(57)【要約】  ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８核酸、特にＥ２及びＥ６−７遺伝子産物をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる核酸が提供される。このような核酸は、生体サンプルからＲＮＡを単離する方法と、生体サンプルにおける特定のＲＮＡスプライシング型変異体の存在を決定するための方法及び手段と、生体サンプルにおけるＲＮＡ比の相対比を決定するための方法及び手段と、前がん性子宮頸部病変の進行を予測するための方法及び手段と、遺伝子又は遺伝子発現の破壊を検出するための方法及び手段とに有用である。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５パーセントの相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む全長が２００ヌクレオチド以下の単離核酸、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体。
【請求項２】
全長が１００ヌクレオチド以下である、請求項１に記載の単離核酸プローブ。
【請求項３】
全長が５０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の単離核酸、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体。
【請求項５】
ストリンジェントな条件下で以下のものとハイブリダイズすることができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離核酸：
（ａ）ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８からなる群から選択されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ゲノムの一部、
（ｂ）前記ＨＰＶゲノム由来のｍＲＮＡ転写産物、又は、
（ｃ）前記ｍＲＮＡの相補体。
【請求項６】
高ストリンジェンシー条件下で以下のものとハイブリダイズすることができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離核酸：
（ａ）ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８からなる群から選択されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ゲノムの一部、
（ｂ）前記ＨＰＶゲノム由来のｍＲＮＡ転写産物、又は、
（ｃ）前記ｍＲＮＡの相補体。
【請求項７】
ストリンジェントな条件下で２種類以上のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ゲノムとハイブリダイズすることができない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離核酸。
【請求項８】
ストリンジェントな条件下でＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８遺伝子、及び／又はＥ２及びＥ６／Ｅ７からなる群から選択されるｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離核酸。
【請求項９】
Ｅ２及びＥ６／Ｅ７からなる群から選択されるＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８遺伝子の一部に対して全長にわたって少なくとも７５パーセントの相同性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離核酸を含み、任意で検出可能な標識及び／又はリガンドを更に含む、核酸プローブ。
【請求項１１】
固体支持体と結合している、請求項１０に記載の核酸プローブ。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の少なくとも１つの核酸プローブを含むプローブセット。
【請求項１３】
標的ＲＮＡの存在を検出する方法であって、
ａ）支持体に結合している少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブを準備することと、
ｂ）前記標的ＲＮＡを前記少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を得ることと、
ｃ）前記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を単離することと、
ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを準備するとともに、該少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを前記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体とハイブリダイズすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を得ることと、
ｅ）抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体を準備するとともに、前記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を該抗体とインキュベートすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を得ることと、
ｆ）前記抗体を検出することであって、該検出によって前記標的ＲＮＡの存在が示されることと、
を含み、前記捕捉プローブ及び／又は前記増幅プローブが請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離核酸を含む、方法。
【請求項１４】
前記標的ＲＮＡがスプライス変異体であり、前記少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブ及び前記少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブが該スプライス変異体の存在を検出するように選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的ＲＮＡの存在を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブを準備することと、
ｂ）支持体に結合している抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド一次抗体を準備することと、
ｃ）前記標的ＲＮＡを前記少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を得ることと、
ｄ）前記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を前記抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド一次抗体とインキュベートすることであって、結合した標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を得ることと、
ｅ）少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを準備するとともに、該少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを前記結合した標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体とハイブリダイズすることであって、結合した標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を得ることと、
ｆ）抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二次抗体を準備するとともに、前記結合した標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を該抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二次抗体とインキュベートすることであって、結合した標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を得ることと、
ｇ）前記抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二次抗体を検出することであって、該検出によって前記標的ＲＮＡの存在が示されることと、
を含み、前記捕捉プローブ及び／又は前記増幅プローブの少なくとも１つが請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離核酸を含む、方法。
【請求項１６】
前記標的ＲＮＡがスプライス変異体であり、前記少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブ及び前記少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブが該スプライス変異体の存在を検出するように選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸がサンプル中に存在しないか、又はサンプル中で破壊されているか否かを決定する方法であって、
ａ）前記サンプルの第１の部分を、
ｉ）前記標的核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第１のセット、及び、
ｉｉ）参照核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第２のセット、
の形成を誘導するのに十分な条件下で処理することと、
ｂ）前記ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第１のセットの形成は誘導しないが、前記ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第２のセットの形成を誘導するのに十分な条件下で前記サンプルの第２の部分を処理することと、
ｃ）前記サンプルの第１の部分及び前記サンプルの第２の部分において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの濃度と相関する強度を有する検出可能なシグナルを発生させることと、
ｄ）前記サンプルの第１の部分における検出可能なシグナルの強度を、前記サンプルの第２の部分における検出可能なシグナルの強度と比較することであって、
ｉ）前記サンプルの第１の部分における検出可能なシグナルの強度が、前記サンプルの第２の部分における検出可能なシグナルの強度より大きい場合、前記標的核酸が該サンプル中に無傷で存在し、
ｉｉ）前記サンプルの第１の部分における検出可能なシグナルの強度が、前記サンプルの第２の部分における検出可能なシグナルの強度より小さいか又は該強度と等しい場合、前記標的核酸が該サンプル中に存在しないことと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記サンプルの第１の部分と前記サンプルの第２の部分とが、前記サンプルを
ａ）ストリンジェントな条件下で前記標的核酸に特異的な第１の捕捉プローブであって、該第１の捕捉プローブと該標的核酸とのハイブリダイゼーションによって第１の捕捉複合体が生成する、第１の捕捉プローブ、及び、
ｂ）ストリンジェントな条件下で前記参照核酸に特異的な第２の捕捉プローブであって、該第２の捕捉プローブと該参照核酸とのハイブリダイゼーションによって第２の捕捉複合体が生成する、第２の捕捉プローブ、
に接触させることを含む方法によって形成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の捕捉複合体と前記第２の捕捉複合体とを支持体に捕捉することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の捕捉プローブと前記第２の捕捉プローブとが前記支持体に結合しているか、又は結合するように適合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記捕捉プローブがリガンドを含み、前記支持体がリガンド結合部を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の捕捉プローブと前記第２の捕捉プローブとが同じリガンドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の捕捉プローブと前記第２の捕捉プローブとが異なるリガンドを含み、
ａ）前記サンプルの第１の部分を、前記第１の捕捉プローブのリガンドと結合することが可能なリガンド結合部と、前記第２の捕捉プローブのリガンドと結合することが可能なリガンド結合部とを含む固体支持体の第１のセットに接触させ、
ｂ）前記サンプルの第２の部分を、前記第２の捕捉プローブのリガンドと結合することができるが、前記第１の捕捉プローブのリガンドとは結合することができないリガンド結合部を含む固体支持体の第２のセットに接触させる、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルの第１の部分と前記サンプルの第２の部分とを、
ｉ）前記標的核酸とハイブリダイズすることができる複数のシグナルプローブを含む第１のプローブセット、及び、
ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記参照核酸とハイブリダイズすることができる複数のシグナルプローブを含む第２のプローブセット、
に接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の捕捉プローブと前記第２の捕捉プローブとがビオチン化しており、前記第１の支持体と前記第２の支持体とがビオチン結合部を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記捕捉プローブが前記支持体に共有結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）前記第１の捕捉複合体と前記第２の捕捉複合体とがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを含み、
ｂ）前記第１の捕捉複合体及び前記第２の捕捉複合体が、該第１の捕捉複合体及び該第２の捕捉複合体を、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができるエンティティに接触させることを含む方法により、前記第１の支持体及び前記第２の支持体に捕捉され、ここでＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができる該エンティティは該支持体に結合しているか、又は該支持体に結合するように適合されている、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができる前記エンティティがリガンドを含み、前記第１の支持体と前記第２の支持体とがリガンド結合部を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができる前記エンティティがビオチン化しており、前記支持体がビオチン結合部を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができる前記エンティティが前記支持体に共有結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができる前記エンティティがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異抗体又はその断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）前記第１の捕捉プローブが、
ｉ）ストリンジェントな条件下で前記標的核酸とハイブリダイズすることができる領域と、
ｉｉ）アンカープローブの第１の核酸配列とハイブリダイズすることができる領域と、
を含み、
ｂ）前記第２の捕捉プローブが、
ｉ）ストリンジェントな条件下で前記標的核酸とハイブリダイズすることができる領域と、
ｉｉ）アンカープローブの第２の核酸配列とハイブリダイズすることができる領域と、
を含み、ここで前記アンカープローブが前記第１の支持体及び／又は前記第２の支持体に結合しているか、又は結合するように適合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列とが同じである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列とが異なる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列とが同じアンカープローブ内に配置されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列とが異なるアンカープローブ内に配置されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）前記第１の支持体が、前記第１の核酸配列を含むアンカープローブと、前記第２の核酸配列を含むアンカープローブとを含み、
ｂ）前記第２の支持体が、前記第２の核酸配列を含むアンカープローブを含むが、前記第１の核酸配列を含むアンカープローブを含まない、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの前記第１のセットが、前記サンプルを、前記標的核酸とハイブリダイズすることができる第１のシグナルプローブに接触させることを含む方法により形成され、
ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの前記第２のセットが、前記サンプルを、前記参照核酸とハイブリダイズすることができる第２のシグナルプローブに接触させることを含む方法により形成される、
請求項１７に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）前記サンプルの第１の部分を、前記第１のシグナルプローブ及び前記第２のシグナルプローブに接触させ、
ｂ）前記サンプルの第２の部分を、前記第２のシグナルプローブに接触させるが、前記第１のシグナルプローブには接触させず、
ここで、前記第１のシグナルプローブはストリンジェントな条件下で前記標的核酸に特異的であり、前記第２のシグナルプローブはストリンジェントな条件下で前記参照核酸に特異的である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）前記第１のシグナルプローブが、前記標的核酸とハイブリダイズすることができる複数のシグナルプローブを含む第１のプローブセット内に配置されており、
ｂ）前記第２のシグナルプローブが、前記参照核酸とハイブリダイズすることができる複数のシグナルプローブを含む第２のプローブセット内に配置されている、
請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）前記第１のプローブセットの複数のシグナルプローブが、前記標的核酸の少なくとも７０％とハイブリダイズすることができ、
ｂ）前記第２のプローブセットの複数のシグナルプローブが、前記参照核酸の少なくとも７０％とハイブリダイズすることができる、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能なシグナルが、前記サンプルの第１の部分及び前記サンプルの第２の部分を、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができるエンティティに接触させることを含む方法により発生する、請求項１７に記載の方法。
【請求項４３】
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができる前記エンティティがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド特異抗体又はその断片である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ａ）前記サンプルの第１の部分及び前記サンプルの第２の部分を、
ｉ）前記サンプルを、ストリンジェントな条件下で前記標的核酸に特異的な少なくとも１つの第１のビオチン化捕捉プローブに接触させることと、
ｉｉ）前記サンプルを、ストリンジェントな条件下で前記参照核酸に特異的な少なくとも１つの第２のビオチン化捕捉プローブに接触させることと、
ｉｉｉ）前記サンプルを、ストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズに、前記ビオチン化捕捉プローブを該ストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合させるのに十分な条件下で接触させることと、
ｉｖ）前記サンプルの第１の部分及び前記サンプルの第２の部分を形成するために、前記ストレプトアビジンでコーティングしたビーズを別々の容器に分けることと、
を含む方法により生成することと、
ｂ）前記サンプルの第１の部分を、
ｉ）ストリンジェントな条件下で前記標的核酸とハイブリダイズすることができる検出可能に標識された複数の核酸プローブであって、該複数の核酸プローブは該標的核酸をカバーするのに十分である、核酸プローブと、
ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記参照核酸とハイブリダイズすることができる検出可能に標識された複数の核酸プローブであって、該複数の核酸プローブは該標的核酸をカバーするのに十分である、核酸プローブと、
を含むプローブカクテルに接触させることを含む方法により、前記サンプルの第１の部分において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの前記第１のセット及びＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの前記第２のセットを形成することと、
ｃ）前記サンプルの第２の部分を、ストリンジェントな条件下で前記参照核酸とハイブリダイズすることができる検出可能に標識された複数のシグナルプローブであって、該複数のシグナルプローブは該標的核酸をカバーするのに十分である、シグナルプローブを含むプローブカクテルに接触させることを含む方法により、前記サンプルの第２の部分において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの前記第２のセットを形成することと、
を含み、前記検出可能なシグナルが、前記検出可能に標識されたシグナルプローブによって発生する、請求項１７に記載の方法。
【請求項４５】
ａ）前記標的核酸がＨＰＶ  Ｅ２核酸であり、
ｂ）前記参照核酸が、
ｉ）ＨＰＶ  Ｅ１の核酸と、
ｉｉ）ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７の核酸と、
ｉｉｉ）ＨＰＶ  Ｌ１の核酸と、
ｉｖ）ＨＰＶ  Ｌ２の核酸と、
からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項４６】
ｉ）ＨＰＶ  Ｅ１のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと、
ｉｉ）ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと、
ｉｉｉ）ＨＰＶ  Ｌ１のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと、
ｉｖ）ＨＰＶ  Ｌ２のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと、
からなる群から選択される少なくとも２つの参照核酸を含む参照核酸群が検出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記参照核酸群が、
ｉ）ＨＰＶ  Ｅ１のｍＲＮＡと、
ｉｉ）ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７のｍＲＮＡと、
ｉｉｉ）ＨＰＶ  Ｌ１のｍＲＮＡと、
ｉｖ）ＨＰＶ  Ｌ２のｍＲＮＡと、
を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
患者においてＨＰＶ誘発性の細胞形質転換の発生を予測する方法であって、該方法が請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法により、該患者由来のＨＰＶ感染組織におけるＨＰＶ  Ｅ２のｍＲＮＡの有無を検出することを含み、ＨＰＶ  Ｅ２のｍＲＮＡが存在しないことがＨＰＶ誘発性の細胞形質転換の発症の指標となる、方法。
【請求項４９】
ＨＰＶゲノムの宿主細胞のゲノムへの組込みを検出する方法であって、該方法が請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法により、患者由来のＨＰＶ感染組織におけるＨＰＶ  Ｅ２のｍＲＮＡの有無を検出することを含み、ＨＰＶ  Ｅ２のｍＲＮＡが存在しないことがＨＰＶゲノムの宿主細胞のゲノムへの組込みの指標となる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、サンプルにおけるヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）由来の核酸を含む核酸の存在を決定するための方法、組成物及びキットに関するものである。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１１年２月２４日付けで出願された米国仮出願第６１／４４６，３０６号、更には２０１１年５月１３日付けで出願された米国仮出願第６１／４８６，１１８号（どちらも内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は子宮頸がんの最も重大な原因であり、その中の１３タイプがＨＰＶ関連の子宮頸疾患及び子宮頸がんを引き起こす。分子検査を用いた発がん性のＨＰＶ  ＤＮＡのスクリーニングが、ＨＰＶ関連の疾患を診断するのに有用であるとされている。しかしながら、現在の検査方法では、ほとんどのＨＰＶ感染が一過性のものであり自然消退するために、どの感染ががんへと発展し得るかを正確に予測することはできない。そのため、どの感染が進行し、更なる治療を要するかを確認するために、反射アッセイ（reflex assays）における更なるバイオマーカーの使用が検討されている。
【０００４】
疾患の進行が或る特定のＨＰＶ遺伝子の発現に関連している。そのため、ＨＰＶのｍＲＮＡの検出が重症感染症の更なるバイオマーカーとなり得る。診断のために開発された一部のＨＰＶのｍＲＮＡアッセイによって、Ｅ６又はＥ７の腫瘍遺伝子配列といった単一の転写産物種が検出される。これらのアッセイでは、単一種の存在量が、疾患の経過中に起こる複雑な発現パターンによって又は免疫応答によるＨＰＶの分解によって変動し得るため、重症感染症を予測することはできない。さらに、ｍＲＮＡ標的が回収後に分解されるか、又は回収した試料における感染細胞の数が少ない場合があり、これらがアッセイ結果に影響し得る。解決策としては、２種のｍＲＮＡを一定比率で同時に検出するように設計されたＨＰＶアッセイによって、単一のｍＲＮＡ種を検出するアッセイよりも疾患を予測しやすくなる。
【０００５】
また、ＨＰＶ  ＤＮＡは通常、循環したエピソーム状態における増殖感染として１細胞当たり５０〜１００のコピー数に維持される。この状態では、ＨＰＶの腫瘍遺伝子Ｅ６及びＥ７の転写は、Ｅ２タンパク質により厳しく制御されている。Ｅ６及びＥ７はそれぞれｐ５３及びｐＲｂを標的としており、正常な細胞周期を妨げるものである。この転写制御が取り除かれた細胞には、細胞周期への再入が促進されるため、他の細胞を上回る増殖優位性がある。ウイルスが宿主ゲノムへと組み込まれる際に頻繁に起こるＥ２遺伝子の破壊又は欠失は、Ｅ６及びＥ７に対する負のフィードバックを取り除き、テロメラーゼを活性化させ、ｈＴＥＲＴ発現を抑制解除し、このことは明らかに細胞の不死化の進行及び最終的にはがんの進行の一因となる。
【０００６】
特定の核酸配列及び配列の変化の検出及び特徴付けが、感染の指標となるウイルス性又は細菌性の核酸配列の存在、疾患及びがんに関連する哺乳動物遺伝子の変異体又は対立遺伝子の存在を検出するのに、法医学サンプルに見られる核酸源の特定に、並びに父子鑑定に用いられている。正常な生物学的過程に関わるＲＮＡ種の特徴付けは、殆ど知られていない様々な生物学的過程を理解するのに重要であり得る。
【０００７】
ＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、及び他のＲＮＡ）の検出及び特徴付けは、分子生物学、毒物学、及び生化学を含む多くの分野において重要なツールである。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、細胞の必須の機能成分であり、遺伝子発現過程中に、ｍＲＮＡの機能的一本鎖構造が合成され、タンパク質合成における翻訳過程の鋳型中間体として働く。ｍＲＮＡ分子の短時間の存在は、ＤＮＡのＲＮＡ分子への転写から始まり、最終的に分解に終わる。その期間内において、ｍＲＮＡ分子は、翻訳される前にプロセシング、エディティング、及び輸送されることもある。スプライシングは、前ｍＲＮＡを修飾して、イントロンと呼ばれる非コード配列の或る特定のストレッチ（stretches）を除去する過程である。残存するストレッチはタンパク質コード配列を含むものであり、エキソンと呼ばれる。前ｍＲＮＡのメッセージ（messages）は幾つかの異なる方法でスプライシングされることもあり、それにより単一転写産物が複数のタンパク質をコードすることが可能になる。
【０００８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の検出は、ＤＮＡ検出では不可能なウイルス量及び遺伝子発現情報を提供することができるため、診断上非常に重要である。これらの因子によって、疾患の進行及び予後診断に関する手がかりが得られることは多い。現在のｍＲＮＡ検出技術は、複雑であり、汚染の可能性があるといった多くの問題を抱えている。
【０００９】
最も一般的なｍＲＮＡ検出方法としては、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。しかしながら、これらの技法はそれぞれ感度において一定の利点をもたらすが、時間及び材料を必要とする。さらに、全ｍＲＮＡが全ＲＮＡの約１％にすぎず、また任意の特定のｍＲＮＡの割合が極めて少ないため、技法によっては標的ｍＲＮＡの増幅が必要となるものもある。
【００１０】
現在、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡ転写産物を特徴付けるのに広く用いられている。しかしながら、この方法には以下の制限がある：１）限られた数の特異的領域しか同時に増幅することができず、２）突然変異又は選択的スプライシングが、特異的プライマーのＲＮＡ検出能を制限する場合があり、３）連続モードの方法でｍＲＮＡ構造を特徴付けることが困難である。
【００１１】
したがって、所与の核酸がサンプルに存在するか又は存在しないかを決定することができる材料及び方法を有することが有用であると考えられる。さらに、ＨＰＶ  Ｅ２遺伝子を含む遺伝子が宿主細胞において破壊されているか、欠失されているか、又はそうでなければ発現されていないか否かを決定することができる材料及び方法を有することが有用であると考えられる。
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、サンプルにおいて特定の核酸を検出し、それらの核酸が無傷であるか又は破壊されているかを決定するのに有用な核酸及び方法を提供する。
【００１３】
一態様では、配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５パーセントの相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる全長が２００ヌクレオチド以下の単離核酸、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体が提供される。
【００１４】
一態様では、標的ＲＮＡの存在を検出する方法であって、ａ）支持体に結合している少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブを準備することと、ｂ）標的ＲＮＡを上記少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を得ることと、ｃ）標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を単離することと、ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを準備するとともに、該少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブを上記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体とハイブリダイズすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を得ることと、ｅ）抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体を準備するとともに、上記標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を該抗体とインキュベートすることであって、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を得ることと、ｆ）上記抗体を検出することであって、該検出によって上記標的ＲＮＡの存在が示されることと、を含む、方法が提供される。一態様では、抗体は検出可能なマーカーとコンジュゲートし（conjugated）、検出工程はマーカーを検出することを含む。一態様では、検出可能なマーカーは、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼからなる群から選択される。一態様では、検出工程は上記抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体と結合する二次抗体を準備することを含み、該二次抗体は検出可能なマーカーとコンジュゲートし、ここでは上記検出工程はマーカーを検出することを更に含む。一態様では、支持体は磁性ビーズを含む。一態様では、磁性ビーズは少なくとも１つのストレプトアビジン分子とコンジュゲートし、少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブはビオチン分子とコンジュゲートする。一態様では、捕捉プローブ及び／又は増幅プローブの少なくとも１つは、上記された核酸プローブである。
【００１５】
一態様では、少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブ及び少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブが約１５塩基長〜約２００塩基長である。
【００１６】
一態様では、標的ＲＮＡはスプライス変異体であり、少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブ及び少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブは、該スプライス変異体の存在を検出するように選択される。
【００１７】
一態様では、少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブ及び少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブは高リスク型ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、２６、６６、７３、及び８２由来のＲＮＡに相補的である。
【００１８】
別の態様では、ａ）磁性支持体に結合している少なくとも１つのＤＮＡ捕捉プローブと、ｂ）少なくとも１つのＤＮＡ増幅プローブと、ｃ）抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体と、ｄ）検出試薬とを含む、標的ＲＮＡを検出するキットが提供される。一態様では、上記抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体は検出可能なマーカーとコンジュゲートし、上記検出試薬は該検出可能なマーカーの基質を含む。一態様では、キットは、上記抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体と結合する二次抗体を更に含み、該二次抗体が検出可能なマーカーとコンジュゲートし、上記検出試薬は該検出可能なマーカーの基質を含む。
【００１９】
本開示は、検出のための標的ＲＮＡを準備する方法であって、該方法が、標的ＲＮＡを含有する生体サンプルをカルボキシルビーズとインキュベートすることと、ビーズを単離することと、単離ビーズに付着した生体サンプルを溶解することと、溶解した生体サンプルからビーズを単離することとを含み、得られる上清が検出のための標的ＲＮＡを含有する、方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、標的の増幅に依存することのない核酸検出方法が開示される。対象の核酸は、特異的な核酸オリゴヌクレオチドにより捕捉される。シグナル増幅は、後にＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと特異的に結合することができるエンティティを用いて検出される捕捉ＲＮＡ標的（又は逆に標的がＤＮＡである）をカバーするＤＮＡプローブを付加することによりもたらされる。このハイブリッド捕捉アッセイによって、転写産物の量及び長さの両方が増大するにつれて、シグナルの線形増大がもたらされる。結果として、本方法は既存の技術では不可能である欠失の測定に使用することができる。完全な参照核酸セットのシグナル全体と比較して標的核酸の破壊の程度を化学分析することにより、標的が破壊されているか否か、また標的がどの程度破壊されているかを決定することができる。
【００２１】
一態様では、標的の破壊は、サンプルを少なくとも第１の部分と第２の部分とに分離することにより決定される。サンプルの第１の部分を、２セットのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド（一方のセットが標的核酸を含み、もう一方のセットが少なくとも１つの参照核酸を含む）を生成するのに十分な条件下で処理する。次いで、サンプルの第２の部分を、参照核酸を含むが、標的核酸を含まないＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのセットを生成するのに十分な条件下で処理する。次いで、サンプルの第１の部分におけるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの総量を、サンプルの第２の部分におけるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの総量と比較する。標的核酸が喪失している場合、サンプルの第１の部分におけるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと、第２の部分におけるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドとが同量であるはずである。標的核酸の相当部分に特異的な複数のプローブを適用し、プローブを徐々に取り除くことによって、存在する場合に（if any）破壊の程度を決定するという上記方法の変形形態も提示される。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの変化を検出する前に取り除くことのできるプローブが多ければ、標的核酸が破壊されている程度が大きくなる。
【００２２】
別の態様では、Ｅ２遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡが存在しないか又は破壊されているか否かを決定する方法が提供される。このような方法は、とりわけＥ２遺伝子が発現されているか否か、ＨＰＶゲノムが宿主細胞ゲノムに組み込まれているか否かを決定するのに適用することで、ＨＰＶ感染の進行を評価し、及び／又はＨＰＶ感染ががんへと進行する危険性を決定することができる。
【００２３】
本開示の本質、目的及び利点の更なる理解のために、添付の図面と併せて読むことで以下の詳細な説明に言及する。図中、同種の符号は同種の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ビオチン化ＤＮＡプローブ（白色バー）により捕捉される標的ＲＮＡ（斜行平行バー）の概略図である。「Ｂ」はビオチン部を表し、「ＳＡ」はストレプトアビジン部を表し、「ＡＰ」は抗体とコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを表すが、「ＡＰ」は任意の他の適切な検出可能部（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ等）であってもよく、「Ｂ」及び「ＳＡ」は他の連結部に置き換えることができる。
【図２】標的ＲＮＡ（斜行平行バー）を増幅させる必要なくシグナルを「増幅する」ための、ＤＮＡ捕捉プローブ（白色バー）、複数のＤＮＡ増幅プローブ（黒色バー）、及び複数のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド抗体の使用を表す図である。「Ｂ」はビオチン部を表し、「ＳＡ」はストレプトアビジン部を表し、「Ｂ」及び「ＳＡ」はＤＮＡプローブをビーズにコンジュゲートさせる他のコンジュゲーション技術に置き換えることができる。「ＡＰ」は抗体とコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを表すが、「ＡＰ」は任意の他の適切な検出可能部（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ等）であってもよい。
【図３】基質（Ｓ）に結合した様々なＤＮＡ捕捉プローブにより捕捉される標的ＲＮＡ（破線矢印）の図である。さらに、非コンジュゲートＤＮＡ増幅プローブ（黒色バー）と、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド領域を検出し、該領域と結合する複数の抗体（アルカリホスファターゼ又は任意の他の適切な検出可能部、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ等とコンジュゲートしている）とが示される。基質（例えばビーズ）は複数のＤＮＡ捕捉プローブを保有することができ、ＤＮＡ捕捉プローブは同じもの（すなわち同じ配列及び／又は長さ）であってもよく、又は異なるもの（すなわち異なる配列及び／又は異なる長さ）であってもよい。
【図４】ＲＮＡ捕捉後に非ビオチン化ＤＮＡプローブを付加することの効果を示す実験結果を表す図である。この実験では、可変数のビオチン化プローブがストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされていた。標的はＨＰＶ１６のＥ６／７遺伝子転写産物であった。アッセイは、非標識シグナル増幅プローブを付加して（黒色バー）、また付加せずに（白色バー）、各ビーズセットを用いて行った（一工程対二工程アッセイ（one-versus two-step assay））。シグナル増幅工程が付加されなかった場合（白色バー）、シグナルは、捕捉プローブにより与えられるカバレッジの大きさ（amount）に応じて増大した。しかしながら、シグナル増幅プローブが付加された場合（黒色バー）、シグナルは、付加されなかった場合よりも大きかった。シグナル増幅プローブによって、より少ない（３個〜５個の）捕捉プローブでシグナルをより大きくすることが可能となる。
【図５】内因性ハイブリッドが臨床バックグラウンドノイズの原因となることが多いことを示す図である。「ＲＬＵ」＝相対発光量。
【図６】ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）溶液において細胞サンプルを化学分析する際の、アッセイバックグラウンドに対する溶解バッファ（１００％バッファには、約３Ｍ  チオシアン酸グアニジンと約２％界面活性剤とが含まれる）の濃度の影響を示す図であり、溶解バッファの濃度が減少するにつれて臨床バックグラウンドが低減することを実証している。
【図７】細胞ペレットの低張溶解によって、バックグラウンドノイズが低く安定した状態を維持し、またバックグラウンドは用いられる試料量に関わらずほとんど変化しないことを示す図である。「ＰＣ」＝ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）溶液、「ＰＣ（−）」＝ＨＰＶ標的を含まないＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）溶液中で固定された試料（子宮頸部擦過物）プール。
【図８】ＨＰＶ陽性細胞（ＳｉＨａ）由来のＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７の検出限界を示す図である。図８は本開示の方法を使用することで、ＨＰＶ  Ｅ６／７のＲＮＡ検出には、僅か１×１０３個の細胞しか必要としないことを示している。
【図９】ＣＯＯＨビーズにより捕捉される細胞を溶解する能力に関する様々な溶解バッファの試験結果を示す図である。図９のデータは、下記の表１のデータと併せて、好ましい溶解バッファは約１Ｍ  チオシアン酸グアニジン及び約０.７％界面活性剤であることを示している。
【図１０】カルボン酸修飾（carboxylate-modified）（ＣＯＯＨ）磁性ビーズ（Sera Dyn、カタログ番号６５１５−２１０５−０５０３５０）による経時的な細胞捕捉を示す図であり、細胞の約９５％が３０分のインキュベーション後に捕捉されたことが実証されている。
【図１１】ＣＯＯＨビーズ捕捉と低張溶解との比較を示す図であり、細胞からｍＲＮＡを得るのには、ＣＯＯＨビーズ捕捉が低張溶解よりも有効であることが示されている。「ＰＣ−」はＨＰＶが存在しない子宮頸部擦過試料のプールを示す。
【図１２】捕捉プローブとシグナル増幅プローブとの設計領域を示す図である。ＨＰＶ転写産物の長さは、特異的な標的を捕捉する特異的な捕捉オリゴによる磁性ビーズ上への捕捉によって「特徴付け」することができ、ＨＰＶ転写産物はハイブリッド領域の長さを伸ばすのに使用される非標識オリゴヌクレオチドの様々なセットを用いて検出することができる。捕捉ＲＮＡが、使用される捕捉プローブに相補的な配列を保有している場合に、シグナルが得られる。シグナル出力は、最大長に達するまでは増幅シグナルプローブの連続付加に伴い増大し、そこでシグナルはプラトーとなる。ＨＰＶ１６の様々なＨＰＶ転写産物が示されている。破線ボックスにより示された領域はプローブ設計を指定するものである。
【図１３】シグナル増幅プローブの数が増大するにつれてシグナルが増大することを示す図である。このようにして、ＲＮＡ転写産物の長さは、連続的な増幅プローブの数の増大により発生するシグナルの増大により測定することができる。図１３では、５つのオリゴの各セットが互いに隣接しており、それにより連続したセットが付加されるにつれて、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが長くなり、シグナルが大きくなる。
【図１４】初期：後期ＨＰＶ  ｍＲＮＡ比が高い細胞の画分を、低い比の細胞のバックグラウンドに対して検出することができることを示す図である。この図１４では、ＳｉＨａ細胞（子宮頸がん細胞株）を子宮頸部試料（それぞれ、高悪性度のＨＰＶ関連病変と診断されている）のプールに付加した。ＳｉＨａ細胞には、子宮頸がんの一般的特徴である、高いＨＰＶ初期転写産物：ＨＰＶ後期転写産物比が包含される。サンプルは、前がん性病変細胞中にがん細胞を有する試料を模倣したものであった。結果は、本アッセイによってより良性の病変細胞のプールにおいてがん細胞が検出されることを示している。
【図１５】ＬＢＣ臨床試料プールに保存されるＳｉＨａ細胞のＨＰＶ  ＲＮＡの安定性を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲプロットは、６７日にわたってインキュベートされたＳｉＨａ細胞のサンプルに関してＰＣＲサイクル数（ｘ軸）に対してプロットされたアッセイシグナル（ｙ軸）を示している。符号は星形、３日間；四角形、１３日間；三角形、２６日間；黒色の菱形、４２日間；白色の菱形、６７日間である。値は各日の２つの反応の平均である。
【図１６】Ａ）は、ＨＰＶ  ｍＲＮＡのハイブリッド捕捉検出の一般図である。ＨＰＶ  ｍＲＮＡ標的（点線）を捕捉オリゴ（短い灰色のバー）にアニーリングさせ、捕捉オリゴを磁性ビーズ（丸形）と共役させる。ＲＮＡ標的をシグナル増幅オリゴ（短い黒色のバー）にアニーリングさせ、より長いハイブリッドを作製する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをアルカリホスファターゼとコンジュゲートしたハイブリッド捕捉抗体（Ｙ字及びＡＰ符号）と結合させる。化学発光基質（図示せず）を付加して、照度計において複合体を検出する。Ｂ）は、標識遺伝子（大きな灰色の矢印）を含むＨＰＶゲノム構造の概略図を示す。Ｅ６−７プローブ（１）又はＥ２プローブ（２）に対する遺伝子座を、下の黒色のバーで示している。遺伝子の配置及びＤＮＡプローブに対する遺伝子座は、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８とで類似しているが、一次配列は特有のものである。
【図１７ａ】同じ標的入力（コピー数１×１０５、ＨＰＶ１６  Ｅ６−７のｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ）での１アッセイ当たりの相補的シグナル増幅プローブの数に対する発光シグナル出力（平均ＲＬＵ、ｎ＝４）の依存性を示す図である。この実験では、５個、１０個及び１５個のプローブを付加することで、ウェル内のハイブリッドの長さが増大した。１５個の相補的プローブに５個の非相補的プローブを付加してもウェルにおいてシグナルは増大しなかった（５＋１５で示される）。
【図１７ｂ】ハイブリッド捕捉アッセイでの標的入力（１反応当たりのＲＮＡコピー数）に対する発光シグナル出力（平均ＲＬＵ、サンプル数ｎ＝３、誤差バーは標準偏差を示す）の依存性を示す図である。シグナル：ノイズ比はバーの上に与えられる。
【図１８ａ】ＨＰＶ１６  Ｅ６−７（灰色のバー）及びＥ２（黒色のバー）（別々のウェルで２回のアッセイ）に関してプロットした１アッセイ当たりのＳｉＨａ細胞の数に対するシグナル：ノイズ（平均、ｎ＝３）の依存性を示す図である。これらのアッセイでは、標的を付加しない対照アッセイ由来のシグナルからおよそ５０ＲＬＵのバックグラウンドノイズが得られた。
【図１８ｂ】ＨＰＶ  Ｅ６−７及びＥ２のｍＲＮＡアッセイに関するシグナル：ノイズの値を示す図である。これらの値は、比としてがん細胞株であるＳｉＨａ、Ｃａｓｋｉ及びＨｅＬａに関してプロットした。バーは３回の反復実験の平均比を表す。
【図１９】ＳｉＨａ細胞とＨＰＶ陽性試料のプールの細胞との混合物におけるＨＰＶ１６  Ｅ６−７：Ｅ２転写産物の比の検出を示す図である。培養したＳｉＨａ細胞をＨＰＶ陽性の液状化細胞診断試料（２ｍｌ中、およそ１０００００個の総細胞数）のプール（２ｍｌ）と混合した。
【図２０】子宮頸部試料におけるＨＰＶ１６  Ｅ６−７：Ｅ２比を示す図である。Ｅ６−７：Ｅ２比をハイブリッド捕捉アッセイ結果からプロットした。
【図２１】Ｅ２遺伝子発現が存在しないか又は破壊されているか否かを決定する方法を示す図である。
【図２２】ＳｉＨａ細胞及びＷ１２細胞におけるＥ２遺伝子発現の完全性の比較を示す図である。
【図２３】ＬＳＩＬサンプル及びＨＳＩＬサンプルにおけるＥ２遺伝子発現の完全性の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示を更に説明する前に、本開示は下記の本開示の特定の態様に限定されず、そのため特定の態様の変形形態を作製することができ、それらの変形形態も添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。用いられる専門用語は特定の態様を説明するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解される。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈上特に明示のない限り、数量が特定されていないものは、単数及び複数を包含することを意図される（the singular forms "a," "an," and"the" include plural reference）。特に規定のない限り、本明細書において用いられる技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２７】
ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８とハイブリダイズすることができる単離核酸及びプローブ
２００以下のヌクレオチドからなり、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズすることができる核酸が本明細書で与えられる。
【００２８】
一態様では、核酸は、配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる態様では、核酸は、配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体を含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。
【００２９】
一態様では、核酸は、ストリンジェントな条件下で、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８ゲノム又はそれら由来の核酸と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一な核酸とハイブリダイズすることができるものである。例示的なＨＰＶ１６ゲノムの配列はＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿０１５２６（配列番号１０６）に開示されている。例示的なＨＰＶ１８ゲノムの配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ０５０１５（配列番号１０７）に開示されている。
【００３０】
別の態様では、核酸は、ＨＰＶ１６若しくはＨＰＶ１８のｍＲＮＡ、又はそれらの相補体と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一な核酸とハイブリダイズ又は結合することができるものである。別の態様では、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のｍＲＮＡは、Ｅ２及びＥ６／Ｅ７のｍＲＮＡからなる群から選択される。
【００３１】
本目的では、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間に２５％以下のミスマッチが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、より正確な定義付けのために特定のレベルのストリンジェンシーに分けることができる。ゆえに、本明細書で使用される「低（moderate）ストリンジェンシー」条件は、２５％を超える配列ミスマッチでは分子がハイブリダイズしない条件であり、「中等度の（medium）ストリンジェンシー」条件は、１５％を超えるミスマッチでは分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」条件は、１０％を超えるミスマッチでは配列がハイブリダイズしない条件である。「超高ストリンジェンシー」条件は、６％を超えるミスマッチでは配列がハイブリダイズしない条件である。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook他（編）, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 1989, chapters 9 and 11（引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）にも述べられている。
【００３２】
一態様では、本明細書に開示される単離核酸を少なくとも１つ含むプローブセットが提供される。例示的なものであり、これに限定するものではないが、プローブセットは、配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる単離核酸、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体を含み得る。更なる態様では、プローブセットは、配列番号１〜配列番号１０５及び配列番号１１１〜配列番号３０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる単離核酸、そのＲＮＡ相当物、及びその相補体を含み得る。単離核酸は、非修飾プローブとして与えられてもよく、又は修飾されていてもよい。例示的なものであり、これに限定するものではないが、修飾が、例えばリガンド及び／又は検出可能な標識の付加による、プローブ及び該プローブがハイブリダイズした核酸の単離及び／又は検出を容易にすることがある。一態様では、プレート、チューブ、ビーズ、マイクロチップ、又は他の固体表面等の固体支持体に結合したプローブを提供することができる。
【００３３】
ＨＰＶのｍＲＮＡを同定する方法
本開示の方法を用いて、サンプル由来の標的核酸の存在を検出することができる。このような核酸はＲＮＡとすることができ、このようなサンプルとしては、生体サンプル及び環境サンプルを含む試料又は培養物（例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物）が挙げられるが、これらに限定されない。生体サンプルは、真核生物、原核生物、古細菌、ウイルス、ヒトを含む動物、植物、真菌、エクスカバータ（excavata）由来のものとすることができ、流体、固体（例えば糞便）又は組織、細胞培養物、液体培地又は固体培地、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体及び固体の食品及び飼料品及び原料、並びに廃棄物とすることができる。環境サンプルとしては、地表物質、土壌、水、空気、及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品加工及び乳加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て品及び廃棄不要品から得られるサンプルが挙げられる。子宮頸部上皮細胞（例えば子宮頸部スワブ又は生検試料から得られるサンプル）、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、唾液及び精液を含むが、これらに限定されない生体サンプルが特に好ましい。サンプルは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むリボ核酸を含み得る。
【００３４】
本開示は、サンプルにおいて標的ＲＮＡの存在を決定する方法であって、ａ）標的ＲＮＡを標的ＲＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズして、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を形成することであって、ＤＮＡ捕捉プローブが支持体にコンジュゲートしていることと、ｂ）非結合ＲＮＡから標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を（例えば洗浄によって）分離することと、ｃ）任意で標的ＲＮＡに相補的な配列を有する少なくとも１つの増幅プローブを標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体とハイブリダイズすることであって、それにより標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を形成することと、ｄ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識し、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと結合する抗体を加えて、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体と結合することにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を形成することであって、抗体が検出可能なマーカーで標識されていることと、ｅ）上記抗体上のマーカーを検出することであって、検出によって標的リボ核酸の存在が示されることと、ｆ）検出結果を増幅プローブの様々な組合せから得られた結果と比較することであって、比較によって特定のＲＮＡスプライシング型が存在することが示されることとを含む、方法を提供する。
【００３５】
本開示は、サンプルにおいて標的ＲＮＡの存在を決定する方法であって、ａ）標的ＲＮＡを標的ＲＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズして、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を形成することであって、ＤＮＡ捕捉プローブが支持体にコンジュゲートしていることと、ｂ）非結合ＲＮＡから標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を分離することと、ｃ）任意で標的ＲＮＡに相補的な配列を有する少なくとも１つの増幅プローブを標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体とハイブリダイズすることであって、それにより標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体を形成することと、ｄ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識し、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと結合する抗体を加えて、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉／増幅プローブ複合体と結合することにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｅ）一次抗体を認識して、該一次抗体と結合する二次抗体を付加することであって、二次抗体が検出可能なマーカーで標識されていることと、ｆ）二次抗体上のマーカーを検出することであって、検出によって標的リボ核酸の存在が示されることと、ｇ）検出結果を増幅プローブの様々な組合せから得られた結果と比較することであって、比較によって特定のＲＮＡスプライシング型が存在することが示されることとを含む、方法を提供する。
【００３６】
本開示は、サンプルにおいてリボ核酸（ＲＮＡ）スプライシング型の存在を検出する方法であって、ａ）プローブと標的リボ核酸とがハイブリダイズする条件下で、標的ＲＮＡを、標的ＲＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズすることにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を形成することと、ｂ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識して、該ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと結合する一次抗体を付加して、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体と結合することにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ：抗体複合体を形成することであって、一次抗体が支持体にコンジュゲートしていることと、ｃ）非結合ＲＮＡから標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ：抗体複合体を分離することと、ｄ）標的ＲＮＡに相補的な配列を有し、特異的な標的ＲＮＡ領域をカバーする組合せで付加される少なくとも１つの増幅プローブを標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ：抗体複合体とハイブリダイズすることにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｅ）ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を認識して、該ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖と結合する二次抗体を付加して、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体と結合させ、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体（複数）複合体を形成することであって、二次抗体が検出可能なマーカーで標識されていることと、ｆ）上記二次抗体上のマーカーを検出することであって、検出によって標的ＲＮＡの存在が示されることと、ｇ）検出結果を増幅プローブの様々な組合せにより得られる結果と比較することであって、比較によって特定のＲＮＡスプライシング型が存在することが示されることとを含む、方法も提供する。
【００３７】
本開示は、サンプルにおいてリボ核酸（ＲＮＡ）スプライシング型の存在を検出する方法であって、ａ）プローブと標的リボ核酸とがハイブリダイズする条件下で、標的ＲＮＡを、標的ＲＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡ捕捉プローブとハイブリダイズすることにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体を形成することと、ｂ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識して、該ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと結合する一次抗体を付加して、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体と結合することにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ：抗体複合体を形成することであって、一次抗体が支持体にコンジュゲートしていることと、ｃ）非結合ＲＮＡから標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ：抗体複合体を分離することと、ｄ）標的ＲＮＡに相補的な配列を有し、特異的な標的ＲＮＡ領域をカバーする組合せで付加される少なくとも１つの増幅プローブを標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ：抗体複合体とハイブリダイズすることにより、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｅ）ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を認識して、該ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖と結合する二次抗体を付加して、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体複合体と結合させ、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体（複数）複合体を形成することと、ｆ）非結合二次抗体から標的ＲＮＡ：ＤＮＡ：抗体（複数）複合体を分離することと、ｇ）二次抗体及び／又は一次抗体を認識して、該二次抗体及び／又は一次抗体と結合する、検出可能なマーカーで標識された三次抗体を付加することと、ｈ）三次抗体上のマーカーを検出することであって、検出によって標的ＲＮＡの存在が示されることと、ｉ）検出結果を少なくとも１つの増幅プローブの様々な組合せにより得られる結果と比較することであって、比較によってＲＮＡスプライシング型が存在することが示されることとを含む、方法も提供する。
【００３８】
ＲＮＡは、異なるプロモータから転写され、スプライシングされることで、異なる遺伝子をコードする領域を含む多くの形態が得られる。基礎研究及び特定のｍＲＮＡアイソフォームの検出が重要である応用において、ＲＮＡのこれらの多くのスプライシング型を特徴付けることは重要である。
【００３９】
本開示の一応用が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）におけるｍＲＮＡ発現の検出及び特徴付けである。子宮頸部の癌は、高リスクＨＰＶ型の存在（現在、約１３〜約１８の高リスク型が同定されている）に関連することが分かっている。ＨＰＶ  ＤＮＡ試験は、高リスクＨＰＶ型を同定することができるが、前がん性臨床試料においては疾患の進行に対する不良の予測因子である。したがって、ＨＰＶ試験の予測値を改善するのに、追加的な方法及びマーカーが必要とされる。本開示によって提供される、Ｅ６／７腫瘍遺伝子及び他のｍＲＮＡの存在についてのｍＲＮＡの特徴付けは、他のウイルス遺伝子に対するこれらの腫瘍遺伝子の発現の比を決定する正確かつ信頼できる方法を提供することになる。Ｅ２、Ｅ４、及び／又はＬ１  ｍＲＮＡに対するＥ６／Ｅ７  ｍＲＮＡの比は、前がん性子宮頸部病変の進行に対するより良好な予測因子であり得る（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第６，３５５，４２４号を参照されたい）。ハイブリッド捕捉技術は線形シグナル増幅法である。したがって、本開示は、コルポスコピーを要する患者数を最小限に抑えながら、治療戦略を導くための貴重な方法を提供する。本開示は、スプライシング型を特徴付けるための、異なる長さ／遺伝子のＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）とハイブリダイズすることができる短いオリゴヌクレオチドの混合物を使用する方法を提供する。
【００４０】
標的核酸
一態様では、検出対象の標的リボ核酸は、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核小体ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、異種核ＲＮＡ等であってもよく、ここで１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡプローブである。標的リボ核酸は、生体サンプル及び環境サンプルを含む、試料又は培養物（例えば、細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物）中に見出される核酸を含むが、これに限定されない。標的リボ核酸は、ヒトを含む動物由来の生体サンプル、流体、固体（例えば糞便）又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体及び固体の食品及び飼料品及び原料、並びに廃棄物中に見出され得る。標的リボ核酸は、環境サンプル中に見出される場合があり、環境サンプルは地表物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品加工及び乳加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て品及び廃棄不要品から得られるサンプルを含む。特に好ましいものは、子宮頸部サンプル（例えば子宮頸部スワブから得られるサンプル）、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、唾液、尿及び精液を含むが、これらに限定されない生体サンプルを含むが、これらに限定されない生体サンプル中に見出される標的核酸である。
【００４１】
他の態様では、標的リボ核酸は、ウイルス、細菌、マイコバクテリウム又はプラスモジウム、例えば、これらに限定されることを意図しないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、クラミジア種（Chlamydiaspp.）、ナイセリア種（Neisseria spp.）（例えば淋菌（N. gonorrhea））、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、マイコバクテリウム（例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis））、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、又はオルソミクソウイルス科（Orthomixoviridae）（例えばインフルエンザウイルス）に由来する。
【００４２】
一態様では、標的リボ核酸は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり、ＨＰＶの遺伝的変異体を含む。変異体は、標的核酸の多型、突然変異体、誘導体、修飾体、改変体、又はそれに類する形態を含む。一態様では、標的核酸は、ＨＰＶ核酸である。別の態様では、ＨＰＶ核酸は、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡである。別の態様では、標的核酸は、高リスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、２６、６６、７３、及び８２である。
【００４３】
ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出（例えば、ＴＲＩ試薬としても知られるＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬を用いる）、低張溶解、及びカルボキシル（ＣＯＯＨ）ビーズ捕捉を含む（がこれらに限定されない）種々の方法及び試薬によるハイブリダイゼーションのために単離及び調製され得る。ＲＮＡ単離の原理は、細胞／組織溶解、その後の抽出、沈降、及び洗浄に基づく。これらの技法は、非常に有効であるが、高レベルの技術的精度を必要とし、自動化の候補とはならない。他のＲＮＡ調製方法は、ＤＮＡ及び他の潜在的な汚染物質を完全に除去することはなく、高価な酵素を必要とし、また多くの（場合によって時間のかかる）洗浄工程を必要とする。課題は、現在の課題の多くを軽減し、特定遺伝子の発現についての迅速な情報を提供し得るｍＲＮＡ検出方法を開発することである。本開示においては、２つの一次サンプルの調製方法、すなわち低張性細胞溶解及びカルボキシルビーズ捕捉が考案されている。また、ＴＲＩｚｏｌ（商標）又はＱＩＡＧＥＮ樹脂技術（例えば、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いて単離されたＲＮＡをこのアッセイに使用することができる。
【００４４】
或る特定の態様では、生体サンプルは、子宮頸部細胞、特にヒト子宮頸部細胞からなる。サンプルは、Ｄａｃｒｏｎ（商標）（ポリ（エチレンテレフタレート））付きスワブ（tipped swab）等の化学的に不活性な回収デバイスを含む、当該技術分野で既知の任意の方法又はデバイスを用いて回収することができる。綿棒、子宮頸部ブラシ、フロックスワブ（flocked swab）（Ｄａｃｒｏｎ（商標）スワブ様形状であるが、より多くの細胞の回収及び細胞のより容易な放出を可能にするナイロン繊維製のスワブ）、子宮頸部ブルーム、ミニブルーム（mini broom）、洗浄、又はＰＡＰ塗抹試験（パパニコロー試験）で使用されることが多い任意の回収デバイスを含むが、これらに限定されない他の許容可能な回収デバイスを使用することができる。子宮頸部細胞は生検試料の一部であってもよい。
【００４５】
サンプル調製
ＲＮＡを単離するためのＴＲＩｚｏｌ（商標）の使用、及び他の既知のＲＮＡ単離方法を、本開示の方法に用いることができる。細胞ペレットの低張溶解によるサンプル調製は、アッセイ検出工程と干渉する可能性がある内因性ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの放出を低減するものであり、また好ましいＲＮＡ単離方法である。このサンプル調製方法では、細胞は遠心分離を介してペレット化され、上清は除去され、ペレットは再懸濁され、細胞は溶解される。溶解後、細胞残屑はペレット化され、（ＲＮＡを含有する）上清は回収される。（バッファ中の塩及び界面活性剤濃度によって測定される）溶解のストリンジェンシーが低下することにより、メタノールベースの子宮頸部試料のプールから生成される臨床バックグラウンドが低減される（図５及び図６）。また、シグナル：ノイズ比は上昇し、プール間のバックグラウンド及び干渉における変動性は低下する。他の試験によると、低張溶解は、細胞と環境との間の張性の差異により細胞膜を破裂させることによって作用し、細胞を巨大分子に対して透過性にさせることが分かっている。したがって、細胞内のＲＮＡは、細胞から溶液中に放出される一方、アッセイに対する汚染物質（例えば内因性ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド）は、不溶性細胞残渣中に残存することになる。この方法は、試料中のＲＮＡの量が限られている場合、試料の量の増加がバックグラウンドの増大を引き起こさないことから、有用であり得る。
【００４６】
別のサンプル調製方法は、ＤＮＡ単離のために細胞を濃縮するのに生体サンプルに直接付加することができる磁性カルボキシル（ＣＯＯＨ）ビーズを使用する。サンプル中の細胞は、疎水相互作用を介してビーズに引き付けられる。磁性ラックを使用し、ビーズをペレット化した後、上清を除去し、細胞を溶解することができる。磁性ラックを介したペレット化の代わりに遠心分離を用いることで、非磁性ＣＯＯＨビーズ又は他の吸着粒子（adsorptiveparticles）を使用することもできる。（通常６５℃で１５分間行われる）溶解後、ビーズを再びペレット化し、残留上清を、本開示の方法に直接使用することができる。この方法においても溶解ストリンジェンシーが低下することにより、バックグラウンドが低減されるが、水単独では、細胞からＲＮＡを放出するのに不十分である。そのため、本開示の全てのサンプル調製方法において、約１Ｍチオシアン酸グアニジン及び約０．７％界面活性剤を含む溶解バッファを使用することは好ましい（例えば、図５及び図６を参照されたい）。
【００４７】
ハイブリダイゼーション／捕捉−捕捉プローブ
サンプルが調製され、標的ＲＮＡが放出された後、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブがサンプル中の標的ＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、該標的ＲＮＡを少なくとも１つのポリヌクレオチドＤＮＡ捕捉プローブに接触させる。ＤＮＡ捕捉プローブは、完全長ＤＮＡ、切断ＤＮＡ、又は合成ＤＮＡとすることができる。ＤＮＡ捕捉プローブは、標的ＲＮＡに特異的な配列である。ＤＮＡ捕捉プローブは、理想的には約２５塩基長〜３５塩基長であり、かつ標的ＲＮＡの任意の領域に相補的であり得る。ＤＮＡ捕捉プローブは、約１５塩基長〜約２００塩基長の範囲であり得る。他の態様では、捕捉プローブは、１００ヌクレオチド長以下又は５０ヌクレオチド長以下であり得る。更に別の態様では、捕捉プローブは、２０塩基長〜１００塩基長、２５塩基長〜１００塩基長、３０塩基長〜１００塩基長、３５塩基長〜１００塩基長、４０塩基長〜１００塩基長、４５塩基長〜１００塩基長、又は５０塩基長〜１００塩基長であり得る。
【００４８】
例示的なものであり、これに限定するものではないが、捕捉プローブは、配列番号１〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。更なる態様では、捕捉プローブは、配列番号１〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。一態様では、配列番号１〜配列番号１０からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉プローブを含む、ＨＰＶ１６に特異的な捕捉プローブセットが提供される。一態様では、配列番号１１〜配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉プローブを含むＨＰＶ１８に特異的な捕捉プローブセットが提供される。
【００４９】
ＤＮＡ捕捉プローブは支持体に結合されていてもよい。「結合される（Bound）」は、化学的に付着される、共有結合される（covalently bound）、また共有結合的に連結される（covalently linked）を含むが、これらに限定されない。図３に概略的に示されるように、複数のＤＮＡ捕捉プローブ及び複数の異なるＤＮＡ捕捉プローブが、同じ支持体（例えば、同じ磁性ビーズ）に結合されていてもよい。最適な結果を得るのに必要なのは、僅か３個〜５個の異なる捕捉プローブであるため（図４を参照されたい）、これらのプローブが、配列特異的でありかつ一部の変異体内でスプライシングによって取り除かれ得る（spliced out）領域に含まれないような非常に高い柔軟性が提供される。一態様では、配列特異的なＤＮＡ捕捉プローブは、ビオチン化され、また、磁性ストレプトアビジンビーズへのコンジュゲーションによって結合されている。捕捉プローブは、スプライシング部位に架橋する単一のオリゴを含む場合、特定のスプライシング型を単離することができる。
【００５０】
支持体としては、ビーズ、磁性ビーズ、カラム、プレート、濾紙、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、及びディップスティックが挙げられるが、それらに限定されない。液相の抽出を可能にし、かつ結合捕捉プローブ又は抗体と非結合捕捉プローブ又は抗体とを分別する能力を提供するものであれば、いずれの支持体を使用してもよい。磁性ビーズは、磁場の適用によってビーズが適所に保持されている場合、溶液中に残存可能であり、かつ液相を抽出又はデカンテーションすることができるという点で特に有用である。小型でありかつ表面積が大きいビーズ、例えば直径が約１μｍのビーズが好ましい。或る特定の態様では、支持体は、標的ｍＲＮＡに相補的でかつ特異的なＤＮＡ捕捉プローブでコーティングされているか、又は標的ｍＲＮＡに相補的でかつ特異的なＤＮＡ捕捉プローブが付着されている、修飾磁性ビーズを含む。磁場を用いて、非結合リボ核酸から二本鎖核酸／磁性ビーズ複合体を分離する。特定の態様では、支持体は、ビーズを、二本鎖ハイブリッド核酸に対して免疫特異的な一次抗体でコーティングすることによって修飾されている修飾磁性ビーズを含む。磁場を用いて、非結合リボ核酸から核酸ハイブリッド／抗体／磁性ビーズ複合体を分離する。電荷スイッチング（charge switching）又はシリカ捕捉（磁場に対抗する）を用いる他のビーズを同様に使用してもよい。別の態様では、検出能のある磁性ビーズ（例えば磁性Ｌｕｍｏｎｅｘビーズ）が、特定のスプライシング型を捕捉し、検出することができる。
【００５１】
上記のような標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの捕捉後、捕捉された標的ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、磁場の適用（磁性ビーズの場合）、及び捕捉されなかった核酸を洗い流すことにより、サンプルの残りから分離することができる。望ましくない干渉物質を洗い流すことは、様々な温度で使用される、塩及び／又は界面活性剤を含有するバッファを用いて実行することができる。磁性ビーズ以外の支持体を使用する場合、洗浄を含むが、これに限定されない、捕捉されたハイブリッドをサンプルの残りから分離する代替的な方法が行われる。二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡのｄｎアーゼ等の酵素過程を使用して、標的ＲＮＡの単離を促進することができる。
【００５２】
ハイブリダイゼーション／捕捉−増幅プローブ
洗浄工程によって標的のみを残存させた後、シグナル増幅ＤＮＡプローブは、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし、ここでシグナル増幅プローブは、標的ｍＲＮＡに対して相補的及び／又は特異的な非標識ＤＮＡプローブである。増幅プローブは、標的核酸に特異的である必要がない。例えば、ＤＮＡ増幅プローブは、設計された標的以外の他の核酸と結合することができる場合がある。ｍＲＮＡ領域に相補的なＤＮＡシグナル増幅プローブは、特異的遺伝子をカバーする混合物中で設計され、結合される。カバレッジを拡大し、変化させることにより、どの遺伝子が存在し、ＲＮＡの特定のスプライシング型があるかを判定することができる。「カバレッジ」は、相補的シグナルプローブによって挟まれた標的配列の範囲又は長さとして定義される。シグナル増幅プローブは、約４０塩基長であるが、それらが捕捉プローブの周囲に設計されることから、４０塩基より増減する場合もある。シグナル増幅プローブは、約１５塩基長〜約２００塩基長であり得る。更に他の態様では、シグナル増幅プローブは、２０塩基長〜１００塩基長、２５塩基長〜１００塩基長、３０塩基長〜１００塩基長、３５塩基長〜１００塩基長、４０塩基長〜１００塩基長、４５塩基長〜１００塩基長、又は５０塩基長〜１００塩基長であり得る。カバレッジを増大させること（すなわち、より多くのシグナルプローブを標的ＲＮＡの相補的領域とハイブリダイズさせること）により、シグナルが増大することになる。したがって、増幅シグナルを得るのに、より多くのプローブを使用することが好ましい。検出限界は、部分的には、標的核酸（すなわち標的遺伝子）の長さに依存する。
【００５３】
例示的なものであり、これに限定するものではないが、増幅プローブは、配列番号２１〜配列番号１０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。更なる態様では、増幅プローブは、配列番号２１〜配列番号１０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、それから本質的になる。一態様では、配列番号２１〜配列番号６２からなる群から選択される少なくとも１つの増幅プローブを含む、ＨＰＶ１６に特異的な増幅プローブセットが提供される。一態様では、配列番号６３〜配列番号１０５からなる群から選択される少なくとも１つの増幅プローブを含むＨＰＶ１８に特異的な増幅プローブセットが提供される。
【００５４】
増幅シグナルプローブは、既知のＲＮＡスプライシング型の遺伝子配列全体に広がるような組合せで付加される。シグナル増幅プローブを組み合わせることで、標的ｍＲＮＡ上のカバレッジの程度、ひいてはシグナル出力が決定されることになる。増幅プローブの異なる組合せから得られるシグナル出力の比較により、特定のｍＲＮＡスプライシング型変異体の存在が示されることになる。このように、この方法は、シグナル出力が、存在するスプライシング型に依存する点で「分子定規（molecular ruler）」である。例えば、捕捉プローブ３は、Ｅ６／７標的ｍＲＮＡとハイブリダイズするが、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｌ１、又はＬ２とハイブリダイズしないことが想定される（例えば、表３及び図１２を参照されたい）。シグナル増幅プローブ１及びシグナル増幅プローブ６は、捕捉プローブ３とのハイブリダイゼーション後に使用されると、スプライシングＥ６／７型から強いシグナル、またスプライシング／組込みＥ６／７型から弱いシグナルが発生することになる。捕捉プローブ及び増幅プローブの組合せ及び数を変化させることにより、シグナル出力は、どのウイルス遺伝子が発現しているかに関する情報（例えばその比）に加え、これらの遺伝子のどのスプライシング型が発現されているかに関する情報を提供する。このような情報は、臨床データ及び実験データと併せると、前がん性子宮頸部病変の進行に対するより良好な予測因子を提供することが期待される。
【００５５】
ｍＲＮＡレベルの測定による細胞内での遺伝子発現の特徴付けは、細胞に病原体が感染しているか否か、及び疾患の進行状態を判定するのに有用なツールである。
【００５６】
本開示は、既知及び未知のスプライシング型変異体における遺伝子転写産物の長さを決定する方法を提供する。選択的にスプライシングされた転写産物の発現を測定するための信頼できるロバストな方法は、各変異体の有意性を研究する上で重要な工程である。これまで、スプライス変異体の正確な定量、例えばノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、従来の方法に特有の制限に起因し、面倒で困難なものであった。本開示は、スプライシング型変異体の存在を決定する方法を提供する。例えば、初期ＨＰＶ転写産物（例えばＨＰＶ  Ｅ６＊Ｉ）が後期遺伝子配列を有するか否かについての疑問は、転写産物を初期領域に相補的な捕捉プローブで捕捉し、次いで後期領域に相補的な増幅プローブで検出することによって判定することができ、得られたシグナルは、初期遺伝子転写産物上での後期領域の存在を示し得る。さらに、予測されるスプライシング型配列をカバーする縮重シグナル増幅プローブの組合せを提供することにより、スプライス変異体の存在は決定され得る。さらに、領域が存在しないことは、選択した（selected）ＤＮＡプローブによる捕捉の欠如によって示され得る。
【００５７】
得られるハイブリッドは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識する分子を使用して捕捉／検出される。二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これに限定されないがＲＮアーゼＨ等のタンパク質、アプタマーを含むが、これに限定されない核酸、又は配列特異的な核酸が挙げられるが、それらに限定されない。アプタマーは、特定の標的分子と結合する短いオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、ランダム配列の大きなプールから選択することによって作製されることが多いが、天然アプタマー（例えばリボスイッチアプタマー）は既知である。
【００５８】
ハイブリダイゼーション／捕捉−抗ハイブリッド抗体
一態様では、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗体（「抗ハイブリッド抗体」）である。ハイブリッドは、二本鎖核酸ハイブリッドとの結合を可能にするのに十分な時間、抗ハイブリッド抗体とインキュベートする。抗ハイブリッド抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよい。最も好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００５９】
別の態様では、一次抗体が支持体に結合される。この態様では、サンプルが調製され、ＲＮＡが放出された後、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブをサンプル中の標的ＲＮＡとハイブリダイズするのに十分な条件下で、サンプルを少なくとも１つのポリヌクレオチドＤＮＡ捕捉プローブと接触させ、二本鎖核酸ハイブリッドを形成する。標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉プローブ複合体の形態で、非結合ＲＮＡから洗浄によって分離される。洗浄工程によって残存するＲＮＡを標的ＲＮＡのみとした後、シグナル増幅ＤＮＡプローブを標的ＲＮＡとハイブリダイズし、ここでシグナル増幅プローブは、標的ＲＮＡに対して相補的及び／又は特異的な非標識ＤＮＡプローブである。捕捉プローブ及び増幅プローブと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、二本鎖核酸ハイブリッドが作製される。得られたハイブリッドは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識する分子を使用して検出される。好ましい態様では、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗体（「抗ハイブリッド抗体」）である。二本鎖核酸ハイブリッド領域との結合を可能にするのに十分な時間、ハイブリッドを抗ハイブリッド抗体とインキュベートする。抗ハイブリッド抗体は、支持体にコンジュゲートされ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドとの結合によって、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド：抗体複合体が形成する。複合体は非結合抗体から分離される。支持体が磁性ビーズである用途では、磁場を使用して、任意の非結合抗体が分別される。
【００６０】
検出
非結合抗ハイブリッド抗体が除去された後、二次抗体が付加され、ここで二次抗体は、検出可能なマーカーで標識され、一次抗体を認識するとともに一次抗体と結合する。二次抗体上に存在する標識が検出され、それにより標的リボ核酸の存在が示される。様々な標識を検出するための方法が当該技術分野で既知である。例えば、比色定量法、放射性、表面プラスモン共鳴、又は化学発光法については、例えば、Coutlee他、J. Clin. Microbiol. 27:1002-1007(1989)に記載されている。
【００６１】
例えば、少なくとも１つのアルカリホスファターゼ分子とコンジュゲートした抗体は、例えば、Ｅ／Ｌｕｍｉｎａ（商標）照度計（Source Scientific Systems, Inc.(Garden Grove, CA)）、Ｏｐｔｏｃｏｍｐ  Ｉ（商標）照度計（MGM Instruments(Hamden, CT)）等の検出器を使用する、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ（商標）５３０試薬（Lumigen(Detroit, MI)）又はＤＲ２（AppliedBiosystems(Foster City, CA)）等の試薬を用いた化学発光により検出することができる。本明細書中に記載のように、二次抗体上の標識の検出は、サンプル中での、１つ又は複数のプローブに相補的な１つ又は複数の標的リボ核酸の存在の指標となる。洗浄後、サンプルは、例えば、二次抗体上の標識に対する基質を含有する検出バッファ中に懸濁される。
【００６２】
下記の本アッセイでは、抗ハイブリッド抗体を使用し、及び／又は磁性ビーズとカップリングし、及び／又は支持体上に固定化することができる。好ましい態様では、標的核酸の捕捉及び検出に使用される抗体はモノクローナル抗体である。一次抗体及び二次抗体は、捕捉及び検出において同じであってもよく（すなわち同じハイブリッド骨髄腫細胞株によって産生されてもよく）、又は異なっており、異なるハイブリッド骨髄腫細胞株によって産生されてもよい。最も好ましい態様では、捕捉及び／又は検出に使用される一次モノクローナル抗体及び二次モノクローナル抗体は、同じであり、またＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的である。また、抗体の結合領域を含有していれば、二本鎖ハイブリッドに特異的な抗体の免疫断片又は誘導体も含まれる。
【００６３】
例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドで免疫付与された脾臓細胞と融合された骨髄腫細胞に由来するモノクローナルＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体を使用することができる。ハイブリッド特異抗体は、例えば、Kitawaga他、Mol. Immunology, 19:413(1982)、及び米国特許第４，７３２，８４７号（これらの各々は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のように、固体支持体上に固定化されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対する親和性精製によって精製することができる。
【００６４】
例えば、ライブラリーから組換え抗体（例えば、一本鎖Ｆｖ若しくはＦａｂ、又は他のその断片）を選択するか、又はヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫付与に依存する方法を含む、ヒト抗体又は人工抗体を含む抗体を産生又は単離する他の好適な方法を使用することができる（例えば、Jakobovits他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551(1993)、Jakobovits他、Nature,362:255(1993)、及び米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５４５，８０７号を参照されたい）。
【００６５】
更に別の態様では、本開示は、生体サンプル又は核酸を含有するサンプル中でのリボ核酸の検出を可能にするキットを提供する。好ましい態様では、キットは、ａ）磁性ビーズにコンジュゲートされたＤＮＡ捕捉プローブと、ｂ）ＤＮＡ増幅プローブと、ｃ）抗ハイブリッド一次抗体と、ｄ）一次抗体と結合しかつ検出可能に標識された二次抗体を含む検出試薬と、ｅ）界面活性剤ベースの洗浄バッファと、ｆ）二次抗体上の標識に対する基質を含む第２の検出試薬とを含む。好ましい界面活性剤ベースの洗浄バッファは、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００６６】
或る特定の態様では、本開示の検出方法では、まず標的を、磁性ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされている相補的ビオチン化ＤＮＡプローブ上に捕捉することにより、ＲＮＡが検出される。このプローブ−ビーズ複合体は、予めコンジュゲートされていてもよく、４℃で数か月間安定である。この捕捉工程は、好ましくは、常に振盪しながら６０℃で行われ、約３０分間（捕捉させるのに十分な時間）進行させる。次いで、捕捉された標的を含むビーズは、任意の非標的ＲＮＡ配列が除去されるように洗浄する。ハイブリッド捕捉抗体が個別のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと結合することから、標的領域をＤＮＡ増幅プローブでカバーし、最大シグナルを得ることが好ましい（図１及び図２を参照されたい）。そのため次いで、更なるプローブを標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。この時点で標的のみが捕捉されていることから、これらのプローブは配列特異的である必要がなく、特異的なビオチン化プローブによって既にカバーされている領域を除く、遺伝子の完全長をカバーすることができる。シグナル増幅プローブは、ｍＲＮＡ領域に相補的であり、特異的遺伝子をカバーする混合物中で設計され、結合される。カバレッジを拡大し、変化させることにより、特定の遺伝子及び特定のスプライス変異体を決定することができる。これらの「シグナル増幅」プローブは４．２ｎＭの濃度で使用されるのが好ましい。このハイブリダイゼーションはまた、好ましくは、およそ７．８のｐＨ、６０℃で３０分間行われる。次いで、ハイブリダイゼーションに続き、上述のハイブリッド捕捉抗体系を用いて検出が行われる（抗ハイブリッド抗体及び抗ハイブリッド抗体を検出するための二次抗体の使用）。
【００６７】
標的核酸の存在、破壊又は非存在を決定する方法
別の態様では、サンプルにおいて標的核酸の有無を決定する方法であって、（ａ）サンプルの第１の部分を、（α）標的核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第１のセット、及び（β）参照核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第２のセットの形成を誘導するのに十分な条件下で処理することと、（ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第１のセットの形成は誘導しないが、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第２のセットの形成を誘導するのに十分な条件下で、サンプルの第２の部分を処理することと、（ｃ）サンプルの第１の部分及びサンプルの第２の部分において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの濃度と相関する強度を有する検出可能なシグナルを発生させることと、（ｄ）サンプルの第１の部分における検出可能なシグナルの強度と、サンプルの第２の部分における検出可能なシグナルの強度とを比較することであって、（α）サンプルの第１の部分における検出可能なシグナルの強度が、サンプルの第２の部分における検出可能なシグナルの強度より大きい場合、標的核酸がサンプルに存在し、（β）サンプルの第１の部分における検出可能なシグナルの強度が、サンプルの第２の部分における検出可能なシグナルの強度より小さいか又は該強度と等しい場合、標的核酸がサンプルに存在しないこととを含む、方法が提供される。
【００６８】
本明細書に使用される「サンプル部」は、いずれかの方法で分離したサンプルを指すものである。例えば、サンプルを体積及び／又は質量に従って等しく分離することができる。代替的には、様々な部分を、サンプルから様々な構成要素を抽出することにより生成することができる。例示的なものであり、これに限定するものではないが、「サンプル部」は、支持体に結合し、サンプルの残りから分離した標的核酸と参照核酸との集合体を指す場合もある。どのようにしてサンプル部を生成させるかにかかわらず、各サンプル部には、おおよそ等しい量の参照核酸が含まれているものとする。
【００６９】
例示的な一態様では、サンプルの第１の部分及びサンプルの第２の部分は、サンプルを、（ａ）ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的な第１の捕捉プローブに（ここで、第１の捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションが第１の捕捉複合体を生じさせる）、及び（ｂ）ストリンジェントな条件下で参照核酸に特異的な第２の捕捉プローブに（ここで、第２の捕捉プローブと参照核酸とのハイブリダイゼーションが第２の捕捉複合体を生じさせる）接触させることを含む方法によって形成される。次いで捕捉複合体が支持体に結合され得る。
【００７０】
第１の及び／又は第２の捕捉プローブが、支持体に共有結合して提供され得るか、又は代替的には支持体に結合するように適合され得る。例示的なものであり、これに限定するものではないが、捕捉プローブはリガンドで修飾することができ、また支持体はリガンドと結合することができる部分でコーティングすることができる。このような構造において、捕捉プローブは、リガンドとリガンド結合部との間の結び付きによって支持体と結合する。例示的なものであり、これに限定するものではないが、リガンドはビオチンとすることができ、リガンド結合部はアビジン及びストレプトアビジン等のビオチンに結合することができる分子である。所望に応じて、第１の捕捉プローブと第２の捕捉プローブとは異なるリガンドを有していてもよい。このような場合、第１の支持体は第１の捕捉プローブ及び第２の捕捉プローブの両方と結合することができるように提供され、第２の支持体は第２の捕捉プローブのみと結合することができるように提供される。このようにして、更なるレベルの特異性を付加することができる。
【００７１】
或る特定の態様では、捕捉プローブが標的核酸及び／又は参照核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成する。このような構造では、サンプル部は、サンプルを、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと結合することができるエンティティ、例えば二本鎖ハイブリッド核酸に対して免疫特異的な抗体（又はその断片）により修飾された支持体に接触させることにより形成することができる。次いで、捕捉プローブ並びに標的核酸及び／又は参照核酸により形成されるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを支持体に結合させ、抗体の結合を介してサンプルの残りから分離することができる。抗体は、支持体に共有結合するか、リガンド／リガンド結合部に（by virtue of）結合するか、又は支持体にコーティングされた抗体、例えばＩｇ特異抗体と結合することができるエンティティに結合することができる。
【００７２】
別の態様では、支持体を本明細書でアンカープローブと称される核酸でコーティングする。このような構造では、捕捉プローブは、アンカー核酸の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる配列を含むように設計することができ、それにより捕捉複合体が支持体に結合する。このような構造では、捕捉プローブは、（α）ストリンジェントな条件下で標的核酸及び／又は参照核酸とハイブリダイズすることができる領域と、（β）アンカープローブの配列とハイブリダイズすることができる領域とを含み得る。各捕捉プローブに対するアンカープローブは同じであってもよく、又は異なっていてもよい。さらに、各捕捉プローブは、同じアンカープローブの異なる配列とハイブリダイズすることができる配列を含んでいてもよい。異なる配列が、同じ又は異なるアンカープローブに配置されていてもよい。
【００７３】
別の例示的な態様では、（ａ）サンプルの第１の部分が、第１の支持体に第１の捕捉複合体及び第２の捕捉複合体を捕捉することを含む方法によって形成され、（ｂ）サンプルの第２の部分が、第２の支持体に第２の捕捉複合体を捕捉するが、第１の捕捉複合体は捕捉しないことを含む方法によって形成される。このような態様では、第１の支持体は、該支持体に共有結合した第１の捕捉プローブ及び第２の捕捉プローブ（又はそれを捕捉することができるエンティティ）を含んでいてもよく、第２の支持体は、該支持体に結合した第２の捕捉プローブを含むが、第１の捕捉プローブ（又はそれを捕捉することができるエンティティ）は含んでいなくてもよい。代替的には、第１の支持体と第２の支持体とは実質的に同一であってもよい。このような場合、初めにサンプルを分離し、その後適切な捕捉プローブに接触させた後、それぞれの支持体に接触させる。
【００７４】
別の態様では、サンプルの第１の部分と第２の部分とが、（ａ）第１の捕捉複合体及び第２の捕捉複合体を第１の支持体に捕捉させ、サンプルの第１の部分を形成することと、（ｂ）第１の捕捉複合体及び第２の捕捉複合体を第２の支持体に捕捉させ、サンプルの第２の部分を形成することを含む方法によって形成される。
【００７５】
サンプル部が支持体への捕捉により形成される場合、捕捉複合体は任意で、捕捉されていない核酸を取り除くために洗浄することができる。望ましくない干渉物質を洗い流すことは、様々な温度で使用される、塩及び／又は界面活性剤を含有するバッファを用いて実行することができる。
【００７６】
サンプルを第１の部分と第２の部分とに分離し、任意で洗浄してから、標的核酸及び／又は参照核酸を、標的核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第１のセット及び参照核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第２のセットを形成することによって検出する。
【００７７】
一態様では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、サンプル部を、標的核酸及び／又は参照核酸を含むＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することができるシグナルプローブに接触させることによって形成される。本明細書で使用される「シグナルプローブ」という用語は、ストリンジェントな条件下で標的核酸又は参照核酸とハイブリダイズし、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することができる任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。シグナルプローブは、標的核酸又は参照核酸に特異的であってもよいが、そうである必要はない。例えば、シグナルプローブは、設計標的以外の他の核酸と結合することができるものであってもよい。シグナルプローブは、約１５塩基長〜約２００塩基長であるのが好ましい。幾つかの態様では、シグナルプローブは、３５ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長となるように設計される。他の態様では、標的核酸及び／又は参照核酸の異なる領域とハイブリダイズすることができる複数のシグナルプローブを含むシグナルプローブセットが提供される。
【００７８】
一態様では、（ａ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第１のセットは、サンプルを標的核酸とハイブリダイズすることができる第１のシグナルプローブに接触させることを含む方法によって形成され、（ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの第２のセットは、サンプルを参照核酸とハイブリダイズすることができる第２のシグナルプローブに接触させることを含む方法によって形成される。それぞれの場合、サンプルの第１の部分は、第１のシグナルプローブ及び第２のシグナルプローブの両方に接触させるものとする。サンプルの第２の部分が、標的核酸及び参照核酸の両方を含む場合、第１のシグナルプローブとは接触しないものとする。
【００７９】
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが形成されてから、検出可能なシグナルが発生する。シグナルの強度はサンプル部におけるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの総濃度に相関する。検出可能なシグナルの強度がサンプルの第１の部分と比較してサンプルの第２の部分において同じか又はより大きい場合、標的核酸は存在しない。他方で、検出可能なシグナルの強度がサンプルの第１の部分と比較してサンプルの第２の部分において小さい場合、標的核酸は存在する。
【００８０】
幾つかの態様では、標的核酸及び／又は参照核酸の大部分をカバーするように、複数のシグナルプローブが設計される。カバレッジを拡大、変更することによって、標的核酸のおおよその部分が存在することを決定することができる。カバレッジの増大（すなわちより多くのシグナルプローブを標的核酸の相補的領域とハイブリダイズすること）により、シグナルの増大がもたらされる。そのため、増幅シグナルを得るためにより多くのプローブを使用することが好ましい。検出限界は一部、標的核酸（すなわち標的遺伝子）の長さに依存する。一態様では、プローブセットは標的核酸及び／又は参照核酸の少なくとも７０パーセントをカバーするのに十分なプローブを含む。他の態様では、プローブセットは、標的核酸及び／又は参照核酸の少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、及び少なくとも９５パーセントをカバーするのに十分なプローブを含む。他の態様では、プローブセットのシグナルプローブは、２０ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長の平均長を有するように設計される。
【００８１】
一態様では、シグナルプローブは、切断されているか、又は選択的（alternatively）スプライシングされている疑いがある標的ｍＲＮＡの遺伝子配列に及ぶように、組み合わせて加えられる。シグナルプローブを組み合わせることで、標的ｍＲＮＡに対するカバレッジ、ひいてはシグナル出力の程度が決定される。シグナルプローブの様々な組合せにより得られたシグナル出力の比較が、特定のｍＲＮＡスプライシング型変異体の存在を示す。このように、この方法は、シグナル出力がスプライシング型の存在に依存するという点で「分子定規」である。
【００８２】
本開示は、高リスクＨＰＶ  Ｅ２遺伝子が宿主細胞において発現されているか又は破壊されているかを決定するアッセイであって、標的核酸がＥ２  ｍＲＮＡであり、参照核酸がＨＰＶ  Ｅ１、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７、ＨＰＶ  Ｌ１、及びＨＰＶ  Ｌ２  ｍＲＮＡからなる群から選択される、アッセイも提供する。このような方法は、ＨＰＶの宿主細胞ゲノムへの組込みを検出し、及び／又はＨＰＶ関連の細胞形質転換及び／又はがん、例えば子宮頸がんの発生を予測するのにも適用することができる。高リスクＨＰＶ型には、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、及び８２が含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。
【００８３】
或る特定の態様では、本開示の検出方法は、サンプルを標的核酸に相補的なビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブ及び参照核酸に相補的なビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブ（捕捉プローブは磁性ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートしている）に接触させることによってｍＲＮＡを検出する。プローブ−ビーズ複合体は、予めコンジュゲートされていてもよく、４℃で数か月間安定である。この捕捉工程は、好ましくは、常に振盪しながら６０℃で行われ、約３０分間（捕捉を可能にするのに十分な時間）進行させる。次いで、捕捉された標的を有するビーズは、任意の非標的／参照ＲＮＡ配列が除去されるように洗浄される。次いでビーズによって捕捉された標的／参照核酸複合体を多数の等しい部分に分離する。それから各サンプル部を参照ｍＲＮＡの相当部分をカバーするのに十分なＤＮＡシグナルプローブに接触させる。サンプル部を標的ｍＲＮＡの漸増部をカバーするのに十分なＤＮＡシグナルプローブにも接触させる。少なくとも一部分は、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるシグナルプローブと接触しないものとする。標的及び／又は参照ｍＲＮＡのみがこの点で捕捉されないために、これらのプローブは配列特異的である必要がなく、ビオチン化特異的プローブが既にカバーしている領域を除くｍＲＮＡの完全長をカバーすることができる。これらのシグナルプローブは、およそ４.２ｎＭの濃度で使用するのが好ましい。このハイブリダイゼーションは、およそ７.８のｐＨ、６０℃で３０分間実施するのも好ましい。次いで、ハイブリダイゼーションの後に、上述のハイブリッド捕捉抗体系による検出（抗ハイブリッド抗体及び抗ハイブリッド抗体を検出するための二次抗体の使用）が続く。
【００８４】
本発明は、チューブ、ディップスティック、マイクロアレイ、マイクロプレート、３８４ウェルプレート、他のマイクロタイタープレート及びマイクロ流体システムを含むが、それらに限定されない多くのプラットフォームで実施することができることが当業者に理解される。発展途上国にとって適切であるとして、本発明は、液体の動きを伴う工程のために滴下瓶、ゴム球、パスツールピペット、又は噴出瓶等の低技術方法を利用することができることが当業者に理解される。これらのデバイスが、アッセイに必要とされるおおよその範囲内に比較的正確な容量を送達させる。一態様では、本開示の方法は、自動ピペッター又は他のバッテリー式若しくはエネルギー式分注デバイスを含まない。
【実施例】
【００８５】
実施例１  細胞ペレットの低張溶解によるサンプル調製
内因性ハイブリッドは、ハイブリッド捕捉抗体によって検出されることから、検出アッセイに特有の問題を抱える。したがって、サンプル調製は、隔離、結合又は分解により内因性ハイブリッドがシグナルに加えられるのを防ぐことによって、これらのハイブリッドのバックグラウンドを不活性なものにするのが好ましい。低張溶解は前者の方法に依存する。この方法では、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、ペレットを溶解する。図６に示されるように、バッファ中の塩及び界面活性剤の濃度を変化させることによって溶解のストリンジェンシーを低下させることにより、メタノールベースの子宮頸部試料のプールからもたらされる臨床バックグラウンドが低減する。シグナル：ノイズ比も高くなり、プール間のバックグラウンド及び干渉の変動性は低下する（表２）。他の試験は、低張溶解は、環境に対する細胞の張性の差異により細胞膜を破裂させることによって作用し、細胞をより可溶性のｍＲＮＡに対して透過性にさせるが、溶解性の低い内因性ハイブリッド及び核ＤＮＡに対しては透過性にさせないことを示している。したがって、細胞内のＲＮＡは、細胞から溶液中へ放出される一方、ハイブリッド等のアッセイに対する汚染物質は、不溶性細胞残渣とともに残存することになる。この方法は、試料の量の増加がバックグラウンドの増大を引き起こさないことから、試料中のＲＮＡの量が制限される場合に有用であり得る（図７）。ＨＰＶ陽性細胞を陰性子宮頸部試料のプールにスパイクするというモデルを使用すると、低張溶解の後に本開示の検出方法を行うことで、丁度１０００個の細胞からＨＰＶ  Ｅ６／７のＲＮＡを検出することができる（図８）。
【００８６】
実施例２
磁性カルボキシルビーズによるサンプル調製
本開示の方法における使用に関して特徴付けられている別のサンプル調製方法では、生体サンプルに直接付加され得る磁性カルボキシル修飾（ＣＯＯＨ）ビーズ（例えば、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Thermo Fisher Scientific, Inc.）を使用する。サンプル中の細胞を、疎水相互作用を介してビーズに結合させる。磁性ラックを使用し、ビーズをペレット化した後は、上清を除去し、細胞を溶解することができる。溶解後、ビーズを更にペレット化し、残存する上清を、本開示の方法での使用のために移す。この方法において、溶解ストリンジェンシーの低下により、更にバックグラウンドが低減するが（表１を参照されたい）、水単独では、細胞からＲＮＡを放出するには不十分である。表１中の数値では、最終溶液ではなく、２％溶液のパーセントを示している。但し、好ましい溶解バッファは、溶解及びハイブリダイゼーションの両方を支持することから、約１Ｍチオシアン酸グアニジン及び約０．７％界面活性剤である（図９を参照されたい）。ハイブリダイゼーション捕捉工程前に希釈される場合、より高い溶解バッファの濃度を使用することができる。図１０に示されるように、細胞のビーズ上への捕捉は二相性反応である。カルボキシルビーズを、子宮頸部細胞のＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）ベースのサンプルに直接スパイクした。サンプル中の全細胞の約５０〜６０％を、暴露から最初の１分以内にビーズに引き付けた。このプロセスは、少なくとも１５分間一定の状態を保つが、ビーズ付加のおよそ３０分後、細胞の少なくとも９５％が捕捉されている（上清中に残存する細胞を計数することによって測定；図１０を参照されたい）。図１１は、本開示の方法を用いると、僅かおよそ１０００個のＨＰＶ陽性細胞を使用して結果が得られる可能性があり、カルボキシルビーズ細胞捕捉の後に本開示の検出方法を行うことが、低張細胞溶解の後に本開示の検出方法を行うよりも細胞からｍＲＮＡを得るのに効率的であることを示す（図１１を参照されたい）。
【００８７】
【表１】
2014511182.tif 000003
【００８８】
実施例３
アッセイのバックグラウンドに対する内因性ハイブリッドの効果
内因性ハイブリッドは、臨床上のバックグラウンドノイズ源であることが多い（図５を参照されたい）。ＨＰＶ１６  Ｅ６／７  ＲＮＡを（ＨＰＶを有しない；ＫＰＳＴＭ（−））臨床プールにスパイクする場合、バックグラウンドは高く、シグナルはマスクされる。しかし、ＲＮＡの付加前、プールが変性され（１．７５Ｍ  ＮａＯＨ）、中和される場合、バックグラウンドは低く、シグナルは回復される。これは、核酸ハイブリッドを認識する抗体を使用する検出方法を用いる前に、内因性核酸ハイブリッドを除去するか又はその放出を阻止する必要性があることを示す。
【００８９】
実施例４
バックグラウンドに対する溶解バッファ濃度の効果
溶解ストリンジェンシーの低下により、臨床上のバックグラウンドノイズが低減される（図６を参照されたい）。１ｍＬのメタノールベースの子宮頸部サンプルを遠沈させ、ｘ軸上に示されるように、ペレットをバッファに様々な濃度（１００％バッファ＝約３Ｍチオシアン酸グアニジン＋約２％界面活性剤）で再懸濁した。ペレット化細胞を、６５℃で１５分間加熱した。次いで、ＲＮＡの捕捉のため、本開示の方法に従い、溶解バッファの最終濃度を３２．５％に調整した。図６に示されるように、バックグラウンドは、溶解バッファの濃度の減少とともに低減した。本実験は、細胞の低張溶解が内因性核酸ハイブリッドの放出の阻止において奏功した証拠を提供する。細胞質中のＲＮＡが細胞から放出される一方、ハイブリッド等のアッセイに対する汚染物質は、核内に残存することになる。
【００９０】
さらに、水溶解は、よりストリンジェントな溶解に対し、バックグラウンド及び変動性の低下とシグナル：ノイズの上昇とをもたらす（下の表２を参照されたい）。表２中の値は、子宮頸部サンプルの４つの異なる臨床プールから得られる結果を通じて平均化されている。典型的には、これらのプールは、バックグラウンドが大幅に変化する。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
実施例５
細胞ペレットの低張溶解
図７は、細胞ペレットの低張溶解が、バックグラウンドノイズが安定状態を維持することを保証することを示す。様々な量の子宮頸部サンプル（２５０μｌ〜１０ｍｌ）を遠沈させ、水で溶解し、本開示のＲＮＡ検出アッセイを施した。図７中のグラフに示されるように、バックグラウンドは、使用した試料の量にかかわらず有意に変化しない。
【００９３】
実施例６
検出の限界
ＨＰＶ陽性細胞（ＳｉＨａ細胞）由来のＨＰＶ１６  Ｅ６／７  ＲＮＡにおける検出の限界について試験した（図８を参照されたい）。細胞を１ｍＬの陰性子宮頸部試料のプールにスパイクし、臨床サンプルをモデル化した。遠沈し、水で溶解し、加熱してから、バッファを細胞に加え（３２．５％バッファ、又は約１Ｍチオシアン酸グアニジン及び約０．７％界面活性剤の濃度になるまで）、それらをプレート内に入れ、本開示のＲＮＡ検出アッセイを開始した。結果は、本開示の方法を用いる場合、ＨＰＶ  Ｅ６／７  ＲＮＡ検出において必要なのは、僅か１×１０３個の細胞であることを示す。
【００９４】
実施例７
ＣＯＯＨビーズによって捕捉される細胞の溶解
様々な溶解バッファを、ＣＯＯＨビーズによって捕捉される細胞に対する溶解能について比較した（図９を参照されたい）。結果は、水単独がＣＯＯＨビーズによって捕捉される細胞を溶解するのに十分でないことを示す。ＨＰＶ陰性又はＨＰＶ陽性のいずれかの細胞を、１ｍＬの陰性子宮頸部プールにスパイクした。細胞をビーズによって捕捉し、上清を除去した後、（チオシアン酸グアニジン及び界面活性剤を含有する）様々な濃度のバッファをサンプルに添加し、次いでそれを６５℃で１５分間加熱した。本開示の方法を用いるＲＮＡ検出のため、バッファ濃度を全部で３２．５％に調整した。遠沈方法で見られるように、バックグラウンドは、塩及び界面活性剤の量の減少とともに低下する。しかし、ＲＮＡを放出するのに十分な細胞を溶解するためには、少なくとも３２．５％のバッファ（全部で約１Ｍの塩及び０．７％界面活性剤）が必要である。
【００９５】
実施例８
ＣＯＯＨビーズによる細胞捕捉の経時変化は細胞のビーズ上への捕捉が二相性反応であることを示す
ＣＯＯＨビーズによる細胞捕捉の経時変化を実施した（図１０を参照されたい）。細胞を１ｍＬの陰性子宮頸部プールにスパイクした。細胞のベースライン数を計数し、ＣＯＯＨビーズの付加後の各時点で、計数のため、ビーズを１．５分間ペレット化し、次いで上清を除去し、希釈した。約５０％の細胞が、１分以内に捕捉された。捕捉は次いでプラトーに達したが、３０分の時点では、少なくとも９５％の細胞が捕捉されている。ビーズを増加させることにより、僅かにより効率的な捕捉が得られる。
【００９６】
実施例９
カルボキシル（ＣＯＯＨ）ビーズ捕捉は低張溶解より効率的である
１ｍＬの陰性子宮頸部試料のプール中のＨＰＶ１８陽性（ＨｅＬａ）細胞を、ＣＯＯＨビーズ捕捉又はペレット化及び低張溶解を用いて調製した。また、カルボキシルビーズ捕捉方法における検出の限界は約１０００個のＨＰＶ陽性細胞であり、リバースハイブリッド捕捉アッセイの結果は、この方法が細胞からｍＲＮＡを得るためにより効率的であることを示す（図１１を参照されたい）。バックグラウンドはＣＯＯＨビーズ捕捉が用いられる場合より僅かに高く（２７１ＲＬＵ対１６３ＲＬＵ（低張溶解））、一方、シグナル：ノイズ及びシグナル−ノイズ（検出される全ＲＮＡの尺度）の双方は、低張溶解が用いられる場合よりはるかに高かった。
【００９７】
実施例１０
標的ＲＮＡの検出と組み合わされる前処理手順（低張溶解）
次のプロトコルでは、サンプル前処理手順（低張性細胞溶解を使用）が本開示のＲＮＡ検出方法と組み合わされる。チューブ内の細胞を、１５００相対遠心力（ＲＣＦ）で３分間遠沈する。上清を除去し、３３．７５μＬの水を添加し、ペレットをゆっくりとピペットで取り、再懸濁した。次いで、ゆっくりと振盪させながら、６５℃で１５分間加熱する。次いで、１６．２５μＬのバッファ（約３Ｍチオシアン酸グアニジン及び約２％界面活性剤）を添加し、５０μＬのサンプルをプレート上のウェルに移す。次いで、ビオチン化捕捉プローブを有する１０μＬの予めコンジュゲートしたストレプトアビジンビーズを加え、プレートを、１１５０毎分回転数（ＲＰＭ）で振盪させながら、６０℃で３０分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、ビーズを１．５分間ペレット化し、次いでプレートをデカントし、ブロットする。Ｓｈａｒｐ洗浄用バッファ（１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄する（１回目の洗浄は２分間、２回目の洗浄は５分間である必要がある）。洗浄後、プレートをデカントし、ブロッティングにより十分に乾燥させる。各ウェルに対し、ＲＮＡハイブリダイゼーションバッファで４．２ｎＭに希釈した６５μＬのシグナル増幅プローブを加える。次いで、プレートを、１１５０ＲＰＭで振盪させながら、６０℃で３０分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に３分間置き、デカントし、ウェルを乾燥させる。３５μＬのＤｉｇｅｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ２キットの検出試薬１（０．０５％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジドを有し、ＲＮアーゼを有しない緩衝溶液中、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対するアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体）を各ウェルに加え、プレートを４５℃で３０分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、デカントし、ブロットする。プレートを、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するバッファで５回洗浄し、プレートを１回の洗浄につき１分間静置しておく。次いで、ウェルをデカントし、乾燥させる。次いで、４５μＬのＤｉｇｅｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ２キットの検出試薬２（化学発光基質のＥｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（商標）を有するＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）試薬）を各ウェルに加える。プレートを遮光し、３００ＲＰＭで振盪させながら、室温で１５分間インキュベートする。プレートを、照度計で読み取る。
【００９８】
実施例１１
標的ＲＮＡの検出と組み合わされる前処理手順（ＣＯＯＨビーズ捕捉）
以下のプロトコルでは、カルボキシルビーズ捕捉サンプル調製が本開示のＲＮＡ検出方法と組み合わされる。各サンプルに対し、８μＬのカルボキシル（ＣＯＯＨ）ビーズ（２ｍＬのウェルプレート）を加え、室温、８００ＲＰＭで３０分間振盪する。プレートを磁性ラック上に２分間置き、ビーズをペレット化する。上清を真空下で除去し、５０μＬの３２．５％バッファ（約１Ｍチオシアン酸グアニジン及び約０．７％界面活性剤）に再懸濁する。次いで、６５℃、１０００ＲＰＭで１５分間振盪する。プレートを磁性ラック上に置き、ビーズをペレット化し、上清を新しいウェルに移す。次いで、ビオチン化捕捉プローブを有する１０μＬの予めコンジュゲートしたストレプトアビジンビーズを加え、プレートを、１１５０ＲＰＭで振盪させながら、６０℃で３０分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、ビーズを１．５分間ペレット化し、次いでプレートをデカントし、ブロットする。Ｓｈａｒｐ洗浄用バッファ（１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄する（１回目の洗浄は２分間、２回目の洗浄は５分間である必要がある）。洗浄後、プレートをデカントし、ブロッティングにより十分に乾燥させる。各ウェルに対し、ＲＮＡハイブリダイゼーションバッファで４．２ｎＭに希釈した６５μＬのシグナル増幅プローブを加える。次いで（then）、プレートを、１１５０ＲＰＭで振盪させながら、６０℃で３０分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に３分間置き、デカントし、ウェルを乾燥させる。３５μＬの検出試薬１（０．０５％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジドを有し、ＲＮアーゼを有しない緩衝溶液中、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対するアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体）を各ウェルに加え、プレートを４５℃で３０分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、デカントし、ブロットする。プレートを、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するバッファで５回洗浄し、プレートを１回の洗浄につき１分間静置しておく。次いで、ウェルをデカントし、乾燥させる。次いで、４５μＬの検出試薬２（化学発光基質のＥｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（商標）を有するＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）試薬）を各ウェルに加える。プレートを遮光し、３００ＲＰＭで振盪させながら、室温で１５分間インキュベートする。プレートを、照度計で読み取る。
【００９９】
実施例１２
ストレプトアビジンビーズ−ビオチン化プローブコンジュゲーション
以下のプロトコルは、磁性ビーズに結合されたＤＮＡ捕捉プローブを形成する方法を提供する。Ｓｅｒａｄｙｎ  ｄｓＭａｇストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎパート番号３０１５２１０３０１０５０、Thermo Fisher Scientific,Inc.）をボルテックスし、超音波処理する。５μＬのビーズを、２５０μＬのビーズコンジュゲーションバッファ（１×ＰＢＳ；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に加える。磁性ラック上のビーズをプルダウンし（Pull down）、ビーズコンジュゲーション洗浄用バッファ（上記の０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄（wash）する。ビーズを、４５ｎＭの各ＤＮＡ捕捉プローブとともに、ビーズコンジュゲーションバッファに再懸濁する。１１５０ＲＰＭで振盪させながら、３７℃で３０分間インキュベートする。ビーズをプルダウンし、ビーズコンジュゲーション洗浄用バッファで３回洗浄する。Ｄｉｇｅｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ２からの２５０μＬのＢｌｏｃｋｅｒバッファ（カゼインベース）に再懸濁し、５０×のビーズを得る。
【０１００】
実施例１３
リバースハイブリッド捕捉アッセイ
リバースハイブリッド捕捉では、まず、標的ＲＮＡを、磁性ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされた相補的ビオチン化ＤＮＡプローブ上に捕捉することにより、ｍＲＮＡが検出される。このプローブ−ビーズ複合体は、予めコンジュゲートされていてもよく、４℃で数か月間安定である。この捕捉工程は、３０分を要し、常に振盪させながら、６０℃で行う必要がある。次いで、捕捉された標的を伴うビーズを、あらゆる非標的ＲＮＡ配列が除去されるように洗浄する。ハイブリッド捕捉抗体が個別のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに結合することから、ＤＮＡプローブ（例えば、ＤＮＡ捕捉プローブ及び増幅プローブ）で標的ＲＮＡをカバーし、最大シグナルを得ることが好ましい（例えば図１及び図２を参照されたい）。したがって、次いで追加的プローブを標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。標的のみがこの時点で存在することから（非標的ＲＮＡは洗い流されていることから）、これらのプローブは、配列特異的である必要はないが、それよりも、既にビオチン化ＤＮＡプローブによってカバーされている領域を除く、遺伝子の完全長をカバーし得る。これらの「シグナル増幅」プローブを、４．２ｎＭの作用濃度まで希釈する。このハイブリダイゼーションはまた、好ましくは振盪させながら、約７．８のｐＨ、６０℃で３０分間行う。次いで、ハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリッド捕捉抗体系で検出する、すなわち検出試薬１（０．０５％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジドを有し、ＲＮアーゼを有しない緩衝溶液中、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対するアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体）に４５℃で３０分間暴露した後、十分に洗浄し、それに続き、検出試薬２（化学発光基質のＥｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（商標）を有するＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）試薬）を室温で１５分間加える。シグナルを、照度計で読み取る。アッセイのこの分析後部分では、約２時間１５分かかる。
【０１０１】
実施例１４
非標識シグナル増幅プローブを付加する効果
シグナルは、僅か３若しくは５つのビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブ及び非標識シグナルプローブなしで捕捉されるＲＮＡ標的において比較的低い。シグナルは、ハイブリッド−捕捉抗体及び発光技術を用いた検出前、非標識プローブが標的にハイブリダイズされる場合より実質的に高い。リバースハイブリッド−捕捉アッセイを使用することで、ＲＮＡが検出される。この実験では、可変数のビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブは、ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされた（図４を参照されたい）。標的は、ＨＰＶ１６のＥ６／７遺伝子であった。アッセイは、シグナル増幅プローブの付加を伴う場合と伴わない場合（各々、一工程対二工程アッセイ）に、ビーズの各セットを用いて実施した。シグナル増幅に対して非標識ＤＮＡプローブを全く付加しなかったとき（一工程アッセイ；灰色バー）、シグナルは、ビオチン化捕捉プローブによって提供されるカバレッジの大きさとともに増大した。しかし、シグナル増幅に対する非標識ＤＮＡプローブを付加したとき（二工程アッセイ；黒色バー）、シグナルは、僅か１、３、若しくは５つの捕捉プローブを使用した場合の一工程アッセイにおけるよりはるかに高かった。二工程アッセイでは、僅か３〜５つの捕捉プローブで、最適なシグナルが得られた。
【０１０２】
実施例１５
分子定規法によって決定されるｍＲＮＡ転写産物の長さ
ＨＰＶ転写産物の長さは、磁性ビーズ上への捕捉及びハイブリッド領域の長さを延長するために使用される非標識オリゴヌクレオチドでの検出によって「測定する」ことが可能である。シグナル出力は、増幅シグナルプローブを、最長に達する（シグナルがプラトーになる場合）まで連続付加することで、増大することになる。ＨＰＶ１６における様々なＨＰＶ転写産物を、図１２に概略図で示す。プローブ設計においては、番号付けられた領域１〜７（図１２）を指定する。例えば、Ｅ６／７遺伝子転写産物は、ＤＮＡ捕捉プローブ３を使用してサンプルから捕捉することが可能であり、シグナル増幅プローブの組合せは、シグナル出力を決定づけることになる。存在する変異体形態が完全長であり、かつ増幅プローブの組合せが転写産物の全長をカバーする場合、シグナルは強力になる。存在するＥ６／７変異体形態がスプライシングされ、シグナルプローブのサブセット（例えば、プローブ１及び６）が使用される場合、シグナル出力は、完全長／未スプライシング型Ｅ６／７からのシグナルと比べてやや弱いものになる（表３を参照されたい）。Ｅ６／７変異体形態がスプライシングされ、組み込まれる場合、それははるかに弱いシグナルをもたらすことになる（表３を参照されたい）。より強いシグナルは、より多くの標的及び特定の病状を示唆する。スプライシングされ、組み込まれたＥ６／７変異体は、より弱いシグナルをもたらし、また、捕捉される標的が減少し、それ故、この遺伝子の発現が低下することを示唆する。それはまた、異なる病状を示唆する。表３は、ＨＰＶ１６の様々な領域に由来する、（図１２中に示される）列挙されるプローブの併用から得られる想定されるシグナルを示す。
【０１０３】
【表３】
2014511182.tif 000005
【０１０４】
再び図１２及び表３を参照すると、（例えば）捕捉プローブ＃２にハイブリダイズする非スプライシング型転写産物によって与えられるシグナルを、他の捕捉プローブを使用して生成されるシグナルから差し引くことで、スプライシングされた転写産物単独から生じるシグナルの程度を判定できる。シグナル増幅プローブの組合せは、標的ｍＲＮＡ上のカバレッジの程度、それ故にシグナル出力を決定づけることになる。増幅プローブの異なる組合せから得られるシグナル出力の比較により、特定のｍＲＮＡスプライシング型変異体の存在が示されることになる。このようにして、本方法は、シグナル出力が存在するスプライシング型に依存し、病状の進行を示し得る「分子定規」である。
【０１０５】
実施例１６
初期：後期ｍＲＮＡ比の上昇の検出
本開示の方法は、初期及び後期ＨＰＶ  ｍＲＮＡ転写産物の比の検出を可能にし、それはＨＰＶ関連子宮頸部疾患の進行を示唆し得る。記載のアッセイは、ＨＰＶ−陽性試料のバックグラウンドに対するＳｉＨａ細胞（癌細胞株）の高い初期：後期ｍＲＮＡ比を検出した（図１４）。捕捉及び検出ＤＮＡプローブを、ＨＰＶの初期転写産物及び後期転写産物を検出するように設計した。これら２つのアッセイを、同じサンプルに対して同時に行い、得られたシグナルの比は、初期及び後期ＨＰＶ転写産物の比を示す。前がん性病変の細胞と混合された数個の癌細胞を含む試料を模倣するため、ＨＳＩＬ試料のプール（高グレード扁平上皮内病変、子宮頸部細胞学におけるベセスダシステムによるもの（per Bethesda System））を、既知数のＳｉＨａ細胞（ｘ軸上に示される）でスパイクし、次いで本開示の方法（例えば、実施例１２を参照されたい）を介して化学分析した。図１４によって示されるように、高いＥ６／７  ｍＲＮＡ比を有する細胞の画分が、低い比を有する細胞のバックグラウンドに対して検出され得る。
【０１０６】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、あたかも各参考文献が引用することにより本明細書の一部をなすべく具体的かつ個別に示されるように、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。任意の参考文献の引用は、出願日に先立つその開示を目的とし、本開示が、先行発明を踏まえ、かかる参考文献に先立つものとしての権限を付与されないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１０７】
上記の要素の各々、又は２つ以上が相まって、上記のタイプと異なる他のタイプの方法において有用な用途を見出すことも可能であることは理解されるであろう。更なる分析を行わずに、上記において本開示の主旨が十分に示されることにより、他者は、現行の知識を適用することにより、それを様々な用途向けに、添付の特許請求の範囲において示される本開示の一般又は特定の態様の本質的特性を先行技術の観点から公正に構成する特徴を省略することなく、容易に適合させることができる。上記の実施形態は、あくまで例として提示され、本開示の範囲は、あくまで以下の特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【０１０８】
実施例１７
本願による核酸の使用
サンプル及び試料
ＳｉＨａ（ＨＴＢ−３５）、ＣａＳｋｉ（ＣＲＬ−１５５０）、ＨｅＬａ（ＣＣＬ−２）及びＨＣＣ  １８０６（ＣＲＬ−２３３５）の細胞株は、ＡＴＣＣ（Manassas, Va.）から入手し、標準的な技法によって培養した。CytologyServices of Marylandでの定期試験後に、液状化細胞診断（ＬＢＣ）培地（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）、Hologics,Ma、元の体積２０ｍｌ）中の残りの子宮頸部試料を入手した。
【０１０９】
試料プールはこれらの試料の幾つかからなるものであった。これらの試料は、５〜８ヶ月齢であり、使用前は室温で保管していた。幾つかの臨床試料のＨＰＶ遺伝子型決定を、Nazarenko他(2008)に従って行い、ＨＰＶ１６の単一感染、又はＨＰＶ  ＤＮＡがないことを確認した。
【０１１０】
ＲＮＡ標的単離
Ｅ６（１〜７９０ｎｔ）及びＥ２（２７５５〜３８５２ｎｔ）領域に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８のＲＮＡを、鋳型としてＨＰＶ１６（配列番号１０６）又はＨＰＶ１８（配列番号１０７）を使用した標準的なクローニング技法を用いて調製した。ＲＮＡは、Ｒｎｅａｓｙ（商標）  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、又はＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（QIAGEN, Valencia, Ca）のいずれかを使用して、サンプル、細胞株及び試料から調製した。ＱＩＡｚｏｌによるＲＮＡ単離では、ＬＢＣ中に保存された細胞を遠心分離により単離し、その細胞を抽出した後、沈殿したＲＮＡをトリスバッファ（ｐＨ７）中に再懸濁した。
【０１１１】
細胞濃縮
試料由来のＬＢＣ培地（１ｍｌ）中に保存された一部の細胞を、カルボキシル修飾磁性ビーズ（８μｌの５％固形分、カタログ番号６５１６２１０５０５０３５０、Seradyn）上への吸着によりマイクロチューブ内で濃縮した。試料−ビーズ懸濁液を回転式マイクロチューブ台（rotating microfuge block）（１１００ｒｐｍ、Eppendorf）において２２℃で３０分間インキュベートした。ビーズ上に吸着した細胞を、磁性チューブホルダー（Promega, Madison, WI）によってペレット化した。既知の細胞数の混合物からペレット化した細胞の割合を、血球計を使用して残りの上清中の細胞を数えることによって決定した。細胞を生理食塩水で洗浄し、溶解バッファ中に再懸濁した後、９６ウェルアッセイプレートに移した。
【０１１２】
オリゴデオキシリボヌクレオチド
オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）プローブを、Ｂｌａｓｔ（NCBI）比較のいずれかを用いて、ＨＰＶ１６（又は１８）のｍＲＮＡ標的に特異的となるように設計した。捕捉プローブの設計を、他のＨＰＶタイプとの交差ハイブリダイゼーションを避けるように調整した。シグナル増幅オリゴは、それらの標的に対して相補的であった（complementary）が、他のＨＰＶタイプとの交差反応性を避けないように設計した。捕捉ブローブ及び増幅プローブの配列を以下の表４に示す。捕捉オリゴは５’ビオチンで修飾した。
【０１１３】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【０１１４】
逆転写ＰＣＲプライマー及びＴａｑＭａｎプローブを、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ（IDT, Coralville, IA）及びＢｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（PaloAlto, Ca）により設計した。全てのオリゴヌクレオチドはIDT（Coralville, IA）により合成された。
【０１１５】
リアルタイム逆転写及びＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
一工程ＲＴ−ＰＣＲを、ベンダープロトコルに従ってＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）５×Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｘ（ｎｏ  ｒｏｘ、QIAGEN, Valencia, Ca）を用いて行った。プライマー及びプローブセットを、ソフトウェアを用いてＥ６−７領域及びＥ２領域に対して設計した。リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００Ｐ（Stratagene, LaJolla, Ca）又はＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ（商標）５（Bio-Rad,Hercules, Ca）のリアルタイムＰＣＲ装置のいずれかを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲの体積は２５μｌであった。コンセンサスＰＣＲ（Nazarenko他、2008）を用いて、子宮頸部試料プールがＨＰＶのＤＮＡタイプを含有するか否かを示した。
【０１１６】
ハイブリッド捕捉アッセイ
ＲＮＡ単離は、１０μｌの磁性ビーズ（ストレプトアビジン修飾、０.０１％固形分、１μｌ, Seradyn）を添加しながら、６０μｌの溶解バッファ（ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ、QIAGEN Inc）中で行った。ビオチン化捕捉オリゴを、標準的な手法を用いて磁性ビーズに共役させた。１つの標的当たり５つの配列特異的な捕捉プローブが存在していた。標的ＲＮＡを、６０℃で３０分間、１１００ｒｐｍで回転させながら、インキュベーション中にこれらのオリゴ修飾ビーズ上に捕捉させた。このサンプルを純水で１：３に希釈して、９６ウェルマイクロタイタープレートの２つのウェルに分割した。増幅ＤＮＡプローブ（各４.２ｍＭ、３３〜４５ｎｔ）を変性試薬：プローブ希釈剤（QIAGEN Inc）の５：８混合物からなるバッファ中の標的ＲＮＡとハイブリダイズさせた。Ｅ６−７標的に対しては１５個の増幅プローブ及びＥ２標的に対しては２７個の増幅プローブが存在していた。ビーズに固定された得られるハイブリッドを、磁気プレートホルダー（Ambion）を用いてペレット化した。磁気プレート上のハイブリッド−ビーズ複合体を、生理食塩水、界面活性剤系バッファ（ｐＨ７.５）で洗浄した。複合体を、アルカリホスファターゼ（ＤＲ１、QIAGEN Inc）にコンジュゲートしたモノクローナルハイブリッド捕捉抗体とインキュベートした（４５℃、３０分）。次いで、この複合体をＨＣ２洗浄バッファ（QIAGEN Inc）で洗浄した。それから複合体を化学発光性アルカリホスファターゼ基質（ＤＲ２、QIAGEN Inc）とインキュベートした（２２℃、１５分、回転３００ｒｐｍ）。シグナルを、ＤＭＬ  ２０００照度計（QIAGEN Inc）を使用して相対発光量単位（ＲＬＵ）で測定した。
【０１１７】
結果
ＨＰＶ  ｍＲＮＡの安定性
ＬＢＣ培地中に固定した細胞内のＨＰＶ  ｍＲＮＡの安定性は、リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲアッセイを使用して決定した。ＳｉＨａ細胞は２コピーの組込みＨＰＶ１６ゲノム（エピソームなし）を含有し、ＨＰＶ  Ｅ６−７のｍＲＮＡを発現する。新たなＳｉＨａ細胞を、ＰＣＲにより示されるようにＨＰＶを予め含有していなかったプールしたＬＢＣ子宮頸部試料中に保存した。これらのサンプルを、室温で６７日間までインキュベートした。２つのアリコート（１ｍｌ）を定期的に（３日目、１３日目、２６日目、４２日目及び６７日目に）取り出し、ＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ試薬により単離した。ＨＰＶのｍＲＮＡレベルを、リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ（５’−３’、フォワードプライマーGCACCAAAAGAGAACTGCAATGT（配列番号１０８）、リバースプライマーCATATACCTCACGTCGCAGTAACT（配列番号１０９）、ＴａｑＭａｎプローブFAM-CAGGACCCACAGGAGCGACCCAGA-BHQ1（配列番号１１０））を用いて決定した。各反応はおよそ１２５０００個のＳｉＨａ細胞由来のｍＲＮＡを含有するものであった。ＲＴ−ＰＣＲのｍＲＮＡ存在量の評価基準であるサイクル閾値は、４２日目まで比較的安定しており、その後４２日目及び６７日目のアリコートではおよそ１〜２サイクルへとシフトした（図１５）。このシフトは、理論ＰＣＲ動態に基づきおよそ３倍の標的ｍＲＮＡの低減を示すものであり得る。
【０１１８】
ハイブリッド捕捉ｍＲＮＡ検出アッセイの分析性能
ｍＲＮＡに関するハイブリッド−捕捉アッセイの概略図を図１６Ａに示す。アッセイは、ｍＲＮＡが標的であり、プローブが合成ＤＮＡ（ＲＮＡではない）からなり、標的のアルカリ変性が含まれず、形成されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＥＬＩＳＡプレートの代わりに磁性ビーズ上に捕捉されることを除き、ｄｉｇｅｎｅ  ＨＣ２  ＨＰＶ  ＤＮＡ  Ｔｅｓｔ（商標）(QIAGENInc）におおよそ基づくものである。ＨＰＶのｍＲＮＡに対する４つのハイブリッド捕捉アッセイを、特異的な捕捉プローブを使用することによりＨＰＶ１６  Ｅ６−７若しくはＥ２、又はＨＰＶ１８  Ｅ６−７若しくはＥ２のいずれかに特異的であるように設計した（表４）。捕捉プローブの特異性は、Ｂｌａｓｔプログラムにより確認した。細胞ペレット又はＲＮＡを溶解し、ＲＮＡを放出するとともに巻き戻した。溶解物をＥ６−７又はＥ２  ｍＲＮＡのいずれかの検出のために別々のウェルに等しく分割した。各ウェルは磁性ビーズに固定した配列特異的な捕捉プローブの特有セット（５つ、３５ｎｔ）を受けるものであった。非結合材料を洗浄した後、幾つかの増幅プローブ（３３〜４５ｎｔ）を、各捕捉ｍＲＮＡ標的に対するＥ６−７コード領域又はＥ２コード領域の全長を補うように加えた。これらの増幅プローブを、他のＨＰＶタイプとの交差反応性を避けないように設計した。それらの機能は、ハイブリッド捕捉抗体とアルカリホスファターゼとの結合の増大を介してシグナル増幅を与えることであった。形成されるハイブリッド標的の長さは、Ｅ６−７でおよそ７４０ｂｐ及びＥ２で１５００ｂｐであった。ハイブリッド捕捉プローブのプローブ遺伝子座を図１６Ｂに示す。
【０１１９】
まずハイブリッド捕捉アッセイを、ＨＰＶ１６  Ｅ６−７、ＨＰＶ１６  Ｅ２、ＨＰＶ１８  Ｅ６−７又はＨＰＶ１８  Ｅ２に対する純粋なｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＨＰＶのＲＮＡ標的で行った。ＨＰＶ１６  Ｅ６−７アッセイの結果を図１７ｂに示す。アッセイによって、１反応当たりおよそ１０００コピーのＲＮＡが検出された。３〜４対数のダイナミックレンジで標的入力に対するシグナルの線形依存性が存在していた。標的入力に対するシグナルの類似の依存性が、ＨＰＶ１６  Ｅ２、ＨＰＶ１８  Ｅ６−７、及びＨＰＶ１８  Ｅ２の転写産物を含む他の３つのＲＮＡ標的で検出された。ＨＰＶ１８のＲＮＡ標的をＨＰＶ１６に特異的なプローブでプロービングした場合又はその逆で、バックグラウンドを超えるシグナルは生じなかった。
【０１２０】
標的の量に加えて、アッセイシグナルは、形成されるハイブリッドの長さに依存するものであり、このことが該アッセイを分子定規として使用することを可能にした。これを実証するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＨＰＶ１６  Ｅ６−７のＲＮＡの相対長を、ハイブリッドを長くするのに使用される隣接増幅プローブの数に対するシグナルの依存性により測定した。同量のＨＰＶ１６  Ｅ６−７のＲＮＡを、幾つかのウェルにおいて磁性ビーズ（５つの捕捉オリゴ）により捕捉した。漸増数の隣接増幅プローブタイプを、各々別個のウェルに加えた。このようにして、各ウェルは、一部のウェルが完全にハイブリダイズしたＲＮＡ標的を含有するまで、連続してより長いＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含んでいた（図１７ａ）。標的が完全にハイブリダイズしたウェルにおいてプラトーに達するまで、ウェルに対するシグナルを増大させた（１５個の増幅プローブを加えた）。５つの非相補的なプローブの更なる付加は、アッセイシグナルを増大させなかった。
【０１２１】
ハイブリッド捕捉アッセイは、ＨＰＶを予め含有していなかったＬＢＣ臨床試料のプールに保存されたＳｉＨａ細胞のＨＰＶ１６のｍＲＮＡを検出するものであった。カルボキシルでコーティングされた磁性ビーズを用いる細胞濃縮法を、方法に記載されるように、ＳｉＨａ細胞及び他の細胞をペレット化するのに適用した。血球計で細胞を数えることによって決定した９５パーセントの細胞を、この濃縮法を用いて３０分でペレット化した。得られる細胞ペレットを溶解し、溶解物を２つのウェルに等しく（容量で）分けた。ＨＰＶ１６  Ｅ６−７転写産物を１つのウェルで化学分析し、ＨＰＶ１６  Ｅ２を第２のウェルで化学分析した。ＳｉＨａ混合物は、豊富なＥ６−７転写産物を発現したが、Ｅ２は発現しなかった（図１８ａ）。ＨＰＶ１６に対するこれらのアッセイは、ＨｅＬａ細胞（１×１０６個の細胞）のＨＰＶ１８のｍＲＮＡを標的として使用した場合、ごく僅かなシグナルしか検出しなかった（Ｓ：Ｎ＜２、図示せず）。他のＨＰＶタイプとの交差反応性は試験しなかった。ＳｉＨａ細胞におけるＨＰＶ１６  Ｅ６−７とＥ２との比を、このデータから算出することができる。Ｅ２ハイブリッドに関する最大シグナルは、その長さの増大のためにＥ６−７ハイブリッドのものよりも比例的に大きいものであった。この理由から、細胞及び試料に関するＥ６−７：Ｅ２比を算出する場合、Ｅ２シグナルを０.５１で除算した。ＨＰＶ１６  Ｅ６−７：Ｅ２比は、アッセイにおける細胞の数に応じてＳｉＨａ細胞では８.２以上であった。この方法を用いて、ＨＰＶ転写産物を発現する他のがん細胞株に関するＨＰＶ  Ｅ６−７：Ｅ２比を算出した。細胞株にはＣａｓｋｉ及びＨｅＬａが含まれ、これらはそれぞれＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８を発現する（図１８ｂ）。ＳｉＨａ細胞株及びＨｅＬａ細胞株に関する比はＣａｓｋｉ細胞のものよりも相対的に高かった。
【０１２２】
実験は、ＨＰＶ  Ｅ６−７転写産物及びＥ２転写産物の両方を同等ではない比で発現するがん細胞と非がん細胞との不均一混合物におけるＨＰＶ  Ｅ６−７：Ｅ２比を決定するために行った。Ｅ６−７:Ｅ２転写産物比が相対的に高いＳｉＨａ細胞を加えて、ＨＰＶ１６にのみ陽性である臨床試料のプール（ＬＢＣ培地）に保存した。ＳｉＨａ細胞を加えなかったプールした試料のＨＰＶ１６  Ｅ６：Ｅ２比はおよそ１であった。ＳｉＨａ細胞の段階希釈物をこの試料プールの２ｍｌのアリコートに添加した。サンプルＲＮＡをＱＩＡｚｏｌ抽出により単離した。ＨＰＶ  Ｅ６−７アッセイ及びＥ２アッセイの結果を比で表した（図１９）。ＳｉＨａ細胞をＨＰＶ陽性プールに加えることで、Ｅ６−７：Ｅ２比が増大し、１０００００個のＳｉＨａ細胞の添加によりおよそ４．２倍と大幅に増大した。比較して、ＳｉＨａ細胞単独（３３０００個の細胞）に関する比は約９であった（図１８ｂ）。
【０１２３】
ＨＰＶ１６  Ｅ６−７：Ｅ２比を、ＨＰＶ１６  Ｅ６−７及びＥ２に関してハイブリッド捕捉アッセイを用いて限定数（ｎ＝１３）の子宮頸部試料においても決定した。試料の組織学的診断は既知であり、全ての試料が、ＨＰＶ１６のみを含んでいることをＰＣＲにより確認した。試料ＲＮＡはＱＩＡｚｏｌ抽出により単離した。全ての組織学的グレードに関して比の広範な分布が存在していたが、一部の試料で比が相対的に高かった（図２０）。
【０１２４】
このハイブリッド捕捉アッセイは、良好な線形性及びおよそ３〜４対数のダイナミックレンジでｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを検出した。この分析性能は、ＤＮＡのハイブリッド捕捉検出のものと同程度である。捕捉オリゴの特異性のために、ＨＰＶ１６のｍＲＮＡとＨＰＶ１８のｍＲＮＡとの間には交差反応性が存在しなかった。全ての様々なＨＰＶタイプの交差反応性は試験しなかった。ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８いずれか由来のＥ６−７又はＥ２のｍＲＮＡの検出が、別々のウェルにおけるアッセイにより実証された。ＨＰＶ  Ｅ６−７：Ｅ２比を、これらの別々のアッセイから算出することができる。標的の捕捉及び検出のための短いＤＮＡプローブの使用によって、様々な標的による設計の柔軟性がもたらされる。アッセイは、単一ウェルにおいて単一ＨＰＶタイプを検出するように（タイピング）又は様々なタイプの多数の特異的なＨＰＶ配列を同時に検出するように（スクリーニング）設計され得る。
【０１２５】
実施例１８
標的核酸の有無を検出する方法
実施例１８〜実施例２１は、図２に例示されるように２つのハイブリダイゼーション工程アッセイを用いる。第１のハイブリダイゼーション工程では、ＲＮＡは磁性ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートしているビオチン化ＤＮＡプローブにより捕捉される。外部ＲＮＡを洗い流した後、ＲＮＡ標的の完全長をカバーするＤＮＡプローブの第２のセット（round）を加える。ＤＮＡプローブの第１のセットは、所望のＲＮＡ標的のみが捕捉されるように特異的なものでなければならないが、プローブの第２のセットはこの工程では標的ＲＮＡのみがウェルに存在しているため、特異的である必要はない。次いで、ハイブリッドは二工程ハイブリッド捕捉抗体系（Qiagen Gaithersburg, Inc., Gaithersburg, M(D）により検出し、シグナルを照度計で読み取る。この方法によって、量及び長さの両方に基づきＲＮＡの線形検出が可能となる。このアッセイに「分子定規」概念を適用することができ、このアッセイでは例えば転写産物の長さを決定するために、漸増量のシグナルプローブを加えることができる。
【０１２６】
以下の実施例ではＲＮＡを使用しているが、一般的な概念を任意の形態の核酸に適用することができる。
【０１２７】
実施例１８：材料及び方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ
Ｅ６／Ｅ７に関するＨＰＶ１６のＲＮＡ由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（７９０個のヌクレオチド）を以下の実施例の幾つかで使用した。ＲＮＡを、鋳型としてＨＰＶ１６プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋＮＣ＿０１５２６、Ｘ０５０１５）を用いた標準的なクローニング技法によって調製した。
【０１２８】
臨床サンプル
ハイブリッド捕捉ＩＩ試験によって高リスクＨＰＶに対する試験結果が陽性である、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）培地中の子宮頸部試料は、２００９年中に入手した。全てのサンプルを、ｇｐ＋コンセンサスプライマーを用いて遺伝子型決定した。ＨＰＶ１６に対する試験結果が陽性である代表的なサンプルを、本研究に使用した。これらの内の１４サンプルがＬＳＩＬと診断され、３５サンプルが高悪性度の子宮頸部上皮間新生物（ＨＳＩＬ）と診断された。各サンプルを、Ｅ２遺伝子発現の完全性に関して分析した。
【０１２９】
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡを、ＱＩＡＺＯＬ（商標）試薬（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いてサンプルから抽出した。サンプルの内容物全体（２ｍｌ〜１６ｍｌの範囲）を１５分間遠心分離した。細胞ペレットを３ｍｌのＱＩＡＺＯＬ（商標）中に再懸濁し、室温で５分間インキュベートして、完全な溶解を達成した。次いで０.６ｍｌのクロロホルムを加えて、サンプルを激しく振盪した後、更に室温で２〜３分間インキュベートするとともに１２０００×ｇで１５分間遠心分離した。無色の水層を１.５ｍｌのイソプロパノールの入った新たなチューブに移し、室温で１０分間インキュベートした。次いで４℃で１０分間１２０００×ｇで更に遠心分離を行い、その間にチューブの壁に沈殿物が形成された。上清を取り除き、ペレットを３ｍｌの７５％エタノールで１回洗浄した。ペレットを１０分間、空気乾燥させた後、５０μｌの分子生物学的グレードの水中で再懸濁した。
【０１３０】
ＤＮＡプローブ
３５ヌクレオチドのＨＰＶ１６に対するＤＮＡ捕捉プローブをそれぞれ、他のＨＰＶタイプに特異的となるようにＢＬＡＳＴ（NCBI）を用いて設計した。これらのプローブは、それぞれの発生し得るＲＮＡ転写産物がプローブにより捕捉されるようにＨＰＶ遺伝子に沿って配置された（spaced）。これらの捕捉プローブを、５’末端上でビオチンを用いることで合成した。次いでシグナルプローブを、ＨＰＶ１６遺伝子の残りをカバーするように設計した。これらのプローブの長さは２８〜４２ヌクレオチドと様々であり、Ｏｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒプログラム（Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa）を用いて、最適な熱力学的安定性及び一貫性を達成した。次いで、これらのプローブをプローブカクテル中にプールした。Ｅ２領域に全てのプローブを欠いた別々のプローブカクテルを更に作製した。
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
ＤＮＡプローブを逆ハイブリッド捕捉ＨＰＶ１６  Ｅ２破壊アッセイに使用した。２つのプローブセットをアッセイに使用した。１つ目のプローブセットがＨＰＶ１６ゲノムに沿って広がるプローブを含み、２つ目のプローブセットがＥ２遺伝子領域にプローブが含まれないサブセットであった。プローブを表６及び表７に挙げ、ビオチン化捕捉プローブは表７に挙げている。
【０１３３】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
ビーズ／プローブコンジュゲーション
磁性ストレプトアビジンビーズ（５％固形分、Seradyn, Inc., Indianapolis, IN）をボルテックスし、Ｔｗｅｅｎ系洗浄バッファで２回洗浄した。次いで磁性ストレプトアビジンビーズを１８０ｎＭのプローブを含むビオチン化捕捉プローブのカクテルとインキュベートするとともに、１１５０ＲＰＭで振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。ビーズをペレット化して、３回以上洗浄して、４℃で保管するためにカゼインブロッキング溶液中で再懸濁した。
【０１３６】
Ｅ２完全性アッセイ
３０μｌのカオトロピック塩溶液中の２０μｌのＱｉａｚｏｌ抽出ＲＮＡを、振盪しながら６０℃で３０分間、ビーズにコンジュゲートされた捕捉プローブ１０μｌ上に捕捉した。この工程の後、サンプルを、ピペッティングすることにより、３０μｌの反応液を同じ９６ウェルプレート上の２つの別々の無菌ウェルに分割した。次いで、磁気ラックを使用して、ビーズ−プローブ−ＲＮＡ複合体をプルダウンして、得られたペレットを緩衝生理食塩水−界面活性剤溶液で２回（１回は２分、及び１回は５分）洗浄した。次いで、シグナルプローブカクテル（１つは全てのプローブを含み、１つはＥ２領域プローブを含まない）を６５μｌの核酸ハイブリダイゼーションバッファ中、４.２ｎＭで添加し、ハイブリダイゼーション反応を振盪しながら６０℃で３０分間行った。この反応の後、ビーズ複合体を更にペレット化して、プレートを吸水性のペーパータオル上で乾燥させた。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗ＤＮＡ：ＲＮＡ核酸ハイブリッド抗体の溶液を４５μｌ／ウェルで添加し、プレートを４５℃で３０分間インキュベートした。ビーズを更にペレット化し、トリス系洗浄バッファで１回当たり１分間、５回洗浄した。それから、３５μｌの化学発光アルカリホスファターゼ基質を加え、プレートを、サンプルを光から保護するためにホイルシールしながら、室温で１５分間、３５０ＲＰＭで振盪した。その後、ウェルからの発光を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）  ＤＭＬ  ３０００（商標）マイクロプレート照度計（Qiagen Gaithersburg, Inc., Gaithersburg, MD）で読み取った。
【０１３７】
２つのウェル（Ｅ２プローブを含むもの及び含まないもの）におけるサンプルシグナル：ノイズ（「Ｓ／Ｎ」）値を決定した。全てのプローブウェルにおいてシグナル：ノイズ値が２未満であるサンプルは、統計分析から排除した。Ｅ２の破壊の程度を、以下の式の割合差によって決定した：［（Ｓ／Ｎ（全て）−Ｓ／Ｎ（Ｅ２なし））／Ｓ／Ｎ（全て）］×１００。
【０１３８】
実施例１９
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を以下に記載のように準備した。転写産物に沿って等間隔に配置された、それぞれが４０ヌクレオチドの３つのビオチン化捕捉プローブを、上記のように磁性ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートした。次いでＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７転写産物の１×１０５個のコピーを上記のようにストレプトアビジンビーズに捕捉させた。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７に対する０個、５個、１０個、１５個及び１９個のシグナルプローブを含むプローブカクテルを生成した。捕捉プローブを除いて、１９個のシグナルプローブが、Ｅ６／Ｅ７転写産物の完全長にハイブリダイズするのに十分である。加えて、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７に対する１９個のシグナルプローブ＋ＨＰＶ１６  Ｌ１に対する５個のシグナルプローブを含むプローブカクテルを生成した。Ｓ／Ｎ比を各プローブカクテルに対して算出した。結果を図１３に示す。図示されるように、シグナル強度は、プローブの数の増大に伴い、幾らか線形的に増大する。
【０１３９】
実施例２０
ＳｉＨａ細胞及びＷ１２細胞におけるＥ２完全性を、実施例１８に記載の方法を用いて比較した。ＳｉＨａ細胞は、組込みＨＰＶ１６ゲノムを含んでおり、そのため細胞で維持されるＥ２遺伝子の大部分で破壊が起こる。対照的に、ＨＰＶ１６ゲノムはＷ１２細胞においてエピソーム形態で維持されるため、Ｅ２遺伝子は無傷のままである。データを図２２に示す。Ｅ２プローブをシグナル増幅カクテルから除去する場合、Ｅ２領域由来の全てのプローブによるシグナルが存在しなくなるため、ＳｉＨａ細胞ではシグナルの低下は起こらない。しかしながら、Ｗ１２由来のシグナルは大幅に低下し、このことは検出されるＲＮＡ転写産物のおよそ５０％がＥ２由来であることを示している。
【０１４０】
実施例２１
ＬＳＩＬサンプル及びＨＳＩＬサンプルを実施例１８に記載のＥ２完全性アッセイにおいて試験した。データを図２３に示し、以下の表８に要約する。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
図示されるように、ＬＳＩＬサンプルとＨＳＩＬサンプルとの間に有意差が存在する（ｐ＝０.００１２）。しかしながら、より注目すべきは、各病変カテゴリーにおけるサンプルの分布である。病変カテゴリーに対する最大の割合差は同程度であるが、最小値は大きく異なる（ＨＳＩＬでは２、及びＬＳＩＬでは１６．５）。僅かな割合のＨＳＩＬサンプルが最終的に子宮頸がんへと進行する場合には、このパターンが理にかなっている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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