(57)【要約】蛍光又は発蛍光団のいずれかの化合物が提供される。化合物を含む組成物及び物品も提供される。加えて、この化合物を用いて微生物を検出する方法が提供される。化合物はフッ素化されており、かつ酸性条件下で有利に使用することのできるものである。【選択図】図２
2014511846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2014511846.tif 000038
（式中、
Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノであり、
Ｒ２は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基であり、
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ４及びＲ５は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであり、
（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである）。
【請求項２】
Ｒ２が、糖基、糖酸基、アミノ糖基、カルボキシル末端化アミノ酸基、カルボキシル末端化ペプチド基、エステル基、エステル含有基、ホスフェート基、又はスルファート基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、単糖基又は二糖基である糖基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、−（ＣＯ）−ＯＲ３であり、Ｒ３、がアルキルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１が、五員の複素環を有する複素環基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１が、ベンゼン環に縮合した五員の複素環を有する複素環基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
水混和性有機溶媒と、式（Ｉ）の化合物とを含む、組成物
【化２】
2014511846.tif 000039
（式中、
Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノであり、
Ｒ２は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基であり、
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ４及びＲ５は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであり、
（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである）。
【請求項８】
前記組成物が、式（Ｉ−１）の化合物と式（Ｉ−２）の化合物との混合物を含む、請求項７に記載の組成物。
【化３】
2014511846.tif 000040
【請求項９】
物品であって、
ａ）支持層である第一層と、
ｂ）前記支持層に隣接する第二層と、を含み、前記第二層が、式（Ｉ）の化合物
【化４】
2014511846.tif 000041
（式中、
Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノであり、
Ｒ２は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基であり、
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ４及びＲ５は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであり、
（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである）を含む、物品。
【請求項１０】
前記第二層が、式（Ｉ−１）の化合物と、式（Ｉ−２）の化合物との混合物を含む、請求項９に記載の物品。
【化５】
2014511846.tif 000042
【請求項１１】
前記第二層が、ゲル化剤、増殖培地、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項９又は１０に記載の物品。
【請求項１２】
前記第二層が脱水されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１３】
前記第二層が、ポリマー粒子を更に含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１４】
前記ポリマー粒子が、アクリレートポリマー又はコポリマー、スチレンポリマー又はコポリマー、セルロースポリマー又はコポリマー、デキストランポリマー又はコポリマー、これらの誘導体、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の物品。
【請求項１５】
前記ポリマー粒子が、０．０１マイクロメートル〜１マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、請求項１３又は１４に記載の物品。
【請求項１６】
微生物を検出するための方法であって、
式（Ｉａ）の蛍光性化合物を提供することと、
【化６】
2014511846.tif 000043
（式中、
Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノであり、
Ｒ２ａは、酵素反応性基であり、
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ４及びＲ５は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであり、
（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである）
試験サンプルを前記式（Ｉａ）の蛍光性化合物とインキュベートすることであって、前記試験サンプルが酵素を含有し、該酵素がＲ２ａ基を分解することで、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を形成することと、
【化７】
2014511846.tif 000044
式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を第一波長の光で励起させることと、前記第一波長よりも長波長の第二波長で放射される光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記第一波長の光及び前記第二波長の光が、紫外、可視、赤外領域のものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験サンプルを前記蛍光性化合物とインキュベートすることが、液体形態の前記試験サンプルを、前記式（Ｉａ）の蛍光性化合物と増殖培地とを含有する脱水層に加えることを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ポリマー粒子上に前記式（Ｉｂ）の化合物を捕捉することを更に含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマー粒子が、０．０１マイクロメートル〜１マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
式（Ｉｂ）の化合物を調製する方法であって、
【化８】
2014511846.tif 000045
（式中、
Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノであり、
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルであり、
Ｒ４及びＲ５は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであり、
（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである）
前記方法が、
直接フッ素化反応を使用して、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとフッ素化剤とを反応させて、３−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、又はこれらの混合物を含むフッ素化した中間体を生成することと、
フッ素化した中間体を、式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて、
Ｒ１−ＣＨ２−Ｒ２０
（ＩＩＩ）
前記式（Ｉｂ）の化合物を生成することと（式中、Ｒ２０はシアノ、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、又は式−ＣＯＯＲ１の基である）、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１１年３月３０日出願の米国特許仮出願第６１／４６９３５５号の利益を主張するものであり、その開示の前葉をここに援用するものである。
【０００２】
［分野］
本開示は、蛍光性化合物及び発蛍光団化合物、組成物、及びこれらの化合物を含む物品、これらの化合物の製造法、並びにこれらの化合物を用いて微生物を検出する方法に関する。
【０００３】
［背景］
これまでに、酵素活性についての蛍光指示薬として、様々な７−ヒドロキシクマリン系化合物（別称：ウンベリフェロン）及びその誘導体が用いられている。ウンベリフェロンは蛍光性であるが、７−ヒドロキシ基を酵素反応性基により修飾した場合、その結果得られる化合物では蛍光はクエンチされる。適切な酵素と接触することで、酵素反応性基が加水分解により遊離し、その結果、７−ヒドロキシ基が再生され、蛍光が回復する。
【０００４】
既知の蛍光指示薬のうちの幾つかは、例えば、米国特許第５，８３０，９１２号（Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、同第６，５６６，５０８号（Ｂｅｎｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．が記載の記事（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，４１〜４８（１９９９））、及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌが記載の記事（Ｈｕａｘｕｅ  Ｓｈｉｊｉ，３２（８），６７３〜６７６（２０１０））に記載されている。
【０００５】
蛍光指示薬の一例としては４−メチルウンベリフェロングルクロニドが挙げられる。この指示薬は４−ＭＵＧと呼ばれる。大腸菌などの微生物に暴露した場合、非蛍光性４−ＭＵＧは蛍光化合物の４−メチルウンベリフェロンに変換される。この化合物は４−ＭＵと呼ばれる。酵素活性についての蛍光指示薬として使用した場合、一般的に、サンプルのｐＨは、４−ＭＵの蛍光シグナルを最大化させるためにも塩基性である必要がある。すなわち、４−ＭＵなどの化合物は、酸及び塩基形態の両方で存在し得るものであり、塩基形態を有する場合、対象とする波長において、有意に、より強力な蛍光を有する（例えば、最大吸収波長、最大発光波長、又はこれらのいずれの波長についても）。
【０００６】
［概要］
多様な微生物を検出するにあたって、酸性条件下で蛍光を示す化合物が必要とされている。（ａ）酸性条件下で蛍光を発するか、又は（ｂ）酵素反応性基をヒドロキシル基に変換する酵素に暴露した後に、酸性条件下で蛍光を発するか、のいずれかの化合物が提供される。化合物を含む組成物及び物品も提供される。加えて、化合物を製造する方法、並びにこの化合物を用いて微生物を検出する方法が提供される。
【０００７】
第一態様では、式（Ｉ）の化合物が提供される。
【化１】
2014511846.tif 000003
式（Ｉ）中、Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ２基は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基である。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。
【０００８】
第二態様では、式（Ｉｂ）の化合物の製造方法が提供される。
【化２】
2014511846.tif 000004
式（Ｉｂ）では、Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。本方法は、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとフッ素化剤との直接フッ素化反応により、３−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、又はこれらの混合物であるフッ素化した中間体を生成することを包含する。次に、フッ素化した中間体を、式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて、
Ｒ１−ＣＨ２−Ｒ２０
（ＩＩＩ）
式（Ｉｂ）の化合物を生成する。式（ＩＩＩ）では、Ｒ１基は、式（Ｉｂ）について定義されるものと同様であり、かつＲ２０基はシアノ、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、又は式−ＣＯＯＲ１の基である。
【０００９】
第三態様では、式（Ｉ）の化合物と、水混和性有機溶媒とを含有する組成物が提供される。
【００１０】
第四態様では、支持層である第一層と、式（Ｉ）の化合物を含有している第二層と、を包含する物品が提供される。第二層は支持層に隣接する。
【００１１】
第五態様では、微生物を検出する方法が提供される。この方法は、式（Ｉａ）の蛍光性化合物を提供することを包含する。
【化３】
2014511846.tif 000005
式（Ｉａ）中、Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ２ａ基は、酵素反応性基である。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。本方法は、試験サンプルを式（Ｉａ）の蛍光性化合物とインキュベートすることであって、試験サンプルが微生物由来の酵素を含有し、酵素がＲ２ａ基を加水分解することで、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を形成することを更に含む。
【化４】
2014511846.tif 000006
【００１２】
本方法は、更に、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を第一波長の光で励起させることと、第一波長よりも長波長の第二波長で放射される光を検出することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】式（Ｉ）の化合物を含有し得る物品の概略図。
【図１ｂ】式（Ｉ）の化合物を含有し得る物品の概略図。
【図２】式（Ｉ）の化合物を含有し得る薄型フィルム物品の例示概略図。
【図３】６−フルオロ−３−エチルカルボキシレート−７−ヒドロキシクマリン（６−ＦＥＨＣ）と８−フルオロ−３−エチルカルボキシレート−７−ヒドロキシクマリン（８−ＦＥＨＣ）とを含有している混合物（ＦＥＨＣと呼ぶ）の、４５０ナノメートル（ｎｍ）（４００ｎｍで励起）での発光を、３−エチルカルボキシレート−７−ヒドロキシクマリン（ＥＨＣ）の発光と比較してｐＨの関数として示すグラフ。
【図４】４４５ナノメートル（４００ｎｍで励起）での６−ＦＥＨＣの発光を、ＥＨＣの発光と比較してｐＨの関数として示すグラフ。
【図５】４９５ｎｍ（４５０ｎｍで励起）での、３−ベンゾイミダゾリルウンベリフェロン（ＢｉＵ）の発光と、フッ素化３−ベンゾイミダゾリルウンベリフェロンの発光を、ｐＨの関数として示すグラフ。
【図６】４９５ｎｍ（４３０ｎｍで励起）での、３−チエニルウンベリフェロン−ピアノガラクトシド（pyanogalactoside）（ＴＵ−ｇａｌ）、ＴＵ−ｇａｌ＋酵素、フッ素化３−チエニルウンベリフェロン−ピラノガラクトシド（ＦＴＵ−ｇａｌ）、及びＦＴＵ−ｇａｌ＋酵素の発光を、ｐＨの関数として示すグラフ。
【図７】３−チエニルウンベリフェロン（ＴＵ）及びフッ素化３−チエニルウンベリフェロン（ＦＴＵ）によるコロニーの経時的な蛍光のグラフ。
【図８】ＴＵ及びＦＴＵによるコロニーの蛍光が、経時的に、バックグラウンドノイズと比較して上回っていることを示すグラフ。
【００１４】
［詳細な説明］
蛍光又は発蛍光団のいずれかの化合物が提供される。化合物を含む組成物及び物品も提供される。加えて、これらの化合物を製造する方法、並びにこの化合物を用いて微生物を検出する方法が提供される。化合物はフッ素化されており、かつ酸性条件下で有利に使用できる。多くの場合、フッ素化化合物は、フッ素原子を含まない同様の化合物と比較して親油性が増している。
【００１５】
端点による任意の数範囲の引用は、いずれも、その範囲の端点、その範囲内の全ての数、並びに述べられた範囲内の任意のより狭い範囲を含むことを意味する。
【００１６】
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、「少なくとも１つの」と互換的に用いられ、１つ以上の記載された要素を意味する。
【００１７】
用語「及び／又は」とは、一方又は両方を意味する。例えば、表現「Ａ及び／又はＢ」は、Ａ、Ｂ、又はＡとＢとの組み合わせを意味する。
【００１８】
用語「アルキル」は、アルカンのラジカルである一価の基を指し、直鎖、分枝鎖、環式、二環式又はこれらの組み合わせである基を含む。アルキル基は通常、１〜３０個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜２０個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、又は１〜３個の炭素原子を含有する。分枝型アルキルは最低で炭素原子を３つ有し、かつ環状アルキルは最低で炭素原子を３つ有し得ることが理解される。
【００１９】
用語「アルキレン」は、アルカンのラジカルである二価の基を指し、直鎖、分枝鎖、環式、二環式、又はこれらの組み合わせである基を含む。アルキレン基は、典型的には、１〜３０個又は２〜３０個の炭素原子を有する。幾つかの実施形態では、このアルキレン基は、２〜２０個の炭素原子、２〜１０個の炭素原子、２〜６個の炭素原子、又は２〜４個の炭素原子を有する。
【００２０】
用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するアルキレンラジカルである一価の基を意味し、直鎖状、分枝鎖状、環式、二環式又はこれらの組み合わせの基を包含する。アルケニル基は典型的には２〜３０個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アルケニル基は２〜２０個の炭素原子、２〜１２個の炭素原子、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を含有する。
【００２１】
用語「アリール」は、芳香族及び炭素環である一価の基を指す。アリールは、芳香環へと縮合した１つ以上の炭素環を有し得る。任意の更なる環は、不飽和、部分飽和、又は飽和であってもよい。アリール基は、多くの場合、６〜２０個の炭素原子、６〜１８個の炭素原子、６〜１６個の炭素原子、６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有する。
【００２２】
用語「アリーレン」は、芳香族かつ炭素環式である、二価の基を指す。アリーレンは、芳香環へと縮合した１つ以上の炭素環を有し得る。任意の更なる環は、不飽和、部分飽和、又は飽和であってもよい。アリーレン基は、多くの場合、６〜２０個の炭素原子、６〜１８個の炭素原子、６〜１６個の炭素原子、６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有する。
【００２３】
用語「アラルキル」は、アリール基で置換されたアルキル基である一価基を指す。アラルキル基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル部分と、６〜２０個の炭素原子、６〜１８個の炭素原子、６〜１６個の炭素原子、６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有するアリール部分と、を有する。
【００２４】
用語「アラルキレン」は、二価の基、すなわちアリール基で置換されたアルキレン基を意味する。アラルキレン基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル部分と、６〜２０個の炭素原子、６〜１８個の炭素原子、６〜１６個の炭素原子、６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有するアリール部分と、を有する。
【００２５】
用語「カルボニル」は、炭素が二重結合で酸素に結合している式−（ＣＯ）−の二価の基を指す。
【００２６】
用語「シアノ」は、一価の基−Ｃ≡Ｎを意味する。
【００２７】
用語「複素環基」は、第一環が３〜７個の原子を有し、そのうち少なくとも１つの環原子はヘテロ原子であり、かつ少なくとも１つの環原子は炭素である、一価の基を意味する。好適なヘテロ原子は、酸素、硫黄、又は窒素から選択される。環に含まれる原子の内、ヘテロ原子以外の全ての原子は、炭素である。第一環は、飽和、部分的に不飽和、又は不飽和であってよい。場合により、第一環は、１つ以上の炭素環又は複素環と縮合させてよい。複素環基は、典型的には１〜５個のヘテロ原子と１〜１５個の炭素原子、１〜４個のヘテロ原子と１〜１０個の炭素原子、１〜３個のヘテロ原子と１〜１０個の炭素原子、又は１〜３個のヘテロ原子と１〜６個の炭素原子を有する。一部の例では、複素環基は五員環中にヘテロ原子を１〜３個有する。他の例では、複素環基は、炭素環でありかつ飽和、部分的に不飽和、又は不飽和の第二環に縮合している五員環中に、ヘテロ原子を１〜３個有する。例えば、ヘテロ原子を１〜３個有する五員環をベンゼン環と縮合させてもよい。
【００２８】
用語「ニトロ」は、一価の基−ＮＯ２を意味する。
【００２９】
用語「蛍光性」は、蛍光を発しない、又は非常に弱く蛍光を発する化合物であるものの、変換することで、蛍光を発する蛍光性化合物になる、化合物を意味する。蛍光は、電磁スペクトルの任意の領域におけるものであってよいが、多くの場合、紫外、可視、又は赤外領域である。
【００３０】
用語「発蛍光団」は、蛍光性の化合物を意味する。蛍光は、電磁スペクトルの任意の領域におけるものであってよいが、多くの場合、紫外、可視、又は赤外領域におけるものである。
【００３１】
用語「親油性」は、化合物が有機相に分配されることを意味する。親油性は、例えば、対象とする化合物を、非極性有機溶媒（例えばオクタノール）と水との混合物に入れた際に特徴付けられる。親油性指数は、対象とする化合物の有機相中濃度と、対象とする化合物の水相中濃度との比である。この比が高くなるほど、化合物の親油性は高くなる。
【００３２】
７−ヒドロキシクマリン（すなわち、ウンベリフェロン）などの化合物は、既知の蛍光指示薬である。すなわち、これらの化合物は発蛍光団化合物である。クマリン系化合物上の７−ヒドロキシル基を糖残基、リン酸基、又はスルホン酸基などの酵素反応性基により置き換えた場合、化合物の蛍光は典型的にはクエンチされる。すなわち、酵素反応性基を備えるこれらの化合物は、蛍光性化合物である。適切な酵素反応により、酵素反応性基を加水分解させて、蛍光性化合物を発蛍光団化合物ヘと変換することができる。酵素反応性基はヒドロキシル基に変換される。
【００３３】
酵素反応性基を有するクマリン系化合物を使用することで、特定の微生物が存在することの指標になる特定の酵素の存在を検出することができる。解析を行なっているサンプルが、酵素反応性基を加水分解（例えば、切断）することのできる酵素を含有している場合、結果として生じる、７−ヒドロキシル基を有する発蛍光団が蛍光を発し得る。蛍光指示薬として有効であるためには、解析を行っているサンプルのｐＨは多くの場合アルカリ性でなくてはならない（好ましくはｐＨ  ９〜１０）。発蛍光団化合物の７−ヒドロキシル基は、酸性形態又は塩基性形態のいずれでも存在し得ることから、このｐＨ調整が必要とされる。最大蛍光シグナルは、典型的には塩基性形態のときに得られる。
【００３４】
更に、多くの微生物（例えば、大腸菌（E. coli））は、代謝工程の一環として酸を生成する傾向がある。このような微生物を含有しているサンプルのｐＨは、経時的により酸性になる傾向がある。このｐＨ低下により、経時的な蛍光強度の消失が引き起こされることになり、又は蛍光シグナルが低く見積もられるようになり、あるいはこの両方が生じ得る。極端な場合、バックグラウンドシグナルと同程度にまで蛍光シグナルが低下してしまう恐れがある。したがって、酸性条件下で使用することができ、かつ酸性条件下で安定的に蛍光シグナルを提供し得る蛍光指示薬が必要とされる。
【００３５】
二フッ化クマリン系化合物は、ｐＨ  ５〜７の範囲などのように、酸性範囲において良好な蛍光安定性を示すことが知られている。しかしながら、２つのフッ素原子に由来する強力な電子受容性は、クマリンコア及び酵素反応性基間の結合を弱めるのに十分なものであり得る。６，８−ジフルオロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリン及び６，８−ジフルオロ−３−エチルカルボキシレート−７−ヒドロキシクマリンのｐＫａがそれぞれ４．２及び３．８であることからも証明される（Ｂｉｏｏｒｇ．ａｎｄ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８，３１０７〜３１１０（１９９８）を参照されたい）。
【００３６】
既知のクマリン系の蛍光指示薬にまつわる困難さを克服するため、本明細書に記載の化合物はフッ素基を１つ有する。このような化合物は、酸性条件下で使用した場合でさえも安定した蛍光シグナルを示す。加えて、このような化合物は、酵素の非存在下で酵素反応性基に加水分解を受ける傾向が低くなる。
【００３７】
一部の既知のクマリン系蛍光性化合物については、このような問題に加えて、多くの場合、最大励起シグナルが３６５ナノメートル付近であるということも問題になる。この励起波長により、生物材料からかなりのバックグラウンド蛍光が生じ得ることになる。したがって、生物材料を含む試料に関しては、約４００ナノメートルにより近い、又は更にはより長い最大励起シグナルを有する蛍光指示薬を使用することが望ましい場合がある。すなわち、蛍光シグナルが赤色波長側にシフトしている蛍光指示薬が望ましい。ＩｎＧａＮなどの、多くの低コストの半導体レーザ光源は、４００ナノメートル付近又はこれ以上の波長で使用するのに好適である。提供される化合物のうち一部のものは、４００ナノメートル以上の励起波長で使用するのに好適である。
【００３８】
本明細書において提供されるフッ素化化合物は、非蛍光性の対応物と比較して親油性が増大している傾向がある。この親油性の増大は、化合物を隔離するために高分子材料を使用する場合に有利なものであり得る。加えて、親油性の増大により、フッ素化化合物が細胞膜を通過するのが容易になる場合がある。この特徴は、化合物を標的とする酵素が、微生物の細胞内に限定されるものである場合に望ましいものであり得る。
【００３９】
第一態様では、式（Ｉ）のフッ素化化合物が提供される。
【化５】
2014511846.tif 000007
式（Ｉ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ２基は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基である。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｒ１基は式−（ＣＯ）−Ｏ−Ｒ３であり、Ｒ３はアルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ３に好適なアルキル基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、又は１〜３個の炭素原子を有する。Ｒ３に好適なアルケニル基は、多くの場合、２〜１２個の炭素原子、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有する。好適なアリール基は、多くの場合、６〜１２個の炭素原子を有し、及び好適なアラルキル基は、多くの場合、炭素原子を７〜１２個有する。例えば、アリール基はフェニルであってよく、かつアラルキル基は、フェニルで置換された、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を有してよい。一部の特異的なＲ１基としては、限定するものではないが、エチルカルボキシレート（−（ＣＯ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）、及びフェニルカルボキシレート（−（ＣＯ）−Ｏ−Ｃ６Ｈ５）が挙げられる。
【００４１】
他の実施形態では、Ｒ１基は、式−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４及び／又はＲ５に好適なアルキル基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、又は１〜３個の炭素原子を有する。Ｒ４及び／又はＲ５に好適なアリール基は、多くの場合、６〜１２個の炭素原子を有する。アリール基はフェニルであってよい。Ｒ４及び／又はＲ５に好適なアラルキル基は、多くの場合、７〜１２個の炭素原子を有する。アラルキル基は、多くの場合、フェニルで置換された、１〜６個の炭素原子を有するアルキルを有する。
【００４２】
更に他の実施例では、Ｒ１基は複素環基である。少なくとも１つの複素環（すなわち、第１複素環）を有する任意の好適な複素環基を使用することができる。第１複素環としては、少なくとも１つのヘテロ原子を環に含み、残りの環原子は炭素であるものが挙げられる。環に含まれる各ヘテロ原子は、酸素、硫黄、又は窒素から選択される。第一複素環は、多くの場合、環原子を３〜７個有し、かつ追加の環に炭素環又は複素環のいずれかを縮合させることができる。
【００４３】
一部の複素環基は、３〜４個の環原子を有する第一複素環を有する。３個の環原子を有する複素環基の例としては、限定するものではないが、アジリジニル、オキシラニル、及びチイラニル（thiiranyl）が挙げられる。環原子を４個有する複素環基の例としては、限定するものではないが、アゼチジニル、オキセタニル、及びチエタニルが挙げられる。
【００４４】
一部の複素環基は、環原子を５個有する第１複素環を有する。ヘテロ原子を１つ有する飽和複素環基の例としては、限定するものではないが、ピロリジニル、オキソラニル、及びテトラヒドロチオフェニルが挙げられる。ヘテロ原子を１つ有する部分的に不飽和の又は不飽和の複素環基の例としては、限定するものではないが、ピロリル、フラニル、及びチエニルが挙げられる。ヘテロ原子を１つ以上有する飽和複素環の例としては、限定するものではないが、ジオキソラニル及びトリオキサニルが挙げられる。ヘテロ原子を１つ以上有する部分的に不飽和の又は不飽和の複素環基としては、限定するものではないが、イミダゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、及びオキサジアゾリルが挙げられる。ベンゼン環などの、炭素環に縮合した５つの原子を有する第１複素環を有する複素環基としては、限定するものではないが、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、Ｎ−置換ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、及びベンゾイソオキサゾリルが挙げられる。ベンゼン環又はナフタレン環系などの、２つの炭素環に縮合した５つの原子を有する第１複素環を有する複素環基としては、限定するものではないが、カルバゾリル及びナフトオキサゾリルが挙げられる。
【００４５】
他の複素環基は、環原子を６つ有する第１複素環を有する。ヘテロ原子を１つ有する飽和複素環基の例としては、限定するものではないが、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、及びチアニルが挙げられる。ヘテロ原子を１つ有する部分的に不飽和の又は不飽和の複素環基の例としては、限定するものではないが、ピラニル及びチオピラニルが挙げられる。ヘテロ原子を複数有する飽和複素環基の例としては、限定するものではないが、ピペラジニル、モルホリニル、及びジオキサニルが挙げられる。ヘテロ原子を複数有する不飽和の又は部分的に不飽和の複素環の例としては、限定するものではないが、ジアジニル、オキサジニル、チアジニル、トリアジニル、及びテトラジニルが挙げられる。ベンゼン環などの、炭素環に縮合した６つの原子を有する第１複素環を有する複素環基の例としては、限定するものではないが、キノリニル及びイソキノリニルが挙げられる。他の複素環に縮合した６つの原子を有する第１複素環を有する複素環基の例としては、限定するものではないが、ナフチリジニルが挙げられる。
【００４６】
更に他の複素環基は環原子を７つ有する。このような基としては、限定するものではないが、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、ジアゼピニル、及びチアゼピニルが挙げられる。
【００４７】
任意の好適なアリール基をＲ１に使用できる。一部の例では、アリール基は、６〜２０個の炭素原子、６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有する。アリール基の例としては、限定するものではないが、フェニル、ナフチル、アセナフチル、フェナントレニル、アントラセニル、ピレニル、ペリレニル、及びフルオレニルが挙げられる。
【００４８】
任意の好適なアラルキル基を、Ｒ１に使用できる。一部の例では、アラルキル基は、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル部位に加え、６〜２０個の炭素原子、６〜１２個の炭素原子、又は６〜１０個の炭素原子を有するアリール部位を有する、より具体的な例では、アラルキル基は、フェニル基で置換された１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル部分を有する。
【００４９】
Ｒ１のアリール、アラルキル、及び複素環基は、場合により、アルキル、アルコキシ、アリール、アラルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、グアニジノ（すなわち、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ）、−ＳＯ３Ｈ、−（Ｒ６）２、−Ｒ７−（Ｏ−Ｒ７）ｎ−ＯＲ８、−（ＣＯ）−ＯＲ９、又は−（ＣＯ）−（ＮＲ１０）２から選択される１個以上の基により置換され得る。言い換えれば、アリール、アラルキル、及び複素環基は、不飽和であってよく、あるいは１つ以上の置換基で置換されてよい。好適なアルキル及びアルコキシ置換基は、典型的には、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なアリール置換基は、通常、６〜１２個の炭素原子を有する。好適なアラルキル置換基は、通常、７〜１２個の炭素原子を有する。好適なハロ基は、フルオロ、クロロ、又はブロモであってよい。式−Ｎ（Ｒ６）２の置換基では、各Ｒ６は、独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ６に好適なアルキル基は、典型的には、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。Ｒ６に好適なアリール及びアラルキル基は、それぞれ、６〜１２個の炭素原子及び７〜１２個の炭素原子を有する。式−Ｒ７−（Ｏ−Ｒ７）ｎ−ＯＲ８の置換基では、各Ｒ７基は独立して、アルキレン、アリーレン、又はアラルキレンであり、かつＲ８基はアルキル、アリール、又はアラルキルである。可変要素ｎは、０〜１０の範囲、０〜６の範囲、０〜４の範囲、又は０〜２の範囲の整数である。好適なＲ７及び／又はＲ８アルキレン及びアルキル基は、典型的には、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なＲ７及び／又はＲ８アリール及びアラルキル基は、それぞれ、６〜１２個及び７〜１２個の炭素を有する。式−（ＣＯ）−Ｏ−Ｒ９の置換基では、Ｒ９基はアルキル、アリール、又はアラルキルであってよい。好適なアルキルＲ９基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なアリール及びアラルキルＲ９基は、それぞれ、多くの場合、６〜１２個の炭素原子及び７〜１２個炭素原子を有する。式−（ＣＯ）−（ＮＲ１０）２の置換基では、各Ｒ１０基は、独立して、水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであってよい。好適なＲ１０アルキル基は、通常、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なＲ１０アリール基は、典型的には、６〜１２個の炭素原子を有し、及びアラルキル基は、典型的には、７〜１２個の炭素原子を有する。
【００５０】
式（Ｉ）中、Ｒ２基は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基である。酵素反応性基は、典型的には、芳香環に結合したオキシ基を有する。言い換えれば、酵素反応性基は、酵素の作用により加水分解（例えば、分解）され、芳香環に結合したヒドロキシル基が反応生成物として生成される。一部の好適な酵素反応性基としては、限定するものではないが、糖基（例えば、単糖基、二糖基、又は多糖基）、糖酸基（例えば、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を有する単糖又は二糖）、アミノ糖基（例えば、アミノ（−ＮＨ２）基を有する単糖又は二糖）、カルボキシル末端化アミノ酸基、カルボキシル末端化ペプチド基、エステル基、エステル含有基、ホスフェート基、又はスルファート基が挙げられる。
【００５１】
Ｒ２の、一部の好適な酵素反応性の糖基は、糖分子から水素（すなわち、水素原子１個）を取り除いた残基と等価な一価の基である。糖基は、式（Ｉ）の化合物の芳香環に、オキシ基を介して結合している。好適な糖基は、単糖基、二糖基、三糖基、又は多糖基であり得る。好適な単糖基としては、限定するものではないが、α−ガラクトピラノシジル、β−ガラクトピラノシジル、α−グルコピラノシジル、β−グルコピラノシジル、α−マンノピラノシジル、β−マンノピラノシジル、α−イドピラノシジル、β−イドピラノシジル、α−キシロピラノシジル、β−キシロピラノシジル、α−アラビノフラノシジル、及びβ−アラビノフラノシジルが挙げられる。好適な二糖基としては、限定するものではないが、β−セロビオピラノシジル、β−ラクトシル、３−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル、４−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル、β−キシロビオシル、α−マルトシル、β−マルトシル、トレハロシル、及びマンノビオシルが挙げられる。好適な三糖基としては、限定するものではないが、β−セロトリオシル、β−ゲンチオトリオシル、及びマルトトリオシルが挙げられる。好適な多糖基としては、限定するものではないが、β−セロテトロシジル、及びβ−セロペントシジルが挙げられる。
【００５２】
酵素反応性のＲ２基は、カルボニルオキシ基を介して式（Ｉ）の化合物の芳香環に結合している糖酸基であってもよい。糖酸基は、糖酸から水素（すなわち、水素原子１個）を取り除いた残基と等価な一価の基である。好適な糖酸基としては、限定するものではないが、β−グルクロニジル、α−イズロニル、及びガラクツロニルが挙げられる。
【００５３】
他の酵素反応性のＲ２基は、オキシ基を介して式（Ｉ）の化合物の芳香環に結合している、アミノ糖基である。アミノ糖基は、アミノ糖から水素（すなわち、水素原子１個）を取り除いた残基と等価な一価の基である。好適なアミノ糖基としては、限定するものではないが、グルコサミニル、ガラクトサミニル、キトビオシル、及びキトトリオシルが挙げられる。
【００５４】
更に他の酵素反応性のＲ２基は、カルボキシル末端化アミノ酸基、又はカルボキシル末端化（erminated）ペプチド基である。これらの基は、式（Ｉ）の化合物の芳香環に、カルボニルオキシ基を介し結合している。カルボキシル末端化アミノ酸基の例としては、限定するものではないが、Ｌ−アラニル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−シトルリル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グルタミニル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−トリプトフィル、Ｌ−チロシル、及びＬ−バリルが挙げられる。カルボキシル末端化ペプチド基例としては、限定するものではないが、７−グルタリル−フェニルアラニル、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニル、Ｌ−グルタリル−グリシル−アルギニル、グリシル−グリシル、グリシル−Ｌ−フェニルアラニル、グリシル−Ｌ−プロリル、及びＬ−セリル−Ｌ−チロシル、Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−アルギニル、及びＮ−グルタリル−グリシル−アルギニルが挙げられる。
【００５５】
更に好適な酵素反応性のＲ２基は式−Ｏ−（ＣＯ）−Ｒ１２のものであり、Ｒ１２はアルキル、アルキエニル（alkyenyl）、アリール、又はアラルキルである。この基は、式（Ｉ）の化合物の芳香環に、オキシ基を介し結合している。Ｒ１２に好適なアルキル基は、典型的には、１〜２０個の炭素原子、１〜１２個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。Ｒ１２に好適なアルケニル基は、典型的には、２〜２０個の炭素原子、２〜１２個の炭素原子、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有する。Ｒ１２の好適なアリール及びアラルキル基は、典型的には、それぞれ６〜１２個の炭素原子及び７〜１２個の炭素原子を有する。特異的なＲ２基としては、限定するものではないが、アセテート、プロパノエート、２−メチルプロパノエート、ブタノエート、３−メチルブタノエート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ヘプタノエート、オクタノエート、ノナノエート、デカノエート、ウンデシレート、ドデカノエート、トリデカノエート、テトラデカノエート、ペンタデカノエート、ヘキサデカノエート、ヘプタデカノエート、オクタデカノエート、エライダート、オレエート、及びｐ−グアニジノベンゾエート（アリールがグアニジノ基で置換されている）で挙げられる。
【００５６】
更に他の好適な酵素反応性のＲ２基は、式−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＯ）−Ｒ１３のエステル含有基であり、式中、Ｒ１３はアルキルである。Ｒ１３に好適なアルキル基は、通常、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。エステル含有基は、式（Ｉ）の化合物の芳香環に、オキシ基を介して結合している。例としては、限定するものではないが、アセトキシメトキシ、プロパノイルオキシメトキシ、イソブタノイルオキシメトキシ、及びピバロキシメトキシが挙げられる。
【００５７】
更に他の好適な酵素反応性のＲ２基は、式−Ｏ−ＣＨ２−（ＣＯ）−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＯ）−Ｒ１４のエステル含有基であり、式中、各Ｒ１４はアルキルである。Ｒ１４に好適なアルキル基は、通常、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。エステル含有基は、式（Ｉ）の化合物の芳香環に、オキシ基を介して結合している。例としては、限定するものではないが、３−（オクタノイルオキシ）−２−オキソプロポキシ、３−（デカノイルオキシ）−２−オキソプロポキシ、３−（ドデカノイルオキシ）−２−オキソプロポキシ、３−（ブチルオキシ）−２−オキソプロポキシ、及び３−（アセチルオキシ）−２−オキソプロポキシが挙げられる。
【００５８】
他の酵素反応性基は、式−Ｏ−ＳＯ２−（ＯＲ１５）のサルフェート基又は式−Ｏ−（ＰＯ）−（ＯＲ１６）２のホスフェート基であり、式中、各Ｒ１５及びＲ１６は、独立して、各々水素又はアルキルであってよい。サルフェート基及びホスフェート基は、式（Ｉ）の化合物の芳香環にオキシ基を介して結合している。Ｒ１５及びＲ１６に好適なアルキル基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。
【００５９】
Ｒ２に含まれる任意のアリール又はアラルキル基は、場合により、アルキル、アルコキシ、アリール、アラルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、グアニジノ（すなわち、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ）、−ＳＯ３Ｈ、−Ｎ（Ｒ６）２、−Ｒ７−（Ｏ−Ｒ７）ｎ−ＯＲ８、−（ＣＯ）−ＯＲ９、又は−（ＣＯ）−（ＮＲ１０）２から選択される１つ以上の基により置換されてよい。言い換えれば、アリール又はアラルキル基は、非置換であってよく、又は１つ以上の置換基で置換されていてよい。好適なアルキル及びアルコキシ置換基は、典型的には、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なアリール置換基は、通常、６〜１２個の炭素原子を有する。好適なアラルキル置換基は、通常、７〜１２個の炭素原子を有する。好適なハロ基は、フルオロ、クロロ、又はブロモであってよい。式−Ｎ（Ｒ６）２の置換基では、各Ｒ６は、独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ６に好適なアルキル基は、典型的には、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。Ｒ６に好適なアリール及びアラルキル基は、それぞれ、６〜１２個の炭素原子及び７〜１２個の炭素原子を有する。式−Ｒ７−（Ｏ−Ｒ７）ｎ−ＯＲ８の置換基では、各Ｒ７基は独立して、アルキレン、アリーレン、又はアラルキレンであり、かつＲ８基は、アルキル、アリール、又はアラルキルである。可変要素ｎは、０〜１０の範囲、０〜６の範囲、０〜４の範囲、又は０〜２の範囲の整数である。好適なＲ７及び／又はＲ８アルキレン及びアルキル基は、典型的には、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なＲ７及び／又はＲ８アリール及びアラルキル基は、それぞれ、６〜１２個及び７〜１２個の炭素を有する。式−（ＣＯ）−Ｏ−Ｒ９の置換基では、Ｒ９基はアルキル、アリール、又はアラルキルであってよい。好適なアルキルＲ９基は、多くの場合、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なアリール及びアラルキルＲ９基は、それぞれ、多くの場合、６〜１２個の炭素原子及び７〜１２個炭素原子を有する。式−（ＣＯ）−（ＮＲ１０）２の置換基では、各Ｒ１０基は、独立して、水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであってよい。好適なＲ１０アルキル基は、通常、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子を有する。好適なＲ１０アリール基は、典型的には、６〜１２個の炭素原子を有し、及びアラルキル基は、典型的には、７〜１２個の炭素原子を有する。
【００６０】
ヒドロキシルＲ２基を有する式（Ｉ）の化合物の具体例としては、限定するものではないが、３−エチルカルボキシレート−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−エチルカルボキシレート−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−チエニル−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−チエニル−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（２−（５−カルボキシエチルフラニル））−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（２−（５−カルボキシエチルフラニル））−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−シアノ−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−シアノ−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾチアゾリル−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾチアゾリル−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾオキサゾリル−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾオキサゾリル−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（４−イミダゾリル）−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（４−イミダゾリル）−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（１−イミダゾリル）−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（１−イミダゾリル）−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（２−ピロリル）−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（２−ピロリル）−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾイミダゾリル−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾイミダゾリル−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（１−メチルベンゾイミダゾリル）−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−（１−メチルベンゾイミダゾリル）−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾイミダゾリル−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾイミダゾリル−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、３−ベンゾフラニル−６−フルオロ−７−ヒドロキシクマリン、及び３−ベンゾフラニル−８−フルオロ−７−ヒドロキシクマリンが挙げられる。他の化合物例は、ヒドロキシ基を酵素反応性基により置換されており、すなわち糖基（例えば、単糖基、二糖基、又は多糖基）、糖酸基（例えば、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を有する単糖又は二糖）、アミノ糖基（例えば、アミノ（−ＮＨ２）基を有する単糖又は二糖）、カルボキシル末端化アミノ酸基、カルボキシル末端化ペプチド基、エステル基、ホスフェート基、又はスルファート基により置換されている。一部の具体例では、酵素反応性基は、α−ガラクトピラノシジル、β−ガラクトピラノシジル、α−グルコピラノシジル、β−グルコピラノシジル、又はβ−グルクロニジルなどの単糖基である。
【００６１】
式中、Ｒ２がヒドロキシル基である式（Ｉ）に相当する、式（Ｉｂ）の化合物は、任意の既知の合成法により調製することができる。特に有用な合成法は、反応スキームＡに示す通りの直接フッ化法である。
【００６２】
【化６】
2014511846.tif 000008
【００６３】
反応スキームＡでは、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドをフッ素化剤と反応させる。式（ＩＩ）のフッ化ジヒドロキシベンズアルデヒド中間体を最初に調製する。フッ化ジヒドロキシベンズアルデヒドは、３−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、又はこれらの混合物であってよい。次に、式（ＩＩ）の化合物中間体を、クネーフェナーゲル（Knoevenagel）縮合反応により、式（ＩＩＩ）の化合物と反応させる。式（ＩＩＩ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物について上記した通りのＲ１基と、シアノ、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、又は式−ＣＯＯＲ１の基から選択される電子吸引基であるＲ２０基を有する。この第２の反応に使用される触媒は、個々の反応によって変更することができ、例えば、酢酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、トリエチルアミンと無水酢酸との混合物、又はモルホリンと酢酸との混合物、であってよい。
【００６４】
反応スキームＡには任意の好適なフッ素化剤を使用できる。一部の好適なフッ素化剤は、窒素原子に結合したフッ素原子を有する（すなわち、Ｎ−Ｆフッ素化剤）。Ｎ−Ｆフッ素化剤の例としては、限定するものではないが、商品名ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ））の化合物の１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボレート）、商品名ＡＣＣＵＦＬＵＯＲ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｓｅｅｌｚｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の化合物の、１−ヒドロキシ−４−フルオロ−１，４−ジアゾビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボレート）；Ｎ−フルオロベンゼンスルホンイミド；１−フルオロピリジニウムトリフラート；及び２，６−ジクロロ−１−フルオロピリジニウムテトラフルオロボレートが挙げられる。更に他のフッ素化剤としては、テトラブチルアンモニウムビフルオリド、ジエチルアミノトリフルオロ硫黄、モルホリノ硫黄トリフルオロキセノンジフルオリド、及びフッ素が挙げられる。
【００６５】
直接フッ化反応の一例では、フッ素化剤（例えば、ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ）及び２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドを、室温（例えば、２０℃〜２５℃）で、数日間（例えば、５〜１０日間）混合し、５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドと３−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドの５：１比の混合物を生成することができる。この場合の変換率は約６０％である。この混合物は、更に再結晶化により精製することができる。
【００６６】
反応スキームＡに使用するための式（ＩＩＩ）の化合物例としては、例えば、Ｒ１としてチオフェニル基を有する式（Ｉｂ）の化合物の調製については２−チオフェン酢酸、Ｒ１としてベンゾイミダゾリル基を有する式（Ｉｂ）の化合物の調製については２−シアノメチルベンゾイミダゾール、並びにＲ１として炭素イルオキシエチル基（すなわち、エチルカルボキシレート基）を有する式（Ｉｂ）の化合物の調製についてはアセト酢酸エチルが挙げられる。必要に応じて、ろ過により生成物を単離し、反応溶液を水などの非溶媒と混合し、生成物をろ去するか、又は生成物を溶媒抽出により単離することもできる。
【００６７】
反応スキームＡに示される第２反応の生成物は、式（Ｉｂ）の化合物である。多くの実施形態では、この生成物は、式（Ｉｂ−１）及び（Ｉｂ−２）の２種のフッ化化合物の混合物である。この生成物は、式（ＩＶ）の非フッ化化合物の一部を含有してもよい。
【００６８】
【化７】
2014511846.tif 000009
【００６９】
フッ化化合物（すなわち、式（Ｉｂ−１）及び（Ｉｂ−２）の化合物）を、例えば、各種クロマトグラフ法により、非フッ化化合物（すなわち、式（ＩＶ）の化合物）から分離することができる。精製により得られる混合物は、多くの場合、式（Ｉｂ−２）の化合物と式（Ｉｂ−１）の化合物を、次の範囲の重量比、すなわち、６０：４０〜９９：１、７０：３０〜９９：１、８０：２０〜９９：１、９０：１０〜９９：１の範囲の重量比で含有する。すなわち、混合物に含まれる主成分は、多くの場合、式（Ｉｂ−２）の化合物である。
【００７０】
次に、式（Ｉｂ）の化合物を処理し、ヒドロキシル基を酵素反応性基により置き換える。好適な酵素反応性基は、式（Ｉ）においてＲ２基について記載のものである。
【００７１】
一部の実施形態では、Ｒ２基は糖基である。反応スキームＢに示す通り、臭化化合物Ｒ２ｃ−Ｂｒと反応させることにより、このような基を式（Ｉ）の化合物に導入することができる。−ＯＲ２ｃ基は、式（Ｉ）のＲ２基に相当する。
【００７２】
【化８】
2014511846.tif 000010
【００７３】
糖基ピラノガラクトースの付加に関係する更なる具体例を、反応スキームＢ−１に示す。臭化化合物は、ヒドロキシル基がアセチル基により保護されているα−ブロモアセチルピラノガラクトースである。Ｒ２ｃを芳香環に結合させた後、ナトリウムメトキシドにより処理し、アセチル基を除去する。様々な臭化及び保護糖が、例えばＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）から市販されている。
【００７４】
【化９】
2014511846.tif 000011
【００７５】
式（Ｉ）の化合物の他の実施例では、Ｒ２はリン酸基である。リン酸基は、式（Ｉｂ）の化合物をオキシ塩化リンと反応させることにより導入することができる。式（Ｉ）の化合物の更に他の実施例では、Ｒ２は硫酸基である。硫酸基は、式（Ｉｂ）の化合物をクロロスルホン酸と反応させることにより導入することができる。これらの反応の詳細は、例えば、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，１１６，６５〜７５（１９８５）に提供される。
【００７６】
したがって、第二態様では、式（Ｉ）の化合物の製造方法が提供される。本方法は、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとフッ素化剤との直接フッ素化反応により、３−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、又はこれらの混合物であるフッ素化した中間体を生成することを包含する。次に、フッ素化した中間体を式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて、
Ｒ１−ＣＨ２−Ｒ２０
（ＩＩＩ）
式（Ｉｂ）の化合物を生成する。式（ＩＩＩ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノであり、かつＲ２０基は、シアノ、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、又は式−ＣＯＯＲ１の基である。
【００７７】
第３の態様では、組成物が提供される。この組成物は、式（Ｉ）の化合物と、水混和性有機溶媒を含有する。これらの組成物には、１つ以上の式（Ｉ）の化合物と、場合により、更に、式（Ｉ）の化合物以外の化合物とを含有させてよい。組成物は多くの場合、溶液である。
【００７８】
組成物に使用するのに好適な水混和性有機溶媒は、多くの場合、式（Ｉ）の化合物を溶解させ得る溶媒である。通常、水混和性有機溶媒は、式（Ｉ）の化合物の濃度が、少なくとも１０ミリモル濃度（ｍＭ）、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、又は少なくとも５００ｍＭになるように溶液を調製するのに使用することができる溶媒から選択される。水混和性有機溶媒例としては、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、及びアルコール（例えば、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、又は１〜３個の炭素原子を有するアルコール）が挙げられる。この溶液は、典型的には、水、又は式（Ｉ）の化合物を溶解させたまま保持できるような他の極性有機溶媒により希釈することができる。
【００７９】
式（Ｉ）の化合物を含有している溶液には、場合により、特定の所望のｐＨ又はｐＨ範囲を調節又は維持するために緩衝剤を含有させることができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝剤は、酸性範囲である。例えば、ｐＨは、３〜１０、４〜１０、４〜８、又は４〜７の範囲であってよい。一部の緩衝剤例としては、各種リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、又はこれらの混合物が挙げられる。
【００８０】
多くの実施形態では、組成物は、式（Ｉ−１）の化合物及び式（Ｉ−２）の化合物の混合物を含有する。
【化１０】
2014511846.tif 000012
例えば、一部の組成物は、式（Ｉｂ−１）及び式（Ｉｂ−２）の化合物を両方含有する。
【化１１】
2014511846.tif 000013
一部の組成物は更に、式（ＩＶ）の非フッ化化合物を含有し得る。
【化１２】
2014511846.tif 000014
Ｒ１基及びＲ２基は、式（Ｉ）について上記に定義したものと同様のものである。
【００８１】
第４の態様では、物品が提供される。物品は、支持層である第一層と、式（Ｉ）の化合物を含む第二層とを含む。第二層は第一層に隣接する。本明細書で使用するとき、用語「隣接」は、２層が互いに接触しているか、１つ以上の介在層により互いに分離されていることを意味する。物品についての２つの概略図を図１ａ及び図１ｂに示す。図１ａの物品１０は、支持層２０と、支持層２０に接触している第二層３０とを含む。図１ｂの物品５０は、支持層２０と、接着層２５と、第二層３０とを含む。図１ｂにおいて、接着層は支持層と第二層３０の間に位置する。多様な微生物の存在又は非存在を検出するために、このような物品を使用することができる。
【００８２】
任意の好適な支持層２０を使用できる。支持層は、多くの場合、水を吸収しないか、あるいは水による影響を受けないものであるよう選択される。好適な支持層は、例えば、ポリマー材料、ガラス、又はセラミック材などであってよい。支持層は、支持層を介して微生物の各種コロニーを観察するのが望ましいか否かをもとに、透明又は不透明にしてよい。支持層には、場合により、微生物のコロニーの係数を容易にする格子模様（例えば、正方形）が印刷される。支持層は、平坦であっても、又は各種ウェルを含んでいてもよい。ウェルは、任意の好適な形状及び大きさを有し得る。一部の実施形態では、支持層は、典型的にはペトリ皿である。
【００８３】
一部の用途については、支持層としてはポリマー材料が特に有利なものであり得る。ポリマー材料は、多くの場合、比較的硬くかつ自己支持性であるフィルム形態である。ポリマー材料例としては、限定するものではないが、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びこれらのコポリマー）、及びポリスチレンが挙げられる。他の好適な基材としては、例えば、ポリオレフィンコーティング又は耐水性コーティングを備える紙が挙げられる。
【００８４】
第二層は式（Ｉ）の化合物を含む。多くの実施形態では、物品は、各種微生物の存在又は非存在について検出するために使用する前に式（Ｉａ）の化合物を含む。
【化１３】
2014511846.tif 000015
Ｒ２ａ基は、酵素反応性基を指す。式（Ｉａ）の化合物は、蛍光を有していないものの、酵素反応性基Ｒ２ａがヒドロキシル基へと加水分解されたときに、蛍光性の発蛍光団化合物ヘと変換され得る、蛍光性化合物である。得られる発蛍光団化合物は式（Ｉｂ）の化合物である。
【化１４】
2014511846.tif 000016
式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）中、Ｘ１、Ｘ２、及びＲ１基は、これまでに式（Ｉ）の化合物について定義したものと同様のものである。
【００８５】
物品の一部の実施例では、第二層は、各種微生物の存在又は非存在について検出するために使用する前に、式（Ｉａ−１）の化合物と、式（Ｉａ−２）の化合物との混合物を含む。
【化１５】
2014511846.tif 000017
【００８６】
好適な酵素との反応後、第二層は、式（Ｉｂ−１）の化合物と、式（Ｉｂ−２）の化合物の化合物との混合物を含む。
【化１６】
2014511846.tif 000018
【００８７】
任意の好適な方法を用い、第二層を第一層に適用することができる。式（Ｉ）の化合物（例えば、式（Ｉａ）の化合物）を含有している溶液を、任意の好適な方法を用い、支持層に適用することができる。例えば、式（Ｉ）の化合物の溶液を適用し、次に乾燥させて、支持層表面に、式（Ｉ）の化合物の粉末（すなわち、脱水和物形態又は脱水和層）をもたらすことができる。第二層は、支持層の表面全体にわたって連続的なものであっても、非連続的なものであってもよい。第二層を、例えば、支持層のウェル又は領域の模様に堆積させることもできる。
【００８８】
一部の実施形態では、接着層は支持層表面と接触しており、かつ式（Ｉ）の化合物が接着層の外側表面に添加されている。すなわち、物品は、支持層と、式（Ｉ）の化合物を含む第二層との間に配置された接着層を含む。式（Ｉ）の化合物は接着層により支持層に貼り付けられている粉末又はコーティングの形態であってよい。粉末又はコーティングは、接着層上に均一に堆積させてよく、又はパターン様に堆積させてもよい。好適な接着剤は、典型的には水又は水性媒質に可溶性のものであり、かつ微生物の増殖を阻害しないものである。好ましくは、接着剤は、支持層の表面上に存在し得る格子パターンを観察するために水で湿潤させた場合に、十分な透明性が提供されるよう選択される。
【００８９】
式（Ｉ）の化合物が粉末（例えば、脱水和物形態）として存在する場合、接着層の厚みは、典型的には外側表面に取り付ける任意の粉末の直径未満であるよう選択される。接着層があまりに薄い場合、粉末を十分に支持層に接着させるのが難しくなる場合がある。しかしながら、接着層があまりに厚い場合には、粉末は接着層内に完全に埋没してしまう恐れがある。
【００９０】
多くの場合、接着層は感圧接着剤であるものの、他の種類の接着剤を使用することもできる。一部の実施形態では、接着剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７０３，１２０号（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）に記載のものなどのシリコーン系接着剤であってよい。他の実施形態では、接着層は、例えば、アクリル酸イソオクチルとアクリルアミドとのコポリマー（例えば、モル比９０：１０〜９８：２又はモル比９２：８〜９６：４）、又はイソオクチルアクリレートとアクリル酸とのコポリマー（例えば、モル比９０：１０〜９８：２、モル比９２：８〜９６：４、又はモル比９４：６〜９６：４）、などのアクリル系コポリマーを含有する。アクリル系コポリマーからなる好適な接着剤は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６８１，７１２号（Ｎｅｌｓｏｎ）に更に記載される。接着層は、ナイフコーティング、押し出し成形、及び剥離ライナからの積層の移行などの任意の既知の加工法により、支持層に適用することができる。
【００９１】
式（Ｉ）の化合物に加え、第二層には更に所望により、ゲル化剤、微生物を増殖させるための増殖培地、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、及びポリマー粒子などの追加の成分を１つ以上含有させ得る。これらの成分は、多くの場合、室温にて、又は室温付近にて水溶性であるよう選択される。これらの追加成分を、溶液として式（Ｉ）の化合物と混合させ、次に支持層又は接着層に直接適用する。適用後、必要に応じて、任意の好適な乾燥法を用い液体を乾燥させることができる。別の方法としては、第二層の一部となる任意のその他の成分を適用する前又は後に、式（Ｉ）の化合物を支持層又は接着層に適用することができる。一部の実施形態では、追加成分を式（Ｉ）の化合物と混合し、次に、支持層又は接着層の表面上に、粉末として噴霧乾燥させる。他の実施形態では、液体組成物に各種成分を連続的に添加し、次に乾燥させて第二層を生成する。一部の実施形態では、適用方法とは無関係に、第二層はわずかに水を含有する場合がある。すなわち、第二層は、本質的に脱水和された層であるか、又は脱水和物形態である（すなわち、第二層は、周囲環境に存在する水分により第二層が平衡化されることに伴う量の水のみを含有する）。
【００９２】
一部の実施形態では、物品の第二層は所望によりゲル化剤を含有する。当該技術分野において既知の任意の好適なゲル化剤を使用することができる。好適なゲル化剤は、多くの場合水溶性であり（例えば、室温、又は室温付近の水に可溶性）、限定するものではないが、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ローカストビーンガム、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアー、アラビアゴム（アカシアゴム）、キサンタンガム、カラギーナン、グルコマンナン、又はこれらの素材の組み合わせが挙げられる。他の好適なゲル化剤は、ポリアクリルアミド、又はグリコールで修飾した多糖及びデンプン−グラフト−ポリ（アクリル酸ナトリウム−コ−アクリルアミド）などの超吸収体材料であり得る。一部のゲル化剤は、水と反応してヒドロゲルを形成し得る。
【００９３】
第二層には所望により界面活性剤を含有させることができる。多くの場合、界面活性剤は、選択されたゲル化剤を水に分散させやすくするために添加される。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤であってもよい。例としては、限定するものではないが、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリアルキレンオキシド誘導体、及びポリソルベートが挙げられる。ポリソルベートの例としては、限定するものではないが、商品名ＰＬＵＲＯＮＩＣでＢＡＳＦ（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から市販されているものなど、商品名ＴＲＩＴＯＮ（例えば、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）でＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）市販されているものなど、商品名ＴＷＥＥＮ（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０及びＴＷＥＥＮ  ８０）でＲｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されているものなど、並びに同様物などの、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートが挙げられる。
【００９４】
第二層には、微生物を増殖させるのに好適な増殖培地を含有させることもできる。当該技術分野において既知の任意の好適な増殖培地を使用できる。好適な増殖培地は、多くの場合、水溶性（例えば、室温又は室温付近の水に可溶性）のブロス形態である。増殖培地は、対象とする特定の微生物の増殖を特に最適化させるために選択することができる。例としては、限定するものではないが、易分解性糖質、アミノ酸、肉抽出物、酵母抽出物、緩衝塩、及び同様物が挙げられる。
【００９５】
第二層には、所望によりｐＨ緩衝材を含有させることもできる。任意の好適なｐＨ緩衝材を使用することができる。式（Ｉ）の化合物は、酸性条件下で有利に使用できるものであることから、ｐＨ緩衝材は、しばしば、酸性範囲にあるものから選択される。好適なｐＨ緩衝材は、多くの場合、リン酸緩衝材、酢酸緩衝材、炭酸緩衝材、又はこれらの混合物である。ｐＨは典型的には、少なくとも４である。一部の実施形態では、ｐＨは、３〜１０、４〜１０、４〜８、４〜７、又は５〜８の範囲である。
【００９６】
第二層には、所望により、各種ポリマー粒子を含有させることができる。すなわち、物品の第二層には、式（Ｉ）の化合物と、ポリマー粒子とを含有させることができる。ポリマー粒子は、対応する式（Ｉａ）の化合物をサンプル中に存在する酵素と反応させた後の、式（Ｉｂ）の化合物の蛍光強度を増感させるために使用することができる。ポリマー粒子は、通常、親油性の蛍光性及び／又は発蛍光団化合物を溶液から捕捉する。本明細書で使用するとき、用語「捕捉する」は、拡散性の化合物上に又は固相（例えば、ポリマー粒子）に堆積することを意味する。この捕捉により、式（Ｉ）の化合物の拡散が制限されるようになり、希釈効果に起因する蛍光の損失を最小化することができる。ポリマー粒子は、固体又は半固体（例えば、ヒドロゲル）培地での微生物の増殖に関連付けられる酵素活性を検出する際に、式（Ｉ）の化合物の拡散（希釈）を最小化するのに特に有用であり得る。
【００９７】
好適なポリマー粒子は、多くの場合、アクリレートポリマー又はコポリマー、スチレンポリマー又はコポリマー、セルロースポリマー又はコポリマー、デキストランポリマー又はコポリマー、これらの誘導体、又はこれらの組み合わせから調製される。好適なポリマー粒子としては、限定するものではないが、Ｓｏｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から商品名ＭＸ（例えば、ＭＸ−１８０）、ＭＲ、ＭＰ、ＳＧＰ、及びＳＸ−５００で市販のもの、Ｅｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）から商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（例えば、ＲＬＰＯ  ａｎｄ  Ｓ−１０００）で市販のもの、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商品名ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（例えば、非イオン性吸収剤、及びイオン交換樹脂）で市販のもの、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から商品名ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（例えば、イオン交換樹脂）のもの、並びにＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から商品名ＷＨＡＴＭＡＮ（例えば、ＷＨＡＴＭＡＮ  ＱＡ  ５２、及びＷＨＡＴＭＡＮ  ＤＥ  ５３）及びＳＥＰＨＡＤＥＸで市販のものが挙げられる。
【００９８】
式（Ｉ）の発蛍光団化合物の捕捉に好適なポリマー粒子は、典型的には、０．０１マイクロメートル〜１ミリメートルの範囲、０．０５マイクロメートル〜２０マイクロメートルの範囲、０．１マイクロメートル〜５マイクロメートルの範囲、０．２マイクロメートル〜２マイクロメートルの範囲、の平均粒径を有する。
【００９９】
第二層は任意の好適な量で物品に含有させることができる。第二層が粉末形態である場合、第二層は、多くの場合、平方ｃｍあたり少なくとも０．４ミリグラム（ｍｇ／ｃｍ２）に相当する被覆重量を有する。例えば、被覆重量は、少なくとも０．５ｍｇ／ｃｍ２、少なくとも１ｍｇ／ｃｍ２、少なくとも２ｍｇ／ｃｍ２であってよい。
【０１００】
一部の実施形態では、物品は、米国特許第４，５６５，７８３号（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、同第５，０８９，４１３号（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、及び同第５，６８１，７１２号（Ｎｅｌｓｏｎ）に記載のものなどの、薄型フィルム型培養装置である。これらの特許に記載の薄型フィルム型培養装置は、参照により本明細書に組み込まれる。このような物品の一例を図２に示す。物品１００は、支持層１１０、接着層１２０、式（Ｉ）の化合物を含む第二層１３０、スペーサー層１４０、カバー層１５０を含む。カバーシート１５０は、ヒンジ領域１６０で支持層１１０と連結されている。
【０１０１】
支持層１１０は、多くの場合、例えば、ポリエステルフィルム（例えば、少なくとも約１００マイクロメートルの厚さを有するフィルム）、ポリカーボネートフィルム（例えば、少なくとも約１００マイクロメートルの厚さを有するフィルム）、ポリプロピレン又はポリエチレンフィルム（例えば、少なくとも約１００マイクロメートルの厚さを有するフィルム）、ポリスチレンフィルム（少なくとも約３００マイクロメートルの厚さを有するフィルム）、又はポリエチレンコーティングなどの防水性コーティングを施した紙などの比較的硬いフィルムである。支持層は、接着層１２０により被覆される。接着層１２０は、図１ｂに記載の接着層２５と同様のものであってよい。接着層１２０は、支持層１１０と、第二層１３０との間に配置される。第二層１３０は、図１ａ及び１ｂで第二層３０に関し記載されるものと同様のものであってよい。
【０１０２】
図２中のスペーサー層１４０は、疎水性（すなわち、水性媒質により湿潤されない）であり、微生物に対して不活性であり、かつ滅菌耐性であるポリマー材料から形成することができる。好適な材料としては、限定するものではないが、独立気泡ポリエチレンフォームが挙げられる。第二層１３０を曝露し、かつ所定の大きさ及び形状（例えば、円形、正方形、楕円形、又は長方形）を有するウェル１７０を提供する孔部を、スペーサー層１４０の中央領域に含ませることができる。液体サンプルに曝露され得る第二層１３０の領域は、孔部の直径により画定される。一部の実施形態では、ウェル１７０は、円筒形状を有する。スペーサー層１４０の厚み、及び孔の大きさのそれぞれにより、ウェル１７０の容量と、第二層１３０に曝露させることのできる液体サンプルの最大容量とが決定される。スペーサー層１４０の厚みは、多くの場合、少なくとも０．５ミリメートル（ｍｍ）、少なくとも１ｍｍ、少なくとも１．５ｎｍ、又は少なくとも２ｍｍである。
【０１０３】
図２は単独のウェル１７０のみを示すものの、スペーサー層に複数の孔を切り込み、複数のウェルをもたらすこともできる。例えば、物品には２０個以上のウェルを含有させることができ、かつ各ウェルでは、種々のサンプルを、対象とする微生物の存在又は非存在について解析するために、使用することができる。
【０１０４】
スペーサー層１４０の一端には、カバーシート１５０が取り付けられる。カバーシートは、外側表面１５０ａと、内側表面１５０ｂとを有する。カバーシート１５０は、ステープル、縫合、接着、及び接着テープなどの、任意の既知の種類の取付手段を用い取り付けることができる。カバーシート１５０は、多くの場合、人の目には透明である、微生物不透過性でありかつ水蒸気不透過性である、空気透過性である、又はこれらの組み合わせであるように選択される。透明であることで微生物のコロニーを計数しやすくなる。カバーシート１５０は、第二層１３０の望ましくない汚染を予防する又は最小化するよう機能し得る。加えて、任意のインキュベーション期間中に微生物の増殖を支持し得る閉鎖環境をもたらすために、カバーシート１５０を支持層１１０と組み合わせて使用することができる。カバーシート１５０は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、及びポリビニリデンフルオリドなどから調製することができる。一部の物品では、カバーシートは二軸延伸ポリプロピレンである。カバーシート１５０には、所望により、接着層（掲載せず）、及びゲル化剤、増殖培地、又はこれらの組み合わせを含む少なくとも１つの追加の層（掲載せず）を更に含有させることができる。任意のこれらの所望の層は、典型的には、ウェル１７０を覆うカバーシートの内側表面１５０ｂ上に存在する。
【０１０５】
図２の物品は、試験サンプルに含まれる微生物を検出するために使用できる。試験サンプルは、ウェル１７０に導入することができ、ウェル１７０では、試験サンプルはウェル１７０の底部にある第二層１３０に曝露される。インキュベート時には、試験サンプルに含まれる微生物が増殖し得る。微生物が、式（Ｉ）の化合物の酵素反応性基Ｒ２基（例えば、式（Ｉａ）の化合物中のＲ２ａ基）を加水分解し得る酵素を含有する場合、得られる式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物は、蛍光分光法を用い検出することができる。蛍光シグナル強度は、酵素濃度及び微生物濃度に相関し得る。
【０１０６】
第五態様では、微生物を検出する方法が提供される。この方法は、式（Ｉａ）の蛍光性化合物を提供することを包含する。
【化１７】
2014511846.tif 000019
式（Ｉａ）中、Ｒ１は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ２ａ基は、酵素反応性基である。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。本方法は更に、試験サンプルを式（Ｉａ）の化合物とインキュベートすることであって、試験サンプルは酵素を含有し、酵素がＲ２ａ基を分解することで、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を形成することを含む。
【化１８】
2014511846.tif 000020
【０１０７】
本方法は、更に、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を第一波長の光で励起させることと、第一波長よりも長波長の第二波長で放射される光を検出することと、を含む。本方法は、所望により、物品の第二層に使用するための上述のものなどのポリマー粒子を用い、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を捕捉することを更に含むことができる。
【０１０８】
多くの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図１ａ、１ｂ、及び２に例示するものなどの物品中に存在する。物品は、多くの場合、ゲル化剤、増殖培地、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、又はこれらの混合物を物品の第二層に含有する。
【０１０９】
検出され得る微生物は、式（Ｉａ）の蛍光性化合物上の酵素反応性基Ｒ２ａを加水分解することのできる酵素を含有するか、又は産生する微生物である。例えば、好適な酵素としては、グリコシダーゼ酵素、エステラーゼ酵素、ホスファターゼ酵素、スルファターゼ酵素、ペプチダーゼ、及びリパーゼなどが挙げられる。
【０１１０】
酵素反応性基（すなわち、式（Ｉａ）中のＲ２ａ基）を加水分解することのできる酵素を含有し得る、原核生物及び真核生物などの微生物を特に対象とする。例としては、限定するものではないが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、酵母、及びウイルスが挙げられる。代表的な菌は、例えば、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcusneoformans）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ステラトイデア（Candidastellatoidea）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・パラシローシス（Candidaparapsilosis）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Candida guilliermondii）、カンジダダ・ヴィスワナティ（Candida viswanathii）、カンジダ・ルシタニアエ（Candidalusitaniae）、及びロドトルラ・ムチラギノーザ（Rhodotorula mucilaginosa）など）、並びにカビ（アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、クラドスポリウム（Cladosporium）、フザリウム（Fusarium）、ムコール（Mucor）、ペニシリウム（Penicillium）、クモノスカビ（Rhizopus）、スタキボトリス（Stachybotrys）、及びトリコデルマ（Trichoderma）など）の両方を含む。代表的な細菌は、以下の微生物を含む：アシネトバクター・ルオッフィ（Acenitobacter Iwoffii）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Aeromonashydrophilia）、アエロモナス・カヴィエ（Aeromonas caviae）、アエロモナス・ソブリア（Aeromonas sobria）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・ズブチルス（Bacillussubtilis）、バチルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス中間種（Bacteroidesintermedium）、シトロバクター・フレウンデイ（Citrobacter freundii）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacteraerogenes）、エンテロバクタークロアカエ（Enterobacter cloacae）、腸球菌（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フィカリス（Enterococcusfaecalis）、大腸菌（Escherichia coli）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、インフルエンザ菌（Haemophilusinfluenzae）、パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、コクリア・バリアンス（Kocuriavarians）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア・イノキュア（Listeriainnocua）、マイコバクテリウム・エステラロマテイカム（Mirobacteriumesteraromaticum）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacteriumfortuitum）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、オルガネラ・モルガニイ（Organella morganii）、ペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Peptostreptococcusanaerobius）、ペプトコッカス・マグナス（Peptococcus magnus）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonasfluorescens）シュードモナス・プジタ（Pseudomonas pudita））、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア・リクファシエンス（Serratialiquefaciens）、霊菌（Serratia marcescens）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcusepidermidis）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans）、ストレプトコッカス・アガラクティエＢ（Streptococcusagalactiae B）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、大便連鎖球菌Ｄ（Streptococcusfaecalis D）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcusuberis）、及びキサントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）。
【０１１１】
好適な試験サンプルは、様々な供給源から得られ、又はそれらに由来し得る。供給源は、固体、液体、半固体、ゼラチン性物質、分散体、乳濁液、懸濁液、及びガス（例えば、空気）などであってよい。例えば、試験サンプルとしては、臨床サンプル、環境サンプル、食品サンプル、化粧サンプル、飲料サンプル、水サンプル、及び土壌サンプルが挙げられる。一部の実施形態では、サンプル採取装置及びサンプル採取技術を使用して、試験サンプルを濃縮するか、又は試験サンプルをより解析に好適な形態に変換することができる。試験採取装置の一部の例としては、限定するものではないが、フィルタ、膜、吸着培地、スポンジ、ワイプ、及びスワブなどが挙げられる。
【０１１２】
ワイプ、スポンジ、及びスワブなどのサンプル採取装置の表面を接触させることにより、各種表面（例えば、壁、床、手術装置、器具、食品加工装置）を微生物の存在について試験することができる。サンプル採取装置例としては、商品名３Ｍ  ＱＵＩＣＫ  ＳＷＡＢで３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から市販されているもの、商品名ＰＵＲＥ−ＷＲＡＰＳでＰｕｒｉｔａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．ＬＬＣ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＭＥ）から市販されているもの、商品名ＥＳＷＡでＣｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｏｎａ，ＣＡ）から市販されているもの、及び商品名ＦＬＯＣＫＥＤＳＷＡＢでｍｉｃｒｏＲｈｅｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓ．ｒ．ｌ．（Ｂｒｅｓｃｉａ，ＩＴ）から市販されているものが挙げられる。
【０１１３】
次に、ワイプ、スポンジ、及びスワブなどを直接解析することができ、又は適切な溶媒若しくは溶液などで洗い、抽出するなどして、液体培地に移すことができる。液体培地は、多くの場合、例えば、水、有機溶媒、緩衝材、界面活性剤、又はこれらの組み合わせを含有し得る。次に液体サンプルを直接解析することができ、あるいは濃縮、沈殿、濾過、遠心分離、透析、希釈、解析と干渉し得る特定の成分の不活化、試薬の添加、及び化学処理などの処理を更に行うことができる。
【０１１４】
他の試料採取法としては、膜濾過による微生物の濃縮が挙げられる。例えば、微小孔膜フィルタを使用して、液体サンプル又は気体サンプルから微生物を採取することができる。好適な膜フィルタの平均孔径は、多くの場合、１マイクロメートル未満、０．８マイクロメートル未満、０．４５マイクロメートル未満、又は０．２マイクロメートル未満である。液体サンプル又は気体サンプルを、微生物を保持させるのに十分小さな孔径を有する膜に通過させることができる。微生物は、多くの場合、例えば、物理的な捕捉、特異的な相互作用（例えば、抗原−抗体、又は受容体−リガンド相互作用）、又は非特異的な化学的相互作用（例えば、疎水性の吸着又はイオン交換）により保持することができる。比較的薄型である一部の膜及びフィルタは、多くの場合、本明細書に記載の物品の第二層に隣り合わせて配置することにより、直接解析することができる。言い換えれば、膜及びフィルタは、式（Ｉ）の化合物と、所望によりゲル化剤、緩衝剤、及び増殖培地などと接触させて配置することができる。場合によっては、フィルタ又は膜を導入する前に、液体を加えて第二層を水和する。
【０１１５】
どのような形態であれ、典型的には、試験サンプルを式（Ｉ）の化合物の存在下でインキュベートする。単純に各種成分を一緒に混合することにより、試験サンプルと、式（Ｉａ）の蛍光性化合物又は蛍光性化合物に加えて、増殖培地とを共にインキュベートすることができる。必要に応じて混合物を撹拌及び／又は加熱することができる。培養工程は、任意の時間にわたって行うことができる。一実施形態では、試験サンプル及び酵素基質をインキュベートさせる。インキュベーションには、任意の好適な時間及び温度を使用することができる。インキュベーションは、必要に応じて好気性条件下で実施することができる。例えば、微生物を含有している可能性のある試験サンプルと接触させた物品を、２５℃〜４５℃、２５℃〜４０℃、又は３０℃〜４０℃の温度範囲にて、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、又は更には９６時間以上にわたってインキュベータ内に配置することができる。
【０１１６】
インキュベートしたサンプルに、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物に第一波長よりも長波長の第二波長を放射させるのに十分な時間にわたって、第一波長を有する光を照射することができる。第一及び第二波長の光は、典型的にはいずれも電磁スペクトルの紫外、可視又は赤外領域のものである。インキュベートしたサンプルには、多くの場合、一秒から数十秒にわたって第一波長の光を照射する。
【０１１７】
有利には、式（Ｉ）の化合物は、酸性領域のｐＨを有する試験サンプル中に含まれる微生物の存在又は非存在を検出するために使用することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、式（Ｉ）の化合物上にフッ化物基が存在することで、化合物が有用に機能するｐＨ範囲が拡張される。すなわち、驚くべきことに、式（Ｉｂ）の化合物は、長期間にわたってｐＨ範囲を酸性範囲に含むフルオロフォアである。多くのその他の非フッ化クマリン系化合物蛍光指示薬と比較して、蛍光強度は、酸性条件下で一定時間経過後も比較的一定に維持される傾向がある。
【０１１８】
一部の実施形態では、式（Ｉｂ）の化合物を、約４００ナノメートル又はそれ以上の波長の光により励起することができる。例えば、化合物は、約４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、又は４５０ｎｍ波長で励起することができる。これは、生物由来の物質を含有しているサンプルなどの一部のサンプルに関し有利なものであり得る。生物由来の物質を含有しているサンプルは、多くの場合、約３６５ナノメートルで励起した際に顕著なバックグラウンドシグナルを有するが、約４００ナノメートル又はそれ以上で励起した際にはそのようなシグナルは有さない。これらの波長での励起では、ＩｎＧａＮなどの各種安価な半導体レーザ光源を使用できるようになる。
【０１１９】
約４００ナノメートル又はそれ以上の波長で励起する際には、Ｒ１基が複素環化合物である式（Ｉｂ）の化合物が特に有用である。より詳細には、好適なＲ１基は、多くの場合、環中に二重結合を二つ有する五員の複素環を有する。かかる複素環は、ヘテロ原子を１つ又は２つ有し得る。複素環基の例としては、限定するものではないが、チエニル、ピロリル、フラニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、及びイソチアゾリルが挙げられる。その他の複素環基の例としては、限定するものではないが、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、Ｎ−置換ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、及びベンゾイソオキサゾリルが挙げられる。
【０１２０】
励起した式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物より放射される光は、任意の既知の検出器を用い検出することができる。例えば、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤ）、光ダイオード、及び他の能動装置等の検出器が、利用される場合がある。検出器は、各種一般的に利用されるフィルタ及び光学要素と組み合わせることもできる。
【０１２１】
発光の検出に応じ、様々な追加の工程を任意に実行することもできる。１つの任意の工程では、試験サンプル内の微生物の量を測定するために発光を定量化することができる。発光の定量は、試験サンプルから放射された光の積分強度と、１つ以上の標準サンプルから放射された光の積分強度（同様の条件下）とを比較することによって達成されてもよい。相対比較はまた、例えば、２つの異なる時間（例えば、滅菌手順の前と後）における蛍光強度を比較することによって実行されてもよい。
【０１２２】
任意に実行され得る別の追加の工程としては、検出された光の画像を生成することが挙げられる。実施形態において、多数の個々に指定可能な感光検出器又は要素を有するＣＣＤ（又は他の検出器）は、ピクセル毎のセンサー又はセンサーアレイからの蛍光データの収集を可能にする。このアレイは、例えば、二次元培養表面（例えば、図２に示すのと同様であり、ただしウェルを複数有する物品を用いる）で増殖している微生物コロニーの領域の画像を得るために、照明光源と適切な集光光学機器とを組み合わせて使用してもよい。得られた電子画像は、処理装置アセンブリに、すなわち、画像解析ソフトウェアにより画像のコントラストを強調することができ、かつ自動的に蛍光ゾーンの数を計数するために使用することのできる、処理装置アセンブリに伝送してもよい（あるいは使用者が手動でゾーンの数を計数してもよい）。
【０１２３】
好適な測定装置としては、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ）から商品名３Ｍ  ＡＴＴＥＳＴ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭとして市販の装置が挙げられる。この測定装置では、インキュベートしたサンプルに第一波長の光を約１秒照射することができる。この照射時間は、通常、安定した励起状態を得て、発光強度を積分するのに十分なものである。図２に示すものなどの物品を利用することのできる実施形態では、インキュベートした物品には、最大で数十秒間照射を行うことができる。
【０１２４】
キットもまた本明細書に開示される。本明細書で開示されるキットには、式Ｉの蛍光性化合物、及びその他の成分を包含させることができる。キットには、少なくとも、蛍光性化合物と試験するサンプルとを混合するために構成された容器も含有させることができる。実施形態において、任意選択の容器には、蛍光性化合物を予め装填してもよく、又は実施形態において、任意選択的な容器には、蛍光性化合物を含有している増殖培地を予め装填してもよい。蛍光性化合物を含有している増殖培地を予め装填することのできる容器例としては、図２に示す物品が挙げられる。例えば、式（Ｉａ）の蛍光性化合物を、商品名３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（３Ｍ（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ））などの物品に使用することができる。
【０１２５】
化合物、組成物、物品、微生物の検出法、並びに化合物の合成法などの、多数の項目が提供される。
【０１２６】
第１の項目は式（Ｉ）の化合物である。
【化１９】
2014511846.tif 000021
式（Ｉ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ２基は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基である。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。
【０１２７】
第２の項目は、式中、Ｒ２が、糖基、糖酸基、アミノ糖基、カルボキシル末端化アミノ酸基、カルボキシル末端化ペプチド基、エステル基、エステル含有基、ホスフェート基、又はスルファート基である項目１の化合物である。
【０１２８】
第３の項目は、式中、Ｒ２が単糖基又は二糖基である第一又は第２の項目に記載の化合物である。
【０１２９】
第４の項目は、第１〜第３の任意の項目の化合物のうち、式中、Ｒ１が、−（ＣＯ）−ＯＲ３であり、Ｒ３がアルキルである化合物である。
【０１３０】
第５の項目は、第１〜第４の任意の項目の化合物のうち、式中、Ｒ１が五員の複素環を有する複素環基である、化合物である。
【０１３１】
第６の項目は、第１〜第５の任意の項目の化合物のうち、式中、Ｒ１が、ベンゼン環に縮合した五員の複素環を有する複素環基である、化合物である。
【０１３２】
第７の項目は、水混和性有機溶媒と、式（Ｉ）の化合物とを含む組成物である。
【化２０】
2014511846.tif 000022
式（Ｉ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ２基は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基である。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。
【０１３３】
第８の項目は、第７の項目で記載した組成物であり、この組成物は式（Ｉ−１）の化合物と式（Ｉ−２）の化合物との混合物を含む。
【化２１】
2014511846.tif 000023
【０１３４】
第９の項目は、ａ）支持層である第一層、及びｂ）支持層に隣接した第二層を含む物品であり、第二層は式（Ｉ）の化合物を含む。
【化２２】
2014511846.tif 000024
式（Ｉ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ２基は、ヒドロキシル基又は酵素反応性基である。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。
【０１３５】
第１０の項目は、第９の項目に関し記載した物品であり、第二層は、式（Ｉ−１）の化合物と、式（Ｉ−２）の化合物との混合物を含む。
【化２３】
2014511846.tif 000025
【０１３６】
第１１の項目は、第９又は第１０の項目に関し記載した物品であり、この物品では、第二層は、ゲル化剤、増殖培地、又はこれらの組み合わせを更に含む。
【０１３７】
第１２の項目は、第９〜第１１の項目のうちの任意の物品であり、この物品では、第二層は脱水されている。
【０１３８】
第１３の物品は、第９〜第１２の項目のうちの任意の物品であり、この物品では、第二層は、更に、ポリマー粒子を含む。
【０１３９】
第１４の項目は、第１３の項目に関し記載した物品であり、ポリマー粒子が、アクリレートポリマー又はコポリマー、スチレンポリマー又はコポリマー、セルロースポリマー又はコポリマー、デキストランポリマー又はコポリマー、これらの誘導体、又はこれらの組み合わせを含む。
【０１４０】
第１５の項目は、第１３又は第１４の項目に関し記載した物品であり、ポリマー粒子が、０．０１マイクロメートル〜１マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する。
【０１４１】
第１６の項目は、微生物を検出する方法であり、この方法は、式（Ｉａ）の蛍光性化合物を提供することを包含する。
【化２４】
2014511846.tif 000026
式（Ｉａ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ２ａ基は、酵素反応性基である。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。本方法は、試験サンプルを式（Ｉａ）の蛍光性化合物とインキュベートすることであって、試験サンプルが微生物由来の酵素を含有し、酵素がＲ２ａ基を分解（すなわち、加水分解）することで、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を形成することを更に含む。
【化２５】
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本方法は、式（Ｉｂ）の発蛍光団化合物を第一波長の範囲の光で励起させることと、第一波長よりも長波長の第二波長で放射される光を検出することと、を更に含む。
【０１４２】
第１７の項目は、第１６の項目に関し記載した物品であり、光の第一波長及び第二波長は、紫外、可視、赤外領域のものである。
【０１４３】
第１８の項目は、第１６又は第１７の項目に関し記載した物品であり、試験サンプルを蛍光性化合物と共にインキュベートすることが、液体形態の試験サンプルを、式（Ｉａ）の蛍光性化合物と増殖培地とを含有する脱水和層に加えることを含む。
【０１４４】
第１９の項目は、第１６又は第１８の項目に関し記載した方法であり、この方法では、ポリマー粒子に式（Ｉｂ）の化合物を捕捉することを更に含む。
【０１４５】
第２０の項目は、第１９の項目に関し記載した方法であり、この方法では、ポリマー粒子は、０．０１マイクロメートル〜１マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する。
【０１４６】
第２１の項目は、式（Ｉｂ）の化合物の調製法である。
【化２６】
2014511846.tif 000028
式（Ｉｂ）中、Ｒ１基は、−（ＣＯ）−ＯＲ３、−（ＣＯ）−ＮＲ４Ｒ５、複素環基、アリール、アラルキル、又はシアノである。Ｒ３基は、アルキル、アルケニル、アリール、又はアラルキルである。Ｒ４基及びＲ５基は、各々独立して水素、アルキル、アリール、又はアラルキルである。（ａ）Ｘ１は水素でありかつＸ２はフルオロであるか、又は（ｂ）Ｘ１はフルオロでありかつＸ２は水素であるかのいずれかである。本方法は、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドをフッ素化剤により直接フッ素化し、フッ素化した中間体、すなわち３−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、５−フルオロ−２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、又はこれらの混合物を生成することを包含する。次に、フッ素化した中間体を式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて、
Ｒ１−ＣＨ２−Ｒ２０
（ＩＩＩ）
式（Ｉｂ）の化合物を生成する。式（ＩＩＩ）では、Ｒ１基は、式（Ｉｂ）について定義されるものと同様であり、かつＲ２０基はシアノ、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、又は式−ＣＯＯＲ１の基である。
【実施例】
【０１４７】
以下の実施例内の全ての部分、割合、比率などは、特に記載がない限り、重量によるものとする。
【０１４８】
Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）の商品ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲは、（１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボレート））、マロン酸ジエチル、及びナトリウムメトキシドを含有しているフッ化試薬である。
【０１４９】
アセトニトリル、酢酸、シリカゲル、酢酸エチル、ヘキサン、トリエチルアミン、無水酢酸、濃ＨＣｌ、硫酸マグネシウム、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、デキストロース、シリカゲル、酵母エキス、及びカゼインの膵臓消化物は、ＥＭＤ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）から得た。
【０１５０】
２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドは、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ、ＴＮ）から得た。
【０１５１】
モルホリンは、Ｍａｔｈｅｓｏｎ（Ｃｏｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＯＨ））から得た。
【０１５２】
２−チオフェン酢酸、ピルビン酸ナトリウム、二塩基性リン酸カリウム、及び一塩基性リン酸カリウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得た。
【０１５３】
無水メタノールはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＹ）から得た。
【０１５４】
α−ブロモアセチルピラノガラクトースは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得た。
【０１５５】
水酸化ナトリウム（１Ｎ）は、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から得た。
【０１５６】
ＭＸ−１８０は、Ｓｏｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｏｓａｋａ  Ｊａｐａｎ）から得た単分散アクリレート粒子の商品名である。
【０１５７】
イナゴマメゴムは、ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から得た。
【０１５８】
キサンタンガムは、ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から得た。
【０１５９】
剥離ライナは、Ｌｏｐａｒｅｘ  ＬＬＣ（Ｈａｍｍｏｎｄ，ＷＩ）から入手可能である。
【０１６０】
３−カルボキシエチル−７−ヒドロキシクマリン化合物は、Ｃｈｉｌｖｅｒｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，９１，１１１８〜１１３０（２００１）に従って調製した。
【０１６１】
３−チエニルウンベリフェロン化合物及び３−チエニルウンベリフェロン−ピアノガラクトシド（pyanogalactoside）（ＴＵ−ｇａｌ）は、米国特許第６，５６６，５０８号（Ｂｅｎｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の通りに調製した。調製手順は、参照により本明細書に組み込む。
【０１６２】
２−シアノメチルベンゾイミダゾール化合物は、Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９４３，６５，１０７２（１９４３）に従って調製した。
【０１６３】
３−ベンゾイミダゾリル−７−ヒドロキシクマリン（ＢｉＵ）化合物は、Ｅｌｎａｇｄｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ），３７５（１９９７）に従って調製した。
【０１６４】
実施例１：フッ素化２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドの調製
【化２７】
2014511846.tif 000029
開けたばかりの瓶（０．００２７重量％  Ｈ２Ｏ）から４００ミリリットル（ｍＬ）のアセトニトリルを丸底フラスコに入れ、１２．２３０グラム（３４．５ミリモル）のフッ化試薬（ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ試薬）を溶解させて、溶液を調製した。フッ化試薬を完全に溶解させた後、７．００グラムの（５０．６ミリモル）２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（ＤＨＢｚ）を加え、窒素導入口を有する栓でフラスコの口を閉じ、内容物を室温（約２２℃）にて磁気撹拌棒により撹拌した。２日後、ＮＭＲスペクトルにより、約２９モル％のＤＨＢｚが変換され、かつ９５モルパーセントのＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ試薬が消費されていることが示された。この溶液に窒素を約３０分間バブリングし、更に１２．２９グラムの（３４．７ミリモル）ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ試薬を加えた。溶液は冷凍庫内で２日間持続的に撹拌し、次に室温で３日間撹拌した。
【０１６５】
７日後、濁った懸濁液をろ過し、黄色溶液と白色沈殿を得た。沈殿をろ紙上で乾燥させ、ろ液を真空下で乾燥させた。ろ液から乾燥させた残渣を２００ｍＬのジエチルエーテルに入れ約１時間撹拌し、次にろ過し、黄色固体と黄色ろ液を得た。乾燥させた白色固体及び黄色固体を計量したところ、それぞれ６．０５グラム及び１５．７２グラムであった。各固体に対するＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）はＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ製品のものと一致し、ベンズアルデヒド誘導体のスペクトルは示されなかった。固体の総量は２１．７７グラムであった。ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲ試薬が完全に回収された場合（活性なＦがＨにより置換されたものと仮定する）、約２３．３グラムになるはずである。
【０１６６】
黄色ジエチルエーテル溶液を真空条件下で乾燥させた。ＮＭＲにより、ＤＨＢｚ、５−フルオロ−ＤＨＢｚ（５−Ｆ）、及び３−フルオロ−ＤＨＢｚ（３−Ｆ）の、０．４１：０．４８：０．１１比の混合物であり、微量の不純物を有することが示された。黄色固体の重量は７．５２グラムであった。これらの比に基づく理論収量は、７．５３グラムであったことから、ベンズアルデヒド生成物が完全に回収されたことが示された。黄色の固体を温水に溶解させ、ゆっくりと室温へと冷却し、次にろ過及び乾燥させて、再結晶化した。
【０１６７】
実施例２：部分フッ素化３−エチルカルボキシレート−７−ヒドロキシクマリン（ＦＥＨＣ）の調製
【化２８】
2014511846.tif 000030
窒素導入口を取り付けた丸底フラスコに、開けたばかりの瓶から１５ｍＬのメタノール（水０．００２重量％）を分取し、実施例１の、フッ素化ジヒドロキシベンズアルデヒドのエーテル可溶性混合物（約１９ミリモル）２．８０４グラムを加え、窒素存在下で撹拌して溶液を調製した。３．３ｍＬ（２２ミリモル）のジエチルマロナートを加え、溶液を加熱して３０分間還流した。２００マイクロリットル（μＬ）のモルホリンと、５０μＬの酢酸との固体化（solidified）混合物を加えたところ、反応溶液は直ちに褐色に変色した。この溶液を２時間加熱した後、室温下で約３０分間おいて粗熱をとり、次に冷蔵庫で一晩おいた。
【０１６８】
生成された少量の白〜黄色の針状の結晶をろ過し、ろ紙上で乾燥させた。１Ｈ及び１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、３−エチルカルボキシレート−７−ヒドロキシクマリン（ＥＨＣ）と、６−フルオロ−ＥＨＣ（６−ＦＥＨＣ）と、８−フルオロ−ＥＨＣ（８−
【化２９】
2014511846.tif 000031
ＦＥＨＣ）との１：０．７：０．３比混合物のものと一致した。この構造は上記に示される。
【０１６９】
この混合物を再度加熱して３時間還流し、次いで一晩冷却し、結晶化させた。フラスコのこの結晶ジエチルエーテルで洗浄したところ、更に多量に沈殿した。
【０１７０】
部分フッ素化ＥＨＣ（ＥＨＣと、６−ＦＥＨＣと、８−ＦＥＨＣとの１：０．７：０．３比混合物。ＦＥＨＣと呼ぶ。）を、１ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）濃度でＤＭＳＯに溶解させた。各ウェルに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０〜２．５の範囲で、０．５ユニットずつ増分）を１００マイクロリットルずつ分注し、９６ウェルプレートを用意した。各ウェルに、１０マイクロリットルのＦＥＨＣ溶液を加えた。高濃度での蛍光色素分子の自己消滅による影響を排除するために、１０倍希釈ウェルも１組調製した。１０倍希釈品は、ＤＭＳＯを用いて１ｍｇ／ｍＬ溶液を０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、この溶液から１０μＬを、各ウェルに分取した１００μＬの１００ｍＭリン酸緩衝液に添加することによって調製した。
【０１７１】
ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  Ｍ５蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）から入手可能）を用い、各ｐＨに関し、２５０ナノメートル（ｎｍ）〜５００ｎｍの吸収スペクトルを記録した。
【０１７２】
４００ｎｍの励起波長でＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  Ｍ５蛍光プレートリーダーを用い、プレートのｐＨ範囲にわたって、４１０ｎｍ〜７００ｎｍ波長での発光スペクトルも記録した。最大発光は、４５０ｎｍの波長で生じた。図３は、ＥＨＣ及びＦＥＨＣの、４５０ｎｍ（４００ｎｍ励起）での蛍光カウント数対ｐＨのグラフを示す。ｐＨの関数としてのＦＥＨＣの吸光度及び最大発光は、ＥＨＣ標準のものと同様であった。しかしながら、ｐＨ  ４．５〜６．５での４００ｎｍでの吸光度（及び４５０ｎｍでの発光強度）は、ＥＨＣよりもＦＥＨＣの方が高かった。ＦＥＨＣの蛍光強度は、ｐＨ  ７〜約２．５までの間にわずかに低下した。
【０１７３】
実施例３：クロマトグラフィーによるＦＥＨＣ分離
酢酸エチルとヘキサンとの６０／４０混合物を用い、実施例１の部分フッ化ＥＨＣ（１．５グラムのＦＥＨＣ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離した。３０ｍＬの画分を合計２０画分回収し、薄層クロマトグラフィーで確認し、可能性の高いものを組み合わせた。溶離液の第６画分は、回収後すぐに沈殿し始め、最終的には第４画分〜第８画分で沈殿の兆候が見られた。カラムを、２倍量以上の約２００ｍＬの８０／２０酢酸エチル／ヘキサンの混合物と、続いて２００ｍＬの酢酸エチルとで洗浄した。最後の２画分からは、ロータリーエバポレーターにより、それぞれ溶媒を除去した。重量比９５：５の、６−ＦＥＨＣと８−ＦＥＨＣとの混合物が単離された。
【０１７４】
リン酸緩衝液を入れた各ウェルに、９５：５混合物の１ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液１０マイクロリットルを加えたことを除き、実施例２に記載の手順に従って９６ウェルプレートを用意した。
【０１７５】
ｐＨ範囲にわたって、４００ｎｍでの吸光及び４５０ｎｍでの発光を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  Ｍ５蛍光プレートリーダーで記録した。重量比９５：５の６−ＦＥＨＣと８−ＦＥＨＣとの混合物（６−ＦＥＨＣとして参照する）のスペクトルを、ＥＨＣのみの場合のスペクトルと比較し、図４に示す。図４は、フッ素の添加により、ｐＫａが約６．５〜約４．５に低下したことを示す。これは、蛍光カウントのプロットのおよそ中点のｐＨであった。
【０１７６】
実施例４：部分フッ化３−ベンゾイミダゾリルウンベリフェロン（ＦＢｉＵ）の調製及び分光測定
【化３０】
2014511846.tif 000032
０．２１５グラムの２−シアノメチルベンゾイミダゾール（１．４ミリモル）を、実施例１の０．２１３グラムのフッ素化ジヒドロキシベンズアルデヒド（１．４ミリモル）と、０．２２６グラムの酢酸アンモニウム（２．９ミリモル）と、エタノール（２ｍＬ）と、混合して、溶液を調製した。この溶液を加熱して１．５時間還流した。次に、冷却し、更に１時間撹拌し、次にろ過し、ろ紙上で約２０ｍＬのエタノールにより洗浄し、真空オーブンで室温で一晩乾燥させた。オレンジ色の乾燥固体の重量は３３２ミリグラムであった。
【０１７７】
得られる部分フッ化３−ベンゾイミダゾリルウンベリフェロン（ＦＢｉＵと参照する）を、濃度１ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）でＤＭＳＯに溶解した。各ウェルに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０〜２．５の範囲で、０．５ユニットずつ増分）を１００マイクロリットルずつ分注し、９６ウェルプレートを用意した。各ウェルに、１０マイクロリットルのＦＢｉＵ溶液を加えた。高濃度での蛍光色素分子の自己消滅による影響を排除するために、１０倍希釈ウェルも１組調製した。１０倍希釈品は、ＤＭＳＯを用いて１ｍｇ／ｍＬ溶液を０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、この溶液から１０μＬを、各ウェルに分取した１００μＬの１００ｍＭリン酸緩衝液に添加することによって調製した。
【０１７８】
ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  Ｍ５蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）から入手可能）を用い、１０倍希釈ウェルの３００ナノメートル（ｎｍ）〜７００ｎｍの吸収スペクトルを、各ｐＨに関し記録した。
【０１７９】
４５０ｎｍの励起波長でＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  Ｍ５蛍光プレートリーダーを用い、プレートのｐＨ範囲にわたって、４７０ｎｍ〜６５５ｎｍ波長での発光スペクトルも記録した。最大発光は、４９５ｎｍの波長で生じた。未フッ素化３−ベンゾイミダゾリルウンベリフェロン（ＢｉＵ）の場合と同様に、吸収及び発光スペクトルを記録した。
【０１８０】
図５は、ＦＢｉＵ及びＢｉＵを、４９５ｎｍ（４５０ｎｍ励起）での蛍光カウント数対ｐＨについて比較するグラフを示す。ｐＨの関数としてのＦＢｉＵの吸光度及び最大発光は、このｐＨ範囲でのＢｉＵ標準のものと同様だった。しかしながら、ＦＢｉＵでは、６超から約２．５までのｐＨで蛍光が増感されていることが示された。
【０１８１】
実施例５：フッ素化３−チエニルウンベリフェロン（ＦＴＵ）の調製
【化３１】
2014511846.tif 000033
実施例１のフッ素化ジヒドロキシベンズアルデヒド２．００６グラム（１３．５ミリモル）と、２−チオフェン酢酸１．９３グラム（１３．５ミリモル）とを、丸底フラスコに入れ、磁気撹拌棒により撹拌して溶液を調製した。次に、トリエチルアミンを２．４ｍＬと、続いて無水酢酸を１２ｍＬ加えた。窒素導入口を取り付けた蓋によりフラスコを密閉し、約１２０℃の油浴中で、窒素雰囲気下で約２時間加熱した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、６０：４０酢酸エチル及びヘキサン）により解析したところ、互いにかなり近接した２点の明るい青色蛍光点と、ごくわずかに残留した出発物質とが示された。溶液を大体室温まで冷却させた。生成された褐色固体を約１００ｍＬのＤＩ水に加え、約１時間撹拌し、次にろ過し、わずかに蛍光を帯びた黄色のろ液と、黄土色固体とを得た。この固体の１９Ｆ  ＮＭＲでは、ピークは、−１３２．９ｐｐｍ（ｄｄ；９．９，６．６Ｈｚ）及び−１４９．９ｐｐｍ（ｄ，６．６Ｈｚ）の２箇所に５：１比でスプリットして示された。これらのピークは、反応生成物について予想された構造と一致した。
【０１８２】
固体物質を、真空オーブン中で、室温で一晩乾燥させた。得られた重量は３．５４グラムであった。理論収量は３．８７グラムである（収率９１％超）。少量のサンプルを取り分け、残りを５０ｍＬのメタノールに入れ撹拌した。約３０ｍＬのＨＣｌと、３０ｍＬの脱イオン（ＤＩ）水との混合物を加え、懸濁液を加熱して約２時間還流したところ、懸濁液は還流開始から約３０分後から緑色に変化した。１．５時間撹拌して懸濁液を冷却させ、次にＤＩ水２００ｍＬを加え、約１５分。懸濁液をろ過したところ、暗緑色の固体と、淡黄色のろ液とが得られた。固体を、真空オーブン中で、室温で一晩乾燥させた。
【０１８３】
真空乾燥させる前に採取したサンプルの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、予想積分値（ビニルに対して）が１０．６〜１１．２ｐｐｍであり、シャープである、別個のフェノールピークが観察された。芳香族領域は複雑であったものの、全体的な積分値は、予想される望ましい生成物を組み合わせたものと一致した。１９Ｆ  ＮＭＲでは、２つのピークが、−１３９．５ｐｐｍ（ｄｄ，１０．５，７．６Ｈｚ）と、−１６０．３ｐｐｍ（ｄ，７．５Ｈｚ）とに５：１比で検出された。これらのピークは、６−フルオロ−ＦＴＵ（６−ＦＴＵ）と８−フルオロ−ＦＴＵ（８−ＦＴＵ）との混合物であるフッ素化チエニルウンベリフェロン（ＦＴＵ）のものと一致する。脱アセチル化により得られた重量は２．８２グラムであった（収率９３％）。
【０１８４】
【化３２】
2014511846.tif 000034
【０１８５】
実施例６：アセチル化ＦＴＵ−ピラノガラクトシド（ＦＴＵ−ｇａｌ）の調製
【化３３】
2014511846.tif 000035
実施例５のフッ素化クマリン混合物を、わずかに過剰な量（１．５２グラム、６ミリモル）で丸底フラスコに加え、磁気撹拌棒により、α−ブロモアセチルピラノガラクトース２．０６グラム（５ミリモル）と、１Ｎ  ＮａＯＨ  １０ｍＬと、アセトン２０ｍＬと共に、室温で５日間撹拌した。真空下でアセトンを除去した後、残渣をクロロホルム約１００ｍＬで抽出した。１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用い、残留した未反応成分を抽出し、クロロホルム中の残渣をＤＩ水１００ｍＬで３回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、次に真空下で溶媒を除去し、アセチル化ＦＴＵ−ピラノガラクトシド（ＦＴＵ−ｇａｌアセテート）を得た。１Ｈ及び１９Ｆ  ＮＭＲ解析は、いずれも、６−ＦＴＵ−ｇａｌアセテートと８−ＦＴＵ−ｇａｌアセテートと非フッ化生成物との重量比０．５３：０．１１：０．３７の混合物と一致した。
【０１８６】
実施例７：アセチル化ＦＴＵ−ピラノガラクトシドの脱保護
【化３４】
2014511846.tif 000036
実施例６のＦＴＵ−ｇａｌ  １．２グラムをメタノール１５ｍＬに加え、混合物を調製した。ＦＴＵ−ｇａｌアセテートのほとんどが溶解した。ＮａＯＭｅを１００ミリグラム加えた時点で完全に溶解し、黄色に変化した。溶液を窒素雰囲気下で室温で１〜２時間撹拌したところ、ゆっくりと黄色沈殿物が生成された。溶液をろ過し、黄色固体をろ紙上で乾燥させた。次に、黄色固体を温メタノール約５００ｍＬに溶解させ、冷蔵庫で冷却し、次に更に冷凍庫（−２０℃）で３日間冷却させた。
【０１８７】
連続的にろ過した４画分から、合計０．５８グラムを回収し、体積を減らして（reducing volume）冷蔵庫で冷却させた。アセテート残渣を１Ｈ  ＮＭＲにより確認した。第一画分を１Ｈ及び１９Ｆ  ＮＭＲにより測定したところ、６−ＦＴＵ−ｇａｌと８−ＦＴＵ−ｇａｌと非フッ素化成分との、重量比０．６９：０．０３：０．２８の混合物が含まれていた。６−ＦＴＵ−ｇａｌが最初に溶液から溶出され、次に８−ＦＴＵ−ｇａｌ、続いて非フッ化成分が溶出されたことが観察された。
【０１８８】
第一画分のＦＴＵ−ｇａｌの吸光度及び発光スペクトルを、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの存在下及び非存在下で、ｐＨ  ２．５〜８．０で記録し、次に、同一条件下でＴＵ−ｇａｌ（米国特許第６，５６６．５０８号（Ｂｅｎｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）に従って調製）のスペクトルと比較した。
【０１８９】
図６に示す通り、反応させたアニオンの最大吸収波長（４０５ｎｍ）において、未反応のＦＴＵ−ｇａｌに由来する検出され得る吸収を最小化するために４３０ｎｍで励起し、発光スペクトル（４９５ｎｍ）を記録した。このグラフでは、フッ素化されていないＴＵと比較して、ｐＨ  ５〜７での強度が２倍超増強されていたことが示される。試験した約２／３のサンプルがフッ素化されていた。
【０１９０】
実施例８及び比較例Ｃ１：微生物コロニーの検出
微生物培養プレートの調製
５０ｇのキサンタンガム粉末と５０ｇのイナゴマメゴム粉末との混合物を、５００ｍＬのボトルに入れ、約５分間手動で撹拌した。商品名９７９５Ｒ  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＳＥＡＬＩＮＧ  ＴＡＰＥで３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ  ＭＮ）から市販の感圧接着剤被覆シートの接着剤面に、この混合物を散布してカバーフィルムを用意した。接着剤被覆シートを傾け、過剰量の粉末を除去した。ガム類の被覆重量は、２４平方インチあたり８５ミリグラム（すなわち、１平方センチメートルあたり０．５５ミリグラム）であった。
【０１９１】
２２．８部のカゼインのすい臓消化物、１５．９部の酵母抽出物、４５．５部のピルビン酸ナトリウム、４．１部のデキストロース、９．０部の二塩基性リン酸カリウム、及び２．８部の一塩基性リン酸カリウムを混合することにより増殖培地混合液を調製した。エアモーターミキサを用い、ビーカー中で、５００ｍＬの脱イオン水と、１４．７８グラムの増殖培地混合物とを混合して、増殖培地のブロスを調製し、５グラムのイナゴマメゴムを少しずつ加えて数分間混合した。ビーカーをホイルで覆って、混合物を８０℃まで加熱し、約６分間混合し、次いで、加熱せずに混合しながら、約１０分間冷却した。次いで、ブロスを滅菌ビーカーに注ぎ入れ、プラスチック袋で覆い、冷蔵した。冷却したブロスをスパチュラで注意深く撹拌し、次に２４．４ｃｍ幅の４ｍｉｌシート（０．１０ｍＭ厚ポリエチレンテレフタレートフィルム。商品名ＭＥＬＩＮＥＸ  ４５３でＤｕＰｏｎｔ  Ｔｅｉｊｉｎ  Ｆｉｌｍｓ（Ｈｏｐｅｗｅｌｌ  ＶＡ）から市販）にナイフコーティングした。ブロスをコーティングしたフィルムを、２１０℃の温度に設定したオーブン内で約１０分間乾燥させた。乾燥コーティング重量は、一平方ｃｍあたり約１ｍｇであった。
【０１９２】
２０．３センチメートル（ｃｍ）幅の４ｍｉｌ（０．１０ｍＭ）（ｍｉｌは０．００１インチ（０．０２５ｍＭに相当））厚独立気泡ポリスチレンフォームシート（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｕｊｉ  Ｓｅａｌ，Ｉｎｃ．（Ｂａｒｄｓｔｏｗｎ，ＫＹ）から市販）を、剥離ライナ上の感圧接着剤転写テープに積層した。具体的には、使用した転写テープは、アクリル系感圧接着剤を有し、商品名３Ｍ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＤＨＥＳＩＶＥ  ９２７で３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ）から市販されている。７．６ｃｍ×１０．１６ｃｍの長方形の、７．６ｃｍの一辺と、他方の１０．１６ｃｍの辺中の７．６ｃｍとからなる正方形の中央部に、直径５ｃｍの円盤をダイカットし、積層体から取り出し、円形開口部を作成した。ライナを取り外し、ポリスチレン発泡体の接着剤コーティング表面をブロスコーティングフィルムに接着し、ブロスコーティングした自己支持性基材と、支持性基材のブロスコーティング表面に接着している疎水性スペーサー要素（すなわち、「発泡体ダム」）とを有する基板部材を提供した。積層体から、７．６ｃｍ×１０．１６ｃｍの長方形プレートを切り出した。このプレートには、７．６ｃｍの一辺と、他方の１０．１６ｃｍの辺中の７．６ｃｍとからなる正方形の中央部に、円形開口部を作製した。カバーフィルムの粉末コーティング面を発泡体ダムに向けて、両面感圧接着テープにより基板基材に接着させ、培養プレートを作製した。
【０１９３】
指示液の調製
実施例８に関しては、実施例６のＦＴＵ−ｇａｌを５０ｍＭ（ミリモル濃度）濃度でＤＭＳＯに溶解し、指示液を調製した（指示液１）。この溶液を更に２０倍希釈して、２．５ｍＭ溶液を調製した（指示液２）。
【０１９４】
比較例Ｃ１については、ＴＵ−ｇａｌを２０ｍＭ濃度でＤＭＳＯに溶解させ、指示液を調製した（指示液３）。この溶液を更に希釈して、２．５ｍＭ溶液を調製した（指示液４）。
【０１９５】
ポリマー粒子懸濁液の調製
アクリレート粒子（ＭＸ−１８０）６００ｍｇをバターフィールド緩衝液（３Ｍ（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）より入手可能）１２ｍＬに懸濁し、均質化されるまでボルテックスにかけ、次に４０℃で５０分間超音波処理した。
【０１９６】
微生物試料の準備
製造元からの取扱説明書に従って、３重量パーセント濃度で、トリプチックソイ寒天プレート（商品名ＢＡＣＴＯトリプチケースソイアガーでＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）から市販）を調製した。プレートに大腸菌（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）のＡＴＣＣ  ２９４２５）を画線し、３７℃で一晩インキュベートした。画線したプレートからコロニーを９ｍＬのトリプチックソイブロス（商品名ＢＤ  ＢＡＣＴＯトリプチケースソイアガーでＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）から市販）に単離し、３７℃で一晩（１８〜２０時間）インキュベートした。得られたブロスを、理論上、１ｍＬあたり１０３のバクテリアが存在するようバターフィールド緩衝液で希釈し、微生物懸濁液を調製した。
【０１９７】
１．５ｍＬの滅菌エッペンドルフチューブを１０本用い各サンプルを調製した。１０本中６本にはポリマー粒子懸濁液を１ｍＬ入れ、４本にはバターフィールド緩衝液を１ｍＬ入れた。各チューブには、指示液２、指示液３、又は指示液４のいずれかを１０マイクロリットルか、あるいは指示液１を４マイクロリットル加え、続いて、各チューブには、１０マイクロリットルの１０３個大腸菌懸濁液を加えた。表１は、実施例８−１〜８−５と、比較例Ｃ１〜Ｃ５を要約する。サンプル指示液濃度（蛍光化合物のサンプル濃度）はナノモル濃度（ｎＭ）単位であった。
【０１９８】
１ｍＬのサンプルを、上記のように微生物用培養プレートに接種した。各サンプルについての説明を、表１に示す。
【０１９９】
【表１】
2014511846.tif 000037
【０２００】
プレート８−１及びＣ−１
プレート８−１及びＣ−１を、２時間毎に３枚撮像を行うよう設定したイメージング／インキュベーターシステム（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ（ＲｏｃｈｅｓｔｅｒのＮＹ）インビトロイメージングシステムＦＸ  Ｐｒｏ）でインキュベートした。１枚目は白色光下で撮像し、２枚目は蛍光条件下（５３５ｎｍで励起し、４２０ｎｍで発光）で５秒撮像し、３枚目は同様の蛍光条件下で３０秒撮像した。インキュベータの温度は、約２０℃〜２７℃で変化させた。
【０２０１】
１４時間後には、プレート８−１及びＣ−１では撮像にコロニーがはっきりと写っていた。コロニーは、同様の強度を示しているように見えた。各プレートに関し、対象とする領域では、６個のコロニーと、バックグラウンドを表すために同様の領域のうちコロニーの存在しない近隣スポット６つとを指定した。各プレート毎に、３０秒蛍光放射させた場合の、規定の領域内の平均強度を（平均６コロニー）時間に対しプロットしたものを図７に示す。プロットは、サンプルを含有しているＦＴＵ−ｇａｌの蛍光と、サンプルを含有しているＴＵ−ｇａｌの蛍光とが、初期段階では同等であるものの、サンプルを含有しているＴＵ−ｇａｌの蛍光は経時的に平衡に達する傾向があるのに対し、サンプルを含有しているＦＴＵ−ｇａｌの蛍光は増加し続けたことを示す。この観察は、微生物の代謝に由来する酸性副産物の堆積により、サンプルを含有しているＴＵ−ｇａｌからの発光が、サンプルを含有しているＦＴＵ−ｇａｌからの発光と比較して減少していることと一致する。
【０２０２】
図７で観察される通り、６コロニーに由来するシグナルと、６つのバックグラウンドスポットとを正規化し、バックグラウンドに対するシグナルの対時間比をプロットした。サンプルを含有しているＦＴＵ−ｇａｌに関しては、ノイズ（バックグラウンド）に対するシグナルは、常にサンプルを含有しているＴＵ−ｇａｌよりも高く、差は時間と共に増大した。
【０２０３】
プレート８−２〜８−５及びＣ−２〜Ｃ−５
プレート８−２〜８−５及びＣ−２〜Ｃ−５を３０℃でインキュベートした。プレートをインキュベータから取り出し、１日及び２日後に撮像した。撮像は、暗室内で、３６５ｎｍのＵＶ照射下で、Ｃａｎｏｎ  ４０Ｄカメラにより記録した。全てのプレート上にコロニーが視認された。フルオロフォアが低濃度である場合には、カメラを用いた場合により容易に観察された（プレート８−３対プレート８−２、及びプレートＣ−３対プレートＣ−２）。コロニーから得られた蛍光は、全て、ＭＸ−１８０粒子を存在させた場合の方が、これらを存在させなかった場合よりもかなり強かった。
【０２０４】
以上を以って、蛍光性化合物、発蛍光団化合物、これらの化合物を含有している物品、及びこれらの化合物を用い微生物を検出する方法、並びにこれらの化合物の製造方法が開示された。本開示を、開示されたもの以外の実施形態によって実施することが可能な点は当業者には認識されるであろう。開示された実施形態は、説明を目的として提示されるものであって、限定を目的として提示されるものではなく、本開示は以下の「特許請求の範囲」によってのみ限定されるものである。
【図１ａ】
2014511846.tif 000046
【図１ｂ】
2014511846.tif 000047
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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