(57)【要約】  本開示内容は、オプソニン、特にオプソニン抗体の産生を誘導する抗原性ポリペプチド、および、ヒトの細菌性病原体から守るワクチンにおける該抗原性ポリペプチドの使用に関する。【選択図】図７
2014506880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの細菌性病原体から単離したポリペプチドを含有するワクチン組成物であって、該ポリペプチドが、
ｉ）  配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６６または６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）  前記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠損または置換により修飾されており、ヘム結合活性の亢進および／または溶血性活性の低減を保つまたは持っているアミノ酸配列、
を有している、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６６または６８に示すアミノ酸配列を含むかまたはからなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：１または２に示すアミノ酸配列を含むかまたはからなる、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
ヒトの細菌性病原体から単離された抗原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するワクチン組成物であって、該核酸分子が、
ｉ）    配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、６０、６３、６５または６７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
ｉｉ）  遺伝子コードの結果として（ｉ）に定義されるヌクレオチド配列と縮重しているヌクレオチド配列を含む、そして
ｉｉｉ）  ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｉ）およびｉｉ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子の相補鎖であって、ヘム結合タンパク質をコード化する核酸分子である、
ワクチン組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が、配列番号：３または４に示すヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、関連する核酸分子の転写に適するプロモーターに操作可能に連結された抗原性ポリペプチドをコード化する核酸分子を含む転写カセットを含む、請求項４または５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が発現ベクターの一部である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドまたは核酸分子がヒトのグラム陰性細菌性病原体から単離される、請求項１から７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記ヒトの細菌性病原体は、ナイセリア属種、モラクセラ属種、大腸菌属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種、シュードモナス属種、ヘリコバクター属種、レジオネラ属種、ヘモフィルス属種、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、クロノバクター属種、セラチア属種、キンゲラ属種およびパスツレラ属種からなる属群から選択される、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記のヒト細菌性病原体がナイセリア・メニンギティディスである、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記のヒト細菌性病原体がナイセリア・ゴノレアである、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記組成物がさらにアジュバントまたはキャリアを含有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、アルミニウムまたはリン酸カルシウムからなる群から選択される、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントが、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦαおよびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記アジュバントが、ＴＬＲアゴニスト、例としてＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリル脂質Ａ、ポリＩ：Ｃ及びその誘導体である、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントが、細菌細胞壁誘導体、例としてムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコレート（ＴＤＭ）である、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
オプソニンの産生に使用するための、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６６または６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる抗原性ポリペプチドを含有する免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：１または２を含むかまたはからなる、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、６０、６３、６５または６７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはからなる核酸分子によってコードされる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記核酸分子が配列番号：３または４を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記オプソニンが抗体である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
病原性細菌種に対してヒトを免疫化する方法であって、
ｉ）  有効量の用量の請求項１から１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物をヒト被検体に投与して、防御免疫を誘導すること、場合によって、
ｉｉ）防御免疫を誘導するために十分な一または複数の更なる用量のワクチン組成物を前記被検体に投与すること
を含む方法。
【請求項２３】
ヒト被検体の病原性グラム陰性細菌感染の治療に用いるための、請求項１から１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
ヒトの細菌性病原体から単離される抗原に対するオプソニンの産生方法であって、
ｉ）  請求項１から１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物を提供すること、
ｉｉ）オプソニン産生を誘導するために十分な有効量の前記組成物をヒト被検体に投与すること
を含む方法。
【請求項２５】
前記組成物が少なくとも一の更なる抗菌剤を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が第二の異なるワクチンおよび／または免疫原性物質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒトの細菌感染またはヒトの細菌感染から生じる状態の治療に用いるための、本明細書中に記載のポリペプチドまたは核酸分子。
【請求項２８】
前記細菌感染が一または複数のグラム陰性細菌によって生じる、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記グラム陰性細菌が、ナイセリア属種、モラクセラ属種、大腸菌属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種、シュードモナス属種、ヘリコバクター属種、レジオネラ属種、ヘモフィルス属種、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種およびセラチア属種からなる属群から選択される、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記のヒト細菌性病原体はナイセリア・メニンギティディスである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記のヒト細菌性病原体はナイセリア・ゴノレアである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物の有効量をヒト被検体にワクチン接種することを含む、ヒト被検体を免疫化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示内容は、オプソニン、特にオプソニン抗体の産生を誘導する抗原性ポリペプチド、および、ヒトの細菌性病原体から守るワクチンにおける該抗原性ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原細菌は、何百万人ものヒトを襲う感染性疾患の主要な原因である。細菌感染の制御には、細菌が増殖する条件を提供する環境での細菌増殖を制御するための消毒薬の使用；感染したまたは感染が疑われる被検体、例えば免疫抑制患者での細菌感染を制御するための抗菌薬の使用；および感染から被検体を守るワクチン（すなわち予防用ワクチン）または感染症に罹患している被検体を治療するために用いるワクチン（すなわち治療用ワクチン）の開発が含まれる。
【０００３】
ワクチンは広範な感染性疾患に効く。多くのワクチンは、被検体に注入される不活化又は弱毒化病原体によって産生される。免疫のある被検体は体液性（例えば抗体）と細胞性（例えば細胞溶解性Ｔ細胞）の両方の応答を生じさせて応答する。例えば、インフルエンザワクチンには、ホルムアルデヒドによる化学的処理によってウイルスを不活性化することによって製造されるものもある。多くの病原体を化学的または熱によって不活化するために、防御免疫を付与するワクチン免疫原を引き起こす一方で、発熱や注射部位反応などの副作用も引き起こしうる。細菌の場合には、不活性化された生物は非常に毒性が強く、副作用により粗ワクチン免疫原を用いることができない傾向があり（例えば細胞百日咳ワクチン）、ゆえに、ワクチン開発は薬剤開発に後れをとっている。また、不活化生物の全細胞を用いた有効性が高いワクチンの開発は、エピトープマスキング、免疫優性、低い抗原濃度および抗原重複性の問題がある。残念なことに、現在の抗生物質治療は今や、薬剤耐性菌の出現に害されている。
【０００４】
したがって、近年の多くのワクチンは、分子クローニングにより単離され、副作用を生じる物質から精製された病原体の防御抗原から作られている。これらのワクチンは「サブユニットワクチン」として知られている。サブユニットワクチンの開発は、近年、非常に研究の焦点となっている。新たな病原体の出現および抗生物質耐性の成長により、新たなワクチンを開発し、サブユニットワクチンの開発に有用なさらなる候補分子を同定する必要が生じている。同様に、ゲノムおよびプロテオミクス研究から新規のワクチン抗原を発見することにより、特に細菌性病原体に対して新しいサブユニットワクチン候補の開発が可能となっている。しかしながら、サブユニットワクチンは死亡又は弱毒化病原体ワクチンの副作用を避ける傾向にあるが、それらの「純粋な」状態はサブユニットワクチンが常に防御を付与するのに十分な免疫原性を持つわけではないことを意味する。
【０００５】
前述のように、ワクチンは、特定の誘導抗原を発現する標的生物に対して抗体および／または細胞溶解性Ｔ細胞の産生を誘導する。保護を与えうる抗原は、病原体の細胞表面で発現されるもの、あるいは、周囲環境に分泌されて免疫系に接触可能なものである傾向がある。誘導された抗体はオプソニンとして知られているプロセスで機能することができる。オプソニン作用は、微生物病原体が免疫系の食細胞による摂取の対象となるプロセスである。オプソニンの結合は、細菌性病原体の破壊をもたらす食細胞を引き付ける。貪食は、マクロファージや多形核白血球により媒介され、微生物、破損または死んだ細胞、細胞の破片、不溶性粒子、および活性化凝固因子の摂取と消化が含まれる。オプソニンは上記の異物の貪食を促進する薬剤である。ゆえに、オプソニン抗体は同じ機能を提供する抗体である。オプソニンの例は、抗体のＦｃ部分または補体成分Ｃ３である。
【０００６】
本開示内容は、標的ヒト病原性細菌、例えばナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）（Ｎ．メニンギティディス）に対するオプソニンの産生を有利に誘導する防御抗原のクラスの同定に関する。 Ｎ．メニンギティディスは、細菌性髄膜炎および、特に小児では、いずれも死を引き起こしうる髄膜炎菌性疾患および敗血症の原因物質であるグラム陰性細菌である。病気の進行が急速であるため、髄膜炎の発症には速やかに医師の手当てが必要であり、治療介入をしなければ昏睡状態や死につながりうる。一般的に治療は、複数の抗生物質の静脈内投与を伴う。この病原体に対して免疫化することが非常に望ましい。Ｇｌｙ１抗原は分泌タンパク質であり、例えばＮ．メニンギティディスを鉄供給源としてヘムやヘモグロビンと共に限定培地で生育する場合、その増殖に必須であることが示されている。Ｇｌｙ１は鉄代謝に関与し、Ｇｌｙ１の欠失変異体の表現型はこれらの条件下で増殖しないので必須の機能を提供する。さらに、本発明者等はＧｌｙ１にて免疫化したウサギの血清は殺菌活性を持つことを示す。Ｇｌｙ１タンパク質は、ヘム隔離に関与する多くの病原性細菌種に見られるタンパク質の一クラスの例であり、細菌増殖の維持および感染の確立に必須である。
【０００７】
発明者等は、Ｇｌｙ１およびその配列変異体を含むワクチン組成物、およびヒトの予防用および治療用のワクチン接種におけるその使用を開示する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の態様によると、ヒトの細菌性病原体から単離したポリペプチドを含有するワクチン組成物であって、該ポリペプチドが、
ｉ）  配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６６または６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）  前記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠損または置換により修飾されており、ヘム結合活性の亢進および／または溶血性活性の低減を保つまたは持っているアミノ酸配列、
を有している、ワクチン組成物が提供される。
【０００９】
本明細書中で開示する修飾ポリペプチドは、いずれの組み合わせでも存在しうる一または複数の置換、付加、欠損、短縮化により、アミノ酸配列が異なっていてよい。好適な変異型には、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドから変化しているものがある。このような置換は、類似の性質を持つ他のアミノ酸によって所定のアミノ酸を置換するものである。以下のアミノ酸の非限定的列挙は保存的置換（類似）と見なされる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、およびｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。最も好ましくは、変異する前の参照ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を保つまたは亢進する変異体である。
【００１０】
ある実施態様では、変異ポリペプチドは、本明細書中に示す完全長アミノ酸配列と、少なくとも３５％の同一性、より好ましくは少なくとも４０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも４５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【００１１】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６６または６８に示すアミノ酸配列を含むかまたはからなる。
【００１２】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：１または２に示すアミノ酸配列を含むかまたはからなる。
【００１３】
本発明の他の態様によると、ヒトの細菌性病原体から単離された抗原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するワクチン組成物であって、該核酸分子は、
ｉ）    配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、６０、６３、６５または６７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
ｉｉ）  遺伝子コードの結果として（ｉ）に定義されるヌクレオチド配列と縮重しているヌクレオチド配列を含む、そして
ｉｉｉ）  ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｉ）およびｉｉ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子の相補鎖であって、ヘム結合タンパク質をコード化する核酸分子である、
ワクチン組成物が提供される。
【００１４】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が互いに多くの水素結合を受ける場合に生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸周辺の環境条件、ハイブリダイゼーション法の性質、および使用した核酸分子の組成および長さによって異なりうる。ある一定のストリンジェンシーに達するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する算出は、Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)；および、Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993)のTijssen, Laboratory Techniquesにおいて論じられている。Ｔｍは、所定の鎖の核酸分子の５０％がその相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は一連のハイブリダイゼーションの例であるが、限定するものではない。
【００１５】
超高ストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６５℃、５×ＳＳＣ、１６時間
２回の洗浄：            室温（ＲＴ）、２×ＳＳＣ、各々１５分間
２回の洗浄：            ６５℃、０．５×ＳＳＣ、各々２０分間
高ストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６５℃〜７０℃、５×〜６×ＳＳＣ、１６〜２０時間
２回の洗浄：            ＲＴ、２×ＳＳＣ、各々５〜２０分間
２回の洗浄：            ５５℃〜７０℃、１×ＳＳＣ、各々３０分間
低ストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：ＲＴ〜５５℃、６×ＳＳＣ、１６〜２０時間
少なくとも２回の洗浄：  ＲＴ〜５５℃、２×〜３×ＳＳＣ、各々２０〜３０分間
【００１６】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子は、配列番号：３または４に示すヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。
【００１７】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子は、関連する核酸分子の転写に適するプロモーターに操作可能に連結された抗原性ポリペプチドをコード化する核酸分子を含む転写カセットを含む。
【００１８】
本発明の好適な実施形態では、前記プロモーターは恒常的プロモーターである。
【００１９】
本発明の他の好適な実施形態では、前記プロモーターは、調節可能なプロモーター、好ましくは誘導プロモーターおよび／または組織／細胞特異的プロモーターである。
【００２０】
「プロモーター」とは、当分野で認識された用語であり、明確にするために、例示として以下の特徴を含む。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位の5'に見られることが多いｃｉｓ作動性核酸配列である（エンハンサーは遺伝子配列の３’にも見られ、またはイントロン配列にさえも配置しうる）。エンハンサーはエンハンサーが連結している遺伝子の転写率を高めるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているｔｒａｎｓ作動性転写因子に応答する。転写因子の結合／活性（David S LatchmanによるEukaryotic Transcription Factors, Academic Press Ltd, San Diegoをご参照下さい）は、多くの生理学的／環境的要因に応答する。プロモーターエレメントは、いわゆるＴＡＴＡボックスおよび、転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択配列も含む。これら配列は、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促すように機能するポリペプチドにも結合する。
【００２１】
本発明の好適な実施形態では、前記プロモーターは骨格筋特異的プロモーターである。
【００２２】
筋特異的プロモーターは当分野で知られている。例えば、国際公報第０００９６８９号は、横紋筋優先発現遺伝子および同族プロモーターであるＳＰＥＧ遺伝子を開示している。欧州特許第１０７２６８０号はミオスタチン遺伝子の調節領域を開示している。この遺伝子は、圧倒的に遺伝子発現の筋肉特異的パターンを示す。米国特許第５７９５８７２号は、筋肉組織での外来タンパク質の高レベルの発現を達成するために、クレアチンキナーゼプロモーターの使用を開示している。筋肉特異的遺伝子であるＭｙｏＤも筋芽細胞に限定した発現パターンを示す。さらなる例は国際公報第０３／０７４７１１号に開示されている。
【００２３】
好ましくは、前記恒常的プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、β−グロビンＲＳＶエンハンサー／プロモーターホスホグリセリン酸キナーゼ（マウスＰＧＫ）プロモーター、α−アクチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンプロモーター、転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）プロモーターからなる群から選択される。
【００２４】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子はベクターの一部である。
【００２５】
本発明の好適な実施形態では、前記ベクターは、本発明に係る前記抗原性ポリペプチドをコードする前記核酸分子の発現に適する発現ベクターであり、好ましくは、前記核酸分子は少なくとも一のプロモーター配列に操作可能に連結している。
【００２６】
一般に、発現ベクター構築と組換えＤＮＡ技術に関しては非常に多くの公表された文献がある。Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY and references therein; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK；DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)をご参照下さい。
【００２７】
治療剤としてのウイルスまたは「ウイルスベクター」の使用は当分野で十分に知られている。さらに、外来遺伝子の運搬のためにベクターとして多くのウイルスが一般に用いられている。一般に用いられるベクターには、組み換えて修飾されたエンベロープありまたはエンベロープなしのＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、好ましくはレトロウイルスバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選択されるものが含まれる。また、それぞれの親のベクター性質の有利なエレメントを利用するキメラベクターも用いられてよい（例としてFeng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870を参照のこと）。このようなウイルスベクターは、野生型であっても、組換えＤＮＡ技術により修飾して複製能を欠損させるか、条件的に複製させるか、複製能を与えてもよい。好適なベクターは、レトロウイルスゲノム（例えばレンチウイルス）由来であるか、アデノウイルスベースである。
【００２８】
ウイルスベクターは、条件的な複製または複製の能力を有していてよい。条件的に複製可能なウイルスベクターは、有害な広域スペクトル感染を避けつつ特定の細胞種における選択的な発現を達成するために用いられる。条件的に複製可能なベクターの例は、Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343；Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8):1165-1171に記載されている。選択的に複製可能なベクターの他の例には、ウイルスの複製に必須の遺伝子が、特定の細胞種又は細胞状態にのみ活性となるプロモーターの制御下にあってこの遺伝子の発現がなければウイルスは複製しないベクターが含まれる。このようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日発行のHenderson, et al.の米国特許第５６９８４４３号、および１９９９年２月１６日発行のHenderson, et al.の米国特許第５８７１７２６号に記載されており、これらの教示内容全体は出典明記によって本明細書中に援用される。
【００２９】
さらに、ウイルスゲノムは、ある条件下でのみの複製または発現を達成する誘導性プロモーターを含むように修飾されてよい。誘導性プロモーターの例は科学文献において知られている（例としてYoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430；Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059；Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131；Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105；およびDreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371）。
【００３０】
本発明の好適な実施形態では、前記ポリペプチドまたは前記核酸分子はヒトのグラム陰性細菌性病原体から単離される。
【００３１】
本発明の好適な実施形態では、前記ヒトの細菌性病原体は、ナイセリア属種、モラクセラ属種、大腸菌属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種、シュードモナス属種、ヘリコバクター属種、レジオネラ属種、ヘモフィルス属種、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、クロノバクター属種およびセラチア属種からなる属群から選択される。
【００３２】
本発明の好適な実施形態では、前記ヒトの細菌性病原体はナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）である。
【００３３】
本発明の好適な実施形態では、前記ヒトの細菌性病原体はナイセリア・ゴノレア（淋菌）である。
【００３４】
本発明の好適な実施形態では、前記組成物はさらにアジュバントまたはキャリアを含有する。
【００３５】
アジュバント（免疫増強因子または免疫調節因子）はワクチン抗原に対する免疫応答を改善するためにここ数十年間使用されている。ワクチン製剤へのアジュバントの混入は、ワクチン抗原に対して特異的な免疫応答を亢進する、加速するおよび延長することを目的としている。アジュバントの利点は、弱い抗原の免疫原性の強化、免疫化の成功に必要な抗原量の削減、必要な追加免疫の頻度の減少、および高齢者や免疫不全ワクチン受診者の免疫応答の改善を含む。選択的に、アジュバントは、例えば免疫グロブリンクラスおよび細胞障害性またはヘルパーＴリンパ球の誘導に関して望ましい免疫応答を最適化するためにも用いられ得る。さらに、ある種のアジュバントは、粘膜表面での抗体応答を促進するために用いられ得る。水酸化アルミニウムおよびアルミニウムまたはリン酸カルシウムは、ヒトワクチンに日常的に用いられている。さらに最近では、ＩＲＩＶ（免疫刺激性再構築インフルエンザビロソーム）に混入される抗原およびエマルジョンベースのアジュバントＭＦ５９を含有するワクチンが各国で認可されている。アジュバントは、その起源、作用のメカニズムおよび物理的又は化学的性質に従って分類することができる。最も一般的に記載されるアジュバント分類は、ゲルタイプ、微生物、油エマルジョンおよび乳化剤ベース、微粒子、合成およびサイトカインである。複数のアジュバントが最終ワクチン生成物中に存在してもよい。それらはワクチン中に存在する単一の抗原またはすべての抗原と組み合わされてもよいし、各アジュバントをある特定の抗原と組み合わせてもよい。現在使用されるまたは開発中のアジュバントの起源と性質は非常に多様である。例えば、アルミニウムベースのアジュバントは単純な無機化合物から構成され、ＰＬＧは重合炭水化物であり、ビロソームは異種ウイルス粒子に由来しうるものであり、ＭＤＰは細菌の細胞壁に由来するものであり、サポニンは植物起源のものであり、スクアレンはサメ肝臓由来のものであり、そして組換え内因性免疫調節因子は組換え細菌、酵母または哺乳動物細胞由来のものである。動物用ワクチンには、ヒトへの使用では反応が強すぎる鉱物油エマルジョンなど、様々なアジュバントが認可されている。同様に、完全フロイントアジュバントは、最も強力なアジュバントの一つとして知られているがヒトへの使用には適さない。
【００３６】
キャリアは、第二分子に結合した場合に後者への免疫応答を増強する免疫原性分子である。キャリアなる用語は以下のように解釈される。キャリアは、第二分子に結合した場合に後者への免疫応答を増強する免疫原性分子である。いくつかの抗原は、本来免疫原性ではないが、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイドのような外来タンパク質分子と結合した場合に抗体反応を生成することができる。このような抗原はＢ細胞エピトープを含むがＴ細胞エピトープは含んでいない。このようなコンジュゲートのタンパク質部分（「キャリア」タンパク質）は、抗原特異的Ｂ細胞を順に刺激してプラズマ細胞に分化させ、抗原に対する抗体を産生するヘルパーＴ細胞を刺激するＴ細胞エピトープを提供する。
【００３７】
本発明の好適な実施形態では、前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、アルミニウムまたはリン酸カルシウムからなる群から選択される。
【００３８】
本発明の好適な実施形態では、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００３９】
本発明の更なる他の実施形態では、前記アジュバントは、ＴＬＲアゴニスト、例としてＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリル脂質Ａ、ポリＩ：Ｃ及びその誘導体である。
【００４０】
本発明の好適な実施形態では、前記アジュバントは、細菌細胞壁誘導体、例としてムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコレート（ＴＤＭ）である。
【００４１】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、オプソニンの産生に使用するための、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６６または６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【００４２】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：１または２を含むかまたはからなる。
【００４３】
本発明の他の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、６０、６３、６５または６７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはからなる核酸分子によってコードされる。
【００４４】
好ましくは、前記核酸分子は配列番号：３または４を含む。
【００４５】
本発明の好適な実施形態では、前記オプソニンは抗体である。
【００４６】
本発明の態様によると、病原性細菌種に対してヒトを免疫化する方法であって、
ｉ）有効量の用量の本発明に係るワクチン組成物をヒト被検体に投与して、防御免疫を誘導すること、場合によって、
ｉｉ）防御免疫を誘導するために十分な一または複数の更なる用量のワクチンを前記被検体に投与すること
を含む方法が提供される。
【００４７】
本発明の他の態様によると、ヒト被検体の病原性グラム陰性細菌感染の治療に用いるための本発明に係るワクチン組成物が提供される。
【００４８】
本発明の他の態様によると、ヒトの細菌性病原体から単離される抗原に対するオプソニンの産生方法であって、
ｉ）本発明に係るワクチン組成物を提供すること、
ｉｉ）オプソニン産生を誘導するために十分な有効量の前記組成物をヒト被検体に投与すること
を含む方法が提供される。
【００４９】
本発明のワクチン組成物は、注入、例えばエアロゾルや点鼻薬などの吸入による鼻腔スプレーを含め任意の従来の経路によって投与されうる。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または皮内であってよい。本発明のワクチン組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独でまたは更なる投薬で所望の応答を生成するワクチン組成物の量である。特定の細菌性疾患を治療する場合には、感染性作用物質によって刺激されると所望の応答は防御を提供する。
【００５０】
ワクチンの量は、当然のことながら、年齢、身体状態、体積および体重、治療期間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路および保健従事者の知識と専門性の範囲内の因子を含む、個々の患者パラメータに依存するであろう。これらの因子は当業者によく知られており、所定の実験を超えない範囲内で対処することができる。概して、個々の成分またはそれらの組み合わせの最大用量が免疫を誘発するために十分に用いられることが好ましい。この量はつまり正当な医学的判断による安全性の高い用量である。しかしながら、患者は、医学的な理由、心理学的理由または実質的な他の理由によりより低用量または耐容量を主張することは当業者が容易に理解できるであろう。
【００５１】
被検体に投与されるワクチンの用量は、異なるパラメーターに従って、特に用いる投与様式および被検体の状態に従って選択されうる。被検体の応答が用いた初期用量では不十分である場合には、より高用量（または異なるより局在的な運搬経路による効果的な高用量）が患者の許容範囲内で用いられてよい。
【００５２】
一般に、複数用量のワクチンが製剤化され、当分野で標準的な手順に従って有効な免疫化用量で投与される。ワクチン組成物の投与のための他のプロトコールは当業者に知られており、その場合、投薬量、注入計画、注入部位、投与様式などは前述から変更されうる。ヒト以外の哺乳動物へのワクチン組成物の（例えば試験目的または獣医治療目的のための）投与は、前述と実質的に同じ条件で行われる。
【００５３】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一の更なる抗菌剤を含む本発明に係るワクチン組成物が提供される。
【００５４】
本発明の好適な実施形態では、前記薬剤は第二の異なるワクチンおよび／または免疫原性物質（例えば細菌性ポリペプチドおよび／または多糖類抗原）である。
【００５５】
本発明の他の態様によると、ヒトの細菌感染またはヒトの細菌感染から生じる状態の治療に用いるための、本明細書中に記載のポリペプチドが提供される。
【００５６】
本発明の好適な方法では、前記細菌感染が一または複数のグラム陰性細菌によって生じる。
【００５７】
本発明の好適な方法では、前記グラム陰性細菌は、ナイセリア属種、モラクセラ属種、大腸菌属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種、シュードモナス属種、ヘリコバクター属種、レジオネラ属種、ヘモフィルス属種、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、クロノバクター属種、セラチア属種、キンゲラ属種およびパスツレラ属種からなる属群から選択される。
【００５８】
他の種には、緑膿菌やその他のシュードモナス属種、ステノトロホモナス・マルトフィリア、バークホルデリア・セパシアやその他のバークホルデリア属種、アルカチゲネス・キシロスオキシダンス、アシネトバクター、腸内細菌、ヘモフィルス、モラクセラ、バクテロイド、フランシセラ、赤痢菌、プロテウス、ビブリオ、サルモネラ、ボルデテラ、ヘリコバクター、レジオネラ、シトロバクター、セラチア、カンピロバクター、エルシニアおよびナイセリアの属種が含まれる。本発明の他の実施態様では、グラム陰性菌には、セラチア属、プロテウス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、シトロバクター属、クロノバクター属、サルモネラ属、プロビデンシア属、モルガネラ属、セデセア属および大腸菌などの生物からなる群から選択される腸内細菌科が含まれる。
【００５９】
本発明の好適な実施形態では、前記のヒト細菌性病原体はナイセリア・メニンギティディスである。
【００６０】
本発明の好適な実施形態では、前記のヒト細菌性病原体はナイセリア・ゴノレアである。
【００６１】
本発明の他の態様によると、本発明に係るワクチン組成物の有効量をヒト被検体にワクチン接種することを含む、ヒト被検体を免疫化する方法が提供される。
【００６２】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、「含む」および「含有する」なる語句およびこれら語句の変形、例えば「含んでいる」および「含み」は、「含むがこれらに限定しない」ことを意味し、他の部分、付加物、成分、整数または工程を除くことを意図しない（または除かない）。
【００６３】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の必要性がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、文脈上別段の必要性がない限り、複数形および単数形を考慮しているものと理解される。
【００６４】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分、または基は、本明細書において記載されている任意の他の態様、実施形態、または実施例と矛盾しない限り、それらに適用可能であると理解される。
【００６５】
本発明の実施形態は、以下の図を参照して例示としてのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したナイセリアＧｌｙ１タンパク質産生を示す。左のパネルは、レーン１：分子量マーカー、レーン２：誘導していない濃縮培地の上清、レーン３：誘導した濃縮培地の上清を示す。右のパネルは、レーン１：分子量マーカー、レーン２：ニッケルキレートカラムを用いた上清、レーン３：キレートカラムの通過分画、レーン４：イミダゾール勾配によって容離したプールされたキレート分画を示す。
【図２】クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した組換えＨ．インフルエンザＧｌｙ ＯＲＦ１ホモログの発現試験を示す。Ｕ−非誘導細胞ペレット、Ｉ−誘導細胞ペレット。１−ポジティブコントロール−ｐＪＯＮＥＸ４中にＴ５ＦＥＮΔ１９タンパク質を持つＭ７２（λ）大腸菌（誘導に関するポジティブコントロール）、２−Ｈ．インフルエンザＧｌｙ１ ＯＲＦ１ホモログ３を有するＭ７２（λ）大腸菌、３−Ｃ末端ヒスチジンタグを有するＨ．インフルエンザＧｌｙ１ ＯＲＦ１ホモログを有するＭ７２（λ）大腸菌。
【図３】ヘミン［ヘミン、○］およびＮ．メニンギティディスｇｌｙ１タンパク質との複合体［☆］のスペクトルを示す。
【図４】ヘミン［ヘミン、○］およびＮ．インフルエンザｇｌｙ１タンパク質との複合体［☆］のスペクトルを示す。Ｈ．インフルエンザｇｌｙ１タンパク質単独［緑色］ヘミン［ヘミン］（赤色）および複合体（青色）のスペクトル。
【図５】ヘミンビーズに対するＨ．インフルエンザ（ＨｉｎｆＧｌｙ１）およびナイセリア・メニンギティディスＧｌｙ１の選択的結合を示す、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析したヘミン−アガロースビーズプルダウンアッセイを示す。Ｗ−ヘミンビーズとインキュベートする前にＧｌｙ１（下方のバンド）をＢＳＡ（上方のバンド）と混合した。Ｂ−Ｇｌｙ１／ＢＳＡ溶液中でインキュベートした後にヘミンビーズをＰＢＳにて洗浄し、ＳＤＳ中で煮沸させて結合したタンパク質を放出させた。Ｓ−ＢＳＡとＧｌｙ１タンパク質と共にインキュベートした後にビーズをペレット化した後の上清。
【図６】ＰＣＲによるＭＣ５８のＧｌｙ１変異のデータ確認を示す。レーンＭ−関連するバンド標識の分子量を付した１ｋｂのＤＮＡのラダー(Fermentas)；レーン１−プライマーＫＯＦおよびＫＯＲにて増幅したＭＣ５８ΔＧｌｙ１のＰＣＲ産物；レーン２−プライマーＫＯＦおよびＫＯＲにて増幅したＭＣ５８野生型のＰＣＲ産物。
【図７】ＭＣＤＭにおけるＭＣ５８野生型（ＷＴ）およびＭＣ５８ΔＧｌｙ１の増殖を示す。上方パネルは、鉄の唯一の供給源としてのヘムを含む培地中でのＭＣ５８  Ｗ．Ｔ．（青色曲線）およびＭＣ５８ΔＧｌｙ１（赤色曲線）の２０時間にわたる増殖を示す。下方パネルは、鉄の唯一の供給源としてのヘモグロビンを含む培地中でのＭＣ５８  Ｗ．Ｔ．（青色曲線）およびＭＣ５８ΔＧｌｙ１（赤色曲線）の２０時間にわたる増殖を示す。
【図８】Ｇｌｙ１抗体−細菌直接播種の殺菌活性を示す（ＮＭ−Ｎ．メニンギティディスのみ；未処理コントロール群細菌、または他のコントロールにて処理されたもの、Ｃ１；抗ｇｌｙ１抗体を含まない血清、Ｃ２；補体を除去した血清によるＧｌｙ１抗体の１／５０希釈物）。しかしながら、抗ｇｌｙ１抗体と血清の存在により殺菌活動が生じる。抗体と補体を含む試料中での生きている細菌数の減少は、抗Ｇｌｙ１抗体の様々な希釈物で見られる。
【図９】クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分析した、大腸菌でのサルモネラ・エンテリカＧｌｙ１ホモログの発現と精製を示す。Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１は非誘導、レーン２は誘導細胞ペレットであり、この誘導細胞ペレットは、Ｃ末端ヒスチジンタグを含むように  ｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳにクローニングされたＳ．エンテリカＧｌｙ１遺伝子を有するＭ７２（λ）大腸菌のものである。レーン３は、ニッケルキレートカラムに流した総溶解性タンパク質を示す。レーン４および５はそれぞれ、ニッケルキレートおよびアニオン交換カラムにて精製した後のサルモネラＧｌｙ１ホモログを示す。
【図１０】サルモネラ・エンテリカＧｌｙ１ホモログのクローニング、発現およびウエスタンブロッティングを示す。
【実施例】
【００６７】
材料と方法
クローニング：  プラスミドｐＪＯＮＥＸ４（J. R. Sayers, F. Eckstein, Nucleic Acids Res. 19, 4127 (1991)）をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、２つのオリゴヌクレオチド（C1 5’ GATCCTGCAGGATGACGATGACAAACACCATCATCACCATCATTAGおよびC2 5’ AGCTCTAATGATGGTGATGATGGTGTTTGTCATCGTCATCCTGCAG）からなる二本鎖ＤＮＡとライゲートして、ｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳと称するプラスミドを作製した。このプラスミドはコンピテント大腸菌へ形質移入して、子孫プラスミドはＤＮＡ配列決定によって特徴付けた。ＰＣＲプライマーＦ１(TTTCGAATTCTAAGGAAATACGATGAA)およびＲ１(ATCCGCCCCGGGATCCCGGAAAAAT)を用いて標準法によりＮ．メニンギティディスＭＣ５８からｇｌｙ１ ｏｒｆ１遺伝子をＰＣＲ増幅し、結果として生じた断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（部位を下線で示す）にて消化し、ｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩへライゲートした。この結果、Ｃ末端エンテロキナーゼ認識部位、６つのヒスチジン残基および停止コドンを有するＧｌｙ１コード領域のインフレーム融合物が生じた。新たに構築したＤＮＡを２８℃でＬＢアンピシリンプレート上でＭ７２（λ）へ形質移入した。生じた組換えコンストラクトをｐＪＯＮＧＬＹ１ｈｉｓと称し、標準的なＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いて配列決定した(Core Genomics Facility, University of Sheffield Medical School)。
【００６８】
ヘモフィルス・インフルエンザ（ジェンバンク寄託番号ＡＪ６２７３８６）株はオックスフォード大学のDavid Wyllie博士より快く贈与された。培養物は、チョコレートアガープレート上に描き広げ、ＣＯ２増加条件下で３７℃で終夜インキュベートした。単一コロニーを無菌ループにて０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを添加した５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）へ移し、細胞懸濁液を９５℃で１０分間インキュベートすることによって溶解した。この溶解物をＰＣＲの鋳型に用いた。野生型Ｈ．インフルエンザｇｌｙ１（ＨｉｎｆＧｌｙ１  ＷＴ）は、プライマーＧｌｙ１＿ｈｉｎｆ＿Ｋ．ｆ(AATAGGTACCTGAGGAGAAACAAATGACAAAATTACTCACTCACTATTGGAGC)＋Ｈｉｎｆ＿ｇｌｙ１．ｒ(TATTCGATCCCTCAAGCTTTCATACTGCGACGT)を用いて入手した。Ｃ末端ｈｉｓタグ付加Ｈ．インフルエンザｇｌｙ１（ＨｉｎｆＧｌｙ１  Ｃ６Ｈ−ｔａｇ）は、プライマーＧｌｙ１＿ｈｉｎｆ＿Ｋ．ｆおよびＨｉｎｆ＿Ｇｌｙ１Ｈ６．ｒ  ＃(AAATGTCGACGCTTATTTTATCTCTATTTACGCTTATGA)を用いて標準的なプロトコールにより入手した。産生物ＨｉｎｆＧｌｙ１  ＷＴはＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、ｐＪＯＮＥＸ４（同じ制限酵素にて切断したもの）へライゲートしてｐＪＯＮＨＧＬＹを生成し、一方、ＨｉｎｆＧｌｙ１  Ｃ６Ｈ−ｔａｇはＫｐｎＩ＋ＳａｌＩにて消化し、ｐＪＯＮＥＸ４−ＣＨＩＳへライゲートしてｐＪＯＮＨＧＬＹ−ｈｉｓを生成した。
【００６９】
タンパク質生成：  １００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５ＹＴ培地中のＭ７２（ｐＪＯＮＧＬＹ１ｈｉｓ）の終夜培養物（１００ｍｌ）を１．５Ｌの５ＹＴ／カルベニシリン培地を含む２Ｌの発酵槽に播種し、７５０ｒｐｍで攪拌し、２Ｌ／分の給気を行いながら３０℃でインキュベートした。中央対数期には、温度を４２℃に上げて３時間置いた。次いで、室温で１００００×ｇにて２０分間遠心して細胞を上清から取り除いた。同様な手法を他のｇｌｙ１ホモログにも行った。
【００７０】
タンパク質精製：  Ｃ末端ｈｉｓタグ付加タンパク質は、基本的に記載されているように(D. N. Arvidson, R. F. Pearson, C. G. Arvidson, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59, 747 (2003))、金属アフィニティクロマトグラフィを用いて浄化した上清から精製した。タグが付加されていないタンパク質は、標準的なプロトコールを用いてカチオンおよびアニオン交換カラムによるイオン交換クロマトグラフィを用いて上清から精製し，精製はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。別法として、タンパク質は、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（１ｇの血中血球当たり１０ｍｌ）、その後固形塩酸塩グアニジウム中の血中血球（packed cell）に再懸濁し、懸濁液が透明になるまで撹拌することによって細胞ペレットから抽出した。超音波処理によって粘稠性を低減し、室温で４３０００×ｇにて３０分間遠心してデブリを取り除いた。次いで上清を取り除き、塩酸塩グアニジウムにおよそ３Ｍとなるように希釈し、前記のように遠心して、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィカラムにかけた。カラムを１０容量の適合性緩衝液にて洗浄し、その後酸またはイミダゾール勾配にて洗浄することによって塩酸塩グアニジウムを取り除き、溶出を実施した。
【００７１】
ヘム（ヘミン）結合アッセイ：  ｇｌｙ１結合および非結合のヘミンの可視的ＵＶスペクトルの変化を分光法によって、キャリアであるＢＳＡとＧｌｙ１との混合物からＧｌｙ１タンパク質を引き下ろす（プルダウンする）ためにアフィニティマトリクスとしてヘミン−アガロースビーズを用いて調査した。
【００７２】
抗体の産生：  タンパク質試料を氷上で解かし、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換した。次いで、タンパク質を用いてウサギ(BioServ UK Ltd, Sheffield)を免疫化した。
【００７３】
遺伝子ノックアウト：  髄膜炎菌（ＭＣ５８株）は通常通り血液とチョコレートアガープレート(Oxoid, UK)または１％（ｗ／ｖ）  Ｖｉｔｏｘ(Oxoid, UK)を添加したＧＣアガープレート上で生育させた。髄膜炎菌を生育するために通常用いる液体培地は、鉄供給源を含む髄膜炎菌の化学的限定培地（ＭＣＤＭ）または脳心臓輸液培地(Oxoid, UK)とした。Ｇｌｙ１オープンリーディングフレームの上流および下流の５００ｂｐ断片とｇｌｙ１遺伝子を含む１．３ｋｂの断片は、以下のプライマー；Ｇｌｙ１ＫＯＦ−5’-GCCGACGGCAAAACGGTTCA-3’およびＧｌｙ１ＫＯＲ5’-CCAAACCGGCAGGCGCAAA-3’を用いたＰＣＲによりＮ．メニンギティディスのＭＣ５８株のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅した断片は、  Ｓｓｐ１消化したプラスミドｐＫＮＴ２５(Karimova, G, Dautin, N & Ladant, D. J Bacteriol. 2005 April; 187(7): 2233-2243)のブラント化末端にクローニングして、ｐＫＮＴ２５Ｇｌｙ１を得た。ｐＫＮＴ２５Ｇｌｙ１はさらに、ｇｌｙ１遺伝子を真ん中で切断するＳｓｐ１にて消化し、線状プラスミドｐＫＧｌｙ１ΔＳｓｐ１を得た。プライマーＥｒｙ＿Ｆｏｒ−5’-GGGGCCCTGTGTTGATAGTGCAGTATCTTAAAA-3’およびＥｒｙ＿Ｒｅｖ−5’-GGGGCCCTATATCTAATAATTTATCTCCATTCCCTT-3’を用いたＰＣＲによってプラスミドｐＦＮＲ１からエリスロマイシン耐性カセット（ｅｒｍＲ）を増幅した。増幅した断片ｅｒｍＲをプラスミドｐＫＧｌｙ１  Ｓｓｐ１部位にライゲートして、プラスミドｐＫＧｌｙ１ｅｒｍＲを生成した。ｇｌｙ１遺伝子の断片に隣接してｅｒｍＲを含む２．５ｋｂ断片ｇｌｙ１−ｅｒｍＲは、プライマーＧｌｙ１ＫＯＦ−5’-GCCGACGGCAAAACGGTTCA-3’とＧｌｙ１ＫＯＲ−5’-CCAAACCGGCAGGCGCAAA-3’を用いたＰＣＲによって増幅した。
【００７４】
チョコレートアガープレートにて終夜生育させたＮ．メニンギティディスは、プロテオース−ペプトンブロス（プロテオース ペプトンＮｏ３(BD Biosciences, NJ, USA)−１５ｍｇ／ｍｌ；Ｄｉ−リン酸水素カリウム−４ｍｇ／ｍｌ；オルトリン酸２水素カリウム−１ｍｇ／ｍｌ；ＮａＣｌ−５ｍｇ／ｍｌ；１％（ｗ／ｖ）  Ｖｉｔｏｘ(Oxoid, UK)および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に終濃度ＯＤ６００ｎｍが０．２となるように再懸濁した。２５０μｌの懸濁液に１μｇの増幅ｇｌｙ１−ｅｒｍＲ断片を加えた。次いで、ＤＮＡとの細菌懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。同時にＤＮＡを含まないＴＥ緩衝液のみのコントロール形質転換も行った。インキュベート後、１００μｌの両懸濁液を５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン(Sigma, MO, USA)を含む１％  Ｖｉｔｏｘ(Oxoid, UK)添加ＧＣアガープレートに塗り広げた。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２にて終夜インキュベートした。得られたコロニーを、エリスロマイシンを含む新鮮ＧＣアガープレートに再び描き広げ、野生型対立遺伝子の存在の可能性を割り引いた。３回の選別を行った後、得られたコロニーを組み合わせ、相変化の可能性を取り除き、−８０℃に保存した。
【００７５】
プライマーＧｌｙ１ＫＯＦおよびＧｌｙ１ＫＯＲにてＭＣ５８ΔＧｌｙ１のゲノムＤＮＡを増幅し、ｇｌｙ１遺伝子の途中にｅｍｒＲカセットが挿入したことによる増幅断片のサイズの増加を解析することによって、突然変異誘発を立証した。ｅｍｒＲカセットの存在は、プライマーＥｒｙ＿ｆｏｒおよびＥｒｙ＿ｒｅｖによってフラグメントを増幅することによって確認した。挿入突然変異はさらに、プライマーＧｌｙ１ＫＯＦ、Ｇｌｙ１ＫＯＦ、Ｅｒｙ＿ｆｏｒおよびＥｒｙ＿ｒｅｖにて増幅された断片の配列決定により確認した。
【００７６】
ＭＣＤＭにおけるＮ．メニンギティディスＭＣ５８ＷＴおよびＭＣ５８ＤＧｌｙ１の増殖
溶液Ａは、４７５ｍｌの滅菌水中に１６６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４および６２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を溶解して含む。この溶液は高圧蒸気滅菌器にて滅菌した。溶液Ｂは、４７５ｍｌの滅菌水中に１．６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１１６ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌおよび５６ｍＭ  ＭｎＳＯ４を溶解して含む。この溶液は高圧蒸気滅菌器にて滅菌した。溶液Ｃは、２０ｍｌの滅菌水中に３５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４／ヘム／ヘモグロビン２５０ｍＭ  ＣａＣｌ２および７．５ｍＭ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を溶解して含む。次いでこの溶液はフィルター滅菌した。溶液Ｄ（添加剤）は、２０ｍｌの滅菌水中に１．４ｍＭ  アルギニン、０．０６ｍＭ  システイン、１ｍＭ  グルタミン酸および１ｍＭ  グリシンを溶解して含む。この溶液はフィルター滅菌した。溶液Ｅ（ビタミン剤）は、１００ｍｌの滅菌水中にチアミン塩酸塩０．０２ｇ、パントテン酸カルシウム０．０１９ｇおよびチアミンピロリン酸塩化物（コカルボキシラーゼ）０．００４８ｇを溶解して含む。次いでこの溶液はフィルター滅菌した。溶液Ｆは、５０ｍｌのエタノール中にビオチン０．０１５ｇを溶解して含み、終容量を滅菌水にて最大１００ｍｌとした。この溶液はフィルター滅菌した。
【００７７】
ＭＣＤＭは、２２８ｍｌの溶液Ａ、２２８ｍｌの溶液Ｂ、２０ｍｌの溶液Ｃ、８．３ｍｌの溶液Ｄ、３．３ｍｌの溶液Ｅおよび８．３ｍｌの溶液Ｆを混合して調製した。グルコースとＮａＨＣＯ３は３０ｍＭの終濃度まで添加した。溶液のｐＨはＨＣｌにて７．２に調整した。滅菌水にて５００ｍｌの溶液とした。
【００７８】
髄膜炎菌の化学的限定培地（ＭＣＤＭ）におけるＮ．メニンギティディスの増殖
ＭＣ５８野生型およびＭＣ５８ΔＧｌｙ１は、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン(Sigma, MO, USA、変異体用)を含むまたは含まない、１％  Ｖｉｔｏｘ(Oxoid, UK)含有ＧＣアガープレートにて通常通り生育させた。細菌は３７℃、５％ＣＯ２にて終夜生育させた。そして、増殖した細菌を外的鉄供給源を含まない髄膜炎菌の化学的限定培地（ＭＣＤＭ−０）に回収し、さらにそれぞれ鉄の供給源を含む予め温めたＭＣＤＭに希釈した。培養物を３７℃で生育させ、６００ｎｍの吸光度を測定して増殖を算出した。吸光度は播種の２、４、６、８、１０、１８および２０時間後に測定した。ヘミンまたはヘモグロビンを鉄供給源として添加した。
【００７９】
血清殺菌性抗体アッセイ
Ｎ．メニンギティディスＭＣ５８は、１％  ｖｉｔｏｘ(Oxoid, UK)を添加したＧＣアガープレートまたはチョコレートアガープレート上で終夜生育させた。細菌を回収し、１％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳに希釈した。およそ１５００ｃｆｕの髄膜炎菌を、Ｇｌｙ１抗体の異なる希釈物（１／１０、１／５０、１／１００、１／２００）および補体の供給源として働くヒト血清の存在下で、１％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で９６ウェルプレートにてインキュベートした。最終反応容量はＰＢＳにて１００μｌにした。抗体および／または血清を含まないコントロールを常に含めた。３７℃、５％ＣＯ２にて１時間インキュベートした後、各反応物から得た２０μｌの試料を血液アガープレート上に塗り広げ、３７℃、５％ＣＯ２にて１６時間生育させた。インキュベート後、生きている細胞を数え、グラフにした。実験は、異なる３つの時点に３通り行い、平均および標準偏差をプロットした。
【００８０】
サルモネラ・エンテリカＧｌｙ１ホモログの構築および合成
サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾナ菌のアミノ酸配列（ＹＰ＿００１５７３３０９）、ナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）ＧＬＹ１ＯＲＦ１ホモログをコードする合成ＤＮＡは、遺伝子合成(Eurofins MWG)によって構築し、隣接するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位によりｐＪＯＮＥＸ４プラスミドにクローニングした。同様に、停止コドンをＢａｍＨＩにより部位に置き換えてＹＰ＿００１５７３３０９をＣ末端６ヒスチジンタグとインフレーム融合した融合タンパク質配列として発現するようにしたＤＮＡコンストラクトを調製し、ｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳにサブクローニングした。組み換えプラスミドを用いてタグ付加および非タグ付加のＳ．エンテリカＧｌｙ１ホモログ（ＳａｌＧＬＹ１）を作製した。
【００８１】
実施例
図１および２に示すように、組換えＧｌｙ１タンパク質は大腸菌において容易に生成した。Ｎ．メニンギティディスおよびＨ．インフルエンザのＧｌｙ１タンパク質は、図３および４に示すようにヘミンの可視的スペクトルの変化を生じた。図３および４は、Ｇｌｙ１タンパク質がリガンドとして結合することを示す。これは、図５に示すようにヘミン−アガロースビーズによるプルダウンアッセイを用いて確認した。
【００８２】
Ｎ．メニンギティディスにおいてｇｌｙ１遺伝子を欠失させた（図６）。この変異体は、野生型の親と異なり、鉄供給源としてのヘミンまたはヘモグロビン上で生育できなかった（図７）。
【００８３】
ウサギが産生した組換えＮ．メニンギティディスＧｌｙ１タンパク質に対するポリクローナル抗体は、図８に示すように血清殺菌活性を媒介することができた。
【００８４】
図９は、タンパク質サイズマーカー（Ｍ）、誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）のＣ−ｈｉｓタグ付加ＳａｌＧｌｙ１の組換え遺伝子を持つＭ７２細胞からの総タンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶解後、溶解性タンパク質（レーン３）、タンパク質はニッケルキレート（レーン４）およびイオン交換クロマトグラフィ（レーン５）によって精製した。右手側のパネルは、１：５０００の希釈でラットにおいて生じた一次抗血清と示した量のＳａｌＧｌｙ１タンパク質を用いたウエスタンブロットの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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