(57)【要約】  本発明は、銀およびヒアルロン酸に基づく組成物、ならびに主に、滲出液の存在そしてしたがって感染の高リスクによって特徴付けられる場合の、多様な起源の皮膚病変（急性および慢性創傷、潰瘍、火傷等）の皮膚病変の管理における使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸および銀を含む組成物であって、ヒアルロン酸が１３０〜２３０Ｋｄａの間の平均重量分子量を有し、そして銀が多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型またはコロイド性金属型を有する、前記組成物。
【請求項２】
ヒアルロン酸が１４５〜２１０Ｋｄａの間の平均重量分子量を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸が１６０〜２００Ｋｄａの間の平均重量分子量を有し、そして銀が多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸が１６０〜２００Ｋｄａの間の平均分子量を有し、そして銀がコロイド性金属型を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型の銀が、２〜１８マイクロメートルの間の平均粒子サイズおよび５ｍ２／ｇ未満ではない表面積を有する、請求項１〜３記載の組成物。
【請求項６】
ヒアルロン酸が総組成物の０．１〜２％ｗ／ｗの間の濃度を有する、先行する請求項いずれか記載の組成物。
【請求項７】
ヒアルロン酸が総組成物の０．１〜０．５％ｗ／ｗの間の濃度を有する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ヒアルロン酸が総組成物の０．２％ｗ／ｗの濃度を有する、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型またはコロイド性金属型の銀が、総組成物の１〜３％ｗ／ｗの間の濃度を有する、先行する請求項いずれか記載の組成物。
【請求項１０】
銀が総組成物の２％ｗ／ｗの濃度を有する、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
先行する請求項いずれか記載の組成物、および少なくとも１つの薬学的に許容されうる賦形剤を含む、薬学的配合物。
【請求項１２】
少なくとも１つの賦形剤が、懸濁剤、ビヒクルおよび噴霧剤より選択される、請求項１１記載の薬学的配合物。
【請求項１３】
噴霧剤が、イソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物およびｎ−ブタンからなる群より選択される、請求項１２記載の薬学的配合物。
【請求項１４】
皮膚適用に適した乾式スプレー、泡または親水性ゲルの形である、請求項１１記載の薬学的配合物。
【請求項１５】
乾式スプレーの形の請求項１４記載の薬学的配合物であって、１６０〜２００ｋＤａの間の平均重量分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属微粒子化型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてｎ−ブタンを含む、前記配合物。
【請求項１６】
乾式スプレーの形の請求項１４記載の薬学的配合物であって、１６０〜２００ｋＤａの間の平均重量分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、コロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてｎ−ブタンを含む、前記配合物。
【請求項１７】
病変腔中に透明なゲルとして置かれ、最適な湿潤創傷治癒を促進する、乾式スプレーの形の請求項１４〜１６記載の薬学的配合物。
【請求項１８】
１６０〜２００ｋＤａの間の平均重量分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属微粒子化型またはコロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてイソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物を含む、泡の形の請求項１４記載の薬学的配合物。
【請求項１９】
１６０〜２００ｋＤａの間の平均重量分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属微粒子化型またはコロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で含む、親水性ゲルの形の請求項１４記載の薬学的配合物。
【請求項２０】
表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療における薬剤として使用するための請求項１〜１０記載の組成物または請求項１１〜１９記載の配合物。
【請求項２１】
表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療における薬剤として使用するための請求項１５記載の薬学的配合物。
【請求項２２】
表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療における薬剤として使用するための請求項１６記載の薬学的配合物。
【請求項２３】
表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療における薬剤として使用するための請求項１８記載の薬学的配合物。
【請求項２４】
表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療における薬剤として使用するための請求項１９記載の薬学的配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀およびヒアルロン酸に基づく組成物に、前記組成物を含む薬学的配合物に、皮膚病変および創傷の治療におけるその使用に、そして前記組成物を含む装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な起源の急性または慢性皮膚病変は、創傷治癒を助け、血管再建を促進し、滲出液を吸収し、そして必要な場合、抗細菌／抗微生物作用を発揮する医学デバイスの適用によって管理される。
【０００３】
通常、滲出液は、炎症組織における毛細管の透過性増加の結果である。滲出液は、病的プロセスを限局し、微生物の拡散を防止し、そして免疫機構を通じた危険でありうる抗原の作用を遮断する役割を有する。
【０００４】
対照的に、慢性病変においては、滲出液は、異常な方式で産生され、そして細胞外マトリックスのタンパク質および増殖因子の破壊によって、そして細胞増殖の阻害によって、組織修復プロセスの遮断を決定する。臨床的には、滲出過剰（ｈｙｐｅｒｅｘｕｄａｔｉｏｎ）は、特に、細菌種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）による、そして真菌、例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）による、病変周囲の皮膚の浸軟を決定し、そして感染を促進する可能性もある。
【０００５】
さらに、滲出液の過剰産生の結果、創傷被覆材の連続した交換が必要となる。これらの状況において、常に医療の必要があることから生活の質が悪化することを知った患者による不快感も、またその結果としての医療経費の増加も、どちらも過小評価すべきではない。
【０００６】
現在、抗菌剤を含有する多くのデバイスが商業的に入手可能であり、そして意図される適用に応じて、異なる特性を有する。とりわけ、ポリウレタンおよび親水コロイド（Ｃｏｎｔｒｅｅｔ（登録商標））に基づく、またはヒドロファイバー（Ａｑｕａｃｅｌ  Ａｇ）に基づく、接着性または非接着性の泡；多層ポリエチレンネット（Ａｃｔｉｃｏａｔ（登録商標））がある。吸収性粉末を含有するガーゼに言及しなければならない。これらの製品は、吸収性ポリマー性支持体、および金属、特に銀によって特徴付けられる。銀の抗菌特性は周知であり（Ｆｒａｓｅｒ，  Ｊ．Ｆ．ら  ＡＮＺ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ２００４，  ７４，  １３９−２１２）、そして一般的に、イオン性銀の酸化型に関連する。銀は、細菌壁を構成する構造タンパク質の合成を阻害して、その形成を妨げ、そして細菌ＤＮＡの酵素タンパク質に結合し、その機能を妨害する。しかし、こうした結合は、無菌的な方式で起こり、すなわち銀は、創傷中に存在する細菌細胞および取り巻く皮膚／真皮細胞の両方に対して作用し、その結果、創傷を受けた患者に対して、銀毒性を生じる。実際、銀は、角化細胞および線維芽細胞（真皮および表皮の基本的構成要素）の増殖を阻害し、適用する創傷床の再生を遅延させ、そしてこれは、角化細胞培養に対するいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の結果から、銀に基づくデバイスの適用を回避するよう推奨する研究者までいるほど、病変の完全な治癒に対して有害である（Ｌａｍ，  Ｐ．Ｋ．ら  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．，  ２００４，  ６１，  １２５−１２７）。さらに、銀は、主に長期間適用された際、高感度な剤であり、これはちょうど、褥瘡、火傷、または回復が遅い怪我一般の場合に生じる（“Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｓｉｌｖｅｒ  ｏｒ  Ｓｉｌｖｅｒ  ｓａｌｔｓ，  Ｐａｔｔｙ’ｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．２，  Ｇ．Ｄ．  Ｃｌａｙｔｏｎ，  Ｆ．Ｅ．  Ｃｌａｙｔｏｎ監修  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  第３版，  １９８１，  ｐ．１８８１−１８９４）。
【０００７】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、一般的に異なる生物学的効果に相関する広範囲の分子量を有しうるヘテロ多糖、すなわちポリマーである。
ＨＡの生物学的効果の多重度は周知であり、そしてその化学的性質に本質的に結びつく。
【０００８】
高ＭＷ分画（１００万ダルトンの桁）は、非常に高い粘性を有し、そして目の手術に、そしてまた外科的および皮膚美容（ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）目的両方の軟組織充填の特定の症例に特異的な適用を見出す；その代わり、創傷治癒に対する効果は、高平均ＭＷ  ＨＡによる細胞増殖に対して非常に陽性の影響を立証した研究者もいる一方、他の研究者はまったく逆の効果を強調しているほど、非常に議論の余地がある。
【０００９】
中間分子量分画（５００〜７５０ｋＤａ）（Ｂｒｕｎら  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，  ２００３，  １１，  ２０８−１６）は、通常、変形性関節症および関節疾患一般において、関節内補充剤として用いられる。これらは、滑液のものと非常に類似の粘性を持つ溶液を生成しうるため、実際、これらの分画は、機械的潤滑作用を発揮する。最後に、低分子量ＨＡ（オリゴマーＨＡ、一般的に、１〜１０ｋＤａの間で構成される平均ＭＷを有すると意味される）は、顕著な血管新生作用を有し；したがって、特に、適用される組織の血管再建を促進し、創傷治癒を促進する。さらに、低分子量ＨＡは、細胞移動性を刺激し、そして線維芽細胞遊走を活性化する既知の能力を有し、これは、修復プロセスのために明らかに非常に重要である（Ｗｅｓｔら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８５，  ２２８，  １３２４−６；  Ｄｅｅｄら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９７，  ７１，  ２５１−６）。これらの理由から、低分子量ＨＡは、創傷治癒作用を持つ多くの製品およびデバイスの構成要素として使用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒａｓｅｒ，  Ｊ．Ｆ．ら  ＡＮＺ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ２００４，  ７４，  １３９−２１２
【非特許文献２】Ｌａｍ，  Ｐ．Ｋ．ら  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．，  ２００４，  ６１，  １２５−１２７
【非特許文献３】“Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｓｉｌｖｅｒ  ｏｒ  Ｓｉｌｖｅｒ  ｓａｌｔｓ，  Ｐａｔｔｙ’ｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．２，  Ｇ．Ｄ．  Ｃｌａｙｔｏｎ，  Ｆ．Ｅ．  Ｃｌａｙｔｏｎ監修  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  第３版，  １９８１，  ｐ．  １８８１−１８９４
【非特許文献４】Ｂｒｕｎら  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，  ２００３，  １１，  ２０８−１６
【非特許文献５】Ｗｅｓｔら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８５，  ２２８，  １３２４−６
【非特許文献６】Ｄｅｅｄら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９７，  ７１，  ２５１−６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の１つの目的は、皮膚病変の治療に現在利用可能なものよりもより効率が高く、そしてより毒性でない、創傷被覆材および治癒のための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、組織再生に対する阻害性の影響および治療しようとする組織に対する毒性を最小限にしつつ、強い抗菌／抗真菌活性剤を含む被覆材の臨床的必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒアルロン酸および銀を含む組成物であって、ヒアルロン酸が１３０〜２３０Ｋｄａの間の平均重量分子量を有し、そして銀が、コロイド性金属型または多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型を有する、前記組成物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、前記組成物および少なくとも１つの薬学的に許容されうる賦形剤を含む、薬学的配合物も提供する。
薬剤としての、特に表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療のための薬剤としての、前記組成物の使用もまた開示する。
【００１４】
本発明はまた、皮膚適用に適した乾式スプレー、泡または親水性ゲルの形で、前記組成物を分配するための装置にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、５０００〜１００００Ｄａ（試料ｉ）から１，５００，０００〜３，２００，０００Ｄａ（試料ｖ）の範囲の異なる重量平均分子量分画を有するＨＡの存在下で培養した、ヒト線維芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖の評価（実験１）を示す。
【図２】図２は、異なる重量平均分子量分画、すなわち５０００〜１００００Ｄａ（試料ｉ）、１０，０００〜１５，０００Ｄａ（試料ｉｉ）および２００，０００Ｄａ（試料ｉｉｉ）を有するＨＡの、フィブロネクチン発現に対する影響を示す。
【図３】図３は、異なる重量平均分子量分画、すなわち５０００〜１００００Ｄａ（試料ｉ）、１０，０００〜１５，０００Ｄａ（試料ｉｉ）および２００，０００Ｄａ（試料ｉｉｉ）を有するＨＡの、Ｉ型コラーゲン発現に対する影響を示す。
【図４】図４は、対照であり、そしてヒアルロン酸を含まないコロイド性金属性銀を含む商業的に入手可能な配合物（Ｃ）と比較した、５および３０ｍｇ／ｍｌの濃度の、コロイド性金属性銀（Ａ）および微粒子化金属性銀（Ｂ）を含む本発明の組成物の、健康な線維芽細胞の増殖に対する影響を示す。
【図５】図５は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）細菌の増殖に対する、組成物Ａ〜Ｃの活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、用語「重量平均分子量」は、「固有粘度」法で計算されると意図される（Ｔｅｒｂｏｊｅｖｉｃｈら，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  １９８６，  ３６３−３７７）。
【００１７】
本明細書において、「スポンジ様構造」は、オープンセルおよび／またはクローズドセル構造を持ち、５ｍ２／ｇまたはそれより大きい表面積を持つ、完全多孔材料として意図される。
【００１８】
１つの態様において、本発明は、ヒアルロン酸および銀を含む組成物であって、ヒアルロン酸が１３０〜２３０Ｋｄａの間の平均重量分子量を有し、そして銀が多孔性「スポンジ様」構造を持つコロイド性金属型または微粒子化金属型を有する、前記組成物に関する。
【００１９】
本明細書に開示する組成物は、多様な種類の病変（急性、慢性、多様な病因の潰瘍、火傷、痛む箇所（ｓｏｒｅｓ））の治癒を促進し、細菌および／または真菌感染を除去し、そして損傷を受けた組織の治癒を促進する。驚くべきことに、これらの利点が、本明細書に開示するように、ヒト線維芽細胞増殖を刺激して、その結果、コラーゲンおよびフィブロネクチンの沈着を生じ、そして銀がこれらの細胞に対して生じうる損傷に対して防御する、よく定義づけられた平均重量分子量（ＭＷ）を有する、ヒアルロン酸を含む組成物で得られることが見出された。
【００２０】
当該技術分野に知られる組成物の抗菌活性は、塩の形で商業的に入手可能な銀（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な、例えば硝酸塩、硫酸塩、炭酸塩およびその他）、またはコロイド性金属、すなわちその安定性を改善する小分子タンパク質と会合したもの、または金属型の銀によって実行される。
【００２１】
多様なタイプの金属性銀の中で、驚くべきことに、以下の特性を持つ微粒子化金属性銀が特に適切であることが見出された：
−２〜１８マイクロメートルの平均粒子サイズ、好ましくは１０マイクロメートル
−表面積をかなり増加させる高多孔性を持つ「スポンジ様」（ＳＬ）微小構造（≧５ｍ２／ｇ）；
−高純度（好ましくは＞９９．５％）；
（以後、「スポンジ様微粒子化金属性銀」）
前記の特異な「スポンジ様」多孔構造は、創傷床における即時および持続性両方のＡｇイオン（Ａｇ＋）の放出増進を促進し、この結果、以後の実験の結果によって立証されるような、最も一般的に用いられる銀の型に比較して、増加した抗菌および抗真菌活性が生じる。
【００２２】
特に、本発明の組成物中に含まれるような「スポンジ様」微粒子化金属性銀は、皮膚および衣服を染色せず、また、日光への曝露後、滲出液が存在する場合に、創傷を茶色に着色せず、そして本発明にしたがった薬学的型の調製において取り扱いがより容易である。微小スケール粒子サイズによって、「スポンジ様」微粒子化金属性銀は、他の構成要素と容易に混合可能となる。コロイド性金属性銀は、その代わり、スプレーの型での送達が望ましい場合には特に、粉末の塊の形成による閉塞を防止するため、微粒子化プロセスをまず経なければならない。
【００２３】
本発明の組成物に用いる銀は、匹敵する抗細菌／抗微生物活性を有することが見出された、コロイド性または「スポンジ様」微粒子化金属性銀であってもよいが、「スポンジ様」微粒子化金属性銀が好ましい。
【００２４】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、交互のＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基で構成される直鎖ヘテロ多糖であり、抽出源または使用する調製法に応じて、４００〜３ｘ１０６Ｄａの間の範囲であってもよい重量平均分子量を有する。ヒアルロン酸は、実際、例えば、ケイトウ（ｃｏｃｋｓｃｏｍｂｓ）からの抽出によって（ＥＰ  １３８９  ５７２  Ｂ１）、発酵によって、または合成手段によって得られうる。すでに述べたように、ＨＡが、体内で、皮膚、腱、筋肉および軟骨などの多くの組織の細胞に対する機械的な補助から、組織の水和および関節の潤滑までに渡る、多数の役割を発揮することが知られている。さらに、ＨＡが、膜受容体ＣＤ４４を通じて、細胞増殖、遊走、分化および血管新生などの細胞生理学および生物学に関する、多くのそして異なるプロセスを調節可能であることが知られる。
【００２５】
これらの効果は各々、異なる分子量を有するＨＡの分画に本質的に起因するものであり、そして特に、組織修復作用は、驚くべきことに、低重量分子量（オリゴマー性ＨＡ）を有するＨＡ分画で顕著に明らかであり、そして分子量が増加するにつれて減少する。その代わり、数回の試験に渡って、驚くべきことに、「固有粘度」法（Ｔｅｒｂｏｊｅｖｉｃｈら，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．，  １９８６，  ３６３−３７７）で計算される１３０〜２３０ｋＤａの間の範囲に含まれる、したがってその創傷治癒作用に関してすでに知られているものより顕著に高いＭＷを有する、重量平均ＭＷを有するＨＡの特定の分画が、ヒト線維芽細胞増殖に対して非常に有効であることが見出された。さらに、驚くべきことに、１３０〜２３０ｋＤａの間の重量平均分子量を有するＨＡが、会合している銀（コロイド性金属型または「スポンジ様」微粒子化金属型）の抗菌／抗真菌活性を改善し、細胞毒性を劇的に減少させることが見出された。こうしたＨＡ分画は、適切な試験の後、本発明の目的の組成物のために選択され、本明細書記載の実験を通じて、標準的治療に勝る病原体に対する有効性、およびヒト線維芽細胞に対する毒性の減少の両方の結果、創傷治癒活性の増加が立証されている。驚くべきことに、本発明の組成物で用いられるＨＡは、抽出性、発酵（ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））または生合成（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））供給源から、好ましくは発酵または生合成供給源から生じることが可能であり、そして１３０〜２３０ｋＤａの間、好ましくは１４５〜２１０ｋＤａの間、そしてさらにより好ましくは１６０〜２００ｋＤａの間で構成される重量平均ＭＷを有し；後者を略して、以後、１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷ  ＨＡと定義する。これは、ＭＷに関して、望ましい仕様を持つＨＡを提供することが可能である、多くの会社（例えばＬｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；  ＱＰ社；  生化学工業；  資生堂；  Ｆｉｄｉａ  ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ）から購入可能である。
【００２６】
見込みに反して、オリゴマー分画のものより顕著により高い重量平均分子量を有するヒアルロン酸分画は、オリゴマー分画のものより、線維芽細胞増殖に対して、より強い陽性の影響を有することが見出された。ＨＡのこれらの特定の分画および銀を含む組成物は、特定の試験において、銀単独に基づく標準的組成物と比較して、抗菌／抗真菌効果の改善、そしてまた、線維芽細胞に対する毒性の減少を示す。
【００２７】
例えば、図４の第３のカラムを参照すると、ＨＡのこれらの特定の分画および銀を含む本発明の組成物は、対照試料に対して線維芽細胞の増殖を刺激する一方、ＨＡを含まないコロイド性銀を用いると、本発明の組成物を用いた試験におけるものの３分の１程度に低い全体量で、対照に対する線維芽細胞の減少が観察される。
【００２８】
これは、本発明の組成物が、当該技術の最先端よりも、明らかでそして予測不能な進歩を示し、記載される皮膚病変の局所治療に関して現在入手可能な組成物よりも、より効率的で、そしてより毒性でないことを意味する。
【００２９】
以後、開示する実験の結果に基づき、予期せぬことに、重量平均分子量１６０〜２００ｋＤａを有するＨＡおよびコロイド性または微粒子化「スポンジ様」金属性銀を含む、本発明の組成物が、以下の驚くべき特性を有することが見出された：
−重量平均分子量１６０〜２００ｋＤａを有するＨＡによる、線維芽細胞増殖を刺激する、前例のないそして驚くべき能力；
−感染創傷で一般的に見られる微生物に対する慣用的な治療のものに少なくとも匹敵する、コロイド性銀または微粒子化「スポンジ様」金属性銀の存在に関連する抗菌活性；
−特に、微粒子化「スポンジ様」金属性銀を用いた場合、本発明の組成物は、対比させる（ｃｏｎｔｒａｓｔ）ことが特に困難な、ＭＲＳＡに対する標準的な治療よりもより活性である；
−皮膚線維芽細胞に対する非常に低い毒性または毒性欠如；
−ＨＡが線維芽細胞増殖を刺激する能力を維持しながら、市場で入手可能な配合物の５０％より低い銀の量の存在下でもまた発揮される抗菌活性。
【００３０】
これらの理由のため、本発明の組成物は、例えば多様な起源の皮膚病変および／または創傷（急性、慢性、多様な病因の潰瘍、火傷、痛む箇所）から生じる皮膚病変および創傷の治療のための、先行技術において知られる組成物よりも、そして現在入手可能な組成物よりも、特に有利である。
【００３１】
好ましくは、本発明の組成物において、ヒアルロン酸は１４５〜２１０Ｋｄａの平均重量分子量を有する。
好ましくは、本発明の組成物において、ヒアルロン酸は１６０〜２００Ｋｄａの間の平均重量分子量を有し、そして銀は多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型を有する。
【００３２】
好ましくは、本発明の組成物において、多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型の銀は、２〜１８マイクロメートルの間の平均粒子サイズおよび５ｍ２／ｇ未満ではない表面積を有する。
【００３３】
好ましくは、本発明の組成物において、ヒアルロン酸は、総組成物の０．１〜２％ｗ／ｗの間の濃度、より好ましくは総組成物の０．１〜０．５％ｗ／ｗの間の濃度、そしてさらにより好ましくは総組成物の０．２％ｗ／ｗの濃度を有する。
【００３４】
好ましくは、本発明の組成物において、コロイド性金属型または多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型の銀は、総組成物の１〜３％ｗ／ｗの間の濃度、より好ましくは総組成物の２％ｗ／ｗの濃度を有する。
【００３５】
本発明記載の組成物は、多様な型で分配される、粉末、溶液または懸濁物の形であってもよく、とりわけ、親水性ゲル、泡、乾式スプレーが好ましく、これはこれらがいくつかの特に望ましい特性を示すためである。特に、乾式スプレーおよび泡は：
・創傷に適用するために、カットし、または成形する必要がないため、特別な操作を伴わずに、容易に適用可能である；
・創傷との接触を回避して適用可能であり、この方式で、さらなる汚染が引き起こされることを減少させる；
・適用しようとする部位に完璧に適用可能であり、すなわち、表在性の、平坦なまたはいずれにしろいくぶん空洞形成された創傷は、容易に均等に分配される乾式スプレーの適用から利益を受ける。実際、乾式スプレー中に存在するヒアルロン酸粉末は、滲出液と接触して、直ちに透明なゲルを形成し、これが、創傷治癒を促進し、そして同時に周囲の環境から分離し、さらなる汚染を防止する程度に、病変腔を湿らせたまま維持し；深い空洞の創傷においては、代わりに泡を適用することがより有用であり、これは一様にそして均等に全創傷床を満たし、創傷治癒剤（ヒアルロン酸）および抗菌剤（銀）の両方と病変部分との密接な接触を促進する；
・絆創膏で覆う必要は必ずしもなく、包帯交換工程を単純にする利点を持つ。
【００３６】
ヒドロゲルの型に関しては、特に深くなく、または空洞形成されていない創傷およびほとんど滲出液を伴わない場合に、特定の適用を見出し；実際、ヒドロゲル自体は、治癒プロセスに基本的な正しい水分を伴う環境を提供する。
【００３７】
１つの態様において、本発明は、ヒアルロン酸および銀を含む組成物であって、ヒアルロン酸が１３０〜２３０Ｋｄａの間の平均重量分子量を有し、そして銀がコロイド性金属型または多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属型を有する、前記組成物、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容されうる賦形剤を含む、薬学的配合物を提供する。
【００３８】
好ましくは、本発明の薬学的配合物は、懸濁剤、ビヒクルおよび噴霧剤より選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含む。
より好ましくは、本発明記載の薬学的配合物において、噴霧剤は、イソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物およびｎ−ブタンからなる群より選択される。
【００３９】
好ましくは、本発明記載の薬学的配合物は、皮膚適用に適した乾式スプレー、泡または親水性ゲルの形である。
好ましくは、本発明記載の薬学的配合物は、病変腔中に透明なゲルとして置かれ、最適な湿潤創傷治癒を促進する、乾式スプレーの形である。
【００４０】
より好ましくは、本発明記載の薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属性銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてｎ−ブタンを含む、乾式スプレーの形である。
【００４１】
より好ましくは、本発明記載の薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、コロイド性金属性銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてｎ−ブタンを含む、乾式スプレーの形である。
【００４２】
好ましくは、本発明記載の薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属性微粒子化型またはコロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてイソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物を含む、泡の形である。
【００４３】
好ましくは、本発明記載の薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属微粒子化型またはコロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてイソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物を含む、親水性ゲルの形である。
【００４４】
１つの態様において、本発明は、薬剤として使用するための上に開示するような組成物または薬学的配合物に関する。
別の態様において、本発明は、表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療において使用するための上に開示するような組成物または薬学的配合物に関する。
【００４５】
好ましくは、表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療において使用するための薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の平均重量分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ微粒子化金属性銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてｎ−ブタンを含む、乾式スプレーの形である。
【００４６】
好ましくは、本発明にしたがって、表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療において使用するための薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、コロイド性金属性銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてｎ−ブタンを含む、乾式スプレーの形である。
【００４７】
好ましくは、本発明にしたがって、表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療において使用するための薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属微粒子化型またはコロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてイソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物を含む、泡の形である。
【００４８】
好ましくは、本発明にしたがって、表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷の局所治療において使用するための薬学的配合物は、１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸を０．２％ｗ／ｗ濃度で、多孔性「スポンジ様」構造を持つ金属微粒子化型またはコロイド性金属型の銀を２％ｗ／ｗ濃度で、そして噴霧剤としてイソブタン／ｎ−ブタン／プロパン混合物を含む、親水性ゲルの形である。
【００４９】
さらに別の態様において、本発明は、表在性および／または小腔皮膚病変および／または創傷を治療する方法であって、上に開示するような組成物または薬学的組成物の局所適用を含む、前記方法に関する。
【００５０】
１つの態様において、本発明は、乾式スプレー、皮膚適用のための泡、または親水性ゲルの形で、上に開示するような組成物を分配するための装置に関する。
最終産物を適用する際に見られる病的な状況を可能な限り正確に再現するため、本出願において示すすべての実験を、ヒト皮膚生検から単離した健康な線維芽細胞に対して行った。細胞培養試験は、損傷を受けているが、より深部の層である真皮およびより表層の層である表皮を含む創傷床を正確に模倣するため、支持体として、三次元の素材を用いた。
【００５１】
研究プロトコルおよび材料を本明細書に報告する。
【実施例】
【００５２】
実験１：異なるＭＷを有するＨＡの存在下で培養したヒト線維芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖の評価。
当該技術の最先端で入手可能なものに基づいて、異なるＨＡ試料を調製し、そして特に、すべて１ｍｇ／ｍｌ培地の濃度で、以下を調製する：
ｉ．  ＥＰ  ８６８  ４３７の実施例１にしたがって調製した、５，０００〜１０，０００Ｄａの間で構成される重量平均ＭＷを有するＨＡ；
ｉｉ．  ＥＰ  ８６８  ４３７の実施例２にしたがって調製した、１０，０００〜１５，０００Ｄａの間で構成される重量平均ＭＷを有するＨＡ；
ｉｉｉ．  重量平均ＭＷ  １６０，０００〜２００，０００Ｄａを有するＨＡ；
ｉｖ．  ＥＰ  ５３５  ２００の実施例１にしたがって調製した、重量平均ＭＷ  １，０００，０００Ｄａを有するＨＡ；
ｖ．  重量平均ＭＷ  １，５００，０００〜３，２００，０００Ｄａを有するＨＡ、Ｈｙａｌｕｂｒｉｘ（登録商標）（Ｍｉｇｌｉｏｒｅら，  Ａｒｔｈｒ．  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００９，  １１，  Ｒ１８３）。
【００５３】
ヒト皮膚生検からの健康な線維芽細胞の単離：簡潔には、抗生物質を添加したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で何回か洗浄した後、生検を皮下脂肪組織から取り除き、そして小片にカットして、これを酵素ディスパーゼによる酵素消化に３０分間供する。処理終了時に、皮膚を根底の真皮から分離し、これをトリプシンで１０分間消化し；次いで、細胞を遠心分離によって抽出する。
【００５４】
細胞培養：２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および１％グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中に植え付けることによって、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する。
【００５５】
ＭＴＴ試験：このアッセイは、培養細胞におけるコハク酸脱水素酵素活性の存在を定量的に測定し；生存細胞のミトコンドリアにのみ存在するこうした活性は、通常、代謝活性、生存性およびしたがって培養細胞の増殖をチェックするマーカーとして用いられる。この試験は、アゾール性（ａｚｏｌｉｃ）色素ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）がコハク酸脱水素酵素によって黄色から青色に変換されることに基づく。分光測定で決定された青色色素（ホルマザン）の量は、細胞培養におけるコハク酸脱水素酵素の存在に比例し、そして次いで、生存細胞数に比例する。
【００５６】
細胞を０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液と３時間インキュベーションする。インキュベーション終了時、抽出溶液（９０％イソプロパノール、１０％ＤＭＳＯ）を用いて、色素を細胞から抽出し、そして５４０／６６０ｎｍの波長で読み取る。
【００５７】
操作法：前述のように、三次元培養を用い、そして不織布Ｈｙａｆｆ１１上に細胞を正確に植え付けて（ＥＰ  ６１８  ８１７の実施例２のように調製）、細胞増殖試験を行った。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ線維芽細胞増殖を模倣することを意図する場合に選択する方法であり、そしてこれは、真皮において、皮膚線維芽細胞が挿入される、ヒアルロン酸およびコラーゲンで主に形成される細胞外三次元マトリックスからなるものである。
【００５８】
前記にしたがって単離された線維芽細胞を、適切なプレート内に付着された不織布材料の小片（１ｘ１ｃｍ）上に植え付け（６０，０００）、そして２４時間培養を維持する。その後、試験しようとする、異なるＨＡ試料を、培地に添加し、そして３日間処理した後、ＭＴＴ試験を行って細胞増殖を評価した。対照は、ＨＡで処理しない線維芽細胞からなった。
【００５９】
結果：図１に明らかに示すように、当該技術の最先端で記載されるものとは対照的に、低ＭＷ  ＨＡ分画は細胞増殖を刺激しない。その代わり、１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷ分画は、顕著な増殖活性を有し、一方、１００万Ｄａより高いＭＷは、毒性でない場合であっても効果がなかった。
【００６０】
以下の方法にしたがって、Ｉ型コラーゲン（図３）およびフィブロネクチン（図２）の遺伝子発現の定量的評価によってもまた、線維芽細胞の増殖および生存度を確認する。
上述のように線維芽細胞を単離し、そして培養し、そして試料ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ（その他は、細胞増殖に対して負の影響があったため除外した）で３日間処理し；処理終了時、リアルタイムＰＣＲを行って、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの遺伝子発現を評価した：供給者の指示にしたがって、「Ｔｒｉｚｏｌ」法（ＴＲＩＺＯＬ試薬、ＬＩＦＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、細胞ＲＮＡを抽出した。簡潔には、１．０ｍｌのＴｒｉｚｏｌを添加することによって細胞を溶解し、そして２６０ｎｍで吸光度を測定することによって、総ＲＮＡを定量化した。増幅する各遺伝子に関して、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国カリフォルニア州プレザントン）を用いて、適切なプライマーを選択した。Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ  ＴＭ５５００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア・シドニー）を用いて実行するリアルタイムＰＣＲによって、遺伝子発現を評価した。結果を図２および３に要約する：これらは、１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷ  ＨＡが、対照と比較して、両方のタンパク質の遺伝子発現を有意に増加させることを確認し、そしてこれは、処理した線維芽細胞が、創傷の完全な治癒に必須である細胞外マトリックスを構築可能であることを意味する。
【００６１】
結論：驚くべきことに、１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷ  ＨＡは、皮膚線維芽細胞増殖に対して、非常に効率的な作用を示した。こうした線維芽細胞は、細胞外マトリックスを沈着させ、したがって病変皮膚組織の修復を活性化することが可能であるため、生存性であり、そして代謝的に活性である。
【００６２】
上記の予期されない結果に基づき、本明細書に提示する配合物の抗菌および抗真菌効果を評価する。使用する微生物は、感染創傷に一般的に存在するもの、すなわち：大腸菌、緑膿菌、フェカリス菌（バンコマイシンに耐性）、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性）およびＣ．アルビカンスである。
【００６３】
実験培地中に溶解するために、コロイド型および金属型の両方の銀を含有する試験配合物を粉末の形で調製した。
実験２：調製物の抗菌／抗真菌活性の評価。
【００６４】
試験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、したがって、溶解するかまたは懸濁して有効性を評価することが可能であるように、コロイド性金属性または微粒子化金属性銀を含有する試験配合物を粉末の形で調製した。対照配合物（Ｃ）は、粉末、ならびに乾式スプレー（Ｋａｔｏｘｙｎ（登録商標）、Ｄｅｖｅｒｇｅ  Ｍ＆Ｍ）の形で商業的に入手可能である。
【００６５】
配合物Ａ
・０．２％ナトリウムＨＡ  ＭＷ  １６０〜２００ｋＤａ
・２％コロイド性金属性銀
・４％Ｓｙｌｏｉｄ２４４（賦形剤）
・軽カオリン（賦形剤）適量で１００に。
【００６６】
配合物Ｂ
・０．２％ナトリウムＨＡ  ＭＷ  １６０〜２００ｋＤａ
・２％微粒子化金属性銀、スポンジ様（ＳＬ）２％（ＭｉｃｒｏＳｉｌｖｅｒ  ＢＧＴＭ  Ｐｈａｒｍａ）
・４％Ｓｙｌｏｉｄ２４４（賦形剤）
・軽カオリン（賦形剤）適量で１００に
を、
・４．２５％コロイド性金属性銀
・１．５％過酸化ベンゾイル
・１％無水グルコン酸カルシウム（賦形剤）
・ケイ酸アルミニウム（賦形剤）  適量で１００に
からなる標準的商業的組成物（配合物Ｃ−Ｋａｔｏｘｙｎ（登録商標））に対して試験した。
【００６７】
試験微生物：各微生物の液体培養を供給業者の指示にしたがって調製した。リッチでそして生存している培養を得るために、インキュベーションを少なくとも４８時間続けた；各培養のタイターを、マクファーランド基準を通じておおよそ決定した。いくつかの微生物に関しては、２つの１００ｍＬ  ＴＳＢ試料（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に接種することによって、２つの試験懸濁物を調製し、液体培養量は、約１０３および約１０６ＣＦＵを含有した。次いで、接種物を計数に供して、Ｔ＝０での懸濁物の微生物含量を正確に決定した。
【００６８】
配合物試料：約１ｇの２つの試料を各配合物から抜き取り、そして１０３および１０６ＣＦＵを含有する懸濁物、または１０３ＣＦＵのみに添加した。このように調製した試料をインキュベーションし、そして微生物と産物の密接な接触を最大限にし、そして粉末沈降現象を防止するため、一定の緩慢な振盪および垂直方向の回転を維持した。インキュベーション３０分後、アリコットを抜き取り、１０６ＣＦＵを含有する試料に対して適切な希釈を操作することによって、ろ過膜技術により懸濁物の微生物含量の計数を実行した。ろ過に用いた膜をＴＳＡ培地（トリプトン・ダイズ寒天−Ｂｉｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）中に移し、そして少なくとも５日間インキュベーションした。
【００６９】
試験懸濁物中の細菌含量の計数を１２時間後および２４時間後に反復した。
以下の表は、各試験配合物に関して、異なる接触時間後、多様な微生物濃度の対数減少値を開示する。
【００７０】
表１−配合物Ａ
【００７１】
【表１】
2014500257.tif 000002
【００７２】
データから、配合物Ａで処理したすべての接種物中の細菌含量は、１２時間後および２４時間後の両方で、実質的に無であると推測可能である。これは、配合物Ａが殺菌剤として作用し、そして静菌剤ではないことを意味する。実際、欧州薬局方は、局所使用のための殺菌剤を、微生物と２４時間接触させた後、少なくとも２対数分の濃度で、含量を減少させるものと定義している。
【００７３】
表２−配合物Ｂ
【００７４】
【表２】
2014500257.tif 000003
【００７５】
配合物Ｂは、配合物Ａのものと同一の活性プロファイルを有する。これは、ヒアルロン酸と関連して配合された銀のこの実験において、微生物に対する活性が、コロイド型または「スポンジ様」微粒子化金属型のいずれでも定性的／定量的に同一であることを意味する。
【００７６】
表３−配合物Ｃ
【００７７】
【表３】
2014500257.tif 000004
【００７８】
配合物Ｃもまた、配合物ＡおよびＢで見られる結果を再現することが明らかであるようだが、得られたデータは、異なる配合物の間のいくつかの基本的な相違を考慮に入れると、絶対的に予期されない状況を生じさせる：
・ＡおよびＢは、Ｃのものよりも明らかに低い（半分に満たない）銀濃度（２％）を含有する
・Ｃは、過酸化ベンゾイル（ＢＰ）を含有し；すべての過酸化物と同様、ＢＰは、それ自体酸化剤であり、放出する酸素によって微生物を殺す能力を有するため、非常にしばしば、まさにニキビに対する局所調製物中で用いられる。したがって、配合物Ｃの活性は、含有される銀およびＢＰのためであり、ＢＰは、一方で、銀酸化の活性化剤として作用し、そして他方で、抗菌剤、すなわち酸素の供給源として作用する。
【００７９】
結論：試験したすべての配合物は、欧州薬局方にしたがって、局所使用のための殺菌剤と定義可能である。細菌含量を減少させる意味で、３つの調製物は定性的に同等であるが、定量的に同等ではなく、これは絶対的に予測不能であるように、１６０〜２００ｋＤａに等しい重量平均ＭＷを有するヒアルロン酸を含む配合物ＡおよびＢは、Ｃに存在する銀の半分未満しか含有しないためである。
【００８０】
したがって、配合物ＡおよびＢは、銀濃度を顕著に低下させ、そしてさらなる活性剤（過酸化ベンゾイルから放出される酸素）の補助を伴わずに、同じ抗菌／抗真菌効果を誘導するため、配合物Ｃよりも効率的である。
【００８１】
実験２ａ：上記データを考慮して、特に適切な微生物、すなわちメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する組成物Ａ、ＢおよびＣ（上記のように定義）の効果を評価する。ＭＲＳＡは、ときに「多剤耐性黄色ブドウ球菌」と呼ばれるほど、治療が特に困難ないくつかの感染の原因となる細菌である。実際、該細菌は、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンに耐性である。ＭＲＳＡ感染は、開放創傷を有するか、または侵襲性デバイス（例えばカテーテル）を所持する患者が汚染の高リスクを持つ病院において、特に困難である。
【００８２】
無菌フィンガーパッドをＭＲＳＡで汚染させ（３０マイクロリットル体積中、１０８ＣＦＵ）；汚染領域を空中で３分間乾燥させ、その後、試験しようとする産物（組成物Ａ、ＢまたはＣ）を約１５ｃｍの距離から５秒間、３秒間隔を置いて２回適用する。すべての配合物を、湿ったチャンバー中で、微生物と３０分間、３時間、６時間または１５時間接触させる。終了時、フィンガーパッドを１分間、中和培地中に浸して、抗菌作用を遮断し、そして微生物を収集する。中和培地の試料を適切に希釈して、そして適切な固体培地上に植え付ける。２５時間の培養後、ＣＦＵを定量化して、そして生じたデータを図５に開示する。実験１の結果と一致して、組成物Ｃの活性は、組成物Ａのものに、完全に重ね合わせ可能である。驚くべきことに、「スポンジ様」微粒子化金属性銀および重量平均ＭＷ  ２００ｋＤを有するＨＡを含む組成物Ｂは、顕著に優れた効果を有し、３０分後およびそれより遅い時点の両方で、微生物集団をより実質的に減少させた。この側面は、組成物Ｂの銀の量が配合物Ｃのものの半分未満であることを考慮すると、特に注目に値する。
【００８３】
結論：すべての試験した配合物はまた、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）にも有効であるが、「スポンジ様」微粒子化金属性銀および重量平均ＭＷ  １６０〜２００ｋＤａを有するＨＡを含む組成物Ｂは、実質的により効率的である。「スポンジ様」微粒子化金属性銀および重量平均ＭＷ  １６０〜２００ｋＤａを有するＨＡを含む組成物の活性は、この組成物中の銀の量が、商業的に入手可能な組成物中のものの半分未満であることを考慮すると、特に驚くべきことである。
【００８４】
実験２および２ａの結果を考慮して、皮膚線維芽細胞に対する配合物の細胞毒性効果を試験して、銀の存在が、実験１に示す線維芽細胞増殖に対する１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷ  ＨＡが発揮する効果を無にするかどうかを検証する。
【００８５】
実験３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト皮膚生検由来の健康な線維芽細胞の増殖に対する、本発明の配合物の活性。
実験１に記載する方法にしたがって、線維芽細胞の単離および培養を行った。ブロモデオキシウリジンＢｒｄＵ標識試験（ブロモデオキシウリジンキット、ＢｉｏＡｓｓａｙＴＭ）を通じて、細胞増殖を評価した。簡潔には、ＢｒｄＵの取り込み後、細胞を抗ＢｒｄＵ抗体での標識に供し、そして次いで、適切な読み取り装置を通じて分析する。
【００８６】
試料：ＭＲＳＡに対する配合物Ｂの驚くべき有効性を考慮して、配合の利便性のため、配合物Ｃ（市販製品）と比較するために、配合物Ｂ（微粒子化「スポンジ様」金属性銀および重量平均１６０〜２００ｋＤａを有するＨＡに基づく）を選択し、以下のように、異なる濃度（５ｍｇ／ｍｌ；３０ｍｇ／ｍｌ）で試料を調製した。
【００８７】
各配合物の適切な量を重量測定し、ＢｒｄＵを含有するＤＭＥＭ（細胞培地）に溶解し、そして振盪しながら１０分間維持した。次いで、混合物を６０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。こうして得た上清を、培養細胞と接触させ、ＢｒｄＵのみを含むＤＭＥＭ中の細胞（対照）に対して、線維芽細胞増殖を評価した。
【００８８】
実験結果を図４に要約し、この中で、最初のカラムは、インキュベーション３日後の細胞増殖値に相当し、そして第二のカラムはインキュベーション５日後に相当する。
配合物Ｂが、含有する活性成分量に関わらず、対照に比較して、線維芽細胞増殖に正の効果を発揮することが直ちに明らかであるようである。対照に対して評価される効果は、５ｍｇ／ｍｌの試料に関して、そして接触３日後に、より実質的であるが、また、３０ｍｇ／ｍｌ試料に関しても、常に、対照に比較して、３日後および５日後の両方で、有意な細胞増殖が観察される。
【００８９】
特に、図４の第三のカラムを参照すると、３０ｍｇ／ｍｌの組成物Ｂ（２％ｗ／ｗの微粒子化「スポンジ様」銀および重量平均分子量１６０〜２００ｋＤａを有する０．２％ヒアルロン酸ナトリウムを含む）を用いた試験において、対照試料に対して、線維芽細胞の増殖が観察される。その代わり（図４、第四のカラム）、４．２５％コロイド性銀、すなわち３０ｍｇ／ｍｌの組成物Ｂでの試験で用いた量に対して、より少量の銀総量（およそ１／３）を含む組成物Ｃを５ｍｇ／ｍｌ用いると、対照に対して線維芽細胞の減少が発現される。
【００９０】
再び、１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷ  ＨＡは、抗菌／抗真菌剤と関連させた場合もまた、細胞増殖に対する予期されぬ特性を示す。これらの実験のデータは、実際、１６０〜２００ｋＤａ重量平均ＭＷのヒアルロン酸が、微粒子化銀またはコロイド性銀の抗菌活性を改変しないまま、銀の細胞毒性活性から線維芽細胞を保護することを示す。配合物Ｃに関するデータは、その代わり、反対の傾向を示し；  ５ｍｇ／ｍｌの濃度５日目で、すでに、対照と比較して、線維芽細胞増殖の阻害を示す負の増殖値を有する一方、３０ｍｇ／ｍｌを含有する試料では、処理３日後にすでに線維芽細胞数の減少が観察され、該試料の毒性を明らかに示す。５ｍｇ／ｍｌ試料で処理３日後のみがなお、対照と同一の線維芽細胞数を有したが、こうした結果は、同じ条件の濃度および処理時間で、５０％を超えて線維芽細胞増殖が増加する、同等の配合物Ｂと比較した際、絶対的に相当しない。
【００９１】
やはり、本明細書に開示する実験データを考慮して、乾式スプレー、皮膚用の泡または親水性ゲルの形の、ヒアルロン酸および銀を含む本発明の組成物は、滲出液もまた含み、そして次いで、例えば大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびフェカリス菌などの微生物、ならびにカンジダ・アルビカンスなどの真菌による感染が高リスクであることによって特徴付けられる、多様な起源（急性、慢性創傷、多様な病因の潰瘍、火傷、痛む箇所）の皮膚病変および／または創傷の局所治療に適している。用いるヒアルロン酸は、１３０〜２３０ｋＤａの間で構成される、好ましくは１４５〜２１０ｋＤａの間で構成される、そしてさらにより好ましくは１６０〜２００ｋＤａの間で構成される重量平均ＭＷを有する。最終組成物中の濃度は、重量０．１〜２％（ｗ／ｗ）の間、好ましくは０．１〜０．５％ｗ／ｗの間、そしてさらにより好ましくは、０．２％ｗ／ｗに等しい。銀は、上記利点を考慮して、コロイド性金属型または微粒子化「スポンジ様」金属型であってもよく、後者の型が好ましい。最終組成物中の銀濃度は、１〜３％ｗ／ｗの間で構成される可能性があり；好ましい濃度は２％ｗ／ｗに等しい。薬学的型に関しては、ヒドロゲルは、完全に表在性の皮膚病変および／または創傷に特に有用であり；乾式スプレーは、平坦なまたはわずかに空洞形成された皮膚病変および／または創傷で特定の使用を見出し、一方、皮膚用の泡は、空洞形成された皮膚病変および／または創傷上の適用に適している。
【００９２】
乾式スプレーおよび皮膚用の泡の場合、本発明記載の組成物は、噴霧剤としてｎ−ブタン、またはｎ−ブタン、イソブタンおよびプロパンからなる混合物を含み；特に、乾式スプレー配合物においてはｎ−ブタンが好ましく、一方、皮膚用の泡に関しては、ｎ−ブタン、イソブタンおよびプロパン混合物が、選択される噴霧剤である。
【００９３】
例示的目的のため、選択される薬学的型の配合物および調製法を本明細書に提供するが、これは、配合の技術分野の当業者の知識にしたがって、修飾可能である。
コロイド性金属性Ａｇを含む乾式スプレー：産物１００ｇは以下を含有する
【００９４】
【表４】
2014500257.tif 000005
【００９５】
微粒子化し、そして篩にかけたヒアルロン酸を、あらかじめ微粒子化したコロイド性銀で進行性に希釈することによって、混合する。得たプレ混合物を、二酸化ケイ素で進行性に希釈することによって、混合する。こうして得た混合物を、最後に、均質になるまで、軽カオリンと混合する。
【００９６】
上記で得た中間体産物を、次いで、加圧シリンダー中の分配に供する。
微粒子化「スポンジ様」金属性Ａｇを含む乾式スプレー：産物１００ｇは以下を含有する
【００９７】
【表５】
2014500257.tif 000006
【００９８】
微粒子化し、そして篩にかけたヒアルロン酸を、すでにミクロン粒子サイズを有するスポンジ様微粒子化金属性銀で進行性に希釈することによって、混合する。得たプレ混合物を、二酸化ケイ素で進行性に希釈することによって、混合する。こうして得た混合物を、最後に、均質になるまで、軽カオリンと混合する。
【００９９】
上記で得た中間体産物を、次いで、加圧シリンダー中の分配に供する。
コロイド性金属性銀に基づく皮膚用の泡：産物１００ｇは以下を含有する
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
Ｌａｂｒａｓｏｌ中のあらかじめ微粒子化しておいたコロイド性銀の分散物を、振盪しながら、ヒアルロン酸ナトリウムおよびグリセロールで構成される溶液に添加し、そして均質になるまで混合する。ソルビン酸カリウム、ベンジルアルコール、ポリソルベート８０、アルファ−酢酸トコフェリル、水素化ダイズレシチンを添加し、そして溶解するまで振盪する。最終体積に到達するまで精製水を添加し、そして均質になるまで振盪する。得た調製物をろ過し、そして加圧容器中、分配に供する。
【０１０２】
微粒子化「スポンジ様」金属性銀に基づく皮膚用の泡：産物１００ｇは以下を含有する：
【０１０３】
【表７】
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【０１０４】
Ｌａｂｒａｓｏｌ中の微粒子化「スポンジ様」金属性銀の分散物を、振盪しながら、ヒアルロン酸ナトリウムおよびグリセロールで構成される溶液に添加し、そして均質になるまで混合する。ソルビン酸カリウム、ベンジルアルコール、ポリソルベート８０、アルファ−酢酸トコフェリル、水素化ダイズレシチンを添加し、そして溶解するまで振盪する。最終体積に到達するまで精製水を添加し、そして均質になるまで振盪する。得た調製物をろ過し、そして加圧容器中、分配に供する。
【０１０５】
コロイド性金属性銀を含む親水性ゲル：産物１００ｇは以下を含有する：
【０１０６】
【表８】
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【０１０７】
メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートを８０℃で精製水中に溶解する。溶液を室温に冷却した後、ヒアルロン酸ナトリウムを添加し、そして溶解が完了するまで混合する。次いで、均質な分散および後者の完全な水和が得られるまで、ＰＥＧ４００を溶解し、そして振盪を維持しながら、Ｃａｒｂｏｍｅｒ  ９７４Ｐを添加する。次いで、水性相のゲル化が得られるまで、トリエタノールアミンを添加する。最後に、振盪しながら、グリセロール、プロピレングリコールおよびあらかじめ微粒子化しておいたコロイド性銀を添加し、そして均質になるまで混合する。
【０１０８】
微粒子化「スポンジ様」金属性銀を含む親水性ゲル：産物１００ｇは以下を含有する：
【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートを８０℃で精製水中に溶解する。溶液を室温に冷却した後、ヒアルロン酸ナトリウムを添加し、そして溶解が完了するまで混合する。次いで、均質な分散および後者の完全な水和が得られるまで、ＰＥＧ４００を溶解し、そして振盪を維持しながら、Ｃａｒｂｏｍｅｒ  ９７４Ｐを添加する。次いで、水性相のゲル化が得られるまで、トリエタノールアミンを添加する。最後に、振盪しながら、グリセロール、プロピレングリコールおよび微粒子化「スポンジ様」金属性銀を添加し、そして均質になるまで混合する。
【０１１１】
要約すると、２％ｗ／ｗ濃度の銀とともに、１３０〜２３０ｋＤａ、好ましくは１４５〜２１０ｋＤａ、そしてより好ましくは１６０〜２００ｋＤａの間の重量平均ＭＷを有するＨＡを含む配合物は、潜在的に病原性である細菌を除去可能であり、そしてこれを、乾式スプレーまたは皮膚用の泡または親水性ゲルの形で、例えば、多様な起源の皮膚病変および／または創傷から生じる皮膚病変および創傷の治療のための局所療法で有効に使用することも可能である。本発明の組成物中の銀は、コロイド性金属型または微粒子化「スポンジ様」金属型で使用可能であり、ＭＲＳＡ感染に対する驚くべきより高い活性を考慮すると、後者が好ましい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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