(57)【要約】本開示は、有機体を同定する方法を特徴付ける。ある実施形態では、本発明は、有機体、例えば、大腸菌の、毒性株と非毒性株とを区別する方法を提供する。例えば、有機体の未知株を分析する方法であって、有機体の未知株から核酸を取得すること；該核酸から光学マップを作成すること；該未知株の該光学マップを、該有機体の既知株の少なくとも１つの光学マップと比較して、該未知株の該光学マップにおける保存領域および非保存領域を同定すること；ならびに該未知株の該非保存領域を分析することを含む、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機体の未知株を分析する方法であって、
有機体の未知株から核酸を取得すること；
該核酸から光学マップを作成すること；
該未知株の該光学マップを、該有機体の既知株の少なくとも１つの光学マップと比較して、該未知株の該光学マップにおける保存領域および非保存領域を同定すること；ならびに
該未知株の該非保存領域を分析することを含む、
方法。
【請求項２】
前記有機体が、大腸菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分析することが、配列決定を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
配列決定が、
前記非保存領域に隣接する前記未知株の保存領域に対するプライマーを設計すること；
該保存領域に該プライマーをハイブリダイズさせること；および
配列決定反応を行うことを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記有機体が、食品サンプル、環境サンプルおよび哺乳類の組織または体液のサンプルからなる群から選択される少なくとも１つのサンプル種から取得される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記環境サンプルが、水、土壌、下水および植物質からなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
有機体を分析するための方法であって、
サンプル中の有機体から核酸を取得すること；
該核酸から光学マップを作成すること；
該光学マップを、少なくとも１つの参照光学マップと比較して、該有機体の該光学マップにおける保存領域および非保存領域を同定すること；および
該有機体の該非保存領域に隣接するプライマーを設計し、これにより、該有機体の該非保存領域を分析することを含む、
方法。
【請求項８】
前記分析が、前記非保存領域を配列決定することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、食品サンプル、環境サンプルおよび哺乳類の組織または体液のサンプルからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記環境サンプルが、水、土壌、下水および植物質からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
大腸菌の株が毒性であるか、または、非毒性であるかを決定するための方法であって、
大腸菌の未知株から核酸を取得すること；
該核酸から光学マップを作成すること；および、
該光学マップを、大腸菌の毒性株を示す光学マップシグネチャと比較することを含む、
方法。
【請求項１２】
大腸菌の前記株が、前記シグネチャと一致する場合、前記株が毒性である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
大腸菌の前記株が、前記シグネチャと一致しない場合、前記株が非毒性である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記シグネチャが、ＬＢ２２６６９２光学マップにおける複製起点と比較しての下記の位置：２，０２８，６９７から２，０６６，２６７の位置；４，２８６，４３０から４，３１８，２２２の位置；４，８９０，１３５から４，８９７，４１９の位置；５，０９９，２１５から５，１１２，１０１の位置に、ゲノムアイランドの存在を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記大腸菌が、食品サンプル、環境サンプルおよび哺乳類の組織または体液のサンプルからなる群から選択される、少なくとも１つのサンプルタイプから取得される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記環境サンプルが、水、土壌、下水および植物質からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
大腸菌の株が毒性であるか、または、非毒性であるかを決定するための方法であって、
大腸菌の未知株から核酸を取得すること；
前記核酸から光学マップを作成すること；
前記光学マップを、既知の大腸菌の少なくとも１つの光学マップと比較すること；および
該比較する工程の結果に基づいて、大腸菌の前記株が毒性であるか、または、非毒性であるかを決定することを含む、
方法。
【請求項１８】
大腸菌の既知の非毒性株には存在しない、前記株における少なくとも１つのゲノムアイランドの存在が、毒性であることを示す、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノムアイランドが、２，０２８，６９７から２，０６６，２６７の位置；４，２８６，４３０から４，３１８，２２２の位置；４，８９０，１３５から４，８９７，４１９の位置；５，０９９，２１５から５，１１２，１０１の位置；およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、ＬＢ２２６６９２光学マップにおける複製起点と比較しての位置で見出される、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記大腸菌が、食品サンプル、環境サンプルおよび哺乳類の組織または体液のサンプルからなる群から選択される、少なくとも１つのサンプルタイプから取得される、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記環境サンプルが、水、土壌、下水および植物質からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
大腸菌感染の人間を診断する方法であって、
被験体由来のサンプルからの大腸菌から核酸を取得すること；
該核酸から光学マップを作成すること；および
該光学マップを、大腸菌の毒性株を示す光学マップシグネチャと比較することを含み、
大腸菌の該株が、該シグネチャと一致する場合、該株が毒性であり、該人間が大腸菌感染と診断される、
方法。
【請求項２３】
前記シグネチャが、ＬＢ２２６６９２光学マップにおける複製起点と比較しての下記の位置：２，０２８，６９７から２，０６６，２６７の位置；４，２８６，４３０から４，３１８，２２２の位置；４，８９０，１３５から４，８９７，４１９の位置；５，０９９，２１５から５，１１２，１０１の位置に、ゲノムアイランドの存在を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらに、前記人間を処置することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
大腸菌の株が毒性であるか、または、非毒性であるかを決定するための方法であって、
大腸菌の未知株から核酸を取得すること；
該核酸を分析して、毒性の大腸菌株において保存され、非毒性の大腸菌株には存在しない、ゲノムアイランドの存在を検出することを含み、ここで、該アイランドの存在が、大腸菌の毒性株を示す、
方法。
【請求項２６】
分析が、ＰＣＲ、配列決定、プローブハイブリダイゼーション、アレイおよび光学マッピングからなる群から選択される技術を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記大腸菌が、食品サンプル、環境サンプルおよび哺乳類の組織または体液のサンプルからなる群から選択される、少なくとも１つのサンプルタイプから取得される、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記環境サンプルが、水、土壌、下水および植物質からなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
大腸菌感染の人間を診断する方法であって、
被験体由来のサンプルからの大腸菌から核酸を取得すること；および
該核酸を分析して、毒性の大腸菌株において保存され、非毒性の大腸菌株には存在しない、ゲノムアイランドの存在を検出することを含み、ここで、該アイランドの存在が大腸菌の毒性株を示し、しかも、該人間が大腸菌感染であると診断される、
方法。
【請求項３０】
分析が、ＰＣＲ、配列決定、プローブハイブリダイゼーション、アレイおよび光学マッピングからなる群から選択される技術を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
さらに、前記人間を処置することを含む、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年６月１３日に出願した米国非仮出願第１３／１５９，２３２号の利益および優先権を主張する。米国非仮出願第１３／１５９，２３２号の内容は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、有機体、例えば、微生物を同定する方法に関する。前記方法は、前記有機体の核酸を画像化することを含み得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
例えば、制限マップを開発するために制限エンドヌクレアーゼを使用する、ゲノムの物理的なマッピングは、種々の有機体の核酸配列についての正確な情報を提供し得る。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の制限マップは、光学マッピング（ｏｐｔｉｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ）により生成され得る。光学マッピングは、蛍光顕微鏡法を使用して個々の標識されたＤＮＡ分子上の制限エンドヌクレアーゼ切断事象を可視化することにより、順序付けされた制限マップを生じ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本発明は、有機体、例えば、微生物を同定する方法を提供する。前記方法は、有機体から核酸の制限マップを取得すること、および、前記核酸の前記制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることにより、前記有機体を同定することを含む。詳細な制限マップデータベースの使用により、前記有機体は、属および種のレベルだけでなく、亜種（株）、亜株および／または単離株のレベルでも、同定および分類され得る。前記特徴付けられた方法は、有機体を同定するための、素早く、正確で詳細な情報を提供する。前記方法は、臨床状況、例えば、ヒトもしくは獣医学の状況；または、環境もしくは工業の状況（例えば、臨床もしくは工業的な微生物学、食品安全性試験、地下水試験、空気試験、汚染試験等）に使用され得る。本質的に、本発明は、微生物の検出および／または同定が必要であるか、または望まれる、任意の状況（setting）に有用である。
【０００５】
本発明は、特に、有機体からの核酸の制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることにより前記有機体を同定し、そして前記有機体の正体を、前記疾患または障害と関連付けることにより、被験体における疾患または障害を診断する方法も特徴付ける。
【０００６】
一態様では、本発明は、有機体を同定する方法を提供する。前記方法は、核酸サンプルの制限消化を取得すること、制限断片を画像化すること、および、前記画像化されたデータをデータベースと比較することを含む。本発明の制限マップは、例えば、表面に核酸を付着させ、前記表面上でそれらを伸長し、そして１つ以上の制限エンドヌクレアーゼに曝すことにより、順序付けられ得る。一般的に、本発明の好ましい方法は、有機体から核酸サンプルを取得すること；前記核酸を画像化すること；前記核酸の制限マップを取得すること；および、前記核酸の前記制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることにより、前記有機体を同定することを含む。
【０００７】
前記検出される有機体は、微生物、細菌、原生生物、ウイルス、真菌、または病気を引き起こす有機体（微生物（例えば、原虫および多細胞性寄生虫）を包含する）であり得る。前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）であり得るか、または、サンプルから取得されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーであり得る。前記核酸サンプルとしては、任意の組織もしくは体液のサンプル、環境サンプル（例えば、水、空気、土、石等）、および、それらから調製される全てのサンプルが挙げられる。
【０００８】
本発明の方法は、画像化前に、さらに、核酸を１つ以上の酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化することを含み得る。好ましい制限酵素としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
【表１】
2014518068.tif 000002
【０００９】
画像化は、理想的には、前記核酸を標識することを含む。標識方法は、当該分野において公知であり、任意の公知の標識を含み得る。しかし、好ましい標識は、光学的に検出可能な標識であり、例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントエイロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン１５１（Coumaran  151））；シアニン染料；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（5’,5”-dibromopyrogallol-sulfonaphthalein）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体；ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル  １−ピレン；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ、スルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシア��ート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ナフトハロシアニン、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯおよびＪＯＪＯである。
【００１０】
本発明に使用するためのデータベースは、制限マップ類似性クラスターを含み得る。前記データベースは、前記有機体のクレードの少なくとも１つのメンバーからの制限マップを含み得る。前記データベースは、前記有機体の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含み得る。前記データベースは、前記有機体の属、種、株、亜株または単離株からの制限マップを含み得る。前記データベースは、前記有機体の属、種、株、亜株または単離株に共通するモチーフを有する制限マップを含み得る。
【００１１】
別の態様では、本発明は、被験体における疾患または障害を診断する方法であって、検出される有機体を含むことが推測されるサンプルを取得すること；（ｂ）前記有機体からの核酸を画像化すること；（ｃ）前記核酸の制限マップを取得すること；（ｄ）前記核酸の前記制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることにより、前記有機体を同定すること；および、（ｅ）前記有機体の正体を、前記疾患または障害と関連付けることを含む方法を特徴付ける。
【００１２】
方法は、さらに、上記のように被験体における疾患または障害を診断すること、および、前記疾患または障害を改善するために、前記被験体への処置を提供することを含む、前記被験体における疾患または障害を処置することを含み得る。処置は、前記被験体に薬剤を投与することを含み得る。
【００１３】
一実施形態では、単一のＤＮＡ分子から取得された制限マップが、前記データベースに生じる制限断片パターンへの最も密接な一致を同定するために、既知の有機体からの制限マップのデータベースと比較される。この処理は、十分な一致が得られて所定の信頼性レベルで有機体が同定されるまで、反復して繰り返され得る。本発明の方法に従って、サンプルからの核酸は、本願明細書の記載のように、調製され、画像化される。制限マップが調製され、前記制限パターンは、既知の有機体に関する制限パターンのデータベースと関連付けられる。好ましい実施形態では、有機体は、有機体の混合物を含むサンプルから同定される。非常に好ましい実施形態では、本発明の方法は、２つ以上の有機体を含むことが推測されるサンプルに存在する種々の有機体の割合を決定するのに使用される。さらに、本発明の方法の使用は、同じサンプル由来の複数の微生物を、逐次的にまたは同時に、検出することを可能にする。
【００１４】
使用時に、本発明は、環境サンプル中で汚染物質を構成する微生物の同定に適用され得る。例えば、本発明の方法は、空気、水、土壌、衣類、手荷物、唾液、尿、血液、痰、食品、飲料等のサンプルにおける、潜在的な生物学的ハザードを同定するのに有用である。好ましい実施形態では、本発明の方法は、未知の源から得られるサンプル中の有機体を検出および同定するのに使用される。本質的に、本発明の方法は、任意の環境状況または工業状況中のバイオハザードを検出するのに使用され得る。
【００１５】
本発明は、感染性因子の標的株に特異的な配列を使用する、アレイおよび他の核酸プラットホームを作製および使用するのにも有用である。例えば、配列番号１〜３は、ドイツで大流行した大腸菌ＳＴＥＣに特有のゲノム領域を表わす。それらの配列は、大腸菌の毒性株を非毒性株から区別可能な診断用アレイを形成するために、当業者に公知の任意の数の技術を使用して調製される。例えば、ＰＣＲプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ等が、材料を試験して患者サンプル中の毒性株の存在および正体を決定するために調製される。
【００１６】
毒性の大腸菌を同定および／または存在を確認するための技術は、任意の特定のプラットホームと無関係であり、光学マップを作成することなく行われてもよい。例えば、配列番号１〜３は、素早い同定のために、毒性株の特有の領域を増幅するための配列特異的プライマーを調製するのに有用である。それらの配列は、プライマーとして有用な短い断片（例えば、２０マーから１００マー）に、（例えば、音響的、酵素的、機械的に）断片化される。ついで、前記プライマーは、前記サンプル中に存在する場合、前記特有の領域を増幅するためのサンプルを調製するのに適用される。他の技術、例えば、配列決定、アレイ（例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ、順序付けられたアレイ、分子反転プローブアレイ等）、ハイブリッド捕捉法、クロマトグラフィー等が、配列番号１〜３に開示の配列またはそれらの一部分に有用である。ＤＮＡを単離および調製するための技術は、本願全体に提供され、一般的に当該分野において公知である。
【００１７】
一般的に、本願明細書に開示の配列を使用する診断情報は、任意の適切なモダリティ、例えば、光学マッピング、配列決定、ハイブリッド捕捉法等を使用して取得される。
【００１８】
本発明の更なる態様および特徴は、下記のその発明の詳細な説明を精査すれば明らかとなる。
【００１９】
本願明細書で引用される、全ての特許、特許出願および参考文献は、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、大腸菌の６つの単離株の制限マップを示す図である。
【図２】図２は、３つの群：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）ならびにＫ１２（Ｋ１２および７１８を含む）内にクラスター形成された、大腸菌の６つの単離株の制限マップを示す図である。
【図３】図３は、大腸菌の６つの単離株の制限マップの間の共通モチーフを示す図である。
【図４】図４は、ボックスが大腸菌に共通の領域を示す、大腸菌の６つの単離株の制限マップを示す図である。
【図５】図５は、特定の株、すなわち、Ｏ１５７、ＣＦＴまたはＫ１２に特有の領域を示すボックスを有する、大腸菌の６つの単離株の制限マップを示す図である。
【図６】図６は、ボックスが各単離株に特有の領域を示す、大腸菌の６つの単離株の制限マップを示す図である。
【図７】図７は、大腸菌を同定することの可能性のあるレベルを示す、樹形図である。
【図８】図８は、サンプルの制限マップ（中段のマップ）およびデータベースからの関連する制限マップを示す図である。
【図９】図９は、参照光学マップにおける４か所に位置する、保存された、大流行特異的なゲノムアイランドを示す光学マップのセットである。
【図１０】図１０は、参照光学マップにおける４か所に位置する、保存された、大流行特異的なゲノムアイランドを示す光学マップのセットである。
【図１１−１】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−２】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−３】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−４】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−５】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−６】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−７】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−８】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−９】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１０】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１１】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１２】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１３】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１４】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１５】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１６】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１１−１７】図１１は、ゲノムアイランド領域１に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−１】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−２】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−３】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−４】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−５】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−６】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−７】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−８】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−９】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−１０】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−１１】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−１２】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−１３】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１２−１４】図１２は、ゲノムアイランド領域２に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１３−１】図１３は、ゲノムアイランド領域４に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１３−２】図１３は、ゲノムアイランド領域４に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１３−３】図１３は、ゲノムアイランド領域４に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１３−４】図１３は、ゲノムアイランド領域４に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１３−５】図１３は、ゲノムアイランド領域４に整列する、非保存領域の配列を示す。
【図１３−６】図１３は、ゲノムアイランド領域４に整列する、非保存領域の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
本開示は、有機体（例えば、微生物）を同定する方法を特徴付ける。前記方法は、有機体由来の核酸（例えば、ＤＮＡ）の制限マップを取得すること、および、前記核酸の前記制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることにより、前記有機体を同定することを含む。種々の群および下位群に共通するモチーフを含む詳細な制限マップデータベースの使用により、前記有機体は、属および種のレベルだけでなく、亜種（株）、亜株および／または単離株のレベルでも同定および分類され得る。例えば、細菌は、属レベル（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属）、種レベル（例えば、大腸菌種）、株レベル（例えば、大腸菌のＯ１５７、ＣＦＴおよびＫ１２の株）、ならびに、単離株（例えば、（以下の実験３Ｂに記載のとおりの）大腸菌のＯ１５７：Ｈ７単離株）へと同定および分類され得る。前記特徴付けられた方法は、有機体を同定するための、素早く、正確で詳細な情報を提供する。これらの方法は、各種の臨床状況において（例えば、被験体（例えば、ヒトまたは動物の被験体）における有機体の同定のために）使用され得る。
【００２２】
本開示は、特に、有機体からの核酸の制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることにより前記有機体を同定し、そして前記有機体の正体を、疾患または障害と関連付けることにより、被験体における前記疾患または障害を診断する方法も特徴付ける。これらの方法は、臨床状況（例えば、ヒトまたは獣医学的な状況）に使用され得る。
【００２３】
本発明の方法は、食品または環境状況における有機体の同定および／または検出をするのにも有用である。例えば、本発明の方法は、飲料水、空気、土壌および他の環境源における環境的な脅威を評価するのに使用され得る。本発明の方法は、食品中の有機体を同定するのにも有用であり、時間的または地理的に隔てられた複数のサンプル、ならびに、同一もしくは類似のバッチからのサンプルにおける、共通の食品汚染源を決定するのにも有用である。
【００２４】
制限マッピング
【００２５】
本願明細書で特徴付けられた方法は、前記データベースの生成および同定される有機体の処理の両方の間に、制限マッピングを利用する。使用され得る制限マッピングの一つのタイプは、光学マッピングである。光学マッピングは、単一のＤＮＡ分子からの順序付けられた制限マップ生成用の一分子技術である（Ｓａｍａｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．５：１−４，１９９５）。この方法中に、個々の蛍光標識されたＤＮＡ分子は、（第１世代の方法において）カバースリップと顕微鏡スライドとの間のアガロースの流れにおいて伸長されるか、または、（第２の生成法において）ポリリジン処理ガラス表面上に固定化される。同文献（Ｉｄ．）。添加されたエンドヌクレアーゼが、特異的な点でＤＮＡを切断し、断片が画像化される。同文献。制限マップは、前記消化に起因する断片の数に基づいて構築され得る。同文献。一般的に、最終的なマップは、類似の分子に由来する断片サイズの平均である。同文献。したがって、本方法の一実施形態では、同定される有機体の制限マップは、前記有機体を含むサンプルから生成された多くのマップの平均である。
【００２６】
光学マッピングおよび関連する方法は、本願明細書にそれぞれ参考として援用される、米国特許第５，４０５，５１９号、米国特許第５，５９９，６６４号、米国特許第６，１５０，０８９号、米国特許第６，１４７，１９８号、米国特許第５，７２０，９２８号、米国特許第６，１７４，６７１号、米国特許第６，２９４，１３６号、米国特許第６，３４０，５６７号、米国特許第６，４４８，０１２号、米国特許第６，５０９，１５８号、米国特許第６，６１０，２５６号および米国特許第６，７１３，２６３号に記載されている。光学マップは、本願明細書に参考として援用される、Ｒｅｓｌｅｗｉｃら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２に記載のように構築される。手短に述べると、試験有機体からの個々の染色体断片は、負の荷電を持つＤＮＡと正の荷電を持つ表面との間の静電相互作用により誘導体化ガラス上に固定され、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、挿入染料、例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色され、画像分析用の自動化された蛍光顕微鏡上に置かれる。前記染色体断片が固定されるため、前記制限エンドヌクレアーゼでの消化により生成された制限断片が、前記ガラスに付着されたままであり、前記挿入染料による染色後に、蛍光顕微鏡法により可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限断片のサイズは、画像分析ソフトウェアを使用して測定され、そして別の分子における同一の制限断片パターンが、前記染色体全体をカバーする順序付けられた制限マップを組み立てるのに使用される。
【００２７】
制限マップデータベース
【００２８】
本願明細書に記載の方法に使用されるデータベースは、上記で議論した光学マッピング技術により生成され得る。前記データベースは、大量の単離株、例えば、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，５００、約２，０００、約３，０００、約５，０００、約１０，０００またはそれより多くの単離株に関する情報を含み得る。加えて、前記データベースの制限マップは、種々の有機体についての属、種、亜種（株）、亜株および／または単離株に共通するモチーフに関する注釈付きの情報（類似性クラスター）を含む。大量の単離株および特定のモチーフに関する情報は、有機体の正確で素早い同定を可能にする。
【００２９】
前記データベースの制限マップは、特異的な制限エンドヌクレアーゼ酵素により、種々の単離株由来の核酸を消化する（切断する）ことにより生成され得る。一部のマップは、１つのエンドヌクレアーゼによる消化の結果であり得る。一部のマップは、エンドヌクレアーゼの組み合わせ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのエンドヌクレアーゼ）による消化の結果であり得る。前記データベースおよび／または同定される前記有機体についての制限マップを生成するのに使用され得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩが挙げられる。使用され得る他のエンドヌクレアーゼの包括的でない例としては、ＡｌｕＩ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩおよびＳｍａＩが挙げられる。さらに他の制限エンドヌクレアーゼが、当該分野において公知である。
【００３０】
異なる株間におけるマップのアラインメントは、断片サイジングエラー、誤ったおよび欠落した切断、ならびに欠落した小型断片を組み込むスコアリングモデルに従って２つの制限マップの最適なアラインメントを見出す、動的計画法（ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）アルゴリズムにより生成される（Ｍｙｅｒｓら、Ｂｕｌｌ  Ｍａｔｈ  Ｂｉｏｌ  ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｒｏｂａｂ  ３８：３３５−３５６（２００１）；および、Ｗａｔｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２；２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントに関して、前記スコアは、前記アラインメントの長さの対数に比例し、より長く、より良好に一致するアラインメントが、より高いスコアを有するように、２つのマップ間の差異によりペナルティーが課される。
【００３１】
類似性クラスターを生成するために、各マップは、全ての他のマップに対して整列される。これらのアラインメントから、ペアワイズアラインメント分析が、両ゲノムにおける不一致領域の長さの合計を両ゲノムのサイズの合計で割ることにより、前記対のメンバー間の「相違性パーセント」を決定するのに行われる。これらの相違性測定は、統計パッケージ「Ｒ」において実施される場合に、凝集型クラスタリング法「Ａｇｎｅｓ」への入力として使用される。手短に述べると、このクラスタリング法は、まず、それ自身のクラスターに各エントリーを置き、ついで、２つの最も近いクラスターを反復的に連結することにより機能する。ここで、２つのクラスター間の距離は、一方のクラスターにおける点と他方のクラスターにおける点との間の最も小さい相違性である。
【００３２】
同定される有機体
【００３３】
種々の有機体（例えば、ウイルス）および種々の微生物（例えば、細菌、原生生物および真菌）が、本願明細書で特徴付けられた方法により同定され得る。一実施形態では、前記有機体の遺伝情報は、ＤＮＡの形態で保存される。前記遺伝情報は、ＲＮＡとしても保存され得る。
【００３４】
同定される前記有機体を含むサンプルは、ヒトのサンプル、例えば、組織サンプル、例えば、上皮（例えば、皮膚）組織、結合組織（例えば、血液および骨）、筋肉および神経の組織、または分泌サンプル、例えば、唾液、尿、涙および糞便のサンプルであり得る。前記サンプルは、非ヒトのサンプル、例えば、ウマ、ラクダ、ラマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、イタチ、齧歯類、トリ、爬虫類および昆虫のサンプルでもあり得る。前記サンプルは、植物、水源、食品、空気、土壌、植物、または他の環境的源もしくは工業的源に由来し得る。
【００３５】
有機体の同定
【００３６】
本願明細書に記載の方法、すなわち、有機体を同定する方法、被験体における疾患または障害を診断する方法、有機体の抗生物質耐性を決定する方法、細菌の抗生物質耐性プロファイルを決定する方法、および、被験体に投与するのに治療的に有効な抗生物質を決定する方法、ならびに、被験体を処置する方法は、有機体の核酸の制限マップを、制限マップデータベースと関連付けることを含む。前記方法は、未知サンプルからの未加工の一分子マップのそれぞれ（または、前記サンプルの平均制限マップ）を、前記データベースにおけるエントリーの各々と比較し、ついで、全体的な一致可能性を作成するために異なる分子にわたる一致可能性を組み合わせることを含む。
【００３７】
前記方法の一実施形態では、同定される前記有機体のゲノム全体は、前記データベースと比較され得る。別の実施形態では、前記ゲノムから共通の要素を抽出するいくつかの方法が、マッチングアルゴリズムに関する参照点として依然として機能し得る、前記有機体のゲノムにおける領域の縮小セット（reduced  set）を生成するのに作製され得る。
【００３８】
上記および以下の実施例において議論したように、前記データベースの制限マップは、種々の有機体についての、属、種、亜種（株）、亜株および／または単離株に共通するモチーフに関する、注釈付きの情報（類似性クラスター）を含み得る。このような詳細な情報は、亜種レベルでの有機体の同定を可能にし、このことは次に、前記有機体を有する被験体の、より正確な診断および／または処置を可能にする。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の方法は、有機体、株または状態を示す遺伝的モチーフを同定するのに使用される。例えば、本発明の方法は、単離株において、抗生物質耐性を付与する少なくとも１つのモチーフを同定するのに使用される。これにより、更なるクラスター分析をすることなく、処置の適切な選択が可能となる。
【００４０】
用途
本願明細書に記載の方法は、各種の状況において、例えば、ヒトもしくは非ヒトの被験体、食品、環境源（例えば、食品、水、空気）および工業状況における有機体を同定するのに使用され得る。前記特徴付けられた方法は、被験体、例えば、ヒトもしくは非ヒトの被験体における疾患または障害を診断する方法、ならびに、前記診断に基づいて前記被験体を処置する方法も含む。前記方法は、前記被験体由来の有機体を含むサンプルを取得すること；前記有機体からの核酸を画像化すること；前記核酸の制限マップを取得すること；前記核酸の前記制限マップを制限マップデータベースと関連付けることにより、前記有機体を同定すること；および、前記有機体の正体を、前記疾患または障害と関連付けることを含む。
【００４１】
上記で議論したように、種々の有機体は、本願明細書に議論の方法により同定され得る。したがって、種々の疾患および障害は、本方法により診断され得る。前記有機体は、例えば、前記疾患または障害の原因、原因物質および／または症状であり得る。一実施形態では、２つ以上の有機体が、本願明細書に記載の方法により同定され得る。存在する前記有機体の組み合わせが、診断をもたらし得る。当業者であれば、有機体の正体を、疾患または障害と関連付けることができる。例えば、下記は、一部の疾患およびそれを引き起こることが知られている細菌の非包括的な列記である：破傷風−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ；結核−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；髄膜炎−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；ボツリヌス中毒症−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；細菌性赤痢−Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；ライム病−Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；胃腸炎−大腸菌および／またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．；食中毒−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓおよび／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ。これらならびに他の疾患および障害は、本願明細書に記載の方法により診断され得る。
【００４２】
疾患または障害が一旦診断された時点で、前記被験体の処置をすることについての判断が、例えば、医療提供者または獣医によりなされ得る。前記被験体を処置することは、前記同定された有機体が寄与するかまたは前記同定された有機体が原因である前記疾患または障害を改善するために、薬剤または薬剤の組み合わせを投与することを含み得る。前記疾患または障害の改善は、前記疾患または障害の症状の低下を含み得る。前記被験体に投与される薬剤は、精神または身体の経過（process）に影響を及ぼす、任意の化学物質、例えば、抗体および／または低分子を含み得る。前記薬剤は、組成物（例えば、薬剤と薬学的に許容され得るキャリアとを含む組成物）の形態で投与され得る。前記組成物は、例えば、静脈内、経口、局所、筋肉内、皮内、皮下および肛門での投与に適した形態であり得る。適切な薬学的キャリアとしては、例えば、無菌食塩水、生理的緩衝液等が挙げられる。前記薬学的組成物は、さらに、活性成分の放出を制御するか、または、患者の系においてそれらの存在を延長させるために製剤化され得る。数多くの適切な薬剤送達システムが、この目的のために公知であり、例えば、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、マイクロスフェア等が挙げられる。前記被験体を処置することは、化学療法および放射線治療も含み得る。
【００４３】
下記の例により、本方法の実例となる実施形態が提供されるが、限定として扱われるべきではない。
【００４４】
配列決定と組み合わせた光学マッピング
ある実施形態では、光学マッピングは、前記光学マッピングデータに関する更なる情報を取得するために、配列決定と組み合わされる。具体的には、未知の有機体の光学マップが、参照となる有機体の光学マップ、または、光学マップのデータベースと比較される場合、前記未知の有機体のマップは、比較される前記有機体に関して保存された領域および保存されていない領域を有する。前記保存領域の配列は公知であるため、前記非保存領域に隣接する、前記未知の有機体の保存領域に対してプライマーが設計されてもよい。プライマーは、各種の方法（例えば、当該分野において周知の方法（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９））を使用する、適切な配列のクローニングおよび直接化学合成が挙げられるがこれらに限定されない）により調製され得る。プライマーは、商業的な供給元、例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳｉｇｍａおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも入手され得る。コンピュータプログラム（Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、遺伝分析用オリゴヌクレオチドプローブ配列設計ソフトウェア（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒおよび、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇからのＤＮＡｓｉｓが挙げられるがこれらに限定されない）も、プライマーを設計するのに使用され得る。
【００４５】
前記プライマーは、前記非保存領域に隣接する、前記保存領域にハイブリダイズされ、配列決定反応用の出発点として使用される。このようにして、配列情報は、前記未知の有機体の非保存領域において取得される。当業者に公知の核酸を配列決定するための任意の技術が、提供される発明の方法に使用され得る。ＤＮＡ配列決定技術としては、古典的なジデオキシ配列決定反応（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７４（１２）：５４６３  ６７（１９７７）に記載のとおりのサンガー法）が挙げられる。別の従来の配列決定法は、核酸断片の化学分解、標識されたターミネーターまたはプライマー、および、スラブまたはキャピラリーにおけるゲル分離の使用、可逆的に終結される標識ヌクレオチドを使用する合成による配列決定、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、４５４配列決定、標識されたオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーションの前に標識されたクローンのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成による配列決定、重合工程中における標識されたヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ポロニー配列決定（ｐｏｌｏｎｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）およびＳＯＬｉＤ配列決定を含む。分離された分子の配列決定は、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する、逐次または単独の伸長反応により、ならびに、プローブライブラリーとの単独または逐次のディファレンシャルハイブリダイゼーションにより、最近になって説明されている。
【００４６】
提供された発明の方法に使用され得る配列決定技術としては、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）（Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ．Ｄ．ら、（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：１０６−１０９）が挙げられる。前記ｔＳＭＳ技術では、ＤＮＡサンプルが切断されて、おおよそ１００〜２００ヌクレオチドの鎖にされ、そしてポリＡ配列が、各ＤＮＡ鎖の３’端に付加される。各鎖は、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加により標識される。ついで、前記ＤＮＡ鎖は、フローセルの表面に固定化された何百万ものオリゴ−Ｔ捕捉部位を含むフローセルにハイブリダイズされる。前記テンプレートは、約１億テンプレート／ｃｍ２の密度であり得る。ついで、前記フローセルは、機器、例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シークエンサー内に搭載され、レーザが、前記フローセルの表面に照射され、各テンプレートの位置を明らかにする。ＣＣＤカメラが、前記フローセル表面上での前記テンプレートの位置をマッピングし得る。ついで、前記テンプレートの蛍光標識が切断され、洗い流される。配列決定反応が、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたヌクレオチドを導入することにより始まる。前記オリゴ−Ｔ核酸が、プライマーとして機能する。前記ポリメラーゼは、テンプレート特異的な（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ）方法において、前記標識されたヌクレオチドを、前記プライマーに取り込む。前記ポリメラーゼおよび未取込のヌクレオチドが、除去される。蛍光標識されたヌクレオチドを特異的に取り込んだテンプレートは、前記フローセル表面を画像化することにより検出される。画像化後、切断工程により、前記蛍光標識が除去され、前記処理が、所望の読み長が達成されるまで、他の蛍光標識されたヌクレオチドを用いて繰り返される。配列情報が、各ヌクレオチド付加工程により収集される。ｔＳＭＳの更なる説明は、例えば、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許第７，１６９，５６０号）、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許出願公開第２００９／０１９１５６５号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許第６，８１８，３９５号）、Ｈａｒｒｉｓ（米国特許第７，２８２，３３７号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許出願公開第２００２／０１６４６２９号）およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），１００：３９６０−３９６４（２００３）に示される。これらの各参考文献の内容は、その全体が本願明細書に参考として援用される。
【００４７】
提供された発明の方法に使用され得るＤＮＡ配列決定技術の別の例は、４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３７，３７６−３８０）である。４５４配列決定は、２つの工程を含む。第１の工程では、ＤＮＡは剪断されておおよそ３００〜８００塩基対の断片にされ、前記断片は、平滑末端になる。ついで、オリゴヌクレオチドアダプターが、前記断片の末端に結合される。前記アダプターは、前記断片の増幅および配列決定用のプライマーとして機能する。前記断片は、ＤＮＡ捕捉ビーズに（例えば、５’−ビオチンタグを含むアダプターＢを使用して、例えば、ストレプトアビジンコートされたビーズに）付着され得る。前記ビーズに付着された前記断片は、油水エマルジョンの液滴内で、ＰＣＲ増幅される。その結果は、各ビーズ上における、クローン的に増幅されたＤＮＡ断片の複数のコピーである。第２の工程では、前記ビーズが、（ピコリットルサイズの）ウェルに捕捉される。パイロシークエンシングが、各ＤＮＡ断片について並行して行われる。１つ以上のヌクレオチドの付加により、配列決定機器内のＣＣＤカメラにより記録される光シグナルが生成される。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。パイロシークエンシングは、ヌクレオチド付加により放出されるピロホスフェート（ＰＰｉ）を利用する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホスルフェートの存在下で、ＡＴＰスルフリラーゼにより、ＡＴＰへと変換される。ルシフェラーゼはＡＴＰを使用して、ルシフェリンをオキシルシフェリンへと変換し、この反応により、検出および分析される光が生成される。
【００４８】
提供された発明の方法に使用され得るＤＮＡ配列決定技術の別の例は、ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。ＳＯＬｉＤ配列決定では、ゲノムＤＮＡは剪断されて断片にされ、アダプターが、前記断片の５’端および３’端に付着されて、断片ライブラリーが生成される。または、内部アダプターは、前記断片の５’端および３’端へアダプターを結合すること、前記断片を環状化すること、前記環状化された断片を消化して内部アダプターを生成すること、ならびに、得られた断片の５’および３’端へとアダプターを付着してメイトペア（ｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄ）ライブラリーを生成することにより導入され得る。つぎに、クローンのビーズ集団が、ビーズ、プライマー、テンプレートおよびＰＣＲ成分を含むマイクロリアクターにおいて調製される。ＰＣＲ後に、前記テンプレートが変性され、伸長されたテンプレートを有するビーズを分離するために、ビーズが濃縮される。選択されたビーズ上のテンプレートは、ガラススライドへの結合を可能にする３’修飾に供される。前記配列は、特異的なフルオロフォアにより同定される、中央に決定された塩基（または塩基対）を有する部分的にランダムなオリゴヌクレオチドの逐次のハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより、決定され得る。色が記録された後、前記結合されたオリゴヌクレオチドが切断され、そして除去される。ついで、前記処理が繰り返される。
【００４９】
提供された発明の方法に使用され得るＤＮＡ配列決定技術の別の例は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定（米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号、同第２００９／０１２７５８９号、同第２０１０／００３５２５２号、同第２０１０／０１３７１４３号、同第２０１０／０１８８０７３号、同第２０１０／０１９７５０７号、同第２０１０／０２８２６１７号、同第２０１０／０３００５５９号、同第２０１０／０３００８９５号、同第２０１０／０３０１３９８号および同第２０１０／０３０４９８２号）である。これらの各内容は、その全体が本願明細書に参考として援用される。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定では、ＤＮＡは剪断されて、おおよそ３００〜８００塩基対の断片にされ、そして前記断片は、平滑末端である。ついで、オリゴヌクレオチドアダプターが、前記断片の末端に結合される。前記アダプターは、前記断片の増幅および配列決定用のプライマーとして機能する。前記断片は、表面に付着されることができ、そして前記断片が個々に分離可能な解像度で付着される。１つ以上のヌクレオチドの付加により、プロトン（Ｈ＋）が放出され、そのシグナルが配列決定機器において検出および記録される。前記シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。
【００５０】
提供された発明の方法に使用され得る配列決定技術の別の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定である。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定は、フォールドバック（ｆｏｌｄ−ｂａｃｋ）ＰＣＲおよびアンカープライマーを使用する固体表面上での、ＤＮＡの増幅に基づいている。ゲノムＤＮＡが断片化され、アダプターが、前記断片の５’端および３’端に付加される。フローセル流路の表面に付着されたＤＮＡ断片が、伸長され、架橋増幅される。前記断片は、二重鎖となり、前記二重鎖分子が変性される。固相増幅とその後の変性を後の複数サイクル行うことにより、同じテンプレートについての、おおよそ１０００コピーの一本鎖ＤＮＡ分子の数百万のクラスターが、前記フローセルの各流路において作製され得る。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびフルオロフォアで標識された可逆的に終結する４種のヌクレオチドが、逐次配列決定を行うのに使用される。ヌクレオチドの取り込み後に、レーザが、前記フルオロフォアを励起するのに使用され、画像がキャプチャーされ、最初の塩基の同定が記録される。各取り込まれた塩基からの前記３’ターミネーターおよびフルオロフォアが除去され、そして取り込み、検出および同定の工程が、繰り返される。
【００５１】
提供された発明の方法に使用され得る配列決定技術の別の例としては、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術が挙げられる。ＳＭＲＴでは、４種のＤＮＡ塩基の各々が、４種の異なる蛍光染料のうちの１つに付着される。これらの染料は、リン酸基に結合される（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底において、テンプレート一本鎖ＤＮＡの一分子に固定される。ＺＭＷは、ＺＭＷの内外に（マイクロ秒で）素早く拡散する、蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、ＤＮＡポリメラーゼによる一つのヌクレオチドの取り込みの観察を可能にする閉じ込め構造体である。伸長中の鎖にヌクレオチドを取り込むのには数ミリ秒かかる。このタイミング中に、前記蛍光標識が励起され、そして蛍光シグナルが生成され、そして前記蛍光タグが切断される。前記染料の対応する蛍光の検出は、どの塩基が取り込まれたかを示す。前記処理が繰り返される。
【００５２】
提供された発明の方法に使用され得る配列決定技術の別の例は、ナノポア配列決定（Ｓｏｎｉ  Ｇ  Ｖ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：１９９６−２００１）である。ナノポアは、直径が１ナノメートルオーダーの小さな孔である。導電性流体へのナノポアの浸漬およびそれにまたがる電圧の印加は、前記ナノポアを通ってイオンが伝導されることにより、わずかな電流をもたらす。流れる電流の量は、前記ナノポアのサイズに敏感である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するにつれ、前記ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、種々の度合いに前記ナノポアを詰まらせる。このため、前記ＤＮＡ分子が前記ナノポアを通過するにつれての前記ナノポアを通過する電流の変化は、前記ＤＮＡ配列の読み取りを意味する。
【００５３】
提供された発明の方法に使用され得る配列決定技術の別の例は、（例えば、米国特許出願公開第２００９００２６０８２号明細書に記載のように）化学感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを使用してＤＮＡを配列決定することを含む。前記技術の一例では、ＤＮＡ分子は、反応チャンバ内に置かれることができ、そして前記テンプレート分子が、ポリメラーゼに結合された配列決定プライマーにハイブリダイズされ得る。前記配列決定プライマーの３’端での新たな核酸鎖中での、１つ以上のトリホスフェートの取り込みが、ｃｈｅｍＦＥＴによる電流の変化により検出され得る。アレイは、複数のｃｈｅｍＦＥＴセンサを有し得る。別の例では、単一の核酸がビーズに付着され得、そして前記核酸は、前記ビーズ上で増幅され得、そして前記個々のビーズは、ｃｈｅｍＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバに移動させられ得、各チャンバは、ｃｈｅｍＦＥＴセンサを有し、そして前記核酸が配列決定され得る。
【００５４】
提供された発明の方法に使用され得る配列決定技術の別の例は、電子顕微鏡を使用することを含む（Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ  Ｅ．Ｎ．ａｎｄ  Ｂｅｅｒ  Ｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９６５  Ｍａｒｃｈ；５３：５６４−７１）。前記技術の一例では、個々のＤＮＡ分子は、電子顕微鏡を使用して区別可能な、金属標識を使用して標識される。ついで、これらの分子は平坦な表面上で引き伸ばされ、そして配列を測定するために電子顕微鏡を使用して画像化される。
【００５５】
一分子から生じるかまたは一分子からの増幅から生じる配列が、読み取られ得る。一分子の何百万もの独立した増幅物が、固体表面上または、水／油エマルジョンにおけるごく小さな区画中のいずれかにおいて、並行して行われ得る。配列決定されるＤＮＡサンプルは、各区画に１つの分子を得るために十分に希釈および／または分散され得る。この希釈の後にＤＮＡ増幅を行って、元のＤＮＡ配列のコピーを生成し、全てが同じ配列を有する分子の「クラスター」を作製する。ついで、これらのクラスターが、配列決定され得る。何百万もの読み取りが、１回の実行で生成され得る。配列は、増幅された配列の所定の鎖の５’端から始まって生成され得る、および／または、配列は、相補配列の５’端から始まって生成され得る。好ましい実施形態では、両方の鎖からの配列が、生成される、すなわち、対となった端部読み取り（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄｓ）である。
【００５６】
アルゴリズムは、シークエンサーにより生成されるどの配列が、前記ＤＮＡ配列に由来するかを決定するのに使用される。個々に測定された配列（読み取り）は、互いに比較されて、増幅および／または配列決定により導入されたエラーを含むものが相殺され得る。アルゴリズムは、出発材料におけるＤＮＡ配列の頻度をより正確に決定するために、読み取りを互いに組み合わせるのに使用され得る。
【００５７】
参考としての援用
他の文献、例えば、特許、特許出願、特許公開、ジャーナル、本、研究論文、ウェブコンテンツに対する参照および引用が、この開示の全体を通してなされている。全てのこのような文献は、これにより、全ての目的についてその全体が、本願明細書に参考として援用される。
【００５８】
均等物
本願明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の改変およびその多くの更なる実施形態は、本願明細書で引用された科学文献および特許文献に対する参照を含め、この文書の完全な内容から当業者に明らかとなる。本願明細書における主題は、その種々の実施形態およびその均等物において、本発明の実施に採用され得る、重要な情報、例示および指針を含む。
【実施例】
【００５９】
実施例１．光学マッピングを使用する微生物同定
【００６０】
微生物の同定（ＩＤ）は、一般的に、２つの段階を有する。第１段階では、多くの有機体由来のＤＮＡをマッピングし、互いに比較する。これらの比較から、重要な表現型および分類が、マップの特徴と関連付けられる。第２段階では、一分子制限マップをデータベースと比較して、最も良好な一致を見出す。
【００６１】
データベース構築および注釈
【００６２】
有機体の多様性を表すのに十分な、そしてそのことにより種々の有機体の中で区別するのが可能な、マップを生成する。前記データベースにおける前記有機体の多様性が大きいほど、より正確に、未知の有機体を同定する能力がある。理想的に、データベースは、医療的または工業的な状況で有用となるように、十分な各種の微生物についての、種および亜種レベルでの既知の有機体の配列マップを含む。しかしながら、任意の所定のデータベースにマッピングされた有機体の正確な数は、データベースが用いられる望ましい用途に基づいて、ユーザーの都合のいいように決定する。
【００６３】
十分な数の微生物がマッピングされた後、マップ類似性クラスターを生成する。まず、マップツリーを生成する。前記ツリーの構築後、種々の表現型および分類のデータをオーバーレイし、前記集団の残りから個々のクレードを一意的に識別するマップの領域を同定する。その目的は、クラスタリング法に対する改善をある程度通して行われる、目的の表現型／分類と関連付ける具体的なクレードを見出すことである。
【００６４】
前記クラスターおよびツリーが注釈付けされると、前記注釈付けを、個々のマップに遡って適用する。さらに、必要であれば、前記データベースは、重要な識別領域のみを含むように編集される。これにより、時間性能を向上し得る。
【００６５】
未知のもののコール（同定）
【００６６】
未知のものを試験する一実施形態は、未知サンプルからの未加工の一分子マップの各々を、前記データベースにおける各エントリーと比較し、ついで、種々の分子間での一致可能性を組み合わせて、全体的な一致可能性を作製することを含む。
【００６７】
近縁の有機体間の識別は、前記有機体から取得されるデータを、前記データベースにおけるデータと比較することにより、最も多いヒットまたは最も良好な一致可能性を単純に選択することにより行われ得る。より正確な比較は、何が特定のゲノムの識別特徴であるかを、何が同じ種のいくつかの単離株間で共有される共通のモチーフであるかに対して、各ゲノム上に詳細な注釈をつけることにより行われ得る。このため、一致スコアが集約された際に、（単独のゲノムよりむしろ）分類レベルは、確率が割り当てられる。したがって、何が決定する特徴であるかおよび何が共有されるかに関する前記ゲノムの幅広い注釈が、必要とされる。
【００６８】
前記方法の一実施形態では、ゲノム全体を、全ての分子と比較する。種内では一般的にマップの重なりが多いので、別の実施形態が、使用され得る。第２の実施形態では、前記ゲノムから共有される要素を抽出するいくつかの方法が作られて、マッチングアルゴリズムに関する参照点として依然として機能し得る領域の縮小セットを生成する。前記第２の実施形態は、システムの性能を向上するために、参照データベースの簡素化を可能にする。
【００６９】
実施例２．微生物同定のための複数の酵素の使用
【００７０】
一実施形態では、各酵素由来の一分子制限マップを、独立して、実施例１に記載のデータベースと比較し、そして可能性のある同定を、独立して各酵素からコールする。ついで、最終的な一致可能性を、独立した実験として組み合わせる。この実施形態は、前記処理の何らかの組み込み冗長性を提供し、そのため、前記処理の精度を提供する。
【００７１】
序論
【００７２】
一般的に、光学マッピングは、平均断片サイズの特定の範囲内で使用され得、そして任意の所定の酵素に関して、種々のゲノム間では前記平均断片サイズにかなりの変動が存在する。これらの理由から、典型的には、臨床的に適切な微生物の同定のために１つの酵素を選択することは最適ではない。代わりに、酵素の小さなセットが、あらゆる目的の有機体について、データベースにおいてマッピングに適した少なくとも１つの酵素が存在する可能性を最適化するのに選択される。
【００７３】
選択基準
【００７４】
酵素選択の第１の工程は、目的の細菌の同定であった。これらの細菌は、２つの群：（ａ）最も一般的な臨床的に興味深い有機体、および（ｂ）ヒトの健康に関連する他の細菌に分類された。前記選択された酵素セットは、一般的な臨床的に興味深い細菌の各々を、近縁のゲノムの詳細な比較に適した平均断片サイズの範囲（約６〜１３ｋｂ）内で切断する少なくとも１つの酵素を有さなければならない。さらに、残りの有機体に関して、各断片は、光学マッピングについての機能的な範囲（約４〜２０ｋｂ）内でなければならない。これらの制限は、数学的モデリング、指示された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）実験および顧客注文による体験により決定された。最終的に、光学マッピングに既に使用されている酵素が選択された。
【００７５】
推奨セット
【００７６】
上記基準に基づいて、予備のセットは、光学マッピングに使用されている酵素ＢａｌＩＩ、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩからなった。公知の酵素により重要な有機体をカバーする、２８の更なるセットが存在するので、このセットが適切でない場合、それらの代替品が使用される（データを示さず）。
【００７７】
最終工程
【００７８】
実験２における分析が、配列決定されたゲノムに焦点を合わせているため、完全なデータベース作製前に、この酵素セットを、他の臨床的に重要なゲノムに対して試験する。前記試験は、原理研究の証明における第１段階の一部である。
【００７９】
実施例３．大腸菌の同定
【００８０】
Ａ．微生物同定法の一実施形態では、約５００と約１０００との間の単離株の核酸を、光学的にマッピングする。ついで、一意的なモチーフが、属、種、株、亜株および単離株間で同定される。サンプルを同定するために、前記サンプルの単一の核酸分子を、前記モチーフに対して整列し、ｐ値が各モチーフの一致に関して与えられる。前記ｐ値は、モチーフの可能性を見出すために組み合わせられる。最も特異的なモチーフが、同定を与える。
【００８１】
Ｂ．下記の実施形態により、大腸菌を単離株レベルまで同定する方法を説明する。６つの大腸菌単離株の制限マップが、ＢａｍＨＩ制限酵素によるこれらの単離株における核酸の消化により取得された。図１は、これら６つの大腸菌単離株：５３６、Ｏ１５７：Ｈ７（完全なゲノム）、ＣＦＴ０７３（完全なゲノム）、１３８１、Ｋ１２（完全なゲノム）および７１８の制限マップを示す。図２に示すように、前記単離株は、３つの下位群（株）：（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）Ｏ１５７、（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）ＣＦＴ、および（Ｋ１２および７１８を含む）Ｋ１２内にクラスター形成された。
【００８２】
これらの制限マップは、これら６つの単離株の関係に関する複数レベルの情報を提供し、例えば、前記３つの下位群の全てに共通するモチーフ（図３を参照のこと）、および、大腸菌に特異的な領域（図４におけるボックス化された領域を参照のこと）を示した。前記マップは、各株に特有の領域（図５における四角で囲まれた領域を参照のこと）、および、各単離株に特異的な領域（図６における四角で囲まれた領域を参照のこと）も示すことができた。
【００８３】
この情報および類似の情報は、データベースに保存されて、目的の細菌を同定するのに使用され得る。例えば、同定される有機体の制限マップは、前記有機体の核酸をＢａｍＨＩで消化することにより取得され得る。この制限マップが、前記データベースにおける前記マップと比較され得る。同定される前記有機体のマップが、大腸菌に特異的なモチーフ、前記下位群の１つに特異的なモチーフ、前記株の１つに特異的なモチーフおよび／または特定の単離株に特異的なモチーフを含む場合、前記有機体の正体は、前記特異的モチーフを関連付けることにより取得され得る。図６は、可変の長さの類似性ツリーを移動する可能性を説明する図を示す。
【００８４】
Ｃ．下記の実施例により、サンプルを大腸菌細菌と同定することを例示する。サンプル（サンプル２８）を、ＢａｍＨＩにより消化し、その制限マップを取得した（図８、中段の制限マップ）。このサンプルを、種々の大腸菌単離株を含んだデータベースと整列させた。前記サンプルは、４つの大腸菌単離株：ＮＣ００２６９５、ＡＣ００００９１、ＮＣ０００９１３およびＮＣ００２６５５と類似することが見出された。したがって、前記サンプルは、前記ＡＣ００００９１単離株に最も近縁の大腸菌細菌と同定された。
【００８５】
実施例４．毒性大腸菌に関する光学マップシグネチャ
【００８６】
２０１１  Ｇｅｒｍａｎ  ＳＴＥＣ大流行は、多数の人々に強い衝撃を与え、２０名より多くの死者の原因となった。前記大流行株は、２５％より多くの患者において、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を誘発する極度に毒性のものである。どのような大流行においても、患者および可能性のある大流行源（例えば、野菜、肉および乳製品）の両方において、大流行単離株を、通常の「バックグラウンド」株から素早く区別する方法を有することが重要である。最初の大流行後、その株が特に毒性であり、（新たな）「バックグラウンド」の一部になる場合、前記毒性種に感染した患者は、管理を率先して調節するために、前記毒性株について試験される。例えば、重度の大腸菌性下痢の患者は、Ｏ１５７：Ｈ７株についての反射試験を受ける。陽性の場合、前記患者は、ＩＣＵまたは他のモニターされる施設に輸送され、ＨＵＳ予防プロトコルにかけられる。患者の管理に影響を与えるために、株分類アッセイを素早く行う必要がある。免疫アッセイおよび分子アッセイが、最も素早い結果を提供する。しかし、前記２０１１  Ｇｅｒｍａｎ  ＳＴＥＣ株は、他の病原性がより低い株と、抗原決定基（Ｏ１０４：Ｈ４）を共有することが公知である。したがって、分子診断が好ましい。
【００８７】
光学マッピング技術を、前記２０１１  Ｇｅｒｍａｎ大腸菌大流行株に特有の保存されたゲノム領域を同定するために使用した。新たに光学マッピングを使用して、全ての大腸菌大流行単離株において保存されており、かつ他の非毒性の大腸菌株には存在しないゲノム領域／アイランド（すなわち、大腸菌の毒性株を示す光学マップシグネチャ）を同定した。光学マップを、上記のように作成し、光学マップ比較を、上記のように行った。前記保存された、大流行特異的なゲノムアイランドは、下記の４か所に局在する（図９の赤色の要素を参照のこと）。
領域１
開始：２，０２８，６９７ｂｐ
終了：２，０６６，２６７ｂｐ
長さ  ３７，５７１ｂｐ；
領域２
開始：４，２８６，４３０ｂｐ
終了：４，３１８，２２２ｂｐ
長さ：３１，７９３ｂｐ；
領域３
開始：４，８９０，１３５
終了：４，８９７，４１９ｂｐ
長さ：７，２８５ｂｐ；および
領域４
開始：５，０９９，２１５ｂｐ
終了：５，１１２，１０１ｂｐ
長さ：１２，８８７ｂｐ。
全ての位置は、ＬＢ２２６６９２光学マップにおける複製起点と比較してのものである。
【００８８】
前記大流行単離株の配列を決定し、配列コンティグを、参照光学マップと整列した（図９〜１０）。ゲノムアイランド領域１、２および４と整列する非保存領域の配列を、図１１〜１３に示す。この情報は、今や、数多くの技術（ＰＣＲ、アレイ、配列決定または光学マッピングを包含する）の任意の１つを使用する、前記２０１１  Ｇｅｒｍａｎ  ＳＴＥＣ大腸菌株ならびに任意の他の大腸菌株についての分子アッセイの開発に有用である。
【００８９】
ゲノムアイランド３についての隣接配列は公知である。この隣接配列は、第３のゲノムアイランド領域の配列を推定するのに、当業者により使用され得る。
【００９０】
本願明細書で行われる分析は、プラスミドまたは他の可動因子よりもむしろ、大腸菌染色体の完全な構造に基づいていた。従って、本願明細書におけるこのような分析は、安定したゲノム領域を同定する可能性がより高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１１−１１】
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【図１１−１２】
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【図１１−１３】
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【図１１−１４】
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【図１１−１５】
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【図１１−１６】
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【図１１−１７】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１２−１４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月17日(2014.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014518068000001.app
【国際調査報告】
2014518068.tif 000050
2014518068.tif 000051
2014518068.tif 000052