(57)【要約】  本発明は、ａ）二級アルコールを調製する工程、ｂ）前記二級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて酸化する工程、及びｃ）工程ａ）からの酸化生成物をトランスアミナーゼと接触させる工程を含み、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼが組み換え酵素又は単離酵素である方法、前記方法の実施のためのホールセル触媒及び二級アルコールの酸化のための前記ホールセル触媒の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程
ａ）二級アルコールを調製する工程、
ｂ）前記二級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて酸化する工程、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化生成物をトランスアミナーゼと接触させる工程
を含み、前記ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼが組み換え酵素又は単離酵素である方法。
【請求項２】
前記二級アルコールが、α−ヒドロキシカルボン酸、シクロアルカノール、好ましくはビス（ｐ−ヒドロキシシクロヘキシル）メタン、式Ｒ1−ＣＲ2Ｈ−ＣＲ3Ｈ−ＯＨのアルコール並びにそのエーテル及びポリエーテル及び二級アルカノール、好ましくは２−アルカノールを含む群からのアルコールであり、ここで、Ｒ1は、ヒドロキシ、アルコキシ、水素及びアミンを含む群から選択されており、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチル及びプロピル及び水素を含む群から選択されており、Ｒ3は、アルキル、好ましくはメチル、エチル及びプロピルを含む群から選択されている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記二級アルコールが、
式Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ4
［式中、Ｒ4が−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ5を含む群から選択されており、ｘが少なくとも３であり、Ｒ5がＨ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている］の二級アルコールである請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）が、好ましくは組み換え又は単離されたモノオキシゲナーゼによって、式の相応するアルカンのヒドロキシル化によって行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼが、補因子として少なくとも１の亜鉛原子を有するＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼである請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールデヒドロゲナーゼが、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）（データバンクコードAJ491307.1）のアルコールデヒドロゲナーゼＡ又はその変異体である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記モノオキシゲナーゼが、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のAlkBGT、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）又はヒヨコマメ（Cicer arietinum）からのチトクロムＰ４５０を含む群から選択されている請求項４から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記トランスアミナーゼが、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのVal224に相応するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを含む群から選択されるアミノ酸１つを有し、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのGly230に相応するアミノ酸配列の位置にトレオニン以外のアミノ酸、好ましくはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを含む群からのアミノ酸１つを有することを特徴とするトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されている、又は、前記トランスアミナーゼが、ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）（AEA39183.1）のトランスアミナーゼ、バチラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）（YP001374792.1）のトランスアミナーゼ、パラコッカス・デントリフィカンス（Paracoccus denitrificans）（CP000490.1）のトランスアミナーゼ及びその変異体を含む群から選択されている請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）及び／又は工程ｃ）を、単離又は組み換えアラニンデヒドロゲナーゼ及び無機窒素供給源の存在下で実施する請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、モノオキシゲナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを含む群からの少なくとも１の酵素が組み換えられており、かつ、相応する酵素を有するホールセル触媒の形で供給される、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
全ての酵素が１又はそれより多いホールセル触媒の形で供給され、好ましくは１のホールセル触媒が全ての必要な酵素を有する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）で、好ましくは工程ｂ）及びｃ）で、−１．３８より多い、好ましくは−０．５〜１．２、さらに好ましくは−０．４〜０．４のｌｏｇＰを有する有機補助溶媒が存在する請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
補助溶媒が、不飽和脂肪酸、好ましくはオレイン酸を含む群から選択されている請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記補助溶媒が、式Ｒ6−Ｏ−（ＣＨ2）x−Ｏ−Ｒ7［式中、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ相互に独立してメチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、ｘは１〜４であり、好ましくはＲ6及びＲ7はそれぞれメチルであり、ｘは２である］の化合物である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくは補因子として少なくとも１の亜鉛原子を有するＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、任意にモノオキシゲナーゼ及び任意にアラニンデヒドロゲナーゼを有し、これら酵素が組み換え酵素である、ホールセル触媒。
【請求項１６】
好ましくは式Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ4［式中、Ｒ4が−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ5を含む群から選択されており、ｘが少なくとも３であり、Ｒ5がＨ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている］の二級アルコールである、二級アルコールの酸化及びアミン化のための、請求項１５記載のホールセル触媒の使用。
【請求項１７】
−１．３８より多い、好ましくは−０．５〜１．２、さらに好ましくは−０．４〜０．４のｌｏｇＰを有する有機補助溶媒がさらに存在する請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
前記補助溶媒が、不飽和脂肪酸、好ましくはオレイン酸を含む群から選択されている請求項１７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
ａ）二級アルコールを調製する工程、
ｂ）前記二級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて酸化する工程、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化生成物をトランスアミナーゼと接触させる工程を含み、
前記ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼが組み換え酵素又は単離酵素である方法、前記方法の実施のためのホールセル触媒及び二級アルコールの酸化のための前記ホールセル触媒の使用に関する。
【０００２】
アミンは、化学産業の多数の生成物、例えばエポキシ樹脂、ポリウレタンフォーム、イソシアナート、特にポリアミドのための合成要素として使用されている。ポリアミドは、繰り返しアミド基により特徴付けられているポリマークラスである。「ポリアミド」との概念は、化学的に類似のタンパク質とは異なり、通常は合成され、市販で入手できる熱可塑性プラスチックに関する。ポリアミドは、一級アミン又は二級アミンから誘導され、これらは通常は炭化水素のクラッキングの際に入手される。しかし、誘導体、正確にはアミノカルボン酸、ラクタム及びジアミンも、ポリマー製造に使用されることができる。興味をもたれるのは、さらに、出発材料としての短鎖のガス状アルカンであり、これは再生原料から出発してバイオテクノロジー手法によって獲得できる。
【０００３】
多くの市販で極めて需要のあるポリアミドは、ラクタムから出発して製造される。例えば、「ポリアミド６」は、ε−カプロラクタムの重合により、「ポリアミド１２」は、ラウリンラクタムの重合により得られることができる。更なる市場で興味を持たれる生成物は、ラクタムのコポリマー、例えばε−カプロラクタム及びラウリンラクタムのコポリマーを含む。
【０００４】
慣用の化学−技術的なアミン製造は、化石原料の供給に依存しており、非効率的で、この場合に多量の不所望な副生成物が発生し、大抵の合成段階で８０％までである。そのようなプロセスの一例は、ラウリンラクタムの製造であり、これは慣用的にはブタジエンの三量化により獲得される。三量化生成物であるシクロドデカトリエンは水素化され、ここから生じるシクロドデカンをシクロデカノンに酸化し、これを引き続きヒドロキシルアミンを用いてシクロドデカンオキシンに反応させ、これは最終的にベックマン転位を経てラウリンラクタムに変換される。
【０００５】
これら欠点を考慮して、生体触媒を使用して再生原料からアミンを獲得する方法が開発された。ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７４４７は、化学的に類似の生成物、より正確にはω−アミノカルボン酸を、一連の適した酵素活性を有し、かつ、カルボン酸を相応するω−アミノカルボン酸に変換することができる細胞を使用して製造するための生物学的システムを記載する。しかし、この場合に使用される、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）GP01からのAlkBGT−オキシダーゼシステムの既知の欠点は、これが、脂肪族アルカンから二級アルコールへの選択的酸化を果たすことができないことである。それどころか、多数の酸化生成物が発生し、特に高度に酸化された生成物、例えば相応するアルデヒド、ケトン又は相応するカルボン酸の割合は反応期間の増加と共に高まり（C. Grant, J. M. Woodley and F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486）、このことは所望のアミンの収率を相応して低下させる。
【０００６】
この背景のもとで、本発明の基礎をなす課題は、生体触媒を使用して二級アルコールの酸化及びアミン化のための改善された方法を提供することである。更なる課題は、前記方法をさらに改善して、収率を高める及び／又は副生成物の濃度を低下させることにある。最後に、ポリアミド又は出発材料の製造を再生原料を基礎とする製造のために可能にする方法に対する要求がある。
【０００７】
以上の及び更なる課題は、本出願の主題によって、特に付属する独立請求項の主題によっても解決され、その際、実施態様は従属項から明らかである。
【０００８】
本発明によれば、前記課題は、第１の観点において、
次の工程
ａ）二級アルコールを調製する工程、
ｂ）前記二級アルコールを、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼと接触させて酸化する工程、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化生成物をトランスアミナーゼと接触させる工程
を含み、前記ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼが組み換え酵素又は単離酵素である方法
によって解決される。
【０００９】
第１の観点の第１の実施態様において、二級アルコールは、α−ヒドロキシカルボン酸、シクロアルカノール、好ましくはビス（ｐ−ヒドロキシシクロヘキシル）メタン、式Ｒ1−ＣＲ2Ｈ−ＣＲ3Ｈ−ＯＨのアルコール並びにそのエーテル及びポリエーテル及び二級アルカノール、好ましくは２−アルカノールを含む群からのアルコールであり、ここで、Ｒ1は、ヒドロキシ、アルコキシ、水素及びアミンを含む群から選択されており、Ｒ2は、アルキル、好ましくはメチル、エチル及びプロピル及び水素を含む群から選択されており、Ｒ3は、アルキル、好ましくはメチル、エチル及びプロピルを含む群から選択されている。
【００１０】
第１の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第２の実施態様において、二級アルコールは、
式Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ4
［式中、Ｒ4が−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ5を含む群から選択されており、ｘが少なくとも３であり、Ｒ5がＨ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている］の二級アルコールである。
【００１１】
第１及び第２の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第３の実施態様において、工程ａ）は、好ましくは組み換え又は単離されたモノオキシゲナーゼによって、式の相応するアルカンのヒドロキシル化によって行われる。
【００１２】
第２〜第３の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第４の実施態様において、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼは、補因子として少なくとも１の亜鉛原子を有するＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。
【００１３】
第１〜第４の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第５の実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）（データバンクコードAJ491307.1）のアルコールデヒドロゲナーゼＡ又はその変異体である。
【００１４】
第１〜第５の実施態様の実施態様である、第１の観点の第６の実施態様において、モノオキシゲナーゼが、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のAlkBGT、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）又はヒヨコマメ（Cicer arietinum）からのチトクロムＰ４５０を含む群から選択されている。
【００１５】
第１〜第６の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第７の実施態様において、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのVal224に相応するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを含む群から選択されるアミノ酸１つを有し、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのGly230に相応するアミノ酸配列の位置にトレオニン以外のアミノ酸、好ましくはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを含む群からのアミノ酸１つを有することを特徴とするトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されている、又は、トランスアミナーゼが、ビブリオ・フルビアリス（Vibrio fluvialis）（AEA39183.1）のトランスアミナーゼ、バチラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）（YP001374792.1）のトランスアミナーゼ、パラコッカス・デントリフィカンス（Paracoccus denitrificans）（CP000490.1）のトランスアミナーゼ及びその変異体を含む群から選択されている。
【００１６】
第１〜第７の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第８の実施態様において、工程ｂ）及び／又は工程ｃ）を、単離又は組み換えアラニンデヒドロゲナーゼ及び無機窒素供給源、好ましくはアンモニア又はアンモニウム塩の存在下で実施する。
【００１７】
第１〜第８の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第９の実施態様において、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、モノオキシゲナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを含む群からの少なくとも１の酵素が組み換えられており、かつ、相応する酵素を有するホールセル触媒の形で供給される。
【００１８】
第９の実施態様の実施態様である、第１の観点の第１０の実施態様において、全ての酵素が１又は１より多いホールセル触媒の形で供給され、好ましくは１のホールセル触媒が全ての必要な酵素を有する。
【００１９】
第１〜第１０の実施態様の実施態様でもある、第１の観点の第１１の実施態様において、工程ｂ）で、好ましくは工程ｂ）及びｃ）で、−１．３８より多い、好ましくは−０．５〜１．２、さらに好ましくは−０．４〜０．４のｌｏｇＰを有する有機補助溶媒が存在する。
【００２０】
第１１の実施態様の実施態様である、第１の観点の第１２の実施態様において、補助溶媒が、不飽和脂肪酸、好ましくはオレイン酸を含む群から選択されている。
【００２１】
第１１の実施態様の好ましい実施態様である、第１の観点の第１３の実施態様において、補助溶媒が、式Ｒ6−Ｏ−（ＣＨ2）x−Ｏ−Ｒ7［式中、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ相互に独立してメチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、ｘは１〜４であり、好ましくはＲ6及びＲ7はそれぞれメチルであり、ｘは２である］の化合物である。
【００２２】
本発明によれば、前記課題は、第２の観点において、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくは補因子として少なくとも１の亜鉛原子を有するＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、任意にモノオキシゲナーゼ及び任意にアラニンデヒドロゲナーゼを有し、これら酵素が組み換え酵素であり、前記アルコールデヒドロゲナーゼが好ましくは好ましい基質として二級アルコールを認識する、ホールセル触媒によって解決される。
【００２３】
本発明によれば、前記課題は、第３の観点において、好ましくは式Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ1［式中、Ｒ1が−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ2を含む群から選択されており、ｘが少なくとも３であり、Ｒ2がＨ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている］の、二級アルコールの酸化及びアミン化のための、本発明の第２の観点に応じたホールセル触媒の使用によって解決される。
【００２４】
第１の実施態様の実施態様である、第３の観点の第１の実施態様において、前記使用はさらに、−１．３８より多い、好ましくは−０．５〜１．２、さらに好ましくは−０．４〜０．４のｌｏｇＰを有し、最も好ましくはジメトキシエタンである有機補助溶媒の存在を含む。
【００２５】
第２の実施態様の実施態様である、第３の観点の第２の実施態様において、補助溶媒は、不飽和脂肪酸を含む群から選択され、好ましくはオレイン酸である。
【００２６】
第２〜第３の観点の更なる実施態様は、本発明の第１の観点の全ての実施態様を含む。
【００２７】
本発明の発明者は、二級アルコールの酸化をより少量の副生成物の発生下で実行するために使用できるアルコールデヒドロゲナーゼ群が存在することを意外なことに見出した。本発明者はさらに、アルコールを、生体触媒の使用下で副生成物をさほど発生させないでアミン化できる酵素活性のカスケードが存在し、この場合に還元当量の添加又は排出の必要がないことを意外なことに見出した。本発明者はさらに、ポリアミドを意外なことにホールセル触媒を使用して、かつ再生原料から出発して製造できる方法を意外なことに見出した。本発明の発明者はさらに、二級アルコールのアミン化を事前の酸化後に特に好ましく所定の配列特性によって特徴付けられるトランスアミナーゼ群を用いて実施できることを意外なことに見出した。
【００２８】
本発明の方法は、産業的に関係のある大多数のアルコールに適用できる。考慮されるのは、例えばα−ヒドロキシカルボン酸、好ましくはα−ケトカルボン酸へと酸化できるα−ヒドロキシカルボン酸、すなわち、式ＲS−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＯＯＨのものであり、これは再度アミン化によってタンパク質原アミノ酸、特に必須アミノ酸、例えばメチオニン及びリシンへと変換されることができる。具体例は、ＲSが、Ｈ、メチル、−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、−（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2−（１Ｈ−インドール−３−イル）、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ3、−ＣＨ2−フェニル、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ3を含む群からの置換基である酸を含む。更なる二級アルコールは、２−アルカノール、例えば２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール等を含む。さらに、二級多価アルコール、例えばアルカンジオール、例えばエタンジオール、アルカントリオール、例えばグリセリン及びペンタエリトリトールが考慮される。更なる例は、シクロアルカノール、好ましくはシクロヘキサノール及びビス（ｐ−ヒドロキシシクロヘキシル）メタン、Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ4（式中、Ｒ4は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ5を含む群から選択されており、ｘは少なくとも３であり、Ｒ5は、Ｈ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている）のアルコールを含む。
【００２９】
炭素鎖の長さは、式Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ4のアルコールの場合に可変であり、ｘは少なくとも３である。好ましくは炭素鎖は３より多くのＣ原子を有し、すなわち、ｘ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれより多い。数多くの二級アルコールは市販されており、購入できる形で直接的に使用できる。代わりに、二級アルコールは前もって又はｉｎ  ｓｉｔｕでバイオテクノロジーによって、例えば好適なアルカンオキシダーゼ、好ましくはモノオキシゲナーゼによるアルカンのヒドロキシル化によって生じせしめることができる。先行技術、例えばM. W. Peters et al., 2003は、そのために好適な酵素を教示する。
【００３０】
特に好ましい実施態様において、Ｒ4は、式Ｈ3Ｃ−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ4の二級アルコールの場合に、−ＯＨ及び−ＣＯＯＲ5を含む群から選択されており、ｘは少なくとも１１、Ｒ5は、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを含む群から選択されている。
【００３１】
本発明によれば本方法の工程ｂ）では、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼが二級アルコールの酸化のために使用される。この場合に、例えば、全ての本発明により使用される酵素活性ポリペプチドは、酵素活性ポリペプチドを含む細胞又は全精製工程におけるポリペプチドのその溶解物又は調製物であってよく、粗製溶解物から純粋なポリペプチドまでを含む。当業者には、酵素活性ポリペプチドを好適な細胞において過剰発現及び精製又は単離することができる数多くの方法が、この分野で知られている。そして、ポリペプチドの発現には、全ての当業者に提供可能な発現系、例えばタイプpET又はpGEXのベクターが使用できる。精製にはクロマトグラフィー法が考慮され、例えばタグを備える組み換えタンパク質のアフィニティクロマトグラフィーによる精製が、固定化したリガンド、例えばニッケルイオンをヒスチジンタグの場合に、固定化したグルタチオンを目的タンパク質に融合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの場合に、又は固定化したマルトースをマルトース結合タンパク質を含むタグの場合に使用して、考慮される。
【００３２】
精製される酵素活性ポリペプチドは、溶解した形でも固定化した形でも使用できる。当業者には、ポリペプチドを有機又は無機の固相に共有的に又は非共有的に固定化できる好適な方法、例えばスルフヒドリル−カップリング化学（例えばPierce社のキット）が知られている。
【００３３】
好ましい実施態様において、ホールセル触媒又は発現系として使用される細胞は、原核細胞、好ましくは細菌細胞である。更なる好ましい実施態様において、細胞は哺乳類細胞である。更なる好ましい実施態様において、細胞は低級真核細胞、好ましくは酵母細胞である。例示的な原核細胞は、エシェリキア（Escherichia）、特に大腸菌（Escherichia coli）及びシュードモナス（Pseudomonas）及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）の属の株を含む。例示的な低級真核細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ヤロウィア（Yarrowia）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の属、特にカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerivisiae）の株を含む。
【００３４】
細胞は、１又は１より多くの、本発明により使用される酵素をコードする核酸配列をプラスミド上に有するか、又はそのゲノム中に組み込んで含んでよい。好ましい実施態様において、細胞は、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（好ましくは少なくとも１の亜鉛原子を補因子として有する）、トランスアミナーゼ、モノオキシゲナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを含む群からの少なくとも１の酵素、好ましくは１より多い酵素、最も好ましい場合には全ての酵素をコードする核酸配列を含むプラスミドを含む。
【００３５】
特に好ましい実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、亜鉛含有ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、すなわち、触媒活性酵素であり、これはシステイン基を含む特徴的な配列モチーフによってポリペプチドに対して共有結合している少なくとも１の亜鉛原子を補因子として含む。特に好ましい実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、バチラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（データバンクコードP42328）のアルコールデヒドロゲナーゼ又はその変異体である。
【００３６】
本発明の教示は、本願に記載の生物学的マクロ分子の正確なアミノ酸又は核酸配列の使用下で実施できるだけでなく、１又は複数のアミノ酸又は核酸の欠失、付加又は置換によって得ることが出来るそのようなマクロ分子の変異体の使用下でも実施できる。特に好ましい実施態様において、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」との概念は、以下で同義でかつ交換可能に「ホモログ」との概念が利用されるが、本願で使用される場合には、相応する当初野生型核酸配列又はアミノ酸配列に関して、相同性（本願では同一性と同義に使用される）７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９％又はそれより多いパーセンテージを有する他の核酸配列又はアミノ酸配列を意味し、好ましくは触媒活性中心を形成するアミノ酸又は構造又はフォールディングに必須のアミノ酸以外のアミノ酸が欠失又は置換されており、又は後者のものが単に保存的に置換されており、例えばアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸又はバリンの代わりにロイシンである。先行技術、例えばArthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3rd editionは、２つの配列のホモロジ−の大きさを計算するために使用されることができるアルゴリズムを記載する。本発明の更なる好ましい実施態様において、アミノ酸又は核酸配列の変異体は、好ましくは上述の配列ホモロジ−の他に、野生型分子又は当初分子と実質同一の酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとして酵素活性のあるポリペプチドの変異体は、ポリペプチド酵素と同一又は実質同一のタンパク質加水分解活性を有し、すなわち、ペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有する。特に好ましい実施態様において、「実質同一の酵素活性」との概念は、野生型ポリペプチドの基質に関して、バックグラウンド活性を遙かに超える及び／又は３未満、好ましくは２未満、さらに好ましくは１未満のオーダーで、野生型ポリペプチドが同一基質に関して有するＫm及び／又はｋcat値と異なる活性を意味する。更なる好ましい実施態様において、核酸又はアミノ酸配列の「変異体」との概念は、核酸又はアミノ酸配列の少なくとも１の活性のある部分及び／又は断片を含む。更なる好ましい実施態様において、「活性のある部分」との概念は、本願で使用する場合に、全長よりもより少ないアミノ酸配列を有するか又は全長よりも少ないアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列又は核酸配列を意味し、ここで野生型アミノ酸配列よりもより少ない長さを有するアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、野生型ポリペプチド又はその変異体、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ又はトランスアミナーゼが有するのと実質同一の酵素活性を有する。特別な実施態様において、核酸の「変異体」との概念は、その相補鎖が好ましくはストリンジェントな条件下で野生型核酸に結合する核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者が容易に測定可能であり、一般にプローブの長さ、洗浄の際の温度及び塩濃度に依存する。一般に、より長いプローブはハイブリダイゼーションにより高温を必要とし、それに対して、より短いプローブはより低温で十分である。ハイブリダイゼーションが発生するかどうかは一般に変性したＤＮＡが、その周囲に��在する相補ストランドに、すなわち、溶融温度未満で、アニーリングする能力に依存する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシー及び相応する条件はAusubel et al. 1995に詳細に記載されている。好ましい実施態様において、核酸の「変異体」との概念は、本願で使用する場合に、遺伝子暗号の縮重の範囲において当初核酸又はこのアミノ酸配列の変異体と同一のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を含む。
【００３７】
アルコールデヒドロゲナーゼは、数十年来、生化学において、醸造技術発酵プロセスの関連において重く考慮され、かつバイオテクノロジー的に高い関連性のある酵素クラスであり、これは種々の群のアイソフォームを含む。そして、膜結合した、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）GP01 Alk-Jタイプのフラビン依存性アルコールデヒドロゲナーゼが存在し、これはＮＡＤ+の代わりにフラボ補因子を使用する。更なる群は、鉄含有の、酸素に対して敏感なアルコールデヒドロゲナーゼを含み、これは細菌において、そして不活性な形で酵母において見出される。他の群は、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、特に亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼを含み、この酵素では活性中心が、アルコール基質を固定するシステイン配位した亜鉛原子を有する。好ましい実施態様において、「アルコールデヒドロゲナーゼ」との概念には、本願で使用する場合に、アルデヒド又はケトンを相応する一級又は二級アルコールに酸化する酵素が理解される。好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼは、本発明の方法において、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、すなわち、ＮＡＤ+を補因子としてアルコール又はＮＡＤＨの酸化のために相応するアルデヒド又はケトンを還元のために使用するアルコールデヒドロゲナーゼである。好ましい実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ+依存性の、亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼである。好適なＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼの例は、からのアルコールデヒドロゲナーゼを含む。一実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）からのアルコールデヒドロゲナーゼＡ（データバンクコードAJ491307.1）であるアルコールデヒドロゲナーゼ又はその変異体を含む。更なる例は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）(ACB78191.1)、ラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）(YP_795183.1)、ラクトバチラス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）(ACF95832.1 )であってウマの肝臓由来のもの、パラコッカス・パントトロフォス（Paracoccus pantotrophus）(ACB78182.1 )及びスフィンゴビウム・ヤノイクヤエ（Sphingobium yanoikuyae）(EU427523.1)のアルコールデヒドロゲナーゼ並びにそのそれぞれの変異体を含む。好ましい実施態様において、「ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ」との概念は、本願で使用する場合、ＮＡＤ+及び／又はＮＡＤＰ+依存性であるアルコールデヒドロゲナーゼを指す。
【００３８】
本発明によれば、工程ｃ）においてトランスアミナーゼが使用される。好ましい実施態様において、「トランスアミナーゼ」との概念は、本願で使用する場合に、ドナー、好ましくはアミノ酸からのα−アミノ基を、アクセプター分子、好ましくはα−ケトカルボン酸へ移行することを触媒作用する酵素が理解される。好ましい実施態様において、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのVal224に相応するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを含む群から選択されるアミノ酸を有し、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのGly230に相応するアミノ酸の位置に、トレオニン以外のアミノ酸、好ましくはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを含む群からのアミノ酸を有することを特徴とするトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されている。特に好ましい実施態様において、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）DSM30191からのω−トランスアミナーゼ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）W619からの、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginosa）PA01、ストレプトマイセス・コエリコラー（Streptomyces coelicolor）A3(2)及びストレプトマイセス・アベルミティス（Streptomyces avermitilis）MA 4680からのトランスアミナーゼを含む群から選択されているトランスアミナーゼである。
【００３９】
好ましい実施態様において、「クロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472のトランスアミナーゼからのアミノ酸配列の位置Ｘに相応する位置」との概念とは、本願で使用する場合に、相応する位置が検査される分子のアラインメントの際に、クロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472のトランスアミナーゼからのアミノ酸配列の位置Xに対してホモログに見えることを意味する。当業者には、数多くのソフトウェアパケット及びアルゴリズムが知られており、それを用いてアミノ酸配列のアラインメントが作成可能である。例示的なソフトウェアパケットプロセスは、EMBLにより提供されたパケットClustalWを含み、又は、Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 3rd editionに説明及び記載されている。
【００４０】
本発明で使用される酵素は、好ましくは組み換え酵素である。好ましい実施態様において、「組み換え」との概念は、本願で使用する場合に、相応する核酸分子が天然で発生しない及び／又は遺伝子工学的手法の使用下で製造されていることが理解される。好ましい実施態様において、組み換えタンパク質とは、相応するポリペプチドが組み換え核酸によりコードされている場合をいう。好ましい実施態様において、組み換え細胞とは、本願で使用する場合に、少なくとも１の組み換え核酸又は組み換えポリペプチドを有する細胞が理解される。当業者には、組み換え分子又は細胞の製造に適した方法が知られており、例えばSambrook et al., 1989に記載されている。
【００４１】
本発明の教示は、単離酵素の使用下でもホールセル触媒の使用下でも実施可能である。好ましい実施態様において、「ホールセル触媒」との概念には、本願で使用する場合に、所望される酵素活性を供給する、完全な、生存できる、代謝活性のある細胞が理解される。ホールセル触媒は、代謝すべき基質、本発明の場合にはアルコール又はそこから発生する酸化生成物を、細胞質酵素によってこれらを代謝する細胞内へ輸送することができるか、又は、興味をもたれる酵素を、媒体中の基質に対して直接的に暴露するその表面に提示できる。当業者には数多くのホールセル触媒製造システムが知られており、例えばDE 60216245から知られている。
【００４２】
一連の適用には、単離した酵素の使用が推奨される。好ましい実施態様において、「単離された」との概念は、本願で使用する場合に、酵素がその天然の供給源に比較してより純粋な及び／又はより濃縮した形で存在することを意味する。好ましい実施態様において、酵素がポリペプチド酵素であり、相応する調製物の６０、７０、８０、９０又は好ましくは９５％超の質量タンパク質割合を構成する場合に、酵素は単離されたことになる。当業者には、溶液中でタンパク質の質量を測定するための数多くの方法が知られており、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの相応するタンパク質バンドの厚さに基づいた視覚的評価、ＮＭＲ分光法又は質量分析方法である。
【００４３】
酵素触媒された本発明の方法の反応は、典型的には溶媒又は高い水割合を有する溶媒混合物中で、好ましくは酵素活性と適合性のｐＨ値の調節のための好適な緩衝系の存在下で、実施される。しかし、疎水性出発材料の場合に、特に３個より多い炭素原子を有する炭素鎖を備えるアルコールでは、酵素と基質との接触を媒介できる有機補助溶媒の追加の存在が好ましい。１又はそれより多くの補助溶媒は、溶媒混合物に対する総割合が９５、９０、８５，８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０又は５体積パーセント又はそれより少なく存在する。
【００４４】
補助溶媒の疎水性はこの場合に重要である。これは、ｎ−オクタノール−水−分布係数の常用対数のｌｏｇＰによって表される。好ましい補助溶媒は、−１．３８より多い、好ましくは−１〜＋２、さらに好ましくは−０．８〜１．５又は−０．５〜０．５又は−０．４〜０．４又は−０．３〜０．３又は−０．２５〜−０．１のｌｏｇＰを有する。
【００４５】
ｎ−オクタノール−水−分布係数Ｋow又はＰは、無次元の分布係数であり、１−オクタノール及び水からの二相系における１の物質の濃度比である（J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997参照）。より正確に言えば、Ｋow又はＰは、オクタノールリッチな相中の物質濃度の、水リッチな相中のその濃度に対する比を指す。
【００４６】
Ｋow値は、物質の親油性（脂肪溶解性）と親水性（水溶性）との比のためのモデル基準である。オクタノール−水系中の物質の分布係数を用いて、水相を有する別の系中のこの物質の分布係数をも見積もることができるとの期待がある。Ｋowは、物質が脂肪類似溶媒、例えばｎ−オクタノール中でより良好に溶解する場合に１より大きく、水中により良好に溶解する場合に１より小さい。相応して、ＬｏｇＰは、親油性物質に対して正であり、親水性物質に対して負である。全ての化学物質に対してＫowを測定できないので、種々のモデルが予想のために存在し、例えば、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）によって又は自由エネルギー直線関係（ＬＦＥＲ）によってであり、例えばEugene Kellogg G, Abraham DJ: Hydrophobicity: is LogP(o/w) more than the sum of its parts?. Eur J Med Chem. 2000 Jul-Aug;35(7-8):651-61 又はGudrun Wienke, "Messung und Vorausberechnung von n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten", Doktorarbeit, Univ. Oldenburg, 1 -172, 1993に記載されている。
【００４７】
本発明の範囲では、ｌｏｇＰは、プログラムモジュールACD/LogP DBを用いて、Advanced Chemistry Development Inc., Torontoの方法に応じて決定される。
【００４８】
好ましい補助溶媒は、−１．３８より多い、好ましくは−１〜＋２、さらに好ましくは−０．５〜０．５、−０．４〜０．４又は０〜１．５のｌｏｇＰを有する。好ましい実施態様において、補助溶媒は、−１．３８より多い、好ましくは−１〜＋２、さらに好ましくは０〜１．５のｌｏｇＰを有する式Ａｌｋ1−Ｏ−Ａｌｋ2のジアルキルエーテルであり、ここで両者のアルキル置換基Ａｌｋ1及びＡｌｋ2はそれぞれ相互に独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル及びｔｅｒｔ−ブチルを含む群から選択されている。特に好ましい一実施態様において、補助溶媒とはメチル三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）である。好ましい実施態様において、補助溶媒とはジメトキシエタン（ＤＭＥ）である。
【００４９】
更なる好ましい実施態様において、補助溶媒は、カルボン酸又は脂肪酸、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも１２個の炭素原子を有する脂肪酸である。脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキン酸又はベヘン酸、又は不飽和脂肪酸、例えばミリストオレイン酸、パルミトオトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、イコセン酸又はエルカ酸であってよい。同様に、種々の脂肪酸の混合物、例えば主として不飽和脂肪酸を含むヒゴダイ属油（Kugeldisteloel）が可能である。全ての脂肪酸が言うに値する量では室温溶解性でないため、更なる処置、例えば温度を高めたり又は好ましくは更なる溶媒の添加を行うことが、水相を入手可能にするために必要であってよい。特に好ましい実施態様において、脂肪酸又はそのエステル、好ましくはメチルエステル、最も好ましくはラウリン酸メチルエステルがそのような更なる溶媒として使用される。
【００５０】
本発明の酵素カスケードは、本発明によれば、アラニンデヒドロゲナーゼの存在下で進行できる。この構成が、還元当量中性の反応の実施を可能にする、すなわち、反応が還元当量の形の電子の供給又は除去なしに進行することが本発明の特別な能力である。なぜならば、アルコールデヒドロゲナーゼによってアルコール酸化の過程で生じるＮＡＤＨはアラニンが生じる際に無機窒素ドナー、好ましくはアンモニア又はアンモニア源の消費下で消費されるからである。
【００５１】
好ましい実施態様において、「アラニンデヒドロゲナーゼ」との概念は、本願で使用する場合に、水及びＮＡＤ+の消費下でＬ−アラニンのピルビン酸、アンモニア及びＮＡＤＨへの変換を触媒作用する酵素が理解される。好ましくは、アラニンデヒドロゲナーゼは、細胞内アラニンデヒドロゲナーゼであり、さらに好ましくは細菌のホールセル触媒の組み換え細胞内アラニンデヒドロゲナーゼである。
【００５２】
好ましい実施態様において、本発明の方法にとっては、全ての必要な活性を有するホールセル触媒、すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及び場合によってモノオキシゲナーゼ及び／又はアラニンデヒドロゲナーゼが使用される。そのようなホールセル触媒の使用は、個々の試薬の形で全ての活性が使用され、そして生物学的に活性のある形で酵素を大工業的に処理する必要が無い利点を有する。当業者には、ホールセル触媒の構築のための好適な方法が知られており、特に１又は１より多い組み換えタンパク質の発現又は必要な組み換えタンパク質をコードするＤＮＡの使用される宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組み込みのためのプラスミド系の構築が知られている。
【００５３】
更なる発明の１つは、さらに、一級アルコールの酸化及びアミン化のため系を提供するとの課題を基礎とする。本発明によれば、課題は、第４の観点において、次の工程
ａ）式
ＨＯ−（ＣＨ2）x−Ｒ7
（式中、Ｒ7は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ8を含む群から選択され、ｘは少なくとも３であり、Ｒ8は、Ｈ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている）の一級アルコールの提供、
ｂ）ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼとの接触による一級アルコールの酸化、及び
ｃ）工程ａ）からの酸化生成物とトランスアミナーゼとの接触
を含み、ＮＡＤ+アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はトランスアミナーゼが組み換え酵素又は単離酵素である方法によって解決される。
【００５４】
第４の観点の第１の実施態様において、工程ａ）は、好ましくは組み換えであるか又は単離されているモノオキシゲナーゼによる、式
Ｈ−（ＣＨ2）x−Ｒ7
のアルカンのヒドロキシル化によって行われる。
【００５５】
第１の実施態様の実施態様でもある、第４の観点の第２の実施態様において、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼは、少なくとも１の亜鉛原子を補助因子として有するＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。
【００５６】
第２の実施態様の実施態様である、第４の観点の第３の実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、バチラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（データバンクコードP42328）のアルコールデヒドロゲナーゼ又はその変異体である。
【００５７】
第１〜第３の実施態様の実施態様である、第４の観点の第４の実施態様において、モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のAlkBGT、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）又はヒヨコマメ（Cicer arietinum）からのチトクロムＰ４５０を含む群から選択されている。
【００５８】
第１〜第４の実施態様の実施態様でもある、第４の観点の第５の実施態様において、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのVal224に相応するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを含む群から選択されるアミノ酸を有し、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのGly230に相応するアミノ酸の位置に、トレオニン以外のアミノ酸、好ましくはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを含む群からのアミノ酸を有することを特徴とするトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されている。
【００５９】
第１〜第５の実施態様の実施態様でもある、第４の観点の第６の実施態様において、工程ｂ）及び／又は工程ｃ）は、単離されたか又は組み換えのアラニンデヒドロゲナーゼ及び無機窒素源の存在下で実施される。
【００６０】
第１〜第７の実施態様の実施態様でもある、第４の観点の第７の実施態様において、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、モノオキシゲナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを含む群からの少なくとも１の酵素は組み換えであり、かつ、相応する酵素を有するホールセル触媒の形で提供される。
【００６１】
第７の実施態様の実施態様である、第４の観点の第８の実施態様において、全ての酵素は、１又は１より多いホールセル触媒の形で提供され、好ましくはホールセル触媒は全ての必要な酵素を有する。
【００６２】
第１〜第８の実施態様の実施態様でもある、第４の観点の第９の実施態様において、工程ｂ）では、好ましくは工程ｂ）及びｃ）では、ｌｏｇＰが−１．３８より多い、好ましくは−０．５〜１．２、さらに好ましくは−０．４〜０．４を有する有機補助溶媒が存在する。
【００６３】
第９の実施態様の実施態様である、第４の観点の第１０の実施態様において、補助溶媒が、不飽和脂肪酸、好ましくはオレイン酸を含む群から選択されている。
【００６４】
第９の実施態様の好ましい実施態様である、第４の観点の第１１の実施態様において、補助溶媒が、式Ｒ9−Ｏ−（ＣＨ2）x−Ｏ−Ｒ10
（式中、Ｒ9及びＲ10はそれぞれ相互に独立して、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、ｘは１〜４であり、ここで好ましくはＲ9及びＲ10はそれぞれメチルでありｘは２である）の化合物である。
【００６５】
本発明によれば、第５の観点における課題は、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくは補助因子として少なくとも１の亜鉛原子を有するＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、任意にモノオキシゲナーゼ及び任意にアラニンデヒドロゲナーゼを有するホールセル触媒によって解決され、ここで酵素は組み換え酵素である。
【００６６】
本発明によれば、第６の観点における課題は、式ＨＯ−（ＣＨ2）x−Ｒ7（式中、Ｒ7は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＣＯＯＲ8を含む群から選択されており、ｘは少なくとも３であり、Ｒ8は、Ｈ、アルキル及びアリールを含む群から選択されている）の一級アルコールの酸化及びアミン化のための本発明の第２の観点に応じたホールセル触媒の使用によって解決される。
【００６７】
第１の実施態様の実施態様である、第６の観点の第１の実施態様において、さらに、この使用は、ｌｏｇＰが−１．３８より多い、好ましくは−０．５〜１．２、さらに好ましくは−０．４〜０．４を有する有機補助溶媒の存在を含む。
【００６８】
第２の実施態様の実施態様である、第６の観点の第２の実施態様において、補助溶媒は、不飽和脂肪酸を含む群から選択されており、好ましくはオレイン酸である。
【００６９】
第５の観点及び第６の観点の更なる実施態様は、本発明の第４の観点の全ての実施態様を含む。
【００７０】
本発明の発明者は、少量の副生成物の発生下で、一級アルコールの酸化を引き起こすために使用可能な一群のアルコールデヒドロゲナーゼが存在することを意外なことに見出した。本発明者はさらに意外なことに、アルコールを、生体触媒の使用下で副生成物をさほど発生させないでアミン化できる酵素活性のカスケードが存在し、この場合に還元当量の添加又は排出の必要がないことを見出した。本発明者はさらに意外なことに、ポリアミドを意外なことにホールセル触媒を使用して、かつ再生原料から出発して製造できる方法を見出した。本発明の発明者はさらに意外なことに、一級アルコールのアミン化を事前の酸化後に特に好ましく所定の配列特性によって特徴付けられるトランスアミナーゼ群を用いて実施できることを見出した。
【００７１】
本発明の方法は、産業的に関係のある大多数のアルコールに適用できる。好ましい実施態様において、これは、ω−ヒドロキシカルボン酸又はエステル、好ましくはω−アミノカルボン酸へと酸化及びアミン化されるそのメチルエステルである。更なる実施態様において、これは、ジアミンへと酸化及びアミン化されるジオールである。更なる好ましい実施態様において、一級アルコールはヒドロキシアルキルアミンである。炭素鎖の長さは可変であり、ｘは少なくとも３である。好ましくは炭素鎖は３より多くのＣ原子を有し、すなわち、ｘ＝４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれより多い。例示的な化合物は、ω−ヒドロキシラウリン酸、ω−ヒドロキシ−ラウリン酸メチルエステル及びアルカンジオール、特に１，８−オクタン−ジオール及び１，１０−デカンジオールである。
【００７２】
特に好ましい実施態様において、Ｒ1は、−ＯＨ及び−ＣＯＯＲ2を含む群から選択されており、ｘは少なくとも１１であり、Ｒ2は、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを含む群から選択されている。好ましい実施態様において、一級アルコールはω−ヒドロキシ−脂肪酸−メチルエステルである。
【００７３】
本発明によれば本方法の工程ｂ）では、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼが一級アルコールの酸化のために使用される。この場合に、例えば、全ての本発明により使用される酵素活性ポリペプチドは、酵素活性ポリペプチドを含む細胞又は全精製工程におけるポリペプチドのその溶解物又は調製物であってよく、粗製溶解物から純粋なポリペプチドまでを含む。当業者には、酵素活性ポリペプチドを好適な細胞において過剰発現及び精製又は単離することができる数多くの方法が、この分野で知られている。そして、ポリペプチドの発現には、全ての当業者に提供可能な発現系が使用できる。精製にはクロマトグラフィー法が考慮され、例えばタグを備える組み換えタンパク質のアフィニティクロマトグラフィーによる精製が、固定化したリガンド、例えばニッケルイオンをヒスチジンタグの場合に、固定化したグルタチオンを目的タンパク質に融合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの場合に、又は固定化したマルトースをマルトース結合タンパク質を含むタグの場合に使用して、考慮される。
【００７４】
精製される酵素活性ポリペプチドは、溶解した形でも固定化した形でも使用できる。当業者には、ポリペプチドを有機又は無機の固相に共有的に又は非共有的に固定化できる好適な方法、例えばスルフヒドリル−カップリング化学（例えばPierce社又はQuiagenのキット）が知られている。
【００７５】
好ましい実施態様において、ホールセル触媒又は発現系として使用される細胞は、原核細胞、好ましくは細菌細胞である。更なる好ましい実施態様において、細胞は哺乳類細胞である。更なる好ましい実施態様において、細胞は低級真核細胞、好ましくは酵母細胞である。例示的な原核細胞は、エシェリキア（Escherichia）、特に大腸菌（Escherichia coli）及びシュードモナス（Pseudomonas）及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）の属の株を含む。例示的な低級真核細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ヤロウィア（Yarrowia）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の属、特にカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerivisiae）の属を含む。
【００７６】
特に好ましい実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、亜鉛含有ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、すなわち、触媒活性酵素であり、これはシステイン基を含む特徴的な配列モチーフによってポリペプチドに対して共有結合しているとして少なくとも１の亜鉛原子を補因子として含む。特に好ましい実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、バチラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（データバンクコードP42328）のアルコールデヒドロゲナーゼ又はその変異体である。
【００７７】
本発明の教示は、本願に記載の生物学的マクロ分子の正確なアミノ酸又は核酸配列の使用下で実施できるだけでなく、１又は複数のアミノ酸又は核酸の欠失、付加又は置換によって得ることが出来るそのようなマクロ分子の変異体の使用下でも実施できる。特に好ましい実施態様において、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」との概念は、以下で同義でかつ交換可能に「ホモログ」との概念が利用されるが、本願で使用される場合には、相応する当初野生型核酸配列又はアミノ酸配列に関して、相同性（本願では同一性と同義に使用される）７０、７５、８０，８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９％又はそれより多いパーセンテージを有する他の核酸配列又はアミノ酸配列を意味し、好ましくは触媒活性中心を形成するアミノ酸又は構造又はフォールディングに必須のアミノ酸以外のアミノ酸が欠失又は置換されており、又は後者のものが単に保存的に置換されており、例えばアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸又はバリンの代わりにロイシンである。先行技術、例えばArthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3rd editionは、２つの配列のホモロジ−の大きさを計算するために使用されることができるアルゴリズムを記載する。本発明の更なる好ましい実施態様において、アミノ酸又は核酸配列の変異体は、好ましくは上述の配列ホモロジ−の他に、野生型分子又は当初分子と実質同一の酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとして酵素活性のあるポリペプチドの変異体は、ポリペプチド酵素と同一又は実質同一のタンパク質加水分解活性を有し、すなわち、ペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有する。特に好ましい実施態様において、「実質同一の酵素活性」との概念は、野生型ポリペプチドの基質に関して、バックグラウンド活性を遙かに超える及び／又は３未満、好ましくは２未満、さらに好ましくは１未満のオーダーで、野生型ポリペプチドが同一基質に関して有するＫm及び／又はｋcat値と異なる活性を意味する。更なる好ましい実施態様において、核酸又はアミノ酸配列の「変異体」との概念は、核酸又はアミノ酸配列の少なくとも１の活性のある部分及び／又は断片を含む。更なる好ましい実施態様において、「活性のある部分」との概念は、本願で使用する場合に、全長よりもより少ないアミノ酸配列を有するか又は全長よりも少ないアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列又は核酸配列を意味し、ここで野生型アミノ酸配列よりもより少ない長さを有するアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、野生型ポリペプチド又はその変異体、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ又はトランスアミナーゼが有するのと実質同一の酵素活性を有する。特別な実施態様において、核酸の「変異体」との概念は、その相補鎖が好ましくはストリンジェントな条件下で野生型核酸に結合する核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者が容易に測定可能であり、一般に、プローブの長さ、洗浄時の温度及び塩濃度に依存する。一般に、より長いプローブはハイブリダイゼーションにより高温を必要とし、それに対して、より短いプローブはより低温で十分である。ハイブリダイゼーションが発生するかどうかは一般に変性したＤＮＡが、その周囲に��在する相補ストランドに、すなわち、溶融温度未満で、アニーリングする能力に依存する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシー及び相応する条件はAusubel et al. 1995に詳細に記載されている。好ましい実施態様において、核酸の「変異体」との概念は、本願で使用する場合に、遺伝子暗号の縮重の範囲において当初核酸又はこのアミノ酸配列の変異体と同一のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を含む。
【００７８】
アルコールデヒドロゲナーゼは、数十年来、生化学において、醸造技術発酵プロセスの関連において重く考慮され、バイオテクノロジー的に高い関連性のある酵素クラスであり、これは種々の群のアイソフォームを含む。そして、膜結合した、シュードモナス・プチダＧＰ０１  Ａｌｋ−Ｊタイプのフラビン依存性アルコールデヒドロゲナーゼが存在し、これはＮＡＤ+の代わりにフラボ補因子を使用する。更なる群は、鉄含有の、酸素に対して敏感なアルコールデヒドロゲナーゼを含み、これは細菌において、そして不活性な形で酵母において見出される。他の群は、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、特に亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼを含み、この酵素では活性中心が、アルコール基質を固定するシステイン配位した亜鉛原子を有する。好ましい実施態様において、「アラニンデヒドロゲナーゼ」との概念は、本願で使用する場合に、アルデヒド又はケトンを相応する一級アルコール又は二級アルコールへ酸化する酵素が理解される。好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼは、本発明の方法において、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、すなわち、ＮＡＤ+を補因子としてアルコール又はＮＡＤＨの酸化のために相応するアルデヒド又はケトンを還元のために使用するアルコールデヒドロゲナーゼである。
【００７９】
好ましい実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ+依存性の、亜鉛含有アルコールデヒドロゲナーゼである。
【００８０】
本発明によれば、工程ｃ）においてトランスアミナーゼが使用される。好ましい実施態様において、「トランスアミナーゼ」との概念は、本願で使用する場合に、ドナーからのα−アミノ基、好ましくはアミノ酸を、アクセプター分子、好ましくはα−ケトカルボン酸への移行を触媒作用する酵素が理解される。好ましい実施態様において、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのVal224に相応するアミノ酸配列の位置に、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン及びロイシンを含む群から選択されるアミノ酸を有し、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472（データバンクコードNP_901695）のトランスアミナーゼからのGly230に相応するアミノ酸の位置に、トレオニン以外のアミノ酸、好ましくはセリン、システイン、グリシン及びアラニンを含む群からのアミノ酸を有することを特徴とするトランスアミナーゼ及びその変異体の群から選択されている。特に好ましい実施態様において、トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）DSM30191からのω−トランスアミナーゼ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）W619からの、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginosa）PA01、ストレプトマイセス・コエリコラー（Streptomyces coelicolor）A3(2)及びストレプトマイセス・アベルミティス（Streptomyces avermitilis）MA 4680からのトランスアミナーゼを含む群から選択されているトランスアミナーゼである。
【００８１】
好ましい実施態様において、「クロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472のトランスアミナーゼからのアミノ酸配列の位置Ｘに相応する位置」とは、本願で使用する場合に、相応する位置が検査される分子のアラインメントの際に、クロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472のトランスアミナーゼからのアミノ酸配列の位置Ｘに対してホモログに見えることを意味する。当業者には、数多くのソフトウェアパケット及びアルゴリズムが知られており、それを用いてアミノ酸配列のアラインメントが作成可能である。例示的なソフトウェアパケットプロセスは、EMBLにより提供されたパケットClustalW（Larkin et al., 2007;Goujom etal., 2010）を含み、又は、Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 3rd editionに説明及び記載されている。
【００８２】
本発明により使用した酵素は、好ましくは組み換え酵素である。好ましい実施態様において、「組み換え」との概念は、本願で使用する場合に、相応する核酸分子が天然で発生しない及び／又は遺伝子工学的手法の使用下で製造されていることが理解される。好ましい実施態様において、組み換えタンパク質とは、相応するポリペプチドが組み換え核酸によりコードされている場合をいう。好ましい実施態様において、組み換え細胞とは、本願で使用する場合に、少なくとも１の組み換え核酸又は組み換えポリペプチドを有する細胞が理解される。当業者には、組み換え分子又は細胞の製造に適した方法が知られており、例えばSambrook et al., 1989に記載されている。
【００８３】
本発明の教示は、単離酵素の使用下でもホールセル触媒の使用下でも実施可能である。好ましい実施態様において、「ホールセル触媒」との概念には、本願で使用する場合に、所望される酵素活性を供給する、完全な、生存できる、代謝により活性のある細胞が理解される。ホールセル触媒は、代謝される基質、本発明の場合にはアルコール又はそこから発生する酸化生成物を、細胞質酵素によってこれを代謝する細胞内へ輸送することが出来るか、又は、興味をもたれる酵素を、基質に対して媒体へと直接的に暴露するその表面に提示する。当業者には数多くのホールセル触媒製造システムが知られており、例えばDE 60216245から知られている。
【００８４】
一連の適用には、単離酵素の使用が推奨される。好ましい実施態様において、「単離された」との概念は、本願で使用する場合に、酵素がその天然の供給源に比較してより純粋な及び／又はより濃縮した形で存在することを意味する。好ましい実施態様において、酵素がポリペプチド酵素であり、相応する調製物の６０、７０、８０、９０又は好ましくは９５％超の質量タンパク質割合を構成する場合に、酵素は単離されたことになる。当業者には、溶液中でタンパク質の質量を測定するための数多くの方法が知られており、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの相応するタンパク質バンドの厚さに基づいた視覚的評価、ＮＭＲ分光法又は質量分析方法である。
【００８５】
酵素触媒された本発明の方法の反応は、典型的には溶媒又は高い水割合を有する溶媒混合物中で、好ましくは酵素活性と適合性のｐＨ値の調節のための好適な緩衝系の存在下で、実施される。疎水性出発材料の場合に、特に３個より多い炭素原子を有する炭素鎖を備えるアルコールでは、しかし、酵素と基質との接触を媒介できる有機補助溶媒の追加の存在が好ましい。１又はそれより多くの補助溶媒は、溶媒混合物に対する総割合が９５、９０、８５，８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０又は５体積パーセント又はそれより少なく存在する。
【００８６】
補助溶媒の疎水性はこの場合に重要である。これは、ｎ−オクタノール−水−分布係数の常用対数  ｌｏｇＰによって表される。好ましい補助溶媒は、−１．３８より多い、好ましくは−１〜＋２、さらに好ましくは−０．５〜０．５、−０．４〜０．４又は０〜１．５のｌｏｇＰを有する。
【００８７】
ｎ−オクタノール−水−分布係数Ｋow又はＰは、無次元の分布係数であり、１−オクタノール及び水からの二相系における１の物質の濃度比である（J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997参照）。より正確に言えば、Ｋow又はＰは、オクタノールリッチな相中の物質の濃度の、水リッチな相中のその濃度に対する比を指す。
【００８８】
Ｋow値は、物質の親油性（脂肪溶解性）と親水性（水溶性）との比のためのモデル基準である。オクタノール−水系中の物質の分布係数を用いて、水相を有する別の系中のこの物質の分布係数をも見積もることができるとの期待がある。Ｋowは、物質が脂肪類似溶媒、例えばｎ−オクタノール中でより良好に溶解する場合に１より大きく、水中により良好に溶解する場合に１より小さい。相応して、ＬｏｇＰは、親油性物質に対して正であり、親水性物質に対して負である。全ての化学物質に対してＫowを測定できないので、種々のモデルが予想のために存在し、例えば、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）によって又は自由エネルギー直線関係（ＬＦＥＲ）によってであり、例えばEugene Kellogg G, Abraham DJ: Hydrophobicity: is LogP(o/w) more than the sum of its parts?. Eur J Med Chem. 2000 Jul-Aug;35(7-8):651-61 又はGudrun Wienke, "Messung und Vorausberechnung von n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten", Doktorarbeit, Univ. Oldenburg, 1 -172, 1993に記載されている。
【００８９】
本発明の範囲では、ｌｏｇＰは、プログラムモジュールＡＣＤ／ＬｏｇＰ  ＤＢを用いて、Advanced Chemistry Development Inc., Torontoの方法に応じて決定される。
【００９０】
好ましい補助溶媒は、−１．３８より多い、好ましくは−１〜＋２、さらに好ましくは−０．７５〜１．５又は−０．５〜０．５又は−０．４〜０．４又は−０．３〜−０．１のｌｏｇＰを有する。好ましい実施態様において、補助溶媒は、−１．３８より多い、好ましくは−１〜＋２、さらに好ましくは０〜１．５のｌｏｇＰを有する式Ａｌｋ1−Ｏ−Ａｌｋ2のジアルキルエーテルであり、ここで両者のアルキル置換基Ａｌｋ1及びＡｌｋ2はそれぞれ相互に独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル及びｔｅｒｔ−ブチルを含む群から選択されている。特に好ましい一実施態様において、補助溶媒とはメチル三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）である。最も好ましい実施態様において、補助溶媒とはジメトキシエタン（ＤＭＥ）である。更なる好ましい実施態様において、補助溶媒が、式Ｒ10−Ｏ−（ＣＨ2）x−Ｏ−Ｒ11（式中、Ｒ10及びＲ11はそれぞれ相互に独立して、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択されており、ｘは１〜４であり、ここで好ましくはＲ10及びＲ11はそれぞれｘ２である） の化合物である。
【００９１】
更なる好ましい実施態様において、補助溶媒は、カルボン酸又は脂肪酸、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも１２個の炭素原子を有する脂肪酸である。脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキン酸又はベヘン酸、又は不飽和脂肪酸、例えばミリストオレイン酸、パルミトオレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、イコセン酸又はエルカ酸であってよい。同様に、種々の脂肪酸、例えば主として不飽和脂肪酸を含むヒゴダイ属油（Kugeldisteloel）が可能である。全ての脂肪酸が言うに値する量で室温で溶解性でないため、更なる処置、例えば温度を高めたり又は好ましくは更なる溶媒の添加を行うことが、水相を入手可能にするために必要であってよい。特に好ましい実施態様において、脂肪酸又はそのエステル、好ましくはメチルエステルは、最も好ましいラウリン酸メチルエステルがそのような更なる溶媒として使用される。
【００９２】
本発明の酵素カスケードは、本発明によれば、アラニンデヒドロゲナーゼの存在下で進行できる。この構成が、還元当量中性の反応の実施を可能にする、すなわち、反応が還元当量の形の電子の供給又は除去なしに進行することが本発明の特別な能力である。なぜならば、アルコールデヒドロゲナーゼによってアルコール酸化の過程で生じるＮＡＤＨはアラニンが生じる際に無機窒素ドナー、好ましくはアンモニア又はアンモニア源の消費下で消費されるからである。
【００９３】
好ましい実施態様において、「アラニンデヒドロゲナーゼ」との概念は、本願で使用する場合に、水及びＮＡＤ+の消費下でＬ−アラニンのピルビン酸、アンモニア及びＮＡＤＨへの変換を触媒作用する酵素が理解される。好ましくは、アラニンデヒドロゲナーゼは、細胞内アラニンデヒドロゲナーゼであり、さらに好ましくは細菌のホールセル触媒の組み換え細胞内アラニンデヒドロゲナーゼである。
【００９４】
好ましい実施態様において、本発明の方法にとっては、全ての必要な活性を有するホールセル触媒、すなわち、ＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ及び場合によってモノオキシゲナーゼ及び／又はアラニンデヒドロゲナーゼが使用される。そのようなホールセル触媒の使用は、個々の試薬の形で全ての活性が使用され、そして生物学的に活性のある形で酵素を大工業的に処理する必要が無い利点を有する。当業者には、ホールセル触媒の構築のための好適な方法が知られており、特に１又は１より多い組み換えタンパク質の発現又は必要な組み換えタンパク質をコードするＤＮＡの使用される宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組み込みのためのプラスミド系の構築が知られている。
【００９５】
先の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面に開示される本発明の特徴は、単独でも、任意の組み合わせでも、本発明の改良のために、種々の実施態様において本質的であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、種々のトランスアミナーゼ、特にクロモバクテリウム・ビオラセウムATCC 12472（Chromobacterium violaceum ATCC 12472）（データバンクコード  NP_901695, "TACV_co"）を含む例示的なアラインメントを示す。前記トランスアミナーゼに相応するアミノ酸残基のVal224及びGly230の位置は全ての配列において下線が引かれている。アラインメントをClustalWを使用して作成した。
【図２】図２は、３つの酵素RasADH, pCR6(L417M)及びAlaDH(D196A/L197R)によって触媒作用されるイソソルビット及びアンモニウム塩の反応の９６時間後のFMOC/HPLC分析を示す。（ａ）標準（図３による各１ｍＭのアミノアルコールＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ＋各１ｍＭのジアミンＤＡＩ、ＤＡＳ及びＤＡＭ）、（ｂ）RasADH, pCR6(L417M)及びAlaDH(D196A/L197R)によって触媒作用される９６時間後の反応、（ｃ）（ｂ）と同様だが、RasADHなしの９６時間後のコントロール反応が示されている。誘導体化のために、２０μｌのそのつどの反応試料を６０μｌの０．５Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を有するＨＰＬＣバイアル中に移し、良く混ぜ、８０μｌのFMOC試薬（Alltech Grom）を添加した。過剰のFMOC試薬を、１００μｌのＥＶＡ試薬（Alltech Grom）の添加によって防ぐ。４４０μｌの５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）＋７０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）の添加によって、ＨＰＬＣ分析のための条件に調節した。クロマトグラフィー条件：Agilent SB-C8カラム（4.6×150 mm）；流速１ｍ／分；注射体積：２０μｌ；緩衝液Ａ。５０ｍＭ  酢酸Ｎａ  ｐＨ４．２＋２０％  アセトニトリル（ｖ／ｖ）；緩衝液Ｂ：５０ｍＭ  酢酸Ｎａ  ｐＨ４．２＋９５％  アセトニトリル（ｖ／ｖ）；勾配：０分  １６％  Ｂ、５分  １６％  Ｂ、２５分  １８％  Ｂ、２８分  ５２％  Ｂ、４０分  ２５％  Ｂ。
【図３】図３は、出発基質イソソルビット（１，４：３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−ソルビット（オール））、アミノアルコールの立体異性体（Ｉ〜ＩＶ）並びにジアミン最終生成物の立体異性体形態（ＤＡＩ：２，５−ジアミノ−１，４：３．６−ジアンヒドロ−２，５−ジデオキシ−Ｌ−イジット（オール）、ＤＡＳ：２，５−ジアミノ−１，４：３，６−ジアンヒドロ−２，５−ジデオキシ−Ｄ−ソルビット（オール）及びＤＡＭ；２，５−ジアミノ−１，４：３，６−ジアンヒドロ−２，５−ジデオキシ−Ｄ−マンニット（オール））の化学式を示す。
【図４】図４は、RasADH, pCR6(L417M)及びAlaDH(D196A/L197R)によって触媒作用される種々のアンモニウム濃度でのイソソルビット及び酢酸アンモニウムの反応のＦＭＯＣ／ＨＰＬＣ分析からのモノアミン及びジアミンの収率を示す。反応条件：３００ｍＭ  イソソルビット、２ｍＭ  ＮＡＤＰ+、１００〜３００ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃ、５ｍＭ  Ｌ−アラニン、０．３ｍＭ  ＰＬＰ、１３２μＭ  ＲａｓＡＤＨ、４０μＭ  ｐＣＲ６（Ｌ４１７Ｍ）、２４μＭ  ＡｌａＤＨ（Ｄ１９６Ａ／Ｌ１９７Ｒ）（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ中、ｐＨ８．３）、３０℃でのインキュベーション。
【図５】図５は試料の分析を伴うクロマトグラムを示し、これは例えば実施例３に応じて二級アルコールトリプロピレングリコールの本発明の酸化及びアミン化で獲得した。矢印は、酸化及びアミン化したトリプロピレングリコールのピークをマークしてある。
【００９７】
実施例１：本発明の方法を使用した場合のアルコールデヒドロゲナーゼＡｌｋＪに比較したＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼを使用した場合の種々の基質のアミン化
基質：
基質として、シクロヘキサノール（１）、（Ｓ）−オクタン−２−オール（２）及び（Ｓ）−４−フェニルブタン−２−オール（３）を使用した。
【００９８】
酵素：
アラニンデヒドロゲナーゼ：
バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のＬ−アラニン−デヒドロゲナーゼを、大腸菌中で発現させた。まず、オーバーナイト培養物を準備し、引き続きこれを使用してメイン培養物（ＬＢ−アンピシリン培地）に接種した。細胞を２４時間３０℃及び１２０ｒｐｍで振盪器によりインキュベーションした。引き続き、滅菌条件下で、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ  イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、Ｓｉｇｍａ）を誘導のために添加し、そして、培養物を更なる２４時間２０℃で振盪させた。
【００９９】
細胞を遠心分離により除去し（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、洗浄し、そして、上清を廃棄した。引き続き、細胞を超音波（１秒  パルス、４秒  停止、時間：１０分、振幅４０％）を使用して、破砕し、混合物を遠心分離により分離し（２０分、１８０００ｒｐｍ、４℃）、酵素をＨｉｓｐｒｅｐカラムを使用して精製した。
【０１００】
バチラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH-hT; P42328.1）
バチラス・ステアロサーモフィラスのＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼの調製のために（Fiorentino G, Cannio R, Rossi M, Bartolucci S: Decreasing the stability and changing the Substrate specificity of the Bacillus stearothermophilus alcohol dehydrogenase by Single amino acid replacements. Protein Eng 1998, 1 1 : 925-930）、まずオーバーナイト培養物を調製し（１０ｍｌ  ＬＢ／アンピシリン培地、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、３０℃、１２０ｒｐｍ）、これを引き続き培養容器を接種するために使用して、これを再度約１２時間３７℃及び１２０ｒｐｍで振盪させた。細胞を遠心分離により分離し（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、洗浄し、上清を廃棄し、ペレットを凍結乾燥させた。最後に、細胞を超音波（１秒  パルス、４秒  停止、時間：１０分、振幅４０％）を使用して、破砕し、混合物を遠心分離により分離し（２０分、１８０００ｒｐｍ、４℃）、粗製抽出物として使用した。タンパク質濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【０１０１】
（シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovirans）Ｇｐｏ１からの）ＡｌｋＪ−アルコールデヒドロゲナーゼ：
酵素をバチラス・ステアロテルモフィラスのアルコールデヒドロゲナーゼと同一条件で調製したが、この場合に、プラスミドpTZE03_AlkJ（配列番号２０）及び抗生物質（５０μｇ／ｍｌ）としてカナマイシンを使用した点で異なる。タンパク質濃度を同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【０１０２】
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）からのトランスアミナーゼＣＶ−ωＴＡ；
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）からのＣＶ−ωＴＡの調製のために（U. Kaulmann, K. Smithies, M. E. B. Smith, H. C. Hailes, J. M. Ward, Enzyme Microb. Technol. 2007, 41, 628-637; b) M. S. Humble, K. E. Cassimjee, M. Haekansson, Y. R. Kimbung, B. Waise, V. Abedi, H.-J. Federsei, P. Berglund, D. T. Logan, FEBS Journal 2012, 279, 779-792; c) D. Koszelewski, M. Goeritzer, D. Clay, B. Seisser, W. Kroutil, ChemCatChem 2010, 2, 73-77）、まずオーバーナイト培養物を調製し（ＬＢ／アンピシリン培地、３０℃、１２０ｒｐｍ）、これを引き続き同様の培地を有する培養フラスコを接種するために使用し、これを約３時間３７℃及び１２０ｒｐｍで振盪させて、６００ｎｍで０．７の光学密度を達成した。引き続き、ＩＰＴＧ出発溶液（０．５ｍＭ）を添加し、３時間２０℃及び１２０ｒｐｍで誘導した。細胞を遠心分離により分離し、上清を廃棄し、細胞を４℃で貯蔵した。最後に、細胞を超音波（１秒  パルス、４秒  停止、時間：１０分、振幅４０％）を使用して、破砕し、混合物を遠心分離により分離し（２０分、１８０００ｒｐｍ、４℃）、上清を粗製抽出物として使用した。
【０１０３】
試験実施：
試験バッチは表１に記載されている。
【表１】
2014524245.tif 000002
【０１０４】
基質を相応する量で補助溶媒（ＤＭＥ）に溶解させ、３００μｌの水に溶解させ、Ｌ−アラニンを添加した。７５μｌの水に塩化アンモニウムを添加した。そのつど２５μｌの水に溶解させたＮＡＤ+及びＰＬＰを添加した。ｐＨ値を７．５μｌの６ＭのＮａＯＨ溶液の添加によって調節した。トランスアミナーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼを添加した。反応をアルコールデヒドロゲナーゼの添加によって開始した。２２時間後に、反応を下記の誘導化試薬の添加により停止させた。
【０１０５】
アミンの誘導体化：
５００μｌを有する試料に２００μｌのトリエチルアミン並びにＥＳＯＦ（エチルスクシンイミドオキシホルミアート）（８０又は４０ｍｇ）をアセトニトリル（５００μｌ）中に添加した。試料を引き続き１時間４５℃で振盪させ、引き続きジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ＧＣ−ＭＳを使用して測定した。アラニンデヒドロゲナーゼなしに作業する場合には、水溶液にＬ−アラニン（５００ｍＭ）、ＮＡＤ+（２ｍＭ）及びＰＬＰ（０．５ｍＭ）を８．５のｐＨ値で（ＮａＯＨの添加により調節）を添加し、そして基質をＤＭＥ（１２０μｌ、２５ｍＭ）に添加した。反応をそのつど２００μｌのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ+依存性）又はＡｌｋＪ）及びトランスアミナーゼの添加によって開始した。試料を２５℃で３００ｒｐｍで２４時間にわたり振盪させた。試料を上記のように後処理し、ＧＣ−ＭＳで分析した。
【表２】
2014524245.tif 000003
【０１０６】
まとめ：
一連の構造的に異なる二級アルコールに関して、それぞれ、反応をバチラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のＮＡＤ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼの使用下でアルコールデヒドロゲナーゼＡｌｋＪの使用に比較して顕著により効率的に進行することが示された。
【０１０７】
実施例２：アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ及びアラニンデヒドロゲナーゼのカップリングした酵素反応によるイソソルビット及びアンモニウム塩からのモノアミン及びジアミンの合成
以下の例は、更なる、構造的に異なる基質及びＮＡＤＰ+依存性アルコールデヒドロゲナーゼの使用下の本発明の教示の実施を示す。
【０１０８】
ラルストニア種（Ralstonia sp.）（配列番号２５）のアルコールデヒドロゲナーゼの構造遺伝子をＰＣＲによってオリゴデオキシヌクレオチドADHfw（配列番号３５）及びADHrv（配列番号３６）を使用して、プラスミドpEam-RasADH（Lavandera et al. (2008) J. Org. Chem. 73, 6003-6005）から増幅し、制限酵素KpnIで３′末端で切断し、最後に制限酵素EheI及びKpnIで切断した発現ベクターpASK-IBA35(+)でライゲーションした。Ｎ末端Ｈｉｓ６ｔａｇを有するアルコールデヒドロゲナーゼがコードされている生じる発現プラスミドpASK-IBA35(+)-RasADHを、分析用制限消化並びにＤＮＡ配列決定によって証明した。
【０１０９】
パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）（配列番号３７）からのアミノトランスフェラーゼの遺伝子をＰＣＲによってオリゴデオキシヌクレオチドpCR6fw（配列番号３８）及びpCR6rv（配列番号３９）を使用して、プラスミドpET21 a(+)-pCR6から増幅し、制限酵素HindIIIで３′末端で切断し、最後に制限酵素Ehel及びHindIIIで切断した発現ベクターpASK-IBA35(+)でライゲーションした。Ｎ末端Ｈｉｓ６ｔａｇを有するアミノトランスフェラーゼがコードされている生じる発現プラスミドpASK-IBA35(+)-pCR6を、分析用制限消化並びにＤＮＡ配列決定によって証明した。アミノトランスフェラーゼの酵素変異体L417Mをコードするプラスミドを、QuikChange-Methode (Agilent, Waldbronn)によるプラスミドpASK-IBA35(+)-pCR6の位置特異的突然変異によってオリゴデオキシヌクレオチドpCR6_L417Mfw（配列番号２０）及びpCR6_L417Mrv（配列番号４１）の使用下で生じさせる。生じる発現プラスミドpASK-IBA35(+)-pCR6(L417M)を、DNA配列決定によって証明した。
【０１１０】
バチラス・サチリス（Bacillus subtilis）（配列番号２１）からのAlaDHのD196A L197R突然変異体のための発現プラスミドとして、pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)を使用した。
【０１１１】
３つの酵素のための発現プラスミドpASK-IBA35(+)-RasADH, pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M)及びpASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)を、引き続きそれぞれ大腸菌（E. coli）BL21の形質転換のために使用した。３つの生じる株への遺伝子発現をそれぞれ１００ ｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬＢ培地（５Ｌの振盪フラスコ中の２Ｌ  培養体積）において３０℃で０．２μｇ／ｍｌのａＴｃの添加によってＯＤ550＝０．５での対数成長期において誘導した。３時間の誘導時間後に、培養物を回収し、細胞を４０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌに取り込み、そして、フレンチプレスホモジェナイザーにおいて機械的に破壊させた。明澄な上清をＺｎ2+で負荷したキレート化Sepharose（登録商標） Fast Flowカラムに保持し、Ｈｉｓ６タグと融合させた酵素を線形イミダゾール／ＨＣｌ濃度勾配０〜５００ｍＭを用いて４０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌに溶出させた。溶出分画を、超遠心によって濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００に対するゲル濾過を用いて、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ８．３の存在下で、クロマトグラフィーにより精製した。
【０１１２】
３つの精製した酵素を直接的にイソソルビット（１，４：３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−ソルビット（オール））のアミン化のために、レドックス因子ＮＡＤＰ+及びＬ−アラニンをリサイクルしながら使用した。酵素テストを以下のように構成した：
【表３】
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【０１１３】
３０℃で０〜９６時間の期間にわたるインキュベーションの後に、過剰量のＦＭＯＣ試薬（Alltech Grom, Rottenburg-Hailfingen）の添加における反応生成物としてのモノアミン及びジアミンの形成を、ＨＰＬＣ（Agilent 1200系列；図２参照）によって、蛍光検出器を用いて検出及び定量化した。
【０１１４】
本発明の酸化及びアミン化は、そうして、イソソルビットの使用下でも示されることができた。このことは、本発明の教示の実施可能性を広いスペクトルの基質にわたり実証する。
【０１１５】
実施例３：トリプロピレングリコールの酸化及びアミン化
緩衝溶液（１ｍｌ  リン酸緩衝液、５０ｍＭ  ｐＨ７．５）に、１ｍＭ  ＮＡＤ+、１ｍＭ  ＰＬＰ、５当量のＬ−アラニン、４当量の塩化アンモニウム、５０ｍＭ  トリプロピレングリコール、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）のアラニンデヒドロゲナーゼ（３００μｌ／試料、熱処理）、２０μｌのビブリオ・フルバリス（Vibrio fluvalis）、バチラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、アルトロバクタ−種（Arthrobacter sp.）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）又はｐＣＲ６のトランスアミナーゼを添加し、トランスアミナーゼを含まないブランク試料（ブランク）を除く。試料を引き続き３０℃で４５０ｒｐｍで２４時間にわたり振盪させた。
【０１１６】
後処理のために、試料を電子レンジにおいて６００Ｗで約１５秒間加熱し、引き続き遠心分離により分離した。検出を、実施例１に記載のように行った。
【０１１７】
二級アルコールとしてのトリプロピレングリコールでも、酸化及びアミン化された生成物の形成が検出できた。このことは、本発明の教示の実施可能性を広いスペクトルの基質にわたり実証する。
【０１１８】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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