(57)【要約】  主題発明は、ヤリセンチュウに対して殺線虫活性がある、新規かつ有利なパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）細菌株を提供する。主題発明は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２と称される新規細菌培養物、およびその変異株または変種を提供する。パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株またはその変異株または変種を含んでなる殺線虫組成物、そして植物病原性および土壌棲息線虫を処理するためのその使用もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受入番号ＳＤ−５８３２として寄託された単離パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株、または前記寄託株の殺線虫活性変異株または変種。
【請求項２】
前記寄託株の変種であり、前記変種が、前記寄託株の１６ＳｒＤＮＡ配列、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ配列、ｓｐｏＩＩＡＢ配列、ＡＴＰシンターゼｂサブユニット配列、ａｔｐＦ配列、およびａｔｐＡ配列からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列、およびその断片を有する、請求項１に記載の単離パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株。
【請求項３】
前記変種が、前記寄託株の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９８％同一であるポリヌクレオチド配列、またはその断片を有する、請求項１に記載の単離パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受入番号ＳＤ−５８３２として寄託された、請求項１に記載の単離パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株。
【請求項５】
ホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ  ｇａｌｅａｔｕｓ）に対して活性である、請求項１に記載の単離パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株。
【請求項６】
請求項１に記載の殺線虫性有効量のパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株と、農業用担体とを含んでなる殺線虫組成物。
【請求項７】
前記担体が種子処理剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
線虫を殺線虫性有効量の請求項１に記載のパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株に接触させるステップを含んでなる、線虫を防除する方法。
【請求項９】
前記線虫がホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ  ｇａｌｅａｔｕｓ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サヤインゲン、芝草、甘藷、トマト、綿、トウモロコシ、大豆、オクラ、レタス、カボチャ、野菜、パイナップル、茶、小麦、大麦、稲、落花生、サトウキビ、ソルガム、タバコ、およびカノーラからなる群から選択される作物を保護するのに使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記作物が芝草である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株が土壌に施用される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての図、表または図面を含む、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／４１１，６１３号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
植物寄生性線虫によって引き起こされる、世界的な作物損失は、毎年１０００億ドルを越える。この損傷の防止は、著しい難題である。その一方で、最も広く使用される殺線虫剤の１つである燻蒸剤、臭化メチルの使用と生産は、臭化メチルのオゾン枯渇効果のため、モントリオール協定によって顕著に削減されている。現在のところ、線虫防除のための新しい合成化合物を開発して、登録するには十分な時間がない。したがって線虫を効果的に防除する、材料と方法が緊急に必要とされる。
【０００３】
植物病原性の線虫は、厚い不透過性の角皮、または外被に覆われており、感覚ニューロンが非常にわずかしかないため、防除するのが特に困難である。多くの害虫防除化合物は神経毒として作用するので、植物病原性線虫が露出するニューロン数が少ないことにより、殺線虫化合物が有効な標的領域が減少し、結果的に神経毒性の極めて高い殺線虫化合物が開発されてきた。
【０００４】
さらに植物病原性線虫は、土壌または植物根の中に認められるために、植物病原性線虫の防除剤への曝露は達成し難く、また地下水面をこれらの毒性化合物による汚染の危険にさらすことになる。神経毒ベースの殺線虫剤の使用によって、地下および地表水の双方が汚染される。その結果、これらの化合物の多くは、公衆衛生上の理由により市場から撤去されつつある。
【０００５】
ホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ  ｇａｌｅａｔｕｓ）としてもまた知られているヤリセンチュウは、芝草に対して経済的に最も損害を与える線虫である。ヤリセンチュウは、前端を、または時には全身を根の中に埋没させることで、植物の根系に大規模な損傷を引き起こす。それらは根を餌にするだけでなく、根系に傷口を作り、したがって植物は、その他の病原性生物の影響をより受けやすくなる。
【０００６】
ヤリセンチュウは、芝草、綿、ササゲ、甘藷、大豆、パイナップル、茶、落花生、小麦、米、サトウキビ、ソルガム、タバコ、およびトマトやオクラやカボチャやレタスなどの様々な野菜をはじめとする、多種多様な植物種の根に寄生する。ヤリセンチュウの病原性は、農業および造園に多大な影響を及ぼしている。例えば、それらはニューイングランドからフロリダに至る米国の東海岸に沿って、そしてミシシッピ川流域で、国際的にはカナダ、インド、タンザニア、中南米で、芝草に甚だしい損傷を引き起こす。
【０００７】
栽植に先だつ土壌の燻蒸は、線虫を防除するための一般的な方法である。最も一般的な燻蒸剤の１つである臭化メチルは、そのオゾン破壊特性のために使用廃止が予定されている。さらにこの土壌燻蒸の実施によって、土壌中の生物が無差別に殺滅され、有益な微生物が排除されるリスクがある。環境に無害である効果的な殺線虫剤の全市場は、世界ベースで１０億ドル近いと推定される。
【０００８】
パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）は、１８８８年にＭｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆ（Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  ｌ’ｌｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ２：１６５−１７０）によって、ミジンコの寄生生物として初めて記載された。引き続いてＣｏｂｂは、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）の線虫ドリライムス・ブルビフェロス（Ｄｏｒｙｌａｉｍｕｓ  ｂｕｌｂｉｆｅｒｏｕｓ）による感染症について記載した（２nd  ｅｄ．Ｈａｗａｉｉａｎ  Ｓｕｇａｒ  Ｐｌａｎｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃ．，Ｅｘｐｔ．Ｓｔａ．Ｄｉｖ．Ｐａｔｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．５：１６３−１９５，１９０６）。
【０００９】
本細菌の生活環は、土壌中の線虫の角皮に内生胞子が結合することに始まる。パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）は線虫の体内で増殖し、菌糸体構造および葉状体を含め、内生胞子の発生で完結する、いくつかの実証された形態学的相を経る。内生胞子は、線虫の虫体溶解時に放出される。
【００１０】
線形動物体内の細菌の成長によって、線虫による産卵が低下しまたは排除され、線虫の繁殖率が著しく制限される。宿主作物の経済的被害は、線虫の第一世代の子孫によって通常与えられ、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）によって植物の根域における線虫の子孫の密度が低下することにより予防される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株は、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）（Ｖｅｒｄｅｈｏ，Ｓ．ａｎｄ  Ｒ．Ｍａｎｋａｕ．１９８６．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１８：６３５）およびアレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ａｒｅｎａｒｉａ）（米国特許第６，９１９，１９７号明細書）などの複数の線虫種上で生成されてきたが、これまでにヤリセンチュウ上で、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株は観察されておらず、または成功裏に培養されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
主題発明は、ヤリセンチュウに寄生する、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）細菌の新しく有利な株を提供する。この株は、米国微生物系統保存機関に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＳＤ−５８３２が割り当てられている。
【００１３】
これらの細菌は、ヤリセンチュウおよびその他の植物病原性線虫に、付着し、感染し、体内で成長し、再度胞子形成して、殺滅できる、ユニークで有用な特性を有する内生胞子を生成できる。
【００１４】
主題発明はまた、実質的に同じまたは改善された殺線虫特性を有する、開示されたパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株の変異株も包含する。変異株を作成する手順は、微生物学技術で良く知られている。例えば、紫外線やニトロソグアニジンが、このような目的で広く使用される。
【００１５】
主題発明は、例示される微生物の変種にさらに関する。変種は、例えば、例示される分離株からの配列と高度に相同的なポリヌクレオチド配列によって、ならびにヤリセンチュウに対して所望の生物学的活性を有することで、確認される。
【００１６】
主題発明は、開示されるパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）細菌株の殺線虫性有効量の内生胞子を含んでなる組成物と、植物病原性線虫を防除するためのこれらの組成物の使用とをさらに含む。
【００１７】
一実施形態では、植物種子は、最初に、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子および／または胞子含有組成物に付着し得る被着剤で処理される。被着剤は、例えば、糊および／または１つまたは複数のポリマーまたは共重合体であり得る。被着剤の例としては、糊（ＥＬＭＥＲＳ（商標）糊など）；ポリ酢酸ビニル；シリコーン材料；およびシリカゲルや粘土などの天然無機材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
主題発明の別の態様は、線虫防除のためのパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子の有効量を含んでなるパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）組成物で、少なくともその表面の一部が被覆された種子を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
主題発明の新規細菌株は、ヤリセンチュウ（（ホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ  ｇａｌｅａｔｕｓ））をはじめとする植物病原性の線虫に対して、殺線虫活性を有する。微生物の培養物は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９  ＵＳＡの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されている。寄託には、保存機関受入番号ＡＴＣＣ番号ＳＤ−５８３２が割り当てられており、２０１０年１月１３日に寄託された。
【００２０】
対象培養物は、３７ＣＦＲ１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ１２２の下に、特許商標庁長官がそれを取得する資格があると判断した者にとって、本特許出願の係属中に利用可能であることを保証する条件の下で寄託されている。寄託は、対象出願またはその後継が出願された国々で、外国特許法の要求に応じて入手できる。しかし寄託の可用性は、行政措置によって付与された特許権の適用を制限して、主題発明を実施する免許を構成しないものと理解すべきである。
【００２１】
さらに対象培養物寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条項を踏まえて保管されて公的に入手可能であり、すなわちそれは、それを汚染させることなく生存させておくために必要なあらゆる注意を払いつつ、いかなる場合にも寄託日の後、少なくとも３０年間、保管され、寄託微生物の試料の分譲に係る請求があった場合には、当該最新の請求を受領した後、少なくとも５年間、保管される。寄託者は、請求された時に、保存機関が寄託の状態のためにサンプルを分譲できない場合は、寄託を取り替える責務を受け入れる。対象培養物寄託の公共可用性に関わる全ての制約は、それを開示する特許の付与に際して、変更不可で撤廃される。
【００２２】
本明細書の用法では、「単離」への言及は、株が本来存在する環境から取り出されていることを意味する。したがって単離株は、例えば生物学的に純粋な培養物として、または農業担体と結合した胞子（または株のその他の形態）として存在してもよい。
【００２３】
本明細書の用法では、「含んでなる」という用語は、その中で組成物および／または方法が、列挙された成分および／またはステップ「からなる」または「から本質的になる」状況をさらに考察する。本明細書の用法では、「から本質的になる」への言及は、追加的な成分および／またはステップが、組成物および／または方法の殺虫性活性に影響を及ぼさないものだけである状況を指す。
【００２４】
「殺線虫性有効量」は、本明細書の用法では、線虫を死滅させ、防除し、または感染させ；線虫の成長または繁殖を遅延させ；線虫個体数を低下させ；および／または線虫によって引き起こされる植物に対する損傷を低下できるパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子量を指す。
【００２５】
特定の実施形態では、主題発明は、細菌株ＡＴＣＣＳＤ−５８３２およびその変異株を提供する。変異株を作成する手順は、微生物学技術で良く知られている。例えば、紫外線やニトロソグアニジンが、このような目的で広く使用される。その他の態様では、本発明は、殺線虫活性を有するＡＴＣＣＳＤ−５８３２の変種を提供する。
【００２６】
一実施形態では、「変種」は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ配列、ｓｐｏＩＩＡＢ配列、ＡＴＰシンターゼｂサブユニット配列などのＡＴＰシンターゼサブユニット配列、ａｔｐＦ配列、またはａｔｐＡ配列のいずれかの配列全体または少なくとも核酸１００個のその断片と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド配列を有する株を含む。
【００２７】
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、二本鎖核酸分子中で、特定のプリンと特定のピリミンジ間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す（ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、またはＲＮＡ−ＲＮＡ）。主な特異的対合形成は、グアニンとシトシン、およびアデニンとチミンまたはウラシルである。様々な程度のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用い得る。条件がよりストリンジェントであるほど、二本鎖形成に必要な相補性はより大きくなる。条件のストリンジェンシーは、温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間などによって調節し得る。
【００２８】
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばＫｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．＆  Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ，ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、および姉妹編のＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（第２版をはじめとする様々な版，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，１９９３）に記載されるように、当該技術分野で周知の技術によって、高ストリンジェンシー条件下で行われる。ハイブリダイゼーションはまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００１）をはじめとする、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版された分子クローニングマニュアルで詳しく記述される。これらの刊行物のそれぞれは、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【００２９】
ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件の非限定的例は、６５°Ｃで少なくとも約６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ中の約２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドによる約４２°Ｃで１０分間の１回目の洗浄と、引き続く６５°Ｃで０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳによる洗浄である。ハイブリダイゼーション条件の非限定的例は、特定溶液中の特定配列について、熱融点（Ｔm）よりも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５°Ｃ低くなるように選択された条件である。Ｔmは、完全にマッチするプローブに、５０％の標的配列がハイブリダイズする温度である（イオン強度およびｐＨ依存性）。ナトリウムカチオンはヌクレオチドのアニオン性リン酸基を静電気的に遮蔽して、それらの反発を最小化するので、Ｔmは［Ｎａ+］濃度と共に増大する。用いられる洗浄は、それぞれ約５、１０、１５、２０、２５、３０分間以上であってもよく、所望ならばストリンジェンシーを増大させてもよい。
【００３０】
Ｔmを推定する計算は、当該技術分野で周知である。例えば融解温度は、次式によって記述されてもよい（Ｂｅｌｔｚ，Ｇ．Ａ．，Ｋ．Ａ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｔ．Ｈ．Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，Ｐ．Ｔ．Ｃｈｅｒｂａｓ，ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．Ｋａｆａｔｏｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ［ｅｄｓ．］Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １００：２６６−２８５，１９８３）。
Ｔｍ＝８１．５°Ｃ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／二本鎖塩基対の長さ
【００３１】
Ｔmのより正確な推定は、最も近接なモデルを使用して得てもよい。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０（１９８６）；  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：  １４６０−１４６５（１９９８）；Ａｌｌａｗｉ  ＆  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１０５８１−９４（１９９７）：  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：４５０１−４５０５  （１９９６）。Ｔmはまた、選択された溶液中の示差走査熱量測定（Ｄｕｇｕｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，７１：３３５０−６０，１９９６）によって、またはＵＶモニター融解などのその他の当該技術分野で公知の方法によって、慣例的に測定してもよい。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増大させると、より高い程度の相同性が得られる。
【００３２】
本明細書に記載されるようなＤＮＡ配列の存在を同定するのに使用し得る典型的な方法としては、特異的オリゴヌクレオチドを使用した特異的ＤＮＡ配列ハイブリダイゼーションの検出、直接ＤＮＡ配列決定、制限酵素消化、ＲＮａｓｅ保護、化学開裂、およびリガーゼ媒介検出が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
代案としては、またはそれに加えて、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２変種の一例は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２の１６ＳｒＤＮＡ配列、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ配列、ｓｐｏＩＩＡＢ配列、ＡＴＰシンターゼｂサブユニット配列などのＡＴＰシンターゼサブユニット配列、ａｔｐＦ配列、またはａｔｐＡ配列のいずれかの配列全体またはその断片と、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％を超える配列同一性を有するポリヌクレオチドを含有する株であり、変種は殺線虫活性を有する。
【００３４】
Ｆ１−ＡＴＰアーゼの結晶構造は、Ｓｔｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５（８）：９０４−９１４（２００７）に記載され、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの機能は広範に研究されている。例えば、Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｆ１−Ａｔｐａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ４２７（６９７３）：４０７−８（２００４）、ならびにその中で引用される参考文献を参照されたい。本発明の特定の実施形態では、ａｔｐＡの変種配列は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２のＦ１−ＡＴＰアーゼの配列全体、またはその断片と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％の配列同一性を保つポリペプチドをコードし、変種は殺線虫活性を有する。
【００３５】
ｓｐｏＩＩＡＢタンパク質は、抗σ因子である。Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｌｏｓｉｃｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０（６）：２３２５−２３２９（１９９３）。多様な結晶構造が利用できる。Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３４０（５）：９４１−９５６  （２００４）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，１０８（６）：７９５−８０７  （２００２）。本発明の特定の実施形態では、ｓｐｏＩＩＡＢの変種配列は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２のｓｐｏＩＩＡＢの配列全体、またはその断片と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％の配列同一性を保つポリペプチドをコードし、変種は殺線虫活性を有する。
【００３６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＰシンターゼｂサブユニットの構造的および機能的データは、例えばＤｅｌ  Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３６４（４）：７３５−４６（２００６）；およびＣｌａｇｇｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８９（１５）：５４６３−５４７１（２０７）に記載される。本発明の特定の実施形態では、ａｔｐＦの変種配列は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２のａｔｐＦの配列全体、またはその断片と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％の配列同一性を保つポリペプチドをコードし、変種は殺線虫活性を有する。
【００３７】
特定の実施形態では、ヤリセンチュウに寄生する本発明の株は、１６ｓリボソーム配列の日常分析による測定で、目下、既知であるあらゆるパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株よりもＡＴＣＣＳＤ−５８３２と系統学的により綿密に関連し、（または代案としては、あらゆる既知の非ヤリセンチュウ寄生性パスツリア・ペネトランス（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）株よりもＡＴＣＣＳＤ−５８３２とより綿密に関連する）、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株である。
【００３８】
１６ｓｒＤＮＡの分析に適する多様なツールおよびデータが、当該技術分野で公知である。データベース「ｎｒ」のＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴによってリターンされた以下の受入番号は、ＮＣＢＩＧＩ番号によって参照される、１６ｓリボソーム配列を提供する。１５７３５７３８１；１４５６９０６７５；５５１６８３４０；２１５４９９２５４；２９１６９１７２；１９７７７７５４２；１５３８１６６５０；１８９３５３８４６；１５４４８３０９０；２７３６０４８７；１５３８１６５３３；２７３５９３７１；１００３９６４１；１５３８１６６５１；１５３８１３７７６；１６９１９１２５４；７７９５９８３７；２２３４８９０３９；２２４１５５１８１；１９７７６６２１４；１９７７８２６３２；２２３４７５３２０；１６５９２４３０９；２２５１１１２６２；５０３６３５３９；１６９１８９４０７；１１９６３２７７２；１６７６３０４１７；１４７８３６４５７；３２１１９３；４７５７０２０２；２２９４９９５６５；２９５６５６８２；５５３１８８８；２７３６００６２；１９７７６３２２７；１２１５９２１１０；２２７４９５２６７；３２５６６０３；１９７７８１０４８；１５４５００１６７；１５４５００７９４；１５０２５１５２６；１９７７３５６３５；１５３８１３７８２；１６７４２５５６７；２１２６３２９７８；１５９２１４４９；２１８１５１９４２；１６３７８１８７５；１６９８６９６７２；７８０３３４２６；１５７３５４１０３；４００６２６４５；１１５７６２７４６；８３５９５８４８；１９６０１８３２８；１１５３７９８１６；１７８０８０６；１９８４１７６９４；１５４５００１７０；１０８７０７４０８；２２４０３３５４３；２２３９４７６８３；２２６４４３３８２；２３７８３１２８３；１９５６１４３２８；１９４７０３４０６；２１２２７４３４６；１４９６３３８９５；１１８０８６０８０；１１９１７８９８４；７４００７１８９；１９７７６８０１０；１９１１６２１４８；２１９４６１７０１；１６９２１３８１０；１６７６３０４１６；１９９２７；１９６０１８３２２；１８２７０１８１９；１５６３４１３７４；１１５４６７４００；１２６４３３５３８；１１９１９０１４５；５６４２２９４５；５０５４５９５８；２２３４６６３１１；２１２５０７１２１；１９７７６２４１１；１６９１９４８４０；１９２２９１６４１；１５２０１２８０２；３８３１４４７；６７９０３３５２；３２５６６０４；１７１６８６４１６；１５８２９４６６１；１５４２７３９０１；１１９７２０３４３。特定の実施形態では、本段落でＮＣＢＩｇｉ番号により記載される１６ｓｒＤＮＡ配列は、特許請求される発明から除外されてもよい。
【００３９】
代案としては、またはそれに加えて、ポリヌクレオチドの断片は、例えば、その対応するＡＴＣＣＳＤ５８３２のポリヌクレオチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、２５０、５００、または１０００個の核酸を有する配列と定義される。
【００４０】
一実施形態では、１６ＳｒＤＮＡ配列の断片は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２の１６ＳｒＤＮＡ配列全体の連続配列と定義され、断片は、少なくとも１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、または１４００個の核酸を有する。
【００４１】
別の実施形態では、ｓｐｏＩＩＡＢ配列の断片は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２のｓｐｏＩＩＡＢ配列全体の連続配列と定義され、断片は、少なくとも１５０、１８０、２００、２２０、２５０、または２８０個の核酸を有する。
【００４２】
さらなる実施形態では、ａｔｐＡ配列の断片は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２のａｔｐＡ配列全体の連続配列と定義され、断片は、少なくとも６００、６５０、７００、７５０、または８００個の核酸を有する。
【００４３】
さらに別の実施形態では、ａｔｐＦ配列の断片は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２のａｔｐＦ配列全体の連続配列と定義され、断片は、少なくとも１５０、１８０、２００、２２０、２５０、または２８０個の核酸を有する。
【００４４】
特に断りのない限り、本明細書の用法では、２つの配列のパーセント配列同一性および／または類似性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）のように修正された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムを使用して判定され得る。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれる。ＢＬＡＳＴ検索は、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ＝１２のＮＢＬＡＳＴプログラムによって実施し得て、所望のパーセント配列同一性がある配列を得る。比較目的のギャップありアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）に記載されるようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用し得る。ＮＣＢＩ／ＮＩＨウェブサイトを参照されたい。
【００４５】
それに加えてまたは代案として、本発明は、ＡＴＣＣＳＤ−５８３２の１６ＳｒＤＮＡ配列、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ配列、ｓｐｏＩＩＡＢ配列、ＡＴＰシンターゼｂサブユニット配列などのＡＴＰシンターゼサブユニット配列、ａｔｐＦ配列、またはａｔｐＡ配列のいずれかの配列全体またはその断片と、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％を超える配列同一性を有するポリヌクレオチドを含有する、天然および組換え細菌の双方を考察し、細菌は殺線虫活性を有する。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチド含有する組換え細菌は、当該技術分野で公知の方法によって、細菌細胞にポリヌクレオチド、ベクター、および発現コンストラクトを導入することによって得られる。このような方法としては、形質移入、マイクロインジェクション、電気穿孔、リポフェクション、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿、および遺伝子銃法が挙げられる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは発現コンストラクトは、ウイルスベクターなどのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって生体内に導入し得る。主題発明と共に使用し得る弱毒化または欠損型ウイルスベクターは、当該技術分野で公知である。典型的に、欠陥ウイルスは、細胞にウイルスが導入された後に感染できない。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および発現コンストラクトはまた、リポフェクションにより生体内に導入し得る（合成カチオン性脂質から調製されたリポソームによるＤＮＡ形質移入）（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。合成カチオン性脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してリポソームを調製し、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または発現コンストラクトをカプセル化し得る。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または発現コンストラクトはまた、形質移入、マイクロインジェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、および遺伝子銃法などの当該技術分野で公知の方法を使用して、裸のＤＮＡとして生体内に導入し得る。
【００４７】
パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）変種の殺線虫活性は、当該技術分野で公知の手順を使用して、生物検定によって判定し得る。例えば、殺線虫活性は、様々な生命段階の土壌棲息線虫に変種を施用して、線虫の死滅、防除、および／または感染；線虫の成長または繁殖遅延；線虫個体数低下に対する影響を評価することで判定してもよい。代案としては、殺線虫活性は、栽植前に変種によって種子を処理し、処理された種子を線虫に曝露して、栽植後の根系、種子出現、草高、および植物成長を評価することで、判定してもよい。
【００４８】
したがって当業者は本発明の教示の利益を享受して、本発明のパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）変種を容易に調製して試験し、変種が殺線虫活性を保ち、または改善さえするかどうかを判定し得る。
【００４９】
これらの細菌は、発酵技術を使用して大量に製造し得る。胞子形成は細菌の栄養後期から起きて、成熟休眠胞子が産生される。パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）内生胞子は、乾燥によって損傷しない。したがってそれらは、室温で長期にわたって保存し得る。
【００５０】
パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）を培養する方法は、当該技術分野で公知であり、例えばどちらもその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０９４，９５４号明細書および米国特許第７，０６７，２９９号明細書で記載される方法が挙げられる。
【００５１】
主題発明は、害虫防除に有用な細菌内生胞子組成物をさらに提供する。具体的には、線虫に対して病原性であり、生きた線虫組織の中で、または上で成長する細菌の内生胞子組成物が例示される。
【００５２】
本発明のパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）は、調合されない胞子として、または調合液体または固体組成物、湿潤粉末、粒子スラリー、またはエマルションとして、種子に送達され得る。
【００５３】
内生胞子は、界面活性剤、分散剤、不活性担体、およびその他の成分の添加によって、湿潤性粉末、液体濃縮物、顆粒またはその他の調合物中に配合し得て、特定の標的線虫のための取り扱いと施用が容易な殺線虫組成物が得られる。
【００５４】
市販の調製品は、典型的に、１ｍｌまたは１ｇの乾燥製品あたり１×１０6個の胞子を超え、好ましくは、１ｍｌまたは１ｇの乾燥製品あたり１×１０9個の胞子を越える高濃度の内生胞子を有する。一般に、胞子の有効量は、約１×１０4〜１×１０12（以上）胞子／種子の範囲である。別の実施形態では、胞子の有効量は、約１×１０5〜１×１０11胞子／種子、約５×１０5〜５×１０10胞子／種子、約１×１０6〜１×１０10胞子／種子、約５×１０6〜５×ｌ０9胞子／種子、約１×１０7〜１×１０9胞子／種子、または約５×１０7〜５×ｌ０8胞子／種子の範囲である。好ましくは胞子濃度は、約１×１０6〜約１×１０9胞子／種子の範囲である。
【００５５】
組成物はまた、地中でのみ作用する化合物をはじめとするその他の殺虫剤；カプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、オキサジキシルなどの殺真菌剤、およびこれらの物質のそれぞれの異性体など；カルバメート、チオカルバメート、アセトアミド、トリアジン、ジニトロアニリン、グリセロールエーテル、ピリダジノン、ウラシル、フェノキシ、尿素、および安息香酸から選択される化合物をはじめとする除草剤；ベンゾキサジン、ベンズヒドリル誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアリルジクロロアセトアミド、様々なジハロアシル、オキサゾリジニル、およびチアゾリジニル化合物、エタノン、無水ナフタル酸化合物、およびオキシム誘導体などの除草剤解毒剤；肥料；リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、トリコデナ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｎｎａ）、グロムス属（Ｇｌｏｍｕｓ）、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、および菌根菌からのその他の天然または組換え細菌および真菌などの生物防除剤の１つまたは複数を含み得る。
【００５６】
これらの製剤および施用手順は、全て当該技術分野で周知であり、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）の市販株と共に使用される。殺線虫組成物を葉の上に噴霧または塗布して、植物病原性線虫を防除し得る。
【００５７】
取り得る別のアプローチは、誘引剤を任意選択的に含有する顆粒内に内生胞子を組み込み、土壌棲息線虫を防除するために、これらの顆粒を土壌に施用することである。典型的に、胞子は水への接触時に顆粒から放出され、次に線虫に胞子が付着して感染する。配合胞子は、根または植物全体を処理するための種子コーティングとして塗布し得る。
【００５８】
好ましくは、塗布される内生胞子の量は、殺線虫性有効量である。一実施形態では、効果的線虫防除を達成するのに、エーカーあたり１クオート未満の内生胞子で十分である。
【００５９】
有利には、組成物は、従来の施用装置を用いて容易に施用される。内生胞子の作用様式のために、耐性の発生はありそうもない。入手可能な殺線虫剤のほとんどは、化学薬品が植物に害を及ぼすのを避けるために、栽植前に土壌に施用しなくてはならない。対照的に、このパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株は植物を損傷せず、いつでも施用し得る。
【００６０】
本発明の別の態様は、対象パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）組成物で処理された種子を提供する。一実施形態は、表面積の少なくともの一部がパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）組成物で被覆された種子を提供する。特定の実施形態では、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）で処理された種子は、種子あたり約１０6〜約１０9胞子の胞子濃度を有する。種子は、例えば種子あたり１×１０10、１×１０11または１×１０12胞子などのより多くの胞子を有してもよい。
【００６１】
別の実施形態では、対象組成物は、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）顆粒混合物として調合される。顆粒に対するパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子の量は、約１×１０6〜約７×１０8胞子／ｇ顆粒、約５×１０6〜約５×１０8胞子／ｇ顆粒、約１×１０7〜約１×１０8胞子／ｇ顆粒、または約３×１０7〜約５×１０7胞子／ｇ顆粒に及び得る。
【００６２】
主題発明の材料と方法は、線虫を死滅させ、防除し、および／または感染させ；線虫の成長または繁殖を遅延させ；線虫個体数を低下させ；および／またはホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ  ｇａｌｅａｔｕｓ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ａｒｅｎａｒｉａ）、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）、ニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ベロノライムス・ロンギカウダツス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ  ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ）、およびダイズシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、植物病原性線虫、植物寄生性線虫、およびその他の土壌棲息線虫によって引き起こされる、植物損傷を低下または遅延させるのに有用である。主題発明の材料と方法は、ホプロライムス・ガレアツス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ  ｇａｌｅａｔｕｓ）を死滅させ、防除し、および／または感染させるのに特に有用である。
【００６３】
主題発明の材料と方法使用して、サヤインゲン、芝草、甘藷、トマト、綿、トウモロコシ、大豆、オクラ、レタス、カボチャ、野菜、パイナップル、茶、小麦、大麦、米、落花生、サトウキビ、ソルガム、タバコ、およびカノーラをはじめとするが、これに限定されるものではない、植物種への損傷を低下させ得る。
【００６４】
以下は実施例であり、本発明を実施する手順を例証する。本実施例は、限定的であると解釈すべきでない。特に断りのない限り、全ての百分率は重量に基づき、全ての溶媒混合物比は体積に基づく。
【実施例】
【００６５】
実施例１
種子を処理するための新規パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）株の使用主題発明に従って、植物病原性線虫から防除するために、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子を植物種子にコーティングすることで、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子が効果的に送達される。
【００６６】
パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子は、種子上に自由に被覆し得て、または好ましくは、それらは種子に被覆される前に、液体または固形組成物に調合し得る。例えば、胞子を含んでなる固体組成物は、固体担体が胞子懸濁液で含浸されるまで、個体担体を胞子懸濁液と混合することで調製し得る。次にこの混合物を乾燥させて、所望の粒子が得られ得る。
【００６７】
固体担体は、好ましくは顆粒である。顆粒は、例えば、ＡＸＩＳ（登録商標）からの珪藻土顆粒および／またはＰＲＯＦＩＬＥ（登録商標）からのｇｒｅｅｎｓｇｒａｄｅ粘度顆粒であり得る。被着剤、分散剤、界面活性剤、および栄養素と緩衝成分などの様々な添加剤もまた、担体および胞子懸濁液混合物に含め得る。
【００６８】
特定の実施形態では、コーティングは、胞子の他に被着剤層をさらに含んでなり得る。被着剤は、好ましくは無毒で生分解性かつ粘着性である。このような材料の例としては、ポリ酢酸ビニル；ポリ酢酸ビニル共重合体；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコール共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、およびヒドロキシメチルプロピルセルロースなどのセルロース；デキストリン；アルギン酸塩；糖類；糖蜜；ポリビニルピロリドン；多糖類；タンパク質；脂肪；油；アラビアガム；ゼラチン；シロップ；およびデンプンが挙げられるが、これに限定されるものではない。追加の例は、例えば、本明細書にその内容全体を参照によって援用する、米国特許第７，２１３，３６７号明細書にある。
【００６９】
被着剤層は、種子表面に胞子が付着するのを助け、可能な脱落を防止し得る。これに加えて、コーティングはまた、線虫防除および／またはその他の害虫防除のために、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子と組み合わさって有益な効果を有する、その他の化学的または生物学的製剤作用物質を含んでなり得る。コーティングはまた、種子発芽、および／または植物成長および／または健康の促進を助ける、肥料およびその他の成分を含んでもよい。
【００７０】
したがって主題発明は、植物種子上にパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子コーティングを作成する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子で含浸された乾燥顆粒混合物と、被着剤で被覆された種子とを組み合わせるステップを含んでなる。
【００７１】
種子の処理は、あらゆる生理学的状態の種子に適用し得るが、種子が処理工程中にいかなる損傷も受けないように、種子が十分に耐久性の状態であることが好ましい。典型的に、種子は圃場から収穫され；植物から取り出されて；種子でないその他のあらゆる植物材料から分離される。種子は、好ましくは、処理が種子に生物学的損傷を引き起こさない程度に、生物学的に安定している。一実施形態では、例えば処理は、収穫して浄化され、１５重量％未満の水分含量に乾燥されたトウモロコシ種子に適用し得る。代案の実施形態では、種子はまた、乾燥されて、次に水および／または別の材料で下塗りされ、次にパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子組成物による処理前またはその最中に、再乾燥されたものであり得る。すぐ上に記述される制限内で、処理は、種子の収穫と播種の間に、種子に適用し得る。本明細書の用法では、「非播種の種子」という用語は、種子の収穫と、植物の発芽および成長目的での土壌への播種との間にある、任意の期間の種子を含むことが意図される。
【００７２】
本明細書の用法では、播かれていない種子がパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）含有組成物で「処理される」場合、このような処理は、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）が、種子でなく土壌に適用される実施を含むことを意図しない。
【００７３】
パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子は、典型的に農薬製剤の形態で種子に適用される。本製剤は、液体希釈剤と、バインダーと、ストレス条件において種子を保護する充填剤と、可撓性、接着および／またはコーティングの塗布性を改善する可塑剤とをはじめとするが、これに限定されるものではない、１つまたは複数のその他の望ましい成分を含有してもよい。これに加えて、炭酸カルシウム、カオリンまたはベントナイト粘土、パーライト、珪藻土またはあらゆるその他の吸着材材料などの乾燥剤を製剤に添加することが望ましいことがある。種子処理におけるこのような成分の使用は、当該技術分野で公知である。例えば米国特許第５，８７６，７３９号明細書を参照されたい。当業者は、本開示の便益を有して、製剤中で使用するのに望ましい成分を容易に選択し得る。
【００７４】
種子はまた、１つまたは複数の以下の成分で処理されてもよい。地中でのみ作用する化合物をはじめとするその他の殺虫剤；カプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、オキサジキシルなどの殺真菌剤、およびこれらの物質のそれぞれの異性体など；グリホサート、カルバメート、チオカルバメート、アセトアミド、トリアジン、ジニトロアニリン、グリセロールエーテル、ピリダジノン、ウラシル、フェノキシ、尿素、および安息香酸から選択される化合物をはじめとする除草剤；ベンゾキサジン、ベンズヒドリル誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアリルジクロロアセトアミド、様々なジハロアシル、オキサゾリジニル、およびチアゾリジニル化合物、エタノン、無水ナフタル酸化合物、およびオキシム誘導体などの除草剤解毒剤；肥料；リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、トリコデナ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｎｎａ）、グロムス属（Ｇｌｏｍｕｓ）、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、および菌根菌からのその他の天然または組換え細菌および真菌などの生物防除剤。これらの成分は、種子上に別個の層として添加してもよく、または代案としてはパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）組成物の一部として添加してもよい。
【００７５】
好ましくは、種子処理剤中で使用される新規組成物またはその他の成分の量は、種子の発芽を阻害してはならず、または種子に植物毒性損傷を引き起こしてはならない。
【００７６】
本発明で種子を処理するのに使用される製剤は、懸濁液；エマルション；水性媒体（例えば水）中の粒子スラリー；湿潤粉末；湿潤顆粒（乾燥流動性を有する）；および乾燥顆粒の形態である。懸濁液またはスラリーとして調合される場合、製剤中の活性成分の濃度は好ましくは約０．５％〜約９９重量％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは５〜４０％であり、またはそうでなければ当業者によって調合されるようである。
【００７７】
上述したように、その他の従来の非活性または不活性成分を製剤に組み込み得る。このような不活性成分としては、従来の粘着剤；メチルセルロースなどの分散剤（例えば種子処理で使用される分散剤／粘着剤の組み合わせとして機能するＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ａ１５ＬＶまたはＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ａ１５Ｃ）；ポリビニルアルコール（例えばＥｌｖａｎｏｌ  ５１−０５）；レシチン（例えばＹｅｌｋｉｎｏｌ  Ｐ）、ポリマー分散剤（例えばポリビニルピロリドン／酢酸ビニルＰＶＰＩＶＡ  Ｓ−６３０）；増粘剤（例えば粘度を改善して、粒子懸濁液沈降を低下させるＶａｎ  Ｇｅｌ  Ｂなどの粘土増粘剤）；エマルション安定剤；界面活性剤；凍結防止化合物（例えば尿素）、染料、着色剤などが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で有用なさらなる不活性成分は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，ｖｏｌ．１，”Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，”ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６にある。本発明で有用な追加的な不活性成分は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，ｖｏｌ．２，”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，”ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６にある。
【００７８】
本発明のコーティング製剤は、容器（例えばボトルまたはバッグ）中での混合、機械的塗布、混転、噴霧、および浸漬をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な方法によって種子に塗布し得る。種子を本発明に従った殺虫剤に接触させるために、ＳＥＰＩＲＥＴ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．）およびＯＰＡＣＯＡＴ（商標）（Ｂｅｒｗｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｅｓｔｐｏｉｎｔ，Ｐａ．）などの水性塗膜コーティング材料をはじめとするが、これに限定されるものではない、従来の塗膜コーティング材料などの多様な活性または不活性材料を使用し得る。
【００７９】
当該技術分野で公知の種子コーティング法および組成物は、それらが本発明の実施形態の１つの追加によって修飾された場合に、有用である。このようなコーティング方法およびそれらを塗布する装置は、例えば、米国特許第５，９１８，４１３号明細書、米国特許第５，８９１，２４６号明細書、米国特許第５，５５４，４４５号明細書、米国特許第５，３８９，３９９号明細書、米国特許第５，１０７，７８７号明細書、米国特許第５，０８０，９２５号明細書、米国特許第４，７５９，９４５号明細書、および米国特許第４，４６５，０１７号明細書で開示される。種子コーティング組成物は、例えば、特に米国特許第５，９３９，３５６号明細書、米国特許第５，８８２，７１３号明細書、米国特許第５，８７６，７３９号明細書、米国特許第５，８４９，３２０号明細書、米国特許第５，８３４，４４７号明細書、米国特許第５，７９１，０８４号明細書、米国特許第５，６６１，１０３号明細書、米国特許第５，６２２，００３号明細書、米国特許第５，５８０，５４４号明細書、米国特許第５，３２８，９４２号明細書、米国特許第５，３００，１２７号明細書、米国特許第４，７３５，０１５号明細書、米国特許第４，６３４，５８７号明細書、米国特許第４，３８３，３９１号明細書、米国特許第４，３７２，０８０号明細書、米国特許第４，３３９，４５６号明細書、米国特許第４，２７２，４１７号明細書、および米国特許第４，２４５，４３２号明細書で開示される。
【００８０】
本発明で有用なバインダーは、好ましくは天然または合成であってもよい接着性ポリマーを含んでなり、好ましくは被覆される種子に対して実質的な植物毒性効果がない。バインダーは、ポリ酢酸ビニル；ポリ酢酸ビニル共重合体；酢酸ビニルエチレン（ＥＶＡ）共重合体；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコール共重合体；エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースをはじめとするセルロース；ポリビニルピロリドン；デンプン、加工デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサンをはじめとする多糖類；脂肪；油；ゼラチンおよびゼインをはじめとするタンパク質；アラビアゴム；シェラック；塩化ビニリデンおよび塩化ビニリデン共重合体；リグノスルホン酸カルシウム；アクリル共重合体；ポリビニルアクリレート；ポリエチレンオキシド；アクリルアミドポリマーおよび共重合体；アクリル酸ポリヒドロキシエチル、メチルアクリルアミドモノマー；およびポリクロロプレンから選択されてもよい。
【００８１】
種子処理のために使用されるパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）の量は、種子タイプと活性成分タイプ次第で変動するが、処理は種子を殺虫性有効量のパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）に接触させるステップを含んでなる。本明細書の用法では、殺線虫性有効量は、線虫を殺滅し、または線虫によって引き起こされる損傷量を一貫して低下させまたは遅延させる、パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）の量を意味する。
【００８２】
処理で使用される殺虫剤は、種子発芽を阻害してはならず、種子または植物に損傷を引き起こす線虫の生活環中に、種子および／または植物を保護する上で有効でなくてはならない。一般にコーティングは、播種のおよそ１時間〜１２０日後まで有効である。
【００８３】
殺虫剤で形成されたコーティングは、好ましくは、マトリックスを通じた、周囲の媒体への拡散または移動による殺虫剤放出速度の遅延をもたらし得るタイプである。
【００８４】
被覆層に加えて、種子は、殺真菌剤および除草剤をはじめとするその他の殺虫剤；除草剤解毒剤；肥料および／または生物防除剤の成分の１つまたは複数で処理されてもよい。これらの成分は別個の層として添加してもよく、代案としては殺虫性被覆層に添加してもよい。
【００８５】
農薬製剤は、流動床技術、ローラーミル法、ｒｏｔｏｓｔａｔｉｃ種子処理装置、およびドラムコーターなどの多様な技術と機械を使用して、種子に塗布してもよい。噴流床などのその他の方法もまた、有用なこともある。種子をコーティング前に、プレサイジングしてもよい。コーティング後、種子を典型的に乾燥させ、次にサイジングのためにサイジング機に移す。このような手順は、当該技術分野で公知である。
【００８６】
パスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）で処理した種子は、また塗膜の上塗りで包んでコーティングを保護してもよい。このような上塗りは当該技術分野で公知であり、流動床およびドラム塗膜コーティング技術を使用して塗布されてもよい。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、固体マトリックスの使用によって、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子を種子上に導入し得る。例えば、一定量のパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子を固体マトリックス材料と混合し、次に種子を固体マトリックス材料と一定時間接触させて、殺虫剤を種子に導入し得る。次に種子を任意選択的に固体マトリックス材料から分離して、保存または使用し得て、あるいは固体マトリックス材料と種子の混合物を保存しまたは栽植し得る。本発明で有用な固体マトリックス材料としては、ポリアクリルアミド、デンプン、粘土、シリカ、アルミナ、土壌、砂、ポリ尿素、ポリアクリレート、または一時の間、殺虫剤を吸収または吸着し、その殺虫剤を種子内またはその上に放出できるあらゆるその他の材料が挙げられる。殺虫剤と固体マトリックス材料が互いに適合するよう、確実にすることが有用である。例えば、固体マトリックス材料は、例えば数分間、数時間、数日間などの期間にわたり、妥当な速度で殺虫剤を放出し得るように選択すべきである。
【００８８】
細菌の栄養型とは異なり、パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子は乾燥によって損傷を受けず、それらは長期間室温で保存し得る。したがって主題発明の１つの利点は、種子コーティングのために、胞子の有効性を顕著に低下させることなく、主題発明に、コーティング法で使用される乾燥およびその他の過酷なステップを適用し得ることである。主題発明の種子の保存可能期間が長いことで、栽植スケジュールのバリエーションが可能になる。これに加えてパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子の生存率は、輸送中、および土壌に入れられる播種中に、細菌の栄養型よりもはるかに高い。
【００８９】
一般に胞子の有効量は、１×１０5〜１×１０12（以上の）胞子／種子の範囲である。好ましくは、胞子濃度は、約１×１０6〜約１×１０9胞子／種子である。
【００９０】
一実施形態では、顆粒混合物を得るためのパスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子と顆粒の比率は、約３×１０7〜５×１０7胞子／ｇ顆粒である。特定の実施形態では、約２×１０7胞子／ｍｌの緩衝液を含有する約３〜５ｍｌのパスツリア属（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）胞子懸濁液を約２ｇの顆粒に添加する。比率は、顆粒タイプに左右され得る。例えば、約５ｍｌの胞子懸濁液を２ｇのＡＸＩＳ（登録商標）顆粒に塗布し得る一方、同一量のＰＲＯＦＩＬＥ（登録商標）顆粒には、約３ｍｌの胞子懸濁液が好ましい。被着剤は、ポリ酢酸ビニルを含有するＥＬＭＥＲ社の透明工作糊など、種子および土壌と生体適合性のあらゆる市販の糊であり得る。
【００９１】
胞子を線虫宿主内で生成した場合、線虫を殺滅するために、追加の加熱処理段階を含め得る。加熱処理段階は、顆粒との混合前に胞子懸濁液に適用し得る。代案としては、加熱段階は、顆粒混合物形成後に適用し得る。
【００９２】
本明細書において参照または引用される特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明示的な開示に矛盾しない限り、全ての図および表を含むその全体を参照によって本明細書に援用する。
【００９３】
本明細書において説明される実施例および態様は、あくまで例示を目的としたものであり、当技術分野における当業者にはそれに照らした様々な変形または変更が提案されうるし、それらは本出願の趣旨および範囲内に包含されると理解されるべきである。
【国際調査報告】
2014500715.tif 000002
2014500715.tif 000003
2014500715.tif 000004