(57)【要約】  本発明は、ＩＧＦＢＰ−４（インスリン様成長因子結合タンパク質−４）又はＩＧＦＢＰ−５（インスリン様成長因子結合タンパク質−５）のタンパク質分解断片を患者の血液から検出することを包含する、将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための方法に関する。本発明は、ＩＧＦＢＰのタンパク質分解断片の特異的な測定に適した抗体及び免疫アッセイ法を提供する。本発明は、ＩＧＦＢＰ断片が循環器系主要有害事象（ＭＡＣＥ）の危険度予測用の血中バイオマーカーとして利用可能であることを提案する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該個体から採取した試料において、
配列番号１に相当するＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片、配列番号１の少なくとも１３個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量、又は
配列番号２に相当するＩＧＦＢＰ−４のＣ末端断片、配列番号２の少なくとも１３個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量、又は
配列番号４に相当するＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片、配列番号４の少なくとも９個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量、又は
配列番号５に相当するＩＧＦＢＰ−５のＣ末端断片、配列番号５の少なくとも９個の連続するアミノ酸を有する配列に相当する断片、若しくは配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する配列に相当する断片の定量
を実施する工程、
（ｂ）工程（ａ）において得た定量値を、対応するペプチドに関する適当な参照値と比較する工程、及び
（ｃ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定する工程
を包含する方法。
【請求項２】
個体における循環器系疾患の治療の効果をモニタリングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）該治療の開始前、該治療の開始時、又は該治療の期間中に採取した該個体の第１試料について、請求項１に記載の断片のいずれかを定量する工程、
（ｂ）該第１試料の採取後に該個体から採取した第２試料について、上記断片に対応する断片を定量する工程、
（ｃ）工程（ａ）において得た定量値を、工程（ｂ）において得た対応断片の定量値と比較する工程であって、工程（ｂ）における断片の定量値が、工程（ａ）における断片の定量値に対して増加しているか又は同レベルであることが、該治療は該個体に対しては有効ではないことを示す工程、及び
（ｄ）工程（ａ）において得た定量値を、工程（ｂ）において得た対応断片の定量値と比較する工程であって、工程（ｂ）における断片の定量値が、工程（ａ）における断片の定量値に対して減少していることが、該治療は該個体に対しては有効であることを示す工程
を包含する方法。
【請求項３】
該治療が、該個体のための抗血小板療法、抗炎症療法、スタチン療法、脂質低下療法、プラークの安定化若しくは退縮化のための療法、又は血栓溶解療法であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該断片の定量値が参照値よりも高いことが、該個体の将来の循環器系主要有害事象の危険度が高いことを示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該断片の定量値が参照値よりも低いことが、該個体の将来の循環器系主要有害事象の危険度が低いことを示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該断片の定量値に従って、該個体を異なる危険度群に分類する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
循環器系主要有害事象が、冠動脈心疾患に関連する以下の事象：
急性冠症候群（ＡＣＳ）、不安定狭心症、心筋梗塞（ＭＩ）、ＳＴ上昇型ＭＩ、非ＳＴ上昇型ＭＩ、血管再生、緊急冠動脈バイパス移植、経皮的冠動脈形成、及び死
から選ばれる１種以上の事象であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
循環器系主要有害事象が発作であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
コレステロール分画、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンＴ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ＢＮＰ前駆体ペプチド（ｐｒｏＢＮＰ）、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、コリン、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）からなる群より選ばれる循環器系主要有害事象予測用の１種以上のマーカーを検出するためのアッセイを行う工程をさらに包含し、請求項１に記載のいずれかの断片のレベルと該１種以上のマーカーのレベルとの組合せによって、将来の循環器系主要有害事象の危険度を予測することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該試料における請求項１に記載のいずれかの断片の定量値が、循環器系疾患の病歴を有しない集団に見られる対応断片の量の第５０百分位数よりも上の値であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該試料における請求項１に記載のいずれかの断片の定量値が、循環器系疾患の病歴を有しない集団に見られる対応断片の量の第９５百分位数よりも上の値であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
（ｄ）該試料について、配列番号３に相当するＩＧＦＢＰ−４を定量する工程、
（ｅ）請求項１に記載のいずれかのＩＧＦＢＰ−４断片の定量値の、ＩＧＦＢＰ−４の定量値に対する比率を計算する工程、
（ｆ）工程（ｅ）において求めた比率を、対応断片のための適当な参照用比率と比較する工程、及び
（ｇ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
（ｄ）該試料について、配列番号６に相当するＩＧＦＢＰ−５を定量する工程、
（ｅ）請求項１に記載のいずれかのＩＧＦＢＰ−５断片の定量値の、ＩＧＦＢＰ−５の定量値に対する比率を計算する工程、
（ｆ）工程（ｅ）において求めた比率を、対応断片のための適当な参照用比率と比較する工程、及び
（ｇ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該個体が、ＡＣＳ、胸痛又は息切れを発症している個体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該ＡＣＳが、冠動脈心疾患、安定狭心症、不安定狭心症、ＭＩ、ＳＴ上昇型ＭＩ、非ＳＴ上昇型ＭＩ、左心室機能不全、及び鬱血性心不全から選ばれる１種以上の事象であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該個体が、冠動脈心疾患に関連するいかなる兆候をも示していない個体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該個体が、循環器系疾患に対する何らかの種類の治療を受けている個体であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
循環器系疾患に対する治療の効果を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）臨床試験に参加する少なくとも１つの個体から採取した試料について、請求項１に記載の断片のいずれかを定量する工程であって、該定量を該臨床試験の開始時、該臨床試験の期間中、又は該臨床試験の終了後に行う工程、
（ｂ）請求項１に記載の断片のいずれかについて先に得た定量値と、後に得た定量値とを比較する工程であって、後に得た定量値が先に得た定量値に対して増加しているか又は同レベルであることが、該治療は有効ではないことを示す工程、
（ｃ）請求項１に記載のいずれかの断片について先に得た定量値と後に得た定量値とを比較する工程であって、後に得た定量値が先に得た定量値に対して減少していることが、該治療は有効であることを示す工程
を包含する方法。
【請求項１９】
該試料が血液試料、血漿試料又は血清試料であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
個体における循環器系障害の治療又は進行の遅延のための方法であって、該個体の体循環中に含まれる請求項１に記載の断片のいずれかの減少をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項２１】
該個体がヒト又は他の哺乳動物であることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
発作、心臓麻痺若しくは循環器系疾患の予防用薬剤又は循環器系疾患の治療用薬剤を含有する医薬組成物であって、該薬剤は、抗炎症剤、抗糖尿病薬、抗血栓剤、抗血小板剤、線溶剤、脂質低下剤、直接トロンビン阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤、細胞接着分子に結合し且つ白血球の該分子に接着する能力を阻害する薬剤、カルシウムチャネル遮断剤、β−アドレナリン受容体遮断剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、及びアンジオテンシン系阻害剤からなる群より選ばれるものであり、該医薬組成物は、請求項１に記載のいずれかの断片のレベルを個体において減少させうる成分をさらに含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法を実施するための検査キットであって、該方法を実施するための説明書、並びに
（ａ）個体から採取した試料に含まれる請求項１に記載の断片のいずれかを定量するための手段、及び
（ｂ）工程（ａ）において得た定量値を適当な参照値と比較し、それによって（ｃ）将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための手段
を包含するキット。
【請求項２４】
コレステロール分画、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンＴ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ＢＮＰ前駆体ペプチド（ｐｒｏＢＮＰ）、Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、ホモシステイン（ＨＣＹ）、コリン、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）から選ばれる、循環器系主要有害事象を予測するための１種以上の他のマーカーの検出用アッセイをさらに包含する、請求項２３に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦＢＰ−４（インスリン様成長因子結合タンパク質−４）又はＩＧＦＢＰ−５（インスリン様成長因子結合タンパク質−５）のタンパク質分解断片を患者の血液から検出することを包含する、将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための方法に関する。本発明は、ＩＧＦＢＰのタンパク質分解断片の特異的な測定に適した抗体及び免疫アッセイ法を提供する。本発明は、ＩＧＦＢＰ断片が循環器系主要有害事象（ＭＡＣＥ）の危険度予測用の血中バイオマーカーとして利用可能であることを提案する。
【背景技術】
【０００２】
循環器系疾患の治療のかなりの進歩にもかかわらず、循環器系疾患は依然として先進国における主要な死因である。循環器系疾患の古典的な危険因子（高血圧、糖尿病、喫煙など）の評価は、疾患予防において中心的な役割を担っている。しかし、冠動脈心疾患（心臓に血液を送る血管の狭窄）を有する個体の多くは、古典的危険因子をただ１つ有するか、全然有していない。したがって、伝統的な指標から得られた情報を増大させ、疾患の機構を解明するためには、新たなバイオマーカーが必要である。
【０００３】
将来のＭＡＣＥの危険度を判定するための信頼できるバイオマーカーの探索は、現代の in vitro 診断の重要な課題であると思われる。ＭＡＣＥには、急性冠症候群（ＡＣＳ）、不安定狭心症、及び心筋梗塞（ＭＩ）（ＳＴ上昇型ＭＩと非ＳＴ上昇型ＭＩを含む）、並びに他のいくつかの事象が含まれる。ＭＡＣＥの危険度の判定に用いるための広範囲に亘る候補が文献に記載されているにもかかわらず、心筋梗塞用の心臓トロポニンＩや、心不全診断用のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのような、十分信頼できるバイオマーカーとなるものは１つもなかった。臨床診療において用いられる、ＭＡＣＥの危険度判定用のバイオマーカーの主な欠点は、循環器に対する特異性が不十分であること、検体の血液レベルと発症するであろう循環器系合併症との関連性が不明確であること、及び、それらの結果として、予測的な価値が限定されること、である。急性心筋梗塞の明らかな兆候は示していない（トロポニン試験が陰性であり、心電図においてＳＴ上昇が見られない）が、急性胸痛を患う患者のＭＡＣＥの危険度を判定するために救命病棟において用いることができるバイオマーカーが、緊急に必要である。そのようなバイオマーカーは、循環器系疾患の古典的危険因子を有する患者集団をスクリーニングして、その中から、短期的な心臓事象の発症に対する危険度がより高い部分集団を見出す可能性を開くかもしれない。
【０００４】
動脈硬化性プラークの不安定化に関連する炎症性バイオマーカーの研究は、ＭＡＣＥの危険度判定における新たな見通しを開いた。バイオマーカーの広範囲に亘る候補（高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、単球走化性タンパク質−１、可溶性ＣＤ４０Ｌ、ミエロペルオキシダーゼなど）が、最近１０年間で徹底的に研究された。これらのうちの２つ、ｈｓＣＲＰ及びＬｐ−ＰＬＡ２、については、臨床診療における有用性を支持するのに十分な公表された証拠が蓄積されている。
【０００５】
本発明においては、ＩＧＦＢＰ−４の断片及びＩＧＦＢＰ−５の断片を、ＭＡＣＥ予測用バイオマーカーとして提案する。ＩＧＦＢＰ−４とＩＧＦＢＰ−５の機能に対する主な調節機構は、特異的なタンパク質分解である。妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）は、ＩＧＦＢＰ−４及びＩＧＦＢＰ−５のタンパク質分解並びにその後の活性型ＩＧＦの放出を担う酵素として文献に記載された。動脈硬化性プラークの内部におけるＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性は証明されなかったが、動脈硬化性プラークにおいては、活性化した平滑筋細胞の発現したＰＡＰＰ−ＡがＩＧＦのバイオアベイラビリティーを高めるものと推測された。われわれは、ＭＡＣＥの予測に使用しうる独立した血中バイオマーカーとしての、ＩＧＦＢＰ−４及びＩＧＦＢＰ−５のタンパク質分解断片の使用を提案する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＩＧＦＢＰ−４（インスリン様成長因子結合タンパク質−４）又はＩＧＦＢＰ−５（インスリン様成長因子結合タンパク質−５）のタンパク質分解断片を患者の血液から検出することを包含する、将来の循環器系主要有害事象の危険度を判定するための方法に関する。本発明の方法は、ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片又はＩＧＦＢＰ−４のＣ末端断片、及びＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片又はＩＧＦＢＰ−５のＣ末端断片、の定量値に従って、個体を異なる集団に分類することを可能にする。本発明の方法においては、ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片又はＩＧＦＢＰ−４のＣ末端断片、及びＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片又はＩＧＦＢＰ−５のＣ末端断片、の量の増加は、循環器系主要有害事象の危険度の増大と関係付けられる。本発明は、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片の特異的定量に適した抗体及び免疫アッセイ法、並びに、ＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片の特異的定量に適した抗体及び免疫アッセイ法を提供する。ＩＧＦＢＰ−４又はＩＧＦＢＰ−５のタンパク質分解開裂の過程において形成される新規なタンパク質分解性エピトープ（タンパク質分解性新規エピトープ）に特異的な抗体は、ヒト血液中のＩＧＦＢＰ−４のＮ末端及びＣ末端の両方の断片並びにＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片の、全長ＩＧＦＢＰ−４分子及び全長ＩＧＦＢＰ−５分子の存在とは関係のない正確な免疫学的検出に適している。本発明はまた、全長ＩＧＦＢＰ−４と、全長ＩＧＦＢＰ−４及びＩＧＦＢＰ−４断片の総量とを別個に定量することに基づく、ＩＧＦＢＰ−４の分別検出の方法を提供する。ＩＧＦＢＰ−４断片の濃度は、総ＩＧＦＢＰ−４と全長ＩＧＦＢＰ−４との差として計算された。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】マウスの免疫及び試験のために得た合成ペプチド及び抗原の説明。免疫原は次の通りである。１．ＮＳＯ細胞内で産生した全長ＩＧＦＢＰ−４。２．ＢＳＡと結合したＩＧＦＢＰ−４ペプチド＃１。３．ＢＳＡと結合したＩＧＦＢＰ−４ペプチド＃２。
【図２】選択したモノクローナル抗体の特異性の模式的な説明図。
【図３】ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイの較正曲線（Ａ：免疫アッセイＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４）、及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイの較正曲線（Ｂ：免疫アッセイＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３）、並びにそれぞれの全長ＩＧＦＢＰ−４との交差反応。
【図４】全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的なサンドイッチ免疫アッセイの較正曲線（Ａ：ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１８０、Ｂ：ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１５４）、及びそれぞれのＩＧＦＢＰ−４断片との交差反応。
【図５】（ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片と全長の両方を認識する、）総ＩＧＦＢＰ−４に特異的なサンドイッチ免疫アッセイの較正曲線。（Ａ）ＩＧＦＢＰ−４のＣ末端領域に特異的なアッセイ（ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１９０）、（Ｂ）ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端領域に特異的なアッセイ（ＩＢＰ１７−ＩＢＰ１８０）。Ａｇｓは抗原を表す。
【図６】ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解酵素活性を示す、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片のウェスタンブロッティングによる検出。ウサギ抗ＩＧＦＢＰ−４ポリクローナル抗体を免疫染色に用いた。ＩＧＦＢＰ−４（レーン当たり２００ｎｇ）を次の酵素で処理した。レーン１：組み換えＰＡＰＰ−Ａ、レーン２：アテローム性動脈硬化症組織のＰＡＰＰ−Ａ、レーン３：ＰＡＰＰ−Ａなし。レーン４は分子量標準物質（ｋＤａで示した）。
【図７】サンドイッチ免疫アッセイＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びサンドイッチ免疫アッセイＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４（それぞれＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４及びＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３）を用いた、健常ドナー及びＡＭＩと診断された患者から採取した血漿試料のＩＧＦＢＰ−４断片の定量。急性冠症候群（ＡＣＳ）の患者の血漿におけるＩＧＦＢＰ−４断片のレベル（平均±ＳＤ）は、健常ドナーの血漿と比べ、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４は５．１倍高く（ｐ＜０．０００１）、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４は２．７倍高かった（ｐ＜０．０００１）。
【図８Ａ】サンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４）によって定量したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４のＲＯＣ曲線、及びサンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３）によって定量したＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４のＲＯＣ曲線。ＲＯＣ曲線はＭＡＣＥ予測用である。
【図８Ｂ】サンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４）によって定量したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４のＲＯＣ曲線、及びサンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３）によって定量したＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４のＲＯＣ曲線。ＲＯＣ曲線はＭＡＣＥＡＣＤ予測用である。
【図９】（Ａ）分別免疫アッセイによって定量したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片（ＩＢＰ１７−ＩＢＰ１８０によって定量した総ＩＧＦＢＰ−４と、ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１５４によって定量した全長ＩＧＦＢＰ−４との差）のＲＯＣ曲線。（Ｂ）分別免疫アッセイによって定量したＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片（ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１９０によって定量した総ＩＧＦＢＰ−４と、ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１５４によって定量した全長ＩＧＦＢＰ−４との差）のＲＯＣ曲線。
【図１０】ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（クーマシーブルーＲ−２５０で染色）で検出した、ＩＧＦＢＰ−５のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂。レーン１：ＰＡＰＰ−ＡなしのＩＧＦＢＰ−５（レーン当たり１μｇ）、レーン２：組み換えＰＡＰＰ−Ａを用いて特異的に開裂したＩＧＦＢＰ−５、レーン３：組み換えＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５（１μｇ）、レーン４：組み換えＣＴ−ＩＧＦＢＰ−５（１μｇ）。レーン５：分子量標準物質（ｋＤａで示した）。
【図１１】ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５タンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイの較正曲線（Ａ：ＩＢＰＦ１５−ＩＢＰＦ７２、Ｂ：ＩＢＰＦ１６−ＩＢＰＦ７２）、及びそれぞれの全長ＩＧＦＢＰ−５との交差反応。抗原の濃度は、１ｐｍｏｌ／ｍｌが１６．１ｎｇ／ｍｌのＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５又は２８．６ｎｇ／ｍｌの全長ＩＧＦＢＰ−５に相当する。
【図１２】青線：サンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰＦ１５−ＩＢＰＦ７２）によって定量したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５タンパク質分解断片のＲＯＣ曲線。緑線：サンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰＦ１６−ＩＢＰＦ７２）によって定量したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５タンパク質分解断片のＲＯＣ曲線。
【０００８】
発明の詳細な説明 
本発明のために行った実験では、急性心筋梗塞の患者の血漿におけるＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片のレベル及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片のレベルは、健常ドナーの血漿と比べ、それぞれ５．１倍及び２．７倍高かった。この初期臨床研究の結果は、ＭＡＣＥの危険度評価におけるＩＧＦＢＰ−４断片の価値を検討する可能性を開くものである。
【０００９】
ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片及びＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片の予測的な価値は、その後の追跡臨床研究において評価した。急性胸痛及び息苦しさのために救命病棟に収容された治療継続中の患者をこの研究の対象とした。患者の血漿中のＩＧＦＢＰ−４断片及びＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片を定量した。その後の６ヶ月間に亘り、ＭＡＣＥの発生を観察した。その結果、患者から採取した試料に含まれるＩＧＦＢＰ−４のＮ末端及びＣ末端の両方の断片、並びにＩＧＦＢＰ−５のＮ末端断片のレベルの増加は、ＭＡＣＥの危険度の有意な上昇と関連付けられた。
【００１０】
ＩＧＦＢＰ−４の断片は、ＭＡＣＥの短期的な危険度を予測することができる血液アッセイの、今までは満たされていなかったと思われる要件を満たすことができる。
【００１１】
本発明においては、開発したサンドイッチ免疫アッセイ法の検出用抗体を、安定なＥｕ3+キレートで標識した。他の種々の態様においては、検出用抗体は、種々の標準的な手法、例えば、発光、化学発光、蛍光、吸光度や放射能の検出、あるいは顕微鏡観察、画像化処理などによって視覚化又は検出可能な様々な種類のシグナルを発生しうる様々な種類の標識を付すことが可能である。免疫アッセイには、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ネフェロ分析、比濁分析、免疫放射線アッセイ、ラテラルフロー免疫組織化学／サイトメトリーや、他の当業者に知られた方法が含まれる。
【００１２】
本発明において、アテローム性動脈硬化症型のＰＡＰＰ−Ａは、組み換えＰＡＰＰ−Ａと同じ効率でＩＧＦＢＰ−４を開裂することが示された（実施例６）。こうして、ヒトのプラークにおいて発現されるアテローム性動脈硬化症型のＰＡＰＰ−ＡはＩＧＦＢＰ−４を開裂することができる活性型プロテアーゼであるということが、初めて示された。
【００１３】
免疫アッセイは、試料中のバイオマーカーの存在又は不存在の検出のみならず、試料中のバイオマーカーの量の検出にも用いることができる。試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の量は、試料中に存在することが分かっている参照物質又は標準物質、例えば、完全なＩＧＦＢＰ−４やその他のポリペプチド、との比較によって（又はそれらに対する比として）求めることができる。試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の量は、参照値又は標準値、例えば、参照試料又は対照試料に含まれる内因性ＩＧＦＢＰ−４断片量、組み換えＩＧＦＢＰ−４断片量又は合成ＩＧＦＢＰ−４断片量など、との比較によって求めることもできる。従って、試料中のバイオマーカーの量は絶対量として定量する必要はなく、参照物質又は対照物質に対する相対量として測定することができる。
【００１４】
本発明には多くの態様がある。その中には、ＡＣＳ発症の危険度を評価するための、患者血漿試料からのＩＧＦＢＰ−４のＮ末端若しくはＣ末端の断片の検出、又はＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片とＣ末端断片の同時検出が含まれる。
【００１５】
免疫アッセイは、試料中のバイオマーカーの存在又は不存在の検出のみならず、試料中のバイオマーカーの定量にも用いることができる。試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の量は、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイ（たとえば、総ＩＧＦＢＰ−４量（ＩＧＦＢＰ−４の全長と断片）と、全長ＩＧＦＢＰ−４の量との差）によって測定することができる。本研究は、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片の定量のためにこのような計算を用いることの可能性を示すものである（実施例９）。
【実施例１】
【００１６】
ＩＧＦＢＰ−４の新規なタンパク質分解仲介性エピトープに特異的な、マウスモノクローナル抗体の作製 
マウスの免疫のために入手した合成ペプチド：
ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−１：ＣＨＦＡＫＩＲＤＲＳＴＳＧＧＫＭ
ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−２：ＫＶＮＧＡＰＲＥＤＡＲＰＶＰＱＣ
【００１７】
ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−１及びＩＧＦＢＰ−４ペプチド−２（図１）は、固相Ｆｍｏｃ化学を用いて合成した。ペプチドは、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂上に調製した。樹脂から切り離した後、粗ペプチド標品を逆相高圧液体クロマトグラフィーで精製した。
【００１８】
Ｃ１８分取カラムに０．１％トリフルオロ酢酸水溶液及び０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液の濃度勾配をかけた。精製度（＞９５％）は、分析用Ｃ１８高圧液体クロマトグラフィー及び質量分光測定法（精度が±０．５ダルトンの、マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析法）で決定した。
【００１９】
ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−１は、ＩＧＦＢＰ−４断片１２２−１３５と同一のアミノ酸配列と、そのＮ末端に更に付加された１つのシステイン残基を含有していた。ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−２は、ＩＧＦＢＰ−４断片１３６−１５０と同一のアミノ酸配列と、そのＣ末端に更に付加された１つのシステイン残基を含有していた。これら付加されたシステイン残基のスルフヒドリル基を、担体タンパク質とのペプチド結合体を作製するために使用した。
【００２０】
担体タンパク質とのペプチド結合体の作製には、Pierce（イリノイ州、ロックフォード）より入手したスルホ−ＳＭＣＣを製造社の説明書に従って使用した。結合のために、２．５ｍｇの担体タンパク質、具体的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は卵白アルブミン（共にミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）を、１０ｍＭのＫＨＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（即ち、ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。０．１ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解した２ｍｇのスルホ−ＳＭＣＣをタンパク質溶液に加えた。担体タンパク質の活性化反応を、室温で２時間実施した。過剰なスルホ−ＳＭＣＣを、ＮＡＰ−５カラム（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、GE Healthcare Life Sciencesより入手）を用いたゲル濾過で除去した。ＮＡＰ−５カラムは１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で事前に平衡化しておいた。次に、２ｍｇの合成ペプチド−１又は合成ペプチド−２をタンパク質溶液に加え、結合を開始した。反応は、恒常的な振盪と共に氷上で２時間実施した。未反応ペプチド画分を、ＰＢＳで事前に平衡化しておいたＮＡＰ−５カラムを用いたゲル濾過によってタンパク質−ペプチド結合体から除去した。ペプチドの適切な担体タンパク質への結合は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で求めたタンパク質分子量の３〜５ｋＤａの増加によって確認した。結合体は分注し、使用まで−２０℃で保存した。
【００２１】
ペプチド−（担体タンパク質）結合体によるマウスの免疫 
１群が５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド−タンパク質結合体で５回免疫した。
【００２２】
グループ１．１次免疫：１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、５μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント不完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２．５μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００２３】
グループ２．１次免疫：１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、５μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント不完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２．５μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００２４】
３次免疫の２０日後に、ペプチド特異的抗体の力価が最も高いマウスを最終免疫及びハイブリダイゼーションのために選択した。グループ１のマウスには、１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを静脈注射し、グループ２のマウスには、１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを静脈注射した。次の日にも、同じプロトコルに従って静脈注射を行った（５次免疫）。５次免疫の２日後には、免疫したマウスの脾臓を無菌的に単離し、既報（Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al., 1976; Hammerling et al., 1981）に従って、ホモジェナイズした組織をマウス骨髄腫細胞系ｓｐ２／０と融合した。
【００２５】
生育中のハイブリドーマの馴化培地について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で抗体のスクリーニングを行った。ペプチド−１又はペプチド−２に特異的な抗体を産生したハイブリドーマを、卵白アルブミン−ペプチド−１又は卵白アルブミン−ペプチド−２のそれぞれを前吸着用抗体として用いたＥＬＩＳＡによって選択した。ＮＳＯ細胞系で発現したヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）も、更なる試験において前吸着用抗体として使用した。アッセイのために、ウェル当たり５０ｎｇの卵白アルブミン−ペプチド−１、卵白アルブミン−ペプチド−２又はヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を含むＰＢＳ ０．１ｍｌを免疫アッセイ用ポリスチレンプレート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Corningより入手）に吸着させた。抗原吸着を４０分間行った後、プレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。次にプレートを、生育中のハイブリドーマから回収した馴化培地０．０５ｍｌと共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで２回洗浄した。前吸着させておいた抗原に結合したマウス抗体は、ＨＲＰと結合した２次抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）と３０分間インキュベートすることによって顕在化させた。２次抗体は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。２次抗体とのインキュベーションの後にプレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、０．０３％の過酸化水素を添加した、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有ペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍ リン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。吸光度の測定は、Labsystems Multiscan マイクロプレートリーダー（フィンランド国、Labsystems製）で行った。
【００２６】
卵白アルブミンと結合した適切なペプチドに特異的であり（上記条件において４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．５を超え）、且つ同時に、ヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４とは反応しない（４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．０２５未満）の抗体を産生するハイブリドーマを、更なる研究のために選択した。このようなハイブリドーマを、限界希釈法でクローニングした。所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、１０％胎仔ウシ血清（ユタ州、ローガン、HyClone Laboratories製）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【００２７】
抗体のアフィニティー精製 
選択したハイブリドーマクローンをマウスの腹腔内に注射し、モノクローナル抗体を腹水中で産生した。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて、腹水から抗体を精製した。樹脂はGE Healthcare Life Sciences（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）より入手し、精製は製造者の説明書に従って実施した。精製モノクローナル抗体は、５０％硫酸アンモニウムの懸濁液として４℃で保存した。
【００２８】
モノクローナル抗体の特異性に関する研究 
選択したモノクローナル抗体の特異性を確認するために、ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片を得た。ＰＡＰＰ−Ａ依存性タンパク質分解反応を、既報（Overgaard et al., 2000）の条件に従って実施した。２μｇのヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を、２ｍＭのＣａＣｌ2、１．８μｇのＩＧＦ−ＩＩ（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）、４０ｎｇのヒト組み換えＰＡＰＰ−Ａ（フィンランド国、トゥルク、HyTest製）及び２μｌのタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）の存在下で、０．２３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートした。反応は３７℃で１５時間実施し、試料を−２０℃で凍結することによって反応を停止した。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂の程度は、Abcam（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）より入手した特異的ウサギポリクローナル抗体 １μｇ／ｍｌを用いたウェスタンブロッティングで決定した（図６）。選択したモノクローナル抗体のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に対する特異性の研究は、アフィニティー精製抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡ法で実施した。１０ｎｇの組み換え全長ＩＧＦＢＰ−４又はＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって調製した（方法は上述したとおり）ＩＧＦＢＰ−４断片をポリスチレンプレートに吸着させた。４０分間のインキュベーション後にプレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。選択したＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を振盪下、室温で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。特異的に結合した抗体は、ＨＲＰを結合した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）で検出した。２次抗体は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。２次抗体とのインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、０．０３％の過酸化水素を添加した３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有ペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍリン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって産生されたタンパク質分解断片に特異的であり、完全なＩＧＦＢＰ−４との交差反応性が５％未満である以下のモノクローナル抗体群を最終的に選択した：ＩＢＰ２８、ＩＢＰ２７、ＩＢＰ１２、ＩＢＰ３、ＩＢＰ４、ＩＢＰ７、ＩＢＰ１３、ＩＢＰ１８、ＩＢＰ１９、ＩＢＰ２０、ＩＢＰ３０、ＩＢＰ１６７、ＩＢＰ１７４、ＩＢＰ１６０、ＩＢＰ１６１、ＩＢＰ１６４、ＩＢＰ１７１、ＩＢＰ１６３、ＩＢＰ１６２（図２）。ＩｇＭアイソタイプであるＩＢＰ３０以外の全てのモノクローナル抗体が、ＩｇＧアイソタイプであった。
【実施例２】
【００２９】
完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なマウス モノクローナル抗体の作製 
マウスの免疫 
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、哺乳動物由来のＮＳＯ細胞系で発現させたヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４で５回免疫した。このタンパク質は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。１次免疫：５μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、２μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント不完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００３０】
３次免疫の２０日後に、タンパク質特異的抗体の力価が最も高いマウスを、次の免疫及びハイブリダイゼーションのために選択した。マウスに対する４回目の注射は、２μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌの静脈注射で行った。最後の静脈注射は、次の日に同じプロトコルに従って実施した（５次免疫）。２日後には、免疫したマウスの脾臓を無菌的に単離し、既報（Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al., 1976; Hammerling et al., 1981）に従って、ホモジェナイズした組織をマウス骨髄腫細胞系ｓｐ２／０と融合した。生育中のハイブリドーマの馴化培地について、ＥＬＩＳＡ法でＩＧＦＢＰ−４特異的抗体のスクリーニングを行った。完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、間接ＥＬＩＳＡで選択した。アッセイのために、ウェル当たり５０ｎｇのヒト組み換え全長ＩＧＦＢＰ−４を含むＰＢＳ ０．１ｍｌを免疫アッセイ用ポリスチレンプレートに吸着させた。４０分間のインキュベーションの後にプレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。次にプレートを、生育中のハイブリドーマの入ったウェルから回収した馴化培地０．０５ｍｌと共に３０分間インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した。洗浄後にプレートを、ＨＲＰと結合した２次抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーションの後にプレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ及び０．０３％の過酸化水素を含有するペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍ リン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的な（上記条件において４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．５を超える）抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法でクローニングした。所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、１０％胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭで培養した。
【００３１】
抗体のアフィニティー精製 
選択したハイブリドーマクローンをマウスの腹腔内注射し、全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体を腹水中で産生した。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて、腹水から抗体を精製した。樹脂はGE Healthcare Life Sciences（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）より入手し、精製は製造社の説明書に従って実施した。精製モノクローナル抗体は、５０％硫酸アンモニウムの懸濁液として４℃で保存した。完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体群を最終的に選択した：ＩＢＰ１７、ＩＢＰ１８０、ＩＢＰ１８１、ＩＢＰ１５３、ＩＢＰ１５４、ＩＢＰ１５２、ＩＢＰ１５６、ＩＢＰ１４４、ＩＢＰ１９０、ＩＢＰ１８２、ＩＢＰ１８５、ＩＢＰ１８６、ＩＢＰ１８７（図２）。
【実施例３】
【００３２】
ＩＧＦＢＰ−４断片の定量のためのサンドイッチ免疫アッセイの設計 
アフィニティー精製したモノクローナル抗体の特異性を、サンドイッチ免疫アッセイでも確認した（図３）。要求される特性を示す組合せを発見するために、特異的抗体のいくつかの群を、サンドイッチ免疫アッセイで試験した。完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−４の存在とは関係のない、ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の特異的な検出が可能なサンドイッチ免疫アッセイを開発するために、タンパク質分解性新規エピトープに特異的なモノクローナル抗体を、完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体とともに試験した。ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片（Ｎ末端断片又はＣ末端断片）に特異的な１種のモノクローナル抗体（間接ＥＬＩＳＡにおける全長分子との交差反応性は５％未満）、及び完全なＩＧＦＢＰ−４のいずれかのエピトープを認識する別のＭＡｂを用いる、数種のサンドイッチアッセイを開発した。完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なマウスモノクローナル抗体の作製については、実施例２に記載した。サンドイッチ蛍光免疫アッセイを実施するために、Hyytia et al., 2010に記載されているように安定化Ｅｕ3+キレートで標識した検出用ＭＡｂを用いた。このアッセイに用いる捕捉抗体は完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的であるが、一方、検出用抗体は、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解性新規エピトープに特異的である。ウェル当たり２μｇの捕捉抗体（ＩＢＰ３、ＩＢＰ１８、ＩＢＰ１８５、ＩＢＰ１８２）を含む１００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水を、９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ3を添加した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液（即ち、緩衝液Ａ）で洗浄した。洗浄後、１００ｎｇ／ｍｌのヒト組み換え全長ＩＧＦＢＰ−４又は組み換えＩＧＦＢＰ−４断片を添加した０．１ｍｌのアッセイ用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）、９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ４０、０．５％のＢＳＡ及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ3）をプレートに加えた。プレートを、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、０．１ｍｌの検出用抗体（ＩＢＰ１４４、ＩＢＰ１８０、ＩＢＰ１７７、ＩＢＰ１６３及びＩＢＰ１６２）のアッセイ用緩衝液溶液（１ｍｇ／Ｌ）を添加した。プレートを、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液（１．７５ＭのＮａＳＣＮ、１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２０％の１−プロパノール、５ｍＭのＮａ2ＣＯ3、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．０）を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。蛍光は、１秒当たりのカウント（ＣＰＳ）で表した。開発したサンドイッチ免疫アッセイは、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４断片のみを検出し、全長ＩＧＦＢＰ−４との交差反応は生じなかった（あるいは１％未満であった）。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４に特異的な組合せとして最適なものはＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４（図���Ａ）であり、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４に特異的な組合せとして最適なものはＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３（図３Ｂ）であった。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４に特異的なサンドイッチ免疫アッセイには、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片に特異的なモノクローナル抗体を捕捉抗体として用い、完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体を検出用抗体として用いた。一方、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４に特異的なサンドイッチ免疫アッセイのためには、これとは逆の組み合わせを用いた。
【実施例４】
【００３３】
完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−４の定量のためのサンドイッチ免疫アッセイの設計 
ＩＧＦＢＰ−４断片の存在下における全長ＩＧＦＢＰ−４の定量は、タンパク質のＮ末端ドメインに特異的な１つのモノクローナル抗体と、完全なＩＧＦＢＰ−４のＣ末端ドメインに存在するエピトープを認識する別のＭＡｂとを用いる、特異的なサンドイッチ免疫アッセイによって行うことができる。全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的なマウスモノクローナル抗体の作製については、実施例２に記載した。サンドイッチ蛍光免疫アッセイを実施するために、実施例３に記載した方法を用いた。このアッセイに用いる捕捉抗体は、完全なＩＧＦＢＰ−４のＣ末端領域に特異的であった（ＩＢＰ１８２、ＩＢＰ１８６、ＩＢＰ１８５、ＩＢＰ１８７）。このアッセイに用いる検出用抗体は、全長ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端領域に特異的であった（ＩＢＰ１５４、ＩＢＰ１８０、ＩＢＰ１８１、ＩＢＰ１５３、ＩＢＰ１５６）。開発したサンドイッチ免疫アッセイは、全長ＩＧＦＢＰ−４のみを検出し、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製した断片との交差反応は生じなかった（あるいは１％未満であった）。最適な組合せは、ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１８０とＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１５４とであった（図４）。
【実施例５】
【００３４】
ＩＧＦＢＰ−４の全体の定量のためのサンドイッチ免疫アッセイの設計 
ＩＧＦＢＰ−４の総量を検出するための免疫アッセイを開発するために、両方の形態のＩＧＦＢＰ−４（全長と断片）に特異的なモノクローナル抗体を用いた。このような免疫アッセイにおいては、タンパク質の両方の形態、即ち、全長とタンパク質分解断片、に等しく特異的であることが重要である（図５）。このようなサンドイッチ免疫アッセイとして、次の２種類のものを設計することができる：（１）全長ＩＧＦＢＰ−４とＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片の両方の検出用アッセイ（ＩＧＦＢＰ−４のＣ末端領域に存在するエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体を使用）、（２）全長ＩＧＦＢＰ−４とＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片の両方の検出用アッセイ（ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端領域に存在するエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体を使用）。完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なマウスモノクローナル抗体の作製については、実施例２に記載した。サンドイッチ蛍光免疫アッセイを実施するために、実施例３に記載した方法を用いた。このアッセイに用いた捕捉抗体は、完全なＩＧＦＢＰ−４のＣ末端領域に特異的であった（ＩＢＰ１８２、ＩＢＰ１８６、ＩＢＰ１８５、ＩＢＰ１８７、ＩＢＰ１９０）。このアッセイに用いた検出用抗体は、完全なＩＧＦＢＰ−４のＮ末端領域に特異的であった（ＩＢＰ１５４、ＩＢＰ１８０、ＩＢＰ１８１、ＩＢＰ１５３、ＩＢＰ１５６、ＩＢＰ１７）。開発したサンドイッチ免疫アッセイは、総ＩＧＦＢＰ−４を検出することができ、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４断片及び完全なＩＧＦＢＰ−４との相違は生じない（あるいは、非常に低く、１０％未満である）。最適な組合せは、ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１９０とＩＢＰ１７−ＩＢＰ１８０とであった（それぞれ、図５Ａ及び図５Ｂ）。
【実施例６】
【００３５】
アテローム性動脈硬化症型のＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性 
ヒト アテローム性動脈硬化症の冠状血管試料は、使用するまで−７０℃で保存した。アテローム性動脈硬化症の冠状動脈からのＰＡＰＰ−Ａの抽出は、組織をホモジェナイズした後に行った。抽出したＰＡＰＰ−Ａは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＰＡＰＰ−Ａの精製に用いたアフィニティーマトリックスは、ＰＡＰＰ−Ａ特異的モノクローナル抗体４Ｇ１１（フィンランド国、トゥルク、HyTestより入手）を用いて調製した。精製タンパク質がＰＡＰＰ−Ａであることを確認するために、数種のＰＡＰＰ−Ａ特異的モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング及び液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を使用した。
【００３６】
アテローム性動脈硬化症型のＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性を解析するために、２μｇのヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を、２ｍＭのＣａＣｌ2、１．８μｇのＩＧＦ−ＩＩ（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）、４０ｎｇのアテローム性動脈硬化型ＰＡＰＰ−Ａ及び２μｌのタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）の存在下で、０．２３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートした。反応は３７℃で１５時間実施し、試料を−２０℃で凍結することによって反応を停止した。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂の程度は、ＩＧＦＢＰ−４特異的ウサギポリクローナル抗体（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Abcamより入手）を用いたウェスタンブロッティングで決定した（図６）。
【実施例７】
【００３７】
健常ドナー及びＡＭＩと診断された患者の血漿試料におけるＩＧＦＢＰ−４断片の測定 
ＡＣＳ患者の血漿試料に含まれるＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片の検出を、タンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイを用いて行った。ＡＣＳ患者（心電図においてＳＴ上昇が見られるもの）４３人の血液と、健常ドナー由来の５４例の血漿試料について、断片特異的なサンドイッチ免疫アッセイであるＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４アッセイ（Ｎ末端断片に特異的）及びＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３アッセイ（Ｃ末端断片に特異的）で試験した。全ての血漿試料をＥＤＴＡの存在下で患者から採取し、測定まで−７０℃で保存した。
【００３８】
サンドイッチ免疫アッセイのために、ウェル当たり２μｇの捕捉抗体（ＩＢＰ３及びＩＢＰ１８２）を含む０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。プレートを緩衝液Ａで洗浄した後、アッセイ緩衝液で５倍に希釈した患者の血漿試料０．１ｍｌをプレートに加えた。プレートは、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、安定なＥｕ3+キレートを結合した検出用抗体ＩＢＰ１４４又はＩＢＰ１６３を含むアッセイ用緩衝液溶液 ０．１ｍｌを添加した。プレートは、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。ＡＣＳ患者の血漿におけるＩＧＦＢＰ−４断片レベルは、健常ドナーの血漿におけるレベルよりも５．１倍又は２．７倍も高かった（どちらもｐ＜０．０００５）（図７）。平均±標準偏差を図面に記した。蛍光は、１秒当たりのカウント（ＣＰＳ）で表した。サンドイッチアッセイ用のペアであるＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４及びＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３により、断片量の有意な増加が明らかになった（図７）。
【実施例８】
【００３９】
ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイを用いた循環器系主要有害事象の予測のための、ＩＧＦＢＰ−４断片の追跡研究 
この研究のために、胸痛／息苦しさのために救命病棟に収容された患者から、その収容時に試料を採取した。
【００４０】
熟練した心臓病専門医によって心臓型と分類される特定の胸痛として主に顕在化する虚血症の兆候を有している患者が、研究対象として適していた。１６６人の患者を、この研究の対象とした。患者の静脈血を、Ｋ3ＥＤＴＡを含有する真空チューブ（Greiner Bio-One製）に回収し、３０００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離に付した。血漿試料を−７０℃で保存した。すべての患者について、研究に加えられた日（すべての基準値評価が完了した日）から６ヶ月間又は死に至るまで、追跡研究を行った。登録された主要エンドポイントには、非致死的な心筋梗塞と心臓死を含む循環器系主要有害事象（ＭＡＣＥ）が含まれていた。複合エンドポイントは、ＭＡＣＥと全ての死因による死亡（ＭＡＣＥＡＣＤ）を含んでいた。１６６人の患者の全員について、完全な追跡をすることができた（１００％）。ＭＡＣＥが１７例あり、ＭＡＣＥＡＣＤが３１例であった。
【００４１】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４及び全長ＩＧＦＢＰ−４、並びにこれらの比率の予測的価値を調べるために、ＲＯＣ曲線分析を行った。６ヶ月後のＭＡＣＥエンドポイントが関心のある事象であった。ＭＡＣＥのエンドポイント及びＭＡＣＥＡＣＤのエンドポイントを予測する上で最適なＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４のカットオフ値は、受信者・動作者曲線（ＲＯＣ曲線）によって導きだしたものであり、感度と特異度との最適な組合せをもたらす値として定義した。
【００４２】
本発明においては、急性胸痛患者の血漿試料に含まれるＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片の検出を、タンパク質分解断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイを用いて行った。１６６人の患者の血液を、断片特異的なサンドイッチ免疫アッセイＩＢＰ３−ＩＢＰ１４４（ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４用）及びＩＢＰ１８２−ＩＢＰ１６３（ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４用）によって試験した。
【００４３】
サンドイッチ免疫アッセイによる測定のために、ウェル当たり２μｇの捕捉抗体（ＩＢＰ３及びＩＢＰ１８２）を含む０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。プレートを緩衝液Ａで洗浄した後、アッセイ緩衝液で５倍に希釈した患者の血漿試料０．１ｍｌをプレートに加えた。プレートは、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、検出用抗体ＩＢＰ１４４及びＩＢＰ１６３を含むアッセイ用緩衝液溶液（０．１ｍｌ）を添加した。プレートは、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer）で測定した。
【００４４】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４の濃度とＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４の濃度は、それぞれ、７〜２５５３μｇ／Ｌと１２〜５６４μｇ／Ｌの範囲内であった。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４並びにこれらの比率の、６ヶ月後の時点で発生しているＭＡＣＥに対する予測能を、ＲＯＣ分析によって調べた（図８）。ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ  ＡＵＣ）は、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４アッセイの場合は０．８６１（ｐ＜０．００１）、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４アッセイの場合は０．８００（ｐ＜０．００１）であり、この結果は、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４がＭＡＣＥの予測において優れた指標であることを示している（図８Ａ）。さらに、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４はＭＡＣＥＡＣＤの予測においても優れた指標であり、それらのＲＯＣ  ＡＵＣは、それぞれ、０．８１４（ｐ＜０．００１）、０．８０３（ｐ＜０．００１）であった（図８Ｂ）。本研究におけるカットオフ値は、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４については２１４μｇ／Ｌ、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４については１２４μｇ／Ｌと推定された。
【００４５】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４は、ともに、急性胸痛患者の６ヶ月の追跡期間内に発生するＭＡＣＥ及びＭＡＣＥＡＣＤを予測する優れた指標であると思われた（図８）。
【００４６】
上記の試料から無作為に選ばれた１１４個の試料について、心臓トロポニンＩを定量した。ここで選ばれた試料には、６ヶ月間の追跡期間中にＭＡＣＥが発生したものが１０例あった。ここで選ばれた試料においては、心臓トロポニンＩのＲＯＣ  ＡＵＣは０．６８６（Ｐ＝０．０５３）であり、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４のＲＯＣ  ＡＵＣは０．８（Ｐ＝０．００２）であった。心臓トロポニンＩとＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４の両方に基づく組合せモデルの予測能は、ＲＯＣ  ＡＵＣが０．８４８（ｐ＜０．００１）であった。この結果は、心臓トロポニンＩとＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４とを組み合せたモデルは、これら２つのバイオマーカーを個々に用いた場合よりも、ＭＡＣＥを予測する指標として付加価値を有することを示していた。
【実施例９】
【００４７】
分別サンドイッチ免疫アッセイを用いた循環器系主要有害事象の予測のための、ＩＧＦＢＰ−４断片の追跡研究 
本研究においては、実施例８に記載した採取血液の試料の一部を用いた。ここで用いた試料は、無作為に選ばれた６６人の患者の試料を含んでいた。６ヶ月の追跡期間中に、これらの試料において６例のＭＡＣＥを登録した。
【００４８】
急性胸痛患者の血漿試料におけるＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の検出を、総ＩＧＦＢＰ−４に特異的なサンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰ１７−ＩＢＰ１８０及びＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１９０）並びに全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的なサンドイッチ免疫アッセイ（ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１８０及びＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１５４）を用いて行った。サンドイッチ免疫アッセイによる定量は、実施例８に記載した通りに行った。
【００４９】
この研究コホートにおける全長ＩＧＦＢＰ−４濃度の中央値は８２２μｇ／Ｌ（四分位数範囲は６５２〜１０１３μｇ／Ｌ）であり、その濃度範囲は４４１〜１８６５μｇ／Ｌであった。ＣＴ特異的アッセイ、ＮＴ特異的アッセイによって測定した総ＩＧＦＢＰ−４の濃度範囲は、それぞれ１５９〜１１２４μｇ／Ｌ、４６〜１９６８μｇ／Ｌであった。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片の量は、ＩＧＦＢＰ−４の総量（全長ＩＧＦＢＰ−４及びＮ末端ＩＧＦＢＰ−４断片のアッセイ、ＩＢＰ１７−ＩＢＰ１８０）と全長ＩＧＦＢＰ−４の量との差として計算した。ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片の量は、ＩＧＦＢＰ−４の総量（全長ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４断片のアッセイ、ＩＢＰ１８５−ＩＢＰ１９０）と全長ＩＧＦＢＰ−４の量との差として計算した。
【００５０】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４アッセイ、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４アッセイについてのＲＯＣ  ＡＵＣは、それぞれ、０．７７（ｐ＜０．０１）、０．８（ｐ＜０．０１）であり、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４及びＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４がＭＡＣＥを予測する優れた指標であることを示した（図９）。分別アッセイによって定量したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−４、ＣＴ−ＩＧＦＢＰ−４の、６ヶ月後の時点で発生しているＭＡＣＥに対する予測能は、ＲＯＣ分析によって調べた（それぞれ、図９Ａ、図９Ｂ）。
【実施例１０】
【００５１】
ＩＧＦＢＰ−５の新規なタンパク質分解仲介性エピトープに特異的な、マウス モノクローナル抗体の作製 
マウスの免疫のために入手した合成ペプチド：
ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４：ＣＫＡＥＡＶＫＫＤＲＲＫＫＬＴＱＳ
【００５２】
ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４は、固相Ｆｍｏｃ化学を用いて上記のように合成した。ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４は、ＩＧＦＢＰ−５断片１２８−１４３と同一のアミノ酸配列と、そのＮ末端に更に付加された１つのシステイン残基を含有していた。担体タンパク質（ＢＳＡ又は卵白アルブミン）とのペプチド結合体の作製は、上記のスルホ−ＳＭＣＣを用いて行った。
【００５３】
ペプチド−（担体タンパク質）結合体によるマウスの免疫 
１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド−タンパク質結合体で５回免疫した。１次免疫：１０μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、５μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント不完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２．５μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００５４】
３次免疫の２０日後に、ペプチド特異的抗体の力価が最も高いマウスを、最後の免疫及びハイブリダイゼーションのために選択した。マウスに対して、１０μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌの静脈注射を行った。静脈注射を、次の日に同じプロトコルに従って繰り返した（５次免疫）。５次免疫の２日後には、免疫したマウスの脾臓を無菌的に単離し、既報（Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al., 1976; Hammerling et al., 1981）に従って、ホモジェナイズした組織をマウス骨髄腫細胞系ｓｐ２／０と融合した。
【００５５】
生育中のハイブリドーマの馴化培地について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で抗体のスクリーニングを行った。ＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４に特異的な抗体を産生したハイブリドーマを、卵白アルブミン−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４を前吸着用抗体として用いたＥＬＩＳＡによって選択した。ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞系内で発現させたヒト組み換えＩＧＦＢＰ−５も、更なる試験において前吸着用抗体として使用した。アッセイのために、ウェル当たり５０ｎｇの卵白アルブミン−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４又はヒト組み換えＩＧＦＢＰ−５を含むＰＢＳ ０．１ｍｌを免疫アッセイ用ポリスチレンプレート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Corningより入手）に吸着させた。抗原吸着を４０分間行った後、プレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。次にプレートを、生育中のハイブリドーマから回収した馴化培地０．０５ｍｌと共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで２回洗浄した。前吸着させておいた抗原に結合したマウス抗体は、ＨＲＰと結合した２次抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）と３０分間インキュベートすることによって顕在化させた。２次抗体は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。２次抗体とのインキュベーションの後にプレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、０．０３％の過酸化水素を添加した、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有ペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍ リン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。吸光度の測定は、Labsystems Multiscan マイクロプレートリーダー（フィンランド国、Labsystems製）で行った。
【００５６】
卵白アルブミンと結合した適切なペプチドに特異的であり（上記条件において４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．５を超え）、且つ同時に、ヒト組み換えＩＧＦＢＰ−５とは反応しない（４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．０２５未満の）抗体を産生するハイブリドーマを、更なる研究のために選択した。このようなハイブリドーマを、限界希釈法でクローニングした。所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、１０％胎仔ウシ血清（ユタ州、ローガン、HyClone Laboratories製）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【００５７】
抗体の産生及びアフィニティー精製は、下記の通りに実施した。
【００５８】
モノクローナル抗体の特異性に関する研究 
選択したモノクローナル抗体の特異性を確認するために、ＩＧＦＢＰ−５タンパク質分解断片を得た。ＰＡＰＰ−Ａ依存性タンパク質分解反応を、下記の条件に従って実施した。１２μｇのヒト組み換えＩＧＦＢＰ−５を、２ｍＭのＣａＣｌ2、１２０ｎｇのヒト組み換えＰＡＰＰ−Ａ（フィンランド国、トゥルク、HyTest製）及び０．５μｌのタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）の存在下で、０．１２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートした。反応は３７℃で４０分間実施し、試料を−７０℃で凍結することによって反応を停止した。ＩＧＦＢＰ−５のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂の程度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くクーマシーブルーＲ−２５０染色で決定した（図１０）。選択したモノクローナル抗体のＩＧＦＢＰ−５タンパク質分解断片に対する特異性の研究は、アフィニティー精製抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡ法で実施した。１０ｎｇの組み換え全長ＩＧＦＢＰ−５又はＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって調製した（方法は上述したとおり）ＩＧＦＢＰ−５断片をポリスチレンプレートに吸着させた。４０分間のインキュベーション後にプレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。選択したＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を振盪下、室温で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。特異的に結合した抗体は、ＨＲＰを結合した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）で検出した。２次抗体は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。２次抗体とのインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、０．０３％の過酸化水素を添加した３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有ペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍリン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＩＧＦＢＰ−５のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって産生されたタンパク質分解断片に特異的であり、完全なＩＧＦＢＰ−５との交差反応性が５％未満である１種類のモノクローナル抗体を最終的に選択した：ＩＢＰＦ７２（図２）。ＩＢＰＦ７２は、ＩｇＧアイソタイプであった。
【実施例１１】
【００５９】
完全なＩＧＦＢＰ−５に特異的なマウス モノクローナル抗体の作製 
マウスの免疫のために入手した合成ペプチド：
ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２：ＣＬＮＥＫＳＹＲＥＱＶＫＩＥＲＤＳＲＥＨＥ
【００６０】
ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２は、固相Ｆｍｏｃ化学を用いて上記のように合成した。
【００６１】
ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２は、ＩＧＦＢＰ−５断片８０−１００と同一のアミノ酸配列を含有していた。担体タンパク質（ＢＳＡ）とペプチドとの結合体の作製は、上記のスルホ−ＳＭＣＣを用いて行った。
【００６２】
ペプチド−（担体タンパク質）結合体によるマウスの免疫。１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド−タンパク質結合体で５回免疫した。１次免疫：１０μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、５μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロイント不完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２．５μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００６３】
３次免疫の２０日後に、ペプチド特異的抗体の力価が最も高いマウスを、最後の免疫及びハイブリダイゼーションのために選択した。マウスに対し、１０μｇのＢＳＡ−ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌの静脈注射を行った。静脈注射を、次の日に同じプロトコルに従って繰り返した（５次免疫）。５次免疫の２日後には、免疫したマウスの脾臓を無菌的に単離し、既報（Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al., 1976; Hammerling et al., 1981）に従って、ホモジェナイズした組織をマウス骨髄腫細胞系ｓｐ２／０と融合した。
【００６４】
生育中のハイブリドーマの馴化培地について、ＥＬＩＳＡ法でＩＧＦＢＰ−５特異的抗体のスクリーニングを行った。完全なＩＧＦＢＰ−５に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、間接ＥＬＩＳＡで選択した。アッセイのために、ウェル当たり５０ｎｇのヒト組み換え全長ＩＧＦＢＰ−５を含むＰＢＳ ０．１ｍｌを免疫アッセイ用ポリスチレンプレートに吸着させた。４０分間のインキュベーションの後にプレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。次にプレートを、生育中のハイブリドーマの入ったウェルから回収した馴化培地０．０５ｍｌと共に３０分間インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した。洗浄後にプレートを、ＨＲＰと結合した２次抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーションの後にプレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ及び０．０３％の過酸化水素を含有するペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍ リン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。全長ＩＧＦＢＰ−５に特異的な（上記条件において４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．５を超える）抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法でクローニングした。所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、１０％胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭで培養した。
【００６５】
抗体の産生及びアフィニティー精製は、上記の通りに実施した。完全なＩＧＦＢＰ−５に特異的な次のモノクローナル抗体群を最終的に選択した：ＩＢＰＦ１５、ＩＢＰＦ１６。
【実施例１２】
【００６６】
ＩＧＦＢＰ−５断片の定量のためのサンドイッチ免疫アッセイの設計 
アフィニティー精製したモノクローナル抗体ＩＢＰＦ７２の特異性を、サンドイッチ免疫アッセイでも確認した（図１１）。完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−５の存在とは関係のない、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の特異的な検出が可能なサンドイッチ免疫アッセイを開発するために、ＩＢＰＦ７２を完全な（全長）ＩＧＦＢＰ−５に特異的なモノクローナル抗体とともに試験した。ＩＧＦＢＰ−５のＮ末端タンパク質分解断片に特異的なＩＢＰＦ７２モノクローナル抗体（間接ＥＬＩＳＡにおける全長分子との交差反応性は５％未満）、及び完全なＩＧＦＢＰ−５を認識する別のＭＡｂを用いる、２種類のサンドイッチアッセイを開発した。サンドイッチ蛍光免疫アッセイを実施するために、Hyytia et al., 2010に記載の安定化Ｅｕ3+キレートで標識した検出用ＭＡｂを用いた。このアッセイに用いる捕捉抗体は完全なＩＧＦＢＰ−５に特異的であるが、一方、検出用抗体は、ＩＧＦＢＰ−５のタンパク質分解性新規エピトープに特異的である。ウェル当たり１．５μｇの捕捉抗体（ＩＢＰＦ１５又はIＢＰＦ１６）を含む１００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水を、９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ3を添加した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液（即ち、緩衝液Ａ）で洗浄した。洗浄後、種々の濃度のヒト組み換え全長ＩＧＦＢＰ−５又は組み換えＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５断片を含有する０．０５ｍｌのアッセイ用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）、９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ４０、０．５％のＢＳＡ及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ3）と、０．０５ｍｌの検出用抗体（ＩＢＰＦ７２）溶液（アッセイ用緩衝液からなる４ｍｇ／Ｌ溶液）とをプレートに加えた。プレートを、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液（１．７５ＭのＮａＳＣＮ、１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２０％の１−プロパノール、５ｍＭのＮａ2ＣＯ3、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．０）を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。蛍光は、１秒当たりのカウント（ＣＰＳ）で表した。開発したサンドイッチ免疫アッセイは、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５（即ち、ＩＧＦＢＰ−４の組み換えＮ末端断片）のみを検出し、全長ＩＧＦＢＰ−５との交差反応は生じなかった（あるいは、５％未満であった）。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５に特異的な２つのペアは、ＩＢＰＦ１５−ＩＢＰＦ７２とＩＢＰＦ１６−ＩＢＰＦ７２とであった（それぞれ、図１１Ａ、図１１Ｂ）。
【実施例１３】
【００６７】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５に特異的なサンドイッチ免疫アッセイを用いた循環器系主要有害事象の予測のための、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の追跡研究 
胸痛／息苦しさのために救命病棟に収容された患者をこの研究の対象とした。不安定狭心症又は虚血性心疾患と診断された患者もまた、研究の対象とした。
【００６８】
２７６人の患者を、この研究の対象とした。患者の静脈血を、Ｋ3ＥＤＴＡを含有する真空チューブ（Greiner Bio-One製）に回収し、３０００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離に付した。血漿試料を−７０℃で保存した。すべての患者について、研究に加えられた日（すべての基準値評価が完了した日）から６ヶ月間又は死に至るまで、追跡研究を行った。登録された主要エンドポイントには、非致死的心筋梗塞と心臓死を含む循環器系主要有害事象（ＭＡＣＥ）が含まれていた。本研究には、追跡情報の得られた患者のみを加えた。追跡期間中に、ＭＡＣＥ主要エンドポイントが２４例あった。
【００６９】
ＭＡＣＥの発生したすべての患者の試料と、ＭＡＣＥを発生しなかった患者集団から無作為に選択した２４人の試料とについて、ＩＢＰＦ１５−ＩＢＰＦ７２とＩＢＰＦ１６−ＩＢＰＦ７２とを用い、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の濃度を測定した。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の予測的価値を調べるために、ＲＯＣ曲線分析を行った。
【００７０】
サンドイッチ免疫アッセイによる測定のために、ウェル当たり１．５μｇの捕捉抗体（ＩＢＰＦ１５又はＩＢＰＦ１６）を含む０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪下、室温で４５分間インキュベートした。プレートを緩衝液Ａで洗浄した後、アッセイ緩衝液で２倍に希釈した患者の血漿試料０．０５ｍｌと、０．０５ｍｌの検出用抗体ＩＢＰＦ７２のアッセイ緩衝液溶液をプレートに加えた。プレートは、恒常的な振盪下、室温で４０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。
【００７１】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の濃度は、１５．４〜８３．３μｇ／Ｌの範囲内であった。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５の、６ヶ月後の時点で発生しているＭＡＣＥに対する予測能を、ＲＯＣ分析によって調べた（図１２）。ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５アッセイについてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ  ＡＵＣ）は、ＩＢＰＦ１５−ＩＢＰＦ７２については０．６８（ｐ＝０．０３４）であり、ＩＢＰＦ１６−ＩＢＰＦ７２については０．６７（ｐ＝０．０３９）であった。これは、ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５がＭＡＣＥを予測する優れた指標であることを示している（図１２）。
【００７２】
ＮＴ−ＩＧＦＢＰ−５は、急性胸痛、不安定狭心症又は虚血性心疾患の患者において、６ヶ月の追跡期間内に発生するＭＡＣＥを予測する優れた指標であると思われた。
【００７３】
文献 
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【００７４】
以下に、本願に関する配列表を与える。動物の免疫に用いるペプチド（配列７〜１０）は、より大きい断片（配列１、２及び４）の中では下線を引いてある。配列表は、別に与える。
【００７５】
配列番号１（ＩＧＦＢＮＰ−４のＮ末端）：
ＤＥＡＩＨＣＰＰＣＳＥＥＫＬＡＲＣＲＰＰＶＧＣＥＥＬＶＲＥＰＧＣＧＣＣＡＴＣＡＬＧＬＧＭＰＣＧＶＹＴＰＲＣＧＳＧＬＲＣＹＰＰＲＧＶＥＫＰＬＨＴＬＭＨＧＱＧＶＣＭＥＬＡＥＩＥＡＩＱＥＳＬＱＰＳＤＫＤＥＧＤＨＰＮＮＳＦＳＰＣＳＡＨＤＲＲＣＬＱＫＨＦＡＫＩＲＤＲＳＴＳＧＧＫＭ
【００７６】
配列番号２（ＩＧＦＢＰ−４のＣ末端）：
ＫＶＮＧＡＰＲＥＤＡＲＰＶＰＱＧＳＣＱＳＥＬＨＲＡＬＥＲＬＡＡＳＱＳＲＴＨＥＤＬＹＩＩＰＩＰＮＣＤＲＮＧＮＦＨＰＫＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲＧＫＣＷＣＶＤＲＫＴＧＶＫＬＰＧＧＬＥＰＫＧＥＬＤＣＨＱＬＡＤＳＦＲＥ
【００７７】
配列番号３（ＩＧＦＢＰ−４）：
ＤＥＡＩＨＣＰＰＣＳＥＥＫＬＡＲＣＲＰＰＶＧＣＥＥＬＶＲＥＰＧＣＧＣＣＡＴＣＡＬＧＬＧＭＰＣＧＶＹＴＰＲＣＧＳＧＬＲＣＹＰＰＲＧＶＥＫＰＬＨＴＬＭＨＧＱＧＶＣＭＥＬＡＥＩＥＡＩＱＥＳＬＱＰＳＤＫＤＥＧＤＨＰＮＮＳＦＳＰＣＳＡＨＤＲＲＣＬＱＫＨＦＡＫＩＲＤＲＳＴＳＧＧＫＭＫＶＮＧＡＰＲＥＤＡＲＰＶＰＱＧＳＣＱＳＥＬＨＲＡＬＥＲＬＡＡＳＱＳＲＴＨＥＤＬＹＩＩＰＩＰＮＣＤＲＮＧＮＦＨＰＫＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲＧＫＣＷＣＶＤＲＫＴＧＶＫＬＰＧＧＬＥＰＫＧＥＬＤＣＨＱＬＡＤＳＦＲＥ
【００７８】
配列番号４（ＩＧＦＢＰ−５のＮ末端）：
ＬＧＳＦＶＨＣＥＰＣＤＥＫＡＬＳＭＣＰＰＳＰＬＧＣＥＬＶＫＥＰＧＣＧＣＣＭＴＣＡＬＡＥＧＱＳＣＧＶＹＴＥＲＣＡＱＧＬＲＣＬＰＲＱＤＥＥＫＰＬＨＡＬＬＨＧＲＧＶＣＬＮＥＫＳＹＲＥＱＶＫＩＥＲＤＳＲＥＨＥＥＰＴＴＳＥＭＡＥＥＴＹＳＰＫＩＦＲＰＫＨＴＲＩＳＥＬＫＡＥＡＶＫＫＤＲＲＫＫＬＴＱＳ
【００７９】
配列番号５（ＩＧＦＢＰ−５のＣ末端）：
ＫＦＶＧＧＡＥＮＴＡＨＰＲＩＩＳＡＰＥＭＲＱＥＳＥＱＧＰＣＲＲＨＭＥＡＳＬＱＥＬＫＡＳＰＲＭＶＰＲＡＶＹＬＰＮＣＤＲＫＧＦＹＫＲＫＱＣＫＰＳＲＧＲＫＲＧＩＣＷＣＶＤＫＹＧＭＫＬＰＧＭＥＹＶＤＧＤＦＱＣＨＴＦＤＳＳＮＶＥ
【００８０】
配列番号６（ＩＧＦＢＰ−５）：
ＬＧＳＦＶＨＣＥＰＣＤＥＫＡＬＳＭＣＰＰＳＰＬＧＣＥＬＶＫＥＰＧＣＧＣＣＭＴＣＡＬＡＥＧＱＳＣＧＶＹＴＥＲＣＡＱＧＬＲＣＬＰＲＱＤＥＥＫＰＬＨＡＬＬＨＧＲＧＶＣＬＮＥＫＳＹＲＥＱＶＫＩＥＲＤＳＲＥＨＥＥＰＴＴＳＥＭＡＥＥＴＹＳＰＫＩＦＲＰＫＨＴＲＩＳＥＬＫＡＥＡＶＫＫＤＲＲＫＫＬＴＱＳＫＦＶＧＧＡＥＮＴＡＨＰＲＩＩＳＡＰＥＭＲＱＥＳＥＱＧＰＣＲＲＨＭＥＡＳＬＱＥＬＫＡＳＰＲＭＶＰＲＡＶＹＬＰＮＣＤＲＫＧＦＹＫＲＫＱＣＫＰＳＲＧＲＫＲＧＩＣＷＣＶＤＫＹＧＭＫＬＰＧＭＥＹＶＤＧＤＦＱＣＨＴＦＤＳＳＮＶＥ
【００８１】
配列番号７（ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−１）：ＣＨＦＡＫＩＲＤＲＳＴＳＧＧＫＭ
【００８２】
配列番号８（ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−２）：ＫＶＮＧＡＰＲＥＤＡＲＰＶＰＱＣ
【００８３】
配列番号９（ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−４）：ＣＫＡＥＡＶＫＫＤＲＲＫＫＬＴＱＳ
【００８４】
配列番号１０（ＩＧＦＢＰ−５ペプチド−２）：ＣＬＮＥＫＳＹＲＥＱＶＫＩＥＲＤＳＲＥＨＥ
【図１】
2014515824.tif 000002
【図２】
2014515824.tif 000003
【図３】
2014515824.tif 000004
【図４】
2014515824.tif 000005
【図５】
2014515824.tif 000006
【図６】
2014515824.tif 000007
【図７】
2014515824.tif 000008
【図８Ａ】
2014515824.tif 000009
【図８Ｂ】
2014515824.tif 000010
【図９】
2014515824.tif 000011
【図１０】
2014515824.tif 000012
【図１１】
2014515824.tif 000013
【図１２】
2014515824.tif 000014
【配列表】
2014515824000001.app
【国際調査報告】
2014515824.tif 000015
2014515824.tif 000016
2014515824.tif 000017
2014515824.tif 000018
2014515824.tif 000019
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