(57)【要約】ターゲット医用イメージング及び／又はターゲット治療のためのプレターゲット方法、及び関連するキットが記載され、これはお互いに生体直交反応性を示す非生体反応化学基を用いる。本発明は、プレターゲットプローブとエフェクタープローブとの間のカップリングを与える［４＋２］逆電子要求（レトロ）ディールスアルダー化学を使用する。この目的のため、これらのプローブは電子欠乏性テトラジン又は他の好適なジエンと、及び他方で１以上のアキシャル置換基を持つＥ−シクロオクテンを含む。
2014506869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化１】
2014506869.tif 000038
ここでＲの位置はエクアトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６まで、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ）（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＣＲ’ＮＲ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）；からなる群から選択される置換基を表し；Ｒ又はＲａの１つで、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない。
【請求項２】
請求項１に記載のキットであり、式１のジエノフィルが次の要求の少なくとも１つを満たす：
（ａ）Ｘはメチル；
（ｂ）Ｙはメチル：
（ｃ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキル；
（ｄ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリール；
（ｅ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアルキル；
（ｆ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアリール。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載のキットであり、前記ジエンが、下式（２）、（３）、（４）及び（５）の化合物からなる群から選択され：
【化２】
2014506869.tif 000039
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルール、ＣＦ３、ＣＦ２、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’はＨ、アリール又はアルキル）からなる群から選択され；
【化３】
2014506869.tif 000040
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、
水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり：Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化４】
2014506869.tif 000041
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はａｒｕｋｉｒｕ基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化５】
2014506869.tif 000042
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、２、５−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル又はフェニールであって、これらは場合によりＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されていてもよい（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択され；及び、前記ジエンは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへの少なくとも１つのリンケージを含む、キット。
【請求項４】
第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が、請求項３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、請求項１又は２のいずれかに定めたジエノフィルとしての式（１）のジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、プレターゲット試薬。
【請求項５】
検出可能なラベル、好ましくは、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体および生体直交反応性基を含み、前記生体直交反応性基が、請求項３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、請求項１又は２のいずれかに定めた式（１）のジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、イメージングプローブ。
【請求項６】
好ましくは、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される医薬活性化合物と生体直交反応性基を含む治療用プローブであり、前記生体直交反応性基が、請求項３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、請求項１又は２のいずれかで定めた式（１）よるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、治療用プローブ。
【請求項７】
請求項４によるプレターゲット試薬を対処物に投与し、前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１のターゲット部分が第１のターゲットへ結合するための有効な時間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去することを含む、プレターゲット方法。
【請求項８】
請求項７のプレターゲット方法を実施して、請求項５のイメージングプローブを投与することを含むイメージング方法であり、前記プレターゲット試薬および前記イメージングプローブの生体直交反応性基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、イメージング方法。
【請求項９】
対象物のターゲット医療治療の方法であり、請求項７のプレターゲット方法を実施し、次に請求項６の治療用プローブを投与することを含み、前記プレターゲット試薬および前記治療プローブの生体直交反応性基が一緒になって、前記［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の試薬の、請求項７乃至９のいずれか一項に記載の方法での使用。
【請求項１１】
請求項１又は２のいずれか一項に定められる式（１）を満たす化合物の、動物又はヒトのプレターゲット方法での使用。
【請求項１２】
１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテン、好ましくは実施態様１乃至４のいずれかで定められた式（１）を満たす化合物の、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でジエノフィルとしての使用。
【請求項１３】
ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化６】
2014506869.tif 000043
ここで、Ｒの位置はエカトリアルであり、Ｒａのちはアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、ＲおよびＲａは独立してそれぞれ、Ｈ又は最大６の、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓｉ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＳＯ３、ＳＯ４、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’およびＲ’’は独立してＨ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨまアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、Ｒ又はＲａの１つは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない、キット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキットであり、前記ジエンが以下式（２）、（３）、（４）及び（５）に示される化合物：
【化７】
2014506869.tif 000044
ここで、Ｒ１は、アルキル、アルール、Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｏ−、及びＮＨ２からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）−アルキルからなる群から選択され；
【化８】
2014506869.tif 000045
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され：Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯであり：Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化９】
2014506869.tif 000046
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−Ｏアルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化１０】
2014506869.tif 000047
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、フェニール、又はＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されたフェニール（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択される。
【請求項１５】
第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が、請求項１３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、請求項１４で規定された式（１）のジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、プレターゲット試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲット医療用イメージング及び／又は治療のためのプレターゲット方法に関し、お互いに対して生体直交反応性を示す非生物的化学基の使用からなる。本発明はまた、プレターゲットキットに関連し、少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが、第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を含み、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生物直交反応性部を含む。本発明はまた、前記方法及びキットで使用されるプレターゲット試薬に関する。本発明は、特に核イメージング及び放射線治療に関連する。
【背景技術】
【０００２】
医用診断及び治療の多くの分野で、治療薬（医薬）又は診断（イメージング、画像化）試薬を、患者などの対象体の体内の、特定のサイト又は定められた領域に選択的に輸送することが望まれる。
【０００３】
器官又は組織の活性ターゲット化は、前記望ましい活性部（例えば造影剤又は細胞毒性化合物）を、対象となる前記ターゲットサイトで又はその近くで細胞表面に結合するか又は細胞取り込みを促進するターゲット構成物に直接又は間接的に共役させることで達成される。かかる試薬をターゲットするために使用される前記ターゲット部は、通常、細胞表面ターゲット（例えば膜レセプター）、構造タンパク質（例えばアミロイド斑）、又は細胞内ターゲット（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路）への親和性を持つ構成物である。これらの部は、特定の疾患又は不全に蓄積されることが知られている、抗体（断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ類、同様にペプチド、ペプトイド及び有機薬物化合物などであり得る。又は、造影剤／治療薬は、ＤＮＡ、タンパク質及び膜合成及び炭水化物吸収などでの疾患の際にアップレギュレートされる代謝経路をターゲットすることも可能である。これらの疾患組織では、前記マーカーは、疾患細胞を健康組織から識別することができ、早期検出、特異的診断及び（ターゲット）治療のための独自の可能性を提供する。
【０００４】
一般に分子イメージング／治療薬の成功、特に核イメージング／治療薬の成功のための重要な判断基準は、高いターゲット取り込みと、一方で非ターゲット組織及び血流からの迅速な消失（腎及び／又は肝胆蔵系を介して）を示す、ということである。しかしこれはしばしば問題となり：例えば、ヒトでのイメージング研究では、前記主要サイトでの放射性ラベル化抗体の裁断濃度が２４時間以内に達成されるが、前記ラベル化効果の濃度が、イメージングを成功させるために十分低いレベルに減少するまでにさらに数日を必要とする、ことが示されている、
ターゲット組織での遅い又は不十分な蓄積と、非ターゲット領域からの遅い消失というこの問題（特に核イメージング及び治療で）は、プレターゲット方法の適用を導くことになった。
【０００５】
プレターゲットとは、ターゲット方法の１つのステップを意味し、そこでは、第１のターゲット（例えば細胞表面）がプレターゲットプローブで提供される。前記プレターゲットプローブは、第２のターゲットを含み、これは最終的には、第２のターゲット部を持つさらなるプローブ（前記エフェクタープローブ）によりターゲットされることとなる。
【０００６】
従って、プレターゲットでは、プレターゲットプローブが第１のターゲットへ結合される。前記プレターゲットプローブはまた、第２のターゲットを持ち、これは、診断（イメージング）及び／又は治療試薬への前記エフェクタープローブの特異的共役を容易にする。前記プレターゲットプローブを形成する前記構成物が前記ターゲットサイトに局所化されると（例えば２４時間後）、自然消失が不十分である場合にはクリーニング試薬を使用して前記血液から過剰量を除去する。第２のインキュベーションステップで（好ましくは短時間、例えば１から６時間）で、前記エフェクタープローブは、その第２のターゲット部を介してプレターゲットプローブに結合される。前記第２のターゲット（前記プレターゲットプローブ上に存在する）及び前記第２のターゲット部（前記エフェクタープローブ上に存在する）は、高特異性高親和性を持って迅速に結合し、体内で安定化される。
【０００７】
プレターゲット方法の一般的概念は、図１でイメージングについて概説されている。ここで前記エフェクタープローブは、イメージングモダリティのための検出可能なラベルを含むイメージングプローブである。前記エフェクタープローブは、その第２のターゲット基を介して前記（プレ）結合したプレターゲットプローブへ結合する。
【０００８】
第２のターゲット／第２のターゲット部ペアのための共通の例は、ビオチン／ストレプトアビジン又は抗体／抗原システムである。有効であるためには、前記エフェクタープローブは、体内から迅速に排泄（例えば腎臓を介して）されて、非ターゲット蓄積が比較的低く、前記望ましい高腫瘍蓄積を与えることが必要である。従って、これらのプローブは通常は小さい。
【０００９】
核イメージング及び放射線治療では、プレターゲットの概念は、さらに有利となり、前記時間消費性プレターゲットステップが放射性核を用いることなく実施され、一方放射性核を用いる前記第２のターゲットステップはより迅速に実施され得る、からである。後者は、より短寿命の放射性核の使用を可能にし、例えばＳＰＥＣＴ試薬の代わりにＰＥＴ試薬を使用することで患者への放射線暴露を最小化し得る、からである。多配座リガンドシステム（ストレプトアビジン、デンドリマー）とを組合せて、ＭＲＩでプレターゲット方法を用いることで、ターゲットサイトでのシグナルを増幅させることを可能にする。さらに、一般的に、この方法は汎用の造影剤の使用を容易にする。
【００１０】
一般的に、生体内での、特にプレターゲット（ビオチン−ストレプトアビジン、抗体／ハプテン、アンチセンスオリゴヌクレオチド）での高度に選択的な相互作用を実行する構造物は非常に大きい。その結果、第１のターゲット基としてのペプチド及び小有機部分でプレターゲットすることは、代謝イメージング及び細胞内ターゲットイメージング同様に、前記第２ターゲットのサイズが小さい第１の基の使用を的外れとすることから、不十分のままである。
【００１１】
さらに、現在のプレターゲットシステムは、その生物的性質に伴うファクタで妨げられる。ビオチンは内因性の分子であり、その共役は結成酵素ビオチニダーゼで切断され得る。アンチセンスプレターゲットが使用される場合には、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡアーゼ及びＤＮＡアーゼの攻撃対象とされ得る。タンパク質及びペプチドはまた、天然の分解経路の対象とされる。これらの相互作用はさらに、それらの非共有結合性及び動的性質で損なわれ、及びターゲット滞留時間に限定され得る。また、内因性ビオチンは、ストレプトアビジン結合についてビオチン共役と競合する。最後に、ストレプトアビジンは非常に免疫性である。
【００１２】
最近の進展は、前記天然／生体ターゲット構造（即ち、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／ハプテン、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に基づくのみのプレターゲットに関連する欠点を回避することである。
【００１３】
これについての参照は、国際出願公開第２０１０／０５１５３０号であり、プレターゲットが、テトラジンなどの自演及びトランス−シクロオクテノール（ＴＣＯ）などのジエノフィルとの反応に基づき説明されている。
【００１４】
これについてのさらなる参照は、Ｌｉらの「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１０、  ４６（４２）、  ｐ．  ８０４３−８０４５」であり、３−ジアリール−ｓ−テトラジン及び１８Ｆラベル化トランス−シクロオクテンとのディールスアルダー反応に基づく生体共役のための放射性ラベル化方法を記載している。
【００１５】
Ｒｏｓｓらの「Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．、  Ｅｄ  ２０１０、  ４９、  ｐ．  ３３７５−３３７８」は、逆電子要求ディールスアルダー反応を用いることで、腫瘍プレターゲットと関連する。
【００１６】
Ｂｌａｃｋｍａｎらの「  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、  ２００８、  １３０、  ｐ．  １３５１８−１３５１９」は、逆電子要求ディールスアルダー反応に基づく、迅速生体共役が記載されている。
【００１７】
Ｒｏｙｚｅｎらの「Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、  ２００８、  １３０、  ｐ．  ３７６０−３７６１」は、金属錯体により誘導された官能基化トランス−シクロオクテンの光合成に関する。
【００１８】
かかるシステムに基づいて、比較的迅速な反応が得られるけれど、これは前記ビオチン−ストレプトアビジンシステムの反応性とは異なる。
従って、この欠点を回避するために、前記反応の第１の要求、即ち速度を犠牲にする。従って、前記の生体分子に基づかないシステムであり、なお望ましい迅速な反応速度を持つシステムを提供することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際出願公開第２０１０／０５１５３０号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１０、４６（４２）、ｐ．８０４３−８０４５
【非特許文献１】Ｒｏｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．、Ｅｄ  ２０１０、４９、ｐ．３３７５−３３７８
【非特許文献２】Ｂｌａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、２００８、１３０、ｐ．１３５１８−１３５１９
【非特許文献３】Ｒｏｙｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、２００８、１３０、ｐ．３７６０−３７６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、プレターゲットキット、プレターゲット方法及びその使用試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
前記望みに対応するために、本発明は、１つの側面で、ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットを提供し、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【００２３】
【化１】
2014506869.tif 000003
ここでＲの位置はエクアトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６まで、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ）（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＣＲ’ＮＲ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）；からなる群から選択される置換基を表し；Ｒ又はＲａの１つで、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない。
【００２４】
他の側面で、本発明は、プレターゲット方法、同じくそこで使用するプレターゲット試薬、及びこのキットが使用されるターゲット化医用イメージング又は治療を提供する。
【００２５】
さらなる側面で、本発明は、動物又はヒトでのプレターゲット方法の使用のための前記式（１）を満たす化合物である。
【００２６】
さらに他の側面は、本発明は、レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でのジエノフィル反応物として１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテンの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、前記のプレターゲット方法の一般的スキームを示す。
【図２】図２は、（３、６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジン及びＥ−シクロオクテンとの間の［４＋２］ディールスアルダー反応、続いてレトロディールスアルダー反応により生成物とＮ２が形成される反応スキームを示す。前記トランスシクロオクテン誘導体は古典的ディールスアルダー反応でのような電子吸引性基を含まないことから、このタイプのディールスアルダー反応は古典的反応とは区別され、しばしば「逆電子要求ディールスアルダー反応」と参照されている。以下の記載で、両方のステップの順、即ち最初のディールスアルダーシクロ付加（通常逆電子要求ディールスアルダーシクロ付加）及び続くレトロディールスアルダー反応は、短く「レトロディールスアルダー反応」又は「レトロ−ＤＡ」と参照される。
【図３】図３の（ａ）及び（ｂ）は、レトロディールスアルダー化学を用いてプレターゲットのための一般的スキームを示す。
【図４】図４は、ＴＣＯ−変性ｍＡｂ（Ｂ）及び放射性ラベル化テトラジン（Ａ）が関与するレトロ−ＤＡにより、腫瘍プレターゲットのスキームを示す。
【図５】実施例で参照される化合物の合成経路を示す。
【図６】実施例で参照される化合物の合成経路を示す。
【図７】実施例で参照される化合物の合成経路を示す。
【図８】実施例で参照される化合物の合成経路を示す。
【図９】実施例で参照される化合物の合成経路を示す。
【図１０】実施例で参照される化合物の合成経路を示す。
【図１１】図１１は、シクロオクテンの立体化学、以下説明するＥ−マイナー及びＥ−メジャー異性体及びＺ異性体の比較を示す。
【図１２】図１２はテトラジン−ＤＯＴＡプローブ２８を示す。
【図１３】図１３は、３つの異なるシクロオクテンジエノフィルのマウス中でのインビボ安定性を示す。
【図１４】図１４は、生きたマウスのＳＰＥＣＴ／ＣＴ投影像を示す。
【図１５】図１５は、テトラジン２８の別合成手順を示す、これは対応するＧｄ−錯体、２８−Ｇｄ１１１の合成である。
【図１６】図１６は、テトラジンモデルプローブ３５、３８、４０及び４２の合成経路を示す。
【図１７】図１７は新規ＴＣＯの合成経路を示す。
【図１８】図１８は、低濃度のＰＢＳ中でＴＣＯ（２０ａ又は２０ｂ）及び１７７Ｌｕ−テトラジン２８（１当量）添加キャリアとの基準化反応収率を与える。
【図１９】図１９は、血液消失について補正されたＣＣ４９結合ＴＣＯ２０ｂのインビボ安定化を示す。データ点は、平均と１標準偏差（ｎ＝３）を表すエラーバーを表す。
【図２０】図２０は、ＣＣ４９−ＴＣＯ（２０ｂ）構造物の血液曲線を示す。データ点は平均と１標準偏差（ｎ＝３）を表すエラーバーを表す。
【図２１】図２１は、無腫瘍マウスでのＣＣ４９−ＴＣＯ（２０ｂ）の生体内分布を表す。棒グラフは平均と１標準偏差（ｎ＝３）を表すエラーバーを表す。
【図２２】図２２は、無腫瘍マウス（ｎ＝３）での１２５Ｉ−ＣＣ４９及び１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂ（７．５）の血中動態を示す。データは、１グラム当たりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）として、１標準偏差（誤差バー）と共に表される。
【図２３】図２３は、無腫瘍マウス（ｎ＝３）での１２５Ｉ−ＣＣ４９（白棒）及び１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂ（７．５）（黒棒）の生体分布を表す。データは、１グラム当たりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）として、１標準偏差（誤差バー）と共に表される。
【図２４】図２４は、ＣＣ４９へ共役されたＴＣＯ４４ｂのインビボ安定性を示す。データ点は、３回の測定の平均と１標準偏差（誤差バー）と共に示され、これは２次多項式でフィッティング（Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ．  ５．０１）されている。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明で使用される歪シクロオクテンジエノフィルは以下Ｅ−シクロオクテンとする。前記従来命名を参照する上で理解されるべきことは、置換基Ｘ又はＹの結果として、前記置換基の位置及び分子量に依存して、同じシクロオクテン異性体が形式的にＺ異性体となり得る、ということである。本発明及び本発明の全ての変更例において、形式的「Ｅ」又は「Ｚ」、又は「シス」又は「トランス」異性体かどうかは、無置換トランス−シクロオクテン又は無置換Ｅ−シクロオクテンの誘導体と考えられる。用語「トランス−シクロオクテン」（ＴＣＯ）はＥ−シクロオクテン同様、交換可能に使用され、本発明の全てのジエノフィルについて維持され、又置換基が形式的に逆の命名を必要とする場合であっても、維持される。即ち、本発明は、シクロオクテンに関し、ここで以下で炭素原子１及び６と数字付けされた炭素原子がＥ（エントゲーゲン）又はトランス位置にある。
【００２９】
【化２】
2014506869.tif 000004
一般的には、本発明は、ジエノフィルとして、トランス−シクロオクテン誘導体、例えばトランス−シクロオクテノールを使用するシステムにおいて、前記異性体は、リンカー構造に誘導体化するために使用される前記ヒドロキシル基が、アキシャル位置となるように選択される。Ｅ−シクロオクテノールは、所謂クラウンエーテル立体配座であるが、２つの異性体を含み、その１つはＯＨをエカトリアル位置に持ちメジャー異性体となり、他の１つはＯＨをアキシャル位置に持ちマイナー異性体となる。後者異性体は、本発明により選択され以下「Ｅ−マイナー」とされる。
【００３０】
理論に縛られるものではないが、本発明者は、この知見に基づき、ＴＣＯの１以上のアキシャル置換基の存在が、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でのより高い反応性の必要性に答えることができるものである、と考える。
【００３１】
広い意味で、本発明は従って、前記の式（１）を参照して与えられた置換基の定義を超えるものである。１以上のアキシャル置換基が存在するという事実は、結果としてより高いＨＯＭＯエネルギーとなる、と考えられる。当業者に知られるＨＯＭＯは、最高占有分子軌道の略である。本発明によれば、ＭＯＰＡＣシミュレーションが前記ＴＣＯのＨＯＭＯエネルギーを決定するために使用される。ＭＯＰＡＣ（分子軌道パッケージ）は計算化学の分野ではよく知られたソフトウェアである。前記ＭＯＰＡＣソフトウェアは、ＡＭＩＴＩＥやＰＭ３を含むいくつかのよく知られた半経験的分子軌道計算方法を取り込んでいる。用語ＡＭＩ及びＰＭ３は異なるハミルトニアンを参照し、即ちオースチンモデルｏｄｅｌ１及びパラメータ化モデル３ハミルトニアンである（ＡＭＩについては、Ｍ．Ｊ．Ｓ．Ｄｅｗａｒ、ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１０７、３９０２（１９８５）；ＰＭ３についてはＪ．Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１０、２０９（１９８９）及びＪ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、１０、２２１（１９８９）を参照）。
【００３２】
本発明においては、コンピュータ環境下で、シクロオクテン誘導体の分子構造を与え、それぞれの分子構造を最低エネルギーが形成されるように最適化し、前記ＡＭＩ及びＰＭ３ハミルトニアンを決定し、及びそれにより最高占有分子軌道（ＨＯＭＯ）を決定する、ことを含む方法が使用される。
【００３３】
表６のＭＯＰＡＣデータは、アキシャル置換基の存在は、トランス−シクロオクテン環にＨＯＭＯエネルギーを増加させる目的を達成する、ということを示す。
【００３４】
本発明は、さらに、具体的な実施態様及び添付図面を参照して説明されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲にのみ限定される。請求項の全ての参照符号は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。記載される図面は概略的なものであり限定するものではない。図面で、いくつかの要素のサイズは誇張されている場合があるが、これは説明のためだけに描かれており寸法通りではない場合がある。用語「含む」は、本発明の説明及び特許請求の範囲で使用される場合には、他の要素又はステップを排除するものではない。
単数を示す不定冠詞「１つの」、「ひとつの」は、特に記載がない限り、複数を含む。
【００３５】
さらに留意すべきことは、詳細な説明及び特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、続いて列挙される手段に限定されるものではなく、他の要素及びステップを排除するものではない、ということである。従って、「手段Ａ及びＢを含む装置」なる表現の範囲は、部品Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるものではない。本発明に関しては、これは、前記装置の単に関連する部品がＡ及びＢである、ということを意味する。
【００３６】
いくつかの化学式で、「アルキル」及び「アリール」が参照される。この観点で、「アルキル」とは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｎ又はＳなどの１〜３のヘテロ原子を含み得る、炭素原子１０まで、好ましくは１〜６の炭素原子の、脂肪族、直鎖、分岐又は環状アルキル基を示し、「アリール」とは、それぞれ独立して、Ｎ又はＳなどの１〜３のヘテロ原子を含み得る、炭素原子１０までの芳香族又はヘテロ芳香族基を示す。いくつかの式で、基又は置換基は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」などの文字、及び「Ｒ」基の種々の数字を参照して示される。これらの文字の定義は、それぞれの式に付されており、即ち特に記載のない限り異なる式ではこれらの文字はそれぞれ独立して異なる意味を持ち得る。
【００３７】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、以下いくつかの化学式において、「アルキル」及び「アリール」が参照される。この側面で、「アルキル」とは、それぞれ独立して、１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含み得る、１０までの炭素電子の、脂肪族、直鎖、分岐、飽和、不飽和及び／又は環状ヒドロカルビル基を示し、及び
「アリール」とは、それぞれ独立して、２０炭素原子までの芳香族又はヘテロ方構造基を示し、これは１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含み得る。「アリール」基はまた、「アルキルアリール」又は「アリールアルキル」基（簡単例：ベンジル基）を含む。「アルキル」、「アリール」、「アルキルアリール」及び「アリールアルキル」が含み得る炭素原子の数は、かかる用語に先行する指定用語により示される（砂割、Ｃ１〜１０アルキルとは、前記アルキル基が炭素原子を１〜１０含み得る、ということを意味する）。本発明のいくつかの化合物は、キラル中心及び／又は互変異性体（トートマー）を含み得るが、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー及び互変異性体は本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
レトロディールスアルダー反応
前記レトロディールスアルダーカップリング化学は一般的には、１対の反応物を含み、これらはカップリングして不安定な中間体を形成し、前記中間体はレトロディールスアルダー反応の唯一の副生成物として小分子（これは出発物質に依存し、例えばＮ２、ＣＯ２、ＲＣＮなど）を除去して安定な生成物を形成する。前記一対の反応物は、１つの反応物として（即ち１つの生体直交反応性基）、テトラジンの誘導体、例えば電子欠乏テトラジンなどの好適なジエン、及び他の反応物として（即ち他の生体直交反応性基）、式（１）により歪シクロオクテンを含む。
【００３９】
例えば電子欠乏性（置換）テトラジンと本発明の歪Ｅ−シクロオクテンとの例外的に速い反応により、中間体を経て、Ｎ２を［４＋２］レトロディールスアルダーシクロ付加での唯一の副生成物として除去することで安定なジヒドロピリダジンへ変換される結果となる。これは図２に示される。
【００４０】
前記２つの反応種は非生物的であり、従って、インビボで迅速に代謝されることはない。それらは生体直交性であり、例えばこれらは生理的媒体中でお互いに選択的に反応する。その利点は、前記ジエン及びシクロオクテンは共に、細胞の内部又は表面及び血清などの全ての領域において生体分子とは反応しない、ということである。従って、本発明の前記化合物及び方法は、生体細胞、組織又は器官で使用され得る。さらに、前記反応種は比較的小さく、生体サイズを大きく変化させることなく生体サンプル又は生体器官内に導入可能である。［４＋２］レトロディールスアルダー反応を用いることで、抗体などの大きいサイズの第１のターゲット部と、ラベル化剤、又は小さい反応相手、例えばテトラジン又はシクロオクテンを用いる他の分子と結合させることが可能となる。より大きな利点は、比較的小さい、例えばペプチドである第１のターゲット部は、ラベル化剤又は小さい（適合化された）反応相手、例えばテトラジン又はシクロオクテンを用いる他の分子と結合させることが可能となる。プレターゲットプローブ及びエフェクタープローブのサイズ及び性質は、第２のターゲット及び第２のターゲット部でそれほど影響されず、（プレ）ターゲット方法を小さいターゲット部のために使用されることを可能にする。このために、他の組織がターゲットされ得ることとなり、即ち前記プローブの目標は、抗体−ストレプトアビジンによる現在のプレターゲット方法の場合のように、血管系及び間質空間に限定されるものではない。
【００４１】
前記逆電子要求ディールスアルダー反応についての参考文献は：「Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、Ｆ；Ｗａｌｌｆａｈｒｅｒ、Ｕ；Ｓａｕｅｒ、Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９０、３１（４７）、６８５１−６８５４」；「Ｗｉｊｎｅｎ、ＪＷ；Ｚａｖａｒｉｓｅ、Ｓ；Ｅｎｇｂｅｒｔｓ、ＪＢＦＮ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、６１、２００１−２００５」；「Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９」；「Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．Ｒｅｎａｒｔ  Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｓａｎｄｒａ  Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、１．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ２０１０、４９、３３７５」；「Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ、Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ、Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ、Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ、Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ２００９、４８、７０１３」及び「Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、１−５」を含む。
【００４２】
理解されるべきことは、広い意味で、本発明により、前記カップリング化学は、プレターゲットで使用され得る基本的に全ての、分子、基又は部分に適用され得る。即ち、かかる対の１つは、第１のターゲット部を持ち、これは第１のターゲットへ結合でき、及びさらに少なくとも１つの第２のターゲットを含む。他の１つは、前記第２のターゲットとの結合に使用される好適な第２のターゲット部であり、さらに、治療作用（通常は医薬活性化合物）を発揮するか、又はイメージング技術（即ちラベル）を適用されるか、又はその両方のために好適な部分を含む。
【００４３】
従って、本発明によれば、プレターゲットプローブ及びエフェクタープローブのいずれかは、前記のアキシャル置換されたシクロオクテンで官能基化され、かつ他方はテトラジン又は他の好適なジエンで官能基化されている。これは図３に示される。図３の上（図３ａ）は、プレターゲットプローブを示し、これはジピリジルテトラジンを含み、これはリンカー部（場合によりフレキシブルなスペーサーを含む）を介して前記第１のターゲット部としての抗体へ結合されており、及びエフェクタープローブがリンカー（フレキシブルなスペーサー）を介して検出可能なラベルに結合されている。図３の下（図３ｂ）は、丁度逆の場合を示し、即ちプレターゲットプローブがシクロオクテンを含み、及びエフェクタープローブがテトラジンを含む。
【００４４】
図には立体化学が明記されていないが、本発明において前記シクロオクテンが前記式（１）によるアキシャル置換シクロオクテンであることは、理解される。
【００４５】
ジエノフィル
本発明の基本的な成果は、ジエノフィル、即ち前記の式（１）によるアキシャル置換ＴＣＯの選択であり、これにより前記生体直交カップリング反応の反応速度を１０倍以上増加させることができる、ということである。又は言い換えると、反応時間はとうｈ粗生成物必要とされていた時間のほんの１０％である、ということである。さらに言い換えると、１つの反応物の濃度が１０倍低いということである。
【００４６】
広い意味で、ジエノフィルは、少なくとも１つアキシャル置換を持つトランス−シクロオクテンであり、即ち少なくとも１つの飽和炭素の少なくとも１つの位置が水素ではない、ということである。
【００４７】
前記の通り、少なくとも１つで最大４のＲａは水素ではなく、これはかかるＲａが置換基又はリンカー構造に一部であることを意味する。好ましくは非水素のＲａの数は１又は２である。
【００４８】
より好ましくは、少なくとも１つ、最大４の非水素Ｒａは、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ及びＲ５ａからなる群から選択される位置である。さらに好ましくは、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ及びＲ５ａの１又は２が非水素である。最も好ましくは、置換又はリンカー構造が、Ｒ３ａ及びＲ４ａの１つ又は両方に存在することである。
【００４９】
好ましくは、前記置換基は前記式（１）の説明に定義された基から選択される。より好ましくは、前記置換基Ｒａはアルキル基又はＯ−アルキル基、より好ましくはメチル又Ｏ−ｔ−ブチル基である。
【００５０】
留意すべきことは、Ｒａの前記選択は、エカトリアル位置（即ち前記式（１）のＲ基）に、他の炭素原子又は同じ炭素原子にいかなる置換基が存在するかどうかには関係ない、ということである。好ましくは、１又は２のアキシャル置換に加えてまた、１又は２のエカトリアル置換基が存在し、前記置換基が好ましくはリンカー構造の一部分であるＲ又はＲａを含む。しかし、他の選択では、合成の努力と反応性の間のバランスをとるために、１又は２のＲａが水素ではなく、かつ全ての他のＲ及びＲａは水素である。
【００５１】
さらなる選択では、Ｘ及び／又はＹは、Ｏ−アルキル又はアルキルであり、さらの好ましくはメチルである。
【００５２】
ジエン
当業者は、前記レトロディールスアルダー反応で反応性であるジエンの多くを認識する。好ましくはジエンは、以下式（２）から（５）に示される。
【００５３】
【化３】
2014506869.tif 000005
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルール、ＣＦ３、ＣＦ２、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’はＨ、アリール又はアルキル）からなる群から選択される。
【００５４】
シクロオクテンの反応相手として好適なジエンは：
【００５５】
【化４】
2014506869.tif 000006
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり：Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
【００５６】
シクロオクテンの反応相手として好適な他のジエンは：
【００５７】
【化５】
2014506869.tif 000007
であり、
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はａｒｕｋｉｒｕ基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
【００５８】
特に有用なテトラジン誘導体は、電子欠乏テトラジン、即ち一般的に電子供与として保持せず、好ましくは電気吸引性置換基を持つ基又は部分で置換されたテトラジンである。
【００５９】
これらの電子欠乏タトラジンは一般的には次の構造式を持ち：
【００６０】
【化６】
2014506869.tif 000008
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、２、５−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル又はフェニールであって、これらは場合によりＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されていてもよい（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択される。
【００６１】
式（２）から（５）のそれぞれによる化合物で、Ｒ１及びＲ２基（そのＸ及びＹ基を含む）は、さらに、以下説明するような好適なリンカー又はスペーサーを含み得る。同様に又は独立して、前記式（１）のジエノフィルはさらに、以下説明するような好適なリンカー又はスペーサーを含み得る。
【００６２】
１つの実施態様では、本発明はターゲットイメージングのために使用される。
この実施態様によると、第１のターゲットのイメージングが、前記プレターゲットプローブの前記第１のターゲット部の特異的な結合及びこの結合を前記エフェクタープローブに含まれる検出可能なラベルを用いて検出することにより達成され得る。
【００６３】
第１のターゲット
本発明で使用される「第１のターゲット」は、診断及び／又はイメージング方法で検出されるターゲット、及び／又は変更され、結合され又は医薬活性化合物が輸送されるターゲットに関連する。
【００６４】
前記第１のターゲットは、ヒト又は動物体内又は病原体や寄生虫の全ての好適なターゲットから選択され得るものであり、例えば、細胞膜や細胞壁などの細胞、細胞膜受容体のような受容体、ゴルジ体やミトコンドリアなどの細胞内構造、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスまたはウイルス粒子、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチン受容体、モノアミン酸化酵素、ムスカリン受容体、心筋神経系、例えば白血球上ロイコトリエン受容体、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（μＰＡＲ）、葉酸受容体、アポトーシスマーカー、（抗）血管新生マーカー、ガストリン受容体、ドーパミン系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ作動性システム、アドレナリン作動系、コリン作動系、オポイド受容体、ＧＰＩＩｂ  ／  ＩＩＩａ受容体や他の血栓関連受容体、フィブリン、カルシトニン受容体、タフシン受容体、インテグリン受容体、ＶＥＧＦ／ＥＧＦ受容体、ＥＧＦマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ｐ／Ｅ／Ｌ−セレクチン受容体、ＬＤＬ受容体、Ｐ−糖蛋白質、ニューロテンシン受容体、神経ペプチド受容体、サブスタンスＰ受容体、 ＮＫ受容体、ＣＣＫ受容体、シグマ受容体、インターロイキン受容体、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼを含む群から選択される。
【００６５】
本発明の特に具体的な実施態様によると、前記第１のターゲットはレセプターなどのタンパク質である。又は、前記第１のターゲットは、感染や癌などの疾患の際にアップレギュレートされる代謝経路であり得、例えばＤＮＡ、合成、タンパク質合成、膜合成及び炭水化物取り込みなどである。疾患組織で、前記マーカーは健康な組織とは異なり、早期検出、特異的診断及び治療、特にターゲット治療のためのユニークな可能性を提供し得る。
【００６６】
プレターゲットプローブ
プレターゲットプローブは、対象とする前記第１のターゲットへ結合し得る部分を含む。
【００６７】
ターゲット部分は通常は、細胞表ターゲット（例えば膜レセプター）、構造タンパク質（例えばアミロイド斑）、又は細胞内ターゲット（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達系）に親和性を持つ構造物である。これらの部分は、抗体（断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、同様にペプチド、ペプタイド及び医薬化合物などであって、特定の疾患又は異常において蓄積されることが知られているものである得る。
【００６８】
本発明のきっとで使用される好適な第１のターゲット部分の具体的な実施態様は、個々に記載されレセプター結合性ペプチド及び抗体を含む。本発明の具体的な実施態様は、ペプチドなどの小さいターゲット部分の使用に関し、それにより細胞透過性ターゲットプローブを得ることが可能となる。
【００６９】
本発明で使用される「第１のターゲット部分」は、第１のターゲットに結合する前記ターゲットプローブの部分に関する。第１のターゲット部分の具体的例示はレセプターに結合するペプチド又はタンパク質である。第１のターゲット部分の他の例示は細胞性化合に結合する抗体又はその断片である。抗体は、タンパク質又はペプチド同様に、非タンパク質性化合物とすることも可能である。他の第１のターゲット部分は、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖と同様に、ペプトイド及び有機医薬化合物からも作成され得る。第１のターゲット部分は好ましくは、高特異性、高親和性で、場合により共有結合で結合し、前記第１のターゲットとの結合は好ましくは体内安定である。
【００７０】
前記列挙の第１のターゲットの特異的ターゲットを可能にするために、前記ターゲットプローブの第１のターゲット部分は、限定されるものではないが、Ｆａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶなどの抗体断片、二重特異的抗体、ポリマー（ＥＰＲ効果による腫瘍ターゲット化）タンパク質、ペプチド例えばオクトレオチド及び誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド類似物、炭水化物、単糖類、多糖類、ウイルス、全細胞、ファージ、医薬物、化学療法医薬、レセプター作動薬及び拮抗剤、が含まれる。本発明に含まれる有機化合物の例は、エストラジオール、アンドロゲン、プロゲスチン、コルチコステロイド、パクリタキセル、エトポシド、ドキソルブリシン、メトトレキサート、葉酸及びコレステロールなどのエストラゲン又はその誘導体である。
【００７１】
本発明の１つの具体的実施態様によると、前記第１のターゲットは、限定されるものではないが、レセプターなどのリガンド又はその一部分であってなお前記レセプターに結合するもの、例えばレセプター結合性タンパク質リガンドの場合のレセプター結合性ペプチドである。
【００７２】
タンパク質性の第１のターゲット部分の他の例は、アルファ、ベータ、ガンマインターフェロンなどのインターフェロン、インターロイキン、及び腫瘍成長因子などのタンパク質成長因子、例えばアルファ、ベータ腫瘍成長因子、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡＲターゲットタンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン及びアンジオスタチンを含む。
【００７３】
第１のターゲット部分の他の例は、例えば前記第１のターゲットと相補的である、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含む。
【００７４】
本発明の１つの具体的実施態様によると、細胞内の第１のターゲットへ結合し得る小さい脂質親和性第１のターゲット部分が使用される。
【００７５】
本発明のさらなる具体的実施態様によると、前記第１のターゲット及び第１のターゲット部分は、癌、炎症、感染症、心血管疾患などの組織又は疾患、血栓、アテローム性動脈硬化症などの心臓欠陥疾患、脳卒中などの低酸素サイト、腫瘍、心臓血管疾患、脳疾患、アポトーシス、血管形成、器官、およびレポーター遺伝子／酵素などの特異的ターゲット化又は強調ターゲット化を可能にする。これは、組織、細胞又は疾患特異的発現を用いて第１のターゲットを選択することで達成できる。例えば、膜葉酸レセプターは、葉酸エステル及びメトトレキサートなどの類似物の細胞内特席を媒介する。発現は正常組織では元適されているが、種々の腫瘍細胞タイプではレセプターが過剰発現している。
【００７６】
１つの実施態様によると、前記プレターゲットプローブ及び前記エフェクタープローブは、多量体化合物であって、複数の第１の及び／又は第２のターゲット及び／又はターゲット部分を含む。これらの多量体化合物は、ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ポリマー粒子又は他のポリマー性構造物であり得る。検出シグナルの増幅の特に興味あることは、１以上の第２のターゲットを持つターゲットプローブであり、これはいくつかのエフェクタープローブの結合を可能にする。
【００７７】
プレターゲットプローブはさらに、前記の第１の生体直交反応基を持つ。この基は、前記レトロディールスアルダーカップリング化学の前第１の反応相手を与える前記ターゲットプローブの部分として、「第２のターゲット」として作用する。
【００７８】
前記第２のターゲットは前記の通り、前記カップリング反応のいずれかの相手となり得る。即ち、１つの実施態様では、電子欠乏テトラジンである。他の実施態様では、前記式（１）のアキシャル置換ＴＣＯである。
【００７９】
前記プレターゲットでは、前記第１のターゲット部分及び前記第１の生体直交反応基はお互いに直接リンクされている。これらはまた、お互いにリンカーを介して結合され、さらにこれらは共に第１のターゲット足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、例えばポリペプチドなどの生体ポリマーにリンクされ得る。即ち、最も単純な意味で、前記リンカー部は１つの結合である。好適なリンカー部はさらに、限定されるものではないが、２から２００、具体的には３から１１３、及び好ましくは５から５０の間の繰り返し単位のポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）を含む。前記ＰＥＧ鎖長を調節することで、生理的システム中での前記プローブの循環時間を変更することができる。これはプレターゲットプローブについて特に関係がある（前記第１のターゲット部分と前記第１のターゲットをリンクする最初のターゲットステップが、比較的遅いプロセスを含み、比較的長い循環時間を必要とするからである）。リンカー部は場合により生体ポリマー断片、例えばオリゴ又はポリペプチド又はポリラクトドを含む。
【００８０】
理解されるべきは、本発明は、前記ジエンとジエノフィルが前記プレターゲット又はエフェクタープローブのいずれかに攻撃され得る全ての方法を含む、ということである。例えばリジンやシステインなどの反応性アミノ酸によりこれらのプローブへ共役させる方法は当業者に知られている。
【００８１】
エフェクタープローブ
エフェクタープローブは、望ましい診断、イメージング、及び／又は治療の効果を与えることのできるエフェクター部分を含む。前記エフェクタープローブは第２のターゲット部分を含む。
【００８２】
前記第２のターゲット部分は、利用可能な第２のターゲットの反応相手、即ち前記プレターゲットプローブ内に含まれる前記生体直交反応基を形成する前記エフェクタープローブの部分である。理解されるべきことは、前記第２のターゲットが前記式（１）のアキシャル置換ＴＣＯであるという範囲において、前記第２のターゲット部分はテトラジンなどのジエンであり、又はその逆である、ということである。
【００８３】
前記エフェクター部分は例えば検出可能なラベルであり得る。ここで使用される「検出可能なラベル」とは、前記エフェクタープローブの部分であり、例えば細胞、粗生成物ｓ基又は器官内に存在する場合に前記プローブの検出を可能にする部分を意味する。本発明の範囲に含まれる検出可能なラベルの１つのタイプは造影剤である。異なるタイプの検出可能なラベルが本発明の範囲に含まれ以下説明される。
【００８４】
従って、本発明の具体的な実施態様によれば、本発明のプレターゲットキット及び方法はイメージングにおいて使用され、特に医用イメージングにおいて使用される。前記第１のターゲットを識別するために、エフェクタープローブとして、１以上の検出可能なラベルを含むイメージングプローブが使用される。前記イメージングプローブの検出可能なラベルの具体的な例は、ＭＲＩ−イメージング可能構造物、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答構造物、Ｘ線応答部分、放射性元素、（生体）発光及びＦＲＥＴタイプの色素などの従来のイメージングシステムで使用される造影部分である。本発明に含まれる検出可能なラベルの例は、限定されるものではないが、蛍光分子、例えば自動発光分子、試薬に接触すると発光する分子、放射性元素ラベル；ビオチン、例えばアビジンによるビオチンの結合を介して検出される；蛍光タグ、常磁性金属を含むＭＲＩのためのイメージング構造物、米国特許第４、７４１、９００号及び５、３２６、８５６号に記載されたイメージング試薬を含む。イメージングに使用される放射性元素は、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される。
【００８５】
他の元素及び同位体で、治療のためなどに使用されるものはまた、ある応用においてイメージングのために適用され得る。
【００８６】
ＭＲＩイメージング可能部分は、例えば常磁性イオン又は超常磁性粒子であり得る。前記常磁性イオンは、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｉ、Ｐａ、Ｌａ、Ｓｃ、Ｖ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｔｌからなる群から選択され得る。超音波応答部分は、マイクロバブル、リン脂質からなるシェル及び／又は（生分解性）ポリマー、及び／又はヒト血清アルブミンを含み得る。前記マイクロバブルは、フッ化ガス又は液体で充填され得る。
【００８７】
Ｘ線応答部分は、限定されるものではないが、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィンを含み、又ベシクル、リポソーム又はヨウ素及び／又は硫酸バリウムで充填されたポリマー性カプセルを含み得る。
【００８８】
さらに、本発明に含まれる検出可能なラベルはまた、例えば検出可能なラベル化抗体の結合により又はサンドイッチタイプのアッセイにより結合抗体を検出することにより、検出されるペプチド又はポリペプチドを含む。１つの実施態様では、検出可能なラベルは小さいサイズの有機ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴラベルでえあり、１８Ｆ、１１Ｃ又は１２３Ｉである。この小さいサイズにより、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴラベルは、細胞内事象をモニターするための理想的に好適であり、というのはそれらは一般に前記ターゲット装置の性質及び具体的にその膜輸送へ大きくは影響しないからである。ＰＥＴラベル及び第２のターゲット部分としていずれかの前記レトロディールスアルダー活性部分を含むイメージングプローブは脂質親和性であり、結合相手を見出すまで細胞内を又は細胞から能動的に拡散され得る。さらに、両方の成分は、血液脳関門の横断を排除せず、従って脳内の領域をイメージングすることを可能にする。
【００８９】
前記エフェクタープローブが、ランタニド（例えばＧｄ）などの金属に基づくＭＲＩの造影強化のための脱着可能なラベルを含むことができ、これは好ましくはキレートに形で提供される。かかる場合には、エフェクタープローブは好ましくは、かかる金属と配位錯体を形成し得る構造部分を持つ。ここで好ましい例は、大環状ランタニド（ＩＩＩ）キレートであり、１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７、１０−四酢酸（Ｈ４ｄｏｔａ）、及び１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−α、α’、α’’、α’’’−テトラメチル−１、４、７、１０−四酢酸（Ｈ４ｄｏｔｍａ）である。
【００９０】
前記エフェクター部分はまた、医薬活性化合物などの治療部分である得る。医薬活性化合物の例はここで与えられている。治療プローブは、場合によりまた検出可能なラベルを含む。
【００９１】
従って、他の実施態様によると、本発明の前記プレターゲットキット及び方法は、ターゲット治療に使用される。これは、第２のターゲット部分及び１以上の医薬活性試薬（即ち、医薬又は放射線治療での放射性同位元素）を含むエフェクタープローブの使用を行うことで達成される。ターゲット医薬輸送の使用に好適な医薬は当技術部分野で知られている。場合により、治療プローブはまた、１以上のイメージング試薬などの検出可能なラベルを含むことができる。治療のために使用される放射性同位元素は、例えば、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される。
【００９２】
または、治療プローブ内の医薬は、光動的治療のための増感剤から選択される。
【００９３】
又は前記治療プローブは、インビボで治療位置、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞又はその他のタンパク質などの内因性構造物へ結合する認識部分を含む。
【００９４】
エフェクタープローブで、前記第２のターゲット部分、即ち第２の生体直交反応基及び前記エフェクター部分は、お互いに直接リンクされ得る。これらはまた、リンカーを介してお互いに結合され、さらにこれらは共に第２のターゲット足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に結合され得る。前記リンカーは、独立して、同じ部分から選択されることができ、例えば前記のポリエチレングリコールである。前記第２のターゲット足場は、例えばポリペプチドなどの生体ポリマーであり得る。
【００９５】
本発明はまた、レトロディールスアルダー反応を用いるプレターゲット方法に関する。ここで、好適なジエン、好ましくは前記式（２）から（５）のいずれかの化合物、又は前記式（１）のシクロオクテンで官能基化された第１のターゲット部分を含むプレターゲットプローブ（例えば抗体及び抗体断片又はレセプター結合ペプチド）を対象物に注入される。前記ターゲット（例えば第１の又は転移性腫瘍性病変、動脈硬化性プラーク、梗塞領域、炎症又は感染サイトなど）への結合及び前記循環及び非ターゲット組織（例えば血液、肝臓、脾臓、腎臓など）からの除去の後、第２のターゲット部分を含むエフェクタープローブ、例えばＥ−シクロオクテン又はテトラジン誘導体それぞれ（即ち、前記プレターゲットプローブの前記生体直交反応基の対向反応相手）、及び医薬又はイメージング可能ラベルが注入される。前記エフェクタープローブは前記第１のターゲット部分に結合し、前記疾患サイトの造影又は選択的処置を提供する。
【００９６】
本発明はまた、一般的な代謝経路のターゲットに関し、これは疾患（感染や癌など）の際にアップレギュレートされるものであり、例えばＤＮＡ、タンパク質及び膜合成及び炭水化物取り込みなどである。好適なプローブは、［１１Ｃ］−メチオニン、［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、デオキシ−［１８Ｆ］−フルオロチミジン（ＦＬＴ）及び［１１Ｃ］−コリンで現在使用されている代謝トレーサーに類似する、ジエン又はジエノフィルラベル化アミノ酸、糖、核酸及びコリンが含まれる。高い代謝や増殖を行う細胞はこれらをより多く取り込む。この方法で、例えばテトラジン又はＥ−シクロオクテン誘導体がこれらの又は他の経路に入り細胞内及び／又は細胞上に蓄積される。十分な蓄積がなされ遊離プローブを洗浄した後、検出可能にラベル化された又は医薬担持（細胞透過性）テトラジンプローブ又はＥ−シクロオクテンプローブ（又は本発明により他のジエン／ジエノフィル担持プローブ）は、前記蓄積されたＥ−シクロオクテン、テトラジン代謝物それぞれに結合するために送られる。通常のＦＤＧ（フッ素１８フルオロデオキシグルコース）タイプのイメージングでの利点は、放射活性物を導入する前に前記ターゲット部分を高蓄積させる十分な時間があり、それにより前記ターゲットと非ターゲットとの比率を増加させることができる、ということである。又は、疾患に特異的な代謝経路及び／又は代謝物がターゲットされ得る。
【００９７】
本発明はまた、細胞内ターゲットのプレターゲットに関する。サイズが小さいことから、有機ＰＥＴラベル（１８Ｆ、１１Ｃ）は細胞内事象をモニターするために理想的であり、というのは一般に前記ターゲット装置及び特に（大ききかつ極性の放射性金属キレート構造共役と対照的に）前記膜輸送に対して大きな影響を与えないからである。本発明で使用される前記置換テトラジン部分及び前記Ｅ−シクロオクテンは、小さいことは必須ではなく、それらは比較的非極性であり、細胞内のタンパク質、ｍＲＮＡ、シグナル伝達経路などのイメージングのために使用され得る。前記第２（例えばＰＥＴラベル）のち管テトラジン部分又はＥ−シクロオクテンプローブ（即ちエフェクタープローブ）は、その結合相手を見出すまで細胞内で又は細胞外へ能動的に拡散核酸することができ、又は活性取り込み機構の対象となる。これらの性質はまた、両方の成分が脳血管関門を溶断することを排除しないからである脳内でプレターゲットのためにレトロディールスアルダー反応の使用を可能にする。
【００９８】
本発明はまた、プレターゲットシグナル増幅及び／又は多価装備に関する。少なくとも１つの第１のターゲット装置が、多数のテトラジン部分を含むデンドリマー、ポリマーー又はナノ粒子へ共役される。レセプター結合後、核イメージング（例えば放射性金属キレート、放射性ハロゲンなど）又はＭＲＩ（例えばＧｄキレート）のための１以上の造影部分が共役された（１又はそれ以上の）シクロオクテンが注入される。その結果前記続くレトロディールスアルダー反応により、前記ターゲット組織でＭＲＩ造影剤は高濃度となる。さらに、前記ターゲットサイトでの多価性は、前記アキシャル置換ＴＣＯエフェクター共役の反応速度を増加させ、例えばＭＲＩ造影剤の効果的なターゲット蓄積を可能にする。通常は、前記アキシャル置換ＴＣＯはまた、前記ターゲット装置共役で、及び前記レセプターと共役された前記テトラジン（又は本発明の他のジエン）で使用され得る。
【００９９】
共役経路及びキット
本発明はさらに、イメージング剤と医薬をペプチドなどのターゲット構造物に共役させる経路としてレトロディールスアルダー反応を使用することに関する。前記エフェクターは、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ核ラベル化合成基、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩ用金属錯体及び超音波イメージングのためのマイクロバブルを含みことができるが、しかしまた、放射線治療用α線及びβ線放射及び一般に細胞毒性抗癌剤を含み得る。前記イメージング剤／治療薬は、ペンダントテトラジン又はその他の好適なジエン部分で官能基化され、前記ターゲット基が前記アキシャル置換ＴＣＯ誘導体で官能基化されるか、又はそれらの逆が可能である。
【０１００】
現在の経路は特に核イメージング及び放射線治療のために試薬にとって有利である：放射性核の減衰の点から、最も時間を要するステップ（対象物の体内で実際のターゲット化）するをプレターゲットステップとして実施することは有利である。本発明によれば、前記第２のターゲット化のための前記の非常に速いレトロディールスアルダー化学を得るためにアキシャル置換ＴＣＯの選択することで、既存の方法と比べてより短寿命の種を含む広い範囲の放射線核種を使用することを可能にする。アキシャル置換ＴＣＯ官能基化エフェクタープローブ及び好適なジエン、例えばテトラジン担持プレターゲットプローブは、インビボで、エフェクター部分（例えば放射性核）を持続的に血液循環させる必要がなく、非常に低い濃度でカップリングさせることを可能にする。理解されるべきことは、このことは、ジエン特にタトラジンと結合されたアキシャル置換ＴＣＯ担持プレターゲットプローブ、官能基化エフェクタープローブについても該当する、ということである。さらに、前記反応基は有利には安定であり、及び従って副反応を容易に生じることなくより長い寿命反応性を表す。
【０１０１】
理解されるべきことは、前記方法は、患者へ放射線投与を最小化するなどの利点を与えるということである。またこれは、ＳＰＥＣＴ（即ち、シングルフォトンエにッションコンピュータトモグラフ）の代わりにＰＥＴ（即ちポジトロンエミッショントモグラフ）剤の使用を可能にするということである。さらには前記反応性の増加は、インビボより低濃度で適用することを可能にする。
【０１０２】
本発明は、特に、マルチモーダルイメージング、場合により同じターゲットを可視化させる異なるイメージング剤を用いる、マルチモーダルイメージンに好適である。
又は前記イメージングプローブは、少なくとも２つの異なるラベルを有しマルチモーダルイメージングを可能にする。
【０１０３】
本発明の前記改良［４＋２］レトロディールスアルダー化学の分子イメージングへの適用は、プレターゲット方法を、全てのタイプ及びサイズのターゲット構造体へ適用可能にするものである。これは、細胞内及び代謝イメージングが、プレターゲット蓄積から達成可能となる、高ターゲット蓄積及び低バックグランドにより、利益を得ることを可能にする。同様に、プレターゲットシグナル増幅方法、例えばポリテトラジン及び／又はポリアルキレンデンドリマー又はリポソームは、より小さく、かつより広範囲のターゲット装置を利用可能なものとする。
【０１０４】
前記反応相手が非生物的であり生体直交性であることから、アキシャル置換ＴＣＯを前記ジエノフィルとして用いる［４＋２］レトロディールスアルダー反応を用いるプレターゲットは、内因性競合及び代謝／分館には邪魔されず安定な共有結合を可能にする。ターゲット代謝経理、及び例えば正常細胞に対して腫瘍細胞でその高い濃度の対応するテトラジン代謝誘導体は、高濃度の人工テトラジンレセプターの装備又は細胞中又はターゲット細胞の表面で他の化学的ハンドルの装備を可能にし、場合により低レベルであり得る内因細胞表面レセプターの使用を回避することを可能にする。
【０１０５】
本発明のさらなる具体的実施態様はキットに関し、このキットは代謝前駆体とイメージングプローブを含み、より具体的には、前記イメージングプローブは検出可能なラベルを含み、これは通常のイメージングシステインで使用される造影剤である。かかる検出可能なラベルは、限定されるものではないが、ＭＲＩ−イメージング可能な構造物、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答剤、Ｘ線応答剤、放射性核及びＦレＴ−タイプの色素が挙げられる。本発明の具体的な実施態様では、レセプタープローブが使用される。かかるレセプタープローブは、酵素の基質であり、前記酵素はより具体的には前記細胞には内因性でなく、遺伝子治療又は外部試薬の感染により導入されたものであり得る。ここで細胞又は組織に関して非内因性とは、前記遺伝子が天然には存在せず及び／又は細胞又は組織で発現しないものを意味する。又は、かかるレセプタープローブは、レセプター又はポンプの方法で細胞内に導入された分子であり、内因性であるか、又は遺伝子治療又は外部試薬の感染により細胞内に導入されたものであり得る。又は前記レセプタープローブは、細胞又は組織環境である（変化）条件に反応する分子であり得る。
【０１０６】
本発明はまた、前記キットのための試薬を含む。１つのかかる試薬は、プレターゲット剤であり、第１のターゲット部分及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の相手である。具体的な反応相手はこれまで説明されたものであり、即ち一般的には、電子欠乏性テトラジン又はその他の前記好適なジエンであるか、又は本発明によるアキシャル置換されたシクロオクテンのいずれかである。本発明はまた、これらの試薬を、ターゲット医用イメージング又はターゲット治療での使用に関し、及びかかる方法でのそれらの試薬の使用に関する。具体的には、本発明はこれらの試薬のプレターゲット方法での使用、及びかかる方法での使用のためのこれらの試薬に関する。他のかかる試薬は、イメージングプローブであり、検出可能なラベル及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手である。
【０１０７】
本発明はまた、イメージングプローブに関し、検出可能なラベル及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手である。本発明はさらに、治療プローブに関し、医薬活性化合物及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手である。
【０１０８】
本発明の一部はまた、プレターゲット方法であり、これは前記プレターゲット試薬を対象物に投与し、及び前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１の対象物部分が第１のターゲットに到達する有効な時間の間循環させ、続いて非結合の試薬を前記体内から除去することを含む。通常このための時間は１２から９６時間であり、具体的には≒時間である。
【０１０９】
さらに、本発明はイメージング方法を提供するものであり、前記方法は、前記のプレターゲット方法を実行し、続いてまた本発明によるイメージングプローブを投与し、前記プレターゲット試薬及び前記イメージングプローブ中の前記生体直交反応基が  ［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成させることを含む。同様に、本発明は、対象物内で、ターゲット医学治療の方法を提供し、前記方法は、前記プレターゲット方法を実行し、続いてまた本発明による治療プローブを投与し、前記プレターゲット試薬及び前記イメージングプローブ中の前記生体直交反応基が  ［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成させることを含む。
【０１１０】
本発明はまた、前記イメージング又は治療で使用するための前記プレターゲット試薬を含む。
【０１１１】
まとめると、レトロディールスアルダー化学に基づき、生体直交プレターゲット分子イメージング及び治療が患者に大きな利益をもたらす。一方で、これは、癌及び血液循環器系疾患の顕著な画像を取得することを可能にする。他方で、放射性化合物及び一般的に潜在的に毒性の医薬物の投与から生じる本来的な副作用は、疾患組織へ到達する有効用量が増加することから、大きく低減され得る。さらには、疾患を生じる追跡可能な分子事象の収集を大きく広げるものである。特にこの技術は、血管からずっと離れたターゲット組織への到達させ、情報の豊富な細胞内環境のイメージングを容易にするものである。
【０１１２】
本発明は、以下の非限定的な実施例及び添付された非限定的な図面に基づいて説明される。
【実施例】
【０１１３】
材料
全ての試薬及び溶媒は、市販品（試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、  Ａｃｒｏｓ、  ＡＢＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＭｅｒｃｋから入手、通常及び重水素化溶媒はＢｉｏｓｏｌｖｅ、  Ｍｅｒｃｋ及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）から入手し、特に記載されていない限りさらに精製することなく使用した。１−アミノ−３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサノトリアコンタン−３９−酸（２１）はＰｏｌｙｐｕｒｅから入手。１１１Ｉｎ塩化物及び［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手した。水は蒸留して、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱イオン化（１８ＭΩｃｍ）した。前記ラベル緩衝液は、Ｃｈｅｌｅｘ−１００樹脂（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で一晩処理し、次に０．２２μｍを通して４℃で貯蔵した。Ｉｏｄｏｇｅｎヨウ素化チューブ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイのキット、ゲルコード青色タンパク質染色溶液及びＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａＭＷカットフ、０．５−２ｍＬ）はＰｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を調製するための錠剤はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｍｅｒｃｋ）から入手した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４及びＵｌｔｒａ−１５遠心濾過ユニット（５０ｋＤａＭＷカットオフ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した。マウス血清はＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。テトラジン２８の合成及び放射性ラベル化は、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ２０１０、４９、３３７５」に記載の方法で実施した。
【０１１４】
方法
ＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ３又は［Ｄ６］ＤＭＳＯ中で、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ３００スペクトルメータ又はＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ６００スペクトルメータで測定した。１３ＣＮＭＲ多重性（ｑ＝４級、ｔ＝３級、ｓ＝２級及びｐ＝１級）はＤＥＰＴパルスシーケンスを用いて識別した。高分解能ＥＳＩスペクトル（ＨＲＭＳ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置で、陽イオンモードで測定された。
【０１１５】
分取用カラムクロマトグラフは、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ装置（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ）によりＳｉｌｉＣｙｃｌｅシリカカラムを用いて行った。分取用ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００装置を用いて実施され、Ｃ１８Ｚｏｒｂａｘカラム（２１．２ｘ１５０ｍｍ、５μｍ粒子）で、水及びＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を用いて行った。分析放射性−ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射性検出装置（Ｒａｙｔｅｓｔ）を付けたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００システムを用いて行った。サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６Ｘ１５０ｍｍ、５μｍ粒子）に負荷し、０．１％ＴＦＡを含む水中でＭｅＣＮの直線的勾配（２分間は１９％ＭｅＣＮで、次に１１分間４５％ＭｅＣＮに増加）を用いて１ｍＬ／分で溶出した。、ＵＶ波長は２５４ｎｍｍと設定された。サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射性検出装置（Ｒａｙｔｅｓｔ）を付けたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００システムを用いて行った。サンプルを、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ  ２０００カラム（３００ｘ７．８ｍｍ、５μｍ粒子、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に負荷し、２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．８を用いて、１ｍＬ／分で溶出した。ＵＶ波長は２６０及び２８０ｎｍに設定された。
【０１１６】
１１１Ｉｎ及び１７７Ｌｕラベル化の収率は、ＩＴＬＣ−ＳＧ  ストリップ（Ｐａｌｌ）による放射性ＴＬＣにより行い、０．９％ＮａＣｌ水溶液中の２００ｍＭＥＤＴＡで溶出させ、発光イメージング装置（ＦＬＡ−７０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で画像化された。これらの条件で、遊離の１１１ＩＮ及び１７７Ｌｕは、Ｒｆ＝０．９で移動し、一方１１１Ｉｎ／１７７Ｌｕ−テトラジンは最初の位置にとどまった。１２５Ｉラベル化収率はまた、ＩＴＬＣ−ＳＧストリップ（Ｐａｌｌ）による放射性ＴＬＣにより行い、１：１ＭｅＯＨ／酢酸エチル混合物で溶出させ、発光イメージング装置上で画像化された。この条件で、遊離の１２５Ｉ及び１２５Ｉ−ＳＨＰＰは、Ｒｆ＝０．９で移動し、一方１２５Ｉ−ｍＡｂは最初の位置にとどまった。
【０１１７】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥは  Ｐｈａｓｔｇｅｌシステムを用いて、ＩＥＦ−３−９ゲル及び７．５％ＰＡＧＥ均一ゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をそれぞれ使用して行った。前記ＩＥＦ標準溶液（広いＰＩ、ｐＨ３〜１０）はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手し、タンパク質ＭＷ標準溶液（精度及び色標準）はＢｉｏＲａｄから入手した。電気泳動で、前記ゲルを２時間ゲルコード青で染色し、水中で脱染色し、次に従来に平坦麺スキャナーでデジタル化した。
【０１１８】
ＣＣ４９の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００スペクトルメータ（吸収波長２８０ｎｍ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＢＣＡ試験で決定された。
【０１１９】
ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデル。ヒト大腸癌細胞下部ＬＳ１７４ＴはＡＴＣＣから入手し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを追加したＥａｇｌｅの最小必要培地（Ｓｉｇｍａ）中に保持した。ヌードメスＢａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２５ｇ体重、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中の５ｘ１０６細胞を皮下接種した。
【０１２０】
実施例１
図３ａで概要が示される抗体へテトラジン誘導体部分をリンクする例として、分子１（図５参照）が合成された。Ｅ−シクロオクテンから誘導される、対応するプローブ２の例は、図６で表される。両方の分子はＰＥＧ鎖を含む。分子１はＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分を含み、これは前記抗体中のアミノ基を持つ前記分子とカップリングするために使用される。分子２のＤＯＴＡ誘導部分は、ＭＲイメのためのＧｄ又は核イメージング及び治療（ＳＰＥＣＴ）のためのＬｕ−１７７などの貴金属イオンを担持するために使用され得る。
【０１２１】
１の合成は図５に概説されている。出発テトラジン誘導分子５は、  Ｂｌａｃｋｍａｎらの「Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９）」に」より合成された。これは、無水グルタル酸との反応で酸６に変換され、次にそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル７へ変換される。このＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、市販（ＩＲＩＳ  ｂｉｏｃｈｅｍ）のＰＥＧ誘導体８と反応させて酸９とし、さらにそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１に変換する。
【０１２２】
２の合成は図６に概説されている。（Ｅ）−シクロオク−４−テノールは、Ｙａｐらの「Ｙａｐ、ＧＰＡ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（１２）、３７６０−６１）」により合成した。市販（Ａｌｄｒｉｃｈ）のイソシアネート誘導体１１で、これはエステル１２へ変換され、次に加水分解されて酸１３へ変換される。１３から形成されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４は、ＤＯＴＡ及びＰＥＧ誘導アミン１８との反応で最終生成物２が合成される。ＤＯＴＡ誘導体１８は前記１７の脱保護の後合成され、１７はＤＯＴＡＫＥＮ誘導体１５とＰＥＧ誘導体１６から合成され、両方共市販品が利用できる（それぞれＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ及びＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手）。
【０１２３】
実施例２
この例は実施例１の分子の逆対（ペア）を示す、前記抗体へ共役した後前記プレターゲット部分を形成するための前記Ｅ−シクロオクテン誘導体３は図７に示されている。前記テトラジン／ＤＯＴＡ誘導体プローブ４は、図３ｂで概説されるエフェクタープローブとして作用し得るものであり、図８に示される。
【０１２４】
Ｅ−シクロオクテン誘導体３は、市販（ＩＲＩＳ  ｂｉｏｃｈｅｍ）のＰＥＧ誘導体８（図５参照）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４との反応により酸１９を形成し、次にこの酸からＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を形成する。
【０１２５】
前記テトラジン／ＤＯＴＡ誘導プラークの合成は図８に概説されている。このプローブは、ＤＯＴＡとＰＥＧ誘導体アミン１８（図６参照）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル７（図５参照）との反応で合成される。
【０１２６】
実施例３
この例は図９に示され、（Ｅ）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（４−（（シクロオク−４−テン−１−イルオキシ）メチル）フェニル）−１−オキソ−５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート（ＴＣＯ−Ｏ−ＰＥＧ１０−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、メジャー及びマイナー異性体、それぞれ２３ａ及び２３ｂ）の合成のスキームを示す。
【０１２７】
本化合物の（数字）ａはＥ−メジャー異性体、及び本化合物の（数字）ｂはＥ−マイナー異性体を表す。
【０１２８】
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（（シクロオク−４−テニルオキシ）メチル）ベンゾエート（２０ａ）。（Ｅ）−シクロオク−４−テノール（約１３％のＺ異性体を含む、１０ａメジャー異性体）は文献記載の手順「Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ、Ｇ．Ｐ．Ａ．Ｙａｐ、Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００８、１３０、３７６０）．」により合成した。
【０１２９】
６０％の水素化ナトリウム分散物（１．８ｇ、４５ｍｍｏｌ）を、氷冷された、６０ｍＬのＤＭＦ中の１０ａ（１．７０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）に添加した。室温で４時間撹拌後、４−ブロモメチル安息香酸（３．８５ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を小分けにして添加し、前記分散物を室温で一晩撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）に投入し、ｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ）を加えて、さらに３７％塩酸水（５ｍＬ）を添加した。分離後、水層をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した（２ｘ１００ｍＬ）。有機層を集めて、水（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥して、蒸発させた。残渣を薄シリカ層を、４：１ヘキサン／酢酸エチルを用いて通した。蒸発後得られた残渣をヘプタン（５０ｍＬ）に７０℃での溶解させた後冷却して１９ａを得た。生成物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５７ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷し、次にＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０３ｇ、４．９９ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、氷冷バスを外し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。濾過して蒸発させた後、残渣はシリカのカラムクロマトグラフにより、ヘプタン中の酢酸エチル勾配（０〜１５％）を用いて精製した。次に、残渣をｔ−ブチルメチルエーテル（２０ｍＬ）中に溶解し、これをヘプタン（５０ｍＬ）中に投入して、２０ａ（１．４２ｇ、２９％）を白色個体として得た。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．６０（ｍ、１Ｈ）、５．３４（ｍ、１Ｈ）、４．５４（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．０９（ｍ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．４０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．０（ｑ）、１６１．５（ｑ）、１４６．７（ｑ）、１３５．１（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１３０．４（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２３．７（ｑ）、８５．３（ｔ）、６８．０（ｓ）、４０．５（ｓ）、３７．７（ｓ）、３４．２（ｓ）、３２．７（ｓ）、３１．４（ｓ）、２５．４（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ２０Ｈ２３ＮＯ５Ｎａ＋（［Ｍ−Ｎａ］＋）：３８０．１４７４、実測値：３８０．１４７２。
【０１３０】
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（４−（（シクロオク−４−テ−１−イルオキシ）メチル）フェニル）−１−オキソ−５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート（２３ａ）。
【０１３１】
ジクロロメタン（２ｍＬ）中の２０ａ（１００ｍｇ、０．２８０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷冷して撹拌されたジクロロメタン（２ｍＬ）中の２１（１７５ｍｇ、０．２８３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２９０μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）の溶液中に滴下した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。蒸発させて得られた粗中間物２２ａをジクロロメタン（５ｍｌ）中に溶解し氷冷した。ビス（２、５−ジオキソピロリジン−１−イル）  カーボネート（１７０ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）及びピリジン（２８μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し反応混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を濾過し、蒸発させ、生成物をシリカカラムクロマトグラフで、ジクロロメタン中のメタノール勾配（０〜１０％）を用いて精製し、２３ａを粘調なオイル状物として９３％収率で得た。
１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７９（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．００（ｓ、１Ｈ）、５．５９（ｍ、１Ｈ）、５．３３（ｍ、１Ｈ）、４．４９（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４２（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４８Ｈ）、３．０９（ｍ、１Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．４０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６７．０（ｑ）、１６５．４（ｑ）、１６４．８（ｑ）、１４０．８（ｑ）、１３３．５（ｔ）、１３１．７（ｑ）、１３０．４（ｔ）、１２５．３（ｔ）、８３．４（ｔ）、６８．７（ｓ）、６８．４（ｓ）、６８．０（ｓ）、６７．６（ｓ）、６８．４（ｓ）、６３．９（ｓ）、３８．９（ｓ）、３７．９（ｓ）、３６．１（ｓ）、３２．６（ｓ）、３１．１（ｓ）、３０．３（ｓ）、２９．８（ｓ）、２３．７（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ４７Ｈ７６Ｎ２Ｏ１８Ｈ＋（［Ｍ−Ｈ］＋）：９５７．５１７１、実測値：９５７．５１７４。
【０１３２】
（Ｅ−マイナー）２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（（シクロオク−４−テニルオキシ）メチル）ベンゾエート（２０ｂ）。
【０１３３】
（Ｅ）−シクロオク−４−テノール（１０ｂ、マイナー異性体）は前記文献の手順で合成された。６０％水素化ナトリウム（２．１ｇ、５３ｍｍｏｌ）を、氷冷した５０ｍＬテトラヒドロフラン中の１０ｂ（２．５３ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）の溶液中に添加した。室温で４時間撹拌後、混合物を再び冷却し、そこに４−ブロモメチル安息香酸（４．５３ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）を小分けにして５分間で添加した。２５ｍＬのテトラヒドロフランを添加し懸濁液を室温で４日間撹拌した。氷を添加し、次に１２．０ｇのクエン酸を添加した。混合物を２回１５０ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を２５ｍＬの水で洗浄し、乾燥して溶媒を揮発させた。残渣は、８０ｇのシリカゲルクロマトグラフで、溶出液としてヘプタン中の酢酸エチルの量を徐々に増加させて精製した。生成物の分画（生成物と出発物質アルコールとの完全な分離ではない）を集め、約３０ｍＬヘプタン（−１５０℃へ冷却）から再結晶させて、白色固体として１９ｂを得た（０．８６ｇ、１７％）。これをジクロロメタン４０ｍＬに溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４８ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷で冷却した。Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．８０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間氷冷して撹拌し、次に室温で１８時間撹拌した。濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、ロータリーエバポレータ処理し、残渣を２５ｇのシリカゲル上で、溶出液ヘプタン−酢酸エチルでクロマトグラフして生成物を得た。蒸発生成物画分を７５ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルと混同し、混合物を６０℃に温めて溶液を作った。前記溶液を２０ｍＬへ濃縮した。ここにヘプタンをゆっくりと添加することで生成物を沈殿させた。濾過して集め、ヘプタンで洗浄して、１．０５ｇの２０ｂを得た（１５％を超える）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．７３（ｍ、１Ｈ）、５．５２（ｍ、１Ｈ）、４．６０（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．１０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．０（ｑ）、１６１．５（ｑ）、１４６．７（ｑ）、１３５．１（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１３０．４（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２３．７（ｑ）、８５．３（ｔ）、６８．０（ｓ）、４０．５（ｓ）、３７．７（ｓ）、３４．２（ｓ）、３２．７（ｓ）、３１．４（ｓ）、２５．４（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ２０Ｈ２３ＮＯ５Ｎａ＋（［Ｍ−Ｎａ］＋）：３８０．１４７４、実測値：３８０．１４７２。
【０１３４】
（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（４−（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）メチル）フェニル）−１−オキソ−５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート（２３ｂ）
これは、２０ｂを出発物質として２３ａと同様の方法で得られた。２３ｂは粘調オイルとして９３％収率で得られた。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８０（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４３（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、６．８３（ｓ、１Ｈ）、５．６７（ｍ、１Ｈ）、５．５５（ｍ、１Ｈ）、４．５７（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４９Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．４３−０．９０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．２．０（ｑ）、１６７．６．４（ｑ）、１６７．０（ｑ）、１４３．４（ｑ）、１３６．２（ｔ）、１３３．８（ｑ）、１３１．６（ｔ）、１２７．４（ｔ）、１２７．１（ｔ）、７４．７（ｆ）、７１．１（ｓ）、７０．９（ｓ）、７０．６（ｓ）、７０．２（ｓ）、７０．１（ｓ）、６６．１（ｓ）、４０．５（ｓ）、４０．１（ｓ）、３４．９（ｓ）、３３．３（ｓ）、３２．５（ｓ）、３０．２（ｓ）、２８．０（ｓ）、２５．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ４７Ｈ７６Ｎ２Ｏ１８Ｈ＋（［Ｍ−Ｈ］＋）：９５７．５１７１、実測値：９５７．５１７９．
実施例４
この実施例は図１０に、（Ｅ）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニイルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−１−オキソ−５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエートの合成スキームが示される。
【０１３５】
前記化合物（数字）ａはＥ−メジャー異性体を、及び化合物（数字）ｂはＥ−マイナー異性体を示す。
【０１３６】
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（（（シクロクオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）ベンゾエート１４ａ
Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（９．５０ｇ、０．０４６ｍｏｌ）を、小分けして、氷冷した６０ｍＬのイソプロパノールとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５．０ｇ、０．０４４ｍｏｌ）に添加した。室温で１６時間撹拌後、前記懸濁物を濾過し、得られた固体をイソプロパノール６０ｍＬ中でさらに１時間撹拌した。濾過及び真空乾燥して得られた粗固体生成物２４を１００ｍＬのジクロロメタンと混合し氷冷した。トルエン（２６ｍＬ、４９．４ｍｍｏｌ）中の２０％ホスゲン溶液を添加した後、溶液を３０分間撹拌した。蒸発させて得られた固体を２回トルエンで洗浄し、真空乾燥した。４．０３ｇの２５（３６％を超える）が白色固体として得られた。固体を小分けして、３５ｍＬのジクロロメタン中１０ａ（１．４０ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）の溶液中に添加した。懸濁液を一晩撹拌し、その後２時間４０℃に暖めた。これをシリカ上でジクロロメタンで溶出してトルエンから再結晶させて、固体の１．７７の１４ａ（４１％）を得た。得られた生成物は約１２％のＺ異性体を含み、これはクロマトグラフ又は再結晶では除去できなかった。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０６（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．５１（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、６．８２（ｍ、１Ｈ）、５．５７（ｍ、２Ｈ）、３．４８（ｍ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、４Ｈ）、２．４０（ｍ、３Ｈ）、２．２３−１．５０（ｍ、７Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．７（ｑ）、１６１．６（ｑ）、１５２．７（ｑ）、１３５．２（ｔ）、１３３．４（ｔ）、１３２．５（ｔ）、１１９．４．０（ｑ）、１１７．９（ｔ）、８２．３（ｔ）、４１．３（ｓ）、３８．９（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．８（ｓ）、３１．３（ｓ）、２６．０（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ２０Ｈ２２Ｎ２Ｏ６Ｎａ＋（［Ｍ−Ｎａ］＋）：４０９．１３７６、実測値：４０９．１３７２
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−１−オキソ−５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８−ドデカオキソ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート２７ａ
ジクロロメタン（２ｍＬ）中の１４ａ（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）溶液を、氷冷撹拌されたジクロロメタン（２ｍＬ）中の２１（１６０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４００μｌ、２．９ｍｍｏｌ）へ滴下した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。蒸発させて得られた粗中間物２６ａをジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、氷冷した。ビス（２、５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（８９ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し反応混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を濾過し、３回３ｍＬの水、１会の３ｍＬの食塩水で抽出した。硫酸マグネシウム上で乾燥した後、溶媒を揮発させて、粘調なオイルとして１．２３ｇの２７ａを得た（４７％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．１６（ｓ、１Ｈ）、６．９３（ｓ、１Ｈ）、５．５６（ｍ、２Ｈ）、４．４６（ｍ、１Ｈ）、３．８４（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４８Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．５０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．２（ｑ）、１６７．２（ｑ）、１６７．１（ｑ）、１５３．２（ｑ）、１４１．６（ｑ）、１３５．２（ｔ）、１３３．４（ｆ）、１２９．３（ｑ）、１２８．６（ｔ）、１１８．１（ｔ）、８１．７（ｓ）、７０．９（ｓ）、７０．６（ｓ）、７０．２（ｓ）、６６．１（ｓ）、．４１．４（ｓ）、４０．１（ｓ）、３８．９（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．９（ｓ）、３２．５（ｓ）、３１．４（ｓ）、２８．４（ｓ）、２５．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ４７Ｈ７５Ｎ３Ｏ１９Ｈ＋（［Ｍ−Ｈ］＋）：９８６．５０７３、実測値：９８６．５０８５．
（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）ベンゾエート１４ｂ
この化合物は、１４ａと類似の方法であるが、出発物質を１０ｂとして、３２％を超える収率で得られた。１０ｂが純粋に得られたことから、この生成物はＺ異性体を含まなかった。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０４（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１（ｓ、１Ｈ）、５．６１（ｍ、２Ｈ）、５．０５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、４Ｈ）、２．３６（ｍ、４Ｈ）、２．２３−１．２０（ｍ、６Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．８（ｑ）、１６１．６（ｑ）、１５２．７（ｑ）、１４４．６（ｑ）、１３５．７（ｔ）、１３２．５（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１１９．４．０（ｑ）、１１８．０（ｔ）、７２．１（ｔ）、４１．３（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．９（ｓ）、３０．３（ｓ）、２８．５（ｓ）、２６．０（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ２０Ｈ２２Ｎ２Ｏ６Ｎａ＋（［Ｍ−Ｎａ］＋）：４０９．１３７６、実測値：４０９．１３６７．
（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルビニル）アミノ）フェニル）−１−オキソ−５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８−ドデカオキサ−２−アザヘンタトラコンタ−４１−ノエート２７ｂ
この化合物は出発物質１４ｂを用いて２７ａと類似の方法で８９％収率で得られた。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）：δ＝７．７９（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．５４（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４４（ｓ、１Ｈ）、６．９０（ｍ、１Ｈ）、５．６０（ｍ、２Ｈ）、５．０３（ｍ、１Ｈ）、３．８３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４８Ｈ）、２．８９（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．５０−１．２０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．２．０（ｑ）、１６７．２（ｑ）、１６７．０（ｑ）、１５３．２（ｑ）、１４１．６（ｑ）、１３５．７（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１２９．３（ｑ）、１２８．５（ｔ）、１１８．３（ｔ）、７１．０（ｓ）、７０．９（ｓ）、７０．６（ｓ）、７０．１（ｓ）、６６．０（ｓ）、．４１．４（ｓ）、４０．１（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．９（ｓ）、３２．５（ｓ）、３０．３（ｓ）、２８．４（ｓ）、２５．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ４７Ｈ７５Ｎ３Ｏ１９Ｈ＋（［Ｍ−Ｈ］＋）：９８６．５０７３、実測値：９８６．５０５８．
実施例５  
テトラジン放射性ラベル化
ＤＯＴＡ共役テトラジン（２８；図１２、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ２０１０、４９、３３７５」に記載）を、０．２Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．０中に溶解し、使用前に−８０℃で保存した。２８の一定量を［１１１Ｉｎ］塩化インジウム又は、［１７７Ｌｕ］塩化ルテチウムの適切な量と組み合わせて、ゆっくりと撹拌しつつ３７℃で１０分間インキュベートした。次に、５μＬの１０ｍｍＤＴＰＡを添加して溶液をさらに５分間インキュベートした。支持体添加ラベル化反応を、前記テトラジンに対して０．９モル当量のＩｎＣｌ３又はＬｕＣｌ３を添加することで実施した。通常は定量的ラベル収率及び９８％を超える放射化学純度がこの方法で得られた。
【０１３７】
ｍＡｂとシクロオクテン（ＴＣＯ）ＮＨＳエステルとの共役１４、２０、２３、２７
ここで、続くステップと同様、全ての化合物の数字は、前記ａ異性体もｂ異性体も意味するものとする。
【０１３８】
通常、１ｍｇのＣＣ４９（５ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液）が、２５０μＬＰＢＳの全容積内に、ＴＣＯ−ＮＨＳ構造物が０．６モル（動力学測定）又は１０モル当量（インビボ研究）変性される。ｐＨは１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で９に調節された。反応は、暗室で室温３０分間撹拌下実施された。続いて、ＴＣＯ−変性ｍＡｂをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心装置を用いてＰＢＳで．激しく洗浄した。抗体あたりのＴＣＯ基の数は、以下概説するテトラジン滴定で決定された。
【０１３９】
テトラジン−ＤＯＴＡ２８は担持体付加１７７Ｌｕで放射線ラベル化された。約０．６モル当量のＴＣＯで変性されたｍＡｂ（２５μｇ）を、１７７Ｌｕ−２８（０．５ｎＭ）と反応させた。約１０モル当量のＴＣＯで変性されたｍＡｂ（２５μｇ）を、１７７Ｌｕ−２８（２．５ｎＭ）と反応させた。前記反応は、５０μＬのＰＢＳｐＨ７．４中で、３７℃で１０分間行った。反応混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び発光イメージングで分析され、反応収率は、前記ｍＡｂに対応するバンドの放射線から決定された。計数（カウント）はＡＩＤＡ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）を用いて定量化された。前記ＴＣＯ−ｍＡｂ共役収率は、８０〜９０％の範囲であることが見出された。
ｍＡｂ放射性ラベル化
５０μＬのＰＢＳ中の［１２５Ｉ］ヨウ素（５〜１５ＭＢｑ）の適切な量に、ＤＭＳＯ中のＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｎ−スクシミジル−３−［４−ヒドロキシフェニル］プロピオネート（ＳＨＰＰ））の１ｍｇ／ｍＬ溶液の１μＬ、及び｀ＰＢＳ中のクロラミン−Ｔ（Ｎ−クロロ−４−メチルベンゼンスルホンアミド、ナトリウム塩）の４ｍｇ／ｍＬの２５μＬを添加した。得られた溶液を１０〜２０秒混合して、５μＬＤＭＦ及び１００μＬトルエンを前記容器に投入し、及び１２５Ｉ−ＳＨＰＰを有機層に抽出し、次にこれをガラスバイアルに移した。トルエンをＮ２のゆっくりとした流れで除去し、その後ＣＣ４９−ＴＣＯ溶液（５０〜２５０μＬＰＢＳ、中の０．１〜０．５ｍｇ）を加え、ｐＨを炭酸塩緩衝液で９に調節し、及び反応混合物を室温で３０分間ゆっくりと振り混ぜながらインキュベートした。インキュベート後、前記ラベル化収率を放射性−ＩＴＬＣで決定した。粗反応混合物を次に、生理食塩水で前平衡化させたＺｅｂａスピン脱塩カラムに負荷した。前記反応バイアルを２０μＬ生理食塩水でリンスし、リンスされたものも前記カラムに同様に負荷した。Ｚｅｂａ精製後、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ溶液の放射性純度を放射性−ＩＴＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定し；タンパク質濃度はＢＣＡアッセイで決定した。
【０１４０】
通常、この手順で、７０％を超える１２５Ｉ−ＳＨＰＰｍＡｂ共役及び、精製１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの放射性純度は９８％を超えるものが得られた。
反応速度
テトラジンＤＯＴＡ２８は、比活性３ＭＢｑ／μｇの担持体付加１７７Ｌｕで、放射線ラベル化した。１７７Ｌｕ−２８（３３ｎＭ）は、ｐＨ７．４の２００μＬのＰＢＳ中で３７℃５分間１当量のＴＣＯで変性されたＣＣ４９と増加する濃度（０．３３、１、及び１．６７μＭ）で反応させた。選択された時間で（１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０及び３００秒）、２０μＬのサンプルを取り出し、テトラジン６（図５；Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ２０１０、４９、３３７５」に記載）で失活させた（ＤＭＦ中５ｍｇ／ｍＬの１．５μＬ）。それぞれの混合物の一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び発光イメージング装置で分析し、シクロ付加反応収率は、前記ｍＡｂに対応するバンドの放射能から決定された。係数（カウント）は、ＡＩＤＡ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）で定量化した。
【０１４１】
【表１】
2014506869.tif 000009
実施例６
インビボでのトランスシクロオクテン安定性
無腫瘍性マウス（群あたりｎ＝３）に、ＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２３ａ；ＣＣ４９あたり８．４ＴＣＯ；マウス当たり３００μｇ／１００μＬ）、ＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯ−Ｃマイナー（ＣＣ４９−２７ｂ；ＣＣ４９あたり３．３ＴＣＯ；マウス当たりμｇ／１００μＬ）及びスペーサーなしＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２０ａ；ＣＣ４９あたり８．０ＴＣＯ；マウス当たり３００μｇ／１００μＬ）を皮下注射した。選択された時点（注射後、１時間から４日まで）で、伏在静脈から血液サンプルが取り出され、ヘパリン含有バイアルに集められた。血液サンプルを秤量し、過剰の１１１Ｉｎ−テトラジン２８が添加された。３７℃でインキュベートした後、一定量の血液がＰＢＳ速度で１０倍希釈されＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。シクロ付加収率は、ｍＡｂに対応するバンドでの放射能から決定され、係数（カウント）はＡＩＤＡ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアで定量化された。それぞれの時点で血液中に存在するｍＡｂの量（％ＩＤ／ｇ血液）が対応する１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ（マウス当たり３００μｇ／１００μＬ、約０．２ＭＢｑ）で注射されたマウス（ｎ＝３）の３つの別の群で評価された。データは、ｍＡｂのクリアランスが補正され、ｔ＝０で１００％ＩＤＴＣＯに標準化された。
【０１４２】
この実験の結果は、ＰＥＧ１０スペーサーを介してＣＣ４９へＴＣＯが共役された構造物を注射された両方の群のマウスにおいて、血液からのｍＡｂクリアランスによるＴＣＯの生理的減少の他に、時間と共に循環する反応性ＴＣＯ基の量が減少する、ということを示す（図１２Ａ及びＢ）。これは、スペーサーなしでＴＣＯがｍＡｂと共役された構成物を注射されたマウスの場合では起こらなかった。このことは、前記ＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯ構成物に関してインビボでスペーサーなしのＣＣ４９−ＴＣＯ構成物の高い安定性を示唆する。
【０１４３】
実施例７
生体内分布実験
二重同位体生体内分布実験が、ＰＥＧ１０スペーサー有り及び無しの１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ構成物を腫瘍保持マウス（ｎ＝３）に皮下注射し（マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、約０．２ＭＢｑ）、２４又は７２時間後、１１１Ｉｎ−テトラジン２８（マウス当たり２１μｇ／７５μＬ、約０．８ＭＢｑ））を注射して実施した。テトラジン投与後３時間、動物をイソフルランで麻酔し頚椎脱臼により屠殺した。血液を心臓穿刺により取り出し、対象となる器官及び組織を取り出し、ドライブロッティングし秤量した。サンプルの放射能は、％ＩＤ／ｇを決定するための標準品と共にγ計数器で測定した。エネルギー窓は、１２５Ｉ及び１１１Ｉｎについてそれぞれ、１０〜８０ｋｅＶ、１００〜５１０ｋｅＶとした。放射性ラベル化ｍＡｂ及び１１１Ｉｎ−テトラジンの分布が表２〜５に示される。
【０１４４】
【表２】
2014506869.tif 000010
【０１４５】
【表３】
2014506869.tif 000011
【０１４６】
【表４】
2014506869.tif 000012
【０１４７】
【表５】
2014506869.tif 000013
前記生体内分布データは、前記第１のＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯ−Ｏメジャ２３ａに関してスペーサーの無いＣＣ４９−ＴＣＯ構成物のインビボでのより高い安定性を確認する。テトラジンの注射前にＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯＯ（ＣＣ４９−２３ａ）で処理されたマウスでは、腫瘍内に存在する高いｍＡｂ量（１５．８１±０．２２％ＩＤ／ｇ）は、前記ＴＣＯ及びテトラジンとの反応により、３．０９±０．０１％ＩＤ／ｇの１７７Ｌｕ蓄積を与える結果となった。残念なことに、１７７Ｌｕ−テトラジンと血液中循環する高濃度のｍＡｂ−ＴＣＯとの反応はまた、低腫瘍対血液比率（Ｔ／Ｂ＝３．１±１．０）を与える結果となった。前記Ｔ／Ｂは、前記放射性ラベル化テトラジンがｍＡｂ後４日で投与される場合には、ｍＡｂクリアランスにより改善された（２１．３±４．０）。しかしこの時点では腫瘍中には約４倍低い１７７Ｌｕ−テトラジン蓄積がまた観測された（０．８６±０．３９％ＩＤ／ｇ）。絶対的なテトラジン蓄積の減少は、組織からｍＡｂ−ＴＣＯが放出された結果ではなく（１０．９９±４．２４  ％ＩＤ／ｇの１２５Ｉ−ｍＡｂはなお腫瘍に存在する）、注射の間に４日間でインビボでのＴＣＯ分解によると考えられる。
【０１４８】
逆に、前記マウスがＰＥＧ１０スペーサーの無いＣＣ４９ＴＣＯ構成物で処理される場合、１１１Ｉｎ−テトラジンの腫瘍での取り込みの減少は、ｍＡｂ注射後１日に対してｍＡｂ注射後３日でも観測されなかった。同時に、前記Ｔ／Ｂ比率は、血液からｍＡｂ−ＴＣＯクリアランスのために約２から４異常に増加した。この時間の間の前記腫瘍結合ＴＣＯの維持された反応性は、前記第１のＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯに対してそのより高い安定性を強化する。
【０１４９】
実施例８
イメージング実験
腫瘍保持マウスにＰＥＧ１０スペーサー無しのＣＣ４９−ＴＣＯ構成物を投与した後３又は４日後に１１１Ｉｎ−テトラジン２８（マウス当たり２１μｇ／７５μＬ、２０〜５０ＭＢｑ）を注射した。約１時間後、マウスを麻酔し、麻酔のためのノーズコーンと呼吸モニターセンサを付けた動物ベッドに置いた。シングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフ（ＳＰＥＣＴ）は、４ヘッドマルチピンホール小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングシステム（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｉｎｃ．）を用いてテトラジン注射後２時間で実施した。前記ＳＰＥＣＴ取得（全１時間）は、１．４ｍｍ直径ピンホールで、及び１視野当たり１２０〜１４０秒の取得時間で実施された。１１１Ｉｎのエネルギー窓は、１３５ｋｅＶ±１５％及び１７１ｋｅＶ±２０％に設定された。最初のスキャンから２から４日後、マウスを過剰麻酔により安楽死させ、第２のＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャンを一晩取得した。それぞれのＳＰＥＣＴ測定の前にＣＴスキャン（１投影当たり２秒、３６０投影）を実行して放射能分布の解剖学的情報を得た。前記取得後、データは製造者のソフトウェア（ＩｎＶｉｖｏＳｃｏｐｅ  １．３９、  ｐａｔｃｈ  １）を持ち知恵繰り返し再構成した。興味対象領域（ＲＯＩ）は手動で、腫瘍、肝臓、腎臓及び大腿筋で３回描かれた。既知量の１１１Ｉｎを充填したファントムを、組織放射能定量化のためにスキャナーを較正するために使用した。ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏマイナー（ＣＣ４９−２０ｂ）、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２０ａ）及びＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｃマイナー（ＣＣ４９−１４ｂ）を注射された３マウスのそれぞれの時間でのイメージが、図１３Ａ〜Ｃにそれぞれ示される。
【０１５０】
図１３の左側は、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏマイナー（ＣＣ４９−２０ｂ）（Ａ）、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２０ａ）（Ｂ）又はＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｃマイナー（ＣＣ４９−１４ｂ）（Ｃ）の注射の３から４日後に、１１１Ｉｎーテトラジン２８（マウス当たり２１μｇ／７５μＬ、約４０ＭＢｑ）を注射後２時間での生きたマウスのＳＰＥＣＴ／ＣＴ投影画像である。図１３の右側は、最初のイメージング実験の後２から４日後の同じマウスの死後ＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャンを示す。
【０１５１】
マウスでの縦ＳＰＥＣＴ／ＣＴ研究は、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏ（メジャー及びマイナーの両方）での前処理後３日で腫瘍への１１１Ｉｎ−テトラジン取り込みを示し、それによりこれらのＴＣＯ−構成物のインビボでの安定性を確認する（図１３Ａ及びＢ）。この時点で、非腫瘍結合のｍＡｂ−ＴＣＯのほとんどが循環系から除去され、従って、腫瘍以外の可視化される器官は、１１１ＩＮ−テトラジン尿中排泄による腎臓及び膀胱のみである。重要なことは、血液中及び肝臓などの血液の多い器官には放射能が見られないということである。バックグランド放射能が非常に低いことは、前記第１のＣＣ４９−ＰＥＧ１０−ＴＣＯで得られる結果に関して基本的な改善となり（Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．Ｒｅｎａｒｔ  Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｓａｎｄｒａ  Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、１．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ２０１０、４９、３３７５）」参照）、これは患者の骨髄及び投与制限される器官へのより低暴露を与えることとなる。
【０１５２】
注目すべきことは、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏで処理されたマウスの腫瘍は、１１１Ｉｎ−テトラジン注射後７２から９６時間でもなお高い放射能を持つということであり、これは前記ＴＣＯ−テトラジンシクロ付加生成物のインビボでの高い安定性を示唆するものである。後の時点で、いくらかの活性がなおマウス腎臓で見られ、いくらかが肝臓に蓄積されているが、これは抗原脱離、及びテトラジン注射の時点で血液中になお循環するｍＡｂの除去によると考えられる。相当な長い時間の間腫瘍での放射能が維持されることはまた、癌患者でプレターゲットＲＩＴが目的とされる場合に非常に重要となる。事実、治療用放射性核がより長くターゲット組織に結合することは、前記腫瘍へのより高い用量を輸送することとなる。驚くべきことに、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｃマイナーの投与の後に１１１Ｉｎ−テトラジンを注射されたマウスではむしろ低放射能取り込みが観察されたということであり、これは前記２つの処置の間の４日の遅延によると考えられる。しかしこの場合はなた、腫瘍でのシグナルは、最初のスキャン後２日でもなお存在し、このことはインビボでのディールスアルダー反応から得られるシクロ付加生成物のインビボでの安定性を確認するものである。
【０１５３】
実施例９
この実施例は、シクロオクテンの種々の位置での種々の置換基のインシリコ試験に関する。種々の置換シクロオクテンについて、ＨＯＭＯエネルギーをＭＯＰＡＣソフトウェア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｓｔｗａｒｅ  Ｍｏｐａｃ  Ｐｒｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０３）を用いて計算された。得られた結果を以下表６に示す。
表６  異なる置換基についてＭＩＰＡＣで決定されたＨＯＭＯ。エネルギー
ここで（ａ）はアキシャル；（ｅ）はエカトリアルを示す。炭素原子は次の構造式により番号付けされている。
【０１５４】
【化７】
2014506869.tif 000014
【０１５５】
【表６】
2014506869.tif 000015
2014506869.tif 000016
実施例１０
テトラジン２８の他の合成手順及び対応するＧｄ−錯体、２８−Ｇｄ
図１５に、５−オキソ−５−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−ｌ、４−ジホドロ−１、２、４、５−ｔテトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ペンタン酸（３０）の合成経路が示される。
【０１５６】
６−（６−（オイリジン−２−イル）−１、４−ジホドロ−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−アミン（２９）は文献（Ｍ．Ｌ．Ｂｌａｃｋｍａｎ、Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ．Ｊ．Ｆｏｘ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８、１３０、１３５１８−１３５１９）に従った。２９（４２８ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び無水グルタル酸（２３１ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中混合物を６０℃に４０時間、アルゴン不活性雰囲気下で加熱した。冷却後、オレンジ色の沈殿をＴＨＦ（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥してオレンジ色固体として３０を得た（５３７ｍｇ、８７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．１（ｂｒ．ｓ、１Ｈ）、１０．３７（ｓ、１Ｈ）、８．９２（ｓ、１Ｈ）、８．８７（ｓ、１Ｈ）、８．８２（ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１５（ｄｄ、Ｊ１＝８．４Ｈｚ、Ｊ２＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．０−７．９（ｍ、３Ｈ）、７．５３（ｄｔ、Ｊ１＝１．８Ｈｚ、Ｊ２＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．４３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．８３（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：５＝１７４．２、１７１．６、１４８．６、１４７．３、１４６．３、１４６．１、１４１．４、１３８．９、１３７．４、１３７．２、１２６．６、１２５．３、１２１．３、１２０．９、３５．３、３２．９、２０．２；ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ１７Ｈ１８Ｎ７Ｏ３＋（［Ｍ＋Ｕ］＋）：３６８．１５、実測値：３６８．２５
５−オキソ−５−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ペンタン酸（６）
化合物３０（１６６ｍｇ；０．４５２ｍｍｏｌ）を酢酸（３ｍＬ）中に懸濁させ、亜硝酸ナトリウム（９３．５ｍｇ；１．３６ｍｍｏｌ）を添加した。紫色懸濁液に直ぐに変化した。撹拌１５分後、反応混合物を濾過し、水（２ｘ６ｍＬ）及びアセトン（３ｍＬ）で洗浄し乾燥して、紫色固体として生成物を得た（１５２ｍｇ、９２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．１３（ｓ、１Ｈ）、１０．５８（ｓ、１Ｈ）、９．０５（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．９４（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．６２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６０（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄｄ、Ｊ１＝２．３Ｈｚ、Ｊ２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１６（ｔｄ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３（ｄｄｄ、Ｊ１＝１．１Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ、Ｊ３＝７．４Ｈｚ）、２．５０（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．３３（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．８６（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１７４．１（ｑ）、１７２．０（ｑ）、１６３．０（ｑ）、１６２．７（ｑ）、１５０．６（ｔ）、１５０．２（ｑ）、１４３．８（ｑ）、１４１．３（ｔ）、１３８．４（ｑ）、１３７．７（ｔ）、１２６．５（ｔ）、１２６．１（ｔ）、１２４．８（ｔ）、１２４．１（ｔ）、３５．４（ｓ）、３２．９（ｓ）、２０．２（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ１７Ｈ１６Ｎ７Ｏ３＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：３６６．１３１４、実測値：３６６．１３１３．
ｔｅｒｔ−ブチル（３７、４１−ジオキソ−４１−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３−ウンデカオキサ−３６−アザヘンテトラコンチル）カルバメート（３１）
ＰｙＢＯＰ（１４８ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を、６（９４．４ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）、アミノ−ＰＥＧ１０−アミノ−Ｂｏｃ（１５０ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）、及びＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（新規に蒸留した。１００ｍｇ、０．７７４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ９中混合物に０℃で添加した。混合物を室温に戻し撹拌を１５分間続けた。透明、暗赤色溶液を揮発させて乾燥し、生成物をクロロホルム（５ｍＬ）に再度溶解させ、０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ＝４．３、３．３ｍＬ）溶液及び飽和Ｎａ２ＣＯ３（２．３ｍＬ）溶液で洗浄し、その後ジエチルエーテル（２０ｍＬ）中で沈殿させた。沈殿は遠心装置で収集し、シリカ上で、クロロホルム中のメタノールの勾配（０〜１０％）を用いてカラムクロマトグラフにより精製し、紫色ワックス状固体として３１を得た（１４８ｍｇ、６４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝９．０７（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．９７（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．７３（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．７２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６３（ｄｄ、Ｊ１＝２．３Ｈｚ、Ｊ２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０３（ｔｄ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．５９（ｄｄｄ、Ｊ１＝１．１Ｈｚ、Ｊ２＝４．６Ｈｚ、Ｊ３＝７．４Ｈｚ）、７．０１（ｓ、１Ｈ）、５．１４（ｓ、１Ｈ）、３．９−３．２（ｂｒｏａｄｓ、４８Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．０９（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．４３（ｓ、９Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７３．８（ｑ）、１７３．１（ｑ）、１６３．８（ｑ）、１６３．７（ｑ）、１５１．３（ｔ）、１５０．５（ｑ）、１４４．０（ｑ）、１４２．７（ｔ）、１３９．２（ｑ）、１３７．９（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２６．９（ｔ）、１２５．５（ｔ）、１２４．７（ｔ）、７９．５（ｑ）、７０．５（ｓ）、７０．１（ｓ）、４０．７（ｓ）、３９．７（ｓ）、３６．５（ｓ）、３５．５（ｓ）、２８．８（ｐ）、２１．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ４６Ｈ７４Ｎ９Ｏ１５＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：９９２．５３０４、実測値：９９２．５３０１
２、２’、２’’−（１０−（２、４０、４４−トリオキソ−４４−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ウンデカオキサ−３、３９−ジアザテトラテトラコンチル）−１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７−トリイル）トリ酢酸（２８）
生成物３１（７２．３ｍｇ、０．０７２７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ１ｍＬ）中に溶解して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。蒸発させた後、残渣をアセトニトリル（１．５ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）で沈殿させた。紫色沈殿をろ過して分離し、３２のＴＦＡ塩を定量的に得た。これをＤＭＦ（１．５ｍＬ）中に溶解し、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ（６９．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）及びＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（新たに蒸留して使用。４４ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０分撹拌した。当家な暗赤色／紫色溶液を揮発させて、粗生成物を水に溶解し、分取用ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、２８（８０．５ｍｇ、収率８７％を超える）が得られた。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：５＝９．２２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、９．１０（ｄｄ、Ｊ１＝４．７Ｈｚ、Ｊ２＝１．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．７８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．７５（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９（ｄｄ、Ｊ１＝２．４Ｈｚ、Ｊ２＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３２（ｔｄ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．０８（ｄｄｄ、Ｊ１ｉ＝１．１Ｈｚ、Ｊ２＝４．７Ｈｚ、Ｊ３＝７．８Ｈｚ）、３．９−３．１（ｍ、８０Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：５＝１７２．８（ｑ）、１７２．５（ｑ）、１６３．８（ｑ）、１６３．５（ｑ）、１５１．３（ｔ）、１５０．９（ｑ）、１４４．５（ｑ）、１４２．０（ｔ）、１３９．３（ｑ）、１３８．５（ｔ）、１２７．３（ｔ）、１２６．９（ｔ）、１２５．６（ｔ）、１２４．９（ｔ）、７０．５（ｓ）、７０．３（ｓ）、６９．９（ｓ）、６９．５（ｓ）、３９．２（ｓ）、３６．４（ｓ）、３５．２（ｓ）、２１．７（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ５７Ｈ９２Ｎｉ３０２０＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：１２７８．６５８２、実測値：１２７８．６５５７
２８のＧｄＩＩＩ−錯体（２８−ＧｄＩＩＩ）
化合物２８（２０４ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）を水溶性酢酸アンモニウム（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．５、５ｍＬ）中に溶解し、酢酸ガドリニウム（ＩＩＩ）水和物（９６．８ｍｇ、０．２３９ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を室温で３０分撹拌し、直ぐに分取ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、ＧｄＩＩＩ−錯体が、紫色固体として得られた（１８８ｍｇ、８２％収率）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ５７Ｈ８９Ｎｉ１３Ｏ２０Ｇｄ＋（［Ｍ＋Ｈ］＋）：１４３３．５６、実測値：１４３３．５８．
実施例１１
新テトラアザプローブの化学合成
他のテトラジン部分を持ついくつかのテトラジン型プローブが合成された。
合成経路は図１６に示されている。
【０１５７】
３−（５−ブチルアミド−２−ピリジル）−６−（５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（３５）
２−シアノ−５−トリフルオロメチル−ピリジン（２００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、２−シアノ−５−アミノ−ピリジン（３００ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）及び硫黄（８０ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中、アルゴン不活性雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン水和物（０．６０ｇ；１２．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８０℃で一番加熱した。反応混合物を冷却し、水（２ｍＬ）を添加した。遠心文して得た固体を水／エタノール＝１／２で洗浄し、乾燥して粗生成物３３を１３５ｍｇ得た。遠心分離の上澄みを集めて水を加えることでさらに粗生成物の沈殿させ、遠心分離して乾燥させた。この粗生成物アミン（３３）及び無水酪酸（２８５ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（の５ｍＬ）中で一晩６５℃で撹拌した。反応混合物を脳ｈスクして残渣をヘキサン／ジエチルエーテル＝３／１中で撹拌した。この懸濁液をガラスフィルタで濾過し、残渣を、溶出液としてヘキサン／アセトン勾配を用いてシリカカラムクロマトグラフし、粗生成物３４（約６０％純度）を９０ｍｇ得た。前記粗アミド化ジヒドロテトラジン３４（６２ｍｇ）を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）と水（２．０ｍＬ）との混合物に懸濁させた。撹拌の間に、ＮａＮＯ２（８８ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を添加し、その後水（１ｍＬ）中の硫酸（１３０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）溶液を、０℃で滴下した。撹拌３分後、反応混合物をクロロホルムと水で希釈し、紫色沈殿を得、これをガラスフィルタで濾過して分離した。濾液の有機層を濃縮し、ジエチルエーテルで希釈して、第２の紫色固体生成物を得た。固体を一緒にして、クロロホルム及びジエチルエーテルの混合物で粉砕し、濾過して、純粋なテトラジン３５（約２５ｍｇ、２−シアノ−５−トリフルオロメチル−ピリジンから計算して全収率８％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝９．２（ｓ、１Ｈ）、８．９（ｄ、１Ｈ）、８．７５（多重シグナル、３Ｈ）、８．３（ｄ、１Ｈ）、２．４５（ｔ、２Ｈ）、１．８（ｍ、２Ｈ）、１．０５（ｔ、３Ｈ）ｐｐｍ．１９ＦＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝−６２．９ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムの１つのピーク、ｍ／ｚ＝３９０．２（Ｍ＋Ｈ＋）及び８００．８（２Ｍ＋Ｎａ＋）、λｍａｘ＝３２９及び５２６ｎｍ
３−（５−フルオロ−２−ピリジル）−６−（５−ブタンアミド−２−ピリジルイ）−１、２、４、５−テトラジン（３８）
２−シアノ−５−フルオロ−ピリジン（１００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）、２−シアノ−５−アミノ−ピリジン（２００ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）及び硫黄（５５ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を、エタノール（１．５ｍＬ）中アルゴン不活性雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン水和物（０．３５ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を９０℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、エタノール（５ｍＬ）を添加した。ガラスフィルタで濾過して固体を得、これをヘキサンで洗浄して、乾燥して、粗生成物３６を９０ｍｇ得た。
【０１５８】
続いて、この組成アミン生成物３６及び無酪酸（９３ｍｇ；０．５９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中で６５℃で撹拌加熱した。アルゴン下で一晩反応させた後、反応混合物を冷却し、いくらかのヘキサン（約３ｍＬ）で希釈してガラスフィルタで濾過した。残渣を、溶出溶媒としてヘキサン／アセトン混合物でシリカカラムクロマトグラフにより精製し、純粋なアミド化生成物３７（約２８ｍｇ、２−シアノ−５−フロロ−ピリジンから計算して全収率１０％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝９．２５（ｂｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７（ｓ、１Ｈ）、８．５（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．４（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｉｇｎａｌｓ、２Ｈ）、８．２（ｍ、１Ｈ）、８．１（ｍ、１Ｈ）、７．９５（ｍ、１Ｈ）、７．５（ｍ、１Ｈ）、２．４（ｔ、２Ｈ）、１．７５（ｍ、２Ｈ）、１．０５（ｔ、３Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７２．８、１６１．６、１５９．０、１４６．６、１４６．１、１４３．５（ｄ）、１４１．６、１３９．３、１３６．８、１３６．６、１３６．４、１２７．０、１２４．０、１２３．８、１２２．６、１２１．５、３８．９、１８．８、１３．５ｐｐｍ（Ｃ−Ｆカップリングによる、いくつかの炭素シグナルはダブレット）．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムの１つのピークｍ／ｚ＝３４２．１（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２８８ｎｍ．
アミド化ジヒドロテトラジン３７（２８ｍｇ；０．０８２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２ｍＬ）及び水（２ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。撹拌の間に、ＮａＮＯ２（８５ｍｇ；１．２３ｍｍｏｌ）、及び水（２ｍＬ９中の硫酸（１２０ｍｇ；１．２３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。直ぐに紫色懸濁液となった。撹拌３分後、クロロホルムと水を添加した。紫色のクロロホルム層を水で２回線上し、濃縮した。固体表面対残渣を少量のクロロホルム中で撹拌し、そこのヘキサンを添加した。ほとんど無職の上澄みを除き、固体を乾燥させて２１ｍｇの紫色粉末（収率７５％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝８．８（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｉｇｎａｌｓ、５Ｈ）、７．７５（ｍ、１Ｈ）、２．４５（ｔ、２Ｈ）、１．８（ｍ、２Ｈ）、１．０５（ｔ、３Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．４、１６２．９、１６２．６、１６２．４、１５９．８、１４６．０、１４３．２、１４１．３、１３９．７ａｎｄ１３９．４、１３８．８、１２６．９、１２５．８（ｄ）、１２５．２、１２４．４、１２４．２、３９．０、１８．７、１３．５ｐｐｍ（Ｃ−Ｆカップリングによる、炭素シグナルのいくつかはダブレット）．１９ＦＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）：δを＝−１２０．４ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムの１つのピークｍ／ｚ＝３４０．２（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝３２４及び５２９ｎｍ．
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１、２、４、５−テトラジン（４０）  
２−シアノピリジン（５００ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、アセタミジンヒドロクロリド（２．００ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）及び硫黄（１５５ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）中でアルゴン不活性雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン水和物（２．７ｇ；５５．２ｍｍｏｌ）を展開して混合物を２０℃で一晩撹拌した。混濁を濾過し、濾液を蒸発乾燥させ、オレンジ色粗生成物３９を２．９ｇ得た。
【０１５９】
続いて、この粗生成物（８００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）及び酢酸（４ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。水（３ｍＬ９中のＮａＮＯ２（２．０ｇ；２９．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。直ぐに赤／紫色懸濁液となった。０℃で５分間撹拌後、クロロホルムと水を添加した。紫色クロロホルム層を水で２回洗浄し、その後濃縮した。固体表面対残渣を、クロロホルムとヘキサンの１：１混合物中で撹拌し、その後濾過した。濾液を濃縮し、粗生成物を、クロロホルム／アセトン混合物を溶出溶媒として用いてシリカクロマトグラフで精製し、純粋な生成物４０を得た（４８ｍｇ、２−シアノピリジンから計算して全収率２１％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．９６（ｄ、２Ｈ）、８．６５（ｄ、２Ｈ）、７．９９（ｔ、２Ｈ）、７．５６（ｄｄ、３Ｈ）、３．１７（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６８．１．１６３．６、１５０．９、１５０．３、１３７．４、１２６．３、１２３．９、２１．４ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムから１つのピーク、ｍ／ｚ＝１７４．３（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２７４及び５２４ｎｍ．
３、６−ビス（４−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（４２）
４−シアノピリジン（８５８ｍｇ；８．２４ｍｍｏｌ）及びヒドラジン水和物（１．２４ｇ；２４．７ｍｍｏｌ）を、アルゴン不活性雰囲気下で９０℃で１６時間加熱した。混合物を室温に冷却し、水で希釈した。オレンジ色の沈殿（４１）を濾過し、水（３ｍＬ）で洗浄し、続いてＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中に溶解した。ＤＤＣ（３７２ｍｇ；１．６４ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。直ぐに暗赤色溶液となった。６０分後、飽和水素化炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）を添加し、生成物をクロロホルムで抽出した（３０ｍＬ、３回）。有機層を集めてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させて乾燥して、表題の化合物をピンク色固体として得た（５２ｍｇ；４−シアノピリジンから計算した全収率５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．９７（ｄ、４Ｈ）、８．５２（ｄ、４Ｈ）ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クトマトグラムからの１ピーク、ｍ／ｚ＝２３７．２（Ｍ＋Ｈ＋）、λｍａｘ＝２７１及び５２３ｎｍ．
実施例１２
さらなるトランスーシクロオクテン構成物の化学合成
詳細な合成経路は図１７に示される。
【０１６０】
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（シクロオク−４−テン−１−ニルオキシ）アセテート（４４ａ）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１０ａ（１．７３ｇ、１３．７３ｍｍｏｌ、約１０％のシス異性体が混入）の氷冷溶液に、オイル中の水素化ナトリウム（６０％、２．６０ｇ、６５．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１５分間混合物を撹拌した後、５０℃で１時間加熱した。混合物を氷冷し、ブロモ酢酸（２．５０ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁液を１時間氷冷して撹拌し、その後２５℃で６４時間撹拌し、さらにＴＨＦを撹拌可能にするために添加した（合計１００ｍＬ）。５０℃で１時間加熱後、混合物を冷却し水をゆっくりと添加した。ロータリーエバポレーターでほとんどのＴＨＦを除去し、さらに水を加えた（合計５０ｍＬ）。水溶性混合物を、ＭＴＢＥで抽出し（２ｘ７５ｍｌ）、その後有機層を２５ｍＬの水で洗浄した。水溶を集めて、１６ｇのクエン酸で酸性化し、生成物を２ｘ７５ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥しロータリーエバポレーターで除去し、残渣をカラムクロマトグラフで精製した（４０ｇ、ＳｉＯ２）。生成物画分を集め、痕跡量のＭＴＢＥを含むヘプタンから再結晶させた。これにより８１０ｍｇの生成物４３ａを得た（８１０ｍｇ、４．４０ｍｍｏｌ、３２％少量のシス異性体を含む）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．４−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．１−３．２（ｍ、１Ｈ）、３．９−４．１（ＡＢ、２Ｈ）、５．３−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
生成物４３ａを３０ｍＬのクロロホルムに溶解した。Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（７１５ｍｇ、６．２２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（１．４２ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷して３０分撹拌し、その後室温で４時間撹拌した。濾過して、ロータリーエバポレーターで濃縮し、４０ｇのシリカ上で、ヘプタン／酢酸エチル勾配を溶出溶媒として用いてクロマトグラフにより、４４ａを得た。生成物画分を集め、少量のＭＴＢＥを含むヘプタンから再結晶した。生成物はこすると結晶化した。濾過後、生成物１８０ｍｇが得られた（０．６４ｍｍｏｌ、１５％、シス異性体が約２０％混在）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．４−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．８（ｓ、４Ｈ）、３．１−３．２（ｍ、１Ｈ）、４．３（ｓ、２Ｈ）、５．３−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（シクロオク−４−テン−１−ニルオキシ）アセテート（４４ｂ）
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の１０ｂ（０．７８ｇ、６．１９ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、オイル中の水素化ナトリウム（６０％を超える、０．９４ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１５分間混合物を撹拌した後、５０℃で１時間加熱した。混合物を氷冷し、ブロモ酢酸（１．４１ｇ、１０．１４ｍｏｌ）を添加した。この懸濁液を約３５℃で２０時間撹拌し（サンプルはカップリングが生じていないことを示した）、続いて５５℃で６時間、２５℃で３日間、さらに６時間５５℃で撹拌した。ロータリーエバポレーターでほとんどのＴＨＦを除去し、さらに５０ｍＬのＭＲＢＥ、続いて氷と水２５ｍＬを加えた。層分離させ、水層を３０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。有機層を合せて２５ｍＬの水で洗浄した。水層を合せて氷で冷却し、５０ｍＬのＭＲＢＥを添加し、続いて５．１ｇのクエン酸を添加した。相分離させ、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥させロータリーエバポレーターで濃縮して得られた残渣（４３ｂ）を次のステップに使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ、２Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
生成物４３ｂを３０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒロソキシスクシンイミド（１．６０ｇ、１３．９１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（３．１１ｇ、１５．１０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷して３０分、その後室温で３時間撹拌した。濾過して、ロータリーエバポレーターで濃縮し、４０ｇのシリカ上で、トルエンを溶出溶媒として用いてクロマトグラフして４４ｂを得、これをブロモ酢酸のＮＨＳエステルと混合した。混合物を２５ｍＬＭＴＢＥ中に溶解させ、２５ｍＬのヘプタンを溶液に添加した。２時間撹拌後、混合物を濾過した（固体はブロモ酢酸のＮＨＳエステル）。濾液をロータリーエバポレーターし、残渣を暖めたＭＴＢＥに溶解し、いくらかのヘプタンを添加して溶液を室温に戻した。これにより沈殿を得た。ろ過して生成物４４ｂを３０ｍｇ得た（０．１１ｍｍｏｌ、２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．４（ｓ、２Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）．
（Ｅ−メジャーｒ）−２、５−ヂオキソピロリジン−１−イル  ２−（シクロオク−４−テ−１−イルオキシ）−２−フェニルアセテート（４６ａ）  
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１０ａ（３．０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、１０％未満のシス異性体混入）溶液にオイル中の６０％ＮａＨ（３．０ｇ、７５．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１０分間撹拌し、１．５時間５０℃に加熱した。氷冷後、ＤＬ−２−ブロモフェニル酢酸（３．８７ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を分けて添加した。ＴＨＦ（２０ｍＬ）を得られた粘性ペースト状物の添加し、得られた懸濁液を２５℃で１８時間撹拌した。ＴＨＦのほとんどをロータリーエバポレーターで５５℃で除去した後、５５ｍＬのＭＴＢＥを加えた。混合物を冷水で冷却して、いくらかの氷を加え、続いて５０ｍＬの水を添加した。層を分離し、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。有機層を集めて２０ｍＬの水で洗浄した。水層を集めて氷冷し、５０ｍＬのＭＲＢＥを添加し、続いて１０ｇのクエン酸を加えた。層を分離し、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥してロータリーエバポレーターして残った５．０５ｇの生成物４５ａを次のステップに使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．０５−３．１５（ｍ、１Ｈ）、４．８（２ｓ、１Ｈ）、５．１５−５．３（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、１Ｈ）、７．３−７．５（ｍ、５Ｈ）．
生成物５４ａを５０ｍＬｎｏジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．５１ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（５．０３ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷して１５分、その後室温で３時間撹拌した。濾過、ロータリーエバポレーター、さらにトルエン／ジクロロメタン勾配溶出溶媒で５５ｇのシリカ上でクロマトグラフにより、２．８ｇの４６ａを得た（７．８３ｍｍｏｌ、１０ａから３３％収率、約５％のシス異性体が混入）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．４−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．７（ｓ、４Ｈ）、３．２５−３．３５（ｍ、１Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ、１Ｈ）、５．２（ｓ、２Ｈ）、５．３５−５．６５（ｍ、２Ｈ９、７．３５−７．５５（ｍ、５Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２、５−２、５−ジオキソピリジン−１−イル  ２ー（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）−２−フェニルアセテート（４６ｂ）
前記混合物とオイル中ＮａＨ（１．２６ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）を１．５時間５０℃に加熱した。０℃に冷却後、Ｄ、Ｌ−２−ブロモフェニル酢酸（２．２２ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の溶液として添加し、粘調懸濁液を激しく室温で１６時間撹拌した。さらに２４時間４０℃で加熱した後、混合物を水（１００ｍＬ）中のクエン酸（９．２ｇ）溶液中へ投入した。水性混合物をＭＴＢＥで抽出し（３ｘ５０ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させて黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ２％）で精製し、生成物、未反応ＴＣＯ及び副生成物の混合物を得た。さらに精製は、ＭＴＢＥ及び水に溶解し、これを３３％ＮａＯＨ溶液で塩基性とすることで行った。水層をＭＴＢＥで洗浄し、クエン酸で酸性化し、ついでＭＴＢＥで抽出した（３ｘ）。有機層を集めてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させて、化合物４５ｂを黄色油状物として得た（４６３ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ、２３％収率）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．７−３．８（ｍ、１Ｈ）、４．９及び４．９５（２ｓ、１Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）、７．３−７．５５（ｍ、５Ｈ）．
４５ｂ（４６３ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２５０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（９ｍＬ）溶液中に、０℃で、ＤＣＣ（３７２ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）養溶液を添加した。反応混合物を室温で１６時間」撹拌し、沈殿を濾過して除去した。濾液を真空で濃縮しカラムクロマトグラフ（Ｓｉ２、ヘプタン／酢酸エチル勾配２５％〜４０％）により精製して、４６ｂ（４５１ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、７１％収率）でム速シロップ状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．１−２．６（ｍ、１０Ｈ）、２．８（ｓ、４Ｈ）、３．８−３．９（ｍ、１Ｈ）、５．２ａｎｄ５．３（２ｓ、２Ｈ）、５．４−５．７５（ｍ、２Ｈ）、７．３−７．６（ｍ、５Ｈ）．
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）−２−メチルプロパノエート（４９ａ）
ＴＨＦ（１２０ｍｌ）中の１０ａ（３．０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）の溶液を氷冷し、オイル中の６０％を超える水素化ナトリウム（３．８ｇ、９５ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷バスを取り除き、混合物を室温で３０分間撹拌し、次に５０℃で１時間撹拌した。氷冷後、ＤＬ−ブロモプロピオン酸（３．３ｍＬ、３５．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物は添加の間に非常に粘調となり、ＴＨＦ（５０ｍＬ）で希釈した。添加を完了した後氷冷バスを外し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行は、ＮＭＲで追跡し、１６時間後４０％の変換が示された。反応混合物を次にさらに２４時間３５℃で撹拌して８４％の変換を達成した。反応混合物を真空で濃縮し、ＭＴＢＥで希釈し、その後水（２００ｍＬ）で失活させた。層を分離させ、水層を水（６０ｍＬ９中のクエン酸（２２．５ｇ）の溶液で酸性化した。水層をＭＴＢＥで抽出した（３ｘ２００ｍＬ）。有機層を合せて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、４７ａを含む混合物（５．１９ｇ）を得た。これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ）、１．４（ｄ）（１３Ｈ）、３．１−３．２（ｍ、１Ｈ）、３．９−４．０（ｑ、１Ｈ）、５．３−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
−７０℃でＴＨＦ（２００ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（１３ｍＬ、９２ｍｍｏｌ）に、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ブチルリチウム（３２ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物をゆっくりと−２０℃に上げ、再び−７０℃に冷却した。化合物４７ａ（５．１９ｇ）をＴＨＦ溶液として添加し、得られた混合物をー２０℃に上げた。この温度でヨードメタン（１０．７ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５℃に上げた。サンプルを取り出してＮＭＲ分析して、反応の完了を確認した。
反応混合物を水（２００ｍＬ）中のクエン酸（４０ｇ）溶液中に入れ、ＭＴＢＥで抽出した（３ｘ１５０ｍＬ）。有機層を集めて塩含有水溶性クエン酸で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した後溶媒を蒸発させて黄色オイル状物を得た（９．４ｇ）。カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ＣＨ２ＣＨ２／ＭｅＯＨ１〜４％勾配）で精製し、純粋な４８ａを黄色シロップ状物として得た（１．１５ｇ、５．４ｍｍｏｌ、２ステップで収率２３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ）及び１．４（２ｓ）（１６Ｈ）、３．２−３．３（ｍ、１Ｈ）、５．３−５．７（ｍ、２Ｈ）．
４８ａ（１．１５ｇ、５．４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６２２ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２７ｍＬ）溶液に、０℃で、ＤＣＣ（１．１２ｇ、５．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液」を添加した。勾配を室温に上げた後その温度で１６時間撹拌した。勾配をＭＴＢＥで希釈し、沈殿を濾過して除いた。溶媒を蒸発させた後残渣をカラムクロマトグラフ（ＳＯ２、ヘプタン／酢酸エチル２０〜４０％勾配）で精製した。ヘプタン／酢酸エチルから再結晶して、４９ａを無色結晶として得た（７０７ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、収率４２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５−２．４（ｍ）、１．５５（ｓ）、１．６０（ｓ）（１６Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．２−３．３（ｍ、１Ｈ）、５．４−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）−２−メチルプロパノエート（４９ｂ）
氷冷したＴＨＦ（６０ｍＬ９中の１０ｂ（１．５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液中に、６０％を超えるオイル中の水素化ナトリウム（１．５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷バスを外して混合物を５０℃で１．５時間撹拌した。氷冷して、ＤＬ−ブロモプロピオン酸（１．７ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物は添加の間に非常に粘調になり、ＴＨＦ（３５ｍＬ）で希釈した。添加を終了後、氷冷バスを外し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物は次に４３℃に上げさらに２４時間撹拌した。反応混合物を真空で濃縮し、ＭＴＢＥで希釈し、水で失活させた（２００ｍＬ）。層分離させ、水層を水中のクエン酸で酸性化した。水層をＭＴＢＥで抽出した（３ｘ１００ｍＬ）。有機層を集め、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させて４７ｂを含む混合物を得た（２．２６ｇ）。この物はさらに精製することなく次のステップで使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．５（ｍ）及び１．５（２ｄ）（１３Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、３．９５−４．１５（２ｑ、１Ｈ）、５．４−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のジイシプロピルアミン（５．６ｍＬ、３９．６ｍｍｏｌ）の溶液中に、−７０℃で、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ブチルリチウム（１３．５ｍＬ、３３．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物を次の０℃に上げ、再び−７０℃へ下げた。この温度で、ヨードメタン（４．６ｍＬ、７３．９ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を１５℃に上げた。サンプルを取り出しＮＭＲ分析により反応終了を確認した。反応混合物を水（１４０ｍＬ）中のクエン酸に入れてＭＴＢＥで抽出した（３ｘ１００ｍＬ）。有機層を集めて、塩含有水溶性クエン酸で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、溶媒を蒸発させて黄色シロップ状物を得た（４．６ｇ）。カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ＣＨ２ＣＨ２／ＭｅＯＨ１％〜４％勾配）で繰り返し精製して純粋な４８ｂを白色結晶性固体として得た（１８１ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、２ステップで収率７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ）及び１．４５（２ｓ）（１６Ｈ）、３．９−４．０（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
ＴＨＦ（５ｍＬ９中の４８ｂ（１８１ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）に、０℃でＤＣＣ（１７５ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を添加した。添加後、混合物を室温に上げ、その温度で５時間撹拌した。混合物をＭＴＢＥで希釈し、沈殿を濾過して除いた。蒸発後の残渣をカラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ヘプタン／酢酸エチル２５％勾配）で精製して、４９ｂを白色固体として得た（２５７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−２．６（ｍ）、１．５５（ｓ）、１．６０（ｓ）（１６Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．８−３．９（ｍ、１Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）
（Ｅ−メジャー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキソ）ベンゾエート（５２ａ）
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の１０ａ（３．５４ｇ、２７．３８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にオイル中水素化ナトリウム（６０％を超える、２．５ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間氷冷して撹拌し、その後５０℃にして１時間撹拌した。混合物を氷冷して、４−フロロベンゾイルクロリド（１．７２ｇ、１０．８４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＴＨＦに溶解して、５分間で添加した。混合物を２日２５℃で撹拌し（サンプルのＮＭＲは多くの生成物を示したが、また４−フロロ安息香酸のＴＣＯエステルの存在も示した）、その後３時間５０℃で撹拌した。混合物を水で冷却し、１０ｍＬの水をゆっくりと添加し、次に２ｇの水酸化ナトリウム及び５ｍＬの水を添加した。ロータリーエバポレーターで溶媒をほとんど除去し、ＴＨＦ及び２ｇの水酸化ナトリウムを添加し、混合物を５０℃で４時間暖めた。ロータリーエバポレーターでほとんどの溶媒を除去し、メタノールを残渣ペースト状物に添加した。混合物を５０℃で２時間温め、次にロータリーエバポレーターで５５℃で暖めた。残渣懸濁物を５０ｍＬの水で希釈した。ＭＴＢＥ（１００ｍｌ）を添加し、前記層を分離して有機層を水２５ｍＬで洗浄した。有機層は、ａ．ｏ．トランスシクロオクテノールを含有する。氷冷した水層を集めて、２０ｇのクエン酸で処理し、生成物を２ｘ７５ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥してロータリーエバポレーターで溶媒を除去して得られた固体残渣は、生成物と４−フロロ安息香酸を含んでいた。前記固体を４０ｍＬのメタノールで暖めた。水（１５〜２０ｍＬ）をゆっくりと前記暖めた溶液に、濁りが生じるまで添加した。濾過して濾液を冷却することで生成物を沈殿させた。これを濾過し、１／１のメタノール／水で洗浄し、真空乾燥して、望ましい生成物５１ａを０．８２７ｇ得た（３．３６ｍｍｏｌ、４−フロロベンゾイルクロリドから計算して収率３０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５−２．５（ｍ、１０Ｈ）、４．０−４．１（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．７５（ｍ、２Ｈ）、６．８（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
メジャートランス酸５１ａ（１．１４ｇ、４．６３ｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７２５ｍｇ、６．３０ｍｍｏｌ）の５０ｍＬジクロロメタンの氷冷混合物を、ＤＣＣ（１．４６ｇ、７．０８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を１時間氷冷温度で撹拌し、次に室温で３時間撹拌した。濾過し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除いた後、４０ｇのシリカゲルでヘプタン／酢酸エチル勾配を用いてクロマトグラフして、シス異性体を含有した５２ａの画分を得た。次の生成物画分と合せ、ヘプタンと酢酸エチル混合物と共に６０℃に暖めた。懸濁液を室温へ冷却し、次に濾過した。これにより生成物５２ａを０．９７３ｇ得た（２．８３ｍｍｏｌ、６１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．６−２．５（ｍ、１０Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、４．０−４．１（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．７５（ｍ、２Ｈ）、６．８（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）ベンゾエート（５２ｂ）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１０ｂ（２．８２ｇ、２２．３８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にオイル中水素化ナトリウム（６０％を超える、２．０ｇ、５０５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間氷冷して撹拌し、その後室温で３０分、その後５０℃にして１時間撹拌した。混合物を氷冷して、４−フロロベンゾイルクロリド（１．７２ｇ、１０．８４ｍｍｏｌ）を８ｍＬＴＨＦに溶解して、１５分間で添加した。混合物を１８時間室温で撹拌し（サンプルのＮＭＲは多くのトランスシクロオクテノールを示した）、その後３時間５０℃で、３日間２５℃で撹拌した。水５ｍＬ中の２．０ｇの水酸化ナトリウム溶液をゆっくりと添加し、次に５ｍＬの水を添加した。ロータリーエバポレーターでＴＨＦをほとんど除去し、４０ｍＬのメタノールを添加してペースト状物を得た。混合物を５０℃で３時間温め、２０ｍＬのＴＨＦを添加し、加熱を４時間続けた。混合物を一晩２５℃で撹拌し（ＮＭＲは、なお少量のエステルの存在を示した）、次の４時間５０℃に加熱し、続いてロータリーエバポレーター蒸発させた。残留懸濁物を５０ｍＬの水で希釈した。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を添加し、前記層を分離し、有機層を２５ｍＬの水で洗浄した。有機層は、ａ．ｏ．トランスシクロオクテノールを含む。合せて氷冷した水層を１５ｇのクエン酸で処理し、生成物を２ｘ７５ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥後ロータリーエバポレーターで蒸発させて得られた固体残渣は生成物と４−フロロ安息香酸との混合物からなっていた。固体を４０ｍＬのメタノールで暖めた。水（２５ｍＬ）を、前記暖めた溶液中にゆっくりと添加し、続いて室温へ冷却し一晩撹拌した。濾過し、１／１のメタノール／水で洗浄し、真空乾燥して、望む生成物５１ｂを０．７６ｇ得た（３．０９ｍｍｏｌ、４−フロロベンゾイルクロリドから計算して２８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．３−２．６（ｍ、１０Ｈ）、４．５５−４．６５（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．８５（ｍ、２Ｈ）、６．９（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
前記マイナートランス酸５１ｂ（０．６６ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の５０ｍＬジクロロメタン氷冷混合物を、ＤＣＣ（４６０ｍｇ、４．６１ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を氷冷して１時間撹拌し、次に室温で１６時間撹拌した。濾過し、ロータリーエバポレーターした後、ジクロロメタンを溶出溶媒として用いて３０ｇのシリカゲルでクロマトグラフを行った。生成物を５ｍＬの酢酸エチルに溶解した。ヘプタンを添加し、溶液を沈殿が現れるまで部分的に６０℃でロータリーエバポレーターした。ヘプタンを加えて混合物を５分間６０℃で撹拌し、次の室温へ冷却した。濾過して、生成物５２ｂを０．４３７ｇ得た（１．２７ｍｍｏｌ、４７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．４−２．６（ｍ、１０Ｈ）、２．９（ｓ、４Ｈ）、４．５５−４．６５（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．８（ｍ、２Ｈ）、６．９（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
（Ｅ−メジャー、マイナー）２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−メチルシクロオク−４−テン−１−イル）アセテート（５８）
過酸化水素（２５ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）の３５％溶液を、酢酸パラジウム（４５％Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、１．０ｇ、２ｍｍｏｌ）、ベンゾキノン（４３２ｍｇ、４ｍｍｏｌ）及び１、５−シクロオクタジエン（２７ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）の混合物へ添加した。混合物を３０℃で５日間、ＮＭＲ分析が出発物質の９５％変換を示すまで撹拌した。混合物をＥｔ２Ｏ（１Ｌ）へ投入し、水を添加した（１Ｌ）。混合物を、氷冷下で、３３％のＮａＯＨ溶液でゆっくりと塩基性とした。前記層を分離し、水層をＥｔ２Ｏで抽出した（２ｘ）。有機層を合せて、１ＮのＮａＯＨで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を注意して蒸発させて、粗生成物５３を黄色オイル状物として得た（１６．１ｇ、１３０ｍｍｏｌ、収率６５％）。
【０１６１】
ヘキサン中１．６Ｍのｎ−ブチルリチウム溶液（４５ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルアミン（１４ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５０ｍＬ）溶液中に、−８０℃で添加した。混合物を徐々に０℃に温めて次に−８０℃に冷却した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のトリエチルホスホノアセテート（１５ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）溶液を添加し、混合物を４５分間−７０℃で撹拌した。その後、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の５３（６．２１ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物をゆっくりと室温へ戻した。１６時間後混合物をさらに加熱し、ＮＭＲ分析により変換が完了したことを示すまで８時間還流した。混合物を水（２５０ｍＬ）に投入し、ＭＴＢＥで抽出した（３ｘ）。有機層を合せて塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレーターで除き、カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ヘプタン／酢酸エチル５％）で精製して５４を無色オイル状物として得た（４．７４ｇ、２４ｍｍｏｌ、４９％収率）。
【０１６２】
メチルリチウム（５９ｍＬ、９４ｍｍｏｌ）の１．６Ｍ溶液を、Ｅｔ２Ｏ（２１ｍＬ）中ヨウ化銅（Ｉ）（９．５３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の懸濁物を氷冷して添加した。灰色溶液を真空で０℃で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出した。残渣を冷ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中で懸濁させ、−８０℃に冷却して後、ＴＭＳＣｌ（４．０ｍＬ、４６．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その後、ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中の５４（４．７４ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下し、混合物を室温で２時間以上暖めた。混合物をさらに１６時間室温で撹拌し、その後飽和水溶性ＮＨ４Ｃｌ（１５０ｍＬ）で失活させた。混合物を室温で撹拌し、アンモニア（５０ｍＬ９を添加した。混合物を濾過し、濾液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３ｘ７５ｍＬ）。有機層を合せて水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレーター蒸発させ、カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ヘプタン／酢酸エチル３％）で精製して、５５を無色オイル状物として得た（４．４７ｇ、２１ｍｍｏｌ、８９％収率）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−１．９（ｍ）、１．０５（ｓ）及び１．２５（ｔ）（１６Ｈ）、２．１５−２．３（ｍ、２Ｈ）、４．０−４．２（ｑ、２Ｈ）、５．４−５．５５（ｍ、１Ｈ）、５．６５−５．７５（ｍ、１Ｈ）．
水銀ランプを備え、及びポンプと、１０％硝酸銀（Ｉ）含有シリカゲル（３６ｇ、底部にはいくらかの通常グレードのシリカゲルを含む）を充填したカラムに接続されたフラスコに、ヘプタン／Ｅｔ２Ｏ（３：１体積／体積）（約５００ｍＬ）を充填した。５５（４．４７ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）及びメチルベンゾエート（２．７ｍＬ、２１．３ｍｍｏｌ）を少量のＥｔ２Ｏの溶液を添加した後、水銀ランプのスイッチを入れた。前記カラムを通じる照射溶液の連続流に２０時間照射した後、ＮＭＲ分析で出発物質がもはや観測されなくなり、前記反応物及びカラムをヘプタン中３０％のＭＴＢＥで洗浄した。前記カラム内容物をアンモニアで処理し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３ｘ）．
有機層を合せてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ヘプタン／酢酸エチル３％〜４％勾配）で精製して、化合物５６を得た（１．４１ｇ、６．７ｍｍｏｌ、収率３１％）。前記メジャー及びマイナー異性体は分離されず、従って、これらの異性体は混合物としてさらに使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８−１．９（ｍ）、１．０（ｓ）及び１．２５（ｔ）（１６Ｈ）、２．１−２．４（ｍ、２Ｈ）、４．０−４．２（ｑ、２Ｈ）、５．５−５．６５  （ｍ、２Ｈ）．
水（１ｍＬ）及びＥｔＯＨ（１ｍＬ）中の水酸化リチウム１水和物（８４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を５６（２１０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に添加した。前記化合物をより溶解させるために、ＴＨＦ（１ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加した。室温で１６時間撹拌後、変換はなお完了しなかった。追加の水酸化リチウム（８５ｍｇ）を添加して、混合物を４５℃に４時間加熱し、後３０℃で１６時間及び５０℃で４時間、変換が完了するまで加熱した。混合物を真空で濃縮し、クエン酸溶液で中和した。ＭＴＢＥで抽出（３ｘ）し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させて、５７を黄色オイル状物として得た（１５０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、収率８２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．０（２ｓ、３Ｈ）、１．３−２．０（ｍ、１０Ｈ）、２．１−２．４５（ｍ、２Ｈ）、５．５
５．６５（ｍ、２Ｈ）．
５７（１５０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１３ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の氷冷ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、ＤＣＣ（１７０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）溶液を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＭＴＢＥで希釈した。沈殿を濾過して除去し、溶媒を蒸発させた後、カラムクロマトグラフ（ＳｉＯ２、ヘプタン／酢酸エチル１０％〜３０％勾配）で精製し、無色オイル状物として化合物５８を得た（１９７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、８６％収率）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．０５ａｎｄ１．１（２ｓ、３Ｈ）、１．３５−２．３５（ｍ、１０Ｈ）、２．４（ｓ、１Ｈ）、２．５−２．７５（ＡＢ、１Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、５．５−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
実施例１３
新規なＴＣＯの反応速度論
新規に合成したＴＣＯ構成物がそれぞれのテトラジン２８に対する反応性について評価された。手順は実施冷５に記載されている。
【０１６３】
【表７】
2014506869.tif 000017
全てのＴＣＯについて、前記メジャー（エカトリアル）及びマイナー（アキシャル）異性体の間に一貫した一定の反応性の違いがあり、マイナー異性体がメジャー異性体よりもずっと反応性が高い。さらに、ＴＣＯ５８の高い反応性は、抗体へのリンカーなしでもアキシャル位置での置換はなお、トランスシクロオクテン環の反応性を増加させること、を支持する。
【０１６４】
実施例１４
新規モデルテトラジンプローブの安定性と反応性
他のテトラジン部分を含むいくつかのテトラジンモデルプローブが、水中でのそれらの反応性及び安定性につき評価された。
テトラジンの加水分解安定性
ＤＭＳＯ（２５ｍＭ）中の特定のテトラジンの１０μＬ溶液をＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）で希釈し、この溶液を濾過した。
ＵＶスペクトル分析を用いて、５２５ｎｍの吸収バンドの減少をモニタし、加水分解速度のデータから半減期を決定した。
テトラジンの、トランス−シクロオク−４−テ−１−ノール（マイナー異性体、１０ｂ）に対する反応性
競争実験を、特定にテトラジン及び３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１、２、４、５−テトラジン（これは標準テトラジンとして選択された）との反応性の比率を、トランス−シクロオク−４−テ−１−ノール（マイナーいせおタイ、１０ｂ）との逆−電子要求ディールスアルダー反応において、決定するために実施した。
【０１６５】
アセトニトル（０．１００ｍＬ）に、ＤＭＳＯ（２５ｍＭ）中の特定のテトラジン溶液５μＬ及びＤＭＳＯ（２５ｍＭ）前記標準テトラジン５μＬを添加した。この混合物を水（０．９ｍＬ）で希釈し、両方のテトラジンの絶対量をＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析装置で決定した。続いて、ＤＭＳＯ（２５μＬ、２．５ｍＭ）のトランス−シクロオク−４−テ−１−ノール（マイナー異性体、１０ｂ）を添加し、混合物を５分撹拌した。再び、両方のテトラジンの絶対量をＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析装置で決定し、両方のテトラジンの変換を計算した。この変換から、両方のテトラジンの反応性比率を決定した。
【０１６６】
【表８】
2014506869.tif 000018
表８から、テトラジンのち換気は、安定性及び反応性に対して一定の効果を持ち、特定の応用に合わせたプローブの設計において使用することができる、ということを明らかになる。
【０１６７】
実施例１５
メジュアー対マイナーＴＣＯ、２０ａ対２０ｂのテトラジンプローブ２８との、インビトロ反応性の違い
この実験は、より高いＴＣＯ反応性は、放射性ラベル化テトラジンと、両方の試薬が低濃度でより高い反応収率を与える、ということを示すために実施された。この目的で、我々は、ＣＣ４９（メジャー及びマイナーそれぞれの分子当たり６．１及び６．６ＴＣＯ）と共役したＴＣＯメジャー２０ａ（ｋ２＝  １９６００±１４００  Ｍ−１ｓ−１）及びＴＣＯマイナー２０ｂ（ｋ２＝１３６７００±２３００Ｍ−１ｓ−１）を用いた。２つのｍＡｂ溶液をＰＢＳで希釈し、ＴＣＯ濃度を、１ｘ１０−５Ｍから１ｘ１０−８Ｍの範囲とし、支持体付加１７７Ｌｕ−テトラジン（ｍＡｂに対して１当量）と３７ドで１分間反応させた。その後過剰のテトラジン６で失活させた前記反応混合物の一部（２０μｌ）に、非減少性サンプル緩衝液を加えＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。シクロ付加反応は、前記ｍＡｂに対応するバンドの放射能から決定し、計数（カウント）をＡＩＤＡ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアで定量化した。実験は３回繰り返した。生体分子反応について予期されるように、溶液中での２つの反応種の濃度における減少は、１分のインキュベート後ではより低い反応性となる（図１８）。しかし、アキシャルＴＣＯ２０ｂを用いる場合には、反応収率は、エカトリアルＴＣＯ２０ａでマイクロモル濃度以下で得られるよりもずっと高く、これはテトラジンとのより速い反応速度によるものである。
【０１６８】
実施例１６
ＴＣＯ２０ｂのインビボ安定性
この実験は、実施例６で説明したインビボＴＣＯ安定性測定を拡張するために実施された。この一連において、ＰＥＧスペーサーでＣＣ４９と結合されたＴＯＣメジャー及びマイナー（２３ａ及び２７ｂ）はインビボでは不安定であることが示され、一方ＰＥＧスペーサのないＴＣＯメジャー（２０ａ）は、少なくとも４日間インビボで安定であることが見出された（図１３）。新たな実験では、同じ手順に従って、我々は、ＰＥＧスペーサなしでＣＣ４９−結合ＴＣＯマイナーのインビボ安定性を試験した。前記インビボ安定性データは、ｍＡｂクリアランスで補正して、図１９に示される。前記ＣＣ４９−結合ＴＣＯ２０ｂは、インビボではゆっくりと分解されることが見出され、さらに、抗体との短いリンカーを持つＴＣＯはインビボでは、より長いリンカーで共役されたＴＣＯよりもより安定であることが見出された。
【０１６９】
実施例１７
種々の範囲のＴＣＯ２０ｂ部分で官能基化されたＣＣ４９抗体の血中動態及び生体内分布
一連の研究が、ＣＣ４９分子当たりのＴＣＯ（２０ｂ）の数の、血液循環及び腫瘍ターゲットに対する影響の評価するために実施された。予想されることは、多すぎるＴＣＯ部分で抗体を修飾することは血液循環半減期を下げることとなり、ＣＣ４９ＴＣＯ構成物の腫瘍での取り込みに影響を与えるであろう、ということである。
ＣＣ４９−ＴＣＯ構成物の血中動態（図２０及び２１参照）
ヌードメスＢａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２５ｇ体重、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｎ＝３）に、ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、約０．５ＭＢｑ）当たり０、４．９、９．３または１５．８ＴＣＯ（２０ｂ）を担持する１２５Ｉ−ＣＣ４９担持を注射した。選択された時間（５分、３時間、６時間、１日、２日、３日）で、血液サンプルを在副静脈から取り出し、秤量して１ｍＬＰＢＳで希釈した。ｍＡｂ注射後４日で、動物は麻酔され頚椎脱臼で屠殺し、血液を心臓穿刺で集め、興味対象である器官及び組織を取り出し、乾燥ブロットし、秤量し１ｍＬＰＢＳを添加した。全てのサンプルの放射能がガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ  ＩＩ、  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、１グラムの組織当たりの注入された投与量（％ＩＤ／ｇ）を決定するための標準品当業者ともに測定した。血液中のＣＣ４９−ＴＣＯの半減期は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０１）を用いて、血液曲線を２相減衰にフィッティングさせて決定した。
【０１７０】
【表９】
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ＣＣ４９−ＴＣＯ（２０ｂ）構成物の腫瘍ターゲット
腫瘍保持マウス（方法を参照；１００ｍｍ３腫瘍サイズ）に、ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ／１００μ、約０．２〜０．４ＭＢｑ、ｎ＝４）当たり、０、８．５、１２．７又は１８．７グループで官能基化された１２５Ｉ−ＣＣ４９を注射した。１２５Ｉ−ＣＣ４９を受けたマウスをｍＡｂ注射後４日で屠殺した。１２５−ＣＣ４９−ＴＣＯ２０ｂを受けたマウスは、ｍＡｂ注射後２８及び７２時間後に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−テトラジン２８（ｍＡｂに関し２５当量、約０．８ＭＢｑ）を注射し、３時間後屠殺された。屠殺の時点で、血液を心臓穿刺で集め、興味対象である器官及び組織を集め、ブロット乾燥し、秤量し、１ｍＬのＰＢＳを加えた。全てのサンプルの放射能をガンマ計数器（Ｗｉｚａｒｄ  ３、  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、二重同位体手順（エネルギー窓は、１２５Ｉ、１１１Ｉｎのそれぞれで、１０〜８０ｋｅＶ及び１００から５１０ｋｅＶで設定）により、１グラム組織当たりのパーセント注入投与量（％ＩＤ／ｇ）を決定するための標準と共に測定した。
【０１７１】
【表１０】
2014506869.tif 000020
【０１７２】
【表１１】
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表９から表１１のデータから、ＴＣＯ就職比率は９を超えるべきではないことが明らかとなる。
【０１７３】
実施例１８
ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂの血液反応速度及びインボビ安定性
血中動態
無腫瘍マウス（群ごとにｎ＝３）に、７．５ＴＣＯ４４ｂグループ（マウス当たり１００μｇ、０．２〜０．４ＭＢｑ）で修飾されたＣＣ４９の１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９を注射した。選択された時点（１、３、６、２４、４８及び７２時間）で、伏在静脈から血液サンプルを取り出し、ヘパリン含有バイアルに集めた。ｍＡｂ注射後４日で、マウスを麻酔して脊椎脱臼で屠殺した。血液を心臓穿刺で集め、興味対象器官と組織を取り出し、ブロット乾燥し、秤量して１ｍＬのＰＢＳを添加して、器官当たりのパーセント注射投与量（％ＩＤ）を決定するために標準と共に、ガンマ係数器（Ｗｉｚａｒｄ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で放射能を測定した。
【０１７４】
この研究で、ＴＣＯ修飾ＣＣ４９は、修飾していないＣＣ４９の比較してやや速いクリアランスを示した（図２２）．
曲線下領域から計算された血液中の半減期（Ｔ１／２＝ｌｎ２ｘＡＵＣ／Ｃ０）は、ＣＣ４９−ＴＣＯ及びＣＣ４９でそれぞれ、２２．２及び２６．３時間であった。我々はこれは、ｍＡｂのＬｙｓ側鎖の官能基化によると考える。短い血液循環の結果として、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの低濃度がまた、ほとんどの器官で観察され、これは実験の終了時で、計数の前に灌流されなかった。
インビボ安定性
無腫瘍マウスの別の群（ｎ＝３）に、１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂ（マウス当たり２２０μｇ、０．４ＭＢｑ）を注射した。選択された時間（１、３、６、２４、４８及び７２時間）で、血液サンプルを伏在静脈から取り出し、ヘパリン含有バイアルに集めた。ｍＡｂ注射後４日でマウスを麻酔し、脊椎脱臼で屠殺した。血液を心臓穿刺で取り出し、胃と甲状腺を除去し、ブロット乾燥し、器官当たりにパーセント注射投与量  （％ＩＤ）を決定するため標準と共にガンマ計数器で計数した。これらの器官の低い１２５Ｉの取り込み（胃で０．１７±０．０３％ＩＤ及び甲状腺で０．８８±０．３３％ＩＤ）は、前記放射線ラベル化ｍＡｂが４日の評価の間、インビボで前記ラベルを維持することを確認する。
【０１７５】
血液サンプルを秤量し、ＰＢＳで１００μｌに希釈し、０．１ＭＢｑ／μｇの比放射能で放射性ラベル化過剰の担持体付加１７７Ｌｕ−テトラジン２８を添加した。この混合物を、２０分３７ドでインキュベートし、４００ｚｇで５分間遠心して血液細胞を分離した。その後、３０μｌの上澄みをＺｅｂａ脱塩スピンカラム（０．５ｍｌ、  ４０ｋＤａＭＷカット、Ｐｉｅｒｃｅ）へ適用した。遠心後、高分子量ディールスアルダー反応生成物をカートリッジから溶出し、一方で過剰のテトラジンを保持させた。溶出液中に含まれる放射能を、二重同位体手順（１２５Ｉ及び１７７Ｌｕに対してそれぞれ、１０〜８０ｋｅＶ、１５５〜３８０ｋｅＶの窓を設定）でガンマ計数器で測定した。１７７Ｌｕのみを含む血清サンプルが前記カートリッジから漏れる１７７Ｌｕを補正するために使用された。前記Ｉ計数は、放射性崩壊を補正し、１７７Ｌｕ／１２５Ｉ比率が計算された。１７７Ｌｕ／１２５Ｉ比率の減少は、マウス血液サンプル中に存在する過剰の１７７Ｌｕ−テトラジンと１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯとのより低い反応収率を意味し、それによりインビボでの前記ＴＣＯ器の不活性化を意味する。図２４は、時間と共に１７７Ｌｕ／１２５Ｉ比率の変化を、％当初（インタクト）ＴＣＯ（ｔ＝０で１００％に規格化されている）で示す。注目すべきことは、ＴＣＯ４４ｂはｍＡｂ注射後４８時間までインビボで完全に安定である（インタクトＴＣＯの９７．８±１．６％）であり、一方後にはいくらかの分解が見られる（ｍＡｂ注射後４日でインタクトＴＣＯの８０．４±１．８％）となる、ということである。
実施例１９
ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂでプレターゲットされた腫瘍保持マウスでの１７７Ｌｕ−テトラジン２８の生体内分布
腫瘍保持マウス（方法を参照；１００ｍｍ３腫瘍サイズ；ｎ＝４）に、７．５４４ｂ基で官能基化された１２５Ｉ−ＣＣ４９（マウス当たり、１００μｇ、約０．２ＭＢｑ）を注射した。ｍＡｂ注射後３０及び４８時間後、前記マウスは１投与の洗浄試薬（ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン、１投与当たり１６０μｇ）を投与され、続いて２時間後１７７Ｌｕ−テトラジン２８を投与された（ｍＡｂに対して１０当量、約０．５ＭＢｑ）。テトラジン注射後３時間、マウスは麻酔され脊椎脱臼で屠殺され、血液を心臓穿刺で取り出し、興味対象の器官と組織を取り出しブロット乾燥した。集めたサンプルを秤量し、１ｍＬＰＢＳを添加した。サンプルの放射能を、二重同位体手順（１２５Ｉ及び１７７Ｌｕについてそれぞれ、１０〜８０ｋｅＶ、１５５〜３８０ｋｅＶの窓を設定）で、１グラム当たりの組織のパーセント投与量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために標準と共にガンマ計数器で計数した。
【０１７６】
生体内分布データは、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂの高い腫瘍取り込みを示す。前記腫瘍取り込みは、他のＴＣＯ構成物で得られるよりも高く（下記参照）、これは７．５ＴＣＯ−４４ｂ器で官能基化されたＣＣ４９ｎｏより長い血液内循環によると考えられる。対照的に、全ての他の器官でのｍＡｂの保持は、２つの洗浄試薬を投与することで低くなるが、これらは前記循環ＣＣ４９−ＴＣＯを補足し、肝臓へ輸送し、そこで迅速に分解させるからである。腫瘍での高いｍＡｂの取り込みの結果として、また、１７７Ｌｕ−テトラジン取り込みも以前の実験で得られた結果よりもずっと高くなった。また、テトラジン投与の前の段階で非腫瘍結合性のＣＣ４９−ＴＣＯが除去されるために、全ての他の器官への１７７Ｌｕ取り込みは無視出来る程度となる。腎臓のみがむしろ高い１７７Ｌｕの保持を示すが、これはテトラジンの尿内排泄の結果である。これにより、腎臓以外の全ての器官において、高いターゲット対非ターゲット比率が得られる結果と成る。注目すべきことは、腫瘍及び血液に存在するＴＣＯの３４±４％および１０±１％がそれぞれテトラジンと反応したことである。
【０１７７】
【表１２】
2014506869.tif 000022
【０１７８】
以下本発明のいくつかの実施態様をまとめる。
１．ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化８】
2014506869.tif 000023
ここでＲの位置はエクアトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６まで、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ）（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＣＲ’ＮＲ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）；からなる群から選択される置換基を表し；Ｒ又はＲａの１つで、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない、キット。
２．実施態様１によるキットであり、前記式１のジエノフィルが、次の要求の
１以上を持たすキット：
（ａ）Ｘはメチル；
（ｂ）Ｙは］メチル：
（ｃ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキル；
（ｄ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリール；
（ｅ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアリール。
３．実施態様１又は２のいずれか一つに記載のキットであり、Ｘがメチル又は水素、Ｙがメチル又は水素、およびＲ３ａ又はＲ４ａがＯ−アルキル又はＯ−アリールである。
４．実施態様１乃至３のいずれかに記載のキットであり、前記リンカー部分がＲ３ａのＯ−アルキル又はＯ−アリール基へ結合する。
５．実施態様１乃至４のいずれかに記載のキットであり、前記ジエンが、式（２）、（３）、（４）および（５）の化合物からなる群から選択される：
【化９】
2014506869.tif 000024
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルール、ＣＦ３、ＣＦ２、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル））からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’はＨ、アリール又はアルキル）であり；
【化１０】
2014506869.tif 000025
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり：Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化１１】
2014506869.tif 000026
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はａｒｕｋｉｒｕ基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化１２】
2014506869.tif 000027
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、２、５−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル又はフェニールであって、これらは場合によりＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されていてもよい（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択され；および前記ジエンは、前記プレターゲットプローブ又はエフェクタープローブとの少なくとも１つのリンケージを、場合によりスペーサを介して含む、キット。
６．実施態様１乃至５のいずれかに記載のキットであり、前記プレターゲットプローブが、第１のターゲット部分として抗体を含む、キット。
７．実施態様１乃至６のいずれかに記載のキットであり、
前記エフェクタープローブが、エフェクター部分として検出可能なラベルを含み、前記ラベルが好ましくは、イメージングシステムで使用される造影剤であり、前記イメージング造影剤が、
ＭＲＩイメージング可能試薬、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答試薬、Ｘ線応答試薬、放射性核、ＦＲＥＴ−タイプ色素、（生体）発光又は蛍光分子又はタグ、ビオチン、常磁性イメージング剤および超常磁性イメージング剤からなる群から選択される、キット。
８．実施態様１乃至７のいずれかに記載のキットであり、前記エフェクタープローブが、エフェクター部分として、医薬的に活性な化合物を含む、キット。
９．実施態様８によるキットであり、前記医薬活性化合物が、
２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される、キット。
１０．第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が、実施態様５で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、プレターゲット試薬。
１１．検出可能なラベル、好ましくは、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体および生体直交反応性基を含み、
前記生体直交反応性基が、実施態様５で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、イメージングプローブ。
１２．好ましくは、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される医薬活性化合物と生体直交反応性基を含む治療用プローブであり、前記生体直交反応性基が、実施態様５で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、治療用プローブ。
１３．実施態様１０によるプレターゲット試薬を対処物に投与し、前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１のターゲット部分が第１のターゲットへ結合するための有効な時間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去することを含む、プレターゲット方法。
１４．実施態様１３のプレターゲット方法を実施して、実施態様１１のイメージングプローブを投与することを含むイメージング方法であり、前記プレターゲット試薬および前記イメージングプローブの生体直交反応性基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、イメージング方法。
１５．対象物にターゲット医療治療の方法であり、実施態様１３のプレターゲット方法を実施し、次に実施態様１２の治療用プローブを投与することを含み、前記プレターゲット試薬および前記治療プローブの生体直交反応性基が一緒になって、前記［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、方法。
１６．実施態様１３乃至１５のいずれか１つの方法で使用するための実施態様１０の試薬。
１７．動物又はヒトでプレターゲットで使用するための、実施態様１乃至４のいずれかで定めた式（１）を満たす化合物の使用。
１８．１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテン、好ましくは実施態様１乃至４のいずれかで定められた式（１）を満たす化合物の、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でジエノフィルとしての使用。
１９．ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化１３】
2014506869.tif 000028
ここでＲの位置はエクアトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６まで、アルキル、Ｏ−アルキル、
Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓｉ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＳＯ３、ＳＯ４、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ又はアルキル）ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨまアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、Ｒａの１つは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；
Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない、キット。
２０．実施態様１９に記載のキットであり、式１のジエノフィルが次の要求の少なくとも１つを満たす：
（ａ）Ｘはメチル；
（ｂ）Ｙは］メチル：
（ｃ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキル；
（ｄ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリール。
２１．実施態様１９又は２０のいずれか一つに記載のキットであり、Ｘがメチル又は水素、Ｙがメチル又は水素、およびＲ３ａ又はＲ４ａがＯ−アルキル又はＯ−アリールである。
２２．実施態様１９乃至２１のいずれかに記載のキットであり、前記リンカー部分がＲ３ａＯ−アルキル又はＯ−アリール基へ結合する。
２３．実施態様１９乃至２２のいずれかに記載のキットであり、前記ジエンが、式（２）、（３）、（４）および（５）の化合物からなる群から選択される：
【化１４】
2014506869.tif 000029
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルール、Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｏ−、およびＮＨ２：Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル））からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及び
Ｙは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキルから選択され；
【化１５】
2014506869.tif 000030
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキルおよびＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯであり：Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−アルキル、およびＮから選択され：Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化１６】
2014506869.tif 000031
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、ＯＣ（＝Ｏ）−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、およびＮＯ２からなる群から選択され、Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−アルキルからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化１７】
2014506869.tif 000032
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、フェニール又は、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されているフェニール（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択され；２４．実施態様１９乃至２３のいずれかのキットであり、前記プレターゲットプローブが、第１のターゲット部分として抗体を含む、キット。
２５．実施態様１９乃至２４のいずれかに記載のキットであり、
前記エフェクタープローブが、エフェクター部分として検出可能なラベルを含み、前記ラベルが好ましくは、イメージングシステムで使用される造影剤であり、前記イメージング造影剤が、
ＭＲＩイメージング可能試薬、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答試薬、Ｘ線応答試薬、放射性核、ＦＲＥＴ−タイプ色素、（生体）発光又は蛍光分子又はタグ、ビオチン、常磁性イメージング剤および超常磁性イメージング剤からなる群から選択される、キット。
２６．実施態様１９乃至２５のいずれかに記載のキットであり、前記エフェクタープローブが、エフェクター部分として、医薬的に活性な化合物を含む、キット。
２７．実施態様２６によるキットであり、前記医薬活性化合物が、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される、キット。
２８．第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が、実施態様２３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、プレターゲット試薬。
２９．検出可能なラベル、好ましくは、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体および生体直交反応性基を含み、
前記生体直交反応性基が、実施態様２３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、イメージングプローブ。
３０．好ましくは、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される医薬活性化合物と生体直交反応性基を含む治療用プローブであり、前記生体直交反応性基が、実施態様２３で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、治療用プローブ。
３１．実施態様２８によるプレターゲット試薬を対処物に投与し、前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１のターゲット部分が第１のターゲットへ結合するための有効な時間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去することを含む、プレターゲット方法。
３２．実施態様１３のプレターゲット方法を実施して、実施態様２９のイメージングプローブを投与することを含むイメージング方法であり、前記プレターゲット試薬および前記イメージングプローブの生体直交反応性基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、イメージング方法。
３３．対象物にターゲット医療治療の方法であり、実施態様３１のプレターゲット方法を実施し、次に実施態様３０の治療用プローブを投与することを含み、前記プレターゲット試薬および前記治療プローブの生体直交反応性基が一緒になって、前記［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、方法。
３４．実施態様３１乃至３３のいずれか１つの方法で使用するための実施態様２８の試薬。
３５．動物又はヒトでプレターゲットで使用するための、実施態様１９乃至２２のいずれかで定めた式（１）を満たす化合物の使用。
３６．１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテン、好ましくは実施態様１９乃至２２のいずれかで定められた式（１）を満たす化合物の、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でジエノフィルとしての使用。
さらなる実施態様を以下まとめる。
実施態様１．ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化１８】
2014506869.tif 000033
ここで、Ｒの位置はエカトリアルであり、Ｒａのちはアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、ＲおよびＲａは独立してそれぞれ、Ｈ又は最大６の、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓｉ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＳＯ３、ＳＯ４、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’およびＲ’’は独立してＨ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨまアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、Ｒ又はＲａの１つは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない、キット。
実施態様２．実施態様１に記載のキットであり、式１のジエノフィルが次の要求の少なくとも１つを満たす：
（ａ）Ｘはメチル；
（ｂ）Ｙは］メチル：
（ｃ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキル；
（ｄ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリール。
実施態様３．実施態様１又は２のいずれかのキットであり、Ｘがメチル又は水素であり、Ｙがメチル又は水素であり、およびＲ３ａ又はＲ４ａがＯ−アルキル又はＯ−アリールである、キット。
実施態様４．実施態様１乃至３のいずれかのキットであり、前記リンカー部分が、Ｒ３ａのＯ−アルキル又はＯ−アリール部分に結合される、キット。
実施態様５．実施態様１乃至４のいずれかのキットであり、前記ジエンは、以下式（２）、（３）、（４）及び（５）に示される化合物：
【化１９】
2014506869.tif 000034
ここで、Ｒ１は、アルキル、アルール、Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｏ−、及びＮＨ２からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）−アルキルからなる群から選択され；
【化２０】
2014506869.tif 000035
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され：Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯであり：Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化２１】
2014506869.tif 000036
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−Ｏアルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化２２】
2014506869.tif 000037
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、フェニール、又はＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されたフェニール（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択される。
実施態様６．実施態様１乃至５のいずれかのキットであり、前記プレターゲットプローブが、第１のターゲット部分として抗体を含む、キット。
実施態様７．実施態様１乃至６のいずれかに記載のキットであり、前記エフェクタープローブが、エフェクター部分として検出可能なラベルを含み、前記ラベルが好ましくは、イメージングシステムで使用される造影剤であり、前記イメージング造影剤が、ＭＲＩイメージング可能試薬、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答試薬、Ｘ線応答試薬、放射性核、ＦＲＥＴ−タイプ色素、（生体）発光又は蛍光分子又はタグ、ビオチン、常磁性イメージング剤および超常磁性イメージング剤からなる群から選択される、キット。
実施態様８．実施態様１乃至７のいずれかに記載のキットであり、前記エフェクタープローブが、エフェクター部分として、医薬的に活性な化合物を含む、キット。
実施態様９．実施態様８によるキットであり、前記医薬活性化合物が、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される、キット。
実施態様１０．第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が、実施態様５で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、プレターゲット試薬。
実施態様１１．検出可能なラベル、好ましくは、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体および生体直交反応性基を含み、
前記生体直交反応性基が、実施態様５で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、イメージングプローブ。
実施態様１２．好ましくは、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される医薬活性化合物と生体直交反応性基を含む治療用プローブであり、前記生体直交反応性基が、実施態様５で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、実施態様１から４のいずれかによるジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、治療用プローブ。
実施態様１３．実施態様１０によるプレターゲット試薬を対処物に投与し、前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１のターゲット部分が第１のターゲットへ結合するための有効な時間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去することを含む、プレターゲット方法。
実施態様１４．実施態様１３のプレターゲット方法を実施して、実施態様１１のイメージングプローブを投与することを含むイメージング方法であり、前記プレターゲット試薬および前記イメージングプローブの生体直交反応性基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、イメージング方法。
実施態様１５．対象物のターゲット医療治療の方法であり、実施態様１３のプレターゲット方法を実施し、次に実施態様１２の治療用プローブを投与することを含み、前記プレターゲット試薬および前記治療プローブの生体直交反応性基が一緒になって、前記［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成する、方法。
実施態様１６．実施態様１３乃至１５のいずれか１つの方法で使用するための実施態様１０の試薬。
実施態様１７．動物又はヒトでプレターゲットで使用するための、実施態様１乃至４のいずれかで定めた式（１）を満たす化合物の使用。
実施態様１８．１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテン、好ましくは実施態様１乃至４のいずれかで定められた式（１）を満たす化合物の、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でジエノフィルとしての使用。
【図１】
2014506869.tif 000048
【図２】
2014506869.tif 000049
【図３ａ】
2014506869.tif 000050
【図３ｂ】
2014506869.tif 000051
【図４】
2014506869.tif 000052
【図５】
2014506869.tif 000053
【図６】
2014506869.tif 000054
【図７】
2014506869.tif 000055
【図８】
2014506869.tif 000056
【図９】
2014506869.tif 000057
【図１０】
2014506869.tif 000058
【図１１】
2014506869.tif 000059
【図１２】
2014506869.tif 000060
【図１３】
2014506869.tif 000061
【図１４】
2014506869.tif 000062
【図１５】
2014506869.tif 000063
【図１６】
2014506869.tif 000064
【図１７】
2014506869.tif 000065
【図１８】
2014506869.tif 000066
【図１９】
2014506869.tif 000067
【図２０】
2014506869.tif 000068
【図２１】
2014506869.tif 000069
【図２２】
2014506869.tif 000070
【図２３】
2014506869.tif 000071
【図２４】
2014506869.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月16日(2013.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化１】
2014506869.tif 000073
ここでＲの位置はエクアトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６まで、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ）（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＣＲ’ＮＲ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）；からなる群から選択される置換基を表し；Ｒａは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない。
【請求項２】
請求項１に記載のキットであり、式１のジエノフィルが次の要求の少なくとも１つを満たす：
（ａ）Ｘはメチル；
（ｂ）Ｙはメチル：
（ｃ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキル；
（ｄ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリール；
（ｅ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアルキル；
（ｆ）Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアリール。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載のキットであり、前記ジエンが、下式（２）、（３）、（４）及び（５）の化合物からなる群から選択され：
【化２】
2014506869.tif 000074
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルール、ＣＦ３、ＣＦ２、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’はＨ、アリール又はアルキル）からなる群から選択され；
【化３】
2014506869.tif 000075
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、
水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり：Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化４】
2014506869.tif 000076
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はａｒｕｋｉｒｕ基であり、Ｒ’’’はそれぞれ独立してアリール又はアルキル）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化５】
2014506869.tif 000077
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、２、５−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル又はフェニールであって、これらは場合によりＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されていてもよい（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択され；及び、前記ジエンは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへの少なくとも１つのリンケージを含む、キット。
【請求項４】
第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が請求項１又は２のいずれかに定めたジエノフィルとしての式（１）のジエノフィルである、プレターゲット試薬。
【請求項５】
検出可能なラベル、好ましくは、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体および生体直交反応性基を含み、前記生体直交反応性基が、請求項１又は２のいずれかに定めた式（１）のジエノフィルである、イメージングプローブ。
【請求項６】
好ましくは、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される医薬活性化合物と生体直交反応性基を含む治療用プローブであり、前記生体直交反応性基が、請求項１又は２のいずれかで定めた式（１）によるジエノフィルである、治療用プローブ。
【請求項７】
請求項４によるプレターゲット試薬を対処物に投与し、前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１のターゲット部分が第１のターゲットへ結合するための有効な時間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去することを含む、プレターゲット方法。
【請求項８】
イメージング方法であり、前記方法は：
−  請求項７のプレターゲット方法を実施し、次に、検出可能なラベル、好ましくは、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体を含むラベル及び生体直交反応性基を投与することを含み、前記生体直交反応性基が請求項３に規定する式（２）から（５）のいずれかのジエンである、又は
−  第１のターゲット部分を含むプレターゲット試薬を及び生体直交反応性基を対象物に投与することを含み、前記試薬を前記対象物のシステム内を、前記第１のターゲット部分が第１のターゲットへの結合を達成する有効な時間の間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去して、さらに請求項５に記載のイメージングプローブを投与することを含み、前記プレターゲット試薬及び前記イメージングプローブの生体直交反応性基が共に［４＋２］レトロディールスアルダー反応の相手となる、イメージング方法。
【請求項９】
対象物のターゲット医療治療の方法であり、前記方法は：
−  請求項７のプレターゲット方法を実施し、次に医薬的活性化合物、好ましくは、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択される同位体を含む治療用プローブ、及び生体直交反応性基を投与することを含み、前記生体直交反応性基が請求項３に規定する式（２）から（５）のいずれかのジエンである、又は
−  第１のターゲット部分を含むプレターゲット試薬を及び生体直交反応性基を対象物に投与することを含み、前記試薬を前記対象物のシステム内を、前記生体直交反応性基が請求項３に規定する式（２）から（５）のいずれかのジエンであり、前記対象物の体内で第１のターゲットへの結合を達成する有効な時間の間循環させ、次に前記体内から非結合試薬を除去して、さらに請求項６に記載のイメージングプローブを投与することを含み、前記プレターゲット試薬及び前記治療用プローブの生体直交反応性基が共に［４＋２］レトロディールスアルダー反応の相手となる、医療治療の方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の試薬の、請求項７乃至９のいずれか一項に記載の方法での使用。
【請求項１１】
請求項１又は２のいずれか一項に定められる式（１）を満たす化合物の、動物又はヒトのプレターゲット方法での使用。
【請求項１２】
１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテン、好ましくは実施態様１乃至４のいずれかで定められた式（１）を満たす化合物の、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でジエノフィルとしての使用。
【請求項１３】
ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性部を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性部を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性部のいずれかがジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性部がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
【化６】
2014506869.tif 000078
ここで、Ｒの位置はエカトリアルであり、Ｒａのちはアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、ＲおよびＲａは独立してそれぞれ、Ｈ又は最大６の、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓｉ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＳＯ３、ＳＯ４、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’およびＲ’’は独立してＨ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨまアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）、Ｒ又はＲａの１つは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない、キット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキットであり、前記ジエンが以下式（２）、（３）、（４）及び（５）に示される化合物：
【化７】
2014506869.tif 000079
ここで、Ｒ１は、アルキル、アルール、Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｏ−、及びＮＨ２からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）−アルキルからなる群から選択され；
【化８】
2014506869.tif 000080
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され：Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯであり：Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化９】
2014506869.tif 000081
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）−Ｏアルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化１０】
2014506869.tif 000082
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、フェニール、又はＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されたフェニール（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニール、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択される。
【請求項１５】
第１のターゲット部分と生体直交反応性基を含むプレターゲット試薬であり、前記生体直交反応性基が、請求項１４で規定された式（２）から（５）のいずれかによるジエンと、請求項１３で規定された式（１）のジエノフィルとの間の［４＋２］レトロディールスアルダー反応のための反応相手である、プレターゲット試薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【化１】
2014506869.tif 000083
ここでＲの位置はエクアトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６まで、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ）（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）、ＣＲ’ＮＲ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルール）；からなる群から選択される置換基を表し；Ｒａは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲａ基の２つが共に環を形成し；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲａは水素ではない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
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