(57)【要約】【課題】本発明は、循環中への緩徐な吸収を示し、グルコース調節の定常状態レベルが延長されたインスリン療法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、一つには注射部位からの緩徐な吸収を提供する薬剤に関する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、インスリンアミノ酸配列および注射部位からの緩徐な吸収を提供するアミノ酸配列、例えば、プロリン残基の実質的に反復するパターンを有するアミノ酸配列を含む。【選択図】  図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続的血糖管理を提供するための医薬組成物であって、有効量のインスリンアミノ酸配列と注射部位からの徐放を提供するアミノ酸配列とを含むタンパク質、および徐放を達成するための医薬品賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
インスリンアミノ酸配列がＡ鎖およびＢ鎖アミノ酸配列を含み、Ａ鎖およびＢ鎖が、場合によって、まとめて１〜８個のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有する配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記注射部位からの緩徐な吸収を提供する前記アミノ酸配列が前記インスリンＡ鎖と共有結合する、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記Ａ鎖およびＢ鎖が１以上のジスルフィド結合によって結合する、請求項２または３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ａ鎖およびＢ鎖がペプチドまたは化学リンカーによって結合する、請求項２または３記載の医薬組成物。
【請求項６】
徐放を提供する前記アミノ酸配列がプロリン残基の実質的に反復するパターンを有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
徐放を提供する前記アミノ酸配列がエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）アミノ酸配列である、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＥＬＰがＶＰＧＸＧ（配列番号３）の繰り返しを含み、各Ｘが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン残基から独立して選択される、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
Ｘがバリンである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＥＬＰのアミノ酸配列がＡＶＧＶＰ（配列番号４）、ＩＰＧＶＧ（配列番号６）、またはＬＰＧＶＧ（配列番号８）の繰り返しを含む、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＥＬＰがＥＬＰアミノ酸単位の少なくとも１５の繰り返しを含む、請求項１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＥＬＰがＥＬＰ単位の少なくとも３０の繰り返しを含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＥＬＰがＥＬＰ単位の少なくとも６０の繰り返しを含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＥＬＰがＥＬＰ単位の少なくとも９０の繰り返しを含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＥＬＰがＥＬＰ単位の少なくとも１２０の繰り返しを含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＥＬＰがＥＬＰ単位の少なくとも１８０の繰り返しを含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物が配列番号１４を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ＥＬＰが生理食塩水中で３７℃より少しだけ低い転移温度を有する、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
徐放を提供する前記アミノ酸配列が、ランダムコイルまたは非球状の拡張構造または非構造化バイオポリマーであって、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される際少なくとも５０％の前記アミノ酸が二次構造を欠いている、バイオポリマーを形成する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列が、拡張された非球状構造、またはランダムコイル構造を有するタンパク質である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記医薬組成物が融合タンパク質である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記医薬組成物が約１１０ｍＭの塩化ナトリウムおよび約２０ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記医薬組成物がほぼ１週間につき１回の投与のために処方される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記医薬組成物が毎日投与するために処方される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記医薬組成物が約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの投与量での投与のために処方される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記医薬組成物が約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの投与量での投与のために処方される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項２７】
持続的血糖管理を提供するための医薬組成物であって、インスリンアミノ酸配列と注射部位からの徐放を提供するアミノ酸配列とを含む有効量のタンパク質、および徐放を達成するための医薬品賦形剤を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病の治療法。
【請求項２８】
前記患者が１型糖尿病に罹っている、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が２型糖尿病に罹っている、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物が１ヶ月あたり１〜約３０回の頻度で投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物がほぼ毎週投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬組成物が１週間につき２または３回投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬組成物がほぼ毎日投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物が皮下投与される、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、その内容はそれらの全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる、２０１１年１１月２８日付で出願された米国仮特許出願第６１／５６３，９８５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は一つには、持続性生物学的作用を有するインスリンおよびその誘導体の形態に関する。
【０００３】
電子出願されたテキストファイルの説明
添付した電子出願テキストファイルの内容は、それらの全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる：配列表のコンピュータで読み込み可能な形式のコピー（ファイル名：ＰＨＡＳ＿０２５＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１２年１１月２８日、ファイルサイズ３８キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
ペプチドおよび小分子薬剤の有効性は、多くの場合、循環におけるそのような薬物の半減期、ならびに実質的に一定の血漿中濃度を得る際の困難によって制限される。例えば、インクレチンＧＬＰ−１は、循環中のその短い半減期に対処するためには比較的高用量で投与しなければならず、これらの高用量は、とりわけ吐き気と関連する。Murphy and Bloom, Nonpeptidic glucagon-like peptide 1 receptor agonists: A magic bullet for diabetes?  PNAS 104 (3):689-690 (2007)。さらに、ペプチド剤血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）は、いくつかの推定では、１分未満の半減期を示し、そのためにこの薬剤は製薬学的用途に非実用的となる。Domschke et al., Vasoactive intestinal peptide in man: pharmacokinetics, metabolic and circulatory effects, Gut 19:1049-1053 (1978)、Henning and Sawmiller, Vasoactive intestinal peptide: cardiovascular effects, Cardiovascular Research 49:27-37 (2001)。ペプチド薬物についての短い血漿中半減期は、多くの場合、体循環中の酵素分解と同様に速い腎クリアランスによる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インスリン、またはその誘導体にも同様の難点がある。インスリンは酵素（たとえばインスリナーゼ）によって分解される前の短期間だけ活性であり、したがってわずか約６分の半減期を有する。さらに、インスリンは対象に急速に吸収される可能性があり、したがってそのような対象は１日に２回以上の注射が必要である可能性があり、用量は、血中グルコースレベルの自己測定に基づいて調節される。さらに、インスリンレベルの山と谷は対象に重大な合併症をもたらす。循環中への緩徐な吸収を示し、グルコース調節の定常状態レベルが延長されたインスリン療法が依然として必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、徐放のためのインスリン系製剤処方、および徐放処方での治療計画を実施するための方法を提供する。本発明はそれによってインスリン系製剤処方の改善された薬物動態を提供する。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、有効量のタンパク質であって、インスリンアミノ酸配列および注射部位からの徐放を提供するアミノ酸配列を含むタンパク質、ならびに徐放を達成するための医薬品賦形剤を含む持続的血糖管理を提供するための医薬組成物を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、持続的血糖管理を提供するための医薬組成物を投与することを含む、糖尿病の治療法を提供する。組成物は、インスリンアミノ酸配列および注射部位から徐放を提供するアミノ酸配列を含む有効量のタンパク質、ならびにそれを必要とする患者に対する徐放を達成する医薬品賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、患者は１型糖尿病または２型糖尿病に罹っている。いくつかの実施形態において、方法は、１ヶ月につき１〜約３０回、またはほぼ週１回、または１週間につき約２もしくは３回、または毎日の頻度で医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、医薬組成物を皮下投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ヒトプロインスリン配列（配列番号１３）を示す。プロインスリン配列は、Ｃペプチドに連結されたＢ鎖およびＡ鎖から構成される。Ｃペプチドは、２つの隣接する二塩基性部位（イタリック体で下線）での酵素的切断後に成熟インスリンから除去される。
【図１Ｂ】Ａ鎖のＣ末端に融合した１２０のＥＬＰ単位を有する、ＰＥ０１３９またはＩＮＳＵＭＥＲＡまたはインスリン−ＥＬＰ１−１２０と称される構造の図を示す。
【図２】ｐＰＥ０１３９プラスミドのマップを示す。
【図３】プロインスリンＥＬＰ１−１２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。プロインスリン配列（下線）はＥＬＰ１−１２０配列と融合している。アミノ酸配列は場合によってＮ末端で開始メチオニン残基を含む。
【図４】は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験を示す。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｃペプチドが切断されたので酵素処理後に予想される減少した融合タンパク質分子量を示した。レーン１：ＳＥＥＢＬＵＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ２前染色標準（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、レーン２：ＥＬＰ１−１２０、レーン３：プロインスリンＥＬＰ１−１２０、レーン４：インスリンＥＬＰ−１２０  ３μｇ、レーン５：インスリンＥＬＰ１−１２０  ６μｇ、レーン６：ＳＥＥＢＬＵＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ２前染色標準（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）。
【図５】抗インスリンＢ鎖ウェスタンブロットを示す。抗インスリンＢ鎖ウェスタンブロットを実施して、ＥＬＰと融合したＡ鎖およびＢ鎖両方の存在を確認した。データは、非還元条件下でのＢ鎖の存在を示し、Ａ鎖とＢ鎖との間のジスルフィド結合の形成を意味する。融合タンパク質およびジスルフィド結合の還元の結果、融合物からＢ鎖が除去された。レーン１：Ｂ鎖の欠如を示す還元インスリンＥＬＰ融合物、レーン２：Ｂ鎖の存在を示す非還元インスリンＥＬＰ融合物、レーン３：ＥＬＰ１−１２０、レーン４：Ｂ鎖の存在を示すプロインスリンＥＬＰ融合物。
【図６】未処理インスリン−ＥＬＰ１−１２０に関するＥＳＩ−ＭＳデータを示す。エレクトロスプレーイオン化質量分析は５７００８．５Ｄａの未処理プロインスリンＥＬＰ融合物の質量を確認した（ＳＧＳ  Ｍｓｃａｎ  Ｃｏｄｅｓ  １０４５３１  ＆  １０４５３２）。さらなる塩付加物が存在していた。
【図７】処理されたｐＰＥ０１３９に関するＥＳＩ−ＭＳデータを示す。エレクトロスプレーイオン化質量分析は、Ｃペプチドの酵素による除去後の成熟インスリンＥＬＰ融合物の質量を確認した（ＳＧＳ  Ｍ−ｓｃａｎ  Ｃｏｄｅｓ  １０７６１０）。インスリンＥＬＰのＥＳＩ−ＭＳは、Ｃペプチド切断後の成熟インスリンＥＬＰを意味する約５３２９８Ｄａの分子量を有する主生成物ピークを示した。微小ピークは部分的に分解した融合物または塩付加物として帰属される可能性が高い。
【図８】インスリングラルギンと比較した、インスリン−ＥＬＰ１−１２０融合物でのマウスにおける血糖低下を示す。
【図９】１型真性糖尿病（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）投薬を示す。特に、単回投与データを示す。結果は、等モルのＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）投薬と比較して、ＩＮＳＵＭＥＲＡについてグルコース低下期間が長いことを示す。ＳＴＺはストレプトゾトシンである；未治療群とは、正常な非糖尿病動物を指す；Ｎ＝１群あたり８匹。
【図１０】１型真性糖尿病（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）投薬を示す。特に、毎日投薬データを示す。結果は、活性および半減期に関して、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）と比較してＩＮＳＵＭＥＲＡの優位性を示す。ＳＴＺはストレプトゾトシンである；未治療群は正常な非糖尿病の動物を指す；６時間の時点で、２５ｍｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの群についてＮ＝５；８時間の時点で、２５ｍｇ／ｋｇの群についてＮ＝３、５０ｍｇ／ｋｇの群についてｎ＝２；２４時間の時点で、２５ｍｇ／ｋｇについてＮ＝１そして５ｍｇ／ｋｇの群についてＮ＝７。
【図１１Ａ】ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）と比較した、１型真性糖尿病（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）低用量滴定を示す。特に、図１１Ａは、単回皮下投薬を示す。ＳＴＺはストレプトゾトシンである；未治療群は、正常な非糖尿病動物を指す；ＬＡＮＴＵＳ、ＰＥ０１３９  １ｍｇ／ｋｇおよび未治療群についてＮ＝８；ＰＥ０１３９  ３．３３ｍｇ／ｋｇ群についてＮ＝７。
【図１１Ｂ】ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）と比較して、１型真性糖尿病（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）低用量滴定を示す。特に、図１１Ｂは１４日間の毎日皮下投薬を示す。ＳＴＺはストレプトゾトシンである；未治療群は正常な非糖尿病の動物を指す；ＬＡＮＴＵＳ、ＰＥ０１３９  １ｍｇ／ｋｇおよび未治療群についてＮ＝８；ＰＥ０１３９  ３．３３ｍｇ／ｋｇ群についてＮ＝７。
【図１２Ａ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）がＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）に対して有意に増加した血糖管理を有することを示す。Ｌａｎｔｕｓに対して第１、３、７および１４日に濃度曲線下面積（ＡＵＣ）血糖において２７〜３９％の減少が見られる。特に、図１２Ａは、化合物投与の第１日および０〜２４時間での血糖ＡＵＣを示す。
【図１２Ｂ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）がＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）に対して有意に増大した血糖管理を有することを示す。Ｌａｎｔｕｓに対して第１、３、７および１４日に濃度曲線下面積（ＡＵＣ）血糖において２７〜３９％の減少が見られる。特に、図１２Ｂは化合物投与の第１４日のおよび０〜２４時間での血糖ＡＵＣを示す。
【図１３Ａ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）が皮下注射後に小さなピーク対トラフ比で長い半減期を達成することを示す。特に、図１３Ａは、糖尿病のブタにおける単回皮下注射後の薬物動態（ＰＫ）薬物レベルを示す。
【図１３Ｂ】ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）が、毎日皮下注射した後に定常状態ピーク対トラフ薬物動態（ＰＫ）レベルを達成することを示す。特に、図１３Ｂは、糖尿病のブタにおける２週間の毎日皮下注射を示す；ＰＫレベルは投薬前に測定。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、持続性生物学的作用を示すインスリン系医薬組成物を提供する。高血糖症および糖尿病を含む疾患を、本発明の組成物で治療する方法も提供される。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、持続的血糖管理を提供するための医薬組成物であって、インスリンアミノ酸配列と注射部位からの徐放を提供するアミノ酸配列とを含む有効量のタンパク質、および徐放を達成するための医薬品賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、インスリンアミノ酸配列はＡ鎖およびＢ鎖アミノ酸配列を含み、このＡ鎖およびＢ鎖は、場合によってあわせて１〜８アミノ酸の挿入、欠失、または置換を有する、配列番号１３のアミノ酸配列を有する（図１）。いくつかの実施形態において、注射部位から緩徐な吸収を提供するアミノ酸配列はインスリンＡ鎖と共有結合する。もう１つの実施形態において、Ａ鎖およびＢ鎖は１以上のジスルフィド結合によって結合するか、またはペプチドもしくは化学リンカーを介して結合される。
【００１３】
もう１つの実施形態において、徐放を提供するアミノ酸配列は、プロリン残基の実質的に反復するパターンを有する。実質的に反復するパターンは一連のβターンまたはβターンのパターンを形成し得る。他の実施形態において、徐放を提供するアミノ酸配列はエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）アミノ酸配列である。もう１つの実施形態において、ＥＬＰはＶＰＧＸＧ（配列番号３）の繰り返しを含み、ここで、各Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン残基から独立して選択される。もう１つの実施形態において、ＥＬＰアミノ酸配列は、ＡＶＧＶＰ（配列番号４）、ＩＰＧＶＧ（配列番号６）、またはＬＰＧＶＧ（配列番号８）の繰り返しを含む。様々な実施形態において、ＥＬＰは、少なくとも１５、または少なくとも３０、または少なくとも６０、または少なくとも９０、または少なくとも１２０、または少なくとも１８０のＥＬＰアミノ酸単位の繰り返しを含む。もう１つの実施形態において、ＥＬＰアミノ酸配列は生理食塩水中で３７℃より少しだけ低い転移温度を有する。
【００１４】
もう１つの実施形態において、医薬組成物は融合タンパク質である。もう１つの実施形態において、医薬組成物は配列番号１４を含む（図３）。
【００１５】
さらにもう１つの実施形態において、徐放を提供するアミノ酸配列はランダムコイルまたは非球状拡張構造または非構造化バイオポリマーであって、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される際少なくとも５０％のアミノ酸が二次構造を欠いている、バイオポリマーを形成する。さらにもう１つの実施形態において、徐放を提供するアミノ酸配列は、拡張された非球状構造、またはランダムコイル構造を有するタンパク質である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、糖尿病を治療する方法であって、本明細書中で記載される医薬組成物を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、患者は、高血糖症、１型糖尿病もしくは２型糖尿病、または肥満にかかっている。いくつかの実施形態において、方法は、医薬組成物を１ヶ月あたり１〜約３０回、またはほぼ１週間に１回、またはほぼ１週間に２もしくは３回、またはほぼ毎日の頻度で投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、医薬組成物を皮下投与することを含む。
【００１７】
インスリンアミノ酸配列
例えばヒトインスリンなどのインスリン注射を使用して糖尿病を治療することができる。身体のインスリンを作る細胞はβ細胞と呼ばれ、それらは膵腺で見られる。これらの細胞は凝集して、それらを説明したドイツ人の医学生にちなんで名づけられた「ランゲルハンス島」を形成する。
【００１８】
インスリンの合成は、染色体１１上にあるインスリン遺伝子の翻訳から始まる。翻訳の間、２つのイントロンは、１１０アミノ酸の長さのタンパク質をコードするｍＲＮＡ産物からスプライシングで切り出される。この一次翻訳産物はプレプロインスリンと呼ばれ、不活性である。それは２４アミノ酸の長さのシグナルペプチドを含有し、これはタンパク質が細胞膜を通過するために必要である。ヒトプロインスリンは３１アミノ酸Ｃペプチドで互いに連結されたＡ鎖およびＢ鎖から構成される（図１）。
【００１９】
一旦プレプロインスリンが小胞体に達すると、プロテアーゼはシグナルペプチドを切断してプロインスリンを形成する。具体的には、一旦ジスルフィド結合がＡ鎖およびＢ鎖間に形成されると、プロインスリンはトリプシン／カルボキシペプチダーゼＢ様系によるＣペプチドの除去によってインビボで成熟インスリンに変わる。プロインスリンは３つのドメイン、すなわちアミノ末端Ｂ鎖、カルボキシル末端Ａ鎖、およびＣペプチドとして知られる中央の結合ペプチドからなる。インスリンは鎖Ａ（２１アミノ酸ＧＩＶＥＱＣＣＡＳＶＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ）（配列番号１５）および鎖Ｂ（３０アミノ酸ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ）（配列番号１６）と呼ばれるアミノ酸の２つの鎖から構成され、これらは２つのジスルフィド架橋によって連結されている。Ａ鎖の６番目および１１番目の残基を連結するＡ鎖内の第３のジスルフィド架橋がある。ほとんどの種において、鎖Ａおよび鎖Ｂの長さおよびアミノ酸組成は類似し、３つのジスルフィド結合の位置は高度に保存される。このために、ブタインスリンは糖尿病患者における不十分なヒトインスリンレベルを戻すことができる。今日、ブタインスリンは、細菌によるヒトプロインスリン（組換え型インスリン）の大量生産によって大部分は取って代わられている。
【００２０】
インスリン分子は溶液中で二量体を形成する傾向を有し、亜鉛イオンの存在下で、インスリン二量体は会合して六量体になる。インスリンのモノマーが容易に血液中に拡散し、速効を有するのに対して、六量体はゆっくりと拡散し、遅延型作用の発現を有する。組換え型インスリンの設計で、インスリンの構造は、インスリン分子の二量体および六量体を形成する傾向を減少させるが、インスリン受容体に対する結合を妨げないように修飾することができる。このように、短時間作用型から長時間作用型までおよぶ様々な製剤が作成される。
【００２１】
小胞体内で、プロインスリンは、Ｃペプチドを除去してインスリンの成熟・活性形態を生成する複数の特異的ペプチダーゼに暴露される。ゴルジ装置では、インスリンおよび遊離Ｃペプチドが分泌顆粒中に一括され、これらはβ細胞の細胞質中に蓄積する。顆粒のエクソサイトーシスは、ベータ細胞へのグルコースの侵入によって誘発される。インスリンの分泌は代謝に対して広範な影響を及ぼす。
【００２２】
グルコースの上昇に反応するインスリン放出には２段階ある。第１のものは、インスリンの即時放出である。これは、分泌顆粒中に貯蔵される前もって形成されたインスリンの放出に起因する。少し遅れて、新たに合成されたインスリンのより持続性の第２の放出がある。
【００２３】
一旦放出されると、酵素によって分解される前の短時間でのみ活性である。肝臓および腎臓で見られるインスリナーゼは血漿中を循環するインスリンを分解し、その結果、インスリンはわずか約６分の半減期を有する。この短い作用の持続期間の結果、インスリンの循環レベルで急速な変化が起こる。
【００２４】
治療特性が改善されたインスリンアナログが開発され（Owens et al., 2001, Lancet 358: 739-46、Vajo et al., 2001, Endocr Rev 22: 706-17）、そしてそのようなアナログは本発明と関連して用いることができる。インスリンＢ鎖のＣＯＯＨ終端側末端の伸長およびアルブミンに対する実質的な親和性を有する脂肪酸−アシル化インスリンの操作を含む様々な方策を使用して、長時間作用型のインスリンアナログを生成させる。しかしながら、利用可能な長時間作用型のインスリン化合物でのインビボ治療は依然として、高頻度の血糖低下偏位および血糖上昇偏位ならびにＨｂＡ１ｃのわずかな低下をもたらす。したがって、真に長時間作用型で安定なヒトインスリンアナログの開発が引き続き重要な課題である。
【００２５】
本発明にしたがって用いることができるインスリンの機能的アナログとしては、即効型アナログ、例えばリスプロ、アスパルトおよびグルリジンが挙げられ、これらは皮下注射後に急速に（３０分未満）吸収され、１時間で最高であり、そして比較的短い作用持続期間（３〜４時間）を有する。加えて、２つの長時間作用型インスリンアナログ：グラルギンおよびデテミルが開発され、これらは本発明と関連して用いることができる。長時間作用型インスリンアナログは約２時間の作用の発現を有し、４〜６時間で生物学的作用のプラトーに達し、２４時間まで持続し得る。
【００２６】
したがって、１つの実施形態において、インスリンアミノ酸配列はリスプロ（ＨＵＭＡＬＯＧ（Eli Lilly）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリンリスプロは、インスリンＢ鎖の２８位のプロリンがリジンで置換されていること、および２９位のリジンがプロリンで置換されていることで、ヒトインスリンとは異なる。これらの修飾は受容体結合を変更しないが、それらはインスリン二量体および六量体の形成を妨げるのに役立ち、より多量の活性な単量体インスリンを食後注射に利用できるようにする。
【００２７】
もう１つの実施形態において、インスリンアミノ酸配列は、アスパルト（ＮＯＶＯＬＯＧ（Novo Nordisk）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。ヒトインスリンＢ鎖の２８位でアスパラギン酸によるアミノ酸プロリンの１つの置換を有するインスリンアスパルトが設計される。この修飾は、インスリン六量体の形成の妨げるのに役立ち、より即効性のインスリンを形成する。
【００２８】
さらにもう１つの実施形態において、インスリンアミノ酸配列はグルリジン（ＡＰＩＤＲＡ（Sanofi-Aventis）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリングルリジンは、ヒトインスリンＢ鎖の３位でのアスパラギンのリジンによる置換および２９位でのリジンのグルタミンによる置換によって作成される短時間作用型アナログである。インスリングルリジンは通常のヒトインスリンよりも迅速な作用の発現およびより短い作用の持続期間を有する。
【００２９】
もう１つの実施形態において、インスリンアミノ酸配列はグラルギン（ＬＡＮＴＵＳ（Sanofi-Aventis）としても知られる）のＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。ＬＡＮＴＵＳは、中性の生理的ｐＨの存在下でインスリン結晶の微小析出物（microprecipitate）形成を引き起こすその酸性ｐＨのために遅延型吸収を有する。インスリングラルギンは、Ａ鎖の２１位のアミノ酸アスパラギンがグリシンによって置換され、Ｂ鎖のＣ末端に２つのアルギニンが付加されている点でヒトインスリンと異なる。就寝時の中間型プロタミン（ＮＰＨ）インスリン（中間型インスリン）と比較して、インスリングラルギンは２型糖尿病の患者における夜間低血糖とあまり関連しない。
【００３０】
さらにもう１つの実施形態において、インスリンアミノ酸配列はデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（Novo Nordisk）としても知られる）からのＡ鎖および／またはＢ鎖を含有し得る。インスリンデテミルは、Ｂ３０のアミノ酸トレオニンが除去され、１４炭素ミリストイル脂肪酸がＬｙｓＢ２９のイプシロン−アミノ基にアセチル化されている可溶性（中性ｐＨで）長時間作用型インスリンアナログである。皮下注射後、デテミルは解離し、それによって遊離脂肪酸を暴露させ、これはアルブミン分子に対する可逆性結合を可能にする。したがって、定常状態で、遊離非結合インスリンの濃度は大幅に減少し、その結果、安定な血漿グルコース値が得られる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、インスリンアミノ酸配列は単鎖インスリンアナログ（ＳＩＡ）であり得る（例えば、それらの全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許第６，６３０，４３８号および国際公開第２００８／０１９３６８号で記載されるとおり）。単鎖インスリンアナログは、Ａ鎖およびＢ鎖がポリペプチドリンカーによって共有結合する構造上関連するタンパク質の基を含む。ポリペプチドリンカーはＢ鎖のＣ末端をＡ鎖のＮ末端に結合させる。ＳＩＡがグルコース取り込みおよびインスリン受容体結合効果を有するために必要な構造上のコンフォメーション（structural conformation）をリンカーが提供する限り、このリンカーは任意の長さのものであってよい。いくつかの実施形態において、リンカーは約５〜１８アミノ酸の長さである。他の実施形態において、リンカーは約９〜１５アミノ酸の長さである。ある特定の実施形態において、リンカーは約１２アミノ酸長である。ある特定の例示的実施形態において、リンカーは、配列ＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲ（配列番号１７）またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号１８）を有する。しかしながら、グルコース取り込みおよびインスリン受容体結合活性において産生されるＳＩＡの有効性が実質的に損なわれることなく長さ（付加および欠失の両方）およびアミノ酸の置換においてなどのこの配列の多くの変形が可能であることが理解されるべきである。例えば、産生されるＳＩＡの活性を実質的に低下させることなくどちらかの末端にいくつかの異なるアミノ酸残基を付加することができるか、またはどちらかの末端から除去することができる。
【００３２】
現在臨床開発中の例示的単鎖インスリンアナログはアルブリン（albulin）である（Duttaroy et al., 2005, Diabetes 54: 251-8）。アルブリンは酵母またはほ乳類細胞中で産生させることができる。それは、ドデカペプチドリンカーによって連結され、天然のヒト血清アルブミンのＮＨ２末端に融合したヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖（天然のヒトインスリンと１００％同一性）からなる。アルブリンの発現および精製のために、Duttaroyらは４つの重複プライマーおよびＰＣＲ増幅を使用して、ドデカペプチドリンカーによって連結された成熟ヒトインスリンのＢ鎖およびＡ鎖を含有する単鎖インスリンをコードする合成遺伝子構築物を構築した。結果として得られるＰＣＲ産物を、酵母における発現のためのｐＳＡＣ３５ベクター内に含まれる、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のシグナルペプチドと成熟ＨＳＡのＮＨ２末端との間でフレーム内でライゲートした。本発明にしたがって、アブリン（abulin）のＨＳＡ成分を、本明細書中で記載される徐放を提供するアミノ酸配列で置換することができる。
【００３３】
したがって、１つの態様において、本発明は、例えば、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）を含む、徐放を提供するアミノ酸配列、およびインスリンアミノ酸配列を含む医薬組成物を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、インスリンは、ほ乳類インスリン、例えばヒトインスリンまたはブタインスリンである。本発明にしたがって、徐放成分を提供するアミノ酸配列をインスリンＡ鎖、もしくはＢ鎖、または両方と（例えば、組換え融合もしくは化学的結合によって）カップリングさせることができる。いくつかの実施形態では、注射部位から緩徐な吸収を提供するアミノ酸配列はインスリンＡ鎖と共有結合している。インスリンは鎖Ａ、Ｂ、およびＣ（配列番号１９および２０）のそれぞれを含み得るか、または鎖ＡおよびＢだけを含有する処理された形態を含み得る。いくつかの実施形態において、鎖ＡおよびＢを短い連結ペプチドによって結合させて、単鎖インスリンを形成する。インスリンは、（鎖ＡおよびＢのいずれかまたは両方の）Ｎ末端および／またはＣ末端で１〜１０個のアミノ酸、例えば１、２、３、または約５個のアミノ酸がトランケートされた機能的フラグメントを含むヒトインスリンの機能的アナログであり得る。機能的アナログは、天然配列（例えば、配列番号１５および１６）に対して１〜１０個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換（まとめて）を含む可能性があり、それぞれの場合、ペプチドの活性を保持する。例えば、機能的アナログは天然配列（鎖ＡおよびＢ、または鎖Ａ、Ｂ、およびＣを含み得る）に対して１、２、３、４、または５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換（まとめて）を有し得る。そのような活性は、本明細書中に記載されるものを含む任意の利用可能なアッセイを用いて確認または分析することができる。これらまたは他の実施形態において、インスリン成分は、鎖ＡおよびＢ（配列番号１５および１６）について天然配列のそれぞれと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する。２つの配列間（例えば、天然配列と機能的アナログとの間）の配列同一性の決定は、Tatusova et al., Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250 (1999)を含む任意の位置合わせツールを使用して達成することができる。インスリン成分は、当該技術分野で公知のさらなる化学修飾を含み得る。
【００３４】
インスリンアナログまたは徐放を提供するアミノ酸配列を含有するインスリンアナログのインビトロ結合特性を特性化するために、競合結合アッセイをインスリン受容体を発現する様々な細胞系で実施することができる（Jehle et al., 1996, Diabetologia 39: 421-432）。例えば、ヒトインスリン受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞を使用する競合結合アッセイを用いることができる。インスリンはさらに、ＩＧＦ−１受容体とインスリン受容体よりも低い親和性で結合することができる。徐放を提供するアミノ酸を含有するインスリンアナログの結合親和性を決定するために、Ｌ６細胞で１２５Ｉ−標識ＩＧＦ−１を使用して競合結合アッセイを実施することができる。
【００３５】
インスリンの活性は、末梢グルコース処理の刺激および肝臓グルコース産生の阻害を含む。徐放を提供するアミノ酸配列を含有するインスリンアナログがこれらの生物活性を媒介する能力は、公知方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、徐放を提供するアミノ酸配列を含有するアナログの３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞でのグルコース取り込みに対する影響を測定することができ、インスリンの影響と比較することができる。生物学的に活性なアナログでの細胞の前処理は概して２−デオキシグルコース取り込みにおいて用量に依存した増加をもたらす。徐放を提供するアミノ酸を含有するインスリンアナログがグルコース産生を調節する能力は、任意の数の細胞型、例えば、Ｈ４ＩＩｅヘパトーマ細胞で測定することができる。このアッセイでは、生物学的に活性なアナログでの前処理は、概して放出されたグルコースの量の用量に依存した阻害をもたらす。
【００３６】
徐放を提供するアミノ酸配列
いくつかの実施形態において、徐放を提供するアミノ酸配列は、タンパク質骨格基および／または側鎖基によって水素結合を形成し、マトリックス形成に対する疎水性相互作用に寄与し得る構造単位を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸側鎖は水素結合ドナー基を含まず、水素結合は実質的にタンパク質骨格によって形成される。例示的アミノ酸としては、プロリン、アラニン、バリン、グリシン、およびイソロイシン、ならびに類似のアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、構造単位は、実質的に反復する構造モチーフ、および実質的に反復する水素結合能力を作成するような実質的に反復する構造単位である。これらや他の実施形態において、アミノ酸配列は少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％のプロリンを含み、これは実質的に反復するパターンで配置されている可能性がある。プロリンの実質的に反復するパターンは反復するβターン構造を形成し得る。この文脈において、実質的に反復するパターンとは、アミノ酸配列のプロリン残基の少なくとも５０％または少なくとも７５％が限定可能な構造単位の一部であることを意味する。さらに他の実施形態において、アミノ酸配列は水素結合ドナー側鎖有するアミノ酸、たとえばセリン、トレオニン、および／またはチロシンを含む。いくつかの実施形態において、反復配列は１〜約４個のプロリン残基を含んでもよく、残りの残基は非極性残基、たとえばグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンから独立して選択される。非極性または疎水性残基はマトリックスの形成に対する疎水性相互作用に寄与する可能性がある。
【００３７】
アミノ酸配列は、貯蔵温度よりも高い温度で注射すると「ゲル様」状態を形成する可能性がある。例示的配列は繰り返しペプチド単位を有する、および／またはさらに低温では比較的構造化されていない可能性があり、さらに高温では、水素結合した構造化状態を達成する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、４〜１０個のアミノ酸の繰り返し単位を有するペプチドである。繰り返し単位は、マトリックスの形成において１、２または３個の水素結合を形成し得る。ある特定の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、絹、エラスチン、コラーゲン、もしくはケラチン、またはそれらの模倣物のアミノ酸配列、あるいは参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許第６，３５５，７７６号で開示されているアミノ酸配列である。
【００３９】
ある特定の実施形態において、アミノ酸配列はエラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）配列である。ＥＬＰ配列は、エラスチンタンパク質に関連するか、またはエラスチンタンパク質の模倣物である構造的ペプチド単位もしくは配列を含むかまたは構造的ペプチド単位もしくは配列から構成される。ＥＬＰ配列は、３〜約２０個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では、４〜１０個のアミノ酸、たとえば４、５もしくは６個のアミノ酸の構造単位から構築される。個々の構造単位の長さは変わり得るか、または不変であり得る。例示的構造単位としては、配列番号１〜１２（下記）によって定義される単位が挙げられ、これはタンデム−繰り返し単位を含む繰り返し構造単位として用いることができるか、またはある組み合わせで用いることができる。したがって、ＥＬＰは、以下で定義される配列番号１〜１２から選択される構造単位（複数可）を含み得るか、またはそれらから構成され得る。
【００４０】
構造単位がＥＬＰ単位である実施形態を含むいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は約１０〜約５００個の構造単位、またはある特定の実施形態では、約５０〜約２００個の構造単位、またはある特定の実施形態では、約８０〜約２００個の構造単位、もしくは約８０〜約１５０個の構造単位、例えば配列番号１〜１２によって定義される１つの単位もしくは単位の組み合わせを含むかまたはこれらから本質的に構成される。したがって、構造単位はあわせて約５０〜約２０００個のアミノ酸残基、または約１００〜約８００個のアミノ酸残基、または約２００〜約７００個のアミノ酸残基、または約４００〜約６００個のアミノ酸残基の長さを有し得る。
【００４１】
アミノ酸配列は選択された処方で可視および可逆性逆相転移を示す可能性がある。すなわち、アミノ酸配列は構造的に無秩序であり得、転移温度（Ｔｔ）以下で処方中に非常に可溶性で有り得るが、処方の温度がＴｔを超えて上昇すると急激な（２〜３℃の範囲）無秩序から秩序への相転移を示し得る。温度に加えて、アミノ酸ポリマーの長さ、アミノ酸組成、イオン強度、ｐＨ、圧力、温度、選択された溶媒、有機溶質の存在、およびタンパク質濃度も遷移特性に影響を及ぼす可能性があり、これらを望ましい吸収プロフィールのために処方中で調整することができる。吸収プロフィールは、インスリンアミノ酸配列の血漿濃度または活性を経時的に測定することによって容易に試験することができる。
【００４２】
ある特定の実施形態において、ＥＬＰ成分（複数可）は、限定されないが：
（ａ）テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、すなわちＶＰＧＧ（配列番号１）；
（ｂ）テトラペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、すなわちＩＰＧＧ（配列番号２）；
（ｃ）ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）、すなわちＶＰＧＸＧ、ここで、Ｘは任意の天然または非天然アミノ酸残基であり、Ｘは場合によってポリマーまたはオリゴマー繰り返し間で変動する；
（ｄ）ペンタペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、またはＡＶＧＶＰ（配列番号４）；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＸＧ（配列番号５）、ここでＸは任意の天然または非天然アミノ酸残基であり、Ｘは場合によってポリマーまたはオリゴマー繰り返し間で変動する；
（ｆ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、すなわちＩＰＧＶＧ（配列番号６）；
（ｇ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ、すなわちＬＰＧＸＧ（配列番号７）、ここでＸは任意の天然または非天然アミノ酸残基であり、Ｘは場合によってポリマーまたはオリゴマー繰り返し間で異なる；
（ｈ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、すなわちＬＰＧＶＧ（配列番号８）；
（ｉ）ヘキサペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、すなわちＶＡＰＧＶＧ（配列番号９）；
（ｊ）オクタペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、すなわちＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号１０）；
（ｋ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＦＧＶＧＡＧ（配列番号１１）；および
（ｌ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、すなわちＶＰＧＶＧＶＰＧＧ（配列番号１２）
を含む構造単位から形成することができる。
【００４３】
配列番号１〜１２によって規定されるそのような構造単位は構造的繰り返し単位を形成する可能性があるか、または組み合わせで使用してＥＬＰを形成することができる。いくつかの実施形態において、ＥＬＰ成分は、配列番号１〜１２から選択される（例えば、２、３または４個の）構造単位の１つまたは組み合わせから完全に（またはほぼ完全に）形成される。他の実施形態において、ＥＬＰ成分の少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％が配列番号１〜１２から選択され、繰り返し単位として存在し得る構造単位の１つまたは組み合わせから形成される。
【００４４】
ある特定の実施形態において、ＥＬＰは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）の、タンデム繰り返し単位を含む繰り返し単位を含み、ここで、Ｘは前述の通りであり、全ＥＬＰ成分（ＶＰＧＸＧ（配列番号３）以外の構造単位を含み得る）に対してＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）単位が占めるパーセンテージはＥＬＰの約５０％超、または約７５％超、または約８５％超、または約９５％超である。ＥＬＰは配列番号３の５〜１５個の構造単位（例えば、約１０個の構造単位）のモチーフを含有し得、ゲスト残基Ｘはモチーフ中の単位の少なくとも２または少なくとも３の間で変化する。ゲスト残基は、アミノ酸Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、およびＷなどの非極性または疎水性残基などから独立して選択することができる（そして所望の逆相遷移特性を保持するように選択することができる）。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＥＬＰはβターン構造を形成し得る。βターン構造を作成するために好適な例示的ペプチド配列は、その全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６号で記載されている。例えば、配列ＶＰＧＸＧ（配列番号３）中の第４の残基（Ｘ）は、βターンの形成を排除することなく変更することができる。
【００４６】
例示的ＥＬＰの構造は、ＥＬＰｋ［ＸｉＹｊ−ｎ］という表記を使用して記載することができ、ここで、ｋは特定のＥＬＰ繰り返し単位を表し、括弧内の大文字は１文字アミノ酸コードであり、それらの対応する下付き文字は、構造単位（該当する場合）中の各ゲスト残基Ｘの相対比を表し、ｎは構造上の繰り返しの数で表したＥＬＰの全長を記載する。例えば、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）の１０個の繰り返し単位を含むＥＬＰ成分を表し、ここで、Ｘは約５：２：３の相対比のバリン、アラニン、およびグリシンである；ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］はペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）の４個の繰り返し単位を含むＥＬＰ成分を表し、ここで、Ｘは約１：２：１の相対比のリジン、バリン、およびフェニルアラニンである；ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］はペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）の９個の繰り返し単位を含むポリペプチドを表し、ここで、Ｘは約１：７：１の相対比のリジン、バリン、およびフェニルアラニンである；ＥＬＰ１［Ｖ−５］はペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）の５個の繰り返し単位を含むポリペプチドを表し、ここで、Ｘはバリンである；ＥＬＰ１［Ｖ−２０］はペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）の２０個の繰り返し単位を含むポリペプチドを表し、ここで、Ｘはバリンである；ＥＬＰ２［５］はペンタペプチドＡＶＧＶＰ（配列番号４）の５個の繰り返し単位を含むポリペプチドを表し；ＥＬＰ３［Ｖ−５］は、５個のペンタペプチドＩＰＧＸＧ（配列番号５）の繰り返し単位を含むポリペプチドを表し、ここでＸはバリンである；ＥＬＰ４［Ｖ−５］はペンタペプチドＬＰＧＸＧ（配列番号７）の５個の繰り返し単位を含むポリペプチドを表し、ここでＸはバリンである。
【００４７】
ＥＬＰに関して、Ｔｔはゲスト残基の疎水性の関数である。したがって、ゲスト残基（複数可）の同一性およびそれらのモル分率（複数可）を変えることによって、広範囲にわたって逆転移を示すＥＬＰを合成することができる。したがって、所与のＥＬＰ長さでのＴｔは、ＥＬＰ配列中に組み入れる疎水性ゲスト残基の割合が大きいほど減少する可能性がある。好適な疎水性ゲスト残基の例としては、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。やや疎水性であるチロシンも使用することができる。反対に、グルタミン酸、システイン、リジン、アスパルテート、アラニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グリシン、アルギニン、およびグルタミンから選択されるものなどの残基を組み入れることによってＴｔを増加させることができる。
【００４８】
１００，０００超の分子量を有するポリペプチドについて、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６号（その全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる）で開示されている疎水性尺度は、特定のＥＬＰ配列のおよそのＴｔを予測する１つの手段を提供する。１００，０００未満の分子量を有するポリペプチドについて、Ｔｔは次の二次関数によって予測または決定することができる：Ｔｔ＝Ｍ０＋Ｍ１Ｘ＋Ｍ２Ｘ２（式中、Ｘは融合タンパク質の分子量であり、Ｍ０＝１１６．２１；Ｍ１＝−１．７４９９；Ｍ２＝０．０１０３４９）。
【００４９】
いくつかの実施形態のＥＬＰは、処方条件で約１０〜約３７℃、例えば約２０〜約３７℃、または約２５〜約３７℃の範囲のＴｔを提供するように選択または設計される。いくつかの実施形態において、生理的条件（例えば、０．９％の生理食塩水）での転移温度は、若干低い末梢温度を考慮すると、約３４〜３６℃である。
【００５０】
ある特定の実施形態において、水素結合したマトリックスを体温で形成することができるアミノ酸配列は［ＶＰＧＸＧ］９０（配列番号３１）を含み、ここで、各ＸはＶ、Ｇ、およびＡから選択され、Ｖ：Ｇ：Ａの比は約５：３：２であり得る。例えば、体温で水素結合したマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は［ＶＰＧＸＧ］１２０（配列番号３２）を含み得、ここで、各ＸはＶ、Ｇ、およびＡから選択され、Ｖ：Ｇ：Ａの比は約５：３：２であり得る。本明細書中で示されるように、このＥＬＰの１２０の構造単位は、約５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質で約３７℃の転移温度を提供することができる。約４０〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、相転移温度は約３５摂氏度（体温より少しだけ低い）であり、これにより末梢体温が３７℃よりも少しだけ低くなる。
【００５１】
あるいは、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配は［ＶＰＧＶＧ］９０（配列番号３１）、または［ＶＰＧＶＧ］１２０（配列番号３２）を含む。本明細書中で示されるように、このＥＬＰの１２０の構造単位は、約０．００５〜約０．０５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質で約３７℃の転移温度を提供することができる。
【００５２】
エラスチン様−ペプチド（ＥＬＰ）タンパク質ポリマーおよび組換え融合タンパク質は、参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許公開第２０１０／００２２４５５号で記載されているようにして調製することができる。
【００５３】
他の実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列はランダムコイルまたは非球状拡張構造を含み得る。例えば、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、それぞれ参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許公開第２００８／０２８６８０８号、ＷＩＰＯ特許公開第２００８／１５５１３４号、および米国特許公開第２０１１／０１２３４８７号で開示されているアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、主にプロリンとセリン、アラニン、およびグリシン残基のうちの１以上から構成され得る。いくつかの実施形態において、体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列は、５０％、または６０％、または７０％、または７５％、または８０％、または９０％のプロリン、セリン、アラニン、およびグリシン残基（まとめて）である。
【００５４】
例えば、いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、少なくとも４０個のアミノ酸の非構造化組換え型ポリマーを含む。例えば、非構造化ポリマーは、非構造化ポリマー中に含まれるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基の合計が全アミノ酸の約８０％超を構成する場合と定義することができる。いくつかの実施形態において、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される際少なくとも５０％のアミノ酸は、二次構造が欠如している。非構造化ポリマーは、約１００、１５０、２００またはそれを超える連続したアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、ランダムコイルドメインを形成する。特に、「ランダムコイルコンフォメーション」を有するかまたは形成するポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーは、規定の二次および三次構造が実質的に欠如している。
【００５５】
様々な実施形態において、意図される対象はヒトであり、体温は約３７℃であり、したがって医薬組成物はこの温度で徐放を提供するように設計される。水素結合および／または疎水性相互作用の逆転をともなう循環中への徐放は、体温が一定のままであっても、注射部位で生成物が拡散するにつれて濃度が降下することによって推進される。他の実施形態において、対象は非ヒトほ乳類であり、医薬組成物は、例えばある特定の飼い慣らされたペット（例えば、イヌまたはネコ）または家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、またはブタ）についてなど、いくつかの実施形態では、約３０〜約４０℃であり得るほ乳類の体温で徐放を示すように設計される。一般的に、Ｔｔは、医薬組成物が注射用溶液中に残存するように処方の貯蔵条件（１０〜約２５℃、または１５〜２２℃であり得る）よりも高い。
【００５６】
いくつかの実施形態において、徐放は、医薬本発明の組成物の低温処方（cold formulation）（例えば２〜１５℃、または２〜１０℃、または２〜５℃）を投与することによって実施される。したがって、いくつかの実施形態において、低温処方が提供される。低温処方は、約２〜約３℃、約２〜約４℃、約２〜約５℃、約２〜約６℃、約２〜約７℃、約２〜約８℃、約２〜約１０℃、約２〜約１２℃、約２〜約１４℃、約２〜約１５℃、約２〜約１６℃、約２〜約２０℃、約１０〜約２５℃、または１５〜２２℃で投与することができる。
【００５７】
医薬組成物は概して、「全身性送達」のためであり、これは薬剤が病理学的部位または作用部位に局所的に送達されないことを意味する。その代わり、薬剤は、注射部位から血流中に吸収され、この場合、薬剤は全身的に作用するか、または循環によって作用部位へ輸送される。
【００５８】
徐放
１つの態様において、本発明は徐放性製剤処方を提供する。処方は全身投与用医薬組成物を含み、ここで、医薬組成物は、インスリンアミノ酸配列と、本明細書中で記載される対象の体温で可逆性マトリックスを形成することができるアミノ酸配列（すなわち、徐放を提供するアミノ酸配列）とを含む。可逆性マトリックスは、水素結合（例えば、分子内および／または分子間水素結合）ならびに疎水性寄与から形成される。処方は、投与されるとマトリックスの形成を誘導する１以上の薬剤的に許容される賦形剤および／または希釈剤をさらに含む。マトリックスは注射部位から循環への緩徐な吸収を提供する。注射部位からの徐放、または緩徐な吸収は，濃度が注射部位で消散するにつれてマトリックスがゆっくりと逆転するためである。一旦生成物が循環中に移動したら、処方は長い半減期および改善された安定性を付与する。したがって、緩徐な吸収と長い半減期との独特の組み合わせが達成され、浅いピーク対トラフ比および／または長いＴｍａｘを有する望ましいＰＫプロフィールをもたらす。
【００５９】
具体的には、本発明は、低いピーク対トラフ比、および／または長いＴｍａｘを有する比較的フラットなＰＫプロフィールを含むインスリンアミノ酸配列のようなペプチド薬物の改善された薬物動態を提供する。ＰＫプロフィールは、比較的低頻度の投与計画、例えばいくつかの実施形態では、１ヶ月あたり１〜８回の注射で維持することができる。
【００６０】
１つの態様において、本発明は徐放性製剤処方を提供する。処方は全身投与のための医薬組成物を含み、ここで、医薬組成物は、インスリンアミノ酸配列と、対象の体温でマトリックスを形成することができるアミノ酸配列とを含む。可逆性マトリックスは、水素結合（例えば、分子内および／または分子間水素結合）ならびに疎水性寄与から形成される。処方は、投与されるとマトリックスの形成を誘導する１以上の薬剤的に許容される賦形剤および／または希釈剤をさらに含む。マトリックスは注射部位から循環へ緩徐な吸収を提供し、理論によって拘束されないが、この緩徐な吸収は、タンパク質濃度が注射部位で減少する際のマトリックスのゆっくりした逆転のためである。緩徐な吸収プロフィールはフラットなＰＫプロフィール、ならびに便利で快適な投与レジメンを提供する。例えば、様々な実施形態において、数日間にわたる（例えば、２〜約６０日、または約４〜約３０日）インスリンアミノ酸配列の血漿濃度は１０倍、または約５倍、または約３倍を超えて変化しない。一般的に、このフラットなＰＫプロフィールは複数の（実質的に等間隔の）投与、例えば少なくとも２回、少なくとも約５回、または少なくとも約１０回の処方の投与にわたってみられる。いくつかの実施形態において、緩徐な吸収は、約５時間超、約１０時間超、約２０時間超、約３０時間超、または約５０時間超のＴｍａｘ（最大血漿濃度になるまでの時間）によって示される。
【００６１】
注射部位からの徐放、または緩徐な吸収は、対象の体温で水素結合したマトリックスを形成することができるアミノ酸配列、ならびに処方の成分によって制御される。
【００６２】
処方は、投与されるとマトリックスの形成を誘導する１以上の薬剤的に許容される賦形剤および／または希釈剤を含む。例えば、そのような賦形剤は、塩、および水素結合を安定化させるように作用し得る他の賦形剤を含む。例示的塩としては、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムなどのアルカリ土類金属塩が挙げられる。対イオンとしては、塩化物およびリン酸塩が挙げられる。例示的塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、およびリン酸カリウムが挙げられる。
【００６３】
処方中のタンパク質濃度は、賦形剤とともに投与温度でのマトリックスの形成を推進するように調節される。例えば、タンパク質濃度が高いほどマトリックスの形成の推進に役立ち、この目的のために必要とされるタンパク質濃度は用いられるＥＬＰシリーズに応じて変わる。例えば、ＥＬＰ１−１２０、または同等の転移温度を有するアミノ酸配列を使用する実施形態において、タンパク質は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在するか、または約５ｍｇ／ｍＬ〜約１２５ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在する。医薬組成物は約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約１５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在し得る。ＥＬＰ４−１２０、または同等の転移温度を有するアミノ酸配列を使用する実施形態において、タンパク質は約０．００５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在するか、または、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在する。
【００６４】
医薬組成物は、体温（例えば、３７℃、またはいくつかの実施形態では、３４〜３６℃）でのマトリックスの形成を推進するために充分なｐＨ、イオン強度にて、一般的には賦形剤で処方される。医薬組成物は概して、貯蔵条件でマトリックスを形成しないように調製される。貯蔵条件は、概して、約３２℃未満、または約３０℃未満、または約２７℃未満、または約２５℃未満、または約２０℃未満、または約１５℃未満など、処方の転移温度未満である。例えば、処方は血液と等張であり得るか、または生理的条件を模倣するイオン強度を有し得る。例えば、処方は、少なくとも２５ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも３０ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも４０ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも７５ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも１００ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも１５０ｍＭの塩化ナトリウムのイオン強度を有し得る。ある特定の実施形態において、処方は約０．９％の生理食塩水より低いイオン強度を有する。いくつかの実施形態において、処方は塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、およびリン酸水素ナトリウムのうちの２以上を含む。
【００６５】
ある特定の実施形態において、処方は約５０ｍＭのヒスチジン、または約４０ｍＭのヒスチジン、または約３０ｍＭのヒスチジン、または約２５ｍＭのヒスチジン、または約２０ｍＭのヒスチジン、または約１５ｍＭのヒスチジンを含んでもよい。
【００６６】
液体処方は約１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび約２０ｍＭのヒスチジンを含んでもよく、冷蔵保存または室温で保存することができる。塩濃度を変更して、注射部位で等張性を提供することができる。
【００６７】
処方は、１週につき１回、１週につき２回、または１ヶ月につき１〜８回投与するための前もって１回分を計量されたペン（pre-dosed pen）もしくは注射器などの形態にパッケージすることができるか、あるいは通常のバイアルなどに充填することができる。
【００６８】
例示的実施形態において、本発明は治療薬を含む徐放性製剤処方を提供し、この治療薬（例えば、ペプチドまたはタンパク質治療薬）は、インスリンアミノ酸配列および［ＶＰＧＸＧ］９０（配列番号３１）、または［ＶＰＧＸＧ］１２０（配列番号３２）を含むアミノ酸配列を含み、ここで、各ＸはＶ、Ｇ、およびＡから選択される。Ｖ、Ｇ、およびＡは約５：３：２の比で存在し得る。あるいは、アミノ酸配列は［ＶＰＧＶＧ］９０（配列番号３１）または［ＶＰＧＶＧ］１２０（配列番号３２）を含む。処方は、ヒト対象へ投与する際の水性形態から可逆性マトリックスの形成のために１以上の薬剤的に許容される賦形剤および／または希釈剤をさらに含む。インスリンおよびその誘導体は本明細書中、および参照することによって本明細書中に組み込まれる米国仮特許出願第６１／５６３，９８５号で記載されている。
【００６９】
これらの実施形態において、インスリンアミノ酸配列は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在する可能性があるか、または約５ｍｇ／ｍＬ〜約１２５ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在する可能性がある。インスリンアミノ酸配列は約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内、または約１５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在する。処方は、少なくとも２５ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも３０ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも４０ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも７５ｍＭの塩化ナトリウム、または少なくとも１００ｍＭの塩化ナトリウムのイオン強度を有し得る。処方は約０．９％生理食塩水のイオン強度よりも低いイオン強度を有し得る。処方は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、およびリン酸水素ナトリウムのうちの２以上を含む。
【００７０】
例えば所望の安定性を達成するための他の処方成分も用いることができる。そのような成分は１以上のアミノ酸または糖アルコール（例えば、マンニトール）、防腐剤、および緩衝剤を含み、そのような構成要素は、当該技術分野で周知である。
【００７１】
別の態様において、本発明は、インスリンアミノ酸配列の徐放レジメンを実施するための方法を提供する。方法は、本明細書中で記載される処方を必要とする対象に投与することを含み、この場合、処方は１ヶ月あたり約１〜約８回投与される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、処方はほぼ週１回投与され、そして皮下または筋肉内投与され得る。いくつかの実施形態において、投与部位は病理学的部位ではなく、例えば意図される作用部位ではない。
【００７３】
様々な実施形態において、インスリンアミノ酸配列の血漿濃度は、少なくとも２回、少なくとも約５回、または少なくとも約１０回の処方の投与などの複数回の投与にわたって、１０倍、または約５倍、または約３倍を超えて変化しない。投与は、例えば、ほぼ毎日またはほぼ１週間につき１回または１ヶ月につき１〜約５回など実質的に等間隔である。
【００７４】
ある特定の実施形態では、対象はヒトであるが、他の実施形態では、非ヒトほ乳類、例えば飼い慣らされたペット（例えば、イヌまたはネコ）、または家畜もしくは飼育場の動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタ）であってよい。
【００７５】
複合体化（conjugation）およびカップリング
組換えで産生された融合タンパク質は、本発明のある特定の実施形態によると、徐放を提供するアミノ酸配列（例えば、ＥＬＰ）および遺伝子融合によって互いに結合したインスリンアミノ酸配列を含む。例えば、融合タンパク質は、徐放成分を提供するアミノ酸配列とフレーム内でクローン化されたインスリンアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの翻訳によって生成させることができる。
【００７６】
ある特定の実施形態において、徐放成分を提供するアミノ酸配列およびインスリンアミノ酸配列は、様々な長さのリンカーペプチドを使用して融合させて、さらに強力な物理的分離を提供し、そして融合した部分間のさらに大きな空間移動を提供することができ、かくしてその受容体に対する結合のためのインスリンアミノ酸配列の利用可能性を最大化することができる。リンカーペプチドは柔軟性またはより硬質であるアミノ酸から構成され得る。例えば、柔軟性リンカーは、比較的小さな側鎖を有するアミノ酸を含み得、これは親水性であり得る。限定されないが、柔軟性リンカーはグリシンおよび／またはセリン残基を含み得る。さらに硬質のリンカーは、例えば、さらに立体的に遮蔽されたアミノ酸側鎖、たとえば（限定されないが）チロシンまたはヒスチジンを含有し得る。リンカーは、約５０、４０、３０、２０、１０、または５個未満のアミノ酸残基であり得る。リンカーは、インスリンアミノ酸配列および徐放を提供するアミノ酸配列に共有結合し、またインスリンアミノ酸配列および徐放を提供するアミノ酸配列間を共有結合させることができる。
【００７７】
リンカーまたはペプチドスペーサーはプロテアーゼ切断可能または切断不可能であり得る。一例として、切断可能なペプチドスペーサーとしては、限定されないが、Ｔｅｖ、トロンビン、第Ｘａ因子、プラスミン（血液プロテアーゼ）、メタロプロテアーゼ、カテプシン（例えば、ＧＦＬＧ、配列番号２１など）、および他の身体の部分で見られるプロテアーゼなどの様々な種類のプロテアーゼ（インビトロまたはインビボで）によって認識されるペプチド配列が挙げられる。切断可能なリンカーを使用するいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、融合物として不活性、低活性、または作用が弱い可能性があり、これをその後インビボでスペーサーの切断により活性化する。あるいは、インスリンアミノ酸配列が融合物として充分活性である場合、切断不可能なスペーサーを用いることができる。切断不可能なスペーサーは、例えば、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（配列番号３４）（式中、ｎは１〜４であり、両端を含み、ｍは１〜４であり、両端を含む）を有する切断不可能なスペーサー部分を含む任意の好適な種類のものであり得る。あるいは、必要な効果を達成しつつ、骨格ＥＬＰとは異なる短いＥＬＰ配列をリンカーまたはスペーサーの代わりに用いることができる。
【００７８】
さらに他の実施形態において、医薬組成物は、各末端で徐放成分を提供するアミノ酸配列成分が隣接するインスリンアミノ酸配列を有する組換え融合物である。徐放成分を提供する少なくとも１つのアミノ酸配列は、インスリンアミノ酸配列が不活性であるが、１つのＥＬＰ成分のタンパク質分解による除去によってインビボで活性化されるように、切断可能なスペーサーによって結合させることができる。活性であり、インビボで増強された半減期（または本明細書中で記載される他の特性）を有する結果として得られる徐放を提供する１つのアミノ酸配列融合物。
【００７９】
他の実施形態において、本発明は、インスリンアミノ酸配列および徐放成分を提供するアミノ酸配列の化学的複合体（chemical conjugate）を提供する。複合体は、徐放成分を提供するアミノ酸配列をインスリンアミノ酸配列と当該技術分野で周知の任意の数の方法によって化学的にカップリングさせることによって作成することができる（たとえば、Nilsson et al., 2005, Ann Rev Biophys Bio Structure 34: 91-118を参照のこと）。いくつかの実施形態において、化学的複合体は、直接または短いもしくは長いリンカー部分により、治療用タンパク質成分、たとえばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基上の１以上の官能基により、インスリンアミノ酸配列を徐放成分を提供するアミノ酸配列に共有結合させることによって共有結合性複合体（covalent conjugate）を形成することによって、形成することができる。さまざまな従来のリンカー、たとえばジイソシアネート、ジイソチオシアネート、カルボジイミド、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどを用いることができる。
【００８０】
非ペプチド化学スペーサーはさらに、例えば、Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson,Academic Press, Inc.,より出版、1995で記載される機能的リンカー、およびthe Cross-Linking Reagents Technical Handbook, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois)から入手可能、で特定されたものなど、任意の好適な種類のものであり得、それらの開示はそのそれぞれの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。化学スペーサーの実例としては、Ｌｙｓのアミン基に結合することができるホモ二官能性リンカー、ならびに一端のＣｙｓに、そして他端のＬｙｓに結合することができるヘテロ二官能性リンカーが挙げられる。
【００８１】
ある特定の実施形態において、室温（またはヒト体温、たとえば３７℃超のＴｔ）で転移しない比較的小さなＥＬＰ成分（例えば、約３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、または１０ｋＤａ未満のＥＬＰ成分）を化学的にカップリングまたは架橋させる。例えば、同一または異なる特性を有する２つの比較的小さなＥＬＰ成分を化学的にカップリングさせることができる。そのようなカップリングは、いくつかの実施形態において、ＥＬＰのＣ末端またはその付近で１つのシステイン残基を添加することによって、インビボで起こり得る。そのようなＥＬＰ成分は、標的での活性または親和性を増加させるように、それぞれ１以上のインスリンアミノ酸配列と融合させることができる。
【００８２】
疾患を治療する方法
様々な実施形態において、本明細書中で記載される本発明の医薬組成物を、糖尿病もしくは高血糖症などの病状、または様々な代謝異常を含む状態の症状および合併症の対抗もしくは軽減の目的のためにインスリン投与が望ましい任意の他の状態を有する患者の管理および治療のために使用する。治療は、本発明の処方を投与して症状もしくは合併症の発症を防止すること、症状もしくは合併症を軽減すること、または疾患、状態、もしくは障害を排除することを含む。本発明の方法は、１型糖尿病、すなわち身体がインスリンを産生せず、したがって血液中の糖の量を制御することができない状態、および２型糖尿病、すなわち身体がインスリンを正常に使用せず、したがって血液中の糖の量を制御することができない状態の治療を含む。
【００８３】
様々な実施形態において、徐放は持続的血糖管理を提供する。血糖管理とは、真性糖尿病の人における血糖（グルコース）の典型的なレベルを指す。微小血管合併症を含む糖尿病の長期的合併症の多くは、長年の高血糖症に由来する。良好な血糖管理は糖尿病治療の重要な目標である。血糖レベルは１日を通して変動し、グルコース記録はこれらの変化の不完全な指標であるので、グリコシル化されるヘモグロビンのパーセンテージが、糖尿病の人の臨床試験および臨床診療における長期血糖管理の代用の尺度として使用される。この試験では、ヘモグロビンＡ１ｃまたはグリコシル化ヘモグロビンは前の２〜３ヶ月の平均グルコース値を反映する。
【００８４】
正常なグルコース代謝を有する非糖尿病の人では、グリコシル化ヘモグロビンレベルは最も一般的な方法によると通常約４〜６％である（通常の範囲は方法によって変わり得る）。「完全な血糖管理」は、グルコースレベルが常に正常（例えば、約７０〜１３０ｍｇ／ｄｌ、または約３．９〜７．２ミリモル／Ｌ）であり、糖尿病のない人と区別不可能であることを示す。実際は、治療手段の欠点のために、「良好な血糖管理」でさえも平均で大抵の時、通常よりも多少高い血中グルコースレベルを示す。なお、「良好な血糖管理」とみなされるものは年齢および患者の低血糖に対する感受性によって異なる。米国糖尿病協会は、患者および医師が２００ｍｇ／ｄｌ（１１ミリモル／ｌ）および８％以下の平均グルコースおよびヘモグロビンＡ１ｃ値を目指して努力することを主張している。「不良な血糖管理」とは、持続的に高い血糖およびグリコシル化ヘモグロビンレベルを指し、これは重症合併症が起こるまで長い年月にわたって例えば２００〜５００ｍｇ／ｄｌ（約１１〜２８ミリモル／Ｌ）および約９〜１５％以上の範囲であり得る。
【００８５】
様々な実施形態において、本発明は、本明細書中で記載される医薬組成物および疾患の治療に有効な他の薬剤、例えば本明細書中で記載されるものを含む、併用療法および／または共処方（co-formulation）を提供する。
【００８６】
１つの実施形態において、本発明は、参照することによって本明細書中に組み込まれる米国特許第８，１７８，４９５号で開示されるグルカゴン様受容体（ＧＬＰ）−１受容体アゴニスト、例えばＧＬＰ−１（配列番号２２）、エキセンジン−４（配列番号２３）、またはその機能的アナログおよび／もしくは誘導体との組み合わせまたは共処方を提供する。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１（Ａ−Ｂ）であり、ここで、Ａは１〜７の整数であり、Ｂは３８〜４５の整数である。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２４）、もしくはその機能的アナログまたはＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号２５）、もしくはその機能的アナログである。
【００８７】
もう１つの実施形態において、本発明はＧＬＰ−２（配列番号２６）、ＧＩＰ（配列番号２７）、グルカゴン（配列番号２８）、およびオキシントモジュリン（配列番号２９）またはその機能的アナログおよび／もしくは誘導体との組み合わせまたは共処方を提供する。機能的アナログは天然配列に対して１〜１０個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換（まとめて）を含み得る。
【００８８】
様々な実施形態において、併用療法および／または共処方は、融合タンパク質を、例えば本明細書中で記載されるＥＬＰまたはマトリックス形成成分とともに含む。いくつかの実施形態において、ＥＬＰは少なくとも６０単位（配列番号３０）、または９０単位（配列番号３１）、または１２０単位（配列番号３２）、または１８０単位のＶＰＧＸＧ（配列番号３３）を含み、ここで、Ｘは独立して選択されたアミノ酸である。様々な実施形態において、Ｘは５：３：２の比のＶ、Ｇ、もしくはＡ、または１：２：１の比のＫ、Ｖ、もしくはＦ、または１：７：１の比のＫ、Ｖ、もしくはＦ、またはＶである。
【００８９】
もう１つの実施形態において、本発明は本明細書中で記載される様々な形態のインスリンとの組み合わせまたは共処方を提供する。１つの実施形態において、インスリンは速効性または即効性インスリンである。
【実施例】
【００９０】
ヒトプロインスリンをＥＬＰ１−１２０バイオポリマーに遺伝的に融合させ、大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）の可溶性画分中で発現させた。プロインスリン部分の成熟インスリンへの精製酵素プロセッシング後、融合タンパク質を正常マウスモデルにおけるグルコース低下について試験し、インスリン単独と比較した。インスリンＥＬＰ融合物はインスリンと同様にグルコース低下を示した。加えて、融合タンパク質の低下効果は、モデルにおけるインスリンよりも長期間に及ぶことが示された。
【００９１】
インスリン融合物構造
ヒトプロインスリンは３１個のアミノ酸からなるＣペプチドと連結されたＢ鎖およびＡ鎖からなる（図１Ａおよび１Ｂ）。一旦Ｂ鎖およびＡ鎖間にジスルフィドが形成されたら、トリプシン／カルボキシペプチダーゼＢ様系によるＣペプチドの除去によってプロインスリンをインビボで成熟インスリンに変換する。このペプチドプロセッシングは、組換え型トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを使用してインビトロで再現することができる。融合物は大腸菌の可溶性画分で発現されるので、リフォールディングステップは必要ない。
【００９２】
プロインスリンヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ系ベクターｐＰＢ１０３１中にサブクローンし、ＥＬＰ１−１２０配列のＮ末端に配置してプラスミドｐＰＥ０１３９を作成した（図２）。
【００９３】
図３は、プロインスリンＥＬＰ１−１２０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。プロインスリン配列（下線）はＥＬＰ１−１２０配列と融合している。アミノ酸配列は場合によってＮ末端で開始メチオニン残基を含む。
【００９４】
発酵
インスリンＥＬＰ融合プラスミドｐＰＥ０１３９は、流加培養発酵プロセスでＴ７プロモータの制御下にて大腸菌の細胞内画分で発現された。グリセロール細胞ストックを、主炭素源としてグリセロールおよび主窒素源として酵母エキスを有する半規定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）の動物性材料を含まない培地（ＥＣＰＭ＋プロリン）中、２段階振盪フラスコシードトレインを使用して増殖させた。シードトレインで充分な細胞密度が達成された後、シードトレインと同じ培地を含む発酵装置に培養物を移した。処理パラメータ（ｐＨ、温度、溶存酸素）をＰＩＤ制御によって設定点で維持した。培養物を静止期に達するまで成長させ、直後に、グリセロール／酵母エキス／硫酸マグネシウム供給を開始した。培養物を炭素制限下で維持し、ＩＰＴＧを使用してプロモータの誘導を達成した。発酵の終わりに、培養物を遠心分離して、インスリンＥＬＰ融合物を含有するバイオマスを使用済み培地から分離した。細胞ペーストをその後の精製まで−７０℃で保存した。
【００９５】
精製
凍結細胞ペーストを、２Ｍの尿素（インスリンＥＬＰの解離のため）を含有する溶解緩衝液中に再懸濁させ、そして均一になるまで混合した。溶解は、細胞膜を破壊するためにマイクロフリューダイザーを使用して達成された。２段階接線流ろ過（ＴＦＦ）システムを使用して、生成物を清澄化し、濃縮した。インスリンＥＬＰ融合物を捕捉ステップとしてＨＩＣカラム上に流し、宿主細胞汚染物質を洗い流した。勾配を使用して生成物を溶出させて、生成物に関連する不純物（分解種）を分画した。ＴＦＦ緩衝液交換を選択された画分に関して実施して、残存ＤＮＡ、エンドトキシンおよび宿主細胞タンパク質を除去するための２つのアニオン交換カラム前に残存塩を除去した。最終ＴＦＦ濃度および緩衝液交換を使用して生成物を処方した。０．２μＭろ過を殺菌のために使用した。生成物を酵素消化まで４℃で保存した。
【００９６】
プロインスリンＥＬＰ融合物（ＰＥ００８３）の酵素処理
精製されたプロインスリンＥＬＰ１−１２０を処方緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。プロインスリンＥＬＰを成熟インスリンＥＬＰにプロセッシングするための２Ｘ酵素溶液を次のとおりに調製した：５０ｍＭの重炭酸ナトリウム、２ｕｇ／ｍＬのトリプシンおよび２０ｕｇ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＢ。２Ｘ酵素溶液を等体積の１ｍｇ／ｍＬのＰＥ００８３に添加し、そして３７℃で１〜２時間インキュベートした。ＥＬＰの相転移特性を使用して酵素反応を停止させた。塩化ナトリウムを反応に添加して、融合物に相転移を誘導した。成熟インスリンＥＬＰはコアセルベートを形成し、遠心分離によってペレット化した。残存酵素を洗い流し、ペレット化された融合物を低塩緩衝液中に再溶解させた。２回の相転移精製を実施した。
【００９７】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４）は、Ｃペプチドが切断されるので、酵素処理後に予測された減少した融合タンパク質分子量を示した。
【００９８】
抗インスリンＢ鎖ウェスタンブロット（図５）を実施して、ＥＬＰと融合したＡ鎖およびＢ鎖の両方の存在を確認した。データは、非還元条件下でＢ鎖の存在を示し、Ａ鎖とＢ鎖との間のジスルフィド結合形成を意味した。融合タンパク質およびジスルフィド結合の還元の結果、融合物からＢ鎖が除去された。
【００９９】
エレクトロスプレーイオン化質量分析は、プロインスリンＥＬＰ融合物（図６）およびＣペプチドの酵素による除去後の成熟インスリンＥＬＰ融合物（図７）の質量を確認した。さらなる塩付加物が両試料中に存在していた。ジスルフィド結合の存在は、Ｅｌｌｍａｎの試薬アッセイを使用して確認した。遊離チオールが存在しないことは、ジスルフィド結合が形成されたことを示した。
【０１００】
インビボグルコース低下
正常なマウスを一晩絶食させ、生理食塩水（負の対照）、１３ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリングラルギン（正の対照）または３５ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリンＥＬＰ融合物（ＩＮＳＵＭＥＲＡ）を皮下注射した。投薬前および投薬後８時間まで１時間ごと、および投薬後２４時間に血糖値を読み取った。投薬後１時間に食物を入手可能にした。図８は血糖データ（平均＋−ＳＥ）を示す。インスリンＥＬＰ融合物は生理食塩水対照に対して有意な血糖低下を示す。加えて、インスリンＥＬＰ融合物は、インスリングラルギン対照（２時間）よりもさらに延長された（７時間）血糖低下を示した。
【０１０１】
１型糖尿病モデルにおけるインビボ効果
ＥＬＰ−インスリン融合物、ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）を、１型真性糖尿病（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ）マウスモデルで投与した。特に、単回投与データを図９で示す。結果は、等モルのＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）投薬と比較して、ＩＮＳＵＭＥＲＡについてより長いグルコース低下期間を示した。化合物を毎日レジメンで投薬した場合（図１０）、結果は、活性および半減期に関して、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）と比較してＩＮＳＵＭＥＲＡの優位性を示す。
【０１０２】
図１１Ａおよび１１Ｂは、ＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）と比較した、１型真性糖尿病（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ）マウスモデルにおけるＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）低用量滴定を示す。図１１Ａは単回皮下投薬を示し、一方、図１１Ｂは１４日の毎日皮下投薬を示す。どちらの場合も、より顕著で持続したＩＮＳＵＭＥＲＡの血糖低下効果が示される。
【０１０３】
研究は、ＩＮＳＵＭＥＲＡの、患者における血糖の典型的なレベルの尺度である血糖管理の程度を測定するためにも実施した。図１２Ａおよび１１Ｂは、ＩＮＳＵＭＥＲＡ（ＰＥ０１３９）がＬＡＮＴＵＳ（インスリングラルギン、ＳＡＮＯＦＩ−ＡＶＥＮＴＩＳ）に対して有意に増加した血糖管理を有することを示す。２７〜３９％の減少が血糖曲線下面積（ＡＵＣ）で見られる。図１２Ａは、化合物投与の第１日および０〜２４時間での血糖ＡＵＣを示す。図１２Ｂは、化合物投与の第１４日および０〜２４時間での血糖ＡＵＣを示す。ＩＮＳＵＭＥＲＡは、両投薬レジメンで、ＬＡＮＴＵＳよりも有効に血糖ＡＵＣを低下させた。
【０１０４】
研究をさらに実施して、ＩＮＳＵＭＥＲＡ治療の薬物動態（ＰＫ）を評価した。糖尿病のブタにおいて、単回皮下注射（図１３Ａ）または毎日皮下注射のいずれかの２週間（図１３Ｂ）レジメンを追跡した。結果は、ＩＮＳＵＭＥＲＡが皮下注射後に小さなピーク対トラフで長い半減期を達成することを示す。
【０１０５】
均等論
当業者は、単なる日常的実験を用いて、本明細書中で具体的に記載される特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は以下の請求項の範囲に含まれることが意図される。
【図１Ａ】
2014534265.tif 000003
【図１Ｂ】
2014534265.tif 000004
【図２】
2014534265.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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