(57)【要約】  本開示は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−クルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼのうちの２つ以上を含んでいる宿主細胞；ならびにセロデキストリンを分解する目的、炭化水素もしくは炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する目的、またはグルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる目的において、そのような細胞を用いる方法に関する。
2014506464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項２】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［Ｃ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項３】
グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによってグルコース−１−リン酸に分解され、
セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる、方法。
【請求項４】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えホスホグルコムターゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、分解される、方法。
【請求項１６】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えホスホグルコムターゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは上記細胞に輸送され、上記宿主細胞は輸送されたセロデキストリンから炭化水素または炭化水素誘導体を生成する、方法。
【請求項１７】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、分解される、方法。
【請求項２２】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは上記細胞に輸送され、上記宿主細胞は、輸送されたセロデキストリンから炭化水素または炭化水素誘導体を生成する、方法。
【請求項２３】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
上記組換えポリペプチドは、当該組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項３９】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項４０】
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
当該第２の組換えポリペプチドは、−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有している、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２と膜貫通型のαヘリックス３とを接続するループが配列番号３を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型の配列番号４を含んでいるαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６と膜貫通型のαヘリックス７との間にある配列が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいるポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が、配列番号８を含んでいるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含んでいる、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記位置は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置にある、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン酸（Ｅ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項６２】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項６３】
グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによってグルコース−１−リン酸に分解され、
セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる、方法。
【請求項６４】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項６９】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項７０】
グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法であって、
（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによってグルコース−１−リン酸に分解され、
セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる、方法。
【請求項７１】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項６１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項６１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項６１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項６１〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは分解される、方法。
【請求項８２】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項８３】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項８６〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８６〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
上記組換えポリペプチドは、当該組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる、請求項８６〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を有しており、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでいる、請求項６１〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに:
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記第１の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項９８】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記第１の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項９９】
上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
上記第１の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１０１】
上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
上記第１の組換えポリペプチドは１つ以上の変異を含んでいる、請求項９７〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
上記第１の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９７〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項９７〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項９７〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項１１１】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項１１２】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１１０または１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項１１０〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
セロデキストリンを分解する方法であって、
（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される、方法。
【請求項１１７】
炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法であって、
（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有しており、
上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する、方法。
【請求項１１８】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１１６または１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項１１６〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項１１０〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）、および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１２２〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２２〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
上記宿主細胞は、組換えセロデキストリントランスポータをさらに含んでおり、
上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２と膜貫通型のαヘリックス３とを接続するループが配列番号３を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型の配列番号４を含んでいるαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６と膜貫通型のαヘリックス７との間にある配列が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいるポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が、配列番号８を含んでいるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含んでいる、請求項６１〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１２９〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記位置は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置にある、請求項１２９〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン酸（Ｅ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２９〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでおり、請求項９７〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項９７〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
上記宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子をさらに含んでおり、
少なくとも１つのグルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、当該タンパク質の野生型の活性レベルと比べて変更されている、請求項１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
上記１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１からなる群から選択される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
上記１つ以上のグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて向上されている、請求項１３８または１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
上記１つ以上のグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて低下されている、請求項１３８または１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
セロデキストリンの上記源は、セルロースを含んでいる、請求項１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
上記セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群から選択される１つ以上から選択される、請求項１〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
上記炭化水素または炭化水素誘導体は燃料として使用され得る、請求項２、４〜１４、１６〜２０、２２〜３７、３９〜６０、６２、６４〜６７、６９、７１〜８０、８２〜９６、９８〜１０９、１１１〜１１５および１１７〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
上記炭化水素または炭化水素誘導体はエタノールを含んでいる、請求項２、４〜１４、１６〜２０、２２〜３７、３９〜６０、６２、６４〜６７、６９、７１〜８０、８２〜９６、９８〜１０９、１１１〜１１５および１１７〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
上記エタノールは、少なくとも約０．１０〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間の範囲の速度において生成される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
上記炭化水素または炭化水素誘導体はブタノールを含んでいる、請求項２、４〜１４、１６〜２０、２２〜３７、３９〜６０、６２、６４〜６７、６９、７１〜８０、８２〜９６、９８〜１０９、１１１〜１１５および１１７〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
上記宿主細胞は真菌細胞である、請求項１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
上記宿主細胞は酵母細胞である、請求項１〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
上記酵母細胞はS.cerevisiaeである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリペプチドは、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）、またはＹ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項１５２】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１５１に記載の宿主細胞。
【請求項１５３】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項１５１に記載の宿主細胞。
【請求項１５４】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１５３に記載の宿主細胞。
【請求項１５５】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１５１〜１５４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１５６】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項１５５に記載の宿主細胞。
【請求項１５７】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５１〜１５６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１５８】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項１５１〜１５７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１５９】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１５８に記載の宿主細胞。
【請求項１６０】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項１５１〜１５９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１６１】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１６０に記載の宿主細胞。
【請求項１６２】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１６１に記載の宿主細胞。
【請求項１６３】
組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えホスホグルコムターゼを含んでいる、宿主細胞。
【請求項１６４】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１６３に記載の宿主細胞。
【請求項１６５】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項１６３または１６４に記載の宿主細胞。
【請求項１６６】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１６５に記載の宿主細胞。
【請求項１６７】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１６６に記載の宿主細胞。
【請求項１６８】
組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる、宿主細胞。
【請求項１６９】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１６８に記載の宿主細胞。
【請求項１７０】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１６９に記載の宿主細胞。
【請求項１７１】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項１６８〜１７０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７２】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１７１に記載の宿主細胞。
【請求項１７３】
上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記組換えポリペプチドは、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）、またはＹ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項１６３〜１７２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７４】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１７３に記載の宿主細胞。
【請求項１７５】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項１７３に記載の宿主細胞。
【請求項１７６】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１７５に記載の宿主細胞。
【請求項１７７】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１７３〜１７６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７８】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項１７７に記載の宿主細胞。
【請求項１７９】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７３〜１７８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８０】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、βグルコシダーゼ活性を有している、請求項１５１〜１７９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８１】
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項１８０に記載の宿主細胞。
【請求項１８２】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１８０または１８１に記載の宿主細胞。
【請求項１８３】
組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項１８４】
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項１８３に記載の宿主細胞。
【請求項１８５】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１８３または１８４に記載の宿主細胞。
【請求項１８６】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項１８３〜１８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８７】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１８６に記載の宿主細胞。
【請求項１８８】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項１８３〜１８７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８９】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項１８８に記載の宿主細胞。
【請求項１９０】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９１】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項１８３〜１９０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９２】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１９１に記載の宿主細胞。
【請求項１９３】
上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項１９１に記載の宿主細胞。
【請求項１９４】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項１９３に記載の宿主細胞。
【請求項１９５】
上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１９１〜１９４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９６】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項１９５に記載の宿主細胞。
【請求項１９７】
上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９１〜１９６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９８】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２と膜貫通型のαヘリックス３とを接続するループが配列番号３を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型の配列番号４を含んでいるαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６と膜貫通型のαヘリックス７との間にある配列が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいるポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が、配列番号８を含んでいるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含んでいる、請求項１５１〜１９７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９９】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである、請求項１９８に記載の宿主細胞。
【請求項２００】
上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している、請求項１９９に記載の宿主細胞。
【請求項２０１】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項１５１〜２００のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０２】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項２０１に記載の宿主細胞。
【請求項２０３】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置にある、請求項１５１〜２０２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０４】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン酸（Ｅ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５１〜２０２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０５】
組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項２０６】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２０５に記載の宿主細胞。
【請求項２０７】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項２０５または２０６に記載の宿主細胞。
【請求項２０８】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２０７に記載の宿主細胞。
【請求項２０９】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２０８に記載の宿主細胞。
【請求項２１０】
組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項２１１】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２１０に記載の宿主細胞。
【請求項２１２】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２１１に記載の宿主細胞。
【請求項２１３】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項２１０〜２１２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１４】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２１３に記載の宿主細胞。
【請求項２１５】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２０５〜２１４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１６】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項２０５〜２１４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１７】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）、および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２１６に記載の宿主細胞。
【請求項２１８】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項２０５〜２１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１９】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項２１８に記載の宿主細胞。
【請求項２２０】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０５〜２１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２１】
組換えホスホグルコムターゼおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる、宿主細胞。
【請求項２２２】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２２１に記載の宿主細胞。
【請求項２２３】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２２１または２２２に記載の宿主細胞。
【請求項２２４】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２２３に記載の宿主細胞。
【請求項２２５】
上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記組換えポリペプチドは、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）、またはＹ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項２２１〜２２４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２６】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２２５に記載の宿主細胞。
【請求項２２７】
上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項２２５に記載の宿主細胞。
【請求項２２８】
上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）、および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２２７に記載の宿主細胞。
【請求項２２９】
上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項２２５〜２２８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２３０】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項２２９に記載の宿主細胞。
【請求項２３１】
上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２５〜２３０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２３２】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している、請求項２０５〜２３１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２３３】
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項２３２に記載の宿主細胞。
【請求項２３４】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２３２または２３３に記載の宿主細胞。
【請求項２３５】
第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記第１の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有しており、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項２３６】
上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２３５に記載の宿主細胞。
【請求項２３７】
上記第１の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項２３５に記載の宿主細胞。
【請求項２３８】
上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２３７に記載の宿主細胞。
【請求項２３９】
上記第１の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項２３５〜２３８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２４０】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項２３９に記載の宿主細胞。
【請求項２４１】
上記第１の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３５〜２４０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２４２】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項２３５〜２４１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２４３】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２４２に記載の宿主細胞。
【請求項２４４】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項２３５〜２４３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２４５】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２４４に記載の宿主細胞。
【請求項２４６】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２４５に記載の宿主細胞。
【請求項２４７】
組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項２４８】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２４７に記載の宿主細胞。
【請求項２４９】
上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる、請求項２４７または２４８に記載の宿主細胞。
【請求項２５０】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２４９に記載の宿主細胞。
【請求項２５１】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２５０に記載の宿主細胞。
【請求項２５２】
組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）からなる群から選択される１つ以上の配列を含んでおり、βグルコシダーゼ活性を有している、宿主細胞。
【請求項２５３】
上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２５２に記載の宿主細胞。
【請求項２５４】
上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である、請求項２５３に記載の宿主細胞。
【請求項２５５】
上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる、請求項２５２〜２５４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２５６】
上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる、請求項２５５に記載の宿主細胞。
【請求項２５７】
上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでおり、
上記第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している、請求項２４７〜２５６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２５８】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２５７に記載の宿主細胞。
【請求項２５９】
上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している、請求項２５７に記載の宿主細胞。
【請求項２６０】
上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）、および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２５９に記載の宿主細胞。
【請求項２６１】
上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項２５７〜２６０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２６２】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項２６１に記載の宿主細胞。
【請求項２６３】
上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５７〜２６２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２６４】
上記宿主細胞は、組換えセロデキストリントランスポータをさらに含んでおり、
上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２と膜貫通型のαヘリックス３とを接続するループが配列番号３を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型の配列番号４を含んでいるαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６と膜貫通型のαヘリックス７との間にある配列が配列番号６を含んでいるポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいるポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が、配列番号８を含んでいるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含んでいる、請求項２０５〜２６３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２６５】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである、請求項２６４に記載の宿主細胞。
【請求項２６６】
上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）のアミノ酸配列に対して、有している、請求項２６５に記載の宿主細胞。
【請求項２６７】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる、請求項２６４〜２６６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２６８】
上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である、請求項２６７に記載の宿主細胞。
【請求項２６９】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せからなる群から選択される位置にある、請求項２６４〜２６８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７０】
上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでおり、
１つ以上の上記アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン酸（Ｅ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６４〜２６８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７１】
β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）からなる群から選択される２つ以上の配列を含んでいる、請求項２３５〜２７０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７２】
β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる、請求項２７１に記載の宿主細胞。
【請求項２７３】
上記宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子さらに含んでおり、
少なくとも１つのグルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、当該タンパク質の野生型の活性レベルと比べて変更されている、請求項１５１〜２７２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７４】
１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１からなる群から選択される、請求項２７３に記載の宿主細胞。
【請求項２７５】
少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて向上されている、請求項２７３または２７４に記載の宿主細胞。
【請求項２７６】
少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて低下されている、請求項２７３または２７４に記載の宿主細胞。
【請求項２７７】
上記宿主細胞は真菌細胞である、請求項１５１〜２７６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７８】
上記宿主細胞は酵母細胞である、請求項１５１〜２７７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７９】
上記酵母細胞はS.cerevisiaeである、請求項２７８に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願に対する相互参照〕
本願は、いずれも参照によってその全体が本明細書に援用される米国仮出願第６１／４４０，３０５号（出願日：２０１１年２月７日）、および米国仮出願第６１／５６６，５４８号（出願日：２０１１年１２月２日）の利益を主張する。
【０００２】
ASCIIテキストファイル（配列表のコンピュータ読取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：677792001340SeqList.txt、記録日：２０１２年２月６日、サイズ：１２０９ＫＢ））に基づく以下の提出物の内容は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本開示は、セロデキストリンを分解するための、および炭化水素または炭化水素誘導体を生成するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
生物燃料は、エネルギー確保、環境維持および世界的な気候変動について増大する懸念に起因して、集中的に研究されている（Lynd et al., Science, 1991）。植物由来のリグノセルロース材料の、生物燃料への生物変換は、化石燃料の化学製品に対する魅力的な代替物と考えられている（Lynd et al., Nat Biotech, 2008; Hahn-Hagerdal et al., Biotechnol Biofuels, 2006）。リグノセルロースバイオマスの、エタノールへの変換を効率的に行うための微生物の改変は、依然として生物燃料分野の主な目標である。多くの研究は、リグノセルロースバイオマスの重合体を微生物に分解可能にさせるセルラーゼおよび他の酵素を発現させ、１つの細胞内（統合されたバイオプロセシング（ＣＢＰ）として公知の過程）においてエタノールを生成させるために、単純な糖をアルコールに発酵させる微生物を、遺伝的に操作することに集約されている。
【０００５】
パン酵母としても知られているSaccharomyces cerevisiaeは、単純なヘキソース糖の、エタノールへの生物変換のために数千年にわたって使用されている。Saccharomyces cerevisiaeは、Ｄ−グルコースの、エタノールへの大規模な工業的な発酵に、最も広く使用されている微生物である。S. cerevisiaeは、リグノセルロースバイオマスの、生物燃料への生物変換に非常に適した候補である（van Maris et al., Antonie Van Leeuwenhoek, 2006）。S. cerevisiaeは、よく研究されている遺伝的背景および生理学的背景、豊富な遺伝学的ツール、ならびに高濃度のエタノールおよびリグノセルロース加水分解物に存在する阻害剤に対する高い耐性を有している（effries, Curr Opin Biotechnol, 2006）。また、S. cerevisiaeの低い発酵ｐＨは、発酵の間における細菌汚染を防ぎ得る。
【０００６】
しかし、S. cerevisiaeは、植物の細胞壁に存在するより複雑なバイオマス重合体（例えばセルロース）を、天然に分解しないし、発酵させない。バイオマス重合体の分解に有用な酵素は、天然にバイオマスを分解する生物（例えば、Neurospora crassaおよびTrichoderma reesei）に求められている。N. crassaにおける植物壁分解の最近の研究は、種々のセルラーゼの発現に加えて、N. crassaが、セルロースに応じてセロデキストリントランスポータおよび細胞内β−グルコシダーゼを発現することを示した（Tian et al., PNAS USA 106, 22157, 2009；Galazka et al., Science 330, 84, 2010）。セロデキストリンは、グルコースのβ（１→４）結合したオリゴ糖であり、真菌のセルラーゼによるセルロース脱重合の生成物である（Zhang and Lynd, Biotechnol Bioeng 88, 797, 2004）。β−グルコシダーゼはセロデキストリンをグルコースに加水分解する。
【０００７】
セロデキストリントランスポータおよび細胞内β−グルコシダーゼを発現させるために改変されたS. cerevisiaeは、単独の炭素源としてセロデキストリンを用いて増殖可能であり、セロビオースをエタノールに効率的に発酵可能である（Galazka et al., Science 330, 84, 2010）。しかし、セロデキストリンをグルコースに加水分解するためにβ−グルコシダーゼを用いることは、１つのグルコースにつき１つのＡＴＰを消費する、さらなる過程が生じ得る前の反応において、生成されたすべてのグルコースが、グルコース−６−リン酸までリン酸化されることを必要とする。これは、ＡＴＰが供給不足のとき問題になる。
【０００８】
さらに、セロデキストリンの輸送、これに続く細胞内の加水分解は、S. cerevisiaeが通常には利用できないセルロース由来のグルコースおよびヘミセルロース由来のキシロースの共発酵を促進する。しかし、これらの改変株は、グルコースを検出し、グルコースに応答するためのそれらの内因性の系が、グルコースの細胞外レベルに依存しているので、最適な代謝をともなってグルコースを発酵し得ない。グルコースが、セロデキストリンを細胞に輸送すること、およびセロデキストリンを細胞内において分解することによって細胞内に生成されるので、上記改変株において、グルコースの細胞外レベルは、細胞が利用可能なグルコースのレベルにもはや関連しない。
【０００９】
したがって、バイオマス重合体の、生物燃料および他の有用な化学物質への統合されたバイオプロセシングを実行し得、かつセロデキストリンの切断から生成されるグルコースをリン酸化するときにより少ないＡＴＰを消費する、改良された改変酵母株に対する必要性が存在している。
【発明の概要】
【００１０】
上述の必要性を満たすために、本開示は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−グルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞；ならびにセロデキストリンを分解する目的、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する目的、およびセロデキストリン利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる目的において、そのような細胞を用いる方法を提供する。さらに、本開示は、β−グルコシダーゼではなく細胞内セロデキストリンホスホリラーゼを発現するために改変酵母株が、β−グルコシダーゼを発現する酵母株と比べて、セロデキストリンの利用においてＡＴＰをより少なく消費し、ほぼ等量のエタノールを生成したという新規な発見に少なくとも部分的に基づいている。有利なことに、セロデキストリンホスホリラーゼは、無機リン酸を利用して、セロデキストリンにおけるグルコース部分の間にあるβ−グリコシド結合を切断する。加リン酸分解反応は、切断反応につき１当量のＡＴＰの消費を低下させ、グルコース−１−リン酸の放出を生じる（図１）。生じたグルコース−１−リン酸は、それから、ホスホグルコムターゼによって、グルコース−６−リン酸に変換され得る（図１）。さらに上記酵母は、生じたグルコース−６−リン酸を成長および発酵のために直接的に利用し得る。
【００１１】
したがって、本開示の一部の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。本開示の他の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによってグルコース−１−リン酸に分解され、ここで、セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでおり、１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００１２】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えホスホグルコムターゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えホスホグルコムターゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記宿主細胞は、輸送されたセロデキストリンから炭化水素または炭化水素誘導体を生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００１３】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは上記細胞に輸送され、上記宿主細胞は、輸送されたセロデキストリンから炭化水素または炭化水素誘導体を生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。
【００１４】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでおり、１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、当該組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１���０％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００１５】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３��％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００１６】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２および膜貫通型のαヘリックス３を接続するループが配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６および膜貫通型のαヘリックス７の間にある配列が配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が配列番号８を含んでいる、ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである。一部の実施形態において、上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該位置は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７��番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００１７】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。本開示の他の局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって、グルコース−１−リン酸に分解され、セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００１８】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。本開示の他の局面は、（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによってグルコース−１−リン酸に分解され、セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００１９】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、当該組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。
【００２０】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２のポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００２１】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該第１の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、複数の上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。第１の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ���［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、複数の上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第１の��換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００２２】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００２３】
本開示のいくつかの局面は、（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記組換えポリペプチドによって分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。
【００２４】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００２５】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えセロデキストリントランスポータをさらに含んでいる。当該組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２および膜貫通型のαヘリックス３を接続するループが配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６および膜貫通型のαヘリックス７の間にある配列が配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびそれらの間にある配列が配列番号８を含んでいる、ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである。一部の実施形態において、上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該位置は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ)の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置におけ���、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００２６】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子をさらに含んでいる。少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、当該タンパク質の野生型の活性と比べて変更されている。一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて、向上されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて、低下されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンの上記源は、セルロースを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントース、およびセロヘキソースからなる群の１つ以上から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、燃料として使用され得る。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、エタノールを含んでいる。一部の実施形態において、エタノールは、少なくとも約０．１０〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間の範囲にある速度において生成される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、ブタノールを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は真菌細胞である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、上記酵母細胞はS.cerevisiaeである。
【００２７】
本開示の他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）、またはＹ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００２８】
本開示の他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えホスホグルコムターゼを含んでいる宿主細胞に関する。一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００２９】
本開示の他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞に関する。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。
【００３０】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該組換えポリペプチドは、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）、またはＹ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００３１】
本開示の他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ��−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目��アミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００３２】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が、配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２および膜貫通型のαヘリックス３を接続するループが配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が、 配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が、 配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７の間にある配列が配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリッ���ス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が、配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびそれらの間にある配列が配列番号８を含んでいる、ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである。一部の実施形態において、上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ)の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列��号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００３３】
本開示の他の局面は、組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００３４】
本開示の他の局面は、組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００３５】
本開示の他の局面は、組換えホスホグルコムターゼおよび組換えヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞に関する。一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該組換えポリペプチドは、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）、またはＹ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００３６】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２のポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００３７】
本開示の他の局面は、第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該第１の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列���号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第１の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００３８】
本開示の他の局面は、組換えホスホグルコムターゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。
【００３９】
本開示の他の局面は、組換えヘキソキナーゼおよび組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞に関する。当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでおり、β−グルコシダーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えホスホグルコムターゼをさらに含んでいる。一部の実施形態において、組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。
【００４０】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、第２の組換えポリペプチドをさらに含んでいる。当該第２の組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでおり、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有している。一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記第２の組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。
【００４１】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えセロデキストリントランスポータをさらに含んでいる。当該組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２および膜貫通型のαヘリックス３を接続するループが配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６および膜貫通型のαヘリックス７の間にある配列が配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびそれらの間にある配列が配列番号８を含んでいる、ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである。一部の実施形態において、上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ)の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する���置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００４２】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子をさらに含んでいる。少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、当該タンパク質の野生型の活性と比べて変更されている。一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて向上されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて低下されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は真菌細胞である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、上記酵母細胞はS.cerevisiaeである。
【００４３】
本開示の一部の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータ、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチド、組換えホスホグルコムターゼ、および組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンを分解する方法に関する。セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでいる。β−グルコシダーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、分解される。本開示の他の局面は、（ａ）組換えセロデキストリントランスポータ、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチド、組換えホスホグルコムターゼ、および組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに（ｂ）セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において、上記宿主細胞を培養することによって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでいる。β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。上記（ｂ）によって、セロデキストリンは、上記細胞に輸送され、分解され、上記宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えセロデキストリントランスポータ、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチド、組換えホスホグルコムターゼ、および組換えヘキソキナーゼの２つ以上、３つ以上または４つを含んでいる。セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ��２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでいる。β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。
【００４４】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼである。一部の実施形態において、上記セロビオースホスホリラーゼは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のα��リックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２および膜貫通型のαヘリックス３を接続するループが配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６および膜貫通型のαヘリックス７の間にある配列が配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；ならびに膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通��のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が、配列番号８を含んでいる、ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである。一部の実施形態において、上記セロビオーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該位置は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ)の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ
）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子をさらに含んでいる。少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、当該タンパク質の野生型の活性と比べて変更されている。一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて向上されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて低下されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンの上記源は、セルロースを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントース、およびセロヘキソースから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、燃料として使用され得る。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、エタノールを含んでいる。一部の実施形態において、エタノールは、少なくとも約０．１０〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間の範囲にある速度において生成される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、ブタノールを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は真菌細胞である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、上記酵母細胞はS.cerevisiaeである。
【００４５】
本開示の他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータ、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチド、組換えホスホグルコムターゼ、および組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞に関する。セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでいる。β−グルコシダーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、組換えセロデキストリントランスポータ、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有している組換えポリペプチド、組換えホスホグルコムターゼ、および組換えヘキソキナーゼの２つ以上、３つ以上または４つを含んでいる。セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでいる。β−グルコシダーゼ活性を有している当該組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１８）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１９）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号２０）から選択される１つ以上の配列を含んでいる。
【００４６】
一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、セロビオースホスホリラーゼである。一部の実施形態において、上記組換えセロビオースホスホリラーゼは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）および配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）から選択されるアミノ酸に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せから選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）、［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）、および［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）から選択される２つ以上の配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、β−グルコシダーゼ活性を有している上記組換えポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、NCU00130のアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えホスホグルコムターゼは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）のアミノ酸配列を有している保存されたモチーフを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えヘキソキナーゼはＨＸＫ１である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１が配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２が配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス２および膜貫通型のαヘリックス３を接続するループが、配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス５が配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６が配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス６および膜貫通型のαヘリックス７の間にある配列が配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス７が配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；および膜貫通型のαヘリックス１、膜貫通型のαヘリックス２、膜貫通型のαヘリックス３、膜貫通型のαヘリックス４、膜貫通型のαヘリックス５、膜貫通型のαヘリックス６、膜貫通型のαヘリックス７、膜貫通型のαヘリックス８、膜貫通型のαヘリックス９、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαヘリックス１０、膜貫通型のαヘリックス１１およびこれらの間にある配列が、配列番号８を含んでいる、ポリペプチドから選択されるポリペプチドを含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、セロビオーストランスポータである。一部の実施形態において、上記セロビ��ーストランスポータは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、配列番号９（ＣＤＴ−１）または配列番号１０（ＣＤＴ−２）に対して、有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、１つ以上の変異を含んでいる。一部の実施形態において、上記１つ以上の変異はアミノ酸置換である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記組換えセロデキストリントランスポータは、配列番号９（ＣＤＴ−１）のアミノ酸配列の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の当該アミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ)の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９
の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；およびこれらの組合せから選択される位置にある。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子をさらに含んでいる。少なくとも１つの当該グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、当該タンパク質の野生型の活性と比べて変更されている。一部の実施形態において、上記１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて向上されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、少なくとも１つの上記グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性レベルは、その野生型の活性レベルと比べて低下されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は真菌細胞である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、上記酵母細胞はS.cerevisiaeである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、酵母に存在する代謝経路および本開示の新規な代謝経路の間における比較を示している。酵母における標準的な代謝経路は、ハッチドライン（hatched line）の左に示されている。ここで、グルコースは、ヘキソーストランスポータを介して細胞に入り、それからヘキソキナーゼによってリン酸化されて、グルコース−１−リン酸を形成する。本開示の新規な代謝経路は、ハッチドラインの右に示されている。ここで、セロデキストリンは、セロデキストリントランスポータを介して細胞に入る。続いて、１つのグルコース部分は、セロデキストリンホスホリラーゼによって切断され、グルコース−１−リン酸および短縮されたセロデキストリンを生じる。グルコース−１−リン酸は、ホスホグルコムターゼによってグルコース−６−リン酸に変換される。図１は、セロトリオースが炭素源として使用される場合の模式図を示している。
【図２】図２は、考えらえる２つのセロビオースの発酵経路を模式的に示している。セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ）による原形質膜を越える輸送に続いて、セロビオースは、β−グルコシダーゼ（例えばＧＨ１）を介した加水分解（左パネル）またはセロビオースホスホリラーゼ（例えばＣＢＰ）を介した加リン酸分解（右パネル）のいずれかによって切断される。細胞内のグルコースは、加水分解経路において形成され、ヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）によってグルコース−６−リン酸（Ｇｌｃ６Ｐ）に変換される。細胞内のグルコースおよびグルコース−１−リン酸は、加リン酸分解経路において形成される。ここで、グルコース−１−リン酸は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によってＧｌｃ６Ｐに変換され、グルコースは、ＨＸＫによってＧｌｃ６Ｐに変換される。両方の経路において、Ｇｌｃ６Ｐは、内因性の酵母の酵素によってエタノールおよびＣＯ２まで発酵される。酵母において改変された酵素は強調されている。
【図３】図３は、改変された３つの酵母株のセロビオース発酵のプロファイルを示しており、当該酵母株は、セロデキストリントランスポータ遺伝子ｃｄｔ−１、および３つあるうちの１つのセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を発現している。上記株がセロビオース（菱形）をエタノール（三角）に発酵させた速度は、酸素制限条件において決定された。また、生成されたバイオマスの量が観察された（丸）。各プロファイルは、独立した２つ１組において取られ、反復の間における変動は５％未満であった。代表的なプロファイルが示されている。図３Ａは、ｃｄｔ−１、およびC. gilvus由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。図３Ｂは、ｃｄｔ−１、およびS. degradans由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。図３Ｃは、ｃｄｔ−１、およびC. thermocellum由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。
【図４】図４は、セロデキストリントランスポータ遺伝子ｃｄｔ−１およびセロビオースホスホリラーゼ遺伝子とともに、ＰＧＭにとってのS. cerevisiae遺伝子を発現している改変された３つの酵母株のセロビオース発酵のプロファイルを示している。上記株がセロビオース（三角）をエタノール（菱形）に発酵させた速度は、酸素制限条件において決定された。また、生成されたバイオマスの量が観察された（丸）。各プロファイルは、独立した２つ１組において取られ、反復の間における変動は５％未満であった。
【図５】図５は、セロデキストリントランスポータ遺伝子ｃｄｔ−１の自然に生成された変異を有している、改変酵母株の発酵プロファイルを示している。上記株がセロビオース（三角）をエタノール（菱形）に発酵させた速度は、酸素制限条件において決定された。また、生成されたバイオマスの量が観察された（丸）。すべての値は、２つの独立した発酵に関する結果の平均であり、エラーバーは、２つの発酵の間における結果の標準偏差を表している。図５Ａは、野生型ｃｄｔ−１、およびS. degradans由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。図５Ｂは、変異体ｃｄｔ−１（Ｆ２１３Ｌ）、およびS. degradans由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。図５Ｃは、野生型ｃｄｔ−１およびβグルコシダーゼ遺伝子ｇｈｌ−１を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。図５Ｄは、変異体ｃｄｔ−１（Ｆ２１３Ｌ）およびβグルコシダーゼ遺伝子ｇｈｌ−１を用いて形質転換されたS. cerevisiaeのＤ４５２−２株を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、種々の変異体ＣＤＴ−１を用いた、加水分解経路を介したセロビオース発酵の時間プロファイルを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、種々の変異体ＣＤＴ−１を用いた、加リン酸分解経路を介したセロビオース発酵の時間プロファイルを示している。
【図７】図７は、種々のセロデキストリントランスポータ遺伝子（ｃｄｔ−１）の変異体（Ｑ９１Ａ、Ｑ１０４Ａ、Ｆ１７０Ａ、Ｒ１７４Ａ、Ｅ１９４Ａ、Ｆ２１３ＬおよびＦ３３５Ａ）を有している改変酵母株のセロビオース消費およびエタノール生成を示している。S. cerevisiaeのＤ４５２−２株は、野生型ｃｄｔ−１もしくはｃｄｔ−１変異体のいずれか、およびβ−グルコシダーゼ遺伝子ｇｈｌ−１もしくはS. degradans由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を用いて形質転換された。種々のｃｄｔ−１変異体およびセロビオースホスホリラーゼを用いた生産性は、ｙ軸に沿って示されており、種々のｃｄｔ−１変異体およびβグルコシダーゼを用いた生産性は、ｘ軸に沿って示されている。すべての値は、２つの独立した発酵の結果の平均であり、エラーバーは、２つの発酵の間における結果の標準偏差を表している。図７Ａはセロビオース消費速度を示している。図７Ｂはエタノール生成の速度を示している。
【図８】図８は、野生型ｃｄｔ−１および３つのｃｄｔ−１変異体の輸送動態を示している。野生型ｃｄｔ−１、ｃｄｔ−１（Ｇ９１Ａ）、ｃｄｔ−１（Ｆ３３５Ａ）、またはｃｄｔ−１（Ｆ２１３Ｌ）を発現している改変された酵母への［３Ｈ］セロビオース取込みの線形速度は、種々の濃度のセロビオースを用いて決定された。エラーバーは、各濃度における３つの反復測定の標準偏差を示している。図８Ａは野生型ｃｄｔ−１の輸送動態を示している。図８Ｂはｃｄｔ−１（Ｇ９１Ａ）の輸送動態を示している。図８はｃｄｔ−１（Ｆ３３５Ａ）の輸送動態を示している。図８はｃｄｔ−１（Ｆ２１３Ｌ）の輸送動態を示している。
【図９】図９は、ＣＤＴ−１変異体の発現レベルおよび発酵能の間における相関を示している。セロビオースは、ＣＤＴ−１のＧＦＰタグ付きの１つの変異体およびβ−グルコシダーゼＧＨ−１もしくはセロビオースホスホリラーゼＳｄＣＢＰのいずれかを有している改変酵母株によってエタノールに発酵させられた。これらの発酵の対数期の間に、細胞を回収し、ＧＦＰ蛍光を、測定し、培養ＯＤについて補正した後にプロットした。示されている値は２つの発酵の平均であり、エラーバーは２つの発酵の間における標準偏差を表している。図９Ａは、ＣＤＴ−１のＧＦＰタグ付きの１つの変異体およびβ−グルコシダーゼＧＨ−１を有している改変酵母株を示している。図９Ｂは、ＣＤＴ−１のＧＦＰタグ付きの１つの変異体およびセロビオースホスホリラーゼＳｂＣＢＰを有している改変酵母株を示している。
【図１０】図１０は、細胞抽出物における、精製されたβ−グルコシダーゼＧＨ−１、S. degradansのセロビオースホスホリラーゼＳｄＣＢＰ、およびS. cerevisiaeのヘキソキナーゼの活性を示している。細胞抽出物は、グルコース富化培地（ＹＰＤ８０）に基づいて増殖するＤ４５２−２酵母と、セロデキストリントランスポータＣＤＴ−１およびβ−グルコシダーゼもしくはS. degradansのセロビオースホスホリラーゼＳｄＣＢＰのいずれかを発現している、グルコース富化培地（ＹＰＤ８０）に基づいて増殖するＤ４５２−２酵母とから回収された。１０μｇの抽出物におけるヘキソキナーゼ活性またはセロビアーゼ活性の程度（機序に関わらず放出されたグルコースの割合と規定される）が測定された。さらに、各株に存在するトランスポータの量は、ＧＦＰ蛍光を測定することによって見積もられた。結果は、３つの培養物の平均±標準偏差である。図１０Ａはトランスポータの存在量を示している。図１０Ｂはセロビオース活性を示している。図１０Ｃはヘキソキナーゼ活性を示している。
【図１１】図１１は、β−グルコシダーゼＧＨ−１のグリコシル転移活性を示している。２００ｐｋａｔの精製されたＧＨ−１はいずれも、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、３０℃において２４時間にわたって、２０％（ｗ／ｖ）のセロビオースとともにインキュベートされた。同じインキュベーションが、コントロールとして酵素なしで実施された。それから生成物はＨＰＬＣによって分析された。
【図１２】図１２は、精製されたＧＨ−１およびＳｂＣＢＰ酵素の特性を示している。β−グルコシダーゼＧＨ−１およびS. degradansのセロビオースホスホリラーゼＳｂＣＢＰは、試験された酵母株から直接的に精製された。触媒の線形速度は、種々のセロビオース濃度において３つ１組にして決定され、動態パラメータは、非線形回帰によって決定された。図１２ＡはＧＨ−１の動態を示している。図１２ＢはＳｃＣＢＰの動態を示している。
【図１３】図１３は、精製されたヘキソキナーゼの活性に対するセロビオースの影響を示している。S. cerevisiaeの３つのキナーゼＨｘｋ１、Ｈｘｋ２およびＧｌｋ１は、E. coliから発現され、精製された。ヘキソキナーゼ活性に対するセロビオースの影響を決定するために、グルコースをリン酸化する活性の線形速度は、１８４ｍＭのセロビオースの存在下（グレーのバー）または非存在下（黒のバー）において決定された。結果は、３つ１組の測定の平均±標準偏差である。
【図１４】図１４は、変異体セロデキストリントランスポータＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）を用いた、加リン酸化経路を介した向上したセロビオース発酵能についての、ヘキソキナーゼＨｘｋ１、Ｈｘｋ２およびＧｌｋ１の過剰発現の比較を示している。図１４Ａは酵母細胞密度を示している。図１４Ｂはセロビオース消費を示している。図１４Ｃはエタノール生成を示している。
【図１５】図１５は、４つの異なる初期の細胞ＯＤ値において培養された場合における、ヘキソキナーゼＨＸＫ１およびセロデキストリントランスポータ変異体ＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）を過剰発現している改変酵母株の加リン酸化経路を介した、セロビオース発酵のプロファイルを示している。セロビオース消費（四角）、エタノール生成（菱形）、および酵母細胞密度（丸）が測定された。図１５Ａは１．６の初期ＯＤを示している。図１５Ｂは７．５の初期ＯＤを示している。図１５Ｃは１３．６の初期ＯＤを示している。図１５Ｄは２３．１の初期ＯＤを示している。
【図１６】図１６は、ヘキソキナーゼＨＸＫ１が変異体セロデキストリンＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）とともに過剰発現されている場合の加リン酸化経路を介した、初期の細胞ＯＤおよびエタノール生産性の間における比例の関係を示している。
【図１７】図１７は、Cellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼ（ＰＤＢ  2CQS）の結晶構造を示している。特定されたモチーフはネズミ色になっている。
【図１８】図１８は、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースに基づいて増殖させた改変S. cerevisiae株の増殖曲線を示している。記号：S. cerevisiaeのＤ４５２−２（黒丸）、Ｄ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１（逆三角）、Ｄ４５２−ＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌ−ＣＤＴ−１（四角）、Ｄ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１（菱形）およびＤ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ−ＣＤＴ−１（三角）。図１８Ａはセロビオースに基づく増殖を示している。図１８Ｂはセロトリオースに基づく増殖を示している。図１８Ｃはセロテトラオースに基づく増殖を示している。
【図１９】図１９は、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースに基づいて増殖させた改変S. cerevisiae株の増殖曲線を示している。記号：S. cerevisiaeのＤ４５２−２（黒丸）、Ｄ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ（逆三角）、Ｄ４５２−ＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ（四角）、Ｄ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ（菱形）およびＤ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ（三角）。図１９Ａはセロビオースに基づく増殖を示している。図１９Ｂはセロトリオースに基づく増殖を示している。図１９Ｃはセロテトラオースに基づく増殖を示している。
【図２０】図２０は、細胞外の糖の認識に関与する遺伝子の単独欠失を含んでいる、セロビオースを利用するS. cerevisiae株の増殖を示している。図２０は、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、Ｓｎｆ３欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＳｎｆ３）、Ｒｇｔ２欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＲｇｔ２）、およびＧｐｒ１欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＧｐｒ１）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。
【図２１】図２１は、細胞内シグナル経路に関与する遺伝子の単独欠失を含んでいる、セロビオースを利用するS. cerevisiae株の増殖を示している。図２１Ａは、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、Ｇｐａ２欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＧｐａ２）、およびＲａｓ２欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＲａｓ２）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。Ｇｐａ２およびＲａｓ２は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）を活性化するために平行して機能している。図２１Ｂは、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、Ｒａｓ２欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＲａｓ２）、およびＳｃｈ９欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＳｃｈ９）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。Ｓｃｈ９はＲａｓ／ＰＫＡ経路と平行して作用している。図２１Ｃは、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、およびＹａｋ１欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＹａｋ１）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。Ｙａｋ１は、Ｒａｓ／ＰＫＡ経路と平行して働いているが、細胞増殖を刺激するのではなく、阻害するタンパク質キナーゼである。
【図２２】図２２は、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、Ｇｐａ２欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＧｐａ２）、およびＧｐａ２  Ｇ１３２Ｖ変異体（Ｇｐａ２（Ｇ１３２Ｖ））を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＲａｓ２）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。
【図２３Ａ】図２３Ａは、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、およびＨｘｋ２欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＫｘｋ２）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、およびＨｘｋ２ｗｒｆ変異体を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。
【図２４】図２４は、セロビオースを利用する野生型のS. cerevisiae株（ＷＴ）、Ｒｉｍ１５欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＲｉｍ１５）、Ｓｔｂ３欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＳｔｂ３）、およびＫｃｓ１欠失を含んでいるセロビオースを利用するS. cerevisiae株（ΔＫｃｓ１）の、セロビオースおよびグルコースに基づく増殖を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
〔概要〕
本開示は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−グルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞に関する。本開示の他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−グルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびにセロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養すること（これによって、セロデキストリンが分解される）によって、セロデキストリンを分解する方法に関する。本開示のさらなる他の局面は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−グルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびにセロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養すること（これによって、当該宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する）によって、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法に関する。本開示のさらなる局面は、組換えセロデキストリンホスホリラーゼと、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えホスホグルコムターゼまたは組換えヘキソキナーゼの１つ以上とを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびにセロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養すること（これによって、セロデキストリンは、組換えセロデキストリンホスホリラーゼによってグルコース−１−リン酸に分解される）によって、グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法に関する。当該方法において、セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。
【００４９】
さらに、本開示は、S. cerevisiaeを利用することによってセロデキストリンをグルコースリン酸に分解するための新規な戦略に少なくとも部分的に基づいている。当該S. cerevisiaeは、改変されて、細胞にセロデキストリンを輸送するための、Neurospora crassaのセロデキストリントランスポータ遺伝子；輸送されたセロデキストリンをグルコース−１−リン酸およびグルコースに分解するための、Celvibrio gilvus、Sacharophagus degradans、またはClostridium thermocellumから得られたセロビオースホスホリラーゼ；グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するための、組換えホスホグルコムターゼ；ならびにセロデキストリンの分解によって生成されるグルコースをグルコース−６−リン酸に変換するための、組換えヘキソキナーゼを発現した（図１）。
【００５０】
〔定義〕
特に規定されていない限り、すべての科学用語および技術用語は、それらが属する技術において通常、使用される通りと同じ意味を有していると理解される。本開示の目的のために以下の用語が規定されている。
【００５１】
本明細書に使用されるとき、“セロデキストリン”は、種々の長さのβ（１→４）グルコース重合体を指し、“セロデキストリン”としては、セロビオース（２つのグルコース単量体）、セロトリオース（３つのグルコース単量体）、セロテトラオース（４つのグルコース単量体）、セロペントース（５つのグルコース単量体）およびセロヘキトース（６つのグルコース単量体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書に使用されるとき、“セロデキストリンホスホリラーゼ”は、無機リン酸を利用することによってセロデキストリンの分解を触媒して、当該セロデキストリンにおけるグルコース部分の間にある１つ以上のβグリコシド結合を切断する酵素を指す。
【００５３】
本明細書に使用されるとき、“セロデキストリントランスポータ”は、細胞の細胞膜を越えてセロデキストリンを輸送可能な任意の糖トランスポータタンパク質を指す。
【００５４】
本明細書に使用されるとき、“糖”は、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース）、二糖（例えば、セロビオース、スクロース、ラクトース、マルトース）、およびオリゴ糖（３〜１０の構成単糖を典型的に含んでいる）を指す。
【００５５】
本明細書に使用されるとき、“ポリヌクレオチド”、“核酸配列”、“核酸の配列”およびそれらの変化形は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含んでいる）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含んでいる）、プリン塩基もしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他の型、および非ヌクレオチド骨格を含んでいる他の重合体（ただし、当該重合体は、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対合および塩基スタッキングを可能にする配置において核酸塩基を含んでいる）に対する総称である。したがって、これらの用語は、公知の型の核酸配列修飾を含んでいる。当該核酸修飾は、例えば、天然に存在するヌクレオチドの、類似物との置換；ヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷の結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホラミダイト、カルバメートなど）、負電荷の結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正電荷の結合（例えば、アミノアルキルホスホラミダイト、アミノアルキルホスホトリエステルなど）を用いた修飾など）；ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどが挙げられる）など）を含んでいる修飾；インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を用いた修飾；およびキレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）を用いた修飾である。本明細書に使用されるとき、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのための記号は、IUPAC-IUB生化学命名委員会（Biochem. 9:4022, 1970）によって推奨されている記号である。
【００５６】
本明細書に使用されるとき、“ポリペプチド”は、重合されている連続した複数のアミノ酸残基（例えば、重合されている連続した少なくとも約１５のアミノ酸残基、必要に応じて、重合されている連続した少なくとも約３０のアミノ酸残基、重合されている連続した少なくとも約５０のアミノ酸残基）を含んでいるアミノ酸配列である。多くの場合において、ポリペプチドは、トランスポータ、酵素、機能未知の、予測のタンパク質、またはこれらのドメイン、一部もしくは断片である重合されているアミノ酸残基配列を含んでいる。トランスポータは、イオン、小分子または巨大分子（例えば炭水化物）の、生物学的な膜を越えた移動に関与している。酵素は、宿主における化学反応（例えば、炭水化物のアルコールへの反応）を触媒し得る。ポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、コドンによってコードされていない天然に存在するアミノ酸残基、および天然に存在しないアミノ酸残基を必要に応じて含んでいる。
【００５７】
本明細書に使用されるとき、“タンパク質”は、天然に存在するか、または合成の、アミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはこれらの一部を指す。
【００５８】
本開示に使用され得る遺伝子およびタンパク質としては、本願を通して説明されているそれらの遺伝子およびタンパク質の保存的に変更されているバリアントである、保存的に変更されているバリアントをコードする遺伝子およびタンパク質が挙げられる。本明細書に使用されるとき、“保存的に変更されているバリアント”は、化学的に類似のアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含んでいる。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的な置換の表は、当該技術において周知である。保存的に変更されているそのようなバリアントは、本開示の多型バリアント、種間相同物、および対立形質を除外しない。以下の８つの群は、互いにとって保存的な置換である複数のアミノ酸を含んでいる。（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照すればよい）。
【００５９】
また、本明細書に記載の遺伝子およびタンパク質の相同物は、本開示に使用され得る。本明細書に使用されるとき、“相同性”は、基準配列と、第２の配列の少なくとも断片との間における配列類似性を指す。相同物は、配列の単一の第２の配列、配列の単一の断片、または複数の配列のデータベースに対して、基準配列を比較するために、当該技術において公知の任意の技術によって、好ましくはBLASTツールを用いることによって、同定され得る。後述の通り、BLASTは、パーセント同一性およびパーセント類似性に基づいて複数の配列を比較する。本明細書に使用されるとき、“相同分子性（orthology）”は、共通先祖の遺伝子に由来する異なる種における遺伝子を指す。
【００６０】
１つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、“同一”またはパーセント“同一性”という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。以下の場合に、２つの配列は“実質的に同一”である。当該場合は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてか、または手動の整列化もしくは目視検査によって、比較され、比較範囲または指定領域にわたる最大の適合のために整列化されたときに、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域、または特定されていないときに全体の配列にわたる、２９％の同一性、必要に応じて３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性）を２つの配列が有している場合である。必要に応じて、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さ、より好ましくは少なくとも約１００〜５００ヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）の長さの領域にわたって存在する。
【００６１】
配列比較のために、１つの配列は、試験配列が比較される基準配列の役割を典型的に果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および基準配列がコンピュータに入力され、部分配列の座標が必要に応じて指定され、配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。初期値のプログラムパラメータが使用され得、代替のパラメータが指定され得る。配列比較アルゴリズムは、それから参照配列と比較した試験配列にとってのパーセント配列同一性を、プログラムパラメータに基づいて算出する。同一性に関して２つの配列を比較する場合、配列は連続している必要はないが、ギャップは全体の配列同一性を低下させるペナルティをともなう。blastnについて、初期値のパラメータは、Gap opening penalty=5、Gap extension penalty=2である。blastpについて、初期値のパラメータは、Gap opening penalty=11、 Gap extension penalty=1である。
【００６２】
本明細書に使用されるとき、“比較範囲”は、連続する位置の数（配列が、２つの配列の最適な整列化後に連続する位置の同じ数の基準配列と比較され得る、２０〜６００、一般的に約５０〜２００、より一般的に１００〜１５０が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれか１つの部分に対する指定を包含している。比較のための配列の整列化方法は、当該技術において周知である。比較のための最適な整列化は、例えば、Smith and Waterman (1981)の局所的な相同性アルゴリズムによってか、Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol 48(3):443-453の相同性整列化アルゴリズムによってか、Pearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448の類似性手法のための検索によってか、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）におけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）の実施をコンピュータ化することによってか、または手動の整列化および目視検査（例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)を参照すればよい）によって実施され得る。
【００６３】
パーセンテージ配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの２つの例は、BLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズム（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410にそれぞれ記載されている）である。BLAST解析を実施するソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを介して、一般に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定することを含んでおり、当該高スコア配列ペアは、データベース配列における同じ長さのワードと整列化される場合にポジティブと評価される閾値スコアＴのいくつかと適合しているか、または当該いくつかを満たしている。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（上述のAltschul et al.）。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含んでいるより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するシードの役割を果たす。ワードヒットは、累積する整列化スコアが上昇する限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積するスコアは、パラメータＭ（一致する残基の対に対する報酬スコア；常に０を超える）およびＮ（不一致の残基に対するペナルティスコア；常に０未満）を用いて、ヌクレオチド配列に関して算出される。アミノ酸配列のために、スコアリングマトリクスが、累積するスコアを算出するために使用されている。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積する整列化スコアがその最大に達した値から数量Ｘまで低下した場合；累積するスコアが０未満になった場合；またはいずれかの配列の終端に達した場合に中断される。BLASTアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列化の感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝５および両方の鎖の比較を、初期値として使用している。アミノ酸配列用のBLASTPプログラムは、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびBLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919を参照すればよい）、整列化（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を、初期値として使用している。
【００６４】
また、BLASTアルゴリズムは、２つの配列間における類似性の統計的解析を実行する（例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877を参照すればよい）。BLASTアルゴリズムによって付与される類似性の測定値の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における一致が偶然に生じる確率の指標を与える最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は、基準配列と類似とみなされる。
【００６５】
以上に言及した配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である他の指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、２つのペプチドが保存的な置換によってのみ異なる場合に、あるポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、２つの分子またはそれらの相補物がストリンジェントな条件において互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらなる他の指標は、同じプライマーが当該配列の増幅に使用され得ることである。
【００６６】
〔本開示の宿主細胞〕
本開示の一部の局面は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−グルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼのうちの１つ以上を含んでいる宿主細胞に関する。当該宿主細胞は、セロデキストリンを分解して、セロデキストリンから炭化水素もしくは炭化水素誘導体を生成するか、またはグルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させるために用いられ得る。
【００６７】
“宿主細胞”および“宿主微生物”は、交換可能に用いられて、組換えＤＮＡまたは組換えＲＮＡの挿入を介して形質転換され得る生物学的な生細胞を指す。当該組換えＤＮＡまたは組換えＲＮＡは、発現ベクター内にあり得る。したがって、本明細書に記載のような宿主生物または宿主細胞は、原核生物（例えば真正細菌界の生物）または真核細胞であり得る。当業者によって正しく理解される通り、原核細胞は、膜に囲まれている核を欠いており、真核細胞は膜に囲まれている核を有している。
【００６８】
任意の原核宿主細胞または真核宿主細胞は、核酸配列を用いた形質転換後に生存可能な限り、本開示に用いられ得る。宿主細胞は、必要な核酸配列の形質導入、これに続く、タンパク質または生じる中間生成物の発現によって、悪影響を受けないことが好ましい。好適な真核細胞としては、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
好ましい実施形態において、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において使用されるような“菌類”としては、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門および接合菌門（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKによって規定されている）、ならびに卵菌門（上述のHawksworth et al., 1995, page 171に引用されている）およびすべての栄養胞子形成菌（上述のHawksworth et al., 1995）が挙げられる。
【００７０】
一部の実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。本明細書において使用されるような“酵母”としては、有子嚢胞子酵母（エンドミセス菌目）、担子菌酵母、および不完全真菌に属す酵母（ブラストミセス菌目）が挙げられる。酵母の分類は、将来において変わり得るため、本開示の目的のために、酵母は、Biology and Activities of Yeast（Skinner, F. A., Passmore, S. M., and Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載のように規定され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、酵母の宿主細胞は、Candida、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、またはYarrowiaの株である。他の実施形態において酵母の宿主細胞は、Saccharomyces carlsbergensis（Todkar, 2010)、Saccharomyces cerevisiae (Duarte et al., 2009)、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis、Saccharomyces monacensis（GB-Analysts Reports, 2008)、Saccharomyces bayanus (Kristen Publicover、2010)、Saccharomyces pastorianus (Nakao et al., 2007）、Saccharomyces pombe (Mousdale, 2008)またはSaccharomyces oviformisの株である。さらなる他の実施形態において、酵母宿主は、Kluyveromyces lactis（O.W. Merten, 2001)、Kluyveromyces fragilis（Pestal et al., 2006；Siso, 1996）、Kluyveromyces marxiamus（K. Kourkoutas et al., 2008）、Pichia stipitis（Almeida et al., 2008）、Candida shehatae（Ayhan Demirbas, 2003）、またはCandida tropicalis（Jamai et al., 2006）である。他の実施形態において、酵母宿主は、Yarrowia lipolytica（Biryukova E.N., 2009）、Brettanomyces custersii（Spindler D.D. et al., 1992）またはZygosaccharomyces roux（Chaabane et al., 2006)であり得る。好ましい一実施形態において、酵母細胞はS. cerevisiaeである。
【００７２】
他の実施形態において、真菌宿主は糸状菌の株である。“糸状菌”としては、真菌門および卵菌門の亜門（上述のHawksworth et al., 1995によって規定されている）のすべての糸状形態が挙げられる。糸状菌は、一般的にキチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複合多糖からなる菌糸体壁によって特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長に基づいており、炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae）による栄養成長は、単細胞の葉状体の出芽に基づいており、炭素代謝は発酵性であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、糸状菌宿主は、Acremonium、Aspergillus、Fusarium、Humicola、Mucor、Myceliophthora、Neurospora、Penicillium、Scytalidium、Thielavia、TolypocladiumまたはTrichodermaの株であるが、これらに限定されない。
【００７４】
他の実施形態において、糸状菌宿主は、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus nigerまたはAspergillus oryzaeの株である。さらなる他の実施形態において、糸状菌宿主は、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、またはFusarium venenatumの株である。さらなる他の実施形態において、糸状菌宿主は、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Scytalidium thermophilum、Sporotrichum thermophile（Topakas et al.、2003）またはThielavia terrestrisの株である。さらなる実施形態において、糸状菌宿主はTrichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、またはTrichoderma virideの株である。
【００７５】
他の実施形態において、宿主細胞は原核生物であり、一部の実施形態において、原核生物は、E. coli（Dien, B.S. et al., 2003; Yomano, L. P. et al., 1998; Moniruzzaman et al., 1996）、Bacillus subtilis（Susana Romero et al., 2007）、Zymomonas mobilis（B. S. Dien et al., 2003; Weuster Botz, 1993; Alterthum and Ingram, 1989）、Thermoanaerobacterium saccharolyticum（Marietta Smith, 2009）、またはKlebsiella oxytoca（Dien, B.S. et al., 2003; Zhou et al., 2001; Brooks and Ingram, 1995）である。他の実施形態において原核生物の宿主細胞は、Carboxydocella sp.（Dominik et al., 2007）、Corynebacterium glutamicum（Masayuki Inui, et al., 2004）、Enterobacteriaceae（Ingram et al., 1995）、Erwinia chrysanthemi（Zhou and Ingram, 2000; Zhou et al., 2001）, Lactobacillus sp.（McCaskey, T.A., et al., 1994）、Pediococcus acidilactici（Zhou, S. et al., 2003）、Rhodopseudomonas capsulata（X.Y. Shi et al., 2004）、Streptococcus lactis（J.C. Tang et al., 1988）、Vibrio furnissii（L.P. Wackett, 2010）、Vibrio furnissii M1（Park et al., 2001）、Caldicellulosiruptor saccharolyticus（Z. Kadar et al., 2004）、またはXanthomonas campestris（S.T. Yang et al., 1987）である。他の実施形態において、宿主細胞はシアノバクテリアである。細菌の宿主細胞のさらなる例としては、Escherichia、Enterobacter、Azotobacter、Erwinia、Bacillus、Pseudomonas、Klebsiella、Proteus、Salmonella、Serratia、Shigella、Rhizobia、Vitreoscilla、Synechococcus、Synechocystis、およびParacoccusの分類学的な分類に割り当てられている種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本開示の宿主細胞は、組換え核酸が宿主細胞に導入されている点において遺伝学的に変更され得、したがって遺伝学的に変更された宿主細胞は天然に存在しない。本開示の好適な宿主細胞は、異なる機能のための１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸構築物を発現可能な宿主細胞である。
【００７７】
本明細書に使用されるとき、“組換え核酸”、“異種核酸”または“組換えポリヌクレオチド”は、以下（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つが当てはまる核酸の重合体である。（ａ）核酸の配列は、所定の宿主細胞に対して外因性である（すなわち天然に見られない）；（ｂ）上記配列は、所定の宿主細胞において天然に見られるが、異常な（例えば予想以上の）量であり得る；または（ｃ）核酸の配列は、互いに同じ関係において天然に見られない２つ以上の部分配列を含んでいる。例えば、（ｃ）の場合について、組換え核酸配列は、機能的な新規の核酸を作製するために配置されている、無関係な遺伝子に由来する２つ以上の配列を有している。特に、本開示は、宿主細胞への発現ベクターの導入について説明しており、当該発現ベクターは、宿主細胞に通常には見られないタンパク質をコードする核酸配列を含んでいるか、または細胞に通常、見られるタンパク質をコードするが、異なる制御配列の制御下にある核酸配列を含んでいる。よって、宿主細胞のゲノムに関して、上記タンパク質をコードする上記核酸配列は組換え体である。組換え体と言及されているタンパク質は、宿主細胞において組換え核酸配列によって当該タンパク質がコードされることを一般的に示している。
【００７８】
本開示の、“組換え”ポリペプチド、“組換え”タンパク質または“組換え”酵素は、“組換え核酸”、“異種核酸”または“組換えポリヌクレオチド”によってコードされるポリペプチド、タンパク質または酵素である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞において所望のタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞に対して異種であり得るか、またはこれらの遺伝子は宿主細胞に対して内因性であるが、（複数の）遺伝子のより高い発現を宿主細胞においてもたらす異種のプロモータおよび／または制御領域と作動可能に連結され得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、所望のタンパク質を天然に産生せず、これらの分子を産生するために必要な１つ以上の遺伝子を発現可能な異種の核酸構築物を含んでいる。
【００８０】
核酸分子もしくはポリペプチド、および特定の細胞もしくは微生物に関して本明細書に使用されるとき、“内因性”は、組換え改変技術を用いて細胞に導入されなかった、細胞に存在している核酸配列またはポリペプチド（例えば、細胞が自然から単離された当初から細胞に存在していた遺伝子）を指す。
【００８１】
“遺伝学的に改変された”または“遺伝学的に変更された”は、向上したレベル、低下したレベルまたは変異させた形態においてタンパク質を発現する原核宿主細胞または真核宿主細胞を作製するために用いられる、任意の組換えＤＮＡ法または組換えＲＮＡ法を指す。言い換えると、宿主細胞は、組換えポリヌクレオチド分子を用いてトランスフェクトされるか、形質転換されるか、または形質導入され、それによって、所望のタンパク質の発現を当該細胞に変えさせるように変化させられている。宿主細胞を遺伝学的に改変するための方法およびベクターは、当該技術に周知であり、例えば、種々の技術がCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.（Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates）に例示されている。遺伝学的に改変する技術としては、発現ベクターと、標的相同性組換えおよび遺伝子活性化と（例えば、米国特許第５，２７２，０７１号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
［セロデキストリントランスポータ］
本開示の一部の局面は、組換えセロデキストリントランスポータを含んでいる宿主細胞に関する。セロデキストリントランスポータは、細胞の外側から細胞の内側および／または細胞の内側から細胞の外側に、セロデキストリン分子を輸送する、任意の膜貫通型のタンパク質である。一部の実施形態において、セロデキストリントランスポータは、細胞の外側から細胞の内側および／または細胞の内側から細胞の外側に、セロデキストリン分子を輸送する能力を維持している機能的な断片である。
【００８３】
本開示の組換えセロデキストリントランスポータは、Tian et al., 2009における３頁のSupplemental Data, Dataset S1にあるTable 10；ならびに表１および２に挙げられている遺伝子のいずれかによってコードされ得る。
【００８４】
【表１】
2014506464.tif 000003
【００８５】
【表２】
2014506464.tif 000004
【００８６】
【表３】
2014506464.tif 000005
【００８７】
他の実施形態において、本開示の組換えセロデキストリントランスポータは、約２０％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％のアミノ酸残基配列の同一性を、Tian et al., 2009における３頁のSupplemental Data, Dataset S1にあるTable 10；ならびに表１および２に挙げられている遺伝子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対して、有している。
【００８８】
さらに、本開示の組換えセロデキストリントランスポータとしては、NCU00801、NCU00809、NCU08114、XP_001268541.1、LAC2、NCU00130、NCU00821、NCU04963、NCU07705、NCU05137、NCU01517、NCU09133およびNCU10040が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータは、少なくとも約２０％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％のアミノ酸残基配列同一性を、NCU00801、NCU00809、NCU08114、XP_001268541.1、LAC2、NCU00130、NCU00821、NCU04963、NCU07705、NCU05137、NCU01517、NCU09133またはNCU10040の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドに対して、有している。
【００８９】
好ましい特定の実施形態において、宿主細胞は、NCU00801によってコードされるセロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１またはＣＢＴ１としても知られている）を含んでいる。他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、NCU08114によってコードされるセロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−２またはＣＢＴ２としても知られている）を含んでいる。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＴ−１（配列番号９）またはＣＤＴ−２（配列番号１０）に対して、有しているアミノ酸配列を有している。
【００９０】
また、本開示の好適なセロデキストリントランスポータとしては、米国特許出願公開第２０１１／０２６２９８３号および国際公開第２０１１／１２３７１５号に記載のセロデキストリントランスポータが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、好適なセロデキストリントランスポータとしては、ＨＸＴ２．１、ＨＸＴ２．２、ＨＸＴ２．３、ＨＸＴ２．４、ＨＸＴ２．５、ＨＸＴ２．６およびＨＸＴ４が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本開示のセロデキストリントランスポータは、約２０％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％のアミノ酸残基配列同一性を、米国特許出願公開第２０１１／０２６２９８３号および国際公開第２０１１／１２３７１５号に挙げられている遺伝子における挙げられている遺伝子（例えば、ＨＸＴ２．１、ＨＸＴ２．２、ＨＸＴ２．３、ＨＸＴ２．４、ＨＸＴ２．５、ＨＸＴ２．６およびＨＸＴ４）のいずれかによってコードされるポリペプチドに対して、有している。
【００９１】
本開示の組換えセロデキストリントランスポータとしては、以上に挙げられている遺伝子によってコードされるポリペプチドの、保存的に変更されたバリアントをコードするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。本開示の組換えセロデキストリントランスポータとしては、Tian et al., 2009における３頁のSupplemental Data, Dataset S1にあるTable 10；表１および２、米国特許出願公開第２０１１／０２６２９８３号、国際公開第２０１１／１２３７１５号に挙げられている遺伝子のいずれかによってコードされるポリペプチドの、相同物または相同分子種をコードするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがさらに挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９２】
（セロデキストリントランスポータの配列モチーフ）
本明細書に記載のような本開示の組換えセロデキストリントランスポータとしては、メジャーファシリテータスーパーファミリー（Major Facilitator Superfamily）の糖トランスポータファミリー（NCU00988、NCU10021、NCU04963、NCU06138、NCU00801、NCU08114およびNCU05853が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。トランスポータのメジャーファシリテータスーパーファミリー（ＭＳＦ）（Transporter Classification # 2.A.1）のメンバーは、１２の膜貫通型αへリックスをほぼ必ず含んでおり、細胞内にＮ末端およびＣ末端を有している（Pao et al., Microbiol Mol Biol Rev 62, 1, March 1998）。ＭＦＳトランスポータの１次配列は、非常に異なっている一方で、すべては、E. coli.のラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）（J. Abramson et al., Science 301, 610, 2003）およびE. coli.のＰｉ／グリセロール−３−リン酸（ＧｌｐＴ）（Huang et al., Science 301, 616 , 2003）の３次構造を共有していると考えられる。これらの例において、６つのＮ末端へリックスおよび６つのＣ末端へリックスは、へリックス６とへリックス７との間にある長い細胞質ループによって接続されている、２つの異なるドメインを形成している。この対称性は、ＭＦＳを生じさせたと考えられる重複現象に対応している。基質は、Ｎ末端ドメインのへリックス１、２、４および５と、Ｃ末端ドメインのへリックス７、８、１０および１１とによって形成される親水性の空洞内に結合する。この空洞は、へリックス３、６、９および１２によって安定化されている。
【００９３】
ＭＦＳの糖トランスポータのファミリー（Transporter Classification # 2.A.1.1）は、膜貫通型のへリックス６および１２（ＰＥＳＰＲ（配列番号２３１）／ＰＥＴＫ（配列番号２３２））、ならびにループ２および８（ＧＲＲ／ＧＲＫ）に見られるモチーフによって特徴づけられている（M. C. Maiden, E. O. Davis, S. A. Baldwin, D. C. Moore, P. J. Henderson, Nature 325, 641 (Feb 12-18, 1987)）。このファミリーにとっての完全な隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、pfam.janelia.org/family/PF00083#tabview=tab3.に見られ得る。PROSITE（N. Hulo et al., Nucleic Acids Res 34, D227 (Jan 1, 2006））は、このファミリーのメンバーを同定するために、２つのモチーフを用いている。第１は、［ＬＩＶＭＳＴＡＧ］−［ＬＩＶＭＦＳＡＧ］−｛ＳＨ｝−｛ＲＤＥ｝−［ＬＩＶＭＳＡ］−［ＤＥ］−｛ＴＤ｝−［ＬＩＶＭＦＹＷＡ］−Ｇ−Ｒ−［ＲＫ］−ｘ（４，６）−［ＧＳＴＡ］（配列番号１９８）である。第２は、［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡ］−｛Ｖ｝−ｘ−Ｇ−｛ＫＰ｝−ｘ（７）−［ＬＩＦＹ］−ｘ（２）−［ＥＱ］−ｘ（６）−［ＲＫ］（配列番号１９９）である。PROSITEモチーフの読み方の例として、以下のモチーフ：［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝（配列番号２００）は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛ＧｌｕまたはＡｓｐを除いて任意｝（配列番号２００）と解釈される。
【００９４】
推定のセロデキストリントランスポータの相同分子種と、確認済みのセロデキストリントランスポータとの間のT-COFFEEにおいて生成された多重配列アライメントによって、保存されたモチーフが同定された。保存されたモチーフは、PROSITEの表示法を用いて規定された。PROSITEモチーフの読み方の例として、以下のモチーフ：［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝（配列番号２００）は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛ＧｌｕまたはＡｓｐを除いて任意｝（配列番号２００）と解釈される。膜貫通型のへリックス１は、モチーフ［ＬＩＶＭ］−Ｙ−［ＦＬ］−ｘ（１３）−［ＹＦ］−Ｄ（配列番号１）を含んでいる。膜貫通型のへリックス２は、モチーフ［ＹＦ］−ｘ（２）−Ｇ−ｘ（５）−［ＰＶＦ］−ｘ（６）−［ＤＱ］（配列番号２）を含んでいる。膜貫通型のへリックス２と膜貫通型のへリックス３とを接続しているループは、モチーフＧ−Ｒ−［ＲＫ］（配列番号３）を含んでいる。膜貫通型のへリックス５は、モチーフＲ−ｘ（６）−［ＹＦ］−Ｎ（配列番号４）を含んでいる。膜貫通型のへリックス６は、モチーフＷＲ−［ＩＶＬＡ］−Ｐ−ｘ（３）−Ｑ（配列番号５）を含んでいる。膜貫通型のへリックス６と膜貫通型のへリックス７との間の配列は、モチーフＰ−Ｅ−Ｓ−Ｐ−Ｒ−ｘ−Ｌ−ｘ（８）−Ａ−ｘ（３）−Ｌ−ｘ（２）−Ｙ−Ｈ（配列番号６）を含んでいる。膜貫通型のへリックス７は、モチーフＦ−［ＧＳＴ］−Ｑ−ｘ−Ｓ−Ｇ−Ｎ−ｘ−［ＬＩＶ］（配列番号７）を含んでいる。膜貫通型のへリックス６は、モチーフＬ−ｘ（３）−［ＹＩＶ］−ｘ（２）−Ｅ−ｘ−Ｌ−ｘ（４）−Ｒ−［ＧＡ］−Ｋ−Ｇ（配列番号８）を含んでいる。
【００９５】
したがって、本開示の一部の局面は、１つ以上の保存されたモチーフを含んでいる組換えセロデキストリントランスポータ、またはその機能的な断片に関する。一部の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータまたはその機能的な断片としては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス１が配列番号１を含んでいるポリペプチドが挙げられる。他の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス２が配列番号２を含んでいるポリペプチドが挙げられる。さらなる他の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαへリックス１２および膜貫通型のαへリックス２と膜貫通型のαへリックス３とを接続しているループを含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス３が配列番号３を含んでいるポリペプチドが挙げられる。さらなる他の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαヘリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス５が配列番号４を含んでいるポリペプチドが挙げられる。さらなる他の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαへリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス６と膜貫通型のαへリックス７との間の配列が配列番号６を含んでいるポリペプチドが挙げられる。さらな��他の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαへリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス７が配列番号７を含んでいるポリペプチドが挙げられる。他の実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαへリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１およびこれらの間の配列は配列番号８を含んでいるポリペプチドが挙げられる。
【００９６】
さらに、上述した実施形態のそれぞれは、多数の組合せにおいて組み合わせられ得る。上述の実施形態のいずれかに係る組換えセロデキストリントランスポータとしては、配列番号１〜８のいずれか１、２、３、４、５、６または７つを含んでいるポリペプチドが挙げられ得る。例えば、組換えセロデキストリントランスポータは、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαへリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス１が配列番号１を含んでおり、膜貫通型のαへリックス２と膜貫通型のαへリックス３とを接続しているループが配列番号３を含んでおり、かつ膜貫通型のαへリックス７が配列番号７を含んでいる、ポリペプチドが挙げられ得る。代替的に、他の例において、組換えセロデキストリントランスポータとしては、膜貫通型のαへリックス１、膜貫通型のαへリックス２、膜貫通型のαへリックス３、膜貫通型のαへリックス４、膜貫通型のαへリックス５、膜貫通型のαへリックス６、膜貫通型のαへリックス７、膜貫通型のαへリックス８、膜貫通型のαへリックス９、膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１、膜貫通型のαへリックス１２を含んでいるポリペプチドであって、膜貫通型のαへリックス２が配列番号２を含んでおり、膜貫通型のαへリックス３が配列番号３を含んでおり、膜貫通型のαへリックス６が配列番号５を含んでおり、かつ膜貫通型のαへリックス１０、膜貫通型のαへリックス１１およびこれらの間の配列が配列番号８を含んでいる、ポリペプチドが挙げられ得る。
【００９７】
（変異体セロデキストリントランスポータ）
本開示の他の局面は、本開示のセロデキストリントランスポータの機能および／または活性を向上させるために使用され得る変異体セロデキストリントランスポータに関する。変異体セロデキストリントランスポータは、本開示のセロデキストリントランスポータをコードするポリヌクレオチドを変異させることによって生成され得る。いくつかの実施形態において、本開示の変異体セロデキストリントランスポータは、向上した機能および／または活性を有しているセロデキストリントランスポータをもたらす変異（点変異、ミスセンス変異、置換変異、フレームシフト変異、挿入変異、重複変異、増幅変異、転位変異または反転変異が挙げられるが、これらに限定されない）の少なくとも１つを含み得る。
【００９８】
所定のセロデキストリントランスポータに少なくとも１つの変異を生成させる方法は、当該技術において周知であり、ランダム変異生成およびスクリーニング、部位特異的変異生成、ＰＣＲ変異生成、挿入変異生成、化学的変異生成、ならびに放射線照射が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、変異体セロデキストリントランスポータは、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。例えば、本開示の組換えポリペプチドは、ＣＤＴ−１のアミノ酸配列（配列番号９）の位置に対応する１つ以上の位置に、アミノ酸置換を含んでいる。１つ以上の好適な位置としては、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
非限定的な一例において、１つ以上の位置のアミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換；配列番号９の１０４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン（Ｑ）の置換；配列番号９の１７０番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の１７４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのアルギニン（Ｒ）の置換；配列番号９の１９４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグルタミン酸（Ｅ）の置換；配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号９の３３５番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；またはこれらの組合せである。好ましい特定の実施形態において、１つ以上の位置のアミノ酸置換は、配列番号９の９１番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのグリシン（Ｇ）の置換および／または配列番号９の２１３番目のアミノ酸に対応する位置における、リジン（Ｌ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、変異体セロデキストリントランスポータの向上した機能および／または活性は、変異体セロデキストリントランスポータを欠いている細胞におけるセロデキストリンの消費速度より高速にセロデキストリンを消費する宿主細胞をもたらす。例えば、変異体セロデキストリントランスポータを含んでいる宿主細胞におけるセロデキストリンの消費速度は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、またはより高いパーセンテージだけ、対応する野生型のセロデキストリントランスポータを含んでいる宿主細胞におけるセロデキストリン消費速度より速い。
【０１０２】
（セロデキストリントランスポータとの組合せ）
本開示のさらなる局面は、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、本開示の組換えホスホグルコムターゼ、および本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上と組み合わせて、少なくとも１つ以上の本開示のセロデキストリントランスポータを含んでいる宿主細胞に関する。
【０１０３】
いったん本開示のセロデキストリントランスポータがセロデキストリン（例えばセロビオース）を細胞内に輸送すると、一般的に、当該細胞は、セロデキストリンを分解する必要がある。しかし、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞（例えば酵母細胞）は、細胞によって利用され得る複雑さのより小さい糖に、セロデキストリンを分解するために必要な酵素を天然に含んでいない。したがって、宿主細胞は、セロデキストリンを分解するために、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼおよび／または本開示の組換えβ−グルコシダーゼを発現するために改変され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つの組換えセロデキストリンホスホリラーゼおよび／または少なくとも１つの組換えβ−グルコシダーゼと組み合わせて、少なくとも１つの組換えセロデキストリントランスポータを発現する。さらに、種々のストレス条件下において、組換えセロデキストリンホスホリラーゼおよび組換えβ−グルコシダーゼの両方を、セロデキストリントランスポータを含んでいる細胞において発現することが、有益であり得る。さらに、当該宿主細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ経路およびβ−グルコシダーゼ経路を種々のストレス条件下において最適化するために、改変され得る。したがって、一部の実施形態において、セロデキストリントランスポータを含んでいる本開示の宿主細胞はまた、少なくとも１つの組換えセロデキストリンホスホリラーゼおよび少なくとも１つの組換えβ−グルコシダーゼを発現する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、セロデキストリントランスポータを含んでいる本開示の宿主細胞は、グルコース−１−リン酸および短鎖のセロデキストリンに、セロデキストリンを加リン酸分解的に切断可能である。生成されたグルコース−１−リン酸を細胞が利用するために、グルコース−１−リン酸は、細胞の解糖系に入るためにグルコース−６−リン酸に変換される必要がある。グルコース−１−リン酸は、宿主細胞において天然に発現されるホスホグルコムターゼによってグルコース−６−リン酸に変換され得る。しかし、ホスホグルコムターゼは、糖分解性の増殖の間に転写について下方制御され得る。さらに、他の組換えタンパク質もしくは酵素の発現、または利用される培養条件はまた、細胞内における内因性のホスホグルコムターゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、当該細胞において少なくとも１つのホスホグルコムターゼを組換え発現することによって克服され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つの組換えホスホグルコムターゼと組み合わせて、少なくとも１つの組換えセロデキストリントランスポータを発現する。
【０１０５】
さらなる実施形態において、組換えセロデキストリントランスポータを含んでいる宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）をグルコースに分解可能である。しかし、生成されたグルコースを細胞が利用するために、グルコースは、グルコース−６−リン酸にリン酸化される必要がある。一般的に、グルコースは、細胞において天然に発現されているヘキソキナーゼによってグルコース−６−リン酸にリン酸化される。しかし、本開示の宿主細胞は、生成されたグルコースのすべてを効率的にリン酸化するために十分な程度のへキソキナーゼ活性を発現し得ない。さらに、組換えタンパク質の発現、組換え酵素の発現、または利用される培養条件は、細胞における内因性のヘキソキナーゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、少なくとも１つのへキソキナーゼを細胞において組換え発現させことによって克服され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つのヘキソキナーゼと組み合わせて、少なくとも１つのセロデキストリントランスポータを発現している。
【０１０６】
［セロデキストリンホスホリラーゼ］
本開示の他の局面は、組換えセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞に関する。本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼは、セロデキストリンにおけるグルコース部分の間にあるβグルコシド結合を、無機リン酸を利用して切断することによるセロデキストリンの分解を触媒する。本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼとしては、以下の反応：
（１，４−β−Ｄ−グルコシル）ｎ＋無機リン酸←→（１，４−β−Ｄ−グルコシル）ｎ−１＋α−Ｄ−グルコース−１−リン酸
を触媒するＥＣ  ２．４．１．４９活性を有しているポリペプチドが挙げられ得る。ＥＣ  ２．４．１．４９活性を有しているポリペプチドは、グルコシドヒドロラーゼのＧＨ９４ファミリーに属する。ＥＣ  ２．４．１．４９活性を有しているポリペプチドとしては、１，４−ベータ−Ｄ−オリゴ−Ｄ−グルカン：リン酸、アルファ−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ、およびベータ−１，４−オリゴグルカン：オルトリン酸グルコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
また、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼとしては、以下の反応：
セロビオース＋無機リン酸←→α−Ｄ−グルコース−１−リン酸＋Ｄ−グルコース
を触媒するＥＣ  ２．４．１．２０活性を有しているセロビオースホスホリラーゼ酵素が挙げられる。ＥＣ  ２．４．１．２０活性を有している酵素は、グルコシドヒドロラーゼのヘキソシルトランスフェラーゼファミリーに属する。ＥＣ  ２．４．１．２０活性を有している酵素としては、セロビオースホスホリラーゼ、およびセロビオース：アルファ−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
一部の実施形態において、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼは、対応する全長セロデキストリンホスホリラーゼの触媒活性を維持している機能的な断片である。
【０１０９】
好適なセロデキストリンホスホリラーゼは、セルロースを加水分解する微生物から入手され得る。当該微生物の例としては、Celvibrio gilvus、Sacharophagus degradansおよびClostridium thermocellumが挙げられるが、これらに限定されない。好適なセロデキストリンホスホリラーゼの例としては、表３に挙げられているセロデキストリンホスホリラーゼ、それらの相同物およびそれらの相同分子種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
【表４】
2014506464.tif 000006
【０１１１】
【表５】
2014506464.tif 000007
【０１１２】
いくつかの実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）である。好適なセロビオースホスホリラーゼの例としては、Celvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼＣｇＣＢＰ、Sacharophagus degradansのセロビオースホスホリラーゼＣｄＣＢＰ、Clostridium thermocellumのセロビオースホスホリラーゼＣｔＣＢＰ、それらの相同物およびそれらの相同分子種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
【表６】
2014506464.tif 000008
【０１１４】
【表７】
2014506464.tif 000009
【０１１５】
本開示のセロデキストリンホスホリラーゼとしては、Clostridium lentocellumのセロデキストリンホスホリラーゼＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、Clostridium thermocellumのセロデキストリンホスホリラーゼＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ、およびAcidovibrio cellulolyticusのセロデキストリンホスホリラーゼＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態において、セロデキストリンホスホリラーゼは、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ、またはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列に対して、有しているアミノ酸配列を有している。
【０１１６】
好ましい特定の実施形態において、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼは、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、ＣｇＣＢＰ（配列番号１１）、ＳｄＣＢＰ（配列番号１２）またはＣｔＣＢＰ（配列番号１３）に対して、有しているアミノ酸配列を有している。
【０１１７】
他の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つのさらなる組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、またはその機能的な断片を含んでいる。少なくとも１つのさらなる組換えセロデキストリンホスホリラーゼは、ＣｇＣＢＰ、ＳｄＣＢＰおよびＣｔＣＢＰから選択されるセロビオースホスホリラーゼであるであることが好ましい。
【０１１８】
（セロデキストリンホスホリラーゼ配列モチーフ）
Clostridium thermocellum（BAA22081.1）、Acidovibrio cellulolyticus（ZP_07328763.1）およびClostridium lentocellum（YP_004310865.1）の、セロデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、“セロデキストリンホスホリラーゼ”と注釈されているポリペプチドを同定するために、PSI-BLASTによって同時に解析された。同定されたすべてのポリペプチドは、次に、２回目のPSI-BLASTのための入力として用いられた。これらの結果から、セロデキストリンホスホリラーゼの配列は、保存されたPROSITEモチーフを同定したPRATT解析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって解析された。保存された配列は、Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）である。PROSITEモチーフの読み方の例としては、以下のモチーフ：［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝（配列番号２００）は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛ＧｌｕまたはＡｓｐを除いて任意｝（配列番号２００）：と解釈される。この保存された配列は、さらなるセロデキストリンホスホリラーゼを同定するために用いられる。例えば、配列番号１４は、PROSITEサーバ（PROSITE ExPASyのウェブサイト）を用いることによって、さらなる１６のセロデキストリンホスホリラーゼを同定するために用いられた。したがって、本開示の好適なセロデキストリンホスホリラーゼとしては、表４に挙げる同定された１６のセロデキストリンホスホリラーゼが挙げられる。
【０１１９】
【表８】
2014506464.tif 000010
【０１２０】
表３に挙げるセロデキストリンホスホリラーゼタンパク質の、アミノ酸配列の整列化およびPRATT解析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって、これらのタンパク質は保存されたPROSITEモチーフを含んでいることが明らかになった。保存された配列は、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）である。この保存されたモチーフは、他のセロビオースホスホリラーゼを同定するために用いられ得る。例えば、配列番号１５は、PROSITEサーバ（PROSITE ExPASyのウェブサイト）を用いることによって、さらなる９１のセロビオースホスホリラーゼを同定するために用いられた。したがって、本開示の好適なセロビオースホスホリラーゼとしては、表５に挙げる同定された９１のセロビオースホスホリラーゼが挙げられる。特定のセロデキストリンホスホリラーゼは、宿主細胞に含まれ得るセロデキストリントランスポータに依存して選択され得る。
【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
さらに、セロビオースホスホリラーゼとセロデキストリンホスホリラーゼとの両方において保存されたPROSITEモチーフを同定するために、Cellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼのＸ線結晶構造は、PDB ID 3QG0を用いて使用され、PRATT解析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって解析された。保存されたモチーフは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）である。この保存されたモチーフは、さらなるセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを同定するために用いられ得る。
【０１２４】
したがって、本開示の一部の局面は、保存されたモチーフを有しているセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼに関する。一部の実施形態において、本開示のセロビオースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、またはそれらの機能的な断片は、配列番号２３３の配列を含んでいる。他の実施形態において、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼ、またはその機能的な断片は、配列番号１４の配列を含んでいる。さらなる実施形態において、本開示のセロビオースホスホリラーゼ、またはその機能的な断片は、配列番号１５の配列を含んでいる。
【０１２５】
（変異体セロデキストリンホスホリラーゼ）
本開示の他の局面は、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼの機能および／または活性を向上させるために用いられ得る変異体セロデキストリンホスホリラーゼに関する。一部の実施形態において、変異体セロデキストリンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼである。変異体セロデキストリンホスホリラーゼは、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチドを変異させることによって生成され得る。本開示の変異体セロデキストリンホスホリラーゼは、向上した機能および／または活性を有しているセロデキストリンホスホリラーゼをもたらす変異（点変異、ミスセンス変異、置換変異、フレームシフト変異、挿入変異、重複変異、増幅変異、転位変異または反転変異が挙げられるが、これらに限定されない）の少なくとも１つを含み得る。
【０１２６】
所定のセロデキストリンホスホリラーゼに少なくとも１つの変異を生成する方法は、当該技術において周知であり、ランダム変異生成およびスクリーニング、部位特異的変異生成、ＰＣＲ変異生成、挿入変異生成、化学的変異生成、ならびに放射線照射が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、変異体セロデキストリンホスホリラーゼは、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。例えば、本開示の変異体セロデキストリンホスホリラーゼは、表３および４に挙げるセロデキストリンホスホリラーゼまたはセロビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列のいずれかの位置に対応する１つ以上の位置に、それぞれアミノ酸置換を含み得る。さらに、本開示の変異体セロデキストリンホスホリラーゼは、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍまたはＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌのアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含み得る。他の実施形態において、本開示のセロビオースホスホリラーゼは、配列番号１１（ＣｇＣＢＰ）、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）または配列番号１３（ＣｔＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含み得る。
【０１２８】
さらに、本開示の変異セロビオースホスホリラーゼは、配列番号１２（ＳｄＣＢＰ）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含み得る。１つ以上の好適な位置としては、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置、配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
非限定的な一例において、１つ以上の位置におけるアミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、グルタミン（Ｑ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、スレオニン（Ｔ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、セリン（Ｓ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の４８４番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのシステイン（Ｃ）の置換；配列番号１２の６５１番目のアミノ酸に対応する位置における、トリプトファン（Ｗ）へのフェニルアラニン（Ｆ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン（Ｎ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；配列番号１２の６５３番目のアミノ酸に対応する位置における、アラニン（Ａ）へのヒスチジン（Ｈ）の置換；およびこれらの組合せである。好ましい一部の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１２の４０９番目のアミノ酸に対応する位置における、メチオニン（Ｍ）へのイソロイシン（Ｉ）の置換および／または配列番号１２の４８２番目のアミノ酸に対応する位置における、アスパラギン酸（Ｄ）へのアスパラギン（Ｎ）の置換である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、変異体セロデキストリンホスホリラーゼの向上した機能および／または活性は、野生型（すなわち非変異型）のセロデキストリンホスホリラーゼを発現している細胞におけるセロデキストリンの分解速度を超える速度において、セロデキストリン（例えばセロビオース）を分解する宿主細胞をもたらす。例えば、変異体セロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞におけるセロデキストリンの分解速度は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、またはより高いパーセンテージだけ、対応する野生型のセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞におけるセロデキストリン分解速度より速い。
【０１３１】
（セロデキストリンホスホリラーゼとの組合せ）
本開示のさらなる局面は、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、本開示の組換えホスホグルコムターゼおよび本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上と組み合わせて、少なくとも１つの本開示のセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞に関する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）を細胞内に輸送可能である。当該宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）を細胞内に輸送する内因性のタンパク質または組換えタンパク質を発現することによってセロデキストリンを輸送し得る。そのような実施形態において、組換えセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞は、本開示の組換えβ−グルコシダーゼと組み合わせて、組換えセロデキストリンホスホリラーゼを発現することが有益であり得る種々のストレス条件下において、培養され得る。さらに、宿主細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ経路およびβグルコシダーゼ経路を最適化するために改変され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つの組換えβ−グルコシダーゼと組み合わせて、少なくとも１つの組換えセロデキストリンホスホリラーゼを発現する。
【０１３３】
他の実施形態において、組換えセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞は、グルコース−１−リン酸および短鎖のセロデキストリンに、セロデキストリンを加リン酸分解的に切断する。そのような実施形態において、グルコース−１−リン酸は、当該細胞によって利用されるために、グルコース−６−リン酸に変換され得る。グルコース−１−リン酸は、宿主細胞において天然に発現されるホスホグルコムターゼによってグルコース−６−リン酸に変換され得る。しかし、ホスホグルコムターゼは、糖分解性の増殖の間に転写について下方制御され得る。さらに、他の組換えタンパク質の発現、酵素の発現、または利用される培養条件はまた、細胞内における内因性のホスホグルコムターゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、当該細胞において少なくとも１つのホスホグルコムターゼを組換え発現することによって克服され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つの組換えホスホグルコムターゼと組み合わせて、少なくとも１つの組換えセロデキストリンホスホリラーゼを発現している。
【０１３４】
さらなる実施形態において、組換えセロデキストリンホスホリラーゼを含んでいる宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）をグルコースに分解可能である。生成されたグルコースを細胞が利用するために、グルコースは、グルコース−６−リン酸にリン酸化される必要がある。一般的に、グルコースは、細胞において天然に発現されるヘキソキナーゼによってグルコース−６−リン酸にリン酸化される。しかし、本開示の宿主細胞は、生成されたすべてのグルコースを効率的にリン酸化するために十分な程度のへキソキナーゼ活性を発現し得ない。さらに、組換えタンパク質の発現、組換え酵素の発現、または利用される培養条件は、細胞における内因性のヘキソキナーゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、少なくとも１つのへキソキナーゼを細胞において組換え発現することによって克服され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つのヘキソキナーゼと組み合わせて、少なくとも１つのセロデキストリンホスホリラーゼを発現している。
【０１３５】
［β−グルコシダーゼ］
本開示のさらなる局面は、ＡＴＰが制限されていない実施形態においてセロデキストリンホスホリラーゼの代りにか、またはセロデキストリンホスホリラーゼに加えて、細胞内β−グルコシダーゼを利用する宿主細胞に関する。β−グルコシダーゼは、宿主細胞にとって内因性または組換え体であり得る。本明細書に使用されるとき、β−グルコシダーゼは、β−Ｄ−グルコースの放出をともなう、末端の非還元β−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒する、β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．２．１．２１）を指す。β−グルコシダーゼは、グルコースの放出をともなう、β−Ｄ−グルコシドにおける末端の非還元残基の加水分解を触媒する任意の酵素である。
【０１３６】
一部の実施形態において、本開示のβ−グルコシダーゼは、全長β−グルコシダーゼの触媒活性を維持している機能的な断片である。
【０１３７】
好適なβ−グルコシダーゼとしては、グルコシルヒドロラーゼのグルコシルヒドロラーゼファミリー１（ＧＨ１）のメンバーが挙げられるが、これらに制限されない。いくつかの実施形態において、β−グルコシダーゼはN. crassa由来であり、好ましい特定の実施形態において、β−グルコシダーゼは、ＧＨ１−１としても知られているNCU00130である。また、本開示の好適なβ−グルコシダーゼとしては、NCU00130の相同物または相同分子種が挙げられる。NCU00130の例としては、T. melanosporum、CAZ82985.1；A. oryzae、BAE57671.1；P. placenta、EED81359.1；P. chrysosporium、BAE87009.1；Kluyveromyces lactis、CAG99696.1；Laccaria bicolor、EDR09330；Clavispora lusitaniae、EEQ37997.1；およびPichia stipitis、ABN67130.1が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
（β−グルコシダーゼ配列モチーフ）
本明細書に開示されているような本開示のβ−グルコシダーゼとしては、グルコシルヒドロラーゼのＧＨ１ファミリーのメンバーが挙げられる。このグループのメンバーのPRATT解析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって、２つの保存されたPROSITEモチーフの存在が同定された。第１のPROSITEモチーフは、Ｎ末端の保存された部分に対応しており、配列：Ｆ−ｘ−［ＦＹＷＭ］−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］−ｘ−［ＧＳＴＡ］（２）−［ＦＹＮＨ］−［ＮＱ］−ｘ−Ｅ−ｘ−［ＧＳＴＡ］（配列番号１６）を有している。第２のPROSITEモチーフは、Ｃ末端の保存された部分に対応しており、配列：［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１７）を有している。ここで、Ｅは触媒性のグルタミン酸である。PROSITEモチーフの読み方の例として、以下のモチーフ：［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝（配列番号２００）は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛ＧｌｕまたはＡｓｐを除いて任意｝（配列番号２００）と解釈される。これらの２つのモチーフは、一般的に、さらなるβ−グルコシダーゼを同定するために用いられ得るが、グルコシルヒドロラーゼのＧＨ１ファミリーのすべてのβ−グルコシダーゼが、保存されたモチーフの両方を含んでいるわけではないことに留意すべきである。例えば、NCU00130は、配列番号１６の保存されたモチーフを含んでいるが、配列番号１７の保存されたモチーフを欠いている。
【０１３９】
さらなる好適なβ−グルコシダーゼとしては、グルコシルヒドロラーゼのグルコシルヒドロラーゼファミリー３の群に由来するβ−グルコシダーゼが挙げられる。このグループのメンバーのPRATT解析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって、活性部位を含んでいる保存された部分と対応するPROSITEモチーフの存在が同定された。保存された配列は、［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１８）である。ここで、Ｄは触媒性のアスパラギン酸である。この保存されたモチーフは、さらなるβ−グルコシダーゼを同定するために用いられ得る。
【０１４０】
さらにまた、好適なβ−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ／６−ホスホ−β−グルコシダーゼ／β−ガラクトシダーゼの、NCBI配列COG2723に見られる保存されたドメインを含んでいる任意のβ−グルコシダーゼが挙げられ得る。特定のβ−グルコシダーゼは、宿主細胞に含まれ得るセロデキストリントランスポータに依存して選択され得る。
【０１４１】
したがって、本開示の一部の局面は、１つ以上の保存されたモチーフを有しているβ−グルコシダーゼに関する。一部の実施形態において、本開示のβ−グルコシダーゼまたはその機能的な断片は、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から選択される１つ以上の配列を含んでいる。他の実施形態において、本開示のβ−グルコシダーゼまたはその機能的な断片は、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８から選択される２つ以上の配列を含んでいる。
【０１４２】
（β−グルコシダーゼとの組み合わせ）
本開示のさらなる局面は、本開示の組換えホスホグルコムターゼおよび本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上と組み合わせて、少なくとも１つの本開示の組換えβ−グルコシダーゼを含んでいる宿主細胞に関する。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、組換えβ−グルコシダーゼを含んでいる本開示の宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）を細胞内に輸送可能である。当該宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）を細胞内に輸送する、内因性のタンパク質または組換えタンパク質を発現することによって、セロデキストリンを輸送し得る。
【０１４４】
また、いくつかの実施形態において、組換えβ−グルコシダーゼを含んでいる宿主細胞は、セロデキストリンを加リン酸分解的に切断可能である。宿主細胞は、内因性または組換えのセロデキストリンホスホリラーゼのいずれかを発現することによって、セロデキストリンを加リン酸分解的に切断し得る。代替的に、宿主細胞は、セロデキストリンの加リン酸分解的な切断をもたらす補助的な経路を発現し得る。そのような実施形態において、セロデキストリンの加リン酸分解的な切断は、グルコース−１−リン酸の生成をもたらす。しかし、生成されたグルコース−１−リン酸を細胞が利用するために、細胞は、グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換する必要がある。グルコース−１−リン酸は、宿主細胞において天然に発現されるホスホグルコムターゼによって、グルコース−６−リン酸に変換され得る。しかし、ホスホグルコムターゼは、糖分解性の増殖の間において転写について下方制御され得る。さらに、組換えタンパク質の発現、組換え酵素の発現、または利用される条件は、細胞における内因性のホスホグルコムターゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、少なくとも１つのホスホグルコムターゼを細胞において組換え発現することによって克服され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つのホスホグルコムターゼとの組合せにおいて少なくとも１つのβ−グルコシダーゼを発現する。
【０１４５】
他の実施形態において、組換えβ−グルコシダーゼを含んでいる宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）をグルコースに分解可能である。生成されたグルコースを細胞が利用するために、グルコースは、グルコース−６−リン酸にリン酸化される必要がある。一般的に、グルコースは、細胞において天然に発現されているヘキソキナーゼによってグルコース−６−リン酸にリン酸化される。しかし、本開示の宿主細胞は、生成されたすべてのグルコースを効率的にリン酸化するために十分な程度のへキソキナーゼ活性を発現し得ない。さらに、組換えタンパク質の発現、組換え酵素の発現、または利用される培養条件は、細胞における内因性のヘキソキナーゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、少なくとも１つのへキソキナーゼを細胞において組換え発現することによって克服され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つのヘキソキナーゼと組み合わせて、少なくとも１つのβ−グルコシダーゼを発現している。
【０１４６】
［ホスホグルコムターゼ］
本開示の他の局面は、ホスホグルコムターゼを含んでいる宿主細胞に関する。本明細書に使用されるとき、“ホスホグルコムターゼ”は、順方向における１’位から６’位または逆方向における６’位から１’位への、α−Ｄ−グルコース単量体上にあるリン酸基の転位を触媒するＥＣ  ５．４．２．２活性を有しているポリペプチドを指す。特に、ＥＣ  ５．４．２．２活性を有しているポリペプチドは、グルコース−１−リン酸およびグルコース−６−リン酸の相互変換を触媒する。一部の実施形態において、本開示のホスホグルコムターゼは、対応する全長ホスホグルコムターゼの触媒活性を維持している機能的な断片である。
【０１４７】
本開示のホスホグルコムターゼは、本開示の宿主細胞において、内因的または異所的に発現され得る。本開示のホスホグルコムターゼが宿主細胞において異所的に発現される場合の一部の実施形態において、当該宿主細胞は、組換えポリペプチドをさらに含んでいる。
【０１４８】
好ましい一部の実施形態において、ホスホグルコムターゼは、S. cerevisiaeのホスホグルコムターゼＰＧＭ２である。他の実施形態において、ホスホグルコムターゼは、S. cerevisiaeのホスホグルコムターゼＰＧＭ２の相同物または相同分子種である。さらなる実施形態において、ホスホグルコムターゼは過剰発現される。
【０１４９】
（ホスホグルコムターゼの配列モチーフ）
公知のホスホグルコムターゼのアミノ酸配列の整列化およびPRATT分析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって、これらのタンパク質は、保存されたPROSITEモチーフを含んでいることが明らかになった。保存されたモチーフは、［ＧＳＡ］−［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−［ＰＧＡ］−Ｓ−Ｈ−［ＮＩＣ］−Ｐ（配列番号１９）である。保存されたこのモチーフは、さらなるホスホグルコムターゼを同定するために使用され得る。
【０１５０】
したがって、本開示の一部の局面は、保存されたモチーフを有しているホスホグルコムターゼまたはその機能的な断片である。一部の実施形態において、本開示のホスホグルコムターゼは配列番号１９の配列を含んでいる。
【０１５１】
（ホスホグルコムターゼとの組合せ）
本開示のさらなる局面は、本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上と組み合わせて、組換えホスホグルコムターゼの少なくとも１つを含んでいる宿主細胞に関する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、組換えホスホグルコムターゼを含んでいる本開示の宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）を当該宿主細胞に輸送可能であり、輸送されたセロデキストリンを分解可能である。そのような宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）を当該宿主細胞に輸送する内因性または組換え体のタンパク質を発現することによって、セロデキストリンを輸送し得る。また、これらの宿主細胞は、セロデキストリンを分解する内因性または組換え体のタンパク質を発現することによって、輸送されたセロデキストリンを分解し得る。そのような実施形態において、組換えヘキソグルコムターゼを含んでいる宿主細胞は、セロデキストリン（例えばセロビオース）をグルコースに分解可能である。生成されたグルコースを細胞が利用するために、グルコースは、グルコース−６−リン酸にリン酸化される必要がある。一般的に、グルコースは、細胞において天然に発現されているヘキソキナーゼによってグルコース−６−リン酸にリン酸化される。しかし、本開示の宿主細胞は、生成されたすべてのグルコースを効率的にリン酸化するために十分な程度のヘキソキナーゼ活性を発現し得ない。さらにまた、他の組換えタンパク質の発現、他の組換え酵素の発現、または利用される栄養条件は、上記細胞における内因性のヘキソキナーゼの発現に影響を与え得る。これらの欠点は、上記細胞において少なくとも１つのヘキソキナーゼを組換え発現させることによって解決され得る。したがって、一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、少なくとも１つの組換えヘキソキナーゼと組み合わせて、少なくとも１つの組換えホスホグルコムターゼを発現する。
【０１５３】
［ヘキソキナーゼ］
本開示のさらなる局面は、ヘキソキナーゼを含んでいる宿主細胞に関する。本明細書に使用されるとき、“ヘキソキナーゼ”は、６炭糖であるヘキソースの、ヘキソースリン酸へのリン酸化を触媒するＥＣ  ２．７．１．１活性を有しているポリペプチドを指す。本開示のヘキソキナーゼはグルコースをリン酸化することが好ましい。一部の実施形態において、本開示のヘキソキナーゼは、対応する全長ヘキソキナーゼの触媒活性を維持している機能的な断片である。
【０１５４】
本開示のヘキソキナーゼは、本開示の宿主細胞において、内因的または異所的に発現され得る。ヘキソキナーゼが本開示の宿主細胞において異所的に発現される場合の実施形態において、当該宿主細胞は組換えヘキソキナーゼをさらに含んでいる。
【０１５５】
一部の実施形態において、ヘキソースはS. cerevisiaeのヘキソキナーゼＨＸＫ１である。他の実施形態において、ヘキソキナーゼは、S. cerevisiaeのヘキソキナーゼＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１の相同物または相同分子種である。さらなる実施形態においてヘキソキナーゼは過剰発現される。
【０１５６】
（ヘキソキナーゼの配列モチーフ）
公知のヘキソキナーゼのアミノ酸配列整列化およびPRATT分析（ExPASyのバイオインフォマティクスのウェブサイト）によって、これらのタンパク質は保存されたPROSITEモチーフを含んでいることが明らかになった。保存されたモチーフは、［ＬＩＶＭ］−Ｇ−Ｆ−［ＴＮ］−Ｆ−Ｓ−［ＦＹ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＮＳＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ（２）−Ｗ−Ｔ−Ｋ−  ｘ−［ＬＦ］（配列番号２０）である。保存されたこのモチーフは、さらなるヘキソキナーゼを同定するために使用され得る。
【０１５７】
したがって、本開示のヘキソキナーゼは、保存されたモチーフを有しているヘキソキナーゼまたはその機能的な断片に関する。一部の実施形態において、本開示のヘキソキナーゼは配列番号２０の配列である。
【０１５８】
［グルコース応答遺伝子］
本開示の宿主細胞は、１つ以上のグルコース応答遺伝子をさらに含み得る。１つ以上のグルコース応答遺伝子は、上記宿主細胞にとって組換え体または内因性であり得る。本明細書に使用されるとき、“グルコース応答遺伝子”は、グルコースに対する細胞応答に関与するタンパク質をコードする任意の遺伝子を指す。典型的に、グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質は、上記細胞が、細胞にとって栄養素のために利用可能なグルコースの量を“感知”または“認識”すること、ならびにグルコースの利用可能な量に適合させるために代謝率および増殖速度を調節することを可能にする。グルコース応答遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、細胞の代謝が最適であり、かつグルコースが効率的に利用されることを保証する。
【０１５９】
好ましい実施形態において、１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１およびＴｐｓ１から選択される。他の実施形態において、１つ以上のグルコース応答遺伝子は、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１もしくはＴｐｓ１の相同分子種；または少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％のアミノ酸同一性を、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ１、Ｒｇｔ２、Ｙｃｋ１／２、Ｓｔｄ１、Ｍｔｈ１、Ｓｎｆ１／４、Ｇｒｒ１、Ｇｐｒ１、Ｇｐａ２、Ｒａｓ２、Ｓｔｂ３、Ｈｘｋ２、Ｐｆｋ２７、Ｐｆｋ２６、Ｓｃｈ９、Ｙａｋ１、Ｍｉｇ１、Ｒｉｍ１５、Ｋｃｓ１もしくはＴｐｓ１よってコードされるポリペプチドに対して、有しているポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。
【０１６０】
Ｓｎｆ３（NM_001180254.1）は、低濃度の細胞外グルコースを検出する高親和性のグルコースセンサをコードする（Ozcan, PNAS, 1996）。
【０１６１】
Ｒｇｔ１（NM_001179604.1）は、グルコースに応答して種々のグルコーストランスポータ（ＨＸＴ）の発現を制御するグルコース応答性の転写因子をコードする（Kim and Johnston, J Biol Chem, 2006）。
【０１６２】
Ｒｇｔ２（NM_001180198.1）は、高濃度の細胞外グルコースを検出する低親和性のグルコースセンサである（Ozcan, PNAS, 1996）。
【０１６３】
Ｙｃｋ１／２（NM_001179265.1、NM_001182992.1）は、グルコース感知に関与する膜結合カゼインキナーゼＩであり、Ｓｎｆ３またはＴｇｒ２の膜貫通部分によって活性化される。Ｙｃｋ１／２は、Ｓｎｆ１またはＲｇｔ２と結合したＭｔｈ１およびＳｔｄ１をリン酸化し、Ｇｒｒ１ユビキチンリガーゼによるそれらの認識、および続く分解を引き起こす（Moriya and Johnston, PNAS, 2004）。
【０１６４】
Ｓｔｄ１（NM_001183466.1）またはＭｔｈ１（NM_001180585.1）の非存在は、ＤＮＡに対する結合およびＨＸＴ遺伝子の抑制を妨げる、Ｒｇｔ１のリン酸化を導く。
【０１６５】
Ｓｎｆ１／４（NM_001180785.1、NM_001180980.1）は、グルコースの添加によって不活性化されるＳＮＦ１キナーゼ複合体をともに形成する。
【０１６６】
Ｇｒｒ１（NM_001181747.1）は、Ｍｔｈ１、Ｓｔｄ１、Ｐｆｋ２７、Ｔｙｅ７、Ｓｔｐ２、Ａｒｏ１、Ｈｉｓ４、Ｈｏｍ３およびＭａｅ１を抑制するユビキチンリガーゼである。
【０１６７】
Ｇｒｐ１（NM_001180094.1）は、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路におけるＧタンパク質結合受容体である。糖リン酸が存在すると、それは、グルコースに応答してｃＡＭＰ生成を誘導する（Rolland et al., FEMS Yeast Res, 2002）。
【０１６８】
Ｇｐａ１（NM_001178911.1）は、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路におけるＧｐｒ１と会合するＧ−アルファサブユニットである（Rolland et al., FEMS Yeast Res, 2002）。
【０１６９】
Ｒａｓ２（NM_001182936.1）は、グルコースに応答して細胞に生じる転写の変化に関与すると考えられているＧＴＰ結合タンパク質である（Wang et al., PLOS Biology, 2004）。
【０１７０】
Ｓｔｂ３（NM_001180476.1）は、増殖遺伝子の転写を抑制するリボソームＲＮＡプロセシングエレメント（ＲＲＰＥ）結合タンパク質である。この抑制は、グルコースによって解除される（Liko et al., Genetics, 2010）。
【０１７１】
Ｈｘｋ２（NM_001181119.1）は、グルコース、フルクトースおよびマンノースに基づく増殖の間に使用される支配的なイソ酵素である。それは、非発酵性の炭素源によって抑制される。Ｈｘｋ２は、グルコースに対する十分な転写応答に必須であり、自己の発現を制御する。Ｈｘｋ２媒介性の転写応答は、Ｈｘｋ２のヘキソキナーゼ活性と相関しておらず、Ｈｘｋ２のシグナル伝達およびキナーゼ活性は別個であることを示唆している（Moreno and Herrero, FEMS Microbiol Rev, 2002）。
【０１７２】
Ｐｆｋ２７（NM_001183390.1）は、解糖を活性化させ、糖新生を抑制する二次情報伝達物質であるフルクトース−２，６−２リン酸の合成を触媒する（Benanti, Nat Cell Biol, 2007）。それは、発酵性の炭素源によって誘導され、安定化される。Ｐｆｋ２７は、Ｓｎｆ１によってリン酸化され、Ｇｒｒ１による分解の対象にされる。
【０１７３】
Ｐｆｋ２６（NM_001179455.1）は、解糖を活性化させ、糖新生を抑制する二次情報伝達物質であるフルクトース−２，６−２リン酸の合成を触媒する。
【０１７４】
Ｓｃｈ９（NM_0011799336.1）は、浸透圧ストレス応答性の遺伝子の転写活性に関与し；Ｇ１期の進行、ｃＡＰＫ活性、ＦＧＭ経路の窒素活性化を制御し；寿命の制御に関与し；Ａｋｔ／ＰＫＢと相同的なプロテインキナーゼである。
【０１７５】
Ｙａｋ１（NM_001181574.1）は、グルコース利用能に応じた増殖制御に関与するグルコース感知系の一部であり；グルコースシグナルに応じて、細胞質から核に移行し、Ｐｏｐ２をリン酸化するセリン−スレオニンプロテインキナーゼである。
【０１７６】
Ｍｉｇ１（NM_00180900.1）は、グルコース抑制に関与する転写因子であり；２つのＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフを含んでいる配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質であり；ＳＮＦ１キナーゼおよびＧＬＣ７ホスファターゼによって制御されている。
【０１７７】
Ｒｉｍ１（NM_001179933.1）は、栄養素に応じた細胞増殖（特に静止期の確立）の間におけるシグナル伝達に関与し；ＩＭＥ２の制御因子と同定されており；Ｐｈｏ８０ｐ−Ｐｈｏ８５ｐキナーゼの基質であるグルコース応答性のプロテインキナーゼである。
【０１７８】
Ｋｃｓ１（NM_001180325.1）は、イノシトール６リン酸（ＩＰ６）およびイノシトール７リン酸（ＩＰ７）のキナーゼである。Ｋｃｓ１ｐによる高エネルギーのイノシトール２リン酸の生成は、多くの過程（例えば、液胞の生合成、ストレス応答およびテロメアの維持）に必要とされる。
【０１７９】
Ｔｐｓ１（NM_00117874.1）は、貯蔵糖であるトレハロースを合成するトレハロース−６−リン酸シンターゼ／ホスファターゼのシンターゼサブユニットであり；単量体としても見られ；発現が、ストレス応答によって誘導され、Ｒａｓ−ｃＡＭＰ経路によって抑制される。
【０１８０】
（変更されたタンパク質活性のレベル）
１つ以上のグルコース応答遺伝子を含んでいる宿主細胞において、少なくとも１つグルコース応答遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質は、１つ以上の当該タンパク質の野生型の活性レベルと比べて変更され得る。１つ以上のタンパク質の活性レベルは、１つ以上のタンパク質の野生型の活性レベルと比べて、向上され得るか、または低下され得る。
【０１８１】
タンパク質の活性レベルの変更は、宿主細胞の遺伝的改変によって実現され得る。遺伝子発現またはタンパク質の活性の向上を生じる遺伝的改変は、遺伝子の増強、過剰産生、過剰発現、活性化、亢進、付加、または上方制御と呼ばれ得る。それは、コードされるタンパク質の向上された発現および／または活性を包含し得、タンパク質のより高い活性または作用（例えば、特異的な活性またはインビボの酵素活性）、タンパク質の低下した阻害または分解、ならびにタンパク質の過剰発現を包含している。例えば、遺伝子のコピー数が増加され得るか、発現レベルは、天然のプロモータより高い発現レベルをもたらすプロモータの使用によって向上させられ得るか、または遺伝子は、酵素の生物活性もしくはタンパク質の作用を向上させる遺伝子操作もしくは典型的な変異生成によって改変され得る。遺伝子を持続的に発現させる変異、またはコードされるタンパク質を構成的に活性化する変異は、タンパク質の活性の向上を生じる遺伝的改変のさらなる例である。また、上述した改変のうちいずれかの組合せが、可能である。
【０１８２】
遺伝子発現またはタンパク質の活性の低下を生じる遺伝的改変は、遺伝子の不活性化（完全または部分的な）、欠失、分断、妨害、サイレンシング、下方制御、または発現の減弱と呼ばれ得る。例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の低下を生じる遺伝子における遺伝的改変は、当該遺伝子の完全な欠失（すなわち当該遺伝子は存在せず、したがってタンパク質は存在しない）、タンパク質の翻訳を不完全に生じるか、もしくは翻訳を生じない（例えば、当該タンパク質は発現されない）当該遺伝子における変異、またはタンパク質の天然の機能を低下させるか、もしくは破壊する（例えば、低下したか、または消失した酵素活性または作用を有しているタンパク質が発現される）遺伝子における変異の結果であり得る。より詳細には、本明細書に述べられているタンパク質の作用を低下させることへの言及は、タンパク質の低下した発現および／または生物活性を生じる、対象の宿主細胞における任意の遺伝的改変を一般的に指し、当該言及は、タンパク質の低下した活性、タンパク質の増大した阻害もしくは分解、およびタンパク質の発現の低下もしくは消失を包含している。例えば、タンパク質の作用または活性は、タンパク質の生成を遮断もしくは低下させること、タンパク質の作用を低下させること、またはタンパク質の作用を阻害することによって低下させられ得る。また、これらのいくつかの改変の組合せが可能である。タンパク質の生成を遮断することまたは低下させることは、培地における誘導化合物の存在を必要とするプロモータの制御下に、当該タンパク質をコードする遺伝子を置くことを含み得る。誘導物質が培地から枯渇する条件を確立することによって、タンパク質をコードする遺伝子の発現（したがってタンパク質合成）は、停止され得る。また、タンパク質の作用を遮断すること、または低下させることは、米国特許第４，７４３，５４６号に記載の手法と類似の切除手法を用いることを含み得る。この手法を用いるために、所定のタンパク質をコードする遺伝子は、ゲノムからの当該遺伝子の制御された特異的な切除を可能にする特異的な遺伝配列の間にクローン化される。切除は、例えば、米国特許第４，７４３，５４６号にあるような培養物の培養温度の変更、またはいくつかの他の物理的シグナルもしくは栄養性シグナルによって、実施され得る。
【０１８３】
一般的に本開示によれば、タンパク質の活性における変更は、同じ生物（同じ起源または親配列）に由来する野生型の（すなわち未改変の正常な）タンパク質の、同じか、または等価な条件のもとに測定されるか、または確立される同じ特性についてなされる。そのような条件としては、タンパク質の活性が測定されるアッセイ条件または培養条件（例えば、培地の成分、温度、ｐＨなど）の他に、使用されるアッセイ、評価される宿主細胞の種類などが挙げられる。上述のように、等価な条件は、必ずしも同一ではなく（例えば、条件におけるいくつかのわずかな変更が許容され得る）、同じ条件のもとになされた比較と比べて、細胞増殖または生物学的活性に対する影響を実質的に変更しない類似の条件（例えば培養条件）である。
【０１８４】
［ペントーストランスポータ］
本開示の宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体の生成のためにヘミセルロース性のペントース糖を細胞が利用することを可能にする少なくとも１つの組換えペントーストランスポータをさらに含み得る。ペントーストランスポータは、細胞外から細胞内および／または細胞内から細胞外にペントース分子を輸送する任意の膜貫通型のタンパク質である。本明細書に使用されるとき、ペントースは、５つの炭素原子を有している任意の単糖を指す。ペントースの例としては、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースおよびラムノースが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
一部の実施形態において、本開示のペントーストランスポータは、細胞外から細胞内および／または細胞内から細胞外にペントース分子を輸送する能力を維持している機能的な断片である。
【０１８６】
好適なペントーストランスポータの例としては、表６に記載のペントーストランスポータが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
【表１１】
2014506464.tif 000013
【０１８８】
一部の実施形態において、ペントーストランスポータはキシローストランスポータである。好適なキシローストランスポータの例としては、表７に記載のキシローストランスポータが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
【表１２】
2014506464.tif 000014
【０１９０】
他の実施形態において、ペントーストランスポータはアラビノーストランスポータである。好適なアラビノーストランスポータの例としては、表８に記載のアラビノーストランスポータが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
【表１３】
2014506464.tif 000015
【０１９２】
いくつかの実施形態において、本開示のペントーストランスポータとしては、キシローストランスポータNCU08221およびSTL12/XUT6；アラビノーストランスポータXUT1；アラビノース／グルコーストランスポータNCU06138；キシロース／グルコーストランスポータSUT2、SUT3およびXUT3；キシロース／アラビノース／グルコーストランスポータNCU04963；それらの相同物；ならびにそれらの相同分子種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
他の実施形態において、本開示の宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の組換え酵素をさらに含んでいる。１つ以上の酵素は、宿主細胞にとって内因性または外因性であり得る。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素としては、任意の組合せにおけるＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ４エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビチノール−４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロリダクターゼ、およびキシリトールデヒドロゲナーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの酵素は、ペントース糖を天然に代謝する任意の生物に由来し得る。そのような生物の例としては、Kluyveromyces sp.、Zymomonas sp.、E. coli、Clostridium sp.、および Pichia sp.が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
〔本開示の宿主細胞を生成し、培養する方法〕
本開示の一局面は、組換えセロデキストリントランスポータ、組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、組換えβ−グルコシダーゼ、組換えホスホグルコムターゼ、または組換えヘキソキナーゼの１つ以上を含んでいる宿主細胞の生成に関する。一部の実施形態において、宿主細胞は、本開示の１つ以上のグルコース応答遺伝子、本開示の１つ以上のペントーストランスポータ、および／またはペントース利用に関与する本開示の１つ以上の組換え酵素をさらに含み得る。そのような宿主細胞は、セロデキストリンを分解し、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成するために使用され得る。
【０１９５】
本開示の宿主細胞を生成し、培養する方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターの、宿主細胞への導入または移動を包含し得る。発現ベクターを宿主細胞に移動させるそのような方法は、当業者にとって周知である。例えば、発現ベクターを用いてE. coliを形質転換する１つの方法は、塩化カルシウム処理を含んでおり、発現ベクターはカルシウム沈殿を介して導入される。また、他の塩（例えばリン酸カルシウム）は、同様の手法にしたがって使用され得る。さらに、エレクトロポレーション（すなわち核酸配列に対する細胞の透過性を向上させるための電流の印加）は、宿主細胞をトランスフェクトするために使用され得る。また、核酸配列のマイクロインジェクションは、宿主細胞をトランスフェクトする能力をもたらす。また、他の手段（例えば、脂質複合体、リポソームおよびデンドリマー）が採用され得る。当業者は、これらまたは他の方法を用いて、所望の配列を用いて宿主細胞をトランスフェクトし得る。
【０１９６】
ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、複製が染色体複製と独立している染色体外存在物として存在するベクター（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニクロモソームまたは人工染色体））であり得る。ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含み得る。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、組み込まれている（複数の）染色体とともに複製されるベクターであり得る。さらに、宿主のゲノムに導入されるべきすべてのＤＮＡ、またはトランスポゾンをともに含んでいる単一のベクターもしくはプラスミド、または２つ以上のベクターもしくはプラスミドが使用され得る。
【０１９７】
ベクターは、形質転換された宿主の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを好ましく含んでいる。選択マーカーは、殺生剤耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、および栄養要求株に対する原栄養性などをその産物がもたらす遺伝子である。細菌細胞の選択は、遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子）によって付与されている抗菌耐性に基づき得る。
【０１９８】
酵母宿主にとって好適なマーカーは、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主における使用にとって好適なマーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸リダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。Aspergillusにおける使用にとって好ましいのは、Aspergillus nidulansまたはAspergillus oryzaeのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにStreptomyces hygroscopicusのｂａｒ遺伝子である。Trichodermaにおける使用にとって好ましいのは、ｂａｒおよびａｍｄＳである。
【０１９９】
ベクターは、宿主ゲノムへのベクターの組込み、またはゲノムと独立した細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする（複数の）エレメントを好ましく含んでいる。
【０２００】
宿主ゲノムへの組込みのために、ベクターは、遺伝子の配列、または相同性もしくは非相同性の組換えによるゲノムへのベクターの組込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。代替的に、ベクターは、宿主のゲノムへの相同性組換えによる組込みを導くための付加的なヌクレオチド配列を含み得る。付加的なヌクレオチド配列は、（複数の）染色体の（複数の）正確な位置において、ベクターを宿主ゲノムに組込み可能である。正確な位置における組込みの可能性を上昇させるために、組込みエレメントは、相同性組換えの確率を上昇させるための、十分な数（例えば、１００〜１００００塩基対、好ましくは４００〜１００００塩基対、最も好ましくは８００〜１００００塩基対）の、対応する標的配列と相同性の高い核酸を好ましく含んでいる。組込みエレメントは、宿主のゲノムにおける標的配列と相同的な任意の配列であり得る。さらに、組込みエレメントは、ヌクレオチドの非コード配列またはコード配列であり得る。一方で、ベクターは、非相同性組換えによって宿主のゲノムに組み込まれ得る。
【０２０１】
自律的な複製のために、ベクターは、対象である宿主においてベクターを自律的に複製可能にする複製開始点をさらに含み得る。複製開始点は、細胞において機能する自律的な複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであり得る。“複製開始点”または“プラスミドレプリケータ”という用語は、プラスミドまたはベクターをインビボにおいて複製可能にする配列と、本明細書では規定される。酵母宿主における使用にとっての複製開始点の例は、２ミクロンの複製開始点（ＡＲＳ１、ＡＲＳ２）、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組合せである。糸状菌細胞において有用な複製開始点はＡＭＡ１およびＡＮＳ１である（Gems et al., 1991; Cullen et al., 1987；国際公開第００／２４８８３号）。ＡＭＡ１遺伝子の単離および当該遺伝子を含んでいるプラスミドもしくはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に記載の方法にしたがって実現され得る。
【０２０２】
他の宿主にとっての形質転換の手法は、KluyveromycesについてJeremiah D. Read, et al., Applied and Environmental Microbiology, Aug. 2007, p. 5088-5096；Zymomonas についてOsvaldo Delgado, et al., FEMS Microbiology Letters 132, 1995, 23-26；Pichia stipitisについて米国特許７，５０１，２７５号および；Clostridiumについて国際公開第２００８／０４０３８７号に見られ得る。
【０２０３】
２コピー以上の遺伝子が、遺伝子産物の産生を向上させるために宿主に挿入され得る。遺伝子のコピー数の増加は、少なくとも１つのさらなる遺伝子の、宿主ゲノムへの組込み、またはヌクレオチド配列とともに増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めること（ここで、多コピーの選択マーカー遺伝子、したがって多コピーの上記遺伝子を含んでいる細胞は、適切な選択試薬の存在下において当該細胞を培養することによって選択され得る）によって、達成され得る。
【０２０４】
上述の要素を連結して、組換え発現ベクターを構築するために使用される手法は、当業者にとって周知である（例えば、上述のSambrook et al., 1989を参照すればよい）。
【０２０５】
宿主は少なくとも１つの発現ベクターを用いて形質転換される。単一の発現ベクターのみが（媒介物の添加なしに）使用される場合、ベクターは必要な核酸配列のすべてを含んでいる。
【０２０６】
宿主細胞が発現ベクターを用いて形質転換されると、宿主細胞は培養される。本発明の方法は、組換え核酸が細胞において発現されるように、宿主細胞を培養することを包含している。微生物宿主のために、この過程は、適切な培地において細胞を培養することを必要とする。典型的に、細胞は適切な培地において３５℃で培養される。本発明における好ましい培養培地としては、例えば、工業的に調製された通常の培地（例えば、Luria Bertani（ＬＢ）ブロス、Sabouraud Dextrose（ＳＤ）ブロス、またはYeast medium（ＹＭ）ブロス）が挙げられる。また、他の規定培地または合成の培養培地が使用され得、特定の宿主細胞の増殖にとって適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者によって公知である。培養にとって好適な温度範囲および他の条件は、当該技術において公知である（例えば、Bailey and Ollis 1986を参照すればよい）。
【０２０７】
本開示のいくつかの局面によれば、培養培地は、宿主にとっての炭素源を含んでいる。そのような“炭素源”は、原核細胞または単純な真核細胞の増殖にとっての炭素の源として使用される好適な基質または化合物を一般的に指す。炭素源は、種々の形態（重合体、糖質、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。これらとしては、例えば、種々の単糖（例えばグルコース）、オリゴ糖（例えばセロデキストリン）、多糖、バイオマス重合体（例えば、セルロースまたはヘミセルロース）、キシロース、アラビノース、二糖（例えばスクロース）、飽和もしくは不飽和の脂肪酸、コハク酸塩、乳酸塩、酢酸塩、エタノールなど、またはこれらの混合物が挙げられる。さらに、炭素源は、光合成の産物（これが挙げられるが、これに限定されない）であり得る。
【０２０８】
リグノセルロースバイオマスは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されている。いくつかの実施形態において、炭素源は、バイオマス重合体（例えば、セルロースまたはヘミセルロース）である。本明細書において使用されるとき、“バイオマス重合体”は、生物材料に含まれている任意の重合体である。生物材料は、生きていても、死んでいてもよい。バイオマス重合体としては、例えば、セルロース、キシラン、キシロース、ヘミセルロース、リグニン、マンナン、およびバイオマスに一般的に見られる他の材料が挙げられる。バイオマス重合体の原料の非限定的な例としては、イネ科草本（例えばスイッチグラス、Miscanthus）、もみ殻、バガス、綿花、ジュート、麻、亜麻、竹、シサル麻、アバカ、麦わら、葉、刈り取った芝、トウモロコシの茎および葉、トウモロコシの穂軸、蒸留穀物残渣、マメ科植物、モロコシ、サトウキビ、テンサイのパルプ、木材の切りくず、おがくず、ならびにバイオマス作物（例えばCrambe）が挙げられる。
【０２０９】
適切な炭素源に加えて、培地は、適したミネラル、塩、補助因子、緩衝液、および当業者に公知の他の成分（培養物の増殖と、種々の糖の発酵ならびに炭化水素および炭化水素誘導体の生成に必要な酵素経路の促進とに適した成分）を含んでいる必要がある。反応は、好気性条件または嫌気性条件において行われ得、好気性条件、無酸素条件、または嫌気性条件は、微生物の要求に基づいて選択され得る。種々の糖もしくはバイオマス重合体に基づく増殖、糖発酵、または炭化水素もしくは炭化水素誘導体の合成に必要な、酵素、トランスポータまたは他のタンパク質の発現は、宿主細胞の成長および／または増殖にしたがって影響される。
【０２１０】
〔共発酵の方法〕
本開示の他の局面は、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵する方法に関する。本明細書に使用されるとき、共発酵は、同じ容器における２つ以上の糖の、宿主細胞による同時の発酵を指す。当該方法は、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、本開示の組換えホスホグルコムターゼもしくは本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上、および本開示の組換えセロデキストリントランスポータを含んでいる宿主細胞を準備するステップと；当該宿主細胞がセルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵する条件のもとに、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップとを包含している。本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、本開示の組換えホスホグルコムターゼもしくは本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上、および本開示の組換えセロデキストリントランスポータを含んでいる、本明細書に記載の任意の宿主細胞が使用され得る。
【０２１１】
一部の実施形態において、宿主細胞は、１つ以上の本開示のグルコース応答遺伝子、１つ以上の本開示のペントーストランスポータ、および／またはペントース利用に関与する１つ以上の本開示の組換え酵素をさらに含み得る。代替的に、少なくとも１つのペントーストランスポータおよびペントース利用に関与する１つ以上の酵素は、宿主細胞にとって内因性であり得る。１つ以上の酵素としては、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４イソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビチノール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、または当業者にとって公知の、任意の他のペントース利用酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
本明細書に記載のような共発酵の方法において、セルロース由来の糖としては、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースなどが挙げられるが、これらに限定されず、ヘミセルロース由来の糖としては、キシロースおよびアラビノースが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞による共発酵のためにセルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を調製する目的において、典型的に、リグノセルロースバイオマスは、その構造を変化させ、セルロースのより良好な加水分解を可能にさせるために、最初に前処理される。前処理は、物理的または化学的な方法（例えば、アンモニア繊維／凍結爆砕、水酸化カルシウムもしくは水酸化ナトリウムに基づく石灰法、および酸触媒のありもしくはなしの蒸気爆砕が挙げられる）を包含し得る。次に、前処理されたバイオマスのセルロース成分は、セルラーゼの混合によって加水分解されることが好ましい。市販のセルラーゼ混合物の例としては、Celluclast 1.5L（登録商標）（Novozymes）、Spezyme CP（登録商標）（Genencor）（Scott W. Pryor, 2010, Appl Biochem Biotechnol）、およびCellulyve 50L（Lyven）が挙げられる。
【０２１３】
〔セロデキストリンを分解する方法〕
本開示の他の局面は、宿主細胞においてセロデキストリンを分解する方法を提供する。一局面において、本開示は、宿主細胞を準備すること、およびセロデキストリンの源を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養する（これによってセロデキストリンは分解される）ことによって、セロデキストリンを分解する方法を提供する。当該宿主細胞は、本開示の組換えセロデキストリントランスポータ、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、本開示の組換えホスホグルコムターゼ、または本開示の組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる。本開示の組換えセロデキストリントランスポータ、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、本開示の組換えホスホグルコムターゼ、または本開示の組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる、本明細書に記載の任意の宿主細胞が、使用され得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、１つ以上の本開示のグルコース応答遺伝子、１つ以上の本開示のペントーストランスポータ、および／またはペントース利用に関与する１つ以上の本開示の組換え酵素をさらに含み得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、セロデキストリンの源は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含んでいるリグノセルロースバイオマスである。他の実施形態において、セロデキストリンの源はヘミセルロースである。一部の実施形態において、セロデキストリンの源はセルロースである。典型的に、セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースまたはセロヘキソースである。細胞へのセロデキストリンの輸送は、当業者に公知の任意の方法（米国特許出願公開第２０１１／００２０９１０号に記載の方法が挙げられる）によって測定され得る。
【０２１５】
セロデキストリンを分解するために宿主細胞にとって十分な培養条件は、当業者にとって周知であり、当該培養条件としては、本明細書に記載の適切な任意の培養条件が挙げられる。典型的に、宿主細胞による利用のために培養培地に含められるセロデキストリンまたはセロデキストリンの源を調製するために、リグノセルロースバイオマスは、その構造を変化させ、かつセルロースのより良好な加水分解を可能にさせるために、最初に前処理される。前処理は、物理的または化学的な方法（例えば、アンモニア繊維／凍結爆砕、水酸化カルシウムもしくは水酸化ナトリウムに基づく石灰法、および酸触媒のありもしくはなしの蒸気爆砕が挙げられる）を包含し得る。次に、前処理されたバイオマスのセルロース成分は、セルラーゼの混合によって加水分解されることが好ましい。市販のセルラーゼ混合物の例としては、Celluclast 1.5L（登録商標）（Novozymes）、Spezyme CP（登録商標）（Genencor）（Scott W. Pryor, 2010, Appl Biochem Biotechnol）、およびCellulyve 50L（Lyven）が挙げられる。
【０２１６】
〔炭化水素または炭化水素誘導体の合成方法〕
本開示のさらなる局面は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法を提供する。
【０２１７】
本明細書に使用されるとき、“炭化水素”は、完全に、水素および炭素からなる有機化合物である。炭化水素としては、メタン、エタン、エテン、エチレン、プロパン、プロペン、プロピン、シクロプロパン、アレン、ブタン、イソブテン、ブテン、ブチン、シクロブタン、メチルシクロプロパン、ブタジエン、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ペンテン、ペンチン、シクロペンタン、メチルシクロブタン、エチルシクロプロパン、ペンタジエン、イソプレン、ヘキサン、ヘキセン、ヘキシン、シクロヘキサン、メチルシクロペンタン、エチルシクロブタン、プロピルシクロプロパン、ヘキサジエン、ヘプタン、ヘプテン、ヘプチン、シクロヘプタン、メチルシクロペンタン、ヘプタジエン、オクタン、オクテン、オクチン、シクロオクタン、オクタジエン、ノナン、ノネン、ノニン、シクロノナン、ノナジエン、デカン、デケン、デシン、シクロデカンおよびデカジエンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
本明細書に使用されるとき、“炭化水素誘導体”は、水素以外の少なくとも１つの元素、および炭素の有機化合物である。炭化水素誘導体としては、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパノール、ソルビトールおよびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−ヒドロキシプロピオン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸およびキシロン酸）；エステル；ケトン（例えば、アセトン）；アルデヒド（例えば、フルフラール）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジン、セリンおよびスレオニン）；気体（例えば、二酸化炭素および一酸化炭素）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
好ましい実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体は、燃料として使用され得る。特に好ましい実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体はエタノールまたはブタノールである。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、炭化水素または炭化水素誘導体はエタノールである。一部の実施形態において、エタノールは、少なくとも０．１０〜少なくとも５０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．１〜少なくとも４０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．１〜少なくとも３０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．１〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．１〜少なくとも１０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．１〜少なくとも５ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．１〜少なくとも１ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．５〜少なくとも４０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．５〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．５〜少なくとも１０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．５〜少なくとも５ｇ／Ｌ−時間、少なくとも０．５〜少なくとも１ｇ／Ｌ−時間、少なくとも１〜少なくとも４０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも１〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも１〜少なくとも１０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも１〜少なくとも５ｇ／Ｌ−時間、少なくとも５〜少なくとも４０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも５〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも５〜少なくとも１０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも１０〜少なくとも５０ｇ／Ｌ−時間、少なくとも１０〜少なくとも４０ｇ／Ｌ−時間、または少なくとも１０〜少なくとも２０ｇ／Ｌ−時間の範囲の速度において生成される。
【０２２１】
他の実施形態において、エタノールは、約０．１０、約０．１５、約０．２０、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４０、約０．４５、約０．５０、約０．５５、約０．６０、約０．６５、約０．７０、約０．７５、約０．８０、約０．８５、約０．９０、約０．９５、約１．００、約１．２５、約１．５０、約１．７５、約２．００、約２．２５、約２．５０、約２．７５、約３．００、約３．２５、約３．５０、約３．７５、約４．００、約４．２５、約４．５０、約４．７５、約５．００、約５．２５、約５．５０、約５．７５、約６．００、約６．２５、約６．５０、約６．７５、約７．００、約７．２５、約７．５０、約７．７５、約８．００、約８．２５、約８．５０、約８．7５、約９．００、約９．２５、約９．５０、約９．７５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、約１３、約１３．５、約１４、約１４．５、約１５、約１５．５、約１６、約１６．５、約１７、約１７．５、約１８、約１８．５、約１９、約１９．５、約２０、約２０．５、約２１、約２１．５、約２２、約２２．５、約２３、約２３．５、約２４、約２４．５、約２５、約２５．５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約4５、約５０ｇ／Ｌ−時間またはそれ以上の速度において生成される。本明細書に記載のエタノール生成の速度は、±０．０２ｇ／Ｌ−時間だけ変わり得る点に注意すべきである。例えば、約１０ｇ／Ｌ−時間の速度は、９．９８ｇ／Ｌ−時間から１０．０２ｇ／Ｌ−時間まで変わり得る。
【０２２２】
本開示の一局面によれば、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する方法は、本開示の組換えセロデキストリントランスポータ、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、または本開示の組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる宿主細胞を準備するステップと；セロデキストリンまたはセロデキストリンの源を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養する（これによって、宿主細胞は、炭化水素または炭化水素誘導体をセロデキストリンから生成する）ステップとを包含している。本開示の組換えセロデキストリントランスポータ、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、本開示の組換えβ−グルコシダーゼ、または本開示の組換えヘキソキナーゼの２つ以上を含んでいる、本明細書に記載の任意の宿主細胞が使用され得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、１つ以上の本開示のグルコース応答遺伝子、１つ以上の本開示のペントーストランスポータ、および／またはペントース利用に関与する１つ以上の本開示の組換え酵素をさらに含み得る。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、セロデキストリンの源は、セルロース、ヘミセルロールおよびリグニンを含んでいるリグノセルロースバイオマスである。他の実施形態において、セロデキストリンの源はヘミセルロースである。好ましい一部の実施形態において、セロデキストリンの源はセルロースである。典型的に、セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースまたはセロヘキソースである。
【０２２４】
〔グルコース利用の間におけるＡＴＰ消費を低下させる方法〕
本開示の他の局面は、宿主細胞におけるグルコース利用の間の、ＡＴＰ消費を低下させる方法を提供する。一局面において、本開示は、宿主細胞を準備すること；およびセロデキストリンもしくはセロデキストリンの源を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養することによって、宿主細胞におけるグルコース利用の間のＡＴＰ消費を低下させる方法を提供する。上記宿主細胞は、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチドを含んでおり、かつ本開示の組換えセロデキストリントランスポータ、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、または本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上を含んでいる。上記組換えポリペプチドは、Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）、Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１４）、またはＧ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１５）を含んでいる。上記方法において上記宿主細胞を培養することによって、セロデキストリンは上記組換えポリペプチドによってグルコース−１−リン酸に分解され、ここで、セロデキストリンからのグルコース−１−リン酸の生成は、上記組換えポリペプチドを欠いている対応する細胞と比べて、ＡＴＰ消費を低下させる。本開示の組換えセロデキストリントランスポータ、本開示の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、または本開示の組換えヘキソキナーゼの１つ以上を、本開示の組換えセロデキストリントランスポータとともに含んでいる、本明細書に記載の任意の宿主細胞が使用され得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、１つ以上の本開示のグルコース応答遺伝子、１つ以上の本開示のペントーストランスポータ、および／またはペントース利用に関与する１つ以上の本開示の組換え酵素をさらに含み得る。
【０２２５】
セロデキストリンホスホリラーゼは、セロデキストリンをグルコース−１−Ｐに加リン酸分解するために無機リン酸を利用するので、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有している組換えポリペプチドを含んでいる宿主細胞は、ＡＴＰ消費を低下させた。ここで、それから、グルコース−１−Ｐは、ホスホグルコムターゼによってグルコース−６−リン酸に変換され得る。一方で、セロデキストリンを分解する加水分解経路（例えば、β−グルコシダーゼを利用する経路）は、グルコースを生成し、グルコースは、それからリン酸供与体としてＡＴＰを利用することによってグルコース−６−リン酸に変換される必要がある。したがって、セロデキストリンホスホリラーゼを利用することは、切断反応ごとに１当量のＡＴＰを確保し、グルコースが解糖によって利用されるまでに、セロデキストリン由来のグルコースをリン酸化するために消費される必要のあるＡＴＰの量を低下させる。ＡＴＰ消費は、当業者にとって公知の任意の方法（本明細書に開示の任意の適した方法が挙げられる）によって測定され得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、セロデキストリンの源は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含んでいるリグノセルロースバイオマスである。他の実施形態において、セロデキストリンの源はヘミセルロースである。好ましい一部の実施形態において、セロデキストリンの源はセルロースである。典型的に、セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースまたはセロヘキソースである。
【０２２７】
本開示は、その好ましい一部の実施形態に関連して説明されており、上述の説明は、例証を目的としており、本開示の範囲を限定しないと理解される。本開示の範囲内にある他の局面、利点および変更は、本開示の属する技術の当業者にとって、明確に理解できる。
【０２２８】
以下の実施例は、与えられている実施形態を例証するために提示されており、本開示の範囲を限定すると意図されていない。
【実施例】
【０２２９】
〔実施例１〕
［概論］
微生物を改変して、植物の細胞壁に見られる糖を燃料および他の化学物質に変換することに、大きな重要性がある。植物の細胞壁は、セルロース（グルコースの重合体）、ヘミセルロース（ペントース、ヘキソースおよび糖酸の不均一重合体）、およびリグニン（フェノール類の不均一重合体）から構成されている。それらは、農業廃棄物、一般廃棄物およびエネルギー専用の作物に豊富にある。酵母Saccharomyces cerevisiaeは、頑健であり、遺伝子操作が容易であり、炭素フラックスが高いので、これらの遺伝子工学的な試みにとって好適なプラットフォームである。これにもかかわらず、S. cerevisiaeは、多くの不十分な点（ペントース糖を天然に発酵できないこと、溶媒に対する感受性、および分解された植物材料に見られる阻害化合物に対する感受性が挙げられる）を有している。
【０２３０】
他の不十分な点は、S. cerevisiaeが、セロデキストリン（例えばセロビオース）を天然に発酵させないことである。セロデキストリンは、β（１→４）結合されたグルコースの短い重合体であり、セルロースの繰返し単位であり、セルラーゼによるセルロースの酵素的な消化によって生成される。セロデキストリン消費を可能にするために、S. cerevisiaeは、β−グルコシダーゼを分泌するか、もしくは表面提示して、細胞外においてセロデキストリンをグルコースに加水分解するためにか；またはβ−グルコシダーゼによる細胞内の加水分解を目的としてセロデキストリントランスポータを用いてセロデキストリンを取り込むために、改変されている。
【０２３１】
２つの上述の加水分解経路において、セロデキストリンのｏ−グリコシド結合は、加水分解酵素および水によって切断されて、グルコースを生成し；加リン酸分解経路において、セロデキストリンのｏ−グリコシド結合は、ホスホリラーゼおよび無機リン酸（Ｐｉ）によって切断されて、グルコースおよびグルコース−１−リン酸を生成する。エムデン−マイエルホーフ解糖経路の第１段階が、ＡＴＰを消費してグルコースをリン酸化するので、この差は重要である。したがって、加リン酸分解経路は、グルコースのリン酸化のためにより少ないＡＴＰが消費されるので、ＡＴＰが供給不足の場合に好適であり得る。
【０２３２】
低いＡＴＰ要求を有している経路は、リグノセルロース基質からの、燃料および化学物質の生成にとって好適であり得る。リグノセルロースは、ヘミセルロースを加水分解し、かつリグニンからセルロースを遊離させるために、希酸を用いて一般的に処理される。セルロースの酵素的な加水分解は、ヘキソース糖およびペントース糖を含んでいるだけでなく、ヘミセルロース由来の高濃度の酢酸を含んでいる低ｐＨの加水分解物を生じる。低ｐＨにおいて、酢酸は、S. cerevisiaeの原形質膜を越えて、酢酸が酢酸塩へと脱プロトン化する細胞質に移動する。恒常性を保つために、解離したプロトンおよび酢酸塩は、いずれもＡＴＰを消費する膜結合型Ｈ＋ポンプＰｍａ１、および弱酸流出ポンプＰｄｒ１２を介して運び出される必要がある。
【０２３３】
したがって、以下の実施例は、取り込まれたセロビオースが切断される機序のみにおいて異なる２つのセロビオース発酵経路の能力を比較する（図２）。第１の経路は細胞内の加水分解酵素を利用しており、第２の経路は細胞内の加リン酸分解酵素を利用している（図２）。
【０２３４】
［材料および方法］
（セロビオースホスホリラーゼおよびホスホグルコムターゼのクローニング）
Celvibrio gilvus（ＣｇＣＢＰ、Accession: AB010707）、Sacharophagus degradans（ＳｄＣＢＰ、Accession: YP_526792）およびClostridium thermocellum（ＣｔＣＢＰ、Accession: YP_001036707）由来のセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）遺伝子は、コドン最適化され、ＤＮＡ２．０によって合成された。上記遺伝子を、２μプラスミドのｐＲＳ４２５における制限酵素認識部位ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩの間に挿入した。ｐＲＳ４２５は、変更されて、S. cerevisiaeのＰＧＫ１プロモータおよびＣｙｃ転写ターミネータを含んでいた（ＰＧＫ１＿ｐＲＳ４２６）。
【０２３５】
C. gilvusのＣＢＰ遺伝子は、ＰＧＫ１＿ｐＲＳ４２６プラスミドに挿入されて、プラスミドＰＧＫ１＿ＣｇＣＢＰ＿４２５を生成した。C. gilvusのＣＢＰ遺伝子を、以下のプライマーを使用して挿入した。
【０２３６】
【化１】
2014506464.tif 000016
【０２３７】
S. degradansのＣＢＰ遺伝子は、ＰＧＫ１＿ｐＲＳ４２６プラスミドに挿入されて、プラスミドＰＧＫ１＿ＳｄＣＢＰ＿４２５を生成した。S. degradansのＣＢＰ遺伝子を、以下のプライマーを使用して挿入した。
【０２３８】
【化２】
2014506464.tif 000017
【０２３９】
C. thermocellumのＣＢＰ遺伝子は、ＰＧＫ１＿ｐＲＳ４２６プラスミドに挿入されて、プラスミドＰＧＫ１＿ＣｔＣＢＰ＿４２５を生成した。C. thermocellumのＣＢＰ遺伝子を、以下のプライマーを使用して挿入した。
【０２４０】
【化３】
2014506464.tif 000018
【０２４１】
本明細書に開示のすべてのプライマーについて、制限酵素認識部位に下線を付し、６×ヒスチジンタグにイタリックを使用している。
【０２４２】
ＣＢＰ遺伝子およびS. cerevisiaeのホスホグルコムターゼ遺伝子の両方を含んでいるプラスミドを構築するために、Ｐｇｍ２（Accession: CAA89741）は、プラスミドＰＧＫ１＿ｐＲＳ４２６における制限酵素認識部位ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩの間にまずクローニングされて、プラスミドＰＧＫ１＿ＰＧＭ＿４２５を生成した。Ｐｇｍ２遺伝子を、以下のプライマーを使用して挿入した。
【０２４３】
【化４】
2014506464.tif 000019
【０２４４】
ＰＧＫ１プロモータおよびＣｙｃ転写ターミネータによって１つにまとめられたＰｇｍ２遺伝子を、それからＰＧＫ１＿ＰＧＭ＿４２５プラスミドから、以下のプライマーを用いて増幅した。
【０２４５】
【化５】
2014506464.tif 000020
【０２４６】
この断片は、ＰＧＫ１＿ＳｄＣＢＰ＿ｐＲＳ４２５プラスミド、ＰＧＫ１＿ＣｇＣＢＰ＿４２５プラスミド、およびＰＧＫ１＿ＣｔＣＢＰ＿４２５プラスミドのＳａｃＩ制限酵素認識部位に挿入され、ＰＧＫ１＿ＳｄＣＢＰ＿ＰＧＭ＿４２５、ＰＧＫ１＿ＣｇＣＢＰ＿ＰＧＭ＿４２５およびＰＧＫ１＿ＣｔＣＢＰ＿ＰＧＭ＿４２５のプラスミドを生成した。
【０２４７】
（S. cerevisiae株の構築および増殖）
本研究に使用される酵母株を生成するために、酵母EZ-Transformationキット（BIO 101, Vista, Calif.）を使用して、S. cerevisiae株Ｄ４５２−２（ＭＡＴα  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｕｒａ３  ｃａｎ１）（Hosaka,1992）にプラスミドを導入した。アミノ酸栄養要求性マーカーを用いて形質転換体を選択するために、６．７ｇ／Ｌの酵母用の窒素塩基に加えて、＋２０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌの寒天およびＣＳＭ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ（Bio 101, Vista, CA）を含んでいる酵母合成完全（ＹＳＣ）培地を使用した。この培地は、適切なヌクレオチドおよびアミノ酸を供給した。
【０２４８】
（発酵）
ＹＳＣプレートからの単一のコロニーを、２０ｇ／Ｌのセロビオースを含有している５ｍＬのＹＰ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および２０ｇ／Ｌのペプトン）おいて一晩培養した。対数期の中間にある細胞を、回収し、滅菌水による２回の洗浄後に播種した。フラスコの発酵実験のすべてを、２５０ｍＬフラスコに入っている、８０ｇ／Ｌのセロビオースを含んでいる５０ｍＬのＹＰ培地を用いて、１．０以下の初期ＯＤ６００および酸素制限条件のもとに、３０℃において実施した。細胞の増殖を、紫外可視分光光度計（Biomate 5, Thermo, NY）を使用して、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）によってモニタした。エタノール、酢酸塩、グルコースおよびグリセロールの濃度を、Rezex ROA-Organic Acid H+（８％）カラム（Phenomenex Inc.、Torrance、CA）を用いた、屈折率検出器を備えた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Agilent Technologies 1200 Series）によって、測定した。カラムを、０．００５ＮのＨ２ＳＯ４を用いて０．６ｍｌ／分の流速、５０℃において抽出した。
【０２４９】
（加リン酸分解性株の進化分子工学）
発酵反応を、ｃｄｔ−１およびS. degradansのＣＢＰを用いて形質転換されたS. cerevisiaeＤ４５２−２株を使用して、上述の通りに開始した。セロビオースの濃度がほぼゼロに達すると、細胞を、回収し、０．０１以下のＯＤ（６００ｎｍ）において新たな反応を確立するために使用した。この処理を、３０日間に７回繰り返した。この時点おいてクローンを分離するために、細胞を、２０ｇ／Ｌのセロビオースを含有しているＹＳＣプレート上に播いた。分離されたクローンから向上した表現型を確認した後、プラスミドを、代表的なクローンの１つから単離し、配列決定した。
【０２５０】
（部位特異的変異生成およびトランスポータの動態）
部位特異的変異生成を、Quickchange（登録商標）プロトコル（Zheng et al., Nucleic Acids Res. 2004 Aug 10;32(14):e115）を使用して、実施した。各変異を導入するために使用されたプライマーは、表９に挙げられている。トランスポータの動態を、わずかな変更をともなってこれまでに述べられているように測定した（Galazka et al., Science. 2010 Oct 1;330(6000):84-6. Epub 2010 Sep 9）。手短にいうと、変異体トランスポータを用いて形質転換された酵母株Ｄ４５２−２を、５０ｍＬのＤＯＢ−ウラシル５０ｍＬにおいて０．２以下のＯＤ（６００ｎｍ）に調整し、１以下のＯＤ（６００ｎｍ）まで培養した。細胞を、それから遠心分離によって回収し、１０ｍＬの輸送緩衝液（３０ｍＬのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ５．６）、５０ｍＭのＥｔＯＨ）を用いて３回洗浄し、４０以下の最終ＯＤ（６００ｎｍ）まで輸送緩衝液に再懸濁した。１００μＬのこれらの細胞のＧＦＰ蛍光を、Beckman Coulter Paradigm（商標）プレートリーダーにおいて、４８５／５３５ｎｍの励起／発光波長を用いて測定した。９５秒間の全体における取込みの直線的な変化率を記録するために、５０μＬの細胞を、１００μＬのシリコンオイル（Sigma 85419）の上に層状化されている輸送緩衝液における、４０μＣｉ／μｍｏｌのＳ．Ａ．を有している適切な濃度の５０μＬの［３Ｈ］−セロビオースに加えた。反応を、１７０００ｇにおいて１分間にわたってオイルを通して細胞をスピンさせることによって停止させ、チューブを、エタノール／ドライアイスにおいて凍結させ、細胞ペレットを含んでいるチューブの底部を、１ｍＬの０．５ＭのＮａＯＨに取った。ペレットを、１晩かけて可溶化し、５ｍＬのUltima Goldシンチレーション液を加え、ＣＰＭを、Tri-Carb 2900TRシンチレーションカウンターにおいて測定した。［３Ｈ］−セロビオースは、Moravek Biochemicals, Inc.から購入され、４Ｃｉ／ｍｍｏｌの比放射能および９９％を超える純度を有していた。ＶｍａｘおよびＫＭの値は、SigmaPlot（登録商標）における非線形回帰による速度対セロビオースの濃度のプロットに、単一の２パラメータ双曲線関数を適合させることによって決定された。
【０２５１】
【表１４】
2014506464.tif 000021
【０２５２】
（発酵の間におけるＧＦＰ蛍光の測定）
発酵の間に、ＯＤ（６００ｎｍ）が１０．０に達すると、細胞を、回収し、滅菌水によって２回洗浄した。２００μＬの細胞懸濁液を、黒色のCorning９６ウェルオプティカルボトムプレート（Corning, NY）に移した。蛍光強度を、Biotek Synergy HT分光光度計（Biotek, Winooski, VT）を用いて、４８５ｎｍの励起波長、５２８ｎｍの発光において測定した。
【０２５３】
（細胞抽出液における酵素活性の測定）
発酵反応を、ＹＰＣ８０培地またはＹＰＤ８０培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、８０ｇ／Ｌのグルコース）のいずれかにおいて上述のように準備した。反応の対数期に一致する１０以下のＯＤ（６００ｎｍ）において、２ｍＬの培養物を取り出し、細胞を回収した。細胞のペレットを、５００μＬの氷冷の抽出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、２ｍＭのＤＴＴ、およびRoche Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail）において２回洗浄し、２００μＬのこの緩衝液に再懸濁させ、これを、１００μＬ以下の０．４ｍｍのジルコニア／シリカビーズの入っているねじ蓋のチューブに移した。それから、細胞を、Biospecの製品Mini-BEADBEATERを使用して、各実施の間に３０秒間の休止を有している、４℃における３０秒にわたる３回のビーズ撹拌によって溶解させた。それから、細片を、ペレット化し、上清におけるタンパク質の濃度を、Bio-Radから得た試薬およびマイクロタイターのプレートプロトコルを用いた、Bradfordアッセイ分析によって測定した。
【０２５４】
細胞抽出物におけるセロビアーゼ活性の程度を、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイによって測定した。１０μｇの細胞抽出物を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１０Ｕのグルコースオキシダーゼ、１０Ｕのペルオキシダーゼ、１ｍＭのｏ−ジアニシジンおよび１０ｍＭのセロビオースからなる１ｍＬのアッセイ混合物に加えた。１秒あたりに生成されるグルコースのピコモル数を、４３６ｎｍにおける増加率に、グルコースの検量線から定められた換算値１．１７×１０３を掛けることによって算出した。
【０２５５】
細胞抽出物におけるヘキソキナーゼの活性の程度を、グルコース−６−リン酸脱水素酵素によるＮＡＤＰ＋の還元に対して、グルコース−６−リン酸の生成を結び付けることによって測定した。１０μｇの細胞抽出物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（３０℃におけるｐＨ８．０）、１３．３ｍＭのＭｇＣｌ２、５４０μＭのＡＴＰ、２０μＭのＮＡＤＰ＋、１ＵのS. cerevisiaeグルコース−６−リン酸脱水素酵素、および１１２ｍＭのグルコースからなる１ｍＬのアッセイ混合物に加えた。１秒当たりに生成されるグルコース−６−リン酸のピコモル数を、３４０ｎｍにおける増加率に、グルコース−６−リン酸の検量線から定められた換算値１．８５×１０３を掛けることによって算出した。
【０２５６】
（ＧＨ１−１、ＳｄＣＢＰ、Ｈｘｋ１、Ｈｘｋ２およびＧｌｋ１の精製）
ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰを、上述のＤ４５２−２酵母株から直接精製した。ＤＯＢ  −ウラシル  −ロイシンにおける２００ｍＬの培養物を、７以下のＯＤ（６００ｎｍ）になるまで培養した。細胞を、ペレット化し、４０ｍＬのｄｄＨ２Ｏを用いて１回洗浄した。細胞のペレットを、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ８．０］、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、２ｍＭのＤＴＴ、およびRoche Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktailの２５ｍＬに再懸濁し、２００００Ｐ．Ｓ．Ｉ．においてAvestin EmulsiFlex C-3ホモジナイザーに通すことによって溶解させた。それから、細胞の細片を、ペレット化し、タンパク質を、Qiagenによって提供されているネイティブなバッチ精製用の手順にしたがって、Qiagenから得たNickel-NTAアガロースビーズを使用して精製した。ビーズから溶出されたタンパク質を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１０％のグリセロールおよび２ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液に緩衝液交換し、（ｌ）Ｎ２において瞬間凍結させ、−８０℃において保存した。タンパク質の濃度を、ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰについて、それぞれ１０８７５０Ｍ−１ｃｍ−１および１７８５４０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いた２８０ｎｍにおける吸光度によって測定した。
【０２５７】
Ｈｘｋ１（Accession: NP_116711）、Ｈｘｋ２（Accession: NP_011261）、およびＧｌｋ１（Accession: NP_009890）の遺伝子を、E. coliにおいて発現させ、精製した。遺伝子を、発現プラスミドｐＥＴ３０２の制限酵素認識部位ＰｍｌＩおよびＸｈｏＩの間に、まずクローン化した。Ｈｘｋ１遺伝子を、以下のプライマーを用いて増幅した。
【０２５８】
【化６】
2014506464.tif 000022
【０２５９】
Ｈｘｋ２遺伝子を、以下のプライマーを用いて増幅した。
【０２６０】
【化７】
2014506464.tif 000023
【０２６１】
Ｇｌｋ１遺伝子を、以下のプライマーを用いて増幅した。
【０２６２】
【化８】
2014506464.tif 000024
【０２６３】
E. coliのＢＬ２１（ＤＥ３）株にこれらのコンストラクトを形質導入し、タンパク質を発現させ、Qiagenによって提供されているネイティブなバッチ精製用の手順にしたがって、Qiagenから得たNickel-NTAアガロースビーズを使用して精製した。ビーズから溶出されたタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［３０℃におけるｐＨ８．０］、１３．３ｍＭのＭｇＣｌ２、および２ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液に緩衝液交換し、（ｌ）Ｎ２において瞬間凍結させ、−８０℃において保存した。タンパク質の濃度は、Ｈｘｋ１、Ｈｘｋ２およびＧｌｋ１について、それぞれ４５８４０Ｍ−１ｃｍ−１、４５８４０Ｍ−１ｃｍ−１および３０３７０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いた２８０ｎｍにおける吸光度によって測定した。
【０２６４】
（ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰのグリコシル転移活性）
ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰのグリコシル転移活性を測定するために、１００ｎｋａｔの各酵素を、５０ｍＭのリン酸緩衝液および２ｍＭのＤＴＴにおいて１００μＬの２０％（ｗ／ｖ）のセロビオースとともに、３７℃においてインキュベートした。１２時間後、反応を、４００μＬの０．１ｍＭのＮａＯＨにおいて停止させ、CarboPac PA200カラムを用いた、Dionex ICS-3000を有しているイオンクロマトグラフィによって分析した。ピークを、電気化学的検出器を用いて検出した。
【０２６５】
（ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰの動態パラメータ）
精製されたＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰの動態パラメータを、細胞抽出物に対して使用されたすでに詳述されていると同様に、グルコースオキシターゼ／ペルオキシターゼアッセイを用いて、種々のセロビオース濃度におけるグルコース生成の速度を測定することによって決定した。１ｍＬのアッセイは、８．７５ｐｍｏｌのＧＨ１−１または２０ｐｍｏｌのＳｄＣＢＰのいずれかを含んでいた。ＶｍａｘおよびＫＭの値は、SigmaPlot（登録商標）における非直線回帰によるグルコース生成の速度対セロビオース濃度のプロットに、単一の２パラメータ双曲線関数を適合させることによって決定された。
【０２６６】
（S. cerevisiaeヘキソキナーゼに対するセロビオースの作用）
精製されたＨｘｋｌｐ、Ｈｘｋ２ｐおよびＧｌｋ１ｐの活性に対する高濃度のセロビオースの作用を測定するために、精製されたタンパク質の活性を、細胞抽出物に対して使用されたすでに詳述されていると同様に、グルコース−６−リン酸の生成を、グルコース−６−リン酸脱水素酵素によるＮＡＤＰ＋の還元に結び付けることによって、１８４ｎＭのセロビオースの存在下または非存在下において測定した。１〜１０ｐｍｏｌのＨｘｋ１、Ｈｘｋ２およびＧｌｋ１を使用した。
【０２６７】
［結果］
（セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリントランスポータを発現する酵母株）
Sacharophagus degradans（ＳｄＣＢＰ）、Celvibrio gilvus（ＣｇＣＢＰ）、およびClostridium thermocellum（ＣｔＣＢＰ）由来のセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）遺伝子を、コドン最適化し、合成し、２μプラスミドにクローン化した。これらのプラスミドを、ＧＦＰタグ付きのセロデキストリントランスポータ遺伝子ｃｄｔ−１を有しているプラスミドとともに、S. cerevisiae株Ｄ４５２−２に形質導入した。
【０２６８】
生じた３つの株のすべては、セロビオースを消費し、エタノールを生成した（図３）。３つの各改変株のセロビオース消費速度は、類似しており、約０．９５から約１．０２ｇ／Ｌ−時間の範囲であった。また、３つの株のエタノール生成速度は、類似しており、約０．４２から約０．４４ｇ／Ｌ−時間の範囲であった。７７時間後、ほぼすべてのセロビオースは、約０．４３から約０．４５ｇ／ｇの範囲の収率を有して、３つの株のそれぞれによってエタノールに発酵された。さらに、酢酸塩、グルコースまたはグリセロールの明らかな蓄積はなかった。
【０２６９】
β−グルコシダーゼによる細胞内加水分解に依存している、これまでに開発されたセロビオースを輸送する酵母株は、細胞外の培地におけるグルコースおよびセロデキストリン（例えば、セロトリオースおよびセロテトラオース）の同時の蓄積をともなって、セロビオースを発酵させる。しかし、この現象は、β−グルコシダーゼではなくセロビオースホスホリラーゼを発現する３つの酵母株において観察されなかった。
【０２７０】
（ホスホグルコムターゼの異所的な発現）
セロビオースホスホリラーゼは、グルコースおよびグルコース−１−リン酸に、セロビオースを加リン酸分解的に切断し、グルコース−１−リン酸は、解糖経路に入るために、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって、グルコース−６−リン酸に変換される必要がある。ＰＧＭは、糖分解性の増殖の間に転写について下方制御されるので、S. cerevisiaeのＰＧＭがＣＤＴ−１およびＣＢＰとともに異所的に発現されている一連の酵母株を、ＰＧＭの異所的発現がエタノール生成を向上させるか否かを決定するために試験した。しかし、これらの酵母株は、ＰＧＭを異所的に発現しない対応する酵母株と比較してわずかに低い能力を示した（図４）。
【０２７１】
（改良された加リン酸分解性の酵母株）
セロデキストリントランスポータおよびセロビオースホスホリラーゼを発現する改変酵母株の発酵結果を向上させるために、ＣＤＴ−１およびＳｄＣＢＰを発現する株を、８０ｇ／Ｌのセロビオースを含有しているＹＰ培地への、３０日にわたる連続的な移し替えによって濃縮した。改良された株は、親株より２倍速く、セロビオースを消費し、エタノールを生成すると明らかになった。進化株によるエタノール生産性は、１．００ｇ／Ｌ−時間であり、親株は、０．４０ｇ／Ｌ−時間のエタノール生産性を示した。
【０２７２】
改良された酵母株の原因になっている変異を同定するために、両方の２μプラスミド（ｐＲＳ４２５−ＳｄＣＢＰおよびｐＲＳ４２６−ＣＤＴ−１）を、進化株から単離し、配列決定した。配列決定によって、翻訳されたポリペプチドにおける２１３位におけるフェニルアラニンのロイシンへの変更（Ｆ２１３Ｌ）に対応する、ｃｄｔ−１のオープンリーディングフレームにおける単一のヌクレオチド変異（Ｃ６３９Ａ）が同定された。天然のＤ４５２−２酵母株への単離したプラスミドの形質導入が、上記結果を再現したので、この単一の変異は、向上した能力を担っている（図５）。変異体ＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）およびＳｄＣＢＰを発現する株は、２．０６±０．０４ｇ／Ｌ−時間の速度においてセロビオースを消費し、０．９０±０．０１ｇ／Ｌ−時間の速度においてエタノールを生成した（図５Ｂ）。これは、セロビオース生成速度における１０２％の向上であり、エタノール生成速度における１０５％の向上である。エタノールの収率は影響を受けず、酢酸塩、グルコース、グリセロールまたはセロデキストリンの明らかな蓄積はなかった。
【０２７３】
（β−グルコシダーゼ発現と関連する変異体ＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）の発現）
細胞内β−グルコシダーゼとともにＣＤＴ−１を発現する株は、セロビオースをエタノールに発酵するとこれまでに示されている。また、変異体ＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）がそのような株の能力を向上させるか否かを評価するために、変異体ＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）を、細胞内β−グルコシダーゼＧＨ１−１とともにＤ４５２−２において発現させた。セロビオースの発酵におけるわずかな向上のみが、野生型ＣＤＴ−１およびＧＨ１−１を発現する株と比べて認められた（図５Ｃおよび図５Ｄ）。
【０２７４】
これまでに報告されているように（Ha et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Feb 15;108(7):2735-40. Epub 2011 Jan 31）、ＣＤＴ−１およびＧＨ１−１を発現する株によるセロビオース発酵は、グルコースおよびセロデキストリンの蓄積をともなって生じ、同じ傾向が、ＧＨ１−１およびＣＤＴ−１  Ｆ２１３Ｌを発現する株において見られた。
【０２７５】
（セロデキストリントランスポータの変異体）
他のＣＤＴ−１変異体が、セロビオースの発酵に対する類似の作用を有しているか否かを決定するために、これまでに同定されている７つのアラニン変異体を試験した。β−グルコシダーゼＧＨ１−１と組み合わせたこれらのトランスポータ変異体のそれぞれの発現は、セロビオースに基づいて異なる速度においてS. cerevisiaeが増殖することを可能にすると、これまでに認められている。野生型ＣＤＴ−１の発現と比較して、トランスポータ変異体Ｇ９１ＡおよびＦ３３５Ａの発現は、より早い成長速度をもたらし、トランスポータ変異体Ｑ１０４ＡおよびＦ１７０Ａは、中程度の成長速度をもたらし、トランスポータ変異体Ｅ１９４ＡおよびＲ１７４Ａは、遅い成長速度をもたらした（図６Ａ）。
【０２７６】
ＧＨ１−１と組み合わせて７つのトランスポータのそれぞれを発現する酵母株の発酵速度は、Ｇ９１Ａ＞Ｆ３３５Ａ＞Ｆ２１３Ａ＞ＷＴ＞Ｆ１７０Ａ＞Ｑ１０４Ａ＞Ｒ１７４Ａ＞Ｅ１９４Ａを有している同じ傾向にしたがった（図６Ａ、図７および表１０）。しかし、セロビオースホスホリラーゼＳｄＣＢＰと組み合わせて７つのトランスポータのそれぞれを発現する酵母株において、異なる傾向が認められた。この場合、傾向は、Ｆ２１３Ａ＞Ｇ９１Ａ＞ＷＴ＞Ｑ１０４Ａ＞Ｆ１７０Ａ＞Ｆ３３５Ａ＞Ｒ１７４Ａ＞Ｅ１９４Ａであった（図６Ｂ）。最も顕著な差異は、ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰを発現する株の間において、最適なトランスポータが異なることである。
【０２７７】
【表１５】
2014506464.tif 000025
【０２７８】
表１０は、種々のｃｄｔ−１変異体を有している改変酵母株のセロビオース消費およびエタノール生成を定量化している。S. cerevisiaeのＤ４５２−２株は、ｃｄｔ−１変異体のうちの１つもしくは野生型ｃｄｔ−１のいずれか、およびS. degradans由来のコドン最適化されたセロビオースホスホリラーゼもしくはβ−グルコシダーゼ遺伝子ｇｈ１−１を用いて形質転換された。上記株がセロビオースを消費した速度およびエタノールを生成した速度は、表１０に示されている。すべての値は、２つの独立した発酵の結果の平均値であり、エラーバーは、２つの発酵の間における、結果の標準偏差を表している。
【０２７９】
トランスポータの機能を直接的に評価するために、最高の発酵速度を示す４つのトランスポータ（ＷＴ、Ｇ９１Ａ、Ｆ３３５ＡおよびＦ２１３Ｌ）のミカエリス−メンテン分析を、種々の濃度の［３Ｈ］セロビオースにおける細胞への［３Ｈ］セロビオース取込みの速度を測定することによって、実施した（図８）。結果は、表１１に定量化されている。ＷＴ（ＫＭ＝７．６±１．５μＭ、Ｖｍａｘ＝０．６０±０．０３ｐｍｏｌ／ｓ）と比較して、すべての変異体は、セロビオースとのより低い親和性を有していた。しかし、３つの変異体は、より高いＶｍａｘを有していた。したがって、より速い発酵速度を可能にするトランスポータはまた、より高い最高速度においてセロビオースを輸送する。
【０２８０】
【表１６】
2014506464.tif 000026
【０２８１】
トランスポータの動態の測定において、株は、グルコースに基づいて培養され、細胞ごとのＧＦＰの蛍光量によって判断される通り、同様のレベル（ＷＴの±２０％以下）において発現されている各トランスポータを生じた。しかし、セロビオースの発酵中には、そうではなかった。酵母細胞が発現させたトランスポータ変異体に依存して、細胞ごとのＧＦＰの蛍光量に大きな差があった（図９）。さらに、これらの差異は、セロビオース消費速度およびエタノール生成速度と強く相関していた。
【０２８２】
（細胞内セロビオース代謝の分析）
同一のトランスポータ遺伝子の使用にもかかわらず、加リン酸分解に対して加水分解によって、セロビオースが切断されるときの株の能力における明確な差異は、輸送されるセロビオースの運命がその細胞内プロセスの機序および動態に依存することを示唆している。したがって、改変酵母株の細胞内代謝を、全細胞抽出物における選ばれた酵素活性を測定することによって分析した。抽出物を、ＧＨ１−１またはＳｄＣＢＰのいずれかと、ＣＤＴ−１とを発現する株によるセロビオース発酵の対数期における細胞から調製した。株は、ＧＦＰの蛍光量によれば、同一レベルにおいてＣＤＴ−１を発現していた（図１０Ａ）。さらなる比較のために、抽出物を、グルコース発酵の対数期における野生型Ｄ４５２−２酵母から調製した。
【０２８３】
細胞内のセロビオースを切断する２つの株の能力に有意差があるか否かを決定するために、１０μｇの抽出物におけるセロビアーゼ活性の程度（Bradfordアッセイによって決定されるような）を、測定した。セロビアーゼ活性は、機序とは無関係にセロビオースから生成されたグルコースの割合と規定され、ＧＨ１−１またはＳｄＣＢＰを発現する株において同様であった（図１０Ｂ）。予想通り、野生型Ｄ４５２−２の抽出物に、検出可能なセロビアーゼの活性はなかった（図１０Ｂ）。この酵素によって生成されるグルコース−１−リン酸について明らかにされないので、このアッセイは、セロビオースホスホリラーゼの活性を５０％だけ少なく見積もることに注意することが重要である。
【０２８４】
さらに、１０μｇのこれらの抽出物におけるヘキソキナーゼ活性の程度は、ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰを有している株の間において区別できなかった（図１０Ｃ）。さらに、両方の株は、野生型Ｄ４５２−２株よりわずかに高いヘキソキナーゼ活性を有していた（図１０Ｃ）。
【０２８５】
上述の通り、ＧＨ１−１とともにＣＤＴ−１変異体を発現する株を用いて行われるセロビオース発酵の間に、グルコースおよびセロデキストリンは培地に蓄積した。ＳｄＣＢＰとともにＣＤＴ−１変異体を発現する株を用いて行われたセロビオース発酵の間には、これは観察されない。グルコースおよびセロデキストリンの蓄積は、セロビオースの加水分解またはグリコシド転移のいずれかに続くそれらの流出に起因すると考えらえている。β−グルコシダーゼによるグリコシル転移は、高濃度のグルコースおよびセロビオースが、セロトリオースおよびセロテトラオースに脱水される、十分に実証されている作用である。
【０２８６】
ＧＨ１−１およびＳｄＣＢＰのグリコシド転移活性をアッセイするために、両方の酵素を、ＩＭＡＣによって細胞抽出物から濃縮した。それから、濃縮された酵素を、２０％（ｗ／ｖ）のセロビオースとともに２４時間にわたってインキュベートし、反応生成物を、ＨＰＬＣによって分析した。ＳｄＣＢＰではなくＧＨ１−１は、２ｍｇのセロビオースから約０．４５ｍｇのセロトリオースおよび約０．１ｍｇのセロテトラオースを生成する、これらの条件下における重要なグリコシド転移活性を有していた（図１１）。また、濃縮されたタンパク質の動態パラメータを測定し、その結果は、図１２に示され、表１２に定量化されている。
【０２８７】
【表１７】
2014506464.tif 000027
【０２８８】
（ヘキソキナーゼ活性）
セロビオースは、S. cerevisiaeの細胞質に天然には見られず、その存在は、予測不可能な多くの影響を有し得る。見込まれる影響の１つはヘキソキナーゼに関与し得る。ヘキソキナーゼは、グルコースと強固に結合し、したがってセロデキストリントランスポータおよびセロビオースホスホリラーゼを発現させるために改変された株に見られる高濃度のセロビオースと相互作用し得るか、またはセロビオースによって抑制され得る。
【０２８９】
セロビオースが酵母のヘキソキナーゼを抑制するか否かを調べるために、ヘキソキナーゼを、E. coliに発現させ、精製した。それから、精製された酵素の活性を、１８４ｍＭ以下のセロビオースの存在下および非存在下においてアッセイした。セロビオースのこれらの極端な濃度において、ヘキソキナーゼＨｘｋ１の活性は、影響を受けなかった（図１３）。しかし、ヘキソキナーゼＨｘｋ２およびＧｌｋ１の活性は、２０％以下だけ低下した（図１３）。
【０２９０】
ヘキソキナーゼの活性が、改変された経路に限定的であるか否かを決定するために、酵母ヘキソキナーゼ（ＨＫＸ１、ＨＸＫ２およびＧＬＫ１）の３つすべてを、変異体セロデキストリントランスポータＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）、およびS. degradansのセロビオースホスホリラーゼＳｄＣＢＰを発現する株において、過剰発現させた（図１４）。ＨＸＫ２またはＧＬＫ１の過剰発現は、株の能力を変えず、ＨＸＫ１の過剰発現は、エタノールの生産性の２８％の向上を生じさせた（図１４Ｃおよび表１３）。これらの株に関する、細胞密度、エタノールの生成および収率、ならびにエタノール生産性は、表１３にまとめられている。
【０２９１】
【表１８】
2014506464.tif 000028
【０２９２】
さらに、ＨＸＫ１を発現する株のエタノール生産性は、２３．１の初期密度（ＯＤ）に対して２．６９ｇエタノール／Ｌ−時間まで、初期の細胞密度の増大とともに直線的に増大した（図１５および図１６）。
【０２９３】
［考察］
ここに開示されているのは、リグノセルロース供給原料からの燃料および化学物質の向上された生成を目的とした、S. cerevisiaeに作り出された２つのセロビオース発酵経路の分析である。第１の経路は、これまでに報告されている通り、セロデキストリントランスポータおよび細胞内β−グルコシダーゼを利用する。第２の経路は、細胞内セロビオースホスホリラーゼとともに、同じセロデキストリントランスポータを利用する。加水分解経路は、セルロース分解性真菌に一般に見られ、その生物学的役割は、セルロースの感知および代謝、ならびに植物との共生関係を可能にすることを含んでいると考えらえている。加リン酸分解経路は、同時にセルロース分解性および嫌気性である原核生物内に存在し、呼吸ができない場合の、セロデキストリン消費からのエネルギーの獲得を最大化する。これは、加リン酸分解性の切断が、グルコース−１−Ｐを生成し、したがって、セロデキストリン由来のグルコースを、解糖に加わる前にリン酸化するために消費される必要のあるＡＴＰの量を減少させるからである。
【０２９４】
機能的なセロビオース発酵経路は、７１％以下の２つ１組のアミノ酸同一性を有している、３つの異なる嫌気性細菌に由来するセロビオースホスホリラーゼを用いて首尾よく構築され、酵素的な中心機能の他に特別な性質は、必須ではないことを示唆していた。しかし、上述の結果は、S. cerevisiaeにおける発現のためにこれらの遺伝子をコドン最適化することが重要であり、その結果が、使用される最適化アルゴリズムにともなって変化することを示唆している。
【０２９５】
セロビオーストランスポータＣＤＴ−１および細胞内セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）を有している最適化されていない株は、ＣＤＴ−１および細胞内βグルコシターゼを有している株より遅く、セロビオースをエタノールに発酵させた。これは、ＣＢＰ活性が制限的であることを示唆する一方で、他の結果は、この反対を示している。セロビオース培地における加リン酸分解性株の連続継代の後に、加水分解経路を有している株とほぼ同程度に速くセロビオースを発酵させる新たな株が生じ、この改良に必要な点変異は、ＣＢＰ活性が制限的である場合に予想されるような、ＣＢＰ遺伝子またはその発現への影響を及ぼさなかった。むしろ、セロデキストリントランスポータ、ＣＤＴ−１は、低親和性／高能力の形態に変異されていた。さらに、ＣＤＴ−１の低親和性／高能力の他の形態は、加リン酸分解経路を用いた発酵速度を向上させた。これらの観察はともに、輸送速度が加リン酸分解性株を実際に制限していることを示唆している。
【０２９６】
しかし、理想のトランスポータは、最適な輸送動態が代謝的な理由に依存するために、単に最高の能力を有しているトランスポータとは思われない。これは、細胞内β−グルコシダーゼもしくはセロビオースホスホリラーゼのいずれか、および種々のＣＤＴ−１変異体を有している株の我々の比較に明らかに認められる。この分析は、同一のトランスポータが、加水分解経路または加リン酸分解経路のいずれかの関連において、同一の結果を生じさせることを示した。例えば、ＣＤＴ−１変異体Ｇ９１Ａは、加水分解経路にとって最適であり、変異体Ｆ２１３Ｌは、加リン酸分解経路にとって最適である。
【０２９７】
結局、任意の代謝経路の能力は、小分子の基質、生成物およびエフェクタとの酵素の相互作用によって決定づけられような、経路における酵素の最大能力および酵素のインビボ活性の両方に依存し得る。本研究では、セロビオース発酵の間におけるこれらの要素の、加水分解性および加リン酸分解性の株の間における一部の比較がなされている。解糖への移行点であるグルコース−６−リン酸へと、セロビオースから導く株の酵素の能力に有意差はなかった。顕著な例外が、より長いセロデキストリン（例えば、セロトリオースおよびセロテトラオース）までセロビオースにグリコシルを転移する、加水分解経路の能力にある。ＧＨ１−１は、この作用を可能にし、加水分解経路を有している株は、セロビオースをエタノールに発酵するにしたがって、より長いセロデキストリンの顕著な増加を生じる。
【０２９８】
セルロース分解経路の最大の利点は、よい多い細胞の添加量が使用されるときに、その能力が向上し続けていることであり得る。これは、高比重の発酵が供給原料の迅速な発酵のために一般に採用され、したがって、資本集約的な発酵槽の空間を最大限に利用する燃料生成において、特に重要である。
【０２９９】
〔実施例２〕
本実施例は、セロデキストリンホスホリラーゼにおける保存されたモチーフの同定およびさらなるセロデキストリンホスホリラーゼの同定について説明する。
【０３００】
PSI-BLASTの１回目を、Clostridium thermocellum（BAA22081.1）、Acidovibrio cellulolyticus（ZP_07328763.1）および Clostridium lentocellum（YP_004310865.1）のセロデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列を同時入力として用いて行った。１回目の結果から、“セロデキストリンホスホリラーゼ”と注釈されているすべてのヒットを、PSI-BLASTの２回目のための同時入力として使用した。
【０３０１】
２回目の結果から、“セロデキストリンホスホリラーゼ”と注釈されているすべての配列を、T-COFFEEを用いた多重配列アラインメントを生成するために使用した。
【０３０２】
この多重配列アラインメントを、PRATTサーバ（http://web.expasy.org/pratt/）のための入力として、最も高いスコアのモチーフを同定するために使用した。モチーフは、PROSITE形式：Ｇ−ｘ（２）−［ＦＹ］−ｘ−Ｎ−［ＡＧＳ］−ｘ−［ＡＳ］−Ｗ−［ＡＰＳ］−Ｖ−［ＩＬ］−［ＡＳ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ（２）−［ＤＥ］−ｘ−［ＡＩ］−ｘ（３）−［ＬＭＶ］−［ＤＥＮ］−［ＡＳＶ］−［ＩＬＶ］−ｘ（３）−Ｌ−ｘ−Ｔ−ｘ（２）−Ｇ−［ＩＬＶ］−ｘ（２）−［ＳＶ］−ｘ−Ｐ−［ＡＧ］（配列番号１４）と示されている。
【０３０３】
それから、保存されたモチーフを、PROSITEサーバ（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）を使用することによって、セロビオースホスホリラーゼタンパク質を見つけるために使用した。PROSITEサーバによって、さらなる１６のセロデキストリンホスホリラーゼが同定された。１６のホスホリラーゼは上述の表４に挙げられている。
【０３０４】
〔実施例３〕
本実施例は、セロデキストリンホスホリラーゼにおける保存されたモチーフの同定およびさらなるセロデキストリンホスホリラーゼの同定について説明する。
【０３０５】
（セロデキストリンホスホリラーゼにおける保存されたモチーフ）
PSI-BLASTの１回目を、同時入力された、Saccharophagus degradans（YP_526792.1）、Cellvibrio gilvus（2CQS_A）、および Clostridium thermocellum（YP_001036707.1）のセロビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列を用いて行った。１回目の結果から、“セロビオースホスホリラーゼ”または“セルロース分解生成物のホスホリラーゼ”と注釈されているすべてのヒットを、PSI-BLASTの２回目のための同時入力として使用した。
【０３０６】
２回目の結果から、Saccharophagus degradans（YP_526792.1）、Cellvibrio gilvus（2CQS_A）、およびClostridium thermocellum（YP_001036707.1）のセロビオースホスホリラーゼよりスコアのすべての配列は、ＰＤＢファイルを有しているＥＸＰＲＥＳＳＯ、構造テンプレートとして2CQSを用いて、多重配列アラインメントを生成するために使用された。
【０３０７】
この多重配列アラインメントは、PRATTサーバ（http://web.expasy.org/pratt/）のための入力として使用され、最も高いスコアのモチーフを同定する。上記モチーフは、PROSITE形式：Ｙ−Ｑ−［ＣＮ］−Ｍ−［ＩＶ］−Ｔ−Ｆ−［ＣＮ］−［ＦＩＬＭＶ］−［ＡＳ］−Ｒ１−［ＳＴ］−［ＡＳ］−Ｓ−［ＦＹ］−［ＦＹ］−Ｅ−［ＳＴＶ］−Ｇ−ｘ−［ＧＳ］−Ｒ２−Ｇ−［ＩＭ］−Ｇ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−［ＡＣＮＳ］−Ｑ−Ｄ−［ＩＬＶ］−［ＩＬＭＶ］−Ｇ−ｘ−Ｖ−Ｈ−ｘ−［ＩＶ］−Ｐ−［ＡＤＥＳＴ］−ｘ−［ＡＶ］−［ＫＲ］−［ＡＥＱ］−ｘ−［ＩＬ］−［ＦＩＬ］−Ｄ（配列番号１５）と示されている。このモチーフにおいて、Ｒ１は、Cellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼにおける無機リン酸の結合に関与するアルギニン（Ｒ３５１）を示している。Ｒ２は、Cellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼにおけるセロビオースの結合ポケットの形成に関与するアルギニン（Ｒ３６２）を示している。
【０３０８】
保存されたモチーフを、Cellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼPDB 2CQSの結晶構造において同定した（図１７）。
【０３０９】
それから、保存されたモチーフを、PROSITEサーバ（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）を使用することによって、セロビオースホスホリラーゼタンパク質を見つけるために使用した。PROSITEサーバによって、さらなる９１のセロビオースホスホリラーゼが同定された。９１のホスホリラーゼは上述の表５に挙げられている。
【０３１０】
（セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼの両方に見られる保存されたモチーフ）
セロデキストリンホスホリラーゼは、無機リン酸がどのように結合されるかにおいて、セロビオースホスホリラーゼと異なると思われる。例えば、Cellvibrio gilvusのセロビオースホスホリラーゼにおいて同定される保存された２つのアルギニンは、セロデキストリンホスホリラーゼの全体に保存されていない。セロデキストリンホスホリラーゼの結晶構造は知られていないが、Cellvibrio gilvusセロビオースホスホリラーゼの結晶構造についての上述の類似の手法を、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼの両方に保存されたPROSITEモチーフを同定するために使用した。モチーフは、PROSITE形式：Ｙ−ｘ（２）−Ｇ−ｘ−［ＫＲ］−Ｅ−Ｎ−［ＡＧ］−［ＡＧ］−［ＩＶ］−Ｆ−ｘ（２）−［ＡＮＳＴ］−［ＮＳＴ］−ｘ（２）−［ＡＩＶ］−ｘ（２）−［ＡＧＴ］−ｘ（４）−［ＡＧ］−ｘ（４）−［ＡＤＮＳ］（配列番号２３３）と示されている。
【０３１１】
PDB 3QG0を用いたCellvibrio gilvusセロビオースホスホリラーゼ結晶構造の分析に基づいて、保存されたモチーフは、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼの基質結合部位を一列に並べていると思われる。
【０３１２】
〔実施例４〕
本実施例は、セロデキストリントランスポータおよびセロデキストリンホスホリラーゼを発現する改変Saccharomyces cerevisiaeを用いた、促進されたセロデキストリン利用について説明する。
【０３１３】
［概論］
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）をコードする３つの遺伝子（ＣＤＰ−Ａｃｅｌｌ、ＣＤＰ−ＣｌｅｎｔおよびＣＤＰ−Ｃｔｈｅｒｍ）は、野生型セロデキストリントランスポータＣＤＴ−１または変異型セロデキストリントランスポータＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ）を発現するS. cerevisiaeに導入された。セロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオースの、S. cerevisiae改変株による利用能を確認するために、セロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオースを含有しているＹＰ培地において、小規模な発酵実験を行った。
【０３１４】
［材料および方法］
（株）
利用されたS. cerevisiae株は表１４に記載されている。
【０３１５】
【表１９】
2014506464.tif 000029
【０３１６】
表１４において、“Name”は、株の名称を指し、“CBP.CDP”は、株によって発現されるセロビオースホスホリラーゼ遺伝子またはセロデキストリンホスホリラーゼ遺伝子を指し、Cellodextrin Transporter”は、株によって発現されるセロデキストリンホストランスポータ遺伝子を指す。
【０３１７】
（発酵条件）
発酵実験を、５ｇ／Ｌのセロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオースを含有しているＹＰ培地において行った。９６ウェルプレートを、単独の炭素源としてのセロデキストリンに基づく増殖を観察するために使用した。各ウェルにおける培地の量は２００μＬであり、５０μＬの鉱物油を培地上に重層して、増殖測定の間における培地の蒸発が防止された。初期の細胞密度は、ＯＤ６００＝０．２以下に調節された。Synergy H4 hybrid Microplate Reader（BioTek Instruments Inc., Winooski, VT）を、連続的な混合オプションを用いて、６００ｎｍにおける吸光度を測定するために使用した。
【０３１８】
［結果］
（野生型ＣＤＴ−１遺伝子および種々のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）遺伝子を発現するS. cerevisiae株によるセロビオースまたはセロデキストリンの利用）
Clostridium lentocellum、Clostridium thermocellum、Acidovibrio cellulolyticusにそれぞれ由来する３つのセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ、ＣＤＰ＿ＣｔｈｅｒｍおよびＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌ）のそれぞれ、およびNeurospora crassa由来のセロデキストリントランスポート（ｃｄｔ−１）を、S. cerevisiaeのＤ４５２−２に導入した。生じた形質転換体を、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースに基づく増殖試験に供した（図１８）。セロビオースホスホリラーゼ（ＳｄＣＢＰ）およびセロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１）を発現する改変株を、増殖比較のためのコントロール株として使用した。セロビオース培地において、セロビオースホスホリラーゼ（ＳｄＣＢＰ）およびセロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１）を有しているＤ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１のみが、良好に増殖可能であった。セロデキストリンホスホリラーゼおよびセロデキストリントランスポータを有している改変S. cerevisiae株は、セロビオースに基づいて増殖せず、C. lentocellum由来のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ）およびセロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１）を発現するＤ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１株は、セロビオースに基づいて極めて緩慢に増殖可能であった（図１８Ａ）。この結果は、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔが、セロビオースを基質として使用し得ると示唆している。セロトリオースが炭素源として使用される場合、測定可能な増殖を示す改変株はなかった。Ｄ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１のみは、極めて緩慢に増殖した（図１８Ｂ）。セロテトラオースが炭素源として使用される場合、Ｄ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１およびＤ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１は、測定可能な増殖を示した（図１８Ｃ）。
【０３１９】
これらの結果は、セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１）がS. cerevisiaeにおいて共発現される場合に、C. lentocellum由来のセロデキストリンホスホリラーゼＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔが、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースの利用を容易にすることを示唆している。
【０３２０】
（変異体ＣＤＴ−１  Ｆ２１３Ｌ遺伝子および種々のＣＤＰ遺伝子を発現するS. cerevisiae株によるセロビオースまたはセロデキストリンの向上された利用）
種々のセロデキストリンホスホリラーゼを発現するS. cerevisiae改変株によるセロデキストリンの利用は、セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１）の能力によって制限され得る。したがって、３つのセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌ、ＣＤＰ＿ＣｌｅｎｔおよびＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ）のそれぞれ、および変異体セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１  Ｆ２１３Ｌ））を発現する改変株の新たな組を構築した。これらの株によるセロデキストリンの利用率を比較するために、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースに基づく細胞の増殖をモニターした。セロビオースホスホリラーゼ（ＳｄＣＢＰ）およびセロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１Ｆ２１３Ｌ）を発現する改変株を、増殖を比較するためのコントロール株として使用した。炭素源としてセロビオースが使用される場合、セロビオースホスホリラーゼ（ＳｄＣＢＰ）および変異体セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１（Ｆ２１３Ｌ））を有しているＤ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、以前に観察された通り、急速に増殖した（図１９Ａ）。また、Clostridium lentocellum由来のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ）および変異体セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１Ｆ２１３Ｌ）を発現するＤ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、セロビオースに基づいて良好に増殖した（図１９Ａ）。炭素源としてセロトリオースが使用される場合、Ｄ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３ＬおよびＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌの両方の株は、増殖可能であった（図１９Ｂ）。しかし、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、セロビオース条件と異なり、Ｄ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌを大きく超えて良好に増殖した。さらに、ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、セロテトラオースに基づいてさえ、極めて良好に増殖し、Ｄ４５２−ＳｄＣＢＰ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、セロテトラオースに基づく測定可能な増殖を示さなかった（図１９Ｃ）。これらの結果は、Clostridium lentocellum由来のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ｃｌｅｎｔ）が、試験された３つのセロデキストリン（セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオース）を利用し得ることを示唆している。
【０３２１】
Clostridium thermocellum由来のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ）および変異体セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１Ｆ２１３Ｌ）を有しているＤ４５２−ＣＤＰ＿Ｃｔｈｅｒｍ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、セロトリオースおよびセロテトラオースに基づく測定可能な増殖を示した（図１９Ｂおよび図１９Ｃ）。しかし、Acidovibrio cellulolyticus由来のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌ）および変異体セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１Ｆ２１３Ｌ）を発現するＤ４５２−ＣＤＰ＿Ａｃｅｌｌ−ＣＤＴ−１＿Ｆ２１３Ｌ株は、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースに基づく測定可能な増殖をまったく示さなかった。
【０３２２】
改変S. cerevisiaeによる向上したセロデキストリン利用は、変異体セロデキストリントランスポータ（ＣＤＴ−１Ｆ２１３Ｌ）が、セロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼのいずれかと組にされる場合に観察され、ＣＤＴ−１  Ｆ２１３Ｌトランスポータが、より高い重合度（ＤＰ）を有しているセロデキストリンおよびセロビオースの効率的な輸送を容易にし得ることを示唆している。
【０３２３】
〔実施例５〕
本実施例では、セロデキストリントランスポータＣＤＴ−１および種々のSacharophagus degradansセロビオースホスホリラーゼ変異体（ＳｄＣＢＰ）を用いて形質転換されたS. cerevisiae株の、セロビオースを介した増殖速度について説明する。
【０３２４】
［材料および方法］
点変異を含んでいるSacharophagus degradansのセロビオースホスホリラーゼ（ＳｂＣＢＰ）をそれぞれコードするプラスミドは、ＣＤＴ−１セロデキストリントランスポータを発現するS. cerevisiaeのＤ４５２−２株に形質移入された。それぞれのＣＢＰ変異体について、単一のコロニーを採取して、炭素源として２％のセロビオースを含んでいるＹＢ培地に５ｍＬの開始培養物を播種した。
【０３２５】
発酵培養物についての開始ＯＤを０．５以下に設定し、８％のセロビオースを炭素源として有している、５０ｍＬのFalconチューブに入れた５ｍＬのＹＰ培地を用いて、発酵実験を行った。連続的に振盪しながら３０℃において、培養物を培養した。また、野生型のＳｄＣＢＰまたは野生型のβ−グルコシダーゼＧＨ−１を含んでいるS. cerevisiaeのＤ４５２−２株に対して、発酵実験を行った。
【０３２６】
各培養物のＯＤ６００を、１２時間ごとに測定し、増殖速度（１時間ごとの増殖の上昇）を表１５に示す。各ポイントは、３回の測定の平均を表している。
【０３２７】
［結果］
表１５に示されている結果は、野生型のＣＢＰを含んでいる株の増殖速度に匹敵するか、またはより高い増殖速度を、一部のＣＢＰ変異体を含んでいる株が有していたことを示している。特に、Ｉ４０９Ｍ  ＣＢＰ変異体は、野生型のＣＢＰの増殖速度（１．１３５時間−１）に匹敵する１．０６１時間−１を有しており、ＣＢＰ変異体Ｎ４８２Ｄは１．２３６時間−１の増殖速度を有していた。
【０３２８】
【表２０】
2014506464.tif 000030
【０３２９】
〔実施例６〕
本実施例では、セロデキストリンを輸送する細胞におけるグルコース応答経路を、代謝を最適化するために変更することについて説明する。
【０３３０】
この実施例において、セロデキストリントランスポータおよび細胞内β−グルコシダーゼを発現する酵母のグルコース応答経路を、グルコースの細胞の代謝を最適化するために変更した。細胞内β−グルコシダーゼ（ｇｈ１−１）とともにｃｄｔ−またはｃｄｔ−２を発現するために改変された酵母株は、遺伝的にさらに変更されて、種々のグルコース応答遺伝子の構成的に活性なアリルを発現する。構成的に活性なアリルは、誘導可能なプロモータの制御下において発現される。代替的に、野生型のアリルを、標的組換えによって構成的に活性なアリルと置換した。
【０３３１】
誘導可能な発現または標的組換えのいずれかによって、以下の変異体アリルを用いて、酵母を改変した。Ｓｎｆ３  Ｒ２２９Ｋアリル（Ozcan, PNAS, 1996）、Ｒｇｔ２  ２３１Ｋアリル（Ozcan, PNAS, 1996）、Ｙａｋ１−Ｒｇｔ２ｔａｉｌキメラ（Moriya and Johnston, PNAS, 2004）、Ｇｐａ２ｖａｌ１３２（Tamaki, J of Biosciences and Bioengineering, 2007）、Ｇｐａ２Ｑ３００Ｌ（Wang et al., PLOS Biology, 2004）、Ｒａｓ２Ｇ１９Ｖ（Wang et al., PLOS Biology, 2004）、Ｈｘｋ２Ｓ１４Ａ（Moreno and Herrero, FEMS, 2002）、Ｐｆｋ２７ΔＮ、およびＳｎｆ３もしくはＲｇｔ２のＣ末端テイルを含んでいるＨｘｋグルコーストランスポータ遺伝子のそれぞれ。
【０３３２】
変異体グルコース応答遺伝子アリルを用いた改変の後に、単独の炭素源としてセロデキストリンを用いて、発酵条件のもとに酵母を増殖させる。各株によって生成されたエタノールの量を、コントロール株（ｃｄｔ−１もしくはｃｄｔ−２およびｇｈ１−１を、野生型のすべてのグルコース応答遺伝子とともに発現する酵母株）によって生成されたエタノールの量と比較する。コントロール株と比べた実験株におけるエタノールの生成の向上は、グルコース代謝が最適化されていることを示している。
【０３３３】
〔実施例７〕
この実施例では、セロビオースを利用するために改変されている酵母株におけるグルコース応答経路の変更の結果について説明する。
【０３３４】
［概論］
セルロース分解性真菌Neurospora crassaによる細胞壁の分解の体系的な研究に基づいて、２つのセロデキストリントランスポータファミリーが発見された。これらのトランスポータおよびN. crassa由来のベータ−グルコシダーゼを外来的に発現する、エタノール生成性のSaccharomyces cerevisiaeは、セロデキストリンを基質として使用して、エタノールを生成し得る。同定されたトランスポータ経路は、植物の細胞壁に由来するヘキソースおよびペントースの微生物発酵について検討する新たな道を開いている［１］。しかし、セロデキストリンの非天然の基質が、天然の基質（例えばグルコース）の代わりに使用されるとき、S. cerevisiaeにおける誘導期は延長され、最大の増殖速度は低下する。また、この現象は、S. cerevisiaeにおけるペントース利用によって例証されている［２］。S. cerevisiaeは、グルコースのような迅速に発酵可能な炭素源として、これらの非天然の基質を感知し、代謝し得ないと思われる。
【０３３５】
S. cerevisiaeは、その周囲におけるグルコースを感知するために、少なくとも３つの異なる経路を使用している［４］。これらは、３つの細胞外経路（Ｇタンパク質受容体Ｇｐｒ１および２つのトランスポータＳｎｆ３およびＲｇｔ２を介する）、およびＲａｓ／ＰＫＡをともなう１つの細胞内経路を含んでいる。セロビオース輸送経路は、Ｇｐｒ１、Ｓｎｆ１またはＲｇｔ２をおそらく回避するので、セロビオースの輸送および加水分解へと続く、Ｒａｓ／ＰＫＡ経路を部分的にのみ活性化可能である。したがって、セロビオースに基づいて増殖しているS. cerevisiaeの代謝状態は、セロビオースの加水分解がもたらすグルコースのフラックスに対応するために最適化されていない。上述の仮定に取り組むために、シグナル伝達経路における重要な遺伝子（表１６）を欠失または構成的な活性化によって変異させて、生じた株の誘導期の長さおよび成長速度を調べた。
【０３３６】
【表２１】
2014506464.tif 000031
【０３３７】
［材料および方法］
（株およびプラスミドコンストラクト）
S. cerevisiaeのＢＹ４７４２（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）を、酵母におけるセロビオース代謝を操作するために使用した。ＭＡＴａｌｐｈａノックアウト酵母株を、Open Biosystemsから入手した。Escherichia coliのＴｏｐ  １０を、遺伝子のクローニングおよび操作のために使用した。セロビオース代謝は、Neurospora crassaのベータ−グルコシダーゼ遺伝子（ｇｈ１−１）およびセロデキストリントランスポータ遺伝子（ｃｄｔ−１）から構成された。これまでに報告されている［５］通りに、ｇｈｇ１−１を、ＰＧＫプロモータおよびＣＹＣ１ターミネータに基づくｐＲＳ４２５プラスミドにクローン化し、ｃｄｔ−１を、ＰＧＫプロモータおよびＣＹＣ１ターミネータに基づく、Ｃ末端ＧＦＰタグを有しているｐＲＳ４２６にクローン化した。
【０３３８】
（培地および培養条件）
E. coliを、Luria-Bertani培地（必要に応じて５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを培地に加えた）において増殖させた。酵母株を、２０ｇ／Ｌのグルコースを有しているＹＰ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物および２０ｇ／ＬのBactoペプトン）、３０℃において培養した。形質転換された株を、アデニンヘミサルフェートを１００ｍｇ／Ｌまで補った、適切な完全最少ドロップアウト培地において増殖させた。炭素源変換実験のために、６．７ｇ／Ｌの酵母用窒素塩基および２０ｇ／Ｌのグルコースもしくはセロビオースと、適切なヌクレオチドおよびアミノ酸を与えたＣＳＭ−Ｌｅｕ−Ｕｒａとを含んでいる酵母合成完全（ＹＳＣ）培地を使用した。
【０３３９】
（変異生成）
QuikChange部位特異的変異生成キット（Stratagene）を用いた部位特異的変異生成を介して、Ｒａｓ２、Ｇｐａ２およびＳｃｈ９の変異体を、生成し、配列決定によって確認した。制御機能を欠いているＨｘｋ２変異体を、報告されている方法［６］にしたがって構築した。ヌクレオチド＋１９〜＋４８の間にある３０ｂｐのＰＣＲ欠失によってトランケーション変異体を入手し、生じた遺伝子ＨＸＫ２ΔＫ６Ｍ１５は、Ｌｙｓ６〜Ｍｅｔ１５までのアミノ酸のないトランケートされたＨｘｋ２タンパク質（Ｈｘｋ２ｗｒｆ）を発現した。２段階（選択、対抗選択）の遺伝子置換法［７］を用いて野生型アリルを置換するために、Ｈｘｋ２、Ｒａｓ２、Ｇｐａ２およびＳｃｈ９の変異体型を染色体に導入した。野生型アリル（ＡＴＧからストップコドンまで）を、ＰＣＲに基づく遺伝子操作法［８］を用いてＵＲＡ３マーカーと置換した。形質転換体を、ＹＳＣ−Ｕｒａプレートにおいて選択し、置換されたＯＲＦの−２００ｂｐ上流のフォワードプライマーおよびＵＲＡ３マーカー配列内のリバースプライマーを用いたＰＣＲによって確認した（表１６）。ＵＲＡ３マーカーを、それから同一の手法（ポジティブの形質転換体の選択を５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に対して行った点を除く）を用いて変異体アリルと置換し、欠失確認用の同じフォワードプライマーおよび置換されたＯＲＦ内のリバースプライマー（表１７）を用いたＰＣＲによって確認した。特に、Ｃ末端ＧＦＰタグ付きのＨｘｋ２およびＨｘｋ２ｗｒｆを、遺伝子置換に使用した。正確な遺伝子置換を配列決定によって確認した。
【０３４０】
表１７には、変異体を生成するために使用されたプライマーが挙げられている。表１６において、下線付きのヌクレオチドは、変異生成によって変更されたヌクレオチドである。
【０３４１】
【表２２】
2014506464.tif 000032
【０３４２】
（炭素源変換実験）
セロビオース利用経路を含んでいる組換え株を、ＹＳＣ＋グルコース培地に基づいて６４時間にわたって３０℃において後期の静止期まで増殖させ、それから、ＹＳＣ＋グルコースおよびＹＳＣ＋セロビオースに並行して播種した。初期のＯＤ６００は０．２であった。すべての株のために生物学的な３通りを、１０ｍｌの培地の入っている５０ｍｌチューブにおいて実施した。
【０３４３】
［結果および考察］
（グルコースセンサおよび受容体による細胞外セロビオース感知）
S. cerevisiaeがグルコースを感知する手段の１つは、２つの膜貫通型のグルコースセンサＳｎｆおよびＲｇｔ２を介している。細胞外グルコースは、ヘキソーストランスポータをコードするＨＸＴ遺伝子の発現を誘導する細胞内シグナルを、これらのセンサに生成させる［９］。グルコースシグナルは、Ｒｇｔ１転写抑制因子の機能に影響を与えることによってこの発現を誘導する。Ｓｎｆ３およびＲｇｔ２は、グルコースに対する異なる親和性を有しており、重複しない機能に分かれている［１０］。Ｓｎｆ３は、低レベルのグルコースのセンサと思われ、Ｒｇｔ２は、高グルコース濃度のセンサである。また、グルコースに加えて、Ｓｎｆ３は、フルクトース、マンノースおよびグルコース類似物（２−デオキシグルコース、３−Ｏ−メチルグルコシドおよび６−デオキシグルコース）を感知する。キシロースを利用する改変酵母の転写分析によって、細胞外キシロースはＲｇｔ２およびＳｎｆ３によって感知され得ることが示唆された［３］。
【０３４４】
S. cerevisiaeがグルコースを認識する他の手段は、Ｇｒｐ１を介している。Ｇｒｐ１は、７つの膜貫通ドメインを有している形質膜タンパク質であり、発酵の刺激を導くシグナル伝達カスケードを惹起するグルコースによって引き起こされるｃＡＭＰレベルの増加に関与しており、Ｇタンパク質Ｇｐａ２と結合する［１１］。Ｇｐｒ１−Ｇｐａ２結合は、グルコースおよびスクロースに対して応答性であるが、他の糖（例えば、フルクトース、２−デオキシグルコースまたはキシロース）に対して応答性ではなく；１００ｍＭの糖が使用されると、マンノースはアンタゴニストとして作用する（Rolland et al., 2000）。２１０ｍＭより高い濃度のキシロースが、Ｇｐｒ１によって感知されるために必要とされ得る［２］。
【０３４５】
酵母が通常のグルコースセンサを介して細胞外セロビオースを感知するか否かを決定するために、Ｓｎｆ３、Ｒｇｔ２およびＧｐｒ１の単独欠失株を、セロビオース利用経路を用いて形質転換し、セロビオースおよびグルコースに基づくそれらの増殖を比較した（図２１）。Ｓｎｆ３の欠失は、低グルコース濃度に対する迅速な適合を妨げると報告されている［１２］。本研究では、炭素源変換実験によって、Ｓｎｆ３欠失は、グルコースに基づく増殖をわずかに低下させるが、セロビオースに基づく増殖に影響しないと示された（図２１）。Ｒｇｔ２に関して、野生株との有意差は認められなかった（図２１）。これらの結果は、Ｓｎｆ３およびＲｇｔ２の単独欠失が酵母におけるセロビオース感知に影響しないことを示唆しているが、セロビオースがＳｎｆ３およびＲｇｔ２を回避することを意味しない。一方で、Ｇｐｒ１欠失は、セロビオースおよびグルコースの両方に基づく増殖を有意に低下させた（図２１）。この結果は、Ｇｐｒ１がセロビオースを感知可能であり、Ｇｐｒ１／Ｇｐａ２経路がセロビオースによって活性化され得ることを示唆している。
【０３４６】
（セロビオースに対する、細胞内シグナル経路の応答）
Ｒａｓ２およびＧｐａ１
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、増殖、グルコースに対する細胞の応答、および細胞周期の進行を蓄積量に結び付けることにおいて、重要な役割を果たす。この経路は、リボソームにおけるタンパク質合成、リボソームの生合成、糖化、ならびにストレス応答、糖新生および貯蔵炭水化物の代謝に関与する遺伝子の抑制に関与する遺伝子を主に誘導する。グリセロール培地において増殖している酵母細胞におけるＲＡＳ２の活性化アリル（ＲＡＳ２Ｇ１９Ｖ）の誘導は、野生型の細胞に対するグルコースの添加によって発現が変更されるすべての遺伝子の９０％の発現における、同一の定性的および定量的な変化を導く［１３］。２つの活性低下型アリルＲＡＳＱ７７ＫおよびＲＡＳＤ１１２Ｙは、最近、ガラクトースに基づく特有の増殖速度の向上を示した進化株において見出された［１４］。Ｇｐｒ１およびＧｐａ２は、ＰＫＡを活性化させるためのＲａｓ２と並行して働いている栄養素感知経路を規定している。これらの観察は、Ｒａｓ２が、グルコース誘導性の遺伝子発現の変化を媒介することに主要な役割を果たし、Ｇｐａ２が、グルコース応答においてより補助的な役割を果たし、両方が、ＰＫＡの調節を介して単にそれらを行っていることの有力な証拠を与えている。報告されている通り、細胞外グルコース検出は、Ｇｒｐ１の非存在下における構成的に活性なＧｐａ２Ｇ１９Ｖアリルを介して実現され得る［１５］。さらに、マイクロアレイデータは、ＧＰＡ２Ｑ３００Ｌの誘導が、Ｒａｓ２の活性化アリルの誘導を起こした遺伝子の同じ集合における発現の変化を生じたことを示していた［１６］。
【０３４７】
Ｓｃｈ９
Ｓｃｈ９は、Ｒａｓ／ＰＫＡ経路と並行して作用するが、グルコース媒介性の転写の変化にとって副次的な経路として機能すると思われる。Ｓｃｈ９の過剰発現は、ＰＫＡ経路における不足を抑え、その活性化は、減退した増殖およびリボソーム生合成における低下した遺伝子発現をもたらす。Ｓｃｈ９は、ＴＯＲＣ１が増殖および蓄積量に影響を与えている主要な経路として機能すると思われる。Ｓｃｈ２Ｄ３Ｅ（Ｔ７２３Ｄ、Ｓ７２６Ｄ、Ｔ７３７Ｅ、Ｓ７５８ＥおよびＳ７６５Ｅ）は、ＴＯＲ非依存性のＳＣＨ９アリルである［１７］。したがって、Ｓｃｈ９は、ＰＫＡと同じ下流の標的の多くに影響を与えており、当該影響は、ＰＫＡ活性の低下を補う、過剰なＳｃｈ９の能力とみなし得る。両方のキナーゼは、別のシグナル伝達カスケードを介して作用している。さらに、ＰＫＡおよび／またはＳｃｈ９のシグナル伝達が特に影響を受けている条件および株を用いたゲノムの広範な発現分析によって、両方のキナーゼは、所定の遺伝子標的を相加的または正反対に制御していることが証明された［１８］。
【０３４８】
Ｙａｋ１
Ｙａｋ１は、グルコースに応じてＲａｓ／ＰＫＡ経路と並行して、逆の作用を有して働くプロテインキナーゼである。ＰＫＡは、ストレス応答を抑制し、増殖を刺激し、一方、Ｙａｋ１は、ストレス応答を刺激し、増殖を抑制する［４］。
【０３４９】
セロビオース輸送経路を含んでいる、Ｒａｓ２、Ｇｐａ２、Ｓｃｈ９およびＹａｋ１の単独欠失株を利用した炭素源変換実験に基づいて、Ｒａｓ２およびＳｃｈ９の単独欠失株の両方は、グルコースに基づく誘導期とは対照的に、セロビオースに基づく誘導期を有意に延長させた（図２２Ａおよび２２Ｂ）。一方で、Ｇｐａ２欠損株は、グルコース媒介性の増殖に比べて、セロビオース媒介性の増殖に対するより強い作用を有していた（図２２Ａ）。これらの結果は、グルコースに基づいて増殖した細胞が、堅牢なシグナル伝達ネットワークを有していることを示唆している。Ｙａｋ１欠損株は、セロビオース媒介性およびグルコース媒介性の両方の増殖に対して、わずかな作用を有しており、Ｙａｋ１は、シグナル伝達経路において副次的な役割を果たすことを確認した（図２２Ｃ）。興味深いことに、Ｇｐａ２の構成的に活性なアリル（Ｇｐａ２Ｇ１９Ｖ）は、セロビオース媒介性の増殖に対して中程度の作用を有しているが、細胞がグルコースに基づいて増殖する場合、野生型と同様であった（図２３）。
【０３５０】
（セロビオースは、細胞内グルコース抑制経路を活性化する）
Ｈｘｋ２
Ｈｘｋ２は、二重の細胞内局在を有している。Ｈｘｋ２は、細胞質において糖分解酵素として、核において、Ｍｉｇ１に制御される種々の遺伝子の転写制御因子として機能する。機能的な研究によって、Ｈｘｋ２の主要な調節性の役割が、核における抑制複合体を生成するための、転写抑制因子Ｍｉｇ１およびＳｎｆ１プロテインキナーゼとの相互作用によってもたらされることが示唆されている［１９、２０］。Ｌｙｓ６からＭｅｔ１５までのアミノ酸を欠いているＨｘｋ２ｗｒｆ変異体アリルは、ヘキソースリン酸化活性を維持していたが、グルコース抑制シグナル伝達し得なかった［６］。
【０３５１】
炭素源変換実験によって、Ｈｘｋ２欠失、およびＨｘｋ２の制御機能を欠いているＨｘｋ２ｗｒｆ変異体は、セロビオースまたはグルコースに基づく増殖に影響しないらしいことが示された（図２４Ａおよび２４Ｂ）。これらの結果は、セロビオースがグルコースと同程度に強くＨｘｋ２媒介性のグルコース抑制を活性化させ得ることを示唆している。
【０３５２】
（細胞増殖に関連する重要な他の遺伝子）
Ｒｉｍ１５
Ｒｉｍ１５は、栄養素に応じた細胞増殖の間におけるシグナル伝達（特に静止期の確立）に関与する、グルコース抑制可能なプロテインキナーゼである。
【０３５３】
Ｓｔｂ３
Ｓｔｂ３は、静止状態から増殖へのグルコース誘導性の移行に関与する、リボソームＲＮＡプロセシングエレメント（ＲＲＰＥ）−結合タンパク質である。Ｓｔｂ３の過剰発現は緩やかな増殖の表現型を形成する。
【０３５４】
Ｋｃｓ１
Ｋｃｓ１欠失は、高濃度のＡＴＰ、向上した解糖フラックス、および向上した解糖発酵を導く［２２］。
【０３５５】
Ｔｐｓ１
糖分解活性および遺伝子発現は、代謝中間体（トレハロース−６−Ｐが挙げられる）によって制御されている。Ｔｐｓ１は、Ｈｘｋ２活性を阻害するトレハロース−６−Ｐの合成に関与する［２３］。
【０３５６】
セロビオースおよびグルコースの両方に基づくＲｉｍ１５欠失株の増殖は、低下した増殖を示した（図２５）。セロビオースおよびグルコースに基づいて増殖させたＳｔｂ３欠失株は、セロビオースに基づく増殖が低下し、グルコースに基づく増殖が向上するという対照的な結果を示すと思われた（図２５）。Ｋｃｓ１欠失株は、セロビオースに基づく低下した増殖を示した（図２５）。Ｋｃｓ１欠失が高濃度のＡＴＰを導くと報告されていることを考えると、Ｋｃｓ１を欠失することは、セロビオース利益をもたらすと予想されたので、Ｋｃｓ１を用いた結果は意外であった。
【０３５７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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