(57)【要約】  本発明は、グルタミン酸塩興奮毒性及びβ‐アミロイド毒性に関連する神経疾患の治療のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、多発性硬化症、アルツハイマー病、アルツハイマー病関連疾患、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、神経因性疼痛、アルコール性神経障害、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の新しい併用療法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシンもしくはブロモクリプチン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤を含み、
神経疾患の治療において、その治療を必要とする対象者に使用するための組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であり、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、ブロモクリプチンもしくはトルセミド、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤から選択される少なくとも１種の異なる化合物をさらに含む組成物。
【請求項３】
前記請求項２に記載の組成物であり、
下記化合物、
‐バクロフェン及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトルセミド、
‐エプレレノン及びトルセミド、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾール、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐レボシメンダン及びメキシレチン、
‐レボシメンダン及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びモキシフロキサシン、
‐テルビナフィン及びトルセミド、
‐モキシフロキサシン及びトリメタジジン、
‐モキシフロキサシン及びイフェンプロジル、
‐イフェンプロジル及びシンナリジン、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
‐イフェンプロジル及びシンナリジン、バクロフェン及びトリメタジジン及びトルセミド、
‐バクロフェン及びシナカルセト及びトルセミド、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトリメタジジン及びトルセミド及びゾニサミド、
‐スルフィソキサゾール及びメキシレチン及びトルセミド及びシナカルセト、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びジエチルカルバマジン、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びバクロフェン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びアミノカプロン酸及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びテルビナフィン及びトリメタジジン、又は
‐レボシメンダン及びスルフィソキサゾール及びトリメタジジン、
の組合せのうち少なくとも１つを含む組成物。
【請求項４】
前記請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であり、
薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む組成物。
【請求項５】
前記請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物であり、
前記神経疾患は、アルツハイマー病、アルツハイマー病関連疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、神経因性疼痛、アルコール性神経障害、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷から選択される、組成物。
【請求項６】
前記請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物であり、
前記組成物における前記化合物を一緒に、個別に、もしくは連続して製剤又は投与する、組成物。
【請求項７】
前記請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物であり、
対象者に繰り返して投与する、組成物。
【請求項８】
トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、ブロモクリプチン、及びそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体もしくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択される、少なくとも１種の第１化合物を含む組成物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤、並びに薬学的に許容される賦形剤から選択され、前記第１化合物とは異なる少なくとも１種の第２化合物との組合せであり、
同時、個別又は連続投与をするためである組成物。
【請求項９】
前記請求項８に記載の組成物であり、
下記化合物、
‐バクロフェン及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトルセミド、
‐エプレレノン及びトルセミド、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾール、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐レボシメンダン及びメキシレチン、
‐レボシメンダン及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びモキシフロキサシン、
‐テルビナフィン及びトルセミド、
‐モキシフロキサシン及びトリメタジジン、
‐モキシフロキサシン及びイフェンプロジル、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
‐イフェンプロジル及びシンナリジン、
‐バクロフェン及びトリメタジジン及びトルセミド、
‐バクロフェン及びシナカルセト及びトルセミド、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトリメタジジン及びトルセミド及びゾニサミド、
‐スルフィソキサゾール及びメキシレチン及びトルセミド及びシナカルセト、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びジエチルカルバマジン、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びバクロフェン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びアミノカプロン酸及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びテルビナフィン及びトリメタジジン、又は
‐レボシメンダン及びスルフィソキサゾール及びトリメタジジン
の組合せのうち少なくとも１つを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患及び障害の治療に対する組成物及び方法に関しており、より詳しくは、本発明は、アルツハイマー病及び関連疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ニューロパシー、アルコール依存症、アルコール離脱症、ハンチントン病、及び脊髄損傷などの疾病に対する新しい併用療法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶障害に特徴づけられる原型的な皮質認知症であり、皮質連合野の関与に起因する不全失語症（発話及び聴覚理解に対する機能障害を有する言語障害）、協調運動障害（運動または知覚機能の欠乏により、特定の意図を持つ動作及び身ぶりを調和させ、行う能力の欠如）、並びに失認（もの、ひと、音、かたち、または匂いを認識する能力の欠如）を伴う（参考文献１〜４）。
【０００３】
現在、アルツハイマー病（ＡＤ）は認知症の最も一般的な病因である。臨床的には、認知機能の全体的な低下として特徴づけられており、徐々に進行し、末期患者は寝たきり、及び失禁するようになり、療護が必要になる。発症後、平均して９年で死に至る（参考文献５）。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）の発症率は、年齢とともに急激に増加する。国際連合の人口予測では、８０歳以上の人口は、２０５０年までに３７０万人に達すると推定されている。現在は、８５歳以上の人口の５０％が、ＡＤに苦しめられると予測されている。そのため、全世界で１００万人以上の人々が、５０年以内に、認知症に罹るであろう。継続的な介護、及び他のサービスを必要とする多数の人々が、医療上、経済上、及び人的資源に深刻な影響を与えると思われる（参考文献６）。
【０００５】
記憶障害は、疾患の初期症状であり、エピソード記憶（日々の出来事の記憶）に関連する。意味記憶（言語及び視覚の理解からくる記憶）は、疾患の後期に関わる。ＡＤの病理学的特徴は、β‐アミロイド（Ａベータ）と、タウ、ニューロン及びシナプスの機能障害及び低下を含む神経原線維変性（ＮＦＴ）とを含有するアミロイド斑を含む（参考文献７〜９）。この１０年間で、ＡＤの病因に対する２つの主要な仮説が示された。その1つである「アミロイド・カスケード説」は、神経変性プロセスが、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常プロセスにより引き起される一連のイベントであることを提示しており（参考文献１０）、もう１つの「ニューロン細胞骨格変性説」（参考文献１１）は、細胞骨格の変化がイベントのきっかけになることを示す。ＡＤ進行の説明として最も広く受け入れられている仮説は、依然として「アミロイド・カスケード説」のままであり（参考文献１２〜１４）、ＡＤ研究者は、主に、Ａベータタンパク質に付随する毒性の根本的なメカニズムを特定することに集中している。その結果、微小血管透過性及びリモデリング、血管新生異常、並びに血液脳関門の機能停止が、アミロイド・カスケードにおいて、ＡＰＰ毒性の原因となる主要なイベントであると特定された（参考文献１５）。それに対し、タウタンパク質は、アミロイドの機能及び実用性への関心から、アミロイドに比べ、医薬産業ではあまり重要視されてこなかった。さらに、シナプス密度の変化は、他の２つより、認知障害に関係の深い病変である。
【０００６】
コリン作動性末端は最も弱く現れ、続いてはグルタミン酸末端、最後はGABA性末端である神経伝達物質の特異的様式において、アミロイド病変は進行するようであるということが、研究により明らかになった（参考文献９）。グルタミン酸塩は、哺乳類の神経系において、最も豊富な興奮性神経伝達物質である。病的状態のもとでは、シナプス間隙のグルタミン酸異常蓄積は、グルタミン酸受容体の過剰活性を引き起す（参考文献１６）。シナプス間隙のグルタミン酸異常蓄積は、グルタミン酸受容体の過剰活性を引き起し、病的プロセス、及び最終的にニューロン細胞死という結果になる。このプロセスは興奮毒性と名付けられ、急性及び慢性的な神経疾患において、一般的に、ニューロン組織に見られる。
【０００７】
興奮毒性は、様々な病因における複数の疾患の発病に関わるということが明らかになってきており、その疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、及びハンチントン病などの神経変性疾患、並びに脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、聴力損失、アルコール依存症、アルコール離脱症、アルコール性神経障害、または神経因性疼痛などである（参考文献１７〜１９）。これらの疾患に対する効果的な治療法の開発は、疾患の発生率及び治癒的治療の欠如から、主要な公衆衛生の問題点として残っている。
【０００８】
受容体の様々な部位を標的とするＮＭＤＡＲアンタゴニストは、興奮毒性を中和するためにテストされてきた。非競合のＮＭＤＡＲアンタゴニストは、イオンチャンネル細孔を標的とし、カルシウムのシナプス後ニューロンへの侵入を減少させる。いくつかのＮＭＤＡＲアンタゴニストは、承認状況に至った。例として、メマンチンは、現在、中等度から重度のアルツハイマー病への適用が承認されている。また、興奮毒性成分を有する他の適応症において臨床試験されており、その対象は、アルコール依存（第２段階）、筋萎縮性側索硬化症（第３段階）、パーキンソンに伴う認知症（第２段階）、てんかん、ハンチントン病（第４段階）、多発性硬化症（第４段階）、パーキンソン病（第４段階）、及び外傷性脳損傷（第４段階）などである。しかしながら、ほとんどのアルツハイマー病患者にとって、その分子の効果は限定的であり、それは、わずかな症状への効果しか持たないためである。興奮毒性を抑える他の方法は、グルタミン酸塩のシナプス前放出を抑制することからなる。現在、筋萎縮性側索硬化症に対して承認されているリルゾールは、虚血及び外傷性脳損傷モデルに対し、励みになる結果を示している（参考文献２０〜２３）。初期の多発性硬化症、パーキンソン病（プラセボほどの結果は示していない）、及び脊髄損傷に対する第２段階のテストは、現在行われている。リルゾールは、１９９５年に筋萎縮性側索硬化症の治療の、及び１９９６年にはハンチントン病の治療のためのオーファンドラッグになるに至った。
【０００９】
国際公開第２００９／１３３１２８号、国際公開第２００９／１３３１４１号、国際公開第２００９／１３３１４２号、及び国際公開第２０１１／０５４７５９号は、神経疾患の治療のための組成物に使用されうる分子を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この分野の活発な研究にかかわらず、神経疾患に対する代替または改良された効果的な治療が依然として必要とされており、その神経疾患は、特に、グルタミン酸塩、及び／またはアミロイドベータ毒性と関連した神経疾患のことである。本発明は、そのような中枢神経系（ＣＮＳ）、及び末梢神経系（ＰＮＳ）の神経疾患のための新しい治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、神経疾患の治療のための新しい療法を提供することである。
【００１２】
本発明は、特に、発明者による偶然の発見を基にしており、その偶然の発見とは、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、及びモキシフロキサシンのうち単独のもの、または組合せが、神経疾患の治療に対して新しくて効果的な療法を示すということである。
【００１３】
それゆえ、本発明は、神経疾患の治療のための新しい組成物及び方法を提供しており、その神経疾患とは、特に、ＡＤ及び関連疾患、多発性硬化症 （ＭＳ）、萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛またはアルコール性神経障害）、アルコール依存症またはアルコール離脱症、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄損傷を含む。
【００１４】
より具体的には、本発明は、神経疾患の治療に用いられる組成物に関しており、この組成物は少なくとも、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシンもしくはブロモクリプチン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤を含む。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、以下の組成物に関しており、この組成物は、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、及びブロモクリプチン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択した、少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤から選択し、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、との組合せを含み、これらは同時に、個別に又は連続して投与する。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の治療に用いられる組成物に関しており、この組成物は、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、及びブロモクリプチン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択した、少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤から選択し、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、との組合せを含み、これらは同時に、個別に又は連続して投与する。
【００１７】
本発明は、また、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、及びブロモクリプチン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択した、少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤、並びに薬学的に許容される賦形剤から選択し、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、との組合せを含み、同時に、個別に又は連続して投与される組成物に関する。
【００１８】
最も好ましい薬剤組成物は１、２、３、４または５つの異なる薬剤、さらに好ましくは２、３または４つの異なる薬剤を含む。なおかつ、前述の薬剤組成物は、神経疾患の対象者に有効な1種または数種の追加薬剤、もしくは治療のさらなる組合せの中にも使用される可能性がある。
【００１９】
本発明は、また、神経疾患の治療に関しており、その方法は、上記に開示した薬剤または組成物を必要とする対象者に投与することを含む。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の治療方法に関しており、その方法は、上記に開示した併用薬剤を必要とする対象者に、同時に、個別に又は連続して投与することを含む。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の治療のための薬剤の製造において、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択した、少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の治療のための薬剤の製造において、上記に開示した併用薬剤の使用に関する。
【００２３】
本発明は、疾病のいかなる段階においても、あらゆる哺乳類対象者、特にヒト対象者に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
すべての図面において、＊：ｐ＜０．０５：対照群と有意に異なる（中毒はない）、「ｎｓ」：有意な作用はない（分散分析＋Ｄｕｎｎｅｔｔポストホックテスト）
【図１】ＨＢＭＥＣにおけるヒトＡβ１−４２障害に対する、選択薬剤での前処理の作用（図Ａ）。薬剤スクリーニングに用いられる実験モデルの検証：１時間、１０ｎＭでのＶＥＧＦ前処理は、このアミロイド障害から毛細管網を有意に保護した（アミロイド中毒と比較して、毛細管網の＋７０％）。トルセミド（図Ｂ）、及びブロモクリプチン（図Ｃ）を、それぞれ４００ｎＭ及び ３．２ｐＭの低用量で摂取することにより、この中毒は有意に抑えられた。一方、より高い用量及びより低い用量の摂取では、効果はない又は作用は弱いということが分かった。◎：ｐ＜０．０５：アミロイド中毒と有意差がある。
【図２】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性分析におけるＬＤＨ放出に対する、選択薬剤での前処理の作用。薬剤スクリーニングに用いられる実験モデルの検証：（図Ａ）1時間のエストラジオール（１５０ｎｇ／ｍｌ）前処理は、アミロイド障害からニューロンを有意に保護した（−７０％）。これは神経防護作用の陽性対照群と考えられる。すべての実験で、Ａβ１−４２は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、ブロモクリプチン（４０ｎＭ、−２９％）（図Ｂ）、トリメタジジン（４０ｎＭ、−９４％）（図Ｃ）、イフェンプロジル（６００ｎＭ、−９４％）（図Ｄ）、メキシレチン（３．２ｎＭ、−７３％）（図Ｅ）、モキシフロキサシン（２０ｎＭ、−６３％）（図Ｆ）により、有意に抑えられる。他の濃縮薬剤において、より高い用量及びより低い用量の摂取では、効果はない又は作用は弱いと分かったことは注目すべきである。◎：ｐ＜０．０５：Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図３】ベータアミロイド中毒化したＨＢＭＥＣ培養物における、毛細管網の全長に対するバクロフェン及びトルセミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、バクロフェン及びトルセミドの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のバクロフェン（図Ｂ）及びトルセミド（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５：Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図４】ベータアミロイド中毒化したＨＢＭＥＣ培養物における、毛細管網の全長に対するスルフィソキサゾール及びトルセミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、スルフィソキサゾール及びトルセミドの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のスルフィソキサゾール（図Ｂ）及びトルセミド（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５：Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図５】ベータアミロイド中毒化したＨＢＭＥＣ培養物における、毛細管網の全長に対するエプレレノン及びトルセミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、エプレレノン及びトルセミドの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のトルセミド（図Ｂ）及びエプレレノン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５：Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図６】ベータアミロイド中毒化したＨＢＭＥＣ培養物における、毛細管網の全長に対するブロモクリプチン及びスルフィソキサゾールの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾールの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のブロモクリプチン（図Ｂ）及びスルフィソキサゾール（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図７】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対する、アカンプロセート及びイフェンプロジルの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、アカンプロセート及びイフェンプロジルの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のアカンプロセート（図Ｂ）及びイフェンプロジル（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図８】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるバクロフェン及びメキシレチンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、バクロフェン及びメキシレチンの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のバクロフェン（図Ｂ）及びメキシレチン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＝０．０５１、Ａβ１−４２中毒と異なる。
【図９】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるバクロフェン及びトリメタジジンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、バクロフェン及びトリメタジジン（図Ａ）の組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のバクロフェン（図Ｂ）及びトリメタジジン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１０】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるシナカルセト及びメキシレチンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、シナカルセト及びメキシレチンの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のシナカルセト（図Ｂ）及びメキシレチン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１１】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるシンナリジン及びトリメタジジンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、シンナリジン及びトリメタジジンの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のシンナリジン（図Ｂ）及びトリメタジジン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１２】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるトリメタジジン及びゾニサミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、トリメタジジン及びゾニサミドの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のトリメタジジン（図Ｂ）及びゾニサミド（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１３】ベータアミロイド中毒化したＨＢＭＥＣ培養物における、毛細管網の全長に対するテルビナフィン及びトルセミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、テルビナフィン及びトルセミドの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のテルビナフィン（図Ｂ）及びトルセミド（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１４】ベータアミロイド中毒化したＨＢＭＥＣ培養物における、毛細管網の全長に対するシナカルセト及びメキシレチンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、シナカルセト及びメキシレチンの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のシナカルセト（図Ｂ）及びメキシレチン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１５】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるバクロフェン及びトルセミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、バクロフェン及びトルセミドの組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のバクロフェン及びトルセミド濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１６】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるトルセミド及びスルフィソキサゾールの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、トルセミド及びスルフィソキサゾールの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のトルセミド（図Ｂ）及びスルフィソキサゾール（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１７】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるモキシフロキサシン及びトリメタジジンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシン及びトリメタジジンの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられる。モキシフロキサシンの添加は、トリメタジジン単独（図Ｃ）で見られる作用を１００％増加させるが、一方で、同じ濃度の、単独のモキシフロキサシン（図Ｂ）は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１８】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるモキシフロキサシン及びバクロフェンの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシン及びバクロフェンの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のモキシフロキサシン（図Ｂ）及びバクロフェン（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１９】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるモキシフロキサシン及びシナカルセトの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシン及びシナカルセトの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のモキシフロキサシン（図Ｂ）及びシナカルセト（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２０】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるモキシフロキサシン及びゾニサミドの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシン及びゾニサミドの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられる。モキシフロキサシンの添加は、のゾニサミド単一（図Ｃ）で見られる作用を８１％増加させるが、一方で、同じ濃度の、単独のモキシフロキサシン（図Ｂ）は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２１】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるモキシフロキサシン及びスルフィソキサゾールの併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾールの組合せ（図Ａ）で有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のモキシフロキサシン（図Ｂ）及びスルフィソキサゾール（図Ｃ）濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２２】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性で、ＬＤＨ放出におけるメキシレチン（ＭＥＸ）及びイフェンプロジル（ＩＦＮ）の併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド凝集体（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、メキシレチン２５．６ｐＭ及びイフェンプロジル２４ｎＭの組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のメキシレチン及びイフェンプロジル濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．０５７２、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２３】ベータアミロイド中毒化した皮質ニューロンで、神経突起網全長におけるバクロフェン（ＢＣＬ）及びトルセミド（ＴＯＲ）の併用療法の作用。ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理した細胞と比較して、１５％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、トルセミド及びバクロフェンの組合せで有意に抑えられる。さらに、この組合せは神経突起の成長を促進する。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２４】ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸塩中毒に対する、シナカルセト及びメキシレチンの併用療法の作用。グルタミン酸塩中毒は、シナカルセト（６４ｐＭ）及びメキシレチン（２５．６ｐＭ）の組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のシナカルセト及びメキシレチン濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．００１、グルタミン酸塩中毒と有意差がある（分散分析＋Ｄｕｎｎｅｔｔポストホックテスト）。
【図２５】ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸塩中毒に対する、スルフィソキサゾール及びトルセミドの併用療法の作用。グルタミン酸塩中毒は、スルフィソキサゾール（６．８ｎＭ）及びトルセミド（４００ｎＭ）の組合せで有意に抑えられるが、一方で、組合せの場合で使用したのと同じ濃度の単独のスルフィソキサゾール及びトルセミド濃縮物は、中毒に対する有意な作用を有しない。◎：ｐ＜０．００１、グルタミン酸塩中毒と有意差がある（分散分析＋Ｄｕｎｎｅｔｔポストホックテスト）。
【図２６】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性分析で、ＬＤＨ放出におけるトルセミド（ＴＯＲ）前処理の作用。Ａβ１−４２は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、トルセミド（２００ｎＭ、−９０％）で有意に抑えられる。○：ｐ＜０．０００１：Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２７】ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性分析で、ＬＤＨ放出におけるアカンプロセート及びその誘導体であるホモタウリン前処理の比較。Ａβ１−４２は、ビヒクルで処理したニューロンと比較して、重大な中毒を引き起こす。この中毒は、ホモタウリン及びアカンプロセート（９９％、８ｎＭ）で等しく有意に抑えられる。○：ｐ＜０．０００１：Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、神経疾患の治療のための新しい組成物を提供する。本発明は、そのような疾患を効果的に改善し、かつ患者の治療に使われうる薬剤の新しい適用、または新しい併用薬剤を開示している。本発明は、中枢または末梢を問わず、あらゆる神経疾患の治療に適しており、特にアミロイドまたはグルタミン酸塩興奮毒性が関わる疾患の治療に適する。そのような疾患の具体的な例は、アルツハイマー病及び関連疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）などの神経変性疾患、または、ニューロパシー（例として、アルコール性神経障害、もしくは神経因性疼痛）、アルコール依存症、もしくはアルコール離脱症、及び脊髄損傷などの他の神経疾患を含む。ニューロパシーは、末梢神経系の神経の損傷状態に関し、これは、遺伝因子、炎症性疾患、または薬剤（ビンクリスチン、オキサリプラチン、エチルアルコール）を含む化学物質から引き起される末梢神経系の損傷を含む。また、ニューロパシーの治療は、神経因性疼痛の治療を含む。
【００２６】
本発明は、特に、ＡＤ及び関連疾患の治療に適している。本発明の文脈では、「ＡＤの関連疾患」という用語は、アルツハイマー型老年性認知症（ＳＤＡＴ）、レビー小体型認知症（Lewis body dementia）、血管性認知症、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、及び加齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）を含む。
【００２７】
ここで用いられる「治療」は、上記疾患もしくは障害から引き起された症状の、または疾患もしくは障害の原因の治療、抑止、予防、遅延、または低減を含む。治療という用語は、特に、病気の進行及び関連症状の管理を含む。特に、治療という用語は、対象者の治療において、ｉ）アミロイドベータを原因とする毒性に対する防御、または、前記毒性の低減もしくは遅延、及び／または、ｉｉ）グルタミン酸塩興奮毒性に対する防御、または、前記毒性の低減もしくは遅延を含む。また、治療という用語は、認知症状の改善またはニューロン細胞の保護を示す。
【００２８】
本発明の文脈内では、特定の化合物の指示は、前記具体的に名前をあげた分子だけでなく、薬学的に許容されるすべての、そして任意の純度の、それらの塩、水和物、誘導体（例として、エステル、エーテル）、異性体、ラセミ化合物、複合体、またはプロドラッグを含むことを意図している。
【００２９】
ここで使用される「プロドラッグ」という用語は、本発明の化合物における、あらゆる機能の誘導体（または前駆体）に関し、生体系へ投与されると、例えば自然化学反応（spontaneous chemical reactions）、酵素触媒化学反応、及び／または、代謝化学反応などの結果として、前述の化合物を生成する。通常、プロドラッグは、不活性であるか、または生じる薬剤より低活性であり、例えば、薬剤の物理化学的特性の改善、薬剤の特定組織への標的化、薬剤の薬剤動態、及び薬理学的特性の改善、及び／または、望ましくない副作用の低減などに使用可能である。プロドラッグの設計に適する共通の官能基のいくつかは、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミン基、リン酸塩／ホスホン基及びカルボニル基を含むが、これに限らない。これらの基の修飾から典型的には製造されるプロドラッグは、エステル類、炭酸塩類、カルバメート類、アミド類及びリン酸塩類を含むが、これには限らない。適するプロドラッグ選択のための具体的な技術ガイダンスは、一般常識である（参考文献２４〜２８）。加えて、プロドラッグの調製は、当業者に知られている従来の方法によって行われることが可能である。他のプロドラッグを合成するために使用可能な方法は、本主題の数多くの先行文献に記載されている（参考文献２５、２９〜３５）。例を挙げると、アルバクロフェン・プラカルビルは、ChemID plus Advanceデータベース（ウェブサイト：http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/）に載っており、アルバクロフェン・プラカルビルは、バクロフェンのプロドラッグとしてよく知られている（参考文献３６、４３）。
【００３０】
化合物の「誘導体」という用語は、該化合物に、機能上および／または構造上関連するあらゆる分子を含み、そのような化合物の酸、アミド、エステル、エーテル、アセチル化体、ヒドロキシル化変異体、またはアルキル化（Ｃ１−Ｃ６）変異体などのことである。また、誘導体という用語は、先に挙げたような1つ以上の置換基を失った構造上関連した化合物を含む。例としては、ホモタウリンはアカンプロセートの脱アセチル化誘導体である。既知の方法が示すように、ある化合物の好ましい誘導体は、該化合物にかなりの程度の類似性を持つ分子である。親分子との類似性指標を持つ類似化合物は、PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)またはDrugBank(http://www.drugbank.ca/)など、数多くのデータベースに見られる。より好ましい実施形態では、誘導体は、親薬剤に対する谷本類似係数(Tanimoto similarity index)が０．４を超え、好ましくは０．５を超え、より好ましくは０．６を超え、さらにより好ましくは０．７を超えるほうがよい。谷本類似係数は、２分子間の構造的類似の程度を測定するために広く用いられている。谷本類似係数は、インターネット上で使用可能なthe Small Molecule Subgraph Detector（参考文献３７〜３８）(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/)などのソフトウェアにより解析可能である。好ましい誘導体は、構造上並びに機能上の両面において、親化合物に関するべきであり、言い換えれば、誘導体はまた、少なくとも親薬剤の活性の一部を保持すべきであり、より好ましくは、誘導体はＡβまたはグルタミン酸塩毒性に対する防御作用を有するべきである。
【００３１】
また、用語「誘導体」は薬剤の代謝物を含み、例としては、組織への投与後に、通常は特別な酵素系を通る前述の薬剤における（生化学的）変形もしくは作用の結果としての分子、及び薬剤の生物活性を示し、かつ保持する分子が挙げられる。代謝物は親薬剤の治療効果の多くを担っていることが示されている。具体的な実施形態では、ここで使用される「代謝物」は、変形または作用後の薬剤を示し、それらは、親薬剤の活性の少なくとも一部を保持し、好ましくはＡβ毒性またはグルタミン酸塩毒性に対する防御作用を持つ。代謝物の例は、薬剤の肝代謝の結果としての、トルセミドのヒドロキシル型を含む（Ｄｒｕｇ  ｂａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  （参考文献３９））。
【００３２】
用語「塩」は、本発明における化合物の、薬学的に許容された、比較的非毒性の、無機または有機酸付加塩を示す。医薬塩の形成は、酸性、塩基性、または双性イオン性の薬剤分子を反対イオンと対形成させて薬剤の塩型を作成することである。広範囲の多様な化学種は、中和反応おいて使用することができる。このように、本発明の薬学的に許容される塩は、塩基として機能する主化合物を、塩を形成するための無機または有機酸と反応させることにより得られる塩を含み、例として、酢酸、硝酸、酒石酸、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、またはクエン酸の塩が挙げられる。また、本発明の薬学的に許容される塩は、酸として機能する主化合物を適切な塩基と反応させた塩を含む。例として、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩またはコリン塩が挙げられる。一定の活性成分の大部分の塩は生物学的に同等であるが、とりわけ、一部の塩は溶解性または生物学的利用能が増加する可能性がある。現在、塩の選択は、Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ  Ｗｅｒｍｕｔｈによるハンドブックの教授により薬剤開発の過程において、一般標準的手順になっている（参考文献４０）。
【００３３】
「併用」又は「組合せ治療／療法」という用語は、ある生物学的作用を引き起こすために少なくとも２種以上の薬剤を対象に共に投与する治療を指す。本発明の併用療法では、少なくとも２種の薬剤を一緒にもしくは個別に、同時にもしくは連続して投与してもよい。また、この少なくとも２種の薬剤は、異なる経路及びプロトコルにより投与してもよい。結果として、これらを一緒に製剤化することも、組合せ薬剤を個別に製剤化することもできる。
【００３４】
実施例に開示したように、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシンは、神経疾患に関わる生物学的プロセスに、予想外の強い作用を有する。さらに、これらの化合物はまた、生体内で、そのような疾患症状の改善に大変効能があることを示した。したがって、これらの分子は、単独または併用療法で、神経疾患の治療のための新しい方法を提示しており、その神経疾患とは、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、及び脊髄損傷などである。これら薬剤と他の選択化合物の組合せ（表２参照）は特に有効であり、それは、薬剤単独では本来効果がないところに、投薬で、それら化合物が驚くべき、そして予想外の相乗効果を生むからである。また、この効能により、ここで開示した併用薬剤は低用量にて使用可能であり、これはさらに大きな実質的利点になる。
【００３５】
これに関し特定の実施形態では、本発明は、ＡＤ、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の治療に使用する組成物に関しており、その組成物は少なくともトルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、もしくはモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体もしくはそれらの徐放性製剤を含む。
【００３６】
各化合物の具体的なＣＡＳ番号は下記表1に提示する。また表1は、非制限的に、本発明の組成物に使用される化合物の一般的な塩、ラセミ化合物、プロドラッグ、代謝物または誘導体にも言及する。
【００３７】
【表１】
2014506909.tif 000002
【００３８】
上記の分子は、単独、または、最大限の臨床上の利益を提供するために、好ましくは併用療法にて用いられる。これに関し、好ましい実施形態では、本発明は神経疾患の治療に用いられる組成物に関しており、その神経疾患とは、望ましくはＡＤ、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷を含み、上記化合物のうちのいずれか１つと、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、ブロモクリプチンもしくはトルセミド、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤から選択した、少なくとも１つの異なる化合物との組合せを含む。
【００３９】
表１の化合物とは異なる、各添加相違化合物の具体的なＣＡＳ番号は、以下表２に提示する。
【００４０】
【表２】
2014506909.tif 000003
【００４１】
バクロフェンのプロドラッグの具体的な例は、２０１１年のＨａｎａｆｉ、外による文献４１に掲載されており、特に、バクロフェンエステル及びバクロフェンエステルカルバメートは、中枢神経系（ＣＮＳ）を標的にした特定指向性を持つ。したがって、特にそのようなプロドラッグは、本発明の組成物に特に適している。前述したバクロフェン・プラカルビルも既知のプロドラッグであり、本発明の組成物におけるバクロフェンの代替に使用してもよい。バクロフェンのその他のプロドラッグは以下の特許出願に見受けられる。国際公開第２０１０／１０２０７１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７９５８号、国際公開第２００９／０９６９８５号、国際公開第２００９／０６１９３４号、国際公開第２００８／０８６４９２号、米国特許出願公開第２００９／０２１６０３７号、国際公開第２００５／０６６１２２号、米国特許出願公開第２０１１／００２１５７１号、国際公開第２００３／０７７９０２号、国際公開第２０１０／１２０３７０号。
【００４２】
アカンプロセートの有効なプロドラッグである、アカンプロセートのパントイン酸エステルネオペンチルスルホニルエステル、ネオペンチルスルホニルエステルプロドラッグ、または潜在性カルボキシレートネオペンチルスルホニルエステルプロドラッグなどは、特に、国際公開第２００９／０３３０６９号、国際公開第２００９／０３３０６１号、国際公開第２００９／０３３０５４号、国際公開第２００９／０５２１９１号、国際公開第２００９／０３３０７９号、米国特許出願公開第２００９／００９９２５３号、米国特許出願公開第２００９／００６９４１９号、米国特許出願公開第２００９／００８２４６４号、米国特許出願公開第２００９／００８２４４０号、及び米国特許出願公開第２００９／００７６１４７号に挙げられている。
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明は以下の組成物に関しており、その組成物は
トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤から選択した、少なくとも１つの第１の化合物を含み、その組合せとして、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤から選択した、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、を含み、それらを必要とする対象者の神経疾患の治療に用いられる。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明は、ＡＤまたは関連疾患の治療のために、その治療を必要とする対象者において、薬剤または組成物を使用することに関する。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明は、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の治療のために、その治療を必要とする対象者において、薬剤または組成物を使用することに関する。
【００４６】
実施例で開示するように、上記に挙げた薬剤のうちの１つ以上を用いる組成物療法は、アルツハイマー病及び他の神経疾患の効果的改善を導く。実験の項で示すように、少なくともトルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、及びモキシフロキサシンを含む組成物は、ヒト細胞におけるアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質またはペプチドの毒性作用の抑制に、実質的な治療的及び生物学的作用を提供する。さらに生体内では、これらの組成物は、認知症状の改善、及びグルタミン酸塩興奮毒性内のＡβ中毒から引き起こされる分子経路の抑制を導く。したがって、組成物療法はそのような疾患の治療に対して、新しく、そして有力な方法を示す。さらにまた、実験の項では、上記の組成物は、ｉ）グルタミン酸塩毒性から生体外ニューロン細胞を相乗的に保護し、そしてｉｉ）グルタミン酸塩興奮毒性に関する疾患に対し、生体内モデルで臨床効果をもたらす、という点で、効果的であるということを示す。
【００４７】
より好ましくは、本発明の薬剤組成物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の併用療法を必要とする対象者におけるその併用療法のための、１、２、３、４または５つの異なる薬剤、さらにより好ましくは２、３または４つの異なる薬剤を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、最大限の効果を提供するために、同時、個別または連続投与ための１つまたは複数の組合せで用いられる。
【００４８】
特定の実施形態では、本組成物は、（ｉ）トルセミド並びに（ｉｉ）ブロモクリプチン、バクロフェン、スルフィソキサゾール、エプレレノンもしくはテルビナフィン、または前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、もしくは徐放性製剤から選択した化合物を含む。
【００４９】
別の特定の実施形態では、本組成物は、（ｉ）トリメタジジン並びに（ｉｉ）バクロフェン、シンナリジン、ゾニサミドもしくはモキシフロキサシン、または前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、もしくは徐放性製剤から選択した化合物を含む。
【００５０】
さらなる特定の実施形態では、本組成物は、（ｉ）モキシフロキサシン並びに（ｉｉ）バクロフェン、シナカルセト、ゾニサミド、スルフィソキサゾール、もしくはトリメタジジン、または前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、もしくは徐放性製剤から選択した化合物を含む。
【００５１】
別のさらなる特定の実施形態では、本組成物は、（ｉ）メキシレチン並びに（ｉｉ）バクロフェン、シナカルセト、イフェンプロジル、もしくはレボシメンダン、または前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、もしくは徐放性製剤から選択した化合物を含む。
【００５２】
また、特定の実施形態は、（ｉ）イフェンプロジル並びに（ｉｉ）アカンプロセート、レボシメンダン、もしくはメキシレチン、または前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、もしくは徐放性製剤から選択した化合物を含む組成物に関する。
【００５３】
本発明の好ましい組成物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などの神経疾患の治療に用いられ、同時、個別又は連続の投与として、下記併用薬剤、
‐バクロフェン及びトルセミド、
‐エプレレノン及びトルセミド、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾール、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐スルフィソキサゾール及びトルセミド、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐レボシメンダン及びメキシレチン、
‐レボシメンダン及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びモキシフロキサシン、
‐テルビナフィン及びトルセミド、
‐モキシフロキサシン及びトリメタジジン、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、または
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
のうちの１つに含まれる。
【００５４】
本発明にかかる好ましい組成物の実施例は、同時、個別又は連続の投与として、少なくとも３つの化合物の組合せを含み、これを以下に示す。
【００５５】
‐バクロフェン及びトリメタジジン及びトルセミド、
‐バクロフェン及びシナカルセト及びトルセミド、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド、
‐レボシメンダン及びバクロフェン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びアミノカプロン酸及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びテルビナフィン及びトリメタジジン、または
‐レボシメンダン及びスルフィソキサゾール及びトリメタジジン。
【００５６】
本発明にかかる好ましい組成物の実施例は、同時、個別又は連続の投与として、少なくとも４つの化合物の組合せを含み、これを以下に示す。
【００５７】
‐スルフィソキサゾール及びトリメタジジン及びトルセミド及びゾニサミド、
‐スルフィソキサゾール及びメキシレチン及びトルセミド及びシナカルセト、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びジエチルカルバマジン、または
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びイフェンプロジル。
【００５８】
実験の項で開示しているように、本発明の上記併用療法は、Ａβ毒性に対する強力な神経保護作用を誘引し、行動特性及び生体内の生化学分析で有効な結果を示す。この結果は、本発明の組成物がｉ）生体内において、Ａβ凝集体が引き起こす分子経路を効果的に改善し、ｉｉ）ニューロン生存またはシナプス統合性として、罹患動物に見られる神経生理学的機能障害の改善を導くことを示す。さらに、本結果ではまた、前記併用療法が、グルタミン酸塩興奮毒性(図２４及び２５、表８) に対し、すなわち、ＡＤ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などの様々な神経疾患に関する経路に対し、重要な相乗神経保護作用を示すことを表す。この併用療法は、これら疾患の生体内または体外モデルで有効な結果を示している。加えてまた、生体内の結果は、本発明の組成物がいくつかの神経疾患で障害になることで知られる血液脳関門の完全性を効果的に回復することを示す。
【００５９】
したがってまた、本発明の目的は、神経疾患の治療のための、上記に定義したような組成物にあり、その神経疾患とは、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などである。
【００６０】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の治療に対する製剤のための、上記に定義したような組成物の使用にあり、その神経疾患とは、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などである。
【００６１】
加えて本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などの神経疾患の治療のための方法を提供し、この治療を必要とする対象者において、上記に開示した有効な量の組成物を投与することを含む。
【００６２】
前述したように、本発明の併用療法の化合物または組成物は、一緒にまたは個別に製剤でき、そして一緒に、個別にまたは連続して、及び／または繰り返して投与できる。
【００６３】
これに関し、本発明の特定の目的は、対象者のＡＤ、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の治療方法であり、そのような治療を必要とする対象者において、上記に開示した有効な量の組成物を、同時に、個別に又は連続して投与することを含む方法を提供する。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象者における、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の治療の方法に関し、有効な量のトルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチンもしくはモキシフロキサシン、またはそれらの塩、もしくはそれらのプロドラッグ、もしくはそれらの誘導体、もしくはそれらの徐放性製剤を、好ましくは上記に開示した組合せで対象者に投与することを含む方法である。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などの神経障害の治療を必要とする対象者における、治療方法であって、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはあらゆる製剤からなる群より選択した、少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはあらゆる製剤から選択した前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、との組合せで、対象者に同時、個別または連続して投与することを含む方法に関する。
【００６６】
さらなる実施形態では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の治療の方法に関しており、トルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはあらゆる製剤からなる群より選択した、少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トルセミド、及びモキシフロキサシン、またはそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、もしくはあらゆる製剤から選択した、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、との組合せを、それを必要とする対象者に投与することを含む方法に関する。
【００６７】
本発明の方法と組成物は、生体外または生体内で、対象者または特定の状態により大変効果的であるが、この方法と組成物は、対象者の神経疾患の治療に有益な添加薬剤または治療とさらに併用して用いるとよい。これに関し、特定の実施形態では、本発明にかかる薬剤または組成物は、さらにＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａエキスと併用するとよい。これに適する抽出物はＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａエキス、改良型Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａエキス（例として、活性成分を濃縮した、またはを混入物質を減少させたもの）、またはＧｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａエキスを含むあらゆる薬剤を含み、制限はない。
【００６８】
Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａエキスは、少なくともトルセミド、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル及びモキシフロキサシンを含む組成物に使用されるとよい。
【００６９】
好ましい実施形態では、Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａエキスは、以下の併用薬剤、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトルセミド、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾール、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐エプレレノン及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトルセミド、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐レボシメンダン及びメキシレチン、
‐レボシメンダン及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びモキシフロキサシン、
‐テルビナフィン及びトルセミド、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びトリメタジジン及びトルセミド、
‐バクロフェン及びシナカルセト及びトルセミド、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトリメタジジン及びトルセミド及びゾニサミド、
‐スルフィソキサゾール及びメキシレチン及びトルセミド及びシナカルセト、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びジエチルカルバマジン、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトルセミド及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びバクロフェン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びアミノカプロン酸及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びテルビナフィン及びトリメタジジン、または
‐レボシメンダン及びスルフィソキサゾール及びトリメタジジン、
のうちのいずれか１つと組み合わせて用いられる。
【００７０】
本発明にかかる薬剤または併用薬剤とともに用いられる他の療法は、アルツハイマー病、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパシー（例としては、神経因性疼痛もしくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷の症状を改善する１つ以上の薬剤、またはこれらの疾患の緩和治療に使用されうる１つ以上の薬剤を含むとよい。
【００７１】
例としては、本発明の組合せは、ドネペジル（ＣＡＳ：１２００１４−０６−４）、ガバペンチン（ＣＡＳ：４７８２９６−７２−９、６０１４２−９６−３）、リバスチグミン（１２３４４１−０３−２）またはメマンチン（ＣＡＳ：１９９８２−０８−２）と併用して用いることができる。
【００７２】
本発明のさらなる目的は、前記に挙げた疾患の治療に対する薬剤製造のための上記に開示したような化合物または化合物の組合せの使用に関し、この化合物または化合物の組合せを必要とする対象者において、同時に、個別に又は連続して投与して用いられる。
【００７３】
本発明のさらなる目的は、医薬組成物の調製方法であり、上記化合物を適切な賦形剤または担体へ混合することを含む方法である。
【００７４】
本療法の継続期間は、治療する疾患もしくは障害の段階、使用する組合せ、患者の年齢及び状態、並びにその患者の治療に対する反応の様子に依拠する。組合せの各成分の投与量、頻度及び様式は、独立して制御することができる。例として、１つの薬剤を経口投与し、第２の薬剤を筋肉注射で投与してもよい。併用療法は、患者の身体が、あらゆる予期せぬ副作用から回復する時間がとれるように、休止期間をはさんだ断続的周期で行われてもよい。またこの薬剤は、１回の投薬ですべての薬剤を送達するように、一緒に製剤してもよい。
【００７５】
組合せの各薬剤の投与は、他の成分との組合せで、患者の状態を改善することができる、または疾患もしくは障害を効果的に治療できる薬剤の濃度を生じるあらゆる適切な手段で行われるとよい。
【００７６】
組合せの活性成分を、純粋な化学物質として投与することは可能であるが、それらを医薬組成物（この文脈では、医薬製剤ともいう）として提供することが好ましい。可能な組成物としては、経口投与、直腸投与、局所投与（経皮、頬側及び舌下投与を含む）、または非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内投与を含む）に適切なものを含む。
【００７７】
更に一般には、これらの医薬製剤は、いくつかの単位用量を含む「患者用パック」にして、または個別の治療期間に使用するのために単一包装（通常はブリスターパック）した計量単位用量の投与のための他の手段で患者に処方される。患者用パックは、患者が常に患者用パックに含まれる添付文書を利用できる（従来処方では普通は紛失している）という点で、薬剤師が医薬の患者供給分をバルク供給分から分割する従来処方よりも利点がある。添付文書の封入は、医師の指示の患者コンプライアンスを改善することを示した。従って、本発明は、前述の製剤に適切な包装材料を組み合わせた、本明細書に前記の医薬製剤を更に含む。このような患者用パックでは、併用療法のための製剤の使用目的は、その治療に最も適切に製剤を使用するための指示、施設、設備、適応及び／又は他の手段により推察することができる。このような評価基準により、患者用パックは、本発明の組合せでの治療のための使用に、特に適切であり、そして適応している。
【００７８】
薬剤は、任意の適量で、任意の適切な担体物質中（例えば、賦形剤、ビヒクル、補助剤）に含まれ、そして組成物の総重量の１〜９９重量％の量で存在しうる。この組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内）、直腸内、経皮、鼻内、膣内、吸入、皮膚（パッチ）、又は眼内の投与経路に適した投与剤形として提供することができる。すなわち、本組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、泥膏、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、飲薬、浸透圧送達装置、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、噴霧剤、又はエアゾール剤の剤形を取りうる。
【００７９】
本医薬組成物は、従来の製薬の実務により製剤化することができる（例えば、Remington:The Science and Practice ofPharmacy(20th ed.)、ed. A.R.Gennaro、Lippincott Williams & Wilkins、2000及びEncyclopediaof Pharmaceutical Technology、eds.J.Swarbrickand J.C.Boylan、1988~1999、Marcel Dekker、New Yorkを参照のこと）。
【００８０】
本発明にかかる医薬組成物は、投与直後に、又は投与後の任意の所定の時点もしくは期間に、十分に活性薬剤を放出するように製剤化することができる。
【００８１】
放出制御製剤は、（ｉ）長時間にわたり体内で薬剤の実質的な一定濃度をもたらす製剤、（ｉｉ）所定の遅延時間後に長時間にわたり体内で薬剤の実質的な一定濃度をもたらす製剤、（ｉｉｉ）活性薬剤物質の血漿レベルの変動に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えると共に、体内で比較的一定の有効薬剤レベルを維持することにより、所定の期間、薬剤作用を持続する製剤、（ｉｖ）例えば、患部組織もしくは臓器の近く、又はその中に放出制御組成物を空間配置することにより、薬剤作用を局在化させる製剤、及び（ｖ）薬剤を特定の標的細胞型に送達するための担体又は化学的誘導体を使用することにより、薬剤作用を標的化する製剤、を含む。
【００８２】
放出制御製剤の形態での薬剤の投与は、その薬剤が、単独または組合せのいずれかで、（ｉ）低い治療指数（即ち、有害な副作用又は毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度の間の差が小さい。一般には、治療指数、ＴＩは、５０％致死量（ＬＤ５０）に対する５０％有効量（ＥＤ５０）の比として定義される）、（ｉｉ）狭い消化管吸収域、または（ｉｉｉ）非常に短い生物学的半減期（これにより、血漿レベルを治療レベルに維持するために１日に頻回の投与が必要となる）を有する場合に特に好ましい。
【００８３】
問題の薬剤の放出速度が代謝速度を上回る放出制御を得るために、多数の方策のいずれも追求することができる。放出制御は、例えば、放出制御組成物及びコーティングの様々なタイプを含む、種々の製剤パラメータ及び成分の適切な選択により得られる。即ち、この薬剤は、適切な賦形剤と共に、投与により薬剤を制御放出する医薬組成物へと製剤化される（単独、または複数単位の錠剤またはカプセル剤組成物で、油性液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、及びリポソーム）。
【００８４】
＜経口使用のための固体投与剤形＞
経口使用のための製剤は、薬学的に許容される非毒性の賦形剤との混合物中に活性成分を含む錠剤を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、ショ糖、微結晶性セルロース、バレイショデンプンを包むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、顆粒剤及び崩壊剤（例えば、微結晶性セルロースを含むセルロース誘導体、バレイショデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネイト、またはアルギン酸）、結合剤（例えば、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はポリエチレングリコール）、並びに潤滑剤、滑剤、及び粘着防止剤（例えば、ステアリン酸、シリカ、またはタルク）であろう。他の薬学的に許容される賦形剤は、着色剤、香料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであってよい。
【００８５】
錠剤は、素錠であっても、または場合により消化管での崩壊及び吸収を遅延させることにより長時間にわたる持続作用を提供するために、既知の手法によりコーティングされていてもよい。コーティングは、活性薬剤物質を既定のパターン（例えば、放出制御製剤を得るための）で放出するようにつくるか、または胃の通過後まで活性薬剤物質を放出しないようにつくる（腸溶性コーティング）ことができる。コーティングは、糖衣、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレート共重合体、ポリエチレングリコール及び／もしくはポリビニルピロリドンに基づく）、または腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、及び／もしくはエチルセルロースに基づく）であってよい。時間遅延物質として、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを利用することができる。
【００８６】
固体の錠剤組成物は、不要な化学変化（例えば、活性薬剤物質の放出に先立つ化学分解）からの組成物保護に適したコーティングを含んでもよい。このコーティングは、Encyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載の同様の方法で固体投与剤形に適用することができる。
【００８７】
数種の薬剤が、錠剤中で混合されていても、または仕切られていてもよい。例えば、第１の薬剤の放出前に第２の薬剤の大部分が放出されるように、第１の薬剤は錠剤の内側に、そして第２の薬剤は外側に含まれる。
【００８８】
経口使用のための製剤はまた、活性成分を不活性固体希釈剤（例えば、バレイショデンプン、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリン）と混合したチュアブル錠として、もしくは硬ゼラチンカプセル剤として、または、活性成分を水もしくは油性媒体、例えば、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセル剤として提供することができる。散剤及び顆粒剤は、錠剤及びカプセル剤について上記で述べた成分を用いて、従来法で調製することができる。
【００８９】
経口使用のための放出制御組成物は、例えば、活性薬剤物質の溶解及び／または拡散を制御することにより活性薬剤を放出するように構成することができる。
【００９０】
溶解制御放出または拡散制御放出は、薬剤の錠剤製剤、カプセル剤製剤、ペレット製剤、もしくは顆粒製剤に適切なコーティングを施すことにより、又は薬剤を適切なマトリックスに組み込むことにより得ることができる。放出制御コーティングは、上記のコーティング物質のうちの１種以上、及び／または、例えば、セラック、ミツロウ、グリコワックス（ｇｌｙｃｏｗａｘ）、硬化ヒマシ油（ｃａｓｔｏｒ  ｗａｘ）、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、及び／または、ポリエチレングリコールを含み得る。放出制御マトリックス製剤において、マトリックス物質はまた、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバロウ及びステアリルアルコール、ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセ
リル、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、及び／または、ハロゲン化フルオロカーボンを含み得る。
【００９１】
本特許請求における組合せのうち１種以上の薬剤を含む放出制御組成物はまた、浮揚性錠剤またはカプセル剤（即ち、経口投与されると、一定時間、胃の内容物上に浮いている錠剤またはカプセル剤）の剤形であってもよい。薬剤の浮揚性錠剤の製剤は、賦形剤及び２０％〜７５％（ｗ／ｗ）の親水コロイド（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）との薬剤の混合物を顆粒化することにより調製することができる。得られる顆粒は次に、錠剤へと圧縮することができる。この錠剤は、胃液と接触すると、その表面周囲に、実質上水不透過性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは、１未満の密度を維持することに関与し、それによって錠剤が胃液中で浮揚性を保持できる。
【００９２】
＜経口投与用液剤＞
水の添加により水性懸濁液の調製に適している散剤、分散性散剤、または顆粒剤は、経口投与に便利な投与剤形である。懸濁液としての製剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、及び１種以上の保存料との混合物で活性成分を提供する。適切な懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどである。
【００９３】
＜非経口投与用組成物＞
本医薬組成物はまた、注射、点滴又は注入（implantation）（静脈内、筋肉内、皮下など）により、従来の非毒性の薬学的に許容される担体及びアジュバントを含む、投与剤形、製剤で、または適切な送達装置もしくはインプラントを介して非経口投与してもよい。このような組成物の製剤設計及び調製法は、医薬品製剤の当業者には周知である。
【００９４】
非経口使用の組成物は、単位投与剤形として（例えば、単回投与用アンプルとして）、または数回の用量を含むバイアルとして提供することができ、そしてその中に適切な保存料を加えることができる（以下を参照のこと）。この組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、点滴装置、もしくはインプラント用の送達装置の剤形をとることが可能であり、または使用前に水もしくは別の適切なビヒクルで再構成するドライパウダーとして提供してもよい。活性薬剤の他に、本組成物は、適切な非経口投与に許容しうる担体及び／または賦形剤を含むことができる。活性薬剤は、放出制御のためにマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム、または同様のものに組み込むことができる。本組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、及び／または分散剤を含んでもよい。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、無菌注射に適した剤形であり得る。このような組成物を調製するために、適切な活性薬剤を非経口投与に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁する。利用可能で許容されるビヒクル及び溶媒には、水、適切なｐＨに調整するために適量の塩酸、水酸化ナトリウムもしくは適切な緩衝剤を添加した水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。本水性製剤はまた、１種以上の保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）を含んでもよい。薬剤の１つが水にやや溶けにくいか溶けにくい場合にのみ、溶解増強剤もしくは可溶化剤を添加することができ、あるいはこの溶媒は１０％〜６０％（ｗ／ｗ）のプロピレングリコールなどを含むことが可能である。
【００９６】
放出制御非経口組成物は、水性懸濁剤、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁性マイクロスフェア、油性液剤、油性懸濁剤、または乳剤の剤形であってもよい。あるいは、活性薬剤は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または点滴装置に組み込むことができる。マイクロスフェア及び／またはマイクロカプセルの調製に使用する物質は、例えば、ポリグラクチン、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）などの、生分解性／生浸食性（bioerodible）ポリマーである。放出制御非経口製剤を製剤化するときに使用できる生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。インプラントに使用する物質は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）、または生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）もしくはポリ（オルトエステル））であり得る。
【００９７】
＜その他の経路＞
好ましさ、便利さには欠けるが、他の投与経路、及びそのための他の製剤は考慮され得る。これに関して、直腸内適用では、組成物に適する投与剤形は、坐剤（乳剤または懸濁剤型）、及び直腸用ゼラチンカプセル剤（液剤または懸濁剤）を含む。典型的な坐剤製剤では、活性薬剤は、適切な薬学的に許容される坐剤基剤（カカオバター、エステル化脂肪酸、グリセリンゼラチンなど）及びポリエチレングリコールのような種々の水溶性または分散性基剤と合わせられる。種々の添加剤、増強剤、または界面活性剤を組み込んでもよい。
【００９８】
本医薬組成物はまた、マイクロスフェア及びリポソームを含む、非毒性の薬学的に許容される担体及び賦形剤を慣例的に含有する投与剤形又は製剤として、経皮吸収のために皮膚上に局所投与することができる。この製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、液剤、懸濁剤、スティック剤、噴霧剤、泥膏、硬膏剤、及び他の種類の経皮薬物送達システムを含む。薬学的に許容される担体または賦形剤は、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存料、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、及び皮膚保護剤を含んでもよい。
【００９９】
保存料、保湿剤、浸透促進剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルのようなパラベン類、及び塩化ベンザルコニウム、グリセリン、プロピレングリコール、尿素などであってよい。
【０１００】
皮膚への局所投与のための上記の医薬組成物はまた、治療すべき身体の部分への、またはその近くへの局所投与に関連して使用することができる。本組成物は、直接適用として、または特別な薬物送達手段による適用に適合でき、その特別な薬物送達手段とは、包帯、または代替的な硬膏、パッド、スポンジ、ストリップ、もしくは他の形態の適切な柔軟性のある材料などである。
【０１０１】
＜用量及治療の期間＞
組合せの薬剤は、同一もしくは異なる医薬品製剤のいずれかで同時に、または連続して投与するとよいであろう。連続投与であるならば、第２の（または
追加の）活性成分を投与する際の遅延時間は、活性成分の組合せの有効な作用の恩恵を失わないようにすべきである。本記述の組合せにとって最小限の要件は、この組合せが、活性成分の組合せの有効作用の恩恵を持つ組合せ使用を目的とすべきことである。組合せの使用目的は、本発明の組合せの使用を助けるための施設、設備、適応及び／または他の手段により推察することができる。
【０１０２】
本発明の活性薬剤は、分割用量で、例えば、１日２回または３回投与することができるが、組合せの各薬剤の１日１回服用が好ましく、単一医薬組成物（単位投与剤形）にした全ての薬剤の１日１回服用が最も好ましい。
【０１０３】
「単位投与剤形」という用語は、ヒト対象のための単位用量に適した物理的に個別のユニット（カプセル剤、錠剤、または充填済み注射シリンジなど）に関し、所定量の活性物質（単数または複数）を含む各ユニットは、必要な製剤担体と一緒に望ましい治療効果を生み出すように算出する。
【０１０４】
投与は通常繰り返して行われる。投与が１日１〜数回、数日〜数年にわたることはあり得ることで、患者の生涯にわたることさえある。長期投与または少なくとも定期的に反復する長期投与が、多くの症例において示されている。
【０１０５】
さらには、特定の患者に対する薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態、薬力学または有効性プロファイルに及ぼす遺伝子型の影響）情報が、使用する用量に影響しうる。
【０１０６】
特に機能低下した場合の対応時を除いて、高用量が必要とされうる際に、組合せの各薬剤の好ましい用量は、通例、長期維持療法に通常処方されるか、または第３段階臨床試験において安全が証明された量を超えない用量の範囲内である。
【０１０７】
本発明の１つの注目に値する利点は、組合せで実質的な臨床効果を患者にもたらしながら、併用療法で、各化合物を低用量で使用できることである。併用療法は、化合物が個々には実質的な作用を持たない用量で、実際に有効になりうる。したがって、本発明の特別な利点は、各化合物の準最適用量、すなわち、通常処方される治療用量より低い用量、好ましくは治療用量の１／２、より好ましくは治療用量の１／３、１／４、１／５、または更により好ましくは治療用量の１／１０で使用可能なことにある。特定の実施例においては、治療用量の１／２０、１／３０、１／５０、１／１００の低用量で、またはさらに低い用量で用いられる。
【０１０８】
このような準最適用量では、本発明の組合せは十分に効果があるが、単独の化合物は実質的に不活性であろう。
【０１０９】
好ましい用量は、長期維持療法に通常処方される量の１％〜５０％の量に相当する。
【０１１０】
最も好ましい用量は、長期維持療法に通常処方される量の１％〜１０％の量に相当するとよい。
【０１１１】
本発明の使用薬剤用量の具体例を以下に提供する。
【０１１２】
‐ブロモクリプチン、経口、１日当たり約０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１日当たり５ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり２．５ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり１ｍｇ未満、この用量は特に経口投与に適する、
‐イフェンプロジル、経口、１日当たり約０．４ｍｇ〜６ｍｇ、好ましくは１日当たり３ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１．５ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０．７５ｍｇ未満、この用量は特に経口投与に適する、
‐メキシレチン、経口、１日当たり約６ｍｇ〜１２０ｍｇ、好ましくは１日当たり６０ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり３０ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり１５ｍｇ未満、この用量は特に経口投与に適する、
‐モキシフロキサシン、経口、１日当たり約４ｍｇ〜４０ｍｇ、好ましくは１日当たり２０ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１０ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり５ｍｇ未満、この用量は特に経口投与に適する、
‐トルセミド、経口、１日当たり約０．０５ｍｇ〜４ｍｇ、好ましくは１日当たり２ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０.５ｍｇ未満、この用量は特に経口投与に適する、
‐トリメタジジン、経口、１日当たり約０．４ｍｇ〜６ｍｇ、好ましくは１日当たり３ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１．５ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０．７５ｍｇ未満、この用量は特に経口投与に適する、
‐アカンプロセート、経口、１日当たり約１ｍｇ〜４００ｍｇ、
‐アミノカプロン酸、経口、１日当たり約０．１ｍｇ〜２．４ｇ、
‐バクロフェン、経口、１日当たり約０．１５ｍｇ〜１５ｍｇ、
‐ジエチルカルバマジン、経口、１日当たり約０．６ｍｇ〜６００ｍｇ、
‐シナカルセト、経口、１日当たり約０．３ｍｇ〜３６ｍｇ、
‐シンナリジン、経口、１日当たり約０．６ｍｇ〜２３ｍｇ、
‐エプレレノン、経口、１日当たり約０．２５ｍｇ〜１０ｍｇ、
‐レフルノミド、経口、１日当たり約０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、 
‐レボシメンダン、経口、１日当たり約０．０４ｍｇ〜０．８ｍｇ、
‐スルフィソキサゾール、経口、１日当たり約２０ｍｇ〜８００ｍｇ、
‐スロデキシド、経口、１日当たり約０．０５ｍｇ〜４０ｍｇ、
‐テルビナフィン、経口、１日当たり約２．５ｍｇ〜２５ｍｇ、
‐ゾニサミド、経口、１日当たり約０．５ｍｇ〜５０ｍｇ。
【０１１３】
実際に投与する薬剤の量は、疾患もしくは治療すべき疾患、投与する的確な組成物、個々の患者の年齢、体重及び反応、患者の症状の重症度、並びに選択する投与経路を含む関連する状況に照らして、医師により決定されるべきである。したがって、上記用量範囲は、本明細書における教示のための一般的なガイダンス及びサポートを提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１４】
以下の実施例は、例示を目的として述べるもので、限定する目的ではない。
［実施例］
実験と同じく、動物の管理と維持は、Ｉ．Ａ．Ｓ．Ｐ．の研究・倫理問題委員会のガイドライン（１９８３）に準じて行った。
【０１１５】
（Ａ）Ａβ毒性に関する疾患の治療
この一連の実験では、候補化合物がヒトＡβ１−４２の毒性作用を抑止または低減する能力をテストした。Ａβ１−４２は、ＡＤに苦しむヒト患者の生体組織検査に見られる凝集体を構成する完全長ペプチドである。本薬剤は、最初に個別にテストし、続いてそれらの組合せの作用の分析を行う。この作用は、ＡＤの異なる生理学的特徴を示す体外モデルにおいて、化合物の活性をさらに例証するために、種々の細胞型で測定する。また、生体内研究は、ｉ）動物の認知行動、及びｉｉ）ＡＤの分子特徴（アポトーシス誘発、酸化ストレス誘発、炎症経路誘発）において、化合物の作用を評価することで、ＡＤについての防御作用を検証するために、マウスモデルで行われる。
【０１１６】
１．ヒトＡβ１−４２の毒性を抑止する化合物
１‐１．ヒトの脳微小血管内皮細胞モデルにおけるＡβ１−４２毒性に対する保護
ヒトの脳微小血管内皮細胞培養は、Ａβ１−４２毒性における候補化合物による保護研究に用いられた。
【０１１７】
ヒトの脳微小血管内皮脳細胞（ＨＢＭＥＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社  Ｒｅｆ：１０００、１０パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ１０）で凍結）は、＋３７℃の水浴で急速に解凍された。その上澄みを、直ちに、ウシ胎児血清を１０％（ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ社  ｒｅｆ：１０２７０−１０６）を含む９ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  ｒｅｆ：Ｐ０４−０３６００）に入れた。細胞懸濁液は、＋４℃で１０分間、１８０ｘｇで、遠心分離され、そして、ペレットはＣＳＣ無血清培地（ＣＳＣ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｒｅｆ：ＳＦ−４Ｚ０−５００−Ｒ、Ｂａｔｃｈ  ５１４０７−４）で、１．６％の無血清ロケットフューエル（ＲｏｃｋｅｔＦｕｅｌ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｒｅｆ：ＳＦ−４Ｚ０−５００−Ｒ、Ｂａｔｃｈ  ５４１０２）、２％、１０．０００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＰＳ、  Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  ｒｅｆ：Ｐ０６−０７１００、ｂａｔｃｈ  １３３０８０８０８）とともに懸濁し、１００μｌの最終量で、９６ウェルプレート（ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｌａｙｅｒ  ｂｉｏｃｏａｔ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤ社、Ｒｅｆ  ３５４１５０、Ｂａｔｃｈ  Ａ８６６２）の、ウェルにつき２０，０００細胞の密度で播種した。マトリゲルの補助により、内皮脳細胞は、毛細管網の形態形成プロセスを自然に開始した（参考文献３３）。
【０１１８】
３つの異なる培養は、条件毎に行われ、１つの条件は６ウェルで行われる。
【０１１９】
＜候補化合物及びヒトアミロイド‐β１−４２処理＞
Ａβ１−４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ社、ｒｅｆ：Ｈ１３６８、ｂａｔｃｈ  １０１０５３３）は、一時的に、２０μＭ（母液）で既定培地において再構成され、そして凝集のために、暗所で３日間、＋３７℃で、ゆっくりと振動させた。対照培地は、同じ条件で調製した。
【０１２０】
３日後、このヒトアミロイドペプチド凝集は、対照培地において、２．５μＭに希釈して、ＨＢＭＥＣに用いられた（最適培養時間）。１８時間のインキュベーションのために、  Ａβ１−４２ペプチドを、マトリゲル上でのＨＢＭＥＣ播種の２時間後に加えた。
【０１２１】
マトリゲルのＨＢＭＥＣ播種の１時間後、テスト化合物及びＶＥＧＦ−１６５を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解し、そして、Ａβ１−４２適用前に、ＨＢＭＥＣで１時間のプレインキュベートをした（培養ウェルにつき１００μｌの最終量で）。さらなる薬剤希釈を避けるために、テスト化合物またはＶＥＧＦインキュベーションの１時間後（マトリゲルの細胞播種の2時間後）に、テスト化合物またはＶＥＧＦのある対照培地の２．５μＭ希釈の最終濃縮物に、１００μｌのＡβ１−４２ペプチドを加えた（２００μｌ全量／ウェルになる）。
【０１２２】
＜培養プレートの編成＞
ＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進アイソフォームとして知られるＶＥＧＦ−１６５は、参照化合物として、この研究のすべての実験に用いられた。ＶＥＧＦ−１６５は、血管新生に関わる、最も豊富なＶＥＧＦアイソフォームうちの１つである。ＶＥＧＦは参考テスト化合物として、１０ｎＭで用いられた。
【０１２３】
次の条件、
・陰性対照群：単独培地＋０．１％ＤＭＳＯ、
・中毒性：アミロイド‐β１−４２（２．５μＭ）、１８時間、
・陽性対照群：ＶＥＧＦ−１６５（１０ｎＭ）（1参照化合物／培養）、１８時間のインキュベーション時間のためのＡβ１−４２（２．５μＭ）添加の１時間前、
・テスト化合物：テスト化合物、１８時間のインキュベーション時間のためのＡβ１−４２（２．５μＭ）添加の１時間前、
で評価した。
【０１２４】
＜毛細管網の定量化＞
ウェル毎に、ＩｎＣｅｌｌ  ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、光透過にて、４倍のレンズで２枚の写真が撮影された。すべての画像は同じ条件で撮影した。血管新生網分析は、開発ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて行われ、毛細管網の全長が測定された。
【０１２５】
＜データ処理＞
すべての値は、３培養の平均±標準誤差（ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍｅａｎ）として表す（ｎ＝条件に付き６）。統計分析は、分散分析、可能なら続いてＤｕｎｎｅｔｔテストをし、様々な条件で行う（Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）。グラフに挿入した値(％表示)は、アミロイド毒性放出を示す。実際は、アミロイド毒性は１００％であり、テスト化合物の作用は、このアミロイド毒性に対する比率で算出した。
【０１２６】
＜結果＞
図１は結果を示す。この結果は、単独でテストをした薬剤が、Ａβペプチド１−４２を原因とする毒性に対し、実質的な保護作用をもたらすことを示し、低用量の、例えば４００ｎＭのトルセミドは強い保護作用をもたらし、また低用量の、例えば３．２ｎＭのブロモクリプチンは強い保護作用をもたらす。
【０１２７】
また、本結果は、上記の薬剤濃度と比較して、より高いまたはより低い薬剤濃度が、予想外に、このモデルのＡβ１−４２毒性において、作用がほとんどない〜ない、または悪化をまねく可能性があることを示す。
【０１２８】
１‐２．一次皮質ニューロン細胞におけるＡβ１−４２毒性に対する保護
＜テスト化合物及びヒトアミロイド‐β１−４２処理＞
ラットの皮質ニューロンは、Ｓｉｎｇｅｒ、外（参考文献４２）の記述に添って培養を行った。妊娠１５日の妊娠期間の雌のラット（ウィスターラット）を、短時間で、頚椎脱臼により安楽死させ、そしてその胎児を子宮から取り出した。皮質は取り出され、そして、２％のペニシリン１０．０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ、及び１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、氷温のリーボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）（Ｌ１５）の培地に配置した。皮質はトリプシンにより、２０分間、３７oＣで分離した（０．０５％）。反応は、ＤＮａｓｅ１グレードＩＩ及び１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の添加により停止した。その後細胞は、１０ｍｌピペットを用いて３連続継代で、機械的に分離し、そして＋４℃で、１０分間、５１５ｘｇで遠心分離をした。上澄みは廃棄され、細胞のペレットは、Ｂ２７（２％）、Ｌ−グルタミン（０．２ｍＭ）、２％ＰＳ溶液、及び１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで補完したＮｅｕｒｏｂａｓａｌからなる既定培地に再懸濁した。生存細胞は、トリパンブルー排除法を用いて、Ｎｅｕｂａｕｅｒサイトメータで数えた。細胞は、９６ウェルプレート(ウェルは、ポリ‐Ｌ‐リジン（１０μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングした)を用いて、３０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、そして加湿空気（９５％）／ＣＯ２（５％）環境において、＋３７℃で培養した。Ａβ１−４２ペプチドは、一時的に、４０μＭの既定培地で再構成し（母液）、そして、凝集のために暗所で３日間、＋３７℃で、ゆっくりと振動させた。対照培地は同様の条件で調製した。
【０１２９】
３日後、溶液を以下のように一次皮質ニューロンに用いた。
【０１３０】
ニューロン培養の１０日後に、薬剤を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解し、そして、Ａβ１−４２適用前に、ニューロンともに１時間のプレインキュベートをした（培養ウェルにつき１００μｌの最終量で）。さらなる薬剤希釈を避けるために、薬剤インキュベーションの１時間後、薬剤で１０μＭ希釈の最終濃縮物に、１００μｌのＡβ１−４２ペプチドを加えた。皮質ニューロンは２４時間で中毒になった。３つの異なる培養は、条件毎に行われ、１つの条件は６ウェルで行われた。
【０１３１】
ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びエストラジオール‐β（１５０ｎＭ）は、それぞれ陽性対照群及び参照化合物として用いられた。
【０１３２】
＜培養プレートの編成＞
１５０ｎＭのエストラジオール‐βは、陽性対照群として用いられた。
【０１３３】
エストラジオール‐βを培地に溶解し、凝集アミロイド‐β１−４２適用前に１時間のプレインキュベートをした。
【０１３４】
下記の条件で評価した。
【０１３５】
‐対照プレート：１２ウェル／条件
・陰性対照：単独培地＋０．１％ＤＭＳＯ
・中毒性：アミロイド‐β１−４２（１０μＭ）、２４時間
・参照化合物：エストラジオール（１５０ｎＭ）、１時間
‐薬剤プレート：６ウェル／条件
・陰性対照：単独培地＋０．１％ＤＭＳＯ
・中毒性：アミロイド‐β１−４２（１０μＭ）、２４時間
・薬剤：薬剤、１時間、続いてアミロイド‐β１−４２（１０μＭ）、２４時間
＜乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性分析＞
中毒化２４時間後で、上澄みを取り出し、そして細胞毒性検出キット（ＬＤＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ｒｅｆ：１１６４４７９３００１、ｂａｔｃｈ：１１８００３００）で分析した。細胞毒性の定量化のための比色分析は、死細胞のサイトゾルから上澄み中に放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測定に基づく。
【０１３６】
＜データ処理＞
すべての値は、３培養の平均±標準誤差として表す（ｎ＝条件に付き６)。統計分析は、様々な条件で行われた。（分散分析、可能なら続いてＤｕｎｎｅｔｔテスト（Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０））。
【０１３７】
＜結果＞
一次皮質ニューロン細胞の毒性分析で、各選択薬剤から得られた結果は、図２及び図２６に示す。この結果は、単独でテストをした薬剤が、Ａβペプチド１−４２を原因とする毒性に対する実質的な保護作用をもたらし、下記の結果を示す。
【０１３８】
‐低用量の、例えば４０ｎＭのトリメタジジンは強い保護作用をもたらす、
‐３．２ｎＭの低用量のメキシレチンは、強い保護作用をもたらす、
‐４０ｎＭの低用量のブロモクリプチンは、強い保護作用をもたらす、
‐６００ｎＭの低用量のイフェンプロジルは、強い保護作用をもたらす、
‐２０ｎＭの低用量のモキシフロキサシンは、強い保護作用をもたらす。
【０１３９】
‐２００ｎＭの用量のトルセミドは、強い保護作用をもたらす。
【０１４０】
‐８ｎＭの用量のホモタウリンは、強い保護作用をもたらす。
【０１４１】
また、得られた結果は、上記に示したものより、より高いまたはより低い薬剤濃度が、ニューロン細胞のＡβ１−４２毒性において、予想外に、保護作用がほとんどない〜ないまたは悪化をまねく可能性があるということを示す。
【０１４２】
２．ヒトＡβ１−４２毒性を抑止する併用療法
２‐１．  ヒトＨＢＭＥＣ細胞のヒトＡβ１−４２ペプチド毒性における併用療法の作用
本発明の併用薬剤の有効性は、ヒト細胞で評価される。これらの分析で用いられる手順は上記１‐１節に記載されたものと同様である。
【０１４３】
＜結果＞
テストしたすべての併用薬剤は、下記表３に示し、また図３〜図６、並びに図１３及び図１４に例示するように、ＨＢＭＥＣモデルにおいて、ヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対し保護作用を提示する。この結果は、ヒトアミロイドペプチド凝集（Ａβ１−４２  ２．５μＭ）による中毒が、本発明の組合せにより有意に抑止されるが、一方で、単独薬剤の濃縮物は、上記記載の実験の条件では、中毒に対する有意な作用を有しないことを明らかに示す。
【０１４４】
【表３】
2014506909.tif 000004
【０１４５】
図３〜図６、図１３及び図１４に例示するように、次の併用薬剤、
‐バクロフェン及びトルセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトルセミド、
‐トルセミド及びエプレレノン、
‐スルフィソキサゾール及びブロモクリプチン、
‐テルビナフィン及びトルセミド、または
‐シナカルセト及びメキシレチンは、
中毒ＨＢＭＥＣ細胞におけるヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対して、特に興味深い保護作用を示す。
【０１４６】
２‐２．  一次皮質ニューロン細胞のヒトＡβ１−４２ペプチド毒性における併用療法の作用
本発明の併用薬剤の有効性は、一次皮質ニューロン細胞で評価する。この分析で用いられる手順は、上記１‐２節に記載されたものと同様である。
【０１４７】
＜結果＞
テストしたすべての併用薬剤は、下記表４に示し、また図７〜図１２、及び図１６〜図２２に例示するように、一次皮質ニューロン細胞において、ヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対し保護作用を提示する。この結果は、ヒトアミロイドペプチド凝集（Ａβ１−４２  １０μＭ）による毒性が、本発明の組合せにより有意に抑止されるが、一方で、単独薬剤の濃縮物は、上記記載の実験の条件では、中毒に対する有意な作用を有しないことを明らかに示す。
【０１４８】
【表４】
2014506909.tif 000005
【０１４９】
図７〜図１２、及び図１５〜図２２に例示するように、次の併用薬剤、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトルセミド、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びトリメタジジン、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、または
‐トルセミド及びスルフィソキサゾールは、
中毒の一次皮質ニューロン細胞におけるヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対して、特に興味深い保護作用を示す。
【０１５０】
２‐４．Ａβ１−４２毒性に対する神経突起伸長の保護
＜テスト化合物及びＡβ１−４２処理＞
ラットの一次皮質ニューロンを前述のように培養する。
【０１５１】
培養の１０日後、細胞を薬剤とともにインキュベートされる。１時間後、細胞は、ＢＤＮＦではなく薬剤とともに既定の培地で、２．５μＭのベータアミロイド（１−４２、Ｂａｃｈｅｍ社）により中毒になる。皮質ニューロンは２４時間中毒状態に置かれる。ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は陽性（神経保護）対照群として用いられる。３つの異なる培養は、条件毎に行われ、１つの条件は６ウェルで行われる。
【０１５２】
＜神経突起長＞
２４時間の中毒化の後、上澄みを取り出し、そして皮質ニューロンを、エタノール（９５％）及び酢酸（５％）の低温溶液で、５分間処理する。０．１％のサポニンで透過後、細胞は、１％のウシ胎児血清を含むＰＢＳで、２時間遮断した。その後、細胞は、モノクローナル抗体である抗微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２、Ｓｉｇｍａ社）でインキュベートする。この抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗-マウスＩｇＧ（分子プローブ）で明らかになる。ニューロンの核は蛍光マーカ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社）で標識した。
【０１５３】
ウェル毎に、ＩｎＣｅｌｌ  ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ１０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、２０倍で１０枚の写真を撮影した。すべての写真は同じ条件で撮影された。神経突起網分析は、開発ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて行われ、神経突起網の全長を測定した。
【０１５４】
＜結果＞
バクロフェン及びトルセミドの組合せは、図２３に示すように、一次皮質ニューロン細胞において、ヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対する有意な防御作用をもたらす（神経突起網を５３１％改善）。この結果は、ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２  ２．５μＭ）による中毒が、この組合せにより有意に抑止されること、さらには、対照群と比較して、この組合せが神経突起網を増進させることを明らかに示す。
【０１５５】
従って、この組合せは、ヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対して、皮質ニューロン細胞及び細胞ニューロン網を効果的に保護する。さらには、このような神経突起網の増進は、脊髄損傷などの神経障害におけるこれら薬剤の有効性を裏付ける。
【０１５６】
３．生体内においてヒトＡβ２５−３５毒性を抑止する化合物
＜動物＞
オスのスイスマウスはこの研究全体で用いられる。動物は、行動実験時を除き、実験室の飼料と水に自由に行き来できるプラスチックのおりで飼育し、そして１２時間ごとの明暗周期下、管理環境で飼育した（午前８時に点灯)。行動実験は防音及び空調制御した実験室で行われ、マウスは、各実験の少なくとも３０分前にこの実験室に慣らされている。
【０１５７】
＜アミロイドペプチドの調整及び注入＞
Ａβ２５‐３５ペプチド及び凝集Ａβ２５‐３５ペプチドは、殺菌２重蒸留水に溶解し、そして、使用するまで−２０℃で保管した。光学顕微鏡観察では、培養したＡβ２５‐３５ペプチド（凝集Ａβ２５‐３５ペプチドではない）は、不溶性沈殿の２型、複屈折原線維状の構造物、及び不定形球状凝集体をもたらすことを示した。その後、β‐アミロイドペプチドを脳室内投与した（ｉ．ｃ．ｖ．）。手短に述べると、各マウスにエーテルで軽く麻酔をかけ、そして、規格のステンレス鋼針を、頭蓋骨の平面に垂直に、両眼球及び両耳から等距離のところで、各眼球から等距離の正中線の右片側１ｍｍに挿入する。ペプチドまたはビヒクルは、約３秒以内で徐々に送達する。マウスは、注射後、１分以内では通常行動を示す。投与場所は、予備実験で、墨汁を注入して確かめる。針の挿入も、またはビヒクルの注入も、生存、行動反応もしくは認知機能に有意な影響を与えない。
【０１５８】
＜薬剤治療＞
前日、つまりＡβ２５‐３５ペプチド注射の２４時間前に、薬剤、併用薬剤、またはビヒクル溶液を、１日に２回、強制経口投与する（午前８時及び午後６時)。
【０１５９】
当日（午前１０時）に、マウスのｉ．ｃ．ｖ．に、Ａβ２５‐３５ペプチドまたは凝集Ａβ２５‐３５ペプチド（対照群）を、３μ１（３ｍＭ）の最終量で注入する。
【０１６０】
当日から７日目まで、薬剤、併用薬剤、またはビヒクル溶液は、１日に１回もしくは２回、強制経口投与される（午前８時及び午後６時)。１つの動物群は、ドネペジル（参照化合物  １ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を、１回の注入で、強制経口投与される（午前８時）。薬剤は、各強制投与直前に水に溶かし、新しく調整する。
【０１６１】
７日目に、すべての動物について、空間作業記憶の指標として、Ｙ迷路試験で自発的交替行動をテストする。
【０１６２】
７日目及び８日目に、動物の文脈的長期記憶を、ステップダウン型受動的回避法を用いて評価する。
【０１６３】
８日目に、動物を屠殺した。動物の脳を解剖し、さらなる分析のために−８０℃で保存する。
【０１６４】
Ａβ２５‐３５ペプチドのｉｃｖ注射の７日後に行われた行動及び生化学分析では、特に表５に挙げた組合せで、有益な結果を得た。
【０１６５】
【表５】
2014506909.tif 000006
【０１６６】
４．中毒の動物における行動及び認知行動を増進する化合物
上記節の記述のように、動物は中毒である。
【０１６７】
＜自発的交替行動‐Ｙ迷路試験＞
７日目に、すべての動物について、空間作業記憶の指標として、Ｙ迷路試験で自発的交替行動をテストする。Ｙ迷路は灰色のポリ塩化ビニル製である。各アームは、床が長さ４０ｃｍ、高さ１３ｃｍで、幅３ｃｍ、天井は幅１０ｃｍで、等角度で連結する。各マウスは、１つのアームの端に置かれ、８分間のテスト中は、迷路の中を自由に動き回れる。一連のアーム進入で、同じアームに戻る可能性も含み、視覚的に確認する。交替反応は３つのアームすべてに連続して進入する場合と定める。したがって、最大の交替回数は、アームへの総進入回数引く２であり、交替反応率は、（実際の交替数／最大の交替数）ｘ１００で算出される。パラメータは交替反応率（記憶指標）及び、アームへの総進入回数（探査指標）を含む。極端な行動を示す動物は除く（交替反応率＜２５％、もしくは、＞８５％またはアームへの進入回数＜１０）。通常、これは動物のうち０〜５％を占める。このテストは、Ａβ２５‐３５注入によりマウスに引き起こされる影響及び記憶喪失作用の行動レベルの分析に、付随的に役立つ。
【０１６８】
＜受動的回避テスト＞
器具は２つの区画に仕切られた（１５ｃｍ×２０ｃｍ×高さ１５ｃｍ）箱で、１区画は白いポリ塩化ビニルの壁で明るく、もう１区画は黒いポリ塩化ビニルの壁で暗くなっており、格子状の床を持つ。ギロチン戸は各区画を隔てている。器具の４０ｃｍ上に配置した６０Ｗの照明は、実験中に白い区画を照らす。格子状床には、ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｃｒａｍｂｌｅｒ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＵＳＡ）を用いて、無作為のフットショック（０．３ｍＡで３秒間）が行われうる。訓練期間中には、最初にギロチン戸は閉じられている。各マウスを白い区画に配置し、５秒後に戸が上がる。マウスが暗い区画に入り、四肢が格子床に着いたとき、戸は閉まり、そして３秒間のフットショックが行われる。ステップスルー待ち時間、つまりこの待ち時間は、暗い区画に入るのにかかる時間のことであり、また、発声回数は記録される。記憶テストは、訓練の２４時間後に行われる。各マウスは再び白い区画に配置される。５秒後に戸が上がり、ステップスルー待ち時間、及び脱出待ち時間、すなわち白い区画内に戻るのにかかる時間を、３００秒上限で記録する。
【０１６９】
表６に挙げた組合せのテストで、それぞれ有益な結果が見られる。
【０１７０】
【表６】
2014506909.tif 000007
【０１７１】
５．本発明の化合物の、神経疾患の神経生理学的問題の改善
Ａβ中毒の生体内モデルにおいて、併用療法をテストする。神経疾患に影響するいくつかのパラメータ、
‐アポトーシスの指標とみなされる、カスパーゼ３及び９の発現レベル、
‐酸化ストレスレベルのマーカとみなされる、脂質過酸化反応、
‐脳の炎症レベルのマーカとみなされる、ＧＦＡＰ発現分析、
‐血液脳関門の完全性、
‐シナプス全体の完全性（シナプトフィジンＥＬＩＳＡ）
における作用を評価する。
【０１７２】
＜血液脳関門の完全性＞
Ａβによる動物の中毒についての実験設計は、ＩＩＩ部と同様である。
【０１７３】
血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性における併用療法の潜在的保護作用は、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）に、オリゴマーβ‐アミロイド２５−３５ペプチド（Ａβ２５−３５）、または凝集Ａβ２５−３５ペプチド対照群（Ｓｃ．Ａβ）を注入したマウスを用い、注入の７日後に分析した。
【０１７４】
Ａβ２５−３５注入後７日目で、ＥＢ（エバンスブルー）法を用いて、ＢＢＢ完全性を評価するため、動物をテストした。ＥＢ染色は、末梢への注入後、血清アルブミンと結合することで知られており、血清アルブミントレーサとして使用されてきた。
【０１７５】
経心臓灌流に３時間先立ち、ＥＢ染色（生理食塩水で２％、４ｍｌ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入する。その後マウスは、前混合した２００μｌのケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．を麻酔され、開胸される。マウスは、右心房からの流動体が無色になるまで、約１５分間、２５０ｍｌの生理食塩水で経心臓灌流する。頚椎を切り離した後、脳は取り除かれ、大脳皮質（左＋右）、海馬（左＋右）、間脳の３部位に解剖される。そして、各脳の部位は、ＥＢ‐アルブミン溢出の定量測定のために重量を量る。
【０１７６】
サンプルは、リン酸塩緩衝剤生理食塩水溶液で均質化し、タンパク質を沈殿するため、６０％トリクロロ酢酸を添加後ボルテックスミキサーにかける。サンプルは、４℃に冷却され、そして、４℃、１０，０００ｇで、３０分間遠心分離する。上澄みは、分光光度計を用いて、ＥＢの吸収度を６１０ｎｍで測定する。
【０１７７】
ＥＢは、下記、
・既知のＥＢ‐アルブミン濃度から得た標準曲線を用いた、脳組織のμｇ／ｍｇ、
・タンパク質のμｇ／ｍｇ、
の両方で定量化する。
【０１７８】
表７の記述のように、未治療の中毒状態の動物と比較して、本発明の併用療法はBBB完全性の維持に有効である。
【０１７９】
＜シナプス全体の完全性（シナプトフィジンＥＬＩＳＡ）＞
シナプトフィジンは、シナプスの完全性のマーカとして選択されており、市販のＥＬＩＳＡキット（ＵＳＣＮ、Ｒｅｆ．Ｅ９０４２５Ｍｕ）を用いて分析される。サンプルは海馬組織から準備し、製造業者及び参考文献に具体的に記述されている抽出緩衝剤で均質化する。
【０１８０】
組織は、余分な血液を完全に取り除くため、氷温のＰＢＳ（０．０２ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．０〜７．２）ですすぎ、重量を量った後、窒素凍結し、−８０℃で保管する。組織は、小片に切り分けられ、ガラスホモジナイザーを用い、１ｍｌの氷温リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で均質化する。生じた懸濁液は、超音波細胞破砕器で分解されるか、またはさらに細胞膜を破壊するため２回の凍結‐解凍循環にかける。そして、ホモジネートは、５、０００ｇで５分間遠心分離され、上澄みは直ちに分析される。
【０１８１】
すべてのサンプルは３重分析される。
【０１８２】
タンパク質の定量化は、抽出実績を評価し、標準化するため、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｅｆ♯２３２２７）で行われる。
【０１８３】
そして、総タンパク質濃度は、希釈標準曲線から算出され、ＥＬＩＳＡの結果の標準化に使用される。
【０１８４】
結果（表７）は、併用療法が、未治療の中毒状態の動物と比較して、治療後動物の脳において、総シナプトフィジンレベルを維持するのに有効であるということを示す。
【０１８５】
＜酸化ストレス分析＞
マウスは、頚椎切断により屠殺し、その後両海馬をすばやく取り除き、重量を測定、分析まで液体窒素で保存する。解凍後、海馬は冷メタノール（１／１０ｗ／ｖ）で均質化し、１、０００ｇで５分間遠心分離して、上澄みをエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに入れる。各ホモジネートの反応量は、１ｍＭのＦｅＳＯ４、０．２５ＭのＨ２ＳＯ４、１ｍＭのキシレノールオレンジに添加し、室温で３０分間インキュベートする。吸収度を５８０ｎｍ（Ａ５８０  １）で観測後、１ｍＭのクメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）を１０μｌ、サンプルに添加し、最大酸化レベルを測定するため、室温で３０分間インキュベートする。吸収度は５８０ｎｍ（Ａ５８０  ２）で測定される。脂質過酸化反応レベルはＣＨＰ当量（ＣＨＰＥ）として、ＣＨＰＥ＝Ａ５８０  １／Ａ５８０  ２ｘ［ＣＨＰ］、により測定される。そして、脂質過酸化反応レベルは組織の重量毎のＣＨＰ当量及び対照群データの割合として表される。
【０１８６】
結果（表７）は、併用療法が、未治療の中毒状態の動物と比較して、治療後動物の脳において、Ａβにより引き起こされる総酸化ストレスを低減する効果があることを示す。
【０１８７】
＜カスパーゼ経路の誘発分析及びＧＦＡＰ発現分析＞
マウスを頚椎切断により屠殺し、その後両海馬をすばやく取り除き、余分な血液を完全に取り除くため、氷温のＰＢＳ（０．０２ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．０〜７．２）ですすぎ、重量を測定、分析まで液体窒素で保存する。組織は、小片に切り分けられ、ガラスホモジナイザーを用い、１ｍｌの氷温ＰＢＳで均質化する。生じた懸濁液は超音波細胞破砕器で分解されるか、またはさらに細胞膜を破壊するため、２回の凍結‐解凍循環にかける。そして、ホモジネートは、５、０００ｇで５分間遠心分離され、上澄みは直ちに分析される。
【０１８８】
実験は、市販の分析キット、Ｃａｓｐａｓｅ−３（ＵＳＣＮ‐Ｅ９０６２６Ｍｕ）、Ｃａｓｐａｓｅ−９（ＵＳＣＮ‐Ｅ９０６２７Ｍｕ）、ＧＦＡＰ（ＵＳＣＮ‐Ｅ９００６８）で行われる。
【０１８９】
タンパク質の定量化は、抽出実績を評価し、標準化するため、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｅｆ♯２３２２７）で行われる。
【０１９０】
結果（表７）は、併用療法が、未治療の中毒状態の動物と比較して、治療後動物の脳において、アポトーシス及び炎症のマーカで有益な作用を有することを示す。
【０１９１】
【表７】
2014506909.tif 000008
【０１９２】
（Ｂ）ニューロン細胞のグルタミン酸塩毒性の抑止
このさらなる実験一式で、候補化合物の、ニューロン細胞におけるグルタミン酸塩毒性の毒性作用を抑止または低減する能力をテストした。グルタミン酸塩毒性は、神経疾患または障害の病因に関わり、その神経疾患または障害とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ニューロパシー、アルコール依存症もしくはアルコール離脱症、または脊髄損傷などである。薬剤は、最初に個別にテストされ、続いて組合せ作用の分析をする。
【０１９３】
＜方法＞
本発明の併用薬剤の効能は、一次皮質ニューロン細胞で評価される。これらの分析で使用するプロトコルは、上記（Ａ）１‐２項の記述と同様である。
【０１９４】
＜グルタミン酸塩毒性分析＞
化合物の神経保護作用は、特にグルタミン酸塩作動性ニューロンを示す神経突起網（ニューロフィラメント免疫染色（ＮＦ））の定量化により評価される。
【０１９５】
ニューロン培養の１２日後、候補組合せの薬剤を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解する。そして、候補組合せを、グルタミン酸塩損傷の前に、ニューロンとともに１時間プレインキュベートする。さらなる薬剤希釈を避けるため、インキュベーション後１時間で、候補組合せにおいて、４０μＭの最終濃縮物に、グルタミン酸塩を２０分間加える。インキュベーションの最後に、培地を、グルタミン酸塩を除いた候補組合せの培地に変える。培養は、グルタミン酸塩損傷後２４時間行われる。ＭＫ８０１（ジゾシルピン水素マレイン酸塩（Dizocilpinehydrogen maleate）、７７０８６−２２−７、２０μＭ）は陽性対照群として用いられる。
【０１９６】
サポニン（Ｓｉｇｍａ社）で透過後、細胞は、１０％のヤギ血清を含むＰＢＳで２時間遮断し、その後、細胞は、ニューロフィラメント抗体（ＮＦ、Ｓｉｇｍａ社）に対するマウスモノクローナル一次抗体で培養する。この抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗-マウスＩｇＧで示される。
【０１９７】
細胞核は、蛍光マーカ（Hoechst solution、ＳＩＧＭＡ社）により標識化され、神経突起網が定量化される。３つの異なる培養で、条件毎に６ウェルがニューロン生存評価に使用される。
【０１９８】
＜結果＞
テストした併用薬剤はすべて、皮質ニューロン細胞におけるグルタミン酸塩毒性に対する保護作用を示す。結果は、以下表８に示す。
【０１９９】
図２４及び図２５で例示するように、本発明の組合せは、上記記載の実験の条件下で、グルタミン酸塩毒性からニューロンを強力に保護する。単独で使用される薬剤が有意な作用を有しない、または低い保護作用しか有しない薬剤濃度を用いても保護効果があることが分かったことは注目すべきである。
【０２００】
【表８】
2014506909.tif 000009
【０２０１】
（Ｃ）本発明の組合せを用いたグルタミン酸塩興奮毒性に関する他の障害の改善
上記に記述した、本発明の薬剤及び併用薬剤のグルタミン酸塩毒性に対する生体保護作用は、いくつかのＡＤモデルに例示した保護作用と同時に起こり、発明者に、ＭＳ、ＡＬＳ及び神経因性疼痛などのグルタミン酸塩毒性も関連する病因において、疾患のいくつかのモデルでこれら薬剤及び組合せのテストを促した。
【０２０２】
１．多発性硬化症の生体モデルにおける組合せの保護作用
慢性の進行性ＥＡＥを有する、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質免疫化（ＭＯＧ免疫化）したマウスのモデルは、多発性硬化症治療における本発明の組成物の有益な作用を示すために用いられた。
【０２０３】
＜動物と化学物質＞
Ｃ５７Ｌ／６Ｊの雌マウス（生後８週）をＪａｎｖｉｅｒ（フランス）から購入する。２週間の馴化後、雌マウス（生後１０週）は、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）ペプチドで免疫付与後、慢性麻痺を発症する。実験上の脳脊髄炎は、ＥＡＥ誘導のためのＨｏｏｋｅ  ｋｉｔ  ＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ＰＴＸ（百日咳毒素）で誘導する（ＥＫ−０１１０、ＥＫ−０１１５、Ｈｏｏｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。対照群キットはＣＫ−０１１５（Ｈｏｏｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）である。
【０２０４】
＜実験手順＞
実験上の脳脊髄炎は以下の手順により誘導する。
【０２０５】
実験当日、各０．１ｍｌの２回の皮下注射が行われ、１つはマウスの背中の上部、もう１つはマウスの背中の下部に行われる。各注射は１００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）、２００μｇの不活性ヒト結核菌Ｈ３７Ｒａを含み、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Ｈｏｏｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で乳化する。この乳化剤は、ＭＯＧ特定自己免疫型Ｔ細胞の感作及び区別に必要な抗原を提供する。
【０２０６】
ＰＢＳ（Ｈｏｏｋｅ  ｋｉｔ）において、５００ｎｇの百日咳毒素の２回の腹腔内注射は、ＭＯＧ注射後２時間（当日）、及び２４時間（1日目）で行われる。百日咳毒素は、添加アジュバントによりＥＡＥ誘導を促進する。
【０２０７】
マウスは免疫付与後８日でＥＡＥを発症し、そして実験期間中、慢性麻痺状態になる。免疫付与後、ブラインド試験でマウスの臨床症状を毎日観測する。動物は、従来型無菌施設で飼育され、すべての実験は、生命倫理学の現地常設委員会により規定及び認定されたガイドラインに従って行われる。
【０２０８】
＜実験群及び薬剤治療＞
開示した雌のマウス群、
‐対照群：ＥＡＥマウスの条件と同様にビヒクルを注射（実験前日より２８日目まで、プラセボを毎日投与）、
‐ＥＡＥ群：ＭＯＧ注射（当日）＋百日咳毒素を注射（当日及び１日目）、実験前日より２８日目まで、プラセボを毎日経口投与、
‐ＥＡＥ＋陽性対照群：ＭＯＧ注射（当日）＋百日咳毒素を注射（当日及び１日目）、実験前日より２８日目まで、デキサメタゾンを毎日経口投与、
‐ＥＡＥ＋治療群：ＭＯＧ注射（当日）＋百日咳毒素を注射（当日及び１日目）、治療は免疫付与の１日前に始め、２８日目まで継続は、免疫付与の前に体重により均一化する。
【０２０９】
臨床スコアは当日、５日目、８日目、９日目、１２日目、１４日目、１６日目、１９日目、２１日目、２３日目、２６日目、２８日目に測定される。
【０２１０】
Statistica software(Statsoft Inc.)は、統計分析全体に利用する。分散分析及びスチューデントｔ検定は臨床疾患スコア分析に使用する。Ｐ＜０．０５で有意差と考えられる。
【０２１１】
疾患出現の遅延、臨床スコア及び死亡の遅延は、カプランマイヤー曲線及びコックスモデル（Ｒパッケージ「ｓｕｒｖｉｖａｌ」）で、各群間と対象「免疫」群を比較した。結果のｐ値は、一側性であり、対象「免疫」群よりよいという仮説の検証になる。
【０２１２】
総臨床スコアは、下記記載の尾スコア、後肢スコア、前肢スコア及び膀胱スコアから成る。
【０２１３】
尾スコア
2014506909.tif 000010
【０２１４】
後肢スコア
2014506909.tif 000011
【０２１５】
前肢スコア
2014506909.tif 000012
【０２１６】
膀胱スコア
2014506909.tif 000013
【０２１７】
各動物の総スコアは上記記述の区分すべての加算により定める。生存動物の最大スコアは１０である。
【０２１８】
＜結果‐併用療法はＭＳモデルにおいて有効である＞
総臨床スコアの顕著な改善は「ＥＡＥ＋治療群」のマウスにおいて見られ、特に表９に挙げた組合せから分かる。
【０２１９】
【表９】
2014506909.tif 000014
【０２２０】
２．ＡＬＳモデルにおける組合せの保護作用
本発明にかかる併用療法は、生体外では共培養モデルで、そして生体内ではＡＬＳマウスモデルでテストする。プロトコル及び結果はこの項で示す。
【０２２１】
２‐１．  神経‐筋共培養の一次培養におけるグルタミン酸塩毒性に対する防御効果
＜神経及び筋肉細胞の一次共培養＞
ヒトの筋肉は、健康な被験者の生検の部分から先述の方法にしたがって用意する（参考文献４４）。筋肉細胞は、解離細胞（ウェル毎に１００００細胞）から株化し、４８ウェルプレート上に０．１％ゼラチン被膜に配置し、そしてＭＥＭ培地及びＭ１９９培地の混合からなる増殖培地で培養する。
【０２２２】
外套細胞融合後すぐに、生後１３日のウィスターラットの、後根神経節（ＤＲＧ）に付随した胚脊髄の全体横断面を、筋肉単層上に、１ウェルにつき１外植片（中央エリアに）置く。ＤＲＧは、神経支配の好比率を達成するために必要である。神経支配された培養物は混合培地に保持する。２４時間後、通常の共培養で、脊髄外植片から伸びる神経炎が観察される。神経炎は、管状筋細胞に接触して、８日後に最初の収縮を引き起こす。その後直ちに、脊髄外植片に近接する神経支配された筋肉繊維は、実質的には連続的に収縮する。神経支配された繊維は、形態的及び空間的に非神経支配繊維と区別され、容易に識別可能である。
【０２２３】
１つの共培養を行う（条件に付き６ウェル）。
【０２２４】
＜グルタミン酸塩損傷＞
２７日目に、共培養物を、グルタミン酸塩中毒（６０μＭ）の1時間前に、候補化合物またはリルゾールで２０分間インキュベートする。そして、共培養物を洗浄し、候補化合物またはリルゾールをさらに４８時間の間添加する。このインキュベーション時間後、固定されていない共培養物を、Ａｌｅｘａ  ４８８と結合したα-ブンガロトキシンとともに、５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、室温で１５分間、インキュベートする。その後、共培養物は、室温で２０分間、ＰＦＡにより固定する。０．１％のサポニンで透過後、共培養物は、抗ニューロフィラメント抗体（ＮＦ）でインキュベートする。
【０２２５】
これらの抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ヤギ抗-マウスＩｇＧ（分子プローブ）で検知される。ニューロンの核は蛍光マーカ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で標識する。
【０２２６】
評価項目は（１）総神経突起長、（２）運動単位数、（３）総運動単位野であり、これらは運動ニューロンの生存および機能性の指標である。
【０２２７】
各条件で、InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare)を用いて、ウェル毎の２ｘ１０の写真を、２０倍の拡大率で撮影する。すべての画像を同様の条件で撮影する。
【０２２８】
＜結果＞
本発明の薬剤は、共培養モデルで、運動ニューロン及び運動単位を有効に保護する。さらに、薬剤を表１０に挙げた併用薬剤の組合せで使用する場合、保護の向上がみられる。
【０２２９】
【表１０】
2014506909.tif 000015
【０２３０】
２‐２  ＡＬＳマウスモデルにおける併用療法の有効性
実験は、雄マウスで行われる。トランスジェニック雄マウスＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１）２Ｇｕｒ／Ｊ及びそれらの対照（それぞれＳＮ２７２６及びＳＮ２２９７、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｂｅｎ  Ｈａｒｂｏｒ、 ＵＳＡ）、フランスではＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社より流通)は、模倣ＡＬＳの実験一式において選択する。
【０２３１】
罹患マウスは、内因性ヒトＳＯＤ１プロモーターにより駆動する、変異型ヒトＳＯＤ１遺伝子（コドン９３におけるアラニンへグリシンの単一アミノ酸置換）で設計した、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランス遺伝子を発現する。対照マウスは対照ヒトＳＯＤ１遺伝子を発現する。
【０２３２】
＜薬剤投与＞
マウスは、生後６０日目から死亡まで、ビヒクル希釈の候補薬剤治療を受ける。候補薬剤の希釈溶液は，投与開始の直前に、室温にて、水で調製される。
【０２３３】
＜＜飲料水＞＞
リルゾールは、５％シクロデキストリン内で、６ｍｇ／ｍｌの最終濃度（各群の平均体重に調整)で飲料水に添加される。マウスは１日につき約５ｍｌ飲むので、推定投与量は、マウスの生存期間の伸びを示す用量である３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。
‐シクロデキストリンは５％の最終濃度でビヒクルとして用いられ、原液（シクロデキストリン２０％）から、室温で水に希釈する。
【０２３４】
＜＜経口投与（ｐｅｒ  ｏｓ）＞＞
‐併用薬剤は、毎日、経口投与する。
‐シクロデキストリンは、５％の最終濃度でビヒクルとして用いられ、原液（シクロデキストリン２０％）から、室温で水に希釈する。
【０２３５】
＜臨床観察＞
各マウスの臨床観察は、治療初日（生後６０日）から死亡（または屠殺時）まで、毎日行われる。臨床観察は、麻痺の開始、「開脚の低下（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｐｌａｙ）」、「立ち直り反射の消失」、及び一般的な歩行観察、の行動テスト調査を含む。
【０２３６】
麻痺の開始では、観察は、各肢の麻痺観察からなる。麻痺の開始は、麻痺の最初の兆候の日に相当する。
【０２３７】
開脚の低下（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｐｌａｙ）テストは、震えもしくは振動の認識、及びマウスが尾でぶら下がったときの、後肢の位置（下がっているまたは広がっている）からなる。
【０２３８】
立ち直り反射の消失テストは、どちらかの側にひっくり返されてから３０秒以内に正方向に戻ることで、マウスの能力を評価する。マウスが正常に戻れなければ立ち直り反射は消失している。立ち直り反射の消失は、疾患の最終段階を示し、正方向に戻れないマウスは安楽死させる。
【０２３９】
＜結果‐併用療法はＡＬＳ生体内モデルにおいて有効＞
疾患の改善は、本発明の薬剤及び併用薬剤で治療した罹患動物において観察された。特に、表１１に挙げた併用薬剤は、疾患の異なる段階で、これら動物の臨床スコアを効果的に改善する。
【０２４０】
【表１１】
2014506909.tif 000016
【０２４１】
３．神経因性疼痛の生体内モデルにおけるオキサリプラチン誘導のニューロパシーに対する本発明の組合せの保護作用
本発明の併用療法は、末梢ニューロパシーの適切なモデル、すなわち、オキサリプラチン誘導ニューロパシーの急性モデル、及びオキサリプラチン誘導ニューロパシーの慢性モデルで、生体内テストする。動物、プロトコル及び結果についてこの項で説明する。
【０２４２】
＜動物の管理＞
オキサリプラチン処置実験開始時に（当日）、体重が１５０ｇ〜１７５ｇのスプラーグドーリーラット（ＣＥＲＪ、フランス）を使用する。動物は、実験中、標準的なペレット状の実験用飼料と水に自由にアクセスでき、１２時間ごとの明暗周期で、温度（１９．５℃〜２４．５℃）及び相対湿度（４５％〜６５％）制御した部屋のある、アクセス制限付き動物施設で飼育する。動物はケージ毎に４または５匹飼育され、あらゆるテストの前に、１週間の順応期間を設ける。
【０２４３】
＜実験設計＞
以下のラットの４群はすべての実験に用いられる。
【０２４４】
＜＜対照群＞＞
１群：オキサリプラチンのビヒクル（蒸留水）、腹腔内／候補組合せのビヒクル（蒸留水）経口、毎日。
【０２４５】
２群：オキサリプラチン（蒸留水）、腹腔内／候補組合せのビヒクル（蒸留水）経口、毎日。
【０２４６】
３群：オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／単独薬剤（蒸留水）、経口、毎日ｘ９。
【０２４７】
＜＜テスト組成物群＞＞
４群：オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／候補組合せ（蒸留水）、経口、毎日ｘ９。
【０２４８】
５群：オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）（蒸留水）、経口、テスト日（つまり、１日目及び８日目）。
【０２４９】
ビヒクル及びテスト剤は、前日から７日目（テスト最終日の前日）まで毎日投与するが、一方、ガバペンチンはテスト日（テストの１２０分前）に投与する。
【０２５０】
可能であれば、すべての治療は符号化した順番及び無作為の順番に行われる。用量は活性物質において表される。
【０２５１】
＜ニューロパシー誘導＞
急性ニューロパシーは、オキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射により誘導する。
【０２５２】
慢性末梢ニューロパシーは、当日、２日目、４日目及び７日目に、オキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の反復腹腔内注射により誘導される（ＣＤ＝１２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。ヒトの慢性末梢ニューロパシーは同様に累積的であり、オキサリプラチンの総用量の５４０ｍｇ／ｍ２または５４０ｍｇ／ｍ２以上を投与した患者に最も一般的にみられ、この用量はラットの累積用量としては、〜１５ｍｇ／ｋｇに相当する（Ｃｅｒｓｏｓｉｍｏ  Ｒ．Ｊ．  ２００５）。
【０２５３】
オキサリプラチン誘導による、ラットの疼痛性ニューロパシーは、オキサリプラチン処理をした対象の疼痛症状を再現する。
【０２５４】
最初期症状は熱痛覚過敏である。これはアセトンテストまたは尾の浸水テストで測定できる。
【０２５５】
機械的痛覚過敏は後に現れる。これは、フォンフライテストまたは足の圧力テストで数値化できる。
【０２５６】
＜動物への投薬及びテスト＞
すべての併用薬剤は、オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇの最初の腹腔内注射の前日から投与し、そして７日目まで毎日経口投与を続ける。テスト日には（つまり、１日目及び７日目）、併用薬剤をテスト後に投与する。参考治療群の動物（ガバペンチン）はテスト日のみ投与する。
【０２５７】
＜アセトンテスト＞
冷感異痛は、１日目（オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇの最初の注射から約２４時間後（オキサリプラチンの急性作用））、及び８日目（オキサリプラチンの慢性作用）に、熱非侵害受容刺激への反応を測定するアセトンテスト用いて評価する。
【０２５８】
アセトンテストでは、両後肢の足底表面に１滴のアセトンを適用後、後肢を引っ込める待ち時間を測定し（反応時間）、反応の強さを記録する（冷却スコア）。アセトンの冷却作用への反応時間は、アセトン適用後２０秒以内（カットオフ）に測定する。また、アセトンへの反応は、、０（反応なし）、１（迅速に引っ込める、肢の動き）、２（引っ込める時間の延長、または著しい肢の動き）、３（舐めたり噛んだりを伴う肢の動きの反復）の４段階で評価する。
【０２５９】
各実験群において、結果は以下のようになる。
【０２６０】
‐反応時間は、肢反応を引き起こすのに必要とされる秒単位で表される時間として定義する（各ラット合わせて６回の測定の平均±標準誤差）。
【０２６１】
‐累積冷却スコアは、各ラット合わせて６スコアの合計±標準誤差で定義する。最低スコアは０（６回の試験のいずれも反応なし）、そして最大可能スコアは１８である（６回の各試験で、肢の動き及び肢を舐めたり、もしくは噛んだりの反復）。
【０２６２】
＜統計分析＞
スチューデント検定、一側性、タイプ３を行う。有意差はＰ＜０．０５に設定する。すべての群は疾患＋ビヒクル群と比較する（オキサリプラチン処置群）。平均値及び標準誤差は図に示す。
【０２６３】
＜結果＞
オキサリプラチンは、アセトン適用後（疾患群＋ビヒクル）、時間経過で、肢の引っ込みの反応時間において顕著な低下を導いた。この低下は、ビヒクル群と比較して、１日目（オキサリプラチン誘導ニューロパシーの急性モデル）から８日目（慢性モデル）まで進行性があり、顕著である。
【０２６４】
＜＜オキサリプラチン誘導ニューロパシーの急性モデルにおける抗異痛作用＞＞
オキサリプラチン誘導ニューロパシーの急性モデルでテストした併用薬剤は、アセトンテストで評価した。表１２は、オキサリプラチンビヒクル処置群（２群）と比較して、累積冷却スコアで顕著な低下を、そして反応時間の顕著な増加を導く併用薬剤（４群）を示す。
【０２６５】
【表１２】
2014506909.tif 000017
【０２６６】
＋は、４群のラットにおいて、オキサリプラチン誘導の急性モデルで、アセトンテストの累積冷却スコア分析及び反応時間分析を受けて得た抗異痛作用を示す。
【０２６７】
＜＜オキサリプラチン誘導ニューロパシーの慢性モデルにおける抗異痛作用＞＞
オキサリプラチン誘導ニューロパシーの慢性モデルに用いられる併用薬剤は、アセトンテストで評価する。
【０２６８】
表１３は、４群（併用薬剤及びオキサリプラチンで処置をした動物）において、アセトンテストにより反応時間及び冷却スコアを測定した併用薬剤が、オキサリプラチンビヒクル処置群（２群）と比較して、ニューロパシーの慢性モデルにおいて、処置後に、それぞれ顕著に増加及び低下することを示す。結果として、これらの併用薬剤は、オキサリプラチン誘導の慢性ニューロパシーから動物を保護する。
【０２６９】
【表１３】
2014506909.tif 000018
【０２７０】
＋は、４群のラットにおいて、オキサリプラチン誘導の慢性モデルで、アセトンテストの累積冷却スコア分析及び反応時間分析を受けて得た抗異痛作用を示す。
【０２７１】
REFERENCES
1. Crook R.et al.(1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusualplaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5.
2. Houlden H.,Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic paraparesisand cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionallyhigh amyloid-beta concentrations. Ann Neurol. 48(5): 806-8.
3. Kwok J.B.,Taddei K., et al. (1997). Two novel presenilin-1 mutations in early-onsetAlzheimer's disease pedigrees and preliminary evidence for association ofpresenilin-1 mutations with a novel phenotype. Neuroreport. 8(6): 1537-42.
4. Verkkoniemi A.,Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis:neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92.
5. Citron M.(2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat RevNeurosci. 5(9): 677-85.
6. Suh Y.H. andChecler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-synuclein:molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease.Pharmacol Rev. 54(3): 469-525.
7. Glenner G.G.,Wong C.W., et al. (1984). The amyloid deposits in Alzheimer's disease: theirnature and pathogenesis. Appl Pathol. 2(6): 357-69.
8. Ballatore C.,Lee V.M., et al. (2007). Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's diseaseand related disorders. Nat Rev Neurosci. 8(9): 663-72.
9. Bell K.F. andClaudio Cuello A. (2006). Altered synaptic function in Alzheimer's disease. EurJ Pharmacol. 545(1): 11-21.
10. Hardy J.A. andHiggins G.A. (1992). Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.Science. 256(5054): 184-5.
11. Braak H. andBraak E. (1991). Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. ActaNeuropathol. 82(4): 239-59.
12. Golde T.E.(2005). The Abeta hypothesis: leading us to rationally-designed therapeuticstrategies for the treatment or prevention of Alzheimer disease. Brain Pathol.15(1): 84-7.
13. Hardy J. andSelkoe D.J. (2002). The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress andproblems on the road to therapeutics. Science. 297(5580): 353-6.
14. Selkoe D.J.(2000). The genetics and molecular pathology of Alzheimer's disease: roles ofamyloid and the presenilins. Neurol Clin. 18(4): 903-22.
15. Zlokovic B.V., The Blood Brain Barrier In Health And Chronic Neurodegenerative Disorders.Neuron review. 2008, 57, 178-201. 
16. BuddHaeberlein, S.L. and S.A. Lipton, Excitotoxicity in neurodegenerative disease,in Encyclopedia of neuroscience, L.R. Squire, Editor. 2009, Elsevier. p. 77-86.
17. Hughes, J.R.,Alcohol withdrawal seizures. Epilepsy Behav, 2009. 15(2): p. 92-7.
18. Kim, A.H.,G.A. Kerchner, and C. DW, Blocking Excitotoxicity, in CNS Neuroprotection, F.W.Marcoux and D.W. Choi, Editors. 2002, Springer: New York. p. 3-36. 
19. Hama A, SagenJ., Antinociceptive effect of riluzole in rats with neuropathic spinal cordinjury pain. J Neurotrauma. 2011 Jan;28(1):127-34. 
20. Lees, K.R., etal., Glycine antagonist (gavestinel) in neuroprotection (GAIN International) inpatients with acute stroke: a randomised controlled trial. GAIN InternationalInvestigators. Lancet, 2000. 355(9219): p. 1949-54. 
21. Malgouris, C.,et al., Riluzole, a novel antiglutamate, prevents memory loss and hippocampalneuronal damage in ischemic gerbils. J Neurosci, 1989. 9(11): p. 3720-7. 
22. Wahl, F., etal., Effect of riluzole on focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol,1993. 230(2): p. 209-14. 
23. Wahl, F., etal., Riluzole reduces brain lesions and improves neurological function in ratsafter a traumatic brain injury. Brain Res, 1997. 756(1-2): p. 247-55.
24. Ettmayer, P.,Amidon, G. L., Clement, B. & Testa, B. Lessons learned from marketed andinvestigational prodrugs. J. Med. Chem. 47, 2393-2404 (2004). 
25. Beaumont, K.,Webster, R., Gardner, I. & Dack, K. Design of ester prodrugs to enhanceoral absorption of poorly permeable compounds: challenges to the discoveryscientist. Curr. Drug Metab. 4, 461-485 (2003).  
26. Heimbach, T.et al. Enzyme-mediated precipitation of parent drugs from their phosphateprodrugs. Int. J. Pharm. 261, 81-92 (2003).
27. Yang, C. Y.,Dantzig, A. H. & Pidgeon, C. Intestinal peptide transport systems and oraldrug availability. Pharm. Res. 16, 1331-1343 (1999). 
28. Steffansen, B.et al. Intestinal solute carriers: an overview of trends and strategies forimproving oral drug absorption. Eur. J. Pharm. Sci. 21, 3-16 (2004).
29. Stella, V. etal. Prodrugs: Challenges and Rewards (AAPS, New York, 2007).
30. Wermuth, CG.The Practice of Medicinal Chemistry. (Hardbound, 2003). Part VI, Chap 33:Designing prodrugs and bioprecursors.
31. Pezron, I. etal. Prodrug strategies in nasal drug delivery. Expert Opin. Ther. Pat., Vol.12, No. 3 , 331-340 (2002).
32. Stella, V. J.Prodrugs as therapeutics. Expert Opin. Ther. Pat. 14, 277-280 (2004).
33. Stella, V. J.& Nti-Addae, K. W. Prodrug strategies to overcome poor water solubility.Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 677-694 (2007).
34. Higuchi, T.;Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS Symposium Series.American Chemical Society: Washington, DC (1975). 31.
35. Roche, E. B.Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs. AmericanPharmaceutical Association: Washington, DC (1977). 
36.         Lal,R., et al., Arbaclofen placarbil, a novel R-baclofen prodrug: improvedabsorption, distribution, metabolism, and elimination properties compared withR-baclofen. J Pharmacol Exp Ther, 2009. 330(3): p. 911-21.
37. Andrew R.Leach,Valerie J. Gillet. An Introduction to Chemoinformatics. Springer 2007.
38. S. AsadRahman, M. Bashton, G. L. Holliday, R. Schrader and J. M. Thornton: SmallMolecule Subgraph Detector (SMSD) Toolkit, Journal of Cheminformatics 2009,1:12 doi:10.1186/1758-2946-1-12
39. Wishart DS,Knox C, Guo AC, Cheng D, Shrivastava S, Tzur D, Gautam B, Hassanali M.DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets. NucleicAcids Res. 36, Issuesuppl 1. D901-D906 (2008). 
40. Stahl H.,Wermuth C. G. (Eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection,and Use. Wiley-VCH; 2 edition (March 29, 2011).
41. Hanafi R,Mosad S, Abouzid K, Niess R, Spahn-Langguth H. Baclofen ester and carbamateprodrug candidates: a simultaneous chromatographic assay, resolution optimizedwith DryLab. J Pharm Biomed Anal, 2011. 56(3): p.569-76. 
42. Singer C.,Figueroa-Masot X., Batchelor R., and Dorsa D. Mitogen-activated protein kinasepathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primarycortical neurons. J. Neuroscience, 1999. 19(7):2455-2463.
43. Feng Xu, GePeng, Thu Phan, Usha Dilip, Jian Lu Chen, Tania Chernov-Rogan, Xuexiang Zhang,Kent Grindstaff, Thamil Annamalai, Kerry Koller, Mark A. Gallop, David J.Wustrow, Discovery of a novel potent GABAB receptor agonist; Bioorg Med ChemLett. 2011 Nov 1;21(21):6582-5.)
44. Braun S,Croizatb B, Lagrangec MC, Wartera JM,  Poindron P. Neurotrophins increasemotoneurons' ability to innervate skeletal muscle fibers in rat spinalcord-human muscle cocultures.Volume 136, Issues 1-2, March 1996, Pages 17-23.
【図１】
2014506909.tif 000019
【図２】
2014506909.tif 000020
【図３】
2014506909.tif 000021
【図４】
2014506909.tif 000022
【図５】
2014506909.tif 000023
【図６】
2014506909.tif 000024
【図７】
2014506909.tif 000025
【図８】
2014506909.tif 000026
【図９】
2014506909.tif 000027
【図１０】
2014506909.tif 000028
【図１１】
2014506909.tif 000029
【図１２】
2014506909.tif 000030
【図１３】
2014506909.tif 000031
【図１４】
2014506909.tif 000032
【図１５】
2014506909.tif 000033
【図１６】
2014506909.tif 000034
【図１７】
2014506909.tif 000035
【図１８】
2014506909.tif 000036
【図１９】
2014506909.tif 000037
【図２０】
2014506909.tif 000038
【図２１】
2014506909.tif 000039
【図２２】
2014506909.tif 000040
【図２３】
2014506909.tif 000041
【図２４】
2014506909.tif 000042
【図２５】
2014506909.tif 000043
【図２６】
2014506909.tif 000044
【図２７】
2014506909.tif 000045
【国際調査報告】
2014506909.tif 000046
2014506909.tif 000047
2014506909.tif 000048
2014506909.tif 000049
2014506909.tif 000050
2014506909.tif 000051
2014506909.tif 000052
2014506909.tif 000053
2014506909.tif 000054
2014506909.tif 000055
2014506909.tif 000056
2014506909.tif 000057