(57)【要約】  本発明は、対象者から得た前立腺ガン細胞における少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量及び任意にアドレノメジュリンを測定することにより、対象者アンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖をモニターする方法に関する。本発明はまた、抗アドレノメジュリンアンタゴニスト抗体及び/又は少なくとも１つの抗アドレノメジュリンレセプターアンタゴニスト抗体を含んでなる、アンドロゲン非依存性前立腺ガンを治療するための医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ)対象者から得た前立腺ガン細胞における、タンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3から選択される少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量を測定する工程、及び
ｂ)工程ａ)で測定した量を、前記対象者から以前に得た量又は標準のアドレノメジュリンレセプター量と比較する工程
を含んでなり、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量の減少がアンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖退行のマーカーを構成し、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量の増加がアンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖進行のマーカーを構成する、対象者においてアンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖をモニターするエキソビボ又はインビトロ方法。
【請求項２】
工程ａ)において、前記対象者から得た前立腺ガン細胞におけるアドレノメジュリンの量を更に測定し、工程ｂ)において、工程ａ)で測定したアドレノメジュリンの量を、前記対象者から以前に得た量又は標準のアドレノメジュリン量と比較し、アドレノメジュリンレセプター量及びアドレノメジュリン量の減少が、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖退行のマーカーを構成し、アドレノメジュリンレセプター量及びアドレノメジュリン量の増加が、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖進行のマーカーを構成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ)において、前記腫瘍細胞を、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターに結合する少なくとも１つの抗体及び任意にアドレノメジュリンに結合する抗体と接触させることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ)で形成した抗原-抗体複合体がEIA、ELISA、RIA、免疫蛍光又は免疫組織化学からなる群より選択される方法で検出されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体が配列番号９のキメラポリペプチドを動物に免疫して得られることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
抗体が酵素、蛍光体、重金属キレート又は放射性同位体に連結していることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ)において、前立腺ガン細胞における少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量及び任意にアドレノメジュリンの量が、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いてアドレノメジュリンレセプターをコードするRNA配列及び/又はアドレノメジュリンをコードするRNA配列を検出及び定量することにより測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
抗アドレノメジュリンアンタゴニスト抗体及び/又は少なくとも１つの抗アドレノメジュリンレセプターアンタゴニスト抗体を含んでなる、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの治療用医薬として使用する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖を診断するマーカー、並びにアンドロゲン非依存性前立腺ガンを治療するための抗アドレノメジュリン抗体及び/又は抗アドレノメジュリンレセプター抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺ガン(CaP)は、男性において最も多く診断される悪性増殖であり、西洋諸国の大部分において男性のガン死亡原因の第２位である。このガン性腺は、通常、複数の独立した遺伝的に異なる病巣を含み、このことによりこの疾患の異質性が証明される(1, 2)。前立腺の病的増殖は大部分がステロイドアンドロゲンにより制御されるので、局所進行したか又は転移性の疾患の治療は、アンドロゲンレセプター(AR)を標的するホルモン療法に大いに依拠する。しかし、ホルモン療法の主要な限界は、一時的にしか緩和できないことである；最終的には、このガンは、攻撃的増殖及び遠位器官の浸潤により特徴付けられるアンドロゲン非依存性(AI)病巣として再び出現する(3)。クローン性拡大か順応かにかかわらず、AI前立腺ガンの進展は、アンドロゲン以外の因子か又はアンドロゲンと共にそれ以外の因子がAI細胞に生存及び増殖に関する指示をするために存在しているに違いないことを明らかに示している。
したがって、AI前立腺ガンの急性診断マーカーの必要性が存在する。
【０００３】
Rocchiらは、高グリーソンスコアの前立腺ガン患者におけるアドレノメジュリン(AM)の発現及び特徴決定を報告し、前立腺ガンの増殖及びホルモン回避におけるAMの役割を示唆した(4)。発見時、AMは、強力な血管弛緩剤であることが注目され(5)、その後、多くの血管応答(血圧、塩及び水摂取並びに血管形成)の調節(6-8)に関連付けられ、細胞増殖の調節因子としても注目された(7, 9-11)。これら機能は多くの生理学的研究の結果として発見されたものであり、ノックアウト研究(無AMマウスが子宮内で極端な胎児水腫、血管及びリンパ管異常で死亡する)において強調されている(12, 13)。AMは種々の悪性組織で発現し、インビトロでヒトガン細胞株(肺、乳、結腸、グリア芽腫、膵臓、腎臓及び前立腺系統を含む)に対して分裂誘発性であることが示された(4, 8, 14-19)。腫瘍増殖におけるAM誘導血管形成の重要性についての証拠は、中和抗体又はAMアンタゴニスト(hAM22-52)によるAM作用阻害が腫瘍異種移植片のインビボ増殖をブロックすることである(15, 16)。抗AM抗体処理腫瘍において血管密度は減少する；このことは、AMが血管形成、脈管形成及び/又は脈管安定化において役割を演じているという考えを支持する(7, 8, 11, 15, 20, 21)。これら機能と細胞移動、増殖及びアポトーシスに対するAMの強力な効果とを合わせて考えると、AMが腫瘍の増殖及び転移におけるキープレーヤーであり得るとの仮説が導かれる(22, 23)。
【０００４】
AMは、その効果を、Ｇタンパク質共役レセプターであるカルシトニンレセプター様レセプター(CLR)を通じて変換し、AMに対する特異性はレセプター活性修飾タンパク質-２及び-３(RAMP2及びRAMP3)が付与する(24)。AMに高親和性で応答するCLR/RAMP2及びCLR/RAMP3の能力は、それぞれAM1及びAM2レセプターと呼ばれる２つの分子的に異なるAMレセプターの存在を示唆する(25)。AMレセプターの成分であるCLR及びRAMP2が欠損したマウスは、妊娠中期に胎仔性浮腫及び致死を発症する(26)。RAMP2遺伝子標的化マウスの別の研究は、これらマウスで観察される胎仔性浮腫が血管透過性亢進に起因すると結論付けている(27)。AMに対する複数のセカンドメッセンジャー応答が多くの生物学的機能を媒介する(6, 10)。AMによるレセプター活性化は、一般に、cAMPの上昇と関連付けられている(10)。AMは、遊離細胞内Ca2+レベルの上昇(28)、cGMP-NO経路の活性化(10)、cGMP-PKG経路の活性化(29)、Ras-Raf経路(21)、K+-ATPチャネル(30)又はPI3-キナーゼ/Akt、FAKinase及びMAPキナーゼ経路(20)のような他の機序を通じてシグナル伝達され得ることを証明する報告が存在する。
【０００５】
ヒト前立腺組織、前立腺ガン腫及び前立腺ガン細胞株におけるAMの存在が以前に報告されている(4, 31, 32)。本発明者らの一部は、去勢後のLuCaP 23.1異種移植腫瘍におけるAMレベルの増加を示した(33)。Abasaloらは、AMが前立腺ガン細胞におけるアポトーシスを防止することを示した(34)。最近、Joshiらは、AMが前立腺ガンにおいてインターロイキン-13レセプターα2鎖をアップレギュレートすることをインビトロ及びインビボで証明し、このことにより、IL-13R指向治療剤への或るタイプの前立腺腫瘍の感作におけるAMの新規役割が明らかになった(35)。本発明者らの一部は、インビトロ及びインビボで、AMの発現がアンドロゲン感受性LNCaP細胞においてアンドロゲンによりダウンレギュレートされることを報告した。更に、アンドロゲン不在下で、AMは前立腺ガンの腫瘍増殖を促進する(29)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、CaP増殖をアンドロゲン非依存性様式で促進するようにAMが活性化する細胞及び分子機序を研究した。本発明者らは、ホルモン非依存性前立腺ガン細胞株Du145をモデルとして用いて、AM系(AM、AM1及びAM2レセプター)の発現を調べ、その役割をインビトロ及びインビボで評価した。更に、腫瘍増殖に対する抗AMポリクローナル抗体(αAM)の効果を、マウス異所性及び同所性前立腺ガン異種移植モデルで調べた。
国際出願WO 02/098358は、悪性又は非悪性の、アンドロゲン依存性前立腺細胞、アンドロゲンを除去された前立腺細胞及びアンドロゲン非依存性前立腺ガンを(特異ポリヌクレオチドの検出又はイムノアッセイにより)診断する一般的方法及び該細胞を治療する一般的方法を開示する。
【０００７】
本発明者らは、αAMがインビトロでDu145細胞の増殖及び浸潤を減少させ、腫瘍血管形成及びリンパ管形成を標的することでアンドロゲン非依存性Du145腫瘍異種移植片の増殖を阻害することを示した。本発明者らはまた、AMがリンパ管発生及び/又はリンパ管安定化に関与する主要な因子の１つであることを示した。
これら結果は、アンドロゲン除去後のAM機能の妨害が、ホルモン非依存性回避時のCaP増殖の治療及び腫瘍転移の阻害のための扱い易い系を表すことを支持する。
更に、これら結果により、前立腺ガン細胞における少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量及び任意にアドレノメジュリンの量の測定は、アンドロゲン非依存性前立腺ガン腫瘍増殖の退行又は進行の診断に有用であり得ることが支持される。アンドロゲン非依存性前立腺ガン腫瘍増殖の進行が診断されている対象者は、抗アドレノメジュリンアンタゴニスト抗体及び/又は少なくとも１つの抗アドレノメジュリンレセプターアンタゴニスト抗体で治療し得る。
【０００８】
したがって、第１の観点において、本発明は、以下の工程：
ａ)対象者から得た前立腺ガン細胞における、タンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3から選択される少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量を測定する工程、及び
ｂ)工程ａ)で測定した量を、前記対象者から以前に得た量又は標準のアドレノメジュリンレセプター量と比較する工程
を含んでなり、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量の減少がアンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖退行のマーカーを構成し、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量の増加がアンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖進行のマーカーを構成する、対象者におけるアンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖をモニターする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】
【発明を実施するための形態】
【００１０】
前記方法の１つの好適な実施形態では、
工程ａ)において、前記対象者から得た前立腺ガン細胞におけるアドレノメジュリンの量を更に測定し、工程ｂ)において、工程ａ)で測定したアドレノメジュリンの量を、前記対象者から以前に得た量又は標準のアドレノメジュリン量と比較し、アドレノメジュリンレセプター量及びアドレノメジュリン量の減少が、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖退行のマーカーを構成し、アドレノメジュリンレセプター量及びアドレノメジュリン量の増加が、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの腫瘍増殖進行のマーカーを構成する。
前立腺ガン細胞は、一般には、生検により前立腺組織サンプルから得られる。
本明細書で使用する場合、用語「対象者」とは、哺乳動物、好ましくはヒトをいう。
【００１１】
本明細書で使用する場合、用語「アドレノメジュリンレセプター」とは、タンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3をいう。これらタンパク質は、タンパク質複合体CLR/RAMP2、CLR/RAMP3、RAMP2/RAMP3及びCLR/RAMP2/RAMP3の形態であり得る。これらタンパク質CLR、RAMP2、RAMP3は当業者に周知である(24)。例として、タンパク質CLR、RAMP2、RAMP3のアミノ酸配列は、GENBANKデータベースにおいて、それぞれアクセッション番号gi|5031621、gi|118572585及びgi|5032023で入手可能である。
有利には、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つのアドレノメジュリンレセプターの量及び随意にアドレノメジュリンの量を測定する。
本明細書で使用する場合、用語「標準量」とは、前立腺細胞における、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの参照量及び/又はアドレノメジュリンの参照量をいい、これらはアンドロゲン非依存性前立腺ガンに罹患していない対象者の大集団において測定されたものである。
【００１２】
本発明による方法は、インビトロ、エキソビボ又はインビボで実施し得る。
本発明による方法の工程ａ)の１つの好適な実施形態では、前記腫瘍細胞を、少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプター及び随意にアドレノメジュリンに結合する１つ又は複数の抗体と接触させる。
その後、工程ａ)で形成した抗原-抗体複合体は、任意の適切な手段により、例えばEIA、ELISA、RIA、免疫蛍光又は免疫組織化学により、好ましくは免疫組織化学により顕現させ得る。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、天然、合成又は組換え抗体、ラクダ科単一ドメイン抗体、キメラ抗体(例えば、ヒト化抗体)及びアドレノメジュリン、CLR、RAMP2及び/又はRAMP3に結合する能力を保持する前記抗体のフラグメント(例えば、Fab'2、Fab、Fv、scFv)を包含する。
【００１３】
用語「組換え抗体」は、遺伝子工学により、例えばクローニング及び遺伝子増幅により作製された抗体を意味するものとする。
用語「合成抗体」は、酵素的及び/又は化学的合成により作製された抗体を意味するものとする。
用語「キメラ抗体」は、特定動物種の抗体又は特定クラスの抗体であって、別の動物種の抗体又は別の抗体クラスの抗体の重鎖及び/又は軽鎖の全て又は一部を含むものを意味するものとする。用語「キメラ抗体」はまた、多特異性抗体、すなわち少なくとも２つの異なるエピトープに特異的である抗体を指称し得る。多特異性抗体は、上記抗体フラグメントから取得することができる。有利には、多特異性抗体は、アドレノメジュリンのエピトープ、CLRのエピトープ、RAMP2のエピトープ及びRAMP3のエピトープから選択される２つ又は３つの異なるエピトープに結合する。したがって、抗アドレノメジュリンアンタゴニスト抗体及び抗アドレノメジュリンレセプターアンタゴニスト抗体は、１つの多特異性抗体の形態であり得る。例として、二特異性抗体には、AM/CLR、AM/RAMP2、AM/RAMP3、CLR/RAMP2、CLR/RAMP3及びRAMP2/RAMP3から選択される複合体、好ましくはCLR/RAMP2、CLR/RAMP3及びRAMP2/RAMP3から選択される複合体に結合する抗体が含まれる。例として、三特異性抗体には、AM/CLR/RAMP2、AM/CLR/RAMP3、AM/RAMP2/RAMP3及びCLR/RAMP2/RAMP3から選択される複合体、好ましくはCLR/RAMP2/RAMP3複合体に結合する抗体が含まれる。有利には、多特異性抗体は、アドレノメジュリン並びにタンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3に結合する。
【００１４】
用語「ヒト化抗体」とは、抗原への結合部位を形成するCDR(相補性決定領域)の残基が非ヒトモノクローナル抗体のもので置換されている、所望の特異性、親和性及び/又は活性を有するヒト免疫グロブリンをいう。
抗体及び抗体フラグメントは、当業者に周知の従来法により製造することができる。例として、抗AM、抗CLR、抗RAMP2又は抗RAMP3抗体は、Fernandez-Sauzeら(7)、Ouafikら(15)及び国際出願WO 2007/045927及びWO 2010/012911により記載されているように取得することができる。
【００１５】
有利には、抗体は、アドレノメジュリン並びにタンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3の細胞外ドメインにそれぞれ由来する少なくとも６つの連続アミノ酸の４つのペプチドを含んでなるか該４つのペプチドからなるキメラポリペプチド(抗原)で適切な動物を免疫することにより取得することができる。ここで、前記キメラポリペプチドは、該キメラポリペプチドで免疫した動物において、アドレノメジュリン、CLR、RAMP2及びRAMP3に結合するポリクローナル抗体の産生を誘導することができる。免疫動物は、哺乳動物、例えばウマ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラマ及びラクダであり得る。
【００１６】
(タンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3の細胞外ドメインの構造を模倣する)上記キメラポリペプチド(抗原)は、タンパク質CLR、RAMP2及びRAMP3の天然型形態又はタンパク質複合体形態、すなわち、複合体AM/CLR、AM/RAMP2、AM/RAMP3、CLR/RAMP2、CLR/RAMP3、RAMP2/RAMP3、AM/CLR/RAMP2、AM/CLR/RAMP3、AM/RAMP2/RAMP3、CLR/RAMP2/RAMP3又はAM/CLR/RAMP2/RAMP3を特異的に認識する立体構造認識(conformational)アンタゴニスト抗体の、免疫動物における産生を誘導することができる。
【００１７】
有利には、上記抗体を取得するためには、以下のペプチドの各々を使用して、動物を免疫するか、又は動物の免疫に有用なキメラポリペプチドを製造することができる：
−  アドレノメジュリンのフラグメントF14-R12、R17、G19、K25-A27及びT34-S48の連鎖からなるアドレノメジュリン由来ペプチド：
RSFRFGKLATDKDKDNVAPRSKIS(配列番号１、AM24と呼ぶ)
−  タンパク質hCLRのフラグメントS27-K51(配列番号２)又はP89-R119(配列番号３)に由来するペプチド：
SPEDSIQLGVTRNKIMTAQYEAYQK(配列番号２)
PDYFQDFDPSEKVTKIADQDGNWFRHPASNR(配列番号３)、
−  タンパク質hRAMP2のフラグメントK59-K81(配列番号４)又はR91-R118(配列番号５)に由来するペプチド：
KNYETAVQFAWNHYKDQMDPIEK(配列番号４)、
RPYSTLRDALEHFAELFDLGFPNPLAER(配列番号５)、
−  タンパク質hRAMP3のフラグメントK49-K55(配列番号６)、A34-K55(配列番号７)又はG91-E112(配列番号8)に由来するペプチド：
KVDVWK(配列番号６)、
LERLPLAGKAFADMMGKVDVWK(配列番号７)、
GFITGIHRQFFSNATVDRVHLE(配列番号８)。
【００１８】
アドレノメジュリン及びアドレノメジュリンレセプターCLR、RAMP2及びRAMP3のそれぞれに由来する異なるペプチドの順序は、キメラポリペプチドを作製するために、無作為に選択し得る。しかし、Ｎ末端からＣ末端へ、アドレノメジュリン由来ペプチド、CLR由来ペプチド、RAMP3由来ペプチド及びRAMP2由来ペプチドを含んでなるかこれらペプチドからなるキメラポリペプチドを作製することが好ましい。好ましくは、キメラポリペプチド(抗原)は、配列番号９のアミノ酸配列(ch2と呼ぶ)を有する：
RSFRFGKLATDKDKDNVAPRSKISPDYFQDFDPSEKVTKIADQDGNWFRKVDVWKKNYETAVQFAWNHYKDQMDPIEK。
【００１９】
抗体は、以下：
−  酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ；
−  蛍光体、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、紫外光(UV)領域の波長で励起される青色蛍光色素(例えばAMCA(7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸)；Alexa Fluor 350)、青色光で励起される緑色蛍光色素(例えば、FITC、Cy2、Alexa Fluor 488)、緑色光で励起される赤色蛍光色素(例えば、ローダミン、Texas Red、Cy3、Alexa Fluor色素546、564及び594)、又は電子検出器(CCDカメラ、光電子増倍管)で可視化される、赤外光で励起される色素(例えばCy5)；
−  重金属キレート、例えばユーロピウム、ランタン又はイットリウム；及び
−  放射性同位体、例えば[18F]フルオロデオキシグルコース、11C-、125I-、131I-、3H-、14C-、35S又は99Tc-標識化合物
からなる群より選択される診断剤に、直接又は間接に、共有結合的又は非共有結合的に、連結させることができる。
【００２０】
診断剤は、抗体に、該抗体の一方の末端部(Ｎ又はＣ末端)に又は該抗体の１つのアミノ酸の側鎖に直接共有結合することができる。興味対象の物質を、抗体に、該抗体の一方の末端部又は該抗体の１つのアミノ酸の側鎖に接続アーム(すなわち、架橋試薬)により間接的に共有結合させることもできる。興味対象の物質を抗体に連結する方法は当該分野において公知である。
多くの化学架橋方法もまた当該分野において公知である。架橋試薬は、ホモ二官能性である(すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する)か又はヘテロ二官能性であり(すなわち、２つの異なる官能基を有し)得る。多くの架橋試薬が市販されている。それらの使用のための詳細な指示書は、商業的供給者から容易に入手可能である。
【００２１】
アドレノメジュリンレセプター及び任意にアドレノメジュリンを抗アドレノメジュリンレセプター抗体及び任意に抗アドレノメジュリン抗体を用いて検出及び定量する方法は、当業者に公知である(7, 15)。
本発明による方法の工程ａ)の別の１つの好適な実施形態において、インビトロ又はエキソビボで行うとき、前立腺ガン細胞における少なくとも１つのアドレノメジュリンレセプターの量及び任意にアドレノメジュリンの量は、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(Q-RT-PCR)アッセイを用いてアドレノメジュリンレセプターをコードするRNA配列及び任意にアドレノメジュリンをコードするRNA配列を検出及び定量することで測定する。
Q-RT-PCRアッセイを用いてアドレノメジュリンレセプターをコードするRNA配列及び任意にアドレノメジュリンをコードするRNA配列を検出及び定量する方法は、当業者に公知である(4, 15, 29)
【００２２】
第２の観点において、本発明は、抗アドレノメジュリン(抗AM)アンタゴニスト抗体及び/又は少なくとも１つの抗アドレノメジュリンレセプター(抗AMR)アンタゴニスト抗体を含んでなる、アンドロゲン非依存性前立腺ガンの治療用医薬として使用する医薬組成物を提供する。
前記組成物の抗AM及び抗AMR抗体は、以下の特性を有するアンタゴニスト抗体である：
−  AM又はAMRに特異的に結合し、AM又はAMRに関して高親和性を有し、
−  AMとAMRとの結合を用量依存的様式で阻害することができる。
これら特性は、抗体のタンパク質若しくはペプチドへの結合活性又は該活性の阻害を評価できる従来の試験、具体的には直接競合ELISA試験で検証することができる。
有利には、医薬組成物はまた、医薬的に許容されるキャリアを含んでなる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容されるキャリア」は、医薬投与に適合性のありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含むものと意図される。適切なキャリアは、この分野の標準的な参照テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。このようなキャリア又は希釈剤の好適な例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム、カチオン性脂質及び非水性ビヒクル(例えば不揮発性油)もまた使用し得る。医薬活性物質のためのこのような媒質及び剤の使用は、当該分野において周知である。上記治療剤と不適合である場合を除き、本発明の組成物における従来の任意の媒質又は剤の使用も企図される。
前述の特徴に加え、本発明は、本発明を説明する実施例及び添付の図面に言及する、以下の説明から明らかとなる他の特徴を更に含んでなる。
【００２４】
図１：AM、CLR、RAMP2及びRAMP3は前立腺ガン組織で発現する。上皮細胞及び間質細胞の大多数がNSE(ニューロン特異的エノラーゼ)染色された(Ｂ)。このことによりガン標本の神経内分泌分化が示唆される。前立腺のガン上皮におけるAM(Ｃ)、CLR(Ｄ)、RAMP2(Ｅ)及びRAMP3(Ｆ)タンパク質の発現を示す免疫組織化学。ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した同所性腫瘍切片(Ａ)。間質内に分散する細胞のCLR染色が観察される(Ｄ)。
【００２５】
図２：アドレノメジュリンはDu145細胞増殖及び浸潤をインビトロで刺激する。Ａ、培養Du145細胞におけるAM誘導cAMP生成。細胞(３×104細胞/ml)をAM(10-9Ｍ〜10-7Ｍ)で種々の時間処理した。各値は、４連で行った３つの独立実験の平均±SEMである(*、p<0.05；**、p<0.01；***、p<0.001)。Ｂ、Du145細胞のインビトロ増殖に対するAM及びαAMの対抗する効果。増殖アッセイのために、Du145細胞を、６マルチウェルプレートにウェル当たり１×104の密度で、５％ FBSを補充したRPMI 1640培地の存在下に播種した。10-7ＭのAM及びαAM(70μg/ml)を加えた。コントロールとして、無関係な特異性のウサギコントロールIgG(70μg/ml)を使用した。各処理に、３ウェルを準備し、トリプシンに曝露して、細胞をCoulter Counterで計数した。各バーは４つの独立実験の平均±SEMを表す(**、p<0.01；***、p<0.001)。Ｃ、AMはインビトロでDu145細胞の浸潤を刺激する。Du145細胞(1.5×104細胞)をBiocoat Matrigel浸潤上部チャンバに加え、10-7ＭのAMを下部チャンバに加え、６時間後、上部膜の非浸潤細胞を除去し、、DAPI試薬を少なくとも45分間加えた後に読み取ることで蛍光により下部膜に浸潤した細胞を定量した。２％ FBSを含有するRPMI 1640をコントロールとして使用した。bFGFを陽性コントロールとして使用した。データは10の高倍率視野中の移動細胞数であり、３つの独立実験の結果の平均である。各バーは、平均±SEMを表す(**、p<0.01；***、p<0.001)。Ｄ、Du145細胞においてAMにより誘導された細胞内シグナル伝達経路。AM(５×10-7Ｍ)で２、５、10、20及び30分間刺激したDu145細胞におけるリン酸化cRAF(pcRAF)、pMEK1/2、pERK(44及び42kDa)及びERKのウェスタンブロット分析。ERKのAM(５×10-7Ｍ)誘導リン酸化は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼインヒビターU0126(10μM、30分間)で阻害された。cRAF、MEK及びERKのリン酸化を刺激することが知られているEGFを陽性コントロールとして使用した。各サンプルについてロードしたタンパク質の量を評価するため、イムノブロット分析を抗α-アクチンで行った。
【００２６】
図３：ヌードマウスにおける異所性及び同所性のDu145腫瘍異種移植片の増殖は、αAMで阻害される。Ａ、ヒト前立腺腫瘍は、５×106のDu145ガン細胞を無胸腺ヌードマウスの右脇腹にs.c.注入して樹立した。腫瘍をサイズが〜700mm3になるまで増殖させた後、無作為に群分けしたマウスに、αAM又はコントロールIgG(330μg/投与)を３日毎にi.p.注射した。腫瘍体積を週に２回、「材料及び方法」に記載したように測定した。値は平均±SEMである。アスタリスクは、値がコントロールIgGと有意に異なることを示す(**、p<0.01；***、p<0.001)。Ｂ、同所性ヒト前立腺腫瘍は、前立腺の背葉に1×106のDu145ガン細胞を注射して樹立した。30日後、マウスを無作為に群分けし、上記のように処置した。αAM処置動物及びコントロールIgG動物の腫瘍重量を示す。各処置群の平均腫瘍重量を横線で示す。Ｃ、αAM処置動物及びコントロールIgG動物の同所性腫瘍異種移植片の代表的画像。
【００２７】
図４：去勢動物及び非去勢動物におけるLNCaP異種移植片の腫瘍増殖に対するαAMの効果。Matrigel(v/v)中のLNCaP細胞(５×106)をnu/nuマウスに皮下移植した。３ヵ月後、原発性腫瘍が400〜500mm3のサイズになったとき、一群の動物(n=10)を去勢し、αAM又はIgG-コントロールをi.p.投与する２群に無作為に分けた。２つ目の動物群(n=10)は去勢せずに２群に分け、上記のとおり処置した。LNCaP異種移植片のサイズを、図３に記載したとおり測定した。アスタリスクは、去勢動物において、αAM処置異種移植片の腫瘍体積がコントロールIgG処置異種移植片と有意に異なっていることを示す(*、p<0.05；**、p<0.01；***、p<0.001)。
【００２８】
図５：αAM処置腫瘍における内皮細胞の涸渇。腫瘍中の機能的血管を可視化するため、皮下又は同所性の腫瘍切片(６μm)を、内皮細胞を検出するマーカーであるvWF及び成熟周皮細胞のマーカーであるαSMAについて免疫蛍光で評価した。組織切片をDAPIで対比染色した。異所性異種移植片(Ａ)及び同所性異種移植片(Ｂ)でvWF陽性に染色された細胞の細胞密度の定量的評価を顕微鏡により行った。Image J 1.43Uソフトウェアを分析に使用した。値±SEM；n=6。***、p<0.001。
【００２９】
図６：αAMはDu145前立腺腫瘍モデルにおいて腫瘍関連リンパ管形成を阻害する。40日間の処置後、Du145原発腫瘍をIgGコントロールマウス及びαAM処置マウスから採集し、リンパ管についてはマウスLYVE-1抗体(DAB)を使用して、壁在性リンパ細胞については抗αSMA抗体を用いて免疫組織化学で分析した。Ａ、各実験群の代表的な４つのDu145腫瘍の８切片の免疫染色された管構造を示した。値は平均±SEMである；***；p<0.001。Ｂ、αSMAについて陽性染色された壁在細胞の密度の定量的評価を顕微鏡により行い、Image J 1.43Uソフトウェアを用いて分析した。値は平均±SEMである；***；p<0.001。
【００３０】
図７：αAM処置はLECs関連腫瘍アポトーシスを誘導した。Du145細胞(２×106)を無胸腺(nu/nu)マウスの前立腺に移植した。αAM又はIgG-コントロールでの40日間の処置後、動物を屠殺し、同所性Du145前立腺を採集した。腫瘍中のアポトーシスを受けた細胞の性質を可視化するため、腫瘍切片(６μm)を、リンパ内皮細胞を検出するマーカーであるLYVE-1及びアポトーシスを受けた細胞のマーカーであるssDNAについて免疫蛍光で評価した。ssDNAについて陽性染色された細胞の細胞密度の定量的評価を、顕微鏡で行った。Image J 1.43Uソフトウェアを分析に使用した。値は平均±SEMである；***；p<0.001。
【００３１】
図８：前立腺ガン細胞Du145におけるアドレノメジュリンレセプターの発現。Ａ、Du145細胞株からのトータルRNA(１μg)(DNAフリー)をcDNAに逆転写し、CLR、RAMP2及びRAMP3のmRNA対18S rRNAの相対比を見積もるため、リアルタイム定量的逆転写(RT)-PCRに供した。Ｂ、Du145細胞の膜調製物のアリコート(50μg)(レーン１、３、及び５)を12％ SDS-PAGEで分離し、Hybond-C膜に転写し、CLR、RAMP2及びRAMP3ペプチドに対して作製した抗体を使用してイムノブロットした。全てのサンプルについて、20μg/mlのCLR、RAMP2及びRAMP3ペプチドの添加により染色をブロックした(レーン２、４及び６)。各サンプルについてロードしたタンパク質の量を評価するため、イムノブロット分析を抗α-アクチンで行った。Du145細胞は、48kDaの明確なバンドとしてCLRを生じ、73〜76kDaにマルチマー、おそらくヘテロダイマーCLR/RAMP2(AM1レセプター)又はCLR/RAMP3(AM2レセプター)を生じた(図8B、レーン１)。RAMP2及びRAMP3は、28kDaのモノマー並びにマルチマー、おそらく50kDaのホモダイマー及び73〜76kDaのヘテロダイマーとして見えた(AM1及びAM2レセプターはそれぞれ抗RAMP2及び抗RAMP3抗体で検出した)(図8B、レーン３及び５)。まとめると、これら知見により、CLR、RAMP2及びRAMP3のmRNA及びタンパク質がアンドロゲン非依存性Du145細胞で発現されることが証明された。
【００３２】
図９：インビトロでのPC3細胞に対するAMの効果。Ａ、PC3細胞におけるAMR mRNAの発現。PC3細胞株からのトータルRNA(１μg)(DNAフリー)をcDNAに逆転写し、CLR、RAMP2及びRAMP3のmRNA対18S rRNAの相対比を見積もるため、リアルタイム定量的逆転写(RT)-PCRに供した。Ｂ、インビトロでのPC3細胞増殖に対するAM及びαAMの効果。増殖アッセイのために、PC3細胞を24マルチウェルプレートにウェル当たり２×104の密度で、２％ FBSを補充したRPMI 1640培地の存在下に播種した。10-7ＭのAM又はαAM(70μg/ml)を加えた。コントロールとして、無関係な特異性のウサギコントロールIgG(70μg/ml)を使用した。各処置に、６ウェルを準備し、トリプシンに曝露し、細胞をCoulter Counterで計数した。各バーは４つの独立実験の平均±SEMを表す。Ｃ、AMはインビトロでPC3細胞の浸潤を刺激する。PC3細胞(３×104細胞)をBiocoat Matrigel浸潤上部チャンバに加え、10-7ＭのAMを下部チャンバに加え、６時間後、上部膜の非浸潤細胞を除去し、DAPI試薬を45分間加えた後に読み取ることで蛍光により下部膜に浸潤した細胞を定量した。データは、10の高倍率視野中の移動細胞数として表し、各々３連で行った３つの独立実験の結果の平均である。bFGFを陽性コントロールとして使用した。２％ FBSを含有するRPMI 1640をコントロールとして使用した。各バーは平均±SEMを表す(**、p<0.01；***、p<0.001)。
【００３３】
図10：インビトロでのLNCaP細胞に対するAM及びαAMの効果。Ａ、LNCaP細胞株からのトータルRNA(１μg)(DNAフリー)をcDNAに逆転写し、CLR、RAMP2及びRAMP3のmRNA対18S rRNAの相対比を見積もるため、リアルタイム定量的逆転写(RT)-PCRに供した。Ｂ、インビトロでのLNCaP細胞増殖に対するAM及びαAMの効果。増殖アッセイのために、LNCaP細胞を、図９でPC3細胞について記載したように５％ FBSの存在下に播種して処理した。Ｃ、インビトロでのLNCaP細胞浸潤に対してAMは効果を有さない。浸潤アッセイのために、LNCaP細胞(５×104細胞)をboydenチャンバアッセイのMatrigel層に播種し、図９でPC3細胞について記載したとおりに分析した。
【００３４】
図11：αAMはインビトロでヒトLECに対する選択的AM媒介機能をブロックする。新生ヒト真皮リンパ微小脈管内皮細胞(HMVEC-dLyNeo)をLonza(Lonza, Basel, Switzerland)から購入し、増殖補助剤(EGM-2MV, Lonza)を補充した微小脈管内皮細胞増殖培地-２(EGM-2MV, Lonza)で拡大させた。Ａ、LECからのトータルRNA(１μg)(DNAフリー)をcDNAに逆転写し、AM、CLR、RAMP2及びRAMP3のmRNA対18S rRNAの相対比を見積もるため、リアルタイム定量的逆転写(RT)-PCRに供した。Ｂ、LECのインビトロ増殖に対するAM及びαAMの対抗する効果。増殖アッセイのために、LECを、６マルチウェルプレートにウェル当たり3.5×104の密度で、５％ FBSを補充したEBM-2培地の存在下に播種した。AM(10-7Ｍ)及びαAM(70μg/ml)を加え６日間処理した。処理後、細胞をトリプシンに曝露して、Coulter Counterでの細胞数計数の準備をした。各バーは３つの独立実験の平均±SEMを表す(*、p<0.05；***、p<0.001)。Ｃ及びＤ、AMはLECの移動及び浸潤を刺激する。αAM(70μg/ml)で30分間予め処理したLEC(３×104細胞)を、24ウェルBoydenチャンバの上部区画に配置した。AM(10-7Ｍ)又はbFGF(10-6Ｍ)を下部ウェルに加えた。フィルターを通って移動した細胞を20時間後に計数し(Ｃ)、Matrigelの存在下に移動した細胞を48時間後に計数した(Ｄ)。データは10の高倍率視野中で移動細胞数として表し、値は各々３連で行った３つの独立実験の平均±SEMを表す(*、p<0.05；**、p<0.01；***、p<0.001)。まとめると、これらデータにより、AMはLECの増殖、移動及び浸潤を誘導し、これらはαAM処理により損なわれることが証明された。
【００３５】
図12．AMは、リンパ性内皮細胞の生存のための増殖因子である。AM(10-7Ｍ)の不在下及び存在下でのDMEM血清欠乏後のLEC死の時間経過。対数増殖期の細胞を無血清培地に交換し、12、24及び48時間後に全ての浮遊細胞をcoulter counterで計数した。各点及びバーは平均±SEMを表す(n=6)；値は、AMの不在下、血清欠乏の48時間後に浮遊している死細胞の総数(100％とした)に対して規格化した。**、p<0.01。
【実施例】
【００３６】
実施例：アドレノメジュリン遮断は、ホルモン非依存性前立腺ガンにおいて、腫瘍関連血管形成及びリンパ管形成を阻害する
１)材料及び方法
培養細胞：ヒト由来CaP細胞株LNCaP(アンドロゲン依存性)、PC3及びDu145(アンドロゲン非依存性)を、American Type Culture Collection(Rockeville, MD)から入手し、RPMI 1640(Invitrogen Life Technologies Inc., Paris, france)で以前に記載されたように培養した(４)。リンパ内皮細胞(LEC)はLonza(Basel, Switzerland)から入手し、５％ FBS及び増殖因子を補充したEGM-2MVで培養した。
ヒト前立腺標本：グリーソンスコアが高いCaP(n=8)からのヒト前立腺サンプルを泌尿器科(AP-HM, Marseille, France)から入手した。組織調達プロトコルは全て、該当する機関の委員会(Aix-Marseille Universite)が承認し、各患者又はその親族のインフォームドコンセントの下で行った。
RNA調製及び分析：トータルRNAをDu145、PC3、LNCaP細胞及びLECから調製し、cDNAに逆転写し、記載されているように定量した(29)。
【００３７】
抗ヒトAMポリクローナル抗体の作製及び特徴決定：Ouafikら，2002(15)により以前に記載されたとおりに、抗ヒトAMポリクローナル抗体(αAM)を作製し、特徴決定した。具体的には、AM1-52アミドペプチド(Bachem, Switzerland)の全体に相当する合成ペプチドを用いてヒトAMに対するポリクローナル抗体を作製した。雌性ニュージーランドウサギの複数の皮下部位に、完全フロイントアジュバントで乳化した300μgの合成ペプチド注射した。その後、不完全フロイントアジュバントで乳化した120μgのAM1-52アミドでウサギを2.5週の間隔で更に免疫した(42)。４回目のブースター注射後に得られた抗血清を、抗AM活性についてスクリーニングし、その後、rProtein A Sepharose Fast Flowカラム(GE Healthcare, Europe)でアフィニティー精製した。この抗AMポリクローナル抗体(精製IgG)は、AM関連ペプチド(例えば、AM22-52アミド、AM26-52アミド及びAM13-37アミド)と非常に低い交差反応性を示した(<７％)。カルシトニン、CGRP1-37アミド、CGRP8-37アミド及びアミリンは、AMとの幾らかの相同性にもかかわらず、無意味な抗AM抗体結合しか示さなかった(<0.1％)。抗AM抗体は、DU145細胞上の細胞表面レセプターへの125I-AMの結合を用量関連様式でブロックすることも証明された。
【００３８】
ウェスタンブロッティング分析：細胞抽出物を調製し、CLR、RAMP2及びRAMP3ウェスタンブロット分析用に記載されているとおりに処理した(29)。ホスホ-c-Raf、ホスホ-MEK1/2、ホスホ-ERK1/2及びERK1/2のイムノブロッティングを、MAPK-ホスホ-ERK1/2経路サンプルキット(Cell Signaling Technologie, Inc.)を用いて行った。
サイクリックAMPアッセイ：AM(10-7〜10-9Ｍ)でIBMX(10-4Ｍ)の存在下に処理したDu145細胞を作製し、cAMP酵素イムノアッセイBiotrak(EIA)システム(GE Healthcare)を供給業者のプロトコルに従って用いてcAMPの細胞内量を測定した。
細胞移動・浸潤アッセイ：改変Boydenチャンバアッセイを用いて移動及び化学浸潤を評価した(７)。Du145(15×10-3)、LNCaP(50×10-3)及びPC3(30×10-3)細胞を上部区画に６時間加えた。LECについては、(30×10-3)細胞を浸潤については48時間、移動については20時間加えた。
細胞増殖アッセイ：細胞増殖に対するAM、αAM及びコントロールIgGの効果を、示された時点で記載のとおりに調べた(19)。
【００３９】
動物実験プロトコル：無胸腺NMRI(nu/nu)ヌードマウス(Harlan, Gannat, France)を４週齢で購入した。それぞれ５×106及び1×106のDu145細胞を、雄性ヌードマウス(n=30)の右脇腹に又は背側前立腺に同所性に皮下移植した。腫瘍が700±100mm3のサイズになった時点で、動物を無作為に２群に分けた。一方の群(n=20)にはαAM(330μgの精製IgG)を腹腔内(i.p.)注射し、コントロール群(n=10)には無関係の抗体(同じイソタイプのIgG)を投与した。ヌードマウスにおけるαAMの半減期は３〜４日と決定した。
腫瘍異種移植片を記載のとおり分析した(36)。具体的には、無胸腺NMRI(nu/nu)ヌードマウス(Harlan, Gannat, France)を４週齢で購入した。Du145細胞の懸濁液(200μlのPBS中５×106)を、雄性マウス(n=30)の右脇腹に皮下(s.c.)注射した。腫瘍サイズをダイアルキャリパーで測定し、腫瘍体積を幅×長さ×高さ×0.5236(楕円形用)として算出した。直径が1.5cmより大きい腫瘍をs.c.に有するマウスは、マルセイユ大学動物権利委員会(University of Aix-Marseille animal rights Committee)ガイドラインに従って屠殺した。ヌードマウスにおけるαAMの半減期は３〜４日と決定した。腫瘍が700±100mm3のサイズになった時点で、動物を無作為に２群に分けた。一方の群(n=20)にはαAM(330μgの精製IgG)をPBS中の懸濁液として３日毎に0.2mlの容量で腹腔内(i.p.)注射した。コントロール群(n=10)には無関係の抗体(同じイソタイプのIgG)を投与した。腫瘍サイズを２日毎に測定し、注射の12週間後にマウスを屠殺した。病理学的研究及び免疫組織化学のために、腫瘍を液体窒素中に保存するか又はパラフィン中に包埋した。
【００４０】
同所性注射については、マウスを、キシラジン(10mg/kg)及びケタミン(50mg/kg)のi.p.注射で麻酔した。腹筋を切開して、膀胱及び精嚢を露出させ、切開部からこれらを取り出して背側前立腺を露出させる。Du145細胞(１×106)を背葉に50μl容量で注入した。腫瘍細胞移植の１ヵ月後に処置を開始し、330μgのαAM(n=10)又はコントロールIgG(n=10)を週３回i.p.注射した。この処置を実験終了まで継続した。マウスを屠殺後、腫瘍を４％パラホルムアルデヒドに浸漬し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、ホールマウント染色のために加工処理した。
LNCaP細胞に関する実験には、異所性LNCaP腫瘍(〜500mm3)を有するマウス(n=20)を２群に分けた。一群の動物(n=10)を去勢して２群に分け、この２群に330μgのαAM(n=5)又はコントロールIgG(n=5)を３日毎にi.p.注射した。同じパラダイムを非去勢動物に適用した。
【００４１】
免疫組織化学及び画像分析：ヒトCaP標本並びに皮下及び同所性腫瘍のパラフィン包埋サンプルの切片を記載されたとおりに分析した(４，36)。リンパ管を評価するため、ヤギポリクローナル抗LYVE-1抗体(1/100；R&D systems)を使用した。具体的には、クエン酸緩衝液(pH６)中97℃にて40分間の熱誘導抗原回復後に、ヒトCaP標本のパラフィン包埋サンプルの切片(４μm)を、AM、CLR、RAMP2、RAMP3及びNSEの存在について試験した。抗AM抗体(４)及び抗CLR抗体(36)に最適な希釈率は1/2000であり、抗RAMP2抗体(36)について1/750、抗RAMP3抗体(36)については1/1500、抗NSE抗体(Dako, Glostrup, Denmark)については1/200であった。インキュベーションを一晩４℃にて維持し、続いてはビオチン化抗ウサギ抗血清(Histostatin plus, Zymed)を含む第２層であった。次に、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体キット(Histostatin plus, Zymed)を用いて処理した。内因性ビオチン及び内因性ペルオキシダーゼをそれぞれビオチンブロッキング系(Dako, Glostrup, Denmark)及び３％ H2O2で中和したことに留意すべきである。
【００４２】
皮下及び同所性腫瘍のパラフィンブロックを６μm切片に切り出し、形態学的評価のためにヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色した。Vectastain Elite ABC Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を用いて免疫組織化学を行った。薄切片(６μm)を、抗フォン・ヴィレブランド因子抗体(抗vWF)(1:400；Dako, Glostrup, Denmark)又は抗α-平滑筋アクチン抗体(抗αSMA)(1/80；Dako, Glostrup, Denmark)とインキュベートして腫瘍の血管分布を評価するか、又はヤギポリクローナル抗LYVE-1抗体(1/100；R&D systems)とインキュベートしてリンパ管を評価した。一次抗体は、適切なAlexa Fluor 48又は568二次抗体コンジュゲート(Molecular Probes/Invitrogen Life Technologies)で検出した。全ての蛍光標識サンプルを、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Invitrogen Life Technologies)を含むVectashieldマウント培地を用いてマウントし、複合式蛍光顕微鏡で分析した。非免疫蛍光染色には、DAB色素原を用いて検出を行った。陰性コントロールスライドは、一次抗体を省いて得た。
統計学的分析：データは、少なくとも３つの独立実験の平均±SEMとして表す。統計分析には、一元分散分析(ANOVA)又はフィッシャーのPLSD検定(Statview 512; Brain Power Inc., Calabasas, CA, USA)を用いた。ｐ値<0.05を有意とみなし、図中ではアスタリスクで示した。２個及び３個のアスタリスクはそれぞれp<0.01及びp<0.001を示す。
【００４３】
２)結果
AM、CLR、RAMP2、RAMP3及びNSEタンパク質の免疫細胞化学：
NSE、AM、CLR、RAMP2及びRAMP3タンパク質の発現及び共存を免疫組織化学で評価した(図１)。ヒト前立腺ガン標本の連続切片を、AM、CLR、RAMP2、RAMP3及びNSEに対して作製した抗体で標識した。顕著にNSE標識されるが弱く上皮標識される間質細胞を観察することができる(図1B)。ガン標本が示す濃密なAM標識は、本発明者らが以前に報告したように(４)、上皮細胞の細胞質で特異的に検出される一方、間質細胞では染色は観察されなかった。ガン性上皮の顕著なCLR、RAMP2及びRAMP3標識が観察された(図1D、E及びF)。間質コラーゲン隔壁に散在する、CLR、RAMP2及びRAMP3について標識された細胞の多くのクラスターが一貫して見出された(図1D, E及びF)。CaPに由来し且つ対応するペプチドで事前に中和された切片では、全く標識されない上皮細胞及び間質細胞が示された(図1G及びH)。
【００４４】
外因性AMはアンドロゲン非依存性ガン細胞株の増殖、cAMP活性及び浸潤を刺激する：
アンドロゲン非依存性Du145細胞株はAM1及びAM2レセプターを発現した(図８)。AMが培養Du145細胞におけるAMの主要なセカンドメッセンジャーである(10、28)細胞内cAMPを増大させるかどうかを調べた。AMは、Du145細胞においてcAMPレベルを用量依存的に増大させた(図2A)。AM(10-7Ｍ)は、cAMP含量の2.8±0.14倍(ｐ≦0.001)増加を誘導し、５分間までに最大に達した(図2A)。AMの漸増濃度(10-9〜10-7Ｍ；５分間)とのDu145細胞のインキュベーションにより、細胞増殖をモジュレートすることが知られているシグナル伝達経路であるcAMP生成の用量依存的刺激が誘導された(図2A)。このことは、AMがDu145細胞増殖に関与し得ることを示唆する。したがって、10-7ＭのAMは、６及び８日間の処理により、Du145細胞増殖を、非処理細胞と比較して有意に(それぞれ51±9.9％(p<0.01)及び96±14.6％(p≦0.001))刺激した(図2B)。AMが前立腺ガン細胞にオートクリン様式で影響する可能性を調べるため、前立腺アンドロゲン非依存性ガン細胞の基本機能に対するαAMの効果を調べた。αAM(70μg/ml)は、６及び８日間の処理により、基礎の細胞増殖を、非処理細胞と比較して有意に(それぞれ33.8±3.0％及び39.8±12％)(p<0.01)低減させた(図2B)。対照的に、70μg/mlの無関係な特異性のIgGコントロールは、細胞増殖の阻害を示さなかった(図2B)。まとめると、これらデータは、AMがアンドロゲン非依存性Du145細胞のオートクリン調節因子として作用することを強く示唆する。PC-3細胞は、外因性AM又はαAMでの処理後にも増殖応答を示さなかった。このことにより、AM系はPC-3細胞のインビトロ増殖に関与しないことが示唆される(図９)。
【００４５】
次に、Du145細胞浸潤に対するAMの外因性添加の効果を分析した。下部ウェルへのAM(10-7Ｍ)の添加は、浸潤細胞数を増加させた。このデータは、AMが浸潤に対して有意な(p<0.001)効果を誘導し、その効果がコントロールとの比較で92±22％に達することを証明した(図2C)。浸潤に対するAMの効果は、細胞を中和αAMと予めインキュベートしたとき、ほぼ完全に阻害された(図2C)。浸潤に対するAMの効果は、bFGF(10-6Ｍ)で観察されたものと類似していた(図2C)。これらデータにより、前立腺アンドロゲン非依存性Du145ガン細胞はAM刺激に感受性で応答性であることが示唆される。興味深いことに、同じ知見がPC-3細胞で得られ、AMは浸潤を誘導した(144±7.6％；p<0.001)。αAMとのプレインキュベーションは誘導を74±3.8％に減少させ(p<0.01)、このことから内因性AMはPC-3細胞の浸潤プロセスに、おそらくはオートクリン/パラクリン様式で関与し得ることが示唆される(図９)。最大限に活性な濃度のAM(２×10-7Ｍ)でのLNCaP細胞の処理で、コントロール細胞と比べて、増殖速度が僅かに減少した(図10)。AMについてもαAMについても、LNCaP細胞浸潤に対する効果は観察することができない(図10)。
【００４６】
アドレノメジュリンはMAPKのリン酸化を媒介する：
ERK及びAktは細胞増殖を調節することが知られており、この信号伝達経路はAM/cAMP経路の下流で機能すると報告された(37、38)。したがって、AMで刺激した後の培養Du145細胞におけるERK及びAkt経路の活性(リン酸化)を調べた。先ず、cRafのリン酸化を測定した。AM(５×10-7Ｍ)は２分程度の早期にcRafリン酸化を増大させ、その後低下して10分までにコントロールレベルに達することが見出された(図2D)。MAPK活性を調べるため、MEK1/2のリン酸化及び２つのMAPK：ERK1(p44MAPK)及びERK2(p42MAPK)のリン酸化を測定した。Du145細胞におけるp-MEK及びp-ERKのレベルは、AM(５×10-7Ｍ)刺激の開始後それぞれ２分程度及び５分程度の早期に有意に増加した(図2D)。これら効果は、30分までコントロールレベルより高く維持された。対照的に、Du145細胞におけるp-Aktレベルは、AMにより顕著に増加しなかった(データは示さず)。加えて、AMにより誘導されるp-ERKは、MEKインヒビターU0126(10μM、30分間)により完全に阻害された(図2D)。これら結果により、AM誘導細胞増殖は少なくとも一部がcAMP/MEK/ERK経路により媒介されることが示唆される。
【００４７】
αAMはアンドロゲン非依存性前立腺ガン腫瘍異種移植片の増殖を阻害する：
更に、免疫欠損マウスにおいてインビボで成長した腫瘍に対する内因性AMの効果を分析することが望まれた。本発明者らは、AMが腫瘍細胞のインビボ増殖に関与する古典的増殖因子に過ぎないのか、又は安定的に血管形成及びリンパ管形成をなして機能的な血管及びリンパ管を産生することで腫瘍増殖を維持するというより複雑な役割を有するのかを決定しようと望んだ。第１の一連の実験で、腫瘍細胞を雄性無胸腺マウス(nu/nu)の脇腹に皮下(s.c.)注射し、腫瘍が700±100mm3のサイズに達したら、マウスに、330μgのαAM又は無関係な特異性のコントロールウサギIgGのi.p.注射を開始し、３日毎に連続4.85週間継続した。腫瘍増殖はαAM処置腫瘍で抑制された(p<0.001)(図3A)。22日目に、αAM処置マウスの腫瘍は〜421±179mm3の平均サイズに達した一方、コントロール群の腫瘍は2,612±300mm3の平均サイズを示した。
【００４８】
腫瘍増殖に対するαAMの効果を、Du145同所性モデルを用いて試験した。腫瘍増殖についてのs.c.モデルに比べ、同所性モデルはマウス前立腺への腫瘍細胞の直接移植を必要とした。分析のために屠殺するまで、マウスに330μgのαAM又はコントロールIgGのi.p.注射を週３回行った(図3B)。全ての実験で、抗体処置は、マウスの健康に対して顕著な効果を示した。同所性の腫瘍細胞移植の10週間後、コントロール群のマウスは、不活発及び毛なみの悪い外見によって特徴付けられる病的で悪液質のように見えた。同時期に、抗体処置マウスは、健康で活動的に見え、通常の毛繕い行動を維持していた。６週間の処置後、動物を屠殺し、腫瘍量を評価した。10匹のコントロールIgG処置マウスのうち９匹は、前立腺組織の大部分が腫瘍組織に置き換わった劇症疾患に進展した(図3B及びC)。対照的に、10匹のαAM処置動物のうち６匹は、全体検査に際して、小さな腫瘍しか示さない(６匹中２匹)又は腫瘍が全く存在しない(６匹中４匹)という劇的な応答を示した(p<0.001；図3B)。腫瘍重量は、コントロールIgG処置動物と比較して、αAM処置動物で有意に低く(p<0.001)、腫瘍抑制が更に証明された(図3B)。
【００４９】
アンドロゲン不在下で、αAMはインビボでLNCaP腫瘍増殖を阻害する：
去勢後、LNCaP異種移植片はアンドロゲン非依存性様式で増殖し、ホルモン非依存性細胞(例えばDu145細胞)について観察されたものと匹敵する増殖パターンを示した。更に、去勢に際して発現する内因性AMが去勢動物の腫瘍増殖に何らかの様式で関与し得るかどうかを調べるため、異所性LNCaP腫瘍異種移植片を有する去勢動物及び非去勢動物にαAM又はコントロールIgGを週３回i.p.投与した。異種移植片の増殖は、αAM処置により、去勢動物でコントロールIgG群と比較して有意に減少した(図4A)。非去勢動物のαAM処置は、IgG-コントロール群と比較して腫瘍増殖の阻害を示さず、アンドロゲン存在下で腫瘍増殖がAM非依存性であることを強く示唆する(図4B)。
【００５０】
AM遮断は腫瘍における内皮細胞及び周皮細胞を涸渇させる：
αAM処置した異所性(図5A)及び同所性(図5B)のDu145腫瘍の組織学的検査により、コントロールIgG処置腫瘍と比較して、脈管密度の顕著な減少が見られた。vWFに対する抗体での腫瘍の免疫染色により、αAM処置腫瘍はコントロール腫瘍より血管が有意に少ないことが証明された。抗vWF及び抗α-SMA抗体での同時染色により、両細胞タイプが低密度であり、脈管形成は高度に破壊され、内皮細胞及び周皮細胞の全体的減少で特徴付けられることが証明された。vWF染色内皮細胞及びα-SMA染色周皮細胞の定量により、コントロールIgG処置腫瘍と比較したとき、αAM処置腫瘍における両細胞タイプの明白な減少が証明される(p<0.001；図5A及びB)。対照的に、コントロールIgG処置腫瘍は良好に組織された脈管形成を示した。正常組織における脈管形成は、αAM処置で破壊されなかったことは興味深い(データは示さず)。CD31及びαSMAマーカーでの免疫染色により、コントロール群と比較したとき、αAM処置去勢動物におけるLNCaP異種移植片の血管破壊が証明される(データは示さず)。
【００５１】
αAMは腫瘍関連リンパ管形成の進展をブロックする：リンパ管成長は、腫瘍転移及び炎症を含む幾つかの病的状態に関係する(39〜41)。αAM処置が腫瘍関連リンパ管形成を阻害するかどうかを決定するため、Du145同所性腫瘍を有し、αAM又はコントロールIgGで処置した動物に由来する原発腫瘍を、LYVE-1(リンパ管内皮レセプター１)の免疫染色により腫瘍関連リンパ管について評価した(図６)。腫瘍リンパ管の表面積は、αAM処置動物に由来する腫瘍で、コントロールIgG処置動物と比較して顕著に減少した。重要なことに、腫瘍周辺に近接する正常マウス組織で検出された非腫瘍関連LYVE-1陽性リンパ管は、αAM処置で影響されないままであった。興味深いことに、ヒトLECについてのインビトロ研究で、αAMは選択的なAM媒介機能(例えば、増殖、移動及び浸潤)をブロックすることが証明される(図11)。
【００５２】
また、(腫瘍組織内の収集脈管(collecting vessels)周囲の)平滑筋細胞は、αAM処置腫瘍でコントロールIgG処置腫瘍と比較して全滅していた。更に、リンパ内皮細胞間の分離がαAM処置腫瘍のリンパ管で生じ、コントロールIgG処置腫瘍のリンパ管では生じなかった。リンパ管数の定量評価により、コントロールIgG処置腫瘍と比較して、αAM処置腫瘍組織に特異的で有意な減少が明らかとなった(p<0.001；図6A)。興味深いことに、腫瘍周辺組織のリンパ管数についてはIgG-コントロール動物とαAM処置動物との間に有意差は観察できず、αAM処置は既存の又は非腫瘍関連リンパ管を妨げないことが示唆される(図6A)。抗体染色でのαSMA壁在細胞数の定量評価により、コントロールIgG処置腫瘍における壁在細胞と比較して、腫瘍組織に特異的な壁在細胞の全体的減少(46±1.9％)が明らかとなった(p<0.01；図7B)。
【００５３】
αAM処置に際してのリンパ管数減少の問題に取り組むため、αAM処置がアポトーシスよるLEC死を誘導し得ることを示唆して、AMがリンパ内皮細胞(LEC)の生存に何らかの様式で必要であると仮定した。Mab 7-26抗体(ssDNA)での免疫染色により検出されるアポトーシス性細胞は、血管裏打ち内に優勢に位置しており、LYVE-1に対する抗体での同時染色により、それらはLECと同定された。αAM処置腫瘍のアポトーシス指数は処置により増加し、コントロール腫瘍と比較して〜６倍の有意な増加に達した(p<0.001；図７)。更に、培地から血清を涸渇させると、LEC培養物は常に或る割合の浮遊細胞を含有し、ほとんど全ての浮遊細胞がアポトーシスに特徴的な形態学的特徴(例えば、膜小胞形成及び細胞収縮)を示した。血清飢餓後12時間で相当数の細胞(約16％)が浮遊し始め、48時間後には顕著に増加した(84％)。AM(10-7Ｍ)の添加は、血清飢餓後のアポトーシスを防止し、これは48時間持続した(図12)。多くの接着性培養細胞は、血清を涸渇させると、核及び細胞断片を示した。細胞を単鎖DNA及びヘマトキシリンに対する抗体で染色すると、免疫組織化学的に陽性の細胞は、細胞及び核断片を示すものと非常に良好に一致した(図12)。AM(10-7Ｍ)の添加は、接着性培養物のアポトーシス性細胞死を顕著に抑制した(図12)。まとめると、これら知見は、αAM処置が(i)腫瘍周辺リンパ管を破壊し、(ii)腫瘍リンパ管形成の誘導を防止することができることを示す。
【００５４】
３)考察
アンドロゲン非依存性状態へのCaPの進行は、腫瘍学的挑戦である。このガンの形質転換を担う機序は十分には理解されていない。AMはCaPで発現することが以前に観察されている(４)。本研究では、この疾患におけるオートクリン/パラクリン因子としてのAMの可能性のある役割を更に調べた。AM及びAMレセプター(AM1及びAM2レセプター)の存在が証明され、AMが前立腺のアンドロゲン非依存性ガンにおけるオートクリン/パラクリン増殖因子である可能性が示唆された。
アンドロゲン非依存性CaP Du145細胞に対するAMのオートクリン効果の可能性を調べるため、AMの外因性添加及び阻害の効果をインビトロで調べた。上記データは、AMがDu145細胞の増殖、侵襲性、cAMPの刺激及びErk-マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)経路の活性化を有意に増大させることを示した。これらデータは、ホルモン非依存性CaP細胞が、AMに対して、アンドロゲン非依存性CaPの更なる攻撃性が予想される様式で応答できることを示す。重要なことに、αAMがCaPのアンドロゲン非依存性細胞増殖及び浸潤の基礎レベルをインビトロで阻害することが更に見出された。これらデータは、Du145細胞により産生されるAMと細胞レセプターとの相互作用の阻害がこれら細胞機能を低下させることを示す。まとめると、これらデータは、AMがアンドロゲン非依存性CaPにおいてオートクリン様式で作用し得るという結論を強力に支持する。AM及びそれ自体のレセプターが関与するオートクリンループの存在は、腫瘍におけるAM産生細胞の巣がAMレセプター発現細胞をオートクリン/パラクリン機序を介して刺激し得ることを示唆する。
【００５５】
CaPにおけるAMレセプターの存在により、AMは原位置で或る役割を演じなければならないことが確証される。腫瘍増殖の促進、アポトーシスの阻害(22)及び血管形成の促進(7, 8, 15, 16)による腫瘍悪化におけるAMの重要な役割は、十分に理解されている。これら全ての活性は前立腺ガンに該当し得る。αAM治療に応答した腫瘍増殖を調べるために、Du145細胞の異所性異種移植片を成長させた。上記結果により、αAMは、インビボで効率的に送達され、確立したDu145異種移植片の増殖を有意に抑制できることが証明された。15日間の処置後、コントロールIgGで処置したマウスの腫瘍は、屠殺に至るサイズまで進行性に増殖した一方、αAM処置腫瘍の体積は安定し、コントロールと比較して少なくとも80％減少に達した。AMは血管形成の多工程プロセスに関与することが示されている(７，22)。20日間のαAM処置後、抗vWF抗体での腫瘍切片の免疫染色により、内皮細胞数の明白な減少を伴って脈管の84％以上が消失することが証明された。このデータにより、管腔を有する脈管の密度が抗体処置腫瘍で減少したことが証明され、AM系が、グリア芽腫(U87)、肺ガン(A549)及び結腸直腸ガン(HT-29)の異種移植片について以前(15，36)に証明されているとおり、新脈管形成及び/又は脈管安定化に関与しているに違いないことが強力に示唆される。Du145細胞のインビトロ増殖がαAMにより阻害されるので、対応する腫瘍異種移植片のインビボ増殖の阻害は、腫瘍細胞増殖に対する効果と腫瘍新血管形成に対する効果との組合せ効果の結果であり得る。去勢動物におけるLNCaP異種移植片のαAM処置による腫瘍増殖阻害は、Du145異種移植片で得られたデータを補強し、内因性発現AMがアンドロゲン除去後の腫瘍増殖におけるキープレイヤーの１つであり得ることを証明する強力な証拠をもたらした。これらデータは、栄養及び酸素の供給を導く新脈管形成を誘導し安定化することによる腫瘍細胞増殖及び腫瘍微小環境に対する効果によってAMがアンドロゲン不在下で有し得る鍵となる役割を強調している。興味深いことに、正常組織における通常の脈管形成はαAM処置により影響されなかった。このことは、AM系(リガンド及びそのレセプター)が、病的状況(例えば腫瘍増殖)又は生理学的事象(例えば創傷治癒又は月経周期)で十分に発現し、同様に活性化されることを示唆する。
【００５６】
皮下腫瘍は同所性腫瘍とは異なる脈管分布を有することが周知であり、同所性モデルにおけるαAMの効果を評価する目的で、アンドロゲン非依存性Du145細胞の同所性ヒト前立腺ガン異種移植片を成長させた。αAMでの処置は、組織学的レベルにて、異所性異種移植片で観察されたような微小脈管密度の減少を伴う脈管破壊により特徴付けられる腫瘍増殖の明白な阻害を引き起こした。しかし、皮下腫瘍は、コントロール腫瘍でさえ、同所性腫瘍より多くの脈管形成がなされていることが観察された。リンパ管がCaP同所性異種移植片で血管より優勢であり得るかどうかを決定するために、リンパ管をマウスLYVE-1抗体を用いて分析した。LYVE-1+リンパ管はコントロール処置標本では腫瘍内に観察され、αAM処置腫瘍では全く無くなっていた。重要なことに、正常組織で検出されるLYVE-1陽性リンパ内皮の密度は、コントロール 対 処置動物で同じであったので、αAM処置は既存のリンパ管を害しないことが観察された。延長された阻害は成熟リンパ管には影響せず、これにより、AM/AM1及びAM/AM2信号伝達は成体におけるリンパ脈管構造の維持に必要でないことが示される。このことは、αAMが腫瘍リンパ管を特異的に標的し、正常リンパ管を標的せず、このことが増殖、移動、浸潤並びに腫瘍増殖の間の機能的リンパ管の組織化及び/又は安定化に関するLECに対するAMの重要な役割の基礎であることを示唆する。
【００５７】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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