(57)【要約】  本発明は、神経変性障害及び／又は認知能力喪失の予防又は治療に使用するための、チコリ、詳細には焙煎チコリ根を含む組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、精神的能力又は認知能力を維持するための非治療的な方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性障害及び／又は認知能力喪失の予防又は治療に使用するための、焙煎チコリ根を含む組成物。
【請求項２】
チコリが、抽出物の形態で供給される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、チコリの酢酸エチル又はエタノール／水抽出により得られる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症又はてんかんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
認知能力喪失が、記憶、注意力、言語、推理能力の喪失及び／又は認知機能障害である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
医薬、食品又は食品への添加剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ヒト、好ましくは成人による消費を対象とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
動物、好ましくはネコ又はイヌによる消費を対象とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
長期間にわたる、好ましくは数年にわたる消費計画を対象とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
個体の精神的能力又は認知能力を維持するための非治療的な方法であって、前記個体に、焙煎チコリ根を含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
精神的能力又は認知能力が、精神的な集中、持続的な注意力、記憶の保持、精神の覚醒、学習能力、実行機能、推理能力、気分、及びストレス耐性からなる群より選択される、請求項１０に記載の非治療的な方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、神経変性障害及び／又は認知能力喪失の予防又は治療に使用するためのチコリを含む組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、精神的能力又は認知能力を維持するための非治療的な方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
神経変性障害は、ニューロンの構造及び機能の進行性喪失を特徴とし、最終的にはニューロンの死に至る。アルツハイマー病、パーキンソン病又はハンチントン病などの多くの疾患において、神経変性過程は、疾患の経過を左右する重要な有害要素である。神経変性疾患にとって最大の危険因子は、老化である。これらの疾患の多くは遅発性であり、これは、人が老化するにつれて変化するいくつかの要因があることを意味している。不変の要因の１つは、各疾患において、加齢に伴い疾患が進行するにつれてニューロンの機能が次第に失われることである。このようなニューロン機能の連続的で重度の喪失によるさらなる結果は、様々な形態の認知症で明らかに示されるような認知能力喪失である。それにより、正常な認知機能は、例えば記憶、注意力又は精神的な集中、言語、及び問題解決能力の喪失の影響を受ける可能性がある。特に神経変性状態の後期の段階では、罹患した人は、時間、場所、及び人間関係について見当識を失う可能性がある。神経変性障害は、ある程度は治療可能であることが多いが、通常、進行性で治療不能の原因によって引き起こされる。特に高齢者のための、ニューロンの進行性の変性による神経変性障害並びに認知能力喪失を予防及び治療する解決手段を見出すという明確且つ既存の必要性がある。
【０００３】
［発明の概要］
本発明の目的は、このような神経変性障害を予防又は治療するために、薬物療法を介して適用することができる、又は食物として消費することができる、上記で述べた必要性の自然な解決手段を提供することである。
【０００４】
本発明の目的は、独立請求項に記載された主題によって達成される。さらに従属項によって本発明の概念が展開される。
【０００５】
従って、本発明は、第一の態様において、神経変性障害及び／又は認知能力喪失の予防又は治療に使用するためのチコリを含む組成物を提供する。
【０００６】
「神経変性障害」は、本明細書では、進行性の神経系機能不全を特徴とする遺伝性疾患又は散発性の疾患と定義される。これらの障害は、罹患した中枢又は末梢神経系構造の萎縮に関連することが多い。これらの障害は、例えばアルツハイマー病及び別の認知症、変性性神経疾患、てんかん、遺伝学的な脳障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルーゲーリック病）、ハンチントン病、及びプリオン病などの疾患を含む。
【０００７】
「認知能力」は、本明細書では、個体が、概念に気付く、認識する、又は理解するに至る知力を要する過程と定義される。認知能力は、あらゆる態様の知覚、認識、概念構成力、感知、思考、推理、想起、及びイメージ化を含む理解の質を包含する。認知能力喪失とは、新しい情報又は状況に対処したり、或いは応答したりすることが困難なことである。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、チコリ抽出物が、ニューロン老化のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてニューロンの生存を確実に高めることを見出した。それゆえに、チコリ抽出物は、神経変性に対する魅力的な医薬的及び／又は栄養学的な解決策の一つとなる可能性がある。
【０００９】
例えば動物実験でｉｎ  ｖｉｖｏの試験を行う前に、まず神経保護活性を有する可能性がある化合物又は組成物をニューロン細胞培養でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することが一般的である。それにより、さらなるメカニズムに関する調査、例えばトランスクリプトミクス及びプロテオミクス的なツールを用いた調査も可能になる。このような化合物又は組成物の細胞生存に対する有益な作用は、慣例的には、細胞培養物に、グルタミン酸受容体アゴニスト（例えばグルタメート、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）若しくはカイニン酸）又は酸化剤（例えば過酸化水素、Ｈ２Ｏ２）を用いて神経毒による傷害を与え、それにより生じた酸化ストレス及び興奮毒性を一定期間で、例えば２〜３日で測定することによって調査される（Ａｋｓｅｎｏｖａ、Ｍ．Ｖ．ら、２００５、Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｖａｓ．Ｒｅｓ．２、７３〜８９；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ、Ｄ．Ｇ．、２００４、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（２）、１４９〜１７７）。次に、処理された培養物と未処理の培養物とで細胞生存を比較する。しかしながら、このような一定期間での細胞培養の刺激は、ヒト又は動物において自然に起こる進行が遅い変性過程を正確に模擬しない可能性が最も高い。従って、本発明者らは、ニューロンを神経毒による傷害で刺激しないで、それよりかなり長い期間、例えば数週間にわたり自然な進行性の老化を経る培養モデルを利用した。この生物学的試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるような実際の過程をよりよく模擬している。
【００１０】
それによって、本発明者らは、培地中で数週間インキュベートすることによって、数種の異なるチコリ抽出物がニューロン細胞の生存をＤＭＳＯ対照サンプルと比較して有意に高めることを見出した。生存は、ＮｅｕＮ（ニューロン核（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｉ））免疫染色を用いて評価した（Ｍｕｌｌｅｎ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９２、Ｄｅｖｅｌｏｐ．１１６、２０１〜２１１；Ｗｏｌｆ、Ｈ．Ｋ．ら、１９９６、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４４（１０）、１１６７〜１１７１）。この細胞生存への有意な作用はさらに、結合性の分子指標、すなわち細胞培養中のＰＳＤ−９５（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ，Ｍ．ら、２００３、Ｎｅｕｒｏｎ  ４０、５９５〜６０７）を調査することによって確認され、それによれば、ＰＳＤ−９５はまた、対照サンプルと比較して顕著に保存されていた。
【００１１】
チコリ抽出物での処理はさらに、陽性対照サンプルと平行して行われた。この対照は、ＳＩＲＴ２を阻害する合成化合物（ＡＫ−１）からなっており、この化合物は、これまでにパーキンソン病モデルにおいて細胞死からの保護作用があることが示されている（Ｏｕｔｅｉｒｏ，Ｔ．Ｍ．ら、２００７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７、５１６〜５１９）。驚くべきことに、この陽性対照サンプルは、改善型の細胞培養バイオアッセイにおいて、未処理の細胞に比べて有意な陽性を示すにもかかわらず、チコリ抽出物よりも低い神経保護作用を示した。これは、チコリの有益な作用は、ＳＩＲＴ２のより優れた阻害作用か、又はニューロン細胞のより強い保護の基礎となる異なるメカニズムのいずれかが介在することを示唆する可能性がある。当面の所、このような細胞に対するチコリ抽出物の作用機序はわかっていない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】４週齢から（Ａ）６週齢及び（Ｂ）８週齢までのニューロンの死で示された大脳皮質の寿命モデルを示す図である。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで焙煎チコリ根の抽出物（サンプル１）で処理した８週目の細胞のＮｅｕＮ数を示す図であり、（Ａ）５０μｇ／ｍｌ及び（Ｂ）１００μｇ／ｍｌで神経保護作用を示す。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで焙煎チコリ根のエタノール／水抽出物（サンプル２；Ａ及びＢ）、又は乾燥チコリ根の酢酸エチル抽出物（サンプル４；Ｃ）若しくは焙煎チコリ根（サンプル３；Ｄ）で処理した８週目の細胞のＮｅｕＮ数を示す図である。データは、（Ａ）５０μｇ／ｍｌ及び（Ｂ）１００μｇ／ｍｌでの焙煎チコリ根のエタノール／水抽出物（サンプル２）の神経保護作用を示す。（Ｃ）乾燥チコリ根の酢酸エチル抽出物（サンプル４）は、５０μｇ／ｍｌで神経保護作用を示した。（Ｄ）焙煎チコリ根（サンプル３）は、１００μｇ／ｍｌで神経保護作用を示した。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明は、神経変性障害及び／又は認知能力喪失の予防又は治療に使用するためのチコリを含む組成物に関し、この場合のチコリは、チコリという植物の根である。根は、乾燥させるか、又は焙煎されることが好ましい。乾燥させた又は焙煎チコリ根は、既存の産業的な原材料である。このことから、チコリ根は、最も工業的に利用可能な形態で使用できるという利点があり、例えば特定の飲料の生産のための工業的に提供されるような乾燥根の状態で、又は焙煎した状態で使用できる。さらに、乾燥チコリ根、さらにより好ましくは焙煎チコリ根は、神経変性障害又は認知能力喪失の予防又は治療に使用するための活性組成物を得るための優れた原材料であることが証明された。
【００１４】
焙煎チコリ根を使用する利点は、焙煎チコリ根から、焙煎していないチコリ植物材料から生産された抽出物と比較して有意に高い生物活性を有する抽出物を生産できることである。活性分子を遊離させたり、及び／又はある種の不活性分子を活性分子に変換したりするのに、熱処理が役立つ可能性がある。実際に、焙煎する過程で、多くの分子が化学変換される。適切な溶媒を選択し抽出過程を最適化することによって、収量及び生物活性を考慮して抽出過程をさらに最適化することができる。
【００１５】
焙煎チコリ根を使用するさらなる利点は、原材料が工業的に利用可能なことであり、すなわち焙煎した根は微生物学的に安全であり、工業的な条件下で比較的長い時間安全に保存することができる。
【００１６】
好ましい実施形態において、チコリは、抽出物の形態で提供される。それにより、一方で、例えばより効果的で高濃度の投与のためにチコリの活性成分をまず濃縮することが可能になり、他方で、例えばバッチ式の生産様式でサンプル及びそれらの有効な活性を画一化してよりよく制御することも可能になる。
【００１７】
一実施形態において、抽出物は、チコリ根のエタノール−水抽出により得られる。そのためには、チコリ根をまず薄切りにするか、又はダイス状に切断して、乾燥させる。その後、それらを直接抽出するか、又はエタノールと水との混合物と共に焙煎した後に抽出する。遠心分離又はろ過した後、液体を蒸発させて抽出物を得る。抽出過程にエタノール及び水を用いる利点は、食品グレードの粗抽出物を得ることができることである。得られる抽出物は、水又はエタノール／水混合物に可溶性である。
【００１８】
別の実施形態において、抽出物は、チコリ根の酢酸エチル抽出によって得られる。そのためには、乾燥させた、又は焙煎チコリ根の薄切り又はダイスを磨砕した後、得られた粉末をヘキサンで抽出して脂質を除去し、乾燥させる。この脂質を含まない乾燥粉末を、塩酸の沸騰溶液で処理し、さらに酢酸エチルで抽出する。有機相を分離して蒸発させ、酢酸エチル抽出物を得る。酢酸エチル抽出の利点は、得られた抽出物は、かなり高度に濃縮されていることである。酢酸エチル抽出は、かなり選択的であり、より優れた活性因子の濃縮を可能にする。しかしながら、得られた抽出物は通常は水に不溶であり、この形態では例えば食品に直接使用できないとみなされる。
【００１９】
一実施形態において、本発明の組成物は、神経変性障害の予防又は治療に使用するためのものであり、この場合の神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症又はてんかんである。アルツハイマー病（ＡＤ）、てんかん、トラウマ、脳卒中、及びパーキンソン病（ＰＤ）などの急性及び慢性神経障害は、結果的にしばしば神経障害を引き起こす神経変性を特徴とする。このような神経障害は、日々の生活に対処する患者の能力のほとんどが損なわれ、結果的に患者の生活の質を低下させるほどに重度である可能性がある。それゆえに、神経変性及びその結果起こる認知障害を予防する、遅延させる、又は進行を遅らせる方策を見出すことに労力が注がれてきた。細胞死の経路を調節するか又は停止させることによって細胞を神経変性から守ることができる物質を同定することは、難しいことが証明されている。本発明で健康なニューロン又は損傷を受けたニューロンを標的とすることによって、神経毒による傷害（例えば酸化ストレス）に対応するか、又はさらに耐えて、結果的にニューロンの生存を改善するニューロンの能力を改善することができる。このニューロンの生存の改善及びそれに関連する神経変性の減少はさらに、神経障害の経過も調節する可能性が高い。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、認知能力喪失の予防又は治療に使用するためであり、この場合の認知能力喪失は、記憶、注意力、言語、推理能力の喪失及び／又は認知機能障害である。
【００２１】
本発明の組成物は、医薬、食品又は食品への添加剤であってもよい。
【００２２】
一実施形態において、本発明の組成物は、ヒト、好ましくは成人による摂取を対象とする。神経変性障害又は認知機能障害の多くは、個体の加齢に伴って起こる。従って、臨床症状は、成人期又はすでに高齢の状態でしか認められないことが多い。従って、本発明は、このような神経変性障害又は認知能力喪失が発症する前、又は発症している間の成人を対象とすることが好ましい。そのために、ニューロン細胞の変性のさらなる進行を制限したり又は減少させたりするために、上記障害又は認知機能障害を早期に治療することが有利である。より理想的には、このような変性の発症は、個体がまだ健康であり十分な認知能力を有する成人期における早期適用の予防的作用によって、遅延又は低減させることができる。
【００２３】
代替の実施形態において、本発明の組成物は、動物、好ましくはネコ又はイヌによる摂取を対象とする。ヒトの場合と同様に、動物、特に家畜及びペットとして飼われている動物でも神経変性を観察することができる。従って、ネコ又はイヌの飼い主にとって、愛するコンパニオンアニマルが動物の加齢に伴って神経変性障害又は認知能力喪失に冒されるのを見るのは特につらく心が痛むものである。有利には、本発明は、飼い主がコンパニオンアニマルに提供することもできる解決手段を提供する。
【００２４】
本発明の組成物は、長期間にわたる、好ましくは数年にわたる消費計画を対象とすることが好ましい。神経変性障害及び認知能力喪失は、ゆっくりだが何年もかけて徐々に進行する可能性がある遅い過程であり、最終的にはそれにより罹患した個体は死に至る可能性がある。典型的には、このような変性性障害に罹患した人は、疾患の性質によるが、疾患の影響を受けてから５年、１０年、１５年、２０年又はそれより長く生存する可能性がある。それゆえに、有利には、本発明の組成物は、このような期間全体で使用され、又は好ましくは、効果を最大にするために、個体がこのような障害を発症する前から使用を始める。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、個体の精神的能力又は認知能力を維持するための非治療的な方法であり、本方法は、前記個体にチコリを含む組成物を投与するステップを含む。本発明の非治療的な方法の利点は、神経変性障害と診断されていない、又は神経変性障害の即時的な危険がない健康な個体のためである、という点である。それにより、健康な個体は、何らかの疾患又は障害の状態が現れる前に早くも極めて軽微な神経変性作用を予防又は阻止することができる。それにより、そのような個体の精神的能力又は認知能力を維持することができ、さらには改善することもできる。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明の非治療的な方法は、精神的な集中、持続的な注意力、記憶の保持、精神の覚醒、学習能力、実行機能、推理能力、気分、及びストレス耐性からなる群より選択される精神的能力又は認知能力に関する。
【００２７】
当業者であれば当然のことながら、本明細書において開示された本発明のあらゆる特徴を自由に組み合わせることができる。特に、本発明の組成物に関して説明された特徴を、本発明の非治療的な方法と組み合わせてもよいし、逆もまた同様である。さらに、本発明の異なる実施形態に関して説明された特徴を組み合わせてもよい。本発明のさらなる利点及び特徴は図面及び実施例から明白である。
【実施例】
【００２８】
実施例１：焙煎チコリ根からのエタノール／水抽出物の調製
チコリ根を薄切りにし、工業的スケールで１６０℃で８０分焙煎した。焙煎した後、根を磨砕して粉末にし（０．５ｍｍで篩い分け）、エタノール／水の（５０／５０）混合物を用いて撹拌しながら２時間抽出した（チコリ根粉末５００ｇあたりエタノール／水溶液２．５Ｌ）。２０℃で１０分、６０００ｒｐｍで遠心分離した後、エタノールを蒸発させた（ロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）を４６℃で使用）。残った水相を凍結乾燥させて、抽出物を得た。抽出物の収量は、元のチコリ粉末１ｋｇあたり抽出物５８５ｇであった。
【００２９】
実施例２：焙煎チコリ根からの酢酸エチル抽出物の調製
実施例１と同様にしてチコリ根を薄切りにし、焙煎した。焙煎した後、根を磨砕して粉末にし（０．５ｍｍで篩い分け）、ヘキサンでそれぞれ１時間で３回抽出した。ヘキサン相を捨て、磨砕物を室温で一晩乾燥させた。次に、乾燥させた磨砕物を１ＮのＨＣｌ溶液（粉末１００ｇに対して１ＮのＨＣＬを８５０ｍｌ）で１００℃で１時間３０分加水分解した。１時間３０分後、酸性の水性画分を５００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。３種の酢酸エチル相を合わせて、水で洗浄して、酸性度を低下させ、蒸発させ、酢酸エチル画分を得た。収量は、元のチコリ粉末１ｋｇあたり抽出物７６ｇであった。
【００３０】
実施例３：初代皮質ニューロンの老化モデル
ニューロン老化への化合物の作用を研究するための初代大脳皮質培養系が開発されており、これを、ニューロンの生存へのチコリの作用を研究するのに適用した。この細胞培養系は、神経毒による傷害を受けていない正常なニューロン老化の際に起こる過程を模擬するためのニューロン老化モデルとして開発された。このモデルを使用すれば、老化の際の生理学的な神経変性に対する有益な作用を研究して、ニューロンの生存を高める化合物を同定することができる。これは、様々な程度の神経変性を誘発するために細胞に神経毒による傷害を与える従来技術で説明されたモデルとは異なるアプローチである。抗原の免疫細胞化学的な解析、すなわち神経変性を感知するマーカーであるＮｅｕＮ（ニューロン核）を用いて、培養における皮質ニューロンの寿命を試験するための信頼できる方法が確立されている。ＮｅｕＮの感度は、ニューロンの衰退に応じて発現強度が一定の減少を示すことに起因する可能性があり、これは、発現によって生きたニューロンと死んだニューロンしか区別することができない多くの抗原とは対照的である。４〜６週間平板培養した後、皮質ニューロンは衰退し始めるが、この期間にＮｅｕＮ数に有意な傾向はみられない（図１Ａ）。８週目までのＮｅｕＮ数の減少は、４週目と比較して有意であり（図１Ｂ）、これは、数週間にわたりニューロンが段階的に失われることを示しており、このようなニューロン老化の傾きを小さくする能力を有する栄養化合物に関してスクリーニングするための長期ウインドウを提供した。全ての試験は、６〜８週の間の時点で固定された。
【００３１】
初代培養の調製：
Ｅ１６ラット由来の線条体及び大脳皮質の培養物をこれまでに述べられた手法（Ｚａｌａら、２００５、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２０（３）、７８５〜７９８）に従って調製した。妊娠したスプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）をＣＯ２吸入法によって殺した。氷上で胎芽を回収し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋非含有リン酸緩衝生理食塩水、０．６％Ｄ−グルコース、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む培地中で実体顕微鏡を用いて解剖した。分離した脳領域を鉗子で細かく刻み、解剖用培地を除去し、１％ウシ血清アルブミン（Ｆｌｕｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＤＭＸ中で繰り返しピペッティングすることによって組織をホモジナイズした。遠心分離し（４℃、５分、１０００×ｇ）、ニューロベーサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で再懸濁した後、０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌリシン（ＭＷ：３００００〜７００００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でコーティングした９６ウェルの培養皿（コースター（ＣＯＳＴＡＲ）（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ、ＵＳＡ）で、ウェルあたり５００００個の密度で細胞を平板培養した。８週目にニューロンの生存を解析するまで、細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で、１×Ｂ−２７サプリメント、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、５００μＭのＬ−グルタミン、及び１５ｍＭのＫＣｌが補充されたニューロベーサル（商標）培地中でインキュベートした。
【００３２】
ＮｅｕＮ免疫染色：
ニューロンを４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で（４℃、１０分）固定し（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで６〜８週目に）、１×ＰＢＳで３回すすいだ。１０％正常ヤギ血清及び０．１％トリトン−Ｘが添加されたＰＢＳを含むブロッキング溶液をニューロンに加えて（室温で１時間、穏やかに振盪し）、続いて細胞を５％正常ヤギ血清及び０．１％トリトン−Ｘを含むＰＢＳ中で抗ＮｅｕＮ（１：４００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした（４℃、一晩、穏やかに揺らした）。次にニューロンを１×ＰＢＳで３回すすぎ、その後アルミニウム箔で覆って、抗マウスＣｙ（商標）３結合アフィニピュア（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの二次抗体（１：８００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＫ）とインキュベートした（室温、２時間、穏やかに振盪した）。次に培養物を１×ＰＢＳで３回すすぎ、解析前の期間は遮光した。固定が１００％メタノール中で行われたこと（−２０℃、１０分）を除いて、ＰＳＤ−９５による標識付けは同一であった。抗ＰＳＤ−９５（ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）を１：５００の濃度で用いた。ＢＤパスウェイ（ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ）（商標）８５５ハイコンテンツバイオイメージャー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いてＮｅｕＮ細胞数の評価を行った。条件間の不偏比較と同じパラメーターを用いて各ウェルの写真を自動撮影した。イメージＪソフトウェアを用いて、プラグイン式の内蔵型画像補正装置によって全ての画像を積層化し、ニューロン核として考察するために固定サイズ（０．００１４〜０．０２８正方画素）及び円形度（０．５〜１．０）の条件を満たす蛍光性物体の数を解析することによって、写真を解析した。統合された画素密度測定に用いられたＰＳＤ−９５画像を、ＮｅｕＮと同じ方式で得た。マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（登録商標）エクセルを用いて、片側ｔ検定によってデータ対間の統計的有意性を評価した。０．０５からの有意水準αを用いて有意性の根拠とした。ｐ値は星印で示されており、すなわち＊は、ｐ＜０．０５であることを示す。
【００３３】
実施例４：（実施例３の）ニューロン老化モデルにおける（実施例１の）チコリ抽出物の活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大脳皮質の培養老化モデルにおいて、上述のチコリ抽出物は、有意な神経防護作用を示した。標準的な処方計画に従って細胞を処理した。１１日目に培養培地の体積の半分を通常培地で交換し、１７日目に、培地の半分を、ＤＭＳＯ媒体（対照）で、或いは望ましい最終濃度を達成するのに必要な量の抽出物の１種で交換することにより処理を開始した。毎週、細胞の生存能力を維持するために、等量のビヒクル又は望ましい最終濃度を達成するような量の抽出物を含む培地を用いて培地の半分を交換した。全ての処理条件を、等濃度のＤＭＳＯ又は水媒体で処理した培養と比較した。上述のようなＮｅｕＮ数を用いて細胞の生存能力を評価した。ＮｅｕＮ単独では細胞の生存能力しか評価できないため、ニューロンの機能への抽出物の作用の相互関係も証明するために、別のマーカー、すなわちニューロンの結合性の指標であるＰＳＤ−９５を用いた。この第二の読み出しにより、ニューロンの健康状態のさらなる尺度が得られる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのポリグルタミン病の皮質ニューロンモデルにおいて、ＰＳＤ−９５陽性シナプスの減少と、バースト発火活性の減少との相互関係を証明することにより、ＰＳＤ−９５はニューロンの発火挙動と関連することが確認された。それゆえに、この分析が、本発明者らの初代培養において、興味深く且つ関連性のあるニューロンの機能に関する二次試験を構成することを本発明者らは確認している。
【００３４】
焙煎チコリ根の抽出物（サンプル１）は、５０μｇ／ｍｌ（４００％、図２Ａ）及び１００μｇ／ｍｌ（６５０％、図２Ｂ）の両方において、対応するＤＭＳＯ対照よりも有意に高いＮｅｕＮ数をもたらした。
【００３５】
別のチコリ抽出物を試験することによって、チコリ抽出物の神経保護作用が確認された（図３）。焙煎チコリ根の水／エタノール抽出物（サンプル２）は、５０μｇ／ｍｌ（約１３０％、図３Ａ）及び１００μｇ／ｍｌ（約１７０〜１８０％、図３Ｂ）の両方において神経保護作用があった。また酸性加水分解後に酢酸エチル抽出することによって調製された焙煎チコリの抽出物（サンプル３）も、１００μｇ／ｍｌ（約３００％、図３Ｄ）で神経防護作用を示した。しかしながら、酸性加水分解後にメタノール及び酢酸エチル抽出することによって調製された乾燥根由来の別の抽出物（サンプル４）は、５０μｇ／ｍｌ（約３３０％、図３Ｃ）で強い神経保護作用を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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