(57)【要約】  本発明は、低刺激性アレルゲンとして有用な突然変異体ポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、突然変異体のＢｅｔ  ｖ  １タンパク質およびこのようなポリペプチドの、カバノキ花粉アレルギーに対して脱感作するための低刺激性アレルゲンとしての使用を提供する。さらに、本発明は、このようなポリペプチドを含むワクチン処方物、このような処方物の使用、およびカバノキ花粉アレルギーに対するワクチン接種の方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示される野生型アミノ酸配列、または任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、アミノ酸残基１０１、１３７、９９、８０、８２、８４、１１７、１１９、７、９、１３３、１４１、および１４５からなる群から選択される位置における、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号４〜３９からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４１〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそのアイソフォームを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸１０１がＫである配列番号４１、
アミノ酸１３７がＫである配列番号４２、
アミノ酸９９がＫである配列番号４３、
アミノ酸８０がＹである配列番号４４、
アミノ酸８２がＫである配列番号４５、
アミノ酸８４がＫである配列番号４６、
アミノ酸１１７がＫである配列番号４７、
アミノ酸１１９がＥである配列番号４８、
アミノ酸７がＥである配列番号４９、
アミノ酸９がＥである配列番号５０、
アミノ酸１３３がＹである配列番号５１、
アミノ酸１４１がＫである配列番号５２、および
アミノ酸１４５がＹである配列番号５３
からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそのアイソフォーム
を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、アミノ酸１０１、１３７、または９９位に位置する、請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｓ９９が、チロシンにより置きかえられている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｋ１３７が、チロシンにより置きかえられている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｅ１０１が、リシンにより置きかえられている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ヒスタミン放出能が、前記野生型Ｂｅｔ  ｖ  １のヒスタミン放出能と比較すると、少なくとも２０分の１に低減されている、請求項１〜８の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ヒスタミン放出能の低減が、少なくとも１００分の１である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
併せて少なくとも２、３、または４つのアミノ酸置換が存在する、先行する請求項の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の少なくとも１つの低刺激性ポリペプチドと、医薬として許容可能な希釈剤またはアジュバントとを含むワクチン。
【請求項１３】
舌下投与用であることを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
配列番号４に示される野生型アミノ酸配列、またはその任意のＢｅｔ  ｖ１野生型変異体に基づく組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ１ポリペプチドであって、アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ１３７、Ｓ９９、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ１１７、Ｋ１１９、Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｅ１４１、およびＲ１４５からなる群から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドの、ワクチンとしての使用。
【請求項１５】
カバノキ花粉アレルギーに対してワクチン接種する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１１の何れか１項に記載の少なくとも１つの低刺激性ポリペプチドと、少なくとも１つの医薬として許容可能なアジュバントとを含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１６】
配列番号４に示される野生型アミノ酸配列、または任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、アミノ酸残基１０１、１３７、９９、８０、８２、８４、１１７、１１９、７、９、１３３、１４１、および１４５からなる群から選択される位置における、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ワクチンとして用いるためのポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、低刺激性アレルゲンとして有用な突然変異体ポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、突然変異体のＢｅｔ  ｖ  １タンパク質、およびカバノキ花粉アレルギーに対して脱感作するための低刺激性アレルゲンとしての、このようなポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、このようなポリペプチドを含むワクチン処方物、ワクチン接種におけるこのような処方物の使用、およびカバノキ花粉アレルギーに対するワクチン接種の方法にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
アレルギーは、一般的には無害なタンパク質であるアレルゲンに対する免疫反応によって引き起こされる。アレルギー性疾患は、全世界で流行性といい得る比率に達しつつある。工業国における人口の２５％超が、Ｉ型アレルギーを患い、その数は、着実に増大しつつある。カバノキ花粉アレルギーは、Ｉ型アレルギーの極めて一般的な形態である。Ｂｅｔ  ｖ  １とは、カバノキ花粉の主要なアレルゲンである。Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲン、そのイソアレルゲン、および変異体についてのより多くの情報は、ＷＨＯのウェブサイトであるｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇにおいて見出される。
【０００３】
Ｉ型アレルギーは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の形成に基づき、アレルゲン分子が、マスト細胞または好塩基球の表面上の受容体に結合した２つのＩｇＥ抗体に結合し、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ複合体の架橋形成を誘導すると、症状が発生する。これは、炎症性の反応および症状、例えば、アレルギー性喘息、鼻炎、食物および皮膚アレルギー、ならびにまたアナフィラキシーを引き起こす生物学的メディエーター、例えば、ヒスタミンおよび脂質メディエーターの脱顆粒を誘発する。
【０００４】
ＩｇＥは、２つの同一な軽鎖および重鎖からなる大型の分子である。ＩｇＥの重鎖には５つのドメイン：ＶＨ、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３、およびＣε４が存在する。完全なＩｇＥ分子のサイズは、約２００ｋＤａである。そのＦｃεＲＩ受容体へと結合したＣε２〜Ｃε４断片およびＣε２〜Ｃε４断片の結晶構造は、決定されている（Ｇａｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００（４０６）：２５９〜２６６；およびＷａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２（３）：６８１〜６８６）。
【０００５】
過去数年間において、多数の異なるアレルゲンの三次元構造が決定されている。これらのアレルゲンは、構造的に大幅にばらつき、アレルゲンがＩｇＥ抗体の産生を引き起こす能力を説明しうる一般的な構造モチーフは同定されていない。しかし、アレルギー誘発性が少数のタンパク質ファミリーだけに制約されていることを示唆する研究がなされており、これにより、タンパク質の構造的特徴もまた、アレルギー誘発性において役割を果たすという証拠が提起されている（Ｒｏｕｖｉｎｅｎら、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ２０１０（５）：ｅ９０３７；Ｒａｕｄａｕｅｒら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８（１２１）：８４７〜８５２）。
【０００６】
Ｎｉｅｍｉらによる最近の文献、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２００７（１５）：１４１３〜２１は、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）と複合体化したＩｇＥのＦａｂ断片の結晶構造について開示している。Ｎｉｅｍｉらはまた、２つのＩｇＥ／Ｆａｂ分子が、二量体のＢＬＧにいかに結合するのかについても示し、ＩｇＥのエピトープが、βシート領域内に位置する「平坦な」表面であり、既知のＩｇＧエピトープ構造と比較すると異なることについても示した。
【０００７】
今日、全てのアレルギー性症状の処置における趨勢は、しばしば不可能であるか、または症状の処置に過ぎないアレルゲンの回避ではなくて、アレルゲン特異的脱感作を用いる、能動的な忍容性の誘導へと向かっている。現行の脱感作療法は、天然の供給源から精製されたアレルゲンであって、バッチ間のばらつきにより、処置の適正な用量および有効性を見出し、これを維持することと関連する問題がもたらされうるアレルゲンに基づく。これらの問題は、アナフィラキシー性の副作用および新たなアレルゲンへの感作の潜在的危険性をもたらしうる。
【０００８】
脱感作のために組換えアレルゲンを用いれば、バッチ間のばらつきと関連する欠点が除去されるであろうし、最初の組換えアレルゲンが臨床試験にかけられている（Ｖａｌｅｎｔａら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０（２８）：２１１〜４１）。したがって、臨床におけるこのようなアレルゲンの有効性は、今後の課題である。いくつかの修飾組換えアレルゲンが報告されている。
【０００９】
国際特許公開ＷＯ０２／４０６７６および同ＷＯ０３／０９６８６９は、カバノキ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １の多くの突然変異体形態を開示している。これらの突然変異体は、ランダム突然変異を、Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドの保存的表面構造の配列解析に基づく推定ＩｇＥ結合部位に導入することにより作製された。ＷＯ０３／０９６８６９は、アレルゲン表面上の異なる「小型基」における４つの主要な突然変異の使用について開示している。
【００１０】
国際特許公開ＷＯ２００７／０７３９０７は、アミノ酸部位５４、１１５、または１２３における３つのアミノ酸の置換または欠失を含むＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドについて開示している。これらの突然変異体により、ヒスタミン放出能が低減されたという証拠はない。
【００１１】
国際特許公開ＷＯ２００９／０２４２０８は、アミノ酸１００〜１２５の領域内に少なくとも４つの突然変異を有するＢｅｔ  ｖ  １突然変異体について開示している。しかし、突然変異のためにポリペプチドの三次元構造は失われており、活性も報告されていない。
【００１２】
国際特許公開ＷＯ２００８／０９２９９２は、不連続のアレルゲン誘発性エピトープ、すなわち、アレルゲン誘発性物質上の６００〜９００Åの領域を伴う平面状の表面におけるアミノ酸残基を修飾することにより、Ｉ型表面におけるアレルゲン誘発性物質の相互作用を遮断する方法について開示し、これにより、低刺激性カバノキ花粉タンパク質を調製しうることを示唆している。
【００１３】
アレルギー治療の問題の増大に応じるための、安全で有効なワクチンおよび治療用生成物に対するニーズは、認知されており、大きなものである。現在のところ、アレルギーの安全で有効な療法のための市場は十分に開発されていない。
【発明の簡単な説明［開示］】
【００１４】
本発明は、配列番号４に示される野生型アミノ酸配列、または任意の他のＢｅｔ  ｖ  １野生型アイソフォームに基づく、組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、アミノ酸残基１０１、１３７、９９、８０、８２、８４、１１７、１１９、７、９、１３３、１４１、および１４５からなる群から選択される位置における、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドに関する。
【００１５】
好ましい態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ１３７、Ｓ９９、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ１１７、Ｋ１１９、Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｅ１４１、およびＲ１４５からなる群から選択される位置におけるものである。
【００１６】
特定の態様では、本発明によるポリペプチドが、配列番号４〜３９からなる群から選択されているアミノ酸配列により表される。
【００１７】
一態様では、本発明によるポリペプチドが、アミノ酸１０１、１３７、または９９位、好ましくはＥ１０１、Ｋ１３７、またはＳ９９に位置するアミノ酸置換を有する。
【００１８】
本発明の一態様では、前記置換が、チロシンにより置きかえられているＳ９９であり、別の態様では、前記置換が、チロシンにより置きかえられているＫ１３７である。さらなる態様では、前記置換が、リシンにより置きかえられているＥ１０１である。
【００１９】
本発明による低刺激性ポリペプチドは、ヒスタミン放出能が、Ｂｅｔ  ｖ  １野生型のヒスタミン放出能と比較すると、少なくとも２０分の１に低減されている。一態様では、ポリペプチドのヒスタミン放出能が、少なくとも１００分の１に低減されている。
【００２０】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの低刺激性ポリペプチドを含むワクチンにも関する。
【００２１】
本発明の一態様では、前記ワクチンが、舌下投与用である。
【００２２】
本発明は、配列番号４に示される野生型アミノ酸配列、またはその任意のＢｅｔ  ｖ１野生型変異体に基づく組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ１ポリペプチドであって、アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ１３７、Ｓ９９、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ１１７、Ｋ１１９、Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｅ１４１、およびＲ１４５からなる群から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドの、単独でまたは少なくとも１つの医薬として許容可能なアジュバントと組み合わせた、ワクチンとしての使用にさらに関する。
【００２３】
本発明はまた、カバノキ花粉アレルギーに対してワクチン接種する方法であって、それを必要とする対象に、本発明による低刺激性ポリペプチドの少なくとも１つと、少なくとも１つの医薬として許容可能なアジュバントを含む組成物を投与することを含む方法にも関する。
【００２４】
本発明はまた、配列番号４に示される野生型アミノ酸配列、または任意の他のＢｅｔ  ｖ１野生型アイソフォームに基づく組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、アミノ酸残基１０１、１３７、９９、８０、８２、８４、１１７、１１９、７、９、１３３、１４１、および１４５からなる群から選択される位置における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ワクチンとして用いるためのポリペプチドにも関する。
【００２５】
以下では、本発明が、付属の図面を参照しながら、好ましい態様を介して、より詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】例１において導出されるＢｅｔ  ｖ１の第１の推定エピトープを例示する図。
【図２】例１において導出されるＢｅｔ  ｖ１の第２の推定エピトープを例示する図。
【図３】Ｂｅｔ  ｖ  １の３６のアイソフォームのアミノ酸配列アラインメントを示す図。
【図４】組換えアレルゲンを産生するための細菌の発現ユニットであって、Ｐｔａｃがプロモーターであり、ＰｅｌＢ  ＳＳが組換えアレルゲンのコード領域へと連結されたシグナル配列であり、星印がアミノ酸置換部位を例示する発現ユニットを概略的に示す図。
【図５】例２で用いられるＢｅｔ  ｖ  １野生型ポリペプチド（Ａ）、Ｓ９９Ｙポリペプチド（Ｂ）、Ｋ１３７ポリペプチド（Ｃ）、およびＥ１０１Ｋポリペプチドの核酸配列（配列番号１〜３）を示す図。
【図６】血清中ＩｇＥのＢｅｔ  ｖ  １への結合に対する、組換えＢｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９ＹおよびＥ１０１Ｋポリペプチドによる競合的阻害を示す図。
【図７】組換えＢｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙ、およびＫ１３７Ｙポリペプチドによるヒスタミン放出実験の結果を示す図。
【図８】濃度３μＭにおける組換えＢｅｔ  ｖ  １野生型および組換えＢｅｔ  ｖ  １突然変異体Ｅ１０１Ｋの未変性型ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ質量スペクトルを示す図。
【発明の詳細な説明】
【００２７】
以下の記載、例、および特許請求の範囲では、アミノ酸に３文字コードと１文字コードの両方を用いる。本発明によるポリペプチドにおけるアミノ酸部位を命名するために、以下のコードが使用される：Ｓ９９とは、９９位にセリンが存在することを意味するのに対し、Ｓ９９Ｙとは、９９位におけるセリンがチロシンにより置きかえられていることを意味する。
【００２８】
カバノキ花粉アレルギーとは、アレルギーの極めて一般的な形態であり、シラカバ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）の花粉は、欧州および北米におけるＩ型アレルギー反応の主要な原因の１つである。人口の約１０〜１５％が、カバノキ花粉アレルギーを患っている可能性があることが推測されている。さらに、対象が花粉にさらされない場合であっても、他のアレルゲン、例えば、リンゴアレルゲンが、アレルギー性反応を引き起こすカバノキ花粉に特異的なＩｇＥと交差反応する。
【００２９】
Ｂｅｔ  ｖ  １とは、カバノキ花粉の主要なアレルゲンであり、カバノキ花粉アレルギー性対象のうちの９５％超におけるＩｇＥ結合の一因である。Ｂｅｔ  ｖ  １とは、分子量が１７ｋＤのタンパク質である。野生型Ｂｅｔ  ｖ  １のアミノ酸配列を、配列番号４に示す。ＷＨＯのアレルゲンについてのウェブサイト（ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇ）は、Ｂｅｔ  ｖ  １の３６のアイソフォームを列挙しており、その配列は図３で対比されている。アラインメントは、Ｂｅｔ  ｖ  １が、高度に保存的であることを示す。本発明において野生型Ｂｅｔ  ｖ  １として用いられるアイソフォームは、アイソフォームＢｅｔ  ｖ  １ａ（Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１）であるが、これらのイソアレルゲンのうちの何れか１つを用いて、本発明による低刺激性変異体を提供することができる。野生型配列（配列番号４）は、全てのＢｅｔ  ｖ  １アイソフォーム配列を含むことを意図している。
【００３０】
合計３６のＢｅｔ  ｖ  １アイソフォームのアミノ酸配列は、それぞれ、配列表で以下の通りに開示される：１．０１０１（配列番号４）、１．０１０２（配列番号５）、１．０１０３（配列番号６）、１．２５０１（配列番号７）、１．１５０１（配列番号８）、１．１５０２（配列番号９）、１．２８０１（配列番号１０）、１．３００１（配列番号１１）、１．２９０１（配列番号１２）、１．２３０１（配列番号１３）、１．０５０１（配列番号１４）、１．０６０１（配列番号１５）、１．０６０２（配列番号１６）、１．０８０１（配列番号１７）、１．１７０１（配列番号１８）、１．０４０１（配列番号１９）、１．０４０２  ０８０１（配列番号２０）、１．０７０１  ０８０１（配列番号２１）、１．１００１  ０８０１（配列番号２２）、１．２４０１  ０８０１（配列番号２３）、１．２６０１  ０８０１（配列番号２４）、１．２７０１  ０８０１（配列番号２５）、１．２２０１  ０８０１（配列番号２６）、１．０２０１  ０８０１（配列番号２７）、１．０９０１  ０８０１（配列番号２８）、１．０３０１  ０８０１（配列番号２９）、１．１４０１  ０８０１（配列番号３０）、１．１４０２  ０８０１（配列番号３１）、１．１９０１  ０８０１（配列番号３２）、１．２００１  ０８０１（配列番号３３）、１．１８０１  ０８０１（配列番号３４）、１．１１０１  ０８０１（配列番号３５）、１．１２０１  ０８０１（配列番号３６）、１．１６０１  ０８０１（配列番号３７）、１．２１０１  ０８０１（配列番号３８）、および１．１３０１  ０８０１（配列番号３９）。
【００３１】
Ｂｅｔ  ｖ  １のアイソフォームは、異なるアレルゲン誘発の可能性を有する変異体を包含する。Ｂｅｔ  ｖ  １のアイソフォームは、配列番号４のＢｅｔ  ｖ  １野生型アミノ酸配列と少なくとも９４％同一である。例えば、Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１に対するアミノ酸残基同一性が９６％のアイソフォームであるＢｅｔ  ｖ  １．０４０１と、残基同一性が９４％のＢｅｔ  ｖ  １．１００１は、それらがメディエーター放出の微弱な誘導剤であるために、天然の低刺激性アレルゲンとして同定されている。
【００３２】
本発明は、Ｂｅｔ  ｖ  １の突然変異させた低刺激性変異体であって、それを必要とする対象を免疫化し、これにより、カバノキ花粉に対するアレルギーを防止および／または緩和し、カバノキ花粉に対するアレルギーを患う対象を脱感作するためのワクチンとして有用な低刺激性ポリペプチド変異体を提供する。本発明による組換えカバノキ花粉Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｅ１０１、Ｋ１３７、Ｓ９９、Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ１１７、Ｋ１１９、Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｅ１４１、およびＲ１４５からなる群から選択される位置における、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように野生型アミノ酸配列を突然変異させる。本発明によるポリペプチドは低刺激性であり、突然変異させていないＢｅｔ  ｖ  １野生型のヒスタミン放出能と比較して少なくとも２０分の１、好ましくは１００分の１に低減されたヒスタミン放出能を呈示する。
【００３３】
本発明による低刺激性ポリペプチドは、アレルギー、とりわけ、カバノキ花粉アレルギーに対するワクチンとして有用である。本発明によるポリペプチドを含むワクチンは、当業者に知られている標準的な製薬手順により調合される。本発明によるワクチンは、とりわけ、舌下投与に適する。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、本発明の少なくとも１つの組換え低刺激性Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドと、少なくとも１つの医薬として許容可能な希釈剤またはアジュバント、例えば、生理食塩液、緩衝液、水酸化アルミニウムなどとを含む。
【００３４】
本発明による低刺激性変異体は、いくつかの（１〜５）特異的なアミノ酸残基、例えば、かさ高い側鎖がＢｅｔ  ｖ  １のエピトープ表面に位置する残基を突然変異させることにより得られる。選択されたアミノ酸残基は、それらの側鎖が溶媒の方へと外側を向く残基である。このような残基を突然変異させることによりアレルゲンの基本的な三次元構造に最小限の変化を引き起こす。しかし、好ましくは、変異体の全体的構造が野生型アレルゲンの全体的構造と依然として酷似している一方で、突然変異誘発により、エピトープの表面が、マスト細胞表面におけるＩｇＥ抗体の結合および架橋形成が防止されるかまたは強く低減される程度まで修飾される。このような突然変異は、野生型アレルゲンと突然変異させた変異体アレルゲンの両方に結合する能力を有するＩｇＧおよび他の防御的抗体の誘導に好適である。突然変異の効果は、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の、修飾Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンに対するアフィニティーの低下として決定される。好ましくは、突然変異は、特異的ＩｇＥ抗体のアフィニティーを、少なくとも１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１、より好ましくは２０から１００分の１、最も好ましくは１００分の１未満に減少させる。結果として得られる修飾Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンは、アレルギー性患者におけるカバノキ花粉に対する忍容性を惹起するのに用いることができる。
【００３５】
アレルゲン特異的脱感作において有用な、本発明による低刺激性変異体ポリペプチドは、２つの特徴：１）ＩｇＥを介する反応を強く低減する能力；および２）野生型３Ｄフォールディングの保持であり、したがって、ｗｔアレルゲンに結合することが可能なＩｇＧ抗体の産生を誘導する能力を保有する。
【００３６】
ＩｇＥ結合エピトープの構造についての知識があれば、低刺激性変異体のデザインが大幅に簡略化されるであろう。しかし、ＩｇＥ抗体と共に複合体化したＢｅｔ  ｖ  １の構造は、残念ながら入手可能でない。また、エピトープ走査におけるペプチドの使用も信頼できるものではなく、実際に有用なのは直鎖状エピトープを走査する場合に限られる（Ｎｉｅｍｉら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２００７（１５）：１４１３〜２１）。単一のペプチドの立体配座のほか、物理的特性、例えば、可溶性は、天然のタンパク質構造の一部を形成するポリペプチド鎖の対応する部分の場合とは顕著に異なりうる。したがって、突然変異体Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンのデザインは、突然変異体を調製し、これを調べることにより、エピトープの構造を解明し、潜在的なヒットについて調べるのに分子グラフィックスプログラム、例えば、ＰｙＭＯＬを用いる、分子表面解析に基づいた。
【００３７】
Ｂｅｔ  ｖ  １（タンパク質データバンクコード：１ＢＶ１）の結晶構造を用いて、Ｂｅｔ  ｖ  １の四次構造を規定した。ＰＤＢｅＰＩＳＡのインターネットサーバーを、Ｂｅｔ  ｖ  １の対称性の二量体のための座標を創出するのに用いた。マスト細胞表面上のクラスター内のＩｇＥ抗体間の距離は、約５ｎｍであることが推測されている（Ｋｎｏｌ，ＥＦ；Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．５０（２００６）：６２０）。Ｂｅｔ  ｖ  １の分子表面上では、対称軸から２．５ｎｍ以内の距離にある２回対称軸周囲のＢｅｔ  ｖ  １二量体の分子表面を研究することにより、２つの推定エピトープ（図１および図２）が同定された。
【００３８】
推定エピトープ１が、アミノ酸残基Ｖ２〜Ｅ６；Ｒ７０〜Ｄ７５；Ｎ７８〜Ｓ８４；Ｅ９６〜Ｋ１０３；およびＫ１１５〜Ｈ１２１からなるのに対し、推定エピトープ２は、アミノ酸残基Ｆ３〜Ｖ１２；Ａ１３０〜Ｌ１５２；およびＴ１０７〜Ｄ１０９からなる。
【００３９】
突然変異点として使用できるアミノ酸残基を同定するために、これらの推定エピトープを注意深く解析した。好ましい突然変異点は、アレルゲンのＩｇＥ抗体への結合を減少させるが、野生型アレルゲンの三次元構造をやはり維持する能力を有するものとする。第１の推定エピトープは、アミノ酸残基Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｅ１０１、Ｓ１１７、およびＫ１１９を包含する。第２の推定エピトープは、残基Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｋ１３７、Ｅ１４１、およびＲ１４５を包含する。残基Ｓ９９、Ｅ１０１ＫおよびＫ１３７は、それらが、２つの推定エピトープの中央部に位置するので、最も興味深い突然変異点と考えられた。
【００４０】
これらの３つの残基は、Ｂｅｔ  ｖ  １の３６のアイソフォーム全てにおいて高度に保存的であり、残基９９において唯一の変異があり、セリン（２４のアイソフォームにおける）、またはシステイン（１２のアイソフォームにおける）として存在する。図３において示される通り、残基８０、８４、１１９、１４１、および１４５が保存的であるのに対し、残基８２、１１７、７、９、１３３はわずかに変異する。
【００４１】
次のステップは、各残基に適切な突然変異を選択することであった。例として述べると、Ｓ９９（エピトープ１における）は、小型で親水性および中性のアミノ酸残基である。したがって、ＩｇＥの結合に干渉する突然変異となれば、「反対の」性質、すなわち、大型でかつ／または帯電した残基のもの、例えば、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐへの突然変異となるであろう。同様に、エピトープ１におけるＥ１０１も、反対の電荷を伴う残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）または疎水性残基（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕ）で置きかえることができる。第２の例として述べると、Ｋ１３７の側鎖（エピトープ２における）は、長く、可撓性であり、正に帯電している。小型の残基への突然変異であれば、自由空間により抗体への結合を防止しないために、おそらく役に立たないであろう。したがって、Ｋ１３７は、負に帯電した残基であるＡｓｐ、Ｇｌｕで、または非可撓性で大型の残基、例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、もしくはＭｅｔで置換されることになろう。
【００４２】
したがって、残基Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｅ１０１、Ｓ１１７、およびＫ１１９ならびに残基Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｅ１４１、およびＲ１４５のそれぞれにおける置換をデザインしうるであろう。表１は、本発明によるＢｅｔ  ｖ１低刺激性突然変異体をもたらす潜在的な置換を列挙する。
【表１】
2014514312.tif 000002
【００４３】
本発明の好ましい態様では、本発明のポリペプチドが、配列番号４１〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそのアイソフォームを含む。好ましくは、本発明のポリペプチドが、配列番号４１〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそのアイソフォームを有する。
【００４４】
さらに好ましい態様では、ポリペプチドが、アミノ酸１０１がＫである配列番号４１、アミノ酸１３７がＫである配列番号４２、アミノ酸９９がＫである配列番号４３、アミノ酸８０がＹである配列番号４４、アミノ酸８２がＫである配列番号４５、アミノ酸８４がＫである配列番号４６、アミノ酸１１７がＫである配列番号４７、アミノ酸１１９がＥである配列番号４８、アミノ酸７がＥである配列番号４９、アミノ酸９がＥである配列番号５０、アミノ酸１３３がＹである配列番号５１、アミノ酸１４１がＫである配列番号５２、およびアミノ酸１４５がＹである配列番号５３、またはそのアイソフォームからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、ポリペプチドが、それぞれ、上述の置換を伴うこれらのアミノ酸配列である配列番号４１〜５３のうちの何れか１つ、またはそのアイソフォームを有する。配列番号４１は、Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列であって、１０１位におけるアミノ酸が置換されており、野生型アミノ酸ＥではないＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド配列を開示している。同様に、配列番号４２〜５３は、Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドであって、１３７、９９、８０、８２、８４、１１７、１１９、７、９、１３３、１４１、および１４５位におけるアミノ酸が、それぞれ、置換されており、野生型のアミノ酸ではないＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドを示す。
【００４５】
本発明のさらに好ましい態様では、Ｂｅｔ  ｖ  １の置換が、少なくとも、Ｅ１０１およびＫ１３７、Ｅ１０１およびＳ９９、Ｅ１０１およびＫ８０、Ｅ１０１およびＮ８２、Ｅ１０１およびＳ８４、Ｅ１０１およびＳ１１７、Ｅ１０１およびＫ１１９、Ｅ１０１およびＴ７、Ｅ１０１およびＴ９、Ｅ１０１およびＶ１３３、Ｅ１０１およびＥ１４１、Ｅ１０１およびＲ１４５、Ｋ１３７およびＳ９９、Ｋ１３７およびＫ８０、Ｋ１３７およびＮ８２、Ｋ１３７およびＳ８４、Ｋ１３７およびＳ１１７、Ｋ１３７およびＫ１１９、Ｋ１３７およびＴ７、Ｋ１３７およびＴ９、Ｋ１３７およびＶ１３３、Ｋ１３７およびＥ１４１、Ｋ１３７およびＲ１４５、Ｓ９９およびＫ８０、Ｓ９９およびＮ８２、Ｓ９９およびＳ８４、Ｓ９９およびＳ１１７、Ｓ９９およびＫ１１９、Ｓ９９およびＴ７、Ｓ９９およびＴ９、Ｓ９９およびＶ１３３、Ｓ９９およびＥ１４１、Ｓ９９およびＲ１４５位にある。
【００４６】
本発明の好ましい一態様では、併せて少なくとも２、３、または４つのアミノ酸置換が存在する。好ましくは、本発明のポリペプチドが、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の置換を有する。より好ましくは、ポリペプチドが、２、３、または４つの置換を有する。本発明の利点の１つは、少数の（少なくとも２つの）置換だけが、所望の効果に必要とされることである。
【００４７】
本発明による修飾Ｂｅｔ  ｖ  １低刺激性アレルゲンは、ワクチンとして有用である。従来のアレルギー用ワクチン接種は、典型的に、長期間、例えば、１年から２年にわたる複数回の皮下免疫化として実行する。アナフィラキシー反応の危険性を最小化するために、免疫化スキームを初期の用量増加相および維持相の２相で適用する。用量増加相は、微量で開始し、次いで、典型的には、維持用量に達するまで１６週間にわたりゆっくりと増加させる。維持相は、典型的に、６週目ごとの注射を含む。このようなワクチン接種のレジメは、患者にとって退屈であり、長期にわたる拘束が要請される。さらにこのようなワクチン接種のレジメは、安全性および再現性の点で、ワクチンの安定した品質に対して大きな影響を及ぼす。患者は、各注射後に、厳密にモニタリングされ、しばしば、入院することが必要である。
【００４８】
本発明による低刺激性アレルゲンのヒスタミン放出能は実質的に低減されるので、用量増加相は、従来のアレルギー用ワクチン接種の用量増加相よりかなり短いか、または、最良の場合、用量増加スキームは必要とされない可能性があるだろう。本発明による修飾組換え低刺激性アレルゲンは、バッチ間のばらつきを少しも示さない。したがって、用量応答および起こり得る副作用についての緊密なモニタリングは必要とされない。
【００４９】
本発明は、カバノキ花粉アレルギーに対してワクチン接種する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の少なくとも１つの低刺激性ポリペプチドと、少なくとも１つの医薬として許容可能なアジュバントとを含む組成物を投与することを含む方法にさらに関する。低刺激性ポリペプチドのワクチン接種スケジュールおよび量であって、カバノキ花粉に対する防御的抗体の産生を誘導するのに有効なワクチン接種スケジュールおよび量が用いられる。
【００５０】
ワクチン接種の「対象」は、ヒト（成人、小児、または青年）または動物である。好ましくは、動物は、任意の家畜動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタである。「それを必要とする対象」とは、カバノキ花粉アレルギーを患うヒトまたは動物を意味する。
【００５１】
例えば、本発明による低刺激性アレルゲンは、従来のワクチン処方物、例えば、当技術分野でよく知られた方法を用いる水酸化アルミニウム吸着ワクチンとして調合される（Ｎｉｅｄｅｒｂｅｒｇｅｒら、ＰＮＡＳ、１０１（２）：１４６７７〜８２、２００４年）。しかし、本発明による低刺激性アレルゲンは、当技術分野で知られた方法および処方物を用いて、他の適切なワクチン接種の経路およびスキーム、例えば、口腔粘膜または舌下投与により投与されうる。例えば、欧州特許公開ＥＰ１８１２０５９を参照されたい。
【００５２】
修飾Ｂｅｔ  ｖ  １低刺激性アレルゲンであれば、例えば、０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌの濃度で用いうるであろう。例示的な用量は、アレルギーの重症度、患者の年齢、および治療履歴に応じて、可能な用量増加相において０．０５μｇ〜２μｇ、維持相において３〜１５μｇ、好ましくは５〜１５μｇ、最も好ましくは約１０μｇで変化させることができる。適切な用量は、アレルギーの処置および防止に精通した医師により容易に決定される。
【００５３】
国際特許公開ＷＯ０４／０４７７９４は、アレルギーワクチンを舌下投与するための固体の急速分散剤形を開示しており、米国特許出願第２００９／０２９７５６４号は、口腔粘膜投与するための液体のワクチン処方物を開示している。
【００５４】
本発明による修飾Ｂｅｔ  ｖ  １低刺激性アレルゲンは、舌下用ドロップを用いて舌下投与するのにも適切である。この目的で、低刺激性ポリペプチドが生理食塩液中に提供される。ポリペプチドを投与するのに安全かつ有効な用量範囲のほか、所望の免疫応答を誘発することが可能な投与レジメは、当技術分野で知られた方法およびスキームを用いる、本発明によるワクチン候補物質の臨床開発において決定される。
【００５５】
本発明による低刺激性アレルゲンの単回の最大耐量は、増加する舌下投与量に曝露されるアレルギー性の男性および女性対象における研究で決定される。あらかじめ規定された用量の最大耐量に達したら、研究を、毎日の投与を伴う用量決定研究であって、用量レベルの変化が２から４倍である研究へと適合させる。初期用量は、１０〜１００μｇの範囲であり、研究は、最大２０ｍｇでありうる舌下最大耐量をもたらす。
【００５６】
その後、毎日または毎週投与される広範な用量範囲にわたり、用量漸増研究および用量決定研究を行う。ワクチン接種用量範囲の安全性については、複数回の投与を行う前に、皮膚プリックテストで予備的に調べる。これらの研究は、第１に、免疫学的パラメーターをもたらし、第２に、カバノキ花粉による感作後における最終的な有効性をもたらす。
【００５７】
本発明による低刺激性ポリペプチドワクチンは、ＴＨ２型からＴＨ１型へのシフトとして検出可能なＴ細胞応答を誘発するものとする。ＩｇＧ抗体の産生は、アレルゲン誘発性感作試験を開始する前に実証可能であるものとする。
【００５８】
最後に、アレルギー性患者における研究を、３〜６カ月間にわたり多数回の舌下投与に曝露されるアレルギー性男性および女性対象における二重盲検無作為化プラセボ対照脱感作研究として、最初の１２カ月間追跡を伴って実施する。対象は、研究を開始する前のほか、その後６カ月ごとに、二重盲検式でアレルゲンにより感作される。
【００５９】
研究は、天然のアレルゲンへと感作されるときの、プラセボを施される群と、本発明による低刺激性アレルゲンワクチンを施される群の間で、統計学的および臨床的な有意差を示すことになる。
【００６０】
［実施例］
以下の例は、本発明の態様をさらに例示するために示されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者には、技法が高度になるにつれて、発明の概念を多様な形で実施しうることが明らかであろう。したがって、本発明およびその態様は、本明細書で記載される例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変化しうるものである。
【００６１】
例１Ｂｅｔ  ｖ  １突然変異のデザイン
低刺激性アレルゲンのデザインにおける目標は、マスト細胞表面におけるＩｇＥ−抗体に結合し、これを架橋する能力が強く低減されるが、野生型アレルゲンと酷似する構造を依然として維持する突然変異体アレルゲンを達成することである。これは、野生型アレルゲンと突然変異体アレルゲンの両方に結合する能力を有するＩｇＧおよび他の抗体の誘導に好適であろう。
【００６２】
ＩｇＥ結合エピトープについての知識があれば、デザインが大幅に簡略化されるであろう。しかし、ＩｇＥ抗体と共に複合体化したＢｅｔ  ｖ  １の構造は、入手可能でない。また、エピトープ走査におけるペプチドの使用も信頼できるものではない（Ｎｉｅｍｉら、２００７）。エピトープについて示唆する唯一の方法は、突然変異体を調製することにより、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルゲンの分子表面を研究し可能なヒットを調べることである。第１に、本発明者らは、Ｂｅｔ  ｖ  １の分子表面上において推定エピトープを同定した（図１および図２）。第２に、本発明者らは、これらの推定エピトープ上において、突然変異させると、野生型アレルゲンと類似する三次元構造を維持するが、それにもかかわらずＩｇＥ抗体への結合を減少させる能力を依然として有する残基を選択した。第１の推定エピトープには、アミノ酸残基Ｋ８０、Ｎ８２、Ｓ８４、Ｓ９９、Ｅ１０１、Ｓ１１７、およびＫ１１９が含まれる。第２の推定エピトープは、残基Ｔ７、Ｔ９、Ｖ１３３、Ｋ１３７、Ｅ１４１、およびＲ１４５を包含する。
【００６３】
第３のステップは、各残基について突然変異を選択することである。例として、Ｓ９９（エピトープ１における）は、小型で親水性および中性の残基である。したがって、ＩｇＥの結合に干渉する突然変異となれば、「反対の」性質、大型でかつ／または帯電した、例えば、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐとなるであろう。エピトープ１におけるＥ１０１Ｋの場合なら、ＩｇＥの結合に干渉する突然変異が、反対の電荷を伴う残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を用いること、または疎水性残基（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）を用いることを包含しうるであろう。第２の例として述べると、Ｋ１３７の側鎖（エピトープ２における）は、長く、可撓性であり、正に帯電している。小型の残基への突然変異であれば、自由空間により抗体への結合を防止しないために、おそらく役に立たないであろう。したがって、Ｋ１３７は、負に帯電した残基であるＡｓｐ、Ｇｌｕで、または非可撓性で大型の残基、例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＭｅｔで置換されることになろう。
【００６４】
例２  組換えＢｅｔ  ｖ  １分子のクローニング
組換えＢｅｔ  ｖ  １分子（ｒＢｅｔ  ｖ  １）の野生型および突然変異体を作製するために、これらの特定のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、細菌性の発現プラスミドへとクローニングした（図４）。まず、例１でデザインされたｒＢｅｔ  ｖ  １のｃＤＮＡであって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによる、ベクターｐＵＣ５７における産生（ｗｔ、Ｓ９９Ｙ、Ｅ１０１Ｋ、およびＫ１３７Ｙ）のためのコドン最適化を伴うｃＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＵＳＡ）へ注文した。ｃＤＮＡは、５’端におけるＮｃｏＩ制限部位および３’端におけるＨｉｎｄＩＩＩを含有した。ｃＤＮＡを、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、Ｅｒｖｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌＢ）のシグナル配列をコードする細菌性の発現ベクターであるｐＫＫｔａｃ（Ｔａｋｋｉｎｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（４）：８３７〜８４１、１９９１）へとクローニングし、発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉのＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株へと形質転換した。ｒＢｅｔ  ｖ  １およびその突然変異体のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ  ３１００；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により検証し、本明細書ではこれを配列番号１〜３および配列番号４０（配列番号１  野生型Ｂｅｔ  ｖ  １；配列番号２  Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙ突然変異体；配列番号３  Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｋ１３７Ｙ突然変異体；配列番号４０  Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｅ１０１Ｋ突然変異体）として示す。
【００６５】
例３  組換えＢｅｔ  ｖ  １分子の産生
細菌性発現のために、ｒＢｅｔ  ｖ  １およびその突然変異体を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＤＥへと形質転換した。単独のコロニーを、５ｍｌのＬＢ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、および１％のブドウ糖へと接種し、２２０ｒｐｍで振とうしながら、＋３７℃で１６時間培養した。培養物は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを伴う３倍濃度のＴＢ  ３００ｍｌへと１：５０に希釈し、ＯＤ６００が４に達するまで＋３７℃で培養した。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによりタンパク質の発現を誘導し、１７０ｒｐｍで振とうしながら、ＲＴで１６時間細胞を培養した。細胞を、＋４℃、５０００ｇで、１５分間にわたる遠心分離により採取し、細胞のペリプラズム画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２００７（５１）：２１６〜２２６においてＢｏｅｒらにより記載される浸透圧ショック法を介して単離した。９００ｍｌ培養物の細胞ペレット同等物を、３０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０％のスクロース、ｐＨ８．０、および１ｍＭのＥＤＴＡによる３００ｍｌ中に再懸濁させ、氷上における振とう下で２０分間インキュベートした。懸濁液は、４℃、８０００ｇで２０分間にわたり遠心分離した。この後、ペレットを、氷冷させた５ｍＭのＭｇＳＯ４  ７５ｍｌ中で再懸濁させ、氷上において４℃で２０分間振とうし、４℃、８０００ｇで２０分間にわたる遠心分離により浸透圧ショック流体を採取した。
【００６６】
例４  ｒＢｅｔ  ｖ  １分子の精製
ペリプラズム画分に１ＭのＮａＣｌを補充し、これを、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ＭのＮａＣｌと共に、ｐＨ５．０、２ｍｌ／分の流速で、フェニル−セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと投入した。溶出は、７．５％のイソプロパノールを補充した２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．３による直線勾配として実施した。組換えＢｅｔ  ｖ  １Ｅ１０１ＫおよびＫ１３７Ｙポリペプチドを含有する画分をプールし、濃縮し、４６０ｍｍの層高、および流速を０．３ｍｌ／分とする１倍濃度のＰＢＳ緩衝液を伴う２００ｍｌのカラムにおいて、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ６０サイズ除外クロマトグラフィーにかけた。ｒＢｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙ突然変異体の場合は、サイズ除外クロマトグラフィーの前に、さらなるＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーステップが要請された。５０ｍＭのグリシン、ｐＨ３．８中のｒ  Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙは、ＣＭカラムにかけ、直線ＮａＣｌ勾配（５ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ中の５０ｍＭのグリシン、ｐＨ３．８）で溶出させた。
【００６７】
プールされるｒＢｅｔ  ｖ  １画分のタンパク質濃度は、２８０ｎｍで決定された。
【００６８】
例５  質量分析によるｒＢｅｔ  ｖ  １および突然変異体の解析
従来のＥＳＩ供給源（Ａｐｏｌｌｏ−ＩＩＴＭ）を装備した４．７  Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＡＰＥＸ−ＩＩ  ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により、質量分析実験を実施した。未変性型質量スペクトル：１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．９）中３μＭの濃度の脱塩されたアレルゲン試料を、乾燥（２００℃、６ミリバール）および噴霧用ガスとして用いられる乾燥窒素と共に、１．５ｍＬ／分の流速で直接的に注入した。全ての装置パラメーターを、気相における非共有結合的相互作用を維持するように、かつ、ｍ／ｚ２０００〜３０００のイオン透過を最大化するように最適化した。異なる試料間のバイアスを回避するために、同じ装置パラメーターの設定を終始使用した。典型的には、共付加された１２８ｋｗｏｒｄの時間ドメイン過渡信号５００〜１０００を記録し、５１２ｋｗｏｒｄのデータへと処理してから、高速フーリエ変換および大きさの計算を行った。ＥＳ  Ｔｕｎｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）のイオンに関しては、外部から質量較正を行った。変性型スペクトルは、典型的に、アセトニトリル／水／酢酸溶液中で測定した。全てのデータは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＸＭＡＳＳ  ７．０．８ソフトウェアを用いて収集および処理した。図８における未変性型ＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ質量スペクトルは、組換えＢｅｔ  ｖ  １突然変異体であるＥ１０１Ｋが、組換えＢｅｔ  ｖ  １野生型と同様な形でフォールドすることを示す。
【００６９】
例６  競合的ＥＬＩＳＡにより解析される、血清中ＩｇＥの、組換えＢｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙ、およびＥ１０１Ｋポリペプチドへの結合に対する阻害
カバノキ花粉アレルギー性患者のＩｇＥ血清試料（Ｅ３）の、ストレプトアビジンウェル上に固定化されたビオチニル化ｒＢｅｔ  ｖ  １への結合を、ｒＢｅｔ  ｖ  １およびｒＢｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙ、およびＥ１０１Ｋ突然変異体の量を増加させることにより阻害した。まず、市販されるｒＢｅｔ  ｖ  １（野生型；Ｂｉｏｍａｙ）を、製造元のプロトコールによりＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチニル化した。ビオチニル化ｒＢｅｔ  ｖ  １（ウェル１つ当たり０．５μｇ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）ウェル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｇｍｂｈ）へと固定化した後、洗浄ステップおよびＥ３血清の添加を行う（１：６の希釈率）。シェーカー内、ＲＴにおいて２時間のインキュベーションおよび洗浄ステップの後に、異なる量（４、１、０．２５、０．０６２５、０．０１５６、および０．００３９μｇ）のｒＢｅｔ  ｖ  １を添加し、シェーカー内、ＲＴにおいて２時間インキュベートした。洗浄ステップの後に、希釈率１：１０００のＡＦＯＳコンジュゲート抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、シェーカー内、ＲＴにおいて１時間のインキュベーションにより、結合したＩｇＥ分子の検出を実施した。最後に、基質溶液であるｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した（Ｖａｒｉｏｓｃａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００７０】
競合的ＥＬＩＳＡにより解析される、血清中ＩｇＥの、ｒ  Ｂｅｔ  ｖ  １ポリペプチドへの結合結果を図６に示す。ｒＢｅｔ  ｖ  １タンパク質である、ｗｔ、Ｓ９９Ｙ、およびＥ１０１Ｋを、血清中ＩｇＥ  Ｅ３の、固定化されたｒＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ）への結合に対する競合に用いた。何れのｒＢｅｔ  ｖ  １野生型分子（Ｂｉｏｍａｙ製の市販品と本発明者ら独自の生成物）も、ＩｇＥの、固定化されたＢｅｔ  ｖ  １への結合を阻害していた。ｒＢｅｔ  ｖ  １対照と比較したところ、Ｂｅｔ  ｖ  １突然変異体である、Ｓ９９ＹおよびＥ１０１Ｋが、阻害剤のとりわけ低濃度範囲で阻害の低減を示したことから、デザインされたこれらの突然変異が、Ｂｅｔ  ｖ  １のＩｇＥエピトープ領域にあることが示される。
【００７１】
例７  ヒスタミン放出アッセイ
精製組換えＢｅｔ  ｖ１タンパク質（ｗｔ、Ｓ９９Ｙ、およびＫ１３７Ｙ）の生物学的活性を、市販の組換えＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ、Ａｕｓｔｒｉａ）と並行して、ストリッピング処理された好塩基球に対する受動感作法、およびその後のアレルゲン分子による感作を介して解析した。ヒスタミン放出アッセイは、公認のヒスタミン放出アッセイ法を有する、ＲｅｆＬａｂ  ＡｐＳ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋの外注サービスとして行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、好塩基球性の白血球からのヒスタミンの放出の、市販の組換えＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ）、ならびに３つの組換えＢｅｔ  ｖ  １タンパク質であるｗｔ、Ｓ９９Ｙ、およびＫ１３７Ｙによる誘導を測定した。４つのアレルゲンの各々について、濃度範囲２０〜０．０６ｎｇ／ｍｌの用量応答研究としての受動伝達試験において調べた。各濃度を２連で調べた。
【００７２】
アッセイは、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルギー性患者の血清および０．０６〜２０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲における精製アレルゲン（ｘ軸）により、２例のドナーについて実施した。その結果を図７に示す（ドナー１：上パネル）およびドナー２（下パネル）（２連での測定の平均値を示す）。上清へと放出されたヒスタミンの百分率をｙ軸に示す。
【００７３】
３つのＢｅｔ  Ｖ１類似体（タンパク質２、３、および４）は異なり、ｒＢｅｔ  ｖ  １の生物学的活性が基準抽出物と同等であったのに対し、ｒＢｅｔ  ｖ  １  Ｋ１３７ＹおよびｒＢｅｔ  ｖ  １  Ｓ９９Ｙの生物学的活性は、市販の基準組換えＢｅｔ  ｖ  １（Ｂｉｏｍａｙ）と比較して、それぞれ、２０分の１および１００分の１であることを示した。
【００７４】
当業者には、技法が高度になるにつれて、発明の概念を多様な形で実施しうることが明らかであろう。本発明およびその態様は、上記の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変化しうるものである。
【００７５】
例８  皮膚プリックテスト
皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）を、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会による承認後、２例がカバノキ花粉アレルギーと診断され、１例が非アトピー性患者である、３例のボランティア被験者について、組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチドおよび関与性の対照により実施した。組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド調製物の内毒素は、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ：型番２０３４４）により除去し、その後、内毒素含量を、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ：型番Ｌ００３５０Ｃ）により解析した。組換えＢｅｔ  ｖ  １ポリペプチド調製物は、Ｃｏｓｔａｒ  ＳＰＩＮ−Ｘ（型番８１６０）により濾過滅菌し、−２０℃のアリコートで保管した。
【００７６】
ＳＰＴは、５０および５μｇ／ｍｌの濃度で組換えＢｅｔ  ｖ  １ａ  ｗｔ（Ｂｉｏｍａｙ）およびＥ１０１Ｋ突然変異体、ならびに市販のカバノキ花粉抽出物（ＡｌｋＡｂｅｌｌｏ）を用いて実行した。塩化ナトリウム（０．９％）およびヒスタミン二塩酸塩（ＡｌｋＡｂｅｌｌｏ）が、それぞれ、陰性および陽性対照として用いられた。皮膚をプリッキングする前に、ランセット（乱切刃）を、皮膚プリック試薬を含有する試験管内に入れた。１５分後ならびに６および２０時間後に応答を測定した。各被験個体におけるヒスタミン二塩酸塩に対する皮膚応答の直径は、１５分後に５ｍｍであり、この値を陽性（＋）応答として選択した（表２）。濃度が５０μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのＢｅｔ  ｖ  １突然変異体Ｅ１０１Ｋにより誘導される即時的皮膚反応は、同等であった。注目すべきことに、何れのアレルギー性患者の場合も、Ｂｅｔ  ｖ  １  Ｅ１０１Ｋ突然変異体により誘導される皮膚反応は、Ｂｅｔ  ｖ  １  ｗｔと比較して著しく短い時間内で消失した。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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