(57)【要約】疾患に関連するタンパク質凝集体または他の誤って折り畳まれたタンパク質と優先的に会合するペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを用いて、該タンパク質凝集体または該誤って折り畳まれたタンパク質を、個体の眼において検出するための方法を記載する。該方法は非侵襲的に行うことができる。2014514576.tif 000010
2014514576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体、または他の誤って折り畳まれたタンパク質を、個体の眼において検出するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(A)ペプチドプローブ、ペプトイドプローブ、またはペプチド模倣体プローブを該個体に投与する段階であって、該プローブが、該Aβタンパク質凝集体または誤って折り畳まれた非Aβタンパク質凝集体と優先的に会合する、段階、および
(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合した任意のプローブを検出する段階。
【請求項２】
前記プローブが、検出可能な標識で標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが、第一の検出可能な標識および第二の検出可能な標識で別々の部位において標識されており、かつ、該プローブが前記Aβタンパク質凝集体と会合した場合に該標識がシグナルを発生する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記第一の標識および前記第二の標識がピレンを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記プローブがペプチドプローブであり、該ペプチドプローブが、10〜50個のアミノ酸残基からなり、かつ、Aβタンパク質のβシート形成領域と少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記プローブがペプチド模倣体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが、SEQ ID NO:56およびSEQ ID NO:62からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記投与する段階が、全身注射、直接注射、前記プローブと眼の結膜もしくは角膜との接触、鼻腔内投与、または吸入投与によって実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが、視神経および網膜からなる群より選択される眼の領域に局在するAβタンパク質凝集体と優先的に会合する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記Aβタンパク質凝集体が、視神経、水晶体、毛様体、硝子体、網膜、および眼血管からなる群より選択される眼の領域において検出される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記検出する段階が、網膜イメージング装置を用いて、眼底カメラを用いて、透視検査装置によって操作される細隙灯を用いて、または、通常の光もしくはレーザー光を用いる直接検査によって実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記アミロイド形成性疾患が、アルツハイマー病および成人黄斑変性からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記成人黄斑変性がウェット変種またはドライ変種である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
アミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体を個体の眼において検出するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(A)ペプチドプローブ、ペプトイドプローブ、またはペプチド模倣体プローブを該個体に投与する段階であって、該プローブが、(i)該Aβタンパク質凝集体と優先的に会合し、かつ、(ii)該Aβタンパク質凝集体と会合した場合に、検出可能なシグナルを発生する、段階、ならびに
(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合している該プローブに起因する任意の検出可能なシグナルを検出する段階であって、検出可能なシグナルの存在が、アルツハイマー病、加齢黄斑変性、糖尿病、スクレイピー、BSE、CJD、慢性消耗病(CWD)、および伝達性海綿状脳症(TSE)の存在を示す、段階。
【請求項１５】
加齢黄斑変性に関連するドルーゼンを個体の眼において検出するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(A)ペプチドプローブ、ペプトイドプローブ、またはペプチド模倣体プローブを該個体に投与する段階であって、該プローブが該ドルーゼンと優先的に会合する、段階、および
(B)眼に存在する任意のドルーゼンと会合した任意のプローブを検出する、段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2011年4月27日に出願され、その全内容がそのまま参照により本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第61/479,677号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
誤って折り畳まれたタンパク質障害の原因は、正常タンパク質から凝集しやすいβシートリッチ立体構造への変換を特徴とする。これらの立体構造はアミロイド形成性疾患に関与している。アルツハイマー病(AD)の場合、ADを引き起こす主要機構に関する主な仮定の一つが、アミロイドβ(Aβ)タンパク質から神経毒性のあるオリゴマーおよび原線維への自己集合である。疾患に関連する他の誤って折り畳まれたタンパク質には、伝達性海綿状脳症(TSE)、脳アミロイドアンギオパチー(CAA)、および脳血管疾患(CVD)におけるプリオン;パーキンソン病のレヴィー小体における-シヌクレイン沈着、前頭側頭認知症およびピック病における神経原線維濃縮体中のタウ;筋萎縮性側索硬化症(amylotrophic lateral sclerosis)におけるスーパーオキシドジスムターゼ;ハンチントン病におけるハンチンチン;ならびに成人黄斑変性(AMD)におけるドルーゼンが挙げられる。例えば、Glenner et al., J. Neurol. Sci. 94:1-28, 1989(非特許文献1); Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4):305-310, 1990(非特許文献2)を参照されたい。
【０００３】
米国特許第7,166,471号(特許文献1)、米国特許第2006/0286672号(特許文献2)、米国特許第2005/0026165号(特許文献3)、米国特許第2008/0171341号(特許文献4)、米国特許第2006/0057671号(特許文献5)、および米国特許第2008/0095706号(特許文献6)は、例えば、誤って折り畳まれたタンパク質、主にβシート二次構造を有する標的タンパク質、および特定の自己凝集状態にある標的タンパク質を検出するのに有用なペプチドについて説明している。本明細書において記述されたペプチドは、これらの特許文書のいずれかにおいて記述された方法において使用することができる。これらの特許文書のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第7,166,471号
【特許文献２】米国特許第2006/0286672号
【特許文献３】米国特許第2005/0026165号
【特許文献４】米国特許第2008/0171341号
【特許文献５】米国特許第2006/0057671号
【特許文献６】米国特許第2008/0095706号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Glenner et al., J. Neurol. Sci. 94:1-28, 1989
【非特許文献２】Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4):305-310, 1990
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、アミロイド形成性疾患に関連するタンパク質凝集体、または他の誤って折り畳まれたタンパク質を、個体の眼において検出するためのインビボ方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(A)ペプチドプローブ、ペプトイドプローブ、またはペプチド模倣体プローブを該個体に投与する段階であって、該プローブが、Aβタンパク質凝集体または誤って折り畳まれた非Aβタンパク質凝集体と優先的に会合する、段階、および(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合した任意のプローブを検出する段階を含む。他の態様において、該方法は、(A)ペプチドプローブ、ペプトイドプローブ、またはペプチド模倣体プローブを個体に投与する段階であって、該プローブが、(i)タンパク質凝集体と優先的に会合し、かつ、(ii)該タンパク質凝集体と会合した場合に、検出可能なシグナルを発生する、段階;および(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合している該プローブに起因する任意の検出可能なシグナルを検出する段階を含む。これらの態様のいずれかによれば、Aβタンパク質凝集体は、視神経、網膜、水晶体、毛様体、硝子体および/または眼血管において検出される。
【０００７】
いくつかの態様において、プローブは、検出可能な標識で標識されている。いくつかの態様において、プローブは、第一の標識および第二の標識で別々の部位において標識されており、該プローブが、Aβタンパク質凝集体と会合した場合にシグナルを発生する。さらなる態様において、第一の標識および第二の標識の部位は、(i)N末端およびC末端;(ii)N末端、およびC末端以外の別の位置;(iii)C末端、およびN末端以外の別の位置;ならびに(iv)N末端以外およびC末端以外の2つの位置より選択される。
【０００８】
いくつかの態様において、第一の標識および第二の標識はエキシマー形成標識である。さらなる態様において、第一の標識および第二の標識はピレンまたはフルオロフォア/クエンチャーペアを含む。別の態様において、第一の標識は蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)ペアの一方のメンバーを含み、第二の標識はFRETペアの他方のメンバーを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、プローブはタンパク質凝集体と会合すると立体構造の変化を起こす。さらに具体的な態様において、立体構造の転換は、(a)Aβタンパク質凝集体と会合すると、第一の標識および第二の標識の物理的近接性を上げる立体構造をとること;(b)Aβタンパク質凝集体と会合すると、第一の標識および第二の標識の物理的近接性を減少させる立体構造をとること;ならびに(c)第一の標識と第二の標識との間の関係を変える立体構造をとることからなる群より選択されてもよい。
【００１０】
いくつかの態様において、プローブはペプチド(またはペプチドミメティックまたはペプトイド)プローブである。さらなる態様において、ペプチドプローブは10〜50個のアミノ酸残基からなる。さらなる態様において、ペプチドプローブは、Aβタンパク質のβシート形成領域と少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ペプチドプローブは、Aβタンパク質のβシート形成領域に対応する10〜50個のアミノ酸残基からなり、プローブのアミノ酸配列は、Aβタンパク質の対応する領域と少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一である。別の態様において、プローブは、ペプチド、ペプチドミメティック、またはペプトイド模倣体である。
【００１１】
いくつかの態様において、プローブは個体に注射される。さらなる態様において、プローブは全身注射される。別の態様において、プローブは、直接、眼の硝子体区画に注射される。別の態様において、点眼薬のようにプローブは眼の結膜または角膜と接触される。別の態様において、プローブは吸入投与を介して鼻腔内に、または呼吸器系に投与される。
【００１２】
いくつかの態様において、検出する段階は、網膜イメージング装置を使用することを含む。さらなる態様において、網膜イメージング装置は細隙灯である。さらなる態様において、細隙灯は透視検査装置によって操作される。いくつかの態様において、眼底カメラが用いられる。別の態様において、検出する段階は、通常の光もしくはレーザー光を用いる直接検査を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、アミロイド形成性疾患はアルツハイマー病である。他の態様において、アミロイド形成性疾患は、様々な型(例えば、「ウェット」変種または「ドライ」変種)の加齢黄斑変性、糖尿病、スクレイピー、BSE、CJD、慢性消耗病(CWD)および伝達性海綿状脳症(TSE)である。
【００１４】
いくつかの態様において、前記方法は、(A)ペプチドプローブ、ペプトイドプローブ、またはペプチド模倣体プローブを個体に投与する段階であって、該プローブがドルーゼンと優先的に会合する、段階、および(B)眼に存在する任意のドルーゼンと会合した任意のプローブを検出する段階を含む、加齢黄斑変性に関連するドルーゼンを該個体の眼において検出する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本明細書において記述された方法において有用な、いくつかのペプチドプローブのアミノ酸配列(SEQ ID NO:1〜13)を示す。
【図２】本明細書において記述された、ペプチドプローブおよび2種類のペプトイド類似体のそれぞれによる緩衝液中での合成Aβオリゴマーの検出を示す。
【図３】選択された患者における染色データを示す表(表3)である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい態様の詳細な説明
1.概説
本発明者らは、2010年1月28日に出願された米国特許出願第12/695,968号のような、アミロイドβ凝集体またはオリゴマーを検出する優先的な能力を有する、ヒトアミロイドβ配列に基づく一連の立体構造的に動的なペプチドを以前に述べた。米国特許出願第12/695,968号の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。アミロイドβ配列は、アミロイド形成性疾患に関連する病理学的影響と関連することが示されており、このカテゴリーに分類される疾患マーカーとして結び付けられている。N末端およびC末端が、例えば、蛍光活性部分で標識されたペプチドプローブは、凝集体と会合することによって、プローブの蛍光発光プロファイル変化のために検出することができるので、アミロイドβ凝集体の存在を報告する。
【００１７】
Aβタンパク質凝集体によって引き起こされる疾患を含むアミロイド形成性疾患を示す誤って折り畳まれたタンパク質は脳内の組織および血管において発見することができる。脳神経組織の代理として眼の網膜は脳とつながっており、血流を共有する。従って、脳に局在する誤って折り畳まれたタンパク質は、眼血管を含む眼において発見されると予想される。実際に、水晶体および角膜においてAβが検出されている。例えば、Goldstein et al., The Lancet, 361:1258-1265 (2003); Isas et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 51(3):1304-1310 (2010); Kam et al., PLoS, 5(10):e13127 (2010); Kipfer-Kauer et al., Current Eye Research, 35(9):828-834 (2010); Leger et al., J Neuropathol Exp Neurol, 70(1):63-68 (2011);およびUmeda et al., FASEB, 19:1683-1685(2005)を参照されたい。
【００１８】
個体の眼において、アミロイド形成性疾患に関連するタンパク質凝集体を検出するためのインビボ方法が本明細書において記述されている。いくつかの態様において、該方法は、(A)ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを個体に投与する段階であって、該プローブがAβタンパク質凝集体と優先的に会合する、段階、および(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合した任意のプローブを検出する段階を含む。他の態様において、該方法は、(A)検出可能な標識を含むペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを対象に投与する段階であって、該プローブが任意のタンパク質凝集体と会合した場合に該検出可能な標識がシグナルを発生する、段階、および(B)該シグナルを検出する段階を含む。該方法は、外来の場において低コストでハイスループットスクリーニングを提供することができ、安全でかついくつかの態様では非侵襲的な診断ツールおよび予後ツールを提供することができる。該方法のさらなる局面およびバリエーションは下記でさらに詳細に説明される。適宜、該方法は、多くのアミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質に関して本明細書において説明されるが、本発明は、任意の特定のアミロイド形成性(誤って折り畳まれた)タンパク質にも任意の特定のアミロイド形成性疾患にも限定されない。
【００１９】
2.定義
本明細書において用いられる場合、「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」という単数形は、単数形だけを指すよう明示的に記述されていない限り、単数形も複数形もともに指す。
【００２０】
「約」という用語、および約という用語によって修飾されるかに関係なく、一般的な範囲の使用は、含まれる数が、本明細書において示される正確な数に限定されないことを意味し、本発明の範囲から逸脱しないが、実質的に引用された範囲内にある範囲を指すことが意図される。本明細書において用いられる場合、「約」は当業者によって理解されるものであり、これが使用される状況に応じてある程度変動する。この用語が使用される状況が当業者に明確に示されずに、この用語が使用される場合、「約」は特定の用語の±10%までを意味する。
【００２１】
本明細書において用いられる場合「対象」は、ヒト、および魚類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギなどのような家畜を含む任意の動物を示す。「対象」はまた、生物学および医学研究において用いられるトランスジェニック動物のような実験研究動物モデルを含む。「対象」はまた、脊椎動物および非脊椎動物を含む、魚類、虫、マウス、および他の小型哺乳動物を含む、研究の場において用いられる動物も含む。典型的な対象は、アミロイド形成性疾患に罹患していると疑われてもよく、アミロイド形成性疾患のリスクを作り出す状態に曝露されたことがあると疑われてもよく、アミロイド形成性疾患の遺伝的リスクを有してもよく(例えば、アミロイド形成性疾患に罹患している家族またはApoE4対立遺伝子変種を有する家族がいる個体)、アミロイド形成性疾患に関するリスクまたは状態を確かめたいと思っていてもよい。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、「立体構造」とは、タンパク質またはペプチドの二次構造または三次構造、例えば、αヘリックス、ランダムコイル、またはβシート二次構造をいう。「立体構造の転換」は、N末端とC末端との間の(または他の任意の2つの点の間の)距離の変化のようなタンパク質の「非一次構造」の立体構造の任意の変化、大なり小なり緻密な折り畳み、主にαヘリックス/ランダムコイルから主にβシートのような主にある二次構造から主に別の二次構造への変化、または主要な二次構造の変化がなくても、αヘリックス/ランダムコイルおよびβシート二次構造の相対量の変化のような異なる二次構造の相対量の任意の変化を意味する。立体構造の転換はペプチドレベルまたは凝集体レベルで検出することができる。本明細書において用いられる場合、「立体構造の転換」は、タンパク質またはペプチド立体構造を研究するための標準的な方法を含む任意の手段によって、ならびにCDのようなより直接的な立体構造の測定が立体構造の変化を明らかにしなくても、下記で議論される標識シグナリングを介するような間接的な手段によって検出することができる転換を含む。
【００２３】
「Aβタンパク質」という用語は、Aβ40およびAβ42を含む全ての形態のAβタンパク質をいうために本明細書において用いられる。「Aβ」タンパク質はまた、凝集体を形成する高い傾向を示すことが知られている天然に存在する変異体を含む、天然に存在する全ての変異体も含む。このような変異体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるMurakami et al., J. Biol. Chem. 46:46179-46187, 2003に開示される変異体のように当技術分野において公知である。Aβは、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)のいくつかの部位のいずれかを切断することによって生成され、この結果、いくつかのAβ型が生じる。アミロイドプラークに見出される2種類の豊富な型がAβ1-40 (Aβ40とも呼ばれる)およびAβ1-42 (Aβ42とも呼ばれる)であり、これらはオルタナティブなAPPカルボキシ末端切断によって生成される。例えば、Selkoe et al., PNAS USA 85:7341-7345, 1988; Selkoe, Trends Neurosci. 16:403-409, 1993を参照されたい。Aβ40およびAβ42は同一のアミノ酸配列を有し、Aβ42のC末端には2個の追加の残基(IleおよびAla)がある。Aβ40の方が豊富にあるが、Aβ42の方が原線維形成性が高く、理論に拘束されるものではないが、アルツハイマー病および脳アミロイドアンギオパチーのアミロイド沈着において顕著であると考えられる。例えば、Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-90 (2002)を参照されたい。前記のとおり、天然に存在するAβタンパク質変異体は全て標的タンパク質になりうる、または本発明の状況における参照配列の基礎として役立ちうる。
【００２４】
「標的タンパク質」は、立体構造変化、誤った折り畳み、または凝集が可能なタンパク質のような、本発明による標的化、検出、または特定に適した任意のタンパク質をいうために本明細書において用いられる。標的タンパク質は、本明細書において記述されるようなAβシート立体構造を特徴とする疾患状態と関連してもよいが、他の立体構造の変化が含まれる。標的タンパク質は天然に存在するタンパク質でもよい。
【００２５】
本明細書において記述される場合、「アミロイド形成性疾患」とは、アミロイドβ、アミロイドP、または他の形態のアミロイドのような任意の形態のアミロイドプラークまたはアミロイド沈着が体内に形成される疾患である。アミロイド形成は糖尿病、AD、スクレイピー、BSE、CJD、慢性消耗病(CWD)、関連する伝達性海綿状脳症(TSE)、成人黄斑変性(AMD)、および本明細書において開示する他の疾患のような、多数の障害に見られる。しかしながら、本発明はアミロイド形成性疾患に限定されることはなく、タンパク質の特定の立体構造または凝集状態に関連する任意の疾患または状態の診断および処置において有用である。
【００２６】
「プリオン」とは、プリオンに基づく疾患に関連するタンパク質をいう。「PrPタンパク質」、「PrP」などは本明細書で互換的に用いられて、ヒトおよび動物において疾患(海綿状脳症のような)を引き起こすことが公知の感染性粒子形態(「PRPSc」)も、該当する条件の下で、感染性PRPSc形態に変換される非感染性形態(「PRPC」)もともに意味する。プリオン粒子は、PrP遺伝子によってコードされるPRPSc分子で、排他的にではないにせよ、大部分が構成される。本明細書において用いられる場合、「プリオン」は、これらの疾患の全てもしくはいずれか、または使用される任意の動物、特に、ヒトおよび家畜において他の疾患を引き起こす全形態のプリオンを含む。
【００２７】
「プローブ」とは、標的タンパク質に結合するペプチドまたはペプチド模倣体をいう。一つの態様において、標的タンパク質がアミロイド形成性疾患に関連する特定の立体構造を有するか、または特定の自己凝集状態にある場合に、プローブは標的タンパク質に会合または結合する。いくつかの態様において、プローブは標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こす。他の態様において、プローブは、2010年1月28日に出願された米国特許出願第12/695,968号に記述されるような、ヒトアミロイド配列に基づく立体構造的に動的なペプチドである。米国特許出願第12/695,968号の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。便宜上、ペプチドおよびペプチド模倣体は、他の文脈においてその有用性を損なうことなく、本明細書において「プローブ」と呼ばれる。これらのプローブは下記においてさらに詳細に議論される。
【００２８】
「天然の」または「天然に存在する」タンパク質とは、自然界に存在する供給源から回収されたタンパク質をいう。天然のタンパク質は、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化、ファルネシル化、および切断を含む翻訳後修飾を含んでもよい。「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は互換的に用いられる。
【００２９】
「ペプチド模倣体」は、ペプチドミミック(peptidomimic)またはペプチドミメティックまたはペプトイドとも呼ばれ、ペプチド構造およびある特定の物理化学的特性のようなペプチドの特性を模倣する任意の分子をいう。ペプチド模倣体は、特定のペプチドの折り畳みおよび/もしくは二次構造を模倣するポリマー分子、ならびにペプチドの生物学的特性もしくは化学的特性を模倣するポリマー分子を含む。ペプチド模倣体はアミノ酸バックボーンを有してもよく、非天然の化学置換またはアミノ酸置換を含有しうる。ペプトイドは、ペプチドのようにα炭素の代わりにバックボーンアミド窒素上に側鎖(R基)を有しうる。これは、以下のいくつかの目的の一つまたは複数にかなうかもしれない。(1)ペプトイドがタンパク質分解に対して耐性になる場合がある;(2)ペプトイド二次構造形成が水素結合に依存しない場合があるので、ペプチドと比較して高い熱安定性を示す場合がある。(3)多数の利用可能なペプトイド残基があるため、アッセイ法開発を助けうる多種多様な三次元構造の生成が可能になる。または、ペプチド模倣体は、β-ペプチド、アントラニルアミドオリゴマー、オリゴ(m-フェニレンエチニレン)、オリゴウレア、オリゴピロリノン、アザチド、およびN置換グリシンオリゴマーのような異なる化学バックボーンを有しうる。ペプチド模倣体は、ペプチド折り畳みおよびペプチド間相互作用(例えば、水素結合などを介した相互作用を含む)のようなペプチド特徴を保持しながら、プロテアーゼ耐性のような異なる化学的特性を有しうる。本発明において任意の適切なペプチド模倣体を使用することができ、Chongsiriwatana, N. P, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105, (8), 2794-9; Kirshenbaum, K., et al., Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, (4), 530-535; Lee, B. C, et al., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, (31), 10999-11009に記述されるとおりに設計および/または構築されたものを含む。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３０】
二つのポリペプチド間の「類似性」は、一つのポリペプチドのアミノ酸配列を別のポリペプチドの配列と比較することによって判定される。一つのポリペプチドのアミノ酸は別のポリペプチドの対応アミノ酸に対し、同一であるまたは保存的アミノ酸置換であるなら類似している。保存的置換はDayhoff, M.O.(編), The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978)に、およびArgos, P. (1989) EMBO J. 8:779-785に記述されているものを含む。例えば、以下の群の一つに属するアミノ酸は保存的変化または置換を示す:
-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr;
-Cys、Ser、Tyr、Thr;
-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;
-Lys、Arg、His;
-Phe、Tyr、Trp、His;および
-Asp、Glu。
【００３１】
「相同性」、「〜の相同体」、「相同の」、「同一性」または「類似性」とは二つのポリペプチド間の配列類似性をいい、同一性がいっそう厳密な比較である。相同性および同一性はそれぞれ、比較の目的で整列されうる各配列中の位置を比較することにより判定することができる。比較される配列中の位置が同じアミノ酸によって占有されている場合には、その位置で分子は同一である。アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置の同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置の、アミノ酸の、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数の関数である。「関連のない」または「非相同の」配列は、本明細書において記述する配列の一つと10%またはそれ未満の同一性を共有する。関連する配列は、少なくとも約15%の配列同一性、少なくとも約20%の配列同一性、少なくとも約30%の配列同一性、少なくとも約40%の配列同一性、少なくとも約50%の配列同一性、少なくとも約60%の配列同一性、少なくとも約70%の配列同一性、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約90%の配列同一性、少なくとも約95%の配列同一性または少なくとも約99%の配列同一性などの、10%を超える配列同一性を共有する。
【００３２】
「同一性の割合」という用語は、二つのペプチド間のアミノ酸配列同一性をいう。比較の目的で整列される各配列中の位置を比較することにより、同一性を判定することができる。一方の比較配列中の等価の位置がもう一方においてこの同じ位置で同じアミノ酸によって占有されている場合には、その位置で分子は同一であり;等価の部位が同じまたは類似のアミノ酸残基(例えば、立体的および/または電気的性質が類似)によって占有されている場合には、その位置で分子は相同(類似)ということができる。相同性、類似性または同一性の割合と表現することは、比較される配列によって共有される位置での同一または類似のアミノ酸の数の関数をいう。FASTA、BLASTまたはENTREZを含む、さまざまなアライメント・アルゴリズムおよび/またはプログラムを使用することができる。FASTAおよびBLASTは、GCG配列解析パッケージ(ウィスコンシン大学、Madison, Wis.)の一部として利用可能であり、例えば、デフォルト設定で使用することができる。ENTREZは、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, NIH, Bethesda, Mdを通じて利用可能である。一つの態様において、二つの配列の同一性の割合は、1のギャップ重み付けを用いてGCGプログラムにより判定することができ、例えば、各アミノ酸のギャップは、それが二つの配列間の単一のアミノ酸のミスマッチであるかのように重み付けされる。配列同一性を判定するための他の技術は周知であり、当技術分野において記述されている。
【００３３】
3.標的疾患
特定の立体構造状態または自己凝集状態をとった場合にヒトまたは動物の疾患に関連するタンパク質が当技術分野において公知である。このような疾患の例には、アルツハイマー病(AD)、加齢黄斑変性、脳アミロイドアンギオパチー(CAA)、および脳血管疾患(CVD)を含むアミロイド形成性疾患が挙げられる。本明細書において用いられる場合、「アミロイド形成性疾患」は、アミロイドプラークまたはアミロイド沈着が体内で形成される疾患である。アミロイド形成は、糖尿病、AD、スクレイピー、ウシ海綿状脳症(BSE)、クロイツフェルト‐ヤコブ病(CJD)、慢性消耗病(CWD)、関連する伝達性海綿状脳症(TSE)、および成人黄斑変性(AMD)のような多数の障害において見出される。
【００３４】
様々な疾患が、特定の構造形態のタンパク質(例えば、「誤って折り畳まれたタンパク質」または自己凝集タンパク質)に関連するが、異なる構造形態にあるタンパク質(例えば、「正常タンパク質」)は有害でない。従って、これらの状態の場合、βシート立体構造が疾患を検出するための標的構造状態になりうるのに対し、αヘリックスおよび/またはランダムコイル立体構造が、疾患の非存在を確かめるための、または疾患の進行状態の非存在を特定するための標的構造状態になりうる。多くの場合に、正常なタンパク質は可溶性であるのに対し、誤って折り畳まれたタンパク質は溶解度の低い凝集体または不溶性凝集体を形成する。以下は、特定の構造タンパク質状態に関連する疾患の非限定的な一覧であり、その後には関連タンパク質が括弧内に続く:アルツハイマー病(APP、Aβペプチド、α1-アンチキモトリプシン、タウ、非Aβ成分、プレセニリン1、プレセニリン2、アポE);プリオン病、CJD、スクレイピーおよびBSE(PrPSc);ALS(SODおよび神経フィラメント);ピック病(ピック小体);パーキンソン病(レヴィー小体におけるα-シヌクレイン);前頭側頭認知症(原線維中のタウ);II型糖尿病(アミリン);多発性骨髄腫-形質細胞疾患(IgGL鎖);家族性アミロイド神経障害(トランスサイレチン);甲状腺髄様がん(プロカルシトニン);慢性腎不全(β2-ミクログロブリン);うっ血性心不全(心房性ナトリウム利尿因子);老人性心および全身性アミロイドーシス(トランスサイレチン);慢性炎症(血清アミロイドA);アテローム性動脈硬化症(アポA1);家族性アミロイドーシス(ゲルゾリン);ならびにハンチントン病(ハンチンチン)ならびに成人黄斑変性(ドルーゼンおよびアミロイドP)。また、伝達性海綿状脳症(TSE);脳アミロイドアンギオパチー(CAA)、および脳血管疾患(CVD) におけるプリオン;ならびに筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼも挙げられる。例えば、Glenner et al., J. Neurol. Sci. 94:1-28, 1989; Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4):305-310, 1990を参照されたい。
【００３５】
多くの場合、これらの不溶性タンパク質は、β-プリーツシート立体構造に共通の特徴を有する非分枝性の原線維で構成される凝集体を形成する。CNSにおいて、アミロイドは脳髄膜血管(脳血管沈着物)に、および脳実質(プラーク)に存在しうる。ヒトおよび動物モデルにおける神経病理学的研究によって、アミロイド沈着物の近位にある細胞はその正常な機能が妨げられることが示されている。例えば、Mandybur, Acta Neuropathol. 78:329-331, 1989; Kawai et al., Brain Res. 623:142-146, 1993; Martin et al., Am. J. Pathol. 145:1348-1381, 1994; Kalaria et al., Neuroreport 6:477-80, 1995; Masliah et al., J. Neurosci. 16:5795-5811, 1996を参照されたい。他の研究によってさらに、アミロイド原線維が神経変性を実際に惹起しうることが示されている。例えば、Lendon et al., J. Am. Med. Assoc. 277:825-831, 1997; Yankner, Nat. Med. 2:850-852, 1996; Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295-18298, 1996; Hardy, Trends Neurosci. 20:154-159,1997を参照されたい。
【００３６】
タンパク質の誤った折り畳みを引き起こす基礎となる分子機構はまだ完全に理解されていないが、前述の全ての神経障害に共通の特徴は、一体となってβシート構造または他の立体構造を形成する凝集体および/または原線維を形成しやすい傾向である。プラーク沈着に関連する原線維形成およびその後の二次βシート構造形成は、核形成段階が関与する複雑な機構を介して発生する。核形成段階ではタンパク質モノマーが会合して原線維を形成し、その後、原線維が両端に伸長する。例えば、タンパク質はモノマーから自己集合して、可溶性オリゴマー(可溶性凝集体)、不溶性オリゴマー(例えば、不溶性非晶質自己凝集体)、プロトフィブリル、および原線維になった後に、プラークのような不溶性の大きな凝集沈着物を形成しうる。従って、原線維形成を破壊することができるペプチドプローブ、タンパク質プローブ、または抗体プローブは、速度を弱めるか、または疾患進行を完全に阻止すると予想され、従って、治療上有用であると予想される。さらに、特定の状態の疾患タンパク質(例えば、不溶性の凝集体または原線維)と会合することができる作用物質は、特定の形態の誤って折り畳まれたタンパク質を検出および定量するための、または疾患の存在、進行、重篤度、および予後、または凝集体および原線維の形成の破壊を目的とした薬物もしくは化合物の効力への洞察を得るための有用な診断ツールである。従って、特定の誘導凝集状態または自己凝集状態にある特定のタンパク質と会合することができる高度に選択的なペプチド作用物質は、検出剤として、創薬において、診断において、および予後ツールとして、ならびに最終的な治療用途のために有用である。
【００３７】
個体の眼(網膜および/または視神経および/または眼血管および/または他の構造を含む)において、疾患に関連する誤って折り畳まれた標的タンパク質を検出するためのインビボ方法が本明細書において説明される。このような誤って折り畳まれたタンパク質はβシート二次構造または立体構造の増加を示してもよく、例えば、このような疾患の顕著な特徴でありうるプラークのような不溶性の凝集体、原線維、または沈着物を形成してもよい。便宜上、下記の議論は、「アミロイド形成性疾患に関連するタンパク質凝集体」の検出について言及しているが、これに限定されず、タンパク質の誤った折り畳み、凝集、および立体構造変化に関連する他の疾患の検出を含む。
【００３８】
(i)アミロイド形成性疾患
アミロイドβタンパク質(Aβ)は、アルツハイマー病(AD)、脳アミロイドアンギオパチー(CAA)、および脳血管疾患(CVD)のようなアミロイド形成性疾患における主な原因物質である。
【００３９】
Aβタンパク質は、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)のいくつかの部位のいずれかを切断することによって生成され、この結果、いくつかのAβ型が生じる。アミロイドプラークに見出される2種類の豊富な型がAβ1-40 (Aβ40とも呼ばれる)およびAβ1-42 (Aβ42とも呼ばれる)であり、これらは、オルタナティブなAPPカルボキシ末端切断によって生成される。例えば、Selkoe et al., PNAS USA 85:7341-7345, 1988; Selkoe, Trends Neurosci. 16:403-409, 1993を参照されたい。Aβ40およびAβ42は同一のアミノ酸配列を有し、Aβ42のC末端には2個の追加の残基(IleおよびAla)がある。Aβ40の方が豊富にあるが、Aβ42の方が原線維形成性が高く、ADおよびCAAのアミロイド沈着における2種類のうちの主な成分である。例えば、Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-90 (2002)を参照されたい。前記のとおり、天然に存在するAβタンパク質変異体は全て標的タンパク質になりうる、または本発明の状況における参照配列の基礎として役立ちうる。
【００４０】
可溶性Aβは健常個体の血漿中および脳脊髄液中に見出され、疾患は、疾患のある個体において見出されるプラークまたは凝集体を形成する不溶性原線維と相関すると考えられる。Aβ42およびAβ40の血漿レベルはモノクローナル抗体を用いて求めることができる。前記のAD症例におけるアミロイド沈着に加えて、AD症例は血管壁内のアミロイド沈着に関連することがある。例えば、Vinters H. V., Stroke Mar-Apr; 18(2):311-324, 1987; Itoh Y., et al., Neurosci. Lett. 155(2):144-147, Jun. 11, 1993を参照されたい。
【００４１】
アルツハイマー病では、アミロイド原線維およびプラークの前駆体として形成しうるアミロイドタンパク質凝集体(例えば、Aβタンパク質凝集体)が、眼に関連する組織(網膜、視神経、および眼血管を含む)のような脳とつながっている組織中に見出されることが発見されている。理論に拘束されるものではないが、これらの中心から離れた組織において検出されるAβタンパク質凝集体は、Aβタンパク質凝集体が発生した脳(または他の神経外細胞/組織)からのアミロイド移動(transposition)の結果である。この移動プロファイルは、脳から眼の視神経、網膜へと漸減する勾配のような、脳から、中心から離れた組織へとAβタンパク質凝集体の漸減する勾配をもたらしうる。いくつかの態様において、Aβタンパク質凝集体は、中心から離れた組織から脳へと移動することができる。従って、(網膜および/または視神経を含む)眼のAβタンパク質凝集体を検出する能力は、疾患の他の症状を示さない患者でもアルツハイマー病の早期診断を可能にすることができる。さらに、もしくはまたは、(視神経および/または網膜を含む)眼において検出されるAβタンパク質凝集体のレベルを用いて、脳に存在する可能性の高いAβタンパク質凝集体のレベルを評価することができる。
【００４２】
(ii)プリオン病および伝達性海綿状脳症
プリオンは、ヒトおよび動物において中枢神経系の海綿状脳症を引き起こす感染性病原体である。潜在的なプリオン前駆体はPrP27-30といわれるタンパク質であり、これは、感染脳内でプラークとして見出される棒状フィラメントに重合する(凝集する)28キロダルトンの疎水性糖タンパク質である。正常なプリオンタンパク質(PrPC)は、主にαヘリックスおよびコイルド-ループ構造を有する細胞表面メタログリコタンパク質である。異常型(PrPSc)は、プロテアーゼ耐性があり、かつ主にβシートを含む二次構造を有する配座異性体である。この二次構造の立体構造変化は、プリオン病プロセスにおける凝集および最終的な神経毒性プラーク沈着につながると考えられている。
【００４３】
プリオン関連疾患は伝達性海綿状脳症または「TSE」とも知られ、ヒツジおよびヤギのスクレイピー、シカおよびエルクの慢性消耗病、ならびにウシのウシ海綿状脳症(BSE)を含む。例えば、Wilesmith and Wells、 Microbiol. Immunol. 172:21-38, 1991を参照されたい。4つのヒトプリオン病、つまり(1)クールー、(2)クロイツフェルトヤコブ病(CJD)、(3)ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病(GSS)、および(4)致死性家族性不眠症(FFI)が特定されている。例えば、Gajdusek, D.C., Science 197:943-969, 1977; Medori et al., N. Engl. J. Med. 326:444-449, 1992を参照されたい。TSEは致死性の神経変性疾患である。これらの疾患は、宿主によりコードされるプロテアーゼ感受性の正常プリオンタンパク質(PrP-sen)のプロテイナーゼK抵抗性の異常アイソフォーム(PrP-res)の脳内での形成および蓄積によって特徴付けられる。PrP-resは、PrP-senをβシート含有量のより多いPrP-res分子凝集体に変換する立体構造変化を伴う翻訳後過程によりPrP-senから形成される。PrP-resのこれらの高分子凝集体の形成は、PrP-resのアミロイド沈着が脳内に形成され、最終的には「海綿状」となる(孔で満たされる)、TSEによって媒介される脳病態と密接に関連している。
【００４４】
細胞タンパク質PrP-senは、ヒトでは、第20番染色体上に位置する遺伝子によってコードされるシアロ糖タンパク質である。PrP遺伝子は神経組織においても非神経組織においてもともに発現されており、そのmRNAの最大濃度はニューロンで認められる。Prp遺伝子の配列は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,565,186号に開示される。
【００４５】
4.プローブ
前記のとおり、本明細書において記述されたペプチドおよびペプチド模倣体は、例えば、アミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体を含む、特定の立体構造または自己凝集状態を有するAβタンパク質およびAβタンパク質凝集体のような標的タンパク質を検出するのに有用である。なぜなら、本明細書において記述されたペプチドおよびペプチド模倣体は、このような標的タンパク質と優先的に会合するからである。いくつかの態様において、プローブは標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こす。いくつかの態様において、プローブは、標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こさない場合がある。いくつかの態様において、プローブは、米国特許出願第12/695,968号に記述されるとおり、ヒトアミロイドβ配列に基づく立体構造的に動的なペプチドである。プローブはまた、US2008/0095706に記述されるとおり、アルツハイマー病を治療するための薬物候補をスクリーニングする方法において有用でありうる。US2008/0095706の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４６】
いくつかの態様において、ペプチドプローブは10〜50個のアミノ酸残基からなる。いくつかの態様において、プローブは、αヘリックス/ランダムコイル立体構造からβシート立体構造への転換のような立体構造の転換を起こす標的タンパク質のアミノ酸配列を含む。例えば、Aβタンパク質のアミノ酸16〜35はβシート形成領域を含むことが知られている。従って、プローブは、Aβタンパク質のアミノ酸16〜35もしくは17〜35、またはその変種であるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、プローブは、βシート立体構造をとる、および/または凝集体を形成する高い傾向を示すことが知られている変異体のような、標的タンパク質の天然に存在する変異体のβシート形成領域のアミノ酸配列を含む。Aβ変異体の例は、その一部がMurakami,前記において記述されており、置換H6R、D7N、A21G、E22G、E22P、E22Q、E22K(「イタリア(Italian)」)、およびD23Nを含む。他のAβ変異体には、例えば、スウェーデン(Swedish)(K-2N M-1L)、フランス(French)(V44M)、ドイツ(German)(V44A)、およびロンドン(London)(V46IまたはV46G)変異体のような、1〜42アミノ酸配列の外側にある天然変異体が挙げられる。従って、ペプチドプローブのアミノ酸配列は、既存の配列および立体構造情報に基づいて標的タンパク質配列から設計することができる、または実験により容易に決定することができる。
【００４７】
いくつかの態様において、ペプチドプローブは、Aβプラークと比較してAβタンパク質凝集体(例えば、可溶性オリゴマーもしくは可溶性凝集体、不溶性オリゴマーもしくは不溶性非晶質自己凝集体、またはプロトフィブリル)と優先的に会合する標的タンパク質のアミノ酸配列を(様々な程度で)含む。他の態様において、ペプチドプローブは、このような原線維および/またはプラークのようなAβタンパク質の高次構造と優先的に会合する標的タンパク質のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
いくつかの態様において、ペプチドプローブは、(i)標的タンパク質のβシート形成領域のアミノ酸配列からなる参照配列の変種であるアミノ酸配列を含む10〜50個のアミノ酸残基からなり、(ii)ランダムコイル/αヘリックス立体構造もβシート立体構造もともにとることができ、もしかすると、(iii)βシート立体構造を示す標的タンパク質と結合した場合にβシート立体構造をとるか、または標的タンパク質と結合した場合に検出可能なシグナルを発生する立体構造の変化を起こす。変種配列は、参照配列と比べて、(A)変種配列のランダムコイル/αヘリックス立体構造が酸化環境において参照アミノ酸配列からなるプローブより安定性が高くなるような、ならびに/または(B)ランダムコイル/αヘリックス立体構造にある変種配列のN末端とC末端との距離がβシート立体構造にある変種配列のN末端とC末端との距離と異なるような、ならびに/または(C)変種配列が、βシート立体構造を示す標的タンパク質と結合した場合に参照配列より効率的にβシート立体構造をとるような、ならびに/または(D)変種配列が、βシート立体構造を示す標的タンパク質と結合した場合に低次立体構造をとるような、ならびに/または(E)変種配列のβシート構造が参照配列のβシート構造より熱力学的に弱くなるような、ならびに/または(F)変種配列が参照配列より高安定性および/もしくは低反応性になるような、ならびに/または(G)変種配列が水溶液中で参照配列より高い親水性および/もしくは溶解度になるような、ならびに/または(H)変種配列が参照配列よりもさらなるAβ結合モチーフを有するような、ならびに/または(I)変種配列が凝集体を形成する高い能力を有するような、一つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失を含んでもよい。いくつかの態様において、変種配列はC末端にリジン残基の付加をさらに含む。
【００４９】
いくつかの態様において、ペプチドプローブが、前記参照配列と少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有する可能性があることは、参照配列のアミノ酸配列と比較した付加、欠失、および/または置換によって決まる。いくつかの態様において、ペプチドプローブは、参照配列と比較して一方の末端または両方の末端に一つまたは複数の追加のアミノ酸のあるアミノ酸配列を有してもよい。付加、置換、および欠失は参照配列の内部位置に加えられてもよく、内部および末端に加えられてもよい。
【００５０】
本明細書において記述されたプローブはいずれも、C末端およびN末端の一方または両方において、約1〜約5アミノ酸のサイズの小さな疎水性ペプチドを用いてエンドキャップが取り付けられてもよい。他の態様において、例えば、標識を容易にするために、C末端およびN末端の一方または両方にはリジン残基がある。さらに、もしくはまたは、C末端およびN末端の一方または両方にはシステイン残基がある。さらに、もしくはまたは、本明細書において記述されたプローブはいずれも、メチオニン残基を、アラニン残基のような酸化に対して耐性のある残基で置換することによって改変されてもよい。さらに、もしくはまたは、本明細書において記述されたプローブはいずれも、参照配列の連続した残基の少なくとも3つをアラニン残基で置換することによって改変されてもよい。
【００５１】
本明細書において記述されたプローブはいずれも、N末端において、および/またはC末端付近のリジン側鎖から伸びる末端において、および/または標識に適した他の任意の部位においてジピレンブチレート(dipyrene butyrate)(PBA)部分を含んでもよい。さらに、もしくはまたは、本明細書において記述されたプローブはいずれも、C末端において、天然に存在するカルボキシル基の代わりにアミド基を含めるように改変されてもよい。
【００５２】
特定の態様において、プローブは、2つの点変異(例えば、SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:62);2つのd-アルギニン残基(r)の付加(例えば、SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:62);本明細書において記述された変異の組み合わせ(例えば、SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:62);天然に存在する「イタリア」変異体(SEQ ID NO:64);またはリンカーおよびビオチンの付加(例えば、SEQ ID NO:41)からなってもよい。
【００５３】
いくつかの態様において、一つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失は、グルタミン酸残基とヒスチジン残基、グルタミン酸残基とアルギニン残基、および/またはグルタミン酸残基とリジン残基との間のように2つの残基間に塩橋を導入してもよい。さらに、アミノ酸の付加、置換、または欠失は、GXXEGモチーフ(SEQ ID NO:25)のようなAβ結合モチーフをペプチドプローブに導入してもよい。
【００５４】
前記で開示されたとおり、変種配列は、任意で、βシート立体構造を示す標的タンパク質に結合した場合に高次立体構造または低次立体構造をとることができる。いくつかの態様において、例えば、標的タンパク質はAβタンパク質であり、変種配列は、G29H、G29R、G29K、およびG33Eからなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む。さらに、もしくはまたは、変種配列のβシート構造は参照配列のβシート構造より熱力学的に弱くてもよい。特定の態様において、変種配列は、I32S、F19S、S26D、H29D、I31D、L34D、およびL34Pからなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む。
【００５５】
前述の態様のいずれかによれば、ペプチドプローブは、例えば、ペプチドリンカーを介して、ビオチン部分と結合体化されてもよい。特定の態様において、ペプチドリンカーは、可動性リンカー、ヘリックスリンカー、トロンビン部位リンカー、および屈曲(kinked)リンカーからなる群より選択される。他の態様において、ペプチドプローブは、内部リジン残基の側鎖を介してビオチン部分と結合体化される。他の適切なペプチドリンカーが当技術分野において記述されている(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、U.S.6,448,087; Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-1290 (2002);およびKim et al., J. Biol. Chem. 280:35059-35076 (2005)を参照されたい)。いくつかの態様において、適切なリンカーは長さが約8〜12アミノ酸でもよい。さらなる態様において、リンカーのアミノ酸残基の約75%超がセリン残基、グリシン残基、およびアラニン残基より選択される。
【００５６】
例えば、ビオチン化は、AD310(SEQ ID NO:38)によって例示されるとおり、C末端にあるEAAAK(SEQ ID NO:57)のようなヘリックスリンカーを介して達成することができる。一般的に、ヘリックスリンカーには、アラニン残基のようなαヘリックスを形成する残基が挙げられる。または、ビオチン化は、AD313(SEQ ID NO:39)によって例示されるとおり、内部リジン残基または末端リジン残基を含むリジン残基上の側鎖を介して達成することができる。または、ビオチン化は、AD314(SEQ ID NO:40)によって例示されるとおり、C末端にある可動性リンカー(例えば、GSSGSSK(SEQ ID NO:58))を介して達成することができる。一般的に、可動性リンカーは、一つまたは複数のグリシン残基および/もしくはセリン残基、またはφ角およびψ角を中心に自由に回転することができる他の残基を含む。または、ビオチン化は、AD317(SEQ ID NO:41)によって例示されるとおり、C末端にあるトロンビン部位リンカー(例えば、GLVPRGSGK(SEQ ID NO:60)のようなLVPRGS(SEQ ID NO:59)を含むリンカー)を介して達成することができる。または、ビオチン化は、AD321(SEQ ID NO:42)によって例示されるとおり、C末端にある屈曲リンカー(例えば、PSGSPK(SEQ ID NO:61))を介して達成することができる。一般的に、屈曲リンカーは、一つもしくは複数のプロリン残基、またはペプチドプローブのタンパク質結合モチーフからビオチン部分を固定して突き出す、決まったφ角およびψ角を有する他の残基を含む。
【００５７】
さらにまたは代替的に、変種配列は水溶液中で参照配列より高い親水性および/または溶解度を有してもよい。特定の態様において、変種配列は、グルタミン酸残基および/またはd-アルギニン残基を導入する一つまたは複数のアミノ酸付加または置換を含む。さらに、もしくはまたは、変種配列は、可溶性ポリエチレングリコール部分のような親水性部分と結合体化されてもよい。
【００５８】
いくつかの態様において、変種配列は、グルタミン酸残基による少なくとも一つの残基の置換を含む。いくつかの態様において、変種配列は、ヒスチジン残基による少なくとも一つの残基の置換を含む。いくつかの態様において、変種配列は、セリン残基によるイソロイシン残基の置換;プロリン残基、グリシン残基、グルタミン残基、またはリジン残基によるグルタミン酸残基の置換;セリン残基によるフェニルアラニン残基の置換;プロリン残基によるロイシン残基の置換;グリシン残基によるアラニン残基の置換;およびアスパラギン残基によるアスパラギン酸残基の置換からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む。
【００５９】
プローブは、標的タンパク質の最小数の隣接アミノ酸、例えば、標的タンパク質配列の少なくとも約5個の、少なくとも約6個の、少なくとも約7個の、少なくとも約8個の、少なくとも約9個の、少なくとも約10個の、少なくとも約11個の、少なくとも約12個の、少なくとも約13個の、少なくとも約14個の、少なくとも約15個の、少なくとも約16個の、少なくとも約17個の、少なくとも約18個の、少なくとも約19個の、少なくとも約20個の、少なくとも約21個の、少なくとも約22個の、少なくとも約23個の、少なくとも約24個の、少なくとも約25個の、少なくとも約30個の、少なくとも約35個の、少なくとも約40個の、少なくとも約41個の、少なくとも約42個の、少なくとも約43個の、少なくとも約44個の、少なくとも約45個の、少なくとも約46個の、もしくは少なくとも約50個の隣接アミノ酸、またはこれらの数の間の任意の範囲の、例えば、標的タンパク質配列の約10〜約25個の隣接アミノ酸を含むことができる。いくつかの態様において、プローブは標的タンパク質の天然に存在する完全長配列を含まない。
【００６０】
プローブは、標的タンパク質の最大数の隣接アミノ酸、例えば、標的タンパク質配列の約5個までの、約6個までの、約7個までの、約8個までの、約9個までの、約10個までの、約11個までの、約12個までの、約13個までの、約14個までの、約15個までの、約16個までの、約17個までの、約18個までの、約19個までの、約20個までの、約21個までの、約22個までの、約23個までの、約24個までの、約25個までの、約30個までの、もしくは約35個までの隣接アミノ酸、またはこれらの数の間の任意の範囲の、例えば、標的タンパク質配列の約10〜約25個の隣接アミノ酸を含むことができる。
【００６１】
参照配列は、標的タンパク質の最小数の隣接アミノ酸、例えば、標的タンパク質配列の少なくとも約5個の、少なくとも約6個の、少なくとも約7個の、少なくとも約8個の、少なくとも約9個の、少なくとも約10個の、少なくとも約11個の、少なくとも約12個の、少なくとも約13個の、少なくとも約14個の、少なくとも約15個の、少なくとも約16個の、少なくとも約17個の、少なくとも約18個の、少なくとも約19個の、少なくとも約20個の、少なくとも約21個の、少なくとも約22個の、少なくとも約23個の、少なくとも約24個の、少なくとも約25個の、少なくとも約30個の、少なくとも約35個の、少なくとも約40個の、少なくとも約41個の、少なくとも約42個の、少なくとも約43個の、少なくとも約44個の、少なくとも約45個の、少なくとも約46個の、もしくは少なくとも約50個の隣接アミノ酸、またはこれらの数の間の任意の範囲の、例えば、標的タンパク質配列の約10〜約25個の隣接アミノ酸を含むことができる。
【００６２】
参照配列は、標的タンパク質の最大数の隣接アミノ酸、例えば、標的タンパク質配列の約5個までの、約6個までの、約7個までの、約8個までの、約9個までの、約10個までの、約11個までの、約12個までの、約13個までの、約14個までの、約15個までの、約16個までの、約17個までの、約18個までの、約19個までの、約20個までの、約21個までの、約22個までの、約23個までの、約24個までの、約25個までの、約30個までの、もしくは約35個までの隣接アミノ酸、またはこれらの数の間の任意の範囲の、例えば、標的タンパク質配列の約10〜約25個の隣接アミノ酸を含むことができる。
【００６３】
プローブそれ自体は長さが少なくとも約5アミノ酸を含んでもよく、約50アミノ酸またはそれ以上に至るまで、または長さが約10アミノ酸〜約50アミノ酸のような、その間の任意のサイズを含んでもよい。いくつかの態様において、プローブは、約5アミノ酸〜約50アミノ酸、約10アミノ酸〜約50アミノ酸、約10アミノ酸〜約25アミノ酸、約15アミノ酸〜約25アミノ酸、または約20アミノ酸〜約25アミノ酸からなる。さらなる態様において、プローブは、約20アミノ酸、約21アミノ酸、約22アミノ酸、約23アミノ酸、約24アミノ酸、または約25アミノ酸を含む、約17アミノ酸〜約34アミノ酸を含む。異なる長さのプローブが、標的タンパク質と異なる程度の相互作用および結合を示すことがあり、本明細書における教示に導かれて当業者は適切な長さを選択することができる。
【００６４】
いくつかの態様において、プローブは、SEQ ID NO:1〜56、またはSEQ ID NO:1〜56もしくは62より選択される。いくつかの特定の態様において、プローブは、SEQ ID NO:2、22、23、41、56、および62からなる群より選択される。いくつかの態様において、プローブはPEP-10、PEP-11、およびPEP-12である。Aβタンパク質を標的化するためのUS2008/0095706において記述されたプローブおよび米国特許出願第12/695,968号に従って設計されたプローブは本明細書に記述されるとおりに使用することができる。これらの出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
前記の原理に従って設計された例示的なペプチドプローブを以下の表1に示す。表中のシェーディングによって示されたとおり、ペプチド配列の大部分は、Aβペプチドのβシート形成領域である、Aβペプチドのアミノ酸16〜35(WT; SEQ ID NO:1)に基づく(その他はAβペプチドのさらに大きな部分に基づく)。標識を容易にするためにC末端リジン残基が付加されている。配列変種のカテゴリー(または複数のカテゴリー)を表中に示した(例えば、安定性を改善する、塩橋を設ける、溶解度を増加させる、αヘリックス形成を容易にする、βシート構造を不安定化する、Aβ結合モチーフを付加するなどのために改変されている)。異なる標識部位および標識ペアを含むペプチドプローブ標識のための選択肢も図示した。特別の定めのない限り、全てのペプチドは2つのピレン標識で標識され、一方の標識はN末端アミン上にあり、他方の標識はC末端リジン残基の側鎖上にある。さらに、特別の定めのない限り、全ての構築物はカルボキシル基の代わりにC末端アミドを含有する。
【００６６】
表中に以下の略語が用いられる。
「PBA」=ピレン酪酸
「r」=d-アルギニン
「ダブシル(Dabcyl)」=4-(4-ジメチルアミノフェニル)ジアゼニル安息香酸
「EDANS」=5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸
「FAM」=5(6)カルボキシフルオレセイン
「ダンシル(Dansyl)」=5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホニル
「FITC」=フルオレセインイソチオシアネート
「Ahx」=アミノヘキシル
【００６７】
（表１）ペプチドプローブ
2014514576.tif 000003
2014514576.tif 000004
2014514576.tif 000005
2014514576.tif 000006
2014514576.tif 000007
2014514576.tif 000008
【００６８】
または、プローブは、本明細書において記述されたペプチドプローブのいずれかのペプチド模倣体(「ペプトイド」)でもよい。いくつかの態様において、プローブは、天然のペプチドバックボーンを有するが、非天然のアミノ酸または化学部分を有するペプチド模倣体である。他の態様において、プローブは、非ペプチドバックボーンを有するペプチド模倣体であり、ポリマーバックボーンのような化学バックボーンを含む。いくつかの態様において、ペプチド模倣体は、対応するペプチドより高い安定性を示す。
【００６９】
本方法における使用のために、さらなるプローブを設計および試験することができる。簡単に述べると、疎水性トポロジー(hydrophobic topology)ならびに野生型Aβペプチド(SEQ ID NO:1)および/または前記のとおりに望ましい特徴を有するプローブとの分子内ペア接触と厳密に一致するように、ペプチドおよびペプチド模倣体を計算によって設計することができる。このようなペプチドおよびペプチド模倣体を設計するためのアルゴリズムは当技術分野において公知である。例えば、Mobley, D. L., et al., Structure 2009, 17, (4), 489-98; Fennell, C. J., et al., J Phys Chem B 2009; Voelz, V. A., et al., PLoS Comput Biol 2009, 5, (2), el000281.; Shell, M. S., et al., Biophys J 2009, 96, (3), 917-24; Mobley, D. L., et al., J Chem Theory Comput 2007, 3, (4), 1231-1235; Wu, G. A., et al., Structure 2008, 16, (8), 1257-66; Chorny, I., et al., J Phys Chem B 2005, 109, (50), 24056-60を参照されたい。
【００７０】
本明細書において記述されたプローブは標的タンパク質と選択的に会合する。いくつかの態様において、プローブは、標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こすことができる。例えば、いくつかの態様において、本明細書において記述されたプローブは、アミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体に結合し、このように結合すると立体構造の転換を起こす。前記のとおり、立体構造の転換は、プローブのN末端とC末端との(もしくは他の任意の2つの点の間の)距離の変化、大なり小なり緻密な折り畳み、主にある二次構造から主に別の二次構造への変化、または異なる二次構造の相対量の任意の変化、またはプローブ上にある任意の標識間の関係の任意の変化を含んでもよい。前記のとおり、「立体構造の転換」には、CDのようなより直接的な立体構造の測定が立体構造の変化を明らかにしなくても、下記で議論される標識シグナリングを介した手段のような間接的な手段を含めて、タンパク質またはペプチド立体構造を検出するための標準的な方法を含む任意の手段によって検出することができる転換が挙げられる。
【００７１】
いくつかの態様において、プローブは、標的タンパク質の立体構造変化に似た立体構造変化を起こす。例えば、いくつかの態様において、プローブは、主にランダムコイル/αヘリックス立体構造も主にβシート立体構造もともにとることができ、主にβシート立体構造を示す標的タンパク質と結合すると主にβシート立体構造をとる。いくつかの態様において、主にαヘリックス/ランダムコイル立体構造にあるプローブが提供され、主にβシート立体構造にある標的タンパク質と接触、結合、会合、および/または相互作用すると、主にβシート立体構造への立体構造の転換を起こす。他の態様において、プローブは、さらに凝縮するか、さらに拡散するか、または任意の異なる立体配置をとることによって立体構造を転換する。いくつかの態様において、プローブは、さらに近接してAβタンパク質凝集体の立体構造をとる。任意の生理学的に許容される溶液に溶解してプローブが提供されてもよい。例えば、プローブはトリフルオロ酢酸塩として調製され、100%HFIPまたは50%ACNのような有機溶媒に再懸濁されてもよい。
【００７２】
他の態様において、プローブと標的タンパク質との会合は、発生する場合がある、または発生しない場合がある立体構造の転換とは無関係に、例えば、標的タンパク質と会合したプローブの直接検出によって、例えば、標的タンパク質と会合したプローブ上にある検出可能な標識の検出によって検出される。いくつかの態様において、初めにプローブと標的タンパク質が会合し、その後に、標的タンパク質からプローブが解離するように、会合は一時的なものである。
【００７３】
5.標識
前記のとおり、本明細書において開示するプローブは、一つまたは複数の検出可能な標識を含んでもよい。例えば、プローブは、リンカーを用いて、またはリンカーを用いずに、共有結合または非共有結合により標識と結合または融合されてもよい。いくつかの態様において、標識は、標的タンパク質と会合したプローブの直接検出を可能にするように選択される。従って、例えば、一つまたは複数の標識は、蛍光標識、放射性標識などのような直接検出によって検出可能であってもよい。このような会合は、標的タンパク質との現在のプローブ会合でもよく、標的タンパク質との過去のプローブ会合でもよい。他の態様において、標識は、プローブが神経変性疾患に関連したAβタンパク質凝集体と会合した場合にとる立体構造などの、プローブの特定の立体構造の検出を可能にするように選択される。このシナリオでは、プローブが第一の非会合立体構造(例えば、主にランダムコイル/αヘリックス立体構造または組織化されていない、もしくは密度の低い形態)にある場合に、標識は第一のシグナルを発してもよく(またはシグナルを発しなくてもよく)、プローブが標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こした場合に(例えば、主にβシート立体構造または組織化された、もしくは密度の高い形態)、標識は第二のシグナルを発してもよく、シグナルを発しなくてもよい(すなわち、プローブは消光される)。第一のシグナルおよび第二のシグナルは、強度、波長などのような一つまたは複数の特質の点で異なってもよい。シグナルが発光を含む態様において、第一のシグナルおよび第二のシグナルは励起波長および/または放出波長の点で異なってもよい。プローブが立体構造の転換を起こした場合に発生するシグナルは、同じプローブに結合している標識間の相互作用に起因してもよく、および/または異なるプローブに結合している標識間の相互作用に起因してもよい。前記のとおり、他の態様において、標識は、プローブの立体構造とは無関係に検出可能である、および/または任意の立体構造の転換にも標的との会合にも無関係に検出可能である。
【００７４】
いくつかの態様において、ペプチドプローブは、N末端において、C末端において、両端において、あるいは、ペプチドが標的タンパク質と会合した場合に、シグナルを発生するか、または、標的タンパク質と結合すると、βシート立体構造をとるもしくは立体構造変化を起こす、一つもしくは複数の位置において、検出可能な標識で標識されてもよい。ペプチドプローブは2種類またはそれ以上の標識で標識されてもよい。ここで、ペプチドプローブが標的タンパク質に結合した場合のペプチドプローブ上にある2種類またはそれ以上の標識間の距離は、ペプチドプローブが標的タンパク質に結合していない場合の距離とは異なる。さらに、もしくはまたは、ペプチドプローブは、エキシマーペア、FRETペア、およびフルオロフォア/クエンチャーペアより選択される検出可能な標識で標識されてもよい。ペプチドプローブがピレンペアのようなエキシマーペアで標識された場合、βシート立体構造を示す場合にエキシマーシグナルを発することができる。ペプチドプローブがDACIA-I/NBD、マリナブルー(MarinaBlue)/NBD、ダンシル/Trp、およびEDANS/FAMのようなFRETペアで標識された場合、βシート立体構造を示す場合に蛍光共鳴転移(FRET)シグナルを発することができる。ペプチドプローブが、ピレン/ダブシル、EDANS/ダブシル、およびFAM/ダブシルのようなフルオロフォア/クエンチャーペアで標識された場合、βシート立体構造を示す場合に、フルオロフォアシグナルを消光することができる。
【００７５】
前述のいずれかに従って、検出可能な標識は、ペプチドプローブの末端リジン残基の側鎖および/またはペプチドプローブの内部リジン残基の側鎖と結合体化されてもよい。
【００７６】
いくつかの態様において、標識がプローブの立体構造に基づいて相互作用するように、または相互作用しないように、例えば、プローブが非会合立体構造にある場合に標識が相互作用せず、かつ、プローブが標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こす場合に相互作用して、検出可能なシグナル(消光を含む)を発生するように、標識または標識部位は選択され、逆の場合も同様である。これは、プローブの会合状態に応じて、例えば、プローブが標的タンパク質と会合した後に立体構造の転換を起こしたかどうかに応じて離れる、または接近する標識部位を選択することによって達成されてもよい。いくつかの態様において、会合したプローブに関連するシグナルの大きさは、検出される標的タンパク質の量と直接の相関関係がある。従って、本発明の方法は標的タンパク質の検出および定量を可能にする。
【００７７】
例えば、プローブがアミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体と会合した場合にとる立体構造のような、プローブの特定の立体構造の検出を可能にするために、エキシマー、FRET、またはフルオロフォア/クエンチャー標識ペアを使用することができる。これらの態様において、プローブは第一の標識および第二の標識で別々の部位において標識され、それぞれがエキシマー、FRET、またはフルオロフォア/クエンチャーペアの相補メンバーである。
【００７８】
例えば、プローブが非会合状態にある場合に、エキシマー形成標識はモノマーシグナルを発してもよく、プローブが標的タンパク質と会合した後に標識を物理的に近づける立体構造の転換を起こした場合に、エキシマー形成標識はエキシマーシグナルを発してもよい。同様に、プローブが標識を物理的に近づける立体構造の転換を起こした場合に、FRET標識はFRETシグナルを発してもよい。他方で、プローブが非会合状態にある場合に、フルオロフォア/クエンチャー標識ペアはフルオロフォアシグナルを発してもよい。プローブが標識を物理的に近づける立体構造の転換を起こした場合に、このシグナルは消光されてもよい。前記のとおり、プローブが標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こした場合に、逆のシグナル変化が起こるように標識は配置されてもよい。
【００７９】
いくつかの態様において、プローブは、(ペプチドの一方の末端または両方の末端において)検出可能な標識を用いてエンドキャップが取り付けられる。いくつかの態様において、プローブは、C末端、N末端、もしくはその両方において、またはC末端、N末端、もしくはその両方の付近に検出可能な標識を含む。例えば、プローブは、C末端、N末端、もしくはその両方において、またはプローブがアミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体と会合すると立体構造の転換を起こす場合にシグナルを発生する他のどこかの部位において検出可能な標識を含んでもよい。従って、例えば、標識部位は、(i)N末端およびC末端;(ii)N末端、およびC末端以外の別の部位;(iii)C末端、およびN末端以外の別の部位;ならびに(iv)N末端以外およびC末端以外の2つの部位より選択されてもよい。
【００８０】
他の態様において、ペプチドプローブは、N末端において、C末端において、両端において、またはプローブの立体構造または立体構造移行とは関係なく検出可能な一つもしくは複数の位置(側鎖を含む)において検出可能な標識で標識されてもよい。前述のいずれかに従って、検出可能な標識は、ペプチドプローブの末端リジン残基の側鎖および/またはペプチドプローブの内部リジン残基の側鎖と結合体化されてもよい。
【００８１】
いくつかの態様において、検出可能な標識はリンカーによってプローブに取り付けられる。特定の態様において、ペプチドリンカーは、可動性リンカー、ヘリックスリンカー、トロンビン部位リンカー、および屈曲リンカーからなる群より選択される。特定の態様において、リンカーはアミノヘキシルリンカーである。他の態様において、ペプチドプローブは、内部リジン残基の側鎖を介して連結と結合体化される。他の適切なペプチドリンカーが当技術分野において記述されている(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、U.S. 6,448,087; Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-1290 (2002);およびKim et al., J. Biol. Chem. 280:35059-35076 (2005)を参照されたい)。いくつかの態様において、適切なリンカーは長さが約8〜12アミノ酸でもよい。さらなる態様において、リンカーのアミノ酸残基の約75%超がセリン残基、グリシン残基、およびアラニン残基より選択される。
【００８２】
一つの態様において、ピレン部分はプローブの各末端に、または各末端の付近に存在し、ピレンがβシート立体構造では物理的に近接し、ランダムコイル/αヘリックス立体構造では離れるように、ペプチドの立体構造に応じてピレン部分が異なる距離で隔てられうるので、ピレンモノマーシグナル対ピレンエキシマーシグナルの比はプローブの立体構造に依存する。例えば、ペプチドは水中でβシート立体構造をとり、ピレン部分は比較的近接している(N末端ピレン環中心とC末端ピレン環中心の間は約10Å)。対照的に、ペプチドは40%トリフルオロエタノール(TFE)中ではαヘリックス立体構造をとり、ピレン部分は離れている(N末端ピレン環中心とC末端ピレン環中心の間は約20Å)。従って、例えば、プローブが非会合状態にある場合に、モノマーシグナルは優勢であることがあり、プローブが標的タンパク質と会合すると立体構造の転換を起こした場合に、エキシマーシグナルは優勢であることがある(またはエキシマーシグナルは必ずしも優勢とならずに増加することがある)。従って、ピレンモノマーシグナルとピレンエキシマーシグナルとの比を測定することができる。この状況において、エキシマー形成が立体構造依存的である限り、プローブ上の他の部位に存在するピレン部分も有用な場合がある。
【００８３】
エキシマーの形成は光学特性の変化によって検出することができる。このような変化は、フルオロフォア標識に応じて、特に、UV、IR、CD、NMR、または蛍光を含む公知の蛍光定量法によって測定することができる。これらの光学特性変化の大きさは、シグナルに関連する立体構造をとったプローブの量と直接の関係があり、そのため、存在する標的タンパク質または構造の量と直接の関係がある。
【００８４】
これらの態様はエキシマーペアに関して詳細に説明されたが、当業者であれば、類似する考慮すべき事項がFRETおよびフルオロフォア/クエンチャーペアに当てはまることを理解するだろう。
【００８５】
さらに、これらの態様はペプチドプローブ1個あたり2個の標識の使用に関して説明されたが、複数の標識を使用できることが理解されるはずである。例えば、一種または複数種の標識が、それぞれの標識部位に存在してもよく、複数種の標識がそれぞれプローブ上の異なる標識部位に存在してもよい。これらの態様において、標識は無関係のシグナルを発生してもよく、エキシマーペア、FRETペア、シグナル/クエンチャーなどとして関係があってもよい。例えば、ある部位は1個の、2個の、3個の、4個の、またはそれより多いピレン部分を含んでもよく、別の部位は対応するクエンチャーを含んでもよい。
【００８６】
これらの態様のいずれかにおいて使用するための例示的な標識には、蛍光剤(例えば、フルオロフォア、蛍光タンパク質、蛍光性半導体ナノ結晶)、リン光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、色素、放射性核種、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、ハプテンなど)、酵素(例えば、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど)、酵素基質、酵素補因子(例えば、NADPH)、酵素阻害剤、シンチレーション剤、阻害剤、磁性粒子、オリゴヌクレオチド、および当技術分野において公知の他の部分が挙げられる。標識がフルオロフォアである場合、フルオロフォアの一つまたは複数の特徴を用いて、標識プローブの会合状態を評価することができる。例えば、フルオロフォアの励起波長は、標識プローブが非会合立体構造または標的タンパク質と会合した後にとる立体構造にあるかどうかに基づいて変わることができる。いくつかの態様において、蛍光の放出波長、強度、または偏向は、標識プローブの会合状態に基づいて変わることができる。
【００８７】
本明細書において用いられる場合「フルオロフォア」とは、光により励起されて蛍光またはリン光を放出しうる化学基である。「クエンチャー」とは、蛍光供与体からの蛍光シグナルを消光できる作用物質である。第一のフルオロフォアは、第二のフルオロフォアを励起する蛍光シグナルを放出しうる。第一のフルオロフォアは、第二のフルオロフォアにより消光されるシグナルを放出しうる。本明細書において開示するプローブは、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を起こすことができる。
【００８８】
フルオロフォアおよびクエンチャーは、以下の作用物質(または以下の商品名で販売されているフルオロフォアおよびクエンチャー)を含むことができる:1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; ウンベリフェロン(例えば、4-メチルウンベリフェロン); アクラジマム(acradimum)エステル、5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン; 5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM); 5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA) ; 5-FAM (5-カルボキシフルオレセイン); 5-HAT (ヒドロキシトリプタミン) ; 5-ヒドロキシトリプタミン(HAT); 5-ROX (カルボキシ-X-ローダミン); 5-TAMRA (5-カルボキシテトラメチルローダミン); 6-カルボキシローダミン6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-アミノ-4-メチルクマリン; 7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD); 7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン; 9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン; ABQ; 酸性フクシン(Acid Fuchsin); ACMA (9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン); アクリジンオレンジ(Acridine Orange); アクリジンレッド(Acridine Red); アクリジンイエロー(Acridine Yellow); アクリフラビン(Acriflavin); アクリフラビンフュールゲン(Acriflavin Feulgen) SITSA; アレキサフルオル(Alexa Fluor) 350(商標); アレキサフルオル430(商標); アレキサフルオル488(商標); アレキサフルオル532(商標); アレキサフルオル546(商標); アレキサフルオル568(商標); アレキサフルオル594(商標); アレキサフルオル633(商標); アレキサフルオル647(商標); アレキサフルオル660(商標); アレキサフルオル680(商標); アリザリンコンプレキソン(Alizarin Complexon); アリザリンレッド(Alizarin Red); アロフィコシアニン(Allophycocyanin) (APC); AMC; AMCA-S; AMCA (アミノメチルクマリン(Aminomethylcoumarin)); AMCA-X; アミノアクチノマイシン(Aminoactinomycin) D; アミノクマリン(Aminocoumarin); アミノメチルクマリン(Aminomethylcoumarin) (AMCA); アニリンブルー(Anilin Blue); ステアリン酸アントロシル; APC (アロフィコシアニン(Allophycocyanin)); APC-Cy7; APTS; アストラゾンブリリアントレッド(Astrazon Brilliant Red) 4G; アストラゾンオレンジ(Astrazon Orange) R; アストラゾンレッド(Astrazon Red) 6B; アストラゾンイエロー(Astrazon Yellow) 7GLL ; アタブリン(Atabrine); ATTO-TAG(商標) CBQCA; ATTO-TAG(商標) FQ; オーラミン(Auramine); オーロホスフィン(Aurophosphine) G; オーロホスフィン; BAO 9 (ビスアミノフェニルオキサジアゾール(Bisaminophenyloxadiazole)); 硫酸ベルベリン(Berberine Sulphate); βラクタマーゼ(Beta Lactamase); BFP青色偏移GFP (BFP blue shifted GFP) (Y66H); 青色蛍光タンパク質(Blue Fluorescent Protein); BFP/GFP FRET; ビマン(Bimane); ビスベンズアミド(Bisbenzamide); ビスベンズイミド(Bisbenzimide) (ヘキスト(Hoechst)); ブランコファー(Blancophor) FFG; ブランコファーSV; BOBO(商標)-1; BOBO(商標)-3; ボディピ(Bodipy) 492/515; ボディピ493/503; ボディピ500/510; ボディピ505/515; ボディピ530/550; ボディピ542/563; ボディピ558/568; ボディピ564/570; ボディピ576/589; ボディピ581/591; ボディピ630/650-X; ボディピ650/665-X; ボディピ665/676; ボディピFL; ボディピFL ATP; ボディピF1-セラミド(Ceramide); ボディピR6G SE; ボディピTMR; ボディピTMR-X結合体; ボディピTMR-X, SE; ボディピTR; ボディピTR ATP; ボディピTR-X SE; BO-PRO(商標)-1; BO-PRO(商標)-3; ブリリアントスルホフラビン(Brilliant Sulphoflavin) FF; カルセイン(Calcein); カルセインブルー(Calcein Blue); カルシウムクリムソン(Calcium Crimson) (商標); カルシウムグリーン(Calcium Green); カルシウムオレンジ(Calcium Orange); カルコフルオアホワイト(Calcofluor White); カルボキシ-X-ローダミン(5-ROX); カスケー���ブルー(Cascade Blue) (商標); カスケードイエロー(Cascade Yellow); カテコールアミン(Catecholamine); CCF2 (GeneBlazer); CFDA; CFP-シアン蛍光タンパク質(Cyan Fluorescent Protein); CFP/YFP FRET; クロロフイル(Chlorophyll); クロモマイシン(Chromomycin) A; CL-NERF (レシオ色素、pH) (Ratio Dye, pH); CMFDA; セレンテラジン(Coelenterazine) f; セレンテラジンfcp; セレンテラジンh; セレンテラジンhcp; セレンテラジンip; セレンテラジンn; セレンテラジンO; クマリンファロイジン(Coumarin Phalloidin); C-フィコシアニン(phycocyanine); CPMメチルクマリン; CTC; CTCホルマザン(Formazan); Cy2(商標); Cy3.1 8; Cy3.5(商標); Cy3(商標); Cy5.1 8 ; Cy5.5(商標); Cy5(商標); Cy7(商標); シアン(Cyan)GFP; 環状AMPフルオロセンサー(cyclic AMP Fluorosensor) (FiCRhR); ダブシル; ダンシル; ダンシルアミン(Dansyl Amine); ダンシルカダベリン(Dansyl Cadaverine); ダンシルクロリド(Dansyl Chloride); ダンシル(Dansyl)DHPE; ダンシルフルオリド(Dansyl fluoride); DAPI; ダポキシル(Dapoxyl); ダポキシル2; ダポキシル3; DCFDA; DCFH (ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate)); DDAO; DHR (ジヒドロローダミン(Dihydorhodamine) 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (ノンレシオ) (non-ratio); DiA (4-Di-16-ASP); ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate) (DCFH); DiD-脂溶性トレーサー(Lipophilic Tracer); DiD (DiIC18(5)); DIDS ; ジヒドローダミン(Dihydorhodamine) 123 (DHR); DiI (DiIC18(3)); ジニトロフェノール(Dinitrophenol); DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DiIC18(7)); DNP; ドーパミン(Dopamine); DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; EDANS; エオシン(Eosin); エリスロシン(Erythrosin); エリスロシンITC ; エチジウムブロミド(Ethidium Bromide); エチジウムホモダイマー(Ethidium homodimer)-1 (EthD-1); オイクリシン(Euchrysin); ユーコライト(EukoLight); 塩化ユウロピウム(III) (Europium (III) chloride); EYFP; ファストブルー(Fast Blue); FDA; フォイルゲン(Feulgen) (パラローザニリン(Pararosaniline)); FITC; フラゾオレンジ(Flazo Orange); フルオ(Fluo)-3; フルオ-4; フルオレセイン(Fluorescein) (FITC); フルオレセインジアセテート(Fluorescein Diacetate); フルオロ-エメラルド(Fluoro-Emerald); フルオロ-ゴールド(Fluoro-Gold) (ヒドロキシスチルブアミジン(Hydroxystilbamidine)); フルオル・ルビー(Fluor-Ruby); フルオルX (FluorX); FM 1-43(商標); FM 4-46; フラレッド(Fura Red) (商標); フラレッド(商標)/フルオ-3; フラ-2(Fura-2); フラ-2/BCECF; ゲナクリルブリリアントレッド(Genacryl Brilliant Red) B; ゲナクリルブリリアントイエロー(Genacryl Brilliant Yellow) 10GF; ゲナクリルピンク(Genacryl Pink) 3G; ゲナクリルイエロー(Genacryl Yellow) 5GF; ジーンブレイザー(GeneBlazer) (CCF2); 蛍光タンパク質(例えば、GFP (S65T); 赤色偏移GFP (GFP red shifted) (rsGFP); GFP野生型(GFP wild type)、非UV励起(non-UV excitation) (wtGFP); GFP野生型、UV励起(UV excitation) (wtGFP); およびGFPuv); グロキサン酸(Gloxalic Acid); グラニュラーブルー(Granular Blue); ヘマトポルフィリン(Haematoporphyrin); ヘキスト33258; ヘキスト33342; ヘキスト34580; HPTS; ヒドロキシクマリン(Hydroxycoumarin); ヒドロキシスチルブアミジン(Hydroxystilbamidine) (フルオロゴールド(FluoroGold)); ヒドロキシトリプタミン(Hydroxytryptamine); インド(Indo)-1; インドジカルボシアニン(Indodicarbocyanine) (DiD); インドシアニングリーン (Indocyanine Green) (ICG); インドトリカルボシアニン(Indotricarbocyanine) (DiR); イントラホワイト(Intrawhite) Cf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; ラウロダン(Laurodan); LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); リューコファー(Leucophor) PAF; リ���ーコファーSF; リューコファーWS; リサミンローダミン(Lissamine Rhodamine); リサミンローダミンB; カルセイン(Calcein)/エチジウムホモダイマー(Ethidium homodimer); LOLO-1; LO-PRO-1; ルシファーイエロー(Lucifer Yellow); ルミノール(luminal)、ライソトラッカーブルー(Lyso Tracker Blue); ライソトラッカーブルー・ホワイト(Lyso Tracker Blue-White); ライソトラッカーグリーン(Lyso Tracker Green); ライソトラッカーレッド(Lyso Tracker Red); ライソトラッカーイエロー(Lyso Tracker Yellow); ライソセンサーブルー(LysoSensor Blue); ライソセンサーグリーン(LysoSensor Green); ライソセンサーイエロー/ブルー(LysoSensor Yellow/Blue); Magグリーン(Mag Green); マグダラレッド(Magdala Red) (フロキシン(Phloxin) B); Mag-フラレッド(Mag-Fura Red); Mag-フラ-2 (Mag-Fura-2); Mag-フラ-5 (Mag-Fura-5); Mag-インド-1 (Mag-Indo-1); マグネシウムグリーン(Magnesium Green); マグネシウムオレンジ(Magnesium Orange); マラカイトグリーン(Malachite Green); マリナブルー(Marina Blue); マキシロンブリリアントフラビン(Maxilon Brilliant Flavin) 10 GFF; マキシロンブリリアントフラビン8 GFF; メロシアニン(Merocyanin); メトキシクマリン(Methoxycoumarin); ミトトラッカーグリーン(Mitotracker Green) FM; ミトトラッカーオレンジ(Mitotracker Orange); ミトトラッカーレッド(Mitotracker Red); ミトラマイシン(Mitramycin); モノブロモビマン(Monobromobimane); モノブロモビマン(mBBr-GSH); モノクロロビマン(Monochlorobimane); MPS (メチルグリーンピロニンスチルベン(Methyl Green Pyronine Stilbene)); NBD; NBDアミン(Amine); ナイルレッド(Nile Red); NED(商標); ニトロベンゾキシアジドール(Nitrobenzoxadidole); ノルアドレナリン(Noradrenaline); ヌクレアファストレッド(Nuclear Fast Red); ヌクレアイエロー(Nuclear Yellow); ニロサンブリリアントイアビン(Nylosan Brilliant Iavin) E8G; オレゴングリーン(Oregon Green); オレゴングリーン488-X; Oregon Green(商標); オレゴングリーン (商標) 488; オレゴングリーン (商標) 500; オレゴングリーン(商標) 514; パシフィックブルー(Pacific Blue); パラローザニリン(Pararosaniline) (フォイルゲン(Feulgen)); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-テキサスレッド(PE-TexasRed) [レッド613]; フロキシン (Phloxin) B (マグダラレッド); ホルワイト(Phorwite) AR; ホルワイトBKL; ホルワイトRev; ホルワイトRPA; ホスフィン(Phosphine) 3R; フィコエリスリン(Phycoerythrin) B [PE]; フィコエリスリン(Phycoerythrin) R [PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; ポントクロームブルーブラック(Pontochrome Blue Black); POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; プリムリン(Primuline); プロシオンイエロー(Procion Yellow); プロピジウムイオジド(Propidium Iodid) (PI); PyMPO; ピレン(Pyrene); ピロニン(Pyronine); ピロニンB; ピロザールブリリアントフラビン(Pyrozal Brilliant Flavin) 7GF; QSY 7; キナクリンマスタード(Quinacrine Mustard); レッド613 [PE-テキサスレッド]; レゾルフィン(Resorufin); RH 414; Rhod-2; ローダミン(Rhodamine); ローダミン110 ; ローダミン123; ローダミン5 GLD; ローダミン6G; ローダミンB; ローダミンB 200; ローダミンB エキストラ; ローダミンBB; ローダミンBG; ローダミングリーン; ローダミンファリシジン(Rhodamine Phallicidine); ローダミンファロイジン(Rhodamine Phalloidine); ローダミンRed; ローダミンWT; ローズベンガル(Rose Bengal); R-フィコシアニン(phycocyanine); R-フィコエリスリン(phycoerythrin) (PE); RsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; サファイア(Sapphire) GFP; SBFI; セロトニン(Serotonin); セブロンブリリアントレッド(Sevron Brilliant Red) 2B; セブロンブリリアントレッド4G; セブロン���リリアントレッドB; セブロンオレンジ(Sevron Orange); セブロンイエロー(Sevron Yellow) L; sgBFP(商標); sgBFP(商標) (スーパーグロウ(super glow) BFP); sgGFP(商標); sgGFP(商標) (スーパーグロウGFP); SITS; SITS (プリムリン(Primuline)); SITS (スチルベンイソチオスルホン酸(Stilbene Isothiosulp
honic Acid)); SNAFLカルセイン; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARFカルセイン; SNARF1; ナトリウムグリーン(Sodium Green); スペクトラムアクア(SpectrumAqua); スペクトラムグリーン(SpectrumGreen); スペクトラムオレンジ(SpectrumOrange); スペクトラムレッド(Spectrum Red); SPQ (6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル)キノリニウム); スチルベン(Stilbene); スルホローダミン(Sulphorhodamine) B can C; スルホローダミンG エキストラ; SYTO 11 ; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61 ; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOXブルー(Blue); SYTOXグリーン(Green); SYTOXオレンジ(Orange); TET(商標); テトラサイクリン(Tetracycline); テトラメチルローダミン(Tetramethylrhodamine) (TRITC); テキサスレッド(Texas Red) (商標); テキサスレッド-X (Texas Red-X) (商標)結合体; チアジカルボシアニン(Thiadicarbocyanine) (DiSC3); チアジンレッド(Thiazine Red) R; チアゾールオレンジ(Thiazole Orange); チオフラビン(Thioflavin) 5; チオフラビンS; チオフラビンTCN; チオライト(Thiolyte); チオゾールオレンジ(Thiozole Orange); チノポール(Tinopol) CBS (カルコフロールホワイト(Calcofluor White)); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; トリコロール(TriColor) (PE-Cy5); TRITC テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TetramethylRodamineIsoThioCyanate); トゥルーブルー(True Blue); トゥルーレッド(TruRed); ウルトラライト(Ultralite); ウラニン(Uranine) B; ウビテックス(Uvitex) SFC; VIC(登録商標); wt GFP; WW 781 ; X-ローダミン; XRITC; キシレンオレンジ(Xylene Orange); Y66F; Y66H; Y66W; イエロー(Yellow) GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3;およびそれらの塩。
【００８９】
特定の態様において、フルオロフォア標識は、インドシアニングリーン(ICG)、Cy3、Cy5、Cy7、またはFITCである。これらの直接検出可能な標識および他の直接検出可能な標識は、ペプチドプローブが標的タンパク質と会合した場合に立体構造の転換または変換を起さないことがある態様において有用である。
【００９０】
前記のとおり、いくつかの態様において、標識はピレン部分を含む。本明細書において用いられる場合、ピレン部分には、4個のベンゼン縮合環を含むピレンまたはピレン誘導体が挙げられる。ピレン誘導体とは、ピレンの4個のベンゼン縮合環を含み、ピレン炭素原子の一つまたは複数がさらなる部分で置換されているか、さらなる部分と結合体化されている分子を意味する。例示的なピレン誘導体には、ピレン炭素原子の一つまたは複数が、直鎖または分枝鎖、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基、例えば、C1〜C20、該基が、例えば、O、N、もしくはS原子を含む部分(例えば、カルボニル、アミン、スルフヒドリル)またはハロゲンで置換されてもよい直鎖または分枝鎖、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基で置換されているアルキル化ピレンが挙げられる。いくつかの態様において、ピレン誘導体は、一つもしくは複数の遊離カルボキシル基および/または一つもしくは複数の遊離アミン基を含む。これらはそれぞれ、ピレン炭素原子に直接取り付けられてもよく、一つもしくは複数の、例えば、1〜3個、1〜5個、またはそれより多い原子によってピレン炭素から分けられている炭素原子に取り付けられるように、前記の直鎖または分枝鎖、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基上の任意の位置に取り付けられてもよい。いくつかの態様において、ピレンは一つもしくは複数の酢酸部分および/または一つもしくは複数のエチルアミン部分で置換される。いくつかの態様において、ピレン誘導体は一つのメチル、エチル、プロピル、またはブチル基で置換される。いくつかの態様において、ピレンはピレンブチレートのような短鎖脂肪酸で置換される。別の態様において、ピレンは、アルブミン、転移(transferring)、または抗体のFc断片と結合体化される。いくつかの態様において、置換基は、炭素-炭素結合、アミノ基、ペプチド結合、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、またはエステル結合を介してピレンに取り付けられる。他の態様において、ピレン誘導体はPEG化ピレン、すなわち、ポリエチレングリコール(PEG)と結合体化されたピレンである。このようなピレン誘導体はインビボで長い循環半減期を示しうる。他の態様において、ピレン誘導体はアルブミンと結合体化されたピレンである。
【００９１】
いくつかの態様において、標識は、融合タンパク質の一部としてプローブに組み入れられる蛍光タンパク質を含む。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(例えば、GFP、eGFP、AcGFP、TurboGFP、エメラルド(Emerald)、アザミグリーン(Azami Green)およびZsGreen)、青色蛍光タンパク質(例えば、EBFP、サファイア(Sapphire)およびT-サファイア(T-Sapphire))、シアン蛍光タンパク質(例えば、ECFP、mCFP、セルリアン(Cerulean)、CyPet、AmCyan1およびミドリイシシアン(Midoriishi Cyan))、黄色蛍光タンパク質(例えば、EYFP、トパーズ(Topaz)、ビーナス(Venus)、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellow1およびmBanana)ならびに橙色および赤色蛍光タンパク質(例えば、クサビラオレンジ(Kusabira Orange)、mOrange、dTomato、dTomato-Tandem、DsRed、DsRed2、DsRed-Express (T1)、DsREd-Monomer、mTangerine、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRed1、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlumおよびAQ143)を含むことができる。他の蛍光タンパク質は当技術分野において記述されている(Tsien, R. Y., Annual. Rev. Biochem. 67:509-544 (1998);およびLippincott-Schwartz et al., Science 300:87-91 (2003))。これらの直接検出可能な標識および他の直接検出可能な標識は、ペプチドプローブが標的タンパク質と会合した場合に立体構造の転換または変換を起こさないことがある態様において有用である。
【００９２】
前記のとおり、プローブは、プローブのN末端またはC末端において結合された蛍光タンパク質も含む融合タンパク質に含まれてもよい。この蛍光タンパク質は、当技術分野に記述される(全体が参照により本明細書に組み入れられる、U.S. 6,448,087; Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-1290 (2002);およびKim et al., J. Biol. Chem. 280:35059-35076 (2005))とおりにペプチドリンカーを介して結合されてもよい。いくつかの態様において、適切なリンカーは長さが約8〜12アミノ酸でもよい。さらなる態様において、リンカーのアミノ酸残基の約75%超がセリン残基、グリシン残基、およびアラニン残基より選択される。
【００９３】
いくつかの態様において、標識はオリゴヌクレオチドを含む。例えば、プローブは、当技術分野において公知の方法(例えば、PCR、TMA、b-DNA、NASBAなどのような増幅アッセイ法)によって検出することができるオリゴヌクレオチドタグと結合されてもよい。
【００９４】
いくつかの態様において、インビボイメージングに有用な標識を使用することができる。例えば、フッ素-18のような磁気共鳴画像法に有用な標識を使用することができ、同様に化学発光標識も使用することができる。別の態様において、プローブは放射性標識で標識される。例えば、標識は、この目的に用いられる機械によって検出されるのに十分なエネルギーのポジトロン放出を提供することができる。このような実体の一例は、酸素-15(ポジトロン放出によって崩壊する酸素同位体)または他の放射性核種を含む。別の例が炭素-11である。これらの直接検出可能な標識および他の直接検出可能な標識は、ペプチドプローブが標的タンパク質と会合した場合に、または任意のこのような立体構造の転換とは無関係にプローブを検出することが望ましい場合に、立体構造の転換または変換を起こさない場合がある態様において有用である。このような標識で標識されたプローブを患者に投与し、Aβタンパク質凝集体を含有する部位に局在させ、患者を造影(スキャン)して、局在化プローブを検出し、従って、局在化標的タンパク質の部位を特定することができる。使用することができるイメージング法には、とりわけ、磁気共鳴画像法(MRI)、X線撮影、断層撮影、透視検査、核医学、光学イメージング、脳造影、および超音波検査が挙げられる。このような方法において使用するのに適した標識は、前記で議論した標識を含めて当技術分野において公知である。
【００９５】
6.方法
前記で議論したとおり、本発明は、アミロイド形成性疾患に関連するAβタンパク質凝集体(または他の誤って折り畳まれたタンパク質)を個体の眼において検出するためのインビボ方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(A)ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを個体に投与する段階であって、該プローブがタンパク質凝集体と優先的に会合する、段階、および(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合したプローブを検出する段階を含む。他の態様において、該方法は、(A)ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを個体に投与する段階であって、該プローブが、(i)タンパク質凝集体と優先的に会合し、かつ、(ii)タンパク質凝集体と会合した場合に、検出可能なシグナルを発生する、段階;および(B)眼に存在する任意のタンパク質凝集体と会合しているプローブに起因する任意の検出可能なシグナルを検出する段階を含む。これらの態様のいずれかによれば、Aβタンパク質凝集体は、網膜および/または視神経および/または眼血管のような眼の一つまたは複数の別々の領域において検出されてもよい。いくつかの態様において、ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブは、眼血管、角膜、水晶体、毛様体、視神経、上皮細胞、赤血球、または網膜内のニューロンのような眼のAβタンパク質凝集体部位に局在化する。
【００９６】
段階(A)は、全身注射、眼内注射を含む直接注射、または眼の表面もしくは鼻腔内を含む直接適用のような、眼内の標的タンパク質部位における局在化を可能にする任意の適切な手段による投与を含んでもよい。ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブは、投与経路に適した任意の組成物、例えば、全身注射、直接注射、または結膜もしくは角膜への適用のための薬学的に許容される担体に溶解して処方することができる。例えば、ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブは、非経口、鼻、吸入、もしくは眼の注射/投与用の組成物、眼用溶液(例えば、点眼薬)、または鼻用溶液(例えば、点鼻薬もしくは点鼻液)に溶解して処方することができる。ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブは単回投与で投与されてもよく、様々な期間で投与されうる複数回投与で投与されてもよい。
【００９７】
段階(B)は、プローブ上にある任意の検出可能な標識を検出するか、または、眼に存在する任意のタンパク質凝集体に会合しているプローブに起因する任意の検出可能なシグナルを含む、標的タンパク質と会合した任意のプローブを検出する任意の検出方法を含んでもよい。いくつかの態様において、段階(B)は、眼に、プローブ上の検出可能な標識に関連する光源を当てることを含む。いくつかの態様において、段階(B)は、網膜血管イメージング装置を使用することを含む。いくつかの態様において、網膜イメージング装置は、近赤外線蛍光眼底画像を捕らえることができる眼底カメラである。いくつかの態様において、網膜イメージング装置は細隙灯である。いくつかの態様において、網膜イメージング装置は、レーザーのような透視検査装置によって補助される。いくつかの態様において、シグナルは通常の光もしくはレーザー光を用いる直接検査によって検出される。いくつかの態様において、シグナルは、ポジトロン放出断層撮影(PET)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、磁気共鳴画像法(MRI)、X線撮影、断層撮影、透視検査、核医学、光学イメージング、脳造影、および超音波検査のようなイメージング法を用いて検出される。他の態様において、段階(B)の前に、眼の瞳孔を広げる段階などのさらなる段階が採用される。
【００９８】
いくつかの態様において、段階(B)の後に、視神経において検出されたプローブと網膜において検出されたプローブとの比較などの、眼の異なる部位に局在するプローブ間のコントラストを計算するさらなる任意の段階を実施することができる。
【００９９】
本明細書において記述されたペプチドプローブがインビボで脳内のAβタンパク質凝集体の場所を突き止め、検出する能力が示されており、例えば、US2008/0095706の実施例11に報告される。インビボ方法に関するさらなる詳細は、例えば、US2008/0095706に示される。US2008/0095706の内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
ペプチドプローブ(またはペプチド模倣体プローブ)はいずれも、および前記の標識はいずれも使用することができる。特定の態様において、ペプチドプローブは蛍光標識または放射性標識のような検出可能な標識で標識されてもよい。ここで、このような標識の検出はプローブの特定の立体構造または立体構造の変化に頼らない。いくつかの態様において、ペプチドプローブは直接検出可能な標識で標識されてもよく、段階(B)は、例えば、蛍光標識、放射性標識などを検出することによって標識を検出することを含んでもよい。他の態様において、ペプチドプローブはエキシマーペアで標識されてもよく、段階(B)は、任意の増加した自己シグナルまたは減少したエキシマーシグナルを検出することを含んでもよい。他の態様において、ペプチドプローブはFRETペアで標識されてもよく、段階(B)は、任意の増加した非FRETフルオロフォアシグナルまたは減少したFRETシグナルを検出することを含んでもよい。他の態様において、ペプチドプローブはフルオロフォア/クエンチャーペア標識され、段階(B)は、任意の増加したフルオロフォアシグナルを検出することを含んでもよい。
【０１０１】
7.キット
本明細書において記述されたプローブを含むキットも提供される。本明細書において記述された方法を実践するために、キットを調製することができる。典型的には、キットは少なくとも一つの構成要素または方法を実践するのに有用な構成要素の包装した組み合わせを含む。「包装した組み合わせ」とは、キットが、プローブ、緩衝液、使用説明書などのような、一つまたは複数の構成要素の組み合わせを含有する単一の包装を提供することを意味する。単一の容器を含有するキットは「包装した組み合わせ」の定義のなかに含まれる。キットは、本明細書において開示する方法を実践するのに必要な構成要素の一部または全てを含んでもよい。典型的に、キットは少なくとも一つの容器の中に少なくとも一つのプローブを含む。キットは、一つまたは複数の容器の中に、異なる配列および/または異なる標識を含むプローブのような、同じでもよく異なってもよい複数のプローブを含んでもよい。複数のプローブは単一の容器または別個の容器の中に存在し、それぞれが単一のプローブを含んでもよい。
【実施例】
【０１０２】
実施例1-ペプチドプローブ
本明細書において記述された原理に従って、Aβ凝集体を検出するためのプローブを設計した。表1に図示したとおり、これらのペプチド配列は、Aβペプチドのβシート形成領域であるAβペプチドのアミノ酸17〜35に基づく。参照配列(WT; SEQ ID NO:1)は野生型配列に対応し、ピレン標識を容易にするために末端リジン残基が付加されている。これらのペプチドは、Aβタンパク質に優先的に会合することが示されており、米国特許出願第12/695,968号に記述されるとおりに立体構造の転換を起こしてシグナルを発生することができる。特定の例示的なペプチドプローブを以下の表2に記載する。これらのプローブは、参照Aβペプチド配列と比較して水溶液中での溶解度をより高める改変を含む。これらのプローブは、N末端に、およびC末端付近のリジン側鎖から伸びる末端にジピレンブチレート(PBA)部分を含む。さらに、これらは、C末端に、天然に存在するカルボキシル基の代わりにアミド基を含むように改変されている。
【０１０３】
（表２）
2014514576.tif 000009
【０１０４】
本明細書の説明に従って選択および/または設計された他のプローブが、アミロイド形成性疾患に関連するAβ凝集体と優先的に会合する能力は、US2008/0095706および米国特許出願第12/695,968号において記述された方法によって評価および確認することができる。例えば、プローブ-オリゴマー複合体をモノクローナル6E10抗体およびプロテインG-アガロースを用いて免疫沈降する、ビーズベースのオリゴマー結合アッセイ法を使用することができる。
【０１０５】
6E10抗体は、プローブに見られない、エピトープに対応するAβ42ペプチドのN末端(1〜10aa)に特異的である。従って、この抗体は、存在しうる完全長Aβタンパク質にのみ結合し、プローブに結合しない。このアッセイ法を実施するために、6E10モノクローナル抗体とオリゴマーの結合を確実にするために、アミロイド形成性疾患試料/プローブ反応混合物を平衡状態に置く。短時間のインキュベーション後に、抗体をプロテインG-アガロースビーズで沈降させ、全ての非結合タンパク質を除去するために洗浄する。ビーズに結合したタンパク質を溶出させ、SDS PAGEおよびウエスタンブロットで特徴付ける。試料中のアミロイド形成性疾患関連Aβ凝集体の存在を確認するために、プローブ結合のレベルを標準品と比較することによって評価する。
【０１０６】
実施例2-ペプトイドを用いた合成Aβ凝集体の検出
SEQ ID NO:2のペプチドプローブの2種類のペプトイド類似体を調製し、アミロイドβ凝集体と相互作用する能力について試験した。モデリング研究は、これらの構造が、水性条件下でペプチドプローブにおいて観察されるβシート構造に似たコンパクトな構造を形成するはずだと示唆している。さらに、2つのピレン部分間の距離は、ペプチドプローブについて観察された距離(約10〜15Å)に匹敵する。
【０１０７】
図2に示したとおり、これらの2種類のペプトイドをアッセイ法において使用する。70nMの2種類のペプトイドプローブ1または2をそれぞれ、15nM、5nM、1.5nM、または0nMの合成Aβ42オリゴマーとインキュベートする(3回繰り返す)。反応は、マイクロタイタープレートの中で、10 mM Hepes(pH7.0)に溶解して、室温、200μLの最終体積で実施される。次いで、Tecan safire2蛍光プレートリーダーを用いてプレートを分析する。それぞれの試料について、ペプトイドの自己蛍光反応(370〜385nmの蛍光発光)をアミロイドβ凝集体濃度の関数としてプロットする。3種類のプローブ構造のアミロイドβ凝集体用量反応は同等である。
【０１０８】
前記のプレートアッセイ法のようなアッセイ法において使用するために、ビオチンを付け加えた、これらのペプトイドの変種を合成することができる。
【０１０９】
実施例3-眼血管におけるアミロイドタンパク質凝集体の検出
患者に、本明細書において記述された標識されたペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを、全身注射によって、片眼もしくは両眼の硝子体区画への直接注射によって、(例えば、点眼薬で)結膜への直接適用によって、または(例えば、鼻用溶液、点鼻薬、もしくはスプレーで)鼻を介した直接適用によって投与する。ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを眼に局在化させる、および/または眼血管に存在する任意のアミロイドタンパク質凝集体と会合させる。個体の眼血管の視覚化は、眼血管に存在する任意のアミロイドタンパク質凝集体と会合した任意の標識されているペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを検出および/または定量するために、透視検査(LASER)装置の助けを借りて細隙灯(または他の網膜血管イメージング装置)によって実践される。このようなプローブの検出は標的眼血管におけるアミロイド負荷(burden)と相関関係にあり、アミロイドタンパク質凝集体に関連する診断または疾患状態を示す。
【０１１０】
実施例4-マウス脳組織におけるアミロイドタンパク質凝集体の検出
アルツハイマー病トランスジェニックマウス(Tg AD)の脳組織内のアミロイドタンパク質凝集体を検出するためのプローブを、本明細書において記述された方法に従って調製した。具体的には、PEP-11(FITCで標識されたSEQ ID NO:63)を調製し、Tg AD脳組織および対照として使用した同年齢の非TGマウス脳組織に適用した。
【０１１１】
結果として生じた染色から、PEP-11は非Tg対照組織の歯状回または中脳の場所を最小限にしか染色しなかったが、Tg AD組織の歯状回組織および中脳組織を有意に大きな程度まで染色したことが明らかになった。これらの結果から、PEP-11は脳組織内のアミロイドタンパク質凝集体を特異的に検出できることが証明される。
【０１１２】
実施例5-ヒト脳組織におけるアミロイドタンパク質凝集体の検出
PEP-11を調製し、アルツハイマー病脳組織および対照として使用した同年齢の非アルツハイマー病ヒト脳組織に適用した。
【０１１３】
結果として生じた染色から、PEP-11は、非アルツハイマー病対照組織の新皮質または海馬の場所を最小限にしか染色しなかったが、アルツハイマー病組織の新皮質組織および海馬組織を有意に大きな程度まで染色することが明らかになった。これらの結果から、PEP-11はヒト脳組織内のアミロイドタンパク質凝集体を特異的に検出できることが証明される。
【０１１４】
実施例6-非コンゴレッド親和性アミロイドタンパク質凝集体の染色
PEP-11を用いて、アルツハイマー病にかかっている患者およびアルツハイマー病にかかっていない患者に由来するヒト脳組織の海馬領域および大脳皮質に由来するヒト組織を染色した。PEP-11染色を同じ領域のコンゴレッド染色と比較した。
【０１１５】
図3(表3)は、試験患者のサブセット:(1)患者0001:女性、85歳。アルツハイマー病診断あり。海馬錐体細胞層神経原線維濃縮体およびプラーク、神経外もつれを含む嗅内皮質、ならびに神経原線維濃縮体を含む多くのニューロンを示す死後神経病理によって確認された;ならびに(2)患者0002:男性、90歳。アルツハイマー病なし。皮質下白質がかなり有髄化されていることを示す死後神経病理によって確認された。新皮質および脳幹においてアルツハイマーII型グリアなし。海馬において急性または慢性のニューロン消失なし。海馬硬化症なし。
【０１１６】
女性患者では、PEP-11染色は細胞外構造およびニューロン構造において見られた。対照的に、男性患者では、細胞外構造およびニューロン構造の染色はなかった。
【０１１７】
一般的に、海馬領域において、コンゴレッドはプラークの中心にあるアミロイドプラークを染色した。対照的に、PEP-11は、プラーク近傍にある(コンゴレッドが結合しない)非コンゴレッド親和性プラーク様構造を染色したが、プラーク中心そのものを染色しなかった。
【０１１８】
同様に、アルツハイマー病患者の大脳皮質において、コンゴレッドはコンゴレッド親和性神経原線維濃縮体を染色したが、対照的に、PEP-11は、もつれニューロン近傍にある非コンゴレッド親和性プラーク様構造を染色した。コンゴレッドもPEP-11も脳実質内にある形態学的構造を染色しなかった。
【０１１９】
全体的に見て、PEP-11染色は、アミロイドプラーク中心を取り囲む拡散性の染色として現れる。理論に拘束されるものではないが、PEP-11は、コンゴレッドで染色されるアミロイドプラークのAβタンパク質凝集体前駆体と優先的に会合すると考えられる。
【０１２０】
実施例7-眼アミロイドタンパク質の検出
アルツハイマー病にかかっているドナーおよびアルツハイマー病にかかっていないドナーのヒト眼をGeorgia Eye Bankから入手した。眼を切片にし、次いで、PEP-11、またはアルツハイマー病を検出するためのプローブとして用いられる低分子色素であるBC750(正の対照)で染色した。
【０１２１】
図3(表3)は、試験患者のサブセットを示す:(1)患者0003:男性、60歳。アルツハイマー病なし。死後神経病理学から、患者に複数のドルーゼン、限局的な末梢類嚢性変性、および加齢黄斑変性に関連するドルーゼンがあったことを示す。(2)患者11-1649/0:女性、67歳。アルツハイマー病なし(死後神経病理情報は入手できなかった)。(3)患者11-1755/6:男性、73歳。アルツハイマー病および認知症あり(死後神経病理情報は入手できなかった)。ならびに(4)患者11-1767-8、女性、80歳。アルツハイマー病あり(死後神経病理情報は入手できなかった)。
【０１２２】
一般的に、PEP-11は、視神経(例えば、篩骨篩板のすぐ後方にある視神経)および毛様体網膜の両方においてアミロイド凝集体に結合した。
【０１２３】
患者(3)において、毛様体網膜のバックグラウンド染色は中程度かつ均一であり、視神経染色は中程度であった。患者(4)において、毛様体網膜のバックグラウンド染色は中程度かつ均一であり、視神経染色は強かった。
【０１２４】
一般的に、視神経において、BC750もアミロイド凝集体に結合したが、この眼領域におけるPEP-11による結合強度の方が有意に強かった。網膜において、BC750は、網膜組織の普遍的なバックグラウンド染色を示したPEP-11より強くかつ不均一に、この組織を染色するように見えたが、アルツハイマー病眼と比較して非アルツハイマー病眼を弱く染色した。しかしながら、BC750による網膜染色は、アルツハイマー病組織と非アルツハイマー病組織との区別においてPEP-11より有効でなかった。
【０１２５】
PEP-11はアルツハイマー病患者の視神経を用量勾配様式で染色すると考えられることも観察された。特に、PEP-11染色は脳および周囲のアミロイドプラークでは最も強く、後視神経では染色が弱く、感覚網膜では染色がさらに弱いと考えられる。理論に拘束されるものではないが、この染色パターンは、脳(最大濃度)から、視神経、感覚網膜(最小濃度)へと広がるアミロイドタンパク質凝集体の濃度勾配があることを示唆する。
【０１２６】
一般的に、PEP-11は患者眼においてドルーゼンも染色するようであるが、患者(1)のドルーゼンは標識されなかったことも観察された。
【０１２７】
実施例8-眼底カメラによるアミロイドタンパク質凝集体の検出
患者に、本明細書において記述された標識されたペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを片眼または両眼の硝子体区画への直接注射によって投与する。ペプチドプローブまたはペプチド模倣体プローブを眼に局在化させる、および/または眼血管に存在する任意のアミロイドタンパク質凝集体と会合させる。次いで、散瞳点眼薬を用いて、注射された眼の瞳孔を広げる。点眼薬が分散する機会があると、眼底カメラから近赤外蛍光画像を撮影する。次いで、視神経-頭部と網膜との間で画像の輝度を測定し、その後に、視神経-頭部と網膜との間でコントラストを計算する。
【０１２８】
視神経乳頭輝度と網膜輝度とのコントラストの存在が、アミロイドプラーク(すなわち、原線維)の前駆体になりうるアミロイドタンパク質凝集体に局在化したプローブの標準指標となる。このようなコントラストの存在から、脳に存在するアミロイドタンパク質凝集体のレベルが示されうる。
【図１】
2014514576.tif 000011
【図２】
2014514576.tif 000012
【図３】
2014514576.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月26日(2013.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014514576000001.app
【国際調査報告】
2014514576.tif 000014
2014514576.tif 000015
2014514576.tif 000016
2014514576.tif 000017