(57)【要約】  本開示は、抗炎症タンパク質、その使用、調製の方法、及びそれらの検出の方法に関する。特に、本発明は、マヌカハニーからのメチルグリオキサールによって修飾された主ローヤルゼリータンパク質及びその断片に関する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルグリオキサール（ＭＧＯ）によって化学的に修飾されている、単離したアパルブミンタンパク質又はその断片。
【請求項２】
修飾されたアパルブミン１（Ａｐａ１）タンパク質又はその断片である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
マヌカハニーから単離される請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＭＧＯによって修飾された少なくとも１７個のアミノ酸残基を有する請求項２又は３に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＭＧＯによって修飾された１７個〜３２個の間のアミノ酸残基を有する請求項２〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＭＧＯによって修飾された約３２個のアミノ酸残基を有する請求項２〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
修飾される前記アミノ酸残基が、リジン又はアルギニンのいずれかである請求項２〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
修飾される前記アミノ酸残基がリジンである請求項２〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離したタンパク質を含む組成物。
【請求項１０】
配列番号１に記載のアミノ酸配列に少なくとも７５％の配列同一性で、アミノ酸配列を含む抗炎症能力を有する、単離されたＭＧＯ修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。
【請求項１１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列に少なくとも８５％の配列同一性で、アミノ酸配列を含む抗炎症能力を有する、単離されたＭＧＯ修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。
【請求項１２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性で、アミノ酸配列を含む抗炎症能力を有する、単離されたＭＧＯ修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。
【請求項１３】
マヌカハニーから単離される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の単離したＭＧＯ修飾アパルブミンタンパク質又はその断片。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の前記タンパク質を含む組成物。
【請求項１５】
ローヤルゼリーを修飾することによって抗炎症性分子を生成する方法であって、ローヤルゼリーを少なくとも０．１％のＭＧＯと反応させる工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、ローヤルゼリーを少なくとも０．５％のＭＧＯと反応させる工程を含む方法。
【請求項１７】
ローヤルゼリーを少なくとも１．０％のＭＧＯと反応させる前記工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＧＯ修飾アパルブミン（ＭＲＪＰ１）タンパク質を前記ローヤルゼリー製品から単離する工程を更に含む請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞組織における炎症を低減する方法であって、請求項８又は１４に記載の前記組成物を前記細胞組織に接触させる工程を含む方法。
【請求項２０】
免疫系細胞による食作用の速度を低減する方法であって、請求項８又は１４に記載の前記組成物を免疫系細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項２１】
免疫系細胞への食作用に関する受容体を阻害する方法であって、請求項８又は１４に記載の前記組成物を免疫系細胞に投与する前記工程を含む方法。
【請求項２２】
呼吸バースト及び活性酸素種の放出を低減する方法であって、請求項８又は１４に記載の前記組成物を炎症細胞に投与する工程を含む方法。
【請求項２３】
ハチミツの試料の（ｉ）抗炎症能力又は（ｉｉ）ＭＧＯ修飾アパルブミン濃度を同定する方法であって、
ａ）前記ハチミツ試料の前記蛍光をアッセイする工程と、
ｂ）前記ハチミツ試料の蛍光の測定値及びハチミツの１つ以上の試料の前記抗炎症能力を、食作用を阻害するための先に測定された能力と比較することによって、前記ハチミツ試料の前記蛍光の測定値を、前記ハチミツ試料の前記抗炎症能力に相関させる工程と
を含む方法。
【請求項２４】
前記ＭＧＯ修飾アパルブミンが、修飾されたアパルブミン１タンパク質（修飾ＭＲＪＰ１）である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
所望の抗炎症能力又はＭＧＯ修飾アパルブミン含量を含有するハチミツ試料を得るために、ミツバチ管理者が巣箱からハチミツを収穫するための好期を決定することを可能にするよう使用される請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
所望の抗炎症能力又はＭＧＯ修飾アパルブミン含量を有するハチミツ試料を得るために、ハチミツ製造者がハチミツを保存するための所望の期間を決定することを可能にするよう使用される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＭＧＯ、ホルムアルデヒド、グリオキサール及び／又はグルタルアルデヒドで化学的に処置することにより、１つ以上のアパルブミンタンパク質の前記抗炎症能力を増大させる方法。
【請求項２８】
ハチミツの試料の前記抗炎症能力とＭＧＯ修飾アパルブミンタンパク質含量を増大させる方法であって、ＭＧＯ又はＭＧＯ−前駆体分子をハチミツ試料に添加する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記アパルブミンタンパク質が、修飾されたアパルブミン１タンパク質である請求項２７又は２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗炎症タンパク質、それらの使用、及びそれらの検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハチミツは、その多くの健康上の利益のために、世界中の文化により数世紀にわたって使用されてきた。ハチミツの２つの最も重要な健康上の利益は、その抗菌及び抗炎症特性である。ニュージーランド及び南オーストラリアに固有の植物である、ギョリュウバイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）からの花蜜を集めるミツバチによって生成されるマヌカハニーは、特に有効な抗菌及び抗炎症特性を呈する多様なハチミツであると確認されている。
【０００３】
昨今、化学的なメチルグリオキサール（ＭＧＯ／２−オキソプロパナール）が、マヌカハニーの抗菌活性の主要成分であることが発見された。ＭＧＯのより高い濃度を含有するマヌカハニー試料は、ＭＧＯの低濃度を有するハチミツ試料に比べて、より多量の抗菌活性を有する。ＭＧＯは、高度に化学反応性化合物であるために、抗菌特性に関与し、並びにＭＧＯは細胞構成分子と容易に反応し得ると考えられている。細菌におけるＭＧＯと細胞構成分子との間の化学反応は、細菌の生存能力に重要である分子を損傷し、これによって、ＭＧＯは抗菌剤として機能する。
【０００４】
ハチミツにおける高レベルのＭＧＯの存在は、マヌカハニーを他の様々なハチミツから識別する特徴である。大部分の種類のハチミツが若干の抗菌活性を呈するが、大部分のハチミツにおける抗菌活性は、主としてハチミツ中の過酸化水素の存在の結果である。これとは対照的に、マヌカハニーは、ハチミツ中のＭＧＯの存在のために、主として抗菌活性を呈する。
【０００５】
２００４年に、Ｋｏｈｎｏらが、ロイヤルゼリーの抗炎症効果又は作用をサイトカインレベルで実験した。この研究結果は、ロイヤルゼリーが、マクロファージによって活性化される、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカイン生成の阻害によってもたらされる抗炎症作用を有することを示唆している。この研究は、ロイヤルゼリーからの活性フラクション又は化合物は、５ｋＤａと３０ｋＤａの間の分子量を有することを更に示唆した。この研究は、ハチミツで生じるロイヤルゼリータンパク質のために大部分のハチミツが抗炎症効果を有する理由をおそらく説明している。
【０００６】
マヌカハニーの抗菌活性の作用の多くのメカニズムが理解されているが、マヌカハニーが抗炎症剤として機能することによるメカニズムは、未知のままである。現在使用可能な多くの抗炎症剤が、それらを使用するための大きな欠陥を有するために、ハチミツに基づく抗炎症剤を開発することへの要求がある。例えば、ＣＯＸ−２阻害剤は、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の形態ではあるが、患者において心臓発作及び卒中のリスクを増加させる場合があり、アスピリンは、胃腸管出血のリスクを増大させ場合がある。加えて、コルチコステロイドは、上皮細胞の成長を阻害することが報告され、ＮＳＡＩＤについては、細胞傷害性であると報告されていているために、これら部類の抗炎症剤の双方ともに創傷治療における使用に不適切である。ハチミツに由来する抗炎症剤は、現在使用可能な薬剤よりも、１つ以上の領域でより少ない毒性副作用を有し得、現在使用可能な抗炎症剤とは異なる可能な使用を提供し得る。
【０００７】
ハチミツに基づく抗炎症剤の開発への要求に加えて、ハチミツの試料の抗炎症性特性を試験するための簡単な方法を開発することへの要求もまた存在する。本開示は、これら及び他の未達成の問題の双方を解決する。
【０００８】
本発明者は、マヌカハニーで見出される高レベルのメチルグリオキサールから得られる、マヌカハニーから約５５〜７５ｋＤａの修飾アパルブミンを同定した。本発明者は、修飾アパルブミンが、非修飾アパルブミンよりも著しく大きな抗炎症特性を有することを確認した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載されるものは、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）によって化学的に修飾され、著しく増強された抗炎症効果を呈することがハチミツにおいて確認されたアパルブミンタンパク質である。一態様では、単離されたアパルブミンタンパク質又はその断片であり、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）によって化学的に修飾されたものを提供する。別の実施形態では、このタンパク質は、修飾アパルブミン１（Ａｐａ１／ＭＲＪＰ）タンパク質又はその断片である。他の実施形態では、修飾アパルブミンタンパク質又はその断片が、マヌカハニーから単離される。
【００１０】
別の実施形態では、このタンパク質又はその断片は、ＭＧＯによって修飾された少なくとも１７個のアミノ酸残基、又はＭＧＯによって修飾された１７個〜３２個の間のアミノ酸残基若しくはＭＧＯによって修飾された約３２個のアミノ酸残基を有する。別の実施形態では、この修飾されたアミノ酸残基は、１つ以上のリジン又はアルギニン残基のいずれかである。
【００１１】
別の実施形態では、単離された、ＭＧＯに修飾されたアパルブミンタンパク質又はその断片を提供する。
【００１２】
他の態様では、「抗炎症能力」を有する単離されたＭＧＯに修飾されたアパルブミンタンパク質又はその断片を提供し、これらは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性でアミノ酸配列を含む。一実施形態では、単離された、ＭＧＯに修飾されたアパルブミンタンパク質又はその断片は、マヌカハニーから単離される。
【００１３】
他の態様では、細胞組織における炎症を低減する方法を提供し、この方法は、上記記載の、単離され、ＭＧＯに修飾されたアパルブミンタンパク質を含む組成物を細胞組織に接触させる工程を含む。
【００１４】
別の態様では、（ｉ）免疫系細胞による食作用の速度を低減させる方法、又は（ｉｉ）免疫系細胞上の食作用に関する受容体を阻害する方法を提供し、これらは、上記記載の、単離され、ＭＧＯに修飾されたアパルブミンタンパク質を含む組成物を免疫系細胞に投与する工程を含む。
【００１５】
別の実施形態では、ローヤルゼリーを修飾することによって、抗炎症性分子を生成する方法が提供され、この方法は、ローヤルゼリーを少なくとも０．０１％のＭＧＯ、又は０．５％のＭＧＯ若しくは１．０％のＭＧＯと反応させる工程を含む。この方法は、ＭＧＯ修飾されたアパルブミン（ＭＲＪＰ１）タンパク質をローヤルゼリー生成物から単離する工程を更に含んでもよい。
【００１６】
別の態様では、ハチミツ試料の（ｉ）抗炎症能力又は（ｉｉ）ＭＧＯで修飾されたアパルブミン濃度を同定する方法を提供し、この方法は、
ａ）ハチミツ試料の蛍光を評価分析する工程と、
ｂ）ハチミツの試料の蛍光の測定値と、先に測定された食作用を阻害するための能力を有する１つ以上のハチミツの試料の抗炎症能力とを比較することによって、ハチミツ試料の蛍光の測定値を、ハチミツ試料の抗炎症能力に相関させる工程と、を含む。
【００１７】
一実施形態では、ＭＧＯに修飾されたアパルブミンは、修飾アパルブミン１タンパク質である。
【００１８】
一実施形態では、この方法は、所望の抗炎症能力又はＭＧＯに修飾されたアパルブミン含量を含有するハチミツ試料を獲得するために、ミツバチ管理者が巣箱からハチミツを収穫するための好期を決定することを可能にするよう用いられる。
【００１９】
他の実施形態では、この方法は、所望の抗炎症能力又はＭＧＯに修飾されたアパルブミン含量を含有するハチミツ試料を獲得するために、ハチミツ製造者が、ハチミツを貯蔵するための所望の期間を決定することを可能にするよう用いられる。
【００２０】
１つ以上のアパルブミン／（ＭＲＪＰ）タンパク質の抗炎症特性及び蛍光特性を増加させる方法は、ＭＧＯで化学的に処理することによる。
【００２１】
ハチミツの試料の抗炎症能力及びＭＧＯで修飾されたアパルブミンタンパク質含量を増加させる方法は、ＭＧＯ又はＭＧＯ前駆体分子をハチミツ試料に添加する工程を含む。
【００２２】
別の実施形態では、ＭＧＯ、ホルムアルデヒド、グリオキサール及び／又はグルタルアルデヒドデで化学的に処理することによって、１つ以上のアパルブミンタンパク質の抗炎症能力を増加させる方法が提供される。
【００２３】
別の実施形態では、ＭＧＯ、グリオキサール及び／又はグルタルアルデヒドデで化学的に処理することによって、１つ以上のアパルブミンタンパク質の抗炎症能力を増加させる方法が提供される。
【００２４】
上述の簡単な概要は、本発明の特定の実施形態の特徴及び技術的利点を広く記述している。更なる技術的利点は、本発明の発明を実施するための形態及びそれに続く実施例で記載されるであろう。本発明の特性であると考えられる新規な特徴は、いずれかの添付される図面及び実施例に関連付けて考察される場合、本発明の発明を実施するための形態からより良く理解されるであろう。しかしながら、本明細書で提供される図面及び実施例は、本発明を説明することに役立つよう、又は本発明の理解を深めることで補助する意図されるものであり、本発明の範囲を限定するよう意図されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】（ａ）高い蛍光を有するマヌカハニーの１０％溶液の蛍光放射スペクトルであり、（ｂ）水中１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを４００μｇ／ｍｌのＭＧＯと共にインキュベートすることによって調製されたＭＧＯで修飾されたウシ血清アルブミンの溶液の蛍光放射スペクトルを示す。
【図２】様々なハチミツ試料に関する食作用阻害（ＰＩＡ）対蛍光のグラフを示す。
【図３】１８０ｍｌのＧ−５０セファデックスカラム上のマヌカハニーの透析保持液のクロマトグラフィーからの溶出を示す。フラクションサイズは１ｍｌであった。
【図４】図３に示すＧ−５０セファデックスクロマトグラフィーから得られたフラクション８、１４及び２３の食作用阻害活性を示す。結果は、非処理対照によるものと比較された食作用の減少％を示す。エラーバーは、少なくとも３つのアッセイからの平均の±１  ＳＤを示す。フラクション２３は、それがタンパク質をほとんど含有しない又は全く含有しないような対照として含まれた。
【図５】セファデックスＧ−５０上のクロマトグラフィーからのフラクション４〜１０の２５ｍｌのＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＦＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーからの溶出プロファイルを示す。フラクションサイズは１ｍｌであった。
【図６】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィーカラムで単離されたフラクション８のトリプシン消化物によって得られたペプチドの質量スペクトルを示す。
【図７】スーパーロース１２クロマトグラフィーカラムで単離されたフラクション１４のトリプシン消化物によって得られたペプチドの質量スペクトルを示す。
【図８】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィーカラムからのフラクションで行われた銀染色されたＳＤＳ電気泳動ゲルの画像を示す。
【図９】インキュベーション前の未処理マヌカハニー及びクローバーハチミツのＳＤＳ電気泳動からの銀染色されたゲルを示す（二通り）。
【図１０】牧草ハチミツの３ヶ月のインキュベーション後（レーン１）及びインキュベーション前（レーン２）及びマヌカハニーの３ヶ月のインキュベーション後（レーン３）及びインキュベーション前（レーン４）のＳＤＳ電気泳動からの銀染色されたゲルを示す。
【図１１】ＭＧＯの異なる濃度でのＭＲＪＰ  １へのＭＧＯ修飾によってもたらされるダルトンにおける質量変化を示す。
【図１２】ＭＧＯの異なる濃度でのＭＲＪＰ  １へのＭＧＯ修飾によって達成されるＤＦＣＤＡ生物学的アッセイ結果を示す。
【図１３】１０μＬの細胞を使用するＤＣＦＤＡアッセイの薬物動態解析のプロットを示す。
【図１４】ＭＧＯ、フルクトース、グルタルアルデヒド及びグルコースを使用するＭＲＪＰ  １の修飾によって達成されたＤＦＣＤＡ生物学的アッセイ結果を示す。
【図１５】ＭＲＪＰのＬｙｓ  Ｃ消化のＭＳを示す。
【図１６】０．１％のＭＧＯで修飾されたＭＲＪＰのＬｙｓ  Ｃ消化のＭＳを示す。
【図１７】０．５％のＭＧＯで修飾されたＭＲＪＰのＬｙｓ  Ｃ消化のＭＳを示す。
【図１８】１．０％のＭＧＯで修飾されたＭＲＪＰのＬｙｓ  Ｃ消化のＭＳを示す。
【図１９】図１５〜１９で示すＬｙｓ  Ｃ消化のＭＳプロットのオーバーレイを示す。
【図２０】ＭＲＪＰ１−ＭＧＯ修飾を有さないＭＲＪＰ抽出物のトリプシン消化に由来するものとして同定されたピークを示す。
【図２１】ＭＲＪＰ１−０．１％のＭＧＯ修飾を有するＭＲＪＰ抽出物のトリプシン消化に由来するものとして同定されたピークを示す。
【図２２】ＭＲＪＰ１−０．５％のＭＧＯ修飾を有するＭＲＪＰ抽出物のトリプシン消化に由来するものとして同定されたＭＳピークを示す。
【図２３】ＭＲＪＰ１−１％のＭＧＯ修飾を有するＭＲＪＰ抽出物のトリプシン消化に由来するものとして同定されたＭＳピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下の説明は、多数の例示的構成、パラメータなどを記載する。しかしながら、このような説明は本発明の範囲を限定するものとして意図されておらず、それよりも例示的実施形態の説明として提供されるものであることが認識されるべきである。
【００２７】
定義
アパルブミンタンパク質は、糖タンパク質である。ハチミツ及びローヤルゼリーで見出される多数のアパルブミンがある。ハチミツで見出される主要なアパルブミンは、主ローヤルゼリータンパク質１（ＭＲＪＰ  １）としても知られるアパルブミン１（Ａｐａ１）である。本明細書は、ハチミツで見出される主要なアパルブミンに焦点を当てているが、ハチミツで見出される他のアパルブミンもまた、それらが全て、Ｋｉｍｕｒａらにより、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．に２０００年に報告されているように、高マンノース型のグリコシル化を有する糖タンパク質であるために、同様な修飾潜在能力及び同様な抗炎症能力を呈し得ることを理解されたい。およそ９つの主ローヤルゼリータンパク質が存在し、この主ローヤルゼリータンパク質１〜５の配列が以下に示される。
【００２８】
ハチミツ又はアパルブミン又は主ローヤルゼリータンパク質に関して本明細書の全体を通して使用される用語「蛍光」とは、低波長の光によって励起される場合、主として４４０〜５６０ｎｍの範囲における光の最大放射に実質的に相当する波長である。
【００２９】
「ローヤルゼリー」は、ミツバチの働き蜂の下咽頭腺から分泌されるミツバチの分泌物である。水を除いて、タンパク質がローヤルゼリーの主成分である。
【００３０】
「炎症性」である組織とは、その中で組織内の損傷又は感染に応答して免疫応答が生じた組織、並びにその中で組織が、痛み、浮腫、発熱、敏感性又は発赤の１つ以上の症状を有する組織として定義される。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「抗炎症能力」とは、細胞組織における炎症又は炎症の症状を臨床的に低減する能力として定義される。抗炎症能力は、以下に詳細に記載される食作用阻害アッセイ（ＰＩＡ）又は以下に詳細に記載されるＤＣＦＤＡアッセイを使用して決定され得る。
【００３２】
一次アミノ酸配列の「修飾」は、「欠失」（すなわち、その中で１つ以上のアミノ酸残基が不在であるポリペプチド）、「付加」（すなわち、特定化されたポリペプチドと比較して、１つ以上の追加的アミノ酸残基を有するポリペプチド）、「置換」（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基の置き換えから生じるポリペプチド）、及び「断片」（すなわち、特定化されたポリペプチドの一次配列の一部に同一である一次アミノ酸配列からなるポリペプチド）を包含するよう理解される。
【００３３】
「修飾アパルブミン」とは、アミノ酸上のメチルグリオキサールの化学反応によって、又はこのタンパク質を構成するアミノ基の側鎖上のメチルグリオキサールの化学反応によって修飾された、任意のアパルブミンタンパク質又はその断片を包含するよう理解される。メチルグリオキサール修飾は、アパルブミン及び末端アミノ酸内のリジン、アルギニン、及び／又はシステインアミノ酸の遊離アミノ基で起こる可能性が高く、このようなＭＧＯ修飾は、タンパク質内のおよそ１〜４０部位で生じることができる。例えば、修飾アパルブミン１とは、ＭＧＯ修飾Ａｐａ１をもたらすために、そのアミノ酸配列上の１つ以上の部位で修飾されたＡｐａ１を意味する。
【００３４】
アミノ酸「配列類似性」又は「配列同一性」とは、アミノ酸が同一であるか、又は同様な、電荷又は疎水性などの化学的及び／又は物理的特徴を有する場合、適切な場所での２つ又はそれ以上のポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の比較を指す。この比較に基づいて、次いで「同一性パーセント」が比較されたポリペプチド配列間で決定され得る。
【００３５】
配列の簡単な説明
配列番号１−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ１８３３０から得られたＡｐａ１（主ローヤルゼリータンパク質１とも知られる）のアミノ酸配列
【００３６】
【化１】
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ＭＧＯによるグリケーションの可能な部位を識別するために、リジン（Ｋ）の２２部位及びアルギニン（Ｒ）の１７部位が強調されており、これによりＭＧＯで修飾されたアパルブミンが生じる。
【００３７】
配列番号２−ｈｔｔｐ：／／  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ７７０６１から得られる主ローヤルゼリータンパク質２のアミノ酸配列が、配列表に示される。
【００３８】
配列番号３−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１７０６０−１から得られる主ローヤルゼリータンパク質３のアミノ酸配列が、配列表に示される。
【００３９】
配列番号４−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１７０６０−１から得られる主ローヤルゼリータンパク質４のアミノ酸配列が、配列表に示される。
【００４０】
配列番号５−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／０９７４３２から得られる主ローヤルゼリータンパク質５のアミノ酸配列が、配列表に示される。
【００４１】
ＭＧＯで修飾されたアパルブミン１
アパルブミン１（Ａｐａ１又は「主ローヤルゼリータンパク質１」（ＭＲＪＰ１）ともしても知られる）は、様々なハチミツ製品で、異なる濃度で見出されるタンパク質である。Ａｐａ１は、ミツバチによって分泌される４８．９キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質であり、これはハチミツ、ローヤルゼリー、及び他のハチミツ製品において存在する。試験された様々なハチミツの全てが、Ａｐａ１を含有することが示された（Ｊ．Ｓｉｍｕｔｈら、２００４年）。Ａｐａ１は、ローヤルゼリーにおけるタンパク質の４８％を構成すると概算される（Ｂ．Ｌｅｒｒｅｒら、２００７年）。
【００４２】
メチルグリオキサール又はＭＧＯは、式Ｃ３Ｈ４Ｏ２を有する高化学反応性化合物である。ＭＧＯは、生物体内の複数の代謝経路によって形成される。「活性」マヌカハニーと呼ばれるマヌカハニーの特定の調製物は、他の様々なハチミツよりもより高い濃度のＭＧＯを含有する。活性マヌカハニーは、他の様々なハチミツにおけるＭＧＯ濃度の１０００倍を超えるまでのＭＧＯ濃度を含有することが決定されている（Ｅ．Ｍａｖｒｉｃら、２００８年）。
【００４３】
ＭＧＯは、「進行性グリケーション最終産物」（ＡＧＥｓ）の形成プロセスを含む生物体内の様々な化学反応に関与する。グリケーションは、反応の触媒としての酵素の関与がない、糖のタンパク質又は脂質との反応である。ＭＧＯは、アミノ酸アルギニン、リジン及び／又はシステイン並びに末端アミノ酸の遊離アミノ基との反応によってタンパク質をグリケートすることができ、これによって、アルギニン及び／又はリジンを含有するタンパク質を化学的に修飾することが可能である。配列番号１から見られるように、Ａｐａ１は、ＭＧＯによって化学的に修飾され得る合計で約３９個のアルギニンとリジン残基を含有する。
【００４４】
ＭＧＯ修飾Ａｐａ１は、活性マヌカハニーからの分子の単離によって誘導され得る。ＭＧＯ修飾Ａｐａ１は、生化学的技術によって、ハチミツから単離されるか及び／又はハチミツから濃縮され得る。これら技術としては、濾過、遠心分離、並びにイオン交換、親和性、疎水性相互作用、サイズ排除、及び逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。ＭＧＯ修飾Ａｐａ１はまた、ローヤルゼリーへのＭＧＯの添加によって、様々な供給源から精製され得るか又は化学的に合成され得る。
【００４５】
ＭＧＯ修飾Ａｐａ１はまた、アミノ酸配列の配列番号１をコードする遺伝子を得ること、この遺伝子を適切なベクターにクローニングすること、細胞系をこのベクターで形質転換すること、ポリペプチドを発現させること、ポリペプチドを精製すること、このポリペプチドをＭＧＯと混合して、ＭＧＯとこのポリペプチドとの間の反応を可能にすること、並びにＭＧＯ修飾ポリペプチドを精製することによって誘導され得る。
【００４６】
発現系は、プロモーター、エンハンサーなどの制御配列と、様々な宿主に関して当該技術分野で既知であるものなどの終結制御とを含有してもよい（例えば、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。この発現系はまた、遺伝子の発現及び／又はタンパク質の折りたたみを容易にするシグナルペプチド及びプロタンパク質配列を含有してもよい。
【００４７】
Ａｐａ１（配列番号１）のアミノ酸変異体のＭＧＯ修飾形態もまた、抗炎症能力を呈し得る。当業者であれば理解されるように、配列番号１の一次アミノ酸配列のマイナーな修飾は、配列番号１に比較して実質的に等価な又は増強された抗炎症活性を有するポリペプチドをもたらす場合がある。Ａｐａ１修飾が１つ以上の置換を含む場合、好ましい置換は、保存的であるようなもので、すなわち、残基が別の同様な一般的なタイプによって置換されているものである。Ａｐａ１タンパク質に修飾を施すことにおいて、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る（例えば、その全体で参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５〜１３２（１９８２）を参照）。特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を保持し得ることが当該技術分野で知られている。
【００４８】
好ましくは、ＭＧＯ修飾Ａｐａ１変異体は、非変異体Ａｐａ１配列に対して少なくとも約７５％の配列同一性を呈し、好ましくは、本明細書に記載の任意の野生型又は参照配列に対して少なくとも約８０％の同一性を呈し、より好ましくは、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を呈する。更により好ましくは、ＭＧＯ修飾Ａｐａ１変異体は、非変異体ＭＧＯ修飾Ａｐａ１のものにほぼ匹敵する抗炎症能力を呈する。
【００４９】
ハチミツにおけるＭＧＯ修飾Ａｐａ１の形成は、（ｉ）周囲温度での長期間貯蔵、又は（ｉｉ）高い温度（３０〜４０℃）でのハチミツのインキュベーションによって刺激され得、これによって、ハチミツの試料の抗炎症能力を増加させる。ハチミツの試料へのＭＧＯの添加、又はＭＧＯ前駆体をＭＧＯに変換するための十分な時間及び／又は加熱を伴っての、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）などのＭＧＯ前駆体の添加もまた、ハチミツの試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の形成を刺激することが可能であり、並びにハチミツ試料におけるＭＧＯ修飾Ａｐａ１の発生によって、ハチミツの試料の抗炎症能力を増加させることも可能である。
【００５０】
増強された抗炎症特性を有するＡｐａ１は、ハチミツの外部でも形成され得る。完全に又は部分的に精製されたＡｐａ１は、ＭＧＯ修飾Ａｐａ１を産生するために、ＭＧＯで処理可能であることが見出されている。このＭＧＯ修飾Ａｐａ１は、非修飾Ａｐａ１に比較される場合、増強した抗炎症特性を呈する。
【００５１】
ＭＧＯ修飾Ａｐａ１及びその変異体は、医薬組成物中に治療的有効量で含まれ得る。本開示の医薬組成物は、以下に適合されるものを含む、固体又は液体形状での投与用に特別に処方化され得る：（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性若しくは非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば口腔、舌下、及び全身性吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；（２）非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射で、例えば、無菌溶液又は懸濁液、又は徐放性処方物；（３）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、又は制御放出パッチ又はスプレーとして；（４）膣内又は直腸内投与、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォーム；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮投与；（８）肺内投与、又は（９）鼻腔内投与。本発明の化合物が、ヒト及び動物に医薬品として投与される場合、これらはそれ自体で、又は例えば、薬学的に許容可能な担体と組み合わされて、約０．１％〜９９％、又は約１〜５０％、又は約１０〜４０％、又は約１０〜３０％、又は約１０〜２０％、又は約１０〜１５％の活性成分を含有する医薬組成物として提供され得る。
【００５２】
湿潤剤、乳化剤及び、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤及び香料剤、防腐剤及び酸化防止剤もまた、本明細書に記載の医薬組成物中に存在することができる。これら組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントも含有してもよい。本発明の化合物への微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等によって確実にされ得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に封入することも望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬品形態の長期間の吸収は、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の封入によってもたらされ得る。
【００５３】
実施例１−マヌカハニーからのＭＧＯ修飾アパルブミンタンパク質の単離
ニュージーランドのＨｏｎｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｉｋａｔｏから入手され、１２％ｗ／ｖのフェノールに等価な非過酸化物抗菌活性を有したマヌカハニーの試料を、以下のように分画した。
【００５４】
１．１  ハチミツの低分子量成分の排除
２５ｇのマヌカハニーを２５ｍｌの蒸留水中に懸濁させて、１リットルの水道水に対して、４℃で４８時間透析し（Ｃｅｌｌｕ  Ｓｅｐ  Ｔ１チューブ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅｇｕｉｎ，Ｔｘ；ＥＥＵＵ，３５００Ｄａの分子質量カットオフ）、この間、１リットルの水を４回交換した。透析保持物を凍結乾燥し、次いで分析まで−２０℃で保存した。凍結乾燥試料を、０．３モル／ｌの酢酸アンモニウム緩衝液で２ｍｌに再構成した。
【００５５】
１．２  セファデックスＧ−５０上でのクロマトグラフィー分離
次いで、透析からの再構成した保持物（２ｍｌ）を、セファデックスＧ−５０カラム（１８０ｍｌ）上に充填し、物質を１ｍｌフラクションで溶出した（２８０ｎｍで流速０．５ｍｌ／分）。図３に示す２つのピークから得られたフラクションを凍結乾燥し、食作用アッセイにおける予備評価のために、純水で１００μｌに再構成した。このアッセイは、阻害活性が最初に溶出したピークにあることを示した。更なるクロマトグラフィー分離が行われ、より大量のタンパク質を生成した。セファデックスＧ−５０カラム上のクロマトグラフィーを３回繰り返し行い、各実行からの溶出痕跡での最初のピークにおけるフラクションを一緒にプールし、ロータリーエバポレーターで２００μｌまで蒸発させて、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム上で分離した。
【００５６】
１．３  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２上のタンパク質の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）分離
セファデックスＧ−５０溶出痕跡上の第１のピークを更に分画するために、１００μｌの量の再構成した試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＦＰＬＣカラム（２５ｍｌ）上に注入し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１１）で１ｍｌのフラクションとして、２８０ｎｍで監視された、流速０．５ｍｌ／分、０．５ｃｍ／ｍｌで溶出した。これらフラクションを、更なる使用まで−２０℃で凍結させた。得られた２つの明確に分離した主ピーク（フラクション８及び１４）を、食作用アッセイにおける阻害活性に関してアッセイした。これらフラクションを、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で走行させて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析同定用に処理した。
【００５７】
１．４  活性フラクションの逆相
食作用阻害活性を有することが認められたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２上のクロマトグラフィーからのフラクション（フラクション８）を、ＭＡＬＤＩ質量分析同定用に更にタンパク質を精製するために、逆相カラム上でクロマトグラフィーにかけた。クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）上のカラムを使用して実施した。５００μｌの量のフラクション８試料を、カラムに注入し、２６０ｎｍで監視された１ｍｌ／分の流速で、１００％の水〜１００％のアセトニトリルの濃度勾配での移動相で溶出した。得られた２つの主ピークを含むフラクション（フラクション２３及び２６）をロータリーエバポレーターで５０μｌまで蒸発させた。このフラクション（５μｌ）を１０％のＳＤＳミニゲル上に充填し可視化させて、以下に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で処理した。
【００５８】
実施例２：ＴＨＰ−１細胞を使用する食作用阻害アッセイ（ＰＩＡ）
食作用は、細胞応答又は固体粒子を包み込むプロセスであり、免疫系において、これは病原菌及び細胞破壊片を除去するために使用される主要なメカニズムである。細菌、死滅組織細胞、及び小鉱物粒子は、細胞によって食作用され又は包み込まれ得る対象の全ての例である。食作用は、炎症のトリガに対する白血球の炎症応答の開始時に発生する。その中で食作用が活性化される場合に、細胞によって生成される活性酸素種及びサイトカインは、食作用と共に全てが開始する炎症応答である細胞事変のカスケードの一部として、より多くの食作用を動員しかつ活性化させる。したがって、食作用のいずれの阻害物質も、炎症応答を正にカスケードの開始時に効果的に停止する。
【００５９】
ニュージーランドハチミツのタイプの範囲での食作用阻害活性を測定した。マヌカハニーは、以下の表１に示すように、他のタイプよりも非常に高い活性を有することが全体で見出され、表１は、ＬＰＳ活性化ＴＨＰ−１細胞中のラテックス粒子の食作用に及ぼす異なるタイプのハチミツ（０．５％）の効果を示す。このアッセイは、ラテックス粒子の添加後４時間で実施された。マヌカ及び人工ハチミツ濃度は、ハチミツを無菌ＲＰＭＩ  １６４０完全培地で希釈することによって達成された。マヌカハニーは、ニュージーランドのＨｏｎｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｉｋａｔｏから入手し、１２％ｗ／ｖのフェノールと等価の非過酸化物抗菌活性を有した（Ａｌｌｅｎ，Ｍｏｌａｎら、１９９１年）。ハチミツを１．３７ｇ（ｍｌ当たりのハチミツの密度）を重量測定し、無菌ＲＰＭＩ  １６４０で使用する直前に、これを１９ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水（５％Ｖ／Ｖ濃度）で希釈することによって希釈し、花粉、ミツバチ組織などを除去するために、濾過した（５０μｍ、８μｍ及び３μｍ、Ｍｉｎｉｓａｒｔ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。未希釈のハチミツを、酵素変性及び分解を防止するために、黒色の容器内で４℃にて保持した。人工ハチミツは、ハチミツで見られる天然糖類の浸透効果のための対照を提供するよう使用された。この組成物は、公開されている（Ｗｈｉｔｅ  １９７５年）。
【００６０】
マヌカがニュージーランド全域にわたって広く生育し、ミツバチにとって花蜜の好まれる供給源であるために、ニュージーランドで生産されるハチミツの一部のタイプが、ミツバチによって生産されていると同時に、若干のマヌカの花蜜がまたその中に含まれていることは周知である。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
ＴＨＰ−１は、十分に特性決定が行われたヒトの単球系白血病細胞系である。この細胞は、数個の基準に関して単球に類似し、ＰＭＡ、ＬＰＳ又はＶｉｔ  Ｄでの処置によってマクロファージ様細胞へと分化され得る（Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．，１９９１年）。一旦活性化されると、マクロファージは、ラテックスビーズ又は同類物と共にマクロファージをインキュベートし、顕微鏡下で細胞を観察することにより食細胞吸収を記録することによって、食作用を考察することに使用されることが可能である。蛍光ラテックスビーズを使用することによって、食作用後に、このビーズは細胞の内部で見える。食作用を阻害する物質は、この物質が添加されていない食作用の量と、この物質が添加される場合の食作用の量を比較することによって考察され得る。
【００６３】
細胞形態、食作用、細胞分裂の速度、及び選択された表面マーカーにおける変化が、ＬＰＳ、ＰＭＡ及びＶｉｔ−Ｄによる活性化の後に、ハチミツに曝されたＴＨＰ−１細胞の培養で評価された。活性化速度がより短く、アッセイを３０時間以内に完了させることが可能であるために、ＬＰＳが更なる研究のために選択された。ＬＰＳ活性化細胞は、２４時間でマクロファージになるが、一方ＰＭＡ及びＶｉｔ  Ｄで処置された細胞は、少なくとも７２時間を要する。ＴＨＰ−１細胞の分化に関する基準は、細胞接着、細胞形態における変化、並びにＬＰＳ処置及び未処置細胞からのｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、マクロファージ表現型に関連するヒト軟骨群タンパク質―３９（ＨＣｇｐ−３９）及びカルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）の細胞表面マーカー発現プロファイルにおける変化であった。
【００６４】
ＴＨＰ−１細胞を、抗生物質を伴い、１０％のウシ胎児血清及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するエンドトキシンを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地中で、３７℃、５％のＣＯ２、及び９５％の相対湿度（ＲＨ）で維持した。細胞を３日毎に継代培養し、細胞計数を１０６／ｍｌ周辺で維持し、処置前に、生存率をトリパンブルー排除法によって血球計算器で評価した。継代数は、常に４０〜５５の間であった。
【００６５】
１ｍｇのＬＰＳを無菌ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に溶解することによって、ＬＰＳの１００ｕｇ／ｍｌ原液を調製した。この原液を−２０℃で保した。使用直前に、ＬＰＳ原液を融解し、新たに継代培養した細胞に添加し、生存率９５％又はそれ以上で、１０６／ｍｌのＴＨＰ−１細胞を有して、５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度にした。細胞を、２４ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）において、ウェル当たり１ｍｌでプレートし、蒸発を回避するよう、このプレートを密閉した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、及び９５％の相対湿度（ＲＨ）で２４時間インキュベートして、活性化させた。
【００６６】
食作用アッセイに先立って、各々のウェルを倒立型顕微鏡でチェックし、有効な形質転換を示す形態学的変化を観察した。対照ＴＨＰ−１（ＬＰＳ非処置）は丸い形状を維持し、集塊をなさず、又は培養プレート表面に接着しなかったが、一方ＬＰＳで処置された活性化ＴＨＰ−１細胞は凝集し、平坦になり、かつ明らかな偽足を有するアメーバ状になり、培養プレート表面に接着した。
【００６７】
ＬＰＳ活性化ＴＨＰ−１細胞の単層を無菌ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、懸濁した細胞を除去し、次いで、５００μｌのＲＰＭＩ中で、ハチミツを含まないもの、人工ハチミツ（０．２５％）又はハチミツ（０．２５％）の３つの処置のいずれか１つで３０分間インキュベートした。無菌の１．０μｍのコーティングしたポリスチレンラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｌ５４０５−１ｍｌ）（細胞当たり約２５個のビーズ）を単層に添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、及び９５％ＲＨでインキュベートした。各処置群は、実験当たり少なくとも３回の反復試験を有し、別の日に少なくとも２回繰り返した。
【００６８】
インキュベーションの４時間後に、懸濁した細胞を除去し、単層を氷冷した無菌リン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄することによって、食作用を停止させた。１００μｌのＰＢＳをプレートの壁に上下に穏やかにピペッティングすることによって、接着細胞をプレートから外した。４０倍のレンズを有するＡｘｏｓｔａｒ  ｐｌｕｓ  Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡フェーズＩＩを使用して、各試料から少なくとも２００個の細胞を血球計算器上で計測した。少なくとも３個のビーズを含有した細胞が、食作用に関して陽性であると考えられた。非活性化ＴＨＰ−１細胞（単球）は、予備アッセイにおいて観察された５％未満の食作用速度を有した。アッセイ後に、トリパンブルー排除法を使用して生存率をチェックし、処置又はハチミツがアポトーシスを誘導しなかったことを確認した。
【００６９】
ＴＨＰ−１細胞がラテックスビーズを食作用する能力は、ハチミツ処置物／ハチミツを含まない対照のパーセンテージで定量化される。第１の活性化速度が、食作用細胞の数を血球計算器上で計測された細胞の数で割ることによって得られた。４時間のインキュベーションに関する許容可能な活性化速度は７０％以上であった。ハチミツ処置物もまた、この方法で計測され、次いで食作用の減少パーセンテージが、以下の式に従って計算された。
【００７０】
食作用の減少％＝（ハチミツ処置の食作用速度／対照）×１００−１００
例示的計算は以下のとおりである：
対照、７５％（細胞の７５％が少なくとも３個のビーズを食作用した）
ハチミツ処置物１、２５％（細胞の２５％が少なくとも３個のビーズを食作用した）
ハチミツ処置物１、食作用阻害活性＝（２５／７５）×１００−１００＝６６．７％
【００７１】
この結果は、ハチミツ処置物１が、ラテックスビーズの食作用吸収に及ぼす６６．７％の阻害効果を有したことを示す。
【００７２】
試料のロットのスクリーニングについては、このアッセイは、（Ｗａｎ，Ｐａｒｋら、１９９３年）によって述べられた修正プロトコルを使用して、９６ウェルプレートで実行するよう修正され得る。このアッセイは、ＴＨＰ−１及びその生育条件／培地並びに同じラテックスビーズを使用するよう修正された。ハチミツとのインキュベーション後に、ウェルをＰＢＳで洗浄し、プレートリーダー又はＬＡＳ−１０００のいずれかでの測定前に、懸濁した細胞及び遊離ラテックスビーズを除去した。両方法が比較され、非常に類似した結果を得る。
【００７３】
実施例３：蛍光強度の測定
ハチミツの蛍光強度を、高機能ダークボックスＩＩ（Ａｌｐｈａｔｅｃｈ）を装備したフジフィルムＬＡＳ−１００で測定する。データを、提供されたソフトウェア、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ−１０００プラス簡易版１．５及びＩｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ４．０を使用して分析する。
【００７４】
ハチミツを室温に戻し、二回蒸留したＨ２Ｏ中で１０％ｖ／ｖまで希釈する（１ｍｌのハチミツ＝１．３７ｇｍ）。次いで、希釈ハチミツ５ｍｌを０．２μｍのＭｉｎｉｓａｒｔ無菌単回使用注射器フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｓ）を通して濾過した。希釈ハチミツの１００μｌを９６ウェルブラックプレート（ｎｕｎｃ  ＣＡＴ  １３７１０１）の５つのウェルにピペットで入れる。既知の蛍光を有する標準ハチミツもまた、バックグラウンド読取り値のために、水を含むウェルと空のウェルにプレートする。
【００７５】
プレートをダークボックス（レベル４）の内側に配置し、Ｉｍａｇｅ  ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ  １０００とプログラムを使用して焦点を合わせる。およそ３０秒である必要な照射時間を判断するために、前照射が行われる。一旦画像が撮影されると、提供されたＩｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  ４．０を使用して結果が得られる。簡単に言うと、蛍光がウェルを横切って任意単位（ＡＵ）で測定され、バックグラウンド強度が減算され、４００００ＡＵから２６００００ＡＵの範囲での読取り値をもたらす。試料が平均化され、典型的標準偏差＋／−１５００ＡＵを有する最終読取り値を得る。蛍光強度が高過ぎる場合には、過照射を回避するために、照射時間が減らされる。標準ハチミツＡＵは、これらハチミツの正確なＡＵを誘導するために使用される（少数のハチミツだけがこの蛍光を有するにすぎないために、これはほとんど実行されない）。
【００７６】
１％の濃度で、それらはハチミツ中に存在した。ハチミツの分画化からの使用可能なタンパク質の量がより少ないために、２００μｌのアッセイ試料サイズを使用した。上記のように得られたフラクション８及び１４を、食作用阻害活性に関してアッセイした。フラクション８は、強い食作用阻害活性を有したが、フラクション１４は、活性をほとんど有さなかった。両フラクションを、以下に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、有意なヒットで同定した。抗炎症活性の大部分を有するフラクション（フラクション８）は、修飾アパルブミン１（ＭＲＪＰ−１）であった。フラクション１４は２つのヒットを返し、１つは有意であり、これはアパルブミン３（ＭＲＪＰ−３）であった。非有意なヒットは、大部分がＭＧＯによって修飾されていない蛍光が高い、アパルブミン１（ＭＲＪＰ−１）であった。
【００７７】
実施例４  ＳＤＳミニゲル上の電気泳動
ハチミツの分画化から得られたタンパク質を、可視化しかつ分子量推定値を提供するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走行させた。１０％及び１２％のアクリルアミドを有する分離ゲルを、異なる範囲のタンパク質を分離するために使用した。１０％ゲルは、１４〜２０５ｋＤのタンパク質を分離するために最適であり、１２％ゲルは、１４〜６６ｋＤａのタンパク質に最適である。このゲルは、組み立てられた清浄なガラスプレートを使用して、ＯＷＬ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍゲルキャスター（ＢｉｏＬａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＤ）で作成された。分離ゲルを先ず、注射器を使用して注ぎ、均一なゲル表面を確保するために、ブタノールの層で覆って硬化するよう放置した。ゲルが硬化した際に、ブタノールを除去し、積層ゲルを注ぎ、ゲルコームを挿入し、試料充填のためのウェルを作成した。ゲルの組成物は：
１０％分離ゲル
３７％のアクリルアミド  ６．８ｍｌ
１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）  ２ｍｌ
水  ５．９ｍｌ
１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）  １５０μｌ
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）  １５μｌ
１０％の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）  １５０μｌ
１２％分離ゲル
３７％のアクリルアミド  ８．２ｍｌ
１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）  ２ｍｌ
水  ４．５ｍｌ
１０％のＳＤＳ  １５０μｌ
ＴＥＭＥＤ  １５μｌ
１０％のＡＰＳ  １５０μｌ
５％積層ゲル
３７％のアクリルアミド  ０．６６ｍｌ
０．５Ｍのトリス（ｐＨ６．８）  １．２５ｍｌ
水  ３．０ｍｌ
１０％のＳＤＳ  ５０μｌ
ＴＥＭＥＤ  ５μｌ
１０％のＡＰＳ  ５０μｌ
であった。
【００７８】
積層ゲルをセットしたときに、ゲルを電気泳動チャンバに挿入し、移動緩衝液（１ｌのＭｉｌｌｉＱ水中、３．０ｇのトリス、１４．４ｇのグリシン、１ｇのＳＤＳ）をチャンバの上部及び底部に添加した。コームを取り外し、試料ウェルを電気泳動緩衝液で洗浄した。次いでゲルを１０ｍＡで１０分間走行させて、重合されなかったアクリルアミドを除去した。ゲル上に充填される試料を、２Ｘ  Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１モル／ｌのトリス  ｐＨ６．８、２４％（ｗ／ｖ）のグリセロール、８％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．２モル／ｌのジチオスレイトール、０．０２％（ｗ／ｖ）のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０）と１：１で混合し、９９℃で５分間加熱し、冷却するよう放置した。試料を遠心分離し（２０００×ｇで２０秒間）いかなる沈殿物もペレット化し、１０μｌの試料をレーン毎に充填した。ＢＩＯＲＡＤ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｕｒタンパク質標準ラダー（Ｃａｔ．Ｎｏ．＃１６１−０３７４）を試料と一緒に走行させて、試料に推定されたタンパク質サイズを提供した。１０〜２５０ｋＤａにサイズ設定されたタンパク質を含有する標準の６μｌを、ゲルの両端で充填した。試料が積層ゲルを経て分離ゲルに移動してしまうまで、ゲルを１０ｍＡで走行させた。次いで電流を２０ｍＡまで増加させた。試料中の染料がゲルの両端から流出した場合、電流を切り、ゲルを除去し、染色した。バンドを可視化するために２つの方法が使用された。より微弱なバンドを同定するために、より感度が高いため銀染色が使用された。染色剤が銀よりもより容易に除去されるために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の実行に先立って、ファーストブルー法が使用された。ファーストブルーは、糖タンパク質により小さな親和性で結合するＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅを使用する染色剤であり、かなりの糖タンパク質を有するハチミツには理想的である。残留する染色剤は、定量を妨害する可能性があるために、このことは、タンパク質ＭＡＬＤＩ質量分析法の実行に先立って、より良好な染色剤除去を可能にする（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  １９９０年）。全ての試薬は、染色が実施される前５分に新たに生成され、必要になるまで４℃で保管した。ゲルを、最初に、５０％のエタノール／１２％の酢酸中で３０分間固定化し、次いで３０％のエタノール中に１５分間浸漬させた。次いで、１００ｍｌの０．０２％チオ硫酸ナトリウムを添加し、１〜２分間放置した。ゲルを０．１％硝酸銀１００ｍｌ＋ホルムアルデヒド１００μｌ中に１０分間浸漬した。次いで、これを水で１０秒間洗浄し、１００ｍｌの顕色剤（ＭｉｌｌｉＱ水１００ｍｌ中、炭酸ナトリウム３ｇ、ホルムアルデヒド１００μｌ、１％チオ硫酸ナトリウム４０μｌ）を添加した。バンドが可視となった後に、顕色を１０％酢酸で停止した。顕色されたゲルを、必要になるまで、ＭｉｌｌｉＱ水中で保存した。ファーストブルーはＦｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃから入手された（Ｃａｔ．Ｎｏ．＃ＦＳ−１００）。使用前に、ファーストブルーを希釈した（ファーストステイン濃縮物８ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ水３２ｍｌ、１０％酢酸を伴う４５％メタノール１０ｍｌ）。まず初めにゲ��を、１０％酢酸を含む４０％メタノールで１０〜２０分間洗浄し、続いて、ＭｉｌｌｉＱ水で濯いだ。次いで、希釈したファーストブルー１００ｍｌを添加し、ゲルをこの溶液中で、２０分間穏やかにかき混ぜた。ゲルを１０％酢酸で１０分間脱染色し、次いで、必要になるまでＭｉｌｌｉＱ水中で保存した。
【００７９】
ＳＤＳゲルから推測されたフラクション８（Ａｐａ１／ＭＲＪＰ−１）に関する分子量は、６０ｋＤａであり、これは、タンパク質サイズをわずか４８．９ｋＤａと報告したスイスプロットとして予期されたものよりも１０ｋＤａ大きい。このサイズの不一致は、グリコシル化及び／又は架橋結合によって説明され得る。３つの予測されたＮ−結合グリコシル化部位が、ＭＲＪＰ−１で報告されている（Ｓｒｉｓｕｐａｒｂｈ，Ｋｌｉｎｂｕｎｇａら、２００３年）。これらの部位のグリケーションは、分子量を増加させるであろう。フラクション８は、空容積内にあるために（カラムから排除されるような十分に大きなマクロ分子は、カラムから先ず初めに溶出することを意味する（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムの空容積は１１ｍｌである））、このことは、４８．９ｋＤａ（Ａｐ１／ＭＲＪＰ−１の分子量）でモノマータンパク質は容易にカラムに入るはずであるので、Ａｐａ１／ＭＲＪＰ−１は高度にグリコシル化及び／又は架橋結合されていることを示唆することができる。
【００８０】
実施例５  活性ハチミツタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析同定
以下に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ作業は、Ｗａｉｋａｔｏ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｉｋａｔｏで完了した。
【００８１】
５．１  タンパク質の調製
清潔な解剖用メスを使用して、バンドを切除し、次いでこれを３０％のエタノールで脱染色し、６０℃で１５分間インキュベートすることで、又はゲル片が無色になるまで、ファーストブルー染料を除去した。バンドを３０％のエタノール中で２回洗浄し、次いで１００％アセチルニトリルで１０分間収縮させた。吸引によってアセチルニトリルを除去し、ゲル片をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ内で真空により乾燥させて、残留水分を３０分にわたり除去した。ゲル片中のタンパク質をトリプシンで消化させることによって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法による分析用に、ゲル片中のタンパク質をペプチドに開裂させた。使用された方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷａｉｋａｔｏのＪｏ  ＭｃＫｅｎｚｉｅによって提供された詳細から適応された。それぞれのゲル片に、２５ミリモル／ｌの重炭酸アンモニウムの１０μｌを添加し、続いて配列決定品質のトリプシン溶液（１０％アセチルニトリル中２５ミリモル／ｌの重炭酸アンモニウムの４９μｌ、１μｌの配列決定用トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｖ５１１１）１０μｌを添加した。次いで、管を３７℃で一晩放置した。それぞれの管に、０．３％トリフルオロ酢酸を有する５０％アセチルニトリルを１４μｌ添加し、管をボルテックス混合し、１０分間超音波処理した。ゲル片を廃棄し、溶液を使用まで冷蔵した。
【００８２】
５．２  マトリックスの調製
使用された方法は、Ｗａｉｋａｔｏ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｉｋａｔｏから得られた。５ｍｇのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を１％トリフルオロ酢酸を有する６５％アセチルニトリルの５００μｌに添加した。この溶液をボルテックス混合し、１０分間超音波処理し、再度２分間ボルテックス混合し、次いで１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。調製したタンパク質消化溶液とマトリックスを合わせて（２：１）、その１μｌをＭＡＬＤＩアンカーチップターゲットプレートにスポットした。このスポットを空気乾燥させて、次いで１％トリフルオロ酢酸の５μｌを乾燥したマトリックススポット上又はその周辺部分にピペット操作し、乾燥させた。
【００８３】
５．３  オートフレックス操作手順
分析に先立って、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ標準２０６１９５で外部較正を実行した。モノアイソトープペプチド較正は、±０．１％の縮小拡大を使用した。一旦、良好でクリーンなスペクトルが採取されたら、質量分析計は自動的に再較正される。誤差がわずか±１０ｐｐｍの場合、適合結果は許容される。内部較正は、トリプシンの自己消化から得られる生成物が存在する場合は、実行され得る。これら生成物は、８４２及び２２１１でピークを産生する。このピークはフレックス分析プログラムにおける内部較正として割り当てられる。Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計が、ペプチド消化を分析するよう使用された。サンプル当たり平均で３０ショットが取られ、ペプチド質量フィンガープリントスペクトルを構築した。質量範囲セレクターを低い範囲で設定し、検出器ゲイン電圧オフセットを１４００ｖで設定した。検出設定は、４８０〜３５４０Ｄａの範囲で設定した。機器は、フレックスコントロールソフトウェアを使用して手動で操作された。好適なスペクトルが保存され、フレックス分析にエクスポートされた。
【００８４】
５．４  ＭＡＬＤＩスペクトルの分析
Ｂｉｏｔｏｏｌｓソフトウェアを使用して、採取したスペクトルが、様々なタンパク質データベースに対して検索され得る。好ましい使用のデータベースは、ＳＷＩＳ  Ｐｒｏｔ及びＮＣＢＩｎｒである。ＳＷＩＳ  Ｐｒｏｔにおける真核生物タンパク質の検索のためのパラメータは、±２００ｐｐｍのペプチド耐性と１つの欠落した開裂である。６４を超えるタンパク質スコアは、Ｓｗｉｓ  Ｐｒｏｔに有意である。ＮＣＢＩｎｒにおける真核生物タンパク質の検索のためのパラメータは、１つの欠落した開裂及び±２００ｐｐｍのペプチド耐性である。ＮＣＢＩｎｒにおける有意なヒットに必要とされるタンパク質スコアは、７８である。これらパラメータは、少なくとも２００９年５月までは正確である。分子質量は、分子／ペプチドの総分子質量の０．０１％の精度の範囲内で測定され得る。これは、少量の質量変化、例えば、１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換又は翻訳後の修飾が検出されるのに十分である。
【００８５】
質量分析装置の主要な機能は、質量対電荷比による質量分析計のイオン化供給源において形成されたイオンを分離又は解像することである。トリプシン消化によって生成されたペプチドは、それらの質量のためにイオン化によって分離され、この質量が計算され得る。検出器がイオン電流を監視し、それを増幅し、次いでこのシグナルがデータシステムに送られ、そこでこれが質量スペクトルの形態で記録される。イオンの電荷に対する質量値がそれらの強度に対してプロットされ、試料中の成分の数、各成分の分子質量、及び試料中の様々な成分の相対量を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦがタンパク質を同定するよう使用される場合、発生したイオンは、強いピークを伴うクリアーな質量スペクトルを形成するはずであり、これは、１つのみのタンパク質（少なくともかなりの量で）がＳＤＳ電気泳動ゲルからのバンド切断部中に存在することを示唆する。１つ以上のタンパク質が試料中に存在する場合、典型的には、大量の同一のペプチドに相関するクリアーなピークは存在しない。
【００８６】
５．５  活性タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析同定
上記のようなＳＤＳ電気泳動からのゲル中の切除したバンドから回収されたタンパク質、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィー分離からのフラクション８及び１４を、同定のために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析用にトリプシン消化にかけた。上記のＡｕｔｏｆｌｅｘ操作手順を使用して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィーカラムから単離されたフラクション１４のペプチド質量フィンガープリントスペクトルを得た。図７に示すようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法から生じた質量スペクトルは、各ペプチドに関する分子量を提供し、これをＳＷＩＳ  Ｐｒｏｔライブラリに挿入し、一致を検索した。ＳＷＩＳ  Ｐｒｏｔライブラリに対するトリプシンペプチドの分子量の２つのヒット／一致が得られた。最も有意なヒット／一致は、タンパク質アパルブミン３（ＭＲＪＰ−３）についてであった。第２のヒットのアパルブミン（ＭＲＪＰ−１）は、それ自体では有意な一致ではないが、この一致に対応する質量スペクトルピークが、ＭＲＪＰ−３に関する一致に起因するものとは異なるために、試料中にこれが存在する可能性は非常に高い。
【００８７】
同一の手順がまた、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィーカラムから単離されたフラクション８に関して実行された。図６に示すようなフラクション８からのペプチドのＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、質量ペクトルへの１つの有意なヒット、すなわちＭＲＪＰ−１への一致をもたらした。
【００８８】
実施例６−ＭＧＯの存在下でのハチミツのインキュベーション
マヌカハニー又は非マヌカハニーの双方がインキュベートされた。インキュベーションのためのマヌカハニーは、その初期の高いＭＧＯレベル及び低い蛍光に基づいて選択された。非マヌカハニーは、その低い蛍光及びＭＧＯの欠如に基づいて選択された。ハチミツは３ヶ月にわたってインキュベートされ、その間、蛍光読取り値が追跡された。インキュベートされたそれぞれのハチミツはまた、元の品質を維持するために凍結された試料も有した。インキュベートされたハチミツ及び凍結ハチミツを、食作用の阻害についてアッセイし、インキュベーションに起因する任意のタンパク質サイズ修正を決定するためにミニゲル上でのＳＤＳ電気泳動にかけられた。高蛍光を有するマヌカハニーと低蛍光を有するマヌカハニーもまた、インキュベートされたハチミツとインキュベートされないハチミツとの比較のために、ＳＤＳ電気泳動にかけられた。全クローバー及び牧草ハチミツをＭＧＯと共に又はＭＧＯなしで、３７℃で３ヶ月にわたりインキュベートし、ＭＧＯの存在が非蛍光ハチミツにおいて経時的に蛍光を発生し、食作用阻害活性を増加させるかどうかを決定した。このハチミツは、食作用阻害活性に関して先アッセイし、低活性を有したものである。ハチミツをＳＤＳミニゲル上で電気泳動し、インキュベーションに起因する任意のタンパク質サイズ修正を決定した。ＭＧＯ処置ハチミツを、食作用アッセイにおいてアッセイし、有効なインキュベーションが食作用阻害活性を有することを決定した。メチルグリオキサール（４０％）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｍ０２５２）から購入し、１５の非過酸化物抗菌活性（およそ４００μｇ／ｇｍのハチミツ又は４０％のＭＧＯ／ｋｇハチミツの１ｍｌ）に相当する最終濃度で使用した。
【００８９】
６．１  ハチミツインキュベーション
全マヌカハニー（ＭＳＢ２０の２０ｇ、ＮＰＡ２０＋）、牧草ハチミツ（２０ｇ）及びクロバーハチミツ（２０ｇ）を３７℃で３ヶ月にわたりインキュベートした。４００μｇ／ｇのＭＧＯで処置されたクロバーハチミツ（２０ｇ）をそれに混合し、これをまた、３７℃で３ヶ月間インキュベートした。全てのハチミツの対照試料（２０ｇ）をこの持続時間で凍結した。ハチミツの蛍光をＭＧＯの添加直後に測定し、ハチミツに添加された濃度では、蛍光は、添加されたＭＧＯによる増加は認められなかった。ハチミツのインキュベーションの６週間後及び３ヶ月後に、蛍光を測定した。
【００９０】
６．２  インキュベートしたハチミツのＳＤＳゲル電気泳動
上記のハチミツ試料を、１２％のＳＤＳミニゲル上を走行させた（上記のとおり調製かつ実行された）。比較のために更に含まれたものは、高蛍光を有するマヌカハニーと低蛍光を有するマヌカハニーであった。ハチミツを１０％に希釈した。ゲルに充填される試料を２Ｘ  Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと１：１で混合し、９９℃で５分間加熱し、次いで充填に先立って冷却した。染色前に、ゲルをＵＶゲル照明装置で撮像し、タンパク質バンドの蛍光を観察した（この蛍光は、染色後見えなかった）。ＳＤＳミニゲルを銀染色した。
【００９１】
以下の表２は、天然ＭＧＯレベル（マヌカ）と、又は４００ｍｇ／ｋｇのＭＧＯが添加されたもの（牧草及びクローバー）との３７℃で３ヶ月間のインキュベーション前、インキュベーション中、及びインキュベーション後の選択されたハチミツに関する蛍光測定値を示す。対照においては、これは、４℃で３ヶ月間保持されたマヌカハニー（高い天然ＭＧＯ含量を有する）、並びに４℃で３ヶ月間保持された、４００ｍｇ／ｋｇのＭＧＯを添加された牧草及びクローバーハチミツ、又はＭＧＯを添加されていないハチミツ（牧草及びクローバー）は、蛍光での増加は存在しなかった（結果は図示せず）。
【００９２】
【表２】
2014515724.tif 000005
【００９３】
６．３  インキュベートされたハチミツのＳＤＳ電気泳動ゲル画像
ＭＧＯでインキュベートされたハチミツの電気泳動の結果を図９及び１０に示す。図９は、クローバーハチミツとマヌカハニーとの間の主要タンパク質（６０〜６５Ｄｋａ)のサイズ差を示す。図１０は、ＭＧＯと共にハチミツをインキュベートすることが、双方のハチミツタイプにおいて、主要タンパク質のサイズを増加させた（約５〜１０ｋＤａまで）ことを示す。
【００９４】
上記に詳細に説明されたように、活性誘導分画化が、マヌカハニーの試料の成分を単離するために使用された。食作用阻害活性を有するマヌカハニーの単離された成分が蛍光であることが本発明者によって見出された。ハチミツをフラクションに分離するそれぞれの段階で、各フラクションが、約４９０ｎｍで成分の蛍光を測定することによって、どれほどの食作用阻害活性がそれに存在するかを測定するよう試験された。図１ａから見られるように、放射波長は４５０〜５５０ｎｍの間である。活性であるマヌカハニーを透析した後に、この活性は、透析保持物中にあり、これは３．５ｋＤａを超える分子量の成分を含有するフラクションであり、３．５ｋＤａより低い分子量の成分を含有するフラクションである透析物中にはないことが確認された。食作用阻害活性は、溶出トレース上の第１のピークとして見られたフラクション（フラクション８）中に大部分が見出され、これはカラムの空容積を超える容積で溶出することが見出された。少量の活性が、溶出トレース上の次のピークとして見られるフラクション中にあることが認められた。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２のカラムから溶出された第１及び第２のピークにおけるマヌカハニーのフラクションを、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムが存在するポリアクリルアミドゲル電気泳動）上を走行させた。銀染色は、１つのバンドが存在することを示した。ゲルの対応する部分をゲルの未染色の部分から切除し、タンパク質をトリプシンで消化させて、このように得られたペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス補助レーザー脱着飛行時間型質量分析）を走行させた。ペプチドのこの質量をＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース内のデータと比較し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィーからの第１のピークにおけるタンパク質に関して主ローヤルゼリータンパク質−１（アパルブミン−１としても知られる）と一致すること、並びにＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２クロマトグラフィーからの第１のピークにおけるタンパク質に関して主ローヤルゼリータンパク質−３（アパルブミン−３としても知られる）と一致することを見出した。
【００９５】
Ａｐａ１又はＭＲＪＰ−１タンパク質が抗炎症活性の原因の成分であることが活性誘導分画化によって発見されたこと、並びに他のハチミツが主ローヤルゼリータンパク質を有することが解明されたことで、マヌカハニーにおける高レベルのＭＧＯの存在がＡｐａ１／ＭＪＲＰタンパク質を修飾するかどうかを決定するために、更なる研究が実施された。マヌカハニーは、他のハチミツでは同程度まで見られない高蛍光を有し、この蛍光が、ＭＧＯがハチミツ中のタンパク質を修飾していることに起因することが見出された。特定の理論に束縛されようとするものではないが、マヌカハニーの独特な特徴である高レベルのＭＧＯは、Ａｐａ１／ＭＲＪＰタンパク質のグリケーションを誘起し、Ｓｃｈｍｉｔｔら著、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５で報告されているように蛍光性である進行性グリケーション最終産物受容体（ＡＧＥｓ）を形成すると考えられる。ハチミツのＭＧＯとのインキュベーションは、ウシ血清アルブミンがＭＧＯと共にインキュベーションされた場合、ウシ血清アルブミンにおいて発生される蛍光と同一の放射波長の蛍光での増加をもたらすことが、本発明者によって見出された。更なる分析は、抗炎症活性もまた、この処置の結果として増加することを示した。図２に示すように、ハチミツの試料の蛍光と抗炎症活性との間の相関性が見出された。ＭＧＯでの処置はまた、Ａｐａ１／ＭＲＪＰタンパク質の分子量（ＳＤＳ電気泳動上）を増加させ、図８及び１０で示すように、増加した分子量のバンドは蛍光性であった。
【００９６】
ＭＧＯ修飾アパルブミンに関する使用法
組織における炎症は、１つ以上の精製したＭＧＯ修飾アパルブミンポリペプチド又はＭＧＯ修飾アパルブミン含有組成物を炎症した組織に投与することによって軽減され得る。
【００９７】
ＭＧＯ修飾アパルブミンは、免疫細胞による食作用の速度を低減することによって、並びに食作用のトリガである免疫細胞上のマンノース受容体を遮断することによって、組織における炎症を軽減する。免疫細胞は、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び顆粒球細胞を含む。
【００９８】
ＭＧＯ修飾アパルブミンは、様々な形態で炎症した組織に投与されてもよく、これらは、他の成分から精製されたＭＧＯ修飾アパルブミン、及び薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又は治療的分子などの１つ以上の他のタイプの成分を含有する組成物の形態であるＭＧＯ修飾アパルブミンが挙げられる。ＭＧＯ修飾アパルブミンは、活性マヌカハニーから精製されてもよく、又はＭＧＯ若しくはＭＧＯ前駆体がアパルブミンを修飾するために添加されたマヌカハニー又は他のタイプのハチミツから精製されてもよく、あるいはこれは、その中でアパルブミンが遺伝子組み換え的に発現され、次いでＭＧＯで処置されたローヤルゼリー又はその系から精製されてもよい。
【００９９】
１つ以上の他のタイプの化合物を含有する組成物におけるＭＧＯ修飾アパルブミンとしては、ハチミツ中のＭＧＯ修飾アパルブミン又はＭＧＯ修飾アパルブミンが強化されたハチミツ抽出物、アパルブミンの組換え生成に関連する抽出物中のＭＧＯ修飾アパルブミン、及びＭＧＯでのアパルブミンの化学的修飾物が挙げられる。
【０１００】
精製したＭＧＯ修飾アパルブミン又はＭＧＯ修飾アパルブミン  １含有組成物は、様々な異なる形態で炎症した組織に投与されることができ、これらは、クリーム、ローション、液体溶液、又はパップ剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＧＯ修飾アパルブミンは、ＭＧＯ修飾アパルブミンを食用製品に封入することによってなどで炎症した組織に投与されてもよい。このような製品としては、飲料、キャンディー、シロップ、トローチ剤、ピル及び食品が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ＭＧＯ修飾アパルブミンを検出する方法及びハチミツの特徴の特性評価
ハチミツの試料の抗炎症能力は、ＭＧＯ修飾アパルブミンの検出を通して決定され得る。ＭＧＯによるＡｐａ１の化学的修飾は、ＭＧＯによって修飾されていないＡｐａ１のものよりもより大きな蛍光を呈するＭＧＯ修飾アパルブミンを生じる。Ａｐａ１はハチミツ中に存在するために、ハチミツの試料の蛍光を測定することによって、ハチミツ試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の相対的濃度の測定を得ることができる。ハチミツの試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の濃度の測定は、ハチミツの試料の抗炎症能力に直接関連する。図２は、蛍光、したがってＭＧＯ修飾Ａｐａ１含量と食作用阻害能力との間の相関性を示す。
【０１０２】
Ａｐａ１などの既知の低い濃度のＭＧＯ修飾アパルブミンを有するハチミツの試料の蛍光を測定することによって、並びに既知の高濃度のＭＧＯ修飾Ａｐａ１を有するハチミツの試料の蛍光も測定することによって、標準スケールが生成され、これがハチミツの試料の蛍光を、そのハチミツの試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の濃度に相関させる。蛍光試験及び標準スケール生成に使用され得る既知のＭＧＯ修飾Ａｐａ１濃度を含有するハチミツの試料を得るために、ハチミツの試料のＭＧＯ修飾Ａｐａ１濃度が、質量分析法などの標準分析化学的技術によって決定され得る。
【０１０３】
ハチミツの試料の蛍光をハチミツの試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１濃度に相関させる標準スケールが一旦生成されたら、ハチミツ生産及び分析で有用な様々なタイプの情報を生成するために、この標準スケールがハチミツの試料の蛍光試験と組み合わせて使用されてもよい。
【０１０４】
例えば、未知のＭＧＯ修飾Ａｐａ１濃度を有するハチミツの試料の蛍光が測定されることができ、この蛍光測定値及び標準スケールに基づいて、試験ハチミツ試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の濃度が決定されることが可能である。ハチミツの試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の濃度を決定するこの蛍光法は、質量分析法などの他の分析化学的技術よりも非常に安価でありかつ速い。このような方法でハチミツ試料中のＭＧＯ修飾Ａｐａ１の濃度を測定することによって、ハチミツ試料の抗炎症能力もまた迅速に決定される。
【０１０５】
高ＭＧＯ濃度が、全てのハチミツ品種の中でマヌカハニーに独特な特性であるために、ハチミツ生産者は、ＭＧＯを所望の濃度のＭＧＯを天然には含有しないハチミツの試料に添加することによって、活性マヌカハニーを疑似しようとする場合がある。消費者は、処置されたハチミツよりもはるかに天然のハチミツを好む。精製された活性ＭＧＯは、商業的化学薬品製造業者から容易に入手可能であり（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯは、約４０％のメチルグリオキサール水溶液を販売する）、ハチミツ製造者は、ハチミツ中のＭＧＯの濃度を所望のレベルまで引き上げるために、ＭＧＯの所望の濃度を天然には含有しないハチミツの試料にＭＧＯを添加することもできる。「天然ハチミツ形成に非依存的なプロセス」は、ミツバチによって実行されないいずれかの活動を含み、したがって、これは精製ＭＧＯのハチミツ試料への添加などの作用が挙げられる。「天然ハチミツ形成に非依存的なプロセス」は、ミツバチが、高レベルのＭＧＯ又はＭＧＯ前駆体分子を含有する花蜜、花粉、又は他の植物生成物を収集するなどの活動を含まない。
【０１０６】
ハチミツの蛍光はまた、所望の抗炎症特性を有するハチミツを得るために、巣箱からハチミツを収穫するのに適した時期又は収穫したハチミツを保存するのに適した時間を決定するために使用されてもよい。ハチミツにおけるＭＧＯによるアパルブミンの修飾は、ある期間にわたって発生し得るので、ハチミツ製造者は、ハチミツが所望の抗炎症能力及びＭＧＯ修飾アパルブミンの濃度を含有するまで、巣箱内にハチミツを保持するよう選択することが可能である。異なる時間間隔で巣箱からのハチミツ試料の蛍光を測定することによって、ハチミツ製造者は、ハチミツの蛍光の測定値を、ハチミツ中に所望の抗炎症特性を有するハチミツを得るために、巣箱からハチミツを収穫するための最適な時期を決定するための方法として使用することが可能である。同様に、ハチミツ製造者は、ハチミツ試料が抗炎症特性の所望のレベルを有するかどうかを決定するために、巣箱の外側で保存されたハチミツの蛍光を測定することもできる。ハチミツ試料の蛍光を測定することによって、所望の抗炎症能力を含有するハチミツ試料を得ようとするハチミツ製造者は、ハチミツがＭＧＯ修飾アパルブミンの形成によって所望のレベルの抗炎症能力を進展させるまで、ハチミツを保存することが可能である。
【０１０７】
ＭＧＯによるローヤルゼリーの修飾及び得られた分子量変化の評価
ローヤルゼリーを採取し、シナピン酸をマトリックスとして使用し、陽イオンモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。およそ５２．４ｋＤａのｍ／ｚでの１つの有意なピークを同定した。このピークは、主ローヤルゼリータンパク質として前に同定されたものである逆相単離されたフラクションから得られた５２．４ｋＤａのｍ／ｚと一致した。
【０１０８】
分析ＲＰ  ＨＰＬＣプロトコルを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ  Ｃ−１８ガードカラムを備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｔｅｏ９０カラム（３μ、９０Å、Ｃ１８、２５０×４．０６ｍｍ）で実施した。カラムを緩衝液Ａ：Ｎａｎｏｐｕｒｅ水中０．１％のＴＦＡで、１ｍＬ／分の流速で平衡化した。緩衝液Ｂ（０．１％のＴＦＡを含有する１００％のアセトニトリル）のグラディエントを以下のように適用し、吸光度を２１４ｎｍで監視した（表１）。
【０１０９】
次いで、ローヤルゼリーを、メチルグリオキサールと０．１％、０．５％及び１．０％で反応させた。ローヤルゼリータンパク質溶液を、ＰＢＳ中に、部分的に解凍した調製液を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することによって調製した。ＭＧＯ溶液を、原液（Ｓｉｇｍａ、４０％）をＰＢＳで希釈して、０．１、０．５及び１．０％の範囲で最終濃度を得ることによって調製した。９００μＬのタンパク質溶液に、１００μｌの必要な濃度のＭＧＯ溶液を添加し、混合物を６０℃で一晩インキュベートした。得られた反応生成物をまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで検討した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの使用では、０．５及び１．０％のＭＧＯ反応生成物において、１つのみのピークが見られ、これは、およそ５５．１ｋＤａでの修飾されたＭＲＪＰ１主タンパク質であった。０．１％のＭＧＯ反応では、非誘導化タンパク質の存在ばかりでなく、修飾ＭＲＪＰ−１主タンパク質の存在もあることが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルから明らかであった。このことは、ＭＧＯのレベルが、ＭＲＪＰ−１との反応を完了するのに十分ではなかったことを示唆した。５２．４ｋＤａから５５．１ｋＤａまでのｍ／ｚにおけるシフトは、Ａｒｇ上の７２．０７Ｄａ付加物を占める単一のＭＧＯ単位の添加がメチルグリオキサール由来ジヒドロキシイミダゾリジン（ＭＧ  ＤＨ）を生成したことに基づいて説明することができ、並びに７０．０５の質量シフトは、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾリン（ＭＧ−ＨＩ）に基づいて説明することができる。リジンとの反応は、ＣＥＬ、Ｎε−（カルボキシルメチル）リジンに関する７２．０７の質量シフトを伴ってＣＥＬを形成し、ＭＯＬＤ（メチルグリオキサールリジンダイマー）に関して１８０．２５Ｄａの増加をもたらして、ＭＯＬＤを形成する。他のアルギニン修飾及びそれらの質量変化は、２−アンモニオ−６−（［２−［（４−アンモニオ−５−オキシド−５−オキソペンチル）アミノ］−４−メチル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イリデン］アミノ）ヘキサノエート（ＭＯＤＩＣ）の１６６．２３Ｄａの増加、１６０．１８Ｄａの質量変化を有するテトラヒドロピリミジン（ＴＨＰ）、及び８０．０９の質量変化を伴うアルグピリミジンである。Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅで２００６年１２月４日にオンラインで公開された、Ｂｒｏｃｋら著、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００７；４２：８９〜１００の「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｍｅｔｈｌｇｌｙｏｘａｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照されたい。
【０１１０】
【表３】
2014515724.tif 000006
【０１１１】
多くの付加物が可能であり、それぞれの形成で異なる傾向があるので、８２の平均数が、ＭＲＪＰ１でのＭＧＯ修飾の相対的レベルを決定するよう使用された。部分的に反応したＭＲＪＰ１タンパク質をもたらす０．１％のＭＧＯレベルでは、未反応ＭＲＪＰ１と比較された質量単位での差は１４２２．０Ｄａであって、これはＭＲＪＰ１上におよそ１７個のＭＧＯ付加物が形成されたことになる。０．５％及び１．０％のＭＧＯ反応生成物の場合では、質量単位における差は、以下の表４で見ることができる。０．５％及び１．０％のＭＧＯの双方が、ＭＲＪＰ１上に形成されたおよそ３１〜３２個のＭＧＯ付加物を提供した。ＭＧＯがＭＲＪＰ１上に付加物を形成することができる最大で３９個の部位がある（Ｃｙｓ残基を除く）ことも注目に値する。２２個のアルギニン部位と１７個のリジン部位がある。この結果が示唆することは、ＭＧＯ付加物形成に可能である部位のおよそ８２％が、ＭＧＯによって修飾されていることを示唆する。図１１に示されるように、０．５％及び１．０％のＭＧＯの双方が、ＭＲＪＰ１とほぼ等しく反応したために、この反応が完了まで進んだと結論付けることが可能である。更には、マヌカハニー中の天然レベルのＭＧＯがおよそ０．４〜０．５％まで蓄積する傾向があることも注目に値する。次いで、ＤＣＦＤＡアッセイ（以下に詳説）によって、０．５％及び１％のＭＧＯ反応生成物の生物学的活性は、対照に勝って統計的に有意であったが、一方０．１％のＭＧＯ反応生成物はそうではなかった（図１２参照）。このことは、修飾されたＭＲＪＰ１反応生成物において活性を確認するためには、少なくとも１７個のＭＧＯ部位修飾が存在する必要があることを示唆する。
【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
ＤＣＦＤＡ  ＲＯＳ活性アッセイ
細胞は、好気性代謝中に、活性酸素種（ＲＯＳ）を定常的に発生させる。このＲＯＳ発生は、免疫系において重要な保護的及び機能的役割を果たす。細胞は、ＲＯＳの過剰な生成と戦うための強力な抗酸化防御系を備える。ＲＯＳの発生が細胞の天然の抗酸化防御を圧倒する場合、酸化的ストレスが細胞内で生じる。ＲＯＳ及び酸化的損傷は、癌、アテローム性硬化症、他の神経変性疾患及び糖尿病を含む多くのヒトの疾患で重要な役割を果たすと考えられている。したがって、それらの正確な役割を確立することは、ＲＯＳ及びそれらが引き起こす酸化的損傷を正確に測定する能力を必要とする。細胞中のフリーラジカル生成を測定するための多くの方法がある。ＲＯＳ生成は、炎症応答へ本質的に導く。最も単純な技術は、細胞透過性蛍光及び化学発光プローブを使用する。２’−７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＤＡ）酸化は、細胞のレドックス状態を直接的に測定するために最も広範に使用されている技術である。これは、開発された他の技術に勝るいくつかの利点を有する。これは使用が容易であり、細胞のレドックス状態における変化に非常に敏感であり、安価であり、かつ経時的にＲＯＳにおける変化を追跡するよう使用され得るからである。細胞における炎症応答の指標測定値である、活性酸素種ＲＯＳ生成に関するＤＣＦＤＡアッセイは、上記の食作用試験に対する代替の生物学的活性試験として開発されたものである。このアッセイを、９０μＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び目的とする試料を伴う１０μＬの細胞を三組の９６ウェルプレート中に配置させ、続いて５０μＬのＤＣＦＤＡ溶液を添加することによって調製した。ＤＣＦＤＡは、１ｍＬのＤＭＳＯ中に３ｍｇを溶解することで調製した。次いで、１００μＬのＤＭＳＯ溶液を１０ｍＬのＰＢＳと混合した。フルオレセインへのＤＣＦＤＡの酸化を、Ｅｘ  ４７３ｎｍとＥｍ  ５２０ｎｍを使用してのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ４プレートリーダーにおける発光を用いて監視した。アッセイは、０分、２分、５分及び１０分の時間で監視された。初期アッセイを、細胞の存在下及び細胞の不在下で５分間の時間で１０秒毎に測定が実施された速度論解析を使用して実施した。初期プレートを使用して、どれほどの数の細胞が必要であるか、並びに使用される試料の容量はどれほどであるかを決定した。全９６ウェルプレートにわたる平均値の標準誤差は、わずか５％であった。複数チャンネルピペットを使用することで、我々は、自信を持って全プレートの分析を１０分以内に実行することができた。目的とするタンパク質及びペプチドを同定しようと試みるためには、迅速な処理時間が、生成した試料を分析し、かつアッセイ誘導された試料の分画化を実行するために必要であった。１０μＬの細胞を使用するＤＣＦＤＡアッセイの速度論的解析が、図１３に示されている。
【０１１４】
ＬＰＳ及び１μｍの球状体によるヒツジの脾臓細胞の活性化は、無菌技術を使用することなく試料が調製されかつ即時に使用されるので、必要がないように思われる。図１に示すように、ＤＣＦＤＡの線形酸化が、細胞のみの存在下で得られ、ＤＣＦＤＡは、使用された条件に対して安定であるように見えた。
【０１１５】
ＤＣＦＤＡ  ＲＯＳ活性アッセイ用の細胞の調製
新鮮な全脾臓を、地方の食肉解体処理場（Ｔａｙｌｏｒ  Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）から入手した。細胞は、典型的には採取の１時間以内に得られたが、４℃で２４時間貯蔵後の脾臓の処理加工もまた実施した。脾臓を、切り込み間１ｃｍのギャップで縦方向にスライスし、次いでゲルナイフを使用して、脾臓から赤血球塊をかき落とした。細胞を２００ｍＬのＰＢＳと混合し、次いで、ハンドブレンダーで間単にホモゲナイズし、細胞塊を個々の細胞に分けた。次いで混合物を４層のモスリン布を通して注いだ。次いで細胞を使用まで４℃で保存した。
【０１１６】
リジン残基の有意性
アセチル化は、リジン残基を選択的に遮断する。１．２８１４ｇの解凍したＲＪＰ混合物を、６Ｍの尿素を含有する５０ｍＬのトリス／ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）中で溶解した。この溶液を氷水浴上で冷却した。無水酢酸を、０．５ｍＬのアリコートで２０分毎に２時間にわたって添加した。毎添加前に溶液のｐＨを決定し、トリス／ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ８．５）を使用してｐＨを７．５超に調整した。次いで、試料を透析管（１０ｋＤａの分子量カットオフ）に移し、透析液を３回交換して、１．６リットルの水に対して一晩透析した。透析管の内容物を凍結させて、凍結乾燥させた。２３９．９ｍｇの白色の僅かに粘着性の物質を回収した。アセチル化試料は、ＭＧＯ処置後にＤＣＦＤＡアッセイにおける活性をもはや有さないことが見出された。このことは、リジン残基のＭＧＯ修飾が、修飾ＭＲＪＰによって見られる機能的活性に必須であることを示唆した。
【０１１７】
Ｌｙｓ  Ｃ消化：ローヤルゼリーの試料を以下のプロトコルを使用して、加水分解した。４μｇのＬｙｓ  Ｃを１００μＬの炭酸アンモニウム（ｐＨ８．４）中に溶解した。１０μＬのＬｙｓ  Ｃ原液を、１００μＬ中の１００μｇのＭＲＪＰ抽出物に直接添加した。反応を、室温で７２時間実施した。次いで、試料をシナピン酸溶液と１：１で混合し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ３８４ウェルプレート上に、２通りで１μＬスポットした。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ５８００を使用して、ペプチドを分析し、質量及びＭＳＭＳスペクトルを決定した。０．１、０．５及び１０％でのＭＧＯを使用しての修飾からのＬｙｓ  Ｃ抽出物を、質量分析法によって検討し、そのＭＳプロットを図１５〜１９に示す。ＭＲＪＰ１のＭＧＯ修飾後に、Ｌｙｓ  Ｃからより大きなピーク及びより多数のピークが同定された。ＭＧＯ濃度がより高くなるにつれて更に大きな数のより大きなピークが観測されることも認められた。これらＬｙｓ  Ｃの結果は、ＭＲＪＰ１の全体にわたって様々なＬｙｓ残基上で複数の修飾が発生したことを示唆している。
【０１１８】
ＭＲＪＰ１及びＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ１のトリプシンスピンカラム加水分解：ローヤルゼリーの試料（１０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｓｉｇｍａのトリプシンスピンカラム（ＴＴ００１０）を使用して、製造者の使用説明書を用いて、トリプシン加水分解にかけた。加水分解を、重炭酸アンモニウム緩衝液中で、ＭＲＪＰ（１００μｇ）の２つのパスで、室温で３０分にわたり実施した。ＭＲＪＰはまた、ＭＧＯと０．１、０．５及び１．０％の濃度で、６０℃で一晩にわたって反応させた。このＭＧＯ修飾ＭＲＪＰもまた、天然酵素について記載されたものと同一の条件下で、トリプシン加水分解にかけた。ＭＧＯ修飾ＭＲＪＰ試料はまた、ＤＣＦＤＡの酸化速度を低減するそれらの能力についても試験した。２つのより高い濃度は、より高い活性であることを示した。活性のより低い量は、０．１％のＭＧＯで処置された試料で観察された。
【０１１９】
修飾ＭＧＯ（０．１、０．５及び１．０％）トリプシン消化は、質量分析法によって検討され、そのＭＳプロットを図２１〜２３に示す。非修飾のトリプシン消化のＭＳプロットを、図２０に示す。このタンパク質がその天然の状態で加水分解された場合、ＭＲＪＰ１に関するシーケンスカバレッジは広範囲であり、多数の小断片が検出された。しかしながら、ＭＧＯ修飾が、ＭＲＪＰ１上の様々なＬｙｓ及びＡｒｇ残基で発生する場合、６個までの異なる付加物が形成することが可能であり、付加物の位置的部位に基づいて発生した多くの組み合わせが、より多くのペプチドを生じさせた。この修飾はまた、トリプシンに関する開裂部位を遮断するので、このことが生じるペプチドのポテンシャル数を減少させる。Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基の修飾を介して、特定の部位が開裂されることが阻止されるとともに、観察されるものは非常に多数のより大きなペプチドである。多数のペプチドは、ＭＧＯ処置ＭＲＪＰ１に関して観察された。このことは、Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基の予期されたランダムな反応性及び目的の活性物質をもたらす様々な部位の複数の付加物の発生に関する傾向性と一致している。
【０１２０】
ＭＲＪＰ抽出物の加水分解を、トリプシンを含む様々な酵素で実施し、消化物のＭＧＯ修飾を実行した。得られた加水分解抽出物は、ＤＣＦＤＡアッセイにおいて良好な活性を有することが見出された（結果は示されず）。
【０１２１】
代替試薬による未処置ＲＪＰの修飾
グリオキサール及びグルタルアルデヒドを含むタンパク質と架橋結合する多くの他の化合物もまた、これら薬剤を使用して少量レベルの抗食作用活性が発生する可能性があるかどうかを決定するために検討が行われた。
【０１２２】
未処置ＭＲＪＰを、ペプチド及びタンパク質と架橋結合するとして既知である他の試薬で処置した。これら試薬としては、グリオキサール、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドが挙げられる。グリオキサールの溶液を、ＰＢＳを使用して１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にまで構成した。グルタルアルデヒドの原液（２５％）及びホルムアルデヒドの原液（３７％）を、ＰＢＳを使用して、それぞれ２．５倍及び３．７倍に希釈し、１０％の最終濃度を提供した。これら試薬溶液の５００μｌを、４．５ｍｌのＲＪＰ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に添加し、６０℃で一晩インキュベートした。
【０１２３】
ＲＪＰはまた、グルコース及びフルクトースと以下のように反応させた。ＰＢＳ中４．５ｍｌのタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＢＳ中それぞれの炭水化物の５００μＬ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合物を６０℃で一晩インキュベートした。ＭＲＪＰを、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬで調製し、以下の試薬で、６０℃で一晩修飾させた：１）グリオキサール、２）グルコース（１０％  ２ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ  １９．７＋１．９７）、３）フルクトース（１０％  ２ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ  ２４．１＋２．４１）、４）グルタルアルデヒド（２５％希釈  ２．５×２ｍＬ  ８００マイクロＬ＋１２ｍＬのＰＢＳ）、５）ＭＧＯ（４０％希釈  ４×２ｍＬ  ５００マイクロＬ＋１．５ｍＬ  ＰＢＳ）及び未処置ブランク。試料をＲＯＳ生成に関してＤＣＦＤアッセイで試験し、その結果を図１４に示した。ＭＲＪＰがＭＧＯ又はグルタルアルデヒドのいずれかで修飾された場合、統計的に有意な結果が確認された。グルコース又はフルクトースが架橋結合剤として使用された場合、活性は認められなかった。このことは、抗食作用活性は、共有結合又は架橋結合を形成する能力に直接的に関連することを示唆している。この活性は、最初の試料で存在していた遊離ＭＧＯに対応するために、試料の１：１０００希釈で観察された。
【０１２４】
このセクションで記載されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ研究は、ニュージーランドのウェリントンにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｃｔｒｉａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで完了した。
【０１２５】
本発明及びその実施形態が詳細に説明されてきた。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書に記載されたいずれかのプロセス、製造、物質の組成物、化合物、手段、方法、及び／又は工程の特定の実施形態に限定されるよう意図されるものではない。様々な修正、置き換え、及び変形が、本発明の精神及び／又は本質的特性から逸脱しない範囲で開示された材料になされ得る。結果的に、当業者であれば、本明細書に記載された実施形態と同様な機能を実質的に実施するか又は同様な結果を実質的に達成するような後の修正、置き換え、及び／又は変形が、本発明のこのような関連する実施形態に従って利用し得ることが、本開示から容易に理解されるであろう。したがって、以下の特許請求の範囲は、本明細書に開示されるプロセス、製造、物質の組成物、化合物、手段、方法、及び／又は工程へのこれら範囲の修正、置き換え、及び変形を包含するよう意図されている。
【０１２６】
参照文献
Ｋ．  Ｋｏｈｎｏ，  Ｉ．  Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｏ．  Ｓａｎｏ，  Ｎ．  Ａｒａｉ，  Ｋ．  Ｉｗａｋｉ，  Ｍ．  Ｉｋｅｄａ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，  “Ｒｏｙａｌ  Ｊｅｌｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ”，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６８  （１），  ２００４  ｐｐ．  １３８−１４５．
Ｋｉｍｕｒａ  Ｙ，  Ｍｉｙａｇｉ  Ｃ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｍ，  Ｎｉｔｏｄａ  Ｔ，  Ｋａｗａｉ  Ｎ，  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｈ．  “  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｒｏｙａｌ  ｊｅｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ  ｔｙｐｅ，  ｈｙｂｒｉｄ  ｔｙｐｅ，  ａｎｄ  ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｔｙｐｅ  ｇｌｙｃａｎｓ．”  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４（１０）  （２０００）  ｐｐ  ２１０９−２０．
Ｊ．  Ｓｉｍｕｔｈ，  Ｋ．  Ｂｉｌｉｋｏｖａ，  Ｅ．  Ｋｏｖａｃｏｖａ，  Ｚ．  Ｋｕｚｍｏｖａ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｏｎｅｙ：  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｊｅｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｈｏｎｅｙ”；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５２（８），  ２００４；  ｐｐ．  ２１５４−８．
Ｂ．  Ｌｅｒｒｅｒ，  Ｋ．  Ｚｉｎｇｅｒ−Ｙｏｓｏｖｉｃｈ，  Ｂ．  Ａｖｒａｈａｍｉ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｇｉｌｂｏａ−Ｇａｒｂｅｒ，  “Ｈｏｎｅｙ  ａｎｄ  ｒｏｙａｌ  ｊｅｌｌｙ，  ｌｉｋｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ，  ａｂｒｏｇａｔｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ａｄｈｅｓｉｏｎ”；  ＩＳＭＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １，  ２００７；  ｐｐ．  １４９−１５５．
Ｅ．  Ｍａｖｒｉｃ，  Ｓ．  Ｗｉｔｔｍａｎｎ，  Ｇ．  Ｂａｒｔｈ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｈｅｎｌｅ  “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ  ａｓ  ｔｈｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｎｕｋａ  （Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）  ｈｏｎｅｙｓ  ｆｒｏｍ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ”；  Ｍｏｌ．  Ｎｕｔｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．  ５２，  ２００８．
Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．  （１９９１）．  “Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，  ＴＨＰ−１：  ａ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．  ４７：２２-３１．
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Ａｌｌｅｎ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｐ．  Ｃ．  Ｍｏｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．．  （１９９１）．  “Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｈｏｎｅｙｓ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４３（１２）：  ８１７−２２．
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Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｗ．  Ｃ．  Ｂｒｏｃｋ，１  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｃｏｔｈａｍ，１  Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｒ．  Ｔｈｏｒｐｅ，１  Ｊｏｈｎ  Ｗ  Ｂａｙｎｅｓ１  ａｎｄ  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．  Ａｍｅｓ２．  （２００７）．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２００７；  ４２：  ８９-１００
【図１】
2014515724.tif 000008
【図２】
2014515724.tif 000009
【図３】
2014515724.tif 000010
【図４】
2014515724.tif 000011
【図５】
2014515724.tif 000012
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月23日(2013.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2014515724.tif 000042
2014515724.tif 000043
2014515724.tif 000044
2014515724.tif 000045