(57)【要約】哺乳類細胞中でＤＥＡＤボックスへリカーゼの阻害剤として示される、ＲＫ−３３化合物、またはその塩、溶媒和物、立体異性体若しくはこれらの誘導体を提供する。ＲＫ−３３は、また増殖性疾患に罹患し、放射線治療下にある対象の放射線照射増感剤としても使用される。ガン等の増殖性疾患の治療方法として、ＲＫ−３３と定位放射線治療（ＳＡＢＲ）等の放射線治療を組み合わせる治療方法も提供する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための、好適には哺乳類細胞若しくは哺乳類細胞群におけるＤＤＸ３阻害剤として使用するための、またはより好適には増殖性疾患に罹患して放射線治療下にある対象における放射線照射増感剤として使用するための、ＲＫ−３３化合物、またはその塩、溶媒和物、立体異性体若しくはこれらの誘導体。
【請求項２】
薬剤として使用するための、好適には哺乳類細胞若しくは哺乳類細胞群におけるＤＤＸ３阻害剤として使用するための、またはより好適には増殖性疾患に罹患して放射線治療下にある対象における放射線照射増感剤として使用するための、ＲＫ−３３化合物、またはその塩、溶媒和物、立体異性体若しくはこれらの誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬剤組成物。
【請求項３】
前記増殖性疾患がガンである、請求項１または２に記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項４】
前記ガンが、高い照射量の放射線治療で治療可能なタイプである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項５】
前記ガンが、グリア芽腫及び髄芽腫を含む、肺ガン、乳ガン、膵ガン、肝ガン、前立腺ガン及び中枢神経系のガンである、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項６】
ガン細胞が低酸素抵抗性である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項７】
ガン細胞が化学療法抵抗性である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項８】
ガン細胞が放射線治療抵抗性である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項９】
対象のガンを治療する方法であって：
ａ）単回投与または複数回投与で請求項２に記載の薬剤組成物を有効量で対象に投与するステップ；及び
ｂ）対象のガン部位付近に電離放射線を照射するステップ、
を備えた方法。
【請求項１０】
さらに、ステップａ）及びステップｂ）を２サイクル以上繰り返す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電離放射線の照射量が０．１Ｇｙ〜約３０Ｇｙの範囲内であり、好ましくは５Ｇｙ〜約２５Ｇｙの範囲内である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記放射線が定位放射線治療（ＳＡＢＲ）または定位放射線療法（ＳＢＲＴ）である、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
本願は、２０１１年３月９日付の米国仮出願である、出願番号第６１／４５０，９６９号に基づく優先権を主張する。前記米国仮出願の内容は、あらゆる目的において、本明細書に引用して取り込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
固形腫瘍の治療において、電離放射線が広く使用されている。従来の限定的な放射線治療は、何週にもわたって、低量（２〜３Ｇｙ）の処理を多数回（一般的には２０〜４０回）実施することを要する。定位放射線治療（ＳＡＢＲ）として知られる、高量（＞１５〜２０Ｇｙ）で５回未満実施する放射線治療についても、ヒト腫瘍の効果的な治療を提供するための有望なデータが報告されている。近年、頭蓋内の微小な腫瘍に対する定位放射線手術（ＳＲＳ）において初めてＳＡＢＲが試され、これは、ミリメートル単位未満の送達精度と、標的となる腫瘍を跨ぐ急勾配の量変化を可能とする技術により実現可能となった。ＳＡＢＲは、定位放射線療法（ＳＢＲＴ）としても知られ、脳以外の標的腫瘍にする、より先進的な技術とともに、最近開発されてきた治療であり、実際に身体の主要な各部位の腫瘍に対して用いられてきた。早期段階の肺ガン及び少数転移ガンにおける初期のＳＡＢＲの臨床試験において、〜９０％の良好な局所制御が可能であることが示された。しかしながら、ＳＡＢＲでの極端に高い量は、正常な組織に対する顕著な傷害性に関連し得る。このように、ＳＡＢＲの提供には、技術的な複雑さや傷害性の増加があることから、分画ごとに低い量を使用できる、腫瘍選択的な放射線増感剤の探索が続けられている。また、生体内でＳＡＢＲが腫瘍に対して作用し、従来の放射線増感剤（例えば白金試薬）がＳＡＢＲを促進するするメカニズムについてはあまり知られておらず、従来の放射
線増感剤（例えば白金試薬）がＳＡＢＲを促進することを予測することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そのため、効果的なＳＡＢＲでの治療および顕著に低い量での放射線照射を可能とする、改良された放射線量増感剤の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
表現型の変化に必須の多様な細胞経路の定性試験を行うことにより、ＲＮＡへリカーゼファミリーの１つである、ＤＤＸ３が同定された。ＤＤＸ３は、肺ガンを含む多くの種類のガンにおいて、調節不可能となる。本発明は、低分子阻害剤：ＲＫ−３３（融合ジイミダゾジアゼピン）を使用したＤＤＸ３を標的とする治療が、カルボプラチン抵抗性の細胞株を含む、試験された全ての肺ガン細胞株において効果的であることを提供する。最も重要なことは、自然発症ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／ｔｅｔＯ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｔｅｔＯ−Ｔｗｉｓｔ１（ＣＲＴ）トランスジェニック肺ガンマウスモデル使用時に、生体内にＳＡＢＲ（１５Ｇｙ×１）と組み合せてＲＫ−３３を投与して、従来の分画された最低限の照射（３Ｇｙ×１０）を行うことで、本発明の方法が、肺腫瘍の負担を顕著に低減させることができることである。本発明は、ＳＡＢＲ治療の効果を促進する新規の放射線増感剤として、化合物ＲＫ−３３とその誘導体を提供するものである。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、薬剤として使用するための、好適には哺乳類細胞内または細胞群内でのＤＤＸ３阻害剤として使用するための、より好ましくは、増殖性の疾患に罹患した対象における放射線治療下で放射線量増感剤として使用するための、ＲＫ−３３化合物、またはその塩、溶媒和物、立体異性体若しくはこれらの誘導体及び薬学的に許容可能な担体、を提供する。
【０００６】
他の実施形態において、本発明は、対象のガンを治療する方法であって、ａ）ＲＫ−３３化合物、またはその塩、溶媒和物、立体異性体若しくはこれらの誘導体及び薬学的に許容可能な担体を、単回または複数回で対象に投与するステップと、ｂ）対象のガン部位付近に電離放射線を照射するステップ、を備える方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】肺ガン細胞株中でのＤＤＸ３の発現を表すイムノブロットである。１Ａ）は、２種類の濃度のタバコ煙濃縮物（ＣＳＣ）にそれぞれ曝されたＢｅａｓ２Ｂ細胞株のＤＤＸ３の発現を示す。１Ｂ）は、非小細胞性肺ガン細胞株（Ｈ２３及びＡ５４９）におけるＤＤＸ３の発現を示す。アクチンは、ローディングコントロールとして使用した。
【図２】Ａ５４９及びＡ５４９−ｓｈＤＤＸ３細胞株を使用した軟寒天アッセイにおいて形成されたコロニー数を示す棒グラフである。実験は、三重測定にて行った。
【図３】正常な肺及び多様な病態ステージの肺ガンにおけるＤＤＸ３の発現を表す顕微鏡写真のセットである。正常な肺の顕微鏡写真は４０倍の倍率で、肺ガン試料の顕微鏡写真は２０倍の倍率で撮影した。
【図４】ＲＫ−３３によるＤＤＸ３のへリカーゼ活性の阻害を示すチャートである。
【図５】２つの肺ガン細胞株でのＲＫ３３の効果を示すプロットである。肺ガン細胞株は、多様な濃度のＲＫ−３３とともに培養した。３日目に、代謝活性を有する細胞のパーセンテージを割り出すために、ＭＴＳアッセイを実施した。Ｈ２３及びＡ５４９のＩＣ５０値は、それぞれ３．５及び５μＭである。
【図６】ＲＫ−３３が低酸素状態下で細胞死を引き起こし得ることを示す。低酸素状態で誘発される赤色蛍光タンパク質（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現するよう設計された細胞をＣｏＣｌ２（低酸素状態類似化合物）存在下で２４時間培養し、その後、ＲＫ−３３を添加して７２時間培養した。顕微鏡写真は２０倍の倍率で撮影した。実験は二回繰り返した。
【図７】Ａ５４９細胞がカルボプラチンには耐性であるが、ＲＫ−３３には感受性であることを示すＭＴＳアッセイの結果を表す曲線である。実験は三重測定にて行った。
【図８】放射線照射とＲＫ−３３のＡ５４９細胞に対する効果を示す１セットの棒グラフである。上記の組み合わせの処理により、細胞死に関して相乗効果を示した。実験は三重測定にて行った。
【図９】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いた、マウスにおける多様な時間間隔でのＲＫ−３３の生体分散性を示す１セットの曲線である。この実験において、１つの時間点について計５匹のマウスを使用した。
【図１０】本発明の誘導型肺上皮特異的Ｔｗｉｓｔ１−ルシフェラーゼマウスモデルの発生を示す概略図および一連の写真である。  １０Ａ）ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡを含むマウスは、Ｔｗｉｓｔ１−ｔｅｔ−Ｏ−Ｌｕｃ系列と交配され、ドキシサイクリンを投与されたバイトランスジェニックアニマル（ｂｉｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）（ＣＴ）は、Ｔｗｉｓｔ１及びＬｕｃの転写を誘導する。  １０Ｂ）ＣＴトランスジェニックマウス系列は、ウエスタンブロット法と（１０Ｃ）のキセノンスペクトル上のＢＬＩで示すように、バイトランスジェニックマウスの肺においてのみ誘導型Ｔｗｉｓｔ１及びルシフェラーゼを発現する。  １０Ｄ）Ｔｗｉｓｔ１は、２９週間（ＣＲ）から１４週間（ＣＴＲ）へと、Ｋｒａｇ１２Ｄによって誘導される肺腫瘍形成を促進させる。  １０Ｅ）ＣＲＴ腫瘍は、マイクロＣＴ（左図）若しくはマイクロＰＥＴ（右図）に示すように、ドキシサイクリンの中止後またはＫｒａｓ＆Ｔｗｉｓｔ１腫瘍遺伝子の停止後、急速に退行する。
【図１１】放射線と併用したＲＫ−３３の化学増感により、ＣＲＴマウスの肺腫瘍が減少することを示す棒グラフである。ＲＫ−３３と放射線の治療の後、マイクロＣＴを用いて動物の画像を取得した（図示せず）。棒グラフは、１グループあたりｎ＝８の動物における肺腫瘍の体積現象を示す。腫瘍体積は、ヒト患者を対象とした診療所で使用される、画像解析及び体積測定に有用なＰｉｎｎａｃｌｅ３  放射線治療設計ソフトウェア  ｖ．８．１ｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いた一連のＣＢＣＴデータより定量化した。一連のＣＢＣＴデータは、それぞれ、腫瘍の負荷評価のための完全３Ｄ体積データを包含する。
【図１２】生体外でＲＫ−３３と放射線とで処理されたＡ５４９細胞の一連の生存曲線である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、ＳＡＢＲ治療の効果を促進するために、新規の放射線増感剤として、化合物ＲＫ−３３とその誘導体を提供する。ＲＫ−３３は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５２７３において提供された融合ジイミダゾジアゼピンの新規のクラス（本明細書に引用して取り込む）の一つである。ＲＫ−３３の構造は、下記の通りである。
【化１】
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【０００９】
別の実施形態において、本発明は、ＤＤＸ３のＡＴＰ結合領域に適合し、ガン細胞中で細胞死を誘導する、新規の小分子としてＲＫ−３３を提供する。そして、本発明は、さらに、肺ガン細胞中のＤＤＸ３の機能を減衰させる方法を提供する。該方法は、ほとんどまたは全く動物に対する毒性を示すことなく、カルボプラチン耐性の肺ガン細胞株においても細胞死を誘導する。
【００１０】
ある実施形態によると、本発明は、薬剤として使用するための、好ましくは哺乳類の細胞または細胞集団におけるＤＤＸ３阻害剤として使用するための、より好ましくは増殖性疾患に罹患して放射線治療を受けている対象において放射線増感剤として使用するための、ＲＫ−３３の化合物、塩、溶融和物、立体異性体、またはこれらの誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００１１】
したがって、本発明の化合物およびその誘導体には、開示された化合物の互変異性体と、鏡像異性体、立体異性体およびジアステレオ異性体を含む異性体と、それの薬学的に許容可能な塩類とが包含される。「薬学的に許容可能な塩類」の用語は、例えば、水溶性を高めるために使用される、アルカリ金属塩を形成する塩や、遊離酸または遊離塩基の追加の塩類を形成する塩として、一般的に用いられる塩類を包含する。薬学的に許容可能な酸性追加塩類の形成に使用可能な酸の例としては、塩酸、硫酸及びリン酸等の無機酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸等の有機酸が挙げられる。他の薬学的に許容可能な塩類としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属との塩類、または、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基との塩類が挙げられる。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩類として適切なものとしては、例えば、本発明の化合物の溶液と、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸等の薬学的に許容可能な酸の溶液とを混合することで形成される、酸性追加塩類が挙げられる。これらの塩類は全て、例えば、適切な酸又は塩基を本発明の適切な化合物と反応させる等、従来の手段で調製することができる。
【００１２】
遊離カルボキシル基から形成される塩類も、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ）等の無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基より生成することができる。
【００１３】
薬剤としての使用のため、本発明の化合物の塩類は、薬学的に許容可能な塩類でなければならない。しかしながら、他の塩類も、本発明の化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩類の調製に使用可能である。
【００１４】
また、本発明の実施形態には、本発明の化合物の水和物を包含する。「水和物」の用語は、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物等を包含するが、これに限定されるものではない。本発明の化合物の水和物は、選択された水和物を製造するために適した条件下で、化合物と水とを接触させることにより調整することができる。
【００１５】
本発明の実施形態は、化合物を含む薬剤製品の調製方法をも包含する。本明細書で定義される「薬剤製品」の用語は、薬剤用途（薬剤組成物）に適した組成物を意味する。本発明の化合物を含む特定のアプリケーションのために製剤化される薬剤組成物は、本発明の一部であり、本発明の一実施形態として認識すべきである。
【００１６】
本明細書で使用される、「治療する（ｔｒｅａｔ）」の用語は、この用語の本来の意味とともに、予防手段や障害軽減療法（ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｒｅｍｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）をも包含する。「減少させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」及び「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」の用語は、これらの用語の本来の意味とともに、少なくなる（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）または減少する（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）の意味としても、一般的に理解し得る。これらの用語は、必ずしも、１００％または完全な、治療、現象、抑制、予防または阻害を意味するわけではない。
【００１７】
本明細書に記載される薬剤組成物に関して、薬学的に許容可能な担体は、溶解性や活性化合物との非反応性等の物理化学的な考察や、投与経路によってのみ制限されるものの、従来から使用されているものをいずれも使用可能である。本明細書において記載される薬学的に許容可能な担体（例えば、賦形剤、補助剤、添加剤及び希釈剤）は、当業者にとって周知であり、公衆が直ちに利用できるものである。薬学的に許容可能な担体の例としては、物理的に許容可能な周知のバッファー（例えばリン酸バッファー）等の可溶性の担体や、固形状担体またはラテックスビーズ等の固体組成物が挙げられる。薬学的に許容可能な担体は、活性を有する薬剤に対して化学的に不活性なものであり、かつ、使用条件下で有害な副作用または毒性をほとんどまたは全く示さないものであることが好ましい。
【００１８】
本明細書で使用される担体または希釈剤は、固体担体または固形剤形用の希釈剤であっても、液体担体または液体剤形用の希釈剤であっても、これらの混合物であってもよい。
【００１９】
固体担体または希釈剤としては、ガム、デンプン（例えば、コーンスターチ、未ゼラチン化デンプン（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ  ｓｔａｒｃｈ））、糖（例えば、例えばラクトース、マンニトール、ショ糖、ブドウ糖）、セルロース材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（例えば、ポリメチルアクリル酸塩）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルクまたは混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
液体製剤においては、薬学的に許容可能な担体は、例えば、水性若しくは非水性の溶液、懸濁液、乳化液または油とすることができる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。水性の担体としては、例えば、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、乳化液または懸濁液が挙げられ、これらには、生理食塩水や緩衝性媒体も含まれる。
【００２１】
油の例としては、石油系、動物、植物または合成系の油が挙げられ、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、胡麻油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリンおよびミネラルオイルが挙げられる。非経口製剤での使用に適した脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例として挙げられる。
【００２２】
非経口性の賦形剤（皮下、静脈内、動脈内または筋肉内注射用）としては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ‘ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液及び不揮発性油が挙げられる。非経口投与に適した製剤としては、水性及び非水性の等張性無菌注射溶液、及び水性及び非水性の無菌懸濁液が挙げられる。該注射溶液は、酸化防止剤、バッファー、静菌剤及び製剤と投与対象の血液とを等張とするための溶質を含み得る。該懸濁液は、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存料を含み得る。
【００２３】
静脈内賦形剤としては、例えば、液状の栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲル・デキストロースを主成分としたもの）等が挙げられる。例としては、水や油の無菌の液体であって、界面活性剤及び他の薬学的に許容可能な補助剤を添加したものも、していないものも挙げられる。通常、水、生理食塩水、ブドウ糖液及び関連する糖溶液、及びプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、液体担体、特に注射溶液として好適である。
【００２４】
また、一実施形態において、本発明の化合物は、例えば、結合剤（例えば、アカシア（ａｃａｃｉａ）、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、ナトリウム澱粉グリコール酸ナトリウム）、多様なｐＨ及びイオン強度のバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸バッファー、リン酸バッファー）、表面の吸着を防ぐためのアルブミンまたはゼラチン等の添加剤、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩類）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、浸透性促進剤、可溶化剤（例えば、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ、グリセロール、ポリエチレングリコール、ステアリン酸）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール）、増粘剤（例えば、カルボマー、コロイダル二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、流動助剤（例えば、コロイダル二酸化ケイ素）、可塑化剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸取トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ｐｏｒｏｘａｍｅｒまたはｐｏｒｏｘａｍｉｎｅ）、コーティングまたはフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩）及び／または補助剤を、さらに含有することができる。
【００２５】
担体の選択は、一つには、特定の化合物や、該化合物を投与するための特定の方法に従って行われる。そのため、本発明の薬剤組成物には、種々の適切な剤形が存在する。皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜化、腹膜内投与等の、非経口投与が例示されるが、これらに限定されるものではない。化合物投与には複数の経路を使用してもよく、特定の例において、特定の経路は他の経路より、迅速かつ効果的な反応を奏することができる。
【００２６】
非経口製剤に適した石鹸としては、例えば、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、適した界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）としては、例えば、（ａ）ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、アルキルピリジニウムハロゲン化物等のカチオン性界面活性剤、（ｂ）アルキル、アリール及びオレフィンスルホン酸、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリド硫酸塩、及びスルホコハク酸塩等のアニオン性界面活性剤、（ｃ）脂肪族アミン酸化物、脂肪族アルカノアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等の非イオン性界面活性剤、（ｄ）アルキル−β−アミノプロピオン酸塩及び２−アルキル−イミダゾリン−第４級アンモニウム塩等の両性界面活性剤、及び（ｅ）これらの混合物が挙げられる。
【００２７】
非経口製剤は、通常、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の前記化合物を含む。保存料及びバッファーを使用してもよい。注射位置での刺激を最小限にするかなくすために、例えば、１以上の非イオン性界面活性剤を組成物に配合してもよく、例えば、親水親油バランス（ＨＬＢ）を約１２〜１７としてもよい。該製剤における界面活性剤の量は、通常は、約５重量％〜約１５重量％とする。適した界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンのモノオレイン酸塩）や、プロピレン酸化物をプロピレングルコールとの縮合により形成される、高分子量のエチレンオキシドの疎水性塩基付加物が挙げられる。
【００２８】
非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単回投与用または複数回投与用の密封容器により提供することができ、凍結乾燥の状態で保存することができ、使用直前に、注射用に、水等の無菌液体担体の添加だけが要求される。無菌の粉体、加硫、及び錠剤から、即席の注射溶液及び懸濁液を調整することができる。
【００２９】
本発明は、注射用製剤を包含する。注射用組成物に効果的な薬剤担体に必要とされる事項は、当業者にとって周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), and ASHP Handbook on InjectableDrugs, Trissel, 15th ed., pages 622-630 (2009)を参照のこと）。
【００３０】
本明細書において「放射線量増感剤」の用語は、細胞、細胞群または組織に接触することで、その細胞、細胞群または組織の電離放射線への感受性を高めることができる、あらゆる薬剤を包含する。
【００３１】
本明細書において、「増殖性疾患」の用語は、ガン及び他の疾患（例えば新生組織形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）及び過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ））を包含する。細胞増殖性疾患としては、例えば、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節症、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、脈管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、前ガン病変、上皮内ガン、口腔毛状白板症または乾癬が挙げられる。１以上の実施形態において、「ガン」の用語は、例えば、肺、肝臓、膵臓、前立腺、乳房および中枢神経系のガンを包含し、これらはグリア芽腫およびこれに関連する腫瘍をも含む。他の実施形態において、「ガン」の用語は、高用量の放射線に対して耐性を示す、組織内のガンを包含する。高用量の放射線としては、２Ｇｙより高い用量のものが包含される。
【００３２】
一実施形態において、本発明によって治療されるガンは、例えば、低酸素療法、タモキシフェンまたはタキソール等の化学療法に対して耐性のガンや、すでに放射線治療に耐性を有するガンを含む。
【００３３】
他の実施形態において、本発明は、対象のガンを治療する方法であって、ａ）１回以上投与分の、ＲＫ−３３化合物、もしくは、その塩、溶融和物、立体異性体またはこれらの誘導体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、有効量の薬剤組成物を対象に投与する工程と、ｂ）対象のガン部位に近接位置に電離放射線を照射する工程とを備える方法を提供する。
【００３４】
一実施形態において、「投与」の用語は、本発明の化合物を、対象、好ましくは増殖性疾患の治療を受ける対象に導入し、該化合物が生体内の１以上の疾患に関連する細胞または細胞群に接触できるようにすることを意味する。
【００３５】
本明細書に定義されるように、他の実施形態では、「接触」の用語は、試験管、フラスコ、組織培養、チップ、アレイ、プレート、マイクロプレート、毛細管等において、本発明の化合物の１以上を、少なくとも一つのガン細胞及び適切な酵素または薬剤を有するサンプルに導入し、少なくとも１つの化合物がガン細胞に結合して取り込まれるのに充分な温度及び時間でインキュベーションする、ことを意味する。サンプルを化合物または他の特定の結合成分に接触させる方法は、当業者にとって周知であり、実施されるアッセイプロトコルの種類に合わせて選択され得る。インキュベーション方法についても、標準的なものであり、当業者にとって公知である。
【００３６】
本明細書で使用される「治療」の用語は、その本来の意味とともに、障害軽減療法と同様に診断及び治療をも包含し、ＳＡＢＲ、ＳＲＳ及びＳＢＲＴ法を含む、対象または細胞若しくは細胞群に対する１回以上の放射線の照射を包含するが、これに限定されるものではない。対象が、複数の治療か、周期的な放射線治療を受けることが、腫瘍体積を減少させ、ガン／標的細胞の死を引き起こすのに効果的であることは、理解され得るであろう。
【００３７】
放射線治療、放射免疫療法またはプレターゲット（Ｐｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）放射免疫療法が、腫瘍学的な性質を有する疾患の治療に使用される。「放射線治療（Ｒａｄｉａｔｈｅｒａｐｙ）」または放射線治療は、電離放射線を用いた、ガン及び他の疾患の治療を意味する。電離放射線は、治療領域（標的組織）の細胞を、それらの遺伝物質に損傷を与え、これらの細胞の成長継続を不可能とすることによって、傷害または破壊する。放射線治療は、皮膚、舌、咽頭、脳、乳房、肺、または子宮頸部ガン等の局所的な固形腫瘍の治療に使用してもよい。また、白血病及びリンパ腫、すなわち、順に造血細胞及びリンパ系のガンの治療に使用してもよい。通常使用される放射線治療の一つとしては、光子（例えばＸ線）が挙げられる。放射線の有するエネルギー量によって、光線は、身体の表層または深部のガン細胞の破壊に使用可能である。Ｘ線光線のエネルギーが高いほど、Ｘ線は標的組織により深く進入できる。線形加速器およびベータトロンは、より大きなエネルギーのＸ線を生じる機械である。機会を使用してＸ線等の放射線をガン部位に集中させる方法は、外部光線放射線治療と呼ばれる。γ線は、放射線治療で使用される光子の他の形態である。
特定の元素（例えば、ラジウム、ウラン及びコバルト６０）が分解または崩壊する際に放射線を放出することにより、γ線は自発的に生成される。ガン細胞へと放射線を送達するための他の技術として、腫瘍または体腔内に放射活性を有する移植片を直接配置することがある。これを内部放射線治療という。近接照射療法、組織内照射法、腔内照射法は、種々の内部放射線治療である。この治療において、放射線量は小さな領域に集中し、患者は２、３日間の入院することとなる。内部放射線治療は、舌、子宮体および子宮頸部のガンに対してよく用いられる。更に他の技術としては、手術内照射があり、手術内照射においては、手術の間に大用量の外部放射線が、腫瘍および周辺組織に照射される。他の方法としては、粒子線放射線治療がある。この種の治療は、局所的なガンの治療に高速運動の亜原子粒子を使用する点で、光子放射線治療と異なる。いくつかの粒子（中性子、π中間子及び重イオン）は、組織を通過する経路に沿って、Ｘ線またはγ線と比して高いエネルギーを与え、これにより、粒子が当たった細胞に対してより多くの損傷を生じさせる。この種の放射線は、しばしば、高い線エネルギー付与（高ＬＥＴ）放射線として参照される。放射線感受性増強物質は、腫瘍細胞をより損傷を受け得る状態とし、そして、放射線防護剤は、通常の組織を放射線の影響から保護する。
【００３８】
ある実施形態において、本発明は、対象のガンを治療する方法であって、ａ）ＲＫ−３３を含む有効量の薬剤組成物を対象に投与する工程と、ｂ）対象のガン部位付近に電離放射線を照射する工程、を備える方法を提供する。他の実施形態において、該方法は、対象に対して２以上のサイクルで繰り返されてもよい。
【００３９】
さらに他の実施形態において、該方法で使用する薬剤組成物は、ＲＫ−３３及び他の治療薬または薬剤を含んでいてもよい。
【００４０】
本明細書で使用される「対象」の用語は、マウス及びハムスター等のネズミ目、ラビット等のウサギ目等（ただし、これらに限定されない）のあらゆる哺乳類動物を示す。該哺乳類動物は、ネコ及びイヌ等を包含する食肉目であることが好ましい。該哺乳類動物は、ウシ及びブタ等を包含する偶蹄目、またはウマを包含する奇蹄目であることが、より好ましい。該哺乳類が、Ｃｅｂｏｉｄまたはサル等の霊長目、またはヒト及び類人猿等の真猿亜目であることが、最も好ましい。特に好適な哺乳類動物は、ヒトである。
【００４１】
本明細書に使用される「化学療法剤」の用語は、その本来の意味とともに、通常、ガン細胞内のＤＮＡ合成または機能への干渉により作用する、薬学的または治療的活性を有する化合物を包含する。細胞レベルのそれらの化学作用に基づいて、化学療法剤は、細胞周期特異的な薬剤（細胞周期の特定の段階で効果的である）と、細胞周期非特異的な薬剤（細胞周期の全ての段階で効果的である）とに分類することができる。化学療法剤の例としては、特定の例に限定されるものではないが、アルキル化薬、血管形成抑制剤、アロマターゼ阻害薬、代謝拮抗物質、アントラサイクリン系、抗腫瘍抗生物質、単クローン性抗体、プラチナ製剤、トポイソメラーゼ阻害剤および植物アルカロイド等が挙げられる。
【００４２】
さらに他の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、上記の状態または疾患を治療し得る薬剤として知られる、１以上の追加の治療活性を有する薬剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明の組成物は、増殖性疾患の治療において、１以上の公知の治療活性を有する薬剤と組み合わせて使用することが可能であった。本発明の組成物及び方法による薬剤組成物と組み合わせて使用可能な、治療活性を有する他の薬剤の例としては、酵素核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、またはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体等の抗体、小分子、及び、金属、塩、及びイオン等の他の有機及び／または無機化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本明細書において「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」の用語は、ＤＤＸ３の発現、または、１以上のＤＤＸ３タンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子相当物のレベル、または、ＤＤＸ３タンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性を、上昇または下降させることを意味し、上記の発現、レベル、活性は、調節因子の不存在下で観測される値より、高いか、または低くなる。例えば、「調節する」の用語は、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」の意味で使用されるが、「調節する」の用語の意味は、この定義に限定されるものではない。
【００４４】
通常は、個々の対象を治療するための組成物の投与量は、主治医が、治療対象の年齢、体重、全身の健康状態、食事、性別、投与される化合物、投与ルート及び重症度等の多様な要素を考慮して決定する。例えば、本発明の範囲を限定するものではないが、本発明の組成物の投与量は、治療対象の体重に対して約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇとすることができる。他の実施形態において、本発明の組成物の投与量は、約１ｎＭ〜約１００ｍＭ、好適には約１０μＭ〜約５０ｍＭ、より好適には約１００μＭ〜約５ｍＭとすることができる。
【００４５】
ある実施形態において、本発明は、抗ガン剤をスクリーニングする方法であって：候補薬剤をＣＴ及び／またはＣＲＴトランスジェニックマウスに投与し、前記マウスのガン表現型に対する効果の有無により該候補薬剤の抗ガン活性を判定することを備えた方法を提供する。
【００４６】
さらなる実施形態において、本発明は、ガン細胞またはガン細胞群内のＤＤＸ３の発現を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって：候補薬剤をＣＴ及び／またはＣＲＴトランスジェニックマウスに投与し、前記マウスのガン細胞またはガン細胞群内のＤＤＸ３の発現に対する効果の有無により該候補薬剤の調節活性を判定することを備えた方法を提供する。
【実施例】
【００４７】
ＣＲＴマウスの生成と薬物治療。結果に示されるように、ＣＲＴマウスの機能的な有用性を検証した。ＣＲＴマウスは、バイトランスジェニックマウス（例えば、ＣＴ×ＣＲ）の組み合わせにより生成される。離乳直後の４〜５週齢のＣＲＴマウスに、ドキシサイクリンを飲料水に入れて３５０ｍＬ（２ｍｇ／ｍＬ以下）与えることで投与して、Ｔｗｉｓｔ１とＫｒａｓＧ１２Ｄの両方の導入遺伝子を同時に活性化させた。新しいドキシサイクリンを含む水を毎週投与した。遺伝子導入を行ってから１０週後に、マウスのマイクロＣＴ画像より腫瘍の進行を判定した。導入遺伝子の誘導と腫瘍進行度のマイクロＣＴによるイメージングを実験終了まで毎週継続した。肺ガンの誘導及び形成の後、ＲＫ−３３（１ｍＭ、４０ｍｇ／ｋｇに相当する）を、下記表に示されるスケジュールで、放射線と組み合わせて腹腔内に投与した。各群で使用した動物の数は、２５であった。
【００４８】
転移の実験的モデルと薬物治療。肺腫瘍転移モデルを構築するために、１×１０５のＡ５４９−ｔｄトマト細胞をＳＣＩＤマウスの尾部静脈に注射した。注射２週間後に、該動物の腹腔内にＲＫ−３３（１ｍＭ）を１週間で３回注射し、その後、ＳＡＢＲと一週間追加のＲＫ−３３注射（１ｍＭ、３回）を行い、マイクロＣＴの画像と光学的画像を取得した。各群で使用した動物の数は、２５であった。
【００４９】
腫瘍誘導と薬物治療。ＣＲＴマウスの肺ガンと、Ａ５４９実験転移モデルの構築は、上記のように実施した。各群（対象群と治療群）について２５匹のマウスを使用した。薬剤と放射線の投与量は、下表に示す通りである。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
非侵襲性の光学画像を使用した、前臨床モデルの腫瘍進行度の判定。腫瘍進行度の違いは、最初に、実験的な肺移転モデルの光学的イメージングを使用して予測する。動物の画像を、薬剤投与前、及び薬物投与後１週間ごとに取得した。全ての生存する動物の蛍光光学的なイメージングは、ジョンズホプキンス大学分子イメージングセンターで、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  システム（カリフォルニア州アラメダ）を用いて実施された。イメージングパラメーターは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）３．５ソフトウェアの機器を通じて、選択し、実装した。画像は、５７０ｎｍのバンド幅の励起フィルターを６４０ｎｍの発光フィルターと組み合わせて使用することで収集した。明視野写真を、各イメージング時間の間に取得した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェアを用いて明視野写真と蛍光画像とを結合させた。報告された蛍光画像は、リアルタイムで未処理の画像であった。
【００５２】
マイクロＣＴの手順。現在のところ、動物の放射線治療のための、小動物放射線研究プラットフォームが構築されている。このプラットフォームは、アイソセントリックな構台のデザインを採用しており、ボード上のコーンビームＣＴ（ＣＢＣＴ）を備えて、目標への正確な焦点照射を容易としている。したがって、該プラットフォームは、従来の診療所で使用されるヒトの治療法のモデルとなる。プラットフォームは、画増化及び照射のための二重焦点スポット定電圧Ｘ線源（Ｓｅｉｆｅｒｔ、ペンジルバニア州Ｆａｉｒｖｉｅｗ  Ｖｉｌｌａｇｅ）を使用する。光源−アイソセンター間の距離が３５ｃｍとなるように、それを構台に搭載する。手動による構台の回転は、垂直方向から１２０°±１５°に制限される。ロボット平行移動／回転ステージを、動物の位置制御に使用する。対象となる組織に合わせて、より微小な０．４ｍｍの焦点スポットからの５０〜１００ｋＶｐのＸ線をイメージングに使用する。ボード上のコーンビームＣＴ（ＣＢＣＴ）のイメージングは、静止Ｘ線源と２０×２０ｃｍのフラットパネル検出機（パーキンエルマー、カリフォルニア州サンタクララ）の間の横方向の動物の２π回転により実現できる。フラットパネルは、５１２×５１２ピクセルを有し、１．５の画像拡大のために配置され、アイソセンターにおいて０．２６ｍｍ×０．２６ｍｍのピクセルサイズを達成させる。実用的な理由により、ＣＢＣＴ画像は、０．５２ｍｍ×０．５２ｍｍ×０．５２ｍｍのボクセル解像度画像を再構築した。動物は、窒素／酸素混合物中の2％イソフルオレンにより麻酔する。画像の再構築は、市販のソフトウェア（ＸＶＩ  Ｌａｕｎｃｈ，Ｇｕｌｍａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて処理され、観察される。
【００５３】
ＣＲＴマウスの放射線治療。ＣＴイメージングの照射量は、５０ｋＶｐに対しては２ｃＧｙ未満とし、１００ｋＶｐに対しては１ｃＧｙ未満とする。本発明のアプローチにより、０．２ｍｍの共形供給精度が可能となった。
【００５４】
胸部画像−誘導照射。プラットフォームステージ上で、７０％Ｏ２／３０％Ｎ２中の２％イソフルレンをノーズコーンを経て供給することで、動物を麻酔する。胸部処理の全体を通して、２．５ｃｍ×１．４ｃｍのコリメーターが使用され、フィールドの配置をＣＢＣＴ及びロボット構台の調整を経て制御される。最終的な画像は、開放フィールドに結合した二重露出イメージングを用いて評価した。アイソセンターで算出された１５Ｇｙの放射線は、単一の後部フィールドを使用して送達した。１５グレイは、ＳＡＢＲ供与のシミュレーションのために選択され、患者の初期肺ガン治療のために、より一般的となっている撮画条件である。
【００５５】
治療線量測定は、各コリメーターについて評価され、このセットアップで２．２８Ｇｙ／分の線量率とすることができる。フラットパネル検出器は、照射の間、フィールドにおける肺の被照射範囲を評価し、リアルタイムでの画像誘導を提供することを可能とする。半胸郭の治療には、より小型の、０．５ｃｍ×０．９ｃｍのコリメーターを使用した同様の方法が使用され、線量はわずかに低い２．０８Ｇｙ／分となる（データは示さず）。
【００５６】
生体内実験のエンドポイント。第一のエンドポイントは、生存群（上記表のグループ１の動物）である。処置後の動物は、その死亡及び罹患の兆候について、動物ケアスタッフによって毎日、研究者によって週３回モニタリングされる。生存群は、カプラン−マイヤー法（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）によって分析する。第二のエンドポイントは、連続イメージング使用時の、腫瘍の応答を包含する。腫瘍の進行度は、画像と、ヒト患者のためのクリニックにおいて用いられる、Ｐｉｎｎａｃｌｅ３  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｌａｎｎｉｎｇ  ソフトウェア  ｖ．８．１ｙ（フィリップス社、ワイオミング州マディソン）の体積輪郭づけ機能を用いた、ＣＢＣＴのデータセットにより定量化される。各ＣＢＣＴデータセットは、腫瘍の進行度の予測のための、フル３Ｄ体積定量データを包含する。ガン放射線治療専門医及び小動物イメージングの専門家による会議により、Ｐｉｎｎａｃｌｅワークステーション上の腫瘍の同定と輪郭づけが実行された。体積は、適切な統計分析により計測し、プロットした。
【００５７】
生体外の組織学及び免疫組織化学。上記の処置の後、肺のサンプルを収集し、固定し、切断し、ヘマトキシリン／エオシンで染色して、肺結節の数を評価する。定義された時間点は、処置後（上記表のグループ２の動物）、１〜２日、１週間、２週間及び４週間である。肺腫瘍の切断面は、ｇＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１交替を用いて免疫染色し、二重鎖の破壊度合いを検出する。平行な切断面について、β−ガラクトシダーゼ染色によって老化細胞を染色し、Ｔｕｎｅｌアッセイを用いてアポトーシスを染色する。胸部、食道及び心臓の正常な組織も取り出し、Ｈ＆Ｅにより検査し、正常組織の損傷における放射線治療の差異を比較した。
【００５８】
クローン形成分析。約１×１０５のＡ５４９細胞を、ＲＫ−３３（１〜６μＭ）で治療し、増量したＩＲ（１〜２０Ｇｙ）を供与した。２４時間後、各組合せ処置群のうち５００細胞を、６−ウェルプレートにプレーティングした。１〜３週間のインキュベーション後、コロニーを、グルタルアルデヒド（６．０％ｖ／ｖ）中で固定し、クリスタルバイオレット（０．５％ｗ／ｖ）で染色し、立体顕微鏡を用いてカウントした。５０細胞以上の群（つまり６回の細胞倍化）をコロニーとして計数した。ＲＫ−３３による放射線増感の程度は、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ式を用いて計測し、組み合わせインデックス（ＣＩ）を決定した。ＣＩが０．９〜１．１の場合は相加性を示し、ＣＩ＜０．９の場合は相乗性を示した。生存曲線Ｓは、放射線感度の古典的なパラメータを決定づけるため、Ｓ＝ｅｘｐ（−αＤ−βＤ２）の線形二次モデルに適合させた。
【００５９】
フローサイトメトリー分析。組み合わせ処置の後、クローン形成分析の段落でも説明した通り、細胞を収集し、固定し、Ｍａｇｉｃ溶液（ＰＢＳ中、０．５６％のＮＰ−４０、３．７％のホルムアルデヒド及び０．０１ｍｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８）またはヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ）で染色した。次いで、ＬＳＲ（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州サンノゼ）上で、レーザースキャニングサイトメトリーにより、細胞の周期分析を実施した。実験は、二回同時に実施、または二回繰り返して実施した。データは、ＭｏｄＦｉｔ  ＬＴ  ２．０ソフトウェア（Ｖｅｔｉｒｙ  Ｈｏｕｓｅ、メイン州トップシャム）を使用して分析した。
【００６０】
組み合せ処置後の分子挙動の分析。処置後、全タンパク質を抽出して、Ｂａｘ等のプロアポトーシスのタンパク質と同様に、切断されたポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ＩＡＰ−２及びＢｃｌ−ｘＬ等の抗アポトーシス性タンパク質について、イムノブロッティングを用いて評価した。細胞は、アポトーシスキットを用いてγＨ２ＡＸ巣及び活性型Ｃａｓｐａｓｅ−２について免疫染色した。
【００６１】
実施例１
実験により、肺細胞系におけるＤＤＸ３の活性化を示す（図１Ａ）。さらに、Ａ５４９及びＨ２３等の浸潤性の肺ガン細胞系は、強いＤＤＸ３発現を示した（図１Ｂ）。重要なことに、Ａ５４９中のＤＤＸ３を下方制御することで、軟寒天分析におけるコロニー形成能が失われた（図２）。これらのデータは、ＤＤＸ３が肺ガン発生の必須要素の一つであり、肺ガン治療の新規の標的を提供するものである。
【００６２】
実施例２
肺ガンの臨床サンプルにおけるＤＤＸ３の発現。ＤＥＡＤボックスへリカーゼは、成長促進遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の両方の転写活性化補助因子として同定された。そこで、我々は、免疫組織化学によって、肺ガン患者サンプル中のＤＤＸ３の表現型を調査する我々の研究を継続した。図３に示す通り、肺の腺ガンサンプルは、小細胞ガン及び扁平上皮ガンと同様に、通常の肺ガンと比較して強力なＤＤＸ３の発現を示した。興味深いことに、小細胞ガン及び扁平上皮ガンは、腺ガンサンプルより多くの各染色を有した。これは、ヒトの肺ガン病態におけるＤＤＸ３の役割を示す。
【００６３】
実施例３
ＤＤＸ３機能の小分子阻害剤の生成。ＤＤＸ３機能の欠如により、肺ガンサンプルでのさらなる発現とともに、コロニー形成能が失われることから、ＤＤＸ３タンパクの機能的な基剤結合サイトを標的とし得る分子の検索と同定を開始した。はじめに、ＲＮＡへリカーゼを標的とする融合ジイミダゾジアゼピン環状分子（ＲＫ−３３）を生成した。ＲＫ−３３の機能的な活性を確認するために、へリカーゼ活性へのＲＫ−３３の効果を判定する生体外実験を実施した。ＤＤＸ３タンパク質は、ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴシステムを用いて合成した。ＤＤＸ３を精製した後、精製したＤＤＸ３及びＲＫ−３３の二本鎖を用いて巻き戻し分析を実施した。元の二本鎖オリゴと巻き戻したオリゴのピクセル密度を測定し、定量化した。図４に示す通り、１００μＭのＲＫ−３３は、二本鎖オリゴの巻き戻しを、８０分間で６０％以上減少させることができた。これは、ＲＫ−３３がＤＤＸ３の巻き戻し性能を阻害する能力を有することを示す。
【００６４】
実施例４
ＲＫ−３３のガン細胞の成長及び増殖への効果を調査するため、肺ガン細胞系（Ｈ２３及びＡ５４９）を最初の試験に使用した。図５に示す通り、８μＭのＲＫ−３３により、両方のガン細胞系を効果的に除去することができた。我々の知る限りでは、これは、小分子のＤＤＸ３阻害剤が肺ガン細胞を死滅させる有効性を有することを示す、最初のデータセットである。
【００６５】
実施例５
細胞死を誘導するＲＫ−３３の機能的な活性における低酸素状態の効果。固体腫瘍の生成の間、腫瘍中の脈管構造が十分に形成されなかった範囲内に、低酸素領域が構築される。これらの領域は、化学療法及び放射線治療に対して抵抗性を示し、悪性進行にも密接に関連する。腫瘍の低酸素症は、低放射線量のＳＡＢＲによる治療可能性の、主要な阻害要因であると断定する報告もみられる。現在ガン治療薬として処方される多くの化学療法薬は、低酸素下での細胞死の誘導に対して充分な効果を示していない。ＲＫ−３３の低酸素下での細胞死の誘導の有効性を評価するため、細胞をＣｏＣｌ２（低酸素擬態化合物）と共に２４時間培養した後、ＲＫ−３３を添加してさらに７２時間培養した。図６に示す通り、ＲＫ−３３は、酸素正常状態と低酸素状態の両方において、その活性を保持していた。このように、ＲＫ−３３は、ガン治療一般において優れた薬剤である。
【００６６】
実施例６
肺ガン細胞系（Ａ５４９）におけるＲＫ−３３と放射線の組み合わせの効果。肺ガン患者に対する従来の治療手順（化学療法及び放射線を含む）とともに、化学療法／放射線抵抗性肺ガン細胞系、Ａ５４９における、ＲＫ−３３の細胞殺傷能力を、放射線と組み合せて評価した（図７）。図８に示す通り、ＲＫ−３３と放射線との組み合わせは、各処置を単独で実施するより、多くの細胞を死滅させることができた。この実験において、相加的か相乗的な効果の存在を確認するため、ＩＣ５０値未満のＲＫ−３３を使用した。Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｙに基づく分析により、棒グラフで定量化した通り、２及び７グレイの放射線照射時の、４及び６μＭの濃度のＲＫ−３３が、細胞死について顕著な相乗効果を有することを示した。ＲＫ−３３を用いて処理した、上述のＡ５４９細胞の生存曲線は、図１２に示される。
【００６７】
実施例７
ＳＣＩＤマウスにおけるＲＫ−３３の毒性分析。死亡確認後、全組織の病理学的試験を継続して実施し、組織が損傷されていないことを確認した。続いて、我々は、複数の組織部位において、薬物動態学試験を実施した。このために、マウス血漿中のＲＫ−３３量測定を行うＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を構築した（図９挿入図）。ＲＫ−３３及び内部標準のテマゼパムをアセトニトリルで沈殿分離し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａカラム上でサンプルを調製した。図９に示す通り、脳の露出時間を充分に制御し、対象組織を充分に殺傷性のある濃度中におく。動物の腹腔内に注射し（５匹の動物に２０ｍｇ／ｋｇの単回投与分、腕部経由）、組織を複数の時間間隔（３０分間、６０分間及び２４時間）で収集し、分析した。
【００６８】
実施例８
誘導可能な自然発生肺腫瘍マウスモデルの生成。ＲＫ−３３及び放射線の肺腫瘍治療効果を試験するため、Ｔｒａｎ博士により自然発生モデルが構築された。これは、Ｔｗｉｓｔ１及びＫｒａｓＧ１２Ｄガン遺伝子の発現に基づくものである。端的にいうと、ルシフェラーゼを共発現できる、ｔｅｔ−誘導可能なＴｗｉｓｔ１トランスジェニックマウスモデルを生成した。検証後、Ｌｕｃ−ｔｅｔＯ−Ｔｗｉｓｔ１（Ｔ）構造物を、単細胞胚への顕微鏡下注射に用い、これを偽妊娠のメスに移植した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりスクリーニングした個体を、ＣＣＳＰｒｔＴＡ（Ｃ）マウス系に交配させ、バイトランスジェニックＣＴマウスを作り出した。ＣＣＳＰｒｔＴＡマウスは、ｒｔＴＡの大部分を肺胞のＩＩ型肺細胞において発現し、肺組織特異性を呈する。ＫｒａｓＧ１２Ｄガン遺伝子の発現によるトリトランスジェニックマウス（ｔｒｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ）［ＣＣＳＰｒｔＴＡ／ｔｅｔＯ−Ｋｒａｓ１２Ｄ／Ｌｕｃ−ｔｅｔＯ−Ｔｗｉｓｔ１（ＣＲＴ）］の生成により、ＣＣＳＰｒｔＴＡ／ｔｅｔＯ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ（ＣＲ）マウスと比較して、肺腫瘍の形成が加速されることが判明した。ドキシサイクリン処理下で、ＣＲマウスは、３２週のメジアン潜伏期間を経て、肺腫瘍を発症した。
【００６９】
驚くべきことに、ＣＲＴマウスにおいては、肺腫瘍発症までの潜伏期間が１５週と短かった。これは、Ｔｗｉｓｔ１が、劇的にＫ−ｒａｓＧ１２Ｄ誘導性の肺腫瘍形成を促進したことを示す（カプラン−マイヤー非腫瘍生存数ログランク（Ｌｏｇ−ｒａｎｋ）分析、ｐ＜０．０００１）。これらのＣＲＴ腫瘍は、組織学的に腺腫／腺ガンからなるが、ＣＲ肺ガンとは対照的に、ＣＲＴマウスにおいては腺ガンの数が多大に増殖した（図１０）。
【００７０】
ＣＲ及びＣＲＴマウスモデルにテトラサイクリン誘導性遺伝子発現系を利用することで、このモデルを、腫瘍構築後にガン遺伝子を「オフ」にする、ガン遺伝子標的治療のシミュレーションに用いることができる。そのため、一実施形態として、本発明は、自発的自然発生的肺腫瘍の、新規のトランスジェニックマウスモデルシステムを提供する。ＣＲＴトランスジェニックモデルは、微細な損傷もない腫瘍の複合的な効果を有する免疫応答性の宿主を使用して、自然発生的な初期の肺腫瘍について、放射線と組み合わせてガン治療に使用される新規の前臨床化合物を試験するための、ユニークなモデルを提供する。さらに重要なことは、肺腫瘍の発現するこれらのＴｗｉｓｔ１は、ＤＤＸ３のレベルも上昇させた（データは示さず）。
【００７１】
実施例９
ＲＫ−３３とＳＡＢＲとの組み合わせ治療は、ＣＲＴマウスの臨床的応答に相乗的に作用する。ＲＫ−３３と放射線を使用して生体外での良好な結果を取得した後、ＣＲＴマウスでの該組み合わせ治療の有効性を評価した。肺腫瘍の瀕死のＣＲＴマウス小試験群（各治療群でｎ＝２〜７）について、１週間の間に３回ＲＫ−３３（終濃度１ｍＭ）または担体コントロールを腹腔内投与し、ＳＡＲＲＰ上で１５Ｇｙの画像誘導全胸部ＳＡＢＲを行った（α／βを１０と仮定するとＢＥＤは３５．７Ｇｙである）。動物には、さらに１週間継続してＲＫ−３３を投与した。治療への応答は、２週間の間、毎週連続してマイクロＣＴを用いてモニタリングした。次いで、マウスを殺して肺サンプルの組織病理学試験を行った。単一の薬剤が、均衡状態またはおそらく微細な後退を示したのに対し、ＲＫ−３３とＳＡＢＲの間に劇的な生体内の相乗効果が見られた。これは、動物のマイクロＣＴと最終的なＨ＆Ｅ組織染色によって見られた劇的な腫瘍の後退により示された（図１１）。同様の傾向が、４週間までの継続治療においても維持された。
【００７２】
ＲＫ−３３について、標準的な従来の分割照射線放射とともに試験した。生物学的に等価の照射で比較するために、３Ｇｙを１０分割で照射した（α／βを１０と仮定するとＢＥＤは３９Ｇｙである）。興味深いことに、実験で使用した設定の範囲内の従来の放射線量（３Ｇｙ×１０）では、腫瘍体積の減少について、ＲＫ−３３との相乗効果を示さなかった（図１１）。この発見によって、ＲＫ−３３は、標準的な従来の分割放射線照射よりも、ＳＡＢＲと組み合されることで、肺腫瘍の負荷を減少させるにあたり、大きな有効性を呈することが分かった。
【００７３】
各引用文献が個々に、かつ特に示されて、完全に本明細書に記載されたのと同様に、本明細書で引用した、出版物、特許出願、及び特許を含むすべての引用文献は、参照により本明細書に取り込むものとする。
【００７４】
本発明に記載される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の語（特に、特許請求の範囲の文中の用語）は、文中で明らかに示されるか否定されない限り、単数と複数の両方を包含するものとするものと理解される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及び「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の用語は、特に明記しない限り、制限なしの条件として理解される（即ち、「含むがこれに限定されない」ことを意味する）。特に明記しない限り、本明細書における数値範囲の規定は、範囲内にある個々の値を個々に参照するための簡易な記載としたものであり、個々の数値は、それぞれ個別に記載されたのと同様に本明細書に取り込まれるものとする。本明細書に記載される全ての方法は、特に明記するか否定しない限り、あらゆる適切な態様で実行することができる。本明細書中の、それぞれの、及び全ての例または例示的な言語は（例えば「〜等の（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）、特に明記するか否定しない限り、本発明をよりよく表示するためのものであり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。本明細書中の用語は、請求していないいかなる要素も、本発明の実行の必須要素として解釈されるべきではない。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために発明者らの知る最良の形態を含めて、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形例は、前述の説明により、当業者にとって当然に明確となるものである。発明者らは、当業者が、これらの変形例を適宜実施するものと予測する。そして、本明細書において特に記載していない範囲も実施され得ることを予測する。したがって、本発明は、法の適用される範囲において、全ての修正形態、添付の請求項に記載の発明特定事項と等価のものを包含するものとする。さらに、その全ての可能な変形例における上記の要素のいかなる組み合わせも、特に明記するか否定しない限り、本明細書において本発明に包含される。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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