(57)【要約】  本発明は、新規の金−白金系バイメタルナノ結晶懸濁液であって、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用される典型的な化学的還元剤／安定剤及び／又は原材料と関連する有機又はその他の不純物又は膜を実質的に含まないナノ結晶表面を有するものに関する。具体的には、表面は、溶液中の金属イオンから金属ナノ粒子を成長（及び／又は懸濁）させるために有機（又はその他の）還元剤及び／又は界面活性剤を必要とする化学的還元（及びその他の）プロセスを用いて形成された金属系ナノ粒子の表面と比較して「クリーン」である。本発明は、バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するための新規の電気化学的な製造装置及び製造技術を含む。これらの技術はプロセス／最終懸濁液を製造するための塩素イオン／原子及び／又は塩化物又は塩素系材料の使用又は存在を必要としない。本発明はさらにその医薬組成物を含み、また金属に基づく療法が既知である、例えば癌疾患又は癌状態を含む疾患又は状態を治療又は防止するために、バイメタルナノ結晶又はその懸濁液又はコロイドを使用することを含む。
2014518847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容し得る懸濁液であって、
ａ）  医薬等級の水と；
ｂ）  少なくとも１種の処理増強剤と；
ｃ）  懸濁液を形成している前記水中に懸濁された金−白金バイメタルナノ結晶と
を含み；
前記金−白金バイメタルナノ結晶は：
i)  (1) その表面に有機化学成分が接着又は付着されていないこと、及び(2) 実質的にクリーンであり、且ついずれも前記ナノ結晶の機能を変えることのない、水、水の分解反応生成物（lysis products of water）又は前記処理増強剤以外は、その表面に化学成分が接着又は付着されていないこと、から成る特徴群から選択された少なくとも１つの特徴を含む表面を有しており；
ii)  粒度が約５０ｎｍ未満であり；
iii)  総原子金属濃度約２〜１０００ｐｐｍで前記懸濁液中に存在しており；
ｄ）  前記懸濁液はｐＨが約５〜約１２であり、ゼータ電位が少なくとも約−３０ｍＶである、
医薬的に許容し得る懸濁液。
【請求項２】
前記処理増強剤は重炭酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記懸濁液はゼータ電位が少なくとも約−４０ｍＶであり、ｐＨが約８〜約１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記懸濁液はゼータ電位が少なくとも約−５０ｍＶである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記表面に有機化学成分が接着又は付着されていない、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記表面が実質的にクリーンであり、且つ前記水の分解反応生成物以外は、当該表面に化学成分が接着又は付着されていない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記懸濁液の総金属濃度が約１０〜５００ｐｐｍである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記金−白金バイメタルナノ結晶が金と白金との合金を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
白金が前記バイメタルナノ結晶中の微量成分であり、金が前記バイメタルナノ結晶中の主成分である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記懸濁液が塩化物及び塩素系種を含んでいない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬懸濁液であって：
ａ）  ｐＨが約５〜約１２の、少なくとも１種の処理増強剤を含有する医薬等級の水と；
ｂ）  前記懸濁液を形成している前記水中の金−白金バイメタル合金ナノ結晶と
を含み；
前記懸濁液はゼータ電位が少なくとも約−３０ｍＶであり、そして前記金−白金バイメタル合金ナノ結晶が：
i)  (1) その表面に有機化学成分が接着又は付着されていないこと、及び(2) 実質的にクリーンであり、且つ、その表面に化学成分が接着又は付着されていないこと、から成る特徴群から選択された少なくとも１つの特徴を含む表面を有しており；
ii)  粒度が約５０ｎｍ未満であり；そして
iii)  濃度約２〜１０００ｐｐｍで前記懸濁液中に存在している、
医薬懸濁液。
【請求項１２】
前記懸濁液はゼータ電位が少なくとも約−４０ｍＶであり、ｐＨが約８〜約１２である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記懸濁液が塩化物及び塩素系種を含んでいない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記表面が実質的にクリーンであり、且つ水又は水の分解生成物以外は、その表面に化学成分が接着又は付着されておらず、そして前記懸濁液が塩化物及び塩素系種を含んでいない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくともいくらかの白金イオンが前記水懸濁液中に存在している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
懸濁液であって：
ａ）  ｐＨが約５〜約１２の、少なくとも１種の処理増強剤を含有する純水と；
ｂ）  前記懸濁液を形成している前記水中の金−白金バイメタル合金ナノ結晶と
を含み；
前記懸濁液はゼータ電位が少なくとも約−３０ｍＶであり、そして前記金−白金バイメタル合金ナノ結晶が：
i)  (1) その表面に有機化学成分が接着又は付着されていないこと、及び(2) 実質的にクリーンであり、且ついずれも前記ナノ結晶の触媒機能を変えることのない、水、水の分解反応生成物、又は前記処理増強剤以外は、その表面に化学成分が接着又は付着されていないこと、から成る特徴群から選択された少なくとも１つの特徴を含む表面を有しており；
ii)  粒度が約５０ｎｍ未満であり；そして
iii)  濃度約２〜１０００ｐｐｍで前記懸濁液中に存在している、
懸濁液。
【請求項１７】
前記懸濁液はゼータ電位が少なくとも約−４０ｍＶであり、ｐＨが約８〜約１２である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記表面に有機化学成分が接着又は付着されていない、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記表面が実質的にクリーンであり、且つ水又は水の分解生成物以外は、当該表面に化学成分が接着又は付着されていない、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記懸濁液は、金−白金バイメタルナノ結晶を形成するために使用される塩化物又は塩素系材料を含有していない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
癌状態の患者を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、請求項１に記載の有効量の組成物を投与することを含む、癌状態の患者を治療する方法。
【請求項２２】
該癌状態は、膀胱、乳房、頸部、ＣＮＳ、結腸、Ｈ＆Ｎ、肺、卵巣、前立腺、胃、甲状腺、子宮及び外陰の癌のうちの少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該癌状態は結腸癌を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
白金療法を受容できる状態の患者を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、請求項１に記載の有効量の組成物を投与することを含む、白金療法を受容できる状態の患者を治療する方法。
【請求項２５】
該組成物が経口投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
該組成物が腹腔内投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
該組成物が腫瘍内投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
水中に懸濁された金−白金バイメタルナノ結晶を形成する方法であって：
前記水中の少なくとも１種の処理増強剤を提供し；
少なくとも１つの第１トラフ部材を用意し；
前記少なくとも１つの第１トラフ部材を通る、前記水及び処理増強剤の流動方向を生成し；
前記水の表面から間隔を置いて少なくとも１つの白金系プラズマ形成電極を用意し、これにより、前記少なくとも１つの白金系プラズマ形成電極と前記水の前記表面との間に間隔を形成し；
前記少なくとも１つの金属系プラズマ形成電極と前記水の前記表面との間の前記間隔内に少なくとも１つのプラズマを形成し；
前記水と接触する少なくとも２つの電極セット、すなわち前記水が前記少なくとも１つの白金系プラズマ形成電極を流過した後に前記水と接触する電極第１セットと、前記水が前記電極第１セットを流過した後に続いて前記水と接触する電極第２セットとを用意し；
前記少なくとも２つの電極セットを用いて、前記水中の少なくとも１つの白金種を形成させ；
前記水中の前記少なくとも１つの白金種を、少なくとも１つの第２トラフ部材に提供し；
前記少なくとも１つの第２トラフ部材を通る、前記水中の前記少なくとも１つの白金種の流動方向を生成し；
前記水中の前記少なくとも１つの白金種の表面から間隔を置いて少なくとも１つの金系プラズマ形成電極を用意し、これにより、前記少なくとも１つの金系プラズマ形成電極と前記水中の前記少なくとも１つの白金種との間に間隔を形成し；
前記少なくとも１つの金系プラズマ形成電極と前記水中の前記少なくとも１つの白金種との間の前記間隔内に少なくとも１つのプラズマを形成し；
前記水と接触する少なくとも２つの第２電極セット、すなわち前記水中の前記少なくとも１つの白金種が前記少なくとも１つの金系プラズマ形成電極を流過した後に前記水中の前記少なくとも１つの白金種と接触する前記第２電極の第１セットと、前記水中の前記少なくとも１つの白金種が前記第２電極第１セットを流過した後に続いて前記水中の前記少なくとも１つの白金種と接触する前記第２電極の第２セットとを用意し；そして、
前記少なくとも２つの第２電極セットを用いて、前記金−白金バイメタルナノ結晶を形成させる
ことを含む、
金−白金バイメタルナノ結晶を形成する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって製造された生成物。
【請求項３０】
水中に懸濁された金−白金バイメタルナノ結晶を形成する方法であって、
先ず、水中の少なくとも１つの白金種及び水の少なくとも１つの分解反応生成物を電気化学的に形成し、これにより白金種及び水材料を生成し；そして
前記白金種及び水材料を第２の電気化学反応に使用してバイメタル金−白金ナノ結晶懸濁液を形成する
ことを含む、
水中に懸濁された金−白金バイメタルナノ結晶を形成する方法。
【請求項３１】
水中の前記少なくとも１つの白金種を形成するために少なくとも１つの白金電極を使用し、そして前記金−白金バイメタルナノ結晶を形成するために少なくとも１つの金電極を使用する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記金−白金バイメタルナノ結晶を形成するために、塩化物又は塩素系種が必要とされない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記金−白金バイメタルナノ結晶が金と白金との合金を含む、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2011年3月30日付けで出願された米国特許出願第61/469,525号明細書の優先権を主張する。本発明は、新規の金−白金系バイメタルナノ結晶懸濁液であって、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用される典型的な化学的還元剤／安定剤及び／又は原材料と関連する有機又はその他の不純物又は膜を実質的に含まないナノ結晶表面を有するものに関する。具体的には、表面は、溶液中の金属イオンから金属ナノ粒子を成長（及び／又は懸濁）させるために有機（又はその他の）還元剤及び／又は界面活性剤を必要とする化学的還元（及びその他の）プロセスを用いて形成された金属系ナノ粒子の表面と比較して「クリーン」である。
【０００２】
本発明は、バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するための新規の電気化学的な製造装置及び製造技術を含む。これらの技術はプロセス／最終懸濁液を製造するための塩素イオン／原子及び／又は塩化物又は塩素系材料の使用又は存在を必要としない。本発明はさらにその医薬組成物を含み、また金属に基づく療法が既知である、例えば癌疾患又は癌状態を含む疾患又は状態を治療又は防止するために、バイメタルナノ結晶又はその懸濁液又はコロイドを使用することを含む。
【背景技術】
【０００３】
金属系ナノ粒子を形成する１つの動機は、バルク材料に対してナノスケールで新規性能が達成されることである。ナノスケール寸法の材料は、マクロスケールで観察されるものとは異なる種々様々な特性を提供し、ひいては、種々様々な独自の用途を潜在的に可能にする。具体的には、ナノ金属は、金属材料がバルク形態を成すときには典型的には達成し得ない種々の電子、光学、磁気、及び／又は化学特性を呈する。例えばマクロスケールで比較的不活性である金属、例えば白金及び金は、ナノスケールでは優れた触媒である。さらに、ナノスケールの相異なる２種の金属（バイメタル）の組み合わせは更なる興味深い性能問題をもたらす。種々異なる金属は、金属混合物、合金、又は不均質構造となってよく、これらはそれぞれ、異なる物理特性及び／又は性能特徴を呈することができる。バイメタルナノ粒子金属の用途は電子装置及びコンピュータデバイス、バイオナノテクノロジー、医学的な治療及び診断、並びにエネルギーの生成及び貯蔵を含む。種々様々な用途のためのこれらバイメタルナノ金属の使用は、このような材料を製造するための効率的且つ安全なアプローチを必要とする。
【０００４】
一般に、基本的に異なる２つのアプローチを用いてバイメタルナノ材料を製造しており、これらのアプローチは「トップダウン」及び「ボトムアップ」アプローチと呼ばれている。トップダウン・アプローチの場合、バイメタルナノ材料は、典型的には原子レベルの制御なしに、より大きい存在物から製造される。典型的なトップダウン・アプローチは、フォトリソグラフィ及び電子ビーム・リソグラフィのような、大型材料で始まり、機械加工技術又はエッチング技術を用いて小型材料を形成するような技術を含む。レーザーアブレーションも周知のトップダウン・アプローチである。
【０００５】
対照的に、「ボトムアップ」アプローチの場合、バイメタルナノ材料を２種又は３種以上の分子成分から製造する。これらの分子成分を集成することによりバイメタルナノ粒子材料を形成する。これに関連して、先ずビルディングブロックを形成し、次いで、これらのビルディングブロックを集成することにより最終ナノ材料を形成する。ボトムアップ・アプローチにおいて、種々様々な一般的な合成アプローチが利用されている。例えば、いくつかのバイメタル・アプローチは、鋳型形成、化学合成、音響化学アプローチ、電気化学アプローチ、音響電気化学アプローチ、γ線、ｘ線、レーザー、及びマイクロ波を含む熱・光化学的還元法を含む。これらはそれぞれ、或る特定のネガティブなプロセス及び／又は生成物の制限を伴う。
【０００６】
いずれのアプローチを利用するとしても、バイメタル粒度制御、粒度分布、形状制御、形態又は構造制御、スケールアップ能力、及び最終用途における形成済バイメタル粒子ナノ材料の適合性の結果が、全ての考察事項である。
【０００７】
２種の金属をバイメタルナノ粒子として形成する場合、更なる考察事項、例えばバイメタルナノ粒子が合金であるか、部分合金であるか、又は部分相分離又は完全相分離されているかどうかも重要である。なぜならば、ナノ粒子の特定の形態が異なる性能（生物学的又は触媒的）をもたらし得るからである。２種の異なる金属を種々様々なバイメタルナノ粒子として形成するための種々の技術が存在する。これらの技術のうちのいくつかを以下に論じる。
【０００８】
Ａ．化学的還元技術
マイケル・ファラデーは、およそ１８５０年代に化学的還元法によって最初のコロイド金懸濁液を製造したと考えられている（Faraday, 1857)。ファラデーは、エーテル（例えばＣＨ3−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3）中に分散されたリン、又は二硫化炭素（すなわちＣＳ2）を還元剤として利用して、水性金塩、クロロアウレート（すなわち金（ＩＩＩ）塩）を化学的に還元するために還元化学技術を用いた。
【０００９】
今日、ほとんどのコロイド金調製物は、クエン酸ナトリウムのような還元剤で塩素酸を還元することにより形成され（水素テトラクロロアウレート）、これにより「チンダル紫(Tyndall's purple)」をもたらす。現在、コロイド金を形成するために用いられる種々様々な「典型的」な還元化学法がある。具体的には、いくつかのクラスの合成ルートが存在し、これらのルートのそれぞれが、これにより生成される最終生成物（コロイド金ナノ粒子）における種々異なる特徴を示す。利用される還元剤の強度、量、及びタイプに加えて、安定剤（すなわち溶液相合成プロセスにおいて利用される化学物質）の作用も極めて重要であることも注目されている(Kimling, 2006)。
【００１０】
ファラデーはコロイド金溶液を導入したが、Turkevich及びFrensの均質結晶化法（及びこれらのバリエーション）が今日最も一般的に利用されており、典型的には、粒度範囲全体にわたって大部分が球形である粒子をもたらす(Kimling, 2006)。具体的には、大抵の現行の方法は、金（ＩＩＩ）錯体、例えば水素テトラクロロアウレート（又は塩素酸）で出発し、そして添加された化学種還元剤、例えばＮａチオシアネート、白リン、Ｎａ3シトレート及びタンニン酸、ＮａＢＨ4、クエン酸、エタノール、Ｎａアスコルベート、Ｎａ3シトレート、ヘキサデシルアニリン、及びその他を使用することによって、金錯体中の金を金金属（すなわち金（０）又は金属金）に還元する（Brown, 2008）。
【００１１】
溶液中の金属ナノ粒子合成は一般に、安定剤及び／又はキャッピング剤として界面活性剤及び／又は両親媒性ポリマーの使用を必要とする。界面活性剤及び／又は両親媒性ポリマーが、分散された粒子のサイズ、形状、及び安定性を制御するための重要な役割を果たすことがよく知られている(Sakai, 2008)。
【００１２】
固形状態、ガス状態、及び溶液状態からナノ粒子を形成することを含む数多くの種々異なる技術によってバイメタルナノ結晶が形成されている。固形状態は典型的には高温加熱及びアニールを必要とする。典型的なガス状態アプローチは普通、分子ビーム技術、すなわちレーザー、パルスアークビームなどによる混合金属粉末の蒸発を利用する。しかしながら、溶液状態アプローチは、はるかに頻繁に利用されるバイメタルナノ粒子形成技術である。典型的な溶液系処置では、所期金属ナノ粒子を得るために、（発生し得る又は発生する）所定の中間反応の適切な制御、及び対応する結晶化反応の制御が必要となる(Wang, 2011)。さらに、種々異なるタイプのバイメタルナノ結晶、例えばコアシェル（ヘテロ凝集体とも呼ばれる）、ヘテロ構造又はヘテロ凝集体、金属間化合物、混合物又は合金、並びに種々のコアシェル配列を得ることもできる (Wanjala, 2011)。これらの種々異なるタイプのバイメタルナノ結晶の全ては全く異なる物理性能能力を有することができる。
【００１３】
加えて、金−白金合金の製造が極めて難しいことが知られている。その理由は、このような合金がメタ安定的であり調製が難しいからである(Zhou, 2007)。異なる金属／金属イオンに対して存在する異なる酸化還元電位を含む種々様々な処理問題から、典型的な製造困難が生じる。さらに、白金と金とが合金されると、バイメタルＰｔ−Ａｕナノ粒子が、モノメタル非合金固形物のナノ粒子とは異なる独自の物理化学特性を示すことも知られている(Hernandez-Fernandez, 2007)。
【００１４】
Ｐｔ−Ａｕバイメタル・コアシェルナノ粒子の種々異なるアプローチが存在するが、しかし典型的には、コアには金が配置され、そして形成済バイメタルナノ結晶の表面上には白金が配置される。溶液中の典型的なＡｕイオン及びＰｔイオンの還元電位が異なるため、このようなコアシェル構造を形成することは比較的容易である (Ataee-Esfahani, 2010)。
【００１５】
さらに、バイメタルＰｔ−Ａｕナノ粒子を含む一般のナノ粒子の形成中に使用される還元剤及び／又は安定剤、及び／又は他の原材料成分が、結果としてのナノ粒子性能に極めて大きな影響を及ぼすという認識が目下高まりつつある。具体的には、例えば、ナノ粒子のサイズ及び形状の影響に起因して差異のあるナノ粒子性能に関して多くの研究者が歴史的に観察して報告している（すなわちサイズ及び形状が性能を決定づけると考えられる）が、つい最近では、ナノ粒子の表面に存在する材料の影響を定量化しようという試みが為されている。ナノ粒子製造中に使用される種々様々な安定剤及び／又は還元剤、及び／又は他の原材料成分に由来するもののような不純物の存在が、サイズ及び形状だけよりも劇的に性能を変えることがある（例えばいくつかの事例では、サイズ及び形状は表面化学特性に次ぐ二次的なものであり得る）。これに関しては、ナノ粒子の特性に対する安定剤の影響（例えばナノ粒子表面上の不純物）が、その触媒特性の変化を誘発するという「警鐘」を現在鳴らしている研究者もいる。従って、ナノ粒子がどのように形成されたか、そしてこれらの具体的な表面化学特性を考察することが、ナノ粒子の性能特徴を理解する上で最も重要である(Zhang, 2010)。
【００１６】
さらに、界面活性剤及び分散剤が大量に使用されることも懸念材料であることも知られている。なぜならば、このような添加剤は白金表面の真の触媒活性（例えばナノ粒子の性能）の評価を困難にしてしまうからである(Roy, 2012)。
【００１７】
ナノ粒子表面化学特性の重要性が、ナノ粒子性能問題を理解し制御するための鍵として焦点を当てられ始めている以上、現在、形成済ナノ粒子の表面上に配置された製造プロセスと関連する成分（外層、又は還元剤及び／又は表面キャッピング剤及び／又は他の原材料を使用する結果として形成された成分の存在）を除去しようという試みが為されつつある。この試みは、電気化学ストリッピングと組み合わせて酸素プラズマを利用することまでも含む(Yang, 2011)。しかし、このような表面改質アプローチの結果、ナノ粒子表面自体も変化してしまう。
【００１８】
表面形態（すなわち形成プロセスの関数としてナノ粒子表面上に配置された成分）と関連する特性を測定した研究者もおり、彼らは、ナノ粒子の最終表面形態が、おそらくはサイズ及び形態の作用よりも大きい影響を根本的な触媒活性に及ぼすと結論づけた(Liang, 2007)。
【００１９】
Ｂ．化学的還元技術によって形成されたコロイド金ナノ粒子のクリーニング
いくつかの事例において、還元剤表面被膜又は膜は、ナノ粒子の表面上の不純物として残ることを許されるが、しかし他の事例では、これはある程度複雑で高価な種々の技術によって除去するように試みられる。除去される場合には、被膜を典型的には、別の組成物又は被膜によって置き換えることにより、ナノ粒子が水和されたときに懸濁液中に残留するのを可能にする。ナノ粒子の化学的性質及び特性に対する表面純度の影響はしばしば見過ごされるが、しかし今や結果は、精製の程度が顕著な影響を及ぼし得ることを示す(Sweeney, 2006)。これらの研究者は、ナノ粒子の十分な精製が、精製自体、通常は退屈で多大な時間を費やす、無駄の多い手順、例えば大規模な溶剤洗浄及び分別結晶を伴うという点で、より難関であり得ることに注目している。このような精製がなければ、化学的に還元されたナノ粒子の表面上の表面化学特性に関連する汚染物質の変量が、基本的な構造−機能の関係を理解／制御する能力に影響を及ぼす(Sweeney, 2006)。
【００２０】
後続の処理技術は、一連の洗浄工程、或る特定の濃縮又は遠心分離工程、及び／又は後続の化学反応被覆工程を必要とすることもある。これらの工程の全ては、ナノ粒子及びナノ粒子懸濁液の望ましい結果及び所定の性能特性（例えばリガンド交換に起因する安定化、有効性、など）を得るために必要となる(Sperling, 2008)。他の事例では、過酷なストリッピング法を用いて、極めてクリーンなナノ粒子表面を保証する(Panyala, 2009)。
【００２１】
従って、他の研究者らは、疾患の管理、治療、及び／又は予防における金ナノ粒子の開発が、現行の金ナノ粒子製造方法が概ね化学的還元プロセスに基づくという事実によって妨げられていると結論づけている。具体的には、Robyn Whymanが1996年に、種々の還元化学技術によって製造されたコロイド金の進展を妨害している主なものの１つが、「比較的シンプルな、再現可能な、そして一般に適用可能な合成手順」の欠如であることを見いだした（Whyman 1996）。
【００２２】
他の研究者らは、形成されるナノ粒子の有害な物理的／生物学的性能を、ナノ粒子を製造するために用いられる化学的形成（すなわち化学的還元）プロセスから完全に切り離すことはできないことに気づき始めた。この点に関しては、多少複雑、高価であり、そして環境に優しくない洗浄又はクリーニング・プロセスを利用して、還元化学反応によって製造されたナノ粒子の表面を変化させるか又はクリーニングしても、化学プロセスの要素はナノ粒子表面に残ったまま、表面に（ひいては生物学的効果及び／又は毒性を含むこれらの機能に）影響を及ぼすことがある。
【００２３】
他の研究者は、クリーンなナノ粒子表面を得ようとするために、ＰＶＰ除去中の化学変化の最小化と組み合わせた手軽な新規の化学的方法によって、ＰＶＰを除去する方法を開発した(Monzo, 2012)。しかし、伝統的な洗浄アプローチによるこのような材料の除去は依然として達成しにくい。
【００２４】
還元化学アプローチによって生成されたコロイド組成物のそれぞれにおいて、還元剤及び／又は界面活性剤又はキャッピング剤のうちの１種又は２種以上の元素を含む表面被膜が、懸濁されたナノ粒子の少なくとも一部の上又は中に存在するようになることは明らかである。還元剤の使用は典型的には、液体（例えば水）中にナノ粒子を懸濁させるのを支援し得る。しかし還元剤被膜又は表面不純物は、界面活性剤被膜又はキャッピング剤に付加されることがあり、又は界面活性剤被膜又はキャッピング剤によって置き換えられることすらある。このような還元剤／界面活性剤被膜又は膜は、金属系ナノ粒子の上及び／又は中に位置する不純物と見なすことができ、ナノ粒子自体よりも保護被膜又は膜の特性の多くを実際に有しているようなコロイド又はゾルを生じさせることができる(Weiser, p.42, 1933)。
【００２５】
例えば、界面活性剤及び両親媒性ポリマーは、ナノ粒子の形成に関与する（ひいてはサイズ及び形状に影響を与える）だけでなく、ナノ粒子自体にも深く関与するようになる。ナノ粒子の表面特性は、還元剤被膜及び／又は界面活性剤被膜によって改変される(Sperling, 2008)。
【００２６】
Ｃ．添加された化学的還元剤に依存しないナノ粒子製作技術
１．  音響電気化学
単一金属ナノ粒子及びバイメタルナノ粒子双方を製造するための種々の音響電気化学技術が存在する。音響電気プロセスは典型的には、金属系原材料塩（例えばＨＡｕＣｌ4・４Ｈ2Ｏ（ＡｕＣｌ4-）、ＮａＡｕＣｌ4・２Ｈ2Ｏ、Ｈ2ＰｔＣｌ6・６Ｈ2Ｏ、ＨＡｕＣｌ3・３Ｈ2Ｏなど）に向けられる電気音響エネルギーに関し、そしてこれらの塩中の金属イオンが、音響電気化学法によって生成された１種又は２種以上の還元剤種によって還元させられる。これに関して、しばしば単一の電極が、電気化学工程によって、そしてこれに続いて音響工程によって、電極上のナノ粒子の成長を誘発する。音響工程は多かれ少なかれ電極からナノ粒子を放出しようとし、例えば水分子の分解反応によって付加的な還元剤材料を生成する。これに関して、単一電極は典型的には、電気化学（例えばナノ粒子形成）及び音響化学（例えば還元剤形成）双方の二重の仕事を行う(Nagata, 1996)。
【００２７】
音響電気化学技術のほとんどは、プロセスによってその場で形成され得るもののいずれかに加えて１種又は２種以上の還元剤及び／又はキャッピング剤を利用する。これに関しては、種々異なるポリマーが単一金属ナノ粒子のためのキャッピング剤として利用されている(Saez, 2009)。しかし他の研究者による研究(Liu, 2004; Ou, 2011; Mai, 2011;及びLiu, 2006)は全て、報告によれば還元剤を添加せずに音響電気化学パルス法を用いて金ナノ粒子を形成するための同様の音響電気化学技術を開示している。例えば、金電極から金イオンをストリッピングし、そして水溶液中のＡｕＣｌ4-化合物を形成するための電気化学サイクルと組み合わせて酸溶液を利用することが開示されている (Liu, 2004)。続いて、金イオンは、音響電気化学プロセスにおいて製造された生成済の還元剤種（例えばＨ2Ｏの溶解生成物）によって還元される。しかしおそらくは、製造された金ナノ粒子の濃度は、他の材料（例えば安定剤）を添加することのないこの技術によって著しく制限される（例えば３ｐｐｍ）(Ou, 2011)。
【００２８】
金ナノ粒子を形成するために、別の音響電気化学技術が用いられている。具体的には、ＮａＯＨを添加することによって、ＨＡｕＣｌ4・４Ｈ2Ｏ及びＫＮＯ3の出発材料をｐＨ調節することによって、異なるｐＨを得る。この場合約１０のｐＨが最適であることが判っている。直径約２０ｎｍのナノ粒子が製造された。ｐＨがほぼ１０の金ナノ粒子の表面電位は−５４．６５ｍＶであった。ＯＨ-基が金ナノ粒子上に吸着され、これらの間に静電反発力を引き起こすことが結論づけられた。従って、還元剤の添加は必要とならなかった(Shen, 2010)。
【００２９】
バイメタルナノ粒子を製造するための種々の音響電気化学技術も示されている。例えばＰＥＧ−ＭＳ（ポリエチレングリコールモノステアレート）によって安定化された白金−金ナノ粒子が製造されている(Fujimoto, 2001)。さらに、界面活性剤（アニオン性界面活性剤；ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）又は非イオン性界面活性剤ポリエチレングリコールモノステアレートＰＥＧ−ＭＳ）を利用して音響電気化学技術によって製造される二元金／白金ナノ粒子も形成されている(Nakanishi, 2005)。この方法において、いくつかの界面活性剤の添加が分散不能であると報告されている(Nakanishi, 2005)。同様に、関連研究において、種々の音響電気化学技術との組み合わせでＳＤＳ又はＰＥＧ−ＭＳを使用することが報告されている(Takatani, 2003)。音響電気化学技術によって形成されるこれらのバイメタルナノ結晶は全て界面活性剤の使用を必要とする。
【００３０】
２．ガンマ線照射
ナノ粒子を形成するための放射線分解技術は、主として単一金属（すなわちバイメタルではない）向けである。還元剤の必要性を最小化又は排除し、且つ／又は還元剤の望ましくない酸化生成物を最小化するための、より古いより複雑な技術は、線量率１．８ｘ１０4ｒａｄ／ｈの60Ｃｏ源からのγ線照射を利用する。この場合、先ず水の放射線分解から水和電子を形成し、そして水和電子を利用して金イオンを還元することにより、Ａｕ（ＣＮ）2が還元された。つまり：
ｅaq-＋Ａｕ（ＣＮ）2→Ａｕ0＋２ＣＮ-    (Henglein, 1998)。
さらに、線形加速器からのパルス活性化による水和電子及びＯＨラジカルの生成も行われている(Ghosh-Mazumdar, 1968)。生成されたこのような種は、水性金属系塩から種々の金属を還元するのを支援する。
【００３１】
３．Ｘ線照射
金属系ナノ粒子を製造するためにＸ線を用いるほとんどの研究は、単一金属組成物金属系ナノ粒子に焦点を当てているものの、（界面活性剤を用いて）合金を形成するための強力Ｘ線照射に関しても研究が行われている。
【００３２】
ＮａＣＯ3の添加とともにＨＡｕＣｌ4のシンクロトロンＸ線合成を行うことにより、付加的な還元剤を添加することなしにコロイド金ナノ粒子が形成されている(Yang, 2006)。この技術において、溶液を形成するために金塩を溶解し、そして適量のＮａＨＣＯ3をこれに添加した。報告された結果において、粒度の測定値は１０〜１５ｎｍであり、またｐＨは約７であった。金ナノ粒子の周りにＯＨ-基が配位されているため、金懸濁液は比較的安定であった(Yang, 2006)。
【００３３】
Ｘ線照射による静電保護によって安定化された単一金属金ナノゾルも生じている(Wang, 2007; Wang, 2007)。Ｘ線は前駆体溶液中に還元剤電子を発生させた。このアプローチは極めて強力なＸ線ビームを必要とする（ひいてはシンクロトロン源を必要とする）ことも判った(Wang, 2007; Wang, 2007)。加えてナノ粒子懸濁液はｐＨ９で形成され、その表面電位はゼータメーターによって測定して−５７．８＋／−ｍＶであった。形成済ナノ粒子のサイズは約１０ｎｍであった。加えて、溶液にＮａＯＨを添加することによって、ｐＨを６〜９の値に変化させた(Wang, 2007)。さらに、使用されるＸ線は水放射線分解のための閾値エネルギーを大きく上回り、付加的なＸ線エネルギーは、認識されていない中間反応を引き起こすことがある（キネティック効果）(Wang, 2007)。
【００３４】
さらに、Ｘ線光化学反応を用いて、金属ナノ粒子懸濁液が形成されている(Ma, 2008)。ナノ粒子形成前の中間反応の詳細に関する知識が、サイズ、形状、及び特性を制御するために重要であることが判った(Ma, 2008)。
【００３５】
強力Ｘ線照射によるＡｕ−Ｐｔ合金のワンポット合成も開示されている(Wang, 2011)。入射Ｘ線は、ＰＥＧ（ナノ粒子凝集を防止することで知られる一般的な界面活性剤分子）を含有する金／白金塩溶液（すなわちＨＡｕＣｌ4・３Ｈ2Ｏ及びＨ2ＰｔＣｌ6・６Ｈ2Ｏ）を照射する。しかし、ＰＥＧは表面条件に対して鋭敏な用途、例えば触媒にはネガティブな影響を及ぼすおそれがあることが判った(Wang, 2011)。
【００３６】
４．レーザー照射
フェムト秒レーザー合成によってバイメタルＰｔ−Ａｕナノ粒子が形成されている(Chau, 2011)。具体的には、金塩溶液及び白金塩溶液（すなわちＨＡｕＣｌ4・４Ｈ2Ｏ及びＨ2ＰｔＣｌ6・６Ｈ2Ｏ）をＰＶＰ（周知の分散／安定剤）と組み合わせ、溶液をレーザー照射した。関連研究において、金塩及び白金塩の同様の溶液を高強度レーザー照射した。しかしこの溶液中にはＰＥＧは添加されず、結果として生じたナノ粒子は安定ではないことが判った(Nakamura, 2011; Nakamura, 2010; Nakamura, 2009)。
【００３７】
５．レーザーアブレーション
金ナノ粒子を形成するためのトップダウン・レーザーアブレーション・アプローチが試みられている。しかしながら、レーザーアブレーションは典型的には、金属テーゲット表面上にある種の酸化物を生じさせる(Sylvestre, 2004)。
【００３８】
６．電子加速器
また、電子ビーム照射によってバイメタル金−白金ナノ粒子が形成されている (Mirdamadi-Esfahani, 2010)。具体的には、このアプローチにおいて、電子ビーム照射は水の放射線分解によって水和電子及び還元ラジカルを生成する。金及び白金の金属塩（すなわちＫＡｕＣｌ4及びＨ2ＰｔＣｌ6）をポリアクリル酸（すなわち分散剤／安定剤）と混合し、そして加速された電子をこれに導く。
【００３９】
Ｄ．生物学的性能
異なる表面化学特性又は表面膜（例えば還元剤副産組成物の存在及び／又は還元剤副産物の厚さ（例えば膜））は、ナノ粒子と、例えば生物内の種々様々なタンパク質との種々異なる相互作用をもたらすことができる。タンパク質に対するナノ粒子の生物物理学的な結合力（例えば静電、疎水性、水素結合、ファンデルワールス）は、ナノ粒子のサイズ、形状、及び組成の関数であるだけでなく、ナノ粒子上の表面不純物又は被膜のタイプ及び／又は厚さの関数でもある(Lacerda, 2010)。
【００４０】
ナノ粒子の生物学的効果をより良く理解するためには、それ自体をナノ粒子と関連づける生体内タンパク質の結合特性を理解することが必要となる。ナノ粒子上のタンパク質吸収率（又はタンパク質コロナ）は、ナノ粒子サイズ及び表面層の組成及び厚さの関数として変化することができる。ナノ粒子を「ドレッシング」するタンパク質層が、ナノ粒子が凝集する傾向を制御し、そして生物学的物質とのこれらの相互作用に強い影響を与える（Lacerda, 2010)。
【００４１】
加えて、ナノ粒子の形状及び表面化学特性の両方は、モデル生体系内の細胞毒性及び細胞取り込みに影響を及ぼす(Qiu, 2010)。しかし、表面化学特性だけが望ましくない細胞特性に関与すると結論づけられた。具体的には、ＣＴＡＢ被膜（すなわちセチルトリメチルアンモニウムブロミド）を有する金ナノ粒子は、生物学的プロセス内の異なる時点で、且つ／又は生物内部の異なる個所でこれらの被膜の部分を放出する。このことが毒性をもたらす(Qui, 2010)。
【００４２】
さらに２０１０年に発表された重要な論文において、著者は1981年以来、２３０件を超える発表済みの研究が、クエン酸塩還元法から生成された金ナノ粒子を利用しており、反応系内の非金成分に関するデータは稀であると述べている(Balassubramanian, 2010)。著者は、生物学的性能試験の多くが、ナノ粒子自体ではなくナノ粒子内／上に存在する成分（例えば表面化学特性）を理解していないことによって歪曲されていることは明らかである、と結論づけている(Balassubramanian, 2010)。
【００４３】
ナノ粒子上に形成されたタンパク質コロナは、ナノ粒子に生物学的同一性を与えるタンパク質コロナであるという理由から重要である(Lynch, 2007)。ナノ粒子の表面並びにそのサイズ及びその形状は、タンパク質コロナの形成を支援する(Lynch, 2007)。
【００４４】
さらに、アルブミン系薬物送達が新規の治療アプローチとして認識されている(Wunder, 2003; Stehle, 1997; Stehle, 1997)。具体的には、アルブミン結合は、治療薬の望ましいターゲット個所への送達を支援し、効果を高め／毒性を低くする。
【００４５】
参考文献
「背景技術」全体を通して引用された参考文献を以下に詳細に挙げる。
Ataee-Esfahani, H., Wang, L., Nemoto, Y. & Yamauchi, Y. (2010). Synthesis of Bimetallic Au@Pt Nanoparticles with Au Core and Nanostructured Pt Shell toward Highly Active Electrocatalysts. Chem. Mater., 22, 6310-6318.
Balasubramanian, S.K., Yang, L., Yung, L.-Y.L., Ong, C.-N., Ong, W.-Y. & Yu, L.E. (2010). Characterization, purification, and stability of gold nanoparticles. Biomaterials, 31, 9023-9030.
Brown, C.L., Whitehouse, M.W., Tiekink, E.R.T., & Bushell G.R. (2008). Colloidal metallic gold is not bio-inert. Inflammopharmacology, 16, 133-137.
Chau, J.L.H., Chen, C.-Y., Yang, M.-C, Lin, K.-L., Sato, S., Nakamura, T., Yang, C.-C. & Cheng, C.-W. (2011). Femtosecond laser synthesis of bimetallic Pt-Au nanoparticles. Materials Letters, 65, 804-807.
Faraday, M. (1857). The Bakerian lecture: Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosoph. Trans. R. Soc. London, 147, 145-181.
Fujimoto, T., Mizukoshi, Y., Nagata, Y., Maeda, Y. & Oshima, R. (2001). Sonolytical Preparation of Various Types of Metal Nanoparticles in Aqueous Solution. Scipta mater., 44, 2183-2186.
Ghosh-Mazumdar, A.S. (1968). A Pulse Radiolysis Study of Bivalent and Zerovalent Gold in Aqueous Solutions. Radiation Chemistry, 193-209.
Henglein, A. & Meisel, D. (1998). Radiolytic Control of the Size of Colloidal Gold Nanoparticles. Langmuir, 14, 7392-7396.
Hernandez-Fernandez, P., Rojas, S., Ocon, P., Gomez de la Fuente, J.L., San Fabian, J., Sanza, J., Pena, M.A., Garcia-Garcia, F.J., Terreros, P. & Fierro, J.L.G. (2007) Influence of the Preparation Route of Bimetallic Pt-Au Nanoparticle Electrocatalysts for the Oxygen Reduction Reaction. J. Phys. Chem. C, 111, 2913-2923.
Kimling, J., Maier, M., Okenve, B., Kotaidis, V., Ballot, H. & Plech, A. (2006). Turkevich Method for Gold Nanoparticle Synthesis Revisited. J. Phys. Chem. B, 110, 15700-15707.
Lacerda, S.H.D.P., et al. (2010). Interaction of Gold Nanoparticles with Common Human Blood Proteins. American Chemical Society, 4 (1), 365-379.
Liu, Y.-C, Lin, L.-H. & Chiu, W.-H. (2004) Size-Controlled Synthesis of Gold Nanoparticles from Bulk Gold Substrates by Sonoelectrochemical Methods. J. Phys. Chem. B, 108, 19237-19240.
Liu, Y.-C, Yu, C.-C, & Yang, K.-H. (2006). Active catalysts of electrochemically prepared gold nanoparticles for the decomposition of aldehyde in alcohol solutions. Electrochemistry Communications, 8, 1163-1167.
Liu, Y.-C, Lee, H.-T. & Peng, H.-H. (2004). New pathway for sonoelectrochemical synthesis of gold-silver alloy nanoparticles from their bulk substrates. Chemical Physics Letters, 400, 436-440.
Lynch, I., Cedervall, T., Lundqvist, M., Cabaleiro-Lago, C, Linse, S. & Dawson, K.A. (2007). The nanoparticle-protein complex as a biological entity; a complex fluids and surface science challenge for the 21st century. Advances in Colloid and Interface Science, 134-135.
Ma, Q., Divan, R., Mancini, D.C & Keane, D. T. (2008). Elucidating Chemical and Morphological Changes in Tetrachloroauric Solutions Induced by X-ray Photochemical Reaction. J. Phys. Chem. A., 112, 4568-4572.
Mai, F.-D., Hsu, T.-C, Liu, Y.-C. & Yang, K.-H. (2011). Strategy of fabricating enriched gold nanoparticles based on electrochemical methods. Materials Letters, 65, 1788-1790.
Mirdamadi-Esfahani, M., Mostafavi, M., Keita, B., Nadjo, L., Kooyman, P. & Remita, H. (2010). Bimetallic Au-Pt nanoparticles synthesized by radiolysis: Application in electro-catalysis. Gold Bulletin, 43, (1).
Monzo, J., Koper, M.T.M. & Rodriguez, P. (2012). Removing Polyvinylpyrrolidone from Catalytic Pt Nanoparticles without Modification of Superficial Order. ChemPhysChem, 13, 709-715.
Nagata, Y., Mizukoshi, Y. Okitsu, K. & Maeda, Y. (1996). Sonochemical Formation of Gold Particles in Aqueous Solution. Radiation Research, 146, 333-338.
Nakamura, T., Herbani, Y. & Sato, S. (2011). Fabrication of Gold-Platinum Nanoalloy by High-Intensity Laser Irradiation of Solution. Supplemental Proceedings, 2, 3-8.
Nakamura, T., Herbani, Y. & Sato, S. (2010). Fabrication of gold-platinum nanoparticles by intense, femtosecond laser irradiation of aqueous solution. Optical Society of America.
Nakamura, T., Magara, H., Herbani, Y., Ito, A. & Sato, S. (2009). Fabrication of gold-platinum nanoparticles by intense, femtosecond laser irradiation of aqueous solution. Optical Society of America.
Nakanishi, M., Takatani, H., Kobayashi, Y., Hori, F., Taniguchi, R., Iwase, A. & Oshima, R. (2005). Characterization of binary gold/platinum nanoparticles prepared by sonochemistry technique. Applied Surface Science, 241, 209-212.
Ou, K.-L., Yang, K.-H., Liu, Y.-C, Hsu, T.-C. & Chen, Q.-Y. (2011). New strategy to prepare enriched and small gold nanoparticles by sonoelectrochemical pulse methods. Electrochimica Acta, 58, 497-502.
Panyala, N.G., Pena-Mendez, E.M., & Havel, J. (2009). Gold and nano-gold in medicine: overview, toxicology and perspectives. Journal of Applied Biomedicine, 7, 75-91.
Qiu, Y., et al. (2010). Surface chemistry and aspect ratio mediated cellular uptake of Au nanorods. Biomaterials, 31 , 7606-7619.
Roy, R.K., Njagi, J.I., Farrell, B., Halaciuga, I., Lopez, M. & Goia, D.V. (2012). Deposition of continuous platinum shells on gold nanoparticles by chemical precipitaion. Journal of Colloid and Interface Science, 369, 91-95.
Saez, V. & Mason, T.J. (2009). Sonoelectrochemical Synthesis of Nanoparticles. Molecules, 14, 4284-4299.
Sakai, T., Enomoto, H., Torigoe, K., Kakai, H. & Abe, M. (2008). Surfactant-and reducer-free synthesis of gold nanoparticles in aqueous solutions. Colloids and Surface A: Physiocochemical and Engineering Aspects, 18-26.
Shen, Q., Min, Q., Shi, J., Jiang, L., Hou, W. & Zhu, J.-J. (2011). Synthesis of stabilizer-free gold nanoparticles by puls sonoelectrochemical method. Ultrasonics Sonochemistry, 18, 231-237.
Sperling, R.A., Gil, P.R., Zhang, F., Zanella, M., & Parak, W.J. (2008). Biological applications of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev, 37, 1896-1908.
Stehle, G., Sinn, H., Wunder, A., Schrenk, H.H., Schutt, S., Maier-Borst, W. & Heene, L. (1997). The loading rate determines tumor targeting properties of methotrexate-albumin conjugates in rats. Anti-Cancer Drugs, 8, 677-685.
Stehle, G., Wunder, A., Sinn, H., Schrenk, H.H., Schutt, S., Frei, E., Hartung, G., Maier-Borst, W. & Heene, D.L. (1997). Pharmacokinetics of methotrexate-albumin conjugates in tumor-bearing rats. Anti-Cancer Drugs, 8, 835-844.
Sweeney, S.F., Woehrle, G.H. & Hutchison, J.E. (2006). Rapid Purification and Size Separation of Gold Nanoparticles via Diafiltration. J. Am. Chem. Soc, 128, 3190-3197.
Sylvestre, J.-P., Poulin, S., Kabashin, A.V., Sacher, E., Meunier, M. & Luong, J.H.T. (2004). Surface Chemistry of Gold Nanoparticles Produced by Laser Ablation in Aqueous Media. J. Phys. Chem. B., 16864-16869.
Takatani, H, Kago, H, Nakanishi, M., Kobayashi, Y., Hori, F. & Oshima, R. (2003). Characterization of Noble Metal Alloy Nanoparticles Prepared by Ultrasound Irradiation. Rev. Adv. Mater. Sci., 5, 232-238.
Wang, C.H., et al. (2007). Aqueous gold nanosols stabilized by electrostatic protection generated by X-ray irradiation assisted radical reduction. Materials Chemistry and Physics, 106, 323-329.
Wang, D. & Li, Y. (2011). Bimetallic Nanocrystals: Liquid-Phase Synthesis and Catalytic Applications. Adv. Mater, 23, 1044-1060.
Wang, C.-H, Hua, T.-E., Chien, C.-C, Yu, Y.-L., Yang, T.-Y., Liu, C.-J., Leng, W.-H, Hwu, Y., Yang, Y.-C, Kim, C.-C, Je, J.-H, Chen, C.-H, Lin, H.-M. & Margaritondo, G. (2007). Aqueous gold nanosols stabilized by electrostatic protection generated by X-ray irradiation assisted radical reduction. Materials Chemistry and Physics, 106, 323-329.
Wang, C.-H, Chien, C.-C, Yu, Y.-Lu., Liu, C.-J., Lee, C.-F., Chen, C.-H, Hwu, Y., Yang, C-S., Je, J.-H. & Margaritondo, G. (2007). Structural properties of 'naked' gold nanoparticles formed by synchrotron X-ray irradiation. J. Synchrotron Rad., 14, 477-482.
Wang, C.-L., Hsao, B.-L, Lai, S.-F., Chen, W.-C, Chen, H.-H., Chen, Y.-Y., Chien, C.-Ch. Cai, X., Kempson, I.M., Hwu, Y. & Margaritondo, G. (2011). One-pot synthesis of AuPt alloyed nanoparticles by intense x-ray irradiation. Nanotechnology, 22, 065605-065611.
Wanjala, B.N., Luo, J., Fang, B., Mott, D. & Zhong, C-J. (2011). Gold-platinum nanoparticles: alloying and phase segregation. J. Mater. Chem, 21, 4012-4020.
Weiser, H.B. Inorganic Colloid Chemistry - Volume I: The Colloidal Elements. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1933.
Whyman, R. (1996). Gold Nanoparticles A Renaissance in Gold Chemistry. Gold Bulletin, 29(1), 11-15.
Wunder, A. Muller-Ladner, U., Stelzer, E.H.K., Funk, J., Neumann, E., Stehle, G., Pap, T., Sinn, H., Gay, S. & Fiehn, C. (2003). Albumin-Based Drug Delivery as Novel Therapeutic Approach for Rheumatoid Arthritis. The Journal of Immunology, 170, 4793-4801.
Yang, S., Park, N.-Y., Han, J.W., Kim, C, Lee, S.-C. & Lee, H. (2012). A distinct platinum growth mode on shaped gold nanocrystals. Chem. Commun, 48, 257-259.
Yang, Y.-C, Wang, C.-H., Hwu, Y.-K. & Je, J.-H. (2006). Synchrotron X-ray synthesis of colloidal gold particles for drug delivery. Materials Chemistry and Physics, 100, 72-76.
Zhang, G.-R. & Xu, B.-Q. (2010). Surprisingly strong effect of stabilizer on the properties of Au nanoparticles and Pt-Au nanostructures in electrocatalysts. Nanoscale, 2, 2798-2804.
Zhou, S., Jackson, G.S. & Eichhorn, B. (2007). AuPt Alloy Nanoparticles for CO-Tolerant Hydrogen Activation: Architectural Effects in Au-Pt Bimetallic Nanocrystals. Adv. Funct. Mater., 17, 3099-3104.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４６】
提供される新しいバイメタルナノ結晶懸濁液は、有機又はその他の不純物又は膜を実質的に含まず（本明細書中で定義される）にすみ、或いは所定の事例では、何らかの望ましい膜又は部分被膜を含有してもよい。具体的には、表面は、溶液中の金属イオンから金ナノ粒子を成長させるために化学的還元剤及び／又は界面活性剤を必要とする化学的還元プロセスを用いて形成されたものと比較して「クリーン」である。結果として生じるバイメタルナノ結晶懸濁液又はコロイドの望ましいｐＨ範囲は例えば４．０〜１２．０、より典型的には５．０〜１１．０、そしてさらに典型的には８．０〜１１．０、そして多くの実施態様では１０．０〜１１．０であり、そしてゼータ電位値は当該ｐＨ範囲に対応して、少なくとも−２０ｍＶ、より典型的には少なくとも−４０ｍＶ、、そしてさらに典型的には少なくとも−５０ｍＶである。
【００４７】
下記製造プロセスに従って調製されるこれらのバイメタルナノ結晶の形状及び形状分布の一例としては、球形、五角形、六角形（例えば六角両錐体、二十面体、八面体）、及び「その他」が挙げられる。
【００４８】
提供し得るバイメタルナノ結晶はいずれの所期平均サイズも１００ｎｍ未満である。最も望ましい結晶サイズ範囲は、平均結晶サイズ（明細書中に詳細に開示された特定技術によって測定され定義される）が主として１００ｎｍ未満、より典型的には５０ｎｍ未満、さらに典型的には３０ｎｍ未満であるものを含む。そして明細書中に開示された好ましい実施態様の場合、ナノ結晶サイズ分布の平均結晶サイズは２０ｎｍ未満であり、さらに好ましい範囲は８〜１８ｎｍである。しかし、特定の用途の場合、望まれるならば、本明細書中に開示された電気化学技術を利用して、より大型のナノ結晶をもたらすことができる。
【００４９】
本発明によれば、種々様々な濃度のバイメタルナノ結晶を提供することができる。例えば、最初に製造されるバイメタルナノ結晶の総原子金属濃度は数ｐｐｍ（すなわちμｇ／ｍｌ又はｍｇ／ｌ）〜数百ｐｐｍであってよいが、しかし典型的には２〜２００ｐｐｍ（２μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ）、より多くの場合には２〜５０ｐｐｍ（２μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）、そしてさらに典型的には５〜２０ｐｐｍ（５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）であり得る。しかし、濃縮「初期」生成物が、２００〜５，０００ｐｐｍ、より好ましくは２００〜３，０００ｐｐｍ、そしてさらに好ましくは２００〜１，０００ｐｐｍのｐｐｍを有するように形成されるのを可能にする新規の濃縮技術が本明細書中に開示されている。
【００５０】
懸濁液中のバイメタルナノ結晶は合金、部分合金、相分離又はヘテロ凝集体又は混合物として形成することができる。本明細書中の好ましい実施態様において、バイメタルナノ結晶は合金及び／又はヘテロ凝集体である。金が典型的には主成分（すなわち体積比及び容積比がより大きい）であり、白金が典型的には微量成分（すなわち体積比及び容積比がより小さい）である。典型的な比は２／１〜１０／１であり、好ましい範囲は３／１〜８／１であり、さらに好ましくは３／１〜６／１である。
【００５１】
これらの独自のバイメタルナノ結晶を製造するために、新規の一連のプロセスが提供される。それぞれのプロセスは水中でバイメタルナノ結晶を生成することを伴う。好ましい実施態様において、水は、添加された「処理増強剤（process enhancer)」を含有している。この処理増強剤は、形成済金ナノ結晶に有意には結合せず、むしろ電気化学的刺激を受ける成長プロセス中の核形成及び／又は結晶成長を容易にする。処理増強剤は例えば、結晶が成長するのを可能にするように、電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することを含むプロセスにおいて重要な役割を担う。
【００５２】
好ましい実施態様において、第１工程は、少なくとも１種の処理増強剤を用いて白金金属系種を形成することを含み、そして形成された水性懸濁液／溶液を次いで原材料溶液／懸濁液として第２工程において使用する。この第２工程では、金金属系種を還元及び／又は共還元することによってバイメタルナノ結晶を水中で成長させる。具体的には、これらのプロセスは先ず、水中の少なくとも１つの白金種及び水の少なくとも１種の分解反応生成物（lysis product of water；以下、同じ）を電気化学的に形成し、これにより白金種及び水材料を生成し；そして生成された白金／水材料を第２の電気化学反応に使用することにより、水中のバイメタル金−白金ナノ結晶の懸濁液を形成することを伴う。
【００５３】
本発明の電気化学製造プロセスに従うことによって、これらのバイメタルナノ結晶はコア金属上に合金又は金属「被膜」（又は被膜部分、例えば島）を形成することができ、或いはヘテロ凝集体を形成することもできる。或いは、ナノ結晶混合物を製造することもできる。また、種々の合金又は混合物又はヘテロ凝集体が、所望の場合には単一コロイド又は懸濁液内部に生じてもよい。いくつかの事例において、望ましい残留金属イオンが懸濁液中に溶液の形態を成していてよい。
【００５４】
これらの新規の電気化学プロセスは、バッチ法、半連続又は連続法で行うことができる。これらのプロセスは、制御されたバイメタルナノ結晶濃度、制御されたナノ結晶サイズ、及び制御されたナノ結晶サイズ範囲をもたらす。これらのバイメタルナノ結晶を製造するために、新規の製造アセンブリが提供される。
【００５５】
これらのバイメタルナノ結晶は以前から利用可能な金属系（又はバイメタル系）ナノ粒子よりも著しくクリーンな表面を有しており、そして新規の結晶形状及び／又は結晶形状分布を形成する、空間的に広がる低指数結晶面を望ましく含有することができる。バイメタルナノ結晶は、表面汚染物質、例えば化学的還元剤及び／又は界面活性剤、又は伝統的な化学的還元（又は他の）プロセスから生じる残留原材料を含有するものよりも活性であるように見える（例えば生物学的に活性であり、また毒性がより低いことがあり得る）。従って、ナノ粒子の用途、例えば触媒プロセス、医学的治療、生物学的プロセス、医学的診断などに、本明細書中の技術に従って製造されたより低い濃度の金属系ナノ結晶で影響を与えることができる。
【００５６】
さらに、バイメタルナノ結晶を成長させるために使用される原材料金属イオンが、種々の電気化学プロセス中に使用される犠牲金属電極によって提供されるので、Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液を形成するための原材料として金系塩（又は等価物）又は白金系塩（又は等価物）を用意する必要はない。従って、Ｃｌ-、塩化物、又は塩素系材料のような成分が、新規プロセスの一部又は製造される新規バイメタルナノ結晶懸濁液の一部である必要はない。加えて、Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液を製造するために塩素系酸も必要とされない。
【００５７】
さらに、本発明の上述の金属系バイメタルナノ結晶懸濁液又はコロイドを、他の金属系溶液又はコロイドと混合する又は組み合わせることにより、新規の溶液又はコロイド混合物（例えばこの事例において、明確な金属種を懸濁液中の複合体又は明確な種としてなおも識別することができる）。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、本発明による手動電極集成体を示す概略断面図である。
【図２】図２は、本発明による自動電極制御集成体を示す概略断面図である。
【図３】図３ａ〜図３ｅは、電極１のための構造の５つの異なる代表的実施態様を示す図である。
【図４】図４は、図３ｅに相当する電極１の１つの具体的な構造を利用して産出されたプラズマを示す断面概略図である。
【図５】図５ａ〜５ｅは、種々のトラフ部材３０を示す種々の断面図である。
【図６】図６は、トラフ部材３０上に配置された１組の制御装置２０を、液体３がトラフ部材を貫流して貯蔵容器４１内に入る状態で示す概略断面図である。
【図７ａ】図７ａは、本発明の異なる実施態様とともに使用するためのＡＣ変圧器の電気配線図である。
【図７ｂ】図７ｂは、変圧器６０を示す概略図である。
【図７ｃ】図７ｃは、同相の２つの正弦波を示す概略図である。
【図７ｄ】図７ｄは、異相の２つの正弦波を示す概略図である。
【図８ａ】図８ａは、本明細書中にいくつかの例において使用された金ワイヤー５ａ及び５ｂの図である。
【図８ｂ】図８ｂは、本明細書中にいくつかの例において使用された金ワイヤー５ａ及び５ｂの図である。
【図８ｃ】図８ｃは、本明細書中の例全体にわたる全てにおいて使用される装置２０を示す図である。
【図８ｄ】図８ｄは、装置２０を監視及び／又は制御するために使用される配線図である。
【図８ｅ】図８ｅは、装置２０を監視及び／又は制御するために使用される配線図である。
【図８ｆ】図８ｆは、装置２０を監視及び／又は制御するために使用される配線図である。
【図８ｇ】図８ｇは、装置２０を監視及び／又は制御するために使用される配線図である。
【図８ｈ】図８ｈは、装置２０に給電するために使用される配線図である。
【図８ｉ】図８ｉは、装置２０に給電するために使用される配線図である。
【図８ｊ】図８ｊは、装置２０内のワイヤ５／５に給電するための設計を示す図である。
【図９】図９は、１つのプラズマ４ａが形成される第１トラフ部材３０ａを示す図である。この第１トラフ部材３０ａ’の出力は第２トラフ部材３０ｂ’内に流入する。
【図１０ａ】図１０ａは、トラフ部材部分３０ａ’及び３０ｂ’が隣接している、トラフ部材３０ｂ’の別の設計を示す図である。
【図１０ｂ】図１０ｂは、トラフ部材部分３０ａ’及び３０ｂ’が隣接している、トラフ部材３０ｂ’の別の設計を示す図である。
【図１０ｃ】図１０ｃは、トラフ部材部分３０ａ’及び３０ｂ’が隣接している、トラフ部材３０ｂ’の別の設計を示す図である。
【図１０ｄ】図１０ｄは、トラフ部材部分３０ａ’及び３０ｂ’が隣接している、トラフ部材３０ｂ’の別の設計を示す図である。
【図１１ａ】図１１ａは、図１０ａ〜１０ｄ及び本明細書中の種々の例と関連して使用される２つのトラフ部材３０ｂ’のうちの１つを示す図である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、図１０ａ〜１０ｄ及び本明細書中の種々の例と関連して使用される２つのトラフ部材３０ｂ’のうちの１つを示す図である。
【図１１ｃ】図１１ｃは、例１に関連して形成された乾燥金成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１１ｄ】図１１ｄは、例１に関連して形成された成分に対するＴＥＭ測定から生じた粒度分布ヒストグラムを示す図である。
【図１１ｅ】図１１ｅは、例１に従って形成された金懸濁液のそれぞれのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル・パターンを示す図である。
【図１２ａ】図１２ａは、バッチ法で示される装置であって、第１工程においてプラズマ４を形成することにより流体３’をコンディショニングする装置を示す概略図である。
【図１２ｂ】図１２ｂは、図１２ａに示された装置と関連して、そして本明細書中の種々の例において論じられているように、懸濁液（例えばコロイド）中のバイメタルナノ結晶を形成するためにワイヤー５ａ及び５ｂを利用するバッチ法で使用される装置を示す概略図である。
【図１２ｃ】図１２ｃは、図１２ａに示された装置と関連して、そして本明細書中の種々の例において論じられているように、懸濁液（例えばコロイド）中のバイメタルナノ結晶を形成するためにワイヤー５ａ及び５ｂを利用するバッチ法で使用される装置を示す概略図である。
【図１２ｄ】図１２ｄは、図１２ａに示された装置と関連して、そして本明細書中の種々の例において論じられているように、懸濁液（例えばコロイド）中のバイメタルナノ結晶を形成するためにワイヤー５ａ及び５ｂを利用するバッチ法で使用される装置を示す概略図である。
【図１２ｅ】図１２ｅは、例２及び３において使用される増幅器を示す概略図である。
【図１２ｆ】図１２ｆは、例２及び３において使用される給電装置を示す概略図である。
【図１２ｇ】図１２ｇは、例６に従って形成されたＡｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル・パターンを示す図である。
【図１３】図１３は、本明細書中の多くの例においてナノ結晶を生成するために用いられる給電装置の電気的設定を示す概略図である。
【図１４】図１４は、例２と関連して形成された乾燥白金成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１５ａ】図１５ａは、例３と関連して形成された乾燥白金成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１５ｂ】図１５ｂは、例３と関連して形成された成分のＴＥＭ測定から生じた粒度分布ヒストグラムを示す図である。
【図１６】図１６は、例４と関連して形成された乾燥白金成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、例５に従って形成された７種の白金溶液／懸濁液のそれぞれのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル・パターンを示す図である。
【図１８】図１８は、例６に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図１９】図１９は、例７に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、例８に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２１】図２１ａ及び２１ｂは、例９に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２２ａ】図２２ａは、図２１ａに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２２ｂ】図２２ｂは、図２１ｂに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２３】図２３ａ及び２３ｂは、例９に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２４ａ】図２４ａは、図２３ａに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２４ｂ】図２４ｂは、図２３ｂに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２５ａ】図２５ａは、例１０に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２５ｂ】図２５ｂは、図２５ａに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２６ａ】図２６ａは、例１１に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２６ｂ】図２６ｂは、図２６ａに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２７】図２７は、ＧＰＢ−０３２のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルグラフを示す。
【図２８ａ】図２８ａは、Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液の３つのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルグラフを示す。
【図２８ｂ】図２８ｂは、５種の異なるＧＰＢバイメタル懸濁液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルグラフを示す。
【図２８ｃ】図２８ｃは、例１６に従って形成されたバイメタルナノ粒子の粒子半径対周波数のグラフを示す。
【図２９ａ】図２９ａは、例１７に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２９ｂ】図２９ｂは、図２９ａに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２９ｃ】図２９ｃは、例１７に従って形成された乾燥成分の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【図２９ｄ】図２９ｄは、図２９ｃに対応する代表的なＥＤＳスペクトルである。
【図２９ｅ】図２９ｅは、ＧＰＢ−０４０懸濁液中のナノ結晶の走査透過電子顕微鏡画像である。
【図２９ｆ】図２９ｆは、ＧＰＢ−０４０懸濁液中のナノ結晶の走査透過電子顕微鏡画像である。
【図２９ｇ】図２９ｇは、ＧＰＢ−０４０懸濁液中のナノ結晶の走査透過電子顕微鏡画像である。
【図２９ｈ】図２９ｈは、例１７に対応する代表的なＸＰＳスペクトルである。
【図２９ｉ】図２９ｉは、例１７に対応する代表的なＸＰＳスペクトルである。
【図３０】図３０は、例１７に従って形成されたＧＰＰ−０４０のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルグラフである。
【図３１ａ】図３１ａは、例１８において用いられる透析処置の概略図である。
【図３１ｂ】図３１ｂは、例１８において用いられる透析処置の概略図である。
【図３１ｃ】図３１ｃは、ＴＦＦ装置の概略図である。
【図３２ａ】図３２ａは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｂ】図３２ｂは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｃ】図３２ｃは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｄ】図３２ｄは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｅ】図３２ｅは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｆ】図３２ｆは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｇ】図３２ｇは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｈ】図３２ｈは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｉ】図３２ｉは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｊ】図３２ｊは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｋ】図３２ｋは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｌ】図３２ｌは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｍ】図３２ｍは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｎ】図３２ｎは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｏ】図３２ｏは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｐ】図３２ｐは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｑ】図３２ｑは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｒ】図３２ｒは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｓ】図３２ｓは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｔ】図３２ｔは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｕ】図３２ｕは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｖ】図３２ｖは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｗ】図３２ｗは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｘ】図３２ｘは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｙ】図３２ｙは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ｚ】図３２ｚは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ａａ】図３２ａａは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ａｂ】図３２ａｂは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ａｃ】図３２ａｃは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３２ａｄ】図３２ａｄは、２種の懸濁液(ＮＥ１０２１４及びバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−０３２）の抗癌活性を示すグラフである。
【図３３ａ】図３３ａは、例２０ａに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３３ｂ】図３３ｂは、例２０ａに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３４ａ】図３４ａは、例２０ｂに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３４ｂ】図３４ｂは、例２０ｂに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３５ａ】図３５ａは、例２０ｃに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３５ｂ】図３５ｂは、例２０ｃに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３６ａ】図３６ａは、例２０ｄに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３６ｂ】図３６ｂは、例２０ｄに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３７ａ】図３７ａは、例２０ｅに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３７ｂ】図３７ｂは、例２０ｅに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３８ａ】図３８ａは、例２０ｆに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３８ｂ】図３８ｂは、例２０ｆに示された癌異種移植試験の結果を示す。
【図３９ａ】図３９ａは、例２１に示されたマウスの液体消費量及び体重増加を示す。
【図３９ｂ】図３９ｂは、例２１に示されたマウスの液体消費量及び体重増加を示す。
【図４０ａ】図４０ａは、ＧＰＢ−１１及び種々のタンパク質バインダーの吸光量を示すグラフである。
【図４０ｂ】図４０ｂは、ＧＰＢ−１１及び種々のタンパク質バインダーの吸光量を示すグラフである。
【図４０ｃ】図４０ｃは、ＧＰＢ−１１のナノ粒子に結合するＤＮＡのＡＦＳ顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
Ｉ．新規の金属系ナノ結晶
金供与体電極材料と白金供与体電極材料との組み合わせから、新しい水性バイメタルナノ結晶懸濁液が製造される。このようなバイメタルナノ結晶は、有機又はその他の不純物又は膜を実質的に含まないことが可能なナノ結晶表面を含む。具体的には、バイメタルナノ結晶の表面は、（１）原材料溶液中に含有される遷移金属イオンからバイメタル系ナノ粒子を形成するために使用される原材料の一部として化学的還元剤及び／又は界面活性剤及び／又は種々の塩化合物を必要とする化学的還元プロセス；及び（２）例えば種々様々な還元剤又は塩素系（又は塩系）原材料（例えば金属塩）を使用するその他のプロセス（音響電気化学、γ線照射、Ｘ線照射、レーザー照射、電子加速器などを含む）を用いて形成された同様の化学組成ナノ粒子の表面と比較して「クリーン」である。
【００６０】
金及び白金の新しいバイメタルナノ結晶は、本明細書中に詳説する新規の電気化学製造手順を介して製造される。新しい電気化学製造手順は、金属イオンを還元し且つ／又は形成済バイメタルナノ結晶を安定化するために、化学的還元剤及び／又は界面活性剤（例えば有機化合物）又は他の物質を添加することを必要としない。さらに、これらのプロセスは、金属イオン（金属ナノ粒子を形成するために還元される）、及び正荷電金属イオンの電荷を平衡させる会合イオン又は会合種の両方を含有する原材料の添加を必要としない。還元剤、安定剤、及び原材料の非金属イオン部分のこのような添加が望ましくないのは、これらが典型的には粒子内又は粒子上に担持される場合、或いは、化学的還元された粒子の表面の少なくとも一部に望ましくない状態で付着され且つ／又は懸濁液中にイオンとして残る場合である。今理解されるのは、所定のナノ結晶性能要件を、表面上に配置又は表面に結合されたこのような不純物によっては満たし得ないことである。そしてこのような不純物は、種々の望ましくないプロセスを用いて続いてストリッピング又は除去されることが必要である（例えばプラズマエッチング）。このようなプロセスはそれ自体でナノ粒子表面に影響を及ぼし得る。
【００６１】
好ましい実施態様の場合、このプロセスの第１の一連の電気化学工程は、白金金属源から白金種を現場生成すること（例えば原材料）を伴う。白金種は、「処理増強剤（process enhancer又はprocessing enhancer）」（典型的には無機材料又は炭酸塩など）を含有する水中で生成される。処理増強剤は、懸濁液中の形成済ナノ結晶に有意には結合せず、むしろ供与体白金金属源からの金属イオンの除去を容易にし、且つ／又は電気化学的刺激を受ける成長プロセス中の核形成及び／又は結晶成長を支援する。より具体的には、処理増強剤は、金属イオンが溶液中に存在するのを可能にし、且つ／又はナノ結晶が成長するのを可能にするように、電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することを含むプロセスにおいて重要な役割を担う。処理増強剤は極めて重要なことには、溶液中に残り、且つ／又は被膜（例えば有機被膜）を形成することがなく、且つ／又は形成済ナノ結晶又は形成済懸濁液の性能に不都合な影響を及ぼすことがなく（例えば不活性）、且つ／又は電気化学プロセス中に破壊、蒸発されるか、又はその他の形で失われ得る化合物である。好ましい処理増強剤は重炭酸ナトリウムである。他の処理増強剤の例は炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸カリウムなど、及びこれらの組み合わせである。さらなる好ましい処理増強剤は、重炭酸ナトリウムと水酸化カリウムとの混合物である。
【００６２】
プロセスの第１工程における処理増強剤の望ましい濃度範囲は典型的には０．０１〜２０グラム／ガロン（０．００２６〜２．１７３０ｍｇ／ｍｌ）、より典型的には０．１〜７．５グラム／ガロン（０．０２６４〜１．９８１３ｍｇ／ｍｌ）、そして最も典型的には０．５〜２．０グラム／ガロン（０．１３２１０〜０．５２８３ｍｇ／ｍｌ）を含む。
【００６３】
さらに、プロセスの第１電気化学工程で形成された白金種の望ましい濃度は、約０．５ｐｐｍ〜約２０ｍｍｐ、最も典型的には約１〜８ｐｐｍ、そしてより典型的には約０．５〜４ｐｐｍである。第１の一連の電気化学工程の結果は水中のプラットフォーム種である。白金種は主としてナノ結晶又はナノ結晶と白金イオンとの混合物であり得る。好ましい実施態様では、白金種は主としてイオンであり、白金イオン−水材料は、懸濁液中のバイメタルＡｕ−Ｐｔナノ結晶を形成するために、第２の一連の電気化学工程において使用される。
【００６４】
具体的には、好ましい実施態様において、電気化学プロセスの第２の一連の工程が、バイメタルナノ結晶の核形成及び成長を伴う。このような成長は、（１）２種の金属の混合物、（２）２種の金属の合金、及び／又は（３）２種の金属のヘテロ凝集体（例えば複合体）を含む。例えば好ましい実施態様の第１工程から産出された白金種及び水（なお、第１電気化学プロセス中に使用された電気化学処理増強剤も存在する）は、好ましい実施態様の第２電気化学処理工程に導入される原材料として作用する。形成済白金種、処理増強剤成分、原材料の具体的な濃度及びタイプ、及び電気化学プロセスの実施条件（使用される装置を含む）に応じて、上述のバイメタルナノ結晶成分のうちの１つ又は２つ以上を、第２の一連の電気化学処理工程中に水性懸濁液中の安定なナノ結晶として製造することができる。
【００６５】
成長したバイメタルナノ結晶は金及び／又は白金金属の「裸の」又は「クリーン」な表面（例えばゼロ酸化状態にある）を有しているので、バイメタルナノ結晶表面は高触媒作用又は高い生体触媒作用（並びに高い生体利用性）を有する。バイメタルナノ結晶は事実上、水系ジャケットによって取り囲まれている。ジャケットは例えば、好ましい実施態様の１つ又は２つ以上の工程で行われる水の分解反応（lysing of water）によって利用可能になる水種を含む。分解反応種（lysed species）は水和電子、ＯＨ-、Ｈ*、Ｈ3Ｏ、Ｈ2Ｏ2などを含んでいてよい。しかし、いかなる特定の理論又は解釈にも縛られたくはないが、ＯＨ-基（例えば分解反応水又は処理増強剤から生じる）はそれ自体が形成済バイメタル結晶の周りに位置しており、結晶との静電的な相互作用を形成することがある。これらのクリーンな表面形体は、種々様々な工業用途及び医療用途において新規の高められた性能を提供し、且つ／又は、医療用途において一般的な望ましくない毒性を低減することができる。なぜならば、製造プロセスに起因して表面上に望ましくない毒素又は毒が存在しないからである。
【００６６】
好ましい実施態様において、ナノ粒子は使用前には乾燥させず、これらがその中に形成された液体（すなわち懸濁液を形成）の形態で直接に使用する。或いは、形成済懸濁液をその濃縮物又は再構成濃縮物として形成することもできる。これらの結晶をその懸濁液から完全に取り出す（例えば、完全に乾燥する）と、或る事例では結晶の表面特性に不都合な影響を及ぼすおそれがあり（例えば部分酸化が発生する、安定化基が取り返しがつかないほどの損傷を受ける、など）、且つ／又は結晶を再水和する能力に不都合な影響を及ぼすおそれがある。例えば、最初に形成されたウォータージャケットが、静電相互作用を支援するＯＨ-を含む場合には、ＯＨ-配位を変化させると懸濁液の安定性を攪乱することがある。
【００６７】
しかし、透析処置を利用する所定の濃縮プロセスを利用し得ることが判っている。透析処置は、透析バッグの内側に形成済バイメタルナノ結晶懸濁液を入れることを伴う。透析バッグの外側にはポリエチレン溶液を配置し（例えば透析バッグを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を収容する好適な容器とともに配置することができる）、懸濁液中のナノ結晶の安定性を含むことなしに、浸透圧によって形成済バイメタルナノ結晶懸濁液から水が除去されるのを可能にする。さらに、或るイオン成分がナノ結晶を懸濁する液体中に残っているならば、イオン成分の除去がバイメタルナノ結晶又はナノ結晶懸濁液の安定性及び／又は性能に不都合な影響を与えない限り、所望の場合には、このようなイオン成分のいくらか又は全てを前記液体から除去することができる。
【００６８】
さらに、いくつかの医療ベースの生成物のためには、製造プロセスにおいて使用された上述の処理増強剤に加えて、滅菌医薬等級の水（例えばＵＳＰ）などを使用することが最適である場合もある。いくつかの事例において、水は逆浸透及び／又はイオン濾過手段によってＵＳＰよりもさらに純粋ですることが可能である。
【００６９】
或いは別の実施態様の場合、バイメタルナノ結晶は例えば、別の反応、例えば別の電気化学、化学、又は触媒プロセスに関与する電極又は基質内又は上にその場で乾燥させてもよい。例えば本発明に従って形成されたバイメタルナノ結晶は工業用途のために使用することもできる。工業用途では、金属反応性が重要である（例えば触媒及び／又は電気化学プロセス）が、しかし医薬等級生成物／成分は必要とならない。非医薬用途のために調製されるときには、具体的な用途に応じて、本明細書中で論じるように、バイメタルナノ結晶はより多様な溶媒中で、そしてより多様な処理増強剤とともに形成することができる。しかしながら、バイメタルナノ結晶表面のクリーンな特徴は、優れた性能を達成するために維持されるべきである。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施態様において、本発明の電気化学プロセス工程は、結果として得られる懸濁液中に２種以上のバイメタルナノ結晶が存在するように制御することができる。例えば、白金及び金ナノ結晶の混合物は懸濁液中に存在してよく、白金及び金のナノ結晶合金は懸濁液中に存在してよく、且つ／又は白金及び金のナノ結晶ヘテロ凝集体も懸濁液中に存在してよい。
【００７１】
本明細書中のプロセスによれば、バイメタルナノ結晶は、固有の識別可能な表面特性、例えば空間的に広がる低指数結晶面｛１１１｝、｛１１０｝及び／又は｛１００｝、及びこのような面（及びこれらと同等のもの）から成る群を提供するように、成長させることができる。このような結晶面は種々異なる望ましい触媒性能を示すことができる。本明細書中に開示された実施態様に従って製造されたバイメタルナノ結晶懸濁液中には種々の結晶形状を見いだすことができる。さらに、成長したバイメタルナノ結晶の表面はその結晶状態（例えば表面欠陥）に基づいて高活性であり、またクリーンであるべきである。
【００７２】
１００ｎｍ未満のバイメタルナノ結晶の任意の所期平均サイズを提供することができる。最も望ましいナノ結晶サイズ範囲は、主として１００ｎｍ未満、より典型的には５０ｎｍ未満、さらにより典型的には３０ｎｍ未満である平均結晶サイズ（本明細書中に詳細に開示された特定の技術によって測定されて割り出される）を有するものを含み、本明細書中に開示された好ましい実施態様の多くにおいて、ナノ結晶サイズ分布のモードは２０ｎｍ未満であり、８〜１８ｎｍのさらに好ましい範囲内にある。しかしながら、いくつかの用途の場合、本発明の技術は、著しく大きい粒子を製造するために用いることができる。
【００７３】
目標ｐＨ範囲を有する、又は有するように調節される、結果としてのバイメタルナノ結晶性懸濁液又はコロイドを提供することができる。例えば本明細書中に詳細に開示された量の重炭酸ナトリウム又はその他の「塩基性」（例えばＯＨ-濃度が比較的高くされている）処理増強剤を用いて調製する場合、ｐＨ範囲は典型的には８〜１１である。この範囲は所望通りに調節することができる。さらに所定の処理増強剤を使用する結果、より高いｐＨ範囲、例えば約９〜１２又は１０．３〜１２．０のｐＨをもたらすことができる。
【００７４】
形成されたバイメタルナノ結晶の表面電荷（すなわち正又は負）の性質及び／又は量は、ナノ粒子／懸濁液又はコロイド（又は濃縮ナノ結晶）の挙動及び／又は効果に多大な影響を与えることもできる。例えば、生物医学用途の場合、生体内で形成されるアルブミン・コロナ及び／又はトランスフェリン・コロナのようなタンパク質コロナに、ナノ粒子の表面電荷又は表面特性（例えば処理技術に由来して存在する不純物又は残留成分を含む）によって影響を与えることができる。このようなコロナは、ナノ粒子の生物学的同一性を決定づけ、ひいては生物学的利用可能性を導く。
【００７５】
このような表面電荷は一般に、「ゼータ電位」と呼ばれる。ゼータ電位（正又は負）が大きければ大きいほど、溶液中のナノ粒子の安定性も大きくなる（すなわち懸濁液はより安定になる）ことがよく知られている。形成されたナノ粒子又はナノ結晶の表面電荷の性質及び／又は量を制御することにより、このようなナノ粒子懸濁液の性能を生物学的用途及び非生物学的用途において制御することができる。
【００７６】
ゼータ電位は、コロイド系内の運動電位の尺度として知られており、また粒子上の表面電荷を意味する。ゼータ電位は、流体の静止層と、粒子が分散される流体との間に存在する電位差である。ゼータ電位はしばしばミリボルト（すなわちｍＶ）で測定される。ほぼ２０〜２５ｍＶのゼータ電位値は、分散媒質中で分散粒子が安定しているか否かを見極めるために選ばれた任意の値である。このように、本明細書中で「ゼータ電位」に言及するときには、言うまでもなく、言及されたゼータ電位は、二重層に存在する電荷の規模の記述又は定量化である。
【００７７】
ゼータ電位は、ヘンリーの等式：
【数１】
2014518847.tif 000003
（上記式中、ｚはゼータ電位であり、ＵEは電気泳動移動度、εは誘電定数であり、ηは粘度であり、ｆ（ｋａ）はヘンリー関数である。スモルコフスキー近似値の場合、ｆ（ｋａ）＝１．５である）によって、電気泳動移動度から計算される。
【００７８】
本明細書中の方法に従って調製された金ナノ結晶のゼータ電位（ＺＰ）は、典型的には少なくとも−２０ｍＶ、より典型的には少なくとも約−３０ｍＶ、さらにより典型的には少なくとも約−４０ｍＶ、そしてさらにより典型的には少なくとも約−５０ｍＶのＺＰを有している。
【００７９】
さらに、好ましい実施態様の別の重要な特徴は、原材料金属イオンが好ましい実施態様の処理条件に基づいて、Ｐｔ及びＡｕの供与体電極金属（例えば犠牲電極又は供与体電極）によって製造されることである。この「トップダウン」型の第１の一連の電気化学工程が意味するのは、他の技術で金属系ナノ粒子を形成するために典型的に使用される材料、例えば金属塩（例えばＰｔ塩、Ａｕ塩など）を、本明細書中に開示された実施態様では使用せずにすむことである。従って、金属塩の（望ましくないことがある）他の成分、例えばＣｌ-又は種々の塩素系材料は発生せず、或いは、本明細書中の好ましい実施態様に従って形成された生成物の所要部分ではない。換言すれば、例えば種々の金属系原材料塩を含む他の成分は、本明細書中に論じられたバイメタルナノ結晶懸濁液中に存在する必要がない（例えばバイメタル懸濁液は塩素又塩化物を含まないことが可能である）。もちろん、念のために述べておけば、懸濁液中に溶解された塩素系材料であって、ナノ粒子製造プロセスに必要でない又は必須でないものの存在は本開示の範囲内と見なされる。
【００８０】
ＩＩ．バイメタルナノ結晶の製造方法
これらの独自のバイメタルナノ結晶を製造するために、一連の新規のプロセス工程が提供される。プロセス工程は、水中でバイメタルナノ結晶を形成することを伴う。好ましい実施態様において、水は、添加された「処理増強剤（process enhancer)」を含有している。この処理増強剤は、形成されたナノ結晶に有意には結合せず、むしろ電気化学的刺激を受ける成長プロセス中の核形成及び／又は結晶成長を容易にする。処理増強剤は、結晶が成長するのを可能にするように、電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することを含むプロセスにおいて重要な役割を担う。これらの新規の電気化学プロセスは、バッチ式、半連続式、又は連続式プロセスで行うことができる。これらのプロセスは制御された金及び白金のバイメタルナノ結晶濃度、制御されたバイメタルナノ結晶サイズ、及び制御されたバイメタルナノ結晶サイズ範囲をもたらす。これらのバイメタルナノ結晶を製造するために新規の製造アセンブリが提供される。別の実施態様では、金属系成分、例えば望ましい金属イオンを別個に含むか、又はバイメタルナノ結晶懸濁液と組み合わせて含むことができる。
【００８１】
１つの好ましい実施態様の場合、バイメタルナノ結晶懸濁液又はコロイドは、バッチ式、半連続式、又は連続式プロセスで電気化学技術によって形成されるか又は成長させられる。量、平均粒度、結晶面及び／又は粒子形状及び／又は粒子形状分布は、高い生物学的活性及び／又は低い細胞／生物学的毒性（例えば高い治療指数）を達成するように制御且つ／又は最適化される。望ましい平均結晶サイズは種々異なる範囲を含むが、しかし最も望ましい範囲は、主に１００ｎｍ未満、より典型的には、多くの用途では５０ｎｍ未満、さらにより典型的には、種々様々な用途、例えば経口用途では３０ｎｍ未満である平均結晶サイズを含み、そして本明細書中に開示された好ましい実施態様の多くの場合、ナノ結晶サイズ分布モードは、ゼータサイザー（本明細書中でさらに詳述する）によって測定して２０ｎｍ未満であり、より好ましい範囲２〜１８ｎｍである。さらに、粒子は望ましくは、結晶面を含有し、このような望ましい（そしてしばしば好反応性の）結晶面は、｛１１１｝、｛１１０｝及び／又は｛１００｝ファセット、並びに欠陥を有する結晶を含む。このような結晶は優れた相互作用、例えば触媒作用をもたらし得る。
【００８２】
さらに、本発明の電気化学製造プロセスに従うことにより、このようなバイメタル金属ナノ結晶は合金であることが可能であり、或いは液体中で他の金属と合体させて、金属「被膜」を他の金属上に発生させることによって複合体又はヘテロ凝集体を形成してよく、或いは金属系ナノ結晶の混合物を形成することもできる。
【００８３】
さらに、本発明のバイメタルナノ結晶懸濁液又はコロイドを、他の金属系溶液又はコロイドと混合又は合体することにより、新規の溶液混合物又はコロイド混合物を形成することもできる（例えばこの場合、明確な金属種がまだ識別可能である）。
【００８４】
本発明による新規の金属系ナノ結晶懸濁液又はコロイドを製造する方法は、概して言えば、ミクロン・サイズ粒子、ナノ結晶、イオン種、及び、その水性組成物を含む、ナノ結晶／液体、溶液、コロイド、又は懸濁液を含む液体中の種々の成分を連続式、半連続式、及びバッチ式に製造するための新規の方法及び新規の装置に関する。産出された成分及びナノ結晶は、考えられ得る種々様々な組成、濃度、サイズ、結晶面（例えば空間的に広がる低指数結晶面）、及び／又は形状を成すことができ、これらがともに原因となって、本発明による組成物が、新規の興味深い種々様々な物理、触媒、生体触媒、及び／又は生物物理特性を呈するようにすることができる。このプロセス中に使用され、生成／改質される液体は、成分（例えばナノ結晶）を独立して、又はこれらを含有する液体と相乗的に製造し、且つ／又は機能させる上で重要な役割を果たことができる。粒子（例えばナノ結晶）は、例えば典型的には少なくとも１種の調節可能なプラズマ（例えば少なくとも１つのＡＣ及び／又はＤＣ電源によって生成する）を利用して、少なくとも１種の液体（例えば水）中に存在させられる（例えば生成され、且つ／又は液体に、粒子が存在しやすい性質が与えられる(例えばコンディショニング））ことになる。この調節可能なプラズマは、液体の表面の少なくとも一部と連通する。しかしまた、このようなプラズマを使用せずに、効果的な成分（例えばナノ結晶）懸濁液又はコロイドを得ることもできる。
【００８５】
調節可能なプラズマの形成に使用するには、種々の組成及び／又は独自の形態又は配列を有する金・白金系電極が好ましい。後続の及び／又は実質的に同時に行われる少なくとも１種の調節可能な電気化学処理技術を利用することも好ましい。電気化学処理技術に使用するためには、金・白金系電極が好ましい。本発明の調節可能なプラズマ及び／又は調節可能な電気化学処理技術によって好都合な影響を与えることができる変数のいくつかの例としては、電界、磁界、電磁界、電気化学特性、ｐＨ、ゼータ電位、存在する化学／結晶成分などが挙げられる。本発明の処理の利点の多くを達成し、また、好ましい実施態様の教示を実施することから生じる新規のバイメタルナノ結晶及びバイメタルナノ結晶組成物の多くを達成して本発明による水溶液、懸濁液及び／又はコロイドのほとんど無制限の組み合わせを形成するために、複数の調節可能なプラズマ及び／又は調節可能な電気化学技術が本発明の多くの実施態様において好ましい。
【００８６】
本発明の連続プロセスの好ましい実施態様では、少なくとも１種の液体、例えば水が少なくとも１つのトラフ部材内に流入し、トラフ部材を貫流し、そしてトラフ部材から流出し、そしてこのような液体は、前記少なくとも１種の調節可能なプラズマ及び／又は前記少なくとも１種の調節可能な電気化学技術によって処理され、コンディショニングされ、修正され、且つ／又は影響を与えられる。第１トラフ部材内の連続処理の結果は、液体中の新たな成分、例えばイオン成分、新規の且つ／又は制御可能なサイズ、流体力学半径、濃度、結晶サイズ及び結晶サイズ範囲、ゼータ電位、ｐＨ及び／又は特性を有するナノ結晶（例えば白金系ナノ結晶）を含み、このような白金ナノ結晶／イオン／液体混合物は、効率的且つ経済的に製造される。
【００８７】
さらに、好ましい実施態様の場合、このプロセスの第１の一連の工程は、白金金属源から白金種を現場生成すること（例えば原材料）を伴う。白金種は、「処理増強剤（process enhancer又はprocessing enhancer）」（典型的には無機材料又は炭酸塩など）を含有する水中で生成される。処理増強剤は、懸濁液中の形成済ナノ結晶に有意には結合せず、むしろ供与体金属源からの金属イオンの除去を容易にし、且つ／又は電気化学的刺激を受ける成長プロセス中の核形成及び／又は結晶成長を支援する。より具体的には、処理増強剤は、ナノ結晶が成長するのを可能にするように、電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することを含むプロセスにおいて重要な役割を担う。処理増強剤は極めて重要なことには、溶液中に残り、且つ／又は被膜（例えば有機被膜）を形成することがなく、且つ／又は形成済ナノ結晶又は形成済懸濁液の性能に不都合な影響を及ぼすことがなく（例えば不活性）、且つ／又は電気化学プロセス中に破壊、蒸発されるか、又はその他の形で失われ得る化合物である。好ましい処理増強剤は重炭酸ナトリウムである。他の処理増強剤の例は炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸カリウムなど、及びこれらの組み合わせである。さらなる好ましい処理増強剤は、重炭酸ナトリウムと水酸化カリウムとの混合物である。
【００８８】
処理増強剤の望ましい濃度範囲は典型的には０．０１〜２０グラム／ガロン（０．００２６〜２．１７３０ｍｇ／ｍｌ）、より典型的には０．１〜７．５グラム／ガロン（０．０２６４〜１．９８１３ｍｇ／ｍｌ）、そして最も典型的には０．５〜２．０グラム／ガロン（０．１３２１０〜０．５２８３ｍｇ／ｍｌ）を含む。
【００８９】
好ましい実施態様の場合において、プロセスの第２の一連の工程が、バイメタル系ナノ結晶の核形成及び成長を伴う。このような成長は、（１）２種の金属の混合物、（２）２種の金属の合金、及び／又は（３）２種の金属のヘテロ凝集体を含む。例えば好ましい実施態様の第１工程から産出された水産出物、プロセスの第１工程から生じた白金種、及び第１の一連の工程中に使用される処理増強剤は、好ましい実施態様の第２電気化学工程に導入される原材料として作用する。白金種、処理増強剤成分の具体的な濃度、及び電気化学プロセスの実施条件（使用される装置を含む）に応じて、上述のバイメタルナノ結晶成分のうちの１つ又は２つ以上を、第２の一連の電気化学処理工程中に水性懸濁液中の安定なバイメタルナノ結晶として製造することができる。
【００９０】
例えば、或る処理増強剤は解離して正イオン（カチオン）及び負イオン（アニオン）になってよい。液体組成、イオンの濃度、イオンの変化状態、印加された場、印加された場の周波数、印加された場の波形、温度、ｐＨ、ゼータ電位などを含む種々の要因に応じて、アニオン及び／又はカチオンは、対向荷電電極に向かってナビゲート又は移動する。前記イオンがこのような電極に又はその近くに位置すると、イオンは、電極及び／又はこのような電極に又はその近くに位置するその他の成分との１種又は２種以上の反応に関与することができる。イオンは電極内の１種又は２種以上の材料と反応することもある。このような反応は、いくつかの事例では望ましく、又は他の事例において望ましくない。さらに、電極間で溶液中に存在するイオンは生成物を形成するように反応しない場合があり、むしろ電極内（又は電極の近く）の材料に影響を及ぼすことにより、電極によって提供された材料から「成長」した金属ナノ結晶を形成することもある。例えば、或る特定の金属イオンは液体３に電極５から入り、そして互いに一緒になって（核形成）、液体３内部に成分（例えばイオン、ナノ結晶など）を形成するようにされてよい。
【００９１】
さらに、種々の商業用途（例えば医薬、触媒、医学的診断など）の許容性を最大限にするために、性能に不都合な影響を及ぼすことのない処理増強剤、例えばバイメタルナノ結晶に、又は結晶が懸濁された液体に不都合な性能、又は例えば毒性を与えることのない処理増強剤を選択することが重要である。例えば或る用途では、塩素イオン又は塩化物又は塩素系材料は、このような種が例えば塩化金塩を形成する場合には所望されないことがある。塩化金塩はいくつかの理由（例えば毒性、安定性などに影響を及ぼし得る）から望ましくないことがある。
【００９２】
加えて、ヒドロキシル基ＯＨ-（例えば処理増強剤の一部、又は液体３に処理増強剤を添加することの結果である）に関与する所定の処理増強剤も望ましいことがある。これに関しては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＮａＨＣＯ3（及びこれらの混合物）の望ましい処理増強剤が本明細書中のいくつかの好ましい実施態様において望ましいものとして具体的に開示される。
【００９３】
さらに、具体的な形成済生成物に応じて、乾燥、濃縮及び／又は凍結乾燥を利用することにより、懸濁液体の少なくとも一部、又は実質的に全てを除去し、その結果例えば部分的又は実質的に完全に脱水されたバイメタルナノ結晶を生じさせることもできる。このようなナノ結晶が基体上（例えば触媒基質又は電極上）に最終的に配置される場合、完全乾燥が必要となることがある。溶液、懸濁液又はコロイドが完全に脱水される場合には、金属系種は、いくつかの事例において、液体（例えば除去されたものと同様又は異なる組成を有する）を添加することによって再水和可能であるべきである。しかしながら、本発明の全ての組成物／コロイドを、組成物／コロイドの性能に不都合な影響を与えることなしに完全に脱水できるわけではない。例えば液体中に形成された多くのナノ結晶は、乾燥させられると塊形成するか又はくっつき合う（又は表面に付着する）傾向がある。このような塊形成が後続の再水和ステップ中に逆転されないならば、脱水は回避されるべきである。しかし、種々の用途に対しては、このような塊形成は許容することができる。さらに基体上を乾燥させると、このような塊形成が回避されることがある。
【００９４】
一般に、組成物を不安定化させることなしに、本発明に従って形成された所定のバイメタルナノ結晶の溶液、懸濁液、又はコロイドを数倍濃縮することが可能である。例えば、これに縛られたくはないが、最初に形成されたウォータージャケットが、静電相互作用を支援するＯＨ-を含む場合には、ＯＨ-配位を変化させると懸濁液の安定性を攪乱することがある。
【００９５】
しかし、透析処置を利用する所定の濃縮プロセスを利用し得ることが判っている。透析処置は、透析バッグの内側に形成済バイメタルナノ結晶懸濁液を入れることを伴う。透析バッグの外側にはポリエチレン溶液を配置し（例えば透析バッグを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を保持する好適な容器とともに配置することができる）、懸濁液中のナノ結晶の安定性を含むことなしに、浸透圧によって形成済バイメタルナノ結晶懸濁液から水が除去されるのを可能にする。さらに、或るイオン成分がナノ結晶を懸濁する液体中に残っているならば、イオン成分の除去がバイメタルナノ結晶又はナノ結晶懸濁液の安定性及び／又は性能に不都合な影響を与えない限り、所望の場合には、このようなイオン成分のいくらか又は全てを前記液体から除去することができる。
【００９６】
下記の説明は完全であると考えるが、読者は関連出願である2011年1月13日付けで発行された国際公開第２０１１／００６００７号も参照されるべきであり（この主題は参照することにより本明細書中に明示的に組み込まれる）。
【００９７】
本発明の１つの重要な態様は、少なくとも１つの調節可能なプラズマの生成に関与する。この調節可能なプラズマは、液体（例えば水）の表面の少なくとも一部に隣接して（例えば上方に）位置決めされた少なくとも１つの電極と、液体表面自体の少なくとも一部との間に配置されている。液体は少なくとも１つの第２電極（又は複数の第２電極）と電気的に連通して、液体表面を電極として機能させ、ひいては、調節可能なプラズマの形成に関与する。このような構造は、液体表面がこの構造では活性電極であることを除けば、誘電体バリア放電構造と類似のいくらかの特性を有している。
【００９８】
利用される各調節可能なプラズマは、少なくとも１つの導電性電極を液体中（例えば少なくとも部分的に）のどこかに配置することにより、液体表面の上方に配置された少なくとも１つの電極と、液体表面との間に配置することができる。少なくとも１つの電源（好ましい実施態様では、ボルト及びアンペアの少なくとも１つの源、例えば変圧器又は電源）が、液体表面の上方に配置された少なくとも１つの電極と、液体表面と接触する（例えば少なくとも部分的又はほぼ完全に液体中に配置される）少なくとも１つの電極との間に電気的に接続されている。電極は、任意の好適な組成（しかし白金及び金が好ましい）及び好適な物理形態（例えばサイズ及び形状）を有していてよく、その結果、液体表面の上方に配置された電極と、液体表面自体の少なくとも一部との間に望ましいプラズマが形成される。
【００９９】
電極（プラズマを形成するための少なくとも１つの電極として機能する液体表面を含む）間の印加電力（例えばボルト数又はアンペア数）は、ＡＣ源及びＤＣ源の双方、及びこれらの変更形及び組み合わせを含む任意の好適な源（例えば変圧器からの電圧）によって発生させることができる。一般に、液体中に配置された（例えば液体表面の下方に少なくとも部分的に配置された）電極又は電極組み合わせは、液体又は溶液に電圧及び電流を提供することにより、プラズマの形成に関与する。しかし、調節可能なプラズマは、実際に、液体表面の上方に配置された電極の少なくとも一部（例えばその先端又は点）と、液体表面自体の１つ又は２つ以上の部分又は区域との間に配置される。これに関しては、電極と液体表面との周り及び／又は間の気体又は蒸気が破壊電圧に達するか、又は維持されるときに、調節可能なプラズマを、上述の電極間（すなわち液体表面の少なくとも一部の上方に配置された電極と、液体表面自体の一部との間）に形成することができる。
【０１００】
本発明の１つの実施態様の場合、液体は水（又は所定の処理増強剤を含有する水）を含み、そして水面と水面の上方に位置する電極との間の気体（すなわち、調節可能なプラズマの形成に関与する気体又は雰囲気）は、空気を含む。空気は、種々異なる含水量及び所期湿度を含有するように制御することができ、その結果、成分（例えばナノ結晶）の種々異なる組成、濃度、結晶サイズ分布、及び／又は結晶形状分布を本発明に従って製造することができ（例えば、調節可能なプラズマ中及び／又は溶液又は懸濁液中の或る成分の種々異なる量は、液体表面の上方に位置する空気中の含水量の関数であり得る）、また、液体中の種々の成分の所定の濃度を得るために必要となる種々異なる処理時間などをもたらすことができる。
【０１０１】
乾燥空気に対する標準的な圧力及び温度における破壊電界は、約３ＭＶ／ｍ又は約３０ｋＶ／ｃｍである。こうして、例えば金属点の周りの局所的電界が約約３０ｋＶ／ｃｍを超えると、プラズマを乾燥空気中で発生させることができる。等式（１）は、破壊電界「Ｅc」と２電極間の距離「ｄ」（メートル）との経験的関係は：
【数２】
2014518847.tif 000004
を与える。もちろん、破壊電界「Ｅc」は、電極間に位置する気体又は蒸気の特性及び組成の関数として変化することになる。このことに関して、水（又は処理増強剤を含有する水）が液体である場合の１つの好ましい実施態様の場合、顕著な水蒸気量が「電極」間（すなわち、液体表面の上方に配置された少なくとも１つの電極と、プラズマ形成の１つの電極として機能する液体表面自体との間）の空気中に固有に存在することが可能であり、またこのような水蒸気は、少なくとも、これらの間にプラズマを生成するために必要となる破壊電界に対して効果を与えるはずである。さらに、調節可能なプラズマと水面との相互作用により、生成されたプラズマ中及びプラズマの周りに局所的により高い濃度の水蒸気を存在させることもできる。生成されたプラズマ中及びプラズマの周りに存在する「湿分」の量は、本明細書中で後で詳しく論じる種々様々な技術によって制御又は調節することができる。同様に、任意の液体中に存在する或る構成要素が、液体表面と、液体表面に隣接して（例えば沿って）配置された電極との間に位置する調節可能なプラズマを形成する成分の少なくとも一部を形成することもできる。調節可能なプラズマ中の成分、並びにプラズマ自体の物理特性は、液体に対して、また処理技術のうちの所定のものに対して劇的な影響を与えることができる（本明細書中で後で詳しく論じる）。
【０１０２】
電極に、そして電極近くに生成された電界強度は、典型的には電極表面で最大となり、そして典型的にはこの表面からの距離が増大するのに伴って減少する。液体表面と、液体に隣接して（例えば上方に）配置された少なくとも１つの電極との間に、調節可能なプラズマを生成することを伴う事例では、液体表面の上方に配置された電極と、液体表面自体の少なくとも一部との間の気体の体積の一部が、調節可能なプラズマを生成するのに十分な破壊電界を含有することができる。生成されたこれらの電界は、例えば調節可能なプラズマの挙動、液体の挙動（例えば液体の結晶状態に影響を与える）、液体中の成分の挙動などに影響を与えることができる。
【０１０３】
これに関連して、図１は、例えば「Ｆ」の方向に流動する液体３の表面２の上方に距離「ｘ」を置いて配置された三角形の断面形状を有する点源電極１の１実施態様を示している。点源電極１と、液体３に連通する電極５（例えば電極５は少なくとも部分的に液体３の表面２の下方にある）との間に適切な電源１０が接続されていると、電極１の先端又は点９と液体３の表面２との間に、調節可能なプラズマ４を発生させることができる。
【０１０４】
図１に示された実施態様において生成された調節可能なプラズマ領域４は、典型的には、プロセスの少なくとも一部にわたって、円錐状構造又は楕円状構造に相当する形状を有することができ、本発明のいくつかの実施態様の場合、実質的に全プロセスにわたってこのような形状（例えば円錐形状）を維持することができる。調節可能なプラズマ４の体積、強度、成分（例えば組成）、活性、正確な位置などは、数多くのファクタに応じて変化することになり、これらのファクタの一例としては、距離「ｘ」、電極１の物理的及び／又は化学的な組成、電極１の形状、電源１０（例えばＤＣ、ＡＣ、整流ＡＣ、ＤＣ及び／又は整流ＡＣ、ＡＣ又はＤＣ波形、ＲＦなどの印加極性）、電源によって印加される電力（例えば、典型的には１０００〜５０００ボルト、より典型的には１０００〜１５００ボルトの印加されるボルト数、印加されるアンペア数、電子速度など）、適用される電源によって生成される電界及び／又は磁界、周囲の電界、磁界、又は電磁界、音場の周波数及び／又は大きさ、電極１と液体３の表面２との間及び／又はその周りの、自然発生する又は供給された気体又は雰囲気の組成（例えば空気、窒素、ヘリウム、酸素、オゾン、還元性雰囲気など）、温度、圧力、体積、方向「Ｆ」における液体３の流量、スペクトル特性、液体３の組成、液体３の導電率、電極１及び５の近く及び周りの液体の断面積（例えば体積）、（例えば液体３が、調節可能なプラズマ４と相互作用することを許される時間量（すなわち滞留時間）、及びこのような相互作用の強度）、液体３の表面２における又は表面２の近くなどの雰囲気流（例えば空気流）の存在（ファン又は雰囲気運動手段の提供）（本明細書中で後から詳しく論じる）が挙げられる。
【０１０５】
図１の調節可能なプラズマ４の生成に関与する電極１の組成は、本発明の１つの好ましい実施態様の場合、金属系組成物（例えば金、及び／又はこれらの合金又は混合物などのような金属）であるが、しかし電極１及び５は、本明細書中に開示された本発明の種々の特徴（例えば処理パラメータ）と適合性のある任意の好適な材料から形成されていてよい。これと関連して、例えば液体３（例えば水）の表面２の上方の空気中にプラズマ４を生成している間、典型的には、少なくとも若干のオゾン、並びに所定量の窒素酸化物及びその他の成分が産出される。これらの産出成分は制御することができ、結果として産出された、液体中の成分（例えばナノ結晶）、及び／又はナノ結晶懸濁液又はコロイドの形成及び／又は性能にとって有用なことも有害なこともあり、本明細書中で後から詳しく論じる種々異なる技術によって制御されることが必要となる場合がある。図１に示されているように、調節可能なプラズマ４は実際には、液体３の表面２と接触する。本発明のこの実施態様の場合、電極１に由来する材料（例えば金属）は、調節可能なプラズマ４の一部を含んでいてよく（例えば、従ってプラズマの発光スペクトルの一部であってよい）、そして、液体３（例えば水）上及び／又は液体３（例えば水）中に「スパッタリング」させられてよい。従って、電極１として金属が使用されるときには、種々様々な成分を電気的なプラズマ中に形成することができ、その結果、例えば元素金属、金属イオン、ルイス酸、ブレンステッド−ラウリ酸、金属酸化物、金属窒化物、金属水素化物、金属水和物、及び／又は金属炭化物などを含む、処理液体３（例えば水）の一部となる特定の成分をもたらし、これらの成分は、調節可能なプラズマ４と関連する特定の一連の動作条件、及び／又は後続の電気化学的な処理動作に応じて、液体３中に（例えばプロセスの少なくとも一部にわたって）見いだすことができる（そして同時／後続の反応に関与することができる）。このような成分は、処理液体３中に一時的に存在してよく、或いは半永久的又は永久的であってもよい。このような成分が一時的又は半永久的であるならば、このような形成済成分との後続の反応（例えば電気化学反応）のタイミングは、生成される最終生成物に影響を与えることができる。このような成分が永久的であるならば、これらは、活性成分ナノ結晶の所期性能に不都合な影響を及ぼしてはならない。
【０１０６】
さらに、例えば液体３中及び液体３の周りの電界、磁界、及び／又は電磁界の強さ、及びこのような場に晒された液体３の体積（本明細書中で後から詳しく論じる）、電極１及び５の物理的及び化学的な組成、（自然発生する又は供給された）雰囲気、液体組成に応じて、より多量又はより少量の電極材料（例えば金属又は金属の誘導体）を液体３中に見いだすことができる。所定の状況では、液体３中（永久的又は一時的）はプラズマ４中に見いだされる材料（例えば金属又は金属複合材料）又は成分（例えばルイス酸、ブレンステッド−ラウリ酸など）が極めて望ましい効果を有することがある。この場合には、このような材料は比較的多量であることが望ましい。これに対して他の事例では、液体３中に見いだされる所定の材料（例えば副産物）が望ましくない影響を及ぼすおそれがあり、ひいては、このような材料を最小限にすることが液体ベースの最終生成物において望ましい場合がある。従って、電極の組成は、本明細書中に開示された実施態様に従って形成される材料において重要な役割を果たすことができる。本発明のこれらの成分間の相互作用については、本明細書中で後から詳しく論じる。
【０１０７】
さらに、電極１及び５は、液体の種々の組成及び／又は構造、及び／又は本明細書中で後から詳しく論じる特定の効果を達成するために、同様の化学組成（例えば主成分として同じ化学元素を有する）及び／又は機械構造を有するか、又は完全に異なる組成（例えば主成分として異なる化学元素を有する）を有していてもよい。
【０１０８】
電極１と５；又は１と１（本明細書中に後で示す）、又は５と５（本明細書中に後で示す）との間の距離「ｙ」は、本発明の１つの重要な特徴である。一般に、作業条件下でプラズマを発生させることができる電源と連携する場合、本発明に使用される電極の最も近い部分の間の最小距離「ｙ」の位置は、（何らかのタイプの電気的絶縁がこれらの間に提供されていない場合）望ましくないアーク又は望まれないコロナ又はプラズマの形成が電極間（例えば電極１と電極５との間）に生じるのを防止するために、距離「ｘ」よりも大きくあるべきである。電極のデザイン、電極の位置、及び種々の電極間の電極相互作用に関する本発明の特徴について、本明細書中で後から詳しく論じる。
【０１０９】
電源１０を通して印加される電力は、本発明の全ての方法条件下で、望ましい調節可能なプラズマ４を生成する任意の好適な電力であってよい。本発明の１つの好ましい態様において、昇圧器からの交流電流が利用される。本明細書中に開示された種々の実施態様において使用するための好ましい変圧器６０（例えば図７ａ〜７ｂ参照）は、変圧器６０内の磁気分路の使用によって可能にされる、意図的に低い出力電圧調節力を有している。これらの変圧器６０はネオンサイン変圧器として知られる。このような形態は、電極１／５内への電流を制限する。出力負荷電圧が大きく変化すると、変圧器６０は、比較的狭い範囲内に出力負荷電圧を維持する。
【０１１０】
変圧器６０は、二次開回路電圧と、二次短絡回路電流とに関して格付けされる。開回路電圧（ＯＣＶ）は、電気的接続が存在しないときだけ、変圧器６０の出力端子に現れる。同様に、短絡が出力端子を横切って存在する場合にだけ、短絡回路電流が出力端子から引き出される（この場合、出力電圧がゼロに等しい）。しかしながら、負荷がこれらの同じ端子を横切って接続されているときに、変圧器６０の出力電圧はゼロと定格ＯＣＶとの間のいずれかの値でなければならない。事実、変圧器６０が適切に負荷されると、電圧はおよそ定格ＯＣＶの半分になる。
【０１１１】
変圧器６０は、平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）（例えば以前は平衡中間点接地としても知られていた）として知られている。これは中電圧から高電圧の格付けを有する変圧器、及びほとんどの６０ｍＡ変圧器において最も共通に見いだされる。これは、「中間帰線」システムにおいて許容され得る唯一のタイプの変圧器である。「平衡」変圧器６０は、１つの一次コイル６０１と、２つの二次コイル６０３とを有していて、それぞれの二次コイルが一次コイル６０１の各側に位置している（図７ｂの概略図に全体的に示されている）。この変圧器６０は様々な意味で、２つの変圧器のように機能することができる。不平衡の中間点参照型のコア及びコイルと同様に、各二次コイル６０３の一方の端部はコア６０２に取り付けられ、続いて変圧器容器に取り付けられ、また各二次コイル６０３の他方の端部は出力リード又は端子に取り付けられている。こうして、コネクタの存在なしに、無負荷時１５，０００ボルトのこのタイプの変圧器は、各二次端子から変圧器容器まで約７，５００ボルトとなるが、しかし２つの出力端子の間では約１５，０００ボルトとなる。これらの模範的な変圧器６０は、本明細書中の例において開示されたプラズマ４を形成するために利用した。しかし、他の適切な変圧器（又は電源）も、本発明の範囲に含まれるものと理解されるべきである。しかし、本明細書中に開示された他の例のほとんどにおける電極５／５’のためには、異なる給電装置５０１ＡＣ（本明細書中の他の個所で論じる）を利用する。
【０１１２】
図１に示された構造をさらに参照すると、電極ホルダ６ａ及び６ｂは、任意の好適な手段によって昇降させることができる（ひいては電極も昇降させることができる）。例えば電極ホルダ６ａ及び６ｂは、絶縁部材８（断面で示す）内を通って昇降させることができる。ここに示す機械的な実施態様は雄／雌ねじ山を含む。部分６ａ及び６ｂは、例えば付加的な電気絶縁部分７ａ及び７ｂによってカバーすることができる。電気絶縁部分７ａ及び７ｂは、任意の好適な材料（例えばプラスチック、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリスチレン、アクリル、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ナイロン、ゴム、繊維性材料であってよい。）これらの材料は、人が電極ホルダ６ａ及び６ｂを調整するとき（例えば電極の高さを調節しようとするとき）に発生するおそれのある望ましくない電流、電圧、アークなどを防止する。同様に、絶縁部材８は、望ましくない電気的事象（例えばアーク形成、溶融など）が発生するのを防止する任意の好適な材料、並びに、本発明を実施するのに構造的且つ環境的に適した任意の材料から形成することもできる。典型的な材料は、構造用プラスチック、例えばポリカーボネート、プレキシガラス（ポリ（メチルメタクリレート））、ポリスチレン、及びアクリルなどを含む。本発明とともに使用するための付加的な好適な材料については、本明細書中の別の個所で詳細に論じる。
【０１１３】
電極１，５を自動的に上昇及び／又は降下させる好ましい技術については、本明細書中で後から詳しく論じる。電源１０は、電極１及び５に任意の好都合な電気的形式で接続することができる。例えば、部分１１ａ，１１ｂ間、ひいては電極１，５間に電気的接続を達成することを主な目的として、電極ホルダ６ａ，６ｂ（及び／又は電気絶縁部分７ａ，７ｂ）の少なくとも一部の内部にワイヤー１１ａ及び１１ｂを配置することができる。
【０１１４】
図２は、本発明の好ましい実施態様の別の概略図を示している。ここでは、本発明の制御装置２０が電極１及び５に接続されているので、制御装置２０は、液体３の表面２に対して電極１，５を遠隔位置から（例えば別の装置又は構成部分からの命令で）上昇及び／又は降下させることができる。本発明の制御装置２０については、本明細書中で後から詳しく論じる。本発明のこの１つの好ましい特徴において、電極１及び５は、例えば遠隔位置から降下させ制御することができ、また、適宜のソフトウェア制御プログラムを含有する好適なコントローラ又はコンピュータ（図２には示されない）によって監視し制御することもできる。従って、図１に示された実施態様は、本発明の技術とともに使用するための手動制御式装置であると考えられるべきであり、これに対して、図２に示された実施態様は、適宜の命令に応答して電極１及び５を遠隔位置から昇降させることができる自動的な装置又は集成体２０を含むと考えられるべきである。さらに、図２に示す本発明の好ましい実施態様は、表面２から離隔した電極１の先端９（及び電極５の先端９’）の距離「ｘ」をコンピュータで監視し、そしてコンピュータ制御すること；又は電極５が液体３中に／液体を通って進められる速度をコンピュータで監視し且つ／又は制御することを採用することもできる。従って、電極１及び５を上昇及び／又は降下させる適宜の命令は、個々の操作者及び／又は好適な制御装置、例えばコントローラ又はコンピュータ（図２には示されない）から出ることが可能である。
【０１１５】
図３ａ〜３ｅは、図１〜２（及びその他の図面、及び本明細書中で後から論じる実施態様）に示された電極１のための種々様々な望ましい電極構造の斜視図を示している。図３ａ〜３ｅに示された電極構造は、本発明の種々の実施態様において有用な種々異なる数多くの構造の代表である。電極１に対する適宜の電極選択の基準の一例としては、下記条件、すなわち、極めて明確な先端又は点９の必要性、組成、機械的制限、電極１を含む材料から所定の形状を形成する能力、電極１を含む材料のコンディショニング（例えば熱処理又はアニーリング）、便宜性、プラズマ４内に導入される成分、液体３に対する影響など、が挙げられる。これに関して、例えば図１〜２に示された電極１を含む小さな質量の材料は、本発明に従って調節可能なプラズマ４を生成すると（本明細書中で後から詳しく論じる）、動作温度まで上昇することがある。この温度では、電極１のサイズ及び／又は形状が不都合な影響を受けるおそれがある。これに関しては、例えば、電極１が比較的小さな質量を有しており（例えば電極１が金から形成されておりその重量が約０．５グラム以下である）、そして極めて微細な点を先端９として含むならば、或る種の付加的な相互作用（例えば内部冷却手段又は外部冷却手段、例えばファンなど）がない限り、微細な点（例えば直径が僅か数ミリメートルであり、数１００〜数１０００ボルトに曝露される細いワイヤー；又は三角形の金属片）は電極１として機能できなくなる（例えば電極１は望ましくない状態に変形するか又は溶融するおそれがある）ことが、本明細書中の種々の実施態様中に用いられる或る一連の条件下ではあり得る。従って、電極１（例えば電極を含む材料）の組成は、例えば融点、感圧性、環境反応（例えば調節可能なプラズマ４の局所的環境は、電極の望ましくない化学的、機械的及び／又は電磁的腐食を生じさせるおそれがある）などに起因して、電極の考えられ得る好適な物理的形状に影響を及ぼすことがある。
【０１１６】
さらに、言うまでもなく、本発明の別の好ましい実施態様では、先端９のために明確な鋭利な点が常に必要とされるわけではない。これに関連して、図３ｅに示された電極１は、丸みを帯びた先端９を含む。なお、部分的に丸みを帯びた又は円弧状の電極が、電極１として機能することもできる。なぜならば、本明細書中に示された本発明の実施態様（例えば図１〜２参照）において生成される調節可能なプラズマ４は、丸みを帯びた電極、又はより鋭利な又はより尖った構成要件を有する電極から生成することができるからである。本発明の技術の実施中、このような調節可能なプラズマは、図３ｅに示された電極１の種々の点に沿って位置決めするか又は配置することができる。これに関して、図４は種々様々な点「ａ〜ｇ」を示しており、これらの点は、電極１と液体３の表面２との間に発生するプラズマ４ａ〜４ｇの開始点９に相当する。従って、言うまでもなく、電極１に対応する種々のサイズ及び形状を、本発明の教示に従って利用することができる。さらに、ここで種々の図面に示された、それぞれ電極１及び５の先端９，９’は、比較的鋭利な点又は比較的丸みのある端部として示されることがある。これらの電極先端９，９’の具体的な特徴を文脈上より詳細に論じるのでない限り、図面に示す電極先端９，９’の実際の形状はさほど重要でないものとする。
【０１１７】
図１及び２に大まかに示された電極構造は全て、種々様々な構成要件の関数として種々異なる結果（流体３の種々異なるコンディショニング効果、流体３中の種々異なるｐＨ、種々異なるナノ結晶サイズ、及びサイズ分布、異なるナノ結晶形状、及びナノ結晶形状分布、及び／又は流体３中に見いだされる成分（例えばナノ結晶物質及び／又は供与体電極から生じる金属イオン）の量、流体／ナノ結晶の組み合わせの異なる機能（例えば異なる生物学的／生体触媒効果）、異なるゼータ電位、など）をもたらすことができる。これらの構成要件は、流体流動方向「Ｆ」に対する電極の配向及び位置、トラフ部材３０（又は３０ａ’及び／又は３０ｂ’）の断面形状及びサイズ、及び／又はトラフ部材３０内部の液体３の量、及び／又はトラフ部材３０内部及び電極５ａ／５ｂ内／周囲の液体の流量、電極の厚さ、提供される電極対の数、及びトラフ部材３０内の相互の位置、並びに、液体３内への電極の深さ（すなわち液体３との接触量）、液体３内へ／液体３を通る電極の運動速度（電極の表面プロフィール又は形状を維持又は調節する）、電極対に印加された電力を含む。さらに、電極の組成、サイズ、具体的な形状、提供される異なるタイプの電極の数、印加されるボルト数、印加される且つ／又は液体３中で達成されるアンペア数、ＡＣ源（及びＡＣ源周波数及びＡＣ波形形状、デューティ・サイクルなど）、ＤＣ源、ＲＦ源（及びＲＦ源周波数、デューティ・サイクルなど）、電極極性などは全て、液体３がこれらの電極１，５と接触、相互作用し、且つ／又はこれらを流過するのに伴って、液体３（及び／又は液体３中に形成又は含有されるナノ結晶）の特性、ひいてはこれから産出される材料（例えば生成されたナノ結晶、金属イオン、及び／又は懸濁液又はコロイド）の結果としての特性に影響を与えることができる。
【０１１８】
図５ａ〜５ｅは、本明細書中の好ましい実施態様に使用される液体含有トラフ部材３０を示す断面図である。図５ａ〜５ｅのそれぞれに示された好ましい実施態様の距離「Ｓ」及び「Ｓ’」は、例えば約０．２５インチ〜約６インチ（約０．６ｃｍ〜１５ｃｍ）である。距離「Ｍ」は約０．２５〜約６インチ（約０．６ｃｍ〜１５ｃｍ）である。距離「Ｒ」は約１／２インチ〜約７インチ（約１．２ｃｍ〜１７．８ｃｍ）の範囲である。これらの実施態様の全て（また、別の実施態様を表す付加的な構造も本発明の範囲に含まれる）は、本発明の他の特徴との組み合わせで利用することができる。なお、液体含有トラフ部材３０（又は３０ａ’及び／又は３０ｂ’）のそれぞれの内部に含有される液体３の量は、深さ「ｄ」の関数であるだけでなく、実際の断面の関数でもある。手短に言うと、電極１及び５の中及び周りに存在する液体３の量は、液体３に対する調節可能なプラズマ４の１つ又は２つ以上の効果、並びに、電極５と液体３との電気化学相互作用に影響を与えることができる。さらに、電極１及び５の中及び周りの液体３の流量は、結果として生じるコロイド又は懸濁液中に形成されたナノ結晶の特性の多くに影響を及ぼすこともできる。これらの効果は、液体３に対する、調節可能なプラズマ４のコンディショニング効果（例えばプラズマの電界及び磁界の相互作用、プラズマの電磁線の相互作用、液体中の種々の化学種（例えばルイス酸、ブレンステッド−ラウリ酸）の生成、ｐＨの変化、液体の温度変動（例えば液体流が低速であるほど、高い液体温度をもたらし、且つ／又は、電極１／５との又は電極１／５の周りの接触時間又は滞留時間が長いほど、生成された最終生成物、例えば形成済ナノ結晶のサイズ／形状に望ましい影響を与えることもできる、など）を含むだけでなく、濃度、又は調節可能なプラズマ４と液体３との相互作用をも含む。同様に、液体３に対する電極５の多くの特徴の影響（例えば電気化学相互作用、温度など）は、少なくとも部分的には、電極５と並置された液体の量の関数でもある。これらのファクタの全ては、核形成と、液体３中で成長したナノ結晶の成長との間に存在するバランスに影響を与えることができ、その結果例えば、粒子サイズ及びサイズ範囲の制御、及び／又は粒子形状及び形状範囲の制御を行うことができる。
【０１１９】
また、トラフ部材３０（又は３０ａ’及び／又は３０ｂ’）内に流入させられる液体３の初期温度は、本明細書中の開示内容に従って生成された生成物の種々の特性に影響を与えることもできる。例えば、液体３の種々異なる温度は、ナノ結晶のサイズ及び形状、種々の形成済成分（例えば一時的、半永久的又は永久的な成分）の濃度又は量、液体のイオン制御、ｐＨ、ゼータ電位などに影響を与えることができる。同様に、トラフ部材３０（又は３０ａ’及び／又は３０ｂ’）の少なくとも一部又は実質的に全ては望ましい効果を有することができる。例えば、局所的な冷却を可能にすることにより、形成済生成物（ナノ結晶サイズ及び／又はナノ結晶形状）の結果としての特性を制御することができる。処理中の好ましい液体３温度は、氷点と沸点との間、より典型的には室温と沸点との間であり、より典型的には４０〜９８℃、より典型的には約５０〜９８℃である。このような温度は、例えば処理装置の種々の部分又は部分の近くに配置されたコンベンショナルな冷却手段によって制御することができる。
【０１２０】
さらに、所定の処理増強剤を液体３に添加するか又はこれと混合してもよい。処理増強剤は固体及び液体の両方（及びいくつかの事例では気体）を含む。処理増強剤は、特定の処理利点及び／又は望ましい最終生成物特性を提供することができる。処理増強剤の一部は、例えば、本発明の電気化学的成長プロセスにおいて、望ましい種晶として機能し、影響を与え、又はその部分になることができ（又は所望の種晶を促進するか、又は核形成部位の形成に関与することができる）、且つ／又は結晶面成長促進剤／防止剤として機能し、影響を与え、又はその部分になることもでき；或いは、単に本発明の電気化学プロセスにおける電流又は電力調節剤として機能することもできる。このような処理増強剤は電極１／５及び／又は５／５の間の電流及び／又は電圧条件に望ましい影響を及ぼすこともできる。
【０１２１】
好ましい処理増強剤は、重炭酸ナトリウムである。他の処理増強剤の例は炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸カリウムなど、及びこれらの組み合わせである。別の特に好ましい処理増強剤は、重炭酸ナトリウムと水酸化カリウムとの混合物である。所定の条件下で医療用途のバイメタルナノ結晶を形成するためのさらに他の処理増強剤は、本明細書中に記載される電気化学的成長プロセスを支援する任意の物質であってよく；そしていずれの材料も金ナノ結晶表面内又は表面上に実質的に組み込まれることがなく；またナノ結晶又はナノ結晶を含有する懸濁液に毒性を与えることがない。処理増強剤は、本明細書中に開示された電気化学反応のうちの１つ又は２つ以上を支援してよく、且つ／又は本明細書中の教示内容に従って形成される生成物の１つ又は２つ以上の望ましい特性を達成するのを支援してもよい。好ましくは、このような処理増強剤は、他の処理技術によって必要とされるＣｌ-又は塩化物又は塩素系材料を含有しない。
【０１２２】
例えば、所定の処理増強剤は解離して正イオン（カチオン）及び負イオン（アニオン）になることがある。液体組成、イオンの濃度、印加された場、印加された場の周波数、印加された場の波形、温度、ｐＨ、ゼータ電位などを含む種々の要因に応じたアニオン及び／又はカチオンは、対向荷電電極に向かってナビゲート又は移動する。前記イオンがこのような電極に又はその近くに位置すると、イオンは、電極及び／又はこのような電極に又はその近くに位置するその他の成分との１種又は２種以上の中間反応に関与することができる。イオンは電極内の１種又は２種以上の材料と反応し、金属イオンを液体中に生成させることもある。具体的には、電極間で溶液中に存在するイオンは、電極内（又は電極の近く）の材料に影響を及ぼすことにより、電極によって提供された材料から「成長」した金属ナノ結晶を形成することもある。例えば、所定の金属イオンは液体３に電極５から入り、そして互いに一緒になって（核形成）、液体３内部に成分（例えばイオン、ナノ結晶など）を形成するようにされてよい。次いでこのようなイオンは、バイメタルナノ結晶の成長のための原材料として使用することができる。
【０１２３】
特定の空間的に広がる低指数結晶面を含有する所定のナノ結晶形状（又は形状分布）が存在することにより、種々異なる反応を生じさせることができ（例えば種々異なる触媒的、電気化学的、生体触媒的及び／又は生物物理学的反応を生じさせ、且つ／又は、種々異なる生物学的シグナル伝達経路を、このような形状のナノ粒子が存在しない場合に対して活性／不活性にさせる）、且つ／又は、種々異なる反応を、実質的に同一の条件下で選択的に発生させることができる。このような性能差は、表面プラズモン共鳴及び／又はこのような共鳴の強度に起因する場合がある。このように、量（例えば濃度）、ナノ結晶サイズ、特定の拡張成長結晶面の有無、及び／又はナノ結晶形状又は形状分布を制御することによって、所定の反応（触媒的、電気化学的、生物学的反応、及び／又は生物学的シグナル伝達経路）に望ましい影響を与え、且つ／又はこれらの反応を制御することができる。このような制御の結果、所定の生物学的反応及び／又はシグナル伝達経路の関数である種々異なる疾患又は兆候を予防及び／又は治療することができ、また、非生物学的反応経路を制御することができる。
【０１２４】
さらに、所定の処理増強剤は、電荷担体として機能し得る材料を含んでいてもよいが、これら自体はイオンでなくてもよい。具体的には、本明細書中に開示された電気化学処理技術によって導入されるか又はその場で形成される（例えば、不均質又は均質核生成／成長）金属系粒子が、電荷担体、結晶核形成剤及び／又は成長促進剤として機能することもできる。その結果、種々異なる結晶形状（例えば六角形板、八面体、四面体、五角両錐体（十面体）など）を形成することができる。ここでもやはり、特定の粒子結晶サイズ、拡大結晶面及び／又はこのような結晶の形状又は形状分布の存在は、特定の反応の発生に望ましい影響を及ぼすことができる（例えば特定のタンパク質又はタンパク質相同体に結合する、及び／又は、特定の生物学的シグナル伝達経路、例えば炎症経路又はプロテアソーム経路に影響を与える）。
【０１２５】
例えば、図９及び１０ａ〜１０ｄを参照すると、第１トラフ部材３０ａ’／３０ｂ’内で形成された白金種を第２トラフ部材３０ａ’／３０ｂ’内に流入させ、第２トラフ部材内のバイメタルナノ結晶の形成に関与させる。より具体的には第１の一連の電気化学反応が、改質水処理増強剤溶液／懸濁液を形成するように、好適な処理増強剤を含有する水中で行われる。次いで改質水処理増強剤溶液／懸濁液は、第２トラフ部材３０ａ’／３０ｂ’内で発生する第２の一連の電気化学反応のための原材料供給物として役立つ。いくつかの事例において、２つの別個のトラフ部材は別個の部材として保持され、第１トラフ部材の流出物は、第２トラフ部材内に流入する前に冷却しておく。しかし別の実施態様では、２つのトラフ部材は、２つの識別可能な部分３０ａ’／３０ｂ’の間に配置された冷却手段を有する又は有さない一体的なユニットであってよい。
【０１２６】
さらに、本発明の処理増強剤は、伝統的な還元化学技術において使用される伝統的な有機系分子を考えていないので、このような化学的還元剤（又は添加界面活性剤）が欠けていることは、本発明の成長したナノ結晶の表面が、伝統的な還元化学アプローチによって形成されるナノ粒子と比較して極めて「クリーン」であることを意味する。なお、「クリーン」という用語をナノ結晶表面に関連して使用するとき、又は、「有機不純物又は膜を実質的に含まない」（又は同様の言い回し）を使用するときには、これは、（１）ナノ結晶の機能を変え且つ／又は（２）有意な部分（例えば結晶の少なくとも２５％、より典型的には結晶の少なくとも５０％）を覆う層、表面、又は膜を形成する化学成分が、形成済ナノ結晶の表面に接着又は付着することがないことを意味する。好ましい実施態様の場合、ナノ結晶表面は、その機能を物質的に変化させるいかなる有機汚染物質又は反応物質も全く含んでいない。なお、本発明のナノ結晶の機能には不都合又は物質的な影響を及ぼすことのない、本発明のナノ結晶に付着させられる偶発的な成分は、本発明の範囲内に含まれるものとなおも考えるべきである。
【０１２７】
添加化学物質（例えば有機物質又は塩素系材料）がないことにより、金属原子の成長が可能になり、またナノ粒子の性能に不都合な影響が及ぼされない（例えば生体内の触媒反応又は生物学的反応において、例えば血清中のナノ粒子／ナノ結晶の周りに形成されるタンパク質コロナに影響を与え、且つ／又は細胞又は生物内へ導入される毒性化合物を低減する）。例えば、特定の理論又は説明に縛られたくはないが、生物学的反応においてタンパク質コロナ形成は、生体内のナノ粒子／ナノ結晶の場所を制御し、また、ナノ粒子／ナノ結晶の表面又は表面近くのタンパク質の折り畳みを制御することもできる。性能のこのような相違は、例えば表面電荷、表面プラズモン共鳴、エピタキシャル効果、表面二重層、影響範囲、毒性表面汚染物質、及びその他のものを含むような要因に起因すると言える。このような新規の形状はまた触媒にも影響を及ぼす。
【０１２８】
さらに、プロセス中に種晶が発生し、且つ／又は一連の拡大結晶面が成長し始める（例えば同質核形成）か、又は種晶が別々に提供される（例えば異種核形成）と、形成済粒子（例えば金属原子）が電気化学プロセスにおいて１つ又は２つ以上の電極に又は電極の近くに滞留するのを許された時間量は、結果として、時間の関数として増大するこのようなバイメタルナノ結晶のサイズをもたらすことができる（例えば金属原子はまとまって金属ナノ結晶になることができ、そして液体中の特定の有機成分によって妨害されなければ、結晶は成長して種々の形状及びサイズになることができる）。結晶の核形成／成長条件が存在する時間量は、成長するナノ結晶の形状及びサイズを制御することができる。従って、電極における滞留時間又は電極の周りの滞留時間、液体流量、トラフ断面形状などは全て、本明細書中の他の場所で論じられているようにナノ結晶成長条件に関与する。
【０１２９】
本明細書中の好ましい実施態様の多くの場合、１つ又は２つ以上のＡＣ源が利用される（例えば変圧器６０及び給電装置５０１ＡＣ）。１つの電極の「＋」極性から同じ電極の「−」極性への変化速度はヘルツ、Ｈｚ、周波数、又は１秒当たりのサイクル数として知られている。米国内では標準出力周波数は６０Ｈｚであり、これに対して欧州ではほとんどが５０Ｈｚである。本明細書中の「例」に示すように、周波数も、本明細書中の電気化学技術に従って形成されたナノ結晶のサイズ及び／又は形状に影響を及ぼすこともできる。好ましい周波数は５〜１０００Ｈｚ、より典型的には２０〜５００Ｈｚ、さらに典型的には４０〜２００Ｈｚ、さらにより典型的には５０〜１００Ｈｚである。例えば、特定の理論又は説明に縛られたくはないが、核形成された結晶又は成長中の結晶は先ず、例えば異符号吸引に起因して、結晶（又は結晶の形成に関与する結晶成長成分、例えばイオン又は原子）に加えられた吸引力を有することができ、次いで（例えば同符号反発に起因して）反発力がこのような成分に加えられる。これらのファクタも明らかに、粒度及び／又は粒子の形状に影響を与え、また、還元剤又は界面活性剤（すなわち、従来技術である還元化学技術に関与するために添加することが必要となるもの）を必要とすることなしに、結晶が形成されるのを可能にして、このような添加化学種をナノ結晶表面が含まないようにすることによって形成される新規のナノ結晶の核形成及び／又は結晶成長に大きな役割を果たす。成長したナノ結晶の表面上に有機系被膜がないことは、これらの生物学的機能を変える（そしていくつかの事例では制御する）。さらに、水が液体として使用されるときには、電極で加水分解が発生することができ、結果としてガスが生成される。水の他の分解反応生成物（other lysis products of water）の製造は、水和電子、ＯＨ-、Ｈ*、Ｈ3Ｏ、Ｈ2Ｏ2などを含む。このような溶解生成物は本明細書中に開示された結晶成長プロセスを支援し、且つ／又は懸濁液中のバイメタルナノ結晶の安定化を支援することもできる。
【０１３０】
さらに、特定の周波数のために使用される特定の波形も、ナノ結晶成長条件に影響を与え、ひいてはナノ結晶のサイズ及び／又は形状にも影響を及ぼす。米国が使用する標準ＡＣ周波数は６０Ｈｚであり、「正弦」波の標準波形も使用する。本明細書中の「例」に示されているように、波形を正弦波から方形波又は三角波へ変化させると、このこともナノ結晶結晶化条件に影響を及ぼし、ひいては、結果として生じるナノ結晶サイズ及び形状にも影響を与える。好ましい波形は、正弦波、方形波、及び三角波を含むが、しかしハイブリッド波形も、本発明の範囲に含まれるものと考えるべきである。
【０１３１】
さらに、本明細書中に開示された新規の電気化学技術において印加された電圧も、ナノ結晶のサイズ及び形状に影響を与えることができる。好ましい電圧範囲は２０〜２０００ボルト、より好ましい電圧範囲は５０〜１０００ボルトであり、そしてさらにより好ましい電圧範囲は１００〜３００ボルトである。電圧に加えて、これらの電圧と一緒に使用されるアンペア数は、典型的には０．１〜１０アンペア、より好ましいアンペア数範囲は０．１〜５アンペア、そしてさらにより好ましいアンペア数範囲は、本明細書中に開示された処理パラメータ下の１電極セット当たり０．４〜１アンペアである。
【０１３２】
さらに、本明細書中に開示された新規の電気化学技術において印加されたそれぞれの波形に対応して使用される「デューティ・サイクル」も、ナノ結晶のサイズ及び形状に影響を与えることができる。これに関して、特定の理論又は説明に縛られたくはないが、電極が正にバイアスされている時間量は、第１の一連の反応をもたらすことができ、これに対して、電極が負にバイアスされているときには、異なる一連の反応が発生し得る。電極が正又は負にバイアスされている時間量を調節することによって、成長したナノ結晶のサイズ及び／又は形状を制御することができる。さらに、電極が＋又は−に変換する速度も、波形形状の関数であり、これもまたナノ結晶のサイズ及び形状に影響を与える。
【０１３３】
温度も重要な役割を果たす。本明細書中に開示された好ましい実施態様のいくつかでは、金ナノ結晶が核形成されて成長させられる処理容器の少なくとも一部で、水の沸点温度に近づく。例えば、本明細書中の連続式処理の例における流出水の温度は、約６０℃〜９９℃である。しかしながら、本明細書中の他の場所で論じたように、異なる温度範囲も望ましい。温度は、結果として生じる生成物（例えばナノ結晶のサイズ及び／又は形状）並びに結果として生じる生成物の量（すなわち、懸濁液又はコロイド中のナノ結晶のｐｐｍレベル）に影響を与えることができる。例えば、（本明細書中の「例」のいくつかに開示されているような）種々の周知の技術によってトラフ部材３０内の液体３を冷却することが可能ではあるものの、本明細書中の例の多くは液体３を冷却することはなく、その結果、その処理中に液体３の一部を蒸発させる。
【０１３４】
言うまでもなく、トラフ部材３０（又は３０ａ’及び／又は３０ｂ’）のためには種々異なる形状及び／又は断面が存在し得る。これらの形状のいずれか１つが、設計及び製造上の種々様々な考慮事項の関数として、望ましい結果をもたらすことができる。例えば、部分３０ａ’又は３０ｂ’内で生成される１種又は２種以上の成分は一時的（例えば種晶又は核生成の時点）且つ／又は半永久的（例えばコロイド中に存在する成長したナノ結晶）であってよい。例えば部分３０ａ’内で製造されたこのような成分を、例えば部分３０ｂ’内で製造された１種又は２種以上の成分と望ましい状態で且つ制御可能に反応させることができるならば、このような混合から生じる最終生成物（例えば最終生成物の特性）は、部分３０ａ’及び３０ｂ’内で形成された成分がいつ混合されるかの関数となり得る。さらに、第１トラフ部材３０ａ’／３０ｂ’内で形成された一時的成分は、第２トラフ部材３０ａ’／３０ｂ’内の後続のバイメタルナノ結晶形成に影響を与えることもできる。従って、第１トラフ部材内の第１水性生成物の製造時点と、このような第１生成物が第２トラフ部材内の原材料になる時点との間で経過する時間量は、形成されるバイメタルナノ結晶懸濁液に影響を与えることもできる。従って、流入・流出する液体の温度を監視／制御することにより、所定の望ましい処理条件及び／又は最終生成物の望ましい特性を最大化し、且つ／又は所定の望ましくない生成物を最小化することができる。さらに、処理増強剤を、異なるトラフ部材の部分のうちの１つ又は２つの部分内で選択的に利用してよい。
【０１３５】
図６は、本発明の好ましい実施態様のうちのいくつかの教示内容に従って利用される一般的な装置を示す概略図である。具体的には、この図６は、液体３を含有するトラフ部材３０を示す側面概略図である。トラフ部材３０の上側に、複数の制御装置２０ａ〜２０ｄが載置されており、これらの制御装置はこの実施態様では、取り外し可能にトラフ部材３０に取り付けられている。制御装置２０ａ〜２０ｄはもちろん、本発明の種々の実施態様を実施するときに、永久的に所定の位置に固定されていてよい。制御装置２０（及び対応する電極１及び／又は５並びにこのような電極の構造）の正確な数、及び制御装置２０（及び対応する電極１及び／又は５）の位置決め又は配置は、本明細書中の他の個所で詳しく論じる本発明の種々の好ましい実施態様の関数である。しかしながら、一般には、流入液体３（例えば処理増強剤を含有する水又は純水）は、液体搬送手段４０（例えば液体ポンプ、液体３をポンピングするための重力、液体ポンピング手段）、例えば液体３をトラフ部材３０内にその第１端部３１でポンピングするための蠕動ポンプ４０に提供される。液体搬送手段４０は、例えば重力送り手段又は静水圧手段、ポンピング手段、調節手段又は弁手段などを含む、液体３を動かすための任意の手段を含んでいてよい。但し、液体搬送手段４０は、既知量の液体３をトラフ部材３０内に信頼性高く且つ／又は制御可能に導入できなくてはならない。液体３がトラフ部材３０内部（例えば１つ又は２つ以上の電極１／５又はその周り）に含有されている時間量も、生成される生成物に影響を与える（例えば成長したナノ結晶のサイズ及び／又は形状）。
【０１３６】
一旦液体３がトラフ部材３０内に提供されると、トラフ部材３０内部で液体３を連続して動かす手段が必要とされることも必要とされないこともある。しかしながら、液体３を連続して動かす単純な手段は、トラフ部材３０が、これが載置された支持面に対して僅かな角度θ（例えば低粘度流体３、例えば水の場合には、１度未満〜数度）を成して設置されることを含む。例えば、液体３の粘度が余りにも高くない限り（例えば水の粘度付近の任意の粘度は、一旦このような流体がトラフ部材３０内部に含有又は配置されたら、重力流によって制御することができる）、支持面に対して約６フィート（約１．８メートル）だけ間隔を置いて設けられた入口部分３１と出口部分３２との間に１インチ未満の鉛直方向高さの差を形成するだけで済む。より大きい角度θは、粘度が水よりも高い液体３を処理する結果として、また、液体３がより高速でトラフ３０を通過する必要があるときなどに、必要となることがある。さらに、液体３の粘度が重力単独では不十分なほど増大するときには、静水圧ヘッド圧又は静水圧を具体的に用いるように他の現象を利用して、望ましい流体流を達成することもできる。さらに、トラフ部材３０に沿って液体３を動かすための付加的な手段を、トラフ部材３０内部に設けることもできる。流体を動かすためのこのような手段は、機械手段、例えばパドル、ファン、プロペラ、オーガーなど、音響手段、例えばトランスデューサ、熱手段、例えばヒータ及び／又は冷却器（付加的な処理上の利益を有することができる）などを含み、これらは、本発明と一緒に使用するのに望ましい。
【０１３７】
図６はまた、トラフ部材３０の端部３２に設けられた貯蔵タンク又は貯蔵器４１を示している。このような貯蔵器４１は、例えばトラフ部材３０内部に産出された液体３（又は液体中に含有される成分）と不都合に相互作用することのない１種又は２種以上の材料から成る任意の許容し得る容器及び／又はポンピング手段であってよい。許容し得る材料の一例としては、プラスチック、例えば高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ガラス、金属（例えば特定の等級のステンレス鋼）などが挙げられる。さらに、この実施態様では貯蔵タンク４１が示されているが、タンク４１は、トラフ部材３０内で処理された流体３を分配するか又は直接にボトリング又はパッケージングするための手段を含むものとして理解されるべきである。
【０１３８】
例えば図２及び６に概略的に示された電極制御装置は図８ｃにおいてより詳細に示されている。具体的には、図８ｃは制御装置２０の斜視図を示している。図８ｃに示されているように、ベース部分２５が設けられており、前記ベース部分は上側部分２５’と下側部分２５’’とを有している。ベース部分２５は、例えば構造用プラスチック、樹脂、ポリウレタン、ポリプロピレン、ナイロン、テフロン、ポリビニルなどから形成された材料を含む好適な剛性プラスチック材料から成っている。２つの電極調節集成体の間に隔壁２７が設けられている。隔壁２７は、ベース部分２５を含む材料と同様の又は異なる材料から形成することができる。ベース部分２５の表面２５’に、２つのサーボ−ステッピングモータ２１ａ及び２１ｂが固定されている。ステッピングモータ２１ａ，２１ｂは、ステッピングモータ２１ａ／２１ｂの周方向運動が、モータと連通する電極１又は５を鉛直方向に昇降させるように、僅かに運動可能な（例えば３６０度を基準として、１度よりも僅かに小さく運動可能又は僅かに大きく運動可能な）いかなるステッピングモータであってもよい。これに関して、第１のホイール状の構成部分２３ａが、駆動モータ２１ａの出力軸２３１ａに結合された駆動輪であるので、駆動軸２３１ａが回転すると、駆動輪２３ａの周方向運動が形成される。さらに、追従輪２４ａが駆動輪２３ａに押しつけられるので、これらの間に摩擦接触が存在する。駆動輪２３ａ及び／又は追従輪２４ａは、電極１，５を収容するのを助けるためにその外側部分に切欠き又は溝を含んでいてよい。追従輪２４ａは、追従輪２４ａに取り付けられた部分２４１ａ及び２６１ａの間に配置されたばね２８５によって、駆動輪２３ａに押しつけられる。具体的には、ブロック２６１ａから延びる軸２６２ａの部分の周りにコイルばね２８５を配置することができる。ばねは、駆動輪２３ａと追従輪２４ａとの間に妥当な摩擦力を生じさせるのに十分な張力を有することにより、軸２３１ａが所定の量だけ回転すると、電極集成体５ａ，５ｂ，１ａ，１ｂなどがベース部分２５に対して鉛直方向に動くようになるべきである。駆動輪２３ａのこのような回転運動又は周方向運動の結果、図示の電極１，５を直接、鉛直方向に移動させる。駆動輪２３ａの少なくとも一部が、電気絶縁材料から形成されているべきであり、これに対して追従輪２４ａは、導電性材料又は電気絶縁材料から、しかし好ましくは電気絶縁材料から形成することができる。
【０１３９】
駆動モータ２１ａ／２１ｂは、小さく回転することができる（例えば１°／３６０°を僅かに下回るか又は１°／３６０°を僅かに上回る）ので、駆動軸２３１ａの小さな回転変化は、電極集成体の小さな鉛直方向の変化に変換される。好ましい駆動モータは、RMS Technologies製の駆動モータ、モデル1MC17-S04ステッピングモータを含む。これはＤＣ作動型駆動モータである。このステッピングモータ２１ａ／２１ｂはそれぞれRS-232接続部２２ａ／２２ｂを含む。この接続部は、ステッピングモータが、遠隔制御装置、例えばコンピュータ又はコントローラによって駆動されるのを可能にする。
【０１４０】
部分２７１，２７２及び２７３はトラフ部材３０に対するベース部分２５の高さを調節する、主に高さ調節部分である。部分２７１，２７２及び２７３は、ベース部分２５と同じ、類似の、又は異なる材料から形成することができる。部分２７４ａ／２７４ｂ及び２７５ａ／２７５ｂも、ベース部分２５と同じ、類似の、又は異なる材料から形成することができる。但しこれらの部分は、これらが電圧及び電流を電極集成体１ａ／１ｂ，５ａ／５ｂなどに供給することに関連する種々のワイヤー構成部材を収容する点で、電気絶縁部分であるべきである。
【０１４１】
図８ｃに示された制御装置２０のサイズに関して、長さ及び幅は、ステッピングモータ２１ａ／２１ｂのサイズ及びトラフ部材３０の幅を収容する任意の寸法であってよい。これに関して、図１７ｆに示された長さは、この長さが少なくともトラフ部材３０の幅と同じ長さであるように、また典型的には僅かに長く（例えば１０〜３０％）なるのに十分である必要がある。幅は、ステッピングモータ２１ａ／２１ｂを収容するのに十分に幅広であり、しかも、トラフ部材３０の長さに沿った長手方向スペースを不必要に遊ばせておくほどには幅広でないことが必要である。本発明の１つの好ましい実施態様の場合、長さは約７インチ（約１９ミリメートル）であり、幅は約４インチ（約１０．５ミリメートル）である。ベース部材２５の厚さは、ベース部材２５のために構造的、電気的及び機械的剛性を提供するのに十分な任意の厚さであり、約１／４インチ〜３／４インチ（約６ｍｍ〜１９ｍｍ）のオーダーであるべきである。これらの寸法はさほど重要ではないが、これらの寸法は、本発明の１つの好ましい実施態様の特定の構成部分の大まかなサイズを理解することを可能にする。
【０１４２】
さらに、ベース部材２５（及びこれに装着された構成部分）を、好適なカバー（図示せず）によってカバーすることにより、電気的に絶縁し、またベース部材２５に取り付けられた構成部分の全てのための局所的な保護環境を形成することができる。このようなカバーは、好適な安全性及び動作柔軟性を提供する任意の好適な材料から形成することができる。材料の例は、トラフ部材３０の他の部分及び／又は制御装置２０のために使用されるものと同様のプラスチックを含み、好ましくは透明である。カバー部材は、ベース部分２５を形成するために使用されるものと同じタイプ材料から形成することもできる。カバー部材は貫通孔を含むことができる。これらの貫通孔は例えば、電極５の余剰部分と整列させることができる。これらの余剰部分は、例えば電極ワイヤーのスプールに接続することができる（これらの図面に示されていない）。
【０１４３】
図８ｊに示された部分２４２，２４２ａ及び２４２ｂは、その間に設けられるようになっているワイヤー５ａ又は５ｂのために弾性張力を提供する。加えて、この制御装置のデザインによって、電源６０又は５０１ＡＣと電極１／５との間に電気的な接続が生じる。サーボモータ２１ａは上述のように機能するが、しかし、単一のサーボ駆動モータ２１ａによって２つの電極が駆動される。従って、図８ｊに示された実施態様の事例では、単一の駆動モータ２１ａが２つの駆動モータの代わりとなることができる。さらに、電気コンタクトをワイヤー１／５と電源６０／５０１ＡＣとの間に設けることにより、頂面上に全ての電気接続部が提供される（すなわちこの表面は液体３から大きく離れている）ことにより、設計及び製造上の或る特定の利点がもたらされる。
【０１４４】
図８ｃは耐火材料構成部材２９ａ，２９ｂを示している。構成部材２９は、例えば酸化アルミニウムなどを含む好適な耐火成分から形成されている。耐火部材２９は、電極１及び／又は５との電気的な接続を可能にする横方向貫通孔を有していてよい。さらに、長手方向貫通孔が耐火部材２９の長さに沿って存在しているので、電極集成体１／５がこれを貫通して延びることができる。
【０１４５】
図８ｃは１つの電極１ａを、第１耐火部分２９ａを通って延びるものとして示されており、そして１つの電極５ａは、第２耐火部分２９ｂを通って延びるものとして示されている。従って、本明細書中に明示的に開示された、また本明細書中で言及された電極集成体のそれぞれは、ここに示された制御装置の好ましい実施態様との組み合わせで利用することができる。
【０１４６】
制御装置２０を作動させるためには、２つの大まかなプロセスが行われることが必要である。第１プロセスは、電極１及び／又は５を電気的に活性化する（例えば、好ましい電源１０から電力を印加する）ことを伴い、また、第２の大まかなプロセスの発生は、例えばどれだけ多くの電力（例えば電圧及び／又は電流）を電極に印加するかを割り出し、このような割り出した値に応じて電極１／５の高さを適切に調節する（例えば電極１／５の高さを手動及び／又は自動で調節する）か；又は電極高さを調節し、又は時間の関数として、単に電極を液体３と接触させる（例えば電極５が液体３中を徐々に前進するようにする）又は接触させないように動かすことを伴う。制御装置２０を利用する場合、好適な指示が、RS-232ポート２２ａ及び２２ｂを介してステッピングモータ２１に伝えられる。制御装置２０の構成部分、並びに電極活性化プロセスの重要な実施態様については、本明細書中で論じる。
【０１４７】
本発明の好ましい実施態様は、種々の図面に示された自動制御装置２０を利用する。ステッピングモータ２１ａ及び２１ｂが例えば図８ｃに示されている。電極１／５は、図８ｄ〜８ｈのそれぞれに示された電気回路（例えばプラズマ４を形成する電極セット１／５又は電極セット５／５に対応）によって監視されるか、又は本明細書中のいくつかの実施態様の場合、電極セット５／５に対応して図８ｇ及び８ｉのそれぞれに示された電気回路によって監視される。
【０１４８】
具体的には、この実施態様では、図８ｈの電気回路は電圧監視回路である。具体的には、変圧器６０内の二次コイル６０３の出力脚部のそれぞれから出力された電圧が、点「Ｐ−Ｑ」及び点「Ｐ’−Ｑ’」にわたって監視される。具体的には、「ＲL」によって示された抵抗器は、マルチメータ測定装置（図示せず）の内部抵抗に相当する。点「Ｐ−Ｑ」及び「Ｐ’−Ｑ’」の間で測定された出力電圧は典型的には、本明細書中で後から「例」の項で示すいくつかの好ましい実施態様の場合、約２００ボルト〜約４，５００ボルトである。しかしこれよりも高い、またこれよりも低い電圧も、本明細書中に開示された実施態様の多くと連携することができる。トラフ部材３０ａ’に沿った各位置における各電極セット１及び／又は５毎に、望ましいターゲット電圧が割り出されている。このような望ましいターゲット電圧は、例えば図８ｄ，８ｅ及び８ｆに示された回路制御を利用することによって、実際の印加電圧として達成される。これら図８ｄ，８ｅ及び８ｆは、Velleman K8056回路集成体（マイクロチップPIC16F630-I/Pを有する）によって制御されたリレーセットを示している。図８ｈに示されている形式でそれぞれの変圧器６０が電気的に接続される。各変圧器６０及び関連する測定点「Ｐ−Ｑ」又は「Ｐ’−Ｑ’」が、個々のリレーに接続されている。例えば、点「Ｐ−Ｑ」は、図８ｄのリレー５０１に相当し、点「Ｐ’−Ｑ’」は、図８ｄのリレー５０２に相当する。従って、２つのリレーが各変圧器６０に対して必要となる。各リレー５０１，５０２などは順次、二次コイル６０３の第１脚部からの第１出力電圧を問い合わせ、次いで二次コイル６０３の第２脚部からの第２出力電圧を問い合わせ、そしてこのような問い合わせは、第２変圧器６０ｂの二次コイル６０３の第１脚部からの第１出力電圧に対して、次いで二次コイル６０３の第２脚部に対して、以下同様に続けられる。
【０１４９】
開示された問い合わせ電圧調節技術のためのコンピュータ又は論理制御は、例えば、好ましい実施態様の場合、ＰＣ内で利用される標準的なビジュアル・ベーシック・プログラミング・ステップを含む任意のコンベンショナルのプログラム又はコントローラによって達成される。このようなプログラミング・ステップは、問い合わせ、読み取り、比較、及び適切な作動符号を送信する（例えば液体３の表面２に対して電極を昇降させる）ことを含む。このような技術は、当業者には明らかなはずである。
【０１５０】
さらに、電極セット５／５’のための例１において利用される本発明の別の好ましい実施態様の場合、自動制御装置２０は、例えば図８ｅ，８ｆ，８ｇ及び８ｉの電気回路によって制御される。具体的には、図８ｉの電気回路は、電流を測定するために使用される電圧監視回路である。この場合、電圧及び電流は、抵抗器の選択により同じ数値である（本明細書中で後から論じる）。具体的には、それぞれの電源５０１ＡＣから出力された電圧が、点「Ｐ−Ｑ」及び点「Ｐ’−Ｑ’」にわたって監視される。具体的には、「ＲL」によって示された抵抗器は、マルチメータ測定装置（図示せず）の内部抵抗に相当する。点「Ｐ−Ｑ」及び「Ｐ’−Ｑ’」の間で測定された出力電圧は典型的には、本明細書中で後から例において示すいくつかの好ましい実施態様の場合、約０．０５ボルト〜約５ボルトである。しかしこれよりも高い、またこれよりも低い電圧も、本明細書中に開示された実施態様の多くと連携することができる。トラフ部材３０ｂ’に沿った各位置における各電極セット５／５毎に、望ましいターゲット電圧が割り出されている。このような望ましいターゲット電圧は、例えば図８ｅ，８ｆ，８ｇ及び８ｉに示された回路制御を利用することによって、実際の印加電圧として達成される。これらの図８は、Velleman K8056回路集成体（マイクロチップPIC16F630-I/Pを有する）によって制御されたリレーセットを示している。
【０１５１】
具体的には、サーボモータ２１は、望ましい電極５プロフィールを維持するために、具体的な所定の時点で回転させられる。サーボモータ２１は、時計回り方向で所定の量だけ回転することにより応答する。具体的には、サーボモータ２１は、電極５の約０．００９インチ（０．２２９ｍｍ）が雌受容体部分ｏ５に向かってそして雌受容体部分ｏ５（例えば、図１０ｂ及び図１１ａに示されている）内に前進させられる。こうして、電極５は液体３を通って徐々に前進させられる。本明細書中で論じられた１つの好ましい実施態様の場合、このような電極５運動は、約４．３分毎に生じる。従って、各電極５の雌受容体部分ｏ５内への鉛直運動速度は、８時間毎に約１インチ（約１．９ｃｍ）である。従って、実質的に一定の電極５の形状又はプロフィールは、液体３内及び液体３を通って電極を一定に又は徐々に前進させることによって維持される。さらに、電極５の前端部が雌受容体部分ｏ５内の長手方向端部に達したら、電極５を処理装置から取り外すことができる。或いは、電極の「使用済」部分を捕集するための電極捕集手段を設けることもできる。
【０１５２】
電極５を捕集するためのこのような手段の一例としては、巻き取り又はスプール装置、及び延長部分ｏ５、ワイヤークリッピング装置、又はワイヤー切断装置などが挙げられる。しかし、種々異なる電流／電圧プロフィール（ひいては種々異なるナノ結晶サイズ及び／又は形状）を達成するために、他の電極運動速度も本発明の範囲に含まれる。
【０１５３】
さらに、図８ｅ，８ｆ，８ｇ及び８ｉを具体的に参照すると、各電極の電圧を割り出すことにより、問い合わせ手順が順次生じることに注目すべきである。この電圧は本明細書中の実施態様では、アンペア数と等価である。なぜならば、図８ｉでは、抵抗器Ｒａ及びＲｂはほぼ１オームであり、従ってＶ＝Ｉであるからである。換言すれば、各電源５０１ＡＣは、図８ｅ，８ｆ，８ｇ及び８ｉに示されている形式で電気的に接続される。各電源５０１ＡＣ及び関連する測定点「Ｐ−Ｑ」又は「Ｐ’−Ｑ’」が、２つの個々のリレーに接続されている。例えば、点「Ｐ−Ｑ」は、図８ｇのリレー５０１及び５０１’に相当し、点「Ｐ’−Ｑ’」は、図８ｇのリレー５０２，５０２’に相当する。従って、リレーが各電極セット５／５に対して必要となる。各リレー５０１／５０１’及び５０２／５０２’などは順次、電源５０１ＡＣからの出力電圧を、次いで同じ電源５０１ＡＣからの第２電圧を問い合わせ、そして以下同様に続ける。
【０１５４】
開示された電極高さ調節技術のためのコンピュータ又は論理制御は、例えば、好ましい実施態様の場合、ＰＣ内で利用される標準的なビジュアル・ベーシック・プログラミング・ステップを含む任意のコンベンショナルなプログラム又はコントローラによって達成される。このようなプログラミング・ステップは、読み取り、及び適切な作動符号の送信を行うことにより、液体３の表面２に対して電極を降下させることを含む。このような技術は、当業者には明らかなはずである。
【０１５５】
定義
本発明の目的上、明細書及び特許請求の範囲に現れる下記用語及び表現は、下記の意味を有するものとする：
【０１５６】
本明細書中に使用される「実質的にクリーン」という用語は、ナノ結晶表面を記述するために使用されるときには、本明細書の「例」に示された金属系ナノ結晶の重要な特性のうちの少なくとも１つにおいてナノ結晶の機能を物質的に変化させるような量で、化学成分が結晶表面に接着又は付着されることがないことを意味する。或いは、金属系ナノ結晶は、有意な部分（例えば結晶の少なくとも２５％、又は別の実施態様では結晶の少なくとも５０％）を覆う層、表面、又は膜を有さない。この用語はまた、ナノ結晶表面が、その機能を物質的に変化させるいかなる有機汚染物質も、裸の金結晶表面上に全く含んでいないことを意味することもできる。なお、本発明のナノ結晶の機能には不都合又は物質的な影響を及ぼすことのない、本発明のナノ結晶に付着させられる偶発的な成分は、本発明の範囲内に含まれるものとなおも考えるべきである。この用語はまた、本発明の成長したナノ結晶の表面上に伝統的な有機系分子（すなわち伝統的な還元化学技術において使用される分子）がないことを意味する相対的な用語であると理解されるべきである。
【０１５７】
本明細書中に使用される「処理増強剤（process enhancer又はprocessing enhancer）」又は「処理増強された」という用語は、少なくとも１種の材料（固体、液体及び／又はガス）、典型的には無機材料であって、形成されたナノ結晶に有意には結合せず、むしろ電気化学的刺激を受ける成長プロセス中の核形成及び／又は結晶成長を容易にするものを意味する。材料は、結晶が成長するのを可能にするように、電気化学的溶液中に荷電イオンを提供することを含むプロセスにおいて重要な役割を担う。処理増強剤は極めて重要なことには、溶液中に残り、且つ／又は被膜（１実施態様では有機被膜）を形成することがなく、且つ／又は形成済ナノ結晶又は形成済懸濁液に不都合な影響を及ぼすことがなく、且つ／又は電気化学プロセス中に破壊、蒸発されるか、又はその他の形で失われる化合物である。
【０１５８】
本明細書中に使用される「トラフ部材」という表現は、ここに開示された電気化学プロセスと適合し得る限り、管、半管、材料又は物体中に存在する通路又は溝、導管、ダクト、チューブ、シュート、ホース及び／又は樋を含む多種多様の流体処理装置を意味するものと理解されるべきである。
【０１５９】
下記例は、本発明の或る実施態様を説明するのに役立つが、しかし添付の特許請求の範囲において定義された開示内容の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【０１６０】
例１
金系ナノ結晶／ナノ結晶懸濁液ＮＥ１０２１４の製造
一般に、この例は、図９、１０ｃ及び１１ａに大まかに示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。前述の図面における全てのトラフ部材３０ａ’及び３０ｂ’を、それぞれ１／８インチ（約３ｍｍ）厚のプレキシガラス、及び１／４インチ（約６ｍｍ）厚のポリカーボネートから形成した。支持構造３４（図面の多くでは示されていないが、しかし図９には示されている）も、約１／４インチ厚（約６ｍｍ〜７ｍｍ厚）であるプレキシガラスから形成した。各トラフ部材３０ａ’はトラフ部材３０ｂ’と一体的である。この例において使用されたトラフ部材３０ａ’の断面形状は、図５ｂに示された形状に相当した（すなわち台形断面）。３０ａ’の該当寸法は、約１．５インチ（約３．８１ｃｍ）である「Ｓ，Ｓ’」、約２．５インチ（約６．３５ｃｍ）である「Ｍ」、約３／４インチ（約１．９ｃｍ）である「Ｒ」、及び約１／２インチ（約１．３ｃｍ）である「ｄ」である。
【０１６１】
各トラフ部材部分３０ｂ’は、図５ａに相当する断面形状を有した。トラフ部材部分３０ｂ’の該当寸法を、「Ｍ」（すなわちトラフ部材３０ｂ’の入口及び出口部分におけるトラフの内幅）、「ＬT」（すなわちトラフ部材３０ｂ’の横方向長さ又は流れ長さ）、「Ｓ」（すなわちトラフ部材３０ｂ’の高さ）、及び「ｄ’’」（すなわちトラフ部材３０ｂ’内部の液体３’’の深さ）として表１に報告する。トラフ部材３０ｂ’のそれぞれの側壁部分の厚さも約１／４インチ厚（約６ｍｍ）厚であった。
【０１６２】
トラフ部材３０ａ’内へ流入させるものとして例１に使用される（そして例１〜１７では処理増強剤との組み合わせで使用される）水３を、逆浸透法及び脱イオン化法によって製造した（ここでは脱イオン水と呼ぶ）。本質的には、逆浸透（ＲＯ）は、溶解された種及び／又は懸濁物質を地下水から分離する圧力駆動膜分離法である。これは、自然の浸透流（膜の両側の物質の濃度を平衡させようとする）を逆転させるために圧力が加えられるので「逆」浸透と呼ばれる。加えられた圧力は水が強制的に膜を通るようにし、膜の一方の側に汚染物質を残し、そして他方の側に精製水を残す。逆浸透膜は、互いに結合されてプラスチック管の周りに螺旋形態を成して巻き付けられたいくつかの薄層膜又は薄板膜を利用した（これは薄膜複合体又はＴＦＣ膜としても知られている）。溶解された種の除去に加えて、ＲＯ膜はまた、水中に存在し得る微生物を含む懸濁物質を分離する。ＲＯ処理後、混床脱イオン化フィルタを使用した。両処理後の総溶解溶媒量（「ＴＤＳ」）は、Accumet（登録商標） AR20 pH／導電率メータによって測定して、約０．２ｐｐｍであった。
【表１】
2014518847.tif 000005
【０１６３】
表１は、精製水に添加された処理増強剤（ＰＥ）（ＮａＨＣＯ3）の量が約０．５３ｍｇ／ｍｌであったことを示している。言うまでもなく、この処理増強剤の他の量も本発明の範囲内で機能する。精製水／ＮａＨＣＯ3混合物を、トラフ部材３０ａ’内に流入させられる液体３として使用した。トラフ部材３０ａ’（すなわちここでプラズマ４が形成される）内の液体３’の深さ「ｄ’」は、トラフ部材３０ａ’に沿った種々の点において、約７／１６インチ〜約１／２インチ（約１１ｍｍ〜約１３ｍｍ）であった。深さ「ｄ’」は、ダム８０（図９に示す）を使用することによって部分的に制御した。具体的には、ダム８０はトラフ部材３０ａ’の流出端部３２の近くに設けられ、約７／６インチ〜約１／２インチ（約１１ｍｍ〜約１３ｍｍ）の深さになるように深さ「ｄ’」（「ｄ」として図５ｂに示されている）を形成するのを助けた。ダム８０の高さは約１／４インチ（約６ｍｍ）であり、また長手方向長さは約１／２インチ（約１３ｍｍ）であった。幅は、トラフ部材３０ａ’の底部寸法「Ｒ」を完全に横切った。従って、動作中のトラフ部材３０ａ’内の液体３の総体積は、約２．１４立方インチ（約３５ｍｌ）〜約０．８９立方インチ（約１４．５８ｍｌ）であった。
【０１６４】
トラフ部材３０ａ’内及びトラフ部材３０ｂ’内へ入る液体３’の流量は約２３０ｍｌ／分であり、トラフ部材３０ｂ’から入る液体３’流量は約２２０ｍｌ／分（すなわち蒸発に起因して）であった。他の許容し得る流量も本発明の範囲に含まれると考えられるべきである。
【０１６５】
液体３’のこのような流量は、定格0.1馬力、10-600rpmのMasterflex（登録商標） L/Sポンプ駆動装置４０を利用することにより得られた。Masterflex（登録商標）ポンプ４０のモデル番号は7723-80であった。ポンプ駆動装置は、Easy-Load Model No. 77201-60として知られている、これもMasterflex（登録商標）製のポンプヘッドを有した。一般的に言うと、ポンプ４０のためのヘッドは蠕動ヘッドとして知られている。ポンプの正確な設定値は１分当たり２３０ミリミットルであった。蠕動ヘッド内に、直径１／４インチ（すなわちサイズ06419-25)のTygon（登録商標）管を入れた。管は、Masterflex（登録商標）のためにSaint Gobainによって製造された。管の一方の端部をトラフ部材３０’ａの第１の端部３１に供給した。
【０１６６】
表１は単一の電極セット１ａ／５ａがあったことを示す。各電極セット１／５に対する電源はＡＣ変圧器６０であった。具体的には、図７ａは、変圧器６０に接続されたＡＣ電源６２を示している。加えて、例えば回路内の損失係数を調節できるように、キャパシタ６１が設けられている。変圧器６０の出力は、制御装置２０を介して電極１／５に接続される。本発明とともに使用するための好ましい変圧器は、容易に磁束を導くコア６０２内に交流磁束を確立するために、一次コイル６０１内に流れる交流電流を使用する変圧器である。
【０１６７】
二次コイル６０３が一次コイル６０１及びコア６０２の近くに位置していると、この磁束は二次コイル６０３を一次コイル６０１にリンクすることになる。二次コイル６０３のこのようなリンクは、二次端子を横切る電圧を誘導する。二次端子における電圧の大きさは、一次コイルの巻き数と二次コイルの巻き数との比に対して直接に関連する。一次コイル６０１よりも二次コイル６０３の巻き数が多いと、電圧が増大するのに対して、巻き数が少ないと電圧が減少する。
【０１６８】
これらの例において使用するための好ましい変圧器６０は、変圧器６０内の磁気分路の使用によって可能にされる、意図的に低い出力電圧調節力を有している。これらの変圧器６０はネオンサイン変圧器として知られる。このような形態は、電極１／５内への電流を制限する。出力付加電圧が大きく変化すると、変圧器６０は、比較的狭い範囲内に出力付加電圧を維持する。
【０１６９】
変圧器６０は、二次開回路電圧と、二次短絡回路電流とに関して格付けされる。開回路電圧（ＯＣＶ）は、電気的接続が存在しないときだけ、変圧器６０の出力端子に現れる。同様に、短絡が出力端子を横切って存在する場合にだけ、短絡回路電流が出力端子から引き出される（この場合、出力電圧がゼロに等しい）。しかしながら、負荷がこれらの同じ端子を横切って接続されているときに、変圧器６０の出力電圧はゼロと定格ＯＣＶとの間のいずれかの値でなければならない。事実、変圧器６０が適切に付加されると、電圧はおよそ定格ＯＣＶの半分になる。
【０１７０】
変圧器６０は、平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）（例えば以前は平衡中間点接地としても知られていた）として知られている。これは中電圧から高電圧の格付けを有する変圧器、及びほとんどの６０ｍＡ変圧器において最も共通に見いだされる。これは、「中間帰線」システムにおいて許容され得る唯一のタイプの変圧器である。「平衡」変圧器６０は、１つの一次コイル６０１と、２つの二次コイル６０３とを有していて、それぞれの二次コイルが一次コイル６０１の各側に位置している（図７ｂの概略図に全体的に示されている）。この変圧器６０は様々な意味で、２つの変圧器のように機能することができる。不平衡の中間点参照型のコア及びコイルと同様に、各二次コイル６０３の一方の端部はコア６０２に取り付けられ、続いて変圧器容器に取り付けられ、また各二次コイル６０３の他方の端部は出力リード又は端子に取り付けられている。こうして、コネクタの存在なしに、無負荷時１５，０００ボルトのこのタイプの変圧器は、各二次端子から変圧器容器まで約７，５００ボルトとなるが、しかし２つの出力端子の間では約１５，０００ボルトとなる。
【０１７１】
ライン力率１（又は１００％）を処理する交流（ＡＣ）回路において、電圧及び電流はそれぞれゼロで始まり、頂点まで上昇し、ゼロまで降下し、負の頂点へ行き、そしてゼロまで戻る。これにより、典型的な正弦波の１サイクルが完結される。このサイクルは典型的な米国の適用では１秒当たり６０回生じる。こうして、このような電圧又は電流は、１秒当たり６０サイクルの特徴的な「周波数」（又は６０ヘルツ）の電力を有する。力率は、電流波形に対する電圧波形の位置に関連する。両波形が一緒にゼロを通過し、これらの頂点を一緒に通過する場合、これらの波形は同相であり、力率は１又は１００％である。図７ｃに示す２つの波形「Ｖ」（電圧）及び「Ｃ」（電流）は互いに同相であり、力率１又は１００％であるのに対して、図７ｄに示す２つの波形「Ｖ」（電圧）及び「Ｃ」（電流）は互いに異相であり、力率１又は約６０％であり、両波形は同時にゼロを通過することはない。波形は異相であり、これらの力率は１００％未満である。
【０１７２】
大抵のこのような変圧器６０の標準力率は主として、磁気分路６０４及び二次コイル６０３の効果に起因する。磁気分路６０４及び二次コイル６０３は、変圧器６０の回路の出力内にインダクタを加えることにより、電極１／５への電力を制限する。力率は、変圧器６０の一次コイル６０１を横切るように配置されたキャパシタ６１を使用することにより、より高い力率に増大させることができる。キャパシタ６１は、電圧波及び電流波をより同相にする。
【０１７３】
本発明において使用されるべき任意の変圧器６０の無負荷電圧、並びに変圧器の内部構造は重要である。本発明において使用するのに望ましい無負荷変圧器は、約９，０００ボルト、１０，０００ボルト、１２，０００ボルト及び１５，０００ボルトである変圧器を含む。しかし、これらの特定の無負荷ボルト変圧器の測定値は、付加的な実施態様として許容し得る電源の範囲を限定するものとして見るべきではない。本明細書中に開示された本発明の種々の実施態様と一緒に使用するための具体的な望ましい変圧器は、Franceformer製のCatalog No. 9060-P-Eである。これは一次側では120ボルト、60Hz、及び二次側では9,000ボルト、60mAで動作する。
【０１７４】
従って、各変圧器集成体６０ａ〜６０ｈ（及び／又は６０ａ’〜６０ｈ’；及び／又は６０ａ’’〜６０ｈ’’）は、同じ変圧器であってよく、又は異なる変圧器（並び異なる極性）の組み合わせであってもよい。変圧器の選択肢、力率、キャパシタ６１、極性、電極のデザイン、電極の位置、電極の組成、トラフ部材３０ａ’の断面形状、局所的又は全体的な電極組成、雰囲気、局所的又は全体的な液体３の流量、液体３’の局所的成分、トラフ部材３０ａ’内の種々の場に局所的に曝露される液体３’の体積、近隣（上流側及び下流側の両方）の電極セット、局所的な場の濃度、任意の膜の使用及び／又は位置及び／又は組成、などは全て、処理条件、並びに液体３’中で産出された成分の組成及び／又は体積、本明細書中に開示された種々の実施態様により形成されるナノ結晶及びナノ結晶／懸濁液又はコロイドに影響を与えるファクタである。従って、数多くの実施態様を、本明細書中に提供した詳細な開示内容に従って実施することができる。
【０１７５】
電極１を変圧器６０に取り付けるために使用されるワイヤーは、例１〜３に対しては直径約１ｍｍの純度９９．９５％（３Ｎ５）金ワイヤーであった。図３ｅに示されているのと同様の形状を成す、重量が約９．２グラムの電極１によって、プラズマ４を形成した。この電極は９９．９５％純度の金であった。他の電極５ａは、約１ｍｍ厚の金ワイヤー（９９．９５％）であり、これを液体３’中に約９ｍｍ浸漬した。
【０１７６】
図１０ｂ及び１１ａに示されているように、トラフ部材３０ａ’からの流出物は、コンディショニング済の液体３’であり、このコンディショニング済液体３’を第２のトラフ部材３０ｂ’内に直接に流入させた。図１０ｂ及び１１ａに示された第２のトラフ部材３０ｂ’は、表１で報告されている測定値を有した。このトラフ部材３０ｂ’は約８８５ｍｌの液体３’’を含有した。表１は、図８ｂ及び１１ａに示された電極構造を示している。すなわち、７つの電極セット５／５’（図８ｂに示されている）が図１１ａに示されているように位置決めされた（すなわち液体３’’の流れ方向に対して垂直方向）。表１で報告されているように、電極セット５／５’のそれぞれは、直径約１．０ｍｍの純度９９．９９％の金ワイヤーを含んだ。液体３’’と接触している各ワイヤー電極５の長さ（表１では「ＷL」として報告する）は、約１インチ（約２５．４ｍｍ）であった。他の配向も本開示の範囲に含まれる。
【０１７７】
図１３に示されたＡＣ電源（又は変圧器）５０１ＡＣを、本明細書中に含まれた例のための給電装置として使用した。この変圧器５０１ＡＣは、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。図１０ａ〜１０ｄ及び１１ａ〜１１ｂに関して、それぞれの別個の電極セット５／５’（例えばセット２、セット３〜セット８又はセット９）を、図１０ａに示されているような給電装置５０１ＡＣに電気的に接続した。具体的には、給電装置５０１ＡＣを、図１０ａに示された配線図に従って、各電極セットに電気的に接続した。表１は、「セット＃」（例えば「セット１」〜「セット８」）によって表される電極セットのそれぞれに関する。１／５又は５／５電極セットのそれぞれの電極を、特定の電圧範囲内で動作するように設定した。表１に挙げられた電圧は、それぞれの電極セットのために使用された電圧である。各電極セットの中心線と隣接電極セットとの距離「ｃ−ｃ」（図６参照）も報告する。さらに、利用されるそれぞれの電極１と関連する距離「ｘ」も報告する。電極５に関しては距離「ｘ」がないことが報告される。他の関連パラメータも表１に報告する。電極１／５のための全ての材料は、23 Lewis Street, Fort Erie, Ontario L2A2P6, Canada在、Hi-Relから入手した。図１０ｂ，１０ｃ及び１１ａを参照すると、液体が丁度雌受容管ｏ５に入るように各電極５／５’を先ず液体３’’と接触させた。所定の処理時間後、金金属を各ワイヤー電極５から取り出した。このことは電極５を薄くした（すなわち直径が小さくなる）。これにより、例えば金ナノ粒子が形成される際の電流密度及び／又は速度が変化した。従って、電極５を雌受容管ｏ５に向かって動かし、その結果新鮮なより厚い電極５が液体３’’の上面部分に入る。本質的には、或る程度の処理時間が経過した後、電極５上に腐食プロフィール又はテーパリング効果が形成され（すなわち、液体３’’の表面近くのワイヤー部分は典型的には雌受容管ｏ５の近くの部分よりも厚い）、そしてこのようなワイヤー電極のプロフィール又はテーパリングは、所望の場合には、製造過程全体にわたって本質的に一定のままであることが可能であり、その結果、本質的に同一の生成物が、生産工程中の初期前平衡段階後の任意の時点で生産され、例えばそのプロセスが現行のＦＤＡガイドライン下のｃＧＭＰであること、及び／又はＩＳＯ  ９０００に準拠していることを可能にする。
【０１７８】
電極５／５は、８時間毎に約１インチの速度で作動させられ動かされた。試料は平衡段階だけから収集した。前平衡段階が発生するのは、液体３’’中で産出されたナノ結晶の濃度が、これが平衡状態（装置内部の実質的にコンスタントな核形成・成長条件）に達するまでは時間の関数として増大するという理由による。この平衡状態は、本明細書中に開示された制御過程に起因する処理の残り全体を通して実質的に一定であり続ける。
【０１７９】
例えば各電極セットにおける各電極１／５又は５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ａ〜２０ｇに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。それぞれの雌受容管ｏ５をポリカーボネートから形成し、雌受容管ｏ５は内径が約１／８インチ（約３．２ｍｍ）であり、溶媒型接着剤によってトラフ部材３０ｂ’の底部の所定の位置に固定した。トラフ部材３０ｂ’の底部に穴が設けられていることにより、管ｏ５の一方の端部がトラフ３０ｂ’の底部の表面と同一平面になるように、各管ｏ５の外径がその中に固定されるのを可能にした。管ｏ５の底部はシールする。管ｏ５の内径は、任意の顕著な量の液体３’’が雌受容管ｏ５内に入るのを効果的に防止した。しかし、多少の液体が雌受容管ｏ５のうちの１つ又は２つ以上の内部に流入することがある。この例において使用された各雌受容管ｏ５の長さ又は鉛直方向高さは、約６インチ（約１５．２４ｃｍ）であったが、これよりも短い又は長い長さもこの開示内容の範囲に含まれる。さらに、雌受容管ｏ５がほぼ真直ぐなものとして示されているが、このような管をＪ字形又はＵ字形に湾曲させることにより、所望の場合には、トラフ部材３０ｂ’から離反した管開口が、液体３’’の上面よりも上方に位置するようにすることもできる。
【０１８０】
この例に記載されたランは下記処理増強剤を利用する。具体的には、約２．０グラム／ガロン（すなわち約０．５２８ｇ／リットル）の化学式ＮａＨＣＯ3の炭酸水素ナトリウム（「ソーダ」）を水３に添加し、これと混合した。ソーダはAlfa Aesarから入手した。このソーダは式量８４．０１、密度約２．１５９ｇ／ｃｍ3であった。
【０１８１】
具体的には、６０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、本明細書中の教示内容に従ってナノ結晶懸濁液又はコロイド及び／又はイオン溶液を形成した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ源を利用した。印加電圧は約２２０ボルトであった。印加電流は約４．５アンペア〜約５．５アンペアであった。
【０１８２】
表１は、図９及び１０ｃとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表１は、１）「製造Ａｕ  ＰＰＭ」（例えば金ナノ結晶濃度）；２）ＴＥＭ平均直径（ＴＥＭ分析によって測定して、最も頻繁に発生した結晶直径に相当するモード）；及び３）Zetasizer ZS-90によって測定した流体力学半径、を開示する。これらの物理的特性付けは、本明細書中の他の個所で論じるように行った。
【０１８３】
透過電子顕微鏡法
具体的には、網目サイズ２００の、炭素で安定化されたFormvar被覆グリッドを利用することにより、ＴＥＭ試料を調製した。グリッドを先ず真空下でプラズマ処理することにより前処理した。グリッドを、方形の濾紙でライニングされた顕微鏡スライド上に置き、次いで、必要なプラズマ発生器付属品が取り付けられたDenton Vaccum装置内に入れた。真空を７５ｍＴｏｒｒで維持し、そしてプラズマを開始し、３０秒間にわたって運転した。完了したら、システムを通気し、グリッドを取り除いた。グリッドは、湿度条件に応じて７〜１０日間まで安定であったが、しかし全ての事例において１２時間以内で使用した。
【０１８４】
ほぼ１μＬの本発明のそれぞれのナノ粒子溶液を各グリッド上に置き、室温で２０〜３０分間にわたって、又は液滴が蒸発するまで室温で空気乾燥させておいた。蒸発が完了したら、ＴＥＭ分析を実施するまで、グリッドをホルダー板上に置いた。
【０１８５】
Philips/FEI Tecnai 12透過電子顕微鏡を使用して、全ての調製済試料に対して問い合わせを行った。機器を、加速電圧１００ｋｅＶで運転した。ビームの整列後、６３０，０００ｘまでの種々の倍率で試料を試験した。付属のOlympus Megaview III横置きカメラを介して画像を収集した。このカメラは、それぞれカメラ及びＴＥＭ機器の両方の制御を可能にするiTEM及びTecnai User Interfaceソフトウェアを備えたＰＣに、直接に画像を伝送した。
【０１８６】
図１１ｃは、この例に従って形成された、懸濁液から乾燥させた金ナノ結晶から成る乾燥溶液ＮＥ１０２１４に相当する代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。図１１ｄは、ＴＥＭ平均直径を計算するために用いられ、表１で参照される測定ＴＥＭサイズ分布に相当する。
【０１８７】
Accumet (登録商標) AR20 pH/導電率メーターを使用してｐＨ測定を行った。当該試料を含有する５０ｍＬバイアル内にｐＨプローブを入れ、安定化させておいた。次いで、３つの別々のｐＨ測定値を求め、１試料当たりの平均値を出した。ＮＥ１０２１４のｐＨは約８．９４であった。
【０１８８】
ＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、試料に対してエネルギー吸収スペクトルを得た。この情報は、複光束Czerny-Turner モノクロメーターシステム及びデュアル・シリコンフォトダイオードを備えたThermofisher Evolution 201 UV-VIS分光計を使用して獲得した。数多くの石英ガラスホルダ又は「キュベット」のうちの１つを使用して低濃度液体試料の測定を支援するように設備を用意した。次のパラメータ、すなわち帯域幅１ｎｍ、データピッチ０．５ｎｍを用いて約３００〜９００ｎｍの波長範囲にわたってデータを獲得した。キセノンフラッシュランプが一次エネルギー源であった。分光計の光路は、エネルギービームがそれぞれの試料キュベットの中心を通るのを可能にするように配置された。試料の調製をキュベットの充填及びキャッピングに制限し、分光計の完全密閉された試料区画内部でキュベットホルダ内に試料を物理的に入れた。各試料のエネルギーの光吸収量を割り出した。データ出力を測定し、そして吸光度単位（ランベルト−ベールの法則による）対波長として表示した。
【０１８９】
図１１ｅは、波長約３５０ｎｍ〜９００ｎｍに対応する、懸濁液／コロイドＮＥ１０２１４のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルパターンを示す。
【０１９０】
動的光散乱Zetasizer
具体的には、Zetasizer Nano ZS-90 DLS機器で動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。ＤＬＳにおいて、レーザー光が小型粒子及び／又は小型粒子（波長よりも小さい）の周りの組織化水構造に衝突すると、光は全ての方向に散乱し、その結果、散乱強度の時間依存性変動が生じる。強度変動は、散乱粒子のブラウン運動／水構造の組み合わせに起因し、そして粒度分布に関する情報を含む。
【０１９１】
試験前の少なくとも３０分間、機器をウォームアップさせておいた。１ｃｈの光路長さの正方形ガラスセルPCS8501を使用して測定を行った。下記手順を用いた：
１．  先ず、１ｍｌマイクロピペットを使用して、１ｍｌのＤＩ水をセル内に加え、次いでセルから水を廃棄物用ビーカーに注ぎ、そして水の残りをセル測定キャビティから振り落とした。このステップをさらに２回繰り返すことにより、セルを十分に濯いだ。
２．  １ｍｌマイクロピペットを使用して、１００μｌの試料をセル内に加えた。その後、同じピペットで、同じピペットチップを使用してセルから全ての液体を取り除き、そして廃棄物用ビーカー内に排出した。同じチップを使用して１ｍｌの試料を再び加えた。
３．  試料を含むセルを、Zetasizer機器の温度制御されたセルブロック内に、刻まれた文字が前方に向くように入れた。Zetasizerソフトウェアにおける新しい試験を開始した。温度が平衡化され、レーザー出力が適正な値に減衰されてから１分後に、測定を開始した。全てのランが終わった後、結果を保存した。
４．  セルを機器から取り出し、そして同じピペット及びステップ２で使用したチップを使用して、試料をセルから取り出した。
５．  ステップ２〜４を試料毎にさらに２回繰り返した。
６．  新しい試料の場合には、１ｍｌのピペットのための新しいピペットチップを採用して、前の試料による汚染を回避し、ステップ１〜５を繰り返した。
【０１９２】
Zetasizerソフトウェア、バージョン6.20でデータの収集及び処理を実施した。次のパラメータを全ての試験のために使用した：ラン継続時間−２ｏ；試験数−１０；溶媒−水、０ｍｍｏｌ；粘度−０．８８７２ｃＰ；屈折率−１．３３３；ブロック温度−＋２５℃。各試験毎のデータを保存した後、その結果をソフトウェアの「Records View」の頁で見た。粒度分布（すなわち流体力学半径）を、「強度ＰＳＤ」グラフで分析した。動的光散乱技術を利用して、この例に従って製造された結晶サイズ（例えば流体力学半径）の指示を得た。流体力学半径は表１において１９．４３ｎｍであると報告されている。
【０１９３】
原子吸光分光法
Perkin Elmer AAnalyst 400 SpectrometerシステムからＡＡＳ値を得た。原子吸光分光法を用いて、種の濃度を割り出し、これを「ｐｐｍ」で報告する。
【０１９４】
Ｉ）  原理
フレーム原子吸光分析の技術は、液体試料が吸引され、エアロゾル化され、そして可燃性ガス、例えばアセチレン及び空気と混合されることを必要とする。混合物は温度約２１００〜約２４００℃の火炎中で着火される。燃焼中、試料中の当該元素の原子は還元されて、遊離した非励起基底状態原子になる。これらの原子は固有波長で光を吸収する。固有波長は元素特異的であり、０．０１〜０．１ｎｍに対して正確である。元素特異的波長を提供するために、被測定元素から形成されたカソードを有する中空陰極ランプ（ＨＣＬ）からの光ビームが火炎を通過するようにする。光検出器が、被分析物による吸収に起因する光強度の低下量を検出する。光検出器の前面にモノクロメーターを使用することにより、バックグラウンド周囲光を低減し、そして検出のために必要となるＨＣＬから特異的波長を選択する。加えて、重水素アーク灯が、原子雲中の非原子種によって引き起こされるバックグラウンド吸収を補正する。
【０１９５】
ＩＩ）  試料調製
１０ｍＬの試料、０．６ｍＬの３６％ｖ／ｖの塩酸及び０．１５ｍＬの５０％ｖ／ｖの硝酸をガラスバイアル内で混ぜ合わせ、約１０分間にわたって７０℃の水浴内でインキュベートした。金濃度が１０ｐｐｍを上回ることが予想される場合には、酸の添加前に試料をＤＩ水で希釈することにより、最終金濃度を１〜１０ｐｐｍにする。例えば、１００ｐｐｍ前後の金濃度の場合、酸の添加前に、０．５ｍＬの試料を９．５ｍＬのＤＩで希釈する。調節可能なマイクロピペット及び正確の量の試料でアリコートを行い、そしてOhaus PA313 microbalanceによってＤＩ水及び酸を測定する。成分の重量を用いて、ＤＩ水及び酸による希釈のための測定濃度を補正する。
各試料を３部調製し、水浴内でのインキュベーション後、測定を行う前に室温まで冷ましておく。
【０１９６】
ＩＩＩ）  機器の設置
Perkin Elimer AAnalyst 400 Spectrometerシステムのために、下記設定を用いる：
ａ）  バーナーヘッド：２ｐｐｍのＣｕ基準で最大吸収度を得るために、製造手順に従って３つの軸で整列された１０ｃｍシングル・スロットタイプ。
ｂ）  ネブライザー：衝撃ビードの前面にスペーサを有するプラスチック。
ｃ）  ガス流：オキシダント（空気）流量約１２Ｌ／分、燃料（アセチレン）流量約１．９ｍＬ／分。
ｄ）  ランプ／モノクロメーター：Ａｕ中空陰極ランプ、１０ｍＡ動作電流、１．８／１．３５ｍｍスリット、２４２．８ｎｍ波長、バックグラウンド補正（重水素灯）がオンである。
【０１９７】
ＩＶ）  分析手順
ａ）  Ａｕランプ及び火炎をほぼ３０分間にわたって運転することより、システムをウォームアップする。
ｂ）  ３．７％ｖ／ｖの塩酸のマトリックス中の１ｐｐｍ、４ｐｐｍ及び１０ｐｐｍのＡｕ標準で機器を較正する。３．７％ｖ／ｖの塩酸をブランクとして使用する。
ｃ）  ４ｐｐｍ基準を試料として測定することにより、較正スケールを検証する。測定された濃度は、３．８８ｐｐｍ〜４．１２ｐｐｍであるべきである。ｂ）この範囲から外れている場合には、ステップｂ）を繰り返す。
ｄ）  試料の３つの複製を測定する。複製間の標準偏差が５％を上回る場合には、測定を繰り返し、そうでなければ次の試料に進む。
ｅ）  ６つの試料を測定した後又はより高い頻度で、検証ステップｃ）を実施する。検証が失敗した場合には、ステップｂ）及びｃ）を実施し、最後に成功した検証後に測定された試料全てを再測定する。
【０１９８】
Ｖ）データ分析
各複製の測定濃度値を、水及び酸による希釈に対して補正することによって、実際の試料濃度を計算する。報告されたＡｕのｐｐｍ値は、個々の複製に対応する３つの補正値の平均である。
【０１９９】
表１は、ＡＡＳ濃度結果を「製造Ａｕ  ＰＰＭ」とする。相当値は６．６ｐｐｍである。
【０２００】
例２
バッチ法による白金系ナノ粒子／ナノ粒子溶液又はコロイドの製造
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、液体３’を図１２ｃに示された装置内で処理した。
【０２０１】
ＮａＨＣＯ3処理増強剤の使用量は約０．３７５グラム／ガロン（すなわち約０．１０ｇ／Ｌ）〜約３．０グラム／ガロン（すなわち約０．７９ｇ／Ｌ）であった。ＫＯＨ処理増強剤の使用量は約０．９５グラム／ガロン（すなわち約０．２５ｇ／Ｌ）であった。ＫＢｒ処理増強剤の使用量は約４．６グラム／ガロン（すなわち約１．２２ｇ／Ｌ）であった。Ｎａ3ＰＯ4処理増強剤の使用量は約３．９４グラム／ガロン（すなわち約１．０４ｇ／Ｌ）であった。ＫＨ2ＰＯ4処理増強剤の使用量は約３．２４グラム／ガロン（すなわち約０．８６ｇ／Ｌ）であった。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２０２】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０２０３】
図１２ｃに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は約５８ボルト〜約３００ボルトであった。白金線電極の直径は約０．５ｍｍ又は１ｍｍであった。
【０２０４】
これらのプロセスのために、別の給電装置を周波数１〜５Ｈｚで利用した。電極５ａ，５ｂは図１２ｅに示されているように、電力増幅器に電気的に接続した。増幅器の給電装置は図１２ｆに示されている。電力増幅器は、増幅器内の入力ピンに接続された外部関数発生器によって駆動された。
【０２０５】
懸濁液中に生成された白金ナノ粒子の量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約１０ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍであった。この例に従って形成されたナノ粒子のサイズは、本明細書中の表２及び３に十分に論じられている。
【０２０６】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の試料調製は前記方法と同じであったが、SIS Megaview III CCDデジタルカメラを備えたPhilips EM 420 TEM上で問い合わせを実施した。ＴＥＭ顕微鏡写真は、粒子の平均直径が１０ｎｍ未満であることを示す。
図１４は、この例に従って形成された、懸濁液ＧＲＰｔ−６２１から乾燥させた白金ナノ結晶の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。
【表２】
2014518847.tif 000006
【表３】
2014518847.tif 000007
【０２０７】
例３
バッチ法による白金系ナノ粒子／ナノ粒子溶液又はコロイドの製造
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、液体３’を図１２ｄに示された装置内で処理した。
【０２０８】
ＫＢｒ処理増強剤の使用量は約４．６グラム／ガロン（すなわち約１．２ｇ／Ｌ）又は約１．４グラム／ガロン（すなわち約０．４ｇ／Ｌ）であった。Ｎａ3ＰＯ4処理増強剤の使用量は約１．９グラム／ガロン（すなわち約０．５ｇ／Ｌ）であった。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｄに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２０９】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０２１０】
電極５ａ及び５ｂに周波数約２．５Ｈｚで正弦波電圧を印加するために、給電装置（図１２ｆに示す）を利用した。電極を図１２ｅに示すように、電力増幅器に電気的に接続した。電極間の距離は全ての懸濁液において約７ｍｍに固定した。電力増幅器は、増幅器内の入力ピンに接続された外部関数発生器によって駆動された。
【０２１１】
懸濁液中に生成された白金系ナノ粒子及び／又は白金系イオンの量を、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定した。懸濁液ＰＲＸ３７−０１及びＰＲＸ３７−０２は、水３の所与の導電率、及び電極５ａ及び５ｂ間の固定距離で印加された所与の電圧に関して、ＫＢｒ処理増強剤の量が増大するのに伴って、最終懸濁液中の白金の量も増大することを示す。
【０２１２】
形成済粒子の平均流体力学半径を、本明細書中の他の個所で論じた動的光散乱技術によって分析した。流体力学半径は調製物ＰＲＸ３７−０２に関しては報告されていない（ＮＲ）。なぜならば、ＤＬＳ装置において報告された透過量が１００％であり、これは溶解された白金種（例えばイオン）が高度に存在することを示すからである。
【０２１３】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の試料調製は前記方法と同じであったが、SIS Megaview III CCDデジタルカメラを備えたPhilips EM 420 TEM上で問い合わせを実施した。ＰＲＸ３７−０３は、ＴＥＭによって分析された唯一の調製物であった。ＴＥＭ顕微鏡は、配合物ＰＲＸ３７−０３の懸濁液中の粒子の平均直径が約７ｎｍ未満であったことを示す。粒度分布は図１５ｂに示されている。図１５ａは、この例３に従って形成された、懸濁液ＰＲＸ３７−０３から乾燥させた白金ナノ結晶の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。用いられた関連処理条件、並びに調製物ＰＲＸ３７の結果として生じた所定の物理特性を示すために、表４が含まれる。
【表４】
2014518847.tif 000008
【０２１４】
例４
種々の処理増強剤を使用したトラフ法による
白金系ナノ粒子／ナノ粒子溶液又はコロイド又はイオンの製造
（ＰＢ−０９，ＰＢ−１０／ＰＢ−１３，ＰＢ−１６，ＰＢ−１７，ＰＢ−１８，ＰＢ−１９，ＰＢ−２０，ＰＢ−２１，ＰＢ−２３，ＰＢ−２４，ＰＢ−２５，ＰＢ−２６，ＰＢ−２７，ＰＢ−２８，ＰＢ−３２，ＰＢ−３３，ＰＢ−３４，ＰＢ−３５，ＰＢ−４０，ＰＢ−４１，ＰＢ−４２，ＰＢ−４３）
一般に、この例は、図９，１０ｄ及び１１ｂに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示されたＡＣ電源（又は変圧器）５０１ＡＣを、本明細書中に含まれる例のための給電装置として使用する一方、（本明細書中に開示するように）ＡＣ電源５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器５０１ＡＣは、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。正確な電気的接続は本明細書中の別の個所で論じる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続した。しかしそれぞれの「ランＩＤ」の実施時間が短いため、制御装置２０を作動させる必要はなかった。従って、電極５ａ及び５ｂの端部９’をトラフ部材３０ｂ’の底部と並置させた。
【０２１５】
ＮａＨＣＯ3（Fisher Scientific, Cat#S631-3）処理増強剤の使用量は約２．５グラム／ガロン（すなわち約０．６７ｇ／Ｌ）〜約３．５グラム／ガロン（すなわち約０．９３ｇ／Ｌ）であった。ＫＨＣＯ3処理増強剤の使用量は約２．３１グラム／ガロン（すなわち約０．６１ｇ／Ｌ）であった。ＮａＯＨ処理増強剤の使用量は約０．７０グラム／ガロン（すなわち約０．１９ｇ／Ｌ）であった。ＫＯＨ処理増強剤の使用量は約０．７２グラム／ガロン（すなわち約０．１９ｇ／Ｌ）であった。ＮａＢｒ処理増強剤の使用量は約２．１８グラム／ガロン（すなわち約０．５８ｇ／Ｌ）であった。ＫＢｒ処理増強剤の使用量は約２．０４グラム／ガロン（すなわち約０．５４ｇ／Ｌ）であった。Ｎａ2ＰＯ4処理増強剤の使用量は約１．０８グラム／ガロン（すなわち約０．２９ｇ／Ｌ）であった。ＮａＣｌ処理増強剤の使用量は約１．２７グラム／ガロン（すなわち約０．３４ｇ／Ｌ）であった。ＣａＣｌ2処理増強剤の使用量は約１．１６グラム／ガロン（すなわち約０．３１ｇ／Ｌ）であった。
【０２１６】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０２１７】
ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ユニットを利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、ナノ結晶懸濁液又はコロイド及び／又はイオンを形成するために、５Ｈｚ及び８０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用した。印加電圧は約１７５ボルトであった。加えて、関数発生器５０１ＦＧは１５Ｈｚ未満の周波数の正弦波をＡＣ電源５０１ＡＣに提供した。ＡＣ電源は続いて入力信号を異なる周波数で約１７５ボルトに増幅した。印加電流は約３．０アンペア〜約６．５アンペアであった。
【０２１８】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の試料調製法は前記方法と同じであったが、SIS Megaview III CCDデジタルカメラを備えたFEI Tecnai 12 TEM上で問い合わせを実施した。ＴＥＭ顕微鏡写真は、形成済粒子の平均直径が約１０ｎｍ未満であったことを示す。図１６は、この例４に従って形成された、懸濁液ＰＢ−１３から乾燥させた白金ナノ結晶の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示す。
【０２１９】
調製物中に生成された白金ナノ粒子又はイオンの量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約１．０ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍであった。
【０２２０】
表５〜８は、図９ａ及び１０ｄとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表５〜８は、１）結果としての「ｐｐｍ」（例えば白金ナノ結晶／イオン濃度）を開示する。
【０２２１】
なお、水中の白金種を形成するために、２種の異なる塩素系処理増強剤を使用したが、金系ナノ結晶懸濁液を形成するときには、この金系ナノ結晶懸濁液をＡｕ−Ｐｔナノ結晶懸濁液にとっては望ましいとはいえないものにしてしまう種々様々な問題が存在する。
【表５】
2014518847.tif 000009
【表６】
2014518847.tif 000010
【表７】
2014518847.tif 000011
【表８】
2014518847.tif 000012
【０２２２】
例５
連続トラフ法において電極に種々の周波数を印加することによる水中の白金系種の製造
一般に、この例は、図９，１０ｄ及び１１ｂに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示されたＡＣ電源（又は変圧器）５０１ＡＣを、本明細書中に含まれる例のための給電装置として使用する一方、（本明細書中に開示するように）ＡＣ電源５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器５０１ＡＣは、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。正確な電気的接続は本明細書中の別の個所で論じる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続した。しかしそれぞれの「ランＩＤ」の実施時間が短いため、制御装置２０を作動させる必要はなかった。従って、電極５ａ及び５ｂの端部９’をトラフ部材３０ｂ’の底部と並置させた。この例におけるそれぞれのランは、約２．５ｇ／ガロンのＮａＨＣＯ3を処理増強剤として利用し、また液体流量約２２０ｍｌ／分を利用した。
【０２２３】
さらに、プロセス及び調製された生成物に対する種々異なる周波数の影響を示すために、正弦波周波数の変化を利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、低いものでは約１Ｈｚ、そして高いものでは約２００Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、ナノ結晶懸濁液又はコロイド及び／又はイオンを形成した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ源を利用した。印加電圧は、約１５，４０，６０，８０，１００及び２００Ｈｚの６つの異なる周波数の対応正弦波を伴って、約１７５ボルトであった。加えて、関数発生器５０１ＦＧは１５Ｈｚ未満の周波数の正弦波をＡＣ電源５０１ＡＣに提供した。ＡＣ電源は続いて入力信号を異なる周波数、つまり１Ｈｚ及び５Ｈｚで約１７５ボルトに増幅した。印加電流は約４．５アンペア〜約６．０アンペアであった。
【０２２４】
調製物中に生成された白金ナノ粒子又はイオンの量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約７．０ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍであった。
【０２２５】
表９〜１０は、図９及び１０ｄとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表９〜１０は、１）結果としての「ｐｐｍ」（すなわち白金濃度）を開示する。
【０２２６】
本明細書中の他の個所で概略を述べたＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、エネルギー吸収スペクトルを試料に対して得た。図１７は、上記試料に対して収集されたＵＶ−ＶＩＳデータを含み、具体的には２６５ｎｍ〜７５０ｎｍ範囲を示している。
【表９】
2014518847.tif 000013
【表１０】
2014518847.tif 000014
【０２２７】
例６
ＮａＨＣＯ3を処理増強剤として使用するバッチ法による
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造
−ＩＤ＃１１１７１０−９
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、それぞれ白金イオン／粒子及びバイメタルナノ結晶に関して図１２ｃ又は１２ｄに示された装置内で液体３’を処理した。バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するプロセス全体を下述し、表１１に要約する。
【０２２８】
最初に、次のプロセスによって白金イオン及び／又は粒子を水中で形成した。約４．０グラム／ガロン（すなわち約１．０６ｇ／ｍＬ）の処理増強剤重曹（すなわちＮａＨＣＯ3）を約１ガロンの脱イオン水に添加した。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２２９】
電極１で形成される各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design））によって達成した。なお、表１１（及び本明細書中の他の個所）において、「ＧＺＡ」とはプラズマ４の形成と同義である。
【０２３０】
図１２ｃに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲約０〜３００Ｖ、周波数範囲約４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は、約２時間の動作時間にわたって約６０ヘルツの周波数を伴って、約１００ボルトであった。白金ワイヤー電極の直径は１ｍｍであった。白金ワイヤーの長さは約５１ｍｍであった。
【０２３１】
続いて、上記調製済の白金種及び水調製物（原材料）を、等量のコンディショニング済の水（コンディショニング済の水３’は３０分間にわたってプラズマ４を形成する白金電極１によって得られた）、及び処理増強剤ＮａＨＣＯ3  ０．５ｇ／ガロン（（０．１３２ｍｇ／ｍＬ）ＮａＨＣＯ3）と１：１の比で、総体積約８００ｍＬまで混合した。次いで液体３’を図１２ｄの装置を介して金電極（９９．９９％、約０．５ｍｍ直径、及び長さ約６．２５インチ（１５．８８ｃｍ））で約４０分間にわたって、約１６０ボルトの印加電圧及び約４７ヘルツを有するｈｙ  ＡＣ電源を用いて処理した。形成されたバイメタルナノ結晶の流体力学半径は、ViscoTekで測定して約１４．７ｎｍであった。懸濁液は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約１６．１ｐｐｍのＡｕと、約２．１ｐｐｍのＰｔとを含有した。
【０２３２】
図１８は、調製物１１０９１０−４から乾燥させたバイメタルナノ結晶懸濁液の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示している。この調製物は、本明細書中の他の個所で論じられたものと同等の技術によって形成された。
【０２３３】
本明細書中の他の個所で概略を述べたＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、エネルギー吸収スペクトルをこの試料（１１１７１０−ａ）に対して得た。図１２ｇは、この試料（１１１７１０−ａ）に対して収集されたＵＶ−ＶＩＳデータを含み、具体的には３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲を示している。
【表１１】
2014518847.tif 000015
【０２３４】
動的光散乱
具体的には、Viscotek 802 DLS機器で動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。ＤＬＳにおいて、レーザー光が小型粒子及び／又は小型粒子（波長よりも小さい）の周りの組織化水構造に衝突すると、光は全ての方向に散乱し、その結果、散乱強度の時間依存性変動が生じる。強度変動は、散乱粒子のブラウン運動／水構造の組み合わせに起因し、そして粒度分布に関する情報を含む。
【０２３５】
試験前の少なくとも３０分間、機器をウォームアップさせておいた。１２μｌの石英セルを使用して測定を行った。下記手順を用いた：
７．  先ず、１ｍｌマイクロピペットを使用して、１ｍｌのＤＩ水をセル内に加え、次いでセルから水を廃棄物用ビーカーに注ぎ、そして水の残りをセル測定キャビティから振り落とした。このステップをさらに２回繰り返すことにより、セルを十分に濯いだ。
８．  ２００μｌマイクロピペットを使用して、１００μｌの試料をセル内に加えた。その後、同じピペットで、同じピペットチップを使用してセルから全ての液体を取り除き、そして廃棄物用ビーカー内に排出した。同じチップを使用して１００μｌの試料を再び加えた。
９．  試料を含むセルを、Viscotek機器の温度制御されたセルブロック内に、セルの凍結側が左に向くように入れた。Viscotek OmniSIZEソフトウェアにおける新しい試験を開始した。温度が平衡化され、レーザー出力が適正な値に減衰されてから１分後に、測定を開始した。全てのランが終わった後、結果を保存した。
１０．  セルを機器から取り出し、そして同じピペット及びステップ２で使用したチップを使用して、試料をセルから取り出した。
１１．  ステップ２〜４を試料毎にさらに２回繰り返した。
１２．  新しい試料の場合には、２００μｌのピペットのための新しいピペットチップを採用して、前の試料による汚染を回避し、ステップ１〜５を繰り返した。
【０２３６】
Viscotek OmniSIZEソフトウェア、バージョン3,0,0,291でデータの収集及び処理を実施した。次のパラメータを全ての試験のために使用した：ラン継続時間−３秒；試験数−１００；溶媒−水、０ｍｍｏｌ；粘度−１ｃＰ；屈折率−１．３３３；スパイク・トレランス−２０％；ベースライン・ドリフト−１５％；ターゲット減衰−３００ｋカウント；ブロック温度−＋４０℃。各試験毎のデータを保存した後、その結果をソフトウェアの「結果」の頁で見た。粒度分布（すなわち流体力学半径）を、「強度分布」グラフで分析した。そのグラフでは、０．１ｎｍ〜１０μｍの範囲から外れたいかなるピークも、アーチファクトと見なした。具体的には、清浄水（粒子がない）は、０．１ｎｍ〜１０μｍの範囲内ではピークをもたらさず、０．１ｎｍ未満で幅広いピークをもたらす。このピークは機器のノイズ・ピーク（ノイズ流）と見なされる。濃度が極めて低く、又は懸濁ナノ粒子のサイズが極めて小さい試料が、「強度分布」グラフにおいて測定可能なノイズピークを示すことがある。０．１ｎｍ〜１０μｍの範囲内のピークの強度がノイズピークよりも高い場合には、考えられるこれらのピークは真であり、その他の場合には、ピークは疑問の余地があり、データ処理のアーチファクトであるおそれがある。
【０２３７】
なお、動的光散乱粒度の情報は、ＴＥＭで測定されたヒストグラムとは異なる。なぜならば、動的光散乱は、ナノ結晶が全て球体（これらはそうではない）であることを想定するアルゴリズムを使用し、また、流体力学半径の尺度となるからである（例えば、水に対するナノ結晶の影響も検出され、粒子の実際の物理的半径に加えて報告される）。従って、ちょうど本明細書中に含まれる他の例におけるように、ＴＥＭヒストグラム・データ中で報告された値と、動的光散乱データ中で報告された値との間で、報告粒度に差異があることは、驚くべきことではない。
【０２３８】
例７
ＮａＨＣＯ3を処理増強剤として使用するバッチ法による
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造
−ＩＤ＃１１０８１０
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、それぞれ白金イオン／粒子及びバイメタルナノ結晶に関して図１２ｃ又は１２ｄに示された装置内で液体３’を処理した。バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するプロセス全体を下述し、表１２に要約する。
【０２３９】
最初に、次のプロセスによって白金イオン及び／又は粒子を水中で形成した。約４．０グラム／ガロン（すなわち約１．０６ｇ／ｍＬ）の処理増強剤重曹（すなわちＮａＨＣＯ3）を約１ガロンの脱イオン水に添加した。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。なお、表１２（及び本明細書中の他の個所）において、「ＧＺＡ」とはプラズマ４の形成と同義である。
【０２４０】
電極１で形成される各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design））によって達成した。
【０２４１】
図１２ｃに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲約０〜３００Ｖ、周波数範囲約４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は、約２時間の動作時間にわたって約６０ヘルツの周波数を伴って、約１００ボルトであった。白金ワイヤー電極の直径は約１ｍｍであった。
【０２４２】
続いて、上記調製済の白金種及び水調製物（原材料）を、約６．２９ｍＭのＮａＨＣＯ3と３：１の比で、総体積約３７８５ｍＬまで混合した。次いで液体３’を図１２ｄの装置を介して金電極（９９．９９％、約０．５ｍｍ）で約９０分間にわたって、約２００ボルトの印加電圧及び約６０ヘルツを有するｈｙ  ＡＣ電源を用いて処理した。形成されたバイメタルナノ結晶の流体力学半径は、ViscoTekで測定して約１５．４ｎｍであった。懸濁液は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約５．６ｐｐｍのＡｕと、約１．６ｐｐｍのＰｔとを含有した。
【０２４３】
図１９は、調製物１１０９１０−６から乾燥させたバイメタルナノ結晶懸濁液の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示している。この調製物は、本明細書中の他の個所で論じられたものと同等の技術によって形成された。
【表１２】
2014518847.tif 000016
【０２４４】
例８
ＫＯＨを処理増強剤として使用するバッチ法による
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造
−ＩＤ＃１２２３１０Ａ
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、それぞれ白金イオン／粒子及びバイメタルナノ結晶に関して図１２ｃ又は１２ｄに示された装置内で液体３’を処理した。バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するプロセス全体を下述し、表１３に要約する。
【０２４５】
最初に、次のプロセスによって白金イオン及び／又は粒子を水中で形成した。約０．５８０グラム／ガロン（すなわち約０．１５３ｇ／ｍＬ）の処理増強剤水酸化カリウム（すなわちＫＯＨ）を約１ガロンの脱イオン水に添加した。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２４６】
電極１で形成される各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design））によって達成した。なお、表１３（及び本明細書中の他の個所）において、「ＧＺＡ」とはプラズマ４の形成と同義である。
【０２４７】
図１２ｃに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲約０〜３００Ｖ、周波数範囲約４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は、約２時間の動作時間にわたって約６０ヘルツの周波数を伴って、約２６０ボルトであった。白金ワイヤー電極の直径は約１ｍｍであった。白金ワイヤーの長さは約５１ｍｍ（２．０１インチ／５．１ｃｍ）であった。
【０２４８】
続いて、上記調製済の白金種及び水調製物（原材料）を、下記のようにさらに処理した。次いで液体３’を図１２ｄの装置を介して金電極（９９．９９％、直径約０．５ｍｍ及び全長約６．２５インチ（１５．８８ｃｍ））で約２時間にわたって、約１８０ボルトの印加電圧及び約４７ヘルツを有するｈｙ  ＡＣ電源を用いて処理した。形成された金／白金材料の流体力学半径は、ViscoTekで測定して約１２．５ｎｍであった。懸濁液は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約８．０ｐｐｍのＡｕと、約１．８ｐｐｍのＰｔとを含有した。
【０２４９】
図２０はこの例８に従って形成された、調製物ＩＤ＃１２２３１０Ａから乾燥させたバイメタルナノ結晶懸濁液の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示している。
【表１３】
2014518847.tif 000017
【０２５０】
例９
２種の異なる技術によって形成されたバイメタルナノ結晶の比較
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、それぞれ白金イオン／ナノ結晶及び金ナノ結晶に関して図１２ｃ又は１２ｄに示された装置内で液体３’を処理した。個々のナノ結晶懸濁液を形成し、これらを混合することにより、バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するプロセス全体を以下に説明し、表１４に要約する。
【０２５１】
最初に、次のプロセスによって白金イオン及び／又は粒子を水中で形成した。約４．０グラム／ガロン（すなわち約１．０６ｇ／ｍＬ）の処理増強剤重曹（すなわちＮａＨＣＯ3）を約１ガロンの脱イオン水に添加した。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２５２】
電極１で形成される各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design））によって達成した。
【０２５３】
図１２ｃに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲約０〜３００Ｖ、周波数範囲約４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は、約３０分間の動作時間にわたって約６０ヘルツの周波数を伴って、約１３０ボルトであった。白金ワイヤー電極の直径は約１ｍｍであった。白金ワイヤーの長さは約５１ｍｍであった。白金種及び水材料は取りのけておいた。
【０２５４】
別個の金ナノ粒子懸濁液を次のように調製した。約１．０グラム／ガロン（すなわち約０．２６４ｍｇ／ｍＬ）の処理増強剤重曹（すなわちＮａＨＣＯ3）を約１ガロンの脱イオン水に添加した。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図１２ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２５５】
電極１によって形成される各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design））によって達成した。
【０２５６】
図１２ｄに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲約０〜３００Ｖ、周波数範囲約４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は、約３０分間の動作時間にわたって約６０ヘルツの周波数を伴って、約３００ボルトであった。金ワイヤー電極の直径は約０．５ｍｍであった。金ワイヤーの長さは約１５９ｍｍであった。
【０２５７】
続いて、別個に調製されたＰｔ及びＡｕ水系材料である、上記調製済のＰｔ調製物及びＡｕ調製物を過酸化水素触媒（Ｈ2Ｏ2、Alfa Aesar Cat#L14000）の存在において混合し、次いで試験した。具体的には、約３００ｍＬのＰｔ調製物０６２８１０と約７００ｍＬのＡｕ調製物０６１６１０とを合体させ、そして約２５０μＬのＨ2Ｏ2  ０．８ｖ／ｖ％を添加した。合体調製物の測定流体力学半径は、ViscoTekで測定して約３５ｎｍであった。結果としての懸濁液は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約８．０ｐｐｍのＡｕと、約１．８ｐｐｍのＰｔとを含有した。
【０２５８】
次いで、この懸濁液を、前述のバイメタルナノ粒子懸濁液と比較した。具体的には、代表図２３ａ〜２３ｂ及び代表ＥＤＳ図２４ａ〜２４ｂに示されているように、高分解能分析及びエネルギー分散Ｘ線分析は、結果としてのコロイド又は懸濁液には、形成済金ナノ結晶間に白金が物理的に全くないしはほとんど存在しないことを示した。
【０２５９】
対照的に、例６に記載された試料１１２２１０−１と実質的に同じく形成された試料１１１７１０−９は、形成済バイメタルナノ結晶上に存在する識別可能な白金を有した。バイメタルナノ結晶の測定流体力学半径は、ViscoTekで測定して約１４．７ｎｍであった。懸濁液は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約１６．１ｐｐｍのＡｕと、約２．１ｐｐｍのＰｔとを含有した。図２１ａ〜２１ｂは、上記のように調製された場合に形成される構造を示している。代表図２２ａ〜２２ｂによって示されているように、白金が検出可能な濃度で存在することが、エネルギー分散分析を通して明らかである。
【０２６０】
高分解能透過電子顕微鏡法及びＥＤＳ
網目サイズ２００のレイシーFormvar／炭素被覆銅グリッドを利用することにより、ＴＥＭ試料を調製した。約１〜３μＬの各本発明のナノ結晶懸濁液、コロイド、及び／又は溶液をそれぞれのグリッド上に置き、室温で２０〜３０分間にわたって、又は液滴が蒸発するまで室温で空気乾燥させておいた。蒸発が完了したら、ＴＥＭ分析を実施するまで、グリッドをホルダー板上に置いた。
【０２６１】
Oxford薄型窓軽元素検出器及びEmispec ES vision 4プロセッサを備えたPhilips CM300 FEG 高分解能透過電子顕微鏡を使用して、全ての調製済試料に対して問い合わせを行った。機器を、加速電圧２９７ｋＶで運転した。電子ビームの整列後、８００，０００ｘまでの種々の倍率で調製済試料を試験した。Gatan Image Filter （ＧＩＦ）の背後に取り付けられた一体型ＣＣＤカメラを介して画像を収集した。ＧＩＦはDigital Micrograph Software及びEmispec ES Vision 4.0ソフトウェアを備えたＰＣに直接に接続される。機器上で選択されたビーム幅設定値に相当するビームスポットサイズ２で画像を収集し、スポットサイズ３〜５でエネルギー分散Ｘ線スペクトルを収集した。このことは最大の電子量が収集されるのを可能にした。信号対雑音比をさらに高めるために、Philipsダブルチルトホルダを検出器に向かって１０度だけ回転させた。最後にビームを該当領域まで集め、次いで検出器弁を開き、後続の収集を開始した。
【表１４】
2014518847.tif 000018
【０２６２】
例１０
水酸化カリウムを処理増強剤として使用したトラフ法による
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造（ＰＧＴ００１）
一般に、この例は、図９，１０ｄ及び１１ｂに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、この例のための給電装置として使用する一方、（本明細書中に開示するように）５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。正確な電気的接続は本明細書中の別の個所で論じる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続した。しかしそれぞれの「ランＩＤ」の実施時間が短いため、制御装置２０を作動させる必要はなかった。従って、電極５ａ及び５ｂの端部９’をトラフ部材３０ｂ’の底部と並置させた。
【０２６３】
ランＩＤ「ＰＢ−５３」における水酸化カリウム（Fisher Scientific, Cat#P250-500）処理増強剤の使用量は約０．６０４グラム／ガロン（すなわち約０．１６ｍｇ／Ｌ）であった。供給電極は、Hi-Rel Alloys LTD (Ontario, Canada)から入手した９９．９９％の白金ワイヤー（１ｍｍ／０．０４０インチ直径）であった。
【０２６４】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０２６５】
ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ユニットを利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、Ｐｔイオン及び／又はＰｔコロイドの懸濁液を形成するために、８０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用した。印加電圧は約２１５ボルトであるとともに、印加電流は約４．０〜約５．０であった。
【０２６６】
結果として生じた白金−水系材料を次いで、約５０℃まで冷却させておいた。その時点で白金−水系材料を、下記のような別の分離した異なるトラフユニット内に供給した。
【０２６７】
一般に、この付加的なトラフは、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続は本明細書中の別の個所で見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０２６８】
具体的には、６０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、本明細書中の教示内容に従ってバイメタルナノ結晶懸濁液を形成した。図１０ｃに示されているように、上述の白金−水系材料「ＰＢ−５３」を原材料として、ポンプ４０を介してプラズマトラフ区分３０ａ’内に供給した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ電源を利用した。印加電圧は約２分間にわたって約２６０ボルトであり、これに続いてラン継続時間にわたって約２２０ボルトであった。印加電流は約４アンペア〜約５アンペアであった。
【０２６９】
この例に従って形成されたバイメタルナノ結晶を試験するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いた。具体的にはＴＥＭ試料調製は、高分解能ＴＥＭ及びＥＤＳの項において前述された方法と同一であった。この例に従って形成された懸濁液ＧＰＢ−０００１から乾燥させた状態で示された図２５ａ及び２５ｂにおいて明らかなように、ＴＥＭ顕微鏡写真は、形成済バイメタルナノ結晶がいくつかの事例において白金と相互接続する金ナノ結晶の鎖様形状を成して存在することを示す。
【０２７０】
このバイメタルナノ結晶懸濁液中に含有された白金種及び金種の総量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、それぞれ約１．６ｐｐｍ及び約７．７ｐｐｍであった。
【０２７１】
表１５は、図９及び１０ｂとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表１５は、１）結果としての「ｐｐｍ」（例えば原子白金濃度及び原子金濃度）を開示する。
【表１５】
2014518847.tif 000019
【０２７２】
例１１
ＫＯＨを処理増強剤として使用するバッチ法による
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造
（ＰＧＢ００２）
この例は、本発明によるバッチ法を利用した。図１２ａは、液体３をコンディショニングするために使用される装置を示している。コンディショニングを行ったら、それぞれ白金イオン／粒子及びバイメタルナノ結晶に関して図１２ｃ又は１２ｄに示された装置内で液体３’を処理した。バイメタルナノ結晶懸濁液を形成するプロセス全体を下述し、表１６に要約する。
【０２７３】
最初に、次のプロセスによって白金イオン及び／又は粒子を形成した。約０．５８０グラム／ガロン（すなわち約０．１５３ｇ／ｍＬ）の処理増強剤水酸化カリウム（すなわちＫＯＨ）を約１ガロンの脱イオン水に添加した。処理増強剤を含む水３をプラズマ４に曝露する時間は、図２４ｃに示された装置における後続の処理前の約３０分間であった。
【０２７４】
電極１によって形成されるプラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design））によって達成した。なお、表１６（及び本明細書中の他の個所）において、「ＧＺＡ」とはプラズマ４の形成と同義である。
【０２７５】
図１２ｃに示された電極５ａ／５ｂに、第２の異なる変圧器を電気的に接続した。この変圧器は、電圧範囲約０〜３００Ｖ、周波数範囲約４７〜４００Ｈｚ、そして最大出力定格約１ｋＶＡのｈｙ  ＡＣ電源であった。印加電圧は、約３時間の動作時間にわたって約１００ヘルツの周波数を伴って、約１００ボルトであった。白金ワイヤー電極の直径は約１ｍｍであった。
【０２７６】
続いて、上記調製済の白金種及び水調製物（原材料）を下記のようにさらに処理した。白金種及び水材料を次いで図１２ｄの装置を介して金電極（９９．９９％、約０．５ｍｍ）で約３時間にわたって、約１８０ボルトの印加電圧及び約４７ヘルツを有するｈｙ  ＡＣ電源を用いて処理した。形成されたバイメタルナノ結晶の流体力学半径は、ViscoTekで測定して約１４．６ｎｍであった。懸濁液は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約７．３ｐｐｍのＡｕと、約１．２ｐｐｍのＰｔとを含有した。
【０２７７】
図２６ａ及び２６ｂは、この例１１に従って形成された懸濁液ＩＤ＃ＰＧＢ００２からそれぞれ乾燥させた、形成済バイメタルナノ結晶の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真及びエネルギー分散Ｘ線スペクトルを示している。
【表１６】
2014518847.tif 000020
【０２７８】
例１２
連続トラフ法を利用した白金系ナノ結晶／ナノ結晶懸濁液の製造
（ＰＢ５６００１）
一般に、この例は、図９，１０ｄ及び１１ｂに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、この例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器５０１ＡＣは、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続は好ましい実施態様の詳細な説明に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続した。しかしそれぞれの「ランＩＤ」の実施時間が短いため、制御装置２０を作動させる必要はなかった。従って、図３ｃ及び９ｃを参照して、電極５ａ及び５ｂの端部９’をトラフ部材３０ｂ’の底部と並置させた。この例は、約３．５ｇ／ガロン（すなわち約０．９２５ｍｇ／ｍＬ）のＮａＨＣＯ3を処理増強剤として利用し、また液体流量約１５０ｍｌ／分を利用した。
【０２７９】
具体的には、本明細書中の教示内容に従って、５Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、水中のＰｔ種を形成した。関数発生器５０１ＦＧは１５Ｈｚ未満の周波数の正弦波を給電装置５０１ＡＣ、Chroma 61604プログラミング可能ＡＣ源に提供した。ＡＣ電源は続いて入力信号を異なる周波数で約１５０ボルトに増幅した。印加電流は約５．０アンペア〜約６．５アンペアであった。
【０２８０】
水中に生成された白金種の量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約１５．９ｐｐｍであった。
【０２８１】
表１７は、図９及び１０ｄとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表１７は、１）結果としての「ｐｐｍ」（すなわち白金ナノ結晶濃度）を開示する。
【表１７】
2014518847.tif 000021
【０２８２】
例１３
連続トラフ法セットアップを利用した
白金系ナノ結晶／ナノ結晶懸濁液の製造
（ＰＢ５７００１）
一般に、この例は、図９，１０ｄ及び１１ｂに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、この例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器５０１ＡＣは、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続は好ましい実施態様の詳細な説明に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続した。しかしそれぞれの「ランＩＤ」の実施時間が短いため、制御装置２０を作動させる必要はなかった。従って、電極５ａ及び５ｂの端部９’をトラフ部材３０ｂ’の底部と並置させた。この例は、約２．５ｇ／ガロン（すなわち約０．６６１ｍｇ／ｍＬ）のＮａＨＣＯ3を処理増強剤として利用し、また液体流量約２２０ｍｌ／分を利用した。
【０２８３】
具体的には、本明細書中の教示内容に従って、５Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、水中のＰｔ種を形成した。関数発生器５０１ＦＧは１５Ｈｚ未満の周波数の正弦波を給電装置５０１ＡＣ、Chroma 61604プログラミング可能ＡＣ源に提供した。ＡＣ電源は続いて入力信号を異なる周波数で約１７５ボルトに増幅した。印加電流は約４．０アンペア〜約６．５アンペアであった。
【０２８４】
水中に生成された白金種の量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約７．８ｐｐｍであった。
【０２８５】
表１８は、図９及び１０ｄとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表１８は、結果としての「ｐｐｍ」（すなわち白金ナノ結晶濃度）を開示する。
【表１８】
2014518847.tif 000022
【０２８６】
例１４
水酸化カリウム及び重炭酸ナトリウムを処理増強剤として使用した
連続トラフ法を用いたＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造
（ＧＰＢ−０３２）
一般に、この例は、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書中に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０２８７】
ランＩＤ「ＰＢ−５３」における水酸化カリウム（Fisher Scientific, Cat#P250-500）処理増強剤の使用量は約０．４５０グラム／ガロン（すなわち約０．１１９ｍｇ／Ｌ）であった。加えてランＩＤ「ＰＢ−１０６−２」における重炭酸ナトリウム（Fisher Scientific, Cat#S631-3）処理増強剤の使用量は約０．８５０グラム／ガロン（すなわち約０．２２ｍｇ／Ｌ）であった。供給電極は、Hi-Rel Alloys LTD (Ontario, Canada)から入手した９９．９９％の白金ワイヤー（１ｍｍ／０．０４０インチ直径）であった。
【０２８８】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０２８９】
ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ユニットを利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、水中の少なくとも１種の白金種を形成するために、８０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用した。印加電圧は約２１５ボルトであるとともに、印加電流は約４．０〜約７．０であった。
【０２９０】
結果として生じた水中の白金種を次いで、一晩にわたって約２３℃まで冷却させておいた。その時点で白金−水系材料を、下記のような別の分離した異なるトラフユニット内に供給した。
【０２９１】
一般に、この第２トラフは、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０２９２】
具体的には、６０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、本明細書中の教示内容に従って金ナノ結晶懸濁液又はコロイド又はイオンを形成した。図１０ｃに示されているように、上述の白金−水系材料「ＰＢ−１０６−２」を、ポンプ４０を介してプラズマトラフ区分３０ａ’内に供給した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ電源を利用した。印加電圧は約２分間にわたって約２６０ボルトであり、これに続いてラン継続時間にわたって約２２０ボルトであった。印加電流は約４アンペア〜約７アンペアであった。
【０２９３】
このバイメタルナノ結晶懸濁液中に含有された白金及び金の総量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、それぞれ約３．０ｐｐｍ及び約９．２ｐｐｍであった。
【０２９４】
表１９は、図９及び１０ｂとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表１９は、１）結果としての「ｐｐｍ」（すなわち原子白金濃度及び原子金濃度）を開示する。
【表１９】
2014518847.tif 000023
【０２９５】
この例において、Malvern Instruments製のゼータサイザー(Zeta-Sizer)「Nano-ZS」を利用することにより、ゼータ電位（その詳細については本明細書中に前述した）を割り出した。各測定毎に、透明な使い捨てゼータセルDTS1060C内に１ｍｌの試料を充填した。Dispersion Technology Software, version 5.10を使用することにより、ゼータサイザーを運転し、そしてゼータ電位を計算した。下記設定値を使用した：分散剤−水、温度−２５℃、粘度−０．８８７２ｃＰ、屈折率−１．３３０、誘電定数−７８．５、近似モデル−スモルコフスキー。個別の複製当たり６０ランを３反復、各試料に対して実施した。本明細書中の他の個所で概略を述べたＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、エネルギー吸収スペクトルをこの試料（ＧＰＢ−０３２）に対して得た。図２７は、上記試料（ＧＰＢ−０３２）に対して収集されたＵＶ−ＶＩＳデータを含み、具体的には３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲を示している。
【０２９６】
例１５
重炭酸ナトリウムを処理増強剤として使用した
連続トラフ法を用いたＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造
（ＧＰＢ−０１０）
一般に、この例は、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書中に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０２９７】
ランＩＤ「ＰＢ−７４」における重炭酸ナトリウム（Fisher Scientific, Cat#S631-3）の使用量は約２．５グラム／ガロン（すなわち約０．６６ｍｇ／Ｌ）であった。供給電極は、Hi-Rel Alloys LTD (Ontario, Canada)から入手した９９．９９％の白金ワイヤー（１ｍｍ／０．０４０インチ直径）であった。
【０２９８】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０２９９】
ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ユニットを利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、水中の少なくとも１種の白金種を形成するために、８０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用した。印加電圧は約１７５ボルトであるとともに、印加電流は約４．０〜約７．０であった。
【０３００】
結果として生じた水中の白金種を次いで、一晩にわたって約２３℃まで冷却させておいた。その時点で白金−水系材料を、下記のような別の分離した異なるトラフユニット内に供給した。
【０３０１】
一般に、この第２トラフは、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０３０２】
具体的には、６０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、本明細書中の教示内容に従って金ナノ結晶懸濁液又はコロイド又はイオンを形成した。図１０ｂに示されているように、上述の白金−水系材料「ＰＢ−７４」を、ポンプ４０を介してプラズマトラフ区分３０ａ’内に供給した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ電源を利用した。印加電圧は最初２００ボルトに設定したが、しかし初期電流示度数が典型的には２．５Ａ〜３．５Ａの通常範囲から外れたため、１６５ボルトに設定した。印加電流は約４アンペア〜約７アンペアであった。
【０３０３】
このバイメタルナノ結晶懸濁液中に含有された原子白金及び原子金の総量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、それぞれ約１．７ｐｐｍ及び約７．８ｐｐｍであった。なお、この特定のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液は、生成後４ヶ月未満の期間にわたって沈降するのに伴って安定ではなかった。従って、所定の一連の処理条件下では、重炭酸ナトリウム自体は、ＫＯＨ又はその他の適切な処理増強剤の添加がない場合には、高度に安定なＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の発生を促進しない。しかし、これらの懸濁液はいくつかの目的には適し得る。
【０３０４】
表２０は、図９及び１０ｂとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表２０は、１）結果としての「ｐｐｍ」（すなわち原子白金濃度及び原子金濃度）、及び２）「流体力学半径」（ｎｍ）を開示する。
【表２０】
2014518847.tif 000024
【０３０５】
例１６
種々の印加周波数で連続トラフ法を用いた
種々のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の製造（ＧＰＢ−０１７，ＧＰＢ−０１８，ＧＰＢ−０１９，ＧＰＢ−０２０，ＧＰＢ−０２１，ＧＰＢ−０２３，ＰＧＴ０２４，ＰＧＴ０２５，ＰＧＴ０２６）
一般に、この例は、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書中に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０３０６】
ランＩＤ「ＰＢ−８３，８５，８７及び８８」における水酸化カリウム（Fisher Scientific, Cat#P250-500）処理増強剤使用量は約０．４５０グラム／ガロン（すなわち約０．１２ｍｇ／Ｌ）であった。加えて、ランＩＤ「ＰＢ−８３，８５，８７及び８８」における重炭酸ナトリウム（Fisher Scientific, Cat#S631-3）の使用量は約０．８５０グラム／ガロン（すなわち約０．２２ｍｇ／Ｌ）であった。供給電極は、Hi-Rel Alloys LTD (Ontario, Canada)から入手した９９．９９％の白金ワイヤー（１ｍｍ／０．０４０インチ直径）であった。
【０３０７】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０３０８】
ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ユニットを利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、水中の少なくとも１種の白金種を形成するために、８０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用した。印加電圧は約２１５ボルトであるとともに、印加電流は約４．０〜約７．０であった。
【０３０９】
結果として生じた水材料中の白金種を次いで、一晩にわたって約２３℃まで冷却させておいた。その時点で白金−水系材料を、下記のような別の分離した異なるトラフユニット内に供給した。
【０３１０】
一般に、この第２トラフは、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０３１１】
具体的には、５Ｈｚ〜２００Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、本明細書中の教示内容に従って金ナノ結晶懸濁液又はコロイド又はイオンを形成した。図１０ｂに示されているように、上述の白金−水系材料「ＰＢ−８３，８５，８７及び８８」を、ポンプ４０を介してプラズマトラフ区分３０ａ’内に供給した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ電源を利用した。印加電圧は約２分間にわたって約２６０ボルトであり、これに続いてラン継続時間にわたって約２２０ボルトであった。印加電流は約４アンペア〜約７アンペアであった。
【０３１２】
バイメタルナノ結晶懸濁液中に含有された原子白金及び原子金の総量は表２１ａ，２１ｂ及び２１ｃに概要が示されている。表２１ａは、水中の白金種を形成するために用いられる白金ラン条件を示し、そして表２１ｂ及び２１ｃは、Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液を形成するために用いられるラン条件を示している。
【０３１３】
表２１ａは、図９及び１０ｃとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表２１ａ，２１ｂ及び２１ｃは、１）結果としての「ｐｐｍ」（すなわち原子白金濃度及び原子金濃度）、２）「流体力学半径」（ｎｍ）、及び３）ゼータ電位を開示する。
【０３１４】
本明細書中の他の個所で概略を述べたＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、エネルギー吸収スペクトルをこれらの試料（ＰＧＴ０２４，ＰＧＴ０２５，ＰＧＴ０２６）に対して得た。図２８ａは、これらの試料（ＰＧＴ０２４，ＰＧＴ０２５，ＰＧＴ０２６）に対して収集されたＵＶ−ＶＩＳデータを含み、具体的には３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲を示している。
【０３１５】
本明細書中の他の個所で概略を述べたＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、エネルギー吸収スペクトルをこれらの試料（ＧＰＢ−０１７，ＧＰＢ−０１８，ＧＰＢ−０１９，ＧＰＢ−０２０，ＧＰＢ−０２３）に対して得た。図２８ａは、これらの試料（ＧＰＢ−０１７，ＧＰＢ−０１８，ＧＰＢ−０１９，ＧＰＢ−０２０，ＧＰＢ−０２３）に対して収集されたＵＶ−ＶＩＳデータを含み、具体的には３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲を示している。
【０３１６】
この例に記載されているように、種々のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液を、約５Ｈｚ〜２００Ｈｚの周波数で調製した。粒度対周波数の代表的な比較が図２８ｃに示されている。
【表２１ａ】
2014518847.tif 000025
【表２１ｂ】
2014518847.tif 000026
【表２１ｃ】
2014518847.tif 000027
【０３１７】
例１７
高分解能透過電子顕微鏡法／走査透過電子顕微鏡法及びＸ線光電子分光法による製造済Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液の表面の分析
（ＧＰＢ−０４０）
一般に、この例は、Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液を形成するための図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書中に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図１８ｃ及び１８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０３１８】
ランＩＤ「ＰＢ−１１８」における水酸化カリウム（Fisher Scientific, Cat#P250-500）処理増強剤使用量は約０．４５０グラム／ガロン（すなわち約０．１２ｍｇ／Ｌ）であった。加えて、ランＩＤ「ＰＢ−１１８」における重炭酸ナトリウム（Fisher Scientific, Cat#S631-3）の使用量は約０．８５０グラム／ガロン（すなわち約０．２２ｍｇ／Ｌ）であった。供給電極は、Hi-Rel Alloys LTD (Ontario, Canada)から入手した９９．９９％の白金ワイヤー（１ｍｍ／０．０４０インチ直径）であった。
【０３１９】
電極１によって形成された各プラズマ４のための印加電圧は約７５０ボルトであった。この電圧は、本明細書中の他の個所で論じられた変圧器６０（すなわち平衡中間点参照デザイン（Balanced Mid-Point Referenced Design）によって達成した。
【０３２０】
ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ユニットを利用した。具体的には、本明細書中の教示内容に従って、水中の少なくとも１種の白金種を形成するために、８０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用した。印加電圧は約２１５ボルトであるとともに、印加電流は約４．０〜約７．０であった。
【０３２１】
結果として生じた水材料中の白金種を次いで、一晩にわたって約２３℃まで冷却させておいた。その時点で白金−水系材料を、下記のような別の分離した異なるトラフユニット内に供給した。
【０３２２】
一般に、この第２トラフは、図９，１０ｃ及び１１ａに概略的に示された装置と関連する本発明の所定の実施態様を利用した。図１３に示された電気装置５０１ＡＣを、本明細書に含まれる例のための給電装置として使用する一方、５０１ＡＣを駆動するために関数発生器５０１ＦＧを使用することもあった。この変圧器は、ＡＣ電圧範囲０〜３００Ｖ、周波数範囲１５〜１０００Ｈｚ、そして最大出力定格約２ｋＶＡのＡＣ電源（Chroma 61604）であった。電気的接続の考察は好ましい実施態様の詳細な説明の項に見いだすことができる。図８ｃ及び８ｊに示された制御装置２０をそれぞれ電極１／５及び５／５に接続し、そして電極５／５を８時間毎に約１インチの速度で作動させた。例えば各電極セット５／５における各電極５／５の高さを自動調節する制御装置２０及び２０ｉに、８つの電極セット１／５及び５／５を全て接続し、各電極セットは２つの雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’を有した。所望されたとき、そして所望の場合に、各電極セット５／５内の電極を各雌受容管ｏ５内に取り外し可能に挿入することができるように、雌受容管ｏ５ａ／ｏ５ａ’−ｏ５ｇ／ｏ５ｇ’をトラフ部材３０ｂ’の底部に接続した。
【０３２３】
具体的には、６０Ｈｚの正弦波ＡＣ周波数を利用して、本明細書中の教示内容に従って金ナノ結晶懸濁液又はコロイド又はイオンを形成した。図１０ｃに示されているように、上述の白金−水系材料「ＰＢ−１１８」を、ポンプ４０を介してプラズマトラフ区分３０ａ’内に供給した。ＡＣ電源５０１ＡＣはChroma 61604プログラミング可能ＡＣ電源を利用した。印加電圧は約２分間にわたって約２６０ボルトであり、これに続いてラン継続時間にわたって約２２０ボルトであった。印加電流は約４アンペア〜約７アンペアであった。
【０３２４】
バイメタルナノ結晶懸濁液中に含有された原子白金及び原子金の総量は、本明細書中の他の個所で論じられた原子吸光分光技術によって測定して、約３．２ｐｐｍ〜約９．３ｐｐｍであった。
【０３２５】
表２３は、図９及び１１ａとの関連において用いられる主要処理パラメータを要約する。また、表２３は、１）結果としての「ｐｐｍ」（すなわち原子白金濃度及び原子金濃度）、２）「流体力学半径」（ｎｍ）、及び３）ゼータ電位を開示する。
【０３２６】
本明細書中の他の個所に記載されたPhilips CM300 FEG 高分解能透過電子顕微鏡を使用して高分解能透過電子顕微鏡法（ＨＲＴＥＭ）を実施した。CM300上でＳＴＥＭモードで走査透過電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）も実施した。計測コンピュータ内部の内部較正処置を介して、分析前に較正を行った。図２９ａ及び２９ｃは、代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。図２９ｂ及び２９ｄは、図２９ａ及び２９ｃにおける乾燥ナノ結晶の代表的なＥＤＳスペクトルである。図２９ｅ，２９ｆ及び２９ｇは、ナノ結晶懸濁液から乾燥させた乾燥Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶のＳＴＥＭマッピングである。
【０３２７】
本明細書中の他の個所で概略を述べたＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて、エネルギー吸収スペクトルをこれらの試料（ＧＰＢ−０４０）に対して得た。図３０は、この試料（ＧＰＢ−０４０）に対して収集されたＵＶ−ＶＩＳデータを含み、具体的には３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲を示している。
【０３２８】
本明細書中に記載されているように、接線流濾過（Tangential Flow Filtration: ＴＦＦ）を介してＧＰＢ−０４０濃縮試料を調製した。ここでは、ダイアフィルトレーション緩衝液の代わりに脱イオン水を使用して、溶液から処理増強剤を除去した。ＧＰＢ−０４０を２０倍（体積）に３回濃縮し、毎回脱イオン水で戻した。続いて、ＴＦＦ濃縮ＧＰＢ−０４０を１０分間にわたって１１，０００ｒｐｍで遠心分離し、その結果、１．５ｍＬ遠心分離管の底部にＡｕ−Ｐｔバイメタルペレットを生じさせた。約２４本の管を使用して、出発溶液の約４００倍高い約１．５ｍＬの最終試料を収集した。この溶液を次いで下記のように試料スタブ上に堆積した。
【０３２９】
接線流濾過（ＴＦＦ）
ＧＰＢ−０４０中のバイメタルナノ結晶を濃縮するために、接線流濾過（ＴＦＦ）法を利用した。プロセスにおいて、濾過は、圧力で駆動される分離プロセスである。分離プロセスは、サイズ及び／又は電荷の相違に基づいて懸濁液中のナノ結晶を分離するために膜を使用する。ＴＦＦでは、流体は膜表面に沿って接線方向にポンピングされる。単純なＴＦＦシステムの概略図が図３１ｃに示されている。
【０３３０】
フィードタンク１００１がフィードポンプ１００２内及び濾過モジュール１００３内に流体を提供する。濾液流１００４が廃棄される。リテンテートがリテンテート弁１００５を通って迂回させられ、１００６としてフィードタンク１００１内に戻される。濾過モジュール１００３内の膜表面上を流体がそれぞれ通過している間に、加えられた圧力が流体の一部を強制的に膜に通し、濾液流１００４中に流入させる。膜孔を貫通するには大きすぎるいずれの粒子及びマクロ分子も上流側に保持され、接線流によってリテンテート１００６中に一掃される。より高いコロイド粒子濃度を有するリテンテートがフィードタンク１００１に戻される。フィードタンクに加えられるダイアフィルトレーション緩衝液がない場合には、フィードタンク１００１内のコロイド体積は、除去された濾液の量だけ低減され、懸濁液が濃縮される。
【０３３１】
この例では、Millipore Pellicon XLカセットを５ｋＤａ及び１０ｋＤａ  ＭＷＣＯセルロース膜と一緒に使用した。リテンテート圧力をリテンテート弁１００５によって４０ＰＳＩに設定した。１０ｋＤａ膜は、より大きい孔サイズに対して予測される同じ膜貫通圧力下で、５ｋＤａ膜に比べて約４倍高い濾液流を可能にする。同時に、１０ｋＤａ膜の孔は、ＧＰＢ−０４０のリテンテート中の全ての形成済バイメタルナノ結晶を保持するのに十分に小さい。
【０３３２】
Ｘ線光電子分光法：
バイメタル金−白金ナノ結晶の表面化学分析をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって実施した。加速電圧１５ｋＶを有する３００Ｗビーム出力で動作するＭｇ  Ｋ−アルファ源を備えたPhysical Electronics (PHI) Model 5400光電子分光計を使用して、スペクトルを収集した。高い感度及び分解能を提供する半球状アナライザーによって、放出された光電子を検出した。サンプリング室内の動作圧力は分析中、５×１０-8  Ｔｏｒｒを下回った。
【０３３３】
２つの範囲内でスペクトルを収集した（すなわち当該特定領域内の低分解能サーヴェイスキャン及び高分解能多重スキャン）。サーヴェイスキャンは、結合エネルギー０〜１２００ｅＶで行われる一方、高分解能走査は８０〜１００ｅＶ及び６５〜８５ｅＶで行った。元素金はそれぞれ８７．６ｅＶ及び８３．９ｅＶで多重項（４ｆ5/2＆４ｆ7/2）を呈し、そして酸化物の組成及び濃度のような情報を拡張領域８０〜１００ｅＶから割り出すことができる。白金はそれぞれ７４．５ｅＶ及び７１．２ｅＶで多重項（４ｆ5/2＆４ｆ7/2）を呈し、そして濃度及び酸化物含量のような情報を拡張領域６５〜８５ｅＶから割り出すことができる。
【０３３４】
スパッタ清浄化及び深さプロファイリングをSputter Ion Gun (PHI, Model 04-303)で実施した。入射イオンガンを加速電圧４．０ｋｅＶで走査し、そして、試料電流を試料領域にわたって約２５ｍＡに維持した。主要チャンバ内の圧力を約５×１０-8Ｔｏｒｒで維持した。対応するラスターサイズは４×４ｍｍであり、圧力は２５ｍＰａであった。５，１０，２０，３０，４０，５０，７０，９０，１２０，１８０及び２４０分のインターバルでスパッタリングを行った。
【０３３５】
図２９ｈ〜２９ｉは、ＧＰＢ−０４０、金−白金バイメタルナノ結晶懸濁液から収集されたスペクトルである。スペクトルは、１００〜２００μＬの試料を試料スタブ上に配置し、続いて真空に引いて材料を炭素テープ上に乾燥させることによって調製した。次いでチャンバを開き、さらに１００〜２００μＬを堆積した。このプロセスを１１回繰り返すことにより、炭素テープ上の材料薄膜を生成した。
【０３３６】
初期サーヴェイスキャン（図２９ｈ）は、ナノ結晶の表面汚染物質及び元素組成物を割り出すのに有用である。炭素、酸素、白金、及び金を示すピークが明確に標識付けされている。２８５ｅＶの小さな炭素ピークは、炭素テープの不完全な試料被覆率に由来するのに対して、５３１ｅＶの酸素ピークはおそらく、試料調製技術に起因して捕捉された酸素の結果ではあるが、吸着酸素層内で滴下堆積間に捕捉されるようになったのかもしれない。６９０ｅＶ及び７５０ｅＶのピークは、それぞれフッ素試料チャンバ汚染及び酸素に起因し得る。両方の事例において、ピークは３０分のスパッタ後に消滅した。
【０３３７】
６０ｅＶ〜１００ｅＶの高分解能多重スキャン（図２９ｉ）は、ナノ結晶の金及び白金組成物に関する付加的な情報を提供する。８８ｅＶのＡｕ  ４ｆ5/2ピークは、試料荷電に起因し得る小さな肩を含む。３０分間のスパッタ後、正アルゴンイオンの流れは試料を中和し、肩は消滅した。加えて、３０分間スパッタした後、約７１ｅＶでＰｔ  ４ｆ7/2ピークが立ち上がる。
【０３３８】
図２９ａ〜ｇに明確に示されているように、Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶溶液は原子白金及び原子金と比較して構造が不均質である。図２９ａ及び２９ｃにおける当該特定領域によって示されているように、ＴＥＭの電子ビームを個々のナノ結晶上に集めることにより、エネルギー分散スペクトル（ＥＤＳ）を収集した。結果としてのＥＤＳデータが図２９ｂ及び２９ｄに示されている。両方の事例において約９．４ｋｅＶの白金ピーク及び約９．７ｋｅＶの金ピークが存在する。図２９ｅ〜ｇは懸濁液ＧＰＢ−０４０のバイメタルナノ結晶の走査透過電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）画像である。図２９ｅは、銅グリッド上で乾燥させた少なくとも４つのＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶のＳＴＥＭ画像である。図２９ｆ及びｇは、図２９ｅで画像化されたナノ結晶の、それぞれ白金及び金のＥＤＳマッピングである。図２９ｆ及び図２９ｇから明らかなのは、白金及び金の両方が、被験ナノ結晶全体を通して不均質に存在することである。加えて、図２９ｈ及び２９ｉは、ナノ結晶表面が有機汚染を含んでおらず、しかもコア・シェル挙動を呈さないという更なる証拠を提供する。Ａｕ  ４ｆ7/2及びＰｔ  ４ｆ7/2の相対強度は、スパッタリング時間の関数として変化しない。ナノ結晶が本質的にコア−シェルであるならば、Ｐｔの相対強度は低下することが予測されるはずである。ＨＲＴＥＭ、ＥＤＳ，及びＸＰＳデータを組み合わせることにより、この例に開示された方法によって調製されたナノ結晶が、Ａｕ−Ｐｔバイメタル合金であることが明らかである。
【表２３】
2014518847.tif 000028
【０３３９】
例１８
透析技術による金及び金／白金バイメタル懸濁液の濃縮
透析バッグ技術が、本明細書中の教示内容に従って形成されたコロイドの漸進的な濃縮を可能にする。コロイド懸濁液を透析バッグの内側にいれ、バッグ自体をＰＥＧ系ポリマーの水溶液中に浸した。ＰＥＧ系ポリマーは、負の浸透圧を形成する。負の浸透圧の結果、透析バッグ内部（すなわち内側）に維持されたコロイドから水を抽出させることになる。
【０３４０】
具体的には、図３１ａは、代表的なコロイド懸濁液３０００を含有する透析バッグ２０００、好適なプラスチック容器５０００（ＨＤＰＥプラスチック製）及び容器内のＰＥＧ系ポリマー材料１０００を示している。
【０３４１】
透析バッグ２０００を形成する透析膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、すなわち、それを上回ると大型サイズの種が膜の内側に保持されることになる概算的に得られた閾値サイズによって特徴づけられる。透析バッグ２０００のための３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯを有するセルロース膜を使用することにより、透析濃縮を達成した。ポリマー溶液１０００はＰＥＧ−８０００ポリマーから形成した。これらの条件下で、水分子及び小型イオンはバッグ２０００の透析膜を貫通し得るが、しかし３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯよりも大きいコロイドナノ粒子は透析バッグの内側に保持されるはずである。しかし、ＰＥＧ−８０００分子は（サイズに基づいて）膜を貫通することができず、透析バッグ２０００の外側に残った。
【０３４２】
図３１ｂは、透析バッグ２０００が、その図３１ａのサイズと比較して体積が（経時的に）収縮したことを示している。透析バッグ２０００は、液体がバッグから取り除かれるのに伴って潰されるべきではない。これに関して、バッグ内面に残るナノ結晶は、生じ得る凝集を防止するために過剰負荷されてはならない。
【０３４３】
各透析バッグ２０００を、約４００〜５００ｍＬのナノ結晶懸濁液３０００で満たし、そしてバッグ容積が約１０分の１のサイズ及び体積に減少するまで、ＰＥＧ−８０００溶液１０００中に維持した。いくつかのバッグからの１０倍濃縮されたコロイドを合体させて１つのバッグに入れ、同じ一連の濃縮工程を再び繰り返すことにより、必要であれば、更なる懸濁液濃縮を行った。透析バッグ２０００は顕著な膜汚染なしに約１０回安全に使用することができる。
【０３４４】
透析バッグ２０００の外側のポリマー溶液１０００中の出発ＰＥＧ−８０００は濃度約２５０ｇ／Ｌであり、水が透析バッグ２０００を通ってコロイド３０００から引き出されることに起因して（すなわち、形成された浸透圧に起因して）濃度が自然に低下する。ポリマー濃度が高いこと及び静かに攪拌することにより、コロイド３０００からの水除去速度を高めることができる。
【０３４５】
この透析プロセスは、透析バッグ２０００の可視の汚染を伴わずに金コロイドを濃縮した。懸濁液４０００中の残りの金ナノ結晶の濃度は、体積減少によって評価し、またＩＣＰ−ＭＳ技術（本明細書中で詳細に後述する）によって測定した。懸濁液４０００中の残りの金は、ＩＣＰ−ＭＳ技術によって直接に測定された金濃度と類似した。しかし、バイメタル金／白金ナノ結晶懸濁液の事例において、第１電気化学工程において生成された白金の一部はイオン性であり、そして第２電気化学処理工程後に取り出されたこの白金イオン形態のある程度の量は濃縮中に透析バッグ２０００を貫通した。このような結果は、原子金と比較して原子白金の濃縮係数を低くした（原子金の全てが一見したところ金属形態を成した）。加えて、Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液は透析バッグ２０００の膜を黄緑色の均一色に僅かに染色した。
【０３４６】
透析バッグ技術は、２種の異なるコロイド懸濁液の一連の濃縮範囲を達成するために用いられた。これらのコロイド懸濁液は後続のin-vitro細胞培養試験において使用した。具体的には、表２４は、形成済金懸濁液（ＮＥ１０２１４）及びＡｕ／Ｐｔバイメタル懸濁液（ＧＰＢ−０３２）中の金属の９種の異なる濃度を示している。これらの調製は本明細書中に前述されている。すぐ下で説明する誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって濃度値を測定した。
【０３４７】
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）
ＩＣＰ−ＭＳ値をAgilent 7700xから得た。
Ｉ）原理
誘導結合プラズマ質量分析技術は、液体試料がネブライザーを介して試料チャンバ内に導入されることを必要とし、ひいてはより大きい液滴を除去し、そして微細なエアロゾル・スプレーを、不活性アルゴンガスの供給部を介して運搬して、トーチチャンバ内に導入する。トーチ温度は８０００Ｋ〜１００００Ｋである。エアロゾルは瞬時に脱溶媒和され、プラズマ内部でイオン化され、サンプリング・コーンを介して第１真空段内に抽出され、続いて第２オリフィス、スキマーコーンを通過する。次いでイオンはレンズ系によってコリメートされ、次いでイオン光学系によって合焦される。
【０３４８】
イオンレンズは、四重極及び検出器を入射イオンビームから軸外に取り付けることにより、光子及び中性種が検出器に達するのを防止することによって、ＩＣＰ−ＭＳが高い信号感度を達成するのを可能にする。セルガスであるヘリウムはＯＲＳ内に導入される。ＯＲＳは、イオンレンズ集成体と四重極との間に位置決めされた八重極イオンガイドである。多原子種のような干渉が運動エネルギー識別を介して取り除かれる。貫通するイオンは次いで、４つの長い金属ロッドから成る四重極質量アナライザー内に進む。ＲＦ及びＤＣ電圧はロッドに印加される。これは、ロッドが固有の質量−電荷比のイオンを濾過するのを可能にする電圧の変化である。
【０３４９】
次いでイオンを、パルスアナログ検出器によって測定する。イオンは電子増幅器に入るとダイノードに衝突し、自由電子の存在度を形成する。自由電子は次いで次のダイノードに衝突し、付加的な電子を形成することになる。特定の元素からのイオン量は、生成された電子の量と相関し、ひいてはカウント又はＣＰＳを増減する。
【０３５０】
ＩＩ）試料調製
５００μＬの試料を４．５ｍＬの５％  ＨＮＯ3／２％  ＨＣｌ中に３０分間にわたって７０℃で希釈することによって試料を調製した。試料は３部調製した。続いて試料をポリプロピレン試験管に移し、次いでこれをCetac オートサンプラーのラックに置いた。
【０３５１】
ＩＩＩ）機器設定
Agilent ICP-MS 7700xプラズマをオンにし、始動手順を初期化した。初期最適化実施前の２６分間にわたってプラズマをウォームアップしておいた。最適化工程が成功裡に完了した後、機器は分析の準備が整った。クイック手動調整を行い、低、中、及び高質量の信号（５９，８９＆２０５）をチェックすることによって、機器が我々の内部仕様の範囲内にあることを保証した。その後、内部標準ライン管を５％  ＨＮＯ3ブランクから、Ｉｎ  １１５を含有する内部標準溶液へ切り換えた。
【０３５２】
ＩＶ）分析手順
SPEX CertiPrepによって調製された外部ストック溶液から、較正試料及び独立連続濃度照合（ＩＣＣＶ）標準を調製した。金を含有するMulti-Element３較正標準を１０ｐｐｍからそれぞれ１０００ｐｐｂ，１００ｐｐｂ，１０ｐｐｂ，及び１ｐｐｂまで連続希釈した。希釈剤５％  ＨＮＯ3／２％ＨＣｌのブランク溶液を０ｐｐｂ標準として使用した。ＩＣＣＶ試料を試料バイアル内に入れ、そして較正標準とともにラックに置いた。
【０３５３】
試料分析の前に、０ｐｐｂ，１ｐｐｂ，１０ｐｐｂ，１００ｐｐｂ及び１０００ｐｐｂを測定することによって、較正曲線を生成した。次いで当該試料を、試料取り込み中に９０秒５％ＨＮＯ3濯ぎ工程で測定した。６試料毎に、ＩＣＣＶを実施することにより、較正曲線が実際値の１０％以内にあることを保証した。
【０３５４】
Ｖ）データ分析
データをMass-hunter データ分析ソフトウェアからエクセルへエクスポートすることにより、フォーマットしてチェックした。複製を一緒に平均することにより、平均濃度、標準偏差、及び相対標準偏差を得た。
【表２４】
2014518847.tif 000029
【０３５５】
例１９
in Vitro 癌細胞株に対する濃縮Ａｕ懸濁液（ＮＥ１０２１４）と濃縮Ａｕ／Ｐｔバイメタル懸濁液（ＧＰＢ−０３２）との効果の比較
ＡＴＣＣ及びＤＳＭＺ（全てのＤＳＭＺ細胞株には「＊＊」を付けた）培養バンクから選択された３０の異なるヒト腫瘍タイプを用いて細胞株パネルを集成した。細胞株パネルは、典型的な膀胱、乳房、頸部、ＣＮＳ、結腸、Ｈ＆Ｎ、肺、卵巣、前立腺、胃、甲状腺、子宮、及び外陰癌を含んだ。３０種の特定の細胞株及び腫瘍タイプが表２５に示されている。
【表２５】
2014518847.tif 000030
【０３５６】
試験手順：
３７℃の５％  ＣＯ2の加湿雰囲気において、ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＦＢＳ，２ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  Ｎａピルベート中で細胞を成長させた。細胞を３８４ウェル板内に播種し、３７℃の５％  ＣＯ2の加湿雰囲気中でインキュベートした。細胞播種から２４時間後に化合物ＮＥ１０２１４及びＧＰＢ−０３２を添加した。同時に、タイムゼロ無処理細胞板を生成した。
【０３５７】
７２時間のインキュベーション期間後、細胞を固定し、蛍光ラベル付き抗体及び核色素で染色することにより、核、アポトーシス細胞、及び有糸分裂（マイトーシス）細胞の視覚化を可能にした。抗活性カスパーゼ−３抗体を使用してアポトーシス細胞を検出した。抗ホスホ−ヒストン−３抗体を使用した有糸分裂細胞を検出した。
【０３５８】
濃縮Ａｕ懸濁液（ＮＥ１０２１４、「化合物１」とも称する）と濃縮バイメタルＡｕ／Ｐｔ懸濁液（ＧＰＢ−０３２、「化合物２」とも称する）を下記表２６に示すように希釈し、そして最高試験濃度から最低試験濃度までの９種の濃度にわたってアッセイした。２種の試験化合物を成長培地に添加すると、これらは成長培地によって希釈されるようになった。成長培地中の金属成分（すなわちＮＥ１０２１４におけるＡｕ；及びＧＰＢ−０３２におけるＡｕ＋Ｐｔ）の実際の原子濃度は、表２６において「in Vitro濃度マイクロＭ」として示されている。
【０３５９】
GE Healthcare IN Cell Analyzer 1000を使用して自動蛍光顕微鏡法を実施した。４Ｘ対物レンズによって画像を収集した。
【表２６】
2014518847.tif 000031
【０３６０】
データ分析
INCell Analyzer 1000 3.2を使用して12 bit tiff画像を取得し、そしてDeveloper Toolbox 1.6ソフトウェアによって分析した。非線形回帰を用いてＥＣ50及びＩＣ50を計算することにより、データをシグモイダル４点、４パラメータOne-Site用量反応モデルにフィットさせた。ここでは
y(fit) = A + [(B-A)/(1 + ((C/x) ^ D))]。カスタムデータ整理エンジンMathIQベースソフトウェア（ＡＩＭ）を使用して、曲線フィッティング、ＥＣ50／ＩＣ50計算、及び報告作成を行った。
【表２７】
2014518847.tif 000032
【表２８】
2014518847.tif 000033
【０３６１】
データ解釈
多重細胞毒性アッセイは、細胞画像に基づく分析技術を用いた。ここでは、上述のように、細胞を固定し、蛍光ラベル付き抗体及び核色素で染色した。
【０３６２】
内蔵された核色素の信号強度によって細胞増殖を測定した。細胞増殖アッセイ出力は相対細胞カウントと呼ばれる。細胞増殖エンドポイントを割り出すために、細胞増殖データ出力を、下記式を用いてコントロール・パーセント（ＰＯＣ）に変換した：
POC = 相対細胞カウント（化合物ウェル）/相対細胞カウント（ビヒクル・ウェル）×100
【０３６３】
相対細胞カウントＩＣ50は、最大可能応答の５０％における試験化合物濃度である。相対細胞カウントＥＣ50は、曲線の変曲点又は有効応答の半分における試験化合物濃度である（近似曲線解のパラメータＣ）。ＧＩ50は、観察された成長を半分だけ低減するのに必要とされる濃度である。これは、無処理細胞と、ウェル内に播種された細胞の数との成長中間を阻害する濃度である（タイムゼロ値）。
【０３６４】
タイムゼロ無処理板を使用して７２時間のアッセイ期間における倍加数を割り出す。７２時間の倍加数＝ＬＮ［細胞数（７２時間エンドポイント）＊細胞数（タイムゼロ）］ＬＮ（２）
【０３６５】
各バイオマーカーの出力は、各ウェル内の相対細胞カウントに対して基準化されたビヒクル・バックグラウンドを上回る増加倍率である。
【０３６６】
活性化カスパーゼ−３マーカーは、早期から末期のアポトーシス細胞をラベル付けする。出力は、各ウェル内の相対細胞カウントに対して基準化されたビヒクル・バックグラウンドを上回るアポトーシス細胞の増加倍率(fold increase)である。カスパーゼ−３信号における５倍の誘導を引き起こす試験化合物の濃度は、有意なアポトーシス誘導を示唆する。相対細胞カウントＩＣ95よりも高い濃度を有するウェルは、カスパーゼ３誘導分析から排除される。
【０３６７】
ホスホ−ヒストン−３マーカーは有糸分裂細胞をラベル付けする。出力は、各ウェル内の相対細胞カウントに対して基準化されたビヒクル・バックグラウンドを上回る有糸分裂細胞の発光量(fold induction)である。バックグラウンドを上回る有糸分裂細胞信号の発光量がほぼ１であるときには、細胞周期に対して「効果なし」である。ホスホ−ヒストン−３信号の、ビヒクルを２倍以上上回る増加は、試験化合物の有意な分裂阻止誘導を示唆する。
【０３６８】
ホスホ−ヒストン−３信号の２分の１以下の減少は、細胞毒性レベルが測定相対細胞カウントＩＣ95を下回るときにのみＧ１／Ｓ阻止を示唆し得る。相対細胞カウントＩＣ95よりも高い濃度でホスホ−ヒストン−３信号の２分の１以下の減少が観察されるときには、有糸分裂細胞カウントの減少はおそらく、真のＧ１／Ｓ段階阻止ではなくより一般的な細胞毒性効果に起因する。相対細胞カウントＩＣ95よりも高い濃度を有するウェルはホスホ−ヒストン−３分析から排除される。
【０３６９】
陽性応答の基準
−相対細胞カウントによって測定された細胞増殖
−アポトーシス：
・  活性化カスパーゼ−３信号の５倍超の増加は、アポプトーティク反応（apoptotic response）を示唆する。
・  ホスホ−ヒストン−３信号の２倍超の増加は、ミトーティック阻止（mitotic block）を示唆する。
・  ホスホ−ヒストン−３信号の２分の１未満の減少は、Ｇ１／Ｓ阻止を示唆する。
【０３７０】
化合物はin vitroで比較的低い濃度であるので、提供されたほとんどの濃度は、ＩＣ５０の結果を得るにはあまりにも低かった。濃度レベルが増大するのに伴って、被験腫瘍細胞株の多くにおいて両化合物の活性が明らかになる。表２８は、上述の「化合物１（ＮＥ１０２１４）及び２（ＧＰＢ−０３２）の性能概要」と題し、第３列（「細胞株」）において、それぞれの腫瘍細胞株に対して「*」を付けて強調している。ここではそれぞれの化合物／細胞株の組み合わせに対して有意な抗癌活性が実証された。
【０３７１】
結果
表２８に要約されたデータは、濃縮Ａｕ懸濁液（ＮＥ１０２１４）で治療された３０種の被験腫瘍細胞株のうち１３種において、そして濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液（ＧＰＢ−０３２）で治療された３０種の被験腫瘍細胞株のうち２３種において、治療に応答する有意な抗癌活性が存在することを明確に実証する。
【０３７２】
同様に重要なことは、濃縮Ａｕ懸濁液及び濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液が、３０種の異なる腫瘍細胞株全体にわたって、抗癌活性の著しく異なる存在パターン、及び抗癌活性タイプの著しく異なるパターンを示すことである。
【０３７３】
ここで図３２ａ〜３２ｄを参照する。これらの図は、３０種の被験細胞化物のそれぞれに対する化合物１及び化合物２の性能の相違をグラフで示している。具体的には、「相対細胞カウント％」、「アポトーシス（発光量）」及び「マイトーシス（発光量）」のそれぞれに対して比較を示している。データが示すように、濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液（ＧＰＢ−０３２）で治療された８種の異なる腫瘍細胞株内のアポトーシス誘導率が著しく上昇するが、しかしこの種類の活性は、濃縮Ａｕ化合物（ＮＥ１０２１４）で処理された腫瘍細胞株のいずれにも見いだされない。
【０３７４】
アポトーシス誘導率の有意な上昇は、濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液で治療された下記の８種の腫瘍細胞株内に明らかに存在するが、しかし濃縮Ａｕ懸濁液で治療されたものには存在しない：
-22Rvl   前立腺
-SW962   外陰
-BHT 101内分泌腺
-BT474   乳房
-CaOV-3  卵巣
-DoTc2 4510      頸部
-Du 145  前立腺
-KPL-1   乳房
【０３７５】
第二に、濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液（ＧＰＢ−０３２）で治療された５種の異なる腫瘍細胞株内にマイトーシス阻止が有意に誘導されるが、しかしこの種類の活性は、濃縮Ａｕ懸濁液（ＮＥ１０２１４）で治療されたときには細胞株のいずれにも示されない。
【０３７６】
マイトーシス阻止の有意な誘導は、濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液で治療された下記の５種の腫瘍細胞株内に存在するが、しかし濃縮Ａｕ懸濁液で治療されたものには存在しない：
-SW837   結腸
-RL95-2  子宮
-EFM-19  乳房
-SW962   外陰
-CAOV3   卵巣
【０３７７】
第三に、濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液は１２種の腫瘍細胞株において有意な抗癌活性を示し、この場合、濃縮Ａｕ化合物は活性を全く示さなかった。そして濃縮Ａｕ懸濁液は２種の付加的な腫瘍細胞株において有効であり、この場合、濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液は活性を全く示さなかった。従って、３０種の腫瘍細胞株のうち１４種において、いかなる種類の抗癌活性の存在もオーバーラップは示されない。
【０３７８】
さらに、濃縮Ａｕ懸濁液又は濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液、又はその両方が抗癌活性を示した３０種の細胞株のうち２５種において、４種だけ（４／３０＝１３％）に、両化合物が同じパターン又はタイプの抗癌活性を有する。２７事例のうち２３事例において、活性パターンは著しく異なる。
【０３７９】
要約すれば、
１）有意な抗癌活性レベル：濃縮Ａｕ懸濁液又は濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液、又はその両化合物は、３０種の被験腫瘍細胞株のうちの２５種（２５／３０＝８３％）に対する有意な抗癌活性を有した。
２）著しく異なる抗癌活性パターン：２種の化合物（Ａｕ及びＡｕＰｔ）の抗癌活性パターンは、２５種の腫瘍細胞株のうち２１種において著しく異なった。活性は２１／２５であり→８４％が、濃縮Ａｕ懸濁液と濃縮Ａｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液とでは異なる活性パターンを有した。
【０３８０】
例２０ａ
マウスにおける異種移植癌試験−ＨＣＴ１１６経口投与
概要
この例は、マウス異種移植癌モデルにおいて経口投与された本発明のいくつかの組成物の効果を実証する。雌Balb/C免疫不全受容マウス（６〜８週齢）に腫瘍を移植した。Balb/C供与マウスを使用してＨＣＴ１１６腫瘍を成長させた。これらの腫瘍を供与マウスから切除し、続いて切断してサイズ約２ｍｍ3の小片にした。Balb/C受容マウスに短時間の全身麻酔を施し、次いで、供与マウスに由来する１つのＨＣＴ１１６  ２ｍｍ3腫瘍断片を、トロカールニードルを使用して受容マウスの左右の脇腹のそれぞれに移植した。受容マウスにおける腫瘍が、各マウス皮膚に当てられたキャリパーによって測定して約４×４ｍｍに達したら、受容マウスを１群当たり３匹の治療群にランダムに入れ、経口治療を開始した。治療は専ら、各群内の３マウス間で共有される飲用瓶を介して行った。腫瘍のサイズをキャリパー対を使用して１週当たり５回評価し、マウスの体重も秤によって得た。このような測定は、マウスが死亡する（又は試験から取り除かれる）まで、又は試験が２４日目に終わるまで行った。この例の結果を図３３ａ〜３３ｂに要約する。
【０３８１】
所定の比較ナノ結晶懸濁液及びイオン溶液を調製することにより、バイメタルＡｕ−Ｐｔナノ結晶懸濁液と比較した。
【０３８２】
手短に述べると、ＧＢ−２１８を例１と同様に調製した。その結果、ＡＡＳによって測定した金濃度は７．６ｐｐｍであった。加えて前記溶液は、Viscotekによって測定した流体力学半径が１５．１ｎｍであることが判った。ＧＢ−２１９を例１と同様に調製した。ここでは重炭酸ナトリウムの代わりに、水酸化カリウムを処理増強剤として濃度０．６３ｇ／ガロン（すなわち例えば０．１７ｍｇ／ｍＬ）で使用した。ＧＢ−２１９は、ＡＡＳによって測定して金濃度が８．７ｐｐｍであった。加えて、前記溶液は、Viscotekによって測定した流体力学半径が１８．３ｎｍであることが判った。
加えて、ＰＢ−３９を例１３のＰＢ５７００１の例と同様に調製した。その結果、Ｐｔ濃度７．４ｐｐｍのナノ結晶白金粒子の懸濁液が生じた。ＰＢ−２２−Ｃ４を例１３と同様に調製した。ここでは５０１ＡＣの印加周波数を５Ｈｚの代わりに８０Ｈｚに設定することにより、主としてＰｔイオン種から成り、これとともに少量のＰｔナノ結晶種を含む溶液を生成した。重炭酸ナトリウムの濃度は２．５ｇ／ガロン（すなわち約０．６６ｍｇ／ｍＬ）であった。続いて電気ホットプレートを使用してＰＢ−２２−Ｃ４を濃縮することにより、約８．３ｐｐｍのＰｔ濃度を生成した。
【０３８３】
方法
動物
種：    マウス
系統：  Balb/C免疫不全マウス
源：    Harlan
性別及び数：     雌、２４
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別番号を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、特定病原体を持たない（ｓｐｆ）条件下で３匹から成る群に分けて動物を収容した。使用前の少なくとも７２時間にわたって標準的な畜舎条件下で動物を均衡化した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり３匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び１２時間明暗サイクルを確保した。
食餌：  保持期間、順化期間、及び投与後期間全体を通して、照射ペレット食餌及び水を随時利用可能にした。
【０３８４】
化合物及び試薬
ＨＣＴ  １１６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）
リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）
試験化合物：白金ナノ結晶懸濁液、金ナノ結晶懸濁液、及びＡｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液
陽性対照化合物：シスプラチン
陰性対照化合物：飲用水
【０３８５】
処理群及び投与
陰性対照群１：０〜２４日目に通常の飲用水を与えた。
陽性対照群２：０〜２４日目に通常の飲用水を与え、そして１日投与量８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを腹腔内注射（ＩＰ）によって与えた。
治療群３〜６：０〜２４日目に試験化合物を飲用水として与えた。
【０３８６】
プロトコルＡ：供与腫瘍の調製及び成長
ａ）腫瘍細胞の調製
１．  細胞を完全培地内で成長させ、全ての汚染物質を排除した。
２．  細胞が約７０〜８０％融合したら、収穫前の約３〜４時間にわたって、古い細胞成長培地を新鮮な細胞成長培地と置き換えることにより、死細胞及び／又は分離細胞を除去した。
３．  細胞成長培地をもう一度除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで少量（例えば１０ｍｌ）のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。次いで細胞を完全細胞成長培地中に１０／１〜５／１の比で分散させた。分散した細胞及び培地をその後直ぐに、約１５００ｒｐｍで約５分間にわたって遠心分離し、さらにＰＢＳで２回洗浄し、細胞を氷上に保存した。
４．  次いで、細胞をガラススライド上に伝統的な形式で置き、そして血球計を使用してカウントした。
５．  次いでトリパン−ブルー染色剤を添加することにより死細胞を識別し、続いてこれらを排除した。具体的には、トリパン−ブルー溶液を使用して細胞を約１：１比で混合した。トリパン−ブルーをＰＢＳ中約０．８ｍＭまで希釈した。トリパン−ブルーを室温で保存した。全ての生細胞又は生存細胞はトリパン−ブルーを排除するので、死細胞が色素によって青色に染色される。従って、青色に染色された全ての細胞を除去した。約３００μＬが約３×１０6個の腫瘍成長細胞を含有するように、細胞を懸濁した。この細胞濃度は、それぞれの注射部位において腫瘍成長の成功のために必要とされた。
【０３８７】
ｂ）  腫瘍細胞の注射及び成長
１．  腫瘍細胞の調製と同時に、予め到着しているBalb/Cマウスの健康状態をチェックした。
２．  全ての動物を少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  全てのマウスは接種時に約６〜８週齢であった。接種前に接種領域をエタノールで清浄化して滅菌した。
４．  ニードル無しのシリンジ内に細胞混合物を引き込むことによって、１ｃｃシリンジを癌細胞で充填した。次いでシリンジに２６ゲージのニードルを付加した。
５．  各マウスの一方の下脇腹内に細胞を皮下注射し、そして平均体積が約５０〜６０ｍｍ3に達する腫瘍を形成するまで、これらの細胞を成長させておいた。
６．  次いでマウスに麻酔を施し、そして外科用メスによって腫瘍を収穫し、そして受容マウスに注射する前に適切に保存した。
【０３８８】
プロトコルＢ：供与マウスから受容マウスへの腫瘍の挿入
１．  付加的なBalb/C受容マウスが予め到着している。受容マウスの到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有の耳標でナンバリングした。
２．  受容マウスを少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  上記プロトコルＡで生成されたＨＣＴ１１６腫瘍を外科用メスによって供与マウスから取り出し、そして約２ｍｍ3のサイズの小さな断片にカットした。３ｍｍ直径のトロカールシリンジを使用して、２ｍｍ3の腫瘍を各マウスの左右の脇腹内に移植した（すなわち１脇腹当たり１腫瘍）。０日目に治療が開始される前にサイズが約１００〜２００ｍｍ3に達するまで、腫瘍を受容マウス内で成長させておいた。治療は２４日間にわたって、或いはマウスが試験から除去され安楽死させられるか又はマウスが死亡するまで続いた。
４．  ２４日目の試験終了まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を毎日割り出した。
【０３８９】
図３３ａ及び３３ｂは経口試験の結果をグラフで示す。図３３ａは、異なる化合物間で、時間の関数として、測定腫瘍体積が明確に異なることを示している。腫瘍が小さければ小さいほどよい。さらに、図３３ｂは、異なる化合物間で、時間の関数として、平均マウス体重が異なることを示している。体重が重ければ重いほどよい。
【０３９０】
表２９は、マウスが試験から除去された数及び試験中の時点を要約する。マウスが試験から離れた理由は主として死亡したこと、及び腫瘍サイズが大きい結果安楽死させられたことである。試料ＩＤは、本明細書中で前述した手順に従って製造された化合物に関連する。
【表２９】
2014518847.tif 000034
【０３９１】
例２０ｂ
マウスにおける異種移植癌試験−ＨＣＴ１１６腫瘍内投与
概要
この例は、マウス異種移植癌モデルにおいて腫瘍内（ＩＴ）投与された本発明のいくつかの金属ナノ結晶懸濁液の効果を実証する。雌Balb/C免疫不全受容マウス（６〜８週齢）に腫瘍を移植した。Balb/C供与マウスを使用してＨＣＴ１１６腫瘍を成長させた。これらの腫瘍を供与マウスから切除し、続いて切断してサイズ約２ｍｍ3の小片にした。Balb/C受容マウスに短時間の全身麻酔を施し、次いで、供与マウスに由来する１つのＨＣＴ１１６  ２ｍｍ3腫瘍断片を、トロカールニードルを使用して受容マウスの左右の脇腹のそれぞれに移植した。受容マウスにおける腫瘍が、各マウス皮膚に当てられたキャリパーによって測定して約７×７ｍｍに達したら、受容マウスを１群当たり３匹の治療群にランダムに入れ、「ＩＴ」治療を開始した。治療は専らニードル注射によって腫瘍内に１日２回行った。腫瘍のサイズをキャリパー対を使用して１週当たり５回評価し、マウスの体重も秤によって得た。このような測定は、マウスが死亡する（又は試験から取り除かれる）まで、又は試験が３０日目に終わるまで行った。この例の結果を図３４ａ〜３４ｂに要約する。
【０３９２】
所定の比較ナノ結晶懸濁液及びイオン溶液を調製することにより、バイメタルＡｕ−Ｐｔナノ結晶懸濁液と比較した。
【０３９３】
手短に述べると、ＧＢ−２１８を例１と同様に調製した。その結果、ＡＡＳによって測定した金濃度は７．６ｐｐｍであった。加えて前記溶液は、Viscotekによって測定した流体力学半径が１５．１ｎｍであることが判った。ＧＢ−２１９を例１と同様に調製した。ここでは重炭酸ナトリウムの代わりに、水酸化カリウムを処理増強剤として濃度０．６３ｇ／ガロン（すなわち例えば０．１７ｍｇ／ｍＬ）で使用した。ＧＢ−２１９は、ＡＡＳによって測定して金濃度が８．７ｐｐｍであった。加えて、前記溶液は、Viscotekによって測定した流体力学半径が１８．３ｎｍであることが判った。
加えて、ＰＢ−３９を例１３のＰＢ５７００１の例と同様に調製した。その結果、Ｐｔ濃度７．４ｐｐｍのナノ結晶白金粒子の懸濁液が生じた。ＰＢ−２２−Ｃ４を例１３と同様に調製した。ここでは５０１ＡＣの印加周波数を５Ｈｚの代わりに８０Ｈｚに設定することにより、主としてＰｔイオン種から成り、これとともに少量のＰｔナノ結晶種を含む溶液を生成した。重炭酸ナトリウムの濃度は２．５ｇ／ガロン（すなわち約０．６６ｍｇ／ｍＬ）であった。続いて電気ホットプレートを使用してＰＢ−２２−Ｃ４を濃縮することにより、約８．３ｐｐｍのＰｔ濃度を生成した。
【０３９４】
方法
動物
種：    マウス
系統：  Balb/C免疫不全マウス
源：    Harlan
性別及び数：     雌、２４
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別番号を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、特定病原体を持たない（ｓｐｆ）条件下で３匹から成る群に分けて動物を収容した。使用前の少なくとも７２時間にわたって標準的な畜舎条件下で動物を均衡化した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり３匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び１２時間明暗サイクルを確保した。
食餌：  保持期間、順化期間、及び投与後期間全体を通して、照射ペレット食餌及び水を随時利用可能にした。
【０３９５】
化合物及び試薬
ＨＣＴ  １１６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）
リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）
試験化合物：白金ナノ結晶懸濁液、金ナノ結晶懸濁液、及びＡｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液
陽性対照化合物：シスプラチン
陰性対照化合物：飲用水
【０３９６】
処理群及び投与
陰性対照群１：０〜３０日目に全部で１００μｌの生理食塩水を１日２回、２〜３注射点に分けてそれぞれの腫瘍内に注射した（通常の飲用水を与えた）。
陽性対照群２：０〜３０日目に８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを１日１回、腹膜（ＩＰ）内に注射した（通常の飲用水を与えた）。
治療群３〜６：０〜３０日目に全部で１００μｌのナノ結晶製剤を１日２回、２〜３注射点に分けてそれぞれの腫瘍内に注射した（通常の飲用水を与えた）。
【０３９７】
プロトコルＡ：供与腫瘍の調製及び成長
ａ）腫瘍細胞の調製
１．  細胞を完全培地内で成長させ、全ての汚染物質を排除した。
２．  細胞が約７０〜８０％融合したら、収穫前の約３〜４時間にわたって、古い細胞成長培地を新鮮な細胞成長培地と置き換えることにより、死細胞及び／又は分離細胞を除去した。
３．  細胞成長培地をもう一度除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで少量（例えば１０ｍｌ）のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。次いで細胞を完全細胞成長培地中に１０／１〜５／１の比で分散させた。分散した細胞及び培地をその後直ぐに、約１５００ｒｐｍで約５分間にわたって遠心分離し、さらにＰＢＳで２回洗浄し、細胞を氷上に保存した。
４．  次いで、細胞をガラススライド上に伝統的な形式で置き、そして血球計を使用してカウントした。
５．  次いでトリパン−ブルー染色剤を添加することにより死細胞を識別し、続いてこれらを排除した。具体的には、トリパン−ブルー溶液を使用して細胞を約１：１比で混合した。トリパン−ブルーをＰＢＳ中約０．８ｍＭまで希釈した。トリパン−ブルーを室温で保存した。全ての生細胞又は生存細胞はトリパン−ブルーを排除するので、死細胞が色素によって青色に染色される。従って、青色に染色された全ての細胞を除去した。約３００μＬが約３×１０6個の腫瘍成長細胞を含有するように、細胞を懸濁した。この細胞濃度は、それぞれの注射部位において腫瘍成長の成功のために必要とされた。
【０３９８】
ｂ）  腫瘍細胞の注射及び成長
１．  腫瘍細胞の調製と同時に、予め到着しているBalb/Cマウスの健康状態をチェックした。
２．  全ての動物を少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  全てのマウスは接種時に約６〜８週齢であった。接種前に接種領域をエタノールで清浄化して滅菌した。
４．  ニードル無しのシリンジ内に細胞混合物を引き込むことによって、１ｃｃシリンジを癌細胞で充填した。次いでシリンジに２６ゲージのニードルを付加した。
５．  各マウスの一方の下脇腹内に細胞を皮下注射し、そして平均体積が約５０〜６０ｍｍ3に達する腫瘍を形成するまで、これらの細胞を成長させておいた。
６．  次いでマウスに麻酔を施し、そして外科用メスによって腫瘍を収穫し、そして受容マウスに注射する前に適切に保存した。
【０３９９】
プロトコルＢ：供与マウスから受容マウスへの腫瘍の挿入
５．  付加的なBalb/C受容マウスが予め到着している。受容マウスの到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有の耳標でナンバリングした。
６．  マウスを少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
７．  上記プロトコルＡで生成されたＨＣＴ１１６腫瘍を外科用メスによって供与マウスから取り出し、そして約２ｍｍ3のサイズの小さな断片にカットした。３ｍｍ直径のトロカールシリンジを使用して、２ｍｍ3の腫瘍を各マウスの左右の脇腹内に移植した（すなわち１脇腹当たり１腫瘍）。０日目に治療が開始される前にサイズが約７×７ｍｍに達するまで、腫瘍を受容マウス内で成長させておいた。治療は３０日間にわたって、或いはマウスが試験から除去され安楽死させられるか又はマウスが死亡するまで続いた。
８．  ２４日目の試験終了まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を毎日割り出した。
【０４００】
プロトコルＣ：受容マウス内への腫瘍内注射
１．  それぞれの受容マウスにおける各腫瘍に、約１００μｌの陰性対照、陽性対照、及び試験化合物を１日に２回（約１２時間おきに）注射した。注射のために使用されたニードルは２５Ｇａ又は２６Ｇａニードルであった。腫瘍サイズに応じて、各腫瘍毎に２又は３つの注射点があった。
【０４０１】
図３４ａ及び３４ｂはＩＴ試験の結果をグラフで示す。図３４ａは、異なる化合物間で、時間の関数として、測定腫瘍体積が明確に異なることを示している。腫瘍が小さければ小さいほどよい。さらに、図３４ｂは、異なる化合物間で、時間の関数として、平均マウス体重が異なることを示している。体重が重ければ重いほどよい。
【０４０２】
表３０は、マウスが試験から除去された数及び試験中の時点を要約する。マウスが試験から離れた理由は主として死亡したこと、及び腫瘍サイズが大きい結果安楽死させられたことである。試料ＩＤは、本明細書中で前述した手順に従って製造された化合物に関連する。
【表３０】
2014518847.tif 000035
【０４０３】
例２０ｃ
マウスにおける異種移植癌試験−ＨＣＴ１１６経口投与
概要
この例は、マウス異種移植癌モデルにおいて経口投与された本発明の４種の金属ナノ結晶懸濁液の相対効果を実証する。雌Balb/C免疫不全受容マウス（６〜８週齢）に腫瘍を移植した。Balb/C供与マウスを使用してＨＣＴ１１６腫瘍を成長させた。これらの腫瘍を供与マウスから切除し、続いて切断してサイズ約２ｍｍ3の小片にした。Balb/C受容マウスに短時間の全身麻酔を施し、次いで、供与マウスに由来する１つのＨＣＴ１１６  ２ｍｍ3腫瘍断片を、トロカールニードルを使用して受容マウスの左右の脇腹のそれぞれに移植した。受容マウスにおける腫瘍が、各マウス皮膚に当てられたキャリパーによって測定して約４×４ｍｍに達したら、受容マウスを１群当たり６匹の治療群にランダムに入れ、経口治療を開始した。６マウスは陽性対照群（シスプラチン）に入り、６マウスは陰性対照群に入って水だけを受容した（対照）。治療は専ら、各群内のマウス間で共有される飲用瓶を介して行った。シスプラチンは０日目に腹腔内注射によって与えた。腫瘍のサイズをキャリパー対を使用して１週当たり５回評価し、マウスの体重も秤によって得た。このような測定は、マウスが死亡する（又は試験から取り除かれる）まで、又は試験がスケジュール通りに終わるまで行った。この例の結果を図３５ａ〜３５ｂに要約する。
【０４０４】
方法
動物
種：    マウス
系統：  Balb/C免疫不全マウス
源：    Harlan
性別及び数：     雌、３６
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別番号を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、特定病原体を持たない（ｓｐｆ）条件下で３匹から成る群に分けて動物を収容した。使用前の少なくとも７２時間にわたって標準的な畜舎条件下で動物を均衡化した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり３匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び１２時間明暗サイクルを確保した。
食餌：  保持期間、順化期間、及び投与後期間全体を通して、照射ペレット食餌及び水を随時利用可能にした。
【０４０５】
化合物及び試薬
ＨＣＴ  １１６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）
リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）
試験化合物：白金ナノ結晶懸濁液、金ナノ結晶懸濁液、及びＡｕ−Ｐｔバイメタル懸濁液
陽性対照化合物：シスプラチン
陰性対照化合物：飲用水
【０４０６】
処理群及び投与
陰性対照群１：０〜２４日目に通常の飲用水を与えた。
陽性対照群２：０〜２４日目に通常の飲用水を与え、そして１回限りの投与量８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを０日目に腹腔内注射（ＩＰ）によって与えた。
治療群３〜６：０〜２４日目に試験化合物を飲用水として与えた。
【０４０７】
プロトコルＡ：供与腫瘍の調製及び成長
ａ）腫瘍細胞の調製
１．  細胞を完全培地内で成長させ、全ての汚染物質を排除した。
２．  細胞が約７０〜８０％融合したら、収穫前の約３〜４時間にわたって、古い細胞成長培地を新鮮な細胞成長培地と置き換えることにより、死細胞及び／又は分離細胞を除去した。
３．  細胞成長培地をもう一度除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで少量（例えば１０ｍｌ）のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。次いで細胞を完全細胞成長培地中に１０／１〜５／１の比で分散させた。分散した細胞及び培地をその後直ぐに、約１５００ｒｐｍで約５分間にわたって遠心分離し、さらにＰＢＳで２回洗浄し、細胞を氷上に保存した。
４．  次いで、細胞をガラススライド上に伝統的な形式で置き、そして血球計を使用してカウントした。
５．  次いでトリパン−ブルー染色剤を添加することにより死細胞を識別し、続いてこれらを排除した。具体的には、トリパン−ブルー溶液を使用して細胞を約１：１比で混合した。トリパン−ブルーをＰＢＳ中約０．８ｍＭまで希釈した。トリパン−ブルーを室温で保存した。全ての生細胞又は生存細胞はトリパン−ブルーを排除するので、死細胞が色素によって青色に染色される。従って、青色に染色された全ての細胞を除去した。約３００μＬが約３×１０6個の腫瘍成長細胞を含有するように、細胞を懸濁した。この細胞濃度は、それぞれの注射部位において腫瘍成長の成功のために必要とされた。
【０４０８】
ｂ）  腫瘍細胞の注射及び成長
１．  腫瘍細胞の調製と同時に、予め到着しているBalb/Cマウスの健康状態をチェックした。
２．  全ての動物を少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  全てのマウスは接種時に約６〜８週齢であった。接種前に接種領域をエタノールで清浄化して滅菌した。
４．  ニードル無しのシリンジ内に細胞混合物を引き込むことによって、１ｃｃシリンジを癌細胞で充填した。次いでシリンジに２６ゲージのニードルを付加した。
５．  各マウスの一方の下脇腹内に細胞を皮下注射し、そして平均体積が約５０〜６０ｍｍ3に達する腫瘍を形成するまで、これらの細胞を成長させておいた。
６．  次いでマウスに麻酔を施し、そして外科用メスによって腫瘍を収穫し、そして受容マウスに注射する前に適切に保存した。
【０４０９】
プロトコルＢ：供与マウスから受容マウスへの腫瘍の挿入
９．  付加的なBalb/C受容マウスが予め到着している。受容マウスの到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有の耳標でナンバリングした。
１０．  受容マウスを少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
１１．  上記プロトコルＡで生成されたＨＣＴ１１６腫瘍を外科用メスによって供与マウスから取り出し、そして約２ｍｍ3のサイズの小さな断片にカットした。３ｍｍ直径のトロカールシリンジを使用して、２ｍｍ3の腫瘍を各マウスの左右の脇腹内に移植した（すなわち１脇腹当たり１腫瘍）。０日目に治療が開始される前にサイズが約１００〜２００ｍｍ3に達するまで、腫瘍を受容マウス内で成長させておいた。治療は２４日間にわたって、或いはマウスが試験から除去され安楽死させられるか又はマウスが死亡するまで続いた。
１２．  ２４日目の試験終了まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を毎日割り出した。
【０４１０】
図３５ａ及び３５ｂは経口試験の結果をグラフで示す。図３５ａは、異なる化合物間で、時間の関数として、測定腫瘍体積が明確に異なることを示している。腫瘍が小さければ小さいほどよい。さらに、図３５ｂは、異なる化合物間で、時間の関数として、平均マウス体重が異なることを示している。体重が重ければ重いほどよい。
【０４１１】
表３１は、マウスが試験から除去された数及び試験中の時点を要約する。マウスが試験から離れた理由は主として死亡したこと、及び腫瘍サイズが大きい結果安楽死させられたことである。試料ＩＤは、本明細書中で前述した手順に従って製造された化合物に関連する。
【表３１】
2014518847.tif 000036
【０４１２】
表３２は、試験におけるそれぞれの群ごとの倍加時間（ＲＴＶ２）を比較する。加えて表３２は、成長遅延（日数）、最大パーセント体重損失率、及び統計的有意性をも挙げている。
【表３２】
2014518847.tif 000037
【０４１３】
例２０ｄ
マウスにおける異種移植癌試験−ＨＣＴ１１６経口投与
概要
この例は、マウス異種移植癌モデルにおいて経口投与された本発明の３種の金属ナノ結晶懸濁液のシスプラチンに対する相対効果を実証する。雌Balb/C免疫不全受容マウス（６〜８週齢）に腫瘍を移植した。Balb/C供与マウスを使用してＨＣＴ１１６腫瘍を成長させた。これらの腫瘍を供与マウスから切除し、続いて切断してサイズ約２ｍｍ3の小片にした。Balb/C受容マウスに短時間の全身麻酔を施し、次いで、供与マウスに由来する１つのＨＣＴ１１６  ２ｍｍ3腫瘍断片を、トロカールニードルを使用して受容マウスの左右の脇腹のそれぞれに移植した。受容マウスにおける腫瘍が、各マウス皮膚に当てられたキャリパーによって測定して約４×４ｍｍに達したら、受容マウスを１群当たり８匹の治療群にランダムに入れ、経口治療を開始した。８マウスは陽性対照群（シスプラチン）に入り、８マウスは陰性対照群に入って水だけを受容した（対照）。治療は専ら、各群内のマウス間で共有される飲用瓶を介して行った。シスプラチンは０日目に腹腔内注射によって与えた。腫瘍のサイズをキャリパー対を使用して１週当たり５回評価し、マウスの体重も秤によって得た。このような測定は、マウスが死亡する（又は試験から取り除かれる）まで、又は試験がスケジュール通りに終わるまで行った。この例の結果を図３６ａ〜３６ｂに要約する。
【０４１４】
方法
動物
種：    マウス
系統：  Balb/C免疫不全マウス
源：    Harlan
性別及び数：     雌、３６
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別番号を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、特定病原体を持たない（ｓｐｆ）条件下で３匹から成る群に分けて動物を収容した。使用前の少なくとも７２時間にわたって標準的な畜舎条件下で動物を均衡化した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり３匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び１２時間明暗サイクルを確保した。
食餌：  保持期間、順化期間、及び投与後期間全体を通して、照射ペレット食餌及び水を随時利用可能にした。
【０４１５】
化合物及び試薬
ＨＣＴ  １１６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）
リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）
試験化合物：Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液
陽性対照化合物：シスプラチン
陰性対照化合物：飲用水
【０４１６】
処理群及び投与
陰性対照群１：０〜２１日目に通常の飲用水を与えた。
陽性対照群２：０〜２１日目に通常の飲用水を与え、そして１回限りの投与量８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを０日目に腹腔内注射（ＩＰ）によって与えた。
治療群３〜５：０〜２１日目に試験化合物を飲用水として与えた。
【０４１７】
プロトコルＡ：供与腫瘍の調製及び成長
ａ）腫瘍細胞の調製
１．  細胞を完全培地内で成長させ、全ての汚染物質を排除した。
２．  細胞が約７０〜８０％融合したら、収穫前の約３〜４時間にわたって、古い細胞成長培地を新鮮な細胞成長培地と置き換えることにより、死細胞及び／又は分離細胞を除去した。
３．  細胞成長培地をもう一度除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで少量（例えば１０ｍｌ）のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。次いで細胞を完全細胞成長培地中に１０／１〜５／１の比で分散させた。分散した細胞及び培地をその後直ぐに、約１５００ｒｐｍで約５分間にわたって遠心分離し、さらにＰＢＳで２回洗浄し、細胞を氷上に保存した。
４．  次いで、細胞をガラススライド上に伝統的な形式で置き、そして血球計を使用してカウントした。
５．  次いでトリパン−ブルー染色剤を添加することにより死細胞を識別し、続いてこれらを排除した。具体的には、トリパン−ブルー溶液を使用して細胞を約１：１比で混合した。トリパン−ブルーをＰＢＳ中約０．８ｍＭまで希釈した。トリパン−ブルーを室温で保存した。全ての生細胞又は生存細胞はトリパン−ブルーを排除するので、死細胞が色素によって青色に染色される。従って、青色に染色された全ての細胞を除去した。約３００μＬが約３×１０6個の腫瘍成長細胞を含有するように、細胞を懸濁した。この細胞濃度は、それぞれの注射部位において腫瘍成長の成功のために必要とされた。
【０４１８】
ｂ）  腫瘍細胞の注射及び成長
１．  腫瘍細胞の調製と同時に、予め到着しているBalb/Cマウスの健康状態をチェックした。
２．  全ての動物を少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  全てのマウスは接種時に約６〜８週齢であった。接種前に接種領域をエタノールで清浄化して滅菌した。
４．  ニードル無しのシリンジ内に細胞混合物を引き込むことによって、１ｃｃシリンジを癌細胞で充填した。次いでシリンジに２６ゲージのニードルを付加した。
５．  各マウスの一方の下脇腹内に細胞を皮下注射し、そして平均体積が約５０〜６０ｍｍ3に達する腫瘍を形成するまで、これらの細胞を成長させておいた。
６．  次いでマウスに麻酔を施し、そして外科用メスによって腫瘍を収穫し、そして受容マウスに注射する前に適切に保存した。
【０４１９】
プロトコルＢ：供与マウスから受容マウスへの腫瘍の挿入
１３．  付加的なBalb/C受容マウスが予め到着している。受容マウスの到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有の耳標でナンバリングした。
１４．  受容マウスを少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
１５．  上記プロトコルＡで生成されたＨＣＴ１１６腫瘍を外科用メスによって供与マウスから取り出し、そして約２ｍｍ3のサイズの小さな断片にカットした。３ｍｍ直径のトロカールシリンジを使用して、２ｍｍ3の腫瘍を各マウスの左右の脇腹内に移植した（すなわち１脇腹当たり１腫瘍）。０日目に治療が開始される前にサイズが約１００〜２００ｍｍ3に達するまで、腫瘍を受容マウス内で成長させておいた。治療は２１日間にわたって、或いはマウスが試験から除去され安楽死させられるか又はマウスが死亡するまで続いた。
１６．  ２１日目の試験終了まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を毎日割り出した。
【０４２０】
図３６ａ及び３６ｂは経口試験の結果をグラフで示す。図３６ａは、異なる化合物間で、時間の関数として、測定腫瘍体積が明確に異なることを示している。腫瘍が小さければ小さいほどよい。さらに、図３６ｂは、異なる化合物間で、時間の関数として、平均マウス体重が異なることを示している。体重が重ければ重いほどよい。
【０４２１】
表３３は、マウスが試験から除去された数及び試験中の時点を要約する。マウスが試験から離れた理由は主として死亡したこと、及び腫瘍サイズが大きい結果安楽死させられたことである。試料ＩＤは、本明細書中で前述した手順に従って製造された化合物に関連する。
【表３３】
2014518847.tif 000038
【０４２２】
表３４は、試験におけるそれぞれの群ごとの倍加時間（ＲＴＶ２）を比較する。加えて表３４は、成長遅延（日数）、最大パーセント体重損失率、及び統計的有意性をも挙げている。
【表３４】
2014518847.tif 000039
【０４２３】
例２０ｅ
マウスにおける異種移植癌試験−ＨＣＴ４６０経口投与
概要
この例は、マウス異種移植癌モデルにおいて経口投与された本発明の３種のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液のシスプラチンに対する相対効果を実証する。雌Balb/C免疫不全受容マウス（６〜８週齢）に腫瘍を移植した。Balb/C供与マウスを使用してＨＣＴ４６０腫瘍を成長させた。これらの腫瘍を供与マウスから切除し、続いて切断してサイズ約２ｍｍ3の小片にした。Balb/C受容マウスに短時間の全身麻酔を施し、次いで、供与マウスに由来する１つのＨ４６０  ２ｍｍ3腫瘍断片を、トロカールニードルを使用して受容マウスの左右の脇腹のそれぞれに移植した。受容マウスにおける腫瘍が、各マウス皮膚に当てられたキャリパーによって測定して約４×４ｍｍに達したら、受容マウスを１群当たり８匹の治療群にランダムに入れ、経口治療を開始した。８マウスは陽性対照群（シスプラチン）に入り、８マウスは陰性対照群に入って水だけを受容した（対照）。治療は専ら、各群内のマウス間で共有される飲用瓶を介して行った。シスプラチンは０日目に腹腔内注射によって与えた。腫瘍のサイズをキャリパー対を使用して１週当たり５回評価し、マウスの体重も秤によって得た。このような測定は、マウスが死亡する（又は試験から取り除かれる）まで、又は試験がスケジュール通りに終わるまで行った。この例の結果を図３７ａ〜３７ｂに要約する。
【０４２４】
方法
動物
種：    マウス
系統：  Balb/C免疫不全マウス
源：    Harlan
性別及び数：     雌、３６
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別番号を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、特定病原体を持たない（ｓｐｆ）条件下で３匹から成る群に分けて動物を収容した。使用前の少なくとも７２時間にわたって標準的な畜舎条件下で動物を均衡化した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり３匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び１２時間明暗サイクルを確保した。
食餌：  保持期間、順化期間、及び投与後期間全体を通して、照射ペレット食餌及び水を随時利用可能にした。
【０４２５】
化合物及び試薬
Ｈ４６０細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７７）
リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）
試験化合物：Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液
陽性対照化合物：シスプラチン
陰性対照化合物：飲用水
【０４２６】
処理群及び投与
陰性対照群１：０〜２１日目に通常の飲用水を与えた。
陽性対照群２：０〜２１日目に通常の飲用水を与え、そして１回限りの投与量８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを０日目に腹腔内注射（ＩＰ）によって与えた。
治療群３〜５：０〜２１日目に試験化合物を飲用水として与えた。
【０４２７】
プロトコルＡ：供与腫瘍の調製及び成長
ａ）腫瘍細胞の調製
１．  細胞を完全培地内で成長させ、全ての汚染物質を排除した。
２．  細胞が約７０〜８０％融合したら、収穫前の約３〜４時間にわたって、古い細胞成長培地を新鮮な細胞成長培地と置き換えることにより、死細胞及び／又は分離細胞を除去した。
３．  細胞成長培地をもう一度除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで少量（例えば１０ｍｌ）のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。次いで細胞を完全細胞成長培地中に１０／１〜５／１の比で分散させた。分散した細胞及び培地をその後直ぐに、約１５００ｒｐｍで約５分間にわたって遠心分離し、さらにＰＢＳで２回洗浄し、細胞を氷上に保存した。
４．  次いで、細胞をガラススライド上に伝統的な形式で置き、そして血球計を使用してカウントした。
５．  次いでトリパン−ブルー染色剤を添加することにより死細胞を識別し、続いてこれらを排除した。具体的には、トリパン−ブルー溶液を使用して細胞を約１：１比で混合した。トリパン−ブルーをＰＢＳ中約０．８ｍＭまで希釈した。トリパン−ブルーを室温で保存した。全ての生細胞又は生存細胞はトリパン−ブルーを排除するので、死細胞が色素によって青色に染色される。従って、青色に染色された全ての細胞を除去した。約３００μＬが約３×１０6個の腫瘍成長細胞を含有するように、細胞を懸濁した。この細胞濃度は、それぞれの注射部位において腫瘍成長の成功のために必要とされた。
【０４２８】
ｂ）  腫瘍細胞の注射及び成長
１．  腫瘍細胞の調製と同時に、予め到着しているBalb/Cマウスの健康状態をチェックした。
２．  全ての動物を少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  全てのマウスは接種時に約６〜８週齢であった。接種前に接種領域をエタノールで清浄化して滅菌した。
４．  ニードル無しのシリンジ内に細胞混合物を引き込むことによって、１ｃｃシリンジを癌細胞で充填した。次いでシリンジに２６ゲージのニードルを付加した。
５．  各マウスの一方の下脇腹内に細胞を皮下注射し、そして平均体積が約５０〜６０ｍｍ3に達する腫瘍を形成するまで、これらの細胞を成長させておいた。
６．  次いでマウスに麻酔を施し、そして外科用メスによって腫瘍を収穫し、そして受容マウスに注射する前に適切に保存した。
【０４２９】
プロトコルＢ：供与マウスから受容マウスへの腫瘍の挿入
１７．  付加的なBalb/C受容マウスが予め到着している。受容マウスの到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有の耳標でナンバリングした。
１８．  受容マウスを少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
１９．  上記プロトコルＡで生成されたＨ４６０腫瘍を外科用メスによって供与マウスから取り出し、そして約２ｍｍ3のサイズの小さな断片にカットした。３ｍｍ直径のトロカールシリンジを使用して、２ｍｍ3の腫瘍を各マウスの左右の脇腹内に移植した（すなわち１脇腹当たり１腫瘍）。０日目に治療が開始される前にサイズが約１００〜２００ｍｍ3に達するまで、腫瘍を受容マウス内で成長させておいた。治療は２４日間にわたって、或いはマウスが試験から除去され安楽死させられるか又はマウスが死亡するまで続いた。
２０．  ２１日目の試験終了まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を毎日割り出した。
【０４３０】
図３７ａ及び３７ｂは経口試験の結果をグラフで示す。図３７ａは、異なる化合物間で、時間の関数として、測定腫瘍体積が明確に異なることを示している。腫瘍が小さければ小さいほどよい。さらに、図３７ｂは、異なる化合物間で、時間の関数として、平均マウス体重が異なることを示している。体重が重ければ重いほどよい。
【０４３１】
表３５は、マウスが試験から除去された数及び試験中の時点を要約する。マウスが試験から離れた理由は主として死亡したこと、及び腫瘍サイズが大きい結果安楽死させられたことである。試料ＩＤは、本明細書中で前述した手順に従って製造された化合物に関連する。
【表３５】
2014518847.tif 000040
【０４３２】
表３６は、試験におけるそれぞれの群ごとの倍加時間（ＲＴＶ２）を比較する。加えて表３６は、成長遅延（日数）、最大パーセント体重損失率、及び統計的有意性をも挙げている。
【表３６】
2014518847.tif 000041
【０４３３】
例２０ｆ
マウスにおける異種移植癌試験−ＨＣＴ１１６経口投与
概要
この例は、マウス異種移植癌モデルにおいて経口投与された本発明の１種のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液のシスプラチンに対する相対効果を実証する。雌Balb/C免疫不全受容マウス（６〜８週齢）に腫瘍を移植した。Balb/C供与マウスを使用してＨＣＴ１１６腫瘍を成長させた。これらの腫瘍を供与マウスから切除し、続いて切断してサイズ約２ｍｍ3の小片にした。Balb/C受容マウスに短時間の全身麻酔を施し、次いで、供与マウスに由来する１つのＨＣＴ１１６  ２ｍｍ3腫瘍断片を、トロカールニードルを使用して受容マウスの左右の脇腹のそれぞれに移植した。受容マウスにおける腫瘍が、各マウス皮膚に当てられたキャリパーによって測定して約４×４ｍｍに達したら、受容マウスを１群当たり８匹の治療群にランダムに入れ、経口治療を開始した。８マウスは陽性対照群（シスプラチン）に入り、８マウスは陰性対照群に入って水だけを受容した（対照）。治療は専ら、各群内のマウス間で共有される飲用瓶を介して行った。シスプラチンは０日目に腹腔内注射によって与えた。腫瘍のサイズをキャリパー対を使用して１週当たり５回評価し、マウスの体重も秤によって得た。このような測定は、マウスが死亡する（又は試験から取り除かれる）まで、又は試験がスケジュール通りに終わるまで行った。この例の結果を図３８ａ〜３８ｂに要約する。
【０４３４】
方法
動物
種：    マウス
系統：  Balb/C免疫不全マウス
源：    Harlan
性別及び数：     雌、３６
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別番号を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、特定病原体を持たない（ｓｐｆ）条件下で３匹から成る群に分けて動物を収容した。使用前の少なくとも７２時間にわたって標準的な畜舎条件下で動物を均衡化した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり３匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び１２時間明暗サイクルを確保した。
食餌：  保持期間、順化期間、及び投与後期間全体を通して、照射ペレット食餌及び水を随時利用可能にした。
【０４３５】
化合物及び試薬
ＨＣＴ  １１６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）
リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）
試験化合物：金ナノ結晶懸濁液ＮＥ−２８−１０Ｘ（例１のＮＥ１０２１４と同等に製造されたＮＥ−２８）１０倍濃縮
陽性対照化合物：シスプラチン
陰性対照化合物：飲用水
【０４３６】
処理群及び投与
陰性対照群１：０〜２１日目に通常の飲用水を与えた。
陽性対照群２：０〜２１日目に通常の飲用水を与え、そして１回限りの投与量８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンを０日目に腹腔内注射（ＩＰ）によって与えた。
治療群３：０〜２１日目に試験化合物を飲用水として与えた。
【０４３７】
プロトコルＡ：供与腫瘍の調製及び成長
ａ）腫瘍細胞の調製
１．  細胞を完全培地内で成長させ、全ての汚染物質を排除した。
２．  細胞が約７０〜８０％融合したら、収穫前の約３〜４時間にわたって、古い細胞成長培地を新鮮な細胞成長培地と置き換えることにより、死細胞及び／又は分離細胞を除去した。
３．  細胞成長培地をもう一度除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで少量（例えば１０ｍｌ）のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。次いで細胞を完全細胞成長培地中に１０／１〜５／１の比で分散させた。分散した細胞及び培地をその後直ぐに、約１５００ｒｐｍで約５分間にわたって遠心分離し、さらにＰＢＳで２回洗浄し、細胞を氷上に保存した。
４．  次いで、細胞をガラススライド上に伝統的な形式で置き、そして血球計を使用してカウントした。
５．  次いでトリパン−ブルー染色剤を添加することにより死細胞を識別し、続いてこれらを排除した。具体的には、トリパン−ブルー溶液を使用して細胞を約１：１比で混合した。トリパン−ブルーをＰＢＳ中約０．８ｍＭまで希釈した。トリパン−ブルーを室温で保存した。全ての生細胞又は生存細胞はトリパン−ブルーを排除するので、死細胞が色素によって青色に染色される。従って、青色に染色された全ての細胞を除去した。約３００μＬが約３×１０6個の腫瘍成長細胞を含有するように、細胞を懸濁した。この細胞濃度は、それぞれの注射部位において腫瘍成長の成功のために必要とされた。
【０４３８】
ｂ）  腫瘍細胞の注射及び成長
１．  腫瘍細胞の調製と同時に、予め到着しているBalb/Cマウスの健康状態をチェックした。
２．  全ての動物を少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
３．  全てのマウスは接種時に約６〜８週齢であった。接種前に接種領域をエタノールで清浄化して滅菌した。
４．  ニードル無しのシリンジ内に細胞混合物を引き込むことによって、１ｃｃシリンジを癌細胞で充填した。次いでシリンジに２６ゲージのニードルを付加した。
５．  各マウスの一方の下脇腹内に細胞を皮下注射し、そして平均体積が約５０〜６０ｍｍ3に達する腫瘍を形成するまで、これらの細胞を成長させておいた。
６．  次いでマウスに麻酔を施し、そして外科用メスによって腫瘍を収穫し、そして受容マウスに注射する前に適切に保存した。
【０４３９】
プロトコルＢ：供与マウスから受容マウスへの腫瘍の挿入
２１．  付加的なBalb/C受容マウスが予め到着している。受容マウスの到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有の耳標でナンバリングした。
２２．  受容マウスを少なくとも７２時間にわたって順化させておいた。
２３．  上記プロトコルＡで生成されたＨＣＴ１１６腫瘍を外科用メスによって供与マウスから取り出し、そして約２ｍｍ3のサイズの小さな断片にカットした。３ｍｍ直径のトロカールシリンジを使用して、２ｍｍ3の腫瘍を各マウスの左右の脇腹内に移植した（すなわち１脇腹当たり１腫瘍）。０日目に治療が開始される前にサイズが約１００〜２００ｍｍ3に達するまで、腫瘍を受容マウス内で成長させておいた。治療は２１日間にわたって、或いはマウスが試験から除去され安楽死させられるか又はマウスが死亡するまで続いた。
２４．  ２１日目の試験終了まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を毎日割り出した。
【０４４０】
図３８ａ及び３８ｂは経口試験の結果をグラフで示す。図３８ａは、異なる化合物間で、時間の関数として、測定腫瘍体積が明確に異なることを示している。腫瘍が小さければ小さいほどよい。さらに、図３８ｂは、異なる化合物間で、時間の関数として、平均マウス体重が異なることを示している。体重が重ければ重いほどよい。
【０４４１】
表３７は、マウスが試験から除去された数及び試験中の時点を要約する。マウスが試験から離れた理由は主として死亡したこと、及び腫瘍サイズが大きい結果安楽死させられたことである。試料ＩＤは、本明細書中で前述した手順に従って製造された化合物に関連する。
【表３７】
2014518847.tif 000042
【０４４２】
表３８は、試験におけるそれぞれの群ごとの倍加時間（ＲＴＶ２）を比較する。加えて表３８は、成長遅延（日数）、最大パーセント体重損失率、及び統計的有意性をも挙げている。
【表３８】
2014518847.tif 000043
【０４４３】
例２１
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶製剤
ＧＰＢ−１５−１、ＧＰＢ−１５−２、及びＧＰＢ−０３０−０１の
マウス挙動及び生活の質に対する効果のin vivo試験
概要
このin vivo試験は、Ａｕ−Ｐｔナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−１５−１、ＧＰＢ−１５−２、及びＧＰＢ−０３０−０１の、Swiss Websterマウスの挙動及び生活の質に対する効果を見極めるように構成した。具体的には試験開始時（2011年6月17日）に４７日間にわたって雌マウスにＧＰＢ−１５−１を随意に与えた。ＧＰＢ−１５−２は2011年8月2日に開始して５６日間にわたって随意に与えた。ＧＰＢ−０３０−０１は2011年9月26日に開始して現在投与中である。３種の異なるバイメタルナノ結晶懸濁液を本明細書中のＰＧＴ２５と事実上同じ方法で同様に形成した。雌Swiss Websterマウスは2012年2月20日現在１４７日間にわたってＧＰＢ−０３０−０１を活発に飲んでいる。ＧＰＢ−０３０−０１は2011年9月26日に開始した。
【０４４４】
動物
種：    マウス
系統：  Swiss Webster ND4
源：    Harlan
性別及び数：     雌、１３
齢：    試験開始時週齢約６〜８
識別：  各マウスに固有の識別色を与えた。
飼育：  全ての動物を受け取ったときに健康障害の外的兆候に関して検査し、全ての不健康動物をさらなる評価から排除した。動物ユニットのサーモスタットでモニタリングされた室（２２±４℃）内に、通常飲用条件下で６及び７匹から成る群に分けて動物を収容した。この期間全体を通して動物の健康状態を監視し、そして試験開始前に試験使用に対するそれぞれの動物の適合性を評価した。
ハウジング：     制御された室内で１ケージ当たり６及び７匹から成る群で動物を収容することにより、試験期間にわたって正確な温度、湿度、及び週末の１２時間明暗サイクル、そして１週間の月曜から金曜には８時間明・１６時間暗を確保した。
食餌：  試験期間全体を通してRodent Diet 5002及びボトル入り水（例えばdeer park）又は金／白金ナノ結晶懸濁液を随意に利用可能である。ボトル入り水及びRodent Diet 5002だけは順化期間中に存在する。
【０４４５】
試薬
試験金／白金バイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−１５−１、ＧＰＢ−１５−２、及びＧＰＢ−０３０−０１（ＰＧＴ２４と同等）
ビヒクル：水
【０４４６】
処理群及び投与
対照「ケージ１」、処理「ケージ２」。各群の動物数はそれぞれ６及び７である。
ケージ１（対照）：０日目に通常飲用水を与え、０日目から８ヶ月目そして現在、通常のrodent Diet 5002を与えた。
ケージ２（治療）：金／白金バイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−１５−１（平均４．０ｍｌ  １ｄ；金ｐｐｍ：８．６，白金ｐｐｍ：２．３）を飲用水として、０日目〜４７日目に与えた。ＧＰＢ−１５−２（平均３．９ｍｌ  １ｄ；金ｐｐｍ：８．６，白金ｐｐｍ：２．３）を飲用水として、４８日目〜１０１日目に与えた。ＧＰＢ−０３０−０１（平均４．３ｍｌ  １ｄ；金ｐｐｍ：８．６，白金ｐｐｍ：２．５）を飲用水として、１０２日目から３９週間にわたって与えた。通常のRodent Diet 5002を０日目から３９週間にわたってマウスに与えた。
【０４４７】
プロトコル
動物の到着時に、全てのマウスの健康状態をチェックし、そして健康状態試験に合格した後、それぞれに固有のテイルマーキングで着色した。動物を少なくとも１週間にわたって順化させておいた。
【０４４８】
１３匹の動物を購入し、２つの１０ガロン・ガラスタンク内に隔離した。７匹の動物を治療群に、そして６匹の動物を対照群に入れた。
【０４４９】
濃度がＧＰＢ−１５−１では約８．６ｐｐｍのＡｕ及び２．３ｐｐｍのＰｔ、ＧＰＢ−１５−２では約８．６ｐｐｍのＡｕ及び２．３ｐｐｍのＰｔ、そしてＧＰＢ−０３０−０１では約８．６ｐｐｍのＡｕ及び２．５ｐｐｍのＰｔの懸濁液を得るように、金／白金バイメタルナノ結晶懸濁液を調製した。
【０４５０】
治療薬を毎日与えた。すなわち、2011年10月11日まで24時間毎に新しい懸濁液と代え、この日付後、懸濁液は４８時間毎に交換した。成長があったかどうかを見るために、試料の粒度を試験した。２４時間懸濁液交換期間中のデータを収集し、有意な成長効果が存在しなければ、次いで懸濁液を４８時間毎に交換した。
【０４５１】
全ての懸濁液をガラス瓶で投与することによって、プラスチック瓶の潜在的な影響を排除した。
【０４５２】
動物は金網カバーを備えた１０ガロン・ガラスタンク内に収容した。トウモロコシ穂軸ベッド材料（Andersons製のBed O' Cobs）を床材として用意した。１週間当たり１動物につき１つの巣（Ancareから購入）を与えた。動物は運動のためのホイール（Super Pet製のホイールの周りの８インチ直径のラン）、並びにハウジングユニット（Super Pet製のPet igloo）、及び認定Rodent Dietのためのプラスチック餌皿(Petcoプラスチック皿）にアクセスすることができた。
【０４５３】
ケージの掃除を毎週行い。この場合には、２時間以下の時間にわたって餌及び飲用溶液とともにプラスチック・シューボックス・ケージ内に収容する。各動物の体重を目盛付き天秤によって毎週測定した。認定５０ｇ錘を用いて天秤をチェックすることによりドラフトが生じていないことを保証した（Fisher Scientificから購入したScout pro 200g天秤）。
【０４５４】
動物の健康状態を毎日モニタリングした。
【０４５５】
結果
１．  全ての動物は良好な健康状態にあるように見え、2011年6月17日付けで試験開始して以来正常に挙動している。失われた動物はおらず、病気により試験から取り除かれた動物もいなかった。
２．  図３９ａは、３９週間にわたる、ケージ２（「治療」）のためのバイメタルＡｕ−Ｐｔナノ結晶懸濁液の平均消費量、及びケージ１（「対照」）内の対照飲用水の平均消費量を示している。
図３９ｂは、治療群２及び対照群１の平均体重増加を示している。
３．  液体消費量にも体重増加にも差は見られない。
【０４５６】
例２２
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−１１とゲノムＤＮＡ及びアルブミンとの結合のin vitro試験
概要
このin vitro試験は、Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−１１中のナノ結晶がゲノムＤＮＡ及び／又はアルブミンと結合し得るかどうか、そして優先的な結合があるかどうかを見極めるように構成された。ＧＰＢ−１１を、ヒト、マウス、又はウシのアルブミンの存在又は不在において、ヒト又はマウスのゲノムＤＮＡと一緒にインキュベートした。ＧＰＢ−１１と結合するＤＮＡ又はアルブミンは、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度分析によって定性的及び定量的に特徴づけた。
【０４５７】
アルブミンは既知の安定剤であり、水分散型ナノ粒子のための生体機能化層を提供することができた。金ナノ粒子とＤＮＡとの結合親和性は、ＤＮＡ転写に影響を与えることが判っている。アルブミンは、薬物送達を助けることも知られている。
【０４５８】
アルブミンをＧＰＢ−１１と一緒に結合バッファ中で約１時間にわたって室温でインキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡの不在又は存在において、アルブミンとＧＰＢ−１１との示差結合を見極めた。同様に、同じ温度、そして同じ結合バッファ中でゲノムＤＮＡをＧＰＢ−１１と一緒に約１時間にわたってインキュベートすることにより、アルブミンと一緒に又はアルブミンを伴わずに同時インキュベートした時のＤＮＡのＧＰＢ−１１との結合能力を測定した。反応を生じさせておいた後、ＧＰＢ−１１懸濁液をスピンダウンさせ、洗浄し、そして吸光度測定のために溶出緩衝液中に入れた。
【０４５９】
アルブミン又はＤＮＡのＧＰＢ−１１との結合能力を、Ａ２８０又はＡ２６０（例えばλ＝２８０又はλ＝２６０）の２０１−ＵＶ−ＶＩＳ分光計によってモニタリングした。２０１−ＵＶ−ＶＩＳに設けられた複光束Czerny-Turnerモノクロメーターシステム及びデュアル・シリコンフォトダイオードによって試料からの吸収スペクトルを取得した。ＧＰＢ−１１、アルブミン、及びＤＮＡのバックグラウンドを反応管から差し引いた。
【０４６０】
さらに、ＤＮＡとＧＰＢ−１１との相互作用を視覚化するために、高速走査原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）の設定を利用した。加えて、ナノスケール分解能タイプの走査プローブ顕微鏡法を用いて、相互作用の顕微鏡写真を撮影した。
【０４６１】
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶懸濁液ＧＰＢ−１１の濃縮
濃縮のために使用される設備及び材料
供給元   カタログNo.
エッペンドルフ   Brinkmann Instruments Inc 5417C w Rotor
遠心分離器
Zetasizer        Malvern     Nano-ZS90; Model:
Zen3690
1.5mlエッペンドルフ管    Fisher Scientific 05-402-24B
ピペットチップ   Fisher Scientific 02-681-140
ピペッター       Fisher Scientific 21-377-821
重炭酸ナトリウム Fisher Scientific 144-55-8
水酸化カリウム   Fisher Scientific 1310-58-3
【０４６２】
濃縮法
１．  ＧＰＢ−１１（原子濃度Ａｕ，８．２ｐｐｍ；及びＰｔ，２．５ｐｐｍ）をエッペンドルフ管内に入れ、約１０分間にわたって約２０，０００×ｇで遠心分離した。
２．  これらの管の底にペレットが明確に観察された。頂部９５％の上澄みを廃棄し、底部５％の上澄み及びペレットを収集した。次いで濃縮懸濁液を結合反応試験において再懸濁させた。
【０４６３】
濃縮ＧＰＢ−１１の再水和
濃縮ＧＰＢ−１１懸濁液を、２．７ｍＭ炭酸水素ナトリウムと２．１ｍＭ水酸化カリウムとを含有する、上記上澄みと同じ量の溶液中で再水和した。再水和ＧＰＢ−１１及び元のＧＰＢ−１１溶液のゼータ電位を、本明細書中の他の個所で論じられたZetasizerを使用して測定し、その結果はそれぞれ−５０．３ｍＶ及び−５１．７ｍＶであった。このような極めて類似したゼータ電位は、結合反応試験における濃縮ＧＰＢ−１１の再水和が、元の濃度のＧＰＢ−１１を添加したのと同じ効果を有することを暗示した。
【０４６４】
アルブミン又はゲノムＤＮＡと共ナノ結晶ＧＰＢ−１１の結合アッセイ
結合アッセイのための設備及び材料
供給元   カタログNo.
201-UV-VIS (UVcalc-bio)  Thermo spectronic  001201 
pH/導電率メーター  Fisher Scientific Accumet AR 20; ID
1928
Vortexミキサー   Fisher Scientific 02215365
ウシ血清アルブミン       Sigma Aldrich     A9418
マウス血清アルブミン     Sigma Aldrich     A3139
ヒト血清アルブミン       MP Biomedicals, LLC       191349
ヒトゲノムDNA(雌性）     Promega  G1521
イソプロピルアルコール   Sigma Aldrich     W292907
エタノール       Sigma Aldrich    459836
ウィザード・ゲノム       Promega  A1120
DNA生成キット
トリス塩基       Fisher Scientific 77-86-1
塩化カリウム(KCl)  Fisher Scientific 7447-40-7
塩化マグネシウム   Sigma Aldrich     M4880
(MgCl2)
IGEPAL(登録商標)CA-630   Sigma Aldrich     I8896
塩酸    Fisher Scientific 7647-01-0
水酸化ナトリウム(NaOH)   Fisher Scientific 1310-73-2
エチレンジアミン四酢酸   Acros Organics    60-00-4
(EDTA)
【０４６５】
マウス脾臓及びヒト全血からのゲノムＤＮＡの単離
マウス脾臓からのゲノムＤＮＡの単離
・  ６００μｌの冷却した核溶解溶液に１０ｍｇの解凍正常マウス脾臓を添加し、２０分間にわたって６５℃でインキュベートした。
・  ３μｌのＲＮａｓｅ溶液を組織核溶解物中に入れ、混合し、そして２５分間にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベート後、溶解物を室温まで冷ました。
・  ２００μｌのタンパク質沈殿物を組織溶解物と混合し、ボルテックス処理し、そして氷上で５分間にわたって冷却した。
・  上記混合物を１６０００×ｇで４分間にわたって遠心分離した。
・  遠心分離後、室温の６００μｌのイソプロパノールを含有する新鮮な管に上澄みを移し、そして反転させることにより静かに混合した。
・  上記反応混合物を１分間にわたって１６０００×ｇで遠心分離した。
・  上澄みを除去し、そしてペレットを室温の７０％エタノール６００μｌ中に再懸濁させ、そして１分間にわたって１６０００×ｇで遠心分離した。
・  エタノールを吸引し、ＤＮＡペレットを１５分間にわたって空気乾燥させた。
・  乾燥済ＤＮＡペレットを４℃で一晩にわたって１００μｌのＤＮＡ再水和溶液中で再水和した。
【０４６６】
ヒト全血からのゲノムＤＮＡの単離
・  ３ｍｌの正常ヒト雄性全血を９ｍｌの核溶解物と合体させ、反転させることにより混合し、そして室温で１０分間にわたってインキュベートした。
・  上記混合物を１０分間にわたって２０００×ｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、そしてペレットをボルテックス処理した。
・  上記ペレット上に３ｍｌの核溶解溶液を添加し、反転させることにより混合した。
・  上記核溶解物中に１ｍｌのタンパク質沈殿溶液を添加し、そして２０秒間にわたってボルテックス処理し、続いて１０分間にわたって２０００×ｇで遠心分離した。
・  遠心分離後、室温の３ｍｌのイソプロパノールを含有する新鮮な管に上澄みを移し、そして静かに混合した。
・  上記反応混合物を１分間にわたって２０００×ｇで遠心分離した。
・  上澄みを除去し、そしてペレットを室温の７０％エタノール３ｍｌ中に再懸濁させ、そして１分間にわたって２０００×ｇで遠心分離した。
・  エタノールを吸引し、ＤＮＡペレットを１５分間にわたって空気乾燥させた。
・  乾燥済ＤＮＡペレットを４℃で一晩にわたって２５０μｌのＤＮＡ再水和溶液中で再水和した。
【０４６７】
結合バッファの調製
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．１％  ＩＧＥＰＡＬで結合バッファを調製した。塩酸及びＮａＯＨで、ｐＨ／導電率メーターによってｐＨを約７．５まで調節した。
【０４６８】
ＤＮＡ溶出緩衝液の調製
１０Ｘ  ５０Ｔ１Ｅ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を形成するために、６．０５グラムのトリス塩基、及び０．３７グラムのＥＤＴＡを１００ｍｌの蒸留水中で混合することにより溶解した。ｐＨ／導電率メーターによってモニタリングし、そして塩酸及びＮａＯＨで調節することによって、溶液のｐＨを約８まで調整した。ナノ粒子からＤＮＡを溶出させる前に、１０Ｘ  ５０Ｔ１Ｅ溶液を蒸留水で１０倍に希釈した。
【表３９】
2014518847.tif 000044
【０４６９】
結合アッセイのプロトコル
２５．  表２９に示された８つの組み合わせにおいて約１時間にわたって室温で、ＧＰＢ−１１、アルブミン、及びＤＮＡを結合バッファと一緒にインキュベートすることによって、結合反応を行った。インキュベート中、試料を５分毎にボルテックス処理した。
２６．  インキュベート後、反応溶液を室温で約１０分間にわたって２００００×ｇでスピンダウンさせた。
２７．  ペレットを一度洗浄し、そして４００μｌのＤＮＡ溶出バッファ中に再懸濁させた。
２８．  アルブミンに対しては２８０ｎｍの吸光度（すなわち吸収ピーク）を、そしてＤＮＡに対しては２６０ｎｍの吸光度（すなわち吸収ピーク）を２０１−ＵＶ−ＶＩＳで測定した。
【０４７０】
ＤＮＡ結合のためのＡＦＭ画像化
画像化のために使用された設備及び材料
供給元   カタログNo.
Dimension FastScan       Bruker
AFM システム
FastScan A プローブ      AppNano      Probe model: UHF Series
雲母    Bruker
スピンコーター   Instras Scientific       SCK-100
【０４７１】
ＡＦＭ試料の調製及び分析
結合反応を生じさせておいた後、結合バッファ中のヒト雌性ゲノムＤＮＡとＧＰＢ−１１との５０μｌの混合物を新鮮な雲母シート上に堆積し、そしてスピンコートした（少なくとも３０００ｒｐｍ）。雲母含有試料を清浄水で一度濯ぎ、続いて空気中で乾燥させた。NanoScope V及びStage Controllerを有するFastScan AFMによって画像化を行った。ＡＦＭをタッピング・モードで走査し、FastSCan Aプローブ（ｋは約１７Ｎ／ｍ）を使用した。高分解能位相マッピング、オーバーレイ・トポグラフィ（３Ｄ）、及び断面高さを、FastScan NanoScope Softwareによって分析した。結果を本明細書中で後から論じる。
【０４７２】
アルブミン結合
ＧＰＢ−１１と結合するアルブミンの吸光度を２８０ｎｍで測定した。ゲノムＤＮＡの存在又は不在において、アルブミンとＧＰＢ−１１との種々異なる組み合わせを試験した。表３０は、アルブミンとＧＰＢ−１１との種々異なる組み合わせの間で極めて類似した結果が得られたことを示している。代表的なデータは図４０ａにも示されている。
【表４０】
2014518847.tif 000045
【０４７３】
具体的には、図４０ａは、２８０ｎｍの吸光度の関数としての、マウスゲノムＤＮＡの存在又は不在におけるマウス・アルブミン結合量を示すグラフである。ゲノムＤＮＡの不在において、アルブミンはＧＰＢ−１１中のバイメタルナノ結晶に有意に結合した。ゲノムＤＮＡが結合アッセイにおいて添加されると、ＧＰＢ−１１中のナノ結晶に結合するアルブミンは観察されなかった。これらの結果は、ＧＰＢ−１１中のナノ結晶はアルブミンと結合し得るが、しかしマウス・ゲノムＤＮＡに優先的に結合することを示した。換言すれば、ＧＰＢ−１１中のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶はおそらく、アルブミンの軟質コロナを有する。
【０４７４】
ＤＮＡ結合
２６０ｎｍの吸光度を測定することによって、ＧＰＢ−１１中のナノ結晶とのＤＮＡ結合を見極めた。マウス又はヒトのゲノムＤＮＡのＧＰＢ−１１中のバイメタルナノ結晶との結合能力を、アルブミンの種々異なる組み合わせで測定した。表３１は試験された種々の組み合わせ又は混合物を示している。ＤＮＡとＧＰＢ−１１中のナノ結晶との種々異なる組み合わせの間で高度に一致する結果が観察された。代表的な結果を図４０ｂにグラフで示す。
【表４１】
2014518847.tif 000046
【０４７５】
具体的には、図４０ｂはマウス・アルブミンの存在又は不在におけるＤＮＡ結合量をグラフで示している。図４０ｂは、アルブミンの存在及び不在の両方において、ゲノムＤＮＡがＧＰＢ−１１中のナノ結晶に有意に結合したことを示している。アルブミンが不在の場合、ＧＰＢ−１１のナノ結晶と結合するＤＮＡの量は劇的であった。大量のアルブミンが結合アッセイにおいて添加された場合にも、統計的に有意な量のＤＮＡがＧＰＢ−１１のバイメタルナノ結晶に結合されることが観察された。これらの結果はさらに、ＧＰＢ−１１中のバイメタルナノ結晶がアルブミンよりも著しく強くゲノムＤＮＡに結合することを裏付ける。さらに、特定の理論又は説明に縛られたくはないが、ＧＰＢ−１１中のＡｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶が、（ゲノムＤＮＡの存在において）ゲノムＤＮＡに共有結合で結合することが可能である。このような結合はＤＮＡ機能に影響を与え得る。
【０４７６】
Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶とのＤＮＡ結合を画像化しようと試みた。具体的には、ＤＮＡ結合アッセイにおける試料をＡＦＭによって画像化した。代表的な結果を図４０ｃに示す。Ａｕ−Ｐｔバイメタルナノ結晶がヒトゲノムＤＮＡと結合したことが明示されている。ほとんどのナノ結晶が糸状ＤＮＡ分子の末端に結合しているのが観察された。画像化されたナノ粒子の直径は、ＧＰＢ−１１中のナノ結晶のサイズ範囲内に含まれ、従って結合を裏付ける。
【図１】
2014518847.tif 000047
【図２】
2014518847.tif 000048
【図３ａ】
2014518847.tif 000049
【図３ｂ】
2014518847.tif 000050
【図３ｃ】
2014518847.tif 000051
【図３ｄ】
2014518847.tif 000052
【図３ｅ】
2014518847.tif 000053
【図４】
2014518847.tif 000054
【図５ａ】
2014518847.tif 000055
【図５ｂ】
2014518847.tif 000056
【図５ｃ】
2014518847.tif 000057
【図５ｄ】
2014518847.tif 000058
【図５ｅ】
2014518847.tif 000059
【図６】
2014518847.tif 000060
【図７ａ】
2014518847.tif 000061
【図７ｂ】
2014518847.tif 000062
【図７ｃ】
2014518847.tif 000063
【図７ｄ】
2014518847.tif 000064
【図８ａ】
2014518847.tif 000065
【図８ｂ】
2014518847.tif 000066
【図８ｃ】
2014518847.tif 000067
【図８ｄ】
2014518847.tif 000068
【図８ｅ】
2014518847.tif 000069
【図８ｆ】
2014518847.tif 000070
【図８ｇ】
2014518847.tif 000071
【図８ｈ】
2014518847.tif 000072
【図８ｉ】
2014518847.tif 000073
【図８ｊ】
2014518847.tif 000074
【図９】
2014518847.tif 000075
【図１０ａ】
2014518847.tif 000076
【図１０ｂ】
2014518847.tif 000077
【図１０ｃ】
2014518847.tif 000078
【図１０ｄ】
2014518847.tif 000079
【図１１ａ】
2014518847.tif 000080
【図１１ｂ】
2014518847.tif 000081
【図１１ｃ】
2014518847.tif 000082
【図１１ｄ】
2014518847.tif 000083
【図１１ｅ】
2014518847.tif 000084
【図１２ａ】
2014518847.tif 000085
【図１２ｂ】
2014518847.tif 000086
【図１２ｃ】
2014518847.tif 000087
【図１２ｄ】
2014518847.tif 000088
【図１２ｅ】
2014518847.tif 000089
【図１２ｆ】
2014518847.tif 000090
【図１２ｇ】
2014518847.tif 000091
【図１３】
2014518847.tif 000092
【図１４】
2014518847.tif 000093
【図１５ａ】
2014518847.tif 000094
【図１５ｂ】
2014518847.tif 000095
【図１６】
2014518847.tif 000096
【図１７】
2014518847.tif 000097
【図１８】
2014518847.tif 000098
【図１９】
2014518847.tif 000099
【図２０】
2014518847.tif 000100
【図２１ａ】
2014518847.tif 000101
【図２１ｂ】
2014518847.tif 000102
【図２２ａ】
2014518847.tif 000103
【図２２ｂ】
2014518847.tif 000104
【図２３ａ】
2014518847.tif 000105
【図２３ｂ】
2014518847.tif 000106
【図２４ａ】
2014518847.tif 000107
【図２４ｂ】
2014518847.tif 000108
【図２５ａ】
2014518847.tif 000109
【図２５ｂ】
2014518847.tif 000110
【図２６ａ】
2014518847.tif 000111
【図２６ｂ】
2014518847.tif 000112
【図２７】
2014518847.tif 000113
【図２８ａ】
2014518847.tif 000114
【図２８ｂ】
2014518847.tif 000115
【図２８ｃ】
2014518847.tif 000116
【図２９ａ】
2014518847.tif 000117
【図２９ｂ】
2014518847.tif 000118
【図２９ｃ】
2014518847.tif 000119
【図２９ｄ】
2014518847.tif 000120
【図２９ｅ】
2014518847.tif 000121
【図２９ｆ】
2014518847.tif 000122
【図２９ｇ】
2014518847.tif 000123
【図２９ｈ】
2014518847.tif 000124
【図２９ｉ】
2014518847.tif 000125
【図３０】
2014518847.tif 000126
【図３１ａ】
2014518847.tif 000127
【図３１ｂ】
2014518847.tif 000128
【図３１ｃ】
2014518847.tif 000129
【図３２ａ】
2014518847.tif 000130
【図３２ｂ】
2014518847.tif 000131
【図３２ｃ】
2014518847.tif 000132
【図３２ｄ】
2014518847.tif 000133
【図３２ｅ】
2014518847.tif 000134
【図３２ｆ】
2014518847.tif 000135
【図３２ｇ】
2014518847.tif 000136
【図３２ｈ】
2014518847.tif 000137
【図３２ｉ】
2014518847.tif 000138
【図３２ｊ】
2014518847.tif 000139
【図３２ｋ】
2014518847.tif 000140
【図３２ｌ】
2014518847.tif 000141
【図３２ｍ】
2014518847.tif 000142
【図３２ｎ】
2014518847.tif 000143
【図３２ｏ】
2014518847.tif 000144
【図３２ｐ】
2014518847.tif 000145
【図３２ｑ】
2014518847.tif 000146
【図３２ｒ】
2014518847.tif 000147
【図３２ｓ】
2014518847.tif 000148
【図３２ｔ】
2014518847.tif 000149
【図３２ｕ】
2014518847.tif 000150
【図３２ｖ】
2014518847.tif 000151
【図３２ｗ】
2014518847.tif 000152
【図３２ｘ】
2014518847.tif 000153
【図３２ｙ】
2014518847.tif 000154
【図３２ｚ】
2014518847.tif 000155
【図３２ａａ】
2014518847.tif 000156
【図３２ａｂ】
2014518847.tif 000157
【図３２ａｃ】
2014518847.tif 000158
【図３２ａｄ】
2014518847.tif 000159
【図３３ａ】
2014518847.tif 000160
【図３３ｂ】
2014518847.tif 000161
【図３４ａ】
2014518847.tif 000162
【図３４ｂ】
2014518847.tif 000163
【図３５ａ】
2014518847.tif 000164
【図３５ｂ】
2014518847.tif 000165
【図３６ａ】
2014518847.tif 000166
【図３６ｂ】
2014518847.tif 000167
【図３７ａ】
2014518847.tif 000168
【図３７ｂ】
2014518847.tif 000169
【図３８ａ】
2014518847.tif 000170
【図３８ｂ】
2014518847.tif 000171
【図３９ａ】
2014518847.tif 000172
【図３９ｂ】
2014518847.tif 000173
【図４０ａ】
2014518847.tif 000174
【図４０ｂ】
2014518847.tif 000175
【図４０ｃ】
2014518847.tif 000176
【国際調査報告】
2014518847.tif 000177