(57)【要約】  本出願は、一部には、ｐＡＶＥＣプラスミド、および免疫グロブリンのようなポリペプチドの製造のためのそのようなプラスミドの使用方法、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するそのようなプラスミドの組換え体の製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
制限部位：
【化１】
2014511696.tif 000026
を含むマルチクローニングサイトを含む、線状または環状である単離されたプラスミド。
【請求項２】
図１のプラスミド地図により特徴づけられる、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
該マルチクローニングサイトが、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
配列番号２に記載されているポリヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項５】
請求項１記載のプラスミドを切断し、該切断プラスミドの末端を、導入されるポリヌクレオチドの適合性末端に連結して、閉環状プラスミドを得ることを含む、組換えプラスミドベクターの製造方法。
【請求項６】
該導入ポリヌクレオチドが免疫グロブリン鎖をコードしている、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
該免疫グロブリン鎖が、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、セルトリズマブ・ペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、ＡＬＤ５１８またはトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）からなる群から選択されるメンバーの重鎖または軽鎖であり、あるいは該免疫グロブリン鎖が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＤ−１、ＴＮＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＳＬＰ、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ２３Ｒ、ＰＣＳＫ９、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ａ、ＥｒｂＢ２、ＩｇＥ、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原および呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）抗原からなる群から選択される抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖または軽鎖である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
請求項５記載の製造方法の産物である組換えプラスミドベクター。
【請求項９】
請求項１記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１０】
細菌細胞または哺乳類細胞である、請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
単離された宿主細胞における組換えポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下、請求項５記載の組換えベクターを該宿主細胞内に導入することを含む製造方法。
【請求項１２】
該ポリペプチドを精製することを更に含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載のプラスミドベクターと１以上の追加的成分とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年４月８日付け出願の米国仮特許出願第６１／４７３，４３１号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、例えば、関心のあるポリペプチドを発現させるために使用されうるプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用タンパク質の商業的製造のための細胞培養は、高い経費を要する方法である。必要な設備は高くつき、研究開発および製造のコストは高い。細胞培養１リットル当たりに製造される治療用タンパク質の量を最大にする細胞培養方法の開発は、与えられた量の該タンパク質を製造するのに必要な資源を最小にするであろう。したがって、大量のタンパク質を製造する商業的に実施可能な試薬を使用することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
天然に存在する多数の細胞は標準的な培養条件下で所望のタンパク質を大量には産生しない。したがって、培養内の細胞に大量の治療用タンパク質を産生させる細胞培養方法の広範な研究開発が行われる必要がある。典型的には、タンパク質を高レベルで発現させるのに有用なプラスミドベクターの特定は相当な創作力を要する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一部には、例えば配列番号２のヌクレオチド配列を含む、以下の制限部位を含むマルチクローニングサイトを含む線状または環状の単離されたｐＡＶＥＣプラスミドを提供する。
【０００６】
【化１】
2014511696.tif 000003
例えば、該プラスミドベクターは、図１のプラスミド地図により特徴づけられ、ここで、該プラスミドは、配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む。ｐＡＶＥＣプラスミドベクターは環状であり、したがって自律的異所性生成能を有することが可能であり、あるいは線状であり、例えば宿主細胞の染色体ＤＮＡ内への組込みに使用可能でありうる。
【０００７】
本発明は更に、ｐＡＶＥＣプラスミドを切断し、該切断プラスミドの末端を導入ポリヌクレオチド［例えば、免疫グロブリン、例えば、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、セルトリズマブ・ペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＫ０６４６）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）ＡＬＤ５１８およびトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、あるいは抗体またはその抗原結合性フラグメント（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＴＮＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ−２３Ｒ、ＰＣＳＫ９、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ａ、ＥｒｂＢ２、ＩｇＥ、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原および呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）抗原からなる群から選択される抗原に特異的に結合するもの）の重鎖もしくは軽鎖である免疫グロブリン鎖をコードするもの］の適合性末端に連結して、閉環状プラスミドを得ることを含む、組換えプラスミドの製造方法を含み、この場合、例えば、該導入ポリヌクレオチドは、該プラスミド内のプロモーター、例えばｈＣＭＶプロモーターに機能的に連結されている。そのような方法により製造されるいずれの組換えプラスミドも本発明の一部を構成する。
【０００８】
本発明は更に、本発明のｐＡＶＥＣプラスミドのいずれかを含む単離された宿主細胞を含む単離された宿主細胞（例えば、細菌細胞、または哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞）を含む。
【０００９】
本発明はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明のいずれかの組換えｐＡＶＥＣプラスミドベクターを、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下、宿主細胞内に導入し、所望により該ポリペプチドを精製することを含む、単離された宿主細胞における組換えポリペプチドの製造方法を提供し、この場合、例えば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、該プラスミド内のプロモーター、例えばｈＣＭＶプロモーターに機能的に連結されている。
【００１０】
更に、本発明は、本発明のｐＡＶＥＣプラスミドベクターと１以上の追加的成分とを含むキットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐＡＶＥＣプラスミド地図。
【図２】ｐＡＩＬ１７Ｌプラスミド地図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、いずれかの細胞、例えば哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞における組換えタンパク質発現に有用な発現ベクターを提供する。該ベクターは、広範な組換えタンパク質を一過性または安定に発現させるために使用されうる。該ベクターのマルチクローニングサイトは、種々の発現カセットを収容するための多数の一般的または稀有な制限部位を提供する。
【００１３】
ｐＡＶＥＣプラスミドは、図１に記載されているプラスミド地図により特徴づけられる、および／または配列番号１のヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるプラスミドである。該用語はまた、ｐＡＶＥＣプラスミドを切断し、該切断プラスミドの末端を導入ポリヌクレオチドの適合性末端に連結して、該導入ポリヌクレオチドを含む閉環状プラスミドを得ることを含む製造方法により製造される組換えプラスミドを含む。
【００１４】
分子生物学
本発明においては、当技術分野の技量の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＩおよびＩｌ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔら，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。例えば、本発明の１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドは環状プラスミドｐＡＶＥＣである。
【００１６】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）における一連のヌクレオチドであり、２以上のヌクレオチドの鎖のいずれかを意味する。
【００１７】
発現産物、例えばＲＮＡまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖）を「コード」する配列または「コード配列」は、発現されると該産物の産生をもたらすヌクレオチド配列である。
【００１８】
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは関心のある他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能でありうる、一般には３００ヌクレオチド以下（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１５０、１７５、２００、２５０または３００ヌクレオチド）の核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、通常、一本鎖であるが、二本鎖であることも可能である。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチドの取り込みにより、または例えばビオチンのような標識が共有結合したヌクレオチドの取り込みにより、標識されうる。１つの実施形態においては、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用されうる。もう１つの実施形態においては、オリゴヌクレオチド（そのうちの一方または両方が標識されうる）は、遺伝子の完全長または断片をクローニングするための又は核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用されうる。一般に、オリゴヌクレオチドは、例えば核酸合成装置により、合成的に製造される。
【００１９】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」もしくは「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」はタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドにおける一連の２以上のアミノ酸を意味する。
【００２０】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は２以上のアミノ酸の連続鎖を含む。
【００２１】
「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」なる語は、細胞において若しくは組換えＤＮＡ発現系において通常見出される他の成分またはいずれかの他の混入物から部分的または完全に分離された、それぞれ、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子または混合重合体）またはポリペプチドを含む。これらの成分には、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
単離されたポリヌクレオチド（例えば、ｐＡＶＥＣ）またはポリペプチドは、好ましくは、実質的に均一な分子組成物であるが、ある程度の不均一性を伴いうる。
【００２３】
「宿主細胞」なる語は、該細胞による物質の産生、例えば、該細胞による遺伝子、ポリヌクレオチド、例えば環状プラスミド（例えば、ｐＡＶＥＣ）またはＲＮＡまたはタンパク質の発現または複製のために任意の様態で選択され、修飾され、トランスフェクトされ、形質転換され、成長され又は使用され若しくは操作される任意の生物の任意の細胞を含む。例えば、宿主細胞は、ｐＡＶＥＣプラスミドを維持しうる、そして本発明の１つの実施形態においては、該プラスミドにおけるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、例えば免疫グロブリン鎖の発現を促進しうる、哺乳類細胞または細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、あるいはいずれかの単離された細胞でありうる。哺乳類宿主細胞の例には、限定的なものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ−１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ウシ乳房上皮細胞、マウスＳｅｒｔｏｌｉ細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、マウス乳癌細胞、ラット繊維芽細胞、ウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）細胞、Ａ５４９細胞などが含まれる。１つの実施形態においては、哺乳類宿主細胞はヒト宿主細胞である。哺乳類宿主細胞は、当技術分野で公知の方法により培養されうる（例えば、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６：２２１（１９８３），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい）。適当な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の例には、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５アルファ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥ、ＳＣＳ１１０、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ  １０およびＨＢ１０１が含まれる。本発明のもう１つの実施形態においては、本発明のｐＡＶＥＣプラスミドは宿主細胞内で異所的に維持され、および／または宿主細胞の染色体ＤＮＡ内に組込まれる。そのような宿主細胞およびその使用方法（例えば、本明細書に記載されているもの）は本発明の一部を構成する。
【００２４】
本発明のベクター、例えばｐＶＥＣは、当技術分野で公知の多数の技術のいずれかにより、例えばデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、リポフェクション、核内への該ベクターの直接マイクロインジェクション、または与えられた宿主細胞型に適したいずれかの他の手段により、宿主細胞内に導入されうる。
【００２５】
「カセット」または「発現カセット」は、例えば一定の制限部位において、ベクター内に挿入されうる、発現産物（例えば、ペプチドまたはＲＮＡ）をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを意味する。発現カセットは、ＤＮＡコード配列に機能的に連結されたプロモーターおよび／またはターミネーターおよび／またはポリＡシグナルを含みうる。
【００２６】
一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞内で（例えば、直接的に又は他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）ＲＮＡポリメラーゼに結合しコード配列の転写を開始させうるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般に、その３’末端において、転写開始部位に結合しており、いずれかのレベルで転写を開始させるのに必要な最少数の塩基または要素を含むよう上流（５’方向）に伸長している。該プロモーター配列内には、転写開始部位（簡便には、例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定められる）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在しうる。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列に、または発現されるべき核酸に機能的に結合または機能的に連結されていることが可能である。発現制御配列がプロモーターに機能的に結合または機能的に連結されていると言えるのは、それが該プロモーターからの発現を調節する場合である。
【００２７】
遺伝子発現を制御するために使用されうるプロモーターには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅら，Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：４６６−４７２（１９８８））、ヒトＣＭＶ最初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５）；Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１−１０５（１９８６））、マウスＣＭＶ最初期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））、オルギア・シュードツガタ（Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）最初期プロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２（１９８２））；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１（１９７８））またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３））；ならびに酵母または他の真菌由来のプロモーター、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ４またはＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーター。
【００２８】
ウイルス長末端反復プロモーター、例えばマウス乳癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）（Ｆａｓｅｌら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１（１）：３−７（１９８２））、モロニーマウス肉腫ウイルス長末端反復（Ｒｅｄｄｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（９）：５２３４−５２３８（１９８０））、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（Ｖａｎ  Ｂｅｖｅｒｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（６）：３３０７−３３１１（１９８０））、ＨＩＶ  ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ１００２４５）、ウシフォーミーウイルスＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１８３１）、ＲＳＶ  ５’−ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｋ０００８７）、ＨＩＶ−２  ＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１７２２）、トリレトロウイルスＬＴＲ（Ｊｕら，Ｃｅｌｌ  ２２：３７９−３８６（１９８０））およびヒトヘルペスウイルスＬＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１８０６）が本発明のベクターに含まれうる。
【００２９】
他の許容されるプロモーターには、ヒトＣＭＶ５プロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、肝特異的発現のためのハイブリッドＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーターをヒトα１−アンチトリプシン（ＨＡＴ）もしくはアルブミン（ＨＡＬ）プロモーターの転写プロモーター要素に結合させることにより製造される）、または肝癌特異的発現のためのプロモーター（例えば、この場合、ヒトアルブミン（ＨＡＬ；約１０００ｂｐ）またはヒトα１アンチトリプシン（ＨＡＴ、約２０００ｂｐ）の転写プロモーター要素がヒトα１−ミクログロブリンおよびビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＰ）の１４５ｂｐ長のエンハンサー要素と組合される；ＨＡＬ−ＡＭＢＰおよびＨＡＴ−ＡＭＢＰ）が含まれる。
【００３０】
また、細菌プロモーター、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーターが、発現の制御のために使用されうる。
【００３１】
１つの実施形態においては、プロモーターはヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターである。ｈＣＭＶプロモーターは種々の哺乳類細胞型において高レベルの発現をもたらす。
【００３２】
コード配列が細胞内の転写または翻訳制御配列「の制御下にある」、「に機能的に結合されている」または「に機能的に連結されている」と言えるのは、該配列が該配列の発現を導き又は調節する場合である。例えば、遺伝子に機能的に連結されているプロモーターは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへの該コード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写を導き、ついで該ＲＮＡは（それがイントロンを含有する場合には）スプライシングされることが可能であり、所望により、該コード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されうる。遺伝子に機能的に連結されたターミネーター／ポリＡシグナルはＲＮＡへの遺伝子の転写を終結させ、ＲＮＡ上へのポリＡシグナルの付加を導く。
【００３３】
「発現する」および「発現」なる語は、遺伝子、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列内の情報が現れることを可能にする又はもたらすことを意味し、例えば、対応遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を産生させることを意味する。「発現する」および「発現」は、ＤＮＡからＲＮＡへの、およびＲＮＡからタンパク質への転写を含む。ＤＮＡ配列は細胞内で又は細胞により発現されて、「発現産物」、例えばＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質を生成しうる。また、該発現産物自体が該細胞により「発現される」と言われることが可能である。
【００３４】
「形質転換」なる語は細胞内への核酸の導入を意味する。導入された遺伝子または配列は「クローン」と称されうる。該導入ＤＮＡまたはＲＮＡの受容宿主細胞は「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞または異なる属もしくは種の細胞を含む任意の起源に由来することが可能である。当技術分野で非常によく知られている形質転換方法の例には、リポソーム運搬、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ４形質転換、ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換、マイクロインジェクションおよびウイルス感染が含まれる。
【００３５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含む。「ベクター」なる語は、宿主を形質転換し、所望により導入配列の発現および／または複製を促進するための、宿主細胞内へのＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入をもたらしうるビヒクル（例えば、プラスミド）を意味する。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは発現系において発現されうる。「発現系」なる語は、ベクターにより運ばれ宿主細胞に導入されたタンパク質または核酸を適当な条件下で発現しうる宿主細胞および和合性ベクターを意味する。一般的な発現系には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクター、例えばプラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、およびウイルス、例えばアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が含まれる。
【００３７】
ベクター
本発明は、以下のマルチクローニングサイト：ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＡｐａＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩを含むプラスミドを提供し、これは、例えば、図１に示されているとおり、これらの制限部位間の相対的配置を含み、例えば、該マルチクローニングサイトの重複制限部位は以下のとおりに特徴づけられる。
【００３８】
【化２】
2014511696.tif 000004
本発明の１つの実施形態においては、該マルチクローニングサイトは以下のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
【化３】
2014511696.tif 000005
本発明の１つの実施形態においては、本発明のｐＡＶＥＣプラスミドは、図１に記載されているプラスミド地図により特徴づけられる。
【００４０】
本発明の１つの実施形態においては、該プラスミドは、以下のヌクレオチド配列を含むｐＡＶＥＣである。
【００４１】
【化４】
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遺伝子
幾つかの遺伝子のいずれか（例えば、免疫グロブリン）が本発明のプラスミド内に挿入されうる。以下の標的免疫グロブリンアミノ酸配列のいずれかをコードする本発明のプラスミドは本発明の一部を構成する。本発明は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子（例えば、免疫グロブリンをコードするもの）をｐＡＶＥＣ内に挿入するための、該過程において或るｐＡＶＥＣポリヌクレオチド配列の喪失（例えば、ベクター内への導入遺伝子の連結に適合性である制限酵素切断部位を生成するマルチクローニングサイトの一部の切り出しによるもの）を招くいずれかの方法の産物を含む。そのような方法の産物は、本明細書においては、特定の遺伝子またはポリヌクレオチドを含むｐＡＶＥＣベクターと称されうる。
【００４２】
本発明の範囲は、ｐＡＶＥＣプラスミド内にポリヌクレオチドを導入するための方法を含み、該方法は、該プラスミドを、例えばプラスミドマルチクローニングサイトにおいて、例えば１以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、該切断プラスミドの末端を、例えばＤＮＡリガーゼで、該導入ポリヌクレオチドの適合性末端に連結して、閉じた組換えプラスミドを得ることを含む。そのような方法の産物であるいずれの組換えプラスミドも本発明の一部である。ポリヌクレオチドの適合性末端は、ＤＮＡリガーゼにより連結されうる末端である。本発明の１つの実施形態においては、該末端は平滑または粘着末端（例えば、ＥｃｏＲ１またはＢａｍＨ１のような制限エンドヌクレアーゼによる切断により生じるもの）である。
【００４３】
本発明の１つの実施形態においては、免疫グロブリンは、以下のポリペプチドのいずれか（例えば、可変領域のみ、または可変ドメインおよび定常ドメイン）の成熟または未プロセシング形態である。
【００４４】
【化５】
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2014511696.tif 000014
2014511696.tif 000015
国際出願公開番号ＷＯ２００３／１００００８（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【００４５】
本発明の実施形態は、該プラスミドが２以上の免疫グロブリンを含む実施形態、例えば、該プラスミドが、本明細書に記載されている免疫グロブリンのいずれかの組合せ（例えば、重鎖Ｉｇ＃１．０および軽鎖Ｉｇ＃１．０；またはＬＣＣおよびＨＣＡ；またはＬＣＦおよびＨＣＡ；またはＬＣＣおよびＨＣＢ）を含む実施形態を含む。
【００４６】
本発明の実施形態においては、ｐＡＶＥＣプラスミドは、アミノ酸配列：
【００４７】
【化６】
2014511696.tif 000016
を含む軽鎖免疫グロブリン；および／または、アミノ酸配列：
【００４８】
【化７】
2014511696.tif 000017
を含む重鎖免疫グロブリン；またはその可変ドメイン、または軽鎖および／もしくは重鎖のＣＤＲ（例えば、前記配列において下線で示されているもの）の１以上（例えば、３個）を含む軽鎖および／もしくは重鎖免疫グロブリンを含有する。
【００４９】
本発明の１つの実施形態においては、ｐＡＶＥＣベクターは、例えばアブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、セルトリズマブ・ペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、ＡＬＤ５１８またはトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のような抗体の軽および／または重免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。そのような抗体の配列は当技術分野で公知である。本発明の実施形態においては、ｐＡＶＥＣベクターは、抗原（例えば、いずれかの哺乳動物、例えばヒトまたはイヌまたはサルまたはラットまたはウサギまたはマウスに由来するもの）、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＤ−１、ＴＮＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＳＬＰ、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ２３Ｒ、ＰＣＳＫ９、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ａ、ＥｒｂＢ２、ＩｇＥ、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原および呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）抗原のような抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン；あるいはその抗原結合性フラグメント、またはそのような抗体もしくは抗原結合性フラグメントのいずれかの可変ドメイン、またはそのような抗体もしくは抗原結合性フラグメントのいずれかの軽鎖および／もしくは重鎖のＣＤＲの１以上（例えば３個）を含む軽鎖および／もしくは重鎖免疫グロブリンを含む。本発明の１つの実施形態においては、該抗原が由来する種は軽鎖および／もしくは重鎖定常ドメインならびに／または免疫グロブリンフレームワークのものと同じ又は異なる。
【００５０】
本発明の実施形態においては、ｐＡＶＥＣベクターは、以下のものからなる群から選択されるメンバーを含む軽鎖および／または重鎖免疫グロブリンを含む：
【００５１】
【化８】
2014511696.tif 000018
2014511696.tif 000019
2014511696.tif 000020
タンパク質の発現および精製
本発明のもう１つの態様は、ｐＡＶＥＣを使用する組換えタンパク質の製造方法および／または特定のポリヌクレオチドの増幅方法に関する。例えば、本発明の実施形態においては、タンパク質の発現方法は、（例えば、ｐＡＶＥＣのｈＣＭＶプロモーターのようなプロモーターに機能的に連結された）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するｐＡＶＥＣプラスミドを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、該プラスミドを含む宿主細胞の増殖および該組換えタンパク質の発現を可能にする適当な条件下で培養することを含む。例えば、該方法は以下の工程を含む。
【００５２】
ａ）関心のあるポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖）をコードするポリヌクレオチドをｐＡＶＥＣプラスミド（例えば、配列番号１）（例えば、ｐＡＶＥＣのｈＣＭＶプロモーターのようなプロモーターに機能的に連結されているもの）内に導入する工程。
【００５３】
前記のとおり、ｐＡＶＥＣプラスミド内への該ポリヌクレオチドの導入は、例えば、該プラスミド内への導入ポリヌクレオチドの末端の連結に適合性である制限酵素切断部位を生成するためのマルチクローニングサイトの一部の切り出しによる、或るｐＡＶＥＣポリヌクレオチド配列の喪失を招きうる。
【００５４】
ｂ）関心のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｐＡＶＥＣプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトする工程。
【００５５】
該プラスミドは、異所的に自律複製要素として（例えば、該プラスミドが高コピー数、例えば、約２、３、４、５、１０、２０または５０のコピー数を有する場合）または宿主細胞染色体内に組込まれて、宿主細胞において増幅されうる。
【００５６】
ｃ）該プラスミドを含む宿主細胞の増殖および組換えタンパク質の発現を可能にする適当な条件下、細胞を培養する工程。
【００５７】
ｄ）所望により実施されうる、産生されたポリペプチドを回収する工程。
【００５８】
与えられたタンパク質を、例えば、細胞、細胞培養、または細胞が培養された培地から回収（単離および／または精製）するための方法は、当技術分野でよく知られている。非限定的な例としては、塩またはアルコール沈殿（例えば、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿）、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、精製タグと共に用いられる）；免疫アフィニティまたはイオン交換カラム上での分画；高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；等電点フォーカシング；向流分配；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するもの）；およびＩｇＧのような混入物を除去するためのプロテインＡセファロースカラムにより、生物学的物質からタンパク質が単離および／または精製されうる。そのような精製方法は当技術分野でよく知られており、例えば、“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに開示されている。
【００５９】
液体水性培養内の哺乳類細胞の増殖（成長）は当技術分野でよく知られている。当技術分野で公知の哺乳類細胞培養増殖培地の例には、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ、ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；後記で更に詳細に説明される）、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｆ−１０栄養混合物、ＲＰＭＩ培地１６４０、Ｆ−１２栄養混合物、培地１９９、イーグルＭＥＭ、ＲＰＭＩ、２９３培地およびイスコベ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地が含まれる。
【００６０】
細胞増殖は幾つかの系のいずれかにおいて行われうる。例えば、細胞増殖は、単純なフラスコ、例えばガラス振とうフラスコにおいて行われうる。他の系には、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターおよび使い捨てバイオリアクターが含まれる。タンクバイオリアクターには、典型的には、細胞を液体培地内で増殖させる金属容器（例えば、ステンレス鋼ジャケット付き容器）を含む。タンクバイオリアクターは広範な培養体積（例えば、１００Ｌ、１５０Ｌ、１００００Ｌ、１５０００Ｌ）で使用されうる。タンクバイオリアクターは、しばしば、温度制御、培地攪拌、スパージガス濃度の制御、ｐＨの制御、Ｏ２濃度の制御、培地からのサンプルの除去、リアクター重量表示および制御、ハードウェアの清掃、ハードウェアの滅菌、全供給を送るための配管またはチューブ配置、培地の添加、ｐＨの制御、溶液の制御および気体の制御、増殖溶液内への無菌流体の送出、ならびに管理上の制御およびデータ収集のための手段を含む、細胞増殖条件を制御するための追加的な特徴を有する。タンクバイオリアクターの分類は、熱および材料（例えば、酸素および基質）を分配するためにリアクターを混合するために機械的攪拌装置（例えば、羽根車）が使用される攪拌タンクリアクターを含む。バブルカラムリアクターは、内容物を混合するために空気のみを使用する背の高いリアクターである。エアリフトリアクターはバブルカラムリアクターに似ているが、それがドラフトチューブを含有する点で異なる。ドラフトチューブは、典型的には、循環および酸素移動を改善し該リアクター内のせん断力を均等化する内部チューブである。流動床リアクターにおいては、細胞は、流体と共に移動する小粒子上に「固定化」される。該小粒子は、細胞が付着するための並びに該細胞への酸素および栄養物の高率の移動を可能にする大きな表面積をもたらす。充填床リアクターにおいては、細胞は大粒子上に固定化される。これらの粒子は液体と共には移動しない。充填床リアクターは、構築および運転が簡単であるが、閉塞および酸素移動不良を被りうる。使い捨てバイオリアクターは、使い捨て可能な１回使用のためのバイオリアクターである。しばしば、使い捨てバイオリアクターは、非使い捨てバイオリアクターに類似した特徴（例えば、攪拌系、スパージ、プローブ、出入口など）を有する。
【００６１】
ポリペプチドが細胞または組織から単離される場合には特に、１以上のタンパク質分解酵素インヒビター、例えばフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）ＳＣ、ペプスタチン、ロイペプチン、キモスタチンおよびＥＤＴＡをアッセイ系に加えることが好ましい。
【００６２】
幾つかの実施形態においては、関心のあるタンパク質は、「タグ」または「マーカー」と称されうる第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド部分を伴う。タグは、例えば、発現後のポリペプチドの精製または検出を促進するために使用されうる。例えば、発現されるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’または３’末端におけるタグをコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入により、融合ポリペプチドが構築されうる。ついで本発明の発現系において融合ポリヌクレオチドが発現されうる。そのようなタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグおよびｍｙｃタグが含まれる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために、検出可能なタグ、例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａが使用されうる。そのような融合体を構築し使用するための方法は非常に一般的であり、当技術分野でよく知られている。
【００６３】
関心のあるポリペプチドに適した精製方法は、組換え細胞培養内の発現の際の該ポリペプチドの特性の変化に対処するための修飾を要しうる、と当業者は理解している。
【００６４】
本発明はまた、宿主細胞をｐＡＶＥＣプラスミドで形質転換することを含む、ポリヌクレオチドをｐＡＶＥＣプラスミド内に導入するための方法に関する。例えば、該方法は以下の工程を含む。
【００６５】
ａ）該ポリヌクレオチドの挿入が望まれる部位において、（例えば、制限酵素、例えば、挿入されるポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適合性である、および該ポリヌクレオチドの後続の連結の末端に適合性である末端を生成する制限酵素を使用して）ｐＡＶＥＣプラスミドを切断する工程。挿入されるポリヌクレオチドの末端は、切断プラスミドの末端に適合性の末端を生成する制限酵素での切断を含む方法によっても生成されうる。
【００６６】
前記のとおり、ｐＡＶＥＣプラスミド内への該ポリヌクレオチドの導入は、例えば、該プラスミド内への導入ポリヌクレオチドの末端の連結に適合性である制限酵素切断部位を生成するためのマルチクローニングサイトの一部の切り出しによる、或るｐＡＶＥＣポリヌクレオチド配列の喪失を招きうる。
【００６７】
ｂ）該切断ｐＡＶＥＣの末端を、（例えば、ＤＮＡリガーゼを使用して）該ポリヌクレオチドの末端に連結して、最終的な環状組換えプラスミドを得る工程。
【００６８】
ｂ）ついで該組換えプラスミドは、該プラスミドおよび添加ポリヌクレオチドが増幅される宿主細胞内に形質転換されうる。該プラスミドは、異所的に自律複製要素として（例えば、該プラスミドが高コピー数、例えば、約２、３、４、５、１０、２０または５０のコピー数を有する場合）または宿主細胞染色体内に組込まれて、宿主細胞において増幅されうる。
【００６９】
キット
本発明のｐＡＶＥＣプラスミドベクターはキットにおいて提供されうる。本発明のキットは、該プラスミドベクターに加えて、該プラスミドベクターの利用において使用されうるいずれかの試薬を含みうる。１つの実施形態においては、該キットは、細菌および／または哺乳類宿主細胞内への該ベクターの形質転換に必要な試薬を含む。例えば、該キットは、リン酸カルシウム形質転換法のための試薬、すなわち、塩化カルシウム、バッファー（例えば、２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）および無菌蒸留水を含みうる。もう１つの実施形態においては、該キットは、ＤＥＡＥ−エキストラン形質転換のための試薬、すなわち、ＰＢＳ中のクロロキン、ＰＢＳ中のＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸緩衝食塩水を含む。更にもう１つの実施形態においては、該キットには、リポソーム形質転換のための試薬、すなわち、ＤＯＴＡＰ／コレステロール押出し（ｅｘｔｒｕｄｅｄ）リポソームから押出されたリポソームが含まれる。例えば、該キットはカチオン性脂質系トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタミン）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含みうる。
【００７０】
該キットは、本発明のベクターの細菌形質転換に必要な試薬を含みうる。例えば、該キットは形質転換コンピテント細菌（例えば、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＳＵＲＥ、ＳＣＳ１１０、ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｔｏｐ１０またはＨＢ１０１）を含みうる。
【００７１】
該キットは、増殖培地、または増殖培地の調製に必要な試薬を含みうる。例えば、１つの実施形態においては、該キットは哺乳類細胞の増殖のためのウシ胎児血清またはＤＭＥＭ（ダルベッコ／フォークト変法イーグル（ハリー・イーグル）最少必須培地）を含みうる。もう１つの実施形態においては、該キットは、細菌を増殖させるための適当な抗生物質（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン）を含有する粉末ルリアブロス培地またはルリアブロスプレートを含有しうる。
【００７２】
該キットにおいて供給される成分は適当なバイアルまたは容器（例えば、プラスチックまたはガラスバイアル）内で提供されうる。該キットは貯蔵のための適当なラベル表示、および使用のための適当な説明を含みうる。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、本発明を更に詳しく説明するために記載されており、それを限定するものと解釈されるべきではない。本発明の範囲は、以下の実施例に記載されている方法の全てを含む。
【００７４】
実施例１：ｐＡＶＥＣプラスミドの構築
マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の配列：
【００７５】
【化９】
2014511696.tif 000021
2014511696.tif 000022
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成した。ついでＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ベクターｐＡＩＬ１７Ｌ（図２）も制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。最後に、該消化ＰＣＲ産物を該消化ベクターに連結し、ベクターｐＡＶＥＣに関して形質転換体をスクリーニングした。ついでｐＡＶＥＣにおけるマルチクローニングサイトを、該部位の完全性に関する配列決定により分析した。
【００７６】
ｐＡＩＬ１７Ｌの配列：
【００７７】
【化１０】
2014511696.tif 000023
2014511696.tif 000024
2014511696.tif 000025
本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【００７８】
本出願の全体にわたり特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコールが引用されているが、それらの開示の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
【図１】
2014511696.tif 000027
【図２】
2014511696.tif 000028
【配列表】
2014511696000001.app
【国際調査報告】
2014511696.tif 000029