(57)【要約】本発明は、新規な水痘帯状疱疹ウイルス株及びそれを用いた水痘及び帯状疱疹ウイルスワクチンに関し、より詳細には、韓国人患者から分離したＶＺＶ  ＭＶＡ０６のゲノムＤＮＡ、そのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）、前記ＶＺＶ  ＭＶＡ０６のゲノムＤＮＡ及びそのＯＲＦによりコードされたタンパク質、並びに前記タンパク質を有効成分とするワクチン組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなる水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されることを特徴とする、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）。
【請求項３】
請求項２又は３に記載のＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのオープンリーディングフレームによりコードされたタンパク質。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列からなるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ、配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されるオープンリーディングフレームを含む、組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大膓菌、昆虫細胞から選択されるものであることを特徴とする、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記形質転換された宿主細胞は、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、ミエローマ細胞株、ＨｕＴ７８細胞及び２９３細胞、大膓菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
配列番号１〜６から選択される何れか１つの塩基配列によりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載のＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質を有効成分とするワクチン組成物。
【請求項１０】
体内への注入時に抗体形成を増進させる役割をする薬学的に許容される免疫アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記免疫アジュバントは、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、ＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な水痘帯状疱疹ウイルス株及びそれを用いた水痘及び帯状疱疹ウイルスワクチンに関し、より詳細には、韓国人患者から分離して弱毒化したＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ、そのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、以下「ＯＲＦ」）、前記ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ及びそのＯＲＦによりコードされたタンパク質、並びに前記タンパク質を有効成分とするワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水痘帯状疱疹ウイルス株（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ、以下「ＶＺＶ」）はヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスであり、２つの異なる症状を示す疾患（水痘及び帯状疱疹）の原因である。
【０００３】
臨床検体から分離した水痘帯状疱疹ウイルス株（非特許文献１）として、Ｄｕｍａｓ株（Ｄｕｍａｓ  ｓｔｒａｉｎ）の完全なヌクレオチド配列が最初に報告された。また、現在までｐａｒｅｎｔ  Ｏｋａ株、Ｏｋａ株由来の３つのワクチンウイルス株（弱毒化ｖＯＫａ株、ＶＡＲＩＶＡＸ  ＯＫａ株、ＶＡＲＩＬＲＩＸ  ＯＫａ株）を含み、総２３個の水痘帯状疱疹ウイルス株の完全な全体ヌクレオチド配列がＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに報告されている。
【０００４】
現在、ワクチンウイルス株と臨床ウイルス株の全体ヌクレオチド配列の比較分析は、ワクチン株の弱毒化のための特定部位に関する研究を可能とした（Ａｒｇａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｇｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｔｉｌｌｉｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｙａｍａｎｉｓｈ，２００８）。
【０００５】
一方、株式会社ミドリ十字（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ  Ｃｒｏｐ．）は、１９９４年から水痘に対する弱毒化ワクチンとして「ＳｕｄｕＶａｘ」を生産している。前記ＳｕｄｕＶａｘの生産に用いられるＭＡＶ０６ウイルス株は、１９８９年水痘に感染した３３ヶ月の韓国人患者の水疱から水痘ウイルスを分離してヒト胎児肺細胞に初代培養することで得られ、様々な水痘ウイルス特性試験を行うことにより、新規な水痘帯状疱疹ウイルスであることを確認した（非特許文献２）。
【０００６】
前記ＳｕｄｕＶａｘは１９９４年以後に韓国で商品化されており、１９９８年から海外市場に拡大されて用いられている。しかし、ＳｕｄｕＶａｘの効能及び安定性が市場で立証されているが、これに対するワクチンの効能及び弱毒化のメカニズムを説明することができる分子生物学的特性はまだ報告されていない。
【０００７】
前記分子生物学的特性は、弱毒化ワクチンの有効性、安全性及び同質性を保障及び保証するための品質管理及び品質保証の正確度を増加させるために非常に重要であり、これは解決すべき急務の課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｓｏｎ、Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｅ、１９８６
【非特許文献２】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａ，Ｊ  Ｋｏｒ  Ｓｏｃ  Ｖｉｒｏｌ  ２１，１−９，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の問題点を解決するために、本発明者らは、韓国人患者から分離した新規なＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノム配列を明らかにし、これに対するＯＲＦ分析及び系統発生学的分析を含む分子生物学的分析を行って、本発明を成すに至った。
【００１０】
本発明の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのＯＲＦを提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのＯＲＦによりコードされたタンパク質を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ又はそのＯＲＦを含む組換え発現ベクターを提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ又はそのＯＲＦを含む形質転換体を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ又はそのＯＲＦによりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質の製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質を有効成分とするワクチン組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的を果たすために、本発明は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ及びそのＯＲＦを提供する。
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本明細書で用いられた用語「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、アミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ塩基配列であって、翻訳開始コドン（例：ＡＴＧ）から終止コドン（例：ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）までを含む塩基配列を意味する。
【００２０】
本発明は、配列番号１の塩基配列からなる水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡを提供する。
【００２１】
本発明は、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのＯＲＦを提供する。より詳細には、前記ＯＲＦは、配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されることを特徴とする。
【００２２】
本発明は、前記ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ及びそのオープンリーディングフレームによりコードされたタンパク質を提供する。より詳細には、配列番号１の塩基配列からなるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ、配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されるオープンリーディングフレームによりコードされたタンパク質を提供する。
【００２３】
本発明は、前記ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ及びそのオープンリーディングフレームを含む組換え発現ベクターを提供する。より詳細には、配列番号１の塩基配列からなるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ、配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されるオープンリーディングフレームを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００２４】
本発明において「組換えベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することができる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須的な調節エレメントを含む遺伝子作製物をいう。本発明において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能を行うために、核酸発現調節配列と、目的タンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で公知されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断及び連結は、本発明が属する技術分野で一般に知られている酵素などを用いて容易に行うことができる。
【００２５】
本発明で用いられる適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）などの発現調節エレメントの他にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終止コドンは、通常、免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部とみなされ、遺伝子作製物が投与された時、個体において必ず作用を示さなければならず、コード配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）にあるべきである。一般のプロモーターは、構成的又は誘導性である。原核細胞としてはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。真核細胞としては、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターだけでなく、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン由来のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。前記発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性又は表面タンパク質の発現といった選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられることができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞のみが生存するため、形質転換された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターの場合、複製が開始される特定の核酸配列である複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができる。組換え発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミドなどの様々な形態のベクターを用いることができる。組換えベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の各種宿主細胞で目的の遺伝子を発現し、目的のタンパク質を生産する機能を行うものであれば特に限定されないが、強い活性を示すプロモーターと強い発現力を有しながら自然状態と同様の形態の外来タンパク質を大量生産することができるベクターが好ましい。
【００２６】
本発明による配列番号１〜６から選択される何れか１つの塩基配列によりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質を発現させるために、様々な発現宿主／ベクターの組み合わせが用いられることができる。真核宿主に適した発現ベクターとしては、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス、及びレトロウイルス由来の発現調節配列などが用いられることができるが、これに限定されるものではない。細菌宿主に使用可能な発現ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のような大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主域を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のように非常に多様なファージλ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示されるファージＤＮＡ、及びＭ１３や繊維状１本鎖ＤＮＡファージなどの他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２℃プラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
【００２７】
前記組換えベクターは宿主細胞に挿入されて形質転換体を形成する。この際、適当な宿主細胞は、大膓菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）などの原核細胞であることができ、また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などの真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などの酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞などの真核細胞であることができる。
【００２８】
また、前記宿主細胞は、好ましくは植物、哺乳動物由来のものであることができるが、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、ミエローマ細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であり、これに限定されない。特に、ＣＨＯ細胞が好ましい。
【００２９】
本発明において宿主細胞への「形質転換」は，核酸を有機体、細胞、組職又は機関に取り入れる如何なる方法も含まれ、当分野で公知されたように、宿主細胞に応じて適当な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿法、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌法、アグロバクテリアを介した形質転換法、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制を介した形質転換法などが含まれるが、これに限定されない。
【００３０】
組換えベクターが発現される形質転換された宿主細胞を栄養培地で培養することで、本発明による配列番号１〜６から選択される何れか１つの塩基配列によりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質を大量生産することができる。培地及び培養条件は宿主細胞に応じて適宜選択して用いることができる。培養時、細胞の生育及びタンパク質の大量生産に適するように、温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適当に調節することができる。上記のように組換えで生産された配列番号１〜６から選択される何れか１つの塩基配列によりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質は培地又は細胞分解物から回収されることができ、通常の生化学分離技術により分離、精製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））。これには、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈澱、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）及びその様々な変形及び複合方法などが利用可能であるが、これに限定されない。
【００３１】
本発明は、配列番号１〜６から選択される何れか１つの塩基配列によりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質を有効成分とするワクチン組成物を提供する。この際、前記ワクチン組成物には、薬学的に許容される免疫アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）又は付形剤がさらに含まれることができる。免疫アジュバントとしては、体内への注入時に抗体形成を増進する役割をして本発明の目的を達成することができるものであれば使用可能であり、特に、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）及びＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）から選択される一つ以上が好ましいが、これに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、韓国人患者から分離した水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）ＭＡＶ０６の全体ゲノム配列を分析し、前記ＶＺＶ  ＭＡＶ０６の全体配列と２３個のＶＺＶウイルス株の配列とを比較することで、繰り返し配列及び複製開始点の変形に起因した種の間のゲノム長の多型性を確認することができた。また、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６ウイルスの全体配列は、生物情報学的研究及び比較誘電体研究などによって弱毒化されたＶＺＶワクチンウイルス株の分子特性を理解するに助けとなることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明によるＶＺＶ  ＭＡＶ０６（以下、図面では「ＳｕｄｕＶａｘ」と表示する）のＯＲＦマップを示す図である。
【図２】全体ヌクレオチド配列に基いた２４個のＶＺＶウイルス株の系統樹を示す図である。
【図３】非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ヌクレオチド配列に基いた２４個のＶＺＶ  ウイルス株の系統樹を示す図である。
【図４】ワクチンウイルス株と臨床ウイルス株との間の１２個のＯＲＦ区分に基いたワクチンウイルス株の特徴的な系統樹を示す図である。
【図５】ＶＺＶウイルス株のゲノム長と繰り返し配列との間の相関関係を示す図である。
【図６】本発明によるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のＯＲＦ０とＯｋａワクチンウイルス株との間の突然変異を示す図である。
【図７】本発明によるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のＯＲＦ１７において３ｂｐの欠失部位を示す図である。
【図８】本発明によるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のＯＲＦ５６において３ｂｐの欠失部位を示す図である。
【図９】本発明によるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のＯＲＦ２９において１５ｂｐの欠失部位を示す図である。
【図１０】本発明によるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のＯＲＦ６０において３ｂｐの挿入部位を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を実施例及び添付図面を参照して詳細に説明する。しかし、これらは本発明をより詳細に説明するためのものであり、本発明の権利範囲が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］ウイルス及びＤＮＡシークエンシング
ＭＡＶ０６ウイルス株は、１９８９年水痘に感染された３３ヶ月の韓国人患者の水疱から水痘ウイルスを分離し、ヒト胎児肺細胞に初代培養することで得られた（Ｈｗａｎｇ，Ｋ．Ｋ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｒｙｕ，Ｙ．Ｗ．＆Ｋｉｍ，Ｋ．Ｈ．（１９９１）．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａ．ＪＫｏｒＳｏｃＶｉｒｏｌ２１、２０１−２１０．）。
【００３６】
前記培養されたＭＡＶ０６ウイルス株を３４℃〜３６℃でヒト及びモルモットの胎児正常二倍体肺細胞で（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｉｐｌｏｉｄ  Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌ）５５回継代培養した後、細胞感受性及び温度敏感性試験を行って弱毒化されたことを確認した（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｋｅｒ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａ）。前記弱毒化されたウイルス株を「ＭＡＶ０６」と命名し、これをＳｕｄｕＶａｘの生産に用いた。
【００３７】
前記弱毒化ＭＡＶ０６ウイルス株をヒト胎児正常二倍体肺細胞で連続継代培養してマスターウイルス株（ｖｉｒｕｓ  ｓｅｅｄ）を作製し、これから連続継代培養して製造用ウイルス株（ｖｉｒｕｓ  ｓｅｅｄ）を生産した。
【００３８】
また、最終ワクチンである「ＳｕｄｕＶａｘ」は製造用ウイルスバンクから継代培養されたものを用いて生産し、配列分析には５回継代培養されたウイルスを用いた。
【００３９】
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＭＡＶ０６ウイルス株ストックから５．５ｕｇ／１００ｕｌの濃度でＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ配列を、ハイスループットスクリーニング法（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）であるキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）によりサービスされるロシュダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のゲノムシーケンサＦＬＸスタンダードシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）によって決定した。
【００４０】
平均長さ〜４００ｂｐの２３，７２２配列断片を得て、これらをＣｏｎｓｅｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｏｎｓｅｄ／ｃｏｎｓｅｄ．ｈｔｍｌ）を利用して組み合わせ及び可視化した。配列断片の平均クォリティは９９．９９％であった。総９９．３８％の１２４，７５９配列が、導き出されたコンセンサス配列と一致し、包含範囲はヌクレオチド当り８３リード（ｒｅａｄｓ）であった。これらを２つの参照ウイルス株Ｄｕｍａｓ（ＮＣ＿００１３４８）及びＶａｒｉｌＲｉｘ（ＤＱ００８３５４）に対して整列し、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）の間のギャップは隣接したコンティグから得られたプライマーを用いたＰＣＲシークエンシングにより満たした。
【００４１】
ＭＡＶ０６ウイルス株の完成された全体ゲノム配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに２０１１年８月９日登録（ＪＦ３０６６４１）し、配列番号１に示した。配列番号１に示したように、ＭＡＶ０６ウイルス株のゲノムは１２４，７５９ｂｐの長さを有すると確認された。
【００４２】
［実施例２］オープンリーディングフレーム分析
２つの参照ウイルス株Ｄｕｍａｓ（ＮＣ＿００１３４８）及びＶａｒｉｌＲｉｘ（ＤＱ００８３５４）に対するＢＬＡＳＴ検索（Ｂｌａｓｔ  ｓｅａｒｃｈ）により、全体ゲノム配列でＭＡＶ０６ウイルス株のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置を検索した。結果データは、ＭＡＶ０６ウイルス株のゲノムにおける各ＯＲＦの一番目と最後のヌクレオチド位置及びＯＲＦの方向を含むことを確認することができた。
【００４３】
ＯＲＦ情報を、ＣＬＣシーケンスビューア（ＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒ）（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｃｂｉｏ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）及びＮＣＢＩにより提供されるＯＲＦ  ＦｉｎｄｅｒのようなＯＲＦ確認プログラムによって検証した。ＢＬＡＳＴ検索結果がＯＲＦ確認プログラムの結果と一致しない場合、該当ＯＲＦのヌクレオチド配列をＢｉｏＥｄｉｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｅｄｉｔｏｒ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０．９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）で調査し、手作業で編集して開始及び終止コドンの位置を決定した。最後に、配置された全てのＯＲＦを、翻訳されたアミノ酸配列を確認することで確認した。
【００４４】
前記分析結果を下記（１）〜（４）に示した。
【００４５】
（１）ＭＡＶ０６ウイルス株ゲノム構造及びＯＲＦマッピング
ＭＡＶ０６ウイルス株ゲノム構造は、ゲノムが６部位、ＴＲＬ、ＵＬ、ＩＲＬ、ＩＲＳ、ＵＳ及びＴＲＳに分けられるという点で、ＶＺＶウイルス株の典型的な構造であった。各部位の長さはそれぞれ８８ｂｐ、１０４，７９９ｂｐ、８８ｂｐ、７，２６７ｂｐ、５，２３２ｂｐ及び７，２７６ｂｐであった。
【００４６】
ＭＡＶ０６ウイルス株ゲノムのＧ＋Ｃ含量は約４６．１％であり、ゲノムの総長さは２４個のＶＺＶウイルス株と酷似していた。下記表１に、本発明で分析したＶＺＶウイルス株及びこれらのジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号、ゲノム長及びＧＣ含量を示した。
【００４７】
【表１】
2014508522.tif 000003
【００４８】
ＭＡＶ０６ウイルス株は７４個のＯＲＦを含んでおり、これらのうち６４個はＵＬ遺伝子、４個はＵＳ遺伝子であることを確認した。
【００４９】
ＩＲＳ内の３個の遺伝子（ＯＲＦｓ  ６２−６４）はＴＲＳ（ＯＲＦｓ  ６９−７１）内で逆方向に繰り返して存在し、７４個のＯＲＦのうち７０個は正方向に、３４個は逆方向に存在した。また、ＯＲＦ方向はＶＺＶ菌株で１００％保存されていた。ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＦマップを図１（全ての図面では「ＳｕｄｕＶａｘ」と表示する）に示した。
【００５０】
（２）ＭＡＶ０６ウイルス株の系統発生学的分析
前記表１のウイルス株の全体ヌクレオチド配列に基いて、近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して系統樹を作製した。
【００５１】
ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＦヌクレオチド配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｖｅｒ２．０．１）により、ＮＣＢＩジェンバンクデータベースに登録された前記表１の２４個のＶＺＶウイルス株のヌクレオチド配列及びアミノ酸と多重整列した後、手作業で編集した。
【００５２】
結果出力ファイルを、Ｐｈｙｌｉｐパッケージ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．６９、ｈｔｔｐ：／／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌ）に含まれたＤｎａｄｉｓｔ及びｎｅｉｇｈｂｏｕｒプログラムを利用して系統樹を作成するために用いた。距離マトリックスを木村２パラメータ（Ｋｉｍｕｒａ−２−ｐａｒａｍｅｔｅｒ）により得た。クラスター分析を近隣結合法（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＪ）及び最尤法（ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ、  ＭＬ）により行い、結果ツリーファイルをツリービュー（Ｔｒｅｅｖｉｅｗ）プログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ１．６．６）によって可視化した。系統樹の有意性をブートストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）分析により検証した。系統樹をＳｅｑｂｏｏｔプログラムにより生成された１０００個のレプリケート（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）から構築し、コンセンサスツリーをコンセンス（Ｃｏｎｓｅｎｓｅ）プログラムで確認した。
【００５３】
全体ヌクレオチド配列に基いて最尤法により系統樹を作成した結果、図２から確認できるように、ＭＡＶ０６ウイルス株を含む４個の弱毒化生ウイルスワクチンのウイルス株（ｖＯｋａ、ＶａｒｉｌＲｉｘ、ＶａｒｉＶａｘ）とクラスターを形成し、Ｍ２ＤＲウイルス株と８ウイルス株が隣接したクラスターを形成した。また、ＣＡ１２３ウイルス株は単独で形成、１１、２２、０３−５００、及びＨＪ０ウイルス株がクラスターを形成、残りの臨床ウイルス株がともにクラスターを形成した。
【００５４】
非コードヌクレオチド配列に基いた最尤法により系統樹を作成した結果、図３から確認できるように、韓国で分離したＭＡＶ０６ウイルス株と日本で分離したＯｋａウイルス株は（Ｊａｐａｎ−Ｋｏｒｅａｎ（Ｊ−Ｋ）ｃｌｕｓｔｅｒ）独特のクラスターを形成した。全体ヌクレオチド配列及び共通のアミノ酸配列に基いた２４個のＶＺＶウイルス株の系統樹ではｐＯｋａウイルス株が４個のワクチンウイルス株（ｖＯｋａ、ＶａｒｉｌＲｉｘ、ＶａｒｉＶａｘ、ＭＡＶ０６）と１９個の臨床ウイルス株との間に位置するが、非コードヌクレオチド配列に基いた２４個のＶＺＶウイルス株の系統樹ではワクチンウイルス株の間に位置していた。即ち、４個のワクチンのウイルス株（ｖＯｋａ、ＶａｒｉｌＲｉｘ、ＶａｒｉＶａｘ、ＭＡＶ０６）は全体ヌクレオチド配列及び共通のアミノ酸配列に基いた２４個のＶＺＶウイルス株の系統樹ではＪａｐａｎ−Ｋｏｒｅａｎ（Ｊ−Ｋ）クラスター内で下位クラスターを形成することを確認することができたが、非コードヌクレオチド配列に基いた２４個のＶＺＶウイルス株との系統樹ではそうではなかった。
【００５５】
ワクチンウイルス株と臨床ウイルス株とを区分するための主なＯＲＦを確認するために、ＯＲＦによる７４個の系統樹を作成し、そのうち１２個のＯＲＦで図４のようにワクチンウイルス株の特徴的な系統樹を確認することができた。ワクチンウイルス株の特徴的な系統樹が得られるＯＲＦとしては、ＯＲＦ０、１、６、１８、３１、３５、３９、５９、６２、６４、６９及び７１がある。
【００５６】
（３）繰り返し配列（Ｒｅｉｔｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）とゲノム長の多型性の分析
ＶＺＶウイルス株のＯＲＦの長さは殆ど変化がなかった。ＶＺＶウイルス株の７４ＯＲＦのうち６３番目は、ウイルス株の間に長さ差が殆どないことを確認することができた。３個のＯＲＦ（ＯＲＦ１１、１４、２２）は下記表２から確認できるように、繰り返された配列の長さのため、系統の間に長さの多型性が比較的高く存在することを確認することができた。
【００５７】
【表２】
2014508522.tif 000004
【００５８】
即ち、Ｒ１はＯＲＦ１１に位置し、１８ｂｐのエレメント（コンセンサス：ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡ）及び１５ｂｐのエレメント（コンセンサス：ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡ）の多様な配列の組み合わせで構成されていた。ＭＡＶ０６ウイルス株は、ＯＲＦ１１内の１５ｂｐのエレメントが追加的に繰り返されるため、Ｏｋａワクチンウイルス株とは長さが異なった。
【００５９】
また、Ｒ２はＯＲＦ１４に位置し、多様な４２ｂｐのエレメント（コンセンサス：ＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＴＴ／ａＣＣＣＧＡＡＡＧ／ｔａＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣＧＣＣＣ：小文字は和の小さい偏差を示す）で構成され、その部分的な３２ｂｐのエレメントがさらに追加されている。ＭＡＶ０６ウイルス株はＯｋａワクチンウイルス株のようにＯＲＦ１１内の４２ｂｐのエレメントが７回繰り返されていた。
【００６０】
また、Ｒ３はＯＲＦ２２の３／末端の中間に位置し、９ｂｐのエレメントが繰り返して複製されている。９ｂｐのコンセンサス配列はＧＣ／ｔＣＣＧＣ／ｔＧ／ｃＣＡ／ｇ（小文字は和の小さい偏差を示す）である。繰り返し回数（ｎ）は系統の間に大きく異なる。０３−５００ウイルス株は繰り返し回数が７３回であり、ｖＯｋａウイルス株は繰り返し回数が３回である。ＭＡＶ０６ウイルス株は９ｂｐのエレメントが１１回繰り返されているが、ＶａｒｉｌＲｉｘ及びＶａｒｉＶａｘウイルス株は８回繰り返されている。
【００６１】
また、Ｒ４とＲ５は非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）部位である。Ｒ４は２７ｂｐのエレメント（コンセンサス：ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡ）で構成され、その部分的な１１ｂｐエレメントがさらに追加されている。Ｒ４（Ｒ４ａ）はＩＲＳ内のＯＲＦ６２と６３との間に位置しており、それに相補的なＲ４ｂの位置はＴＲＳ内のＯＲＦ７０と７１との間に位置している。Ｒ４ａの長さはＲ４ｂ長さと同一であるが、ＨＪ０ウイルス株の場合はＲ４ａとＲ４ｂの長さが異なる。ＨＪ０ウイルス株のＲ４ｂの長さは、２７ｂｐのエレメントが４回さらに繰り返されるため、Ｒ４ａより１０８ｂｐ長い。ＶａｒｉｌＲｉｘ及びＶａｒｉＶａｘウイルス株の場合は、２７ｂｐのエレメントが５回さらに繰り返されている。ＭＡＶ０６ウイルス株は、２７ｂｐのエレメントが３回さらに繰り返されている。
【００６２】
Ｒ５はＯＲＦ６０と６１との間に位置しており、２４ｂｐのエレメントが含まれた８８ｂｐのエレメントで構成されている。前記２個のエレメントは、他の繰り返し配列と異なって、２つのタイプの繰り返し配列が存在した。ＭＡＶ０６ウイルス株は大部分のウイルス株と同様に、２個の８８ｂｐのエレメント及び１個の２４ｂｐのエレメントを含んでいたが、ｖＯｋａ及びｐＯｋａウイルス株は３個の８８ｂｐ及び２個の２４ｂｐのエレメントを含んでいた。
【００６３】
２４個のＶＺＶウイルス株のゲノム配列と繰り返し配列の長さを比較することで、ＶＺＶウイルス株のゲノムの長さの多様性は、繰り返し配列の長さによるものであることを確認した。ＢＣウイルス株は最長のゲノムであり、最長の繰り返し配列を含んでいたが、ＭＡＶ０６ウイルス株は最短のゲノムであり、二番目に短い繰り返し配列を含んでいた。最長のゲノムと最短のゲノムとの間の長さ（７００ｂｐ）は、最長の繰り返し配列と最短の繰り返し配列との差（７２４ｂｐ）とほぼ同様であった。もし繰り返し配列がゲノムから除去されると、ＣＶ（変動係数）の変化とともにゲノム長が短くなる。全体ゲノムから繰り返し配列が除去されると０．０００１２９値が削除され、ＣＶは０．００１７９に計算される。
【００６４】
実際に、下記図５から確認できるように、ゲノムの長さの順を繰り返し配列の長さの順にした時に、相関係数（ｒ２）は０．９８５４の値を有し、ＶＺＶウイルス株のゲノムと繰り返し配列の長さが略直線関係になった。
【００６５】
（４）複製開始点（Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）
ＶＺＶウイルス株の複製（ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＯＲＩ）配列はＯＲＦ６２とＯＲＦ６３との間に位置していた。ＯＲＩ配列の長さは、３６ウイルス株では８０ｂｐであり、ＨＪ０ウイルス株では、ＯＲＩ配列の配列中間にＴＡとＧＡのジヌクレオチドの繰り返し数が異なるため１０８ｂｐであった。
【００６６】
ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＩ配列は、下記表３から確認できるように、ゲノムの１１０，０８０番目と１１０，１８３番目の位置の間に位置しており、１５タンデム（ｔａｎｄｅｍ）ＧＡの繰り返し塩基が１５回、ＴＡの繰り返し塩基が１１回含まれていた。
【００６７】
【表３】
2014508522.tif 000005
【００６８】
ゲノムの１１０，２３５位置内の繰り返し塩基数は異なるが、Ｏｋａワクチンウイルス株及びＭＡＶ０６ウイルス株は、通常、参照ウイルス株であるＤｕｍａｓ内の１１０，２３５の該当ヌクレオチド位置でＧＡ繰り返しのうち１つがＡがＧで置換されている。ＯＲＩ配列は、ＨＪ０及びＶａｒｉｌＲｉｘウイルス株を除き、正確に相互補完的な形態にＯＲＦ７０とＯＲＦ７１との間に重複されていた：（ＴＡ）３（ＧＡ）２はＨＪｏウイルス株で欠失されており、ＶａｒｉｌＲｉｘウイルス株では１個のＧＡ繰り返し塩基が欠失されていた。
【００６９】
（５）ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＦの特性分析
ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＦ０の長さは突然変異のため長かった。終止コドンであるＴＧＡ（ヌクレオチド位置３８８−３９０）がアルギニン（Ａｇｒ）をコードするＣＧＡに突然変異されていた。終止コドンと推定されるＴＧＡはＯＲＦ１とともに重なっている下端部位で探すことができた。拡張されたＯＲＦ０は２２１個のアミノ酸残基を有する新しいタンパク質をエンコードした。同一の突然変異を、他の類似のｖＯｋａ、ＶａｒｉｌＲｉｘ、及びＶａｒｉＶａｘワクチンウイルス株でも確認することができた（図６）。
【００７０】
全ての臨床ウイルス株のうちｐＯｋａウイルス株は、１２９個のアミノ酸をコードする３９０ｂｐの長さのＯＲＦ０を含んでいた。
【００７１】
参照ウイルス株であるＤｕｍａｓと比べると、ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＦ１７（配列番号３）とＯＲＦ５６（配列番号５）の長さは、それぞれ６５８〜６６０位置のＴＣＴと３６７〜３６９位置のＴＣＡが欠失されて、３ｂｐの差があった（図７及び図８）。上記のような全ての欠失は、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ、Ｓ）アミノ酸残基の欠失をもたらした。一方、ＭＡＶ０６ウイルス株のＯＲＦ６０（配列番号６）には、２８番目の位置に３個のヌクレオチドＡＴＧが挿入されていた（図１０）。興味深いことに、ｐＯｋａウイルス株を含む全てのＯｋａワクチンウイルス株で、１つの挿入及び２つの欠失を確認することができた。
【００７２】
また、Ｏｋａワクチンウイルス株だけでなくＭＡＶ０６ウイルス株で、ＯＲＦ２９（配列番号４）がＤｕｍａｓおよび大部分の臨床ウイルス株より１５ｂｐ（（ＡＡＣＡＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ）短かった。参照ウイルス株であるＤｕｍａｓおよび大部分の臨床ウイルスは、１５ｂｐの配列を連続的に且つ繰り返して含んでいた。Ｍ２ＤＲ、ＣＡ１２３及び８の臨床ウイルス株は、Ｏｋａワクチンウイルス株及びＭＡＶ０６ウイルス株と同様に、ＯＲＦ６０の長さが同一であった（図９）。
【００７３】
配列番号１はＶＺＶ  ＭＡＶ０６ゲノムＤＮＡを示す。
配列番号２はＶＺＶ  ＭＡＶ０６ゲノムＤＮＡのＯＲＦ０を示す。
配列番号３はＶＺＶ  ＭＡＶ０６ゲノムＤＮＡのＯＲＦ１７を示す。
配列番号４はＶＺＶ  ＭＡＶ０６ゲノムＤＮＡのＯＲＦ２９を示す。
配列番号５はＶＺＶ  ＭＡＶ０６ゲノムＤＮＡのＯＲＦ５６を示す。
配列番号６はＶＺＶ  ＭＡＶ０６ゲノムＤＮＡのＯＲＦ６０を示す。
【図１】
2014508522.tif 000006
【図２】
2014508522.tif 000007
【図３】
2014508522.tif 000008
【図４】
2014508522.tif 000009
【図５】
2014508522.tif 000010
【図６】
2014508522.tif 000011
【図７】
2014508522.tif 000012
【図８】
2014508522.tif 000013
【図９】
2014508522.tif 000014
【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月21日(2013.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなる水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されることを特徴とする、ＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡのオープンリーディングフレームによりコードされたタンパク質。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列からなるＶＺＶ  ＭＡＶ０６のゲノムＤＮＡ、配列番号２の塩基配列からなるＯＲＦ０、配列番号３の塩基配列からなるＯＲＦ１７、配列番号４の塩基配列からなるＯＲＦ２９、配列番号５の塩基配列からなるＯＲＦ５６、及び配列番号６の塩基配列からなるＯＲＦ６０から選択されるオープンリーディングフレームを含む、組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大膓菌、昆虫細胞から選択されるものであることを特徴とする、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記形質転換された宿主細胞は、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、ミエローマ細胞株、ＨｕＴ７８細胞及び２９３細胞、大膓菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
配列番号１〜６から選択される何れか１つの塩基配列によりコードされたＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載のＶＺＶ  ＭＡＶ０６のタンパク質を有効成分とするワクチン組成物。
【請求項１０】
体内への注入時に抗体形成を増進させる役割をする薬学的に許容される免疫アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記免疫アジュバントは、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡＬＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、ＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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