(57)【要約】  本発明は、不純物を含有する溶液中の胆汁酸塩刺激型リパーゼ（ＢＳＳＬ）を回収および精製する方法であって、（ｉ）ＢＳＳＬを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に適用する工程；（ｉｉ）ｐＨが４から５の範囲の洗浄組成物で、前記ＨＩＣ樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；（ｉｉｉ）前記ＨＩＣ樹脂からＢＳＳＬを回収する工程を含む上記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物を含有する溶液中の胆汁酸塩刺激型リパーゼ（ＢＳＳＬ）を回収および精製する方法であって：
（ｉ）ＢＳＳＬを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に適用する工程；
（ｉｉ）ｐＨが３．５から５の範囲の洗浄組成物で、前記ＨＩＣ樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；および
（ｉｉｉ）前記ＨＩＣ樹脂からＢＳＳＬを回収する工程
を含む上記方法。
【請求項２】
ＢＳＳＬが、ヒトＢＳＳＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＳＳＬが、組換えヒトＢＳＳＬである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組換えヒトＢＳＳＬが、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からの発現によって生産される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
洗浄組成物のｐＨが、３．５から４．５である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
洗浄組成物のｐＨが、４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）ＢＳＳＬを陰イオン交換樹脂に適用する工程；
（ｉｉ）ｐＨが４から５の範囲の洗浄組成物で、前記陰イオン交換樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；および
（ｉｉｉ）ＢＳＳＬを回収する工程
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＢＳＳＬが、ｐＨが４から５の範囲の溶離液で前記陰イオン交換樹脂を溶離することにより、回収される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＢＳＳＬが、ＨＩＣ樹脂に適用される前に陰イオン交換樹脂から回収される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ＢＳＳＬを陰イオン交換樹脂に適用する工程；
（ｉｉ）ｐＨが４から５の範囲の洗浄組成物で、該陰イオン交換樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；
（ｉｉｉ）ｐＨが４から５の範囲の溶離液で、該陰イオン交換樹脂を溶離することにより、ＢＳＳＬを回収する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたＢＳＳＬを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に適用する工程；
（ｖ）ｐＨが３．５から５の範囲の洗浄組成物で、該ＨＩＣ樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；および
（ｖｉ）該ＨＩＣ樹脂からＢＳＳＬを回収する工程；
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉ）の洗浄組成物は、４．４から４．６の範囲のｐＨを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉｉ）の溶離液は、４．４から４．６の範囲のｐＨを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｖ）の洗浄組成物のｐＨは、３．５から４．５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｖ）の洗浄組成物のｐＨは、４である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸塩刺激型リパーゼ（ＢＳＳＬ）を精製する方法であって、低ｐＨでの疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび場合により、低ｐＨでの陰イオン交換クロマトグラフィーの使用を含む上記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト乳腺および膵臓は、脂肪分解酵素である胆汁酸塩刺激型リパーゼ（ＢＳＳＬ）を産生し、またこれは、胆汁酸塩活性化リパーゼ（ＢＡＬ）またはカルボキシルエステルリパーゼ（ＣＥＬ）とも呼ばれる。ＢＳＳＬは、膵液の主要成分であり、コレステロールエステルならびにその他の様々な食物性エステルの加水分解に関与する。該酵素は、十二指腸液中でその機能を発揮し、胆汁酸塩と混合すると活性化し、また新生児の体内で乳脂肪を消化する際に重要な役割を果たす（レビュー用として、例えば非特許文献１を参照すること）。
【０００３】
ヒト乳汁およびヒト膵臓に由来するＢＳＳＬは、Ｗａｎｇの報告に従い精製および特徴づけが行われた（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ヒトＢＳＳＬのｃＤＮＡ配列は、Ｎｉｌｓｓｏｎにより同定され（非特許文献６）、また特許文献１および２により開示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ９１／１５２３４
【特許文献２】ＷＯ９１／１８９２３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ  ＆  Ｈａｒｔｓｕｃｋ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ１１６６：１〜１９頁
【非特許文献２】Ｗａｎｇ、１９８０；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５：３９８〜４０２頁
【非特許文献３】Ｂｌａｅｃｋｂｅｒｇ  ＆  Ｈｅｒｎｅｌｌ、１９８１；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１６：２２１〜２２５頁
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９８３；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：４５７〜４６１頁
【非特許文献５】Ｗａｎｇ、１９８８；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６４：１３０２〜１３０９頁
【非特許文献６】Ｎｉｌｓｓｏｎ、１９９０；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９２：５４３〜５５０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
しかし、クロマトグラフィー樹脂が低ｐＨで洗浄される疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィーが関係する方法により、ＢＳＳＬが精製され得ることは、これまで開示されなかった。ＢＳＳＬの精製について改善した方法の必要性が存在し、かかる方法は、宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡのような不純物を効率的に除去することができる一方、同時に生成物の高収率をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】精製方法Ａ、Ｂ、およびＣそれぞれにより、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ）後に得られた生成物中の宿主細胞タンパク質の量（ｎｇ／ｍｇ）を示す図である。図１〜６では、エラーバーは、信頼区間（９５％信頼水準）を示す。
【図２】ＤＥＡＥ後に得られた生成物中のＤＮＡの量（ｐｇ／ｍｇ）を示す図である。
【図３】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）後のＢＳＳＬの収率（％）を示す図である。
【図４】ＨＩＣ後に得られた生成物中の宿主細胞タンパク質の量（ｎｇ／ｍｇ）を示す図である。
【図５】ＨＩＣ後に得られた生成物中のＤＮＡの量（ｐｇ／ｍｇ）を示す図である。
【図６】ＤＥＡＥおよびＨＩＣ併用後のＢＳＳＬの収率（％）を示す図である。
【図７】ＤＥＡＥおよびＨＩＣ併用後に得られた生成物中の宿主細胞タンパク質のｌｏｇ低下量を示す図である。
【図８】ＤＥＡＥおよびＨＩＣ併用後に得られた生成物中のＤＮＡについてのｌｏｇ低下量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
驚くべきことに、胆汁酸塩刺激型リパーゼ（ＢＳＳＬ）は、低ｐＨでも疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により有利に精製され得ることが見出された。宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡにより例示される不純物は、生成物の収率を維持しつつ、本方法により効率的に除去され、またより高純度の生成物が得られる。特に、本発明は、以後「方法Ａ」と呼ぶ、ＢＳＳＬの精製に有用な方法を提供する。方法Ａは、（ａ）低ｐＨでカラムを洗浄する工程、および低ｐＨでＢＳＳＬを溶離する工程を含む陰イオン交換クロマトグラフィー；ならびに（ｂ）低ｐＨでカラムを洗浄する工程を含む疎水性相互作用クロマトグラフィーの併用を含む。
【０００９】
したがって、第１の態様では、本発明は、不純物を含有する溶液中の胆汁酸塩刺激型リパーゼ（ＢＳＳＬ）を回収および精製する方法であって：
（ｉ）ＢＳＳＬを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に適用する工程；
（ｉｉ）ｐＨが３．５から５、好ましくは３．５から４．５の範囲、より好ましくは約ｐＨ４の洗浄組成物で、前記ＨＩＣ樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；および
（ｉｉｉ）前記ＨＩＣ樹脂からＢＳＳＬを回収する工程
を含む上記方法を提供する。
【００１０】
用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）」は、当技術分野において周知であり、またタンパク質を別のタンパク質と分離するのに疎水性の特性を利用する分離技術を意味する。この分離では、高イオン強度のバッファーが最初にカラムに、そしてサンプルに適用される。バッファー中の塩は、タンパク質構造変化を引き起こし、また媒体に吸着される疎水性領域を露出させる。タンパク質を溶離するには、塩濃度を下げる。
【００１１】
用語「不純物」は、特に、標的タンパク質の生成で用いられる細胞に由来し、また培養ブロス中に存在する宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡを意味する。
【００１２】
前記ＢＳＳＬは、好ましくはヒトＢＳＳＬ、より好ましくは組換えヒトＢＳＳＬである。組換えヒトＢＳＳＬは、当技術分野において既知の方法により、例えば実験セクションで下記するように、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現を行うことにより産生され得る。あるいは、組換えＢＳＳＬは、Ｈａｎｓｓｏｎらが、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６６９２〜２６６９８頁で記載するように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；またはＷＯ９６／３７６２２で開示するように、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのようなその他の既知の発現系内で産生可能である。
【００１３】
本発明の好ましい形態では、ＢＳＳＬの精製方法は、ｐＨ４〜５のような低ｐＨでＢＳＳＬを洗浄および溶離する陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。したがって、本発明は、
（ｉ）ＢＳＳＬを陰イオン交換樹脂に適用する工程；
（ｉｉ）ｐＨが４から５、好ましくはｐＨ４．４または４．５のような約４．４から約４．６の範囲の洗浄組成物で、前記陰イオン交換樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；および
（ｉｉｉ）溶離液を用いて前記陰イオン交換樹脂を溶離することによりＢＳＳＬを回収する工程
をさらに含む、上記の（ＨＩＣを含む）方法を提供する。
【００１４】
好ましくは、前記溶離液のｐＨは、４から５、好ましくはｐＨ４．４または４．５のような約４．４から約４．６の範囲である。
【００１５】
用語「陰イオン交換クロマトグラフィー」（ＡＩＥＸ）は、当技術分野において周知であり、また負に荷電したアミノ酸が固定化された陽イオン表面に結合することと関係する分離技術を意味する。通常、生体分子は、塩化ナトリウムでイオン強度を高めるような、バッファー組成を変化させることにより、陰イオン交換体から遊離する。ＨＩＣ工程の前に陰イオン交換工程が実施される、すなわちＢＳＳＬが、ＨＩＣ樹脂に適用される前に陰イオン交換樹脂から回収されることが特に好ましい。
【００１６】
本発明の特に好ましい形態では、ＢＳＳＬ精製方法は、実施例で「方法Ａ」と呼ぶ方法であり、また下記の工程を含む：
（ｉ）ＢＳＳＬを陰イオン交換樹脂に適用する工程；
（ｉｉ）ｐＨが４から５、好ましくはｐＨ４．４または４．５のような約４．４から約４．６の範囲の洗浄組成物で、前記陰イオン交換樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程；
（ｉｉｉ）ｐＨが好ましくは４から５、より好ましくはｐＨ４．４または４．５のような約４．４から約４．６の範囲の溶離液で、前記陰イオン交換樹脂を溶離することにより、ＢＳＳＬを回収する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたＢＳＳＬを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に適用する工程；
（ｖ）ｐＨが３．５から５、好ましくは３．５から４．５の範囲、より好ましくは約ｐＨ４の洗浄組成物で、前記ＨＩＣ樹脂を洗浄することにより、不純物を除去する工程、および
（ｖｉ）前記ＨＩＣ樹脂からＢＳＳＬを回収する工程。
【００１７】
追加工程が本発明による精製方法に含まれ得ることを、当業者は理解するであろう。例えば、ＡＩＥＸの前、ＡＩＥＸとＨＩＣとの間、またはＨＩＣの後のいずれかに、１つまたはそれ以上の追加工程が「方法Ａ」に含まれ得る。かかる追加工程の例として、ウイルス低減工程、限外濾過、および透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）等が挙げられる。
【実施例】
【００１８】
１．組換えＢＳＳＬの発現
ヒトＢＳＳＬは、標準手順に従い、ヒトＢＳＳＬをエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸発現系を含有する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から発現させることにより、産生され得る。要するに、リーダー配列を含む完全長ｈＢＳＳＬをエンコードする２．３ＫｂのｃＤＮＡ配列（Ｎｉｌｓｓｏｎらが、１９９０；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９２：５４３〜５５０頁に記載するように）を、ｐＳ１４６から取得し（Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９３；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６８：２６６９２〜２６６９８頁）、そして発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）−遺伝子発現用のＣＭＶプロモーター／ＳＶ４０ポリＡシグナル、および選択／増幅用のｄｈｆｒ遺伝子を含むｐＢＲに基づくプラスミド−にクローン化してｐＡＤ−ＣＭＶ−ＢＳＳＬを形成した。
【００１９】
次に、ｐＡＤ−ＣＭＶ−ＢＳＳＬをＤＨＦＲ陰性ＣＨＯｓｓ細胞（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）のトランスフェクションで用い−ジェネテシン（Ｇ４１８）耐性について選択するために、ネオマイシン耐性をコードするプラスミドｐＢＲ３１２７  ＳＶ／Ｎｅｏ  ｐＡと同時トランスフェクションして−ＤＨＦＲ陽性ＢＳＳＬを産生するＣＨＯ細胞を作り出した。得られたＣＨＯ細胞を、より大量のｒｈＢＳＳＬを発現する条件およびスケールで培養した。例えば、マスターセルバンク（ＭＣＢ）由来の細胞を解凍し、グルタミンおよびグルコース（ＳＡＦＣ）を含まないが後にグルタミンおよびグルコースが補給されるＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を用いて、シェイカーフラスコ内で増殖させ、その後１５および１００Ｌのバイオリアクター内で増殖を行った後、フェドバッチプロセス内でＢＳＳＬが恒常的に発現および産生される７００Ｌ生成バイオリアクターに播種した。細胞培養物から捕集された材料は、デプスおよびアブソリュートフィルターの併用によりまたは遠心分離のいずれかにより清澄化可能であった。
【００２０】
２．ＢＳＳＬの精製（方法Ａ）
陰イオン交換クロマトグラフィー
ＢＳＳＬを発現するＣＨＯ細胞培養物に由来する清澄化された捕集物を、トリスバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７）で稀釈した（約１：１．２、１７から９ｍＳ／ｃｍ）。稀釈された捕集物をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（商標）陰イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。トリスバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）で初回洗浄（「洗浄１」）後、該カラムを２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むバッファーで洗浄した（「洗浄２」）。ＢＳＳＬを２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および３５０ｍＭのＮａＣｌを含むバッファーで該カラムから段階溶離した。
【００２１】
ウイルスの不活性化
既知の方法による低ｐＨウイルス不活性化については、ＤＥＡＥプール品のｐＨを、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５を添加して３．５に下げた。６０分間、インキュベートした後、０．５Ｍの二塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ９を添加してｐＨを６．３に上げた。
【００２２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
ウイルス不活性化後、４Ｍの塩化ナトリウム／２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６）を添加して、ＢＳＳＬの伝導度を約１４０ｍＳ／ｃｍに調整した。最終塩化ナトリウム濃度は約１．７５Ｍであった。サンプルをＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（商標）高置換度カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。該カラムを２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および１．７５Ｍの塩化ナトリウムを含むバッファーで洗浄した（「洗浄１」）。次に、該カラムを２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４、および１．７５Ｍの塩化ナトリウムで洗浄した（「洗浄２」）。該カラムを「洗浄１」と同一のバッファー（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６、および１．７５Ｍの塩化ナトリウム）で最終的に洗浄した（「洗浄３」）。次に、伝導度を下げて（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６）ＢＳＳＬを溶離した。
【００２３】
３．ＢＳＳＬの精製（比較のための方法Ｂ）
「洗浄２」が陰イオン交換工程およびＨＩＣ工程の両方で除外された点を除き、上記方法Ａと同一の「方法Ｂ」により、ＢＳＳＬを精製した。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィー期間中、トリスバッファーを用いてｐＨ７．２でＢＳＳＬを溶離した。
【００２４】
４．ＢＳＳＬの精製（比較のための方法Ｃ）
下記の工程を除き、上記方法Ａと同一の「方法Ｃ」により、ＢＳＳＬを精製した：
（ｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー期間中、トリスバッファーを用いてｐＨ７．２で「洗浄２」および溶離工程を実施した；ならびに
（ｉｉ）ＨＩＣ期間中、リン酸ナトリウムバッファーを用いてｐＨ６で「洗浄２」を実施した。
【００２５】
下記の表ＩおよびＩＩは、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＨＩＣの期間中に、方法Ａ、Ｂ、およびＣそれぞれの間に認められた差異を要約する。
【００２６】
【表１】
2014514932.tif 000002
【００２７】
【表２】
2014514932.tif 000003
【００２８】
５．方法Ａ〜Ｃから得られた結果
陰イオン交換クロマトグラフィー
表ＩＩＩは、低ｐＨウイルス不活性化を含む陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ＢＳＳＬの精製を行い、この精製から得られた結果を示す。「収率」の欄に示す通り、最も多くの生成物が、「洗浄２」を除外した方法Ｂにより予想通り回収された。しかし、表ＩＩＩは、方法Ｃ（「洗浄２」のｐＨが７．２）よりも方法Ａ（「洗浄２」のｐＨが４．５）による方が、より多くの生成物が回収されることも示す。
【００２９】
【表３】
2014514932.tif 000004
【００３０】
表ＩＩＩおよび図１は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた材料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）含有量を示す。これらのデータから、方法Ａ〜Ｃは、ＨＣＰの除去に関して同様に有効であると考えられる。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析（図示せず）において、方法ＢおよびＣのサンプルでは、ＢＳＳＬとは異なるサイズおよび電荷を有するタンパク質を表すバンドがより強いことが明らかとなり、方法Ａは、ＨＣＰがより少ない材料をもたらすことが示唆された。
【００３１】
表ＩＩＩおよび図２は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた材料中のＤＮＡ含有量を示す。驚くべきことに、方法Ａでは、生成物の処理の有効性を維持しつつ、より多くのＤＮＡが除去され、その結果、得られた生成物中のＤＮＡの除去に関して、方法ＢおよびＣよりも方法Ａの方が有意に有効であることが証明された。
【００３２】
さらに表ＩＩＩに示すように、既知の方法に従ったＳＥ−ＨＰＬＣ（粒径排除型高性能液体クロマトグラフィー）による分析では、方法ＢまたはＣよりも方法Ａを用いた方が、より高純度の生成物（完全長ＢＳＳＬに対応する「主ピーク」）が得られることが示される。
【００３３】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
表ＩＶ（「収率」）および図３に示す通り、生成物の収率は、３つの方法すべてについて類似した。それにもかかわらず、方法ＢおよびＣと比較して方法Ａが若干良好な生成物収率を実現したのは、驚くべきである。
【００３４】
【表４】
2014514932.tif 000005
【００３５】
表ＩＶおよび図４は、疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られた材料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）含有量を示す。データは、方法Ａが、ＨＣＰの除去に関して方法ＢおよびＣよりも優れたことを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図示せず）でも同一の結果が得られた。
【００３６】
表ＩＶおよび図５は、疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られた材料中のＤＮＡ含有量を示す。生成物プール品からＤＮＡを除去する際には、やはり、方法Ａの方が方法ＢおよびＣより優れていることが示された。方法ＢおよびＣを用いた場合、生成物量当たりの残留ＤＮＡ量は、方法Ａの対応する量の６倍よりも多い。さらに、表ＩＶは、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によると、方法Ａでは、最高量の単量体ＢＳＳＬの他、最低量の低分子量（ＬＭＷ）材料が得られたことを示す。
【００３７】
結論
陰イオン交換およびＨＩＣから得られた結果を総合すると、方法Ａ、Ｂ、およびＣより得られた生成物の収率の間で有意差は認められなかったことは明らかである（図６）。しかし、汚染物質ＨＣＰ（図７）およびＤＮＡ（図８）について得られたｌｏｇ値低下量（ＬＲＶ）は、方法ＢおよびＣと比較して、方法Ａの方が優れた。Ｌｏｇ値低下量は、工程に負荷された不純物の総量と工程を経た後（中間プール品中）の不純物の総量との間の比の対数（ｌｏｇ１０）である。
【００３８】
まとめとして、ＢＳＳＬを精製するための「方法Ａ」は、（ａ）低ｐＨでカラムを洗浄する工程および低ｐＨでＢＳＳＬを溶離する工程を含む陰イオン交換クロマトグラフィー；ならびに（ｂ）低ｐＨでカラムを洗浄する工程を含む疎水性相互作用クロマトグラフィーの併用を含む。「方法Ａ」を用いれば、生成物の収率を維持しつつ、宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡとして例示される不純物が、効率的に除去され、より高純度の生成物が得られることが、驚くべきことに見出された。
【図１】
2014514932.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014514932.tif 000012
【図８】
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【国際調査報告】
2014514932.tif 000014
2014514932.tif 000015
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