(57)【要約】本開示は、癌の予後を識別するための、生物学的マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンを含む）の組み合わせに関する。本開示はさらに、前記マーカーを同定する方法、癌に対する予後を予測する方法、および癌の個別化処置を設計する方法にも関する。本開示はさらに、前記予測のための、前記マーカーに対する抗体／前記マーカーを検出する別の方法を含む、キット／試験にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の予後診断のための、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、生物学的マーカー。
【請求項２】
癌が乳癌である、請求項１に記載の生物学的マーカー。
【請求項３】
マーカーが、細胞膜、細胞質、核、および核膜またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される位置における癌の腫瘍細胞上に位置する、請求項１に記載の生物学的マーカー。
【請求項４】
癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後診断のためのキットであって、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を、任意に、有機溶媒、試薬、二次抗体、免疫組織化学の実施用の酵素、および取扱説明書と共に含む、前記キット。
【請求項５】
腫瘍であるかまたは腫瘍であることが疑われる生物学的試料中の細胞上の生物学的マーカーを同定する方法であって、以下の行為：
ａ）生物学的試料を、収集し、固定し、切片化し、有機溶媒を用いて処理すること、次いで、所定の試料希釈液を用いて、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する一次抗体を加えることにより、抗原回復すること；および
ｂ）生物学的マーカーを同定するために、酵素と結合した二次抗体および着色反応物または蛍光を得るための試薬を加えること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
癌が乳癌である、請求項４に記載のキットおよび請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒が、アルコールおよびキシレンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項４に記載のキットおよび請求項５に記載の方法。
【請求項８】
収集、固定、切片化および処理を、所定の条件下で従来の免疫組織化学手法により実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後診断の方法であって、以下の行為：
ａ）対象から生物学的試料を収集し、試料の細胞における、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびＨｅｒ−２−ｎｅｕ受容体またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される受容体の、発現または不在を同定し、発現が同定された細胞を得ること；
ｂ）ステップ（ａ）の細胞上で、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を用いて、免疫組織化学分析を実施すること；および
ｃ）試料の細胞における受容体および１または２以上の生物学的マーカーの発現または不在を同定し、該マーカーの同定を、対象の予後を予測するための予測転帰参照表と相関させること、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
免疫組織化学分析が従来法により実施され、マーカーの同定が、試料からの細胞の染色によって該方法の完了時に得られる着色反応物または蛍光を視覚化することにより行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
相関させることが、染色のパーセント、染色強度および染色位置またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるパラメータに基づき；および、前記染色の位置が、細胞膜、細胞質、核および核膜またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
相関させることが、染色のパーセントを染色強度に乗じて予測スコアを算出することを含み、こうして生物学的マーカーの発現の位置に応じて予後が良いか悪いかを予測する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
予測スコアが、約１〜約８０の範囲の低スコア、約８１〜約１５０の範囲の中スコア、および約１５０〜約３００の範囲の高スコアを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
予測転帰参照表が、１、１Ａ、２、２Ａ、３、３Ａ、４、４Ａ、５、６、６Ａ、７、７Ａ、８、９、および１０またはこれらの表の任意の組み合わせを含む群から選択される、個別の表、またはその組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
癌を処置する方法であって、以下の行為：
ａ）生物学的試料中の腫瘍細胞上に、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーを同定すること、および癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後を予測すること；および
ｂ）この予測に基づき、癌の抑制のための癌治療を設計すること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌の予後を識別するための生物学的マーカーの組み合わせに関する。本開示はさらに、前記マーカーを同定する方法、予後を予測する方法、および癌に対する個人化された処置を計画する方法に関する。本開示はさらに、前記予測のための前記マーカーに対する抗体／これを検出する別の方法を含む、キット／試験にも関する。
【背景技術】
【０００２】
開示の背景および従来技術
化学療法／放射線療法：
腫瘍学の分野では、癌細胞の検出、同定および特徴付けは、診断の重要な側面である。医学の多くの課題の中で、癌の処置と治癒よりも議論の的となる始まりを有するものはなく、苦難に満ちた進歩を経験したものもない。多くの患者に対する効果的な処置は、転移性疾患を突き止めるために身体の全ての臓器に到達することが必要であった。癌患者の７０％以上は化学／放射線療法を受ける。
【０００３】
複数の角度からの癌治療の革新的進歩にもかかわらず、癌の治癒は依然としてとらえどころのないままである。進行した固形悪性腫瘍は、最高の治療を受けたとしても、一部は放射線および化学療法に対する抵抗性の発達により治療の課題が残る。例えば神経グリア芽細胞腫は最も致命的な癌の一つであり、現在の治療では緩和しか提供できない。神経グリア芽細胞腫のための標準の医療は、外科的切除、外部電離放射線照射、および化学療法から構成される。放射線療法は最も効果的な非外科的処置法であるが、しかし再発は本質的に普遍的である。
しかし化学／放射線療法を受ける患者の大部分は、処置による不必要で重篤な副作用に苦しめられる。さらに、多くの患者はまた処置への抵抗性を示し、このため処置の失敗がもたらされる。
【０００４】
したがって、処方された化学／放射線療法の有効性を事前に決定できる診断テストの、開発の必要性が存在する。今日では、処置の決定は、例えば腫瘍組織学、腫瘍体積および腫瘍ステージ、さらに生体イメージング技術などの臨床パラメータに基づいて行われる。放射線／化学療法の用量およびスケジュール、ならびに薬物との組み合わせは、周囲の正常組織の許容限度を考慮した経験的クラスの解として処方される。現在の標準的処置の処方は、腫瘍の不均一性／個性を考慮しないために、治療はしばしば失敗し、患者は不必要な副作用を受ける。
腫瘍は典型的に２種類の細胞、ＣＳＣと腫瘍細胞を有する。ＣＳＣは腫瘍の一部のみを構成し、通常は少数である。腫瘍の大部分は、定常的に分裂して「腫瘍」と呼ばれる固体の大きな塊をつくる、腫瘍細胞から構成される。
【０００５】
一方ＣＳＣは、ほとんど分裂せずに自己再生する能力を有する静止細胞であり、すなわち、それ自身の完全なコピーでありかつ移動して特定の腫瘍の様々な細胞に分化することができる娘細胞を作るような方法で分裂する（参考文献：The Biology of Cancer Stem Cells, Neethan A. Lobo et al, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. 23:675-99およびThe theoretical basis of cancer-stem-cell-based therapeutics of cancer: can it be put into practice?, Isidro Sa´ nchez-Garc?´a et al, BioEssays 29:1269-1280）。
【０００６】
化学／放射線治療は、急速に分裂する細胞を標的として殺すことにより、腫瘍サイズの縮小を目指す。ＣＳＣはほとんど分裂しないため、これらの治療によっては殺されず、生き残って再度腫瘍を作り、これは癌の「再発」と呼ばれる。（参考文献：Chemotherapy and Cancer Stem Cells, Jeremy N. Rich et al, Cell Stem Cell 1, October 2007；Identification of Selective Inhibitors of Cancer Stem Cells by High-Throughput Screening, Piyush B. Gupta et al, Cell 138, 1-15, August 21, 2009；Identification and targeting of cancer stem cells, Tobias Schatton et al, BioEssays 31:1038-1049；TUMOUR STEM CELLS AND DRUG RESISTANCE, Michael Dean et al, Nature Reviews, cancer, Volume 5, April 2005；Cancer stem cells in solid tumors, Patrick C. Hermann et al, Seminars in Cancer Biology (2008)）。
【０００７】
上記の参考文献から、ＣＳＣが、新鮮な腫瘍からそれが有する特定の細胞表面マーカーに基づいて、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）を用いて単離されてきたことがわかる。これらの単離されたＣＳＣは、１００００〜２００００個までの非ＣＳＣ／大量の腫瘍細胞に対し、１００〜２００個の細胞であっても新しい腫瘍を誘導するのに十分であった。（参考文献：Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells, Muhammad Al-Hajj et al, PNAS, April 1, 2003, vol. 100 _ no. 7 _ 3983-3988；Identification of a Cancer Stem Cell in Human Brain Tumors, Sheila K. Singh et al, CANCER RESEARCH 63, 5821-5828, September 15, 2003；Identification of human brain tumour initiating cells, Sheila K. Singh et al, NATURE | VOL 432 | 18 NOVEMBER 2004）。ＣＳＣは、９０年代半ばに血液の癌で同定され、固体腫瘍では２００３年に初めて乳癌から、続いて脳およびすべての他の癌から同定された。
【０００８】
ＣＳＣの存在およびこれに対する薬物の欠如は、癌の治癒が達成されない理由の１つとなり得る。多くの製薬会社およびバイオテクノロジー企業が、腫瘍内のこれらＣＳＣを特異的に標的化し、癌の再発を予防する薬物の発明に努力を傾けている。これらの薬物の多くは臨床試験に供されている。
化学／放射線療法への抵抗性および処置の失敗は、腫瘍内の癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれるものの存在による。腫瘍は本質的に不均質であり、２種類の細胞、すなわち癌幹細胞と腫瘍の大部分を形成する腫瘍細胞とを含む。全ての腫瘍細胞が、新しい腫瘍や処置後の再発を誘導する能力を有するのではないことは、昔から認識されていたが、最近になって初めて方法論的進歩があり、これが最終的にＣＳＣを同定して、その生物学的調査を可能とした。ＣＳＣは、白血病および乳房、脳、結腸、頭頸部および膵臓の腫瘍を含む、より多くのヒト癌から予測的に単離されてきた。異なる腫瘍に対して、ＣＳＣ亜集団の移植は、同じ腫瘍からの未分類集団と比べて、より高い腫瘍保有率をもたらすことが示されている。
【０００９】
ＣＳＣは、自己更新して、腫瘍を構成するすべての癌細胞の異種の系統を生成する能力を有する、腫瘍内の細胞として定義される。これはＣＳＣが、対称または非対称分裂によってＣＳＣプールを拡大するかまたは癌前駆細胞に分化することができる、腫瘍細胞の小さな亜集団の可能性があることを意味する。しかし、これについては腫瘍種類に依存し、メラノーマにおいてＣＳＣは、総腫瘍細胞の顕著に高い割合を占める。非幹細胞は、腫瘍内の全ての癌細胞の大部分を構成するが、増殖能は限られており、腫瘍発生性ではない。
【００１０】
ＣＳＣの特性：ＣＳＣは腫瘍内に存在する静止細胞であり、したがって、腫瘍の大部分を構成する急速に増殖する腫瘍細胞とは機能的に異なっている。静止する性質により、ＣＳＣは化学／放射線療法の「望ましい効果」に良好に抵抗するが、それは、これらの療法が腫瘍の急速に分裂する細胞を標的とするためである。加えてＣＳＣは、複数のイオンチャネル／輸送、より高い低酸素耐性、および差次的遺伝子発現などに恵まれており、これらはＣＳＣの化学／放射線耐性現象に寄与している。増加するデータ集団は、ＣＳＣと非ＣＳＣの生物学的な違いが標準療法への応答に重要であることを示唆しており、多くの製薬会社は、ＣＳＣに対する合理的な薬物の設計にこれらの違いを用いている。放射線療法および化学療法の処置の失敗についての根本的な理由の１つは、現在の処置の、癌幹細胞（ＣＳＣ）の根絶に対する有効性の低さのためである可能性がある。ＣＳＣは細胞傷害性／放射線療法に抵抗性であり、このため処置の失敗に貢献する可能性があることを、多くの証拠が示している。
【００１１】
本開示と類似の分野の現在の技術には、Oncotype DxおよびMammaprintが含まれる。これらは類似しているが、ＣＳＣの存在を検出しない。これらは、患者におけるＥＲ／ＰＲおよびＨｅｒ−２−ｎｅｕ経路の存在を評価して、患者が術後化学療法を必要とするかどうかを評価する。現在、腫瘍におけるＣＳＣの存在を検出する診断テストは存在せず、したがって、再発の時間と化学および放射線治療の有用性を予測できない。また、現在の方法は、特定の化学療法薬／組み合わせを選択する際の支援を提供しない。
【００１２】
臨床的観点から、この概念の直接的な帰結は、癌治療が患者を治癒できるのは、全てのＣＳＣが除去された場合のみであり、１個のＣＳＣの生存が再発や転移を引き起こし得るということである。さらにまた、腫瘍が、化学／放射線療法を処方する前に、ＣＳＣの存在について評価される場合、腫瘍医にとって、処置の有効性を予測でき、癌処置をより良好に管理し、治療が有効でない場合に患者に対する望ましくない処置の副作用を低減する、かなりのチャンスがある。２００４年の最初の固形腫瘍のＣＳＣの発見以来、ＣＳＣの生物学について大きな進歩があった。ＣＳＣの内容、分布および感度、微小環境のＣＳＣニッチおよびシグネチャー（signature）についての予測試験を用いて、解のクラス内で、ＣＳＣに基づく個別に設計された治療を可能とすべきである。
【００１３】
開示の陳述
従って、本開示は以下に関する：癌の予後診断のための、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、生物学的マーカー；癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後診断のためのキットであって、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を、任意に、有機溶媒、試薬、二次抗体、免疫組織化学の実施用の酵素、および取扱説明書と共に含む、前記キット；腫瘍であるかまたは腫瘍であることが疑われる生物学的試料中の細胞上の生物学的マーカーを同定する方法であって、以下の行為：ａ）生物学的試料を収集し、固定し、切片化し、有機溶媒を用いて処理し、次いで、所定の試料希釈液を用いて、抗原回復すること、およびｂ）ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する一次抗体を加え、生物学的マーカーを同定するために、酵素と結合した二次抗体および着色反応物または蛍光を得るための試薬を加えること、を含む、前記方法；癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後診断の方法であって、以下の行為：ａ）対象から生物学的試料を収集し、試料の細胞における、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびＨｅｒ−２−ｎｅｕ受容体またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される受容体の、発現または不在を同定し、発現が同定された細胞を得ること、ｂ）ステップ（ａ）の細胞上で、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を用いて、免疫組織化学分析を実施すること、およびｃ）試料の細胞における受容体および１または２以上の生物学的マーカーの発現または不在を同定し、該マーカーの同定を、対象の予後を予測するための予測転帰参照表と相関させること、を含む、前記方法；および、癌を処置する方法であって、以下の行為：ａ）生物学的試料中の腫瘍細胞上に、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーを同定すること、および癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後を予測すること、およびｂ）予測に基づき、癌の抑制のための癌治療を設計すること、を含む、前記方法。
【００１４】
発明の詳細な説明
本開示は、癌の予後診断のための、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに関する。
本開示の一態様において、癌は乳癌である。
本開示の別の態様において、マーカーは、細胞膜、細胞質、核、および核膜またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される位置における癌の腫瘍細胞上に位置する。
【００１５】
本開示はさらに、癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後診断のためのキットであって、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を、任意に、有機溶媒、試薬、二次抗体、免疫組織化学の実施用の酵素、および取扱説明書と共に含む、前記キットに関する。
【００１６】
本開示はさらに、腫瘍であるかまたは腫瘍であることが疑われる生物学的試料中の細胞上の生物学的マーカーを同定する方法であって、以下の行為：
ａ）生物学的試料を、収集し、固定し、切片化し、有機溶媒を用いて処理すること、次いで、所定の試料希釈液を用いて、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する一次抗体を加えることにより、抗原回復すること；および
ｂ）生物学的マーカーを同定するために、酵素と結合した二次抗体および着色反応物または蛍光を得るための試薬を加えること、を含む、前記方法に関する。
【００１７】
本開示の一態様において、癌は乳癌である。
本開示の別の態様において、有機溶媒は、アルコールおよびキシレンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
本開示のさらに別の態様においては、収集、固定、切片化および処理を、所定の条件下で従来の免疫組織化学手法により実施する。
【００１８】
本開示はさらに、癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後診断の方法であって、以下の行為：
ａ）対象から生物学的試料を収集し、試料の細胞における、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびＨｅｒ−２−ｎｅｕ受容体またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される受容体の、発現または不在を同定し、発現が同定された細胞を得ること；
ｂ）ステップ（ａ）の細胞上で、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を用いて、免疫組織化学分析を実施すること；および
ｃ）試料の細胞における受容体および１または２以上の生物学的マーカーの発現または不在を同定し、該マーカーの同定を、対象の予後を予測するための予測転帰参照表と相関させること、
を含む、前記方法に関する。
【００１９】
本開示の一態様において、免疫組織化学分析は従来法により実施され、マーカーの同定は、試料からの細胞の染色によって該方法の完了時に得られる着色反応物または蛍光を視覚化することにより行われる。
本開示の別の態様において、相関させることは、染色のパーセント、染色強度および染色位置またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるパラメータに基づき；および、前記染色の位置は、細胞膜、細胞質、核および核膜またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００２０】
本開示のさらに別の態様において、相関させることは、染色のパーセントを染色強度に乗じて予測スコアを算出することを含み、こうして生物学的マーカーの発現の位置に応じて予後が良いか悪いかを予測する。
本開示のさらに別の態様において、予測スコアは、約１〜約８０の範囲の低スコア、約８１〜約１５０の範囲の中スコア、および約１５０〜３００の範囲の高スコアを含む群から選択される。
本開示のさらに別の態様において、予測転帰参照表は、１、１Ａ、２、２Ａ、３、３Ａ、４、４Ａ、５、６、６Ａ、７、７Ａ、８、９、および１０またはこれらの表の任意の組み合わせを含む群から選択される、個別の表、またはその組み合わせである。
【００２１】
本開示はさらに、癌を処置する方法であって、以下の行為：
ａ）生物学的試料中の腫瘍細胞上に、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＡＢＣＧ２、ＥＳＡ、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＡＰＣ、βカテニン、およびＰカドヘリンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生物学的マーカーを同定すること、および癌を有するかまたは癌を有することが疑われる対象の予後を予測すること；および
ｂ）予測に基づき、癌の抑制のための癌治療を設計すること、
を含む、前記方法に関する。
【００２２】
本開示は、あるＣＳＣ特異的マーカーを用い、ある腫瘍中の、標準治療に対する患者の応答の指標であるＣＳＣ／薬物耐性細胞の存在を調べるための手法として免疫組織化学および逆転写ポリメラーゼ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、腫瘍試料を評価する診断テストである。マーカーの例としては、限定はされないが、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＣＳＣ上に存在するイオントランスポーター／チャネルであって例えばトランスポーターのＡＢＣファミリー、すなわちＡＢＣＧ２およびＡＢＣＣ４、ＥＳＡ、ＡＰＣ、Ｐカドヘリン、Ｂカテニン（リン、総リン、および非リン）を含む。
【００２３】
本開示は、腫瘍学の分野において、腫瘍の早期発見に有用性を有する。可能な癌の診断／予後診断は、腫瘍専門医が化学療法を計画し、代替の標的処置を処方することを支援する。患者はさらに、高価な処置の望ましくない副作用から免れる。
本開示はまた、ＣＳＣを同定するのに用いるマーカーおよびこれらのマーカーの組み合わせに、ならびにかかる癌幹細胞（ＣＳＣ）を検出する方法論にも関する。
以下の具体的な例を参照してより完全な理解を得ることができ、これらは例示のみを目的として提供され、本開示の範囲の限定は意図していない。
【００２４】
以下の例は、乳癌の予後診断のために、個別にまたは互いに組み合わせて用いることができる、種々のマーカーを示す。本明細書に提供される例は、癌を有するか有することが疑われる対象の予後を解析するため、および予後診断に到達するための可能な組み合わせの種類を例示する。本明細書に提供される表は、マーカーの組み合わせまたは個別のマーカーのどちらかを認識することによって如何にして解釈に到達するかについての、説明および明確さのために組み合わされている。本明細書に示されている任意の組み合わせからの任意の表は、単一で、または本明細書に提供されている任意の別のマーカーと組み合わせて、本明細書の例によっては明示的に説明されていない可能性もある解釈のために、用いることができる。全てのかかる可能な組み合わせおよびかかる組み合わせの解釈は、本開示の範囲内である。当業者はしたがって、試料を検査し、結論に到達し、結論を本明細書に提供されているマーカーの解釈と比較することにより、対象の予後を予測することができ、正確な予後診断と、かかる予後診断に基づくさらなる処置の過程の戦略化を行うことができる。
【００２５】
例
本開示において、ＩＨＣ（免疫組織化学）を、ＣＤ４４とＣＤ２４に対する２種の抗体を用いて実施して、これらの患者において任意のＣＳＣシグネチャーが見出せるかどうかを確かめる。探索するシグネチャーは、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗである。
しかしながらこれら２つのマーカーは、表面／膜に関連する発現のみを検出するＦＡＣＳ分析に基づいて、ＣＳＣ上に存在することが知られている。ＦＡＣＳは膜発現のみを検出可能であり、細胞質でのＣＤ２４発現が多くの場合に見られたとしても、これは陰性としてとらえられるか、または細胞質としてマークされる。しかしＩＨＣは、膜および細胞質の両方でＣＤ２４の存在を検出することができ、多くの場合発現は膜に加えて細胞質で見られるか、または細胞質のみで見られる場合もある。したがって、本開示の一部の表に開示されるように発現が完全に細胞質である場合、そこでの結果は、ＦＡＣＳを用いて検出した場合には、本開示のＩＨＣを用いる場合と異なり、ＣＤ２４−（ＣＤ２４陰性）と考えられる。本開示のＩＨＣに基づく検出により、膜および細胞質、および核膜での発現が検出される。
【００２６】
本開示の一態様において、癌／腫瘍のリンパ節状態／ステージＮ０でも、悪い転帰を示す場合があることに留意すべきである。しかし一般的な方法として、通常はリンパ節ステージの増加、例えばＮ２またはＮ１は悪い転帰を示し、一方Ｎ０は隣接するリンパ節への転移がないと考えられ、したがって良い転帰／癌・腫瘍のより軽症の形態を有するものとされる。それにもかかわらず、本開示で開示された表１０（患者の病歴）によれば、低いリンパ節ステージの腫瘍でも悪い転帰があり、その逆もあることが明確に示されている。したがって、リンパ節の状態には完全に依拠することができず、良いまたは悪い予後診断を、リンパ節状態の同定等の以前から知られている技術のみに基づいて実施することができないため、試料のより深い分析が求められる。したがって、本開示は明らかに、腫瘍のリンパ節の状態等の以前から知られている技術と組み合わせることができる、癌細胞上に存在するマーカーの同定の必要性とその重要性を示している。したがって、本開示から明らかであるように、染色された細胞％、染色強度および各マーカーの位置の組み合わせを考慮して、患者試料の正確な予後診断に到達すべきである。
【００２７】
本開示の別の態様において、以下に示されるマーカーを、患者試料の癌幹細胞／癌始原細胞／腫瘍始原細胞においてのみでなく、試料の全腫瘍細胞を包含して同定すべきであることにも、留意されたい。
【００２８】
例１
本開示の患者試料中のマーカーの同定に用いる技術には、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはＲＴ−ＰＣＲが関与する。
腫瘍から癌幹細胞を同定するためのプロセスを、下記のような技法を用いて行う：
腫瘍試料を患者から採取する。試料をパラフィン中に包埋してホルマリン固定し、ブロックを作る
↓
ブロックを、スライド上で切片化する
↓
スライドを一連の有機溶媒に通して脱水する
↓
抗原回復を、制御された実験条件下で、特定の試料希釈を用いて実施する
↓
続いて、スライド上の切片を室温（ＲＴ）に冷却する
↓
続いて遮断剤を添加する
↓
続いて抗原に対する一次抗体を加える
↓
続いて酵素に結合した二次抗体を加える
↓
続いて着色反応物を得るための試薬を加える
↓
染色を観察して、染色の％、染色の強度および位置を同定する。
これら全結果の相関をとって、腫瘍試料におけるＣＳＣの存在の同定を行い、その結果として良い／悪い転帰に到達する。
【００２９】
本発明の一態様において、以下の詳細なプロトコルに記載されている有機溶媒、試薬、二次抗体および酵素は例示目的のみであり、本質的に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、当業者に一般に知られており使用されているかかる溶媒、試薬、二次抗体および酵素の、全ての可能な組み合わせおよび代替物を想定し包含する。
本開示で使用するプロセスの明解性をさらに提供するために、以下に免疫組織化学の詳細なプロトコルを提供する：
【００３０】
ＩＨＣプロトコル
Ａ］スライドのコーティングおよびＦＦＰＥブロックの切片の切り取り
１．新しいスライドガラスを水道水で洗浄する。
２．スライドを、１％酸性アルコール溶液（１ｍｌのＨＣｌ＋９９ｍｌの７０％エタノール）に５分間浸す。
３．スライドを蒸留水で１度洗浄し、酸アルコールが洗い流されていることを確認する。
４．スライドを乾燥させる。
５．スライドを、水中の１０％ポリ−Ｌ−リジン溶液（ＰＬＬ）に室温（ＲＴ）で１５分間浸す。
６．スライドを取り出し、室温で乾燥させる。
７．これらのＰＬＬ被覆スライド上に、ＦＦＰＥ腫瘍ブロックの３〜５ミクロンの切片をLeica Microteomeを用いて載せる。
８．切片を６０℃で３時間または一晩インキュベートする。
【００３１】
Ｂ］脱パラフィン化プロトコル：
１．腫瘍切片を有するスライドを、キシレン−Ｉに室温で１０分間浸す。
２．スライドを、キシレン−ＩＩに室温で１０分間浸す。
３．スライドを、キシレン−ＩＩＩに室温で１０分間浸す。
４．スライドを、１００％アルコールに室温で５分間浸す。
５．スライドを、１００％アルコールに室温で５分間浸す。
６．スライドを、７０％アルコールに室温で５分間浸す。
７．スライドを、７０％アルコールに室温で５分間浸す。
８．スライドを、Ｄ／Ｗに室温で５分間浸す。
９．スライドを、メタノール中の３％Ｈ２Ｏ２に室温で２０〜３０分間浸す。
【００３２】
Ｃ］抗原回復および免疫染色：
このステップは、各抗体／マーカーにより異なる。以下は抗体ＡおよびＢに対するプロトコルである。両抗体に対する抗原回復用の緩衝液は以下である：
１ｍＭのＥＤＴＡ＋１０ｍＭのトリス−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．４
１．抗体Ａ対して：抗原は、圧力鍋条件を用いて、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中３笛で最大に回復される（用いる圧力鍋により笛数は調節可能。加熱し過ぎを避けること）。
抗体Ｂ対して：抗原は、次の電子レンジ条件を用いて最大に回復される：
８００ワットで６分間
８００ワットで６分間
２００ワットで１５分間
【００３３】
しかし、上のような圧力鍋の方法を試してみてもよい。
２．抗原回復後、スライドを緩衝液中で室温に３０分間冷却する。
３．スライドを蒸留水で２分間洗浄する。
４．スライドを、ＴＢＳＴ（トリス緩衝食塩水に０．１％Tween 20）で５分間洗浄する。
５．スライドをＴＢＳＴで５分間洗浄する。
６．スライドを３％ＢＳＡ溶液でブロックする／二次抗体用キットを用いている場合は、キットで提供される遮断を適宜用いる。
７．緩衝液で希釈した一次抗体（下記参照）を、室温で６０分間加える。
８．スライドを、ＴＢＳＴで室温で５分間洗浄する。
９．８番のステップをさらに２回繰り返す。
１０．二次抗体、すなわちＨＲＰ結合抗マウス抗体を、キットに従って適切な希釈で加える。室温で３０〜６０分間インキュベートする。
【００３４】
１１．ＴＢＳＴで室温で５分間洗浄する。
１２．１１番のステップをさらに２回繰り返す。
１３．キット推奨の基質ＤＡＢ等を加える。
１４．過剰な基質をキットに従って洗い流す。
１５．ヘマトキシリンにより逆染色する。
１６．１００％アルコールに５分間浸すことにより、過剰な染色を洗い流す。
１７．１６番のステップを繰り返す。
１８．スライドを乾燥させる。
１９．キシレン中で室温で５分間、１回洗浄する。
２０．ＤＰＸ／適切な封入剤中に封入する。
２１．シートに従って、スライドをスコア／グレード付けする。
【００３５】
溶液の処方：
１．酸アルコール：１ｍｌの濃ＨＣｌ＋９９ｍｌの７０％アルコール
２．抗原回復緩衝液： １０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０＋１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４
３．一次抗体希釈緩衝液：１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４＋０．９％ＮａＣｌ＋０．５％ＢＳＡ
４．遮断緩衝液：トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４中の３〜５％ＢＳＡ、または、キットが提供する遮断液、または、それぞれのプロトコルによる
５．ＴＢＳＴ：１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４＋０．９％ＮａＣｌ＋０．１％Tween -20
さらに、抗原回復のために使用する特定の試料希釈液、有機溶媒および実験条件は、例示目的のみのために、以下のように提供される。当業者は、用いられる種々のパラメータおよび条件を理解することができ、したがって、かかる分析用のプロトコルに到達するための、当技術分野での知識を有する者に知られている全ての様々な代替および置換もまた、本開示の範囲内である。
【００３６】
抗体Ａ−圧力鍋（ＰＣ）、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）ｐＨ７．４の緩衝液、設定２で２笛および設定１で１笛；希釈１：１４００
抗体Ｂ−電子レンジ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０；電子レンジ／Ｃｉｔ６．０／「高」の設定−７００Ｗで７分；高−７５０Ｗで５分；「解凍」の設定−２００Ｗで１５分；希釈１：５０
抗体Ｃ−２ＮのＨＣｌ、室温；希釈１：３００
抗体Ｅ−５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で９０℃で３０分間の水浴；希釈１：６００
抗体Ｆ−圧力鍋、クエン酸緩衝液ｐＨ６．０；ヒーター上で設定１で１笛、および設定１で２０分沸騰；希釈１：２００
抗体Ｇ−２ＮのＨＣｌ、室温で１５分、希釈１：５０
抗体Ｈ−ＰＣ／Ｃｉｔ６．０／設定２で２笛＆設定１で１笛；希釈１：１０００
抗体Ｉ−圧力鍋（２分で２笛、設定１で１笛）、Ｃｉｔ６．０；希釈１：１０００
【００３７】
抗体Ｊ−圧力鍋、Ｃｉｔ６．０；圧力鍋（２分で２笛、設定１で１笛）；１：５０の抗体希釈
抗体Ｋ−クエン酸塩ｐＨ６．０中で９０℃で３０分の水浴；希釈１：１００
抗体Ｌ−圧力鍋（２分で２笛、１分で１笛）；ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４、会社からの予備希釈された抗体
抗体Ｏ−圧力鍋のクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中、設定２で２笛、設定１で１笛
【００３８】
例２
本開示で使用する抗体は、次の１または２以上から選択される：
ＣＤ４４：（参照：ＣＤ４４標準／ＨＣＡＭ Ａｂ−４（クローン１５６−３Ｃ１１））
ＣＤ２４：（参照：（ＣＤ２４（ＧＰＩ結合表面ムチン）Ａｂ−２（クローンＳＮ３ｂ）
ＡＢＣＧ２：（参照：ＮＢ−１１０９３５１１、Novus Biologicalsより）
ＥＳＡ：（参照：Novocastra上皮特異抗原）
ＡＢＣＣ４：（参照：ＡＢＣＣ４モノクローナル抗体（Ｍ０３）、クローン１Ｂ２）
ＣＤ１３３：（参照：ＰＡＢ−１２６６３、Abnovaより）
Ｏｃｔ−４：（参照：Ｏｃｔ−４抗体（ＮＢ１１０−９０６０６））
Ｓｏｘ−２： （Ｅ−１８６００、Spring Biosciencesより）
ＡＰＣ：（参照：腺腫性ポリポーシス遺伝子産物）
Ｐカドヘリン：（参照：抗Ｐカドヘリン抗体［５６Ｃ１］、希釈済み（ａｂ７５４４２））
Ｂカテニン：（参照：抗活性βカテニン（抗ＡＢＣ）、クローン８Ｅ７）ＪＢＣ−１８７００５７。
【００３９】
以下の表１〜９の全ての表において、細胞染色の強度は１〜３の値を有する。ここで、強度１＝極めて淡褐色の染色スライド、強度２＝中程度の褐色の染色スライド、および強度３＝暗褐色の染色スライド。中間の色を観察した場合は、１〜２または２〜３等と表示する。
さらに、本明細書に提供されている１、１Ａ、２、２Ａ、３、３Ａ、４、４Ａ、５、６、６Ａ、７、７Ａ、８、９、および１０を含む群から選択される個別の表、またはその任意の組み合わせの表は、当業者が使用することができ、癌を有するか有することが疑われる対象の予後予測のための関連する結果について解釈され、これに到達することができる。個別または組み合わせのこれらの表はまた、本開示において、予測転帰参照表とも称される。
【００４０】
【表１−１】
2014515821.tif 000002
【００４１】
【表１−２】
2014515821.tif 000003
【００４２】
表１Ａ
Ａ／ＣＤ４４の発現は、ＤＣＩＳ辺縁部においてではなく、浸潤辺縁部においてスコア付けされるべきである。
Ｍ：細胞膜
Ｃ：細胞質
Ｎ：核
ＮＭ：核膜
【表１Ａ】
2014515821.tif 000004
【００４３】
範囲：低：１〜８０；中：８１〜１５０；高：１５０〜
スコア付けに適用される式：
カラムＡ合計（細胞の％）／患者試料数＝スコアＡ
カラムＢ合計（強度）／患者試料数＝スコアＢ
スコアＡ×スコアＢ＝該カテゴリーにおける該マーカーの最終スコア
上記のスコア付けと式は、カテゴリーの全ての患者試料ではなく、特定の分野［マーカーの位置］内の実体を念頭に置いて用いられてきた。例えば：ＥＲ−／ＰＲ−状態の患者でマーカーＡについて悪い転帰を有する者において、予後を予測するためのスコア付けは以下の方法で行う：
マーカーＡの膜と細胞質の両方における発現という解釈に到達するために、９試料中の６つのみを考慮し、これは残りの３つは膜のみで発現を有する試料を構成するからである。
同様に、マーカーＡの膜のみでの発現という解釈に到達するために、９試料中の３つのみを考慮し、これは残りの６つは、このカテゴリーの予測に要求される基準である膜のみではなく、細胞質と膜の両方で発現を有する試料を構成するからである。
同様の戦略および変換を用いて、全てのマーカーおよびＥＲ／ＰＲ状態にわたる、全試料の結果の解釈を行う。
【００４４】
注記：ＥＲ＋／ＰＲ＋良い転帰：
浸潤辺縁部におけるマーカーの存在または不在を評価することが重要である。ＤＣＩＳ病巣を有する腫瘍全体はＡの高発現を有するが、浸潤辺縁部では低い発現か発現がない可能性があり、したがって、マーカーＡについての結果解釈に非常に重要なのは、浸潤辺縁部における実際の発現である。
【００４５】
表１および１Ａの解釈：
患者試料を、ＥＲ＋／ＰＲ＋状態に基づきこれを１つの群とし、ＥＲ−／ＰＲ−状態を別の群として分離する。かかる発現の選択および分離において、試験試料を、表１に示す個別マーカーまたはマーカーの組み合わせ（例えばここに示すように：ＣＤ４４とＣＤ２４の組み合わせを考慮する）のどちらかの存在について検査する。
【００４６】
良いおよび悪い予後／転帰の結果は、表１に開示されているように、染色強度の発現をマーカーの位置および染色％と組み合わせて考慮した後に、マーカー状態を理想的に示す。表１Ａに示す良い／悪い転帰のパターンの判定は、前述の例１に開示されたプロセスステップを実施した後の試料における３つの実体、すなわち染色％、染色強度、およびマーカー位置を相関させることによる。留意すべきなのは、浸潤辺縁部におけるマーカーＡの有無を評価することが非常に需要であることである。ＤＣＩＳ病巣を有する腫瘍全体はＡの高発現を有するが、浸潤辺縁部では低い発現か発現がない可能性があり、したがって、この側面は、マーカーＡについての結果解釈に非常に重要である。
【００４７】
上述のプロセスステップを試験試料に行って得られた結果が、良い転帰に対するマーカー発現結果（表１に開示されたもの）と一致すれば、表１０（患者病歴）の良い転帰を有する患者についての処置モジュールを参照することができて、したがってかかる患者に対する処置戦略は、少ないフォローアップまたはより攻撃的でない処置戦略が必要であろう。しかし、悪い転帰についてのマーカー発現（表１に開示のように）と一致する試料の結果の場合には、かかる患者は、より攻撃的なフォローアップを戦略的な処置モジュールと共に必要とするか、または、その発現を低減するための、これらのマーカーの組み合わせ（ここではＣＤ４４とＣＤ２４）に特異的な抗体を開発および投与することを本質的に含み得る、代替的な処置のアプローチを用いるか、これを考慮することが必要である。
【００４８】
世界中でさらに認識されているのは、悪い転帰を有する傾向のある、ＥＲ＋／ＰＲ＋患者のサブセットの存在である。我々の上述の結果は、良いおよび悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ＋／ＰＲ＋の女性を、ＣＤ４４とＣＤ２４の発現に基づいて分離することを可能とする。しかし当業者は上述の結果に基づき、これらの患者を処置する一方法は抗ＣＤ４４抗体を処方することであり、それは、ＣＤ４４がこれらの患者の細胞膜で高発現されており、長期の疾患なしの生存の希望が持てるからであることを理解できるであろう。一方、悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ−／ＰＲ−の患者においては、全体的にＣＤ４４の低い発現があり、そのためＣＤ４４に対する抗体はあまり効果がないであろう。それでも、かかる患者を同定し、より標的化された薬物で適切に処置し、頻繁で完全なフォローアップ等を行って、長期の疾患なしの生存を保証することは重要である。類似の戦略を、様々なマーカー発現を有する癌患者の処置に用いることができ、これらのいくつかは以下の表に例示される。
【００４９】
さらに留意すべきは、ＥＲ／ＰＲ状態にわたる良い転帰は組み合わせられないことである。前述のように、典型的に＋／＋の患者は良好な予後のケースと考えられ、したがって攻撃的に処置する必要はない。典型的に＋／＋の患者に対するフォローアップは６〜１２月に１回実施することができ、これは＋／＋の悪い転帰の群に対しては長すぎる。したがって前述の転帰の解釈の場合に、中間再発と呼ばれる２度のフォローアップの中間での癌の再発を低減するより頻繁なフォローアップを、特に＋／＋の悪い転帰のケース／患者に対して推論することができる。一方−／−の癌は攻撃的な癌であり、そのため良い転帰の患者は攻撃的に処置する必要はない。一方で悪い転帰の−／−患者は、より詳細で効果的かつ革新的なフォローアップを受けて転移をできるだけ早くとらえ、処置を開始することができる。
【００５０】
【表２−１】
2014515821.tif 000005
【００５１】
【表２−２】
2014515821.tif 000006
【００５２】
【表２−３】
2014515821.tif 000007
【００５３】
【表２Ａ】
2014515821.tif 000008
【００５４】
Ａ／ＣＤ４４の発現は、ＤＣＩＳ辺縁部においてではなく、浸潤辺縁部においてスコア付けされるべきである。
Ｍ：細胞膜
Ｃ：細胞質
Ｎ：核
ＮＭ：核膜
【００５５】
表２および２Ａの解釈：
患者試料を、ＥＲ＋／ＰＲ＋状態に基づきこれを１つの群とし、ＥＲ−／ＰＲ−状態を別の群として分離する。かかる発現の選択および分離において、試験試料は、表２に示す個別マーカーまたはマーカーの組み合わせ（例えばここに示すように：ＣＤ４４とＣＤ２４の、ＡＢＣＣ４との組み合わせを考慮する）のどちらかの存在について検査する。
良いおよび悪い予後／転帰の結果は、表２に開示されているように、染色強度の発現をマーカーの位置および染色％と組み合わせて考慮した後に、マーカー状態を理想的に示す。
【００５６】
表２Ａに示す良い／悪い転帰のパターンの判定は、前述の例１に開示されたプロセスステップを実施した後の試料における３つの実体、すなわち染色％、染色強度、およびマーカー位置を相関させることによる。留意すべきなのは、浸潤辺縁部におけるマーカーＡの有無を評価することが非常に需要であることである。ＤＣＩＳ病巣を有する腫瘍全体はＡの高発現を有するが、浸潤辺縁部では低い発現か発現がない可能性があり、したがって、この側面は、マーカーＡについての結果解釈に非常に重要である。
【００５７】
上述のプロセスステップを試験試料に行って得られた結果が、良い転帰に対するマーカー発現結果（表２に開示されたもの）と一致すれば、表１０（患者病歴）の良い転帰を有する患者についての処置モジュールを参照することができて、したがってかかる患者に対する処置戦略は、少ないフォローアップまたはより攻撃的でない処置戦略が必要であろう。しかし、悪い転帰についてのマーカー発現（表２に開示のように）と一致する試料の結果の場合には、かかる患者は、より攻撃的なフォローアップを戦略的な処置モジュールと共に必要とするか、または、その発現を低減するための、これらのマーカーの組み合わせ（ここでは、ＣＤ４４とＣＤ２４をＡＢＣＣ４と組み合わせたもの）に特異的な抗体を開発および投与することを本質的に含み得る、代替的な処置のアプローチを用いるか、これを考慮することが必要である。
【００５８】
世界中でさらに認識されているのは、悪い転帰を有する傾向のある、ＥＲ＋／ＰＲ＋患者のサブセットの存在である。我々の上述の結果は、良いおよび悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ＋／ＰＲ＋の女性を、ＣＤ４４とＣＤ２４の発現に基づいて分離することを可能とする。しかし当業者は上述の結果に基づき、これらの患者を処置する一方法は抗ＣＤ４４抗体を処方することであり、それは、ＣＤ４４がこれらの患者の細胞膜で高発現されており、長期の疾患なしの生存の希望が持てるからであることを理解できるであろう。一方、悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ−／ＰＲ−の患者においては、ＣＤ４４の全体的な低い発現があり、そのためＣＤ４４に対する抗体はあまり効果がないであろう。それでも、かかる患者を同定し、より標的化された薬物で適切に処置し、頻繁で完全なフォローアップ等を行って、長期の疾患なしの生存を保証することは重要である。類似の戦略を、様々なマーカー発現を有する癌患者の処置に用いることができ、これらのいくつかは以下の表に例示される。
【００５９】
さらに留意すべきは、ＥＲ／ＰＲ状態にわたる良い転帰は組み合わせられないことである。前述のように、典型的に＋／＋の患者は良好な予後のケースと考えられ、したがって攻撃的に処置する必要はない。典型的に＋／＋の患者に対するフォローアップは６〜１２月に１回実施することができ、これは＋／＋の悪い転帰の群に対しては長すぎる。したがって前述の転帰の解釈の場合に、中間再発と呼ばれる２度のフォローアップの中間での癌の再発を低減するより頻繁なフォローアップを、特に＋／＋の悪い転帰のケース／患者に対して推論することができる。一方−／−の癌は攻撃的な癌であり、そのため良い転帰の患者は攻撃的に処置する必要はない。一方で悪い転帰の−／−患者は、より詳細で効果的かつ革新的なフォローアップを受けて転移をできるだけ早くとらえ、処置を開始することができる。
【００６０】
ＡＢＣＣ４は膜トランスポーターである。細胞はこれを用いて化学療法の薬物を排出し、したがってこのマーカーの発現が高い場合、細胞はＣＴ（化学療法）により抵抗性である。また留意すべきなのは、このトランスポーターの細胞質発現が、細胞が薬物を排出するのを助けることであり、これは患者を処置するときに考慮されるべきである。ＡＢＣＣ４のＭまたはＭ＋Ｃでの高い発現を有する患者は、薬物に対してより抵抗性であり、そのため悪い予後／転帰を有することになり、したがってこれに応じて処置されるべきである。
【００６１】
【表３−１】
2014515821.tif 000009
【００６２】
【表３−２】
2014515821.tif 000010
【００６３】
【表３Ａ】
2014515821.tif 000011
Ｍ：細胞膜
Ｃ：細胞質
Ｎ：核
ＮＭ：核膜
【００６４】
表３および３Ａの解釈：
患者試料を、ＥＲ＋／ＰＲ＋状態に基づきこれを１つの群とし、ＥＲ−／ＰＲ−状態を別の群として分離する。かかる発現の選択および分離において、試験試料は、表３に示す個別マーカーまたはマーカーの組み合わせ（例えばここに示すように：Ｏｃｔ−４とＳｏｘ−２の組み合わせを考慮する）のどちらかの存在について検査する。
良いおよび悪い予後／転帰の結果は、表３に開示されているように、染色強度の発現をマーカーの位置および染色％と組み合わせて考慮した後に、マーカー状態を理想的に示す。
表３Ａに示す良い／悪い転帰のパターンの判定は、前述の例１に開示されたプロセスステップを実施した後の試料における３つの実体、すなわち染色％、染色強度、およびマーカー位置を相関させることによる。
【００６５】
上述のプロセスステップを試験試料に行って得られた結果が、良い転帰に対するマーカー発現結果（表３に開示されたもの）と一致すれば、表１０（患者病歴）の良い転帰を有する患者についての処置モジュールを参照することができて、したがってかかる患者に対する処置戦略は、少ないフォローアップまたはより攻撃的でない処置戦略が必要であろう。しかし、悪い転帰についてのマーカー発現（表３に開示のように）と一致する試料の結果の場合には、かかる患者は、より攻撃的なフォローアップを戦略的な処置モジュールと共に必要とするか、または、その発現を低減するための、これらのマーカーの組み合わせ（ここでは、Ｏｃｔ−４とＳｏｘ−２）に特異的な抗体を開発および投与することを本質的に含み得る、代替的な処置のアプローチを用いるかこれを考慮することが必要である。
【００６６】
さらに留意すべきは、ＥＲ／ＰＲ状態にわたる良い転帰は組み合わせられないことである。前述のように、典型的に＋／＋の患者は良好な予後のケースと考えられ、したがって攻撃的に処置する必要はない。典型的に＋／＋の患者に対するフォローアップは６〜１２月に１回実施することができ、これは＋／＋の悪い転帰の群に対しては長すぎる。したがって前述の転帰の解釈の場合に、中間再発と呼ばれる２度のフォローアップの中間での癌の再発を低減するより頻繁なフォローアップを、特に＋／＋の悪い転帰のケース／患者に対して推論することができる。一方−／−の癌は攻撃的な癌であり、そのため良い転帰の患者は攻撃的に処置する必要はない。一方で悪い転帰の−／−患者は、より詳細で効果的かつ革新的なフォローアップを受けて転移をできるだけ早くとらえ、処置を開始することができる。
【００６７】
【表４−１】
2014515821.tif 000012
【００６８】
【表４−２】
2014515821.tif 000013
【００６９】
【表４−３】
2014515821.tif 000014
【００７０】
【表４Ａ】
2014515821.tif 000015
【００７１】
Ｍ：細胞膜
Ｃ：細胞質
Ｎ：核
ＮＭ：核膜
【００７２】
表４および４Ａの解釈：
患者試料を、ＥＲ＋／ＰＲ＋状態に基づきこれを１つの群とし、ＥＲ−／ＰＲ−状態を別の群として分離する。かかる発現の選択および分離において、試験試料は、表４に示す個別マーカーまたはマーカーの組み合わせ（例えばここに示すように：ＡＰＣとＢカテニンの組み合わせを考慮する）のどちらかの存在について検査する。
良いおよび悪い予後／転帰の結果は、表４に開示されているように、染色強度の発現をマーカーの位置および染色％と組み合わせて考慮した後に、マーカー状態を理想的に示す。
表４Ａに示す良い／悪い転帰のパターンの判定は、前述の例１に開示されたプロセスステップを実施した後の試料における３つの実体、すなわち染色％、染色強度、およびマーカー位置を相関させることによる。
【００７３】
上述のプロセスステップを試験試料に行って得られた結果が、良い転帰に対するマーカー発現結果（表４に開示されたもの）と一致すれば、表１０（患者病歴）の良い転帰を有する患者についての処置モジュールを参照することができて、したがってかかる患者に対する処置戦略は、少ないフォローアップまたはより攻撃的でない処置戦略が必要であろう。しかし、悪い転帰についてのマーカー発現（表４に開示のように）と一致する試料の結果の場合には、かかる患者は、より攻撃的なフォローアップを戦略的な処置モジュールと共に必要とするか、または、その発現を低減するための、これらのマーカーの組み合わせ（ここでは、ＡＰＣとＢカテニン）に特異的な抗体を開発および投与することを本質的に含み得る、代替的な処置のアプローチを用いるかこれを考慮することが必要である。
【００７４】
さらに留意すべきは、ＥＲ／ＰＲ状態にわたる良い転帰は組み合わせられないことである。前述のように、典型的に＋／＋の患者は良好な予後のケースと考えられ、したがって攻撃的に処置する必要はない。典型的に＋／＋の患者に対するフォローアップは６〜１２月に１回実施することができ、これは＋／＋の悪い転帰の群に対しては長すぎる。したがって前述の転帰の解釈の場合に、中間再発と呼ばれる２度のフォローアップの中間での癌の再発を低減するより頻繁なフォローアップを、特に＋／＋の悪い転帰のケース／患者に対して推論することができる。一方−／−の癌は攻撃的な癌であり、そのため良い転帰の患者は攻撃的に処置する必要はない。一方で悪い転帰の−／−患者は、より詳細で効果的かつ革新的なフォローアップを受けて転移をできるだけ早くとらえ、処置を開始することができる。
【００７５】
【表５−１】
2014515821.tif 000016
【００７６】
【表５−２】
2014515821.tif 000017
【００７７】
【表６−１】
2014515821.tif 000018
【００７８】
【表６−２】
2014515821.tif 000019
【００７９】
【表６Ａ】
2014515821.tif 000020
Ｍ：細胞膜
Ｃ：細胞質
Ｎ：核
ＮＭ：核膜
【００８０】
表６および６Ａの解釈：
患者試料を、ＥＲ＋／ＰＲ＋状態に基づきこれを１つの群とし、ＥＲ−／ＰＲ−状態を別の群として分離する。かかる発現の選択および分離において、試験試料は、表６に示す個別マーカーまたはマーカーの組み合わせ（例えばここに示すように：Ｐカドヘリンのみを考慮する）のどちらかの存在について検査する。
良いおよび悪い予後／転帰の結果は、表６に開示されているように、染色強度の発現をマーカーの位置および染色％と組み合わせて考慮した後に、マーカー状態を理想的に示す。
【００８１】
表６Ａに示す良い／悪い転帰のパターンの判定は、前述の例１に開示されたプロセスステップを実施した後の試料における３つの実体、すなわち染色％、染色強度、およびマーカー位置を相関させることによる。
上述のプロセスステップを試験試料に行って得られた結果が、良い転帰に対するマーカー発現結果（表６に開示されたもの）と一致すれば、表１０（患者病歴）の良い転帰を有する患者についての処置モジュールを参照することができて、したがってかかる患者に対する処置戦略は、少ないフォローアップまたはより攻撃的でない処置戦略が必要であろう。しかし、悪い転帰についてのマーカー発現（表６に開示のように）と一致する試料の結果の場合には、かかる患者は、より攻撃的なフォローアップを戦略的な処置モジュールと共に必要とするか、または、その発現を低減するための、これらのマーカーの組み合わせ（ここでは、Ｐカドヘリンのみ）に特異的な抗体を開発および投与することを本質的に含み得る、代替的な処置のアプローチを用いるかこれを考慮することが必要である。
【００８２】
世界中でさらに認識されているのは、悪い転帰を有する傾向のある、ＥＲ＋／ＰＲ＋患者のサブセットの存在である。我々の上述の結果は、良いおよび悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ＋／ＰＲ＋の女性を、Ｐカドヘリンの発現に基づいて分離することを可能とする。しかし当業者は上述の結果に基づき、これらの患者を処置する一方法は抗Ｐカドヘリン抗体を処方することであり、それは、Ｐカドヘリンがこれらの患者の細胞膜で高発現されており、長期の疾患なしの生存の希望が持てるからであることを理解できるであろう。一方、悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ−／ＰＲ−の患者においては、Ｐカドヘリンの全体的な低い発現があり、そのためＰカドヘリンに対する抗体はあまり効果がないであろう。それでも、かかる患者を同定し、より標的化された薬物で適切に処置し、頻繁で完全なフォローアップ等を行って、長期の疾患なしの生存を保証することは重要である。類似の戦略を、様々なマーカー発現を有する癌患者の処置に用いることができ、これらのいくつかは以下の表に例示される。
【００８３】
さらに留意すべきは、ＥＲ／ＰＲ状態にわたる良い転帰は組み合わせられないことである。前述のように、典型的に＋／＋の患者は良好な予後のケースと考えられ、したがって攻撃的に処置する必要はない。典型的に＋／＋の患者に対するフォローアップは６〜１２月に１回実施することができ、これは＋／＋の悪い転帰の群に対しては長すぎる。したがって前述の転帰の解釈の場合に、中間再発と呼ばれる２度のフォローアップの中間での癌の再発を低減するより頻繁なフォローアップを、特に＋／＋の悪い転帰のケース／患者に対して推論することができる。一方−／−の癌は攻撃的な癌であり、そのため良い転帰の患者は攻撃的に処置する必要はない。一方で悪い転帰の−／−患者は、より詳細で効果的かつ革新的なフォローアップを受けて転移をできるだけ早くとらえ、処置を開始することができる。
【００８４】
【表７−１】
2014515821.tif 000021
【００８５】
【表７−２】
2014515821.tif 000022
【００８６】
【表７−３】
2014515821.tif 000023
【００８７】
【表７Ａ−１】
2014515821.tif 000024
【００８８】
Ａ／ＣＤ４４の発現は、ＤＣＩＳ辺縁部においてではなく、浸潤辺縁部においてスコア付けされるべきである。
Ｍ：細胞膜
Ｃ：細胞質
Ｎ：核
ＮＭ：核膜
【００８９】
表７および７Ａの解釈：
患者試料を、ＥＲ＋／ＰＲ＋状態に基づきこれを１つの群とし、ＥＲ−／ＰＲ−状態を別の群として分離する。かかる発現の選択および分離において、試験試料は、表７に示す個別マーカーまたはマーカーの組み合わせ（例えばここに示すように：ＣＤ４４と、ＣＤ２４、Ｏｃｔ−４、およびＳｏｘ−２の組み合わせを考慮する）のどちらかの存在について検査する。
良いおよび悪い予後／転帰の結果は、表７に開示されているように、染色強度の発現をマーカーの位置および染色％と組み合わせて考慮した後に、マーカー状態を理想的に示す。
【００９０】
表７Ａに示す良い／悪い転帰のパターンの判定は、前述の例１に開示されたプロセスステップを実施した後の試料における３つの実体、すなわち染色％、染色強度、およびマーカー位置を相関させることによる。留意すべきなのは、浸潤辺縁部におけるマーカーＡの有無を評価することが非常に需要であることである。ＤＣＩＳ病巣を有する腫瘍全体はＡの高発現を有するが、浸潤辺縁部では低い発現か発現がない可能性があり、したがって、この側面は、マーカーＡについての結果解釈に非常に重要である。
【００９１】
上述のプロセスステップを試験試料に行って得られた結果が、良い転帰に対するマーカー発現結果（表７に開示されたもの）と一致すれば、表１０（患者病歴）の良い転帰を有する患者についての処置モジュールを参照することができて、したがってかかる患者に対する処置戦略は、少ないフォローアップまたはより攻撃的でない処置戦略が必要であろう。しかし、悪い転帰についてのマーカー発現（表７に開示のように）と一致する試料の結果の場合には、かかる患者は、より攻撃的なフォローアップを戦略的な処置モジュールと共に必要とするか、または、その発現を低減するための、これらのマーカーの組み合わせ（ここでは、ＣＤ４４と、ＣＤ２４、Ｏｃｔ−４、およびＳｏｘ−２の組み合わせ）に特異的な抗体を開発および投与することを本質的に含み得る、代替的な処置のアプローチを用いるかこれを考慮することが必要である。
【００９２】
世界中でさらに認識されているのは、悪い転帰を有する傾向のある、ＥＲ＋／ＰＲ＋患者のサブセットの存在である。我々の上述の結果は、良いおよび悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ＋／ＰＲ＋の女性を、ＣＤ４４とＣＤ２４の発現に基づいて分離することを可能とする。しかし当業者は上述の結果に基づき、これらの患者を処置する一方法は抗ＣＤ４４抗体を処方することであり、それは、ＣＤ４４がこれらの患者の細胞膜で高発現されており、長期の疾患なしの生存の希望が持てるからであることを理解できるであろう。一方、悪い転帰を有する可能性のあるＥＲ−／ＰＲ−の患者においては、ＣＤ４４の全体的な低い発現があり、そのためＣＤ４４に対する抗体はあまり効果がないであろう。それでも、かかる患者を同定し、より標的化された薬物で適切に処置し、頻繁で完全なフォローアップ等を行って、長期の疾患なしの生存を保証することは重要である。類似の戦略を、様々なマーカー発現を有する癌患者の処置に用いることができ、これらのいくつかは以下の表に例示される。
【００９３】
さらに留意すべきは、ＥＲ／ＰＲ状態にわたる良い転帰は組み合わせられないことである。前述のように、典型的に＋／＋の患者は良好な予後のケースと考えられ、したがって攻撃的に処置する必要はない。典型的に＋／＋の患者に対するフォローアップは６〜１２月に１回実施することができ、これは＋／＋の悪い転帰の群に対しては長すぎる。したがって前述の転帰の解釈の場合に、中間再発と呼ばれる２度のフォローアップの中間での癌の再発を低減するより頻繁なフォローアップを、特に＋／＋の悪い転帰のケース／患者に対して推論することができる。一方−／−の癌は攻撃的な癌であり、そのため良い転帰の患者は攻撃的に処置する必要はない。一方で悪い転帰の−／−患者は、より詳細で効果的かつ革新的なフォローアップを受けて転移をできるだけ早くとらえ、処置を開始することができる。
【００９４】
【表８−１】
2014515821.tif 000025
【００９５】
【表８−２】
2014515821.tif 000026
【００９６】
【表８−３】
2014515821.tif 000027
【００９７】
【表９−１】
2014515821.tif 000028
【００９８】
【表９−２】
2014515821.tif 000029
【００９９】
【表１０−１】
2014515821.tif 000030
【０１００】
【表１０−２】
2014515821.tif 000031
【０１０１】
【表１０−３】
2014515821.tif 000032
【０１０２】
【表１０−４】
2014515821.tif 000033
【０１０３】
【表１０−５】
2014515821.tif 000034
【０１０４】
【表１０−６】
2014515821.tif 000035
【０１０５】
【表１０−７】
2014515821.tif 000036
【０１０６】
【表１０−８】
2014515821.tif 000037
【０１０７】
【表１０−９】
2014515821.tif 000038
【０１０８】
【表１０−１０】
2014515821.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月21日(2013.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の予後診断のための、以下の組み合わせ：
ａ）ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニンからなる生物学的マーカー；または
ｂ）ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４からなる生物学的マーカー；または
ｃ）ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２およびＣＤ１３３からなる生物学的マーカー；または
ｄ）ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＰカドヘリンからなる生物学的マーカー。
【請求項２】
ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニンからなる生物学的マーカーの組み合わせが、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体またはその両方を発現する細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項３】
ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４からなる生物学的マーカーの組み合わせが、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現しない細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項４】
ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、およびＣＤ１３３からなる生物学的マーカーの組み合わせが、ヒト上皮細胞成長因子受容体２、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現しない細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項５】
ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＰカドヘリンからなる生物学的マーカーの組み合わせが、ヒト上皮細胞成長因子受容体２を発現し、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現しない細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項６】
マーカーが、細胞膜、細胞質、核、および核膜またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される位置における、対象の腫瘍細胞上に位置する、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項７】
乳癌を有するかまたは乳癌を有することが疑われる対象の予後診断のためのキットであって、以下の組み合わせ：
ａ）ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニンからなる生物学的マーカー；または
ｂ）ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４からなる生物学的マーカー；または
ｃ）ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、およびＣＤ１３３からなる生物学的マーカー；または
ｄ）ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＰカドヘリンからなる生物学的マーカー、
に対する抗体を、任意に、有機溶媒、試薬、二次抗体、免疫組織化学の実施用の酵素、および取扱説明書と共に含む、前記キット。
【請求項８】
乳癌を有するかまたは有することが疑われる対象の生物学的試料中の細胞上の生物学的マーカーを同定する方法であって、以下の行為：
ａ）生物学的試料を、収集し、固定し、切片化し、有機溶媒を用いて処理すること、次いで、所定の試料希釈液を用いて、以下の組み合わせ：
ｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニンからなる生物学的マーカー；または
ｉｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４からなる生物学的マーカー；または
ｉｉｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、およびＣＤ１３３からなる生物学的マーカー；または
ｉｖ．ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＰカドヘリンからなる生物学的マーカー、
に対する一次抗体を加えることにより、抗原回復すること；および
ｂ）生物学的マーカーを同定するために、酵素と結合した二次抗体および着色反応物または蛍光を得るための試薬を加えること、
を含む、前記方法。
【請求項９】
有機溶媒が、アルコールおよびキシレンまたはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項７に記載のキットまたは請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニンからなる生物学的マーカーの組み合わせが、エストロゲン受容体またはプロゲステロン受容体またはその両方を発現する細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項７に記載のキットまたは請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４からなる生物学的マーカーの組み合わせが、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現しない細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項７に記載のキットまたは請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、およびＣＤ１３３からなる生物学的マーカーの組み合わせが、ヒト上皮細胞成長因子受容体２、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現しない細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項７に記載のキットまたは請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＰカドヘリンからなる生物学的マーカーの組み合わせが、ヒト上皮細胞成長因子受容体２を発現し、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現しない細胞を有する対象における、乳癌の予後を診断する、請求項７に記載のキットまたは請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
収集、固定、切片化および処理を、所定の条件下で従来の免疫組織化学的技術により実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
乳癌を有するかまたは乳癌を有することが疑われる対象の予後診断のためのキットであって、
ａ）ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、βカテニン、ＡＢＣＧ２およびＣＤ１３３、および任意にＯｃｔ−４からなる群から選択される少なくとも３つの生物学的マーカーの組み合わせに対する抗体；および
ｂ）任意に、有機溶媒、試薬、二次抗体、免疫組織化学の実施用の酵素、および取扱説明書を含む、前記キット。
【請求項１６】
乳癌を有するかまたは乳癌を有することが疑われる対象の予後診断の方法であって、以下の行為：
ａ）対象から生物学的試料を収集し、試料の細胞における、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびヒト上皮細胞成長因子受容体２受容体またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される受容体の、発現または不在を同定して、発現が同定された細胞を得ること；
ｂ）ステップ（ａ）の細胞上で、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＣ４、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ−４、Ｐカドヘリンおよびβカテニンからなる群から選択される生物学的マーカーに対する抗体を用いて、免疫組織化学分析を実施すること；および
ｃ）試料の細胞における受容体および生物学的マーカーの発現または不在を同定し、該マーカーの同定を、以下にそれぞれ示す予測転帰参照表Ｎｏ．１１、１２、１３、１４、１５および１６に基づく対応する転帰と相関させて、対象の予後を予測すること：
【表１１】
2014515821.tif 000040
【表１２】
2014515821.tif 000041
【表１３】
2014515821.tif 000042
【表１４】
2014515821.tif 000043
【表１５】
2014515821.tif 000044
【表１６】
2014515821.tif 000045
表中、低発現は、０〜４０％の間の細胞染色強度パーセントを、および高発現は、４０％を超えて１００％までの細胞染色強度パーセントを表す、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
乳癌を有するかまたは乳癌を有することが疑われる対象の予後診断の方法であって、以下の行為：
ａ）対象から生物学的試料を収集し、試料の細胞における、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびヒト上皮細胞成長因子受容体２受容体またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される受容体の、発現または不在を同定して、発現が同定された細胞を得ること；
ｂ）ステップ（ａ）の細胞上で、以下の組み合わせ：
ｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニンからなる生物学的マーカー；または
ｉｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４からなる生物学的マーカー；または
ｉｉｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、およびＣＤ１３３からなる生物学的マーカー；または
ｉｖ．ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＰカドヘリンからなる生物学的マーカー、
に対する抗体を用いて、免疫組織化学分析を実施すること；および
ｃ）試料の細胞における受容体および生物学的マーカーの発現または不在を同定し、該マーカーの同定を、予測転帰参照表Ｎｏ．１１、１２、１３、１４、１５および１６の組合せに基づく対応する転帰と相関させて、対象の予後を予測すること、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
免疫組織化学分析が従来法により実施され、マーカーの同定が、試料からの細胞の染色によって該方法の完了時に得られる着色反応物または蛍光を視覚化することにより行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
相関させることが、染色のパーセント、染色強度および染色位置またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるパラメータに基づき；および、前記染色の位置が、細胞膜、細胞質、核および核膜またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
相関させることが、染色のパーセントを染色強度に乗じて予測スコアを算出することを含むか、または、相関させることが、染色された細胞のパーセントに基づいて実施され、こうして生物学的マーカーの発現の位置に応じて予後が良いか悪いかを予測する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
乳癌を処置する方法であって、以下の行為：
ａ）生物学的試料中の腫瘍細胞上の生物学的マーカーの組み合わせを同定し、乳癌を有するかまたは乳癌を有することが疑われる対象の予後を予測すること；および
ｂ）この予測に基づき、乳癌の抑制のための癌治療を設計すること；
ここで、生物学的マーカーの組み合わせは：
ｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＣ４、Ｐカドヘリン、およびβカテニン；または
ｉｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１３３およびＰカドヘリン、および任意にＯｃｔ−４；または
ｉｉｉ．ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、およびＣＤ１３３；または
ｉｖ．ＣＤ４４、ＣＤ１３３、およびＰカドヘリン、である、
を含む、前記方法。
【国際調査報告】
2014515821.tif 000046
2014515821.tif 000047
2014515821.tif 000048