(57)【要約】&#8195;リグニン及び他の生物学的生成物、例えば発酵性糖を草本植物材料から酵素によって単離する方法を説明する。該方法は、生成物の純度の増大、並びにプロセスエネルギー要件及び生成物の変性及び汚染の低減といった改善をもたらすことができる。該方法を実施するためのシステムも提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース材料の構成要素を単離する方法であって、
リグノセルロース材料を粉砕し、粉砕されたリグノセルロース材料を形成することと、
リグニンを含む前記リグノセルロース材料の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する酵素加水分解のために、該リグノセルロース材料からの任意の事前の非酵素的なリグニン分離をせずに、前記粉砕されたリグノセルロース材料、少なくとも１つの酵素ブレンド、及び水溶液を含む混合物を酵素消化することと、
前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する前記水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む前記不溶性部分から分離することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記水溶液が酸性有機緩衝水溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液中の前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖が、可溶化したＣ６糖及び／又はＣ５糖、若しくは懸濁したＣ６糖及び／又はＣ５糖粒子状物質、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酵素ブレンドを用いた前記水溶液中の前記粉砕されたリグノセルロース材料の酵素消化が、約３０℃〜約６０℃の温度で少なくとも約１時間、混合物を撹拌することを含み、分離が、撹拌するのを止め、沈殿固体を含む不溶性部分から前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する前記水溶液の少なくとも一部分をデカントすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リグノセルロース材料が、綿実殻、穀物殻、サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、麦藁、スイッチグラス、葉、茎、植物の外皮、軟材片、硬材片、おが屑、製紙工場のパルプ、古紙、再生紙、又はそれらの任意の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リグノセルロース材料が綿実殻を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの酵素ブレンドが１）群〜５）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む第１の酵素ブレンドを含む、請求項１に記載の方法：
１）エンドグルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、
２）エキソグルカナーゼ、アビセラーゼ、
３）セロビアーゼ、β−グルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ、
４）エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−（１，４）−β−キシラノヒドロラーゼ、
５）β−１，３−キシラナーゼ、１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、及びエキソ−１，３−β−キシロシダーゼ。
【請求項８】
第１の酵素ブレンドが、
１）群及び／又は２）群に由来する少なくとも１つの酵素、
３）群の少なくとも１つの酵素、及び、
４）群及び／又は５）群の少なくとも１つの酵素、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの酵素ブレンドが、１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む第２の酵素ブレンドを更に含む、請求項１に記載の方法：
１ａ）エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、
２ａ）ラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）、
３ａ）エキソ−１，２−１，６−α−マンノシダーゼ、
４ａ）β−Ｄ−キシロピラノシル−（１，４）−β−Ｄ−キシロピラノース、
５ａ）α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ、
６ａ）フェルロイルエステラーゼ、
７ａ）エンド−１，５−α−アラビナナーゼ、
８ａ）ペクチナーゼ、
９ａ）ポリガラクツロナーゼ、
１０ａ）ペクチンエステラーゼ、
１１ａ）アスパラギン酸プロテアーゼ、
１２ａ）メタロプロテアーゼ、
１３ａ）エンド−(１，４）−マンナナーゼ、
１４ａ）フィターゼ、
１５ａ）α−グルクロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ、
１６ａ）ヘキセヌロニダーゼ;
１７ａ）アルカリホスファターゼ及び酸ホスファターゼ、
１８ａ）α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、
１９ａ）β−マンノシダーゼ、
２０ａ）α−フコシダーゼ。
【請求項１０】
リグニンの収率が少なくとも約９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ６糖及び／又はＣ５糖の収率が少なくとも約９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
リグノセルロース材料の構成要素を単離する方法であって、
ａ）リグノセルロース材料を粉砕されたリグノセルロース材料ヘと粉砕することと、
ｂ）リグニンを含む前記リグノセルロース材料の第１の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する第１の酵素加水分解のために、該リグノセルロース材料の任意の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに、前記粉砕されたリグノセルロース材料、第１の酵素ブレンド、及び第１の水溶液を含む第１の混合物を酵素消化することと、
ｃ）前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する前記第１の水溶液の少なくとも一部分を前記第１の不溶性部分から分離することと、
ｄ）前記第１の不溶性部分を粉砕された第１の不溶性部分へと粉砕することと、
ｅ）リグニンを含む第２の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する第２の酵素加水分解のために、前記粉砕された第１の不溶性部分、第２の酵素ブレンド、及び第２の水溶液を含む第２の混合物を酵素消化することと、
ｆ）リグニンを含む前記第２の不溶性部分を前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含む前記第２の水溶液から分離することと、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記リグノセルロース材料の粉砕が該リグノセルロース材料を約２ｍｍ未満のサイズまで摩砕することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の不溶性部分の粉砕が該第１の不溶性部分を約５０ミクロン未満のサイズまで摩砕又は破砕することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
分離した後に、前記第１の不溶性部分を少なくとも１回洗浄し、洗浄した第１の不溶性部分を該第１の不溶性部分を粉砕する前に乾燥させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の水溶液が酸性有機緩衝水溶液を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の水溶液中の前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖が、可溶化したＣ６糖及び／又はＣ５糖、若しくは懸濁したＣ６糖及び／又はＣ５糖粒子状物質、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の酵素ブレンドを用いた前記第１の水溶液中の前記粉砕されたリグノセルロース材料の酵素消化が、約３０℃〜約６０℃の温度で少なくとも約１時間、前記第１の混合物を撹拌することを含み、分離が、撹拌するのを止め、沈殿固体を含む前記第１の不溶性部分から前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する前記第１の水溶液の少なくとも一部分をデカントすることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記リグノセルロース材料が、綿実殻、穀物殻、サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、麦藁、スイッチグラス、葉、茎、植物の外皮、軟材片、硬材片、おが屑、製紙工場のパルプ、古紙、再生紙、又はそれらの任意の組合せである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記リグノセルロース材料が綿実殻を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の酵素ブレンドが１）群〜５）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む、請求項１２に記載の方法：
１）エンドグルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、
２）エキソグルカナーゼ、アビセラーゼ、
３）セロビアーゼ、β−グルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ、
４）エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−（１，４）−β−キシラノヒドロラーゼ、
５）β−１，３−キシラナーゼ、１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、及びエキソ−１，３−β−キシロシダーゼ。
【請求項２２】
前記第２の酵素ブレンドが、１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む、請求項１２に記載の方法：
１ａ）エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、
２ａ）ラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）、
３ａ）エキソ−１，２−１，６−α−マンノシダーゼ、
４ａ）β−Ｄ−キシロピラノシル−（１，４）−β−Ｄ−キシロピラノース、
５ａ）α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ、
６ａ）フェルロイルエステラーゼ、
７ａ）エンド−１，５−α−アラビナナーゼ、
８ａ）ペクチナーゼ、
９ａ）ポリガラクツロナーゼ、
１０ａ）ペクチンエステラーゼ、
１１ａ）アスパラギン酸プロテアーゼ、
１２ａ）メタロプロテアーゼ、
１３ａ）エンド−(１，４）−マンナナーゼ、
１４ａ）フィターゼ、
１５ａ）α−グルクロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ、
１６ａ）ヘキセヌロニダーゼ;
１７ａ）アルカリホスファターゼ及び酸ホスファターゼ、
１８ａ）α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、
１９ａ）β−マンノシダーゼ、
２０ａ）α−フコシダーゼ。
【請求項２３】
リグニンの収率が少なくとも約９０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖の収率が前記リグノセルロース材料に存在する元の量をベースとして少なくとも約５０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖の生物学的発酵処理を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
リグノセルロース材料の構成要素を単離するシステムであって、
リグノセルロース材料を粉砕するための少なくとも１つの粉砕機と、
内部アジテーターを備える容器を含む少なくとも１つの消化槽であって、該容器は前記リグノセルロース材料の任意の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに、粉砕されたリグノセルロース材料、少なくとも１つの酵素ブレンド、及び水溶液の混合物を保持するのに使用可能であり、少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を、リグニンを含む該リグノセルロース材料の不溶性部分から遊離する酵素加水分解のために、撹拌しながら前記混合物を酵素消化するのに使用可能である、少なくとも１つの消化槽と、
前記少なくとも１つの糖を含有する前記水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む前記不溶性部分から分離するためのセパレーターと、
を含む、システム。
【請求項２７】
リグニンを含む前記不溶性部分を乾燥させるための乾燥機と、
第１の不溶性材料を粉砕するための粉砕機と、
内部アジテーターを備える容器を含む消化槽であって、該容器は粉砕された第１の不溶性材料、少なくとも１つの酵素、及び水溶液の混合物を保持するのに、また少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を、リグニンを含む前記リグノセルロース材料の不溶性部分から遊離する酵素加水分解のために、撹拌しながら前記混合物を接触させるのに使用可能である、少なくとも１つの消化槽と、
前記少なくとも１つの糖を含有する前記水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む前記不溶性部分から分離するためのセパレーターと、
を更に含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記消化槽から遊離したＣ６糖及び／又はＣ５糖を受け取り、該Ｃ６糖及び／又はＣ５糖をエタノールへと発酵させるのに適した生物学的発酵処理システムを更に含む、請求項２６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリグニン及び他の生物学的生成物を草本植物から酵素によって単離すること、具体的にはリグニン及び糖をリグノセルロース材料から酵素によって単離するプロセス、並びにこれらのプロセスを実施するシステムに関する。
【０００２】
本願は、２０１１年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４３５，４９２号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものであり、この出願の全体は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００３】
生物学的生成物の生産のための豊富に存在し得るバイオマス源は草本植物のリグノセルロース繊維である。例えば植物繊維に見られる一部のセルロース多糖類をリグニンから単離し、発酵性糖へと分解することができる。これらの糖を発酵させ、例えばアルコール（例えばエタノール、ブタノール）、有機酸（例えば酢酸、クエン酸）、及び他の生成物（例えば他の炭水化物、タンパク質）を生産することができる。リグニンは例えば燃焼することでエネルギー源として、また様々な化学物質及び組成物のための原材料又は添加剤としての多様な用途に使用されている。しかしながら一般的に理解されるように、リグノセルロース材料の天然構造が、リグノセルロース材料の苛酷な及び／又はエネルギー集約的な手段を用いない分画化に対する耐性を非常に強いものにしている。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスは例えば、約３５ｗｔ％〜５０ｗｔ％のセルロース、約１５ｗｔ％〜３５ｗｔ％のヘミセルロース、及び約５ｗｔ％〜３０ｗｔ％のリグニン、又はその起源に応じて他の割合で上記のものを含有し得る。セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンは多くの場合、リグノセルロース系バイオマスの主要構成要素であり得るが、結合形態及び非結合形態の両方で存在する他の材料が様々な量で存在することもある。これらの微量の構成要素には、例えばタンパク質、ウロン酸、酢酸、灰分、スクロース等の遊離糖、土壌物質、及び異物が含まれ得る。セルロースは一般的にグルコースの重合体である。グルコース分子をβ−１，４−グリコシド結合によって連結することができる。ヘミセルロースは一般的に主にキシロース及びアラビノース等の五炭糖を含有する重合体であり、幾つかのグルコース及びマンノースが全体に分散されている場合がある。ヘミセルロースは、植物細胞壁においてセルロース及びリグニンと相互作用し、植物細胞壁を強固にする重合体を形成する傾向がある。リグニンは柔軟性を付加すると同時にセルロース−ヘミセルロースマトリックスの結合を助ける傾向がある。リグニン重合体の分子構造は通常、例えばランダムで無秩序である場合があり、主に多糖類によって相互接続された炭素環構造（例えばメトキシル基、ヒドロキシル基、及びプロピル基を有するベンゼン環）からなり得る。リグニン−ヘミセルロースマトリックスは通常セルロースを内包し、リグノセルロース材料を消化し難いものにしている。
【０００５】
バイオマスにおいてリグニンをバイオポリマーから分離するためのリグノセルロース材料の処理は積極的に研究されている分野であり、多様な熱的前処理アプローチ、機械的前処理アプローチ、及び化学的前処理アプローチ（及びそれらの組合せ）が研究され報告されている。これまで、リグニンをリグノセルロース材料の他の成分から分離するために、例えば強い化学物質及び／又は強力な加熱処理を伴う苛酷な処理が使用されてきた。一部の従来のプロセスにおける草本植物のリグノセルロース繊維材料でのセルロース多糖類の、例えば保護リグニンからの分離は、高いエネルギーコストを必要とするか、又は変性生成物若しくは汚染生成物を生じるか、又はそれらの下流の処理に影響を与えるか、又は他の欠点を有していた。
【０００６】
製紙工場で用いられているようなクラフトパルプ化プロセス又は亜硫酸パルプ化プロセスは、製紙の予備操作としてパルプを濃酸（例えば硫酸）、硫化ナトリウム、又は硫酸塩で前処理することによって、リグニンを軟材、硬材、又はその両方のセルロース繊維から取り出す。リグノセルロース材料を濃酸又は濃アルカリ／アルカリ性剤で処理することによって、硫黄で汚染されたリグニン材料であるリグノスルホネートが生成される場合がある。リグノセルロース材料の苛酷な酸処理は阻害物質の存在をもたらすこともあり、阻害物質によって生物学的生成物の下流の処理が複雑になり、これに伴う解毒工程により生産コストが増大し得る。リグニンを取り出し、セルロースを露出させるための別の従来技法には、例えばエネルギーコストの増大を伴い得る高圧蒸気の使用が含まれる。リグニン及び糖を綿実殻から遊離するための従来プロセスの実施には、例えば多大なエネルギーが要求される、材料の高温（例えば１８０℃超）及び蒸気圧による処理が含まれる。リグノセルロース材料に対する濃酸／アルカリと蒸気処理との併用も報告されているが、これは上記の欠点を増幅させる場合がある。別の従来プロセスはリグノセルロース系バイオマス原料を電離するために照射装置を使用してきた。照射はリグニン構成要素及びそのリグニン誘導体の構造を変える可能性がある。他の従来技術は他の加水分解酵素の放出を高めるために組換えポリペプチドを使用してきた。組換えポリペプチドの使用はより高い材料コストを伴う場合があり、天然の作用物質は使用されない。従来の実施では、連続処理のためにバイオリアクターフィルムを用いた連続バイオリアクタープロセスも使用されてきた。バイオリアクターフィルムの使用には、構成要素の一貫しない収率を伴う処理時間の延長が必要となる場合がある。他の従来プロセスは、必要とされる放出作業を行うために生物の生きた嫌気性培養物を使用してきた。生きた嫌気性培養物の使用は処理の複雑さ及びコストを増大させる場合がある。
【０００７】
本発明者らは、リグニン及び糖のようなリグノセルロース材料（例えば綿実殻）の或る特定の構成要素及び構成要素の誘導体は、抽出されたリグニン及び糖を分解せずに、廃棄副産物を少なくした上でより純粋な形態で単離することができれば、工業原材料としてより有用になるであろうことを認識している。本発明者らは更に、天然でより環境にやさしい再生可能な活性剤のみを使用してエネルギー要件を低くしてリグニン及び糖を綿実殻等の草本植物材料から単離する必要性を認識している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の特徴は、全酵素プロセスを用いてリグニン及び他の生物学的生成物を草本植物のリグノセルロース材料から単離する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる特徴は、全酵素プロセスを用いてリグニン及び糖を綿実殻から単離する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の特徴は、高温処理、電離照射処理、強酸、強アルカリ性剤、キレート剤、組換えＤＮＡ、及び／又は生きた嫌気性微生物培養物を必要とせずに全酵素プロセスを用いてリグニン及び糖を綿実殻から単離する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる特徴及び利点は、以下の明細書で一部説明され、本明細書から一部明らかとなるか、又は本発明の実施により認識することができる。本発明の目的及び他の利点は、本明細書及び添付の特許請求の範囲において具体的に指摘された要素及び組合せを用いて実現及び達成される。
【００１２】
本明細書において具体化されるとともに広く記載される、これらの利点及び他の利点を達成するために、並びに本発明の目的に従って、本発明は一部、リグノセルロース材料の構成要素を単離する方法であって、リグノセルロース材料を、増大した表面積を有するより小さな粒径へと粉砕することを含む、方法に関する。次いで、粉砕されたリグノセルロース材料、少なくとも１つの酵素ブレンド、及び水溶液を含む混合物を、リグニンを含むリグノセルロース材料の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する酵素加水分解のために、リグノセルロース材料の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに、酵素消化する。それから、少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する水溶液の少なくとも一部分を生物学的生成物のいずれか又は両方の回収のためにリグニンを含む不溶性部分から分離する。
【００１３】
本発明は更に、リグノセルロース材料の構成要素を単離する方法であって、リグノセルロース材料を、第１の増大した表面積を有するより小さな粒径へと粉砕することと、次いで、粉砕されたリグノセルロース材料、第１の酵素ブレンド、及び第１の水溶液を含む第１の混合物を、リグニンを含むリグノセルロース材料の第１の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する第１の酵素加水分解のために、リグノセルロース材料の任意の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに酵素消化することと、を含む、方法に関する。それから、少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する第１の水溶液の少なくとも一部分を第１の不溶性部分から分離した後、分離した第１の不溶性部分を、第２の増大した表面積を有するより小さな粒径へと粉砕する。次いで、粉砕された第１の不溶性部分、第２の酵素ブレンド、及び第２の水溶液を含む第２の混合物を、リグニンを含む第２の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する第２の酵素加水分解のために酵素消化した後、リグニンを含む第２の不溶性部分を第２の水溶液から分離する。
【００１４】
上記の包括的記載及び下記の詳細な記載はともに例示的なものであり、説明的なものにすぎず、特許請求される本発明の更なる説明を与えることのみを意図するものであることが理解されよう。
【００１５】
本発明で使用される場合、「リグノセルロース材料」又は「リグノセルロース」は、マトリックス内にリグニン及びセルロース、任意に更にはヘミセルロースを含有する植物細胞壁材料を指す。これらの成分を含有するリグノセルロース材料は、草本材料、農業残留物、森林残留物、都市固形廃棄物、再生紙及び古紙（無漂白紙）、並びにパルプ製紙工場残留物（例えば無漂白パルプ製紙工場残留物）であり得るが、これらに限定されない。
【００１６】
「リグニン」は、植物及び一部の藻類の二次細胞壁の不可欠な部分である複合バイオポリマーを指す。リグニンは細胞壁内においてセルロース、ヘミセルロース、及び存在する場合はペクチン構成要素の間の間隙を埋める。リグニンは例えばＣＡＳ番号９００５−５３−２によって特定することができる。
【００１７】
「Ｃ６糖及び／又はＣ５糖」は、例えばヘキソース（「Ｃ６」）糖（例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、グロース、イドース、タロース、アルドヘキソース、アロース、アルトロース等のアルドヘキソース；及びプシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のケトヘキソース；又はそれ以外、単独で又はそれらの任意の組合せで）、及び／又はペントース（「Ｃ５」）糖（例えばキシロース、アラビノース、リボース、リキソース等のアルドペントース；リブロース、キシルロース等のケトペントース；及びそれ以外、単独で又はそれらの任意の組合せで）を含む単糖類を指す。ヘキソースは、化学式がＣ６Ｈ１２Ｏ６である６つの炭素原子を有する単糖である。ヘキソースは、例えば官能基によって、１位にアルデヒド官能基を有するアルドヘキソースと、２位にケトン官能基を有するケトヘキソースと、に分類することができる。知られているとおり、六炭のアルドース糖はピラノース構造を含み得る環状ヘミアセタールを形成することができる。溶液中で、開鎖形態及び環状形態の六炭のアルドース糖は平衡状態にあり得るか、又は互いに他の相対比で存在し得る。添付の図面に含まれる図は、説明的なものにすぎず、必ずしもこれに限定されないが、Ｄ−グルコース及びＤ−マンノースの開鎖形態及び環状形態を示している（図４）。指定の図に示されるように、ヘキソースの炭素の番号はその開鎖形態に対して指定されている（同様の炭素付番方式がペントースに用いられている）。これに関して提示されている図に示された環状環における任意のひだ状（puckered：歪み）構造（例えば椅子型立体構造）は説明を簡略化するために示しておらず、これらの構造は当業者にとって理解されるものとする。ペントースは、化学式がＣ５Ｈ１０Ｏ５である５つの炭素原子を有する単糖である。ペントースは、例えば１位にアルデヒド官能基を有するアルドペントースと、２位にケトン官能基を有するケトペントースとの２つの群に分類することができる。知られているとおり、五炭のアルドース糖はフラノース構造を含み得る環状ヘミアセタール形態を有することもできる。五炭のアルドース糖のヘミアセタール環状形態は自然発生的に開環及び閉環することがあり、変旋光が起こり得る。
【００１８】
「グルカン」はグリコシド結合によって結合したＤ−グルコースモノマーの多糖を指す。グルカンは、単独で又はそれらの任意の組合せでβ−グルカン（例えばセルロース、カードラン、ラミナリン、クリソラミナリン、レンチナン、リケニン、プレウラン（pleuran）、ザイモサン）、α−グルカン（例えばデキストラン、グリコーゲン、プルラン、デンプン）を指し得る。
【００１９】
「酵素活性」は特に他に指示がなければ、酵素の加水分解活性を指す。
【００２０】
「非酵素的なリグニン分離処理」は、リグノセルロース材料の加水分解を引き起こすか又は誘導することができる、高温／高圧プロセス、電離照射プロセス、強酸処理、強アルカリ性剤処理、キレート剤処理、組換えＤＮＡ処理、若しくは生きた嫌気性微生物培養物による処理、又は酵素ベースの加水分解プロセスではない任意の他の処理プロセスのいずれかを指し、リグニンをリグノセルロース材料のＣ６糖及び／又はＣ５糖から検出可能な量で分離するには十分苛酷なものである。
【００２１】
本願に組み込むことによりその一部をなすものとする添付の図面は、本発明の態様を示すものであり、本明細書とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一例に従ってリグニン及び他の生物学的生成物をリグノセルロース材料から単離する方法のプロセスブロック図である。
【図２】本発明の一例に従ってリグニン及び糖を綿実殻として例示されるリグノセルロース材料から単離する方法のプロセスブロック図である。
【図３】本発明の一例に従ってリグニン及び糖をリグノセルロース材料から単離する方法のプロセスフロー図である。
【図４】Ｄ−グルコース及びＤ−マンノースの開鎖形態及び環状形態の非限定的な図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、回収可能な糖及び／又は他の生物学的生成物の同時遊離とともにリグニンを草本植物から酵素によって精製する方法を提供する。本方法は、生物学的生成物の品質を落とし得る及び／又はそうでなければ生産を複雑にし得る若しくは生産のコストを増大し得るリグノセルロース材料の任意の苛酷な非酵素的な前処理又は同時処理を必要としない、全酵素ベースのプロセスであり得る。本方法では、リグノセルロース原料を、原料粒子状物質の表面積を増大する及び／又はそうでなければ該材料をセルロース分子のその後の酵素加水分解処理により利用しやすくするために、原料粒子状物質の物理的サイズを物理的に低減することにより前処理することができる。本発明の方法において前処理された（サイズを変更した）リグノセルロース材料で続いて行われる酵素加水分解では、セルロース分子を分解して発酵性糖及び他のより小さな分子を遊離することができ、粉砕前処理をせずに可能なものよりも高度に精製された形態でそれらのそれぞれの回収のために、リグニンから分離する。例えば、本発明の方法において中間材料として生成される粉砕された（サイズを変更した）リグノセルロース材料におけるセルロース鎖を、Ｃ６糖分子及び／又はＣ５糖分子へとより容易に分解し、酵素のみを使用してリグニンから単離することができる。本方法に用いられる粉砕を、リグノセルロース原料の加水分解を引き起こさない又は誘導しない好ましい方法で行うことができ、材料のサイズを変更する以外は、元の成分（例えばリグニン、セルロース）は続く単離処理のために実質的に又は本質的に完全に無傷のままにする。本方法は粉砕された原料に対する酵素加水分解反応を提供し、ここで酵素ブレンドは１つ又は複数の消化段階に使用される。本方法で可能な全体的な戦略は、粉砕されたリグノセルロース原料に存在する多糖類（例えばセルロースポリマー、キシランポリマー、ヘキソースポリマー、及び／又はペントースポリマー）を可能な限り多く取り除き（消化し）、本質的に無傷の形態で単離されたリグニン、並びにＣ６糖及び／又はＣ５糖、例えば発酵性Ｃ６糖及び／又はＣ５糖を得ることである。さらに、リグノセルロース材料を、本発明の方法において比較的穏和な条件（例えば約５０℃、約５のｐＨ、及び略大気圧、又は他の穏和な条件）で酵素によって加水分解することができる。これによって、より苛酷な加水分解条件に伴い得る望ましくない副産物（例えば産物汚染物質及び反応阻害物質）の形成が低減した効率的なセルロース分解が可能となり得る。さらに、本明細書の実施例に記載の実験研究の結果により示されるように、リグノセルロース原料の苛酷な非酵素的な前処理（例えば強酸処理又は高温及び高圧でのより弱い酸による処理）を含まなくても、本発明の方法はリグノセルロース材料の大幅な酵素加水分解を達成し、高度に精製されたリグニン、発酵性糖、又はその両方を提供することができることが見出されている。
【００２４】
草本植物は本発明の方法を用いて処理することができるリグノセルロース材料の供給源であり得る。リグノセルロース材料は例えば、リグニン（例えば乾燥固体ベースで少なくとも１ｗｔ％、又は少なくとも３ｗｔ％、又は少なくとも５ｗｔ％、又は少なくとも１０ｗｔ％、又は少なくとも１５ｗｔ％、又は少なくとも２５ｗｔ％のリグニン）を含有する木質材料、草本材料、及び／又はこれらの材料に由来する廃棄産物であり得る。リグノセルロース材料は例えば、農業残留物及び農業廃棄物（例えば綿実殻、穀物殻、サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、麦藁、スイッチグラス、葉、茎、外皮等）、森林産物（例えば軟材、硬材等）、廃材（例えばおが屑、木片、樹皮等）、製紙工場のパルプ、並びに古紙若しくは再生紙（例えば無漂白紙、新聞印刷用紙）、並びに他のリグノセルロース材料のカテゴリー又はそれらの任意の組合せにグループ分けすることができる。リグノセルロース材料では、炭水化物ポリマー（例えばセルロース及びヘミセルロース）がリグニンに強く結合し、発酵性糖又はその前駆体がリグニンとヘミセルロースとで形成されるマトリックス内に閉じ込められている。本発明の方法は、所望の生物学的生成物を分解又は汚染することなく、またリグノセルロース材料の苛酷な非酵素的処理を要求することなく経済的な方法で、リグノセルロース材料からのリグニンの単離及び精製、並びに他の有用な生物学的生成物の生成に対するこの障害を乗り越えることを目的とし得る。
【００２５】
本方法では、リグノセルロース材料を粒子状物質の形態で処理することができ、粒径は粒子を処理するのに使用される酵素との相互作用に利用可能な表面積に直接影響し得るため、重要であり得る。本発明の方法では、粒径の低減（すなわち粉砕）を、より純度の高い生成物を提供するために酵素加水分解処理の前に行う。理論に束縛されることを望むものではないが、酵素消化前の粉砕は、材料の全体の表面積を増大することによって酵素のリグノセルロース材料への接近可能性を増大することができる。これによって、酵素加水分解活性がリグノセルロース材料上の露出面でより容易に生じると考えられ、セルロースをリグニンからより容易に切り離すことができる。遊離したセルロースを更に酵素によって加水分解し、単純な単糖又は他の発酵性糖へと分解することができる。さらに、酵素加水分解を、例えば大気圧での穏和な加熱条件下での弱酸性の有機酸緩衝水溶液中の粉砕されたリグノセルロース粒子に対して実施することができ、これにより苛酷な化学物質又はエネルギー集約的な操作に対する必要性が低減又は回避される。
【００２６】
一般的機構に関して、酵素ブレンドを本発明の方法においてリグノセルロース材料の一段階消化又は多段階消化で使用することができる。六炭（Ｃ６）糖及び／又は五炭（Ｃ５）糖は草本材料（例えば綿実殻（ＣＳＨ））のバイオポリマーマトリックスから遊離される。リグニンは加水分解しない固体画分中に残存バイオポリマーとして残る。消化撹拌を止めた後、リグニンが互いに凝集し、析出物として溶液から容易に析出し、これを更に処理し、及び／又は最終生成物として回収することができる。本発明の方法の酵素加水分解のように化学処理によってスルホン化されていない天然の草本材料に対して加水分解を行う場合、得られる凝集したリグニンはスルホネートの形態の硫黄には汚染されない。遊離したＣ６糖及び／又はＣ５糖（例えばグルコース、マンノース、キシロース、アラビノース等）は加水分解溶液中で可溶化又は懸濁し、消化混合物の液体画分からの回収、及び所望に応じて更なる潜在的用途に利用可能である。リグニンの除去後、除去された糖画分（単数又は複数）において回収されたＣ６糖及び／又はＣ５糖を、例えばバイオエタノール発酵産業において認識されるものを含む選ばれた適切な変換生物を導入することによって発酵法を用いてエタノール又は他の生化学系生成物へと直接変換することができる。リグニンは燃料源として、原材料若しくは添加剤として、及び／又は他の用途に使用することができる。
【００２７】
図１を参照すると、本発明の方法１０は例えば、リグノセルロース材料（ＬＣＭ）を増大した表面積を有するより小さな粒径へと摩滅させる粉砕工程１を含み得る。リグノセルロース材料は、例えば約１０ｍｍ未満、若しくは約７ｍｍ未満、若しくは約５ｍｍ未満、若しくは約３ｍｍ未満、若しくは約２ｍｍ未満、若しくは約１ｍｍ未満、若しくは約０.５ｍｍ未満の粒径、又は約０.００１ｍｍ〜約１０ｍｍ、若しくは約０.０１ｍｍ〜約７ｍｍ、若しくは約０.１ｍｍ〜約５ｍｍ、若しくは約１ｍｍ〜約３ｍｍのサイズ、又はこれらの範囲の値の任意の他の組合せへと粉砕することができる。粒径は、例えばメッシュ篩群によって又はマイクロメートル目盛を備える顕微鏡を使用して極微細粒子に対して決定することができる。示される粒径は絶対値又は平均値であり得る。粉砕された粒子の例えば少なくとも７５％（体積基準）、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％が、示される範囲のいずれかの内にあるとすることができる。最適範囲は処理対象のリグノセルロース材料のタイプによって異なり得る。リグノセルロース材料のサイズはリグニン又はセルロース成分が損傷を受けるサイズまでは低減されないことが好ましい。理論に束縛されることを望むものではないが、リグノセルロース材料において標的成分又はそれらの前駆体の損傷が起こる閾値に達するまでは、サイズの低減の程度（表面積の増大の程度）が漸増するにつれて、続く酵素消化において粉砕されたリグノセルロース材料で達成可能な酵素加水分解活性の程度及び／又は酵素加水分解の速度は漸増し得ると考えられる。
【００２８】
次いで図１に示されるように、粉砕されたリグノセルロース材料を酵素消化することができ、例えば３つの異なるプロセス経路Ａ、Ｂ、又はＣに従って、得られる生物学的生成物を分画化することができる。３つ全てのプロセス経路には、プロセス工程（複数の場合もあり）２として包括的に特定される酵素消化レジメンが含まれる。３つの異なるシナリオでは、消化は概して、少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を、リグニンを含むリグノセルロース材料の不溶性部分から遊離する酵素加水分解のために、リグノセルロース材料の任意の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに、粉砕されたリグノセルロース材料、少なくとも１つの酵素ブレンド、及び水溶液を含む混合物を接触させることを含む。図１に示されるように、消化レジメン２を一段階又は多段階で行うことができる。
【００２９】
プロセス経路Ａの工程２ａでは、指定の混合物を、セルロースに対するセルロース加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素、任意でヘミ−セルロースに対して加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素、及びグルカンに対する加水分解活性を有する少なくとも１つの他の酵素で同時に酵素消化する。次いで工程３ａで、糖を含有する水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む不溶性部分から分離し、リグニン含有生成物３１と糖含有水性流３２とを得る。各リグニン生成物流及び糖生成物流を別々に更に処理することができる。例えば、更なる取扱及び使用又は他の取扱の前にリグニン生成物を乾燥させることができる。糖生成物流は、例えばエタノール等の他の生成物を生産するために生物学的発酵施設において処理することができる。
【００３０】
プロセス経路Ｂの工程２ｂでは、混合物を、複数の段階２ｂ−１及び段階２ｂ−２において連続的に酵素消化することができる。セルロースに対するセルロース加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素及び任意でヘミ−セルロースに対して加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素を含む第１の酵素ブレンドを第１の消化２ｂ−１で使用することができる。グルカンに対する加水分解活性を有する第２の酵素ブレンドを第２の消化２ｂ−２で使用することができる。液固分離３ｂ−１及び３ｂ−２をそれぞれの消化段階２ｂ−１及び２ｂ−２の後で行い、糖含有水性流３３及び水性残留糖／洗浄液３４をそれぞれ取り出す。糖含有水性流３３及び水性残留糖／洗浄液３４も示されるように更に処理することができる。リグニン含有生成物３５を第２の液固分離工程３ｂ−２により生成する。リグニン含有生成物３５も示されるように更に処理することができる。
【００３１】
プロセス経路Ｃの工程２ｃでは、混合物を第１の消化においてセルロース分解活性を有する少なくとも１つの酵素及びヘミ−セルロース分解活性を有する少なくとも１つの酵素によって一段階で酵素消化する。液固分離３ｃを単一の消化段階２ｃの後に行い、水性糖及びグルカン含有流３６を取り出し、リグニン含有生成物３７を単離する。このプロセス流も示されるように更に処理することができる。このプロセス経路の水性流３６に存在し得る加水分解されていないグルカンバイオポリマー、例えばペクチンは、二次消化が省略されていることから、発酵酵母による作用を受けない場合がある。
【００３２】
工程２ａ、工程２ｂ−１、又は工程２ｃでは、第１の酵素ブレンドは本明細書で適用される場合、より詳細に記載される酵素の組合せを含むことができる。処理対象のリグノセルロース材料のタイプによっては、ヘミセルロースの分解が残りのプロセスを単純なものにし、ヘミセルロース及びセルロース由来の糖の潜在的に複雑な下流の分離の必要可能性を排除することができる。したがって、第１の酵素ブレンドは、少なくとも一方がセルロースに対する加水分解活性を有し、少なくとも他方がヘミ−セルロースに対する加水分解活性を有する異なる酵素を組み合わせたものであり得る。さらに、これらの工程２ａ、工程２ｂ−１、及び工程２ｃで使用される第１の酵素ブレンドは、例えばセロビアーゼ、若しくはβ−グルコシダーゼ若しくはα−グルコシダーゼ、又はそれらの組合せと組み合わせた、少なくとも１つのエンドグルカナーゼ若しくはエキソグルカナーゼ、又はその両方を含む酵素群を含み得る。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、セロビアーゼ（又はβ−グルコシダーゼ若しくはα−グルコシダーゼ）の存在が例えばフィードバックを抑制することができると考えられる。フィードバックはエンドグルカナーゼ（又はエキソグルカナーゼ）が例えばリグノセルロースマトリックスからＣ２〜Ｃ５モノマーを切断する傾向があり、Ｃ２〜Ｃ５モノマーを酵素加水分解反応の進行を阻害し得るレベルまで高める現象を指す。セロビアーゼ、又はβ−グルコシダーゼ若しくはα−グルコシダーゼは例えばＣ２〜Ｃ５モノマー（例えばＣ２〜Ｃ５短鎖糖）を分解し、それによりエンドグルカナーゼ及び／又はエキソグルカナーゼに関連する酵素反応に対するフィードバックを抑制又は阻害することができる。この点において選択肢として、セロビアーゼを使用して、フィードバックを抑制することができる。相当量のＣ６糖及びＣ５糖（例えばリグノセルロース原料に存在する元の理論量をベースとして少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％、又は少なくとも７０重量％、又は少なくとも８０重量％、又は少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％、又は少なくとも９９重量％）を、プロセス経路Ｂの第１の消化工程２ｂ−１後にリグニンから遊離することができる。
【００３３】
プロセス経路Ａの工程２ａでの第１の消化と効果的に組み合わされた、プロセス経路Ｂの第２の消化段階２ｂ−２は、リグニンの二次クリーニングを行う第２の酵素ブレンド、例えばグルカナーゼとペクチナーゼとの組合せ等、又はこの酵素ブレンドに関して本明細書に記載される他の酵素を使用することができる。この二次クリーニングはグルカン（例えばペクチン）の第２の鎖を破壊すること、及びそれらを遊離糖（例えばガラクトース、マンノース）としてリグニンから取り出すことを伴い得る。
【００３４】
プロセス経路Ａの同時消化の性能は、例えば達成される遊離したＣ５糖及びＣ６糖のリグニンの純度並びに遊離したＣ５糖及びＣ６糖の量に関して、プロセス経路Ｂの多段階消化の性能と同程度であり得るが、必ずしもそうである必要はない。例えば、プロセス経路Ａ及びプロセス経路Ｂにより得られるリグニンの純度は例えば、互いに約±２５％内、又は約±２０％内、又は約±１５％内、又は約±１０％内、又は約±５％内、又は約±２％内にあり得る。プロセス経路Ａ及びプロセス経路Ｂにより得られるリグニン及び／又はＣ６糖及びＣ５糖の収率は例えば同じ許容値のいずれかの内にあり得る。２つのプロセス経路Ａ及びプロセス経路Ｂの結果の相違は、プロセスＡの生成物流では、第２の酵素ブレンドによりリグノセルロースマトリックスから遊離された糖及び任意のより小さな分子と第１の酵素ブレンドの作用により遊離した糖及び他の生物学的生成物とが組み合わされており、一方でプロセス経路Ｂではこれらの生物学的生成物を各消化段階及び関連する液固分離工程の後にリグニン固体から取り除かれた別々の生成物流において回収することができることであり得る。プロセス経路Ｃでは、リグニンの第２の酵素ブレンドによる第２のクリーニングは含まれない。プロセス経路Ｃのリグニン生成物は依然として高純度のリグニン生成物を提供することができるが、同じ材料に適用する場合、プロセス経路Ａ及びプロセス経路Ｂで達成可能なものに満たない傾向があり得る（処理対象の特定のリグノセルロース材料に応じる）。重要なこととしては、プロセス経路Ａ、プロセス経路Ｂ、及びプロセス経路Ｃでは、使用する酵素はリグニンに対して酵素的に不活性であるのが好ましく、Ｃ６糖及びＣ５糖を遊離する際、リグニンが無傷のままであるのが好ましい。リグニンに対する酵素効果を有し得る酵素、例えばラッカーゼは使用しないのが好ましいが、断定的に排除するものではない。
【００３５】
本方法を回分式に又は連続して行うことができる。いずれの戦略でも、一段階又は多段階であるかに関わらず本明細書で記載されるような酵素消化順序をリグノセルロース材料の構成要素の単離に用い、少なくとも最初の酵素消化段階の前に、リグノセルロース材料を増大した表面積を有するより小さな粒径へと粉砕する。好ましくは、元のリグノセルロース原料及び粉砕されたリグノセルロース材料のいずれも最初の又は単一の酵素消化段階が適用される前に、任意の非酵素的なリグニン分離処理には供しない。多段階を用いる場合、リグノセルロース材料は、連続する消化段階のそれぞれの前に段階的により小さなサイズへと粉砕し、表面積を増大させるのが好ましい。さらに、示されるように本発明の方法では、酵素の第１のブレンド及び第２のブレンドを一消化段階において同時に、又は別々の消化段階において別々に使用することができる。示されるように、第１の酵素ブレンドは好ましくは、例えば少なくともセルロースに対するセルロース加水分解活性を有する酵素、及び任意で少なくともヘミセルロースに対する加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素、又はその両方を含み得る。第２の酵素ブレンドは好ましくは、例えば残留糖又は他の非リグニン材料を取り除くためのリグニンを含有する固体粒子の二次クリーニング又は例えば「清澄化（polishing）」をもたらす、少なくともグルカンポリマーに対する加水分解活性を有する酵素を含み得る。
【００３６】
第１の酵素ブレンドは例えば、酵素の以下の１）群〜５）群の内の２群以上から選択される少なくとも１つの酵素を含み得る：
１）エンドグルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカノヒドロラーゼ）、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）（これは例えばバイオポリマー鎖の本体に沿って攻撃を与えることができ、セルロース鎖のランダム切断を生じさせ、グルコース及びセロ−オリゴ糖を得ることができる）；
２）エキソグルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ）、アビセラーゼ（Ｃ１）（これは一次構造としてセロビオースを有するセルラーゼの非還元端にエキソ（末端）攻撃を与えることができる）；
３）セロビアーゼ、β−グルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ（これらは示されるように、エンドグルカナーゼ及び／又はエキソグルカナーゼに関連する酵素反応に対するフィードバックを抑制又は阻止することができ、セロビオースをグルコースヘと加水分解することができる）；
４）エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−（１，４）−β−キシラノヒドロラーゼ（ここでキシラナーゼは例えばヘミ−セルロースを分解することができる）；
５）β−１，３−キシラナーゼ、１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、及びエキソ−１，３−β−キシロシダーゼ。
【００３７】
１）群〜５）群の中の複数の群から選択される酵素の任意の組合せを第１の酵素ブレンドに使用することができる。これらの組合せは、１）群〜５）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素、又は１）群〜５）群の内の少なくとも３群に由来する少なくとも１つの酵素、又は１）群〜５）群の内の少なくとも４群に由来する少なくとも１つの酵素、又は１）群〜５）群の５群全てに由来する少なくとも１つの酵素を含み得る。示されるように、１つの好ましいブレンドは１）群及び／又は２）群の酵素と３）群の酵素とのブレンドである。別の組合せは１）群、２）群、３）群の酵素、並びに４）群及び／又は５）群の少なくとも１つの酵素、又はその両方であり得る。
【００３８】
第２の酵素ブレンドは例えば、酵素の以下の１ａ）群〜２０ａ）群の２群以上に由来する少なくとも１つの酵素を含み得る：
１ａ）エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、
２ａ）ラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）、
３ａ）エキソ−１，２−１，６−α−マンノシダーゼ、
４ａ）β−Ｄ−キシロピラノシル−（１，４）−β−Ｄ−キシロピラノース、
５ａ）α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ、
６ａ）フェルロイルエステラーゼ、
７ａ）エンド−１，５−α−アラビナナーゼ、
８ａ）ペクチナーゼ、
９ａ）ポリガラクツロナーゼ、
１０ａ）ペクチンエステラーゼ、
１１ａ）アスパラギン酸プロテアーゼ、
１２ａ）メタロプロテアーゼ、
１３ａ）エンド−(１，４）−マンナナーゼ、
１４ａ）フィターゼ、
１５ａ）α−グルクロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ、
１６ａ）ヘキセヌロニダーゼ、
１７ａ）アルカリホスファターゼ及び酸ホスファターゼ、
１８ａ）α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、
１９ａ）β−マンノシダーゼ、
２０ａ）α−フコシダーゼ。
【００３９】
１ａ）〜２０ａ）のこれらの酵素群の任意の組合せを第２の酵素ブレンドに使用することができる。これらの組合せには、例えば１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素、又は１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも３群に由来する少なくとも１つの酵素、又は１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも４群に由来する少なくとも１つの酵素、又は１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも５群に由来する少なくとも１つの酵素、及び同様に１ａ）群〜２０ａ）群のそれぞれに由来する少なくとも１つの酵素の組合せまでが含まれ得る。１つの方法では、例えば１ａ）群、２ａ）群、及び８ａ）群に由来する少なくとも１つの酵素が第２の酵素ブレンドに含まれる。別の方法では、１ａ）群〜２０ａ）群の大部分に由来する少なくとも１つの酵素が第２の酵素ブレンドに使用される。別の方法では、１ａ）群〜２０ａ）群の内の２群、又は３群、又は４群、又は５群、又は６群、又は７群、又は８群、又は９群、又は１０群、又は１１群、又は１２群、又は１３群、又は１４群、又は１５群、又は１６群、又は１７群、又は１８群、又は１９群、又は２０群全てに由来する少なくとも１つの酵素が第２の酵素ブレンドに使用される。
【００４０】
添加される第１の酵素ブレンドの総量は例えば、固体重量ベースでリグノセルロース材料に対して約０.００１重量％〜約３重量％の総酵素、又は約０.０１重量％〜約１重量％の総酵素、又は約０.０１５重量％〜約０.８重量％の総酵素、又は約０.０５重量％〜約０.６重量％の総酵素、又は約０.１重量％〜約１重量％の総酵素、又は約０.２重量％〜約０.８重量％の総酵素、又は約０.２５重量％〜約０.７５重量％の総酵素、又は約０.４重量％〜約０.６重量％の総酵素、又は約０.５重量％の総酵素であり得るが、他の量を用いてもよい。１）群〜５）群のそれぞれに由来する使用酵素の割合は同じであっても又は異なっていてもよい。第１の酵素ブレンドの酵素の割合は例えば、１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％の１）群及び２）群の総酵素、１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％の３）群の総酵素、並びに０ｗｔ％〜９０ｗｔ％の４）群及び５）群の総酵素；又は１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％の１）群及び２）群の総酵素、１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％の３）群の総酵素、並びに１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％の４）群及び５）群の総酵素；又は２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％の１）群及び２）群の総酵素、２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％の３）群の総酵素、並びに２０ｗｔ％〜４０ｗｔ％の４）群及び５）群の総酵素；又は他の割合であり得る。使用する第２の酵素ブレンドの総量は例えば、第１の酵素ブレンドに関して示されているものと同程度の量、又は他の有効量であり得る。第２の酵素ブレンドにおける酵素の割合は例えば、処理対象のリグノセルロース材料又はその固体画分誘導体の固体重量ベースで少なくとも０.５ｗｔ％、又は０.５％〜５０％、又は約２％〜約１０％の１ａ）群〜２０ａ）群の大部分、又はこれらの群の内の他の指定の数の群に由来する少なくとも１つの酵素であり得る。本明細書に示される任意の酵素の任意量は活性酵素に基づくものであり得る。
【００４１】
酵素ブレンドを、溶液中で又は基材を使用して乾燥形態で導入することができる。各ブレンドの個々の酵素を（例えば共通の溶液中に）予混合することができるか、又は個別に若しくは他のより小さな包含される組合せで消化槽へと別々に導入し、ｉｎ  ｓｉｔｕで酵素ブレンドを形成することができる。酵素を乾燥形態で消化槽に導入することもでき、ここでは酵素は例えばタルク、カオリン、デンドライト等の基材とともに使用される。乾燥酵素に対する基材は（例えば基材に起因する固体を回収するために）付加的な取扱い要件をもたらすことがあり、使用する場合、基材が消化を妨げていないかモニタリングする必要がある。
【００４２】
図２を参照すると、本発明は、１つ又は複数の特定用途において、例えば発酵性糖の同時遊離を伴う、リグニンを綿実殻等の草本植物から酵素によって精製する方法２００に関し得る。工程２０１では、綿実殻（ＣＳＨ）を２ｍｍ未満のサイズまで摩砕する。工程２０２では、摩砕した綿実殻を第１の酵素消化に供する。工程２０３では、より重い固体を沈殿させ、沈殿固体から水相中の糖をデカントする。工程２０４では、沈殿固体を再懸濁し、洗浄し、更なる処理のために回収する。工程２０５では、析出物を乾燥させる。工程２０６では、乾燥した析出物を５０μｍ未満のサイズまで摩砕する。工程２０７では、摩砕した析出物を第２の酵素消化に供する。工程２０８では、より重い固体を沈殿させ、沈殿固体から水相中の残留糖をデカントする。工程２０９では、沈殿固体を再懸濁し、洗浄し、更なる処理のために回収する。工程２１０では、析出物を乾燥させる。工程２１１では、幾らかの不純物を含むリグニンが回収される。このプロセスフローは、本願の教示を鑑みて容易に行うことが可能な適合又は変更を加えて、他のリグノセルロース材料にも適用することができる。
【００４３】
図３を参照すると、本発明の方法３０は例えば、リグノセルロース原料３０１、例えば綿実殻又は他のリグノセルロース材料を第１の粉砕機３００に供給することを含み得る。該原料は、既に或る程度、細かく砕き、細断し、細かく刻み、及び／又は破砕された植物繊維材料であり得る。リグノセルロース原料を第１の粉砕機３００によって、より実現可能な方法で粒子の任意の他の事前調整（preconditioning）を要することなく、酵素加水分解を摩滅した粒子で行うことができる十分な増大した表面積を有するより小さな粒径へと摩滅することができる。これに関して与えられる粉砕された原料の粒径は例えば、リグノセルロース原料材料のタイプに応じて変わり得る。綿実殻に関する粉砕された粒径は例えば、約５ｍｍ未満、又は約３ｍｍ未満、又は約２ｍｍ未満、又は約１.５ｍｍ未満、又は約１ｍｍ未満、又は約１ｍｍ未満、又は０.５ｍｍ未満、又は約０.００１ｍｍ〜約５ｍｍ、又は約０.０１ｍｍ〜約３ｍｍ、又は約０.１ｍｍ〜約２.５ｍｍ、又は約０.２ｍｍ〜約２ｍｍ、又は約０.５ｍｍ〜約１.５ｍｍ、又は他の値であり得る。綿実殻に関するこれらの粒径は絶対値又は平均値を示し得る。粉砕された粒子の例えば少なくとも７５％（体積基準）、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％が、示される範囲のいずれかの内にあるとすることができる。これらの粒径を他のリグノセルロース材料にも適用することができる、又は続く酵素処理に好適な粉砕粒径を、本願の教示を用いて経験的に決定することができる。粉砕装置は例えば、乾式ミル（例えばハンマーミル、回転式ハンマーミル等）、湿式ミル、又は原料の粒径を低減するための他の既知の装置及び配置であり得る。粉砕された原料を任意で、例えばメッシュ篩スクリーン群を用いて篩分し、粒群（size fractions）を選択するか、又はそうでなければ粒子状物質を第１の酵素消化槽において更に処理する前に粒径分布を更に制御することができる。消化槽は混合物の構成要素全てを保持する容量が十分にあり、穏和な温度制御手段（例えば従来の容器加熱手段）を備えることができる任意の容器であり得る。消化槽は撹拌装置（従来の撹拌装置（例えばインペラ、マグネチックスターラー等）であり得る）を備えることができるのも好ましく、適用可能な吸入口及び排出口が消化槽に付いていてもよい。理解されるように、保持容器、撹拌装置、加熱手段等のより好適なタイプはプロセスの規模に応じて変わり得る。本方法を、例えば工業プラント、パイロットプラント、研究所、又は他の規模を含む任意の規模で実行することができる。
【００４４】
粉砕されたリグノセルロース材料、第１の酵素ブレンド３１１、及び酸性水緩衝液３０２を含む第１の水溶液を含む混合物を第１の消化槽３１０において調製する。示されるように、第１の酵素ブレンドを、例えば少なくともセルロース、任意でヘミセルロース、又はその両方に対してセルロース分解活性を有するように選択することができる。示されるように、リグニン生成物の純度が望まれる場合、ラッカーゼ等のリグニンを変性し得る酵素はあまり好ましくない。酵素及び緩衝液を消化槽で導入するか、又は粉砕されたリグノセルロース原料と合わせた後、消化槽に導入することができる。第１の水溶液は例えば、クエン酸緩衝液等の酸性有機緩衝水溶液を含み得る。酸性緩衝溶液は例えば、約４.５〜約６.９、又は約４.７〜約５.５、又は約４.８〜約５.２のｐＨを有し得る。酸緩衝溶液はリグノセルロース材料の酸加水分解を引き起こすか、又は酵素加水分解機構を損なうほど酸性ではない。原料、酵素、緩衝液、及び溶液の混合物を撹拌し、それにより消化中により均一な組合せが与えられるとともに維持される。混合物を、例えばＣ６糖及び／又はＣ５糖がリグニンを含むリグノセルロース材料の第１の不溶性部分から遊離するのに十分な期間、穏和な加熱下で撹拌することができる。混合物を例えば少なくとも約３０℃の温度で少なくとも約１時間、消化することができる。消化温度は、例えば約６０℃を超える必要はなく、実際により低い温度を用いることができる。また消化をリグノセルロース粒子で所望の酵素活性を達成するのに消化槽の内容物を加圧する必要なく、略大気圧で実施することができる。混合物を例えば、少なくとも約３５℃、又は少なくとも約４０℃、又は少なくとも約４５℃、又は少なくとも約５０℃、又は約３０℃〜約５０℃の温度又は他の温度で、少なくとも約３時間、又は少なくとも約６時間、又は少なくとも約９時間、又は少なくとも約１２時間、又は少なくとも約１５時間、又は少なくとも約１８時間、又は少なくとも約２１時間、又は少なくとも２４時間、消化することができる。少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する第１の水溶液３１２の一部を第１の不溶性部分からデカントする。Ｃ６糖及び／又はＣ５糖は、可溶化したＣ６糖及び／又はＣ５糖、懸濁したＣ６糖及び／又はＣ５糖粒子状物質の少なくとも１つ、又はその両方を含み得る。容器内で析出したリグニン含有材料を、酵素消化した混合物の水相をデカント又は吸い上げる（siphoning off）ことによって、Ｃ６糖及び／又はＣ５糖を含有する水相から分離することができる。濾過（例えばスクリーン濾過）、遠心分離、及び固体を水相から分離する他の既知の手段を使用することができる。デカンテーション若しくは吸い上げ（siphoning）、又は沈殿固体相を相対的にそのままにしながら液相を取り出す他の分離方法は、消化混合物のリグニン含有固体画分を単離するのに好ましい分離方法である。遠心分離のような他の技法は、固体画分中の非リグニン不純物の増大を引き起こす可能性がある。デカントした糖を発酵処理システム３１５へと送ることができる。これらの糖を発酵するために用いることができる技法が既知であり、この技法は一般的に糖溶液の微生物発酵工程、およそ９５％純度のアル��ールを生成する蒸留工程、及びエタノール濃度を９９.５％超にする分子篩による脱水工程を含み得る技法、又は他の既知の発酵方法である。糖からのエタノールの生成は、例えば米国特許第２，８０２，７７４号に記載されるようなサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）等の酵母によって達成することができる。他の有用な微生物は、例えば米国特許第４，０９４，７４２号に記載されるエタノール産生桿菌であり、これらの特許は全て引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【００４５】
第１の消化槽内の不溶性部分を再懸濁し、少なくとも１回洗浄することができる。使用される最初の洗浄液は弱酸性であってもよく、続く任意の洗浄液は水単独であり得る。沈殿固体を消化が行われるのと同じ容器で洗浄することができる、又は代替的に別々の容器を、沈殿固体を洗浄するのに使用することができる。洗浄液３１３を任意の便利な固液分離技法（例えばデカンテーション、吸い上げ、遠心分離、スクリーン濾過等）により取り除く又は除去することができる。洗浄析出物３１４を乾燥機３２０内で乾燥させることができる。乾燥した不溶性部分を粉砕機３３０で第２の増大した表面積を有するより小さな粒径へと粉砕することができる。この粉砕機は先のユニットのものと同じであっても又は異なっていてもよい。乾燥した粒子を粉砕機３３０で、続く消化において酵素作用に利用可能な更なる表面積をもたらすために、先の消化槽に与えられるものよりも更に小さな粒径へと粉砕することができる。綿実殻において第２の粉砕機ユニット３３０で生じる粉砕粒径は例えば、約５０μｍ未満、又は約４０μｍ未満、又は約３０μｍ未満、又は約２０μｍ未満、又は１０μｍ未満、又は約１μｍ〜約５０μｍ、又は約５μｍ〜約４０μｍ、又は約７.５μｍ〜約３０μｍ、又は他の値であり得る。これらの粒径は絶対値又は平均値を示し得る。粉砕された綿実殻粒子の例えば少なくとも７５％（体積基準）、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％が、示される範囲のいずれかの内にあるとすることができる。これらの粒径を他のリグノセルロース材料にも適用することができる、又は続く酵素処理に好適な粉砕粒径を、本願の教示を用いて経験的に決定することができる。
【００４６】
第１の消化槽で使用されるものと同様のものであり得る、粉砕された第１の不溶性部分、第２の酵素ブレンド３４１、及び酸性水緩衝液３３１を含む第２の水溶液を含む第２の混合物を第２の消化槽３４０に供給する。第２の酵素ブレンドを溶液中で又は乾燥形態で導入することができる。示されるように、第２の酵素ブレンドを、例えば少なくともグルカンに対してセルロース加水分解活性を有するように選択することができる。第２の混合物を残留Ｃ６糖及び／又はＣ５糖がリグニンを含む第２の不溶性部分から遊離するのに十分な期間、穏和な加熱下で撹拌することができる。例えば第１の消化槽３１０で示される温度条件及び圧力条件を第２の消化槽３４０に使用することができる。第１の消化槽と同様に、消化温度は、例えば約６０℃を超える必要はなく、実際により低い温度及び大気圧を用いることができる。残留糖を含有する水相３４２を第２の消化槽からデカントし、任意で発酵処理システム３１５又は他の処理システムヘと送ることができる。リグニンを含む第２の不溶性部分を再懸濁し、洗浄することができる。残存する析出物３４４を乾燥機３５０に供給し、リグニン生成物３５１を回収することができる。二段階の粉砕／消化プロセスが説明されているが、一段階プロセスを使用しても、又は三段階プロセス若しくは四段階プロセス若しくは更により多段階のプロセスを使用してもよいことが理解される。
【００４７】
図３で説明されるプロセス容器及び器具は全て、かかる目的において有益な取付具及び器具を使用するような、適用可能なあらゆる供給物の導入に適した吸入口及び示される材料の除去のための排出口が付いていてもよい。液体材料は重力排水するか、又はプロセス容器から容器へと圧送することができる。この配置を用いて処理することができるリグノセルロース材料は、必ずしも限定されておらず、本明細書で先に示された材料を含む。当業者であれば、他のリグノセルロース含有原料が存在し、これを本発明の方法を実施することによって分画化することができることが認識される。さらに図３には示されていないが、酵素の回収は糖水性流３１６、又は水性流３４５、又はそれらの複合流３１７で行うことができる。これらの水性流の酵素内容物は、例えば逆浸透、精密濾過、又は他の方法を使用する等といった好適な分離プロセスによって分離することができ、必要に応じ上記のシステムにおいて消化槽内で再使用するために再循環することができる。新たな酵素のみを本方法に使用することができる、又は再利用酵素のみを使用することができる、又は新たな酵素と再利用酵素との組合せを本方法において任意の割合で使用することができる。
【００４８】
本発明の方法を実施することによって、リグノセルロース材料を少なくともリグニンとＣ６糖及び／又はＣ５糖（例えば発酵性糖）とに分画化することができる。他の材料が、示される本方法の生成物流の１つ又は複数に存在していてもよい。本発明の方法によって得られる生成物の収率は高いとされる。本明細書の目的上、「収率」は（酵素加水分解反応のために添加される水に占める）最初のリグノセルロース材料に存在する量をベースとする理論的最大値で除算した、回収された或る特定の生成物の質量である。リグニンの収率は、例えば少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又はそれ以上であり得る。Ｃ６及びＣ５糖の収率は、例えば少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又はそれ以上であり得る。
【００４９】
得られるリグニンは、硫黄を含有しない、高品質、比較的高純度、低分子量のリグニンであり得る。本発明の方法のリグニン生成物は多くの可能な用途を有する。リグニンをエネルギー生産のために燃焼することができる。リグニンに関する幾つかの他の可能な用途としては、炭素繊維生産、アスファルト生産、及びバイオポリマーの構成要素としての用途が挙げられる。これらの使用としては例えば、石油採掘添加剤、コンクリート添加剤、染料分散剤、農薬、動物飼料、工業用結合剤、製紙業用の特殊ポリマー、貴金属回収助剤、木材防腐剤、無硫黄リグニン製品、自動車のブレーキ、木製パネル製品、バイオ分散剤（biodispersants）、ポリウレタンフォーム、エポキシ樹脂、プリント基板、乳化剤、金属イオン封鎖剤（sequestrants）、水処理配合物、壁材用の補強剤、接着剤、バニリン、キシリトールの原材料、及びパラクマリルアルコール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコールの供給源としての使用が挙げられる。
【００５０】
本プロセスのＣ６糖生成物及びＣ５糖生成物を、例えばエタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、有機酸、パン酵母、又は選ばれた発酵用微生物の細胞代謝の任意の他の生成物ヘと発酵させることができる。糖から製造することができる他の市販製品としては、例えば動物用の飼料添加物、キシリトール甘味料、フルフラール、及び他の有用な製品が挙げられる。
【００５１】
本発明の方法はリグノセルロース材料の構成要素を遊離するために濃酸又は濃アルカリを使用する幾つかの事前プロセスの実施を回避することができる。本方法の酵素処理はリグニン構成要素の放出のためのこれらの苛酷な化学処理によるものではなく、製紙に用いられている従来のパルプ処理に伴うリグノスルホネートの生成を排除することができる。本発明の酵素プロセスは、純粋なリグニン構成要素の価値を損なう可能性もある高圧蒸気を使用する従来の熱化学プロセスよりもエネルギー消費量を大幅に少なくすることができる。さらに、本発明の方法で用いられる酵素処理は、ＥＤＴＡ等の一部のキレート剤の使用とは異なり下流の処理に影響を与えないか、又は少なくとも著しい影響は与えない。したがって、本発明の方法を用いることで、リグニンの最終精製工程を補助する後処理サブシステムの必要性が軽減又は完全に回避される。照射処理とは異なり、本発明の方法に用いられる酵素的アプローチは、リグニン構成要素を変性させず、無傷のまま徐々に放出し、また照射器具を必要としないことからコストが低減される。不純な取扱いの難しい材料が消化される。リグニン構成要素の任意の最終精製を容易にするのに組換えポリペプチドを必要とすることなく、天然酵素を構成要素の放出のために本発明の方法において使用することができる。生きた嫌気性微生物は、該微生物の非存在下において酵素溶液のみを使用するのであれば必ずしも必要ではない。遊離した天然のリグニン構成要素及びリグニン誘導体の変換を補助する穏和な酵素加水分解によってこれらの不純物が自然と除去されることから、取扱いが難しい場合がある不純物を低減するために強硬手段を原料溶液に対して用いる必要はない。さらに、本発明の方法はそれ自体が酵素の構成要素の再利用に有用であり、この再利用によって有益な別々の材料の回収コストを下げることが可能になる。本方法は操作コスト及びコミュニティの観点から環境に優しくかつ地球にも優しいものであり得る。
【００５２】
本発明は以下の態様／実施形態／特徴を任意の順序及び／又は任意の組合せで包含する：
１．  本発明は、リグノセルロース材料の構成要素を単離する方法であって、
リグノセルロース材料を粉砕し、粉砕されたリグノセルロース材料を形成することと、
リグニンを含むリグノセルロース材料の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する酵素加水分解のために、リグノセルロース材料からの任意の事前の非酵素的なリグニン分離をせずに、粉砕されたリグノセルロース材料、少なくとも１つの酵素ブレンド、及び水溶液を含む混合物を酵素消化することと、
少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む不溶性部分から分離することと、
を含む、方法に関する。
２．  水溶液が酸性有機緩衝水溶液を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
３．  水溶液中の少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖が、可溶化したＣ６糖及び／又はＣ５糖、若しくは懸濁したＣ６糖及び／又はＣ５糖粒子状物質、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
４．  酵素ブレンドを用いた水溶液中の粉砕されたリグノセルロース材料の酵素消化が、約３０℃〜約６０℃の温度で少なくとも約１時間、混合物を撹拌することを含み、分離が、撹拌するのを止め、沈殿固体を含む不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する水溶液の少なくとも一部分をデカントすることを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
５．  リグノセルロース材料が、綿実殻、穀物殻、サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、麦藁、スイッチグラス、葉、茎、植物の外皮、軟材片、硬材片、おが屑、製紙工場のパルプ、古紙、再生紙、又はそれらの任意の組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
６．  リグノセルロース材料が綿実殻を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
７．  少なくとも１つの酵素ブレンドが１）群〜５）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む第１の酵素ブレンドを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法：
１）エンドグルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、
２）エキソグルカナーゼ、アビセラーゼ、
３）セロビアーゼ、β−グルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ、
４）エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−（１，４）−β−キシラノヒドロラーゼ、
５）β−１，３−キシラナーゼ、１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、及びエキソ−１，３−β−キシロシダーゼ。
８．  第１の酵素ブレンドが、
１）群及び／又は２）群に由来する少なくとも１つの酵素、
３）群の少なくとも１つの酵素、及び、
４）群及び／又は５）群の少なくとも１つの酵素、
を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
９．  少なくとも１つの酵素ブレンドが、１ａ）群〜２０ａ）群の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む第２の酵素ブレンドを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法：
１ａ）エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、
２ａ）ラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）、
３ａ）エキソ−１，２−１，６−α−マンノシダーゼ、
４ａ）β−Ｄ−キシロピラノシル−（１，４）−β−Ｄ−キシロピラノース、
５ａ）α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ、
６ａ）フェルロイルエステラーゼ、
７ａ）エンド−１，５−α−アラビナナーゼ、
８ａ）ペクチナーゼ、
９ａ）ポリガラクツロナーゼ、
１０ａ）ペクチンエステラーゼ、
１１ａ）アスパラギン酸プロテアーゼ、
１２ａ）メタロプロテアーゼ、
１３ａ）エンド−(１，４）−マンナナーゼ、
１４ａ）フィターゼ、
１５ａ）α−グルクロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ、
１６ａ）ヘキセヌロニダーゼ、
１７ａ）アルカリホスファターゼ及び酸ホスファターゼ、
１８ａ）α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、
１９ａ）β−マンノシダーゼ、
２０ａ）α−フコシダーゼ。
１０．  リグニンの収率が少なくとも約９０％である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１１．  Ｃ６糖及び／又はＣ５糖の収率が少なくとも約９０％である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１２．  リグノセルロース材料の構成要素を単離する方法であって、
ａ）リグノセルロース材料を粉砕されたリグノセルロース材料ヘと粉砕することと、
ｂ）リグニンを含むリグノセルロース材料の第１の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する第１の酵素加水分解のために、リグノセルロース材料の任意の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに、粉砕されたリグノセルロース材料、第１の酵素ブレンド、及び第１の水溶液を含む第１の混合物を酵素消化することと、
ｃ）少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する第１の水溶液の少なくとも一部分を第１の不溶性部分から分離することと、
ｄ）第１の不溶性部分を粉砕された第１の不溶性部分へと粉砕することと、
ｅ）リグニンを含む第２の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を遊離する第２の酵素加水分解のために、粉砕された第１の不溶性部分、第２の酵素ブレンド、及び第２の水溶液を含む第２の混合物を酵素消化することと、
ｆ）リグニンを含む第２の不溶性部分を少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含む第２の水溶液から分離することと、
を含む、方法。
１３．  リグノセルロース材料の粉砕がリグノセルロース材料を約２ｍｍ未満のサイズまで摩砕することを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１４．  第１の不溶性部分の粉砕が第１の不溶性部分を約５０ミクロン未満のサイズまで摩砕又は破砕することを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１５．  分離した後に、第１の不溶性部分を少なくとも１回洗浄し、洗浄した第１の不溶性部分を第１の不溶性部分を粉砕する前に乾燥させることを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１６．  第１の水溶液が酸性有機緩衝水溶液を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１７．  第１の水溶液中の少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖が、可溶化したＣ６糖及び／又はＣ５糖、若しくは懸濁したＣ６糖及び／又はＣ５糖粒子状物質、又はそれらの任意の組合せを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１８．  第１の酵素ブレンドを用いた第１の水溶液中の粉砕されたリグノセルロース材料の酵素消化が、約３０℃〜約６０℃の温度で少なくとも約１時間、第１の混合物を撹拌することを含み、分離が、撹拌するのを止め、沈殿固体を含む第１の不溶性部分から少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を含有する第１の水溶液の少なくとも一部分をデカントすることを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
１９．  リグノセルロース材料が、綿実殻、穀物殻、サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、麦藁、スイッチグラス、葉、茎、植物の外皮、軟材片、硬材片、おが屑、製紙工場のパルプ、古紙、再生紙、又はそれらの任意の組合せである、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
２０．  リグノセルロース材料が綿実殻を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
２１．  第１の酵素ブレンドが１）〜５）の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法：
１）エンドグルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、
２）エキソグルカナーゼ、アビセラーゼ、
３）セロビアーゼ、β−グルコシダーゼ、α−グルコシダーゼ、
４）エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−（１，４）−β−キシラノヒドロラーゼ、
５）β−１，３−キシラナーゼ、１，３−β−Ｄ−キシロシダーゼ、及びエキソ−１，３−β−キシロシダーゼ。
２２．  第２の酵素ブレンドが、１ａ）〜２０ａ）の内の少なくとも２群に由来する少なくとも１つの酵素を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法：
１ａ）エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、
２ａ）ラミナリナーゼ（エンド−１，３−β−グルカナーゼ）、
３ａ）エキソ−１，２−１，６−α−マンノシダーゼ、
４ａ）β−Ｄ−キシロピラノシル−（１，４）−β−Ｄ−キシロピラノース、
５ａ）α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ、
６ａ）フェルロイルエステラーゼ、
７ａ）エンド−１，５−α−アラビナナーゼ、
８ａ）ペクチナーゼ、
９ａ）ポリガラクツロナーゼ、
１０ａ）ペクチンエステラーゼ、
１１ａ）アスパラギン酸プロテアーゼ、
１２ａ）メタロプロテアーゼ、
１３ａ）エンド−(１，４）−マンナナーゼ、
１４ａ）フィターゼ、
１５ａ）α−グルクロニダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ、
１６ａ）ヘキセヌロニダーゼ、
１７ａ）アルカリホスファターゼ及び酸ホスファターゼ、
１８ａ）α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、
１９ａ）β−マンノシダーゼ、
２０ａ）α−フコシダーゼ。
２３．  リグニンの収率が少なくとも約９０％である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
２４．  少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖の収率がリグノセルロース材料に存在する元の量をベースとして少なくとも約５０％である、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
２５．  少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖の生物学的発酵処理を更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
２６．  リグノセルロース材料の構成要素を単離するシステムであって、
リグノセルロース材料を粉砕するための少なくとも１つの粉砕機と、
内部アジテーターを備える容器を含む少なくとも１つの消化槽であって、容器はリグノセルロース材料の任意の事前の非酵素的なリグニン分離処理をせずに、粉砕されたリグノセルロース材料、少なくとも１つの酵素ブレンド、及び水溶液の混合物を保持するのに使用可能であり、少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を、リグニンを含むリグノセルロース材料の不溶性部分から遊離する酵素加水分解のために、撹拌しながら混合物を酵素消化するのに使用可能である、少なくとも１つの消化槽と、
少なくとも１つの糖を含有する水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む不溶性部分から分離するためのセパレーターと、
を含む、システム。
２７．  リグニンを含む不溶性部分を乾燥させるための乾燥機と、
第１の不溶性材料を粉砕するための粉砕機と、
内部アジテーターを備える容器を含む消化槽であって、容器は粉砕された第１の不溶性材料、少なくとも１つの酵素、及び水溶液の混合物を保持するのに、また少なくとも１つのＣ６糖及び／又はＣ５糖を、リグニンを含むリグノセルロース材料の不溶性部分から遊離する酵素加水分解のために、撹拌しながら混合物を接触させるのに使用可能である、少なくとも１つの消化槽と、
少なくとも１つの糖を含有する水溶液の少なくとも一部分を、リグニンを含む不溶性部分から分離するためのセパレーターと、
を更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のシステム。
２８．  消化槽から遊離したＣ６糖及び／又はＣ５糖を受け取り、Ｃ６糖及び／又はＣ５糖をエタノールへと発酵させるのに適した生物学的発酵処理システムを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様のシステム。
【００５３】
本発明は文及び／又は段落に記載される上記及び／又は下記のこれらの様々な特徴又は実施形態の任意の組合せを包含し得る。本明細書に開示される特徴の任意の組合せが本発明の一部であるとみなされ、組み合わせることができる特徴に関しては何ら限定を意図しない。
【００５４】
以下の実施例は本発明を説明することを意図するものであり、限定するものではない。以下の実施例において、他に特に規定がなければ全ての部は重量比である。
【実施例】
【００５５】
実施例１
実験は、リグニン精製及び糖単離のためのリグノセルロース材料の供給源である粉砕された綿実殻に対する酵素の有効性を評価するために行った。
【００５６】
実験手順
精製方法
綿実殻はBuckeye Technologies（Memphis,Tennessee）から入手した。綿実殻を２ｍｍ未満のサイズまで乾式摩砕した。摩砕をハンマーミル摩砕又は同程度の摩砕により行った。摩砕殻のサイズはメッシュ篩によって決定した。およそ２２０ｇの摩砕された綿実殻を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５.０）中の１０％固形分溶液として作製した。綿実殻の１０％固形分溶液はおよそ２２００ｍｌの溶液中に２２０ｇの綿実殻を含有するものとした。
【００５７】
５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を以下のように調製した。クエン酸緩衝液ストック（ｐＨ５.０）を、９００ｇの水に２１０ｇのクエン酸一水和物を混合し、次いで１００ｍｌの５０％ＮａＯＨをかき混ぜながら徐々に添加することにより調製し、これによって１Ｌのクエン酸緩衝液ストック（ｐＨ５.０）を得た。５０ｍＭ（０.０５Ｍ）クエン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を、５０ｍｌ〜５５ｍｌのクエン酸緩衝液ストック溶液（ｐＨ５.０）を１Ｌの水で希釈することにより緩衝液ストックを使用して調製し、綿実殻固体のための緩衝溶液として使用される５０ｍＭクエン酸緩衝液を得た。ｐＨメーターを使用して、クエン酸緩衝液のｐＨをモニタリングした。クエン酸緩衝液のｐＨは、必要に応じて５０％ＮａＯＨ又は濃ＨＣｌを滴加することによって５.０のｐＨが与えられ維持されるように、随時調整した。
【００５８】
１０％綿実殻溶液の温度をおよそ５０℃に上昇させ、この温度で保持した。加熱した溶液に消化槽としての４Ｌ容の発酵ビーカー内で０.５％の第１の酵素溶液を加えた（amended with）。第１の酵素溶液は、Novozymes North America（Franklinton， North Carolina）から入手した、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼを含む酵素調製物であるＣｅｌｌｉｃ（商標）ＣＴＥＣ  １／３重量部、Sigma-Aldrich（St. Louis, Missouri）から入手したグルコシダーゼ  １／３重量部、並びにNovozymes North Americaから入手したＨ−ＴＥＣキシラナーゼ  １／３重量部からなる酵素の混合物を含有するものとした。得られる混合物を、マグネチックスターラーを使用しておよそ２００ｒｐｍで２４時間、撹拌した。２４時間後、撹拌を止め、固体を沈殿させた。沈殿固体上にある水相を消化槽からデカントした。デカントした水相は糖及び懸濁した微細糖粒子状物質を含有する。より大きく重い固体のみを沈殿析出物として消化槽内に保持した。沈殿固体を、水を添加することで消化槽内において再懸濁し、ＨＣｌを用いてｐＨ２.５まで酸性化し、次いで撹拌して、弱酸洗浄工程を行った。固体を洗浄した後に撹拌を止め、固体を再度沈殿させた。洗浄液の水相を消化槽からデカントし、固体のみを残した。固体を水単独（酸性化の必要なし）中で再懸濁し、撹拌し、撹拌を止めた後、固体を再回収した。この洗浄手順を、水相が透明又はほぼ透明になるまで繰り返すことができる。次いで固体をおよそ５０℃の温度の熱風炉内において一晩乾燥させた。乾燥した析出物（固体）を５０ミクロン未満のサイズまで摩砕した。乳鉢及び乳棒を使用して、固体を極微細粉末へと破砕した。マイクロメートル目盛を備える顕微鏡を使用して、破砕固体のサイズを測定した。固体の破砕期間は、指定の粒径が得られ、その後破砕を止めるまで、破砕固体のサイズを確認するために断続的なものであった。この粉末は特に吸湿性ではない。摩砕粉末を再度０．０５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で上述のように１０％固形分溶液となるように作製した。溶液を、マグネチックスターラーを用いておよそ２００ｒｐｍで撹拌し、第２の酵素溶液を加えた。第２の酵素溶液は、Specialty Enzymes and Biotechnologies（Chino,California）から入手したＣＥＬＬＵＳＵＢ  １／３重量部及びペニシリン種酵素（penicillinsp. ferment）  ２／３重量部を含む溶液中の酵素ブレンドであり、この溶液は示される第２の酵素ブレンドの酵素を全て又は本質的に全て含む現場で作製される調製物であった。得られる混合物をおよそ４５℃の温度で６時間消化した。撹拌を止め、上述のように固体（析出物）を沈殿させた。沈殿固体の上にある水相をデカントし、水相中に懸濁する微細粒子状物質をできる限り多く除去し、より重い沈殿固体は消化槽内に残した。水相が透明又はほぼ透明になるまで、沈殿固体を非酸性化水で洗浄し、より多くの微粒子を除去することができる。析出物を上記の第１の乾燥手順と同様の条件下で熱風炉内において乾燥させる。最終乾燥材料は幾らかの小さな不純物を含むリグニンである。
【００５９】
リグニンアッセイ：
臭化アセチルアッセイ溶液を使用して、綿実殻及び最終リグニン生成物におけるリグニンを同定し定量した。リグニンに対する臭化アセチルアッセイは、IIyama, K., et al., "Determination of Lignin in HerbaceousPlants by an Improved Acetyl Bromide Procedure"（JSci Food Agric 1990）、及びHatfield, R.D., et al., "Usingthe Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in HerbaceousPlants: Some Cautionary Notes"（J Agric Food Chem1999）の公開手順に従うものであった。アッセイ方法は概して以下の手順を含むものであった。
（１）各試験管に、１０ｍｇ〜１５ｍｇの乾燥破砕サンプルを加える。サンプルを粉末になるまで破砕し、最大でも２０メッシュスクリーンを通過する（work）ようにする。また、サンプル重量は２ｍｇ〜４０ｍｇの範囲にあれば、良好な結果を示すことができるが、少なくとも１０ｍｇを用いることでより正確な質量が確保され、１５ｍｇ以下を用いることで完全な消化が確保される。１本の試験管を常に手順ブランクとして使用し、少なくとも２本の試験管を「標準」として使用する。
（２）各試験管に、１０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏを加える。試験管を６５℃（８５に設定した）のドライブロックに入れ、１０分ごとにかき混ぜながら１時間加熱する。
（３）サンプルをＧＦ／Ａガラス繊維フィルターに通し、以下の溶液をそれぞれこの順序で用いて３回洗い流す：水、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル。洗い流すのにそれぞれ２〜３分かけた。
（４）フィルターディスクを２０ｍｌ容のガラス製シンチレーションバイアル（蓋なし）に入れて、７０℃で一晩加熱する。
（５）２.５ｍｌの酢酸中の２５％ＡｃＢｒを各バイアルに加える。
（６）バイアルに蓋をして、それを５０℃のオーブンに２時間入れ、時折回転させる。
（７）サンプルを冷蔵室内で冷却する。１０ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム及び１２ｍｌの酢酸が入ったメスフラスコを準備する。各サンプルをシンチレーションバイアルからメスフラスコへと移す。濾紙を酢酸でメスフラスコへと十分に洗い流し、酢酸を用いて容量を調節する（bring to volume）。
（８）サンプルを最後に１時間、好ましくは一晩沈殿させ、次いで２８０ｎｍで測定した吸光度を用いてサンプルを測定する。
【００６０】
アッセイ結果：
アッセイ結果は、２２０ｇの綿実殻についてはおよそ２０％の純リグニン含量という分析結果であったことを示していた。最終リグニン生成物については約９５％の純リグニン含量という分析結果であった。
【００６１】
実験研究の結果によって、膨大な量の糖が第１の酵素消化によって除去されたことが示されている。第２の消化後では、ほとんどのリグニンが幾らかの不純物を含んだままである。フラクションインベントリ（Fraction inventory）によって、元の２２０ｇの内のおよそ６０ｇが第１の消化後に固体として残ったままであることが実証された。そのため、膨大な量の糖が初めに第１の消化において除去された。純化する第２の消化のみでリグニンの二次クリーニングが行われる。理論に束縛されることを望むものではないが、酵素処理前の固体の微細摩砕（粉末化）は、表面を増大させ、固体の純化に用いられる第２の酵素消化（濃カルボヒドラーゼ）の際の残留糖の除去を大いに助けると考えられる。したがって、プロトコル又はプロセスは好ましくは、酵素を利用可能な糖へと近付けさせる最大の表面積をもたらすことが可能な最小の粒径と連動するものであり得る。消化する混合物の総量をベースとして２０％〜３０％の固体で一次消化を行うことが可能であり得る。またこれに続けて、第１の消化後の固体の量を或る期間回収し、次いで純化サイズ（例えば約５０ミクロン未満）まで摩砕した後、第２の消化段階を実施することができる。
【００６２】
出願人らはこの開示における全ての引用文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値と好ましい下限値とのリストのいずれかとして与えられる場合、これは範囲が別々に開示されているかに関わらず、任意の範囲上限又は好ましい値と任意の範囲下限又は好ましい値との任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示するものと理解される。数値の範囲が本明細書で言及されている場合、特に指定のない限り、範囲はその端点、並びに範囲内の全ての整数及び少数を含むことが意図される。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に言及された特定の値に限定されることは意図されない。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から当業者にとって明らかであろう。本明細書及び本実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲及びその均等物により示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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