(57)【要約】  本明細書中には、被験者における泌尿器科の炎症を治療または予防する方法が記載されており、本方法はａ．前記ヒアルロナンまたはその医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステルが、少なくとも１つの硫酸基と、アルキル基またはフルオロアルキル基を含んでなるＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシル位と、を含んで構成される、改変型ヒアルロナンまたは医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステルと、ｂ．部分的若しくは完全硫酸化ヒアルロナン、または医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステル、またはそれらの組み合わせと、を含有してなる有効量の化合物を被験者に投与する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者における泌尿器科の炎症を治療または予防するための方法において、該方法が
ａ．部分的若しくは完全硫酸化ヒアルロナン、または医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステル、またはこれらの組み合わせ、または
ｂ．改変型ヒアルロナンまたは医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステルと、
を含有してなる有効量の化合物を被験者に投与する工程を含み、
前記ヒアルロナンまたはその医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステルが、少なくとも１つの硫酸基と、アルキル基またはフルオロアルキル基を含んでなるＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシル位を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が改変型ヒアルロナンまたは医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステルであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記アルキル基が非置換アルキル基であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記非置換アルキル基がメチルであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法において、前記フルオロアルキル基が少なくとも１つのトリフルオロメチル基を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法において、前記Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の前記第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンの１％〜１００％がアルキル基またはフルオロアルキル基で置換されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法において、改変前の前記ヒアルロナンの分子量が１０ｋＤａ未満であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法において、改変前の前記ヒアルロナンの分子量が１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法において、少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン及びＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＣ−４ヒドロキシル位、前記グルクロン酸残基のＣ−２位、前記グルクロン酸、またはそれらの任意の組み合わせのＣ−３位で前記ヒアルロナンが硫酸化されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法において、前記化合物の二糖類単位当たりの硫酸化度が０．５〜４．０であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法において、前記アルキル基はメチルであり、少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン及び／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法において、前記アルキル基はメチルであり、少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン及び／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換され、かつ前記化合物の分子量が２ｋＤａ〜１０ｋＤａであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記改変型ヒアルロナンがメチル、エチル、プロピル及びブチルからなる群から選択される非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル基を有し、前記硫酸基が、二糖類単位当たりの硫酸化度が０．５〜３．５であるグルクロン酸部分の前記Ｃ−２またはＣ−３ヒドロキシル位にあり、かつ前記改変型ヒアルロナンの分子量が２ｋＤａ〜１０ｋＤａであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の方法において、前記化合物が部分的若しくは完全硫酸化ヒアルロナン、または前記医薬的に許容可能な塩若しくはそのエステルであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、ヒアルロナンの前記Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の前記第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンの１％〜１００％が硫酸基で置換されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法において、ウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン及びＣ−３ヒドロキシルプロトン、並びにＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法において、前記化合物の二糖類単位当たりの硫酸化度が０．１〜４．０であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法において、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズが２０ｋＤａ未満であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法において、前記部分的硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズが２ｋＤａ〜１０ｋＤａであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法において、前記医薬的に許容可能なエステルがプロドラッグであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、前記硫酸化されたヒアルロナンの平均分子サイズが３ｋＤａ〜６ｋＤａであり、置換度が３．０〜３．５であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法において、前記化合物が医薬組成物として投与されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、前記組成物がカプセル、錠剤、チューインガム、トローチ剤、パウダーまたは飲料を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法において、前記組成物が、静注、筋注、皮下、経口摂取、または経粘膜的に投与されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法において、前記組成物が経粘膜的に投与され、前記経粘膜投与が口腔粘膜、舌下、口腔、膣、鼻腔内、直腸経由、または膀胱内滴注を包含することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の方法において、前記組成物が消炎の用に供する炎消炎剤、解熱性剤、ステロイド薬及び非ステロイド薬、ホルモン、成長因子、避妊薬、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌薬、鎮痛薬、催眠薬、鎮静剤、精神安定剤、抗痙攣薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、鎮痙薬、抗潰瘍薬、ペプチド性アゴニスト、交感神経作動薬、心血管薬剤、制癌薬、またはオリゴヌクレオチドを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法において、前記化合物（ａ）若しくは（ｂ）の医薬的に許容可能な塩が有機塩、金属塩、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法において、前記化合物（ａ）若しくは（ｂ）の医薬的に許容可能な塩がＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、Ｃｕ＋２、Ａｌ＋３、Ｚｎ＋２、２−トリメチルエタノールアンモニウムカチオン（コリン）、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２‐ジメチルアミノエタノール、２‐ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン及びヒスチジンの第四級塩からなる群から選択される塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法において、前記泌尿器科の炎症が前記膀胱、尿道、尿路上皮内膜、腎臓、前立腺、膣、子宮、またはそれらの任意の組み合わせの炎症を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法において、前記化合物の投与が被検者におけるＬＬ−３７の活性を阻害することを特徴とする方法。
【請求項３３】
被検者における泌尿器科の炎症を治療または予防できる化合物をスクリーニングする方法において、該方法が
ａ．前記被験者における泌尿器科の炎症を誘発する量のＬＬ−３７を実験動物の尿生殖器系に投与する工程と、
ｂ．ステップ（ａ）の前及び／またはステップ（ａ）の後に前記動物に試験化合物を投与する工程と、
ｃ．前記動物における泌尿器科の炎症の量を、前記試験化合物でないＬＬ−３７を同量投与された対照動物の泌尿器科の炎症の量と比較する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第１３／０６９，８６０号明細書（２０１１年３月２３日出願）からの優先権を主張する一部継続出願である。該出願は米国特許出願第１２／８７０，７７４号明細書（２０１０年８月２７日出願）からの優先権を主張する一部継続出願であり、該出願は国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９４９８号明細書（２００９年４月３日出願）からの優先権を主張する一部継続出願であり、該出願は米国仮特許出願第６１／０４２，３１０号明細書（２００８年４月４日出願）の利益を主張するものである。本出願はまた、米国仮特許出願第６１／３５２，５５０号明細書（２０１０年６月８日出願）に対する優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／３９５５０号明細書（２０１１年６月８日出願）に対して優先権を主張するものでもある。これらの出願は、それら全ての教示内容に関して、その全体が本明細書において参照により援用されている。
【０００２】
謝辞
本研究は、米国国立衛生研究所（許可番号Ｔ３２  ＨＬ０７９８７４−０４）、及び中小企業技術革新制度（許可番号Ｒ４３  ＤＫ０９３４１３−０１）から一部の資金助成を受けて、本発明に至った。
【背景技術】
【０００３】
泌尿器科の炎症は、多くの個人にとって健康上の大きな懸念である。例えば、神経因性膀胱（ＮＧＢ：ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｂｌａｄｄｅｒ）疾患が過度な炎症によるものであり、後に膀胱線維症を来たす場合がある。小児における先天性疾病の多くは、後部尿道弁、膀胱／排泄腔外反症、及び脊髄髄膜瘤（ＭＭＣ：ｍｙｅｌｏｍｅｎｉｎｇｏｃｅｌｅ）／二分脊椎を含むＮＧＢ疾病につながる。ＮＧＢ疾患はいまだに、小児における腎不全及び腎移植の原因で最も多いものの１つであり続けている。小児におけるこれらのプロセスは成人におけるものと共通部分があり、間質性膀胱炎（ＩＣ：ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ）などの慢性炎症膀胱疾患から、有意な骨盤部疼痛及び消耗性尿症状が起こる。米国においてＩＣに患う人々は４百万人を突破し、その大部分は女性が占めている。根本となる生理は炎症に基づくが、厳密な病因については解明がつかないままになっている。近年、米国泌尿器疾患プロジェクトによってＩＣ関連の経費及び疾病負担額が分析され、年間７億５千万ドルを超過していることが判明した。この病状は原因及び病因が不可解なため、現在における治療は最適なものにはなっていない。疾病過程を永続させる炎症カスケードについての根本的な理解の欠如が、治療選択肢の不足という結果を招いていた。
【０００４】
膀胱痛症候群／間質性膀胱炎（ＰＢＳ／ＩＣ：ｐａｉｎｆｕｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ／ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ）は、消耗性疾病にとどまる無痛性の膀胱疾患であり、真に有効な治療選択肢は僅かしかない１〜４。ＰＢＳ／ＩＣは、主として女性に影響を及ぼす慢性の疾病であり、頻尿、膀胱痛、夜間多尿、尿意促迫、及び骨盤部疼痛により特徴付けられる。根本となる生理が炎症に基づくのに対して、機序の一因となる病因は多くの因子からなり４、ＧＡＧ層の欠失、及びマスト細胞によって媒介される神経性炎症を包含する５。米国においてＰＢＳ／ＩＣは１９９７年には約百万人に影響すると推定されていた６。より最近の推定値は、全女性の０．１％〜１％の範囲に及ぶ２。近年、ＰＢＳ／ＩＣに関連した経費及び疾病負担は、米国泌尿器疾患プロジェクトによって分析され、年間７億５千万ドルを超過していることが判明した７。
【０００５】
２つの消炎性の硫酸化多糖類は、現在利用可能な医療治療法であるが、両方とも特に効果が無い。まず、膀胱内にヘパリンを投与した。ただし、作用が非特異的であり、コストが嵩み、大きな効能が得られないため、定期的な使用を制限された８〜１０。第二に、ＧＡＧ層を補充すると言われる経口エルミロン（ペントサンポリ硫酸）は、効能開始のリードタイムが長いため、その効能が発揮されるのは女性の５０％未満に過ぎず、生物学的利用能に乏しい（摂取量の６％未満）１１、１２。他の２とおりの治療法には、Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ１３（未改変型０．０４％のヒアルロン酸、ＨＡ）、及びＣｙｓｔｏＰｒｏｔｅｋ１４、１５、または０．２％のコンドロイチン硫酸を膀胱内に滴注することが包含される。ＰＢＳ／ＩＣ治療技術の選択肢としては、経口ヒドロキシジン、ケルセチン、アミトリプチリン、ガバペンチン及び麻薬が挙げられ、また、併用療法のほか、膀胱内ＤＭＳＯ、レシニフェラトキシン及びボトックスも使用されている２〜４。治療選択肢を再考すると、効力の高い治療が必要であるという点に同意出来る２、３。
【０００６】
膀胱に尿が貯蔵されるためには、柔順性（適応性）が必要である。これは、低圧では尿の可変容積の保持が不可避的なものであることを意味する。機能不全になると、結果として膀胱圧力が上昇し、尿が腎臓に送られ、糸球体の外傷、腎実質性の線維症、及び腎機能不全を招く。膀胱壁内における細胞外基質（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）の過剰な堆積は、膀胱壁の柔軟性が失われる主要な機序である。この線維症は複数の機序に起因する場合があり、それらの機序の１つに慢性炎症が含まれる。それに呼応して、膀胱線維症は、ＥＣＭタンパク質（コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型）が蓄積される創傷癒合プロセスの一部になっている。また、慢性組織の炎症中に、線維芽細胞及び筋線維芽細胞に対する損傷は、細胞増殖、自動能、収縮性、及びＥＣＭ合成を活性化させる。最終的な結果として、線維症、柔順性の欠如、及び膀胱機能不全に至る。
【０００７】
従来より受け入れられている炎症の治療としてはほかにも、ＵＶ光線療法、コルチコステロイド及び糖質コルチコイド、アシトレチン、シクロスポリン及びメトトレキサートを挙げることができるが、これらの治療はそれぞれ、免疫抑制及び肝疾患から皮膚の菲薄化までにわたる重篤な副作用を引き起こし、更には出生時欠損の原因にもなりかねない。これらの治療は、部分的または完全に効果が無いため、多くの場合は、患者が結果に納得のいかない状態に放置されることになる。
【０００８】
上述したように、ヘパリン治療はまた実験的にも探求されてきた。ヘパリン（即ち、硫酸化多糖）は、因習的に殆ど抗凝固剤としてしか使用されてこなかったが、その消炎特性はよく知られている。これらの炎症疾患の治療においては、ヘパリン及びその誘導体が幾分有望であることが立証されてきた。炎症カスケードにおいて、特にヘパリン及びその誘導体は、少なくとも３つの重要な事象を阻害する。第一に、ヘパリンが白血球インテグリンＰセレクチン及びＬセレクチンに結合してブロックすることである。第二に、ヘパリン及びその誘導体が、カチオン性ＰＭＮプロテアーゼヒト白血球エラスターゼ及びカテプシンＧに結合しこれを阻害することである。それによって炎症カスケードが低減され、セレクチン阻害の第１のヘパリン障壁をエスケープするＰＭＮを介して、タンパク質分解性の組織外傷が軽減される。第三に、ヘパリン及びその誘導体が、前進性グリコシル化終末産物に対する受容体（ＲＡＧＥ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の相互作用をそのリガンドで阻害する可能性のあることである。
【０００９】
ヘパリン及びその誘導体が炎症治療において有望であることが立証されてきた一方で、ヘパリン及びその誘導体を用いた治療は幾つかの重大な欠点も露呈している。第一は、ヘパリン及びその誘導体はブタ由来であることから、ウイルスの異種間転移が懸念されることである。第二は、ヘパリンの抗凝血性特性により、この化合物で治療された糖尿病患者が出血過剰の危険に曝されることである。第三は、カチオンタンパク質血小板因子−４（ＰＦ−４）を有するヘパリンの複合体に対する抗体を産生する特定の個体において、ヘパリンが血小板減少を誘発し、結果として、破滅的な血小板凝集、並びに全身的な奇異性の動脈及び静脈凝固を来たす可能性のあることである。ゆえに、泌尿器科の炎症の治療に使用できる一方で他の治療において遭遇する無数の副作用を回避できる化合物を処方することが重要となっているが、そのニーズはいまだ満たされていない。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書中には、被験者における泌尿器科の炎症を治療または予防する方法が記載されており、本方法は
ａ．前記ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルが、少なくとも１つの硫酸基と、アルキル基またはフルオロアルキル基を含んでなるＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシル位と、を含んで構成される、改変型ヒアルロナンまたは薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルと、
ｂ．部分的若しくは完全硫酸化ヒアルロナン、薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステル、またはそれらの組み合わせと、
を含有してなる有効量の化合物を被験者に投与する工程を含む。
【００１１】
本発明の利益は、後述する説明の一部に記載されており、部分的にはその説明から明らかであり、または以下に記載する態様の慣行によって学ぶことができる。以下に記述した利益は、特に添付の請求の範囲において指摘されている要素及び組み合わせによって実現され、達成される。上掲の概要説明及び下掲の詳細説明は両方とも、例示的かつ単なる説明であり、限定的なものでないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
添付の図面は、本明細書の一部分に組み込まれ、本明細書の一部分を構成しており、後述する幾つかの態様を示す。
【００１３】
【図１】図１は、アルキル化及びフルオロアルキル化ヒアルロナン及び硫酸化されたその誘導体を生成するための合成スキームを示す。
【図２】図２は、部分的硫酸化ヒアルロナンを製造するための例示的な合成手順であって、この合成手順とは、（１）制御された加水分解的な鎖開裂による局部脱重合、（２）トリブチルアンモニウム塩への変換、及び（３）硫酸化によって部分的硫酸化ヒアルロナンの生成である。
【図３】図３は、ＬＬ−３７を滴注された膀胱と生理食塩水対照とを比較した膀胱の肉眼的画像を示す。１２時間後（Ａ）及び２４時間後（Ｂ）に、生理食塩水を滴注された対照膀胱を回収した。内側粘膜表面を露出した半切除済み膀胱には、炎症の形跡がなかった。１２時間後（Ｃ）及び２４時間後（Ｄ）に、ＬＬ−３７を滴注された膀胱（４５分間の単回滴注）を回収した。１２時間後（Ｃ）、中度の炎症が観測され、紅斑／出血の病巣領域、及び大域的な浮腫が観測された。２４時間後（Ｄ）、重篤な炎症が観測され、大域的な浮腫／出血、有意な浮腫、及び血管過多が明瞭に見られた。
【図４】図４は、ＬＬ−３７を滴注された膀胱と生理食塩水対照とを比較した、Ｈ＆Ｅによる組織像を示す。１２時間後（Ａ）及び２４時間後（Ｂ）に、生理食塩水を滴注された対照膀胱を回収した。断面の組織診断に基づき、１２時間目または２４時間目に炎症（Ｕ−尿路上皮、ＳＢＭ−粘膜下組織、ＬＰ−基底膜、ＳＭＣ−平滑筋細胞層）の形跡が無いことが実証された。１２時間後（Ｃ）及び２４時間後（Ｄ）に、ＬＬ−３７を滴注された膀胱（４５分間の単回滴注）を回収した。１２時間後（Ｃ）、中度の炎症が観測され、尿路上皮の潰瘍の病巣領域、ＳＢＭにおける中度の組織浮腫、及びＬＰ層が観測された。全ての層（Ｕ、ＳＢＭ、ＬＰ及びＳＭＣ）にわたって中度のＰＭＮ浸潤があると共に、血管からＰＭＮ（矩形）が辺縁趨向していた。微小膿瘍（ＭＡ）が形成された形跡はなかった。２４時間後（Ｄ）、重篤な炎症が観測され、ＳＢＭにおける中度の浮腫、及びＬＰにおける重篤な浮腫が見られた。全ての層（円形）にわたってＰＭＮが有意に浸潤し、ＭＡが形成されているほか、血管からＰＭＮ（矩形）が辺縁趨向していることも認められた。画像の拡大倍率は全て１０倍である。
【図５】図５は、ＬＬ−３７を滴注された膀胱と生理食塩水対照とを比較する、組織ＭＰＯ炎症定量アッセイを示す。生理食塩水対照組織における最小のＭＰＯ活性（１２時間後に１１ｎｇ／ｍＬ、２４時間後に１４ｎｇ／ｍＬ；青いバー）。ＬＬ−３７を滴注された膀胱におけるＭＰＯ活性の有意な上昇、及び１２時間（２２９ｎｇ／ｍＬ）〜２４時間（８４９ｎｇ／ｍＬ）の継続的な漸増（赤いバー）。
【図６】図６は、ＬＬ−３７を滴注する前（Ａ）のＧＭ−１１１１（１０ｍｇ／ｍｌ）プレコート／前処理、及びＬＬ−３７を滴注した後（Ｂ）のＧＭ−１１１１（１０ｍｇ／ｍｌ）後処理の肉眼的画像（内側粘膜表面を露出した半切除済み膀胱）を示す。２４時間後に全ての組織を回収した。（Ａ）において最小限度の炎症が観測され、浮腫及び斑状の血管過多が軽度にすぎないことが認められた。（Ｂ）において中度の炎症が観測され、中度の浮腫が認められたが、出血の形跡はなかった。パネル（Ｃ）及び（Ｄ）組織の組織像（（Ｃ）は（Ａ）に対応し、（Ｄ）は（Ｂ）に対応する）。粘膜下組織（ＳＢＭ：ｓｕｂｍｕｃｏｓａ）においてＳＡＧＥプレコート／前処理（Ｃ）によって、中度の浮腫があることが明らかにされたが、基底膜（ＬＰ：ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ）における浮腫の形跡はなかった。全ての層にわたってＰＭＮの形跡がなく、血管からの辺縁趨向が無いことも観測された。ＧＭ−１１１１後処理（Ｄ）により、ＳＢＭ及びＬＰに浮腫が存在する一方、尿路上皮及びＳＢＭにはＰＭＮが全く存在せず、ＬＰ層内にはＰＭＮが有意に少ないことが明らかにされた。平滑筋細胞層（ＳＭＣ：ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）と隣接したＬＰ層の深部においては、存在するＰＭＮ（円形）が濃厚化されていた。血管からＰＭＮ（矩形）が辺縁趨向している有意な形跡は、観測されなかった。パネル（Ｅ）は、ＧＭ−１１１１プレコート／前処理の組織ＭＰＯアッセイを示し、前処理済みサンプルにおいてＭＰＯ活性が２２倍に減少したことを図示したものである（紫色のバー）。パネル（Ｆ）は、ＧＭ−１１１１後処理の組織ＭＰＯアッセイを示し、後処理済みサンプルにおいてＭＰＯ活性が２．５倍に減少したことを図示したものである（紫色のバー）。組織像の画像の拡大倍率は全て１０倍である。
【図７】図７は、ＬＬ−３７を滴注する前（Ａ）のヘパリン（１０ｍｇ／ｍｌ）プレコート／前処理、及びＬＬ−３７を滴注した後（Ｂ）のヘパリン（１０ｍｇ／ｍｌ）後処理の肉眼的画像（内側粘膜表面を露出した半切除済み膀胱）を比較対照して示している。２４時間後に全ての組織を回収した。（Ａ）において有意な炎症が観測され、浮腫、血管過多、及び出血が明瞭に見られた。（Ｂ）において有意な炎症が観測され、同様なレベルの浮腫、血管過多、及び出血が明瞭に見られた。パネル（Ｃ）及び（Ｄ）の組織の組織像（（Ｃ）は（Ａ）に対応し、（Ｄ）は（Ｂ）に対応する）。ヘパリンプレコート／前処理（Ｃ）によって、尿路上皮の潰瘍（Ｕ）、粘膜下組織（ＳＢＭ）及び基底膜（ＬＰ）における浮腫、全ての層にわたってＰＭＮが存在しており、かつ血管からＰＭＮが辺縁趨向していることも明らかにされた。ヘパリン後処理済みサンプル（Ｄ）に同様な炎症の組織像が観測された。パネル（Ｅ）は、ヘパリンプレコート／前処理の組織ＭＰＯアッセイを示し、前処理済みサンプルにおいてＭＰＯ活性が僅かに減少したことを図示したものである（紫色のバー）。パネル（Ｆ）は、ヘパリン後処理の組織ＭＰＯアッセイを示し、後処理済みサンプルにおいてＭＰＯ活性に有意な減少がなかったことを図示したものである（紫色のバー）。組織像の画像の拡大倍率は全て１０倍である。
【図８】図８は、ＧＭ−１１１１を「膀胱アーマー（ｂｌａｄｄｅｒ  ａｒｍｏｒ）」として使用してコーティングした図を示す。パネル（Ａ）及び（Ｂ）は、ＧＭ−１１１１（１０ｍｇ／ｍｌ）の滴注直後に回収された組織を表す。（Ａ）は低倍率（１０倍）、（Ｂ）は高倍率（２０倍）である。（Ａ）及び（Ｂ）は、尿路上皮（Ｕ）と隣接した泌尿器ＧＡＧ層の一様なＧＭ−１１１１でのコーティング（緑色蛍光）、粘膜下組織（ＳＢＭ）、基底膜（ＬＰ）、及び表在性平滑筋（ＳＭＣ）層への浸透が深くなったことを示したものである。細動脈を裏打ちする内皮細胞は、基底部及び管腔の両側面（矩形）にＧＭ−１１１１で有意なコーティングを施した図である。パネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＧＭ−１１１１（１０ｍｇ／ｍｌ）の滴注後２４時間目に、回収された組織を表す。（Ｃ）及び（Ｄ）は両方とも２０倍の拡大倍率で撮像された。泌尿器のＧＡＧ層沿いにはＧＭ−１１１１の形跡が無いが、血管構造は依然として、ＳＢＭの選択領域内で、並びに小細動脈を裏打ちする内皮の基底部及び管腔の両側面（矩形）沿いに、顕著に確認された。ＧＭ−１１１１は依然として、ＳＭＣ層の無作為領域に挿入されていることが明瞭に見られた。
【図９】図９は、ＧＭ−０１１１の事前滴注が、ＬＬ−３７（２５０μＭ）誘発性膀胱炎を予防することを示している。ＬＬ−３７を膀胱腔内に滴注した後２４時間目の体量（ａ）、膀胱重量／体量（ｂ）、死体解剖スコア（ｃ）、及び組織学的スコア（ｄ）の変化が、データに示されている。各グラフ内の横線は、平均値（ａ及びｂ）並びにメジアン値（ｃ及びｄ）を示す。グレー色の領域は正常範囲を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】図１０は、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された組織の顕微鏡写真を示す。ＬＬ−３７（２５０μＭ）を滴注した後２４時間目に、膀胱における炎症が顕著に変化したことがわかる。ＧＭ−０１１１の事前滴注によって、膀胱における炎症変化の重篤度が用量依存的な様式で低減する。このことは、多形核好中球浸潤（ＰＭＮで充填された好塩基領域、矢印）、大浮腫(*)、及び剥離した上皮層（矢印）の炎症が軽減されたという特徴によって示されている。膀胱は無処理の正常なもの（ａ及びｅ）、ＰＢＳ／ＬＬ−３７（ｂ及びｆ）、ＧＭ−０１１１（１０ｍｇ／ｍＬ）／ＬＬ−３７（ｃ及びｇ）、並びにＧＭ−０１１１（１００ｍｇ／ｍＬ）／ＬＬ−３７（ｄ及びｈ）で処理されたものである。ＭＬは筋肉層、ＥＬは上皮層、及びＬｕは内腔である。ａ−ｄは画像の概観図、ｅ−ｈは元の拡大率を５ｘとして囲繞領域（ｂｏｘｅｄ  ａｒｅａ）を拡大表示した画像である。
【図１１】図１１は、ＧＭ−０１１１の事前滴注によって、ＬＬ−３７（２５０μＭ）による膀胱炎誘発が防止されることを示す。ＬＬ−３７を膀胱腔内に滴注した後２４時間目の血清中のＳＡＰ濃度（ａ）、ＭＰＯの組織活性（ｂ）、ＩＬ−６の組織中濃度（ｃ）、及びＰＴＸ３（ｄ）が、データに示されている。各グラフ内の横線は平均値を示す。グレー色の領域は正常範囲を示す（＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本化合物、組成物、及び／または方法を開示し記述する前に、下掲の態様はそれらに限定されるものではなく、特定の化合物、合成方法、またはそのような使用は当然変動し得ることを理解すべきである。また、本明細書において用いられている用語は特定の態様に関してのみ記述することを目的とするものであって、制限を意図したものではないことも、理解すべきである。
【００１５】
本明細書、及びそれに続く特許請求の範囲においては、複数の用語に言及する。それらの用語は以下の意味を持つように定義されていなければならない。
【００１６】
明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられているように、文脈上別段の指示が無い限り、単数形の名詞「或る（ａ）」または「或る（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は複数形の指示物を包含することに注意すべきである。ゆえに、例えば、「薬学的担体」に言及する場合、２つ以上のそのような担体の混合物、及びこれらに類するものが包含される。「任意選択的（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」或いは「任意選択的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、後述する事象または状況が起こり得るかどうか、並びに事象または状況が起こる事例、及び起こらない事例がその説明に包含されることを意味する。例えば、語句「任意選択的に置換された低級アルキル」は、低級アルキル基の置換が可能または不可能であり、この説明には非置換低級アルキル及び置換低級アルキルの両方が包含されることを意味する。
【００１７】
明細書及び結びの特許請求の範囲において組成物または物品における特定のエレメントまたは成分の重量部に言及する場合、エレメントまたは成分と、重量部を表す対象となる組成物または物品中の他の任意のエレメントまたは成分との間の重量関係を示す。ゆえに、２重量部の成分Ｘと５重量部成分Ｙとを含む化合物においてはＸ及びＹが２：５の重量比で存在し、化合物中に付加的な成分が含有されているかどうかに関係なくそのような重量比で存在する。
【００１８】
成分の重量％は、特に別段の指定が無い限り、成分が含まれている処方物または組成物の総重量に基づく。
【００１９】
明細書及び結びの特許請求の範囲において使用されている化学種の残基は、特定の反応スキーム、または以降の処方物若しくは化学製品おいて、その化学種から部分が実際に採取されるかどうかに関係なく、化学種の結果的産物としての部分を指す。例えば、Ｙをヒアルロナン分子の残部（即ち、残基）とした場合、少なくとも１つの−ＯＨ基を含有するヒアルロナンは、式Ｙ−ＯＨで表すことができる。
【００２０】
本明細書において用いられている「治療する」という用語は、先在する症状の徴候を維持するかまたは低減するものとして定義される。本明細書において用いられている「防止する」という用語は、１つ以上の疾患の徴候が起こる確率をなくすか減ずるものとして定義される。本明細書において用いられている「阻害する」という用語は、本明細書に記載されている化合物が、化合物の不在下における同じ活性と比較して活性を完全になくすかまたは活性を減ずることができることを云う。
【００２１】
本明細書において用いられている「泌尿器科の炎症」という用語は、泌尿生殖系の任意の部分または領域に関連する炎症として定義される。泌尿器科の炎症には、膀胱、尿道、尿路上皮内壁、腎臓、前立腺、膣、子宮、またはそれらの任意の組み合わせの炎症が包含されるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書において用いられている「ＳＡＧＥ」という用語は、アルキル化及びフルオロアルキル化半合成グリコサミノグリコサンエーテルとして定義される。
【００２３】
泌尿器科の炎症を治療または防止するための方法が、本明細書中に記載されている。一態様において本方法は、改変型ヒアルロナンまたは薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルを被検者に投与する工程を含み、前記ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルが、少なくとも１つの硫酸基と、アルキル基またはフルオロアルキル基を含んでなるＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシル位と、を含んで構成される。
【００２４】
一態様においては、改変型ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシル位が、非置換アルキル基で置換される。本明細書において用いられている「アルキル基」という用語は、炭素原子数が１〜２４の分枝状または無分枝状の飽和炭化水素基である。一態様において、アルキル基はＣ１−Ｃ１０分枝状または直鎖状アルキル基である。アルキル基は非置換または置換であり得る。アルキル基が置換されている場合、アルキル基上に存在する１つ以上の水素原子が、アルキニル、アルケニル、アリール、ハライド、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、アラルキル、またはアルコキシを含むがこれらに限定されない１つ若しくはそれ以上の基と置換され得る。アルキル基に関して「非置換」という用語は、水素と炭素のみからなる飽和炭化水素のことを指す。非置換アルキル基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル及びこれらに類するものが挙げられる。
【００２５】
別の態様においては、ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンが、フルオロアルキル基で置換される。本明細書において用いられている「フルオロアルキル基」という用語は、少なくとも１つの水素原子がフッ素で置換されている、炭素原子数が１〜２４の分枝状または無分枝状の飽和炭化水素基のことを指す。或る態様において、フルオロアルキル基は少なくとも１つのトリフルオロメチル基を含む。他の態様において、フルオロアルキル基は式−ＣＨ２（ＣＦ２）ｎＣＦ３を有し、式中のｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の整数である。一態様において、フルオロアルキル基は−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３または−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３である。
【００２６】
一態様においては、（ａ）ヒアルロナンまたはその誘導体を十分な量の塩基と反応させて、Ｎ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンを脱プロトン化する工程と、（ｂ）脱プロトン化されたヒアルロナンまたはその誘導体をアルキル化剤と反応させるか、または少なくとも１つの脱プロトン化された第一級Ｃ−６ヒドロキシル基をアルキル化若しくはフルオロアルキル化するのに十分な時間及び濃度にてフルオロアルキル化する工程と、によって、ＳＡＧＥが生成される。塩基性条件がまた改変プロセス中にグリコシド結合の開裂、更にはヒアルロナン誘導体の低分子量化につながり得ることは、当業者であれば理解されるであろう。また、塩基性条件によって酸が脱プロトン化され、カルボキシレート基及び二次ヒドロキシル基を生じ、これらの求核性部分のそれぞれが、平衡状態における相対存在量及びアニオン種の求核性に比例して、引き続いて起こるアルキル化に関与し得ることも理解されよう。例えば、グルクロン酸部分の２−Ｏ及び／若しくは３−Ｏヒドロキシルプロトン、またはＮ−アセチルグルコサミン部分のＣ−４ヒドロキシル位は、脱プロトン化され、アルキル化若しくはフルオロアルキル化され得る。これについての例は図１に示されている。図中のＲは水素、アルキル基またはアルキル基であり得る。ヒアルロナン出発材料は、遊離酸またはその塩として存在し得る。
【００２７】
ヒアルロナン出発材料の誘導体はまた本明細書中で使用できる。アルキル化またはフルオロアルキル化ステップに先立って、誘導体はヒアルロナンに対する何らかの改変を含む。本明細書においては多種多様な分子量ヒアルロナンを使用できる。一態様において、改変（例えば、アルキル化、フルオロアルキル化、及び硫酸化）前のヒアルロナンの分子量は１０ｋＤ未満である。別の態様において、アルキル化またはフルオロアルキル化前のヒアルロナンの分子量は、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、または５０ｋＤａ〜５００ｋＤである。或る態様において、ヒアルロナン出発材料またはその誘導体は、動物源から誘導されない。これらの態様において、ヒアルロナンは細菌などの他の源から誘導され得る。例えば、組み換えＢ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現系またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株をヒアルロナン出発材料の生成に使用できる。
【００２８】
ヒアルロナン出発材料またはその誘導体を最初に十分な量の塩基と反応させて、Ｎ−アセチル−グルコサミンの少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンを脱プロトン化する。塩基の選択肢は多様であり得る。例えば、本明細書においては水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどのアルカリ水酸化物を使用できる。塩基の濃度または量は、所望のアルキル化度またはフルオロアルキル化度に応じて変動し得る。一態様において塩基の量は、ヒアルロナン出発材料またはその誘導体のＮ−アセチル−グルコサミン部分の少なくとも０．００１％の第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンを脱プロトン化するのに十分である。他の態様において塩基の量は、ヒアルロナン出発材料またはその誘導体のＮ−アセチル−グルコサミン部分の第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンの０．００１％〜１００％、０．００１％〜９０％、０．００１％〜８０％、０．００１％〜７０％、０．００１％〜６０％、０．００１％〜５０％、１％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３０％、５％〜２０％、１０％〜５０％、２０％〜５０％、または３０％〜５０％を脱プロトン化するのに十分である。溶液の塩基性が高いほど、鎖開裂反応が発生する確率が上昇し、アルキル化／フルオロアルキル化が遂行され得る度合いが高まることが理解されよう。例えば、ヒアルロナン上に存在する他のヒドロキシル基（例えば、２−ＯＨ、及び／または３−ＯＨ）が、アルキル化またはフルオロアルキル化され得る。一態様においては、ヒアルロナン上に存在する全てのヒドロキシル基が、アルキル化またはフルオロアルキル化され得る。他の態様においては、ヒアルロナン上に存在するヒドロキシルプロトンの０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、またはその任意の範囲が脱プロトン化され、引き続いてアルキル化またはフルオロアルキル化され得る。
【００２９】
ヒアルロナン出発材料またはその誘導体を塩基で処理した後、脱プロトン化ヒアルロナンをアルキル化剤またはフルオロアルキル化剤と反応させて、ＳＡＧＥを生成する。アルキル化剤の例としては、限定はされないが、アルキルハライドが挙げられる。臭化アルキル及びヨウ化アルキルは、特に有用である。同様に、フルオロアルキル化剤はフルオロアルキルハライドを包含し得る。有機合成に一般に使用されるアルキル化剤及びフルオロアルキル化剤は、本明細書中で使用できる。
【００３０】
アルキル化及びフルオロアルキル化されたＳＡＧＥを製造するための例示的な合成手順は、図１に提供されている。図１を参照すると、ヒアルロナン（ＨＡ：ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）を塩基（例えば、ＮａＯＨ）及びアルキル化剤（例えば、ＣＨ３Ｉ）で処理し、ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンでメチル化して、メチル化したヒアルロナン（ＭＨＡ：ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）を生成する。図１にはまた、フルオロアルキル化剤（例えば、ＣＦ３（ＣＦ２）２ＣＨ２Ｂｒ）を使用してフルオロアルキル化ヒアルロナン（ＦＨＡ：ｆｌｕｏｒｏａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）を製造するための例示的な合成手順が提供されている。
【００３１】
アルキル化またはフルオロアルキル化されたＳＡＧＥは、アルキル化またはフルオロアルキル化されたＳＡＧＥを硫酸化剤と反応させて硫酸化生成物を生じる。硫酸化の度合いは、部分的な硫酸化から完全な硫酸化にいたるまで変動し得る。一般的に、アルキル化またはフルオロアルキル化されたヒアルロナンまたはその誘導体上に存在する遊離ヒドロキシル基は、硫酸化され得る。一態様において、少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン、及び／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換される。追加の実施形態は、Ｎ−アセチルグルコサミン部分のＣ−４ヒドロキシル位における硫酸塩、または本化合物のグルクロン酸部分のＣ−２位、Ｃ−３位、及びＮ−アセチルグルコサミン部分のＣ−４ヒドロキシル位における硫酸化の任意の組み合わせを含み得る。硫酸化度は、アルキル化またはフルオロアルキル化されたＳＡＧＥの０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、またはその任意の範囲／二糖類単位であり得る。一態様においては、アルキル化またはフルオロアルキル化されたＳＡＧＥを塩基で処理することによって、１つ以上のヒドロキシルプロトンを脱プロトン化し、続いて、硫酸化剤を添加する。硫酸化剤は、ヒドロキシル基または脱プロトン化されたヒドロキシル基と反応して硫酸基を生ずる任意の化合物である。ＳＡＧＥの分子量は反応条件に応じて変動し得る。一態様において、ＳＡＧＥの分子量は２ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、２ｋＤａ〜１００ｋＤａ、２ｋＤａ〜５０ｋＤａ、２ｋＤａ〜２５ｋＤａ、または２ｋＤａ〜１０ｋＤａである。図１は、硫酸化されたアルキル化またはフルオロアルキル化されたＳＡＧＥ（それぞれＳＭＨＡ及びＳＦＨＡ）の例示的な合成を示す。
【００３２】
一態様においては、改変型ヒアルロナンのアルキル基がメチルであり、ヒアルロナンの少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン及び／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換される。別の態様において、改変型ヒアルロナンのアルキル基はメチルであり、ヒアルロナンの少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン、及び／またはＣ−３ヒドロキシルプロトンが硫酸基で置換され、アルキル化後に化合物の分子量が２ｋＤａ〜２００ｋＤａである。そのような化合物の例は、実施例に記載されているＧＭ−１１１１０１である。追加の実施形態は、Ｎ−アセチルグルコサミン部分のＣ−４ヒドロキシル位における硫酸塩、または本化合物のグルクロン酸部分のＣ−２位、Ｃ−３位、及びＮ−アセチルグルコサミン部分のＣ−４ヒドロキシル位における硫酸化の任意の組み合わせを含み得る。或る態様において、Ｃ−６位がアルキル化またはフルオロアルキル化されていない場合、１つ以上のＣ−６位が硫酸化される。一態様においては、Ｃ−６位の最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％、または１００％が硫酸化される。他の態様においては、アルキル化、及び／若しくはフルオロアルキル化、または硫酸化のいずれかによって全てのＣ−６位が改変される。
【００３３】
本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンは、多分散性及び初期平均分子量が異なる様々なヒアルロン酸源から調整され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的結果、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性、及びアルキル化／硫酸化レベルは、開始ＨＡのサイズ及び可溶性に基づいて変動し得る。例えば、サイズが５〜６０ｋＤａの易溶性ＨＡから始めて、再現可能なレベルのメチル化、硫酸化、及び生物学的に高い活性が得られる。
【００３４】
一態様において、部分的若しくは完全硫酸化ヒアルロナンまたは薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルは、泌尿器科の炎症を治療するまたは防止する目的に被検者に投与し得る。本明細書において用いられている「部分的硫酸化ヒアルロナン」という用語は、ヒアルロナンにおいて二糖類単位当たりの硫酸化度が３．５未満である場合を云う。本明細書において用いられている「完全硫酸化ヒアルロナン」という用語は、ヒアルロナンにおいて二糖類単位当たりの硫酸化度が３．５〜４．０である場合を云う。この場合、ヒアルロナンＣ−６ヒドロキシル基の全体ではないにしてもその大部分が硫酸化されている。
【００３５】
ヒアルロナン出発材料は、遊離酸またはその塩として存在し得る。ヒアルロナン出発材料の誘導体はまた本明細書中で使用できる。硫化に先立って、誘導体はヒアルロナンに対する何らかの改変を含む。本明細書における多種多様な分子量ヒアルロナンは、脱重合ステップに使用できる。一態様において、脱重合前のヒアルロナンの分子量は１，０００ｋＤ超である。別の態様において、脱重合前のヒアルロナンの分子量は１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤであり得る。別の態様において、脱重合前のヒアルロナンの分子量は１０ｋＤａ未満であり得る。また、硫酸化ステップに使用できるヒアルロナン分子量には様々な種類があり得る。一態様においてヒアルロナン出発材料は、硫酸化によって部分的硫酸化ヒアルロナンを生じる前に、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖に変換できる。後で更に詳述するように、低分子量ヒアルロナンは酸または塩基で減成されたヒアルロナンである。別法としてヒアルロナンオリゴ糖は、例えば、ヒアルロナンシンターゼまたはヒアルロニダーゼなどの酵素でヒアルロナンを制御された様式で減成することによって生成される。以後に、様々な分子量を有するヒアルロナンオリゴ糖は、ＧＰＣまたはイオン交換分離によって分離できる。図１は、ヒアルロナンから低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖を生成するための例示的な手順を示す。
【００３６】
一態様において、硫酸化対象となるヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖は分子量が１ｋＤａ〜２，０００ｋＤａである。別の態様において、硫酸化対象となる低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖は分子量が５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜１００ｋＤａである。低分子量ヒアルロナンを調製するための例示的な手順は、実施例に提供されている。上述したように、ヒアルロナンを酸または塩基で開裂して低分子量のヒアルロナンを生成することによって、ヒアルロナンの分子量を改変できる。或る態様において、ヒアルロナン出発材料またはその誘導体は、動物源から誘導されない。これらの態様において、ヒアルロナンは細菌などの他の源から誘導され得る。例えば、組み換えＢ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現系をヒアルロナン出発材料の生成に使用できる。
【００３７】
低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖を塩基で処理した後、硫酸化剤と反応させて、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを生成した。有機合成に一般に使用されている硫酸化剤は、本明細書中で使用できる。硫酸化剤の例としては、限定はされないが、ピリジン三酸化硫黄複合体、トリエチルアミン三酸化硫黄複合体、またはジメチルホルムアミド三酸化硫黄複合体が挙げられる。部分的硫酸化ヒアルロナンを製造するための例示的な合成手順は、図２に提供されている。図２を参照すると、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖はトリブチルアミン塩に変換され、凍結乾燥され、ジメチルホルムアミド中に再懸濁され、引き続き硫酸化剤（例えば、ピリジン三酸化硫黄複合体、トリエチルアミン三酸化硫黄複合体、またはジメチルホルムアミド三酸化硫黄複合体）で処理されて、１つ以上のヒドロキシルプロトンを硫酸化する。場合によっては、多糖をピリジン三酸化硫黄複合体で硫酸化すると、結果として多糖の一部分の鎖が切断されて還元末端を生じ、この還元末端がグリコシル硫酸に変換され、複合体中のピリジンと反応して、多糖断片のＮ−グリコシル−ピリジニウム複合体が形成され得ることは、当該技術分野において公知である。一部の態様において、これらの複合体は、効能の減失または有害な影響を示す。他の態様において、硫酸化ＨＡ複合体は、驚くべきことに、活性を保持し、または更には活性の改善をも示すことの両方が見出された。
【００３８】
一態様において、部分的硫酸化ヒアルロナンの二糖類単位当たりの硫酸化度は、０．１、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５若しくは最大４．０、またはその任意の範囲である。別の態様において、部分的硫酸化ヒアルロナンの硫酸化度は約２．５〜４．０まで、２．５〜３．５、または３．０〜３．５である。一態様において、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子量は１００ｋＤａ未満である。別の態様において、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズは１ｋＤａ〜５０ｋＤａ未満、２Ｄａ〜２０ｋＤａ、または３ｋＤａ〜１０ｋＤａである。一態様において、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズは約３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、または１０ｋＤａであり、任意の値は下方端点または上方端点を形成し得る。別の態様において、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズは約３ｋＤａ〜１０ｋＤａ未満、約３ｋＤａ〜約９ｋＤａ、約３ｋＤａ〜約８ｋＤａ、約３ｋＤａ〜約７ｋＤａ、約３ｋＤａ〜約６ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約６ｋＤａ、または約５ｋＤａである。反応条件に応じて、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖上に存在する１つ以上の異なるヒドロキシル基が、硫酸化され得る。一態様においては、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖のＮ−アセチル−グルコサミン残基の第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトンが、硫酸化される。別の態様においては、ヒアルロナンのＮ−アセチル−グルコサミン残基の第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトン、及びウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトンまたはＣ−３ヒドロキシルプロトン、またはＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４ヒドロキシルプロトンが、硫酸基で置換される。別の態様においては、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖のＮ−アセチル−グルコサミン残基の第一級Ｃ−６ヒドロキシルプロトン、ウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２ヒドロキシルプロトン及びＣ−３ヒドロキシルプロトン、並びにＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４ヒドロキシルプロトンが、硫酸基で置換される。別の態様においては、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖上に存在するヒドロキシルプロトンの０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％未満、またはその任意の範囲が脱プロトン化され、引き続き硫酸化され得る。
【００３９】
本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルであり得る。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸を適量の薬学的に許容可能な塩基で処理することによって調製される。薬学的に許容可能な塩は、有機塩、金属塩、またはそれらの組み合わせであり得る。薬学的に許容可能な塩基の代表は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−トリメチルエタノールアンモニウムカチオン（コリン）、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及びこれらに類するものである。一態様において反応は、水中で、単独でまたは不活性な水溶性有機溶媒と組み合わせて、約０℃〜約１００℃の温度で、例えば室温にて実行される。構造式Ｉの化合物と使用される塩基とのモル比率は、何らかの特定の塩に所望される比率が得られるように選択される。例えば、遊離酸出発材料のアンモニウム塩を調製する場合、その出発材料をおよそ１当量の薬学的に許容可能な塩基で処理することによって中性塩を生じ得る。
【００４０】
下記の実施例に例示するように、エステル誘導体は典型的に本化合物の酸性型の前駆体として調製されるため、プロドラッグとして役立ち得る。これらの誘導体は一般に、メチル、エチル、及びこれらに類するものなどの低級アルキルエステルになる。アミド誘導体−（ＣＯ）ＮＨ２、−（ＣＯ）ＮＨＲ、及び−（ＣＯ）ＮＲ２（式中、Ｒは上に定義されているアルキル基）は、カルボン酸含有の化合物をアンモニアまたは置換アミンと反応させて調整し得る。また、エステルは脂肪酸エステルであり得る。例えば、パルミチン酸エステルを調製し、代替エステラーゼ活性プロドラッグとして使用してもよい。
【００４１】
本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、医薬組成物を生成するうえで生物学的系またはエンティティが許容する任意の賦形剤の形で処方できる。そのような賦形剤の例としては、限定はされないが、水、水性ヒアルロン酸、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、及び他の水性の生理的バランスのよい塩溶液が挙げられる。不揮発性油などの非水性ビヒクル、オリーブ油及び胡麻油などの植物油、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルもまた使用できる。他の有用な処方物としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液が挙げられる。賦形剤はまた、等張性及び化学安定性を増強する物質などの添加剤を小量含有していてもよい。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、及びトリス緩衝液が挙げられ、一方、保存料の例としては、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）、クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが挙げられる。或る態様においてｐＨは、投与様式に応じて変化し得る。例えば、組成物のｐＨは、局所投与に適した約５〜約６である。加えて、医薬組成物は、本明細書に記載されている化合物のほか、担体、濃化剤、希釈液、保存料、界面活性剤、及びこれらに類するものも包含し得る。
【００４２】
医薬組成物はまた、本明細書に記載されている化合物と併用される１種以上の活性成分を含み得る。結果として得られた医薬組成物は、適用場所と隣接しているかまたは適用場所から遠位の組織に薬剤及び他の生理活性物質を持続的、継続的送達するための系を提供し得る。生理活性物質は、適用の対象となる生物学的系において局所若しくは全身に生物学的、生理的、治療的な効果をもたらし得る。例えば、薬剤は、数ある機能の中でもとりわけ、感染または炎症の抑制及び／または防止、細胞増殖及び組織再生の増強、腫瘍成長の抑制、鎮痛剤としての作用、抗細胞結合の促進、歯槽骨及び歯の喪失の低減、軟骨及び重量軸受継ぎ手の退化の阻害、並びに骨成長の増強に向けて作用し得る。加えて、本明細書に記載されている化合物はいずれも、２つ以上の薬学的に許容可能な化合物の組み合わせを含み得る。
【００４３】
そのような化合物の例としては、限定はされないが、抗菌剤、消炎剤、麻酔剤、及びこれらに類するものが挙げられる。これらの組成物を薬物供給装置として使用する方法については、以下に詳述する。
【００４４】
医薬組成物は、当該技術分野において公知の技術を使用して調製できる。一態様において組成物は、本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンを薬学的に許容可能な化合物、及び／または担体と混合して調製される。用語「混合」は、化学反応または物理的相互作用が生じないように、２つの成分を混ぜ合わせることとして定義される。用語「混合」には、化合物と薬学的に許容可能な化合物との間の化学反応または物理的相互作用もまた包含される。本化合物に対して、反応性治療薬（例えば、求核基を有するもの）への共有結合が為され得る。第二に、架橋結合した多糖においては、薬理活性剤の非共有結合的閉じ込めもまた起こり得ることである。第三に、静電気的または疎水的な相互作用によって、本明細書に記載されている化合物において薬学的に許容可能な化合物の保持が促され得ることである。
【００４５】
周知のように、指定された場合において改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンの実際の好ましい量は、利用される特定の化合物、処方された特定の組成物、適用の様式、並びに特定の治療対象の特定の位置及び被検者に応じて変動する。所与の宿主に対する用量は、従来の考慮点を用い、例えば、対象化合物及び公知の薬剤の差次的活性の慣習的比較によって（例えば、適切な従来型の薬理学的プロトコールによって）定量できる。医師及び処方者、即ち、医薬化合物の用量を定量する当業者は、標準的な推奨事項に従って問題なく用量を定量できる（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂａｒｎｈａｒｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９９年））。
【００４６】
本明細書に記載されている医薬組成物の投与方法には幾つかの方法があり得、所望される治療が局所的かまたは全身的かに応じて、更には治療対象となる領域に応じても異なる。処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、トローチ剤、液体及び粉剤が包含され得る。従来の薬学的担体、水溶性、粉剤、または油性基剤、濃化剤、及びこれらに類するものは、必要であるかまたは望ましい。投与物はまた、エアロゾルまたは乾燥した微粒状の粉剤を吸入するという手段で直接肺に投与できるほか、炎症を起こした空間または縮重した関節空間内に直接に注射することもできる。また、静注、筋注、皮下、経口摂取、または経粘膜的に投与を行うこともできる。経粘膜経路には、口腔粘膜経由、舌下、経口、腔口、鼻腔内、直腸、及びこれらに類するものが包含され得る。また、膀胱内滴注によって（即ち、尿道カテーテル経由で）膀胱への投与を行うこともできる。
【００４７】
投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液及び乳剤が包含される。非水性担体の例としては、水、アルコール／水溶性溶液、乳剤または懸濁液（生理食塩水及び緩衝媒質を含む）が挙げられる。非経口ビヒクル（開示された組成物及び方法の副次的使用に必要とされる場合）としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーズデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガーズ、または不揮発性油が挙げられる。静脈内のビヒクルは、流動性、及び栄養素補充液、電解質補充液（リンガーズデキストロースを主成分とするものなど）、並びにこれらに類するものが挙げられる。また、保存料及び他の添加剤、例えば、抗菌物質、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス、及びこれらに類するものなども存在し得る。
【００４８】
投薬量は通常１日に１回以上とされるが、治療のコースは数日から数か月、または当業者が送達を中止すべきであると断定するまで継続する。最適な用量、投薬方法、及び繰り返し数は、当業者であれば容易に定量できる。
【００４９】
改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、全身的な泌尿器炎症疾患を治療または防止する目的に、非経口的、静注、筋注、または皮下経由で注射できる。同様に、改変型ヒアルロナン若しくは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンはまたカプセル、錠剤、チューインガム、粉剤、トローチ剤、または飲料の形でも経口投与できる。別法として、改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは膀胱内導入（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）によって（即ち、カテーテルを通して）投与され得る。
【００５０】
本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、少なくとも１つの薬学的に許容可能な化合物を、そのような送達を必要とする患者に送達することが可能であり、薬学的に許容可能な化合物を受容可能な少なくとも１つの組織を、本明細書に記載されている１つ以上の組成物に接触させることを含む。改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、ヒトまたはヒト以外の動物にとって治癒または治療上の価値がある多種多様な放出性生物活性物質に対して、担体として使用され得る。これらの物質のうち、改変型ヒアルロナン、または部分的／完全硫酸化ヒアルロナンによって担持され得るものの多くは、上述されている。本発明のゲルへの取り込みに適した生物活性材料としては、消炎の用途に有効な治療薬、例えば、消炎剤、解熱剤、ステロイド性及び非ステロイド性の薬物、ホルモン、成長因子、避妊薬、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌薬、鎮痛剤、催眠薬、鎮静剤、精神安定剤、抗痙攣薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、鎮痙薬、抗潰瘍薬、ペプチド性アンタゴニスト、交感神経様作用剤（ｓｙｍｐａｔｈｉｍｏｍｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、心血管剤、制癌薬、オリゴヌクレオチド及びそれらの類似物などが挙げられる。生物活性物質は、薬学的活性量で添加される。
【００５１】
本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、他の関連する療法よりも安全性が高い。例えば、ヘパリン及び他の硫酸化多糖は動物実験及び臨床研究の両方において糖尿病の合併症を低減でき、特に糖尿病性腎症に効力がある。ただし、ヘパリンは糖尿病性合併症を防止するための一般的な臨床的環境においては使用できない。これは、ヘパリンの抗凝固特性が過度の出血リスクを招くためである。本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは抗凝固活性が低い。この点は、長期治療にとって重要な考慮事項であり、下掲の実施例において実証されている。加えて、ＳＡＧＥは毒性が殆ど無いかまたは皆無であり、実施例においても実証されている。
【００５２】
一態様において、本明細書に記載されている改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、被検者におけるＬＬ−３７の活性を阻害し得る。ＬＬ−３７はｈＣＡＰ１８前駆体タンパク質のＣ末端から生成される宿主防御ペプチドであり、循環好中球、粘膜上皮の細胞、ケラチノサイト、脊髄性骨髄細胞、皮膚の上皮細胞、消化管、副睾丸腺、及び肺において生成される。ＬＬ−３７はヒト及びマウスの両方における尿路の上皮細胞（尿路上皮細胞）によって生成され、腎臓及び／または膀胱感染症（腎盂腎炎または膀胱炎）の発症時に尿濃度が有意に高くなる。ＬＬ−３７は免疫調節剤であるがゆえに、微生物を根絶する役割を担うばかりでなく白血球走化性、血管新生を促し、マスト細胞の脱顆粒を刺激し、好中球機能を増強し、ＩＬ−８をはじめとするケモカインを誘発し、ＮＦ−kＢ経由で炎症応答を調節し、細胞外基質成分の発現を増強することによって、炎症を誘発する。ＬＬ−３７の作用の下流炎症機序の詳細は完全には理解されていないが、応答には幾つかの細胞表面レセプター及びシグナル伝達経路の活性化が関与する。実施例に示すように、本明細書に記載されている化合物によるＬＬ−３７の阻害は泌尿器科の炎症の治療においてだけでなく、泌尿器科の炎症防止においても有用であり得る。
【００５３】
ＬＬ−３７の濃度上昇と泌尿器科の炎症発生とのつながりに基づき、化合物が被験者における泌尿器科の炎症を治療または防止する能力を有するかどうかに関して、スクリーニングする方法が本明細書に記載されている。一態様において本方法は、被験者における泌尿器科の炎症を誘発する量のＬＬ−３７を実験動物に投与する工程と、被験者における泌尿器科の炎症を誘発する量のＬＬ−３７を実験動物に投与する工程と、ステップ（ａ）の前及び／またはステップ（ａ）の後に動物に投与する工程と、同量のＬＬ−３７を投与された対照動物（化合物でない）と比較する工程と、
を含む。
【００５４】
一態様においては、ネズミモデルを使用して、様々な化合物がＬＬ−３７を阻害することにより泌尿器科の炎症を治療または防止する能力を有するかどうかに関してスクリーニングできる。泌尿器科の炎症の治療及び防止に有用な化合物をスクリーニングするための例示的な手順が、実施例に提供されている。
【００５５】
或る態様において、改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンが泌尿器系の組織内を貫通し限局する能力を追跡することが望ましい。例えば、改変型ヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、蛍光で標識できる。一態様において蛍光標識された改変型ヒアルロナンまたは薬学的に許容可能な塩若しくはそのエステルは、（ａ）少なくとも１つの硫酸基と、（ｂ）アルキル基またはフルオロアルキル基を含んでなるＮ−アセチル−グルコサミン残基の少なくとも１つの第一級Ｃ−６ヒドロキシル位と、（ｃ）少なくとも１つの二糖類単位に共有結合される蛍光基と、を含んで構成される。蛍光標識された改変型ヒアルロナンを製造するための例示的な手順が、実施例に提供されている。
【実施例】
【００５６】
下記実施例は、本明細書に記載されかつ請求されている化合物、組成物、及び方法を製造し評価する方法に関する完全な開示及び記述を当業者に提供する目的で記載されており、単なる例示を目的としたものであって発明者らが自らの発明と見なすものの範囲を制限することは意図していない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確保するための努力が為されてきたが、多少の誤差及び逸脱があることを考慮すべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、温度は℃単位であるかまたは周囲の温度であり、圧力は大気または大気付近の圧力である。反応条件のバリエーション及び組み合わせ（例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力及び他の反応範囲）、並びに記述されたプロセスから得られる生成物の純度及び収率を最適化する目的に使用できる条件は非常に多い。そのようなプロセス条件の最適化に必要とされるものは、合理的かつ日常的な実験だけである。
【００５７】
Ｉ．アルキル化及び硫酸化されたヒアルロナンの評価
ＧＭ−１１１１の調製
下記の研究において評価された改変型ヒアルロナンＧＭ−１１１１は、本明細書中に参照により援用されている国際公開第ＷＯ２００９／１２４２６６号パンフレットにおいて以前に合成されたものである。ＧＭ−１１１１の構造は図１に提供されており、「ＳＭＨＡ」として示されている。
【００５８】
膀胱炎に関するＬＬ−３７誘発モデル
ユタ大学において全ての動物実験は、完全な承認の下でＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って行われた。全ての動物実験に、８〜１２週齢の成体雌のＣ５７／Ｂｌ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）が利用された。全ての動物を、病原体のいない環境に収容して維持し、１２時間の光サイクルで食物及び水を自由に（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）与えた。合成されたＬＬ−３７はユタ大学の中核施設（ペプチド配列：ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ）からＨＰＬＣ均一形態で購入されたものであり、このＬＬ−３７を超純水に溶解して３２０μＭの作用濃度にした。各実験群は、６匹のマウスから構成されていた。イソフルラン（Ｍｉｎｒａｄ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）媒介の全身麻酔に続き、可撓性カテーテル（ＳＩＬＡＳＴＩＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｕｂｉｎｇ，ＤＯＷ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，０．３０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×０．６４ｍｍ  Ｏ．Ｄ．，１．５ｃｍ長）を無菌条件の下で経尿道的に導入した。尿を完全に排液させた後、発熱物質を含まない０．９％の塩化ナトリウム溶液１５０μｌを１分間滴注し、洗浄ステップとして空にした。次に、ＬＬ−３７（３２０μＭ）を最大容量（１５０μｌ）に等しい容積で滴注した。膀胱内接触／滞留時間は４５分であった。対照は発熱物質を含まない０．９％の塩化ナトリウム滴注物から構成され、容積及び接触／滞留時間は実験群と同じであった。突然の過膨張に起因する膀胱の外傷の可能性を回避し、潜在的膀胱尿管逆流を予防するため、注入操作を低速に維持し、滴注用シリンジをカテーテル上に維持して、４５分間全体で溶液の漏出が起こることのないようにした。４５分間の接触／滞留時間の後、膀胱を完全に空にして動物を麻酔から覚ました。実験群に応じて、動物を屠殺し、膀胱内投与後１２時間目または２４時間目のいずれかに組織を回収した。
【００５９】
改変型ヒアルロナン及びヘパリンによるＬＬ−３７誘発性膀胱炎の治療
２つの実験群をＳＡＧＥ及びヘパリン処理の両方について調べた。マウスに麻酔をかけ、先に詳述したようにカテーテル処置を行った。第１（ＳＡＧＥ及びヘパリン処理のそれぞれについてｎ＝４）群は、最初にＬＬ−３７（３２０μＭ）を最大膀胱容量（１５０μｌ）で４５分間滴注し、次に完全に空にする工程から構成された。その後直ちに、ＳＡＧＥまたはヘパリンのいずれか１０ｍｇ／ｍｌを最大膀胱容量（１５０μｌ）で４５分間滴注した。続いて、ＳＡＧＥまたはヘパリンを膀胱内投与した後２４時間目に、膀胱を回収した。第２（ＳＡＧＥ及びヘパリン処理のそれぞれについてｎ＝４）群は、最初にＳＡＧＥまたはヘパリンのいずれか１０ｍｇ／ｍｌを最大膀胱容量で４５分間滴注する工程から構成された。その後、膀胱を空にし、ＬＬ−３７（３２０μＭ）に４５分間にわたって曝露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）させた。ＬＬ−３７投与後２４時間目に、組織を回収した。全ての膀胱組織を半切除、処理、固定し、Ｈ＆Ｅによる染色または組織ＭＰＯアッセイのいずれかを行い、炎症の度合いを数量化する。
【００６０】
蛍光ＧＭ−１１１１の合成
ＧＭ−１１１１（表１）５０ｍｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１０ｍｇとを脱イオン化（ＤＩ）Ｈ２Ｏ１０ｍＬ中に溶かした撹拌溶液に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３ヒドラジド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中に溶かした溶液を添加した。ｐＨを４．７５に調整し、粉末状Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）１０ｍｇを添加した。３規定のＮａＯＨを滴下により添加して、混合物のｐＨを４．７５に維持した。反応混合物をアルミニウム箔で光線から保護し、室温で一晩撹拌した。その後、反応混合物をＮａＣｌ溶液（ＭＷＣＯ  １０００）１００ｍｍに対して２回透析してから、ＤＩ  Ｈ２Ｏに対して１回透析した。透析された溶液を凍結乾燥で乾燥させることによって、ＧＭ−１１１１−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３接合体２５ｍｇが得られた。Ｃａｒｙ５０  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、溶液１ｍｇ／ｍｌの吸光度から６３２ｎｍにおける置換度（ＳＤ）を求めた。ＧＭ−１１１１では平均分子量が５０００Ｄａ、二糖類重量が５３９（二糖類９つ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３では１２００Ｄａ、ＳＤが１４％、即ち、二糖類７単位当たりＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３の修飾はおよそ１つである。
【００６１】
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３−ＧＭ−１１１１の滴注による膀胱のコーティング
マウスに麻酔をかけ、先に詳述した方法と同様にカテーテル処置を行った。ＳＡＧＥ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３バイオコンジュゲート（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、最大膀胱容量（１５０μｌ）で４５分間膀胱に滴注した。その後直ちに（ｔ＝０）または膀胱内ＳＡＧＥ投与後２４時間目に（ｔ＝２４）、膀胱を回収した。全ての組織を処理し、固定して、感光条件下で切断した。全ての細胞核を識別できるように、組織切片をＤＡＰｉで対比染色した。ユタ大学の中核施設において、ＦＶ１０００  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡、及び可変光フィルタ付きＨｅＮｅレーザーを利用して、蛍光画像処理が行われた。
【００６２】
組織収集及び組織学的評価
膀胱を摘出して長手方向に分割した。膀胱の１切片を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、２切片目を組織ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ：ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）アッセイ用に処理した。解剖用実体顕微鏡を使用して半切除済み膀胱の肉眼的画像の処理（ｇｒｏｓｓ  ｉｍａｇｅｓ）を行い、Ｍｏｔｉｃａｍ１０００デジタルカメラ（Ｍｏｔｉｃａｍ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で撮影した。膀胱における炎症の変化を評価するため、組織を一連の等級のアルコールで処理してパラフィンに包埋し、５μＭ切片を切断して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ：ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）で染色した。膀胱上皮（尿路上皮）、粘膜下層、固有層、及び平滑筋層における炎症浸潤物（多形核白血球（ＰＭＮ））の存在及び度合い、浮腫と出血の存在及び度合い、表在性尿路上皮の変化の存在、糜爛、潰瘍化、並びに微小膿瘍形成を基準に、膀胱炎の重篤度を評価した。個々のスライドを検査して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡（オリンパス株式会社，東京，日本）及びＩｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｎｅｔ  １．４  ＭＰＸデジタル顕微鏡カメラ（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｎｅｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）で撮影した。
【００６３】
組織ミエロペルオキシダーゼアッセイ
半切除済み膀胱を組織ＭＰＯアッセイ用に前もって別にしておき、液体窒素中で急速冷凍して、−８０℃で貯蔵した。溶解緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス、１０％のグリセリン）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃７８１４０，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を冷凍組織サンプル（２００μｌ溶解緩衝液／１０ｍｇ冷凍組織）に添加した。組織をマイクロ剪刀で切り刻み、小型のサンプル実験室用Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｏｄｅｌ  ＃９８５−３７０，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を使用して４℃で９０秒間ホモジナイズした。サンプルを２回にわたってそれぞれ（１５００ｇを４℃で）１５分間遠心分離し、上清を新しい無菌管に移した。ＭＰＯ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃ＨＫ２１０，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、膀胱サンプルホモジェネートにおけるＭＰＯの活性を定量した。概括して言うと、ＥＬＩＳＡキットＤｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒを用いサンプルを１：５で希釈して、メーカーの推奨事項に従ってアッセイを実行した。標準液のデュプリケート１００μｌ、サンプル及び対照をウェルに添加した。特に明記しない限り、全てのインキュベーションを室温で１時間行い、続いて洗浄した。インキュベーション及び洗浄ステップの後で、トレーサー及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを順番に添加した。ＴＭＢ基質を添加して２５分間インキュベートした。その後、停止液を添加し、マイクロプレートリーダー（Ｏｐｔｉｍａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各サンプルプレート上の標準曲線を生成し、線形回帰曲線を生成した。全ての値は、平均値＋／−ＳＤとして表される。
【００６４】
抗凝固特性及び毒性
ＧＭ−１１１１が抗Ｘａ抗凝固活性を全く示さず、０．２Ｕ／ｍｇ未満の抗ＩＩａ抗凝固活性を示す。対照的に、非分画ヘパリンの抗Ｘａ抗凝固活性及び抗ＩＩａ抗凝固活性はそれぞれ１５０Ｕ／ｍｇであった。大きな電荷を有するポリアニオン系ポリマーは、ヘパリンとは異なり、第ＸＩＩ因子を活性化し、二次的にキニンを活性化することによって、内因性凝固カスケードを強力に誘発する。第ＸＩＩ因子の活性化に対する検査では、Ｐセレクチン及びＲＡＧＥの薬理学的阻害を遂行するのに必要とされるよりも１０倍〜１００倍の高濃度においてさえも、医療用ヘパリンよりもＧＭ−１１１１の方が安全性が高いようである。ＧＭ−１１１１は、最適な安全性及び広範な効能を有するようである。
【００６５】
標準ドレイズ試験においてＧＭ−１１１１は、培養線維芽細胞または上皮細胞に対して毒性を全く示さず、皮膚毒性は皆無であった。ＧＭ−１１１１の作用に関する予備的な非ＧＬＰ研究では、ラットに対する単回静脈内投与として、及び毎日の静脈内注射において（ラット雌雄それぞれｎ＝３）、ＧＭ−１１１１は毒性の徴候を呈さず、単回急性用量に対する任意の用量レベルにて１００ｍｇ／ｋｇまでであり、７回繰り返された毎日の静脈内投与は１０ｍｇ／ｋｇであった。ＧＭ−１１１１に対する静脈内ＬＤ５０は１００ｍｇ／ｋｇ超である。
【００６６】
結果
ＬＬ−３７による膀胱炎の誘発
膀胱腔内をＬＬ−３７に１回曝露させた後、１２時間目及び２４時間目に、組織を回収して調べた。１２時間後の肉眼的検査から、膀胱に中度の炎症があると思われた。この炎症は、紅斑及び出血の病巣領域と共に大域的浮腫によって特徴付けられる（図３Ｃ）。２４時間後、膀胱に重篤な炎症があるように見えた。この炎症は、大域的浮腫及び出血と共に、有意な組織浮腫及び血管過多によって特徴付けられる（図３Ｄ）。生理食塩水に曝露された対照組織は両方の時点において完全に正常であり、炎症の形跡が無いことが観測された（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【００６７】
その後、１２時間目及び２４時間目の両方の組織をＨ＆Ｅによる染色で処理し、組織構造に基づき評価した。図３Ａ及び図３Ｂに図示されているように、生理食塩水に曝露された対照組織は両方の時点に予期されたとおり、全く炎症が観測されなかった。尿路上皮、粘膜下組織、基底膜、及び平滑筋層は完全に無傷で、ＰＭＮまたはリンパ球浸潤の形跡がなく、組織浮腫もなかった。１２時間後、ＬＬ−３７に曝露された組織において（図３Ｃ）、尿路上皮細胞潰瘍の病巣領域が存在していた。中度の組織浮腫が粘膜下組織及び基底膜層に存在していた。加えて、尿路上皮、粘膜下組織及び基底膜（表面及び深部）層内に中度の数のＰＭＮに加えて、血管からの辺縁があるＰＭＮも観測された。１２時間後に、微小膿瘍（ＰＭＮクラスタ）の形跡は観測されなかった。肉眼的及び組織学的な調査結果からの形跡から、１２時間後に中度の組織炎症反応が生じたことが実証された。これらの調査結果は、１２時間目の回収群における６匹のマウス全てに一貫して観測された。
【００６８】
２４時間目の回収群におけるＬＬ−３７に曝露された膀胱の組織学的評価によって、同様な炎症反応が生じたが、炎症が重度化したことが明瞭にわかった（図４Ｄ）。粘膜下組織内に存在する組織浮腫の質的な量は、２４時間目と１２時間目の組織とで類似していたが、基底膜に生じた浮腫は重度化した。加えて、２４時間目の組織は、尿路上皮、粘膜下組織、及び基底膜（表面及び深部）層内に存在するＰＭＮが有意に多かった。そのうえ、２４時間目の組織は、微小膿瘍（ＰＭＮクラスタ）が存在する複数の領域を有し、炎症反応の顕著化を更に呈した。両方の回収グループにおいて血管からのＰＭＮ辺縁趨向のパターンは類似していることが認められた。ＬＬ−３７に１回曝露させた後、２４時間目の回収群については、肉眼的及び組織学的な調査結果の形跡から炎症の重度がわかりやすいことが実証され、また１２時間目の回収群の方がよりわかりやすいことが実証された。２４時間目のコホートにおいても、１２時間目の回収群と同様の調査結果が６匹のマウス全てに一貫して観測された。
【００６９】
組織ＭＰＯアッセイを使用して、炎症の度合いを定量した。ＭＰＯは、骨髄性系統の全ての細胞において発現される糖タンパク質であり、ＰＭＮのアズール顆粒で多量に存在する。それは、感染症または炎症の発症時に、活性化されたＰＭＮによって放出される重要な酵素であり、ゆえに、炎症の定量的マーカーとして利用される。１２時間目に回収された組織（図５）を比較した発明者らによる結果は、生理食塩水を滴注された対照膀胱（１１ｎｇ／ｍＬ）及び無処理／無滴注の対照膀胱（５ｎｇ／ｍＬ）に対する最小限度のＭＰＯ活性を図示したものである。１２時間後に、ＬＬ−３７に曝露された組織のＭＰＯ活性は、生理食塩水に曝露させた対照サンプル（１１ｎｇ／ｍＬ）と比較して、際立って２１倍に増加したことが明らかにされた（２２９ｎｇ／ｍＬ）。２４時間目に回収された組織（図５）を更に評価したところ、ＭＰＯ活性は、生理食塩水に曝露された対照組織（１４ｎｇ／ｍＬ）において前と同じように最小限度であったが、対照的に、ＬＬ−３７に曝露された膀胱においては６１倍に増加したことが明らかにされた（８４９ｎｇ／ｍＬ）。ＭＰＯデータは、Ｈ＆Ｅによる組織構造を裏付けると共にこれと一貫性を持つ。１２時間後に中度の炎症が生じ、２４時間後には炎症の度合いが増した。
【００７０】
改変型ヒアルロナンによるＬＬ−３７誘発性膀胱炎の排除
硫酸化多糖溶液１０ｍｇ／ｍｌを滴注してＧＭ−１１１１がＬＬ−３７誘発性膀胱炎を防止または軽減する能力を評価した。２つの群が調査の対象となった。第１（後処理、ｎ＝４）群は、ＬＬ−３７に４５分間曝露させ、その後直ちにＧＭ−１１１１で処理する（滞留時間を４５分間とする）工程から構成された。第２（前処理、ｎ＝４）群は、ＧＭ−１１１１で処理し（滞留時間を４５分間とする）続いてＬＬ−３７に４５分間曝露させる工程から構成された。第２群は事前のコーティングが予防的効果を発揮するかどうかを評価するのに役立つ。両方の群において、２４時間後にマウスを屠殺し、膀胱の回収、撮像、処理を行い、Ｈ＆Ｅで染色した。
【００７１】
第１群において、ＧＭ−１１１１後処理の膀胱の肉眼的検査では、紅斑及び血管過多が軽減されたように見えたが、膀胱は依然として浮腫状であった（図６Ｂ）。組織学的評価によって、尿路上皮及び粘膜下組織にＰＭＮが全く存在せず、基底膜層の全体にわたってＰＭＮが有意に少ないことが、露呈された。加えて、調査結果はグラジエント型の応答と一貫しており、ＰＭＮの所在は基底膜層の深部だけに限られているようであった（図６Ｄ）。更にまた、ＳＡＧＥ処理済みの膀胱に微小膿瘍が形成された形跡はなく、血管から少量のＰＭＮが延在していることが観測された。組織ＭＰＯアッセイによって炎症を定量し、ＬＬ−３７で炎症を起こした膀胱と第１群の組織とを比較することによって、ＧＭ−１１１１処理済みの膀胱における炎症反応が１／２．５に減少したことが露呈された（図３Ｆ−青色のバー）（ＬＬ−３７のＭＰＯ活性が８４９ｎｇ／ｍＬであったのに対して、ＳＡＧＥで後処理された第１群のＭＰＯ活性は３４７ｎｇ／ｍＬであった）。
【００７２】
第２群においては、ＳＡＧＥで処理される前の膀胱に紅斑及び血管過多がほぼ全く存在せず、かつ浮腫の所在が最小限度に限られていることが明瞭なことが、肉眼的検査から明らかにされた（図６Ａ）。組織学的評価によって粘膜下組織における中度の浮腫が露呈されたが、基底膜には浮腫の形跡がなかった。膀胱の全ての層にわたってＰＭＮの形跡が全くなく、血管から少量のＰＭＮが延在または辺縁趨向している形跡も無いことが観測された（図６Ｃ）。ＧＭ−１１１１前処理済み組織は概して、炎症の無い生理食塩水対照組織とほぼ似ていた。組織ＭＰＯアッセイによって炎症を定量し、ＬＬ−３７で炎症を起こした膀胱と第２群の組織とを比較することによって、ＧＭ−１１１１で前処理された膀胱における炎症反応が１／２２．３に減少したことが露呈された（図６Ｅ）（ＬＬ−３７のＭＰＯ活性は８４９ｎｇ／ｍＬであったのに対して、ＧＭ−１１１１で前処理された第２群のＭＰＯ活性は３８ｎｇ／ｍＬであった）。組織学的な調査結果及びＭＰＯ結果の両方から、膀胱組織をＧＭ−１１１１で前処理すれば、重要な保護治療として役立ち得ることが示唆された。
【００７３】
膀胱をヘパリンで処理することによって、準最適な消炎結果が得られた。第１（後処理）群の肉眼的結果から、浮腫、血管過多、及び出血が全く明瞭に見られるという点で炎症が有意なものであることが露呈された（図７Ｂ）。組織学的な調査結果に一貫性があり、尿路上皮の潰瘍、粘膜下組織及び基底膜浮腫、全ての組織層にわたる大量のＰＭＮ、及び血管から辺縁趨向しているＰＭＮが認められた（図７Ｄ）。ＭＰＯアッセイ（図７Ｆ）によって、無処理のＬＬ−３７に曝露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）された膀胱とヘパリン後処理済み組織との間の炎症性活性の差異はほぼ無視してよい程度であることが露呈された（ＬＬ−３７のＭＰＯ活性が８４９ｎｇ／ｍＬであったのに対して、ヘパリンで後処理された第１群のＭＰＯ活性は８２７ｎｇ／ｍＬであった）。第２（前処理）群の肉眼的結果から、浮腫、血管過多、及び出血が全く明瞭に見られる形態であるという点で炎症が有意なものであり、調査結果が第１群と類似していることが露呈された（図７Ａ）。組織学的な調査結果も第１群と相似しており、尿路上皮の潰瘍、粘膜下組織及び基底膜浮腫、全ての組織層にわたって存在するＰＭＮ、及び血管から辺縁趨向しているＰＭＮが認められた（図７Ｃ）。ＭＰＯアッセイ（図７Ｅ）によって、無処理のＬＬ−３７に曝露された膀胱とヘパリン前処理の組織との間の炎症性活性の差異はごく僅かであることが露呈された（ＬＬ−３７のＭＰＯ活性が８４９ｎｇ／ｍＬであったのに対して、ヘパリンで前処理された第２群のＭＰＯ活性は７５９ｎｇ／ｍＬであった）。
【００７４】
「膀胱アーマー（Ｂｌａｄｄｅｒ  Ａｒｍｏｒ）」剤としてのＧＭ−１１１１
改変型ヒアルロナンの組織コーティング特性及び貫通特性をよりよく解明するために、蛍光標識されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３−ＧＭ−１１１１溶液１０ｍｇ／ｍを滴注し、４５分間の滞留時間を１回経た直後に（ｔ＝０）組織を回収して、２４時間後に（ｔ＝２４）再び組織を回収した。また、全ての細胞核を識別できるように、処理済みの組織をＤＡＰｉで染色した。即時回収群の最初の結果から、尿路上皮に近接した表在性泌尿器ＧＡＧ層のコーティングが均一なことと、粘膜下層、基底膜、及び表在性平滑筋層への浸透が深くなったことがわかった（図８Ａ及び図８Ｂ）。加えて、細動脈を裏打ちする内皮細胞において、これらの血管構造の基底部及び管腔の両側面にＧＭ−１１１１で有意なコーティングが施されていることも図示されている。細動脈を裏打ちする内皮においてＧＭ−１１１１でコーティングされている形跡が無いことが観測された。２４時間目の回収群の結果から、即時回収群において前回観測された認められたＧＭ−１１１１が、泌尿器ＧＡＧ層沿いに存在する形跡の無いことが明らかにされた。重要な点は、粘膜下組織の領域内、並びに基底部及び管腔の両側面上の小細動脈を裏打ちする内皮沿いに、ＧＭ−１１１１が依然としてはっきり鮮明に見えたことであった（図８Ｃ及び図８Ｄ）。最後に、ＧＭ−１１１１は依然として、膀胱平滑筋の無作為領域に挿入されていることが可視化された。これらの結果から、２４時間後に依然として膀胱内でＧＭ−１１１１の単回曝露が持続していることがわかった。
【００７５】
ＩＩ．部分的及び完全硫酸化ヒアルロナンの評価
塩基処理済みヒアルロナンを原料とする硫酸化低分子量ヒアルロナン（ＬＭＷ−ＨＡ）の調製
ａ．塩基処理済みＬＭＷ  ＨＡ
１００ｍｌのビーカーに入ったＮａＯＨ（４０％のｗ／ｖ）２０ｍＬにＨＡ（２ｇ、６７ｋＤａ）を溶解して、混合物を室温にて２時間撹拌し、ストランド開裂を誘発させて部分的にＨＡを脱重合した。結果として得られた粘性液を、イソプロパノール１００ｍＬが入った４００ｍｌのビーカーに移し、室温で２４時間撹拌した。結果として得られた溶液を重力濾過器（濾紙）に通して粗生成物を収集してから、蒸留水２５０ｍＬ中に溶解させ、ｐＨを７．０に調製した。その溶液を蒸留水に対して２４時間透析し、この間にウォーターバスを４回交換してから、凍結乾燥で乾燥させ、１．２ｇの塩基処理済みＨＡを得た。この生成物のサイズはＨＰＬＣ＜ＧＰＣまたは電気泳動で定量でき、概して５ｋＤａ〜２０ｋＤａの範囲である。
【００７６】
ｂ．部分的Ｏ−硫酸化塩基処理済みＬＭＷ  ＨＡ
ＬＭＷ  ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るため、塩基処理済みＨＡ（０．２ｇ）を蒸留水２０ｍＬ中に溶かしたものに、ＴＢＡ０．２ｍＬを添加した。その混合物を激しく撹拌して凍結乾燥で乾燥させた。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＨＡ−ＴＢＡ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させ、必要過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中の総ヒドロキシル基（即ち、二糖当たり４）の当量）のピリジン三酸化硫黄複合体（０．３２５ｇ）を添加した。３時間後４０℃にて水２０ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール３０ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させた。硫酸化された粗生成物を濾過して収集し、蒸留水（３０ｍＬ）中に溶解させ、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させた。生成物の収率は６１％（０．２２ｇ）であった。１Ｈ  ＮＭＲに基づく置換度は、およそ０．５〜１であった。元素分析によって硫黄含有率４．１３％が求められた。平均分子量はＧＰＣで６，１００と定量され、多分散性は２．３であった。
【００７７】
ｃ．完全Ｏ−硫酸化塩基処理済みＬＭＷ  ＨＡ
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るため、塩基処理済みＨＡ（０．２ｇ）を蒸留水２０ｍＬ中に溶かしたものに、ＴＢＡ０．２ｍＬを添加した。その混合物を激しく撹拌して凍結乾燥で乾燥させた。結果として得られた塩（ＬＭＷ  ＨＡ−ＴＢＡ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させ、必要過剰量（１６ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシ基の当量）のピリジン三酸化硫黄複合体（１１．０ｇ）を添加した。３時間後４０℃にて水２０ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール３０ｍＬを添加して、粗生成物を沈殿させた。硫酸化された生成物を濾過して収集し、蒸留水（３０ｍＬ）中に溶解させ、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって０．２６ｇの生成物が得られた（６０％の収率）。生成物を１Ｈ  ＮＭＲにより特性評価し、概算の置換度が約３．５であることがわかった。元素分析によって硫黄含有率１３．２２％が求められた。平均分子量はＧＰＣで５，９００と定量され、多分散性は２．２であった。
【００７８】
酸処理済みヒアルロナンを原料とする硫酸化低分子量ヒアルロナン（ＬＭＷ−ＨＡ）の調製
ａ．完全Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（Ｆ−ＯＳＨＡ（１）−１０，０００）
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るため、ＨＡ（０．２ｇ、約１０，０００Ｄａ、１．３ＭＤａのＨＡから減成したもの）を蒸留水２０ｍＬ中に溶かしたものに、０．２ｍＬのＴＢＡを添加した。その混合物を激しく混合して凍結乾燥で乾燥させた。結果として得られた塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させ、必要過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシル基の当量）のピリジン三酸化硫黄複合体（０．３２５ｇ）を添加した。３時間後４０℃にて水２０ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール３０ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させた。硫酸化された生成物を濾過して収集し、蒸留水（３０ｍＬ）中に溶解させ、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって０．１９ｇの生成物が得られた（５８％の収率）。元素分析によって硫黄含有率１２．６２％が求められた。これは、硫酸化度が３．０〜３．５であることを示している。分子量は３，０００Ｄａ未満であり、これは硫酸化及びワークアップ中の酸性脱重合を示唆している。
【００７９】
ｂ．完全Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（Ｆ−ＯＳＨＡ（２）−１０，０００）
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るため、酸変性１０，０００ＭＷのＨＡ（０．２ｇ）を蒸留水２０ｍＬ中に溶かしたものに、ＴＢＡ０．２ｍＬを添加した。その混合物を激しく混合して凍結乾燥で乾燥させた。結果として得られた塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を２０ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、必要過剰量（１６ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシル基の当量）のピリジン三酸化硫黄複合体（１．１ｇ）を添加した。３時間後４０℃にて水２０ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール３０ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させた。硫酸化された生成物を濾過して収集し、蒸留水（３０ｍＬ）中に溶解させ、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥させることによって０．２３ｇの生成物が得られた（６２％の収率）。その生成物を１Ｈ  ＮＭＲにより特性評価し、置換度が３．０〜３．５であることがわかった。元素分析によって硫黄含有率１２．１０％が求められた。分子量は３，０００Ｄａ未満であった。
【００８０】
ｃ．完全Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（Ｋｅｗｐｉｅ  Ｈｙａｌｏ−Ｏｌｉｇｏ−Ｐｙｒ．ＳＯ３）
Ｋｅｗｐｉｅ製Ｈｙａｌｏ−Ｏｌｉｇｏ  ＨＡ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ、８．４ｋＤａ）をＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解させた。撹拌しながらＴＢＡ（１当量、０．５ｍｍｏｌｅ、０．１２ｍＬ）を添加し、更に１０分間撹拌した。必要過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシル基の当量数）のピリジン三酸化硫黄複合体（２４当量、１２ｍｍｏｌｅ、１．９１６ｇ）を添加した。４０℃で３時間撹拌した後、水１５ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール２５ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させた。硫酸化された生成物を濾過して収集し、蒸留水２５ｍＬ中に溶解させて、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって０．１７５ｇの生成物が得られた（５１％の収率）。その生成物を１Ｈ  ＮＭＲにより特性評価し、置換度が３．５超であることがわかった。平均分子量はＧＰＣで６，８００Ｄａと定量され、多分散性は１．８８であった。
【００８１】
ｄ．完全Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ−Ｐｙｒ．ＳＯ３）
Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製ＨＡ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ）を１１ｋＤａに減成させたものを、ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解させた。撹拌しながらＴＢＡ（１当量、０．５ｍｍｏｌｅ、０．１２ｍＬ）を添加し、混合物を更に１０分間撹拌した。次に、必要過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシル基の当量数）のピリジン三酸化硫黄複合体（２４当量、１２ｍｍｏｌｅ、１．９１６ｇ）を添加した。４０℃で３時間撹拌した後、水１５ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール２５ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させた。硫酸化された生成物を濾過して収集し、蒸留水２５ｍＬ中に溶解させて、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって０．１９４ｇの生成物が得られた（５７％の収率）。その生成物を１Ｈ  ＮＭＲにより特性評価し、置換度が約３．０〜３．５であることがわかった。平均分子量はＧＰＣで８，１００Ｄａと定量され、多分散性は２．００であった。
【００８２】
ｅ．部分的Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ−Ｐｙｒ．ＳＯ３）
Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製ＨＡ（４００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌｅ、１１ｋＤａ）を１１ｋＤａに減成させたものを、ＤＭＦ２５ｍＬ中に溶解させた。撹拌しながらＴＢＡ（１当量、１．０ｍｍｏｌｅ、０．２４ｍＬ）を添加し、更に１０分間撹拌した。必要過剰量（３ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシル基の当量数）のピリジン三酸化硫黄複合体（１２当量、１２ｍｍｏｌｅ、１．９０８ｇ）を添加した。４０℃で３時間撹拌した後、水３０ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール５０ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させてから、濾過して収集した。結果として得られた部分的Ｏ−硫酸化粗ＨＡを蒸留水４０ｍＬ中に溶解させて、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって０．３８６ｇの生成物が得られた（５６％の収率）。その生成物を１Ｈ  ＮＭＲにより特性評価し、置換度が２．０であることがわかった。平均分子量はＧＰＣで９，５００Ｄａと定量され、多分散性は１．７７であった。
【００８３】
ｆ．完全Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ−ＤＭＦ．ＳＯ３）
Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製ＨＡ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ）を１１ｋＤａに減成させたものを、ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解させた。撹拌しながらＴＢＡ（１当量、０．５ｍｍｏｌｅ、０．１２ｍＬ）を添加し、混合物を更に１０分間撹拌した。必要過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中で利用可能なヒドロキシル基の当量数）のＤＭＦ三酸化硫黄複合体（２４当量、１２ｍｍｏｌｅ、１．８３６ｇ）を添加した。３０℃で３時間撹拌した後、水１５ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール２５ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させてから、濾過して収集した。結果として得られた完全Ｏ−硫酸化粗ＨＡを蒸留水２５ｍＬ中に溶解させて、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって０．０５７ｇの生成物が得られた（１７％の収率）。その生成物を１Ｈ  ＮＭＲにより特性評価し、置換度が約３．０〜３．５であることがわかった。平均分子量はＧＰＣで１，９００Ｄａと定量され、多分散性は２．４８であった。
【００８４】
図３ａは、（Ａ）ＦＯＳ  ＨＡ（２）１０ｋＤａ、（Ｂ）ＦＯＳ  ＨＡ（１）１０ｋＤａ、（Ｃ）ＦＯＳ  ＢＨＡ、及び（Ｄ）ＰＯＳ  ＢＨＡに関する非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を示す。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシン１８％のゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で各サンプルを１０μｇずつ分離させ、非変性条件下で１２５Ｖにて１．５時間泳動させた。図３ｂは、（Ｅ）ピリジン三酸化硫黄複合体を使用してＫｅｗｐｉｅ製Ｈｙａｌｏ  Ｏｌｉｇｏ  ＨＡから製造されたＦＯＳ  ＨＡ、（Ｆ）ピリジン三酸化硫黄複合体を使用してＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＨＡから製造されたＦＯＳ  ＨＡ、（Ｇ）ピリジン三酸化硫黄複合体を使用してＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＨＡから製造されたＰＯＳ  ＨＡ、及び（Ｈ）三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド複合体から製造されたＦＯＳ  ＨＡ  １０ｋＤａに関する非変性ＰＡＧＥ分析を示す。２０％のアクリルアミドＩＤＳｍａｒｔゲル（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）上で各サンプルを１５μｇずつ分離させ、非変性条件下で１２５Ｖにて７５分間泳動させた。０．０８％アズールＡ水溶液中でゲルを染色した。
【００８５】
ｇ．完全Ｏ−硫酸化低ＭＷ  ＨＡ（ＧＭ−０１１１）
Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製ＨＡ（５．０ｇ、５．４ｋＤａ、９５０ｋＤａのＨＡから減成されたもの）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４００ｍｌ中に懸濁させて、３．０ｍｌ（１当量）のトリブチルアミン（ＴＢＡ）を添加した。溶液を５分間撹拌した。ピリジン三酸化硫黄複合体（２４当量、４８．４ｇ）を６回に分けて添加し、混合物を４０℃で３時間撹拌した。水１００ｍＬを添加して反応を抑制し、無水酢酸ナトリウムで飽和された低温エタノール５００ｍＬを添加して、粗製物質を沈殿させた。硫酸化された生成物を濾過して収集し、蒸留水（６５０ｍＬ）中に溶解させ、２日間にわたってＮａＣｌ溶液１００ｍｍに対して（溶液を６回交換）及び水に対して（水を２回交換）透析して、１日に４回溶液を交換してから、凍結乾燥で乾燥させることによって４．６ｇの生成物が得られた（５１％の収率）。元素分析によって硫黄含有率１３．５％が求められた。これは、硫酸化度が３．０〜３．５  ＳＤであることを示している。分子量はゲル浸透クロマトグラフィで５．１ｋＤａと定量され、多分散性は１．９であった。
【００８６】
抗凝固特性及び毒性
ＧＭ−０１１１は耐性が極めて十分であり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２，０００ｍｇ／ｋｇを１回で経口的に大量に瞬時に投与したときに、毒性の徴候をいっさい呈しなかった。加えて、ＧＭ−０１１１経口投与後２４間目に死体解剖の調査結果からは、いかなる異常も認められなかった。
【００８７】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ研究
ａ．ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ：Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｅｌａｓｔａｓｅ）阻害アッセイ
白血球エラスターゼに対する硫酸化ＨＡの阻害作用を調べるため、７．５μｇ／ｍｌのＨＬＥ１００μｌを０．００１〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲の硫酸化ＨＡ１００μｌと共にインキュベートした。混合物を２５℃で１０分間インキュベートし、その後にＨＬＥ基質ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ｐＮＡ５０μｌ（１．５ｍｍ）を添加した。基質が活性ＨＬＥによって開裂され、色原体のｐＮＡが生成された後、動力学的読み出し（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒｅａｄ）によって４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。ＩＣ５０値は、硫酸化ＨＡ濃度に対するＶｍａｘ（吸収速度）の４パラメータロジスティック非線形回帰方程式を使用して求められる（表１）。
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【００８８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から、ＧＭ−０１１１がヒト白血球エラスターゼを阻害し、そのＩＣ５０が４３０ｎｇ／ｍＬであることがわかった。ＧＭ−０１１１−０３は、リガンドに結合するＲＡＧＥを阻害した。ＩＣ５０はＣＭＬ−ＢＳＡに対しては３６ｎｇ／ｍＬ、Ｓ−１００タンパク質に対しては６０ｎｇ／ｍＬ、ＨＭＧＢ１に対しては９１ｎｇ／ｍＬであった。
【００８９】
ｂ．ＣＭＬ−ＢＳＡ／ＲＡＧＥ複合体阻害アッセイ
ＣＭＬ−ＢＳＡ及びＲＡＧＥ複合体阻害アッセイは、ポリ塩化ビニルプレートを５μｇ／ｍｌのＣＭＬ−ＢＳＡ１００μｌでコーティングして準備された。別途に、ＲＡＧＥ−Ｆｃキメラ含有ＰＢＳＴ−０．１％ＢＳＡの１μｇ／ｍｌ溶液を、等量の連続希釈済み硫酸化低分子量ヒアルロナン及びＨＡオリゴ糖（０．０００５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＲＡＧＥ−硫酸化ＨＡ混合物５０μｌをそれぞれリガンドでコーティングされたウェルに移して３７℃で１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。結合したＲＡＧＥを検出するため、０．５μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ抗体５０μｌをそれぞれのウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、再びウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰ接合二次抗体（５０μｌ／ウェル）を添加し、ウェルを室温で１時間インキュベートしてからＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ１００μｌを添加して比色反応を開始させ、１規定のＨＣｌを５０μｌ添加して停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を硫酸化ＨＡ濃度に対してプロットし、４パラメータロジスティック非線形回帰方程式を使用してＩＣ５０値を求めた（表２）。
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【００９０】
ｃ．ピリジニウム付加体の特性評価
ピリジン三酸化硫黄複合体を使用して調製された硫酸化ＨＡサンプルのピリジニウム含有率を、ＵＶ吸光度により分析した。１−臭化ブチルピリジニウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して標準曲線を作成し、必要に応じて、ＵＶ測定値が標準曲線内に収まるように硫酸化ＨＡサンプルを２ｍｇ／ｍｌから０．０２５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。標準液及びサンプルについてクォーツ製キュベットにおける２５５ｎｍでの吸光度値を記録した。標準曲線から、各サンプルについてピリジニウムの重量％値を計算した。これらの計算は表３に記載されている。また、ＦＯＳＨＡ−Ｋｅｗｐｉｅ−Ｐｙｒ．ＳＯ３のピリジニウム付加体も１３Ｃ  ＮＭＲ分光法により特性評価し、公開されているデータと比較した（Ｈｉｎｔｚｅ  Ｖ，Ｍｏｅｌｌｅｒ  Ｓ，Ｓｃｈｎａｂｅｌｒａｕｃｈ  Ｍ，Ｂｅｉｒｂａｕｍ  Ｓ，Ｖｉｏｌａ  Ｍ，Ｗｏｒｃｈ  Ｈ，Ｓｃｈａｒｎｗｅｂｅｒ  Ｄ．“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−４（ｈＢＭＰ−４）”Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １０：３２９０−３２９７，２００９年）。１３Ｃ  ＮＭＲデータを表４に示す。最後に、図５は１Ｈ  ＮＭＲスペクトルのＦＯＳＨＡ−Ｋｅｗｐｉｅ−Ｐｙｒ．ＳＯ３で、ピリジニウム付加体のピリジニウムプロトンを示し８．００ｐｐｍ〜９．１０ｐｐｍの間の３つのピークを露呈している。
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【００９１】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ研究
ａ．マウスの膀胱炎モデル
マウスの膀胱はＬＬ−３７（カテリシジンペプチド）をはじめとする様々な催炎物質に対する感受性が高く、膀胱炎を含む炎症疾患において有望な治療剤を研究するための秀逸な動物モデルとして役立つ。硫酸化ＨＡの消炎効果を研究するため、ネズミ膀胱炎モデルでＦＯＳＨＡ誘導体の防護効果を測定した。最初に、Ｃ５７／ＢＬ６成体雌のマウスを麻痺させて、尿道を通してカテーテルを膀胱に挿入した。０．９％の滅菌生理食塩水を注入してから排液させて、膀胱を洗浄した。その後、膀胱に１５０μＬの生理食塩水、または１０ｍｇ／ｍｌのＦＯＳＨＡ（Ｋｅｗｐｉｅ）若しくは１０ｍｇ／ｍｌのＦＯＳＨＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）のいずれかを１時間事前滴注した。膀胱を空にしてから、更に１時間かけて３２０μｍのＬＬ−３７を１５０μＬ滴注した。全ての動物が合併症を伴わずに完全に回復した。手順完了後２４時間目に、膀胱を摘出し、撮影して、ＭＰＯ分析用に冷蔵した。
【００９２】
ｂ．ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）アッセイ
催炎物質に対する主な細胞応答は、損傷のある細胞から様々なサイトカインを分泌して様々な免疫細胞を標的部位に補充するというものである。ＭＰＯは、炎症の初期に炎症部位に補充される一次細胞である多形核細胞において多量に発現するペルオキシダーゼ酵素であり、ゆえに、炎症の度合いを量的に測定するマーカーとして優れている。ネズミ膀胱炎モデルにおいて、完全硫酸化ＨＡの消炎作用を分析するため、酸化ＨＡで前処理された膀胱内で発現したＭＰＯの量を測定し、無処理の膀胱及び生理食塩水対照において発現したＭＰＯの濃度と比較した。膀胱を秤量してホモジナイズした。ホモジナイズされたサンプルを５，０００ｒｐｍで遠心分離し、可溶な画分を組織破片から分離させてから、マウスＭＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（ＨＫ２１０，Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して組織ホモジェネート内のＭＰＯ濃度（ｎｇ／ｍｇ組織）を測定し、生理食塩水を滴注された対照（炎症の無い正常な膀胱）との差分（％）として表した。結果を図２に示す。
【００９３】
ＬＬ−３７の滴注により誘発された組織ＭＰＯ濃度が、硫酸化ＨＡの前処理によって低減するかどうかを判別するため、発明者らは一方向ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行い、続いてＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用してテューキー・クレーマー（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）の多重比較試験を行った。統計的有意性は、ｐ＜０．０に設定された。
【００９４】
ｃ．結論
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究による結果は、ＲＡＧＥ拮抗剤活性に関して硫酸化度が重要なことを実証している（表２）。部分的硫酸化（硫黄分が６％未満）の場合、ＲＡＧＥ拮抗剤の効力が大幅に低下する。硫酸化ＨＡ化合物ＭＷが２，０００Ｄａ未満の場合はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける効力の低減を示す。膀胱炎のマウスモデルにおいて完全硫酸化ＨＡ化合物（１％ｗ／ｗ超のピリジニウム付加体を有するものを含む）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症を軽減する効果が良好であることを示した。
【００９５】
ＧＭ−０１１１を用いた事前滴注実験
ＬＬ−３７により誘発されたネズミ膀胱炎モデルにおいて、ＧＭ−０１１１の治療効果を研究するため、更なる実験を行った。各動物をイソフルランで麻痺し、可撓性カテーテル（ＳＩＬＡＳＴＩＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｕｂｉｎｇ，０．３０ｍｍ  ｉ．ｄ．×０．６４ｍｍ  ｏ．ｄ．，ＤＯＷ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＭＩ）を、尿道口を通して膀胱中に挿入した。腹部を静かに押圧して尿を排液させた。エンドトキシンを含まない滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ａｍｒｅｓｃｏ，ＯＨ）１５０μＬを滴注し排泄させて、膀胱を洗浄した。その後、空にした膀胱に１５０μＬのＰＢＳを充填するか、または様々な濃度のＧＭ−０１１１（１、５、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ中に溶解した。膀胱に対するＧＭ−０１１１の接触を増やすために、膀胱から排液してから、ＰＢＳまたはＧＭ−０１１１のいずれかを再滴注した。ＧＭ−０１１１を１時間滴注した後、膀胱炎を誘発するため、膀胱から排液してから同じ容量のＬＬ−３７（２５０μＭ）を滴注した。また、ＧＭ−０１１１を滴注するたびにＬＬ−３７の滴注手順を繰り返した。ＬＬ−３７の初回滴注後１時間目に、カテーテルを取り出して動物を回復させた。膀胱の損傷を最小限に抑え、膀胱尿管逆流を低減するため、溶液を流速２μＬ／ｓｅｃ（または１０μＬ／５ｓｅｃ）で滴注した。溶解した全ての材料を除菌して、微生物汚染の可能性を最小限に抑えた。
【００９６】
死体解剖及び死体解剖スコア
ＬＬ−３７滴注後２４時間目に、動物をイソフルランで高度に麻痺させて死体解剖を行った。尾部大静脈を通して全血液を収集し、動物を失血させて、膀胱を回収した。血液をＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移して、血清を収集する。回収された膀胱を秤量して横方向に二等分した。続いて、二等分された膀胱を（血清サンプルと同様）生化学分析の目的に−２０℃で貯蔵するか、または組織学的評価の目的に４％ホルマリンで貯蔵した。
【００９７】
死体解剖時に、充血の有無（０：無し、及び１：充血）、並びに浮腫の程度（０：無し、１：軽度、２：中度、及び３：重度）をスコアすることによって、膀胱炎の重篤度を定量した。充血及び浮腫のスコア合計を、統計分析の目的に死体解剖スコアとして使用した。
【００９８】
生化学分析
体内において誘発性膀胱炎による全般的な反応を定量するため、ＧＭ−０１１１の防護効果を調べて、ＥＬＩＳＡキット（ＩＣＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＯＲ）を使用して血清アミロイドＰ（ＳＡＰ：ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ）の濃度を測定した。局部組織内の炎症の重篤度を定量するため、プロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）を補充した溶解緩衝液（２００ｍｍのＮａＣｌ、１０ｍｍのトリス、１０％のグリセリン）中で膀胱をホモジナイズした。Ｆｌｕｏｒｏ  ＭＰＯ（商標）キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）を使用してミエロペルオキシダーゼの組織活性を測定し、ＩＬ−６及びＰＴＸ−３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＣＡ  ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）の組織中濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【００９９】
組織学的評価
ホルマリンで固定した組織をパラフィン包理し、４μｍの厚さに切断して、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｂｙ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）で染色した。下掲の基準（表５）に従い、浮腫の有無及び程度、多形核好中球（ＰＭＮ：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ）浸潤、並びに各断層内の尿路上皮の糜爛を評価することによって、各サンプルの炎症の重篤度を評価し、定量した。
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【０１００】
統計分析
様々な測定からのデータを全て個別に識別した。ＧＭ−０１１１の事前滴注が、ＰＢＳ処理と比較して、観測されたデータに有意に異なる変更をもたらしたかどうかを比較するため、分散試験の分析を行ってからダネットのｔ検定を行った。死体解剖スコア及び組織学的スコアをクラスカル−ウォリス順位和検定で評価し、続いて、Ｒ２．１４．０を使用したｐｇｉｒｍｅｓｓライブラリでｋｗｍｃ（多重比較）試験を行った。また、データを無処理の正常な動物のデータと比較し、試験を繰り返して、ＧＭ−０１１１の事前滴注が膀胱に炎症性変化が生ずるのを防ぐかどうかを判別した。
【０１０１】
結果
ＧＭ−０１１１の事前滴注による、膀胱における膀胱炎の防止
ＬＬ−３７誘発性膀胱炎モデルに対するＧＭ−０１１１の防護効果を定量するため、膀胱を数とおりの濃度のＧＭ−０１１１を膀胱に１時間滴注してコーティングし、続いてＬＬ−３７を１時間滴注した。ＬＬ−３７滴注後２４時間目に動物を屠殺し、死体解剖を行い、生化学及び組織学的評価の目的のために膀胱を回収した。
【０１０２】
死体解剖時に、肉眼的な解剖学的変化を観測し、膀胱の重量を測定することによって、各動物における炎症の重篤度を定量した。膀胱にＧＭ−０１１１を事前滴注するとＬＬ−３７誘発性膀胱炎が生ずる徴候が低減することが、発見された。ＧＭ−０１１１を事前注入された動物の体重は、ＰＢＳで処理された動物よりも有意に増加した（図９ａ）。炎症を起こした組織内で流体及びコロイド状タンパク質が増加した結果として、浮腫のある膀胱の重量が増加した。膀胱にＧＭ−０１１１を事前滴注すると膀胱重量が有意に減少したことも、発見された（図９ｂ）。これは、ＬＬ−３７により誘発される炎症性変化が低減したことを示唆している。
【０１０３】
ＬＬ−３７（２５０μＭ）を膀胱に滴注すると炎症性変化が誘発され、粘膜下層への多形核好中球（ＰＭＮ）の浸潤、血管増加、出血、膀胱の全層にわたる広範な浮腫、並びに尿路上皮層の菲薄化及び糜爛という特質が認められた（図１０ｅと１０ｆとを比較対照のこと）。流体の増加及び血管化の存在によって、膀胱の典型的な外観が充血を生じて大きくなる（図１０ａと１０ｂとを比較対照のこと）。肉眼的観測結果をより綿密に評価するため、膀胱にＧＭ−０１１１を事前滴注した結果としてもたらされる組織学的変化を調べた。ＧＭ−０１１１の事前滴注によって、炎症の徴候の重篤度が有意に低減した。この炎症の徴候は僅か５ｍｇ／ｍｌ程度の投与量で容易に観測でき、ＰＢＳを事前滴注された膀胱と比較して、ＧＭ−０１１１を事前注入された膀胱内において尿路上皮層が損なわれず、かつ浮腫が狭範化しＰＭＮが減少したことによって示される（図１０ｂと、１０ｃ及び１０ｄとを比較対照のこと）。濃度１０ｍｇ／ｍＬ以上のＧＭ−０１１１を事前滴注された膀胱の組織学的な外見は、無処理の正常な膀胱に近いか類似していた（図１０ｅと１０ｇ及び１０ｈとを比較対照のこと）。
【０１０４】
膀胱においてＧＭ−０１１１がＬＬ−３７媒介の炎症性変化を低減しかつ動物の全身健康状態を改善する機序を調べるため、膀胱及び血清における生化学マーカーの変化を調べた。最初に、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の組織活性を定量した。ＭＰＯの一次供給源は、炎症中に主として病原体を取り除くのに使用される好中球顆粒の白血球である。ＰＢＳを事前滴注されたＭＰＯの膀胱内での平均組織活性は、無処理の正常な動物の組織におけるよりも１１４倍高かった（図１１ｂ）。ＧＭ−０１１１を事前滴注すると、１ｍｇ／ｍＬの場合でもＭＰＯの組織活性が有意に低下した（図１１ｂ）。次に、炎症の刺激により様々な細胞が放出する主要な炎症性サイトカインの１つである、ＩＬ−６の組織中濃度を定量した。ＰＢＳを事前滴注された膀胱内でのＩＬ−６の濃度は、正常な膀胱におけるよりもおよそ７０倍高いことが発見された（図１１ｃ）。ＧＭ−０１１１の事前滴注によって、ＧＭ−０１１１の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬの場合でも、組織内のＩＬ−６の濃度が正常な膀胱内と同様な濃度まで急激に低減した。また、発明者らはＬＬ−３７での炎症刺激により変化する独立した組織マーカーを捜し求めた。ＰＴＸ３は、様々な炎症刺激により、組織または血清中で増加する長いペントラキシンファミリの新規メンバである。ＭＰＯ及びＩＬ−６の測定データと一貫して、ＰＴＸ３の組織中濃度は検出不可能な濃度ＰＢＳを事前滴注された組織の１．１ｎｇ／ｍｇまで顕著に増加した（図１１ｄ）。これらの増加は、ＧＭ−０１１１の事前滴注によって１ｍｇ／ｍｌの場合でも有意に低減し、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度のＧＭ−０１１１を事前滴注された組織において、多くは検出濃度未満（組織の２ｐｇ／ｍＬ未満）に維持された。これらのデータは、ＬＬ−３７が誘発した膀胱炎に対するＧＭ−０１１１の防護効果が有意であることと、僅か１ｍｇ／ｍｌ程度の濃度のＧＭ−０１１１を事前滴注することによってもたらされ得ることを示唆している。
【０１０５】
モデルの膀胱炎の進行をモニタするため、血液中に存在すると考えられるバイオマーカーを調べた。血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）は、哺乳動物の肝臓で産生されて分泌されるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ：Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に類似する短いペントラキシンである。ＳＡＰは、齧歯動物における炎症性サイトカインＩＬ−６の濃度上昇に応答して、急激に増加することが知られている。ＩＬ−６の組織中濃度をＬＬ−３７によって上昇させると同時に血清中のＳＡＰ濃度も上昇するかどうかについて試験し、更にはＧＭ−０１１１の事前滴注がＳＡＰ濃度に影響するかどうかについても判別した。ＰＢＳを事前滴注された動物におけるＳＡＰ濃度は無処理の正常な動物におけるよりもおよそ５倍高まったことが、測定値からわかる（図１１ａ）。ただし、ＧＭ−０１１１（１０ｍｇ／ｍＬ以上）を事前滴注された動物におけるＳＡＰ濃度は、ＰＢＳを事前滴注された動物におけるよりも有意に低下した。これらのデータが組織学的評価と一貫していることから、ＳＡＰが組織における炎症変化を指示するうえで好適なバイオマーカーであり得ることがわかる。
【０１０６】
様々な生化学的及び組織学的分析によるデータは総体的に、ＧＭ−０１１１が、ＬＬ−３７で誘発された膀胱の炎症の重篤度の防止及び低減に極めて強力な化合物であることを示唆している。動物モデルにおいてＧＭ−０１１１が僅か１ｍｇ／ｍＬ程度でも防護効果を認めることができ、１０ｍｇ／ｍＬからは防護効果が強力になり、最大１００ｍｇ／ｍｌまで安全に利用できると思われる。
【０１０７】
本出願全体を通して様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容全体は、本明細書において参照によって本出願に組み込まれており、それによって、本明細書に記載されている化合物、組成物及び方法がより詳細に記述されている。本明細書に記載されている化合物、組成物及び方法に対しては、様々な修正及び変形を施すことができる。本明細書に記載されている化合物、組成物及び方法の他の態様は、本明細書を考慮し、本明細書中に開示されている化合物、組成物及び方法を実用化することによって明らかとなろう。本明細書及び実施例は、例示的であると見なされるように意図されている。
【０１０８】
参照文献
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１２．  Ｓａｎｔ，  Ｇ．；  Ｐｒｏｐｅｒｔ，  Ｋ．；  Ｈａｎｎｏ，  Ｐ．；  Ｂｕｒｋｓ，  Ｄ．；  Ｃｕｌｋｉｎ，  Ｄ．；  Ｄｉｏｋｎｏ，  Ａ．；  Ｈａｒｄｙ，  Ｃ．；  Ｌａｎｄｉｓ，  Ｊ．；  Ｍａｙｅｒ，  Ｒ．；  Ｍａｄｉｇａｎ，  Ｒ．；  Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｅ．；  Ｐｅｔｅｒｓ，  Ｋ．；  Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ，  Ｔ．；  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｊ．；  Ｗｅｉｎ，  Ａ．；  Ｓｔｅｅｒｓ，  Ｗ．；  Ｋｕｓｅｋ，  Ｊ．；  Ｎｙｂｅｒｇ，  Ｌ．，  Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｐｅｎｔｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｚｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ．  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  ２００３，  １７０，  ８１０−８１５．
１３．  Ｉａｖａｚｚｏ，  Ｃ．；  Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ，  Ｓ．；  Ｐｉｔｓｏｕｎｉ，  Ｅ．；  Ｆａｌａｇａｓ，  Ｍ．，  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ，  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ？  Ｅｕｒｏｐ．  Ｕｒｏｌ．  ２００７，  ５１，  １５３４−１５４１．
１４．  Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ，  Ｔ．；  Ｓａｎｔ，  Ｇ．，  Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ  ｏｆ  ＣｙｓｔｏＰｒｏｔｅｋ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００５，  １８，  １８３−１８８．
１５．  Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ，  Ｇ．；  Ｉｔｔａｈ，  Ｂ．；  Ｒｏｗａｎ，  Ｓ．，  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ０．２％  ｉｎ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ．  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  ２００２，  ９，  １４５４−１４５８．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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