アジュバントとしての前記ＰＡＣＡＰ及び前記抗原を含む組成物が同じ免疫化スケジュール間において同時、個別又は連続的に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＡＣＡＰペプチドがａ）その天然源からの単離により、ｂ）化学合成により、若しくはｃ）組換えＤＮＡ技術により得られるか又は核酸として得られる、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、具体的にはワクチン開発及びワクチンのためのアジュバントについての、医薬、分子生物学及び免疫学の分野に関する。とりわけ、本発明は免疫化戦略に使用されるワクチンのための分子アジュバントとしての脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種の主な目的は病原体に対する特異的で効果的な免疫応答を誘導することであり、そのことにより感染及び／又は疾患に対する防護も行い、病原体を除去する。ワクチン製剤にある種の化合物を加えることにより特定の抗原に対する免疫応答が改善され得るという概念は約１００年前に示され、その時にはアルミニウム塩が製剤の中へ導入され「アジュバント」と呼ばれた（Ｇ．Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓ（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８Ｓ  Ｃ２５−Ｃ３６）。
【０００３】
従来のワクチンは不活化又は弱毒化した病原体又はそれらの微生物由来の毒素から構成される。不活化又は弱毒化した病原体を使用すると高い免疫原性を示すが、これらの製剤の高い毒性のため現在のところワクチン学においては魅力的ではない。
【０００４】
したがって、組換えタンパク質サブユニット、合成ペプチド及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プラスミドに基づいた新世代ワクチンの開発に関連するアジュバントの研究分野が関心を集めている。これらの新しい変種ワクチン体は、毒性が低いものの、免疫刺激アジュバントなしに投与された際に大部分は免疫原性が低い。この理由のために、近年では、より安全で強力なアジュバントの必要性が高まっている（Ｓａｅｎｚら（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（４７）：７５５６−７５６２）。
【０００５】
アジュバントの使用はよく知られているものの、それらがどのように作用するかについては、あまり明確ではない。一般的に、アジュバントは下記の項目を含むいくつかのメカニズムによりワクチンの効能を高めると考えられている。１）抗原のプロセシングと樹状突起細胞による提示を促進させること、２）「Ｔｏｌｌ様」受容体のような病原体に付随したパターンを認識する受容体により仲介されるシグナル伝達経路による「危険」信号を誘導すること、及び、３）リンパ球を活性化させる共刺激シグナルを活性化させること。これらのメカニズムはサイトカイン誘導と適切な共刺激シグナルの発現の上方制御により引き起こされる（Ｓｅｃｏｍｂｅｓ（２０１０）Ｆｉｓｈ  ＆  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４０９−４１６）。
【０００６】
いくつかの内在性分子及びタンパク質（Ｙｉｎ  ａｎｄ  Ｋｗａｎｇ（２０００）Ｆｉｓｈ  ＆  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，３７５−３７８；Ｌｉｎｇｎａｕら（２００７）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ６（５）：７４１−６；Ｚｈａｎｇら（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：５１１４−５１２７）がアジュバントとして研究されてきている。また、ある種の免疫刺激ペプチドがインビボにおいてタンパク質又はペプチド抗原の免疫応答を刺激するアジュバントとして作用し得ることが知られている（Ｓａｅｎｚら（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（４７）：７５５６−７５６２）。
【０００７】
ＰＡＣＡＰはセクレチン／グルカゴン／血管作用性腸ペプチドのスーパーファミリーに属している（Ｍｉｙａｔａら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １６４：５６７−５７４）。それは神経栄養性及び下垂体刺激性因子として、哺乳動物における神経伝達物質、神経調節物質及び血管拡張剤分子として、重要な役割を果たす多機能性神経ペプチドである（Ａｒｉｍｕｒａ  Ａ．（１９９８）Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４８：３０１−３１）。その役割は細胞分裂及び分化において、また細胞死においても実証されている（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２１：６１９−６７０）。このペプチドは３８（ＰＡＣＡＰ３８）及び２７（ＰＡＣＡＰ２７）アミノ酸の２つの分子型が存在する（Ｍｉｙａｔａら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １７０：６４３−８）。ＰＡＣＡＰの生物学的活性はセクレチン・Ｇタンパク質共役受容体：ＰＡＣＡＰに高度に特異的でありＰＡＣ−１と呼ばれるタイプＩ受容体；及びＰＡＣＡＰについて血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）と同様の親和性を示し、ＶＰＡＣ−１及びＶＰＡＣ−２として知られるタイプＩＩ受容体（Ｖａｕｄｒｙら（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５２：２６９−３２４）に属する３つのＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体ファミリーによって発揮される。
【０００８】
ＰＡＣＡＰは免疫系に関連するものを含む様々な組織に広く分布しているが、哺乳動物の免疫系細胞内におけるこのペプチド及びその受容体の存在は部分的に解明されているに過ぎない（Ｇａｙｔａｎら（１９９４）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２７６：２２３−７，Ａｂａｄら（２００２）Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  １０：１７７−８６）。
【０００９】
ＰＡＣＡＰは炎症反応をインターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の制御により調節する（Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５６（１１）：４１２８−３６；Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ８５（２）：１５５−６７，Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６３（５）：５９１−６０１）。
【００１０】
活性化されたマクロファージにおいて、ＰＡＣＡＰは炎症誘発性サイトカインの産生を阻害し、抗炎症性サイトカインの産生を刺激することにより、免疫系の恒常性を促す。さらに、ＰＡＣＡＰは共刺激分子Ｂ７．２／Ｂ７．１の発現とそれに続くヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）の活性化を減少させることが知られている。一方で、ＰＡＣＡＰは活性化マクロファージにおいてそのＰＡＣ−１受容体によるＩＬ−６の産生を阻害し、炎症を抑制する（Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ８５（２）：１５５−６７，Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９８，６３（５）：５９１−６０１）。激しい炎症刺激に応答したＩＬ−６転写に対するＰＡＣＡＰの阻害活性は、組織の保護と免疫系の恒常性に役立つ（Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ８５（２）：１５５−６７；Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｍａｙ；６３（５）：５９１−６０１）。それとは対照的に、ＰＡＣＡＰは刺激されていないマクロファージにおいてＢ７．２の発現を誘導し、Ｔｈ２への細胞分化を促進する（Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｇａｎｅａ（２００１）Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）４９（２）：１０１−１０）。ＰＡＣＡＰはアヒルのリンパ系器官において存在していることが報告されている（Ｓｑｕｉｌｌａｃｉｏｔｉら（２００５）Ａｎａｔｏｍｉａ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉａ，Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｉａ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３４，Ｉｓｓｕｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  １，ｐａｇｅ  ４９）。
【００１１】
哺乳動物においてＰＡＣＡＰを感染性ショック、関節リウマチ関節リウマチ及びクローン病などの自己免疫疾患を治療するための治療剤として使用することが提案されている（Ｇｏｍａｒｉｚら（２００６）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０７０：５１−７４）。自己免疫疾患においては生体物質及び組織に対する制御できない免疫応答があることが知られている。この点において、ＰＡＣＡＰは自己免疫疾患の動物モデルにおいて、サイトカインとケモカインとその受容体の適切なバランス、免疫細胞の動員、並びにＴｈ１細胞及びそれらの細胞が分泌するサイトカインの産生及び活性化を制御することにより炎症を防ぐ。
【００１２】
さらに、「Ｔｏｌｌ様」受容体などの免疫系の恒常性に関わる分子は、適応免疫応答を増強する先天性免疫応答の活性化に不可欠であることが知られている。しかし、この応答は急性及び／又は慢性炎症、自己免疫及び癌の原因につながる可能性がある（Ｇｏｍａｒｉｚら（２０１０）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  １６：１０６３−１０８０）。この点において、ＶＩＰ−ＰＡＣＡＰ系はこれらの受容体をコードする遺伝子の発現制御に関わっていることが知られている（Ｇｏｍａｒｉｚら（２００６）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０７０：５１−７４）。したがって、両ペプチドはこれらの受容体の産生の制御経路において障害をもたらし得る。
【００１３】
ＰＡＣＡＰは内因性分子ＨＭＧＢ１（高移動度グループボックス１）（Ｔａｎｇら（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８（１２）：１６４６−１６５１）により仲介されるサイトカインの循環レベルを減弱させ、それらの放出を阻害する。ＨＭＧＢ１分子及びその派生ペプチドはアジュバントとして作用することができ、ペプチド抗原及びタンパク質に対する免疫応答を亢進することが知られている（Ｓａｅｎｚら（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（４７）：７５５６−７５６２）。
【００１４】
魚類の免疫応答の調節におけるＰＡＣＡＰの機能についての知識は我々の研究グループにより行われている研究に限定されている。我々は浸漬浴又は注射により投与された組換えクラリアス・ガリエピヌス（Ｃｌａｒｉａｓ  ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）ＰＡＣＡＰが仔魚及び稚魚において、成長を促進するのみでなく、自然免疫パラメータ（リゾチーム、一酸化窒素由来代謝産物及び抗酸化防御）並びに後天免疫（ＩｇＭ）を刺激することを実証した（Ｃａｒｐｉｏら（２００８）Ｆｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２５：４３９−４５；Ｌｕｇｏら（２０１０）Ｆｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：５１３−５２０）。これらのＰＡＣＡＰの特性は国際特許出願ＷＯ２００７／０５９７１４「水生生物養殖のための神経ペプチド（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｏｓ  ｐａｒａ  ｅｌ  ｃｕｌｔｉｖｏ  ｄｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍｏｓ  ａｃｕａｔｉｃｏｓ）」に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
現在、ヒト及び獣医学の分野において、現存のワクチンに取り込むことができる安全でより有効なアジュバントとして使用できる化合物を同定することに、なお関心がもたれており、それらは開発途上である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は同時投与される抗原に対する免疫応答を強く増強することができる新しいアジュバント代替物を提供することにより上述の課題を解決するものであり、したがって、高い効果を有するアジュバントをなすものである。様々な免疫化戦略において使用されるワクチン内に存在する抗原のための分子アジュバントとしての「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」（ＰＡＣＡＰ）の使用が本発明の目的である。この発明の一実施形態において、アジュバントとしてＰＡＣＡＰを含む前記ワクチンは感染性因子に対する免疫化のために設計される。これらの感染性因子はとりわけウイルス、細菌及び外寄生生物であってよい。特別な実施形態において、これらの感染性因子に、哺乳動物、鳥類及び魚類が罹患する。
【００１７】
本発明で使用する用語、「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）」は、天然源から単離されたか、化学合成により生成されたか、又は組換えＤＮＡ技術により生成された、この分子の任意の変種（ＰＡＣＡＰ２７又はＰＡＣＡＰ３８）を含みペプチドとしての使用又は核酸の形態での使用を含む。
【００１８】
この発明の内容において、用語「分子アジュバント」はワクチン抗原に対する免疫応答を調節し、増強することができる任意のタンパク質源の分子を言う。
【００１９】
現在までに、ＰＡＣＡＰの分子アジュバントとしての使用を実証した研究は無い。前述のように、哺乳動物においてこのペプチドを感染性ショック、関節リウマチ及びクローン病などの自己免疫疾患の治療のための治療剤として使用することが提案されている（Ｇｏｍａｒｉｚら（２００６）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７０：５１−７４）。この点において、ＰＡＣＡＰは自己免疫疾患の動物モデルにおいて、サイトカインとケモカインとその受容体の適切なバランス、免疫細胞の動員、並びにＴｈ１細胞及びそれらの細胞が分泌するサイトカインの産生及び活性化を制御することにより炎症を防ぐ。これらの知見を考慮すれば、我々の研究の一部として見出されたＰＡＣＡＰの効果、つまり、ＰＡＣＡＰを抗原と組み合わせて投与すると、刺激誘発性サイトカインの刺激及び体液性免疫応答の他の要素により、該抗原に対する免疫応答を上昇させるという効果は、予期できないものである。
【００２０】
さらに、ＶＩＰ−ＰＡＣＡＰ系は「Ｔｏｌｌ様」受容体をコードする遺伝子発現の制御に関わるものであることが知られている（Ｇｏｍａｒｉｚら（２００６）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０７０：５１−７４）。この意味で、いずれのペプチドもこれらの受容体の産生の制御経路において障害をもたらす可能性があるため、それをワクチンアジュバントとして使用することは自明ではない。本発明において開示するＰＡＣＡＰの新しい使用と対照をなすもう一つの要素は、このペプチドが内因性ＨＭＧＢ１分子（Ｔａｎｇら（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８（１２）：１６４６−１６５１）により仲介されるサイトカインの循環レベルを減弱させ、その放出を阻害するということについての実証である。
【００２１】
本発明において、体液性及び細胞性免疫応答の両方のレベルで観察される、ＰＡＣＡＰと同時投与されたワクチン抗原に特異的な免疫応答の上昇が、初めて実証された。
【００２２】
本発明の他の目的は、アジュバントとしてのＰＡＣＡＰ、少なくとも１つのワクチン抗原及び薬学的に許容可能な媒体又は希釈剤を含むワクチン組成物である。アジュバントとしてのＰＡＣＡＰ及び少なくとも１つの関心の抗原を含むワクチン組成物により、該単数又は複数の抗原に対する局所的若しくは全身的な免疫応答が生じる。本発明のワクチン又はワクチン組成物は、例えば、組換えタンパク質、弱毒化微生物又は核酸に基づいてもよい。本発明の一実施形態において、前述のワクチン組成物は経口、注射又は浸漬浴により投与される。
【００２３】
本発明の内容において、このようなワクチン組成物中、ＰＡＣＡＰは天然源からの単離された、化学合成又は組換えＤＮＡ技術により得られたペプチドとして投与される。ＰＡＣＡＰは核酸として使用してもよい。
【００２４】
本発明の異なる実施形態において、いくつかの抗原と組み合わせてＰＡＣＡＰを含むワクチンは哺乳動物、鳥類、及び魚類に投与され、初めてＰＡＣＡＰのアジュバント効果が示された。意外にも、抗原と組み合わせて神経ペプチドＰＡＣＡＰを投与すると哺乳動物、鳥類及び魚類における該抗原に対する特異的抗体のレベルが上昇することが観察された。さらに、ＰＡＣＡＰは魚類白血球内のインターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）及びインターロイキン１５（ＩＬ１５）の転写物を顕著に上昇させることがインビトロにおいて初めて実証された。
【００２５】
ＰＡＣＡＰをアジュバントとして含むワクチン組成物又は組み合わせを開示する本発明の異なる実施形態において、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のＥ２糖タンパク質、鳥インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）、カリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）のポリペプチドｍｙ３２、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）の不活化細胞、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）の１０６ｋＤａポリタンパク質（ＮＨ２−ＶＰ２−ＶＰ４ＶＰ３−ＣＯＯＨ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）のＧ糖タンパク質及び繊毛寄生虫イクチオフチリウス・ムルチフィリス（Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｉｌｉｉｓ）などの種々の抗原が使用される。
【００２６】
発明の特定の実施形態において、ワクチン組成物中に、ＰＡＣＡＰは配合食料として５０から７５０μｇ／ｋｇ食料の濃度で与えられる。本発明の第２の実施形態において、ＰＡＣＡＰは注射により０．１から１０μｇ／ｇ体重の濃度で与えられる。本発明の他の実施形態において、ＰＡＣＡＰは水生生物体に浸漬浴により５０から１０００μｇ／リットル水の濃度で与えられる。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、抗原及びアジュバントＰＡＣＡＰはワクチン組成物の一部であり、その要素は同じ免疫化プロトコール間において同時、個別又は連続的に投与される。本発明の特別な実施形態において、組み合わせはウイルス、細菌及び寄生物疾患の予防に使用される。このワクチンの組み合わせにおいては、ＰＡＣＡＰ及び単数又は複数の抗原は、経口、注射又は浸漬浴により投与される。
【００２８】
特定の実施形態において、このＰＡＣＡＰは配合食料として５０から７５０μｇ／ｋｇ食料の濃度で与えられる。第２の実施形態において、このＰＡＣＡＰは注射により０．１から１０μｇのペプチド／ｇ体重の濃度で与えられる。本発明の他の実施形態において、ＰＡＣＡＰは浸漬浴により５０から１０００μｇのＰＡＣＡＰ／リットル水の濃度で魚類へ与えられる
【００２９】
本発明の他の態様は、「脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド」（ＰＡＣＡＰ）を抗原のアジュバントとして含むワクチン組成物を使用して、抗原への免疫応答を上昇させる方法である。本発明に記載の方法によると、アジュバントとしてのＰＡＣＡＰ及び抗原は同じ免疫化スケジュール間において同時、個別又は連続的に投与することができる。ＰＡＣＡＰはその天然源から、化学合成により、又は組換えＤＮＡ技術により得られるペプチドとして、本発明の方法におけるアジュバントとして使用される。また、本発明はアジュバントとして使用されるＰＡＣＡＰが核酸の形態で投与される方法を含む。本発明の方法によると、ＰＡＣＡＰと同時投与されたワクチン抗原に特異的な免疫応答の上昇が体液性及び細胞特異的免疫応答の両者において起こる。
【００３０】
発明のいくつかの実施形態において実証されるように、関心の抗原に対する免疫応答の増強又は上昇が、様々な感染性因子（ウイルス、細菌及び外寄生生物体を含む）に対するより高いレベルの防御として発現される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】マウスにおいて神経ペプチドＰＡＣＡＰ３８と同時投与したＯＶＡで免疫化することにより誘導された総免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ａ）、ＩｇＧ１（Ｂ）及びＩｇＧ２ａ（Ｃ）のタイトルを示す図である。動物６匹ずつの２つの実験群を使用した。陰性対照群（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／ＯＶＡ）には、０日目と７日目に６μｇ  ＯＶＡ／０．２ｍＬ  ＰＢＳの用量で腹腔内接種した。ＰＡＣＡＰ３８（ＰＢＳ／ＯＶＡ＋ペプチド）を投与した群には、０日目と７日目に６μｇ  ＯＶＡ＋０．５μｇ  ＰＡＣＡＰ３８／０．２ｍＬ  ＰＢＳの用量で腹腔内に接種した。それぞれの文字は有意差を示す。
【図２】Ｅ２−ＰＡＣＡＰに基づくワクチン組成物によりワクチン接種したブタにおける細胞性免疫応答の評価を示す図である。Ｅ２（群１）、Ｅ２＋ＰＡＣＡＰ（群２）及びプラセボ（群３）によるワクチン接種後５日後に単離したブタリンパ球における細胞性免疫応答を測定した。（Ａ）リンパ球増殖アッセイ：実験結果は刺激された培養物のカウント／分（ｃｐｍ）と未処理の対照群のｃｐｍとの間の比により定義される刺激インデックス（ＳＩ）により表した。ＳＩ≧２のリンパ球増殖反応は陽性であると考えられる。（Ｂ）リアルタイムＰＣＲによるＩＦＮ−γ分泌の決定。値は２−△△Ｃｔの算術平均により表した。（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図３】ＨＡ又はＨＡ−ＰＡＣＡＰで免疫化したニワトリにおける赤血球凝集阻害（ＨＩ）価を示す図である（Ａ）。抗体価の算術平均は赤血球凝集阻害を生じる血清の最高希釈度の逆数のｌｏｇ２値として表した。（Ｂ）免疫化したニワトリにおける細胞性免疫応答を示す図である。ＩＦＮ−γ分泌はリアルタイムＰＣＲにより決定した。値は２−△△Ｃｔの算術平均として表した。（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図４】若いニジマスの末梢血白血球（Ａ）及び前腎（Ｂ）内のＩＬ１βの転写におけるＰＡＣＡＰ３８のインビトロでの効果のリアルタイムＰＣＲによる発現解析を示す図である。１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ及び１０−８Ｍの濃度でのＰＡＣＡＰ投与の効果を処置後４８時間において評価した。実験は４回、繰り返した。白血球培養液は二連で処理し、ＰＣＲは三連で実行した。データは内在性伸長因子ＥＦ１αに対するＩＬ１βの相対的発現量の平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。（＊）ｐ＜０．０５。＊（ｐ＜０．０５）は関心の遺伝子の相対的発現は未処理の白血球培養液（陰性対照）中の相対的発現と比較して統計学的により高いことを意味する。
【図５】若年ニジマスの末梢血白血球（Ａ）及び前腎（Ｂ）内ＩＬ１５の転写に対するＰＡＣＡＰ３８のインビトロでの効果のリアルタイムＰＣＲによる発現解析を示す図である。１０−１０Ｍ，１０−９Ｍ及び１０−８Ｍの濃度でのＰＡＣＡＰ投与の効果は処置後４８時間において評価した。実験は４回、繰り返した。白血球培養液は二連で処理し、ＰＣＲは三連で実行した。データは内在性伸長因子ＥＦ１αに対するＩＬ１５の相対的発現量の平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。（＊）ｐ＜０．０５。
【図６】コイのＡ・ハイドロフィラに対する凝集抗体価を示す図である。Ｙ軸の値は抗体価の算術平均±標準誤差を表す。（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１。群１：ＰＢＳを注射したもの、群２：ホルマリンで不活化したＡ・ハイドロフィラ細胞を注射したもの、群３：ホルマリンで不活化したＡ・ハイドロフィラ細胞及びＰＡＣＡＰ（１μｇ／匹）を注射したもの。
【図７】１μｇ／匹の用量のＤＮＡワクチン（ｐＰ−ＩＰＮＶ）及びヒトサイトメガロウイルス（ｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ）の最初期プロモーターの制御下でクラリアス・ガリエピヌス（Ｃｌａｒｉａｓ  ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）ＰＡＣＡＰ  ｃＤＮＡを有するプラスミドＤＮＡを筋肉内注射により同時投与した場合の効果を示す図である。ワクチン接種後３０日目、１００μＬのＩＰＮＶ（１×１０７（ＴＣＩＤ５０）ｍｌ−１／匹）の腹腔内注射により、魚をウイルスに曝露した。感染後７日目、前腎におけるウイルス量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価するために群当たり１０匹の魚を屠殺した。値は平均±標準偏差を表す。それぞれの上付き文字は、群間の統計的有意差を表す。群１：ＰＢＳを注射したもの、群２：１μｇ／匹の用量のｐＰ−ＩＰＮＶを注射したもの、群３：ｐＰ−ＩＰＮＶ（１μｇ／匹）とｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ（０．５μｇ／匹）を同時に注射したもの、群４：ｐＰ−ＩＰＮＶ（１μｇ／匹）とｐＣＭＶ（０．５μｇ／匹）を同時に注射したもの、群５：ｐＰ−ＩＰＮＶ（１μｇ／匹）とｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ（０．０５μｇ／匹）を同時に注射したもの、群６：ｐＰ−ＩＰＮＶ（１μｇ／匹）とｐＣＭＶ（０．０５μｇ／匹）を同時に注射したもの。
【図８】ＶＨＳＶの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子に基づくＤＮＡワクチン（ｐＧ−ＶＨＳＶ）及びペプチドＰＡＣＡＰを筋肉内免疫したニジマスの累積死亡率。ワクチン接種後４週目、魚は浸漬浴によりウイルス（１×１０５  ＴＣＩＤ５０  ｍＬ−１／匹）に曝露した。負荷試験後４週間、累積死亡率を評価した。群１：ＰＢＳを注射したもの、群２：ｐＧ−ＶＨＳＶ（０．０１μｇ／匹）を注射したもの、群３：ｐＧ−ＶＨＳＶ（０．０１μｇ／匹）及びＰＡＣＡＰ（０．１μｇ／匹）を注射したもの、群４：ｐＧ−ＶＨＳＶ（０．０１μｇ／匹）及びＰＡＣＡＰ（０．５μｇ／匹）を注射したもの。
【実施例】
【００３２】
（例１）マウスにおける体液性免疫応答についてのＯＶＡとＰＡＣＡＰの共免疫化の効果
体重２０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１２）を６匹ずつの２つの実験群に分けた。陰性対照群（ＰＢＳ／ＯＶＡ）には、０日目と７日目に６μｇ  ＯＶＡ／０．２ｍＬ  ＰＢＳの用量で腹腔内注射した。ＰＡＣＡＰ３８（ＰＢＳ／ＯＶＡ＋ペプチド）で処理した群には、０日目と７日目に６μｇ  ＯＶＡ＋０．５μｇ  ＰＡＣＡＰ３８／０．２ｍＬ  ＰＢＳの用量で腹腔内注射した。免疫化プロトコールの１５日目に、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ価を評価するために各々の魚から採血した。
【００３３】
図１Ａ、Ｂ及びＣはそれぞれ、ＯＶＡをＰＡＣＡＰ３８と同時投与することにより免疫化したマウスにより誘導された全ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ価を示す。ＰＢＳ／ＯＶＡ＋ペプチド群の動物のＯＶＡに対する特異的な全ＩｇＧ価は、対照群に比べて、統計学的に優れた値であることを示した（図１Ａ）。同様に、我々はＯＶＡ＋ＰＡＣＡＰで免疫化した群においてＯＶＡに対して特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの名目が、ＯＶＡのみで免疫化した群で観察されたよりも有意に高いことを観察した（図１Ｂ及び１Ｃ）。
【００３４】
（例２）Ｅ２−ＰＡＣＡＰに基づいたワクチン組成物によりワクチン接種を行ったブタにおける細胞性免疫応答の評価
抗原Ｅ２はＣＳＦＶの主要な外被糖タンパク質である。Ｅ２−ＰＡＣＡＰに基づいたワクチン組成物でワクチン接種したブタにおける細胞性免疫応答を評価するため、及びその反応をＥ２抗原により生じたものと比較するために、我々は平均２０ｋｇでｍＣＳＦＶに対して血清学的に陰性である１８匹の健康なブタを、その前３年間にこの疾患歴とＣＳＦＶに対するワクチン接種歴の無い農場から選択した。ブタは６匹ずつの３つの異なる群に仕分け、自由に水と食料を与えた。１回の免疫化において各々のワクチン組成物を次のように投与した：２５μｇの組換えＥ２（群１）、及び同様の量のＰＡＣＡＰ３８を同時に投与した２５μｇのＥ２（群２）。群３はプラセボ群に設定した。免疫原はオイルアジュバントのエマルジョンとして製剤し、２ｍＬの最終容量で筋肉内注射により接種した。動物は免疫化後８日目に、ＣＳＦＶの筋肉内注射により負荷試験を課した（１０５ＬＤ５０の「マルガリータ（Ｍａｒｇａｒｉｔａ）」単離）。我々は臨床徴候について日単位の解析を行い、細胞性免疫応答の指標としてリンパ球増殖及びＩＦＮ−γの発現を測定するために３日目と５日目に血液サンプルを採取した。Ｅ２−ＰＡＣＡＰにより免疫化した動物はリンパ球反応の上昇を検出し（図２Ａ）、５日目にＩＦＮ−γが他の群に比べて最も高いレベルに達した（図２Ｂ）。この結果はＥ２抗原をＰＡＣＡＰと共に同時投与すると、ブタのＣＳＦＶに対する細胞性免疫応答を生じることを示すものである。
【００３５】
（例３）鳥インフルエンザウイルス（Ａ型ウイルス／ベトナム１２０３／２００４）のＨＡ及びＰＡＣＡＰの共免疫化によるニワトリの体液性及び細胞性免疫応答における効果
免疫化には生後３週齢の白レグホン種ニワトリを使用した。１０匹ずつ３つの実験群を使用した。
群１：２０μｇのＨＡを注射した。
群２：２０μｇのＨＡ＋０．５μｇのＰＡＣＡＰ２７を注射した。
群３：２０μｇのウシ血清アルブミンを注射した。
ＨＡは動物細胞における組換え発現により得た。ワクチンはモンタニド８８８（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ８８８）を用いて製剤し、最終容量０．５ｍＬで皮下経路により投与した。動物は免疫化後２８日目に再免疫化した。赤血球凝集阻害アッセイを用い防御抗体価を評価するため及び白血球を単離してワクチンにより生じた細胞性免疫応答をインビトロにおいても評価する目的で、０、１４、２８、３５、４２及び４９日目に血液サンプルを採取した。
【００３６】
再免疫化の３５日目から、ＨＡ−ＰＡＣＡＰで免疫化したニワトリは、ＨＡで免疫化した群に比べて優れた抗体応答を示した（図３Ａ）。ＩＦＮ−γの刺激について測定した場合、ＨＡ−ＰＡＣＡＰで処理した群は、ＨＡにより免疫化した群又は対照群と比較して、細胞性免疫応答の上昇を示した（図３Ｂ）。
【００３７】
（例４）若いニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）の末梢血及び前腎白血球におけるＩＬ１−β及びＩＬ１５の発現についてのＰＡＣＡＰの効果。
我々はＶＨＳＶ及びＩＰＮＶを保有しない約５０ｇの若いニジマス（Ｏ．ｍｙｋｉｓｓ）を使用した。魚（ｎ＝５）はメタンスルホン酸塩（Ｓｉｇｍａ、米国）を用い麻酔し、末梢血を各々の魚の尾静脈から無菌的に採血した。その後、前腎を採取した。
【００３８】
末梢血及び前腎白血球はＧｒａｈａｍ及びＳｅｃｏｍｂｅｓにより記載された方法に従って単離した（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｍｂｅｓ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６５：２９３−７）。
【００３９】
細胞は５×１０６細胞／ｍｌの濃度で５％ＦＣＳを含むＬ−１５に再懸濁し、２４穴プレートに１ウェル当たり１ｍＬで分配した。白血球は化学合成により得たクラリアス・ガリエピヌス（Ｃｌａｒｉａｓ  ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）ＰＡＣＡＰ３８の３つの用量（１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ及び１０−８Ｍ）で二重で処理した。二重で分配した未処理の白血球は陰性対照として使用した。
【００４０】
ＩＬ１β及びＩＬ１５のレベルを処置後４８時間に評価した。この目的のために、全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉにより記載された方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９）によりＰＡＣＡＰで処理した白血球培養物から精製した。
【００４１】
ＩＬ１β及びＩＬ１５を増幅するために設計したプライマーはｃＤＮＡとゲノムＤＮＡを区別しないため、異なる組織から精製した全ＲＮＡはＤＮＡ分解酵素、特にＲＱ１  ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（プロメガ）で処理した。
【００４２】
ｃＤＮＡ合成のためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素を使用した商用キット（インビトロジェン）を使用した。最後に、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために市販のＰＣＲ混合試薬：パワーＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を使用した。ｑＰＣＲの結果は構成的発現を行っている内在性遺伝子、特に伸長因子１α（ＥＦ１α）に対して正規化し、三連で実施した。結果は２−△Ｃｔとして表した。ここで、△Ｃｔは、標的遺伝子のＣｔ値から正規化した遺伝子ＥＦ１αのＣｔ値を引いた残部に等しい。
【００４３】
ＩＬ１βタンパク質レベルは１０−１０Ｍ  ＰＡＣＡＰ３８により処置した末梢血白血球において処置後４８時間後に上昇した。１０−９Ｍの用量では、陰性対照群と比較してＩＬ１βの転写におけるＰＡＣＡＰ３８の刺激効果もあったが、この場合に検出した発現レベルは１０−１０Ｍの用量で得られたものよりも低いものであった。これらの結果は低濃度（１０−９Ｍ及び１０−１０Ｍ）でのＩＬ１βの転写におけるＰＡＣＡＰ３８の陽性効果を示している（図４Ａ）。前腎白血球において、ＰＡＣＡＰ３８のＩＬ１βの転写における効果は末梢血白血球で得られたものに比べて穏やかであり、刺激効果は１０−９Ｍの用量においてのみ見られた（図４Ｂ）。
【００４４】
さらに、我々は１０−１０Ｍ及び１０−９Ｍの用量のＰＡＣＡＰにより刺激した末梢血白血球におけるＩＬ１５の発現について、ＰＡＣＡＰ３８の刺激効果を観察した。最も高い値は１０−１０Ｍの用量で得られた（図５Ａ）。前腎白血球において、ＩＬ１β転写において前に観察されたように、効果は穏やかであった。１０−９Ｍ用量のＰＡＣＡＰ処置群におけるＩＬ１５の発現レベルは、陰性対照群よりも統計学的により高かった（図５Ｂ）。
【００４５】
（例５）：抗原ｍｙ３２及びｍｙ３２とＰＡＣＡＰの同時投与により事前に腹腔内免疫したタイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）における、カリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）による対照比較負荷試験。
ｍｙ３２タンパク質は、形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２８ａ−ｍｙ３２の破砕したペレット中に、組換え体の形態で得た。このタンパク質は腹腔内（ＩＰ）に投与すると、タイセイヨウサケ（Ｓ．ｓａｌａｒ）へのＣ・ロゲルクレッセイイ（Ｃ．ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）による負荷試験の際に、第２世代の寄生体の感染について５７％の阻害を生じることがわかっている（Ｃａｒｐｉｏら（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ．２９（１５）：２８１０−２０）。
【００４６】
このタンパク質に対するＰＡＣＡＰのアジュバント効果を実証するために、我々はタイセイヨウサケについての対照比較条件下でのワクチン接種−負荷試験実験を計画した。この実験においては２５匹ずつ（平均体重８０ｇ）の６つの実験群を設立した。
群１：ＰＢＳを腹腔内注射した
群２：１μｇ／匹の用量のＰＡＣＡＰ３８を腹腔内注射した
群３：３μｇ／ｇ体重（ｇｂｗ）の用量でのｍｙ３２を腹腔内注射した
群４：３μｇ／ｇｂｗのｍｙ３２と１μｇ／匹の用量のＰＡＣＡＰの腹腔内注射による同時投与
群５：３μｇ／ｇｂｗの用量のｍｙ３２を腹腔内注射した魚であって、ｍｙ３２による免疫化の前後１週間の間、１日に２５０μｇＰＡＣＡＰ／Ｋｇ食料で給餌したもの
【００４７】
実験の過程で、魚には１日２回、その体重の１％の割合でＰＡＣＡＰを含まない市販の配合飼料を給餌した。ただし、群５についてはウイルスＶＨＳＶの弱毒株の経口投与のためのＡｄｅｌｍａｎｎら（（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６，８３７−８４４）により記載されているように、免疫化の前後１週間、ＰＡＣＡＰを含む同じ市販の配合飼料を与えた。
【００４８】
５００の任意の熱量単位の後、魚は２週間の間、海水に順応させた。引き続き、それらは各々の水槽につき２０００±２００のコペポダイトにより負荷試験を実施した。魚は暗所で水の流れの無い状態においてＳｔｏｎｅら（Ｄｉｓ  Ａｑｕａｔ  Ｏｒｇａｎ，２０００，４１：１４１−１４９）により提案された温度、塩分、酸素条件下で２４日間の間、保持した。還流及び濾過は４８時間おきに手動で行った。２４日目に魚を麻酔し、実体顕微鏡下での寄生虫計測のために屠殺した。表１の結果はＰＡＣＡＰ、ｍｙ３２及びＰＡＣＡＰ＋ｍｙ３２で処理した群における侵襲レベルの減少を示す。最も大きな減少は群４及び５で生じ、抗原に対するＰＡＣＡＰのアジュバント効果を示している。
【表１】
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【００４９】
（例６）コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）対アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）の体液性免疫応答におけるＰＡＣＡＰアジュバント効果。
４０±１０ｇのコイ（Ｃ．ｃａｒｐｉｏ）について実験を行った。これらの水槽は６００Ｌ、２８±２℃の温度に保った。各々１０匹のコイで３つの実験群を設立し、それらは下記の免疫原により腹腔内注射した。
群１：ＰＢＳ
群２：Ａ．ハイドロフィラの不活化細胞
群３：Ａ．ハイドロフィラの不活化細胞プラス１μｇ／匹のＰＡＣＡＰ３８。
【００５０】
魚は０日目と１４日目に注射し、０日目と２１日目に尾静脈から血液を採取した。細菌にＰＡＣＡＰを加えて免疫化した群は細菌のみで免疫化した群に比べて凝集抗体価が有意に高いという結果が示された（図６）。これらの結果は、分子アジュバントとしてのＰＡＣＡＰの効果を実証する。Ａ．ハイドロフィラの細胞調製及び抗体価測定はＹｉｎら（（１９９６）Ｆｉｓｈ  ＆  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，５７−６９）に従って行った。
【００５１】
（例７）不活化細菌並びに不活化細菌及びＰＡＣＡＰの同時投与により事前に腹腔内免疫化したコイ（Ｃ．ｃａｒｐｉｏ）におけるＡ．ハイドロフィラによる対照比較負荷試験。
実験は３０±５ｇのコイ（Ｃ．ｃａｒｐｉｏ）について行った。魚は２５０Ｌの水槽において、３０±２℃の温度で維持した。各々２０匹のコイで３つの実験群を設立し、腹腔内注射した。
群１：ＰＢＳ
群２：Ａ．ハイドロフィラの不活化細胞
群３：Ａ．ハイドロフィラの不活化細胞プラス１μｇ／匹のＰＡＣＡＰ３８。
０日目と１４日目に魚に注射した。２１日目にＬＤ５０の細菌を腹腔内注射することにより負荷試験を行い、７日間、死亡率を記録した。相対的生存パーセント（ＲＰＳ）は下記のように計算した：
ＲＰＳ（％）＝（対照群の死亡率％−処置を行ったものの死亡率％）／（対照群の死亡率％）×１００
群２においては６５％、群３においては９５％の結果が得られ、これはＰＡＣＡＰの投与がワクチン接種及び負荷をかけた魚の病原体に対する生存率を上昇させることを実証するものである。
【００５２】
（例８）実験的にＩＰＮＶで負荷をかけたニジマス（オンコルヒュンクス・ミキス；Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）において、ＩＰＮＶの１０６ｋＤａのポリタンパク質（ＶＰ２−ＶＰ４ＶＰ３−ＮＨ２−ＣＯＯＨ）をコードする遺伝子に基づくＤＮＡワクチンとＰＡＣＡＰの同時投与の効果。
実験的にＩＰＮＶで負荷をかけたニジマスにおいて、ＩＰＮＶの１０６ｋＤａのポリタンパク質（ＶＰ２−ＶＰ４ＶＰ３−ＮＨ２−ＣＯＯＨ）をコードする遺伝子に基づくＤＮＡワクチンとＰＡＣＡＰの筋肉内同時投与の効果を評価するために実験を行った。６つの実験群を各々１５匹（１２±１ｇ）に適合させ、１０〜１２℃の水中で維持した。
群１：ＰＢＳを注射した魚
群２：１μｇ／匹の用量でＤＮＡワクチン（ｐＰ−ＩＰＮＶ）を注射した魚
群３：１μｇ／匹の用量のＤＮＡワクチン（ｐＰ−ＩＰＮＶ）及びヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターの制御下でクラリアス・ガリエピヌス  ＰＡＣＡＰのｃＤＮＡ配列を有するプラスミド（ｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ）を０．５μｇ  ｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ／匹の用量で同時注射した魚
群４：ｐＰ−ＩＰＮＶワクチン（１μｇ／匹）と０．５μｇ  ｐＣＭＶ／匹の用量の陰性対照プラスミドを同時注射した魚
群５：１μｇ／匹の用量のＤＮＡワクチン（ｐＰ−ＩＰＮＶ）及びクラリアス・ガリエピヌスＰＡＣＡＰのｃＤＮＡ配列を有するプラスミド（ｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ）を０．０５μｇ  ｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰ／匹の用量で同時注射した魚
群６：ｐＰ−ＩＰＮＶワクチン（１μｇ／匹）と０．０５μｇ  ｐＣＭＶ／匹の用量の陰性対照プラスミドを同時注射した魚
【００５３】
ワクチン接種３０日後、１００μＬのＩＰＮＶ（１×１０７  ＴＣＩＤ５０  ｍＬ−１／匹）を腹腔内注射することにより、魚をウイルスに曝露した。
【００５４】
感染後７日目、群当たり１０匹の魚を屠殺し、前腎におけるウイルス量を評価した。
【００５５】
ウイルス量を決定するために、ＲＮＡを個々の試料から単離し、１μｇのＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを行った。ＶＰ１遺伝子発現の検出は、リアルタイムＰＣＲにより評価した。結果を図７に示す。
【００５６】
ｐＰ−ＩＰＮＶと空のベクターを同時注射した群と比較して、ｐＰ−ＩＰＮＶとｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰを同時に投与することにより大幅にウイルス量が減少した。試験したｐＣＭＶ−ＰＡＣＡＰの用量間において差は認められなかった。
【００５７】
（例９）実験的にＶＨＳＶウイルスで負荷をかけたニジマス（Ｏ．ｍｙｋｉｓｓ）における、ＰＡＣＡＰとＶＨＳＶのＧ糖タンパク質をコードする遺伝子に基づいたＤＮＡワクチンの同時投与の効果
実験的にＶＨＳＶウイルスで負荷をかけたニジマスにおいて、クラリアス・ガリエピヌスＰＡＣＡＰとＶＨＳＶのＧ糖タンパク質をコードする遺伝子に基づくＤＮＡワクチン（ｐＧ−ＶＨＳＶ）の筋肉内注射による同時投与の効果を評価するために実験を行った。各々２０匹（１０±２グラム）の４つの実験群を作成し、１０〜１２℃の水で維持した。
群１：ＰＢＳを注射した魚
群２：ＤＮＡワクチンｐＧ−ＶＨＳＶ（０．０１μｇ／匹）を注射した魚
群３：０．０１μｇ／匹の用量のＤＮＡワクチンｐＧ−ＶＨＳＶ及び０．１μｇ  ＰＡＣＡＰ  ／匹の用量のクラリアス・ガリエピヌスＰＡＣＡＰを同時注射した魚
群４：０．０１μｇ／匹の用量のＤＮＡワクチンｐＧ−ＶＨＳＶ及び０．５μｇ  ＰＡＣＡＰ  ／匹の用量のクラリアス・ガリエピヌスＰＡＣＡＰを同時注射した魚
【００５８】
ワクチン接種後４週目に、浸漬浴により魚をウイルスに曝露した。この負荷はＶＨＳＶ感染用量（１×１０５  ＴＣＩＤ５０／匹ｍＬ−１）を含有する水中で２時間行った。累積死亡率を、負荷後４週間、評価し、その結果を図８に示す。
【００５９】
ペプチドをそれぞれ、０．１及び０．５μｇＰＡＣＡＰ／匹の用量でＤＮＡワクチンと同時に投与することにより、ＤＮＡワクチン単独での投与と比較して死亡率を１５％及び２９％減少させた。
【００６０】
（例１０）繊毛寄生虫ウオノカイセンチュウ（Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｉｌｉｉｓ）の遊走子（ｔｈｅｒｏｎｔ）による免疫後のブチナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）の生存におけるＰＡＣＡＰ投与の効果
実験は、繊毛寄生虫ウオノカイセンチュウの遊走子で免疫化した後のブチナマズ（Ｉ．ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）の生存に対するＰＡＣＡＰ投与の効果を評価するために行った。ワクチン接種及び負荷試験手順はＷａｎｇとＤｉｃｋｅｒｓｏｎ（（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９（１），１７６−１８１）によって提案されたように実施した。２５匹ずつ（１２±５グラム）の４つの実験群を設立した。
群１：１日目及び３５日目にＰＢＳで免疫化した魚
群２：１日目に８０００の生きたウオノカイセンチュウ遊走子で、３５日目に１００００の生きた寄生虫遊走子で免疫化した魚
群３：１日目に８０００の生きたウオノカイセンチュウ遊走子で、３５日目に１００００の生きた寄生虫遊走子で免疫化した魚。これらの魚は浸漬浴により１００μｇ  ＰＡＣＡＰ／Ｌ水の用量の神経ペプチドＰＡＣＡＰも投与された。処置は負荷試験に先立って１時間、日を挟んで、２週間の間（６つの浸漬浴）行った。
群４：１日目に８０００の生きたウオノカイセンチュウ遊走子で、３５日目に１００００の生きた寄生虫遊走子で免疫化した魚。これらの魚も、群３に類似の手順により、１時間、ＰＡＣＡを含まない浸漬浴に供した。
【００６１】
免疫化に先立ち、魚は既存の外部寄生虫を除去するためにホルマリンで処理した。魚は２３±２℃、連続水流で維持した。
【００６２】
８４日目、魚は１５０００の遊走子で負荷試験を行った。負荷試験後３０日間、死亡率データを得た。結果を表２に示す。これらの結果は、ＰＡＣＡＰで同時に処理した免疫化した魚の生存率が２７％増加したことを示す。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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