(57)【要約】  本発明は、グラム陽性細菌におけるポリシストロン性発現に関し、特に、細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子に転写可能に結合されたグラム陽性細菌に対して内因性の１つまたは複数の遺伝子を含む、ポリシストロン性発現ユニットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、内因性遺伝子、および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記１つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も３’側の遺伝子である、グラム陽性細菌。
【請求項２】
ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、グラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子、および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された、グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子を連続して含み、前記１つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も３’側の遺伝子である、組換え核酸。
【請求項３】
前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質または多量体タンパク質など、対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの産物をコードする、請求項１に記載のグラム陽性細菌または請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
１つまたは複数の外因性遺伝子が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質または多量体タンパク質など、対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの産物をコードする、薬剤として使用するための、好ましくは対象への前記産物の投与または送達に使用するための、請求項１に記載のグラム陽性細菌または請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子がグラム陽性細菌に対して内因性であるプロモーターにより転写制御される、請求項１、３もしくは４のいずれかに記載のグラム陽性細菌または請求項２から４までのいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記プロモーターが必須遺伝子プロモーター、構成的プロモーター、中心的代謝遺伝子プロモーターおよび／またはハウスキーピング遺伝子プロモーターである、請求項５に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項７】
前記プロモーターがリボソーム遺伝子プロモーターである、請求項５に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項８】
前記プロモーターが解糖系遺伝子プロモーターである、請求項５に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項９】
前記プロモーターが前記グラム陽性細菌のｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳのプロモーターからなる群から選択される、請求項５に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項１０】
前記内因性遺伝子がグラム陽性細菌における天然の染色体遺伝子座に位置する、請求項１または３〜９のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１１】
１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことにより、好ましくは１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における前記内因性遺伝子の３’に染色体上で組み込むことにより、前記内因性遺伝子が１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合された、請求項１０に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１２】
前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域によって転写可能に結合されており、好ましくは前記遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、請求項１もしくは３〜１１のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜９のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項１３】
前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、請求項１２に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項１４】
好ましくは遺伝子間領域がグラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域である、前記グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結されたグラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域を含む、組換え核酸。
【請求項１５】
前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、請求項１４に記載の組換え核酸。
【請求項１６】
１つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖（ＶＬ）をコードし、別の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖（ＶＨ）をコードし、より好ましくは機能性断片がＦａｂである、請求項１もしくは３〜１３のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜９もしくは１２〜１５のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項１７】
前記ＶＬまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子が、前記ＶＨまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の３’末端と転写可能に結合された、請求項１６に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項１８】
前記グラム陽性細菌が、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）もしくはエンテロコッカス属（Enterococcus）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であるか、または前記グラム陽性細菌がビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）である、請求項１、３〜１３、１６もしくは１７のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜９もしくは１２〜１７のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項１９】
請求項１、３〜１３または１６〜１８のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌を含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、前記産物が対象における治療または予防効果を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２〜９または１２〜１８のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医学、より詳細には分子および細胞生物学の分野に属し、微生物によるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などの産物の組換え工学技術および発現に関する。より具体的には、本発明は、微生物によるそのような産物の発現のためのポリシストロン性発現構築物またはカセットに関し、さらに、関連ベクター、形質転換宿主、対象へのそのように発現した産物の送達、特に治療的送達などの使用および応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在までのところ、組換えタンパク質の多くの発現系が様々な生物工学的応用のために開発されている。異種または同種遺伝子発現のための系が原核生物、酵母および真菌ならびに哺乳類細胞において確立された。
【０００３】
酵母において産生される大部分の組換えタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主系として用いて発現された。これにもかかわらず、いくつかの制限がＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）系に検出された。例は、通常低い産物の収量および非効率的な分泌（多くのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）タンパク質は、培地中に遊離の状態で見いだされずに、細胞周辺腔に保持または細胞壁と結合している）（Dominguezら、Int. Microbiol.、1998年、1巻（2号）、131〜142頁）である。酵母における産生の制限があるため、安価なブロス中で増殖させるのが容易であり、組換えタンパク質を製造するために頻繁に用いられている、細菌におけるタンパク質の発現が大きな関心を呼んだ。原核生物系のうちで、最高のタンパク質レベルは、通常、大腸菌（Escherichia coli）（E. coli）における組換え発現を用いて得られる（Jana & Deb. Appl. Microbiol. Biotechnol.、2005年、67巻(3号)、289〜298頁）。しかし、大腸菌（E. coli）において、最も一般的に用いられている産生戦略は、細胞内（周辺質または細胞質中）であり、したがって、費用がかかり、しばしば問題のある下流精製工程を含む。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの異種ポリペプチドの組換え発現（例えば、米国特許第５，５５９，００７号）ならびに抗原および／または治療上関連するポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕでの発現および送達（例えば、国際公開第９７／１４８０６号）のための宿主としてますます重要になりつつある。これらのグラム陽性菌宿主において産生される異種タンパク質は、培地中に容易に分泌させることができ、それにより、それらの精製ならびに対象へのそれらの直接的送達が促進される。
【０００５】
ほとんどの発現系は、１つの単一タンパク質の発現（１つの単一遺伝子配列の結果として）を非常に首尾よく取り扱うことができる。しかし、場合によって、複数のタンパク質もしくは多重遺伝子性タンパク質複合体を発現することができる、例えば、抗体もしくはタンパク質複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現だけでなく、特定の疾患において相乗効果を有する２つ以上のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｓｉｔｕ発現および送達または抗体もしくはその機能性（多重遺伝子性）断片のｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｓｉｔｕ発現および送達も可能である発現系を有することが望ましい。これらの場合、多重遺伝子の緊密な共調節が必要であるため、１つのプロモーターの制御下で所望のタンパク質または抗体をコードしている多重遺伝子を有することが望ましい。
【０００６】
組換えタンパク質複合体を製造するための２つの最も一般的なアプローチは、個別に発現させ、精製したサブユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再構成を実施すること、または適切な宿主においてサブユニットを共発現させることによりｉｎ  ｖｉｖｏでの再構成を実施することである（Selleck & Tan、「Recombinant protein complex expression in E. coli」、Curr. Protoc. Protein Sci.、2008年、chapter 5:unit 5、21頁）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再構成は成功裏に使用されたが、方法が冗長であり（各サブユニットを発現させ、精製しなければならず、再構成の後に複合体をさらに精製しなければならない）、再構成の収率がしばしば低い。これに反して、共発現によるｉｎ  ｖｉｖｏでの再構成は、効率の良さ（１ラウンドの発現および精製のみ）ならびに所望の複合体の潜在的により高い収率および質（複合体の再折りたたみおよび集合が細胞環境におけるタンパク質折りたたみ酵素の存在下で起こる）という利点がある（Selleck & Tan、2008年、前出）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの再構成は、個々のタンパク質サブユニットを発現するバキュロウイルスを昆虫細胞に共感染させることにより（Tirodeら、Mol. Cell、1999年、3巻（1号）、87〜95頁）、また複数のプラスミドにより（Johnstonら、Protein Expr. Purif.、2000年、20巻(3号)、435〜443頁、McNallyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、85巻(19号) 7270〜7273頁）または特殊化したポリシストロン性プラスミドにより（Henricksenら、J. Biol. Chem.、1994年、269巻(15号)、11121〜11132頁、Ishiaiら、J. Biol. Chem.、1996年、271巻(34号)、20868〜20878頁、Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、94巻(6号)、2278〜2283頁）細菌において成功裏に行われた。
【０００７】
大腸菌（E. Coli）においてタンパク質複合体を産生させるための一般的ポリシストロン性発現系が記載された（Selleck & Tan、2008年、前出、Tan、Protein. Expr. Purif.、2001年、21巻(1号)、224〜234頁、Tanら、Protein Expr. Purif.、2005年、40巻(2号)、385〜395頁）。これらの系は、必要な開始および停止コドンを有するコーディング領域を含み、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列などの翻訳開始シグナルおよび翻訳エンハンサーが先行する翻訳カセットの概念を利用する（Tan、2001年、Tanら、2005年、前出）。ｍＲＮＡに転写されたとき、翻訳カセットは、大腸菌（E. coli）翻訳機構がｍＲＮＡの所望のポリペプチドへの翻訳を開始し、持続するために必要かつ十分な情報を含む（Selleck & Tan、2008年、前出）。
【０００８】
インターロイキン１８のバイシストロン性発現ベクターは、大腸菌（E. coli）において記載されたが、２つの遺伝子の間の遺伝子間領域が合成リンカーからなり、カスパーゼ４の発現がＩＣＥの発現よりはるかに高かったことから、明らかに遺伝子特異的である。Ｓｍｏｌｋｅらは、合成遺伝子間領域配列を用いてオペロンにおける２つ以上の遺伝子によりコードされるタンパク質レベルを差別的に制御することが可能であることを以前に示した（Smolkeら、Appl. Environ. Microbiol.、2000年、66巻(12号)、5399〜5405頁、Smolke & Keasling、Biotechnol. Bioeng.、2002年、80巻(7号)、762〜776頁）。しかし、このアプローチは、ランダムな組合せに依拠し、発現ホストへの合成配列の導入を必要とする。
【０００９】
新規かつ改善された抗体産生系の需要が近年生じた。抗体発現のための系が原核生物、酵母および真菌ならびに哺乳類細胞において確立された。単鎖および単ドメイン抗体は、細菌から作製することがより容易であるが、フルサイズ抗体は、注射したとき、一般的により高い結合親和力と中和抗体の形成のより低いリスクを有する。
【００１０】
フルサイズ抗体は、細菌から作製することができる（Mazorら、Nat. Biotechnol.、2007年、25巻(5号)、563〜565頁、Simmonsら、J. Immunol. Methods、2002年、263巻(1〜2号)、133〜147頁）。組換え原核生物発現に関する大部分の報告に、ほぼもっぱら大腸菌（E. coli）からであるが、抗体断片の作製が記載されている。多くの操作されたＬＡＢは、ジスルフィド結合を修正することができるが、文献にはＬＡＢから産生された抗体様分子の限られた数の例のみが含まれている（Krugerら、Nature Biotechnology、2002年、20巻(7号)、702〜706頁、Beninatiら、Nature Biotechnology、2000年、18巻(10号)、1060〜1064頁、Chanceyら、J. Immunol.、2006年、176巻(9号)、5627〜5636頁、Hultbergら、BMC Biotechnol.、2007年、7巻、58頁、Yuvarajら、Mol. Nutr. Food. Res.、2008年、52巻(8号)、913〜920頁）。これらの報告にはラクトバシラス属（Lactobacillus）種、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）およびストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）において発現した単鎖抗体断片のみが記載され、多重遺伝子性、二本鎖抗体断片またはフルサイズ抗体は記載されていない。ポリシストロン性発現系は、抗体のような複合タンパク質の効率的な原核生物における合成および発現を得るうえで不可欠であり得る。依然として移植拒絶反応の管理に利用できる最も強力な免疫抑制薬の１つである（Hooksら、Pharmacotherapy、1991年、11巻(1号)、26〜37頁）、ムロモナブＣＤ３（Muromonab-CD3）の１９８６年におけるＦＤＡ承認以来、フルサイズ抗体および抗体断片は、医学におけるますます重要かつ多目的ツールになっている。
【００１１】
現況技術では細菌細胞におけるポリシストロン性発現系のいくつかの例が示されているが、これらは、かなり限定されており、複数の遺伝子を導入し、発現するためのより効率の高い系の必要性を際立たせている。したがって、タンパク質の発現、好ましくは異種タンパク質の発現、より好ましくは複数の異種タンパク質の発現に有利に用いることができるさらなる配列を提供する必要がある。
【００１２】
上述のことに加えて、組換え微生物による直接的なタンパク質の送達のためならびにバルクタンパク質の生産および下流精製のためにより多くの量の組換えタンパク質を製造する努力は、多大な技術的努力を意味する。異種タンパク質の産生を増加させるための既存のアプローチは、選択される強プロモーターを使用することである（例えば、国際公開第２００８／０８４１１５号参照）。このアプローチにおいて、微生物により発現された最も豊富な内因性タンパク質を同定するためにプロテオミック解析が行われる。ゲノム配列を用いることにより、それぞれの遺伝子およびプロモーターを同定し、単離することができる。これらの強プロモーター（例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ｈＩＩＡ遺伝子プロモーター、ＰｈＩＩＡ）は、異種遺伝子の前に配置することができ、このようにして、高発現を達成することができる。しかし、宿主の生理を障害する発現のレベルは、宿主に増殖負荷を負わせる可能性があり、対抗選択をもたらす。これは、発現宿主における所定の異種タンパク質の最高の可能な発現を特定の固有のレベルに本質的に制限する。これは、染色体局在性発現ユニットの開発における特にやっかいな障害である。
【００１３】
対抗選択の問題は、選択マーカーの準備によって伝統的に対処されている。実際、例えば、抗生物質耐性遺伝子を準備することによる正または負の選択は、導入された異種遺伝子の損失を防ぐことができる。あるいは、または選択マーカーの使用に加えて、宿主の非カップリング増殖および異種タンパク質の発現を可能にし、それにより、異種遺伝子が発現しない場合に増殖段階における可能性のある対抗選択を予防する、誘導遺伝子発現系を用いることができる。これに関連して、欧州特許第０５６９６０４号は、異種遺伝子がＬａｃＺ遺伝子の５’側に強制的に配置されている、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）における誘導発現系を記載している。このようにして、異種遺伝子の発現は、誘導性であるだけでなく、さらに、ＬａｃＺ遺伝子の発現を必要とする、炭素源としてのラクトースを含むそれらの自然生息環境乳汁中で細菌を増殖させることによって、異種遺伝子の維持も選択される。
【００１４】
上述の異種遺伝子発現のための系は、応用分野が限定されていることは明らかである。例えば、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーの使用は、食物生産または製薬応用分野における応用に容易に耐えられない。さらに、自然生息環境中の増殖に、または増殖のために自然生息環境からの炭素源を用いることに限定することは、異種遺伝子発現のための系の汎用性を著しく低くする。また、誘導系の使用は、誘導物質を添加すべき定義された培地が異種タンパク質の発現を保証するために必要であるような、宿主の増殖条件に本質的に依存する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、当技術分野において異種タンパク質発現を増大させる必要もあり、また様々な異なる条件下で多目的に使用でき、広く適用できると同時に、産業および／または治療環境において十分な量の発現異種タンパク質を得るために高い発現レベルを達成することができる配列、クローニングシステムおよび戦略が必要である。これらの環境において、それぞれがそれ自体の生物学的活性および治療効果を有する複数のタンパク質の発現を得ることも特に有用であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の態様および実施形態は、当技術分野の上述の必要性の少なくとも一部、例えば、１つまたは複数に対応する。
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことにグラム陽性細菌が、これらの細菌の内因性遺伝子（単数または複数）も含むポリシストロン性発現ユニットからの外因性または異種遺伝子を効率的に発現することができることを発見した。このように、グラム陽性細菌は、そのような遺伝子がこれらの細菌の内因性遺伝子（単数または複数）に転写可能または翻訳可能に結合される場合にポリシストロン性発現ユニットからの外因性または異種遺伝子を効率的に発現することができる。意外なことに、本発明者らは、内因性遺伝子およびポリシストロン性発現ユニットにおける外因性遺伝子の転写可能および／または翻訳可能な結合がグラム陽性細菌における外因性遺伝子の高い発現レベルをもたらすことを発見した。特に、グラム陽性細菌の内因性遺伝子に転写可能および／または翻訳可能に結合された外因性遺伝子の発現レベルは、グラム陽性細菌の内因性遺伝子に転写可能または翻訳可能に結合されない外因性遺伝子の発現レベルと少なくとも同等、有利なことにより高いことが見いだされた。
【００１８】
したがって、一態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含む。ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子（例えば、制限なしに１つの内因性遺伝子）および１つまたは複数の外因性遺伝子を含むと示すこともできる。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットは、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む。したがって、そのようなポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子（例えば、制限なしに１つの内因性遺伝子）および１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含むと示すこともできる。ポリシストロン性発現ユニットは、ポリシストロン性ｍＲＮＡにおける１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子の転写をもたらすように構成されている。したがって、本グラム陽性細菌は、１つまたは複数の外因性遺伝子が転写可能または翻訳可能に結合された１つまたは複数の内因性遺伝子を含むと別途示すことができる。したがって、１つまたは複数の外因性遺伝子が転写可能および／または翻訳可能に結合された１つまたは複数の内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌も提供する。
【００１９】
他の態様は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸を提供し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、グラム陽性細菌に内因性の遺伝子およびグラム陽性細菌に外因性の１つまたは複数の遺伝子を含む。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットは、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む。したがって、グラム陽性細菌に外因性の１つまたは複数の遺伝子が転写可能および／または翻訳可能に結合されたグラム陽性細菌に内因性の１つまたは複数の遺伝子を含むポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸も提供する。
【００２０】
好ましくは、本明細書を通して意図するように、前記１つまたは複数の外因性遺伝子は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能または翻訳可能に結合させることができる。本発明者らは、そのような構成が異種タンパク質発現レベル、ポリシストロン性発現ユニットの維持および／またはゲノム安定性の点で有益であることを驚くべきことに発見した。さらなる下流のゲノム配列が重要性がより低いか、または重要でないことがさらに発見された。
【００２１】
転写可能または翻訳可能に結合された１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子の転写は、グラム陽性細菌における転写を達成することができるプロモーターにより適切に調節または制御することができ、好ましくは前記グラム陽性細菌の内因性プロモーターにより調節または制御することができる。したがって、１つまたは複数の外因性遺伝子が転写可能または翻訳可能に結合された、その天然の染色体遺伝子座に局在する１つまたは複数の内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌も提供する。好ましくは、これらの転写可能または翻訳可能に結合された１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子の転写は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子の天然のプロモーターにより調節または制御される。適切には、転写または翻訳共役は、例えば、１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’に染色体上で組み込むことなどにより、１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことによって達成することができる。
【００２２】
したがって、一態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、好ましくは前記１つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も３’側の遺伝子（単数または複数）（the most 3' gene(s)）である。
【００２３】
本発明者らは、それ自体、例えば、オペロンなどのポリシストロン性遺伝子であり得る天然の遺伝子の３’側に転写可能に結合された外因性または異種遺伝子（または複数の異種遺伝子）の染色体組込みが、（１つまたは複数の）外因性遺伝子に対する対抗選択が予想に反して存在しないか、または最小限である、安定な発現ユニットをもたらすことを驚くべきことに発見した。
【００２４】
本発明者らは、ポリシストロン性発現ユニットの発現が特に特定の種類のプロモーターにより特定の条件下で達成されるときに、本明細書で述べる利点がますます明らかになることを思いがけなく発見した。本発明者らは、異種タンパク質（単数または複数）に対する対抗選択が、選択マーカーの使用などの従来の手段により、または誘導系の使用により対処されない、本明細書で述べるポリシストロン性発現系は、それにもかかわらず高レベルで安定に維持し、発現させることができ、それにより、様々な異なる条件下で広く適用でき、選択剤または誘導物質の必要がないことを驚くべきことに発見した。したがって、本明細書で述べるポリシストロン性発現モジュールは、非選択可能（non-selectable）内因性および／または外因性遺伝子の使用を可能にする。
【００２５】
一態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が構成的プロモーターにより達成される。
【００２６】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が中心代謝遺伝子プロモーターにより達成される。
【００２７】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現がハウスキーピング遺伝子プロモーターにより達成される。
【００２８】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が必須遺伝子プロモーターにより達成される。
【００２９】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が誘導遺伝子プロモーターにより達成されない。
【００３０】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現がリボソーム遺伝子プロモーターにより達成される。
【００３１】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が解糖遺伝子プロモーターにより達成される。
【００３２】
上でも示したように、好ましい実施形態において、上述のプロモーターは、内因性遺伝子プロモーターである。さらに下でも詳述するように、好ましくは、本明細書で用いるプロモーターは、強プロモーターである。好ましくは、ただし制限なしに、前記内因性プロモーターは、ｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐＢ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳのプロモーターからなる群から選択することができる。極めて好ましくは、翻訳可能に結合された内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子の転写は、前記内因性遺伝子（の１つ）の天然のプロモーターにより調節または制御され得る。
【００３３】
本明細書で述べるプロモーターの特性を本発明により組み合わせることができることを理解すべきである。したがって、実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が、例えば、（内因性）構成的ハウスキーピング遺伝子プロモーター、（内因性）構成的中心代謝遺伝子プロモーター、（内因性）構成的必須遺伝子プロモーター、（内因性）構成的リボソーム遺伝子プロモーター、（内因性）構成的解糖遺伝子プロモーター、（内因性）中心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、（内因性）必須中心代謝遺伝子プロモーター、（内因性）必須中心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、（内因性）必須ハウスキーピング遺伝子プロモーター、（内因性）構成的中心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、（内因性）構成的必須中心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、（内因性）必須リボソーム遺伝子プロモーター、（内因性）必須解糖遺伝子プロモーター、（内因性）構成的必須リボソーム遺伝子プロモーター、（内因性）構成的必須解糖遺伝子プロモーターにより達成される。
【００３４】
好ましくは、本明細書を通して意図するように、前記１つまたは複数の外因性遺伝子は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能または翻訳可能に結合させることができ、それにより、１つまたは複数の内因性遺伝子は、細菌の染色体上のそれら自然位置に存在する。この構成において、１つまたは複数の内因性遺伝子（内因性遺伝子プロモーターを最小限含む）の５’末端における配列は、野生菌株のそれと同じであり、１つまたは複数の外因性遺伝子の３’末端の後の領域は、野生菌株におけるように１つまたは複数の内因性遺伝子の領域３’の配列と同じである。
【００３５】
例えば、組換え微生物による治療用タンパク質の送達のためなどの外因性タンパク質発現の多くの応用は、特定の選択される宿主微生物における前記治療用タンパク質の発現から恩恵を受け得る。これらの微生物は、例えば、ヒトまたは動物微生物群に由来する選択される菌株のような、それらのコロニー形成能に基づいて選択することができると思われる。微生物はまた、例えば、それらの細胞壁、細胞表面または細胞内内容物と宿主免疫系との相互作用の結果として、例えば、ｔｏｌｌ様受容体、Ｉｇファミリーメンバー、補体、サイトカインおよびその他との相互作用により、特定の送達された治療用タンパク質の活性を増強するそれらの能力に基づいて選択することができると思われる。特定の微生物は、腫瘍内、皮膚、高胆汁含量を有する部位、低いｐＨを有する部位およびその他などの特定な苛酷な送達部位内または上で存続するそれらの堅牢性に関して選択することができると思われる。本明細書を通して列挙するグラム陽性細菌は、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）、より好ましくはラクトコッカス属種（Lactococcus sp.）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）またはその亜種またはその菌株であり得る。あるいは、前記ＬＡＢは、好ましくはエンテロコッカス属種（Enterococcus sp.）、より好ましくはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus fecium）またはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはその亜種またはその菌株であり得る。
【００３６】
内因性細菌叢への遺伝子水平伝播を避けるために、染色体埋没型発現ユニットからの発現は、医学における治療用タンパク質の送達ツールとしての組換え細菌叢の使用に極めて有利である。また、染色体に局在する発現ユニットは、染色体に局在する発現ユニットがバルクタンパク質の産生に用いられる産生菌株の望ましい構造であり得るように、世代にわたってはるかにより安定に受け継がれることが証明され得る。現況技術において、染色体挿入は、条件付きで非複製型であり、相同的組換えを可能にする異種遺伝子中間フランキング領域（in-between flanking regions）を含むノックイン（ＫＩ）タイプベクターを用いて実施される。従来のアプローチ（例えば、国際公開第２００８／０８４１１５号参照）では、ＫＩプラスミドは、同族宿主において構築される（Ｌ．ラクティス（L. lactis）のＫＩプラスミドはＬ．ラクティス（L. lactis）において構築される）。多くの分泌シグナルが他の宿主に使用するのに適合しないので、これは、特にタンパク質分泌を必要とする異種発現に当てはまる。細菌染色体上に配置することが意図される発現構築物における強プロモーターの使用は、ＫＩプラスミド中間体からの異種遺伝子の発現により妨げられる。異種遺伝子には強プロモーターが直接先行し、これによって、ＫＩプラスミドからの発現が、意図されず、また要求されないが、最強のプロモーターの使用を本質的に制限することとなる。多くの場合、ＫＩプラスミドは、宿主における染色体数の多重度であるコピー数を有し、組込みにより、発現が数倍低くなる。したがって、染色体発現ユニットは、達成可能な最高であるものより本質的に弱い。この問題は、ここに述べる本発明により回避される。このアプローチにおいて、異種遺伝子は、下流に配置され、細菌染色体上の（強く発現した）内因性遺伝子に転写可能および／または翻訳可能に結合される。この戦略は、内因性（強い）プロモーターがＫＩプラスミド上に存在することを必要としない。むしろ、異種遺伝子の上流に、（強く発現した）内因性遺伝子のプロモーターレス３’末端が配置されている。この種のＫＩプラスミドは、サイレントであり、強いプロモーターの使用を制限しない。
【００３７】
１つまたは複数の外因性遺伝子と１つまたは複数の本明細書で述べる他の遺伝子との転写または翻訳共役は、グラム陽性細菌において活性な（すなわち、機能性の、有効な）遺伝子間領域により、好ましくはグラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域により達成することができる。したがって、さらなる態様は、グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域、好ましくは前記グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結した、グラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域を含む組換え核酸を提供する。作動可能な連結は、ｍＲＮＡ上に存在する遺伝子間領域の転写物ならびに外因性遺伝子の転写物が、グラム陽性細菌における、外因性遺伝子の翻訳の開始のための部位を与えることができることを保証する。好ましくは、遺伝子間領域は、外因性遺伝子の５’に配置することができる。核酸は、各外因性遺伝子に遺伝子間領域が先行する、ポリシストロン性配置の２つ以上の外因性遺伝子を含み得る。遺伝子間領域は、同じまたは異なっていてもよい。例えば、遺伝子間領域が異なる場合、これらは、同じもしくは異なる種の異なる遺伝子に、または異なる種の同じ遺伝子に由来する遺伝子間領域に相当し得る。これらの核酸は、１つまたは複数の他の遺伝子が遺伝子間領域を介して１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能または翻訳可能に結合された、１つまたは複数の外因性遺伝子を含むポリシストロン性発現ユニットを構築するのに有用であり得る。例えば、これらの核酸は、１つまたは複数の内因性遺伝子が遺伝子間領域を介して１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能または翻訳可能に結合された、本明細書で教示したようなポリシストロン性発現ユニットを構築するのに有用であり得る。好ましくはポリシストロン性発現ユニットの第１のシストロンは、強く発現する内因性遺伝子である。
【００３８】
本組換え核酸は、レプリコン上に含まれ得る。一態様はまた、本明細書で教示した核酸を含むレプリコンまたはベクターに関する。例えば、ベクターは、原核生物発現ベクター、好ましくは原核生物ポリシストロン性発現ベクターであり得る。しかし、そのようなプラスミド発現系の開発は、特定のレプリコンと強プロモーターの組合せが不安定であり得るため、面倒であり得る。また、特に、治療用タンパク質の送達のための応用の場合のように、抗生物質選択マーカーを発現プラスミドに含めることができない場合でないとすれば、天然のプラスミドの存在のため、選択される微生物を組換えプラスミドにより形質転換し、微生物において組換えプラスミドを安定に維持することは、不可能であり得る。異種遺伝子を下流に配置し、細菌染色体上で（強く発現した）内因性遺伝子に転写可能または翻訳可能に結合させることによって、この問題を回避することができる。この戦略は、プラスミド媒介性発現系を必要としないので、あらゆるタイプの選択される細菌叢の遺伝子工学に適用され得る一般的なアプローチとして用いることができる。要求される唯一の菌株固有の情報は、最先端技術により速やかに確定することができる。十分に発現したタンパク質のプロテオミック解析と組み合わせた高処理配列決定により、十分に存在するタンパク質をコードする領域のヌクレオチド配列が速やかに得られる。したがって、最も好ましくは、本明細書で述べるベクターは、外因性遺伝子（単数または複数）の染色体組込みを発生させるような、グラム陽性細菌における相同的組換えを達成するように構成することができる。
【００３９】
グラム陽性細菌における１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現のための、または１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現のための本明細書で述べる組換え核酸またはベクターの使用をさらに提供する。その上、グラム陽性細菌が１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現または１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現の能力がある、本明細書で教示した組換え核酸またはベクターを含む（例えば、それにより形質転換した）グラム陽性細菌を開示する。さらに、本明細書で教示した組換え核酸またはベクターを前記グラム陽性細菌に導入するステップを含む、グラム陽性細菌における１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現を達成するためのまたは１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現を達成するための方法を提供する。その上、本明細書で教示した組換え核酸またはベクターを前記グラム陽性細菌に導入するステップを含む、１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現の能力のあるまたは１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現の能力のあるグラム陽性細菌を発生させる方法を提供する。
【００４０】
本発明は、グラム陽性細菌における単一外因性遺伝子または複数の（例えば、２つ、３つもしくはそれ以上の）異なる外因性遺伝子を発現させる、好ましくは強力に（高度に）発現させる。前記外因性遺伝子または複数の外因性遺伝子は、有利にタンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）および／またはペプチド（単数または複数）などの発現産物または複数の発現産物をコードし得る。例として、また制限なしに、そのようなタンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）および／またはペプチド（単数または複数）は、抗原（例えば、免疫または免疫寛容を誘導するため）、アレルゲン、非ワクチン原性治療用ポリペプチド（サイトカイン、成長因子、創傷治癒因子、・・・）、抗体またはその機能性断片（例えば、Ｆａｂ断片）、融合タンパク質、多量体タンパク質などおよびそれらの組合せを含み得る。
【００４１】
ポリシストロン性の編成は、本明細書で教示した発現ユニットを、２種以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（例えば、多量体タンパク質、タンパク質複合体）の発現に特に適するものにすることができる。したがって、本明細書で意図する２種以上の外因性遺伝子は、好ましくは多量体タンパク質の異なるモノマーまたはサブユニットをコードすることができ、それによって、遺伝子がポリシストロン性ｍＲＮＡに共転写され、個々のモノマーまたはサブユニットがこのｍＲＮＡから翻訳される。これにより、例えば、個々のモノマーまたはサブユニットの多量体タンパク質へのバランスのとれた最適な集合を達成することなどの、外因性遺伝子の厳密に調節された共発現が可能になり得る。
【００４２】
この原理の特に好都合な実例は、抗体またはその機能性断片の発現である。したがって、本明細書で教示した２種以上の外因性遺伝子は、好ましくは抗体またはその機能性断片の別個の鎖をコードし得る。例えば、１つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖（ＶＬ）をコードし、他の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖（ＶＨ）をコードし得る。好ましくは、抗体の機能性断片は、Ｆａｂであり得る。特定の非限定的実施形態において、前記Ｆａｂは、サイトカイン、サイトカインの受容体、ケモカインまたは免疫／炎症活性化分子に結合し、かつ／またはその生物学的作用を阻害し得る。好ましい実施形態において、Ｆａｂは、例えば、制限なしに前記ＦａｂがｃＡ２抗ＴＮＦまたはＣＤＰ８７０抗ＴＮＦであり得ることなどのように、ＴＮＦαに結合し、かつ／またはその生物学的作用を阻害し得る。
【００４３】
抗体またはその断片の個々の鎖をコードする外因性遺伝子は、グラム陽性細菌におけるポリシストロン性発現のために転写可能または翻訳可能に結合される。好ましくは、ＶＬまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子は、ＶＨまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の３’末端に転写可能または翻訳可能に結合させることができる。この遺伝子編成は、抗体またはその機能性断片の特に有効な発現および集合をもたらす。
【００４４】
ポリシストロン性の編成はまた、本明細書で教示した発現ユニットを、例えば、細菌によりｉｎ  ｓｉｔｕで送達された場合に、相乗的効果、例えば、相乗的治療または予防効果をもたらすために協力するタンパク質などの産物の共発現に特に適するものにし得る。
【００４５】
他の態様は、１つまたは複数の外因性遺伝子が、対象において治療または予防効果を有するタンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）またはペプチド（単数または複数）などの産物または複数の産物をコードする、本明細書で教示したグラム陽性細菌を提供する。そのような細菌は、詳しくは薬剤として使用するため、より詳しくは対象への前記産物または複数の産物の投与または送達に使用するため、より詳しくは前記産物または複数の産物の投与または送達から恩恵を受け得る疾患の治療に使用するために提供する。また、そのようなグラム陽性細菌を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
その上、本明細書で教示したグラム陽性細菌を対象に投与するステップを含む、タンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）またはペプチド（単数または複数）などの産物または複数の産物を送達する方法を提供し、１つまたは複数の外因性遺伝子が前記産物または複数の産物をコードする。好ましくは、前記産物または複数の産物は、対象における治療または予防効果を有し得る。
【００４７】
対象への本グラム陽性細菌のｉｎ  ｓｉｔｕ送達のために好都合なことに、細菌は、外因性発現産物の配列のほかに、外因性または病原性配列を導入しないか、またはより少ないそれを導入することにより、その内因性の特性をより厳密に保持する。それにより、規制ＧＲＡＳまたは「安全と一般的に認識される」状態ができる限り多く維持され、ひいてはヒトまたは動物における操作された菌株の使用のための臨床承認および販売許可を取得する手続きを促進する。
【００４８】
本発明によるさらなる態様および実施形態を項目（ｉ）〜（ｘｘｉｉ）で下文に示す。
【００４９】
（ｉ）内因性遺伝子および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌。
【００５０】
（ｉｉ）グラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された、グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子を連続して含む、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸。
【００５１】
（ｉｉｉ）前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、対象における治療もしくは予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチド、または免疫もしくは免疫寛容を誘導する抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体もしくはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質もしくは多量体タンパク質をコードする、（ｉ）に記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）に記載の組換え核酸。
【００５２】
（ｉｖ）１つまたは複数の外因性遺伝子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、産物が対象における治療または予防効果を有する、薬剤として使用するための、好ましくは対象への前記産物の投与または送達に使用するための、（ｉ）に記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）に記載の組換え核酸。
【００５３】
（ｖ）前記１つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最３’遺伝子である、（ｉ）、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）に記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）〜（ｉｖ）に記載の組換え核酸。
【００５４】
（ｖｉ）前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、グラム陽性細菌に対して内因性のプロモーターにより転写制御される、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）もしくは（ｖ）のいずれかに記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）〜（ｖ）のいずれかに記載の組換え核酸。
【００５５】
（ｖｉｉ）前記プロモーターが必須遺伝子プロモーター、構成的プロモーター、中心代謝遺伝子プロモーターおよび／またはハウスキーピング遺伝子プロモーターである、（ｖｉ）に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【００５６】
（ｖｉｉｉ）前記プロモーターがリボソーム遺伝子プロモーターである、（ｖｉ）に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【００５７】
（ｉｘ）前記プロモーターが解糖遺伝子プロモーターである、（ｖｉ）に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【００５８】
（ｘ）前記プロモーターが前記グラム陽性細菌のｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳのプロモーターからなる群から選択される、（ｖｉ）に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【００５９】
（ｘｉ）内因性遺伝子がグラム陽性細菌におけるその天然の染色体遺伝子座に局在する、（ｉ）または（ｉｉ）〜（ｘ）のいずれか１つに記載のグラム陽性細菌。
【００６０】
（ｘｉｉ）１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことによって、好ましくは内因性遺伝子の３’の１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことによって、内因性遺伝子が１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合されている、（ｘｉ）に記載のグラム陽性細菌。
【００６１】
（ｘｉｉｉ）内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子がグラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域または複数領域によって転写可能に結合されており、遺伝子間領域または複数領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、（ｉ）もしくは（ｉｉｉ）〜（ｘｉｉ）のいずれか１つに記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）〜（ｘ）のいずれかに記載の組換え核酸。
【００６２】
（ｘｉｖ）前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、（ｘｉｉｉ）に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【００６３】
（ｘｖ）前記グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結したグラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域を含み、遺伝子間領域がグラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域である、組換え核酸。
【００６４】
（ｘｖｉ）前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、（ｘｉｖ）に記載の組換え核酸。
【００６５】
（ｘｖｉｉ）１つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖（ＶＬ）をコードし、他の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖（ＶＨ）をコードし、より好ましくは、機能性断片がＦａｂである、（ｉ）もしくは（ｉｉｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１つに記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）〜（ｘ）もしくは（ｘｉｉｉ）〜（ｘｖｉ）のいずれか１つに記載の組換え核酸。
【００６６】
（ｘｖｉｉｉ）ＶＬまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子がＶＨまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合されている、（ｘｖｉｉ）に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【００６７】
（ｘｉｘ）グラム陽性細菌が乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）もしくはエンテロコッカス属（Enterococcus）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であり、またはグラム陽性細菌がビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）である、（ｉ）、（ｉｉｉ）〜（ｘｉｖ）、（ｘｖｉｉ）もしくは（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１つに記載のグラム陽性細菌または（ｉｉ）〜（ｘ）もしくは（ｘｉｉｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１つに記載の組換え核酸。
【００６８】
（ｘｘ）（ｉ）、（ｉｉｉ）〜（ｘｉｖ）または（ｘｖｉｉ）〜（ｘｉｘ）のいずれか１つに記載のグラム陽性細菌を含む医薬組成物。
【００６９】
（ｘｘｉ）前記１つまたは複数の外因性遺伝子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、産物が対象における治療または予防効果を有する、（ｘｘ）に記載の医薬組成物。
【００７０】
（ｘｘｉｉ）（ｉｉ）〜（ｘ）または（ｘｉｉｉ）〜（ｘｉｘ）のいずれか１つに記載の組換え核酸を含むベクター。
【００７１】
本発明の上述およびさらなる態様ならびに好ましい実施形態は、以下の項および添付の特許請求の範囲に記載する。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書に具体的に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. Cremoris）株ＭＧ１３６３対数末期（end-log）培養の細胞タンパク質のクーマシーブルー染色を示す図である。顕著なタンパク質バンドを１〜１２と示す。
【図２】対照標準モノシストロン性発現構築物（上、ｓＡＧＸ００９０）および遺伝子Ｘが内因性遺伝子を表す、本発明の実施形態によるポリシストロン性（バイシストロン性、デュアルシストロン性）構築物（下）の表示を示す図である。両発現構築物は、ここでは具体例としての外因性遺伝子としての機能を果たす、大腸菌（E. coli）ｕｉｄＡ遺伝子からのβ−グルクロニダーゼの発現を目的とする。
【図３】図２におけるように配置された、対照標準宿主（モノシストロン性：ＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ、ｓＡＧＸ００９０）および本発明の実施形態によるポリシストロン性（バイシストロン性）構築物を含む宿主（内因性遺伝子Ｘ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡ）における相対的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示すグラフである。内因性遺伝子Ｘは、この例において、ｕｓｐ４５、ｅｎｏＡ、ｒｐｌＳ、ｒｐｍＢ、ｐｙｋおよびｇａｐＢである。この例において、ｒｐｍＤ遺伝子間領域は、内因性および外因性遺伝子の転写可能な結合をもたらす。外因性大腸菌（E. coli）ｕｉｄＡ遺伝子は、β−グルクロニダーゼをコードする。すべての発現構築物は、細菌染色体に埋め込まれている。モノシストロン性構築物は、ｔｈｙＡ遺伝子座に存在し、バイシストロン性構築物は、遺伝子Ｘの自然位置に埋め込まれている。データは、すべてのバイシストロン性構築物がモノシストロン性ＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ構築物よりも高いｂ−ガラクトシダーゼ活性を有することを示している。
【図４】対照標準宿主（ｓＡＧＸ０１２２）および本発明の実施形態による宿主（ｓＡＧＸ０１２１およびｓＡＧＸ０１６４）におけるラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）により分泌されたヒトプロインスリン（ｉｎｓ）の定量を示す図である。（Ａ）ｉｎｓ発現モジュールの概要図である。菌株ｓＡＧＸ０１２２は、ｔｈｙＡプロモーターがラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体におけるｔｈｙＡ遺伝子座に埋め込まれている分泌リーダー−ヒトプロインスリン融合体（ＳＳ：：ｉｎｓ）の発現を促進するモノシストロン性発現構築物を運搬する。ｓＡＧＸ０１２１およびｓＡＧＸ０１６４におけるバイシストロン性発現構築物は、ｒｐｍＤ遺伝子間領域を介するそれぞれ内因性ｕｓｐ４５およびｅｎｏＡとＳＳ：：ｉｎｓとの転写共役からなる。これらの構築物は、それぞれラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体上のｕｓｐ４５およびｅｎｏＡ遺伝子の自然位置に位置する。（Ｂ）各種の菌株の上清中で検出されたプロインスリンのレベルを示す図である。これらの菌株の上清中のヒトプロインスリンレベルをそれぞれ示すカラムの下に菌株コード（ｓＡＧＸ０１２２、ｓＡＧＸ０１２１およびｓＡＧＸ０１６４）を示す。データは、両バイシストロン性構築物を運搬する菌株がモノシストロン性：ＰｔｈｙＡ＞＞ｉｎｓ構築物を運搬する菌株より高いヒトプロインスリンレベルを有することを示している。
【図５】ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）におけるｃＡ２抗ＴＮＦ  Ｆａｂの発現を示すグラフである。ＶＬＣＬ（Ｌ）およびＶＨＣＨ１（Ｈ）断片をコードする遺伝子をｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥおよびｒｐｌＮ遺伝子間領域を介して転写可能に結合させた。ＬまたはＨがバイシストロン性構築物の第１の遺伝子として配置されている構築物を作製した。すべての抗ＴＮＦ発現構築物は、プラスミド媒介性であり、ＰｔｈｙＡプロモーターの制御下においた。抗ＴＮＦ活性は、各種菌株の上清中で測定した。データは、Ｈがバイシストロン性構築物の第１の遺伝子であるすべての構築物においてより高い抗ＴＮＦ活性があることを示している。
【図６】ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）におけるＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂの発現を示す図である。（Ａ）配列（ＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＬＣＬおよびＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＨＣＨ１）をコードするｕｐｓ４５分泌リーダーとのＣＤＰ８７０軽および重鎖融合体を、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体におけるｕｐｓ４５から下流に第２および第３のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０２１９、ｓＡＧＸ０２２０）。ｓＡＧＸ０２１９およびｓＡＧＸ０２２０において、ｒｐｍＤを用いてＳＳ：：ＣＤＰ８７０遺伝子をｕｐｓ４５に結合させた。遺伝的不安定性を避けるために、軽および重鎖遺伝子をｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域を介して結合させた。ｓＡＧＸ０２１９では、軽鎖遺伝子が重鎖遺伝子に先行するのに対して、ｓＡＧＸ０２２０では、重鎖遺伝子が軽鎖遺伝子に先行する。（Ｂ）粗培養上清中の抗ヒトＴＮＦ活性の定量を示すグラフである。重鎖および軽鎖の両方がデュアルシストロン構築物により高度に発現し、これが、高レベルの機能性ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂにつながった。ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ発現は、重鎖が軽鎖の前に配置されている場合に実質的に増加した。
【図７】対照標準宿主（ｓＡＧＸ００８５）および本発明の実施形態による宿主（ｓＡＧＸ０２７６）におけるラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）によるヒトトレフォイル因子１（ｈＴＦＦ１）の分泌の定量を示す図である。（Ａ）ｈＴＦＦ１発現モジュールの概要図である。菌株ｓＡＧＸ００８５は、ＰｈｌｌＡプロモーターがラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体におけるｔｈｙＡ遺伝子座に埋め込まれている分泌リーダー−ｈＴＦＦ１融合体（ＳＳ：：ｈＴＦＦ１）の発現を促進するモノシストロン性発現構築物を運搬する。ｓＡＧＸ０２７６におけるバイシストロン性発現構築物は、ｒｐｍＤ遺伝子間領域を介するｇａｐＢとＳＳ：：ｈＴＦＦ１との転写可能な結合からなる。この構築物は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体上のｇａｐＢ遺伝子の自然位置に位置する。（Ｂ）各種菌株の上清中で検出されたｈＴＦＦ１のレベルを示すグラフである。これらの菌株の上清中のヒトｈＴＦＦ１のレベルをそれぞれ示すカラムの下に菌株コード（ｓＡＧＸ００８５およびｓＡＧＸ０２７６）を示す。データは、バイシストロン性構築物を運搬するｓＡＧＸ０２７６がモノシストロン性構築物を保持するｓＡＧＸ００８５よりも高いｈＴＦＦ１レベルをもたらすことを示している。
【図８】エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株ＬＭＧ１５７０９対数末期培養の細胞タンパク質のクーマシーブルー染色を示す図である。顕著なタンパク質バンドを１〜１２と示す。
【図９】遺伝子Ｘが内因性遺伝子を表す、本発明の実施形態によるポリシストロン性（バイシストロン性、デュアルシストロン性）構築物の表示を示す図である。発現構築物は、ここでは具体例としての外因性遺伝子としての機能を果たす、大腸菌（E. coli）ｕｉｄＡ遺伝子からのβ−グルクロニダーゼの発現を目的とする。ｇａｐおよびｅｎｏは、代表的な「第１」の内因性遺伝子である。
【図１０】図９におけるように配置された、対照標準宿主（モノシストロン性：ＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ、ｓＡＧＸ００９０）および本発明の実施形態によるポリシストロン性（バイシストロン性）構築物を含む宿主（内因性遺伝子Ｘ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡ）における相対的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示すグラフである。内因性遺伝子Ｘは、この例において、ｇａｐＢおよびｅｎｏである。この例において、ｒｐｍＤ遺伝子間領域は、内因性および外因性遺伝子の転写可能な結合をもたらす。外因性大腸菌（E. coli）ｕｉｄＡ遺伝子は、β−グルクロニダーゼをコードする。すべての発現構築物は、細菌染色体に埋め込まれている。モノシストロン性構築物は、ｔｈｙＡ遺伝子座に存在し、バイシストロン性構築物は、遺伝子Ｘの自然位置に埋め込まれている。データは、すべてのバイシストロン性構築物がモノシストロン性ＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ構築物よりも高いβ−ガラクトシダーゼ活性を有することを示している。
【図１１】対照標準宿主（ｓＡＧＸ０２７０）および本発明の実施形態による宿主（ｓＡＧＸ０２７９）におけるエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）により分泌されたヒトインターロイキン１０（ｈＩＬ−１０）の定量を示す図である。（Ａ）ｈＩＬ−１０発現モジュールの概要図である。ｓＡＧＸ０２７９におけるバイシストロン性発現構築物は、ｒｐｍＤ遺伝子間領域を介する内因性ｇａｐとＳＳ：：ｈＩＬ１０との転写可能な結合からなる。（Ｂ）各種の菌株の上清中で検出されたｈＩＬ１０のレベルを示すグラフである。
【図１２】対照標準宿主（ｓＡＧＸ０２７０）および本発明の実施形態による宿主（ｓＡＧＸ０３１７）におけるエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）により分泌されたヒトインターロイキン２７（ｈＩＬ−２７）の定量を示す図である。（Ａ）ｈＩＬ−２７発現モジュールの概要図である。ｓＡＧＸ０３１７におけるバイシストロン性発現構築物は、ｒｐｍＤ遺伝子間領域を介する内因性ｇａｐとＳＳ：：ｈＩＬ２７との転写可能な結合からなる。（Ｂ）各種の菌株の上清中で検出されたｈＩＬ−２７のレベルを示すグラフである。
【図１３】エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）におけるＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂ発現を示す図である。（Ａ）配列（ＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＨＣＨ１およびＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＬＣＬ）をコードするｕｐｓ４５分泌リーダーとのＣＤＰ８７０軽および重鎖融合体をｇａｐから下流に第２および第３のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０２７８）。遺伝的不安定性を避けるために、軽および重鎖遺伝子をラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）からのｒｐｍＤに先行する遺伝子間領域を介して結合させたのに対して、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）（ＥＦ）からのｒｐｍＤを用いてｇａｐおよび重鎖遺伝子を結合させた。（Ｂ）粗培養上清中の抗ヒトＴＮＦ活性の定量を示すグラフである。重鎖および軽鎖の両方がデュアルシストロン構築物により高度に発現し、これが、高レベルの機能性ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂにつながった。
【図１４−１】Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスにおけるｈＴＮＦ誘発性毒性および炎症性サイトカイン産生に対する抗ｈＴＮＦ産生Ｌ．ラクティス（L. lactis）細菌（ｓＡＧＸ０２２０）の効果を示す図である。（ａ）２μｇ（左パネル）および６μｇ（右パネル）の組換えｈＴＮＦの注射の１時間前にＡ２０ＩＥＣ−ＫＯマウス（群当たりｎ＝５）に溶媒、ｓＡＧＸ０２２０またはＭＧ１３６３で前処置し、体温を時間的に追跡した。Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスの１群に６μｇのｈＴＮＦの注射の前にレミケード（Remicade）を注射した。（ｂ）２μｇのｈＴＮＦの注射の５時間後の回腸、近位結腸および血清中のＭＣＰ−１レベルを示すグラフである。（ｃ）２μｇのｈＴＮＦの注射の５時間後の回腸ホモジネート中のＫＣおよびＩＬ−６レベルを示すグラフである。（ｄ）６μｇのｈＴＮＦの注射の５時間後の回腸、近位結腸および血清中のＭＣＰ−１レベルを示すグラフである。（ｅ）６μｇのｈＴＮＦの注射の５時間後の回腸ホモジネート中のＫＣおよびＩＬ−６レベルを示すグラフである。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊、ｐ＜０．０５
【図１４−２】（図１４−１の続き）
【図１５−１】本発明の実施形態による菌株におけるＣＤＰ８７０の産生を示す図である。（Ａ）ｕｓｐ４５遺伝子座、ｅｎｏＡ遺伝子座またはｇａｐＢ遺伝子座に組み込まれたＣＤＰ８７０重鎖および軽鎖を示す図である。（Ｂ）本発明の実施形態による各種菌株におけるＣＤＰ８７０発現を示すウエスタンブロット分析を示す図である。（Ｃ）および（Ｄ）本発明の実施形態による各種菌株におけるＣＤＰ８７０発現を示すＥＬＩＳＡ分析を示す図である。（Ｅ）本発明の実施形態による各種菌株のＴＮＦ中和活性を示すグラフである。
【図１５−２】（図１５−１の続き）
【図１５−３】（図１５−２の続き）
【図１６】野生型Ｌ．ラクティス（L. lactis）株で処置したマウスおよびシムジア（Cimzia）で処置したマウスと比較した本発明の実施形態による菌株（抗ｈＴＮＦ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０３０９）での処置後の誘発性ＴＮＢＳ大腸炎を有するＴｇ１２７８マウスの生存率を示すグラフである。
【図１７】野生型Ｌ．ラクティス（L. lactis）株で処置したマウスおよびシムジアで処置したマウスと比較した本発明の実施形態による菌株（抗ｈＴＮＦ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０３０９）での処置後の誘発性ＴＮＢＳ大腸炎を有するＴｇ１２７８マウスの体重の漸進的変化を示すグラフである。上パネル：絶対体重（ｇ）；下パネル：開始体重と相対的な体重（％）
【図１８】野生型Ｌ．ラクティス（L. lactis）株で処置したマウスおよびシムジアで処置したマウスと比較した本発明の実施形態による菌株（抗ｈＴＮＦ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０３０９）での処置後の誘発性ＴＮＢＳ大腸炎を有するＴｇ１２７８マウスの結腸組織の組織学的スコアを示すグラフである。平均値をバーの上に示す。生存率を群ごとに示す。
【図１９−１】健常なマウス、野生型Ｌ．ラクティス（L. lactis）株で処置したマウスおよびシムジアで処置したマウスと比較した本発明の実施形態による菌株（抗ｈＴＮＦ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０３０９）での処置後の誘発性ＴＮＢＳ大腸炎を有するＴｇ１２７８マウスにおける炎症誘発性サイトカイン分泌を示すグラフである。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）にそれぞれ遠位結腸におけるｐｇ／ｍｇ単位のｍＩＬ６、ｍＫＣおよびｍＭＣＰ１レベルを示す。
【図１９−２】（図１９−１の続き）
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本明細書で用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他の状態が明確に指示されない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
【００７４】
本明細書で用いている「含むこと（comprising）」、「含む（comprises）」および「を含む（comprised of）」という用語は、「包含すること（including）」、「包含する（includes）」または「含有すること（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包含的または非制限的であり、追加の非列挙メンバー、エレメントまたは方法ステップを除外しない。「含むこと（comprising）」、「含む（comprises）」および「を含む（comprised of）」という用語が、本明細書で用いているように「からなっている（consisting of）」、「なる（consists）」および「からなる（consists of）」という用語ならびに「から本質的になっている（consisting essentially of）」、「本質的になる（consists essentially）」および「から本質的になる（consists essentially of）」という用語を含むことが十分理解される。
【００７５】
端点による数値範囲の詳述は、各範囲内に含まれるすべての数および分数ならびに詳述された端点を含む。
【００７６】
「約」または「おおよそ」という用語は、本明細書で用いているように例えば、パラメーター、量、持続時間などの測定可能な値に適用する場合、そのような変動が開示した本発明において機能するのが適切である限りにおいて、指定された値の＋／−２０％以下、好ましくは＋／−１０％以下、より好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下の変動を含むことを意味する。修飾語句「約」または「おおよそ」が適用される値は、それ自体も具体的に、また好ましくは開示されることを理解すべきである。
【００７７】
メンバーの群の１つもしくは複数または少なくとも１つのメンバー（単数または複数）などの「１つもしくは複数」または「少なくとも１つ」という用語は、さらなる例示により、それ自体は明らかであるが、当用語は、前記メンバーのいずれか１つへの、または例えば、前記メンバーのいずれか≧３、≧４、≧５、≧６もしくは≧７等およびすべての前記メンバーまでなどの前記メンバーのいずれか２つ以上への言及をとりわけ含む。
【００７８】
本明細書で引用したすべての参考文献は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。特に、具体的に引用した本明細書におけるすべての参考文献の教示は、参照により組み込まれる。
【００７９】
特に定義しない限り、技術および科学用語を含む、本発明を開示するのに用いたすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。さらなるガイダンスとして、本発明の教示をより十分に理解するために用語の定義を含める。
【００８０】
以下の節において、本発明の種々の態様をより詳細に定義する。そのように定義した各態様は、相反するものが明確に示されない限り、他の１つまたは複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００８１】
「１つの実施形態」または「実施形態」への本明細書を通しての言及は、当該実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における「１つの実施形態において」または「実施形態において」という語句の出現は、同じ実施形態に必ずしもすべて言及するものでないが、そうであり得る。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の実施形態において、この開示から当業者に明らかなように、適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書で述べたいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれた一部の特徴を含むが、他の特徴を含むものでないが、異なる実施形態の特徴の組合せは、当業者により理解されるように、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を構成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求の範囲に記載されている実施形態の何らかの組合せで用いることができる。
【００８２】
本発明の以下の詳細な説明において、その一部を構成し、本発明を実施することができる特定の実施形態の例示のみの目的で示す添付図面を参照する。本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造または論理的変更を行うことができることを理解すべきである。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈すべきでなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義されている。
【００８３】
組換えＤＮＡ技術の一般的原理を説明する標準的参考資料は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989年、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York、1992年（定期的更新を含む）（「Ausubelら1992年」）、Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press: San Diego、1990年を含む。微生物学の一般的原理は、例えば、Davis, B. D.ら、Microbiology、第3版、Harper & Row, publishers、Philadelphia、Pa.(1980年)に説明されている。
【００８４】
示したように、本発明の態様は、１つまたは複数の外因性遺伝子が転写可能または翻訳可能に結合された内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌に関する。好ましくは、１つまたは複数の外因性遺伝子は、内因性遺伝子の下流（すなわち、３’末端に）に転写可能または翻訳可能に結合される。関連態様は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌を提供し、前記ポリシストロン性発現ユニットが内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含む。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットは、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む。さらなる態様は、グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子が転写可能または翻訳可能に結合されたグラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子を含むポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸を提供する。好ましくは、１つまたは複数の外因性遺伝子は、内因性遺伝子の下流（すなわち、３’末端に）に転写可能または翻訳可能に結合される。
【００８５】
好ましくは、１つまたは複数の外因性遺伝子（単数または複数）は、ポリシストロン性発現ユニットの最も３’の遺伝子である。すなわち、１つまたは複数の外因性遺伝子（単数または複数）は、ポリシストロン性発現ユニットの最後または最も下流の遺伝子（単数または複数）である。例えば、内因性遺伝子がモノシストロン性である場合、１つまたは複数の外因性遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームの後または下流（すなわち、３’末端に）に位置し、それと転写可能に結合される。同様に、内因性遺伝子が、オペロン（の一部）のように、それ自体ポリシストロン性である場合、１つまたは複数の外因性遺伝子は、内因性ポリシストロン性遺伝子の最後の（すなわち、最も下流または最も３’の）内因性遺伝子の後または下流に（すなわち、３’末端に）位置する。
【００８６】
最も好ましくは、本明細書で説明を通して言及する内因性遺伝子は、モノシストロン性である。したがって、内因性遺伝子は、好ましくは内因性オペロンの一部を構成しない。
【００８７】
好ましくは、本明細書で述べるポリシストロン性発現ユニットの発現は、次の特性の１つまたは複数のものであり得るまたは示し得るプロモーターによりもたらされる：構成的プロモーター、中心代謝遺伝子プロモーター、必須遺伝子プロモーター、強プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、リボソーム遺伝子プロモーター、解糖遺伝子プロモーター。最も好ましくは、プロモーターは、構成的プロモーターである。
【００８８】
本明細書で用いているように、「グラム陽性細菌」という用語は、当技術分野で公知のその一般的意味を有する。さらなるガイダンスとして、グラム陽性細菌は、クリスタルバイオレット染色を保持するのでグラム染色により同定することができる。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明によるグラム陽性細菌は、意図した対象に投与した場合に害をもたらさない、または有害な効果をもたらさないという意味で非病原性である。
【００９０】
好ましくは、本発明によるグラム陽性細菌は、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、アエロコッカス（Aerococcus）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エノコッカス（Oenococcus）、スポロラクトバシラス（Sporolactobacillus）、テトラゲノコッカス（Tetragenococcus）、バゴコッカス（Vagococcus）およびウェイセラ（Weisella）属を含むが、これらに限定されない乳酸菌（ＬＡＢ）である。より好ましくは、ＬＡＢは、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）およびラクトコッカス・ラフィノラクティス（Lactococcus raffinolactis）ならびにそれらの亜種および菌株などであるが、これらに限定されないラクトコッカス種（Lactococcus species）である。最も好ましくは、ラクトコッカス種（Lactococcus species）は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ならびに例えば、制限なしにラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホールドニエ（Lactococcus lactis ssp. hordniae）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ｂｖ．ジアセチラクティス（Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis）などのそのあらゆる亜種および菌株である。本発明のさらなる好ましい実施形態において、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）またはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）であり、例えば、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＳＫ１１（Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＭＧ１３６３（Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363）またはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスＩＬ１４０３（Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403）などのそのあらゆる菌株を含む。他の好ましい実施形態において、ＬＡＢは、エンテロコッカス種（Enterococcus sp.）、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ならびに例えば、制限なしにエンテロコッカス・フェシウム株ＬＭＧ１５７０９（Enterococcus faecium strain LMG15709）などのそのあらゆる亜種および菌株である。
【００９１】
他の好ましい実施形態において、本発明によるグラム陽性細菌は、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）である。
【００９２】
ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）は、グラム陽性、非運動性、しばしば分岐嫌気性細菌の属である。ビフィドバクテリアは、本明細書で用いているように、Ｂ．アドレセンチス（B. adolescentis）、Ｂ．アングラタム（B. angulatum）、Ｂ．アニマリス（B. animalis）、Ｂ．アステリオデス（B.asteroides）、Ｂ．ビフィダム（B. bifidum）、Ｂ．ボウム（B. boum）、Ｂ．ブレーベ（B. breve）、Ｂ．カテヌラタム（B. catenulatum）、Ｂ．コエリナム（B. choerinum）、Ｂ．コリネホルメ（B. coryneforme）、Ｂ．クニクリ（B. cuniculi）、Ｂ．デンチコレンス（B. denticolens）、Ｂ．デンチウム（B. dentium）、Ｂ．ガリクム（B. gallicum）、Ｂ．ガリナルム（B. gallinarum）、Ｂ．インディクム（B. indicum）、Ｂ．インファンチス（B. infantis）、Ｂ．イノピナタム（B. inopinatum）、Ｂ．ラクティス（B. lactis）、Ｂ．ロンガム（B. longum）、Ｂ．マグナム（B. magnum）、Ｂ．メリシクム（B. merycicum）、Ｂ．ミニマム（B. minimum）、Ｂ．シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、Ｂ．シュードロンガム（B. pseudolongum）、Ｂ．プロルム（B. pullorum）、Ｂ．ルミナンチウム（B. ruminantium）、Ｂ．サエクラレ（B. saeculare）、Ｂ．サブチル（B. subtile）、Ｂ．スイス（B. suis）、Ｂ．テルマシドフィラム（B. thermacidophilum）、Ｂ．テルモフィラム（B. thermophilum）を含み得る。好ましくは、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）は、Ｂ．アドレセンチス（B. adolescentis）、Ｂ．ビフィダム（B. bifidum）、Ｂ．ブレーベ（B. breve）、Ｂ．インファンチス（B. infantis）、Ｂ．ロンガム（B. longum）である。ビフィドバクテリアのすべての亜種および株も含まれることを理解すべきである。
【００９３】
本明細書で用いているように、内因性および外因性遺伝子との関連における「連続して」という用語は、ポリ核酸、ベクターまたは染色体における各遺伝子の５’から３’への順序を意味する。例えば、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含むポリシストロン発現ユニットは、１つまたは複数の内因性遺伝子が１つまたは複数の外因性遺伝子の上流に位置するユニットに関する。したがって、１つまたは複数の外因性遺伝子は、１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端の後に位置する。本明細書で述べた連続的結合または順序付けは、内因性および外因性遺伝子の直接的な結合を必ずしも意味しない。付加的な配列が内因性および外因性遺伝子の間に存在し得る。例として、本明細書でさらに定義する遺伝子間領域が、連続的な内因性および外因性遺伝子の間（すなわち、内因性遺伝子の下流または３’と外因性遺伝子の上流または５’との）に存在し得る。本明細書で用いているように、「内因性遺伝子」、「内因性プロモーター」、「内因性遺伝子間領域」、「内因性リボソーム結合部位」という用語は、それぞれグラム陽性細菌にとって自然である遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域もしくはリボソーム結合部位を意味し、またはグラム陽性細菌に天然で見いだすことができる。したがって、内因性遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位という用語は、グラム陽性細菌の異なる属、種、亜種または菌株間のオーソロガス遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域およびリボソーム結合部位を含む。特に、グラム陽性細菌の１つの属、種、亜種または菌株から単離された遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位は、天然におけるグラム陽性細菌の他の属、種、亜種または菌株もそのような遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位を含むならば、ポリ核酸配列の差異にかかわりなく、グラム陽性細菌のすべての他の属、種、亜種または菌株に対して内因性であると言われる。したがって、そのような互いに異なるが、天然に見いだされる遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位配列は、内因性であるとみなされることになる。例として、また制限なしに、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）から単離されるエノラーゼをコードする遺伝子であるｅｎｏＡは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）についても内因性であるとみなされる。
【００９４】
しかし、好ましくは、本明細書で対象とするグラム陽性細菌の所定の属、種、亜種または菌株の「内因性」遺伝子、プロモーターまたは遺伝子間領域は、天然に見いだされる、すなわち、それぞれグラム陽性細菌の当該同じ属、種、亜種または菌株に固有または独特の遺伝子、プロモーターまたは遺伝子間領域を意味し得る。例として、また制限なしに、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）から単離されるエノラーゼをコードする遺伝子であるｅｎｏＡは、好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）に対して「内因性」であるとみなすことができるが、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）に対してはそうではない。
【００９５】
本明細書で用いているように、「外因性遺伝子」という用語は、グラム陽性細菌に固有でない、またはグラム陽性細菌に天然で見いだすことができない遺伝子を意味する。外因性遺伝子という用語は、異種遺伝子という用語と同義である。外因性遺伝子は、全長遺伝子であってもよい、または代わりになるべきものとして切断遺伝子もしくは遺伝子断片であってもよい。例として、外因性遺伝子は、ウイルス、グラム陰性細菌などの他の原核生物に由来し得る、または代わりになるべきものとして、また好ましくは、植物、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトなどの真核生物に由来し得る。あるいは、外因性遺伝子は、完全にまたは部分的に天然に存在しないという意味で、完全にまたは部分的に合成物または人工物であり得る。さらに、外因性遺伝子は、異なる種に由来する配列または天然に存在する配列と合成もしくは人工配列との組合せから構成され得るという意味で、キメラ型であり得る。また、グラム陽性細菌配列ならびに例えば、グラム陽性細菌分泌シグナルペプチドおよび外因性タンパク質から構成された融合タンパク質をコードする配列などのグラム陽性細菌の外因性配列から構成されたキメラ配列が含まれる。
【００９６】
真核生物遺伝子は、大部分はエクソンの傍らにイントロンを含むので、当業者は、本発明によれば、外因性遺伝子への言及がそのような遺伝子のイントロンレスオープンリーディングフレーム、すなわち、そのような遺伝子のタンパク質コーディング配列に関するものであることを十分に理解する。「オープンリーディングフレーム」またはＯＲＦという用語は、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧまたはＧＴＧ）で始まり、翻訳終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わり、単一ポリペプチドをコードするコーディングヌクレオチドトリプレットの連続を意味する。
【００９７】
原核生物遺伝子、特にグラム陽性細菌からの遺伝子は、イントロンを含まない。したがって、原核生物遺伝子のコーディング配列またはオープンリーディングフレームは、翻訳開始コドンで始まり、原核生物ゲノム、特に細菌染色体上に位置する翻訳終止コドンで終わるコーディングヌクレオチドトリプレットの連続に対応する。
【００９８】
したがって、一態様において、本発明は、１つまたは複数の外因性オープンリーディングフレームまたはコーディング配列が転写可能または翻訳可能に結合された内因性オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むグラム陽性細菌に関する。
【００９９】
当業者は、「遺伝子」という用語は、一般的に、プリブノーボックス、シャイン−ダルガルノ配列、オペレーター、ターミネーター、転写領域およびまたは他の機能性配列領域などの転写および翻訳調節領域に関連する遺伝の単位に対応するゲノム配列の配置可能な領域を意味し得るが、本明細書で述べる外因性配列との関連での「遺伝子」という用語への言及は、それに反することが明確に示されない限り、好ましくは当遺伝子のコーディング領域またはオープンリーディングフレームを意味することを理解する。本明細書で述べる内因性配列との関連での「遺伝子」という用語への言及は、調節領域、転写領域およびまたは他の機能性配列領域に関連する遺伝の単位に対応するゲノム配列の配置可能な領域を意味し得るが、あるいは当遺伝子のコーディング領域またはオープンリーディングフレームも意味し得る。
【０１００】
本明細書で用いているように、「翻訳可能に結合される(translationally coupled)」という用語は、「翻訳可能に連結される」または「翻訳可能に接続される」と同義である。これらの用語は、本質的にポリシストロン性発現系またはユニットに関連する。特に共通のプロモーターなどの共通の調節エレメント（単数または複数）が、その後に２つ以上の個別のポリペプチド配列に翻訳され得る、２つ以上の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列をコードする１つのｍＲＮＡとして前記２つ以上の遺伝子の転写をもたらす場合、２つ以上の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列は、翻訳可能に結合されると言われる。当業者は、細菌オペロンが２つ以上の遺伝子が翻訳可能または転写可能に結合された天然に存在するポリシストロン性発現系またはユニットであることを十分に理解する。本発明によれば、転写可能な結合は、翻訳可能な結合の基礎となる。
【０１０１】
したがって、一態様において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列が転写可能に結合された内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌に関する。好ましくは、グラム陽性細菌は、１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列が転写可能に結合された内因性遺伝子を連続して含む。本明細書で用いているように、「転写可能に結合される(transcriptionally coupled)」という用語は、「転写可能に接続される」または「転写可能に連結される」と同義である。これらの用語は、１つのｍＲＮＡとして普通に転写され、２つ以上の個別のポリペプチドに翻訳され得る２つ以上のオープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むポリ核酸配列を一般的に意味する。
【０１０２】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌または組換え核酸に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットが内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含む。
【０１０３】
本明細書で用いているように、「ポリシストロン性発現ユニット」または「ポリシストロン性発現系」という用語は、２つ以上の遺伝子の発現が、プロモーター、オペレーターなどの共通の調節メカニズムにより調節されるユニットを意味する。ポリシストロン性発現ユニットという用語は、本明細書で用いているように、マルチシストロン性発現ユニットと同義である。ポリシストロン性発現ユニットの例は、制限なしにバイシストロン性、トリシストロン性、テトラシストロン性発現ユニットである。タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの個別の発現産物をコードする例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上などの２つ以上のオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むあらゆるｍＲＮＡは、ポリシストロン性という用語に含まれる。
【０１０４】
一実施形態において、本明細書で述べる翻訳可能または転写可能に結合された１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、グラム陽性細菌に対して内因性であるプロモーターにより転写制御される。他の実施形態において、本明細書で述べるポリシストロン性発現ユニットまたは系は、グラム陽性細菌に対して内因性であるプロモーターにより転写制御される。
【０１０５】
「プロモーター」とは、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する、核酸分子上、好ましくはＤＮＡ分子上の領域を意味する。プロモーターは、好ましくは、それがその転写を制御する配列の上流、すなわち、５’に位置するが、必ずしもそうでない。
【０１０６】
さらなる実施形態において、本明細書で述べる翻訳可能または転写可能に結合された１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然のプロモーターにより転写制御される。他の実施形態において、本明細書で述べるポリシストロン性発現ユニットまたは系は、前記ポリシストロン性発現系またはユニットに含まれる前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然のプロモーターにより転写制御される。他の実施形態において、本明細書で述べるポリシストロン性発現ユニットまたは系は、グラム陽性内因性プロモーターに作動可能に連結する。
【０１０７】
本明細書で用いているように、「作動可能に連結した」または「作動可能な連結」という用語は、調節ＤＮＡ配列と発現させようとするＤＮＡ配列が、発現を可能にするような方法で連結されている、連結である。連結または接続が前記遺伝子の転写を可能にする、またはもたらすならば、例えば、プロモーターは、遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列に作動可能に連結されると言われる。さらなる例において、連結または接続が少なくとも３’遺伝子の翻訳を可能にする、またはもたらすならば、５’および３’遺伝子、シストロン、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列は、ポリシストロン性発現ユニットにおいて作動可能に連結されると言われる。
【０１０８】
例えば、配列の間の連結の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらすこと、（２）オープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターの能力を妨げること、または（３）プロモーター領域配列により転写されるオープンリーディングフレームの能力を妨げることをしないならば、例えば、好ましくはプロモーターおよびオープンリーディングフレームなどのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されると言われる。
【０１０９】
具体例としての好ましい実施形態において、プロモーターは、それが作動可能に連結するオープンリーディングフレーム（単数または複数）の上流、すなわち、５’に配置することができる。
【０１１０】
当業者は、プロモーターは、付加的な天然の調節配列または領域、例えば、オペレーターと結合させることができることを十分に理解する。発現のために必要な調節領域の正確な性質は、生物ごとに異なり得るが、原核生物において、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を誘導する）ならびにＲＮＡに転写されたときに、タンパク質合成の開始をシグナルで伝達するＤＮＡ配列の両方を含むプロモーター領域を一般的に含むべきである。そのような領域は、例えば、プリブノーボックス（ＴＡＴＡボックス参照）、シャイン−ダルガルノ配列などの、転写および翻訳の開始と関連性を有する５’非コーディング配列を通常含む。
【０１１１】
さらなる実施形態において、プロモーターは、ポリシストロン性発現ユニットにおける最も５’、すなわち、最も上流の内因性遺伝子の天然のプロモーターである。
【０１１２】
本明細書で用いているように、プロモーターとの関連での（または内因性遺伝子の遺伝子発現に関連する延長による）「構成的」という用語は、その関連遺伝子の連続的転写を可能にするプロモーターを意味する。特に、そのようなプロモーターの制御下での関連遺伝子または複数遺伝子の転写は、インデューサーまたは他の調節シグナルとは無関係に起こる。
【０１１３】
本明細書で用いているように、「ハウスキーピング遺伝子」または「ハウスキーピングプロモーター」という用語は、基本的な細胞機能の維持のために必要な遺伝子または遺伝子のプロモーターを意味する。一部のハウスキーピング遺伝子は、比較的に一定のレベルで発現するが、他のハウスキーピング遺伝子は、外的または実験条件によって変化し得る。ハウスキーピング遺伝子は、例えば、代謝、遺伝子発現（基礎転写機構など）、シグナル伝達に関与し得るが、構造遺伝子でもあり得る。
【０１１４】
本明細書で用いているように、「解糖遺伝子」または「解糖プロモーター」は、解糖経路に関与する遺伝子または遺伝子のプロモーターを意味し、解糖酵素、特に、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼおよびピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子のプロモーターを含む。
【０１１５】
本明細書で用いているように、「リボソーム遺伝子」または「リボソームプロモーター」は、リボソームタンパク質をコードする遺伝子ならびにリボソームＲＮＡに転写された遺伝子を含む、遺伝子またはリボソーム遺伝子のプロモーターを意味する。好ましくは、それは、リボソームタンパク質の遺伝子またはプロモーターを意味し得る。
【０１１６】
本明細書で用いているように、「中心代謝遺伝子」もしくは「中心代謝プロモーター」または代わりになるべきものとして「基礎代謝遺伝子」もしくは「基礎代謝プロモーター」は、重要な代謝経路に関与する遺伝子または遺伝子のプロモーターを意味し、解糖、ペントースリン酸経路およびトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路に関与する遺伝子を含む。
【０１１７】
本明細書で用いているように、遺伝子との関連での（またはそのような遺伝子のプロモーターに関連する延長による）「必須」という用語は、宿主に対して例えば、特に致死性など、有害である、あるいは、例えば、特に増殖または成長などの正常な生理または機能を変化させる、抑制するまたは妨げるその天然の発現産物が存在しない遺伝子に関連する。本明細書で用いているように、遺伝子または遺伝子のプロモーターとの関連での「必須」という用語は、条件付きで必須と対立するものとして、構成的に必須に関する。例えば、いくつかのグラム陽性細菌、特にラクトコッカス属種（Lactococcus sp.）などの乳酸菌におけるベータガラクトシダーゼ遺伝子などのラクトースオペロンの遺伝子は、細菌が主なまたは唯一の炭素源としてのラクトースを含む培地中で培養される場合には必須であり得る。細菌が代替炭素源を含む培地中で培養される場合、これらの遺伝子は、必須ではない。したがって、これらの遺伝子は、条件付きで必須であるにすぎないが、本明細書で意図するように構成的に必須ではない。
【０１１８】
好ましい実施形態において、本明細書で述べる内因性プロモーターおよび／または内因性遺伝子は、以下のラクトコッカス属（Lactococcus）プロモーターおよび／または遺伝子、より詳細にはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス株ＭＧ１３６３（Lactococcus lactis ssp. cremoris strain MG1363）プロモーターおよび／または遺伝子に対応するグラム陽性細菌プロモーターおよび／または遺伝子を含むまたはそれからなる群から選択される：１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ベータ’サブユニット／１６０ｋＤサブユニット（ｒｐｏＣ）、２）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ベータサブユニット／１４０ｋＤサブユニット（ｒｐｂ２またはｒｐｏＢ）、３）ＤＮＡ結合フェリチン様タンパク質（酸化損傷プロテクタント）（ｄｐｓ）、４）ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋ）、５）グルタミル−およびグルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｇｌｎＳまたはｇｌｔＸ）、６）エノラーゼ（ｅｎｏ）、７）グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、８）ＨＴＨ型転写レギュレーター（ｇｌｎＲ）、９）Ｘａａ−Ｈｉｓジペプチダーゼ（ａｒｇＥまたはｐｅｐＶ）、１０）Ｆ０Ｆ１型ＡＴＰシンターゼベータサブユニット（ＡＴＰシンターゼＦ１ベータサブユニット）（ａｔｐＤ）、１１）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）、１２）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／エリスロース−４−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡまたはｇａｐＢ）、１３）酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、１４）３−オキソアシル−（アシル−担体タンパク質）シンターゼ（ｆａｂＢまたはｆａｂＦ）、１５）３−オキソアシル−（アシル−担体タンパク質）レダクターゼ（ｆａｂＧ）、１６）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、アルファサブユニット／４０ｋＤサブユニット（ｒｐｏＡ）、１７）Ｘａａ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ（ｐｅｐＰ）、１８）フルクトース／タガトースビスリン酸アルドラーゼ（ｔｂｐまたはｆｂａＡ）、１９）リボソームタンパク質Ｓ４（ｒｐｓＤ）、２０）スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄＡ）、２１）リボソームタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）およびリボソームタンパク質Ｓ７（ｒｐｓＧ）、２２）リボソームタンパク質Ｌ１８（ｒｐｌＲ）およびリボソームタンパク質Ｓ５（ｒｐｓＥ）およびリボソームタンパク質Ｌ３０／Ｌ７Ｅ（ｒｐｍＤ）、２３）Ｓ−リボシルホモシステインリアーゼ（ｌｕｘＳ）、２４）リボソームタンパク質Ｌ１９（ｒｐｌＳ）、２５）リボソームタンパク質Ｓ１１（ｒｐｓＫ）、２６）リボソームタンパク質Ｌ１０（ｒｐｌＪ）、２７）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（ｒｐｌＬ）、２８）細菌核様体ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ（ｈｕｐまたはｈｌｌＡ）、２９）５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２８（ｒｐｍＢ）、３０）ホスホトランスフェラーゼ系セロビオース特異的成分ＩＩＢ（ｌａｃｅまたはｐｔｃＢ）、３１）Ｆ０Ｆ１型ＡＴＰシンターゼアルファサブユニット（ａｔｐＡ）、３２）ＡＢＣ型糖輸送系（ＡＴＰアーゼ成分）（ｍａｌＫまたはｍｓｍＫ）、３３）アセトインデヒドロゲナーゼ複合体Ｅ１成分アルファサブユニット（ａｃｏＡまたはｐｄｈＡ）、３４）細胞分裂タンパク質（ｄｉｆｌＶＡまたはｆｔｓＡ）、３５）ＵＤＰ−ガラクトピラノースムターゼ（ｇｌｆ）、３６）グルタミルアミノペプチダーゼ（ｆｒｖＸまたはｐｅｐＡ）、３７）予測デヒドロゲナーゼ関連タンパク質（ｍｖｉＭまたはｌｌｍｇ＿０２７２）、３８）リボソームタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）、３９）翻訳開始因子３（ＩＦ−３）（ｉｎｆＣ）、４０）リボソームタンパク質Ｌ４（ｒｐｌＤ）およびリボソームタンパク質Ｌ２３（ｒｐｌＷ）およびリボソームタンパク質Ｌ２（ｒｐｌＢ）、４１）ＥＭＡＰドメイン（ｙｄｊＤ）、４２）転写伸長因子（ｇｒｅＡ）、４３）ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ（ｃｌｐＰ）のプロテアーゼサブユニット、４４）リボソームタンパク質Ｌ１５（ｒｐｌＯ）、４５）リボソームタンパク質Ｌ１１（ｒｐｌＫ）、４６）リボソームタンパク質Ｓ８（ｒｐｓＨ）、４７）リボソームタンパク質Ｌ２１（ｒｐｌＵ）、４８）リボソームタンパク質Ｓ１３（ｒｐｓＭ）、４９）リボソームタンパク質Ｓ１９（ｒｐｓＳ）およびリボソームタンパク質Ｌ２２（ｒｐｌＵまたはｒｐｌＶ）およびリボソームタンパク質Ｌ１６（ｒｐｌＰ）およびリボソームタンパク質Ｌ１４（ｒｐｌＮ）、５０）リボソームタンパク質Ｓ１０（ｒｐｓＪ）、５１）コシャペロニンＧｒｏＥＳ（Ｈｓｐ１０）（ｃｐｎ１０）、５２）リボソームタンパク質Ｌ２４（ｒｐｌＸ）、５３）仮想タンパク質ＬＡＣＲ＿０１３７（ｄｕｆ９６５）ならびに５４）分泌４５ｋＤａタンパク質（ｕｓｐ４５）。好ましくは、内因性プロモーターおよび／または内因性遺伝子は、ｅｎｏＡ、ｕｓｐ４５、ｇａｐＢ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳを含む、またはそれからなる群から選択される。これらのプロモーターおよびそれらの配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０８４１１号、例えば、その表１および図１Ａ〜Ｈに開示されている。一実施形態において、本発明は、内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子が、グラム陽性細菌に対して内因性のプロモーターにより、好ましくは前記グラム陽性細菌のｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳのプロモーターからなる群から選択される内因性プロモーターにより転写制御される、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらなる実施形態において、内因性遺伝子は、グラム陽性細菌におけるその天然の染色体遺伝子座に位置する。
【０１１９】
好ましい実施形態において、前記１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の３’末端に翻訳可能または転写可能に結合される。したがって、一実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌を提供し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、１つまたは複数の５’内因性遺伝子および１つまたは複数の３’外因性遺伝子を含む。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットの最も５’遺伝子は、内因性遺伝子である。例として、また制限なしに、ポリシストロン性発現ユニットは、５’末端から３’末端までの内因性遺伝子とそれに続く１つまたは複数の内因性遺伝子とそれに続く１つまたは複数の外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得る。あるいは、また制限なしに、ポリシストロン性発現ユニットは、５’末端から３’末端までの内因性遺伝子とそれに続く１つまたは複数の外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得る。あるいは、ポリシストロン性発現ユニットは、５’末端から３’末端までの内因性遺伝子とそれに続く１つまたは複数の外因性遺伝子とそれに続く１つまたは複数の内因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得る。
【０１２０】
本明細書で述べた、翻訳可能に結合されたかまたは転写可能に結合された１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子、またはポリシストロン性発現ユニットもしくは系は、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌における内因性および外因性遺伝子の維持および／または増殖および発現を可能にするレプリコンに含まれ得る。
【０１２１】
一実施形態において、本明細書における他所で述べた（内因性）プロモーターを場合によって含む、翻訳可能に結合されたかまたは転写可能に結合された１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子、または本明細書で述べた、ポリシストロン性発現ユニットもしくは系は、ベクター、好ましくはグラム陽性細菌における発現を可能にする発現ベクターに含まれ得る。したがって、本発明はまた、本明細書で述べた組換え核酸を含むベクターに関する。
【０１２２】
本明細書で用いているように、「ベクター」は、核酸断片を挿入し、クローニング、すなわち、増殖させることができる、核酸分子、一般的にＤＮＡを意味する。したがって、ベクターは、一般的に１つまたは複数の独特な制限部位を含み、クローニングされた配列が再現可能なように定義された宿主またはビヒクル生物において自己複製の能力があり得る。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来のベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、直鎖核酸、例えば、直鎖ＤＮＡ等を制限なしに含み得る（例えば、Sambrookら、1989年、Ausubel、1992年参照）。
【０１２３】
特定のベクター、例えば、プラスミドを選択するうえで重要な因子は、とりわけ、ベクターを含む受容細胞が認識され、ベクターを含まない受容細胞から選択され得る容易さ、特定の宿主における望ましいベクターのコピー数、ベクターを異なる種の宿主細胞間で「往復させる」ことができることが望ましいかどうかなどを含む。好ましい原核生物ベクターは、例えば、大腸菌（E. coli）において複製の能力のあるものなどのプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１９等など）を含む。そのようなプラスミドは、Sambrookら、1989年、Ausubel、1992年に記載されている。特に好ましいベクターは、大腸菌（E. coli）（または他のグラム陰性細菌）ならびにグラム陽性細菌、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）などの対象の他の宿主細胞において複製できるものであり得る（例えば、Kokら、Appl. Environ. Microbiol.、1984年、48巻(4号)、726〜31頁）。他の好ましいベクターは、複製し、かつ／または１つもしくは複数のグラム陽性細菌の間を往復することができるものであり得るが、グラム陰性細菌にはない。好ましい実施形態において、ベクターは、参照により本明細書に特に組み込まれる、Steidlerら、Appl. Environ. Microbiol.、1995年、61巻(4号)、1627〜1629頁に記載されているｐＴ１ＮＸである。
【０１２４】
他の実施形態において、本明細書で述べた、翻訳可能に結合されたかまたは転写可能に結合された１つもしくは複数の内因性遺伝子および１つもしくは複数の外因性遺伝子、またはポリシストロン性発現ユニットもしくは系は、グラム陽性細菌ゲノムまたは染色体に組み込まれる。組換えグラム陽性細菌およびランダムならびに相同的組換えを得る方法、ならびに組換えを達成するためのベクターは、当技術分野で周知である。さらなるガイダンスとして、そのような方法およびベクターは、例えば、参照により全体として組み込まれる、Steidlerら（2003年、Nature Biotechnology、21巻、785〜789頁）、Lawら（1995年、J Bacteriol、177巻(24号)、7011〜7018頁）、Leenhoutsら（1998年、Methods in Cell Science、20巻、35〜50頁）および国際公開第２００４／０４６３４６号に開示されている。好ましくは、本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットは、相同的組換えによる細菌染色体における必須の配列の部位特異的組込みによって発生または導入する。
【０１２５】
一実施形態において、組換えベクターは、本明細書における他所で述べた内因性プロモーターおよび場合による付加的な調節配列ならびに本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットを含む。好ましくは、内因性プロモーターとポリシストロン性発現ユニットは、作動可能に連結されている。相同的組換えは、所定の遺伝子座において達成することができる。そのような系は、高度にモジュール式であり、プロモーター、調節配列、内因性遺伝子および外因性遺伝子の個別の選択および組合せならびに挿入部位の選択を可能にする。
【０１２６】
他の実施形態において、本発明によるグラム陽性細菌は、１つまたは複数の内因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列および１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むポリシストロン性発現ユニットが作動可能に連結している、その天然の遺伝子座における、すなわち、細菌染色体上のその天然のゲノムコンテクスト（native genomic context）における本明細書における他所で述べた内因性プロモーターを含む。作動可能な連結は、プロモーターを含む遺伝子座と相同的組換えを達成するように構成された配列が隣接した、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換えベクターとの間の相同的組換えによって達成することができる。したがって、一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことにより、好ましくは１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における内因性遺伝子の３’に染色体上で組み込むことにより、内因性遺伝子が１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合されている、本明細書で述べたグラム陽性細菌に関する。
【０１２７】
ベクターデザインは、内因性遺伝子および／または外因性遺伝子のオープンリーディングフレームまたはコーディング配列が単に対象とする染色体遺伝子座に組み込まれるように選択することができる。この場合、転写および／または翻訳をもたらすプロモーターそれ自体の傍らの調節配列、例えば、オペレーター、転写開始部位、シャイン−ダルガルノ配列、ターミネーター配列等は、プロモーターの天然のゲノム遺伝子座によって備えられている。あるいは、そのような配列は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換えベクター上に備えることができる。後者の場合、必要に応じて、内因性プロモーターと結合した天然の調節配列を相同的組換え時に除去することができる。ここで述べる系は、内因性遺伝子、外因性遺伝子および場合による調節配列の個別の選択に関してモジュール式であるが、選択されるプロモーターの内因性遺伝子座における挿入部位をあらかじめ定める。
【０１２８】
さらなる実施形態において、本発明によるグラム陽性細菌は、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現をもたらすような、１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列が作動可能に連結している、その（それらの）天然の遺伝子座における、すなわち、細菌染色体上のその（それらの）天然のゲノムコンテクストにおける本明細書における他所で述べた内因性プロモーターならびに１つまたは複数の内因性遺伝子を含む。この系では、内因性プロモーターおよび１つまたは複数の内因性遺伝子、ならびに前記１つまたは複数の内因性遺伝子の転写および翻訳をもたらす調節配列がそれらの天然の遺伝子座に存在する。そのような系は、グラム陽性細菌の天然の特性を最大限保存している。
【０１２９】
ポリシストロン性発現ユニットは、少なくとも２つの遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含む。すべての遺伝子の翻訳を開始するために、これらの遺伝子のそれぞれは、一般的にリボソーム結合をもたらす配列、すなわち、リボソーム結合部位と結合している。原核生物において、リボソーム結合部位は、一般的コンセンサス配列５’−ＡＧＧＡＧＧ−３’を有する表示シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列である。ＳＤ配列は、翻訳開始コドンまたは出発コドンの平均で約８塩基対上流（すなわち、その５’）に位置する。５’遺伝子の停止コドンと３’遺伝子の出発コドンとの間の距離（ヌクレオチドの量としての）によって、ＳＤ配列は、一般的に１）距離がＳＤ配列の少なくともサイズである場合、両遺伝子の間の遺伝子間領域に、２）５’遺伝子と３’遺伝子の間がより小さい距離の場合、両遺伝子の間の遺伝子間領域であるが、５’遺伝子の停止コドンと重複した領域に、または３）５’遺伝子の停止コドンと３’遺伝子の出発コドンとの距離が非常に近いか、または重複している場合、５’から５’遺伝子の停止コドンまでに配置することができる。
【０１３０】
一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子の翻訳をもたらすように構成されたリボソーム結合部位を含む１つまたは複数のポリ核酸配列をさらに含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。他の実施形態において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子の翻訳をもたらすように構成された１つまたは複数のリボソーム結合部位をさらに含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらなる実施形態において、本発明は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、リボソーム結合部位により転写可能または翻訳可能に結合された、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位を含むまたはそれから（本質的に）なるポリ核酸配列により５’遺伝子が３’遺伝子に結合している、本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットを含む、グラム陽性細菌または組換え核酸に関する。好ましい実施形態において、前記リボソーム結合部位は、グラム陽性細菌に対して内因性である。さらなる好ましい実施形態において、前記リボソーム結合部位は、遺伝子間領域、好ましくはオペロン遺伝子間領域に含まれる。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子の翻訳をもたらすように構成された遺伝子間領域を含む１つまたは複数のポリ核酸配列をさらに含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらなる実施形態において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子の翻訳をもたらすように構成された１つまたは遺伝子間領域をさらに含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらなる実施形態において、本発明は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、遺伝子間領域により転写可能または翻訳可能に結合された、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、遺伝子間領域を含むまたはそれからなるポリ核酸配列により５’遺伝子が３’遺伝子に結合している、本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットを含む、グラム陽性細菌または組換え核酸に関する。好ましい実施形態において、前記遺伝子間領域は、グラム陽性細菌に対して内因性である。さらなる好ましい実施形態において、前記遺伝子間領域は、オペロン遺伝子間領域である。
【０１３２】
本明細書で用いているように、「遺伝子間領域」という用語は、「遺伝子間リンカー」または「遺伝子間スペーサー」と同義である。遺伝子間領域は、隣接する（すなわち、同じポリ核酸配列上に位置する）遺伝子、オープンリーディングフレーム、シストロンまたはコーディング配列の間のポリ核酸配列と定義される。伸長により、遺伝子間領域は、前記遺伝子間領域によって連結されている５’遺伝子の停止コドンおよび／または３’遺伝子の出発コドンを含み得る。本明細書で定義されているように、遺伝子間領域という用語は、具体的にはポリシストロン性発現ユニットにおける隣接する遺伝子の間の遺伝子間領域に関する。例えば、本明細書で定義した遺伝子間領域は、オペロンにおける隣接する遺伝子の間に見いだすことができる。したがって、一実施形態において、本明細書で定義した遺伝子間領域は、オペロン遺伝子間領域である。
【０１３３】
一実施形態において、遺伝子間領域、リンカーまたはスペーサーは、グラム陽性細菌のｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥまたはｒｐｌＮに先行する、すなわちその５’にある、より詳細には直接５’にある遺伝子間領域を含むまたはそれからなる遺伝子間領域の群から選択される。一実施形態において、前記グラム陽性細菌は、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）種、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）およびその亜種または菌株である。一実施形態において、前記遺伝子間領域は、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐｌＮの出発コドンおよび／または先行する、すなわち、５’にある遺伝子の停止コドンを含む。好ましい実施形態において、本発明は、内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子がグラム陽性細菌において活性な１つまたは複数の遺伝子間領域により転写可能に結合され、好ましくは１つまたは複数の遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性であり、より好ましくは内因性遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。
【０１３４】
当業者は、遺伝子間領域が５’停止コドンおよび／または３’出発コドンを含む場合、正しい翻訳開始および／または終止に影響を及ぼし得る二重の出発および／または停止コドンを避けるために、これらのそれぞれのコドンが好ましくは、前記遺伝子間領域により連結される遺伝子に存在しないことを十分に理解する。遺伝子間領域を同定する方法は、当技術分野で公知である。さらなるガイダンスとして、遺伝子間領域は、例えば、十分なソフトウエアが当技術分野で公知であり、利用できるオペロン、ならびに関連プロモーターおよびオープンリーディングフレームの予測に基づいて同定することができる。
【０１３５】
さらなる実施形態において、前記遺伝子間領域配列は、以下の配列番号１〜７のいずれかを含む、それから本質的になるまたはそれからなる群から選択される。
配列番号１  ＴＡＡＴＧ
配列番号２  ＴＡＡＴＣＣＡＴＧ
配列番号３  ＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧ
配列番号４  ＴＡＡＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＧＴＧ
配列番号５  ＴＡＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ
配列番号６  ＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＧ
配列番号７  ＴＡＡＧＣＡＡＡＡＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＴＡＧＣＡＴＧ。
【０１３６】
さらなる実施形態において、前記遺伝子間領域配列は、配列番号１または配列番号２と比べて１つのヌクレオチドの１つのミスマッチまたは欠失または挿入を示す配列、配列番号３または配列番号４と比べて１つ、２つもしくは３つのミスマッチ、または１つ、２つもしくは３つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列、および配列番号５、配列番号６または配列番号７と比べて１つ、２つ、３つもしくは４つのミスマッチ、または１つ、２つ、３つもしくは４つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる群から選択される。
【０１３７】
配列番号１〜７はすべて、５’停止コドンおよび３’出発コドンを含む。配列番号１〜７は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）株ＭＧ１３６３（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＭ４０６６７１．１）のそれぞれｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥおよびｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域に対応する。これらの配列は、とりわけ、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）株ＣＶ５６（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＰ００２３６５．１）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）株ＮＺ９０００（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＰ００２０９４．１）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）株ＫＦ１４７（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＰ００１８３４．１）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）株ＩＬ１４０３（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＥ００５１７６．１）およびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）株ＳＫ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＰ０００４２５．１）の対応する配列と同じである。
【０１３８】
他の実施形態において、遺伝子間領域、リンカーまたはスペーサーは、グラム陽性細菌のｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥまたはｒｐｌＦに先行する、すなわちその５’にある、より詳細には直接５’にある遺伝子間領域を含むまたはそれからなる遺伝子間領域の群から選択される。一実施形態において、前記グラム陽性細菌は、乳酸菌、好ましくはエンテロコッカス属（Enterococcus）種、より好ましくはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびその亜種または菌株である。一実施形態において、前記遺伝子間領域は、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥまたはｒｐｌＦの出発コドンおよび／または先行する、すなわち、５’にある遺伝子の停止コドンを含む。当業者は、遺伝子間領域が５’停止コドンおよび／または３’出発コドンを含む場合、正しい翻訳開始および／または終止に影響を及ぼし得る二重の出発および／または停止コドンを避けるために、これらのそれぞれのコドンが好ましくは、前記遺伝子間領域により連結される遺伝子に存在しないことを十分に理解する。遺伝子間領域を同定する方法は、当技術分野で公知である。さらなるガイダンスとして、遺伝子間領域は、例えば、十分なソフトウエアが当技術分野で公知であり、利用できるオペロン、ならびに関連プロモーターおよびオープンリーディングフレームの予測に基づいて同定することができる。
【０１３９】
さらなる実施形態において、前記遺伝子間領域配列は、以下の配列番号８〜１３のいずれかを含む、それから本質的になるまたはそれからなる群から選択される。
配列番号８  ＴＡＡＴＣ
配列番号９  ＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＴＡ
配列番号１０  ＴＡＡＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡ
配列番号１１  ＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＴＣ
配列番号１２  ＴＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡ
配列番号１３  ＴＡＡＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣＴＴＴＡＡ
【０１４０】
さらなる実施形態において、前記遺伝子間領域配列は、配列番号８と比べて１つのミスマッチ、または１つのヌクレオチドの欠失または挿入を示す配列、配列番号９または配列番号１０と比べて１つ、２つもしくは３つのミスマッチ、または１つ、２つもしくは３つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列、および配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３と比べて１つ、２つ、３つもしくは４つのミスマッチ、または１つ、２つ、３つもしくは４つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる群から選択される。配列番号８〜１３は、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株ＬＭＧ１５７０９のｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦにそれぞれ先行する遺伝子間領域に対応する。
【０１４１】
一実施形態において、先行する停止コドンを除き、後の出発コドンを除く、本明細書で述べた遺伝子間領域は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上などの１個超のヌクレオチド、好ましくは５超のヌクレオチド、より好ましくは１０以上のヌクレオチドを含むまたはそれからなることができる。他の実施形態において、遺伝子間領域は、例えば、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５または１〜１０個などの１〜５０個のヌクレオチド、好ましくは５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５または５〜１０個のヌクレオチド、より好ましくは１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０または１０〜１５個のヌクレオチドを含み得る。
【０１４２】
本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌の特に好ましい実施形態を表１および２に示し、前記グラム陽性細菌は、内因性プロモーター、表１および２に示された遺伝子間領域に結合したその３’側の内因性遺伝子、遺伝子間領域に結合したその３’側の１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含む。好ましい実施形態において、表１および２に示された各遺伝子は、その天然のプロモーターおよび場合によって調節配列により転写制御される。他の好ましい実施形態において、前記ポリシストロン性発現ユニットは、細菌染色体に組み込まれる。さらなる好ましい実施形態において、前記内因性プロモーターおよび／または内因性遺伝子は、細菌ゲノムまたは染色体上のそれらの天然の遺伝子座に存在する。好ましくは、出発および停止コドンは、存在する場合、それぞれ前記外因性遺伝子および前記内因性遺伝子の出発および停止コドンを置き換える。
【０１４３】
表１：具体例としてのポリシストロン性発現ユニットは、内因性プロモーター＞＞内因性遺伝子＞＞遺伝子間領域＞＞外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得、内因性遺伝子および遺伝子間領域は、以下の組合せから選択される。
【０１４４】
【表１−１】
2014518062.tif 000002
【表１−２】
2014518062.tif 000003
【０１４５】
好ましくは、遺伝子間領域ｒｐｌＷ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧおよびｒｐｌＮは、ラクトコッカス属（Lactococcus）の種、亜種または菌株、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に由来する。好ましくは、遺伝子間領域ｒｐｌＰ、ｒｐｌＭおよびｒｐｌＥは、エンテロコッカス属（Enterococcus）の種、亜種または菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）に由来する。好ましくは、遺伝子間領域ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤおよびｒｐｓＥは、ラクトコッカス属（Lactococcus）の種、亜種または菌株、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に、またはエンテロコッカス属（Enterococcus）の種、亜種または菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）に由来する。
【０１４６】
例えば、ただし制限なしに、ポリシストロン性発現ユニットが２つの外因性遺伝子を含む場合、内因性プロモーター＞＞内因性遺伝子＞＞遺伝子間領域＞＞外因性遺伝子＞＞遺伝子間領域＞＞外因性遺伝子と表される構造は、次の通りであり得る：ｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞ｒｐｍＤ＞＞外因性遺伝子１＞＞ｒｐｌＮ＞＞外因性遺伝子２；ｅｎｏＡ＞＞ｅｎｏＡ＞＞ｒｐｍＤ＞＞外因性遺伝子１＞＞ｒｐｌＮ＞＞外因性遺伝子２；ｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞外因性遺伝子１＞＞ｒｐｌＮ＞＞外因性遺伝子２。例えば、そのような配置は、本明細書で教示した抗ＴＮＦα抗体などの抗体の重および軽鎖の発現（好ましくはその順序の）に特に適する可能性がある。
【０１４７】
表２：具体例としてのポリシストロン性発現ユニットは、内因性プロモーター＞＞内因性遺伝子＞＞遺伝子間領域＞＞外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得、内因性遺伝子および遺伝子間領域は、以下の組合せから選択される。
【０１４８】
【表２−１】
2014518062.tif 000004
【表２−２】
2014518062.tif 000005
【０１４９】
好ましくは、配列番号１〜７のいずれかを含むポリシストロン性発現ユニットを有するグラム陽性細菌は、ラクトコッカス属（Lactococcus）の種、亜種または菌株、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である。好ましくは、配列番号８〜１３のいずれかを含むポリシストロン性発現ユニットを有するグラム陽性細菌は、エンテロコッカス属（Enterococcus）の種、亜種または菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）である。
【０１５０】
当業者は、本発明による外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を、特定の目的を達成する付加的配列に結合させることができることを十分に理解する。例えば、外因性遺伝子の分泌を増加させるために、遺伝子を分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列に結合させることができる。特に好ましい実施形態において、本発明による外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）の種、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ならびにその亜種および菌株に由来するＵｓｐ４５分泌シグナルをコードするポリ核酸配列にその５’末端において結合させる。
【０１５１】
一般的に、分泌シグナル配列は、脂質二重層膜に埋め込まれた状態になり、それにより、宿主細胞からの随伴タンパク質またはペプチド配列の分泌を可能にし、当タンパク質またはペプチドから通常切断される疎水性アミノ酸を通常含む、約１６〜約３５アミノ酸セグメントである。好ましくは、分泌シグナル配列は、前記シグナル配列を含む核酸とともに用いることを目的とした宿主細胞において非常に活性であり得る。
【０１５２】
適切な宿主細胞において活性な分泌シグナル配列は、当技術分野で公知であり、具体例としてのラクトコッカス属（Lactococcus）シグナル配列は、ｕｓｐ４５（米国特許第５，５５９，００７号参照）およびその他のシグナル配列を含む。例えば、Perez-Martinezら、Mol. Gen. Genet.、1992年、234巻、401〜11頁、Sibakovら、Appl. Environ. Microbiol.、1991年、57巻(2号)、341〜8頁を参照のこと。好ましくは、シグナル配列は、プロモーター配列とＯＲＦとの間に位置する。すなわち、シグナル配列は、プロモーター配列の３’側に位置し、対象のポリペプチドのＯＲＦに先行する。好ましい実施形態において、シグナル配列は、アミノ酸配列ＭＫＫＫＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡＰＬＳＧＶＹＡ（ｕｓｐ４５）をコードする。あるいは、対象のポリペプチドのさらなる制御可能な産生および分泌をもたらす突然変異ｕｓｐ４５シグナル配列（ｕｓｐ４５Ｎ）を用いることができる。特に、突然変異体は、４位にリシン（Ｋ）の代わりにアスパラギン（Ｎ）を、またはＫ４Ｎ突然変異を含む。好ましい実施形態において、シグナル配列は、アミノ酸配列ＭＫＫＮＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡＰＬＳＧＶＹＡＤＴＮをコードする。
【０１５３】
本発明はまた、本明細書で述べた本発明によるポリシストロン性発現ユニットを含むポリ核酸配列に関する。特に、一態様において、本発明は、本明細書で述べた本発明によるポリシストロン性発現ユニットを含むポリ核酸配列に関し、前記ポリシストロン性ユニットは、グラム陽性細菌に対して内因性の１つまたは複数の遺伝子ならびにグラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含み、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、本明細書で述べた仕方で翻訳可能または転写可能に結合される。好ましくは、１つまたは複数の内因性遺伝子は、１つまたは複数の外因性遺伝子の５’末端に結合する。好ましくは、１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、本明細書で述べた遺伝子間領域、好ましくは、本明細書の他所で述べたｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥおよびｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域または配列番号１〜７のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥもしくはｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域または配列番号８〜１３のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列により接続される。一実施形態において、ポリ核酸配列は、プロモーター、好ましくはグラム陽性細菌の内因性のプロモーターをさらに含む。他の実施形態において、ポリ核酸配列は、調節配列、例えば、オペレーター、ターミネーターなどをさらに含む。好ましい実施形態において、プロモーターは、内因性遺伝子の天然のプロモーターである。
【０１５４】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で述べたポリ核酸配列を含むレプリコンに関する。好ましくは、前記レプリコンは、本明細書の他所で述べたベクターである。一実施形態において、前記ベクターは、原核生物発現に適する。他の実施形態において、前記ベクターは、グラム陽性細菌における相同的組換えに適する。
【０１５５】
他の態様において、本発明は、グラム陽性細菌のリボソーム結合部位および前記細菌に対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むポリ核酸配列に関し、リボソーム結合部位は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の翻訳を達成するように構成されている。一実施形態において、ポリ核酸配列は、グラム陽性細菌のリボソーム結合部位および前記細菌に対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含み、リボソーム結合部位は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の５’末端に接続されている。
【０１５６】
他の態様において、本発明は、グラム陽性細菌の遺伝子間領域、好ましくはオペロン遺伝子間領域および前記細菌に対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むポリ核酸配列に関し、遺伝子間領域は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の翻訳を達成するように構成されている。一実施形態において、ポリ核酸配列は、グラム陽性細菌の遺伝子間領域、好ましくはオペロン遺伝子間領域および前記細菌に対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含み、遺伝子間領域は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の５’末端に接続されている。好ましくは、遺伝子間領域は、本明細書の他所で述べたｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域または配列番号１〜７のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥもしくはｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域または配列番号８〜１３のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列である。
【０１５７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書の他所で述べたｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域または配列番号１〜７のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥもしくはｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域または配列番号８〜１３のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列を含むポリシストロン性発現ベクターに関する。一実施形態において、前記ベクターは、前記遺伝子間領域の３’末端における遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列、好ましくはグラム陽性細菌に対して外因性である遺伝子をクローニングするのに適している。一実施形態において、前記ベクターは、グラム陽性細菌において複製されるのに適している。さらなる実施形態において、前記ベクターは、グラム陽性細菌における相同的組換えを達成するために、特に、前記遺伝子間領域および前記遺伝子間領域の３’末端における遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の染色体組込みに適している。一実施形態において、前記ベクターは、１つまたは複数のプロモーター、好ましくはグラム陽性細菌プロモーターをさらに含む。さらなる実施形態において、前記ベクターは、調節配列、例えば、オペレーター、ターミネーターなどをさらに含む。さらに他の実施形態において、前記ベクターは、抗生物質耐性遺伝子などの１つまたは複数の選択マーカーをさらに含む。
【０１５８】
他の態様において、本発明は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含み、本明細書で述べた（内因性）プロモーターを場合によってさらに含むベクターを用いて前記グラム陽性細菌を形質転換するステップを含む、グラム陽性細菌における外因性遺伝子発現の方法に関する。
【０１５９】
さらなる態様において、本発明は、グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列のポリシストロン性発現のための本明細書で述べたグラム陽性細菌の遺伝子間領域を含むポリ核酸配列の使用に関する。一実施形態において、本発明は、グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列および前記グラム陽性細菌に対して内因性の１つまたは複数の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列のポリシストロン性発現のための本明細書で述べたグラム陽性細菌の遺伝子間領域を含むポリ核酸配列の使用に関する。一実施形態において、前記グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子は、前記内因性遺伝子の３’末端に結合している。好ましくは、遺伝子間領域は、本明細書の他所で述べたｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域または配列番号１〜７のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＥもしくはｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域または配列番号８〜１３のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列である。
【０１６０】
他の態様において、本発明は、ポリシストロン性ｍＲＮＡに転写されるような本明細書で述べた１つまたは複数の外因性タンパク質をコードするポリ核酸配列またはベクターをグラム陽性細菌に導入するステップを含む、グラム陽性細菌における１つまたは複数の外因性タンパク質を発現させる方法に関する。
【０１６１】
さらに他の態様において、本発明は、ポリシストロン性ｍＲＮＡに転写されるような本明細書で述べた１つまたは複数の外因性タンパク質をコードするポリ核酸配列またはベクターをグラム陽性細菌に導入するステップを含む、１つまたは複数の外因性タンパク質を発現することができるグラム陽性細菌を発生させる方法に関する。
【０１６２】
本発明によれば、１つまたは複数の外因性遺伝子、コーディング配列のオープンリーディングフレームは、あらゆる種類または起源のものであり得る。一実施形態において、１つまたは複数の外因性遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド、好ましくは対象における治療もしくは予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチド、または好ましくは免疫もしくは免疫寛容を誘導するための抗原などの抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体もしくはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質もしくは多量体タンパク質をコードする。好ましい実施形態において、１つまたは複数の外因性遺伝子は、抗体または機能性抗体断片をコードする。本明細書で用いているように、「機能性」という用語は、その意図された機能、すなわち、抗原結合を依然として発揮し得る抗体断片に適用される。抗体という用語は、本明細書で用いているように、通常の抗体、キメラ抗体、ｄＡｂ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、二価抗体、三価抗体、多価抗体、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ジアボディ、トリアボディ、単鎖抗体、単ドメイン抗体、単一抗体可変ドメインを含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
本文脈において、「抗体」という用語は、天然であるか、または部分的もしくは完全に操作されたかにかかわりなく、免疫グロブリンを記述するために用いる。抗体は多くの方法で修飾することができるので、「抗体」という用語は、特異的結合性分子または分子の対の他のメンバー、すなわち、上文で定義した標的分子に対する所要の結合特異性を有する結合ドメインを有する物質を対象とするものと解釈すべきである。したがって、この用語は、抗体断片、抗体の誘導体、機能性同等物および同族体、ならびに天然であるか、または部分的もしくは完全に操作されたかにかかわりなく、免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドを含む、単鎖抗体、２機能性抗体、二価抗体、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ジアボディ、トリアボディおよびラクダ科動物抗体を対象とする。免疫グロブリンの結合ドメインを含むキメラ分子、または他のポリペプチドと融合した同等物は、したがって含まれる。この用語は、抗体の結合ドメインである、またはそれと同族である結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体模倣体も対象とする。抗体の例は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプサブクラスである。したがって、当業者は、本発明が、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ジアボディおよびトリアボディなどの抗原結合ドメインを含む抗体断片にも関することを十分に理解する。一実施形態において、本発明は、１つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖（ＶＬ）をコードし、他の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖（ＶＨ）をコードし、より好ましくは機能性断片がＦａｂである、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。一実施形態において、ＶＬまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子は、ＶＨまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合される。
【０１６４】
一実施形態において、本明細書で述べた抗体は、サイトカインまたはケモカインなどの標的分子の生物学的活性を少なくとも部分的または完全に阻害、抑制または中和する。本明細書で用いているように、「中和する」または「中和」という表現は、例えば、実施例で詳述するような当技術分野で公知の方法によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるサイトカインの生物学的活性の抑制または低下を意味する。特に、抑制または低下は、大腸炎スコアを測定することにより、または組織もしくは血液試料中の標的分子を測定することにより、測定することができる。本明細書で用いているように、「中和する」または「中和」という表現は、少なくとも１０％以上、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、より好ましくは１００％の、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるサイトカインの生物学的活性の抑制または低下を意味する。
【０１６５】
好ましくは、前記結合分子は、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（またはそのサブユニットＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ１２ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３（またはそのサブユニットＩＬ−２３ｐ１９）、ＩＬ−２７、ＩＬ−３２（およびそのスプライス変異体）、ＩＦＮ（α、β、γ）およびＴＮＦαのリストから選択されるサイトカインに結合し、その生物学的作用を抑制する。好ましくは、前記結合分子は、ｇｐ１３０などの可溶性サイトカイン受容体であるか、または前記サイトカインの受容体、例えば、炎症性シグナルを誘起せずに、ＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２）、ＩＬ−１２Ｒ（ベータ１、ベータ２）、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−２３ＲまたはＩＬ−６Ｒに結合している。好ましくは、前記結合分子は、ＭＩＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびエオタキシンのリストから選択されるケモカインを中和する。好ましくは、前記結合分子は、ＣＤ３／ＣＤ２８、ＨＶＥＭ、Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０／Ｘ４０Ｌ、ＣＤ２７／ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）および４１ＢＢ／４１ＢＢＬのリストからの共刺激分子に結合することにより、免疫活性化の阻害を解消する。好ましくは、前記結合分子は、Ｉ−ＣＡＭ１、α４インテグリンおよびα４β７インテグリンのリストからの接着分子に結合することにより炎症の阻害を解消する。好ましくは、前記結合分子は、ＣＤ３、ＣＴＬＡ４および／またはＰＤ１に対する共刺激およびアゴニスト作用を有する。好ましくは、前記結合分子は、ＣＤ２５、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ９５、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬおよび／またはＩｇＥを標的にすることによりＴ細胞またはＢ細胞活性を中和する。好ましくは、前記結合分子は、ＭＭＰファミリーからの酵素に結合することにより炎症の阻害を解消する。好ましくは、前記結合分子は、αｖβ３／α５β１およびＩＬ−８活性を中和することなどの抗血管新生作用を実証する。さらなる好ましい実施形態において、前記結合分子は、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＬ−２３またはＩＬ−１７の生物学的作用を中和することができる。好ましくは、前記結合分子は、以下のものからなる群から選択される。
−  抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦα抗体断片、抗ＴＮＦα単一抗体可変ドメイン、可溶性ＴＮＦ受容体またはＴＮＦαのドミナントネガティブ変異体；
−  抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１２抗体断片、抗ＩＬ−１２単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１２のドミナントネガティブ変異体またはＩＬ−１２ｄＡｂ；
−  抗ＩＬ−１２ｐ３５抗体、抗ＩＬ−１２ｐ３５抗体断片、抗ＩＬ−１２ｐ３５単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−１２ｐ３５受容体、ＩＬ−１２ｐ３５のドミナントネガティブ変異体またはＩＬ−１２ｐ３５ｄＡｂ；
−  抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体断片、抗ＩＬ−１２ｐ４０単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０受容体、ＩＬ−１２ｐ４０のドミナントネガティブ変異体またはＩＬ−１２ｐ４０ｄＡｂ；
−  抗ＩＬ−２３抗体、抗ＩＬ−２３抗体断片、抗ＩＬ−２３単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２３のドミナントネガティブ変異体またはＩＬ−２３ｄＡｂ；
−  抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体断片、抗ＩＬ−２３ｐ１９単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−２３ｐ１９受容体、ＩＬ−２３ｐ１９のドミナントネガティブ変異体またはＩＬ−２３ｐ１９ｄＡｂ；
−  抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＦＮγ抗体断片、抗ＩＦＮγ単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＦＮγ受容体、ＩＦＮγのドミナントネガティブ変異体；
−  抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩＬ−１７抗体断片、抗ＩＬ−１７単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１７のドミナントネガティブ変異体またはＩＬ−１７ｄＡｂ；
−  抗ＭＣＰ−１抗体、抗ＭＣＰ−１抗体断片、抗ＭＣＰ−１単一抗体可変ドメイン、可溶性ＩＬ−１７受容体、ＭＣＰ−１のドミナントネガティブ変異体またはＭＣＰ−１ｄＡｂ。
【０１６６】
好ましい実施形態において、前記抗体は、Ｆａｂ断片（抗原結合断片）である。Ｆａｂ断片は、当技術分野で周知である。さらなるガイダンスとして、Ｆａｂ断片は、抗原に結合する抗体上の領域である。それは、重および軽鎖のそれぞれの１つの定常ドメインと１つの可変ドメインから構成されている。
【０１６７】
一実施形態において、Ｆａｂは、ｃＡ２抗ＴＮＦ  Ｆａｂ（その重鎖および軽鎖の可変ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、米国特許第６，７９０，４４４号にそれぞれ配列番号４および５（重鎖）ならびに配列番号２および３（軽鎖）として開示されている）またはＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂ（その重鎖および軽鎖のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、国際公開第０１／９４５８５にそれぞれ配列番号１１４および１１５（重鎖）ならびに配列番号１１２および１１３（軽鎖）として開示されている）である。
【０１６８】
当業者は、抗体、そのままの機能性抗体断片および特にＦａｂ断片は、ジスルフィド架橋により共有結合していてもよい異なる個々のポリペプチドから構成されている。特に、重鎖および軽鎖は、別個の個々のコーディング配列によりコードされる。
【０１６９】
したがって、重および軽鎖のコーディング領域は、それぞれ本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットに含まれ得る。重および軽鎖をコードするポリ核酸配列は、異なるポリシストロン性発現ユニットに組み込むことができる。好ましくは、重鎖および軽鎖をコードするポリ核酸配列は、同じポリシストロン性発現ユニットに組み込む。したがって、一実施形態において、本発明は、翻訳可能または転写可能に結合された、１つまたは複数の内因性遺伝子、抗体重鎖をコードする１つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断片、好ましくは機能性断片および抗体軽鎖をコードする１つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断片、好ましくは機能性断片を含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌に関する。他の実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、１つまたは複数の内因性遺伝子、抗体重鎖をコードする１つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断片、好ましくは機能性断片および抗体軽鎖をコードする１つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断片、好ましくは機能性断片を含む。さらに他の実施形態において、軽鎖をコードするポリ核酸配列は、重鎖をコードするポリ核酸配列の３’末端に転写可能または翻訳可能に結合される。有利なことに、そのような結合は、重および軽鎖の両方の発現をさらに増大させる。
【０１７０】
本発明はまた、治療のための本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌の使用に関する。本発明はさらに、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。
【０１７１】
したがって、一態様において、本発明は、薬剤として使用するための本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。他の態様において、本発明は、療法または治療用の本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、薬剤の製造のための本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物の使用に関する。さらに他の態様において、本発明は、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物を投与するステップを含む、治療の方法に関する。一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の外因性遺伝子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、産物が対象における治療または予防効果を有する、好ましくは薬剤として使用するための、好ましくは対象への前記産物の投与または送達に使用するための、本明細書で述べたグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。
【０１７２】
関連態様において、本発明は、それを必要とするヒトまたは動物への本発明のグラム陽性細菌に含まれる１つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列によりコードされるポリペプチドの送達の方法であって、治療上有効量の本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌を前記ヒトまたは動物に投与するステップを含む、上記方法を提供する。動物は、好ましくは例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などの家畜、圃場家畜、動物園動物、スポーツ用動物、ペットおよび実験動物、類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類、イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物、ネコ、ライオンおよびトラなどのネコ科動物、ウマ、ロバおよびシマウマなどのウマ科動物、ウシ、ブタおよびヒツジなどの食用動物、シカおよびキリンなどの有蹄動物、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類動物などの哺乳動物であり得る。
【０１７３】
本明細書で用いているように、「治療する」または「治療」という用語は、治療上の処置および予防処置の両方を意味し、目的は、望ましくない生理的変化または障害を予防または遅くする（軽減する）ことである。「治療を必要とするヒトまたは動物」は、所定の状態の治療により恩恵を受ける者を含む。
【０１７４】
「治療上有効量」という用語は、対象、例えば、ヒトまたは動物における疾患または障害を治療するのに、すなわち、所望の局所または全身効果および成果を得るのに有効な治療用物質または組成物を意味する。例として、治療上有効量の細菌は、例えば、単回または反復投与で少なくとも１個の細菌、または少なくとも１０個の細菌、または少なくとも１０２個の細菌、または少なくとも１０３個の細菌、または少なくとも１０４個の細菌、または少なくとも１０５個の細菌、または少なくとも１０６個の細菌、または少なくとも１０７個の細菌、または少なくとも１０８個の細菌、または少なくとも１０９個、または少なくとも１０１０個、または少なくとも１０１１個、または少なくとも１０１２個、または少なくとも１０１３個、または少なくとも１０１４個、または少なくとも１０１５個、またはそれ以上のグラム陽性細菌を含み得る。
【０１７５】
本発明のグラム陽性細菌は、単独でまたは１つまたは複数の活性化合物と併用して投与することができる。後者は、グラム陽性細菌の投与の前、後または同時に投与することができる。
【０１７６】
抗原および／または治療上有効なポリペプチドの送達に関する多くの従来技術の開示が存在し、そのような開示は、本発明のグラム陽性細菌によりさらに有利に修正することができることが十分に理解されなければならない。例として、また制限なしに、インターロイキン、特に、大腸炎を治療するためのＩＬ−１０（例えば、国際公開第００／２３４７１号）、炎症反応を調節するためのＩＬ−２７（国際公開第２００４／０６９１７７号）の細菌送達、ワクチンとしての抗原の送達（例えば、国際公開第９７／１４８０６号）、ＧＬＰ−２および関連類似体の送達は、短腸病、クローン病、骨粗鬆症を治療するのに、また癌化学療法時のアジュバント療法等として用いることができる。さらに、トレフォイルペプチドの細菌送達は、消化管の疾患を治療するのに用いることができる（例えば、国際公開第０１／０２５７０号）。特に、口、食道、胃ならびに大および小腸を含む消化管の障害および損傷の治療のためのならびに消化管外にある組織の保護および治療のためのトレフォイルタンパク質またはペプチドの使用は、国際公開第９７／３８７１２号および国際公開第９２／１４８３７号に記載されている。これらのタンパク質は、これらの部位の病変を治療するために、または病変の形成を抑制するために用いることができる。これらの病変は、癌の治療のための放射線療法または化学療法、消化管を損傷するアルコールを含む他の薬物、放射線または原因物質への偶発的曝露、口腔粘膜炎、腸粘膜炎、食道炎、直腸炎、非潰瘍性消化不良症、胃炎、消化性または十二指腸潰瘍、胃癌、大腸癌、ＭＡＬＴリンパ腫、メネトリエ症候群、胃食道逆流疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎および化学物質、細菌または不明瞭な原因による急性大腸炎を含むが、これらに限定されない消化器疾患によって引き起こされ得る。本発明のプロモーターおよび宿主細胞を用いたさらなる治療への応用が想定される。
【０１７７】
本発明による治療用ポリペプチドの送達によりヒトまたは動物における治療可能な疾患の種類のさらなる非限定的な例は、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（例えば、ＩＬ−Ｉｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７またはトレフォイルペプチドにより治療可能）、乾癬、慢性関節リウマチ、紅斑性狼瘡を含むが、これらに限定されない自己免疫疾患（例えば、ＩＬ−Ｉｒａ、ＩＬ−２７、ＩＬ−１０または関連自己抗原により治療可能）、喘息、食物アレルギーを含むが、これらに限定されないアレルギー性疾患（関連アレルゲンにより治療可能）、セリアック病（グルテンアレルゲンにより治療可能）、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋委縮側索硬化症を含むが、これらに限定されない神経疾患（例えば、脳由来神経栄養因子および毛様体神経栄養因子により治療可能）、癌（例えば、ＩＬ−１、コロニー刺激因子またはインターフェロンＷにより治療可能）、骨粗鬆症（例えば、形質転換成長因子ｆ３により治療可能）、糖尿病（例えば、インスリンにより治療可能）、心血管疾患（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子により治療可能）、アテローム動脈硬化症（例えば、サイトカインおよびサイトカインアンタゴニストにより治療可能）、血友病（例えば、凝固因子により治療可能）、変性肝疾患（例えば、肝細胞増殖因子またはインターフェロンａにより治療可能）、嚢胞性線維症などの肺疾患（例えば、アルファ抗トリプシンにより治療可能）、肥満、病原体感染、例えば、ウイルスまたは細菌感染症（任意の数の上述の組成物または抗原により治療可能）等を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明によるグラム陽性細菌は、感染症を治療するためにも用いることができる。一実施形態において、本発明によるグラム陽性細菌により局所的に産生され、分泌される毒素中和抗体によるクロストリジウム属（Clostridium）、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium dificile）関連疾患（ＣＤＡＤ）に対する受動免疫を得ることできる。好ましくは、前記グラム陽性細菌は、ラクトコッカス属の菌種（Lactococcus sp.）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）またはその亜種またはその菌株である。
【０１７９】
ＣＤＡＤは、２種の外毒素、すなわち、毒素Ａ（エンテロトキシン；例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００９０８９．１参照、領域：ＤＮＡ配列について７９５８４３．．８０３９７５またはタンパク質配列についてＹＰ＿００１０８７１３７．１）および毒素Ｂ（サイトトキシン；例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００９０８９．１参照、領域：ＤＮＡ配列について７８７３９３．．７９４４９３またはタンパク質配列についてＹＰ＿００１０８７１３５．１）により媒介される。両者は、腸上皮細胞の表面に結合する高分子量タンパク質であり、そこで内部移行し、細胞死、炎症および下痢をもたらす細胞質ｒｈｏタンパク質のグルコシル化を触媒する。それらは、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）の病原性、定着および好中球の走化性および活性化の促進にも関与していた。細菌自体は、侵襲性でなく、組織損傷を引き起こさない。抗体によりＣ．ディフィシレ（C. difficile）毒素を中和することにより、病原体の病原機構が遮断され、腸内で生育するその能力を低下させることができ、微生物の生態に対する影響を最小限にすることができ、正常な細菌叢の回復が可能となる。このアプローチの医学的利点は、より速やかな回復、より少ない再発および正常な腸細菌叢における抗生物質耐性に対する選択的圧力の軽減などであり得る。
【０１８０】
したがって、一実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットがクロストリジウム属（Clostridium）の毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する本明細書の他所で述べた抗体またはその断片、好ましくはＦａｂを含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌に関する。最も好ましくは、前記抗体またはその断片は、中和抗体である。さらなる実施形態において、本発明は、好ましくは細菌染色体に組み込まれたポリシストロン性発現ユニットを含む、グラム陽性細菌、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス属種（Lactococcus sp.）またはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）もしくはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）などのエンテロコッカス属種（Enterococcus sp.）に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、好ましくはラクトコッカス属種（Lactococcus sp.）またはエンテロコッカス属種（Enterococcus sp.）に由来するｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳからなる群から選択される内因性遺伝子ならびにクロストリジウム属（Clostridium）、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium dificile）の毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する中和抗体または抗体断片、好ましくはＦａｂをコードする１つまたは複数の外因性遺伝子を含み、前記ポリシストロン性発現ユニットは、好ましくは前記内因性遺伝子の天然の遺伝子座において染色体に組み込まれており、前記毒素Ａおよび／または毒素Ｂ抗体（断片）遺伝子は、好ましくは前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合され、前記転写可能な結合は、グラム陽性細菌、好ましくはラクトコッカス属種（Lactococcus sp.）またはエンテロコッカス属種（Enterococcus sp.）のｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から好ましくは選択される遺伝子間領域によってもたらされる。本明細書で述べたクロストリジウム属（Clostridium）毒素Ａおよび毒素Ｂの抗体は、当技術分野で公知である（例えば、Leungら、J Pediatr、1991年、118巻(4Pt1)、633〜637頁、Wilcox. J Antimicrob Chemother、2004年、53巻(５号)、882〜884頁、Sougioultzisら、Gastroenterology、2005年、128巻(3号)、764〜770頁、Kyneら、N Engl J Med、2000年、342巻(6号)、390〜397頁、Lowyら、N Engl J Med、362巻(3号)、197〜205頁参照）。両抗体またはその断片は、同じまたは異なるグラム陽性細菌における別個のポリシストロン性発現ユニットに配置することができるが、好ましくは単一ポリシストロン性発現ユニットに配置する。本発明はさらに、そのようなグラム陽性細菌を投与するステップを含む、ＣＤＡＤを予防および／または治療する方法に関する。
【０１８１】
熟練した読者は、本明細書で具体的に列挙した疾患は、例となるものにすぎず、それらの列挙は、本発明により提供される試薬、例えば、本発明のプロモーター、核酸、ベクターおよび宿主細胞の使用をこれらの特定の疾患に限定することを意図するものではないことを十分に理解しなければならない。それよりも、熟練した読者は、本発明の試薬は、列挙したものにおいてだけでなく、ヒトおよび動物の様々なさらなる疾患または状態においても治療上関連性のあり得る、対象の発現産物、好ましくはポリペプチドを原理上は発現させるのに用いることができることを理解する。したがって、適切な発現産物、好ましくはポリペプチド、例えば、抗原、抗体（断片）および／または非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチドが所定の病気について選択または決定されたならば、当業者は、その発現、単離および／または送達を本発明の試薬を用いて達成することができるであろう。
【０１８２】
本発明はまた、イヌ、ウマ、ネコおよび鳥を含む他の動物における疾患の治療を予期する。イヌにおける疾患は、イヌジステンパー（パラミクソウイルス）、イヌ肝炎（アデノウイルスＣａｖ−１）、ケンネルコフまたは咽頭気管炎（アデノウイルスＣａｖ−２）、伝染性イヌ腸炎（コロナウイルス）および出血性腸炎（パルボウイルス）を含むが、これらに限定されない。
【０１８３】
ネコにおける疾患は、ウイルス性鼻気管炎（ヘルペスウイルス）、ネコカリシウイルス感染症（カリシウイルス）、ネコ伝染性腹膜炎（パルボウイルス）およびネコ白血病（ネコ白血病ウイルス）を含むが、これらに限定されない。ウマおよび鳥における他のウイルス性疾患も、本発明の方法および組成物を用いて治療可能であると考えられる。この目的に向けて、組換えインターフェロンを発現する微生物の使用は特に好ましい。
【０１８４】
本明細書で用いているように、医薬組成物は、好ましくは治療上有効量の本発明のグラム陽性細菌ならびに薬学的に許容される担体、すなわち、１つまたは複数の薬学的に許容される担体物質および／または添加物、例えば、緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤等を含む。
【０１８５】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で用いているように、当技術分野と調和し、医薬組成物の他の成分と適合性があり、その受容者に対して有害でないことを意味する。
【０１８６】
本発明のグラム陽性細菌は、治療すべき疾患を有するヒトまたは動物への投与のための医薬製剤中に懸濁することができる。そのような医薬製剤は、生存グラム陽性細菌および投与に適する媒体を含むが、これらに限定されない。グラム陽性細菌は、ラクトース、他の糖、アルカリおよび／またはアルカリ土類ステアリン酸塩、炭酸塩および／または硫酸塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、着香料および香料などの一般的な賦形剤の存在下で凍結乾燥することができる。そのように凍結乾燥されたグラム陽性細菌は、それぞれを経口経路により投与することができる、カプセル剤、錠剤、顆粒剤および散剤（例えば、口内洗浄散剤）の形態で調製することができる。あるいは、一部のグラム陽性細菌は、適切な媒体中水性懸濁剤として調製することができ、または凍結乾燥細菌は、使用直前に適切な媒体、本明細書で言及した賦形剤ならびにグルコース、グリシンおよびサッカリン酸ナトリウムなどの他の賦形剤を含むそのような媒体に懸濁することができる。
【０１８７】
経口投与のために、胃抵抗性経口剤形を調合することができ、その剤形は、グラム陽性細菌の制御放出をもたらす化合物も含み、それにより、その中にコードされている所望のタンパク質の制御放出をもたらし得る。例えば、経口剤形（カプセル剤、錠剤、ペレット剤、顆粒剤および散剤を含む）は、胃内の溶解または崩壊に抵抗するが、腸内ではそうでなく、それにより、腸内での崩壊、溶解および吸収のために胃を通過することを可能にする賦形剤（通常ポリマー、セルロース誘導体および／または親油性物質）の薄層で被覆することができる。
【０１８８】
経口剤形は、例えば、制御放出、持続放出、持効性放出、持続作用錠剤またはカプセル剤として、グラム陽性細菌および産生された外因性タンパク質の徐放を可能にするように設計することができる。これらの剤形は、通常、親油性、重合性、セルロース系、不溶性、膨潤性賦形剤などの従来型で、周知の賦形剤を含む。制御放出製剤は、腸、結腸、生体接着または舌下送達（すなわち、歯粘膜送達）および気管支送達を含む他の送達部位にも用いることができる。本発明の組成物を直腸または膣に投与すべきである場合、医薬製剤は、軟膏剤、坐剤およびクリーム剤を含み得る。この場合、グラム陽性細菌を脂質も含む一般的な賦形剤の混合物中に懸濁する。前述の製剤のそれぞれは、当技術分野で周知であり、例えば、以下の参考文献に記載されている。Hanselら、Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems、5版、WilliamおよびWilkins、1990年、Chien、1992年、Novel drug delivery system、2版、M. Dekker、Prescottら(1989年、Novel drug delivery、J. Wiley & Sons)、Cazzanigaら、1994年、Oral delayed release system for colonic specific delivery、Int. J. Pharm.i08;7'。
【０１８９】
好ましくは、浣腸製剤を直腸投与に用いることができる。「浣腸」という用語は、直腸用の液体製剤をカバーするために用いられる。浣腸は、1回量容器入りで通常供給され、水、グリセロールまたはマクロゴールまたは他の適切な溶媒に溶解または分散させた１つまたは複数の活性物質を含む。
【０１９０】
したがって、本発明によれば、好ましい実施形態において、所望の外因性遺伝子をコードする本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌は、特定の経路に適用できる最先端技術を用いた製剤のいずれか１つにより粘膜、例えば、経口、鼻、直腸、膣または気管支経路を経て動物またはヒトに投与することができる。投与のためのグラム陽性細菌の用量は、細菌の種類およびそれによりコードされる遺伝子、治療される疾患の種類および重症度ならびに使用される投与経路などのかなり多数の因子によって異なる。
【０１９１】
したがって、詳細な用量は、本発明のそれぞれおよびすべての実施形態について定めることはできないが、本発明があるならば当業者に容易に明らかになる。用量は、ＥＬＩＳＡまたはビアコア（Biacore）（実施例参照）として公知のものなどの周知の方法を用いてあらかじめ定めた数の細胞の投与後の組換えタンパク質の血清レベル濃度を測定することにより個別的方法で決定することができる可能性がある。送達された組換えタンパク質の速度論的プロファイルおよび半減期の解析は、形質転換宿主細胞の有効量範囲の決定を可能にするのに十分な情報を提供する。
【０１９２】
一実施形態において、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌が抗原を発現する場合、本発明は、ワクチンも提供し得る。
【０１９３】
「ワクチン」という用語は、動物またはヒト対象に有効量で投与した場合、ワクチンに含まれる免疫原に対する抗体を誘導し、かつ／または対象における防御免疫を誘起することができる薬学的に許容される組成物を指す。
【０１９４】
本発明のワクチンは、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌を、またさらに賦形剤を場合によって含むことになる。そのようなワクチンは、アジュバント、すなわち、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または組成物も含み得る。アジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの界面活性物質、多価陰イオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョンならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテルム・パルバム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用な薬学的に許容されるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。
【０１９５】
本発明により、骨折治癒障害の診断、予測、予後診断および／またはモニタリングにおける実質的な利点をもたらすバイオマーカー、使用および方法が提供されたことが明らかになる。本発明をその特定の実施形態とともに記述したが、前述の説明に照らして多くの代替形態、修正形態および変形形態が当業者には明らかであることは明白である。したがって、すべてのそのような代替形態、修正形態および変形形態は、以下のように特許請求の精神および広い範囲に含まれるものである。
【０１９６】
本発明の態様および実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに裏付けられる。
【実施例１】
【０１９７】
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ゲノムからの遺伝子間領域の選択
図１に示すように、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）株ＭＧ１３６３の対数末期培養の細胞タンパク質をタンパク質ゲル上でクーマシーブルー染色により視覚化した。レーンＡおよびＢは、それぞれ２９μｇおよび５８μｇのＭＧ１３６３タンパク質を含んでいた。レーンＡからの１２の明確なタンパク質バンドをゲルから単離した。タンパク質を単離し、遺伝子間領域を以下により同定した。
１）部分的ペプチド配列決定（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）ならびにペプチドの質量および配列の複合情報を用いたデータベース検索による断片における多量に発現したタンパク質の同定
２）オペロンに存在する多量に発現したタンパク質（１）をコードする遺伝子のラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）株ＭＧ１３６３の染色体配列（Wegmannら）を用いた同定、ただし、「第１の遺伝子」としてでない
３）これらの多量に発現した遺伝子に先行する遺伝子間領域の同定
【０１９８】
表３にそのように同定された遺伝子間領域を示す。下線を引いた配列は、リボソーム結合部位である。
【０１９９】
【表３】
2014518062.tif 000006
【実施例２】
【０２００】
バイシストロン性発現の部位の選択
表４に高レベル発現を推進するものとして実施例１で同定された標的プロモーターを示す。これらのプロモーターは、外因性遺伝子のポリシストロン性発現の標的部位として用いることができる。
【０２０１】
【表４−１】
2014518062.tif 000007
【表４−２】
2014518062.tif 000008
【０２０２】
大腸菌（E. Coli）からのβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子をリポーター遺伝子としてラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３に導入した。ｕｉｄＡ遺伝子産物β−グルクロニダーゼは、組織化学的および分光光度測定基質として市販されている様々なβ−グルクロニドの開裂を触媒する。菌株ｓＡＧＸ００９０は、ｔｈｙＡ遺伝子座においてＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ発現カセットを有する（図２）。このプロモーターは、菌株ｓＡＧＸ００３７およびｓＡＧＸ００８５においても用いられた。
【０２０３】
図２に示すように、デュアルシストロン構築物は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体におけるいくつかの内因性遺伝子（遺伝子Ｘ）の３’末端にｕｉｄＡを挿入することにより作製した。これによって、ｒｐｍＤを表４からの対象の内因性遺伝子とｕｉｄＡとの間の遺伝子間配列として用いて、ｓＡＧＸ００９０と比較して高いβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性をもたらす部位を同定した。
【０２０４】
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）培養を、必要な場合にチミジンを添加したＧＭ１７中で３０℃で１６時間増殖させた。１ｍｌの培養の細胞を洗浄し、１ｍｌの脱鉱物化水に再懸濁した。細胞を、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ溶解マトリックスＢおよびＦａｓｐｒｅｐ−２４装置を用いて６ｍ／秒で４０秒間破壊した。管を遠心分離し、細胞上清の希釈系列を調製した。ＧＵＳ活性は、ｐ−ニトロフェニル基質およびβ−グルクロニダーゼの存在により溶液に黄色をもたらすβ−メルカプトエタノールを加えることにより測定した。ＧＵＳ活性を４０５ｎｍで測定し、対照標準菌株ｓＡＧＸ００９０に対して相対的に表した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２０５】
図３に遺伝子Ｘ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡデュアルシストロン構築物の相対ＧＵＳ活性を示す。ＧＵＳ活性は、ＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ発現カセットを運搬する対照標準菌株ｓＡＧＸ００９０に対して相対的に表し、Ｙ軸上に示す。すべてのデュアルシストロン菌株におけるＧＵＳ活性は、対照標準菌株より高いことが認められた。特に、ｓＡＧＸ０１６８（ｅｎｏＡ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡ）およびｓＡＧＸ０２２２（ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡ）におけるＧＵＳ活性は、それぞれｓＡＧＸ００９０と比較したとき６．８９および２０．９９倍高いことがわかった。
【０２０６】
これらの結果は、バイシストロン性発現が様々な状況にわたってタンパク質発現レベルの増大をもたらすことを明確に確認するものである。
【実施例３】
【０２０７】
ヒトプロインスリンのバイシストロン性発現
プロインスリンの分泌を得るためにｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳ）をヒトプロインスリン（ｉｎｓ）に融合させた（ＳＳ：：ｉｎｓ）。［ＳＳ：：ｉｎｓ］発現カセットを、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体にｔｈｙＡ遺伝子座において組み込み、ＰｔｈｙＡから直接発現させた（ｓＡＧＸ０１２１）か、またはＳＳ：：ｉｎｓに先行するｒｐｍＤ遺伝子間領域とともにｕｓｐ４５（ｓＡＧＸ０１２１）もしくはｅｎｏＡ（ｓＡＧＸ０１６４）から下流の第２のシストロンとして挿入した（図４ａ）。インスリン分泌能力をＥＬＩＳＡにより定量して、ｔｈｙＡ遺伝子座におけるＰｔｈｙＡ促進発現と比較してカーゴ（cargo）のバイシストロン性発現を評価した。
【０２０８】
ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳ：：ｉｎｓ組込みプラスミドを構築する試みは、失敗した。
【０２０９】
菌株を単一コロニーから必要な場合に２００μＭチミジンを添加した２ｍｌのＧＭ１７中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。プロインスリン分泌の定量のために、これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＡＭ９培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＡＭ９は、Ｍ９塩、０．５％アミノプラスマル、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。培養上清中の分泌ヒトプロインスリンの量をＭｅｒｃｏｄｉａにより提供されたＥＬＩＳＡにより定量した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２１０】
図４ｂにラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株ｓＡＧＸ０１２２、ｓＡＧＸ０１２１およびｓＡＧＸ０１６４により分泌されたヒトプロインスリンの定量を示す。分泌されたプロインスリンの量をｎｇ／ｍｌとして表し、Ｙ軸上に示した。図からバイシストロン性発現カセットを含む菌株が対照標準菌株より有意に高いカーゴ発現を有することが明瞭にわかる。特に、インスリン分泌は、ＳＳ：：ｉｎｓをｒｐｍＤを介してｅｎｏＡに結合させた場合に最も高かった。
【実施例４】
【０２１１】
ｃＡ２  Ｆａｂのバイシストロン性発現
ｃＡ２抗ｈＴＮＦ  Ｆａｂの重鎖および軽鎖を用いて、デュアルシストロン発現構築物を作製した。すべての発現ユニットは、ｔｈｙＡプロモーターにより促進され、プラスミド上に位置する。軽鎖ＶＬＣＬ（Ｌ）および重鎖のＦａｂ断片ＶＨＣＨ１（Ｈ）のすべての運搬遺伝子は、ｃＡ２インフリキシマブモノクローナル抗体に由来していた。Ｌ＞＞ＨおよびＨ＞＞Ｌ配置をｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥまたはｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域により結合させる。すべての構築物は、プラスミド由来である。
【０２１２】
図５で重鎖および軽鎖の両方がデュアルシストロン構築物により高度に発現し、これが高レベルの機能性ｃＡ２抗ＴＮＦ  Ｆａｂにつながったことがわかる。図５でさらに重鎖を軽鎖の前に配置した場合に、遺伝子間領域にかかわりなく、ｃＡ２抗ＴＮＦの発現が増大したことがわかる。
【０２１３】
抗ｈＴＮＦ分泌の定量のために、菌株を単一コロニーから２ｍｌのＧＭ１７中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＡＭ９培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＡＭ９は、Ｍ９塩、０．５％アミノプラスマル、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、抗ＴＮＦ活性の存在について分析した。これは、捕捉タンパク質としてヒトＴＮＦを用いて直接ＥＬＩＳＡにより行った。ＶＬＣＬ部分は、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗血清により検出され、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗血清により明らかにされた。ホスファターゼ活性は、比色分析により測定し、ＯＤ４０２として読み取った。すべての菌株を並行して処理した。
【実施例５】
【０２１４】
ＣＤＰ８７０のバイシストロン性発現
ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂの重鎖および軽鎖を用いて、デュアルシストロン発現構築物を作製した。すべての発現ユニットは、細菌染色体上に位置している。
【０２１５】
図６ａ：配列（ＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＬＣＬおよびＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＨＣＨ１）をコードするｕｓｐ４５分泌リーダーとのＣＤＰ８７０軽および重鎖Ｆａｂ融合体を、ｕｓｐ４５から下流に第２および第３のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０２１９、ｓＡＧＸ０２２０）。ｓＡＧＸ０２１９およびｓＡＧＸ０２２０において、ｒｐｍＤを用いてＳＳ：：ＣＤ８７０遺伝子をｕｓｐ４５に結合させた。遺伝的不安定性を避けるために、軽および重鎖遺伝子をｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域を介して結合させた。ｓＡＧＸ０２１９では、軽鎖遺伝子が重鎖遺伝子に先行するのに対して、ｓＡＧＸ０２２０では、重鎖遺伝子が軽鎖遺伝子に先行する。
【０２１６】
抗ｈＴＮＦ分泌の定量のために、菌株を単一コロニーから２ｍｌのＧＭ１７中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＡＭ９培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＡＭ９は、Ｍ９塩、０．５％アミノプラスマル、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、抗ＴＮＦ活性の存在について分析した。これは、レミケード（Remicade）を対照標準として、補足タンパク質としてヒトＴＮＦを用いて直接ＥＬＩＳＡにより行った。ＶＬＣＬ部分は、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗血清により検出され、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗血清により示された。ホスファターゼ活性は、比色分析により測定し、ＯＤ４０２として読み取った。すべての菌株を並行して処理した。
【０２１７】
図６ｂで重鎖および軽鎖の両方がデュアルシストロン構築物により高度に発現し、これが高レベルの機能性ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂにつながったことがわかる。図６ｂでさらに重鎖を軽鎖の前に配置した場合に、ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦの発現が実質的に増大したことがわかる。
【実施例６】
【０２１８】
ヒトトレフォイル因子１（ｈＴＦＦ１）のバイシストロン性発現
ｈＴＦＦ１に融合したｕｓｐ４５分泌リーダーコーディング配列（ＳＳ：：ｈＴＦＦ１）を用いて発現構築物を作製した。すべての発現ユニットは、細菌染色体上に位置している。ＰｈｌｌＡより強いプロモーターを用いてモノシストロン性ｈＴＦＦ１発現のための組込みプラスミドを構築することは、可能でなかった。
【０２１９】
図７ａ：ｈＴＦＦ１の分泌を得るためにｕｓｐ４５分泌リーダーコーディング配列（ＳＳ）をｈＴＦＦ１に融合させた（ＳＳ：：ｈＴＦＦ１）。ＳＳ：：ｈＴＦＦ１発現カセットを、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３染色体にｔｈｙＡ遺伝子座において組み込み、ＰｈｌｌＡから直接発現させた（ｓＡＧＸ００８５）か、またはＳＳ：：ｈＴＦＦ１に先行するｒｐｍＤ遺伝子間領域とともにｇａｐＢから下流の第２のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０２７６）。
【０２２０】
図７ｂ：ＴｈｙＡ遺伝子座におけるＰｈｌｌＡ促進発現と比較したカーゴのバイシストロン性発現を評価するために、ｈＴＦＦ１分泌能力をＥＬＩＳＡにより定量した。
【０２２１】
ｈＴＦＦ１分泌の定量のために、菌株を単一コロニーから２ｍｌのＧＭ１７中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＡＭ９培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＡＭ９は、Ｍ９塩、０．５％アミノプラスマル、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。この段階で、すべての培養のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、精製ｈＴＦＦ１を対照標準として用いてＥＬＩＳＡにより分析した。分泌ｈＴＦＦ１の量をｎｇ／ｍｌおよびｎｇ／１０９ＣＦＵとして表した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２２２】
図７ｂにバイシストロン性発現カセットを含む菌株（ｓＡＧＸ０２７６）が対照標準菌株（ｓＡＧＸ００８５）より有意に高いカーゴ発現を有することが示されている。分泌ｈＴＦＦ１発現の量は、ｈＴＦＦ１をｒｐｍＤを介してｇａｐＢに結合させた場合、実質的に増大した（ｍｌ当たり＞５倍；ＣＦＵ当たり＞１２倍）。
【実施例７】
【０２２３】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ゲノムからの遺伝子間領域の選択
図８に示すように、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株ＬＭＧ１５７０９（Enterococcus faecium [Orla-Jensen 1919] Schleifer and Kilpper-Balz 1984 VP; LMG15709; ATCC6057; DSM2146; NCIMB8842）の対数末期培養の細胞タンパク質をタンパク質ゲル上でクーマシーブルー染色により視覚化した。レーンＡ、ＢおよびＣは、それぞれエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ＬＭＧ１５７０９の２８４μｌ、１４２μｌおよび５６．８μｌの対数末期培養の溶解細胞相当物の細胞タンパク質を含んでいた。レーンＣからの１２の明確なタンパク質バンドをゲルから単離した。タンパク質を単離し、遺伝子間領域を以下により同定した。
１）部分的ペプチド配列決定（ＮＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）ならびにペプチドの質量および配列の複合情報を用いたデータベース検索による断片における多量に発現したタンパク質の同定
２）オペロンに存在する多量に発現したタンパク質（１）をコードする遺伝子のエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ＰＣ４．１の染色体配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｎｋから検索、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＤＭＭ０１００００００）を用いた同定、ただし、「第１の遺伝子」としてでない
３）これらの多量に発現した遺伝子に先行する遺伝子間領域の同定（表５）
【０２２４】
表５にエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ＬＭＧ１５７０９における同定された遺伝子間領域を示す。下線を引いた配列は、リボソーム結合部位である。
【０２２５】
【表５】
2014518062.tif 000009
【実施例８】
【０２２６】
バイシストロン性発現のためのエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ゲノムにおける部位の選択
表６に高レベル発現を推進するものとして実施例７で同定された高度に発現したエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）遺伝子を示す。これらの遺伝子を促進するプロモーターは、外因性遺伝子のポリシストロン性発現のための標的部位として用いることができる。これらの内因性遺伝子はさらに、下流外因性遺伝子に遺伝子間領域を介して転写可能または翻訳可能に結合されたポリシストロン性発現モジュールにおける第１の遺伝子として用いることができる。
【０２２７】
【表６−１】
2014518062.tif 000010
【表６−２】
2014518062.tif 000011
【０２２８】
そのような方法で、大腸菌（E. coli）からのβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）遺伝子をリポーター遺伝子としてエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ＬＭＧ１５７０９に導入した。ｕｉｄＡ遺伝子産物β−グルクロニダーゼは、組織化学的および分光光度測定基質として市販されている様々なβ−グルクロニドの開裂を触媒する。図９に示すように、デュアルシストロン構築物は、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ＬＭＧ１５７０９染色体におけるいくつかの内因性遺伝子（この実施例では遺伝子Ｘ、ｇａｐおよびｅｎｏ；図９）の３’末端にｕｉｄＡを挿入することにより作製した。これによって、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｒｐｍＤを表６からの対象の内因性遺伝子とｕｉｄＡとの間の遺伝子間領域として用いて、最高のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性をもたらす部位を同定した（図１０）。
【０２２９】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）培養を、チミジンを添加したＧＭ１７中で３０℃で１６時間増殖させた。１ｍｌの培養の細胞を洗浄し、１ｍｌの脱鉱物化水に再懸濁した。細胞を、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ溶解マトリックスＢおよびＦａｓｐｒｅｐ−２４装置を用いて６ｍ／秒で４０秒間破壊した。管を遠心分離し、細胞上清の希釈系列を調製した。ＧＵＳ活性は、ｐ−ニトロフェニル基質およびβ−グルクロニダーゼの存在により溶液に黄色をもたらすβ−メルカプトエタノールを加えることにより測定した。ＧＵＳ活性を４０５ｎｍで測定し、対照標準ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株ｓＡＧＸ００９０に対して相対的に表した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２３０】
図１０に遺伝子Ｘ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡデュアルシストロン構築物の相対ＧＵＳ活性を示す。ＧＵＳ活性は、ＰｈｌｌＡ＞＞ｕｉｄＡ発現カセットを運搬する対照標準菌株ｓＡＧＸ００９０に対して相対的に表し、Ｙ軸上に示す。すべてのデュアルシストロン菌株におけるＧＵＳ活性は、対照標準菌株より高いことが認められた。
【０２３１】
特に、ｓＡＧＸ０２７０（ｇａｐ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡ）およびｓＡＧＸ０２７１（ｅｎｏ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｉｄＡ）におけるＧＵＳ活性は、それぞれｓＡＧＸ００９０と比較したとき３０．６および２６．９倍高いことがわかった。
【０２３２】
これらの結果は、バイシストロン性発現が様々な状況にわたってタンパク質発現レベルの増大をもたらすことを明確に確認するものである。
【実施例９】
【０２３３】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）によるヒトインターロイキン１０（ｈＩＬ１０）のバイシストロン性発現
ｈＩＬ１０の分泌を得るために、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）のｕｓｐ４５分泌リーダーのＤＮＡコーディング配列（ＳＳ）を成熟ｈＩＬ１０のＤＮＡ配列にフレームで融合させた。［ＳＳ：：ｈＩＬ１０］発現カセットをＳＳ：：ｈＩＬ１０に先行するエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｒｐｍＤ遺伝子間領域とともに、ｇａｐから下流の第２のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０２７９；図１１ａ）。ｈＩＬ１０分泌能力をＥＬＩＳＡにより定量して、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）におけるカーゴのバイシストロン性発現を評価した。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｓＡＧＸ０２７０を陰性対照とした。
【０２３４】
菌株を単一コロニーから必要な場合に２００μＭチミジンを添加した１０ｍｌのＧＭ１７（ＧＭ１７Ｔ）中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。ｈＩＬ１０分泌の定量のために、これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７Ｔ培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＡＭ９Ｔ培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＡＭ９Ｔは、Ｍ９塩、０．５％アミノプラスマル、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。培養上清中の分泌ヒトｈＩＬ１０の量をサンドイッチｈＩＬ１０  ＥＬＩＳＡにより定量した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２３５】
図１１ｂにエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株ｓＡＧＸ０２７０およびｓＡＧＸ０２７９により分泌されたヒトｈＩＬ１０の定量を示す。分泌されたｈＩＬ１０の量を３時間におけるｎｇ／１０９ＣＦＵとして表し、Ｙ軸上に示す。図からバイシストロン性発現カセットを含むエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株がかなりの量のカーゴタンパク質ｈＩＬ１０を分泌することができることが明瞭にわかる。
【実施例１０】
【０２３６】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）によるヒトインターロイキン２７（ｈＩＬ２７）のバイシストロン性発現
ｈＩＬ２７の分泌を得るために、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）のｕｓｐ４５分泌リーダーのＤＮＡコーディング配列（ＳＳ）を成熟ｈＩＬ２７のＤＮＡ配列にフレームで融合させた。［ＳＳ：：ｈＩＬ２７］発現カセットをＳＳ：：ｈＩＬ２７に先行するエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｒｐｍＤ遺伝子間領域とともに、ｇａｐから下流の第２のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０３１７；図１２ａ）。ｈＩＬ２７分泌能力をＥＬＩＳＡにより定量して、ｈＩＬ２７のバイシストロン性発現を評価した。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｓＡＧＸ０２７０を陰性対照とした。
【０２３７】
菌株を単一コロニーから２００μＭチミジンを添加した１０ｍｌのＧＭ１７（ＧＭ１７Ｔ）中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。ｈＩＬ２７分泌の定量のために、これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７Ｔ培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＭ９Ｔ培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＭ９Ｔは、Ｍ９塩、０．５％カジトン、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。培養上清中の分泌ヒトｈＩＬ２７の量をサンドイッチｈＩＬ２７  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により定量した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２３８】
図１２ｂにエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株ｓＡＧＸ０２７０およびｓＡＧＸ０３１７により分泌されたヒトｈＩＬ２７の定量を示す。分泌されたｈＩＬ２７の量を３時間におけるｎｇ／１０９ＣＦＵ細胞として表し、Ｙ軸上に示す。図からエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｇａｐ遺伝子の下流に位置したバイシストロン性発現カセットを含むエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）株ｓＡＧＸ０３１７がかなりの量の外因性タンパク質ｈＩＬ２７を効率的に分泌することができることが明瞭にわかる。
【実施例１１】
【０２３９】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）によるＣＤＰ８７０Ｆａｂのバイシストロン性発現
ＣＤＰ８７０Ｆａｂの重鎖および軽鎖遺伝子を用いてデュアルシストロン発現構築物を作製した。すべての発現ユニットは、細菌染色体上に位置している。
【０２４０】
図１３ａ：配列［ＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＨＣＨ１］および［ＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＬＣＬ）をコードするラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３  ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳ）とのＣＤＰ８７０重および軽鎖Ｆａｂ融合体を、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ＬＭＧ１５７０９  ｇａｐ遺伝子から下流に第２および第３のシストロンとして挿入した（ｓＡＧＸ０２７８）。ｓＡＧＸ０２７８において、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｒｐｍＤの遺伝子間領域を用いてＳＳ：：ＣＤ８７０発現カセットをｇａｐに結合させた。遺伝的不安定性を避けるために、重および軽鎖遺伝子をラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ｒｐｍＤに先行する遺伝子間領域を介して結合させ、異なるコドン使用頻度を２つのＳＳ：：ＣＤ８７０発現カセットのｕｓｐ４５分泌シグナルに用いた。重鎖発現カセットがｓＡＧＸ０２７８における軽鎖発現カセットに先行する。
【０２４１】
ＣＤＰ８７０ｆａｂ分泌の定量のために、菌株を単一コロニーから１０ｍｌのＧＭ１７Ｔ中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を５ｍｌの新鮮ＧＭ１７Ｔ培地で１／２５に希釈し、３０℃で４時間増殖させた。細胞を、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、等量のＢＡＭ９Ｔ培地に再懸濁し、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＡＭ９Ｔは、Ｍ９塩、０．５％アミノプラスマル、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２００μＭチミジンを含む。細胞および培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、ＴＮＦ結合活性の存在について分析した。これは、ヒトＴＮＦを捕捉タンパク質として用い、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）（ＰＥＧに連結したＣＤＰ８７０ｆａｂ）を対照標準として直接ＥＬＩＳＡにより行った。ＣＤＰ８７０ｆａｂは、ヤギ抗ヒトＦａｂ抗血清により検出し、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗血清により示した。ＨＲＰ活性をＴＭＢ基質により視覚化した。反応は、３０分後にＨＣｌを加えることにより停止させた。吸光度は、５９５ｎｍを参照波長として４５０ｎｍで測定した。すべての菌株を並行して処理した。
【０２４２】
図１３ｂから重鎖および軽鎖がエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）における多シストロン構築物により発現し、機能性ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂの分泌につながったことがわかる。
【実施例１２】
【０２４３】
抗ｈＴＮＦ産生Ｌ．ラクティス（L. lactis）細菌（本発明による）がＡ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスにおけるｈＴＮＦ誘発性腸損傷を防御する
組織特異的Ａ２０欠損マウスの作製
ｔｎｆａｉｐ３遺伝子のエクソンＩＶおよびＶが２つのＬｏｘＰ部位により隣接されている、条件付きＡ２０／ｔｎｆａｉｐ３ノックアウトマウスを記載されたように作製した（Piguetら、1999年、Lab Invest、79巻、495〜500頁）。Ａ２０フロックスマウスをＶｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配して、ＩＥＣ特異的Ａ２０ノックアウトマウス（Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯ）を作製した（Madisonら、2002年、J Biol Chem、277巻、33275〜33283頁）。実験は、少なくとも４世代にわたってＣ５７ＢＬ／６遺伝的バックグラウンドに戻し交配されたマウスにおいて実施した。
【０２４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏＴＮＦ毒性
マウスに各種用量のｈＴＮＦ（５０、１０、８、６、４および２μｇ  ｈＴＮＦ／２０ｇ体重）をｉ．ｐ．注射した。大腸菌（E. coli）由来組換えｈＴＮＦは、６．８×１０７ＩＵ／ｍｇの比活性を有していた。ヒトＴＮＦは、我々の研究室で産生させ、均一になるまで精製したところ、エンドトキシンレベルは、１ｎｇ／ｍｇのタンパク質を超えなかった。Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスにおけるｈＴＮＦ注射により、腸損傷を示すいくつかの病理学的および免疫学的変化が誘発される。低用量のｈＴＮＦは、高度な全身性の影響および致死性をもたらさないが、血清および小腸のホモジネートの両方において測定することができる炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン発現を誘導する。マウスは、組織学的分析のために４または５時間後に安楽死させた。治療試験のために、Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスにｈＴＮＦ（２μｇおよび６μｇ  ｈＴＮＦ／２０ｇ体重）の腹腔内注射の前に抗ＴＮＦ産生Ｌ．ラクティス（L. lactis）細菌（本発明による）を経口強制投与により５回投与した（３０分間隔で５×１０１０ＣＦＵ）。対照群は親Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ＭＧ１３６３または細菌培地ＢＭ９Ｔ（媒体）で処置した。さらに、陽性対照群をレミケード（３０ｍｇ／ｋｇ）の単回注射により処置した。体温を毎時モニターした。
【０２４５】
組織試料の調製
新たに単離した結腸および回腸セグメントをＰＢＳでフラッシュして、糞内容物を除去し、その後ホルマリン（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％ホルムアルデヒド）でフラッシュし、１０倍過剰のホルマリン中で４℃で一夜のインキュベーションにより固定した。ホルマリンを除去し、標準的な方法でパラフィンワックスに包埋する前に腸をＰＢＳで２回洗浄した。
【０２４６】
組織学
４μｍの組織切片を切りだし、標準的な技法を用いてヘマトキシリン／エオシンで染色した。複合アルシアンブルー（ＡＢ）およびＰＡＳ染色のために、脱ろう切片を蒸留水に水和し、アルシアンブルー中で２０分間インキュベートした。その後、切片を１％過ヨウ素酸中で１０分間インキュベートした後、シッフ試薬中で１０分間インキュベートした。核をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで３０秒間対比染色した。アルカリホスファターゼの検出は、暗所でＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液中での脱ろうおよび水和組織切片のインキュべーションにより実施した（７０μｌ  ＮＢＴ＋７０μｌ  ＢＣＩＰ＋４８６０μｌ緩衝液Ａ、ＮＢＴ＝７０％ジメチルホルムアミド中１．５％塩化ニトロブルーテトラゾリウム溶液、ＢＣＩＰ＝１００％ジメチルホルムアミド中１％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ、緩衝液Ａ＝０．１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）。免疫化学のために、切片を脱ろうし、Ｄａｋｏ抗原性賦活化溶液中でインキュベートし、Ｐｉｃｋ細胞クッキングユニット（cell cooking unit）中で２０分間煮沸し、２．５時間にわたって冷却した。スライド標本をペルオキシダーゼブロッキング緩衝液（０．０４０Ｍクエン酸、０．１２１Ｍリン酸水素二ナトリウム、０．０３０Ｍアジ化ナトリウム、１．５％過酸化水素）中に室温で１５分間にわたり浸漬することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン）を室温で３０分間スライド標本に加えた。一次抗体（ウサギ抗リゾチーム；１：１，７５０希釈−Ｄａｋｏ；ウサギ抗ムチン２；１：５００  ２２）をブロッキング緩衝液に加え、組織切片を一夜インキュベートした。二次抗体（ポリマー西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）を室温で３０分にわたって加えた。ジアミノブテン酸（ＤＡＢ）基質を室温で１０分間加えることによってペルオキシダーゼを検出し、核をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで２分間対比染色した。パネート（Paneth）細胞顆粒の半径の顕微鏡による測定は、Ｌｅｉｃａ  Ｉｍａｇｅ  ｍａｎａｇｅｒ  ５００ソフトウエアを用いて行った。
【０２４７】
サイトカインの定量
血清および組織ホモジネート中のサイトカインおよびケモカインをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏおよびＣＢＡソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を搭載したＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒサイトメーターでＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（ＣＢＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量した。
【０２４８】
定量的実時間ＰＣＲ
長さ５ｃｍの回腸セグメントを新たに単離し、ＰＢＳでフラッシュして、糞内容物を除去した。一端を結紮し、セグメントにＲＮＡ溶解緩衝液（Ａｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を満たし、氷上で５分間インキュベートした。Ａｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＲＮＡを溶解物溶液から精製した。ｃＤＮＡ合成は、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）上でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）および特異的プライマーを用いて、１０μｌの総容積で、１０ｎｇのｃＤＮＡを定量的ＰＣＲに用いた。実時間ＰＣＲ反応を３連で実施した。次のマウス特異プライマーを用いた：ユビキチンフォワード、５’−ＡＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＡＣＧＴＡ−３’（配列番号１４）；ユビキチンリバース、５’−ＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号１５）。リゾチームＰフォワード、５’−ＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＡＡＣＡＡＴＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１６）；リゾチームＰリバース、５’−ＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号１７）；クリプチジン１フォワード、５’−ＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１８）；クリプチジン１リバース、５’−ＴＧＧＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１９）。
【０２４９】
統計解析
結果は、平均値±ＳＥＭとして表す。実験群間の統計的有意性は、対応のない２標本Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて評価した。
【０２５０】
Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスにおけるｈＴＮＦ誘発性病理学的および免疫学的変化を防御する抗ｈＴＮＦ産生Ｌ．ラクティス（L. lactis）細菌の特徴付け
２μｇのｈＴＮＦを注射した両対照群は、抗ｈＴＮＦ産生Ｌ．ラクティス（L. lactis）細菌で処置したＡ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスと比較して大幅な体温の低下を示した（図１４ａ、左パネル）。２μｇのｈＴＮＦで処置したマウスで認められたｓＡＧＸ０２２０投与の防御効果は、マウスにより高い濃度のｈＴＮＦ（６μｇ）を注射した場合にもはや認めることができなかったが、レミケードでの処置は、防御効果を明らかに示した（図１４ａ、右パネル）。ｓＡＧＸ０２２０の前投与は、媒体処置マウスと比較して、２μｇのｈＴＮＦで処置したマウスの回腸および結腸ホモジネート中ならびに血清中のＭＣＰ−１、ＫＣおよびＩＬ−６レベルを有意に低下させた（図１４ｂ、ｃ）。しかし、親Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ＭＧ１３６３で処置したマウスにおいて同等の低下があり、細菌自体の投与が既にプロバイオティック防御効果を有し得ることがわかる。６μｇのｈＴＮＦをチャレンジ投与したマウスは、ｓＡＧＸ０２２０の前投与により、レミケードの投与と同程度に、血清および組織サイトカインおよびケモカインレベルの同様な低下を示した（図１４ｄ、ｅ）。しかし、この状況において、親ＭＧ１３６３株の防御効果は、大部分失われている（図１４ｄ、ｅ）。
【実施例１３】
【０２５１】
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）により局所的に産生され、分泌された毒素中和抗体によるクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）関連疾患に対する受動免疫
ａ）Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）毒素ＡおよびＣ．ディフィシレ（C. difficile）毒素Ｂ中和ｍＡｂのＶＬＣＬおよびＶＨＣＨ１の遺伝子合成
常用の方法（Stemmerら、Gene、1995年、164巻(1号)、49〜53頁）に従ってＶＨおよびＶＬアミノ酸配列情報に基づいて、デノボ遺伝子合成（Ｌ．ラクティス（L. lactis）コドン使用頻度について最適化）を行う。この方法は、コーディング鎖のすべてのオリゴヌクレオチドが、非コーディング鎖における２つの連続オリゴヌクレオチドのそれぞれ最後および最初の２０塩基対と１００％相補的である（逆もまた同様）ように、全コーディングならびに非コーディング鎖にわたる合成４０量体オリゴヌクレオチドを利用する。
【０２５２】
Ｌ．ラクティス（L. lactis）未確認分泌（unidentified secreted）４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）の分泌リーダーをコードする遺伝情報をＶＬＣＬおよびＶＨＣＨ１遺伝子の５’末端に加える。
【０２５３】
共役発現を保証するために、これらの合成ＶＬＣＬおよびＶＨＣＨ１遺伝子をタンデムに配置し、ｒｐｍＤ遺伝子間領域により結合させる。これが、機能性ＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１オペロンの形成をもたらす。Ｃ末端ＥおよびＦＬＡＧペプチドタグもコードする上述の合成遺伝子の変異体も構築する。これは、全サイズおよび／または潜在的分解産物を視覚化し、軽鎖および重鎖アセンブリならびに毒素の結合の確認を可能にする。
【０２５４】
得られた遺伝子構築物は、配列を確認する。
【０２５５】
ｂ）毒素Ａ／Ｂ中和Ｆａｂを分泌するＬ．ラクティス（L. lactis）株の構築：Ｕｓｐ４５遺伝子座における組込み
この課題は、以下の段階からなる。
１．以下のｕｓｐ４５遺伝子座の下流の組込みのための組込みベクターの構築
・  Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）毒素Ａ中和ＭａｂのＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１
・  Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）毒素Ｂ中和ＭａｂのＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１
・  上述のものの３’ＥおよびＦＬＡＧ標識変異体
合成ＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１オペロンは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）ｕｓｐ４５遺伝子の３’末端の１ｋｂとそれに続くｒｐｌＮ遺伝子間領域によって５’末端において隣接されている。ＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１オペロンは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）ｕｓｐ４５遺伝子の３’下流フランキング領域の１ｋｂ断片によって３’末端において隣接されている。構築物は、オーバーラップＰＣＲ  ＤＮＡアニーリングにより作製される。得られたプラスミドは、配列が確認されている。
【０２５６】
２．上述の作製された組込みプラスミドは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３のｕｓｐ４５遺伝子への翻訳可能な結合による組込みのために用いられる。組込みは、５’および３’フランキング領域（ｕｓｐ４５の３’末端に隣接する１ｋｂ領域に対応する）の両方における二重相同的組換えによって行われ、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により確認される。
【０２５７】
ｃ）毒素Ａ／Ｂ中和Ｆａｂを分泌するＬ．ラクティス（L. lactis）株の構築：ｅｎｏＡ遺伝子座における組込み
この課題は、以下の段階からなる。
１．以下のｅｎｏＡ遺伝子座の下流の組込みのための組込みベクターの構築
・    Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）毒素Ａ中和ＭａｂのＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１
・  Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）毒素Ｂ中和ＭａｂのＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１
・  上述のものの３’ＥおよびＦＬＡＧ標識変異体
課題７からの合成ＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１オペロンは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）ｅｎｏＡ遺伝子の３’末端の１ｋｂとそれに続くｒｐｌＮ遺伝子間領域によって５’末端において隣接されている。ＶＬＣＬ＞＞ＶＨＣＨ１オペロンは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）ｅｎｏＡ遺伝子の３’下流フランキング領域の１ｋｂ断片によって３’末端において隣接されている。構築物は、オーバーラップＰＣＲ  ＤＮＡアニーリングにより作製される。得られたプラスミドは、配列が確認されている。
【０２５８】
２．上述の作製された組込みプラスミドは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）ＭＧ１３６３のｅｎｏＡ遺伝子への翻訳可能な結合による組込みのために用いられる。組込みは、５’および３’フランキング領域（ｅｎｏＡの３’末端に隣接する１ｋｂ領域に対応する）の両方における二重相同的組換えによって行われ、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により確認される。
【０２５９】
ｄ）ＣＤＡＤのＴｏｐＡｃｔ（商標）適合性ハムスターモデルの確立
ＣＤＡＤのハムスターモデルは、毒素誘発性抗生物質関連下痢および大腸炎の研究のための十分に確立されたモデルである。ハムスターにおけるＣ．ディフィシレ（C. difficile）感染症の最も広範に研究されたモデルは、一次チャレンジモデルである。手短かに述べると、ハムスターの結腸における正常細菌叢を破壊するためのＣ．ディフィシレ（C. difficile）胞子の投与の２４時間前に、ハムスターにクリンダマイシン（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）を経口胃内経路により（orogastrically）前投与する。Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）胞子（例えば、株６３０またはＢ１の１００個の胞子；Gouldingら、Infect Immun、2009年、77巻(12号)、5478〜5485頁）を経口胃内投与し、ハムスターを観察する（ＣＤＡＤ一次チャレンジモデル）。一般的に、ハムスターの１００％が、胞子の投与後３６時間から７２時間までの間に疾患のために死亡する。死亡の前には、疾患の症状は、下痢および体重減少を含む。一般的に、症状は、ヒトに見られるものよりもはるかに重症であるが、ハムスターモデルは、バンコマイシンによる治療などの臨床的疾患に用いられる治療戦略に反応する。したがって、ＣＤＡＤの研究に広く用いられている。
【０２６０】
ＣＤＡＤ再発コントロールをシミュレートするために、修正された一次疾患ハムスターモデルを用いる。バンコマイシンは、ヒトにおけるのと同様に、ハムスターをＣ．ディフィシレ（C. difficile）疾患から保護する。バンコマイシン治療を中止した場合、ハムスターは重度の疾患を再発するが、発病率は異なる。手短かに述べると、ハムスターにクリンダマイシンの単回投与を行い、続いて、１日後にＣ．ディフィシレ（C. difficile）株Ｂ１胞子を経口胃内投与する。バンコマイシン治療は、胞子チャレンジの当日または２４時間後に開始し、その後２〜４日間毎日続ける（ＣＤＡＤ再発モデル）。このプロトコールは、バンコマイシンによる救助の後の再発を保証するためにさらに最適化することができる。
【０２６１】
ハムスターにおける感染の一次および／または再発モデルにおける死亡の予防におけるＬ．ラクティス（L. lactis）により腸に送達された毒素中和Ｆａｂの恩恵を評価するために、Ｌ．ラクティス（L. lactis）の増殖およびＦａｂ産生能力に対するクリンダマイシンおよびバンコマイシンによる影響を実証することは重要である。したがって、Ｆａｂ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）株の生存率および代謝活性を測定するために、以下のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行う。
・  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価：クリンダマイシン／バンコマイシン添加Ｌ．ラクティス（L. lactis）培養からのＦａｂ産生（ＥＬＩＳＡによる）および増殖（平板培養による）を、抗生物質不含有培養および５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を添加した培養と比較する。この濃度では、Ｃｍは、Ｌ．ラクティス（L. lactis）が感受性を示す、タンパク質合成および増殖の公知の阻害剤である。
・  ｉｎ  ｖｉｖｏ評価：ハムスターへの強制経口投与および各種用量のクリンダマイシン／バンコマイシンとの併用投与後のＦａｂ産生（ＥＬＩＳＡによる）および生存率（平板培養による）を小／大腸において測定する。
【０２６２】
これらの評価は、それらの予防および治療効果についてＬ．ラクティス（L. lactis）送達システムの評価に十分に適する、すなわち、Ｌ．ラクティス（L. lactis）の生存率および代謝活性に対する負の影響なしに、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）感染症に対する感受性を示す、（より低い）クリンダマイシン（およびバンコマイシン）濃度および／または抗生物質の異なるカクテルを用いるＣＤＡＤのハムスターモデル（チャレンジおよび再発）をデザインし、適用することを可能にする。
【０２６３】
ｅ）ＣＤＡＤのハムスターモデルのバリデーション
ハムスター一次チャレンジモデルにおいて、シリアンゴールデンハムスター（７０〜８０ｇ）にＣ．ディフィシレ（C. difficile）胞子の投与の３日前から開始して４日間にわたり選択される抗毒素Ａ／Ｂ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）（抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ単独ならびに併用）の各種経口投与（ｑｄ、ｂｉｄもしくはｔｉｄ）を行うか、または１ｍｌの抗毒素Ａ／Ｂ  ｍＡｂ（陽性対照として）を腹腔内投与する。クリンダマイシン（上記で定義した抗生物質の用量または他のカクテル）は、標準的小動物給餌針を用いてＣ．ディフィシレ（C. difficile）胞子チャレンジの２４時間前に経口胃内投与する。動物を病的状態および死亡について観察し、腸組織を組織学的および肉眼的損傷について評価し、腸管内容物および糞中のＣ．ディフィシレ（C. difficile）毒素の産生を測定する。
【０２６４】
ハムスター再発モデルにおいて、シリアンゴールデンハムスター（７０〜８０ｇ）にクリンダマイシン（上で定義した抗生物質の用量または他のカクテル）を経口胃内投与し、２４時間後にＣ．ディフィシレ（C. difficile）Ｂ１胞子を経口胃内経路でチャレンジ投与する。胞子投与時または２４時間後に、バンコマイシン処置（上で定義した用量）を経口胃内経路で開始し、合計２〜４日間にわたって毎日継続した。バンコマイシンの投与後１、２、３、４または５日目に開始して、合計５〜１０日間にわたり選択される抗毒素Ａ／Ｂ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）（抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ単独ならびに併用）の各種経口投与（ｑｄ、ｂｉｄもしくはｔｉｄ）を行うか、または１ｍｌの抗毒素Ａ／Ｂ  ｍＡｂ（陽性対照として、腹腔内）を投与する。動物を病的状態および死亡について観察し、腸組織を組織学的および肉眼的損傷について評価し、腸管内容物および糞中のＣ．ディフィシレ（C. difficile）毒素の産生を測定する。
【０２６５】
本発明によるグラム陽性細菌は、ＣＤＡＤに対する免疫化に効果的に用いることができると結論することができる。特に、本発明によるグラム陽性細菌は、ＣＤＡＤの発生を防ぎ、ＣＤＡＤの再発を予防し、ならびにＣＤＡＤを治療することができる。
【実施例１４】
【０２６６】
再構成用口内洗浄粉末
口内洗浄製剤の製剤原料（ＤＳ）は、本発明による操作された菌株の均一な凍結乾燥粉末であり、凍結防止剤（デキストリン、ソルビトールおよびグルタミン酸ナトリウム）と混合される。
【０２６７】
製剤原料の製造工程は、次の連続するステップを含む：発酵、バイオマス濃縮（ダイアフィルトレーショナー（diafiltrationor）遠心分離）、凍結防止剤を用いた製剤化、適切なトレーへの充填およびバルク凍結乾燥。凍結乾燥ケーキの均質化およびふるい分けは、賦形剤との混合および所望の医薬剤形への充填に適する均一な粉末（製剤原料）を製造するために実施する。
【０２６８】
再構成用の口内洗浄製剤原料（ＤＰ）粉末は、賦形剤としてのマンニトールと混合された凍結乾燥Ｌ．ラクティス（L. lactis）細菌からなり、（圧縮）粉末として提供される。臨床製剤は、口内洗浄剤の形態での経口、局所投与である。この口内洗浄剤懸濁液は、ＤＰの選択される溶液への再構成により調製される。
【０２６９】
再構成用の口内洗浄粉末の製造工程は、以下の一連の連続するステップを含む。
・  バルクＤＳをマンニトールと混合するステップ、
・  ５００ｍｇのＤＰ粉末混合物を５００ｍｇの分散性粉末圧粉体に圧縮するステップ、
・  圧縮粉末をガラスバイアルに充填するステップ、
・  不正開封防止小児用安全ネジ蓋によりバイアルを閉鎖するステップ、および
・  アルミニウム（Ａｌｕ）バッグにバイアルを包装するステップ。
【実施例１５】
【０２７０】
ＣＤＰ８７０のバイシストロン性発現
ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂの重鎖および軽鎖を用いて、デュアルシストロン発現構築物を作製した。すべての発現ユニットが細菌染色体上に位置する。
【０２７１】
図１５Ａ、様々な菌株におけるＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ発現ユニットの概要図：配列（ＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＬＣＬおよびＳＳ：：ＣＤＰ８７０  ＶＨＣＨ１）をコードするｕｓｐ４５分泌リーダーとのＣＤＰ８７０軽および重鎖Ｆａｂ融合体を、ｕｓｐ４５（ｓＡＧＸ０３０９、ｓＡＧＸ０３１９）、ｅｎｏＡ（ｓＡＧＸ０２７５）およびｇａｐＢ（ｓＡＧＸ０３２３、ｓＡＧＸ０３２６）から下流に第２および第３のシストロンとして挿入した。これらの菌株において、ｒｐｍＤを用いてＳＳ：：ＣＤ８７０遺伝子をそれぞれｕｓｐ４５、ｅｎｏＡまたはｇａｐＢに結合させた。遺伝的不安定性を避けるために、軽および重鎖遺伝子をｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域を介して結合させた。図１５ＢおよびＣにおいて、ｓＡＧＸ０３２６の４つの同一のクローン（クローン１〜４）を分析し、報告した。菌株は、実験を通して並行に処理した。
【０２７２】
ＣＤＰ８７０抗ｈＴＮＦ分泌の視覚化および定量のために、菌株を単一コロニーから１０ｍｌのＧＭ１７Ｔ（Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｍ１７、ＢＤ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、＋０．５％グルコース＋２００μＭチミジン）中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。これらの飽和一夜培養からの細菌を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、１０ｍｌの新鮮なＧＭ１７Ｔ培地に再懸濁し、３０℃で２時間増殖させた。細菌および粗培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。すべての菌株からの粗上清を並行して調製し、分析のために菌株ごとに分割した（図１５ＢおよびＣ）。
【０２７３】
５ｍｌの容積の粗培養上清の全タンパク質含量をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に再懸濁した。１ｍｌの粗培養上清の相当物をヤギ抗ヒトＦａｂを一次抗血清として用いてウエスタンブロットにより分析し、ウサギ抗ヤギＡＰおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色により明らかにした（図１５Ｂ；菌株はそれぞれのレーンの右に示す）。
【０２７４】
個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清をｈＴＮＦ結合活性の存在について分析した。これは、Ｃｉｍｚｉａを対照標準とし、ｈＴＮＦを捕捉タンパク質として用いて直接ＥＬＩＳＡにより行った。ＶＬＣＬ部分は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗血清により検出され、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヤギ抗血清により明らかにされた。ＨＲＰ活性は、比色分析により測定した。データを図１５Ｃに示し、菌株を各バーの下に示す。
【０２７５】
図１５（ＢおよびＣ）で重鎖および軽鎖の両方がデュアルシストロン構築物により高度に発現し、これが、高レベルの機能性ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂにつながったことがわかる。図１５（ＢおよびＣ）で重および軽鎖遺伝子をｅｎｏＡから下流に第２および第３のシストロンとして挿入した場合、ｕｓｐ４５の下流の挿入と比べたときＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ発現がわずかに増加したことがわかる。図１５（ＢおよびＣ）でさらに重および軽鎖遺伝子をｇａｐＢから下流に第２および第３のシストロンとして挿入した場合、ｕｓｐ４５またはｅｎｏＡから下流の挿入と比べたときＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ発現が実質的に増加したことがわかる。
【０２７６】
比ｈＴＮＦ中和能力（ＴＮＦ結合タンパク質の量当たりの生物学的活性）の測定のために、菌株を単一コロニーから５ｍｌのＧＭ１７Ｔ中に接種し、３０℃で１６時間増殖させた。これらの飽和一夜培養からの細菌を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、５ｍｌのＢＭ９Ｔ培地に再懸濁し、３０℃で２時間増殖させた。細菌および粗培養上清を３２２０×ｇで１０分間の遠心分離により分離した。個々の菌株を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、分析のために菌株ごとに分割した（図１５ＤおよびＥ）。
【０２７７】
個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清をＴＮＦ結合活性の存在について分析した。これは、Ｃｉｍｚｉａを対照標準とし、ヒトＴＮＦを捕捉タンパク質として用いて直接ＥＬＩＳＡにより行った。ＶＬＣＬ部分は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗血清により検出され、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヤギ抗血清により明らかにされた。ＨＲＰ活性は、比色分析により測定した。すべての菌株は、並行に処理した。データを図１５Ｄに示し、菌株を各バーの下に示す。
【０２７８】
個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清をＴＮＦ中和活性の存在について分析した。これは、ｈＴＮＦ感受性ＷＥＨＩ細胞をヒトＴＮＦとともにインキュベートし、抗ＴＮＦを加えることにより行った。抗ＴＮＦは、ｈＴＮＦを除去し、ＷＥＨＩ細胞を細胞死から保護する。粗上清の１／２希釈系列ならびに対照標準（６３ｎｇ／ｍｌのＣｉｍｚｉａ）をｈＴＮＦに曝した細胞培養に加えた。細胞死に対する影響を確認した。データを図１５Ｅに示し、菌株を各バーの下に示す。
【０２７９】
図１５Ｄで重鎖および軽鎖の両方がデュアルシストロン構築物により高度に発現し、これが、高レベルの機能性ＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ  Ｆａｂにつながったことがわかる。図１５Ｄで重および軽鎖遺伝子をｇａｐＢから下流に第２および第３のシストロンとして挿入した場合、ｕｓｐ４５の下流の挿入と比べたときＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ発現が実質的に増加したことがわかる。
【０２８０】
図１５ＤおよびＥに菌株ｓＡＧＸ０３２３およびｓＡＧＸ０３２６の粗培養上清中のＣＤＰ８７０抗ＴＮＦの比ＴＮＦ中和能力（ＴＮＦ結合タンパク質の量当たりの生物学的活性）がＣｉｍｚｉａのそれと同じであることが示されている。
【実施例１６】
【０２８１】
抗ｈＴＮＦα  Ｆａｂ断片を分泌するＬ．ラクティス（L. lactis）の有効性
実験の構成は、マウスＴＮＦの非存在下で正常に調節されたヒトＴＮＦ発現を有するトランスジェニックマウスであるＴｇ１２７８ＴＮＦｋｏマウスに基づいている（Kefferら、EMBO.J、10巻、4025〜4031頁、1991年）。大腸炎は、１回の皮膚前感作の後の４０％エタノール中４％ＴＮＢＳの直腸投与チャレンジにより誘発された。手短かに述べると、マウスを、背部の剃毛した１．５×１．５ｃｍの皮膚の部位に１容量の５％ＴＮＢＳ＋４容量の４：１アセトン：オリーブ油を適用することによって直腸内チャレンジの７日前（−７日目）に感作した。チャレンジの当日（０日目）に、マウスを最初にケタミン／キシラジンにより麻酔し、その後、直腸内に４ｃｍ挿入した柔軟なカテーテルを介して１００μｌの４％ＴＮＢＳ／４０％ＥｔＯＨを投与した。結腸内の浣腸剤の均等な分布を保証するために、直腸チャレンジ直後の３０秒間マウスを垂直位に保持した。
【０２８２】
治療は、直腸ＴＮＢＳチャレンジの１日前（−１日目）に開始し、さらに４日間（＋３日目）継続した。マウスの３群は、１０１０ＣＦＵのＭＧ１３６３（陰性対照）、１０１０ＣＦＵのｓＡＧＸ０３０９または１０μｇのＣｉｍｚｉａ（陽性対照）の胃内接種を１日１回受けた。０日目に開始して毎日、マウスを体重、病的状態および生存についてモニターした。＋３日目にマウスを屠殺し、結腸試料および血清を組織学検査（結腸）およびサイトカイン（結腸および血清）分析のために採取した。
【０２８３】
本発明の実施形態による菌株（抗ｈＴＮＦ分泌Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０３０９）による治療は、野生型Ｌ．ラクティス（L. lactis）株ＭＧ１３６３と比較して高い生存率（図１６および表７）を、また、驚くべきことに、Ｃｉｍｚｉａで処置したマウスより高い生存率をもたらした。
【０２８４】
【表７】
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【０２８５】
マウスの体重も治療中に追跡し、図１７に示す。図１７から、体重減少は、Ｃｉｍｚｉａによる治療と比較して本発明の実施形態による菌株による治療後に低いことは明らかである。
【０２８６】
結腸の組織学的状態も分析し、組織学的スコアを表８に従って割り当てた。結果を図１８に示す。図１８から、組織学的スコアの有意な改善と、したがって、結腸の病的状態の減少が、本発明の実施形態による菌株による治療後に明らかである。
【０２８７】
【表８】
2014518062.tif 000013
【０２８８】
最後に、図１９から、本発明の実施形態による菌株での処置が結腸における炎症誘発性サイトカインの分泌の抑制をもたらしたことは明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１４−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月26日(2014.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含み、前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が前記グラム陽性細菌に対して内因性のプロモーターによって転写制御され、前記プロモーターがリボソーム遺伝子プロモーターまたは解糖系遺伝子プロモーターである、グラム陽性細菌。
【請求項２】
ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、グラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子、および前記グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子を含み、前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が前記グラム陽性細菌に対して内因性のプロモーターによって転写制御され、前記プロモーターがリボソーム遺伝子プロモーターまたは解糖系遺伝子プロモーターである、組換え核酸。
【請求項３】
前記プロモーターが前記グラム陽性細菌のｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳのプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のグラム陽性細菌または請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記１つまたは複数の外因性遺伝子が前記内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された、請求項１もしくは３のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２もしくは３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記１つまたは複数の外因性遺伝子が前記ポリシストロン性発現ユニットの最も３’側の遺伝子である、請求項４に記載のグラム陽性細菌または請求項４に記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域によって転写可能に結合された、請求項１もしくは３〜５のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜５のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項７】
前記遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、請求項６に記載のグラム陽性細菌または請求項６に記載の組換え核酸。
【請求項８】
前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、請求項６もしくは７のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項６もしくは７のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項９】
前記１つまたは複数の外因性遺伝子が生成産物をコードする、請求項１もしくは３〜８のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項１０】
前記生成産物が対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドである、請求項９に記載のグラム陽性細菌または請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項１１】
前記生成産物が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質、あるいは多量体タンパク質である、請求項９に記載のグラム陽性細菌または請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項１２】
薬剤として使用するための、好ましくは対象への前記生成産物の投与または送達に使用するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項１３】
前記内因性遺伝子が前記グラム陽性細菌における天然の染色体遺伝子座に位置する、請求項１または３〜１２のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことにより、好ましくは前記１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における前記内因性遺伝子の３’に染色体上で組み込むことにより、前記内因性遺伝子が前記１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合された、請求項１３に記載のグラム陽性細菌。
【請求項１５】
グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結され、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域を含み、前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、組換え核酸。
【請求項１６】
前記遺伝子間領域がグラム陽性細菌の内因性の遺伝子間領域である、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項１７】
１つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖（ＶＬ）をコードし、別の外因性遺伝子が前記抗体またはその機能性断片の重鎖（ＶＨ）をコードし、より好ましくは前記機能性断片がＦａｂである、請求項１もしくは３〜１４のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜１２、１５もしくは１６のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項１８】
前記ＶＬまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子が、前記ＶＨまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の３’末端と転写可能に結合された、請求項１７に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
【請求項１９】
前記グラム陽性細菌が、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）もしくはエンテロコッカス属（Enterococcus）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であるか、または前記グラム陽性細菌がビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）である、請求項１、３〜１４、１７もしくは１８のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または請求項２〜１２もしくは１５〜１８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項２０】
請求項１、３〜１４または１７〜１９のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２〜１２または１５〜１９のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
最後に、図１９から、本発明の実施形態による菌株での処置が結腸における炎症誘発性サイトカインの分泌の抑制をもたらしたことは明らかである。
上記の開示によって提供される本願発明の具体例として、以下の発明が挙げられる。
［１］  ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、内因性遺伝子、および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された１つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記１つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も３’側の遺伝子である、グラム陽性細菌。
［２］  ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、グラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子、および前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写可能に結合された、グラム陽性細菌に対して外因性の１つまたは複数の遺伝子を連続して含み、前記１つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も３’側の遺伝子である、組換え核酸。
［３］  前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質または多量体タンパク質など、対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの産物をコードする、［１］に記載のグラム陽性細菌または［２］に記載の組換え核酸。
［４］  １つまたは複数の外因性遺伝子が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはＦａｂなどのその機能性断片、融合タンパク質または多量体タンパク質など、対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの産物をコードする、薬剤として使用するための、好ましくは対象への前記産物の投与または送達に使用するための、［１］に記載のグラム陽性細菌または［２］に記載の組換え核酸。
［５］  前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子がグラム陽性細菌に対して内因性であるプロモーターにより転写制御される、［１］、［３］もしくは［４］のいずれかに記載のグラム陽性細菌または［２］から［４］までのいずれかに記載の組換え核酸。
［６］  前記プロモーターが必須遺伝子プロモーター、構成的プロモーター、中心的代謝遺伝子プロモーターおよび／またはハウスキーピング遺伝子プロモーターである、［５］に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
［７］  前記プロモーターがリボソーム遺伝子プロモーターである、［５］に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
［８］  前記プロモーターが解糖系遺伝子プロモーターである、［５］に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
［９］  前記プロモーターが前記グラム陽性細菌のｅｎｏ、ｕｓｐ４５、ｇａｐ、ｐｙｋ、ｒｐｍＢおよびｒｐｌＳのプロモーターからなる群から選択される、［５］に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
［１０］  前記内因性遺伝子がグラム陽性細菌における天然の染色体遺伝子座に位置する、［１］または［３］〜［９］のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
［１１］  １つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことにより、好ましくは１つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における前記内因性遺伝子の３’に染色体上で組み込むことにより、前記内因性遺伝子が１つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合された、［１０］に記載のグラム陽性細菌。
［１２］  前記内因性遺伝子および前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域によって転写可能に結合されており、好ましくは前記遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、［１］もしくは［３］〜［１１］のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または［２〜［９のいずれかに記載の組換え核酸。
［１３］  前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、［１２］に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
［１４］  好ましくは遺伝子間領域がグラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域である、前記グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結されたグラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域を含む、組換え核酸。
［１５］  前記遺伝子間領域がｒｐｌＷ、ｒｐｌＰ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥおよびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、［１４］に記載の組換え核酸。
［１６］  １つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖（ＶＬ）をコードし、別の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖（ＶＨ）をコードし、より好ましくは機能性断片がＦａｂである、［１］もしくは［３］〜［１３］のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または［２］〜［９］もしくは［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の組換え核酸。
［１７］  前記ＶＬまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子が、前記ＶＨまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の３’末端と転写可能に結合された、［１６］に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
［１８］  前記グラム陽性細菌が、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）もしくはエンテロコッカス属（Enterococcus）、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）であるか、または前記グラム陽性細菌がビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）である、［１］、［３］〜［１３］、［１６］もしくは［１７］のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌または［２］〜［９］もしくは［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の組換え核酸。
［１９］  ［１］、［３］〜［１３］または［１６］〜［１８］のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌を含む医薬組成物。
［２０］  前記１つまたは複数の外因性遺伝子が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、前記産物が対象における治療または予防効果を有する、［１９］に記載の医薬組成物。
［２１］  ［２］〜［９］または［１２］〜［１８］のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むベクター。
【国際調査報告】
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