(57)【要約】エンドグリンは、心不全と関連する疾患症候、特に心臓線維化を低減させる治療の重要な標的であることが示されてきた。可溶性エンドグリンは、TGFβ1活性に対するアンタゴニストとして同定されている一方、膜結合性エンドグリンは、心不全においてTGFβ1活性を促進するために必要な成分として同定されている。従って、本発明は、膜結合性エンドグリンの直接阻害または可溶性エンドグリンの発現の促進のいずれかを通してTGFβ1シグナル伝達を減少させる組成物を投与する工程による、心不全または関連障害を有する対象の処置のための方法およびキットを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後を処置するためまたは予防的に処置するための方法であって、TGFβ1媒介エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物の治療的有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が可溶性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、可溶性エンドグリン、またはそのTGFβ1阻害断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記可溶性エンドグリンが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記可溶性エンドグリン類似体が、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、抗体、またはその抗原結合断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がエンドグリン受容体のアンタゴニストである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が前記エンドグリン受容体に結合する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記投与が、心臓線維化の低減をもたらす、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記心不全がうっ血性心不全である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記心不全が、収縮期心不全または拡張期心不全である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、冠状動脈疾患を患っているか、または患ったことがある、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記高血圧症が、成人高血圧症または小児高血圧症である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記左心室機能不全が、無症候性左心室機能不全または心筋梗塞後左心室機能不全である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
（a）エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物；および
（b）心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、心筋梗塞後の処置用の該組成物の投与のための指示書
を含む、キット。
【請求項１８】
対象において線維化を低減させるための方法であって、TGFβ1媒介エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物の有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記組成物が可溶性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、可溶性エンドグリン、またはそのTGFβ1阻害断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記可溶性エンドグリンが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶性エンドグリン類似体が、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、抗体、またはその抗原結合断片を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がエンドグリン受容体のアンタゴニストである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が前記エンドグリン受容体に結合する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が心臓線維化の低減をもたらす、請求項18〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が、心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後からなる群より選択される状態を患っている、請求項18〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記心不全がうっ血性心不全である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記心不全が、収縮期心不全または拡張期心不全である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記高血圧症が、成人高血圧症または小児高血圧症である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
前記左心室機能不全が、無症候性左心室機能不全または心筋梗塞後左心室機能不全である、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、冠状動脈疾患を患っているか、または患ったことがある、請求項18〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある、請求項18〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記投与が、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内である、請求項18〜33のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究についての声明
本発明は、National Institutes for Healthにより与えられた助成金番号HL094909の下で米国政府の援助でなされた。政府は、本発明に対してある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、心不全の処置、および線維化、特に心臓線維化を低減させるための方法に関連する。
【０００３】
心不全は、世界中で2400万人を超える個体に影響を及ぼす、罹病および死亡の主要な原因である（Rosamond et al., Circulation 117:e25-146, 2008（非特許文献1）、Cowie et al., Eur. Heart. J. 18:208-25, 1997（非特許文献2）、Davies et al., Lancet 358:439-44, 2001（非特許文献3））。傷害機構に関係なく、左心室（LV）機能の低下は、LV容積の増加および圧負荷をもたらす。この血行力学的刺激が、いくつかのシグナル伝達カスケードを活性化して、これにより心臓構造および機能が変化する（これは、心臓リモデリングとして公知の過程である）。持続的な血行力学的負荷は、心筋細胞肥大および間質性線維化をもたらし、その後、筋細胞壊死および悪化した置換性線維形成をもたらす。急性負荷から代償性肥大までの心臓リモデリングの各相において、種々のシグナル伝達カスケードが関係している（Berk et al., J. Clin. Invest. 117:568-75, 2007（非特許文献4））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Rosamond et al., Circulation 117:e25-146, 2008
【非特許文献２】Cowie et al., Eur. Heart. J. 18:208-25, 1997
【非特許文献３】Davies et al., Lancet 358:439-44, 2001
【非特許文献４】Berk et al., J. Clin. Invest. 117:568-75, 2007
【発明の概要】
【０００５】
以下に詳細に記載されるように、本発明者らは、エンドグリン受容体を通したTGFβ1媒介シグナル伝達が、心不全を患う個体において認められる心臓組織に対する損傷、特に心臓線維化を促進することを発見した。重要なことに、本発明者らはまた、エンドグリンの可溶性形態（sEng）が、恐らくTGFβ1に結合するその能力により、これらの作用に対して防御的であり、従って、エンドグリンの膜結合性受容体形態（mEng）を通したシグナル伝達を減少させることも発見した。さらに、本研究者らは、mEngの発現または活性を低減させることもまた、心臓におけるTGFβ1シグナル伝達を制限し、これにより、線維化の制限および生存の改善がもたらされることを特定した。
【０００６】
従って第1の局面において、本発明は、心不全（例えば、うっ血性心不全、収縮期心不全、または拡張期心不全）、左心室機能不全（例えば、無症候性左心室機能不全または心筋梗塞後左心室機能不全）、右心室機能不全、高血圧症（例えば、成人または小児）、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後を、必要とする対象において処置するためまたは予防的に処置するための方法を特徴とする。本方法は、エンドグリン活性を阻害しかつそれによりTGFβ1シグナル伝達を制限する組成物の治療的有効量を、対象に投与する工程を含む。組成物は、可溶性ポリペプチドを含んでもよく、ここで該ポリペプチドは、可溶性エンドグリン、例えば、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586、またはそのTGFβ1阻害断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、可溶性エンドグリン類似体は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586と実質的に（例えば、少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％）同一であるアミノ酸配列を有する。他の態様において、組成物は、抗体、またはその抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体（scFv）、Fab、Fab'2、scFv、SMIP、二重特異性抗体、ナノボディ、アプタマー、またはドメイン抗体などの、本明細書において記載される任意の抗体または抗体断片）を含む。抗体は、例えばmEngに結合する、エンドグリン受容体の任意の成分のアンタゴニストであってもよい。他の態様において、組成物は、mEng発現を低減させることができるsiRNA分子を含む。特定の態様において、組成物の投与は、心臓線維化の低減をもたらす。
【０００７】
ある特定の態様において、対象は、冠状動脈疾患、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈であるか、またはそれらを患ったことがある。特定の態様において、投与は、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内である。
【０００８】
別の局面において、本発明は、（a）エンドグリン活性を阻害する組成物（本明細書において記載される任意の組成物または本発明の第1の局面、例えば、可溶性エンドグリン、またはその断片もしくは類似体など）；および（b）心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、心筋梗塞後、または本明細書において記載される任意の他の状態もしくは疾患の処置用の組成物の投与のための指示書を含む、キットを特徴とする。
【０００９】
別の局面において、本発明は、対象において線維化（例えば、心臓線維化）を低減させるための方法を特徴とする。本方法は、TGFβ1媒介エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物の有効量を対象に（例えば、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内）投与する工程を含む。組成物は、可溶性ポリペプチドを含んでもよく、ポリペプチドは、可溶性エンドグリン、またはそのTGFβ1阻害断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含み、例えば、可溶性エンドグリンは、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含み、または、可溶性エンドグリン類似体は、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する。別の態様において、組成物は、抗体、またはその抗原結合断片を含む（例えば、抗体は、エンドグリン受容体に結合する抗体などの、エンドグリン受容体のアンタゴニストである）。他の態様において、組成物は、エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む。対象は、心不全（例えば、うっ血性、収縮期、もしくは拡張期心不全）、左心室機能不全（例えば、無症候性左心室機能不全もしくは心筋梗塞後左心室機能不全）、右心室機能不全、高血圧症（例えば、成人高血圧症もしくは小児高血圧症）、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後からなる群より選択される状態を患っていてもよい。特定の態様において、対象は、冠状動脈疾患、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある。
【００１０】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を意味する。
【００１１】
対象において疾患、障害、または状態を「処置する」とは、治療剤を対象に投与する工程により、疾患、障害、または状態の少なくとも1つの症候を低減させることを意味する。
【００１２】
対象において疾患、障害、または状態を「予防的に処置する」とは、疾患症候の発症より前に治療剤を対象に投与することにより、該疾患、障害、または状態の出現の頻度を低減させること、またはその重症度を低下させることを意味する。
【００１３】
「可溶性エンドグリン」とは、エンドグリンの細胞外ドメインを含むが、エンドグリンの膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを含まず、かつエンドグリン受容体のTGFβ1媒介活性化を低減させる能力を有する、ポリペプチドを意味する。可溶性エンドグリンは、図10に示されるSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含み得る。
【００１４】
「可溶性エンドグリン断片」とは、可溶性エンドグリンの少なくとも4、5、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、または450アミノ酸の断片を意味する。
【００１５】
「膜結合性エンドグリン（mEng）」とは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む完全長エンドグリン（アミノ酸1〜633）を意味する。エンドグリンの長い（L）および短い（S）アイソフォームの両方が、mEngの定義に含まれる。
【００１６】
「実質的同一性」または「実質的に同一」とは、それぞれ参照配列と同じポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列を有するか、または、2つの配列を最適に整列させた場合に参照配列内の対応する位置において同じであるそれぞれアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定のパーセンテージを有する、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。例えば、参照配列と「実質的に同一」であるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有する。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、一般的に、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300、または350個の連続したアミノ酸（例えば、完全長配列）であろう。核酸の場合、比較配列の長さは、一般的に、少なくとも5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続したヌクレオチド（例えば、完全長ヌクレオチド配列）であろう。配列同一性は、デフォルト設定の配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis Software Package）を用いて測定してもよい。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせ得る。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、添付の図面、および添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示す画像である。単離されたマウス内皮、心筋細胞、および心臓繊維芽細胞におけるエンドグリン発現の代表的なウェスタンブロットである。
【図１Ｂ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示す画像である。野生型と比較した際に、Eng+/-マウス由来の全左心室溶解物において低減したエンドグリン発現を示すウェスタンブロットである（n＝3／群）。
【図１Ｃ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示すグラフである。野生型マウスにおいて胸部大動脈狭窄（TAC）後に、左心室エンドグリンmRNA発現が増加することを示すグラフである。Eng+/-マウスは、野生型マウスと比較して低減したエンドグリンmRNAレベルを呈する（n＝6／群）。（対応する時点で、*、野生型偽に対してp＜0.05；†、Eng+/-偽に対してp＜0.05；‡、野生型に対してp＜0.05。）
【図１Ｄ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示すグラフである。野生型マウスにおいて胸部大動脈狭窄（TAC）後に、左心室エンドグリンタンパク質発現が増加することを示すグラフである。Eng+/-マウスは、野生型マウスと比較して低減したエンドグリンタンパク質レベルを呈する（n＝6／群）。（対応する時点で、*、野生型偽に対してp＜0.05；†、Eng+/-偽に対してp＜0.05；‡、野生型に対してp＜0.05。）
【図１Ｅ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示すグラフである。野生型マウスにおいてTAC後に、可溶性エンドグリンの循環レベルが、2週間後に増加し、その後正常に低減することを示すグラフである。TACのすべての時点にわたって、sEngのレベルは、野生型と比較してEng+/-マウスにおいて有意により低い（n＝6／群）。（対応する時点で、*、野生型偽に対してp＜0.05；†、Eng+/-偽に対してp＜0.05；‡、野生型に対してp＜0.05。）
【図１Ｆ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示す画像である。TAC後にEng+/-マウスにおいて保存されたLV機能と比較した、野生型マウスにおける進行性のLV拡張を示すMモード心エコー図である。
【図１Ｇ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示すグラフである。TACの4週間後の代表的な左心室圧容積ループを示すグラフであり、TAC後に野生型マウスと比較してEng+/-マウスにおいて、より少ない容積負荷およびより高いLV収縮期圧を示す。
【図１Ｈ】圧負荷により誘導された心不全において、エンドグリン発現の低減が、心臓機能および生存の改善と相関することを示すグラフである。TACの10週間後に野生型マウスと比較してEng+/-マウスにおいて著しく改善された生存を示す、カプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである（n＝8／群）。
【図２】TACに供した野生型マウスの、LVにおけるエンドグリンmRNA発現の増加を示すが、末梢大動脈における増加は示さないグラフである。
【図３Ａ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示す画像である。TACの4週間後の野生型およびEng+/-マウスの両方における、代表的な組織染色を示す顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示すグラフである。TACの4週間後の野生型およびEng+/-マウスの両方における、肥大を示す左心室心筋細胞横断面積の棒グラフである。
【図３Ｃ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示すグラフである。TACの4週間後に野生型およびEng+/-マウスにおいて、心臓肥大と関連する胎児遺伝子（β-MHC）のLV発現が類似したパターンを示すことを示すグラフである。
【図３Ｄ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示すグラフである。TACの4週間後に野生型およびEng+/-マウスにおいて、心臓肥大と関連する胎児遺伝子（SERCa）のLV発現が類似したパターンを示すことを示すグラフである。
【図３Ｅ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示すグラフである。TACの4週間後の野生型およびEng+/-マウスにおける、カルシニューリンのLVタンパク質発現を示すグラフである。
【図３Ｆ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示す画像である。TACの4週間後に、野生型マウスと比較した際にEng+/-マウスにおいて増加した毛細血管密度を実証する、抗CD31抗体を用いたLV心筋毛細血管の代表的な組織染色を示す顕微鏡写真である。
【図３Ｇ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示すグラフである。野生型およびEng+/-マウスにおいて、TACの4週間後のLVにおける心筋毛管現象の定量化を示す棒グラフである。
【図３Ｈ】エンドグリン発現の低減は心臓肥大に影響を及ぼさないが、心筋毛管現象の増加と関連することを示すグラフである。野生型およびEng+/-マウスにおいて、TACの4週間後のLVにおける心筋毛管現象の定量化を示す棒グラフである。
【図４】図4A〜4Bは、TACの10週間後に野生型およびEng+/-マウスにおいて、β-MHCおよびSERCaの類似した変化を示すグラフである。
【図５】図5A〜5Fは、圧負荷により誘導された心不全後のEng+/-マウスにおいて、心臓線維化の低減を示す画像およびグラフである。図5Aは、TAC後の野生型およびEng+/-マウスにおける、左心室コラーゲン存在度の代表的な組織染色の顕微鏡写真である。図5Bは、TAC後に野生型と比較してEng+/-マウスにおいて有意に少ない線維化を示す、LV線維化のパーセントの定量化を示すグラフである（n＝6／群）。図5Cは、野生型と比較した際に、TACの4週間後のEng+/-マウスにおいてLVのI型コラーゲンmRNAのレベルが低減することを示すグラフである（n＝6／群）。図5Dは、TAC後に野生型マウスにおいて、LVのI型コラーゲンタンパク質発現が時間依存的様式で増加することを示すグラフである。Eng+/-マウスにおいて有意により低いレベルが、各時点で認められた（n＝6／群）。図5Eは、TACの4週間後に野生型およびEng+/-マウスの両方において、TGFβ1 mRNAの増加したレベルを示すグラフである。図5Fは、TAC後に野生型マウスにおいて、増加したpSmad-2/3発現を示すグラフおよびウェスタンブロット画像である。TAC後にEng+/-マウスにおいては、pSmad-2/3発現における変化はなかった。
【図６】図6A〜6Dはグラフである。図6Aは、野生型およびEng+/-マウスにおいて、TACの10週間後のI型コラーゲンmRNA発現を示す。図6Bは、TACの4週間後のLV組織溶解物における、活性TGFβ1タンパク質発現のレベルを示すグラフである。図6Cは、TGFβ1活性の下流標的であるPAI-1のmRNA発現が、TACに供したEng+/-マウスにおいて、野生型対照と比較した際に有意に減衰することを示す。図6Dは、TACの4週間後に、pSmad-1/5/8発現のタンパク質発現が、野生型マウスにおいては変化しないが、Eng+/-マウスにおいて増加することを示す（代表的なウェスタンブロットの下にn＝6マウス／群についての棒グラフにおける定量化）。
【図７Ａ】ヒト心臓繊維芽細胞（hCF）において、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を示すグラフおよび画像である。抗エンドグリン抗体での処置が、hCFにおいてI型コラーゲンmRNA（棒グラフ）およびタンパク質の発現（ウェスタンブロット）を低減させたことを示す。
【図７Ｂ】ヒト心臓繊維芽細胞（hCF）において、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を示すグラフおよび画像である。エンドグリン発現のサイレンシングが、hCFにおいてTGFβ1により誘導されるI型コラーゲンmRNA（棒グラフ）およびタンパク質の発現（ウェスタンブロット）を減衰させたことを示す。
【図７Ｃ】ヒト心臓繊維芽細胞（hCF）において、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を示す画像である。完全長エンドグリンのアデノウイルス媒介過剰発現（Ad-FL-Eng）が、hCFにおいてTGFβ1により誘導されるI型コラーゲンタンパク質合成を減衰させることを示すウェスタンブロットの画像である。
【図７Ｄ】ヒト心臓繊維芽細胞（hCF）において、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を示すグラフである。Ad-FL-EngをトランスフェクションしたhCF由来の調整培地における可溶性エンドグリンのレベルを示す。
【図７Ｅ】ヒト心臓繊維芽細胞（hCF）において、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を示すグラフおよび画像である。組み換えヒト可溶性エンドグリン（RhsEng）が、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲンタンパク質発現を用量依存的様式で減衰させることを示す（ウェスタンブロットの定量化が棒グラフに示される）。
【図７Ｆ】ヒト心臓繊維芽細胞（hCF）において、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を示すグラフおよび画像である。ヒトsEngを過剰発現するアデノウイルス（AdhsEng）をトランスフェクションしたCOS-7細胞由来の調整培地が、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲンタンパク質合成（棒グラフおよびウェスタンブロット）ならびにpSmad-2/3発現（ウェスタンブロット）を用量依存的様式で減衰させたことを示す。
【図８】図8A〜8Dはグラフである。図8A〜8Bは、エンドグリン発現のサイレンシングが、ヒト心臓繊維芽細胞においてTGFβ1により誘導されるPAI-1 mRNAおよびCTGF mRNA発現を減衰させることを示す。図8Cは、組み換えヒト可溶性エンドグリン（RhsEng）が、hCFにおいて用量依存的様式で、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲンmRNA発現を減衰させることを示す。図8Dは、AdhsEngをトランスフェクションしたCOS-7細胞が、培養培地中に検出されるsEngのレベルにおいて用量依存的増加を実証することを示す。
【図９Ａ】ヒトsEngの過剰発現が、インビボで心臓線維化を制限することを示すグラフである。AdhsEngの静脈内注射が、マウスsEngのレベルに影響を及ぼすことなく、野生型マウスにおいてヒト可溶性エンドグリンの循環レベルを増加させたことを示すグラフである。
【図９Ｂ】ヒトsEngの過剰発現が、インビボで心臓線維化を制限することを示す画像である。AdhsEngで処置した野生型マウスにおいて、ヌルアデノウイルス（Adヌル）で処置したマウスと比較して低減した、コラーゲンについてのピクロシリウスレッド染色を示す代表的な組織画像である。
【図９Ｃ】ヒトsEngの過剰発現が、インビボで心臓線維化を制限することを示すグラフである。LVのI型コラーゲンmRNAのレベルが、AdhsEngで処置した野生型マウスにおいて、Adヌル対照と比較した際に有意に低減したことを示すグラフである。
【図９Ｄ】ヒトsEngの過剰発現が、インビボで心臓線維化を制限することを示す模式図である。Eng+/-マウスにおけるmEng発現の低減が、TGFβ1により誘導されるpSmad-2/3およびI型コラーゲン発現を減衰させ、それにより心臓線維化を制限することを実証する模式図である。sEngでの処置は、pSmad-2/3およびI型コラーゲン発現を低減させることにより、エンドグリン欠損状態を再現する。可溶性エンドグリンは、従って、TGFβ1のリガンドトラップとして働き得る。
【図１０】エンドグリンアイソフォーム1前駆体およびエンドグリンアイソフォーム2前駆体のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明者らは、可溶性エンドグリンが、エンドグリン受容体を通したTGFβ1シグナル伝達の負の制御因子として作用すること、および、可溶性エンドグリン（sEng）を用いた阻害が、心不全と関連した病態生理、特に心臓線維化における低減をもたらすことを発見した。この発見に基づいて、本発明は、可溶性エンドグリンなどの、エンドグリン受容体経路を通したTGFβ1シグナル伝達を阻害する組成物を投与する工程により、心不全を処置するための方法を特徴とする。
【００２０】
エンドグリン
エンドグリン（Eng；CD105）は、180 kDaの膜結合性二量体糖タンパク質（mEng）であり、可溶性エンドグリン（sEng）として公知である細胞外ドメインから構成される循環形態としても見出される。エンドグリンは、血管リモデリングにおいて重要な役割を果たす。基本状態の下で、血管内皮は、それぞれ増殖または静止表現型のいずれかを促進する、アクチビン様キナーゼ（ALK）1およびALK5として公知である2つのI型シグナル伝達受容体のいずれかと会合するTGF-βII型受容体を通してTGFβ1に応答する。エンドグリンは、TGFβ1に対する応答を調節し、かつALK5からALK1へのシグナル伝達経路の切り換えの制御に関係している。
【００２１】
心臓繊維芽細胞および、線維化が主要な役割を果たす心不全における、TGF-β1シグナル伝達の調節因子としてのエンドグリンの役割は、本発明の前には探索されていなかった。いくつかの系統の証拠が、エンドグリンが血管恒常性の維持において重要な役割を果たすことを示唆している（Lopez-Novoa et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299:H959-74, 2010）が、心臓リモデリングおよび心不全におけるエンドグリンの役割は、ほとんど無視されたままであった。
【００２２】
TGFβ1、エンドグリン、および心不全
TGFβ1は、心筋細胞肥大および線維化を調節することが公知である重要な過程の中で中心に位置する強力なサイトカインである。後述のように、エンドグリンは、圧負荷により誘導された心不全における心臓リモデリングの病態生理において重要な役割を果たす。本発明者らは、TGFβ1シグナル伝達のための重要な制御タンパク質であるエンドグリンの心臓発現が、非心筋細胞の細胞集団に主として制限されていると最初に特定することにより、インビボで心臓繊維芽細胞におけるTGFβ1シグナル伝達の低減の効果を研究することができた。本発明者らは、心不全を有するヒト対象における本発明者らの知見と同様に、圧負荷により誘導された心不全のマウスモデルにおける、増加したmEngおよびsEng発現を認めた。重要なことに、野生型対照と比較した時、mEngおよびsEng発現のパターンは、TACに供したEng+/-マウスにおいて類似していた；しかしながら、発現レベルは有意により低かった。mEng発現の低減は、心不全における生存促進性の心臓表現型と相関し、かつ、心筋細胞肥大の保存、心筋毛管現象の少なめの増加、および心臓線維化の有意な低減と関連していた。本発明者らは次に、機能消失研究を用いて、ヒト心臓繊維芽細胞におけるmEng発現に対するTGFβ1シグナル伝達の依存性を実証した。逆説的に、mEngの過剰発現は同様に、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成を減衰させ、sEngをhCFにおけるTGFβ1活性の自己分泌阻害剤として暗に示した。組み換えペプチドとしてのsEngの処置またはインビトロでのアデノウイルス過剰発現による処理のいずれかは、TGFβ1シグナル伝達およびI型コラーゲン合成を制限することにより、エンドグリン欠損状態を反映した。最終的に、本発明者らは、圧負荷により誘導された心不全においてsEngの潜在的な臨床的有用性を探索し始め、ヒトsEngを過剰発現するアデノウイルスで処置したマウスにおいて心臓線維化の低減を認めた。全体として、これらの知見はエンドグリンを、心臓線維化（図5D）およびリモデリングの生物学における重要な関係者として、ならびに心不全において生存を改善するための潜在的に新規の治療標的として特定する。
【００２３】
本発明者らがEng+/-マウスにおいて認めた生存促進性の表現型は、心筋細胞肥大が並行する心筋毛管現象増加により支持される、以前に記載された生理学的肥大モデルに類似している。本発明者らのモデルにおいて、最も深い意味を有する知見は、心臓肥大に影響を及ぼすことなく心臓線維化がほぼ完全に消失したことであった。生存の改善はまた、心不全における抗線維化治療の前臨床および臨床研究においても認められている（Zannad et al., Circulation 102:2700-6, 2000；Kuwahara et al., Circulation 106:130-5, 2002）。本発明者らのモデルにおいて、本発明者らは、生存の改善を認めただけではなく、心臓機能の保存を認め、慢性LV圧負荷にもかかわらず心臓拡張は認められなかった。これらの知見は、有害な心臓リモデリングに対する、および末期の拡張型心筋症の病因における心臓線維化の重要な寄与を強調するものである。
【００２４】
可溶性エンドグリンは、マトリクスメタロプロテイナーゼ14（MT1-MMP）によるエンドグリン細胞外ドメインのタンパク質分解性切断に起因すると考えられている。ひとたび放出されると、エンドグリン細胞外ドメインの過剰発現は、TGFβ1活性を負に制御し（Venkatesha et al., Nat. Med. 12:642-9, 2006、Letamendia et al., J. Biol. Chem. 273:33011-9, 1998）、sEngはTGFβ1のリガンドトラップとして働き得る（Venkatesha et al., Nat. Med. 12:642-9, 2006）（図5D）。pSmad-2/3およびI型コラーゲン発現の低減により証明されるように、本発明者らのデータは、sEngがヒト心臓繊維芽細胞におけるTGFβ1活性の重要な負の制御因子であることを示す。心不全におけるsEngの切り離しは、従って、TGFβ1による心臓線維化の刺激を低減させるための防御機構として働き得る。
【００２５】
sEngはまた、BMP9などの血管形成促進性TGFβファミリーメンバーにも結合し、それにより組織血管形成を負に制御し得（Castonquay et al., J. Biol. Chem. 286:30034-46, 2011）、このことは、本発明者らが、各時点でのmEngの変動する発現にもかかわらず、心臓圧負荷のすべての相を通して有意により低いsEngレベルを表したEng+/-マウスにおける心筋毛細血管密度の増加に注目したという、本発明者らの知見と一致する。
【００２６】
さらに、本発明者らは、TACに供したEng+/-マウスにおけるpSmad-1/5/8発現が野生型対照と比較して増加したことを認め、これは、他のTGFβファミリーリガンドがEng+/-マウスにおいてより活性を有し得ることを示唆した。従って、mEng発現の低減は、インビボにおいて心臓線維化を制限することにより生存を促進し得る一方、sEng発現の低減は、BMP9などの血管形成促進性サイトカインのリガンドトラッピングを制限することにより心筋毛管現象を促進する。最終的に、sEngの過剰発現は、エンドグリン欠損状態を再現することにより、心臓線維化および、心不全における有害なリモデリングを制限し得る。全体として、本発明者らのデータは、圧負荷により誘導された心不全において心臓リモデリングを制御するためにはmEng対sEngの発現間のバランスが重要であることを強調する。
【００２７】
別の重要な知見は、エンドグリンが、pSmad-2/3リン酸化およびその後の心臓線維化を促進する役割を果たすことである（図5F）。いくつかの先行する報告が、Smad-2/3が心臓線維化および有害なリモデリングを促進することを実証している（Letamendia et al., J. Biol. Chem. 273:33011-9, 1998；Dobaczewski et al., Circ. Res. 107:418-28, 2010）。本発明者らの知見を支持して、TACに供された、II型TGFβ受容体（TBR2CKD）の条件的ノックダウンを有するマウスは、心臓間質性線維化の低減、心筋毛管現象の増強、および心臓機能の保存を実証する（Huang et al., Hypertension 55:1165-71, 2010）。対照と比較して、TAC後のTBR2CKDマウスにおいて、pSmad3のレベルもまた低減した。エンドグリンは有効なTGFβ1リガンド結合のためにTBRIIを必要とするため（Barbara et al., J. Biol. Chem. 274:584-94, 1999）、本発明者らのモデルはTAC後のTBR2CKDマウスの表現型を厳密に再現しており、本発明者らはEng+/-マウスにおいてpSmad-2/3発現の類似した消失を観察している。さらに、骨形態形成タンパク質2型受容体の発現を欠如したマウス（BMPR2-/-）が、肺高血圧症のモデルとして研究されている。これらのマウスにおいて、pSmad-1/5/8発現の低減は、慢性RV圧負荷の存在下での右心室（RV）不全と関連している（Koitabashi et al., J. Clin. Invest. 121:2301-12, 2011；Upton et al., J. Biol. Chem. 284:15794-804, 2009）。BMP7などのBMPR-2のリガンドもまた、心不全のマウスモデルにおいて強力な抗線維化効果を実証しており（Long et al., Circulation 119:566-76, 2009）、pSmad-1/5/8活性を促進することが心臓機能に対して有益な効果を有し得るという概念をさらに支持する。総合すると、TBRIICKDおよびBMPR2-/-マウスモデルと関連する知見により、Smad-2/3シグナル伝達の低減およびSmad-1/5/8シグナル伝達の増強の有益な効果が強調される。重要なことに、エンドグリンは、TGFβ1ならびにBMP-2、-4、-7、および-9などの、TBRIIおよびBMPR2の両方と会合するリガンドに結合し得（Zeisberg et al., Nat. Med. 13:952-61, 2007）、従って、それぞれSmad-2/3およびSmad-1/5/8を通してシグナル伝達するこれらの重要なII型受容体間の重要な位置に、この補助受容体を位置づける。
【００２８】
結論として、エンドグリンは、LV圧負荷に応答する心臓リモデリングを制御する。本発明者らの結果は、心臓繊維芽細胞におけるTGFβ1活性の調節因子としてのmEngおよびsEngの反対の役割を強調する。さらに、リガンド、受容体、および下流のSmadエフェクタータンパク質の重複は、pSmad-2/3を介するTGFβ1シグナル伝達の媒介においてエンドグリンが重要な役割を果たすという本発明者らの知見の重要性をさらに支持する。従って、心不全においてエンドグリンの生物学を標的とする治療は、この破壊的な状態に罹患した個体における臨床転帰を改善する可能性がある。
【００２９】
心不全または関連疾患を患う対象の処置
本発明の方法は、心不全または関連状態、特に心臓線維化と関連する状態またはそれにより引き起こされる状態を患う対象を処置するために使用されてもよい。
【００３０】
心不全は、心臓が身体のその他の部分に十分な血液をもはや送り出すことができない時に起こる。心不全は、最も一般的には冠状動脈疾患により引き起こされるが、心筋症（感染による心筋の脆弱化）、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、およびある特定の不整脈を含む他の原因にも起因し得る。心不全に寄与し得る他の疾患は、気腫、過活動甲状腺、重症貧血、および低活動甲状腺を含む。本明細書において記載される方法は、これらの状態または疾患のいずれかを患う対象の処置または予防的処置を含み得る。
【００３１】
心不全の症候は、咳、疲労、衰弱、失神、食欲の消失、夜間の尿意、速いもしくは不規則な脈拍または心臓の動悸、活動後または横臥後の息切れ、腫れた肝臓または腹部、腫れた足、くるぶし、または脚、息切れによる2、3時間後の睡眠からの目覚め、体重増加、膨張した頸静脈、および肺における液体蓄積を含む。本明細書において記載される方法は、これらの症候の任意の1つまたは複数を処置し得る。
【００３２】
本明細書において記載される方法を用いて処置され得る他の疾患は、左心室機能不全（例えば、無症候性または心筋梗塞後）、高血圧症（例えば、成人または小児）、急性心筋梗塞、および心筋梗塞後を含む。
【００３３】
可溶性エンドグリン
本発明の方法は、ある特定の態様において、可溶性エンドグリン、可溶性エンドグリン断片、または可溶性エンドグリン類似体、例えば、TGFβ1に結合する能力を保持する断片または類似体を使用することができる。
【００３４】
完全長エンドグリンは、TGF-βスーパーファミリーのメンバーに対する180 kDaのホモ二量体共受容体である。エンドグリンの2つのアイソフォームである、633アミノ酸のタンパク質および600アミノ酸のタンパク質が公知である。これらの2つの形態は、その細胞質尾部の長さが異なり；より長い形態は47アミノ酸の尾部を有する（L-mEng）一方、より短い形態は14アミノ酸の細胞質尾部を有する（S-mEng）。エンドグリンのアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001108225およびNP_000109.1に記載され、図10に示される。成熟エンドグリン配列は、アイソフォーム1のアミノ酸26〜658、およびアイソフォーム2のアミノ酸26〜625を含む。両方のアイソフォームにおいて、アミノ酸587〜611は膜貫通ドメインであると予測される。エンドグリンの対応する細胞外領域（アミノ酸26〜586または27〜586）、その断片、またはその類似体が、従って、本発明において使用されてもよい。
【００３５】
本明細書において記載される方法はまた、可溶性エンドグリン（例えば、本明細書において記載されるもののいずれか）の断片も用いることができる。好ましい断片は、例えば、可溶性エンドグリンまたは可溶性エンドグリンの天然形態の結合親和性の少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、または99％で、TGFβ1に結合することが可能である。
【００３６】
本明細書において記載される方法はまた、可溶性エンドグリン類似体も用いることができる。ある特定の態様において、類似体は、可溶性エンドグリンまたは可溶性エンドグリン断片に対して少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。好ましい類似体は、例えば、可溶性エンドグリンの結合親和性の少なくとも1％、5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、または99％で、TGFβ1に結合することが可能である。
【００３７】
抗体
本発明の方法は、TGFβ1によるエンドグリン活性を阻止する抗体、またはその抗原結合断片を使用することができる。ある特定の態様において、抗体は、mEngまたはsEngに特異的に結合する。抗体は、mEngの細胞外ドメイン（ECD）、ECDの切断後のmEngの残りの膜結合成分、または循環sEngに特異的に結合することができる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。ある特定の態様において、抗体はヒト化される。抗体または抗体断片は、一本鎖抗体（scFv）、Fab、Fab'2、scFv、SMIP、二重特異性抗体、ナノボディ、アプタマー、またはドメイン抗体であり得る。
【００３８】
エンドグリンに対する抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、または単一特異性抗体）（例えば、アンタゴニスト抗体）は、当技術分野において公知である抗体を作製するための多数の方法のいずれかを用いて作製することができる。1つの例において、関連するエンドグリン配列を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）（Smith et al., Gene 67:31-40, 1988）とのC末端融合物として産生させる。融合タンパク質を、グルタチオン-Sepharoseビーズ上で精製し、グルタチオンで溶出し、トロンビンで（操作された切断部位で）切断し、ウサギの免疫のために精製する。一次免疫はフロイント完全アジュバントと共に、その後の免疫はフロイント不完全アジュバントと共に行う。トロンビンで切断したGST融合タンパク質のタンパク質断片を用いたウェスタンブロットおよび免疫沈降解析により、抗体力価をモニタリングする。免疫血清を、CNBr-Sepharose結合タンパク質を用いて親和性精製する。抗血清の特異性を、無関連のGSTタンパク質のパネルを用いて判定することができる。
【００３９】
あるいは、エンドグリンに特異的に結合するモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えば、Kohler et al., Nature 256:495-7, 1975；Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511-9, 1976；Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292-5, 1976；Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981を参照されたい）。産生されたら、モノクローナル抗体をウェスタンブロットまたは免疫沈降解析により特異的認識について試験することもできる。あるいは、モノクローナル抗体を、上記の本発明のポリペプチドおよびファージディスプレイライブラリー（Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14:309-14, 1996）を用いて調製することができる。
【００４０】
大規模にかつ低価格でポリクローナル抗体を生成するために、適切な動物種を選択することができる。ポリクローナル抗体を、例えば、免疫したウシの乳または初乳から単離することができる。ウシの初乳はリットルあたり28 gのIgGを含有する一方、ウシの乳はリットルあたり1.5 gのIgGを含有する（Ontsouka et al., J. Dairy Sci. 86:2005-11, 2003）。ポリクローナル抗体をまた、免疫したニワトリ由来の卵の卵黄から単離することもできる（Sarker et al., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 32:19-25, 2001）。
【００４１】
有用な抗体を、いくつかの異なるスクリーニングアッセイにおいて特定することができる。最初に、抗体が免疫抗原（すなわち、エンドグリン）について特異的であるか否かを判定するために、抗体をELISAによりアッセイする。標準的な技術を用いて、ELISAプレートを免疫原でコーティングし、抗体をプレートに添加し、洗浄し、抗体を生成させた種のIgに特異的な二次抗体を用いて、結合した抗体の存在を検出する。
【００４２】
RNA干渉
本明細書において記載される方法はまた、エンドグリン発現を阻害するためにRNAiを用いることができる。RNA干渉（RNAi）とは、関心対象の遺伝子またはmRNAに対応する二本鎖RNA（dsRNA）が生物中に導入され、これにより対応するmRNAの分解がもたらされる、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）の機構である。RNAi反応においては、dsRNA分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、21〜23ヌクレオチド（nt）の長さにわたり、かつ2ヌクレオチドの3'尾部を有する小さなRNA断片またはセグメントにプロセシングされる。あるいは、21〜23 ntの長さであり、かつ2ヌクレオチドの3'尾部を有する合成dsRNAを、合成し、精製し、反応において用いることができる。これらの21〜23 ntのdsRNAは、「ガイドRNA」または「短干渉RNA」（siRNA）として公知である。
【００４３】
siRNA二重鎖は次に、タンパク質から構成されるヌクレアーゼ複合体に結合し、それが、該複合体内のsiRNAに対して相同性を有する内在性mRNAを標的として破壊する。該複合体は、siRNA鎖の一方と内在性mRNAとの間の塩基対形成相互作用を通して相同的なmRNA分子を標的とすることにより、機能する。該mRNAはその後、siRNAの3'末端からおよそ12 ntで切断され、分解される。この様式で、特異的遺伝子を標的として分解することができ、それにより、標的とした遺伝子からのタンパク質発現の消失がもたらされる。siRNAはまた、化学的に合成するか、またはsiRNAを化学的に合成する会社（例えば、Dharmacon Research Inc.、Pharmacia、またはABI）から入手することができる。
【００４４】
エンドグリンRNAi分子は市販されており、Santa Cruz Biotechnology（siRNA；カタログ番号sc-35302）を含む様々な供給源から入手することができる。
【００４５】
dsRNAの特定の必要条件および修飾は、参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開第WO 01/75164号、および米国特許出願公開第20060067937号、およびPCT公開第WO 06/034507号に記載されている。
【００４６】
投与および投薬量
本明細書において記載される方法は、TGFβ1媒介エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物の投与を特徴とする。組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用のために製剤化することができる。1つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤または担体もまた、妥当な製剤のための組成物に含まれることができる。本発明における使用に適する製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985に見出される。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、例えば、Langer（Science 249:1527-1533, 1990）を参照されたい。
【００４７】
薬学的組成物は、予防的および／または治療的処置用に、非経口、鼻腔内、局部的、経口、または局所投与のために、例えば経皮手段により使用することができる。薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射により）、または経口摂取により、または、血管もしくは癌状態により影響を受けた領域での局部的適用もしくは関節内注射により、投与することができる。追加的な投与の経路は、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、心室内、硬膜外（intraepidural）、および、鼻、眼、強膜内、眼窩内、直腸、局部的、またはエアロゾル吸入投与を含む。蓄積注射または侵食性インプラントもしくは成分などの手段による徐放性投与もまた、本発明に具体的に含まれる。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝水、食塩水、PBSなどに溶解または懸濁された上述の作用物質を含む、非経口投与用の組成物を提供する。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、界面活性剤などのような、生理学的状態に近づくために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。本発明はまた、錠剤、カプセルなどの製剤用の、結合剤または充填剤のような不活性構成要素を含有し得る、経口送達のための組成物も提供する。さらに、本発明は、クリーム、軟膏などの製剤用の、溶媒または乳化剤のような不活性構成要素を含有し得る、局所投与のための組成物を提供する。
【００４８】
これらの組成物は、従来の滅菌技術により滅菌してもよいし、または濾過滅菌してもよい。得られた水性溶液を、そのまま使用のために包装してもよいし、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌水性担体と組み合わせる。調製物のpHは、典型的に、3〜11の間、より好ましくは5〜9の間または6〜8の間、最も好ましくは7〜8の間、例えば7〜7.5であろう。得られた固体形態の組成物を、複数の単一用量単位で包装してもよく、各々が、例えば、錠剤またはカプセルの密封包装中に、上述の1種または複数種の作用物質の一定量を含有する。固体形態の組成物はまた、柔軟な量のための容器中、例えば、局部的に適用可能なクリームまたは軟膏のために設計された絞り出せるチューブ中に包装することができる。
【００４９】
有効量を含有する組成物を、予防的または治療的処置のために投与することができる。予防的適用において、組成物を、心不全の危険性があると診断された（例えば、米国特許出願第13/288,493号に記載されるように、より低いレベルの可溶性エンドグリンを有する）対象に投与することができる。本発明の組成物は、障害の発症を遅延、低減、または好ましくは阻止するのに十分な量で、対象（例えば、ヒト）に投与することができる。治療的適用において、組成物を、障害の症候およびその合併症を治癒させるかまたは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、本明細書において記載される任意の障害の心不全をすでに患っている対象（例えば、ヒト）に投与する。この目的を達成するために適切な量は、疾患または医学的状態と関連する少なくとも1つの症候を実質的に改善するのに十分な化合物の量である、「治療的有効量」として定義される。例えば、心不全の処置において、状態の任意の症候を減少、遅延、抑制、または停止する作用物質または化合物が、治療的に有効であると考えられる。作用物質または化合物の治療的有効量は、疾患または状態を治癒することは要求されないが、疾患もしくは状態の発症が遅延、妨害、もしくは阻止されるか、または、疾患もしくは状態の症候が寛解されるか、または、疾患もしくは状態の期間が変更されるか、もしくは、例えば、より重症でなくなるか、または、個体において回復が加速されるように、疾患または状態のための処置を提供する。
【００５０】
この使用のために有効な量は、疾患または状態の重症度、ならびに対象の体重および全身状態に依存し得る。本発明の、および哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本発明の方法において使用される組成物の治療的有効量は、哺乳動物の年齢、体重、および状態における個体差を考慮して、処置する医療従事者が決定することができる。本発明の作用物質は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に、処置される対象において望ましい結果（例えば、心臓線維化の低減）を生じる量である有効量で、投与される。治療的有効量はまた、当業者が経験的に決定することもできる。
【００５１】
有効量を含む本発明の組成物の単回または複数回の投与は、処置する医療従事者により選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。用量および投与スケジュールは、臨床家により一般的に実施される方法または本明細書において記載される方法に従って処置の経過を通してモニタリングされ得る、対象における疾患または状態の重症度に基づいて、決定および調整することができる。
【００５２】
本発明の化合物は、従来の処置もしくは治療の方法のいずれかと組み合わせて使用してもよいし、または、従来の処置もしくは治療の方法とは別々に使用してもよい。
【００５３】
本発明の化合物を他の作用物質との併用療法において投与する時、それらを、逐次的にまたは同時に個体に投与してもよい。あるいは、本発明による薬学的組成物は、本明細書において記載されるような薬学的に許容される賦形剤、および当技術分野において公知である別の治療剤または予防剤を伴う、本発明の化合物の組み合わせから構成されてもよい。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の限定ではなくむしろ例証を意図している。
【実施例】
【００５５】
実施例1
左心室圧負荷中の心臓繊維芽細胞におけるエンドグリン発現
心不全におけるエンドグリンの役割を探索するために、本発明者らは最初に、エンドグリンが、心臓繊維芽細胞および内皮を含む、単離された非心筋細胞集団により主として発現されることを実証した（図1A）。本発明者らは次に、胸部大動脈狭窄（TAC）により誘導されたLV圧負荷の十分に確立されたマウスモデルを使用し、その後心不全から2、4、および10週間の時点で組織の特徴決定を行った。LVにおけるベースラインのエンドグリン発現は、野生型マウスと比較して、Eng+/-マウスにおいて有意により低かった（図1B）。TAC後、LV mEng mRNAおよびタンパク質の発現は、野生型マウスにおいて、2週間までに有意に増加し、その後TACの4週間後まで上昇したままであり、10週間までに正常近くに戻った（図1Cおよび図1D）。TAC結紮の部位に対して遠位の大動脈においては、エンドグリン発現に変化は観察されなかった（図2）。sEngの血清レベルもまた、TAC後、2週間以内に上昇し、4週間および10週間までに正常化した（図1E）。Eng+/-マウスにおいて、全体のmEngおよびsEng発現は、野生型マウスと比較して有意に低減していた（図1C〜図1E）。しかしながら、Eng+/-マウスは、野生型マウスと類似した発現のパターンを呈した。LV mEng mRNAおよびタンパク質の発現は、TACの2週間後に増加し、4週間および10週間までに正常値近くに低減した。すべての時点にわたって、sEngレベルは、野生型と比較してEng+/-マウスでより低かった。これらの知見は、圧負荷が、全身のmEng発現に影響を及ぼすことなく、mEngの左心室での発現を直接刺激していることを示唆する。圧負荷の急性期の間、sEngレベルは野生型マウスにおいてLV mEngレベルと調和して増加しており、このことは、エンドグリンのこの循環形態が心臓起源である可能性を示唆する。重要なことに、Eng+/-マウスは、圧負荷により誘導された心不全に応答して、mEngおよびsEng発現のレベルの低減を呈する。
【００５６】
実施例2
エンドグリン発現の低減は心不全において生存促進性の心臓表現型を促進する
本発明者らは次に、圧負荷により誘導された心不全中のエンドグリン発現の低減の機能的影響を検討した。Eng+/-マウスは、心エコー検査および圧容積ループ解析により心臓機能の保存を、ならびにTAC後に野生型マウスと比較して生存の改善（それぞれ、88％対50％、p＜0.01）を実証した（図1I〜図1J）。これらの知見と一致して、野生型マウスは、TACの4週間後および10週間後の両方で全体重の有意な低減を示したが、Eng+/-マウスはそうではなかった（表1）。
【００５７】
（表１）野生型マウス対Eng+/-マウスにおけるTAC後の生理学的知見
2014524417.tif 000002
★、p＜0.05：4週間対TAC前；★★、p＜0.05：10週間対TAC前；#、p＜0.05：Eng+/-対野生型
【００５８】
肺重量は、ベースライン値と比較して、TACのすべての期間にわたって両方のマウス群において有意に増加した；しかしながら、肺重量は、TACの10週間後に、野生型と比較してEng+/-マウスにおいてより低かった（表1）。TACの4週間後および10週間後の両方で、LV収縮期圧（LVSP）および拡張終期圧（LVEDP）は、野生型およびEng+/-マウスの両方において、それぞれの偽手術された対照と比較して増加した。LVEDPは、野生型とEng+/-マウスとの間で有意には異ならなかったが、LVSPは、TACの4週間後および10週間後の両方で、野生型と比較してEng+/-マウスにおいて有意により高かった。LV収縮性（dP/dt最大）は、TAC後に野生型マウスにおいて時間依存的様式で有意に減少したが、Eng+/-マウスにおいては心臓圧負荷のすべての相にわたって不変のままであった（表1）。心エコー検査により、TAC後に野生型においてLV短縮率（FS％）の有意な時間依存的低下が実証されたが、Eng+/-マウスにおいては実証されなかった。LV機能の保存と共に、LV後壁の厚さ（PWT）における有意な増加が、ベースライン値と比較してTAC後に野生型およびEng+/-マウスの両方において注目された。しかしながら、TACの10週間後に、野生型マウスは、Eng+/-マウスと比較して有意により大きなLV拡張およびより小さなPWTを示した（表1）。これらの知見は、同一の程度のLV圧負荷にもかかわらず、エンドグリン発現の低減によって、すべての時点にわたってLV機能が保存され、かつ生存が改善されたことを示唆する。特に、野生型マウスと比較して、LVの厚さの心エコー検査による測定値は類似していた；しかしながら、収縮期圧を生成するLVの能力は、Eng+/-マウスにおいて有意により高く、このことは、心臓肥大以外の心臓リモデリングの何らかの構成要素が、エンドグリン発現の低下によって変更され得ることを示唆している。
【００５９】
実施例3
エンドグリン発現の低減は心臓線維化を減衰させる
エンドグリン発現の低減が心臓線維化を減衰させる可能性を探索するために、本発明者らは、心臓肥大における変化を検討した。偽手術された対照と比較すると、正規化したLV質量は、LV圧負荷のすべての相にわたって野生型およびEng+/-マウスの両方において有意に増加した。末期心不全の際、LV質量は、野生型と比較してEng+/-マウスにおいて有意により低く、恐らく、LVの拡張および偏心性リモデリングの欠如を反映した（表1）。同様に、筋細胞横断面積は、野生型およびEng+/-マウスの両方においてTAC後に有意に増加した（図3A〜3B）。β-MHC、SERCa、およびカルシニューリンなどの、心不全において活性化されることが公知である胎児遺伝子およびタンパク質の発現は、野生型およびEng+/-マウスの両方において、TACの4週間後（図3C〜図3E）および10週間後（図4A〜図4B）に、類似した発現のパターンを呈した。次に、本発明者らは、TACの4週間後（両方のマウス群が類似した程度のLV肥大を示している）の心筋毛管現象を検討し、TAC後に野生型およびEng+/-マウスにおいて、心筋細胞に対する毛細血管の比および全毛細血管密度における有意な増加を認めた。心筋毛管現象の両方の測定値は、TAC後に、野生型マウスと比較してEng+/-マウスにおいてより高かった（図3F〜3G）。筋細胞肥大が群間で類似しており、かつ心筋毛管現象がEng+/-マウスにおいて少なめにしか増加しなかったとの知見に基づいて、本発明者らは、心臓線維化における変化を次に検討した。
【００６０】
LVにおける組織学的に明白なコラーゲン沈着の定量は、偽手術された対照と比較して、野生型マウスにおいて時間依存的様式で増加したが、Eng+/-マウスにおいては有意な変化はなかった（図5A〜図5B）。I型コラーゲンmRNA（図5C）およびタンパク質（図5D）の発現は、TAC後に野生型マウスにおいて同様に増加する一方、Eng+/-マウスは、圧負荷により誘導された心不全の末期の際のI型コラーゲン発現において小さな増加のみを呈した（図5Cおよび図6A）。重要なことに、TACの4週間後に、野生型およびEng+/-群の両方のLVにおいて、TGFβ1 mRNA（図5E）および活性TGFβ1タンパク質（図6B）発現の増加が観察された。10週間までに、TGFβ1 mRNA発現は、野生型偽と比較して野生型TACにおいて上昇したままであった；しかしながら、Eng+/-マウスにおいては偽手術された対照と比較して変化が認められなかった（データは示されていない）。リン酸化Smad-2/3（図5F）およびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1（PAI-1）（図6C）などの、TGFβ1シグナル伝達の下流標的の発現は、偽対照と比較してTAC後に野生型マウスにおいて有意に増加した。しかしながら、Eng+/-TACマウスにおいては、対照と比較して差異が認められなかった。興味深いことに、リン酸化Smad-1/5/8のレベルは、TACの4週間後に、野生型マウスにおいて有意に増加しなかったが、Eng+/-マウスにおいては上昇した（図6D）。総合すると、これらのデータは、エンドグリン発現の低減が、筋細胞肥大性シグナル伝達を保存する一方、線維形成促進性シグナル伝達カスケードを制限することを示唆する。さらに、TGFβ1レベルにおける類似の増加にもかかわらず、III型TGFβ1受容体であるエンドグリンの消失は、pSmad-2/3およびPAI-1のレベルの低減により証明されるように、下流のシグナル伝達を減衰させるのに十分であった。これらのインビボでの知見から、本発明者らは、インビトロでエンドグリン発現に対するTGFβ1の線維化促進性シグナル伝達の依存性を探索することにした。
【００６１】
実施例4
膜結合性エンドグリンはTGFβ1により誘導されるCOL1合成に必要とされる
本発明者らは、心臓手術中に取得された新鮮な組織試料からhCFを単離し、培養した。エンドグリンの役割を、最初に、機能消失アプローチを用いて検討した。アイソタイプ対照抗体での処置と比較して、抗エンドグリン抗体での前処置は、TGFβ1により誘導されたI型コラーゲンmRNAおよびタンパク質の発現を減衰させた（図7A）。次に、エンドグリン発現を、hCFにおいてsiRNAアプローチ（siEng）を用いてサイレンシングさせた。スクランブル対照siRNAでの処置と比較して、TGFβ1により誘導されたI型コラーゲンmRNAおよびタンパク質の発現は、有意に低減した（図7B）。特に、エンドグリン発現のサイレンシングはまた、hCFにおいて、TGFβ1により誘導されるPAI-1および結合組織増殖因子（CTGF）の発現も有意に制限した（図8A〜図8B）。これらの知見は、エンドグリンがhCFでのTGFβ1活性の制御において果たす重要な役割を強調する。本発明者らは次に、エンドグリンの過剰発現が、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン合成を促進するか否かを探索した。
【００６２】
実施例5
エンドグリンの過剰発現は恐らく可溶性エンドグリンの増加のためにエンドグリン欠損状態を反映する
hCFに、完全長エンドグリンを過剰発現するアデノウイルス（Ad-FL-Eng）または導入遺伝子を発現しない対照アデノウイルス（Adヌル）をトランスフェクションした。興味深いことに、TGFβ1により誘導されるI型コラーゲン発現は、完全長エンドグリンを過剰発現するhCFにおいて有意に低減した（図7C）。なぜエンドグリンの過剰発現が本発明者らの機能消失研究において注目される知見を反映するのかを検討するために、本発明者らは、Ad-FL-EngをトランスフェクションしたhCF由来の調整培地中のsEngのレベルを測定し、Adヌルで処置した対照と比較して有意により高いsEngレベルを認めた（図7D）。sEngがTGFβ1により誘導されるI型コラーゲン発現を制御し得るか否かを探索するために、本発明者らは、hCFを組み換えヒト可溶性Eng（RhsEng）で前処置し、媒体で処置した対照と比較してI型コラーゲンタンパク質（図7E）およびmRNA（図8C）発現における用量依存的減少を認めた。TGFβ1活性の負の調節因子としてのsEngの役割を確認するために、本発明者らは、COS-7細胞に、ヒトsEngを過剰発現するアデノウイルス（Ad-hsEng）をトランスフェクションし、培養培地中のsEngのレベルにおける用量依存的増加を確認した（図8D）。RhsEngでの処置と同様に、AdhsEngをトランスフェクションしたCOS（AdhsEng-COS）細胞由来の調整培地の存在下でTGFβ1で処置したhCFもまた、TGFβ1により誘導されたpSmad-2/3発現およびI型コラーゲン発現の両方における用量依存的減少を実証した（図8F）。
【００６３】
実施例6
可溶性エンドグリンは圧負荷により誘導された心不全において心臓線維化を減衰させる
sEngがインビボで心臓線維化を制限するか否かを探索するために、本発明者らは最初に、野生型マウスをAdhsEngの静脈内注射で処置し、マウスsEngの基本的発現における変化を伴うことなく、循環中のヒトsEngの有意に増加したレベルを認めた（図9A）。次に、本発明者らは、心臓圧負荷の誘導より1日前に、野生型マウスをAdhsEngで処置した。TACの4週間後、AdhsEngで処置したマウスは、Adヌルで処置した対照と比較してより少ない心臓線維化を呈し（図9B）、かつI型コラーゲンのLV発現を低減させ（図9C）、それによってsEngを、圧負荷により誘導された心不全における心臓線維化の負の制御因子として示した。
【００６４】
実施例7
右心室圧負荷におけるエンドグリンシグナル伝達の関与
右心室（RV）機能は、肺高血圧症（PH）における臨床転帰の主要な決定要因である。本発明者らは従って、PHにより誘導されたEng発現がRVにおいてTGFβ1活性および線維化を増大させるという仮説、ならびに、エンドグリン活性の遮断がPHにおけるRV線維化を制限するという仮説を試験した。
【００６５】
RVリモデリングにおけるエンドグリンの機能的役割を探索するために、オスの野生型マウスおよびエンドグリンヘテロ接合（Eng+/-）マウスにおいて肺動脈狭窄（PAC）を行った。偽対照と比較して、PACは、野生型マウス（21±6対50±4、p＜0.01）およびEng+/-マウス（24±3対46±9、p＜0.01）の両方において同等にRV収縮期圧を増加させた。野生型マウスにおいて、Eng mRNAおよびタンパク質の発現は、PACの7日後にRVにおいて増加し、RVの線維化および肥大を伴った。野生型マウスと対照的に、Eng+/-マウスでは、RV1回拍出量（4±1対7±1、p＜0.01）および心拍出量（1.9±0.7対3.6±0.8 ml/分、p＜0.01）が保存されていた。PAC後に、より少ないRV線維化がEng+/-マウスにおいて観察された一方、RV質量は野生型と同等であった。野生型およびEng+/-マウスのRVにおける活性TGFβ1のレベルは同様に増加したにもかかわらず、PAC後、pSmad-2/3およびpERK-1/2のレベルが野生型マウスのRVにおいては増加したが、Eng+/-マウスにおいては変化しなかった。エンドグリン発現に対するTGFβ1シグナル伝達の依存性を、中和抗エンドグリン抗体（TRC105；Tracon Pharma）を用いてさらに試験した。IgGで処置した対照と比較して、TRC105は、PAC後の野生型マウスにおいて、RV線維化、pSmad-2/3発現、および1型コラーゲン発現を制限した。野生型マウスと比較して、Eng+/-マウスおよびTRC105で処置したマウスの両方は、PAC後の生存を改善していた（Eng+/-またはTRC105マウス対野生型について、それぞれ、60％；n＝7/12対100％；n＝8/8対88％；n＝7/8、p＜0.01）。
【００６６】
実施例8
材料および方法
以下の材料および方法を、上記の実施例において用いた。
【００６７】
マウスTACモデル
成体、オス、14〜16週齢のC57/B16野生型およびEng+/-マウスが、以前に記載されたような胸部大動脈狭窄（TAC）を受けた（Donaldson et al., Circ. Res. 104:265-75, 2009）。TACの2、4、および10週間後に、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、免疫ブロット法、組織学、および酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によるさらなる解析のために、マウスを屠殺し、心臓組織および血液を取得した。Eng+/-マウスは、University of TorontoのMichele Letarte博士より提供を受けた。
【００６８】
インビボでの生理学的特徴決定
10μl/gのアビジンの腹腔内注射で麻酔したマウスに対して、15 mHz変換器（Acuson）を備えたSonos 5500心エコー検査機械（Hewlett-Packard）を用いて、経胸郭心エコー検査を行った。傍胸骨短軸像を、左心室を通して乳頭筋レベルで取得した。LA横断面積、LV後壁の厚さ、LV拡張終期径、および収縮終期径のために、Mモード軌跡を記録した。大きさは、3回の心臓周期にわたって平均した。圧容積ループの測定のためにコンダクタンスカテーテルを用いて、本発明者らの研究室により以前に記載されたように、各採取時点で血行力学的評価を行った（Donaldson et al., Circ. Res. 104:265-75, 2009）。
【００６９】
インビトロ研究
以前に記載されたように（Neuss et al., Cell Tissue Res. 286:145-53, 1996）、hCFを、Tufts Medical Centerで心臓手術中に採取された心筋組織から単離した。細胞を、2％ウシ血清アルブミンを含有する繊維芽細胞増殖培地（FGM-2, Lonza）中で培養した。繊維芽細胞表現型を、繊維芽細胞特異的ペプチドおよびジスコイジンドメイン受容体2（DDR2）についての免疫染色を用いて確認した。すべてのインビトロでの実験は、4回未満の継代の細胞を用いた。hCFを、80％コンフルエントになるまで培養し、その後24時間血清を欠乏させた。TGFβ1（Sigma-Aldrich、カタログ番号T7039）を、3μM HCl中の50μg/mlストック溶液として調製した。細胞を、pSmad 2/3発現における変化を評定するために30分間、またはTGFβ1により誘導されるコラーゲン合成を研究するために16〜24時間、10 ng/ml TGFβ1で処置した。RNA、タンパク質溶解物、および調整培地を、コラーゲンおよびエンドグリン発現のその後の解析のために採取した。
【００７０】
リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
すべての細胞ベースのRT-PCR実験に関して、全RNAは、Trizol（Invitrogen）を用いて直接抽出した。組織ベースのRT-PCRに関して、全RNAは、Trizol試薬を用いてホモジナイズした組織試料から抽出した。全RNAを分光光度計を用いて定量化し、5μgの抽出したRNAを、RT-PCR用のランダムヘキサマーを有するHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）を用いて、RT酵素により、キットのプロトコルに従ってcDNAへ逆転写した。Platinum PFX酵素（Invitrogen）、0.5 mMマグネシウム、ならびに、ヒトおよびマウスエンドグリン、I型コラーゲン、TGFβ1、PAI-1、およびCTGF用のプライマーを用いて、RT反応物の10分の1をPCR鋳型として使用した。すべてのRT-PCR実験について、ABI Prism（登録商標）7900 Sequence Detection Systemを使用し、94℃30秒、60℃45秒、72℃45秒で行った40サイクルを用いて、試料を3つ組で定量化した。
【００７１】
免疫ブロット解析（ウェスタンブロット）
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した組織ホモジネートまたは培養細胞を、氷上、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（1 mM PMSF；1 mM EDTA；1μg/mlのロイペプチン、アプロチニン、およびぺプスタチンA；1 mMオルトバナジン酸ナトリウム；50 mMフッ化ナトリウム；40 mMβ-グリセロホスファート）を含有するRIPA緩衝液（50 mM トリス／HCl、pH 7.5；150 mM NaCl；1％ Nonidet P-40；0.5％デオキシコレート；0.1％ SDS）中で溶解し、その後、18,000 gで10分間、4℃で遠心分離した。全タンパク質を、標準曲線（Bio-Rad）を用いて定量化した。25μgのタンパク質を、4〜12％ SDS-PAGEゲルを通して電気泳動し、その後Immobilon-P（PVDF）膜（Millipore, Bedford, Mass.）上に転写した。一晩のブロッキングの後、ブロットを、1:1000希釈の適切な一次抗体（下記を参照されたい）とインキュベーションし、その後、1:5,000希釈の対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Amersham）とインキュベーションした。免疫反応性のバンドを、増強化学発光（ECL-Plus; Amersham）を用いてオートラジオグラフィーにより検出し、UN-SCAN-ITソフトウェア（Silk Scientific）を用いた濃度測定解析により定量化した。60℃で20分間ストリップ用緩衝液（100 mM 2-メルカプトエタノール、2％ SDS、62.5 mMトリス／HCl、pH 6.7）を用いてブロットを剥がし、その後、免疫沈降されたタンパク質の量を標準化するためにリプローブしてもよい。得られたバンドを、画像ソフトウェアプログラムで濃度測定的に解析した。ヒトおよびマウスの標的タンパク質に対する抗体は、エンドグリン、COL1、pSmad2/3、pSmad1/5/8、全Smad3、全Smad1、CD-31、およびカルシニューリンを含んだ。
【００７２】
インビトロsiRNAプロトコル
心臓繊維芽細胞を、80％コンフルエントになるまで、抗生物質を補充していないFGM-2中で増殖させた。すべてのsiRNA構築物について、50μM siRNAストック（Ambion）を、Optimem（Invitrogen）中で1.0 nMの作業用濃度に希釈した。この作業用希釈物を、98μlのOptimem中に希釈した2μlのカチオン性脂質トランスフェクション試薬Lipofectamine（Invitrogen）と混合した。20分のインキュベーション後、培養細胞を、siRNA/Lipofectamineの組み合わせに曝露した。細胞をその後、ヒトエンドグリンsiRNA（Ambion、カタログ番号145527）で処置した。すべてのsiRNA実験は、スクランブルsiRNA（陰性対照；Ambion、カタログ番号4390844）およびGAPDH siRNA（陽性対照；Ambion、カタログ番号4390850）で対照をとった。トランスフェクションの24〜36時間後に、全RNAを単離して、上記のようにRT-PCR解析用にcDNAに変換した。別々の系列において、タンパク質溶解物をトランスフェクションの36〜48時間後に採取し、上記のようにウェスタンブロット解析を用いて解析した。
【００７３】
インビトロでの可溶性エンドグリン処置プロトコル
血清を欠乏させた心臓繊維芽細胞を、80％コンフルエントになるまで培養し、その後、エンドグリンの細胞外ドメインの完全長配列に由来する組み換えヒト可溶性エンドグリン（R&D Systems）で24時間処置した。次に細胞を、10 ng/ml TGFβ1（Sigma）でさらに24〜48時間刺激した後、RT-PCRおよび免疫ブロット解析のための全RNAおよびタンパク質溶解物の単離を行った。
【００７４】
酵素結合免疫吸着検定法
市販されているELISAキット（ヒトエンドグリン（R&D Systems、カタログ番号DNDG00）；マウスエンドグリン（R&D Systems、カタログ番号DY1320））を、調整培地およびマウス実験由来の血清試料を解析するために用いた。
【００７５】
インビトロでのhCFのアデノウイルス感染
エンドグリン過剰発現研究については、ヒトエンドグリンの完全長cDNAを発現する第1世代のアデノウイルス（Ad-FL-Eng）を、Maine Medical CenterのCalvin Vary博士より好意で提供を受けた。可溶性エンドグリンの過剰発現については、ヒトエンドグリンの細胞外ドメインの完全長cDNAを発現する第1世代のアデノウイルス（Ad-hs-Eng）を、Ananth Karumanchi博士（Beth Israel Deaconess Medical Center）より好意で提供を受けた。インビボでのアデノウイルストランスフェクションは、導入遺伝子を発現しないアデノウイルス（Adヌル）を用いて対照をとった。
【００７６】
最適感染多重度（MOI）
心臓繊維芽細胞を最初に、80％コンフルエントになるまで12ウェルディッシュ上で2 ml FGM-2中で増殖させた。ウイルスを氷上で融解させ、典型的なMOI用量曲線（0、50、100、200、500、1000 MOI）を用いて添加した。ウイルスに感染した細胞を、24時間37℃でインキュベーションした。ヒトエンドグリンについてのRT-PCRおよびウェスタンブロット解析のために、全RNAおよびタンパク質溶解物を抽出した。
【００７７】
インビトロでの過剰発現プロトコル
100 mmディッシュ中で培養したコンフルエントのhCF（継代3）に、導入遺伝子を発現しないアデノウイルス（Adヌル）のいずれかを、20プラーク形成単位（p.f.u.）／細胞で3 mlのFGM-2（Lonza）中で感染させた。1時間のインキュベーション後、細胞を2回PBSでリンスし、10 ml FGM-2中で培養した。培養培地を24時間の間隔で交換し、免疫ブロット解析、ELISA、およびRT-PCRのために、感染の1、4、5、10、14、21、および28日後に培地および細胞を採取した。感染させなかった心臓繊維芽細胞の群を、この実験についての対照として用いた。
【００７８】
可溶性エンドグリン調整培地実験
調整培地研究のために、COS-7細胞に、増加する濃度のAd-hs-EngまたはAdヌルを24時間トランスフェクションした。調整培地を単離し、ヒトsEngレベルをELISAにより確認した。調整培地をその後、血清を欠乏させたhCFを含有する12ウェルディッシュ中に移し、その後TGFβ1（10 ng/ml）で刺激した。
【００７９】
他の態様
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、あたかも各独立した特許、特許出願、または刊行物が参照により組み入れられるように具体的にかつ個々に示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2014524417.tif 000003
【図１Ｂ】
2014524417.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2014524417.tif 000009
【図１Ｈ】
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【図２】
2014524417.tif 000011
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
2014524417.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月6日(2014.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、肺高血圧症、心筋症、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後を処置するためまたは予防的に処置するための組成物であって、エンドグリン活性を阻害する有効量である、組成物。
【請求項２】
前記組成物が可溶性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、可溶性エンドグリン、またはエンドグリン活性を阻害するその断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記可溶性エンドグリンが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
前記可溶性エンドグリン類似体が、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項2記載の組成物。
【請求項５】
エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物の投与が、心臓線維化の低減をもたらす、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
前記心不全がうっ血性心不全である、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
前記心不全が、収縮期心不全または拡張期心不全である、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記対象が、冠状動脈疾患を患っているか、または患ったことがある、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
前記対象が、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
前記肺高血圧症が、成人肺高血圧症または小児肺高血圧症である、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
前記左心室または右心室機能不全が、無症候性左心室もしくは右心室機能不全または心筋梗塞後左心室もしくは右心室機能不全である、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内投与される、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
対象において線維化を低減させるための組成物であって、エンドグリン活性を阻害する有効量である、組成物。
【請求項１５】
前記組成物が可溶性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、可溶性エンドグリン、またはエンドグリン活性を阻害するその断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
前記可溶性エンドグリンが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含む、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
前記可溶性エンドグリン類似体が、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項15記載の組成物。
【請求項１８】
エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１９】
前記対象が、心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、肺高血圧症、心筋症、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後からなる群より選択される状態を患っている、請求項14〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
前記心不全がうっ血性心不全である、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
前記心不全が、収縮期心不全または拡張期心不全である、請求項19記載の組成物。
【請求項２２】
前記肺高血圧症が、成人肺高血圧症または小児肺高血圧症である、請求項19記載の組成物。
【請求項２３】
前記左心室または右心室機能不全が、無症候性左心室もしくは右心室機能不全または心筋梗塞後左心室もしくは右心室機能不全である、請求項19記載の組成物。
【請求項２４】
前記対象が、冠状動脈疾患を患っているか、または患ったことがある、請求項14〜23のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２５】
前記対象が、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある、請求項14〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内投与される、請求項14〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
前記線維化が心臓線維化である、請求項14記載の組成物。
【請求項２８】
右心室における心臓線維化を特異的に低減させる、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
前記心筋症が拡張型心筋症である、請求項1〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
抗体もしくはその抗原結合断片、またはRNAi剤を含む、請求項1〜29のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体または抗原結合断片が、エンドグリン活性を特異的に阻害するか、またはエンドグリン受容体のアンタゴニストである、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体がエンドグリン受容体に結合する、請求項31記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
[本発明1001]
それを必要とする対象において心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後を処置するためまたは予防的に処置するための方法であって、TGFβ1媒介エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物の治療的有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
前記組成物が可溶性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、可溶性エンドグリン、またはそのTGFβ1阻害断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記可溶性エンドグリンが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記可溶性エンドグリン類似体が、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、本発明1002の方法。
[本発明1005]
前記組成物が、抗体、またはその抗原結合断片を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記抗体がエンドグリン受容体のアンタゴニストである、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記抗体が前記エンドグリン受容体に結合する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記組成物が、エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記投与が、心臓線維化の低減をもたらす、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記心不全がうっ血性心不全である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記心不全が、収縮期心不全または拡張期心不全である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記対象が、冠状動脈疾患を患っているか、または患ったことがある、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記対象が、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記高血圧症が、成人高血圧症または小児高血圧症である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記左心室機能不全が、無症候性左心室機能不全または心筋梗塞後左心室機能不全である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記投与が、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内である、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
（a）エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物；および
（b）心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、心筋梗塞後の処置用の該組成物の投与のための指示書
を含む、キット。
[本発明1018]
対象において線維化を低減させるための方法であって、TGFβ1媒介エンドグリンシグナル伝達を阻害する組成物の有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1019]
前記組成物が可溶性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、可溶性エンドグリン、またはそのTGFβ1阻害断片もしくは類似体のアミノ酸配列を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記可溶性エンドグリンが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜586を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記可溶性エンドグリン類似体が、天然ヒト可溶性エンドグリン配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記組成物が、抗体、またはその抗原結合断片を含む、本発明1018の方法。
[本発明1023]
前記抗体がエンドグリン受容体のアンタゴニストである、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記抗体が前記エンドグリン受容体に結合する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記組成物が、エンドグリン発現を低減させることができるsiRNA分子を含む、本発明1018の方法。
[本発明1026]
前記投与が心臓線維化の低減をもたらす、本発明1018〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記対象が、心不全、左心室機能不全、右心室機能不全、高血圧症、急性心筋梗塞、または心筋梗塞後からなる群より選択される状態を患っている、本発明1018〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記心不全がうっ血性心不全である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記心不全が、収縮期心不全または拡張期心不全である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前記高血圧症が、成人高血圧症または小児高血圧症である、本発明1027の方法。
[本発明1031]
前記左心室機能不全が、無症候性左心室機能不全または心筋梗塞後左心室機能不全である、本発明1027の方法。
[本発明1032]
前記対象が、冠状動脈疾患を患っているか、または患ったことがある、本発明1018〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記対象が、先天性心臓疾患、心臓発作、心臓弁疾患、または不整脈を患っているか、または患ったことがある、本発明1018〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記投与が、静脈内、経口、筋肉内、関節内、皮下、腹腔内、または病巣内である、本発明1018〜1033のいずれかの方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、添付の図面、および添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014524417000001.app
【国際調査報告】
2014524417.tif 000035
2014524417.tif 000036