(57)【要約】  本発明は、がんを治療するための、腫瘍抗原と特異的に結合する脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体とヒトＩＬ−１５との併用療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの治療に使用するための、ヒトＩＬ−１５と組み合わせた抗ＣＤ２０抗体。
【請求項２】
前記ＣＤ２０抗体が、フコースの量が６０％以下である脱フコシル化抗体であり、前記がんが、ＣＤ２０発現性のがんであることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項３】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項４】
前記抗ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブであることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項５】
前記がんが、白血病であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項６】
前記がんが、慢性リンパ球性白血病であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項７】
抗ＣＤ２０抗体が、ＡＤＣＣの増加を示す脱フコシル化抗体であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項８】
１または複数のさらなる他の細胞傷害性薬物、化学療法剤もしくは抗がん剤、またはそのような薬剤の効果を増進する化合物もしくは電離放射線が投与されることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０抗体。
【請求項９】
がんの治療を必要とする患者に（ｉ）第１有効量の抗ＣＤ２０抗体と（ｉｉ）第２有効量のヒトＩＬ−１５とを投与することを含む、がんを治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ２０抗体およびサイトカインヒトＩＬ−１５を用いた、がんに罹患している患者の併用治療、特に白血病、例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）のような血液の悪性腫瘍に罹患している患者の併用治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱フコシル化抗体
モノクローナル抗体の細胞媒介性のエフェクター機能は、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁およびＵＳ６，６０２，６８４に記載されるようにしてそれらのオリゴ糖成分を工学的に改変することにより増強できる。がん免疫療法において最も一般的に用いられるＩｇＧ１型抗体は、それぞれのＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７と結合している２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋もれ、ポリペプチド主鎖と高度な接触を形成しており、該オリゴ糖の存在は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のようなエフェクター機能を抗体が媒介するために必須である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１９９５）８１３〜８２２頁；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３（１９９８）５９〜７６頁；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）２６〜３２頁）。Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁およびＷＯ９９／５４３４２は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）の過剰発現が、抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を著しく増加することを示した。Ｎ２９７炭水化物の組成の変更または該炭水化物の排除は、Ｆｃとの結合、ＦｃγＲおよびＣ１  ｑとの結合にも影響する（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４（２００１）２８８〜２９４頁；Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）４５５３９〜４５５４７頁；Ｒａｄａｅｖ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）１６４７８〜１６４８３頁；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４頁；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２６７３３〜２６７４０頁；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３（２００２）１３３〜１４７頁）。
【０００３】
Ｉｉｄａ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２（２００６）２８７９〜２８８７頁は、脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体の効力がフコシル化抗ＣＤ２０の添加により阻害されたことを示す。脱フコシル化抗ＣＤ２０とフコシル化抗ＣＤ２０との１：９混合物（１０マイクロｇ／ｍＬ）の効力は、脱フコシル化抗ＣＤ２０単独の１，０００倍希釈物（０．０１マイクロｇ／ｍＬ）よりも劣っていた。彼らは、フコシル化対応物を含まない脱フコシル化ＩｇＧ１が、その高いＦｃガンマＲＩＩＩａ結合により、ＡＤＣＣに対する血漿ＩｇＧの阻害効果を回避できると結論付けている。Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．らは、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０６（２００５）９３〜１０３頁において、ヒトＩｇＧ１型抗体の複合型オリゴ糖からのフコースの除去が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の大きな増進をもたらすことを示している。Ｓａｔｏｈ，Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（２００６）１１６１〜１１７３頁は、次世代の治療用抗体としての脱フコシル化治療用抗体について論じている。Ｓａｔｏｈ，Ｍ．は、脱フコシル化型ヒトＩｇＧ１だけからなる抗体が理想的であると考えられると結論付けている。Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（２００６）６８０〜６８８頁は、フコシル化ＣＤ２０抗体（９６％フコシル化、ＣＨＯ／ＤＧ４４  １Ｈ５）と脱フコシル化ＣＤ２０抗体とを比較した。Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４（２００１）２８８〜２９４頁は、ＣＤ２０抗体について、ＡＤＣＣの増加がＦｃγＲＩＩＩとの結合の増加と相関することを報告している。
【０００４】
フコースの量を低減することによりモノクローナル抗体の細胞媒介性のエフェクター機能を増進する方法は、例えばＷＯ２００５／０１８５７２、ＷＯ２００６／１１６２６０、ＷＯ２００６／１１４７００、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００５／０１１７３５、ＷＯ２００５／０２７９６６、ＷＯ１９９７／０２８２６７、ＵＳ２００６／０１３４７０９、ＵＳ２００５／００５４０４８、ＵＳ２００５／０１５２８９４、ＷＯ２００３／０３５８３５、ＷＯ２０００／０６１７３９、Ｎｉｗａ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０６（２００５）１５１〜１６０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８（２００３）３４６６〜３４７３頁；ＷＯ０３／０５５９９３またはＵＳ２００５／０２４９７２２に記載されている。
【０００５】
ＣＤ２０および抗ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０分子（ヒトＢリンパ球拘束分化抗原またはＢｐ３５ともよばれる）は、プレＢリンパ球および成熟Ｂリンパ球に局在するおよそ３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）（１９８９）１１２８２〜１１２８７頁；およびＥｉｎｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ａ．ら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７（３）：７１１〜７１７頁；Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５（１９８８）２０８〜１２頁；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７（１９８８）１９７５〜８０頁；Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２（１９８９）２５６０〜８頁）。ＣＤ２０は、９０％より多くの末梢血またはリンパ器官からのＢ細胞の表面上で見出され、初期プレＢ細胞発生の間に発現され、形質細胞の分化まで残る。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞および悪性Ｂ細胞の両方に存在する。特に、ＣＤ２０は、９０％より多くのＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）で発現される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ６３（６）（１９８４）１４２４〜１４３３頁）が、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常形質細胞またはその他の正常組織では見出されない（Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（２）（１９８５）９７３〜９７９頁）。
【０００６】
ＣＤ２０タンパク質の８５アミノ酸カルボキシル末端領域は、細胞質内に局在する。この領域の長さは、それぞれ３、３、２８、１５および１６アミノ酸の比較的短い細胞質内領域を有するＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧ重鎖または組織適合性抗原クラスＩ１ａもしくはβ鎖のようなその他のＢ細胞特異的表面構造の長さとは対照的である（Ｋｏｍａｒｏｍｙ，Ｍ．ら、ＮＡＲ  １１（１９８３）６７７５〜６７８５頁）。最後の６１カルボキシル末端アミノ酸のうち、２１は酸性残基であるが、２だけが塩基性であり、この領域が強い正味の負電荷を有することを示している。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＮＰ−６９０６０５である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の活性化および分化プロセスの早期段階（複数可）の調節に関与し（Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（８）（１９８６）８８１〜８８７頁）、カルシウムイオンチャネルとして機能し得る（Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４Ｄ（１９９０）１９５頁）と考えられる。
【０００７】
ＣＤ２０結合の様式および生物活性が大きく異なる、２つの異なる型の抗ＣＤ２０抗体が存在する（Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０３（２００４）２７３８〜２７４３頁；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０１（２００３）１０４５〜１０５２頁）。例えばリツキシマブ（通常のグリコシル化パターンを有する非脱フコシル化、非糖鎖工学改変抗体、「ＲＴＸ」とも命名される）のようなＩ型抗体は、補体媒介性の細胞傷害において効力があるが、例えばトシツモマブ（Ｂ１）、１１Ｂ８、ＡＴ８０またはヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体のようなＩＩ型抗体は、ホスファチジルセリン曝露を伴うカスパーゼ非依存性アポトーシスにより標的の細胞死を効率的に開始させる。
【０００８】
Ｉ型およびＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の共通する特徴を、表１にまとめる。
【０００９】
2014534250.tif 000002
【００１０】
ＵＳ５，７３６，１３７は、通常のグリコシル化パターンを有する非脱フコシル化、非糖鎖工学改変抗体であるリツキシマブに関する。ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５は、対応する親の抗体と比較してフコースの量が低減された脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体に関する。ＷＯ２００８／１２１８７６（Ａ２、Ａ３）は、対応する親の抗体と比較してフコースの量が低減された脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体に関する。
【００１１】
サイトカイン：
サイトカインの特性
サイトカインは、免疫、炎症および造血を媒介して調節する小型の分泌タンパク質である。サイトカインは、免疫刺激に応答して新しく産生されなければならない。サイトカインは、一般的に（常にではない）、短い距離および短い時間で、非常に低濃度にて作用する。サイトカインは、特定の膜受容体と結合することにより作用し、該受容体が、次いで、しばしばチロシンキナーゼであるセカンドメッセンジャーにより細胞にシグナル伝達して、その挙動（遺伝子発現）を変更する。サイトカインに対する応答は、膜タンパク質（サイトカイン受容体を含む）の発現の増加または減少、増殖、およびエフェクター分子の分泌を含む。
【００１２】
サイトカインは、全般的な名称である。その他の名称は、リンホカイン（リンパ球により作製されるサイトカイン）、モノカイン（単球により作製されるサイトカイン）、ケモカイン（走化性活性を有するサイトカイン）およびインターロイキン（ある白血球により作製され、他の白血球に作用するサイトカイン）を含む。サイトカインは、それらを分泌する細胞（自己分泌作用）、近くの細胞（傍分泌作用）またはあるいくつかの場合では離れた細胞（内分泌作用）に対して作用し得る。
【００１３】
異なる型の細胞が同じサイトカインを分泌すること、または単一のサイトカインがいくつかの異なる型の細胞に作用すること（多面作用）は一般的である。サイトカインは、その活性が冗長であり、このことは類似の機能が異なるサイトカインにより刺激され得ることを意味する。サイトカインは、あるサイトカインがその標的細胞を刺激してさらなるサイトカインを作製する、カスケードでしばしば産生される。サイトカインは、相乗的（２以上のサイトカインが一緒に作用する）または拮抗的（サイトカインが反対の活性を引き起こす）に作用することもできる。
【００１４】
サイトカインの短い半減期、低い血漿濃度、多面作用および冗長性は全て、サイトカインの単離および特徴付けを複雑にした。新しいサイトカインについての探索は、現在、既知のサイトカイン遺伝子に類似の遺伝子を同定する、ＤＮＡレベルでしばしば行われている。
【００１５】
サイトカイン活性
サイトカイン活性は、組換えサイトカインおよび精製された細胞集団を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けられる、またはサイトカイン機能をｉｎ  ｖｉｖｏで特徴付けるために個別のサイトカイン遺伝子についてのノックアウトマウスを用いて特徴付けられる。サイトカインは、多くの細胞集団により作製されるが、主な生産者は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）およびマクロファージである。
【００１６】
インターロイキン（ＩＬ）−１５は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−２１を含む大きいサイトカインファミリーに属する。これらのサイトカインは、同じガンマ鎖（γｃ）受容体を共有するが、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、ＩＬ−２ＲおよびＩＬ−１５Ｒのα鎖との結合特性と、それらの細胞活性化機構との両方に関連する特異的機能を有する。ＩＬ−１５の作用機構は、いまだに議論されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１５の主な生産者である単球および／または樹状細胞のような細胞パートナーによるトランス提示であるとみられる。
【００１７】
ＩＬ−１５は、自然免疫および適応免疫を容易にする重要な生理的機能を示す。ＩＬ−１５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）またはＴリンパ球細胞のような免疫細胞の発達、恒常性および活性化において重要な役割を有する。ＩＬ−１５は、大部分がアクセサリー細胞によりトランス提示され、またＮＫ細胞に対して多面的な活性を有し、その活性はすなわち生存；増殖；分化；細胞傷害機能の増加；ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインの産生の刺激；ならびにＮＫ／マクロファージ相互作用の制御である。ＩＬ−１５は、単球およびマクロファージも活性化して、抗感染免疫におけるそれらの関与を導く。さらに、ＩＬ−１５は、好中球および好酸球のアポトーシスを阻害し、抗アポトーシスタンパク質の上方制御によりＢ細胞またはＴ細胞のＦａｓ媒介性アポトーシスも阻害することが見出されている。感染または疾患におけるＩＬ−１５の役割も報告されている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、脱フコシル化抗体、好ましくはフコースの量が６０％以下である腫瘍抗原と特異的に結合する抗体の、サイトカインヒトＩＬ−１５との組み合わせでがんを治療するための使用を含む。
【００１９】
好ましい実施形態では、脱フコシル化抗体は、がんの治療に使用するためのヒトＩＬ−１５と組み合わせた抗ＣＤ２０抗体である。
【００２０】
好ましくは、抗ＣＤ２０抗体は、前記ＣＤ２０抗体が、フコースの量が６０％以下である脱フコシル化抗体であり、前記がんが、ＣＤ２０発現性のがんであることを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であり、前記がんは、ＣＤ２０発現性のがん、好ましくは白血病、より好ましくは慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【００２２】
本発明の一実施形態は、サイトカインとしてＩＬ−１５のみが、前記併用治療において併用投与されることを特徴とする。
【００２３】
本発明の一実施形態は、脱フコシル化抗体が、ＡＤＣＣの増加を示すことを特徴とする。
【００２４】
本発明の一実施形態は、抗ＣＤ２０抗体とヒトＩＬ−１５とを含む、がんの治療のための組成物である。
【００２５】
サイトカインＩＬ−１５と組み合わせた抗ＣＤ２０抗体の併用治療は、対応する非脱フコシル化、非糖鎖工学改変抗体とサイトカインＩＬ−１５との組み合わせと比較して、抗腫瘍阻害活性の増進を示す。併用治療は、アクセサリー細胞によるトランス提示により抗腫瘍効力を媒介し、ＣＬＬのような血液悪性腫瘍のようながんの治療について特に価値がある。
【００２６】
好ましくは、抗ＣＤ２０抗体は、１または複数のさらなるその他の細胞傷害性薬物、化学療法剤もしくは抗がん剤、またはこのような薬剤の効果を増進する化合物もしくは電離放射線が投与されることを特徴とする。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、がんの治療を必要とする患者に（ｉ）第１有効量の抗ＣＤ２０抗体と、（ｉｉ）第２有効量のヒトＩＬ−１５とを投与することを含む、がんを治療する方法に関する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、フコースの量がＡｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の６０％以下である腫瘍抗原と特異的に結合するＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の脱フコシル化抗体の、サイトカインヒトＩＬ−１５との組み合わせでがんを治療するための医薬品の製造のための使用であって、がんが、前記腫瘍抗原を発現する使用を含む。
【００２９】
一実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の２０％から６０％の間である。
【００３０】
用語「抗体」は、それらに限定されないが、抗体全体、ヒト抗体、ヒト化抗体および遺伝子学的改変抗体、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体または組換え抗体ならびに本発明による特徴的な特性が保持される限りそのような抗体の断片を含む、様々な形の抗体を包含する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で用いる場合、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物のことをいう。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体のことをいう。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合された、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００３１】
用語「キメラ抗体」は、組換えＤＮＡ技術により、通常、調製される、ある供給源または種からの可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部分とを含むモノクローナル抗体のことをいう。マウス可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体が、特に好ましい。このようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントとヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明が包含するその他の形の「キメラ抗体」は、クラスまたはサブクラスが元の抗体のものから改変または変更されたものである。このような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」ともいう。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術において現在周知である従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（１９８４）６８５１〜６８５５頁；ＵＳ５，２０２，２３８およびＵＳ５，２０４，２４４を参照されたい。
【００３２】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親の免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むようになった抗体のことをいう。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域にグラフト化して「ヒト化抗体」を調製する。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（１９８５）２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラおよび二重機能性抗体について上記の抗原を認識する配列を示すものに相当する。
【００３３】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、最先端技術において周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５（２００１）３６８〜３７４頁）。このような技術に基づいて、多様な標的に対するヒト抗体を産生できる。ヒト抗体の例は、例えばＫｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（２００２）５９３〜５９７頁に記載されている。
【００３４】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で用いる場合、ＮＳ０もしくはＣＨＯ細胞のような宿主細胞またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体のような組換え手段により調製、発現、作出または単離された全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、再構成された形のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。本発明に従う組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞超変異に付されている。よって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来しそれらに関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにてヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しないことがある。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語「結合する」または「特異的に結合する」は、精製野生型抗原を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）における、抗体と腫瘍抗原のエピトープとの結合のことをいう。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、ｋＤ（解離定数）およびＫＤ（ｋＤ／ｋａ）により定義される。「結合する」または「特異的に結合する」は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。よって、本発明に従う脱フコシル化抗体は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で腫瘍抗原と特異的に結合する。
【００３６】
用語「核酸分子」は、本明細書で用いる場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であってよいが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００３７】
「定常ドメイン」は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、エフェクター機能（ＡＤＣＣ、補体結合およびＣＤＣ）に関与する。
【００３８】
「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、本明細書で用いる場合、抗体と抗原との結合に直接関与する軽鎖と重鎖とのそれぞれの対のことをいう。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ全体的構造を有し、それぞれのドメインは、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域（これらの配列は、広く保存され、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）で接続されている）を含む。）フレームワーク領域は、ｂ−シート立体構造を採用し、ＣＤＲは、ｂ−シート構造を接続するループを形成することがある。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によりそれらの３次元構造を保ち、他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。
【００３９】
用語「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。よって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に対して最も貢献する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）の標準的な定義および／または「超可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００４０】
用語「脱フコシル化抗体」は、Ａｓｎ２９７にてＦｃ領域中のグリコシル化のパターンが変更され、フコース残基のレベルが低減された、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体のことをいう。ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のグリコシル化は、２までのＧａｌ残基を末端に有するコアフコシル化二分岐複合オリゴ糖グリコシル化として、Ａｓｎ２９７にて生じる。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α１，６またはα１，３）またはＧ２グリカン残基と称する（Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．１（２００３）４４〜５３頁）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型のグリコシル化は、例えばＲｏｕｔｉｅｒ，Ｆ．Ｈ．、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１４（１９９７）２０１〜２０７頁により記載されている。非糖鎖改変ＣＨＯ宿主細胞において組換え発現された抗体は、通常、少なくとも８５％の量でＡｓｎ２９７にてフコシル化される。
【００４１】
よって、本発明に従う脱フコシル化抗体は、フコースの量がＡｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の６０％以下である（これは、Ａｓｎ２９７でのＦｃ領域のオリゴ糖の少なくとも４０％以上が脱フコシル化されていることを意味する）、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の抗体を意味する。一実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのＦｃ領域のオリゴ糖の２０％から６０％の間である。一実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのＦｃ領域のオリゴ糖の４０％から６０％の間である。別の実施形態では、フコースの量は、５０％以下であり、さらに別の実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのＦｃ領域のオリゴ糖の３０％以下である。本発明によると、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定され、平均値として算出される（フコースの量を決定するための詳細な手順について、実施例８を参照されたい）、Ａｓｎ２９７と結合している全てのオリゴ糖（糖）の総計（例えば複合、ハイブリッドおよび高マンノース構造）に対するＡｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）鎖内の前記オリゴ糖（フコース）の量を意味する。
【００４２】
さらに、Ｆｃ領域のオリゴ糖は、好ましくは二分されている。本発明に従う脱フコシル化抗体は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を、Ｆｃ領域におけるオリゴ糖を部分的にフコシル化するために十分な量で発現するように工学的に改変された糖鎖改変宿主細胞において発現できる。一実施形態では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。代わりに、宿主細胞のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性をＵＳ６，９４６，２９２に従って減少または排除することが可能で、それにより糖鎖改変宿主細胞を作製する。抗体フコシル化の量は、例えば発酵条件（例えば発酵時間）により、またはフコシル化の量が異なる少なくとも２の抗体の組み合わせにより予め決定できる。このような脱フコシル化抗体およびそれぞれの糖鎖工学法は、ＷＯ２００５／０４４８５９、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００７／０３１８７５、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁、ＷＯ９９／１５４３４２、ＷＯ２００５／０１８５７２、ＷＯ２００６／１１６２６０、ＷＯ２００６／１１４７００、ＷＯ２００５／０１１７３５、ＷＯ２００５／０２７９６６、ＷＯ９７／０２８２６７、ＵＳ２００６／０１３４７０９、ＵＳ２００５／００５４０４８、ＵＳ２００５／０１５２８９４、ＷＯ２００３／０３５８３５、ＷＯ２０００／０６１７３９に記載されている。これらの糖鎖工学改変抗体は、ＡＤＣＣが増加している。本発明に従う脱フコシル化抗体を産生するその他の糖鎖工学法は、例えばＮｉｗａ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０６（２００５）１５１〜１６０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８（２００３）３４６６〜３４７３頁；ＷＯ０３／０５５９９３またはＵＳ２００５／０２４９７２２に記載されている。
【００４３】
本発明の一実施形態は、脱フコシル化抗体が、ＡＤＣＣの増加を示す（対応する非脱フコシル化親抗体と比較して）ことを特徴とする。一実施形態では、脱フコシル化抗体は、対応する非脱フコシル化親抗体と比較して、少なくとも５０％（１０ｎｇ／ｍｌ抗体濃度および２５：１のエフェクター細胞／腫瘍細胞Ｅ：Ｔ比にて、新しく単離したＰＢＭＣをエフェクター細胞として、および適切な抗原発現腫瘍細胞（例えばＣＤ２０についてＲａｊｉ）を用いて）ＡＤＣＣが増加している。
【００４４】
本発明に従う脱フコシル化抗体、例えば抗ＣＤ２０抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増加している。
【００４５】
「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増加している脱フコシル化抗体（例えば抗ＣＤ２０抗体）」は、当業者に知られる任意の適切な方法により決定して、ＡＤＣＣが増加している脱フコシル化抗体（例えば抗ＣＤ２０抗体）（この用語は本明細書で定義するとおり）を意味する。
【００４６】
対応する野生型親抗体と比較した脱フコシル化抗体のＡＤＣＣの増加を決定するためのある受け入れられているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイは、ＷＯ２００５／０４４８５９に記載されている：
１）該アッセイは、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することがわかっている標的細胞を用いる；
２）該アッセイは、エフェクター細胞のような、無作為に選択した健常ドナーの血液から単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いる；
３）該アッセイは、以下のプロトコールに従って行う：
ｉ）ＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離手順を用いて単離し、５×１０６細胞／ｍｌにてＲＰＭＩ細胞培養培地に懸濁する；
ｉｉ）標的細胞を標準的な組織培養法により成長させ、対数増殖期に９０％より高い生存率で採集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、細胞培養培地に１０５細胞／ｍｌの密度にて再懸濁する；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終標的細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで細胞培養培地中で系列希釈し、得られた抗体溶液の５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に加える（上記の濃度範囲全体をカバーする様々な抗体濃度を３重で試験する）；
ｖ）最大放出（ＭＲ）対照のために、標識標的細胞を含有するプレート中のさらに３つのウェルに、５０マイクロリットルの非イオン洗浄剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の２％（ＶＮ）水性溶液を、抗体溶液（上記の項目ｉｖ）の代わりに加える；
ｖｉ）自発放出（ＳＲ）対照のために、標識標的細胞を含有するプレート中のさらに３つのウェルに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を、抗体溶液（上記の項目ｉｖ）の代わりに加える；
ｖｉｉ）９６ウェルマイクロタイタープレートを、次いで、５０×ｇにて１分間遠心分離し、４℃にて１時間インキュベートする；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁物（上記の項目ｉ）を各ウェルに加えて、２５：１のエフェクター：標的細胞比を得て、プレートを、５％ＣＯ２環境の下でインキュベータに３７℃にて４時間入れる；
ｉｘ）各ウェルからの無細胞上清を採集し、実験的に放出された放射活性（ＥＲ）を、ガンマカウンタを用いて定量する；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、式：（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲは、抗体濃度について定量された平均放射活性（上記の項目ｉｘを参照されたい）であり、ＭＲは、ＭＲ対照（上記の項目ｖを参照されたい）について定量された平均放射活性（上記の項目ｉｘを参照されたい）であり、ＳＲは、ＳＲ対照（上記の項目ｖｉを参照されたい）について定量された平均放射活性（上記の項目ｉｘを参照されたい）である）に従って各抗体濃度について算出する；
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記の試験した抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増加、および／または上記の試験した抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの１／２を達成するために必要な抗体の濃度の低減のいずれかとして定義される。好ましい実施形態では、ＡＤＣＣの増加は、１０ｎｇ／ｍｌ抗体濃度、ならびにエフェクター細胞として新しく単離したＰＢＭＣおよび適切な抗原発現腫瘍細胞（例えば４時間後のＣＤ２０についてＲａｊｉ）を用いて２５：１のエフェクター細胞／腫瘍細胞Ｅ：Ｔ比にて観察される特異的溶解のパーセンテージの増加として定義される。
【００４７】
ＡＤＣＣの増加は、当業者に知られる同じ標準的な産生、精製、処方および貯蔵方法を用いて同じ型の宿主細胞により産生されるが、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように工学的に改変された宿主細胞により産生されていない同じ抗体により媒介され、上記のアッセイで測定されるＡＤＣＣに対する。
【００４８】
前記「ＡＤＣＣの増加」は、前記抗体の糖鎖工学的改変により得ることができ、これは、モノクローナル抗体の前記自然の細胞媒介エフェクター機能を、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁およびＵＳ６，６０２，６８４に記載されるようにしてそれらのオリゴ糖成分を工学的に改変することにより増進することを意味する。このような糖鎖工学的に改変された抗体におけるフコースの量は、６０％以下であるが、対応する野生型の親抗体（糖鎖構造が工学的に改変されていない）におけるフコースの量は、通常、８５％以上である。
【００４９】
用語「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、補体の存在下での本発明に従う抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解のことをいう。ＣＤＣは、ＣＤ２０発現細胞の調製物を、本発明に従う抗ＣＤ２０抗体で、補体の存在下にて処理することにより好ましく測定される。抗体が、１００ｎＭの濃度にて４時間後に腫瘍細胞の２０％以上の溶解（細胞死）を誘導するならば、ＣＤＣが見出される。該アッセイは、５１ＣｒまたはＥｕ標識腫瘍細胞と、放出される５１ＣｒまたはＥｕの測定とを用いて好ましく行われる。対照は、抗体なしでの補体と腫瘍標的細胞とのインキュベーションを含む。
【００５０】
「腫瘍抗原」は、本明細書で用いる場合、ヒト起源の腫瘍抗原のことをいい、当該技術において知られる意味（これは、腫瘍細胞の腫瘍形成性の特徴に貢献することが知られているかまたは貢献すると考えられている腫瘍細胞上で発現する（または該腫瘍細胞の発達に関連する）任意の分子を含む）を含む。多数の腫瘍抗原が当該技術において知られている。分子が腫瘍抗原であるかは、例えばクローン原性アッセイ、形質転換アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成アッセイ、ゲル泳動アッセイ、遺伝子ノックアウト分析などのような当業者に周知の技術およびアッセイに従って決定することもできる。好ましくは、用語「腫瘍抗原」は、本明細書で用いる場合、ヒト膜貫通タンパク質、すなわち細胞の脂質二重層に繋がれた細胞膜タンパク質のことをいう。ヒト膜貫通タンパク質は、リガンドと結合できる、本明細書で用いる「細胞外ドメイン」と、親油性膜貫通ドメインと、保存された細胞内ドメインチロシンキナーゼドメインと、リン酸化され得るいくつかのチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインとを一般的に含む。腫瘍抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、リンホトキシン−ベータ受容体、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ヘプシン、黒色種関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤＣＰ１、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ様のアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＩＬ−１Ｒ、好ましくはＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＤ２０またはＩＧＦ１−Ｒ、より好ましくはＣＤ２０のような分子を含む。よって、本発明に従う前記脱フコシル化抗体は、好ましくは、抗ＣＤ２０抗体である。
【００５１】
よって、本発明の一態様は、フコースの量がＡｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の６０％以下である腫瘍抗原と特異的に結合するＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の脱フコシル化抗体の、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−１５の群から選択される１または複数のサイトカインとの組み合わせでがんを治療するための医薬品の製造のための使用であって、腫瘍抗原が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、リンホトキシン−ベータ受容体、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ヘプシン、黒色種関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤＣＰ１、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ様のアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＩＬ−１Ｒ、好ましくはＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＤ２０またはＩＧＦ１−Ｒ、より好ましくはＣＤ２０から選択される使用である。一実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の２０％から６０％の間である。別の実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の４０％から６０％の間である。
【００５２】
よって、本発明の一態様は、フコースの量がＡｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の６０％以下である腫瘍抗原と特異的に結合するＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ（好ましくはＩｇＧ１アイソタイプ）の脱フコシル化抗体の、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−１５の群から選択される１または複数のサイトカインとの組み合わせでがんを治療するための医薬品の製造のための使用であって、がんが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、リンホトキシン−ベータ受容体、ＣＣＲ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ヘプシン、黒色種関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤＣＰ１、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＩＧＦ１−Ｒ、ＴＳＬＰ−Ｒ、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ様のアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＩＬ−１Ｒ、好ましくはＭＣＳＰ、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＣＤ２０またはＩＧＦ１−Ｒ、より好ましくはＣＤ２０から選択される前記腫瘍抗原を発現する使用である。一実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の２０％から６０％の間である。別の実施形態では、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖）の合計量の４０％から６０％の間である。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「結合する」または「特異的に結合する」は、精製野生型抗原を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）における、抗体と抗原のエピトープとの結合のことをいう。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、ｋＤ（解離定数）およびＫＤ（ｋＤ／ｋａ）により定義される。「結合する」または「特異的に結合する」は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。よって、本発明に従う脱フコシル化抗体は、腫瘍抗原と特異的に結合し、これについて、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で特異的である。
【００５４】
「ＣＤ２０」は、本明細書で用いる場合、プレＢおよび成熟Ｂリンパ球上に局在するおよそ３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である、ヒトＢリンパ球抗原ＣＤ２０（ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５およびＬＦ５としても知られている；配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６を特徴とする）のことをいう（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）（１９８９）１１２８２〜１１２８７頁；Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５（１９８８）２０８〜１２頁；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７（１９８８）１９７５〜８０頁；Ｅｉｎｆｅｌｄ，Ｄ．Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７（１９８８）７１１〜７頁；Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２（１９８９）２５６０〜８頁）。対応するヒト遺伝子は、ＭＳ４Ａ１としても知られる膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１である。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴と類似のイントロン／エキソンスプライス境界とを特徴とし、造血細胞および非リンパ組織のうちで独特の発現パターンを示す。この遺伝子は、形質細胞へのＢ細胞の発達および分化において役割を演じるＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスタのうちで１１ｑ１２に局在化される。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする２つの転写バリアントをもたらす。
【００５５】
用語「ＣＤ２０」および「ＣＤ２０抗原」は、本明細書において交換可能に用いられ、細胞により自然に発現されるかまたはＣＤ２０遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の任意のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログを含む。本発明の抗体とＣＤ２０抗原との結合は、ＣＤ２０を不活性化することにより、ＣＤ２０を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介する。ＣＤ２０を発現する細胞の死滅は、以下の機構：細胞死／アポトーシス誘導、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの１または複数により生じることがある。
【００５６】
当該技術において認識されるＣＤ２０の同義語は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１、Ｌｅｕ−１６、Ｂｐ３５、ＢＭ５およびＬＦ５を含む。
【００５７】
本発明に従う用語「抗ＣＤ２０抗体」は、ＣＤ２０抗原と特異的に結合する抗体である。抗ＣＤ２０抗体とＣＤ２０抗原との結合特性および生物活性に応じて、２つの型の抗ＣＤ２０抗体（Ｉ型およびＩＩ型抗ＣＤ２０抗体）が、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０３（２００４）２７３８〜２７４３頁；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０１（２００３）１０４５〜１０５２頁に従って区別できる。表２を参照されたい。
【００５８】
2014534250.tif 000003
【００５９】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（ＷＯ２００５／０４４８５９に開示されるとおりのキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０３５６０７に開示されるとおり）およびＡＴ８０  ＩｇＧ１を含む。典型的に、ＩｇＧ１アイソタイプのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、特徴的なＣＤＣ特性を示す。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのＩ型抗体と比較してＣＤＣが減少している（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）。
【００６０】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例は、例えばリツキシマブ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（ＷＯ２００５／１０３０８１に開示されるとおり）、２Ｆ２  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０３５６０７およびＷＯ２００５／１０３０８１に開示されるとおり）および２Ｈ７  ＩｇＧ１（ＷＯ２００４／０５６３１２に開示されるとおり）を含む。
【００６１】
本発明に従う脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、好ましくはＩＩ型抗ＣＤ２０抗体であり、より好ましくは、ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５に記載される脱フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【００６２】
「リツキシマブ」抗体（参照抗体；Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例）は、ヒトＣＤ２０抗原を指向するモノクローナル抗体を含有する、遺伝子工学改変キメラヒトガンマ１マウス定常ドメインである。しかし、この抗体は、糖鎖工学的に改変されておらず、脱フコシル化されていないので、フコースの量が少なくとも８５％である。このキメラ抗体は、ヒトガンマ１定常ドメインを含有し、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに付与され、１９９８年４月１７日に登録されたＵＳ５，７３６，１３７（Ａｎｄｅｒｓｅｎら）において「Ｃ２Ｂ８」の名称で同定されている。リツキシマブは、再発または難治性で低悪性度または濾胞性のＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療について承認されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用機構の研究は、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すことを示している（Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ８３（２）（１９９４）４３５〜４４５頁）。さらに、これは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて活性を示す。用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５に開示されるヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体のことをいい、これらは、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖の可変領域（ＶＨ）：配列番号１；マウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）：配列番号２−Ｐｏｐｐｅｍａ，Ｓ．およびＶｉｓｓｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｔｅｓｔ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ３（１９８７）１３１〜１３９頁を参照されたい）から、ＩｇＧ１からのヒト定常ドメインとのキメラ化とその後のヒト化により得られた（ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５を参照されたい）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５に詳細に開示されている。
【００６３】
好ましくは、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号３〜配列番号１９の群から選択される重鎖の可変領域（ＶＨ）を有する（ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ２〜Ｂ−ＨＨ９およびＢ−ＨＬ８〜Ｂ−ＨＬ１７）。特に好ましくは、配列番号３、４、７、９、１１、１３および１５である（ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ２、ＢＨＨ−３、Ｂ−ＨＨ６、Ｂ−ＨＨ８、Ｂ−ＨＬ８、Ｂ−ＨＬ１１およびＢ−ＨＬ１３）。好ましくは、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号２０の軽鎖の可変領域（ＶＬ）を有する（ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＫＶ１）。好ましくは、「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、配列番号７の重鎖の可変領域（ＶＨ）（ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＨＨ６）と、配列番号２０の軽鎖の可変領域（ＶＬ）（ＷＯ２００５／０４４８５９およびＷＯ２００７／０３１８７５のＢ−ＫＶ１）とを有する。このヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、本明細書で用いる場合、「ＧＡ１０１」または「オビヌツズマブ」と命名する（ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、第２５巻、第１号、２０１１年）。前記抗体が好ましい。さらに、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、好ましくはＩｇＧ１抗体である。本発明に従って、このような脱フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＷＯ２００５／０４４８５９、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００７／０３１８７５、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁およびＷＯ９９／１５４３４２に記載される手順に従って、Ｆｃ領域において糖鎖工学的に改変される（ＧＥ）。脱フコシル化糖鎖工学改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１（Ｂ−ＨＨ６−Ｂ−ＫＶ１  ＧＥ）が、本発明の一実施形態において好ましい。このような糖鎖工学改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化のパターンが変更され、好ましくはフコース残基のレベルが低減している。好ましくは、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖の合計量の６０％以下である（一実施形態では、フコースの量は、４０％から６０％の間であり、別の実施形態では、フコースの量は、５０％以下であり、さらに別の実施形態では、フコースの量は、３０％以下である）。さらに、Ｆｃ領域のオリゴ糖は、好ましくは二分されている。これらの糖鎖工学改変ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体は、ＡＤＣＣが増加している。
【００６４】
オリゴ糖成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態および特異的生物活性を含む、治療用糖タンパク質の効力と関連する特性に著しく影響し得る。このような特性は、オリゴ糖の存在または非存在だけでなく、特定の構造にも依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間のいくらかの普遍化を行うことができる。例えば、あるオリゴ糖構造は、特定の炭水化物結合タンパク質との相互作用により血流からの糖タンパク質の迅速なクリアランスを媒介するが、他のものは抗体と結合して、望ましくない免疫応答を引き起こすことができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）９７５〜８１頁）。
【００６５】
哺乳類細胞は、ヒトへの使用のために最も適合する形でタンパク質をグリコシル化する能力により、治療用糖タンパク質の製造のために好ましい宿主である（Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｄ．Ａ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １（１９９１）１１５〜３０頁；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）９７５〜８１頁）。細菌はタンパク質を非常に希にグリコシル化し、酵母、糸状菌、昆虫および植物細胞のようなその他の型の一般的な宿主と同様に、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用およびいくつかの具体的な事例では生物活性の低減と関連するグリコシル化パターンを生じる。哺乳類細胞のうちで、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、過去２０年間で最も一般的に用いられている。適切なグリコシル化パターンを与えることに加えて、これらの細胞は、遺伝子的に安定し、高度に生産的なクローン性株化細胞を一貫して産生することを可能にする。これらは、無血清培地を用いて単純なバイオリアクタ中で高密度まで培養でき、安全で再現性のあるバイオプロセスの開発を可能にする。その他の一般的に用いられる動物細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−およびＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞を含む。より最近では、トランスジェニック動物からの産生も試みられている（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６）９７５〜９８１頁）。
【００６６】
全ての抗体は、重鎖定常領域の保存された位置にて炭水化物構造を含有し、それぞれのアイソタイプは、独特の一連のＮ結合型炭水化物構造を有し、これがタンパク質の集合、分泌または機能的活性に様々に影響する（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）２６〜３２頁）。結合するＮ結合型炭水化物の構造は、プロセシングの程度に応じて著しく異なり、高マンノース、多重枝分かれおよび二分岐複合オリゴ糖を含み得る（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）２６〜３２頁）。典型的に、モノクローナル抗体でさえ複数のグリコフォームで存在するように、特定のグリコシル化部位にて結合したコアオリゴ糖構造の不均質なプロセシングが存在する。同様に、抗体グリコシル化における主要な違いが株化細胞間で生じ、さらにマイナーな違いが異なる培養条件下で成長した所定の株化細胞について見られることが示されている（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（８）（１９９５）８１３〜２２頁）。
【００６７】
単純な産生プロセスを維持し、重大で望ましくない副作用をできるだけ回避しながら効力を大きく増加させるためのある方法は、モノクローナル抗体の自然の細胞媒介エフェクター機能を、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁およびＵＳ６，６０２，６８４に記載されるようにしてそれらのオリゴ糖成分を工学的に改変することにより増進することである。がん免疫療法において最も一般的に用いられるＩｇＧ１型抗体は、それぞれのＣＨ２ドメイン中にＡｓｎ２９７にて保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７と結合している２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋もれ、ポリペプチド主鎖と高度な接触を形成しているが、該オリゴ糖の存在は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のようなエフェクター機能を抗体が媒介するために必須である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１９９５）８１３〜８２２頁；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３（１９９８）５９〜７６頁；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）２６〜３２頁）。
【００６８】
二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩ１７ｙ）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、工学的に改変されたＣＨＯ細胞により産生される抗神経芽腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を著しく増加することが以前に示された。（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁；およびＷＯ９９／１５４３４２（これらの全体の内容は、本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい）。抗体ｃｈＣＥ７は、高い腫瘍親和性および特異性を有するが、ＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く標準的で工業的な株化細胞において産生した場合に臨床的に有用であるには効力が低すぎる、大きいクラスの非結合モノクローナル抗体に属する（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０頁）。この研究は、ＡＤＣＣ活性の大きい増加が、抗体産生細胞がＧｎＴＩＩＩを発現するように該細胞を工学的に改変することにより得ることができ、このことがまた、自然に存在する抗体で見出されるレベルを超えて、二分された非フコシル化オリゴ糖を含む定常領域（Ｆｃ）結合二分オリゴ糖の割合の増加も導くことを最初に示した。
【００６９】
インターロイキン（ＩＬ）−１５は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−２１を含む大きいサイトカインファミリーに属する。これらのサイトカインは、同じガンマ鎖（γｃ）受容体１を有するが、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、ＩＬ−２ＲおよびＩＬ−１５Ｒ  ２のα鎖との結合特性と、それらの細胞活性化機構との両方に関連する特異的機能を有する。組換えヒトＩＬ−１５は、例えばＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、Ｌｅ  Ｐｅｒｒａｙ−ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から商業的に入手可能である。
【００７０】
用語「がん」は、本明細書で用いる場合、脱フコシル化抗体が特異的に結合する腫瘍抗原を発現するがんまたは腫瘍のことをいう。このようながんは、リンパ腫、リンパ球性白血病、好ましくは急性または慢性リンパ球性白血病、骨髄性白血病、好ましくは急性または慢性骨髄性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしくは頚部のがん、皮膚もしくは眼球内黒色種、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ  ｔｕｍｏｒｓ）、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、有棘細胞癌、下垂体腺腫（任意の上記のがんの再発バージョン、または上記のがんの１もしくは複数の組み合わせを含む）を含む。好ましくは、上記のがんは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【００７１】
好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦおよび／またはヒトＩＬ３（これらは全てヒト単球／周細胞をマクロファージに分化させる）から選択されるサイトカインとの組み合わせでの本発明に従う脱フコシル化抗体の併用治療は、単球／周細胞が浸潤したがんまたは腫瘍の治療のために用いられ、単球／周細胞が高度に浸潤したがんまたは腫瘍の治療のために特に価値がある。がんまたは腫瘍の単球／周細胞浸潤は、ＣＤ１４のような単球特異的マーカーを用いる単球／周細胞特異的染色により（生検後の腫瘍組織中で）検出できる（Ｗｒｉｇｈｔ  Ｓ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０）１４３１〜１４３３頁；Ｂｏｇｍａｎ  Ｍ．Ｊ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２３（１９９１）１２９３〜１２９４頁；Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ，Ｒら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．４７（６）（１９９０）４９０〜７頁）。典型的に、当業者は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦおよび／またはヒトＩＬ３から選択されるサイトカインとの組み合わせでの本発明に従う脱フコシル化抗体の併用治療を、脱フコシル化抗体が特異的に結合する腫瘍抗原を発現する単球／周細胞浸潤がんまたは腫瘍の治療のために用いる。よって、一実施形態では、がんは、単球／周細胞浸潤がんである（単球特異的ＣＤ１４抗原により検出可能）。
【００７２】
用語「ＣＤ２０」抗原「の発現」は、細胞における、好ましくは腫瘍またはがんのそれぞれから、好ましくは非固形腫瘍からのＴまたはＢ細胞、より好ましくはＢ細胞の表面上のＣＤ２０抗原の著しいレベルの発現を示すことを意図する。「ＣＤ２０発現性のがん」の患者は、当該技術において知られる標準的なアッセイにより決定できる。例えば、ＣＤ２０抗原発現は、免疫組織化学的（ＩＨＣ）検出、ＦＡＣＳを用いて、または対応するｍＲＮＡのＰＣＲに基づく検出により測定する。
【００７３】
用語「ＣＤ２０発現性のがん」は、本明細書で用いる場合、がん細胞がＣＤ２０抗原の発現を示す全てのがんのことをいう。好ましくは、ＣＤ２０発現性のがんは、本明細書で用いる場合、リンパ腫（好ましくはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））およびリンパ球性白血病のことをいう。このようなリンパ腫およびリンパ球性白血病は、例えばａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（風土性バーキットリンパ腫、孤発性バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫および脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺Ｂ細胞性リンパ腫を含む）、ｆ）ヘアリー細胞白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ｈ）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ｊ）ホジキン病を含む。
【００７４】
より好ましくは、ＣＤ２０発現性のがんは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。特に、ＣＤ２０発現性のがんは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ＨＩＶ関連リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、または原発ＣＮＳリンパ腫である。
【００７５】
例えばがんに対して用いる場合の用語「治療する方法」またはその等価物は、患者におけるがん細胞の数を低減もしくは排除するように、またはがんの症状を緩和するように設計された手順または一連の措置のことをいう。がんまたは別の増殖性障害を「治療する方法」は、がん細胞もしくはその他の障害が実際に排除されること、細胞の数もしくは障害が実際に低減されること、またはがんもしくはその他の障害の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。がんを治療する方法は、しばしば、成功の見込みが低くても行われるが、患者の病歴および推定余命に鑑みて、それでも全体的に有益な一連の作用を誘導するとみられる。
【００７６】
用語「併用投与」または「併用投与する」は、前記脱フコシル化抗体、好ましくは脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体とヒトＩＬ−１５とを１の単独製剤として、または２の別々の製剤として投与することをいう。併用投与は、同時またはいずれかの順序で逐次的であり得、ここで、好ましくは、両方（または全ての）活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する時間がある。前記脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５は、連続的注入（抗体についてのものと、最終的にヒトＩＬ−１５についてのもの）により同時または逐次的（例えば静脈内（ｉ．ｖ．）により）のいずれかで併用投与される。両方の治療剤が逐次的に併用投与される場合、用量は、同じ日に２の別々の投与で投与されるか、または一方の薬剤を第１日に投与し、第２の薬剤を第２日から第７日、好ましくは第２日から第４日に投与する。よって、用語「逐次的」は、第１成分（サイトカインまたは抗体）の用量の後７日以内、好ましくは第１成分の用量の後４日以内を意味する。用語「同時」は、同じ時間を意味する。前記脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５の維持用量に関する用語「併用投与」は、両方の薬物について治療サイクルが適切であるならば維持用量を同時に例えば毎週併用投与できることを意味する。または、ヒトＩＬ−１５を、例えば第１日から第３日ごとに例えば投与し、前記脱フコシル化抗体を毎週投与する。または、維持用量を１日以内もしくは数日以内のいずれかに逐次的に併用投与する。
【００７７】
抗体を患者に「治療上有効量」（または単純に「有効量」）（これは、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床家が調べようとする組織、系、動物またはヒトの生物学的または医療的応答を惹起するそれぞれの化合物または組み合わせの量である）で投与することが自ら明らかである。
【００７８】
前記脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５の併用投与の量ならびに併用投与のタイミングは、治療される患者の型（種、性別、年齢、体重など）および状態ならびに治療される疾患または状態の重症度に依存する。前記脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５は、適切には、患者に、１回または一連の治療にわたって併用投与される。疾患の型および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の前記脱フコシル化抗体と１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のヒトＩＬ−１５が、患者への両方の薬物の併用投与についての初期候補投与量である。投与が静脈内であるならば、前記脱フコシル化抗体またはヒトＩＬ−１５の初期注入時間は、後続の注入時間よりも長くてよく、例えば初期注入についておよそ９０分および後続の注入（初期注入に対する耐容性がよいならば）についておよそ３０分であってよい。
【００７９】
前記脱フコシル化抗体の好ましい投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）の１または複数の用量を患者に併用投与してよい。一実施形態では、前記脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは脱フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体）の好ましい投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）の１または複数の用量を患者に併用投与してよい。ヒトＩＬ−１５の好ましい投与量は、ヒトＩＬ−１５について０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。患者の型（種、性別、年齢、体重など）および状態ならびに脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５の種類に応じて、前記脱フコシル化抗体の投与量および投与予定は、ヒトＩＬ−１５の投与量と異なることがある。例えば、前記脱フコシル化抗体は、例えば１週間から３週間ごとに投与してよく、ヒトＩＬ−１５は、毎日または２日から１０日ごとに投与してよい。初期のより高い負荷用量と、その後の１または複数のより低い用量とを投与してもよい。
【００８０】
一実施形態では、前記脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体（好ましくは脱フコシル化ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体）の好ましい投与量は、３週間から６週間の投与サイクルの第１、８、１５日に８００から１６００ｍｇ（一実施形態では８００から１２００ｍｇ）、および３週間から４週間の９回までの投与サイクルの第１日に４００から１２００ｍｇ（一実施形態では８００から１２００ｍｇ）である。
【００８１】
好ましい実施形態では、医薬品は、がん、好ましくは単球／周細胞浸潤がんに罹患している患者における転移またはさらなる播種を防止または低減するために有用である。医薬品は、このような患者の生存期間を増加し、このような患者の無憎悪生存期間を増加し、応答の期間を増加するのに有用であり、生存、無憎悪生存期間、応答率もしくは応答期間により測定して、治療患者の統計学的に有意で臨床的に意味のある改善をもたらす。好ましい実施形態では、医薬品は、患者の群において応答率を増加するために有用である。
【００８２】
本発明の関係において、さらなるその他の細胞傷害性薬物、化学療法剤もしくは抗がん剤またはこのような薬剤の効果を増進する化合物（例えばサイトカイン）を、がんの脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５併用治療において用いてよい。このような分子は、組み合わせにおいて、意図する目的のために効果的である量で適切に存在する。好ましくは、前記脱フコシル化抗体ヒトＩＬ−１５併用治療は、このようなさらなる細胞傷害性薬物、化学療法剤もしくは抗がん剤またはこのような薬剤の効果を増進する化合物なしで用いられる。
【００８３】
このような薬剤は、例えばシクロホスファミド（ＣＴＸ；例えばｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ；例えばｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ；例えばｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、ブスルファン（例えばｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣなどのようなアルキル化剤もしくはアルキル化作用を有する薬剤；メトトレキセート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；例えばｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えばＸｅｌｏｄａ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのような代謝拮抗剤；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；例えばａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなどの抗生物質；ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなどのようなビンカアルカロイドのようなアルカロイド；ならびにパクリタキセル（例えばｔａｘｏｌ（登録商標））およびパクリタキセル誘導体のようなその他の抗腫瘍薬、細胞増殖抑制薬、デキサメタゾン（ＤＥＸ；例えばｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））のようなグルココルチコイド、およびプレドニゾンのようなコルチコステロイド、ヒドロキシウレアのようなヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼのようなアミノ酸除去酵素、ロイコボリンおよびその他の葉酸誘導体、ならびに同様の多様な抗腫瘍薬を含む。以下の薬剤もさらなる薬剤として用いてよい：アミフォスチン（例えばｅｔｈｙｏｌ（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（例えばｄｏｘｉｌ（登録商標））、ゲムシタビン（例えばｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えばｄａｕｎｏｘｏｍｅ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えばｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、リュープロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル。好ましくは、脱フコシル化抗体およびＩＬ−１５併用治療は、このようなさらなる薬剤なしで用いられる。
【００８４】
化学療法計画における上記の細胞傷害性薬物および抗がん剤ならびにプロテインキナーゼ阻害剤のような抗増殖性標的特異的抗がん剤の使用は、がん療法技術において全般的によく特徴付けられており、本明細書においてそれらを用いる場合、いくらかの調整を加えて、耐容性および効果のモニタリングならびに投与経路および投与量の制御について同じように考慮する。例えば、細胞傷害性薬物の実際の投与量は、組織培養法を用いて決定される患者の培養細胞応答に依存して変動し得る。一般的に、投与量は、さらなるその他の薬剤の非存在下で用いる量と比較して低い。
【００８５】
効果的な細胞傷害性薬物の典型的な投与量は、製造者により推奨される範囲内であり得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答または動物モデルにおける応答により示される場合、濃度または量の大きさの約１桁分まで低減できる。よって、実際の投与量は、医師の判断、患者の状態および初代培養悪性細胞もしくは組織培養組織試料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答性または適当な動物モデルにおいて観察される応答に基づく治療方法の効果に依存する。
【００８６】
本発明の関係において、ＣＤ２０発現性のがんの脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５併用治療に加えて、有効量の電離放射線照射を行ってよく、かつ／または放射性医薬品を用いてよい。放射線照射源は、治療される患者にとって外的または内的のいずれでもあり得る。源が患者にとって外的である場合、療法は、体外照射療法（ＥＢＲＴ）として知られる。照射源が患者にとって内的である場合、治療は、密封小線源療法（ＢＴ）とよばれる。本発明の関係において用いるための放射活性原子は、それらに限定されないが、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１を含む群から選択できる。抗体をこのような放射活性同位体で標識することも可能である。好ましくは、脱フコシル化抗体およびヒトＩＬ−１５併用治療は、このような電離放射線なしで用いられる。
【００８７】
照射療法は、切除不能もしくは手術不能な腫瘍および／または腫瘍転移を管理するための標準的な治療である。照射療法を化学療法と組み合わせた場合に結果の改善がみられる。照射療法は、標的領域に送達される高線量の放射線が腫瘍および正常組織の両方における再生可能な細胞の死をもたらすという原理に基づく。放射線投与計画は、放射線吸収線量（Ｇｙ）、時間および分割の点で一般的に定義され、腫瘍学者により注意深く定義されなければならない。患者が受ける放射線の量は、様々な考慮すべき事柄に依存するが、最も重要な２つの点は、他の重要な構造または体の器官との関係での腫瘍の場所と、腫瘍が広がっている範囲である。照射療法を受ける患者のための治療の典型的な経過は、１週間から６週間の期間にわたる治療スケジュールで、約１．８から２．０Ｇｙの単一１日分割量で１週間に５日間、１０から８０Ｇｙまでの合計線量で患者に対して行われる。本発明の好ましい実施形態では、ヒト患者における腫瘍を本発明の併用治療と放射線照射で治療した場合に、相乗効果がある。言い換えると、本発明の組み合わせを含む薬剤による腫瘍成長の阻害は、放射線照射と、場合によってさらなる化学療法剤または抗がん剤と組み合わせた場合に増進される。補助放射線療法のパラメータは、例えばＷＯ９９／６００２３に含まれている。
【００８８】
脱フコシル化抗体は、既知の方法に従って、ボーラスとしての静脈内投与により、またはある期間にわたる連続注入により、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内またはくも膜下腔内の経路により患者に投与される。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。
【００８９】
ヒトＩＬ−１５は、既知の方法に従って、例えばボーラスとしての静脈内投与により、またはある期間にわたる連続注入により、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内または経口（ｐｅｒｏｒａｌ）の経路により患者に投与される。ヒトＩＬ−１５の静脈内、皮下または経口（ｏｒａｌ）投与が好ましい。
【００９０】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤ならびに薬学的投与に適合するその他の材料および化合物を含む、薬学的投与に適合する任意のおよび全ての材料を含むことを意図する。任意の従来の媒体または剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【００９１】
医薬組成物
医薬組成物は、本発明に従う脱フコシル化抗体、例えば抗ＣＤ２０抗体および本発明に従うヒトＩＬ−１５を、薬学的に許容される無機または有機担体と共に加工することにより得ることができる。ラクトース、コーンスターチまたはそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを、例えば錠剤、被覆錠剤、糖衣剤およびゼラチン硬カプセル剤のための担体として用いることができる。ゼラチン軟カプセル剤のための適切な担体は、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体および液体ポリオールなどである。しかし、活性物質の性質に応じて、ゼラチン軟カプセル剤の場合には担体が通常必要でない。液剤およびシロップ剤の製造のために適切な担体は、例えば水、ポリオール、グリセロール、植物油などである。坐剤のための適切な担体は、例えば天然または硬化油、ワックス、脂肪、半固体および液体ポリオールなどである。
【００９２】
医薬組成物は、さらに、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧変動用の塩、緩衝剤、マスキング剤または抗酸化剤を含有できる。組成物は、まだ他の治療上価値のある物質も含有できる。
【００９３】
本発明の一実施形態は、フコースの量が６０％以下である前記脱フコシル化抗体（好ましくは前記脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体）とヒトＩＬ−１５との両方を含む、がん、特にＣＤ２０発現性のがんの治療において用いるための組成物である。
【００９４】
前記医薬組成物は、１または複数の薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【００９５】
本発明は、（ｉ）フコースの量が６０％以下である第１有効量の脱フコシル化抗体（好ましくは脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体）と、（ｉｉ）第２有効量のヒトＩＬ−１５とを含む、特にがんにおいて用いるための医薬組成物をさらに提供する。このような組成物は、薬学的に許容される担体および／または補形剤を場合によって含む。
【００９６】
本発明に従って用いられる脱フコシル化抗体単独の医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、場合によって用いられる薬学的に許容される担体、補形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と、凍結乾燥製剤または水性溶液の形で混合することにより貯蔵ために調製される。許容される担体、補形剤または安定化剤は、採用する投与量および濃度にてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン界面活性剤を含む。
【００９７】
ヒトＩＬ−１５の医薬組成物は、それらの薬学的特性に依存する。このような組成物は、脱フコシル化抗体について上に記載したことと同様であり得る。
【００９８】
本発明のさらなる一実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、好ましくは、前記脱フコシル化抗体とヒトＩＬ−１５とについて２つの別々の製剤である。
【００９９】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によりまたは種間重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中にまたはマクロエマルジョン中に取り込まれてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１００】
持続放出調製物も調製できる。持続放出調製物の適切な例は、成形体、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形であり、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含む。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（ＵＳ３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸リュープロリドとで構成される注射用マイクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために用いる製剤は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌ろ過メンブレンを通してろ過することにより容易に達成される。
【０１０２】
本発明は、がんの治療を必要とする患者に（ｉ）フコースの量が６０％以下である第１有効量の脱フコシル化抗体（好ましくは脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体）と、（ｉｉ）第２有効量のヒトＩＬ−１５とを投与することを含む、がんを治療する方法をさらに提供する。
【０１０３】
一実施形態では、方法は、脱フコシル化抗体が、ＡＤＣＣの増加を示すことを特徴とする。
【０１０４】
一実施形態では、方法は、前記脱フコシル化抗体が、抗ＣＤ２０抗体であり、前記がんが、ＣＤ２０発現性のがんであることを特徴とする。
【０１０５】
一実施形態では、方法は、前記脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体が、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体であることを特徴とする。
【０１０６】
一実施形態では、方法は、前記脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブであることを特徴とする。
【０１０７】
一実施形態では、方法は、前記がんが、単球／周細胞浸潤がんであることを特徴とする。
【０１０８】
一実施形態では、方法は、サイトカインとしてＩＬ−１５だけが、前記併用治療において併用投与されることを特徴とする。
【０１０９】
一実施形態では、方法は、１または複数のさらなる他の細胞傷害性薬物、化学療法剤もしくは抗がん剤、またはこのような薬剤の効果を増進する化合物もしくは電離放射線が投与されることを特徴とする。
【０１１０】
本明細書で用いる場合、用語「患者」は、いずれの目的のためにも脱フコシル化抗体、好ましくは脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体（例えばそれぞれＣＤ２０発現性のがんに罹患している患者）を用いる治療を必要とするヒト、より好ましくは、がんまたは前がん状態もしくは病変を治療するためにそのような治療を必要とするヒトのことをいうことが好ましい。しかし、用語「患者」は、非ヒト動物、好ましくはなかでもイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよび非ヒト霊長類のような哺乳動物のことをもいうことができる。
【０１１１】
本発明は、ヒトＩＬ−１５との組み合わせでがんを治療するための脱フコシル化抗体、好ましくは脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体をさらに含む。
【０１１２】
本発明は、がんを治療するための、フコースの量が６０％以下である腫瘍抗原（これはＣＤ２０である）と特異的に結合する脱フコシル化抗体とヒトＩＬ−１５とをさらに含む。
【０１１３】
一実施形態では、前記がんは、単球／周細胞浸潤がんである。
【０１１４】
一実施形態では、脱フコシル化抗体は、ＡＤＣＣの増加を示す。
【０１１５】
一実施形態では、前記脱フコシル化抗体は、抗ＣＤ２０抗体であり、前記がんは、ＣＤ２０発現性のがんである。
【０１１６】
一実施形態では、前記脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体である。
【０１１７】
一実施形態では、脱フコシル化抗体（好ましくは脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体）は、ＩＬ−１５と組み合わせて用いられる。
【０１１８】
好ましくは、ＣＤ２０発現性のがんは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。より好ましくは、ＣＤ２０発現性のがんは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【０１１９】
以下の実施例および図面は、本発明を理解する助けとなるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神を逸脱することなく、上記の手順において改変を加えることができることが理解される。
【０１２０】
配列表
配列番号１  マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１の重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列
配列番号２  マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１の軽鎖の可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列
配列番号３〜１９  ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体（Ｂ−ＨＨ２〜Ｂ−ＨＨ９、Ｂ−ＨＬ８およびＢ−ＨＬ１０〜Ｂ−ＨＬ１７）の重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列
配列番号２０  ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体Ｂ−ＫＶ１の軽鎖の可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ＣＬＬ試料においてモノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導されるＮＫ細胞活性化。ＣＬＬ患者からのＰＢＭＣを、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）と共にまたはなしでＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）またはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）と共にまたはなしで７日間処理した後にフローサイトメトリーにより分析した。結果は、モノクローナル抗体およびＩＬ−１５の存在下または非存在下での７日間の培養（ｎ＝２６）後の、全ＮＫ細胞のうちのＣＤ６９＋ＮＫ細胞のパーセンテージを表す。水平のバーは、中央値を表す（＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２】ＣＬＬ試料においてモノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導されるＮＫ細胞増殖。ＣＬＬ患者からのＰＢＭＣを、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）と共にまたはなしでＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）またはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）と共にまたはなしで７日間処理した後にフローサイトメトリーにより分析した。（Ａ）モノクローナル抗体およびＩＬ−１５の存在下または非存在下でのＮＫ細胞に対するＣＦＳＥ希釈の代表的実験（ｎ＝１９）。（Ｂ）抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｎ＝１７）およびＩＬ−１５の存在下または非存在下での７日間の培養後の全ＮＫ細胞のうちの増殖しているＮＫ細胞のパーセンテージ。水平のバーは、中央値を表す（＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３】白血病Ｂ細胞上清およびＩＬ−１５を含むかまたは含まないモノクローナル抗体による健常ドナーからの精製ＮＫ細胞の増殖。結果は、ＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）またはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で７日間（次いで、フローサイトメトリーにより分析した）のＮＫ細胞に対するＣＦＳＥ希釈の代表的な実験を示す（ｎ＝５）。（Ａ）健常ドナーからのＣＦＳＥ標識精製ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むかまたは含まない培養培地で培養した。（Ｂ）精製白血病Ｂ細胞を、ＩＬ−１５を用いて７日間刺激したかまたはしなかった。ＣＦＳＥ標識精製ＮＫ細胞増殖の分析のための培養培地として上清を用いた。
【図４】トータル試料と単球除去または単球／ＣＤ３＋除去ＣＬＬ試料とにおける、モノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導されるＮＫ細胞増殖。ＣＬＬ患者からのトータル試料、単球除去または単球／ＣＤ３＋除去試料を、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）と共にまたはなしでＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）またはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）と共にまたはなしで７日間処理した後にフローサイトメトリーにより分析した。（Ａ）モノクローナル抗体およびＩＬ−１５の存在下または非存在下でのＮＫ細胞に対するＣＦＳＥ希釈の代表的実験（ｎ＝９）。（Ｂ）モノクローナル抗体およびＩＬ−１５の存在下または非存在下での７日間の培養後（ｎ＝９）のトータル試料（●）、単球除去（○）または単球／ＣＤ３＋除去試料（＊）における全ＮＫ細胞のうちの増殖しているＮＫ細胞のパーセンテージの平均およびＳＥＭ（標準誤差）。
【図５】ＣＬＬ試料においてモノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導される白血病Ｂ細胞除去。ＣＬＬ患者からのトータル試料、単球除去または単球／ＣＤ３＋除去試料を、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）と共にまたはなしでＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）またはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）と共にまたはなしで７日間処理した後にフローサイトメトリーにより分析した。７日間の処理後に未処理細胞と比較したＣＤ１９＋／ＣＤ５＋生存細胞のパーセンテージを、材料および方法に記載するようにして評価した。（Ａ）トータル試料における７日間の処理後のＣＤ１９＋／ＣＤ５＋生存細胞の絶対数（ｎ＝３５）。水平のバーは、中央値を表す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｂ）７日間の処理後のトータル試料（●）、単球除去（○）または単球／ＣＤ３＋除去試料（＊）におけるＣＤ１９＋／ＣＤ５＋生存細胞の絶対数の平均およびＳＥＭ（標準誤差）（ｎ＝７）。
【図６】ＣＬＬ試料においてモノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導される白血病Ｂ細胞除去。ＣＬＬ患者からのＰＢＭＣを、ＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）、ＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）、ＲＴＸ  Ｆ（ａｂ’）２（１０μｇ／ｍＬ）、ＧＡ１０１  Ｆ（ａｂ’）２（１０μｇ／ｍＬ）と共にまたはなしで７日間処理した後にフローサイトメトリーにより分析した。７日間の処理後に未処理細胞と比較したＣＤ１９＋／ＣＤ５＋生存細胞のパーセンテージを、材料および方法に記載するようにして評価した（ｎ＝７）。水平のバーは、中央値を表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
実験手順
材料および方法
細胞および試薬
未治療ＣＬＬ患者からの末梢血試料（ｎ＝３４、表１）を、インフォームドコンセントと共に得て、ＨＩＭＩＰ実験室に照会した。フランスの法律に従って、ＨＩＭＩＰは、高等教育および研究省（ＤＣ２００８−３０７コレクション１）に申告し、倫理委員会（Ｃｏｍｉｔｅ  ｄｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ  Ｓｕｄ−Ｏｕｅｓｔ  ｅｔ  Ｏｕｔｒｅｍｅｒ  ＩＩ）により許可された後に移動合意書（ＡＣ２００８−１２９）を得た。試料の臨床的および生物学的な注釈は、ＣＮＩＬ（Ｃｏｍｉｔｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ  ｅｔ  Ｌｉｂｅｒｔｅｓ：データ処理および自由についての国家委員会）に申告された。
【０１２３】
フィコール勾配遠心分離による分離の後に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を直ちに用いた。
【０１２４】
白血病Ｂ細胞は、製造者（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の使用説明書に従ってＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＢ細胞濃縮キットを用いてＣＤ４３除去なしで磁気分離により精製した。健常ドナーからのＮＫ細胞を、新しいバフィーコート（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅから得た）から単離し、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＮＫ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製した。白血病Ｂ細胞またはＮＫ細胞の純度を、フローサイトメトリーにより評価したところ、９０から９８％の間であった。
【０１２５】
単球およびＴリンパ球を、製造者（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の使用説明書に従ってＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ヒト単球除去カクテル（ＣＤ３６）およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ヒトＣＤ３除去カクテルをそれぞれ用いて、全血試料から除去した。単球およびＴリンパ球の除去を、フローサイトメトリーにより評価したところ、残存細胞のレベルは０．１％未満であった。
【０１２６】
ＲＴＸおよびＧＡ１０１モノクローナル抗体、ならびにＲＴＸ  Ｆ（ａｂ’）２およびＧＡ１０１  Ｆ（ａｂ’）２断片を、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得た。組換えヒトＩＬ−１５は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、Ｌｅ  Ｐｅｒｒａｙ−ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、以前の研究１１、２６、２７と同様に１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で用いた。
【０１２７】
全ての実験について、細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中で培養した。長期間の生存性を与えるために、ＣＬＬ培養を高細胞密度（１０×１０６細胞／ｍＬ）にて行った。
【０１２８】
フローサイトメトリー
細胞染色のために用いたモノクローナル抗体は、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ３、パシフィックブルー−抗ＣＤ３およびＰＥ−Ｃｙ−７−抗ＣＤ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｏｚｙｍｅ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からのパシフィックブルー−抗ＣＤ１９およびＰＥ−Ｃｙ−７−抗ＣＤ１６；ＰＥ−抗ＣＤ６９およびＰＥ−Ｃｙ７−抗ＣＤ５６（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｒｏｉｓｓｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；ならびにアイソタイプが一致した対照コンジュゲートであった。簡単に述べると、ＰＢＭＣまたは精製細胞を、１％ＦＣＳを含有する冷ＰＢＳで洗浄し、適当なコンジュゲート抗体を用いて氷上で３０分間染色し、次いで、洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。
【０１２９】
ＣＬＬ試料からのＮＫ細胞活性化アッセイ
未治療ＣＬＬ患者からの新しいＰＢＭＣを、１０×１０６細胞／ｍＬにて培養培地中に播種し、未処理のまま放置したか、またはＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）もしくはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）で７日間処理した。適当なときに、組換えヒトＩＬ−１５を１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ３−／ＣＤ５６＋ゲート通過細胞におけるＣＤ６９発現を検出するフローサイトメトリーにより評価した。
【０１３０】
ＮＫ細胞増殖アッセイ
ＣＬＬ患者から新しく単離したＰＢＭＣまたは健常ドナーからの精製ＮＫ細胞（５×１０６細胞／ｍＬ）を、１μＭのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間、３７℃にて標識し、製造者の使用説明書に従ってＰＢＳで洗浄した。標識細胞を、次いで、ＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）もしくはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）および／または１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５を含むかまたは含まない完全培地中で７日間培養した。いくつかの実験について、健常ドナーからのＣＦＳＥ標識精製ＮＫ細胞を、ＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）またはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）を補ったかまたは補っていない１００％白血病Ｂ細胞上清中でインキュベートした。全ての実験において、ＣＦＳＥ希釈は、フローサイトメトリーによりＣＤ３−／ＣＤ５６＋ゲート通過細胞上で分析した。
【０１３１】
ＣＬＬ上清の産生
精製白血病Ｂ細胞を、１０×１０６細胞／ｍＬにて培養培地中に播種し、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）と共にまたはなしでインキュベートした。７日後に、細胞を遠心分離した。上清をろ過し、直ちに用いたかまたは−８０℃にて貯蔵した。
【０１３２】
ＣＬＬ試料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ白血病Ｂ細胞除去アッセイ
未治療ＣＬＬ患者からの新しいＰＢＭＣを、１０×１０６細胞／ｍＬにて培養培地中に播種し、未処理のまま放置したか、またはＲＴＸ（１０μｇ／ｍＬ）もしくはＧＡ１０１（１０μｇ／ｍＬ）で７日間処理した。適当なときに、ＩＬ−１５を１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。白血病Ｂ細胞除去は、フローサイトメトリーにより決定される生存ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋リンパ球のパーセンテージと組み合わせた全生存細胞数決定（トリパンブルー排除による）に基づき、以下のようにして算出した：
生存細胞のＣＤ１９＋／ＣＤ５＋絶対数：決定された生存細胞数×％ＣＤ１９＋ＣＤ５＋
ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋生存細胞の％＝１００×（処理試料中の絶対数／未処理試料中の絶対数）。
【０１３３】
自己クロム放出細胞傷害アッセイ
４名の無作為なＣＬＬ患者からのエフェクター細胞の自然細胞傷害性を、古典的なクロム放出アッセイを用いて試験した。簡単に述べると、ＮＫ細胞を、ＰＢＬ試料から、カスタムＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ヒトＮＫ細胞濃縮キット（＃Ｒ１７５２３、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製し、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激したかまたは刺激しなかった。自己白血病Ｂ細胞（標的細胞）を、ＲＰＭＩ  １％ＦＣＳ中で１時間、３７℃にて、５１Ｃｒ（クロム酸ナトリウム、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）（１０６細胞あたり１００μＣｉ）とインキュベートした。細胞を次いで洗浄し、１０４／ウェルにて丸底９６ウェルプレートに入れた。漸増量のエフェクター細胞を、ＮＫ／標的比が０．０１／１から０．８／１の範囲で３重でウェルに加えた。対照ウェルには、標的細胞のみを含有させて、自発的な放出を測定したか、または標的細胞と０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有させて、最大放出を測定した。遠心分離後に、プレートを４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。次いで、５０μＬを各ウェルから回収し、ガンマカウンタにて計測した。特異的溶解のパーセンテージを、次のようにして算出した：（（試料放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００。
【０１３４】
白血病Ｂ細胞上でのＣＤ２０発現の定量
ＣＤ２０発現を、ＢＤ  ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ蛍光アッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋ゲート通過細胞でフローサイトメトリーにより定量した。細胞あたりに結合した抗体（ＡＢＣ）の値は、抗ＣＤ２０抗体と結合する各細胞の最大能力の平均値を表し、製造者の使用説明書に従って評価した。
【０１３５】
統計
対応のあるまたは対応のないスチューデントのｔ検定を用いて、適当であれば試料間の相違を決定した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であるとみなした。
【０１３６】
結果
ＣＬＬ試料においてモノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導されるＮＫ活性化
ＮＫ活性化を、無作為ＣＬＬ試料（ｎ＝２６）において、細胞表面活性化マーカーとしてＣＤ６９発現を用いて評価した（図１）。ＣＤ６９は、培養中にその発現が持続される、早期活性化マーカーである（データは示さず）。未処理試料において、ＮＫ活性化は、僅か７日間の培養後に観察された。ＲＴＸまたはＧＡ１０１とのインキュベーションにより、未処理細胞（中央値：３５．７５％）と比較した場合に、活性化ＮＫ細胞が増加した（全ＮＫ細胞のうちのＣＤ６９＋細胞の％は、ＲＴＸおよびＧＡ１０１についてそれぞれ６５．２５％および７２．２５％の中央値であった）。この現象は、ＲＴＸよりもＧＡ１０１を用いると有意により高かったことが注目に値する（ｐ＜０．０１）。観察されたＮＫ細胞活性化は、モノクローナル抗体のＦｃ部分に依存した。なぜなら、Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて著しい活性化は観察されないからであり（データは示さず）、このことはＣＤ１６シグナル伝達（受容体との抗体−Ｆｃ断片の結合による）の重要性を強調している。ＩＬ−１５を加えることにより、ＲＴＸまたはＧＡ１０１（中央値：それぞれ９６．７５％および９５．７５％）により誘導される相乗的または相加的な効果なしで、全てのＮＫ細胞が活性化された（中央値：９５．２５％）。
【０１３７】
ＣＬＬ試料におけるモノクローナル抗体およびＩＬ−１５により誘導されるＮＫ増殖
ＮＫ細胞増殖に対するＩＬ−１５およびモノクローナル抗体の組み合わせた効果を、７日間のＣＬＬ培養において評価した。結果は、ＣＦＳＥ希釈により特徴付けられる、ＲＴＸおよびＧＡ１０１単独により誘導されるゲート通過ＣＤ３−／ＣＤ５６＋細胞の増殖を示し、ＧＡ１０１処理試料においてＲＴＸ処理試料よりも有意に高い割合の増殖ＮＫ細胞が示された（増殖ＮＫ細胞の中央値％：それぞれ３１．７５％対１４．７５％）（図２）。ＮＫ活性化について観察された通り、これらの結果は、ＮＫ細胞増殖におけるＣＤ１６シグナル伝達の重要性を確認する。さらに、ＩＬ−１５処理は、ＮＫ細胞の強い増殖を誘導した（中央値：４２．２５％）。重要なことに、この現象は、ＩＬ−１５とモノクローナル抗体との組み合わせで有意により大きく、ＩＬ−１５／ＧＡ１０１により、ＩＬ−１５／ＲＴＸと比較してより強いＮＫ増殖が誘導された（中央値：それぞれ６７．２５％対５３．７５％；ｐ＜０．００１）。この効果は、ＩＬ−１５とインキュベートしたＮＫ細胞におけるＣＤ１６発現の増加によるものでない（ＩＬ−１５とインキュベートした試料中のＣＤ１６発現の蛍光強度の平均は、５４８１±３３９５であり、これに対して培地単独においては６４９１±２６４４であった；ｐ＝０．１０２）。これらのデータは、ＩＬ−１５とＣＤ１６シグナル伝達の協働がＮＫ細胞増殖において重要であるという仮説を支持する。
【０１３８】
ＩＬ−１５およびモノクローナル抗体により精製ＮＫ細胞の増殖は誘導されない
ＣＬＬ細胞は、傍分泌または自己分泌活性を有する可溶性因子を放出する能力を有し、よって、免疫エフェクター機能を調節できる１４。Ｂ−ＣＬＬ放出可溶性因子がＮＫ増殖に影響できるかどうかを評価するために、健常ドナーからの精製ＮＫ細胞を、適切な培地中で、またはモノクローナル抗体を含むかもしくは含まないＩＬ−１５刺激ＣＬＬ細胞上清中で７日間培養した。高密度にて７日間の培養により、培地栄養分が減少し、細胞生存性に影響する可能性がある。我々の実験では、培地またはＢ−ＣＬＬ上清中で培養したＮＫ生存細胞の絶対数は、両方の条件下で同一である（ｐ＝０．４５）。図３に示すように、培地単独、またはモノクローナル抗体ありもしくはなしでのＩＬ−１５の存在下のいずれでも、ＮＫ増殖は観察されなかった。未処理のまたはＩＬ−１５刺激された精製白血病Ｂ細胞のいずれからのＢ−ＣＬＬ上清の添加も、モノクローナル抗体の存在下または非存在下でよりよいＮＫ増殖を誘導せず、このことはＢ−ＣＬＬ可溶性因子がＮＫ増殖に関与しないことを示唆し、このプロセスについての細胞間相互作用の仮説を支持する。
【０１３９】
ＣＬＬ細胞によるＩＬ−１５トランス提示は、モノクローナル抗体によるＮＫ増殖を誘導した
以前に記載したように、ＩＬ−１５作用の一般的な機構は、単球のようなアクセサリー細胞によるトランス提示である。Ｂ細胞蓄積によりＣＬＬ試料中で単球が比較的少数である（表１）にもかかわらず、我々は、ＮＫ増殖におけるＩＬ−１５トランス提示の寄与度を、ＩＬ−１５Ｒα陽性細胞の連続的な除去を用いて調べた。結果は、トータル試料と比較して、ＮＫ増殖が、単球除去および単球／ＣＤ３＋除去ＣＬＬ試料において変化しなかった（それぞれｐ＝０．６０２およびｐ＝０．７７５）ことを示す（図４）。これらのデータは、白血病Ｂ細胞とＮＫ細胞との間の相互作用が、ＩＬ−１５の存在下でのＮＫ増殖を刺激するために重要であることを確認する。モノクローナル抗体の存在下で観察された増殖の改善は、ＣＤ２０認識を介するＢ細胞とＮＫ細胞との間のより強い相互作用に帰する可能性がある。ＩＬ−１５が白血病Ｂ細胞上のＣＤ２０発現をモジュレートしなかったことは注目に値する（ｐ＝０．３６）。まとめると、これらの結果は、白血病Ｂ細胞が、ＮＫ細胞へのＩＬ−１５トランス提示のためのアクセサリー細胞として作用することを強く示す。
【０１４０】
白血病Ｂ細胞除去におけるＩＬ−１５およびモノクローナル抗体の共活性
ＩＬ−１５刺激ＮＫ細胞の機能的な意味を、未治療患者からのＣＬＬ試料における白血病Ｂ細胞除去アッセイにより評価した（ｎ＝３４、表１）。Ｂ細胞培養を高密度（１０×１０６細胞／ｍＬ）にて行って、長命を与えた（これらは低密度で自発的に死滅するからである１３、２９）。この高い細胞濃度にて、自発的なＣＬＬ死は７日後に３４％を超えなかった。驚くべきことに、結果は、最初にＩＬ−１５単独でわずかなＢ細胞除去を誘発したことを示す（図５Ａ）。よって、我々は、自己白血病Ｂ細胞に対するＮＫ細胞傷害機能に与えるＩＬ−１５刺激の影響を試験した。０．０２／１のＮＫ／Ｂ比（Ｂ−ＣＬＬ試料において観察されるＮＫ／Ｂ比に関係する、表１）では、ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の自然細胞傷害性を増加できた（特異的細胞傷害性の％：ＮＫ細胞について０．０３±０．１％；ＩＬ−１５刺激ＮＫ細胞について８．９±１．９％；ｐ＝０．００４）。
【０１４１】
全ＰＢＭＣ試料では、ＧＡ１０１は、ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋細胞除去に関してＲＴＸよりも大きい細胞傷害活性を示した（生存白血病Ｂ細胞の中央値はそれぞれ３９．９％対７９．５％；ｐ＜０．０００１）（図５Ａ）。この観察されたＢ細胞除去は、モノクローナル抗体のＦｃ部分に依存した。なぜなら、Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて著しい除去は観察されず（図６）、培養条件によりＣＤＣと関係しなかったからである。最も重要なことには、ＲＴＸまたはＧＡ１０１媒介性のＢ細胞除去は、ＩＬ−１５の存在下で有意に増加した（生存白血病Ｂ細胞の中央値：ＲＴＸ７９．５％対ＲＴＸ／ＩＬ−１５  ５０．４％、ｐ＜０．０００１；ＧＡ１０１  ３９．９％対ＧＡ１０１／ＩＬ−１５  １７．８％、ｐ＜０．０００６）（図５Ａ）。これらの観察結果は、ＣＬＬ試料におけるＲＴＸまたはＧＡ１０１媒介性の白血病細胞除去におけるＩＬ−１５およびＣＤ１６活性化の協働的役割を示唆し、このプロセスにおけるＩＬ−１５／ＧＡ１０１の組み合わせのより大きい効力を強調する。
【０１４２】
白血病Ｂ細胞の除去が厳密にＮＫ依存性であることを確認するために、単球およびＴリンパ球をＣＬＬ試料から連続的に取り除いた。結果は、単球を取り除くことおよび単球／Ｔリンパ球の両方を取り除くことが、ＩＬ−１５と共にまたはなしでＲＴＸまたはＧＡ１０１により誘導されるＢ細胞除去に影響しないことを示す（トータル試料と比較して、単球除去試料についてｐ＞０．５１；単球／Ｔリンパ球除去試料についてｐ＞０．５９）（図５Ｂ）。
【０１４３】
まとめると、これらのデータは、自然自己細胞傷害性およびＡＤＣＣの両方の増加を導く、ＣＬＬにおけるＮＫ細胞に対するＩＬ−１５の強い効果を強調する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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