(57)【要約】本発明は、ナノ粒子アセンブリー、ならびに、局所的あるいは皮膚に施用するための、ナノ粒子およびこのようなナノ粒子を含む組成物を調製する方法を包含する。本発明は、このように得られた本発明のナノ粒子を送達デバイスとして使用して、様々な分子実体および細胞実体をナノ粒子に複合体化する方法をさらに包含する。ナノ粒子は、種々の用途、例えば、がんの治療、腫瘍ターゲティング、薬物の毒性のインビボでの低減、複合体化剤の有効性のインビボでの増加、複合体化剤の分解からの保護、薬物の皮膚への浸透及び保持の増加、および薬物または他の薬剤の水溶性の増強のために使用することができる。
2014515007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロラミンタンパク質、カーゴもしくはカーゴ分子、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および任意選択でリン脂質、少なくとも１種のタンパク質ポリマー、少なくとも１種の多糖類、または少なくとも１種の合成ポリマーを含み、生分解性、生体適合性、および非免疫原性であり、直径が、約４００ｎｍ未満である、ナノ粒子。
【請求項２】
前記プロラミンタンパク質が、白色ゼイン、黄色ゼイン、グリアジン、ホルデイン、またはカフィリンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記カーゴまたはカーゴ分子が、医薬品材料、治療材料、化粧品材料、診断薬、農業材料、免疫強化剤、生物活性剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記カーゴ分子が、レチノール、１３−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（トレチノイン）、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸（イソトレチノイン）、９−ｃｉｓ−レチノイン酸（アリトレチノイン）、レチンアルデヒド、エトレチネート、アシトレチン、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、およびこれらの組合せからなる群から選択されるレチノイドであり、前記ナノ粒子が、リン脂質およびポロキサマー非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記レチノイドが、（Ｃ２〜Ｃ２２）カルボン酸でエステル化したレチノールを含む、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記レチノイドが、酢酸レチニルまたはパルミチン酸レチニルである、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記レチノイドが、直鎖または分岐状（Ｃ１〜Ｃ２２）アルコールでエステル化したレチノイン酸を含む、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子中の前記レチノイドが、前記ナノ粒子中の前記プロラミンの約０．０１重量％〜約０．３重量％である、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記カーゴ分子が、５−フルオロウラシルである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記カーゴが、細胞、タンパク質、核酸、抗体、増殖因子、またはこれらの組合せである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記カーゴが、多血小板血漿であり、前記カーゴが、前記ナノ粒子の表面に吸着されている、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記カーゴが、抗体である、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
架橋されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記ナノ粒子の前記プロラミンタンパク質が、ＰＥＧ化されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記ＰＥＧ化が、約３ｋＤａ〜約２２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧでＰＥＧ化することを含む、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ化が、約４ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧでＰＥＧ化することを含む、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
１種もしくは複数のさらなる生物活性剤、診断薬、造影剤、またはこれらの組合せをさらにカプセル化する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
乾燥した易流動性の無色または白色の非吸湿性粉末の形態である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
レチノイドおよび医薬品としてもしくは化粧品として許容される組成物を形成するための賦形剤、添加剤、または担体をさらに含む、請求項１８に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記組成物が、分散液、エアゾール製剤、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、またはシャンプーの形態である、請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
局所製剤の形態である、請求項１９に記載の医薬品または化粧品組成物。
【請求項２２】
前記ナノ粒子の多分散性指数が、約０．２〜約０．５である、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ナノ粒子が、カプセル化されたレチノイドの安定性を増強させる、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ナノ粒子が、哺乳動物の皮膚と接触したときに、前記ナノ粒子の非存在下での哺乳動物の皮膚への前記レチノイドの投与と比較して、前記レチノイドによるより大きな皮膚浸透および保持をもたらす、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記製剤が、ヒトの皮膚に非ナノ粒子製剤中で投与される同じ量の前記レチノイドよりも、ヒトの皮膚に対する刺激性が弱い、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
皮膚疾患または皮膚状態の治療のための医薬を生成するための、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
前記疾患または状態が、ざ瘡、乾癬、角化障害、皮膚変色、または皮膚の悪性腫瘍（皮膚がんもしくは黒色腫）を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記治療が、しわ、光による老化、セリュライトを低減させ、または開放創を治癒させる、請求項２６または２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記組成物が、前記レチノイドの長期放出を実現する、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドをカプセル化して、それによって前記レチノイドの化学的安定性を増強させることを含む、レチノイドの化学的安定性を増強させる方法。
【請求項３１】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドを配合することを含む、レチノイドの保存寿命を増加させる方法。
【請求項３２】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドをカプセル化して、それによって前記レチノイドの水溶性を増強させることを含む、レチノイドの水分散性を増強させる方法。
【請求項３３】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドをカプセル化することを含む、組成物からのレチノイドの持続放出を実現する方法であって、前記カプセル化したレチノイドを使用して医薬を生成し、前記レチノイドは、約１時間〜約１４日の期間にわたり前記ナノ粒子から放出される、方法。
【請求項３４】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドをカプセル化することを含む、レチノイドの皮膚浸透を増加させる方法であって、前記カプセル化したレチノイドを使用して、前記ナノ粒子の非存在下での前記レチノイドの皮膚浸透と比較して、前記レチノイドの皮膚浸透を増加させる医薬を生成する、方法。
【請求項３５】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中に薬物をカプセル化することを含む、腫瘍における薬物の蓄積を増強させる方法であって、前記カプセル化した薬物を使用して、医薬を生成し、前記薬物が、前記ナノ粒子の非存在下での腫瘍における蓄積と比較して、腫瘍においてより大きい程度に蓄積し、前記腫瘍が、皮膚がん腫瘍であり、投与が、局所である、方法。
【請求項３６】
請求項１から８または２１から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドをカプセル化することを含む、腫瘍を担持していない組織における薬物の蓄積を低減させる方法でであって、前記カプセル化したレチノイドを使用して、局所医薬を生成し、薬物が、前記ナノ粒子の非存在下より、腫瘍を担持していない組織においてより少ない程度に蓄積する、方法。
【請求項３７】
請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載のナノ粒子中にレチノイドをカプセル化することを含む、レチノイドの毒性を低減させる方法であって、前記カプセル化したレチノイドを使用して、前記ナノ粒子の非存在下での前記レチノイドの毒性と比較して、前記レチノイドの毒性が低減するような医薬を生成する、方法。
【請求項３８】
複数の請求項１から８または１９から２９のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子をカプセル化することを含む、局所的に施用したレチノイドの皮膚刺激レーティングを低減させる方法であって、前記カプセル化したレチノイドを使用して、医薬を生成し、前記レチノイドの刺激レーティングが、前記ナノ粒子の非存在下での前記レチノイドと比較して、低減または除去される、方法。
【請求項３９】
プロラミンタンパク質を、水性アルコール溶媒および緩衝液、有機溶媒、またはアニオン性界面活性剤および緩衝液に溶解し、沈殿物を形成させ、前記緩衝液は、クエン酸アニオンおよび少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、少なくとも１種のリン脂質、リンタンパク質、少なくとも１種の多糖類、リンタンパク質−多糖類コンジュゲート、少なくとも１種の合成ポリマー、またはこれらの組合せを含むことと、
前記沈殿物を超音波処理することと、
残りの水相を遠心分離して、ペレットを形成させることと、
前記ペレットから水性分散液を形成させ、凍結防止剤を任意選択で加えることと、
前記分散液を凍結乾燥させることと
を含み、
このように得られたナノ粒子が、約１００ｎｍ未満〜約２２５ｎｍの粒径を有する、ナノ粒子を調製する方法。
【請求項４０】
前記溶解ステップが、前記プロラミンタンパク質を、水性アルコール溶媒およびクエン酸アニオン含有緩衝液に溶解することを含み、前記リンタンパク質が、β−カゼインであり、前記多糖類が、デキストランまたはアラビアゴムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記溶解ステップが、前記プロラミンタンパク質を、水性アルコール溶媒およびクエン酸アニオン含有緩衝液に溶解することを含み、前記リンタンパク質−多糖類コンジュゲートが、デキストランにコンジュゲートしたβ−カゼインである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記溶解ステップが、前記プロラミンタンパク質を、アニオン性界面活性剤およびクエン酸アニオン含有緩衝液に溶解することを含み、前記アニオン性界面活性剤が、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｎ−ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、前記緩衝液が、非イオン性界面活性剤およびリン脂質を含み、前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびこれらの組合せからなる群から選択され、前記リン脂質が、卵レシチン、ダイズレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記リン脂質が、カゼインまたは１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンで置換されていてもよい、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記溶解ステップの間にカーゴまたはカーゴ分子をカプセル化することをさらに含み、前記カーゴ分子が、治療材料、化粧品材料、診断薬、農業材料、免疫強化剤、生物活性剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ナノ粒子の表面へカーゴまたはカーゴ分子を吸着させることをさらに含み、前記カーゴまたはカーゴ分子を、前記プロラミンタンパク質、クエン酸アニオン含有緩衝液、および少なくとも１種のアニオン性界面活性剤と混合し、前記緩衝液が、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤および少なくとも１種のリン脂質またはリンタンパク質を含み、前記超音波処理ステップの後に前記ナノ粒子を水溶液に対して透析することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記カーゴまたはカーゴ分子が、タンパク質または細胞の混合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記カーゴが、多血小板血漿（ＰＲＰ）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記プロラミンタンパク質が、黄色ゼイン、白色ゼイン、グリアジン、ホルデイン、またはカフィリンを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記カーゴ分子が、レチノール、１３−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（トレチノイン）、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸（イソトレチノイン）、９−ｃｉｓ−レチノイン酸（アリトレチノイン）、レチンアルデヒド、エトレチネート、アシトレチン、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、およびこれらの組合せからなる群から選択されるレチノイドであり、前記ナノ粒子が、リン脂質およびポロキサマー非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
このように得られたナノ粒子が、乾燥した易流動性の無色または白色の非吸湿性粉末である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般的に、薬物送達技術に関し、さらに具体的には疎水性水不溶性タンパク質を使用してナノ粒子薬物送達システムを調製する方法を含めたナノ粒子薬物送達システムに関し、このナノ粒子は、局所薬物送達システムを生じさせるプロラミンを含み得る。
【背景技術】
【０００２】
トウモロコシまたはモロコシから単離することができる植物タンパク質であるゼインは、多量の非極性アミノ酸、例えば、プロリン、グルタミンおよびアスパラギンからなるプロラミンのファミリーに属する。ゼインは、無臭、無毒性、生分解性および水不溶性であり、したがって、多くの用途のための魅力的な構成要素である。
【０００３】
ゼインは、医薬品、医療、食品、化粧品、接着剤および包装産業において、ポリマーとして調査または使用されてきた。食品および医薬品産業において、ゼインは、例えば、材料をフィルムコーティングし、微粒子またはナノ粒子などの粒子系を形成させるために使用されてきた（米国特許第５，６７９，３７７号（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら）、その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（２００５）１０９〜１１５；Ｌｏｐｅｚ  ａｎｄ  Ｍｕｒｄａｎ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ２３（２００６）３０３〜３１４；Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３（２００８）１８６〜１９０；Ｐａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３（２００５）４７８８〜４７９２）。
【０００４】
ゼイン粒子を形成する様々な方法が提案されてきた。例えば、米国特許第５，３３０，７７８号（Ｓｔａｒｋ；その内容全体は参照により本明細書中に組み込まれている）は、ｐＨの変化を使用してゼイン微粒子を形成する、ゼインを使用して微粒子を調製する方法を記載している。しかし、この方法は、より大きなミクロンサイズおよび広い粒径分布を有するゼイン粒子を生成し、これは、例えば、インビボの使用のためにはかなりの欠点を有する。ヒトまたは動物への用途のために使用される生体材料は、安全で、非免疫原性である必要がある。一般に、粒子のインビボでの投与（例えば、体への導入）の際、免疫学的認識および外来粒子の除去に関与する、血液および組織中の食細胞は、粒子の物理化学的特性に応じて免疫応答を開始することができる。食細胞による取込みは、外来粒子の粒径および表面の疎水性の両方によって決まる。直径が約５００ｎｍを超える粒子は、食作用を非常に受けやすい。さらに、疎水性表面を有する粒子は、食細胞によって容易に認識される。例えば、ＬｏｐｅｚおよびＭｕｒｄａｎは、１．３６±０．０３６μｍの直径を有するゼインミクロスフィアが免疫原性であり、結果的に、薬物、ワクチンまたは他の治療担体として適していないことを報告した（Ｌｏｐｅｚ  ａｎｄ  Ｍｕｒｄａｎ，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８（２００６）７６９〜７７４）
【０００５】
したがって、粒子を治療および化粧品用途のために有用なものとするゼイン粒子を調製するための新規な方法が必要とされている。皮膚浸透、保持、安定性、皮膚刺激、および毛包ターゲティングと関連する問題を克服するために、また必要とされているのは、安全で、有効な様式で、重要な治療剤および化粧剤を送達するための新規な治療担体である。
【発明の概要】
【０００６】
本出願人等は、新規なプロラミンをベースとするレチノールのナノ微粒子局所製剤および関連する化合物を開発した。ナノ粒子は、プロラミンタンパク質、例えば、タンパク質由来疎水性植物タンパク質であるゼインを使用して開発した。ゼインは皮膚のケラチンと同様の特徴を有するため、ゼインをモデルタンパク質として使用して、局所製剤において使用する添加剤の皮膚刺激を試験する（ゼイン試験）。ゼインナノ担体は、皮膚のケラチンへのその類似性のため、例えば、皮膚への施用による疎水性および親水性化合物のための優れた送達ビヒクルである。
【０００７】
したがって、本発明は、プロラミンタンパク質および治療剤または化粧剤を含むナノ粒子を提供し、ナノ粒子は、生分解性、生体適合性、および非免疫原性であり、治療剤または化粧剤は、レチノイドまたはそのエステルであり、ナノ粒子の直径は、約４００ｎｍ未満である。プロラミンタンパク質は、ゼイン、グリアジン、ホルデイン、カフィリン、またはこれらの組合せでよい。一実施形態において、プロラミンタンパク質は、白色ゼインである。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、親水性または疎水性化合物をカプセル化することができる。他の実施形態において、ナノ粒子は、レチノイドをカプセル化し得る。
【０００８】
レチノイドは、例えば、レチノール、１３−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（トレチノイン）、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸（イソトレチノイン）、９−ｃｉｓ−レチノイン酸（アリトレチノイン）、レチンアルデヒド、エトレチネート、アシトレチン、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、またはこれらの組合せでよい。例えば、レチノイドは、（Ｃ２〜Ｃ２２）カルボン酸または脂肪酸でエステル化したレチノール、例えば、酢酸レチニルまたはパルミチン酸レチニルを含むことができる。レチノイドはまた、直鎖または分岐状（Ｃ１〜Ｃ２２）アルコールでエステル化したレチノイン酸でよい。
【０００９】
ナノ粒子中のレチノイドは、ナノ粒子のプロラミンの約０．０１重量％〜約０．３重量％でよい。ナノ粒子の直径は、約７５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２８０ｎｍ、または約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍでよい。
【００１０】
ナノ粒子の表面は、架橋することができ、かつ／またはナノ粒子のプロラミンタンパク質はＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化は、約３ｋＤａ〜約２２０ｋＤａ、または約４ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧによりＰＥＧ化することを含むことができる。
【００１１】
実施形態において、ナノ粒子は、これらに限定されないが、デキストラン、β−カゼイン、およびアラビアゴムを含めた他のポリマーに複合体化し得る。
【００１２】
ナノ粒子は、１種または複数のさらなる活性剤、診断薬、造影剤、またはこれらの組合せをカプセル化またはその表面上に吸着させることができる。活性剤は、抗酸化剤、抗炎症剤、抗がん薬、またはフリーラジカル捕捉剤でよい。
【００１３】
ナノ粒子を調製するときに使用する界面活性剤とリン脂質の比は、プロラミンナノ粒子の安定化にかなり影響を与え、凝集を防止することができる。さらに、リン脂質およびプルロニックはまた、プロラミンナノ粒子の皮膚浸透を増加させる浸透増強剤として作用することができる。さらに、ナノ粒子を調製するときに使用するＢＨＴまたは他の抗酸化剤の濃度は、ナノ粒子の安定化にかなり影響することがあり、ＢＨＴまたは他の抗酸化剤は、ナノ粒子内および／またはナノ粒子表面上に位置することができる。
【００１４】
本発明はまた、本明細書に記載の複数のナノ粒子を含む組成物を提供し、組成物は、乾燥した易流動性の無色または白色の非吸湿性粉末の形態である。本発明は、本明細書に記載の複数のナノ粒子、および医薬品としてもしくは化粧品として許容される賦形剤、添加剤、または担体を含む、医薬品または化粧品組成物をさらに提供する。医薬品または化粧品組成物は、例えば、分散液、エアゾール製剤、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、またはシャンプーの形態でよい。いくつかの実施形態において、医薬品または化粧品組成物は、水で除去可能な製剤の形態でよい。
【００１５】
ナノ粒子の多分散性指数は、約０．２〜約０．５でよい。ナノ粒子は、カプセル化したレチノイドまたは他のカプセル化した薬剤の安定性を増強することができる。
【００１６】
組成物は、哺乳動物の皮膚と接触したときに、ナノ粒子の非存在下での哺乳動物の皮膚へのレチノイドの投与と比較して、レチノイドによるより大きな皮膚浸透および保持をもたらすことができる。ナノ粒子の製剤は、非ナノ粒子製剤中でヒトの皮膚に投与される同量のレチノイドより、ヒトの皮膚に対する刺激性を弱くすることができる。
【００１７】
本発明はまた、皮膚疾患または皮膚状態に罹患している対象に、医薬品としてまたは化粧品として有効量の本明細書に記載されているナノ粒子組成物を投与して、それによって疾患または状態を治療することを含む、対象に治療剤を投与する方法を提供する。本明細書に記載されている組成物で治療することができる疾患または状態には、ざ瘡、乾癬、角化障害、皮膚変色、ならびに皮膚の悪性腫瘍（皮膚がんおよび黒色腫）が含まれる。またナノ粒子組成物を使用して、創傷治癒を促進し、しわの出現、セリュライト、および／または光による老化の作用を低減させることができる。組成物は、例えば、１日または数日（例えば、１週間）にわたるレチノイドの長期放出を実現することができる。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化して、それによってレチノイドの化学的安定性を増強することを含む、レチノイドの化学的安定性を増強する方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中に配合することを含む、レチノイドの保存寿命を増加させる方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化して、それによってレチノイドの水分散性を増強することを含む、レチノイドの水溶性を増強する方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化して、それによってレチノイドの水分散性を増強することを含む、レチノイドの水分散性を増強する方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化し、哺乳動物の皮膚とカプセル化した化合物とを接触させることを含む、組成物からのレチノイドの持続放出を実現する方法であって、レチノイドは、約１時間〜約１４日の期間にわたりナノ粒子から放出される、方法を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、対象または試料と、本明細書に記載のナノ粒子または本明細書に記載の組成物とを接触させて、それによって対象または試料に非免疫原性および生体適合性の製剤を提供することを含む、それを必要としている対象または試料に、非免疫原性および生体適合性の製剤中でレチノイドを投与する方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化し、哺乳動物の皮膚とナノ粒子を含む組成物とを接触させて、それによって、ナノ粒子の非存在下でのレチノイドの皮膚浸透と比較して、レチノイドの皮膚浸透を増加させることを含む、レチノイドの皮膚浸透を増加させる方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化し（例えば、皮膚の腫瘍）、それを必要としている対象に複数のナノ粒子を投与することを含む、薬物の蓄積を増強する方法であって、カプセル化した薬物は、ナノ粒子の非存在下で対象に投与された薬物より、腫瘍においてより大きな程度で蓄積し、腫瘍は皮膚がん腫瘍であり、投与は局所である。一実施形態において、治療剤（例えば、細胞、抗体、ホルモン、タンパク質、ペプチド、増殖因子、核酸など）は、ナノ粒子の表面に吸着、複合体化またはコンジュゲートさせることができる、方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、薬物を本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化し、皮膚がん腫瘍を有する対象に複数のナノ粒子を投与することを含む、哺乳動物において腫瘍を担持していない組織における薬物の蓄積を低減させる方法であって、投与は局所であり、カプセル化した治療剤は、ナノ粒子の非存在下で対象に投与された治療剤よりより少ない程度で腫瘍を担持していない組織において蓄積する、方法を提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、複数の本明細書に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む、治療剤（例えば、レチノイド）の治療または化粧品としての有効性を増加させる方法であって、ナノ粒子の非存在下での治療剤の投与と比較して、治療剤の有効性は増加する、方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の複数のナノ粒子を対象に投与することを含む、治療剤の毒性を低減させる方法であって、ナノ粒子の非存在下で投与された治療剤の毒性と比較して、治療剤の毒性が低減する、方法を提供する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の複数のナノ粒子を対象に投与することを含む、局所的に施用したレチノイドの皮膚刺激レーティングを低減させる方法であって、ナノ粒子の非存在下でのレチノイドの投与と比較して、レチノイドの皮膚刺激レーティングは低減する、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
下記の図は明細書の部分を形成し、本発明の特定の実施形態または様々な態様をさらに示すために含まれる。場合によって、本発明の実施形態は、本明細書において示される詳細な記載と組み合わせて添付図面を参照することによって最も理解できる。記載および添付図面は、本発明の特定の具体例、または特定の態様を強調し得るが、当業者は、実施例または態様の一部を本発明の他の実施例または態様と組み合わせて使用し得ることを理解するだろう。
【００３１】
【図１】フローチャートによって、一実施形態による、ブランクゼインナノ粒子を形成させる一般ステップを例示する。これおよび他の図において記載した特定の量は、特定の実施形態の例示のためであり、当業者が容易に認識するように、多くの変形を、本明細書に記載されている手順に適用することができる。
【図２】フローチャートによって、一実施形態による、６，７ヒドロキシクマリンを充填したナノ粒子を形成させるステップを例示する。
【図３】一実施形態による、ｐＨを制御したナノ沈殿を使用したβ−カゼインおよびアラビアゴムにより安定化したゼインナノ粒子の調製のためのステップを例示する。
【図４】一実施形態による、β−カゼイングラフトデキストランにより安定化したゼインナノ粒子の調製のためのステップを例示する。
【図５】ゼインナノ粒子の様々な電子顕微鏡写真を示す。図５（ａ）は、ブランクゼインナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。粒子は、球状であり、滑らかな表面を有することが示される（スケールは、１ｍｍ＝１．７６μｍを表す）。  図５ｂはブランクゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である（スケールは、１ｍｍ＝８．０３８ｎｍを表す）。  図５ｃはクマリンを充填したゼインナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である（スケールは、１ｍｍ＝０．８７μｍを表す）。  図５ｄは６，７−ヒドロキシクマリンを充填したゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である（スケールは、１ｍｍ＝８．０４ｎｍを表す）。
【図６】空気中のタッピングモードにおけるブランクゼインナノ粒子の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。左から右は、代表的な試料の高さ（図６（ａ））、振幅（図６（ｂ））、および位相画像（図６（ｃ））であり、それぞれ、１４．１９ｎｍのｚ−スケール、２２．２Ｖ、および４５°である。スキャンサイズは、１．１４×１．１４ｇｍである。ＡＦＭで測定した５０個の粒子の平均粒径は、１８５ｎｍである。
【図７】凍結乾燥の前および後の、一実施形態によるクマリンを充填したゼインナノ粒子の粒径に対する緩衝液のタイプの影響を例示するグラフである。沈殿法におけるクエン酸緩衝液の使用は、リン酸緩衝液の使用と比較して、凍結乾燥に続いてより小さなサイズのナノ粒子を一貫して生成した（＊ｐ＜０．０５）。グラフ上の各点は、平均±ＳＤを表す（ｎ＝３）。クエン酸緩衝液は、脱イオン水中のクエン酸（０．０１５３ｇ／Ｌ）およびクエン酸ナトリウム（２．９１ｇ／Ｌ）からなった。リン酸緩衝液は、脱イオン水中のリン酸水素二ナトリウム（１．４４ｇ／Ｌ）、リン酸二水素カリウム（０．２５ｇ／Ｌ）および塩化ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）からなった。両方の緩衝液を使用して、第２の水相をｐＨ７．４に維持した。
【図８】リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中の６，７−ヒドロキシクマリンを充填したゼインナノ粒子のインビトロの放出プロファイルを例示する。実施例２において記載した方法によって調製したクマリンを充填したゼインナノ粒子（１０ｍｇ／ｍＬ）を、透析膜（ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ（商標）、分子量５０００Ｄａ）中に入れ、トリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ）の非存在下（非酵素的）、または存在下（酵素的）で、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。エタノール（２０％ｖ／ｖ）を培地に加えシンク条件を維持し、アジ化ナトリウム（０．００５％ｗ／ｖ）を抗菌剤として使用した。溶液を水平シェーカー水浴中で５０ｒｐｍにて３７℃に維持した。一定分量（１ｍＬ）の透析液を７日間の異なる時点において除去し、新鮮な培地と置き換えて、シンク条件を維持した。透析液を、分光蛍光分析（λｍａｘ＝４９０ｎｍ；λｃｍ＝５２０ｎｍ）を使用してゼインナノ粒子から放出されるクマリンについて分析した。各データ点は、３つの実験の平均である（±ＳＤ）。全ての時点において、酵素的放出は、非酵素的放出と比較してより高かった（ｐ＜０．０５）。
【図９】ブタ多形核細胞によるゼインナノ粒子の取込みに対する粒径の影響を例示する。図は、ゼイン粒子および陽性対照ザイモサンの存在下でのルミノール化学発光（９０分にわたる）についての曲線下面積パーセントを示す。各実験は、４つの実験の平均である（±ＳＥＭ）。取込みは、他の群と比較して、より小さな粒子において有意により低い（ｐ＜０．０５）。
【図１０】それぞれ、ゼイン粒子の一次および追加の皮下注射の３週間および５週間後に測定した、抗ゼイン抗体（光学密度）を例示する。各値は、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝４）。一次および追加の力価の両方は、食塩水群と比較して、統計学的に有意性がなかった（ｐ＞０．０５）。粗いゼイン懸濁液、または食塩水中のゼイン粒子（１００μｇ／５０μＬと同等である）を、雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に注射した。血液を眼窩静脈叢から採取し、希釈した血清（１／１６）中の抗ゼイン抗体レベルを、マウスＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。
【図１１】ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用した処理の４時間後のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼの相対的活性として表した、ブタ腸上皮細胞（ＩＰＥＣ−Ｊ２細胞）（２０，０００細胞／ウェル）の細胞生存率に対する、黄色ゼイン（Ｙ）および白色ゼイン（Ｗ）の影響を例示するグラフである。処理なしのプレートを対照として使用して、１００％生存可能であると見なした。ゼイン粉末を５５％ｖ／ｖエタノールに溶解し、無血清培地中の５ｍｇ／ｍＬのストックからそれに続く希釈を行った。全ての濃度において、黄色および白色ゼインの両方は、処理なしの対照から有意に異ならない（＊ｐ＜０．０５）。各データ点は、３つの実験の平均±ＳＥＭである。
【図１２】フローチャートによって、一実施形態による、架橋ブランクゼインナノ粒子を調製する方法を例示する。
【図１３】２４時間の、架橋剤に応じたゼインナノ粒子の架橋の程度を示すグラフである。架橋の程度は、ＴＮＢＳアッセイを使用して決定した。使用した架橋剤は、グルタルアルデヒド（ＧＴＡ）（５００μＬのストック溶液（２５％ｗ／ｖ））、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）（０．６％ｗ／ｖ）、およびＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）（０．６％ｗ／ｖ）であった。使用したゲニピンの濃度は、０．０５％ｗ／ｖであった。「ブランク」は、架橋剤を有さないゼインナノ粒子を表す。データは、２つの実験の平均である。
【図１４】フローチャートによって、一実施形態による、ローダミン−１２３を充填した架橋ゼインナノ粒子を調製する方法を例示する。
【図１５】クエン酸緩衝液（ｐＨ２）中のゼインナノ粒子からのローダミン−１２３のインビトロの放出プロファイルを例示する。結果は、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４）。ＮＣＳ＝非架橋粒子；ＣＳ＝架橋粒子。架橋ナノ粒子からのローダミンの放出は、非架橋ナノ粒子より有意に低かった（ｐ＞０．０５）。本明細書に記載の方法により調製したローダミンを充填したゼインナノ粒子（２０ｍｇ）を、透析膜（ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ（商標）、分子量１０，０００Ｄａ）中に入れ、１０ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ２）中でインキュベートした。溶液を、水平シェーカー水浴中で１００ｒｐｍにて３７℃に維持した。一定分量（１ｍＬ）の透析液を、４８時間にわたり異なる時点において除去し、新鮮な培地と置き換えて、シンク条件を維持した。透析液を、分光蛍光分析（λｍａｘ＝４８５ｎｍ；λｃｍ＝５３０ｎｍ）を使用して、ゼインナノ粒子からのローダミンの放出について分析した（＊は、差異が、ｐ＜０．０５で有意であることを示す）。
【図１６】ｐＨ２にてペプシンの存在下でのゼインナノ粒子からのローダミン−１２３のインビトロの放出プロファイルを例示する。結果は、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４）。ＮＣＳ＝非架橋粒子；ＣＳ＝架橋粒子。架橋ナノ粒子からの薬物放出は、非架橋ナノ粒子より有意に低かった（ｐ＞０．０５）。本明細書に記載の方法によって調製したローダミン−１２３を充填したゼインナノ粒子（２０ｍｇ）を、透析膜（ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ（商標）、分子量１０，０００Ｄａ）中に入れ、３．２ｍｇ／ｍＬのペプシンを含有する１０ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ２）中でインキュベートした。溶液を、水平シェーカー水浴中で１００ｒｐｍにて３７℃に維持した。一定分量（１ｍＬ）の透析液を、４８時間にわたり異なる時点において除去し、新鮮な培地と置き換えて、シンク条件を維持した。透析液を、分光蛍光分析（λｍａｘ＝２０４８５ｎｍ；λｃｍ＝５３０ｎｍ）を使用して、ゼインナノ粒子から放出されたローダミン−１２３について分析した（＊は、差異が、ｐ＜０．０５で有意であることを示す）。
【図１７】フローチャートにおいて、一実施形態による、ブランクＰＥＧ化ゼインナノ粒子の調製のための一般方法を例示する。
【図１８】ＰＥＧ化ナノ粒子の強度加重サイズ分布を例示するグラフである。ｘ軸は、粒径（ｎｍ）を示し、ｙ軸は、強度に相当する。ＰＥＧ化ゼインナノ粒子の粒径は、１３１±１ｎｍ（ｎ＝３）であり、多分散性指数（ＰＤＩ）は、０．２８２±０．０１であった（ｎ＝３）。
【図１９】フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用したレチノールを充填したゼインナノ粒子を調製する一般ステップを例示する。図１９、２３〜２６、および４２において、ＢＨＴは、ブチル化ヒドロキシルトルエン（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）を指す。
【図２０】左から右に、遊離レチノールおよびレチノールを充填したナノ粒子の水分散性を例示する。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２１】リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のゼインナノ粒子からのレチノールのインビトロの放出を例示する。レチノール濃度を、紫外可視分光光度法によって３２０ｎｍにて測定した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２２】左から右に、遊離レチノールおよび凍結乾燥したレチノールナノ粒子を例示する。図は、純粋なレチノールの吸湿性の性質、および、レチノールナノ粒子が非吸湿性易流動性粉末であることを示す。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２３】周辺光下で保存したときの、レチノールを充填したナノ粒子の固体状態の安定性を例示する。遊離レチノールおよびレチノールナノ粒子を透明なガラス製バイアル中に保持し、室内光に１週間曝露させた。異なる時点において残っているレチノールを、紫外可視分光光度法によって３２０ｎｍにて測定した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２４】光の非存在下で保存したときの、レチノールを充填したナノ粒子の固体状態の安定性を例示する。遊離レチノールおよびレチノールナノ粒子を透明なガラス製バイアル中に保持し、暗いキャビネット中に１週間保存した。異なる時点において残っているレチノールを、紫外可視分光光度法によって３２０ｎｍにて測定した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２５】通常の室内光下で保存したときの、レチノールを充填したナノ粒子の液体状態の安定性を例示する。遊離レチノールおよびレチノールナノ粒子をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散させ、室内光において１週間透明なガラス製バイアル中に保存した。異なる時点において残っているレチノールを、紫外可視分光光度法によって３２０ｎｍにて測定した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２６】暗いキャビネット中で光から保護して保存したときの、レチノールを充填したナノ粒子の液体状態の安定性を例示する。遊離レチノールおよびレチノールナノ粒子をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散させ、暗いキャビネット中で１週間透明なガラス製バイアル中に保存した。異なる時点において残っているレチノールを、紫外可視分光光度法によって３２０ｎｍにて測定した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２７】遊離レチノールおよびゼインナノ粒子中にカプセル化したレチノールによる処理の後の、ブタの皮膚およびレセプター媒体中の、４８時間の終わりにおける施用したレチノールの百分率を例示する。切除したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離またはカプセル化したレチノール分散液を、ドナーチャンバー中に充填した。研究の終わりに、皮膚およびレセプターコンパートメント中のレチノール濃度を、３Ｈ標識したレチノールを使用して放射化学的方法によって測定した。０．１Ｍの水酸化ナトリウムを使用して皮膚を消化し、レチノール濃度を決定した（平均±ＳＤ；ｎ＝６）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図２８】遊離レチノールおよびナノ粒子中にカプセル化したレチノールによる処理の後の、ブタの皮膚およびレセプター媒体中の、４８時間の終わりにおける施用したレチノールの百分率を例示する。切除したブタの表皮（Ｅｐｉ）を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間に入れた。第２のセットの実験において、角質層（ＳＣ）をブタの表皮から取り除き、次いでブタの表皮（Ｓａｎｄ）上に物理的に置き（はさみ）、研究において使用した。遊離レチノールまたはレチノールナノ粒子を皮膚上に施用し、研究を４８時間行った。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離またはカプセル化したレチノール分散液を、ドナーチャンバー中に充填した。研究の終わりに、皮膚およびレセプターコンパートメント中のレチノール濃度を、３Ｈ標識したレチノールを使用して放射化学的方法によって測定した。
【図２９】リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のゼインナノ粒子からのローダミン１２３のインビトロの放出を例示する。ナノ粒子を、表８−１において記載した方法を使用して調製した。
【図３０】６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚における遊離ローダミン１２３（１０μｇ）およびローダミンナノ粒子（１０μｇのローダミン１２３と同等である）の浸透を例示する。
【図３１】処理の６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚における遊離ローダミン１２３（１０μｇ）およびゼインナノ粒子中のカプセル化したローダミン１２３（１０μｇのローダミン１２３と同等である）からの蛍光画素を例示する。角質層（ＳＣ）（０〜２０μｍ）および表皮（２０〜１００μｍ）について、蛍光画素を定量化するために共焦点顕微鏡画像からのＸＺ光学切片を使用した。ナノ粒子を、表８−１において記載した方法を使用して調製した。
【図３２】フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用したＦＩＴＣを充填したゼインナノ粒子の調製の一般ステップを例示する。
【図３３】６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚中への遊離ＦＩＴＣ（１０μｇ）およびＦＩＴＣナノ粒子（１０μｇと同等である）の浸透を例示する。皮膚を凍結切片とし、蛍光顕微鏡下で観察した。
【図３４】処理の６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚における遊離ＦＩＴＣ（１０μｇ）およびゼインナノ粒子中のカプセル化したＦＩＴＣ（１０μｇと同等である）からの蛍光画素を例示する。角質層（ＳＣ）（０〜２０μｍ）および表皮（２０〜１００μｍ）について、蛍光画素を定量化するために共焦点顕微鏡画像からのＸＺ光学切片を使用した。
【図３５】フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用した５−フルオロウラシルを充填したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。
【図３６】レセプター媒体中の施用した５−フルオロウラシル（５ＦＵ）の百分率を例示する。
【図３７】ゼイン−カゼインのコアシェルナノ粒子の形成を模式的に例示する。
【図３８】フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用してβ−カゼインにより安定化したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。
【図３９】フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用してβ−カゼインにより安定化したナイルレッドを充填したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。
【図４０】リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のゼイン−カゼインナノ粒子からのナイルレッドのインビトロの放出を例示する。
【図４１】６時間の処理後のブタの皮膚中の遊離ナイルレッド（１０μｇ）およびゼインカゼインナノ粒子（ＮＰ）中にカプセル化したナイルレッドの皮膚浸透を例示する。皮膚中の１〜１００μｍの深さから皮膚を光学的に切り出すことによって共焦点レーザー走査顕微鏡によって皮膚を分析した。角質層（０〜２０μｍ）および生存可能表皮（２０〜１００μｍ）における蛍光強度を、ＩＭＡＧＥＪソフトウェアを使用して定量化した。
【図４２】フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用したカゼインにより安定化したレチノールを充填したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。
【図４３】アルミ箔で覆ったガラス製バイアル中で、室温および４０℃で１カ月の期間保存したレチノールナノ粒子クリーム製剤の安定性を例示する。定期的間隔で、製剤の一定分量を取り出し、ＨＰＬＣを使用してレチノール含量を分析した。製剤は安定的なままであり、室温で大きな分解は示さなかった。各値は、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図４４】ｐＨ７．４でのクリーム製剤からの遊離レチノール（中黒の丸）およびレチノールナノ粒子（中黒の四角）のインビトロの放出を示す。垂直拡散セル透析膜（分画分子量８０００〜１００００Ｄａ）中に入れた約４０ｍｇのクリームを、放出研究のために使用し、レセプター媒体は、ｐＨ７．４の緩衝液からなった。試料をレセプター媒体から集め、３Ｈレチノールを使用して放射化学的方法によって分析した。各データ点は、平均±ＳＤを表す（ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図４５】ヒトの皮膚におけるレチノールクリーム製剤のインビトロの皮膚浸透を例示する。切除したヒトの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。ナノ粒子クリーム製剤中の遊離またはカプセル化したレチノールを、ドナーチャンバー中に充填した。製剤を６時間施用し、次いで、製剤を除去し、浸透研究を４８時間続けた。研究の終わりに、皮膚およびレセプターコンパートメント中のレチノール濃度を、３Ｈ標識したレチノールを使用して放射化学的方法によって測定した。皮膚を、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを使用して消化し、レチノール濃度を決定した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図４６】遊離およびナノ粒子中にカプセル化したレチノール製剤の施用後の、マウスにおける経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）値を例示する。製剤を、ＳＫＨ−１無毛マウスの背中に５日間毎日施用した。ＴＥＷＬ値は、製剤を施用する前にＴＥＷＡメーター（Ｄｅｌｆｉｎ）を使用して毎日測定した。ＴＥＷＬの増加は、皮膚刺激の尺度であり、図を見て分かる通り、ナノ粒子中にカプセル化したレチノールは皮膚刺激を示さず、陰性対照（処理なし）と同程度であった。他方、遊離レチノールクリームは、皮膚刺激を示した。公知の皮膚の刺激物質であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を、陽性対照として使用した。値は、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図４７】ＳＫＨ−１無毛マウスにおける６時間の処理の後の、遊離およびナノ粒子中にカプセル化したレチノールのインビボの局所バイオアベイラビリティーを例示する。クリーム製剤を、イソフルラン麻酔下のマウスの背中上に施用した。動物を安楽死させた後、皮膚をＳＣＯＴＣＨ  ＴＡＰＥを使用してテープによりはがし、角質層（ＳＣ）を取り出した。皮膚（ＳＣおよび表皮／真皮）ならびに血液中のレチノールの量を、分析の放射化学的方法によって３Ｈレチノールを使用して決定した。見ることができるように、ナノ粒子中にカプセル化したレチノールは皮膚中に保持され、血液中への全身的吸収はなかった。値は、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。ナノ粒子を、図１９において記載されている方法を使用して調製した。
【図４８】ＦＩＴＣコンジュゲートゼインナノ粒子による６時間の処理の後の、ブタの皮膚の共焦点ＸＺおよびＸＹＺ像（０〜１００μｍ深さ）を例示する。この図（右のパネル）において見ることができるように、ゼインナノ粒子は、毛包中に主に局在化していた。これはまた、蛍光が線条において表面から皮膚中１００μｍの深さまで観察される左のパネルから明らかである。
【図４９】フローチャートによって、一実施形態による、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のカプセル化のための一般ステップを例示する。
【図５０】フローチャートによって、一実施形態による、多血小板血漿（ＰＲＰ）を吸着させるための一般ステップを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
様々な皮膚科学的状態および毛包障害を治療するための、皮膚を通したレチノールの局所送達のための新規なナノ担体が開発されてきた。このような状態の例には、これらに限定されないが、ざ瘡、乾癬、角化障害、皮膚変色、ならびに皮膚の悪性腫瘍（皮膚がんおよび黒色腫）が含まれる（ならびに創傷治癒および光による老化のため）（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８〜３８８，１９９７）。例えば、本明細書に記載のナノ粒子は、タンパク質薬物の送達のために使用してもよく、ナノ粒子は、ＩＬ−８に対する抗体、または細胞間接着分子−１ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に使用してもよい。他の例には、選択した組織に様々な増殖因子を投与するために使用することができる細胞組成物、例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ）、および小分子、例えば、レチノイドが含まれる。
【００３３】
レチノール（ビタミンＡ）およびその誘導体（レチノイド）は、表皮細胞の増殖および分化、視覚、免疫調節ならびに抗炎症作用を含めて体内の様々な生物学的機能に関与している（Ｓｕｍｍｅｒ，Ｊ  Ｎｕｔｒ  １３８：１８３５〜１８３９，２００８）。特に、レチノールおよびその誘導体は、様々な皮膚科学的状態（ざ瘡、乾癬、角化障害、皮膚変色、ならびに皮膚の悪性腫瘍（皮膚がんおよび黒色腫）を含めた）の治療のために、ならびに創傷治癒および光による老化のために広範に使用されている（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８〜３８８，１９９７）。レチノールはまた、しわを低減させ、セリュライトを治療するために化粧品製剤において使用される（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８〜３８８，１９９７）。しかし、化粧品および皮膚科学的用途のためのレチノールの使用は、その乏しい物理化学的特性および皮膚刺激の可能性によって極度に限定されている（Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３８：３２〜３９，２００９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １４６：６５〜７３，２００３）。
【００３４】
【化１】
2014515007.tif 000003
【００３５】
レチノールは、乏しい水溶性および限定された皮膚浸透性を有する親油性分子（Ｌｏｇ  Ｐ、６．２０）である。さらに、レチノールは、光および湿気の存在下で非常に不安定である（本明細書においてその全体が組み込まれている米国特許第５，８５１，５３８号（Ｆｒｏｉｘら）を参照されたい）。レチノールの局所施用は、軽度の紅斑および角質層剥離として顕在化する重度の局所刺激をもたらし、使用者で使用に関する不遵守をもたらす（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １４６：６５〜７３，２００３）。本出願人等は、局所施用のための新規なタンパク質をベースとするナノ担体中にレチノールをカプセル化することによって、レチノールの送達問題に対して首尾よく取り組んできた。
【００３６】
新規なナノ担体が、本明細書に記載のようにトウモロコシタンパク質のゼインから開発されてきた。ゼインは、皮膚のケラチンと同様に疎水性を示し（Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９：５０８３〜５０８８，２００３）、したがって、皮膚施用のための有望な担体である。ゼインは疎水性であるため、ゼインを使用して、疎水性レチノイドを本明細書に記載のナノ粒子中にカプセル化することができ、ゼインを使用して、疎水性レチノイドをカプセル化して、水により除去可能なレチノイドの製剤を提供することができる。
【００３７】
ナノ粒子によって、様々な局所施用のためのレチノール製剤の選択における柔軟性が実現される。本出願人等は、７６〜１００％のカプセル化効率で約１００ｎｍ〜約３００ｎｍのサイズ範囲の、レチノールを充填したゼインナノ粒子を調製した。レチノールを充填したナノ粒子は、７９〜９１％のカプセル化効率で１８０〜２２０ｎｍのサイズ範囲である。ナノ担体中のレチノールのカプセル化は、水分散性製剤をもたらした。
【００３８】
ゼインナノ粒子は、湿気および光により誘発される分解に対する、レチノールの固体状態および液体状態の安定性をかなり増強した。ゼインナノ粒子からのレチノールの放出は、１週間まで持続した。ゼインは、皮膚のケラチンと同様の特徴を有する米国食品医薬品局により承認された生分解性のタンパク質ポリマーであり、したがって、皮膚適合性のナノ担体である。ナノ粒子はまた、遊離レチノール水性分散液と比較して、レチノールの皮膚浸透を増強させた。ゼインナノ粒子を使用して、化粧品および皮膚科学的用途のために皮膚の層中にレチノールを保持することができる。
【００３９】
ナノ担体の独特の態様は、ナノ粒子におけるレチノールの局所送達のための複数の市場の問題に取り組む能力である。これらの問題は、１）水溶性および水分散性製剤のレチノール、２）光および湿気により誘発される分解に対する安定性が増強したレチノール、３）易流動性で無色および非吸湿性の粉末レチノール、４）持続放出製剤のレチノール、５）より高い皮膚浸透のレチノール、ならびに６）非刺激性製剤のレチノールを提供することを含む。
【００４０】
レチノールの水分散性は、ナノ粒子中のカプセル化後にかなり増加する。ゼインナノ粒子からのレチノールの放出は持続させることができ、より低い用量および施用頻度の低減をもたらす。ゼインナノ粒子中のレチノールのカプセル化は、レチノール製剤の保存寿命をかなり増加させる。ゼインナノ粒子は、固体および半固体製剤においてレチノールの流動性および分散性を増加させる。レチノールは吸湿性粘着性の粉末であるため、ナノ粒子中のレチノールのカプセル化によって、レチノールと関連する困難な取扱いおよび処理の問題を克服することができる。
【００４１】
角質層（ＳＣ）は皮膚の最上層であり、一方、皮膚のより深い層は、生きた表皮および真皮を含む。ゼインナノ粒子は、皮膚の層において化粧品および皮膚科学的用途のためにレチノールの皮膚浸透および保持を増強させることができる。ゼインナノ粒子中のレチノールのカプセル化は、レチノールの黄色を隠す。これによって、レチノール製剤の美的アピールを改善し、黄色の色に染まることを防止する。凍結乾燥したゼインナノ粒子は、様々な局所製剤マトリックス、例えば、ゲル、クリーム、ローションおよび軟膏中に容易に組み込むことができる。
【００４２】
切除したブタの皮膚（多くの重要な点においてヒトの皮膚と類似している）で皮膚浸透研究を行った（Ｓｉｍｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｉｂａｃｈ，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３：２２９〜２３４，２０００．）。マウスにおけるインビボの研究は、ナノ粒子がレチノールの皮膚刺激を低減させる能力をさらに示す。現在市販されている製剤の代わりにナノ粒子を使用する利点には、下記が含まれる。
１．可溶化。レチノールは、水不溶性疎水性化合物である。ゼインナノ粒子中のレチノールのカプセル化は、水分散性である。したがって、ナノ粒子を使用して、局所施用のための水により洗浄可能なレチノール製剤を開発することができる。一般に、水により洗浄可能な製剤は、化粧品および皮膚科学的用途のために好ましい。
２．安定化。レチノールは、湿気および光の存在下で非常に不安定である。これは、レチノール製剤の保存寿命、および施用の間の製剤の有効性を限定する。ナノ粒子中のレチノールのカプセル化は、レチノール製剤の安定性および保存寿命をかなり増強することができる。
３．持続放出。ゼインナノ粒子からのレチノールの放出は、持続させることができる。放出は、１週間まで持続させることができる。これによって、レチノールの用量および施用頻度は低減する。
４．皮膚浸透および保持。レチノールは、乏しい皮膚浸透特性を有する。ナノ粒子は、レチノールの皮膚浸透の増強をもたらす。ナノ粒子を使用して、レチノールを様々な皮膚科学的／化粧品用途のために皮膚の層中に保持することができる。
５．薬用化粧品用途。レチノールを充填したナノ粒子は、化粧品用途、例えば、抗老化、抗しわ、およびセリュライト治療のために使用することができる。
６．皮膚科学的用途。レチノールを充填したナノ粒子は、様々な皮膚科学的状態、例えば、乾癬、ざ瘡、創傷治癒および皮膚の悪性腫瘍、例えば、皮膚がんおよび黒色腫のために使用することができる。
７．効果的および安全な製剤。レチノールを充填したナノ粒子の使用は、より効果的な治療をもたらす。さらに、ナノ粒子中のレチノールのカプセル化は、レチノールによってもたらされる皮膚刺激をかなり低減させることができる。レチノールの皮膚刺激は、レチノールの化粧品および皮膚科学的用途のための使用に関する不遵守のために主要な問題である。
８．他のレチノイドのカプセル化のためのプラットフォーム技術。レチノール、レチノイン酸、およびこれらの誘導体（例えば、脂肪酸エステル）を含めた様々なレチノイドは、化粧品および皮膚科学的用途のためにプロラミンナノ粒子中にカプセル化することができる。カプセル化に適した様々なレチノイドの例には、これらに限定されないが、レチノール、レチノイン酸（例えば、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸および／または１３−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸）、レチンアルデヒド、トレチノイン、イソトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル、ならびにカロテノイド、例えば、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、およびゼアキサンチンが含まれる。
９．併用療法。レチノールナノ粒子は、他の製品、例えば、日焼け止め剤、抗乾癬製品、抗ざ瘡製品および抗皮膚がん製品中に他の薬物と共に組み込むことができる。レチノールはカプセル化されているため、これは他の薬剤との相互作用を防止する。他の薬剤、例えば、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、抗炎症剤はまた、ナノ粒子中にレチノールと共にカプセル化することができる。このような薬剤には、これらに限定されないが、ビタミンＥおよびその誘導体、例えば、酢酸トコフェロール、ビタミンＣおよびその誘導体、例えば、パルミチン酸アスコルビル、グリーンツリー抽出物、アロエベラ、コエンザイムＱ１０、ヒドロキノン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ビサボロール、グリコール酸、乳酸、βヒドロキシブタン酸、サリチル酸、１０−ヒドロキシデカン酸、フェルラ酸、パンテノール、バイオティック、アルブチン、ケルセチン、ヘスペリジン、ならびにこれらの組合せを含むことができる。
【００４３】
定義
本明細書において使用する場合、記載した用語は、下記の意味を有する。この明細書において使用される全ての他の用語および語句は、当業者が理解するようなそれらの通常の意味を有する。このような通常の意味は、専門辞典、例えば、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｒ．Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１を参照することにより得てもよい。
【００４４】
明細書において「１つの実施形態」、「実施形態」などへの言及は、記載される実施形態が特定の態様、特色、構造、部分、または特徴を含み得るが、必ずしも全ての実施形態が、その態様、特色、構造、部分、または特徴を含むことはないことを示す。さらに、このような語句は、必ずしもそうではないが、明細書の他の部分において言及した同じ実施形態を指し得る。さらに、特定の態様、特色、構造、部分、または特徴が実施形態に関連して記載されているとき、明示的に記載されているかどうかを問わず、このような態様、特色、構造、部分、または特徴が、他の実施形態に影響を与え、あるいは関係することは当業者の知識の範囲内である。
【００４５】
「含む」、「含めた」、「有する」、「含有する」、「特徴とする」という用語およびその文法的な同等物は、さらなる記載していない要素または方法ステップを除外しないが、より限定的な用語である「からなる」および「から本質的になる」もまた含む、包括的またはオープンエンドの用語である。
【００４６】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り複数の言及を含む。したがって、例えば、「１つの化合物」（例えば、薬物）への言及は、複数のこのような化合物を含み、その結果、化合物Ｘは、複数の化合物Ｘを含む。さらなる例として、「ナノ粒子」への言及は、複数のこのようなナノ粒子を含むことができ、「分子」への言及は、複数の分子、およびその同等物への言及である。特許請求の範囲は、任意の任意選択の要素を除外するように記載し得ることがさらに留意される。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙、または「消極的な」限定の使用に関連して、排他的な用語法、例えば、「もっぱら」、「のみ」などの使用についての先行詞としての機能を果たすことを意図する。
【００４７】
「および／または」という用語は、この用語と関連する項目のいずれか１つ、項目の任意の組合せ、または項目の全てを意味する。「１つまたは複数の」という語句を、特にその使用と関連して読むとき、当業者は容易に理解する。例えば、フェニル環上の１個または複数の置換基は、例えば、フェニル環が二置換されている場合、１〜５個、または１〜４個を指す。
【００４８】
「約」または「概ね」という用語は、記載した数もしくは量に合理的に近い、または記載した数もしくは量より僅かに多いもしくは少ないことを意味する。したがって、「約」という用語は、特定した値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指すことができる。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５〜５５パーセントの変動を有することができる。整数範囲について、「約」という用語は、記載した整数を超える、および／または記載した整数未満の１つまたは２つの整数を含むことができる。本明細書において他に示さない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能に関して等しい、記載した範囲に最も近い値、例えば、重量パーセントを含むことを意図する。さらに、本明細書において他に示さない限り、記載した範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、範囲内のそれぞれの特定の値またはアイデンティティーを含む。
【００４９】
当業者が理解するように、成分の量を表すものを含めた全ての数、特性、例えば、分子量、反応条件などは近似であり、「約」という用語によって全ての場合において任意選択で修飾されると理解される。これらの値は、本明細書における記載の教示を利用して当業者が得ようとする所望の特性によって変化することができる。このような値は、これらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的にもたらされる可変性を本質的に含有することがまた理解される。
【００５０】
当業者が理解するように、ありとあらゆる目的のために、特に、書面による記載を提供する点から、本明細書において記載した全ての範囲はまた、ありとあらゆる可能性のある部分範囲およびその部分範囲の組合せ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に、整数値を包含する。記載した範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、範囲内のそれぞれの特定の値、整数、小数、またはアイデンティティーを含む。任意の一覧表示された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、または１０分の１に分解されると十分に記載されており、可能であると容易に認識することができる。非限定的例として、本明細書において考察されている各範囲は、下３分の１、中央３分の１および上３分の１などに容易に細分化することができる。
【００５１】
当業者がまた理解するように、全ての言語、例えば、「まで」、「少なくとも」、「超」、「未満」、「超える」、「以上」などは、記載した数を含み、このような用語は、上記で考察するような部分範囲に引き続き細分化することができる範囲を指す。同じ様式で、本明細書における全ての記載した比はまた、より広範な比の範囲に入る全ての部分比を含む。したがって、ラジカル、置換基、および範囲について記載する特定の値は、例示のみのためである。これらは、ラジカルおよび置換基について、他の定義した値、または定義した範囲内の他の値を除外しない。
【００５２】
メンバーが、通常の様式でマーカッシュ群におけるように一緒にグループ化される場合、本発明は、全体として一覧表示されている群全体のみでなく、個々の群の各メンバー、および主群の全ての可能性のある部分群を包含することを、当業者はまた容易に認識するであろう。さらに、全ての目的のために、本発明は、主群のみでなく、群のメンバーの１つまたは複数が存在しない主群も包含する。したがって、本発明は、記載した群のメンバーの任意の１つまたは複数の明示的な除外を予想する。したがって、規定は、開示したカテゴリーまたは実施形態のいずれかに適用してもよく、それによって、記載した要素、種、または実施形態の任意の１つもしくは複数は、例えば、明示的な消極的な限定において使用されるように、このようなカテゴリーまたは実施形態から除外してもよい。
【００５３】
「ゼイン」という用語は、プロラミンタンパク質のクラスのメンバーを指す。プロラミンは、様々な穀物、例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、およびソルガムにおいて、ならびに他の植物および動物において見出される。プロラミンの他の例には、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンが含まれる。これらのプロラミンは、本明細書に記載されている様々な実施形態において、ゼインに交換することができる。ゼインは、高い割合の非極性アミノ酸、例えば、プロリン、グルタミンおよびアスパラギンからなり、約２２〜２７ｋＤａの分子量を有し（Ｓｈｕｋｌａ，Ｚｅｉｎ：ｔｈｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｎ，Ｉｎｄ  Ｃｒｏｐｓ  Ｐｒｏｄ  １３，１７１〜９２；２００１）、様々な分子量を有する３種の別個のタンパク質の混合物でよい。ゼインの典型的な試料は、概ね２０％のロイシン、１０％のプロリン、２１〜２６％のグルタミン、５％のアスパラギン、および１０％のアラニンを有することができ、したがって、そのアミノ酸組成の少なくとも約６１％は、疎水性アミノ酸である。これらの疎水性アミノ酸によって、タンパク質は水不溶性となる。ゼインは、米国食品医薬品局により承認された生分解性のＧＲＡＳポリマーである（Ｆｅｄ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ（１９８５）５０：８９９７〜８９９９）。
【００５４】
ゼインは、トウモロコシグルテンミールから粉末として製造することができる。純粋なゼインは、無臭、無味、水不溶性、および可食であり、これらの特性によって、ゼインは加工食品および医薬品のための重要な構成要素となってきた。ゼインを単離、処理、および使用する方法は当技術分野において公知である。例えば、Ｌａｗｔｏｎ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，７９（１）：１〜１８、およびＷＯ２００９／１３７１１２（Ｐｅｒｕｍａｌら）（これらは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている）を参照されたい。ゼインの「グレード」は、様々な手段、例えば、その内容が参照によりその全体が組み込まれている米国特許第５，２５４，６７３号（Ｃｏｏｋら）に開示されている手段に由来する白色ゼインおよび黄色ゼインを含めたゼインの種々のタイプまたは形態を指す。
【００５５】
「生体適合性」という用語は、言及したポリマーまたはコンジュゲートが、対象にインビボで投与したときに、かなりの有害作用をもたらすことも誘発することもないことを意味する。可能性のある有害作用の例には、これらに限定されないが、過剰な炎症および／または過剰もしくは有害な免疫応答、および毒性が含まれる。ゼインは、生体適合性構成要素である。
【００５６】
「ナノ粒子」という用語は一般に、少なくとも１つの寸法において１０００ｎｍ以下である粒子を指すことが公知である。しかし、本発明の方法によって形成されるナノ粒子は、本明細書に定義されているような特定の値の直径を有する。さらに、「ナノ粒子」という用語の使用はまた、ブランクナノ粒子、および分子を充填し、かつ本発明の方法によって形成されたナノ粒子を総称して指すことを意味する。本明細書において使用する場合、他に定義しない限り（すなわち、図１１）、「ブランクナノ粒子」とは、ナノ粒子と共に形成され、またはナノ粒子とコンジュゲートされる選択した粒子、分子または材料を有さないナノ粒子を指す。
【００５７】
「直径」という用語は、ナノ粒子の寸法との関連において使用されるとき、粒子の質量中心を通過する線についての粒子の平均線寸法を指す。非球状粒子の直径の許容される近似値は、例えば、座標系の３つの直交軸に沿って粒子の厚さの平均をとることによって提供し得る（軸の１つは、粒子の最も長い寸法と一致する）。
【００５８】
「水性アルコール溶媒」という用語は、水およびアルコール溶媒の両方を含む溶媒系、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、またはブタノール（１−ブタノール、２−ブタノール（ｓｅｃ−ブタノール）、イソ−ブタノール、およびｔｅｒｔ−ブタノールを含めた）を指す。通常の水性アルコール溶媒系は、水中に５０％、７０％、９０％、および９２％のエタノールを含む。
【００５９】
「接触させる」という用語は、例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロまたはインビボの、例えば、生理学的反応、化学反応、または物理的変化を引き起こすために、触れる行為、接触を起こす行為、または直近もしくは密接な近接をもたらす行為（細胞または分子レベルを含めた）を指す。
【００６０】
「インビボ」という用語は、対象の体または体内、例えば、患者の体または体内を意味し、これらに限定されないが、経口、静脈内、腫瘍内、腫瘍周囲、腹腔内、非経口、皮下、局所、眼、肺および経鼻投与経路を含めた種々の手段によるナノ粒子の投与を含む。
【００６１】
「インビトロ」という用語は、対象または患者の体の外側の環境を指す。
【００６２】
「インサイチュ」という用語は、最初の位置であり、別の場所へと移動または移行されていないことを指す。
【００６３】
「会合」という用語は、本開示のナノ粒子へのカーゴまたはカーゴ分子の複合体化を指し、これらに限定されないが、粒子の表面または内部領域へのコンジュゲート（共有結合性または非共有結合性）、吸着、およびカプセル化が含まれる。
【００６４】
「複合体化」という用語は、その文法的変形を含めて、様々な細胞的または分子的実体と本開示のナノ粒子との組合せを指す。
【００６５】
「投与した」または「投与」という用語は、ナノ粒子についての治療および診断における使用との関連で使用されるとき、例えば、標的とされる部位へ治療剤を送達する目的のための、インビボまたはインビトロの環境への選択した量のナノ粒子の導入を指し、含む。
【００６６】
「有効量」とは、疾患、障害、および／または状態を治療し、あるいは記載した作用を引き起こすのに有効な量を指す。例えば、有効な量は、治療を受ける状態または症状の進行または重症度を低減させるのに有効な量でよい。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、例えば、ホストにおいて疾患または障害を治療または予防し、あるいは疾患または障害の症状を治療するのに有効な、ブランクナノ担体または本明細書に記載されている薬物を充填したナノ担体（すなわち、ナノ粒子）の量を含むことを意図する。このように、「有効量」は一般に、所望の作用を実現する量を意味する。
【００６７】
「治療すること」、「治療する」および「治療」という用語は、（ｉ）疾患、病的もしくは医学的状態が起こることを予防し（例えば、予防法）；（ｉｉ）疾患、病的もしくは医学的状態を阻害し、またはその発症を抑止し；（ｉｉｉ）疾患、病的もしくは医学的状態を軽減し、かつ／あるいは（ｉｖ）疾患、病的もしくは医学的状態と関連する症状を軽減することを含むことができる。このように、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、予防法にまで及ぶことができ、治療を受ける状態または症状の進行または重症度を予防する、予防すること、予防、低下、停止または逆転させることを含むことができる。したがって、「治療」という用語は、必要に応じて、医学的、治療的、および／または予防的投与の両方を含むことができる。
【００６８】
「対象」または「患者」という用語は両方とも、個々の複雑な生物、例えば、ヒトまたはヒトではない動物を指し、または意味する。
【００６９】
「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」という用語は、疾患、感染症、状態、または細胞の群の増殖または進行を遅延、停止、または逆行させることを指す。阻害は、例えば、処理または接触の非存在下で起こる増殖または進行と比較して、約２０％超、約４０％超、約６０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超でよい。
【００７０】
治療または医薬機能に関して「治療剤」という用語および同様の用語は、言及された分子、巨大分子、薬物または他の物質が、対象における疾患または状態の開始、経過、および／または１つもしくは複数の症状に有利に影響を与えることができ、疾患または他の状態の治療のための医薬の製造においてナノ粒子と併せて使用し得ることを意味する。本明細書に記載されているナノ粒子中へのカプセル化、またはナノ粒子上への吸収のために適した治療剤は、これらに限定されないが、レチノイド、例えば、レチノールおよびそのエステル、ならびにレチノールの誘導体、例えば、レチノイン酸およびレチナール、小分子、抗体、核酸、タンパク質、ホルモン、受容体、リガンド、細胞（例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ））、増殖因子、細胞抽出物などの疎水性治療剤を含む。
【００７１】
治療または医薬機能に関して「治療剤」という用語および同様の用語は、言及された分子、巨大分子、薬物または他の物質が、対象における疾患または状態の開始、経過、および／または１つもしくは複数の症状に有利に影響を与えることができ、疾患または他の状態の治療のための医薬の製造においてナノ粒子と併せて使用し得ることを意味する。
【００７２】
レチノール（Ｃ２０Ｈ３０Ｏ；２８６．４５ｇ／ｍｏｌ）は、重要な生物活性を有するジテルペノイドアルコールである。レチノールは、６１〜６３℃の融点、３１００単位／ｍｇの活性、および６．２のＬｏｇ  Ｐを有する。レチノールは、水中で実際に不溶性であり、エタノール中で可溶性または部分的に可溶性であり、クロロホルム、エーテルおよび石油精と混和性である。レチノールは、光による老化、ざ瘡、創傷治癒、肝斑、乾癬、皮膚がん、黒色腫および他の皮膚状態を含めた様々な皮膚状態のために使用される薬用化粧品／治療剤である（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８〜３８８，１９９７）。レチノールは、乏しい水溶性および乏しい光安定性を有する（Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３８：３２〜３９，２００９；米国特許第５，８５１，５３８号（Ｆｒｏｉｘら）、その内容全体は参照により本明細書中に組み込まれている）。さらに、レチノールはまた、皮膚刺激をもたらす（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．１４６：６５〜７３，２００３）。
【００７３】
ナノ粒子および調製方法
本発明は、疎水性水不溶性タンパク質、例えば、プロラミン、例えば、ゼインから形成することができるナノ粒子を提供する。ナノ粒子を用いて、大きなサイズのナノ粒子または微粒子（例えば、疎水性水不溶性タンパク質から形成されるものを含めて）の使用において経験する免疫原性を欠いているナノ粒子製剤を提供することができる。ナノ粒子の非免疫原性作用は、粒子のサイズ、および粒径範囲を制御することによって達成することができる。
【００７４】
図１は、フローチャートによって、一実施形態による、非免疫原性ナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。使用する特定の量は例示のためであり、当業者が容易に認識するように、多くの変形を本明細書に記載されている手順に適用することができる。方法の最初のステップまたは相において、水不溶性タンパク質（０．４〜１．２５％ｗ／ｖ）を、水性アルコール溶媒（例えば、エタノールおよび脱イオン水の組合せ）に溶解する。溶媒の組成は、例えば、９０％：１０％ｖ／ｖまたは９２％：８％ｖ／ｖのアルコールと水でよい。選択した分子をナノ粒子中にカプセル化する方法のために、カプセル化する分子（０．０３〜０．３％ｗ／ｖ）を、この第１の水相溶液に加える。カプセル化する分子は、タンパク質ポリマーの概ね５０％ｗ／ｗでよい。
【００７５】
溶液のｐＨは、０．０１ＮのＮａＯＨまたは０．０１ＮのＨＣｌを加えることによって変化させることができる（例えば、溶液のｐＨを約ｐＨ６〜約ｐＨ７にさせる）。酸性分子、例えば、レチノイン酸を加えた後で、または塩基性分子によって、水のｐＨが変化する場合、ｐＨをｐＨ６〜７に再調節することができる。第１の相の溶液は、例えば、プローブ超音波処理によって処理して、タンパク質の溶解を補助することができる。
【００７６】
この方法のそれに続くステップにおいて、最初のステップまたは相の水溶液を、任意選択で超音波剪断下にて、緩衝剤に加えることができる。クエン酸緩衝液は、適切な緩衝液である。本開示において下記で記載するように、第２の水相のために使用する緩衝剤の選択は、ナノ粒子形成の間のｐＨを維持するために、およびそれに続く形成されたナノ粒子の凍結乾燥のために重要である。緩衝液が使用されない場合、または、例えば、０．１ＮのＨＣｌを使用して第２の水相溶液のｐＨを調節する場合、生成された粒子は、クエン酸緩衝液により生成されたものより大きい傾向があり、粒子は、より広範なサイズ範囲を示す傾向がある。クエン酸緩衝液の使用によって、最も小さな粒子直径サイズのいくつか、例えば、概ね１００ｎｍが生成する。他の緩衝液の使用によって、概ね１００ｎｍ〜概ね３００ｎｍの同じまたは同様の直径サイズ範囲の粒子を生成し得るが、凍結乾燥ステップの後で、他の緩衝剤を使用して形成したナノ粒子の平均サイズは、２〜３倍増加することが公知であった。
【００７７】
第２の水相溶液のｐＨを約ｐＨ６．８〜約ｐＨ７．４に調節して、所望のサイズのナノ粒子を得ることができる。ｐＨがこの範囲の外である場合、粒径はより大きくなる傾向があり、生成された粒子の多分散性指数（ＰＤＩ）はより高くなる。ＰＤＩは、異なるサイズ範囲の粒子の分布の尺度である。このように、この方法は、概ね６．８〜概ね７．４の選択したｐＨ（ゼインの等電点（すなわち、ｐＩ５〜９）に近い）を有する水性アルコール溶液および水溶液におけるタンパク質、例えば、ゼインの溶解性の差異を使用することができる。
【００７８】
第２の水相溶液への緩衝剤の添加は、高超音波剪断下または高圧均質化下で、または超音波剪断および高圧均質化の両方の組合せ下で行い得る。超音波エネルギー、および超音波剪断の期間は、所望の直径サイズ範囲の粒子の形成にとって特に重要であり得る。超音波剪断エネルギーは、例えば、０．６ｋＷ／ｈ〜１．３９ｋＷ／ｈで、概ね２〜１０分の期間、５〜１０秒のパルスオンタイムおよび１〜５秒のオフタイムにより行い得る。超音波処理は、所望のサイズ範囲の粒子の生成にとって重要であり得る。高圧均質化を用いるとき、この工程は、０．１ｍｍ〜０．２５ｍｍのオリフィスサイズを使用して、５〜１０分の期間、５０００〜４０，０００ｐｓｉの圧力で行い得る。
【００７９】
第２の相の緩衝剤はまた、好ましくは、選択した比で界面活性剤およびリン脂質を含有し得る。界面活性剤とリン脂質の比は、概ね２：１％ｗ／ｗでよく、これは、非常に適切な結果を生じさせる。比はまた、１：０．５％ｗ／ｗまたは１：１％ｗ／ｗまたは１：２％ｗ／ｗでよい。極めて、界面活性剤およびリン脂質の組合せは、生成された粒子を安定化させ、粒子の凝集防止を助けるのに望ましい。
【００８０】
界面活性剤は、例えば、ポロキサマー、例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ６８でよく、リン脂質は、レシチンでよい。この方法において使用し得る他の界面活性剤には、他の非イオン性界面活性剤、例えば、ポロキサマー（プルロニック（登録商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＢＲＩＪ）、ソルビタンエステル（ＳＰＡＮ）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ）、およびイオン性界面活性剤、例えば、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｎ−ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、および／またはポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンが含まれる。この方法において使用し得る他のリン脂質には、非イオン性および帯電した脂質またはリン脂質、例えば、卵レシチン、ダイズレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、カゼイン、またはこれらの組合せが含まれる。
【００８１】
選択した比のポロキサマーおよびレシチンの組合せ（例えば、０．９％ｗ／ｗ：０．４５％ｗ／ｗ）は、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍの所望の直径サイズ範囲のナノ粒子を生成することが見出されてきた。界面活性剤またはリン脂質単独のいずれかの使用は一般に、所望の直径サイズ範囲の外のより大きな粒径をもたらすことが見出されてきた。しかし、本明細書に記載の方法による界面活性剤またはリン脂質の使用は、非免疫原性のために所望のサイズのナノ粒子をもたらすことができる。
【００８２】
実施形態において、ゼインナノ粒子は、ｐＨを制御したナノ沈殿を使用してカゼインおよびアラビアゴムにより安定化し得る。他の実施形態において、ゼインナノ粒子は、ＤＭＳＯを使用してデキストランと複合体化して、ゼイン−デキストランナノ粒子を生じさせてもよい。
【００８３】
第２の相の溶液への超音波剪断または／または高圧均質化の適用の後、混合物を撹拌して、エタノールまたは他の溶媒を蒸発させて、ナノ粒子を形成させることができる。一実施形態において、撹拌は、例えば、概ね３００ｒｐｍ〜概ね５００ｒｐｍの速度で室温（−２３℃）にて概ね１時間から６時間、または約数時間、機械式撹拌機によって行うことができる。
【００８４】
次いで、残留材料からナノ粒子を分離する目的のために、ナノ粒子を超遠心濾過に供することができる。超遠心分離は、約５ｋＤａの分画分子量の遠心濾過機（または５ｋＤａより高いもしくは低い分画分子量を有する他の適当な濾過機）を使用して、およびカプセル化した分子もしくは薬物によって、またはナノ粒子の特定の処理、例えば、ＰＥＧ化によって２ｋＤａ〜４０ｋＤａで行い得る。超遠心分離の時間は、例えば、約２０〜約５０分で変化させることができる。次いで、凍結防止剤を、ナノ粒子に加え得る。例えば、２％ｗ／ｖトレハロースを、凍結防止剤として加えることができる。他の凍結防止剤または溶解保護剤、例えば、糖（グルコース、スクロース、ラクトースを含めた）、ｆｉｃｏｌｌ、ベタイン、またはポリオール、例えば、マンニトールまたはソルビトールをまた使用することができる。ナノ粒子を、例えば、−８０℃に維持して、固体ケークを形成させることができ、次いでこれを、高真空下にて凍結状態でナノ粒子を乾燥させることによるなど凍結乾燥させることができる。超音波エネルギーの期間、界面活性剤のタイプ、界面活性剤の濃度、および緩衝液は、当業者が容易に認識するように所望のパラメーターによって変化し得る。
【００８５】
したがって、本明細書に記載されているナノ粒子の粒子直径サイズの範囲は、概ね４００ｎｍ未満、または概ね３００ｎｍ未満でよい。いくつかの実施形態において、粒子直径サイズの範囲は、概ね１００ｎｍ〜概ね３００ｎｍ、または概ね７５ｎｍ〜概ね３００ｎｍである。サイズを直径に関して考察する一方で、ナノ粒子は、必ずしも完全に球状の形状ではない。しかし、ナノ粒子において球状の形状を達成することができ、これはいくつかの実施形態の典型であり得る。寸法は、粒子の両端の間で、例えば、反対側から粒子を横断する最も大きな寸法、または反対側から粒子を横断する最も大きな寸法と、反対側から粒子を横断する最も小さな寸法との平均で測定することができる。
【００８６】
ナノ粒子のために使用される水不溶性疎水性タンパク質は、種々の源（植物、動物および合成の源を含めた）から由来することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、多量の疎水性アミノ酸、例えば、プロリン、グルタミンおよびアスパラギンからなるプロラミンのファミリーからでよい。これらの疎水性アミノ酸によって、タンパク質は水不溶性となる。プロラミンは、様々な穀物、例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガムにおいて、ならびに他の植物源および動物源において見出すことができる。適切なプロラミンのいくつかの例には、これらに限定されないが、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンが含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、白色ゼインを使用して、適切なナノ粒子、例えば、約１００ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有するものを生成することができる。黄色ゼインは、相対的により大きな直径サイズを有する粒子を生成することができ、また、より広範な粒子直径サイズ分布を有する粒子を生成させることができる。黄色ゼイン中の顔料は、黄色ゼインの溶解性、および黄色ゼインを使用したナノ粒子形成に影響を与え得る。
【００８８】
別の方法で可能であろうものより全体的により小さな直径サイズおよびより狭い直径サイズ範囲のナノ粒子を調製する方法は、本明細書に記載されている。これらのより小さなナノ粒子は、１種または複数の特定のグレードのベースタンパク質、例えば、ゼインを使用した、ｐＨを制御するナノ沈殿工程を実行することによって、ならびにナノ粒子を非免疫原性とするナノ粒径および直径を達成するように選択された緩衝液、界面活性剤、およびリン脂質の様々な組合せを使用することによって調製することができる。
【００８９】
ナノ粒子は、多種多様の「カーゴ」または「カーゴ分子」と共に調製することができる。例えば、変化する物理化学的特性を有する粒子または薬剤を、タンパク質ナノ粒子の調製において加えて、ナノ粒子とカプセル化、吸着、複合体化および／またはコンジュゲートした材料を提供することができる。粒子は、小さな親水性分子、小さな疎水性分子、および／または巨大分子を閉じ込めることができる。概ね６０％〜概ね８０％以上のカプセル化効率を達成することができる。ナノ粒子は、インビトロまたはインビボの環境において、カプセル化した分子の持続送達（１〜７日、または１〜２週間）を実現することができる。いくつかの実施形態（例えば、タンパク質／抗体など）において、カーゴは、ナノ粒子の表面に吸着／複合体化／コンジュゲートし得る。
【００９０】
実施形態において、カーゴまたはカーゴ分子は、医薬品材料である。カプセル化したカーゴもしくはカーゴ分子、複合体化もしくはコンジュゲートしたカーゴ分子、または吸着されたカーゴ分子として、本発明のナノ粒子との使用に適したこのような材料には、ナノ粒子の物理的な完全性を感知できるほどに妨げることなくナノ粒子と会合することができる、対象の診断治療または治療的処置のためのインビボまたはインビトロの使用のための任意の材料、例えば、薬物、例えば、抗生物質、鎮痛剤、昇圧剤、強心剤、ステロイドなど、例えば、アセトアミノフェン、アシクロビル、ａｌｋｅｒａｎ、アミカシン、アンピシリン、アスピリン、ビサントレン、ブレオマイシン、ネオカルチノスタチン、クロランブシル、ヒドロキシクマリン、クロラムフェニコール、シタラビン、ダウノマイシン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、フルオロウラシル、ｔａｘｏｌ、ゲムシタビン、ゲンタマイシン、イブプロフェン、カナマイシン、メプロバメート、メソトレキセート、ノバントロン、ナイスタチン、ｏｎｃｏｖｉｎ、フェノバルビタール、ポリミキシン、プロブコール、プロカルバジン、リファンピン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ、チオグアニン、トブラマイシン、トリメトプリム、およびバルバンル；毒素、例えば、ジフテリア毒素、ゲロニン、エクソトキシンＡ、アブリン、モデシン、リシン、またはその毒性フラグメント；金属イオン、例えば、アルカリおよびアルカリ土類金属；放射性核種、例えば、アクチニドもしくはランタニドもしくは他の同様の遷移元素から、または他の元素、例えば、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８２Ｒｂ、８９Ｓｒ、８８Ｙ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｂａ、１４０Ｌａ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｉｒ、および１９９Ａｕから生じたもの；信号発生物質（その存在に起因する系の検出可能および測定可能な撹乱をもたらす何らか、例えば、蛍光を発する実体、リン光実体および放射線を含む）；信号反射物質、例えば、常磁性実体、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、またはＭｎ；キレートされた金属（キレート剤と会合したとき、例えば、これらが放射性であるかどうかを問わず上記の金属のいずれか）；信号吸収物質、例えば、近赤外線コントラスト剤（例えば、造影剤およびＭＲＩ剤）ならびに電子ビーム乳白剤、例えば、Ｆｅ、ＧｄまたはＭｎ；抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体および抗イディオタイプ抗体を含めた）；抗体フラグメント；アプタマー；ホルモン；生物学的応答修飾物質、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ウイルスおよびウイルスのフラグメント；診断用乳白剤；ならびに蛍光部分が含まれる。カーゴ分子には、捕捉剤、例えば、キレート剤、抗原、抗体、アプタマー、または治療もしくは診断薬を選択的に捕捉することができる任意の部分が含まれる。
【００９１】
他の実施形態において、カーゴまたはカーゴ分子は、農業材料である。本明細書に記載のナノ粒子と共に使用するのに適したこのような材料には、ナノ粒子の物理的な完全性を感知できるほどに妨げることなくナノ粒子と会合（すなわち、カプセル化、コンジュゲートまたは吸着）することができる、インビボもしくはインビトロの治療、診断、または植物もしくは非哺乳動物（微生物を含めた）への施用のための任意の材料が含まれる。例えば、カーゴ分子は、毒素、例えば、ジフテリア毒素、ゲロニン、エクソトキシンＡ、アブリン、モデシン、リシン、またはそれらの毒性フラグメント；金属イオン、例えば、アルカリおよびアルカリ土類金属；放射性核種、例えば、アクチニドもしくはランタニドもしくは他の同様の遷移元素から、または他の元素、例えば、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８２Ｒｂ、８９Ｓｒ、８８Ｙ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｂａ、１４０Ｌａ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｉｒ、および１９９Ａｕから生じたもの；信号発生物質（その存在に起因する系の検出可能および測定可能な撹乱をもたらす何らか、例えば、蛍光を発する実体、リン光実体および放射線を含む）；信号反射物質、例えば、常磁性実体、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、またはＭｎ；信号吸収物質、例えば、コントラスト剤および電子ビーム乳白剤、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、またはＭｎ；ホルモン；生物学的応答修飾物質、例えば、ジベレリン、サイトカイニン、オーキシン、エチレン、アブシジン酸、ウイルスおよびウイルスのフラグメント、プラスミド、プラスチド；殺虫剤（抗菌剤、殺藻剤、アリセルメティック、殺ダニ剤、殺昆虫剤、誘引物質、忌避物質、除草剤および／または殺真菌剤を含めた）、例えば、アセフェート、アシフルオルフェン、アラクロール、アトラジン、ベノミル、ベンタゾン、キャプタン、カルボフラン、クロロピクリン、クロルピリホス、クロルスルフロン、シアナジン、シヘキサチン、シペルメトリン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ダラポン、ジカンバ、ジクロホップメチル、ジフルベンズロン、ジノセブ、エンドサル、フェルバム、フルアジホップ、グリホセート、ハロキシホップ、マラチオン、ナプタラム；ペンジメタリン、ペルメトリン、ピクロラム、プロパクロル、プロパニル、セトキシジム、テメホス、テルブホス、トリフルラリン、トリホリン、ジネブなどでよい。カーゴまたはカーゴ分子には、捕捉剤、例えば、キレート剤、キレートされた金属（これらが放射性であるかどうかを問わず）または農業用薬剤を選択的に捕捉することができる任意の部分が含まれる。
【００９２】
別の実施形態において、カーゴまたはカーゴ分子は、免疫強化剤である。記載されているようにナノ粒子と共に使用するのに適したこのような材料には、ナノ粒子の物理的な完全性を感知できるほどに妨げることなく、ナノ粒子と会合（すなわち、カプセル化、コンジュゲートまたは吸着）することができる、免疫応答を生じさせる任意の抗原、ハプテン、有機部分または有機もしくは無機化合物が含まれる。例えば、運ばれる材料は、マラリア（米国特許第４，７３５，７９９号、その内容全体は参照により本明細書中に組み込まれている）、コレラ（米国特許第４，７５１，０６４号、その内容全体は参照により本明細書中に組み込まれている）および尿路感染症（米国特許第４，７４０，５８５号、その内容全体は参照により本明細書中に組み込まれている）に対するワクチンの生成のために使用される合成ペプチド、抗菌ワクチンを生成するための細菌性多糖類（米国特許第４，６９５，６２４号、その内容全体は参照により本明細書中に組み込まれている）、ならびに疾患、例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎の予防のための抗ウイルス性ワクチンの生成のためのウイルスタンパク質またはウイルス粒子でよい。
【００９３】
免疫強化剤のための担体としてのこれらのナノ粒子の使用によって、アジュバント担体に対して巨大分子構造を与えるために使用される従来の公知の古典的なポリマー構造または合成ポリマーコンジュゲートと関連する能力および構造のあいまい性の不都合が回避される。免疫強化剤のための担体としてのこれらのナノ粒子の使用によって、コンジュゲートのサイズ、形状および表面組成の制御が可能となる。これらの選択肢によって、生物への抗原提示の最適化が可能となり、それによって、従来のアジュバントの使用よりより大きな選択性およびより高い親和性を有する抗体をもたらす。複数の抗原ペプチドまたは基をナノ粒子に結合させること、例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープの両方の付着が望ましいこともある。このような設計は、改善されたワクチンをもたらす。
【００９４】
免疫応答を誘発することができる殺虫剤または汚染物質、例えば、カルバメート、トリアジンまたは有機ホスフェート構成物を含有するものを、ナノ粒子にコンジュゲートすることが望ましいこともある。所望の殺虫剤または汚染物質に対して産生した抗体を、標準的手順によって精製し、適切な支持体上に固定化し、環境中または生物中の殺虫剤または汚染物質をそれに続いて検出するために使用することができる。
【００９５】
実施形態において、カーゴまたはカーゴ分子は、ナノ粒子の物理的な完全性を感知できるほどに妨げることなくこれらのナノ粒子と会合することができる、農業または医薬品材料以外の任意の材料、例えば、金属イオン、例えば、アルカリおよびアルカリ土類金属；信号発生物質（その存在に起因する系の検出可能および測定可能な撹乱をもたらす何らか、例えば、蛍光を発する実体、リン光実体、赤外線、近赤外線、および放射線を含む）；信号反射物質、例えば、常磁性実体、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、またはＭｎ；信号吸収物質、例えば、コントラスト剤および電子ビーム乳白剤、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、またはＭｎ；フェロモン部分；フレグランス部分；色素部分などを含む。カーゴ分子には、捕捉剤、例えば、キレート剤または種々の薬剤を選択的に捕捉することができる任意の部分が含まれる。
【００９６】
カーゴまたはカーゴ分子は、生物活性剤でよい。本明細書において使用する場合、「生理活性」とは、標的とされる実体、例えば、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、受容体、標的とされる疾患部位または標的とされる細胞、標的とされる器官、標的とされる生物［例えば、微生物、植物または動物（哺乳動物、例えば、ヒトを含めた）］、あるいは他の標的とされる部分を検出し、同定し、阻害し、処理し、触媒し、制御し、死滅させ、増強し、または修飾することができる、活性実体、例えば、細胞（例えば、幹細胞、多血小板血漿（幹細胞または細胞培養物のための微小環境／スカフォールドを含めた））、分子、原子、イオンおよび／または他の実体を指す。生物活性剤としてまた含まれるのは、遺伝子療法、ｓｉＲＮＡ、診断、分析、修飾、活性化、アンチセンス、サイレンシング、形質および配列の診断などの分野において広範な適用性を有する遺伝物質（任意の種類のもの（オリゴヌクレオチド、フラグメント、または合成配列））である。これらのカーゴ分子は、細胞トランスフェクション、ならびにナノ粒子および遺伝物質の複合体を含む遺伝物質のバイオアベイラビリティーをもたらし、この複合体をトランスフェクトされる細胞に利用可能なものとすることを含む。
【００９７】
これらのナノ粒子は、種々のインビボ、エキソビボまたはインビトロの診断または治療用途において使用し得る。いくつかの例は、疾患、例えば、がん、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、中枢神経系障害、感染症および心臓障害の治療、診断における使用、例えば、放射線免疫アッセイ、電子顕微鏡観察、ＰＣＲ、酵素結合免疫吸着アッセイ、核磁気共鳴分光法、コントラストイメージング、免疫シンチグラフィー、および殺虫剤、例えば、除草剤、殺真菌剤、忌避物質、誘引物質、抗菌剤または他の毒素の送達である。増殖因子、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球コロニー刺激因子、および他のタンパク質またはこれらのいずれかのフラグメント、抗ウイルス剤などの非遺伝物質がまた含まれる。
【００９８】
本発明はまた、治療用および／または化粧品用ナノ粒子、例えば、活性剤（薬物）または化粧剤を含有するナノ粒子を提供する。ナノ粒子によって、薬剤の標的送達および薬剤の放出の一時的制御を実現することができる。薬剤は、例えば、皮膚の状態または障害を治療するのに有効な薬剤でよい（例えば、本明細書に記載されている他の薬剤の中で、レチノールまたはレチノイン酸、抗体、オリゴヌクレオチド、細胞配合物など）。
【００９９】
本発明はまた、本明細書に記載されているナノ粒子の調製のためのキットを提供する。キットは、選択した量の水溶性タンパク質、１種もしくは複数の緩衝剤、１種もしくは複数の界面活性剤、タンパク質を溶解するための水性アルコール溶媒、またはこれらの組合せを含有することができる。キットはまた、１種または複数のリン脂質を含んでもよく、その量は、選択した比のリン脂質と界面活性剤を提供するのに十分なものでよい。
【０１００】
したがって、本発明は、様々な薬剤をカプセル化したナノ粒子、およびそれらを調製する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、非免疫原性ナノ粒子を生成するためでよい。この方法は、疎水性水不溶性タンパク質を提供すること；タンパク質を水性アルコール溶媒で溶解し、第１の水相溶液を提供すること；界面活性剤およびリン脂質の存在下で緩衝剤を第１の水相溶液に加えて、概ねｐＨ６．８〜概ねｐＨ７．４のｐＨを有する第２の水相溶液を生成すること；第２の水相溶液を処理し、分散液中の粒子の直径サイズの低減をもたらすこと；任意の残留溶媒を蒸発させ、概ね４００ｎｍ未満の直径サイズを有するナノ粒子を生成させることを含むことができる。次いで、ナノ粒子は、単離および収集のために遠心分離することができる。
【０１０１】
この方法は、遠心分離に続いてナノ粒子を凍結乾燥させることを含むことができる。この方法は、大気圧へのナノ粒子の曝露を制限する条件下でナノ粒子を保存することをさらに含むことができる。ベースタンパク質は、例えば、選択したグレードのゼイン、例えば、白色ゼインでよい。
【０１０２】
緩衝剤は、クエン酸緩衝液でよい。界面活性剤は、ポロキサマーでよく、リン脂質は、レシチンでよい。界面活性剤とリン脂質の比は、約２：１でよい。粒子の直径サイズの低減をもたらす第２の水相溶液の処理は、ナノ粒子を、超音波剪断、高圧均質化、またはこれらの組合せに供することをさらに含むことができる。他のナノ粒子調製物について、例えば、界面活性剤は存在しなくてもよく（例えば、β−カゼイン−デキストランナノ粒子もしくはゼイン−β−カゼイン−アラビアゴムナノ粒子）、または他の界面活性剤を使用し得る（例えば、ゼインナノ粒子を調製するために非イオン性界面活性剤に加えてラウリル硫酸ナトリウムが使用される場合）。
【０１０３】
この方法は、第１の相の溶液の形成におけるタンパク質に、ナノ粒子カプセル化のための分子を加えることを含むことができる。分子は、治療的に活性の非免疫原性ナノ粒子を提供するための、対象への投与のために選択される治療物質でよい。タンパク質はまた、ＰＥＧ化および／または架橋することができる。
【０１０４】
本発明は、疎水性水不溶性タンパク質中に治療分子をカプセル化することによって形成される非免疫原性ナノ粒子を含む治療組成物をさらに提供し、ナノ粒子は、約４００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態において、粒子の直径は、約１００ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約１００ｎｍ〜約３００ｎｍである。本発明はまた、治療剤を含む薬理学的治療量の非免疫原性ナノ粒子を提供し、ナノ粒子は、約４００ｎｍ未満の平均直径を有する。ナノ粒子は、治療剤によって治療することができる疾患もしくは状態に罹患している、または罹患する危険性がある（すなわち、それを必要としている）対象における疾患もしくは状態の治療において使用するための医薬の製造のために使用することができる。
【０１０５】
タンパク質、ポリマー、およびナノ粒子構成要素の変形形態
本明細書に記載されているゼインナノ粒子の変形形態も調製することができる。例えば、ゼインの代わりに、他の疎水性プロラミンタンパク質、例えば、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンを、ナノ粒子形成のためのタンパク質として使用し得る。したがって、グリアジンナノ粒子、ホルデインナノ粒子、およびカフィリンナノ粒子は、本明細書に記載されているゼインナノ粒子と同様に、調製および使用することができる。
【０１０６】
さらに、ナノ粒子のタンパク質は、部分、例えば、ＰＥＧにコンジュゲートして、ナノ粒子の表面を修飾することができる。表面修飾部分は、ＰＥＧ部分または他の水溶性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、キトサン、デキストラン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）などでよい。これらの水溶性ポリマーは、疎水性プロラミンタンパク質、例えば、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンのいずれかにコンジュゲートして、ナノ粒子の表面修飾を形成することができる。
【０１０７】
同様に、疎水性ポリマーは、プロラミンナノ粒子に複合体化、混合またはコンジュゲートすることができる。このようなポリマーは、例えば、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−コグリコール酸、ポリプロピレンオキシド、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、スペルミン、ポリリシン、ポリエチレンイミンまたはポリアクリレート（例えば、ポリメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルアクリレートなど）を含むことができる。天然ポリマーはまた、プロラミンナノ粒子、例えば、他のタンパク質ポリマー（アルブミン、カゼイン、ゼラチンなど）、および炭水化物ポリマー、例えば、キトサン、デキストラン、アラビアゴム、デキストラン−グラフトカゼイン、アルギネートまたはこれらの組合せに複合体化、混合またはコンジュゲートすることができる。同様に、脂肪酸はまた、プロラミンナノ粒子表面に、混合、複合体化またはコンジュゲートすることができる。このような脂肪酸の例には、ステアリン酸、パルミチン酸、ホスファチジルエタノールアミン、および／またはオレイン酸を含むことができる。これらのポリマーおよび／または脂肪酸は、疎水性プロラミンタンパク質、例えば、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンのいずれかにコンジュゲートして、表面修飾したナノ粒子を形成することができる。
【０１０８】
ゼインはタンパク質であるため、ナノ粒子の形成においてゼインを使用することのさらなる利点は、ゼインが、特定の組織への薬物ターゲッティングおよび他の生物医学的用途のために標的リガンド、造影剤、薬物および他のポリマーに付着させるのに使用することができる多数の表面官能基を有するという点で実現される。他のまたはさらなる修飾を、プロラミン疎水性コアまたはナノ粒子表面に行うことができる。これらは、刺激反応性要素、例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリレートをナノ粒子にコンジュゲートして、ｐＨ感受性ナノ粒子を調製し、またはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をナノ粒子にコンジュゲートして、温度感受性ナノ粒子を調製することを含み得る。さらに、例えば、架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド、ゲニピン、クエン酸、ポリシアル酸（ＰＳＡ）などを使用してプロラミンナノ粒子を架橋して、薬物放出を制御し、薬物カプセル化の収率および効率性を増加させることができる。
【０１０９】
本明細書に記載の方法を使用して形成されたゼインナノ粒子は、例えば、薬物の局所投与のために、体外で特に重要な用途を有する。例えば、薬物を充填したゼインナノ粒子を使用して、例えば、化粧品および医薬品産業が対象とする分子をカプセル化し、分子の放出を持続させることができる。プロラミンナノ粒子を使用して、分子を有害な環境要因、例えば、湿気、酸化、光などから保護することができ、また特定の薬物に対する患者の皮膚の感受性を低減させることができる。本明細書に記載のように、プロラミンをまた他の天然および合成のポリマーと合わせて、様々な局所施用のために独特の特性を有する新規なナノ粒子を設計することができる。
【０１１０】
ナノ粒子の医薬製剤
本明細書に記載されているナノ粒子を使用して、治療医薬組成物を調製することができる。ナノ粒子は、水性分散液の形態で、または凍結乾燥したナノ粒子の乾燥粉末として、組成物に加えてもよい。ナノ粒子は、種々の形態で、医薬組成物として配合し、哺乳動物宿主、例えば、ヒト患者に投与することができる。これらの形態は、選択した投与経路、例えば、局所投与に特に適合させることができる。
【０１１１】
本明細書に記載されているナノ粒子は、薬学的に許容されるビヒクル、例えば、不活性な賦形剤または公知の局所担体と組み合わせて局所的に投与し得る。局所組成物および調製物は典型的には、少なくとも０．１重量％の活性治療剤または診断薬を含有する。組成物および調製物中の薬剤の重量百分率は変化させることができ、また好都合には所与の単位剤形の重量の約２％〜約６０％でよい。ナノ粒子を含有するこのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効量レベルが得られるような量である。分散液、エアゾール製剤、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、シャンプーなどはまた、下記の１つまたは複数を含有し得る。結合剤、例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチン。単位剤形は、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば、植物性油またはポリエチレングリコールを含み得る。様々な他の材料が存在して、単位剤形の物理的形態を改変し得る。局所製剤は、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベンに加えて、ナノ粒子、および任意選択で色を加えるための色素を含有し得る。単位剤形の調製において使用される任意の材料は、用いられる量において、薬学的に許容され、実質的に無毒性であるべきである。さらに、ナノ粒子分散液または凍結乾燥したナノ粒子は、さらなる持続放出調製物およびデバイス中に組み込み得る。
【０１１２】
ナノ粒子の分散液は、任意選択で緩衝液と混合した水中で、または他の薬学的に許容される溶媒、もしくはこれらの混合物中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有し得る。最終的な剤形は、製造および保存の条件下で無菌、流体および安定的であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物性油、無毒性グリセリルエステル、および適切なこれらの混合物を含む液体分散媒でよい。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサールなどによって実現することができる。多くの場合、いくつかの製剤中に等張剤、例えば、糖、緩衝液、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１１３】
無菌溶液は、必要に応じて種々の上記で列挙した他の成分と共に、必要とされる量のナノ粒子を適当な溶媒中に組み込み、それに続く濾過滅菌によって調製することができる。無菌溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技術を含むことができ、これによって、ナノ粒子の、および従前に無菌濾過した溶液、ゲル、クリーム、ローション、軟膏などの中に存在する任意のさらなる所望の成分の粉末を生じさせる。
【０１１４】
局所投与のために、例えば、固体、液体、ゲル、クリーム、軟膏、またはペーストでよい皮膚科学的に許容される担体と組み合わせて、組成物または製剤としてナノ粒子を皮膚に投与することが一般に望ましい。有用な固体担体には、微粉化した固体、例えば、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが含まれる。有用な液体担体は、水、または水−アルコール／グリコール／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ブレンドを含み、ナノ粒子を、任意選択で無毒性界面活性剤の補助により有効なレベルで液体担体中に分散させることができる。アジュバント、例えば、フレグランスおよびさらなる抗菌剤を加えて、所与の使用のための特性を最適化することができる。流体組成物を、吸収性パッドから付着させ、包帯および他の包帯剤を含浸させるために使用し、またはポンプタイプもしくはエアゾール噴霧機を使用して患部上に噴霧することができる。
【０１１５】
増粘剤、例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース、または修飾鉱物材料をまた、液体担体と共に用いて、使用者の皮膚への直接の施用のための塗り広げられるペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成させることができる。
【０１１６】
活性剤（例えば、薬剤を充填したナノ粒子）を皮膚に送達するための皮膚科学的組成物の例は、当技術分野において公知である；例えば、米国特許第４，６０８，３９２号（Ｊａｃｑｕｅｔら）、同第４，９９２，４７８号（Ｇｅｒｉａ）、同第４，５５９，１５７号（Ｓｍｉｔｈら）、および同第４，８２０，５０８号（Ｗｏｒｔｚｍａｎ）を参照されたい（これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれている）。このような皮膚科学的組成物は、本明細書に記載されているナノ粒子製剤と組み合わせて使用することができる。
【０１１７】
本明細書に記載されている薬物を充填したナノ粒子の有用な投与量は、動物モデルにおけるこれらのインビトロの活性、およびインビボの活性を比較することによって決定することができる。マウス、および他の動物における有効量の、ヒトへの外挿のための方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照によりその全体が組み込まれている米国特許第４，９３８，９４９号（Ｂｏｒｃｈら）を参照されたい。治療において使用するのに必要とされる、ナノ粒子中に充填された化合物、または活性塩、プロドラッグ、またはその誘導体の量は、選択した特定の化合物または塩によってだけではなく、投与経路、治療を受ける状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によってもまた変化し、究極的に担当の医師または臨床医の裁量である。
【０１１８】
治療剤を充填したナノ粒子は、例えば、単位剤形毎に５〜１０００ｍｇ／ｍ２、好都合には１０〜７５０ｍｇ／ｍ２、最も好都合には、５０〜５００ｍｇ／ｍ２の活性成分を含有する単位剤形で好都合には投与することができる。所望の用量は、好都合には、単回用量で、または適当な間隔で、例えば、１日当たり２つ、３つ、４つもしくはそれを超える部分用量として投与する、分割用量として提示し得る。部分用量自体を、例えば、いくつかの別々のゆるやかに間隔を開けた投与にさらに分割し得る。
【０１１９】
本明細書に記載されている薬物を充填したナノ粒子は、有効な抗炎症剤でよく、ナノ粒子にカプセル化されていない抗炎症剤と比較して、より高い効能および／または低減した毒性を有する。本発明は、哺乳動物において炎症を治療する治療方法を提供し、これは、（例えば、皮膚の）炎症を有する哺乳動物に、有効量の本明細書に記載されている組成物または製剤を投与することを含む。哺乳動物は、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウシなどを含む。
【０１２０】
下記の実施例は、上記の発明を例示することを意図し、その範囲を狭めるものと解釈するべきではない。実施例は、本発明を実施することができる多くの他の方法を示唆することを当業者は容易に認識する。本発明の範囲内に留まる一方で、多数の変形および改変を行い得ることを理解すべきである。
【実施例】
【０１２１】
様々な実施形態によるナノ粒子、例えば、約７５ｎｍ〜約４００ｎｍの平均直径を有するものを、下記の実施例に記載するように調製および特性決定した。
【実施例１】
【０１２２】
ゼインナノ粒子の調製
第１の水相において、１３．５ｍｇの白色ゼインを、３ｍＬのエタノールおよび０．２５ｍＬの水の混合物に溶解した。ゼインの濃度または使用した溶媒の組合せは、最適であった。しかし、所望の異なるサイズ範囲のナノ粒子を、ゼインの濃度または溶媒組成を改変することによって生成することができる。約２０秒間のプローブ超音波処理を行うことによってゼインの溶解を補助した。次いで、第１の水相のこのように得られた溶液を、超音波エネルギー（１．３９ｋＷ／ｈ、３７％振幅、１０分間、１０秒のパルスオンタイムおよび１秒のオフタイム）を一定に加えながら、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の１５ｍＬの溶液、ならびにレシチン（０．４５％ｗ／ｖ）およびプルロニック（登録商標）Ｆ６８（０．９％ｗ／ｖ）の組合せに滴下で添加した。超音波剪断工程の間、分散液を氷浴中に保持して、温度を約１０℃に維持した。次いで、エタノールが完全に蒸発するまで、分散液を３００〜５００ｒｐｍで室温（−２３℃）にて磁気撹拌子上に入れた。エタノールの完全な蒸発の後、ナノ粒子を精製し、残留材料および／または表面活性剤を除去した。
【０１２３】
脱イオン化クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による繰返しの洗浄、および５０００Ｄａの分画分子量の遠心濾過機を使用した超遠心分離（３９５０ｇ、５０分間）によって精製が達成された。ゼインナノ粒子のこのように得られた水性懸濁液（クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）（４ｍＬ）に、２％ｗ／ｖトレハロースを凍結防止剤として加え、次いで、ナノ粒子を−８０℃に保持し、固体ケークを形成させた。次いで、材料を−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。次いで、ナノ粒子を、デシケーターにおいて１０℃にて冷蔵庫中で保存した。図１を参照されたい。ゼインナノ粒子を調製するためのさらなる方法は、参照により本明細書中に組み込まれているＷＯ２００９／１３７１１２（Ｐｅｒｕｍａｌら）によって記載されている。
【０１２４】
代替の方法において、第２の相の溶液の超音波剪断は、粒径を低減させるために、分散液を高圧下で狭いオリフィスを通して通過させることによる高圧ホモジナイザーによって補充または置き換えることができる。高濃度のゼインを使用するときに、より小さなサイズ範囲のナノ粒子を生成するのにこれは特に有用である。また、高圧均質化を、ゼインナノ粒子を調製するためのスケールアップした方法として使用することができる。この方法の例を、下記の実施例２に記載する。
【実施例２】
【０１２５】
高圧ホモジナイザーを使用したゼインナノ粒子の調製
ある量の０．６５％ｗ／ｖ白色ゼインを、６ｍＬのエタノールおよび０．５０ｍＬの水の混合物に溶解した。第１の水相のこのように得られた溶液の組成を変化させ、約ｐＨ６〜約ｐＨ７の所望のｐＨを得た。ゼインの溶解を、プローブ超音波処理を約２０秒間行うことによって補助した。次いで、第１の水相のこのように得られた溶液を、超音波エネルギー（１．３９ｋＷ／ｈ、３７％振幅、２分間、１０秒のパルスオンタイムおよび１秒のオフタイム）を一定に加えながら、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４を有する）の３０ｍＬの溶液、ならびにレシチン（０．４５％ｗ／ｖ）およびプルロニック（登録商標）Ｆ６８（０．９％ｗ／ｖ）の組合せ中に滴下で添加した。超音波剪断工程の間、分散液を氷浴中に保持して、温度を約１０℃に維持した。次いで、このように得られた粗い懸濁液を、０．１〜０．２５ｍｍのオリフィスサイズを有する高圧ホモジナイザー（ＮＡＮＯ  ＤＥＢＥＥ（登録商標）、ＵＳＡ）に２０，０００ｐｓｉにて５分間通過させた。高圧均質化工程の間、冷却機を使用して高圧ホモジナイザー中に水を循環させることによって、温度を概ね１０℃に維持する。続いて、エタノールが完全に蒸発するまで、分散液を３００〜５００ｒ．ｐ．ｍで室温にて磁気撹拌子上に保持した。完全な蒸発の後、ナノ粒子を精製し、残留材料または表面活性剤を除去した。
【０１２６】
クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による繰返しの洗浄、および５０００Ｄａの分画分子量の遠心濾過機を使用した超遠心分離（３９５０ｇ、５０分間）によって精製が達成された。ナノ粒子の４ミリリットルの水性懸濁液（クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を、３５ｍｇの２％ｗ／ｖトレハロースと混合し、−８０℃に保持し、固体ケークを形成させた。次いで、ケークを−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。
【０１２７】
選択した分子、例えば、治療薬が、ナノ粒子内にカプセル化される場合、実施例１および２に記載したこの方法は、ナノ粒子の形成のために適合させることができる（例えば、図２を参照されたい）。治療薬は、本明細書に記載の、例えば、クマリン、レチノール、レチノイン酸、またはそのエステルでよい。
【０１２８】
ゼイン粒子の調製に対する他の変形は、図３および図４において見ることができる。第１の方法において、ゼイン粒子を、ｐＨを制御したナノ沈殿を使用してβ−カゼインおよびアラビアゴムにより安定化させる（図３を参照されたい）。第２の方法において、デキストランの還元末端（アルデヒド）を、α−アミノ酸カゼインにコンジュゲートする。手短に言えば、ビーカー中で２０ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で４０ｍｇのβ−カゼインを、１００ｍｇのデキストラン（１１ｋＤａ）と混合した。ビーカーをアルミ箔で覆い、７０℃で一晩撹拌した。図４に示すように、デキストラン−グラフトβ−カゼインを安定剤として使用して、ゼイン−デキストラン−カゼインナノ粒子を調製した。
【０１２９】
さらに、ゼインおよびカゼインを含むナノ粒子を調製し得る（下記の実施例１１を参照されたい）。
【０１３０】
ゼイン−デキストランナノ粒子。さらなる変形において、５０ｍｇのゼインおよびデキストラン（１１ｋＤａ）を、１０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。溶液を室温で２４時間撹拌した。撹拌した後、溶液を透析バッグ（分画分子量、１０，０００）中に導入し、１リットルの蒸留水に対して２日間透析し、その間に蒸留水を第１日目は２時間毎に交換し、有機溶媒を完全に除去した。このように得られた懸濁液を、分析のために使用し、またはフリーズドライした。この方法は、タンパク質と多糖類との相互作用に依存する。
【０１３１】
【表１】
2014515007.tif 000004
【実施例３】
【０１３２】
薬剤をカプセル化したゼインナノ粒子の調製
分子をカプセル化したナノ粒子を形成させる方法の一例は、下記の通りである。１３．５ｍｇの量の白色ゼインを３ｍＬのエタノールおよび０．２５ｍＬのＮａＯＨ（０．０１Ｎ）の混合物に溶解し、ｐＨを６〜７に調節した。溶液に、６．６ｍｇの６，７ヒドロキシクマリンを加え、混合物を２０秒間プローブ超音波処理に供し、溶解を確実なものにした。様々な実施形態において、６，７−ヒドロキシクマリンは、約０．０３ｍｍｏｌ〜約０．０５ｍｍｏｌの本明細書に記載されている異なる薬剤、例えば、レチノールまたはその誘導体と置き換えることができる。いくつかの実施形態において、約０．１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗ、または約０．３％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗの活性剤、例えば、レチノールを用いることができる。このように得られた溶液を、一定の超音波エネルギー（１．３９ｋＷ／ｈおよび３７％振幅、１０分間、１０秒のパルスオンタイムおよび１秒のオフタイム）下で、６７．５ｍｇのレシチンおよび１３５ｍｇのプルロニック（登録商標）Ｆ６８を含有する１５ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に滴下で添加した。超音波処理工程の間、溶液を氷浴中に保持し、温度を概ね１０℃に維持した。続いて、エタノールが完全に蒸発するまで、分散液を３００〜５００ｒ．ｐ．ｍで室温にて磁気撹拌子上に入れた。アルコールの完全な蒸発に続いて、ナノ粒子を精製し、過剰な薬物および／または表面活性剤を除去した。
【０１３３】
クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による繰返しの洗浄、および５０００Ｄａの分画分子量の遠心濾過機を使用した超遠心分離（３９５０ｇ、５０分間）によって精製が達成された。クマリンを充填したナノ粒子の４ミリリットルの水性懸濁液（クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を、３５ｍｇのトレハロースと共に加え、−８０℃に保持し、固体ケークを形成させた。次いで、固体ケークを−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。
【０１３４】
白色ゼインを、適切なベースタンパク質として使用することができることが示されてきた。白色ゼインは、概ね１００ｎｍ〜概ね４００ｎｍの所望の狭いサイズ範囲内の再現性のあるナノ粒子を与え、一方、黄色ゼインは、より広範な粒径分布を有するより大きな粒子を与える。この差異を、下記の表３−１および表３−２に例示する。表１は、上記の実施例１および実施例３の方法によって黄色ゼインから作製したナノ粒子のデータを提供する。ブランクナノ粒子およびクマリンを充填したナノ粒子の両方を示す。それぞれの粒径は、それぞれ概ね４６０ｎｍおよび６１０ｎｍであることを見ることができる。比較すると、下記の表２に示すように、ブランクナノ粒子、ならびに実施例１および実施例３の方法によって白色ゼインから作製したクマリンを充填したナノ粒子はより小さい。図５および図６は、ブランクナノ粒子、およびクマリンを充填したゼインナノ粒子の電子顕微鏡および原子間力画像を示す。
【０１３５】
【表２】
2014515007.tif 000005
【０１３６】
【表３】
2014515007.tif 000006
【０１３７】
黄色ゼイン中の顔料は、ゼインの溶解性、および所望のサイズ分布のナノ粒子の形成に影響を与えるように思われる。一貫して所望の小さなサイズ範囲内である天然ポリマー、例えば、タンパク質を使用して粒子を調製することは特に難易度が高いことが見出されてきた。しかし、本明細書に記載の方法は、適切なグレードのタンパク質、例えば、白色ゼインを使用して、一貫して所望のサイズ範囲のナノ粒子を生成する。極めて、本明細書に記載の方法は、８０ｎｍ〜１００ｎｍほど小さな直径サイズを有するナノ粒子を生成することができ、かつ生成してきた。上記の実施例２に記載するように超音波剪断の一部を高圧均質化で置き換える場合、ブランクナノ粒子のこのように得られた粒径はまた、上記の表２に示す粒径（すなわち、概ね２２０±１５ｎｍの粒径および０．４±０．０７のＰＤＩを有する）と同様である。
【０１３８】
所望のサイズ範囲内である、ナノ沈殿法によって生成されたナノ粒子の収率は、概ね６０％超であることが見出されてきた。この方法は、生成した粒子が、体内に投与されたときに、免疫原性反応を回避するために、主に概ね４００ｎｍ未満の範囲内の直径を有し、典型的には概ね１００ｎｍ〜概ね３００ｎｍの相対的に狭い直径サイズ分布を有するという点で重要である。ブタ血液を使用してインビトロで試験したときに、有利なことには、本明細書に記載の方法によって生成したものなどの概ね１００〜概ね４００ｎｍの直径サイズ範囲のゼインナノ粒子は、食細胞によって取り込まれず、一方、概ね４００ｎｍ超の直径サイズのより大きな粒子は、食細胞によって急速に取り込まれる。これは、ゼインナノ粒子の粒子直径サイズをより小さなサイズ範囲に制御することによって、ナノ粒子への食作用が回避されることを示す。
【０１３９】
直径が約１００〜約４００ｎｍのゼインナノ粒子は非免疫原性であり、一方、約４００ｎｍ超の直径を有するゼインナノ粒子はかなりの免疫応答を生じさせたことをマウスにおける免疫原性研究は示した（抗ゼイン抗体は、食塩水対照と比較して、２倍〜４倍高かった）。約４００ｎｍ未満の直径を有するナノ粒子の調製および使用は、粒子の疎水性タンパク質によってもたらされるかなりの免疫原性を回避するために重要であることをこれらの結果は示す。
【０１４０】
ナノ粒子のサイズを制御する能力は、この方法の第２の水相中の溶液のｐＨを制御することによって部分的に達成される。下記の表３−３におけるデータは、低ＰＤＩを有するより小さなサイズのナノ粒子が、約６．８〜約７．４のｐＨで達成されることを例示する。
【０１４１】
【表４】
2014515007.tif 000007
【０１４２】
ナノ粒子形成のサイズを制御することにおけるさらなる重要な要因は、ナノ粒子を安定化させ、粒子凝集を防止するために使用される界面活性剤およびリン脂質の組合せである。ポロキサマーおよびレシチンの組合せ、例えば、２：１比（例えば、０．９：０．４５％、ｗ／ｗ）のものは、所望のサイズ範囲のナノ粒子を生成する。界面活性剤またはリン脂質が単独で使用される場合、下記の表３−４のデータによって示されるようにより大きな粒子が得られる。
【０１４３】
【表５】
2014515007.tif 000008
【０１４４】
第２の水相のための緩衝剤の選択は、ナノ粒子形成の間に最適ｐＨを維持するために重要であるだけでなく、それに続く凍結乾燥のためにまた重要である。例えば、緩衝剤が第２の水相溶液中で使用されない場合、またはｐＨを調節するために０．１ＮのＨＣｌを使用する場合、このように得られたナノ粒子は、サイズがより大きく、より広範なサイズ範囲またはＰＤＩを有する。図７に示すように、クエン酸緩衝液の使用は、最も小さな粒径を実現した（１０９±１２ｎｍ）。他の緩衝剤、特に、ホスフェートの使用は、凍結乾燥後、ゼインナノ粒子の粒径の２〜３倍の増加をもたらす。
【０１４５】
図７のグラフは、ホスフェートを第２の水相からの溶液中の緩衝剤として使用する方法によって調製し、凍結乾燥後に得られるゼインナノ粒子が、クエン酸緩衝液を第２の水相中の緩衝剤として使用して調製したナノ粒子と比較して、非常により大きな粒子を生成したことを例示する。リン酸緩衝液における粒径の増加は、ｐＨの低下に起因するフリーズドライ温度での緩衝液の結晶化および沈殿により得る（Ｓｈａｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １９（２００２）１９５〜２０１）。この問題は、フリーズドライ温度の間のｐＨの変化に効果的に抵抗するクエン酸緩衝液を使用することによって解決される。ゼイン中のアミノ基は、ゼインナノ粒子をまた安定化することができるクエン酸によって架橋することができる（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．  ２５（２００９）１３９〜１４６）。
【０１４６】
ゼインは生分解性タンパク質であり、また合成ポリマーより生体適合性であることは留意すべきである。ゼインは、食品医薬品局標準によってＧＲＡＳ（一般に安全であると見なされる）ポリマーとして一覧表示されている（Ｗｈｅａｔ  ｇｌｕｔｅｎ，ｃｏｒｎ  ｇｌｕｔｅｎ  ａｎｄ  ｚｅｉｎ  ｆｉｌｍ：ａｆｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＲＡＳ  ｓｔａｔｕｓ，Ｆｅｄ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ５０（１９８５）８９９７〜８９９９）。したがって、本明細書に記載の方法は、カプセル化したカーゴ分子または異なる生理化学的特性の薬物によりゼインナノ粒子を調製するのに適している。下記の表３−５は、様々な実施形態による、本明細書に記載の方法を使用したナノ粒子によってカプセル化し得る様々な分子を例示する。ナノ粒子カプセル化において使用し得る分子の数またはタイプは、本明細書において留意したものに限定されない。
【０１４７】
【表６】
2014515007.tif 000009
【０１４８】
このように、様々なカーゴ分子、例えば、６，７−ヒドロキシクマリンにより形成されたナノ粒子を、粒径および免疫原性を制御して首尾よく調製した。６，７−ヒドロキシクマリンを充填した粒子の調製の例を上記で記載し、一実施形態によるその調製を図８に例示する。
【０１４９】
本明細書に記載のように調製されたゼインナノ粒子は、粒子によるある期間にわたる薬物放出を持続させることを可能とするゼインナノ粒子の水不溶性に部分的に起因して、カプセル化した分子または薬物の有益でありおよび／または有利な持続放出を実現する。例えば、図８は、上記の実施例２に記載されている方法によって作製されたクマリンを充填したナノ粒子についてのインビトロの放出プロファイルを示す。データは、インビトロで、７日までの期間にわたり薬物の持続放出があり、酵素の存在下でより高い放出速度が観察されることを示す。データは、ゼインナノ粒子の放出が、ナノ粒子からの薬物の遅い拡散、およびゼインナノ粒子の酵素による遅い分解によって媒介されることを示す。カプセル化した薬物の他の例は、最初のバースト、それに続く概ね２４時間後の持続放出による混合状態を示した。
【０１５０】
様々なカプセル化した分子についての薬物放出プロファイルは、ゼインナノ粒子が、送達の非経口ならびに非経口以外の投与経路（経口、口腔、経皮的、経鼻、肺および眼の経路を含めた）によって多用途で安全な薬物送達ビヒクルとして使用することができることを示す。治療、診断および美的用途、または療法のために、これらに限定されないが、医薬品および化粧品用物質（例えば、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣおよびその誘導体、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ビタミンＥおよびその誘導体、例えば、酢酸トコフェロール、コエンザイムＱ１０、ミノキシジル、グリーンツリー抽出物、アロエベラ、ヒドロキノン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ビサボロール、グリコール酸、乳酸、βヒドロキシブタン酸、サリチル酸、１０−ヒドロキシデカン酸、フェルラ酸、パンテノール、バイオティック、アルブチン、ケルセチン、ヘスペリジンなど、またはこれらの組合せ）を含めて多くの他の分子、粒子および薬物を、同様にカプセル化し得る。さらに、本明細書に記載の方法によって形成されたナノ粒子の相対的により小さなサイズによって、分子を充填した（例えば、薬物を充填した）ゼインナノ粒子は、食細胞によって認識および排除されることなく体内を長期間循環することができる。
【０１５１】
図９のデータは、ブタ血液を使用してインビトロで試験したときに、１００〜４００ｎｍのサイズ範囲のゼインナノ粒子が血液食細胞によって取り込まれず、一方、＞４００ｎｍのサイズのより大きな粒子は食細胞によって急速に取り込まれることを例示する。このように、食細胞による取込みは、より小さなサイズ範囲のゼインナノ粒子の粒径を制御することによって回避されることを示すことができる。マウスにおける免疫原性研究は、１００ｎｍ〜４００ｎｍのサイズ範囲のゼインナノ粒子が非免疫原性であることを示した。他方、図１０に示すように、＞４００ｎｍのサイズを有するゼインナノ粒子は、対照と比較して、有意な免疫応答（２倍〜４倍）を生じさせた。
【０１５２】
ナノ粒子を作製するために使用するゼインの細胞毒性作用を、細胞増殖研究においてブタ腸上皮細胞（ＩＰＥＣ−Ｊ２）を使用して調査した。例示的細胞毒性研究の結果を図１１に示す。任意の濃度の緩衝液による対照処理と比較して、有意な程度の細胞毒性は白色ゼインおよび黄色ゼインの間で観察されなかった。
【実施例４】
【０１５３】
架橋ナノ粒子
本明細書に記載のように調製されたナノ粒子の酵素的安定性は、架橋によってさらに増強させることができる。図１２は、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用した、架橋ブランクゼインナノ粒子の調製のための一般方法を例示する。このような調製の具体例は、下記の通りである。
【０１５４】
上記のナノ沈殿法を使用して、ブランクゼインナノ粒子を調製した。第２の水相のプローブ超音波処理に続いて、架橋剤を加えた。ナノ粒子を、さらに２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、遠心濾過を使用してナノ粒子を精製し、次いで、凍結乾燥した。白色ゼイン（０．０１３５ｇ）を、３ｍＬのエタノールおよび０．２５ｍＬの水の混合物に溶解した。次いで、第１の相の溶液を、超音波エネルギー（１．３９ｋＷ／ｈおよび３７％振幅、１０分間、１０秒のパルスオンタイムおよび１秒のオフタイム）を一定に加えながら、ｐＨ７．４を有し、かつ０．４５％ｗ／ｖレシチンおよびプルロニック（登録商標）Ｆ６８（０．９％ｗ／ｖ）の組合せを含有する１５ｍＬのクエン酸緩衝液に滴下で添加した。超音波処理工程の間に、溶液を氷浴中に保持し、温度を約１０℃に維持した。溶液に、０．５ｍＬの２５％ｗ／ｖグルタルアルデヒドを加え、溶液を、３００〜５００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で３〜２４時間インキュベートした。残留するグルタルアルデヒドを、１０％ｗ／ｖメタ重亜硫酸塩で中和した。続いて、エタノールが完全に蒸発するまで、分散液を３００〜５００ｒｐｍで室温にて磁気撹拌子上に入れた。アルコールの完全な蒸発後、ナノ粒子を精製し、残留材料を除去した。
【０１５５】
クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による繰返しの洗浄、および５０００Ｄａの分画分子量の遠心濾過機を使用した超遠心分離（３９５０ｇ、５０分間）によって精製が達成された。ナノ粒子の水性懸濁液に、３５ｍｇのトレハロースを加え、溶液を−８０℃に保持し、固体ケークを形成させた。次いで、材料を−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。特に、他の架橋剤、例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳおよびゲニピンについて、図１２の方法において使用されるとき、反応時間は、２４〜７２時間で変化し得る。
【０１５６】
ゼイン中の表面アミノ基は、架橋に関与している。トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を使用して、架橋の前および後のゼイン中の遊離アミノ基を推定した。４４０ｎｍ波長の吸光度に対する非架橋および架橋ゼインの増加する濃度によって標準曲線を生成した。式を使用して架橋効率を計算した。
架橋効率の％＝［ａ−ｂ／ａ］×１００
式中、ａ＝吸光度に対する非架橋ゼインの濃度の勾配、およびｂ＝吸光度に対する架橋ゼインの濃度の勾配。標準曲線を構築するために使用するゼインの濃度範囲は、０．３５７ｍｇ／ｍＬ〜１２ｍｇ／ｍＬであり、相関係数は、０．９９９４である。異なる架橋剤を使用したゼインナノ粒子中の架橋の程度を図１３に示す。架橋効率は、概ね７０％から概ね１００％で変化した。架橋の程度は、架橋剤によって概ね３時間から３日までの範囲で反応時間を変化させることによって変化させることができる。ここで示した架橋剤は単に例であり、本明細書に記載の方法は、開示された架橋剤のみの使用に限定されない。他の架橋剤、例えば、ポリカルボン酸（クエン酸または１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸）を使用することができる。
【実施例５】
【０１５７】
架橋ローダミンをカプセル化したナノ粒子
上記の実施例は、ブランクゼインナノ粒子の調製を例示した。架橋はまた、特定の分子を含有するナノ粒子の形成において行うことができる。ナノ粒子中に水溶性色素であるローダミンを調製する具体例は、下記の通りである（図１４を参照されたい）。この方法は、他の化合物、例えば、レチノールおよび本明細書に記載されている関連する化合物をカプセル化するために使用することができる。
【０１５８】
ローダミン１２３は、３８０．８２の分子量および１．２のＬｏｇＰを有する。これは、水中で微溶性であり、メタノール、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミド中で完全に可溶性である緑色の蛍光色素である。
【０１５９】
【化２】
2014515007.tif 000010
【０１６０】
白色ゼイン（０．０１３５ｇ）を、３ｍＬのエタノールおよび０．２５ｍＬの水（０．２５ｍＬ）の混合物に溶解した。第１の水溶液に、０．０００５ｇのローダミン−１２３を加えた。このように得られた溶液を、超音波エネルギー（１．３９ｋＷ／ｈおよび３７％振幅、１０分間、１０秒のパルスオンタイムおよび１秒のオフタイム）を一定に加えながら、ｐＨ７．４を有し、かつ０．０６７５ｇのレシチンおよび０．１３５ｇのプルロニック（登録商標）Ｆ６８の組合せを含有する１５ｍＬのクエン酸緩衝液中に滴下で添加した。超音波処理工程の間、溶液を氷浴中に保持し、温度を約１０℃に維持した。次いで、０．５ｍＬのグルタルアルデヒド（２５％ｗ／ｖ）を加え、３００〜５００ｒｐｍにて撹拌しながら３７℃にて３時間インキュベートした。残留する架橋剤を、１０％ｗ／ｖメタ重亜硫酸ナトリウムで中和した。続いて、エタノールが完全に蒸発するまで、分散液を３００〜５００ｒｐｍで室温にて磁気撹拌子上に入れた。アルコールの完全な蒸発の後、ナノ粒子を超遠心分離によって精製した。
【０１６１】
クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による繰返しの洗浄、および５０００Ｄａの分画分子量の遠心濾過機を使用した超遠心分離（３９５０ｇ、５０分間）によって精製が達成された。ローダミンを充填したナノ粒子の水性懸濁液（クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に、３５ｍｇのトレハロースを加え、溶液を−８０℃で保持して、固体ケークを形成させ、次いで、これを−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。
【０１６２】
非架橋および架橋（架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用）ローダミン粒子の粒径、多分散性指数およびゼータ電位を、表５−１に示す。
【０１６３】
【表７】
2014515007.tif 000011
【０１６４】
ｐＨ２でのインビトロの薬物放出は、ゼインナノ粒子が架橋しているときより遅く（図１５）、同様に酵素的放出はまたより遅かった（図１６）。ゼインナノ粒子の表面上の遊離アミノ基の架橋は、粒径を低減させ、溶媒のアクセスを低減させ、ナノ粒子の酵素分解を遅延させた。架橋はまた、バースト作用をかなり低減させた。このように、架橋は、ナノ粒子をさらに安定化させることができ、ナノ粒子からのカーゴ放出を持続させる。
【実施例６】
【０１６５】
ＰＥＧ化ゼインナノ粒子
本明細書に記載の方法によって生成されたナノ粒子の治療活性および有効性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をナノ粒子に付着させることによってさらに増強させることができる。ＰＥＧ化の追加の利点の中には、ナノ粒子の循環半減期の増加がある。ＰＥＧのさらなる利点は、直接コンジュゲートすることが容易に合成的に実現可能でない場合、標的リガンド、薬物、および造影剤をゼインナノ粒子に連結するスペーサーとしての役割を果たすことができることである。
【０１６６】
図１７は、別の実施形態によりＰＥＧ化ゼインナノ粒子を調製する方法を例示する。ナノ粒子を作製するためのＰＥＧ化ゼインの利点は、非ＰＥＧ化ゼインのための界面活性剤およびリン脂質の組合せの使用とは対照的に、界面活性剤、例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ６８のみを使用して作製することができることである。ＰＥＧ化ゼインナノ粒子を形成させる特定の方法は、下記の通りである。
【０１６７】
ＰＥＧ化ゼインは、０．１ｇのメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（分子量、５０００Ｄａ）を、５ｍＬの９０％エタノール中の０．１ｇの白色ゼインに加えることによって生成した。混合物を、３７℃で３〜２４時間インキュベートした。次いで、溶液を磁気撹拌子（磁気撹拌棒を１００ｒｐｍで撹拌）中で室温にて２４時間水に対して透析し（分画分子量、１０ｋＤａ）、残留材料を除去した。次いで、このように得られた生成物を−８０℃に凍結し、それに続いて−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間フリーズドライした。様々なインキュベーション時間にわたり観察したＰＥＧ化の効率を下記の表６−１に示し、上記のようなＴＮＢＳアッセイ手順を使用して効率の百分率を決定した。
【０１６８】
他の分子量のＰＥＧ、例えば、５００〜５０００Ｄａのものを使用することができる。同様にＰＥＧ誘導体、例えば、メトキシＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシルスクシネートエステルまたは他の誘導体をまた使用することができる。
【０１６９】
【表８】
2014515007.tif 000012
【０１７０】
５０ミリグラムのＰＥＧ化白色ゼインを、３ｍＬのエタノールおよび０．２５ｍＬの脱イオン水の混合物に溶解した。次いで、ＰＥＧ化ゼイン溶液を、超音波エネルギー（１．３９ｋＷ／ｈおよび３７％振幅、１０分間、１０秒のパルスオンタイムおよび１秒のオフタイム）を一定に加えながら、ｐＨ７．４を有し、かつプルロニック（登録商標）Ｆ６８（０．９％ｗ／ｖ）を含有する１５ｍＬのクエン酸緩衝液中に滴下で添加した。超音波処理工程の間、溶液を氷浴中に維持して、温度を約１０℃に維持した。続いて、エタノールが完全に蒸発するまで、ゼイン懸濁液を３００〜５００ｒｐｍで室温にて磁気撹拌子上に入れた。蒸発が完了したとき、ナノ粒子を精製した。
【０１７１】
クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による繰返しの洗浄、および１００００Ｄａの分画分子量の遠心濾過機を使用した超遠心分離（４４，０００ｇ、３５分間）によって精製が達成された。ＰＥＧ化ゼインナノ粒子の水性懸濁液（クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）に、３０ｇの２％ｗ／ｖトレハロースを加え、溶液を−８０℃に保持し、固体ケークを形成させ、次いで、これを−４７℃にて６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。上記で開示したＰＥＧ化工程は、上記の実施例２に開示されているように高圧均質化を使用して行い得る。ＰＥＧ化ナノ粒子のサイズ分布を、図１８に示す。
【実施例７】
【０１７２】
レチノールを充填したゼインナノ粒子
この実施例は、レチノールを充填したゼインナノ粒子の調製および特性決定、ゼインナノ粒子を使用したレチノールの改善された溶解性、ゼインナノ粒子中にカプセル化することによるレチノールの改善された安定性、ゼインナノ粒子からのレチノールの持続放出、ゼインナノ粒子がレチノールの皮膚浸透および皮膚による保持を増強する能力、ならびにレチノール自体と比較したレチノールナノ微粒子製剤の皮膚刺激がないことまたは皮膚刺激の低減について記載する。
【０１７３】
１．レチノールを充填したゼインナノ粒子の調製および特性決定。ゼインナノ粒子を、相分離法を使用して調製し、ゼイン、レチノールおよびブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）（抗酸化剤）を、９０％エタノールに溶解した。この溶液を、レシチンおよびプルロニックを安定剤として含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ）に加えた。アルコールを蒸発させ、ナノ粒子を形成させ、次いで、ナノ粒子を、遠心分離、それに続く凍結乾燥によって分離した。放射性標識された（３Ｈ）レチノールを、「冷たい」レチノールと共に、分析において使用した。いくつかの実施形態において、ＢＨＴの代わりに、またはＢＨＴと組み合わせて使用することができる他の適切な抗酸化剤には、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、ユビキノン、コエンザイムＱ−１０、イデベノン、リコペン、緑茶、およびシリマリンが含まれる。
【０１７４】
レチノールを充填したゼインナノ粒子の粒径は約１７０〜２９０ｎｍであり、カプセル化効率は７６〜１００％であった。薬物／ポリマー比およびＢＨＴの濃度を変化させることによって、粒径およびカプセル化効率を最適化した。ＢＨＴの非存在下で、カプセル化効率は、＜５０％であった。表７−２は、レチノールを充填したゼインナノ粒子の特性決定のためのデータを提供する。レチノールを充填したゼインナノ粒子の調製の例を提供するフローチャートについては、図１９を参照されたい。
【０１７５】
【表９】
2014515007.tif 000013
【０１７６】
２．水溶液中でのレチノールの溶解性／分散性の増加。遊離レチノールは水中で分散性でなく、薬剤の分散を試みた後でバイアルの底で沈降した（図２０）。他方、レチノールを充填したゼインナノ粒子は、水に容易に分散した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のレチノールの溶解性は、ナノ粒子中のカプセル化後にかなり増強した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のレチノール（レチノール当量）ナノ粒子の１０μｇ／ｍＬの試料は、２０％メタノール中の１０μｇ／ｍＬの遊離レチノールと同程度のＵＶ吸光度（３２０ｎｍ）を示した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のレチノールの１０μｇ／ｍＬの分散液において非常に僅かな吸光度が観察された。
【０１７７】
３．ゼインナノ粒子からのレチノールの放出。ナノ粒子からのレチノールの放出研究を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中で行った。レチノールの濃度を、３２０ｎｍにてＵＶ分光光度計を使用して分析し、三連で放出研究を行った。図２１に示すように、ゼインナノ粒子からのレチノールの放出は数日間持続した。
【０１７８】
４．レチノールを充填したゼインナノ粒子の安定性。レチノールは、黄色の粉末である。これは、周囲条件で吸湿性であり、急速に粘着性となる。カプセル化したレチノールは無色および易流動性であり、かなり吸湿性が低い（図２２）。図２２に示すレチノール試料は明るい黄色であり、ナノ担体製剤は白色であったが、これは、カプセル化がレチノールの明るい黄色を隠すことを示す。ナノ担体製剤はまた、純粋なレチノールより易流動性の粉末をもたらした。
【０１７９】
周囲条件下および暗中でのレチノール製剤の安定性を、１週間の期間研究した。レチノール、およびレチノールを充填したナノ粒子（凍結乾燥した粉末）の固体安定性をまた１週間研究した。液体状態の安定性について、遊離レチノールまたはレチノールを充填したナノ粒子をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散させ、ＵＶ分光法（３２０ｎｍ）を使用してレチノール濃度を１週間測定した。レチノールは一次反応速度式に従うことが見出され、半減期を決定した。表７−２および７−３ならびに図２３〜２６に示すように、下記の結果を得た。
【０１８０】
ゼインナノ粒子は、レチノールを光分解および湿気により誘発される分解から保護した。カプセル化したレチノールは、固体状態および液体状態の遊離レチノールと比較して、増強された安定性を示した。ＢＨＴを抗酸化剤として含むことは、カプセル化したレチノールの安定性をさらに増強した。最後に、レチノールの保存寿命は、ゼインナノ粒子中のカプセル化によってかなり増強された。
【０１８１】
【表１０】
2014515007.tif 000014
【０１８２】
【表１１】
2014515007.tif 000015
【０１８３】
５．レチノールおよびカプセル化したレチノールの皮膚浸透。レチノールおよびカプセル化したレチノールの皮膚浸透を、垂直拡散セルを使用して、切除したブタの耳の皮膚を使用して研究した。この研究において、放射性標識（３Ｈ）されたレチノールを、「冷たい」レチノールと共に使用した。４８時間の終わりにおける皮膚ホモジネートおよびレセプター媒体におけるレチノールの量を、放射化学分析を使用して推定した。実験を６回繰り返した（±ＳＤ）。図２７において見られるように、カプセル化したレチノールは、皮膚におけるレチノールのより大きな保持をもたらした。「皮膚中のレチノールとレセプター中のレチノール」の比は、それぞれ、遊離レチノールおよびレチノールナノ粒子について、３および１１であった。ナノ粒子が皮膚中のレチノールのより大きな保持をもたらしたことを結果は示す。
【０１８４】
要約すれば、ゼインナノ粒子は、レチノールの水溶性および分散性をかなり増加させた。ナノ粒子中のレチノールのカプセル化は、黄色、粘着性および吸湿性粉末である遊離レチノールとは異なる易流動性の無色粉末をもたらした。ゼインナノ粒子は、レチノールの放出を効果的に持続させた。レチノールの光安定性および加水分解安定性は、ゼインナノ粒子中にカプセル化することによってかなり増強されるが、これは、抗酸化剤としてＢＨＴを加えることによってさらに増強され、ゼインナノ粒子は、レチノールのより高い皮膚における保持をもたらした。ナノ粒子はまた、レチノールの皮膚刺激を低減させることができる。
【実施例８】
【０１８５】
ローダミン１２３を充填した非架橋ゼインナノ粒子
相分離法を使用したローダミン１２３（０．０２９６％ｗ／ｗおよび０．０３７０％ｗ／ｗ）を充填した非架橋ゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを、表８−１において下記で提供する。
【０１８６】
【表１２】
2014515007.tif 000016
【０１８７】
図２９は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のゼインナノ粒子からのローダミン１２３のインビトロの放出を例示する。これらの研究において、０．０２９６％ｗ／ｗローダミン１２３を充填した非架橋ナノ粒子を、研究のために使用した。４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長で分光蛍光計によってローダミン１２３の濃度を測定した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）。
【０１８８】
図３０は、６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚中への遊離ローダミン１２３（１０μｇ）およびローダミンナノ粒子（１０μｇのローダミン１２３と同等である）の浸透を例示する。切除したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離ローダミン１２３およびローダミンナノ粒子分散液を、ドナーチャンバー中に充填した。研究の終わりに、皮膚を徹底的に洗浄し、表面に吸着されたローダミン１２３を除去し、皮膚をＯＣＴ流体中に入れ、液体窒素で凍結した。その後皮膚を、ｃｒｙｏｔｏｍｅで切断し、蛍光顕微鏡下で観察した。図３０から見ることができるように、ローダミンナノ粒子は、皮膚の最上層（ＳＣ）に限定されている遊離ローダミンと比較して皮膚中により深く浸透した。
【０１８９】
図３１は、６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚中への、遊離ローダミン１２３（１０μｇ）およびゼインナノ粒子中のカプセル化したローダミン１２３（１０μｇのローダミン１２３と同等である）の浸透を例示する。切除したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離またはカプセル化したローダミン１２３分散液を、ドナーチャンバー中に充填した。研究の終わりに、皮膚を徹底的に洗浄し、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用し、皮膚の異なる層における蛍光画素強度を使用して定量化し、皮膚中のローダミン１２３の蛍光を測定した（平均±ＳＥ；ｎ＝３）。図３１から見ることができるように、ローダミンナノ粒子について蛍光強度は有意により高い。
【実施例９】
【０１９０】
フルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を充填したゼインナノ粒子
フルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、３８９．３８２の分子量および５．０３のＬｏｇＰを有する。ＦＩＴＣは、水中で微溶性（０．１ｍｇ／ｍＬ未満）であり、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミド中で完全に可溶性の蛍光色素である。
【０１９１】
【化３】
2014515007.tif 000017
【０１９２】
エマルジョン溶媒蒸発法を使用して調製したＦＩＴＣを充填したゼインナノ粒子の特徴を、表９−１に示す。
【０１９３】
【表１３】
2014515007.tif 000018
【０１９４】
図３２は、フローチャートによって、一実施形態による、エマルジョン溶媒蒸発法を使用したＦＩＴＣを充填したゼインナノ粒子の調製の一般ステップを例示する。
【０１９５】
図３３は、６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚中への遊離ＦＩＴＣ（１０μｇ）およびＦＩＴＣナノ粒子（１０μｇと同等である）の浸透を例示する。切除したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離ＦＩＴＣおよびＦＩＴＣナノ粒子分散液を、別々のドナーチャンバー中に充填した。研究の終わりに、皮膚を徹底的に洗浄して、表面に吸着されたＦＩＴＣを除去し、皮膚をＯＣＴ流体中に入れ、液体窒素中で凍結した。次いで、皮膚をｃｒｙｏｔｏｍｅで切断し、蛍光顕微鏡下で観察した。図３３から見ることができるように、ＦＩＴＣナノ粒子は、皮膚の最上層（ＳＣ）に限定されていた遊離ＦＩＴＣと比較して、皮膚中により深く浸透していた。
【０１９６】
図３４は、６時間後の、デルマトームで採取したブタの皮膚中への遊離ＦＩＴＣ（１０μｇ）およびゼインナノ粒子中のカプセル化したＦＩＴＣ（１０μｇと同等である）の浸透を例示する。切除したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離またはカプセル化したＦＩＴＣ分散液を、ドナーチャンバー中に充填した。研究の終わりに、皮膚を徹底的に洗浄し、皮膚中のＦＩＴＣ濃度を、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して測定し、皮膚の異なる層における蛍光画素強度を使用して定量化した（平均±ＳＥ；ｎ＝３）。図３４に示すように、蛍光強度は、ＳＣにおいてＦＩＴＣナノ粒子についてより高い。
【実施例１０】
【０１９７】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を充填したゼインナノ粒子
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、１３０．０７７の分子量および−０．８９のＬｏｇＰを有する。５−ＦＵは、冷水およびメタノール中で部分的に可溶性であり、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミド中で完全に可溶性であり、ジエチルエーテル中で不溶性である。
【０１９８】
【化４】
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【０１９９】
５−ＦＵは親水性薬物（ｌｏｇ  Ｐ＝−０．８９）であり、皮膚を通る浸透性が乏しい（Ｃｏｒｎｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ９４，１８９〜１９４，１９９３）。この薬物は、例えば、乾癬、前悪性（光線性角化症）および悪性（皮膚がん）の皮膚状態の治療において使用される（Ｔｓｕｊｉ  ａｎｄ  Ｓｕｇａｉ，Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０５，２０８〜２１２，１９７５；Ｇｏｅｔｔｅ，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４，６３３  ６４９，１９８１）。エマルジョン溶媒蒸発法を使用して調製した５−フルオロウラシルを充填したゼインナノ粒子の特徴を、表１０−１に示す。
【０２００】
【表１４】
2014515007.tif 000020
【０２０１】
図３５は、フローチャートによって、一実施形態による、エマルジョン溶媒蒸発法を使用した５−フルオロウラシルを充填したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。
【０２０２】
図３６は、レセプター媒体中の施した５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の百分率を例示する。切除したデルマトームで採取したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離またはカプセル化した５−ＦＵ分散液を、ドナーチャンバー中に充填した。レセプターコンパートメント中の５−ＦＵの濃度を、１４Ｃ標識した５−ＦＵを使用して放射化学的方法によって様々な間隔で測定した（平均±ＳＥ；ｎ＝３）。図３６から見ることができるように、ゼインナノ粒子は、５−ＦＵの皮膚浸透を有意に増強した。結果は、ゼインナノ粒子が、プルロニック（登録商標）およびレシチンの存在によって皮膚浸透増強剤として作用できることを示す。
【実施例１１】
【０２０３】
ゼイン−カゼインナノ粒子
新規なゼイン−カゼインのコアシェルナノ粒子を調製したが、疎水性ゼインは、コアを形成し、一方、親水性乳タンパク質であるβ−カゼインは、親水性シェルを形成する。他の疎水性プロラミン、例えば、グリアジン、カフィリンおよびホルデインをまた、ゼイン、および他のカゼイン、例えば、κもしくはγカゼインの代わりに使用してもよく、またはカゼイン酸ナトリウムを、カゼインの代わりに使用してもよい。この新規な系の利点は、ゼインおよびカゼインの両方が、生分解性および生体適合性の食品タンパク質であることを含む。カゼインは、ゼインナノ粒子を安定化し、凝集を防止し、より小さなサイズのナノ粒子を形成させる両親媒性界面活性剤である。カゼインは、カプセル化効率の増加を助けることができ、ナノ粒子の薬物放出特徴のモジュレートを助けることができる。薬物は、疎水性コア、親水性シェルまたは両方の中に充填することができる。
【０２０４】
ゼインおよびカゼインの両方はタンパク質であるため、これらは表面修飾またはコア修飾のための多数の官能基を有する。コアおよびシェルは両方とも、様々な用途のために独立に変化させることができる。例えば、コアおよび／またはシェルは、本明細書に記載のように架橋することができる。同様に、薬物を、コアおよび／またはシェルに複合体化および／またはコンジュゲートすることができる。
【０２０５】
両親媒性タンパク質であるカゼインは、皮膚脂質と相互作用して、ナノ粒子の皮膚浸透を増加させることができる。図３７は、ゼイン−カゼインのコアシェルナノ粒子の形成を模式的に例示する。図３８は、フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用してβ−カゼインにより安定化したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。表１１−１は、相分離法を使用して調製したβ−カゼインにより安定化したゼインナノ粒子の様々な特徴を例示する。ゼインナノ粒子の調製のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で０．０５〜１．０％ｗ／ｖの範囲のβ−カゼインの濃度を使用した。
【０２０６】
【表１５】
2014515007.tif 000021
【０２０７】
図３９は、フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用したβ−カゼインにより安定化したナイルレッドを充填したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。表１１−２は、相分離法を使用して調製したβ−カゼインにより安定化したナイルレッドを充填したゼインナノ粒子の様々な特徴を例示する。ナイルレッドナノ粒子の調製のために、ナイルレッドの濃度は、０．００６６〜０．０６６％ｗ／ｗの範囲であった。使用したβ−カゼインの濃度は、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中０．１％〜０．２％ｗ／ｖであった。
【０２０８】
【表１６】
2014515007.tif 000022
【０２０９】
図４０は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のゼイン−カゼインナノ粒子からのナイルレッドのインビトロの放出を例示する。ナイルレッドの濃度を、５５９ｎｍの励起波長および６２９ｎｍの発光波長で分光蛍光計によって測定した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）。図４１は、遊離ナイルレッドおよびゼイン−カゼインナノ粒子中にカプセル化したナイルレッドの皮膚浸透を例示する。図４２は、フローチャートによって、一実施形態による、相分離法を使用してカゼインにより安定化したレチノールを充填したゼインナノ粒子を調製するための一般ステップを例示する。表１１−３は、相分離法を使用して調製したβ−カゼインにより安定化したレチノールを充填したゼインナノ粒子の様々な特徴を例示する。レチノールナノ粒子の調製のために、同等のＢＨＴ濃度を有する０．００６〜０．０６６％ｗ／ｗの範囲のレチノール濃度を考慮した。クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で０．１〜０．２％ｗ／ｖの範囲のβ−カゼインの濃度を使用した。
【０２１０】
【表１７】
2014515007.tif 000023
【実施例１２】
【０２１１】
ゼインナノ粒子中にカプセル化したレチノールのためのクリーム製剤の調製
商業的開発のための送達のための皮膚用製剤の実現可能性を示すために、市販のクリーム基剤（ＭＥＤＣＯ  Ｌａｂｓ）を使用して、遊離レチノールまたはゼインナノ粒子中にカプセル化したレチノールを組み込んだ。クリーム基剤は、ステアリルアルコール（１４％）、セチルエステルワックス（３．５％）、モノステアリン酸グリセリル（２％）、ポリエチレンステアリルエーテル（３％）、ソルビトール（１０％）、パルミチン酸イソプロピル（２％）、メチルパラベン（０．１６％）、プロピルパラベン（０．４％）および精製水（６５％）を含有する。０．１％ｗ／ｗと等しいレチノールを、秤量し、時計皿に移し、ガラス棒を使用して幾何学的希釈によって均質に混合した。これらに限定されないが、油−水クリーム、油中水クリーム、軟膏、ゲルなどを含めた他の製剤を使用し得る。混合物に０．０５μＣｉの３Ｈレチノールを混入し、クリーム中に徹底的に混合した。最後に、調製したクリーム製剤を、ガラス製バイアルに移し、使用するまで保存した。
【０２１２】
【表１８】
2014515007.tif 000024
【０２１３】
図４３において見ることができるように、カプセル化した製剤は安定的のままであり、室温で分解を示さなかった。さらに、図４５において見ることができるように、ナノ粒子からのレチノールの放出は持続した。図４５においてデータによって支持されるように、カプセル化したレチノールでは、遊離レチノールと比較して非常により多くのレチノールが、皮膚中に保持される。
【０２１４】
標準製剤に対するカプセル化した製剤の皮膚刺激を、表１１−２に一覧表示したような処理群を使用してＳＫＨ−１無毛マウスにおいてインビボで試験した。
【０２１５】
【表１９】
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【０２１６】
レチノール製剤（０．５ｇの０．１％ｗ／ｖレチノール当量）を、ＳＨＫ−１無毛マウスの背中に毎日５日間施用した。経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）値を、製剤を施用する前にＴＥＷＡメーター（Ｄｅｌｆｉｎ）を使用して毎日測定した。
【０２１７】
図４６は、カプセル化したレチノールを含有するクリームと遊離レチノールとの間の経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）データを示す。ＴＥＷＬの増加は、皮膚刺激の尺度であり、図において見ることができるように、ナノ粒子中にカプセル化したレチノールは皮膚刺激を示さず、陰性対照（処理なし）と同程度であった。他方、遊離レチノールクリームは、皮膚刺激を示した。公知の皮膚の刺激物質であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を、陽性対照として使用した。
【０２１８】
クリーム製剤についてのバイオアベイラビリティーデータを得るために、遊離レチノールおよびナノ粒子中にカプセル化したレチノールのインビボの局所バイオアベイラビリティーを、ＳＫＨ−１無毛マウスにおいて測定した。図４７において見ることができるように、ナノ粒子中にカプセル化したレチノールは、血液中への全身的吸収を伴わずに皮膚中に保持された。
【実施例１３】
【０２１９】
ゼインナノ粒子の毛包への送達
ゼインナノ粒子の皮膚輸送を追跡するために、蛍光プローブを、ゼインに化学的にコンジュゲートした。２ｍｇのフルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、４ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、および２．９４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、５ｍｌの９０％エタノールに溶解し、撹拌しながら３時間インキュベートした。続いて、ゼイン（５０ｍｇ）を加え、３時間インキュベートした。その後、混合物を水に対して約８〜１０時間透析した。最後に、分散液を凍結乾燥した。ゼイン−ＦＩＴＣのコンジュゲーションを、ＮＭＲ分光法によって確認した。さらに、図１において例示した方法を使用して、ナノ粒子を調製した。ゼイン−ＦＩＴＣがコンジュゲートしたナノ粒子の共焦点研究をまた行った。
【０２２０】
１００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に分散させたゼイン−ＦＩＴＣナノ粒子（５μｇのＦＩＴＣと同等である）を、皮膚浸透研究のために使用した。切除したブタの皮膚を、垂直拡散セルの２つのコンパートメントの間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）からなり、磁気ビーズを使用して撹拌した。ＦＩＴＣ標識ナノ粒子を、皮膚上に６時間施用した。研究の終わりに、皮膚を洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。図４８に示すように、ゼインナノ粒子は、毛包に主に局在化している。さらに、測定した波長で、皮膚からの自己蛍光は存在しなかった。これはまた、蛍光が線条において表面から皮膚中１００μｍの深さまで観察される左のパネルから明らかである。この結果は、ゼインナノ粒子のための皮膚輸送経路を示すことに加えて、これを使用して、毛包を標的とし、様々な毛包疾患を治療することができることをまた示す。これらには、ざ瘡、脱毛、脂漏性湿疹、毛包炎および特定の皮膚がんが含まれる。ざ瘡の治療のためのレチノールの使用という状況から、ゼインナノ粒子中にカプセル化したレチノールは、ざ瘡の有効な治療のために毛包を標的とすることができる。
【０２２１】
レチノールの毛包ターゲティングを示すために、皮膚サンドイッチモデルを使用した。サンドイッチ皮膚（図２８を参照されたい）において、毛包経路を、表皮上にはさんだＳＣによって遮断する。サンドイッチ皮膚モデルにおいて、レセプターコンパートメント中に輸送されたレチノールの量は、従来の皮膚表皮浸透研究と比較して、遊離レチノールおよびナノ粒子中にカプセル化したレチノールの両方について低減した。しかし、ナノ粒子からのレチノールの輸送のかなりの低減があったが、これはレチノールミセルのかなりの割合が、毛包を通って輸送されることを示す。毛包ターゲティングは、レチノールに毛包における疾患部位を標的にさせるナノ粒子の追加の利点である。
【実施例１４】
【０２２２】
ゼインナノ粒子と皮膚脂質の相互作用
ゼインナノ粒子と皮膚脂質との相互作用を理解し、これが皮膚浸透増強剤として作用できるかを試験するために、赤外分光法研究を行った。ブタの表皮を垂直拡散セル中に置き、ゼインナノ粒子で３７℃にて２４時間処理した。スペクトルを記録する前に、表皮をＷＨＡＴＭＡＮ濾紙で水気を取った。スペクトルを処理の前および後に記録した。スペクトルを、ＮＩＣＯＬＥＴ３８０ＡＴＲ−ＦＩＴＲ分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＥＬＥＣＴＲＯＮ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）において２ｃｍ−１の分解能にてＺｎＳｅ上で記録した。各スペクトルは、１００スキャンの平均であった。皮膚脂質のピーク位置を、ＯＭＮＩＣソフトウェアを使用して分析した。
【０２２３】
【表２０】
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【０２２４】
表１４−１において見ることができるように、脂質の対称性（２８５０ｃｍ−１）および非対称性（２９２０ｃｍ−１）ピークは、より高い波数にシフトした。脂質の延ばされたピークにおけるシフトは、皮膚脂質との相互作用を示す。緩衝液による処理において観察されるシフトと比較して、シフトは有意であった。これらの結果は、ゼインナノ粒子が、皮膚浸透を増加させる浸透増強剤として作用できることを示す。理論に束縛されるものではないが、浸透の増強は、製剤中のレシチンおよびプルロニック界面活性剤に起因し得る。
【実施例１５】
【０２２５】
タンパク質薬物のカプセル化／吸着
タンパク質薬物のカプセル化のために、図１の方法を改変した（図４９を参照されたい）。第１の相中のエタノールは水溶性タンパク質薬物を沈殿させることができるため、エタノールをラウリル硫酸ナトリウムと置き換えて、ゼインを可溶化した。図４９および図５０に示すような方法を、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ）および多血小板血漿（ＰＲＰ）のカプセル化のために使用した。
【実施例１６】
【０２２６】
多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製
新鮮なブタ／ヒツジ血液を使用して、ＰＲＰを分離した。ＥＤＴＡを抗凝固剤として加えることによって血液を集めた。概ね１０ｍｌの血液を、２４００ｒｐｍで２０℃にて１０分間遠心分離した。その後、上清（ＰＲＰおよび乏血小板血漿）を別のチューブ中に集め、３６００ｒｐｍで２０℃にて１５分間遠心分離した。乏血小板血漿を除去し、チューブの底の１ｍＬの血漿をＰＲＰとして集めた。水を使用して血漿を１００倍に希釈することによって、自動細胞計数器で血小板計数を行った。
ヒツジ血液のＰＲＰ計数：２．４×１０８血小板／ｍｌ
ブタ血液のＰＲＰ計数：２．３４×１０８血小板／ｍｌ
【０２２７】
【表２１】
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【０２２８】
１ｍｇのナノ粒子を、浴超音波処理器を１分間使用して１ｍｌの水に分散させた。試料を水で１００倍に希釈し、ＮＩＣＯＭＰ粒径分析器を使用して粒径を測定した。
【実施例１７】
【０２２９】
ゼインナノ粒子上へのＰＲＰの吸着
異なる安定剤を第２の水相中で使用したこと以外は、図１において記載したのと同じ手順を使用してゼインナノ粒子を調製した。０．１％ＴＷＥＥＮ８０またはプルロニックＦ６８またはカゼインを、単独で使用した。ＮＩＣＯＭＰ粒径分析器を使用して、ナノ粒子の粒径を測定した。
【０２３０】
【表２２】
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【０２３１】
正確に秤量した量のゼインナノ粒子（２００ｍｇ）を、バイアル中に採取し、０．６ｍｌのＰＲＰ溶液および４．４ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。その後、バイアルを２００ｒｐｍ下で３７℃にて２時間および６時間インキュベートした。研究の終わりに、分散液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に対して特異的なＥＬＩＳＡキットを使用してペレットからの吸着されたＰＲＰをアッセイした。
【０２３２】
【表２３】
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【０２３３】
異なるゼインナノ粒子の間に吸着能力の有意差はなかったが、ゼイン−カゼインナノ粒子が最も高い吸着を示した。同様に、吸着は、インキュベーション時間と共に増加したが、有意ではなかった。したがって、ＰＲＰ吸着のために、２時間で十分であるはずである。
【実施例１８】
【０２３４】
ＰＳＡ架橋ＺＣナノ粒子
この研究の目的は、疎水性コアであるゼインおよび親水性シェルであるカゼインをベースとするシェル架橋ナノ粒子を提供することである。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、１１ｋＤａの分子量を有するα−２、８−連結シアル酸単位からなるホモポリマー負帯電多糖類である。ポリシアル酸を使用して、他の架橋剤と比較したその生体適合性によってシェルを架橋することができる。
【０２３５】
ＥＤＣおよびＮＨＳをＰＳＡに加え、１０ｍｌの脱イオン水に溶解する。室温で３分間撹拌した後、ゼイン−カゼインナノ粒子（図３９において開示した方法を使用して調製）を加えた。反応を一晩進行させる。ＥＤＣを加え、ＰＳＡ上のカルボキシル基をタンパク質の第一級アミンと相互作用させることができるアミン反応性ＮＨＳエステルに変換した。溶液を遠心分離および凍結乾燥し、所望の架橋ナノ粒子（ゼイン−カゼインナノ粒子）を生じさせる。
【実施例１９】
【０２３６】
ＰＳＡ−ゼインナノ担体
この研究の目的は、ゼインをコアとして、および親水性ＰＳＡをシェルとして使用して、コア−シェルナノ担体を形成することである。この場合、ＰＳＡは、ゼインに化学的にコンジュゲートしている。ＰＳＡを、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で酸化する。ＰＳＡおよびゼイン混合物を、暗中で１５分間保持した。酸化したＰＳＡはアルコールにより沈殿し、それに続いて遠心分離し、さらに使用するために凍結乾燥する。ゼインとのアルデヒドＰＳＡ上のカップリング反応を、還元触媒として２−ピコリン−ボランの存在下でＤＭＳＯ／水混合物中で行う。コンジュゲーション反応を可能とするために、混合物を磁気撹拌子下に４８時間保持する。コア−シェルナノ担体を水に対して透析し、凍結乾燥した。
【実施例２０】
【０２３７】
医薬品剤形
下記の製剤は、水性分散液または凍結乾燥した粉末でよい本明細書に記載されているナノ粒子製剤（以下、「組成物Ｘ」と称する）の、治療用または化粧品用の投与のために使用し得る代表的な医薬品剤形を例示する。
【０２３８】
【表２４】
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【０２３９】
これらの製剤は、医薬品の技術分野において周知の従来の手順によって調製し得る。上記の医薬組成物を周知の医薬品技術によって変化させて、異なる量およびタイプの活性成分「組成物Ｘ」を提供し得ることを理解されたい。エアゾール製剤（ｖｉ）は、標準的な定量エアゾールディスペンサーと併せて使用し得る。さらに、特定の成分および割合は、例示の目的のためである。成分は適切な同等物と交換してもよく、割合は対象とする剤形の所望の特性によって変化し得る。
【０２４０】
開示された実施形態および実施例に関して特定の実施形態を上記で記載してきた一方、このような実施形態は、単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定しない。当技術分野の通常の技量に従って、下記の特許請求の範囲において記載したようなそのより広範な態様における本発明から逸脱することなく、変更および改変を行うことができる。
【０２４１】
全ての刊行物、特許、および特許文献は、参照により個々に組み込まれているかのように本明細書において参照により組み込まれている。様々な特定および好ましい実施形態および技術に関して本発明について記載してきた。しかし、本発明の趣旨および範囲内に留まる一方で、多くの変形および改変を行い得ることを理解すべきである。
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【国際調査報告】
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