(57)【要約】  本発明は、様々な治療用途のための、治療薬と結合したポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子とコンジュゲート形成しているか、又はその表面と結合している親水性治療薬、及び前記ナノ粒子内に含まれる親油性治療薬から選択される少なくとも１種の薬剤と結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜１０，０００Ｄａの平均分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項３】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜７，０００Ｄａの平均分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項４】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜５，０００Ｄａの平均分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項５】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、４，０００〜２０，０００Ｄａ、又は４，０００〜１０，０００Ｄａ、又は４，０００〜５，０００Ｄａの平均分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項６】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、約２，０００、約４，５００、約５，０００、約７，０００、又は約１０，０００Ｄａの平均分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びポリグリコール酸（ＰＧＡ）のコポリマーであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項８】
請求項７に記載のナノ粒子において、前記コポリマーが、ブロックコポリマー、ランダムコポリマー及びグラフトコポリマーから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項９】
請求項８に記載のナノ粒子において、前記コポリマーが、ランダムコポリマーであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１０】
請求項９に記載のナノ粒子において、ＰＬＡ及びＰＧＡ各々の前記平均分子量が、互いに独立して、２，０００〜２０，０００Ｄａであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１１】
請求項７に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＡモノマーが、過剰量でＰＬＧＡ中に存在することを特徴とするナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のナノ粒子において、ＰＬＡとＰＧＡのモル比が、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５及び５０：５０から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＡとＰＧＡのモル比が、５０：５０（１：１）であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記平均粒径が、約１００〜２００ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記平均粒径が、約５０〜１００ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記平均粒径が、約５０〜７５ｎｍであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１７】
請求項９に記載のナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、等モルのＰＬＡ及びＰＧＡのランダムコポリマーであり、少なくとも４，５００Ｄａの分子量を有し、また、１００〜２００ｎｍの平均粒径を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のナノ粒子において、ナノカプセル又はナノスフィアの形態であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、医学的病態に関連する少なくとも１つの作用を誘導、促進、停止又は低減するように選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２０】
請求項１９に記載のナノ粒子において、前記治療薬が、ビタミン、タンパク質、抗酸化剤、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、抗体、モノクローナル抗体、ワクチン、予防薬、診断薬、コントラスト剤、核酸、栄養補助食品、分子量が約１，０００Ｄａ未満又は５００Ｄａ未満の小分子、電解質、薬物、免疫剤、及びこれらのいずれかの組合せから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２１】
請求項２０に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、高分子であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２２】
請求項２１に記載のナノ粒子において、前記高分子が、親油性であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２３】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、コルチゾン、及びプレドニゾンから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、１，０００Ｄａより高い分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項２５】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、多くとも３００Ｄａの分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項２６】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、５００〜１，０００Ｄａの分子量を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が、さらに、少なくとも１種の非活性剤と結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２８】
請求項２７に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の非活性剤が、前記ナノ粒子の少なくとも１つの特性を調節するように選択され、前記特性が、粒度、多孔性、疎水性／親水性、電荷、反応性、化学的安定性、クリアランス率、分布、及びターゲティング性から選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２９】
請求項２７に記載のナノ粒子において、前記非活性剤が、少なくとも５個の炭素原子を有する実質的に直線状の炭素鎖であり、前記直線炭素鎖中に１個以上のヘテロ原子を含んでもよいし、含まなくてもよいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項３０】
請求項２７に記載のナノ粒子において、前記非活性剤が、脂肪酸、アミノ酸、脂肪若しくは非脂肪分子、脂肪族チオール、及び脂肪族アミンから選択されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３１】
請求項３０に記載のナノ粒子において、前記非活性剤が、脂肪アミノ酸（アルキルアミノ酸）であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３２】
請求項２６に記載のナノ粒子において、前記アルキルアミノ酸のアルキル部分が、１０〜３０個の炭素原子を有しており、直鎖状又は分枝状、飽和、半飽和若しくは不飽和であってもよいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項３３】
請求項２６又は２７に記載のナノ粒子において、前記アルキルアミノ酸のアミノ酸部分が、天然若しくは非天然アミノ酸、並びに／又はα−及び／若しくはβ−アミノ酸から選択してもよいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記非活性剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３５】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が、非ＰＥＧ化されていることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３６】
請求項２７に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の非活性剤が、前記ナノ粒子のコア内又は前記ナノ粒子のマトリックス内に含有されるように結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３７】
請求項３６に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の非活性剤が、前記ナノ粒子の表面に結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３８】
請求項１又は３７のいずれか１項に記載のナノ粒子において、少なくとも１種の治療薬が、前記ナノ粒子の表面に結合しており、また、少なくとも１種の別の治療薬が、前記ナノ粒子のコア内又は前記ナノ粒子のマトリックス内に含有されるように結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項３９】
請求項３８に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の親水性治療薬又は少なくとも１種の親水性非活性剤が、１つ以上のリンカー部分を介して前記ナノ粒子と結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４０】
請求項３９に記載のナノ粒子において、前記１つ以上のリンカー部分が、前記ナノ粒子との結合が可能な第１部分と、前記非活性剤との結合が可能な第２部分とを有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項４１】
請求項４０に記載のナノ粒子において、前記リンカーが、少なくとも１０個の炭素原子のアルキル鎖を有する脂肪システインであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４２】
請求項４１に記載のナノ粒子において、前記リンカーが、オレイルシステインアミドであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４３】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の治療薬が、共有結合、静電気結合、及び水素結合から選択される化学結合を介して、又は前記薬剤の少なくとも一部分と前記ナノ粒子との物理的結合を介して、前記ナノ粒子と結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４４】
請求項４３に記載のナノ粒子において、前記結合が不安定であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４５】
請求項１に記載のナノ粒子において、前記少なくとも１種の親水性治療薬が、１つ以上のリンカー部分を介して前記ナノ粒子と結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４６】
請求項４５に記載のナノ粒子において、前記１つ以上のリンカー部分が、前記ナノ粒子との結合が可能な第１部分と、前記治療薬との結合が可能な第２部分とを有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項４７】
請求項４６に記載のナノ粒子において、前記リンカー部分が、脂肪アミノ酸（アルキルアミノ酸）であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４８】
請求項４７に記載のナノ粒子において、前記アルキルアミノ酸のアルキル部分が、１０〜３０個の炭素原子を有し、直鎖状又は分枝状、飽和、半飽和若しくは不飽和であってもよいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項４９】
請求項４７又は４８に記載のナノ粒子において、前記アルキルアミノ酸のアミノ酸部分が、天然若しくは非天然アミノ酸、並びに／又はα−及び／若しくはβ−アミノ酸から選択してもよいことを特徴とするナノ粒子。
【請求項５０】
請求項４９に記載のナノ粒子において、前記リンカーが、少なくとも１０個の炭素原子のアルキル鎖を有する脂肪システインであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５１】
請求項５０に記載のナノ粒子において、前記リンカーが、オレイルシステインアミドであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５２】
複数の治療薬を表面に有するポリマーナノ粒子において、前記薬剤の各々が、オレイルシステインアミドを介して前記ナノ粒子と結合していることを特徴とするポリマーナノ粒子。
【請求項５３】
請求項５２に記載のポリマーナノ粒子において、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクト−コ−グリコライド）（ＰＬＧ）、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸及び／又はこれらのコポリマーから選択されるポリマー材料からなることを特徴とするポリマーナノ粒子。
【請求項５４】
請求項５３に記載のポリマーナノ粒子において、前記ポリマー材料が、ＰＬＡ、ＰＧＡ及びＰＬＧＡから選択されることを特徴とするポリマーナノ粒子。
【請求項５５】
請求項５４に記載のポリマーナノ粒子において、前記ポリマーナノ粒子が、ＰＬＧＡからなることを特徴とするポリマーナノ粒子。
【請求項５６】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリマーナノ粒子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５７】
請求項５６に記載の組成物において、医薬組成物であることを特徴とする組成物。
【請求項５８】
請求項５７に記載の組成物において、治療薬の経皮投与のために設計されることを特徴とする組成物。
【請求項５９】
請求項５７に記載の組成物において、皮膚層を介した治療薬の局所投与用であることを特徴とする組成物。
【請求項６０】
請求項５８又は５９に記載の組成物において、角質層を介した治療薬の送達用であることを特徴とする組成物。
【請求項６１】
請求項５８に記載の組成物において、前記経皮投与によって、被検体の循環系中への治療薬の送達が達成されることを特徴とする組成物。
【請求項６２】
請求項５７に記載の組成物において、挫瘡、乾癬、白斑、ケロイド、熱傷、瘢痕、乾燥症、魚鱗癬、角化症、角皮症、皮膚炎、掻痒症、湿疹、皮膚癌、及び皮膚硬結から選択される皮膚疾患の治療を目的とすることを特徴とする組成物。
【請求項６３】
請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の組成物において、前記組成物が、実質的に水を含まないことを特徴とする組成物。
【請求項６４】
請求項５６に記載の組成物において、注射による治療薬の投与のために設計されることを特徴とする組成物。
【請求項６５】
請求項５６に記載の組成物において、治療薬の経口投与のために設計されることを特徴とする組成物。
【請求項６６】
請求項５６に記載の組成物において、治療薬の眼投与のために設計されることを特徴とする組成物。
【請求項６７】
請求項６６に記載の組成物において、前記眼投与が、注射によるものであることを特徴とする組成物。
【請求項６８】
（ｉ）請求項１に記載のＰＬＧＡポリマーナノ粒子；及び
（ｉｉ）前記ナノ粒子と結合した少なくとも１種の治療薬
を含む送達系において、前記少なくとも１種の治療薬は任意選択により、リンカー部分を介して前記表面に結合させるか、あるいは、前記ナノ粒子内に含有させてもよいことを特徴とする送達系。
【請求項６９】
医薬組成物の製造を目的とすることを特徴とする請求項１〜５５のいずれか１項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項７０】
請求項６９に記載の使用において、前記医薬組成物が、被検体の循環系中に、局所、経口、吸入、鼻内、経皮、眼内又は非経口経路により、治療薬を輸送するための送達系として設計されることを特徴とする使用。
【請求項７１】
請求項７０に記載の使用において、前記医薬組成物が、治療薬の経皮送達用であることを特徴とする使用。
【請求項７２】
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の使用において、前記送達系が、標的治療薬送達及び制御放出投与の促進のために設計されることを特徴とする組成物。
【請求項７３】
請求項７１に記載の使用において、前記医薬組成物が、皮膚層を介した治療薬の送達用であることを特徴とする使用。
【請求項７４】
請求項６９〜７３のいずれか１項に記載の使用において、前記治療薬が、高分子であることを特徴とする使用。
【請求項７５】
高分子の経皮送達用の医薬組成物において、前記組成物が、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の少なくとも１種のナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が、前記治療用高分子と結合しており、前記結合は任意選択により、少なくとも１つのリンカーを介するものであってもよいことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７６】
請求項７５に記載の組成物において、前記高分子が、被検体の皮膚層を介して、局所に、又は循環系中に送達されることを特徴とする組成物。
【請求項７７】
請求項７６に記載の組成物において、前記皮膚層が角質層であることを特徴とする組成物。
【請求項７８】
請求項７５に記載の組成物において、前記リンカーが、オレイルシステインアミドであることを特徴とする組成物。
【請求項７９】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載の少なくとも１種のナノ粒子を含む眼投与用組成物において、前記ナノ粒子が、前記治療用高分子と結合しており、前記結合は任意選択により、少なくとも１つのリンカーを介するものであってもよいことを特徴とする組成物。
【請求項８０】
請求項７９に記載の組成物において、眼内注射に好適な形態又は点眼剤の形態であることを特徴とする組成物。
【請求項８１】
請求項１に記載の少なくとも１つのナノ粒子を含むことを特徴とする局所投与用製剤。
【請求項８２】
請求項８１に記載の製剤において、前記少なくとも１種の治療薬が、高分子であることを特徴とする局所投与用製剤。
【請求項８３】
請求項８１に記載の製剤において、前記少なくとも１種の治療薬が、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、コルチゾン、及びプレドニゾンから選択されることを特徴とする製剤。
【請求項８４】
被検体に少なくとも１種の治療薬を送達するための送達系を製造する方法において用いられることを特徴とするオレイルシステインアミドの使用。
【請求項８５】
少なくとも１種のナノ粒子と組み合わせた使用を目的とすることを特徴とするオレイルシステインアミド。
【請求項８６】
オレイルシステインアミドと化学的に結合していることを特徴とする高分子。
【請求項８７】
複数の表面露出チオール基を表面に有するＰＬＧＡナノ粒子において、前記チオール基が、治療薬及び非治療剤から選択される少なくとも１種の治療薬との結合のために活性化されることを特徴とするナノ粒子。
【請求項８８】
請求項８７に記載のナノ粒子において、前記チオール基が、オレイルシステインアミドのものであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項８９】
ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、少なくとも１種の薬剤に表面結合していると共に、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、前記ナノ粒子が、
−多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、ＰＬＧＡの平均分子量が２，０００〜２０，０００ＤａであるＰＬＧＡナノ粒子を取得するステップ；
−ナノ粒子表面とリンカー部分との結合を可能にする条件下で、前記ナノ粒子をリンカー部分と反応させることにより、表面修飾ナノ粒子を取得するステップ；及び
−前記表面修飾ナノ粒子を、治療薬又は非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤と接触させることにより、前記リンカー末端基と前記少なくとも１種の薬剤を結合させるステップ
を含む方法によって取得可能であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項９０】
ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の製造方法において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、少なくとも１種の薬剤に表面結合していると共に、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有しており、前記方法が、
−多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、ＰＬＧＡの平均分子量が２，０００〜２０，０００ＤａであるＰＬＧＡナノ粒子を取得するステップ；
−ナノ粒子表面とリンカー部分との結合を可能にする条件下で、前記ナノ粒子をリンカー部分と反応させることにより、表面修飾ナノ粒子を取得するステップ；及び
−前記表面修飾ナノ粒子を、治療薬又は非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤と接触させることにより、リンカー末端基と前記少なくとも１種の薬剤を結合させるステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９１】
請求項８９に記載のナノ粒子又は請求項９０に記載の方法において、前記リンカー部分が、前記ナノ粒子との結合前に、少なくとも１種の薬剤と結合されることを特徴とするナノ粒子又は方法。
【請求項９２】
請求項８９に記載の粒子又は請求項９０に記載の方法において、前記薬剤が、治療薬であることを特徴とする粒子又は方法。
【請求項９３】
請求項８９に記載の粒子又は請求項９０に記載の方法において、前記リンカー部分が、オレイルシステインアミドであることを特徴とする粒子又は方法。
【請求項９４】
ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の製造方法において、前記ＰＬＧＡが、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、少なくとも１種の薬剤に表面結合していると共に、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有しており、前記方法が、
−多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、ＰＬＧＡの平均分子量が２，０００〜２０，０００ＤａであるＰＬＧＡナノ粒子を取得するステップ；
−前記ナノ粒子を、治療薬又は非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤と反応させることにより、前記少なくとも１種の薬剤と前記ナノ粒子の表面を結合させるステップ
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には、治療化合物の皮膚又は全身送達のためのポリマーを基材とするナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の治療法は、親水性であれ親油性であれ、十分な量の治療化合物を、皮膚を回避して深部の皮膚層に送達することはできないため、依然として困難な課題である。吸収されにくい活性成分の浸透及び透過は、製剤への特定の促進剤の添加や、コロイド状送達系、特にナノ粒子の使用によって、改善することができる。このような適用でのナノ粒子の利点は、近年、複数の科学分野で証明されているが、様々な皮膚層を介したナノ粒子の浸透の可能性についてはほとんどわかっていない。ナノ粒子は、単純にその大きさ（１００ｎｍ以下）によって、生物学的作用を及ぼしうる。
【０００３】
ナノ粒子系を用いたカプセル化は、薬物ターゲティング及び送達において実施が増加している方法である。このような系は、皮膚バリア中への、またこれを介した経皮輸送を促進するために局所投与に提案されている。しかし、このような粒子状製剤が皮膚輸送を促進するメカニズムは、依然として不明のままである。これらのナノメートル系は、大きな表面積を呈するが、これが、これらを皮膚及び経皮送達のための極めて有望な送達系にする特性である。その微小な粒度によって、角質層との密着が確実になるため、粒径を制御することができれば、皮膚部位での深部層局在化を調節することができる［１］。
【０００４】
近年の研究では、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ)を用いて、ブタの皮膚を介した、非生分解性の蛍光性ポリスチレンナノ粒子（粒径２０〜２００ｎｍ）の分布を視覚化した。表面の画像から、（ｉ）ポリスチレンナノ粒子が、毛包開口部中に選択的に蓄積すること、（ｉｉ）この分布が、時間依存的に増加すること、並びに（ｉｉｉ）より小さい粒度によって、毛包での局在化が促進されることが明らかにされた。毛包からの取込み以外にも、皮膚の「溝」内でのナノ粒子の局在化が、表面の画像から明らかであった。しかし、横断面画像から、これらの非毛包構造は、ポリマーベクターに代わりの浸透経路を提供するわけではなく、その輸送は、角質層によって明らかに妨害されることがわかった［２］。
【０００５】
近年、脂質ナノ粒子が、活性物質の局所投与のためのビヒクルとして大きな可能性を示したが、これは、主として、ターゲティング作用の可能性があることと、異なる皮膚層中での制御された放出によるものである。高温高圧均質化及び超音波処理技術を用いて、ケトプロフェン及びナプロキセンを充填した脂質ナノ粒子を調製し、光子相関分光及び示差走査熱量測定により特性決定した。ヒト皮膚に対するナノ粒子の挙動をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することにより、経皮吸収を決定し（フランツセル法）、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性剤局在化（テープストリッピング法）及び制御放出能力（ＵＶＢ誘発性紅斑モデル）を確認した。結果から、粒子が薬物浸透を抑制することができ、同時に、角質層への浸透及び蓄積を増大することがわかった。薬物溶液と比較して、薬物充填ナノ粒子の場合に、持続的な抗炎症効果がみとめられた。直接及び間接的証拠によって、局所投与のための担体として脂質ナノ粒子の有用性に関する初期報告が裏付けられ、当分野での新たな、そしてより深い研究を刺激している［３］。
【０００６】
ポリマーナノ粒子はまた、局所適用のための活性物質の担体としても提案されている。このような送達系の多くの利点の中でも、特に、活性成分の持続的徐放を達成し、感受性化合物を増加し、これによって、皮膚用製剤の治療効果の改善をもたらすことができるポリマーシェルの能力が挙げられる。現在、数種の市販されている化粧品が、ビタミンＡ、バラエキス及び麦芽オイルのカプセル化のためのナノ粒子を組み込んでいる［４］。
【０００７】
Ｗｕら［５］により公開された別の最近の論文は、ポリスチレン及びポリメタクリル酸メチルナノ粒子は、局所適用から６時間後に、皮膚の最も表面の層、すなわち角質層を通過することができないこと；３０ｎｍという微小なポリスチレンナノ粒子でさえ、角質層を越えて浸透できないことを明らかにしている。これに対し、ナノ粒子内部にカプセル化した疎水性化合物が放出されると、皮膚のより深部の層を介して拡散することができた。
【０００８】
ナノ粒子が、皮膚表面で妨げられることは利点となりうる。というのは、ナノ粒子自体は全身に移動することなく、活性成分は、長時間にわたって徐放され、皮膚バリアを介して拡散することができるからである。従って、著者［５］は、インタクトな皮膚を介したナノ粒子の浸透が全身作用を誘発する可能性はありそうにないことを示している。
【０００９】
それでも、保健医療当局は、局所適用後に皮膚を介して非生分解性ナノ粒子により誘発されうるマイナスの潜在的作用に対して非常に注意深い。実際に、２００９年１１月初め、ＥＵの加盟国は、美容品についての単一の規定を採用した。これは、事実上、あらゆる美容品におけるナノ材料の使用に関する規則を組み込むための最初の国内法であった［６］。この規定によれば、新規のナノ材料を含有する製品を流通させようとする者は誰でも、市場に参入する前に、欧州委員会に安全情報を提出する必要がある。こうした懸念は、非生分解性ナノ粒子の使用に関するものであり、妥当な期間をかけて皮膚中で分解されるナノ粒子の使用は、特に分解産物が安全なものであれば、何ら有害な作用を誘発しないと考えられることは強調しておく必要がある。
【００１０】
１９７０年代、ポリマー除去の必要性を回避する適切な薬物送達材料として、生分解性ポリマーが提案された［７］。脂肪族ポリエステル、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）（ＰＨＢ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びそのグリコール酸とのコポリマー、すなわち、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコシド）（ＰＬＧＡ）［８〜１１］が、制御放出装置を製剤化するために広く用いられてきた。ＰＬＡ及びＰＬＧＡがマイクロ及びナノ粒子の製造に広く用いられる理由は、それらが無毒であり、ヒト身体に十分に許容され、生分解性かつ生体適合性であるためである［１２〜１３］。ＰＬＡ及びＰＧＬＡは、皮下及び筋内注射のためのＦＤＡ承認のポリマーである。
【００１１】
バルク侵食としても知られるＰＬＧＡの分解過程は、オリゴマー及びＤ，Ｌ−乳酸及びグリコール酸モノマーへの自然加水分解によるエステル結合の自触的切断によって起こる［１４］。乳酸は、ＴＣＡ回路に入り、代謝されて、ＣＯ２及び水として排除される。グリコール酸は、不変のまま尿中に排出されるか、又はクレブス回路に入って、やはりＣＯ２及び水として排除される。
【００１２】
近年、経皮薬物送達のための担体として蛍光色素を配合した、生分解性ポリ乳酸ナノ粒子（ＰＬＡ、ＭＷ３０，０００）の好適性が、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査型顕微鏡及びフローサイトメトリーを用いて、ヒト皮膚外植片について研究された［１５］。その結果、ＰＬＡ粒子は、軟毛包の５０％に浸透し、すべての観察毛包中の１２〜１５％における皮脂腺への進入に相当する最大深さに到達した。毛包管中での粒子の蓄積は、生存表皮への色素の放出、並びに２４時間までの皮脂腺中でのその滞留を伴った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び皮膚外植片での動力学的試験によって、粒子の不安定化が明らかになり、有機溶剤及び皮膚表面との接触時に、組み込まれた色素の有意な放出が起こった。著者によれば、これらの結果は、ＰＬＡポリマーを基材とする粒子が、毛包及び皮脂腺ターゲティングに理想的な担体となりうることを示している。
【００１３】
参照文献
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［２０］  ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＷＯ  ２００４／０８４８７１
［２１］  ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＵＳ  ２０１０／０２４７６６８
［２２］  ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＷＯ  ２０１０／０５９２５３
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、それ自体で、又は各種活性治療薬と組み合わせて、皮膚に浸透して、治療効果を誘導する能力を有する治療ビヒクルの構築のための新規アプローチに基づく。このビヒクルが、活性物質と結合している場合には、これらは、親水性若しくは親油性いずれかの十分な量の薬剤を深部皮膚層に送達して、これにより、局所若しくは全身効果を誘導することができる。本発明は、主に、皮膚又はその他の組織バリアを介して治療薬を送達するのに使用することができ、また、本明細書に詳しく開示するように、例えば、経口、静脈内、筋内、皮下、眼などの他の様々な投与経路を介して治療薬を送達するのに用いることもできる。本発明のビヒクルは、生体膜を横断して、所望の部位に、２種以上の薬剤、特に疎水性及び親水性薬剤を同時に送達する能力をもたらし、最も重要なことには、他の場合では、投与が妨害されるか、不可能である高分子を送達することができる。理解されるように、リポソーム及びナノエマルジョンなどの公知のナノ粒子送達系は、主に、有意な濃度の親水性高分子を組み込むこと、及び／又は皮膚上層中への浸透及び長時間の滞留を増大できないために、その能力が限定されている。
【００１５】
本発明のナノ粒子ビヒクルは、凍結乾燥粉末として、長期の貯蔵期間に及ぶ長い物理化学的寿命を有し、使用前に精製又は滅菌水を添加して再形成すると、その初期の特性を維持することができる。
【００１６】
本明細書に開示される本発明は、それ自体で（すなわち、治療効果が粒子自体によって示される場合には、追加の活性剤なしに）用いることができるか、又は１種以上の治療薬を担持するように修飾することができるナノ粒子に基づく。本発明のナノ粒子は、そのままでも、あるいは追加の治療薬を含んでも、組織バリア、例えば、皮膚中に、少なくとも１０の表面表皮層、少なくとも４〜２０μｍ（マイクロメートル）の深度まで浸透することができる。ナノ粒子は、それらが浸透する皮膚層中で生分解するため、結合した治療薬によって及ぼすことができる効果（主に、水和又は保湿効果）の他に、乳酸及びグリコール酸、又は乳酸のみによって、浸透可能な組織に皮膚乾燥症（乾燥肌）の治療を少なくとも２４時間、７２時間、さらには数週間にわたってもたらすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明の第１の態様では、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子が提供され、このＰＬＧＡは、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子とコンジュゲート形成した、又はその表面と結合した親水性治療薬、及び前記ナノ粒子内に含まれる親油性治療薬から選択される少なくとも１種の薬剤と結合されている。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を提供し、このＰＬＧＡは、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、ナノ粒子は、少なくとも１種の親水性治療薬と表面結合している。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するＰＬＧＡナノ粒子を提供し、このＰＬＧＡは、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、ナノ粒子は、その内部に少なくとも１種の親油性治療薬を含有する；すなわち、ナノ粒子は、親油性治療薬を封入するか、又はカプセル化することができる。
【００２０】
当業者には理解されるように、治療薬は、ナノ粒子の表面と結合させてもよいし、又は以下に詳述するように、前記ナノ粒子内に含有させてもよい。いくつかの実施形態では、治療薬は、ナノ粒子内に含有させない。すなわち、ナノ粒子のコア又はマトリックスは、このような治療薬を実質的に含まない。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡは、２，０００〜１０，０００Ｄａの平均分子量を有する。別の実施形態では、ＰＬＧＡは、２，０００〜７，０００Ｄａの平均分子量を有する。他の実施形態では、ＰＬＧＡは、２，０００〜５，０００Ｄａの平均分子量を有する。さらに他の実施形態では、このＰＬＧＡは、４，０００〜２０，０００Ｄａ、又は４，０００〜１０，０００Ｄａ、又は４，０００〜５，０００Ｄａの平均分子量を有する。さらに別の実施形態では、ＰＬＧＡは、約２，０００、約４，５００、約５，０００、約７，０００、又は約１０，０００Ｄａの平均分子量を有する。
【００２２】
本明細書で用いるように、本発明の「ナノ粒子」は、粒子状担体、ナノカプセル（ＮＣ）又はナノスフィア（ＮＳ）であるが、これは、生分解性であり、化学的及び／又は物理的破壊に対して十分な耐性を有し、従って、十分な量のナノ粒子は、ヒト又は動物の身体への投与後、所望の標的組織（器官）に達することができるのに十分な時間、実質的にインタクトなままである。一般に、ナノ粒子は、平均粒径が５００ｎｍ以下の球体の形状をしている。粒子の形状が球体でない場合には、粒径は、粒子の最も長い寸法を指すものとする。
【００２３】
いくつかの実施形態では、平均粒径は、約１０〜５０ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、少なくとも約５０ｎｍである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、平均粒径は、約１００〜２００ｎｍである。他の実施形態では、平均粒径は、約２００〜３００ｎｍである。他の実施形態では、別の実施形態では、平均粒径は、約３００〜４００ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、約４００〜５００ｎｍである。
【００２５】
他の実施形態では、平均粒径は、約５０〜５００ｎｍである。他の実施形態では、平均粒径は、約５０〜４００ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、約５０〜３００ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、約５０〜２００ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、約５０〜１００ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、約５０〜７５ｎｍである。別の実施形態では、平均粒径は、約５０〜６０ｎｍである。
【００２６】
ナノ粒子は、各々が実質的に同じ形状及び／又は大きさをしている。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、粒子の０．０１％〜１０％以下が、前述した平均粒径より１０％大きいか、又は平均粒径に満たない粒径であるような粒度分布を有し、いくつかの実施形態では、ナノ粒子の０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９％以下が、前述した平均粒径より１０％大きいか、又は平均粒径に満たない粒径であるような粒度分布を有する。
【００２７】
ＰＬＧＡポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）とポリグリコール酸（ＰＧＡ）のコポリマーであり、このコポリマーは、いくつかの実施形態では、ブロックコポリマー、ランダムコポリマー及びグラフトコポリマーから選択される。いくつかの実施形態では、コポリマーは、ランダムコポリマーである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、連邦食品・医薬品・化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）の第２０１（ｓ）項及び第４０９項に従い、一般に安全と認められるもの（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）として挙げられるＰＬＧＡからなるもので、これらは微粒子系での使用について承認されている。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＰＬＡ及びＰＧＡ各々の平均分子量は、コポリマー中に存在する場合、互いに独立して、２，０００〜２０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＬＡモノマーは、過剰量でＰＬＧＡ中に存在する。他の実施形態では、ＰＬＡとＰＧＡのモル比は、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５及び５０：５０から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＬＡとＰＧＡのモル比は、５０：５０（１：１）である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、等モルのＰＬＡ及びＰＧＡのランダムコポリマーから形成され、コポリマーは、少なくとも４，５００Ｄａの分子量を有し、１００〜２００ｎｍの平均粒径を有するナノ粒子の形態をしている。
【００３１】
単独で治療効果（別の活性物質なしに）を有する、本発明のナノ粒子又は本発明に従い用いられるナノ粒子は、医学的病態、例えば、アトピー性及び接触性皮膚炎、乾癬、湿疹、甲状腺障害、魚鱗癬、強皮症、シェーグレン症候群などを伴う過度の皮膚乾燥の患者に、主として保湿／水和の目的で用いられる。
【００３２】
本発明のナノ粒子は、少なくとも１つの作用（例えば、治療効果）を誘導するように、そのまま用いてもよいし、又は被検体における望ましくない病態若しくは疾患の治療又は予防のために、少なくとも１つの作用を誘導、促進、停止若しくは低減することができる少なくとも１種の薬剤（例えば、治療薬）と結合させてもよい。以下に詳しく開示するように、少なくとも１種の薬剤（物質、分子、要素、化合物、実体、又はこれらの組合せ）は、治療薬、すなわち、治療有効量で投与したとき、治療効果を誘導又は調節することができる薬剤、並びに非治療剤、すなわち、それ自体で治療効果を誘導又は調節しないが、選択された特性をナノ粒子に付与する物質から選択することができる。
【００３３】
少なくとも１種の治療薬は、ビタミン、タンパク質、抗酸化剤、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、抗体、モノクローナル抗体、ワクチン及びその他の予防薬、診断薬、コントラスト剤、核酸、栄養補助食品、小分子（分子量が約１，０００Ｄａ未満又は約５００Ｄａ未満の分子量のもの）、電解質、薬物、免疫剤、並びにこれらいずれかの任意の組合せから選択することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の薬剤は、高分子（１０００Ｄａ超の分子量）であり、皮膚層を介したその送達は、他の場合では不可能である。このような高分子は、親油性であってもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬は、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、コルチゾン、プレドニゾンなどから選択される。
【００３６】
特定の適用の場合、少なくとも１種の治療薬は、その分子量に従い選択される。従って、少なくとも１種の治療薬は、１，０００Ｄａより高い分子量を有するように選択される。他の実施形態では、薬剤は、３００Ｄａ以下の分子量を有するように選択される。別の実施形態では、薬剤は、５００〜１，０００Ｄａの分子量を有するように選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、さらに非活性剤と結合させてもよい。非活性剤（非治療剤）は、ナノ粒子の少なくとも１つの特性を調節するように選択してもよく、このような特性として、例えば、粒度、多孔性、疎水性／親水性、電荷、反応性、化学的安定性、クリアランス率、分布、ターゲティング性の１つ以上が挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、非活性剤は、少なくとも５個の炭素原子を有する実質的に直線状の炭素鎖であり、直線炭素鎖中に１個以上のヘテロ原子を有してもよいし、有していなくてもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、非活性剤は、様々な鎖長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪酸、アミノ酸、脂肪若しくは非脂肪分子、脂肪族チオール、脂肪族アミンなどから選択される。これらの物質は荷電又は非荷電のいずれであってもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、非活性剤は、脂肪アミノ酸（アルキルアミノ酸）である。他の実施形態では、前記アルキルアミノ酸のアルキル部分は、１０〜３０個の炭素原子を有し、直鎖状でも、分枝状でもよく、また、飽和、半飽和若しくは不飽和であってもよい。別の実施形態では、前記アルキルアミノ酸のアミノ酸部分は、天然若しくは非天然アミノ酸、並びに／又はα−及び／若しくはβ−アミノ酸から選択してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、非ＰＥＧ化されていてもよい。すなわち、非活性剤は、ＰＥＧとは異なる。
【００４２】
従って、少なくとも１種の薬剤、例えば、治療薬又は非活性剤に関連する様々なパラメーター（治療又は非治療のいずれであってもよい）に応じて、（パラメーターは、例えば、溶解度、分子量、極性、疎水性／親水性、電荷、反応性、化学的安定性、生物学的活性などである）、薬剤を前記ナノ粒子に含有（カプセル化）させてもよいし、ナノ粒子を構成するポリマーマトリックス中に埋め込むか、及び／又はナノ粒子の表面（表面全体又は一部）と化学的若しくは物理的に結合させてもよい。選択される用途に応じて、ナノ粒子は、コア／シェルの形態（以後、ナノカプセルとも呼ぶ）であってよく、これは、ポリマーシェルと、活性物質を含まないか、又は少なくとも１種の薬剤を含むコアとを有する。
【００４３】
あるいは、ナノ粒子は、明確なコア／シェル構造の特徴をしていない実質的に均一な組成物からなる。これらのナノ粒子は、本明細書ではナノスフィア（ＮＳ）と呼ぶ。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の内部（コア又は内部マトリックス）は、少なくとも１種の親水性薬剤を一切含まないが、コア又はマトリックス中に分散若しくは溶解した親油性薬剤を含むことができる。すなわち、少なくとも１種の親水性薬剤は、ナノ粒子の表面上に滞留させるか、又はこの表面と結合させることができる。
【００４４】
他の実施形態では、ナノ粒子は、ほぼＰＬＧＡから構成される。
【００４５】
ナノカプセル（ＮＣ）を使用する場合には、少なくとも１種の（活性）親油性薬剤を、ＰＬＧＡコポリマーのシェルで囲まれているナノ粒子コア（キャビティー）内、例えば、油性マトリックス内に含有させてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬をナノ粒子の表面と結合させると共に、前記ナノ粒子のコア内又は前記ナノ粒子のマトリックス内に含有されるように、少なくとも１種の異なる治療薬を結合させる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１種の疎水性薬剤を含むナノカプセルである（薬剤は、油性コア内に含有されているため、親油性である）。特定の意図する適用に応じて、油性コアは、あらゆる油性有機溶剤又は媒質（単一材料若しくは混合物）から選択することができ、このような材料は、限定されないが、オクタン酸、オレイン酸、トリ酪酸グリセリル、長鎖トリグリセリド（例えば、ダイズ）などから選択してもよい。
【００４８】
あるいは、比較的均質な構造、例えば、ナノスフィアを用いてもよく、その場合、少なくとも１種の薬剤をナノ粒子マトリックス内に、例えば、均質に埋め込むことができ、これによって、ナノ粒子内の活性剤の濃度が均一なナノ粒子が得られる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、治療薬の送達におけるナノ粒子の効果を高めるために、ナノ粒子（ナノカプセル又はナノスフィアのいずれでも）表面の修飾が必要な場合もある。例えば、ナノ粒子の生分解及びクリアランスの改変を達成するように、ナノ粒子の表面電荷を改変してもよい。また、治療薬の長時間にわたる制御放出を達成するように、粒子のポリマー要素（ナノカプセル内のコア又はナノスフィア中の均質マトリックスのいずれでも）の多孔度を最適化することもできる。
【００５０】
本発明の別の態様では、少なくとも１種の（治療若しくは非治療、又はターゲティング）薬剤との結合を可能にするように、ナノ粒子を修飾する。この結合は、化学結合、例えば、共有結合、静電気結合、イオン相互作用、双極子−双極子相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合、又は薬剤の少なくとも一部とナノ粒子との物理的結合であってもよい。物理的結合は、少なくとも１種の薬剤の少なくとも一部（又はそれと結合したリンカー部分）をナノ粒子要素又は表面に封じ込める、埋め込む、吸着若しくは固定するようなものであってもよい。本明細書において、物理的結合は、一般に「物理的固定」と呼ぶ。
【００５１】
ナノ粒子は、治療若しくは非治療剤のいずれでも、多様な薬剤の１種以上と結合させてもよい。例えば、２種以上の薬剤を用いる場合、これらは類似していても、異なるものでもよい。特定のナノ粒子において複数の薬剤を使用すれば、複数の生物学的標的のターゲティングが可能になるか、又は特定の標的の親和性を高めることができる。さらに、ナノ粒子は、２種の薬剤を含んでもよく、各々、異なる溶解度を有し、一方は疎水性であり（例えば、コア内）、他方は、親水性である（例えば、シェル内若しくは粒子外部に広がる）。
【００５２】
ナノ粒子の各々と様々な薬剤との結合は、意図する用途に応じて、不安定（すなわち、特定の条件下で解離される）であるように、又は安定であるように選択してもよい。典型的には、少なくとも１種の薬剤が治療薬である場合には、これを、不安定結合又は１つ以上のリンカー部分のいずれかを介して、ナノ粒子の表面と結合させる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の薬剤は、１種以上のリンカー部分を介してナノ粒子と結合している治療薬であり、リンカー部分は、二官能価である、すなわちナノ粒子の表面との結合（相互作用）を可能にする第１（例えば、疎水性）部分と、治療薬との結合を可能にする第２（例えば、親水性）部分を有する。
【００５４】
複数のリンカー部分と結合したナノ粒子は、本明細書において、「修飾ナノ粒子」と呼ぶが、これは、すなわち、定義されているように、その表面の少なくとも一部が、少なくとも１種の薬剤と結合させることができるリンカー部分と結合しているナノ粒子である。ナノ粒子の表面と相互作用する複数のリンカーは、すべてが治療薬と結合している必要はない。一部は他の非治療薬と結合してもよく、残りは、裸末端基を有してもよい（薬剤と結合していない）。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上の異なる治療薬と結合している。
【００５５】
リンカーとナノ粒子表面との結合は、典型的に、ナノ粒子の表面へのリンカーの少なくとも一部の共有結合、静電気結合、水素結合及び物理的固定（非共有）から選択される。リンカーと少なくとも１種の治療薬との結合は、共有結合、静電気結合、及び水素結合から選択される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、共有結合を介して（ａ）少なくとも１種の治療薬及び（ｂ）ナノ粒子の表面の一方又は両方と結合させる。他の実施形態では、リンカーとナノ粒子の表面との結合は、ナノ粒子の表面に、リンカーの少なくとも一部を固定する（例えば、ナノ粒子の表面中に、また、ナノ粒子の固体／油性コアに貫通してもよい）ことによって行うが、このとき、リンカーの別の部分は、ナノ粒子の表面から露出し、そこから外部へと延びる。
【００５７】
別の実施形態では、リンカーは、前記少なくとも１種の治療薬に共有結合している。いくつかの実施形態では、（ａ）リンカーと治療薬の結合及び（ｂ）リンカーとナノ粒子表面との結合の一方又は両方が不安定である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子はその表面に、複数のリンカー部分が固定（非共有）されて、前記複数のリンカー部分の各々は、少なくとも１種の薬剤に共有結合しており；表面固定及び共有結合の両方が不安定である。
【００５９】
リンカーとナノ粒子及び薬剤のどちらとの結合も不安定であってもよい。すなわち、リンカーは、容易に切断可能なリンカーであり、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在する条件下で、解離を被りやすい。例えば、本発明のナノ粒子を、局所又は全身にかかわらず、１つ以上の皮膚層に通して又は通過させて皮膚適用のための薬物送達系として用いる場合には、治療薬は、リンカー又はナノ粒子担体から放出することができる。容易に切断可能な結合は、特定の活性の酵素又は加水分解によって切断されるような結合であってもよい。皮膚適用の場合には、リンカーと治療薬との結合又はナノ粒子とリンカーとの結合は、皮膚組織の１つ以上の層に存在する酵素によって切断可能であるように、選択してもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、カルボン酸基（エステルを形成するために）又はチオール基（硫化物結合を形成するために）を含む。
【００６１】
他の実施形態では、リンカー部分は、切断可能な結合の半減期、すなわち、リンカーから解離される治療薬の量に応じて選択する。いくつかの実施形態では、リンカーと治療薬の結合は、１分〜４８時間の半減期を有する。いくつかの実施形態では、半減期は、２４時間未満である。
【００６２】
別の実施形態では、リンカー部分は、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−などから選択される官能基を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、様々な鎖長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される。また、ＰＥＧリンカーは、免疫系を回避し、かつ分解性酵素に作用するのを防止することを目的とする他のリンカーと組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、脂肪酸（アルキルアミノ酸）であり、アルキル部分は、１０〜３０個の炭素原子を有し、直鎖状でも、分枝状でもよく、また、飽和、半飽和又は不飽和であってもよい。アミノ酸部分は、天然若しくは非天然アミノ酸、並びに／又はα−及び／若しくはβ−アミノ酸から選択してもよい。リンカーのアミノ酸基は、限定しないが、α及びβアミノ酸から選択されるアミノ酸から誘導することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０個の炭素原子のアルキル鎖を有する脂肪システインである。
【００６６】
別の実施形態では、リンカーは、式Ｉのオレイルシステインアミドである：
2014505695.tif 000002
【００６７】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、チオール化化合物であり、従って、修飾ナノ粒子は、例えば、高分子（分子量が１０００ダルトンを超える）、親水性分子及び電解質との結合が可能なチオール化ナノ粒子である。チオール化ナノ粒子と薬剤との結合は、薬剤上の活性基を介しても可能であり、このような基は、マレイミド官能基であってもよい。
【００６８】
本発明はまた、その表面に、複数の治療薬を有するポリマーナノ粒子も提供し、各薬剤は、リンカー部分を介して前記ナノ粒子に結合（結合（ｂｏｎｄｅｄ））しており、ナノ粒子は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクト−コ−グリコライド）（ＰＬＧ）、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸及び／又はこれらのコポリマーから選択されるポリマー材料からなる。いくつかの実施形態では、前記ポリマー材料は、ＰＬＡ、ＰＧＡ及びＰＬＧＡから選択される。別の実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ＰＬＧＡからなる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、オレイルシステインアミドである。他の実施形態では、ナノ粒子は、上に開示した物理的特徴を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子であり、ＰＬＧＡは、２０，０００Ｄａ以下の平均分子量を有する。
【００７０】
本発明のナノ粒子は、医療に使用するための医薬組成物の製造に用いてもよい。いくつかの実施形態では、この組成物は、皮膚障害、眼の疾患、並びに本発明の組成物によって治療が可能なあらゆる他の疾患の治療的処置、すなわち治療及び／又は予防に用いられる。
【００７１】
医薬組成物中のナノ粒子の濃度は、その量が、被検体に対する所望の有効量の治療薬を、選択した特定の投与方法に従って、送達するのに十分であるように選択してもよい。周知のように、本明細書において目的とする「有効量」は、当分野では公知の考察事項によって、決定することができる。この量は、中でも、治療しようとする疾患の種類及び重症度並びに治療法に応じて、所望の治療効果を達成するように有効でなければならない。有効量は、典型的に、適切に設計された臨床試験（用量範囲の試験）で決定され、当業者であれば、有効量を決定するためにこのような試験を適正に実施する方法に精通していよう。周知のように、有効量は、受容体に対するリガンドの親和性、身体内の分布プロフィール、身体内での半減期のような各種薬理学的パラメーターなどの様々な因子、もし存在すれば、望ましくない副作用、年齢及び性別などの因子に応じて変動する。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、異なる又は同じ分散材料を用いて、異なる又は同じ分散特性の様々なナノ粒子タイプ又は粒度を含んでいてもよい。
【００７３】
また、ナノ粒子は、多様な治療薬を、局所、経口、吸入、鼻内、又は非経口経路により、投与後に循環系へと輸送するための薬物又は生体活性送達系としても用いてもよい。本発明のナノ粒子送達系は、標的化薬物送達及び制御放出適用を容易にし、また、クリアランスの低減によって作用部位での薬物生体利用率を高め、投薬頻度を減らすと共に、副作用を最小限にする。
【００７４】
極めて概括的には、本発明の送達系は、
（ｉ）本明細書に開示するポリマーナノ粒子；及び
（ｉｉ）前記ナノ粒子と結合した少なくとも１種の薬剤
を含み、ここで、前記少なくとも１種の薬剤は、リンカー部分を介して前記表面と結合していてもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、前記表面に物理的に固定（非共有的に結合）された第１部分と、前記少なくとも１種の薬剤と結合した第２部分とを有する。いくつかの実施形態では、前記表面に物理的に固定された第１部分は、疎水性であり、前記少なくとも１種の薬剤と結合した第２部分は、親水性である。
【００７６】
本発明の送達系は、少なくとも約１２時間にわたり、又はいくつかの実施形態では、少なくとも約２４時間にわたり、又は他の実施形態では、１０〜２０日の期間にわたって、制御放出を可能にする速度で治療薬を送達することができる。それ自体で、本送達系は、例えば、限定しないが、薬物送達、遺伝子治療、医学的診断などの様々な適用、並びに、例えば、皮膚疾患、癌、病原体媒介による疾患、ホルモンに関連する疾患、器官移植に関連する反応副産物、及びその他の異常な細胞又は組織増殖の医学的治療のために用いることができる。
【００７７】
本送達系は、典型的に、この送達系と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として投与される。薬学的に許容される担体は、ビヒクル、補助剤、賦形剤、及び希釈剤から選択してよく、これらは、市販のものを容易に入手できる。薬学的に許容される担体は、本発明の送達系又はそのいずれの成分に対しても化学的に不活性であり、しかも、使用の条件下で、有害な副作用若しくは毒性のないものが選択される。
【００７８】
本発明は、様々な用途のために製剤化された組成物を提供する。いくつかの実施形態では、経皮投与、例えば、被検体の循環系への治療薬の送達のために設計された組成物が提供される。別の実施形態では、局所投与のための組成物が提供される。局所組成物は、典型的に、角質層を介して治療薬を送達するために用いられる。別の実施形態では、治療薬の経口投与のために設計された組成物が提供される。さらに、治療薬の眼投与のために設計された組成物が提供される。眼投与用組成物は、点眼剤又は眼への注射として投与することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のナノ粒子を含む眼投与用組成物が提供され、前記ナノ粒子は、治療用高分子と結合しており、この結合は、少なくとも１種のリンカーを介するものでもよい。いくつかの実施形態では、本組成物は、眼内注射に好適な形態又は点眼剤の形態をしている。
【００８０】
担体の選択は、一部は、特定の治療薬によって、並びに組成物を投与するのに用いられる特定の方法又は送達方法によって決定される。従って、本発明の医薬組成物又は送達系は、経口、腸内、口腔、鼻内、局所、経表皮、直腸、膣内、エアロゾル、経粘膜、表皮、経皮、皮膚、眼、肺、皮下、皮内及び／又は非経口投与経路用に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物又は送達系は、経皮、局所、皮下及び／又は非経口経路によって投与される。
【００８１】
送達系は、生体適合性の水溶液又は脂質溶液として投与することができる。この溶液は、限定しないが、食塩水、水又は薬学的に許容される有機媒質から構成することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、実質的に水を含まない。
【００８３】
送達系製剤の投与は、単一用量で、又は特定の時間間隔を置いて、１回又は複数回用量を繰り返して実施することができる。適切な投薬量は、治療に有効な量などのパラメーターに応じても変動しうるが、この量は、治療しようとする個体、投与方法、治療薬の特有の性質、及び達成しようとする特定の治療効果によって決定され、また直接これらに左右される。適切な用量は、当業者によって確立することができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、あらゆる疾病又は病態を治療、予防若しくは診断するために選択することができる。用語「治療」又はそのあらゆる変化形は、本明細書で用いる場合、疾患に関連する望ましくない症状を改善する、このような症状が起こる前に、それらの発現を予防する、疾患の進行を遅らせる、症状の悪化を遅らせる、寛解期間の開始を高める、疾患の進行性慢性期に引き起こされる不可逆性損傷を遅らせる、前記進行期の開始を遅延させる、疾患の重症度を低減する、若しくはその疾患を治癒させる、生存率を改善する、若しくはより早い回復を誘導する、又は疾患の発生を予防する、あるいは、これらのうち２つ以上の組合せを達成する上で有効な治療量で、本発明の組成物又は系を投与することを意味する。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、物理的障壁によって保護されている組織に対して特に有利となりうる。このような障壁は、皮膚、血液関門（例えば、血液胸腺関門、血液脳関門、血液空気関門、血液精巣関門など）、器官外膜などであってもよい。障壁が皮膚である場合、本発明の医薬組成物によって治療することができる皮膚疾患としては、限定するものではないが、抗真菌性障害若しくは疾患、挫瘡、乾癬、白斑、ケロイド、熱傷、瘢痕、乾燥症、魚鱗癬、角化症、角皮症、皮膚炎、掻痒症、湿疹、皮膚癌、及び皮膚硬結が挙げられる。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、あらゆる皮膚病態を予防若しくは治療するのに用いることができる。いくつかの実施形態では、皮膚病態は、例えば、皮膚炎、湿疹、接触性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乳児湿疹、ベニエー痒疹、アレルギー性皮膚炎、屈面性湿疹、播種性神経皮膚炎、脂漏性皮膚炎（又は湿疹）、乳児脂漏性皮膚炎、成人脂漏性皮膚炎、乾癬、神経皮膚炎、疥癬、全身性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、口周囲皮膚炎、貨幣状湿疹、貨幣状皮膚炎、主婦湿疹、汗疱、手掌足底の不応性膿疹、バーバーズ（Ｂａｒｂｅｒ’ｓ）若しくは膿疱性乾癬、全身性剥脱性皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、静脈瘤性湿疹、汗疱状湿疹、ビダール苔癬（局在性掻痒皮膚炎：神経皮膚炎）、扁平苔癬、真菌乾癬、カンジダ性間擦疹、頭部白癬、白斑点病、パナウ（ｐａｎａｕ）、白癬、水虫、モーリア症、カンジダ症；皮膚糸状菌感染、急性疱状皮膚炎、慢性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、毒物性皮膚炎、ビダール苔癬、皮脂欠乏性湿疹皮膚炎、自家感作性湿疹、又はこれらの組合せなどの皮膚疾患から選択される。
【００８７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、面皰、尋常性挫瘡、母斑、そばかす、入れ墨、瘢痕、熱傷、日焼け、シワ、眉間のシワ、眼尻のシワ、カフェオレ斑、良性皮膚腫瘍を予防若しくは治療するために使用することができ、一実施形態では、疾患は、脂漏性角化症、黒色丘疹性皮膚病、懸垂線維腫、脂腺過形成、汗管腫、黄色板症、又はこれらの組合せ；良性皮膚増殖、ウイルス性疣贅、カンジダ性おむつ皮膚炎、毛包炎、ブルンケル、せつ、よう、皮膚の真菌感染、滴状低メラニン症、脱毛、膿痂疹、肝斑、伝染性軟属腫、酒さ、スクレイピー、帯状疱疹、丹毒、紅色陰癬、帯状ヘルペス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘、皮膚癌（例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫）、前悪性増殖（例えば、先天性母斑、日光性角化症）、蕁麻疹、蕁麻疹、白斑、魚鱗癬、黒色表皮種、水疱性類天疱瘡、胼胝及び皮膚硬結、フケ、乾燥肌、結節性紅斑、グレーブス皮膚病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、毛孔性角化症；光沢苔癬、扁平苔癬、硬化性苔癬、肥満細胞症、伝染性軟疣腫、バラ色粃糠疹、毛孔性紅色粃糠疹、ＰＬＥＶＡ、若しくはムッハ・ハーベルマン病、表皮水疱症、脂漏性角化症、スティーブン・ジョンソン症候群、天疱瘡、又はこれらの組合せである。
【００８８】
別の実施形態では、本発明の組成物は、虫刺され又は刺傷を予防又は治療するために用いることができる。
【００８９】
また別の実施形態では、本発明の組成物は、眼の領域に関連する皮膚病態、例えば、汗管腫、黄色板症、膿痂疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、又はこれらの組合せ；頭皮、指の爪に関連する病態、例えば、細菌、真菌、酵母及びウイルスによる感染、爪囲炎、又は乾癬；口の領域に関連する病態、例えば、口腔扁平苔癬、単純疱疹（ヘルペス性口内炎）、口腔白板、口腔カンジダ症、又はこれらの組合せ；あるいは、以上の組合せを予防又は治療するために用いることができる。
【００９０】
周知のように、ヒトの皮膚は、多数の層からなるが、これらは３つの主要な層群：皮膚の外部表面に位置する角質層、表皮及び真皮に区分することができる。角質層は、細胞外脂質に富んだマトリックス中のケラチンで満たされた細胞の層であり、これは、事実上、皮膚中への薬物送達に対する主要な障壁であり、表皮及び真皮層は可変性の組織である。表皮には血管がないが、真皮は、毛細血管係蹄を含んでおり、これらは、経上皮性全身分布のための治療薬を運搬することができる。
【００９１】
薬物の経皮送達は、好まれる選択経路となるようだが、この経路では、限られた数の薬物しか投与することができない。より多様な薬物を経皮送達することができないのは、主に、薬物が低分子量（分子量が５００Ｄａを超えない薬物）、親油性及び低用量であることが要求されるためである。本発明の送達系は、これらの障害を明らかに克服する。前述したように、本発明の送達系は、非常に多様な分子量及び親水性を有する治療薬を保持することができる。本発明の送達系によって、皮膚層の少なくとも１つを介して、すなわち、角質層、表皮及び真皮層を介した少なくとも１種の治療薬の輸送が可能になる。特定の理論に拘束されるものではないが、角質層を介して治療薬を輸送する送達系の能力は、水和ケラチン層を介した、より深部の皮膚層へのインタクトな系又は解離した治療薬及び／若しくは解離したナノ粒子の拡散などの一連の事象に左右される。
【００９２】
従って、本発明はまた、
（ｉ）本明細書に定義するＰＬＧＡナノ粒子；及び
（ｉｉ）前記ナノ粒子と結合した少なくとも１種の薬剤
を含み、ここで、前記少なくとも１種の薬剤は、リンカー部分を介して前記表面と結合していてもよく、このリンカー部分は、前記ナノ粒子を有するか、あるいは、その内部に含有されている、送達系も提供する。
【００９３】
さらに、
（ｉ）本明細書に開示するポリマーナノ粒子； 
（ｉｉ）前記ポリマーナノ粒子の表面と結合したリンカー部分；
（ｉｉｉ）前記リンカー部分と結合した少なくとも１種の治療薬；及び
（ｉｖ）任意選択により、ナノ粒子と結合していてもよい少なくとも１種の別の薬剤
を含む、多段階送達系が提供される。
【００９４】
生物学的条件下で解離する本発明の送達系の能力により、この多段階系は、以下に挙げる利点のうち１つ以上を提供する：（１）多段階系が、様々なメカニズムにより組織障壁を介して治療薬の輸送を可能にすること；（２）治療薬がナノ粒子と直接結合している場合には、リンカー又はナノ粒子から治療薬を解離することができ、従って、送達系を投与した被検体の身体内の特定の標的組織又は器官に、治療薬を送達可能であること；（３）ポリマーナノ粒子及びリンカー部分（治療薬を含まない）を含む修飾ナノ粒子は、さらなる障壁組織を通過してさらに遠くに移動することが可能であり、その水和を増大すると同時に、さらなる治療効果を誘導しうること；並びに（４）ナノ粒子が、カプセルコア内に薬剤も保持するナノカプセルである場合には、複数の治療薬の同時送達及び局在化を可能にしうること。
【００９５】
従って、本発明の送達系では、各成分は、個別の意図する機能を有するように設計することができ、これらの機能は、別の成分の意図する機能とは異なっていてもよい。例えば、治療薬は、特定の部位をターゲティングするように設計することができ、この部位は、リンカー部分又は裸ナノ粒子によってターゲティングされる部位とは異なっていてもよく、従って、上記治療薬は、特定の生体障壁を克服若しくは回避することができ、この障壁は、送達系全体によって克服若しくは回避される生体障壁とは異なっていてもよい。例えば、少なくとも１種の薬剤が、ナノ粒子と連結した抗体である場合、これは、表皮又は真皮中の細胞の表面上で特定の抗原と結合することができ、その間に、ナノ粒子のコア内部の薬剤は、単純な拡散により早期に放出することができる。さらに、組み込まれた薬剤をナノ粒子からほとんど放出することができると同時に、ナノ粒子は、これよりゆっくりとフラグメント化又は生分解されて、ＰＬＡ若しくはＰＧＡのモノマーとして真皮から排出することができる。
【００９６】
本発明はまた、本発明の送達系の製造方法も提供し、この方法は、
−本明細書に定義するナノ粒子を取得するステップ；
−ナノ粒子表面とリンカー部分との結合を可能にする条件下で、前記ナノ粒子をリンカー部分と反応させることにより、表面修飾ナノ粒子を取得するステップ；及び
−表面修飾ナノ粒子を少なくとも１種の薬剤、例えば、治療薬又は非治療剤と接触させて、リンカー末端基を結合させることにより、本発明の送達系を取得するステップを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、ナノ粒子との接触前に、治療薬と結合させてもよく、従って、この方法は、
−本明細書に定義するナノ粒子を取得するステップ；
−治療薬と結合したリンカー部分を取得するステップ；及び
−治療薬と結合したリンカーを前記ナノ粒子と反応させることにより、前記リンカーの少なくとも一部とナノ粒子の表面とを結合させるステップを含みうる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、送達系／多段階系は、オレイルシステインアミドと結合したナノ粒子を含み、これは、ナノ粒子の界面に固定されているため、異なる分子量の様々なＰＬＡ及びＰＬＧＡポリマー混合物に容易に適用することができ、これによって、非常に多様なチオール化ナノ粒子が得られる。
【００９９】
結合方法は、先験的に、粒子形成ポリマーの化学的修飾を必要としない。これは、分子リンカー（例えば、オレイルシステインアミド）を用いて達成され、このリンカーは、粒子のポリマーマトリックス又はポリマーナノカプセル壁に非共有的に結合する親油性部分と、後のステップで、所望の治療薬と直接結合することができるか、又はマレイミド基で活性化される、チオール化合物を含む第２部分とを有する。このアプローチでは、それぞれ異なる各治療薬に合わせて異なるナノ粒子組成物を設計する必要がなくなるため、様々な治療用途に用いることができる、汎用リンカー（活性治療薬を含む）を可能にする。
【０１００】
治療薬をリンカーに化学的に結合させるのに利用可能な方法、例えば、カルボジイミド媒介結合を用いる以外に、生体電解質（例えば、二価金属、例えば、銅、セレン、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛）のキレート化及び皮膚送達のために、チオール修飾ナノ粒子表面を一緒に、又は代わりに用いてもよい。チオール化ナノ粒子は、不要な過剰量の金属をキレート化することにより、皮膚に対する金属触媒ＲＯＳ（活性酸素）媒介の有害な作用を軽減する送達系としても役立ちうる。
【０１０１】
本発明はまた、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子も提供し、ＰＬＧＡは、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、少なくとも１種の薬剤（治療又は非治療）と表面結合しており、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するものであり、このナノ粒子は、
−多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、ＰＬＧＡの平均分子量が２，０００〜２０，０００ＤａであるＰＬＧＡナノ粒子を取得するステップ；
−ナノ粒子表面とリンカー部分との結合を可能にする条件下で、前記ナノ粒子をリンカー部分と反応させることにより、表面修飾ナノ粒子を取得するステップ；及び
−表面修飾ナノ粒子を、治療薬又は非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤と接触させることにより、リンカー末端基と前記少なくとも１種の薬剤を結合させるステップ
を含む方法によって取得することができる。
【０１０２】
また、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の製造方法も提供され、このＰＬＧＡは、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、少なくとも１種の薬剤に表面結合しており、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するものであり、上記の方法は、
−多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、ＰＬＧＡの平均分子量が２，０００〜２０，０００ＤａであるＰＬＧＡナノ粒子を取得するステップ；
−ナノ粒子表面とリンカー部分との結合を可能にする条件下で、前記ナノ粒子をリンカー部分と反応させることにより、表面修飾ナノ粒子を取得するステップ；及び
−表面修飾ナノ粒子を、治療薬又は非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤と接触させることにより、リンカー末端基と前記少なくとも１種の薬剤を結合させるステップ
を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、上記の方法及びそれらによって製造される製品において、リンカー部分（例えば、オレイルシステインアミド）は、ナノ粒子との結合前に、少なくとも１種の薬剤と結合させる。少なくとも１種の薬剤は、典型的に、治療薬である。
【０１０４】
さらに、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の製造方法も提供され、このＰＬＧＡは、２，０００〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有し、前記ナノ粒子は、少なくとも１種の薬剤に表面結合しており、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するものであり、上記の方法は、
−多くとも５００ｎｍの平均粒径を有し、ＰＬＧＡの平均分子量が２，０００〜２０，０００ＤａであるＰＬＧＡナノ粒子を取得するステップ；
−前記ナノ粒子を、治療薬又は非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤と反応させることにより、少なくとも１種の薬剤と前記ナノ粒子の表面を結合させるステップ
を含む。
【０１０５】
また、多くとも５００ｎｍの平均粒径を有するポリ乳酸（ＰＬＡ）ナノ粒子も提供され、このＰＬＡは、１０，０００Ｄａ以下の平均分子量を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＰＬＡは、１，０００〜１０，０００Ｄａの平均分子量を有する。他の実施形態では、ＰＬＡは、１，０００〜５，０００Ｄａの平均分子量を有する。別の実施形態では、ＰＬＡは、１，０００〜３，０００Ｄａの平均分子量を有する。さらに他の実施形態では、ＰＬＡは、約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００又は約５，０００Ｄａの平均分子量を有する。
【０１０７】
さらに、治療薬を被検体に送達するための送達系を製造する方法におけるオレイルシステインアミドの使用が提供され、前記方法は、前記被検体に送達しようとする治療薬と前記オレイルシステインアミドを反応させることを含む。
【０１０８】
また、少なくとも１種のナノ粒子との結合に用いるためのオレイルシステインアミドも提供される。
【０１０９】
さらに、オレイルシステインアミドと化学的に結合した（例えば、共有結合を介して）高分子も提供される。
【０１１０】
また、複数の表面露出チオール基を表面に有するＰＬＧＡナノ粒子も提供され、前記チオール基は、本明細書に開示するように、治療薬及び非治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤との結合のために活性化される。いくつかの実施形態では、前記チオール基は、オレイルシステインアミドのものである。
【０１１１】
本発明が理解されるように、また実際にどうのように実施されうるかを示すために、以下に、あくまで非限定的例として、添付の図面を参照にしながら、実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】図１Ａは、カーボングリッドの様々な箇所でのブランクＰＬＧＡ４５００ナノ粒子のＣＲＹＯ−ＴＥＭ画像である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、４℃で１ヵ月の保存後の、カーボングリッドの様々な箇所でのブランクＰＬＧＡ４５００ナノ粒子のＣＲＹＯ−ＴＥＭ画像である。
【図２Ａ】図２Ａは、カーボングリッドの様々な箇所でのＤＨＥＡ充填ＰＬＧＡ４５００ナノカプセルのＣＲＹＯ−ＴＥＭ画像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、カーボングリッドの様々な箇所でのＤＨＥＡ充填ＰＬＧＡ５００００ナノカプセルのＣＲＹＯ−ＴＥＭ画像である。
【図３】図３は、異なるＮＩＲ−ＰＬＧＡナノスフィア製剤の３時間にわたる局所投与（２．２５ｍｇ／ｃｍ２）後の様々な連続的テープストリッピングの蛍光画像群である。走査は、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）Ｉｎｆｒａ Ｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＤｉＤ組込みナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（４．５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ充填ＰＬＧＡ４５００ナノスフィアを示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＤｉＤ組込みナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（４．５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ充填ＰＬＧＡ５００００ナノスフィアを示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＤｉＤ組込みナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（４．５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ対照溶液を示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＤｉＤ組込みナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（４．５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ充填ＰＬＧＡ４５００ナノカプセルを示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図５Ａ】図５Ａは、様々な蛍光ナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ組込み及びローダミンＢ結合ＰＬＧＡ４５００ナノスフィアを示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、様々な蛍光ナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ組込み及びローダミンＢ結合ＰＬＧＡ４５００ナノカプセルを示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、様々な蛍光ナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ローダミンＢ組込みラテックスナノスフィアを示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、様々な蛍光ナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ及びローダミンＢ結合ＰＬＧＡ４５００水性分散液対照を示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図５Ｅ】図５Ｅは、様々な蛍光ナノカプセル又はナノスフィアの局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）から２時間後の、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像であり、ＤｉＤ及びローダミンＢ結合ＰＬＧＡ４５００ＭＣＴ含有水性分散液対照を示す。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、Ｚ−ｓｔａｃｋ走査を実施した。
【図６Ａ】図６Ａは、様々なＤｉＤ組込みＲｈｄＢ−ＰＬＧＡ製剤を２時間局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）した後の、２７μｍインクリメンタルオプティカルセクショニングを用いた、皮膚深さの関数としてのＤｉＤ累積蛍光強度を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、様々なＤｉＤ組込みＲｈｄＢ−ＰＬＧＡ製剤を２時間局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）した後の、２７μｍインクリメンタルオプティカルセクショニングを用いた、皮膚深さの関数としてのローダミンＢ累積蛍光強度を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＤｉＤ組込みＲｈｄＢ−ＰＬＧＡ  ＮＰの局所投与から２時間後の厚さ８μｍの皮膚垂直断面のＣＬＳＭ画像である。（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）。バー＝１００μｍ。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＤｉＤ組込みＲｈｄＢ−ＰＬＧＡ  ＮＣの局所投与から２時間後の厚さ８μｍの皮膚垂直断面のＣＬＳＭ画像である。（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）。バー＝１００μｍ。
【図７Ｃ】図７Ｃは、それぞれの対照のＣＬＳＭ画像である。（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）。バー＝１００μｍ。
【図７Ｄ】図７Ｄは、それぞれの対照のＣＬＳＭ画像である。（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）。バー＝１００μｍ。
【図８】図８は、ＰＬＧＡナノスフィア、ナノカプセル及びラテックスナノスフィアなどの様々なローダミンＢ組込み製剤を２時間局所適用（３．７５ｍｇ／ｃｍ２）した後の、２７μｍインクリメンタルオプティカルセクショニングを用いた、皮膚深さの関数としてのローダミンＢ累積蛍光強度を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、様々な放射性ナノ担体及びそれぞれの対照のインキュベーションからの時間経過による、生存表皮の皮膚コンパートメントにおける［３Ｈ］ＤＨＥＡ分布であり、陽（◆）及び陰（■）荷電［３Ｈ］ＤＨＥＡ  ＮＣ及びそれぞれの油性対照（◇、□）を示す。それぞれの対照と比較した陽（＊）及び陰（＊＊）荷電ＤＨＥＡ  ＮＣの有意な差（Ｐ値＜０．０５）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、様々な放射性ナノ担体及びそれぞれの対照のインキュベーションからの時間経過による、生存表皮の皮膚コンパートメントにおける［３Ｈ］ＣＯＥ分布であり、［３Ｈ］ＣＯＥ  ＮＳ（▲）、［３Ｈ］ＣＯＥ  ＮＣ（●）及びそれぞれの対照（△、〇）を示す。それぞれの対照と比較した陽（＊）及び陰（＊＊）荷電ＤＨＥＡ  ＮＣの有意な差（Ｐ値＜０．０５）。
【図９Ｃ】図９Ｃは、様々な放射性ナノ担体及びそれぞれの対照のインキュベーションからの時間経過による、真皮の皮膚コンパートメントにおける［３Ｈ］ＤＨＥＡ分布であり、陽（◆）及び陰（■）荷電［３Ｈ］ＤＨＥＡ  ＮＣ及びそれぞれの油性対照（◇、□）を示す。それぞれの対照と比較した陽（＊）及び陰（＊＊）荷電ＤＨＥＡ  ＮＣの有意な差（Ｐ値＜０．０５）。
【図９Ｄ】図９Ｄは、様々な放射性ナノ担体及びそれぞれの対照のインキュベーションからの時間経過による、真皮の皮膚コンパートメントにおける［３Ｈ］ＣＯＥ分布であり、［３Ｈ］ＣＯＥ  ＮＳ（▲）、［３Ｈ］ＣＯＥ  ＮＣ（●）及びそれぞれの対照（△、〇）を示す。それぞれの対照と比較した陽（＊）及び陰（＊＊）荷電ＤＨＥＡ  ＮＣの有意な差（Ｐ値＜０．０５）。
【図１０】図１０は、陽（◆）及び陰（■）荷電ＤＨＥＡ充填ＮＣ並びにそれぞれの油性対照（◇、□）の局所投与後のレセプターコンパートメント液中で記録された［３Ｈ］ＤＨＥＡを示す。値は、平均±ＳＤである。それぞれの対照と比較した陽（＊）及び陰（＊＊）荷電ＤＨＥＡ  ＮＣの有意な差（Ｐ値＜０．０５）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、１２ｎｍ金粒子に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて、１時間にわたりインキュベートした後の、様々な倍率のセツキシマブ免疫ナノ粒子（ＩＮＰ）の透過型電子顕微鏡写真である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、１２ｎｍ金粒子に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて、１時間にわたりインキュベートした後の、様々な倍率のセツキシマブ免疫ナノ粒子（ＩＮＰ）の透過型電子顕微鏡写真である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、１２ｎｍ金粒子に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて、１時間にわたりインキュベートした後の、様々な倍率のセツキシマブ免疫ナノ粒子（ＩＮＰ）の透過型電子顕微鏡写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、セツキシマブ免疫ナノ粒子とＡ５４９細胞の結合を示すフローサイトメトリーヒストグラムであり、増加する濃度（０．０２５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）での、表面活性化ナノ粒子を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、セツキシマブ免疫ナノ粒子とＡ５４９細胞の結合を示すフローサイトメトリーヒストグラムであり、増加する濃度（０．０２５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）での、リツキシマブ（マッチしたアイソタイプ）免疫ナノ粒子を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、リツキシマブ免疫ナノ粒子の１μｇ／ｍｌ当量と比較した０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ当量のセツキシマブＩＮＰ（フルバックグラウンドヒストグラム）を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与から３時間後の、特定の免疫組織化学染色による、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像である。染色は、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与から３時間後の、特定の免疫組織化学染色による、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像である。染色は、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与から３時間後の、特定の免疫組織化学染色による、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像である。染色は、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与から３時間後の、特定の免疫組織化学染色による、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像である。染色は、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与から３時間後の、特定の免疫組織化学染色による、全皮膚サンプルの再構成蛍光画像である。染色は、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【図１４】図１４は、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与、並びに特定の免疫組織化学染色後の、１２までの連続した約３５μｍ切片について個別に算出したｃｍ２当たりの個々の蛍光強度を示す。
【図１５】図１５は、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与、並びに特定の免疫組織化学染色後の、３８５μｍまでについて算出したｃｍ２当たりの補外累積蛍光強度を示す。
【図１６】図１６は、様々な免疫学的ナノ粒子状製剤及び対照ナノ粒子状製剤（０．１２ｍｇ  ＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２）の局所投与、並びに特定の免疫組織化学染色後の、３８５μｍまでについて算出したｃｍ２当たりの累積蛍光強度の計算ＡＵＣ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
Ｉ．皮膚への乳酸及びグリコール送達
皮膚に適用されて、真皮の上層中に浸透し、時間をかけて制御された方式で、天然の保湿因子である乳酸及びグリコール酸、又は乳酸のみを放出する特定の粒度のナノ粒子を製造するために、臨床的に広く容認されているＰＬＧＡポリマー及び特定の分子量のＰＬＡ粒子が利用されており、これによって、有害となることなく、皮膚の長時間にわたる持続的水和が可能になる。
【０１１４】
ＰＬＧＡナノ粒子は、皮膚内で分解することにより、酪酸及びグリコール酸の段階的かつ連続的放出をもたらすことから、それ自体で、空のまま又は適切な活性成分を充填したいずれでも、持続的活性水和成分として用いられている。表皮又は真皮であっても、それらの深部の層にナノ粒子が浸透しても、加水分解産物である乳酸及びグリコール酸が自然に排除又は排出されるため、既述のように、何ら損傷を引き起こさない。
【０１１５】
本発明は他の有益な活性成分が用いられる可能性も包含しているが、本発明の組成物の活性水和成分としてのＰＬＧＡ（又はＰＬＡ）は、単に皮膚への他の成分を送達するための担体として用いられるわけではないことを強調しておく必要がある。従って、本発明によれば、本組成物は、局所適用を目的とする、すなわち、その他の適用と同様に、局所適用のための担体を含む。
【０１１６】
本発明のナノ粒子は、典型的に、５００ｎｍより小さい粒度である。典型的には、ナノ粒子は、１００〜２００ｎｍ、又は５０〜１００ｎｍの粒度範囲のものである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡの分子量及びＰＬＡとＰＧＡの比は、ナノ粒子が、以下の特性を有するように設計される：
（ａ）少なくとも１０の表面表皮層まで皮膚に浸透すること；
（ｂ）少なくとも４〜２０マイクロメートルの深さまで皮膚に浸透すること；
（ｃ）これらが浸透する皮膚層（典型的には、角質層中の約１５％）中で生分解すること；
（ｄ）乳酸及びグリコール酸又は乳酸のみの２４時間超、好ましくは７２時間超、より好ましくは約１週間にわたる持続的放出。
【０１１８】
特定の理論に拘束されるものではないが、粒度（浸透率及び浸透深さに影響する）、ＰＬＡ及びＰＧＡの比、並びにＰＬＧＡの分子量の間で、相互に影響しあうようであり、従って、前述の特性は、多数の組合せによって達成することができる。パラメーターのいくつかの変更は互いを相殺しうる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＰＬＡ：ＰＧＡの比は、８５：１５；７２：２５；又は５０：５０である。いくつかの実施形態では、この比は、５０：５０である。
【０１２０】
他の実施形態では、ＰＬＧＡの分子量は、２，０００〜１０，０００Ｄａの範囲である。いくつかの実施形態では、この比は、２，０００〜４，０００である。
【０１２１】
他の実施形態では、ＰＬＡ粒子は、それ自体で用いてもよく、このような実施形態において、ＰＬＡ分子量は、４，０００〜２０，０００の範囲である。
【０１２２】
ＩＩ．ナノ粒子中の不溶性化合物のカプセル化方法−ＤＨＥＡ充填ＰＬＧＡナノ粒子の能力
本発明では、ナノ粒子に、ビタミン、ペプチド、及び上に開示したその他の物質などの活性物質を充填することができる。
【０１２３】
ヒトは、多量のデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及びその硫酸塩誘導体（ＤＨＥＡＳ）を分泌する副腎を有する。ヒトにおける血漿ＤＨＥＡ（Ｓ）レベルの顕著な特徴は、加齢と共に大幅に減少することである。研究者らは、ＤＨＥＡ（Ｓ）レベルの加齢による低下は、加齢に関連する退行性変化の一部を説明しうると主張している。ＤＨＥＡ（Ｓ）の作用の３つのメカニズムが確認されている。ＤＨＥＡ及びＤＨＥＡ（Ｓ）は、テストステロン及びエストラジオールの前駆体である。ＤＨＥＡ（Ｓ）は、神経ステロイドであり、神経伝達物質受容体との特異的相互作用を介して神経興奮性を調節し、ＤＨＥＡは、カルシウム依存性カリウムチャンネルの活性化因子である。
【０１２４】
１年にわたり（ほぼ）生理学的用量（５０ｍｇ／日）のＤＨＥＡによる処置を実施した、６０歳以上の２８０人の健康な個体（男性１４０人及び女性１４０人）を含むランダム化プラセボ比較臨床試験によって、非常に明確な結果が得られた。気分、健康状態、認識及び性的機能、骨質量、身体組成、血管危険因子、免疫機能及び皮膚に対するＤＨＥＡ置換処置の影響を評価した。興味深いことに、特に女性において、水和、表皮厚さ、皮脂産生、及び皮膚色素沈着に関して、皮膚の状態の改善が観察された。さらに、１年にわたる５０ｍｇ／日のＤＨＥＡ投与後に、有害な結果は全く観察されなかった。
【０１２５】
ＤＨＥＡは、細胞外基質タンパク質の調節及び分解による皮膚老化の過程に関連する可能性があることがわかっている。ＤＨＥＡは、培養された真皮線維芽細胞中で、プロコラーゲン合成を増大すると共に、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１合成を低減し、かつ組織マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ−１）の産生を増大することによって、コラーゲン分解を阻害できることが実証された。エタノール：オリーブ油（１：２）中のＤＨＥＡ（５％）を、４週間にわたって１２回ボランティアの臀部皮膚に局所適用したところ、高齢及び若年者の皮膚の両方で、プロコラーゲンα（Ｉ）ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を有意に増大することがわかった。他方で、局所ＤＨＥＡは、高齢者の皮膚において、ＭＭＰ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質の基底発現を有意に低減したが、ＴＩＭＰ−１タンパク質の発現を増大した。これら近年の研究結果は、皮膚の老化防止剤としてのＤＨＥＡの可能性を示している。
【０１２６】
報告された結果全体に基づき、局所適用される外性ＤＨＥＡが、表皮の角化を促進して、皮脂の内性産生及び分泌を増大し、これに続いて皮膚のバリア作用を強化することにより、皮膚の水和を促進して、コラーゲン及び結合組織の喪失を阻害することにより真皮の萎縮を治療することができ、最終的には、皮膚の色素沈着を調節することができる。これらの特性によって、ＤＨＥＡが、局所用製剤に適切に溶解して、皮膚適用後に、製剤から皮膚に向かって拡散し、かつ皮膚浸透のために十分に生体利用可能であれば、ＤＨＥＡは、老化防止活性成分としての活性物質候補となる。実際には、ＤＨＥＡは、水、極性油及び植物油のような一般的美容及び医薬品用溶媒において、複雑な溶解性の制約を呈示する。ＤＨＥＡは、ほぼ水不溶性（０．０２ｍｇ／ｍｌ）であり、０．５％未満の濃度であっても、通常の局所製剤中で急速に沈殿する傾向があることが知られており、複数の多形結晶形態を形成するが、これは、制御するのが難しく、非常に遅い溶解速度を示す。さらに、ＤＨＥＡは、親油相においても低い溶解度を示し、中鎖トリグリセリド中での最大溶解度は１．７７％である。最も許容される局所投与形態は、ｏ／ｗエマルジョンであり、そこで、ＤＨＥＡは、親油相に溶解するはずである。しかし、この溶液は、適切な効力の活性を誘発するＤＨＥＡ濃度（約０．５％ｗ／ｖ）を達成するのに、非常に高濃度の油相（７０％を超える）が必要であるために、達成するのは極めて困難である。このように高い油相濃度を含む局所製剤は、不快かつ魅力がなく、美容製品としての有用性から除外される。
【０１２７】
ＤＨＥＡの再結晶過程は、治療的生体利用可能性及び効力に有意な変動を引き起こしうることから、阻止しなければならないことは疑いがない。薬物結晶は、表面皮膚層への拡散及び浸透の前に、まず皮膚中に再溶解させる必要がある。このような過程は、容易には起こりにくく、製品の活性に有意に影響を及ぼす。さらに、再結晶化の過程は、製剤の安定性及び物理的外観にも影響を及ぼしうる。従って、明らかに、ＤＨＥＡ充填ナノ粒子を製剤から適切な濃度沈殿で、分散することができる、好ましくかつ好都合なｏ／ｗ局所製剤を製造する必要がある。さらに、ＤＨＥＡ埋込みナノ担体は、その作用が最も必要とされる表皮及び真皮層内での活性成分の浸透を促進することができる、局所製剤中に組み込むべきである。
【０１２８】
ＩＩＩ．チオール活性化ナノ粒子を用いた表面結合高分子及びミネラルの皮膚への送達
経皮送達を使用する市販の製品は、主として、低分子量の親油性薬物（ＭＷ＜５００Ｄａ）に限定され［１６］、これより大きな分子量（ＭＷ＞５００Ｄａ）は、浸透が困難となる［１７］。高分子に対して不浸透性である角質層の性質のために、好適な浸透促進手段で、皮膚を介した高分子の輸送を改善する必要がある。この目的のために様々な技術が開発されており、例えば、マイクロニードル、エレクトロポレーション、レーザー誘起圧力波、温熱療法、低周波超音波導入法、イオン導入法、浸透促進剤、又はこれら方法の組合せが挙げられる。多くの浸透促進技術は、スケールアップや安全上の懸念など、固有の課題に直面している［１７］。本発明は、チオール化ナノ粒子への高分子の表面結合方法を用いた非侵襲性方法による、大部分が親水性の高分子の送達を提案する。
【０１２９】
チオール化ＮＰ−技術の現状
ナノ粒子をマレイミド部分で官能化し、次に、チオール化タンパク質と結合させた。あるいは、ナノ粒子をチオール基で官能化してから、タンパク質上のマレイミド残基と結合させてもよい。伝統的に、こうした送達系は、ほとんどが、主に悪性腫瘍への、薬物充填ナノ粒子の標的送達のために用いられており、その場合、表面結合タンパク質は、単に、疾患特異的エピトープを認識するターゲティング部分として用いられている。
【０１３０】
ＩＶ．実験
１．ＤｉＤ充填ＰＬＧＡ  ＮＰ及びＮＣ並びに／又はローダミンＢ  ＰＬＧＡ結合ＮＰ若しくはＮＣＳの製造：
ＰＬＧＡを０．６％ｗ／ｖの濃度で、０．２％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０含有のアセトン中に溶解させた。ＮＣを製造した場合には、濃度０．１３％ｗ／ｖのオクタン酸又はＭＣＴも有機相に添加した。ＤｉＤ充填ＮＰを製造した場合には、濃度１ｍｇ／ｍｌのアセトンＤｉＤ溶液のアリコートも有機相に添加し、これにより、１５〜３０μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。ローダミンＢ  ＰＬＧＡ結合ＮＰ若しくはＮＣを製造した場合には、０．０３％ｗ／ｖのローダミンＢ標識ＰＬＧＡを０．５７％ｗ／ｖの非標識ＰＬＧＡと一緒にアセトン中に溶解させた。有機相を、０．１％ｗ／ｖのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５含有水相に添加した。この懸濁液を９００ｒｐｍで１５分間撹拌した後、最終ポリマー濃度３０ｍｇ／ｍｌまで蒸発させることにより、濃縮した。水性及び油性対照組成物は、ポリマーが存在しない以外は、前述の製剤と同じであった。
【０１３１】
２．［３Ｈ］ＤＨＥＡ及び［３Ｈ］ＣＯＥ  ＰＬＧＡ固体ナノ粒子カプセル化並びにその評価
ＤＨＥＡ  ＮＰの製造
界面成膜法［１８］を用いて、ＤＨＥＡ充填ＰＬＧＡナノカプセルを製造した。ＤＨＥＡをオクタン酸／ＭＣＴ／オレイン酸及びアセトンに溶解させた。陽荷電ＤＨＥＡ  ＮＣを製造した場合には、カチオン脂質、ＤＯＴＡＰ［１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン］を濃度０．１％ｗ／ｖで有機相に添加した。放射性ＤＨＥＡ  ＮＣを製造した場合には、ＮＣの製造中に、１５μＣｉのトリチウム化ＤＨＥＡを、１ｍｇの冷ＤＨＥＡと一緒にＮＣの油性コアに挿入した。［３Ｈ］コレステリルオレイルエーテル（［３Ｈ］ＣＯＥ）を製造した場合には、それぞれ、８０及び１２７μＣｉ［３Ｈ］ＣＯＥを、ＭＣＴに溶解させてＮＣを形成するか、又は単に有機相に添加してＮＰを形成した。９００ｒｐｍで撹拌しながら、有機相を滴下して水相に添加し、ポリマー濃度８ｍｇ／ｍｌまで蒸発させることにより濃縮した。製剤を、０．８μｍ膜を介して濾過した後、異なる［３Ｈ］ＤＨＥＡ  ＮＣからの３ｍｌを３０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ３００，０００ＭＷＣＯ，Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，ＵＫ）と一緒に膜分離し、１．２μｍ膜を介して濾過した（ｗ／０．８μｍ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）。全製剤及びそれぞれの対照についての放射能の強さは、適用される有限線量が、合計０．６３〜１．０８μＣｉ／ｍｌの範囲内であるように設定した。有機相及び水相の組成を表１に示す。
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【０１３２】
粒度分析：２５℃で、希釈剤として水を用いて、ＡＬＶ  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂａｃｋ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ（ＡＬＶ−ＮＩＢＳ  ＨＰＰＳ，Ｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、平均粒径及び粒度分布測定を実施した。
【０１３３】
ゼータ電位の測定：ＨＰＬＣグレード水で希釈し、Ｍａｌｖｅｒｎゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて、ＮＰのゼータ電位を測定した。
【０１３４】
走査（ＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：走査及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｔｅｃｈｎａｉ Ｆ２０ １００ ＫＶ）を用いて、形態学的評価を実施した。陰性染色用のタングストリン酸２％（ｗ／ｖ）ｐＨ６．４とサンプルを混合することによって、ＴＥＭ視覚化のための試料を調製した。
【０１３５】
低温透過型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）：
３００メッシュ銅グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌ  Ｌｔｄ）に支持されるカーボンコートホーリーポリマーフィルム上に、水相の一滴を垂らし、過剰液体を吸着させて、−１７０℃までの液体エタン中での急冷により、サンプルをガラス化した。この手順は、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（ＦＥＩ）により自動で実施した。ガラス化したサンプルを貯蔵のために液体窒素中に移した。急冷は、バルク溶液に存在する構造を保存することがわかっているため、乾燥することなく、バルク溶液中の対象の形態及び凝集状態について直接の情報が得られる。−１８０℃に維持したＧａｔａｎクライオホルダー（ｃｒｙｏ−ｈｏｌｄｅｒ）を備えるＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２ Ｇ２ ＴＥＭ（１２０ｋＶ）を用いて、サンプルを試験し、低速走査冷却電荷結合素子ＣＣＤ  Ｇａｔａｎ製カメラで画像を記録した。画像は、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈソフトウエアパッケージを用いて、電子ビーム照射のダメージを最小限にするために、低線量条件で記録した。
【０１３６】
３．拡散実験
有効拡散面積が１／０．２ｃｍ２で、８ｍｌのアクセプターコンパートメントを備えるフランツ拡散セル（Ｃｒｏｗｎ  Ｇｌａｓｓ，Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた。レセプター液は、ｐＨ７．４のリン酸バッファーであった。
【０１３７】
実験全体を通じて、レセプターチャンバー内の含有物は、小型のマグネチックスターラーで連続的に撹拌した。皮膚の温度は、３７℃に調節した水循環システムによって３２℃に維持した。ビヒクル及び製剤の有限用量（セル当たり１０〜５０ｍｇのポリマー）を皮膚の角質層又はセルロース膜に適用した。ドナーチャンバーは、大気に開放した。正確な適用時間を記録し、各セルについて時間ゼロとして考慮した。４、８、１２及び２４時間又は２６時間で、完全なレセプター液を収集し、新鮮な温度平衡レセプター媒質と交換した。拡散された活性成分濃度の決定をアリコートから決定した。２４〜２６時間の期間終了時に、皮膚表面を１００ｍｌの蒸留水又はエタノールで５回洗浄した。洗浄液をプールし、アリコート部分（１ｍｌ）を活性成分濃度についてアッセイした。
【０１３８】
次に、セルを分解し、前述したように、高温によって、真皮を表皮から分離した。ＨＰＬＣ又はその他の承認された分析技術を用いて、活性成分含有率を決定した。さらに、レセプター媒質中の乳酸又はグリコール酸の存在を調べた。
【０１３９】
４．ＤｉＤ充填ＰＬＧＡ  ＮＰ及びＮＣ及び／又はローダミンＰＬＧＡ結合ＮＰ若しくはＮＣＳ部位局在化：
切除したヒトの皮膚又はブタの耳の皮膚サンプルを、オリフィス直径が５／１１．２８ｍｍ、レセプター容量が５／８ｍＬ、また有効拡散面積が０．２／１．０ｃｍ２のフランツ拡散セル（ＰｅｒｍｅＧｅａｒ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｌｌｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）に載せた。レセプター液は、ｐＨ７．４のリン酸バッファーであった。実験全体を通じて、レセプターチャンバー内の含有物は、小型のマグネチックスターラーで連続的に撹拌した。皮膚の温度は、３７℃に調節した水循環システムによって３２℃に維持した。溶液と、遊離ＰＬＧＡを含む封入ＤｉＤ蛍光プローブ、又はローダミンＢと共有結合したＰＬＧＡのいずれかを充填した異なるＮＰ及びＮＣ製剤を、以下に詳述するように皮膚に適用した。このプロトコルは、封入ＤｉＤプローブ及び結合ローダミンＢポリマー両方の皮膚局在化を追跡するために採用した。上の実験の項で説明したように、様々な製剤を調製した。切除した皮膚サンプルへの各製剤の適用量は、ＤｉＤの初期封入蛍光含有率３０μｇ／ｍｌで、ＰＬＧＡポリマー濃度３０ｍｇ／ｍｌの１２５μｌであった。
【０１４０】
１回のインキュベーション期間後、又は様々な時間間隔で、皮膚サンプルの一部を解剖して、共焦点顕微鏡により様々な皮膚層中のナノ担体の局在化部位を確認した。この手順は、組織学的切開を用いて、以下のように行った。４％ホルムアルデヒドを用いて、皮膚サンプルを３０分間固定した。固定した組織を組織凍結媒質（ＯＣＴ，Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中の適切なプラスチックキューブ包埋剤中に導入した。続いて、皮膚サンプルを−８０℃で強力に凍結し、−２０℃で低温槽を用いて、厚さ１０μｍの切片に垂直に切断した。次に、処理したサンプルは、共焦点顕微鏡分析の実施まで、冷蔵庫で保存した。
【０１４１】
さらに、選択した２時間の間隔でのフランツセルインキュベーション後に、いくつかのホールマウント皮膚サンプルはインタクトなまま維持し、直ちに共焦点顕微鏡で観察し、ｚ−ｓｔａｃｋ画像からの３Ｄ画像化を用いて、さらに再構成した。線形プロフィールを使用した、ナノ担体及びそれぞれの対照についての皮膚深さに対する蛍光強度（各切片について計算された強度及び全サンプル蓄積強度を記録する）。サンプルデータを表２に示す。
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【０１４２】
５．［３Ｈ］ＤＨＥＡ  ＮＣ部位局在化及び深部皮膚層局在化：
フランツセル拡散装置を用いて、［３Ｈ］ＤＨＥＡ  ＮＣ製剤を皮膚に適用した。皮膚コンパートメント解剖技術により、様々な皮膚層中の［３Ｈ］ＤＨＥＡ局在化を決定した。ブタの皮膚節皮膚（厚さ６００〜８００μｍ）を、有効拡散面積が１ｃｍ２で、アクセプターコンパートメントが８ｍｌ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）のフランツセル（Ｃｒｏｗｎ  Ｇｌａｓｓ，Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）にマウントした。様々な時間間隔で、皮膚コンパートメント解剖を実施して、皮膚表面、上部角質層、表皮、真皮及びレセプターセルにおけるナノ担体の局在部位を確認した。最初に、適切な回収を可能にするための連続的洗浄後、製剤の残りを収集した。続いて、皮膚表面を適切な連続的テープストリッピングにより剥がして、最初のストリップをドナーコンパートメントに導入した。残りの生存表皮を、高温により真皮から分離した後、可溶性の消化液によって化学的に溶解させた。最後に、レセプター液も収集し、これをさらに分析した。
【０１４３】
さらに、皮膚の様々な層におけるＮＣ及びＮＰの生体内運命（ｂｉｏｆａｔｅ）を定量的に明らかにするために、８０及び１２７μＣｉ［３Ｈ］コレステリルオレイルエーテル（［３Ｈ］ＣＯＥ）をそれぞれ、ＮＣの油性コア中に溶解させるか、又はＮＰのナノマトリックス中に封入した。放射性トレーサーである［３Ｈ］コレステリルオレイルエーテル（［３Ｈ］ＣＯＥ）は、１５を超える（＞１５）ｌｏｇ  Ｐで、高度に親油性であり、皮膚層内でのその局在化は、プローブがその極度に高い親油性のためにナノ担体から放出され得ないため、ＮＣの油性コア又はＮＰのナノマトリックスいずれかの局在化を表す。
【０１４４】
６．オレイルシステインアミドの合成及び特性決定
オレイルシステインアミドの合成
窒素気流下、注射器によりフラスコにオレイン酸（ＯＡ）（２．０ｇ、７．１ｍモル）、６０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン、及びトリエチルアミン（０．５ｍｌ、７．１ｍモル）を導入した。撹拌を開始し、−５℃〜−１０℃のドライアイス−イソプロピルアルコール浴を用いて、溶液を−１５℃の内部温度に冷却した。クロロギ酸エチル（０．８７ｍｌ、６．１ｍモル）を添加し、溶液を５分間撹拌した。クロロギ酸エチルの添加により、内部温度は＋８〜＋１０℃まで上昇し、白色固形物の沈殿が起こった。沈殿の後、やはりドライアイス−イソプロピルアルコール浴中で、連続的に撹拌した混合物を−１４℃の内部温度に到達させた。５％Ｎａ２ＣＯ３溶液（１０ｍｌ）に溶解させたシステイン（１．０ｇ、８．２６ｍモル）を、注射器でフラスコに導入し、この溶液を手で撹拌しながら、１０分間激しく泡立てた：内部温度は、２５℃まで急速に上昇した。フラスコを依然として冷却浴中に維持しながら、撹拌をさらに３０分間継続し、反応混合物を−１５℃の冷凍庫内で一晩保存した。得られたスラリーをテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）と一緒に室温で５分撹拌した後、ブフナー（Ｂｕｅｃｈｎｅｒ）漏斗を用いた吸引濾過により、アンモニア塩を除去した。固形物をテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）ですすいだ後、粗目ガラス濾漏斗器内のシリカゲルのプラグ（２５ｇ  Ｍｅｒｃｋ  ６０  ２３０−４００メッシュ）に、アスピレーター吸引によってろ過物を通過させた。漏斗をアセトニトリル（１００ｍｌ）でさらに洗浄してから、一緒にしたろ過物を蒸発させる（回転式蒸発器）ことによって粘稠液体が得られた。
【０１４５】
オレイルシステインアミドの形成をＨ−ＮＭＲ（Ｍｅｒｃｕｒｙ  ＶＸ  ３００，Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＬＣ−ＭＳ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱＤｕｏ，ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，ＮＹ，ＵＳＡ）によって確認した。
【０１４６】
オレイルシステインアミドの特性決定
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、δ）：０．８１８、０．８４８、０．８６８、０．８７１、０．８８９、１．２４７、１．２５５、１．２９７、１．３９１、１．４２３、１．４５２、１．６２１、１．６４２、１．９６８、１．９８９、２．００８、２．１７４、２．１７７、２．２６８、２．２９３２．３２０、２．３４８、３．００５、３．０５４、４．８８１、５．３１６、５．３２５、５．３３５、５．３４３、５．３５３、５．３６９、６．５１６、６．５４０、７．２５９ｐｐｍ。
ＬＣ−ＭＳ：ピーク：３８４．４２。
ＮＭＲ分析で、リンカーオレイルシステインアミドの形成が確認され、また、ＬＣ−ＭＣスペクトルは、生成物の分子量（３８５．６ｇ／モル）と明らかに相関する。
【０１４７】
７．表面活性化ナノ粒子及び高分子結合物の調製及び特性決定：
ナノ粒子は、十分に確立された界面成膜法［１８］を用いて調製した。オレイルシステインアミドリンカー分子を、水溶性有機溶媒中に溶解したポリマーを含有する有機相中に溶解させた。有機相を滴下しながら、界面活性剤を含む水相に添加した。この懸濁液を減圧下で１０ｍｌの最終ナノ粒子懸濁液まで蒸発させた。マレイミド担持スペーサー分子（ＬＣ−ＳＭＣＣ）を、後のチオールとの結合のために、ｐＨ８の所望の高分子と反応させた。次に、チオール活性化ＮＰ及び関連マレイミド担持分子を混合して、窒素雰囲気下で一晩反応させた。翌日、遊離の非結合分子を、膜分離法により結合ＮＰから分離した。
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【０１４８】
粒度及びゼータ電位の特性決定：
ＤＴＳゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて、様々なＮＰの粒度及びゼータ電位を水中で測定した。
【０１４９】
ＮＰに対する様々な高分子の結合効率の決定：
タンパク質定量のための熱量測定ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて、ＭＡｂなどの高分子の結合効率を決定した。
【０１５０】
本明細書に開示する同じ手順が、ヒアルロン酸をナノ粒子に連結するのに用いられていることに留意すべきである。
【０１５１】
８．無水クリームへのナノ粒子の組込み
無水クリーム中に最終生成物を分散させる利点は非常に大きい。ＮＰの凍結乾燥粉末及び調製ＮＰの量を増加しながら（０．１〜１０％）、無水の新規クリームに含有させる。このクリームの成分の相対量を表４に詳細に記載する。
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【０１５２】
ＩＶ．予備結果
ナノ粒子製剤化及び特性決定
ナノ粒子の視覚的検出を容易にするために、蛍光ナノ粒子を調製した。ＰＬＡを蛍光ローダミンＢプローブに結合させた。次に、上の実験の項に記載したように、ナノ粒子を調製した。
【０１５３】
その結果は、均質なナノ粒子の製剤化を示している。励起／発光波長：５６０／５８０ｎｍのローダミンを用いた蛍光標識により、ナノ粒子を見ることができた。ナノ粒子は、５２ｎｍの平均粒径及び−３７．３ｍＶのゼータ電位値を示した。
【０１５４】
この方法を用いて、局所適用後の皮膚の様々な層において、時間経過によるナノ粒子の局在化を検出及び確認した。
【０１５５】
調製から１か月後のＰＬＧＡ生分解性ＮＰのＣｒｙｏ−ＴＥＭ視覚化
カーボングリッドの様々な箇所でのブランクＰＬＧＡ４５００ナノ粒子のＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像を図１Ａに示す。ナノ粒子は、粒径及び形状共にかなり均一のようである。さらに、４℃で１ヵ月保存後の、カーボングリッドの様々な箇所でのブランクＰＬＧＡ４５００ナノ粒子のＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像を図１Ｂに示す。ナノ粒子は、様々な分解段階にある。ナノ粒子が、水性環境中で時間経過と共に分解したことをみとめることができる。
【０１５６】
ＤＨＥＡ充填ＰＬＧＡナノ粒子
ＤＨＥＡをＰＬＧＡ（４５００又は５００００Ｄａ）ナノカプセルの油性コア内にカプセル化した。カーボングリッドの様々な箇所でのＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像を図２Ａ及び２Ｂに示す。ナノ粒子は、球体及びナノメートルサイズのようであり、ＤＨＥＡの結晶はまったく観察されなかった。
【０１５７】
カプセル化効率及び活性物質含有量の決定のために、［３Ｈ］ＤＨＥＡをＭＣＴ  ＮＣ内に含有させた。カチオン性及びアニオン性ＮＣの初期閾値ＤＨＥＡ含有率は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）による膜分離後、０．４９及び０．５２％であったが、観測された含有率は、それぞれ０．１８及び０．１５％であった。従って、カプセル化の効率は、陽荷電及び陰荷電ＮＣでは、それぞれ３６．５及び３０．４％であった（表５に示す）。
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【０１５８】
蛍光標識ナノスフィアの皮膚浸透
ＮＰの皮膚浸透を評価するために、ＰＬＧＡ４５００又はＰＬＧＡ５００００を含むナノスフィアを調製すると同時に、所定量のポリマーを赤外線色素ＮＩＲ−７８３で共有結合標識した。フランツセルを用いて、蛍光製剤を６０歳男性の腹部ヒト皮膚に局所投与した（２．２５ｍｇ／ｃｍ２）。３時間後、皮膚サンプルを洗浄し、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）Ｉｎｆｒａ Ｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥ，ＵＳＡ）を用いて走査した。局所適用後の様々な連続的テープストリッピングの蛍光画像を図３に示す。特定の理論に拘束されるものではないが、結果は、ＰＬＧＡ４５００が、ＰＬＧＡ５００００より深く、皮膚層に浸透することを示している。これは、ＰＬＧＡ５００００と比較して、ＰＬＧＡ４５００の方が、生分解が速いことに起因すると考えられる。
【０１５９】
蛍光標識ナノカプセルの皮膚浸透
ナノスフィア（ＮＳ）と比較して、ナノカプセルの皮膚浸透を評価するため、蛍光プローブＤｉＤを製剤に組み込んだ。ＰＬＧＡナノ担体の生体運命を決定するために、ローダミンＢと共有結合したＰＬＧＡでコーティングしたＤｉＤ蛍光標識配合ＭＣＴ  ＮＣを調製した。ＭＣＴの非存在下で、ＮＰを形成した。また、非分解性の市販のローダミンＢ配合ラテックスナノスフィアも調べた。
【０１６０】
フランツセルを用いて、蛍光製剤を４０歳女性の腹部ヒト皮膚に局所投与した（４．５ｍｇ／ｃｍ２）。２時間後、皮膚サンプルを洗浄し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて走査した。全皮膚サンプルの再構成蛍光画像を図４Ａ〜Ｄに示す。結果は、すべてのＤｉＤ配合ナノ粒子が、ＤｉＤ対照溶液と比較して、高い蛍光値を誘導したことを明らかに示している。さらに、ＰＬＧＡ４５００ナノカプセルは、他のナノ粒子状送達系と比較して、優れた皮膚浸透／保持を呈示した。
【０１６１】
二重標識したナノ担体製剤及びそれぞれの対照を５０歳女性の腹部ヒト皮膚に２時間にわたり適用した。全皮膚サンプルの再構成蛍光画像を図５Ａ〜Ｅに示す。２時間の局所適用後のＮＰ及びＮＣの３Ｄから、いずれも同じ深さ（２００μｍ近く）に達したが、ＮＣからＮＰより多くの蛍光カーゴ（ｃａｒｇｏ）が放出され、また、それぞれの対照は、表面皮膚層に残ったことがわかる。結果は、ＤｉＤ配合ナノ粒子が、既述したのと同じように浸透することを明らかに示している。さらに、ＰＬＧＡに対する蛍光プローブ結合から元々得られたローダミンＢ強度は、ＰＬＧＡベースのナノ粒子担体を、断面画像（図７Ａ〜Ｄ）にも示されているように、それぞれの処置（図６Ａ〜Ｂ）と比較して局所適用した場合、はるかに高かった。
【０１６２】
最後に、３０歳女性の腹部ヒト皮膚に非分解性ローダミンＢラテックスＮＳを２時間インキュベートした後、低いローダミンＢ強度が記録された。この結果は、分解性の系と比較して、非分解性ベースの担体は、そのカーゴを放出する上で大きな限界を有することを示している（図８）。
【０１６３】
［３Ｈ］ＤＨＥＡ  ＮＣ部位局在及び深部皮膚層局在化
図９Ａ〜Ｄに表される結果は、様々なインキュベーション時間で、陰荷電及び陽荷電［３Ｈ］ＤＨＥＡ充填ＰＬＧＡ  ＮＣ並びにそれぞれの対照の局所適用後の［３Ｈ］ＤＨＥＡの皮膚コンパートメントにおけるｅｘ−ｖｉｖｏ皮膚−生体分布を示す。様々な油性対照から、放射性標識ＤＨＥＡの初期適用量の９０％超が２４時間までの各時間間隔で、ドナーセルから回収された。ＤＨＥＡ充填ＮＣを再度適用したところ、６時間までに平均９０％超で、８、１２及び２４時間では、約８０、６５、及び５５％に著しく低下して、大部分の放射性化合物がドナーコンパートメントで回収された。連続した１０回のテープストリッピング（ＴＳ）の後、ＳＣ深さの関数としての上部皮膚層中の［３Ｈ］ＤＨＥＡ分布を表６に示す。ＴＳの各対を抽出して、液体シンチレーションによって分析したところ、各サンプルからＳＣの連続した５つの下位層（ｓｕｂ−ｌａｙｅｒｓ）の記録が得られた。適用する処置とは無関係に、最高レベルの［３Ｈ］ＤＨＥＡが層Ａ及びＢ（ＳＣの最外部層をなす）で検出されたと共に、内部層Ｃ、Ｄ及びＥで同等の減少が記録されたことをみとめることができる。陰荷電及び陽荷電［３Ｈ］ＤＨＥＡ充填ＮＣを適用した場合、様々なＳＣ層において放射性化合物の経時的蓄積が起こった。製剤とは無関係に、ＳＣ内の放射能の濃度は低かった（約１〜２％）ことに留意すべきである。適用から２４時間後、放射能の濃度は、ＳＣの内部層で次第に低下した（表６）ことがはっきりとみとめられる。しかし、ＤＨＥＡ充填ＮＣとそれぞれの対照との顕著な差が、生存皮膚コンパートメント（表皮及び真皮）において記録された。陽荷電及び陰荷電ＤＨＥＡ  ＮＣ両方の６時間のインキュベーション後、［３Ｈ］ＤＨＥＡレベルは、表皮及び真皮においてそれぞれ約３％及び５．５％の平坦域に達した（図９）が、それぞれの油性対照を用いて、表皮及び真皮で得られた［３Ｈ］ＤＨＥＡレベルは、２４時間までの全処置期間にわたって１％に達しなかった（図９）（Ｐ＜０．０５）。
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【０１６４】
陽荷電及び陰荷電ＤＨＥＡ充填ＮＣ両方をインキュベートしたところ、レセプターコンパートメント液において、時間経過により放射性ＤＨＥＡのレベル上昇がみとめられ、１時間、８時間及び２４時間後に、適用した最初の用量からそれぞれ０．５％、２．５％及び１４％に達した。これに対し、それぞれの油性対照は、ほとんどの時点で、１％放射能に満たない一定［３Ｈ］ＤＨＥＡレベルを呈示した。様々な製剤について３時間の遅れはみとめられたが、陽荷電及び陰荷電ＮＣ適用後に、レセプター液中の［３Ｈ］ＤＨＥＡ出現は、それぞれの油性対照と比較して有意に高かった。様々な処置から放出されたレセプター液中のＤＨＥＡの総量（μｇ／ｃｍ２）を、時間の平方根に対してプロットした（図１０）。油性対照について、作成したグラフの傾きから計算した低く緩徐な流束値０．０６３（μｇ／ｃｍ２／ｈ０．５）は、それらの報告された限定的放出プロフィールと相関する。次に、再度、陰荷電及び陽荷電ＤＨＥＡ  ＮＣを局所適用すると、有意に高い［３Ｈ］ＤＨＥＡレベルがレセプター液中に記録されたが、これは、ナノ担体製剤に充填したとき、薬物の優れた流束及び優れた経皮浸透を明らかにするものである。全ての時点で、２つのＮＣ製剤の間に有意な差はみとめられず、皮膚浸透増大に寄与したのは電荷の性質ではなく、むしろ用いるナノ構造の種類、すなわち小胞ナノカプセルであることを示している点を強調する必要がある。
【０１６５】
空のナノ担体が局所適用された場合の、その運命（ｆａｔｅ）を確認するために、ＰＬＧＡ  ＮＳ及びＭＣＴ含有ＮＣに、高親油性放射性化合物である［３Ｈ］ＣＯＥを組み込んだ。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を用いた膜分離の後、カプセル化効率は、ＮＳ及びＮＣについてそれぞれ４５％及び７０％であった。ポリマーを含まない［３Ｈ］ＣＯＥの水性及び油性対照をｅｘ  ｖｉｖｏ実験のために調製した。ここでも、製剤の種類とは関係なく（データは示していない）、各インキュベーション期間後、ドナーコンパートメントから、滴定ＣＯＥの初期量の９０％超を回収した。表７は、［３Ｈ］ＤＨＥＡについて既述したように、様々な処置後の、ＳＣ層の関数としての［３Ｈ］ＣＯＥ皮膚生体分布を示す。［３Ｈ］ＣＯＥ充填ＮＳ及びＮＣの８時間のインキュベーションまで、上部皮膚層から、適用した用量の１％未満を抽出した。興味深いことに、ＤＨＥＡ  ＮＣを適用した場合に報告された前述の観測と同様に、ＮＳ及びＮＣの１２時間のインキュベーション後に、層Ａ及びＢにおいて著しい上昇がみとめられた。異なる対照を局所適用した場合、［３Ｈ］ＣＯＥのレベルに、インキュベーション期間に関連して、顕著な差はないが、ＭＣＴ中の［３Ｈ］ＣＯＥの定分布は、［３Ｈ］ＣＯＥ界面活性剤溶液と比較して、高かった（表７）。最後に、両方のナノ担体製剤及びそれらの各対照を適用した場合、インキュベーション期間中、生存コンパートメント（表皮、真皮及びレセプター液）中には、０．５％に満たない放射能がカウントされた（表９）。ＣＯＥの様々な製剤同士の違いをはっきりさせるためには、より長いインキュベーション時間が必要なようである。
2014505695.tif 000009
【０１６６】
チオール表面活性化ＮＰ及びＭＡｂ結合ＮＰ
チオール表面活性化ＮＰを以下のポリマーから調製した：
・ＭＷが約４８，０００ＤａのＰＬＧＡ、
・ＰＥＧ−ＰＬＧＡ５０，０００及びＰＬＧＡ４５００、
・ＰＥＧ−ＰＬＡ１００，０００。
【０１６７】
様々なＭＡｂに結合した免疫ＮＰの調製
以下のＭＡｂを、高い結合効率で、チオール化ＮＰの表面に好適に結合させた（表８参照）：
・セツキシマブ
・リツキシマブ
・ヘルセプチン
・アバスチン
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【０１６８】
ＴＥＭを用いた形態学的評価
ＩＮＰに対するセツキシマブＭＡｂの結合を、１２ｎｍ金標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＴＥＭ観察によって定量的に確認した。図１１Ａ〜Ｃにみとめられる各金の黒色スポットは、金標識ＩｇＧと反応したＩＮＰ表面部位に結合したＭＡｂ分子を表している。ＭＡｂは、リンカーによってＩＮＰの表面に結合し、反応条件が、二次抗体に対するＭＡｂの親和性に影響を及ぼさなかったと推定することができる。
【０１６９】
フローサイトメトリーによる、Ａ５４９細胞系におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合能力の決定
フローサイトメトリーを用いた結合特性評価のために、ＥＤＴＡの０．０５％溶液を用いて、細胞を脱離した。細胞をＦＡＣＳ溶液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）中に再懸濁させた。２００μｌ中２００，０００個の細胞を各処理について用いた。４℃にて細胞を１２００ｒｐｍで遠心分離した。続いて、天然のセツキシマブ抗体か、又は等濃度のセツキシマブ免疫ナノ粒子のいずれかと一緒に、細胞を氷上で１時間インキュベートした。０．００５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ及び０．５μｇ／ｍｌセツキシマブ抗体又はＩＮＰ当量を用いた。抗ＣＤ−２０抗体である、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））をアイソタイプのマッチした無関係の非結合対照として用いた。また、ＩＮＰの非特異的結合を排除するために、等濃度の表面活性化ＮＰ及び負の対照としてのリツキシマブＩＮＰと一緒に、細胞をインキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離して、ＦＡＣＳ溶媒で２回洗浄した。続いて、ＦＩＴＣ−結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ）’２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と一緒に、４℃の暗所で細胞を４０分インキュベートした。次に、細胞を遠心分離して、ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した。細胞をＦＡＣＳ溶液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより、蛍光を決定した。結果を図１２Ａ〜Ｃに示す。結果から、明らかに、評価したすべてのＭＡｂ濃度で、セツキシマブ免疫ナノ粒子が優れた結合特性を示すことがわかる。表面活性化ＮＰ（チオール担持ＮＰ）及びアイソタイプのマッチしたリツキシマブ免疫ナノ粒子の両方の細胞インキュベーションによって、非特異的結合を排除した。
【０１７０】
免疫ナノ粒子の皮膚浸透
皮膚への高分子の浸透を促進するナノ粒子の能力を評価するために、セツキシマブＭＡｂと共有結合したＩＮＰを調製した。０．１２ｍｇのＭＡｂ／ｃｍ２と等価の６ｍｇ／ｃｍ２を、関連対照に対して、４４歳女性の腹部ヒト皮膚に、３時間にわたって局所投与した。続いて、皮膚サンプルを洗浄し、Ｃｙ５標識ヤギ抗ヒト二次ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）で免疫染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡を用いて、再構成蛍光画像を撮影した（図１３Ａ〜Ｅ）。
【０１７１】
図１４及び１５は、同じ実験に関連する。ＮＰ及びＩＮＰが、より強力な蛍光値を誘発したことを定量的及び定性的に）みとめることができ、ＮＰと比較して、ＩＮＰのより高い効果が予想される。図１４は、ＩＮＰによって誘発されたｃｍ２当たりの最も顕著な定量的蛍光強度を明らかに示している。図１５及び図１６から、ＩＮＰが、ｃｍ２当たりの最も高い累積強度を誘発したことをみとめることができ、これは、ＮＰがＭＡｂ浸透／滞留を促進することを明らかに示すものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ−５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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