(57)【要約】  本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え型融合タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、抗体成分および標的成分を含む融合タンパク質と、該融合タンパク質を使用し、免疫応答を誘導することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、または３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、抗原性ユニットと、を含む標的ユニットを含むことを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項２】
上記標的ユニットと、上記抗原性ユニットとが二量体化モチーフを介して結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
上記抗原性ユニットは、抗原性ｓｃＦｖ、細菌性抗原、ウイルス性抗原、およびがん関連抗原もしくはがん特異性抗原からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
上記標的ユニットが配列番号１、２、または３と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
上記標的ユニットが配列番号１、２、または３と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
上記標的ユニットが、配列番号１、２、または３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
上記ポリペプチドが二量体として提供されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
上記二量体ドメインが、ヒトＩｇＧ３二量体ドメイン（ｈＣＨ３）を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
上記融合ポリペプチドが、クロスプレゼンテーションを行うＤＣ上のＸｃｒ１と結合することを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の上記融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１１】
上記融合ポリペプチドまたは請求項１から９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１２】
上記ワクチンは、薬学的に許容できるキャリアをさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
被験体が上記抗原に対して免疫応答を作製する条件下、請求項１１から１２のいずれか１項に記載のワクチン組成物を上記被験体に投与する工程を含む、免疫応答の誘導方法。
【請求項１４】
被験体内に免疫応答を産生するための、請求項１から９に記載の融合タンパク質、または請求項１１から１２に記載のワクチンの、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願のクロスリファレンス）
本出願は、２０１２年９月２３日に出願した係属中の米国仮出願第６１／５３８，１８６号に対する優先権を主張するものである。本出願には、上記仮出願の全体が参照により含まれる。
〔技術分野〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質（ワクチボディ（vaccibodies））および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡワクチン接種は、免疫応答を誘導する技術的には簡単な方法である。しかし、小動物を被験体とした試験での成功はいまだ臨床試験で再現されたことはない。ＤＮＡワクチン接種の効能を増加させるために、現在幾つかの戦略が検討されている。
【０００３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）をタンパク質抗原の標的とした場合、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を改善することができる。組換え型免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、この目的に非常に適している。例えば、ＡＰＣの表面分子に特異的な可変（Ｖ）領域を有する上記組換え型Ｉｇを備えることで標的抗原の送達を達成しながら、短鎖抗原エピトープは、Ｉｇ定常ドメイン内のβ−鎖間のループに置き換わることができる。しかし、このような戦略は、同定されていないエピトープを含むより大型の抗原には適しておらず、そのうえ短鎖Ｔ細胞エピトープを有する組換え型Ｉｇ分子は、構造エピトープに対する抗体を誘導させることができない。このような限界を克服するために、構造エピトープを維持しつつ、少なくとも５５０ａａのサイズを有する伝染性抗原または腫瘍抗原を発現する、Ｉｇをベースとした標的ホモ二量体ＤＮＡワクチン（ワクチボディ）が作製されている。
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、効果が不十分だとして人への接種はいまだ承認されていない。また、幾つかの伝染病に対しては、有効なワクチンが存在しない。特に、治療用ＤＮＡがんワクチンの人への使用はまだ承認されていない。
【０００５】
効能が改善されたＤＮＡワクチンが必要とされている。
〔発明の概要〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ)および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【０００６】
したがって、本発明の実施形態は融合ポリペプチドと、上記ポリペプチドをコードする核酸に加えて、ベクターと、上記融合ポリペプチドをコードする上記ベクターを含む細胞であって、上記融合ポリペプチドは、ヒトまたはマウスのＸｃｌ１またはＸｃｌ２のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２、または３と記載）と少なくとも８０％の配列同一性（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の相同性）を有するアミノ酸配列と、抗原性ユニットと、を含む標的ユニットを含み、上記標的ユニットと、上記抗原性ユニットは二量体化モチーフを介して結合されている、融合ポリペプチドと、上記ポリペプチドをコードする核酸に加えて、ベクターと、上記融合ポリペプチドをコードする上記ベクターを含む細胞とを提供する。幾つかの実施形態においては、上記融合ポリペプチドは、クロスプレゼンテーションを行うＤＣ上のＸｃｒ１と結合することが好ましい。幾つかの実施形態において、ヒトもしくはマウスのＸｃｌ１もしくはＸｃｌ２の変異体または相同体は、天然の、ヒトもしくはマウスのＸｃｌ１もしくはＸｃｌ２よりも、Ｘｃｌ１に対してより高い親和性を提示する。
【０００７】
幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは抗原性ｓｃＦｖ、細菌性抗原、ウイルス抗原、またはがん関連抗原もしくはがん特異性抗原である。幾つかの実施形態においては、（Ｇ４Ｓ）３リンカーのようなリンカーが上記抗原性ｓｃＦＶのＶＨとＶＬとを結合する。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ｓｃＦｖは、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞から産生したモノクローナルＩｇ由来である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはテロメラーゼまたはその機能的部分である。幾つかの実施形態においては、上記テロメラーゼはｈＴＥＲＴである。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはメラノーマ抗原である。幾つかの実施形態においては、上記メラノーマ抗原はチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、もしくはＴＲＰ−２である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは前立腺がん抗原である。幾つかの実施形態においては、上記前立腺がん抗原はＰＳＡである。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは頸がん抗原である。幾つかの実施形態においては、上記頸がん抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２からなるリストから選択される。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは細菌由来である。幾つかの実施形態においては、上記細菌由来抗原性ユニットは結核抗原である。幾つかの実施形態においては、上記細菌由来の抗原性ユニットはブルセラ病抗原である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはウイルス由来である。幾つかの実施形態においては、上記ウイルス由来抗原性ユニットはＨＩＶ由来である。幾つかの実施形態においては、上記ＨＩＶ由来抗原性ユニットはｇｐ１２０もしくはＧａｇ由来である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、核タンパク質、ならびにＭ２抗原、および単純疱疹２抗原糖タンパク質Ｄからなるリストから選択される。
【０００８】
幾つかの実施形態においては、上記ポリペプチドは二量体として存在する。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフは、ヒンジ領域と、任意でリンカーを介して結合されている、二量体化を促進する任意の他のドメイン（免疫グロブリンドメインなど）と、を含む。幾つかの実施形態においては、上記二量体ドメインはヒトＩｇＧ３二量体ドメイン（ｈＣＨ３）を含む。幾つかの実施形態においては、上記ヒンジ領域は１つ、２つ、または複数の共有結合を形成する能力を持つ。幾つかの実施形態においては、上記共有結合はジスルフィド架橋である。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフの上記免疫グロブリンドメインはカルボキシ末端Ｃドメイン、または上記Ｃドメインと実質的に相同である配列である。幾つかの実施形態において、上記カルボキシ末端ＣドメインはＩｇＧ由来である。幾つかの実施形態において、上記二量体化モチーフの上記免疫グロブリンドメインはホモ二量体化を行う能力を有する。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフの上記免疫グロブリンドメインは非共有相互作用を介してホモ二量体化を行う。幾つかの実施形態においては、上記非共有相互作用は疎水性相互作用である。幾つかの実施形態においては、上記二量体ドメインは、上記ＣＨ２ドメインを含まない。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフは、リンカーを介してヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインに結合された、ヒンジエキソンｈ１およびｈ４からなる。幾つかの実施形態においては、上記ヒンジ領域と二量体化を促進する他のドメイン（免疫グロブリンドメインなど）とを結合させる上記リンカーは、Ｇ３Ｓ２Ｇ３ＳＧリンカーである。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットおよび上記二量体化モチーフはＧＬＳＧＬリンカーのようなリンカーを介して結合される。幾つかの実施形態においては、好ましい変異型ホモ二量体タンパク質は、天然ホモ二量体タンパク質の親和性と比べて、Ｘｃｒ１ケモカイン受容体に対する親和性が増加している。
【０００９】
幾つかの実施形態においては、本発明は、上記で説明したワクチボディをコードする核酸分子を提供する。幾つかの実施形態においては、本発明に係る上記核酸分子はベクターに含まれている。幾つかの実施形態においては、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、本発明に係る上記核酸分子は、患者の体内においてホモ二量体タンパク質の産生を誘導するために、患者への投与目的で調剤される。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本発明に係るワクチンは薬学的に許容できるキャリアおよび／またはアジュバントを含む。幾つかの実施形態においては、本発明は、がんまたは伝染病に対するワクチンであって、上記ワクチンは、上記で説明したホモ二量体タンパク質、または上記で説明したホモ二量体タンパク質を形成することができる上記単量体タンパク質をコードする核酸分子を免疫学的な有効量含み、上記ワクチンは、Ｔ細胞免疫応答および／またはＢ細胞免疫応答（好ましくは両方）を誘起させることができ、上記ホモ二量体タンパク質は、上記がんまたは上記伝染病に特異的な抗原性ユニットを含有することができる。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本発明に係るワクチンまたは医薬組成物によって治療される上記がんは、多発性骨髄腫もしくは多発性リンパ腫、悪性メラノーマ、ＨＰＶ誘導性がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、および／または肝臓がんである。幾つかの実施形態において、本発明に係るワクチンまたは医薬組成物によって治療される上記伝染病は、インフルエンザ、ヘルペス、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ブルセラ病、ＨＩＶ、ＨＳＶ−２および結核からなるリストから選択される。
【００１２】
本発明はさらに上記融合ポリペプチドを含むキットを提供する。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、被験体が上記抗原性ユニットに対して免疫応答を生成するよう、一定の条件下、本明細書中に記載のワクチン組成物を上記被験体に投与する工程を含む、免疫応答の誘導方法を提供する。
【００１４】
幾つかの実施形態においては、本発明はさらに、上記で説明したホモ二量体タンパク質の作成方法を提供し、上記方法は、上記で説明したホモ二量体タンパク質を形成することができる上記単量体タンパク質をコードする上記核酸分子を細胞集団へ導入する工程と、上記細胞集団を培養する工程と、上記細胞集団から発現したホモ二量体化タンパク質の回収および精製を行う工程と、を含む。
【００１５】
さらなる実施形態は本明細書中にて説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｘｃｌ１を標的としたワクチボディの構造と機能とを示す図である。（Ａ）は、標的ユニットとしてのマウスＸｃｌ１、二量体ドメイン、およびウイルス抗原性ユニットを有するワクチボディ構造を示す。（Ｂ）は、本発明の実施形態に係る融合タンパク質を用いたターゲティングを模式的に示した図である。Ｘｃｌ１−ワクチボディはＸｃｒｌを発現したＤＣサブセットと結合し、続いて、ＭＨＣ−Ｉ上のウイルス性抗原のペプチドをＣＤ８+Ｔ細胞に提供する。これによりウイルス感染した細胞を死滅させることができる細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導する。
【図２】非リンパ系およびリンパ系器官からのＤＣサブセットによるＸＣＲ１の発現を示す。Ａは各器官におけるＤＣサブセットを定義するゲーティング方法を示す。Ｂ−Ｊは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＸＣＲ１−ｂＧａｌマウス（組換え型ＸＣＬ１−ｍＣｈｅｒｒｙが用いられたＥを除く）の様々な器官のＤＣサブセットにおけるＸＣＲ１の発現を表すｂｇａｌ酵素活性を示すヒストグラムである。Ｂは表皮、Ｃは真皮、Ｄ−ＦはＣＬＮ、Ｆは、ＸＣＲ１-ｂＧａｌマウスのｂＧａｌ＋細胞に対してＣ５７ＢＬ/６ＪマウスのｂＧａｌ＋細胞の割合を減じることで、ｂＧａｌ＋細胞の割合を計算したものである。Ｇは、ＣＬＮ常在性のＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ８ａ＋ＤＣにおけるＣＡＤＭ１の発現（左パネル）と、ＣＬＮ−ｍｉｇのＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１０３２、およびＣＤ１０３＋ＤＣにおけるＣＡＤＭ１の発現（右パネル）を示す。Ｈは、肝臓、肺、および腸を示す。Ｉは、ＭｅｄＬＮｓおよびＭＬＮからのＭｉｇ−ＤＣサブセットである。Ｊは、脾臓、ＭｅｄＬＮｓ、およびＭＬＮからのＬＴ常在性ＤＣサブセットである。
【図３】Ｘｃｌ１を標的としたワクチボディの特性を示す。Ａ）ワクチボディは、標的ユニット（Ｘｃｌ１）、二量体ユニット（ｈＣＨ３）および抗原性ユニット（ｍＣｈｅｒｒｙ）からなる二量体タンパク質としてｉｎ  ｖｉｖｏで発現する。Ｘｃｒ１に結合しないと推定される変異体を生成するために、我々は、システイン１１をアラニンに変異させた変異型Ｘｃｌ１（Ｃ１１Ａ）を生成した。Ｘｃｌ１を標的としたワクチボディと、Ｃ１１Ａを標的としないと推定される変異型ワクチボディを２９３Ｅ細胞で発現させ、Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体を用いたウェスタンブロッティング、およびＣ）Ｘｃｌ１に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡで分析した。Ｄ）は常在性ＣＤ８α＋ＤＣへのＸｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙワクチボディおよびＸｃｌ１（Ｃ１１Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙワクチボディの結合（左パネル）と、脾臓から分離させたＣＤ１１ｂ＋  ＤＣを示す。ＤＣは、Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙ存在下で培養したＤＣ、Ｘｃｌ１（Ｃ１１Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙ存在下で培養したＤＣ、およびワクチボディ存在下で培養されなかったＤＣである。Ｅ）Ｘｃｒ１−／−マウスから分離させたＣＤ８α＋ＤＣへの、Ｘｃｌ１-ｍＣｈｅｒｒｙおよびＸｃｌ１（Ｃ１１Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙの結合は見られなかった。
【図４】Ｘｃｌ１を標的としたＨＡ−ワクチボディに対する液性免疫応答を示す。比較は、ＨＡのみ、ＮＩＰ−ＨＡ（ハプテンＮＩＰに特異的な非標的ワクチボディ)、およびＣ１１Ａ変異体に対して行った。a)免疫化から１４日後に採取した血清サンプルで抗ＨＡ抗体の分析を行った。ｂ）上記血清の免疫グロブリン応答については、免疫化から１４日後にさらにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプの分析を行った。Ｂａｌｂ／ｃマウスのＩｇＧ２ａの血清レベルｃ）およびＩｇＧｌの血清レベルｄ）を１８週間にわたって観察し、第１週、３週、５週、７週、１０週、１４週および１８週に血清サンプルを回収した。ｅ）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＸｃｌ１−ＨＡワクチボディＤＮＡをタイトレーションした際のＩｇＧ２ａ血清応答を示す。かっこ内の数字はマウスを免疫化するために用いたＤＮＡの総量を示す。
【図５】ＭＨＣ−Ｉ分子Ｋｄ上に提示されるＨＡペプチドＩＹＳＴＶＡＳＳＬに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のペンタマー染色を示す。ａ）流入領域リンパ節から分離した細胞をＣＤ８発現（Ｒ１）にゲーティングし、ＰＥが連結したＩＹＳＴＶＡＬＬＳペンタマーの結合について分析した。パネル右上の四分の一区画に示す数字はペンタマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。ｂ）すべてのコントロールを包含したペンタマー染色の概要である。ＮＩＰ−ＨＡまたはＣ１１Ａ−ＨＡを投与されたマウスに比べて、Ｘｃｌ１−ＨＡを投与されたマウスのペンタマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞に著しい増加を認めた（Mann-Whitney)。
【図６】Ｘｃｌ１−ＨＡワクチボディは、致命的なインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）の投与からマウスを保護することを示す。ａ）Ｘｃｌ１−ＨＡ、Ｃ１１Ａ−ＨＡ、ＨＡ、およびＮａＣｌを用いて免疫化を行ってから１４日後、マウスに致死量の５倍のＰＲ８を投与し、体重減少を観察した。実験は７日目に終了した。ｂ）７日目の（ａ）の体重データの概要であり、ＮＩＰ−ＨＡを投与したコントロールも含んでいる。Ｘｃｌ１−ＨＡの投与を受けたマウスの体重とＮＩＰ−ＨＡおよびＣ１１Ａ−ＨＡを投与された非標的コントロールの投与を受けたマウスの体重との間には著しい差が認められた。ｃ）免疫化から１４日後、致死量の５倍のＰＲ８を投与する前に、マウスの免疫化に用いたＸｃｌ１−ＨＡ  ＤＮＡの力価を示す。かっこ内の数字はマウスを免疫化するために用いたＤＮＡの総量を示す。ｄ）免疫化から２６週後、マウスにＰＲ８ウイルスを投与し、ウイルス投与後９日目まで体重の減少を観察した。
【図７】表１を示す。
【図８】ネズミならびにヒトＸｃｌ１ワクチボディ、およびヒトＸｃｌ２ワクチボディの発現と分泌とを比較したグラフである。
【図９】図９ａおよび図９ｂは、Ｘｃｌ１ワクチボディおよびＸｃｌ２ワクチボディで免疫化した後の免疫応答を比較したグラフである。
【図１０】図１０ａおよび図１０ｂは、Ｘｃｌ１ワクチボディおよびＸｃｌ２ワクチボディで免疫化してから１４日後にインフルエンザウイルスを投与した後の体重減少を比較したグラフである。
【００１７】
(定義）
本明細書で使われている「免疫応答」という用語は、被験体の免疫システムによる応答を指す。例えば、免疫応答の例として、Ｔｏｌｌ受容体の活性化、リンフォカイン（サイトカイン（例：Ｔｈ１タイプもしくはＴｈ２タイプのサイトカイン）もしくはケモカインなど）の発現および／または分泌、マクロファージの活性化、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化（ＣＤ４+もしくはＣＤ８+Ｔ細胞など）、ＮＫ細胞の活性化、および／またはＢ細胞の活性化（例えば、抗体生成および／または分泌）における検知可能な変化（すなわち増加）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答のさらなる例として、細胞障害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）応答を誘導する、免疫原（例えば、抗原（例：免疫原性ポリペプチド）のＭＨＣ分子への結合、抗原性ポリペプチドの由来となる抗原に対するＢ細胞応答（例えば、抗体産生）ならびに／もしくはヘルパーＴ細胞応答、および／または遅延型過敏（ＤＴＨ）応答の誘導、免疫システム細胞（例：（血漿細胞などの）いかなる発達段階におけるＴ細胞、Ｂ細胞）の増殖（例えば、細胞集団の増加）、および抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび抗原提示の増加が挙げられる。免疫応答は、被験体の免疫システムによって外来性であると認識される免疫原に対するものであってよい（例えば、微生物からの非自己抗原（病原体など）、または外来性として認識された自己抗原）。したがって、本明細書で使われている「免疫応答」は、自然免疫応答（例えばＴｏｌｌ受容体シグナルカスケードの活性化）、細胞性免疫応答（例えばＴ細胞（すなわち抗原特異性Ｔ細胞）および免疫システムの非特異性細胞の仲介による応答）、および液性免疫応答（例えば、（血漿、リンパ液および／または組織液に、抗体を生成および分泌することを介した）Ｂ細胞の仲介による応答）を含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の免疫応答を指すものであると理解されるべきである。「免疫応答」という用語は、被験体の免疫システムが抗原および／または免疫原に対して応答できる能力（例えば免疫原（病原体など）に対する初期応答および後天性免疫応答の結果である獲得（例えば、記憶）免疫応答）の全側面を包含するものである。
【００１８】
本明細書で使われている「免疫」という用語は、疾病の原因となり得る微生物（病原体など）に曝露された際に当該疾病から防護すること（例えば当該疾病の徴候、症候、状態を防ぐことまたは和らげること（抑制など））を指す。免疫は、先天性（例：過去に抗原の曝露を受けていなくても存在する非適応性（非後天性）免疫応答）、および／または後天性（例：過去に抗原の曝露を受けたことによりＢ細胞およびＴ細胞によって仲介される免疫応答（つまり、上記抗原に対して特異性と反応性の増加を示す））であってもよい。
【００１９】
本明細書で使われている「免疫原」という用語は、被験体内で免疫応答を誘導することができる病原体（例えば、微生物（バクテリア、ウイルスもしくは菌類など）および／または病原体の一部もしくは成分（タンパク質抗原など）を指す。幾つかの実施形態において、免疫原は上記免疫原（例えば、病原体もしくは病原体生成物などの微生物）に対して免疫を誘導する。
【００２０】
「試験化合物」という用語は、疾病、疾患、病気、もしくは身体機能の不調の治療または予防に使うことができる、またはサンプルの生理学的状態もしくは細胞の状態を変化させる、あらゆる化学成分、医薬、薬物などを指す。試験化合物には、公知の治療用化合物と、治療用化合物となり得る化合物の双方が含まれる。試験化合物が治療効果を有するか否かは、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングをすることで判断される。「公知の治療用化合物」は、（例えば、動物実験もしくは過去のヒトへの投与経験を通じて）そのような治療または予防において有効であると認められている治療用化合物を指す。
【００２１】
本明細書で使われる「サンプル」という用語にはその用語が意味し得る最も広い範囲を適用する。ある意味においては、「サンプル」という用語は組織サンプルを指し、別の意味においては、「サンプル」という用語は生体ソースなどのあらゆるソースから得られた標本または培養物を含むことを意図する。生体サンプルは動物（ヒトを含む）から得られるものであってよく、液体、固体、組織、気体を包含する。生体サンプルとしては、血漿や血清などの血液製剤が挙げられるがこれらに限定されない。これらの例は本発明に適用できるサンプルの種類を限定するものとして解釈されるべきではない。ヒトの染色体またはヒト染色体と関連する配列を含むと推定されるサンプルは、細胞、細胞から分離された染色体（中期染色体スプレッドなど）、ゲノムＤＮＡ（溶液中に存在するもの、またはサザンブロット分析に用いられるような固体支持体に結合されているもの）、ＲＮＡ（溶液中に存在するもの、またはノーザンブロット分析に用いられるような固体支持体に結合されているもの）、ｃＤＮＡ（溶液中に存在するもの、または固体支持体に結合されているもの）などを含んでいてもよい。タンパク質を含むと推定されるサンプルは、細胞、組織の一部、１つまたはそれ以上のタンパク質を含んだ抽出物などを含んでいてもよい。
【００２２】
本明細書において「アミノ酸配列」という記載を用いて天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を指す場合、「アミノ酸配列」という用語、および「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」のような類似用語は、上記アミノ酸配列を、記載されたタンパク質分子に関連する、完全長で天然のアミノ酸配列に限定するものではない。
【００２３】
本明細書に使われている「ペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸がペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合を介して結合したポリマーを指す。本明細書で使われている「ジペプチド」という用語は、２つのアミノ酸がペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合を介して結合したポリマーを指す。
【００２４】
「野生型」という用語は、天然起源のソースから分離されたときに、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を持った遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、個体群の中で最も頻繁に見られるものであるため、遺伝子の「正常型」または「野生型」として示される。反対に、「改変体（modified）」、「変異体（mutant）」、「変異体（variant）」という用語は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較して、配列およびまたは機能特性（すなわち改変された特徴）における改変を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。なお、天然起源の突然変異体を単離したものであってもよい。これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子生成物と比べた際に改変した特徴があるという事実から同定される。
【００２５】
本明細書で使われる「フラグメント」という用語は、天然タンパク質と比べて、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が全長ｃＣＮＡ配列から演繹したアミノ酸配列における対応ポジションと同一のものであるポリペプチドを指す。フラグメントは、典型的には少なくとも４アミノ酸の長さを有し、好ましくは少なくとも２０アミノ酸の長さを有し、典型的には少なくとも５０アミノ酸またはそれ以上の長さを有し、上記ポリペプチドの組成と上記ポリペプチドの種々のリガンドおよび／または基質とが分子内結合をするうえで必要な上記ポリペプチドの部分に及ぶ。
【００２６】
本明細書で使われる「精製された」または「精製」はサンプルから夾雑物を除去することを意味する。例えば、抗原は夾雑タンパク質を除去することによって精製される。夾雑物の除去により、上記サンプルにおける抗原（例えば、本発明の抗原）の割合が増加する。
【００２７】
「変異体（variant）」という用語は、「変異体（mutant）」という用語と置き換えて使ってもよい。変異体という用語は、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列のそれぞれにおける１か所またはそれ以上の位置での挿入、置換、トランスバージョン、トランケーション、および／または反転を含む。「変異型ポリペプチド」、「ポリペプチド」、「変異体」および「変異体酵素」という表現は、天然Ｘｃｌ１のアミノ酸配列から改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド／タンパク質を意味する。上記変異型ポリペプチドは、Ｘｃｌ１との配列同一性を一定の割合、例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％有するポリペプチドを含む。
【００２８】
「変異体核酸」は、本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な配列と相補的な配列を含む。例えば、変異体配列は、例えば５０℃、０．２ＳＳＣのようなストリンジェント条件下で（１×  ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７・０）、本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な配列と相補的な配列である。より具体的には、「変異型」という用語は、例えば６５℃および０．１×  ＳＳＣのような高いストリンジェント条件下で、本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な配列と相補的な配列を包含する。変異体核酸の融点（Ｔｍ）は野生型核酸のＴｍよりも約１、２、または３℃低い。上記変異体核酸は、Ｘｃｌ１をコードする、または本発明に係るホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸との配列同一性を一定の割合、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％有するポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
本明細書で使われている「ホモ二量体タンパク質」という用語は、２本の個別かつ同一のアミノ酸鎖、または水素結合、イオン性（荷電した）相互作用、実在の共有ジスルフィド結合、もしくはこれらの相互作用の組合せによって単一の二量体タンパク質として結合されたサブユニットを含むタンパク質を指す。
【００３０】
本明細書で使われている「二量体化モチーフ」は、抗原性ユニットと標的ユニットとの間のアミノ酸配列であり、二量体化に寄与する、ヒンジ領域および任意の第２ドメインを含む。この第２ドメインは免疫グロブリンドメインであってよく、上記ヒンジ領域と上記第２ドメインは、任意的にリンカーによって結合される。したがって、二量体化モチーフは抗原性ユニットと標的ユニットとを結合する役割を果たすだけでなく、２つの単量体タンパク質を本発明に係るホモ二量体タンパク質へと二量体化することを促進するヒンジ領域を含む。
【００３１】
本明細書で使われる「標的ユニット」は標的細胞（クロスプレゼンテーションを行う樹状細胞など）に対して、タンパク質とその抗原を送達するユニットを指す。
【００３２】
「ヒンジ領域」という用語は鎖間共有結合（例えばジスルフィド架橋）の形成などを通じて二量体化を促進するホモ二量体タンパク質のペプチド配列を指す。ヒンジ領域はＩｇＧ３といった、Ｉｇのヒンジエキソンｈ１＋ｈ４のように、Ｉｇ由来であってもよい。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質（ワクチボディ）および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【００３３】
樹状細胞（ＤＣ）は解剖学的部位の異なる場所で免疫センチネルの機能を発揮する。非リンパ系組織（ＮＬＴ）の実質組織に常在するＤＣは、間質性ＤＣ（ｉｎｔ−ＤＣ）と呼ばれる。これらのＤＣは組織抗原を流入領域リンパ節（ＬＮ）に輸送し、この場合のＤＣは遊走性ＤＣ（ｍｉｇ−ＤＣ）と呼ばれる。マウスの皮膚において、ＤＣは表皮のランゲルハンス細胞（ＬＣ）と真皮ＤＣの３つの主要サブセット（ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ２４  ＤＣ、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ２４＋ＣＤ１０３２  ＤＣ、およびＣＤ１１ｂＣＤ２４＋ＣＤ１０３＋  ＤＣ（１））を構成する。上記３つの主要サブセットはこれ以降ＣＤ１１ｂ＋  ＤＣ、ＣＤ１０３  ＤＣ、およびＣＤ１０３＋  ＤＣ（表Ｉ）とする。ＬＣおよびすべての真皮ＤＣサブセットが皮膚から皮膚ＬＮ（ＣＬＮ）恒常的に遊走するとしても、上記ＤＣ１０３＋  ＤＣは上記ＣＬＮ内のＣＤ８Ｔ細胞に対してケラチノサイト由来Ａｇを提示するもっとも強力なサブセットとして目立っている（１）。この能力は、クロスプレゼンテーションを行うためのリンパ系組織（ＬＴ）常在性ＣＤ８ａ＋  ＤＣの高い効率性を連想させる。ＤＣ１０３＋  ｉｎｔ−ＤＣはまた、肺や腸のような他の解剖学的部位でも見ることができる。ＣＤ１０３＋  ｉｎｔ−ＤＣおよびＬＴ常在性ＣＤ８ａ＋  ＤＣの発達は、転写因子の共通セットに選択的に依存する（２、３）。したがって、これらマウスのＤＣ集団はＣＤ８ａ＋−タイプＤＣに特有のカテゴリーに属してもよい（１）。
【００３４】
ＣＤ８ａ＋−タイプＤＣは、ヒトおよびヒツジに存在しており、その同定は、ＣＤ８ａ＋−タイプＤＣによる、マウスの脾臓のＣＤ８ａ＋ＤＣと共通する特有の転写フィンガープリントの発現（４、５）、およびＣＤ８ａ＋−タイプＤＣの、ＡＧのクロスプレゼンテーションの効率性（５−９）に基づいて行われた。ＤＣには、組織や種に関係なく、単球由来炎症性ＤＣ、ＬＣ、形質細胞様ＤＣ、ＣＤ１１ｂ+-タイプＤＣ、およびＣＤ８ａ＋−タイプＤＣを主要５つのサブセットとする世界共通の分類が公表されている（１）。ケモカイン受容体ＸＣＲ１は特に、マウスの脾臓、ヒトの血液、およびヒツジのリンパ内のＣＤ８ａ＋−タイプＤＣによって発現する（４−７、１０）。Ｘｃｒ１の機能は、Ｒ．Ｋｒｏｃｚｅｋ（１０）のグループによって最初に明らかになった。Ｒ．Ｋｒｏｃｚｅｋは、抗ＣＤ２０５抗体に結合させたＯＶＡまたはＯＶＡを発現させる同種異形の前駆Ｂ細胞のいずれかをｉｎ  ｖｉｖｏで投与する実験モデルにおいて、ＣＤ８+Ｔ細胞のクロスプライミングは、ＣＤ８+Ｔ細胞がＸｃｒ１のリガンドＸＣＬ１を分泌できる能力に左右されるということを示した。ＣＤ８ａ＋  ＤＣにおけるＸｃｒ１の発現もまた、リステリア菌の感染の際のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を最適に誘導させるために重要であることが分かった（６）。
【００３５】
融合タンパク質ワクチンの例として、例えば国際公開第２００４／０７６４８９号、ＵＳ２００７０２９８０５１、ＥＰ９２０５２２、Fredriksen AB et al. (Mol Ther 2006; 13: 776-85)、およびFredriksen AB and Bogen B (Blood 2007; 110: 1797-805)が挙げられる。本明細書はこれら各文献内容の全体を参照により含む。本発明の実施形態は、Ｘｃｒ１を標的としたＸｃｌ１ケモカインまたはＸｃｌ２ケモカインを含む遺伝子組換え融合タンパク質（すなわちワクチボディ）を提供する。本発明の実施形態のワクチボディは、抗原に対する免疫応答、具体的にはＣＤ８+Ｔ細胞応答を高めるという利点がある。
【００３６】
多くの研究において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を抗原の標的とした場合、免疫応答を高めるということが示されてきた。しかし、すべてのＡＰＣがＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する能力を有するわけではない。最近の公表では、Ｘｃｒ１はＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する能力をもつ、クロスプレゼンテーションを行うＤＣにのみ発現することが示唆されている。クロスプレゼンテーションを行うＤＣへ抗原をターゲティングする（例えばＤＥＣ２０５に向けたターゲティング）ために他のターゲティング方法が追求される一方で、これらの受容体はしばしばＡＰＣの他の集団にも同様に発現する。したがって、Ｘｃｌ１またはＸｃｌ２を介したターゲティングは特異性の高いターゲティングアプローチを確実なものにする。
【００３７】
したがって、本発明の実施形態は免疫グロブリンおよび／または免疫原と融合させたヒトまたはマウスのＸｃｌ１もしくはＸｃｌ２を含む融合タンパク質を提供する。Ｘｃｌ１およびＸｃｌ２は受容体Ｘｃｒ１へ融合ポリペプチドをターゲティングする。Ｘｃｌ１はＧｅｎｂａｎｋにて、受託番号ＮＭ＿００２９９５（ヒト核酸）およびＮＭ＿００８５１０（マウス核酸）で記載されている。本発明の実施形態はさらに、Ｘｃｌ１の変異体、相同体、模倣物を活用する（詳細は以下に記載）。
【００３８】
ヒトおよびマウスＸｃｌ１ポリペプチドの配列は、ＶＧＴＥＶＬＥＥＳＳＣＶＮＬＱＴＱＲＬＰＶＱＫＩＫＴＹＩＩＷＥＧＡＭＲＡＶＩＦＶＴＫＲＧＬＫＩＣＡＤＰＥＡＫＷＶＫＡＡＩＫＴＶＤＧＲＡＳＴＲＫＮＭＡＥＴＶＰＴＧＡＱＲＳＴＳＴＡＩＴＬＴＧ（配列番号：１；マウス）、ＶＧＳＥＶＳＤＫＲＴＣＶＳＬＴＴＱＲＬＰＶＳＲＩＫＴＹＴＩＴＥＧＳＬＲＡＶＩＦＩＴＫＲＧＬＫＶＣＡＤＰＱＡＴＷＶＲＤＶＶＲＳＭＤＲＫＳＮＴＲＮＮＭＩＱＴＫＰＴＧＴＱＱＳＴＮＴＡＶＴＬＴＧ（配列番号：２；ヒト）と記載されている。ヒトＸｃｌ２のアミノ酸配列はＶＧＳＥＶＳＨＲＲＴＣＶＳＬＴＴＱＲＬＰＶＳＲＩＫＴＹＴＩＴＥＧＳＬＲＡＶＩＦＩＴＫＲＧＬＫＶＣＡＤＰＱＡＴＷＶＲＤＶＶＲＳＭＤＲＫＳＮＴＲＮＮＭＩＱＴＫＰＴＧＴＱＱＳＴＮＴＡＶＴＬＴＧ（配列番号：３；ヒト）と記載されており、核酸配列はＡＴＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＡＣＴＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＡＧ(配列番号：４;ヒト)と記載されている。天然Ｘｃｌ２は２１アミノ酸のシグナル配列ＭＲＬＬＩＬＡＬＬＧＩＣＳＬＴＡＹＩＶＥＧ（配列番号：５）で発現している。
【００３９】
本発明の実施形態に係る融合タンパク質の例を図１に示す。幾つかの実施形態においては、上記融合タンパク質は、標的ユニットとしてＸｃｌ１（Ｘｃｌ２とＸｃｌ１とを置換してもよい）、ヒトＩｇＧ３二量体ドメイン（ｈＣＨ３）、および抗原からなるがそれに限定されない抗原性ユニット、とを含む。二量体化によって、標的ユニット（Ｘｃｌ１またはＸｃｌ２）および抗原の双方の点から、ワクチン分子は二価になる。本発明は特定の機構に限定されない。実際、本発明を実施するにあたって上記特定の機構の理解は必要としない。それでもなお、クロスプレゼンテーションを行うＤＣ上のＸｃｒ１への、ワクチボディのターゲティングはＭＨＣ−Ｉ上のウイルスペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞への提示を誘導すると考えられている。後者は、活性化すると、ウイルス感染細胞または同様のペプチド／ＭＨＣ複合体を提示するその他の標的細胞を死滅させることができる。
【００４０】
本発明の実施形態の展開過程において行われた実験は、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）を抗原性ユニットとして使った非標的ワクチボディと比較して試験した際に、Ｘｃｌ１／Ｘｃｌ２を標的としたワクチボディはＤＮＡワクチンとしてより良い効能があることを立証した。Ｘｃｌ１／Ｘｃｌ２を標的としたワクチボディは、致命的なインフルエンザ感染に対して、より強いＩｇＧ２ａ抗体応答と、より良好なマウスの防護とを誘導した（実施例１および図４−６などを参照）。
【００４１】
本明細書に記載の実験においては、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙおよびインフルエンザウイルスからのウイルス性抗原血球凝集素（ＨＡ）とを組み合わせた標的ユニットとしてのＸｃｌ１を含むワクチボディコンストラクトを生成した。初めに、Ｘｃｌ１-ｍＣｈｅｒｒｙワクチボディを評価した。リンパ節または皮膚のいずれかによって強化されたＤＣ上において結合が分析された。Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙは、いずれもＭＨＣ−Ｉ上に抗原（図２−３）のクロスプレゼンテーションを行うとして知られる、ＣＤ８＋常在性ＤＣおよびＣＤ１０３＋遊走性ＤＣに対してのみ結合することが認められた。ワクチン設定においてＸｃｌ１ターゲティングの効果を測定するために、我々はＸｃｌ１−ＨＡワクチボディをマウスに投与し、続いて血清サンプルを回収し、ＩｇＧレベルを測定した。Ｘｃｌ１−ＨＡは強力で持続的なＩｇＧ２ａ応答を誘導した。次に、インフルエンザウイルスによる致命的な感染からマウスを保護するＸｃｌ１−ＨＡの能力を測定した。Ｘｃｌ１−ＨＡによって免疫されたマウスは、ＤＮＡ２５μgの一度の投与後のウイルスから完全に保護された。我々は、タイトレーションにより、マウスを免疫化するために使われるＤＮＡの量を４．１６μｇにまで減少させてもマウスはウイルスから完全に保護されることを突き止めた。このことは、Ｘｃｌ１/Ｘｃｌ２へのターゲティングは、防護的な免疫応答を誘導させる強力な方法を提供することを示す。
【００４２】
本発明に係る融合タンパク質ワクチン（すなわちワクチボディ)は、遺伝子組換え型Ｉｇベースのホモ二量体ワクチンであってもよく、各鎖は、ＩｇヒンジおよびＣＨ３に直接付着した標的ユニットから構成されており、これらの組合せが共有結合したホモ二量体化を誘導する。
【００４３】
Ｘｃｌ１／Ｘｃｌ２ポリペプチドならびにその変異体、および異なる抗体ユニットを含む融合タンパク質は、機能性タンパク質として構築され、発現することが好ましい。特に、本発明は、融合ワクチンにおけるＸｃｌ１／Ｘｃｌ２およびそれらの天然イソフォームを活用し、抗原提示細胞へ抗原送達をターゲティングすることに関する。特に好ましい実施形態において、抗原提示細胞はクロスプレゼンテーションを行う樹状細胞またはＸｃｒ１を提示するその他のＡＰＣである。本発明には、プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＸｃｌ１／Ｘｃｌ２受容体（Ｘｃｒ１）へ抗原送達をターゲティングする融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチンが含まれる。好ましい実施形態において、クロスプレゼンテーションを行うＤＣ上のＸｃｒ１への、ワクチボディのターゲティングはＭＨＣ−Ｉ上のウイルスペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞への提示を誘導すると考えられている。後者は、活性化すると、同様のペプチド／ＭＨＣ複合体を提示するウイルス感染細胞を死滅させることができる。
【００４４】
本発明に係る遺伝子組換え型タンパク質は、がんワクチンのような、ワクチンに有用なヒト抗体様分子であってもよい。ワクチボディとも呼ばれるこれらの分子は、ＡＰＣを結合させ、Ｔ細胞免疫応答及びＢ細胞免疫応答の双方を誘起する。さらに、ワクチボディは二価でＡＰＣに結合し、強い免疫応答の誘導をより効率的に促進すると考えられている。ワクチボディは、ＡＰＣの表面分子に特異性を示す標的ユニットからなる単量体ユニットの二量体であって、ヒンジ領域およびＣγ３ドメイン（後者はＣＯＯＨ末端またはＮＨ２末端部に存在する）のような二量体化モチーフを介して、抗原性ユニットに接続されていることが好ましい。本発明はまた、（ｉ）この遺伝子組換え型タンパク質のＤＮＡ配列をコードすること、（ｉｉ）これらのＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび上記発現ベクターを含む細胞株、（ｉｉｉ）ワクチボディＤＮＡ、ワクチボディＲＮＡまたはワクチボディタンパク質による免疫化を優先させた哺乳動物の治療、そして最後に（ｉｖ）そのような分子を含む医薬品およびキット、に関する。
【００４５】
本発明に係るタンパク質の二量体化モチーフは、ヒンジ領域および免疫グロブリンドメイン（例えばＣγ３ドメイン）例えばカルボキシ末端Ｃドメイン（ＣＨ３ドメイン）、または上記Ｃドメインに対して実質的に相同する配列、を含んで構築されてもよい。上記ヒンジ領域はＩｇ由来であってもよい。上記ヒンジ領域はジスルフィド架橋のような鎖間共有結合を形成することによって二量体化に寄与する。さらに、上記ヒンジ領域は２つの標的ユニットを、様々な距離を有して発現したＡＰＣ上の２つの標的分子に同時に結合することを可能にしながら、ドメイン間の柔軟なスペーサーとして機能する。免疫グロブリンドメインは、疎水性相互作用のような非共有相互作用を通じてホモ二量体化に寄与する。好ましい実施形態において、上記ＣＨ３ドメインはＩｇＧ由来である。これらの二量体化モチーフは他の多量体化部分（他のＩｇアイソタイプ／サブクラスからなど）と交換されてもよい。上記二量体化モチーフは、ヒトＩｇＧのような、天然ヒトタンパク質由来であることが好ましい。上記二量化体モチーフは、抗原性ユニットおよび標的ユニットに対して、どのような配向性を有していてもよいと理解されるべきである。一実施形態において、上記抗原性ユニットは、上記二量体化モチーフのＮ終端に上記標的ユニットが存在する状態で、上記二量体化モチーフのＣＯＯＨ終端に存在する。他の実施形態において、上記抗原性ユニットは、上記二量体化モチーフのＣＯＯＨ終端に上記標的ユニットが存在する状態で、上記二量体化モチーフのＮ終端に存在する。
【００４６】
本明細書に参照され含まれている国際出願第２００４／０７６４８９は、核酸配列とベクターを開示しており、これらは本発明の内容に応じて使われてもよい。
【００４７】
本発明に係るタンパク質は、どのような起源のポリペプチドに対しても免疫応答を誘導するのに適している。特異的エピトープを含み、十分な長さを持つ抗原配列であればどのようなものでも本発明に係るタンパク質の抗原性ユニットとして使ってもよい。したがって、幾つかの実施形態において、上記抗原性ユニットは、そのような抗原性ユニットをコードする核酸配列において少なくとも約２７のヌクレオチドに相当する、少なくとも９アミノ酸の配列を含む。そのような抗原配列は、がんタンパク質由来、または感染因子由来であってもよい。そのようながん配列の例としては、テロメラーゼ、より具体的にはｈＴＥＲＴ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ＴＲＰ−２メラノーマ抗原、前立腺特異抗原、およびイディオタイプが挙げられる。上記感染因子は、結核抗原およびブルセラ病からのＯＭＰ３１のようなバクテリア起源、またはウイルス起源、より具体的にはｇｐ１２０由来の配列のようなＨＩＶ由来の配列、ＨＳＶ−２からの糖たんぱく質Ｄ、および血球凝集素、核タンパク質、並びにＭ２のようなインフルエンザウイルス抗原であってよい。そのような配列のワクチボディのフォーマットへの挿入は、免疫応答の両アームの活性化につながるかもしれない。または、上記抗原性ユニットは抗体またはそのフラグメント（例えばＢ細胞リンパ腫または多発性骨髄腫を患った患者の骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞（骨髄腫／リンパ腫Ｍ成分とも呼ばれる）から製造されたモノクローナルＩｇ由来のＣ末端ｓｃＦｖ）であってもよい。
【００４８】
本発明に係る上記ワクチボディタンパク質、ワクチボディＤＮＡ、またはワクチボディＲＮＡは、例えば、次に続く電気穿孔ありもしくはなしでの筋肉注射または皮下注射によって、対象の免疫化のために使うことができる。
【００４９】
本発明に係るタンパク質の標的ユニットは、ケモカイン受容体への結合を通じて、タンパク質をＡＰＣへターゲティングする。特に好ましい実施形態において、上記ケモカイン受容体はＸｃｒ１である。
【００５０】
本発明に係る融合タンパク質の様々なユニットは、標準的な分子生物的手法、および適切な宿主細胞（ＮＳ０細胞、２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＣＯＳ−７細胞など）にトランスフェクトされたＤＮＡを介して、操作可能に連結されてもよい。トランスフェクタントは遺伝子組換え型タンパク質を産生、分泌する。
【００５１】
本発明はさらに、上記にて説明した遺伝子組換えに基づいたタンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列、または本発明に係る発現ベクターを含む医薬品に関する。上記医薬品はさらに、薬学的に適合性を有するキャリアを適宜含む。適切なキャリア及びそのような医薬品の調剤については、当業者に周知のものである。適切なキャリアの例として、一般的なリン酸緩衝食塩水、水、乳剤（油／水乳剤等）、湿潤剤、無菌液などが挙げられる。上記医薬品は経口投与または非経口投与されてもよい。非経口投与の方法は、局所的投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、骨髄内投与、髄腔内投与、心室投与、静脈内投与、腹腔内投与、または鼻腔内投与を含む。適切な投与量はかかりつけの医者によって決定され、異なる要因（患者の年齢、性別、体重、投与の種類など）に依存する。さらに、本発明は、免疫学的に有効な量の核酸を含む、がんまたは感染性の疾病に対するワクチン成分であって、上記核酸は本発明の分子をコードする、もしくはその変異体を変性するものであり、上記成分はＴ細胞免疫応答およびＢ細胞免疫応答の双方を誘起することができる、ワクチン成分に関する。
【００５２】
本発明はまた、診療用、医療用、科学目的のワクチボディＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含むキットに関する。
【００５３】
本発明はさらに、本発明に係る分子を含むベクターを細胞群にトランスフェクトする工程と、上記細胞群を培養する工程と、上記細胞群から発現した遺伝子組換え型タンパク質を回収する工程と、上記発現したタンパク質を精製する工程と、を含んだ、本発明に係る遺伝子組換え型分子の作成方法に関する。
【００５４】
上記で説明したヌクレオチド配列は、遺伝子治療に適したベクター（特定のプロモーターの制御下におかれ、細胞に導入されたベクター）に挿入されることが好ましい。好まし実施形態において、上記ＤＮＡ配列を含む上記ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである。レトロウイルスは特に好ましい。適切なレトロウイルスの例としては、ＭｏＭｕＬＶまたはＨａＭｕＳＶが挙げられる。遺伝子治療の目的で、本発明に係るＤＮＡ／ＲＮＡ配列はまた、コロイド状分散体の形態で標的細胞に輸送することができる。上記コロイド状分散体は、例えば、リポソームやリポプレックスを含む。
【００５５】
本発明はまた、ポリペプチド、または本明細書に規定されたアミノ酸配列もしくは本明細書に規定された特異的性質を有するポリペプチドと一定の配列同一性または配列相同性を有するポリペプチド内のドメインもしくはモチーフの使用も包含する。特に本発明は、Ｘｃｌ１／Ｘｃｌ２との配列同一性をある程度有するペプチド、またはその相同体を含む。ここで、「相同体」という用語は対象となるアミノ酸配列または対象となるヌクレオチド配列と配列同一性を有する要素であり、この場合、上記対象とするアミノ酸配列はＸｃｌ１／Ｘｃｌ２のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００５６】
一つの様態において、上記相同アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、機能的活性を維持し、および／またはＸｃｌ１／Ｘｃｌ２ポリペプチドの活性を増加させるポリペプチドを提供および／またはコードしなければならない。
【００５７】
本内容においては、相同性配列は、対象とする配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含むものとする。典型的には、相同体は、対象となるアミノ酸配列と同じ活性部位とその他の機能的配列を含む。相同性はまた類似性という観点で考慮されることもあるが（例えばアミノ酸残基が同様の化学特性／機能を持つことなど）、本発明の内容においては、相同性は配列同一性として表現されることが好ましい。
【００５８】
配列同一性の比較は目視によって行うことができるが、より一般的には、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを使って、互いの相違点をもたらしたかもしれない進化的事象を最もよく反映する２つまたはそれ以上の配列のアラインメントを行う。したがって、これらのアルゴリズムは、同一または同様のアミノ酸のアラインメントには得点を与え、ギャップの挿入、ギャップの拡張、ならびに非類似アミノ酸のアラインメントにはペナルティーを与えるという評価システムの下運用される。上記比較アルゴリズムの評価システムは、ｉ）ギャップが挿入されるたびにペナルティースコアを割り当てること（ギャップペナルティースコア）、ｉｉ）既存のギャップが延長して余分のポジションが発生するたびにペナルティースコアを割り当てること（延長ペナルティースコア）、ｉｉｉ）同一のアミノ酸のアラインメントが行われたときには高得点を割り当てること、およびｉｖ）非同一アミノ酸のアラインメントが行われたときには変数スコアを割り当てること、を含む。多くのアラインメントプログラムはギャップペナルティーの変更が可能である。しかし、配列比較にそのようなソフトウエアを使う際には、デフォルト値を使うことが好ましい。
【００５９】
非同一アミノ酸のアラインメントに対して与えられたスコアは、スコア行列、別名アミノ酸置換行列に基づいて割り当てられる。このような置換行列に提供されたスコアは、進化の間、別のアミノ酸に置換されたアミノ酸の類似性は異なるものであり、置換されるアミノ酸の物理的／化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸で置換された場合の類似度は、疎水性アミノ酸で置換されたときに比べて高いものとなる。したがって、スコア行列は同一のアミノ酸に対しては最も高い得点を割り当て、非同一であるが類似するアミノ酸には低い得点を割り当て、非同一であり類似性のないアミノ酸にはさらに低い得点を割り当てる。もっとも頻繁に使われているスコア行列はＰＡＭ行列(Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992))、ＢＬＯＳＵＭ行列(Henikoff and Henikoff (1992))、およびＧｏｎｎｅｔ行列(Gonnet et al. (1992))である。
【００６０】
そのようなアラインメントを行うための適切なコンピュータプログラムとしては、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ(Invitrogen Corp.)、およびＣｌｕｓｔａｌＶ、ＣｌｕｓｔａｌＷならびにＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム(Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007))が挙げられるが、これらに限定されない。異なるアラインメントツールは、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバから選択することができる。配列アラインメントを行うことができるソフトウエアの別の例としては、ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)が挙げられる。ＢＬＡＳＴは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information)のウェブページから入手できる（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410）。
【００６１】
ソフトウエアがアラインメントを作成すると、類似度の割合（％）と配列同一性の割合（％）の計算が可能となる。ソフトウエアは通常この計算を配列比較の一部として行い、数値結果を算出する。
【００６２】
一実施形態においては、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアを使って配列アラインメントを行うことが好ましい。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアラインメントについては、以下のパラメータを用いてペアワイズアラインメントを行うことが好ましい。
【００６３】
【表１】
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ＣｌｕｓｔａｌＷ２は、例えば欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute)のウェブサイトから入手できる(EMBL-EBIウェブページ-tools-sequence analysis-ClustalW2)。
【００６４】
別の実施形態においては、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ(Invitrogen)のＡｌｉｇｎ  Ｘプログラムを使って配列アラインメントを行うことが好ましい。一実施形態においては、Ｅｘｐ１０をデフォルト設定として用いてもよい。
【００６５】
ギャップオープンペナルティー：１０
ギャップ延長ペナルティー：０．０５
ギャップ分離ペナルティー範囲：８
スコア行列：ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２
このように、本発明は、タンパク質、ポリペプチド、本明細書に規定するモチーフまたはドメイン、特にＸｃｌ１／Ｘｃｌ２のアミノ酸配列の変異体、相同体、誘導体の使用をも含む。
【００６６】
とりわけＸｃｌ１／Ｘｃｌ２の変異体、相同体および誘導体の配列はまた、アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換があってもよい。これらにより静的異変が生じるが、機能的に同等な物質がもたらされる。入念なアミノ酸置換は、物質の二次的な結合活性が維持される限り、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性における類似性、および／または残基の両親媒性に基づき行われる。例えば、負電荷をもつアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸を含み、正電荷を持つアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、同様の疎水性数値を示し非電荷極性頭部基を持つアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【００６７】
本発明は、例えば同種置換（塩基性と塩基性との置換、酸性と酸性との置換、極性と極性との置換など）ような、保存的置換（本明細書で使われている「置換」と「交換」はともに既存のアミノ酸残基と別の残基の相互交換を意味する）を含む。また、残基の１クラスから別のクラスへの置換、または非天然アミノ酸（オルニチン（以降Ｚとする）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降Ｂとする）、ノルロイシンオルニチン（以降Ｏとする）、pyriylalanine、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、およびフェニルグリシンなど）の含有が関連する置換、といった、非保存的置換も含む。
【００６８】
起こり得る保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸群（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸群、（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸群（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸群（グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ヒドロキシル基を有するアミノ酸群（セリン、トレオニン）、大型アミノ酸群（フェニルアラニンおよびトリプトファン）、および小型アミノ酸群（グリシン、アラニン）の中で行われる。
【００６９】
交換もまた、非天然アミノ酸によって行われてもよい。上記非天然アミノ酸としては、アルファ＊およびアルファ二置換型＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハライド誘導体（トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルフォン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊など）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体（４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊など）が含まれる。「＊」という表記は、上記説明（相同性置換または非保存的置換に関連する）の目的で使用しており、誘導体の疎水性を示す。「＃」という表記は誘導体の親水性を示すために使用している。「＃＊」という表記は両親媒性を示す。
【００７０】
変異型アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基、またはプロピル基のようなアルキル基を含む配列を有する任意の２つのアミノ酸残基の間に適切なスペーサー基を含んでもよい。１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がペプトイド形態で存在する、さらなる変異形態については、当業者に十分に理解されるであろう。疑義を避けるために、上記「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基が、α−炭素ではなく、アミノ酸残基の窒素原子上に存在する、変異型アミノ酸残基を指すために用いている。ペプチドをペプトイド形態で作成する工程は、例えばSimon RJ et al. (1992)、Horwell DC (1995)のように、知られている技術である。
【００７１】
一実施形態において、本発明に係るホモ二量体タンパク質内で用いられている変異体標的ユニットは、Ｘｃｌ１／Ｘｃｌ２の配列を持ち、Ｘｃｌ１／Ｘｃｌ２の配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、すくなくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を持つ変異体である。一態様において、本発明で用いられているタンパク質または配列は精製されていることが好ましい。「変異体」はタンパク質、ポリペプチド、ユニット、モチーフ、ドメインまたは核酸を指す。
【００７２】
（実験）
以下の実施例は本発明の幾つかの好ましい実施形態および様態を立証し、さらに説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。
〔実施例１〕
材料および方法
細胞株、ウイルス、および抗体
ＨＥＫ２９３Ｅ株を用いて、ＨＡ−ワクチボディの発現と、Ｘｃｒ１−ｅＧＦＰのトランスフェクトを行った。Ｘｃｌ１に対する抗体はLifespan Biosciences社（Ｃ−１６２４１）から取得し、抗体α−ＨＡ（Ｈ−３６−４−５２）、α−ヒトＩｇＧ３（ＨＰ−６０１７）およびα−ｍＣｈｅｒｒｙを実験室で精製した。ＥＬＩＳＡに用いるための血清免疫グロブリンは、α−マウスＩｇＧ１−ｂｉｏ（BH Pharmingen社、クローン１０．９）、α−マウスＩｇＧ２ａ−ｂｉｏ（BD Pharmingen社、クローン８．３）、α−マウスＩｇＧ２ｂ−ｂｉｏ（BD Pharmingen社、クローンＲ１２−３）を用いた。インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）はNorwegian Institute of Public Healthから取得した。
【００７３】
Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙワクチボディの精製
Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＸｃｌ１（Ｃ１１Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙＤＮＡ４０μｇを含むＰＢＳ内で、２×１０７ＮＳ０細胞を電気穿孔して安定発現株を生成した。上記細胞を新鮮なＲＰＭＩ培地に移し、Ｔ−２５フラスコ内に入れ、セレクションを行わずに３７℃で２４時間静置して回復させた。翌日、最終濃度８００μｇ／ｍｌになるようＧ４１８を添加し、細胞を１ウェルあたり５×１０４の密度で９６ウェルプレートに播種した。安定的にトランスフェクトされた細胞が２〜３週間後に得られた。続いて、得られた安定発現株をローラーボトルで増殖させ、５日後に上清を回収し、Ａｋｔａｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓ（GE Healthcare社）に接続したα−ｍＣｈｅｒｒｙカラムに導入した。結合ワクチボディをＰＢＳで洗浄し、ｐＨ１０．５の０．１Ｍグリシン−Ｈｃｌに溶出させ、直ちにＰＢＳ透析した。
【００７４】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート(Coastar社)を不活化されたＰＲ８インフルエンザウイルス（Supplier)２μｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩（ＯＮ）インキュベートした。その後上記プレートをウェルあたり１５０μｌのブロッキングバッファ（アジ化ナトリウム０．０２％（ｗ/ｖ）含有ＰＢＳが１％（ｗ/ｖ）のＢＳＡを含んだもの）で、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。上記プレートの洗浄後、血清サンプルを１：５０の割合で希釈し、続いてＥＬＩＳＡバッファ（アジ化ナトリウム０．０２％（ｗ/ｖ）含有ＰＢＳが０．１％（ｗ/ｖ）のＢＳＡを含んだもの）で１：３の割合で段階希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを血清サンプルとともに４℃で一晩培養した。次に、プレートを洗浄し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３に特異的なビオチン化抗体（BP Pharmingen社）１μｇ／ｍｌを用いて、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、上記プレートをストレプトアビジン−ＡＬＰ（GE Healthcare （ＲＰＮ１２３４Ｖ）、１：３０００）を用いて、室温（ＲＴ）にて４５分インキュベートした。ウェルあたり１００μｌの基質バッファ（リン酸基質１μｇ／ｍｌ（Sigma社、Ｐ４７４４））を添加してＥＬＩＳＡを展開した。３０分後、Ｔｅｃａｎ社のＳｕｎｒｉｓｅでＯＤ４０５が計測された。総血清免疫グロブリンを分析するために、プレートをＡＬＰ結合抗マウスＦｃ(Sigma社)（１：３００）でインキュベートした。抗体力価は、ＮａＣｌを投与されたマウスのＯＤ値の（平均＋５ｘＳＤ）よりも大きいＯＤ値を有する血清サンプルの最も高い希釈度として決定した。
【００７５】
マウス
Ｄｅｌｔａｇｅｎ社作製のＸｃｒ１ｔｍ１Ｄｇｅｎマウス（Ｘｃｒ１−ｂＧａｌ）（６、１０）を、Centre d’Immunologie Marseille-Luminy animal care facilitiesで飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｑ：８マウスはCharles River Laboratories（フランス）から購入した。研究は、動物保護および使用に関する制度規則に則って行った。
【００７６】
ＤＣ分離および分類方法
酵素消化、機械的な破壊、および濃度勾配濃縮（１１）の組合せによって各種器官のＤＣを分離した。ＣＬＮ  ＤＣの分類は先の説明のとおりに行った（１２）。
【００７７】
Ａｂおよびフローサイトメトリー
Ａｂの多くはeBioscience社かBD Biosciences社から購入した。ｍｉｇ−ＤＣの同定は、上記ｍｉｇ−ＤＣがＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩを発現するときの特定パターンに基づいて行った。ヤギ抗ニワトリＩｇＧで明らかにされたニワトリ抗ＳｙｎＣＡＭ/ＴＳＬＣ１  Ａｂ（クローン３．Ｅ．１）を用いてＣＡＤＭ１染色を行った。ｂ−ガラクトシダーゼ（ｂＧａｌ）の蛍光性基質としてフルオレセインｄｉ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて、ＸＣＲ１の発現を検出した（６）。ＣＬＮにおいても、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙと共有結合した遺伝子組換え型マウスＸＣＬ１を用いて、ＸＣＲ１の発現を検出した。
【００７８】
結果
高レベルのＸＣＲ１が、皮膚のＣＤ１０３＋ｉｎｔ−ＤＣおよびＣＬＮのＣＤ１０３＋ｍｉｇ−ＤＣに選択的に発現した。
【００７９】
皮膚およびＣＬＮでＸＣＲ１を発現しているのはどのＤＣサブセットかを調査するために、我々は、ＸＣＲ１のかわりにｂ−ガラクトシダーゼ（ｂＧａｌ）を発現する、レポーター変異体マウスモデルを開発した。皮膚において、ｉｎｔ−ＤＣサブセットは、表皮ＬＣと真皮サブセットＣＤ１０３＋  ＤＣ、ＣＤ１０３２  ＤＣ、ＣＤ１１ｂ＋  ＤＣ、およびＣＤ１１ｂＣＤ２４  Ｔ１  ＤＣを包含する（表Ｉ）。皮膚のｉｎｔ−ＤＣでは、ｂＧａｌ活性はＣＤ１０３＋  ＤＣでは高く、ＣＤ１０３  ＤＣでは低く、ＣＤ１１ｂＣＤ２４  ＤＣ、ＣＤ１１ｂ  ＤＣ、およびＬＣにおいては検出されなかった（図２Ａ、２Ｂ）。ＣＬＮにおいては、ＬＴ常在性ＣＤ８ａ＋  ＤＣおよびＤＣ１０３＋ｍｉｇ−ＤＣのみがＸＣＲ１を発現した（図２Ｃ、２Ｅ）。ＣＬＮ細胞染色を行うための蛍光標識された遺伝子組換え型マウスＸＣＬ１を利用することにより、野生型マウスからのＬＴ常在性ＣＤ８ａ＋  ＤＣおよびＣＤ１０３＋ｍｉｇ−ＤＣにおいて、強力かつ非常に特異的なシグナルを発した（図２Ｄ）。これらのデータにより、タンパク質ＸＣＲ１はＬＴ常在性ＣＤ８ａ＋  ＤＣおよびＣＤ１０３＋ｍｉｇ−ＤＣに特異的に発現することが確認され、またｂＧａｌ活性がＸＣＲ１の発現の忠実なレポーターとして使用されることが実証された。したがって、皮膚及びＣＬＮにおいて、高レベルのＸＣＲ１はＣＤ８ａ＋−ｔｙｐｅ  ＤＣに選択的に発現する。
【００８０】
ＸＣＲ１の発現は内臓器官およびその流入領域ＬＮにおけるＣＤ８ａ＋−タイプ  ＤＣを定義する
次に我々は、異なる組織に常在するＤＣにおけるＸＣＲ１の発現を分析した。皮膚およびＣＬＮと同様、肝臓、肺、小腸において、３つの主要集団をそれぞれＣＤ１１ｂ＋  ＤＣ、ＣＤ１０３＋  ＤＣ、およびＣＤ１０３  ＤＣとして定義した（表Ｉ）。これらの器官において、ＸＣＲ１の発現は、皮膚において観察されたように、ＣＤ１０３＋ｉｎｔ−ＤＣでは高く、ＣＤ１０３  ｉｎｔ−ＤＣでは中程度で、ＣＤ１１ｂ＋  ｉｎｔ−ＤＣでは検出されなかった（図２Ｇ）。腸の腸間膜ＬＮ（ＭＬＮ）および肺の縦隔ＬＮ（ＭｅｄＬＮ）流入領域からのｍｉｇ−ＤＣにおいて、ＸＣＲ１の発現はＣＤ１０３＋サブセットにおいて最も高い状態を維持した（図２Ｈ）。内在性Ｇａｌ活性阻害剤を用いたにもかかわらず腸内の上記ＣＤ１０３＋  ｉｎｔ−ＤＣおよびＭｅｄＬＮ内の上記ＣＤ１０３＋  ｍｉｇ−ＤＣは、野生型マウスにおいて、相当レベルのｂＧａｌ活性を示した。しかし、そのバックグラウンドシグナル以上の明確な増加は、ＸＣＲ１−ｂＧａｌマウスから分離させた対応するサブセットにおいて検出されるかもしれない。ＬＴ常在性ＤＣの中では、ＸＣＲ１の発現は、ＣＤ８ａ＋サブセット（図２Ｉ）に制限されていた。
【００８１】
Ｘｃｒ１を発現したＤＣを標的としたワクチボディを作成するため、我々は、Ｘｃｌ１の内在性シグナルペプチドを、ワクチボディ遺伝子コンストラクトに本来含まれていたヒトＩＧｇ３の内在性シグナルペプチドと交換した。モデル抗原として、蛍光体に対する固有の能力によって、また我々の実験室で作成した特定の抗体（図３ａ）を介して検知できるｍＣｈｅｒｒｙを使用した。Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙに加えて、Ｃｙｓ１１をアラニンに変異させたＣ１１Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ変異型Ｘｃｌ１を作製した。Ｃｙｓ４８に加えてＣｙｓ１１は、Ｘｃｌ１において唯一のシステイン架橋の形成にかかわっているため、変異体は機能を欠くと考えられてきた２。上記２つのワクチボディを、α−ｍＣｈｅｒｒｙカラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きさと二量体化を評価した。β−メルカプトエタノールの存在下では、上記２つのワクチボディの大きさは〜６０ｋｄ、非還元の状態においては、上記大きさは〜１４８ｋｄと、精製されたワクチボディは主に二量体から構成されることを示した（図３ｂ）。標的ユニットの大きさが比較的小さいため、我々はまた、α−Ｘｃｌ１が一次抗体として用いられたＥＬＩＳＡアッセイのワクチボディに、Ｘｃｌ１およびＣ１１Ａが存在することも確認した（図３Ｃ）。
【００８２】
Ｘｃｌ１標的ワクチボディが、Ｘｃｒ１を発現するとして知られるＣＤ８α+  ＤＣ集団に結合したかどうかを評価するため、我々は脾臓からＤＣを分離し、分離したＤＣをＸｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＣ１１Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙと共にインキュベートした（図３ｄ）。Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙはＣＤ８＋  ＤＣにのみ結合し、ＣＤ１１ｂ＋  ＤＣには結合しなかった。このことは、上記ワクチボディはＸｃｒ１＋  ＤＣを特異的に標的にするということを示す。この結合がＸｃｒ１に特異的であることを確実にするため、Ｘｃｒ１−／−マウスからＤＣを分離し、Ｘｃｌ１−およびＣ１１Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙで染色した（図３ｅ）。Ｘｃｒｌ-/-マウスのＤＣ集団には結合が認められなかった。このことはＣＤ８α＋  ＤＣへの結合はＸｃｒ１によって仲介されていることを示す。Ｘｃｌ１−ｍＣｈｅｒｒｙとの結合に比べると大幅に少ないが、Ｃ１１Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙワクチボディとの結合がいくらか確認された。これは、システイン１１のアラニンへの変異は、完全に結合を抑制するものではないということを示す。Ｘｃｒ１−／−マウスにおいては上記Ｃ１１Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙの結合が喪失したため、結合はＸｃｒ１に特異的で、非特異的バックグラウンドではないようである。
【００８３】
次に、Ｂａｌｂ/ｃマウスを、Ｘｃｌ１−ＨＡワクチボディをコードするＤＮＡ２５μｇで免疫化した。Ｃ１１Ａ−ＨＡに加えて、追加的なコントロールとして、ＰＲ８ＨＡのみを発現するプラスミドで免疫化したマウス群、ＮａＣｌ０．９％で免疫化したマウス群、ＮＩＰ−ＨＡ（ハプテンＮＩＰに特異的なｓｃＦｖ）で免疫化したマウス群をそれぞれ１群ずつ含んだ。免疫化から１４日後に血清サンプルを回収し、最初にＨＡ特異的血清ＩｇＧ（図４ａ）を分析した。Ｘｃｌ１−ＨＡで免疫化されたマウスにおいて、ＩｇＧが最も強く誘導されていることが認められた。興味深いことに、ＩｇＧサブクラス応答の分析時に、Ｘｃｌ１−ＨＡは主にＩｇＧ２ａを誘導し、しかもこれらのレベルは他のどの群よりも非常に高いものであることを確認した（図４ｂ）。これは標的ワクチボディで免疫化されたマウスと、非標的ワクチボディで免疫化されたマウスで比較したＩｇＧ１のレベルとは対照的なものである（図４ｂ）。経時的な液性応答の観察時、我々はＩｇＧ２ａの力価が免疫化後７〜１０週あたりでピークを示し、続いて約１５週後の安定的レベルに達するまで減少することを確認した（図４ｃ）。ＩｇＧ１については、免疫化後１０週まで非標的ワクチボディ（ＮＩＰ−ＨＡおよびＣ１１Ａ−ＨＡ）にて力価の増加が認められた（図４ｄ）。これは第３週後にＩｇＧ１の力価の増加がまったく認められなかったＸｃｌ１−ＨＡワクチボディと対照的である。
【００８４】
Ｘｃｒｌ発現細胞に対する抗原のターゲティングの効力を評価するために、我々は、Ｘｃｌ１−ＨＡ  ＤＮＡの量を減少させてＢａｌｂ/ｃマウスを免疫化した。免疫化から２週間後に血清サンプルを回収し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ同様、総ＩｇＧを分析した。ＤＮＡ０．４６μｇおよび１．３９μｇで免疫化したマウスでは最小限のＩｇＧ２ａ応答しか確認できなかったのに対し、ＤＮＡ４．１６μｇを投与されたマウスの血清では中程度のＩｇＧ２ａが確認された（図４ｅ）。
クロスプライミングを行うＸｃｒ１＋  ＤＣサブセットへの抗原のターゲティングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導すると考えられてきた。これを試験するために、我々はＸｃｌ１−ＨＡでマウスを免疫化し、免疫化から１４日後に流入領域リンパ節（鼠蹊部および予備（auxiliary））を回収し、ＨＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を確認するために、ＩＹＳＴＶＡＳＳＬペンタマーを用いて分離した細胞を染色した（図５ａ）。Ｘｃｌ１−ＨＡワクチボディとともに得られたＣＤ８＋陽性Ｔ細胞のペンタマーの割合と、非標的コントロール（ＮＩＰ−ＨＡまたはＣ１１Ａ−ＨＡ）から得られたＣＤ８＋陽性Ｔ細胞のペンタマーの割合を比較した際、我々は、ＨＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｘｃｌ１標的ワクチボディに対して非常に高い数値を示すことを確認した(Mann-Whitney)（図５ｂ）。
【００８５】
次に、我々はＸｃｒ１を発現したＤＣに対する抗原のターゲティングによって誘導された免疫応答がインフルエンザ感染からマウスを保護するのに十分かどうかを評価することにした。Ｂａｌｂ/ｃマウスをＤＮＡ２５μｇで免疫化し、免疫化から１４日後に致命量の５倍のインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を感染させた。疾病の進行の徴候として、体重の減少を観察した。Ｘｃｌ１−ＨＡを投与されたマウスは、はじめは体重の減少がみられたがウイルス感染から４日後に回復した（図６ａ)。ＨＡのみ投与されたマウスは防御反応が誘導されず、７日目に実験が終了するまで体重の減少を続けた。コントロールを含め、マウスの個体ごとにウイルス感染から７日目のデータを評価した際、非標的ワクチン（ＨＡ、ＮＩＰ−ＨＡおよびＣ１１Ａ−ＨＡ）を投与されたマウスとＸｃｌ１−ＨＡを投与されたマウスとの比較において体重に大きな違いを認めた（Mann-Whitney)（図６ｂ）。
【００８６】
ＤＮＡワクチン投与技術をより大型の動物に移転する際の一つの潜在的な障害としては、動物の大きさに応じて防御を誘導するために必要なＤＮＡの量が増加するということである。したがって、ワクチンが比較的低濃度で防御を誘導できることが好ましい。Ｘｃｒ１を発現したＣＤ８α＋  ＤＣへのワクチボディのターゲティングの有効性を評価するために、免疫化から２週間後にＰＲ８を感染させる前に、マウスに投与したＤＮＡの量をタイトレーションした。マウスは計４．１６μｇのＸｃｌ１−Ｈａ  ＤＮＡ（図６ｃ）で免疫化されて以降、一貫して防護された。これは、血清ＩｇＧの力価によって決定された、一貫した免疫応答を誘導するために必要なＤＮＡの量と十分に相関するものである（図６ｃ）。
【００８７】
Ｘｃｌ１−ＨＡワクチボディが長期間にわたる保護を誘導する能力があるかどうかを判断するために、我々は、免疫化から２６週間後に、ＰＲ８をマウスに感染させ、体重減少を観察した（図６ｄ）。Ｈｃｌ１−ＨＡで免疫化されたマウスには、初めに体重減少がみられたが、マウス５匹中１匹を除くすべてのマウスが６日目以降回復し始めた。反対に、ＮａＣｌで免疫化されたマウスには継続して体重の減少がみられ、９日目までには６匹中４匹のマウスを安楽死させる必要があった。変異型Ｃｌ１Ａ−ＨＡで免疫化したマウスは、総じてより多くの体重減少がみられたが、感染から６日後回復し始めた。
〔実施例２〕
標的ユニットとしてＸｃｌ２をＸｃｌ１に置換した以外は、上記の説明と同様にワクチボディを産生した。
【００８８】
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に対し、ネズミ科Ｘｃｌ１−ＨＡ（ｍＸｃｌ１）、ヒトＸｃｌ１−ＨＡ（ｈＸｃｌ１）もしくはヒトＸｃｌ１−Ｈａ（ｈＸｃｌ２）ワクチボディをコードするプラスミドを用いて、一過性のトランスフェクトを行った。４８時間後上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってワクチボディの分泌を分析した。これら３つのワクチボディは、すべて効率的に発現、分泌し、ｈＸｃｌ１およびｈＸｃｌ２がｍＸｃｌ１よりも良好に発現した。結果を図８に示す。次に、ｍＸｃｌ１、ｈＸｃｌ１もしくはｈＸｃｌ２−ＨＡワクチボディをコードするＤＮＡ２５μｇでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。免疫化から１４日後に血液サンプルを回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血清の力価が決定された。ｈＸｃｌ１およびｈＸｃｌ２の双方が、ｍＸｃｌ１よりも高いＩｇＧ１応答およびＩｇＧ２応答を誘導した。結果を図９ａおよび図９ｂに示す。その後、ｍＸｃｌ１、ｈＸｃｌ１もしくはｈＸｃｌ２−ＨＡワクチボディをコードするＤＮＡ２５μｇでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、ワクチン投与から１４日後に致死量のインフルエンザウイルスを感染させた。結果を図１０（ａ）に示す。図１０（ａ）は７日間にわたる体重減少の観察結果であり疾病の進行の徴候として用いられる。ＮａＣｌもしくはＨＡのみの投与を受けたマウスは感染により死亡したが、ｍＸｃｌ１、ｈＸｃｌ１もしくはｈＸｃｌ２を投与されたマウスは生き残った。図１０（ｂ）は感染から７日後のすべてのマウスの体重低下を示したものである。
【００８９】
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本明細書は上記の明細書に言及されているすべての出版物および特許を参照により含む。記載されている発明の方法およびシステムに対する種々の変更および変形例は、本発明の範囲および精神から離れることなく当業者にとって明らかなものである。本発明は特定の好ましい実施形態について記載しているが、特許請求を行う発明がそのような特定の好ましい実施形態に不当に限定されるものではないことは理解されるべきである。さらに、発明を行うために記載された様式に対する種々の変更であって、当業者にとって明らかな変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2014534807.tif 000003
【図２】
2014534807.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月26日(2014.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、または３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、抗原性ユニットと、を含む標的ユニットを含む融合ポリペプチドをコードする核酸と、薬学的に許容可能なキャリアと、を含むことを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項２】
上記標的ユニットと、上記抗原性ユニットとが二量体化モチーフを介して結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
上記抗原性ユニットは、抗原性ｓｃＦｖ、細菌性抗原、ウイルス性抗原、およびがん関連抗原もしくはがん特異性抗原からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
上記標的ユニットが配列番号１、２、または３と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
上記標的ユニットが配列番号１、２、または３と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
上記標的ユニットが、配列番号１、２、または３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
上記ポリペプチドが発現後二量体として提供されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
二量体ドメインが、ヒトＩｇＧ３二量体ドメイン（ｈＣＨ３）を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
上記融合ポリペプチドが、クロスプレゼンテーションを行うＤＣ上のＸｃｒ１と結合することを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
上記核酸がプラスミドであることを特徴とする、請求項１から９のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１１】
被験体が上記抗原性ユニットに対して免疫応答を作製する条件下、請求項１から１０のいずれかに１項に記載のＤＮＡワクチンを上記被験体に投与する工程を含む、免疫応答の誘導方法。
【請求項１２】
被験体内に免疫応答を産生するための、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチンの、使用。
【請求項１３】
被験体にワクチン接種を行うための、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチンの、使用。
【請求項１４】
上記被験体がヒトであることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の、使用。
【国際調査報告】
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