(57)【要約】本発明は、１つまたは複数の中性グリカンの相対量が、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体と比較して増大または減少している点で新規な中性Ｎ結合グリカンプロファイルを伴う抗ＦＲＡ抗体を提供する。本発明は、ＦＲＡへの結合の変化、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の変化、ならびに／またはＦＲＡ発現細胞における内在化速度および／もしくは内在化効率の変化を伴う抗ＦＲＡ抗体をさらに提供する。関連する態様では、本発明は、本発明の抗ＦＲＡ抗体を含む細胞培養物、このような培養物から単離された細胞、本発明の抗ＦＲＡ抗体を含むキットおよび組成物、本発明の抗ＦＲＡ抗体を生成する方法、ならびに本発明の抗ＦＲＡ抗体の診断的使用および治療的使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体の抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と比較して、変化したＡＤＣＣを有する、
モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ＡＤＣＣが増大させられている、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記ＡＤＣＣが減少させられている、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
基準の培養条件下で調製したモノクローナル抗体の内在化速度と比較して、増大した内在化速度を有する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体の内在化速度と比較して、変化した内在化速度を有する、
モノクローナル抗体。
【請求項６】
前記内在化速度が増大させられている、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記内在化速度が減少させられている、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルと比較して、変化した中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを有する、
モノクローナル抗体。
【請求項９】
前記変化した中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、
ａ）増大もしくは減少したＭ３Ｎ２、
ｂ）増大もしくは減少したＭ３Ｎ２Ｆ、
ｃ）増大したＮＡ２、
ｄ）増大もしくは減少したＮＡ２Ｆ、
ｅ）増大もしくは減少したＭＡＮ５、
ｆ）増大したＮＧＡ２、
ｇ）増大もしくは減少したＮＧＡ２Ｆ、または
ｈ）増大もしくは減少したＮＡ２Ｇ１Ｆ
のうちの１つまたは複数を含む、請求項８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体と比較して、増大したＡＤＣＣを有し、かつ増大したＮＧＡ２および増大した全非フコシル化糖型を含む中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを有する、
モノクローナル抗体。
【請求項１１】
増大した内在化速度をさらに有する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体の内在化効率と比較して、減少した内在化効率を有する、
モノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記内在化効率が２８ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記内在化効率が９９０ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記内在化効率が１６３２ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体の結合アフィニティーと比較して、変化した結合アフィニティーを有する、
モノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記結合アフィニティーが増大させられている、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記結合アフィニティーが減少させられている、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
前記結合アフィニティーが１０％以上増大させられている、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
前記結合アフィニティーが１０％以上減少させられている、請求項１８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項２２】
さらなる活性薬剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
真核宿主細胞を含む細胞培養物であって、
該宿主細胞は、配列番号１または配列番号５のアミノ酸をコードし、かつ配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、
細胞培養条件は、ガラクトース、低下した溶存酸素分圧、低下した温度、酪酸ナトリウム、塩化銅、高い容量オスモル濃度、および高ＣＯ２からなる群より選択されるパラメータを含む、
細胞培養物。
【請求項２４】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体をさらに含む、請求項２３に記載の細胞培養物。
【請求項２５】
前記真核宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の細胞培養物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の細胞培養物から単離された宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２４に記載の細胞培養物から単離された、葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２８】
ＦＲＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体のＡＤＣＣと比較して、変化したＡＤＣＣを有し、
該方法は、ガラクトース、低下した溶存酸素分圧、低下した温度、酪酸ナトリウム、塩化銅、高い容量オスモル濃度、および高ＣＯ２からなる群より選択されるパラメータを含む細胞培養条件で、該重鎖アミノ酸配列および該軽鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞を培養するステップを含む、
方法。
【請求項２９】
前記ＡＤＣＣが増大させられ、前記培養条件が低下した溶存酸素分圧および低下した温度から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、増大した内在化速度をさらに有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＦＲＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、
該モノクローナル抗体は、基準の培養条件下で調製した場合のモノクローナル抗体の内在化速度と比較して、変化した内在化速度を有し、
該方法は、ガラクトース、低下した溶存酸素分圧、低下した温度、酪酸ナトリウム、塩化銅、高い容量オスモル濃度、高ＣＯ２、１３日間未満での採取または１５日間を超えた後での採取からなる群より選択されるパラメータを含む細胞培養条件で、該重鎖アミノ酸配列および該軽鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞を培養するステップを含む、
方法。
【請求項３２】
前記内在化速度が増大させられ、前記培養条件が低下した溶存酸素分圧または１３日間未満での採取もしくは１５日間を超えた後での採取から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体は、Ｃ末端のリシンを伴うかまたは伴わない配列番号１または配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列から選択される軽鎖アミノ酸配列を含み、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法により作製される、
モノクローナル抗体。
【請求項３４】
ＦＲＡの増大した発現と関連する異形成細胞の成長の低減を必要とする被験体において、ＦＲＡの増大した発現と関連する異形成細胞の成長を低減する方法であって、該被験体に請求項１から２０、２７、または３３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を投与するステップを含む、方法。
【請求項３５】
前記異形成細胞が、卵巣がん細胞、乳がん細胞、腎臓がん細胞、結腸直腸がん細胞、肺がん細胞、子宮内膜がん細胞、脳のがん細胞、卵管がん細胞、子宮がん細胞、または白血病細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
がんの処置を必要とする被験体において、がんを処置するための方法であって、該被験体に請求項１から２０、２７、または３３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
前記がんが、卵巣がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、または脳のがんから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＦＲＡを発現する細胞を検出するための方法であって、該細胞を、請求項１から２０、２７、または３３のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、結合を検出するステップとを含む、方法。前記細胞が異形成細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
生物学的試料中のＦＲＡを検出するための方法であって、該生物学的試料を、請求項１から２０、２７、または３３のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、結合を検出するステップとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
膜結合型葉酸受容体は、ビタミンである葉酸に結合し、これを細胞へと輸送する。膜結合型葉酸受容体には３つの主要なアイソフォーム：αアイソフォーム、βアイソフォーム、およびγアイソフォームが存在する。「葉酸受容体アルファ」、「ＦＲＡ」、または「ＦＲ−α」とは、膜結合型葉酸受容体のαアイソフォームを指す。ＦＲＡは、単鎖ＧＰＩアンカー膜タンパク質である（非特許文献１）。αアイソフォームとβアイソフォームとは、約７０％のアミノ酸配列の相同性を有し、一部の葉酸では、それらの立体特異性が劇的に異なる。いずれのアイソフォームも、胎児組織および成人組織の両方において発現するが、正常組織は一般に、低量〜中程度量のＦＲ−β（またはＦＲＢ）を発現する。しかし、ＦＲＡは、正常な上皮細胞のサブセットで発現し、多様ながんにおいて顕著に増大することが多い（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；およびＶｅｇｇｌａｎら（１９８９年）、Ｔｕｍｏｒｉ、７５巻：５１０〜５１３頁）。ＦＲＡは、卵巣がんのうちの９０％超において過剰発現する（ＳｕｄｉｍａｃｋおよびＬｅｅ（２０００年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、４１巻（２号）：１４７〜６２頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Ｋｅｌｅｍｅｎ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、（２００６年）１１９巻：２４３〜２５０頁」
【非特許文献２】Ｒｏｓｓら、Ｃａｎｃｅｒ、（１９９４年）７３巻（９号）：２４３２〜２４４３頁
【非特許文献３】Ｒｅｔｔｉｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、（１９８８年）８５巻：３１１０〜３１１４頁
【非特許文献４】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、（１９９１年）５１巻：５３２９〜５３３８頁
【非特許文献５】Ｃｏｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、（１９９１年）５１巻：６１２５〜６１３２頁
【非特許文献６】Ｗｅｉｔｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、（１９９２年）５２巻：３３９６〜３４０１頁
【非特許文献７】Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．、（１９９３年）１４２巻：５５７〜５６７頁
【非特許文献８】Ｈｏｌｍら、ＡＰＭＩＳ、（１９９４年）１０２巻：４１３〜４１９頁
【非特許文献９】Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、（１９９４年）８巻（増刊号）：８９〜９５頁
【非特許文献１０】Ｍｉｏｔｔｉら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、（１９８７年）３９巻：２９７〜３０３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、特に、ＦＲＡ媒介性がんなどのＦＲＡ媒介性疾患を処置する使用のために、抗ヒトＦＲＡ抗体が必要とされている。特に、異なる特性を伴う抗ＦＲＡ抗体、ならびにこのような抗体を作製する方法、ならびに抗体の機能的特徴を多様な治療的使用および診断的使用に適合させる方法が必要とされている。例えば、所望の使用のために、抗ＦＲＡ抗体の結合アフィニティー、抗体依存性細胞傷害作用、内在化効率、および／または内在化速度を変化させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本発明は、中性Ｎ結合グリカンプロファイルが異なり、かつ／または特性が異なる抗ヒトＦＲＡモノクローナル抗体、特に、ＭＯＲＡｂ−００３モノクローナル抗体、ならびに糖供給源としてのブドウ糖をガラクトースで置換すること、温度を低下させること、溶存酸素（ＤＯ）レベルを低減すること、ＣＯ２レベルを増大させること、ＣｕＣｌもしくは酪酸ナトリウムを培養培地に添加すること、または容量オスモル濃度を増大させること、あるいは異なる長さの時間にわたる培養後に抗ＦＲＡ抗体を採取することにより、このような抗体を作製して用いる方法に関する。本発明はまた、結合アフィニティー、抗体依存性細胞傷害作用、内在化効率、および／または内在化速度を変化させた抗ヒトＦＲＡ抗体、特に、ＭＯＲＡｂ−００３抗体、ならびに糖供給源としてのブドウ糖をガラクトースで置換すること、温度を低下させること、溶存酸素（ＤＯ）レベルを低減すること、ＣＯ２レベルを増大させること、ＣｕＣｌもしくは酪酸ナトリウムを培養培地に添加すること、または容量オスモル濃度を増大させること、あるいは異なる長さの時間にわたる培養後に抗ＦＲＡ抗体を採取することにより、このような抗体を生成する方法にも関する。別の態様では、本発明は、本明細書で記載される方法のうちのいずれかを介して生成する抗ヒトＦＲＡ抗体、および前記抗体を含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、抗ヒトＦＲＡ抗体、特に、ＭＯＲＡｂ−００３抗体の重鎖および軽鎖を発現するように操作した細胞培養物であって、細胞培養条件が、ガラクトースの補充、ＤＯの低減、温度の低下、酪酸ナトリウムまたは塩化銅の補充、高い容量オスモル濃度、および高ＣＯ２から選択されるパラメータを含む細胞培養物に関する。本発明はまた、このような細胞培養物から単離された宿主細胞にも関する。
【０００５】
本発明の具体的な非限定的実施形態を、以下の番号付けされた段落に示す。
【０００６】
１．宿主細胞において、所望の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを伴う抗ヒト葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）抗体を生成する方法であって、前記宿主細胞が、前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を、第１の期間にわたり、ブドウ糖を糖供給源として用いて培養するステップと、（２）宿主細胞を、第２の期間にわたり、ガラクトースを糖供給源として用いて培養するステップとを含む方法。
【０００７】
２．宿主細胞を、培養の開始から０日目〜１４日目に、ガラクトースを糖供給源として用いて培養する、実施形態１に記載の方法。
【０００８】
３．第２の期間が、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に始まる、実施形態１に記載の方法。
【０００９】
４．第２の期間が、培養の開始から５日目〜７日目から選択される日に始まる、実施形態１に記載の方法。
【００１０】
５．結合アフィニティーを低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、第１の期間にわたり、ブドウ糖を糖供給源として用いて培養するステップと、次いで、前記宿主細胞を、第２の期間にわたり、ガラクトースを糖供給源として用いて培養するステップとを含み、抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞をガラクトースを伴わずに培養することにより生成させる抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーと比較して低減する方法。
【００１１】
６．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを少なくとも１０％低減する、実施形態５に記載の方法。
【００１２】
７．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを少なくとも１５％低減する、実施形態５に記載の方法。
【００１３】
８．ＡＤＣＣが低減された抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、第１の期間にわたり、ブドウ糖を糖供給源として用いて培養するステップと、次いで、前記宿主細胞を、第２の期間にわたり、ガラクトースを糖供給源として用いて培養するステップとを含み、抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞をガラクトースを伴わずに培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して低減する方法。
【００１４】
９．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを少なくとも５％低減する、実施形態８に記載の方法。
【００１５】
１０．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを少なくとも６５％低減する、実施形態８に記載の方法。
【００１６】
１１．前記宿主細胞を哺乳動物宿主細胞とする、実施形態１、５、または８のいずれか１つに記載の方法。
【００１７】
１２．前記哺乳動物宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態１１に記載の方法。
【００１８】
１３．前記ブドウ糖濃度を１ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌの間とする、実施形態１、５、または８のいずれか１つに記載の方法。
【００１９】
１４．前記ガラクトース濃度を０．０１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌとする、実施形態１、５、または８のいずれか１つに記載の方法。
【００２０】
１５．前記ガラクトース濃度を１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌとする、実施形態１４に記載の方法。
【００２１】
１６．前記ガラクトース濃度を２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌとする、実施形態１４に記載の方法。
【００２２】
１７．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップのうちの少なくとも一部をガラクトースを糖供給源として用いて行う方法。
【００２３】
１８．ガラクトースを糖供給源として用いて行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態１７に記載の方法。
【００２４】
１９．ガラクトースを糖供給源として用いて行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態１７に記載の方法。
【００２５】
２０．ガラクトースを糖供給源として用いて行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から３日目〜７日目から選択される日に開始する、実施形態１７に記載の方法。
【００２６】
２１．ガラクトース濃度を０．０１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌとする、実施形態１７に記載の方法。
【００２７】
２２．ガラクトース濃度を１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌとする、実施形態１７に記載の方法。
【００２８】
２３．ガラクトース濃度を２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌとする、実施形態１７に記載の方法。
【００２９】
２４．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、０〜６．３％のＧ０、２１〜６８％のＧ０Ｆ、２４〜６３％のＧ１Ｆ、０〜０．８％のＧ２、３〜１１％のＧ２Ｆ、０〜０．３９％のＭ３Ｎ２、０〜０．３５％のＭ３Ｎ２Ｆ、および０〜５％のＭＡＮ５を含む、実施形態１に記載の方法。
【００３０】
２５．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：１：１．７：６０：２０：１６：３６５：３７０とする比を含む、実施形態１に記載の方法。
【００３１】
２６．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態１、５、８、または１７のいずれか１つに記載の方法。
【００３２】
２７．中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、ＣＨＯ細胞において、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体を用いて得られるプロファイルとする、実施形態１に記載の方法。
【００３３】
２８．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞をガラクトースを伴わずに培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して８１．３〜８８．３％とする、実施形態５に記載の方法。
【００３４】
２９．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞をガラクトースを伴わずに培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して３９．０〜９７．４％の範囲でＡＤＣＣを誘導する、実施形態８に記載の方法。
【００３５】
３０．宿主細胞において、所望の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを伴う抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、前記宿主細胞が前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を第１の温度で培養するステップと、次いで、（２）宿主細胞を第１の温度より低い第２の温度で培養するステップとを含む方法。
【００３６】
３１．宿主細胞を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に始めて低温で培養する、実施形態３０に記載の方法。
【００３７】
３２．宿主細胞を、培養の開始から３日目〜５日目から選択される日に始めて低温で培養する、実施形態３０に記載の方法。
【００３８】
３３．内在化速度を増大させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１の温度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１の温度より低い第２の温度で培養するステップとを含み、抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、前記宿主細胞を第１の温度で培養することにより生成する抗体の内在化速度と比較して増大させる方法。
【００３９】
３４．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を少なくとも１５％増大させる、実施形態３３に記載の方法。
【００４０】
３５．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を少なくとも２５％増大させる、実施形態３３に記載の方法。
【００４１】
３６．内在化効率を増大させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１の温度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１の温度より低い第２の温度で培養するステップとを含み、抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を第１の温度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して低減する方法。
【００４２】
３７．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を少なくとも１５％低減する、実施形態３６に記載の方法。
【００４３】
３８．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を少なくとも２５％低減する、実施形態３６に記載の方法。
【００４４】
３９．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態３０、３３、３６、または２３０のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
４０．前記哺乳動物宿主細胞を、ＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態３９に記載の方法。
【００４６】
４１．宿主細胞を増殖させる前記第１の温度を約３６〜３８℃とする、実施形態３０、３３、３６、または２３０のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
４２．前記第２の温度を２８〜３５℃とする、実施形態３０、３３、３６、または２３０のいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
４３．前記第２の温度を３０〜３３℃とする、実施形態４２に記載の方法。
【００４９】
４４．前記第２の温度を３０〜３１℃とする、実施形態４２に記載の方法。
【００５０】
４５．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップのうちの少なくとも一部を低温で行う方法。
【００５１】
４６．低温で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態４５に記載の方法。
【００５２】
４７．低温で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態４５に記載の方法。
【００５３】
４８．低温で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から３日目〜５日目から選択される日に開始する、実施形態４５に記載の方法。
【００５４】
４９．低温を２８〜３５℃とする、実施形態４５に記載の方法。
【００５５】
５０．低温を３０〜３３℃とする、実施形態４５に記載の方法。
【００５６】
５１．低温を３０〜３１℃とする、実施形態４５に記載の方法。
【００５７】
５２．抗ヒトＦＲＡ抗体のＮ結合グリカンのプロファイルが、０〜６．３％のＧ０、２１〜６８％のＧ０Ｆ、２４〜６３％のＧ１Ｆ、０〜０．８％のＧ２、３〜１１％のＧ２Ｆ、０〜０．３９％のＭ３Ｎ２、０〜０．３５％のＭ３Ｎ２Ｆ、および０〜５％のＭＡＮ５を含む、実施形態３０に記載の方法。
【００５８】
５３．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記第１の温度だけで生成する抗体の内在化速度と比較して１１７〜１４３％の速度で標的細胞に内在化する、実施形態３３に記載の方法。
【００５９】
５４．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態３０、３３、３６、４５または２３０のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
５５．宿主細胞において、所望の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを伴う抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、前記宿主細胞が前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、（２）宿主細胞を高い容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップとを含む方法。
【００６１】
５６．結合アフィニティーを低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、宿主細胞を高い容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップとを含む方法。
【００６２】
５７．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも２５％低減する、実施形態５６に記載の方法。
【００６３】
５８．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも４０％低減する、実施形態５６に記載の方法。
【００６４】
５９．ＡＤＣＣが低減された抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、宿主細胞を高い容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップとを含む方法。
【００６５】
６０．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態５９に記載の方法。
【００６６】
６１．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも６５％低減する、実施形態５９に記載の方法。
【００６７】
６２．内在化速度を増大させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、宿主細胞を高い容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップとを含む方法。
【００６８】
６３．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５％増大させる、実施形態６２に記載の方法。
【００６９】
６４．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも１０％増大させる、実施形態６２に記載の方法。
【００７０】
６５．内在化効率が低減された抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、宿主細胞を高い容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養するステップとを含む方法。
【００７１】
６６．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を少なくとも９８．６％低減する、実施形態６５に記載の方法。
【００７２】
６７．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態５５、５６、５９、６２または６５のいずれか１つに記載の方法。
【００７３】
６８．前記宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態６７に記載の方法。
【００７４】
６９．前記細胞培養培地の通常の容量オスモル濃度を２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲とする、実施形態５５、５６、５９、６２、または６５のいずれか１つに記載の方法。
【００７５】
７０．前記高い容量オスモル濃度培地の容量オスモル濃度を３６０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌとする、実施形態５５、５６、５９、６２、または６５のいずれか１つに記載の方法。
【００７６】
７１．前記高い容量オスモル濃度培地の容量オスモル濃度を４００〜６５０ｍＯｓｍ／Ｌとする、実施形態７０に記載の方法。
【００７７】
７２．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、前記抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップのうちの少なくとも一部を高い容量オスモル濃度で行う方法。
【００７８】
７３．高い容量オスモル濃度で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態７２に記載の方法。
【００７９】
７４．高い容量オスモル濃度で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態７２に記載の方法。
【００８０】
７５．高い容量オスモル濃度で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から３日目〜５日目から選択される日に開始する、実施形態７２に記載の方法。
【００８１】
７６．高い容量オスモル濃度を３６０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌとする、実施形態７２に記載の方法。
【００８２】
７７．高い容量オスモル濃度を４００〜６５０ｍＯｓｍ／Ｌとする、実施形態７２に記載の方法。
【００８３】
７８．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、０〜７％のＧ０、４９〜９５％のＧ０Ｆ、０〜３９％のＧ１Ｆ、０〜０．７％のＧ２、０〜６％のＧ２Ｆ、０〜０．３５％のＭ３Ｎ２、０．０４〜０．４６％のＭ３Ｎ２Ｆ、および１．２〜５．６％のＭＡＮ５を含む、実施形態５５に記載の方法。
【００８４】
７９．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して６６．８〜７８．９％とする、実施形態５６に記載の方法。
【００８５】
８０．抗ヒトＦＲＡ抗体が、ＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して１０１％の範囲で誘導する、実施形態６２に記載の方法。
【００８６】
８１．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化速度と比較して１０７％の速度で標的細胞に内在化する、実施形態６２に記載の方法。
【００８７】
８２．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を通常の容量オスモル濃度の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して１．４０〜１．４２％の効率で標的細胞に内在化する、実施形態６５に記載の方法。
【００８８】
８３．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態５５、５６、５９、６２、６５、または７２のいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
８４．宿主細胞において、抗ヒトＦＲＡ抗体の所望の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを生成する方法であって、前記宿主細胞が前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、（２）酪酸ナトリウムを通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【００９０】
８５．結合アフィニティーを低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、酪酸ナトリウムを通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【００９１】
８６．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも４０％低減する、実施形態８５に記載の方法。
【００９２】
８７．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態８５に記載の方法。
【００９３】
８８．ＡＤＣＣが低減された抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、酪酸ナトリウムを通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【００９４】
８９．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも２５％低減する、実施形態８８に記載の方法。
【００９５】
９０．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態８８に記載の方法。
【００９６】
９１．内在化効率を低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、酪酸ナトリウムを通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【００９７】
９２．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも２０％低減する、実施形態９１に記載の方法。
【００９８】
９３．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも５０％低減する、実施形態９１に記載の方法。
【００９９】
９４．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態８４、８５、８８または９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
９５．前記宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態９４に記載の方法。
【０１０１】
９６．前記通常の細胞培養培地が酪酸ナトリウムを含有しない、実施形態８４、８５、８８、または９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１０２】
９７．前記酪酸ナトリウムの濃度を０．５ｍＭとする、実施形態８４、８５、８８、または９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１０３】
９８．前記酪酸ナトリウムの濃度を１０ｍＭとする、実施形態８４、８５、８８、または９１のいずれか１つに記載の方法。
【０１０４】
９９．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップのうちの少なくとも一部を酪酸ナトリウムを含む培養培地中で行う方法。
【０１０５】
１００．酪酸ナトリウムを含む培養培地中で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態９９に記載の方法。
【０１０６】
１０１．酪酸ナトリウムを含む培養培地中で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態９９に記載の方法。
【０１０７】
１０２．酪酸ナトリウムを含む培養培地中で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から３日目〜７日目から選択される日に開始する、実施形態９９に記載の方法。
【０１０８】
１０３．酪酸ナトリウムの濃度を０．０１ｍＭ〜９０ｍＭとする、実施形態９９に記載の方法。
【０１０９】
１０４．酪酸ナトリウムの濃度を０．０１ｍＭ〜１６ｍＭとする、実施形態９９に記載の方法。
【０１１０】
１０５．酪酸ナトリウムの濃度を０．５ｍＭ〜１０ｍＭとする、実施形態９９に記載の方法。
【０１１１】
１０６．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、０〜８％のＧ０、３９〜８６％のＧ０Ｆ、９〜４８％のＧ１Ｆ、０〜１．０％のＧ２、０〜７％のＧ２Ｆ、０〜０．４１％のＭ３Ｎ２、０．０３〜０．４５％のＭ３Ｎ２Ｆ、および０〜４．４％のＭＡＮ５を含む、実施形態８４に記載の方法。
【０１１２】
１０７．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して５９〜６４％とする、実施形態８５に記載の方法。
【０１１３】
１０８．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して４４〜５５％とする、実施形態８５に記載の方法。
【０１１４】
１０９．抗ヒトＦＲＡ抗体が、抗体依存性細胞傷害作用を、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して２６〜９１％の範囲で誘導する、実施形態８８に記載の方法。
【０１１５】
１１０．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して４５〜８４％の効率で標的細胞に内在化する、実施形態９１に記載の方法。
【０１１６】
１１１．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態８４、８５、８８、９１、または９９のいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
１１２．宿主細胞において、抗ヒトＦＲＡ抗体の所望の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを生成する方法であって、前記宿主細胞が前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を第１の溶存酸素（ＤＯ）濃度で培養するステップと、次いで、（２）宿主細胞を第１のＤＯ濃度より低い第２のＤＯ濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１１８】
１１３．結合アフィニティーを低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＤＯ濃度より低い第２のＤＯ濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１１９】
１１４．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも３０％低減する、実施形態１１３に記載の方法。
【０１２０】
１１５．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１１３に記載の方法。
【０１２１】
１１６．ＡＤＣＣを増大させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＤＯ濃度より低い第２のＤＯ濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１２２】
１１７．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも２５％増大させる、実施形態１１６に記載の方法。
【０１２３】
１１８．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも５０％増大させる、実施形態１１６に記載の方法。
【０１２４】
１１９．内在化効率を低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＤＯ濃度より低い第２のＤＯ濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１２５】
１２０．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも３０％低減する、実施形態１１９に記載の方法。
【０１２６】
１２１．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも６０％低減する、実施形態１１９に記載の方法。
【０１２７】
１２２．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態１１２、１１３、１１６または１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１２８】
１２３．前記宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態１２２に記載の方法。
【０１２９】
１２４．宿主細胞を増殖させうる前記第１の溶存酸素濃度を３０％〜１００％の間とする、実施形態１１２、１１３、１１６、または１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
１２５．前記第２のＤＯ濃度を０％〜２５％とする、実施形態１１２、１１３、１１６、または１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
１２６．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップのうちの少なくとも一部を低ＤＯで行う方法。
【０１３２】
１２７．低ＤＯで行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態１２６に記載の方法。
【０１３３】
１２８．低ＤＯで行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態１２６に記載の方法。
【０１３４】
１２９．低ＤＯで行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から３日目〜７日目から選択される日に開始する、実施形態１２６に記載の方法。
【０１３５】
１３０．低ＤＯを０％〜３０％とする、実施形態１２６に記載の方法。
【０１３６】
１３１．低ＤＯを５％〜２５％とする、実施形態１３０に記載の方法。
【０１３７】
１３２．低ＤＯを５％〜１０％とする、実施形態１３０に記載の方法。
【０１３８】
１３３．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、２〜１１％のＧ０、３２〜７９％のＧ０Ｆ、１２〜５２％のＧ１Ｆ、０〜１．０％のＧ２、０〜７％のＧ２Ｆ、０〜０．２８％のＭ３Ｎ２、０．０１〜０．４３％のＭ３Ｎ２Ｆ、および０．１〜４．４％のＭＡＮ５を含む、実施形態１１２に記載の方法。
【０１３９】
１３４．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して５０〜６３％とする、実施形態１１３に記載の方法。
【０１４０】
１３５．抗ヒトＦＲＡ抗体が、抗体依存性細胞傷害作用を、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して１００％超〜２００％以上の範囲で誘導する、実施形態１１６に記載の方法。
【０１４１】
１３６．抗ヒトＦＲＡが、前記宿主細胞を第１のＤＯ濃度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して３９〜６４％の効率で標的細胞に内在化する、実施形態１１９に記載の方法。
【０１４２】
１３７．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態１１２、１１３、１１６、１１９または１２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
１３８．宿主細胞において、抗ヒトＦＲＡ抗体の所望の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを生成する方法であって、前記宿主細胞が前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養するステップと、次いで、（２）宿主細胞を第１のＣＯ２濃度より高い第２のＣＯ２濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１４４】
１３９．結合アフィニティーを低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＣＯ２濃度より高い第２のＣＯ２濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１４５】
１４０．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも２５％低減する、実施形態１３９に記載の方法。
【０１４６】
１４１．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１３９に記載の方法。
【０１４７】
１４２．ＡＤＣＣを低減させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＣＯ２濃度より高い第２のＣＯ２濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１４８】
１４３．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１４２に記載の方法。
【０１４９】
１４４．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも６５％低減する、実施形態１４２に記載の方法。
【０１５０】
１４５．内在化速度を増大させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＣＯ２濃度より高い第２のＣＯ２濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１５１】
１４６．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の内在化速度と比較して少なくとも５％増大させる、実施形態１４５に記載の方法。
【０１５２】
１４７．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の内在化速度と比較して少なくとも２５％増大させる、実施形態１４５に記載の方法。
【０１５３】
１４８．内在化効率が低減された抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１のＣＯ２濃度より高い第２のＣＯ２濃度で培養するステップとを含む方法。
【０１５４】
１４９．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも２５％低減する、実施形態１４８に記載の方法。
【０１５５】
１５０．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１４８に記載の方法。
【０１５６】
１５１．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態１３８、１３９、１４２、１４５または１４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
１５２．前記宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態１５１に記載の方法。
【０１５８】
１５３．前記第１のＣＯ２濃度を約５％以下とする、実施形態１３８、１３９、１４２、１４５、または１４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
１５４．前記高ＣＯ２濃度を１０％〜３０％とする、実施形態１３８、１３９、１４２、１４５、または１４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
１５５．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップのうちの少なくとも一部を高ＣＯ２濃度で行う方法。
【０１６１】
１５６．高ＣＯ２濃度で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態１５５に記載の方法。
【０１６２】
１５７．高ＣＯ２濃度で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態１５５に記載の方法。
【０１６３】
１５８．高ＣＯ２濃度で行う培養するステップのうちの一部を、培養の開始から３日目〜７日目から選択される日に開始する、実施形態１５５に記載の方法。
【０１６４】
１５９．高ＣＯ２濃度を１０％〜３０％とする、実施形態１５５に記載の方法。
【０１６５】
１６０．高ＣＯ２濃度を２０％とする、実施形態１５５に記載の方法。
【０１６６】
１６１．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、０〜７％のＧ０、５０〜９７％のＧ０Ｆ、０〜３９％のＧ１Ｆ、０〜０．７％のＧ２、０〜６％のＧ２Ｆ、０〜０．４６％のＭ３Ｎ２、０．０６〜０．４８％のＭ３Ｎ２Ｆ、および０〜３．８％のＭＡＮ５を含む、実施形態１３８に記載の方法。
【０１６７】
１６２．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して４５〜５６％とする、実施形態１３９に記載の方法。
【０１６８】
１６３．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して２３〜８９％の範囲でＡＤＣＣを誘導する、実施形態１４２に記載の方法。
【０１６９】
１６４．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の内在化速度と比較して１０５〜１２５％の速度で標的細胞に内在化する、実施形態１４５に記載の方法。
【０１７０】
１６５．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を第１のＣＯ２濃度で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して４０〜６８％の効率で標的細胞に内在化する、実施形態１４８に記載の方法。
【０１７１】
１６６．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態１３８、１３９、１４２、１４５、１４８または１５５のいずれか１つに記載の方法。
【０１７２】
１６７．宿主細胞において、抗ヒトＦＲＡ抗体の所望の中性Ｎ結合グリカン構造を生成する方法であって、前記宿主細胞が前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含み、
（１）宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、（２）塩化銅を通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【０１７３】
１６８．結合アフィニティーを低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞を宿主細胞が増殖しうる通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、塩化銅を通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【０１７４】
１６９．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも４０％低減する、実施形態１６８に記載の方法。
【０１７５】
１７０．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１６８に記載の方法。
【０１７６】
１７１．ＡＤＣＣが低減された抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、塩化銅を通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【０１７７】
１７２．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも２０％低減する、実施形態１７１に記載の方法。
【０１７８】
１７３．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して少なくとも８０％低減する、実施形態１７１に記載の方法。
【０１７９】
１７４．内在化効率を低下させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養するステップと、次いで、塩化銅を通常の細胞培養培地に添加するステップとを含む方法。
【０１８０】
１７５．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも３０％低減する、実施形態１７４に記載の方法。
【０１８１】
１７６．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して少なくとも６０％低減する、実施形態１７４に記載の方法。
【０１８２】
１７７．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態１６７、１６８、１７１または１７４のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
１７８．前記宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態１７７に記載の方法。
【０１８４】
１７９．前記通常の細胞培養培地が塩化銅を含有しない、実施形態１６７、１６８、１７１、または１７４のいずれか１つに記載の方法。
【０１８５】
１８０．前記塩化銅の濃度を０．０１μＭ〜０．５ｍＭとする、実施形態１６７、１６８、１７１、または１７４のいずれか１つに記載の方法。
【０１８６】
１８１．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養するステップの少なくとも一部を、塩化銅を含む培養培地中で行う方法。
【０１８７】
１８２．塩化銅を含む培養培地中で行う培養するステップの一部を、培養の開始から０日目〜１４日目に行う、実施形態１８１に記載の方法。
【０１８８】
１８３．塩化銅を含む培養培地中で行う培養するステップの一部を、培養の開始から２日目〜１０日目から選択される日に開始する、実施形態１８１に記載の方法。
【０１８９】
１８４．塩化銅を含む培養培地中で行う培養するステップの一部を、培養の開始から３日目〜６日目から選択される日に開始する、実施形態１８１に記載の方法。
【０１９０】
１８５．塩化銅の濃度を０．０１μＭ〜０．５ｍＭとする、実施形態１８１に記載の方法。
【０１９１】
１８６．塩化銅の濃度を０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭとする、実施形態１８１に記載の方法。
【０１９２】
１８７．塩化銅の濃度を０．５ｍＭとする、実施形態１８１に記載の方法。
【０１９３】
１８８．抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、０〜８％のＧ０、３４〜８１％のＧ０Ｆ、１３〜５３％のＧ１Ｆ、０〜０．７％のＧ２、０〜７％のＧ２Ｆ、０．０７〜０．６１％のＭ３Ｎ２、０．１６〜０．５８％のＭ３Ｎ２Ｆ、および０〜４．３％のＭＡＮ５を含む、実施形態１６７に記載の方法。
【０１９４】
１８９．抗ヒトＦＲＡ抗体の相対結合アフィニティーを、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の結合アフィニティーと比較して４１〜５６％とする、実施形態に記載の方法。
【０１９５】
１９０．抗ヒトＦＲＡ抗体が、抗体依存性細胞傷害作用を、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体のＡＤＣＣと比較して２１〜８７％の範囲で誘導する、実施形態１７１に記載の方法。
【０１９６】
１９１．抗ヒトＦＲＡ抗体が、前記宿主細胞を通常の細胞培養培地中で培養することにより生成する抗体の内在化効率と比較して４１〜７１％の効率で標的細胞に内在化する、実施形態１７４に記載の方法。
【０１９７】
１９２．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態１６７、１６８、１７１、１７４、または１８１のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
１９３．ａ）抗ヒトＦＲＡ抗体の中性Ｎグリカンプロファイル、
ｂ）結合アフィニティー、
ｃ）ＡＤＣＣ、
ｄ）内在化速度、および
ｅ）内在化効率
からなる群より選択される抗ヒトＦＲＡ抗体の１または複数の特性を変化させる方法であって、前記抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップと、培養開始後１３日間未満でありまたは１５日間を超える時点において、抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する宿主細胞を採取するステップとを含む方法。
【０１９９】
１９４．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、培養開始の１３〜１５日後に採取した細胞を介して生成する抗体の結合アフィニティーと比較して低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２００】
１９５．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、培養開始の１３〜１５日後に採取した細胞を介して生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも２５％低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０１】
１９６．抗ヒトＦＲＡ抗体の結合アフィニティーを、培養開始の１３〜１５日後に採取した細胞を介して生成する抗体の結合アフィニティーと比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０２】
１９７．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０３】
１９８．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１９４に記載の方法。
【０２０４】
１９９．抗ヒトＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して少なくとも６５％低減する、実施形態１９５に記載の方法。
【０２０５】
２００．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して増大させる、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０６】
２０１．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して少なくとも５％増大させる、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０７】
２０２．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化速度を、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して少なくとも２５％増大させる、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０８】
２０３．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２０９】
２０４．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して少なくとも２５％低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２１０】
２０５．抗ヒトＦＲＡ抗体の内在化効率を、培養開始の１３〜１５日後に採取した抗体と比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１９３に記載の方法。
【０２１１】
２０６．抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップを含み、培養の開始から１３日後以前の時点または１５日後以後の時点に宿主細胞を採取する方法。
【０２１２】
２０７．前記宿主細胞を哺乳動物細胞とする、実施形態１９３または２０６に記載の方法。
【０２１３】
２０８．前記宿主細胞をＧＳ  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系に由来する組換え細胞とする、実施形態２０７に記載の方法。
【０２１４】
２０９．前記採取する時点が、培養を開始して２４０時間〜３１２時間後の時点、および培養を開始して３６０時間〜４８０時間後の時点からなる群より選択される、実施形態１９３または２０６に記載の方法。
【０２１５】
２１０．前記採取する時点を培養開始の２４０時間後とする、実施形態２０９に記載の方法。
【０２１６】
２１１．前記採取する時点を培養開始の４０８時間後とする、実施形態２０９に記載の方法。
【０２１７】
２１２．前記採取する時点を培養開始の４８０時間後とする、実施形態２０９に記載の方法。
【０２１８】
２１３．抗ヒトＦＲＡ抗体が、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施形態１９３または２０６に記載の方法。
【０２１９】
２１４．抗ヒトＦＲＡ抗体の重鎖および軽鎖を発現するように操作した真核宿主細胞を含む細胞培養物であって、細胞培養条件が、ガラクトースの補充、溶存酸素（ＤＯ）の低減、温度の低下、酪酸ナトリウム、塩化銅、高い容量オスモル濃度、および高ＣＯ２からなる群より選択されるパラメータを含む細胞培養物。
【０２２０】
２１５．ＤＯレベルを０％〜約２５％とする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２１】
２１６．ＣＯ２濃度を約１０％〜約３０％とする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２２】
２１７．温度を２８℃〜約３５℃とする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２３】
２１８．ガラクトース濃度を０．０１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌとする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２４】
２１９．酪酸ナトリウムの濃度を０．５ｍＭ〜１０ｍＭとする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２５】
２２０．塩化銅の濃度を０．０１μＭ〜０．５ｍＭとする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２６】
２２１．細胞培養物の容量オスモル濃度を３６０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌとする、実施形態２１１４に記載の細胞培養物。
【０２２７】
２２２．真核宿主細胞をＣＨＯ細胞とする、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２２８】
２２３．ＣＨＯ細胞をＣＨＯ−Ｋ１細胞とする、実施形態２２２に記載の細胞培養物。
【０２２９】
２２４．抗ヒトＦＲＡ抗体がＩｇＧ１アイソタイプのヒト重鎖定常領域を含む、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２３０】
２２５．抗ヒトＦＲＡ抗体が配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列を含み、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む、実施形態２１４に記載の細胞培養物。
【０２３１】
２２６．実施形態２１４に記載の細胞培養物から単離された宿主細胞。
【０２３２】
２２７．実施形態１、５、８、１７、３０、３３、３６、４５、５５、５６、５９、６２、６５、７２、８５、８８、９１、９９、１１３、１１６、１１９、１２６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５５、１６８、１７１、１７４、１８１、２０６、もしくは２３０のいずれか１つに記載の方法を介して生成した抗ヒトＦＲＡアルファ抗体、または前記抗体の抗原結合部分。
【０２３３】
２２８．実施形態２２７に記載の抗ヒトＦＲＡ抗体と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【０２３４】
２２９．さらなる治療剤をさらに含む、実施形態２２８に記載の組成物。
【０２３５】
２３０．ＡＤＣＣを増大させた抗ヒトＦＲＡ抗体を生成する方法であって、抗ヒトＦＲＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を第１の温度で培養するステップと、次いで、宿主細胞を第１の温度より低い第２の温度で培養するステップとを含む方法。
【０２３６】
２３１．実施形態２２５に記載の細胞培養物から単離された宿主細胞。
【０２３７】
２３２．配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列を含み、配列番号２または配列番号２と９９％同一な配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む、実施形態２２７に記載の抗ヒトＦＲＡアルファ抗体。
【０２３８】
２３３．実施形態２３２に記載の抗ヒトＦＲＡ抗体と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｈは、抗ＦＲＡ抗体から回収される中性Ｎ結合抗体のグリカン構造の図を示す。図は、部分的にプロセシングされたグリカン構造であるＭ３Ｎ２（図１Ａ）、Ｍ３Ｎ２Ｆ（図１Ｂ）、ＭＡＮ５（図１Ｃ）、ならびに完全にプロセシングされたグリカン構造であるＮＧＡ２（Ｇ０）（図１Ｄ）、ＮＧＡ２Ｆ（Ｇ０Ｆ）（図１Ｅ）、ＮＡ２Ｇ１Ｆ（Ｇ１Ｆ）（図１Ｆ）、ＮＡ２（Ｇ２）（図１Ｇ）およびＮＡ２Ｆ（Ｇ２Ｆ）（図１Ｈ）を示す。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｈは、抗ＦＲＡ抗体から回収される中性Ｎ結合抗体のグリカン構造の図を示す。図は、部分的にプロセシングされたグリカン構造であるＭ３Ｎ２（図１Ａ）、Ｍ３Ｎ２Ｆ（図１Ｂ）、ＭＡＮ５（図１Ｃ）、ならびに完全にプロセシングされたグリカン構造であるＮＧＡ２（Ｇ０）（図１Ｄ）、ＮＧＡ２Ｆ（Ｇ０Ｆ）（図１Ｅ）、ＮＡ２Ｇ１Ｆ（Ｇ１Ｆ）（図１Ｆ）、ＮＡ２（Ｇ２）（図１Ｇ）およびＮＡ２Ｆ（Ｇ２Ｆ）（図１Ｈ）を示す。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｈは、抗ＦＲＡ抗体から回収される中性Ｎ結合抗体のグリカン構造の図を示す。図は、部分的にプロセシングされたグリカン構造であるＭ３Ｎ２（図１Ａ）、Ｍ３Ｎ２Ｆ（図１Ｂ）、ＭＡＮ５（図１Ｃ）、ならびに完全にプロセシングされたグリカン構造であるＮＧＡ２（Ｇ０）（図１Ｄ）、ＮＧＡ２Ｆ（Ｇ０Ｆ）（図１Ｅ）、ＮＡ２Ｇ１Ｆ（Ｇ１Ｆ）（図１Ｆ）、ＮＡ２（Ｇ２）（図１Ｇ）およびＮＡ２Ｆ（Ｇ２Ｆ）（図１Ｈ）を示す。
【図１−４】図１Ａ〜１Ｈは、抗ＦＲＡ抗体から回収される中性Ｎ結合抗体のグリカン構造の図を示す。図は、部分的にプロセシングされたグリカン構造であるＭ３Ｎ２（図１Ａ）、Ｍ３Ｎ２Ｆ（図１Ｂ）、ＭＡＮ５（図１Ｃ）、ならびに完全にプロセシングされたグリカン構造であるＮＧＡ２（Ｇ０）（図１Ｄ）、ＮＧＡ２Ｆ（Ｇ０Ｆ）（図１Ｅ）、ＮＡ２Ｇ１Ｆ（Ｇ１Ｆ）（図１Ｆ）、ＮＡ２（Ｇ２）（図１Ｇ）およびＮＡ２Ｆ（Ｇ２Ｆ）（図１Ｈ）を示す。
【図２】図２は、多様な条件下で培養した宿主細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体から回収される中性Ｎ結合抗体のグリカン構造の分布を示すグラフである。「Ｐｏｓ．ｃｔｌ．」とは、表３で「陽性対照」として列挙された条件で培養した宿主細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体を表す。「ＭＯＲＡｂ−００３参照基準物質」とは、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列とを有する抗ＦＲＡ抗体を表す。「ガラクトースの補充」、「低温」、「高い容量オスモル濃度」、「０．５ｍＭの酪酸Ｎａ」、「低ＤＯ」、「高ＣＯ２」、「１０ｍＭの酪酸Ｎａ」、「ＣｕＣｌの補充」、「１０日目における採取」、「１４日目における採取」、「１７日目における採取」、および「２０日目における採取」に対応する宿主細胞の培養条件については、実施例１で記載する。
【図３】図３は、多様な条件下で培養した宿主細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体から回収される中性Ｎ結合抗体のグリカン構造の分布を示す表である。「ＭＯＲＡｂ−００３参照基準物質」とは、図２との関連で記載される抗体である。
【図４】図４は、多様な条件下で培養した宿主細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体のＦＲＡ結合アフィニティーを示す表である。
【図５】図５は、多様な条件下で培養した宿主細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを示す表である。
【図６】図６は、ＡＤＣＣ（ｙ軸）と、抗ＦＲＡ抗体におけるグリカンＮＧＡ２（Ｇ０）の相対濃度（％）（ｘ軸）との間の相関を示すレバレッジプロットである。
【図７】図７は、ＡＤＣＣ（ｙ軸）と、抗ＦＲＡ抗体における非フコシル化グリカンの相対濃度（％）（ｘ軸）との間の相関を示すレバレッジプロットである。
【図８】図８は、ＡＤＣＣ（ｙ軸）と、抗ＦＲＡ抗体におけるグリカンＭ３Ｎ２Ｆの相対濃度（％）（ｘ軸）との間の相関を示すレバレッジプロットである。
【図９】図９は、抗ＦＲＡ抗体の内在化を測定する実験の結果を示すグラフである。抗ＦＲＡ抗体の内在化は、抗ヒト二次抗毒素を用いることによるＦＲＡ発現細胞の増殖の阻害の関数として測定した。ｙ軸にはＯＤ５４０を示す。ｘ軸には抗ＦＲＡ抗体の濃度を示す。「参照基準物質」とは、図２との関連で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗体を指す。
【図１０】図１０は、ＦＲＡ発現細胞の増殖の５０％の阻害を結果としてもたらす抗ＦＲＡ抗体の濃度（ＩＣ５０）の計算を示す表である。「ｒｅｆ  ｓｔｄ」とは、図２との関連で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗体を指す。
【図１１】図１１は、抗ＦＲＡ抗体の内在化活性を測定するＦＡＣＳによる結合実験の結果を示すヒストグラムである。「ｒｅｆ  ｓｔｄ」とは、図２との関連で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗体を指す。影を付した領域（Ｐ１集団）は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした細胞に対応する。Ｐ２集団（０％の対照）は、対照としての非関与のヒトＩｇＧおよびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした細胞に対応する。Ｐ３集団は、抗ＦＲＡ抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、酸性のグリシン緩衝液で洗浄した細胞に対応する。Ｐ４集団（１００％の対照）は、抗ＦＲＡ抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液により洗浄した細胞に対応する。
【図１２】図１２は、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、抗ＦＲＡ抗体の内在化活性を測定するＦＡＣＳによる結合実験の結果を示すグラフである。ＦＲＡ発現細胞集団についてのフローサイトメトリーを介して測定した平均蛍光強度（ＭＦＩ）の、各時点における全結合と比べた百分率（ｙ軸）が、時間（ｘ軸）の関数として示される。
【図１３】図１３は、表４で記載される抗ＦＲＡ抗体のほか、対照の抗ＦＲＡ抗体の内在化活性を測定するＦＡＣＳによる結合実験の結果を示すグラフである。ＦＲＡ発現細胞集団についてのフローサイトメトリーを介して測定したＭＦＩの、各時点における全結合と比べた百分率（ｙ軸）が、時間（ｘ軸）の関数として示される。「ＭＯＲＡｂ−００３ｒｅｆ  ｓｔｄ」とは、図２との関連で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗体を指す。
【図１４】図１４は、Ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−可変勾配の、時間の関数としての抗ＦＲＡ抗体の内在化百分率の近似モデルを示す。「ｒｅｆ  ｓｔｄ」とは、図２との関連で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗体を指す。
【図１５】図１５は、実施例５で記載されるＦＡＣＳによる内在化研究の結果をまとめる表である。
【図１６】図１６は、抗ＦＲＡ抗体の結合アフィニティー、ＡＤＣＣ、内在化速度、および内在化効率に関連するデータをまとめる表である。「ＭＯＲＡｂ−００３参照基準物質」とは、図２との関連で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗体を指す。
【発明を実施するための形態】
【０２４０】
本発明は、抗ＦＲＡ抗体、特に、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡモノクローナル抗体を組換え生成するための特定の細胞培養条件を変化させることにより、この抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを変化させることができ、場合によっては、抗ＦＲＡ抗体の１または複数の特性を変化させうることの驚くべき発見に部分的に基づく。特に、本発明者らは、糖供給源としてのブドウ糖をガラクトースで置換すること、温度を低下させること、溶存酸素（ＤＯ）レベルを低減すること、ＣＯ２レベルを増大させること、ＣｕＣｌもしくは酪酸ナトリウムを培養培地に添加すること、容量オスモル濃度を増大させること、または異なる長さの時間にわたる培養後に抗ＦＲＡ抗体を採取することにより、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを変化させることができ、前述の培養条件の各々により中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが変化することを発見した。すなわち、プロファイルを構成する１または複数の中性グリカンは、本明細書で定義した基準条件下で生成する抗ＦＲＡ抗体のプロファイル中の前記グリカンの量と比べて高量または低量で存在する。中性Ｎ結合グリカンを変化させたＭＯＲＡｂ−００３抗体などの抗ＦＲＡモノクローナル抗体は、ｐＫおよび／またはｐＤの変化、半減期の変化、可溶性の改善、免疫原性の低減、または副作用の低減が含まれるがこれらに限定されない、１または複数の所望の特性を有しうるため、代替的な治療分子として有用である。本発明者らはさらに、これらの条件のうちのいずれかの下で抗ＦＲＡ抗体を生成することにより、抗ＦＲＡ抗体の結合アフィニティー、ＡＤＣＣ、内在化速度、および／または内在化効率が変化することも発見した。
【０２４１】
したがって、一態様では、本発明は、１または複数の中性グリカンの相対量を、本明細書で定義した基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体と比較して増大または減少させる点で、新規の中性Ｎ結合グリカンプロファイルを伴う抗ＦＲＡ抗体を提供する。本発明は、ＦＲＡへの結合の変化（典型的には、低減）、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の変化、ならびに／またはＦＲＡ発現細胞における内在化速度および／もしくは内在化効率の変化を伴う抗ＦＲＡ抗体をさらに提供する。多様な実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が、配列番号１もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列と、配列番号２もしくは配列番号６もしくは配列番号７の軽鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列とを含む。具体的な実施形態では、抗体が、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と９９％同一である軽鎖アミノ酸配列、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列および配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む（Ｅｂｅｌら、（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７巻：６頁）。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が、配列番号１または配列番号５と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である重鎖アミノ酸配列と、配列番号２、配列番号６、または配列番号７と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である軽鎖アミノ酸配列とを有する。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖（リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある）と、配列番号９のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖（リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある）とを含む。一部の実施形態では、重鎖アミノ酸配列が、Ｃ末端のリシンを欠く。多様な実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、２００６年４月２４日、ブダペスト条約に従う条項の下、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、受託番号：ＰＴＡ−７５５２で寄託された細胞系を介して生成する抗体のアミノ酸配列、または重鎖Ｃ末端のリシンを欠くこのような配列を有する。
【０２４２】
関連する態様では、本発明は、本発明の抗ＦＲＡ抗体を含む細胞培養物、このような培養物から単離された細胞、ならびに本発明の抗ＦＲＡ抗体を含むキットおよび組成物を提供する。
【０２４３】
別の態様では、本発明は、細胞培養条件を変化させることにより抗ＦＲＡ抗体を生成する方法であって、変化が、ガラクトースを糖供給源として用いること、温度を低下させること、溶存酸素（ＤＯ）レベルを低減すること、ＣＯ２レベルを増大させること、ＣｕＣｌまたは酪酸ナトリウムを培養培地に添加すること、容量オスモル濃度を増大させること、または異なる長さの時間にわたる培養後に抗ＦＲＡ抗体を採取することから選択される方法と、本方法を介して生成する抗ＦＲＡ抗体とを提供する。本発明は、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合プロファイルおよび／または１もしくは複数の特性を変化させるか、あるいは所望の中性Ｎ結合糖型のプロファイルまたは特性を伴う抗ＦＲＡ抗体を、抗ＦＲＡ抗体を発現する宿主細胞を本明細書で記載される変化させた培養条件下で培養することにより生成する方法をさらに提供する。
【０２４４】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明の抗ＦＲＡ抗体を用いる方法を提供する。一部の実施形態では、抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＦＲＡまたはＦＲＡ発現細胞の存在を検出するかまたはこれを定量化する。他の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、単剤で、または１もしくは複数のさらなる治療剤との組合せで治療に用いる。
【０２４５】
本発明の抗体は、ヒト葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に特異的に結合する。本明細書で用いられる、ＦＲＡ（本明細書ではまた、抗ＦＲＡ抗体とも称する）に特異的に結合する抗体は、ＦＲＡではないタンパク質にそれほどは結合しない。抗体は、解離定数（ＫＤ）が≦１ｍＭ、≦１００ｎＭ、または≦１０ｎＭであるとき、抗原に特異的に結合すると言う。特定の実施形態では、ＫＤが、１ｐＭ〜５００ｐＭである。他の実施形態では、ＫＤが、５００ｐＭ〜１μＭの間、１μＭ〜１００ｎＭの間、または１００ｍＭ〜１０ｎＭの間である。好ましい実施形態では、ＦＲＡが、配列番号３に示されるアミノ酸配列または配列番号４のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むヒトＦＲＡなどのヒトＦＲＡである。
【０２４６】
本発明の一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む四本鎖抗体（また、免疫グロブリンとも称する）である。本発明の抗ＦＲＡ抗体の重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とからなる。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とからなる。本出願の目的では、成熟重鎖可変ドメインおよび成熟軽鎖可変ドメインの各々が、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）内に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み、Ｎ末端からＣ末端へと、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順に配置されている。本明細書におけるアミノ酸の各ドメインへの割当ては、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁、またはＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９年）、３４２巻：８７８〜８８３頁の定義に従う。
【０２４７】
本発明の抗体は、ヒトカッパ軽鎖を伴うヒト免疫グロブリンＧの亜型１（ＩｇＧ１）である。
【０２４８】
「抗体」という用語は、文脈に応じて、個別の抗体分子を指す場合もあり、複数の抗体分子を指す場合もある。当業者は、例えば、中性グリカンのプロファイルが、複数の抗体分子に関することを理解するであろう。
【０２４９】
多様な実施形態では、本発明は、図３に示されるかまたは以下の「培養条件」の節で記載される中性Ｎ結合グリカンのプロファイルのうちのいずれかを有する抗ＦＲＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、Ｍ３Ｎ２、ＮＡ２、ＮＡ２Ｆ、ＭＡＮ５、およびＮＡ２Ｇ１Ｆの量の増大と、ＮＧＡ２Ｆの減少とを含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、ＮＧＡ２の量の増大、例えば、ＮＧＡ２の少なくとも２倍または少なくとも３倍の増大を有する。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が、約９％の非フコシル化糖型を含む。本発明はまた、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較してＮＡ２、ＮＧＡ２Ｆ、およびＭＡＮ５の量の増大と、ＮＡ２Ｇ１Ｆの量の減少とを含む中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを有する抗ＦＲＡ抗体も提供する。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、Ｍ３Ｎ２およびＮＡ２の量の増大を含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、ＮＡ２およびＮＧＡ２の量の増大を含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、Ｍ３Ｎ２およびＮＡ２の量の増大と、ＮＡ２Ｆの減少とを含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、Ｍ３Ｎ２Ｆ、ＮＡ２、およびＭＡＮ５の量の増大を含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の培養条件下で生成する抗体のプロファイルと比較して、Ｍ３Ｎ２、Ｍ３Ｎ２Ｆ、およびＮＡ２の量の増大を含む。
【０２５０】
このようなプロファイルでは、Ｍ３Ｎ２、Ｍ３Ｎ２Ｆ、およびＭＡＮ５が、少なくとも約２倍以上増大する可能性がある。ＮＡ２は、少なくとも約１０倍以上増大する可能性がある。ＮＡ２Ｆは、少なくとも約２倍以上増大する可能性がある。ＮＡ２Ｆは、少なくとも約４０％以上減少する可能性もあり、少なくとも約２倍以上増大する可能性もある。ＮＡ２Ｇ１Ｆは、少なくとも約２５％または３０％以上減少する可能性があり、ＮＧＡ２Ｆは、少なくとも約１０％または１５％以上増大する可能性がある。
【０２５１】
具体的な実施形態では、抗ＦＲＡモノクローナル抗体を、ＭＯＲＡｂ−００３モノクローナル抗体とする。「ＭＯＲＡｂ−００３」とは、配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号７の軽鎖アミノ酸配列とを含み、基準の培養条件下で生成し、外部の製造元が供給する抗ＦＲＡ抗体を指す。ＭＯＲＡｂ−００３抗体の参照基準物質と精製されたＦＲ−αとの間の動態結合定数および定常状態結合定数は、表面プラズモン共鳴分光法により決定されている。オン速度（ｋａ）は、（２．２５±０．０２）Ｍ−１秒−１であると決定し、オフ速度（ｋｄ）は、（５．０２±０．０８）秒−１であると決定した。定常状態解離定数（ＫＤ）は、２．２３ｎＭであると決定した（米国特許公開第２００５０２３２９１９号）。
【０２５２】
多様な実施形態では、本発明は、基準の培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体と比較して、結合アフィニティーを減少させるか、ＡＤＣＣを増大もしくは減少させるか、内在化効率を低減するか、または内在化速度を増大させた抗ＦＲＡ抗体を提供する。
【０２５３】
本明細書で用いられる中性Ｎ結合グリカンは、保存的なグリコシル化部位または対応する位置（配列番号５のＡｓｎ２９９）において結合させる。本明細書で用いられる抗ＦＲＡ抗体の「中性Ｎ結合グリカンのプロファイル」は、図１に示される中性グリカン構造を含む。このような構造は、部分的にプロセシングされたグリカンであるＭ３Ｎ２、Ｍ３Ｎ２Ｆ、およびＭＡＮ５と、完全にプロセシングされたグリカンであるＮＧＡ２（Ｇ０）、ＮＧＡ２Ｆ（Ｇ０Ｆ）、ＮＡ２Ｇ１Ｆ（Ｇ１Ｆ）、ＮＡ２（Ｇ２）、およびＮＡ２Ｆ（Ｇ２Ｆ）とを包含する。本出願の目的では、「Ｇ０」とは、ガラクトシル化されていないグリカンを指し、「Ｇ１」とは、モノガラクトシル化グリカンを指し、「Ｇ２」とは、ジガラクトシル化グリカンを指す。
【０２５４】
本発明の抗体のグリカンプロファイルは、実施例２で記載される通りに決定することができる。略述すると、抗体の重鎖に結合したＮ結合グリカンは、ペプチジル−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）を用いて酵素的に除去し、ゲル濾過クロマトグラフィーを介して精製する。結果として得られるグリカン混合物は、例えば、２−アミノベンザミド（２−ＡＢ）を用いて蛍光標識し、順相ＨＰＬＣを介して分解する。蛍光標識したグリカンは、蛍光を介して定量化する。分離時に生じるピークによるグリカンの同定は、直列型質量分析による検出を介して達成する。複合体であるＮ結合グリカンは、酵素的除去の後、任意の適切なフルオロフォア（例えば、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）、２−アミノベンザミド（２−ＡＢ）、２−アミノピリジン（２−ＡＰ）、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）、または９−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ））を用いて標識することもでき、放射性同位元素を用いて標識することもでき、それら自体が他の手段（例えば、ビオチン）を用いて検出されうる低分子の化学的タグを用いて標識することもできる。次いで、標識されたものであれ、標識されていないものであれ、複合体であるグリカンは、ＨＰＬＣ（逆相、順相、アニオン交換）、およびゲルベースの電気泳動法またはキャピラリー電気泳動法を含めた多様な方法を介して分離することができ、蛍光法、パルス電流測定法、屈折率法、蒸発光散乱法、または質量分析法を介して計数することができる。
【０２５５】
本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体は、抗体を発現する細胞を培養することにより生成する。一部の実施形態では、重鎖、軽鎖、またはこれらの両方をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入し、転写制御配列および翻訳制御配列などの発現制御配列に作動可能に連結することができる。
【０２５６】
「作動可能に連結した」配列は、対象の遺伝子と隣接する発現制御配列およびトランスまたは遠位で作用して対象の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を包含する。本明細書で用いられる「発現制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどのＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および、所望の場合、タンパク質の分泌を増強する配列が含まれうる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、真核生物では一般に、このような制御配列が、プロモーター配列および転写終結配列を包含する。「制御配列」という用語は、少なくとも、それらの存在が発現およびプロセシングに不可欠な全ての構成要素を包含することを意図し、また、それらの存在が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も包含しうる。
【０２５７】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＥＢＶに由来するエピソームなどが含まれる。場合によっては、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するそれらの意図される機能を果たすように、本発明の抗体、抗体鎖または抗原結合断片をコードする核酸を、ベクターへとライゲーションする。当業者には周知の通り、発現ベクターおよび発現制御配列は、所望の発現レベル、用いられる発現宿主細胞などと適合可能であるように選択する。抗体の軽鎖または断片および抗体の重鎖または断片をコードする核酸は、別個のベクターに挿入することもでき、同じ発現ベクターに挿入することもできる。核酸は、標準的な方法（例えば、抗体をコードする核酸（複数可）およびベクターにおける相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション）を介して発現ベクターへと挿入する。
【０２５８】
当技術分野では、発現用の宿主として有用な哺乳動物細胞系が周知であり、これらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞など）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞）、Ａ５４９細胞、および他の多数の細胞系が含まれる。特に好ましい細胞系は、発現レベルが高い細胞系を決定することを介して選択する。一実施形態では、細胞を温度感受性の突然変異体の細胞系としない。別の実施形態では、細胞を温度感受性の突然変異体の細胞系とする。一部の実施形態では、宿主細胞をＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、またはＧＳ  ＣＨＯ−Ｋ１細胞とする。
【０２５９】
一部の実施形態では、抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞へと導入し、宿主細胞における抗体の発現または抗体の宿主細胞を増殖させる培養培地への分泌を可能とするのに十分な期間にわたり宿主細胞を培養することにより抗体を生成する。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
【０２６０】
さらに、生成用細胞系からの発現は、多数の公知の技法を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強する一般的な手法である。ＧＳ系は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、欧州特許第２１６８４６号、同第２５６０５５号、同第３２３９９７号、および同第３３８８４１号との関連で全体的または部分的に論じられている。
【０２６１】
一態様では、本発明は、多様な細胞培養条件を用いて抗ＦＲＡ抗体を生成する方法を提供する。本明細書で用いられる「基準の培養条件」とは、２Ｌの撹拌タンク型生成用バイオリアクター内のＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中、１８０ｒｐｍで培養した細胞を指す。基準の細胞培養物のｐＨは、６．９〜７．１の範囲内とする。例えば、ｐＨを、７．０とすることができる。基準の細胞培養物のブドウ糖濃度は、１ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌとする。基準の細胞培養物の温度は、約３６〜３８℃とする。例えば、温度を、３６．５℃とすることができる。ＣＯ２濃度は、約５％とする。細胞培養培地の基準の容量オスモル濃度は、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内とする。基準の細胞培養培地は、酪酸ナトリウムまたは塩化銅を含有しない。基準の細胞培養培地の溶存酸素分圧（ＤＯ）は、３０〜１００％の範囲内とする。例えば、基準の細胞培養培地のＤＯは、３０％〜４０％の間とする。基準の細胞培養条件下で培養した抗体の採取時点は、細胞培養を開始して１３〜１５日後、例えば、１４日後（すなわち、３３６時間後）とすることができ、これは、培養物の生存率が５０％となる時点であることが予測される。図で記載される「ＭＯＲＡｂ−００３参照基準物質」試料、「ＭＯＲＡｂ−００３  ｒｅｆ  ｓｔｄ」試料、「参照基準物質」試料は、配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号７の軽鎖アミノ酸配列とを含み、既に記載した基準の培養条件下で培養した細胞を介して生成し、外部の製造元が供給したものである。
【０２６２】
一部の実施形態では、培養条件を、成長期および／または誘導期において変化させる。バッチ培養とは、閉鎖系において増殖させる細胞集団である。バッチ培養における細胞集団の典型的な成長曲線は、誘導期、対数期、定常期、および死滅期を含む。誘導期とは、集団を旧来の成長環境から新規の環境へと移し、細胞を新規の栄養物質供給源に適合させ、ＲＮＡ、タンパク質、および他の分子を合成させるが、いまだ分裂させはしない、成長周期の第１期を指す。この期間の長さは、培養歴および成長条件に応じて短い場合もあり、長い場合もある。
【０２６３】
例えば、本発明は、抗ＦＲＡ抗体を、培養時間の少なくとも一部にわたり、ガラクトースを糖供給源として用いて抗体を発現することが可能な細胞を培養することにより生成する方法を提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降にガラクトースを糖供給源として用いる。他の実施形態では、第１の期間にわたり、ブドウ糖を糖供給源として用いて細胞を培養し、第２の期間にわたり、ガラクトースを糖供給源として用いて細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、誘導期にブドウ糖を糖供給源として用い、成長期にガラクトースを糖供給源として用いる細胞培養を介して本発明の抗ＦＲＡ抗体を生成する。一部の実施形態では、細胞を、ガラクトースを糖供給源として用いて、０日目〜１４日目に、または２〜１０日目の任意の日に始めて、または好ましくは３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目から開始して培養する。上記の方法のうちのいずれかでは、ガラクトース濃度を０．０１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌとすることもでき、好ましくは１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌとすることもでき、より好ましくは２ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌとすることもできる。一部の実施形態では、ガラクトース濃度を２ｇ／Ｌとすることができる。
【０２６４】
本発明によれば、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して、Ｍ３Ｎ２、ＮＡ２、ＮＡ２Ｆ、ＭＡＮ５、およびＮＡ２Ｇ１Ｆの増大と、ＮＧＡ２Ｆの減少とを含む。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、Ｍ３Ｎ２Ｆの減少、および／またはＮＡ２Ｆの増大、および／またはＮＡ２Ｇ１Ｆの増大、および／またはＮＧＡ２Ｆの減少を含む。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも３０％低減することができる。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも２倍に増大させることができる。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２Ｇ１Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも４０％増大させることができる。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも２５％減少させることができる。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：１：１．７：６０：２０：１６：３６５：３７０とする比を含む。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．１２％のＭ３Ｎ２、０．１４％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．２％のＮＡ２、７．０６％のＮＡ２Ｆ、２．４２％のＭＡＮ５、１．９％のＮＧＡ２、４３．７３％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および４４．４３％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における中性グリカンのうちの少なくとも６％または７％を、ＮＡ２Ｆ糖型とすることができる。一部の実施形態では、ガラクトースを糖供給源として用いて培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約４．６４％の非フコシル化糖型および９５．３６％のフコシル化糖型とする。
【０２６５】
本発明は、抗ＦＲＡ抗体を、抗体を発現することが可能な細胞を培養時間の少なくとも一部にわたり低温で培養することにより生成する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降に低温で細胞を培養する。他の実施形態では、第１の期間にわたり第１の温度で細胞を培養し、第２の期間にわたり低温で細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、誘導期に第１の温度を用い、成長期に低温を用いる細胞培養を介して生成する。第１の温度を、約３６〜３８℃とすることができる。低温を、約２８〜３５℃、または約３０〜３３℃、または約３０〜３１℃とすることができ、約２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、または３５℃とすることができる。一部の実施形態では、第１の期間にわたり温度を３６．５℃として細胞を培養し、第２の期間にわたり３０℃で細胞を培養する。細胞を、０日目〜１４日目に、または２〜１０日目の任意の日に始めて、または好ましくは３日目、４日目、もしくは５日目から開始して低温で培養することができる。
【０２６６】
本発明によれば、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較してＮＧＡ２の増大を含む。本発明によれば、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、ＮＧＡ２の増大、および／またはＮＡ２Ｇ１Ｆの減少を含む。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、非フコシル化糖型の増大を含む。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも２倍に増大させることができる。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２Ｇ１Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも３０％減少させることができる。一部の実施形態では、低温で培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：１３：２．５：７０：１００：３５０：１０５０：３５００とする比を含む。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．０２％のＭ３Ｎ２、０．２５％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．０５％のＮＡ２、１．３６％のＮＡ２Ｆ、２．０４％のＭＡＮ５、６．９８％のＮＧＡ２、６８．５２％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および９０．９２％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における中性グリカンのうちの少なくとも６％または７％を、ＮＧＡ２糖型とすることができる。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体が、約９％の非フコシル化糖型を含みうる。一部の実施形態では、低温で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約９．０９％の非フコシル化糖型および９０．９２％のフコシル化糖型とする。
【０２６７】
本発明はまた、抗ＦＲＡ抗体を、抗体を発現することが可能な細胞を培養時間の少なくとも一部にわたり高い容量オスモル濃度で培養することにより生成する方法も提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降に高い容量オスモル濃度で細胞を培養する。他の実施形態では、第１の期間にわたり基準の容量オスモル濃度で細胞を培養し、第２の期間にわたり高い容量オスモル濃度で細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、誘導期に基準の容量オスモル濃度を用い、成長期に高い容量オスモル濃度を用いる細胞培養を介して生成する。基準の容量オスモル濃度を、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲とすることができる。高い容量オスモル濃度を、３６０〜８００ｍＯｓｍ／Ｌ、または４００〜６５０ｍＯｓｍ／Ｌとすることができる。一部の実施形態では、約４５０ｍＯｓｍ／Ｌ、４７５ｍＯｓｍ／Ｌ、５００ｍＯｓｍ／Ｌ、５２５ｍＯｓｍ／Ｌ、５５０ｍＯｓｍ／Ｌ、５７５ｍＯｓｍ／Ｌ、６００ｍＯｓｍ／Ｌ、６２５ｍＯｓｍ／Ｌ、または６５０ｍＯｓｍ／Ｌで細胞を培養する。一部の実施形態では、第１の期間にわたり２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌで細胞を培養し、第２の期間には６００ｍＯｓｍ／Ｌで細胞を培養する。細胞を、０日目〜１４日目に、または２〜１０日目の任意の日に始めて、好ましくは３日目〜５日目の任意の日に始めて、高い容量オスモル濃度で培養することができる、すなわち、２日目、３日目、４日目、もしくは５日目に始めて、本明細書で記載される高い容量オスモル濃度で細胞を培養することができる。
【０２６８】
本発明によれば、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して、ＮＡ２、ＭＡＮ５、およびＮＧＡ２Ｆの増大と、ＮＡ２Ｇ１Ｆの減少とを含む。本発明によれば、高浸透で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、ＭＡＮ５の増大、および／またはＮＡ２Ｇ１Ｆの減少、および／またはＮＧＡ２Ｆの増大を含む。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも４０％増大させることができる。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２Ｇ１Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも３０％減少させることができる。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８１０−１０）と比較して、少なくとも１５％増大させることができる。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：３：３：１５：４３：３３：２５０：９００とする比を含む。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．０８％のＭ３Ｎ２、０．２５％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．２３％のＮＡ２、１．２３％のＮＡ２Ｆ、３．４％のＭＡＮ５、２．６３％のＮＧＡ２、１９．５７％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および７２．６％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における中性グリカンのうちの少なくとも３％または４％を、ＭＡＮ５糖型とすることができる。一部の実施形態では、高い容量オスモル濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約６．３４％の非フコシル化糖型および９３．６５％のフコシル化糖型とする。
【０２６９】
本発明は、抗ＦＲＡ抗体を、抗体を発現することが可能な細胞を培養時間の少なくとも一部にわたり酪酸ナトリウムの存在下で培養することにより生成する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降に酪酸ナトリウムの存在下で細胞を培養する。他の実施形態では、第１の期間にわたり酪酸ナトリウムの非存在下で細胞を培養し、第２の期間にわたり酪酸ナトリウムの存在下で細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、誘導期に酪酸ナトリウムの非存在下にあり、成長期に酪酸ナトリウムの存在下にある細胞培養を介して生成する。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムを、０．０１ｍＭ〜９０ｍＭ、または０．０１ｍＭ〜１６ｍＭの濃度で用いることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムを、０．５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で用いることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムを、培養を開始して６日後に添加する。細胞を、０日目〜１４日目に、または２〜１０日目の任意の日に始めて、好ましくは３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目から開始して、酪酸ナトリウムの存在下で培養することができる。
【０２７０】
本発明によれば、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して、Ｍ３Ｎ２およびＮＡ２の増大を含む。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、ＭＡＮ５の減少を含む。他の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、Ｍ３Ｎ２の減少、および／またはＭ３Ｎ２Ｆの増大、および／またはＮＡ２の減少、および／またはＭＡＮ５の増大を含む。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも２５％減少させることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも３０％増大させることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも７５％減少させることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも７０％増大させることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも７５％減少させることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：１．７：３：１８：１６：２３：２００：４５０とする比を含む。他の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：８：３：４０：８０：５５：５００：１５００とする比を含む。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．１４％のＭ３Ｎ２、０．２４％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．４７％のＮＡ２、２．４９％のＮＡ２Ｆ、２．１９％のＭＡＮ５、３．２６％のＮＧＡ２、２８．６６％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および６２．５５％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．０５％のＭ３Ｎ２、０．４％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．１３％のＮＡ２、１．８３％のＮＡ２Ｆ、４．１１％のＭＡＮ５、２．７７％のＮＧＡ２、２５．３３％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および６５．３８％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における中性グリカンのうちの少なくとも４％または５％を、ＭＡＮ５糖型とすることができる。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約６．０６％の非フコシル化糖型および９３．９４％のフコシル化糖型とする。一部の実施形態では、酪酸ナトリウムの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約７．０６％の非フコシル化糖型および９２．９４％のフコシル化糖型とする。
【０２７１】
本発明は、抗ＦＲＡ抗体を、抗体を発現することが可能な細胞を培養時間の少なくとも一部にわたり低溶存酸素分圧（ＤＯ）で培養することにより生成する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降に低ＤＯで細胞を培養する。他の実施形態では、第１の期間にわたり基準のＤＯで細胞を培養し、第２の期間にわたり低ＤＯで細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、誘導期に基準のＤＯを用い、成長期に低ＤＯを用いる細胞培養を介して生成する。基準のＤＯを、３０〜１００％の範囲とすることができる。例えば、基準の細胞培養培地のＤＯを、３０％〜４０％の間とすることができる。低ＤＯを、０％〜２５％、または５％〜２５％、好ましくは約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％など、５％〜２０％、５％〜１５％、５％〜１０％のＤＯとすることができる。一部の実施形態では、第１の期間にわたりＤＯ分圧を３０％として細胞を培養し、第２の期間にはＤＯ分圧を５％として細胞を培養する。細胞を、２日目〜１０日目の任意の日に始めて、好ましくは３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目など、３日目〜７日目に始めて、低ＤＯで培養することができる。
【０２７２】
本発明によれば、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と比較して、ＮＡ２およびＮＧＡ２の増大を含む。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と比較して、ＮＡ２およびＭ３Ｎ２の増大を含む。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較してＭ３Ｎ２の減少、および／またはＭＡＮ５の減少、および／またはＮＧＡ２の増大、および／またはＮＡ２Ｇ１Ｆの増大、および／またはＮＧＡ２Ｆの減少を含む。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して非フコシル化糖型の増大を含む。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較してＭ３Ｎ２の減少を含む。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも９５％減少させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも２５％減少させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも２倍に増大させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における非フコシル化糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも４０％増大させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２Ｇ１Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも２０％増大させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも１５％減少させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、少なくとも８０％減少させることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：２０：５０：２８０：２２０：６５０：３２００：５５００とする比を含む。他の実施形態では、低ＤＯで培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：８：３０：４０：５５：８０：５５０：１８００とする比を含む。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．０１％のＭ３Ｎ２、０．２２％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．４８％のＮＡ２、２．８％のＮＡ２Ｆ、２．２２％のＭＡＮ５、６．５３％のＮＧＡ２、３１．９８％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および５５．７５％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．０４％のＭ３Ｎ２、０．３１％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．３％のＮＡ２、１．５９％のＮＡ２Ｆ、２．２３％のＭＡＮ５、３．１７％のＮＧＡ２、２１．９％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および７０．４６％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における中性グリカンのうちの少なくとも６％または７％を、ＮＧＡ２糖型とすることができる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体が、約９％または１０％の非フコシル化糖型を含みうる。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約９．２４％の非フコシル化糖型および９０．７５％のフコシル化糖型とする。一部の実施形態では、低ＤＯで培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約５．７４％の非フコシル化糖型および９４．２６％のフコシル化糖型とする。
【０２７３】
本発明はまた、抗ＦＲＡ抗体を、抗体を発現することが可能な細胞を培養時間の少なくとも一部にわたり高ＣＯ２濃度で培養することにより生成する方法も提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降に高ＣＯ２濃度で細胞を培養する。ＣＯ２濃度は、誘導期後に増大させることが好ましい。他の実施形態では、第１の期間にわたり基準のＣＯ２濃度で細胞を培養し、第２の期間にわたり高ＣＯ２濃度で細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、誘導期に基準のＣＯ２濃度を用い、成長期に高ＣＯ２濃度を用いる細胞培養を介して生成する。基準のＣＯ２濃度を、約５％とすることができる。高ＣＯ２濃度を、１０％〜３０％、または１０％〜２０％、すなわち、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％または約３０％とすることができる。一部の実施形態では、第１の期間にわたりＣＯ２濃度を約５％として細胞を培養し、第２の期間にはＣＯ２濃度を最大２０％として細胞を培養する。細胞を、２日目〜１０日目の任意の日に始めて、すなわち、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、または１０日目に始めて、高ＣＯ２濃度で培養することができる。
【０２７４】
本発明によれば、高ＣＯ２濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して、Ｍ３Ｎ２およびＮＡ２の増大とＮＡ２Ｆの減少とを含む。本発明によれば、高ＣＯ２濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較してＮＡ２の減少、および／またはＭＡＮ５の減少を含む。一部の実施形態では、高ＣＯ２濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも６０％減少させることができる。一部の実施形態では、高ＣＯ２濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも４０％減少させることができる。一部の実施形態では、高ＣＯ２濃度で培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：１．５：１：７：８：１６：１００：４００とする比を含む。一部の実施形態では、高ＣＯ２濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．１９％のＭ３Ｎ２、０．２７％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．２３％のＮＡ２、１．３４％のＮＡ２Ｆ、１．６１％のＭＡＮ５、３．０４％のＮＧＡ２、１９．５１％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および７３．８１％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、高ＣＯ２濃度で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約５．０７％の非フコシル化糖型および９４．９３％のフコシル化糖型とする。
【０２７５】
本発明は、抗ＦＲＡ抗体を、抗体を発現することが可能な細胞を培養時間の少なくとも一部にわたり塩化銅（ＣｕＣｌ）の存在下で培養することにより生成する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、０日目を接種日とする場合、０日目以降にＣｕＣｌの存在下で細胞を培養する。他の実施形態では、第１の期間にわたりＣｕＣｌの非存在下で細胞を培養し、第２の期間にわたりＣｕＣｌの存在下で細胞を培養する。例えば、本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、誘導期にＣｕＣｌの非存在下にあり、成長期にＣｕＣｌの存在下にある細胞培養を介して生成する。ＣｕＣｌを、０．０１μＭ〜０．５ｍＭ、または０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの任意の濃度で用いることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌを、０．５ｍＭの濃度で用いる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌを、培養を開始して０日後〜１４日後の任意の日に始めて添加することができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌを、培養を開始して６日後に添加する。
【０２７６】
本発明によれば、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して、Ｍ３Ｎ２、Ｍ３Ｎ２Ｆ、およびＮＡ２の増大を含む。本発明によれば、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、Ｍ３Ｎ２の増大、および／またはＭ３Ｎ２Ｆの増大、および／またはＮＡ２の減少、および／またはＭＡＮ５の減少、および／またはＮＡ２Ｇ１Ｆの増大、および／またはＮＧＡ２Ｆの減少を含む。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも５０％増大させることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも６０％増大させることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも７５％減少させることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも２５％減少させることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２Ｇ１Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも３０％増大させることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８０９−６５）と比較して、少なくとも１０％減少させることができる。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約２：２：１：１７：１４：２５：２２０：４００とする比を含む。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．３４％のＭ３Ｎ２、０．３７％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．１５％のＮＡ２、２．６％のＮＡ２Ｆ、２．１６％のＭＡＮ５、３．８８％のＮＧＡ２、３３．０３％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および５７．４６％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、ＣｕＣｌの存在下で培養した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約６．５３％の非フコシル化糖型および９３．４６％のフコシル化糖型とする。
【０２７７】
本発明によれば、抗ＦＲＡ抗体は、細胞培養を開始して約１０日後（２４０時間後）、１３日後、１４日後（３３６時間後）、１５日後、１７日後（４０８時間後）、または２０日後（４８０時間後）に採取することができる。
【０２７８】
本発明によれば、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して、Ｍ３Ｎ２およびＮＡ２の増大を含む。本発明によれば、１７日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と比較して、Ｍ３Ｎ２、ＮＡ２およびＭＡＮ５の増大を含む。本発明によれば、２０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と比較して、Ｍ３Ｎ２およびＮＡ２の増大を含む。
【０２７９】
本発明によれば、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、Ｍ３Ｎ２の減少、および／またはＭ３Ｎ２Ｆの減少および／またはＭＡＮ５の減少を含む。一部の実施形態では、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、非フコシル化糖型の減少を含む。一部の実施形態では、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、少なくとも８０％減少させることができる。一部の実施形態では、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２Ｆ糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、少なくとも２５％減少させることができる。一部の実施形態では、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＭＡＮ５糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、少なくとも５０％減少させることができる。一部の実施形態では、１０日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における非フコシル化糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、少なくとも２５％減少させることができる。一部の実施形態では、１０日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：６：８：４０：３０：７０：５５０：１８００とする比を含む。一部の実施形態では、１０日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．０４％のＭ３Ｎ２、０．２４％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．３１％のＮＡ２、１．４８％のＮＡ２Ｆ、１．２８％のＭＡＮ５、２．６４％のＮＧＡ２、２２．３３％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および７１．６８％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、１０日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約４．２７％の非フコシル化糖型および９５．７３％のフコシル化糖型とする。
【０２８０】
本発明によれば、１７日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較してＮＡ２の増大を含む。一部の実施形態では、１７日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体におけるＮＡ２糖型の量を、基準の細胞培養条件下で生成した抗ＦＲＡ抗体（ロット番号：ＮＢ８５９−２５）と比較して、少なくとも５０％増大させることができる。一部の実施形態では、１７日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：２：３：１３：２０：１８：１７０：４４０とする比を含む。一部の実施形態では、１７日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．１５％のＭ３Ｎ２、０．３４％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．５１％のＮＡ２、１．９％のＮＡ２Ｆ、３．１６％のＭＡＮ５、２．７７％のＮＧＡ２、２４．８７％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および６６．３％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、１７日後に採取した細胞を介して生成する抗ＦＲＡ抗体における中性グリカンのうちの少なくとも３％または４％を、ＭＡＮ５糖型とすることができる。一部の実施形態では、１７日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約６．５９％の非フコシル化糖型および９３．４１％のフコシル化糖型とする。
【０２８１】
一部の実施形態では、２０日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルが、Ｍ３Ｎ２：Ｍ３Ｎ２Ｆ：ＮＡ２：ＮＡ２Ｆ：ＭＡＮ５：ＮＧＡ２：ＮＡ２Ｇ１Ｆ：ＮＧＡ２Ｆを、約１：１．８：２．５：１０：１９：１７：１４０：４３０とする比を含む。一部の実施形態では、２０日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約０．１６％のＭ３Ｎ２、０．２９％のＭ３Ｎ２Ｆ、０．４％のＮＡ２、１．６６％のＮＡ２Ｆ、２．９６％のＭＡＮ５、２．６４％のＮＧＡ２、２２．４３％のＮＡ２Ｇ１Ｆ、および６９．４５％のＮＧＡ２Ｆとする。一部の実施形態では、２０日後に採取した抗ＦＲＡ抗体の中性Ｎ結合グリカンのプロファイルを、約６．１６％の非フコシル化糖型および９３．８３％のフコシル化糖型とする。
【０２８２】
本発明は、上記の条件のうちの任意の１または複数を用いて抗ＦＲＡ抗体を生成する方法を包含する。
【０２８３】
一実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、抗ＦＲＡの参照基準物質と比べてヒトＦＲＡに対する結合アフィニティーを変化させている。一部の実施形態では、結合アフィニティーを、ＭＯＲＡｂ−００３参照基準物質と比較して低減することができ、かつ、本明細書で定義した基準の培養条件下で生成する抗体（陽性対照）と比較して低減することができる。このような抗体は、本明細書で記載される通り、ガラクトースを糖供給源として用いて、低温で、高い容量オスモル濃度で、酪酸ナトリウムの存在下で、低ＤＯで、高ＣＯ２濃度で、塩化銅の存在下で、抗ＦＲＡ抗体を発現する宿主細胞を培養し、または培養を開始して１０、１７、もしくは２０日後に抗ＦＲＡ抗体を発現する細胞を採取することにより生成することができる。ガラクトースを糖供給源として用いる実施形態では、２ｇ／Ｌのガラクトースを、培養を開始して５日後に添加することができる。低温を用いる実施形態では、培養温度を、培養を開始して５日後に３６．５℃から３０℃へとシフトすることができる。容量オスモル濃度の増大を用いる実施形態では、培養を開始して７日後にＮａＣｌを添加することにより、培養物の容量オスモル濃度を６００ｍＯｓｍ／Ｌへと増大させることができる。溶存酸素分圧の低下（ＤＯ）を用いる実施形態では、ＤＯを、培養を開始して６日後に３０％から５％へと変化させることができる。酪酸ナトリウムを用いる実施形態では、０．５ｍＭまたは１０ｍＭの酪酸ナトリウムを、培養を開始して６日後に添加することができる。塩化銅を用いる実施形態では、０．５ｍＭの塩化銅を、培養を開始して６日後に添加することができる。他の実施形態では、培地中のＣＯ２濃度を、培養を開始して５日後に２０％へと増大させた。
【０２８４】
前出の実施形態のうちのいずれかでは、培養物が、配列番号１もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列、および配列番号２もしくは配列番号６もしくは配列番号７の軽鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞からなることが可能である。特に、細胞は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と９９％同一である軽鎖アミノ酸配列、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列および配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列と少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸を含みうる。一部の実施形態では、重鎖をコードする核酸が、リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある、配列番号８のヌクレオチド配列を含み、軽鎖をコードする核酸が、リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。多様な実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が、配列番号１もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列と、配列番号２もしくは配列番号６もしくは配列番号７の軽鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列とを含む。具体的な実施形態では、抗体が、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と９９％同一である軽鎖アミノ酸配列、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列および配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。
【０２８５】
抗ＦＲＡ抗体の結合アフィニティーは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）などの表面プラズモン共鳴により測定することができる。本明細書で用いられる「表面プラズモン共鳴」という用語とは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、およびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いるバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの生体特異性の相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．ら、Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．、５１巻：１９〜２６頁（１９９３年）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻：６２０〜６２７頁（１９９１年）；Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｂ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８巻：１２５〜１３１頁（１９９５年）；およびＪｏｈｎｓｓｏｎ  Ｂ．ら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８巻：２６８〜２７７頁（１９９１年）を参照されたい。
【０２８６】
抗ＦＲＡ抗体の結合アフィニティーは、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。多様な実施形態では、ヒトＦＲＡへの結合を低減した本発明の抗ＦＲＡ抗体が、配列番号１もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列と、配列番号２もしくは配列番号６もしくは配列番号７の軽鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列とを含む。特に、抗体は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と９９％同一である軽鎖アミノ酸配列、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列および配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。
【０２８７】
ヒトＦＲＡに対する結合アフィニティーを低減した抗ＦＲＡモノクローナル抗体は、がんを処置するのに有用である。理論により拘束されることなく述べると、結合アフィニティーの低減は、内部腫瘍塊のターゲティングを可能とするように、腫瘍へのより深い浸透を可能とすることができる。Ａｄａｍｓら、「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１巻：４７５０〜４７５５頁（２００１年６月１５日）を参照されたい。
【０２８８】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と比べて変化させることができる。一部の実施形態では、ＡＤＣＣを、抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質と比較して増大させる。一部の実施形態では、変化させた培養条件下における培養を介して生成する抗体もまた、基準条件下で生成する抗体（陽性対照）と比較してＡＤＣＣを増大させる。他の実施形態では、ＡＤＣＣを、陽性対照と比較して増大させるが、抗体の参照基準物質と比較して低減する。さらに他の実施形態では、ＡＤＣＣを、陽性対照および抗体の参照基準物質と比較して低減する。ＡＤＣＣを増大させた抗ＦＲＡモノクローナル抗体は、作用方式を、ＦＲＡ発現標的細胞に対する免疫エフェクター機能を誘発すること、例えば、ＦＲＡ発現細胞を死滅させることが所望される疾患および状態を処置することとする療法に有用である。ＡＤＣＣを低減させた抗ＦＲＡモノクローナル抗体は、作用方式を、抗体をターゲティング剤として用いて、細胞傷害性のペイロードを標的細胞に送達することとする療法において有用である。理論により拘束されることなく述べると、ＡＤＣＣ活性を低減して抗体コンジュゲートの局所濃度ならびに抗体の内在化効率を最大化することが所望されうる。ＡＤＣＣに必要であるように、抗体が免疫エフェクター細胞と相互作用すれば、細胞表面における抗体コンジュゲートのアベイラビリティーが低減され、抗体コンジュゲートの有効性が減少することが予測されるであろう。
【０２８９】
本明細書で用いられるＡＤＣＣとは、抗体の免疫エフェクター活性である。ＡＤＣＣは、細胞溶解および／またはＦＲＡ発現標的細胞の死滅をもたらす、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはマクロファージが含まれるがこれらに限定されないエフェクター細胞におけるＦｃ受容体によって媒介されうる。本発明の抗ＦＲＡ抗体のＡＤＣＣは、当技術分野において公知である標準的なアッセイ（例えば、参照によりその全体において組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０２３９９１１号を参照されたい）を用いて測定することができる。例えば、ＦＲＡ発現細胞は、多様な濃度の抗ＦＲＡ抗体（または抗体なしなどの陰性対照もしくは対照Ｉｇ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの活性化したエフェクター細胞に曝露することができる。ＡＤＣＣは、ＦＲＡ発現細胞による細胞溶解時に生じる乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を介してモニタリングすることができる。ＬＤＨの活性は、分光光度アッセイを介して測定することができる。ＡＤＣＣはまた、ＦＲＡ発現細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ  ＳＥ）で標識することによっても測定することができる。次いで、標識された細胞を、抗ＦＲＡ抗体およびＰＢＭＣに由来する標識されていないエフェクター細胞の希釈液と混合する。インキュベーション後、細胞集団を、フローサイトメトリーにより、残存する標識されたＦＲＡ発現生細胞について評価する。
【０２９０】
多様な実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体は、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体（すなわち、抗体の参照基準物質および／または陽性対照）と関連して生じるＡＤＣＣより少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％高度なＡＤＣＣを誘発しうる。他の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体は、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体と関連して生じるＡＤＣＣより少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低度なＡＤＣＣを誘発しうる。
【０２９１】
本発明の方法によれば、本明細書で記載される通り、抗体を発現する宿主細胞を低温または低ＤＯで培養することにより、抗ＦＲＡ抗体のＡＤＣＣを増大させることができる。一部の実施形態では、培養を開始して５日後に、低温を３６．５℃から３０℃へとシフトすることができる。一部の実施形態では、培養を開始して６日後に、ＤＯを３０％から５％へと変化させることができる。他の方法によれば、培養の開始から１３日後以前または１５日後以降に、抗体を培養物から採取することにより、ＡＤＣＣを減少させることができる。
【０２９２】
前出の実施形態のうちのいずれかでは、培養物が、配列番号１もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列、および配列番号２もしくは配列番号６もしくは配列番号７の軽鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞からなることが可能である。特に、細胞は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と９９％同一である軽鎖アミノ酸配列、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列および配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列と少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸を含みうる。一部の実施形態では、重鎖をコードする核酸が、リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある、配列番号８のヌクレオチド配列を含み、軽鎖をコードする核酸が、リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。
【０２９３】
本発明によれば、ＡＤＣＣの増大は、抗ＦＲＡ抗体におけるＮＧＡ２（Ｇ０）グリカンまたは非フコシル化グリカンの量の増大と相関し、抗ＦＲＡ抗体におけるＭ３Ｎ２Ｆグリカンの量と逆相関する。
【０２９４】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、細胞表面においてＦＲＡに結合すると、細胞へと内在化する。このような内在化抗体は、抗毒素、放射性核種、または細胞傷害剤および細胞増殖抑制剤などの化学療法剤にコンジュゲートすることができる。一実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の内在化効率または内在化速度を、基準の培養条件下で生成する抗体と比べて変化させることができる。この文脈では、内在化効率が、抗ＦＲＡ抗体が標的細胞の内部に保持されうる能力を指すのに対し、内在化速度は、抗ＦＲＡ抗体が標的細胞の細胞膜を透過しうる速度を指す。当技術分野で公知の標準的なアッセイを用いてＦＲＡ発現細胞における本発明の抗ＦＲＡ抗体の内在化をモニタリングすることができる（例えば、参照によりその全体において組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０２３９９１１号を参照されたい）。例えば、Ｈｕｍ−ＺＡＰアッセイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの二次抗毒素を用いて本発明の抗ＦＲＡ抗体の内在化をモニタリングすることができる。二次抗毒素とは、ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびリボソーム不活化タンパク質であるサポリンなど、二次抗体のコンジュゲートである。このような二次抗毒素は、それらが本発明の抗ＦＲＡ抗体に結合するように選択することができる。抗ＦＲＡ抗体が内在化されると、サポリンがタンパク質の合成を阻害し、細胞の死滅を引き起こす。本発明の抗ＦＲＡ抗体および二次抗毒素（または陰性対照）に曝露したＦＲＡ発現細胞の細胞生存率は、分光分析を介して生細胞数を読み取る細胞生存率アッセイなど、標準的な細胞生存率アッセイにより測定することができる。
【０２９５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％高度な内在化速度を呈示しうる。内在化速度を増大させた抗ＦＲＡモノクローナル抗体は、例えば、迅速な内在化が良好な薬力学的特性および潜在的に低頻度または低用量の投与と等価でありうる抗体コンジュゲートに有用である。加えて、抗体−抗原複合体を内在化させることにより細胞表面から抗原を除去することが所望される療法では、内在化速度を速めれば、抗原の細胞表面からの除去の効率を増大させることが予測されるであろう。例えば、がん細胞の成長に関与するＦＲＡ媒介性シグナル伝達経路を標的とする療法では、抗ＦＲＡ抗体が、内在化を介して受容体を細胞表面から除去することにより、受容体のシグナル伝達を低減する。
【０２９６】
他の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低度な内在化速度を呈示する。
【０２９７】
内在化速度を低減した抗ＦＲＡモノクローナル抗体は、治療作用方式が細胞内機構およびエフェクター機能の両方を伴う場合に有用でありうる。理論により拘束されることなく述べると、内在化が緩徐な抗ＦＲＡ抗体は、細胞表面に滞留し、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを含めたエフェクター活性の機会を増大させる。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の最大半量の内在化定常状態を、約５７分間または５８分間とすることができる。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の最大半量の内在化定常状態を、約３６分間、３７分間、４１分間、４２分間、４５分間、または４６分間とする。最大半量の内在化定常状態は、ＦＡＣＳ解析を含めた、本明細書で記載される内在化アッセイにより決定することができる。
【０２９８】
一実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体の内在化効率と比較して、内在化効率の低減を呈示しうる。内在化効率を低減した抗ＦＲＡ抗体は、抗体の免疫系へのアベイラビリティーを増大させるのに有用であり、ＡＤＣＣまたは補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）をさらに強化する。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体が、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成する抗ＦＲＡ抗体より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低度な内在化効率を呈示しうる。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の内在化ＩＣ５０を、１６３２ｎｇ／ｍＬまたは９９０ｎｇ／ｍＬとすることができる。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体の内在化ＩＣ５０を、１６３２ｎｇ／ｍＬまたは９９０ｎｇ／ｍＬとする。ＩＣ５０およびＥＣ５０は、本明細書で記載される内在化アッセイにより決定することができる。
【０２９９】
本明細書で記載される通り、内在化速度は、抗ＦＲＡ抗体を発現する宿主細胞を低ＤＯで培養することにより増大させることもでき、抗ＦＲＡ抗体を培養を開始して１７または２０日後に採取することにより増大させることもできる。一部の実施形態では、培養を開始して６日後に、ＤＯを３０％から５％へと変化させることができる。
【０３００】
前出の実施形態のうちのいずれかでは、培養物が、配列番号１もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列、および配列番号２もしくは配列番号６もしくは配列番号７の軽鎖アミノ酸配列または少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞からなることが可能である。特に、細胞は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列と９９％同一である軽鎖アミノ酸配列、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、もしくは配列番号５の重鎖アミノ酸配列および配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列と少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸を含みうる。一部の実施形態では、重鎖をコードする核酸が、リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある、配列番号８のヌクレオチド配列を含み、軽鎖をコードする核酸が、リーダー配列をコードするヌクレオチドを伴う場合もあり、伴わない場合もある、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。
【０３０１】
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗ＦＲＡ抗体、特に、本明細書で記載される特徴の変化のうちの１または複数を伴うＭＯＲＡｂ−００３抗体と、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」とは、生理的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などでありうる。単に例示を目的として述べると、薬学的に許容される担体の一部の例は、水、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのほか、これらの組合せである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組み入れることが好ましいであろう。薬学的に許容される物質のさらなる例は、抗体の保管寿命または有効性を増強する保湿剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤など、保湿剤または少量の補助物質である。
【０３０２】
本発明の抗ＦＲＡ抗体を含む組成物は、被験体への投与に適する任意の形態、例えば、溶液（例えば、注射溶液および注入溶液）、分散液または懸濁液、エアゾール、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム、および座薬など、液体剤形、半固体剤形、および固体剤形でありうる。当業者が理解する通り、形態は、意図される投与方式および治療適用に依存する。一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ組成物が注射溶液または注入溶液の形態であり、例えば、組成物は、ヒトの受動的免疫化に用いられる組成物と類似しうる。好ましい投与方式は、静脈内注入または静脈内注射を介するなど、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与）であるが、また、筋肉内注射または皮下注射、経口経路および鼻腔内経路を介する投与も目論まれる。本発明により目論まれる他の投与方式には、気管支内投与、経粘膜投与、髄腔内投与、滑膜内投与、大動脈内投与、眼内投与、耳内投与、局所投与、および口腔内投与、ならびに腫瘍内投与が含まれる。
【０３０３】
一部の実施形態では、治療用の抗ＦＲＡ抗体組成物は、製造条件下および保存条件下で無菌および安定である。本発明は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適する他の秩序構造として調合された組成物を包含する。本発明の無菌注射溶液は、抗ＦＲＡ抗体を、上記で列挙した１つの成分または成分の組合せを伴う適切な溶媒中に要請される量で組み込んだ後、要請に応じて濾過による滅菌処理を行うことにより調製することができる。本発明の抗ＦＲＡ抗体を含む分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記で列挙した成分に由来する、要請される他の成分を含有する無菌媒体へと組み込むことにより調製することができる。本発明の抗ＦＲＡ抗体を含む無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末に加えて、あらかじめ無菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合は要請される粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより維持することができる。当業者は、本発明の注射用組成物の吸収を延長させるには、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組み入れうることを理解するであろう。
【０３０４】
特定の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、急速な放出に対して抗体を保護する担体と共に、すなわち、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロ封入された送達系を含めた制御放出処方物として調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。当業者には、このような処方物を調製する多くの方法が一般に公知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年）を参照されたい。
【０３０５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を含む組成物が、さらなる活性化合物をさらに含む。特定の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、１または複数のさらなる治療剤、診断剤、または予防剤と共に共調合し、かつ／またはこれらと共に共投与する。限定なしに述べると、治療剤には、異なる微細な特異性を伴う抗ＦＲＡ抗体、他の標的に結合する抗体、非ステロイド系抗炎症剤、鎮痛剤、抗がん剤、ステロイド、抗アレルギー剤、化学療法剤、抗新生物剤、および細胞傷害剤が含まれる。
【０３０６】
本発明によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、腫瘍またはがん細胞の増殖を阻害することが公知である抗体または他の薬剤、例えば、ｅｒｂＢ２受容体、Ｅ−セレクチン、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、およびＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブ））、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、またはＶＥＧＦ受容体３（ＶＥＧＦＲ３）を阻害する抗体または薬剤と共に共調合することができる。
【０３０７】
限定なしに述べると、化学療法剤の例には、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）、およびＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（ボルテゾミブ）などが含まれる。
【０３０８】
より具体的に述べると、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、アルキル化剤と共に共調合することができる。限定なしに述べると、有用なアルキル化剤の例には、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロランブシル、シスプラチン、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）（シクロホスファミド）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、オキサリプラチン（ｏｘａｌａｐｌａｔｉｎ）、ストレプトゾシン、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）（テモゾロミド）、およびチオテパなどが含まれる。
【０３０９】
本発明の抗ＦＲＡ抗体は、代謝拮抗物質と共に共調合することができる。限定なしに述べると、有用な代謝拮抗物質の例には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、ＡＲＡ−Ｃ（登録商標）（シタラビン）、フルダラビン、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、メトトレキサート、およびＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ペメトレキセド）などが含まれる。
【０３１０】
本発明の抗ＦＲＡ抗体を、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤と共に共調合することができる。限定なしに述べると、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（イリノテカンＨＣｌ）、ＳＮ−３８、カンプトテシン、ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）（トポテカン）、エトポシド、テニポシド、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）（エピルビシン）、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、イダルビシン、ミトキサントロン、ラメラリンＤ、およびＨＵ−３３１（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｇａｎら（２００７年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、６巻：１７３〜１８３頁）などが含まれる。
【０３１１】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、およびマイトマイシンＣなどの抗腫瘍抗生剤と共に共調合することができる。
【０３１２】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、有糸分裂阻害剤と共に共調合することができる。有用な有糸分裂阻害剤の非限定的な例には、ＥＭＣＹＴ（登録商標）（エストラムスチン）、ＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標）（イキサベピロン）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標）（ビンブラスチン）、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）（ビンクリスチン）、およびＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）などが含まれる。
【０３１３】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、分化剤と共に共調合することができる。有用な分化剤の非限定的な例には、三酸化ヒ素、レチノイド、トレチノイン、およびＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）などが含まれる。
【０３１４】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾンなどのステロイド化合物と共に共調合することができる。
【０３１５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、ホルモン関連化合物と共に共調合することができる。有用なホルモン関連化合物の非限定的な例には、エストロゲン、プロゲスチン（ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）など）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）、タモキシフェン、トレミフェン、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）（ロイプロリド）、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（ゴセレリン）、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン）、ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）（ビカルタミド）、ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標）（フルタミド）、およびＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）（ニルタミド）が含まれる。
【０３１６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、ＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤と共に共調合することができる。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の非限定的な例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、バルデコキシブ、およびロフェコキシブなどが含まれる。
【０３１７】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、免疫治療剤と共に共調合することができる。有用な免疫治療剤の非限定的な例には、インターフェロン（インターフェロン−アルファなど）、ＢＣＧ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、サリドマイド、レナリドミド、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）などが含まれる。
【０３１８】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、ＭＭＰ阻害剤と共に共調合することができる。例えば、抗ＦＲＡ抗体は、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤またはＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）阻害剤などの抗血管新生剤と共に共調合することができる。好ましいＭＭＰ阻害剤は、関節痛を示さないＭＭＰ阻害剤である。他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（すなわち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）と比べて、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するＭＭＰ阻害剤がより好ましい。本発明において有用なＭＭＰ阻害剤の一部の具体例は、ＡＧ−３３４０、ＲＯ  ３２−３５５５、ＲＳ  １３−０８３０、および以下のリスト：３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−ｅｘｏ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル−］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシ−カルバモイル−シクロブチル）−アミノ］−プロピオン酸；４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；（Ｒ）３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；３−ｅｘｏ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ（ｉｃｙｃｌｏ）［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−ｅｎｄｏ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および（Ｒ）３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミドなどにおいて列挙される化合物；ならびに前記化合物の薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
【０３１９】
一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体を、インテグリン阻害剤と共に共調合することができる。限定なしに述べると、インテグリン阻害剤には、オブツスタチン、ロドセチン、Ｖｉｔａｘｉｎ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、シレンギチド（ＥＭＤ  １２１９７４；Ｍｅｒｃｋ）、Ｓ１３７（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｓ２４７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＪＳＭ６４２７（Ｊｅｒｉｎｉ）が含まれる（例えば、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏｗｎら（２００８年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、１２３巻：２１９５〜２２０３頁；Ｓｔｕｐｐら（２００７年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２５巻：１６３７〜１６３８頁；Ｅｂｌｅら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３７６巻：７７〜８５頁を参照されたい）。
【０３２０】
本発明の組成物には、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の抗ＦＲＡ抗体が含まれうる。「治療有効量」とは、必要な用量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の治療的結果を達成するのに有効な量を指す。治療有効量の抗体または抗体部分は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体部分が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子により変化しうる。治療有効量とはまた、抗体または抗体部分の任意の毒性作用または有害作用を治療的に有益な作用が凌駕する量でもある。「予防有効量」とは、必要な用量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、被験体において予防用量を用いるのは疾患の初期段階の前または疾患の初期段階であるので、予防有効量は、治療有効量より低量でありうる。
【０３２１】
投薬レジメンは、最適の所望の応答（例えば、治療的応答または予防的応答）をもたらすように調整することができる。例えば、単回のボーラスを投与することもでき、複数回に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件が示すのに応じて比例的に用量を低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に調合することがとりわけ有利である。本明細書で用いられる単位剤形とは、哺乳動物被験体を処置するための単一の用量として適する物理的に個別の単位を指し、各単位が、要請される医薬担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）抗ＦＲＡ抗体の固有の特徴および達成される特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するためにこのような抗体を混合することの当技術分野における固有の限界により決定され、これらに直接に依存する。
【０３２２】
本発明の抗ＦＲＡ抗体の治療有効量または予防有効量の例示的で非限定的な範囲は、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜３ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、抗ＦＲＡ抗体を、ｐＨが約５．０〜約６．５の範囲にあり、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの抗体、約１ミリモル〜約１００ミリモルのＴｗｅｅｎ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０またはポリソルベート２０、約１００ミリモル〜約４００ミリモルのトレハロースまたはスクロースから選択されるがこれらに限定されない非還元性糖、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含み、場合によって、キレート化剤に加えて薬学的に許容される抗酸化剤を含む、無菌水溶液としての処方物により投与する。適切な抗酸化剤には、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼ、および白金が含まれるがこれらに限定されない。例えば、組成物は、１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲にあり、特に、約２７ｍＭである濃度でメチオニンを含有しうる。一部の実施形態では、処方物が、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．５、１４０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０による緩衝液中に５ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する。用量値は、緩和される状態の種類および重症度と共に変化しうることに注意されたい。任意の具体的な被験体について、特定の投薬レジメンを、個別の必要および組成物を投与するかまたは投与を監視する担当者の医師としての判断により、ある期間にわたり調整すべきであり、本明細書で示される用量範囲は例示的なものであるにとどまり、特許請求される組成物の範囲または実施を限定することを意図するものではないことをさらに理解されたい。
【０３２３】
本発明の別の態様は、本発明の抗ＦＲＡ抗体またはこのような抗ＦＲＡ抗体を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または医薬組成物に加えて、診断剤または治療剤を包含しうる。キットはまた、診断法または治療法における使用のための指示書のほか、氷、ドライアイス、発泡スチロール、発泡体、プラスチック、セロファン、シュリンクラップ、バブルラップ、段ボール、およびスターチピーナツなどであるがこれらに限定されない梱包材も包含しうる。一実施形態では、キットが、抗体、または抗体および本明細書で記載される方法において用いうる診断剤を含む医薬組成物を包含する。さらに別の実施形態では、キットが、抗体、または抗体および本明細書で記載される方法において用いうる１または複数の治療剤を含む医薬組成物を包含する。
【０３２４】
本発明はまた、哺乳動物におけるがんを阻害するための組成物およびキットであって、ある量の化学療法剤と組み合わせたある量の本発明の抗体を含み、ある量の化合物、塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および化学療法剤が、併せて異常な細胞成長を阻害するのに有効な組成物およびキットにも関する。当技術分野では現在、多くの化学療法剤が公知である。一部の実施形態では、化学療法剤が、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入抗生剤、ケモカイン阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答修飾剤、抗ホルモン剤、例えば、抗アンドロゲン剤、および抗血管新生剤からなる群より選択される。
【０３２５】
診断的方法
本発明の抗ＦＲＡ抗体は、生物学的試料中のＦＲＡまたはＦＲＡ発現細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて検出するのに用いることができる。抗ＦＲＡ抗体は、限定なしに述べると、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈澱が含まれる従来のイムノアッセイにおいて用いることができる。本発明の抗ＦＲＡ抗体を用いてヒトからＦＲＡを検出することができる。
【０３２６】
別の態様では、本発明は、生物学的試料中のＦＲＡを検出する方法を提供する。方法は、生物学的試料を本発明の抗ＦＲＡ抗体と接触させるステップと、結合した抗体を検出するステップとを含む。抗ＦＲＡ抗体は、検出用標識で直接標識することもでき、標識しないでおくこともできる。標識されない抗体を用いる場合は、この抗ＦＲＡ抗体に結合しうる、標識した二次抗体または他の分子を用いてＦＲＡに結合した抗体を検出する。当業者には周知である通り、特定の種およびクラスの一次抗体に特異的に結合することが可能な二次抗体を選択する。例えば、抗ＦＲＡ抗体がヒトＩｇＧを含む場合は、二次抗体を、標識した抗ヒトＩｇＧ抗体とすることができる。限定なしに述べると、抗体に結合しうる他の分子には、それらの両方が、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏから市販されている、プロテインＡおよびプロテインＧが含まれる。
【０３２７】
抗体に適切な標識または第２の分子が開示されており、これらには、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁気作用物質、および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｏ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン−ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、磁気作用物質の例にはガドリニウムが含まれ、適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが含まれる。
【０３２８】
本発明の抗ＦＲＡ抗体を用いて、組織に由来する異形成細胞など、組織または細胞におけるＦＲＡの存在および／またはレベルを決定することができる。組織は、腫瘍またはその生検などの疾患組織でありうる。細胞は、例えば、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、または肺がん細胞でありうる。検出は、組織試料中で行うこともでき、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともできる。本発明の抗ＦＲＡ抗体を本発明に従って用いて、上記で論じた方法を介して、組織におけるＦＲＡ、ＦＲＡの細胞表面レベル、またはＦＲＡの局在化を検出および／または定量化することができる。
【０３２９】
また、本発明の抗体、とりわけ、ヒト化抗体をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて用いて、組織および器官、例えば、ＦＲＡ発現腫瘍においてＦＲＡを検出することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＦＲＡを検出するには、標識した抗ＦＲＡ抗体を、このような診断検査を必要とする患者に投与し、患者をＦＲＡ発現組織の場所を決定するための画像解析にかける。医療技術分野では、画像解析が周知であり、限定なしに述べると、これには、ｘ線解析、核磁気造影（ＭＲＩ）、またはコンピュータ断層撮影（ＣＥ）が含まれる。本方法の別の実施形態では、腫瘍または組織の生検を患者から得て、それがＦＲＡを発現するかどうかを決定する。造影では、抗ＦＲＡ抗体を、患者において造影されうる検出用薬剤で標識することができる。例えば、抗ＦＲＡ抗体は、ｘ線解析に用いられうるバリウムなどの造影剤、またはＭＲＩまたはＣＥに用いられうるガドリニウムキレートなどの磁気造影剤で標識することができる。限定なしに述べると、他の標識剤には、９９Ｔｃなどの放射性同位元素が含まれる。本発明によれば、抗ＦＲＡ抗体はまた、標識しないでおくことも可能であり、造影は、検出可能であり抗ＦＲＡ抗体に結合しうる二次抗体または他の分子を投与することを介する。
【０３３０】
治療法
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＦＲＡ抗体を治療に用いる方法を提供する。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＲＡ発現細胞の成長、増殖、または生存を低減するステップを包含する。本発明は、それを必要とする被験体におけるがんを処置する方法であって、被験体に本発明の抗ＦＲＡモノクローナル抗体を投与するステップを含む方法をさらに提供する。多様な実施形態では、がんが、卵巣がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、脳のがん、卵管がん、もしくは子宮がん、または白血病である。本発明はまた、それを必要とする被験体におけるＦＲＡの発現の増大と関連する異形成細胞の成長を低減する方法であって、被験体に本発明の抗ＦＲＡモノクローナル抗体を投与するステップを含む方法も提供する。多様な実施形態では、異形成細胞が、卵巣がん細胞、乳がん細胞、腎臓がん細胞、結腸直腸がん細胞、肺がん細胞、子宮内膜がん細胞、脳がん細胞、卵管がん細胞、子宮がん細胞、または白血病細胞である。好ましい実施形態では、被験体がヒトである。
【０３３１】
一実施形態では、本発明は、ＦＲＡ活性を阻害する方法であって、ＦＲＡ発現細胞を抗ＦＲＡ抗体と接触させるかまたはこれに曝露するステップを含む方法を提供する。方法によっては、抗ＦＲＡ抗体を、それを必要とする被験体に投与する。被験体は、異形成またはＦＲＡ発現の増大を特徴とする疾患または状態を患っている可能性がある。非限定的な例には、がん、腫瘍の成長、および過剰増殖性障害が含まれる。被験体は、ヒト被験体の場合もあり、ヒト疾患の非ヒト動物モデルを含めた獣医学的被験体の場合もある。抗ＦＲＡ抗体は、異形成またはＦＲＡ発現の増大を特徴とする状態を処置するための薬物の製造において用いることができる。
【０３３２】
本発明の方法によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体は、そのまま投与することもでき、被験体への投与に適する医薬組成物へと組み込むこともできる。医薬組成物は、生理的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など、薬学的に許容される担体を含みうる。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１または複数のほか、これらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に組み入れることが好ましいであろう。保湿剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの保湿物質または少量の補助物質など、薬学的に許容される物質は、抗体または抗体部分の保管寿命または有効性を増強する。
【０３３３】
抗ＦＲＡ抗体は、１回で投与することもでき、複数回にわたり投与することもできる。複数回投与を用いる場合、複数回投与は、毎日複数回投与の場合もあり、毎週複数回投与の場合もあり、毎月複数回投与の場合もあり、毎日複数回投与を含む任意の適切な間隔を置いた複数回投与の場合もある。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日１回、３日間ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、および６カ月ごとに１回などのスケジュールで行うことができる。抗ＦＲＡ抗体はまた、例えば、ミニポンプを介して持続的に投与することもできる。抗ＦＲＡ抗体は、例えば、経粘膜経路、口腔内経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、非経口経路、または腫瘍内経路を介して投与することができる。抗ＦＲＡ抗体は、１回、少なくとも２回、または少なくとも状態が処置されるか、緩和されるか、または治癒するまでの時間にわたり投与することができる。抗ＦＲＡ抗体は一般に、状態が見られる限り、または状態の再発を防止するために、それより長期間にわたり投与する。上記で説明した通り、抗ＦＲＡ抗体は一般に、医薬組成物の一部として投与する。抗ＦＲＡ抗体の用量は一般に、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ、およびなおより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とする。抗ＦＲＡ抗体の血清濃度は、当技術分野で公知である任意の方法を介して測定することができる。
【０３３４】
別の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体を、別の抗ＦＲＡ抗体を含めた別の治療剤と共に共投与することができる。さらなる治療剤はまた、一本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子を含めたＲＮＡ干渉を介してＦＲＡの発現を低減するオリゴヌクレオチドでもありうる。がんまたは腫瘍などの過剰増殖性障害を患う被験体の場合は、さらなる治療剤を抗新生物剤とすることができる。一態様では、本発明は、それを必要とする被験体における過剰増殖性障害を処置する方法であって、前記被験体に、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物質、挿入剤、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答修飾剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、遺伝子治療剤、抗アンドロゲン剤、抗新生物剤、および細胞傷害剤からなる群より選択されるがこれらに限定されない抗腫瘍剤と組み合わせた治療有効量の本発明の抗ＦＲＡ抗体を投与するステップを含む方法に関する。別の好ましい実施形態では、抗ＦＲＡ抗体または組合せ療法を、放射線療法、化学療法、光力学療法、手術、または他の免疫療法と共に投与する。
【０３３５】
本発明によれば、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、腫瘍またはがん細胞の増殖を阻害することが公知である抗体または他の薬剤、例えば、ｅｒｂＢ２受容体、Ｅ−セレクチン、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、およびＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブ））、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、またはＶＥＧＦ受容体３（ＶＥＧＦＲ３）などを阻害する抗体または薬剤と共に投与することができる。
【０３３６】
本発明の抗ＦＲＡ抗体は、限定なしに述べると、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）、およびＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（ボルテゾミブ）などが含まれる化学療法剤と共に共投与することができる。
【０３３７】
より具体的に述べると、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、アルキル化剤と共に共投与することができる。限定なしに述べると、有用なアルキル化剤の例には、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロランブシル、シスプラチン、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）（シクロホスファミド）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、オキサリプラチン、ストレプトゾシン、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）（テモゾロミド）、チオテパなどが含まれる。
【０３３８】
本発明の抗ＦＲＡ抗体は、代謝拮抗物質と共に共投与することができる。限定なしに述べると、有用な代謝拮抗物質の例には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、ＡＲＡ−Ｃ（登録商標）（シタラビン）、フルダラビン、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、メトトレキサート、ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ペメトレキセド）などが含まれる。
【０３３９】
本発明の抗ＦＲＡ抗体を、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤と共に共投与することができる。限定なしに述べると、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（イリノテカンＨＣｌ）、ＳＮ−３８、カンプトテシン、ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）（トポテカン）、エトポシド、テニポシド、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）（エピルビシン）、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、イダルビシン、ミトキサントロン、ラメラリンＤ、ＨＵ−３３１（Ｋｏｇａｎら（２００７年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、６巻：１７３〜１８３頁）などが含まれる。
【０３４０】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣなどの抗腫瘍抗生剤と共に共投与することができる。
【０３４１】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、有糸分裂阻害剤と共に共投与することができる。有用な有糸分裂阻害剤の非限定的な例には、ＥＭＣＹＴ（登録商標）（エストラムスチン）、ＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標）（イキサベピロン）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標）（ビンブラスチン）、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）（ビンクリスチン）、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）などが含まれる。
【０３４２】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、分化剤と共に共投与することができる。有用な分化剤の非限定的な例には、三酸化ヒ素、レチノイド、トレチノイン、およびＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）などが含まれる。
【０３４３】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンなどのステロイド化合物と共に共投与することができる。
【０３４４】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、ホルモン関連化合物と共に共投与することができる。有用なホルモン関連化合物の非限定的な例には、エストロゲン、プロゲスチン（ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）など）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）、タモキシフェン、トレミフェン、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）（ロイプロリド）、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（ゴセレリン）、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン）、ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）（ビカルタミド）、ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標）（フルタミド）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）（ニルタミド）などが含まれる。
【０３４５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、ＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤と共に共投与することができる。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の非限定的な例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、バルデコキシブ、ロフェコキシブなどが含まれる。
【０３４６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、免疫治療剤と共に共投与することができる。有用な免疫治療剤の非限定的な例には、インターフェロン（インターフェロン−アルファなど）、ＢＣＧ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、サリドマイド、レナリドミド、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）が含まれる。
【０３４７】
一部の実施形態では、本発明の抗ＦＲＡ抗体を、ＭＭＰ阻害剤と共に共投与することができる。例えば、抗ＦＲＡ抗体は、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤またはＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）阻害剤などの抗血管新生剤と共に共投与することができる。好ましいＭＭＰ阻害剤は、関節痛を示さないＭＭＰ阻害剤である。他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（すなわち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）と比べて、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するＭＭＰ阻害剤がより好ましい。本発明において有用なＭＭＰ阻害剤の一部の具体例は、ＡＧ−３３４０、ＲＯ  ３２−３５５５、ＲＳ  １３−０８３０、および以下のリスト：３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−ｅｘｏ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル−］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシ−カルバモイル−シクロブチル）−アミノ］−プロピオン酸；４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；（Ｒ）３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；３−ｅｘｏ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−ｅｎｄｏ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および（Ｒ）３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミドにおいて列挙される化合物；ならびに前記化合物の薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
【０３４８】
一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体を、インテグリン阻害剤と共に共投与することができる。限定なしに述べると、インテグリン阻害剤には、オブツスタチン、ロドセチン、Ｖｉｔａｘｉｎ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、シレンギチド（ＥＭＤ  １２１９７４；Ｍｅｒｃｋ）、Ｓ１３７（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｓ２４７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＪＳＭ６４２７（Ｊｅｒｉｎｉ）が含まれる（例えば、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏｗｎら（２００８年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、１２３巻：２１９５〜２２０３頁；Ｓｔｕｐｐら（２００７年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２５巻：１６３７〜１６３８頁；Ｅｂｌｅら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３７６巻：７７〜８５頁を参照されたい）。
【０３４９】
本発明の抗ＦＲＡ抗体のさらなる治療剤（組合せ療法）との共投与は、抗ＦＲＡ抗体およびさらなる治療剤を含む医薬組成物を投与するステップのほか、２つ以上の別個の医薬組成物：抗ＦＲＡ抗体を含む医薬組成物およびさらなる治療剤（複数可）を含む他の医薬組成物（複数可）を投与するステップも包含する。さらに、共投与または組合せ療法は、同時的もしくは逐次的に、またはこれらの両方で投与される抗ＦＲＡ抗体およびさらなる治療剤を包含する。例えば、抗ＦＲＡ抗体を３日間ごとに１回投与しうる一方、さらなる治療剤は、毎日１回抗ＦＲＡ抗体と同時に、または異なる時点に投与する。抗ＦＲＡ抗体は、さらなる治療剤による処置の前に投与することもでき、その後で投与することもできる。同様に、本発明の抗ＦＲＡ抗体の投与は、放射線照射、手術、身体運動、レーザー療法を含めた光線療法、および栄養補助食品を含めた他の処置モダリティーを包含する処置レジメンの一部でありうる。組合せ療法を投与して、状態の再発を防止することができる。組合せ療法は、複数回にわたり投与することが好ましい。組合せ療法は、毎日３回〜６カ月ごとに１回投与することができる。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日１回、３日間ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、および６カ月ごとに１回などのスケジュールで行うこともでき、例えば、ミニポンプを介して持続的に投与することもできる。組合せ療法は、例えば、経口経路、経粘膜経路、口腔内経路、鼻腔内経路、吸入経路、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、または非経口経路を介して投与することができる。
【０３５０】
一実施形態では、抗ＦＲＡ抗体を、ｐＨを約５．０〜約８．０、好ましくは約６．５〜約７．５、およびより好ましくは約７．０〜約７．２の範囲とする無菌水溶液としての処方物により投与する。処方物は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの抗体を含みうる。処方物は、約１ミリモル〜約１００ミリモルのＴｗｅｅｎ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、約１００ミリモル〜約４００ミリモルのトレハロース、および約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含みうる。好ましい実施形態では、抗体を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２、０．０１％のＵＳＰグレードのＴｗｅｅｎ  ８０中に抗体を５．０±０．５ｍｇ／ｍＬとする処方物により投与する。
【０３５１】
なおさらなる実施形態では、抗ＦＲＡ抗体を、放射性標識、抗毒素、または毒素で標識するか、または細胞傷害性ペプチドを含む融合タンパク質とする。抗ＦＲＡ抗体または抗ＦＲＡ抗体の融合タンパク質は、放射性標識、抗毒素、毒素、または毒性ペプチドを、ＦＲＡ発現腫瘍細胞またはＦＲＡ発現がん細胞へと方向付ける。好ましい実施形態では、抗ＦＲＡ抗体が腫瘍細胞またはがん細胞の表面におけるＦＲＡに結合した後で、放射性標識、抗毒素、毒素、または毒性ペプチドを内在化させる。
【０３５２】
本明細書で記載される実施例および実施形態は、例示だけを目的とするものであり、当業者には、これに照らした多様な改変または変化が明らかであり、これらは、本発明の真の範囲内に包含されるものとし、本発明の真の範囲から逸脱しない限りにおいてこれらを行いうることが理解される。
【実施例】
【０３５３】
（実施例１）
変化させる条件下で培養した抗ＦＲＡ抗体の培養および精製
配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号７の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗ＦＲＡ抗体を生成するＣＨＯ−Ｋ１細胞を極低温保存から回復させ、表１に示される条件下で継代培養した。接種物の増殖および継代培養は、１２５ｍＬおよび５００ｍＬの振とうフラスコにより実施した。
【０３５４】
【表１】
2014505012.tif 000002
回復および継代培養の後、細胞を、多様な実験的な細胞培養条件の変化および陽性対照を伴う２Ｌの撹拌タンク型生成用バイオリアクター（Ｂ−ＤＣＵ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）による流加培養で培養した（表２および３）。
【０３５５】
【表２】
2014505012.tif 000003
【０３５６】
【表３】
2014505012.tif 000004
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の培養物は、以下の通りに精製した。ＭＯＲＡｂ−００３を分泌する細胞に由来する条件付け培養培地（各条件について１．５Ｌずつ）を、遠心分離（１０，０００ｇ、２０分間）を介して清明化させた。結果として得られる上清を、０．２２ｍｍの膜を介して濾過した。条件付け培地中のＭＯＲＡｂ−００３抗体を、ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ  １００Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の補助を伴うプロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーを介して精製した。略述すると、ＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ（型番：１１３１１５８３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填した、ベッド容量を２０ｍＬとするカラムを、ＰＢＳ（０．０２Ｍのリン酸カリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で平衡化した。清明化させた後、ＭＯＲＡｂ−００３を含有する条件付け培地を、５．０ｍＬ／分の流速でカラムへと投入した。樹脂を、１２カラム容量（ＣＶ）にわたりＰＢＳで洗浄した後、３．５ＣＶの溶出緩衝液（１０ｍＭの酢酸、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．８）を用いて、結合したＭＯＲＡｂ−００３抗体を溶出させた。樹脂を、６Ｍの塩酸グアニジン２ＣＶで洗浄した。投入するステップを除く全てのステップにおける流速は、７．０ｍＬ／分とした。プールされた溶出画分は、カットオフを１０ｋＤａとするＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｐｌｅａｔｅｄ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ（型番：６８１００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、４℃で約１５時間にわたり、２ＬのＰＢＳに対して透析した。
【０３５７】
（実施例２）
変化させる条件下で培養した抗ＦＲＡ抗体のグリカンプロファイリング
実施例１で記載した通りにＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体を培養および精製した後で、抗体において見い出される中性Ｎ結合複合体の炭水化物構造を、以下の通りに除去、分離、同定、および定量化した。変化させる条件下で培養した抗ＦＲＡ抗体の試料に割り当てたロット番号を、表４に示す。ＭＯＲＡｂ−００３抗体の重鎖におけるＮ結合グリカンを、ペプチジル−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）を用いて酵素的に除去し、ゲル濾過クロマトグラフィーを介して精製した。結果として得られるグリカン混合物を、２−アミノベンザミド（２−ＡＢ）を用いて蛍光標識し、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ８０−Ａｍｉｄｅカラムを用いる順相ＨＰＬＣを介して分解した。蛍光標識したグリカンは、蛍光（励起波長：３３０ｎｍ／発光波長：４２０ｎｍ）を介して定量化した。分離時に生じるピークに由来するグリカンの同定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器を全イオンクロマトグラムモードまたは抽出イオンクロマトグラムモードで用いる直列型質量分析による検出を介して達成した。回収されたグリカン構造の概略図を図１に示す。
【０３５８】
【表４】
2014505012.tif 000005
ロットＮＢ８５９−２５は、陽性対照ロットであるＮＢ８１０−１０およびＮＢ８０９−６５に用いられる条件下で増殖させた培養物に由来した。ロットＮＢ８５９−２５は、実験結果をラウンド３で生成した他のロットと比較するための陽性対照として指定した。
【０３５９】
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料中の主要な中性Ｎ結合グリカンの分布についての予備的結果を図２に示す。ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料中の中性グリカンの分布についてのさらなる結果を図３に示す。「ＭＯＲＡｂ−００３参照基準物質」とは、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体である。
【０３６０】
（実施例３）
抗ＦＲＡ抗体の結合アフィニティーの、抗体の培養条件およびグリカンの構造との相関
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料の相対結合アフィニティーを、表面プラズモン共鳴分光法を介して決定した。組換えヒト葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）（配列番号３）を、アミン結合反応を介して研究グレードのＣＭ５チップ表面に固定化した。０．０２〜４４ｍｇ／ｍＬの範囲の、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質の希釈液または変異体試料調製物を表面上に連続注入し、４０秒間にわたり会合の進行を可能とした後で、結合レベルを測定した。サイクル間には、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０でフラッシュすることにより表面を更新した。ＭＯＲＡｂ−００３濃度の関数としての結合レベルを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、参照基準物質および全ての試料についてプロットした。データを、５パラメータのロジスティック曲線近似に照らして近似し、参照基準物質と比較した各試料の相対結合効力を、ＳＴＡＴＬＩＡ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２（Ｂｒｅｎｄａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる平行線解析を介して決定した。結果を図４に示す。「測定された効力」欄の結果を計算するため、参照基準物質の結合効力を１００％と定めた。陽性対照を含めた全ての培養条件による結合アフィニティーが、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給するＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体と比較して低かった。
【０３６１】
（実施例４）
抗ＦＲＡ抗体のＡＤＣＣの、抗体の培養条件およびグリカンの構造との相関
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料を介するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を、以下の通りに測定した。ＦＲＡ発現ＩＧＲＯＶ−１ヒト卵巣腺がん細胞（Ｂｅｒｎａｒｄら（１９８５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４巻：４９７０〜４９７９頁）を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ  ＳＥ）で標識した。標識された細胞を、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から誘導した標識されていないエフェクター細胞の希釈液と混合した。４時間のインキュベーション後、細胞集団を、残存する標識されたＩＧＲＯＶ−１生細胞についてのフローサイトメトリーを介して評価した。ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の変異体試料ロットで処置した後で残存する細胞画分を、同一濃度の、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質調製物で処置した細胞の画分と比較した。結果を図５に示す。「測定された効力」欄の結果を計算するため、参照基準物質のＡＤＣＣを１００％と定めた。「相対効力」欄の結果を計算するため、２つの陽性対照の測定されたＡＤＣＣの平均を１００％と定めた。
【０３６２】
低温および低ＤＯの細胞培養条件は、ＮＧＡ２（Ｇ０）グリカンの百分率が高いＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体のアイソフォームをもたらした。ＮＧＡ２（Ｇ０）グリカンの存在は、ＡＤＣＣの増大と相関した（図６）。この相関は、統計学的に有意であった。
【０３６３】
非フコシル化グリカンの存在は、ＡＤＣＣの増大と相関した（図７）。この相関は、統計学的に有意であった。
【０３６４】
Ｍ３Ｎ２Ｆグリカンの存在は、ＡＤＣＣの増大と逆相関した（図８）。
【０３６５】
（実施例５）
抗ＦＲＡ抗体の内在化活性の、抗体の培養条件およびグリカンの構造との相関
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料の内在化活性を、抗ヒト二次抗毒素を用いるＦＲＡ発現細胞の殺滅度を介して評価した。ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料の希釈液と、細胞傷害性の植物タンパク質であるサポリン（Ｈｕｍ−ＺＡＰ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）にコンジュゲートした一定量のヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とを、ウェル１つ当たりのヒトＦＲＡ発現ＩＧＲＯＶ−１細胞２，０００個を含有する９６ウェルの組織培養処理用マイクロ滴定プレートのウェルへと添加した。抗原が結合してＭＯＲＡｂ−００３−Ｈｕｍ−ＺＡＰ複合体が内在化する結果として、ＭＯＲＡｂ−００３依存的な形での細胞毒素のＩＧＲＯＶ−１細胞内への放出がもたらされる。したがって、内在化したＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の画分は、ＩＧＲＯＶ−１細胞の殺滅度に基づいて評価することができる。ＩＧＲＯＶ−１細胞の増殖は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いる、残存する生細胞のＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂｌｕｅ染色を介して測定した。データ（ＯＤ５４０対ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の濃度）は、５パラメータのロジスティック曲線近似アルゴリズムに照らして近似した。ＩＧＲＯＶ−１細胞の５０％の殺滅を結果としてもたらすＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の濃度（ＩＣ５０）は、各曲線について測定した曲線近似パラメータから計算した（図９および図１０を参照されたい）。
【０３６６】
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料の内在化活性はまた、ＦＡＣＳを介しても測定した。ヒトＦＲＡ発現ＩＧＲＯＶ−１細胞を、１μｇ／ｍＬのＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料と共に４℃で３０分間にわたりインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を、４０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共に４℃で３０分間にわたりインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を、３７℃で所与の時間にわたりインキュベートして、内在化を開始させた。細胞を、４℃で酸性のグリシン緩衝液で洗浄して、膜結合した全ての抗体を除去した。酸性のグリシン緩衝液による洗浄後、４℃の細胞についてフローサイトメトリーを実施した。細胞膜内に内在化された抗体だけが、酸性の洗浄後においても保持され、蛍光シグナルをもたらすので、全ての実験において、内在化は、時間依存的な平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増大として定義した。
【０３６７】
図１１は、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質により実施したＦＡＣＳによる結合実験の結果についてのヒストグラムを示す。影を付した領域（Ｐ１集団）は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした細胞に対応する。Ｐ２集団（０％の対照）は、対照としての非関与のヒトＩｇＧおよびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした細胞に対応する。Ｐ３集団は、抗ＦＲＡ抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、酸性のグリシン緩衝液で洗浄した細胞に対応する。Ｐ４集団（１００％の対照）は、抗ＦＲＡ抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液により洗浄した細胞に対応する。
【０３６８】
ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の内在化百分率は、以下：
（（ＭＦＩ［試料］−ＭＦＩ［０％の対照］）／（ＭＦＩ［１００％の対照］−ＭＦＩ［０％の対照］））×１００
の通りに、相対蛍光強度から計算した。
【０３６９】
図１２は、時間と、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質の、ＩＧＲＯＶ−１細胞による内在化との間の関係を示す。ｙ軸は、ある時間（ｘ軸）にわたり、ＩＧＲＯＶ−１細胞集団についてのフローサイトメトリーを介して測定したＭＦＩの、各時点における全結合と比べた百分率を表す。図１３は、時間と、表４で記載されるＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料のほか、本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質の、ＩＧＲＯＶ−１細胞による内在化との間の関係を示し、「ＭＯＲＡｂ−００３ｒｅｆ  ｓｔｄ」と表示された３つの試料は、ＦＡＣＳ実験の異なる試行において用いられる同じバッチの抗体を表す。図１４は、図１３におけるデータの、４パラメータのロジスティック曲線への非線形回帰を介する近似を示す。結果として得られるＥＣ５０曲線の近似パラメータを用いて、図１５にデータを追加した。
【０３７０】
図１５は、ＦＡＣＳによるＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体試料の内在化研究の結果をまとめ、ＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０が低値であれば、迅速な内在化が示される。本明細書で定義した「基準の培養条件」下で生成し、外部の製造元が供給する、ＭＯＲＡｂ−００３抗ＦＲＡ抗体の参照基準物質は、約２時間（１２０分間）で内在化のピークに達した。試料ＮＢ８５９−２６およびＮＢ８５９−２７（培養の１７および２０日後における生成物）のＥＣ５０値が低いことから、陽性対照より迅速な内在化過程が示される。また、試料ＮＢ８５９−２８（低溶存酸素で処置した培養物）も、陽性対照より迅速な内在化過程を示した。
【０３７１】
図１６は、実施例３、４、および５で記載される活性データをまとめる。
【０３７２】
本明細書で別段に定義しない限り、本発明との関連で用いられる科学技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段に要請されない限り、単数形の用語は、複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。一般に、本明細書で記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で用いられる専門用語およびこれらの技法は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる専門用語および技法である。
【０３７３】
別段に示さない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、本明細書の全体で引用されて論じられている多様な一般的参考文献およびより特殊な参考文献で記載されている、従来の方法を介して実施する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００３年）を参照されたい。酵素反応法および精製法は、当技術分野で一般に達成されるか、または本明細書で記載される通り、製造元の仕様により実施する。本明細書で記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬化学との関連で用いられる専門用語、ならびにこれらの実験手順および実験法は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる専門用語ならびに実験手順および実験法である。
【０３７４】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、または他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が、全ての目的について、参照により、組み込まれることが個別に示されたと仮定した場合と同程度に、全ての目的について、参照により、それらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０３７５】
本明細書および実施形態の全体において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変化形は、言及された整数または整数群の包含を含意するものであり、他の任意の整数または整数群の除外を含意するものではないことが理解される。
【０３７６】
【表５−１】
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【０３７７】
【表５−２】
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【０３７８】
【表５−３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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