(57)【要約】  本願は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、該細胞をＭＵＣ１＊アクチベータの存在下で培養することを含む、方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、該細胞をＭＵＣ１＊アクチベータの存在下で培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がヒト幹細胞又はヒト前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が胚起源であるか、又はより幹様となるように誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が胚盤胞由来のヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＵＣ１＊アクチベータが二量体分子又は二価分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＵＣ１＊アクチベータがＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＵＣ１＊アクチベータが二価の抗体又は抗体変異体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がヒトフィーダー細胞又はその分泌物の存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記フィーダー細胞が線維芽細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィーダー細胞ががん細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィーダー細胞が成長的に不活性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ナイーブ幹細胞をナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、ＭＵＣ１＊アクチベータの存在下で該細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１５】
ヒト幹細胞株を樹立する方法であって、胚盤胞から細胞を採取することと、該細胞をＮＭ２３又は二量体ＮＭ２３の存在下で培養することとを含む、方法。
【請求項１６】
ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する、又はナイーブ幹細胞をナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、誘導元の細胞又はナイーブ幹細胞状態を有する細胞を、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に付着させることを含む、方法。
【請求項１７】
前記表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面は、１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とを含み、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％であり、前記表面では、接触角が１４．３度〜１８．８度である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面がＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ナイーブ細胞マーカーの発現が増大した細胞を選択する方法であって、ナイーブ細胞マーカーの発現が増大した細胞を含有すると思われる細胞の集団を、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に曝すことと、選択された細胞を該表面の存在下で培養することとを含む、方法。
【請求項２１】
前記表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記表面は、１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とを含み、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％であり、前記表面では、接触角が１４．３度〜１８．８度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記表面がＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記表面が、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質を更に含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞表面分子がＭＵＣ１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞表面分子がＭＵＣ１＊である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞表面分子がＰＳＭＧＦＲ配列から本質的になる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用物質が抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記作用物質がＰＳＭＧＦＲに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体が以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する、請求項２９に記載の方法：
ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）；ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）；及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）。
【請求項３１】
前記モノクローナル抗体が以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する、請求項２９に記載の方法：
ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）；ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）；及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【請求項３２】
前記作用物質がＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１又はＣＤ３４に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記作用物質がＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の非存在下で行う、請求項１６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記表面上にプレーティングする前に、前記細胞をトリプシン処理して単一細胞にすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を低密度で前記表面上にプレーティングすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を、規定構造１ｃｍ２当たり約１×１０３個の細胞〜規定構造１ｃｍ２当たり１×１０４個の細胞という密度でプレーティングする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞を規定構造１ｃｍ２当たり約５２６３個の細胞でプレーティングする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞を低容量の培地で前記表面上にプレーティングすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記培地の容量が前記表面を被覆するだけのものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記培地の容量が規定構造１ｃｍ２当たり０．１ｍＬ〜０．２ｍＬである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞をＥＤＴＡの存在下で前記表面上にプレーティングすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記プレーティングした細胞を、力を加えることで前記表面に密着させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記力が遠心力である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体。
【請求項４６】
前記表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である、請求項４５に記載の物体。
【請求項４７】
前記表面がＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面である、請求項４５に記載の物体。
【請求項４８】
前記細胞表面分子がＭＵＣ１である、請求項４５に記載の物体。
【請求項４９】
前記細胞表面分子がＭＵＣ１＊である、請求項４８に記載の物体。
【請求項５０】
前記細胞表面分子がＰＳＭＧＦＲ配列から本質的になる、請求項４９に記載の物体。
【請求項５１】
前記作用物質が抗体である、請求項４５に記載の物体。
【請求項５２】
前記作用物質がＰＳＭＧＦＲに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項５１に記載の物体。
【請求項５３】
前記モノクローナル抗体が以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する、請求項５２に記載の物体：
ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）；ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）；及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）。
【請求項５４】
前記モノクローナル抗体が以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する、請求項５２に記載の物体：
ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）；ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）；及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【請求項５５】
前記作用物質がＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１又はＣＤ３４に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項５１に記載の物体。
【請求項５６】
前記作用物質がＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価である、請求項４５に記載の物体。
【請求項５７】
ナイーブ幹細胞状態又はプライム幹細胞状態の特性を示すマイクロＲＮＡシグネチャを同定する方法であって、
（ｉ）ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をＮＭ２３の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
（ｉｉ）前記細胞をＭＵＣ１＊抗体で被覆した幹細胞増殖表面に付着させるとともに、該細胞を成長させることと、
（ｉｉｉ）前記細胞を採取するとともに、工程（ｉｉ）の幹細胞で発現するマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｉｖ）ｂＦＧＦベース培地中のヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をネズミフィーダー細胞の層上で別に培養することと、
（ｖ）前記細胞を採取するとともに、工程（ｉｖ）の細胞で発現するマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）で同定されたマイクロＲＮＡと、工程（ｖ）で同定されたマイクロＲＮＡとを比較することと、
（ｖｉｉ）工程（ｉｉｉ）では存在しているか、又は発現が増大しており、工程（ｖ）では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することにより、ナイーブ細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖ）では存在しており、工程（ｉｉｉ）では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することにより、プライム細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
を含む、方法。
【請求項５８】
前記幹細胞増殖表面がＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ナイーブ幹細胞状態又はプライム幹細胞状態の特性を示すマイクロＲＮＡシグネチャを同定する方法であって、
（ｉ）ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の第１のセット及び第２のセットを、ＮＭ２３の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
（ｉｉ）前記細胞をＭＵＣ１＊抗体で被覆した第１の幹細胞増殖表面に付着させることと、
（ｉｉｉ）細胞の前記第１のセットにおいてマイクロＲＮＡのレベルを測定することと、
（ｉｖ）同一の細胞の前記第２のセットの細胞を採取するとともに、細胞の該第２のセットを第２の幹細胞増殖表面上にプレーティングすることと、
（ｖ）前記第２の幹細胞増殖表面上で一定期間成長させることと、
（ｖｉ）細胞の前記第２のセットにおいてマイクロＲＮＡのレベルを測定することと、
（ｖｉｉ）細胞の前記第１のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の前記第２のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することを含む、ナイーブ幹細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｖｉｉｉ）細胞の前記第２のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の前記第１のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することにより、プライム幹細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
を含む、方法。
【請求項６０】
前記第１の幹細胞増殖表面がＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面であり、前記第２の幹細胞増殖表面がビトロネクチンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、ナイーブ状態の特性を示すマイクロＲＮＡを細胞に導入することを含む、方法。
【請求項６２】
患者においてがんを治療又は予防する方法であって、該患者に、細胞がナイーブ状態からより分化した状態へと移行すると上方調節されるタンパク質又は核酸を投与することを含む、方法。
【請求項６３】
前記核酸がマイクロＲＮＡである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
細胞のより分化した状態がプライム状態である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
幹細胞増殖表面上で幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、
（ａ）前記幹細胞又は前記前駆細胞のサンプルを得ることと、
（ｂ）前記幹細胞又は前記前駆細胞を前記表面に接触させることと、
（ｃ）前記幹細胞又は前記前駆細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する第１の作用物質を含む培地中で培養することと、
を含む、方法。
【請求項６６】
表面に結合するように幹細胞又は前駆細胞を適応させる方法であって、
（ａ）前記幹細胞又は前記前駆細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する第１の作用物質を含む培地中で予めインキュベートすることと、
（ｂ）前記幹細胞又は前記前駆細胞を前記表面に接触させることと、
を含む、方法。
【請求項６７】
前記表面がＭＵＣ１＊を二量体化する第２の作用物質を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ａ）の後でかつ工程（ｂ）の前に、
（ａ）（ｉ）前記ＭＵＣ１＊を二量体化する第１の作用物質を含む培地中でのインキュベートの後に、前記幹細胞又は前記前駆細胞をペレット状にする工程と、
（ａ）（ｉｉ）前記第１の作用物質を含まない培地中で前記幹細胞又は前記前駆細胞を再懸濁する工程と、
（ａ）（ｉｉｉ）前記幹細胞又は前記前駆細胞を前記表面上にプレーティングする工程と、
（ａ）（ｉｖ）４８時間にわたって放置する工程と、
を更に含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に結合するように幹細胞を適応させる方法であって、該細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を含む培地中で予めインキュベートした後、該幹細胞を該表面へと導入することを含む、方法。
【請求項７０】
前記表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
（ｉ）前記幹細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を含む培地中でインキュベートすることと、
（ｉｉ）他の細胞と付着させる前に、前記幹細胞に、該細胞を前記表面に接触させる力を加えることと、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記作用物質を含まない培地中で再懸濁することと、
（ｉｖ）前記表面上にプレーティングすることと、
（ｖ）４８時間にわたって放置することと、
（ｖｉ）ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を添加することと、
を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記表面がＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記力が遠心力、圧力、又は真空である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
（ｉ）フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体と、
（ｉｉ）ＮＭ２３とともに最小培地を含む幹細胞成長培地と、
備えるキット。
【請求項７５】
前記表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記表面がＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７７】
前記細胞表面分子がＭＵＣ１である、請求項７５に記載のキット。
【請求項７８】
前記細胞表面分子がＭＵＣ１＊である、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記細胞表面分子がＰＳＭＧＦＲ配列から本質的になる、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記作用物質が抗体である、請求項７５に記載のキット。
【請求項８１】
前記作用物質がＰＳＭＧＦＲに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８２】
前記モノクローナル抗体が以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する、請求項８１に記載のキット：
ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）；ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）；及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）。
【請求項８３】
前記モノクローナル抗体が以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する、請求項８１に記載のキット：
ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）；ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）；及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【請求項８４】
前記作用物質がＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１又はＣＤ３４に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項８０に記載のキット。
【請求項８５】
前記作用物質がＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価である、請求項７５に記載のキット。
【請求項８６】
前記抗体がヒト化している、請求項８１に記載のキット。
【請求項８７】
前記最小培地が異種成分を含まない、請求項７５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
従来、ヒト幹細胞は、線維芽細胞フィーダー細胞が幹細胞の成長を増大させるとともに幹細胞の自然分化を阻害する未知の因子を分泌することから、フィーダー細胞層上で成長させてきた。最近になって、幹細胞の成長を可能にする規定表面（defined surfaces）を開発する目的から、マトリゲルが、ｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞由来の馴化培地（細胞分泌物）と併用した場合に幹細胞の成長を支持する表面被覆として認定されている。改善点として、本発明者はこれまでに、幹細胞成長培地が、ＭＵＣ１＊アクチベータ、例えば二価の抗ＭＵＣ１＊抗体又は二量体形態のＮＭ２３、好ましくは四量体及び六量体の特徴的な形成を抑えながら、二量体を選択的に形成するＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ等の突然変異体を含んでいれば、マトリゲル上での幹細胞の成長には、フィーダー細胞由来の馴化培地は必要ではないことを究明している。
【０００２】
しかしながら、マトリゲル層上での幹細胞の成長は細胞ベースの表面よりは改善されているが、マトリゲルは治療上の使用を目的とする（destined for）ヒト幹細胞の成長のための最終目標とされる規定の又は異種成分を含まない（xeno-free）表面ではない。マトリゲルは、ヒト移植を目的とする細胞には望ましくない構成要素が混合したものである。マトリゲルには、とりわけマウス肉腫細胞が含まれる。したがって当業者であれば、必要とされるものが、規定の、好ましくは異種成分を含まない（動物材料を含まない）幹細胞成長のための表面であることが理解される。
【０００３】
異種成分を含まない規定の表面が幾つか報告されており、市販されているものもある。Ｖｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）、ヒドロゲル被覆表面、及び組換えビトロネクチンは、幹細胞の付着及び成長を促すと報告されている。しかしながら、これらには依然として、フィーダー細胞馴化培地の使用が必要とされる。加えて、幹細胞の付着の程度は概して、マトリゲルが支持するものよりも低い。この分野が抱える別の問題は、幹細胞の成長培地又は表面を変える際は必ず、幹細胞を徐々に適応させなければならないことである。この適応期間は、幹細胞の培地又は成長表面を変えるのに数週間から数ヶ月かかる場合がある。
【０００４】
近年の研究によって、表面の機械的性質が幹細胞の多能性維持能に影響を与えることが示されている。例えば、剛体表面が分化を誘導し、より弾性の表面が自然分化を阻害することが分かっている。圧力は幹細胞の分化又は分化に対する抵抗性に影響を与える別の因子である。表面の機械的特徴に加えて、表面の化学的性質が分化に影響を与えることが分かっている。さらに、異なる分化段階の幹細胞が異なる結合選択性を有することが報告されている。すなわち、或る段階にある幹細胞は、或る特定の化学的特徴を有する表面に付着するとともに成長することができ、別の段階にある幹細胞はこの第１の表面には結合しないが、第１の表面とは異なる化学組成を有する第２の表面に付着するとともに成長する。
【０００５】
したがって、幹細胞の付着を可能にし、また多能性幹細胞の成長を促進するヒト幹細胞の成長及び維持のための規定表面を開発することは、既存の方法を上回る改善であると考えられる。これらの規定成長表面を、多能性を促進することが知られているリガンドと結合させれば、現行の技術水準の更なる改善となる。多能性幹細胞の成長のための完全に規定されたシステムを作製するような表面及び成長培地が開発されれば、更なる一層の改善となり、システムが動物産物を含まなければより好ましいとされる。通常４〜８週間の順化期間を経ずに成長培地又は成長表面を変えることができるように、幹細胞の適応を合理化する方法を特定することができれば、現行の技術水準の大幅な改善となる。
【０００６】
近年、研究者ら（非特許文献１、非特許文献２）によって、従来方法により成長させたヒト幹細胞は、真の多能性幹細胞ではなく、既に「プライム（primed）」と呼ばれるより成熟した状態へと分化していることが報告された。プライム幹細胞は、ｂＦＧＦ／ＴＧＦ−β経路を介して成長し、内細胞塊由来の「ナイーブ（naive）」又は「基底状態」のマウス幹細胞というよりは胚盤葉上層由来のマウス幹細胞に酷似している。ヒトナイーブ幹細胞対ヒトプライム幹細胞の分野における初期研究の統一見解としては、１）ヒトナイーブ幹細胞はｂＦＧＦの存在下では安定ではなく、２）ヒトナイーブ幹細胞を成長させる成長因子又は経路が未知である。
【０００７】
現在、研究によって、ｂＦＧＦ含有培地で培養したヒト幹細胞は真の多能性ではなくなっていることが分かっている（非特許文献２）。Jaenisch他は、重大な研究論文において、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞は、「ナイーブ」と呼ばれる真の多能性幹細胞ではなく、「プライム」状態のものであると説明している。現在、研究によって、ナイーブ状態のヒト幹細胞は、主要成長因子がｂＦＧＦである標準的な幹細胞成長培地中では維持することができないことが分かっている。
【０００８】
ともに胚盤胞段階の胚由来であるヒトＥＳ細胞とマウスＥＳ細胞とを比較することによって、研究者らは、ヒトＥＳ細胞はマウス幹細胞とは形態学的にかつ分子的に異なることを発見した。研究者らは更に、これまでに単離されてきたヒトＥＳ細胞は真の多能性ではなく、より後期の発生段階である胚盤葉上層段階由来のマウス幹細胞により酷似していることを開示した。これらの所見等によって、我々がヒト多能性ＥＳ細胞と考えているものが実際は、真の多能性幹細胞よりも成熟したものであることが示される。Jaenisch他は、ナイーブ幹細胞を同定する分子マーカーと、プライム幹細胞を同定するマーカーとを発見している。
【０００９】
研究者らは、ＬＩＦ並びにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ１／２）の経路の阻害剤と組み合わせた、Ｏｃｔ４因子、Ｋｌｆ４因子及びＫｌｆ２因子の異所性誘導によって、ヒトプライム幹細胞をナイーブ状態へと一時的に戻すことができた。誘導することができるタンパク質キナーゼＡ経路アゴニストであるホルスコリン、誘導することができるタンパク質キナーゼＡ経路アゴニストであるホルスコリン
【００１０】
Ｋｌｆ４及びＫｌｆ２の発現は、これら２つの遺伝子の異所性発現の必要性に一時的に取って替わっていた。ヒトＥＳ細胞がナイーブ状態へと戻ると、該細胞はＰＤ／ＣＨ／ＬＩＦ／ＦＫ中で培養する必要があるが、数回の継代しかナイーブ状態を維持することができず、その後プライム細胞へと成熟した。このことは、研究者らが、ヒトＥＳ細胞の多能性ナイーブ状態を促進するとともに維持する成長因子を同定することができなかった有力な証拠である。従来のヒトＥＳＣとは対照的に、これらの後成的に変換されたナイーブ幹細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｔｂｘ３、Ｇｂｘ２、Ｌｉｎ２８及びＳＯＣＳ３を発現し（ナイーブマーカー）、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ１７、Ｃｅｒ１、Ｆｏｘａ２、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ２及びＸＩＳＴの発現を喪失したか、又は大きく低減させていた（プライムマーカー）。加えて、ナイーブ状態へと一時的に戻ったプライム細胞は、コロニー状ではなくシート状に成長した。
【００１１】
しかしながら、非特許文献１によって、ナイーブマーカーがＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｒｅｘ１及びＮｒＯｂ１であり、ナイーブ細胞が、ＦＧＦ５及びＸＩＳＴ等のＸ不活性化のマーカーの発現を喪失したか、又は大きく低減させていたことが報告されている。これら２つの研究チームによって作成されたナイーブマーカー及びプライムマーカーのリストが一致していないのは、分析したナイーブ幹細胞の違いによるものであると考えられる。非特許文献２では、マウスナイーブ幹細胞との類似性により、ナイーブ状態へと一時的に戻ったことが確認された、ヒトプライム幹細胞を分析していた。また、先の研究で同定された遺伝子は、非特許文献２に記載の後のより広範な研究で同定された遺伝子の活性化を引き起こし得る。両研究とも、ナイーブマーカーが少なくともＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ２からなっており、プライムマーカーが少なくともＦＯＸａ２及びＸＩＳＴからなっていることは一致している。
【００１２】
これまでの研究では、ヒト幹細胞をナイーブ幹細胞として伝播させる成長経路又は成長因子（複数の場合もある）を同定することはできなかった。さらに、遺伝子の異所性発現及び因子の集合体（concoction）下での成長を用いても、復帰ナイーブ細胞（reverted-naive
cells）は、短期間、ナイーブ状態を維持した後、より分化したプライム段階へと進行した。
【００１３】
ナイーブ幹細胞を培養する方法を特定することができれば、顕著な改善となると考えられる。このような方法には、ナイーブ状態の成長及び維持を刺激する成長経路の特定、それらの増殖を可能にする培地の開発、又はナイーブ幹細胞の成長若しくは単離のためのナイーブ幹細胞が結合する表面の特定が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】J. Nichols and A. Smith, Cell Stem Cell 4 (6), 487 (2009).
【非特許文献２】J. Hanna, A. W. Cheng, K. Saha et al., Proc Natl AcadSci U S A 107 (20), 9222 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、胚若しくは人工多能性状態のいずれかから採取した直後にヒト幹細胞をナイーブ幹細胞として伝播させる方法、又はプライム幹細胞をナイーブ状態へと戻し、該細胞をその状態に長期間維持する方法が必要とされる。プライム幹細胞をナイーブ状態へと安定して変換させる方法が必要とされており、現行の方法では幹細胞をナイーブ状態に一時的にしか保持することができない。理想的には、ヒト幹細胞をナイーブ状態に維持する方法、又はヒト幹細胞をプライム状態からナイーブ状態へと変換させる方法は、遺伝子の異所性発現を伴わないものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、細胞をＭＵＣ１＊アクチベータの存在下で培養することを含む、方法に関する。細胞は、ヒト細胞、幹細胞、ヒト幹細胞、前駆細胞、胚起源とすることができるか、又はより幹様となるように誘導される。細胞は胚盤胞由来のヒト細胞とすることができる。
【００１７】
この方法では、ＭＵＣ１＊アクチベータは、二量体又は二価の分子、例えばＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体、又は二価の抗体若しくは抗体変異体とすることができる。
【００１８】
細胞は、ヒトフィーダー細胞又はその分泌物の存在下で培養することができる。フィーダー細胞は線維芽細胞若しくはがん細胞とすることができるか、又はフィーダー細胞は成長的に不活性である（growth
inactivated）。
【００１９】
本発明は、ナイーブ幹細胞をナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、細胞をＭＵＣ１＊アクチベータの存在下で培養することを含む、方法にも関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒト幹細胞株を樹立する方法であって、胚盤胞から細胞を採取することと、細胞をＮＭ２３又は二量体ＮＭ２３の存在下で培養することとを含む、方法に関する。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する、又はナイーブ幹細胞をナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、誘導元の細胞又はナイーブ幹細胞状態を有する細胞を、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に付着させることを含む、方法に関する。表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である場合がある。表面は、１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とを含み、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％である場合があり、表面では、接触角が１４．３度〜１８．８度である。表面はＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）であり得る。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ細胞マーカーの発現が増大した細胞を選択する方法であって、ナイーブ細胞マーカーの発現が増大した細胞を含有すると思われる細胞の集団を、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に曝すことと、選択された細胞を表面の存在下で培養することとを含む、方法に関する。表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である場合がある。表面は、１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とを含み、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％である場合があり、表面では、接触角が１４．３度〜１８．８度である。表面はＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）であり得る。
【００２３】
上記のいずれの方法においても、表面は、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質を更に含む場合がある。細胞表面分子はＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊であり得る。細胞表面分子はＰＳＭＧＦＲ配列であり得る。作用物質は抗体であり得る。抗体はＰＳＭＧＦＲに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。特に、モノクローナル抗体は以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する場合がある：
ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）；ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）；及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）、又は、
ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）；ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）；及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【００２４】
上記の方法によると、作用物質はＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１又はＣＤ３４に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。記載の作用物質はＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価であり得る。
【００２５】
上記のいずれの方法においても、方法をＲｈｏキナーゼ阻害剤の非存在下で行う場合がある。方法は、表面上にプレーティングする前に、細胞をトリプシン処理して単一細胞にすることを含み得る。また、細胞を例えば規定構造１ｃｍ２当たり約１×１０３個の細胞〜規定構造１ｃｍ２当たり１×１０４個の細胞という低密度で表面上にプレーティングしてもよい。特に、細胞を規定構造１ｃｍ２当たり約５２６３個の細胞でプレーティングする場合がある。
【００２６】
別の態様では、方法は、細胞を低容量の培地、好ましくは表面を被覆するだけの容量の培地で表面上にプレーティングすることを含み得る。この培地の容量は、規定構造１ｃｍ２当たり０．１ｍＬ〜０．２ｍＬであり得る。細胞をＥＤＴＡの存在下で表面上の細胞上にプレーティングしてもよい。さらに、方法は、プレーティングした細胞を、力を加えることで表面に密着させることを含み得る。力は遠心力であり得る。
【００２７】
別の態様では、本発明は、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体に関する。
【００２８】
表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である場合がある。表面はＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面であり得る。細胞表面分子はＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊であり得る。細胞表面分子はＰＳＭＧＦＲ配列であり得る。作用物質は抗体であり得る。抗体はＰＳＭＧＦＲに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。特に、モノクローナル抗体は以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する場合がある：
ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）；ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）；及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）、又は、
ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）；ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）；及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【００２９】
作用物質はＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１又はＣＤ３４に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。記載の作用物質はＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価であり得る。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態又はプライム幹細胞状態の特性を示すマイクロＲＮＡシグネチャを同定する方法であって、
（ｉ）ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をＮＭ２３の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
（ｉｉ）細胞をＭＵＣ１＊抗体で被覆した幹細胞増殖表面に付着させるとともに、細胞を成長させることと、
（ｉｉｉ）細胞を採取するとともに、工程（ｉｉ）の幹細胞で発現するマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｉｖ）ｂＦＧＦベース培地中のヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をネズミフィーダー細胞の層上で別に培養することと、
（ｖ）細胞を採取するとともに、工程（ｉｖ）の細胞で発現するマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）で同定されたマイクロＲＮＡと、工程（ｖ）で同定されたマイクロＲＮＡとを比較することと、
（ｖｉｉ）工程（ｉｉｉ）では存在しているか、又は発現が増大しており、工程（ｖ）では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することにより、ナイーブ細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖ）では存在しており、工程（ｉｉｉ）では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することにより、プライム細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
を含む、方法を含む。
【００３１】
幹細胞増殖表面はＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面であり得る。
【００３２】
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態又はプライム幹細胞状態の特性を示すマイクロＲＮＡシグネチャを同定する方法であって、
（ｉ）ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の第１のセット及び第２のセットを、ＮＭ２３の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
（ｉｉ）細胞をＭＵＣ１＊抗体で被覆した第１の幹細胞増殖表面に付着させることと、
（ｉｉｉ）細胞の第１のセットにおいてマイクロＲＮＡのレベルを測定することと、
（ｉｖ）同一の細胞の第２のセットの細胞を採取するとともに、細胞の第２のセットを第２の幹細胞増殖表面上にプレーティングすることと、
（ｖ）第２の幹細胞増殖表面上で一定期間成長させることと、
（ｖｉ）細胞の第２のセットにおいてマイクロＲＮＡのレベルを測定することと、
（ｖｉｉ）細胞の第１のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第２のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することを含む、ナイーブ幹細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
（ｖｉｉｉ）細胞の第２のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第１のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロＲＮＡを同定することにより、プライム幹細胞状態に特有のマイクロＲＮＡを同定することと、
を含む、方法に関する。
【００３３】
第１の幹細胞増殖表面はＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面であってもよく、第２の幹細胞増殖表面はビトロネクチンであってもよい。
【００３４】
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、ナイーブ状態の特性を示すマイクロＲＮＡを細胞に導入することを含む、方法に関する。
【００３５】
更に別の態様では、本発明は、患者においてがんを治療又は予防する方法であって、患者に、細胞がナイーブ状態からより分化した状態へと移行すると上方調節されるタンパク質又は核酸を投与することを含む、方法に関する。核酸はマイクロＲＮＡであり得る。細胞のより分化した状態はプライム状態であり得る。
【００３６】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞増殖表面上で幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、
（ａ）幹細胞又は前駆細胞のサンプルを得ることと、
（ｂ）幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
（ｃ）幹細胞又は前駆細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する第１の作用物質を含む培地中で培養することと、
を含む、方法に関する。
【００３７】
更に別の態様では、本発明は、表面に結合するように幹細胞又は前駆細胞を適応させる方法であって、
（ａ）幹細胞又は前駆細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する第１の作用物質を含む培地中で予めインキュベートすることと、
（ｂ）幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
を含む、方法に関する。
【００３８】
表面はＭＵＣ１＊を二量体化する第２の作用物質を含み得る。
【００３９】
上記方法は、工程（ａ）の後でかつ工程（ｂ）の前に、
（ａ）（ｉ）ＭＵＣ１＊を二量体化する第１の作用物質を含む培地中でのインキュベートの後に、幹細胞又は前駆細胞をペレット状にする工程と、
（ａ）（ｉｉ）第１の作用物質を含まない培地中で幹細胞又は前駆細胞を再懸濁する工程と、
（ａ）（ｉｉｉ）幹細胞又は前駆細胞を表面上にプレーティングする工程と、
（ａ）（ｉｖ）４８時間にわたって放置する工程と、
を更に含み得る。
【００４０】
更に別の態様では、本発明は、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に結合するように幹細胞を適応させる方法であって、細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を含む培地中で予めインキュベートした後、幹細胞を表面へと導入することを含む、方法に関する。表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である場合がある。
【００４１】
上記方法は、
（ｉ）幹細胞を、ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を含む培地中でインキュベートする工程と、
（ｉｉ）他の細胞と付着させる前に、幹細胞に、細胞を表面に接触させる力を加える工程と、
（ｉｉｉ）細胞を、作用物質を含まない培地中で再懸濁する工程と、
（ｉｖ）表面上にプレーティングする工程と、
（ｖ）４８時間にわたって放置する工程と、
（ｖｉ）ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を添加する工程と、
を更に含み得る。
【００４２】
表面はＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）であり得る。力は遠心力、圧力、又は真空であり得る。
【００４３】
更に別の態様では、本発明は、
（ｉ）フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体と、
（ｉｉ）ＮＭ２３とともに最小培地を含む幹細胞成長培地と、
備えるキットに関する。
【００４４】
表面では、窒素（Ｎ）が少なくとも約０．５％であり、酸素（Ｏ）及び窒素（Ｎ）の合計量が少なくとも約１７．２％以上であり、接触角が少なくとも約１３．９度である場合がある。表面はＶｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）であり得る。細胞表面分子はＭＵＣ１又はＭＵＣ１＊であり得る。細胞表面分子はＰＳＭＧＦＲ配列であり得る。作用物質は抗体であり得る。抗体はＰＳＭＧＦＲに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。特に、モノクローナル抗体は以下のκ鎖可変領域ＣＤＲ配列を有する場合がある：
ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）；ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）；及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）、又は、
ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）；ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）；及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【００４５】
上記の方法によると、作用物質はＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１又はＣＤ３４に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。記載の作用物質はＮＭ２３、又はＮＭ２３の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価であり得る。抗体はヒト化していてもよい。また、最小培地は異種成分を含まなくてもよい。
【００４６】
本発明のこれら及び他の目的は、以下の本発明の説明、本明細書に添付した参照図面及び本明細書に添付した特許請求の範囲から更に十分に理解される。
【００４７】
本発明は、本明細書で下記に与えられる詳細な説明、及び例示目的のみで与えられ、したがって本発明を限定するものではない添付の図面から更に十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】６ウェルプレート形式で示した、実施例３に記載の実験に関する実験設定及び顕著な結果を示す図である。６ウェルの画像は図２〜図４に示される。
【図２】図１に示した実験の様々な表面上にプレーティングし、ＮＭ２３ベース培地又はｂＦＧＦ培地中で培養したヒトＥＳ  Ｈ９細胞の写真を示す図である。画像は培地を交換する２日前に撮影したものであり、Ｖｉｔａ表面又は抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆したＶｉｔａ表面上にプレーティングし、ＮＭ２３ベース培地中で培養したヒト幹細胞のみが幹細胞付着を支持したことを示す。
【図３】Ｖｉｔａ表面又は抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆したＶｉｔａ表面を含み、ＮＭ２３ベース培地中で培養した３日目のウェルの２０倍拡大図である。多能性幹細胞の成長が示されている。
【図４】５日目まで多能性幹細胞として生存した僅か３つのコロニーの写真を示す図である。これらのコロニーは、モノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆したＶｉｔａ表面を含み、ＮＭ２３−最小培地（ＭＭ）中で培養したウェルにおいて発生した。
【図５】６ウェルプレート形式で示した、実施例３に記載の別の実験に関する実験設定及び顕著な結果を示す図である。６ウェルの画像は図６及び図７に示される。この実験の要点は、培地の容量を減らすことが表面への幹細胞の付着を助けるかどうか、更に培地にＭＵＣ１＊リガンドを与えないことが表面上のＭＵＣ１＊抗体への細胞の付着を助けるかどうかを検証することである。
【図６】細胞を含む容量を最小限に抑えられれば、ヒト幹細胞のコロニー片がより良好に表面に付着することを示す写真の図である。この図に示されている時間は、ＮＭ２３を最小培地（ＭＭ）に添加するまでに経過した時間を表す。
【図７】図５に記載の実験の７日目の写真を示す図である。プレーティング容量を減らすことによる細胞付着の増進が実証されている。
【図８】６ウェルプレート形式で示した、実施例３に記載の別の実験に関する実験設定及び顕著な結果を示す図である。６ウェルの画像は図９に示される。この実験では、２つのモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体をＶｉｔａ表面単独と比較する。２つの異なる細胞源由来のヒトｉＰＳ細胞を試験した：予めＮＭ２３−ＭＭ中で培養したｉＰＳ細胞、及び予めｂＦＧＦ＋ＭＥＦ馴化培地中で培養したｉＰＳ細胞（どちらもマトリゲル上で培養）。
【図９】予めＮＭ２３−ＭＭ中で又はｂＦＧＦ＋ＭＥＦ馴化培地中で成長させた細胞源の細胞由来のヒトｉＰＳのコロニー片の７日目の写真を示す図である。加えて、モノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ３及び２Ｄ６Ｃ８をＶｉｔａ表面単独と比較する。これらのｉＰＳ細胞は初めに、プレーティング前３０分間、ＮＭ２３−ＭＭと予めインキュベートし、３時間、１ｍＬのＭＭ中でプレーティングした後、容量をＮＭ２３−ＭＭで４ｍＬに増大させた。
【図１０】６ウェルプレート形式で示した、実施例４に記載の実験に関する実験設定及び顕著な結果を示す図である。６ウェルの画像は図１１に示される。
【図１１】Ｖｉｔａ表面単独（但しＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）を含む）を、抗ＭＵＣ１＊抗体で、但しＲＯＣｉの非存在下において被覆したＶｉｔａ表面と比較した実験における幹細胞の写真を示す図である。
【図１２ａ】トリプシン処理して単一細胞にした後、図のように各種量のモノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａ型表面上にプレーティングし、ＮＭ２３−ＭＭ中で培養したヒトＥＳ細胞の４倍〜２０倍の写真を示す図である。ここで付着を助けるために、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は初めの４８時間存在させた。
【図１２ｂ】トリプシン処理して単一細胞にした後、図のように各種量のモノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａ型表面上にプレーティングし、ＮＭ２３−ＭＭ中で培養したヒトＥＳ細胞の４倍の写真を示す図である。ここで付着を助けるために、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は初めの４８時間存在させた。
【図１２ｃ】トリプシン処理して単一細胞にした後、図のように各種量のモノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａ型表面上にプレーティングし、ＮＭ２３−ＭＭ中で培養したヒトＥＳ細胞の１０倍の写真を示す図である。ここで付着を助けるために、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は初めの４８時間存在させた。
【図１２ｄ】トリプシン処理して単一細胞にした後、図のように各種量のモノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａ型表面上にプレーティングし、ＮＭ２３−ＭＭ中で培養したヒトＥＳ細胞の２０倍の写真を示す図である。ここで付着を助けるために、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は初めの４８時間存在させた。
【図１２ｅ】比較対象の（compared to）Ｖｉｔａ表面（抗体被覆なし）上にプレーティングし、標準ｂＦＧＦ＋ＭＥＦ馴化培地中、ＲＯＣｉの存在下で培養したヒトＥＳ細胞の画像（上図）と、抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆したＶｉｔａプレート上にプレーティングし、８ｎＭ  ＮＭ２３−ＭＭ中、初めの４８時間のみＲＯＣｉの存在下で培養した同じ細胞源の細胞の画像とを示す図である。画像はプレーティングの４日後に撮影した。実施例５を参照されたい。
【図１３】２Ｄ６Ｃ３κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）、ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）、及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）。
【図１４】２Ｄ６Ｃ３重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１：GYAMS（配列番号２３）、ＣＤＲ２：TISSGGTYIYYPDSVKG（配列番号２４）、及びＣＤＲ３：LGGDNYYEY（配列番号２５）。
【図１５】２Ｄ６Ｃ８κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）、ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）、及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【図１６】２Ｄ６Ｃ８重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１：GYAMS（配列番号２９）、ＣＤＲ２：TISSGGTYIYYPDSVKG（配列番号３０）、及びＣＤＲ３：LGGDNYYEY（配列番号３１）。
【図１７】３Ｃ２Ｂ１κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１：RASKSISTSDYNYIH（配列番号３２）、ＣＤＲ２：LASNLES（配列番号３３）、及びＣＤＲ３：QHSRELPLTF（配列番号３４）。
【図１８】３Ｃ２Ｂ１重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１：TYTMS（配列番号３５）、ＣＤＲ２：TISTGGDKTYYSDSVKG（配列番号３６）、及びＣＤＲ３：GTTAMYYYAM（配列番号３７）。
【図１９】プレーティングの前にＥＤＴＡ又はＲＯＣｉの存在下又は非存在下で幹細胞をトリプシン処理した場合の表面への幹細胞の付着を比較する、実施例６に記載の実験の写真を示す図である。
【図２０】細胞をプレーティングした後にプレートを遠心することによって細胞を表面に接触させるのに、力を用いたことを除いて、実施例６に記載され、図１９に示されるものと同じ実験の写真を示す図である。画像は、トリプシン処理に加えて力を加えることで、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の必要性が排除されることを示している。
【図２１】ＲＯＣｉの存在下又は非存在下でプレーティングしたヒトＥＳ細胞の写真を示す図であり、トリプシン処理した細胞を非常に低い密度でプレーティングすることで、細胞付着を促すのにＲｈｏキナーゼ阻害剤の必要性が排除されることを示している。
【図２２】実施例７に記載の実験の結果を示す図である。ａ）は、組換えＮＭ２３野生型（ｗｔ）、発現タンパク質の可溶性画分であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ六量体、大部分が二量体となるように（to produce mostly dimers）、実施例７に従って変性及びリフォールディングを行ったＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体、及び約５０％を二量体が占めるように生成した、六量体と四量体と二量体との混合物であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇミックス（mixed）の多量体化状態を示すＦＰＬＣトレースのオーバーレイである。ｂ）は、合成ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン（ｅｃｄ）ペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）との（ａ）部で示されたＮＭ２３調製物の結合能を決定するためにその能力を調べた実験による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）トレースのオーバーレイである。ＭＵＣ１＊ペプチドとのＮＭ２３の結合量は、各サンプルに存在する二量体の濃度に対応する。ｃ）は、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを含有する、組換えＮＭ２３−ｗｔ、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体及びＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体を特性化するＦＰＬＣトレースのオーバーレイである。ｄ）は、金ＮＴＡ−Ｎｉ−ＳＡＭ被覆ナノ粒子上に固定化されたＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ−Ｈｉｓタグ付き）との各種ＮＭ２３多量体の結合能を調べるナノ粒子実験の写真である。ピンク色から青灰色へのナノ粒子の色の変化は結合を示すものである。（ｅ〜ｈ）は、幹細胞の多能性に対する各種ＮＭ２３多量体の機能的効果を示す。多能性の喪失は、細胞の暗部又は肥厚部として見られる。ｉ）は、ｂＦＧＦを与えない、ＮＭ２３二量体を与えない、又はＮＭ２３二量体−ＭＵＣ１＊相互作用を競合的に阻害することに応答するマイクロＲＮＡ−１４５の測定量のグラフである。ｍｉＲ−１４５の増大は、細胞の多能性からの離脱及び分化の開始を示唆する。
【図Ｓ２２】各種ＮＭ２３調製物の多量体化状態（ａ、ｂ）、及びＮＭ２３二量体の安定性（ｃ）を示すゲル及びウェスタンブロットを示す図である。
【図２３】実施例８の実験写真を示す図である。ここでは、マトリゲル上で成長させ、ＮＭ２３−ＭＭ（上図）又はｂＦＧＦ−ＭＥＦ馴化培地（下図）中で５継代以上培養した、ヒトＨ９  ＥＳ細胞を、胚様体法により分化させた後、３つの生殖系列マーカー＋核染色ＤＡＰＩ（青色）の存在に関して染色した。この図は、ＮＭ２３によって、細胞形態及びその協調分化から明らかなように、幹細胞が、ｂＦＧＦ中で成長させた細胞よりも良好に分化するように成長することを示している。
【図２４】ヒトのＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞が、抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆したＶｉｔａ型表面上で指数関数的に成長することを示す実施例９（細胞はＮＭ２３ベース培地中で培養する）に記載の実験のグラフ及び写真を示す図である。さらに写真は、連続継代後、これらの細胞が３つ全ての生殖系列へと分化することを示している。
【図Ｓ２４ａ】図２４に示されるとともに実施例９に記載されるヒトＥＳ細胞の多能性マーカーの存在に関する免疫細胞（immunocytocellular）（ＩＣＣ）染色の写真と、未変化の核型を示す核型分析とを示す図である。
【図Ｓ２４ｂ】図２４に示されるとともに実施例９に記載されるヒトｉＰＳ細胞の多能性マーカーの存在に関する免疫細胞（ＩＣＣ）染色の写真と、未変化の核型を示す核型分析とを示す図である。
【図２５】実施例１０に記載の各種条件下で成長させたヒトＥＳ細胞のナイーブマーカー及びプライムマーカーの発現レベルを測定するＲＴ−ＰＣＲ実験のグラフを示す図である。
【図２６】図２６のａ〜ｌは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在又は非存在下で培養したヒトＥＳ細胞（幹細胞はＮＭ２３−ＭＮ６中で培養した）の写真を示す。図２６のｍ〜ｔは、ビトロネクチンの層上、ＲＯＣｉの存在又は非存在下（plus or minus）、ＮＭ２３−ＭＭ又はＮＭ２３−ＭＮ６中で培養したヒトＥＳ細胞の画像を示す。
【図２７】ヒトＨＳ２７フィーダー細胞上又はマウスＭＥＦフィーダー細胞上、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像を示し、さらにヒトＨＳ２７フィーダー細胞上又はマウスＭＥＦフィーダー細胞上、ｂＦＧＦ中で成長させたＨ９幹細胞を示す図である。ヒトフィーダー細胞上、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で培養させた細胞のみがＫｌｆ４に関して正に染色し、このことは該細胞がナイーブであることを示す。他の全ての条件ではプライム幹細胞が生じ、プライム細胞のマーカーであるＦｏｘａ２に関して正に染色した。
【図２８】ヒトフィーダー細胞上、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で成長させ、ナイーブ幹細胞のマーカーであるＫｌｆ４に関して正に染色するＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像である。
【図２９】ヒトフィーダー細胞上、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、プライム幹細胞のマーカーであるＦｏｘａ２に関して陰性であることを示す。
【図３０】ヒトフィーダー細胞上、ｂＦＧＦ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、ナイーブ幹細胞のマーカーであるＫｌｆ４に関して陰性であることを示す。
【図３１】ヒトフィーダー細胞上、ｂＦＧＦ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、プライム幹細胞のマーカーであるＦｏｘａ２に関して陽性であることを示す。
【図３２】マウスフィーダー細胞上、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、ナイーブ幹細胞のマーカーであるＫｌｆ４に関して陰性であることを示す。
【図３３】マウスフィーダー細胞上、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、プライム幹細胞のマーカーであるＦｏｘａ２に関して陽性であることを示す。
【図３４】マウスフィーダー細胞上、ｂＦＧＦ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、ナイーブ幹細胞のマーカーであるＫｌｆ４に関して陰性であることを示す。
【図３５】マウスフィーダー細胞上、ｂＦＧＦ中で成長させたＨ９幹細胞の共焦点顕微鏡の画像であり、該細胞が、プライム幹細胞のマーカーであるＦｏｘａ２に関して陽性であることを示す。
【図３６】Ｃ末端に１つ、２つ又は６つの欠失を有するＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ突然変異体の可溶性画分のＦＰＬＣトレースのオーバーレイである。ここでは、二量体ピークを示している。
【図３７】実施例１０に記載の各種条件下で成長させたヒトＥＳ細胞のナイーブマーカー及びプライムマーカーの発現レベルを測定するＲＴ−ＰＣＲ実験のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本願において、数量を特定していないものは単数及び複数の対象の両方を含む（"a" and "an" are used to refer to both single
and a plurality of objects）。
【００５０】
本発明は、哺乳類細胞培養、とりわけ幹細胞等の未熟細胞の培養の分野に関するものであり、少なくとも約０．５％のＮを含有し、Ｏ及びＮの合計量が１７．２％以上であり、接触角が約１３．９度である、フィーダー層を欠いた基質への細胞付着、該基質上での培養、及び該基質からの剥離のための方法及び組成物を提供する。一実施形態では、基質には細胞表面受容体に結合する抗体も付着されている。別の実施形態では、細胞をＭＵＣ１＊アクチベータを含む培地中で培養する。更に別の実施形態では、培地には、更にＲｈｏキナーゼ又はＲｈｏ阻害剤（ＲＯＣｉ）が含まれる。更に別の実施形態では、本発明は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の必要性を排除する方法に関する。更に別の実施形態では、本発明は、ナイーブ状態の幹細胞の選択、維持又は誘導のための方法、成長因子及び表面に関する。
【００５１】
幹細胞増殖表面
本明細書で使用される場合、幹細胞増殖表面は、ヒト幹細胞の付着を可能にするように化学的又は生物学的に改質することができ、更に幹細胞を増殖させ、そこから幹細胞を採取することができる、任意の表面である。国際公開第２００９／１０５５７０号は、得られる表面が細胞付着に良好であり、特に非接着性細胞であるヒト幹細胞の付着を可能にするような、細胞培養用のプラスチック容器のプラズマ改質を記載している。国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面の一つは、Ｖｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）として販売されている。特に、国際公開第２００９／１０５５７０号における表面＃４は幹細胞を成長させることから普及されてきた。残念ながら、これらの表面に結合した後にそこで成長するように、これらの細胞を準備する（「順化する」としても知られる）必要がある方法は非常に長期間にわたる複雑なものである。国際公開第２００９／１０５５７０号は、別の表面から手動で切り離すとともに剥離した幹細胞はそれらの表面には結合しないことを開示している。加えて、幹細胞は、開示された表面上で結合又は成長する前に、単一細胞になるまで、数回、例えば３８回及び４８回、酵素により継代させる必要がある。さらにＶｉｔａ（商標）表面の使用説明書には、幹細胞をＲｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で培養させなければならないことが記載されており、そうしなければ幹細胞が表面に結合しないか、又は表面に結合した状態を保てない。国際公開第２００９／１０５５７０号の更なる欠点は、開示された表面はマトリゲル及びフィーダー細胞の代用を目的とする規定の基質であるが、マウスフィーダー細胞由来の馴化培地を標準ｂＦＧＦ幹細胞培養培地に添加しなければ、幹細胞は表面上で成長することがないことであり、このため規定の動物質を含まない表面の用途にはそぐわない。
【００５２】
本発明では、国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面、より具体的には１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％であり、接触角が１４．３度〜１８．８度である表面は、ＭＵＣ１＊受容体を二量体化するリガンドの存在下で成長させれば、馴化培地の非存在下で幹細胞の培養に使用することができることが示されている。ＭＵＣ１＊受容体を二量体化するとともに活性化するリガンドとしては、細胞表面の近位にあるＭＵＣ１受容体の初めの４５アミノ酸に配列が対応している、ＰＳＭＧＦＲペプチドに対する二価抗体が挙げられる。細胞表面に直接隣接した１０アミノ酸を欠いていることを除いて、配列がＰＳＭＧＦＲペプチドに対応しているペプチドに対する抗体が好ましい。ＮＭ２３はＭＵＣ１＊のリガンドであり、より具体的には二量体ＮＭ２３、又は四量体及び六量体の形成よりも二量体の形成が選好される、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ等の突然変異体（１〜６アミノ酸のＣ末端欠失と組み合わされても又は組み合わされていなくてもよい）が特に好ましい。
【００５３】
馴化培地の必要性が排除されることに加えて、本発明は、幹細胞を、これらの及び他の規定の表面上で成長するように適応させるのに要する順化時間を最小限に抑える方法を開示する。本願の他の箇所でより完全に詳述されているように、ＮＭ２３中で成長させた幹細胞には長期にわたる適応期間は必要ない。さらに、ＦＧＦ及び馴化培地中で予め培養させた幹細胞は、規定の表面に導入する前に細胞をＮＭ２３含有培地中で短期間インキュベートすることによって、国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面に結合するように適応させることができる。国際公開第２００９／１０５５７０号の内容、とりわけ幹細胞成長表面の材料及び組成の開示に関するものは、その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００５４】
別の改良形態では、本発明は、国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面をＭＵＣ１＊受容体と結合するリガンド又は抗体で被覆することに関するものであり、これにより細胞付着の改善がもたらされ、ＭＵＣ１＊リガンドなしで表面を使用するよりも良好に自然分化が阻害される。図１２ｅを参照されたい。本発明は他の幹細胞表面タンパク質へのリガンドの使用も企図している。
【００５５】
ナイーブ細胞
最近の研究論文によって、ＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞馴化培地中で培養したヒト幹細胞は真の多能性（ナイーブ状態又は基底状態）幹細胞ではなくなっていると結論づけられている。正しくは、ｂＦＧＦ中での成長はヒト幹細胞を「プライム状態」と呼ばれるより成熟した状態にさせる。ヒトプライム幹細胞対ヒトナイーブ幹細胞の分野における研究結果によって、プライム幹細胞が、真の多能性幹細胞のように完全に機能的な成体細胞へと分化することができないことが示唆されている。研究者らは、プライム幹細胞を「ナイーブ」と呼ばれる真の多能性状態へと一時的に戻す方法を開発している。ナイーブ幹細胞がプライム幹細胞とは異なる経路を介して成長するため、ナイーブ幹細胞は、プライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なる細胞表面受容体を保有するか、又はプライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なるレベルで発現される細胞表面受容体を保有することになる。そのため、プライム幹細胞とナイーブ幹細胞とは、化学的又は生化学的に規定された表面に対する親和性が異なる。
【００５６】
プライム幹細胞の特徴の一つは、酵素的切断を用いた連続採取では生存することができないことであり、ナイーブ幹細胞は生存することができる。国際公開第２００９／１０５５７０号では、酵素的切断により連続採取された幹細胞のみを表面に結合させることが開示されているため、本発明者らは、ナイーブ幹細胞が国際公開第２００９／１０５５７０号の表面、特にＮｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｖｉｔａ（商標）表面（ThermoFisher, USA）として販売されている表面に結合していると結論づけている。そのため、国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面（本明細書ではＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面と称される）を用いて、ナイーブ幹細胞、より包括的にナイーブ状態、又は従来のｂＦＧＦ培地中、フィーダー細胞表面上で培養したものよりもナイーブな状態にあるヒト幹細胞の成長及び／又は維持を選択することができる。
【００５７】
ナイーブ幹細胞の別の報告されている特徴は、ナイーブ幹細胞がコロニー形態のみならずシート状に成長する能力を有することである。本発明者らは、抗ＭＵＣ１＊抗体及びＮＭ２３を含むＭＵＣ１＊アクチベータとともに培養した幹細胞は、非フィーダー細胞表面及び非マトリゲル表面上で成長させた場合にもシート状で成長することを確認している。より具体的には、抗ＭＵＣ１＊抗体及び二量体ＮＭ２３又はＮＭ２３変異体を含む二価ＭＵＣ１＊アクチベータとともに培養し、抗ＭＵＣ１＊又はＮＭ２３二量体で被覆した表面上で成長させるヒト幹細胞は、ヒトナイーブ幹細胞の特徴であるコロニー状ではなくシート状に成長する。好ましい実施形態では、抗ＭＵＣ１＊抗体はＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面上に吸着され、付着したヒト幹細胞は、ＮＭ２３又は二量体状態にあるＮＭ２３変異体を含む最小幹細胞培地中で培養される。実施例５の結果を示す図１２ｅによって、ヒト幹細胞が、ＭＵＣ１＊アクチベータを含む培地中、任意で抗ＭＵＣ１＊抗体を提示するＶｉｔａ様表面上で培養した場合に、コロニー状ではなくシート状に成長することが実証される。特に好ましい実施形態では、ＭＵＣ１＊アクチベータ培地には、ｂＦＧＦ又はＴＧＦ−βは含まれない。図２５及び実施例１０の実験は、ｂＦＧＦ含有培地中で培養したヒト幹細胞がプライム状態にあり、ＭＵＣ１＊活性化リガンド、例えば二量体ＮＭ２３中、任意で更にＭＵＣ１＊リガンド、例えば抗ＭＵＣ１＊抗体を任意で提示するＶｉｔａ表面又はＶｉｔａ様表面上で培養した幹細胞がナイーブ状態又はよりナイーブの状態にあることを示している。図１２では、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ヒトＨ９  ＥＳ（胚性幹）細胞におけるナイーブ遺伝子対プライム遺伝子の発現レベルを測定する。最小幹細胞培地に４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加する標準方法に従って培養し、マウス線維芽細胞フィーダー細胞（ＭＥＦ）の表面上で成長させたこれらの細胞、「ＭＥＦ／ＦＧＦ  ＣＴ」を「１」と規定し、他の全ての成長方法をこの値に対して正規化している。これらの図では、「ＮＭ２３／ＭＵＣ１＊Ａｂ」は、ＭＵＣ１＊抗体（Ｃ３）で被覆したＶｉｔａプレート上で培養した任意の他の成長因子の非存在下の最小幹細胞培地中で二量体形態にある８ｎＭ  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇを指す。図１２は、従来方法によって培養した幹細胞と比較して、Ｖｉｔａプレート上のＭＵＣ１＊抗体の表面でのＮＭ２３二量体の成長がプライムマーカーのより低い発現及びナイーブマーカーのより高い発現をもたらしたことを示している。
【００５８】
ｍＴｅＳＲは高濃度のｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βを含む市販の半規定培地である。図１２ｂは、ｍＴｅＳＲ中、マトリゲルの層上で培養した同じタイプの幹細胞がプライムマーカーＦｏｘａ２及びＸＩＳＴのより高い発現をもたらしたが、ナイーブマーカーＫｌｆ２、Ｋｌｆ４及びＮａｎｏｇのより低い発現をもたらしたことを示している。多能性マーカーであるＯｃｔ４は、平均すると対照よりも高い発現を示した。継代数（ｐ１〜１４）から分かるように、マトリゲル上でのｍＴｅＳＲ中の連続継代では、「不良」マーカー発現パターンは改善されなかった。
【００５９】
これに対して、図１２ｃは、ＮＭ２３培地中、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上での幹細胞の培養によって、ナイーブ（良好）マーカーの発現が増大し、プライムマーカーの発現が低減したこと、プライムマーカーの発現に対するナイーブマーカーの発現のパターンは各連続継代数に伴い改善したことを示している。ヒトインテグリンビトロネクチンは、規定済みであり、組換えタンパク質として作製される場合、異種成分を含まないが、図１２ｄに示される結果によって、幹細胞の表面上でのビトロネクチンと一部の抗原との相互作用が、ナイーブではない経路を示唆することが強く主張される。同じ親細胞源の幹細胞を、ｂＦＧＦ中、フィーダー上で成長したものから採取し、１回の継代において、ｂＦＧＦ＋フィーダー細胞馴化培地、ｍＴｅＳＲ又はＮＭ２３−最小培地のいずれかで培養し、全てビトロネクチンの層上で成長させた。ＲＴ−ＰＣＲ測定結果によって、ＮＭ２３培地が他よりもナイーブな遺伝子発現プロファイルを示したが、概してビトロネクチン上での成長がプライムマーカーの発現の増大及びナイーブマーカーの発現の低減を引き起こしたことが示される。
【００６０】
図３７は、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦフィーダー上で培養したヒト幹細胞（ｎ＝３）、ｍＴｅＳＲ中、マトリゲル上で培養したヒト幹細胞（ｎ＝５）、又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体の最小幹細胞培地中、１２．５ｕｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体である２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａ表面上で培養したヒト幹細胞（ｎ＝６）のＲＴ−ＰＣＲ測定結果を示している。この実験では、２つの更なるプライムマーカー、ＯＴＸ２及びＬＨＸ２も測定した。図３７のグラフは、他の実験と一致して、ＮＭ２３中、ＭＵＣ１＊のリガンドを提示する表面上での成長がナイーブマーカーの発現を増大させ、プライムマーカーの発現を低減させることを示している。
【００６１】
比較実験では、ＩＣＣ染色を用いて、ｂＦＧＦ又はＮＭ２３（最小幹細胞培地中で二量体）中、マウスフィーダー細胞又はヒトフィーダー細胞上でのヒトＥＳ細胞の成長に応答した僅か２つのマーカー：ＦＯＸａ２（プライム）及びＫＬＦ４（ナイーブ）の発現を評価した。図２７〜図３５によって、ＮＭ２３培地中、ヒト線維芽細胞の表面上で培養したヒト幹細胞のみがナイーブマーカーＫＬＦ４を発現し、プライムマーカーＦＯＸａ２を発現しなかったことが示される。これに対して、マウス線維芽細胞の層上にプレーティングし、ＮＭ２３又はｂＦＧＦを含む培地中で培養した同じ細胞源の細胞はナイーブマーカーＫＬＦ４を発現せず、プライムマーカーＦＯＸａ２を発現した。
【００６２】
まとめると、これらのデータによって、マウス細胞の層上又はビトロネクチンの層上でヒト幹細胞を成長させることでプライム状態が維持又は誘導され、ｂＦＧＦ含有培地中でヒト幹細胞を培養することでもプライム状態が維持又は誘導されることが示されている。そのため、ヒトナイーブ幹細胞は、ＭＵＣ１＊経路によって成長し、この経路を活性化する培地中、例えばＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を含む培地中、及びプライム経路を活性化させず、任意で多能性経路を活性化する溶液中又は表面、例えばＭＵＣ１＊を二量体化するリガンド上で維持又は誘導することができると結論づけられる。好ましい実施形態では、幹細胞は、二量体形態のＮＭ２３を含む培地中で細胞を培養することによって維持するか、又はよりナイーブな状態へと戻るように誘導され、細胞はＶｉｔａ様表面又は抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆した表面に付着する。更により好ましい実施形態では、幹細胞は、ＮＭ２３の濃度が８ｎＭ〜３２ｎＭであり、表面が３ｕｇ／ｍＬ〜１２５ｕｇ／ｍＬの濃度で抗ＭＵＣ１＊抗体２Ｄ６Ｃ３又は２Ｄ６Ｃ８で被覆したＶｉｔａ表面であるＮＭ２３二量体含有培地中で培養する。加えて、任意でＶｉｔａ様表面上にプレーティングした、ＭＵＣ１＊と結合する抗体を用いて、ナイーブ幹細胞を同定及び単離することができる。
【００６３】
加えて、プライム幹細胞を、ＭＵＣ１＊経路が活性化する条件下で細胞を成長させることによって、ナイーブ状態又はよりナイーブな状態へと戻すことができる。例えば、ＭＵＣ１＊、又はＮＭ２３若しくはＮＭ２３変異体を含むそのリガンドの発現を引き起こす若しくは増大させる核酸、又はＭＵＣ１の切断の増大をもたらす作用物質の細胞（成体細胞、前駆細胞又はプライム幹細胞であり得る）への導入によって、細胞がよりナイーブな状態又はナイーブ状態へと戻る。
【００６４】
出願人によって、幹細胞は、ＭＵＣ１＊アクチベータ、例えば二価抗ＭＵＣ１＊又はＮＭ２３、とりわけ二量体ＮＭ２３又は二量体化を選好する突然変異体、例えばＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ、１つ〜６つのアミノ酸欠失が起こり得るＮＭ２３のＣ末端欠失体、又は更にＮ末端に１つ〜６つのアミノ酸欠失を有する、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ若しくはＮＭ２３−Ｐ９６Ｓを含む最小幹細胞培地（ＭＭ又はＭＮ６）中の表面上でより良好に成長し、Ｃ末端に６つの欠失を有するＮＭ２３−Ｐ９６Ｓが、可溶性画分において二量体の大部分を産生することから、好ましいことが発見された。加えて、抗ＭＵＣ１＊抗体の薄層をプラスチック容器、組織培養処理プレート、Ｖｉｔａ様表面又はＶｉｔａ（商標）表面等の表面に塗布する場合、幹細胞増殖が増進し、自然分化が阻害された。さらに、ＦＧＦ及びマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地（ＣＭ）中で培養した幹細胞は、ＦＧＦ−ＣＭ中でプレーティングした場合、Ｖｉｔａ表面への付着不良を示した。対照的に、細胞をＦＧＦ−ＣＭではなくＮＭ２３−ＭＭ培地中でプレーティングし、その後培養した場合は、細胞は付着するとともに成長した。ＦＧＦ−ＣＭ（馴化培地）で成長させた細胞を採取し、その後プレーティングする前に短時間、ＮＭ２３−ＭＭ中でインキュベートした場合、付着及びその後の成長が改善した。
【００６５】
国際公開第２００９／１０５５７０号に記載されるような規定の表面、より具体的には１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％であり、接触角が１４．３度〜１８．８度である表面の性能は、抗ＭＵＣ１＊抗体及びＮＭ２３、特に二量体形成を選好する突然変異体ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇを含む、ＭＵＣ１＊受容体を二量体化する作用物質の層を添加することによって大幅に改善した。本発明は、ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質を、国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面上に付着させることに関するものである。好ましい実施形態では、作用物質は二価抗ＭＵＣ１＊抗体である。モノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ３及び２Ｄ６Ｃ８が特に好ましい。本発明は、抗体を国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の表面に接触したタンパク質又は重合体の層に被覆又は付着させることを更に含む。
【００６６】
本発明は、国際公開第２００９／１０５５７０号に記載の平板固体基質と本質的に同じ割合（％）のＮ、Ｏ及びＮ＋Ｏである化学組成をもたらす表面、より具体的には１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％であり、接触角が１４．３度〜１８．８度である表面上での重合体の生成にも関する。ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質は、任意でこれらの基質に付着させ、ヒト幹細胞の成長及びヒト幹細胞の分化の阻害を改善し、ナイーブ幹細胞の集団を単離及び増進させることができる。
【００６７】
本発明のキットは、表面の化学組成がおおよそ、１．７％〜２．１％の窒素と、２６．４％〜２８．７％の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて２８．２％〜３０．７％であり、接触角が１４．３度〜１８．８度である、細胞培養用の容器と、ＭＵＣ１＊を二量体化する作用物質、例えば二価抗ＭＵＣ１＊若しくはＮＭ２３若しくは二量体形態のＮＭ２３、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ、又はそれらの突然変異体、及び１つ〜６つのＣ末端アミノ酸欠失を有するものを含む培地中で細胞を培養するための使用説明書とからなり得る。
【００６８】
本発明者らは、ヒトナイーブ幹細胞がＭＵＣ１＊経路を介して成長し、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子受容体）経路では成長しないことを発見した。
【００６９】
さらに本発明者らは、プライム幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ（人工多能性幹）細胞を、ＭＵＣ１＊成長因子受容体経路を活性化することによって、ナイーブ状態へと安定して変換させることができることを発見した。
【００７０】
さらに本発明者らは、ヒト幹細胞は、マウス細胞、例えばマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞由来の分泌物の存在下で培養した場合、ＭＵＣ１＊経路が活性化していたとしてもプライム状態へと進行するか、又はナイーブ状態へと戻すことができないことを発見した。対照的に、最小培地＋ＮＭ２３（任意でＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体）中、ヒトフィーダー細胞、例えばＨＳ２７包皮線維芽細胞フィーダー細胞上で培養したヒト幹細胞は、よりナイーブな幹細胞として成長し、無期限に連続継代によってその状態に維持することができる。
【００７１】
ＭＵＣ１＊成長因子受容体を活性化することに加えて、マウス幹細胞を成長させる或る特定の経路を活性化させる必要がない。ＦＧＦはナイーブ状態でヒト幹細胞を培養するのに、培地に添加するべきではない。同様に、ヒト幹細胞は、マウスフィーダー細胞上で培養した場合、プライム状態へと進行する。
【００７２】
対照的に、ヒトナイーブ幹細胞は、ＭＵＣ１＊アクチベータ、例えばＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇとともに培養し、ヒト（非マウス）フィーダー細胞、例えばＨＳ２７包皮線維芽細胞上で、又は異種成分を含まない表面上で成長させた場合、ナイーブ状態又は少なくともよりナイーブな状態に安定して維持するとともに伝播する。細胞に作用し、プライム状態へと成熟させる因子を分泌しない異種成分を含まない表面としては、標準的なプラスチック容器、細胞培養処理プレート、高い結合能を有する基質、例えばＶｉｔａ又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（これらは全て、幹細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＭＵＣ１＊、抗Ｔｒａ  １−８１／１−６０又は抗ＳＳＥＡ３／４等によって任意で誘導体化することができる）が挙げられる。
【００７３】
ＭＵＣ１＊成長因子受容体の経路は、ＮＭ２３、特にＮＭ２３二量体によって活性化される。本発明者らは典型的に、最小幹細胞培地＋二量体化を選好し、ＭＵＣ１＊受容体を活性化しない高次多量体を形成しない突然変異体であるＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体中で細胞を培養することによって、ナイーブ幹細胞の成長を活性化した。他のＭＵＣ１＊アクチベータとしては、二量体化するＭＵＣ１＊部分と結合する二価抗体が挙げられる。例えば、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインの４５アミノ酸に対する抗体は、ＭＵＣ１＊成長因子受容体を二量体化するとともに活性化し、幹細胞の成長を支持する。
【００７４】
本明細書に開示される発見は広範囲にわたって影響を及ぼす。初めに、現行のほとんどのヒト幹細胞は、ＦＧＦ中、マウスフィーダー層上で又はマトリゲル上で成長させ、ＦＧＦ＋マウスフィーダー細胞由来の馴化培地を与えたものである。本明細書で提示された所見によって、ＦＧＦ及びマウスフィーダー細胞はともに、ヒト幹細胞を欠損させ（corrupt）、プライム状態への進行を誘導することが示される。該プライム状態は、機能的な成体細胞へと成熟することができない非生産性状態であり得る。そのため、ヒト幹細胞から機能的な成体細胞を得るために、開始細胞はナイーブ状態でなければならない。幹細胞分野での主な問題は、多くの細胞は機能的な成体細胞へと成熟させることができず、また生体細胞へと成熟させることができたとしても、それは非常に稀なことであるということである。これらの研究によって、主な問題は、現在使用されているヒト幹細胞が、ヒトではない経路に曝されることで欠損することであることが証明されている。したがって、機能的な成体細胞へと成熟することができる幹細胞を得るためには、幹細胞をＭＵＣ１＊アクチベータ、例えば二量体形態のＮＭ２３中で培養させなければならず、またフィーダー細胞を使用する場合は常に、フィーダー細胞はヒト由来でなければならない。
【００７５】
全て「プライム」状態であったこれまでのヒト幹細胞の特性化により推測されること
本明細書に開示される発見によって、欠損した幹細胞を用いた研究に基づく現在の「発見」の多くもまた欠損したものであることが示される。ＦＧＦ経路により及び／又はマウスフィーダー細胞若しくはその馴化培地で成長させた幹細胞の研究により得られたデータは、どの所見がヒトに適用され、どの所見がヒトに適用されないのかを決定することができない関連データと関連のないデータとが混ざったものである。例えば、がんの治療に対する新たなアプローチは、分化を誘導することによってがん細胞の自己複製能を抑制することである。がん細胞のマイクロＲＮＡを、幹細胞、特に新たに分化する幹細胞のマイクロＲＮＡと比較して、どの調節因子ががん細胞に欠けているかを決定するという研究を行った。理論としては、欠けている分化を誘導するマイクロＲＮＡをがん細胞に導入し、がん細胞がより健常細胞のように働くようにがん細胞を「再プログラミング」することができるというものであった。このこれまでの一連の研究の問題は、分析したマイクロＲＮＡがＦＧＦを用いて、マウスフィーダー細胞上で成長させた幹細胞由来のものであるということであった。数多くの証拠が、ｂＦＧＦがヒト多能性幹細胞ではなく、マウス幹細胞を成長させる成長因子であることを裏付けている。現在、本発明者らは、ｂＦＧＦ及びマウスフィーダー細胞がともに、ヒト幹細胞をその自然のナイーブ状態から離脱させ、「プライム」状態又は「マウス−ヒトキメラ」にする因子を分泌することを認識している。プライム状態は、ナイーブ幹細胞で発現されるものとは大きく異なる遺伝子発現パターン、その結果として大きく異なるマイクロＲＮＡ発現パターンを特徴とする。したがって、分化の開始を示唆するものとして同定され、そのため潜在的ながん治療に有用であるとされてきたマイクロＲＮＡの大部分とは言わないまでも多くが、マウス幹細胞分化の開始のみを示唆するものにすぎないか、又はヒトナイーブ幹細胞がＭＵＣ１＊経路を介して伝播し、通常、ナイーブ状態からしか分化することができない自然状態とは全く関連するものではない。そのため、これまでにヒト幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものとして同定されたマイクロＲＮＡは、偽多能性の非自然状態からの離脱を示唆するマイクロＲＮＡであるにすぎず、そのためヒトのがんの治療には全く役に立たない。したがって、がんを治療するのに使用することができる、分化を誘導するマイクロＲＮＡプロファイルを正確に同定するためには、マウス幹細胞経路ではなくヒト幹細胞経路を刺激する成長因子下で培養された、ヒト幹細胞において自然な多能性状態であるナイーブ幹細胞を使用する必要がある。ヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化を調節するマイクロＲＮＡを正確に同定する方法は、ナイーブ状態から分化させたヒトナイーブ幹細胞に対して差分分析を行うことである。次いで、ナイーブ幹細胞が分化を開始した時点で上方調節されているマイクロＲＮＡを同定し、それをがんの治療に使用することができる。好ましい実施形態では、ナイーブ細胞は、ＮＭ２３（二量体形態）中、抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆した表面上でヒト幹細胞を培養することによって得られる。より好ましい実施形態では、抗ＭＵＣ１＊抗体で被覆した表面はＶｉｔａ様表面である。他の実施形態では、ナイーブ様幹細胞を、ＮＭ２３二量体中、不活性化ヒトフィーダー細胞の層上、又はヒトがん細胞の層上、又はそれらの分泌物の存在下で培養することができる。新たに分化したナイーブ幹細胞に存在するが、がん細胞では欠けているマイクロＲＮＡを同定し、それを抗がん治療剤として使用する。
【００７６】
過去の国際公開第２０１１／１５９９６０号において、本発明者らは、がん細胞が幹細胞増殖プラトーに陥った細胞であるという証拠を提示している。本発明者らは、がん細胞は種類によって、同時に培養することができるものもあれば、できないものもあることに言及している。本発明者らは、同時に培養することができるがん細胞は、同じような幹細胞増殖プラトーに陥っており、それらの成長はマイクロＲＮＡの同じシグネチャによって調節されると述べている。同時に培養することができるがん細胞は、原発臓器とは独立して同じがん型に属する。各がん型を調節する各シグネチャにおける個々のマイクロＲＮＡの同一性は、大規模シークエンシング及び全トランスクリプトーム分析等の技法を用いて決定することができる。様々な亜型のがんのマイクロＲＮＡシグネチャが同定されれば、患者に影響を与えているものとは異なるがん型の１つ又は複数のマイクロＲＮＡシグネチャを混合することによって、がんを治療又は予防することができる。代替的なアプローチでは、ヒトナイーブ幹細胞を様々な増殖プラトーに維持するマイクロＲＮＡシグネチャを決定することができ、それからそれらの様々なマイクロＲＮＡシグネチャを混合して、がんワクチンを作製することができる。
【００７７】
ＭＵＣ１
ＭＵＣ１は、Ｃ末端から始まり、細胞膜を通り、細胞外ドメインへと出るという順番で列挙される、本明細書中で以下のように呼ばれる幾つかの領域を含む。ＭＵＣ１受容体の基本構造は、１）細胞質尾部と、２）膜貫通部と、３）ＭＧＦＲと、４）ＩＢＲと、５）特異領域と、６）反復領域と、シグナルペプチドを含むＮ末端領域とを含む。ＭＵＣ１並びに正常細胞及び腫瘍細胞におけるその機能の詳細な説明に関しては、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３２８２１号（その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする）の細胞表面上の切断されたＭＵＣ１の機能及び活性の記載を参照されたい。
【００７８】
「ＭＵＣ１成長因子受容体」（ＭＧＦＲ）という用語は、成長因子等の活性化リガンド、又は切断酵素等の修飾酵素と相互作用して細胞増殖を促進する、ＭＵＣ１受容体部分を意味する機能定義語である。ＭＵＣ１のＭＧＦＲ領域は、細胞表面に最も近く、以下で規定されるＰＳＭＧＦＲの大部分又は全てによって規定される細胞外部分である。ＭＵＣ１の正確な切断部位は知られておらず、さらにこのタンパク質を切断する酵素は１つ又は複数の場所で切断を行うことができる。さらに、切断産物であるＭＵＣ１＊成長因子受容体形態は、細胞型に基づき様々な場所で切断することができると考えられる。ＭＧＦＲには、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方が包含される。本発明の結果は、細胞からのＩＢＲの一部又は全ての放出を引き起こす腫瘍形成に関連する部位でのＭＵＣ１切断の際に、この部分をリガンドに接近可能にさせる機構と一致するものである。ＭＧＦＲはＭＵＣ１＊としても知られる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「抗ＰＳＭＧＦＲ」は、ＭＧＦＲの領域、及び任意でＰＳＭＧＦＲの任意の部分を認識する任意の抗体を指す。ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲに対する抗体が本願で例示され、また好ましいが、この特定の配列に対する抗体に限定されることを意味するものではなく、ＭＧＦＲ及びＰＳＭＧＦＲの他のフラグメントも考慮される。
【００８０】
抗ＭＵＣ１＊抗体は、幹細胞、前駆細胞又はがん細胞に存在する、タンデムリピートドメインを欠いたＭＵＣ１タンパク質を認識する任意の抗体を指す。「ＭＵＣ１成長因子受容体の一次配列」（ＰＳＭＧＦＲ）という用語は、下記で規定されるように、場合によってＭＧＦＲのほとんど又は全てを規定するペプチド配列、並びに該ペプチド配列の機能的変異体及びフラグメントを指す。ＰＳＭＧＦＲは、下記の表１で挙げられる配列番号１０、並びに最大２０（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）という任意の整数値のアミノ酸置換、及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端に最大２０という任意の整数値のアミノ酸付加若しくはアミノ酸欠失を有する全てのその機能的変異体及びフラグメントとして規定される。上記の内容において「機能的変異体又はフラグメント」は、配列番号１０のペプチドと特異的に結合する又はそうでなければ特異的に相互作用するリガンドと特異的に結合する又はそうでなければ特異的に相互作用することができるような変異体又はフラグメントを指す。配列番号１０のＰＳＭＧＦＲペプチド（「天然」であるとしてｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲと称される）の機能的変異体であるＰＳＭＧＦＲの一例は、配列番号１２（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲと称される）であり、これは天然の−ＳＲＹ−の代わりに−ＳＰＹ−配列を含むという点でｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとは異なるものである（配列表の太字を参照されたい）。ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲは、天然型と比較して配座安定性が増進されており、このことは抗体産生等の或る特定の用途にとって重要であり得る。ＰＳＭＧＦＲには、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方が包含される。
【００８１】
表１：ペプチド配列（Ｎ末端からＣ末端へと列挙される）：
完全長ＭＵＣ１受容体（ムチン１前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ１５９４１）
MTPGTQSPFF
LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL
APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS  APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS  APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR
ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS
NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ
FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN
YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL（配列番号１）
【００８２】
ＭＵＣ１受容体及び切断型アイソフォームを細胞膜表面へと指向するＮ末端ＭＵＣ−１シグナル伝達配列。配列番号２、配列番号３及び配列番号４の変異体によって示されるように、Ｃ末端において最大３個のアミノ酸残基が欠けていてもよい。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT（配列番号２）
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT
VVTA（配列番号３）
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT
VVTG（配列番号４）
【００８３】
Ｎ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲを有し、完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型ＭＵＣ１受容体アイソフォーム（翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のＮ末端シグナル配列を除いて示した「ＰＳＭＧＦＲＴＣ」の一例である「ｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲＴＣアイソフォーム」）：
G TINVHDVETQ
FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN
YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL（配列番号５）
【００８４】
Ｎ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲとＰＳＩＢＲとを有し、完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型ＭＵＣ１受容体アイソフォーム（翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のＮ末端シグナル配列を除いて示した「ＣＭアイソフォーム」）：
GFLGLS
NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG
IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE
KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL（配列番号６）
【００８５】
Ｎ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ＋ＰＳＩＢＲ＋特異領域を有し、完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型ＭＵＣ１受容体アイソフォーム（任意のＮ末端シグナル配列を除いて示した「ＵＲアイソフォーム」）：
ATTTPASKST
PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS TVPPLTSSNH
STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ
FNQYKTEAAS
RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL
VALAIVYLIA
LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP
PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL（配列番号７）
【００８６】
完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型ＭＵＣ１受容体アイソフォーム（翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のＮ末端シグナル配列を除いて示した「Ｙアイソフォーム」）：
GSGHASSTPG
GEKETSATQR SSVPSSTEKN AFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ
LTLAFREGTI NVHDMETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA
LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS
YTNPAVAATS ANL（配列番号８）
【００８７】
Ｎ末端にｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ＋ＰＳＩＢＲ＋特異領域＋反復配列を有し、完全長ＭＵＣ１受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型ＭＵＣ１受容体アイソフォーム（翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のＮ末端シグナル配列を除いて示した「Ｒｅｐアイソフォーム」）：
LDPRVRTSAP
DTRPAPGSTA PQAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP
DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP
DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP
DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DNRPALGSTA PPVHNVTSAS
GSASGSASTL VHNGTSARAT TTPASKSTPF SIPSHHSDTP TTLASHSTKT DASSTHHSSV PPLTSSNHST
SPQLSTGVSF FFLSFHISNL QFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ
LTLAFREGTI NVHDVETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA
LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS
YTNPAVAAAS ANL（配列番号９）
【００８８】
ＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ）：
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１０）
【００８９】
配列番号１０のＮ末端に単一アミノ酸欠失を有する、ＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｎａｔ−ＰＳＭＧＦＲ）：
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１１）
【００９０】
安定性が増進したＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列の「ＳＰＹ」機能的変異体（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ）：
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１２）
【００９１】
配列番号１２のＣ末端に単一アミノ酸欠失を有する、安定性が増進したＭＵＣ１成長因子受容体の天然一次配列の「ＳＰＹ」機能的変異体（「ＰＳＭＧＦＲ」の一例であるｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲ）：
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１３）
【００９２】
切断型ＰＳＭＧＦＲ受容体（ＴＲ）（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲの「ＳＰＹ」配列を有する）：
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS（配列番号１４）
【００９３】
ＭＵＣ１成長因子受容体の拡張配列（ＥＳＭＧＦＲ）（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲの「ＳＰＹ」配列を有する）：
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPF（配列番号１５）
【００９４】
ＭＵＣ１成長因子受容体の腫瘍特異的拡張配列（ＴＳＥＳＭＧＦＲ）（ｖａｒ−ＰＳＭＧＦＲの「ＳＰＹ」配列を有する）：
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS
DVPFPFSAQSGA（配列番号１６）
【００９５】
鎖間結合領域の一次配列（ＰＳＩＢＲ）：
GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE（配列番号１７）
【００９６】
切断型鎖間結合領域（ＴＰＳＩＢＲ）：
SVVVQLTLAFREG（配列番号１８）
【００９７】
反復モチーフ２（ＲＭ２）：
PDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA（配列番号１９）
【００９８】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によりその範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の多様な変更形態が、上記の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなる。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。以下の実施例は、本発明の例示として与えられるものであり、限定するものとして与えられるものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例１．１  −  幹細胞最小培地「ＭＭ」
最小培地（「ＭＭ」）５００ｍＬには以下のものが含まれる：４００ｍｌのＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Invitrogen、＃１０５６５−０１８）、１００ｍｌのノックアウト血清代替物（Invitrogen、＃１０８２８−０２８）、５ｍｌの１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen、＃１１１４０−０５０）、０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）のβ−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック液、Invitrogen、＃２１９８５−０２３）、任意で異物混入のリスクを最小限にするために２．５ｍｌのＰＳＡ（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン）（MP Biochem、＃１６７４０４９）を含んでいてもよい。
【０１００】
実施例１．２  −  幹細胞規定培地−「ＭＮ６」
６成分最小培地「ＭＮ６」は、１％非必須アミノ酸と、６４ｍｇ／Ｌアスコルビン酸（Sigma）と、１４ｕｇ／Ｌセレン酸ナトリウム（Sigma）と、１９．４ｍｇ／Ｌインスリン（Sigma）と、５４３ｍｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Sigma）と、１０．７ｍｇ／Ｌトランスフェリン（Sigma）とが添加された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ又は細胞培養に好適な同様の基本培地からなるものである。
【０１０１】
実施例１．３  −  抗体で被覆した表面への幹細胞の付着を促すポリクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体
ウサギポリクローナル抗体は、動物をＭＵＣ１成長因子受容体ペプチドの一次配列（ＰＳＭＧＦＲ）を用いて免疫化させることによって生成した。血清を標準方法に従って採取した後、ＰＳＭＧＦＲペプチド又は最後の１０個のＣ末端アミノ酸を欠いたＰＳＭＧＦＲペプチド「Ｃ−１０ペプチド」のいずれかを結合させたアフィニティーカラム上で精製した。次いで精製した抗体（それぞれＳＤＩＸ−抗ＦＬＲ及びＳＤＩＸ−抗Ｃ−１０）をプラスチック製の細胞培養プレート（Ｖｉｔａプレート、ThermoFisher、又はBD
Falcon、＃３５３０４６）上に直接被覆し、該抗体が幹細胞の付着を促すことを確認した。表面を抗体で被覆するために、完全な表面被覆を可能にする一定容量のＰＢＳ中で１ｕｇ／ｍＬ〜３００ｕｇ／ｍＬの濃度の抗体を４℃で一晩、又は室温でおよそ３時間、インキュベートした。これらの抗ＰＳＭＧＦＲ表面に結合するヒト幹細胞及び付着量は表面上に被覆される抗体の濃度に対応するものであり、対照抗体では幹細胞の付着は全く起こらなかった。図２４ａ〜図２４ｃを参照されたい。ヒト幹細胞Ｈ９（WiCell）及びＢＧＯ１Ｖ／ｈＯＧ細胞（Life Technologies）は、低ナノモル濃度の二量体形態のＮＭ２３−Ｈ１の存在下で最小幹細胞培地「ＭＭ」単独、又はヒト若しくはマウスのいずれかの線維芽細胞フィーダー細胞由来の５０％馴化培地が添加されたＭＭ＋４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ中で培養した場合、未分化幹細胞として付着するとともに増殖した。プレート表面に付着した二価抗ＰＳＭＧＦＲ抗体が、ＭＵＣ１＊受容体の二量体化を引き起こし、そのことから成長因子として作用したと結論づけた。しかしながら、細胞は培地にＮＭ２３（二量体）を添加した場合により高速で増殖した。
【０１０２】
実施例２  −  表面へのヒト幹細胞の付着を促すモノクローナル抗体、２Ｄ６Ｃ８及び２Ｄ６Ｃ３（本明細書ではＣ３及びＣ８とも称される）の開発
細胞表面からはより遠位にあるＭＵＣ１＊細胞外ドメイン部分と選択的に結合するＭＵＣ１＊モノクローナル抗体を同定し、これらのモノクローナル抗体が、表面へのヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞の付着をより良好に促すことを確認した。マウスをＰＳＭＧＦＲ配列で規定されるペプチドを用いて免疫化した。ハイブリドーマクローンの上清を、ＰＳＭＧＦＲペプチドとの結合能に関してＥＬＩＳＡによって試験するとともに、どれが生きたＭＵＣ１＊陽性細胞と結合するかを決定するためにＦＡＣＳによって試験した。ハイブリドーマは、１０Ｃ末端アミノ酸を欠いたＰＳＭＧＦＲペプチドとは選択的に結合するが、該ペプチドが１０Ｎ末端ペプチドを欠いていると結合しない場合に更に選択された。加えて、ハイブリドーマを、プラスチック製の細胞培養プレート等の表面への幹細胞の付着を促す能力に関してスクリーニングした。これらのクローンの中で、表面上に被覆した場合、幹細胞を捕獲するとともにその成長を促す２Ｄ６Ｃ８及び２Ｄ６Ｃ３という２つのクローンを選択した。
【０１０３】
図１３は２Ｄ６Ｃ３κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１：RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号２０）、ＣＤＲ２：KVSNRFS（配列番号２１）、及びＣＤＲ３：FQGSHVPFT（配列番号２２）。
【０１０４】
図１４は２Ｄ６Ｃ３重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１：GYAMS（配列番号２３）、ＣＤＲ２：TISSGGTYIYYPDSVKG（配列番号２４）、及びＣＤＲ３：LGGDNYYEY（配列番号２５）。
【０１０５】
図１５は２Ｄ６Ｃ８κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１：RASKSVSTSGYSYMH（配列番号２６）、ＣＤＲ２：LVSNLES（配列番号２７）、及びＣＤＲ３：QHIRELTRSE（配列番号２８）。
【０１０６】
図１６は２Ｄ６Ｃ８重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１：GYAMS（配列番号２９）、ＣＤＲ２：TISSGGTYIYYPDSVKG（配列番号３０）、及びＣＤＲ３：LGGDNYYEY（配列番号３１）。
【０１０７】
図１７は３Ｃ２Ｂ１κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１：RASKSISTSDYNYIH（配列番号３２）、ＣＤＲ２：LASNLES（配列番号３３）、及びＣＤＲ３：QHSRELPLTF（配列番号３４）。
【０１０８】
図１８は３Ｃ２Ｂ１重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１：TYTMS（配列番号３５）、ＣＤＲ２：TISTGGDKTYYSDSVKG（配列番号３６）、及びＣＤＲ３：GTTAMYYYAM（配列番号３７）。
【０１０９】
実施例２．１  プラスチック容器上に被覆したモノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ８又は２Ｄ６Ｃ３はヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞の付着を促す
モノクローナル抗体２Ｄ６Ｃ８又は２Ｄ６Ｃ３を多様なプラスチック製の細胞培養プレート上に被覆し、多様な細胞源由来のヒト幹細胞を捕獲する能力に関して試験した。３ｕｇ／ｍＬ〜１２５ｕｇ／ｍＬの範囲の濃度の抗体およそ１ｍＬを多様なメーカーからの標準的なプラスチック容器又は組織培養処理プラスチック容器上に被覆した。表面への抗体及び続く幹細胞の付着に関しては、組織培養処理プレートが未処理のポリスチレンよりも僅かに優れていたことが観察された。先の実施例と同じように、最小幹細胞培地（ＭＭ）単独中での成長によって幹細胞の増殖が起こったが、低ナノモル濃度のＮＭ２３−Ｈ１（二量体）又は二価抗ＰＳＭＧＦＲ抗体が培地中に存在する場合に、この増殖が大幅に改善されたことが観察された。
【０１１０】
実施例３  −  ２Ｄ６Ｃ８又は２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａプレートがＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成長の付着を促す
非被覆の（bare）又は１２５ｕｇの２Ｄ６Ｃ８モノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体若しくは２Ｄ６Ｃ３モノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体のいずれかで被覆したＶｉｔａプレート（ThermoFisher）を、幹細胞の付着、及び続く成長を促す能力に関して試験した。ＭＥＦフィーダー細胞上で成長させ、最小幹細胞培地（ＭＭ）＋８ｎＭ  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で培養した胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｈ９）を手動で採取し、コロニー片をＶｉｔａ単独又は２Ｄ６Ｃ８  ｍａｂで被覆したＶｉｔａ又はＶｉｔａ＋２Ｄ６Ｃ３  ｍａｂ上にプレーティングした。第２の幹細胞源を同一の表面上にプレーティングした。これらは、マトリゲル上で成長させ、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞由来の５０％馴化培地中で培養したＨ９  ＥＳ細胞であった。未分化コロニーを手動で切り取り（dissected）、採取した後、Ｖｉｔａ単独又はＶｉｔａ＋抗ＭＵＣ１＊抗体上にプレーティングした。プレーティング後、幹細胞を培地中で培養させた。どちらの培地でも、細胞を二量体形態の８ｎＭ  ＮＭ２３又は４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ＋マウスフィーダー細胞由来の５０％馴化培地中で予め成長させた。驚くべきことにｂＦＧＦ−ＭＥＦ−ＣＭ中で培養した幹細胞を除く、Ｖｉｔａ単独及びＶｉｔａ＋２Ｄ６Ｃ８の両方に付着するＮＭ２３−ＭＭ中で培養した幹細胞が付着不良を示し、付着した僅かの細胞が１〜２日後に線維芽細胞様細胞へと分化するか又は死滅した。Ｖｉｔａ単独表面に結合したＮＭ２３−ＭＭ幹細胞は、Ｖｉｔａ＋２Ｄ６Ｃ８抗体表面上のものより迅速に分化した。細胞源の細胞がＮＭ２３中で培養され、表面が抗ＰＳＭＧＦＲ抗体（２Ｄ６Ｃ８）で被覆したＶｉｔａプレートであった場合、プレーティングの８日後まで未分化コロニーのままであった。これらのコロニーは、採取し、新たなＶｉｔａ＋２Ｄ６Ｃ８表面上で継代したところ、更に５日間、成長速度が低減せずに未分化コロニーとして成長し続けた。実験設定及び実験結果を図１に示す。図２は、図１の実験設定において見られるような、培地を変える前である２日目のウェルの写真を示している。ｂＦＧＦ及び馴化培地中で培養したウェル内の細胞は付着せず、１回目の培地の交換によって失われた。ＮＭ２３−ＭＭ中で培養した左側の（left-most）カラムのウェル内の細胞は両方とも未分化幹細胞コロニーを形成した（図２、図３）。しかしながら、２Ｄ６Ｃ８抗体で被覆した表面のみでコロニーが生じ、５日目まで未分化のままであったため（図４）、連続継代することができた。結論として、Ｖｉｔａ表面単独では、２Ｄ６Ｃ８又は２Ｄ６Ｃ３等の抗ＰＳＭＧＦＲ抗体で被覆したＶｉｔａ表面と同様にヒト幹細胞の成長を支持することはできなかった。さらに、ｂＦＧＦ＋フィーダー細胞馴化培地中で培養した場合、抗体被覆を行っても又は行わなくてもＶｉｔａ表面上でプレーティングした幹細胞は成長が促されることはなかった。図５の実験設定、並びに図６（２日目）及び図７（７日目）の画像は、細胞を抗体被覆表面上にプレーティングする際に幹細胞の体積が低減する場合、細胞付着及びコロニー形成が３倍超になることを示している。４ｍＬではなく１ｍＬのプレーティング細胞で、より大きな体積の３つのコロニー付着と比較して最大１４個のコロニーが形成された。図６及び図７で言及されている時間は、ＭＭ単独中で細胞をプレーティングした時点と、二量体形態のＮＭ２３を添加した時点との間の時間に相当する。該時間はプレーティング後０分〜３時間で最適であると考えられる。
【０１１１】
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を図８の実験設定に従って化学分析し、結果を図９に示す。ａ）予め８ｎＭ  ＮＭ２３二量体中、マトリゲル上で培養した細胞、又はｂ）予め４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ中、マウス線維芽細胞フィーダー細胞上で培養した細胞という２つの細胞源からのｉＰＳ細胞を試験した。幹細胞コロニー片を１ｍＬの８ｎＭ  ＮＭ２３（二量体）−最小培地（ＭＭ）中でプレーティングし、３時間放置した後、体積を６ウェルプレートの１ウェル当たり４ｍＬまで増大させた。培地は４８時間ごとに交換した。細胞を、細胞が過剰成長するようになり、分化し始める７日目まで成長させ、それによってどの条件が全体的な付着、増殖及び分化の阻害に最良であったかを評価した。結論として、両ＭＵＣ１＊抗体によって、Ｖｉｔａ表面がより長い期間、分化を阻害するのに良好なものとなる。Ｖｉｔａ＋抗体表面は、５日目で１００％未分化なコロニーを含み、７日目まで最も多くの細胞と最も少ない分化と示した。
【０１１２】
実施例４  −  ＮＭ２３（二量体）含有培地中、抗ＰＳＭＧＦＲ抗体被覆表面上での幹細胞の成長に関するプロトコルの最適化
ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞の付着及び増殖の効率を改善する幾つかの要因を特定した：１）トリプシン処理した（又はそうでなければ単一の）幹細胞は、抗ＰＳＭＧＦＲ抗体被覆表面を使用する場合、特にベース表面がＶｉｔａ表面と類似の原子組成の表面である場合、コロニー片よりも良好に作用し、２）予め低ナノモル濃度の二量体ＮＭ２３中、フィーダー細胞又はマトリゲル等の他の表面上で培養した細胞はｂＦＧＦ中で培養した細胞よりも良好であったが、この効果はプレーティングの直前の低ナノモル濃度の二量体ＮＭ２３中での３０分のインキュベーションによって最小限になる場合があり、３）プレーティング後の初めの２４時間のＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用によって、幹細胞の付着が改善されるが、幹細胞の生存には影響を与えなかった。さらに、幹細胞成長培地の容量を６ウェルプレートの１ウェル当たり４ｍＬから２ｍＬ又は１ｍＬへと低減させることで幹細胞の付着が増進したことに注目した。さらに、細胞成長培地を４８時間ごとではなく２４時間ごとに交換し、４ｍＬではなく２ｍＬの培地を用いることで、一部の細胞型の維持が改善した。
【０１１３】
実施例４．１  −  幹細胞培養に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤の効果
先の実験では、付着の不良又は塊状での細胞付着のために継代中に幹細胞が大幅に喪失した。本実験では、Ｖｉｔａ表面＋Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ：Ｙ−２７６３２、Calbiochem）又はＲＯＣｉを含まないＶｉｔａ＋抗ＭＵＣ１＊抗体又はＶｉｔａ表面＋抗ＭＵＣ１＊抗体＋ＲＯＣｉ上でのｉＰＳ細胞及びＥＳ  Ｈ９細胞の両方に関する付着、成長及び分化を比較した。細胞の塊化を最小限に抑えるために、初めに未分化幹細胞コロニー片をトリプシン処理し、単一細胞を得た（トリプシンは０．０５％で使用し、０．５ｇ／Ｌ又は２１．４５μＭであり、５０ｍｌの１×溶液として供給されている（Mediatech, Inc.、カタログ番号：２５−０５２）。
【０１１４】
実験設定の第１の部分を図１０に示す。初めに採取した細胞をＮＭ２３−ＭＭ中、１５分間事前にインキュベートした後、洗い流して、１ウェル当たり１ｍＬのＭＭ中でプレーティングした。僅か１５分後、８ｎＭ  ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇを添加し、最終容量を１ウェル当たり４ｍＬとした。図１１から分かるように、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）は、幹細胞を表面に付着させる前に溶液中で幹細胞が塊化するのを防ぐ。実験終了時には、同等品質の同等数のコロニーが存在していたが、これらの結果は、少なくとも初めの２４時間〜４８時間は、ＮＭ２３−ＭＭにＲＯＣｉを添加したＶｉｔａ＋抗体表面からより多くのコロニーが生じたことを示している。実際、任意の細胞源のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液にして、前もってｂＦＧＦ中で培養していれば少なくとも１５分間、低ナノモル濃度の二量体形態のＮＭ２３中で予めインキュベートして、抗ＰＳＭＧＦＲ抗体で被覆した表面上にプレーティングした後、初めの２４時間〜４８時間、低ナノモル濃度のＮＭ２３二量体＋ＲＯＣｉ中で培養した場合、未分化状態での幹細胞の付着及び増殖は少なくとも１０倍〜１００倍に増大した。図１２ａは、８ｎＭ  ＮＭ２３二量体−ＭＭ中、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上での培養物から採取し、各種濃度のＤ２６Ｃ３抗ＰＳＭＧＦＲ抗体で被覆したＶｉｔａ表面上に、初めの４８時間だけ１０ｕＭ  ＲＯＣｉでプレーティングしたヒトＥＳ  Ｈ９細胞のプレーティング後５日目の画像を示している。図１２ｂ〜図１２ｄはこれらの細胞の拡大写真である。
【０１１５】
実施例５  −  Ｖｉｔａ表面技術の改善
本実験では、前もってｂＦＧＦ中、ＭＥＦフィーダー細胞上で培養した後、単一細胞として、ａ）Ｖｉｔａ表面上にプレーティングし、次いで４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、５０％  ＭＥＦ馴化培地及び１０ｕＭ  ＲＯＣｉ（Ｙ−２７６３２、Calbiochem）中で培養するか、又はｂ）１２．５ｕｇ／ｍＬ  Ｄ２６Ｃ３抗ＰＳＭＧＦＲ抗体で被覆したＶｉｔａプレート上にプレーティングし、次いで初めの４８時間のみ１０ｕＭ  ＲＯＣｉを存在させて８ｎＭ  ＮＭ２３二量体−ＭＭ中で培養した、ヒト幹細胞の付着、成長、及びヒトＥＳ細胞の自然分化に対する耐性を比較した。図１２ｅに示される比較によって、表面を抗ＰＳＭＧＦＲ抗体で被覆すること又は細胞をＮＭ２３二量体−ＭＭ中で培養することを含むものではなかった現行の技術水準を上回る改善が示される。
【０１１６】
実施例６  −  Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の必要性は排除することができる
ＲＯＣｉの有無での幹細胞付着の直接比較において、ＲＯＣｉの非存在下では、幹細胞が表面に付着する前に塊化することが観察された。一部のコロニーが細胞の塊の下に形成されたが、大抵の場合、細胞の塊化は表面への幹細胞の付着過程を阻害するものであった。ＲＯＣｉの存在下で幹細胞の付着で観察された改善は、細胞が表面に付着するまで、単一細胞として細胞の分離状態を維持することであると考えた。代替的に、良好な幹細胞付着が、プレーティング前に幹細胞をトリプシン処理することによって達成された。ＥＤＴＡの添加（本発明者らは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを使用した）によっても、表面への幹細胞の接着が増大した。別の方法では、溶液中に幹細胞を含むプレートを遠心することで、細胞を表面に接触させ、幹細胞付着をもたらし、それによる成長は、プレーティング後、初めの２４時間〜４８時間、１０ｕＭ  ＲＯＣｉが存在する事例と変わらないものであった。
【０１１７】
モデル実験では、ヒトＥＳ  Ｈ９細胞を抗ＰＳＭＧＦＲ抗体（２Ｄ６Ｃ３）で被覆したＶｉｔａ表面上にプレーティングし、細胞をＮＭ２３−ＭＭ中に入れ、細胞をトリプシン処理するか（上段）、１ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下でトリプシン処理するか（中段）、又は１０ｕＭ  ＲＯＣｉの存在下でトリプシン処理した（下段）。図１９から分かるように、トリプシン単独では、細胞の塊化及び表面への付着不良が残り、トリプシン＋ＥＤＴＡは細胞付着を改善したが、細胞はニューロン様表現型へと分化した。図２０は、同じ条件下でプレートを遠心することで表面への幹細胞の付着が大きく改善したことを示している。細胞をプレーティングした後、プレートを、スイングバケット式遠心分離器を用いて１２００ＲＰＭで３〜５分間遠心した。図２０が示すように、細胞を表面に物理的に移動させることで、細胞の塊化が取り除かれ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の必要性が排除された。同様の結果は、細胞含有培地に圧力を加えること、又は細胞が隣接細胞とではなく表面と物理的に接触する可能性を増大させる任意の（of）方法によって達成することができる。
【０１１８】
代替方法において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の使用は、細胞のプレーティング密度を単純に低減させることによっても排除することができることが見出された。ＮＭ２３−ＭＭ単独（ＲＯＣｉなし）中での６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０００個又は５００００個の細胞でプレーティングした、表面に付着させる細胞は、ＲＯＣｉが存在しているかのように正常に増殖する。図２１に示される実験では、ＢＧＯ１Ｖ／ｈＯＧ細胞をトリプシン処理し、計数して、６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０００個又は５００００個の細胞のいずれかでプレーティングして、ＮＭ２３−ＭＭ中で７日間培養した。ＲＯＣｉを使用せずとも、細胞はＲＯＣｉが存在するものと区別なく付着するとともに増殖した。
【０１１９】
更に別の方法では、ｒｈｏキナーゼ阻害剤の必要性が基本培地の組成を単純化することで排除される。低ナノモル濃度の二量体ＮＭ２３を含むが、血清アルブミン又はβメルカプトエタノールを含まない培地によって、ＲＯＣｉの必要性が排除された。例えば、ＮＭ２３−ＭＮ６（ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ、又は１％非必須アミノ酸と、６４ｍｇ／Ｌアスコルビン酸（Sigma）と、１４ｕｇ／Ｌセレン酸ナトリウム（Sigma）と、１９．４ｍｇ／Ｌインスリン（Sigma）と、５４３ｍｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Sigma）と、１０．７ｍｇ／Ｌトランスフェリン（Sigma）とが添加された、細胞培養に好適な類似の基本培地）中で培養したヒトＨ９細胞では、幹細胞の７０％〜９０％の付着及び最適な細胞生存にはＲＯＣｉの使用は必要なかった。（図２６）。
【０１２０】
実施例７  −  異なるＮＭ２３多量体を生成させ、機能に関して化学分析する
実施例７．１  −  組換えＮＭ２３−ｗｔ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇのクローニング
ＷＴ  ＮＭ２３−Ｈ１  ｃＤＮＡを、以下のプライマー:5'-atc
gat gga tcc gat ggc caa ctg
tga gcg tac
c-3'（配列番号３８）及び5'-gtg gtg ctc gag ttc ata
gat cca gtt ctg agc-3'（配列番号３９）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＢａｍＨＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素（New England Biolabs）による消化の後、精製フラグメントを、同じ制限酵素によって消化させたｐＥＴ２１ｂベクター（Novagen）にクローニングした。次いで、以下のプライマー：5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'（配列番号４０）及び5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'（配列番号４１）を使用して、メーカーの使用説明書に従ってＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）部位特異的突然変異誘発システム（Life Technologies）を用いることでＮＭ２３−Ｈ１突然変異体Ｓ１２０Ｇ（＃１２０のセリンをグリシンへと突然変異させた）を生成した。配列確認の後、ＷＴ及び突然変異体ＮＭ２３−Ｈ１構築物を、組換えタンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Life Technologies）へと形質転換させた。
【０１２１】
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ−ＤＮＡ配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号４２）
【０１２２】
ＮＭ２３  Ｓ１２０Ｇ−アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH（配列番号４３）
【０１２３】
実施例７．２  −  組換えＮＭ２３−ｗｔ及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの発現／精製
ＬＢブロス（ルリア−ベルターニブロス）を一晩培養物の１／１０で植菌し、ＯＤ６００がおよそ０．５に達するまで３７℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、０．４ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（IPTG, Sigma）を用いて誘導し、培養を４時間後に停止させた。細胞を遠心分離（４℃で１０分間、６０００ｒｐｍ）によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、３６０ｍＭ  ＮａＣｌ及び８０ｍＭイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）及びＤＮアーゼ（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma）を添加した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間、回転台（２７５ｒｐｍ）の上でインキュベートし、５分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離（４℃で３０分間、２００００ｒｐｍ）によって取り除いた。次いで、残屑を除去した（cleared）溶解物を、泳動バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に適用した。カラムを洗浄した後、４２０ｍＭイミダゾールが添加された泳動バッファーによって、タンパク質をカラムから溶出させた。溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、タンパク質を含む画分を組み合わせた。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。
【０１２４】
実施例７．３  −  タンパク質リフォールディング
ＮＭ２３  Ｈ１  Ｓ１２０Ｇを、変性バッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び８Ｍ尿素を用いて変性させた。次いで、変性タンパク質を透析によってリフォールディングに供した。タンパク質を、１）１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４Ｍ尿素、０．２Ｍイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Fluka）及び５％グリセロール（Acros）、２）１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２Ｍ尿素、０．２Ｍイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロール、並びに３）１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ尿素、０．２Ｍイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して２４時間連続して透析した。次いで、タンパク質を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍイミダゾール、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して９時間、並びに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍイミダゾール、０．１Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して一晩透析した。最後に、タンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２Ｍイミダゾール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５％グリセロールに対して４回バッファーを交換して２４時間透析した。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。不溶性の凝集物を遠心分離（４℃で３０分間、２００００ｒｐｍ）によって取り除き、二量体（およそ３７ＫＤａ）を、泳動バッファーとしてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（GE healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、二量体を含む画分を組み合わせた。
【０１２５】
実施例７．４  −  タンパク質のオリゴマー形成状態
ＮＭ２３タンパク質のオリゴマー形成状態を、ゲル濾過標準（Bio-Rad）で較正したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（GE
healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって推測した。ＮＭ２３機能の重大な特徴はその多量体化状態であり、その中でもＮＭ２３の二量体形態は多能性及び細胞成長を促す活性型である。
【０１２６】
ＮＭ２３  Ｈ１アイソフォームを、野生型タンパク質（ｗｔ）、及び更には単一点突然変異、Ｓ１２０Ｇを有するタンパク質として発現させた。サイズ排除クロマトグラフィー（図２２ａ）、ネイティブゲル、及びウェスタンブロット法（図Ｓ２２）による分析によって、８ｎＭ〜１３ｕＭの濃度では、可溶性ＮＭ２３−ｗｔ及び可溶性ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの大部分が六量体（ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体）であることが示された。しかしながら、上で挙げられたタンパク質リフォールディング法を用いると、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇが変性してリフォールディングし、主に二量体からなる集団を生じ、それをサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製することで、本質的に全て二量体の安定した集団（ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体）を回収した。このようにして、どちらも六量体からなるＮＭ２３−ｗｔ及びＳ１２０Ｇ突然変異体と、本質的に全て二量体であるリフォールディングしたＦＰＬＣ精製ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇとを作製した（図２２ａ及び図Ｓ２２ａ、図Ｓ２２ｂ）。
【０１２７】
表面プラズモン共鳴を用いた直接結合アッセイにおいて、ＮＭ２３の六量体及び二量体のＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドとの結合能をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器で試験した。合成ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ−ＨＩＳ６タグ）を金チップ上に固定した。ＮＭ２３−ｗｔ、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体、又は５０％のＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体を含むサンプルをペプチド表面に別々に流した。ペプチド表面に結合したＮＭ２３の量は、各サンプルに存在する二量体の量に対応するものであった（図２２ｂ）。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体は、固定化ＭＵＣ１＊ペプチドとのロバストな結合を示したが、大部分が六量体であるＮＭ２３−ｗｔ及びＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体は最小結合を示した。ＳＰＲシグナルが、溶液−ペプチド表面の界面で結合した分子種の質量に正比例することに留意されたい。そのため、六量体形態のＮＭ２３がＭＵＣ１＊ペプチド表面に結合した場合、六量体の質量が大きくなることによって、二量体の３倍のレゾナンスユニット（ＲＵ）が生じる。六量体の結合量が最小であったという事実は、ＮＭ２３六量体がＭＵＣ１＊受容体と結合しないという考えと一致する。
【０１２８】
ナノ粒子アッセイを用いて、ＮＭ２３二量体対六量体の結合を特性化した。ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHH）（配列番号４４）をＮＴＡ−ＳＡＭ被覆金コロイドに固定化した。ＮＭ２３−ｗｔ、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体及びＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体を発現させ、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを用いて精製した（図２２ｃ）。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体の添加によって、特異的な結合を示すピンク色から青色への溶液の色の変化が誘導され、その後特異的な結合が抗ＭＵＣ１＊  Ｆａｂの添加によって阻害された。これに対して、ＮＭ２３−ｗｔ又はＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体の添加では色の変化が誘導されず、このことは六量体がＭＵＣ１＊受容体と結合しないことを示していた（図２２ｄ）。
【０１２９】
様々なＮＭ２３多量体を、多能性幹細胞成長を維持する能力に関して試験した。ヒトＨ９  ＥＳ細胞を、ＮＭ２３−ｗｔ、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体又はＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体のいずれかを含む最小培地（ＭＭ）中で培養した。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体では、完全に未分化の幹細胞が生じたが（図２２ｅ）、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体及びＮＭ２３−ｗｔ（大部分が六量体）は急速に分化した（図２２ｆ、図２２ｇ）。このことがＮＭ２３二量体と、多能性成長を促進するＭＵＣ１＊細胞外ドメインとの特異的相互作用であることを更に実証するために、合成ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（ＰＳＭＧＦＲ）を最小培地中のＮＭ２３二量体で成長させた幹細胞に添加して、この相互作用を競合阻害した。ＮＭ２３二量体−ＭＵＣ１＊相互作用の破壊によって最高度の分化がもたらされた（図２２ｈ）。
【０１３０】
実施例７．５  −  ＮＭ２３−ＭＵＣ１＊相互作用が阻害されると、ｍｉＲ−１４５が急増する
ｍｉＲ−１４５発現の増大は、幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものである。成長因子を幹細胞培地に与えない（これは分化を誘導する標準的な方法である）と、それに応じてｍｉＲ−１４５発現が急増する。ＲＴ−ＰＣＲ測定結果は、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体−ＭＵＣ１＊相互作用の遊離ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドによる競合阻害によって、単純に成長因子ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体又はｂＦＧＦを与えないことで細胞を分化させることで引き起こされるものよりも早期でかつより大きなｍｉＲ−１４５の発現の急増がもたらされたことを示していた（図２２ｉ）。これらの結果によって、このことがＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体の、多能性を促進するＭＵＣ１＊成長因子受容体の細胞外ドメインとの結合の特異的相互作用であることが実証される。
【０１３１】
全ＲＮＡを、メーカーの使用説明書に従ってｍｉｒＶａｎａ（商標）キット（Applied Biosystem、Ｐ／Ｎ：ＡＭ１５６１）を使用することでサンプルから抽出した。各全ＲＮＡサンプルに対して、２つのｃＤＮＡサンプルを、ＴａｑＭａｎ（商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems、Ｐ／Ｎ：４３６６５９６）と、ｍｉＲ−１４５及び内在性コントロール（endogenous control）として働く核内低分子ＲＮＡ  Ｕ６Ｂ（ＲＮＵ６Ｂ）に特異的な２つの異なるステム−ループプライマーとを使用して合成した。ｃＤＮＡサンプルでのｍｉＲ−１４５及びＲＮＵ６Ｂの定量化を、メーカーの使用説明書に従ってＴａｑＭａｎ（商標）マイクロＲＮＡアッセイ（Applied Biosystems、Ｐ／Ｎ：４４２７９７５）を使用して行った。リアルタイムＰＣＲのデータを、比較Ｃｔ法を用いて分析した。各サンプル中のｍｉＲ−１４５の相対量を、ｍｉＲ−１４５  Ｃｔと、対応するＲＮＵ６Ｂ  Ｃｔとの間の差（ΔＣｔ）を計算することで求めた。２回目の正規化を、データセットでの他の全てのΔＣｔから最小ΔＣｔを減算することによって行った（ΔΔＣｔ）。
【０１３２】
図２２ａは、組換えＮＭ２３野生型及びＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体を、異なる多量体化状態の形成をもたらす異なるプロトコルを用いて発現させ、特性化させた後、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した結果を示す。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体は、安定した二量体集団を生じるプロトコルを用いて変性及びリフォールディングした。六量体と四量体と二量体との混合物を、約５０％の二量体を含むように生成した。図２２ｂは、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ又は野生型多量体を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験し、合成ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン（ｅｃｄ）ペプチドとの結合能を決定した結果を示す。ＭＵＣ１＊ペプチドとのＮＭ２３結合量は、各サンプルに存在する二量体の濃度に対応する。図２２ｃは、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを含む、組換えＮＭ２３−ｗｔ、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体及びＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体をサイズ排除クロマトグラフィーによって特性化した結果を示す。図２２ｄは、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドを提示するナノ粒子を、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを含む、ＮＭ２３−ｗｔ、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体又はＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体と混合した結果を示す。ナノ粒子のピンク色から青灰色への色の変化は結合を示す。ＮＭ２３二量体は６４ｎＭでＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドと結合し、六量体は野生型又はＳ１２０Ｇ突然変異体にかかわらず結合しない。相互作用は抗ＭＵＣ１＊  Ｆａｂによって競合阻害され、このことは色の変化がＮＭ２３二量体とＭＵＣ１＊ｅｃｄとの特異的な相互作用によるものであったことを示している。Ｈ９  ｈＥＳ細胞をＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体（図２２ｅ）、ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体（図２２ｆ）、野生型（図２２ｇ）又はＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体＋合成ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド（図２２ｈ）で培養した。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体のみが多能性幹細胞の成長を支持した。六量体又はＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体−ＭＵＣ１＊相互作用の阻害によって即時分化がもたらされた。図２２ｉは、Ｈ９  ｈＥＳ細胞をｂＦＧＦ＋馴化培地又はＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体のいずれかで培養した後、成長因子を与えないことで分化させた結果を示す。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体で培養した一部の細胞は成長因子を受け続けたが、ＮＭ２３−ＭＵＣ１＊相互作用を競合阻害するＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドも与えられた。多能性からの離脱に関するマーカーであるｍｉＲ−１４５を、ＲＴ−ＰＣＲによって時間の関数として測定した。
【０１３３】
図Ｓ２２は、安定した二量体集団として組換えＮＭ２３を生じるために開発されたプロトコルを示す。図２２ａは、組換えＮＭ２３−ｗｔ、又は可溶性部分から精製し、変性した後、リフォールディングして、二量体集団又は適切な二量体と六量体との５０／５０ミックスをもたらす調製物を形成するＳ１２０Ｇ突然変異体を、ネイティブゲル上で分析し、どのプロトコルがどの多量体を生じたかを決定した。タンパク質は、１ウェル当たり５ｕｇ及び１０ｕｇの総タンパク質でロードした。図２２ｂは、ウェスタンブロット法をネイティブゲル上で実施した結果を示すものであり、ここではＮＭ２３−ｗｔ又はＳ１２０Ｇ突然変異体の様々な調製物を、幹細胞培養物に使用したものと比較して非常に低い濃度（８ｎＭ、１６ｎＭ及び３２ｎＭ）でロードした。図２２ｃは、培養条件下でのＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体の安定性を試験した結果を示す。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体は、細胞培養培地に添加し、ＣＯ２インキュベータ内で４８時間まで維持した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体では、幹細胞培養物での使用に要求される時間枠内で変性は起こらないことが示された。
【０１３４】
実施例８  −  ＮＭ２３−ＭＭ中で長期間培養したヒトＥＳ細胞は３つ全ての生殖系列へと正常に分化し、殆どの場合で協調分化を示した
マトリゲル上のＨ９  ｈＥＳ細胞を、ＭＭ（最小幹細胞培地）中の８ｎＭ  ＮＭ２３二量体又はＭＭ＋ＭＥＦ馴化培地中の４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦで６継代にわたって培養した後、胚様体法によって分化させた。続く核マーカーＤＡＰＩ及び３つの生殖系列のマーカーに対する抗体による染色を行った：図２３ａは内胚葉−αフェトプロテインを示し、図２３ｂは外胚葉−ネスチンを示し、図２３ｃは中胚葉−平滑筋アクチンを示す。ＮＭ２３−ＭＭ中で培養した幹細胞は３つ全ての生殖系列ヘと分化し、単一クラスタ内の殆どの細胞が同じマーカーに対して陽性染色した。ｂＦＧＦ及びＭＥＦ馴化培地中で培養した幹細胞も３つ全ての生殖系列ヘと分化したが、多くの場合で協調分化を示さず、最近接核は試験した生殖系列マーカーに対して陰性染色した（図２３ｄ〜図２３ｆ）。
【０１３５】
実施例９  −  プラスチック製細胞培養プレート上に被覆したモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体であるＭＮ−Ｃ３（２Ｄ６Ｃ３）は、ＮＭ２３−最小培地と併せることで多能性幹細胞の成長を完全に支持する
２Ｄ６Ｃ３モノクローナル抗体又は２Ｄ６Ｃ８モノクローナル抗体を、３．２５ｕｇ／ｍＬ〜１２５ｕｇ／ｍＬの濃度で組織培養処理プレートの表面上に被覆し、室温で３時間、又は４℃で一晩インキュベートした。ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞はこれらの抗体被覆表面上に容易に付着し、連続継代することができた。多能性マーカーでのＩＣＣ染色及びＲＴ−ＰＣＲから明らかなように、得られた幹細胞は多能性であった。
【０１３６】
実施例９．１  −  幹細胞成長表面
Ｖｉｔａ表面を、ＭＵＣ１＊受容体を二量体化することによって、幹細胞付着方法及び成長刺激方法の両方として機能するモノクローナルＭＵＣ１＊ｅｃｄ抗体（Ｄ２６Ｃ３）で被覆した。図２４ａ〜図２４ｃは、幹細胞がＤ２６Ｃ３抗体被覆密度に応じて付着及び増殖したが、対照抗体を使用した場合には幹細胞の付着は観察されなかったことを示す。幹細胞は、任意の成長因子、すなわちＮＭ２３又はｂＦＧＦの非存在下において最小幹細胞培地単独で培養したとしても、表面に固定化した抗体からのＭＵＣ１＊の二量体化によってこれらのＭＵＣ１＊抗体表面上で増殖した。しかしながら、成長速度は最小培地中でのＮＭ２３の使用によって大幅に改善した。場合によっては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を初めの４８時間存在させ、表面への付着を増大させたが、生存には影響を及ぼさなかった。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、ＮＭ２３−ＭＭ中のこれらのＭＵＣ１＊抗体表面上で、成長速度又は多能性を低減させることなく２０継代を超えて連続継代した。さらに、ＮＭ２３−ＭＭ中のＭＵＣ１＊抗体表面上で成長する幹細胞は、連続継代ごとに成長速度が劇的に増大した。４継代までに、プレーティングした６０００００個のｉＰＳ細胞は４日で７．９Ｍ未分化幹細胞へと１３倍に増大した。同様に、５継代までに、Ｈ９細胞は１７倍に増大した（図２４ｄ〜図２４ｆ）。標準多能性マーカーによるＩＣＣ染色によって、細胞が多能性であり、正常な核型を有していたことが確認された（図Ｓ２４ａ及び図Ｓ２４ｂ）。加えて、得られるＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、３つ全ての生殖系列へと分化することが可能であった（図２４ｇ〜図２４ｌ）。要約すると、ＮＭ２３−ＭＭ中、Ｄ２６Ｃ３抗体表面上の成長によって、手動で切り離すことなく、より少ない時間でより多くの未分化幹細胞が生じた。
【０１３７】
図２４ａは、抗ＭＵＣ１＊ウサギポリクローナル抗体又は対照ＩｇＧ抗体を各種濃度で組織培養処理表面上に吸着させた結果を示す。ＢＧＯ１Ｖ／ｈＯＧ  ｈＥＳ細胞を表面上にプレーティングし、９６時間成長させた。細胞数は定量化するのにカルセインアッセイを実施した。ＢＧＯ１Ｖ／ｈＯＧ  ｈＥＳ細胞をＮＭ２３−ＭＭ中で多能性を低減させず又は核型を変えずに２０代培養された。Ｈ９  ｈＥＳ細胞を３．１２ｕｇ（図２４ｂ）又は１２．５ｕｇ（図２４ｃ）のモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体、ＭＮ−Ｃ３で被覆したＶｉｔａ表面上にプレーティングした。細胞は抗体濃度に応じて付着及び増殖した。図２４ｄは、ヒトＨ９  ＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞の成長速度が、抗体被覆表面上にプレーティングし、ＮＭ２３−ＭＭ中で培養した後に指数関数的に増大したことを示している。ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞をＭＮ−Ｃ３で被覆したＶｉｔａ（商標）プレート上で成長させ、ＮＭ２３−ＭＭ中で培養した。各継代の開始時に、６０００００個の細胞をプレーティングし、４〜６日の成長期間後、計数した。これを５、６継代繰り返した。毎回、先の継代由来の６０００００個の細胞から開始した。４継代までに、プレーティングした６０００００個のｉＰＳ細胞は４日で７．９Ｍ未分化幹細胞へと１３倍に増大した。５継代までに、Ｈ９細胞は１７倍に増大した。ＭＮ−Ｃ３表面上での３継代後に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は両方とも、本質的に分化することなく、４日目までほぼ１００％のコンフルエンシーまで成長したことに注目した。４継代後にＮＭ２３−ＭＭ中のＭＮ−Ｃ３抗体表面上で培養したｉＰＳ細胞（図２４ｅ）及びＨ９  ＥＳ細胞（図２４ｆ）の写真を撮影した。６継代後、得られた細胞を胚様体法によって分化させた。核マーカーＤＡＰＩ、並びに内胚葉−αフェトプロテイン（図２４ｇ及び図２４ｊ）、外胚葉−β−チューブリン（図２４ｈ及び図２４Ｋ）、及び中胚葉−平滑筋アクチン（図２４ｉ及び図２４ｌ）という３つの生殖系列のマーカーに対する抗体による染色によって、細胞がＮＭ２３−ＭＭ中の抗ＭＵＣ１＊被覆表面上での連続継代後に正常に分化することが示される。
【０１３８】
図Ｓ２４ａは、少なくとも７継代にわたってＮＭ２３−ＭＭ中の新規の規定表面上で培養したｈＥＳが標準多能性マーカーを発現することを示す。モノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３）表面上のＨ９細胞を、７継代後の標準多能性マーカーの存在に関して化学分析した。細胞は標準多能性マーカーに対して陽性染色し、正常な核型を有していた。
【０１３９】
図Ｓ２４ｂは、少なくとも７継代にわたってＮＭ２３−ＭＭ中の新規の規定表面上で培養したｉＰＳが標準多能性マーカーを発現することを示す。モノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３）表面上のｉＰＳ細胞（ｉＰＳ  ＦＴＤ１９クローン４２）を、７継代後の標準多能性マーカーの存在に関して化学分析した。細胞は標準多能性マーカーに対して陽性染色し、正常な核型を有していた。
【０１４０】
実施例１０  −  ＮＭ２３−ＭＭ中のＭＵＣ１＊抗体表面上で培養したヒト幹細胞はより高いレベルのナイーブ細胞マーカーと、より低いレベルのプライム細胞マーカーとを発現する
実施例１０．１  −  ナイーブ細胞又はプライム細胞
ＮＭ２３−ＭＭ中のＭＵＣ１＊抗体表面上で培養した幹細胞の質を更に評価するために、「ナイーブ」状態又は基底状態にあるヒト幹細胞の指標となる遺伝子の発現レベルを測定した。ナイーブ幹細胞において通常、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ２が高く、ＦｏｘＡ２及びＸＩＳＴ（Ｘ不活性化の指標）は非常に低いか又は全く発現しない。細胞がより分化した状態である「プライム」状態になると、遺伝子発現パターンの逆転が起こる。ＮＭ２３−ＭＭ中、ＭＵＣ１＊抗体表面上で、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦフィーダー細胞上で、又はｍＴｅＳＲ中、マトリゲル上で培養した幹細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを比較した。ＮＭ２３−ＭＭ中、ＭＵＣ１＊抗体表面上で培養した幹細胞は、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で培養した細胞よりも高いレベルのナイーブマーカーと、低いレベルのプライムマーカーとを発現した。ｍＴｅＳＲ中、マトリゲル上で培養した細胞は、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で培養した細胞と比較してより高いレベルのＦｏｘａ２及びＸＩＳＴ（プライム状態の指標となる）と、より低いレベルの幾つかのナイーブマーカーとを発現した（図２５ａ）。
【０１４１】
連続継代数に伴って、ＮＭ２３−ＭＭを使用した場合にはナイーブ状態への傾向が顕著であったが（図２５ｃ）、ｍＴｅＳＲを使用した場合にはその傾向は顕著なものではなかった（図２５ｂ）。図３７は、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦフィーダー上（ｎ＝３）、ｍＴｅＳＲ中、マトリゲル上（ｎ＝５）又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ二量体−最小幹細胞培地中、１２．５ｕｇ／ｍｌモノクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体２Ｄ６Ｃ３で被覆したＶｉｔａ表面上（ｎ＝６）で培養したヒト幹細胞のＲＴ−ＰＣＲ測定結果を示す。この実験では、更に２つのプライム細胞マーカー、ＯＴＸ２及びＬＨＸ２も測定した。図３７のグラフは、他の実験と一致して、ＮＭ２３中、ＭＵＣ１＊に対するリガンドを提示する表面上での成長が、ナイーブマーカーの発現を増大するとともに、プライムマーカーの発現を低減することを示している。
【０１４２】
表面単独の寄与を評価するために、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で４５継代成長させたＥＳ細胞を組換えビトロネクチンの層上にプレーティングした。次いで細胞をＮＭ２３−ＭＭ、ｂＦＧＦ＋ＭＥＦ馴化培地又はｍＴｅＳＲ中で１継代培養した後、ナイーブマーカーとプライムマーカーとのサブセットの発現に関して化学分析した。ＮＭ２３−ＭＭ中で培養した細胞は、ｂＦＧＦ又はｍＴｅＳＲよりも高いナイーブマーカーの発現と、低いプライムマーカーの発現とを示したが、ビトロネクチンでの成長は、全ての試験培地でナイーブマーカーの発現の低減と、プライムマーカーの発現の増大とをもたらした（図２５ｄ）。これらの結果は、ビトロネクチンでの成長がヒト幹細胞をプライム状態へと誘導し、幹細胞の完全性にマイナスの影響を及ぼすことを示している。
【０１４３】
実施例１０．２  −  ナイーブ遺伝子又はプライム遺伝子の発現を定量化するリアルタイムＰＣＲ法
様々な条件で成長させた細胞を採取した。細胞をペレット化し、分析時間まで−７０℃で凍結させた。総ＲＮＡを、メーカーの使用説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Life
Technologies）を用いてサンプルから抽出した。ＲＮＡサンプル中のＦＯＸａ２（Applied Biosystems、アッセイＩＤ：Ｈｓ００２３２７６４＿ｍ１）、ＫＬＦ４（Applied Biosystems、アッセイＩＤ：Ｈｓ００３５８８３６＿ｍ１）、ＮＡＮＯＧ（Applied Biosystems、アッセイＩＤ：Ｈｓ０２３８７４００＿ｇ１）、ＫＬＦ２（Applied Biosystems、アッセイＩＤ：Ｈｓ００３６０４３９＿ｇ１）、ＸＩＳＴ（Applied biosystems、アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０７９８２４＿ｍ１）、ＯＣＴ４（ＰＯＵクラス５ホメオボックス１）（ABI、アッセイＩＤ：Ｈｓ００９９９６３４＿ｇＨ）及びＧＡＰＤＨ（Applied Biosystems、Ｐ／Ｎ：４３１０８８４Ｅ）の定量化を、メーカーの使用説明書に従ってＴａｑＭａｎ（商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス試薬（Applied Biosystems、Ｐ／Ｎ：４３０９１６９）を使用して行った。リアルタイムＰＣＲのデータを、比較Ｃｔ法を用いて分析した。各サンプル中の各転写産物の相対量を、標的Ｃｔと、対応するＧＡＰＤＨのＣｔとの差（ΔＣｔ）を計算することで求めた。２回目の正規化を、データセットでの他の全てのΔＣｔからＭＥＦ／ＦＧＦサンプルのΔＣｔを減算することによって行った（ΔΔＣｔ）。
【０１４４】
図２５は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びＫＬＦ２を含むナイーブマーカーのサブセットの発現（ナイーブ状態で高い）と、ＸＩＳＴ及びＦＯＸＡ２を含むプライムマーカーのサブセットの発現（プライム状態で高い）とを定量化した結果を示す。測定結果を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で培養したＨ９  ＥＳ細胞（対照）に対する倍数変化として表した。図２５ａは、ＮＭ２３−ＭＭ中、ＭＵＣ１＊抗体（ＭＮ−Ｃ３）表面上で培養したＨ９  ＥＳ細胞が平均して、ナイーブマーカーの発現の増大と、プライムマーカーの発現の低減とを示したことを示している（ｎ＝６）。これに対して、ｍＴｅＳＲ中、マトリゲル上で培養したＨ９細胞は、ナイーブマーカーの発現の低減と、プライムマーカーの発現の増大とを示した（ｎ＝５）。ナイーブマーカー又はプライムマーカーのサブセットの個々の測定結果を、ＮＭ２３−ＭＭ、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上（図２５ｂ）及びｍＴｅＳＲ、マトリゲル上（図２５ｃ）に対して継代数の関数としてプロットした。連続継代に伴って、ＮＭ２３−ＭＭではナイーブ状態への傾向が増大したが、ｍＴｅＳＲではその傾向は増大しなかった。図２５ｄは、継代数又は表面に起因する差を補正するために、ｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で４５継代にわたって連続継代したＨ９細胞を細胞源として使用した結果を示す。細胞をビトロネクチンの層上にプレーティングし、ｂＦＧＦ＋ＭＥＦ馴化培地、ｍＴｅＳＲ、又はＮＭ２３−ＭＭ中で１継代培養した。全ての値を、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で培養したＨ９  ＥＳ細胞の対照に対する倍数変化として表した。ＮＭ２３−ＭＭ、ＭＵＣ１＊抗体表面上に対する値を比較のために加える。全体として、ビトロネクチン上にプレーティングした後、ナイーブマーカーの発現が低減するとともに、プライムマーカーの発現が増大した。
【０１４５】
実施例１１  −  ６成分規定培地及び異種成分を含まない培地中でＮＭ２３はＭＵＣ１＊抗体表面上での多能性幹細胞の成長を支持する
ＮＭ２３の、完全に規定された異種成分を含まない６成分培地（ＭＮ６）中で単一成長因子としてＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成長を支持する能力を試験した。結果によって、ＮＭ２３−ＭＮ６が１ウェル当たり１２．５ｕｇで、ＭＵＣ１＊抗体表面及びビトロネクチン等の他の表面上で多能性幹細胞の連続継代を完全に支持したことが示される（図２６ａ〜図２６ｆ）。驚くべきことに、ＮＭ２３とともにＭＮ６培地を使用することで、初めの２４時間〜４８時間Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の必要性が排除されると考えられる（図２６ｇ〜図２６ｌ）。
【０１４６】
図２６は、ｈＥＳ細胞及びｈｉＰＳ細胞をＮＭ２３−完全に規定された異種成分を含まない６成分培地（ＭＮ６）中、ＭＵＣ１＊抗体表面又はビトロネクチンの層上で連続培養した結果を示す。図２６ａ〜図２６ｈは、ｈＥＳ  Ｈ９を、初めの４８時間Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は非存在下で、ＮＭ２３−ＭＮ６中、Ｖｉｔａ（商標）プレート上に被覆したＭＮ−Ｃ３抗体表面上で培養した結果を示している。図２６ｉ〜図２６ｌは、ＮＭ２３−ＭＮ６中、Ｖｉｔａ（商標）プレート上に被覆したＭＮ−Ｃ３抗体表面上で培養したｉＰＳ細胞を示す。図２６ｍ〜図２６ｔは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣｉ）の存在下又は非存在下で、ＮＭ２３−ＭＮ６中、組織培養処理プレート上に被覆したビトロネクチン表面上で培養したｈＥＳ  Ｈ９細胞を示す。初めの４８時間のＲｈｏキナーゼ阻害剤の補助効果は、細胞をＮＭ２３−ＭＮ６中、ＭＮ−Ｃ３抗体表面上で培養した場合に最小となった。
【０１４７】
実施例１２  −  ＮＭ２３又はＦＧＦ中、ヒト又はマウスのフィーダー細胞上で培養したヒト幹細胞をナイーブ状態又はプライム状態のマーカーの存在に関して探索する
プライム状態のＨ９胚性幹細胞から出発した。該幹細胞をｂＦＧＦ中、マウスＭＥＦフィーダー細胞上でおよそ３０継代にわたって培養した。細胞の第１のセットをｂＦＧＦ中、ＭＥＦ上で培養し続けた。第２の群はヒトフィーダー細胞（ＨＳ２７）上へと移したが、第１のセットと同様に４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ中で培養した。細胞の第３のセットをＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で培養したが、マウスＭＥＦフィーダー細胞上に残した。細胞の第４のセットをヒトフィーダー細胞（ＨＳ２７）上に移して、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ中で培養した。全ての細胞を更に６継代にわたってこれらの条件に従って培養した。次いで細胞をナイーブ幹細胞状態のマーカーであるＫｌｆ４、及びプライム幹細胞状態のマーカーであるＦｏｘａ２の存在に関して染色した。図２７〜図３５は、ＮＭ２３中で培養するとともに、ヒトフィーダー細胞に曝した細胞だけがナイーブ幹細胞マーカーＫｌｆ４を発現し、プライム幹細胞マーカーであるＦｏｘａ２は発現しなかったことを示している。
【０１４８】
実施例１３  −  二量体を選択的に形成し、不活性な四量体及び六量体の形成を抑えたＮＭ２３突然変異体
二量体形成を選好するＮＭ２３突然変異体がヒトがんにおいて同定されている。これらの突然変異体の幾つかが、ＭＵＣ１＊と結合せず、多能性を促進しない四量体及び六量体の形成を抑える。ＮＭ２３−Ｓ２０Ｇ等の突然変異体は、野生型（ｗｔ）タンパク質よりも二量体形成を選好するが、高濃度の六量体が分化を誘導しない溶液を得るために、Ｓ１２０Ｇ突然変異体を任意で変性し、リフォールディングして、二量体画分をＦＰＬＣ等の方法を用いて精製する。突然変異ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓも、二量体形成を選好し、組換えタンパク質として発現する場合にＳ１２０Ｇ突然変異体より可溶性となる。ＮＭ２３は、Ｐ９６Ｓ突然変異に加えて、Ｃ末端に０個、１個、２個又は６個のアミノ酸欠失を含むように標準方法によって生成された。図３６は、組換えタンパク質の発現の可溶性画分のＦＰＬＣトレースのオーバーレイである。図３６は、ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ＋２個又は６個のＣ末端欠失では、ＭＵＣ１＊活性化に好適な二量体形態のＮＭ２３がかなりの割合を占めていたことを示している。ＮＭ２３−Ｐ９６Ｓ＋６個のＣ末端欠失が好ましいが、これは可溶性タンパク質として大部分が二量体であるためである。
【０１４９】
実施例１４  −  ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ及び欠失構築物
以下のプライマー：5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'（配列番号４５）及び5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'（配列番号４６）を使用して、メーカーの使用説明書に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Agilent）を用いることでＮＭ２３−Ｈ１突然変異体Ｐ９６Ｓ（＃９６のプロリンをセリンへと突然変異させた）を生成した。配列確認後、欠失構築物をＰＣＲによって生成した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ１を、以下のプライマー：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号４７）及び5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'（配列番号４８）を用いて増幅した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ２を、以下のプライマー：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号４９）及び5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3'（配列番号５０）を用いて増幅した。ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ６を、以下のプライマー：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'（配列番号５１）及び5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'（配列番号５２）を用いて増幅した。得られるフラグメントを精製し、消化し（ＮｄｅＩ、ＡｇｅＩ）、発現ベクターｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩ制限部位とＡｇｅＩ制限部位との間にクローニングした。ｐＥＴ２１ｂは予め、ＸｈｏＩ制限部位をＡｇｅＩに置き換えることで修飾した。
【０１５０】
配列確認後、全ての構築物を組換えタンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（New England Biolabs）に形質転換した。
【０１５１】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  −  ＤＮＡ配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga（配列番号５３）
【０１５２】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  −  アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH（配列番号５４）
【０１５３】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ２  −  ＤＮＡ配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号５５）
【０１５４】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ２  −  アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH（配列番号５６）
【０１５５】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ６  −  ＤＮＡ配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号５７）
【０１５６】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ６  −  アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCATGHHHHHH（配列番号５８）
【０１５７】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ１  −  ＤＮＡ配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga（配列番号６５）
【０１５８】
ＮＭ２３  Ｐ９６Ｓ  ΔＣ１  −  アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYTGHHHHHH（配列番号６６）
【０１５９】
以下は、各種ＮＭ２３変異体の比較アミノ酸配列である。
【０１６０】
【表Ａ】
2014514918.tif 000002
【０１６１】
実施例１５  −  タンパク質発現／精製
ＬＢブロス（ルリア−ベルターニブロス）を一晩培養物の１／１０で植菌し、ＯＤ６００がおよそ０．５に達するまで３７℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、０．４ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（IPTG, Sigma）を用いて誘導し、培養を４時間後に停止させた。細胞を遠心分離（４℃で１０分間、６０００ｒｐｍ）によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、３６０ｍＭ  ＮａＣｌ及び８０ｍＭイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Sigma）、ＭｇＣｌ２（０．５ｍＭ）及びＤＮアーゼ（０．５ｕｇ／ｍＬ、Sigma）を添加した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間、回転台（２７５ｒｐｍ）の上でインキュベートし、５分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離（４℃で３０分間、２００００ｒｐｍ）によって取り除いた。次いで、残屑を除去した溶解物を、泳動バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に適用した。カラムを洗浄した（８ＣＶ）後、４２０ｍＭイミダゾールを添加した泳動バッファー（６ＣＶ）によって、タンパク質をカラムから溶出させた。タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）によって更に精製した。
【０１６２】
本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１６３】
当業者は、単なるルーチン実験を使用して、本明細書に具体的に記載された本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識する、又は確認することができるだろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【符号の説明】
【０１６４】
図６
min  分
hr  時間
図７
min  分
hr  時間
UN  未分化
DIFF  分化
図９
Vita alone  Ｖｉｔａ単独
図１１
Antibody  抗体
図１２ａ
5 days post plating  プレーティングの５日後
図１２ｂ
Day 5  ５日目
図１２ｄ
Day 5  ５日目
図１９
tryp  トリプトファン
2day post SC H9s  ＳＣ  Ｈ９の２日後
hrs  時間
図２０
tryp  トリプトファン
2day post SC H9s  ＳＣ  Ｈ９の２日後
hrs  時間
図２２
hexamer  六量体
tetramer  四量体
dimer  二量体
monomer  単量体
NM23S120G-mixed  NM23S120Gミックス
NM23S120G-hexamer  NM23S120G六量体
NM23S120G-dimer  NM23S120G二量体
Time(s)  時間（秒）
normalized  正規化
No protein  タンパク質なし
Peptide  ペプチド
hrs  時間
withdrawn  排除
図Ｓ２２
hexamer  六量体
tetramer  四量体
dimer  二量体
monomer  単量体
NM23S120G-hexamer  ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ六量体
NM23S120G-mixed  ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇミックス
NM23S120G-dimer  ＮＭ２３Ｓ１２０Ｇ二量体
NativePAGE Novex
4-16% Bis-Tris Gel  ネイティブＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４％〜１６％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル
h  時間
図２３
Alpha Feto
Protein  αフェトプロテイン
Nestin  ネスチン
Smooth Muscle Actin  平滑筋アクチン
図２４
Calcein  カルセイン
Anti-MUC1*  抗ＭＵＣ１＊
Control Ab  対照抗体
# of Cell X 10^6  細胞数×１０６
H9 ES Cells  Ｈ９  ＥＳ細胞
iPS Cells  ｉＰＳ細胞
Alpha Feto Protein  αフェトプロテイン
Beta-Tublin  β−チューブリン
Smooth Muscle Actin  平滑筋アクチン
図Ｓ２４ａ
MERGED  マージ
図Ｓ２４ｂ
MERGED  マージ
図２５
Fold Change Relative
to MEF/FGF CT  ＭＥＦ／ＦＧＦ  ＣＴに対する倍数変化
matrigel  マトリゲル
vitronectin  ビトロネクチン
図２６
MUC1* antibody surface  ＭＵＣ１＊抗体表面
NO ROCi  ＲＯＣｉなし
Vitronectin Surface  ビトロネクチン表面
図３６
dimer  二量体
図３７
PRIMED markers  プライムマーカー
NAIVE markers  ナイーブマーカー
matrigel  マトリゲル
【図１】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図Ｓ２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図Ｓ２４ａ】
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【図Ｓ２４ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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