(57)【要約】本発明は、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＮ末端およびＣ末端に対して融合されている、少なくとも１つの野生型アレルゲンの１０個〜５０個の連続したアミノ酸残基からなる少なくとも３つのペプチド断片を含む表面ポリペプチドに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＮ末端およびＣ末端に対して融合されている、少なくとも１つの野生型アレルゲンの１０個〜５０個の連続したアミノ酸残基からなる少なくとも３つのペプチド断片を含むポリペプチド。
【請求項２】
上記ヘパドナウイルス科のウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記ヘパドナウイルス科のウイルスの上記表面ポリペプチドが、ＰｒｅＳであることを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
上記表面ポリペプチドの上記少なくとも１つの断片が、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳｌまたはＢ型肝炎ＰｒｅＳ２であることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
上記少なくとも１つの野生型アレルゲンに由来する上記少なくとも３つのペプチド断片のうち少なくとも１つが、Ｂ細胞結合ペプチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
上記少なくとも３つのペプチド断片が、ＩｇＥ結合能を示さないか、または、上記野生型アレルゲンよりも低いＩｇＥ結合能を示すことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
上記少なくとも３つのペプチド断片のうち少なくとも１つが、Ｔ細胞反応性を示さないか、または、実質的に示さないことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
上記野生型アレルゲンが、主要なカンバ花粉アレルゲン、特にＢｅｔ  ｖ  １；主要なオオアワガエリ花粉アレルゲン、好ましくはＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７；主要なイエダニアレルゲン、好ましくはＤｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２およびＤｅｒ  ｐ  ２３；主要なネコアレルゲン、特にＦｅｌ  ｄ  １およびＦｅｌ  ｄ  ２；主要なミツバチアレルゲン；主要なスズメバチアレルゲン；プロフィリン、特にＰｈｌ  ｐ  １２；オリーブアレルゲン、好ましくはＯｌｅ  ｅ  １；パリエタリア  ユダイカアレルゲン、好ましくはＰａｒ  ｊ  ２；ブタクサアレルゲン、好ましくはＡｍｂ  ａ  １；ヨモギ花粉アレルゲン、好ましくはＡｒｔ  ｖ  １；ならびに日本のスギ花粉アレルゲン、好ましくはＣｒｙ  ｊ１またはＣｒｙ  ｊ  ２からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
上記ペプチド断片が、Ｐｈｌ  ｐ  １の１５１〜１７７、８７〜１１７、１〜３０、４３〜７０もしくは２１２〜２４１番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ２の１〜３３、８〜３９、３４〜６５もしくは６６〜９６番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ５の９３〜１２８、９８〜１２８、２６〜５３、２６〜５８、１３２〜１６２、２１７〜２４６、２５２〜２８３もしくは１７６〜２１２番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ６の２３〜５４、５６〜９０、７３〜１１４もしくは９５〜１２７番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  １の１〜３４もしくは３５〜７０番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  ２の１〜３４、３５〜６３もしくは６４〜９２番目のアミノ酸、Ｂｅｔ  ｖ  １の３０〜５９、５０〜７９、７５〜１０４、３０〜７４もしくは６０〜１０４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １の１〜３０、５２〜８４もしくは１８８〜２２２番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １０の１〜３５、３６〜７０、７１〜１１０、１１１〜１４５、１４０〜１７０、１７５〜２０５、２１０〜２５０もしくは２５０〜２８４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２１の１〜３５、３５〜７２、７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２３の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０、３２〜６０、５２〜８４、３２〜７０（Ｃｙｓ≧Ｓｅｒ）番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  １の１９〜５８、５９〜９５、９１〜１２０もしくは１２１〜１５７番目のアミノ酸、Ｐａｒ  ｊ  ２の３１〜６０、４５〜８０、６０〜９６もしくは９７〜１３３番目のアミノ酸、Ｏｌｅ  ｅ  １の１〜４０、３６〜６６、６３〜９９、８６〜１２０もしくは１０７〜１４５番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  ２の２５〜５８、９９〜１３３、１５４〜１８３、２７７〜３０７、３３４〜３６３、３７３〜４０２、５４４〜５７３、５７９〜６０８、５８〜９９、１２５〜１６５、１８３〜２２４、２２４〜２６１、２５２〜２８９、３０３〜３４０、４１６〜４５７、４６０〜５００もしくは５０１〜５４２番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  ２の１９〜５８、５２〜９１、８２〜１１９、１０６〜１４４もしくは１３９〜１８０番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  １の１９〜５６、５１〜９０、７８〜１１８、１０６〜１４５もしくは１３５〜１７４番目のアミノ酸、Ａｒｔ  ｖ  １の２７〜７０、７０〜１００もしくは９２〜１３２番目のアミノ酸、Ａｍｂ  ａ  １の３１〜７０、８０〜１２０、１２５〜１５５、１６０〜２００、２２５〜２６３、２６４〜３００  ３０５〜３５０もしくは３５６〜３９６番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ６の１〜３４、３５〜７４、７４〜１１５、１２５〜１６５、１７４〜２１３、２４１〜２８０、２９４〜３３３、３６１〜４００もしくは４０１〜４３８番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ２の  １〜４０、４１〜８０、８１〜１２０もしくは１２１〜１６０番目のアミノ酸、またはこれらの断片もしくは配列変異からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
上記ヘパドナウイルス科のウイルスの上記表面ポリペプチドまたはその少なくとも１つの断片が、そのＮ末端に融合した少なくとも１つの野生型アレルゲンに由来する少なくとも２つのペプチド断片およびそのＣ末端に融合した少なくとも１つの野生型アレルゲンに由来する少なくとも２つのペプチド断片を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
上記少なくとも３つのペプチドのうち少なくとも２つが同一であるを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１および配列番号１５２からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ヒトまたは動物におけるアレルギーの治療または予防におけるワクチンとして使用される請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
上記ポリペプチドが、体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．００３ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり２ｍｇの量で個体に投与されることを特徴とする請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
上記ポリペプチドが、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの産生を誘導することを特徴とする請求項１３または１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
上記ポリペプチドが、野生型アレルゲンのＩｇＥエピトープに集中したＩｇＧ応答を誘導することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
上記ベクターが発現ベクターであることを特徴とする請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
上記ベクターが、細菌ベクター、真菌ベクター、昆虫ベクター、ウイルスベクターまたは哺乳類ベクターであることを特徴とする請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１７に記載の核酸分子または請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１７に記載の核酸分子または請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のベクターのうち少なくとも１つを含むワクチン調合物。
【請求項２３】
草本花粉アレルギーの治療または予防において使用される、草本花粉アレルゲン由来の低アレルギー誘発性ポリペプチドの混合物を含有するワクチン調合物であって、該ポリペプチドのうち少なくとも１つが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７より選ばれることを特徴とするワクチン調合物。
【請求項２４】
カンバ花粉アレルギーの治療または予防において使用される、配列番号１８または配列番号１９より選ばれる低アレルギー誘発性ポリペプチドのうち少なくとも１つを含有することを特徴とするワクチン調合物。
【請求項２５】
イエダニアレルギーの治療または予防において使用される、イエダニアレルゲン由来の少なくとも１つのポリペプチドを含有するワクチン調合物であって、該ポリペプチドのうち少なくとも１つが、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１および配列番号１５２より選ばれることを特徴とするワクチン調合物。
【請求項２６】
上記調合物が、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記ポリペプチド、上記核酸分子または上記ベクターを含むことを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の調合物。
【請求項２７】
上記調合物が、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に受容可能な賦形剤および／または防腐剤をさらに含むことを特徴とする請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の調合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規なポリペプチドおよびこれらの利用に関する。
【０００２】
タイプＩアレルギーは、人口のほぼ２５％を冒しているＩｇＥ媒介過敏性疾患である。それは、本質的に無害な抗原源（例えば、花粉、昆虫、カビおよび動物タンパク質）から由来する無害な風媒、昆虫、毒物、食物のアレルゲンおよび接触アレルゲン抗原の、特異的な免疫グロブリンＥによる認識に基づく。エフェクター細胞結合ＩｇＥ抗体の架橋が、炎症性媒介物（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）の放出につながり、ひいてはアレルギーの即時型の症状（例えば、鼻結膜炎、喘息、皮膚炎）につながる。ＩｇＥ依存性およびＩｇＥ非依存性の機序を介するＴ細胞活性化は、慢性的なアレルギー炎症の原因になる。
【０００３】
アレルギー処置のおそらく唯一の原因作用形態は、ほとんどの源に関するアレルゲン抽出物の漸次的に増加する量の繰り返し投与に基づく、アレルゲン特異的な免疫療法である。多くの臨床研究は、注入免疫療法の臨床的有効性を立証しており、かつこの処置の基礎を成す種々の免疫学的機序に関する証拠がある。あるアレルゲン源に対する高品質なアレルゲン抽出物を調製することの困難性、および患者に対するアレルゲンの投与が種々の副作用の原因になる可能性があるという事実に起因して、アレルゲン特異的免疫療法は、ある患者の群およびある疾患の症状に対してのみ推奨され得る。種々のアレルゲン源に対する共感作を有する患者、および重篤な疾患症状（例えば、アレルギー喘息）にかかっている患者に対する処置は、特に困難である。アレルギー喘息は、日々の生活の質に対して重篤に影響し、高い入院の割合を招き、かつ患者の集中的な看護を必要とする深刻な生命に関わる形態で発症し得ることから、最も激しいアレルギー症状の１つである。
【０００４】
天然のアレルゲン源から調製されるアレルゲン抽出物は、本質的に天然のままであり、かつ技術的手段によって、当該調製物における個々のアレルゲンの質および量に影響を与えることが不可能である。また、それらは、多くの不確定な非アレルギー誘発性成分を含んでおり、かつ種々の最近の研究は、当該抽出物の低品質を指摘しかつそれらの非常な不均一性を立証している。
【０００５】
ここ１０年において、組み換えＤＮＡ技術を用いた分子アレルゲンの性質決定の分野において、大きな進展がなされている。多くの最も重要な疾患誘発アレルゲンは、分子レベルに至るまで性質決定されており、かつ天然アレルゲン抽出物のエピトープの複雑性を模倣する組み換えアレルゲンが製造されている。さらに、種々の研究団体は、アレルゲン構造に関する知識を用いて、定義済の新たなアレルゲンワクチンを開発している。遺伝子工学、合成ペプチド化学、および免疫刺激性ＤＮＡ配列を用いたアレルゲンの接合の使用による、新たなワクチンのアレルギー性活性の低減、ひいては治療誘導副作用の割合の低減が行われている。まず、有望な臨床研究は、当該アレルゲン誘導体を用いて実施された。興味深いことに、遺伝子工学的な組み換えアレルゲンおよびアレルゲン由来合成Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドのＩｇＥ反応性が、大きく低減され得るか、または消滅さえし得るが、これらの誘導体が、やはり注入の数時間後に現れる全身性の副作用を誘導し得ることが判明した。例えば、主要なネコアレルゲンであるＦｅｌ  ｄ  １のＴ細胞エピトープペプチドが、内皮注入後の数時間において、喘息および気管支過敏性を誘導したことが、報告されており、かつこの影響がＴ細胞媒介性であり、かつＭＨＣ限定的であるという強力な証拠がある。
【０００６】
これらの結果は、即時型の反応がこれらの免疫治療研究の過程において記録されなかったことから、ＩｇＥ反応性の排除がＩｇＥ媒介性の副作用を減少させることを指し示している。しかし、組み換えアレルゲン誘導体およびペプチド混合物において保持されているアレルゲン特異的Ｔ細胞エピトープは、遅発型の副作用（例えば、非常に問題となるか、またはアトピー性の皮膚炎、慢性のＴ細胞媒介アレルギー性皮膚症状）の原因である。組み換えアレルゲン誘導体の場合に引き起こされる副作用は、相対的に穏やかであって、かつＴ細胞ペプチドワクチンの場合に引き起こされる副作用は、適切な投薬によって克服され得る。従って、新たな２つの取り組みの両方は、アレルギー性の鼻結膜炎の免疫療法にとって非常に見込みがあるように思われるが、肺における遅発型の副作用の誘導が非常に問題になり得る、アレルギー性の喘息の重篤な形態の治療においては、制限を有する可能性がある。
【０００７】
投与するために、およびその結果としてペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に対する有効な免疫応答を誘発するために、補佐剤および／または担体が定期的に用いられる。例えば、完全フロインド補助液（ＣＦＡ）は、利用できる最も効力のある補佐剤の１つである。アレルゲン由来のペプチドおよびポリペプチドに対して強力な免疫応答を誘導できるワクチン組成物に対する要求、および、当然に、完全フロインド補助液を使用するかまたは使用しない他の抗原に対する要求が存在する。さらに、ＢＳＡは、動物モデルにおいて担体としてうまく使用されている一方において、副作用の危険（例えば、プリオン病（変異型クロイツフェルトヤコブ病）の感染の危険）のせいで、ヒトワクチン組成物における使用に関して適切ではない場合がある。アレルゲンに対する有効なワクチンの開発に対するなお別の課題として、個体または動物において急速にアレルゲンを減少させることが可能な免疫応答が必要とされている。従って、血中における高濃度の、主にＩｇＧサブタイプからなるアレルゲン特異的抗体が、求められる。粘膜表面においては、ＩｇＡ抗体もまた重要である。
【０００８】
また、当該技術において公知の担体タンパク質であるコレラ毒素は、補佐剤として恒常的に使用される。しかし、コレラ毒素は、総体的および特異的なＩｇＥ抗体レベルを増加させ、かつＩｇＥ関連炎症性反応を引き起こす。
【０００９】
ワクチン接種用に使用されるほとんどの担体タンパク質が副作用を誘発することに起因して、毒性のある補佐剤を使用することなく、寛容性に乏しい担体タンパク質を用いることなく、かつ状況によっては潜在的に病的な免疫反応を刺激することなく、アレルゲンまたは他の抗原に対する免疫応答を誘発することができる担体系が必要とされている。これらの指定に合致する新規な担体系は、アレルギー性疾患のような疾患の治療または予防に好適である新規な、接合物および組成物の形成に関して使用され得る。
【００１０】
Ｂｏｈｌｅ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．（J. Immunol. 172 (11) (2004): 6642-6648）において、Ｓ層タンパク質の部分およびＢｅｔ  ｖ  １部分を含む組み換え融合タンパク質について説明されている。この分子は、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的Ｔ細胞エピトープを含む本来のＢｅｔ  ｖ  １アレルゲンを含む。
【００１１】
国際公開第２００４／００４７６１号パンフレットは、免疫原と融合され、かつ免疫付与に使用され得るウイルス様粒子に関する。
【００１２】
国際公開第２００４／００３１４３号パンフレットにおいて、ウイルス様粒子およびワクチン接種に関する免疫原として、アレルギー性分子を含む融合タンパク質の利用が、開示されている。
【００１３】
国際公開第２００７／１４０５０５号パンフレットおよびＥｄｌｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（J. Immunol. 182 (10) (2009) 6298-6306）において、アレルゲン由来のペプチドに対して融合されている種々の担体分子を含む融合タンパク質の使用により、アレルゲン特異的なＩｇＧ抗体が誘導されることが記載されているが、これらのコンストラクトは、ＩＬ−１０免疫またはＴｈ１免疫の誘導等、アレルギー患者にとって有利と考えられ得る免疫調節効果を示さない。Ｅｄｌｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．の図４に、ＫＬＨ融合ペプチドがＴｈ２サイトカインＩＬ−５を誘導すること、およびＶＰ１融合タンパク質がＩＬ−１０やＩＦＮ−ｇａｍｍａを誘導しないことが示されている。
【００１４】
Ｎｉｅｓｐｏｄｚｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ  （J. Allergy Clin. Immunol. 127 (6) (2011) 1562-1570）において、Ｂ型肝炎由来のPreSをそれぞれ含む複数の融合タンパク質および主要なネコアレルゲンであるＦｅｌ  ｄ  １由来の２つのペプチドを使用することにより、アレルゲン特異的なＩｇＧ抗体が誘導されることが記載されている。しかし、ヒトのワクチン接種に適する投与計画が記載されておらず、また、上記ペプチドはアレルゲン特異的なＴ細胞エピトープを含んでいた。
【００１５】
上述の欠点を克服し、かつ副作用が抑制されたアレルゲンワクチン接種を可能にする薬剤および担体を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
従って、本発明は、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＮ末端およびＣ末端に対して融合されている、少なくとも１つの野生型アレルゲンの１０個〜５０個の連続したアミノ酸残基からなる少なくとも３つのペプチド断片、または、少なくとも１つの野生型アレルゲン由来の少なくとも３つのペプチドに対してＮ末端および／またはＣ末端にて融合されている、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたはその少なくとも１つの断片を含む表面ポリペプチドに関する。
【００１７】
分子、特に本発明に係るアレルギー誘発性または低アレルギー誘発性分子に対する増強された免疫応答を誘発させるために、少なくとも１つの野生型アレルゲン由来の少なくとも３つのペプチド断片は、ヘパドナウイルス科のウイルスの、好ましくはＢ型肝炎ウイルスの、より好ましくはＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドの表面ポリペプチドもしくはその少なくとも１つの断片に対して（遺伝子工学によって）融合される。驚くべきことに、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）のような従来恒常的に採用される担体タンパク質とは対照的に、ヘパドナウイルス科のウイルスの、好ましくはＢ型肝炎ウイルスの、より好ましくはＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドの表面ポリペプチドもしくはその断片は、これらのペプチドに対する抗体であって、該ペプチドが結合される抗体の形成の促進に繋がることが判明した。
【００１８】
さらに、野生型アレルゲンを用いた免疫付与が、該アレルゲンの全ての部分（ＩｇＥ反応性を示さない部分も含む）に対するＩｇＧへ導くのに対し、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドに対して融合されている、３つ以上の適切に選択されたアレルゲン由来のペプチド断片を用いた免疫付与により誘導されるアレルゲン特異的なＩｇＧ抗体は、より該アレルゲンのＩｇＥエピトープに集中していることが判明した。ＩｇＧ力価を標準化した実験において、これは、ＰｒｅＳ／ペプチド誘導ＩｇＧが野生型アレルゲン誘導ＩｇＧよりも優れた阻害能を持つことに繋がる（図１２）。
【００１９】
また、極めて驚くべきことに、ヒトＰＢＭＣの培養において、アレルゲン由来のペプチド断片がＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドに融合した融合タンパク質が、サイトカインであるＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマを強く誘導することが判明し、これはアレルギー免疫療法にとってポジティブな指標と見なされている。これと比較して、野生型アレルゲンを用いた免疫付与、アレルゲン由来のペプチド断片を単独で用いた免疫付与またはＰｒｅｓを単独で用いた免疫付与においては、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの誘導は著しく低かった（図１０）。
【００２０】
本明細書において使用されるときに“Ｎ末端およびＣ末端に対して融合されている”は、少なくとも１つのペプチドが、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＮ末端に対して融合されていると共に、少なくとも１つのペプチドが、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＣ末端に対して融合されていることを意味する。本発明の最も単純な実施形態において、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片は、Ｎ末端において１つのペプチドを有すると共にＣ末端において２つのペプチドを有してもよく、またはその逆であってもよい。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも６つの、アレルゲン由来のペプチド断片を含むことが好ましく、ペプチド断片は好ましくはB細胞結合ペプチドであり、この場合には４つのペプチドが最も好ましい。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、担体タンパク質は、下記の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＢ型肝炎ＰｒｅＳ２である。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
また、Ｂ型肝炎ＰｒｅｓＳポリペプチドのＢ型肝炎ＰｒｅｓＳ１断片またはＢ型肝炎ＰｒｅｓＳ２断片を使用することも可能である。Ｂ型肝炎ＰｒｅｓＳポリペプチドの断片は、少なくとも３０個、好ましくは少なくとも４０個、より好ましくは少なくとも５０個の配列番号２１に記載の連続したアミノ酸残基を含んでいるか、または該アミノ酸残基からなることが好ましい。
【００２５】
本明細書において使用されるときに“低アレルギー誘発性”は、アレルギー誘発性の潜在性（当該技術において公知のＩｇＥ結合分析により決定されるＩｇＥ反応性）が低減されているかまたはアレルギー誘発性の潜在性を有さない分子を指す。当該分子は、これらの分子が由来する野生型のタンパク質と比較して、個々においてアレルギー性反応を刺激する能力が低下している。
【００２６】
ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片に対して融合されている、上記少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも６つのペプチド断片は、少なくとも１つの野生型アレルゲンの、１０個〜５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは１５個〜５０個の連続したアミノ酸、特に好ましくは２０個〜５０個の連続したアミノ酸を含んでいるかもしくは該アミノ酸からなり、かつ、該ペプチド断片が由来する上記野生型アレルゲンと比較して好ましくは低下したＩｇＥ反応性を示す。これらのペプチド断片は、Ｔ細胞媒介性の副作用の原因になり得るアレルゲン特異的なＴ細胞エピトープを排除するように設計されることが好ましい。低下したＴ細胞応答を示すＴ細胞エピトープおよび分子は、当業者によって公知の方法（例えば、Bercovici N. et al. Clin Diagn Lab Immunol. (2000) 7:859-864）によって決定され得、かつ同定され得る。
【００２７】
少なくとも１つの野生型アレルゲンの、１０個〜５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは１５個〜５０個の連続したアミノ酸、特に好ましくは２０個〜５０個の連続したアミノ酸を包んでいるかもしくは該アミノ酸からなる、上記少なくとも３つのペプチド断片は、同一のアレルゲンから由来し得る。２つ以上の断片が同一のアレルゲンから由来する場合、該２つ以上の断片は、野生型アレルゲンにおいて隣り合って位置しないおよび／または本発明のポリペプチドにおける該２つ以上の断片の順序は、野生型アレルゲンにおける順序と一致しない。
【００２８】
本明細書において使用されるときに“ペプチド断片”という用語は、野生型アレルゲンの一次構造から由来する本発明の低アレルギー誘発性ポリペプチドまたは融合タンパク質の一部／断片を指し、該低アレルギー誘発性ポリペプチドまたは融合タンパク質は、該野生型アレルゲンの、１０個〜５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは１５個〜５０個の連続したアミノ酸、特に好ましくは２０個〜５０個の連続したアミノ酸を包んでいるかもしくは該アミノ酸からなる。
【００２９】
本明細書において使用されるときに、“アレルゲンから由来する”および“少なくとも１つの野生型アレルゲンから由来する”という用語は、本発明に係るペプチド断片が、断片化または切り詰めによってアレルゲンから直接に取得されることを意味する。本発明のペプチド断片のアミノ酸配列は、当該ペプチド断片が由来する野生型アレルゲンのアミノ配列の範囲に対して、好ましくは少なくとも８０％が同一、より好ましくは少なくとも９０％が同一、最も好ましくは少なくとも９５％が同一、特に１００％が同一である。しかし、野生型アレルゲン断片に対して１００％が同一ではないペプチドは、当該野生型アレルゲン断片に対する１つの抗体または複数の抗体、好ましくはＩｇＧ抗体に対して、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の強度を有して結合可能であるべきである。“少なくとも１つの野生型アレルゲン”という用語は、本発明のポリペプチドが、１つ以上の、好ましくは２つの、より好ましくは３つの異なる野生型アレルゲン（つまり、源）のＢ細胞結合ペプチドを含んでもよい（例えば、１つのペプチドがＢｅｔ  ｖ  １から由来し、別の１つのペプチドがＡｍｂ  ａ  １から由来し、もう１つのペプチドがＰｈｌ  ｐ  １から由来する、または、２つのペプチドがＢｅｔ  ｖ  １から由来し、１つのペプチドがＡｍｂ  ａ  １から由来する）ことを意味する。
【００３０】
第１のアミノ酸の、第２のアミノ酸に対する同一性の程度は、ある演算手順を用いた両方のアミノ酸配列の直接的な比較によって決定され得る。当該演算手順は、例えば、種々のコンピュータプログラム（例えば、"BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-25; Corpet F, Nucl. Acids Res. (1988) 16:10881-10890）に組み込まれている。
【００３１】
本発明に係るポリペプチドは、組み換え法または化学合成によって得られ得る。またこれに代えて、野生型アレルゲンまたは関心のある分子を含むペプチド／タンパク質の酵素的または化学的な切断によって、分子を取得可能であることは当然である。
【００３２】
驚くべきことに、ヘパドナウイルス科のウイルス、より具体的にはヒトＢ型肝炎ウイルスの表面タンパク質により、改善された性質を有するペプチド担体融合タンパク質が得られることが今回判明した。１個〜２０個、好ましくは３個または４個〜２０個、より好ましくは３個または４個〜１５個、さらに好ましくは３個または４個〜１０個（つまり、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個）のペプチド断片、好ましくは低アレルギー誘発性ポリペプチド断片は、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＣ末端およびＮ末端に対して融合され得る。従って、本発明の好ましい実施形態は、少なくとも３個〜６個の低アレルギー誘発性ポリペプチド断片とヒトＢ型肝炎ウイルスの表面抗原由来の担体タンパク質との融合タンパク質である。本発明の特に好ましい実施形態によれば、このような融合タンパク質は、ＰｒｅＳプロテインを担体として使用する。本発明の最も好ましい実施形態は、４個の低アレルギー誘発性ポリペプチド断片がＰｒｅＳ担体タンパク質またはその断片に対して融合してなる融合タンパク質である。上記（低アレルギー誘発性）ペプチド断片は、同一または異なっていると共に１個または数個のアレルギー誘発性タンパク質から由来することができ、かつ、該融合タンパク質内の該ペプチドの遺伝子座は、該担体タンパク質のＣ末端およびＮ末端である。１個〜３個の（低アレルギー誘発性）ペプチド断片は、Ｃ末端およびＮ末端のそれぞれに対し、（低アレルギー誘発性）ペプチド断片の合計が例えば３個または４個〜６個になるように、融合され得る。“融合される”または“融合タンパク質”という用語は、本発明の好ましい実施形態を指し、非アレルギー誘発性担体タンパク質および該担体のＣ末端およびＮ末端における（低アレルギー誘発性）ペプチド断片が、１つの単独組み換えポリペプチド鎖として発現および形成されることを意味する。
【００３３】
本発明の最も非常に好ましい実施形態は、１個または２個の、好ましくは２個のペプチド断片がそれぞれ該担体のＣ末端およびＮ末端に対して融合されるように、特定のアレルゲン由来の（低アレルギー誘発性）ペプチド断片を有する、Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅＳタンパク質の融合タンパク質である。例として、本発明の好ましいポリペプチドは、下記の一般構造で表される一般分子構造体を有していてもよい。
【００３４】
【表２】
2014518635.tif 000004
【００３５】
ペプチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤは同一または異なることができ、かつ、個々の融合タンパク質に対する同一のアレルゲンから由来するか、または異なるアレルゲンから由来することを理解されたい。
【００３６】
ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたは該表面ポリペプチドの少なくとも１つの断片のＮ末端およびＣ末端に対して融合される（低アレルギー誘発性）ペプチドは、主要なカンバ花粉アレルゲン、特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４；主要なオオアワガエリ花粉アレルゲン、特にＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７；主要なイエダニアレルゲン、特にＤｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２、Ｄｅｒ  ｐ  ５、Ｄｅｒ  ｐ  ７、Ｄｅｒ  ｐ  ２１およびＤｅｒ  ｐ  ２３；主要なネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １；主要なブタクサアレルゲンＡｍｂ  ａ  １；主要な日本のスギ花粉アレルゲンＣｒｙ  ｊ１およびＣｒｙ  ｊ  ２；主要なミツバチアレルゲン；主要なスズメバチアレルゲン；プロフィリン、特にＰｈｌ  ｐ  ７およびＰｈｌ  ｐ  １２からなる群より選ばれることが好ましい。
【００３７】
本発明に従って使用されるべき他の適したアレルゲンは、以下の表２から由来し得るが、しかし、この表に限定されない。
【００３８】
【表３】
2014518635.tif 000005
【００３９】
【表４】
2014518635.tif 000006
【００４０】
【表５】
2014518635.tif 000007
【００４１】
【表６】
2014518635.tif 000008
【００４２】
【表７】
2014518635.tif 000009
【００４３】
【表８】
2014518635.tif 000010
【００４４】
【表９】
2014518635.tif 000011
【００４５】
【表１０】
2014518635.tif 000012
【００４６】
【表１１】
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【００４７】
【表１２】
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【００４８】
【表１３】
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【００４９】
【表１４】
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【００５０】
【表１５】
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【００５１】
【表１６】
2014518635.tif 000018
【００５２】
【表１７】
2014518635.tif 000019
【００５３】
【表１８】
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【００５４】
【表１９】
2014518635.tif 000021
【００５５】
【表２０】
2014518635.tif 000022
【００５６】
【表２１】
2014518635.tif 000023
【００５７】
【表２２】
2014518635.tif 000024
【００５８】
【表２３】
2014518635.tif 000025
【００５９】
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【００６０】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、上記少なくとも１つの野生型アレルゲンから由来する上記少なくとも３つのペプチドの内、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つ、特には全てが、Ｂ細胞結合ペプチドである。
【００６１】
本発明に係るアレルギーワクチン接種に用いられる“Ｂ細胞結合ペプチド”は、アレルゲンのＩｇＥ結合部位から由来するかまたは当該部位の近くに存在するが、それ自体においては、野生型アレルゲンと比較して、ＩｇＥ反応性を全く示さないかまたは最低限しか示さない（Focke M et al. Clinical & Experimental Allergy 40(2010):385-397）。Ｂ細胞結合ペプチドの生成および選択に必要なのは、アレルゲンの一次配列およびＩｇＥ結合部位についての知識である。免疫付与が行われると、適切な免疫原性担体に融合したＢ細胞結合ペプチドは、アレルゲンに結合するＩｇＥを阻害できるアレルゲン特異的ＩｇＧの生成を誘導することができる。融合タンパク質により誘導されたＩｇＧがアレルゲンを認識できるか否かは、例えば、完全なアレルゲンとの反応性について、ＩｇＧをテストすることにより決定される。適切な方法には、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット分析またはウエスタンブロット分析が包含される。患者のＩｇＥがアレルゲンに結合するのを阻害するペプチドが好ましい。
【００６２】
適切なＢ細胞結合ペプチドの使用は、特に３つ以上の該ペプチドが本発明に係る適切な担体に融合される時、完全なアレルゲンを用いた免疫付与により誘導されるＩｇＧ反応に比べてみても、よりＩｇＥエピトープに集中したＩｇＧ反応の誘導を可能にすることが本発明により示される。さらに、適切なペプチドならびにその数と、適切な担体とを組み合わせることによって、アレルゲン特異的免疫反応を、好ましい抗アレルギー免疫反応（好ましくはアレルゲン特異的ＩｇＧ反応（ＩｇＥ反応ではない）ならびに寛容原性（ＩＬ−１０）およびＴｈ１（インターフェロンガンマ）サイトカイン反応の誘導を特徴とする）へと導くことができることが本発明により示される。
【００６３】
さらに驚くべきことに、Ｂ細胞結合ペプチドがアレルゲン特異的Ｔ細胞エピトープを欠いているにも関わらず、免疫原性担体に融合した３つ以上のＢ細胞結合ペプチドを含む本発明に係るポリペプチドは、アレルゲン特異的Ｔ細胞反応を低減できることが分かった。これは、本発明の低アレルギー誘発性ポリペプチドを用いた治療ワクチン接種により誘発されるアレルゲン特異的ＩｇＧの存在が、ＩｇＥにより促進されるアレルギーのヒト個体由来のＰＢＭＣにおける抗原提示によって起こる、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性化が低減されることにより示される（図１６）。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記少なくとも３つのペプチドの内少なくとも１つは、ＩｇＥ結合能を示さないか、または野生型アレルゲンと比較して低減された、ＩｇＥ結合能を示す。
【００６５】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、上記少なくとも３つのＢ細胞結合ペプチドの内少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つは、Ｔ細胞反応性を全くまたは実質的に示さない。
【００６６】
アレルゲン特異的Ｔ細胞エピトープの存在は、不要なＴ細胞媒介性副作用を引き起こし得る。従って、本発明のポリペプチドを得るために、Ｔ細胞反応性を全くまたは実質的に示さないペプチドを用いることが特に好ましい。
【００６７】
しかし、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むアレルゲン断片もまた、本発明に係るポリペプチドに使用され得る。
【００６８】
本発明において使用されるときに“低下したＩｇＥ結合能を示すこと”は、本発明に係る分子が、有意に低下したＩｇＥ結合能もしくはＩｇＥ結合活性（野生型アレルゲンと比較して、少なくとも５０％だけ少ない、好ましくは少なくとも７０％だけ少ない、より好ましくは少なくとも８０％だけ少ない、さらに好ましくは少なくとも９０％だけ少ない、最も好ましくは少なくとも９５だけ少ない結合能もしくは結合活性）を示すこと、またはＩｇＥ結合を全く示さないことすらも意味する。
【００６９】
ペプチドおよびタンパク質のような分子のＩｇＥ結合活性／能は、野生型アレルゲンに予めさらされている、例えば対象（すなわち、アレルギー体質の対象）から得られる血清を用いた、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、決定され得る。簡単に言うと、試験されるペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル上に散布される。洗浄およびブロッキングの後に、試験されるペプチドまたは当該ペプチドが由来するタンパク質にさらされているアレルギー体質の対象の血漿からなる抗体溶液が、ウェルにおいてインキュベーションされる。標識２次抗体がウェルに加えられ、インキュベーションされる。それから、ＩｇＥ結合の量が定量され、この量が、精製された野生型アレルゲンが結合するＩｇＥの量と比較される。
【００７０】
これに代えて、ペプチドの結合活性は、ウエスタンブロッティング分析によって測定され得る。例えば、試験されるペプチドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてポリアクリルアミドゲル上を流される。それから、ペプチドはニトロセルロースに転写され、続いてアレルギー体質の対象からの血清を用いてインキュベーションされる。標識２次抗体を用いたインキュベーションの後に、ＩｇＥ結合の量が測定され、定量化される。
【００７１】
ペプチドのＩｇＥ結合活性を測定するために使用され得る他のアッセイは、競合ＥＬＩＳＡアッセイである。簡単に言うと、直接ＥＬＩＳＡによってＩｇＥ反応性であることを示されているアレルギー体質の対象からの血漿を、野生型アレルゲンに混合することによって、ＩｇＥ抗体プールが生成される。このプールは、ＥＬＩＳＡ競合アッセイに使用されて、野生型アレルゲンに対するＩｇＥ結合を、試験されるペプチドと比較する。野生型アレルゲンおよび試験されるペプチドに関するＩｇＥ結合が、測定され、かつ定量化される。
【００７２】
“Ｔ細胞エピトープ”は、Ｔ細胞が抗原特異的結合部位を有し、上記部位に対する結合の結果がＴ細胞を活性化するタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、アレルゲン）またはこれら断片を意味する。本明細書において使用されるときに、“低下したＴ細胞反応性を示すこと”という用語は、低アレルギー誘導性分子が、当該技術における公知の標準的なアッセイにおいて等モル量を用いて得られる野生型アレルゲンによって誘導される刺激と比較して、有意に低減されているＴ細胞反応性を示す分子を指す（低下したＴ細胞反応性は、等モル量における野生型アレルゲンと比較して、低アレルギー誘発性分子の刺激が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％少ないことを意味する）。本発明の特に好ましい実施形態において、分子は、Ｔ細胞エピトープを“欠如”し得、かつこのようにして分子が処置される個体（すなわち、エピトープ提示価数プラットフォーム分子（ｅｐｉｔｏｐｅ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を受け取るべき）において低下したＴ細胞反応性を示し得る。例えば、アレルゲン由来分子が、個体または個体の集団に関してＴ細胞エピトープを欠如し得る一方において、他の個体に関してＴ細胞エピトープを保有することは、あり得る。Ｔ細胞エピトープの存在を検出する方法は、当該技術において公知であり、かつＴ細胞増殖（例えば、チミジンの取り込み）を検出する方法を包含する。チミジン取り込みの定量的な量は、試験される免疫原に依存して変化し得るが、バックグラウンドを超えて統計的に有意な（すなわち、一般的に、標準的な統計学的方法を用いて０．０５以下のｐ）取り込みを誘導できない免疫原は、Ｔ細胞エピトープを欠如すると考えられる（例えば、Zhen L. et al. (Infect Immun. (2003) 71:3920-3926)を参照すればよい）。一般的に、約２〜３に足りない、より好ましくは１未満の刺激指標は、Ｔ細胞反応性およびエピトープの欠如を示す。また、Ｔ細胞エピトープの存在は、標準的な方法に従ってＴ細胞由来のリンホカインの分泌を測定することによって決定され得る。刺激指標（ＳＩ）は、刺激細胞の増殖率（チミジンの取り込み）を、培地単独における非刺激細胞の増殖率によって割ることによって算出され得る。ＳＩ＝１は、非刺激細胞を意味し、ＳＩ＞１は細胞の刺激を示す。Ｔ細胞の位置および含有量は、存在するならば、経験的に決定され得る。
【００７３】
サイトカイン分泌は、Ｔ細胞刺激に加えて測定され得る。例えば、調節性Ｔ細胞の活性の増加の為のバイオマーカーとしてのＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０は、アレルギー免疫療法を成功させるサイトカインとして認識されている。
【００７４】
本発明のペプチド断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の１５１〜１７７、８７〜１１７、１〜３０、４３〜７０もしくは２１２〜２４１番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ２の１〜３３、８〜３９、３４〜６５もしくは６６〜９６番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ５の９３〜１２８、９８〜１２８、２６〜５３、２６〜５８、１３２〜１６２、２１７〜２４６、２５２〜２８３もしくは１７６〜２１２番目のアミノ酸、Ｐｈｌ  ｐ  ６の２３〜５４、５６〜９０、７３〜１１４もしくは９５〜１２７番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  １の１〜３４もしくは３５〜７０番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖  ２の１〜３４、３５〜６３もしくは６４〜９２番目のアミノ酸、Ｂｅｔ  ｖ  １の３０〜５９、５０〜７９、７５〜１０４、３０〜７４もしくは６０〜１０４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １の１〜３０、５２〜８４もしくは１８８〜２２２番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １０の１〜３５、３６〜７０、７１〜１１０、１１１〜１４５、１４０〜１７０、１７５〜２０５、２１０〜２５０もしくは２５０〜２８４番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｒ  ２１の１〜３５、３５〜７２、０７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２３の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０、３２〜６０、５２〜８４、３２〜７０（Ｃｙｓ≧Ｓｅｒ）番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  １の１９〜５８、５９〜９５、９１〜１２０もしくは１２１〜１５７番目のアミノ酸、Ｐａｒ  ｊ  ２の３１〜６０、４５〜８０、６０〜９６もしくは９７〜１３３番目のアミノ酸、Ｏｌｅ  ｅ  １の１〜４０、３６〜６６、６３〜９９、８６〜１２０もしくは１０７〜１４５番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  ２の２５〜５８、９９〜１３３、１５４〜１８３、２７７〜３０７、３３４〜３６３、３７３〜４０２、５４４〜５７３、５７９〜６０８、５８〜９９、１２５〜１６５、１８３〜２２４、２２４〜２６１、２５２〜２８９、３０３〜３４０、４１６〜４５７、４６０〜５００もしくは５０１〜５４２番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  ２の１９〜５８、５２〜９１、８２〜１１９、１０６〜１４４もしくは１３９〜１８０番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  １の１９〜５６、５１〜９０、７８〜１１８、１０６〜１４５もしくは１３５−１７４番目のアミノ酸、Ａｒｔ  ｖ  １の２７〜７０、７０〜１００もしくは９２〜１３２番目のアミノ酸、Ａｍｂ  ａ  １の３１〜７０、８０〜１２０、１２５〜１５５、１６０〜２００、２２５〜２６３、２６４〜３００  ３０５〜３５０もしくは３５６〜３９６番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ６の１〜３４、３５〜７４、７４〜１１５、１２５〜１６５、１７４〜２１３、２４１〜２８０、２９４〜３３３、３６１〜４００もしくは４０１〜４３８番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ２の１〜４０、４１〜８０、８１〜１２０、１２１〜１６０番目のアミノ酸またはこれらの断片または配列変異から構成されるか、または該アミノ酸またはこれらの断片または配列変異からなることが好ましい。
【００７５】
上記において特定されたアレルゲン由来分子の特定のアミノ酸配列は、以下の表の通りである（以下の表中、本発明のポリペプチドにおいて用いられる、Ｎ末端および／またはＣ末端システイン残基（Ｃ）を有するペプチドは、該システイン残基を欠いていてもよい）。
【００７６】
【表２４】
2014518635.tif 000026
【００７７】
【表２５】
2014518635.tif 000027
【００７８】
【表２６】
2014518635.tif 000028
【００７９】
【表２７】
2014518635.tif 000029
【００８０】
【表２８】
2014518635.tif 000030
【００８１】
【表２９】
2014518635.tif 000031
【００８２】
【表３０】
2014518635.tif 000032
【００８３】
※）システインがセリンと交換されている（太字で表示）
用語「これらの断片」および用語「これらの配列変異」は、本明細書で開示されるアレルゲン由来分子より導かれ、当該アレルゲン由来分子と同程度または同一の生化学的特性（例えば、それらの分子が由来するアレルゲンへのＩｇＥ結合を妨げる能力）を示すペプチドを指す。本発明の断片は、当該アレルゲン由来分子の、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも７つ、より好ましくは少なくとも１０の連続した、および／または、最大９５％、好ましくは最大９０％、より好ましくは最大８０％のアミノ酸残基を含む。用語「配列変異」には、断片化（上記参照）、アミノ酸置換（特に、システインまたはメチオニン残基が、セリン、アラニン、他の天然・非天然のアミノ酸またはアミノ酸誘導体と交換され得る）、欠失、または付加等のペプチドの修飾が包含される。「配列変異」は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４（５、６、７、８、９、１０、１５、２０）つのアミノ酸残基がＣ末端および／またはＮ末端に付加された上記の表のアレルゲン由来分子も指す。
【００８４】
なお、本明細書で「クローン３０アレルゲン」と称されるアレルゲンは、イエダニであるデルマトファゴイデス  プテロニッシヌス由来で、次の配列からなるアレルゲンである。
【００８５】
【表３１】
2014518635.tif 000033
【００８６】
一方、クローン３０アレルゲンにはアレルゲン名Ｄｅｒ  ｐ  ２３が与えられている。これは、Ｄｅｒ  ｐ  ２３とクローン３０アレルゲンが同義語であることを意味する。
【００８７】
本発明によれば、上記に開示するアミノ配列と少なくとも８０％同一、好ましくは９０％同一であるペプチドも包含される。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチドまたはその少なくとも１つの断片は、そのＮ末端に融合した少なくとも１つの野生型アレルゲンに由来する少なくとも２つのＢ細胞結合ペプチド断片およびそのＣ末端に融合した少なくとも１つの野生型アレルゲンに由来する少なくとも２つのＢ細胞結合ペプチド断片を含む。
【００８９】
本発明の特に好ましい実施形態では、上記３つのＢ細胞結合ペプチドの内少なくとも２つは同一である。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、人間または動物のアレルギーの治療または予防におけるワクチンとして用いることができる。
【００９１】
当該ポリペプチドは、体重１ｋｇ当たり０．０１マイクログラム〜体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１マイクログラム〜体重１ｋｇ当たり１０マイクログラムの量で個体に投与するのが好ましい。
【００９２】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドごとに、少なくとも１０μｇ、好ましくは少なくとも２０μｇの量で個体に投与する。投与されるポリペプチドの最大量は変更可能であるが、ポリペプチドごとに、好ましくは１００μｇ未満、より好ましくは５０μｇ未満、さらに好ましくは４０μｇ以下である。
【００９３】
１つの剤形を得るために賦形剤と組み合わせられるポリペプチドの量は、治療されるホストおよび特定の投与形態によって変わる。ワクチンの投与量は、個体の病状、年齢、性別、体重および個体において所望の反応を引き出す抗体の能力等の要素によって変わり得る。投与計画は、最適な治療反応を得るために調節され得る。例えば、毎日数回に分けて投与してもよいし、治療状況の危急に示すとおりに比例的に投与量を減少させてもよい。ワクチンの投与量も、環境に応じて最適な予防用量反応を得るために変更され得る。例えば、本発明のポリペプチドおよびワクチンは、常にアレルゲン特異的なＩｇＧ誘導のレベルに応じて、数日、１〜２週間、または数カ月の間隔で個体に投与してもよい。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチド／ワクチンは、２〜１０回、好ましくは２〜７回、さらに好ましくは５回以下、最も好ましくは３回以下与えられる。特に好ましい実施形態では、次のワクチン接種間の間隔は、２週間〜５年、好ましくは１カ月〜最大３年、より好ましくは２カ月〜１．５年になるように選ばれる。本発明のペプチド／ワクチンの反復投与により、治療ワクチン接種の最終効果を最大化し得る。
【００９５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号９、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４２、および配列番号１０からなる群より選ばれる３以上のＢ細胞結合ペプチドが、ヘパドナウイルス科のウイルスの表面ポリペプチド、好ましくは肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片のＮ末端およびＣ末端に結合する。
【００９６】
少なくとも１つの野生型アレルゲンに由来する少なくとも３つのＢ細胞結合ペプチドを含む本発明のポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群より選ばれることが好ましい。
【００９７】
本発明の他の局面は、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００９８】
本発明の他の局面は、本発明に係る核酸分子を含むベクターに関する。
【００９９】
当該ベクターは、発現ベクターであることが好ましい。
【０１００】
本発明の核酸分子を内部に含むベクターは、クローニング目的に用いられてもよいし、発現ベクターの作成に用いられてもよい。当該ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは遺伝子工学で一般的に用いられる他のベクターであってもよく、本発明の核酸分子に加えて、転写および／または翻訳の開始および停止のための調節配列、エンハンサ、プロモータ、シグナル配列等の発現の制御のための真核または原核成分を含むことができる。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態によれば、ベクターは、細菌、真菌、昆虫、ウイルスまたは哺乳類ベクターである。
【０１０２】
本発明のベクターは、好ましくは、細菌、酵母、糸状菌、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞または他の真核または原核細胞等の様々な宿主においてクローニングおよび発現目的で用いられてもよい。よって、当該ベクターは、本発明に係る低アレルギー誘発性分子または融合タンパク質をコードする核酸のほかに、宿主特異的な調節配列を含む。
【０１０３】
本発明の他の局面は、本発明に係る核酸分子またはベクターを含む宿主に関する。
【０１０４】
本発明に係る核酸分子またはベクターは、好適な宿主に導入され得る。当該分子は、宿主のゲノムに組み込んでもよい。ベクターは、細胞質に染色体外に存在してもよいし、宿主の染色体に組み込まれてもよい。
【０１０５】
本発明のさらに他の局面は、本発明に係る低アレルギー誘発性分子、低アレルギー誘発性融合タンパク質、または融合タンパク質に対する抗体に関する。
【０１０６】
本発明の他の局面は、本発明に係る少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つのポリペプチドを含むワクチン調合物に関する。
【０１０７】
本発明の特に好ましい実施形態では、ワクチンは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、および配列番号１５２からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つのポリペプチドを含む。
【０１０８】
組成により、そのようなワクチンは、草本花粉アレルギー、カンバ花粉アレルギー、イエダニアレルギー、またはこれらのアレルギーの組み合わせの、当該アレルギーにかかっているまたはかかる危険性がある個体における治療および／または予防に用いることができる。
【０１０９】
本明細書における用語「予防」は、危険因子削減等の病気の発生の予防だけでなく、発症してしまった場合にその進行を止めたり、その結果を軽減したりする措置もカバーしている。「予防」は、アレルギーにかかる危険性がある個体の感作を防ぐことも意味する。
【０１１０】
本明細書において、用語「治療」または文法上の相当語句には、病気（例えば、アレルギー）の症状の改善および／または反転が包含される。本発明のスクリーニング方法において用いられる際、病気に対応付けられる任意のパラメータを改善させる化合物は、それにより治療化合物として同定される。用語「治療」は、治療上の措置および予防的措置の両方を指す。
【０１１１】
本発明の最も好ましい実施形態の１つによれば、上記ワクチンは、アミノ酸配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７を有するポリペプチドを含む。
【０１１２】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、上記ワクチンは、アミノ酸配列番号１８および／または配列番号１９を有するポリペプチドを含む。
【０１１３】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、上記ワクチンは、イエダニアレルゲンに由来するアレルゲン断片を含む本発明のポリペプチドを含む。特に好ましいのは、Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸残基、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸残基、Ｄｅｒ  ｐ  ２１の１〜３５、３５〜７２、７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸残基、Ｄｅｒ  ｐ  ２３の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０、３２〜６０、５２〜８４、３２〜７０（Ｃｙｓ≧Ｓｅｒ）番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  １の１〜３０、１〜４１、２７〜５７、４２〜８２、５２〜８４、８５〜１１５、９９〜１３５、１４５〜１７５、１５５〜１８７、１７５〜２０８もしくは１８８〜２２２番目のアミノ酸残基である。上記ワクチンが配列番号１４９〜１５２のポリペプチド（図１８Ａ〜Ｄに図示）の少なくとも１つを含むのが最も好ましい。
【０１１４】
特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド／ワクチンは、総治療期間１〜５年、好ましくは２〜３年にわたって年に４回投与される。その毎年４回の投与の内３回は、６〜１２週間、好ましくは８週間以内に、１回目と２回目の間に３〜６週間、好ましくは４週間、２回目と３回目の間に３〜６週間、好ましくは４週間の間隔をあけて行われる。４回目の投与は、３回目の投与の３〜７カ月後に行われる。総治療期間が１年を超えると、同じ投与計画が続く治療年にも適用される。
【０１１５】
季節性アレルギー（例えば、草本花粉アレルギーまたはカンバ花粉アレルギー等の花粉アレルギー）の治療では、１、２、３回目の投与は、アレルゲンに暴露される各季節（花粉の季節）の前にスケジューリングすることが好ましく、４回目の投与は、そのシーズンの後にスケジューリングする。
【０１１６】
本発明に係るワクチン調合物は、当該分野で知られているように調合し、当該ワクチン調合物の投与方法に必然的に適合され得る。
【０１１７】
（本発明の）ワクチン調合物の投与の好ましい方法には、ワクチン接種一般、特にアレルギー免疫療法に関して記述され、提案されている全ての標準的な投与計画（経口、経皮、静脈内、鼻腔内、経粘膜、直腸等）が包含される。ただし、本発明に係る分子およびタンパク質を皮下投与または筋内投与するのが特に好ましい。
【０１１８】
本発明に係るワクチン調合物は、ヘパドナウイルス属のメンバのウイルスカプシドタンパク質またはその断片のみ含んでもよい。
【０１１９】
当該調合物は、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に許容可能な賦形剤および／または防腐剤をさらに含むことが好ましい。
【０１２０】
本発明に係る低アレルギー誘発性分子の免疫原性を高めるために、例えば、補佐剤を本発明に係る薬剤に用いてもよい。本発明に係る補佐剤は、抗原と共にまたは並行して投与されると、その免疫原性を高め、および／または、免疫反応の質に影響を与える補助剤である。よって、補佐剤は、例えば、液性または細胞性免疫反応の程度に大きな影響を与え得る。通常の補佐剤は、例えば、アルミニウム化合物、脂質含有化合物、または不活化マイコバクテリアである。
【０１２１】
一般的に、複数の補佐剤は、ヒトへの投与に適している限り、異なる形態のものであってよい。そのような補佐剤のなお別の例としては、鉱物または植物由来の油乳剤、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム等の鉱物化合物、Ｐ４０（コリネバクテリウム  グラヌロスムの細胞壁由来）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ、ＬＰＳの派生物）、ムラミルペプチド誘導体等の細菌産物および派生物およびこれらの接合物（マイコバクテリウム成分からの派生物）、ミョウバン、不完全フロインド補助液、リポシン、サポニン、スクアレン等が挙げられる（例えば、Gupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)）およびJohnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289）を参照）。本発明の薬剤は、補佐剤としてミョウバンを含むことが最も好ましい。
【０１２２】
本発明の他の好ましい実施形態は、低アレルギー誘発性ペプチドおよびとＢ型肝炎ＰｒｅＳタンパク質を含有する複数の融合タンパク質の組み合わせである。これらの組み合わせは、１つのアレルゲン、または同じアレルゲン源もしくはいくつかの異なるアレルゲン源の複数の異なるアレルゲンからのペプチドに由来してもよい。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態は、Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５およびＰｈｌ  ｐ  ６からの低アレルギー誘発性ペプチドならびにＢ型肝炎ＰｒｅＳタンパク質を含む４つの融合タンパク質の混合物に関する。
【０１２４】
本発明の他の好ましい実施形態は、Ｂｅｔ  ｖ  １からの低アレルギー誘発性ペプチドおよびＢ型肝炎ＰｒｅＳタンパク質を含む融合タンパク質または２つの融合タンパク質の混合物に関する。
【０１２５】
本発明のさらに他の好ましい実施形態は、最も好ましくはＤｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２、Ｄｅｒ  ｐ  ５、Ｄｅｒ  ｐ  ７、Ｄｅｒ  ｐ  ２１およびＤｅｒ  ｐ  ２３から選ばれるイエダニアレルゲンからの低アレルギー誘発性ペプチドならびにＢ型肝炎ＰｒｅＳタンパク質を含む少なくとも２つの融合タンパク質の混合物に関する。混合物は、Ｄｅｒ  ｐ  １、  Ｄｅｒ  ｐ  ２およびＤｅｒ  ｐ  ２３に由来する低アレルギー誘発性ペプチドを含有する３つの融合タンパク質を含有するのが最も好ましい。混合物は、配列番号１４９〜１５２に示すポリペプチド（図１８Ａ〜Ｄも参照）の内、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つを含むことが特に好ましい。
【０１２６】
一般的に、本発明に係る特定のワクチン調合物は、アレルゲン源の臨床的に関連するアレルゲンを表す本発明の低アレルギー誘発性ポリペプチドの組み合わせによる異なるアレルギーの治療または予防のために作成することができる。アレルゲン源の臨床的に関連するアレルゲンを決定する方法は、当該分野で知られており、以前に記述されている（Valenta and Niederberger, 2007, J Allergy Clin Immunol, 119 (4): 826-830）。好ましい実施形態では、当該特定のワクチン調合物の低アレルギー誘発性ポリペプチドは、ヒトに用いることができる補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）に吸着され、その混合物を、一服当たりワクチン調合物における各ポリペプチドを１０ｍｇを超える量で、１年当たり３〜４回、１〜３年間投与する。
【０１２７】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、当該調合物は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記低アレルギー誘発性分子または抗体を含む。
【０１２８】
本発明の他の局面は、ヒトまたは動物におけるウイルス感染および／またはアレルギーの治療または予防のための薬剤の製造のための本発明に係る低アレルギー誘発性タンパク質または抗体の使用に関する。
【０１２９】
当該薬剤は、少なくとも１つの補佐剤、薬学的に許容可能な賦形剤および／または防腐剤をさらに含むことが好ましい。
【０１３０】
本発明に係る薬剤は、能動免疫（本発明の低アレルギー誘発性タンパク質および／または分子の投与）および受動免疫（本発明の低アレルギー誘発性タンパク質および／または分子に対する抗体）にも用いられ得る。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、当該薬剤は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、特に０．５μｇ〜２００μｇの上記低アレルギー誘発性分子、核酸分子、ベクター、宿主または抗体を含む。
【０１３２】
当該薬剤は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１μｇ〜１０μｇの量で個体に投与するのが好ましい。
【０１３３】
特に好ましい実施形態では、当該薬剤は、各低アレルギー誘発性ポリペプチドを絶対量で５〜２００μｇ、より好ましくは１０〜８０μｇ、最も好ましくは２０〜４０μｇ含有する一服で投与する。
【０１３４】
特定の投与計画、すなわち、服用量、タイミングおよび頻度は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。一般的に、半減期等の経験的考察は、投与量の決定に貢献する。投与の頻度は、治療期間中に決定され調節してもよい。
【０１３５】
薬剤の投与計画は、総治療期間２〜３年にわたって同一の一服を年に４回皮下注射することからなるのが最も好ましい。年に４回の皮下注射の内、３回は、６〜１２週間、好ましくは８週間以内に、１回目と２回目の間に３〜６週間、好ましくは４週間、２回目と３回目の間に３〜６週間、好ましくは４週間の間隔をあけて行われる。４回目の投与は、３回目の投与の３〜６カ月後に行われる。同じ投与計画が続く治療年にも適用される。
【０１３６】
季節性アレルギー（例えば、草本花粉アレルギーまたはカンバ花粉アレルギー等の花粉アレルギー）の治療では、１、２、３回目の投与は、アレルゲンへ暴露される各季節（花粉の季節）の前にスケジューリングすることが好ましく、４回目の投与は、そのシーズンの後にスケジューリングする。
【０１３７】
本発明に係る薬剤が投与される個体は、アレルギーを有するまたは有する危険性がある個体または動物であることが好ましい。
【０１３８】
アレルギー、アレルギー性の状態、障害もしくは疾患を有する対象または有する危険がある対象としては、既存のアレルギー性の状態、またはアレルギー性の状態と関連するかもしくはアレルギー性の状態によって引き起こされる症状の発現に向かう、公知のもしくは疑わしい傾向を有する対象が挙げられる。従って、対象は、活発な慢性アレルギー性の状態、障害または疾患、急性アレルギー性の症状の発見、潜在性のアレルギーの状態、障害または疾患を有する可能性がある。あるアレルギー性の状態は、季節的または地理的な環境因子と関連する。従って、危険な状態にある対象としては、これまでの個人的な履歴もしくは家族歴、ならびに季節もしくは自然界の位置に基づく状態に苦しんでいるという観点から危険な状態にある対象が挙げられるが、上記状態と関連する状態または症状は、患者において現在において顕著になっていなくてもよい。
【０１３９】
本明細書で記載されるような少なくとも１つの低アレルギー誘発性分子を含む本発明に係る薬剤の個体に対する投与は、当該個体の感作を予防し得るか、またはアレルゲンに対する適切な免疫反応を引き起こし得る。本発明の薬剤を感作を予防するために用いる場合、当該アレルゲンとの最初の接触の前に個体に投与するべきである。従って、新生児および子供に本発明の薬剤を投与することが好ましい。妊娠中の個体への本発明に係る薬剤の投与が胎児においてアレルゲンに対する抗体の形成を誘発することも分かった。アレルゲン特異Ｔ細胞エピトープの欠如により、アレルギー免疫療法の過程で発生する副作用を著しく減少させるか、完全に回避することさえできるので、そのような治療に本発明に係る低アレルギー誘発性分子を用いることは特に有益である。
【０１４０】
本発明の他の局面は、薬剤またはワクチンにおける担体としてのヘパドナウイルス科のウイルス由来のウイルスカプシドタンパク質の使用に関する。
【０１４１】
そのような担体の利点の１つは、そこに融合または接合した抗原が免疫系に露出され得るだけでなく、ヘパドナウイルスのカプシドタンパク質に対する免疫反応も誘発されることである。結果として、そのようなワクチン接種は、ヘパドナウイルスにより引き起こされる病気の予防および／または治療につながり得る。当該ウイルスは、ヒトＢ型肝炎ウイルスの一種であることが好ましい。
【０１４２】
本発明の他の局面は、Ｃ末端および／またはＮ末端に切り詰めを有し、かつ実質的にＩｇＥ結合能を欠くＰｈｌ  ｐ  ５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ７４３５）に由来する低アレルギー誘発性分子に関する。
【０１４３】
草本花粉は、花粉症やアレルギー喘息の原因となる空中アレルゲンの最も強力な屋外の季節性の源の１つである。
【０１４４】
アレルギー患者の４０％以上が草本花粉アレルゲンとのＩｇＥ反応性を示し、草本花粉アレルゲンは１１を超える群に分割される。草本花粉アレルギー患者の８０％以上が群５のアレルゲンに反応する。
【０１４５】
群５のアレルゲンは、分子量の範囲が２５〜３３ｋＤの高い相同性のある非グリコシル化タンパク質である。群５のアレルゲンは、クローン化されており、および／または、免疫学的に特徴付けられている。
【０１４６】
点変異、連続するいくつかのアミノ酸の変異、または欠失を導入することによりアレルゲン活性を低減させる試みは効果を示さなかった（Schramm G, et al. J Immunol 1999; 162: 2406-1435）。Ｐｈｌ  ｐ  ５のＩｇＥ結合領域（Flicker S, et al. J Immunol 2000; 165: 3849-3859）は既に記載されており、三次元構造は解決されている（Maglio O, et al. 2002. Protein Eng. 15:635-642）。
【０１４７】
特に、Ｃ末端および／またはＮ末端において切り詰められ、ＩｇＥ結合能を欠く本発明に係るＰｈｌ  ｐ  ５ペプチドを個体の能動的ワクチン接種に採用し得ることが分かった。
【０１４８】
本発明の好ましい実施形態によれば、切り詰めた分子は実質的にＴ細胞エピトープを欠くため、Ｐｈｌ  ｐ  ５特異Ｔ細胞反応性を欠く。
【０１４９】
上で概説したように、低アレルギー誘発性分子が実質的にＴ細胞エピトープを欠く場合、アレルゲン免疫療法の遅発性の副作用を著しく低減したり回避したりすることさえできる。
【０１５０】
Ｔ細胞エピトープを欠く切り詰めたＰｈｌ  ｐ  ５分子は、Ｐｈｌ  ｐ  ５の９３〜１２８、９８〜１２８、２６〜５３、２６〜５８もしくは２５２〜２８３番目のアミノ酸、またはこれらの断片または配列変異から構成される。
【０１５１】
特に、これらの切り詰めた分子は、アレルゲン特異Ｔ細胞反応性を実質的に示さないかアレルゲン特異Ｔ細胞反応性が低いが、それでも、野生型アレルゲンに対する適切な免疫反応を引き起こすことができる。
【０１５２】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、低アレルギー誘発性の切り詰めたＰｈｌ  ｐ  ５は、Ｐｈｌ  ｐ  ５の１３２〜１６２、２１７〜２４６もしくは１７６〜２１２番目のアミノ酸、またはこれらの配列変異から構成される。
【０１５３】
これらの低アレルギー誘発性分子は、１以上のＴ細胞エピトープを含むが、ＩｇＥ結合能を欠く。
【０１５４】
本発明の他の好ましい実施形態は、ウイルス担体タンパク質、好ましくはＨｅｐ  Ｂ  ｐｒｅ  Ｓタンパク質に融合したＰｈｌ  ｐ  １の１〜３０、４３〜７０、８７〜１１７、１５１〜１７１もしくは２１４〜２４１番目のアミノ酸、またはその配列変異から構成されるＴ細胞エピトープを欠く切り詰めたＰｈｌ  ｐ  １分子である。
【０１５５】
本発明の他の好ましい実施形態は、ウイルス担体タンパク質、好ましくはＨｅｐ  Ｂ  ｐｒｅ  Ｓタンパク質に融合したＰｈｌ  ｐ  ２の１〜３３、８〜３９、３４〜６５もしくは６６〜９６番目のアミノ酸、またはその配列変異から構成されるＴ細胞エピトープを欠く切り詰めたＰｈｌ  ｐ  ２分子である。
【０１５６】
本発明の他の好ましい実施形態は、ウイルス担体タンパク質、好ましくはＨｅｐ  Ｂ  ｐｒｅ  Ｓタンパク質に融合したＰｈｌ  ｐ  ６の２３〜５４、５６〜９０、７３〜１１４もしくは９５〜１２７番目のアミノ酸、またはその配列変異から構成されるＴ細胞エピトープを欠く切り詰めたＰｈｌ  ｐ  ６分子である。
【０１５７】
本発明の他の好ましい実施形態は、Ｂｅｔ  ｖ  １の３０〜５９、５０〜７９、７５〜１０４、３０〜７４または６０〜１０４番目のアミノ酸から構成されるＴ細胞エピトープを欠く切り詰めたＢｅｔ  ｖ  １分子を指す。
【０１５８】
本発明の他の好ましい実施形態は、上述したように、ウイルス担体タンパク質、好ましくはＨｅｐ  Ｂ  ｐｒｅ  Ｓタンパク質に融合したＴ細胞エピトープを欠く切り詰めたフレウム  プラテンセ分子の組み合わせまたは混合物である。
【０１５９】
本発明の他の好ましい実施形態は、上述したように、切り詰めたＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５およびＰｈｌ  ｐ  ６からの１つのそのような融合タンパク質から構成されるＴ細胞エピトープを欠く切り詰めたフレウム  プラテンセ分子の組み合わせまたは混合物である。
【０１６０】
本発明の他の局面は、Ｃ末端および／またはＮ末端において切り詰められ、ＩｇＥ結合能を欠くＦｅｌ  ｄ  １（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ６２４７７およびＸ６２４７８）に由来する低アレルギー誘発性分子に関する。
【０１６１】
動物に対するアレルギーは、アレルギー患者の最大４０％に影響する。家庭内環境において、最も一般的なペットであるネコやイヌに対するアレルギーが特に蔓延しており、通年性の症状と関連している。動物アレルゲンは、鱗屑、上皮、唾液、血清または尿に存在する。当該アレルゲンへの暴露は、直接的な皮膚の接触またはアレルゲンを運ぶ粒子の吸入により起こり得る。主要なネコおよびイヌのアレルゲンは、広範囲に存在することが示されており、ペットを所有していない家庭や学校などの公共の場所においても検出できた。これは先進工業国においてペットを所有する家庭の数が多くまた増加していること（約５０％）や運ばれかつばらまかれるアレルゲンの高い安定性に起因すると考えられる。
【０１６２】
Ｆｅｌ  ｄ  １は、主要なネコアレルゲンとして同定され、ネコアレルギー患者の９０％以上に認められている。Ｆｅｌ  ｄ  １は、生物学的機能が不明の３８ｋＤａ酸性糖タンパク質を表す。それは、２つの同一の非共有結合したヘテロ二量体からなり、当該ヘテロ二量体は、３つのジスルフィド結合により逆平行に連結される２つのポリペプチド鎖からなる。鎖１および鎖２は、それぞれ３つのエクソンからなる異なる遺伝子上にコードされる。鎖１に対する鎖２の融合プロテインとして発現される組み換えＦｅｌ  ｄ  １（ｒＦｅｌ  ｄ  １）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成されている。この組み換えＦｅｌ  ｄ  １は、野生型アレルゲンの免疫学的性質を完全に模倣することができる。
【０１６３】
主要なネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １に由来し、ＩｇＥ結合能を欠くペプチドは、例えば、免疫療法および予防的アレルギーワクチン接種に好適である。Ｐｈｌ  ｐ  ５や本明細書に記載されるアレルゲン由来ペプチドのようなＦｅｌ  ｄ  １由来合成ペプチドは、ＩｇＧ反応、すなわち、いわゆる「遮断抗体」または「防御抗体」の生成を誘発させることができる。これらの抗体は、アレルゲンＦｅｌ  ｄ  １に対するＩｇＥ結合を妨げる。このようにしてアレルギー症状を著しく低減できる。
【０１６４】
本発明の好ましい実施形態によれば、切り詰めた分子は、Ｔ細胞反応性の低下を示す。
【０１６５】
遅発性の副作用を回避するまたは著しく低減させるために、Ｆｅｌ  ｄ  １由来低アレルギー誘発性分子は、本発明で定義されるように、Ｔ細胞反応性の低下を示す。
【０１６６】
切り詰めたＦｅｌ  ｄ  １は、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖１の１〜３４もしくは３５〜７０番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖２の１〜３４、３５〜６３もしくは６４〜９２番目のアミノ酸、またはその配列変異から構成されるのが好ましい。
【０１６７】
本発明の他の局面は、以下のものから構成されるか、または当該以下のものを含む低アレルギー誘発性分子に関する：Ｄｅｒ  ｐ  ２の１〜３３、２１〜５１、４２〜７３、６２〜１０３もしくは９８〜１２９番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ７の１〜３０、２０〜５０、５０〜８０、９０〜１２５、１２５〜１５５もしくは１６５〜１９８番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２１の１〜３５、３５〜７２、７０〜１００もしくは９０〜１２２番目のアミノ酸、Ｄｅｒ  ｐ  ２３の１〜３２、１５〜４８もしくは３２〜７０、３２〜６０、５２〜８４、３２〜７０（Ｃｙｓ≧Ｓｅｒ）番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  １の１９〜５８、５９〜９５、９１〜１２０もしくは１２１〜１５７番目のアミノ酸、Ｐａｒ  ｊ  ２の３１〜６０、４５〜８０、６０〜９６もしくは９７〜１３３番目のアミノ酸、Ｏｌｅ  ｅ  １の１〜４０、３６〜６６、６３〜９９、８６〜１２０もしくは１０７〜１４５番目のアミノ酸、Ｆｅｌ  ｄ  ２の２５〜５８、９９〜１３３、１５４〜１８３、２７７〜３０７、３３４〜３６３、３７３〜４０２、５４４〜５７３、５７９〜６０８、５８〜９９、１２５〜１６５、１８３〜２２４、２２４〜２６１、２５２〜２８９、３０３〜３４０、４１６〜４５７、４６０〜５００もしくは５０１〜５４２番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  ２の１９〜５８、５２〜９１、８２〜１１９、１０６〜１４４もしくは１３９〜１８０番目のアミノ酸、Ｃａｎ  ｆ  １の１９〜５６、５１〜９０、７８〜１１８、１０６〜１４５もしくは１３５〜１７４番目のアミノ酸、Ａｒｔ  ｖ  １の２７〜７０、７０〜１００もしくは９２〜１３２番目のアミノ酸、Ａｍｂ  ａ  １の３１〜７０、８０〜１２０、１２５〜１５５、１６０〜２００、２２５〜２６３、２６４〜３００  ３０５〜３５０もしくは３５６〜３９６番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ６の１〜３４、３５〜７４、７４〜１１５、１２５〜１６５、１７４〜２１３、２４１〜２８０、２９４〜３３３、３６１〜４００もしくは４０１〜４３８番目のアミノ酸、Ａｌｔ  ａ  ２の１〜４０、４１〜８０、８１〜１２０、１２１〜１６０番目のアミノ酸、またはこれらの断片または配列変異。
【０１６８】
融合タンパク質の生成方法は、当該分野で周知であり、Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)やAusubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed; Wiley and Sons, 1995)等の標準的な分子生物学の参考文献に見出すことができる。一般的に、融合タンパク質は、好適な宿主Ｔ細胞に形質移入するために次に使用される好適な発現ベクターに挿入される融合遺伝子を、まず構築することによって生成される。一般的に、組み換え融合構築物は、プラスミドに組み込まれている所望の配列を結果として生じる、一連の制限酵素消化およびライゲーション反応によって生成される。好適な制限酵素認識部位が利用できない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、当業者によって公知のように使用され得、かつ上記に引用した参考文献に記載されている。アレルゲンおよび本来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好適なベクターに挿入される前に構築され得るか、またはアレルゲンをコードする配列は、ベクター内にすでに存在する本来のタンパク質をコードする配列に隣接して挿入され得る。ベクター内への配列の挿入は、配列がタンパク質に翻訳されるように、インフレームに挿入されるべきである。適確な制限酵素、リンカーおよび／またはアダプターならびに適確な反応条件が、使用される配列およびクローニングベクターによって変わることは、当業者にとって明白である。しかし、ＤＮＡ構築物の構築は、当該技術において日常的な操作であり、かつ当業者によって容易に達成され得る。
【０１６９】
切り詰めた低アレルギー誘発性アレルゲン分子由来の融合タンパク質およびヒトＢ型肝炎Ｂ  ｐｒｅ  Ｓタンパク質は、標準的な発現系において再生可能に発現でき、特に発現系としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて用いることによって、当業者に知られた標準的な発現系において高い歩留まりで再生可能に容易に製造することができる。そのような製造方法は、一般的に、バイオリアクター（例えば、発酵槽、振盪フラスコ）における細胞の培養による本発明に係る分子の発現、それに続く細胞の収集（例えば、ろ過、遠心分離等）や細胞破壊（例えば、高圧均質化、超音波処理、凍結融解サイクル、酵素的または化学的細胞溶解等）、分子の精製（例えば、クロマトグラフィー、ろ過、沈殿、限外／透析ろ過等）および最終的な製品の製造を含む。本発明に係る分子の高い歩留まりを得るには、流加発酵の適用により、高細胞密度培養処理が用いられることが好ましい。
【０１７０】
本発明の他の局面は、本発明に係る低アレルギー誘発性分子および融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【０１７１】
本発明の核酸分子は、例えば上記分子を組み替え的に産生するために、採用され得る。
【０１７２】
上記核酸分子は、−本発明の他の局面に係る−ベクターに含まれ得る。
【０１７３】
このベクターは、発現ベクターであることが好ましい。
【０１７４】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例証されるが、しかし、これらに限定されない。
【０１７５】
図１Ａは、ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５の模式的な概要を示す。
【０１７６】
図１Ｂは、ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３の模式的な概要を示す。
【０１７７】
図１Ｃは、ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２の模式的な概要を示す。
【０１７８】
図１Ｄは、ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１の模式的な概要を示す。
【０１７９】
図２Ａは、融合タンパク質ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ１＿４ｘＰ５の一次配列（ＢＭ３２１、配列番号１４）を示す。
【０１８０】
図２Ｂは、融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３の一次配列（ＢＭ３２２、配列番号１５）を示す。
【０１８１】
図２Ｃは、融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２の一次配列（ＢＭ３２５、配列番号１６）を示す。
【０１８２】
図２Ｄは、融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１の一次配列（Ｂ３２６、配列番号１７）を示す。
【０１８３】
図２Ｅは、融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｂｅｔｖ１＿４ＰＡの一次配列（ＢＭ３１ａ、配列番号１８）を示す。
【０１８４】
図２Ｆは、融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｂｅｔｖ１＿２ＰＡ２ＰＢの一次配列（ＢＭ３１、配列番号１９）を示す。
【０１８５】
図２Ｇは、融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ１の一次配列（配列番号２０）を示す。
【０１８６】
図３Ａは、精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ  ３２１、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２１、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２１、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２１、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２１、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２１、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ  ３２１、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２１）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【０１８７】
図３Ｂは、精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ  ３２２、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２２、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２２、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２２、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２２、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２２、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ３２２、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２２）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【０１８８】
図３Ｃは、精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２５、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２５、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２５、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２５、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２５、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ３２５、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２５）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【０１８９】
図３Ｄは、精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ  ３２６、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２６、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２６、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２６、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２６、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２６、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ  ３２６、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２６）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【０１９０】
図４は、草本花粉アレルゲンに由来する融合ペプチドのＩｇＥ反応性の欠如を示す。完全なアレルゲンと比較して、融合タンパク質のＩｇＥ結合をＩｇＥドットブロット分析によりテストした。示された数の草本花粉アレルギー患者の血清をドットされたタンパク質とインキュベーションし、結合したＩｇＥを１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥで検出した。４つのペプチド−担体融合タンパク質のいずれにもＩｇＥ結合は検出されなかった。ａ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ＸＰ５（ＢＭ３２１）を用いたドットブロット分析の結果を示し、ｂ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２２）を用いたドットブロット分析の結果を示し、ｃ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）を用いたドットブロット分析の結果を示し、ｄ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）を用いたドットブロット分析の結果を示す。
【０１９１】
図５は、アレルギー患者の好塩基球上のＣＤ２０３ｃ発現に決定されるような草本花粉アレルゲン由来融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）の低アレルギー活性を示す。草本花粉アレルギー患者のＰＢＭＣをＰｈｌ  ｐ  １（薄灰色のバー）またはＢＭ３２１（濃灰色のバー）の連続希釈によりインキュベーションした。ＣＤ２０３ｃの誘導を平均蛍光強度として測定した。算出した刺激指標をｙ軸に示す。
【０１９２】
図６は、アレルギー患者の好塩基球上のＣＤ２０３ｃ発現に決定されるような草本花粉アレルゲン由来融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）の低アレルギー活性を示す。草本花粉アレルギー患者のＰＢＭＣをＰｈｌ  ｐ  ６（薄灰色のバー）またはＢＭ３２６（濃灰色のバー）の連続希釈によりインキュベーションした。ＣＤ２０３ｃの誘導を平均蛍光強度として測定した。算出した刺激指標をｙ軸に示す。
【０１９３】
図７は、マウスにおけるオオアワガエリ花粉アレルゲン特異的なＩｇＧ１反応を示す。実験０週目および３週目の時点で、各４匹のマウスの群に、２０ｕｇの融合タンパク質（単一の融合タンパク質および４つの融合タンパク質の組み合わせ）および各１０μｇ（Ｐｈｌ  ｐ１および５）または各５μｇ（Ｐｈｌ  ｐ２および６）の野生型アレルゲンで免疫を付与し、その後実験１７週目の時点でブースト免疫付与を行った。抗原を動物の背中部分に皮下投与した。実験０、３、６、９、１２、１７、２０および２２週目の時点で、マウスの尾静脈から血液を採取した。免疫付与をした実験週では、当該免疫付与の１日前に血液を採取した。マウスの免疫血清をＥＬＩＳＡによりアレルゲン特異性ＩｇＧ１の有無に関して調べた。最初の免疫付与の前の免疫前血清は、全ての動物において陰性だった。個々の融合タンパク質を融合タンパク質の混合物の適用と比較した。ａ）ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（単一成分としてのＢＭ３２１）、ＢＭ３２２、ＢＭ３２５およびＢＭ３２６と混合したＢＭ３２１、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  １で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ  １抗原に対する免疫反応。ｂ）ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（単一成分としてのＢＭ３２１）、ＢＭ３２１、ＢＭ３２５およびＢＭ３２６と混合したＢＭ３２２、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  ２で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ  ２抗原に対する免疫反応。ｃ）ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（単一成分としてのＢＭ３２５）、ＢＭ３２１、ＢＭ３２２およびＢＭ３２６と混合したＢＭ３２５、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  ５で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ  ５抗原に対する免疫反応。ｄ）ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（単一成分としてのＢＭ３２６）、ＢＭ３２１、ＢＭ３２２およびＢＭ３２５と混合したＢＭ３２６、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  ６で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ６抗原に対する免疫反応。
【０１９４】
図８は、組み換え融合タンパク質の分子的および免疫学的特徴を示す。Ａ．Ｂｅｔ  ｖ１由来ペプチド（レーン１：２ｘＰＡ−ＰｒｅＳ、レーン２：２ｘＰＢ−ＰｒｅＳ、レーン３：４ｘＰＡ−ＰｒｅＳ、レーン４：２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳ）および担体ＰｒｅＳ（レーン５）を有する４つのＰｒｅＳ融合タンパク質を示すクーマシー着色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ．ニトロセルロースドット組み換え融合タンパク質およびＰｒｅＳを、ウサギの抗ＰｒｅＳ血清（レーン１）、ウサギの免疫前血清（レーン３）ウサギの抗体のバッファコントロール（レーン３）、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰ２’（ｍＡｂ２）（レーン４）およびＰ４’（ｍＡｂ１２）（レーン５）に対するモノクローナル抗体、モノクローナルマウス抗体のバッファコントロール（レーン６）を用いて調べる。
【０１９５】
図９Ａは、ｒＢｅｔ  ｖ  １およびＰｒｅＳの組み換え融合タンパク質のＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチドとのＩｇＥ反応性を示す。カンバ花粉アレルギー患者の血清、非アレルギーの対照の血清、そしてバッファのみを、ドットブロットしたｒＢｅｔ  ｖ  １、４つの組み換え融合タンパク質（２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡ２ＰＢ−ＰｒｅＳ）およびＰｒｅＳのみに対するそれらの反応性をテストした。結合したヒトＩｇＥを１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した。結合したＩｇＥに対応するカウント毎分（ｃｐｍ）をγカウンターで測定し、Ｙ軸に示す。ボックスプロットは、５０人のカンバ花粉アレルギー患者の結果を示す。
【０１９６】
図９Ｂは、ＣＤ  ２０３ｃ上方調節により測定されるｒＢｅｔ  ｖ１および４つのＰｒｅＳ融合タンパク質による好塩基球の活性化を示す。カンバ花粉アレルギー患者の血液試料を、濃度を高めていった（０．００１−１μｇ／ｍｌ）抗原、バッファコントロール（Ｃｏ）の抗ＩｇＥに暴露した。１人の代表の患者の結果を示す。ＣＤ  ２０３ｃ発現をＦＡＣＳ分析で決定し、刺激指標（ＳＩ（ｙ軸））として示す。３通りの測定の平均を示し、標準偏差を示している。
【０１９７】
図１０は、カンバ花粉アレルギー患者のＰＢＭＣのリンパ球増殖反応およびサイトカイン生成を示す。カンバ花粉アレルギー患者のＰＢＭＣは、等モル量のｒＢｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰＡ・ＰＢ、ＰｒｅＳのみ、およびＰｒｅＳ融合タンパク質（すなわち、２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）で刺激した。刺激指標（ＳＩ）（ｙ軸）を示す。
（Ａ）６人のカンバ花粉アレルギー患者の最も高い濃度（５μｇ／ウェルのＢｅｔ  ｖ  １ならびに等モル量のペプチド、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳ融合タンパク質）のＳ１をボックスブロットとして示す。値の５０％はボックス内にあり、非外れ値はバーの間にある。ボックス内の線は中央値を示す。
（Ｂ）４つの濃度（１＝５μｇ／ウェル、２＝２．５μｇ／ウェル、３＝１．２５μｇ／ｍｌ、４＝０．６３μｇ／ウェルのｒＢｅｔ  ｖ１ならびに等モル量のペプチド、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳ融合タンパク質）のＳ１を１人の代表の患者に関して示す。
（Ｃ）２．５μｇ／ｍＬのｒＢｅｔ  ｖ  １ならびに等モル量のペプチドＰＡ・ＰＢ、ＰｒｅＳおよび４つのＰｒｅＳ融合タンパク質で刺激した６人のカンバ花粉アレルギー患者のＰＢＭＣの上清におけるサイトカイン生成を測定した。抗原での刺激後の観察濃度（ｐｇ／ｍＬ）（ｙ軸）をボックスブロットに示す。値の５０％はボックス内にあり、非外れ値はバーの間にある。ボックス内の線は中央値を示す。
【０１９８】
図１１は、ウサギにおけるＰｒｅＳ融合タンパク質による皮下免疫付与後のｒＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンに対して特異的なＩｇＧ抗体の誘導を示す。
（Ａ）ウサギに、水酸化ミョウバン吸着（ミョウバン）（上）または完全フロインド補佐剤（ＣＦＡ）吸着（下）融合タンパク質（２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）およびｒＢｅｔ  ｖ  １で免疫を付与した。ｒＢｅｔ  ｖ  １に特異的なウサギＩｇＧを測定し、異なる希釈のウサギ抗血清（ｘ軸）に関して２通りの測定の平均光学密度（ＯＤ）を示す（ｙ軸）。
（Ｂ１）ハンノキ（Ａｌｎ  ｇ  １）、ハシバミ（Ｃｏｒ  ａ  １）およびリンゴ（Ｍａｌ  ｄ  １）におけるＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンの多配列アラインメント。同じアミノ酸をドットとして示し、ギャップをダッシュ記号で示す。Ｂｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンのＢｅｔ  ｖ  １に対する同一性のパーセンテージを右側に示す。Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＡ（ＰＡ、点線）およびペプチドＢ（ＰＢ、実線）を枠で囲っている。
（Ｂ２）ｒＢｅｔ  ｖ  １、ｒＡｌｎ  ｇ  １、ｒＣｏｒ  ａ  １およびｒＭａｌ  ｄ  １（ｘ軸）に対する抗ウサギ血清（ｒａｂ  α−２ＰＡ−ＰｒｅＳ、ｒａｂ  α−２ＰＢ−ＰｒｅＳ、ｒａｂ  α−４ＰＡ−ＰｒｅＳ、ｒａｂ  α−２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）のＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。２通りの測定の平均を示す。ウサギ血清（後）におけるアレルゲン特異ＩｇＧに対応する光学密度（ＯＤ）を対応する免疫前血清（前）と比較して示す（ｙ軸）。
（Ｃ）６つのＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチド（Ｐ１’〜Ｐ６’）（ｘ軸）に対する、ｒＢｅｔ  ｖ  １および組み換え融合タンパク質（２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）で免疫付与したウサギのＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。２通りの測定の光学密度（ＯＤ）値の平均（ｙ軸）を示す。
【０１９９】
図１２は、完全ｒＢｅｔ  ｖ  １に対するウサギ血清と比較してアレルギー患者のＩｇＥに対する抗２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳウサギ血清の阻害を示す。抗２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳおよび抗ｒＢｅｔ  ｖ  １ウサギ血清で得たｒＢｅｔ  ｖ  １へのＩｇＥ結合の阻害パーセンテージ（ｙ軸）を阻害ＥＬＩＳＡにより決定し、ボックスブロットとして示す。値の５０％はボックス内にあり、非外れ値はバーの間にある。ボックス内の線は中央値を示す。２１人のカンバ花粉アレルギー患者の結果を示す。
【０２００】
図１３は、Ｐｈｌ  ｐ  ６由来ペプチドの２つまたは４つのコピーを含有するＰｒｅＳ融合タンパク質で免疫付与した後のウサギＩｇＧの滴定を示す。免疫原性のテストのため、水酸化アルミニウムを補佐剤として用い、ウサギ（ニュージーランドホワイトウサギ）に異なる融合タンパク質で免疫付与した。特定の抗体の誘導をＥＬＩＳＡアッセイにおいてモニタリングした。結果は、２つのペプチドを含有する融合タンパク質よりも４つのペプチドを含有する融合タンパク質の方がより免疫原性があることを示している。
【０２０１】
図１４は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物（ＢＭ３２）で皮下免疫付加後のヒト草本花粉アレルギーにおける草本花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １  （Ａ）、Ｐｈｌ  ｐ２  （Ｂ）、Ｐｈｌ  ｐ  ５  （Ｃ）およびＰｈｌ  ｐ  ６  （Ｄ）に対する強いＩｇＧ反応の誘導を示す。ＩｇＧの決定はＥＬＩＳＡにより行った。治療前のＩｇＧレベル（前）を治療後のＩｇＧレベル（後）と比較する。
【０２０２】
図１５は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物からなるワクチン調合物で免疫付加後の草本花粉アレルギー個体のＴ細胞に対するＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。草本花粉と比較するとＴ細胞反応性が強く低減されるか存在しない。グラフのｙ軸は、刺激指標を反映している。
【０２０３】
図１６は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物（ＢＭ３２）による治療により誘導されるＩｇＧは、ヒトＰＢＭＣにおける草本花粉アレルゲンへのリンパ球増殖反応を低減することを示す。（ａ）実験の仕組み。（ｂ）治療により誘導されたＩｇＧの非存在下（前に血清をプラス）および存在下（後に血清をプラス）で行うＴ細胞増殖の結果。グラフのｙ軸は刺激指標を反映している。Ｐ１〜Ｐ５は異なる実験参加者の結果を示す。
【０２０４】
図１７は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物ＢＭ３２を用いる６９人の草本花粉アレルギー個体において行われた臨床試験の仕組みを示す。
【０２０５】
図１８Ａは、融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２−２ｘＰ２−２ｘＰ４（配列番号１４９）の一次配列を示す。
【０２０６】
図１８Ｂは、融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２−３ｘＰ２−３ｘＰ４（配列番号１５０）の一次配列を示す。
【０２０７】
図１８Ｃは、融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２３−２ｘＰ４−２ｘＰ５（配列番号１５１）の一次配列を示す。
【０２０８】
図１８Ｄは、融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２３−４ｘＰ６（配列番号１５２）の一次配列を示す。
【０２０９】
図１９Ａは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物ＢＭ３２を３回皮下注射する治療により引き起こされる鼻の症状の変化を示す。黒いバー：治療前、灰色のバー：治療後。
【０２１０】
図１９Ｂは、ワクチン調合物ＢＭ３２で治療前の滴定皮膚プリックテストと治療後の滴定皮膚プリックテストとの間の平均膨疹面積の変化を示す。滴定皮膚プリックテストは、８連続希釈した草本花粉エキス（非希釈１：１２８）を用いて行った。
【０２１１】
図２０は、ＩｇＥドットブロットアッセイによりテストした完全アレルゲンと比較してＤｅｒ  ｐ  ２由来ペプチドのＩｇＥ結合を示す。２６人のイエダニアレルギー患者の血清をドットしたＫＬＨ接合ペプチドでインキュベーションし、結合したＩｇＥを１２５１標識抗ヒトＩｇＥで検出した。実施例２６のように５つのペプチドのいずれに関してもＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２１２】
〔実施例〕
（実施例１：ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）用発現プラスミドの構築）
合成ＢＭ３２１遺伝子は、合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＣＲ産物から構築され、適切な標準ベクター（ｐＭＫ−ＲＱｋａｎＲ）にクローニングされた。プラスミドは、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株（ＤＨ１０Ｂ−Ｔ１Ｒ）から精製され、濃度はＵＶ分光法によって決定された。最終合成およびコドン最適化ＢＭ３２１ＤＮＡ配列はさらに、適切な制限酵素認識部位（５’末端のＮｃｏＩ部位および３’末端のＥｃｏＲＩ）を用いて、発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）にクローニングされた。プラスミドＤＮＡは、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＨ１０Ｂ（ｄａｍ＋  ｄｃｍ＋）から精製され、濃度はＵＶ分光法によって決定された。最終構築物は挿入物の配列決定によって確認された。プラスミドデータの概要および最終発現ベクター「ｐＢＭ−３２１」のプラスミドマップを以下に示す。
【０２１３】
最終発現ベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）にクローニングされたＢＭ３２１配列の概要
【０２１４】
【表３２】
2014518635.tif 000034
【０２１５】
（実施例２：発現プラスミドのＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）用発現宿主への形質転換）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のケミカルコンピテントセルは、発現プラスミドを用いて熱ショック法により形質転換された。形質転換した細胞は、選択のために、０．５％の塩化ナトリウム、１％の大豆ペプトン、０．５％の酵母エキス、１．５％の寒天および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンからなるＬＢ寒天プレート上で培養された。ＬＢプレート上の細胞は、３７℃において一晩かけて培養して増殖させた。形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の単一コロニーは、単離され、ＬＢ培地で培養され、ＢＭ３２１の増殖および発現についてスクリーニングされた。マスターセルバンクをさらに確立するために、最高のパフォーマンスのクローンが選択された。
【０２１６】
（実施例３：ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）用マスターセルバンクの調製）
選択したクローンの標本は、１５０ｍＬの培地（組成：０．５％の塩化ナトリウム、１％の大豆ペプトン、０．５％の酵母エキス、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）の接種に使用された。マスターセルバンク（ＭＣＢ）培養物は、３７℃において、２００ｒｐｍにおいて絶えず攪拌しながら、ＯＤ６００＝１〜２の光学濃度になるまでインキュベーションされた。１５％ｖ／ｖの最終グリセロール濃度を得るためにグリセロールが添加され、ＭＣＢは、１ｍｌのバイアルに等分され、超低温フリーザーに−７５±１０℃で保存された。
【０２１７】
（実施例４：ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）の高細胞密度流加発酵）
合成培地（１００ｍｌ、ｐＨ＝６．８、塩および微量元素、炭素源として１０ｇ／Ｌのグルコース）は、１ｍＬのマスターセルバンク（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＭ３２１）を用いて接種され、振盪フラスコ（３７℃、２００ｒｐｍ）において、ＯＤ＝１の光学濃度目標値になるまで培養された。２２Ｌのステンレス鋼発酵槽を用いて、流加発酵を実施した。自動および再現送り制御のために、レシピがプログラムされ、比増殖速度、送り速度、バッチ段階の持続時間および指数関数的フィード段階の持続時間を事前に定義することができた。発酵槽の酸素移動速度を高めるために、背圧は制御され、１バールに設定された。発酵槽は、上述の合成培地を用いてその場で滅菌され、前培養を用いた接種によって発酵が開始された。グルコースの枯渇後に、μ＝０．２５ｈ−１の比増殖速度を維持するために、指数関数的フィード段階が開始された。ＯＤ＝４５において、組み換えＢＭ３２１の発現は、ＩＰＴＧの大量瞬時添加によって誘導された（０．８ｍＭの最終濃度）。培養物はＯＤ６００＝７３で回収された。流加発酵から得られたＢＭ３２１産物力価は、培養液１Ｌ当たり１．２ｇであった。その後、細菌培養液は、≦２０℃まで冷却され、４℃、７，０００ｒｐｍ（５，５００ｇ）において、１５分間に渡って遠心分離された。湿細胞は等分され、−７５℃で保存された。
【０２１８】
（実施例５：細胞破壊および浄化）
細胞破壊のために、実施例６からの７４８グラムのバイオマスが解凍され、１２５グラムの標本に細分化され、均質化緩衝液（２０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ  １１．０）において、機械攪拌下で、室温において、３０分間に渡って再懸濁された。細胞破壊のために、凍結／解凍手順は、−７５℃での凍結およびその後の解凍、続いて機械的な均質化によって施された。ホモジネートのｐＨは、ｐＨ＝１０．０に調整された。粗細胞ホモジネートは、７，０００ｒｐｍ（５，５００ｇ）、４℃において、３０分間に渡って遠心分離工程にかけられた。上清は、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて、機械攪拌下で沈殿させた。不溶物は、その後の遠心分離工程によって分離された。浄化上清は、以下のクロマトグラフィー工程にかけられた。
【０２１９】
（実施例６：ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）のクロマトグラフィー精製）
実施例７に記載の浄化工程からの合計１８４０ｍＬのＰＥＩ沈殿上清は、５ｃｍ×３０ｃｍのＱ−セファロースＦＦカラムに充填され、緩衝液Ａ（トリスＨＣｌ、ＥＤＴＡ）を用いて平衡化された。非結合物質は、緩衝液Ａを用いて洗浄し、続いて緩衝液Ｃ（１リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．０）を用いて洗浄することによって、除去された。産物画分の溶出は、ＢＭ３２緩衝液Ｃにおいて、０−１００％のＢＭ３２緩衝液Ｅ（リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．０）を用いた線形勾配溶離によって達成された。貯留用の産物を含む画分の選択は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従って、画分純度の濃度測定評価によって、さらに産物帯強度によって行われた。
【０２２０】
捕捉工程からの貯留画分は、２．５Ｍの塩化ナトリウムの添加によって、１１５ｍＳ／ｃｍの導電率に調整され、この供給原料は、緩衝液Ｄ（リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．０）を用いて平衡化されたフェニルセファロースＨＰカラムに充填された。非結合物質は、緩衝液Ｄを用いて洗浄することによって除去された。産物画分の溶出は、緩衝液Ｄにおいて、４０−１００％の緩衝液Ｃ（リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．０）からの勾配溶離によって達成された。貯留用の産物を含む画分の選択は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従って、画分純度の濃度測定評価によって、さらに産物帯強度によって行われた。
【０２２１】
中間工程からの貯留画分は、２．５Ｍの塩化ナトリウムの添加によって、８０ｍＳ／ｃｍの導電率に調整され、この供給原料は、混合緩衝液Ｆ（リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．０）を用いて平衡化されたトヨパールブチル６５０−Ｓカラムに充填された。非結合物質は、緩衝液Ｃ（リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．０）において、８０〜０％のＢＭ３２緩衝液Ｆを用いた勾配洗浄によって除去された。画分の溶出は、緩衝液Ｃにおいて、０−１の緩衝液Ｇ（リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、イソプロパノール、ｐＨ  ７．０）からの勾配溶離によって達成された。貯留用の産物を含む画分の選択は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従って、画分純度の濃度測定評価によって、さらに産物帯強度によって行われた。
【０２２２】
（実施例７：ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２２）、ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）、およびＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）の製造）
本発明に係る組み換え分子、すなわちＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２２）、ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）、およびＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）の製造には、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５および実施例６に記載のものと同一、類似または同等の方法および手順が適用された。
【０２２３】
（実施例８：ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）、ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２２）、ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）、およびＨＢＶ＿ＰｈｌＰ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）の混合物からなる注入可能な調合物の調製）
それぞれの組み換え精製タンパク質は、０．９％の塩化ナトリウムおよび２ｍＭのリン酸ナトリウムを含む等張緩衝液において各タンパク質溶液に溶解され、適量の水酸化アルミニウムが添加された。等量の４つの生成された懸濁液を含む混合物が調製され、無菌条件下で密封バイアルに等分された。この手順によって得られた注入可能な調合物は、ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ１＿４ｘＰ５、ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ２＿４ｘＰ３、ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ５＿Ｖ２およびＨＢＶ＿ＰｈｌＰ６＿４ｘＰ１をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ含んでいた。
【０２２４】
（実施例９：ｈｉｓタグ付きＨＢＶ＿Ｂｅｔｖｌ＿４ｘＰＡの調製）
Ｎ末端およびＣ末端（すなわち４ＰＡ−ＰｒｅＳ）において２回Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰＡと融合したＰｒｅＳからなる融合タンパク質をコードする遺伝子は、ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ、Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツによって合成され、ベクターｐＥＴ−１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入された。ＤＮＡ配列は、両方のＤＮＡ鎖（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、Ｂａｌｇａｃｈ、スイス）の自動配列決定によって確認された。
【０２２５】
融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ  ホーヤ、カリフォルニア）において発現させた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリアベルターニ培地において、０．６のＯＤに増殖させた。タンパク質発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって、１ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで、３７℃において一晩かけて誘導された。細胞は、３５００ｒｐｍにおいて、１０分間に渡って、遠心分離によって回収された。タンパク質産物は、主に封入体画分において検出された。該タンパク質産物は、６ＭのＧｕＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０において、一晩かけて可溶化された。ホモジネートは、１４，０００ｇにおいて、１８分間に渡って遠心分離された。ホモジネートの上清は、２ｍＬの予め平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて、４時間に渡ってインキュベーションされ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、懸濁液は、続いてカラムに充填され、２カラム容量の洗浄緩衝液（８ｍｏｌ／Ｌの尿素、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、および１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝６．１］）を用いて洗浄され、かつ同一の緩衝液（ｐＨ＝３．５）を用いて溶出された。精製タンパク質は、水に対して透析された。
【０２２６】
組み換えタンパク質の純度は、還元性条件下において、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）によって分析された。
【０２２７】
融合タンパク質の同一性は、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰ２’（ｍＡｂ２）およびＰ４’（ｍＡｂｌ２）ならびにＰｒｅＳ特異的ウサギ抗体および対応するウサギの免疫前のＩｇＧに特異的なモノクローナル抗体を用いたドットブロットによって確認された。１μｇのＰｒｅＳ融合タンパク質、ＰｒｅＳおよびＨＳＡ（対照）は、ニトロセルロース上に固定化され、モノクローナルおよび１：１０００に希釈したウサギ血清を用いて、４℃においてインキュベーションされた。結合した抗体は、１：５００に希釈した１２５標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（ｍＡｂ２、ｍＡｂｌ２）または１２５Ｉ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ウサギ抗ＰｒｅＳ、ウサギ免疫前）ヨウ素（パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ）を用いて、２時間に渡って検出され、オートラジオグラフィーによって可視化された。さらに、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）は、２μｇのＰｒｅＳ融合タンパク質およびＰｒｅＳを用いて被われ、０．１ｍｏｌ／ＬのｐＨ  ９．６の炭酸塩緩衝液において希釈され、０．０５％ｖｏｌ／ｖｏｌのＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳを用いて３回洗浄され、１％のＢＳＡ−ＰＢＳＴを用いて、２時間に渡ってブロッキングされた。続いて、プレートは、ｍＡｂ２、ｍＡｂｌ２、抗ＰｒｅＳウサギ血清およびウサギ抗Ｂｅｔ  ｖ  １抗体を用いて、１：５０００の希釈物（希釈緩衝液：ＰＢＳＴにおける０．５％ｗｔ／ｖｏｌのＢＳＡ）において、４℃において一晩かけてインキュベーションされた。５回の洗浄の後、結合したＩｇＧ抗体は、ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウス抗体（ｍＡｂ２、ｍＡｂｌ２用）またはＨＲＰ標識ロバ抗ウサギ抗体（ウサギ血清）（いずれもＧＥヘルスケア、ウプサラ、スウェーデン）を用いて検出され、呈色反応が示された。
【０２２８】
（実施例１０：ヒスタグ付きＨＢＶ＿Ｂｅｔｖｌ＿２ｘＰＡ２ｘＰＢ（ＢＭ３１）の調製）
Ｎ末端およびＣ末端２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳにおいて２回Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドと融合したＰｒｅＳからなる融合タンパク質をコードする遺伝子は、２ＰＡＰＢ−Ｐｒｅｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー、アメリカ）によって合成され、ベクターｐＥＴ−１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入された。ＤＮＡ配列は、両方のＤＮＡ鎖（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス）の自動配列決定によって確認された。
【０２２９】
組み換えＰｒｅｓ融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア）において発現させた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリアベルターニ培地において、０．６のＯＤに増殖させた。タンパク質発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって、１ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで、３７℃において一晩かけて誘導された。細胞は、３５００ｒｐｍにおいて、１０分間に渡って、遠心分離によって回収された。タンパク質は、主に封入体画分において検出された。結果のタンパク質は、６ＭのＧｕＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０において、一晩かけて可溶化された。ホモジネートは、１４，０００ｇにおいて、１８分間に渡って遠心分離された。ホモジネートの上清は、２ｍＬの予め平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて、４時間に渡ってインキュベーションされ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、懸濁液は、続いてカラムに充填され、２カラム容量の洗浄緩衝液（８ｍｏｌ／Ｌの尿素、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、および１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝６．１］）を用いて洗浄され、かつ同一の緩衝液（ｐＨ＝３．５）を用いて溶出された。タンパク質は、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４に対して透析された。
【０２３０】
組み換えタンパク質の純度は、還元性条件下において、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）によって分析された。融合タンパク質の同一性は、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰ２’（ｍＡｂ２）およびＰ４’（ｍＡｂｌ２）ならびにＰｒｅＳ特異的ウサギ抗体および対応するウサギの免疫前のＩｇＧに特異的なモノクローナル抗体を用いたドットブロットによって確認された。１μｇのＰｒｅＳ融合タンパク質、ＰｒｅＳおよびＨＳＡ（対照）は、ニトロセルロース上に固定化され、モノクローナルおよび１：１０００に希釈したウサギ血清を用いて、４℃においてインキュベーションされた。結合した抗体は、１：５００に希釈した１２５標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（ｍＡｂ２、ｍＡｂｌ２）または１２５Ｉ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ウサギ抗ＰｒｅＳ、ウサギ免疫前）ヨウ素（パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ）を用いて、２時間に渡って検出され、オートラジオグラフィーによって可視化された。さらに、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｏｓｋｌｉｄｅ、デンマーク）は、２μｇのＰｒｅＳ融合タンパク質およびＰｒｅＳを用いて被われ、０．１ｍｏｌ／ＬのｐＨ  ９．６の炭酸塩緩衝液において希釈され、０．０５％ｖｏｌ／ｖｏｌのＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳを用いて３回洗浄され、１％のＢＳＡ−ＰＢＳＴを用いて、２時間に渡ってブロッキングされた。続いて、プレートは、ｍＡｂ２、ｍＡｂｌ２、抗ＰｒｅＳウサギ血清およびウサギ抗Ｂｅｔ  ｖ  １抗体を用いて、１：５０００の希釈物（希釈緩衝液：ＰＢＳＴにおける０．５％ｗｔ／ｖｏｌのＢＳＡ）において、４℃において一晩かけてインキュベーションされた。５回の洗浄の後、結合したＩｇＧ抗体は、ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウス抗体（ｍＡｂ２、ｍＡｂｌ２用）またはＨＲＰ標識ロバ抗ウサギ抗体（ウサギ血清）（いずれもＧＥヘルスケア、ウプサラ、スウェーデン）を用いて検出され、呈色反応が示された。
【０２３１】
（実施例１１：融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）のＩｇＥ反応性の検出）
完全なアレルゲンと比較したＩｇＥ結合はドットブロットアッセイによって試験された。草本花粉アレルギー患者からの血清はドット化タンパク質を用いてインキュベーションされ、結合したＩｇＥは１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。図４Ａに示されるように、ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）に対してＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２３２】
（実施例１２：融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２２）のＩｇＥ反応性の検出）
完全なアレルゲンと比較したＩｇＥ結合はドットブロットアッセイによって試験された。草本花粉アレルギー患者からの血清はドット化タンパク質を用いてインキュベーションされ、結合したＩｇＥは１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。図４Ｂに示されるように、ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２１）に対してＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２３３】
（実施例１３：融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）のＩｇＥ反応性の検出）
完全なアレルゲンと比較したＩｇＥ結合はドットブロットアッセイによって試験された。草本花粉アレルギー患者からの血清はドット化タンパク質を用いてインキュベーションされ、結合したＩｇＥは１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。図４Ｃに示されるように、ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）に対してＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２３４】
（実施例１４：融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）のＩｇＥ反応性の検出）
完全なアレルゲンと比較したＩｇＥ結合はドットブロットアッセイによって試験された。草本花粉アレルギー患者からの血清はドット化タンパク質を用いてインキュベーションされ、結合したＩｇＥは１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。図４Ｄに示されるように、ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）に対してＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２３５】
（実施例１５：融合タンパク質ＨＢＶ＿ｅｔＶ１＿４ｘＰＡおよびＨＢＶ＿Ｂｅｔｖ１＿２ｘＰＡ２ｘＰＢ（ＢＭ３１）のＩｇＥ反応性の検出）
完全なアレルゲンと比較したＩｇＥ結合はドットブロットアッセイによって試験された。草本花粉アレルギー患者からの血清はドット化タンパク質を用いてインキュベーションされ、結合したＩｇＥは１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。図５に示されるように、両方の融合タンパク質に対してＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２３６】
（実施例１６：ウサギ抗ｒ８９Ｐ５がｒＰｈｌ  ｐ  １に対する患者のＩｇＥ結合を阻害する）
アレルギー性患者のＩｇＥ抗体のｒＰｈｌ  ｐ  １に対する結合を阻害するペプチド誘導ウサギＩｇの能力を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  １を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。プレートは、１：１００に希釈したウサギ抗ペプチド（ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５、ＫＬＨＰ５）、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  １と共に、かつ対照を目的として対応する免疫前の血清と共に、前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、Ｐｈｌ  ｐ  １アレルギー性患者からのヒト血清（１：３に希釈）と共にインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥは、マウス抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）を用いて、かつそれからＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清をともなう前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（１００−ＯＤｉ／ＯＤｐ×１００）算出された。
【０２３７】
ＯＤｉおよびＯＤｐは、ウサギ免疫血清およびウサギ免疫前の血清のそれぞれを用いた前インキュベーション後における吸光度を表している。表１は、１３人のアレルギー性患者のＩｇＥの完全なＰｈｌ  ｐ  １に対する結合を阻害する、抗Ｐｈｌ  ｐ  １ペプチド抗体の能力を示している。抗融合タンパク質血清は、ｒＰｈｌ  ｐ  １およびＫＬＨＰ５に対する血清と同程度にＩｇＥ結合を遮断した。表２は、１３人の患者の阻害（％でもって）を示す。
【０２３８】
【表３３】
2014518635.tif 000035
【０２３９】
（実施例１７：ウサギ抗ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３がｒＰｈｌ  ｐ  ２に対する患者のＩｇＥ結合を阻害する）
アレルギー性患者のＩｇＥ抗体のｒＰｈｌ  ｐ  ２に対する結合を阻害するペプチド誘導ウサギＩｇの能力を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  ２を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。プレートは、１：１００に希釈したウサギ抗ペプチド（ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３、ＫＬＨＰ３）、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ２と共に、かつ対照を目的として対応する免疫前の血清と共に、前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、Ｐｈｌ  ｐ  ２アレルギー性患者からのヒト血清（１：３に希釈）と共にインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥは、マウス抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）を用いて、かつそれからＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清をともなう前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（１００−ＯＤｉ／ＯＤｐ×１００）算出された。
【０２４０】
ＯＤｉおよびＯＤｐは、ウサギ免疫血清およびウサギ免疫前の血清のそれぞれを用いた前インキュベーション後における吸光度を表している。表２は、１９人のアレルギー性患者のＩｇＥの完全なＰｈｌ  ｐ  ２に対する結合を阻害する、抗Ｐｈｌ  ｐ  ２ペプチド抗体の能力を示している。抗融合タンパク質血清は、ｒＰｈｌ  ｐ  ２およびＫＬＨＰ３に対する血清と同程度にＩｇＥ結合を遮断した。表２は、１９人の患者の阻害（％でもって）を示す。
【０２４１】
【表３４】
2014518635.tif 000036
【０２４２】
（実施例１８：ウサギ抗ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２がｒＰｈｌ  ｐ  ５に対する患者のＩｇＥ結合を阻害する）
アレルギー性患者のＩｇＥ抗体のｒＰｈｌ  ｐ  ５に対する結合を阻害するペプチド誘導ウサギＩｇの能力を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  ５を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。プレートは、１：１００に希釈したウサギ抗ペプチド（ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿Ｖ２）、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ５と共に、かつ対照を目的として対応する免疫前の血清と共に、前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、Ｐｈｌ  ｐ  ５アレルギー性患者からのヒト血清（１：３に希釈）と共にインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥは、マウス抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）を用いて、かつそれからＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清をともなう前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（１００−ＯＤｉ／ＯＤｐ×１００）算出された。
【０２４３】
ＯＤｉおよびＯＤｐは、ウサギ免疫血清およびウサギ免疫前の血清のそれぞれを用いた前インキュベーション後における吸光度を表している。表３は、１６人のアレルギー性患者のＩｇＥの完全なＰｈｌ  ｐ  ５に対する結合を阻害する、抗Ｐｈｌ  ｐ  ５ペプチド抗体の能力を示している。抗融合タンパク質血清は、ｒＰｈｌ  ｐ  ５に対する血清と同程度に、またＫＬＨペプチド混合物よりも良好にＩｇＥ結合を遮断した。表３は、１６人の患者の阻害（％でもって）を示す。
【０２４４】
【表３５】
2014518635.tif 000037
【０２４５】
（実施例１９：ウサギ抗ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１がｒＰｈｌ  ｐ  ６に対する患者のＩｇＥ結合を阻害する）
アレルギー性患者のＩｇＥ抗体のｒＰｈｌ  ｐ  ６に対する結合を阻害するペプチド誘導ウサギＩｇの能力を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  ６を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。プレートは、希釈したウサギ抗ペプチド（ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１、ＫＬＨＰ１）、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ  ６と共に、かつ対照を目的として対応する免疫前の血清と共に、前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、Ｐｈｌ  ｐ  ６アレルギー性患者からのヒト血清（１：３に希釈）と共にインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥは、マウス抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）を用いて、かつそれからＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清をともなう前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（１００−ＯＤｉ／ＯＤｐ×１００）算出された。
【０２４６】
ＯＤｉおよびＯＤｐは、ウサギ免疫血清およびウサギ免疫前の血清のそれぞれを用いた前インキュベーション後における吸光度を表している。表４は、２１人のアレルギー性患者のＩｇＥの完全なＰｈｌ  ｐ  ６に対する結合を阻害する、抗Ｐｈｌ  ｐ  ６ペプチド抗体の能力を示している。抗融合タンパク質血清は、ｒＰｈｌ  ｐ  ６およびＫＬＨＰ１に対する血清と同程度にＩｇＥ結合を遮断した。表４は、２１人の患者の阻害（％でもって）を示す。
【０２４７】
【表３６】
2014518635.tif 000038
【０２４８】
（実施例２０：ドットブロットおよびＥＬＩＳＡによって決定されたＰｒｅＳ融合タンパク質のＩｇＥ反応性）
精製ｒＢｅｔ  Ｖ  １、組み換え融合タンパク質４ｘＰＡ−ＰｒｅＳおよび２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳは、ＲＡＳＴベースの、非変性ドットブロットアッセイによって、ＩｇＥ反応性について試験された。２μｇの精製タンパク質、および対照の目的としてＨＳＡは、ニトロセルロース膜条片（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）の上にドット化された。
【０２４９】
ニトロセルロース条片は、緩衝液Ａ（Ｖｒｔａｌａ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９７）においてブロッキングされ、カンバ花粉アレルギー患者からの血清（ｎ＝５０）、１：１０に希釈した非アレルギー性の人からの血清（ｎ＝３）、緩衝対照および陽性対照（１：１０００に希釈したウサギ抗ｒＢｅｔ  ｖ  １の抗血清）を用いてインキュベーションされた。結合したＩｇＥ抗体は、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体（ＢＳＭ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、ウィーン、オーストリア）を用いて検出され、結合したウサギ抗体は、１２５Ｉ標識ヤギ抗ウサギ抗血清（パーキンエルマー）を用いて検出され、オートラジオグラフィーによって可視化された（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９２年）。さらに、ＥＬＩＳＡプレートは、ｒＢｅｔ  ｖ  １および精製ＰｒｅＳ融合タンパク質（５μｇ／ｍＬ）を用いて被われた。上述の洗浄およびブロッキングの後、プレートは、カンバ花粉アレルギー患者の血清（ｎ＝２１）および１：５に希釈した３つの非アレルギー性の対照血清を用いてインキュベーションされた。結合したＩｇＥは、１：１０００に希釈した精製マウス抗ヒトＩｇＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって一晩かけて検出され、１：２０００に希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケア）を用いて可視化された。洗浄の後、呈色反応は、上述のように決定された。
【０２５０】
（実施例２１：アレルギー患者の好塩基球におけるＣＤ２０３ｃのアレルゲン誘導上方制御）
ヘパリン添加血液試料は、インフォームドコンセントが得られた後に、カンバアレルギー患者から得られ、０．００１−１  ｍｇ／ｍＬの範囲にある、漸増する濃度のｒＢｅｔ  ｖ  １、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ、陽性対照としてモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、マルセイユ、フランス）、またはＰＢＳ（陰性対照）を用いて、１５分に渡って（３７℃において）インキュベーションされた。ＣＤ  ２０３ｃ発現は、前述のように決定された。
【０２５１】
（実施例２２：カンバ花粉アレルギー患者からのＰＢＭＣにおけるリンパ球増殖反応およびサイトカイン誘導）
ＰＢＭＣ（ｎ＝６）は、カンバ花粉アレルギー患者から、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）密度勾配遠心分離によって単離された。続いて、ＰＢＭＣは、ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク）において、２×１０５細胞／ウェルの最終濃度まで再懸濁され、抗原の用量（５μｇ／ウェル等モル量のｒＢｅｔ  Ｖ  １、ＰＡ、ＰＢ、ＰｒｅＳ、２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）を減少させることによって、培地単独（陰性対照）を用いて、またはＩＬ−２（４  ＩＥ／ウェル）（陽性対照）を用いて刺激された。６日後、増殖応答は、[３Ｈ] チミジン取り込みによって測定され、刺激指標（ＳＩ）として表された。
【０２５２】
さらに、１７の異なるサイトカイン（すなわち、ＩＬ−Ιβ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ  −１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ΜΙΡ−Ιβ、ＭＣＰ−１）のサイトカインの産生は、Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １７−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた刺激の６日後に、メーカーの指示に従って測定された。簡単に言うと、未希釈上清は、捕捉抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）として異なるビーズに結合した抗サイトカイン／ケモカインマウスモノクローナル抗体と混合された。８点標準曲線を用いて、下端の感度を得た。洗浄後、ビオチン化抗サイトカイン検出抗体が添加された。反応は、ストレプトアビジン標識フィコエリスリン（ＰＥ）およびアッセイ緩衝液を添加することによって、可視化された。試料は、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、二ヴェル、ベルギー）という器具において分析され、データは、Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ６．０というソフトウェアを用いて取得された。全ての試料は、１回で分析された。図１０に結果を示す。
【０２５３】
（実施例２３：ＥＬＩＳＡによるｒＢｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンおよびＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチドの認識のためにｒＢｅｔ  ｖ  １およびＰｒｅＳ融合タンパク質を用いて免疫付与されたウサギ血清の分析）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）は、１μｇ／ｍｌのｒＢｅｔ  ｖ  １またはハンノキ（ｒＡｌｎ  ｇ  １）、ハシバミ（ｒＣｏｒ  ａ  １）、リンゴ（ｒＭａｌ  ｄ１）における相同アレルゲンのいずれかを用いて被われ、さらにいくつかの１μｇ／ｍｌの濃度のＢｅｔ  Ｖ  １由来のペプチドを用いて、４℃において一晩かけてコートされた。上述の洗浄およびブロッキングの後、ｒＢｅｔ  ｖ  １およびミョウバンまたはＣＦＡに接合したＰｒｅＳ融合タンパク質を用いて免疫付与されたウサギからの血清は、１：５００から１：１  ２８０  ０００までの１：２の希釈系列、１：１０００の濃度においてインキュベーションされた。結合したウサギＩｇＧは、ＨＲＰ標識ロバ抗ウサギ抗体（ＧＥヘルスケア）を用いて検出され、呈色反応は、上述のように決定された。
【０２５４】
（実施例２４：ｒＢｅｔ  ｖ  １に対するアレルギー患者のＩｇＥ結合の阻害）
阻害ＥＬＩＳＡを用いて、ｒＢｅｔ  ｖ  １に対するカンバ花粉アレルギー患者のＩｇＥ結合の阻害を研究した。ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌの濃度のｒＢｅｔ  ｖ  １を用いて、４℃において一晩かけてコートされた。洗浄およびブロッキングの後、プレートは、ＰｒｅＳ融合タンパク質２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳおよび抗Ｂｅｔ  ｖ  １ウサギ血清に対して対象化されたウサギ血清を用いて、ウサギ免疫前血清と比較して、１：８０および１：１６０の希釈物において、４℃において一晩かけて前インキュベーションされた。追加の洗浄工程の後、１：５に希釈したカンバ花粉アレルギー患者の血清は、４℃において一晩かけて添加され、結合したヒトＩｇＥは、１：１０００に希釈したアルカリホスファターゼ接合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出された。２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳウサギ抗血清およびＢｅｔ  Ｖ  １ウサギ抗血清を用いた前インキュベーションの後のｒＢｅｔ  ｖ  １に対するＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（阻害％＝ １００−（ＯＤｉ×１００／ＯＤｐ）算出された。ＯＤｐおよびＯＤｉは、特異的なウサギＩｇＧ（ＯＤｉ）またはウサギ免疫前の血清（ＯＤｐ）を用いた前インキュベーション後における吸光度を表している（図１２）。
【０２５５】
（実施例２５：草本花粉アレルギーのヒト個体における草本花粉アレルギーの治療のための４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物の使用）
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７の低アレルギー誘発性融合タンパク質と水酸化アルミニウムとの注入可能な調合物は、実施例８に記載したように調製された。臨床研究の過程において、ワクチンは、６９の草本花粉アレルギーのヒト対象に対して、皮下に３回投与された（図１７）。
【０２５６】
ワクチン調合物を用いたワクチン接種は、強いＩｇＧ応答につながった。
３つの異なる用量レベルのワクチンおよびプラシーボの皮下注入後のアレルゲン特異的ＩｇＧの誘導は、ワクチン調合物の皮下注入を用いた処置の前と後の研究参加者から回収された血清において、ＥＬＩＳＡによって決定された（図１４）。
【０２５７】
この目的のために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ロスキレ、デンマーク）は、５μｇ／ｍｌのアレルゲンＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、およびＰｈｌ  ｐ  ６または対照としてのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて、４℃において一晩かけてコートされた。０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＰＴ）を含むＰＢＳを用いた洗浄およびＰＴにおける２％ｗ／ｖのＢＳＡを用いたブロッキングの後、プレートは、１：１０から１：１００に希釈した患者からの血清、非アトピー性の個体からの血清または緩衝液単独を用いて、３つ１組にして、４℃において一晩かけてインキュベーションされた。結合したＩｇＥ抗体は、ＰＴ、０．５％ｗ／ｖのＢＳＡにおいて希釈したＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出された。発色は、染色溶液ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ、米国）（１００μｌ／ウェル）の添加によって行われた。光学密度は、ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒを用いて、４０５ｎｍにおいて測定された。図１４にＩｇＧの評価の結果を示す。
【０２５８】
ワクチンは、生体外Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されたように（図１５）、ワクチン調合物に存在する低アレルギー誘発性融合タンパク質に対する関連するＴ細胞反応性を刺激しなかった。これは、低アレルギー誘発性融合タンパク質のＴ細胞反応性の欠如を証明している。
【０２５９】
Ｔ細胞増殖アッセイは、以下の手順を用いて行われた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、草本花粉アレルギー性患者のヘパリン添加血液試料から、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、イギリス）密度勾配遠心分離によって単離された。その後ＰＢＭＣ（２×１０５）は、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ；Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ロスキレ、デンマーク）の中の、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＳＩＧＭＡ、セントルイス、ミズーリ）、５０μＭのベータメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）および１ｍｌごとに０．１ｍｇのゲンタマイシン（ＳＩＧＭＡ）を補った２００μｌの無血清のＵｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ロックランド、ＭＥ）において、加湿した雰囲気において３７℃および５％のＣＯ２において、３つ１組にして培養された。細胞は、０．２５μｇのワクチンの各ポリペプチド成分を含む混合物および比較を目的として、等モル濃度の草本花粉抽出物、または対照の目的として４Ｕのインターロイキン−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）または培地単独を用いて刺激された。培養から６日後に、ウェルごとに０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンが加えられ、その１６時間後において、取り込まれた放射性がマイクロベータシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  ＡＤＬ、フライブルク、ドイツ）を用いて液体シンチレーションカウントによって測定された。ｃｐｍの平均値は、３つ１組から算出され、かつ刺激指標（ＳＩ）は、抗原刺激またはインターロイキン−２刺激および未刺激対照によって得られたｃｐｍの商として算出された。図１５に増殖アッセイの結果を示す。
【０２６０】
処置誘導ＩｇＧの存在下における草本花粉アレルゲンを用いた刺激の際の低下した増殖応答によって証明されているように、ワクチンを用いた処置は、アレルゲン特異的Ｔ細胞応答を調節する能力を有するＩｇＧ抗体を誘導した（図１６）。この目的のために、Ｔ細胞増殖アッセイは、処置の前と後に同じ参加者から回収された血清と共に４つ草本花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、およびＰｈｌ  ｐ  ６（アレルゲンごとに０．２５μｇ）の混合物を用いて刺激が施されたことを除いては、上述のように、処置の後に研究参加者から単離されたＰＢＭＣを用いて行われた。図１６に実験の設定および結果を示す。
【０２６１】
花粉チャンバにおける誘発によって誘導された鼻アレルギー症状の低減および滴定皮膚プリックテストによって決定された皮膚反応性の低下は、１０μｇの用量の各ポリペプチドを用いた処置の後に上記パラメータの減少がなかった一方において、４つのポリペプチドのそれぞれを２０μｇまたは４０μｇのいずれかを含む３回の注入を受けた患者において観察された（図１９参照）。
【０２６２】
（実施例２６：ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ  Ｐ  ２由来のペプチドの選択およびそれらのペプチドを用いたＰｒｅＳ融合タンパク質の設計）
５つの非ＩｇＥ結合Ｄｅｒ  ｐ  ２由来ペプチド：Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ１（配列番号９６）、  Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ２（配列番号９７）、Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ３（配列番号９８）、Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ４（配列番号９９）、およびＤｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ５（配列番号１００）は、以下についてスクリーニングされた。
・ＩｇＥ結合特性（ドットブロットアッセイ）
・Ｄｅｒ  ｐ  ２特異的Ｔ細胞反応を誘導する潜在能力、および（Ｔ細胞増殖アッセイ）
・Ｄｅｒ  ｐ  ２に対するヒト患者のＩｇＥを阻害する能力を有するＤｅｒ  ｐ  ２特異的抗体を誘導する能力（ウサギ抗ペプチドＩｇＧを用いた阻害ＥＬＩＳＡ）
その目的のために、各ペプチドは、ＫＬＨに化学的に結合された。ＫＬＨおよびペプチドの化学的結合は、異なるペプチドの最初の比較を可能にする、使い易く、確立された、簡単なモデルシステムであるため、このスクリーニング実験に使用された。
【０２６３】
完全なアレルゲンと比較したＤｅｒ  ｐ  ２由来ペプチドのＩｇＥ結合は、ＩｇＥドットブロットアッセイによって試験された。２６人のハウスダストダニアレルギー患者からの血清は、ドット化されたＫＬＨ接合ペプチドを用いてインキュベーションされ、結合したＩｇＥは、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥを用いて検出された。以下に示すように、５つのペプチドのいずれについてもＩｇＥ結合は検出されなかった。
【０２６４】
ハウスダストダニアレルギー患者からのＰＢＭＣにおける低リンパ球増殖反応を誘導するペプチドを同定するために、１０人の患者から単離されたＰＢＭＣは、５つのＤｅｒ  ｐ  ２由来ペプチド単独、ＫＬＨ接合ペプチド、および比較のために野生型Ｄｅｒ  ｐ  ２を用いて刺激された。
【０２６５】
１０人の患者からのＰＢＭＣは、野生型Ｄｅｒ  ｐ  ２によって刺激され、Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ１、  Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ２、およびＤｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ４を用いた刺激の際、全くまたは極小の増殖しかなかった。しかしながら、Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ３および  Ｄｅｒ  ｐ２  Ｐｅｐ５を用いた刺激は、それぞれ１０例のうち４例、１０例のうち３例において有意な増殖をもたらした。これは、ペプチド３および５は、重要なＴ細胞エピトープを含んでいることを示している。
【０２６６】
阻害ＩｇＧを誘導するペプチドの能力を識別するために、ウサギは、５つのＫＬＨペプチド接合物を用いて免疫付与された。続いて、ｒＤｅｒ  ｐ  ２に対するアレルギー患者のＩｇＥ抗体の結合を阻害するペプチド誘導ウサギＩｇＧの能力は、ＥＬＩＳＡによって調べられた。ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのｒＤｅｒ  ｐ  ２を用いて被われ、洗浄され、かつブロッキングされた。プレートは、１：１００に希釈したウサギ抗ペプチド（ＫＬＨ−Ｐ１、ＫＬＨ−Ｐ２、ＫＬＨ−Ｐ３、ＫＬＨ−Ｐ４、およびＫＬＨ−Ｐ５）、ウサギ抗ｒＤｅｒ  ｐ  ２と共に、かつ対照を目的として対応する免疫前の血清と共に、前インキュベーションされた。洗浄の後に、プレートは、ハウスダストダニアレルギー性の、Ｄｅｒ  ｐ  ２感作された患者からのヒト血清（１：３に希釈）と共にインキュベーションされ、かつ結合したＩｇＥは、マウス抗ヒトＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：１０００）を用いて、かつそれからＰＯＸ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出された。抗ペプチド抗血清をともなう前インキュベーションによって達成されたＩｇＥ結合の阻害％は、以下のように（１００−ＯＤｉ／ＯＤｐ×１００）算出された。
【０２６７】
【表３７】
2014518635.tif 000039
【０２６８】
【表３８】
2014518635.tif 000040
【０２６９】
（実施例２７：Ｄｅｒ  ｐ  １由来低アレルギー誘発性ペプチドの選択）
ＩｇＥブロッキングＩｇＧ抗体を誘導するＤｅｒ  ｐ  １由来ペプチドの能力は、Ｄｅｒ  ｐ  ２の代わりに野生型Ｄｅｒ  ｐ  １を用いてＥＬＩＳＡプレートが被われたことを除いては、実施例２６に記載したように、ウサギ抗ペプチドＫＬＨ抗血清および６人のハウスダストダニアレルギー患者からの血清を用いて決定された。
【０２７０】
【表３９】
2014518635.tif 000041
【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１Ａ】ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５の模式的な概要を示す。
【図１Ｂ】ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３の模式的な概要を示す。
【図１Ｃ】ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２の模式的な概要を示す。
【図１Ｄ】ベクターＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１の模式的な概要を示す。
【図２Ａ】融合タンパク質ＨＢＶ＿ＰｈｌＰ１＿４ｘＰ５の一次配列（ＢＭ３２１、配列番号１４）を示す。
【図２Ｂ】融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３の一次配列（ＢＭ３２２、配列番号１５）を示す。
【図２Ｃ】融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２の一次配列（ＢＭ３２５、配列番号１６）を示す。
【図２Ｄ】融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１の一次配列（Ｂ３２６、配列番号１７）を示す。
【図２Ｅ】融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｂｅｔｖ１＿４ＰＡの一次配列（ＢＭ３１ａ、配列番号１８）を示す。
【図２Ｆ】融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｂｅｔｖ１＿２ＰＡ２ＰＢの一次配列（ＢＭ３１、配列番号１９）を示す。
【図２Ｇ】融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ１の一次配列（配列番号２０）を示す。
【図３Ａ】精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ  ３２１、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２１、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２１、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２１、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２１、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２１、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ  ３２１、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２１）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【図３Ｂ】精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ  ３２２、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２２、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２２、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２２、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２２、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２２、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ３２２、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２２）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【図３Ｃ】精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２５、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２５、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２５、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２５、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２５、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ３２５、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２５）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【図３Ｄ】精製した融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ  ３２６、レーン１および１０：５ｕｇの分子マーカー、レーン２、３、１１および１２：５ｕｇのＢＭ３２６、レーン４および１３：２ｕｇのＢＭ３２６、レーン５および１４：１ｕｇのＢＭ３２６、レーン６および１５：０．５ｕｇのＢＭ３２６、レーン７および１６：０．２５ｕｇのＢＭ３２６、レーン８および１７：０．１ｕｇのＢＭ  ３２６、レーン９および１８：０．０５ｕｇのＢＭ３２６）を含有するクマシー・ブルーで着色した１２％ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルを示す。レーン１〜９は還元性条件下であり、レーン１０〜１８は非還元性条件下である。
【図４】草本花粉アレルゲンに由来する融合ペプチドのＩｇＥ反応性の欠如を示す。完全なアレルゲンと比較して、融合タンパク質のＩｇＥ結合をＩｇＥドットブロット分析によりテストした。示された数の草本花粉アレルギー患者の血清をドットされたタンパク質とインキュベーションし、結合したＩｇＥを１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥで検出した。４つのペプチド−担体融合タンパク質のいずれにもＩｇＥ結合は検出されなかった。ａ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ＸＰ５（ＢＭ３２１）を用いたドットブロット分析の結果を示し、ｂ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（ＢＭ３２２）を用いたドットブロット分析の結果を示し、ｃ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（ＢＭ３２５）を用いたドットブロット分析の結果を示し、ｄ）はＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）を用いたドットブロット分析の結果を示す。
【図５】アレルギー患者の好塩基球上のＣＤ２０３ｃ発現に決定されるような草本花粉アレルゲン由来融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（ＢＭ３２１）の低アレルギー活性を示す。草本花粉アレルギー患者のＰＢＭＣをＰｈｌ  ｐ  １（薄灰色のバー）またはＢＭ３２１（濃灰色のバー）の連続希釈によりインキュベーションした。ＣＤ２０３ｃの誘導を平均蛍光強度として測定した。算出した刺激指標をｙ軸に示す。
【図６】アレルギー患者の好塩基球上のＣＤ２０３ｃ発現に決定されるような草本花粉アレルゲン由来融合タンパク質ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（ＢＭ３２６）の低アレルギー活性を示す。草本花粉アレルギー患者のＰＢＭＣをＰｈｌ  ｐ  ６（薄灰色のバー）またはＢＭ３２６（濃灰色のバー）の連続希釈によりインキュベーションした。ＣＤ２０３ｃの誘導を平均蛍光強度として測定した。算出した刺激指標をｙ軸に示す。
【図７】マウスにおけるオオアワガエリ花粉アレルゲン特異的なＩｇＧ１反応を示す。実験０週目および３週目の時点で、各４匹のマウスの群に、２０ｕｇの融合タンパク質（単一の融合タンパク質および４つの融合タンパク質の組み合わせ）および各１０μｇ（Ｐｈｌ  ｐ１および５）または各５μｇ（Ｐｈｌ  ｐ２および６）の野生型アレルゲンで免疫を付与し、その後実験１７週目の時点でブースト免疫付与を行った。抗原を動物の背中部分に皮下投与した。実験０、３、６、９、１２、１７、２０および２２週目の時点で、マウスの尾静脈から血液を採取した。免疫付与をした実験週では、当該免疫付与の１日前に血液を採取した。マウスの免疫血清をＥＬＩＳＡによりアレルゲン特異性ＩｇＧ１の有無に関して調べた。最初の免疫付与の前の免疫前血清は、全ての動物において陰性だった。個々の融合タンパク質を融合タンパク質の混合物の適用と比較した。ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ１＿４ｘＰ５（単一成分としてのＢＭ３２１）、ＢＭ３２２、ＢＭ３２５およびＢＭ３２６と混合したＢＭ３２１、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  １で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ  １抗原に対する免疫反応ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ２＿４ｘＰ３（単一成分としてのＢＭ３２１）、ＢＭ３２１、ＢＭ３２５およびＢＭ３２６と混合したＢＭ３２２、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  ２で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ  ２抗原に対する免疫反応  ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ５＿Ｖ２（単一成分としてのＢＭ３２５）、ＢＭ３２１、ＢＭ３２２およびＢＭ３２６と混合したＢＭ３２５、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  ５で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ  ５抗原に対する免疫反応ＨＢＶ＿Ｐｈｌｐ６＿４ｘＰ１（単一成分としてのＢＭ３２６）、ＢＭ３２１、ＢＭ３２２およびＢＭ３２５と混合したＢＭ３２６、ならびにｒＰｈｌ  ｐ  ６で免疫付与したマウスに関するｒＰｈｌ  ｐ６抗原に対する免疫反応
【図８】組み換え融合タンパク質の分子的および免疫学的特徴を示す。Ａ．Ｂｅｔ  ｖ１由来ペプチド（レーン１：２ｘＰＡ−ＰｒｅＳ、レーン２：２ｘＰＢ−ＰｒｅＳ、レーン３：４ｘＰＡ−ＰｒｅＳ、レーン４：２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳ）および担体ＰｒｅＳ（レーン５）を有する４つのＰｒｅＳ融合タンパク質を示すクーマシー着色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ．ニトロセルロースドット組み換え融合タンパク質およびＰｒｅＳを、ウサギの抗ＰｒｅＳ血清（レーン１）、ウサギの免疫前血清（レーン３）ウサギの抗体のバッファコントロール（レーン３）、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰ２’（ｍＡｂ２）（レーン４）およびＰ４’（ｍＡｂ１２）（レーン５）に対するモノクローナル抗体、モノクローナルマウス抗体のバッファコントロール（レーン６）を用いて調べる。
【図９Ａ】ｒＢｅｔ  ｖ  １およびＰｒｅＳの組み換え融合タンパク質のＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチドとのＩｇＥ反応性を示す。カンバ花粉アレルギー患者の血清、非アレルギーの対照の血清、そしてバッファのみを、ドットブロットしたｒＢｅｔ  ｖ  １、４つの組み換え融合タンパク質（２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡ２ＰＢ−ＰｒｅＳ）およびＰｒｅＳのみに対するそれらの反応性をテストした。結合したヒトＩｇＥを１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した。結合したＩｇＥに対応するカウント毎分（ｃｐｍ）をγカウンターで測定し、Ｙ軸に示す。ボックスプロットは、５０人のカンバ花粉アレルギー患者の結果を示す。
【図９Ｂ】ＣＤ  ２０３ｃ上方調節により測定されるｒＢｅｔ  ｖ１および４つのＰｒｅＳ融合タンパク質による好塩基球の活性化を示す。カンバ花粉アレルギー患者の血液試料を、濃度を高めていった（０．００１−１μｇ／ｍｌ）抗原、バッファコントロール（Ｃｏ）の抗ＩｇＥに暴露した。１人の代表の患者の結果を示す。ＣＤ  ２０３ｃ発現をＦＡＣＳ分析で決定し、刺激指標（ＳＩ（ｙ軸））として示す。３通りの測定の平均を示し、標準偏差を示している。
【図１０】カンバ花粉アレルギー患者のＰＢＭＣのリンパ球増殖反応およびサイトカイン生成を示す。カンバ花粉アレルギー患者のＰＢＭＣは、等モル量のｒＢｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＰＡ・ＰＢ、ＰｒｅＳのみ、およびＰｒｅＳ融合タンパク質（すなわち、２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）で刺激した。刺激指標（ＳＩ）（ｙ軸）を示す。（Ａ）６人のカンバ花粉アレルギー患者の最も高い濃度（５μｇ／ウェルのＢｅｔ  ｖ  １ならびに等モル量のペプチド、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳ融合タンパク質）のＳ１をボックスブロットとして示す。値の５０％はボックス内にあり、非外れ値はバーの間にある。ボックス内の線は中央値を示す。（Ｂ）４つの濃度（１＝５μｇ／ウェル、２＝２．５μｇ／ウェル、３＝１．２５μｇ／ｍｌ、４＝０．６３μｇ／ウェルのｒＢｅｔ  ｖ１ならびに等モル量のペプチド、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳ融合タンパク質）のＳ１を１人の代表の患者に関して示す。（Ｃ）２．５μｇ／ｍＬのｒＢｅｔ  ｖ  １ならびに等モル量のペプチドＰＡ・ＰＢ、ＰｒｅＳおよび４つのＰｒｅＳ融合タンパク質で刺激した６人のカンバ花粉アレルギー患者のＰＢＭＣの上清におけるサイトカイン生成を測定した。抗原での刺激後の観察濃度（ｐｇ／ｍＬ）（ｙ軸）をボックスブロットに示す。値の５０％はボックス内にあり、非外れ値はバーの間にある。ボックス内の線は中央値を示す。
【図１１】ウサギにおけるＰｒｅＳ融合タンパク質による皮下免疫付与後のｒＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンに対して特異的なＩｇＧ抗体の誘導を示す。（Ａ）ウサギに、水酸化ミョウバン吸着（ミョウバン）（上）または完全フロインド補佐剤（ＣＦＡ）吸着（下）融合タンパク質（２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）およびｒＢｅｔ  ｖ  １で免疫を付与した。ｒＢｅｔ  ｖ  １に特異的なウサギＩｇＧを測定し、異なる希釈のウサギ抗血清（ｘ軸）に関して２通りの測定の平均光学密度（ＯＤ）を示す（ｙ軸）。（Ｂ１）ハンノキ（Ａｌｎ  ｇ  １）、ハシバミ（Ｃｏｒ  ａ  １）およびリンゴ（Ｍａｌ  ｄ  １）におけるＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンの多配列アラインメント。同じアミノ酸をドットとして示し、ギャップをダッシュ記号で示す。Ｂｅｔ  ｖ  １相同アレルゲンのＢｅｔ  ｖ  １に対する同一性のパーセンテージを右側に示す。Ｂｅｔ  ｖ  １由来ペプチドＡ（ＰＡ、点線）およびペプチドＢ（ＰＢ、実線）を枠で囲っている。（Ｂ２）ｒＢｅｔ  ｖ  １、ｒＡｌｎ  ｇ  １、ｒＣｏｒ  ａ  １およびｒＭａｌ  ｄ  １（ｘ軸）に対する抗ウサギ血清（ｒａｂ  α−２ＰＡ−ＰｒｅＳ、ｒａｂ  α−２ＰＢ−ＰｒｅＳ、ｒａｂ  α−４ＰＡ−ＰｒｅＳ、ｒａｂ  α−２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）のＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。２通りの測定の平均を示す。ウサギ血清（後）におけるアレルゲン特異ＩｇＧに対応する光学密度（ＯＤ）を対応する免疫前血清（前）と比較して示す（ｙ軸）。（Ｃ）６つのＢｅｔ  ｖ  １由来ペプチド（Ｐ１’〜Ｐ６’）（ｘ軸）に対する、ｒＢｅｔ  ｖ  １および組み換え融合タンパク質（２ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＢ−ＰｒｅＳ、４ＰＡ−ＰｒｅＳ、２ＰＡＰＢ−ＰｒｅＳ）で免疫付与したウサギのＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。２通りの測定の光学密度（ＯＤ）値の平均（ｙ軸）を示す。
【図１２】完全ｒＢｅｔ  ｖ  １に対するウサギ血清と比較してアレルギー患者のＩｇＥに対する抗２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳウサギ血清の阻害を示す。抗２ｘＰＡ２ｘＰＢ−ＰｒｅＳおよび抗ｒＢｅｔ  ｖ  １ウサギ血清で得たｒＢｅｔ  ｖ  １へのＩｇＥ結合の阻害パーセンテージ（ｙ軸）を阻害ＥＬＩＳＡにより決定し、ボックスブロットとして示す。値の５０％はボックス内にあり、非外れ値はバーの間にある。ボックス内の線は中央値を示す。２１人のカンバ花粉アレルギー患者の結果を示す。
【図１３】Ｐｈｌ  ｐ  ６由来ペプチドの２つまたは４つのコピーを含有するＰｒｅＳ融合タンパク質で免疫付与した後のウサギＩｇＧの滴定を示す。免疫原性のテストのため、水酸化アルミニウムを補佐剤として用い、ウサギ（ニュージーランドホワイトウサギ）に異なる融合タンパク質で免疫付与した。特定の抗体の誘導をＥＬＩＳＡアッセイにおいてモニタリングした。結果は、２つのペプチドを含有する融合タンパク質よりも４つのペプチドを含有する融合タンパク質の方がより免疫原性があることを示している。
【図１４】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物（ＢＭ３２）で皮下免疫付加後のヒト草本花粉アレルギーにおける草本花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １  （Ａ）、Ｐｈｌ  ｐ２  （Ｂ）、Ｐｈｌ  ｐ  ５  （Ｃ）およびＰｈｌ  ｐ  ６  （Ｄ）に対する強いＩｇＧ反応の誘導を示す。ＩｇＧの決定はＥＬＩＳＡにより行った。治療前のＩｇＧレベル（前）を治療後のＩｇＧレベル（後）と比較する。
【図１５】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物からなるワクチン調合物で免疫付加後の草本花粉アレルギー個体のＴ細胞に対するＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。草本花粉と比較するとＴ細胞反応性が強く低減されるか存在しない。グラフのｙ軸は、刺激指標を反映している。
【図１６】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物（ＢＭ３２）による治療により誘導されるＩｇＧは、ヒトＰＢＭＣにおける草本花粉アレルゲンへのリンパ球増殖反応を低減することを示す。（ａ）実験の仕組み。（ｂ）治療により誘導されたＩｇＧの非存在下（前に血清をプラス）および存在下（後に血清をプラス）で行うＴ細胞増殖の結果。グラフのｙ軸は刺激指標を反映している。Ｐ１〜Ｐ５は異なる実験参加者の結果を示す。
【図１７】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物ＢＭ３２を用いる６９人の草本花粉アレルギー個体において行われた臨床試験の仕組みを示す。
【図１８Ａ】融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２−２ｘＰ２−２ｘＰ４（配列番号１４９）の一次配列を示す。
【図１８Ｂ】融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２−３ｘＰ２−３ｘＰ４（配列番号１５０）の一次配列を示す。
【図１８Ｃ】融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２３−２ｘＰ４−２ｘＰ５（配列番号１５１）の一次配列を示す。
【図１８Ｄ】融合タンパク質ＨＢＶ  Ｄｅｒ  ｐ２３−４ｘＰ６（配列番号１５２）の一次配列を示す。
【図１９Ａ】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の４つの低アレルギー誘発性融合タンパク質の混合物を含むワクチン調合物ＢＭ３２を３回皮下注射する治療により引き起こされる鼻の症状の変化を示す。黒いバー：治療前、灰色のバー：治療後。
【図１９Ｂ】ワクチン調合物ＢＭ３２で治療前の滴定皮膚プリックテストと治療後の滴定皮膚プリックテストとの間の平均膨疹面積の変化を示す。滴定皮膚プリックテストは、８連続希釈した草本花粉エキス（非希釈１：１２８）を用いて行った。
【図２０】ＩｇＥドットブロットアッセイによりテストした完全アレルゲンと比較してＤｅｒ  ｐ  ２由来ペプチドのＩｇＥ結合を示す。２６人のイエダニアレルギー患者の血清をドットしたＫＬＨ接合ペプチドでインキュベーションし、結合したＩｇＥを１２５１標識抗ヒトＩｇＥで検出した。実施例２６のように５つのペプチドのいずれに関してもＩｇＥ結合は検出されなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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