(57)【要約】本発明は、低温保存された生体試料（１）を監視する方法に関する。その方法は、生体試料（１）を低温保存状態で供給する工程と、ラマン分光測定装置（１０、２０）で少なくとも１つのラマン分光試料特性を測定する工程と、評価装置（３０）で、少なくとも１つの試料特性を参照特性と比較する工程と、その比較の結果に依存し生体試料（１）の保存状態に特徴的な状態特性を供給する工程とを含んでいる。本発明は、さらに、低温保存された試料用の監視装置、特にその方法を実行する監視装置に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温保存された生体試料（１）を監視する方法であって、
（Ａ）低温保存状態の前記生体試料（１）を供給する工程と、
（Ｂ）前記低温保存状態の前記生体試料（１）上で少なくとも１つのラマン分光試料特性を測定する工程と、
（Ｃ）前記少なくとも１つの試料特性を参照特性と比較する工程と、
（Ｄ）前記比較（Ｃ）の結果に依存し前記生体試料（１）の保存状態に応じた状態特性を供給する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）は、前記試料（１）の少なくとも一部分の、ラマン・スペクトルまたはラマン・スペクトルの少なくとも一部を測定すること（Ｂ１）を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（Ｂ）は、前記試料（１）の少なくとも一部分のラマン・スペクトルの少なくとも１つのスペクトル発光値を測定すること（Ｂ２）を含むものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（Ｂ）は、前記試料の少なくとも一部分における前記少なくとも１つのラマン分光試料特性の時間的な変化のラマン分光測定（Ｂ３）を含むものである、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記測定（Ｂ）は、前記生体試料（１）、前記生体試料に含まれるプローブ物質、および試料容器、の中の少なくとも１つについて行われるものである、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記参照特性は、保存されたテーブル値、前記試料特性内のスペクトル参照値、および前の時点で測定された試料特性、の中の少なくとも１つを含むものである、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（Ｃ）は、前記試料特性と前記参照特性の間の差を供給すること（Ｃ１）を含むものである、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程（Ｃ）は、前記試料特性と前記参照特性の比を供給すること（Ｃ２）を含むものである、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記工程（Ｄ）における前記状態特性を供給することは、前記生体試料（１）の状態、品質および汚染の中の少なくとも１つに関する情報を生成すること（Ｄ１）を含むものである、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（Ｄ）における前記状態特性を供給することは、アモルファス状態の氷の割合および結晶状態の氷の割合のうちの少なくとも一方に特徴的な定量的な値の出力（Ｄ２）を含むものである、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（Ｄ）における前記状態特性を供給することは、前記試料（１）のおよび／または前記試料容器の非水性成分の変化に特徴的な定量的な値の出力（Ｄ３）を含むものである、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（Ｄ）における前記状態特性を供給することは、前記生体試料（１）の特性変化を示す警報信号を発生すること（Ｄ４）を含むものである、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（Ｄ）における前記状態特性を供給することは、前記生体試料（１）の破壊を示す劣化信号を発生すること（Ｄ５）を含むものである、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのラマン分光試料特性を測定するよう構成されたラマン分光測定装置と、前記測定された少なくとも１つのラマン分光試料特性を参照特性と比較するよう、および前記状態特性を供給するよう設定された評価装置とが、冷却保存領域にある前記試料（１）から熱的に分離された状態で作動される、請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記測定（Ｂ）は、窓または光ファイバを介して前記生体試料（１）を照明することを含むものである、請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記測定（Ｂ）は、狭帯域スペクトル光源、特に発光ダイオードまたはレーザで、前記生体試料（１）を照明することを含むものである、請求項１乃至１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記測定（Ｂ）は、所定の時間間隔で前記測定（Ｂ）を繰り返すことを含むものである、請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記測定（Ｂ）は、前記生体試料（１）を、前記測定（Ｂ）の期間において低温保存に適した環境の状態に維持することを含むものである、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
低温保存された生体試料（１）を監視するよう適合化された監視装置（１００）であって、
−  少なくとも１つのラマン分光試料特性を測定するよう構成されたラマン分光測定装置と、
−  前記測定された少なくとも１つのラマン分光試料特性を参照特性と比較し、前記比較の結果に依存し前記生体試料（１）の保存状態に応じた状態特性を供給するよう設定された評価装置（３０）と、
を含む、監視装置（１００）。
【請求項２０】
前記測定装置は、
窓および／または光ファイバ（１１）を介して前記生体試料（１）へと、光を供給することができる１つの照明装置（１０）と、
前記試料（１）においてラマン散乱によって生成された光を検出できる１つの検出装置（２０）と、
を含むものである、請求項１９に記載の監視装置。
【請求項２１】
前記評価装置（３０）は、
−  参照特性を格納するよう適合化されたメモリ（３１）と、
−  比較装置（３２）、特に減算ユニットおよび除算ユニットの少なくとも一方を有する比較装置（３２）と、
−  前記状態特性を出力するよう適合化された出力装置（３３）と、
−  前記生体試料（１）の特性状態を表示できる表示器（３４）および／または警報装置（３５）と、
を含むものである、請求項１９または２０に記載の監視装置。
【請求項２２】
低温保存された生体試料の状態を監視するためのラマン分光測定の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温保存された生体試料または標本を監視する方法に関し、特に、低温保存された生体試料の状態を制御する方法に関する。さらに、本発明は、特にその方法による、低温保存された生体試料を監視するよう構成された監視装置に関する。本発明の適用例は、低温保存された試料の状態および品質の管理もしくは制御において実現され、特に長期保存（例えば、生体試料のバンクにおいて）において、または臨床的な試料管理もしくは制御において実現される。
【背景技術】
【０００２】
低温保存（Kryokonservierung：凍結保存）は、実用的な条件の下で、例えば、生物細胞（配偶子を含む）、細胞成分、細胞組成物、組織または組織部分、等の生体試料または生物試料の、生命維持および／または機能保存するための長期保存、またはアーカイブ保管に適していることが判明した唯一の公知技術である。例えば種の保護において、いわゆる“組織工学”および細胞生物学（特に、幹細胞生物学）における、生殖および再生医療における最新の開発に基づく、低温保存の新しい適用例（Anwendungen：アプリケーション、用途）による、低温保存状態の生体（生物）試料の大容量規模の保存、に対する強い要求（需要）が存在する。
【０００３】
生体試料の低温保存に対する１つの重要な要件は、試料が損傷なしで格納され保存されることである。低温保存後の生体試料の適用例では、例えば生きている生物細胞を有機体または生命体に移植する期間において、その結果として、その試料が低温保存中に、例えば遺伝的、後成的（epigenetic）または機能的な損傷を受けた場合に、有機体または生命体に重大な健全性上の（gesundheitliche：衛生上の）結果を生じさせ得る。損傷は、試料の冷却または解凍の期間において、例えば試料の水性成分のような試料成分の変化によって発生し得る。生体試料を冷却しまたは解凍する工程は、損傷の潜在的可能性について検討され、実用的な適用例に最適化され、低温保存状態での試料の可能性ある変化の経緯または経験が現在までのところ限定的に利用されてきた。試料品質の検査は、現時点で、試料を部分的または完全に解凍することによってのみ可能である。しかし、低温保存された試料の中間の解凍によって、損傷の危険性（リスク）が増大する。
【０００４】
現在までのところ、水のガラス転移温度より低い温度の−１３７℃では任意の化学変換（chemische Umwandlung：化学変化）が実質的に無限に減速され、この温度範囲の水では再結晶化の効果が生じない、と仮定される。従って、−１３０℃より低い温度範囲で損傷のない状態で移送された試料は、安定的に保存されている、と考えられる。これらの仮定は、特に、生体試料が有害な氷結晶を形成しないようにすることができる高い冷却速度で凍結された生体試料の検証について、為される。
【０００５】
しかし、冷却または解凍の期間において氷結晶の形成が回避された場合でも、解凍後にその試料が損傷状態を呈し得ることが、実際には知られている。しかし、今日までのところ、長期保存された試料の状態または品質の監視は行われていない。様々な試料から部分試料を取り出して、その解凍後にその状態を分析するというオプション（任意選択肢）はあるが、他の試料またはバルク試料についての部分試料から、発生する損傷過程の統計的な性質によって、結論を導き出すことはできない。現場でのまたはそのままの状態の（in situ）、従って深い冷温状態の試料の状態を、監視する信頼性ある技術的解決法は、現在のところ利用できない。
【０００６】
国際公開第２００６／０５８８１６号には、試料容器内でその試料の光学的分析が行われる形態の低温保存試料用の試料容器が開示されている。この文献では、反射測定または透過測定によって再結晶過程を検出することが示唆されている。しかし、それらの測定は、定量的な試料の特性評価または特性解析には適さない。測定された光強度は、可能性ある試料再結晶化に依存するだけでなく、他の効果にも敏感なので、それらの測定は定性的な観察に限定的に適用できるに過ぎない。さらに、その試料には、細胞外での氷の形成を監視するために蛍光マーカ（蛍光染色）が用いられるが、その試料の結晶化状態の検出については記載がない。
【０００７】
別の敏感な分析方法は一般的に知られているラマン分光法である。この方法は、例えば、米国特許出願公開第２００６／００８２７６２号（Ａ１）またはＲ．Ｓ．ホーク氏（Hawke）、他（"Rev. Sci. Instr." Vol. 45, 1974, p.1598 ff.）に記載されているが、生体試料の測定に対する対処が為されていない。米国特許出願公開第２００４／００７３１２０号（Ａ１）には、生体組織試料に対してラマン分光測定を行うことが示唆されている。しかし、その測定は、室温でのその試料に対して行われるに過ぎない。室温における生体試料に対するラマン分光測定は、欧州特許第１４３８４２１号Ｂ１、独国特許公開第１０１２３４４３号（Ａ１）、独国特許公開第３６８７４３８号（Ｔ２）、米国特許出願公開第２００８／０３０６３４６号（Ａ１）、および米国特許出願公開第２００６／０１５５１９５号（Ａ１）にも、記載されている。
【０００８】
Ｃ．Ａ．タルク氏（Tulk）、他、“Journal of Chemical Physics”（化学物理雑誌） (Vol. 109, 1998, p.8478)の刊行物によって、ラマン分光測定によるアモルファス状態の氷および結晶状態の氷における化学的結合の相違を特性評価または特性解析することが知られている。これらの測定の適用例は基礎研究用に特化された分光装置で行われたが、このことは、Ｃ．Ａ．タルク氏（Tulk）他の文献では言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００６／０５８８１６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／００８２７６２号（Ａ１）
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００７３１２０号（Ａ１）
【特許文献４】欧州特許第１４３８４２１号（Ｂ１）
【特許文献５】独国特許公開第１０１２３４４３号（Ａ１）
【特許文献６】独国特許公開第３６８７４３８号（Ｔ２）
【特許文献７】米国特許出願公開第２００８／０３０６３４６号（Ａ１）
【特許文献８】米国特許出願公開第２００６／０１５５１９５号（Ａ１）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】R. S. Hawke et al., Rev. Sci. Instr. Vol.45, 1974, p.1598 ff.
【非特許文献２】C. A. Tulk et al., Journal of Chemical Physics, Vol.109, 1998, p.8478
【発明の開示】
【００１１】
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服する手段によって、低温保存された生体試料または生物試料を監視するための改良された方法を実現することである。その監視方法によって、特に、試料にいかなる変化も生じさせることなく試料の観察が可能になり、および／または、結晶状態（特に結晶化の度合）に関するおよび／または改良された信頼性あるおよび／または精度で試料の化学変化に関する定量的な情報の取得が可能になる。本発明の目的は、さらに、従来技術の欠点を克服する手段によって、低温保存された生体試料を監視するための改良された装置を実現することである。その監視装置は、特に、生体試料の低温保存のための利用可能な技術との適合性または両立性を有するべきである。
【００１２】
これらの目的は、独立請求項の特徴をそれぞれ有する方法および装置によって達成される。本発明の有利な実施形態および適用例は、従属請求項より明らかになる。
【００１３】
本発明の第１の観点によれば、上述の目的は、一般的に、低温保存された生体試料を監視する方法によって達成され、その際、低温保存状態の生体試料に対してラマン分光測定が行われる。本発明によれば、水の凝固点または氷点より低い温度が優勢的な低温保存装置、特に液体窒素または液体窒素の上の蒸気の温度の低温保存装置の、例えばタンク（槽）の保存領域または格納領域において低温保存状態にある生体試料が提供される、と想定される。本発明によれば、さらに、生体試料の少なくとも１つのラマン分光試料特性を測定し（Raman-spektroskopische Messung）、その特性が少なくとも１つの参照特性または基準特性（Referenzmerkmal）と比較されること、が想定される。本発明によれば、さらに、比較結果に依存し、生体試料の保存条件に応じた（に特徴的な）状態特性（Zustandsmerkmal）を実現すること、が想定される。
【００１４】
ラマン分光測定の適用によって少なくとも１つの試料特性が得られ、その特性は、参照特性との比較によって、有利な形態で試料の結晶状態および化学的組成に関する情報をすぐに得ることができることが、本発明によって確認された。試料の外観（明確な、拡散的な、微細なまたは粗い結晶性、不均一性）に基づく通常の反射または透過測定とは異なり、ラマン分光測定は、試料および／または試料容器の分子特性を決定する物理的な方法（アプローチ）である。例えば霧のかかったまたは曇った試料容器による測定結果に対する望ましくない効果が、除外される。特に、凍結防止（防御）添加剤（Kryoadditiva）（例えば、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコールおよびトレハロース）のような試料の主要成分における、および生体材料そのものにおける化学的過程（プロセス）が、検出でき、任意選択的に定量化できる。利点として、その方法は、分光測定用に意図的に付与されるマーカ物質（Markersubstanzen）が含まれない低温保存試料に対して、実行することができる。さらに、本発明によって、結晶状態に加えて、例えば試料成分の化学変換または化学変化（chemische Umwandlungen）のような試料の別の特性が記録できる。
【００１５】
本発明の第２の観点によれば、上述の目的は、一般的に、ラマン分光測定によって、低温保存された生体試料を監視するよう構成された監視装置によって、達成される。本発明による監視装置は、少なくとも１つのラマン分光試料特性が測定できるラマン分光測定装置を含んでいる。ラマン分光測定装置は、一般的に、試料および／または試料容器を照明する照明装置、好ましくは発光ダイオードまたはレーザ、および、試料および／または試料容器から非弾性的に散乱された光を検出する検出装置を含んでいる。ラマン分光測定装置は、通常のラマン分光計のように構造化させ、または試料を監視するときの測定条件に特に適合化させることができる。本発明による監視装置は、さらに、１つの評価装置を含んでいる。評価装置は、例えば少なくとも１つの計算装置を含み、例えば、少なくとも１つの測定されたラマン分光試料特性を参照（基準）特性と比較する機能と、その比較結果に依存し、生体試料の保存条件に応じた（に特徴的な）状態特性を供給する機能と、の２つの機能用に構成される。
【００１６】
本発明の１つの重要な利点は、特に、ラマン分光法の全ての通常の適用例とは違って、特に、例えば−１３６℃以下の低温条件下での保存中の生体試料の、障害のないおよび損傷のない現場での監視が可能であることである。
【００１７】
利点として、監視装置は、試料の非接触での特性評価に適している。測定前、測定中または測定後に、低温保存装置の保存領域から試料を取り出したり、またはそこに試料を戻したりする必要がない。好ましくは、試料は、いずれの時点でも低温条件の保存領域での測定から離れることがなく、即ち連続的な冷却状態（の連鎖）が中断されることがない。保存領域は、特に試料容器は、閉じた状態を維持する。測定は、保存領域における光学的インタフェース（接触面）を通して非接触で行うことができる。
【００１８】
本発明によって、例えば月単位または年単位で、繰り返し測定を行うことによって、特に、低温条件下での監視が可能になる。発明者たちは、例えば、相転移、相分離および／または結晶化プロセスのような物理化学的プロセス（過程、処理）を、ラマン分光測定で低温条件下で特徴付けまたは特性評価できること、を見出した。
【００１９】
“ラマン分光測定”という用語は、紫外線（ＵＶ）、可視光線（ＶＩＳ）および／または赤外線（ＩＲ）の波長領域における少なくとも１つの波長で（の光を）照射したときの、試料の材料、特に試料の凍結水性成分、および／または試料容器の材料における、非弾性散乱（ラマン線（ライン））の定量的または定性的検出を可能にする任意の光学的測定を指す。特に、少なくとも１つのラマン線の、強度、スペクトル位置、発生および／または時間的変化（Entwicklung：展開、推移、現象）が、検出される。“ラマン分光試料特性”はラマン分光測定の結果として得られる。
【００２０】
本発明の第１の有利な変形形態によれば、ラマン分光測定は、試料および／または試料容器の少なくとも１つの部分の、完全な（全体の）ラマン・スペクトルまたはラマン・スペクトルの少なくとも一部（Ausschnitts）の測定を含む。この場合、ラマン分光試料特性は、結晶化度の検出に加えて、試料の化学組成を特徴付けることを可能にする高度の情報内容を有する。本発明の第２の有利な変形形態によれば、ラマン分光測定は、試料および／または試料容器の少なくとも一部のラマン・スペクトルの少なくとも１つのスペクトル発光値（Emissionswertes：放射値）の測定を含んでいる。この場合、監視装置の簡略化された構造およびコンパクト性に関する利点を得ることができる。別の有利な変形形態によれば、時間分解されたまたは時系列の（zeitaufgeloeste）ラマン分光測定は、試料および／または試料容器の少なくとも一部に対して行うことができる。これらの変形形態は、永続的に、または本発明の実施期間中の或る時間期間に、組み合わせることができる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、ラマン分光測定は、特に０℃未満の温度の、低温保存状態の生体試料、即ち凍結試料上で、直接行われる。低温保存された試料の温度は、特定の場合に、具体的な保存の作業または課題に応じて選択され、特に僅かな（低い）感度の、例えば徐々に凍結される試料については、好ましくは−８０℃未満であり、特にガラス状に凍結されおよび／または非常に敏感な試料については、特に−１３６℃未満である。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、ラマン分光測定は、代替的にまたは追加的に、低温保存された試料を含む試料容器の壁材上で行うこともできる。利点として、試料の望ましくない変化、例えば再結晶プロセスに起因する化学変換または幾何学的（形状）変化、および／または、例えば不所望な温度変動のような保存条件の不所望な変化は、試料容器の材料の少なくとも１つのラマン線（ライン）の、強度、スペクトル位置、発生および／または時間的減衰（崩壊）に影響を与え得る。試料容器の壁材の測定は、例えば、容器材料のポリエチレンおよびポリプロピレンを監視することを含むことができる。その双方の物質は半結晶質である（従って光学的に不透明でありまたは濁っている）。それらは、可塑剤（例えばテレフタレート）を添加するだけでアモルファス（非晶質）（および透明）状態を維持する。材料の脆化と共に（を伴う）、低温での結晶成分（Anteils：部分）の（連続的な）変化が、本発明によって決定または測定することができる。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば、ラマン分光測定は、代替的または追加的に、生体試料に含まれるプローブ（探査）物質上で行うことができる。例えば、金属コロイド（好ましくは、金および銀のコロイド）は、プローブ物質として使用することができ、その金属コロイドは、表面増強ラマン散乱（Surface Enhanced Raman Scattering）（SERS）効果により、個々の振動帯域をかなり増幅することができ、従ってさらに試料の特別な成分をかなり増幅することができる。さらに、添加剤は、例えば、固体相の水（氷）との化合物の形成を示すものであり（添加剤には、凍結防止剤（防御剤）のＤＭＳＯおよびエチレングリコールが含まれる）、また添加剤は、濃度依存性の化学変換（例えば、ダイマー平衡、結晶化）を示すものであり、これらの添加剤は、ラマン分光試料特性評価に用いることができる。
【００２４】
用語“参照特性”（基準特性）は、時間的に安定な化学的および／または物理的に不変の測定対象物の特徴付けまたは特性評価に適した任意の物理的な量、特に分光の量を表す。参照特性は、例えば、前回の比較用の測定または理論的シミュレーションで既知の保存されたテーブル値を含むことができる。参照特性は、さらに、例えばラマン・スペクトルにおける所定のラマン線（ライン）の振幅のような試料特性内のスペクトル参照値を含むことができる。このようにして、内部参照（基準）が有利に与えられる。内部参照は、さらに、例えばラマン線の振幅の所定割合のような、測定されたラマン・スペクトルの少なくとも２つの特性の所定の組合せによって、形成することができる。代替的または追加的に、参照特性は、例えばラマン・スペクトルのような前回の時点で測定された試料特性を含んでいて、時間基準が有利に与えられるようになっている。この点で、ラマン・スペクトル測定は、例えば日単位、週単位または月単位のような所定の時間間隔で繰り返される。監視装置の評価装置は、それに対応して、参照特性を格納するよう設定されたメモリを含んでいることが好ましい。
【００２５】
利点として、少なくとも１つのラマン分光試料特性を少なくとも１つの参照特性と比較するための、相異なるオプション（任意選択肢）がある。例えば、減算処理（例えば、振幅またはスペクトル位置についてのもの）を、測定された各試料特性と参照特性の間に設けることができる。この場合、測定の評価を簡単化することができる。減算は、特に、個々の帯域のスペクトル位置のずれまたはシフトの検出を含むことができる。代替的または追加的に、比または比率の形成（商の形成）処理を、試料特性と参照特性の間に設けることができる。この場合、測定の増強された感度に関する利点が得られる。従って、監視装置の評価装置は、減算および／または除算ユニットを含んでいることが好ましい。
【００２６】
用語“状態特性”（Zustandsmerkmal）は、試料および／または試料容器の物理的および／または化学的な状態（特に、試料の結晶状態）を明確に特徴付け、また情報として提示可能な任意の物理量または任意の物（オブジェクト）を表す。例えば、状態特性を提示するために、生体試料の状態、量および汚染に関する情報を生成することができる。例えば、“結晶化の開始”、“凍結防止剤の均一な分布”または“無視し得る溶媒汚染”のような試料の上述の特性を表すテキスト情報が、表示され、またはそうでなければ示されること、が好ましい。代替的にまたは追加的に、アモルファス状態の氷の一部分および／または結晶状態の氷の一部分に特徴的な定量的な値（結晶化度）を、直接出力することができる。代替的にまたは追加的に、試料および／または試料容器の非水性成分の変化に関する特徴的な定量的な値を、直接出力することができる。また、用語“状態特性”は、特定の試料の状態を示す信号、例えば可視信号または音響信号をも含んでいる。例えば、生体試料の特性変化を示す警報信号を生成することができ、および／または、生体試料の破壊を示す劣化信号を生成することができる。監視装置の評価装置は、それに対応して、状態特性を出力するよう設定された出力装置、および／または、生体試料の特性状態を示すことができるインジケータ（標識、表示器）および／または警報装置を含むこと、が好ましい。
【００２７】
１つの重要な利点として、本発明は、ラマン分光測定とのその後の試料の状態特性の供給を含む複数の工程の期間において、生体試料は、低温保存状態に維持でき、特に、低温保存に適した環境に維持できる。これは、特に、温度が永続的に−１３６℃未満に維持されるアモルファス状態で固化した水性の試料に関する。ラマン分光測定装置および評価装置は、冷却保存領域に配置された試料から熱的におよび空間的に分離されて作動されることが、好ましい。ラマン分光測定に用いられる信号（照明用の光、情報搬送用の光、検出されたラマン散乱光）は、保存領域と測定および評価装置の間で、好ましくは窓または光ファイバを介して、光学的に伝送される。
【００２８】
本発明の別の独立した主題は、低温保存装置、特に低温槽内の試料容器における、低温保存された生体試料の状態を監視するためのラマン分光測定の使用に関する。
【００２９】
以下、本発明の他の詳細および利点を添付図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明による好ましい実施形態の特徴の概略図である。
【図２】図２は、本発明による方法の適用の期間における実験結果を示すグラフを示している。
【図３】図３は、本発明による方法の適用の期間における実験結果を示すグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下で、本発明の好ましい実施形態を、低温保存または凍結保存された（kryokonservierten）生体試料または生物試料にラマン分光測定装置を組み合わせた特徴を参照して説明する。ラマン分光測定と、特にそのために設けられた照明および検出装置の詳細については説明しない。その理由は、そのようなラマン分光法は従来技術で既知であるからである。例えば生体試料におけるラマン散乱の測定を参照することができ、本発明による監視システムは、従って試料容器の材料におけるラマン散乱の測定に基づくものとすることができる。本発明は、既知の低温保存方法によって低温保存装置に設けられた試料の監視に用いることができる。従って、低温保存技術の詳細についても説明しない。
【００３２】
図１は、本発明による監視装置１００を低温保存装置２００と組合せた概略的な図を示している。監視装置１００は、照明装置１０および検出装置２０を有するラマン分光測定装置と、評価装置３０とを含んでいる。評価装置３０は、検出装置２０に接続され、また、任意選択的にデータまたは信号伝送用の照明装置１０にも接続される。低温保存装置２００は、冷却装置２内に配置された試料容器３内に少なくとも１つの生体試料１を含む。図１における概略的な図とは違って、冷却装置２内で、複数の試料容器３の各々に、実際には、１つ以上の生体試料１が配置される。冷却装置２は、例えば、液体窒素で冷却された低温槽（タンク）である。
【００３３】
照明装置１０は、生体試料１または試料容器３の材料におけるラマン散乱を励起するための光源として、例えば、発光波長λ＝５３２ｎｍの固体レーザまたは発光波長λ＝７８５ｎｍの狭帯域ダイオード・レーザのような、レーザを含んでいる。検出装置２０は、生体試料１または試料容器３の材料において散乱された光を検出し、また、少なくとも１つのラマン分光試料特性を測定するよう、構成されている。検出装置２０は、波長選択性の要素および光感性（光検出性）の要素、例えばフォトダイオードまたはＣＣＤカメラを含んでいる。その波長選択性の要素は、具体的に測定されるラマン分光試料特性に応じて、例えば、モノクロメータ（単色分光器）または少なくとも１つの光学フィルタを含んでいる。
【００３４】
評価装置３０は、ラマン分光試料特性の評価用の参照特性または基準特性を格納するメモリ３１と、演算装置、特に比較装置３２とを含んでいる。その比較装置３２は、測定されたラマン分光試料特性を参照特性と比較するよう適合化されており、また、例えば、減算ユニットおよび／または除算ユニットを含んでいる。さらに、評価装置３０は、例えばプリンタのような出力装置３３、例えば表示スクリーンのような表示装置３４、および、例えば音響的警報器のような警報装置３５を備えている。評価装置３０は、例えば、要素３１、３２、３４および３５を含み、さらに要素３３に接続されたコンピュータによって、形成することができる。評価装置３０は、低温保存装置２００の制御装置に一体化することができる。
【００３５】
評価装置３０は、検出装置２０に接続されている。検出装置２０から評価装置３０へ測定信号の伝送が行われる。さらに、その検出装置を作動させるのために、評価装置３０から検出装置２０へ制御信号の伝送を行うことができる。例えば、制御信号は、検出装置２０の波長検出素子を設定するために供給することができる。任意選択的に、さらに、評価装置３０と照明装置１０の間に接続が形成されて、例えば、監視装置１００の実際の動作状態に応じて、照明装置１０をスイッチし（切換え）、および／またはラマン散乱の励起用の所定の波長を設定するようになっている。
【００３６】
照明装置１０は、照明光学系１１を介して試料１に光学的に結合される。照明光学系１１は、例えば、自由空間光学系または光ファイバ（導光光学系）を含んでいる。自由空間光学系の場合、励起光は、照明装置１０から、適用可能な場合には光の屈折および／または反射要素を介して、冷却装置２の壁の窓を通して、試料容器３へと方向づけられまたは導かれる。試料容器３の壁材が、照明装置１０の励起光の波長に対して透明である場合は、励起光は試料１に直接当たる。そうでない場合は、励起光が結合して入射するように、それぞれ試料容器３の壁材に窓を設けることができる。照明光学系１１が光ファイバ（導光光学系）を含む場合には、光ファイバが、照明装置１０から冷却装置２内に結合されて、その試料容器３に結合される。ここで、光ファイバからの励起光は、試料容器３の壁材または対応する光窓を通して、生体試料１に結合されて入射される。さらに、生体試料１は、検出器光学系１２を介して検出装置２０に光学的に接続または結合される。検出光学系１２は、照明光学系１１を参照して上述したように、窓光学系または光ファイバ（導光光学系）を含んでいる。
【００３７】
ラマン分光測定の幾何学的形状構成または配置（Geometrie）は、低温保存装置２００内の具体的な監視目的および幾何学的条件に応じて、自由に選択することができる。分離された照明および検出光学系１１、１２を有する図１に概略的に示された変形形態とは違って、双方の光路は、全体的にまたは部分的に一致させることができる。
【００３８】
生体試料を監視する本発明による方法を実施するために、低温保存装置２００に低温保存状態または凍結保存状態で試料１が配置される。照明装置１０および検出装置２０を用いて、少なくとも１つのラマン分光試料特性の測定、例えば水性試料成分のラマン・スペクトルの測定、が行われる。ラマン・スペクトルは、評価装置３０に伝送され、比較装置３２において、少なくとも１つの参照特性と比較される。その参照特性は、例えば、メモリ３１に保存された比較スペクトルを含んでいる。特定のラマン線（ライン）が、測定されたラマン・スペクトルにおける任意の特性変化を示す場合、状態特性が出力され、または要素３３、３４および３５の中の少なくとも１つの要素で表示される。例えば、必要に応じてスペクトル中の別の線（ライン）に対して正規化された所定のラマン線の強度が、所定の閾値（参照特性）を超えた場合、例えば“結晶化度、少なくとも１０％”のようなテキスト（文字）情報が、表示装置３４にまたはプリンタ３３に出力され、または、試料の臨界状態の場合には、例えば警報信号を鳴らすことができる。
【００３９】
図２および３には、状態特性の判定に用いられる実験結果が例示されている。その結果は、例えば凍結防止剤（Kryoprotektivums：抗凍結剤、凍結防御剤）ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide：ジメチルスルホキシド）の溶液のようなモデル系で測定されたものである。
【００４０】
図２は、−１９６℃の温度の冷却ブロック上に滴下することによって結晶固化され（ガラス状に凍結され）て、制御された形態で加熱された２０％のエチレングリコールを含む２０％ＤＭＳＯの水溶液のラマン・スペクトルの例を示している。点線の曲線は、液体の水に典型的な、構造化されていない（構造のない）発光を有する、結晶固化された水のラマン・スペクトルを示している。試料の温度が試料のガラス転移温度を超えて、試料が結晶氷へと結晶化した後では、結晶氷上でのラマン散乱に特徴的な先鋭な帯（バンド、山）（矢印参照）が、ラマン・スペクトル中に出現しまたは見えるようになる。ＤＭＳＯのＣＨ伸縮振動によって生じる２９２０ｃｍ−１および３０２０ｃｍ−１の他の帯（バンド、山）は、内部参照または基準として、または結晶氷の線（ライン）の正規化のために、用いることができる。図２に示されたスペクトルは、本発明によって測定される試料特性の形成に直接用いることができる。試料特性は、例えば、結晶氷の先鋭なラマン線および／または長波長域のラマン・スペクトルの微細構造を含むことができる。従って、完全に結晶化した氷の帯線は、同様に、参照特性または基準特性として用いることができ、または、ＤＭＳＯ成分の線は参照または基準（Referenzmerkmal）として用いることができる。図３には、別の実験結果が示されており、この実験結果に基づいて本発明による低温保存された生体試料の監視を行うことができる。図３は、最初に結晶固化された２０％のＤＭＳＯ溶液の時系列のラマンス・ペクトルを示している。結晶氷の形成の開始および結晶化した氷の形成の進行は、対応する結晶氷線の出現によって明確に可視化される。
【００４１】
低温保存された試料中の状態の変化を監視するラマン分光法の他の例は、試料の媒体中で他の相転移または相変化によるものとして与えられることができる。凍結防止剤の添加によって、試料はしばしば狙い通りに準安定状態で固化する。しかし、低温保存の保存時間の期間に、相転移または相変化、例えば、成分の分離または凍結防止剤の析出、等が生じ得る。そのような相転移も、ラマンス・ペクトル上で、複雑な組成または複合体の（komplex zusammengesetzten）、試料および／または凍結防止剤について可視化される。
【００４２】
低温保存された試料中の状態の変化を監視するラマン分光法の他の例は、試料の化学組成の緩やかな（即ち、急激でない）変化の現象論的な追跡に基づくものである。試料の初期冷却の直後の時点から保存されたラマン・スペクトルに基づいて、試料中の化学変化は、測定されたラマン・スペクトルを、保存されたスペクトルと後で比較することによって、検出することができる。低温保存は、化学（生化学）プロセスの無限の減速（低速化）に基づくものなので、スペクトルの各変化は、従って試料中の各化学反応は、状態の変化を示すものとして用いることができる。保存された有機体（Organismen：生命体）（脂質、タンパク質、核酸）の主要成分は、ここで、それらの特徴的なラマン線（Ｐ＝Ｏ、Ｐ−Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｈ、Ｎ−Ｈ）によって、狙い（目標）を定めて観察することができる。
【００４３】
別の任意の選択肢は、しばしば、プラスチック、特にポリマー材料を含む試料容器の材料を監視することである。試料容器の材料のスペクトルの変化は、化学的エージング（経年変化）効果の推定を可能にする。そのエージング効果は、試料中の状態の平行的な変化の指標として用いられ、または、適用可能な場合には、保存時間の期間におけるまたはしかし最も遅くても解凍の期間における試料の無菌性を危険に晒すものである。試料容器の材料におけるエージング効果は、例えば、試料容器の壁の脆化を示す、半結晶領域の形成を含み得る。
【００４４】
以上の説明に開示された発明の特徴、図面および特許請求の範囲は、個々に重要であり、またその相異なる実施形態において本発明を実現するための組合せでも重要である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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