(57)【要約】  本発明は癌治療の分野に関する。特に、本発明は、薬剤として、とりわけ転移性癌を治療するための薬剤として使用するための、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するB型プレキシンのアンタゴニストに関する。本発明はまた、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストの同定方法を企図する。最後に、本発明は、機能性の細胞内ドメインを欠くB型プレキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するB型プレキシンのアンタゴニスト。
【請求項２】
転移性癌の治療用の薬剤として使用するための、請求項1記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記転移性癌が、乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮癌からなる群より選択される、請求項2記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、B型プレキシン遺伝子またはその転写産物に特異的にハイブリダイズすることができかつB型プレキシンポリペプチドの発現を妨げる核酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
前記核酸が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスRNA、モルフォリノオリゴヌクレオチド、リボザイム、および三重らせん形成剤からなる群より選択される、請求項4記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
前記アンタゴニストがB型プレキシンポリペプチドに特異的に結合し、かつB型プレキシンポリペプチドのErbB-2への結合を阻害する、請求項1〜4のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
前記アンタゴニストがB型プレキシンの細胞外ドメインに結合する、請求項6記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
前記アンタゴニストが、抗体、アプタマー、ペプチド、およびポリペプチドからなる群より選択される、請求項6または7記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
前記アンタゴニストが、細胞毒性である化合物、癌細胞の細胞増殖もしくは分化を阻害する化合物、癌細胞のアポトーシスを誘導する化合物、および/または腫瘍の血管新生を防止する化合物と組み合わせて、前記薬剤中で使用される、請求項1〜8のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記化合物が、トラスツズマブ、ベバシズマブ、タモキシフェン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン、Ara-C(シタラビン)、CCNU(クロロエチルシクロヘキシルニトロソウレア)、ヒドロキシウレア、アドリアマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカンからなる群より選択される、請求項9記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストを同定するための方法であって、次のステップ：
a) B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストであると予想される化合物を、B型プレキシンおよびErbB-2を含む細胞と、B型プレキシンとErbB-2との相互作用の防止を可能にする条件下で、接触させるステップ；および
b) 該化合物がB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止する能力があるかどうかを判定し、それによって、該相互作用が防止された場合には、該化合物をB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストとして同定するステップ；
を含んでなる方法。
【請求項１２】
前記相互作用が細胞の移動および/または浸潤特性を測定することによって判定される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
機能性の細胞内ドメインを欠くB型プレキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項１５】
前記アンタゴニストが請求項14記載のポリペプチドである、請求項1〜4および6〜10のいずれか一項記載のアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療の分野に関する。特に、本発明は、薬剤として、とりわけ転移性癌を治療するための薬剤として使用するための、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するB型プレキシンのアンタゴニストに関する。本発明はまた、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストの同定方法を企図する。最後に、本発明は、機能性の細胞内ドメインを欠くB型プレキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は女性において最も一般的な原発性の悪性腫瘍である。すべての乳癌の約30％は受容体型チロシンキナーゼErbB-2を過剰発現する(Slamon 1989, Science 244:707-712)。こうした腫瘍の特徴は攻撃的挙動と予後不良である。乳腺でErbB-2を過剰発現し、その後乳癌を発症するトランスジェニックマウスを含めて、多数の証拠は、乳腺発癌におけるErbB-2シグナル伝達の関与を暗示する(Muller 1988, Cell 54:105-15; Guy 1992, Proc Natl Acad Sci U S A 89:10578-82)。しかしながら、これらの乳腺腫瘍の浸潤および転移進行に関与するErbB-2の下流のシグナル伝達事象は、まだほとんど解明されていない。
【０００３】
プレキシン(Plexin)は、発生中の神経系での軸索誘導との関連において最初に特徴づけられた、セマフォリンに対する膜貫通型受容体のファミリーである(Tamagnone 1990, Cell 99:71-80)。プレキシン-B1は、ErbB-2と安定的に相互作用することが示された(Swiercz 2004, J Cell Biol 165:869-880)。この相互作用は、プレキシン-B1のセマフォリンリガンドによる低分子量GTPアーゼRhoAの活性化にとって極めて重要である。低分子量GTPアーゼのRhoファミリーは、癌細胞の浸潤におけるそれらの役割について広く研究されてきた(Sahai 2002, Nat Rev Cancer 2:133-42)。特に、RhoAとRhoCが乳癌で過剰に発現されて、転移および乳癌患者の不良転帰の一因となっている(Lin 2004, Breast Cancer Res Treat 84:49-60)。さらに、リガンドSema4Dのその受容体プレキシン-B1への結合は、ErbB-2のキナーゼ活性を刺激し、これは2個の特定のチロシン残基でのプレキシン-B1のリン酸化につながる(Swiercz 2009, Mol Cell Biol  29:6321-34)。プレキシンD1は、腫瘍の診断と治療のための標的タンパク質として報告されている(US2010/119445)。
【０００４】
しかし、癌、特に乳癌の浸潤と転移を効果的に防止するための手段は、まだ利用可能でないが、それにもかかわらず、非常に要望されている。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、本発明は、上記のニーズに応じるための手段および方法を提供するという技術的課題に関する。その技術的課題は、特許請求の範囲および以下の本明細書中で特徴づけられる実施形態によって解決される。
【０００６】
かくして、本発明は、薬剤として使用するための、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するB型プレキシンのアンタゴニストに関する。好ましくは、本発明は、薬剤として使用するための、ヒトプレキシン-B1とヒトErbB-2との相互作用を防止するヒトプレキシン-B1のアンタゴニストに関する。
【０００７】
本明細書中で用いる用語「アンタゴニスト」は、B型プレキシンとErbB-2との、好ましくはヒトプレキシン-B1とヒトErbB-2との、相互作用を防止することができる化合物を指す。相互作用の防止は、相互作用の機能的防止または機能的・物理的防止であり得る。本発明に従って意図される相互作用の機能的防止は、ErbB-2/B型プレキシン複合体のシグナル伝達の阻害または減少をもたらす。そのようなシグナル伝達の阻害または減少は、以下の実施例に記載されるように、B型プレキシン、好ましくはヒトプレキシン-B1のチロシンリン酸化、あるいはRhoAおよび/またはRhoC活性、好ましくはヒトRhoAおよび/またはRhoC活性を測定することによって、確認することができる。本明細書でいうところのシグナル伝達の減少とは、好ましくは、測定された活性の統計的に有意な減少である。相互作用の防止は、直接的に、すなわちB型プレキシンとErbB-2との物理的相互作用を阻害することによって、あるいは間接的に、すなわち前記物理的相互作用を促進するタンパク質の阻害を介して、または複合体化合物の一方(例えば、細胞で利用可能なB型プレキシンポリペプチドもしくは細胞で利用可能なErbB-2ポリペプチド)の量の減少によって、起こり得る。好ましくは、前記アンタゴニストは、癌細胞が被験者において浸潤および転移するのを防止する。好ましくは、被験者はヒトである。これは、好ましくは、細胞遊走を阻害することによって達成することができ、その細胞遊走は、例えば以下の実施例に示されるように、試験することができる。本発明に従って用いられるアンタゴニストは、小分子化合物、タンパク質、特に抗体、ペプチド化合物、核酸、ポリマー、または任意の他の化合物とすることができる。そうした化合物は当技術分野でよく知られており、また、アンタゴニストとして作用する化合物は、本明細書の他の箇所に本発明に従って記載される方法により同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】野生型ErbB-2または構成的に活性なErbB-2の過剰発現はプレキシン-B1のリン酸化および活性化をもたらすことを示す。(A) HEK293細胞をVSV-プレキシン-B1および構成的に活性なErbB-2 (ErbB-2 VE)または野生型ErbB-2 (ErbB-2 WT)でトランスフェクトした。150nM Sema4Dの非存在下(-)または存在下(+)で20分インキュベートした後、抗VSV抗体を用いてVSV-プレキシン-B1を免疫沈降(IP)させ、抗ホスホチロシン(pTyr)抗体または抗VSV抗体を用いて沈降物をイムノブロット(IB)した。(B〜E) HEK293細胞をVSV-プレキシン-B1ならびにMYC-RhoAおよびFLAG-PDZ-RhoGEF (B)、HA-RhoBおよびFLAG-PDZ-RhoGEF (C)、HA-RhoCおよびFLAG-PDZ-RhoGEF (D)またはHA-R-RasおよびRnd1 (E)でトランスフェクトした。示されている場合は、細胞を、構成的に活性なErbB-2 (ErbB-2 VE)、野生型ErbB-2 (ErbB-2 WT)、または細胞内ドメインを欠くプレキシン-B1欠失構築物(PlxB1ΔC)でさらにトランスフェクトした。150nM Sema4Dの非存在下または存在下で20分インキュベートした後、示した活性RhoアイソフォームまたはR-Rasを実施例に記載したように沈降(プルダウン)させ、Rhoタンパク質またはR-Rasのタグに対する抗体を用いて沈降物をイムノブロット(IB)した。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】プレキシン-B1はErbB-2過剰発現ヒト乳癌細胞の浸潤を促進することを示す。(A)ヒト乳癌細胞株MCF-7、T-47D、SK-BR-3、BT-474または(B)対照siRNAもしくはErbB-2に対するsiRNAでトランスフェクトしたBT-474細胞を溶解し、プレキシン-B1を免疫沈降(IP)させ、抗ホスホチロシン(pTyr)抗体または抗プレキシン-B1抗体を用いて沈降物をイムノブロット(IB)した。並列実験では、活性RhoA/RhoCのレベルを測定した。(C〜F) BT-474細胞を対照またはプレキシン-B1 siRNAでトランスフェクトした。(C)プレキシン-B1および活性RhoA/RhoCの量を測定した。(D)細胞溶解物を抗ホスホErbB-2[Y1248]抗体でプローブした。(E) BT-474細胞の数を5日間連続でカウントした。(F) Matrigel被覆フィルター上に細胞を播種し、浸潤細胞を実施例に記載したようにカウントした。(G,H) siRNA非感受性野生型プレキシン-B1またはsiRNA非感受性変異型プレキシン-B1(Y1708F/Y1732F)を安定的に発現するBT-474細胞をプレキシン-B1 siRNAでトランスフェクトして、内因性プレキシン-B1をノックダウンさせた。(G)プレキシン-B1を免疫沈降させ、抗プレキシン-B1抗体および抗ホスホチロシン(pTyr)抗体を用いて沈降物をイムノブロットした。さらに、活性RhoA/RhoCのレベルを測定した。(H)並行して、Matrigel被覆フィルター上に細胞を播種し、浸潤細胞をカウントした。(I,J) BT-474細胞を(I)マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1; クローン#93, 1.8ng/μl)の非存在下もしくは存在下で、または(J) 150nM PlxB1ext(すなわち、プレキシン-B1の可溶性細胞外ドメイン)の非存在下もしくは存在下でインキュベートし、活性RhoA/RhoCの量を測定した。(K,L) BT-474細胞を(K)マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1; クローン#93, 1.8ng/μl)の非存在下もしくは存在下で、または(L) 150nM PlxB1ext、2μg/mlのトラスツズマブ、もしくは両方の存在下でMatrigel被覆フィルター上に播種し、浸潤細胞をカウントした。データは平均±S.D.として示される。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図２−５】図２−４の続き。
【図２−６】図２−５の続き。
【図３−１】プレキシン-B1はErbB-2過剰発現乳癌のマウスモデルにおいて転移を促進することを示す。(A) MMTVneu;plxnb1+/+マウス(WT)およびMMTVneu;plxnb1-/-マウス(KO)を乳腺腫瘍の出現について毎週検査した。時間に対してプロットされた無腫瘍生存率が示される。WT, n＝37; KO, n＝40。(B)触知可能な腫瘍が最初に出現してから8.5週間後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を摘出して秤量した。データは平均±S.D.として示される。(C)腫瘍を担持するMMTVneu;plxnb1+/+マウス(WT)およびMMTVneu;plxnb1-/-マウス(KO)の肺の巨視的画像。転移は矢印で示される。(D) (C)における結果の定量化。(E)腫瘍担持マウスのH&E染色した組織切片の顕微鏡画像。転移は矢印で示される。(F,G)腫瘍担持マウスの肺切片を顕微鏡で分析し、肺あたりの転移の数(F)および組織切片あたりの転移の数(G)をカウントした。統計的有意性は、ログランク検定(A)、t検定(B,F,G)およびフィッシャーの正確確率検定(D)で判定した；*, p＜0.05；n.s., 有意ではない。(E)におけるスケールバーは100μmを表す。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図３−５】図３−４の続き。
【図４−１】プレキシン-B1はErbB-2陽性ヒト乳癌で活性化され、その発現レベルは患者の予後と相関することを示す。(A)検出可能なErbB-2発現なし(ErbB-2スコア0)またはErbB-2過剰発現あり(ErbB-2スコア3+)の乳癌患者からの腫瘍標本のRNAを単離して、逆転写(RT, 逆転写酵素)した。プレキシン-B1に特異的なプライマーを用いてPCR解析を行った。(B)ヒト乳癌組織の免疫組織化学的染色は、プレキシン-B1タンパク質が癌細胞において発現されることを示している。この染色は、免疫のために使用するペプチドと抗プレキシン-B1抗体(R&D Systems社)とのプレインキュベーションにより、ブロックすることができる。(C)検出可能なErbB-2発現なし(ErbB-2スコア0)または異なるレベルのErbB-2発現あり(ErbB-2スコア1+〜3+)の18人の患者から得られた乳癌組織を溶解した。プレキシン-B1を免疫沈降(IP)させ、抗ホスホチロシン(pTyr)抗体または抗プレキシン-B1抗体を用いて沈降物をイムノブロットした。溶解物をErbB-2、ホスホErbB-2[Y1248]、およびαチューブリンについてプローブした。(D) ErbB-2過剰発現乳癌患者の無病生存率を表すカプラン・マイヤー(Kaplan-Meier)のグラフ。黒色、プレキシン-B1の高発現(プレキシン-B1高; n＝39)；灰色、プレキシン-B1の低発現(プレキシン-B1低; n＝22)。(E) ErbB-2過剰発現乳癌患者の全生存率を表すカプラン・マイヤーのグラフ。黒色、プレキシン-B1の高発現(プレキシン-B1高; n＝13)；灰色、プレキシン-B1の低発現(プレキシン-B1低; n＝7)。(B)におけるスケールバーは50μmを表す。(F) ErbB-2/プレキシン-B1シグナル伝達経路の概略図。受容体型チロシンキナーゼErbB-2の過剰発現は、プレキシン-B1の2個の特定のチロシン残基でのリン酸化をもたらす。このプレキシン-B1のリン酸化は、プレキシン-B1のC末端と安定的に相互作用するRhoGEF 11 (PDZ-RhoGEF)およびRhoGEF 12 (LARG)を介して、RhoAおよびRhoCの活性化を促進する。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図４−５】図４−４の続き。
【図５】ErbB-2の下流のRhoCの活性化はプレキシン-B1によって媒介されることを示す。HEK293細胞をVSV-プレキシン-B1ならびにHA-RhoCおよびFLAG-PDZ-RhoGEFでトランスフェクトした。示されている場合は、細胞を、野生型ErbB-2 (ErbB-2 WT)で、または細胞内ドメインを欠くプレキシン-B1欠失構築物(PlxB1ΔC)でさらにトランスフェクトした。150nM Sema4Dの非存在下または存在下で20分インキュベートした後、活性RhoCを沈降(プルダウン)させ、抗HA抗体を用いて沈降物をイムノブロット(IB)した。
【図６−１】(A) ErbB-2のノックダウンは活性R-Rasレベルに影響を及ぼさない。BT-474細胞を対照またはErbB-2 siRNAでトランスフェクトした。48時間後、細胞を溶解し、活性R-Rasを免疫沈降(プルダウン)させ、抗R-Ras抗体を用いて沈降物をイムノブロットした。(B,C)プレキシン-B1の安定したノックダウンはBT-474細胞の遊走と浸潤を弱める。レンチウイルス系を用いて、BT-474細胞を対照shRNAまたはプレキシン-B1に対するshRNAで安定的にトランスフェクトした。(B)非被覆フィルター上に播種してから24時間後、または(C) Matrigel被覆フィルター上に播種してから48時間後、フィルターの上側の細胞を除去し、フィルターの底部側の細胞を実施例に記載したようにカウントした。(D) RhoAまたはRhoCのsiRNA媒介ノックダウンはBT-474細胞の浸潤性を減じる。対照、RhoAまたはRhoC siRNAでトランスフェクトしたBT-474細胞をMatrigel被覆フィルター上に播種した。48時間後、浸潤しない細胞を除去して、浸潤細胞をカウントした。(E〜H)マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)は、ErbB-2とプレキシン-B1との相互作用を妨害するが、Sema4Dのプレキシン-B1への結合を阻害しない。マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)またはプレキシン-B1の可溶性細胞外ドメイン(PlxB1ext)によるErbB-2とプレキシン-B1のアンカップリング(uncoupling)は、プレキシン-B1のチロシンリン酸化を低減させる。(E) BT-474細胞を示される濃度のマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1；クローン#93)と60分間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、抗ErbB-2抗体を用いてErbB-2を免疫沈降(IP)させ、抗プレキシン-B1抗体(R&D Systems社)を用いてプレキシン-B1を免疫沈降(IP)させた。沈降物は、プレキシン-B1(R&D Systems社)、ホスホチロシン(pTyr)、またはErbB-2に対する抗体でイムノブロット(IB)した。(F) HEK293細胞を3DA.Lucならびにプレキシン-B1およびPDZ-RhoGEFをコードするプラスミドでトランスフェクトした。3DA.Lucは、活性RhoAの下流で活性化される変異型血清応答エレメント(SRE)の制御下でホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドを表す。示される濃度のマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)と60分間インキュベートした後、細胞を150nM Sema4Dで4時間処理し、RhoA活性に対応するホタルルシフェラーゼ活性を実施例1に記載したとおりに測定した。(G)内因性プレキシン-B1を発現するMCF-7細胞を、示される濃度のマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)と1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞をmyc-Sema4Dで30分間処理した。未結合myc-Sema4Dを洗浄により除去した後、細胞をHRPコンジュゲート化抗myc抗体と30分間インキュベートし、洗浄し、HRP活性を実施例に記載したとおりに測定した。(H) BT-474細胞を示される濃度のプレキシン-B1の可溶性細胞外ドメイン（PlxB1ext）と45分間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、抗プレキシン-B1抗体(R&D Systems社)を用いてプレキシン-B1を免疫沈降(IP)させた。沈降物は、プレキシン-B1(R&D Systems社)、ホスホチロシン(pTyr)、またはErbB-2に対する抗体でイムノブロット(IB)した。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図６−４】図６−３の続き。
【図６−５】図６−４の続き。
【図７−１】プレキシン-B1はErbB-2過剰発現ヒト卵巣癌細胞の浸潤を促進することを示す。(A) SK-OV-3細胞を示される濃度のマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1；クローン#93)と60分間インキュベートした。細胞溶解後、抗ErbB-2抗体を用いてErbB-2を免疫沈降(IP)させ、抗プレキシン-B1抗体(R&D Systems社)を用いてプレキシン-B1を免疫沈降(IP)させた。沈降物は、ホスホチロシン(pTyr)、ErbB-2またはプレキシン-B1に対する抗体を用いてイムノブロット(IB)した。(B) SK-OV-3細胞をマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1；クローン#93、1.8ng/μl)の非存在下または存在下で60分間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、活性RhoAおよびRhoCの量を記載したとおりに測定した(プルダウン)。(C) SK-OV-3細胞をマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1；クローン#93、1.8ng/μl)の非存在下または存在下でMatrigel被覆フィルター上に播種した。16時間後、非浸潤細胞を除去し、浸潤細胞をカウントした。データは平均±S.D.として示され、統計的有意性はt検定により判定した；**, p＜0.01。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８−１】MMTVneu原発腫瘍の解析を示す。(A)原発腫瘍および肺転移からのRNAを単離して、逆転写した(RT、逆転写酵素)。プレキシン-B1に特異的なプライマーを用いてPCR解析を行った。β-アクチンに対するプライマーを対照として使用した。MMTVneu原発腫瘍の(B,C)アポトーシス、(D,E)血管新生、(F,G)マクロファージ浸潤、(H,I)ホスホErbB-2スコア、(J,K)悪性度分類、および(L,M)局所浸潤性(プレキシン-B1 WT, n＝7；プレキシン-B1 KO, n＝13)。代表的な写真は（B,D,F,H,J,L）に示され、結果の定量化は（C,E,G,I,K,M）に提供される。矢印は以下を指す：(B)切断型カスパーゼ3に陽性のアポトーシス細胞(青色)、(D)CD31陽性血管(赤色)、(F) Mac-3陽性マクロファージ(赤色)、(J)有糸分裂像。(L)では浸潤の最前部が白の点線でマークされる。スケールバーは、(D)では200μm、(H)では40μm、(B,F,J,L)では20μmを表す。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図８−４】図８−３の続き。
【図８−５】図８−４の続き。
【図８−６】図８−５の続き。
【図８−７】図８−６の続き。
【図８−８】図８−７の続き。
【図８−９】図８−８の続き。
【図８−１０】図８−９の続き。
【図８−１１】図８−１０の続き。
【図８−１２】図８−１１の続き。
【図８−１３】図８−１２の続き。
【図９−１】以下の乳癌を有する患者の無病生存率を表すカプラン・マイヤーグラフを示す：(A) ErbB-2陰性乳癌(プレキシン-B1高: n＝62、プレキシン-B1低: n＝19)、(B) ErbB-2陽性、ER陽性乳癌(プレキシン-B1高: n＝15、プレキシン-B1低: n＝15)、(C) ErbB-2陽性、ER陰性乳癌(プレキシン-B1高: n＝14、プレキシン-B1低: n＝14)。黒色、プレキシン-B1の高発現(プレキシン-B1高)；灰色、プレキシン-B1の低発現(プレキシン-B1低)。統計的有意性はログランク検定により試験した。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】乳癌患者の特徴を示す。これらの患者の(A)凍結乳癌組織をRT-PCRのために取得した；(B)パラフィン包埋乳癌組織を免疫組織化学のために取得した；(C)凍結乳癌組織を免疫沈降およびウェスタンブロットのために取得した。
【図１１】マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(mAb) #19、#93、#527、#538、#635および#830の特性解析を示す。カラム#1：濃度10μg/mlでウェスタンブロット/イムノブロットにおいてプレキシン-B1タンパク質を認識する各mAbの能力。(+)は予想された分子量に若干の反応性があることを意味し、(++)は強いシグナルを意味する。mAb #19および#93を用いたウェスタンを繰り返し行い、また、RNAiの手段によりプレキシン-B1を枯渇させた細胞を用いて特異性を確認した。カラム#2：HEK細胞で過剰発現(OE)されたVSVタグ付きプレキシン-B1を沈降させる各mAbの能力。カラム#3：MCF-7細胞からの天然プレキシン-B1を沈降させる各mAbの能力。カラム#4：プレキシン-B1/ErbB-2複合体を共免疫沈降させる各mAbの能力。免疫沈降はMCF-7、BT-474およびSK-OV-3細胞株で行い、これらの細胞株はすべてプレキシン-B1および異なるレベルのErbB-2を発現する。(-)は、抗体の添加がプレキシン-B1/ErbB-2相互作用をブロックすることを意味し、(NA)は、その抗体が天然のプレキシン-B1を免疫沈降することができないので、適用されない(not applicable)ことを意味する。カラム#5：SK-OV-3細胞はより高い基礎RhoA活性を示し、この活性はプレキシン-B1リン酸化とその後のRhoA活性化をもたらすErbB-2の過剰発現に依存する。(ブロック)は、カラム#4に記載の実験に基づいて、基礎RhoA活性を低下させる各mAbの能力を意味し、その効果はプレキシン-B1/ErbB-2相互作用の阻害による。カラム#6：MCF-7細胞は正常レベルのプレキシン-B1およびErbB-2を発現する；本発明者らは、以前に、プレキシン-B1リガンドのSema4Dによる刺激がErbB-2の活性化と、これに続くプレキシン-B1のリン酸化およびRhoA活性化につながることを示した。(ブロック)は、観察された効果がプレキシン-B1/ErbB-2相互作用の阻害による(mAb #93および#538)か、または受容体プレキシン-B1へのリガンドSema4Dの結合の競合的阻害のためである(抗体#19および#527)、ことを意味する。カラム#7：プレキシン-B1を介したR-Ras不活性化は、ErbB-2との相互作用とは無関係であるが、リガンドSema4Dによる刺激に依存する。(ブロック)は、抗体とのプレインキュベーションが、おそらく抗体とSema4Dの間の競合のために、Sema4Dによる刺激後にR-Rasを不活性化するプレキシン-B1の能力の欠如をもたらす、ことを意味する。カラム#8：プレキシン-B1とその相同体プレキシン-B2を発現する細胞(SKOV)の表面に結合する、およびプレキシン-B1を枯渇させた細胞(SKOV sh)に結合する各mAbの能力。(なし)は、プレキシン-B1を枯渇させた細胞の表面への結合の欠如を示し、したがって、プレキシン-B1に対する抗体の特異性を示す。カラム#9：プレキシン-B1へのSema4Dの結合をブロックする各mAbの能力。実験は、天然プレキシン-B1を発現するMCF-7細胞で行い、抗プレキシン-B1モノクローナル抗体とプレインキュベートした。カラム#10：他のプレキシンファミリーのメンバー(プレキシンA1〜4、B1〜3、C1およびD1)に対する各mAbの交差反応性の試験。(なし) - 交差反応性が観察されない。カラム#11：RhoA媒介基礎細胞浸潤をブロックする各mAbの能力 - カラム#5(Matrigel浸潤アッセイで測定)の場合と同じ作用機構。(あり) - 抗体がSK-OV-3細胞とBT-474細胞の浸潤をブロックする。要約：本発明者らは、マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#93および#538がプレキシン-B1/ErbB-2相互作用をブロックする一方で、抗体#19および#527はリ��ンド(sema4D)-受容体(プレキシン-B1)結合を競合的にブロックする、ことを示すことができた。抗体#635はウェスタンブロットで弱い反応性を示す。抗体#830は非特異的である。#635と#830の両方は、公知のプレキシン-B1介在シグナル伝達経路/細胞効果への阻害作用を示さない。大多数の試験は用量依存的に実施された。すべての試験は少なくとも2回の独立した実験で再現された。
【０００９】
本明細書中で引用したすべての参考文献は、それらの全開示内容および本明細書に具体的に記載された開示内容に関して参照することによって本明細書に組み入れられる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一実施形態において、前記アンタゴニストは、B型プレキシン遺伝子、好ましくはヒトプレキシン-B1遺伝子に、またはその転写産物に、特異的にハイブリダイズすることができ、かつB型プレキシンポリペプチドの発現を妨げる核酸である。さらに好ましくは、前記核酸は、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスRNA、モルフォリノオリゴヌクレオチド、リボザイム、および三重らせん形成剤からなる群より選択される。上記の核酸アンタゴニストは、標的として想定されるB型プレキシン遺伝子またはその転写産物からの核酸のストレッチに相補的である、少なくとも連続核酸のストレッチを含むことを特徴とする。B型プレキシンの核酸配列に関する詳細は、本明細書の他の箇所に見出される。
【００１１】
低分子干渉RNA(siRNA)は標的RNA(すなわち、アンタゴナイズされる目的の遺伝子から転写されるRNA)に相補的である。siRNAはRNA干渉(RNAi)を引き起こし、それによって、目的の遺伝子の転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制または阻害する。同様に、マイクロRNAは相補的RNAターゲッティング配列を含み、これもまたRNAi機構を介して作用する。理論によって束縛されないが、RNAiは一般に、mRNAを標的とすることで、目的の遺伝子の発現を静止させるために使用される。簡単に説明すると、細胞内のRNAiのプロセスは、リボヌクレアーゼで切断される二本鎖RNA(dsRNA)によって開始され、こうしてsiRNA二本鎖が生成される。siRNAは別の細胞内酵素複合体に結合し、それによって、該複合体が活性化されて、siRNA配列に相同(または相補的)であるmRNA分子は何であれ標的とする。該複合体の機能は、siRNA鎖の1つと標的mRNAとの塩基対合相互作用を介して相同mRNA分子を標的とすることである。次いでmRNAはsiRNAの3'末端から約12ヌクレオチドを切断されて、分解される。このように、特定のmRNAを標的化して分解することができ、それによって、標的化mRNAからのタンパク質発現が消失する結果となる。本明細書中で用いる相補的ヌクレオチド配列とは、標的遺伝子の一部のRNA転写産物に相補的な、RNA鎖上の領域を指す。用語「dsRNA」は、2本の相補的な逆平行核酸鎖を含む二本鎖構造を有するRNAを指す。dsRNAのすべてのヌクレオチドは必ずしも完全なワトソン・クリック型塩基対を示すわけではない；2本のRNA鎖は実質的に相補的であり得る。dsRNAを形成するRNA鎖同士は、同じまたは異なる数のヌクレオチドをもつことができ、その場合に塩基対の最大数はdsRNAの最も短い鎖中のヌクレオチドの数である。好ましくは、dsRNAは長さがせいぜい49ヌクレオチドであり、さらに好ましくは25ヌクレオチドより少なく、最も好ましくは19〜23、すなわち19、20、21、22または23ヌクレオチドである。この長さのdsRNAは、RNAiの技術を用いて標的遺伝子の発現を阻害する上で特に効果的である。dsRNAは続いて、リボヌクレアーゼ酵素によって短い干渉RNA(siRNA)に分解される。s
iRNAの相補的領域は、標的RNAへのsiRNAの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、従ってRNAiを媒介する。哺乳動物細胞では、siRNAは約21〜25ヌクレオチドの長さである。siRNA配列は、相補的な塩基対合相互作用を介してsiRNAと標的RNAを一緒に結び付けるのに十分な長さである必要がある。siRNAの長さは、好ましくは10ヌクレオチド以上で、標的RNAと安定的に相互作用するのに十分な長さであり、具体的には15〜30ヌクレオチド、さらに具体的には15および30ヌクレオチドの間の任意の整数、最も好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、および30ヌクレオチドである。「十分な長さ」とは、予想される条件下で意図した機能を提供するのに十分な長さである15ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドを意味する。「安定的に相互作用する」とは、低分子干渉RNAと標的核酸との(例えば、生理的条件下で標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することによる)相互作用を意味する。一般的に、そのような相補性はsiRNAとRNA標的の間で100％であるが、必要に応じてそれより低くてもよく、好ましくは90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％である。例えば、21塩基のうち19塩基が塩基対を形成すればよい。種々の対立遺伝子変異体間での選択が求められる場合には、標的配列を他の対立遺伝子配列から効果的に識別するために、標的遺伝子に対する100％相補性が必要とされる。対立遺伝子標的間で選択を行う場合、長さの選択もまた重要な要因である。というのは、長さは対立遺伝子の差異を区別する能力および相補性パーセントに関与するもう1つの要因であるからである。線虫(C. elegans)、ショウジョウバエ、植物、および哺乳動物を含めて、生物内の遺伝子をサイレンシングするためにRNAiを用いることに関する方法は、当技術分野で知られている(例えば、Fire 1998, Nature 391:806-811; Fire 1999, Trends Genet. 15, 358-363; Sharp 2001, Genes Dev. 15,485-490; Hammond 2001, Nature Rev. Genet. 2, 1110-1119; Tuschl 2001, Chem. Biochem. 2, 239-245; Hamilton 1999, Science 286, 950-952; Hammond 2000, Nature 404, 293-296; Zamore 2000, Cell 101, 25-33; Bernstein 2001, Nature 409, 363-366; Elbashir 2001, Genes Dev. 15, 188-200; WO 0129058; WO 09932619; およびElbashir 2001, Nature 411: 494-498を参照されたい)。
【００１２】
アンチセンス核酸分子は好ましくはRNAであり、標的転写産物に本質的にまたは完全に相補的な核酸配列を含む。好ましくは、アンチセンス核酸分子は本質的に、標的転写産物の少なくとも25個連続したヌクレオチド、少なくとも50個連続したヌクレオチド、少なくとも100個連続したヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個または少なくとも500個連続したヌクレオチドに相補的な核酸配列からなる。アンチセンス核酸分子を作製・使用する方法は当技術分野で周知である(例えば、Weiss, B.(編): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997を参照されたい)。
【００１３】
モルフォリノオリゴヌクレオチド(またはモルフォリノ)は、約20〜30ヌクレオチド、一般的には約25ヌクレオチドの長さを有する合成核酸分子である。モルフォリノは標準的な核酸塩基対合によって標的転写産物の相補的配列に結合する。それらは、デオキシリボース環の代わりにモルフォリン環に結合されかつホスフェートの代わりにホスホロジアミデート基を介して連結された、標準的な核酸塩基を有する(例えば、Summerton 1997, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7(3): 187-95を参照されたい)。陰イオン性ホスフェートの非荷電ホスホロジアミデート基への交換のため、通常の生理学的pH範囲でのイオン化が防止され、そのため生物または細胞内のモルフォリノは非荷電分子である。モルフォリノの骨格全体はこうした改変サブユニットから作製される。阻害性の小分子RNAとは異なり、モルフォリノはそれらの標的RNA分子を分解しない。むしろ、それらはRNA内の標的配列への結合を立体的にブロックして、さもなければそのRNAと相互作用する可能性がある分子を単に妨害する(例えば、Summerton 1999, Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1): 141-58を参照されたい)。
【００１４】
リボザイムは、自己のホスホジエステル結合の1つの加水分解(自己切断性リボザイム)または他のRNA中の結合の加水分解を触媒することができる、特定の三次構造を有する触媒RNA分子であるが、それらはまた、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも見出されている。本発明に従って想定されるリボザイムは、好ましくは、標的転写産物を特異的に加水分解するものである。特に、ハンマーヘッド型リボザイムが本発明において好適である。そのようなリボザイムの作製・使用方法は当技術分野で周知である(例えば、Hean J, Weinberg MS (2008). "The Hammerhead Ribozyme Revisited: New Biological Insights for the Development of Therapeutic Agents and for Reverse Genomics Applications". In Morris KL. RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Norfolk, England: Caister Academic Pressを参照されたい)。
【００１５】
さらに、三重らせん形成剤も本発明のアンタゴニストとして想定される。これらの形成剤もまた、アンタゴナイズされる目的の遺伝子と三重構造を形成するオリゴヌクレオチドである。通常、前記三重らせんは、遺伝子の調節領域に形成されて、該遺伝子からのmRNAの効率的な転写をできなくする。そのような三重らせん形成剤の設計および作製方法は当技術分野で周知である。
【００１６】
さらに、特に好ましいアンタゴニスト核酸は以下の実施例に記載される。かくして、最も好ましくは、該核酸は配列番号3に示される核酸配列を含む、または有する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明のアンタゴニストは、B型プレキシンポリペプチド（好ましくはヒトプレキシン-B1）に特異的に結合し、そして(i) B型プレキシンポリペプチド(好ましくはヒトプレキシン-B1)のErbB-2(好ましくはヒトErbB-2)への結合を阻害するか、または(ii)リガンドSema4D(好ましくはヒトSema4D)のその受容体B型プレキシンポリペプチド(好ましくはヒトプレキシン-B1)への結合を阻害する。さらに好ましくは、前記アンタゴニストは、B型プレキシンの細胞外ドメインに、より好ましくは配列番号2に示されるヒトプレキシン-B1のアミノ酸20-534に、または長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200もしくは300アミノ酸残基であるその断片に結合する。好ましくは、前記アンタゴニストは、抗体、アプタマー、ペプチド、およびポリペプチドからなる群より選択される。B型プレキシンの構造は本明細書の他の箇所に記載される。通常の結合試験により、当業者は、アンタゴニストがB型プレキシンの細胞外ドメインに結合するかどうかを判別することができる。また、本明細書の他の箇所に記載される機能試験によって、ErbB-2とB型プレキシンの相互作用が機能的に妨げられるかどうかを判定することができる。B型プレキシンの細胞外ドメインに結合する抗体、アプタマー、ペプチド、およびポリペプチドの作製方法は当技術分野で周知である。
【００１８】
本明細書でいうところの抗体は、好ましくは、B型プレキシンの細胞外ドメインまたはその断片に特異的に結合する、あらゆるタイプの抗体を包含する。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはB型プレキシンの細胞外ドメインもしくはその断片に特異的に結合する能力がまだある該抗体のフラグメントもしくは誘導体である。B型プレキシン(好ましくはヒトプレキシン-B1)の細胞外ドメインもしくはその断片に特異的に結合することに加えて、前記抗体またはそのフラグメントは、(i) B型プレキシンポリペプチド(好ましくはヒトプレキシン-B1)のErbB-2(好ましくはヒトErbB-2)への結合を阻害するか、または(ii)リガンドSema4D(好ましくはヒトSema4D)のその受容体B型プレキシンポリペプチド(好ましくはヒトプレキシン-B1)への結合を阻害する。好ましくは、前記抗体は、げっ歯類(例：マウス、ラット)、霊長類(例：チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、マカク)またはヒトのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、さらに好ましくは、本明細書の他の箇所で特性評価されるマウスモノクローナル抗体である。本明細書中で用いる用語「抗体」に含まれるフラグメントおよび誘導体は、二重特異性抗体、単鎖二重特異性抗体、ダイアボディ、合成抗体、Fab、F(ab)2、FvもしくはscFvフラグメント、ならびにこれらの抗体のいずれかの化学的改変誘導体を包含する。本発明の抗体との関連で用いられる特異的結合とは、好ましくは、抗体が他のポリペプチドと交差反応しないことを意味する。例えば、B型プレキシンポリペプチド(例：プレキシン-B1)に特異的に結合するモノクローナル抗体はA、CまたはD型プレキシンポリペプチドに結合しない。特異的結合は、以下の実施例に示されるように、さまざまな周知の技術によって試験することができる。抗体またはそのフラグメントは、一般的に、例えばHarlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載の方法を用いることによって、取得することができる。モノクローナル抗体は、免疫した哺乳動物(好ましくは免疫したマウス)由来の脾細胞へのマウスミエローマ細胞の融合を含む技術によって調製することができる(Koehler 1975, Nature 256, 495, およびGalfre 1981, Meth Enzymol 73, 3)。好ましくは、B型プレキシン(さらに好ましくはヒトプレキシン-B1)の細胞外ドメイン、最も好ましくは配列番号2に示されるヒトプレキシン-B1のアミノ酸残基20-534、または長さが約5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400もしくは500アミノ酸残基であるその断片を含む免疫原性(ポリ)ペプチドが、以下の実施例に記載されるように哺乳動物に適用される。前記(ポリ)ペプチドは、好ましくは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの担体タンパク質にコンジュゲート化される。宿主種に応じて、免疫応答を高めるために種々のアジュバントを使用することができる。そうしたアジュバントとしては、好ましくは、フロイントアジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘ��シアニン、およびジニトロフェノールが包含される。B型プレキシンの細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体は、その後、周知のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる、抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに、前記重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ、2つまたは3つの相補性決定領域(CDR)を含む抗体またはそのフラグメントも本発明に包含される。上記の配列は、以下の実施例で特性評価されて使用されるマウスモノクローナル抗体#93に対応する。さらにまた、本発明は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる、抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに、前記重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ、2つまたは3つの相補性決定領域(CDR)を含む抗体も本発明に包含される。前記配列は、以下の実施例で特性評価されて使用されるマウスモノクローナル抗体#538に対応する。そこに示されるように、両マウスモノクローナル抗体#93および#538は、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインまたはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつB型プレキシンポリペプチドのErbB-2への結合を阻害する。
【００２０】
驚くべきことに、マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#93(本明細書中ではクローン番号93ともいう)は、ErbB-2とプレキシン-B1との相互作用を妨害するが、リガンドSema4Dの受容体プレキシン-B1への結合を阻害しない、ことが見出された。
【００２１】
さらに具体的には、マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(mAb)#93は、ヒトプレキシン-B1、すなわちセマフォリンドメインと1つのPSIドメインを含む配列番号2に示されるヒトプレキシン-B1のアミノ酸残基20-534に特異的に結合する。#93は、10μg/mlの濃度でウェスタンブロットおよびイムノブロットにおいて特異的結合を示し(強いシグナル；図11のカラム1参照)、そしてHEK細胞に過剰発現されたプレキシン-B1(図11のカラム2)およびMCF-7細胞内の天然プレキシン-B1(図11のカラム3)を沈殿させることができる。さらに、#93は、(リガンド)Sema4Dの(受容体)プレキシン-B1への結合を妨害することなく(図11のカラム9)、MCF-7、BT-474およびSK-OV-3細胞においてプレキシン-B1とErbB-2との相互作用をブロックする(図11のカラム4)。その上、#93は、プレキシン-B1/ErbB-2相互作用の阻害のため、RhoA活性、SK-OV-3細胞における基礎RhoA活性(図11のカラム5)とMCF-7細胞におけるSema4D依存的RhoA活性化(図11のカラム6)の両方をブロックする。対照的に、#93は、MCF-7細胞におけるSema4Dによる刺激後のプレキシン-B1を介したR-Ras不活性化に影響を与えない。#93はプレキシン-B1に特異的に結合し、他のプレキシンファミリーのメンバーへの交差反応を示さない(図11のカラム8および10)。最後に、#93は、プレキシン-B1/ErbB-2相互作用の阻害のため、SK-OV-3細胞とBT-474細胞の両方において、マトリゲル(Matrigel)浸潤アッセイでRho-A媒介基礎細胞浸潤をブロックする(図11のカラム11)。
【００２２】
マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(mAb)#538は、ウェスタンブロット/イムノブロットでヒトプレキシン-B1を認識できない(図11のカラム1)ことを唯一の例外として、#93と同様の特性を示す。#93のように、#538はプレキシン-B1とErbB-2の相互作用を阻害する。
【００２３】
マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#93および#538の詳細な特性評価は、以下の実施例により提供される。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、本明細書中で用いる用語「アンタゴニスト」は、B型プレキシンポリペプチドの細胞外ドメインに結合しかつ受容体B型プレキシンポリペプチドへのそれぞれのリガンドの結合を阻害またはブロックする能力がある化合物を指す。好ましくは、前記化合物は、リガンドSema4Dのヒトプレキシン-B1への結合を、例えば競合的結合によって、阻害またはブロックする。好ましくは、前記アンタゴニストは、抗体、アプタマー、ペプチド、およびポリペプチドからなる群より選択される。B型プレキシンの構造は本明細書の他の箇所に記載される。通常の結合試験により、当業者は、アンタゴニストがB型プレキシンの細胞外ドメインに結合するかどうかを判別することができる。また、本明細書の他の箇所に記載される機能試験によって、その化合物が各リガンドの受容体(すなわち、B型プレキシン)への結合をブロックまたは阻害するかどうかを判定することができる。B型プレキシンの細胞外ドメインに結合する抗体、アプタマー、ペプチド、およびポリペプチドの作製方法は当技術分野で周知である。
【００２５】
さらに具体的には、本発明は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる、抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに、前記重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ、2つまたは3つの相補性決定領域(CDR)を含む抗体も本発明に包含される。前記配列は、以下の実施例で特性評価されて使用されるマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#19に対応する。さらにまた、本発明は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号18に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる、抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに、前記重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ、2つまたは3つの相補性決定領域(CDR)を含む抗体も本発明に包含される。前記配列は、以下の実施例で特性評価されて使用されるマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#527に対応する。マウスモノクローナル抗体#19および#527は、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインまたはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつリガンドSema4Dのヒトプレキシン-B1への結合を阻害する。マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(mAb)#527は、#527がウェスタンブロットでヒトプレキシン-B1を認識できない(図11のカラム1)ことを唯一の例外として、#19と同様の結果を示す。図11および以下の実施例は、#19および#527の特有の性質を示しており、#19および#527は両方ともヒトプレキシン-B1の細胞外ドメイン、すなわちセマフォリンドメインと1つのPSIドメインを含む配列番号2に示されるヒトプレキシン-B1のアミノ酸残基20-534、に特異的に結合する。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、前記抗体はキメラ抗体である。
【００２７】
好ましくは、キメラ抗体は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。好ましくは、キメラ抗体は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。この種のキメラ抗体は、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインまたはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつB型プレキシンポリペプチドのErbB-2への結合を阻害する。
【００２８】
好ましくは、キメラ抗体は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。好ましくは、キメラ抗体は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号18に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。この種のキメラ抗体は、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインまたはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつリガンドSema4DのB型プレキシンポリペプチドへの結合を阻害する。
【００２９】
さらに、本明細書に記載される前記重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ、2つまたは3つの相補性決定領域(CDR)を含むキメラ抗体またはそのフラグメントは本発明に包含される。
【００３０】
一実施形態において、キメラ抗体はヒト抗体C(定常)領域をさらに含む。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、抗体はヒト化抗体である。
【００３２】
好ましくは、ヒト化抗体は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。好ましくは、ヒト化抗体は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。この種のヒト化抗体は、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインまたはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつB型プレキシンポリペプチドのErbB-2への結合を阻害する。
【００３３】
好ましくは、ヒト化抗体は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。好ましくは、ヒト化抗体は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および/または配列番号18に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含んでなる。この種のヒト化抗体は、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインまたはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつリガンドSema4DのB型プレキシンポリペプチドへの結合を阻害する。
【００３４】
一実施形態において、ヒト化抗体はヒト抗体FR(フレームワーク)領域および/またはヒト抗体C領域をさらに含む。
【００３５】
さらに、本明細書に記載される前記重鎖および/または軽鎖可変領域の1つ、2つまたは3つの相補性決定領域(CDR)を含むヒト化抗体またはそのフラグメントは本発明に包含される。
【００３６】
さらに別の実施形態において、前記抗体またはそのフラグメントは放射性同位体標識または蛍光標識で標識することができる。そうした放射性同位体標識としては、例えば90イットリウム(90Y)、125ヨウ素(125I)および111インジウム(111In)が挙げられる。蛍光標識としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、またはAlexa Fluorが挙げられる。
【００３７】
本発明に用いることができる抗体は、B型プレキシンポリペプチド、好ましくはヒトプレキシン-B1、さらに好ましくは細胞外ドメインまたはその断片に特異的に結合する。本発明の抗体(ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体)は、例えば、以下の方法で調製することができる。
【００３８】
まず、本発明において有用な抗体を作製するために抗原が準備される。B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドを免疫原性タンパク質として用いることができる。あるいは、B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドを発現する細胞を免疫原として用いることもできる。本発明で免疫原として用いられるB型プレキシンポリペプチドのアミノ酸配列および該タンパク質をコードするcDNA配列は、GenBankで公開されている。免疫原として用いるためのB型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドは、利用可能なアミノ酸配列情報を用いて、固相ペプチド合成法などの当技術分野で公知の手法に従って合成的に調製することができる。B型プレキシンポリペプチドの部分ペプチドには、限定するものではないが、ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインの一部に相当する、配列番号2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20-534を含むペプチドが含まれる；以下の実施例を参照されたい。
【００３９】
前記タンパク質もしくはその部分ペプチド、またはそれらを発現する細胞は、公知の遺伝子組換え手法に従って、B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするcDNAの配列情報を用いることによって調製することができる。そうした遺伝子組換え手法による前記タンパク質もしくはその部分ペプチドならびにそれらを発現する細胞の生産は、以下で説明する。
【００４０】
タンパク質生産用の組換えベクターは、上記のcDNA配列を適切なベクターに連結することによって得ることができる。形質転換体は、標的B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドを発現させることができるように宿主にタンパク質生産用の組換えベクターを導入することによって得ることができる。
【００４１】
ベクターとしては、宿主内で自律的に複製する能力があるファージまたはプラスミドが用いられる。プラスミドDNAの例には、pCAGGS、pET28、pGEX4T、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、および大腸菌(Escherichia coli)由来の他のプラスミドDNA；pUB110、pTP5、および枯草菌(Bacillus subtilis)由来の他のプラスミドDNA；ならびにYEp13、YEp24、YCp50および酵母由来の他のプラスミドDNAが含まれる。ファージDNAの例としては、λgt11およびλZAPなどのλファージがある。さらに、レトロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクターを用いることができ、また、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４２】
B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするDNAは、例えば次の方法によって、ベクターに挿入される。この方法では、精製したDNAを適切な制限酵素で切断し、適切なベクターDNAの制限酵素部位またはマルチクローニング部位に挿入することによって、ベクターに連結する。
【００４３】
プロモーターおよびB型プレキシンDNAに加えて、エンハンサーおよび他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合部位(RBS)、ならびに他のエレメントのいずれかを、必要に応じて、哺乳動物細胞において使用するためのタンパク質生産用の組換えベクターに連結することができる。
【００４４】
DNA断片をベクター断片に連結するために、公知のDNAリガーゼを用いることができる。DNA断片とベクター断片をアニールして連結させることにより、タンパク質生産用の組換えベクターが得られる。
【００４５】
形質転換に使用するための宿主は、B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドを宿主内で発現させることができる限り、特に限定されない。宿主の例としては、細菌、例えば大腸菌および枯草菌；酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)；動物細胞、例えばCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、および昆虫細胞が挙げられる。
【００４６】
例えば、細菌を宿主として用いる場合には、タンパク質生産用の組換えベクターは、好ましくは、宿主細菌内で自律的に複製可能であり、かつプロモーター、リボソーム結合部位、B型プレキシンDNA、および転写終結配列を含むべきである。前記組換えベクターはさらに、プロモーターを調節するための遺伝子を含むことができる。大腸菌の例としては大腸菌BRLがあり、バシラス属(Bacillus)の例は枯草菌である。大腸菌などの宿主内で発現させることができるプロモーターはどれも本発明で使用することができる。
【００４７】
組換えベクターは、当技術分野で公知の任意の方法によって宿主細菌内に導入することができる。そうした方法には、例えば、カルシウムイオンを用いる方法およびエレクトロポレーションが含まれる。酵母細胞、動物細胞、または昆虫細胞を宿主として用いる場合には、当技術分野で公知の方法に従って形質転換体を作製し、次いで該宿主(形質転換体)内でB型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドを産生させることができる。
【００４８】
本発明で免疫原として用いるためのB型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドは、上記のように作製された形質転換体の培養物から得ることができる。「培養物」は、培養上清、培養した細胞、培養した微生物、およびそれらのホモジネートのいずれかを指す。形質転換体は、宿主を培養する従来の方法によって培養培地中で培養される。
【００４９】
宿主として大腸菌、酵母または他の微生物を用いて得られた形質転換体を培養するための培養培地は、天然培地または合成培地のいずれであってもよいが、それは炭素源、窒素源、無機塩類、および微生物によって利用可能な他の成分を含み、かつ形質転換体が効率よく増殖できるようにする必要がある。
【００５０】
形質転換体は、一般的に、好気的条件下で攪拌しながら振とう培養または通気培養によって25〜37℃で3〜6時間培養される。培養中、pHは、例えば無機酸または有機酸、およびアルカリ性溶液で調整することによって、中性に近いレベルに保持する。培養中、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質を、必要であれば、組換え発現ベクターに挿入された選択マーカーに応じて培地に添加してもよい。
【００５１】
培養後、B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドが微生物または細胞内で産生される場合には、該微生物または細胞をホモジナイズすることによって該タンパク質またはその部分ペプチドを抽出する。B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドが微生物または細胞から分泌される場合には、培養培地をそのまま用いるか、微生物または細胞の破片を、例えば遠心分離によって、培養培地から除去する。その後、B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドを、タンパク質の単離・精製のための従来の生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを個別にまたは組み合わせて用いて、培養物から単離し、精製することができる。
【００５２】
B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドが得られたかどうかは、例えばSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、確認することができる。
【００５３】
次に、得られたB型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチド、あるいは形質転換体を、免疫原を調製するための緩衝液に溶解する。必要に応じて、効果的な免疫付与のために、そこにアジュバントを添加することができる。そうしたアジュバントとして、例えば、市販のフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントが挙げられる。これらのアジュバントは単独でまたは組み合わせて用いることができる。
【００５４】
そのように調製された免疫原はウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物に投与される。免疫化は主に静脈内、皮下、または腹腔内注射によって行われる。免疫化の間隔は特に限定されず、哺乳動物を数日から数週間の間隔で1〜3回免疫する。最後に免疫してから1〜7日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞の例としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、および末梢血細胞が挙げられる。
【００５５】
ハイブリドーマを得るには、抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、一般的に利用可能な樹立された細胞株を使用することができる。好ましくは、使用される細胞株は、非融合形態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した場合にのみ生き残ることができるような薬剤選択性および特性をもつべきである。可能性のあるミエローマ細胞としては、例えば、P3X63-Ag.8.U1 (P3U1)およびNS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００５６】
次に、ミエローマ細胞と抗体産生細胞を融合させる。融合のために、これらの細胞は、DMEMおよびRPMI-1640培地などの、血清を含まない動物細胞用の培養培地中で、好ましくは抗体産生細胞とミエローマ細胞の比を5：1として、混合し、ポリエチレングリコール(PEG)のような細胞融合促進剤の存在下で融合させる。細胞融合はまた、エレクトロポレーションを用いた市販の細胞融合装置を使って行うこともできる。
【００５７】
その後、上記の融合処理後の細胞からハイブリドーマを拾い上げる。例えば、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地で、適切に希釈し、次にマイクロタイタープレート上にまく。各ウェルに選択培地を添加し、選択培地を適切に交換しながら細胞を培養する。その結果、選択培地で培養を開始してから約30日後に生育している細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５８】
生育中のハイブリドーマの培養上清はその後、B型プレキシンポリペプチドまたはその部分ペプチドと反応する抗体の存在についてスクリーニングされる。ハイブリドーマのスクリーニングは、従来の方法に従って、例えば酵素結合免疫吸着法(ELISA)、酵素免疫測定法(EIA)またはラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて、行うことができる。融合細胞は、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立するために、限界希釈によってクローニングされる。
【００５９】
モノクローナル抗体は、例えば従来の細胞培養法によって、または腹水を生産することによって、樹立ハイブリドーマから採集することができる。必要であれば、抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせなどの公知の方法に従って、上記抗体採集方法で精製することができる。
【００６０】
本発明において有用なモノクローナル抗体のグロブリンタイプは、それらがB型プレキシンポリペプチドに特異的に結合する能力がある限り、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのいずれであってもよい。中でも、IgGが好適である。
【００６１】
本発明では、マウスモノクローナル抗体#19、#93、#527および#538が、以下の実施例に示されるように、樹立に成功して、好んで使用された。
【００６２】
本発明では、組換え型のモノクローナル抗体も使用することができ、それは、従来の遺伝子組換え技術に従って、ハイブリドーマ由来の抗体遺伝子をクローニングし、該抗体遺伝子を適切なベクターに組み込み、該ベクターを宿主に導入し、そして該宿主から抗体を産生させることによって得ることができる(例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192: 767-75を参照されたい)。
【００６３】
本発明では、人為的に改変した組換え抗体もまた、キメラ抗体およびヒト化抗体を含めて、使用することができる。これらの改変型抗体は当技術分野で記載された公知の方法により調製することができる(例えば、US 2009/0093002またはUS 2011/0206700を参照されたい)。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体(mAb)由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有するものである。
【００６４】
本発明によるキメラ抗体は、抗体V(可変)領域をコードするDNAを、ヒト抗体C(定常)領域をコードするDNAに連結し、その連結産物を発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを宿主に導入してキメラ抗体を産生させることにより、調製することができる。
【００６５】
ヒト化抗体は「再構成ヒト抗体」(reshaped human antibody)とも呼ばれ、この抗体では、非ヒト哺乳動物の抗体(例えば、本発明のマウスモノクローナル抗体)の相補性決定領域(CDR)がヒト抗体のものにグラフトされる。こうしたヒト化抗体を作製するための一般的な遺伝子組換え法もまた公知である(例えば、EP 125 023; WO 96/02576)。
【００６６】
具体的には、本発明のマウスモノクローナル抗体のCDRがフレームワーク領域(FR)を介して連結されたDNA配列を設計し、該CDRおよびFRの末端領域にオーバーラップする領域をもつように設計したいくつかのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、PCR法により該DNA配列を合成する。得られたDNAを、ヒト抗体C領域をコードするDNAに連結し、その連結産物を発現ベクターに組み込む。得られた組換え発現ベクターを宿主に導入し、それによってヒト化抗体を産生させる(例えば、WO 96/02576)。
【００６７】
CDRを介して連結されるFRは、CDRが機能的な抗原結合部位を形成することができるように選択される。必要であれば、抗体V領域のFRのアミノ酸(1個以上)は、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成することができるように置換されてもよい(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6)。
【００６８】
キメラ抗体は、非ヒト哺乳動物抗体由来のV領域とヒト抗体由来のC領域からなる。ヒト化抗体は、非ヒト哺乳動物抗体由来のCDRとヒト抗体由来のFRおよびC領域からなる。ヒト化抗体は、人体に対する該抗体の抗原性が低減されるので、臨床用途に有用であり得る。
【００６９】
本発明で用いられるキメラ抗体またはヒト化抗体の具体例は、CDRが本発明のマウスモノクローナル抗体に由来する抗体である。
【００７０】
本明細書中で用いる「アプタマー」とは、好ましくは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である(Ellington 1990, Nature 346 (6287): 818-22; Bock 1992, Nature 355 (6360): 564-6)。オリゴヌクレオチドアプタマーは、選別の反復ラウンド、いわゆる指数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX技法)、を通して設計される。ペプチドアプタマーは、細胞内のタンパク質相互作用を阻害するように設計される。それらは通常、タンパク質の骨格に両端で結合された可変ペプチドループからなる。この二重構造的な制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性をナノモル範囲に増加させる。前記可変ペプチドループの長さは、好ましくは、10〜20アミノ酸で構成され、そして該骨格は、改善された溶解性およびcompacity特性を有する任意のタンパク質、例えばチオレドキシンAであり得る。ペプチドアプタマーの選別は、例えば酵母ツーハイブリッド(two-hybrid)システムをはじめとする、さまざまなシステムを用いて行うことができる(例えば、Hoppe-Seyler 2000,. J Mol Med. 78 (8): 426-30を参照されたい)。
【００７１】
B型プレキシンの細胞外ドメインに結合するポリペプチドまたはペプチドは、好ましくは、リガンドもしくは他の結合タンパク質、B型プレキシン自体またはErbB-2に由来するペプチドおよびポリペプチドを包含する。さらに好ましくは、アンタゴニストとして用いられるポリペプチドは、本明細書の他の箇所に記載される本発明のポリペプチドである。
【００７２】
本明細書中で用いる用語「B型プレキシン」は、B型のプレキシン類、すなわちプレキシン-B1、プレキシンB2およびプレキシンB3を指す。一般的に、プレキシン類はセマフォリンに対する膜貫通型受容体のファミリーであり、発生中の神経系での軸索誘導との関連において最初に特徴づけられた(Tamagnone 1999, Cell 1999, 99:71-80)。プレキシン-B1、-B2および-B3はErbB-2と安定的に相互作用することが示された(Swiercz 2004, J Cell Biol 165:869-880)。この相互作用は、プレキシン-B1のセマフォリンリガンドによる低分子量GTPアーゼRhoAの活性化に、それゆえにシグナル伝達に、重要である。プレキシン-B1、B2およびB3のアミノ酸および核酸配列は当技術分野で記載されている。
【００７３】
プレキシン-B1は、セマフォリン受容体のプレキシンファミリー、Bサブファミリーの300kDaメンバーである。成熟ヒトプレキシン-B1は、2116アミノ酸(aa)のI型膜貫通(TM)糖タンパク質であって、1471aaの細胞外ドメイン(ECD)と612aaの細胞質領域を含む。ECDは1つのセマフォリン(Sema)ドメイン、3つのPSIドメイン、および3つのIPTリピートを含む。ECDは2つのサブユニット、200kDaのα鎖(aa 20-1305)と100kDaのTMβ鎖に切断される。これらのサブユニットは非ジスルフィド結合されており、高親和性の受容体をもたらす。プレキシン-B1はセマフォリン4D/CD100に対する受容体である。それはニューロピリン、MET、およびEGF-R2 (ErbB-2)と受容体複合体を形成する。多数のスプライス変異体が知られている。
【００７４】
好ましくは、本明細書でいうところのB型プレキシンは、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号1に示される核酸配列によってコードされるヒトプレキシン-B1である。さらに、この用語は前記B型プレキシン、特に上述したヒトプレキシン-B1、の変異体を包含する。そのような変異体は特定のB型プレキシンポリペプチドと少なくとも同じ本質的な生物学的・免疫学的特性を有する。変異体が本明細書に記載される同じ特異的アッセイで、例えばB型プレキシンポリペプチドを特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いたELISAアッセイで、検出可能である場合、それらは同じ本質的な生物学的・免疫学的特性を共有するものとみなされる。好ましいアッセイは以下の実施例に記載される。また、当然のことながら、本発明に従って言及される変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失および/または付加のために異なるアミノ酸配列を有するものとし、ここで、該変異体のアミノ酸配列はまだ、好ましくは、特定のB型プレキシンポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である。2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、当技術分野で周知のアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウ上の2つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定されるべきであり、その場合に比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の断片は、最適なアライメントのために、参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して付加または欠失(例えば、ギャップまたはオーバーハング)を含んでもよい。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を数えて、一致する位置の数を得ること、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割ること、その結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ること、によって算出される。好ましくは、配列同一性はアライメントされた配列の全長にわたって比較される。比較のための配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)の局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズム(Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)中のGAP、BESTFIT、BLAST、PASTAおよびTFASTA)のコンピュータによる実施により、または視覚的検査により行うことができる。比較のために2つの配列が同定されたならば、それらの最適なアライメント、従って同一性の程度、を決定するために、好ましくはGAPおよびBESTFITが採用される。好ましくは、gap weight: 5.00およびgap weight length: 0.30のデフォルト値が使用される。上記の変異体は対立遺伝子変異体または他のいずれかの種特異的ホモログ、パラログもしくはオルソログであってよい。また、本明細書でいうところの変異体には、特定のB型プレキシンポリペプチドまたは上述したタイプの変異体の断片が含まれるが、こうした断片は上で言及した本質的な免疫学的・生物学的特性をもつ必要がある。そのような断片は、例えば、B型プレキシンポリペプチドの分解産物またはスプライス変異体であり得る。さらに、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾が原因で異なる変異体も含まれる。
【００７５】
用語「ErbB-2」は「上皮成長因子受容体2」を指し、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。それはまた、CD340、HER2/neuまたはp185とも呼ばれている。ErbB-2の核酸およびアミノ酸配列は種々の生物について当技術分野でよく知られており、例えばBargmann 1986, Nature 319: 226-230に記載されている。本発明に従って言及されるB型プレキシンに加えて、ErbB-2はβ-カテニン、糖タンパク質130、PLCG1、Erbin、MUC1、Grb2、細胞質熱ショックタンパク質90kDaα、DLG4、PIK3R2、PICK1、β4-インテグリンおよびSHC1と相互作用することが報告されている。ErbB-2は細胞膜表面結合型受容体チロシンキナーゼであり、通常は細胞増殖および分化をもたらすシグナル伝達経路に関与している。それはオーファン受容体であると考えられ、EGFファミリーのリガンドのどれもそれを活性化することができない。しかし、ErbB受容体は、好ましくは、リガンド結合時にホモ-およびヘテロ二量体を形成する。ErbB-2受容体をコードするヒトHER2遺伝子は、ヒト17番染色体の長腕(17q21-q22)に位置する癌原遺伝子である。本明細書中で用いる用語「ErbB-2」は、好ましくは、ヒトErbB-2ならびにその変異体を指す。ヒトErbB-2の変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失および/または付加のために異なるアミノ酸配列を有するものとし、ここで、該変異体のアミノ酸配列はまだ、好ましくは、ヒトErbB-2ポリペプチドの(全)アミノ酸配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、かつ同じ生物学的および/または免疫学的特性をまだ有しており、特に、B型プレキシンと相互作用する能力がまだある。そのような同一性の程度を決定する方法は、B型プレキシンに関連して本明細書の他の箇所に記載される。
【００７６】
本明細書中で用いる用語「薬剤」は、一態様では、医薬活性化合物として上記のアンタゴニストを含有する医薬組成物を指し、ここで、医薬組成物は治療上有効な用量でさまざまな疾患や障害のヒトまたは非ヒト治療に使用可能なものである。アンタゴニストは、好ましくは、液体または凍結乾燥形態で存在することができる。薬剤は局所または全身投与用であることが好ましい。慣例的には、薬剤は経口的、静脈内、筋肉内または皮下に投与される。しかし、化合物の性質および作用様式に応じて、薬剤は他の経路で投与してもよい。アンタゴニストは該組成物の活性成分であり、好ましくは通常の剤形で投与されるが、こうした剤形は薬物を従来の手順に従って標準的な医薬担体と組み合わせることによって調製される。これらの手順は、目的の製剤にするために、必要に応じて諸成分の混合、造粒および圧縮、または溶解を含むことができる。当然、薬学的に許容される担体または希釈剤の形態と性質は、それと組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数によって決まる。担体は、製剤の他の成分と適合性がありかつそのレシピエントに有害でないという意味で、許容できるものでなければならない。使用される医薬担体には固体、ゲルまたは液体が含まれる。固形の担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液状担体の例は、リン酸緩衝生理食塩水、シロップ、油、水、エマルジョン、種々のタイプの湿潤剤などである。同様に、担体または希釈剤は、当技術分野でよく知られている時間遅延物質、例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを単独でまたはワックスと一緒に含むことができる。適切な担体は上述したものおよび当技術分野で周知のものを含み、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。希釈剤はその組合せの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらに、医薬組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。治療上有効な用量とは、本明細書で言及する疾患または症状に伴う症状を予防、改善、または治療する本発明の薬剤に用いられる化合物の量を指す。化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えばED50(集団の50％に治療上有効な用量)およびLD50(集団の50％に致死的な用量)により、決定することができる。治療効果と毒性効果の間の用量比は治療指数であり、それは比LD50/ED50として表すことができる。投薬計画は主治医および他の臨床的要因により決定される。医療分野でよく知られているように、いずれの患者の投与量も、例えば、患者の体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。進行状況は定期的な評価によってモニタリングすることができる。本明細書でいうところの薬剤は、本明細書に記載される疾患または症状を���療、改善または予防するために、少なくとも1回投与される。しかし、前記薬剤を2回以上投与してもよい。特定の薬剤は薬学分野において周知の方法で調製され、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合したまたは他の方法で組み合わせた、本明細書中で上述した少なくとも1つの活性化合物を含む。それらの特定の医薬組成物を調製するために、活性化合物(1種以上)は通常、担体または希釈剤と混合される。得られた製剤は投与様式に適合する必要がある。推奨投与量は、検討されるレシピエントに応じて用量の調整を予想するために、処方または取扱説明書中で表示されるものとする。本発明に係る薬剤は、本発明のさらなる態様では、本発明のアンタゴニストに加えて、その製剤化の過程で該薬剤に添加される薬物を含むことができる。そのような薬物の詳細は本明細書の他の箇所で見出される。最後に、薬剤の製剤化は、その薬剤の品質、医薬安全性、および有効性を確保するために、GMP標準条件または同様の条件下で行われる、ことを理解すべきである。
【００７７】
本発明のアンタゴニストの好ましい実施形態では、前記アンタゴニストは転移性癌を治療するための薬剤として使用される。
【００７８】
本明細書中で用いる用語「癌」は任意の悪性新生物を指す。悪性新生物は、被験者における損傷細胞の望ましくない増殖、浸潤、および特定の条件下での転移から生じる疾患である。癌を生じさせる細胞は遺伝的に損なわれており、通常は細胞分裂、細胞遊走挙動、分化状態および/または細胞死機構を制御する能力を失っている。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、白血病のような一部の造血癌は腫瘍を形成しない。本発明に係る癌は、本明細書の他の箇所に記載されるようにErbB-2ポリペプチドおよびB型プレキシンポリペプチドを発現する癌細胞を含むものとする。好ましくは、本明細書中で用いる癌は転移性癌であり、さらに好ましくは、前記転移性癌は乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮癌からなる群より選択される。さまざまな癌の症状および病期分類システムは当技術分野で周知であり、病理学の標準的教科書に記載されている。本明細書中で用いる癌は、任意の病期(ステージ)、グレード、形態的特徴、浸潤性、攻撃性または悪性度の癌、またはそれに罹患した組織もしくは器官を包含する。
【００７９】
本発明に従って言及される被験者は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを包含する。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、臨床的に明らかな症状を考慮して癌に罹患していることが疑われる被験者、または潜在的素因の増加のために癌に罹患することが疑われる被験者に適用される。
【００８０】
本発明のアンタゴニストの好ましい実施形態では、前記アンタゴニストは、細胞毒性である、癌細胞の細胞増殖もしくは分化を阻害する、癌細胞のアポトーシスを誘導する、および/または腫瘍の血管新生を防止する化合物と組み合わせて、前記薬剤中で使用されるべきである。好ましくは、前記化合物は以下からなる群より選択される：トラスツズマブ、ベバシズマブ、タモキシフェン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン、Ara-C(シタラビン)、CCNU(クロロエチルシクロヘキシルニトロソウレア)、ヒドロキシウレア、アドリアマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン。
【００８１】
したがって、本発明はまた、転移性癌に罹患した被験者に、上述したアンタゴニストを治療上有効な量で投与するステップを含む、転移性癌に罹患した被験者において転移性癌を治療するための方法を企図する。好ましくは、アンタゴニストは先に挙げた薬物のいずれかと組み合わせて投与される。
【００８２】
当技術分野で記載された以前の研究では、転移促進性の受容体型チロシンキナーゼErbB-2は全乳癌の約30％において過剰発現されることが見出されている。しかしながら、癌細胞の浸潤および転移を推進するErbB-2の下流のシグナル伝達事象は、完全には解明されていない。ここで、本発明者らは、ErbB-2の過剰発現がセマフォリン受容体プレキシン-B1の活性化につながることを示す。プレキシン-B1は、転移促進性の低分子量GTPアーゼRhoAおよびRhoCのErbB-2依存的活性化に必要とされ、かつヒト乳癌細胞の浸潤挙動を促進した。ErbB-2を過剰発現する乳癌のマウスモデルでは、プレキシン-B1をコードする遺伝子の除去（ablation）が転移の発生を強く低減し、ErbB-2を過剰発現する乳癌を有するヒト患者では、低レベルのプレキシン-B1発現が良好な予後と有意に相関した。したがって、プレキシン-B1は、ErbB-2陽性癌、特にErbB-2陽性乳癌における新たな治療標的を表している。本発明の基礎となる知見のおかげで、癌、特に乳癌の転移を防止することが可能である。また、癌細胞上に存在するB型プレキシンの量に基づいて、転移能力を評価することができ、かつ予後を確立することができる。
【００８３】
上記した用語の説明および定義は、必要な変更を加えて、以下の実施形態に適用する。
【００８４】
本発明はまた、被験者のサンプル中の癌の転移能力を診断するためのB型プレキシンまたはB型プレキシンに特異的に結合する抗体の使用に言及する。
【００８５】
B型プレキシン、好ましくはヒトプレキシン-B1の量は、転移性癌(すなわち、転移する能力がある癌)に罹患していることが疑われる被験者のサンプルにおいて、当技術分野で周知の技法により測定することができる。サンプルの性質に応じて、その量は、ポリペプチドの量を定量化するためのELISAベースの技術により、または組織生検サンプルの免疫組織化学における特異的に結合した抗体の量の定量化により、測定することができる。さらに、B型プレキシンの量は、B型プレキシン遺伝子の転写産物の量を検出することを目的とした手段によって、本発明の使用に従って測定することもできる。そうした技術は、ノーザンブロットまたはPCRベースの測定技術などのハイブリダイゼーション技術を包含する。
【００８６】
本発明の上記使用によれば、当然のことながら、被験者のサンプルにおいて測定されたB型プレキシンの量は、被験者が転移性癌に罹患しているか否かを示す参照量と比較されるべきである。適切な参照量は、転移性癌に罹患していることが知られている被験者から誘導することができる。そのような場合、試験サンプル中の参照量と同一であるかまたは参照量に対して増加している試験サンプル中の測定されたB型プレキシンの量は、被験者が転移性癌に罹患していることの指標となる。参照量に対して減少している試験量は、非転移性癌の指標となる。あるいは、適切な参照量は、転移性癌に罹患していないことが知られている被験者から誘導することができる。そのような場合、試験サンプル中の参照量と同一であるかまたは参照量に対して減少している試験サンプル中の測定されたB型プレキシンの量は、被験者が非転移性癌を有することの指標となる一方で、増加した量は被験者が転移性癌に罹患していることの指標となる。
【００８７】
したがって、本発明はまた、被験者の癌が転移能力をもつかどうかを診断するための方法を企図しており、この方法は、(a)転移性癌に罹患していることが疑われる被験者のサンプルにおいて、B型プレキシン、好ましくはヒトプレキシン-B1の量を測定し、その測定量を参照量(それによって、癌が転移能力をもつか否かが診断される)と比較するステップを含んでなる。被験者のサンプル中のB型プレキシンの量を測定するために、例えば、本発明のモノクローナル抗体を使用することができる。
【００８８】
本発明は、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストを同定するための方法を企図しており、この方法は、次のステップ：
a) B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストであると予想される化合物を、B型プレキシンおよびErbB-2を含む細胞と、B型プレキシンとErbB-2との相互作用の防止を可能にする条件下で、接触させるステップ；および
b) 該化合物がB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止する能力があるかどうかを判定し、それによって、該相互作用が防止された場合には、該化合物をB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止するアンタゴニストとして同定するステップ；
を含んでなる。
【００８９】
本明細書中で用いる用語「接触させる」とは、アンタゴニストであると予想される化合物を、B型プレキシンおよびErbB-2を含む細胞と、物理的に接触させることを指す。該化合物は、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止することができるように、該化合物と該細胞内のその標的との相互作用を可能にするのに十分な時間および条件下で接触させるべきである。適切な条件および適切な時間は、アンタゴニストの化学的性質に応じて当業者が選択することができる。相互作用を例えばB型プレキシンに結合することによって直接防止するアンタゴニストは、細胞内でのB型プレキシン遺伝子の転写またはその転写産物の翻訳の阻害を介して間接的に作用するアンタゴニストより、かなり早く相互作用を防止することができることが理解されよう。
【００９０】
前記化合物がB型プレキシンとErbB-2との相互作用を防止する能力があるかどうかを判定するステップは、B型プレキシンとErbB-2との結合時の応答として細胞内で生理学的に発生する適切な読み出し(readout)を測定することによって行うことができる。適切な読み出しは本明細書の他の箇所に記載され、例えば、以下の実施例に記載されるようなB型プレキシンのチロシンリン酸化またはRhoAおよび/もしくはC活性を測定することを包含する。好ましくは、相互作用はまた、細胞の移動および/または浸潤特性を測定することによって判定される。アンタゴニストを同定するために、アンタゴニストであると予想される化合物に接触させた細胞の読み出しは、該化合物に接触させていない細胞と比較されるべきである。相互作用の防止は測定された読み出しの減少によって確認することができる。
【００９１】
当然のことながら、本発明の上記方法では、B型プレキシンとErbB-2との相互作用を刺激するように細胞を処理することが好ましい。その相互作用は好ましくはセマフォリンで刺激することができる。あるいはまた、相互作用は、細胞内でErbB-2を過剰発現させることによって、またはErbB-2の構成的に活性な変異タンパク質を発現させることによって、刺激してもよい。詳細は以下の実施例に記載される。
【００９２】
アンタゴニストを同定するための本発明の方法で使用できる化合物は、本明細書の他の箇所で潜在的アンタゴニストと呼ばれるものであり、特に、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスRNA、モルフォリノオリゴヌクレオチド、リボザイム、三重らせん形成剤、抗体、アプタマー、ペプチドおよびポリペプチド、または小分子である。
【００９３】
同様に、本発明は、B型プレキシンとそのリガンドとの相互作用、例えばプレキシン-B1とSema4Dとの相互作用を防止するアンタゴニストを同定するための方法を企図する。
【００９４】
また、本発明には、機能的な細胞内ドメインを欠くB型プレキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００９５】
機能的な細胞内ドメインを欠くB型プレキシンは、B型プレキシンの細胞内ドメインの1個以上のアミノ酸の欠失を導入することによって、または細胞内ドメインの1個以上のアミノ酸を変異させることによって、作製することができる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされる適切なB型プレキシン変異タンパク質は、アンタゴニスト活性について本発明の方法により試験することができる。B型プレキシンの構造は本明細書の他の箇所に記載される。最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸、すなわち、配列番号2に示されるヒトプレキシンのアミノ酸1512-2135に対応するアミノ酸、を欠くプレキシン-B1をコードする。
【００９６】
本明細書中で用いる用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖DNA分子ならびにRNA分子を指す。前記用語には、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNAならびにそのような分子種のすべての天然に存在するまたは人工的に改変された誘導体が包含される。ポリヌクレオチドは、ある態様では、直鎖状または環状の分子であってよい。また、上記B型プレキシン変異体ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、5'-または3'-UTR配列のような適切な転写および/または翻訳に必要な追加の配列を含むことができる。
【００９７】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。
【００９８】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクター、ならびに細菌または酵母人工染色体などの人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、ゲノムDNAへのターゲッティング構築物のランダムまたは部位特異的組込みを可能にするターゲッティング構築物に関する。そのようなターゲット構築物は、好ましくは、以下で詳細に説明されるような相同組換えまたは異種組換えに十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、一態様では、宿主内での増殖および/または選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野で周知のさまざまな技術によって宿主細胞に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物もしくは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物に、または荷電した脂質との複合体に、またはフラーレンなどの炭素ベースのクラスターに導入することができる。あるいはまた、プラスミドベクターは、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術によって導入することもできる。ベクターがウイルスである場合、それは宿主細胞に適用する前に適切なパッケージング細胞株を用いてin vitroでパッケージングされてもよい。レトロウイルスベクターは複製可能または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、補完する宿主/細胞内でのみ起こるだろう。さらに、本発明の一態様では、ポリヌクレオチドは、原核もしくは真核宿主細胞またはベクター中のその分離された画分中での発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。ポリヌクレオチドの発現は、該ポリヌクレオチドの翻訳可能なmRNAへの転写を含む。宿主細胞内での発現を確実にする調節エレメントは当技術分野で周知である。一態様において、それらは転写の開始を確実にする調節配列および/または転写の終結と転写産物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサーを含みうる。原核宿主細胞内での発現を可能にすると予想される調節エレメントには、例えば、大腸菌におけるlac-、trp-またはtac-プロモーターが含まれ、そして真核宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1-もしくはGAL1-プロモーター、または哺乳動物および他の動物細胞におけるCMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサーまたはグロビンイントロンである。また、誘導性の発現制御配列は、本発明に包含される発現ベクター中で使用することができる。そのような誘導性ベクターは、tetもしくはlacオペレーター配列または熱ショックや他の環境要因によって誘導される配列を含んでもよい。適切な発現制御配列は当技術分野で周知である。転写の開始に関与するエレメントのほかに、そのような調節エレメントはまた、SV40ポリA部位またはtkポリA部位などの転写終結シグナルを、該ポリヌクレオチドの下流に含むことができる。これに関連して、適切な発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1 (Pharmacia社)、pBluescript (Stratagene社)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen社)もしくはpSPORT1 (Invitrogen社)またはバキュロウイルス由来のベクターである。好ましくは、前記ベクターは���現ベクターおよび遺伝子導入ベクターまたはターゲッティングベクターである。例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターは、標的細胞集団への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために使用することができる。組換えウイルスベクターを構築するために、当業者によく知られた方法を用いることができる；例えば、Sambrook, “Molecular Cloning A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載される技術を参照されたい。
【００９９】
本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む宿主細胞を意図している。
【０１００】
本明細書中で用いる用語「宿主細胞」は、原核および真核宿主細胞を包含する。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞、動物宿主細胞または真菌宿主細胞である。好ましくは、前記細菌宿主細胞は大腸菌宿主細胞である。動物宿主細胞は好ましくは、タンパク質の生産に適した動物細胞株の細胞、または酵母宿主細胞などの真菌宿主細胞である。
【０１０１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
【０１０２】
そのようなポリペプチドは、本明細書の他の箇所で詳細に説明されるように、本発明に係るアンタゴニストとして使用することができる。
【０１０３】
本明細書中で引用したすべての参考文献は、それらの全開示内容および本明細書に具体的に記載された開示内容に関して、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
実施例
以下の実施例は単に本発明を説明するものである。それらは、何であれ、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【実施例１】
【０１０５】
方法
1.1 抗体
次の抗体を使用した：ウサギポリクローナル抗切断型カスパーゼ3(Cell Signaling社)、ウサギポリクローナル抗CD31(Abcam社)、マウスモノクローナル抗ErbB-2(クローンE2-4001、Invitrogen社)、ウサギポリクローナル抗ホスホErbB-2[Y1248] (Cell Signaling社)、ウサギポリクローナル抗ホスホErbB-2[Y1248] (Sigma-Aldrich社)、ラットモノクローナル抗Mac-3(クローンM3/84、BD Pharmingen社)、ヤギポリクローナル抗プレキシン-B1(R&D systems社)、マウスモノクローナル抗プレキシン-B1(クローン439512、R&D Systems社)、ウサギモノクローナル抗RhoA(クローン67B9、Cell Signaling社)、ウサギポリクローナル抗RhoB(Cell Signaling社)、ウサギモノクローナル抗RhoC(クローンD40E4、Cell Signaling社)、マウスモノクローナル抗αチューブリン(Sigma社)、ヤギポリクローナル抗VSV(Thermo社)、マウスモノクローナル抗ホスホチロシン(クローン4G10、Upstate Biotechnology社)、マウスモノクローナル抗FLAG(クローンM2、Sigma社)、ウサギポリクローナル抗MYC(Sigma社)、マウスモノクローナル抗HA(クローンHA-7、Sigma社)、トラスツズマブ(Genentech社)。
【０１０６】
1.2 プラスミド
ErbB-2、FLAG-PDZ-RhoGEF、MYC-RhoA、HA-R-RasおよびRnd1のヒトcDNAを保持する真核生物発現プラスミドは以前(18)に記載された。ヒトVSV-プレキシン-B1は親切にもL. Tamagnone (Torino大学, Torino, イタリア)によって提供された。HA-RhoBおよびHA-RhoCはD. Brandt (Marburg大学, Marburg, ドイツ)から得られた。ヒトErbB-2 V664Eは親切にもAxel Ullrich (マックス・プランク生化学研究所, Martinsried, ドイツ)によって提供された。配列番号2のアミノ酸1514-2135を欠くヒトVSV-プレキシン-B1ΔC (PlxB1ΔC)はPCRにより生成して、pcDNA3にクローニングした。
【０１０７】
1.3 RNA抽出およびRT-PCR
RNA抽出はRNeasyキット(Qiagen社)を用いてメーカーの説明書に従って行った。RT-PCRは標準試薬およびプロトコル(Fermentas社)を用いて行った。ヒト組織におけるmRNA発現を分析するために次のプライマーを使用した：プレキシン-B1 (plxnb1): 5'-CAGCCACCACTTCGTGAGTGCC-3'(センス)(配列番号6)および5'-GGTGACTGCCACAGCTGTTAGCTG-3'(アンチセンス)(配列番号5)；β-アクチン: 5'-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3'(センス)(配列番号7)および5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'(アンチセンス)(配列番号8)。マウス組織におけるmRNA発現を分析するために次のプライマーを使用した：プレキシン-B1 (plxnb1): 5'-GGTGGAAAGGTACTATGCAGACATCAG-3'(センス)(配列番号9)および5'-CCTCCTCCAGGGCAGTGATGATC-3'(アンチセンス)(配列番号10)；β-アクチン: 5'-GGTGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'(センス)(配列番号11)および5'-GAGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3'(アンチセンス)(配列番号12)。すべてのプライマーはイントロンスパニング(intron-spanning)であった。
【０１０８】
1.4 低分子干渉RNA
プレキシン-B1発現をノックダウンするために用いたsiRNAの配列は、ACCACGGUCACCCGGAUUC(配列番号3)であった(IBA社, Goettingen, ドイツ)。対照siRNAおよびErbB-2に対するsiRNAはQiagen社から購入した。
【０１０９】
1.5 細胞培養およびトランスフェクション
MCF-7およびBT-474細胞は、ドイツ微生物・細胞培養コレクション(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures: DSMZ, Braunschweig, ドイツ)から入手した。T-47DおよびSK-BR-3は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Manassas, USA)から入手した。SK-OV-3細胞はセルラインサービス(CLS, ドイツ)から入手した。すべての細胞株はそれぞれDSMZ、ATCCおよびCLSのプロトコルに従って培養した。BT-474細胞は、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)をメーカーの説明書に従って用いて、低分子干渉RNA(siRNA)でトランスフェクトした。タンパク質相互作用試験およびRhoプルダウンアッセイは、siRNAトランスフェクションの48時間後に実施した。HEK 293細胞は、リン酸カルシウム法を用いてcDNAプラスミドでトランスフェクトした。
【０１１０】
1.6 レトロウイルス感染
siRNA非感受性プレキシン-B1を得るために、野生型および変異型(Y1708F/Y1732F)プレキシン-B1をコードするcDNAのコード領域の位置3855(C→T)および3858(G→A)にサイレント変異を導入した。得られた配列をレトロウイルスベクターpLNCX2 (Clontech社)にサブクローニングした。選択およびレトロウイルストランスフェクションは以前(18)に記載されたとおりに実施した。
【０１１１】
1.7 レンチウイルス感染
プレキシン-B1の安定したノックダウンを有するBT-474細胞を作製するために、本発明者らは、Mission shRNAシステム(Sigma-Aldrich社)をメーカーの説明書に従って使用した。簡単に述べると、細胞にshRNAおよびピューロマイシン耐性をコードするレンチウイルスを感染させた。選択後、ノックダウンの成功をウェスタンブロット法により確認した。
【０１１２】
1.8 ウェスタンブロットおよび免疫沈降
ウェスタンブロット法は標準的な実験プロトコルに従って実施した。免疫沈降は氷冷した放射性免疫沈降緩衝液(150mM NaCl, 50mM Tris pH7.4, 5mM EDTA pH8.0, 1％トリトンX-100, 0.1％SDS, 0.5％デオキシコール酸ナトリウム, プロテアーゼ阻害剤および2mM Na3VO4)中で行った。
【０１１３】
1.9 組換えペプチドおよびタンパク質の産生ならびに精製
組換えヒト可溶性Sema4D (Q92854に示されるアミノ酸配列の残基1-657)は、以前(18)に記載されたとおりにチャイニーズハムスター卵巣細胞から精製した。N末端にHisタグを付加した組換えペプチド(ヒトプレキシン-B1(配列番号2)のアミノ酸35-150を含む)は、大腸菌内で発現させ、ニッケルアガロース(GenScript社, USA)を用いた金属イオンアフィニティクロマトグラフィーで精製した。このペプチドは、ヤギを免疫して本研究で用いる抗プレキシン-B1抗体を引き出すための、R&D Systems社(USA)により採用されたペプチドに対応する。ヒトプレキシン-B1の細胞外ドメインを生成するために、最初に、配列番号2に示されるヒトプレキシン-B1のアミノ酸残基20から1491までの完全な細胞外ドメイン(ECD)を使用しようとした。しかし、この組換えタンパク質は可溶性形態で産生可能でなかった。それゆえ、ヒトプレキシン-B1のECDの以下のトランケート型組換え体の組換え生産性および溶解性を試験して、次の結果を得た：
a) 配列番号2のアミノ酸残基20-1298 (セマフォリンドメイン、3つのPSIドメイン、および3つのIPTリピートを含む)：可溶性でない；
b) 配列番号2のアミノ酸残基20-1160 (セマフォリンドメイン、3つのPSIドメイン、および1つのIPTリピートを含む)：可溶性でない；
c) 配列番号2のアミノ酸残基20-1068 (セマフォリンドメインおよび3つのPSIドメインを含む)：可溶性でない；
d) 配列番号2のアミノ酸残基20-678 (セマフォリンドメインおよび2つのPSIドメインを含む)：生産性良好、溶解性不良；
e) 配列番号2のアミノ酸残基20-543 (セマフォリンドメインおよび1つのPSIドメインを含む)：生産性良好、溶解性良好；
f) 配列番号2のアミノ酸残基20-473 (セマフォリンドメインのみを含む)：生産性良好、溶解性不良。
【０１１４】
したがって、ヒトプレキシン-B1(配列番号2)のアミノ酸20-534をコードするcDNA配列をpSecTag2Hygro(A)ベクターにクローニングした。このドメインは、トランスフェクトされたHEK293細胞の上清から、コバルトアガロース(Thermo社)を用いた金属イオンアフィニティクロマトグラフィーと、これに続くSuperdex 200 10/300 GLカラム(Amersham社)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。
【０１１５】
1.10 抗プレキシン-B1抗体の生産
ヒトプレキシン-B1の精製された細胞外ドメイン(配列番号2のアミノ酸20-534；実施例1.9参照)に対するモノクローナル抗体は、Koehler and Milstein (47)に記載の方法に従ってマウスにおいて生起させた。全部で1236のハイブリドーマ上清をELISAによって試験した。163のハイブリドーマ上清が、陽性シグナル、すなわち免疫に使用した組換えタンパク質への結合、を示した。これらの上清を次の能力に関してさらに試験した：ウェスタンブロットで組換えヒトプレキシン-B1タンパク質を認識する能力、Sema4Dリガンドの天然ヒトプレキシン-B1(受容体)への結合を阻害する能力、プレキシン-B1の下流エフェクターであるRhoAのSema4D誘導活性化を阻害する能力、およびプレキシン-B1を発現する細胞に結合する能力。これらのハイブリドーマ上清のうち4つ、すなわち#93、#538、#19および#527は、図11に詳しく示されるように、前記試験の1以上で陽性であった。抗体はハイブリドーマの上清からプロテインA/Gセファロースアフィニティカラムで精製した。
【０１１６】
マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#93(またはクローン#93)は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含む。マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#538は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含む。これらのマウスモノクローナル抗体は両方とも、ヒトプレキシン-B1(配列番号2)の細胞外ドメインのアミノ酸20-534、またはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、ヒトプレキシン-B1のErbB-2への結合を阻害する。予期せざることに、マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#93は、ErbB-2とプレキシン-B1との相互作用を妨害するが、リガンドSema4Dの受容体プレキシン-B1への結合を阻害しないことが見出された。
【０１１７】
マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#19は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含む。マウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体#527は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含むH(重)鎖V(可変)領域および配列番号18に示されるアミノ酸配列を含むL(軽)鎖V(可変)領域を含む。これらのマウスモノクローナル抗体は、ヒトプレキシン-B1(配列番号2)の細胞外ドメインのアミノ酸20-534、またはその部分ペプチドもしくは断片に結合し、かつリガンドSema4Dのヒトプレキシン-B1への結合を阻害する。
【０１１８】
1.11 活性化されたRhoおよびRasの測定
活性化された細胞性RhoA、RhoB、RhoCおよびR-Rasの量は、以前(18)に記載されたように、GSTと、ロテキン(Rhotekin)のRho結合ドメイン(GST-RBD)またはRaf1のRas結合ドメイン(GST-Raf1)とからなる融合タンパク質を用いた沈降によって測定した。すべてのRhoプルダウン実験は、0.5％FBSを含有する培地中で一晩飢餓させた後に実施した。細胞は、細胞溶解に先立って、Sema4Dと20分間、プレキシン-B1の組換え細胞外部分もしくはトラスツズマブと45分間、またはマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(抗PlxB1; クローン#93, 1.8ng/μl)と60分間、インキュベートした。
【０１１９】
1.12 増殖、遊走および浸潤アッセイ
増殖アッセイのために、細胞を24ウェルプレートに播種し、siRNAでトランスフェクトした。次に、細胞を5日間連続してNeubauerチャンバーを用いてカウントした(データ点あたり3ウェル)。並行して、siRNAノックダウン効率をウェスタンブロット法によりモニタリングした。遊走アッセイのために、対照shRNAまたはプレキシン-B1に対するshRNAを安定的に発現する5x104個のBT-474細胞を一晩血清飢餓させ、24ウェルプレートでThinCertフィルターインセット(孔径8.0μm)(Greiner bio-one社)上に播種し、そして20％血清に対して遊走させた。24時間後、フィルターの上面の非遊走細胞を綿棒で取り除き、遊走細胞をトルイジンブルーで染色してカウントした。浸潤アッセイのために、細胞をsiRNAトランスフェクションの24時間後に血清飢餓させた。siRNAトランスフェクションの48時間後、1x105個のBT-474細胞を増殖因子低減Matrigel浸潤チャンバー(Growth Factor Reduced Matrigel Invasion Chamber)(孔径8.0μm)(BD Biosciences社)に播種した。BT-474細胞は20％血清に対して48時間浸潤させた。フィルターの上面の非浸潤細胞を綿棒で取り除いた後、浸潤細胞をトルイジンブルーで染色してカウントした。siRNAノックダウン効率はウェスタンブロット法によりルーチンに評価した。SK-OV-3細胞を用いた浸潤アッセイでは、2.5x104個の血清飢餓細胞を10％血清に対して16時間浸潤させた。
【０１２０】
1.13 SREレポーター遺伝子アッセイ
リン酸カルシウム法を用いて、HEK293細胞は、プレキシン-B1およびPDZ-RhoGEFをコードするプラスミドと共に、3DA.Luc(三元複合体因子の結合部位を欠く変異型血清応答エレメント(SRE.L)の制御下でホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミド(48))でトランスフェクトした。トランスフェクションの36時間後、細胞を血清飢餓状態で12時間培養し、OneGloキット(Promega社)をメーカーの説明書に従って用いてホタルルシフェラーゼの活性を測定した。得られた値は、CellTiter Fluoキット(Promega社)により測定された細胞数に対して正規化した。
【０１２１】
1.14 Sema4D結合アッセイ
MCF-7細胞をマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)の非存在下または存在下で処理した。1時間後、細胞をPBSで洗浄し、myc-Sema4Dと共に30分間インキュベートした。未結合のSema4DをPBSで洗浄して除去し、結合したSema4DはHRPコンジュゲート化抗myc抗体を用いて検出した。HRP活性は、OPD発色性基質(Dako社)を用いてメーカーのプロトコルに従って測定した。
【０１２２】
1.15 遺伝子改変マウス
MMTVneuマウス(5)をJackson Laboratory(ストック番号002376)から購入した。プレキシン-B1ノックアウトマウス(plxnb1-/-)は以前(31)に記載されたとおりに作出した。plxnb1+/- x MMTVneu；plxnb1+/-交配からの雌動物は、本研究の全期間にわたり未受精のまま維持した。本発明者らは、マウスの腫瘍を触診によって毎週モニタリングした。触知可能な腫瘍が最初に出現してから8.5週間後にマウスを犠牲にした。腫瘍を摘出して秤量した。4％PFA中での一晩(4℃)の固定およびエタノール中での脱水後に、肺の写真を撮った。次いで、肺を組織学のためにさらに処理し、ミクロトーム上で薄片(切片厚5μm)にした。切片をH&Eで染色し、転移の存在について分析した。分析した切片間の距離は50μmであった。
【０１２３】
1.16 組織学および免疫組織化学
MMTVneu原発腫瘍の悪性度はH&E染色切片で評点した。分析した腫瘍ごとに、1、2または3のサブスコアを次のパラメータのそれぞれに割り当てた：腺腔形成度(1＝75％超、2＝10〜75％、3＝10％以下)、核異型度(1＝均一、2＝形状および大きさが中等度に変化、3＝著しい変化)、および分裂像数(1＝0〜9/10hpf、2＝10〜19/10hpf、3＝20以上/10hpf)。サブスコアを加算して合計スコアを得た。3〜5の合計スコアは悪性度1に相当し、6〜7の合計スコアは悪性度2に相当し、そして8〜9の合計スコアは悪性度3に相当する。原発マウス腫瘍の局所浸潤性は、周囲の結合組織へのそれらの浸潤に基づいてH&E染色切片で評価した。各腫瘍は「低」または「高」浸潤性であると判定され、ここで「低」浸潤性は周囲の組織への単一細胞浸潤を示さない腫瘍として定義され、そして「高」浸潤性は周囲の組織への単一細胞浸潤を伴う腫瘍として定義される。免疫組織化学は、標準試薬およびプロトコル(Vector Laboratories社)を用いてパラフィン包埋切片で実施した。ホスホErbB-2スコアは、明確に確立されたErbB-2スコアと同様に分析した：スコア0は外周膜に有意な染色がないことを表し、一方スコア1+、2+および3+はホスホErbB-2[Y1248]の陽性の外周膜染色に対応する(1+：腫瘍細胞の1％以上に弱い染色または10％未満に中等度の染色；2+：腫瘍細胞の10％以上に中等度の染色または30％未満に強い染色；3+：30％を超える腫瘍細胞に強い染色)。ヤギポリクローナル抗プレキシン-B1抗体(R&D Systems社)の特異性を試験するために、組織スライドに適用する前に、該抗体を免疫に用いるペプチドと共に質量比1：5で室温にて1時間プレインキュベートした。
【０１２４】
1.17 血管新生、マクロファージ浸潤およびアポトーシスの分析
血管新生の分析のために、腫瘍切片をCD31について染色して画像化した(腫瘍あたりランダムに選択された3視野、倍率100x)。定量化は、記載(49)されたとおりにコンピュータ支援デジタル画像解析により行った。マクロファージは腫瘍切片で抗Mac-3抗体により染色し、マクロファージ数を腫瘍あたりランダムに選択された3視野(倍率200x)でコンピュータ支援デジタル画像解析によりカウントした。アポトーシスの分析のために、切片を切断型カスパーゼ3について染色し、陽性細胞を腫瘍あたりランダムに選択された10視野(倍率400x)でカウントした。
【０１２５】
1.18 患者
凍結したおよびパラフィン包埋した乳癌組織は、国立腫瘍疾病センター(National Centre for Tumor Diseases: NCT, Heidelberg, ドイツ)の組織バンクによって提供された(図10)。ErbB-2スコアは、抗ErbB-2抗体(Dako社、クローンA0485)を用いた免疫組織化学法によって決定した。ErbB-2スコア0は染色なしを表す一方で、ErbB-2スコア1+、2+および3+はErbB-2の陽性染色に対応する(1+：腫瘍細胞の10％に弱い染色；2+：腫瘍細胞の10〜30％に中等度の染色；3+：腫瘍細胞の30％超に強い染色)。
【０１２６】
1.19 マイクロアレイ解析
ヒト乳癌患者の次のデータセットは、遺伝子発現オムニバス(GEO)レポジトリhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/からダウンロードした：GSE1456, GSE2034, GSE3494, GSE4922, GSE5327, GSE7390, GSE11121, GSE12093。すべてのデータセットはプラットフォームHG-U133a CELファイルに対してフィルター処理した。バッチ全体は1548アレイで構成され、Affymetrixパワーツール(正規化法RMA)で前処理した。HG-U133Aアノテーションファイルはhttp://www.affymetrix.comからダウンロードした。ERBB-2プローブセットID 216836_s_atを用いて、アレイをErbB-2過剰発現腫瘍とErbB-2非過剰発現腫瘍とにグループ分けした。本発明者らは、200アレイをErbB-2過剰発現腫瘍として、1348アレイをErbB-2非過剰発現腫瘍として同定した。以前の研究では、ErbB-2 mRNA発現レベルは免疫組織化学法で測定されたタンパク質発現レベルに相関することが示された(50)。ErbB-2過剰発現を有するアレイのグループ内で、2つのサブグループがプレキシン-B1発現レベル(プローブセット215807_s_at)に基づいて特定された：一方のサブグループは最低のプレキシン-B1発現を有する60アレイを含み、他方のサブグループは最高のプレキシン-B1発現を有する60アレイを含んでいた。低プレキシン-B1発現を有する60アレイは利用可能な22の臨床データセットにマッピングされ、高プレキシン-B1発現を有する60アレイは利用可能な39の臨床データセットにマッピングされた。同様に、ErbB-2過剰発現を有しないアレイのグループ内で、2つのサブグループがプレキシン-B1発現レベルに基づいて特定された：一方のサブグループは最低のプレキシン-B1発現を有する100アレイを含み、他方のサブグループは最高のプレキシン-B1発現を有する100アレイを含んでいた。低プレキシン-B1発現を有する100アレイは利用可能な19の臨床データセットにマッピングされ、高プレキシン-B1発現を有する100アレイは利用可能な62の臨床データセットにマッピングされた。異なるアレイは異なる臨床エンドポイントを与えたので、本発明者らは、RFS(無再発生存率)、DMFS(無遠隔転移生存率)およびDFS(無病生存率)を組み合わせて、1つの統一された臨床エンドポイント（無病生存率）とした。生存期間(年数)および生存イベントデータを用いて、本発明者らは生存解析を行った。本発明者らは両グループにおいて十分なイベントを有していたので、自由度1のカイ二乗分布をもつと仮定した。R関数(Survおよびsurvfit)を用いてカプラン・マイヤー曲線をプロットすることによって、本発明者らは、さまざまな生存ラインを実証することができた。これらのラインは互いに交差しなかったので、本発明者らは、イベント発生率がCoxモデルに比例すると仮定した。したがって、本発明者らは、生存曲線を比較するためにログランク検定(これらの知見によってWilcoxonより高いパワー)を選んだ。ログランク検定はR survdiff関数で実行した。全生存率の解析のために、本発明者らは上述したものと同じアレイグループ(ErbB-2過剰発現、最低プレキシン-B1発現を有する60アレイ、最高プレキシン-B1発現を有する60アレイ)を採用し、これらのグループをGEOデータセットからの利用可能な疾患特異的生存率(DSS)データにマッピングした。本発明者らは、低プレキシン-B1発現を有するグループの7アレイおよび高プレキシン-B1発現を有するグループの13アレイをDSS値にマッピングすることができた。カプラン・マイヤー曲線���上述したようにR関数でプロットした。ErbB-2過剰発現を有する200アレイのグループ内では、エストロゲン受容体(ER)の状態に関するデータは77アレイで入手できた。これらのうち、29アレイはER陰性であり(28は臨床転帰データがある)、48アレイはER陽性であった(31は臨床転帰データがある)。利用可能な臨床転帰データがあるアレイをプレキシン-B1の発現について分類し、上述したようにカプラン・マイヤー曲線をR関数でプロットした。
【０１２７】
1.20 統計解析
統計的有意性は両側t検定(図2E、図2F、図2H、図2K、図2L、図3B、図3F、図3G、図6B〜D、図7C)、フィッシャーの正確確率検定(図3D)およびログランク検定(図3A、図4D、図4E、図9A〜C)により評価した。0.05未満のp値を有意と見なした。*は有意水準＜0.05を示し、**は有意水準＜0.01を示し、***は有意水準＜0.001を示す。
【０１２８】
1.21 研究の承認
本研究における動物の管理と使用のすべての処置は、動物実験倫理委員会(local animal ethics committee)(Regierungspraesidium, Karlsruhe, ドイツ)により承認された。凍結およびパラフィン包埋乳癌組織は、国立腫瘍疾病センター(NCT, Heidelberg, ドイツ)の組織バンクから、該組織バンクの規制およびHeidelberg大学の倫理委員会の承認に従って、提供された。患者は組織の使用に対してインフォームドコンセントを与えた。
【実施例２】
【０１２９】
結果
2.1 ErbB-2の過剰発現はプレキシン-B1およびRho GTPアーゼの活性化をもたらす。
ErbB-2の過剰発現がプレキシン-B1をリン酸化して活性化するのに十分であるかどうかを試験するために、本発明者らは、HEK293細胞において野生型または構成的に活性なErbB-2を過剰発現させた。これは、プレキシン-B1のチロシンリン酸化(図1A)ならびにRhoA(図1B)およびRhoC(図1D)の活性化をもたらしたが、RhoB(図1C)の活性化はプレキシン-B1リガンドに関係なく生じなかった。細胞内ドメインを欠くプレキシン-B1変異体の発現はRhoAおよびRhoCの活性化をブロックし、このことは、プレキシン-B1シグナル伝達がErbB-2の下流でのRhoAおよびRhoC活性化に確かに必要であることを示している(図1B、図5)。プレキシン-B1は、Rhoシグナル伝達を媒介するその能力に加えて、R-RasのためのGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)であることが示された(29)。R-RasGAP活性がErbB-2によるプレキシン-B1リン酸化とは無関係であることを示した以前の研究(18)と一致して、野生型または構成的に活性なErbB-2の過剰発現はプレキシン-B1のR-RasGAP活性に影響を及ぼさなかった(図1E)。これらのデータは、ErbB-2の過剰発現が結果的にプレキシン-B1およびRhoシグナル伝達の活性化につながることを示している。
【０１３０】
2.2 ヒト乳癌細胞では、ErbB-2はプレキシン-B1およびRhoA/RhoCを介して浸潤性を促進する。
癌細胞におけるErbB-2/プレキシン-B1シグナル伝達の役割を調べるために、本発明者らは、プレキシン-B1およびRhoA活性に関して数種類のヒト乳癌細胞株を比較した。基礎プレキシン-B1リン酸化およびRhoA活性はErbB-2を過剰発現する癌細胞株においてのみ検出可能であったが、このことは、この経路が高レベルのErbB-2発現を有する乳癌細胞において活発であるが、低レベルのErbB-2発現を有する乳癌細胞では活発でないという概念に一致する(図2A)。これに合致して、BT-474細胞(高レベルのErbB-2を内因的に発現する)でのErbB-2のノックダウンは、プレキシン-B1チロシンリン酸化およびRhoA/RhoC活性の著しい減少をもたらした(図2B)。ErbB-2過剰発現BT-474細胞におけるプレキシン-B1発現の低下はErbB-2チロシンリン酸化に影響を及ぼさなかったが、それはRhoAおよびRhoC活性の強い阻害をもたらした(図2Cおよび2D)。活性RhoBは、その腫瘍抑制機能について知られているが(30)、BT-474細胞では検出されなかった(データは示さず)。したがって、プレキシン-B1はErbB-2過剰発現をRhoAおよびRhoCの活性化に結び付けている。RhoAおよびRhoCの浸潤促進(pro-invasive)細胞効果を踏まえて、本発明者らは、ErbB-2が、プレキシン-B1のリン酸化および活性化を介したRhoAとRhoCの活性化によって、腫瘍細胞の浸潤を促進するかどうかを試験した。プレキシン-B1のノックダウンはErbB-2過剰発現BT-474細胞の増殖に影響を与えなかった(図2E)が、それらの遊走能と浸潤能を強く低減させた(図2F、図6Bおよび6C)。ErbB-2によるプレキシン-B1リン酸化が癌細胞の浸潤性にとって必要であるかを試験するために、本発明者らは、野生型プレキシン-B1のsiRNA耐性バージョンと、ErbB-2によりリン酸化されないプレキシン-B1(Y1708F/1732F)変異体のsiRNA耐性バージョンを発現させた(18)。内因性プレキシン-B1のsiRNA媒介ノックダウンの後で、リン酸化部位欠損プレキシン-B1を発現する細胞は、活性RhoA/RhoCのレベルが著しく低下し、かつ野生型プレキシン-B1を発現する細胞より浸潤が劇的に少なかった(図2Gおよび2H)。癌細胞浸潤におけるそれらの確立された役割に一致して、RhoAまたはRhoCのノックダウンはBT-474細胞の浸潤能を弱めた(図6D)。
【０１３１】
乳癌細胞におけるErbB-2/プレキシン-B1受容体複合体の重要性をさらに分析するために、本発明者らはマウスモノクローナル抗プレキシン-B1抗体を誘起させ、かつプレキシン-B1の細胞外ドメイン(PlxB1ext)を精製した。PlxB1extならびに特定の抗プレキシン-B1抗体(クローン#93)は両方とも、ErbB-2とプレキシン-B1との相互作用を効率的に阻害した(図6E〜H)。BT-474細胞における抗プレキシン-B1抗体による、またはPlxB1extによる、ErbB-2とプレキシン-B1のアンカップリング(uncoupling)は、プレキシン-B1のチロシンリン酸化を強く低減させ(図6Eおよび6H)、RhoAおよびRhoC活性を抑制し(図2Iおよび2J、図6F)、そして腫瘍細胞の浸潤を減弱させた(図2Kおよび2L)。ErbB-2とプレキシン-B1との相互作用に影響を及ぼさない治療用抗ErbB-2抗体トラスツズマブ(データは示さず)は、PlxB1extと同程度に腫瘍細胞浸潤を阻害し(図2L)、そして腫瘍細胞浸潤に対するPlxB1extとトラスツズマブの阻害効果は相加的であった(図2L)。ErbB-2過剰発現卵巣癌細胞株SK-OV-3では、抗プレキシン-B1抗体#93によるErbB-2とプレキシン-B1のアンカップリングは、プレキシン-B1のチロシンリン酸化、RhoAおよびRhoC活性、ならびに腫瘍細胞の浸潤を阻害した(図7)。まとめると、これらのデータは、ErbB-2を過剰発現する乳癌および卵巣癌細胞のin vitroでの浸潤能にとってプレキシン-B1が必要であることを示している。
【０１３２】
2.3 ErbB-2過剰発現乳癌のマウスでは、プレキシン-B1遺伝子の除去は転移を減少させる。
プレキシン-B1がin vivoでもErbB-2依存性転移を媒介するかどうかを試験するために、本発明者らは、乳腺に野生型ErbB-2を過剰発現して転移性乳癌を発症するトランスジェニックMMTVneuマウスを使用した(5)。MMTVneuマウスの原発腫瘍と同様に、肺転移腫瘍もプレキシン-B1を発現した(図8A)。MMTVneuマウスは、プレキシン-B1欠損マウスと交配させたが、このプレキシン-B1欠損マウスは生存力および繁殖力があり、正常な乳の分泌を示し、明白な欠陥を何も持ち合わせていない(31,32)。本発明者らは、プレキシン-B1が無腫瘍生存率または原発腫瘍の大きさに影響を及ぼさないことを見出した(図3Aおよび3B、図8Bおよび8C)。原発腫瘍の組織学的検査は、血管新生または免疫細胞浸潤に対するプレキシン-B1除去の影響を何も明らかにしなかった(図8D〜G)。プレキシン-B1はErbB-2の下流でシグナル伝達するという概念に一致して、プレキシン-B1発現の低下は癌細胞のErbB-2チロシンリン酸化に影響を与えなかった(図8Hおよび8I)。原発腫瘍の悪性度はグループ間で同様であった(図8Jおよび8K)が、プレキシン-B1欠損腫瘍は局所浸潤性が減少する傾向を示した(図8Lおよび8M)。肺の検査は肉眼で見える転移の著しい減少を明らかにした(図3Cおよび3D)。組織学的分析では、肺内転移数の強い減少が確認された(図3E〜3G)。これらの結果から、プレキシン-B1は腫瘍形成または腫瘍増殖に影響を及ぼさないが、in vivoでのErbB-2依存性乳癌の転移には必要であることが示される。
【０１３３】
2.4 プレキシン-B1はヒトErbB-2過剰発現乳癌において活性化され、その発現は予後と相関する。
ErbB-2/プレキシン-B1シグナル伝達がヒト乳癌においても何らかの役割を果たしているかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒト乳癌組織でのプレキシン-B1の発現を研究した(図10Aおよび10B)。プレキシン-B1のmRNAおよびタンパク質は、ErbB-2スコアとは無関係に、分析したすべての乳癌組織で検出可能であった(図4Aおよび4B)。ErbB-2過剰発現乳癌の患者からのサンプル(図10C)では、本発明者らは、プレキシン-B1がチロシンリン酸化されていることを見出したが、ErbB-2陰性乳癌ではプレキシン-B1のチロシンリン酸化を検出することができなかった(図4C)。このことから、ErbB-2はヒト乳癌組織においてもプレキシン-B1をリン酸化して活性化することが示された。
【０１３４】
ヒト乳癌組織のマイクロアレイデータセットでは、プレキシン-B1およびErbB-2の発現レベル間に相関が見られなかった(データは示さず)。ErbB-2陰性乳癌の患者のうち、プレキシン-B1の低い発現レベルは、高いプレキシン-B1発現レベルと比較して、より短い無病生存期間の傾向を示し(図9A)、それによって以前の研究(33)が裏付けられた。著しく対照的に、ErbB-2過剰発現乳癌患者の間では、プレキシン-B1の低い発現レベルが、高いプレキシン-B1発現レベルと比較して、より長い無病生存期間と有意に相関していた(図4D)。全生存率に関するデータは少数の患者についてしか入手できなかった；しかし、低プレキシン-B1発現の患者では、より高い全生存率への統計的に非有意な傾向が認められた(図4E)。エストロゲン受容体の状態によって分類されたErbB-2陽性乳癌のサブセットでは、プレキシン-B1の発現レベルは予後と有意に相関していなかった(図9B〜C)。
【実施例３】
【０１３５】
要約
転移促進性の受容体型チロシンキナーゼであるErbB-2は、全乳癌の約30％において過剰に発現される。癌細胞の浸潤および転移を推進するErbB-2の下流のシグナル伝達事象は、いまだに明らかでない。ここで、本発明者らは、ErbB-2の過剰発現がセマフォリン受容体プレキシン-B1の活性化につながることを示す。プレキシン-B1は、転移促進性の低分子量GTPアーゼRhoAおよびRhoCのErbB-2依存的活性化に必要とされ、ヒト乳癌細胞の浸潤挙動を促進した。ErbB-2過剰発現乳癌のマウスモデルでは、プレキシン-B1をコードする遺伝子の除去が転移の発生を強く抑制し、また、ErbB-2過剰発現乳癌のヒト患者では、低レベルのプレキシン-B1発現が良好な予後と有意に相関していた。したがって、プレキシン-B1は、ErbB-2陽性癌、特にErbB-2陽性乳癌における新たな治療標的を表している。
【実施例４】
【０１３６】
考察
局所的増殖よりもむしろ転移が乳癌における主要な予後因子であることを考えれば、転移の根底にある分子機構の解明は非常に重要である。Rho GTPアーゼは細胞遊走の重要な調節因子であり、Rhoシグナル伝達は癌細胞の浸潤および転移を促進する(23-28)。プレキシン-B1がErbB-2と相互作用し、さらにRhoGEFタンパク質とも相互作用してRhoAを調節することができるという事実は、本発明者らに、プレキシン-B1がErbB-2の下流で作用してErbB-2過剰発現をRho GTPアーゼの活性化に結び付けることができるかどうかを試験するように促した。ErbB-2を過剰発現するヒト乳癌細胞では、プレキシン-B1はチロシンリン酸化されたが、このプレキシン-B1のチロシンリン酸化ならびにRhoA/RhoC活性はErbB-2のsiRNA媒介ノックダウンによってブロックされた。プレキシン-B1発現のノックダウンはErbB-2チロシンリン酸化に影響を及ぼさなかったものの、それはRhoAおよびRhoC活性だけでなく癌細胞の浸潤をも抑制した。内因性プレキシン-B1タンパク質をプレキシン-B1の変異型(ErbB-2によりリン酸化されるチロシン残基を欠く)で置き換えると、やはりRhoA/RhoC活性および癌細胞の浸潤能が強く低下した。さらに、抗プレキシン-B1抗体またはプレキシン-B1の組換え細胞外ドメイン(PlxB1ext)によるErbB-2とプレキシン-B1との相互作用の妨害は、RhoA/RhoC活性および癌細胞浸潤を低減させた。これらのin vitro知見に基づいて、本発明者らは、ErbB-2の過剰発現がプレキシン-B1のリン酸化および活性化をもたらすという結論に達する。これは、RhoGEF11/12タンパク質(20-22)およびRhoA/RhoCの活性化ならびに癌細胞浸潤の増加につながる(図4F)。
【０１３７】
in vitroでの癌細胞株と同様に、本発明者らは、プレキシン-B1がErbB-2を過剰発現するヒト乳癌組織においてもチロシンリン酸化されることを見出した。ErbB-2陽性乳癌のマウスでは、プレキシン-B1の欠如が転移を大幅に低減させ、また、ErbB-2陽性乳癌のヒトでは、プレキシン-B1発現の低レベルが良好な予後と相関していた。興味深いことに、in vitroでのプレキシン-B1のノックダウンならびにin vivoでのプレキシン-B1のノックアウトはどちらも、ErbB-2過剰発現癌細胞の増殖に影響を与えなかった。マウスでの原発腫瘍の組織学的分析は、血管新生または免疫細胞浸潤に関して、プレキシン-B1ノックアウト動物と対照動物の間になんら差異がないことを明らかにした。これは、異種移植癌モデルでの以前の知見に沿っており(34)、かつ腫瘍微小環境の細胞におけるプレキシン-B1の主要な役割と相反する。in vitroでの知見に一致して、プレキシン-B1除去はErbB-2チロシンリン酸化に影響を及ぼさず、それによってErbB-2はプレキシン-B1の上流にあることが示された。興味深いことに、プレキシン-B1欠損原発腫瘍は局所浸潤の減少傾向を示し、このことは、こうした動物におけるより低い転移率を少なくとも部分的に説明することができる。したがって、本発明者らは、プレキシン-B1は乳癌においてErbB-2依存的な癌細胞浸潤および転移の重要な下流メディエーターであるという結論に達する。最近、プレキシン-B1は卵巣癌でも発現されており、プレキシン-B1のノックダウンはErbB-2過剰発現卵巣癌細胞株SK-OV-3の浸潤性を強く抑制するが、増殖は不変のままであることが示された(35)。これに一致して、本発明者らのデータは、これらの細胞においてErbB-2とプレキシン-B1との相互作用の抗プレキシン-B1抗体による阻害がRhoA/RhoC活性および癌細胞浸潤を強く低減させることを示す。したがって、プレキシン-B1の転移を促進する役割はErbB-2陽性乳癌に限られず、他のErbB-2過剰発現癌にも及ぶと考えられる。
【０１３８】
プレキシン-B1発現レベルと癌進行との相関に関して相反するデータが報告されている。いくつかの研究は、黒色腫と腎癌でのプレキシン-B1発現のダウンレギュレーションならびに乳癌での低いプレキシン-B1発現レベルと予後不良との相関を示している(33,36-37)一方で、他の研究は、正常対照組織と比較したときの癌組織でのより高いプレキシン-B1発現レベルを見出している(35,38)。マイクロアレイ解析において、本発明者らは、ErbB-2の発現に従ってデータを層別化した。ErbB-2陰性乳癌の患者では、本発明者らは、プレキシン-B1が低レベルで発現するときに、予後が悪化する傾向を観察した(図9A)。著しく対照的に、ErbB-2陽性乳癌の患者からのデータを解析した際に、プレキシン-B1発現の低レベルが良好な予後と有意に相関していた。以前には、プレキシン-B1の活性化は、異なる補助受容体(co-receptor)への結合次第で、遊走抑制効果と遊走促進効果の両方を誘発し得る、ことが示された(17,39-40)。こうして、プレキシン-B1の機能は状況依存的(context-dependent)であり、そしてある種の癌においてシグナル伝達パートナーの特定のセットと共発現される場合、プレキシン-B1は異なる影響を及ぼし得ると考えられる(41)。
【０１３９】
ErbB-2過剰発現乳癌の患者のために、抗ErbB-2抗体トラスツズマブは癌の再発と転移のリスクを軽減するために承認されたものである。化学療法と併用したまたは化学療法後のトラスツズマブ治療は有意な臨床的有益性を示した(42)。しかし、トラスツズマブは、全生存率を上げることがまだ不十分であり、しばしば耐性を起こしやすく、心臓副作用のリスクを負っている(42-44)。このことは、ErbB-2過剰発現乳癌の治療のための新規治療標的を同定することの必要性を課すものである。本出願のデータは、プレキシン-B1の阻害が癌細胞の浸潤性を低減させることを明らかに示している。in vitro条件下で、本発明者らは、抗プレキシン-B1抗体またはプレキシン-B1の組換え細胞外ドメイン(PlxB1ext)によるErbB-2/プレキシン-B1相互作用の遮断がRho活性および癌細胞の浸潤性を抑制することを示すことができた。対照的に、治療用抗ErbB-2抗体トラスツズマブは、ErbB-2依存的プレキシン-B1調節に直接干渉することはなかった。これに一致して、in vitroでの乳癌細胞の浸潤に対するトラスツズマブおよびPlxB1extの阻害効果は相加的であった。これらのデータは、従来の抗ErbB-2治療と比較して、ErbB-2の下流のプレキシン-B1シグナル伝達のさらなる阻害が該治療の有効性を高める可能性があることを示している。
【０１４０】
トラスツズマブの主な副作用は、心筋細胞におけるErbB-2機能の阻害による心筋症である(42-43)。同様の作用は、拡張型心筋症を発症する、ErbB-2遺伝子の心筋細胞特異的欠失を有するマウスに見られる(45-46)。対照的に、プレキシン-B1欠損マウスは、プレキシン-B1機能の喪失が生理的条件下で明らかに補償されるため、明白な表現型をもたない(31-32)。これは、プレキシン-B1媒介シグナル伝達の妨害に基づいた治療の副作用が少ない傾向にあることを示唆している。
【０１４１】
要約すると、本出願のデータは、プレキシン-B1がErbB-2過剰発現をRhoシグナル伝達および腫瘍細胞浸潤に結び付けている(カップリングしている)こと、そしてプレキシン-B1がErbB-2過剰発現乳癌の転移に中心的に関与していることを示している。したがって、ErbB-2/プレキシン-B1相互作用またはプレキシン-B1媒介シグナル伝達の阻害は、ErbB-2過剰発現乳癌患者における転移のリスクを減らすことができ、それゆえに有望な新しい治療原理を表すことができる。
【０１４２】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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