(57)【要約】  本発明は、哺乳類の網膜色素上皮の光保護のための、ビクサ・オレラナ種子抽出物を含む組成物に関する。  より詳細には、本発明は哺乳類の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療のための、このような組成物の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の網膜色素上皮の光保護のための、ビクサ・オレラナ種子抽出物を含む組成物。
【請求項２】
哺乳類の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療に応用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
シュタルガルト病及び／又は網膜色素変性症の治療に応用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
４３５〜４９０ｎｍの波長の青色光への曝露によって発生し得る網膜の損傷を予防するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
眼内への摂取若しくは注射又は血液中への注射が許容される担体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
薬剤又は栄養補助食品又は食物としての、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
没食子酸誘導体及び／又はアントシアニジンファミリーに属する化合物を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記没食子酸誘導体は、エラグ酸であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アントシアニジンファミリーに属する化合物はシアニジンであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳類の網膜色素上皮の光保護のための、没食子酸誘導体及び／又はアントシアニジンファミリーに属する化合物を含む組成物。
【請求項１１】
哺乳類の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療、若しくはシュタルガルト病及び／若しくは網膜色素変性症の治療に応用するための、又は４３５〜４９０ｎｍの波長の青色光への曝露によって発生し得る網膜の損傷を予防するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記没食子酸誘導体は、エラグ酸であることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アントシアニジンファミリーに属する化合物は、シアニジンであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
薬剤又は栄養補助食品又は食物としての、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜の特定の疾病を防止するための化合物及び組成物の使用に関する。
【０００２】
本発明は、疾病に罹患した患者の視力を改善すること、又は少なくともこれらの疾病の発生を固定化することを目的とする。
【背景技術】
【０００３】
加齢黄斑変性症、即ちＡＭＤは、網膜の慢性変性疾患であり、進行性かつ障害を引き起こすものであり、高齢者に影響を及ぼし、その原因は多因子的である（非特許文献１）。フランスでは、ＡＭＤは５０歳以上の視覚障害の主因であり、患者の数は１００万人と推定される。遺伝的素質による疾病（非特許文献２）は、平均余命の増加に比例した視力低下の症例数の増加の原因である。この疾病は網膜のごく一部である黄斑に影響を及ぼすが、この黄斑は対象物を固定したり、文字を読んだり、人の顔を認識したり、色を識別したりするために使用する領域である。ＡＭＤは、光への長時間の曝露、高血圧、高コレステロール血症及び喫煙等の危険因子の関与により、多因子的となりやすい。ＡＭＤには２つのタイプ、即ち８０％を占める乾燥又は萎縮型のものと、滲出型のものとがある。現在のところ治療の効果があるのは、網膜の後ろ側の新生血管の発現を特徴とする後者のみである。
【０００４】
ＡＭＤの病態生理学的機構は、未だよく分かっていないが、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の死につながる中毒のプロセスの関与が近年立証された。実際、加齢の過程で、これらの細胞はリポフスチン顆粒と呼ばれるタンパク質−脂質複合体のリソソーム蓄積に関連する機能不全を呈することがある。このような顆粒は、光受容体の外側部分のＲＰＥによる食作用に由来する分解されていないタンパク質及び脂質の蓄積によって徐々に形成される（非特許文献３）。リポフスチンは、またＡ２Ｅ等の視覚サイクル色素の細胞毒性誘導体を含み、これは２つのトランスレチナール分子とエタノールアミン分子との組合せで形成される。青色光の影響下において、Ａ２Ｅは酸化されてタンパク質、脂質及びＤＮＡの酸化を誘導し、加齢の過程でＲＰＥ細胞に有意な酸化ストレスを引き起こす（非特許文献４）。乾燥型ＡＭＤの予防又は治療の試みは、Ａ２Ｅの凝集及び／又は副作用を低減する物質を用いた栄養補給に基づく（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００５】
ＡＭＤの発生におけるこのような機構のほぼ確実な役割を考慮して、本発明者らは、Ａ２Ｅを用いた治療と、青色光によるＲＰＥ初代細胞培養の照明とを関連させることによって誘発される光毒性のインビトロ細胞モデルを使用し、細胞生存を測定した。このモデルはＴＨＥ  ＶＩＳＩＯＮ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥによって開発されたものであり、乾燥型ＡＭＤの治療のための新規の候補の発見を目的とした分子のスクリーニングを可能とする。使用する細胞が既に動物飼料由来の保護物質を含有しており、従って「欠乏」状態ではないため、この原モデルは、他の研究室で一般に使用される細胞株よりも「生理学的」環境に近く（非特許文献１１）、Ａ２Ｅの添加によって細胞株の破壊を誘発する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bellmann C, Sahel J-A. 2007. Aspects pathogeniques de la degenerescence maculaire liee a l’age (DMLA). J. Fr. Ophtalmol. 30 (hors-serie 1), 1S11-1S16.
【非特許文献２】Fajnkuchen F, Cohen SY. Degenerescence maculaire liee a l’age et genetique : donnees actuelles. J. Fr. Ophtalmol. 31(6), 630-637.
【非特許文献３】Finnemann SC, Leung LW, Rodriguez-Boulan E. 2002. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proc. Nat. Acad. Sci . USA 99: 3842-2847.
【非特許文献４】Kim SR, Nakanishi K, Itagaki Y, Sparrow JR. 2006. Photooxidation of A2-PE, a photoreceptor outer segment fluorophore, and protection by lutein and zeaxanthin. Exp. Eye Res. 82, 828-839.
【非特許文献５】Dubernard G, Adam R, Proenca J, Offret H, Labetoulle M. 2006. Alimentation et degenerescence maculaire liee a l’age. NPG 6(33), 19-21.
【非特許文献６】Souied E, Le Tien V, Coscas G, Soubrane G. 2007. Vers la prevention de la degenerescence maculaire liee a l’age. J. Fr. Ophtalmol. 30(5), 449-455.
【非特許文献７】Dutot M, Rambaux L, Warnet JM, Rat P. 2008. Modulation du stress oxydant par la myrtille riche en polyphenols sur un modele de cellules humaines de retine. J. Fr. Ophthalmol. 31(10), 975-980.
【非特許文献８】Lecerf J-M. 2009. μnutriments : l’exemple de la degenerescence maculaire liee a l’age (DMLA). Medecine Maladies Metaboliques 3(5), 496-501.
【非特許文献９】Cohen SY, Mauget-Faysse M, Oubraham H, Algan, M, Conrath J, Roquet W. 2010. Impact des habitudes nutritionnelles sur la pathologie maculaire evalue par mesure de la densite optique du pigment maculaire. J. Fr. Ophtalmol. 33, 234-240.
【非特許文献１０】Lecerf J-M, Desmettre T. 2010. Nutrition et degenerescence maculaire liee a l’age. J. Fr. Ophtalmol. 33, 749-757.
【非特許文献１１】Dunn KC, Aotaki-Keen AE, Putkey FR, Hjelmeland LM. 1996. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Exp. Eye Res. 62, 155-169.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって本発明は、既存のものの代替となる治療法を発見する好機を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
具体的には、本発明者らは、特定の分子を用いた従来の細胞のインキュベートは、Ａ２Ｅで事前に処理したＲＰＥ細胞の青色光を用いた照明によって引き起こされる細胞死を大幅に低減することを発見した。
【０００９】
本発明によると、これらの分子はベニノキ抽出物中に存在するか、又は没食子酸の誘導体若しくはアントシアニジンファミリーに属する化合物である。
【００１０】
従って本発明の１つの態様は、哺乳類の網膜色素上皮細胞の光保護のための、ベニノキ種子抽出物を含む組成物に関する。
【００１１】
ベニノキ若しくはアナトー、又はビクサ・オレラナ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）は、熱帯アメリカの樹木又は低木である。これは種子が詰まったとげのある赤い果実を形成する。
【００１２】
本発明の文脈において、「ビクサ・オレラナの種子抽出物」とは、種子の外皮から調製された抽出物のことであり、即ちビクサ・オレラナの種子を覆う蝋質物である。この蝋質物には、ビキシン及びカロテノイドが豊富であることが知られており、また食品着色料としての使用も知られている。
【００１３】
国際公開特許第０１／８５１８３号から、眼障害の予防及び治療のための組成物が知られており、上記組成物はアルドース還元酵素の阻害剤としてビクサ・オレラナの抽出物を含み得る。
【００１４】
この抽出物は没食子酸及び／又はピロガロールを含み、従ってこの抽出物は殆どの場合、Terashimaet al.[Chem.Pharm.Bull.39(12), 3346-3347(1991)]に記載されているように、実際にアルドース還元酵素阻害剤としての活性を示すビクサ・オレラナの葉の抽出物である。
【００１５】
更に、国際公開特許第０１／８５１８３号は、白内障及び糖尿病性網膜症に対する保護のための機構の一部としてのアルドース還元酵素の阻害を示す。
【００１６】
従って、国際公開特許第０１／８５１８３号は、ＲＰＥ細胞の光保護に関するビクサ・オレラナの種子からの抽出物の有効性については示していない。
【００１７】
本発明のある実施形態によると、ビクサ・オレラナの種子由来の組成物は、哺乳類の加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療を対象とする。
【００１８】
本発明の他の実施形態によると、この組成物は、シュタルガルト病及び／又は網膜色素変性症を治療するためのものである。シュタルガルト病又はシュタルガルト症候群は、黄斑の萎縮による両眼の視力の低下を伴う遺伝性疾患である。
【００１９】
本発明の他の実施形態によると、この組成物は、青色光への曝露によって発生し得る網膜の損傷を予防するためのものである。青色光とは、可視光の青色スペクトル帯域、即ち４３５〜４９０ｎｍの波長に対応する放射を意味する。
【００２０】
本発明のある実施形態によると、この組成物は更に、没食子酸の誘導体又はアントシアニジンファミリーに属する化合物を含む。
【００２１】
没食子酸誘導体はエラグ酸であってよく、純エラグ酸又はザクロ抽出物として提供されるものを含む。実際、ザクロは多量のエラグ酸を含有している（Panichayupakarananta P, Issuriya A, Sirikatitham A, Wang W. 2010. Antioxidant assay-guided purification and LC determination of ellagic acid in pomegranate peel. J. Chrom. Sci. 48, 456-459.）。
【００２２】
アントシアニジンファミリーに属する組成物はシアニジンであってよく、純シアニジン又はアサイー抽出物の形態で提供されるものを含む。この植物は実際にはシアニジングルコシドを含有している。シアニジンをハイビスカスの抽出物の形態で提供することもできる。
【００２３】
ビクサ・オレラナの種子由来の組成物は、食物、栄養補助食品又は薬剤として使用できる。
【００２４】
栄養補助食品とは、欧州指令２００２／４６／ＥＣに定義された健康に有益な栄養素を提供することによって食事を補助するための、上記化合物若しくは抽出物を含有するか、又は上記化合物若しくは上記抽出物に富む製品を意味する。例えば栄養補助食品は、嚥下用カプセル若しくは錠剤、又は食物に混合するための粉末若しくは小さなアンプルとすることができ、網膜に有益な効果をもたらす。
【００２５】
薬剤とは、欧州指令６５／６５／ＣＥに定義された上記化合物又は上記抽出物、即ちヒト又は動物の疾病を治療又は予防するための特性を有するものとして提示されるいずれの物質又は組成物の、正確な１用量を含有する製品を意味する。例えば、網膜に有益な効果をもたらすために、治療に有効な１用量の化合物を含有する薬剤を、カプセル若しくは錠剤の形態で経口投与するか、又は硝子体内に注射するか、又は他のいずれの方法で投与してよい。
【００２６】
本発明の他の実施態様は、哺乳類の網膜色素上皮の光保護のための、没食子酸の誘導体及び／又はアントシアニジンファミリーに属する化合物を含む組成物に関する。
【００２７】
没食子酸誘導体は、好ましくはエラグ酸であり、純エラグ酸又はザクロ抽出物として提供されるものを含む。アントシアニジンファミリーに属する化合物は好ましくはシアニジンであり、純シアニジン又はアサイー若しくはハイビスカスの抽出物の形態で提供されるものを含む。
【００２８】
この代替組成物の応用は、ビクサ・オレラナの種子の抽出物を含む上述の組成物と同様である。上述の組成物と同様、この代替組成物も食物、栄養補助食品又は薬剤として使用できる。
【００２９】
以下の説明を読み、添付の図面を精査することで、本発明をより良く理解できるであろう。これら図面は単なる説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、光毒性試験における、ＲＰＥの保護に関するベニノキ抽出物、ビキシン、ノルビキシンの効果を示す。
【図２】図２は、光毒性試験における、ＲＰＥの保護に関するクロロゲン酸、ルチン、エラグ酸の効果を示す。
【図３】図３は、光毒性試験における、ＲＰＥの保護に関するシアニジン、シアニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−サンブビオシドの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
I．ビクサ・オレラナの抽出物（抽出物Ａ）の調製
ベニノキの種子を純エタノール（種子１ｋｇあたり３Ｌ）内で１６時間撹拌することによって、抽出物Ａを得る。アルコール内での撹拌は、種子の表面の蝋質物層を除去する効果を有する。
【００３２】
得られた懸濁液を篩にかけてベニノキ種子を除去する。次にこの懸濁液の体積を１／８に減少させ、静置する。固体析出物が形成される。
【００３３】
脂質に富む上澄液を除去する。マルトデキストリンを固体析出物に加え、この混合物を噴霧乾燥する。
【００３４】
抽出物は１６重量％のビキシンを含有する。以下の実施例では、抽出物の濃度をビキシン等量で表す。
【００３５】
抽出物Ａはカロテノイドにも富んでいる。また、抽出物Ａは、ゲラニルゲラニオール及びトコトリエノール（９０％δ及び１０％β）等の他のテルペン化合物、並びに複数のフラボノイドも含有する。
【００３６】
抽出物は１００ｇあたり以下のような特徴を有する（表１）。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
本発明のある実施形態によると、抽出物Ａを鹸化に供して、全て又は一部のビキシンをノルビキシンに変換することができる。
【００３９】
II．  活性アッセイ
本発明者らは、１５の天然物質及び抽出物Ａを、以下で説明する光毒性のＲＰＥ細胞モデルで試験した（表２）。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
試験物質の光保護効果を試験するために、本発明者らは、Ａ２Ｅによる処置及びそれに続く青色光での照明によって誘発された光毒性の細胞モデルを用いた。このモデルは、ブタ成体のＲＰＥ細胞の一次培養から製造した。生きた細胞と全細胞数（生細胞＋死細胞、それぞれ特異的な染色を用いて定量化した）との間の比によって、細胞生存を決定した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアで制御された蛍光顕微鏡を用いて画像を取得し、取得した画像を定量化専用のプログラムで処理することにより定量化を行った。この実験を９６ウェルマイクロプレートで四重に実施し、少なくとも４回繰り返した。細胞はこれら化合物で４８時間処置され、最後の２４時間はＡ２Ｅが存在し、その後に光毒性を誘発した。各化合物を３つの濃度（０．１、１、１０μＭ）について試験した。いくつかの化合物は、２０μＭで更に試験して様々な濃度を達成した。
【００４２】
III．  結果
結果を平均及び標準偏差で示すが、これはＡ２Ｅを用いない対照と比較した生存百分率として表される。
【００４３】
この実験は、０．１、１μＭの濃度では１５の化合物又は抽出物Ａの保護効果を示さなかった（図１〜３にはルテイン、ゼアキサンチン、レスベラトロール、クロセチン、ナリンゲニン、オリエンチンに関するデータは示さず、ベニノキ抽出物Ａ、シアニジン、エラグ酸に関する結果を示す）。
【００４４】
一連の試験（ｎ＝５）では、抽出物Ａについて、２０μＭにおいてＡ２Ｅを用いない対照のほぼ９３％の細胞生存という、対照＋Ａ２Ｅの細胞生存がわずか４５％であったのと比較すると有意な保護を観察できた（図１）。
【００４５】
１０μＭで試験した１５の化合物中、２つの化合物が光毒性に対する細胞の保護をもたらす。
【００４６】
特にシアニジンは、１０μＭにおいてＡ２Ｅを用いない対照と比較してほぼ８７％の細胞生存という保護をもたらす。２０μＭではシアニジンはほぼ完全な保護をもたらす（図２）。
【００４７】
エラグ酸もまた、Ａ２Ｅを用いない対照と比較してほぼ６８％の細胞生存という保護をもたらす。この化合物は、１０μＭで測定した上記の値と同等の保護を２０μＭでももたらすが、より良好な再現性を有する（図３）。
【００４８】
ルテイン、ゼアキサンチン、レスベラトロール（「陽性対照」）に期待される光保護効果は、これらの実験条件では観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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