(57)【要約】  本発明は、植物において十分発現するよう特に適合させた対象のタンパク質をコードする合成核酸配列を提供する。特許請求する合成配列は、その植物種に天然に存在する遺伝子において平均してほぼ同じ頻度で利用される植物最適化コドンを利用する。本発明は、除草剤耐性、水および／または熱ストレス耐性、健康油修飾用の合成ＤＮＡ配列をさらに含み、形質転換のためにマーカー遺伝子および選択マーカー遺伝子を使用する。合成配列を含有するＤＮＡ構築物およびトランスジェニック植物、農業においてそれらの植物を使用するための方法および組成物を教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ細胞における対象のタンパク質を発現させるための合成ＤＮＡ配列であって、
ａ）対象のタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列、
ｂ）クラスＩおよびクラスＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列
を含み、
クラスＩがＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡ、およびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択され、
クラスＩＩがＡＴＡＴＡＴ、ＴＴＧＴＴＴ、ＴＴＴＴＧＴ、ＴＧＴＴＴＴ、ＴＡＴＡＴＡ、ＴＡＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＡＴＴＴＴＴ、ＴＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＡＴＴ、ＴＡＡＴＡＡ、ＡＴＴＴＡＴ、ＴＡＴＡＴＴ、ＴＴＴＴＡＴ、ＡＴＡＴＴＴ、ＴＡＴＴＡＴ、ＴＧＴＴＴＧ、ＴＴＡＴＡＴ、ＴＧＴＡＡＴ、およびＡＡＡＴＡＡからなる群から選択され、
前記コドン最適化ＤＮＡ配列がクラスＩＩの少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記合成ＤＮＡ配列が前記タンパク質の天然ＤＮＡ配列より少ないクラスＩＩのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記天然ＤＮＡ配列と比較して同数のクラスＩのポリアデニル化シグナル配列を含有する、合成ＤＮＡ配列。
【請求項２】
クラスＩＩのポリアデニル化シグナル配列を実質的に欠く、請求項１に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項３】
クラスＩＩのポリアデニル化シグナル配列を欠く、請求項１に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項４】
殺虫性タンパク質、除草剤耐性タンパク質、ストレス耐性関連タンパク質、および油プロファイル修飾タンパク質からなる群から選択される天然タンパク質をコードする、請求項１に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項５】
殺虫性タンパク質をコードする、請求項４に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項６】
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ１タンパク質をコードする、請求項４に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項７】
ダイズ細胞における対象のタンパク質を発現させるための合成ＤＮＡ配列であって、
ａ）対象のタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列、
ｂ）クラスＩおよびクラスＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列
を含み、
クラスＩがＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡ、およびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択され、
クラスＩＩＩがＡＴＴＴＴＴ、ＴＡＴＴＴＴ、ＴＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＡＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＴ、ＡＡＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＡ、ＡＴＡＴＡＴ、ＴＡＡＴＴＴ、ＴＴＡＡＴＴ、ＡＡＡＴＴＴ、ＡＡＡＴＡＡ、ＡＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＧＴＴ、ＴＴＧＴＴＴ、ＡＴＴＡＴＴ、ＡＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＡＡＴおよびＴＴＴＴＡＡからなる群から選択され、
前記コドン最適化ＤＮＡ配列がクラスＩＩＩの少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記合成ＤＮＡ配列が前記タンパク質の天然ＤＮＡ配列より少ないクラスＩＩＩのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記天然ＤＮＡ配列と比較して同数のクラスＩのポリアデニル化シグナル配列を含有する、合成ＤＮＡ配列。
【請求項８】
クラスＩＩＩのポリアデニル化シグナル配列を実質的に欠く、請求項７に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項９】
クラスＩＩＩのポリアデニル化シグナル配列を欠く、請求項７に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項１０】
殺虫性タンパク質、除草剤耐性タンパク質、ストレス耐性関連タンパク質、および油プロファイル修飾タンパク質からなる群から選択される天然タンパク質をコードする、請求項７に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項１１】
殺虫性タンパク質をコードする、請求項１０に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項１２】
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ１タンパク質をコードする、請求項１０に記載の合成ＤＮＡ配列。
【請求項１３】
配列番号５、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５９、配列番号６５、および配列番号７１からなる群から選択される、合成ＤＮＡ配列。
【請求項１４】
５’非翻訳配列、対象のタンパク質のコード配列、および３’非翻訳領域を含む対象のタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物であって、前記５’非翻訳配列が植物細胞において機能的なプロモーターを含有し、前記コード配列が請求項１に記載の合成ＤＮＡコード配列であり、前記３’非翻訳配列が転写終結配列およびポリアデニル化シグナルを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
５’非翻訳配列、対象のタンパク質のコード配列、および３’非翻訳領域を含む対象のタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物であって、前記５’非翻訳配列が植物細胞において機能的なプロモーターを含有し、前記コード配列が請求項７に記載の合成ＤＮＡコード配列であり、前記３’非翻訳配列が転写終結配列およびポリアデニル化シグナルを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
請求項１に記載の合成ＤＮＡ配列を含有する、トランスジェニック植物。
【請求項１７】
請求項７に記載の合成ＤＮＡ配列を含有する、トランスジェニック植物。
【請求項１８】
穀物または種子中の有害生物を防除する方法であって、請求項５に記載の合成ＤＮＡを含有する植物から前記穀物または種子を得るステップを含む方法。
【請求項１９】
穀物または種子中の有害生物を防除する方法であって、請求項１１に記載の合成ＤＮＡを含有する植物から前記穀物または種子を得るステップを含む方法。
【請求項２０】
穀物または種子中の有害生物を防除する方法であって、請求項５に記載の合成ＤＮＡを含有する植物から前記穀物または種子を得るステップを含む方法。
【請求項２１】
粗挽粉または穀粉中の有害生物を防除する方法であって、請求項５に記載の合成ＤＮＡを含有する穀物から前記粗挽粉または穀粉を得るステップを含む方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載のトランスジェニック植物由来の組成物であって、粗挽粉、穀粉、タンパク質濃縮物、または油からなる群から選択される日用品である組成物。
【請求項２３】
請求項１７に記載のトランスジェニック植物由来の組成物であって、粗挽粉、穀粉、タンパク質濃縮物、または油からなる群から選択される日用品である組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において十分発現するよう特に適合させた対象のタンパク質をコードする合成核酸配列に関するものです。
【背景技術】
【０００２】
トランスジェニック植物において異種タンパク質の望ましい発現レベルを得るため、様々な方法、例えばコドン出現頻度が宿主植物種のコドン出現頻度とより密接に一致するように、および／またはコード配列のＧ＋Ｃ含有量が宿主植物種のコード配列中で典型的に見られるＧ＋Ｃレベルとより密接に一致するように、および／またはｍＲＮＡを不安定化する特定配列が除去されるように、天然、時折野生型または原型と呼ばれるＤＮＡコード配列を改変することは有益であることが分かっている。例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）の植物における昆虫毒素タンパク質結晶の発現は、１つまたは複数のこれらの手法を使用して改善されている。例えば、米国特許第５３８０３０１号、米国特許第５６２５１３６号、米国特許第６２１８１８８号、米国特許第６３４０５９３号、米国特許第６６７３９９０号、米国特許第７７４１１１８号を参照。コドン縮重によって、原型ＤＮＡコード配列中で使用されるコドンと異なるコドンを使用して、対象のタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列を作製することができる。
【０００３】
ｍＲＮＡを不安定化し得る配列の除去に関して、米国特許第７７４１１１８号は１６のポリアデニル化シグナル配列の一覧表を開示し（縦列１５、表ＩＩ）、植物における発現を目的とする合成コード配列中のこのような配列数の低減を要求する。米国特許第７７４１１１８号、表ＩＩ中に列挙されたポリアデニル化シグナル配列は以下の表１中に列挙する：
【０００４】
【表１】
2014515609.tif 000002
【０００５】
米国特許第７７４１１１８号は、それがｍＲＮＡを潜在的に不安定化すると確認されているため、配列ＡＴＴＴＡ（Ｓｈａｗ−Ｋａｍｅｎ配列として知られる）を優先的に除去することも要求する。
【０００６】
米国特許第７７４１１１８号の教示に反して、本発明者らは、前の表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数の減少は、植物における合成遺伝子の高発現を可能にするのに必要でも十分でもないことを見出している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の表２は、トウモロコシ遺伝子において頻繁に出現する２０の潜在的ポリアデニル化シグナル配列を確認する。
【０００８】
【表２】
2014515609.tif 000003
【０００９】
以下の表３は、ダイズ遺伝子において頻繁に出現する２０の潜在的ポリアデニル化シグナル配列を確認する。
【００１０】
【表３】
2014515609.tif 000004
【００１１】
本発明は、トウモロコシ細胞における対象のタンパク質を発現させるための合成ＤＮＡ配列であって、
ａ）対象のタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列、
ｂ）クラスＩおよびクラスＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列
を含み、
クラスＩがＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡ、およびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択され、
クラスＩＩがＡＴＡＴＡＴ、ＴＴＧＴＴＴ、ＴＴＴＴＧＴ、ＴＧＴＴＴＴ、ＴＡＴＡＴＡ、ＴＡＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＡＴＴＴＴＴ、ＴＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＡＴＴ、ＴＡＡＴＡＡ、ＡＴＴＴＡＴ、ＴＡＴＡＴＴ、ＴＴＴＴＡＴ、ＡＴＡＴＴＴ、ＴＡＴＴＡＴ、ＴＧＴＴＴＧ、ＴＴＡＴＡＴ、ＴＧＴＡＡＴ、およびＡＡＡＴＡＡからなる群から選択され、
前記コドン最適化ＤＮＡ配列がクラスＩＩの少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記合成ＤＮＡ配列が前記タンパク質の天然ＤＮＡ配列より少ないクラスＩＩのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記天然ＤＮＡ配列と比較して同数のクラスＩのポリアデニル化シグナル配列を含有する、合成ＤＮＡ配列を提供する。
【００１２】
本発明は、ダイズ細胞における対象のタンパク質を発現させるための合成ＤＮＡ配列であって、
ａ）対象のタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列、
ｂ）クラスＩおよびクラスＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列
を含み、
クラスＩがＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡ、およびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択され、
クラスＩＩＩがＡＴＴＴＴＴ、ＴＡＴＴＴＴ、ＴＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＡＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＴ、ＡＡＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＡ、ＡＴＡＴＡＴ、ＴＡＡＴＴＴ、ＴＴＡＡＴＴ、ＡＡＡＴＴＴ、ＡＡＡＴＡＡ、ＡＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＧＴＴ、ＴＴＧＴＴＴ、ＡＴＴＡＴＴ、ＡＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＡＡＴおよびＴＴＴＴＡＡからなる群から選択され、
前記コドン最適化ＤＮＡ配列がクラスＩＩＩの少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記合成ＤＮＡ配列が前記タンパク質の天然ＤＮＡ配列より少ないクラスＩＩＩのポリアデニル化シグナル配列を含有し、前記天然ＤＮＡ配列と比較して同数のクラスＩのポリアデニル化シグナル配列を含有する、合成ＤＮＡ配列も提供する。
【００１３】
本発明は、対象のタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列を作製する方法であって、（ａ）表２中に列挙した少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列を含む天然配列（複数可）によってコードされる天然に存在するポリペプチド（複数可）由来の対象のタンパク質のアミノ酸配列で開始するステップ、および（ｂ）前記アミノ酸配列をコードし、天然配列（複数可）の対応するコード配列と比較してより少ない、表２中に列挙したポリアデニル化シグナル配列を含有し、同数の表１中に列挙したポリアデニル化シグナル配列を含有する、合成ＤＮＡ配列を作製するステップを含む方法も提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、対象のタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列を作製する方法であって、（ａ）表３中に列挙した少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列を含む天然配列（複数可）によってコードされる天然に存在するポリペプチド（複数可）由来の対象のタンパク質のアミノ酸配列で開始するステップ、および（ｂ）前記アミノ酸配列をコードし、天然配列（複数可）の対応するコード配列と比較してより少ない、表３中に列挙したポリアデニル化シグナル配列を含有し、同数の表１中に列挙したポリアデニル化シグナル配列を含有する、合成ＤＮＡ配列を作製するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、本発明によって提供する合成ＤＮＡ配列は表２および／または表３中に列挙したポリアデニル化シグナル配列を欠き、または表２および／または表３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、表１中で確認した同数のポリアデニル化シグナル配列の維持、および配列内のそれらの元の位置における表１配列の維持と一致させて可能な限り減らす。
【００１６】
幾つかの実施形態では、本発明によって提供する合成ＤＮＡ配列は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に場合によっては由来する殺虫性タンパク質、ならびに除草剤耐性、水および／または熱ストレス耐性、健康油修飾、ならびに形質転換マーカー遺伝子および選択マーカー遺伝子に有用なＤＮＡ配列をコードする。
【００１７】
本発明の合成ＤＮＡ配列は、対象のタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物において使用することができ、この構築物は５’非翻訳配列、本発明の合成ＤＮＡ配列、および３’非翻訳領域を含み、前記５’非翻訳配列は植物において機能するプロモーターを含有し、前記３’非翻訳配列は転写終結およびポリアデニル化シグナルを含む。
【００１８】
本発明は、本発明の合成ＤＮＡ配列を含有するトランスジェニック植物も提供する。
【００１９】
昆虫毒素、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙタンパク質をコードする本発明の合成ＤＮＡ配列を植物において発現させるステップを含む、植物において有害生物を防除する方法も提供する。
【００２０】
知られている除草剤耐性酵素、例えばアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ１）（ＷＯ／２００５／１０７４３７参照）、またはホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、または５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ酵素をコードする本発明の合成ＤＮＡ配列を植物において発現させるステップを含む、植物における除草剤耐性に関する方法も提供する。
【００２１】
植物において油プロファイルを修飾する１つまたは複数の知られている酵素、例えば脂肪酸デサチュラーゼをコードする本発明の１つまたは複数の合成ＤＮＡ配列を植物において発現させるステップを含む、植物において油プロファイルを修飾する方法も提供する。
【００２２】
水および／または熱ストレス、例えばストレス関連タンパク質（ＳＡＰ１）；米国特許公開第２０１０／０２７５３２７、および１−Ｃｙｓペルオキシレドキシン（Ｐｅｒ１）タンパク質（Mowla,et al.,2002,Planta215:716-726）に関する知られているストレス耐性遺伝子をコードする本発明の合成ＤＮＡ配列を植物において発現させるステップを含む、植物におけるストレス耐性に関する方法も提供する。
【００２３】
植物中で機能的な知られている形質転換マーカータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはβグルコロニダーゼ酵素をコードする本発明の合成ＤＮＡ配列を植物において発現させるステップを含む、植物にレポーター遺伝子を加える方法も提供する。
【００２４】
穀物または種子中の有害生物を防除する方法であって、昆虫毒素を発現する本発明の合成遺伝子を含有する植物から前記穀物または種子を得るステップを含む方法、および粗挽粉または穀粉中の有害生物を防除する方法であって、昆虫毒素を発現する本発明の合成遺伝子を含有する穀物から前記粗挽粉または穀粉を得るステップを含む方法も提供する。
【００２５】
本発明の合成ＤＮＡを含有するトランスジェニック植物由来の組成物も提供し、前記組成物は粗挽粉、穀粉、タンパク質濃縮物、または油からなる群から選択される日用品である。
【００２６】
幾つかの場合、表１中に列挙したポリアデニル化シグナルの数は、ＡＡＴＡＡＡの存在を削除し表１中に列挙した別のポリアデニル化シグナル配列で置換することにより、本発明の合成ＤＮＡ配列において維持することができる。これは実施例１、配列番号５において例示される。
【００２７】
配列の説明
配列番号１は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００２８】
配列番号２は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素配列である。
【００２９】
配列番号３は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００３０】
配列番号４は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素配列である。
【００３１】
配列番号５は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００３２】
配列番号６は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素配列である。
【００３３】
配列番号７は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａｂ１毒素をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号８は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａｂ１毒素配列である。
【００３５】
配列番号９は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａｂ１毒素をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号１０は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａｂ１毒素配列である。
【００３７】
配列番号１１は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａｂ１毒素をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００３８】
配列番号１２は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａｂ１毒素配列である。
【００３９】
配列番号１３は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００４０】
配列番号１４は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素配列である。
【００４１】
配列番号１５は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号１６は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素配列である。
【００４３】
配列番号１７は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１８は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素配列である。
【００４５】
配列番号１９は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂ１コア毒素をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号２０は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂ１コア毒素配列である。
【００４７】
配列番号２１は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂ１コア毒素をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号２２は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂ１コア毒素配列である。
【００４９】
配列番号２３は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂ１コア毒素をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号２４は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂ１コア毒素配列である。
【００５１】
配列番号２５は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号２６は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素配列をコードしている。
【００５３】
配列番号２７は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号２８は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素配列をコードしている。
【００５５】
配列番号２９は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００５６】
配列番号３０は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素配列をコードしている。
【００５７】
配列番号３１は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００５８】
配列番号３２は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素配列である。
【００５９】
配列番号３３は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００６０】
配列番号３４は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素配列である。
【００６１】
配列番号３５は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００６２】
配列番号３６は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素配列である。
【００６３】
配列番号３７は、スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００６４】
配列番号３８は、スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１タンパク質配列である。
【００６５】
配列番号３９は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１および表２の配列を維持した、スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００６６】
配列番号４０は、スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１タンパク質配列である。
【００６７】
配列番号４１は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１タンパク質をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号４２は、スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１タンパク質配列である。
【００６９】
配列番号４３は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号４４は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質配列である。
【００７１】
配列番号４５は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１および表２の配列を維持した、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号４６は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質配列である。
【００７３】
配列番号４７は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００７４】
配列番号４８は、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質である。
【００７５】
配列番号４９は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号５０は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質配列である。
【００７７】
配列番号５１は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１および表２の配列を維持した、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００７８】
配列番号５２は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質配列である。
【００７９】
配列番号５３は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００８０】
配列番号５４は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質配列である。
【００８１】
配列番号５５は、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００８２】
配列番号５６は、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１タンパク質配列である。
【００８３】
配列番号５７は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１および表２の配列を維持した、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００８４】
配列番号５８は、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１タンパク質配列である。
【００８５】
配列番号５９は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１タンパク質をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００８６】
配列番号６０は、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１タンパク質配列である。
【００８７】
配列番号６１は、レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００８８】
配列番号６２は、レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質配列である。
【００８９】
配列番号６３は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１および表２の配列を維持した、レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００９０】
配列番号６４は、レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質配列である。
【００９１】
配列番号６５は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００９２】
配列番号６６は、レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のデルタ−９脂肪酸デサチュラーゼタンパク質配列である。
【００９３】
配列番号６７は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列である。
【００９４】
配列番号６８は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質配列である。
【００９５】
配列番号６９は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表１および表２の配列を維持した、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列である。
【００９６】
配列番号７０は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質配列である。
【００９７】
配列番号７１は、トウモロコシに最適化したコドンを使用し表２で確認した配列を除去し表１の配列を維持した、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質をコードする本発明による合成ＤＮＡ配列である。
【００９８】
配列番号７２は、キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質配列である。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
本発明は、対象のタンパク質をコードする合成核酸配列を提供する。合成コード配列は、トランスジェニック植物において対象のタンパク質を発現させる際の使用に特に適合させる。
【０１００】
対象のタンパク質は、天然に存在する任意のタンパク質またはポリペプチド、またはプロセシング型のこのようなタンパク質だけには限られないが、これらを含めた任意の天然に存在する変異体である。対象のタンパク質は、機能タンパク質ドメインの混合および一致などにより、２つ以上の天然に存在するタンパク質の一部分または断片の組合せによって形成されるタンパク質であってもよい。
【０１０１】
対象のタンパク質の好ましい群は、生じる表現型が農業形質である群、または農業形質をもたらすのに有用なレポータータンパク質である。これらには、昆虫に対する耐性、除草剤に対する耐性、水および／または熱ストレスに対する耐性、および油プロファイル修飾があるが、これらだけには限られない。
【０１０２】
対象のタンパク質のより好ましい群は、生じる表現型が農業形質である群である。別の好ましい群は、生じる表現型が除草剤耐性をもたらす群である。別の好ましい群は、生じる表現型がストレス耐性をもたらす群である。別の好ましい群は、生じる表現型がより健康な食品の修飾された油プロファイルをもたらす群である。よりさらに好ましい群は、対象のタンパク質が昆虫耐性をもたらすＣｒｙタンパク質である群である。
【０１０３】
対象のタンパク質をコードする天然／野生型ＤＮＡ配列を確認および分析して、表１および２および／または３中に列挙したポリアデニル化シグナル配列が存在するかどうか決定しなければならない。本発明に従い、トウモロコシにおける使用を目的とするコード配列に関して、表２中に列挙したポリアデニル化シグナル配列の数を、天然配列中に存在する数と比較して減らす。ダイズにおける使用を目的とするコード配列に関しては、表３中に列挙したポリアデニル化シグナル配列の数を減らす。特にそれらが入れ子状マルチマー型で存在する場合、表２および３中に列挙したポリアデニル化シグナル配列を除去することは非常に重要である。
【０１０４】
表２および３中に列挙したポリアデニル化シグナル配列の除去以外に、Ｓｈａｗ−Ｋａｍｅｎ配列、ＡＴＴＴＡの存在を除去することが望ましい可能性がある。
【０１０５】
ポリアデニル化シグナル配列およびＳｈａｗ−Ｋａｍｅｎ配列の除去以外に、本発明者らは、合成ＤＮＡ配列を使用するその植物種に天然に存在する遺伝子において平均してほぼ同じ頻度でコドンを利用する、合成ＤＮＡコード配列の構築を優先する。表４は、様々な特定作物における用途および一般に双子葉植物または一般に植物における用途を目的とする、合成遺伝子におけるコドン出現頻度に適した標的率を与える。
【０１０６】
【表４】
2014515609.tif 000005
【０１０７】
トランスジェニック植物
本発明の好ましい実施形態は、昆虫毒素をコードする遺伝子を用いた植物の形質転換である。昆虫毒素遺伝子を発現する形質転換植物は、形質転換植物の細胞における制御量の本発明の殺虫性タンパク質またはその変異体の存在によって、昆虫標的有害生物による攻撃に耐性がある。殺虫性のＢ．ｔ．殺虫性毒素をコードする遺伝物質を特定害虫によって捕食される植物のゲノム内に取り込むことによって、成体または幼虫は可食植物の消費後死に至る。単子葉植物および双子葉植物分類の多数のメンバーが形質転換されている。トランスジェニック農作物、ならびに果実および野菜は商業的関心となる。このような作物には、トウモロコシ、コメ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、コットン、ピーナッツ、トマト、ジャガイモなどがあるが、これらだけには限られない。外来遺伝物質を植物細胞に導入するため、および導入遺伝子を安定的に維持し発現する植物を得るための、幾つかの技法が存在する。このような技法には、マイクロ粒子にコーティングした遺伝物質の細胞への直接的加速的導入がある（米国特許第４９４５０５０号および米国特許第５１４１１３１号）。植物はアグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を使用して形質転換することができる。米国特許第５１７７０１０号、欧州特許第ＥＰ１３１６２４Ｂ１号、欧州特許第ＥＰ１５９４１８Ｂ１号、欧州特許第ＥＰ１７６１１２Ｂ１号、米国特許第５１４９６４５号、欧州特許第ＥＰ１２０５１６Ｂ１号、米国特許第５４６４７６３号、米国特許第４６９３９７６号、欧州特許第ＥＰ１１６７１８Ｂ１号、欧州特許第ＥＰ２９０７９９Ｂ１号、欧州特許第ＥＰ３２０５００Ｂ１号、欧州特許第ＥＰ６０４６６２Ｂ１号、米国特許第７０６０８７６号、米国特許第６０３７５２６号、米国特許第６３７６２３４号、欧州特許第ＥＰ２９２４３５Ｂ１号、米国特許第５２３１０１９号、米国特許第５４６３１７４号、米国特許第４７６２７８５号、米国特許第５６０８１４２号、および米国特許第５１５９１３５号を参照。他の形質転換技術にはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術がある。米国特許第５３０２５２３号および米国特許第５４６４７６５号を参照。エレクトロポレーション技術も植物を形質転換するために使用されている。ＷＯ１９８７００６６１４、米国特許第５４７２８６９号、米国特許第５３８４２５３号、ＷＯ１９９２０９６９６、米国特許第６０７４８７７号、ＷＯ１９９３０２１３３５、および米国特許第５６７９５５８号を参照。植物を形質転換するための多数の技術以外に、外来遺伝子と接触する組織の型も変わり得る。このような組織には、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、分裂組織などがあるが、これらだけには限られない。当業者の適切な技法を使用して、ほぼ全ての植物組織を脱分化中に形質転換することができる。
【０１０８】
植物にＤＮＡを挿入する知られている方法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によって送達されるＴ−ＤＮＡを形質転換剤として用いる形質転換がある。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡ含有ベクターの使用は徹底的に研究されており、欧州特許第ＥＰ１２０５１６Ｂ１号、Lee and Gelvin (2008) Plant Physiol.146:325-332;Fraley et al.(1986)Crit.Rev.Plant Sci.4:1-46およびAn et al.(1985)EMBO J.4:277-284中に十分に記載され、当技術分野において十分確立している。さらに、送達するＤＮＡを含有するリポソームと植物プロトプラストの融合、ＤＮＡの直接注入、バイオリスティクス形質転換（マイクロ粒子ボンバードメント）、またはエレクトロポレーション、および他の可能な方法を利用することができる。
【０１０９】
挿入したＤＮＡは植物ゲノムに組み込まれた後、それは次世代を通して比較的安定している。植物細胞を形質転換するために使用するベクターは、除草剤または抗生物質、特にビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ベロマイシン、またはヒグロマイシンなどに対する耐性を形質転換植物細胞にもたらすタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を通常含有する。個々に利用する選択マーカー遺伝子は、挿入ＤＮＡを含有しない細胞の増殖を選択化合物によって抑制しながら、形質転換細胞の選択を従って可能にするはずである。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態では、タンパク質コード領域のコドン出現頻度がその植物に最適化された遺伝子を用いて植物を形質転換する。例えば、米国特許第５３８０８３１号を参照。さらに有利なことに、切断型毒素、例えば機能タンパク質ドメインをコードする植物を使用することができる。切断型毒素は、約５５％〜約８０％の天然完全長毒素を典型的にコードする。植物において使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子の作製法は当技術分野で知られている（Stewart 2007,Frontiers in Drug Design and Discovery 1:297-341）。
【０１１１】
形質転換技法とは無関係に、植物用プロモーターをベクター中に含めることにより植物細胞中で対象のタンパク質を発現するように適合させた遺伝子トランスファーベクターに、遺伝子を取り込むことが好ましい。植物用プロモーター以外に、様々な供給源由来のプロモーターを植物細胞中で有効に使用して、外来遺伝子を発現させることが可能である。例えば、細菌由来のプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーターなど、ウイルス由来のプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどを使用することができる。植物由来のプロモーターには、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン脱重合因子）プロモーター、および組織特異的プロモーターがあるが、これらだけには限られない。プロモーターは、転写効率を改善することができる特定エンハンサー配列エレメントも含有し得る。典型的なエンハンサーには、ＡＤＨ１−イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６があるが、これらだけには限られない。構成的プロモーターを使用することができる。構成的プロモーターは、ほぼ全ての細胞型およびほぼ全ての時期で連続的な遺伝子発現を誘導する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、特定細胞または組織型、葉または種子などにおいて遺伝子発現を担い（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシル担体タンパク質））、これらのプロモーターを使用することもできる。植物の特定発生段階中に活性があるプロモーター、ならびに特定植物組織および器官において活性があるプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターの例には、根特異的、花粉特異的、胚特異的、コーンシルク特異的、コットンファイバー特異的、種子内胚乳特異的、し部特異的などであるプロモーターがあるが、これらだけには限られない。
【０１１２】
特定環境下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましい可能性がある。誘導性プロモーターは、物理的刺激（例えば、熱ショック遺伝子）；光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）；ホルモン（例えば、糖質コルチコイド）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン）；代謝産物；およびストレス（例えば、干ばつ）など、特異的シグナルに応答して遺伝子の発現を担う。５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列およびポリアデニレート付加シグナル配列などの、植物において機能する他の望ましい転写および翻訳エレメントを使用することができる。多数の植物特異的遺伝子トランスファーベクターが当技術分野で知られている。
【０１１３】
昆虫耐性（ＩＲ）形質を含有するトランスジェニック作物は、北アメリカ全体ではトウモロコシおよび綿花植物において有力であり、これらの形質の使用は世界規模で広まっている。ＩＲ形質と除草剤耐性（ＨＴ）形質を組合せた市販のトランスジェニック作物が多数の種子会社によって開発されている。これらは、例えばスルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリドなどのアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）阻害剤、例えばビアラフォス、グルフォシネートなどのグルタミン合成酵素（ＧＳ）阻害剤、例えばメソトリオン、イソキサフルトールなどの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、例えばグリホサートなどの５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、および例えばハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどのアセチル−コエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤に対する耐性などの、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質によってもたらされるＩＲ形質とＨＴ形質の組合せを含む。フェノキシ酸除草剤とピリジルオキシアセテートオーキシン除草剤（ＷＯ２００７０５３４８２参照）、またはフェノキシ酸除草剤とアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤（米国特許出願２００９００９３３６６号参照）などの除草剤化学物質クラスに対する耐性を、遺伝子導入により提供されたタンパク質が植物にもたらす、他の例が知られている。ＩＲ形質によって多くの有害生物に関する問題を制御する能力は価値ある市販品の概念であり、昆虫防除形質と雑草防除形質を同一植物で組合せた場合、この製品概念の利便性は高まる。さらに、本発明のＩＲ形質などのＢ．ｔ．殺虫性タンパク質によってもたらされるＩＲ形質と前述の形質などの１つまたは複数の別のＨＴ形質、加えて１つまたは複数の別の入力形質（例えば、Ｂ．ｔ．由来または他の殺虫性タンパク質によってもたらされる他の昆虫耐性、例えばＲＮＡｉなどの機構によってもたらされる昆虫耐性、線虫耐性、疾患耐性、ストレス耐性、改善された窒素利用率など）、または出力形質（例えば、高油含有率、健康油組成、栄養改善など）の単一植物の組合せによって、改善された値を得ることができる。このような組合せは、従来の品種改良（品種改良反復）によって、または多数の遺伝子の同時導入（分子学的反復または同時形質転換）を含めた新規な形質転換事象として一度に得ることができる。利点には、害虫を管理する能力、および生産者および／または消費者に二次的利点をもたらす穀物植物における改善された雑草防除がある。したがって、改善された穀物の性質の完璧な農産物をもたらす様々な形質と、任意数の農業問題を柔軟かつコスト効率よく制御する能力と共に、本発明を使用することができる。
【０１１４】
本明細書中に言及または引用する全ての特許、特許出願、仮出願、および公開は、それらが本明細書の明確な教示に反しない程度に、それらの全容を参照によって組み込む。具体的に明示または暗示しない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書で使用するように「少なくとも１つ」を示す。「単離」によって、本出願人は、ヌクレオチドまたはポリペプチド分子がそれらの本来の環境から除去されていること、および人間の手により異なる環境に置かれていることを意味する。
【０１１５】
本発明の実施形態は以下の実施例においてさらに定義する。これらの実施例が、単なる例証によって与えられることは理解されるはずである。前述の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必要不可欠な特徴を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、本発明の実施形態の様々な変更および修正を施して、様々な使用および条件に適合させることが可能である。したがって、本明細書中に示し記載した実施形態以外の本発明の実施形態の様々な修正が、前述の記載から当業者には明らかであろう。このような修正も、添付の特許請求の範囲の範疇にあるものとする。
【０１１６】
他に示さない限り、全ての割合は重量によるものであり、全ての溶媒混合比は体積によるものである。全ての温度は摂氏温度である。
（実施例）
【実施例１】
【０１１７】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｆａコア毒素をコードする合成コード領域
比較配列。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号１で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号１に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号１によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限部位を除去し、表１中で確認した配列を復元した。配列番号１によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号３で示す。
【０１１８】
配列番号３を分析し、コドンを変更して、表１中で確認したのと同数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号５で示す。表５は、配列番号１中の１つはヌクレオチド４２６および１つはヌクレオチド５８２におけるＡＡＴＡＡＡの２つの存在が、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置を維持するが２つのＡＡＴＡＡＡ配列の各々に関して問題の少ない配列で置換されたＡＡＴＣＡＡで置換されたこと以外、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号５において維持されることを示す。表６は、表２中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は配列番号５において減少することを示す。表２および３中で確認した配列には重複がある（表２中の配列１、２、６、７、８、９、１０、１４、１３、および２０は、それぞれ表３中の配列１６、１５、２、５、１、３、４、６、１３、および１２に対応する）ので、表３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数が配列番号５において減少することも間違いない。
【０１１９】
配列番号５の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１２０】
配列番号５の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号５の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写終結およびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１２１】
このような構築物の一実施形態では、配列番号５を含む一次ｍＲＮＡ転写産物の生成は、その天然イントロン１を有するトウモロコシユビキチン１プロモーターのコピーによって誘導した（米国特許第５５１０４７４号）。トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子由来の３’非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６６９９９８４号）を含む断片を使用して転写を終結させた。前述の遺伝子発現カセットを含有する植物形質転換用バイナリープラスミド、ｐＤＡＢ１１１４４０を構築し、トランスジェニックトウモロコシ植物の生産において利用した。プラスミドｐＤＡＢ１１１４４０は、サトウキビ桿菌状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk et al.(1999) Plant Molec.Biol.39:1221-30）の転写制御下で、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼのコード領域を含む除草剤耐性遺伝子をさらに含む（ＡＡＤ−１  ｖ３；米国特許第７８３８７３３号（Ｂ２）、およびWright et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5）。トウモロコシリパーゼ遺伝子由来の３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）を含む断片を使用して転写を終結させた。
【０１２２】
【表５】
2014515609.tif 000006
【０１２３】
【表６】
2014515609.tif 000007
【実施例２】
【０１２４】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３４Ａ毒素をコードする合成コード領域
比較配列。Ｃｒｙ３４Ａ毒素をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号７で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号７に存在するか、およびそれらの位置を決定した。天然ＤＮＡ配列は、標準的な遺伝子コードを使用して対応するアミノ酸配列に翻訳した。配列番号７によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表７の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限部位を除去し、表１中で確認した全ての配列を復元した。配列番号７によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号９で示す。配列番号９の配列を有するＤＮＡを合成する。
【０１２５】
配列番号９を分析し、コドンを変更して、表１中で確認したのと同数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号１１で示す。表７は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号１１において維持されることを示す。表８は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数が配列番号５において減ることを示す。
【０１２６】
配列番号５のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号１および配列番号３を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１２７】
配列番号５の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１２８】
配列番号５の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号５の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写終結およびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１２９】
【表７】
2014515609.tif 000008
【０１３０】
【表８】
2014515609.tif 000009
【実施例３】
【０１３１】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ３５Ａｂ１毒素をコードする合成コード領域
比較配列。Ｃｒｙ３５Ａｂ１毒素をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号１３で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号１３に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号１３によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号１３によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号１５で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成コード領域との比較に使用する。
【０１３２】
配列番号１５を分析し、配列番号８中の１つはヌクレオチド２２８および１つはヌクレオチド２７６におけるＡＡＴＡＡＡの２つの存在をＡＡＴＣＡＡに変更したこと以外、コドンを変更して、表１中で確認したのと同数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号１７で示す。表９は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号１７において維持されることを示す。表１０は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号１３と比較して配列番号１７において減ることを示す。
【０１３３】
配列番号１７のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号１３および配列番号１５を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１３４】
配列番号１７の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１３５】
配列番号１７の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号１７の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写終結およびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１３６】
【表９】
2014515609.tif 000010
【０１３７】
【表１０】
2014515609.tif 000011
【実施例４】
【０１３８】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ａｂコア毒素をコードする合成コード領域
比較配列。Ｃｒｙ１Ａｂコア毒素をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号１９で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号１９に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号１９によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号１９によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号２１で示す。
【０１３９】
配列番号２１を分析し、コドンを変更して、表１中で確認したのと同数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号２３で示す。表１１は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号２３において維持されることを示す。表１２は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号１９と比較して配列番号２３において減ることを示す。
【０１４０】
配列番号２３の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１４１】
配列番号２３の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号２３の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写終結およびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１４２】
このような構築物の一実施形態では、配列番号２３を含む一次ｍＲＮＡ転写産物の生成は、その天然イントロン１を有するトウモロコシユビキチン１プロモーターのコピーによって誘導した（米国特許第５５１０４７４号）。トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子由来の３’非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６６９９９８４号）を含む断片を使用して転写を終結させた。前述の遺伝子発現カセットを含有する植物形質転換用バイナリープラスミド、ｐＤＡＢ１１１４４９を構築し、トランスジェニックトウモロコシ植物の生産において利用した。プラスミドｐＤＡＢ１１１４４９は、サトウキビ桿菌状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk et al.(1999) Plant Molec.Biol.39:1221-30）の転写制御下で、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼのコード領域を含む除草剤耐性遺伝子をさらに含む（ＡＡＤ−１  ｖ３；米国特許第７８３８７３３号（Ｂ２）、およびWright et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5）。トウモロコシリパーゼ遺伝子由来の３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）を含む断片を使用して転写を終結させた。
【０１４３】
【表１１】
2014515609.tif 000012
【０１４４】
【表１２】
2014515609.tif 000013
【実施例５】
【０１４５】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ１Ｃａコア毒素をコードする合成コード領域
比較配列。Ｃｒｙ３５Ａコア毒素をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号２５で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号２５に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号２５によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号２５によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号２７で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１４６】
配列番号２７を分析し、コドンを変更して、表１中で確認したのと同数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号２９で示す。表１３は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号２９において維持されることを示す。表１４は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号２５と比較して配列番号２９において減ることを示す。
【０１４７】
配列番号２９のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号２５および配列番号２７を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１４８】
配列番号２９の合成遺伝子はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１４９】
配列番号２９の合成遺伝子の発現において使用するための構築物は、配列番号２９の合成遺伝子と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１５０】
【表１３】
2014515609.tif 000014
【０１５１】
【表１４】
2014515609.tif 000015
【実施例６】
【０１５２】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のＣｒｙ６Ａａ毒素をコードする合成コード領域
比較配列。Ｃｒｙ６Ａａ毒素をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号３１で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号３１に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号３１によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号３１によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号３３で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１５３】
配列番号３３を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号３５で示す。表１５は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号３５において維持されることを示す。表１６は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号３１と比較して配列番号３５において減ることを示す。
【０１５４】
配列番号３５のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号３１および配列番号３３を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１５５】
配列番号３５の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１５６】
配列番号３５の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号３５の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１５７】
【表１５】
2014515609.tif 000016
【０１５８】
【表１６】
2014515609.tif 000017
【実施例７】
【０１５９】
スフィンゴビウム・ヘルビシドボランス（Sphingobiurn herbicidovorans）のＡＡＤ１をコードする合成コード領域
比較配列。ＡＡＤ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号３７で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号３７に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号３７によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号３７によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号３９で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１６０】
配列番号３９を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号４１で示す。表１７は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号４１において維持されることを示す。表１８は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号３７と比較して配列番号４１において減ることを示す。
【０１６１】
配列番号４１のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号３７および配列番号３９を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１６２】
配列番号４１の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１６３】
配列番号４１の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号４１の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳配列を組合せることによって作製する。
【０１６４】
【表１７】
2014515609.tif 000018
【０１６５】
【表１８】
2014515609.tif 000019
【実施例８】
【０１６６】
アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９デサチュラーゼをコードする合成コード領域
比較配列。アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のデルタ−９デサチュラーゼタンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号４３で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号４３に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号４５で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１６７】
配列番号４５を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号４７で示す。表１は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号４７において維持されることを示す。表２０は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号４３と比較して配列番号４７において減ることを示す。
【０１６８】
配列番号４７のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号４３および配列番号４５を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１６９】
配列番号４７の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１７０】
配列番号４７の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号４７の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写終結およびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１７１】
【表１９】
2014515609.tif 000020
【０１７２】
【表２０】
2014515609.tif 000021
【実施例９】
【０１７３】
キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１をコードする合成コード領域
比較配列。キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＳＡＰ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号４９で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号４９に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号４９によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素部位を除去した。配列番号４９によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号５１で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１７４】
配列番号５２を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号５３で示す。表１は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号５３において維持されることを示す。表２１は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号４９と比較して配列番号５３において減ることを示す。
【０１７５】
配列番号５３のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号４９および配列番号５１を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１７６】
配列番号５３の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１７７】
配列番号５３の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号５３の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１７８】
【表２１】
2014515609.tif 000022
【０１７９】
【表２２】
2014515609.tif 000023
【実施例１０】
【０１８０】
エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１をコードする合成コード領域
比較配列。エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）のＧＦＰ１をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号５５で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号５５に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号５５によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号５５によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号５７で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１８１】
配列番号５７を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号５９で示す。表１は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号５９において維持されることを示す。表２３は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号５５と比較して配列番号５９において減ることを示す。
【０１８２】
配列番号５９のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号５５および配列番号５７を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１８３】
配列番号５９の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１８４】
配列番号５９の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号５９の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１８５】
【表２３】
2014515609.tif 000024
【０１８６】
【表２４】
2014515609.tif 000025
【実施例１１】
【０１８７】
レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のＦＡＤ９をコードする合成コード領域
比較配列。レプトスファエリア・ノドラム（Leptosphaeria nodorum）のＦＡＤ９タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号６１で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号６１に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号６３で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１８８】
配列番号６３を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号６５で示す。表１は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および場所が配列番号６５において維持されることを示す。表２５は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号６１と比較して配列番号６５において減ることを示す。
【０１８９】
配列番号６５のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号６１および配列番号６３を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１９０】
配列番号６５の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１９１】
配列番号６５の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号６５の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１９２】
【表２５】
2014515609.tif 000026
【０１９３】
【表２６】
2014515609.tif 000027
【実施例１２】
【０１９４】
キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１をコードする合成コード領域
比較配列。キセロフィタ・ビスコサ（Xerophyta viscosa）のＰＥＲ１タンパク質をコードする天然ＤＮＡ配列は配列番号６７で示す。この配列を分析して、表１中で確認したどの配列が配列番号６７に存在するか、およびそれらの位置を決定した。配列番号６７によってコードされるアミノ酸配列は、トウモロコシにおいて使用した合成遺伝子に関して表４の縦列中に与えた標的コドン頻度を使用して、次いで逆翻訳した。生成したＤＮＡ配列を分析し、表１中で確認した全ての配列を維持しながら、必要な場合コドンを変更して、望ましくないオープンリーディングフレームを除去し、望ましくない制限酵素認識部位を除去した。配列番号６７によってコードされるアミノ酸配列は保存した。生成したＤＮＡ配列は配列番号６９で示す。この配列を合成し、本発明に従い設計した合成遺伝子との比較に使用する。
【０１９５】
配列番号６９を分析し、コドンを変更して、表１中で確認した数の配列を維持しながら、表２中で確認した潜在的ポリアデニル化シグナル配列を除去した。本発明を具体化する生成配列は配列番号７１で示す。表１は、表１中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数および位置が配列番号７１において維持されることを示す。表２７は、表２および３中で確認したポリアデニル化シグナル配列の数は、配列番号６７と比較して配列番号７１において減ることを示す。
【０１９６】
配列番号７１のＤＮＡを合成し、この配列を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルを、配列番号６７および配列番号６９を発現するよう形質転換した植物細胞中で観察した発現レベルと比較する。
【０１９７】
配列番号７１の合成コード領域はトウモロコシにおける発現用に最適化した。
【０１９８】
配列番号７１の合成コード領域の発現において使用するための構築物は、配列番号７１の合成コード領域と、植物細胞において機能的なプロモーターを含む５’非翻訳領域および転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む３’非翻訳領域を組合せることによって作製する。
【０１９９】
【表２７】
2014515609.tif 000028
【０２００】
【表２８】
2014515609.tif 000029
【実施例１３】
【０２０１】
Ｘｖ  ＳＡＰ１を用いたトウモロコシのＷＨＩＳＫＥＲＳ（登録商標）形質転換
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）プロモーター、Ｒｄ２９Ａを本発明のＸｖＳＡＰ１再設計コード領域配列（配列番号５３）の５’に配置した、標準ＷＨＩＳＫＥＲＳ形質転換ベクターを構築した。これらの配列は、ＺｅａトウモロコシＰＥＲ５、再設計コード領域の発現を安定化するための３’および５’非翻訳領域と隣接した。イネアクチン１プロモーターによって誘導されるｐａｔ選択カセット（例えば、米国特許第５６４８４７７号参照）は、ＸｖＳＡＰ１発現カセットの３’に配置した。
【０２０２】
ベクターＤＮＡは適切な制限酵素で消化して、ベクター骨格中に存在する細菌アンピシリン耐性遺伝子を含有する断片を切り離し、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換に適した直鎖状ＤＮＡ断片を生成した。ＸｖＳＡＰ１およびｐａｔ発現カセットを含有する直鎖状断片の精製は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により調製スケールで実施した。この植物形質転換ＤＮＡは、（米国特許第５３０２５２３号および米国特許第５４６４７６５号、米国特許公開第２００８／０１８２３３２号、およびPetolino and Arnold (2009)(Methods Molec.Biol.526:59-67中に記載されたのとほぼ同様に)ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換によりトウモロコシＨｉ−ＩＩ縣濁細胞培養液に送達した。
【０２０３】
形質転換体は選択培地中に置き、その後約８週間の行程にわたり形質転換分離株を得た。選択培地は、ビアラフォス（Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有する、ＬＳベース培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；Ｐｈｙｔｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌａｂｒ．）、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）であった。胚分離株を得るまで、３ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含有する選択培地に胚を移した。回収した分離株は、再生およびさらなる分析用に、２週間間隔で新たな選択培地に移すことによって増大させた。
【０２０４】
再生用に、培養物は、低照度条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、次いで高照度条件（約８９μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３ｍｇ／Ｌのビアラフォス、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）に移した。組織は後に（植物成長調整剤を欠くこと以外誘導培地と同じ）「３６」再生培地に移した。苗木が３〜５ｃｍ長に達したとき、ＳＨＧＡ培地（Ｓｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ塩およびビタミン（１９７２）；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌａｂｒ．）、１．０ｇｍ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇｍ／Ｌのスクロースおよび２．０ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．８）を含有するガラス製培養チューブにそれらを移して、苗条および根のさらなる成長および発達を可能にした。植物は本明細書で前に記載したのと同じ土壌混合物に移して、温室内で成長させ開花させた。種子生成のため受粉制御を行った。
【実施例１４】
【０２０５】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換
標準的クローニング法を、バイナリー植物形質転換および発現プラスミドの構築において使用する。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼはＮＥＢから入手する。プラスミド調製は、製造者の説明書に従い、（いずれもＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌからの）ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミド調製キットまたはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＡＸ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉキットを使用して実施する。ＤＮＡ断片は、ゲル単離後に（いずれもＱｉａｇｅｎからの）ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットまたはＱＩＡＥＸ  ＩＩ（登録商標）ゲル抽出キット）を使用して精製する。
【０２０６】
本発明による合成遺伝子は業者により合成することができ（例えば、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）、標準プラスミドベクターにおけるクローン断片として供給することができ、または適切なヌクレオチド配列を含有する他の構築物の標準的な分子生物学的操作によって得ることができる。
【０２０７】
非制限的な例では、基本的クローニング戦略を使用して、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ制限部位で完全長コード配列（ＣＤＳ）を植物発現プラスミドにサブクローニングすることができる。植物発現エレメント、（例えば、植物で発現可能なプロモーター、３’末端転写終結およびポリアデニレート付加決定因子など）の制御下で適切なコード領域を含有する生成した植物発現カセットは、例えばＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術または標準的制限酵素断片クローニング手順を利用して、バイナリーベクタープラスミドにサブクローニングする。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を利用する場合、例えばＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、完全長および修飾型遺伝子植物発現カセットをバイナリー植物形質転換プラスミドに組換えることができる。プラスミドが大腸菌（E.coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞中に存在するとき、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性をもたらす細菌遺伝子を有するバイナリー植物形質転換ベクターを利用することは好都合である。所望の宿主植物において機能的な植物で発現可能な選択マーカー遺伝子を含有する、バイナリーベクタープラスミドを利用することも好都合である。植物で発現可能な選択マーカー遺伝子の例には、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性をもたらすトランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈＩＩ）をコードする遺伝子、ならびにグリホサート；ヒグロマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン（ビアラフォス）、イミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン系除草剤、例えばクロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなどに対する耐性または耐久性をコードする遺伝子があるが、これらだけには限られない。
【０２０８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｚ７０７Ｓのエレクトロコンピテントセル(Ｚ７０７のストレプトマイシン耐性派生株、Hepburn et al.,1985,J.Gen. Microbiol.131:2961-2969.)を調製し、エレクトロポレーションを使用して形質転換する（Weigel and Glazebrook,2002,Arabidopsis: A Laboratory Manual）。エレクトロポレーション後、１ｍＬのＹＥＰブロス（ｇｍ／Ｌ：酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）をキュベットに加え、細胞−ＹＥＰ縣濁液を、４時間一定攪拌しながら水浴中２８℃でのインキュベーション用に１５ｍＬ培養チューブに移す。細胞は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰ＋寒天（２５ｇｍ／Ｌ）上にプレーティングし、プレートは２８℃で２〜４日間インキュベートする。十分分離した単コロニーを選択し、前と同様にスペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含む新たなＹＥＰ＋寒天プレートで画線し、２８℃で１〜３日間インキュベートする。
【０２０９】
バイナリー植物形質転換ベクター中の合成遺伝子挿入体の存在を、ベクター特異的プライマーと選択したアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーから調製した鋳型プラスミドＤＮＡを使用してＰＣＲ分析によって実施する。前と同様にスペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含むＹＥＰで増殖した１５ｍＬ一晩培養物の４ｍＬアリコート由来の細胞ペレットを、製造者の説明書に従い実施し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐｓを使用して抽出した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）エレクトロポレーション形質転換で使用したバイナリーベクター由来のプラスミドＤＮＡを対照として含める。０．５Ｘ濃度で製造者の説明書に従いＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ反応を終了させる。ＰＣＲ反応は、以下の条件：ステップ１）９４℃で３分間、ステップ２）９４℃で４５秒間、ステップ３）５５℃で３０秒間、ステップ４）予想産物長１ｋｂ当たり７２℃で１分間、ステップ５）ステップ２まで２９回、ステップ６）７２℃で１０分間でプログラムした、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて実施する。反応は循環後４℃に維持する。増幅産物はアガロースゲル電気泳動（例えば、０．７％〜１％アガロース、ｗ／ｖ）によって分析し、臭化エチジウム染色により目に見える状態にする。そのＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であるコロニーを選択する。
【０２１０】
あるいは、合成遺伝子挿入体を含有するバイナリー植物形質転換ベクターのプラスミド構造は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）操作の当業者によく知られている標準的な分子生物学的方法により、候補となるアグロバクテリウム（Agrobacterium）分離株から調製したプラスミドＤＮＡの制限酵素消化によるフィンガープリントのマッピングによって実施する。
【０２１１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法によって形質転換植物を得る当業者は、Ｚ７０７Ｓ以外の他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を有利に使用することができ、株の選択は形質転換する宿主植物種のアイデンティティーに依存し得ることを理解している。
【実施例１５】
【０２１２】
双子葉植物における殺虫性タンパク質の生成
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の形質転換。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）Ｃｏｌ−０１を、フローラルディップ法（Weigel and Glazebrook、上記）を使用して形質転換する。選択したアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーを使用して、選択に適した抗生物質を含有するＹＥＰブロスの１ｍＬ〜１５ｍＬ培養物を接種する。２２０ｒｐｍにおいて一定攪拌しながら２８℃で一晩、培養物をインキュベートする。それぞれの培養物を使用して、選択に適した抗生物質を含有するＹＥＰブロスの２つの５００ｍＬ培養物を接種し、新たな培養物は一定攪拌しながら２８℃で一晩インキュベートする。細胞は室温において１０分間約８７００×ｇでペレット状にし、生成する上清は廃棄する。細胞ペレットは、１／２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０４４μＭベンジルアミノプリン（１０μＬ／リットルの１ｍｇ／ｍＬストック、ＤＭＳＯ中）および３００μＬ／リットルのＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７を含有する５００ｍＬの浸潤用培地に軽く縣濁する。最新の花部の浸水が確実となるよう注意して、約１ヶ月齢の植物を１５秒間培地に浸す。次いで植物を横にして置き、（透明または不透明状態で）２４時間覆い、水で洗い、直立状態に置く。植物は１６時間明期／８時間暗期の光周期で、２２℃において成長させる。浸漬後約４週間で種子を採取する。
【０２１３】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）の成長および選択。新たに採取したＴ１種子は、乾燥剤の存在下において室温で少なくとも７日間乾燥させる。種子は０．１％寒天／水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液中に縣濁し、次いで２日間４℃で等級別に分類する。植物を調製するため、１０．５インチ×２１インチの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ）中のＳｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ，ＷＡ）をファインバーミキュライトで覆い、湿潤するまでＨｏａｇｌａｎｄの溶液（Ｈｏａｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｎ、１９５０）で地下灌漑処理し、次いで２４時間排出する。等級分類した種子をバーミキュライトにまき、湿気調節型ドーム（ＫＯＲＤ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で７日間覆う。種子を発芽させ、一定温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）の下１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓｅｃの光強度で長期条件下において（１６時間明期／８時間暗期）、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（モデルＣＭＰ４０３０またはＣＭＰ３２４４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）中で植物を成長させる。植物は最初にＨｏａｇｌａｎｄの溶液、およびその後脱イオン水で湿らせ、土壌を浸潤状態ではなく湿った状態に保つ。
【０２１４】
種まき後５〜６日でドームを除去し、植物には化学的選択剤を噴霧して非形質転換種子から発芽した植物を枯死させる。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターによって与えられる植物で発現可能な選択マーカー遺伝子がｐａｔまたはｂａｒ遺伝子である場合（Wehrmann et al.,1996,Nat.Biotech.14:1274-1278）、Ｆｉｎａｌｅ（５．７８％グルホシネートアンモニウム、Ｆａｒｎａｍ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ．）の１０００×溶液を噴霧することによって形質転換植物を選択することができる。２度のその後の噴霧は５〜７日間隔で実施する。生存植物（活発に生長する植物）は最終噴霧後７〜１０日で確認し、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５で調製したポットに移す。移動した植物は湿気調節型ドームで３〜４日間覆い、前述の成長条件下においてＣｏｎｖｉｒｏｎ中に置く。
【０２１５】
双子葉植物形質転換の当業者は、他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用するとき、形質転換植物の他の選択法が利用可能であることを理解している。
【０２１６】
トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の昆虫バイオアッセイ。Ｃｒｙタンパク質を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）系統は、人工食品オーバーレイアッセイで感受性昆虫種に対して活性があることが実証される。トランスジェニックおよび非トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）系統から抽出したタンパク質を適切な方法によって定量化し、サンプル体積を調節してタンパク質濃度を標準化する。バイオアッセイを前に記載したように人工食品に実施する。非トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）および／またはバッファーおよび水はバックグラウンドチェック処理としてアッセイ中に含める。
【実施例１６】
【０２１７】
スーパーバイナリーベクターを作製するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系を単子葉植物宿主の形質転換に都合よく使用する。スーパーバイナリーベクターを構築し確認するための方法は十分開示されており、参照によって本明細書に組み込む（プラスミドｐＳＢ１の操作マニュアル、バージョン３．１、Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ、Ｉｎｃ．、東京、日本から入手可能）。標準的な分子生物学的および微生物学的方法を使用してスーパーバイナリープラスミドを作製する。スーパーバイナリープラスミドの構造の立証／確認は、バイナリーベクターに関して前に記載した方法を使用して行い、プラスミドｐＳＢ１の操作マニュアルにおいて示唆されるように変更することができる。
【実施例１７】
【０２１８】
単子葉植物における殺虫性タンパク質の生成
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換。ＨｉｇｈＩＩ  Ｆ１交配種(Armstrong et al.,1991,Maize Genet. Coop.Newsletter 65:92-93)由来の種子を、９５％のＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０無土壌増殖培地（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）と５％のクレイ／ローム土の混合物を含有する５ガロンポットにまく。植物は、１６：８時間の明期：暗期の光周期で、高圧ナトリウムおよびメタルハライドランプの組合せを使用して温室内で成長させる。形質転換用の未熟なＦ２胚を得るため、制御型自家受粉を実施する。胚が約１．０〜２．０ｍｍの大きさになったとき、受粉後８〜１０日で未熟な胚を単離する。
【０２１９】
感染および同時培養。液状石鹸で洗浄することによりトウモロコシの雌穂を表面滅菌し、２分間７０％エタノール中に浸し、次いで滅菌水ですすぐまで、３０分間２０％の市販の漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）中に浸す。スーパーバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の縣濁液を、２８℃で２〜３日間１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、および２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含有するＹＥＰ固体培地で増殖させた１〜２群の細菌を、１００μＭアセトシリンゴンを含有する５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基本培地（Linsmaier and Skoog,1965,Physiol.Plant.18:100-127）、Ｎ６ビタミン（Chu et al.,1975,Scientia Sinica 18:659-668）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇｍ／Ｌのスクロース、３６．０ｇｍ／Ｌのグルコース、６ｍＭのＬ−プロリン、ｐＨ５．２）に移すことによって調製する。均一な縣濁液が得られるまで溶液をボルテックスにかけ、パープルフィルターを有するＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を使用し約２００Ｋｌｅｔｔ単位の最終濃度、または５５０ｎｍで約０．４の光学濃度まで濃度を調節する。未熟な胚を、２ｍＬの感染培地を含有するマイクロ遠心分離チューブに直接単離する。培地を除去し、２００Ｋｌｅｔｔ単位の濃度を有する１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液と交換し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）と胚の溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで暗期条件下において２５℃で５日間、同時培養培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、１００μＭアセトシリンゴン、３．０ｇｍ／Ｌのゲランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、ｐＨ５．８）に移す。
【０２２０】
同時培養後、胚を選択培地に移し、その後約８週間の行程にわたり形質転換分離株を得る。植物で発現可能なｐａｔまたはｂａｒ選択マーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリープラスミドで形質転換したトウモロコシ組織の選択用に、ＬＳベース培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌａｂｒ．）、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）をビアラフォス（Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に使用する。胚分離株を得るまで、３ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含有する選択培地に胚を移す。回収した分離株は、再生およびさらなる分析用に、２週間間隔で新たな選択培地に移すことによって一括する。
【０２２１】
トウモロコシ形質転換の当業者は、他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用するとき、形質転換植物の他の選択法が利用可能であることを理解している。
【０２２２】
再生および種子生成。再生用に、培養物は、低照度条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、次いで高照度条件（約８９μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３ｍｇ／Ｌのビアラフォス、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）に移す。組織は後に（植物成長調整剤を欠くこと以外誘導培地と同じ）「３６」再生培地に移す。苗木が３〜５ｃｍ長に達したとき、ＳＨＧＡ培地（Ｓｃｈｅｎｋ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ塩およびビタミン（１９７２）；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌａｂｒ．）、１．０ｇｍ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇｍ／Ｌのスクロースおよび２．０ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．８）を含有するガラス製培養チューブにそれらを移して、苗条および根のさらなる成長および発達を可能にした。植物は本明細書で前に記載したのと同じ土壌混合物に移して、温室内で成長させ開花させる。種子生成のため受粉制御を行う。
【０２２３】
あるいは、バイナリーベクターを使用して、植物ゲノムに安定的に組み込まれ本明細書に開示するコード領域を含む１つまたは複数のキメラ遺伝子を含有する、トランスジェニックトウモロコシ植物を生成することができる。例えば、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、または７１の少なくとも１つのコード領域を含む植物はアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法に従い生成する。バイナリー形質転換ベクターを利用するトウモロコシの形質転換法は当技術分野で知られている。一実施形態では、形質転換組織はハロキシホップ含有培地で増殖するそれらの能力によって選択し、必要に応じてタンパク質産生に関してスクリーニングする。
【０２２４】
雌穂の滅菌および胚単離。トウモロコシの未熟な胚を、温室内で成長させた玉蜀黍（Zea mays）近親交配系Ｂ１０４の植物から得て、自己または自家受粉して雌穂を生成した。雌穂は受粉後約９〜１２日で採取した。実験日に、次亜塩素酸ナトリウム（６．１５％）の２０％溶液に浸すことによって殻を剥いた雌穂を表面滅菌し、２０〜３０分振とうし、次いで滅菌水で３回すすいだ。滅菌後、未熟な接合子胚（１．５〜２．４ｍｍ）をそれぞれの雌穂から無菌状態で切開し、液体接種培地を含有するマイクロ遠心分離チューブにランダムに分配した。接種培地は、２．２ｇｍ／ＬのＭＳ塩（Frame et al.,2011,Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe and E.C.Yeung,(Eds),SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA,LLC.pp327-341）、１×ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン（Frame et al.,2011、上記）、６８．４ｇｍ／Ｌのスクロース、３６ｇｍ／Ｌのグルコース、１１５ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、および２００μＭのアセトシリンゴン（ＤＭＳＯで調製）、ｐＨ５．４を含有する。所与の実験セットに、集めた雌穂由来の胚をそれぞれの形質転換に使用した。
【０２２５】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養の開始。バイナリー形質転換ベクターｐＤＡＢ１１１４４０（実施例１）を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＤＡｔ１３１９２（国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２０１６２２２（Ａ２））のグリセロールストックを、適切な抗生物質を含有するＡＢ最小培地プレート（Watson,et al.,(1975)J.Bacteriol.123:255-264）に画線し、３〜４日間２０℃で増殖させた。単コロニーを採取し、同じ抗生物質を含有するＹＥＰプレート（ｇｍ／Ｌ：酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ５）に画線し、１〜２日間２０℃でインキュベートした。
【０２２６】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の培養および同時培養。アグロバクテリウム（Agrobacterium）のコロニーをＹＥＰプレートから得て、５０ｍＬの使い捨てチューブ中の１０ｍＬ接種培地に縣濁し、分光光度計を使用して、０．２〜０．４のＯＤ５５０（５５０ｎｍで測定した光学濃度、細胞増殖の指標）に細胞密度を調節した。胚の切開を実施しながら、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の培養物を１２５ｒｐｍ（室温）においてロータリーシェーカーでインキュベートした。（滅菌したトウモロコシの中心部から事前に単離し、１ｍＬの接種培地に置いた）未熟な接合子胚を同じ培地で一回洗浄した。２ｍｌのアグロバクテリウム（Agrobacterium）縣濁液をそれぞれの胚用チューブに加え、１０〜１５分間シェーカープラットホームにチューブを置いた。胚盤を表を上に向けて同時培養培地に胚を移し、３日間５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において２４時間光の下で、２５℃でインキュベートした。同時培養培地は、４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ塩、１×ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、３．３ｍｇ／Ｌのジカンバ、ＫＯＨ中（３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解物、１５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、１００μＭのアセトシリンゴン、ＤＭＳＯ中、および３ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）、ｐＨ５．８を含有する。
【０２２７】
カルスの選択および推定事象の再生。同時培養期後、胚を静止培地に移し、５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において２４時間光の下で、３日間２５℃でインキュベートした。静止培地は、４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ塩、１×ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、３．３ｍｇ／Ｌのジカンバ、ＫＯＨ中、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１００ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解物、１５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ．；Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、および２．３ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）、ｐＨ５．８を含有する。胚は選択培地１（これは１００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ）を含む静止培地（前述）からなる）に移し、５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において暗期および／または２４時間光の下のいずれかで、７〜１４日間２８℃でインキュベートした。増殖した胚カルスは選択培地２（これは５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸（０．１８１０ｍｇ／Ｌ）を含む静止培地（前述）からなる）に移し、５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において２４時間の明期で、１４〜２１日間２８℃でインキュベートした。この選択ステップは、トランスジェニックカルスのさらなる増殖および分化を可能にした。
【０２２８】
増殖した胚カルスは再生前培地に移し、７日間２８℃で、５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において２４時間光の下で培養した。再生前培地は、４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ塩、１×ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン、４５ｇｍ／Ｌのスクロース、３５０ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、５０ｍｇ／Ｌのカゼイン酵素加水分解物、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、０．２５ｇｍ／ＬのＭＥＳ、０．５ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸、ＮａＯＨ中、２．５ｍｇ／Ｌアブシジン酸、エタノール中、１ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン、２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）、および５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸、ｐＨ５．８を含有する。苗条のような芽を有する胚カルスは再生培地に移し、７日間５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において２４時間光の下で培養した。再生培地Ｉは、４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ塩、１×ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン、６０ｇｍ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、１２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、３．０ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）、および５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸、ｐＨ５．８を含有する。主根を有する小さな苗条は苗条／根用培地、ＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ．；Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）中に移し、１４０〜１９０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度において１６時間：８時間の明期：暗期で、７日間２７℃でインキュベートした。苗条／根用培地は、４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ塩、１×ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、３．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）、ｐＨ５．８を含有する。定量リアルタイムＰＣＲまたは他の標準的分子分析技法により、導入遺伝子のコピー数に関して推定トランスジェニック苗木を分析し、土壌に移した。
【０２２９】
種子生成のための温室内でのＴ０植物の移動および樹立。５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸を含有する培地で成長するそれらの能力によって選択した形質転換植物組織をＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ３６０無土壌成長培地（ＳＵＮ  ＧＲＯ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ）に移し、成長室で寒気に曝して強くした。次いで植物はＳＵＮＳＨＩＮＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ  １６０土壌混合物に移し、温室内で成長させ開花させた。種子生成のため受粉制御を行う。
【０２３０】
選択したＴ０植物の葉組織をＶ−３〜Ｖ−５段階でサンプリングした。２つの６ｍｍ径の葉サンプルを、分析の日まで、−８０℃で９６ウェルクラスターチューブ用ラック中に保存した。２つのＤＡＩＳＹ（商標）スチール製ＢＢおよび２００μＬの抽出バッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および５μＬ／ｍｌのＳＩＧＭＡプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰＢＳ溶液（カタログ番号９５９９））を各チューブに加えた。最大設定で３分間、サンプルをＫＬＥＣＯビーズミル（Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）で粉砕した。サンプルは５分間３，０００×ｇで遠心分離し、次いで１００μＬの上清を空のサンプルチューブに移した。別の１００μＬの抽出バッファーを植物サンプルに加え、さらに３分間ビーズで粉砕した。再度の遠心分離後、１００μＬのこの抽出物を最初の１００μＬと組合せた。組合せた上清を混合し、抽出と同じ日に分析した。
【０２３１】
葉組織の測定領域から抽出したタンパク質を、標準的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはタンパク質イムノブロット（ウエスタンブロット）によって、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質およびＡＡＤ−１タンパク質の発現に関して分析した。Ｃｒｙ１ＦａのＥＬＩＳＡによる検出用に、ＥＮＶＩＲＯＬＯＧＩＸ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＡＰ０１６ＮＷ  Ｖ１０；Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）からの試薬を製造者の説明書に従い使用した。ＡＡＤ−１の検出は、精製ＡＡＤ−１タンパク質に対して調製したウサギ抗体を使用して、（例えば、Ausubel et al.(1995 and updates) Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York中に教示されたように）標準的なＥＬＩＳＡ法によって実施した。
【０２３２】
ｐＤＡＢ１１１４４０形質転換植物の抽出物から得たＥＬＩＳＡの結果は、表２９において開示する。タンパク質のレベルは、採取した葉領域１平方センチメートル当たりで検出した対象タンパク質のｎｇとして表す。
【０２３３】
【表２９】
2014515609.tif 000030
【０２３４】
表２９中に列挙した５つのｐＤＡＢ１１１４４０形質転換植物のタンパク質抽出物（および非形質転換陰性対照植物からの抽出物）を前述のように調製し、イムノブロット（ウエスタンブロット）でＣｒｙ１Ｆａ抗体を用いてプローブ処理した。イムノブロット手順は、Gallagher et al.(2008;Immunoblotting and Immunodetection. Current Protocols in Immunology 8.10.1−8.10.28)により記載されたのとほぼ同じであった。タンパク質サンプル（８０μＬ）は２０μＬのＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファーと混合し、５分間＞９０℃に加熱し、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルに載せ、ＭＯＰＳ  ＳＤＳランニングバッファーに施した（２００ボルト、４５分）。ＢＩＯＲＡＤ  ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＰＬＵＳ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓを別のレーンに載せた。製造者の説明書に従いＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ｉＢＬＯＴ  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒシステムによって、０．２μＭのニトロセルロース膜にタンパク質を移した。膜はＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＲＥＥＺＥ  ＢＬＯＣＫＩＮＧ  ＭＩＸでブロッキングし、次いで一次抗体（抗Ｃｒｙ１Ｆ精製ウサギ抗体Ｎｏ．Ｄ０６０９ＲＡ０７−Ａ０；Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）、次に二次抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体）と反応させた。これにＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＨＲＰ−ストレプトアビジン結合体を続け、ＰＩＥＲＣＥ  ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＷＥＳＴ  ＰＩＣＯ  ＬＵＭＩＮＯＬ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ  ＡＮＤ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＥＲＯＸＩＤＥ（Ｎｏ．３４０８０）により反応したバンドを検出した。
【０２３５】
陽性対照レーンは、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）発現系における完全長Ｃｒｙ１Ｆａコード領域の発現によって生成した、０．５ｎｇまたは１．０ｎｇの精製Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を含有していた（例えば、米国特許出願第２０１００２６９２２３Ａ１号参照）。完全長Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をトリプシン処理して、推定分子量サイズ６８ｋＤａのＣｒｙ１Ｆａコア毒素セグメントを切り離し、イムノブロットにおける陽性対照標準としてこれを使用した。陰性対照植物からの抽出物において抗体反応があったバンドは検出せず、一方５つ全てのトランスジェニック植物の抽出物は、７５ｋＤａより幾分大きな推定サイズの（対照Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質と強度がほぼ等しい）１つの主要バンドを含有していた。
【０２３６】
害虫の防除方法。昆虫がトランスジェニック植物の発現によって送達された有効量の毒素と接触すると、その結果は典型的には昆虫の死であり、または昆虫は、毒素が昆虫に有効となるその供給源を食さない。
【配列表】
2014515609000001.app
【国際調査報告】
2014515609.tif 000031
2014515609.tif 000032
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