(57)【要約】  焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる方法が、未焙煎コーヒー中のアスパラギン含有率を減少させること及びアスパラギン酸含有率を減少させることを含み、前記焙煎コーヒーは、前記未焙煎コーヒーから前記アスパラギン含有率を減少させ、及び前記アスパラギン酸含有率を減少させた後に得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる方法であって、未焙煎コーヒー中のアスパラギン含有率を減少させること及びアスパラギン酸含有率を減少させることを含み、前記焙煎コーヒーは、前記アスパラギン含有率が減少し及び前記アスパラギン酸含有率が減少した後の前記未焙煎コーヒーから得られることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記のようにアスパラギン含有率を減少させることが、前記アスパラギンを酵素的に分解することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のようにアスパラギン酸含有率を減少させることが、前記アスパラギン酸を酵素的に分解することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記未焙煎コーヒーを水で抽出し、水抽出物及び抽出された未焙煎コーヒーを得て、前記水抽出物を前記の抽出された未焙煎コーヒーから分離することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
水中への前記抽出が、５０℃〜９０℃の温度で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記温度が８０℃である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
水への前記抽出が３〜１２時間実施される、請求項４〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記時間が５時間である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アスパラギンを前記のように酵素的に分解することが、アスパラギナーゼを含む酵素製剤で前記水抽出物を処理することを含む、請求項２に付随する請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アスパラギン酸を酵素的に分解することが、アスパルターゼを含む酵素製剤で前記水抽出物を処理することを含む、請求項３に付随する請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水抽出物の処理が、前記酵素製剤を２５〜６０℃で作用させることを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記温度が３７℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水抽出物の処理が、前記酵素製剤を１０分〜１２０分間作用させることを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記時間が３０分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記水抽出物の処理が、溶液中の酵素、固定化された酵素、未精製の細菌溶解物、固定化された細菌からなる群から選択されるアスパラギナーゼ活性の供給源を使用することを含む、請求項９に記載の又は請求項９に付随する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水抽出物の処理が、溶液中の酵素、固定化された酵素、未精製の細菌溶解物、固定化された細菌からなる群から選択されるアスパルターゼ活性の供給源を使用することを含む、請求項１０に記載の又は請求項１０に付随する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記水抽出物を脱カフェインすることを含む、請求項４に記載の又は請求項４に付随する請求項５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記処理の後、前記水抽出物を濃縮して、濃縮された水抽出物を得ることを含む、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記濃縮が、真空下、４０〜８５℃で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記温度が５０℃である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記濃縮が、大気圧下における蒸発、透析蒸発、凍結による濃縮、逆浸透及びナノ濾過からなる群から選択される手順により達成される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記の抽出された未焙煎コーヒーを乾燥することを含む、請求項４に記載の又は請求項４に付随する請求項５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
１０〜３０重量％の水分を有する乾燥した抽出された未焙煎コーヒーが得られるまで前記乾燥を続ける、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水分が２０〜２５重量％である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の濃縮された水抽出物を前記の乾燥した抽出された未焙煎コーヒーに再混入することを含む、請求項４〜２２のいずれか１項に付随する請求項２３に記載の、又は請求項４〜２３のいずれか１項に付随する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記再混入が、水分を含む再混入された未焙煎コーヒーが得られるまで、前記の濃縮された水抽出物が前記乾燥した抽出された未焙煎コーヒーに吸収されることを可能にすることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
残留水分が８〜１２．５重量％である乾燥した再混入された未焙煎コーヒーが得られるまで、水分を含む再混入された前記未焙煎コーヒーを乾燥することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記残留水分が１０重量％である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記未焙煎コーヒーを焙煎することを含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記未焙煎コーヒーが未焙煎コーヒー豆である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焙煎コーヒー中のアクリルアミドの含有率を減少させる方法に関する。
【０００２】
アクリルアミド（２−プロペンアミド）は、アクリル酸のアミドであり、デンプンに富むか又は高温で熱処理にかけられた食品中におけるその形成が、Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｅｎｃｙ（ＳＮＦＡ）及びストックホルム大学の研究者により２００２年４月に初めて確認され報告された。それ以来、同様な報告が、英国、ノルウエイ及び米国を含む多くの他の国から出されている（ＦＡＯ／ＷＨＯ「Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ」、Ｓｅｓｓｉｏｎ  ３６、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ（ＮＬ）、２２−２６  Ｍａｒｃｈ  ２００４）。
【０００３】
アクリルアミドは、変異原性、発癌性及び神経毒効果を生じ得る。この化合物の変異原作用は、哺乳動物細胞、体細胞及び生殖細胞の両方においてインビトロ及びインビボで示され、アクリルアミドが遺伝性の変異を生じ得ることも示されている。アクリルアミドは、それが種々の器官（例えば甲状腺、副腎腺及び生殖腺）における一定数の良性及び悪性の腫瘍の発生率における増加を生じさせるので、動物において発癌性であるが、発癌作用がヒトにおいても出現することを先験的に排除することはできない。末梢神経病理（構造的及び機能的病変）により本質的に表される神経毒効果が、動物における実験レベル、及びヒトにおける臨床レベルの両方で確認されている（「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ」、２００２、ＥＵＲ  １９８３５  ＥＮ、２４、１〜２０７頁、Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ、ルクセンブルク）。
【０００４】
アクリルアミドを発見することが可能な食品は、ジャガイモを主成分とする食物及び穀類を主成分とする食物であることが最も多いが、それでも、アクリルアミドは、焙煎コーヒー中にも存在する。特に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  （ＥＦＳＡ）は、以下の食品にはリスクがあると考え、その結果、それらを２００７年から２００９まで監視した（サンプリング及び分析を通じて）：「フレンチフリース」（スティック形のフライドポテト）、「ポテトチップス」（薄くてパリッとした薄片として成形されたフライドポテト）、家庭料理用ジャガイモを主成分とする製品、パン、朝食のシリアル、ビスケット、穀類を含有する乳幼児食物、焙煎コーヒー（「Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｎ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｙｅａｒｓ  ２００７−２００９  ａｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」，ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１；９（４）：２１３３））。
【０００５】
定量的観点から、最もリスクがある食品中において、アクリルアミドは、極端に変動し得る濃度で検出された（μｇ／ｋｇ＝ｐｐｂで表される）。例えば、「フレンチフリース」タイプのフライドポテトでは、４５０ｐｐｂと１２００ｐｐｂの間で変動するアクリルアミドの平均濃度が検出されたが、ビスケット及びクラッカーでは、４１０ｐｐｂに等しいアクリルアミドの平均濃度が検出された（Ｋｅｒａｍａｔ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：「ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，ｐｐ．３４０−３６３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。焙煎コーヒーでは、検出されたアクリルアミドの濃度は、４５ｐｐｂと３７４ｐｐｂの間に含まれた（Ａｎｄｒｚｅｊｅｗｓｋｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｂｙ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．７，２００４，ｐｐ．１９９６−２００２）。
【０００６】
未だに科学的研究の目的である上記の食品中におけるアクリルアミドの形成を説明するために種々の機構が提案されている。原理的に、アクリルアミドは、実際、調理中に種々の食物で生じる反応の複合系であるＭａｉｌｌａｒｄ反応を経て形成される。簡単にいえば、Ｍａｉｌｌａｒｄ反応は、アミノ酸と還元性の炭水化物（フルクトース、グルコース）との縮合プロセスを含む。関与するアミノ酸は、アスパラギンであるが、還元性糖類の代替物として、反応性カルボニル（α−ジカルボニル、ｎ−アルデヒド、２−オキシ酸など）を含有する化合物が介在し得る。アスパラギンと還元性炭水化物又は反応性カルボニルとの縮合により、イミン即ちシッフ塩基が形成され、それが脱炭酸される。脱炭酸されたシッフ塩基は、択一的に、アクリルアミドとイミンとに分解するか、又は加水分解により３−アミノプロピオンアミド（３−ＡＰＡ）を生じることができ、３−ＡＰＡは続いて起こる脱アミノ化により、アクリルアミドを形成し得る（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ：「Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１５，２００８，ｐｐ．６１１３−６１４０）。アスパラギン／炭水化物又はアスパラギン／反応性カルボニル縮合に加えて、アクリルアミド形成の代替経路が、仮説として取り上げられている（上で引用したＫｅｒａｍａｔ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）。例えば、脂質（モノグリセリド、トリグリセリド）の酸化分解により、アクロレイン（アクリルアルデヒド）が形成され得て、それがアクリル酸に酸化され得て、後者が、アンモニアと反応することにより、アクリルアミドを形成する。脱アミノ化によりアクリルアミドを形成する３−ＡＰＡは、アスパラギンとピルビン酸との反応により生成し得る（上記のシッフ塩基の加水分解によるのに加えて）。セリンというアミノ酸の脱水及びシステインというアミノ酸の脱硫によりピルビン酸が生成し、それは還元されて乳酸になることができ、次に後者が脱水されてアクリル酸になり、それがアンモニアと反応することにより、アクリルアミドを形成する。アスパラギン酸、β−アラニン及びカルノシン（β−アラニンとヒスチジンから構成されたジペプチド）は、熱的に分解してアクリル酸となり、それは、アンモニアの存在で、アクリルアミドを形成する。さらに、アスパラギン酸は、脱炭酸と脱アミノ化プロセスの組合せによりアクリル酸を生成することができる（Ｙａｙａｌｙａｎ  Ｖ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．「Ａｃｒｉｌａｍｍｉｄｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｏｄ：Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００５，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；８８（１）：２６２−７）。
【０００７】
上で説明したことから、種々の食物が受ける熱処理中の、特にグリーンコーヒーの焙煎中のアクリルアミドの形成は、化学的に複雑で、定量的に無視できない現象であり、消費者の健康に対する過小評価できない影響があることは明らかである。
【０００８】
その結果として、ある方法が、焙煎コーヒー中のアクリルアミドの濃度を減少させるために提案された。
【０００９】
焙煎中のコーヒー豆のスチーム処理が、実験的に評価された（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．「Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｒｏａｓｔｉｎｇ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｆｆｅｅ」  ＡＳＩＣ  ２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１１−１５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００６，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。グリーンコーヒーが、スチーム噴射を備えた焙煎装置中で、２００〜２４０℃の温度、０．０４と０．１６の間に含まれるａｗ（水分活性）値で焙煎された。焙煎時間は、ＣＴＮ（「Ｃｏｌｏｕｒ  Ｔｅｓｔ  Ｎｅｕｈａｕｓ」、最終焙煎点を決定するのに使用される反射率比色単位）値が９０に等しくなるように選択された。そのように製造された焙煎コーヒーを、それらのアクリルアミド含有率を決定するために分析して、分析結果を従来の方式（即ち、スチーム噴射なし）で焙煎されたコーヒーから得られた値と比較された。
【００１０】
スチーム噴射により焙煎されたコーヒー及び従来通り焙煎されたコーヒー中のアクリルアミドの定量の実施に加えて、スチーム噴射により焙煎されたコーヒーから抽出されたコーヒー飲料の試料及び従来通り焙煎されたコーヒーから抽出されたコーヒー飲料の試料が、センサー分析にかけられた。
【００１１】
上記の比較定量の結果により、スチーム噴射により焙煎されたコーヒーの試料は、従来通り焙煎されたコーヒーの試料より少ししかアクリルアミドを含有しないことが示された。その理由は、類似のＣＴＮ値に達するために、スチーム噴射による焙煎に、従来の焙煎より長い焙煎時間が必要であること、そのため熱処理が長くなり、焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率が減少するからである。事実、アクリルアミドの形成は熱処理により実際に誘発されるけれども、アクリルアミドの（物理的及び化学的）分解の現象は焙煎サイクルの終わりに向かって進行が行きわたる傾向があるのに対して、アクリルアミド形成反応は、焙煎サイクルの初めに存在する。
【００１２】
それにも拘わらず、比較のセンサーによる分析の結果により、上で開示された方法は、スチーム噴射により焙煎されたコーヒーの、上記の焙煎時間の延長による感覚器を刺激する性質の望ましくない変化という大きな弱点を有することが示された。
【００１３】
それ故、化学的観点からだけならば、コーヒーをスチーム噴射により焙煎することは、アクリルアミドの問題を解決することに貢献できるが、それにも拘わらず感覚器刺激性という観点から、スチーム噴射により焙煎されたコーヒーの性質は満足のいくものではなく、製品を上市するために明白な欠点がある。
【００１４】
ＷＯ２００４／０３７００７には、焙煎コーヒーにおけるアクリルアミド含有率を減少させる方法が開示されている。該方法は、特異的酵素（アスパラギナーゼ）を含有する水溶液を使用することにより、アクリルアミドの前駆体、即ちアスパラギンを酵素分解することを提供する。グリーンコーヒー中のアスパラギン含有率をこのようにして減少させた後、グリーンコーヒーを焙煎して、前駆体が定量的に減少するとすれば、焙煎中に形成されるアクリルアミドは最小量になるであろう。上記の酵素処理の準備として、ＷＯ２００４／０３７００７は、グリーンコーヒー豆を：
−グリーンコーヒーと酵素との接触表面を増加させるためにコーヒー豆を断片に縮小すること（製粉、粉砕）；
−セルロースを、したがって豆の構造を分解するために、コーヒー豆をセルラーゼ、ヘミセルラーゼ及び／又はペクチナーゼの作用に曝すこと；
−豆の孔を開いて、酵素を含有する水溶液が豆の内部に浸透することを促進するために、コーヒー豆を乾燥すること、又はコーヒー豆を低圧又は大気圧のスチームで処理すること
を含む種々の処理にかけることを提供する。
【００１５】
ＷＯ２００４／０３７００７で開示された方法の決定的な欠点は、グリーンコーヒー豆に施さなければならない種々の準備処理が複雑であることであり、それは、溶液中の酵素とグリーンコーヒー豆に含有されるアスパラギンとの効果的な相互作用を得るために実質的に必要不可欠と思われる。ＷＯ２００４／０３７００７で開示された方法により提供される多様な前処理は、処理を実行することを特に複雑に且つ実質的に不経済にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３７００７
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ＦＡＯ／ＷＨＯ「Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ」、Ｓｅｓｓｉｏｎ  ３６、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ（ＮＬ）、２２−２６  Ｍａｒｃｈ  ２００４
【非特許文献２】「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ」、２００２、ＥＵＲ  １９８３５  ＥＮ、２４、１−２０７、Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ、ルクセンブルク
【非特許文献３】「Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｎ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｙｅａｒｓ  ２００７−２００９  ａｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」，ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１；９（４）：２１３３
【非特許文献４】Ｋｅｒａｍａｔ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：「Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，ｐｐ．３４０−３６３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
【非特許文献５】Ａｎｄｒｚｅｊｅｗｓｋｉ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ  ．  「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｂｙ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．７，２００４，ｐｐ．１９９６−２００２
【非特許文献６】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ：「Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１５，２００８，ｐｐ．６１１３−６１４０
【非特許文献７】Ｙａｙａｌｙａｎ  Ｖ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．「Ａｃｒｉｌａｍｍｉｄｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｏｄ：Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００５，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；８８（１）：２６２−７
【非特許文献８】Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ  ．  「Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｒｏａｓｔｉｎｇ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｆｆｅｅ」  ＡＳＩＣ  ２１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１１−１５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００６，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的の１つは、焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる方法を改善することである。
【００１９】
他の目的は、焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を、焙煎コーヒーの感覚器を刺激する性質を変化させずに減少させる方法を提供することである。
【００２０】
さらなる目的は、焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させるための、時間及び／又は金銭の過剰な消費をもたらさないように、コーヒー豆の複雑な物理的及び／又は化学的前処理を必要としない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明により、焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させるための、請求項１で規定される方法が提供される。
【００２２】
本発明による方法は、驚くべきことに予想されず、脱カフェイン手順中にグリーンコーヒー豆、即ち未焙煎コーヒーから得られた水抽出物に対してＩＬＬｙｃａｆｆｅ  Ｓ．Ｐ．Ａ．により実施された一連の研究の結果の本質をなす一連の実験的根拠に基づく。
【００２３】
第一に、上記の水抽出物中に、アスパラギン及びアスパラギン酸が殆ど等しいか又はしかしながら非常に平均に近い濃度（μｇ／ｇ＝ｐｐｍで示される）で存在することが見出された。この実験的証拠は、既知の科学的文献（Ｍｕｒｋｏｖｉｃ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｇｒｅｅｎ  ｃｏｆｆｅｅ」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６９，２００６，ｐｐ．２５−３２）と矛盾する。この文献によれば、アスパラギン酸は、グリーンコーヒー中に最大濃度２００μｇ／ｇ未満で存在し、一方アスパラギンの最大濃度は９６０μｇ／ｇに達するということで、その結果として、アスパラギン酸は、アクリルアミドの前駆体の中に挙げられているけれども、グリーンコーヒーの焙煎中におけるアクリルアミドの形成においてアスパラギンより重要性が小さいと考えられる。それとは反対に、アスパラギン酸はグリーンコーヒー中にアスパラギンと比較して無視できない濃度で存在するので、焙煎中のアクリルアミドの形成におけるアスパラギン酸の重要性は、アスパラギンの重要性と少なくとも同程度であろう。このことに、アスパラギナーゼによるアスパラギンの酵素分解は（ＷＯ２００４／０３７００７で開示されたように）アスパラギン酸を生成させ、それが、グリーンコーヒー中に元から既に存在するアスパラギン酸に加わることを付け加えなければならない。
【００２４】
アスパラギン及びアスパラギン酸を選択的に分解するのに適した酵素（アスパラギナーゼ、アスパルターゼ）は、上記の水抽出物において、カフェインとグリーンコーヒーの他の化学的成分とが同時に存在しても有効に作用することができること、及び水抽出物は、アスパラギナーゼ及びアスパルターゼによる酵素処理後、グリーンコーヒー中に再混入され得ることも見出された。コーヒーの化学的成分を、したがってコーヒーの芳香プロファイルの原因となる物質を豆に再混入する可能性は、本発明による方法が、焙煎コーヒー及びそれから抽出されたコーヒー飲料中における感覚器を刺激する性質を変化させずに保つことを可能にする原因となる。
【００２５】
水抽出物中に含有されるアスパラギン酸（グリーンコーヒー中に元から存在したもの、及びアスパラギンの酵素分解により生成したものの両方）は、アスパルターゼにより酵素的に分解され、その結果フマル酸が生成する。コーヒーの化学的成分の中に含まれる後者（Ｍａｉｅｒ  Ｈ．Ｇ．「Ｔｈｅ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ｃｏｆｆｅｅ」，１９８７，ＡＳＩＣ，１２ｅ  Ｃｏｌｌｏｑｕｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒ  ｌｅ  Ｃａｆｅ，Ｍｏｎｔｒｅｕｘ）は、完成した製品の感覚器を刺激する性質を変化させず、アクリルアミドの形成のプロセスに関与しない。特に、フマル酸は、アスパルテートアンモニア−リアーゼ（Ｅ．Ｃ．番号４．３．１．１．）がアスパルターゼ活性を有する酵素として使用される場合に生成する。
【００２６】
それでも、アスパラギン酸をアクリルアミドの前駆体でない分子に変換する能力を有する他の知られた酵素も、上記の酵素の代わりに及び／又は一緒に使用することが可能である。
【００２７】
この方式で、アクリルアミドの２種の重要な前駆体、即ちアスパラギン及びアスパラギン酸の含有率が減少したグリーンコーヒーを得ることが可能である。このグリーンコーヒーは、既知の焙煎方法を使用してこのように焙煎することができて、このようにして得られた焙煎コーヒーは、アクリルアミドの濃度の値が減少している。
【００２８】
既知の方法と異なり、本発明による方法は、グリーンコーヒー豆から水相抽出物を得ることで十分なので、ＷＯ２００４／０３７００７で提供されたようなコーヒー豆の手の込んだ化学的及び物理的前処理を含まないことは強調されるべきである。抽出物は、グリーンコーヒーを脱カフェインするために使用される以下の既知の手順（ＣＡ１２０３１１１に開示されている）により得ることができる。したがって本発明による方法は、アクリルアミド含有率が減少した焙煎コーヒーが、時間及び／又は金銭の過剰な消費を必要とせずに、製造されることを可能にする。科学的文献（上で引用した、Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．）で開示されたものと異なり、従来の焙煎方法及び、特に、焙煎時間が過剰に長くない方法を使用することが可能である。それ故、本発明による方法は、アクリルアミド含有率が減少し、所望の感覚器を刺激する性質が変化しないままであり、消費者により高く評価される焙煎コーヒーが得られることを可能にする。焙煎コーヒー中に変化していない感覚器を刺激する性質を保存（preservation）することは、酵素処理が水抽出物に対して実施され、それが続いて後者に含有される溶質の損失なしにグリーンコーヒー豆中に再混入されるという事実にさらに基づく。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
非限定例として、本発明による方法に基づき、アクリルアミド含有率が減少した焙煎コーヒーが製造されることを可能にする工業的手順を下に開示する。
【実施例】
【００３０】
実施例１  アクリルアミド含有率が減少した焙煎コーヒーの製造
１．２ｋｇに等しい多量のグリーンコーヒー豆（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）を、容量１０リットルの知られたタイプの抽出装置に入れる。抽出装置中に一定量の抽出液体、即ち７．５リットルに等しい水を挿入した後、コーヒー豆を８０℃の温度で５時間の間抽出（水中）する。
【００３１】
この抽出工程は、５時間未満又はそれを超えて、特に３時間と１２時間の間に含まれる時間実施することができる。
【００３２】
さらに、抽出工程中、温度は８０℃未満であるか又はそれを超えることができ、特に、５０℃と９０℃の間に含まれてよい。
【００３３】
抽出工程の全持続時間の間、系は一定の攪拌下に保ち、形成されるスチームは凝縮させて抽出装置に還流させる。
【００３４】
抽出工程の終わりに、水抽出物及び抽出されたグリーンコーヒーが得られて分離される。したがって「抽出されたグリーンコーヒー」又は「抽出された未焙煎コーヒー」により、グリーン（未焙煎）コーヒーは、抽出処理されたコーヒー豆を意味する。
【００３５】
アスパラギン及びアスパラギン酸を含有する水抽出物は、約６リットルに等しい体積及び約５．０〜５．５に等しいｐＨを有する。水抽出物を冷却し、適当な容量を有する容器中で３７℃に維持して、恒温攪拌装置中に入れ、その中でアスパラギンを分解するために適した少なくとも１種の酵素、即ちアスパラギナーゼ、及びアスパラギン酸を分解するために適した少なくとも１種の酵素、即ちアスパルターゼを含有する溶液（０．３０ｍｌ）と混合する。
【００３６】
アスパラギナーゼとして、大腸菌から得られたアスパラギナーゼの酵素製剤（ＳＩＧＭＡ、Ｎｏ．Ａ３８０９、１００単位）、又はクロカビから得られたアスパラギナーゼの酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＮＡＮ）を使用することができる。
【００３７】
アスパルターゼとしては、大腸菌から得られたアスパルターゼの酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＡＮＮ）を使用することができる。
【００３８】
酵素処理で使用すべきアスパラギナーゼ及びアスパルターゼの量、即ち単位数は、反応条件により可変である。
【００３９】
事実として、プロセスは、大量の上記の酵素を短縮された反応時間作用させるか、又は酵素の量を減少させ、反応時間を延長して作用させることにより最適化することができる。
【００４０】
その結果、反応時間も可変であり、使用される酵素の量と適合して反応の完結を可能にするように選択される。例えば、反応時間は、１０分と１２０分の間に含まれ、特に、３０分に等しくすることができる。
【００４１】
反応温度も、使用される酵素の性質に基づいて変化させることができ、それ故３７℃を超えるか又は未満にすることができる。特に、反応温度は、２５℃と６０℃の間に含まれ得る。
【００４２】
酵素処理を実施するために、上記のアスパラギナーゼ及びアスパルターゼを主成分とする酵素製剤に加えて、（必要であれば、反応環境及び／又は当業者に明らかな方式による条件を改変して）任意の他の（工業的に適用可能な）アスパラギナーゼ又はアスパルターゼ活性の供給源を使用することは明らかに可能である。
【００４３】
アスパラギナーゼ又はアスパルターゼ活性の上記の供給源は、溶液中の酵素、固定化された酵素（不均一相における生物学的触媒）、未精製の細菌の溶解物、固定化された細菌からなる群から選択することができる。
【００４４】
アスパルターゼ活性の上記の供給源の使用に加えて、アスパラギン酸を知られた非酵素的化学的手順を使用することにより化学的に分解することが可能である。
【００４５】
水抽出物を２種の異なる、一方はアスパラギナーゼを含み及び他方はアスパルターゼを含む溶液と順に混合し、前に開示したように適当な反応時間及び温度を選択することにより、アスパラギナーゼによる酵素処理をアスパルターゼによる酵素処理から分離することも可能である。
【００４６】
それ故、アスパラギナーゼを水抽出物に加えて、反応の完結を可能にするために十分な時間が経過した後、アスパルターゼを水抽出物に加えてこの第２の反応の完結を待つことが可能である。
【００４７】
あるいは、アスパルターゼによる処理を、アスパラギナーゼによる処理に先行させることもできる。
【００４８】
酵素処理が終了したら、水抽出物を、真空下でロータリーエバポレーターにより、５０℃の温度で、体積が１リットルになるまで濃縮する。
【００４９】
この濃縮工程は、５０℃未満又はそれを超える温度で、特に４０℃と６５℃の間で実施することができる。
【００５０】
濃縮工程においては、例えば、大気圧下の蒸発、透析蒸発、凍結による濃縮（凍結濃縮）、逆浸透及びナノ濾過などの他の知られた手順も使用することができる。
【００５１】
水抽出物の酵素処理及びそれに続く濃縮と並行して、抽出されたグリーンコーヒーを、８０℃の温度で、水分が１０重量％と３０重量％の間、特に２０重量％と２５重量％の間に達するまで部分的に乾燥する。
【００５２】
抽出されたグリーンコーヒーが所望の含水率に達したとき、例えば２０重量％と２５重量％の含水率であるとき、濃縮された水抽出物はグリーンコーヒー中に再混入され、再混入されたグリーンコーヒーが得られる。
【００５３】
したがって「再混入されたグリーンコーヒー」、又は「再混入された非焙煎コーヒー」により、豆の中に濃縮された水抽出物が再混入されたグリーン（未焙煎）コーヒー、即ち、抽出工程中に抽出された物質（コーヒー成分）が回収された即ちグリーン（未焙煎）コーヒーが意味される。
【００５４】
これは、抽出されたグリーンコーヒーを適当な容器に入れて、濃縮された水抽出物を加え、周囲温度で１時間混合することにより得られる。
【００５５】
アスパラギン及びアスパラギン酸含有率の低い、水分を含む再混入されたグリーンコーヒーはこのようにして得られ、それは８０℃の温度で、残留水分が８重量％と１２．５重量％の間、特に１０重量％に達するまで、再び乾燥される。
【００５６】
この方式で、再混入された乾燥グリーンコーヒーが得られ、それはアスパラギン及びアスパラギン酸含有率が低く、知られた焙煎方法を使用することにより容易に焙煎される。
【００５７】
このようにして製造された焙煎コーヒーは、アクリルアミド含有率が減少しており、特に、上記の焙煎コーヒーにおいてはアクリルアミドの減少が８０％を超える。
【００５８】
上で開示された手順の品質管理を実施するために、酵素処理された水抽出物及び／又は焙煎コーヒーのサンプルを採取して、採取された試料を分析にかけることが可能である。
【００５９】
特に、酵素処理された水抽出物の試料は、アスパラギン及びアスパラギン酸の残留濃度を確認するために、例えば、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析法）などの知られた方法により分析することができる。
【００６０】
焙煎コーヒーの試料は、アクリルアミドの濃度を確認して残留アクリルアミドの濃度を制御するために、粉砕され、そのようにして得られた焙煎コーヒー粉末を、例えばＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法）などの知られた方法により分析することができる。
【００６１】
実施例１で示される多数のパラメーターの値（使用された原料の量、抽出のために使用された水の体積、抽出装置の容量、抽出工程の持続時間、その他）は、単なる例であり、それ故、得ることが望まれる最終製品（焙煎されたコーヒー）の量及び／又は感覚器を刺激する性質に基づいて、当業者により適当に改変され得ることは留意すべきである。
【００６２】
それに加えて、実施例１で開示された工業的手順により製造された焙煎コーヒーは、再混入する工程でコーヒーの全成分が回収されるので、カフェインを含有するコーヒーであることは留意すべきである。
【００６３】
しかしながら、脱カフェイン工程を酵素処理工程の前に置くことにより、上記の手順を改変することが可能である。
【００６４】
脱カフェイン工程は、ＣＡ１２０３１１１で開示された手順により、即ち水抽出物を、ポンプ及びフィルターを使って、あるいは、抽出装置及び知られたタイプの活性炭又は吸着樹脂を含む吸着カラムを通すことにより、実施することができる。この方式で、酵素処理される前に、水抽出物からカフェインが除かれる。
【００６５】
活性炭のカフェインに対する選択性を増大させるために、例えば、ＵＳ５２０８０５６に開示されたように、活性炭にコーヒー水抽出物中に存在する１種又は複数物質を予め詰める（吸着により）ことが可能である。この方式で、コーヒーの水抽出物中に存在する上記の物質と活性炭に吸着した同じ物質との化学的平衡を成り立たせることができる。その結果として、活性炭は、大量のカフェインを吸着するようにされる。例えば、活性炭に、糖類を含有する水溶液を予め詰めることができる（Ｈｅｉｌｍａｎｎ  Ｗ．「Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｅｃｏｆｆｅｘ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｇｒｅｅｎ  ｂｅａｎ  ｄｅｃａｆｆｅｉｎａｔｉｏｎ」  １９９１，１４ｅ  Ｃｏｌｌｏｑｕｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒ  ｌｅ  Ｃａｆｅ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；ＵＳ５２０８０５６）。糖類は、ショ糖及び／又はグルコースを含むことができ、それに対して酸は酢酸、塩酸、ギ酸を含むことができる（ＵＳ５２０８０５６）。
【００６６】
脱カフェイン工程は、他の知られた方法によっても実施することができる。但し、これらの方法は、カフェインの抽出溶媒として水を使用し、したがって、「水脱カフェイン」法と定義できる。
【００６７】
脱カフェイン工程は、酵素処理後に、酵素処理された水抽出物を吸着カラムに通すことによっても、実施することができる。
【００６８】
さらに別法として、脱カフェイン工程は、酵素処理中に、例えば吸収カラム内に即ち活性炭又は吸着樹脂上に酵素を固定化することにより、実施することができる。
【００６９】
それに加えて、アスパラギナーゼを用いる酵素処理とアスパルターゼを用いる酵素処理とを分離することが可能であれば、その結果として２通りの異なる酵素処理間に脱カフェイン工程を挿入することが可能である。
【００７０】
したがって、水抽出物をアスパラギナーゼで処理して、酵素処理された水抽出物を吸着カラムに通し、それに続いて脱カフェインされた水抽出物をアスパルターゼで処理することが可能である。
【００７１】
あるいは、水抽出物をアスパルターゼで処理して、酵素処理された水抽出物を吸着カラムに通し、それに続いて脱カフェインされた水抽出物をアスパラギナーゼで処理することが可能である。
【００７２】
脱カフェインの目的のために、水による抽出は、実施例１で言及したように５時間を超えて長く行わなければならず、抽出工程の合計持続時間は、当業者周知の基準に従って、即ち到達されるべき残留カフェイン含有率に基づいて確立することができる。
【００７３】
Ｉｌｌｙｃａｆｆｅ  Ｓ．ｐ．Ａ．により実施された上記の研究において、グリーンコーヒーの水抽出物に対して使用された分析及び実験手順の幾つかを、例として下に開示する。
【００７４】
実施例２  アクリルアミドのアミノ酸前駆体の抽出
グリーンコーヒー粒（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）３０ｇを、線が引かれた３頸容器（lined three-neck container）中に入れて１８０ｍｌの水と接触させた。容器を、サーモスタットにより温度を８０℃に、及びマグネチックスターラーにより一定の攪拌下に保った。抽出は５時間実施し、その間形成されたスチームは還流により容器中に凝縮させた。
【００７５】
５時間経過後、ｐＨ５．５の水抽出物を回収して、アクリルアミドのアミノ酸前駆体の定性定量を行った。精製され誘導体化された試料が、「ＥＺ：ｆａａｓｔ（商標）−Ｆｒｅｅ（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と称するキット（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ，Ｎｏ．ＫＧ０−７１６６）を用いて抽出物から得られ、試料をＧＣ−ＭＳで分析した。機器分析のために、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＳＡの「ＺＢ−ＡＡＡ１０ｍ×０．２５ｍｍアミノ酸分析ＧＣカラム」というガスクロマトグラフカラム（キットに含まれる）及びガスクロマトグラフ／質量分光計システムを使用した。
【００７６】
上で開示された分析は、異なった地理的出所のＣ．ａｒａｂｉｃａの複数の試料に対して実施した。分析結果は以下の表Ａに示す。
【表１】
2014518085.tif 000002
表Ａに示した分析結果に基づいて、アスパラギンの濃度の平均値は約５８４μｇ／ｇに等しく、アスパラギン酸の濃度の平均値は約５９２μｇ／ｇに等しい。
【００７７】
実施例３  出発原料のグリーンコーヒーのアミノ酸組成が異なる焙煎コーヒー中のアクリルアミドの量
グアテマラから来たグリーンコーヒー（Ｃ．ａｒａｊｂｉｃａ）の市販のバッチ及びグアテマラから来たラウリナ変種のグリーンコーヒー（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）の市販のバッチを、両方の場合ともミディアムの焙煎規格（合計重量損失１５．０〜１６．０％）を得るために工業的プラントで焙煎した。グリーンコーヒーの元の試料についてアスパラギン及びアスパラギン酸含有率を、実施例２で開示された手順に従って決定した。焙煎コーヒーを、アクリルアミド濃度を確認するために分析した。各焙煎コーヒーについて、１ｇのコーヒー粉末（粉砕された焙煎コーヒー）を知られた抽出方法（Ｈｏｅｎｉｃｋｅ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．５２０，２００４，ｐｐ．２０７−２１５）により抽出処理した。対応する抽出物を、液体クロマトグラフィー用の「ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００ＣＮ」カラム（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによりＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳにかけた。得られた分析結果を以下の表Ｂに示す。
【表２】
2014518085.tif 000003
表Ｂの結果は、焙煎コーヒー中の有意に低いアクリルアミド含有率が、出発原料のグリーンコーヒー中のより低いアスパラギン酸含有率に対応することを証明する。
【００７８】
この実験的根拠により、アクリルアミドの前駆体としてのアスパラギン酸の重要性が確認され、グリーンコーヒー中のアスパラギン酸含有率を減少させることにより、その結果として焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させることが可能であると明言することが可能になる。
【００７９】
実施例４  水抽出物の酵素処理
グリーンコーヒー（出所：インド及びエチオピア）から実施例２で開示されたように調製して得られた２種の水抽出物を、アスパラギナーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｎｏ．Ａ３８０９、１００単位）により３０分間３７℃で処理した。
【００８０】
各試料について、アスパラギン及びアスパラギン酸というアミノ酸の３回の定量を、酵素を添加する前（Ｔ０）、酵素を添加してから２分（Ｔ１）、酵素を添加してから３０分（Ｔ２）に実施した
【００８１】
アスパラギン及びアスパラギン酸の定性的決定は、実施例２で開示された手順に従って、ＧＣ−ＭＳで実施した。
得られた分析結果を以下の表Ｃに示した。
【表３】
2014518085.tif 000004
表Ｃの結果は、アスパラギナーゼ酵素は、上記の反応条件（３７℃、３０分）で、水抽出物中に存在するアスパラギンを、グリーンコーヒーの他の化学的成分の存在（水抽出物中の）により阻害されることなく、アスパラギン酸に変換できることを証明する。
【００８２】
実施例５  焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる手順
グリーンコーヒー豆（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ；出所：ブラジル）１２０ｇを、線が引かれた３頸容器中に入れて７５０ｍｌの水と接触させた。容器は、温度をサーモスタットにより８０℃に、並びにマグネチックスターラーにより一定の攪拌下に保った。抽出を５時間実施し、その間形成されたスチームは還流により容器中に凝縮させた。
【００８３】
５時間経過後、水抽出物を回収して、実施例２で開示された手順（ＧＣ−ＭＳ）により、アスパラギン及びアスパラギン酸の定量を行った。
【００８４】
抽出されたグリーンコーヒーを、換気されている乾燥室中に５０℃で１夜、次に１０１℃で残留水分が２０重量％になるまで入れておいた。
【００８５】
６００ｍｌの体積を有する水抽出物を、サーモスタットを備えた攪拌装置中で、クロカビから得られたアスパラギナーゼの酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＮＡ）３０μｌを用いて、３０分間３７℃で処理した。
【００８６】
酵素処理された水抽出物について、実施例２で開示された手順（ＧＣ−ＭＳ）により、アスパラギン及びアスパラギン酸の定量を行った。
【００８７】
定量後、水抽出物を、ロータリーエバポレーターにより、真空下５０℃の温度で、体積が約１００ｍｌになるまで濃縮した。
【００８８】
抽出されて部分的に乾燥されたグリーンコーヒーを、酵素処理された水抽出物中に浸漬し、約１時間周囲温度で抽出物が豆に吸収されることを可能にすることにより濃縮した。
【００８９】
次に、吸収したグリーンコーヒー（即ち、再混入されたグリーンコーヒー）を真空下でロータリーエバポレーターにより、５０℃の温度で殆ど完全に乾燥した。乾燥は、流動床系でグリーンコーヒーを処理することにより完結し、１１８ｇの乾燥製品を得た。
【００９０】
１００ｇの上記の乾燥製品及び１００ｇの未処理グリーンコーヒーを、合計重量損失１６％で同じ焙煎程度になるように、実験室焙煎機で焙煎した。
【００９１】
アクリルアミド濃度を確認するために、処理された焙煎コーヒー及び未処理焙煎コーヒーを、分析にかけた。
【００９２】
各焙煎コーヒー（処理済み；未処理）について、１ｇのコーヒー粉末（粉砕された焙煎コーヒー）を、知られた抽出方法（Ｍａｓｔｏｖｓｋａ  Ｋ．＆  Ｌｅｈｏｔａｙ  Ｓ．Ｊ．「Ｒａｐｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ｏｒ  ＧＣ−ＭＳ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｆｏｏｄ  ｍａｔｒｉｃｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５４，２００６，ｐｐ．７００１−７００８）に基づいて、「ＱｕＥＣｈＥＲＳ」キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用することにより処理した。対応する抽出物は、液体クロマトグラフィーのための「Ｋｉｎｅｔｅｘ  ２．６μ  ＸＢ−Ｃ１８  １００Ａ」カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を使用することにより、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳにかけた。
得られた分析結果を以下の表Ｄに示す（「ａ．ｕ．」は「任意単位」を意味する）。
【表４】
2014518085.tif 000005
【００９３】
表Ｄの結果により、アクリルアミドの前駆体（アスパラギン）をグリーンコーヒーの水抽出物から酵素的に除去し、それに続いて、酵素処理された水抽出物を同じグリーンコーヒー中に再混入することにより、後者からアクリルアミド含有率が大きく減少した焙煎コーヒーを得ることが可能であることが証明される。
【００９４】
後続の実施例６、７、８に、実施例５で開示された手順と異なって、２種のアクリルアミドの前駆体（アスパラギン；アスパラギン酸）の除去を目標とする本発明による二重の酵素処理が実施された焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる手順が開示される。
【００９５】
実施例６  焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる手順
１２０ｇのグリーンコーヒー豆（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ；出所：ブラジル）を線が引かれた３頸容器中に入れて７２０ｍｌの水と接触させた。容器は、温度をサーモスタットにより８０℃に、並びにマグネチックスターラーにより一定の攪拌下に保った。抽出を５時間実施し、その間形成されたスチームは還流により容器中に凝縮させた。
【００９６】
５時間経過後、水抽出物を回収して、ストレーナーで濾過した。
【００９７】
抽出されたグリーンコーヒーを換気されている乾燥室中に１０１℃で１０分間置いて、次に熱風乾燥機で、残留水分が２０重量％になるまで乾燥した（実際には、約１２０ｇが再び得られた）。
【００９８】
６００ｍｌの体積を有する水抽出物を、サーモスタットを備えた攪拌装置中で、クロカビから得られたアスパラギナーゼ酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＮＡＮ）３０μｌ＋アスパルターゼ酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＡＮ、ｐＨ７の緩衝溶液中に０．１ｍｇ／μＬの濃度で溶解した）ｌｍＬで、２時間３７℃で処理した。
【００９９】
水抽出物を、真空下でロータリーエバポレーターにより、温度を６５℃にして、体積が１００ｍｌになるまで濃縮した。
【０１００】
抽出され部分的に乾燥されたグリーンコーヒーを、酵素処理された水抽出物中に浸漬して、６５℃と７５℃の間に含まれる温度で約２時間、抽出物を豆に吸収させること可能にすることにより濃縮した。
【０１０１】
次に吸収したグリーンコーヒー（再混入されたグリーンコーヒー）を真空下でロータリーエバポレーターにより、６５〜７５℃の温度で殆ど乾燥した。乾燥は、流動床系でグリーンコーヒーを処理することにより完結し、１１３ｇの乾燥製品が得られた。
【０１０２】
１００ｇの上記の乾燥製品及び１００ｇの未処理グリーンコーヒーを、同じ焙煎程度になるように、実験室焙煎機で焙煎した。
【０１０３】
処理された焙煎コーヒー及び未処理焙煎コーヒーを、アクリルアミド濃度を確認するために分析にかけた。
【０１０４】
各焙煎コーヒー（処理された；未処理）について、２ｇのコーヒー粉末（粉砕された焙煎コーヒー）を抽出処理して、知られた抽出方法（Ｗｅｎｚｌ  Ｔ．，Ｓｚｉｌａｇｙｉ  Ｓ．，Ｒｏｓｅｎ  Ｊ．Ａｎｄ  Ｋａｒａｓｅｋ  Ｌ．「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｒｏａｓｔｅｄ  ｃｏｆｆｅｅ」，ＪＲＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ，ＥＵＲ  ２３４０３  ２００８，Ａｎｎｅｘ  ３）に基づいて、ＳＰＥの手順により精製した。対応する抽出物を、液体クロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）用の「Ｈｙｐｅｒｃａｒｉ  ５μ  １００×２．１ｍｍ」カラムを使用することにより、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳにかけた。
【０１０５】
各試料（処理；未処理）について、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳで３回の分析を実施した（試験１；試験２；試験３）。得られた分析結果を次の表Ｅに示す。
【表５】
2014518085.tif 000006
【０１０６】
実施例７  焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる手順
１０００ｇのグリーンコーヒー豆（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ；出所：ブラジル）を線が引かれた３頸容器中に入れて５リットルの水と接触させた。容器は、サーモスタットにより温度を８０℃に、機械的攪拌機により一定の攪拌下に保った。抽出を５時間実施し、その間形成されたスチームを還流により容器中に凝縮させた。５時間経過後、水抽出物を回収して、薄皮を除去するために濾過した。
【０１０７】
抽出されたグリーンコーヒーを、流動床系に８５℃で残留水分が約２０重量％になるまで約１時間置いた（実際には、約１０００ｇが再び得られた）。
【０１０８】
４リットルの体積を有する水抽出物を、サーモスタットを備えた攪拌装置中で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅから得られたアスパラギナーゼ酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＮＡＯ）２００μｌ＋アスパルターゼ酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＡＮＮ、ｐＨ７の緩衝溶液に０．２ｍｇ／μｌの濃度で溶解した）３．３ｍｌで、４０℃で２時間処理した。
【０１０９】
水抽出物を、真空下でロータリーエバポレーターにより、８５℃の温度で、体積が約６７０ｍｌになるまで濃縮した。
【０１１０】
抽出され部分的に乾燥されたグリーンコーヒーを、酵素処理された水抽出物中に浸漬して、８０℃の温度で約１時間、抽出物を豆に吸収させることを可能にすることにより濃縮した。
【０１１１】
次に吸収したグリーンコーヒー（再混入されたグリーンコーヒー）を真空下でロータリーエバポレーターにより、８０℃の温度で殆ど乾燥した。乾燥は、流動床タイプでグリーンコーヒーを処理することにより完結し、９１７ｇの乾燥製品が得られた。
【０１１２】
１００ｇの上記の乾燥製品及び１００ｇの未処理グリーンコーヒーを、同じ焙煎程度になるように、実験室焙煎機で焙煎した。
【０１１３】
処理された焙煎コーヒー及び未処理焙煎コーヒーを、アクリルアミドの濃度を確認するために、実施例６の方法を使用することにより分析にかけた。各試料（処理；未処理）について、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳで２回の分析を実施した（試験１；試験２）。
得られた分析結果を次の表Ｆに示す。
【表６】
2014518085.tif 000007
【０１１４】
実施例８  焙煎コーヒー中のアクリルアミド含有率を減少させる手順
４００ｇのグリーンコーヒー豆（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ；出所：ブラジル）を線が引かれた３頸容器に入れて１．２リットルの水と接触させた。容器は、サーモスタットにより温度を８５〜８７℃に、機械的攪拌機により一定の攪拌下に保った。抽出を５時間実施し、その間形成されたスチームを還流により容器中に凝縮させた。５時間経過後、水抽出物を回収して薄皮を除去するために濾過した。
【０１１５】
抽出されたグリーンコーヒーを、流動床系中に約８５℃で、残留水分が２０重量％になるまで１時間置いた（実際、約４００ｇが再び得られた）。
【０１１６】
０．８５リットルの体積を有する水抽出物を、サーモスタットを備えた攪拌装置中で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅから得られたアスパラギナーゼ酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＮＡＯ３．５  Ｕ／μΙ）６０μｌ＋アスパルターゼ酵素製剤（ＳＰＲＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｄ．ＳＢＡＮＮ、ｐＨ７の緩衝溶液に０．２ｍｇ／μｌの濃度で溶解した）１ｍｌで、１４時間３０〜３５℃で処理した。
【０１１７】
水抽出物を、真空下でロータリーエバポレーターにより、８０℃の温度で、体積が約２００ｍｌになるまで濃縮した。
【０１１８】
抽出され部分的に乾燥されたグリーンコーヒーを、酵素処理された水抽出物中に浸漬して、８０℃の温度で約１時間、抽出物を豆に吸収させること可能にすることにより濃縮した。
【０１１９】
次に吸収したグリーンコーヒー（再混入されたグリーンコーヒー）を真空下でロータリーエバポレーターにより、８０℃の温度で殆ど乾燥した。乾燥は、流動床系でグリーンコーヒーを処理することにより完結し、３７５ｇの乾燥製品が得られた。
【０１２０】
１００ｇの上記の乾燥製品及び１００ｇの未処理グリーンコーヒーを、同じ焙煎程度になるように、実験室焙煎機で焙煎した。
【０１２１】
処理された焙煎コーヒー及び未処理焙煎コーヒーを、アクリルアミドの濃度を確認するために、実施例６の方法を使用することにより分析にかけた。各試料（処理；未処理）について、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳで１回の分析を実施した。
得られた分析結果を次の表Ｇに示す。
【表７】
2014518085.tif 000008
【０１２２】
実施例６、７、８の表Ｅ、Ｆ、Ｇに示した結果は、２種の異なるアクリルアミドの前駆体（アスパラギン、アスパラギン酸）をグリーンコーヒーの水抽出物から酵素的に除去し、それに続いて酵素処理された水抽出物を同じグリーンコーヒー中に再混入することにより、後者からアクリルアミド含有率が大きく減少した焙煎コーヒーを得ることが可能であることを証明する。
【０１２３】
特に、実施例６の実験結果と実施例５の実験結果とを比較することにより、アスパラギンのみを酵素的に除去することにより得られる減少を超えるアクリルアミド含有率減少の最大パーセンテージ（８２．５％に対して８４％）を得る可能性が強調される。
【国際調査報告】
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