(57)【要約】  哺乳動物における心臓機能、心筋収縮性及び弛緩を改善するための組成物及び方法を提供する。プロモーターと操作可能に連結された、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする核酸配列及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする核酸配列を含む1以上の発現ベクターでトランスフェクトされた心筋細胞を、哺乳動物心筋に移植する。あるいは、R1及びR2をコードする構築物（1以上）を有するウイルウスベクター（1以上）を哺乳動物に直接投与する。R1及びR2サブユニットの過剰発現は、RR複合体の形成をもたらし、続いて、dATPが産生される。心臓機能の改善は、L48Q置換、I61Q置換又はL57Q置換されたcTnC変異体をコードする核酸配列を含むベクターの投与によっても達成され得る。また、R1及びR2を過剰発現するドナー細胞の移植を介した、心筋にdATPをデリバリーするための組成物及び方法も提供する。それにより、dATPはin situで産生され、ドナー細胞と宿主心筋細胞との間に確立されたギャップジャンクションを介してデリバリーされる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における心臓機能の改善方法であって、
該哺乳動物の心筋に心筋細胞を移植することを含み、ここで、該心筋細胞は、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一の発現ベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二の発現ベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、R1及びR2の過剰発現を誘導するプロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含み、
それにより、dATPを産生して、哺乳動物における心臓機能を改善する、方法。
【請求項２】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターが形質導入レポーターをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記心筋細胞がヒト胚性幹細胞に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記心筋細胞が、胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記iPSCが哺乳動物から採取された細胞に由来する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物から採取された細胞が線維芽細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記移植工程の前に、
第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターを提供し、かつ
該第一及び第二の発現ベクターで前記心筋細胞をex vivoで形質導入すること
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記心筋が梗塞心筋である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記移植がカテーテルにより心筋細胞をデリバリーすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記移植が梗塞心筋の非梗塞域に心筋細胞をデリバリーすることを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが、CK7プロモーター及びCMVプロモーターから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記第一及び第二の発現ベクターが同一である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物宿主の心筋にdATPをデリバリーする方法であって、
心筋にドナー細胞を移植することを含み、ここで、ドナー細胞は、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2を過剰発現し、dATPをin situで産生するものであり、かつ
該ドナー細胞は、哺乳動物宿主の心筋細胞とギャップジャンクションを形成し、
それにより、dATPを哺乳動物宿主の心筋にデリバリーする、方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物宿主がヒトである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記心筋が梗塞心筋である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記移植がカテーテルによりドナー細胞をデリバリーすることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記移植が梗塞心筋の非梗塞域に心筋細胞をデリバリーすることを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ドナー細胞が心筋細胞及び線維芽細胞から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記心筋細胞がヒト胚性幹細胞に由来する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記心筋細胞が、胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記iPSCが哺乳動物宿主から採取された細胞に由来する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物宿主から採取された細胞が線維芽細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ドナー細胞が、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一の発現ベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二の発現ベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、R1及びR2の過剰発現を誘導するプロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記第一及び第二の発現ベクターが同一のベクターである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物における心臓機能の改善方法であって、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一のウイルスベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二のウイルスベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを投与することを含む、方法。
【請求項３０】
第一及び第二のウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物がヒトである、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
第一及び第二のウイルスベクターが全身投与される、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
第一及び第二のウイルスベクターが静脈内投与される、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
第一及び第二のウイルスベクターが心筋内注入により投与される、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
前記第一及び第二のウイルスベクターの少なくとも1つが形質導入レポーターをさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
第一及び第二のウイルスベクターが同一のベクターである、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物における心筋収縮性及び心筋弛緩の改善方法であって、
該哺乳動物の心筋に心筋細胞を移植することを含み、ここで、該心筋細胞は、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一の発現ベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二の発現ベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、R1及びR2の過剰発現を誘導するプロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含み、
それにより、dATPを産生して、哺乳動物における心筋収縮性及び心筋弛緩を改善する、方法。
【請求項３８】
前記第一及び第二の発現ベクターがウイルスベクターである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記第一及び第二の発現ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記第一及び第二の発現ベクターの少なくとも1つが形質導入レポーターをさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記第一及び第二の発現ベクターが同一のベクターである、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
前記心筋細胞がヒト胚性幹細胞に由来する、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
前記心筋細胞が、胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
前記iPSCが哺乳動物から採取された細胞に由来する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物から採取された細胞が線維芽細胞である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記移植工程の前に、
第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターを提供し、かつ
該第一及び第二の発現ベクターで前記心筋細胞をex vivoで形質導入すること
をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
前記心筋が梗塞心筋である、請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
前記移植がカテーテルにより心筋細胞をデリバリーすることを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４９】
前記移植が梗塞心筋の非梗塞域に心筋細胞をデリバリーすることを含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３７記載の方法。
【請求項５１】
前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項３７記載の方法。
【請求項５２】
前記プロモーターが、CK7プロモーター及びCMVプロモーターから選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物における心筋収縮性及び心筋弛緩の改善方法であって、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一のウイルスベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二のウイルスベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを投与することを含む、方法。
【請求項５４】
前記第一及び第二のウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物がヒトである、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記第一及び第二のウイルスベクターが全身投与される、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
前記第一及び第二のウイルスベクターが静脈内投与される、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
前記第一及び第二のウイルスベクターが心筋内注入により投与される、請求項５３記載の方法。
【請求項５９】
前記第一及び第二のウイルスベクターが同一である、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
前記第一及び第二のウイルスベクターの少なくとも1つが形質導入レポーターをさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項６１】
前記第一及び第二のウイルスベクターが、心臓特異的マーカーと特異的に結合する標的化剤をコードする配列をさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項６２】
L48Qアミノ酸置換を有するcTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルス発現ベクターであって、該cTnC変異体が増加したCa2+結合親和性を有し、該核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターの投与をさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項６３】
リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一のウイルスベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二のウイルスベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項６４】
前記第一及び第二のウイルスベクターが同一である、請求項６３記載の医薬組成物。
【請求項６５】
L48Qアミノ酸置換を有するcTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、該cTnC変異体が増加したCa2+結合親和性を有する、ベクターを含む医薬組成物。
【請求項６６】
I61Q及びL57Qから選択されるアミノ酸置換を有するcTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、該cTnC変異体が減少したCa2+結合親和性を有する、ベクターを含む医薬組成物。
【請求項６７】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項６５又は６６記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記ベクターが、cTnC変異体をコードする核酸配列と操作可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む、請求項６７記載の医薬組成物。
【請求項６９】
リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一の発現ベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二の発現ベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、R1及びR2の過剰発現を誘導するプロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含む心筋細胞を含む、医薬組成物。
【請求項７０】
前記第一及び第二の発現ベクターが同一である、請求項６９記載の医薬組成物。
【請求項７１】
心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、
L48Qアミノ酸置換を有するcTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、該cTnC変異体が増加したCa2+結合親和性を有し、該核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを投与することを含む、方法。
【請求項７２】
前記個体が、収縮低下を生じる心臓の病態を有する、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記個体が、虚血性心疾患、心筋症又は心筋梗塞と診断されている、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
心筋症が、原発性心筋症、遺伝的心筋症及び拡張型心筋症から選択される、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記個体が、収縮機能の低下と診断されている、請求項７１記載の方法。
【請求項７６】
前記個体が、ハイパーにおける遺伝子変異を有する、請求項７１記載の方法。
【請求項７７】
β心臓ミオシン重鎖、心臓アクチン、心臓トロポニンT、αトロポミオシン、心臓トロポニンI、心臓ミオシン結合タンパク質C及びミオシン軽鎖から選択されるサルコメアタンパク質における遺伝子変異を有する個体における心臓機能の改善方法であって、
L57Q又はI61Qアミノ酸置換を有するcTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、該cTnC変異体が減少したCa2+結合親和性を有し、該核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを投与することを含む、方法。
【請求項７８】
ベクターが、リポフェクション、ステントへのコーティング又は直接注入により投与される、請求項７１又は７７記載の方法。
【請求項７９】
ベクターがカテーテルを介して投与される、請求項７１又は７７記載の方法。
【請求項８０】
ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項７１又は７７記載の方法。
【請求項８１】
前記個体が心筋症と診断されている、請求項７７記載の方法。
【請求項８２】
心筋症が肥大型心筋症である、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
図40の核酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチドが治療用タンパク質をコードする遺伝子と操作可能に連結される、発現カセット。
【請求項８４】
前記治療用タンパク質が、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット及びcTnC変異体から選択される、請求項８３記載の発現カセット。
【請求項８５】
前記ポリヌクレオチドが図40の核酸配列を有する、請求項８３記載の発現カセット。
【請求項８６】
請求項８３記載の発現カセットを含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、該ウイルスベクターがAAV6アデノ随伴ウイルスベクターである、ベクター。
【請求項８７】
請求項８３〜８５のいずれか１項記載の発現カセットを含むウイルスベクターを投与することを含む、哺乳動物における治療用タンパク質の心臓特異的発現を高める方法。
【請求項８８】
前記ウイルスベクターがAAV6アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項８７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府支援の研究又は開発の下でなされた発明の権利に関する陳述］
本発明は、国立衛生研究所により付与されたGrant Nos. HL61683、R21 HL091368、HL07828、HL65497、R01 HL64387、R01 HL084642及びP01 HL004374の下、政府支援を受けた。合衆国政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、2011年5月26日に出願された米国仮出願第61／490,450号についての35 U.S.C. §119（e）下の利益を主張し、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
心臓疾患は、米国において、死亡率及び罹患率が最も高い疾患であり、世界中で劇的に増加している8（二重下線）。心臓サルコメア疾患（例えば、HCM、DCMなど）は、複数の筋フィラメントタンパク質の一つにおけるアミノ酸変異を伴い、これは一般に心不全を引き起こし、場合によっては突然心臓死を引き起こす1,2,9（二重下線）。機能的特徴を有する変異の同定数が増えるにつれ、収縮性変化において潜在的類似性を実証するいくつかのパターンが明らかとなっている。例えば、大部分のHCM変異が、除膜（demembranated）心筋において、収縮力のCa2+感受性の増加をもたらす一方1,10−17（二重下線）、大部分のDCM変異は、力のCa2+感受性の低下をもたらす1,18−23（二重下線）。しかし、筋フィラメントCa2+感受性におけるこれらの変化が、疾患の進行とどの程度関与するかは知られていない。変化した筋フィラメントCa2+結合とSR機能との潜在的かつ重要な相互作用は、体系的に研究されておらず、他の細胞内Ca2+バッファー（例えば、ミトコンドリアなど）又は遺伝子制御との相互作用も研究されていない。
【０００４】
多くの心臓病変、並びに虚血再灌流障害及び心筋梗塞は、心筋の一部へのダメージ及び／又は死に起因して、収縮機能の低下を引き起こし、これは、心臓機能を有意に低下させる。梗塞心臓は、多くの場合、体の心臓血管に対する要求を満たさず、β−アドレナリン作動性活性化を増加させることによって代償を試みる。しかし、慢性的なβ−アドレナリン作動性刺激は、収縮予備能を使い果たし、拡張期Ca2+レベルを上昇させる可能性があり、最終的には、アドレナリン反応の下方制御がもたらされ、末期の心不全が引き起こされる8−10*。重要なことに、動物モデルと患者の両方における多数の研究により、梗塞後、筋フィラメント11−16*及び筋小胞体（SR）及び筋線維鞘17,18*のタンパク質含量及びリン酸化の両方における変化が指摘されており、これは、力の筋フィラメントCa2+感受性及びCa2+トランジェント放出／再取り込みを変化させる。同様の変化は、DCM及びHCMと関連する変異を発現する心臓でも観察されている35（二重下線）。ホルモンレベル（例えば、β−アドレナリンアゴニストなど）でのグローバルな変化は、多くの場合、これらの適応に関与するものの、そのメカニズム（1以上）は、SRと筋フィラメントタンパク質との間の細胞内相互作用に（少なくとも部分的に）起因し得る。
【０００５】
心筋梗塞、虚血／再灌流障害、糖尿病、高血圧、並びに肥大型及び拡張型心筋症を含む多くの心臓血管疾患では、心臓機能が低下する。これらの病態生理学的状態は、多くの場合、Ca2+サイクル1、β−アドレナリン反応2、及び／又は心筋細胞の収縮装置3,4を変化させる。今日まで、治療の努力は、主に[Ca2+］iを増加させることに重点を置いており、これは、催不整脈（pro−arrhythmogenic）作用を発揮し、拡張期弛緩の遅れにより心室充満を損ない5、SR Ca2+過負荷によって開始される誘発活動を生じさせる19*傾向にある。アドレナリン作動薬を伴う他のアプローチは、所望しない長期間の副作用、例えば、非標的エリアにおける重大な薬物作用、催不整脈性の誘発活動、心不全への進行を加速させる可能性2などを有し得る。従って、心臓の機能障害に有効な新規アプローチが望まれている。
【０００６】
代替的アプローチは、心臓トロポニンC（cTnC）へのCa2+結合を高め、収縮力を増加させるCa2+増感化合物の使用を伴う4。cTnCのN末端（サイトII、「トリガーサイト」）へのCa2+結合を増加し収縮活性化を高める、カルミダゾリウム、ベプリジル、レボシメンダンなどの医薬品の開発に多大な努力がなされている。このような化合物に付随するいくつかの欠点として、cTnCへの非特異性、並びにCa2+ハンドリングに関与するタンパク質21,22及び興奮収縮連関経路の他の側面5に対する悪影響が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、心臓機能を回復させるのではなく心不全の進行を遅らせることを目的とする、従来の各種薬理的及び外科的アプローチに伴う欠点を考慮すれば、心臓機能を改善する新規の方法が必要とされている。本発明は、ECカップリング6に影響を及ぼすことなく心臓の収縮を高めるためのより標的化されたアプローチ、すなわちCa2+結合特性を変化させた新規組換えcTnC変異体の作製、又は心臓収縮において代替基質として使用するための、リボヌクレオチドレダクターゼによるdATPのin situ産生若しくは投与を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［発明の要旨］
本発明の一側面は、細胞全体のdATPレベルの増加が穏やかであっても（アデニンヌクレオチドプール全体の1.0〜2％ほど低くても）、心筋収縮性の実質的な改善がもたらされるという驚くべき発見に基づく。dATPレベルの増加は、プロモーター駆動性Rrm1（リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット1）又はRrm2（リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット2）を発現するベクターを使用し、これを個体に投与するか、又は該ベクターで形質導入されたドナー細胞を宿主心筋に移植することを介する、本発明の方法により達成される。さらに、本明細書に開示する方法が、心臓の弛緩又はCa2+トランジェントに対して、それに付随する悪影響を及ぼさずに収縮性を改善でき、一見するとカルシウム感受性を増加できることは予想外であった。それどころか、心臓の弛緩は、dATPレベルが増加した結果、目に見えて速かった。心臓機能の改善は、心エコー検査（echoradiography）及びIonOptixシステムビデオ顕微鏡を介して観察されるとおり、左室内径短縮率の増加、並びに単離された心筋細胞の短縮と弛緩の程度及び速度（rate）の増加により証明された。本発明の利点は、正常又は梗塞心臓を有するマウス及びラットの研究により確認された。dATPレベルの増加は、ランゲンドルフ拍動（Langendorf−working）心臓研究において前負荷反応性を増加し、心不全を救うという効果を有した。リボヌクレオチドレダクターゼの自己制御メカニズム、すなわち、ATPによるアロステリック活性化とdATPによる阻害は、RRの過剰発現とともに、dATPレベルが毒性レベルに達することを予防することにより、別の顕著な利点も提供する。このように、本発明は、Ca2+レベル又はアドレナリン作動性シグナリングを操作する従来の治療アプローチに伴う種々の欠点、例えば、不整脈原性、拡張期弛緩の遅れによる心室充満障害、非標的エリアにおける副作用、潜在的に加速される心不全への進行などのない、新規治療アプローチを提供する。
【０００９】
本発明の別の側面は、筋フィラメントCa2+結合の変化（及び収縮特性における関連する変化）が、正常及び疾患心筋において、1）心臓の筋小胞体（SR）機能及び2）心臓パフォーマンスに対して効果を有するという発見に基づく。これらの研究のために、増加又は低下したCa2+結合親和性を有する複数のcTnC変異体を作製した。化学的に除膜した心筋又は心筋原線維に交換すると、これらのcTnC変異体は、それぞれ、力のCa2+感受性を増加及び減少させた6（二重下線）。これらのcTnC変異体（C末端にHisタグを有する）+GFPをコードするcDNAを含み、培養成体ラット心筋細胞にトランスフェクトされる、アデノウイルスベクターを刺激収縮研究のために作製し、L48Q cTnC変異体が、Ca2+結合親和性を増加させ（WT cTnCに対して）、短縮のマグニチュード及び速度を著しく増加させ7（二重下線）、Ca2+トランジェント（レシオメトリックなfura−2蛍光により測定）に対する影響がほとんど又は全くないことを実証した。意義深いことに、L48Q cTnC発現は、梗塞心臓に由来する細胞の収縮性及びCa2+トランジェント振幅特性のいずれの喪失も救った。一方、I61Q cTnC変異体は、Ca2+結合親和性の減少、短縮マグニチュード（＞60％）及び速度の減少を実証し、驚くべきことに、Ca2+トランジェントの振幅（＞20％）及び上昇速度の減少も実証した。これらのデータは、筋フィラメントCa2+結合とSR Ca2+放出との相互作用を示す。注目すべきことに、本明細書では、AAV6−L48Q cTnCの全身注入が、正常マウスの心駆出率を2週間で20％、3週間で30〜40％増加させたことを示す（図12）。
【００１０】
本発明の一側面において、哺乳動物（例えば、ヒトなど）における、心臓機能、心筋収縮性及び心筋弛緩を改善するための方法及び組成物を提供する。リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一の発現ベクターと、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二の発現ベクターとを含む心筋細胞を、治療を必要とする哺乳動物、例えば、梗塞心筋を有する哺乳動物などの心筋に移植する。第一の核酸配列及び第二の核酸配列は、R1及びR2の過剰発現を誘導するプロモーターと操作可能に連結される。いくつかの実施態様において、R1及びR2をコードする構築物は、同一発現ベクターの一部であるか、又は異なる発現ベクター上にある。いくつかの例において、プロモーターは、心臓における選択的な発現のために、心臓特異的プロモーター（例えば、cTnT455など）から選択されてよい。当業者であれば、真核（例えば、哺乳動物）細胞における発現を誘導するのに適した他のプロモーターを用いてよいことを理解するだろう。特定の実施態様において、過剰発現は、CK7プロモーター又はCMVプロモーターにより駆動される。
【００１１】
通常、細胞のdATP産生は、リボヌクレオチドレダクターゼ（R1R2）酵素の作用により、ADPのリボース環の2位からヒドロキシル部分が除去されて、dADPが産生されることにより、哺乳動物細胞内で進む。次いで、dADPはdATPへと急速に変換される。本発明の利点は、R1及びR2の過剰発現によって、リボヌクレオチドレダクターゼ複合体が形成され、最終的に、dATPがin situで産生されることにより達成され得る。
【００１２】
いくつかの実施態様において、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター、例えば、AAV6、AAV2、rAAV2／1、rAAV2／2、rAAV2／3、rAAV2／4、rAAV2／5、rAAV2／6、rAAV2／7 rAAV2／8、rAAV2／9、rAAV2／10、rAAVM41、dsAAVなどである。様々な実施態様において、発現ベクターは、形質導入レポーターをさらに含む。心筋細胞は、哺乳動物起源の、胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来してよい。いくつかの実施態様において、本方法は、ヒト幹細胞由来の心筋細胞を使用する。iPSCは、治療されるべき哺乳動物から採取された細胞（例えば、線維芽細胞など）に由来してよい。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本方法は、心筋細胞の移植前に、R1及びR2をコードする第一及び第二の発現ベクターをex vivoで該心筋細胞に形質導入することを伴う。心筋細胞の移植は、カテーテルによるデリバリーを介して達成されてよい。梗塞心筋の治療を伴う実施態様において、心筋細胞は、生存細胞を含む心筋領域（例えば、心筋の非梗塞域など）にデリバリーされてよい。
【００１４】
あるいは、哺乳動物（例えば、ヒトなど）における心臓機能並びに心筋収縮性及び弛緩の改善は、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一のウイルスベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二のウイルスベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、心臓特異的プロモーター（例えば、cTnT455など）と操作可能に連結されている、ベクターを投与することにより達成されてよい。R1及びR2をコードする構築物は、同一ウイルスベクターの一部であるか、又は異なるウイルスベクター上にあってよい。いくつかの実施態様において、ウイルスベクター（1以上）は、アデノ随伴ウイルスベクターである。ウイルスベクター（1以上）は、全身に（例えば、静脈内など）、又は局所的に（例えば、心筋内注入を介して）投与されてよい。ウイルスベクター（1以上）は、心臓特異的マーカーに特異的に結合する標的化剤をさらにコードしてよい。いくつかの実施態様において、ウイルスベクター（1以上）は、形質導入レポーターをさらに含む。さらに他の実施態様において、本方法は、L48Q cTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、該cTnC変異体が増加したCa2+結合親和性を有し、該核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターの投与をさらに含む。
【００１５】
本発明の別の側面において、哺乳動物宿主（例えば、ヒト宿主など）の心筋にdATPをデリバリーする方法を提供する。リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2を過剰発現するドナー細胞を、心筋に移植する。ある実施態様において、ドナー細胞は、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一の発現ベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二の発現ベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、R1及びR2の過剰発現を誘導するプロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含む。当業者であれば、R1及びR2をコードする構築物が、同一発現ベクターの一部であってよいことを理解するだろう。
【００１６】
dATPは、リボヌクレオチオドレダクターゼ複合体によりin situで産生され、ドナー細胞と宿主心筋細胞の間に確立されるギャップジャンクションを介して哺乳動物宿主の心筋細胞に移される。いくつかの実施態様において、dATPは、梗塞心筋にデリバリーされる。好ましい実施態様において、dATPは、生存細胞を含む心筋領域（例えば、非梗塞域など）にデリバリーされる。ドナー細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞など）の移植は、カテーテルによるデリバリーを介して達成されてよい。当業者が理解するとおり、心筋細胞は、宿主生物と適合する起源から選択される幹細胞（例えば、多能性ESC、iPSC、間葉系幹細胞など）に由来してよい。例えば、iPSCは、哺乳動物宿主から採取された細胞（例えば、線維芽細胞など）に由来する。
【００１７】
本発明のさらに別の側面において、L48Q cTnC変異体をコードするウイルスベクターを投与することによる、個体における心臓機能の改善方法であって、ここで、該cTnC変異体をコードする核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、方法を提供する。L48Q cTnC変異体は、増加したサイトII Ca2+結合親和性を有する。いくつかの実施態様において、個体は、収縮低下を生じる心臓の病態を有する。これらの方法は、心筋症、例えば、虚血性心疾患、心筋症、心筋梗塞、又は収縮機能の低下により特徴付けられるものなどと診断された個体に適用されてよい。例となる心臓病変としては、原発性心筋症、遺伝的心筋症、及び拡張型心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、治療を必要とする個体は、筋原線維収縮のCa2+感受性の低下、及び／又は拡張型心筋症の表現型と関連する、1以上の遺伝子変異を有する。このような遺伝子変異の例としては、文献で報告されるとおり、ミスセンス変異Ser532Pro及びPhe764Leu、cTnTの欠失（deltaLys210）、若しくは遺伝子MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3の変異、又はその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
あるいは、β心臓ミオシン重鎖、心臓アクチン、心臓トロポニンT、αトロポミオシン、心臓トロポニンI、心臓ミオシン結合タンパク質C及びミオシン軽鎖から選択されるサルコメアタンパク質における1以上の遺伝子変異であって、筋原線維収縮のCa2+感受性の増加、及び／又は肥大型心筋症表現型と関連するものを有する個体において、心臓機能を改善できる。このような遺伝子変異の例としては、文献で報告されるとおり、cTnTの残基92での変異（例えば、R92W、R92Q、R92L cTnTなど）、若しくはMYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3の変異、及びその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。心臓機能を改善する方法は、Ca2+増感（sensitized）遺伝子変異（1以上）を有する前記個体に、L57Q又はI61Q cTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されているものを投与することを伴う。L57Q及びI61Q cTnC変異体は、低下したサイトII Ca2+結合親和性を示し、肥大型心筋症と診断された個体の治療に使用することができる。いくつかの実施態様において、L48Q、L57Q又はI61Q cTnC変異体をコードするウイルスベクターは、例えば、リポフェクション、ステントへのコーティング、直接注入（例えば、カテーテルを介するなど）などにより投与される。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターから選択されてよい。
【００１９】
本発明のさらに別の側面において、心臓機能、及び／又は心筋収縮性、及び／又は心筋弛緩を改善するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR1をコードする第一の核酸配列を含む第一のウイルスベクター及びリボヌクレオチドレダクターゼサブユニットR2をコードする第二の核酸配列を含む第二のウイルスベクターであって、該第一の核酸配列及び第二の核酸配列が、心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを含んでよい。いくつかの実施態様において、R1及びR2をコードする構築物は、同一ウイルスベクター上、又は異なるウイルスベクター上にある。あるいは、医薬組成物は、R1及びR2をコードするウイルスベクター（1以上）で形質導入されている心筋細胞を含む。本明細書に記載の他の医薬組成物は、L48Q cTnC変異体をコードする核酸配列、及び／又はI61Q cTnC変異体をコードする核酸配列、及び／又はL57Q cTnC変異体をコードする核酸配列を有するウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、例えば、AAV6、AAV2、rAAV2／1、rAAV2／2、rAAV2／3、rAAV2／4、rAAV2／5、rAAV2／6、rAAV2／7 rAAV2／8、rAAV2／9、rAAV2／10、rAAVM41、dsAAVなどから選択されてよい。いくつかの実施態様において、ウイルスベクター（1以上）は、cTnC変異体をコードする核酸配列と操作可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。ベクターは、当業者に適切に判断されるように、標的化剤をコードする核酸配列をさらに含んでよいことが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、非処理（黒色）、WT cTnC＋GFP（青色）及びL48Q cTnC+GFP（赤色）形質導入心筋細胞の代表的な細胞長トレース（cell length traces）（A）及びCa2+トランジェント（B、Fura−2蛍光）を示す。0.5 Hzで刺激した場合の、非処理筋細胞と比較した、WT cTnC+GFP及びL48Q cTnC+GFP形質導入筋細胞の収縮性（C）及びCa2+トランジェント特性（D）におけるパーセンテージ変化を示す。Vshort＝短縮速度；FS＝短縮率；Vrel＝最大弛緩速度；RT50,90＝それぞれ、50％及び90％弛緩までの時間；FL＝蛍光；DT50,90＝それぞれ、50％及び90％Ca2+減衰までの時間。*p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（WT cTnCと比較）。
【図２】図2は、収縮特性に対する刺激頻度の効果を示す。L48Q cTnC形質導入筋細胞（黒三角）は、刺激頻度に対して、WT cTnC形質導入筋細胞（白丸）及び非処理筋細胞（黒丸）と同様の反応を示すが、全ての頻度で、短縮率（A）及び短縮速度（B）の上昇を示す。弛緩速度（C）及び90％弛緩までの時間（D）もグループ間で類似しており、弛緩までの時間は、刺激頻度が増加するにつれて短くなる。*＝p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（WT cTnCと比較）、‡＝p＜0.05（全てのグループについて0.5 Hzと比較）。
【図３】図3は、Ca2+ハンドリング特性に対する刺激頻度の効果を示す。L48Q cTnC形質導入筋細胞（黒三角）は、最小（A）及び最大（B）蛍光において、刺激頻度に対して、WT cTnC形質導入筋細胞（白丸）及び非処理筋細胞（黒丸）と同様の反応を示す。心筋細胞の弛緩と同様に、50％（C）及び90％（D）Ca2+トランジェント減衰までの時間は、刺激頻度の増加とともに短くなる。*＝p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（WT cTnCと比較）、‡＝p＜0.05（全てのグループについて0.5 Hzと比較）。
【図４】図4は、短縮率を最大fura蛍光（ピークCa2+）で割ったものとして評価される収縮効率により、L48Q cTnC形質導入心筋細胞（黒三角）が、全ての刺激頻度において、Ca2+に対して有意に高い感受性を示す一方、WT cTnC形質導入心筋細胞（白丸）は、非処理心筋細胞（黒丸）と比較して、Ca2+に対する反応性が低いことを示す。*＝p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（WT cTnCと比較）。
【図５】図5では、抗cTnC（A）でプローブされたWT及びL48Q cTnC−His形質導入新生児心筋細胞のウエスタンブロットにより、総cTnC筋フィラメント含量を示す一方、抗His（B）でプローブされたものにより、細いフィラメントへのL48Q cTnの組込みを示す。デンシトメトリーにより、天然cTnCの58±7％がL48Q cTnCに置き換えられたことが示された。
【図６】図6は、非処理（黒色）、GFPのみ（緑色）及びRrm1＋Rrm2＋GFP（赤色）形質導入心筋細胞の代表的な細胞長トレース（a）及びCa2+トランジェント（b、Fura−2蛍光）を示す。0.5 Hzで刺激した場合の、非処理筋細胞と比較した、GFPのみ及びRrm1+Rrm2+GFP形質導入筋細胞の収縮性（c）及びCa2+トランジェント特性（d）におけるパーセンテージ変化を示す。Vshort＝短縮速度；FS＝短縮率；Vrel＝最大弛緩速度；RT50,90＝それぞれ、50％及び90％弛緩までの時間；FL＝蛍光；DT50,90＝それぞれ、50％及び90％Ca2+減衰までの時間。*p＜0.05（非処理と比較）。
【図７】図7は、収縮特性に対する刺激頻度の効果を示す。Rrm1+Rrm2形質導入筋細胞（白三角）は、刺激頻度に対して、GFPのみ形質導入した筋細胞（白丸）及び非処理筋細胞（黒丸）と同様の反応を示すが、全ての頻度で、短縮率（A）及び短縮速度（B）の上昇を示す。弛緩速度（C）及び90％弛緩までの時間（D）もグループ間で類似しており、弛緩までの時間は、刺激頻度が増加するにつれて短くなる。*＝p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（GFPと比較）、‡＝p＜0.05（全てのグループについて0.5 Hzと比較）。
【図８】図8は、Ca2+ハンドリング特性に対する刺激頻度の効果を示す。Rrm1+Rrm2形質導入筋細胞（白三角）は、最小（A）及び最大（B）蛍光において、刺激頻度に対して、非処理筋細胞（黒丸）と同様の反応を示すが、GFPのみ形質導入した筋細胞（黒丸）は、頻度が増加するにつれて、ともに顕著な増加を示した。心筋細胞の弛緩と同様に、50％（C）及び90％（D）Ca2+トランジェント減衰までの時間（DT）は、刺激頻度の増加とともに短くなるが、R1R2形質導入心筋細胞では、両方とも劇的に短くなる。*＝p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（GFPと比較）、‡＝p＜0.05（全てのグループについて0.5 Hzと比較）。
【図９】図9は、短縮率を最大fura蛍光（ピークCa2+）で割ったものとして評価される収縮効率により、Rrm1+Rrm2形質導入心筋細胞（白三角）が、全ての刺激頻度において、Ca2+に対して有意に高い反応性を示す一方、GFPのみ形質導入した心筋細胞（白丸）は、非処理心筋細胞（黒丸）と比較して、2 Hzの刺激頻度においてのみ、Ca2+への反応性が低いことを示す。*＝p＜0.05（非処理と比較）、†＝p＜0.05（GFPと比較）。
【図１０】図10（A）は、抗Rrm1抗体でプローブされた、Rrm1トランスフェクト新生児ラット心筋細胞のウエスタンブロットにより、Rrm1が＞24倍増加したことを示す。図10（B）は、抗Rrm2抗体でプローブされた、Rrm2トランスフェクト新生児ラット心筋細胞のウエスタンブロットにより、Rrm2が＞46倍増加したことを示す。Rrm1+Rrm2過剰発現は、HPLC分析により評価されるとおり、新生児ラット心筋細胞において、細胞内［dATP］を＞10倍有意に増加させた。*＝p＜0.05（GFP形質導入心筋細胞と比較）。
【図１１】図11は、AV−cTnCトランスフェクト心筋細胞の短縮（A）及びCa2+（B）トレースを示す：非梗塞（WT cTnC、黒色）、梗塞コントロール（WT cTnC、赤色）及び梗塞（L48Q cTnC、緑色）。
【図１２】図12は、非処理（UN；n＝5）と、低用量（L；n=3）又は高用量（H；n=3）AAV6−L48Qとの2週間（左）及び3週間（右）でのLV駆出率を示す。
【図１３】図13は、AAV6 L48Q cTnC注入マウス心臓組織（左）及び非注入コントロール（右）についての抗cTnCウエスタンブロットを示す。
【図１４】図14は、AVトランスフェクト細胞の明視野像（左）及び蛍光像（右）を示す。
【図１５】図15は、トランスジェニック動物（表示のとおり）由来の心筋組織のウエスタンブロット分析を示す。FlagタグcTnCは、より高い分子量として示され、flagタグと非タグcTnCとのデンシトメトリー分析は、Tg動物において、天然cTnCの40〜50％の置換を示す。
【図１６】図16は、LV機能の心エコー検査（A〜C）及び拍動心臓（working heart）測定（D）を示し、梗塞後の機能喪失を実証する。
【図１７】図17は、刺激なしに対して1 Hz（30時間）を用いた場合の細胞の収縮及びCa2+トランジェント特性の増加パーセントを示す。
【図１８】図18は、WT cTnC（黒色）に対してL48Q cTnC（青色）を用いた場合に、Ca2+トランジェント（rhod−2）がより急速に減衰することを示す。
【図１９】図19（A）は、WT、I61Q（青色）又はL48Q（赤色）cTnCでの交換後、pCa を8から3.5から8へと急速に溶液交換した場合の心筋原線維の活性化及び弛緩動態を示す。図19（B）は、L48QとWT cTnCについての、高分解能での弛緩トレースを示す。
【図２０】図20（A）は、非処理及びL48Q cTnC−His形質導入心筋細胞の筋フィラメントの銀染色を示し、細いフィラメントタンパク質化学量論の維持を実証する。図20（B）では、抗cTnCを用いたウエスタンブロット（左パネル）により、cTnC筋フィラメントの総含量を示す一方、抗Hisを用いたもの（右パネル）により、デンシトメトリーを介して、細いフィラメントへのL48Q cTnCの組込みが58±7％であることを示す。
【図２１】図21は、WTとI61Q cTnCトランスフェクト心筋細胞について、筋原線維リン酸化プロファイルを示す。図21（A）は、抗ホスホセリンウエスタンブロットを示す。図21（B）は、総タンパク質を示すSDSクマシーブルー染色を示す。図21（C）は、リン酸化を示すPro−Q Diamondを示す。いずれの差も観察されなかった。
【図２２】図22は、スペックルトラッキング心エコーを用いた、放射方向のストレイン及びストレイン速度を示す。図22（a）は、放射方向のストレインに対する分析のために、前壁、側壁、後壁、下壁及び中隔心臓セグメントを示す、色分けされた領域とともに中央心室短軸像を示す（左上欄、矢印は収縮期ピーク（S）を示す；各ラインは、色分けされたセグメントに相当する）。図22（b）は、収縮期及び2つの拡張期（拡張初期（E）及び拡張後期（A））における放射方向のストレイン速度を示す。
【図２３】図23は、ローディングコントロールとしてのGAPDHとともに、R1（A）及びR2（B）に対するウエスタンブロットを示す。トランスフェクト心筋細胞［dATP］のHPLC（C）を示す。
【図２４】図24では、長さ（A）及びCa2+（B）トランジェントにより、GFP及び非処理コントロールに対して、R1R2トランスフェクト細胞において、Ca2+が変化することなく、短縮が増加したことが示される。
【図２５】図25は、短縮の程度（A）及び速度（B）、50％弛緩までの時間（C）及び最大Ca2+放出（D)が、梗塞心臓由来の心筋細胞において、全て抑制されるが、AV−R1R2形質導入によって、コントロールよりも救助又は改善されることを示す。
【図２６】図26（A）は、AV−R1R2尾静脈注入マウス及び心臓直接注入マウスについて、注入4日後、コントロールと比較して左室内径短縮率が増加したことを示す；図26（B）は、注入されたLVを示し、明るい緑色蛍光（GFP由来）によって示される局所的な感染領域を実証する。
【図２７】図27は、コントロール同腹子に対するR1R2過剰発現マウスの、短縮率増加のパーセンテージ（A）及び左心室内径の変化（B）を示す。d−拡張期、s−収縮期。
【図２８】図28は、LV圧力−容積関係（A）及び高［Ca2+］チャレンジに対するLV圧力反応（B）を示す。
【図２９】図29は、ベースライン及び高［Ca2+］チャレンジ後の、WT（A）及びTG−R1R2（B）心臓のNMRスペクトル、並びにPCr／ATP比率（C）を示す。ベースラインでのATP／HW比率（挿入図）。
【図３０】図30は、ATP及びdATPを用いたマウス大動脈平滑筋収縮トレース（A）及びデータの要約（B）を示す。
【図３１】図31は、マウス心臓組織に注入したAAV6 L48Q cTnC（左）及び非注入コントロール（右）についての抗cTnCウエスタンブロットを示す。
【図３２】図32は（A）R1及びR2、並びに（B）ローディングコントロールとしてのα−チューブリンについてのウエスタンブロットを示す。
【図３３】図33は、サンプル心筋原線維活性化及び弛緩トレース（左）を示す。拡大された弛緩の遅速期（右）。張力の上昇速度（rate of tension rise）（kACT）。弛緩の遅速期（kREL,slow）。弛緩の急速期（kREL,fast）。遅速期継続時間（tREL,slow）。
【図３４】図34は、LV機能の心エコー検査（A〜C）及び拍動心臓測定（D）を示し、梗塞後の機能喪失を実証する。
【図３５】図35は、培養hESC心筋細胞への標識dATPの細胞注入（10秒間（A）及び4分間（B））を示す。R1R2過剰発現心筋細胞との共培養は、野生型（レシピエント）筋細胞の収縮特性を高める（C）。hESC−CMを、AV−R1R2又はAV−GFPのいずれかで形質導入し、これらの形質導入筋細胞を野生型（WT）、非形質導入hESC−CMと共培養した。AV−R1R2＋GFP形質導入筋細胞（「dATPドナー細胞」、青色トレース）及び非形質導入筋細胞（WT dATPレシピエント、赤色）の共培養におけるパートナーはともに、その対応するコントロール、すなわち、AV−GFP形質導入（「コントロールドナー」細胞、緑色）又は後者のWTレシピエント（黒色）よりも、高い収縮性を示した。*＝p＜0.05（コントロールに対して）。
【図３６】図36Aは、AAV6−R1R2cTnT455注入（4.5 e13）マウス及びコントロールマウスの、平滑筋、肺及び心臓におけるR1及びR2サブユニットの発現レベルについての予備的なウエスタンブロットの証拠を示す。図36は、20ヶ月後の、非注入マウス（B）とAAV6−アルカリホスファターゼ注入マウス（紫色；C）36由来の心臓組織のデータを示し、AAV6−R1R2cTnT455が、安定で長期にわたるR1R2過剰発現を提供するであろうことが示唆される。
【図３７】図37は、3月齢マウス（グループあたりn＝6）におよそ10倍範囲にわたり全身注入された、1.5 e13、4.5 e13、1.35 e14 AAV6−R1R2cTnT455ベクターゲノム又は生理食塩水（コントロール）のLV機能に対する効果を示す。
【図３８】図38は、心エコー検査により測定されるとおり、梗塞5日後にAAV6−R1R2を心臓に直接注入したラットにおける、非処理梗塞ラット及び非処理偽手術ラットと比較した、短縮率の変化を示す。
【図３９】図39は、図38で評価されるラット心臓のin vitro Neely拍動心臓測定（Neely working heart measurements）を示す。Y軸上の力をg・cm／分の単位とする。梗塞している心臓（心不全）の前負荷反応性の喪失（非処理）、及びベクターを受けた梗塞心臓の前負荷反応性が、コントロール非梗塞心臓レベルまで回復したことが観察され、それにより、心臓機能の回復が実証される。
【図４０】図40は、本発明の例となる実施態様で使用するcTnT455心臓特異的プロモーターの核酸配列を示す。
【００２１】
［発明の詳細な説明］
I．緒言
心不全に対する現在の薬物療法の多くは、細胞内[Ca2+］（[Ca2+］i）代謝を標的としており、これは、不整脈原性などの重大な副作用、又は拡張機能に対する有害な作用を有し得る。一側面において、本発明は、[Ca2+］iと独立して、無傷の心筋細胞の収縮を高めるために、直接標的化された心臓の細いフィラメントのための方法を提供する。具体的には、本明細書において、増加したCa2+結合親和性を有するように設計された（単一のアミノ酸置換（L48Q）により与えられる）心臓トロポニンC（cTnC）変異体を、アデノウイルスを介して過剰発現することにより、心臓の細いフィラメントの活性化が高められたことを示す。スキンド心臓肉柱（skinned cardiac trabeculae）及び筋原線維において、天然cTnCをL48Q cTnCに置換すると、力のCa2+感受性及び力発生の最大速度が増加することが我々及び他の人により示されている。従って、一実施態様において、心臓の細いフィラメントを直接標的とすることにより、無傷の心筋細胞の収縮を高める方法を提供する。
【００２２】
一側面において、本発明は、細胞療法及び遺伝子療法を組み合わせた新規治療アプローチを提供し、例えば、心不全患者などにおいて、心臓パフォーマンスを改善することを意図する。心不全に対する既存療法は、臓器全体の移植を除けば、通常は、細胞内カルシウムシグナリングの薬理学的処置を介して、不都合な心室リモデリングを弱めるか、又は残っている心筋細胞の力発生を高めるかのいずれかに向けられる。前者のアプローチが、典型的には、疾患進行が初期の患者に対してのみ有用である一方、後者のアプローチは、オフターゲットの効果（例えば、不整脈の増加など）により複雑化する。近年、心臓修復を達成する代替手段として細胞移植にかなりの関心が払われているが、このような試みは、用いられる細胞の心臓ポテンシャルが低いこと、及び／又は形成される移植心筋量が相対的に少ないことにより、今日まで限定されている。多能性ヒト胚性幹細胞（ESC）又は関連する人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞は、前臨床試験において、かなりの見込みを示し、少なくとも部分的には宿主筋肉に組み込まれるヒト心筋インプラントを形成する。しかし、繰り返して言うが、形成される移植片は、通常極めて少なく、心拍出量を有意に改善するのに十分な力発生ユニットに貢献しそうもない。
【００２３】
一実施態様において、本発明は、これらの多くの欠点を克服し得る、心不全に対する新規アプローチを提供する。本明細書に示すとおり、2デオキシ−ATP（dATP）の細胞質レベルの増加は、クロスブリッジ結合及び周期的動態（cyclic kinetics）を高め、結果として、細胞内カルシウムを撹乱することなく、非常に高い収縮特性がもたらされる。dATPの濃度は、遺伝子療法アプローチを使用し、その産生の律速酵素であるリボヌクレオチドレダクターゼ（RR）を強制的に過剰発現させることにより、不全心筋細胞において増加させることができる。本明細書で実証するとおり、左心室（LV）壁の小さな領域に限定したトランスフェクション（ウイルスベクターの直接注入により）により、LV機能の実質的な増加がもたらされる。
【００２４】
別の実施態様において、dATPは直ちにギャップジャンクションを通過し、力の増強のために低い濃度しか必要としない（細胞アデニンヌクレオチドプールの≦1％）ため、本発明は、RRを過剰発現するように遺伝子組換えされた細胞であって、標的宿主心筋とギャップジャンクション連結を形成できる第二の細胞タイプを移植することにより、不全心筋にdATPをデリバリーする方法を提供する。ヒトESC又はiPSC由来の心筋細胞は、このような遺伝子組換えに対する従順性、驚異的な増殖能力、及び適切なコネキシンアイソフォームを発現する、安定した心臓内インプラントを形成する能力から、理想的なdATPドナーを示す。例えば、一実施態様において、皮膚線維芽細胞を心不全患者から得、これをiPSCにリプログラミングし、次いで、心臓特異的プロモーターがRRの発現を駆動する構築物を挿入することにより改変する。一実施態様において、この方法は、構築物を挿入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼを介した遺伝子導入（よく特徴づけられた、ゲノム内の「セーフハーバー」遺伝子座（「safe−harbor」locus）の標的化が可能）を使用する。適切に標的化されたiPSCクローンをスクリーニング及び増殖させた後、これらの細胞を心筋細胞に分化させ、次いで、不全心臓に移植（例えば、カテーテルの使用によるなど）する。有利なことに、この戦略は、大きな心臓移植片の形成を必要とせず、移植片を梗塞瘢痕の好ましくない環境内に移植する必要もない。それどころか、移植の目的が、dATPをデリバリーすることにあり、力を産生することではないので、血管に富んだ遠位の心筋に移植されるわずかな移植片で十分であり得る。これは、数多くの潜在的アプローチの一つにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。例えば、ある実施態様において、他のドナー細胞タイプ（例えば、間葉系幹細胞など）を、本明細書で提供する方法で使用してよい。同様に、ある実施態様において、他の遺伝子導入法（例えば、トランスポゾン、プラスミド、ウイルスデリバリーなど）を用いてもよい。
【００２５】
別の側面において、本発明は、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター駆動性Rrm1又はRrm2を発現するアデノウイルスベクターを提供する。一実施態様において、ベクターは、形質導入レポーターとして、緑色蛍光タンパク質（GFP）をさらにコードする。培養した成体ラット心筋細胞をこれらのベクターで形質導入し、48時間のウイルスインキュベーション期間後、ビデオ顕微鏡により、筋細胞の収縮及び弛緩の速度及び程度、並びにCa2+トランジェントの上昇と減衰（Fura2蛍光）をモニタリングした。これらの処置は、0.5 Hz、1 Hz及び2 Hzの刺激時に、Ca2+トランジェントに対して最小限の効果で、細胞［dATP］、短縮の速度及び程度、並びに弛緩の速度を有意に増加させたことを本明細書に示す。従って、一実施態様において、本発明は、アクチン−ミオシンクロスブリッジサイクルを有意に変化させ得る、心臓の細胞内RR及び／又はdATPプールを変化させることにより、拡張機能を損なうことなく、心臓の収縮性を高める方法を提供する。
【００２６】
別の側面において、本発明は、in vivo収縮性を改善するためのヌクレオチド操作の最初の使用を提供する。収縮基質としてのdATPの使用は、筋フィラメントのケモメカニカルトランスダクションを調査するための方法として、15年以上前にDr. Regnierによって初めて研究された。しかし、心筋細胞の機能を改善するためにdATPを適用することは、Ca2+ハンドリングの効果、代謝経路、心疾患の改善を含む（これらに限定されない）研究に対して新たな道を開く可能性を秘めている。さらに、最小限の侵襲性で、より大きな動物モデル及びヒトに拡張可能な標的デリバリー方法も提供する。
【００２７】
dATPの効果に関する最初の研究は除膜骨格筋で実施され、その結果、Ca2+感受性の有意な増加がもたらされたが、最大Ca2+活性化力に変化はなかった。心筋におけるその後の研究はより劇的であり、dATPは、力のCa2+感受性を増加させただけでなく、最大Ca2+活性化力のマグニチュードも約40％増加させた。これらの結果は、心筋収縮の制御は、アクトミオシン活性の変化の影響をより受けやすいことを示唆しており、筋フィラメント標的アプローチのため、心臓特異的な差別的利点を提供する。そこで、我々は、心筋細胞におけるdATP産生を上方制御しようとした。無傷細胞及びin situ研究における課題は、収縮の増加を生じさせるのに十分な細胞内［dATP］を増加させることであった。この課題は、ADPをdADPに変換する天然に存在する酵素（リボヌクレオチドレダクターゼ；R1R2）（dADPは、次いでホスホクレアチンキナーゼによりdATPへと急速にリン酸化される）を過剰発現することにより克服された。Schoffstallら（2006）は、わずか10％の［dATP］（90％［ATP］）が、除膜心臓組織及び単離された収縮性タンパク質の収縮を増加させたと報告しており23*、少ないdATPレベルが無傷の心筋細胞の収縮を増加させ得ることを示唆した。予想外にも、本明細書にて、心筋細胞及び心臓の機能的増強には著しく少ないdATPしか必要とされないことを示す。
【００２８】
II．実験的発見
A．L48Q cTnCの発現は心臓収縮性を高める
ビデオ顕微鏡を用いて、細胞長（CL）及びCa2+（Fura2トランジェント）をモニタリングしたところ、L48Q cTnCの発現（GFPとの共発現により同定される）により、形質導入されていない成体ラット心筋細胞と比較して、Ca2+トランジェントを変化させることなく、短縮の速度及び程度が有意に増加した（それぞれ、33％及び48％）。これらの差は、WT cTnCを形質導入した心筋細胞と比較した場合にさらに劇的であった。重要なことに、弛緩の速度は、他の全てのグループと比較して、L48Q cTnCの存在により影響されなかった。L48Q cTnCの発現及び細いフィラメントへの組込みは、形質導入された心筋細胞の筋原線維をウエスタンブロット分析することにより確認し、天然cTnCの約58％がL48Q cTnCに化学量論的に置き換えられたことが示された。
【００２９】
これらの実験は、弛緩を変化させ損なうことなく心臓の収縮性を高めるために、心臓の細いフィラメントタンパク質を直接標的とすることの実現性を実証する。
【００３０】
この研究の目的の一つは、L48Q cTnCを無傷の心筋細胞で発現させ、筋フィラメントに組み込んだ場合に、心筋細胞の弛緩又はCa2+トランジェント特性に悪影響を及ぼすことなく、収縮性を増加させることができるかを決定することであった。実施例1〜6に示すとおり、L48Q cTnCを過剰発現させると、天然cTnCの58±7％がL48Q cTnCへと置き換えられ、これにより、筋細胞の短縮の程度及び速度、並びに筋細胞弛緩の速度が劇的に増加した一方、Ca2+トランジェント特性に対して明確な作用はなかった。我々は、最低で42％、最高で70％の置き換えを観察したが、これら組込みレベルの間に機能的に有意な差は観察されなかった。
【００３１】
スキンド心臓肉柱を用いた以前の実験では、天然cTnCとL48Q cTnCの受動的な交換は、飽和［Ca2+］（pCa 4.0）を除く全てのCa2+活性化レベルで、力発生及び短縮のマグニチュード及び速度を増加させたことが示されたが、これらの研究は、筋調製物中、天然cTnCを100％置き換えて実施していた。無傷の心筋細胞を用いた今回の研究では、我々は、L48Q cTnCの発現が、天然cTnCを100％置き換えるとは予期していなかった。その一方で、機能の獲得を調べるために、約15〜25％の天然cTnCの置き換えに取り組むためL48Q cTnCレベルを増加させる必要があると予期していた。というのも、これは、我々が以前に、ウサギ腰筋線維において、力のCa2+感受性の有意な増加を調べるのに必要であると決定したTnC（M80Q sTnCF27W）の割合であったからである16。この最小値を遥かに上回ったという事実は予想外であり、これは、有意な機能の増加を観察するのに必要なウイルス量が、本研究で適用されたものよりも少なくてよいことを示唆する点で興味深い。レンチウイルスやAAV6などの異なるウイルス構築物を用いた確実性（robust）の低い遺伝子導入、又はより低い感染多重度でも、有意な機能的改善を依然として達成し得る可能性がある。これは、組織炎症などネガティブな副作用の可能性を避けるための利点である。将来研究では、有意な機能的改善を生じるのに必要なL48Q cTnCの最小量や、この最小量を満たすのに必要なウイルス粒子負荷がどのようなものであるかに焦点をあてるべきである。さらに、他のcTnC変異体が、Ca2+結合親和性を変化させ、力のCa2+感受性及び力発生の速度を増加させる（最大下（submaximal）［Ca2+］にて）が示されており17、従って、これも様々な病的状態に対する治療可能性を有し得る。
【００３２】
治療手段としてのL48Q cTnCの可能性は、特に、タンパク質18又は薬理学的19,20手段を介した筋フィラメントCa2+感受性の増加が、活動電位の挙動を変化させ、不整脈原性のリスクを増加させることを考慮すれば、Ca2+トランジェントの挙動（又は自己律動性（autorythmicity））に対する有意な効果がないという点で有望である。これは、WT cTnC＋GFPが形質導入された心筋細胞において、最小及び最大Ca2+の差が小さい（1 Hzで有意）ことを考慮すれば予想外であった。この効果が、WT cTnCによるのか、それともGFPによるのかについては、この研究では詳細に試験されていなかったが、別の研究から得られた結果は、成体ラット心筋細胞にGFPのみをトランスフェクトすると、特に最も高い刺激頻度にて、最小及び最大Ca2+が有意に増加することが示されている21。従って、この効果は主にGFPに起因し得、cTnCの過剰発現によって部分的に無効化される。いずれにせよ、L48Q cTnCの発現により、形質導入されていない心筋細胞と差異がない最小及び最大［Ca2+］がもたらされた。従って、L48Q cTnC発現の効果は、少なく見積もられている可能性がある。そうであるなら、GFP不在下でのL48Q cTnCの発現は、1）最小［Ca2+］を低下させ、高められた弛緩をもたらし、かつ2）最大［Ca2+］を低下させる傾向にある。これは、所定量のCa2+放出について、さらなる短縮により、収縮効率の測定を増加させる。興味深いことに、Limらは、特発性拡張型心筋症と関連する変異TnC（E59D, D75Y）を過剰発現する成体ラット心筋細胞が、収縮性を顕著に減少させた一方、細胞内Ca2+ホメオスタシスには何の影響も及ぼさなかったことを示しており22、Ca2+トランジェントの挙動に影響を及ぼすことなく、細いフィラメントのCa2+結合親和性を操作可能であることが実証される。
【００３３】
L48Q cTnC変異体を使用することの明らかな利点は、収縮を改善しつつ、より高い刺激頻度でも筋細胞の弛緩に影響を及ぼさず、さらには高めたことにある。Ca2+結合親和性の増加によって、細いフィラメント活性化の延長がもたらされ、従って、クロスブリッジの付着も延長され得、これにより弛緩が妨げられたことが示されている23。収縮の延長及び拡張期弛緩の遅れは、in vivoにおける重篤な機能的結果を有し、拡張期充満を低下させ、結果として心拍出量を低下させ得る。例えば、我々は、心筋原線維の弛緩速度は、L48Q cTnCの約100％の交換後にわずかに増加した（WT cTnC交換との比較）ことを報告した。これは、クロスブリッジの解離（detachment）に依存すると考えられる遅速期（slow phase）の継続時間がわずかに延長されることによるものであった9。しかし、これらの研究が、等尺性条件下で実施された一方、この研究における無傷の筋細胞は、自由に短くなることが可能であった。これらの条件下、弛緩測度は、チチンにより供給される復元力による影響も受け、これは、サルコメアの短縮として直線的に増加する24。本研究で観察される弛緩測度は、細胞短縮率とおおよそ相関する。短縮の増加で予期されるようにL48Q cTnCでは弛緩速度がより速くなったので、これは、L48Q cTnCがクロスブリッジの付着を延長しないことを示すようである。また、弛緩に影響を及ぼすことなく短縮を改善するためには、内因性cTnCの42〜70％をL48Q cTnCに置き換えれば十分であり、それ以上の置き換えは、弛緩に悪影響を及ぼし始め得る可能性もある。さらに、L48Q cTnCの弛緩に対する効果はいずれも、無傷の心筋で生じる最大下［Ca2+］にて低減又は排除され得、効果は、in vivoで遭遇するものなど、負荷される条件下（ストレイン（strain））で異なり得る。
【００３４】
結論として、これらの実験は、拡張機能又はCa2+トランジェントの挙動を変化させることなく、心臓の収縮性を高めるために、心臓の細いフィラメントタンパク質を直接標的化する可能性を実証する。一側面において、上記で概要を述べた戦略を用いて、機能的に欠損した又は病気の心筋由来の心筋細胞を治療してよい。
【００３５】
B．外因性RR複合体の発現は心臓収縮性を高める
［dATP］を増加させるR1及びR2を過剰発現するアデノウイルスベクター（AV−R1R2）をマウス尾静脈又は心臓に直接注入することにより、3〜4日以内に左心室（LV）短縮率及び駆出率が有意に増加（40〜50％）（図27）することを本明細書に示す。興味深いことに、R1R2を過剰発現する8月齢のトランスジェニックマウスを心エコー検査したところ、WT同腹仔と比較して、類似したLV機能の増強が実証され（図27）、心臓病変が外見上見られなかったことから、このアプローチの許容性（tolerance）が示唆される。この増強は、さらに予備的な血流力学実験（Millar）及びランゲンドルフ灌流心実験によっても支持された。重要なことに、予備的なNMR測定は、パフォーマンスの上昇により、たとえ高い［Ca2+］又はドブタミン負荷であっても、エネルギー保存が消費されないことを示唆する。最終的に、dATPは、マウス大動脈平滑筋の収縮を変化させず（ATPとの比較；（図30））、血管緊張の変化は、血流力学パラメーターにおけるいずれの潜在的変化の基礎になりそうもないことが示唆される。
【００３６】
細胞長及びレシオメトリック（fura2）Ca2+蛍光をビデオ顕微鏡によりモニタリングした。Rrm1＋Rrm2過剰発現心筋細胞では、非処理心筋細胞と比較して、0.5 Hz刺激時に、短縮の程度は約40％増加し、最大短縮速度は約80％増加した。最大弛緩速度も、Rrm1＋Rrm2（＋GFP）過剰発現では約150％増加し、結果として、非処理心筋細胞よりも50％弛緩までの時間が減少した。これらの差は、GFPのみを形質導入した心筋細胞と比較した場合、さらにより劇的であった。興味深いことに、Rrm1＋Rrm2過剰発現は、最小又は最大細胞内［Ca2+］（Fura2蛍光）に対して効果を有さなかったことから、収縮性の増加は、筋小胞体からのCa2+放出を変化させることなく、主に筋フィラメント活性を増加させることによるものであることが示される。さらに、機能的増強は、刺激頻度が増加した場合（1 Hz及び2 Hz）、Rrm1＋Rrm2過剰発現で維持された。HPLC分析は、細胞［dATP］が、トランスフェクション後におよそ10倍増加し、アデニンヌクレオチドプールの1％よりもわずかに高くなったことを示した。
【００３７】
これらの実験は、最小又は最大Ca2+に影響を与えることなく、心臓の収縮性及び弛緩を高めるために、アクチン−ミオシンクロスブリッジを直接標的とすることの実現性を実証する。
【００３８】
本研究の目的の一つは、リボヌクレオチドレダクターゼ（Rrm1+Rrm2）の過剰発現が細胞［dATP］を増加させるか、また、それに応えて、心筋細胞の弛緩に悪影響を与えることなく、無傷の心筋細胞において収縮性を増加させるかを測定することであった。Rrm1+Rrm2を過剰発現させると、アデニンヌクレオチドプール全体の約1.0〜1.5％へと細胞［dATP］が増加し、これは、Ca2+トランジェント特性に対して明確な作用を有することなく、筋細胞短縮の程度及び速度、並びに筋細胞弛緩の速度を劇的に増加させた。
【００３９】
スキンド心臓肉柱を用いた以前の実験では、飽和［Ca2+］（pCa 4.0）を含む全てのCa2+活性化レベルにおいて、dATPが、等尺性力、並びに力発生及び短縮の速度を増加させたことが示されたが、これらの研究では、浴液（bathing solution）中、5 mMのATPが5 mMのdATPに100％置換されていた7,8,20。無傷の心筋細胞における今回の研究では、Rrm1＋Rrm2の過剰発現が、高（mM）レベルのdATPをもたらすとは予期しなかった。その一方で、機能の獲得を調べるために、［ATP］の約10％に達するためdATPレベルを増加させる必要があると予期していた。というのも、これは、除膜心筋において、機能の差を調べるのに必要とされる、ATPに対するdATPの割合であったからである21。実際に、ニワトリ胚心筋細胞での以前の実験では、有意な収縮の増強を達成するためには、ATPの約1／3をdATPに置き換えることが必要であり得ることが示唆された22。驚くべきことに、観察された収縮性の大幅な増加は、心筋細胞［dATP］の相対的に小さな増加によって生じた。これにより、機能的に有意な増加を得るために必要とされるウイルス量は、この研究で適用されたものよりも少なくてよいことが示唆される。この利点は、Rrm1＋Rrm2の過剰発現を少なくすることにより、ネガティブな副作用の可能性が抑えられ得ることにある22,23。容易にトランスフェクトされないか、あるいはRrm1＋Rrm2のより少ない過剰発現をしない、コンタミネーションされた細胞（例、線維芽細胞など）の低集団が存在した可能性があり、これは、HPLC分析から、心筋細胞［dATP］の過小評価を導き得る。しかし、培養中、非心筋細胞が相対的に不足していることを考慮すれば、この混同効果は最小限であるはずである。
【００４０】
理論に拘束されるものではないが、どの程度相対的に少ない量の総dATPが、心筋細胞の機能に対してこのような劇的な効果を有し得るかを推測することは興味深い。収縮効率の評価（estimation）（図9）は、Rrm1＋Rrm2形質導入筋細胞における収縮性の増加が主に筋フィラメントに基づくことを示し、従って、dATPは、おそらく、主としてクロスブリッジサイクリングを改善することによって、その効果を有する。これは、通常は遅い（ベータ）ミオシンを発現する心筋細胞において、速い（アルファ）ミオシンを発現させた場合に、結果として、Ca2+トランジェントの振幅に対して何の作用も有することなく機能の増強がもたらされた実験と類似する。この研究で起こった［dATP］の増加とともに筋フィラメント活性が増加するという背景にあるメカニズムは、ATPと比較した濃度が、まだわずか約1％であったことから、複雑である。
【００４１】
骨格筋ミオシンを用いた研究で、我々は、ミオシンによるγ−ホスフェート切断の平衡（cleavage equilibrium）はATPとdATPで類似するが、加水分解後のクロスブリッジ結合及びクロスブリッジ解離速度は、dATPで増加することを示している24。これにより、スキンド骨格筋において、張力発生のCa2+感受性が増加し、張力発生速度及び短縮速度が速くなることが説明できる24−26。我々は、心筋において、dATPを用いた詳細なケモメカニカル分析は実施していないが、これが、ktr及び非負荷の短縮速度の増加に加えて、最大クロスブリッジ結合（剛性測定から示されるとおり）及び等尺性力を≧40％増加させることを示している20。我々はまた、除膜心筋が、主として、α−ミオシン重鎖を発現しているか、あるいはβ−ミオシン重鎖を発現しているかに関わらず、dATPが、全てのCa2+レベルで、心筋において等尺性力及びktrを有意であったことを示している8。骨格筋とは異なって、心筋単収縮の間の細胞内［Ca2+］は、最大活性化範囲のおよそ半分の範囲内のレベルに達するのみであることから、これは重要である。培養した心筋細胞を用いた今回の実験では、dADP.Piを含むミオシンS1頭部の結合のわずかな増加は、細いフィラメント活性化を協調的に増加させるのに十分であり、結果として、短縮のマグニチュード及び速度が増加したのかもしれない。
【００４２】
Rrm1＋Rrm2の過剰発現（及びその後の［dATP］の増加）は、弛緩に対して悪影響がなく、実際に筋細胞の弛緩は強められた。これは、少なくとも部分的には、Ca2+トランジェントの急速な減衰に起因した可能性がある。dATPは、他のATPアーゼ（ミオシンに加えて）、例えば、筋小胞体Ca2+ATPアーゼ（SERCA）、細胞膜Ca2+ATPアーゼ（PMCA）、ナトリウム／カルシウム交換体（NCX）などにより使用される可能性があった。SERCA活性の増加は、特に0.5 Hz及び1.0 Hz刺激時に、Ca2+トランジェントの減衰速度が増加したことを説明し得る。しかし、SERCA活性の増加は、活性化の間にCa2+の放出を容易にする、SR Ca2+ストアを高めることが知られており27、これは、Rrm1＋Rrm2形質導入心筋細胞で観察されなかった（図6d）。さらに、PMCA及びNCX活性の増加は、細胞外にCa2+を押し出すことにより、経時的なCa2+トランジェントの減衰をもたらすはずである。ラット心筋細胞では、SRから約95％の活性化（activating）Ca2+が放出されることから28,29、細胞からのCa2+の押し出しは、Ca2+トランジェント振幅及び収縮の漸減を導き得るが、これらの実験の期間にわたってこれは観察されなかった。しかし、Ca2+トランジェント減衰速度の増加の背後にある特定のメカニズムについてはさらなる調査が必要である。
【００４３】
dATPはクロスブリッジ解離速度を増加させるので20,25、これは、培養した心筋細胞を用いた今回の実験において、弛緩速度が速くなることを説明し得る。無傷の心筋において弛緩を支配する特定のメカニズムは知られていないが、心臓及び骨格筋の筋原線維における初期（early phase）の弛緩は、クロスブリッジ解離速度に支配されることが示されている30−33。非負荷の細胞（培養など）における短縮速度は、主として、クロスブリッジ解離速度により決定されるので34,35、これは、心筋細胞収縮性がRrm1+Rrm2で増加した今回の発見とも一致する。dATPでのクロスブリッジ解離速度の増加は、細いフィラメントのCa2+結合が弛緩の間に減少するにつれ、結合したクロスブリッジ集団が急速に減少することにより、協調的な細いフィラメント不活性化を促進する可能性がある。
【００４４】
従って、一側面において、本発明は、dATPが、Ca2+トランジェント特性を殆ど変化させることなく、陽性変力作用と変弛緩作用（positive inotropy and lusitropy）の二重の利点を提供し得、それにより、現在の医薬治療アプローチの代替としての可能性をもたらす方法を提供する。
【００４５】
本発明をさらに記載する前に、本発明は下記の本発明の特定の態様に制限されず、特定の態様の変形物がなされてもよく、それらも添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。利用された語法は、特定の態様を記載するためのものであり、本発明を制限するものではないことも理解されたい。その代わり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形の「一つの（a）」、「一つの（an）」、及び「その（the）」には、文脈上別段の指示がない限り、複数形の言及が含まれる。
【００４６】
値の範囲が提示されている場合、文脈上別段の指示がない限り、下限の単位の1／10まで、その範囲の上限と下限の間にある各介在値、及びその規定範囲にある任意の他の規定値又は介在値は、本発明に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、規定範囲にある具体的に除外された任意の限度に従って、該より小さな範囲に独立して含まれてよく、かつ本発明の範囲にも含まれる。規定範囲が限度の一方又は両方を含む場合、その含まれた限度のいずれか又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００４７】
他に定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同じか又は等価な任意の方法、装置及び材料は、本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、及び材料をここに記載する。
【００４８】
III．略語
cTnC    心臓トロポニンC
cTnT    心臓トロポニンT
koff    カルシウム解離速度
NRC    新生児ラット心筋細胞
ARC    成体ラット心筋細胞
GFP    緑色蛍光タンパク質
RT50, RT90    50％及び90％弛緩までの時間
DT50, DT90    50％及び90％Ca2+減衰までの時間
WT    野生型
Rrm1又はR1    筋肉のリボヌクレオチドレダクターゼ1
Rrm2又はR1    筋肉のリボヌクレオチドレダクターゼ2
【００４９】
IV．定義
本発明との関連で、「心臓機能」とは、1以上の測定可能なパラメーター、例えば、心筋収縮性、短縮率の変化、最大短縮速度、心筋弛緩、最大心筋弛緩速度、弛緩時間、Ca2+トランジェントに対する効果、心拍数、収縮終期圧、拡張終期圧、収縮末期容量、拡張末期容量、心拍出量、一回仕事量、一回拍出量、心係数などにより反映される心臓の機能を意味する。前記パラメーターは、血流力学及び／若しくは心エコーによる測定、並びに／又は当業者に公知の他の任意の方法により測定されてよい。心臓機能の改善が起こるかどうかは、個体に基づき決定される。例えば、陽性変力作用が必要な個体については、心筋収縮性の改善とは、心筋収縮性の増加を意味する。あるいは、陽性変弛緩作用が必要な個体については、心筋弛緩の改善とは、心筋弛緩の増加（例えば、弛緩速度の増加により反映されるように）を意味する。
【００５０】
「心筋収縮性」とは、本明細書において、用語「変力作用（inotropy）」と交換可能に使用され、血液が心臓から放出される間の心室収縮の強度を意味する。心筋収縮性の改善は、1以上の測定可能な変力作用パラメーターを用いて、個体に基づき決定される。陽性変力作用が必要な個体又は患者について、心筋収縮性の改善は、心エコー検査を用いて測定されるように、心筋収縮性の増加を必要とする。陰性変力作用の必要な個体又は患者について、心筋収縮性の改善は、心筋収縮性の低下を必要とする。測定可能な変力作用パラメーターの例としては、OP／Ot、肥厚の割合、短縮の割合、短縮率及び駆出率が挙げられる。
【００５１】
「心筋弛緩」とは、本明細書において、用語「変弛緩作用（lusiotropy）」と交換可能に使用され、興奮収縮連関後に心臓を弛緩させる能力を意味する。心筋弛緩の改善は、1以上の測定可能な変弛緩作用パラメーターを用いて、個体に基づき決定される。陽性変弛緩作用の必要な個体又は患者について、心筋弛緩の改善は、弛緩速度の増加を必要とする。陰性変弛緩作用が必要な個体又は患者について、心筋収縮性の改善は、弛緩速度の低下を必要とする。測定可能な変弛緩作用パラメーターの例としては、圧力センサー測定から決定されるような拡張期の間の圧力低下速度（−dP／dtmin）、力センサー測定から決定されるような力／ストレイン低下速度（−dF／dt）、及び心臓インピーダンス測定又は検出された心音から決定されるような等容弛緩時間（IVRT）が挙げられる。例えば、測定装置は、拡張期弛緩が損なわれているかどうかを決定するために変弛緩作用パラメーターを指定された閾値と比較し、それに応答して、心臓に交感神経刺激を送出するように神経刺激回路を動作させるようプログラムされてよい。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「移植」とは、細胞を対象に留置することを意味する。細胞は、自家（すなわち、治療されるべき対象に由来）、同系（すなわち、遺伝的に同一であるが異なる対象に由来、例えば、一卵性双生児由来など）、同種異系（すなわち、同じ種の遺伝的に同一でない一員に由来）、及び／又は異種（すなわち、異なる種の一員に由来）であり得る。細胞は、ドナー（生体又は死体のいずれか）から得ても、又は樹立細胞株に由来してもよい。ドナー（例えば、バイオスキャフォールド移植片の可能性のあるレシピエントなど）から細胞を得るために、当分野で公知の標準的な生検技術を用いてよい。代表的な技術は、例えば、米国特許第6,536,567号に記載される。
【００５３】
用語「療法」、「治療」及び「改善」とは、症状の重症度若しくはアミロイド凝集量の任意の低下、又は認識機能の改善を意味する。本明細書で使用する場合、用語「治療する」及び「予防する」は、絶対的であることを意図しない。治療は、発症の遅延、症状の改善、患者の生存率の改善、生存期間又は割合の増加などいずれも意味し得る。治療の効果は、治療を受けていない個体又は個体のプールと比較され得る。
【００５４】
「心筋細胞」は、心筋の細胞である、心臓の収縮性細胞を意味する。心筋細胞は、in vitroで単離及び培養されるか、又は宿主の心筋の一部であってよい。
【００５５】
用語「胚性幹細胞」（ES細胞）とは、細胞株として連続的に継代されている、胚盤胞又は桑実胚の内部細胞塊に由来する細胞を意味する。ES細胞は、精子又はDNAによる卵細胞の受精、核移植、単為発生、又はMHC領域におけるホモ接合性を有するhES細胞を発生させるための手段に由来してもよい。用語「ヒト胚性幹細胞」（hES細胞）とは、細胞株として連続的に継代されている、ヒト胚盤胞又は桑実胚の内部細胞塊に由来する細胞を意味する。hES細胞は、精子又はDNAによる卵細胞の受精、核移植、単為発生、又はHLA領域におけるホモ接合性を有するhES細胞を発生させるための手段に由来してもよい。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「人工多能性幹細胞」又は「iPSC」とは、リプログラミング因子のみを強制発現させる任意の組み合わせ、又は1以上のリプログラミング薬剤との組み合わせにより、生後体細胞に由来する多能性幹細胞を意味する。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「間葉系幹細胞」とは、複数の間葉系列の分化細胞、具体的には、骨芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、及び軟骨芽細胞を生じることのできる細胞を意味する。一般に、間葉系幹細胞は、1以上の以下の特性も有する：非同調性又は対称性の複製を受けることができること、すなわち、分裂後の2つの娘細胞が異なる表現型を有し得ること；広い自己複製能；及びそれらが存在する組織、例えば、骨髄の非造血細胞などのクローン再生。
【００５８】
用語「患者」、「宿主」及び「個体」は、本明細書において交換可能に使用され、診断又は治療が望まれる任意の哺乳動物対象、例えば、霊長類種（例、ヒト、チンパンジーなど）；ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを意味する。好ましい実施態様において、種はヒトである。特に関心のある対象は、リボヌクレオチドレダクターゼの両方のサブユニット（すなわち、R1、R2）を発現する細胞（例、心筋細胞、線維芽細胞など）を対象に移植することにより、治療（例えば、疾患と関連する症状を和らげるなど）の可能性のある心筋関連疾患を有する対象である。多くの実施態様において、宿主はヒトである。
【００５９】
本発明との関連で、「ドナー細胞」とは、哺乳動物起源、例えば、霊長類種（例、ヒト、チンパンジーなど）；ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどに由来する細胞であって、宿主心筋に移植された場合に、宿主の心筋細胞とギャップジャンクションを形成又は確立する能力を有する細胞を意味する。ドナー細胞の例としては、線維芽細胞及び心筋細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ドナー細胞は、自家（すなわち、治療されるべき宿主に由来）、同系（すなわち、遺伝的に同一であるが異なる対象に由来、例えば、一卵性双生児由来など）、同種異系（すなわち、同じ種の遺伝的に同一でない一員に由来）、及び／又は異種（すなわち、異なる種の一員に由来）であり得る。細胞は、ドナー（生体又は死体のいずれか）から得ても、又は樹立細胞株に由来してもよい。ドナーから細胞を得るために、当分野で公知の標準的な生検技術を用いてよい。
【００６０】
「発現ベクター」又は「ベクター」という用語は、宿主微生物を形質導入、形質転換、又は感染させることにより、細胞にとって天然なもの以外の、又は細胞にとって天然には存在しない様式で、核酸及び／又はタンパク質を細胞に発現させることができる、化合物及び／又は組成物を意味する。「発現ベクター」は、宿主微生物により発現されるべき核酸（通常はRNA又はDNA）の配列を含む。任意選択で、発現ベクターは、ウイルス、リポソーム、タンパク質コーティングなどの、宿主微生物に対する核酸侵入の実現を支援する材料も含む。本発明における使用が想定される発現ベクターとしては、任意の好ましい又は所要の操作エレメントと共に核酸配列を挿入可能なものが挙げられる。さらに、発現ベクターは、宿主微生物内に移され、その中で複製可能なものでなければならない。好ましい発現ベクターはプラスミド、特に、制限酵素部位を有するものであり、十分に文献に記載されており、かつ核酸配列の転写に好ましいか又は必要な操作エレメントを含むものである。そのようなプラスミド及び他の発現ベクターは当業者に周知である。いつかの実施態様において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターなどである。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルスベクター」とは、野生型及び組換えアデノ随伴ウイルスベクターの両方を含み、ウイルス複製のためにヘルパーウイルスとの共感染を必要とする、非病原性でエンベロープを有さない、約4.6〜4.8 kbの直鎖状一本鎖ゲノムを含むDNAウイルスである。本発明で有用なアデノ随伴ウイルスベクターの例としては、AAV6、AAV2、rAAV2／1、rAAV2／2、rAAV2／3、rAAV2／4、rAAV2／5、rAAV2／6、rAAV2／7 rAAV2／8、rAAV2／9、rAAV2／10、rAAVM41、dsAAVなどが挙げられるが、これらに限定されない。アデノ随伴ウイルスベクター及び遺伝子導入への適用におけるその使用は以下に概説される：Pacak et al.（2011）Molecular Therapy 19（9）：1582−1590；Hansruedi Biieler, Biol. Chem.（June 1999）380：612 622；Robbins et al., TIBTECH（January 1998）16：35 40；及びPatjin & Kay, Semin. Liver. Dis.（1999）19：61 69。対象となる他の文献としては以下が挙げられる：Burton, et al., Proc Natl Acad Sci USA（1999）96：12725 12730；Fan, et al., Hum. Gene Ther.（1998）9：2527 2535；Miao et al., Nat. Genet.（May 1998）19：13 15；Nakai et al., J. Virol.（July 1999）73：5438 5447；及びRendahl, et al., Nat Biotechnol（1998）16, 757 761；Gregorevic et al.（2004）Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno−associated viral vectors.  Nature Med 10：828−834；Blankinship et al.（2004）Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno−associated virus serotype 6.  Mol Ther 10：671−678；Blankinship et al（2006）Gene therapy strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing recombinant adeno−associated virus vectors.  Mol Ther 13：241−249；及びSalva et al.（2007）Design of tissue−specific regulatory cassettes for high−level rAAV−mediated expression in skeletal and cardiac muscle. Mol Ther 15：320−329。
【００６２】
例示するように、AAV6に基づく遺伝子療法ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）末端逆位配列（inverted terminal repeat；ITR）の2つのコピーの間にDNA発現カセット［例えば、治療的タンパク質又はRNAをコードする相補的DNA（cDNA）配列と、それに続いて転写終結シグナル（例えば、ポリアデニル化配列など）と連結した、遺伝子発現を制御するプロモーター／エンハンサー；いくつかの例では、cDNAとプロモーターはイントロンにより分離される］をクローニングすることにより作製できる。このITR−発現カセット−ITRゲノムは、組換えAAV（rAAV）ゲノムと称する。AAV ITR配列は、組換えAAV粒子に、カプシド形成のためにパッケージングシグナルを提供する。ITRはまた、組換えAAVゲノムの複数のコピーを作製するための複製起点も提供する。次いで、この組換えゲノムを含むDNAは、野生型AAVゲノムのRep／Cap遺伝子及び追加のアデノウイルスヘルパー機能を含むプラスミド（1以上）とともに、種々のアデノウイルスヘルパータンパク質を発現するパッケージング細胞株（通常、HEK293細胞）に共トランスフェクトされ得る。AAVは自律的に複製せず、むしろ重要なヘルパー機能をトランスで供給する第二のウイルス（例えば、アデノウイルスなど）の共感染を必要とする。AAV ITRは、野生型AAVの多数の異なる血清型に由来し得る。例えば、一般に使用されるITRは、AAV血清型2型に由来する。組換えAAV6ベクター（rAAV6）を作製する場合には、AAV血清型6型由来のCap遺伝子を共トランスフェクション工程で使用する。従って、「AAV6」は、発現カセットに隣接してAAV2 ITRを有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、AAV6カプシドタンパク質によりカプシド形成される。
【００６３】
「プロモーター」とは、組換え細胞において転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。「プロモーター」はまた、細胞タイプ特異的、組織特異的、又は外部シグナル若しくは薬剤による誘導性が制御可能である、プロモーター依存的遺伝子発現のために十分なエレメントを含むことを意味する；このようなエレメントは、天然の遺伝子の5'又は3'領域に位置してよい（例えば、エンハンサーエレメント）。プロモーターの例としては、CK7プロモーター及びCMVプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明との関連で、「心臓特異的プロモーター」とは、心臓の細胞において、その制御下で遺伝子の発現を選択的に駆動する、野生型又は組換えプロモーターを意味する。心臓特異的プロモーターの例としては、α−MHC5.5プロモーター、α−MHC86プロモーター、ヒト心臓アクチンプロモーター、及び本明細書に記載のcTnT455プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
「操作可能に連結された」又は「作動可能に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（1以上）に結合された場合に発現を可能にするような様式でDNA配列と調節配列（1以上）が繋がれることを意味する。
【００６６】
2つのアミノ酸、ポリヌクレオチド及び／又は遺伝子配列（適切な場合）と関連して、「パーセント配列同一性」、「パーセントアミノ酸配列同一性」、「パーセント遺伝子配列同一性」及び／又は「パーセント核酸／ポリヌクレオチド配列同一性」とは、配列を最適にアライメントした場合に、2つの配列において同一である残基のパーセンテージを意味する。従って、80％アミノ酸配列同一性とは、最適にアライメントされた2つのポリペプチド配列において80％のアミノ酸が同一であることを意味する。
【００６７】
「形質転換」、「形質導入」、又は「トランスフェクション」とは、新規核酸（例えば、細胞に対し外因性のDNA又はRNA）の組込み後に細胞にて誘導された、永続的な又は一過性の遺伝的変化、好ましくは永続的な遺伝的変化を意味する。遺伝的変化は、新規核酸を宿主細胞のゲノムに組込むことによるか、又はエピソーマルエレメントとして新規DNAを一時的若しくは安定的に維持するかのいずれかで達成され得る。
【００６８】
「形質転換細胞」、「トランスフェクト細胞」又は「形質導入細胞」とは、組換えDNA技術によって、対象のタンパク質をコードするDNA分子が導入されている細胞（又はその祖先）を意味する。
【００６９】
遺伝子産物（例えば、R1、R2など）を「過剰発現する」又はその「過剰発現」とは、例えば、特定の発達段階又は分化段階などにおいて、特定の細胞又は細胞タイプについて、タンパク質発現の通常レベルを超えたタンパク質発現レベルの増加を意味する。特定の例において、過剰発現は、内因性遺伝子と組換え遺伝子のタンパク質発現の累積効果であり得、あるいは本質的には、組換え遺伝子のタンパク質発現であり得る。R1又はR2の過剰発現は、分化の特定の段階において、正常又は野生型細胞と通常関連する発現レベルを超える、リボヌクレオチドレダクターゼタンパク質サブユニットそれぞれの特定の細胞中での発現をいうことを意味する。ある実施態様において、遺伝子産物の過剰発現は、少なくとも約2倍、他の実施態様において、少なくとも約5倍、及びなおさらに他の実施態様において、少なくとも約10倍の発現の増加を意味する。
【００７０】
「構築物」とは、特定のヌクレオチド配列（1以上）を発現させる目的のために作製されているか、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用されるべき組換え核酸、一般的には組換えDNAを意味する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは、i）天然のポリペプチド、ii）生物学的に活性なポリペプチド断片、iii）ポリペプチドの生物学的に活性なポリペプチドアナログ、又はiv）生物学的に活性なポリペプチド変異体、のアミノ酸配列を有する、組換え又は非組み換えポリペプチドのアミノ酸配列を意味する。本発明において有用なポリペプチドは、任意の種、例えば、哺乳動物又は非哺乳動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥類（例えば、ニワトリなど）など）、特に哺乳動物（ヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、又はウマを含む、好ましくはラット又はヒト）から、天然、合成、半合成、又は組換えであるかに関わらず任意の供給源から得られ得る。例えば、「R1ポリペプチド」とは、ヒトから得られた単離されたヒトR1ポリペプチドのアミノ酸配列をいい、かつ天然に存在するすべての対立遺伝子変異体を含むことを意味し、かつそのアミノ酸配列を、記載されたタンパク質分子と関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００７２】
ポリペプチドの「変異体」は、1つ以上のアミノ酸によって変化した（例えば、欠失、付加、挿入及び／又は置換などにより）アミノ酸配列として定義される。一般的に、「付加」とは、分子の末端に加えられるヌクレオチド又はアミノ酸残基をいうのに対して、「挿入」とは、天然に存在する分子の残基の間のヌクレオチド又はアミノ酸残基をいう。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換など）、「保存的」変化を有し得る。よりまれに、変異体は、「非保存的」変化を有し得る（例えば、グリシンのトリプトファンでの置換など）。同様のマイナーバリエーションはまた、アミノ酸欠失又は挿入、あるいはその両方を含み得る。どのアミノ酸残基が、どれほどの数で、生物学的活性又は免疫学的活性をなくすことなく、置換、付加、挿入又は欠失されてよいかを決定するガイダンスは、当分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、DNAStarソフトウェアなど）を用いて見い出すことができる。
【００７３】
「標的化剤」という用語は、特定の標的臓器、組織又は細胞タイプに対して選択性を示す化合物を意味する。標的化剤は、動作可能に関連して、組成物を特定の標的臓器又は組織に指向できる。標的化剤は、少なくとも1のカチオン性ポリマーキャリア及び／又は他の薬剤と動作可能に関連できる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「心筋梗塞」とは、虚血性疾患によって、結果的に心筋のある領域が瘢痕組織に置き換わっていく過程を意味する。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「虚血性心疾患」とは、心筋が必要とする酸素と、適正な酸素供給との間の不均衡に起因する任意の疾患を意味する。虚血性心疾患のほとんどのケースが、アテローム硬化又は他の血管障害で生じるような、冠動脈狭窄に起因する。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「心不全」とは、安静時又は運動時に正常な血液拍出量を心臓が維持できないようにする、又は正常な心充満圧の設定で正常な心拍出量を心臓が維持できないようにする、心臓機能障害を意味する。約40％以下の左心室駆出率が、心不全の指標である（比較として、約55〜60％の割合の駆出率は正常である）。心不全を有する患者は、周知の臨床症状及び徴候、例えば、頻呼吸、胸水、安静時又は運動時の疲労、収縮不全、浮腫などを示す。相対的重症度及び疾患進行は、周知の方法、例えば、身体検査、心エコー検査、放射性核種イメージング、侵襲性血行動態モニタリング、磁気共鳴血管造影、酸素摂取量研究と組み合わされたトレッドミル運動負荷試験などを使用して評価される。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「心筋症」とは、心臓血管障害を意味する。いくつかの実施態様において、心筋症は、原発性の心臓病変（cardiopathology）又は二次性の心臓病変から選択される。心筋症は、遺伝的心臓病変、肥大型心筋症、虚血性心筋症、拘束型心筋症及び拡張型心筋症から選択されてよい。肥大型心筋症を有する個体における心臓機能の改善を伴う実施態様において、心筋症は、（a）心筋梗塞後のリモデリング；（b）心臓弁膜症；（c）持続性の心臓後負荷（sustained cardiac afterload）；（d）心筋炎；又は（e）家族性肥大型心筋症に起因してよい。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「心臓トロポニンC」又は「cTnC」とは、複数のカルシウム結合部位を有するトロポニン複合体のポリペプチドを意味する。好ましい実施態様において、cTnCとは、ヒトcTnC（Entrez Ref：NP_003271）であって、TNNC1遺伝子（Entrez Ref：NM_003280.2）によりコードされるもの、又はその保存的変異体、スプライス変異体、若しくは標識変異体を意味する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「リボヌクレオチドレダクターゼ複合体」、「RR」又は「RNR」とは、RNR1（又は「R1」）及びRNR2（又は「R2」）サブユニットを含む、ヘテロ二量体性の四量体ポリペプチド複合体を意味する。好ましい実施態様において、R1サブユニットとは、ヒトリボヌクレオチドレダクターゼM1サブユニット（Entrez Ref：AAD37491.1）であって、RRM1遺伝子（Entrez Ref：AF107045.1）によりコードされるもの、又はその保存的変異体、スプライス変異体、若しくはその標識変異体を意味する。R2サブユニットとは、リボヌクレオチドレダクターゼM2サブユニット又はリボヌクレオチドレダクターゼM2 Bサブユニットのいずれかを意味してよい。好ましい一実施態様において、R2とは、ヒトリボヌクレオチドレダクターゼM2サブユニット（Entrez Ref：AAK51163）であって、RRM2遺伝子（Entrez Ref：AY032750.1）によりコードされるものを意味する。他の好ましい実施態様において、R2とは、ヒトリボヌクレオチドレダクターゼM2 Bサブユニットアイソフォーム1（Entrez Ref：NP_056528.2）であって、RRM2B遺伝子（Entrez Ref：NM_015713.4）によりコードされるもの；ヒトリボヌクレオチドレダクターゼM2 Bサブユニットアイソフォーム2（Entrez Ref：NP_001165948.1）であって、RRM2B遺伝子（Entrez Ref：NM_001172477）によりコードされるもの；又はヒトリボヌクレオチドレダクターゼM2 Bサブユニットアイソフォーム3（Entrez Ref：NP001165949）であって、RRM2B遺伝子（Entrez Ref：NM_001172478.1）によりコードされるもの；又はその保存的変異体、スプライス変異体、若しくは標識変異体を意味する。
【００８０】
V．実施態様
一側面において、本発明は、心臓機能の治療方法であって、HCM／DCM変異として臨床的に同定されていないが、収縮のCa2+感受性において同様の増加又は減少を生じる、改変cTnC変異体の投与を含む方法を提供する。
【００８１】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、サイトII Ca2+結合親和性が増加したcTnC変異体をコードするベクターを、個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。特定の実施態様において、cTnC変異体は、L48Qアミノ酸置換を含む。
【００８２】
ある実施態様において、個体は、収縮の低下をもたらす心臓病態を有する。特定の実施態様において、個体は梗塞心臓を有する。
【００８３】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、サイトII Ca2+結合親和性が減少したcTnC変異体をコードするベクターを、個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。一実施態様において、cTnC変異体は、L57Qアミノ酸置換を含む。別の実施態様において、cTnC変異体は、I61Qアミノ酸置換を含む。
【００８４】
ある実施態様において、心疾患に対して遺伝的素因を有する個体における心臓機能の改善方法を提供する。より詳細には、遺伝的素因は、β心臓ミオシン重鎖、心臓アクチン、心臓トロポニンT、αトロポミオシン、心臓トロポニンI、心臓ミオシン結合タンパク質C及びミオシン軽鎖から選択されるサルコメアタンパクにおける1以上の遺伝子変異に起因する。いくつかの実施態様において、遺伝子変異（1以上）は、筋原線維収縮のCa2+感受性の増加、及び／又は肥大型心筋症表現型と関連する。このような遺伝子変異の例としては、cTnTの残基92の変異（例えば、R92W、R92Q、R92L cTnTなど）、若しくはMYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3での変異、又はその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの個体における心臓機能の改善方法は、L57Q又はI61Q cTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを、このような個体に投与することを伴う。他の実施態様において、遺伝子変異（1以上）は、筋原線維収縮のCa2+感受性の低下、及び／又は拡張型心筋症表現型と関連する。このような遺伝子変異の例としては、ミスセンス変異Ser532Pro及びPhe764Leu、cTnTの欠失（deltaLys210）、若しくは遺伝子MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3の変異、又はその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。このような個体における心臓機能の改善方法は、L48Q cTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを、Ca2+感受性低下（desensitizing）遺伝子変異（1以上）を有する前記個体に投与することを伴う。
【００８５】
本明細書で提供する特定の方法において、ベクターは、リポフェクション、ステントへのコーティング又は直接注入（すなわち、カテーテルを介する）により投与される。一実施態様において、ベクターは、トランスポゾン、プラスミド又はウイルスベクターを含む。一実施態様において、ベクターは、cTnC変異体をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む。特定の実施態様において、cTnC変異体をコードする核酸は、cTnC変異体をコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。
【００８６】
特別の実施態様において、本発明の方法は、cTnC遺伝子の細胞への導入を達成するために、例えば、リポソーム融合、リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリカチオン、粒子衝突、レセプター媒介性の方法など、非ウイルスベクターを用いる。ある実施態様において、ベクターは、cTnC変異体をコードする核酸と関連するナノ粒子を含む。特定の実施態様において、ナノ粒子は、cTnC変異体をコードする核酸をカプセル化するリポソームを含む。いくつかの実施態様において、ベクターは、心臓組織特異的マーカーに対する親和性を有する標的化剤をさらにコードする。一実施態様において、標的化剤は、抗体、抗体断片及びアプタマーからなる群から選択される。
【００８７】
別の側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）複合体をコードするベクターを個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。一実施態様において、個体は、収縮の低下をもたらす心臓病態を有する。特定の実施態様において、個体は梗塞心臓を有する。
【００８８】
本明細書に記載の特定の方法において、ベクターは、リポフェクション、ステントへのコーティング又は直接注入（すなわち、カテーテルを介する）により投与される。一実施態様において、ベクターは、トランスポゾン、プラスミド又はウイルスベクターを含む。
【００８９】
特定の実施態様において、ベクターは、RR複合体のR1サブユニットとR2サブユニットをコードする核酸を含む細胞を含む。一実施態様において、細胞は心筋細胞である。特定の実施態様において、心筋細胞は、多能性胚性幹細胞（pluripotent embroynic step cell）（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する。一実施態様において、iPSCは、個体から採取した細胞に由来する。特定の実施態様において、個体から採取される細胞は、皮膚線維芽細胞である。本明細書で提供する方法のある実施態様において、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸は、R1及び／又はR2サブユニットをコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結された心臓特異的プロモーターをさらに含む。
【００９０】
特別の実施態様において、ベクターは、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸と関連するナノ粒子を含む。一実施態様において、ベクターは、心臓組織特異的マーカーに対する親和性を有する標的化剤をコードする配列をさらに含む。特定の実施態様において、標的化剤は、抗体、抗体断片及びアプタマーからなる群から選択される。より特定の実施態様において、ナノ粒子は、cTnC変異体をコードする核酸をカプセル化するリポソームを含む。
【００９１】
別の側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、（i）サイトII Ca2+結合親和性が増加したcTnC変異体コードするベクターを個体の心臓組織に投与し、かつ（ii）リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）複合体をコードするベクターを個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。
【００９２】
さらに別の側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体において心臓機能を改善するための医薬組成物であって、サイトII Ca2+結合親和性が増加したcTnC変異体をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施態様において、cTnC変異体は、L48Qアミノ酸置換を含む。
【００９３】
さらに別の側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体において心臓機能を改善するための医薬組成物であって、サイトII Ca2+結合親和性が減少したcTnC変異体をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施態様において、cTnC変異体は、L57Q及び／又はI61Qアミノ酸置換を含む。
【００９４】
本明細書で提供する医薬組成物のある実施態様において、ベクターはcTnC変異体をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む。特定の実施態様において、cTnC変異体をコードする核酸は、cTnC変異体をコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。
【００９５】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体において心臓機能を改善するための医薬組成物であって、リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）複合体をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施態様において、ベクターは、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸を含む細胞を含む。
【００９６】
本明細書で提供する医薬組成物のある実施態様において、細胞は心筋細胞である。特定の実施態様において、心筋細胞は、多能性胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する。さらに特定の実施態様において、iPSCは、個体から採取した細胞、例えば、皮膚線維芽細胞などに由来する。
【００９７】
本明細書で提供する医薬組成物のある実施態様において、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸は、R1及び／又はR2サブユニットをコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結された心臓特異的プロモーターをさらに含む。
【００９８】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、サイトII Ca2+結合親和性が増加したcTnC変異体をコードするベクターを個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。特別の実施態様において、cTnC変異体は、L48Qアミノ酸置換を含む。
【００９９】
上記で提供する方法のある実施態様において、個体は、収縮の低下をもたらす心臓病態を有する。一実施態様において、個体は、虚血性心疾患、心筋症又は心筋梗塞と診断されている。一実施態様において、心筋症は、原発性心筋症、遺伝性心筋症、拡張型心筋症又は肥大型心筋症である。一実施態様において、個体は、収縮機能の低下と診断されている。
【０１００】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法を提供する。より詳細には、個体は、β心臓ミオシン重鎖、心臓アクチン、心臓トロポニンT、αトロポミオシン、心臓トロポニンI、心臓ミオシン結合タンパク質C及びミオシン軽鎖から選択されるサルコメアタンパク質における1以上の遺伝子変異に起因する、Ca2+感受性の増加（sensitizing）又は肥大型心筋症表現型を有する。このような遺伝子変異の例としては、cTnTの残基92の変異（例えば、R92W、R92Q、R92L cTnTなど）、若しくはMYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3での変異、又はその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。このような個体における心臓機能の改善方法は、L57Q又はI61Q cTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記核酸配列が心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを、Ca2+感受性増加遺伝子変異（1以上）を有する個体に投与することを伴う。
【０１０１】
別の側面において、本発明は、β心臓ミオシン重鎖、心臓アクチン、心臓トロポニンT、αトロポミオシン、心臓トロポニンI、心臓ミオシン結合タンパク質C及びミオシン軽鎖から選択されるサルコメアタンパク質における1以上の遺伝子変異と関連する、Ca2+感受性の低下（desensitizing）又は拡張型心筋症表現型を有する個体における心臓機能の改善方法を提供する。このような遺伝子変異の例としては、ミスセンス変異Ser532Pro及びPhe764Leu、cTnTの欠失（deltaLys210）、若しくは遺伝子MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1、ACTC、MYL2、MYL3の変異、又はその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。心臓機能の改善方法は、L48Q cTnC変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記核酸配列が、心臓特異的プロモーターと操作可能に連結されている、ベクターを、Ca2+感受性低下遺伝子変異（1以上）を有する前記個体に投与することを伴う。
【０１０２】
上記で提供する方法のある実施態様において、ベクターは、リポフェクション、ステントへのコーティング又は直接注入（すなわち、カテーテルを介する）により投与される。一実施態様において、ベクターは、トランスポゾン、プラスミド又はウイルスベクターを含む。特定の実施態様において、ベクターは、cTnC変異体をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む。一実施態様において、cTnC変異体をコードする核酸は、cTnC変異体をコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結された、CMVプロモーター、CK7プロモーター、α−MHC5.5プロモーター、α−MHC86プロモーター、心臓アクチンプロモーター、cTnT455プロモーター、又は他の心臓特異的プロモーターをさらに含む。一実施態様において、ベクターは、cTnC変異体をコードする核酸と関連するナノ粒子を含む。一実施態様において、ベクターは、心臓組織特異的マーカーに対する親和性を有する標的化剤をさらにコードする。一実施態様において、標的化剤は、抗体、抗体断片及びアプタマーからなる群から選択される。一実施態様において、ナノ粒子は、cTnC変異体をコードする核酸をカプセル化するリポソームを含む。
【０１０３】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）複合体をコードするベクターを個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。
【０１０４】
上記で提供する方法のある実施態様において、個体は、収縮の低下をもたらす心臓病態を有する。一実施態様において、個体は梗塞心臓を有する。
【０１０５】
上記で提供する方法のある実施態様において、ベクターは、リポフェクション、ステントへのコーティング又は直接注入（すなわち、カテーテルを介する）により投与される。一実施態様において、ベクターは、トランスポゾン、プラスミド又はウイルスベクターを含む。一実施態様において、ベクターは、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸を含む細胞を含む。一実施態様において、細胞は、心筋細胞である。一実施態様において、心筋細胞は、多能性胚性幹細胞（pluripotent embroynic step cell）（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する。一実施態様において、iPSCは、個体から採取した細胞に由来する。一実施態様において、個体から採取した細胞は皮膚線維芽細胞である。
【０１０６】
上記で提供する方法のある実施態様において、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸は、R1及び／又はR2サブユニットをコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結された心臓特異的プロモーターをさらに含む。
【０１０７】
上記で提供する方法のある実施態様において、ベクターは、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸と関連するナノ粒子を含む。一実施態様において、ベクターは、心臓組織特異的マーカーに対する親和性を有する標的化剤をさらにコードする。一実施態様において、標的化剤は、抗体、抗体断片及びアプタマーからなる群から選択される。一実施態様において、ナノ粒子は、cTnC変異体をコードする核酸をカプセル化するリポソームを含む。
【０１０８】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体における心臓機能の改善方法であって、（i）サイトII Ca2+結合親和性が増加したcTnC変異体コードするベクターを個体の心臓組織に投与し、かつ（ii）リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）複合体をコードするベクターを個体の心臓組織に投与することを含む方法を提供する。
【０１０９】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体において心臓機能を改善するための医薬組成物であって、サイトII Ca2+結合親和性が増加したcTnC変異体をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施態様において、cTnC変異体は、L48Qアミノ酸置換を含む。
【０１１０】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体において心臓機能を改善するための医薬組成物であって、サイトII Ca2+結合親和性が減少したcTnC変異体をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施態様において、cTnC変異体は、L57Q及び／又はI61Qアミノ酸置換を含む。
【０１１１】
上記で提供する組成物のある実施態様において、ベクターは、cTnC変異体をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む。一実施態様において、cTnC変異体をコードする核酸は、cTnC変異体をコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。
【０１１２】
一側面において、本発明は、心臓機能の改善を必要とする個体において心臓機能を改善するための医薬組成物であって、リボヌクレオチドレダクターゼ（RR）複合体をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施態様において、ベクターは、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸を含む細胞を含む。一実施態様において、細胞は、心筋細胞である。一実施態様において、心筋細胞は、多能性胚性幹細胞（pluripotent embroynic step cell）（ESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）又は間葉系幹細胞に由来する。一実施態様において、iPSCは、個体から採取した細胞に由来する。一実施態様において、個体から採取した細胞は、皮膚線維芽細胞である。一実施態様において、RR複合体のR1及びR2サブユニットをコードする核酸は、R1及び／又はR2サブユニットをコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結された心臓特異的プロモーターをさらに含む。
【０１１３】
VI．実施例
［実施例1］
成体及び新生児細胞の単離及び培養。これらの研究は、ワシントン大学（UW）動物実験委員会により承認され、連邦政府のガイドラインに沿って実施した。動物は、UWの比較医学科（Department of Comparative Medicine）において、US NIHの実験動物の人道的管理と使用に関する規範（Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals）に従って世話をした。成体ラット（Fischer 344）心筋細胞（ARC）は、酵素（コラゲナーゼ／プロテアーゼ）による細胞分散のために大動脈の逆行性灌流を用いて心臓から単離した10。新生児ラット心筋細胞（NRC）は、以前に記載されるように11、1〜3日齢の新生児Fischer 344ラットから酵素による分散によって単離した。
【０１１４】
［実施例2］
プラスミドの設計及びウイルス作製。我々は、ヒスチジンタグ（N末端に6−His）されたL48Q cTnC又はWT cTnCをCMVプロモーターから発現する、HEK293産生アデノウイルスベクターを作製した。ベクターはともに、形質導入レポータータンパク質としての緑色蛍光タンパク質（GFP）のための第二の発現カセットを含み、我々はGFPのみのベクターも発現させた。細胞あたり約250粒子にて、ウイルスを心筋細胞に導入した。
【０１１５】
CMVプロモーターにより駆動される適切なcDNA構築物を含む組換えアデノウイルスを用いて、トランスフェクトされた培養成体及び新生児ラット心筋細胞においてL48Q及びWT cTnCの過剰発現を誘導した。緑色蛍光タンパク質（GFP）のための第二の発現カセットは、形質導入に成功したレポータータンパク質として、各アデノウイルスに含めた。［L48Q cTnC＋GFP］又は［WT cTnC＋GFP］に対する遺伝子を含むアデノウイルスで2日間心筋細胞を感染させた。顕微鏡にて緑色蛍光により肉眼で示されるとおり、ほぼ100％のトランスフェクション効率及び遺伝子導入を達成した。これは、心筋細胞を用いた以前の研究と一致する13。この期間にわたる細胞の生存は、形質導入されていないコントロール細胞を含む全てのグループで類似しており、これは、これらのウイルスベクターが、心筋細胞の生存を損なわなかったことを示唆する。心筋細胞数及びサルコメア長を表1に要約する。グループ間で、静止時（resting）のサルコメア長に差は生じず、L48Q又はWT cTnC発現（+GFP）の過剰発現が、カルシウム非依存性活性化を増加させないことが示された。
【０１１６】
【表１】
2014517694.tif 000003
【０１１７】
［実施例3］
収縮性評価。周囲温度の改変タイロードバッファー（modified Tyrodes buffer）中、任意に選択した刺激心筋細胞の細胞短縮及び弛緩を、IonOptixシステムビデオ顕微鏡（IonOptix, Milton, MA, USA）を用いて記録した。電気刺激により誘起されるカルシウムトランジェントを、記載されるように12、IonOptix装置を用いて、Fura2負荷細胞にて測定した。Fura2蛍光は、蛍光顕微鏡と接続したIonOptixスペクトロフォトメーター（Stepper Switch）を用いて測定した。放射されるFura2蛍光を40倍対物レンズにより集め、510 nmフィルターを通し、光電子増倍管により検出した。
【０１１８】
成体ラット心筋細胞の刺激短縮−再伸長及びCa2+放出−再取り込みの程度及び速度に対するL48Q cTnC発現の効果は、それぞれ、ビデオ長さ検出（video length−detection）及び蛍光測定（IonOptix）を用いて決定した。非処理（黒色）、WT cTnC＋GFP（青色）及びL48Q cTnC＋GFP（赤色）形質導入心筋細胞について、図1Aは代表的な短縮トレース（shortening trace）を示し、図1Bは代表的なCa2+トランジェント（Fura2蛍光）を示す。0.5 Hz刺激における全ての測定データを表2に要約する。WT cTnC＋GFP過剰発現は、非処理心筋細胞と比較して、収縮速度を有意に遅らせたが、短縮率（FS）に対して有意な効果は有さなかった。この遅れがGFPによるのか、あるいはcTnCの過剰発現によるのかは評価しなかったが、GFPは、GFPの収縮性に対して悪影響を有するか14、又はいずれの効果も有さない12,15と報告されている。いずれにせよ、L48Qの発現は、WT cTnC形質導入心筋細胞及び非形質導入心筋細胞と比較して、短縮の速度及び程度を有意に増加させ、潜在的阻害をそれ以上に克服できた。0.5 Hzの刺激頻度では、最大弛緩速度、又は50％及び90％弛緩までの時間について、グループ間で差は生じなかった。Ca2+トランジェントも、WT又はcTnC過剰発現による影響は殆ど受けなかったが、ただし、WT cTnC形質導入心筋細胞は、最小Ca2+において、有意ではないが（p=0.55）僅かに上昇した。これは、静止時のSL又は最大Ca2+放出に対して効果を有さなかった。図1Cは、短縮の速度及び程度、弛緩速度、並びに50％及び90％弛緩までの時間の％差を表し、図1Dは、最小及び最大Ca2+を含むCa2+トランジェント特性、並びに50％及び90％Ca2+減衰までの時間の％差を表す。最大Ca2+について、WT cTnC＋GFP又はL48Q cTnC＋GFPのいずれも有意な効果を有さず、これは、L48Q cTnCで高められた収縮性は、主として、活性化Ca2+に対する筋フィラメント反応性の増加によるものであることを示す。
【０１１９】
【表２】
2014517694.tif 000004
【０１２０】
［実施例4］
心拍数の変化は、全身の要求に対する正常な生理的適応であるので、L48Q cTnC過剰発現が、刺激頻度の増加に対する正常な細胞の応答に影響を及ぼすかどうかを決定することは重要である。図2に、短縮率（2A）、短縮速度（2B）、弛緩速度（2C）及び90％弛緩までの時間（2D）に対する刺激頻度増加（0.5〜1〜2 Hz）の効果をまとめる。刺激頻度に対する収縮反応はグループ間で類似しており、L48Q cTnC形質導入心筋細胞は、全ての頻度において機能的増強を維持した。重要なことに、ペーシング頻度の増加は、陽性変弛緩作用と関連しており、全てのグループにおいて90％弛緩までの時間が短くなった。非形質導入筋細胞とWT cTnC形質導入筋細胞では殆ど差はなかったが、L48Q cTnC筋細胞では、1 Hz及び2 Hz刺激時に、弛緩速度は実際に増加した。Ca2+トランジェントに対する刺激頻度の効果も評価し、図3に、最小Ca2+（3A）、最大Ca2+（3B）、並びに50％（3C）及び90％（3D）Ca2+減衰までの時間をまとめる。収縮と同様に、非形質導入及びL48Q cTnC形質導入筋細胞の間では、刺激頻度を増加してもCa2+トランジェントの挙動に差はなかった。WT cTnC形質導入心筋細胞では、非形質導入及びL48Q cTnC形質導入筋細胞と比較して、1 Hzにおける最小及び最大Ca2+がわずかに増加したが、50％及び90％弛緩までの時間は、全ての刺激頻度においてグループ間で類似した。
【０１２１】
最小及び最大Ca2+について、グループ間で殆ど差がなかったことから、収縮性の変化は、活性化Ca2+に対する筋フィラメント反応性の変化により最もよく説明できる。これを収縮効率（心筋細胞短縮率を最大fura2蛍光（ピークCa2+）で割ったものとして本明細書で定義する）として図4に示す。L48Q cTnCを発現する心筋細胞は、全ての刺激頻度において、非形質導入又はGFP形質導入心筋細胞よりも、有意に高い収縮効率を有した。興味深いことに、WT cTnCと非形質導入筋細胞との間では、全ての頻度で収縮効率に有意な差があり、これは、L48Q cTnCにより誘起される収縮の増強が過小評価されていることを示し得る。1 Hz及び2 Hz刺激の結果を、それぞれ、表3及び表4に要約する。
【０１２２】
【表３】
2014517694.tif 000005
【０１２３】
【表４】
2014517694.tif 000006
【０１２４】
［実施例5］
L48Q cTnCの筋フィラメントへの組込みレベルを測定するために、培養した新生児心筋細胞を、［L48Q cTnC＋GFP］又は［WT cTnC＋GFP］に対する遺伝子を含むアデノウイルス構築物で48時間感染させるか、あるいは非処理のままとした。成体心筋細胞と同様に、この期間にわたる細胞の生存は、全てのグループで質的に類似しており、これは、ウイルスベクターが、in vitroにおける心筋細胞の生存を損なわなかったこと示唆する。遺伝子導入の成功は、顕微鏡にて感染心筋細胞の緑色蛍光（GFP)により肉眼で示された。WT又はL48Q cTnCの過剰発現及び細いフィラメントへの組込みは、総cTnC含量については抗cTnC（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）で、形質導入されたタンパク質含量については抗His（Novagen, Gibbstown, NJ）でプローブされた形質導入筋細胞から精製された筋原線維のウエスタンブロット分析により実証した。形質導入されたcTnCの筋フィラメントへのおおよその組込みレベルを評価するために、形質導入された筋細胞の筋原線維のウエスタンブロットバンドをデンシトメトリーにより定量化して、総cTnC含量とHisタグcTnC（形質導入されたタンパク質）含量とを比較した。ウエスタンブロットデンシトメトリーの検量線は、既知量のcTnC及びcTnC−Hisから作製した。図5には、2つの細胞バッチについてこの実験の代表例を示し、ここで、天然cTnC（図5A）の約70％（中央レーン）及び56％（右レーン）が、示される形質導入されたcTnC−His（図5B）に置き換えられており、既知濃度の精製cTnC−His（左レーン）と比較した。筋細胞の3つのバッチは、2連で実施し、平均結果は、天然cTnCの58±7％がL48Q cTnCに置き換えられたことを示した。
【０１２５】
［実施例6］
データ処理及び統計分析。短縮速度は、方程式：y=y0+ae-bxを用いた、単一の3つのパラメーター減衰指数関数（single, three parameter decaying exponential）に適合させた非線形回帰分析を用いて検証した。弛緩は、50％、90％及び100％弛緩までの時間（それぞれ、RT50、RT90及びRT100）を測定し、方程式：y=y0+a（1−e−bx）を用いた、単一の3つのパラメーター指数関数に適合させることにより評価した。統計学的差異はANOVAにより決定した。p値＜0.05での差を統計学的に有意とみなした。データは平均±S.E.Mとして示した。
【０１２６】
［実施例7］
成体及び新生児細胞の単離及び培養。これらの研究は、ワシントン大学（UW）動物実験委員会により承認され、連邦政府のガイドラインに沿って実施した。動物は、UWの比較医学科（Department of Comparative Medicine）において、US NIHの実験動物の人道的管理と使用に関する規範（Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals）に従って世話をした。成体ラット（Fischer 344）心筋細胞（ARC）は、酵素（コラゲナーゼ／プロテアーゼ）による細胞分散のために大動脈の逆行性灌流を用いて心臓から単離した13。新生児ラット心筋細胞（NRC）は、以前に記載されるように14、1〜3日齢の新生児Fischer 344ラットから酵素による分散によって単離した。
【０１２７】
［実施例8］
プラスミドの設計及びウイルス作製。HEK293細胞を用いて、CMVプロモーターからRrm1又はRrm2を発現するアデノウイルスベクター15を作製した。ベクターはともに、形質導入レポータータンパク質としての緑色蛍光タンパク質（GFP）のための第二の発現カセットを含み、我々はGFPのみのベクターも発現させた。細胞あたり約250粒子にて、ウイルスを心筋細胞に導入した。
【０１２８】
CMVプロモーターにより駆動される適切なcDNA構築物を含む組換えアデノウイルスでのトランスフェクションを用いて、培養成体及び新生児ラット心筋細胞において、筋リボヌクレオチドレダクターゼ1（Rrm1）及び2（Rrm2）の過剰発現を誘導した。各アデノウイルスは、緑色蛍光タンパク質（GFP）のための第二の発現カセットも含み、形質導入の成功を示すレポータータンパク質として使用した。［Rrm1＋GFP及びRrm2＋GFP］又は［GFP］に対する遺伝子を含むアデノウイルスで2日間心筋細胞を感染させた。顕微鏡にて緑色蛍光により肉眼で示される遺伝子導入の成功は、ほぼ100％のトランスフェクション効率を示した。これは、心筋細胞を用いた以前の研究と一致する17。この期間にわたる細胞の生存は、形質導入されていないコントロール細胞を含む全てのグループで類似しており、これは、これらのウイルスベクターが、心筋細胞の生存を損なわなかったことを示唆する。心筋細胞数及びサルコメア長を表5に要約する。グループ間で、静止時のサルコメア長に差は生じず、Rrm1+Rrm2（又はGFP）の過剰発現が、カルシウム非依存性活性化を増加させないことが示された。
【０１２９】
【表５】
2014517694.tif 000007
【０１３０】
［実施例9］
収縮性評価。周囲温度の改変タイロードバッファー中、任意に選択した刺激心筋細胞の細胞短縮及び弛緩を、IonOptixシステムビデオ顕微鏡（IonOptix, Milton, MA, USA）を用いて記録した。電気刺激により誘起されるカルシウムトランジェントを、記載されるように16、IonOptix装置を用いて、Fura2負荷細胞にて測定した。Fura2蛍光は、蛍光顕微鏡と接続したIonOptixスペクトロフォトメーター（Stepper Switch）を用いて測定した。放射されるFura2蛍光を40倍対物レンズにより集め、510 nmフィルターを通し、光電子増倍管により検出した。
【０１３１】
成体ラット心筋細胞の刺激短縮−再伸長の程度及び速度に対するRrm1+Rrm2過剰発現の効果は、ビデオ長さ検出（IonOptix）を用いて測定した。非処理（黒色）、GFPのみ（緑色）及びRrm1+Rrm2（赤色）形質導入心筋細胞について、図6aは、代表的な短縮トレースを示し、図6bは、代表的なCa2+トランジェント（Fura2蛍光）を示す。0.5 Hzでの全ての測定データを表6に要約する。収縮性に対するGFPの悪影響が以前に報告されている一方18、影響は見られないとの報告もある16,19。GFPは、この研究において、収縮阻害剤として作用するようには見えなかったが、90％弛緩時間を遅らせ、Ca2+トランジェントの50％及び90％減衰の遅延を伴った（図6c、表5）。この効果が、SERCA活性の増加によるのか、あるいは短縮によって誘起される細いフィラメントの不活性化とトロポニンCからのCa2+放出をもたらす急速なクロスブリッジサイクリングによるのかは、今後の研究対象である。いずれにしても、Rrm1+Rrm2（+GFP）で形質導入された心筋細胞は、非形質導入心筋細胞及びGFPのみ形質導入されたコントロールに対して、有意に大きい短縮のマグニチュード及び速度を有した。これを図6Cにて、短縮の速度及び程度、弛緩速度、並びに50％及び90％弛緩までの時間の％差で示す。Rrm1+Rrm2の過剰発現は、弛緩速度を増加し、50％弛緩までの時間を低下させ、この効果は、GFPの存在に起因していくらか過小評価されている可能性がある。図6dは、最小及び最大Ca2+を含むCa2+トランジェント特性、並びに50％及び90％Ca2+減衰までの時間の％差を表す。GFP又はRrm1+Rrm2＋GFPのいずれも最小及び最大Ca2+に対して有意な効果を有さず、これは、Rrm1+Rrm2で高められた収縮性は、主として、活性化Ca2+に対する筋フィラメント反応性の増加によるものであったことを示す。興味深いことに、Rrm1+Rrm2過剰発現は、50％及び90％減衰までの時間の減少により示されるとおり、Ca2+の再隔離（resequestration）を促進し、これにより、心筋細胞弛緩の最大速度の増加が部分的には説明され得る。
【０１３２】
【表６】
2014517694.tif 000008
【０１３３】
［実施例10］
心拍数の変化は、全身の要求に対する正常な生理的適応であるので、Rrm1+Rrm2過剰発現が、刺激頻度の増加に対する正常な細胞の応答に影響を及ぼすかどうかを測定することは重要である。図7に、短縮率（7a）、短縮速度（7b）、弛緩速度（7c）及び90％弛緩までの時間（7c）に対する刺激頻度増加（0.5〜1〜2 Hz）の効果を要約する。刺激頻度に対する収縮反応はグループ間で類似しており、Rrm1+Rrm2形質導入心筋細胞は、全ての頻度において機能的増強を維持した。重要なことに、ペーシング頻度の増加は、陽性変弛緩作用と関連しており、全てのグループにおいて90％弛緩までの時間が短くなった。非形質導入筋細胞とGFPのみ形質導入した筋細胞では殆ど差はなかったが、90％弛緩までの時間は、GFPのみの筋細胞において、0.5 Hzでより長くなる。Ca2+トランジェントに対する刺激頻度の効果も評価し、図8に、最小Ca2+（8a）、最大Ca2+（8b）、並びに50％（8c）及び90％（8d）Ca2+減衰までの時間（DT50、DT90）をまとめる。収縮と同様に、非形質導入及びRrm1+Rrm2形質導入筋細胞の間では、刺激頻度を増加してもCa2+トランジェントの挙動に差はなかった。GFPのみ形質導入した心筋細胞では、非形質導入筋細胞と比較して、2 Hzで最小Ca2+がわずかに増加し、1 Hz及び2 Hzで最大Ca2+が増加したが、50％及び90％減衰までの時間は類似した。Rrm1+Rrm2形質導入筋細胞では、0.5 Hzと同様に、1及び2 Hzの両方で、50％及び90％減衰までの時間が減少（急速な減衰）した。
【０１３４】
最小及び最大Ca2+について、グループ間で殆ど差がなかったことから、収縮性の変化は、活性化Ca2+に対する筋フィラメント反応性の変化により最もよく説明できる。これを収縮効率（心筋細胞短縮率を最大fura2蛍光（ピークCa2+）で割ったものとして本明細書で定義する）として図9に示す。Rrm1+Rrm2を発現する心筋細胞は、全ての刺激頻度において、非形質導入又はGFP形質導入心筋細胞よりも、有意に高い収縮効率を有した。GFPのみ形質導入した筋細胞又は非形質導入筋細胞の間に2 Hzを除いて収縮効率の差はなく、2 Hzが除かれたのは、GFPのみの筋細胞において、短縮率は増加しないが、最大Ca2+が増加し、効率が低下したことに主に起因し得る。1 Hz及び2 Hz刺激の結果を、それぞれ、表7及び表8に要約する。
【０１３５】
【表７】
2014517694.tif 000009
【０１３６】
【表８】
2014517694.tif 000010
【０１３７】
［実施例11］
Rrm1+Rrm2形質導入細胞におけるRR mRNA、RRタンパク質及びdATP産生の増加を検証するために、新生児ラット心筋細胞を集め、RT−PCT、ウエスタンブロッティング及び細胞内［ATP］及び［dATP］のHPLC分析のために処理した。新生児心筋細胞は、細胞内［dATP］がpM範囲であることが知られているので、正確なヌクレオチド含量分析のために十分に高い細胞密度を得るため、これを使用した。成体心筋細胞と同様に、新生児心筋細胞の収縮性は、R1R2過剰発現により有意に増加した。興味深いことに、新生児心筋細胞は、心筋梗塞後の細胞の生着効果を調べるために使用されているので14、これらの細胞における収縮性の改善は、梗塞後の心臓機能を改善するためのもう一つのメカニズムであり得る。Rrm1及びRrm2 mRNAは、アデノウイルストランスフェクション後に有意に増加した。これに伴って、図10a及び10bに、Rrm1及びRrm2形質導入心筋細胞が、Rrm1及びRrm2タンパク質含量をそれぞれ24倍超及び46倍超増加させたことを表す。GAPDHは、ローディングコントロールとして使用した。図10cには、Rrm1+Rrm2形質導入心筋細胞が、GFP形質導入心筋細胞と比較して、約10倍高い細胞［dATP］を有したことを表す（タンパク質1 mgあたり0.35 nmolまで増加）。これはロバストであるが、［dATP］は、通常、アデニン三リン酸ヌクレオチド（adenine triphosphate nucleotide）全体の0.2％未満を占めることから、［dATP］のこの増加は、アデニンヌクレオチドプール全体のわずか約1〜1.5％を表すにすぎない。これは、心筋細胞収縮性の有意な増加には、少量のdATPしか必要とされないことを示唆する。
【０１３８】
［実施例12］
データ処理及び統計分析。短縮速度及びCa2+減衰は、方程式：y=y0+ae-bxを用いた、単一の3つのパラメーター減衰指数関数に適合させた非線形回帰分析を用いて検証した。弛緩速度及びCa2+上昇は、方程式：y=y0+a（1−e−bx）を用いた、単一の3つのパラメーター指数関数に適合させることにより評価した。弛緩及びCa2+減衰も、50％（RT50）及び90％（RT90）弛緩までの時間を測定することによって評価した。統計学的差異は、ポストホックペアワイズテストとしてStudent−Newman−Keulsを用いて、ANOVAにより決定した（SigmaPlot 11）。p値＜0.05での差を統計学的に有意とみなした。データは平均±s.e.mとして示す。
【０１３９】
［実施例13］
心臓の細いフィラメントによる収縮及び弛緩制御の分子メカニズムを研究するために、我々は、複数のcTnC変異体を開発し特徴付けた。表9に要約するとおり、1）全cTn複合体に含めた場合、それらは、以下の順序の親和性（KA）でCa2+（溶液中）と結合する：L48Q＞WT＞L57Q＞I61Q［KA＝kon／koff］（定常状態スペクトロスコピーを介して測定）、2）全cTn Ca2+解離速度（koff）（ストップトフロースペクトロスコピーで測定）は、KAと同じ順序で増加した、かつ3）これは、変異体をスキンド心臓肉柱へと交換する場合に、力のCa2+感受性（pCa50）の低下とよく相関する。
【０１４０】
【表９】
2014517694.tif 000011
【０１４１】
各変異体についてアデノウイルスベクター（AV）を作製し、培養した成体ラット心筋細胞にトランスフェクトし（約250ウイルス粒子／細胞）、GFPの共発現により同定した。短縮及び細胞内Ca2+トランジェントのデータを表10に要約する。データ（0.5 Hz刺激）は、短縮のマグニチュード及び速度が、L48Q＞WT＞L57Q＞I61Qの順序で低下したことを示しており、これは、スキンド心筋の溶液Ca2+親和性及びCa2+感受性についての順序と同一である。AV構築物中、全てのcTnC変異体は、C末端にヒスチジンタグを含んでおり、これにより、筋フィラメントへの組込み量を定量的に評価するためのSDS−PAGE及びウエスタンブロット分析が可能であった。我々が典型的に使用するAV負荷では、このレベルは、通常、40〜60％の範囲にある。興味深いことに、L48Q cTnCは、Ca2+トランジェントの振幅に対して何の効果も有さず、これは、高められた短縮が、筋フィラメントCa2+感受性の増加にのみ起因することを示唆する。対照的に、L57Q及びI61Q cTnCは、短縮／弛緩パフォーマンスを低下させ、Ca2+トランジェントのベースライン及び振幅を低下させた。短縮、Ca2+トランジェントの振幅及び＋kFLが同時に減少したことは、筋フィラメント−SRが、培養わずか48時間後に相互作用することを示唆する。
【０１４２】
【表１０】
2014517694.tif 000012
【０１４３】
表9及び表10に示すデータから、スキンド心筋において力のCa2+感受性を増加／減少させるcTnC変異体は、培養心筋細胞においても、収縮のマグニチュード及び速度を増加／減少させると判断した。興味深いことに、L57Q及びI61Q cTnCはともに、Ca2+トランジェントの減少と同時に収縮性を減少させた一方、L48Q cTnCは、Ca2+トランジェントの振幅を変化させるか、或いは弛緩を遅らせることなく、収縮性を増加させる（表10）。これは、変異体が、心筋細胞の細いフィラメントにおいて、天然タンパク質と部分的にしか置き換わっていないにもかかわらず生じたことから、cTnC変異体は、天然cTnCと完全に置き換わらなくとも、筋フィラメント収縮に大きな影響を与え、SR機能に影響を及ぼし得ることが実証された。天然及び変異体種のこれらの異種集団は、動物モデル及びヒト疾患において、変異の可変的な浸透（variable penetration of mutations）も模倣しており、in vivo心臓研究における組込みプロファイルと類似する可能性が高い。
【０１４４】
短縮及びCa2+トランジェントは、左冠動脈下行枝の永久結紮により梗塞させた心臓（4週間）に由来する心筋細胞において減少した（図11）。収縮挙動の低下は、主として、Ca2+トランジェントの低下に起因し得る（表11）。重要なことに、L48Q cTnC発現は、これらの心筋細胞の短縮及びCa2+トランジェント振幅の両方を救い（図11、表11）、短縮のみが高められた正常な心筋細胞とは対照的であった。これは、L48Q cTnC発現は、不全心筋において、収縮の筋フィラメントCa2+感受性に影響を及ぼすだけでなく、SR機能にも影響を及ぼし得ることを示唆する。AV−WT cTnCでのトランスフェクションは、収縮性又はCa2+トランジェント特性を変化させなかったことから（データは示さず）、これは、細胞質のcTnCプールではなく、筋フィラメントに組み込まれたcTnCに起因する可能性が高い。
【０１４５】
【表１１】
2014517694.tif 000013
【０１４６】
成体心筋細胞は、評価（48〜72時間）まで静止していたことから、収縮性及びCa2+トランジェントの変化は、刺激歴（stimulation history）のない培養時に起こっており、Ca2+トランジェントの変化は、タンパク質含量の変化ではなく、SR及び／又は筋線維鞘タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）の変化に起因し得ることが示唆される。刺激歴の重要性を実証するために、我々は、非刺激（静止）心筋細胞と慢性刺激（1 Hz）心筋細胞との短縮及びCa2+トランジェント振幅を比較し（図17）、播種してから30時間後に、刺激細胞について、45％高い短縮、28％高いCa2+トランジェント振幅、並びに＞50％速いCa2+トランジェントの上昇（+kFL）及び減衰（kDecay）を見出した。
【０１４７】
［実施例14］
AAV6＋心臓特異的プロモーターを介した遺伝子デリバリー。rAAV6ベクターの作製は以前に記載されるとおりである39（二重下線）。WT及びL48Q cTnCのためのべクター（それぞれ、AAV6−WT cTnC、AAV6−L48Q cTnC）は既に作製されており、I61Q及びL57Q cTnCに対するベクターは作製している。簡単に述べると、心臓特異的プロモーター（cTnT455、ワシントン大学のDr. Steven Hauschkaから提供）及びC末端c−Mycタグを含む組換えAAVゲノムを用いてプラスミドを作製する。cTnC変異体導入遺伝子発現（mCherry蛍光レポーターを有する）カセットを、パッケージング／ヘルパープラスミドpDGM6とともに、CaPO4沈殿法によりHEK293細胞へと共トランスフェクションする。ベクターを培養物から集め、凍結融解し、上清を集める。アフィニティー精製にはHiTrapヘパリンカラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を使用する。ウイルスを、ショ糖密度勾配（40％）で、27,000 rpm（18時間、4℃）で遠心分離して濃縮し、Hanks液（Hanks balanced solution）中、再可溶化する。ベクターゲノムは、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、SV40ポリアデニル化領域オリゴヌクレオチド32P末端標識プローブを用いて、プラスミド標準に対して決定し、qPCRにより確認する。
【０１４８】
図12は、3匹のマウスそれぞれに低ウイルス粒子量（dose）（L；0.6×1012）及び高ウイルス粒子量（H；1.2×1012）で全身注入（眼内）したAAV6−L48Q cTnCの初めての使用を実証する。心エコー検査により、注入後2週間で、非注入（UN)コントロールと比較して、左心室（LV）駆出率が約20％増加し、3週間で30〜40％増加したことが示された。この結果を確認するために、偽注入（sham）及びAAV6コントロール注入を実施する必要があるものの、コントロールAVベクター用いた全身注入は、LV機能を変化させない。1匹のAAV6 L48Q cTnC−mycトランスフェクトマウス（及び非注入コントロール）から筋原線維をSDS−PAGEにより分離し、ウエスタンブロットを抗cTnCでプローブした。mycタグの存在によりcTnCの移動が遅くなり（図13）、天然cTnCに対するcTnC−mycの比率を、デンシトメトリーにより約40％と決定した（これは、以下のアデノウイルス及びトランスジェニック動物を用いて観察されたものと類似する）。
【０１４９】
［実施例15］
アデノウイルス（AV）を介した遺伝子デリバリー。AVベクターは、培養でより効率的であるため、いくつかの実験について、我々は、心筋細胞におけるcTnC変異体トランスフェクションのためにそれらの使用を継続する。形質導入細胞を同定するために、同一ウイルス中、別のカセットとして発現するレポータータンパク質GFPとともに、AVベクターをHEK293細胞により作製する（図14）。これらのベクターは、通常、培養心筋細胞の筋原線維において、天然cTnCの40〜60％の置換をもたらす。このレベルは、MolkentinグループのL48Q及びI61Q cTnC誘導性マウスで得られたレベルと類似する（以下）。
【０１５０】
［実施例16］
トランスジェニックL48Q及びI61Q cTnCマウスの使用。野生型（WT）、L48Q又はI61Q cTnCを発現するトランスジェニックマウスを開発した。全ての構築物は、誘導性の心臓特異的α−ミオシン重鎖（α−MHC）プロモーターを利用し40（二重下線）、筋細胞の構造又は機能に影響及ぼさないことが以前に示されている単一の3' flagエピトープタグを含む41（二重下線）。天然cTnCのflagタグcTnCでの置き換えパーセントは、cTnC特異的モノクローナル抗体（Abcam, 1A2クローン）と抗flag抗体（Sigma）の両方を用いて、全心臓溶解物のウエスタンブロットにより、各ラインについて評価した。
【０１５１】
flagエピトープは、cTnCバンドの移動を遅らせるので（図15）、天然cTnCに対するトランスジェニックcTnCの比率をデンシトメトリーにより決定した。全cTnCに対するflagタグcTnCの割合を％置換で表す。各構築物について、最も高い発現ラインは、約40〜50％の置換を有し、遺伝性心筋症患者について予期された置換と類似した。さらに、我々は、天然cTnCの変異体cTnCでのこの％置換が、スキンド調製物におけるCa2+感受性の増加と、無傷の筋細胞における短縮の増加を生じさせるのに十分であることを示している。我々は、動物モデルと比較するために、スキンド肉柱及び培養心筋細胞における力価（titration）の比（WT：変異体）を用いてこれを確認する。flag抗体は、ダブルトランスジェニックマウス（DTG、TTA+及びcTnC+）における導入遺伝子のロバストな発現の証拠も提供するが、導入遺伝子単独で陽性である、マウスにおける誘導性α−MHCプロモーターのわずかなリークも示す。
【０１５２】
［実施例17］
トランスジェニックR92W／L cTnTマウスの使用。変異は、ヒト心筋症患者で見られるものと類似する。ヘテロ接合マウスは、筋フィラメント中に約50％（35〜70％の範囲）のcTnC変異体を組込み、軽度の肥大が認められる。これらのマウス由来のスキンド心臓組織は、短い（1.9 μm）及び長い（2.3 μm）サルコメア長（SL）の両方で、Ca2+感受性の増加（0.3〜0.4 pCa単位）を有する15（二重下線）。培養心筋細胞は、2ヶ月において、静止時のSLが短くなり、短縮及び弛緩速度が減少し、Ca2+トランジェント振幅及び上昇／下降速度が減少する。これは、6ヶ月でいくらか改善し、適応が示唆される。Ca2+ダイナミクスの変化は、SR負荷の増加及びホスホランバン（PLB）のセリン16、17のリン酸化と関連する。
【０１５３】
［実施例18］
梗塞心臓の調製。心筋梗塞は、左冠動脈下行枝の永久結紮により達成される。これは、典型的には、短縮率の低下と空洞拡張の増加を伴う、左心室自由壁断面積の約30〜35％（全LV領域の10〜15％）の梗塞域をもたらし（図16A〜C）（心エコー検査による）、前負荷増加に対する反応性の喪失をもたらす（図6D）（拍動心臓測定による）。
【０１５４】
［実施例19］
我々は、培養成体心筋細胞、培養肉柱及び筋原線維調製物を使用して、収縮及びSR機能に対するcTnC変異体の影響を研究する。培養心筋細胞は、短縮／弛緩サイクルの間、SR機能に対して詳細な情報を提供する一方、細胞は、心臓のような外部ストレインを受けない。培養した肉柱は、Ca2+トランジェントのモニタリングとともに、負荷下の等尺性力及び短縮の測定を可能にする。我々は、殆ど細胞層のない（深さ）小さく薄い肉柱を使用して、拡散を最大限に高め、調製物内への蛍光プローブの通過と拡散勾配に起因するシグナル変化を回避する。単離した筋原線維の力学測定は、最大及び最大下のCa2+活性化の間、筋原線維の細いフィラメントに組み込まれた、変動し（調節可能）、定量可能なレベルのcTnC変異体を用いた、収縮及び弛緩動態の詳細な研究を可能にする。表12に、調製物、変動刺激歴（24〜48時間、AVベクターでトランスフェクション）、試験条件、刺激歴の最後に行われる測定を含む、この目的のための実験を要約する。
【０１５５】
【表１２】
2014517694.tif 000014
【０１５６】
表12に概要を示すとおり、培養成体ラット心筋細胞をWT、L48Q、L57Q又はI61Q cTnCに対するベクターでトランスフェクションした後、非刺激細胞と、刺激歴を有する細胞との収縮性及びCa2+トランジェントを測定する。短期間での1 Hz刺激歴（0〜30分間）は、急速なアドレナリン作動性反応と関連する、筋フィラメント及びSR機能の急性適応反応に関する情報を提供し、一方、長期間の刺激（1〜24時間）は、筋フィラメント、SR、筋線維鞘タンパク質及び関連するキナーゼの転写調節（リアルタイムPCR（RT−PCR）から決定される）を含む、より長期の適応反応についての情報を示す。初期実験により、刺激歴が、収縮、Ca2+サイクリング挙動、及びアドレナリン反応性を変化させるかを決定することができる。次いで、次の実験条件下、これらの効果を独立して研究する。
【０１５７】
我々は、細胞外［Ca2+］（[Ca2+］ext）を変化させて、Ca2+誘発性Ca2+放出（CICR）に対する潜在的効果を測定し、筋フィラメントクロスブリッジ（CB）阻害剤（BDM、ブレビスタチン）を使用して、SR機能に対する収縮力学の影響を測定する。我々は、α−（フェニレフリン）又はβ−アドレナリン（イソプロテレノール）投与（challenge）を使用して、反応が、cTnC変異体及びcTnIとのその相互作用に依存するかどうかを測定する。CB阻害剤及びアドレナリンアゴニストは、収縮測定及びCa2+トランジェント測定の前に除去する。
【０１５８】
短縮及びCa2+トランジェント測定のために、心筋細胞にfura−2 AMを負荷し、0.5、1、2及び3 Hzでの収縮／弛緩をビデオ顕微鏡（IonOptix, Milton, MA）を用いてモニタリングする。SR機能の測定のために（Co−I）、以前に記載されるように42（二重下線）、rhod−2又はfluo−4の膜透過性アセトキシメチルエステル体を負荷した単離心筋細胞において、全体的な（global）［Ca2+］iをNikon x60レンズ（NA＝1.4）を接続したNikon掃引場共焦点システム（swept field confocal system）を用いて画像化する。測定は、リアノジンレセプター（RyR）からの局所的Ca2+放出イベント（スパーク）の振幅及び頻度、肉眼的なCa2+放出及び再取り込みの挙動、及びカフェイン誘導性のSR Ca2+枯渇を用いたSR C
a2+負荷を含み、これらは全てSantana研究所でルーチンに実施する42−46（二重下線）。図18は、Ca2+トランジェントトレース（rhod−2）の例を示し、これにより、L48Q cTnCが、WT cTnCと比較して、RT90及び減衰速度（т）をわずかに加速することが実証される。対応するデータを表13に要約する。
【０１５９】
【表１３】
2014517694.tif 000015
【０１６０】
［実施例20］
培養及びスキンド肉柱を用いた実験：我々は、in vivoで起こるように、外部負荷下及び様々なサルコメア長（SL）において、cTnC変異体が収縮にどのような影響を及ぼすかを決定する。薄い（＜120μm直径、約50μm深さ）心臓肉柱を、全てのcTnC変異体についてAVベクターでトランスフェクションした後、Adlerら47（二重下線）及びJanssenら48（二重下線）により報告されるように培養する。
【０１６１】
初期実験により、cTnC変異体の細いフィラメントへの最適な組込みをもたらすトランスフェクション期間を決定する。培養心筋細胞では、顕著なタンパク質産生が、AVトランスフェクション24時間以内に生じており（GFPシグナルにより示されるとおり）、肉柱でも同様の結果が予期される。1 Hz刺激歴の後、収縮及びCa2+トランジェントを測定する（表12）。調製物にfura−2を負荷し、刺激電極を含む酸素化灌流チャンバー中、力変換器とリニアモーターの間に置く49−51（二重下線）。＜60分間の刺激期間では、fura−2負荷は、刺激プロトコルの開始前に実施する。等尺性単収縮力（twitch force）及びCa2+トランジェント、並びにそれらのSL依存性（Frank−Starling関係、SL＝1.9対2.2μm）は、培養心筋細胞に関するプロトコル（上記参照）と同じプロトコル下で測定する。我々は、標準的なKrebs−Henseleit液、95／5％ O2／CO2及び37℃を使用する48（二重下線）。定常収縮特性は、以前に、0.2〜0.5 Hz刺激で24〜36時間維持されており52（二重下線）、これを48＋時間に延長しても殆ど問題とはならないと予期される。
【０１６２】
コントロールされた最大下のCa2+レベルおいて、筋フィラメント収縮が、cTnC変異体によりどのような影響を受けるかについての詳細を得るために、形質導入した肉柱を、刺激プロトコルの後に化学的に除膜（スキン）する。長いSL及び短いSLにおいて、pCa対力、力の再発生の速度（kTR）及び負荷された短縮を測定する。補足実験において、スキンド肉柱を、cTnC変異体とWT cTnCとの混合物に交換して、収縮に影響を及ぼす必須レベルの変異体組込み（細いフィラメントへの）を測定する。筋フィラメントへのcTnC変異体の組込みを定量化する（下記参照）。
【０１６３】
［実施例21］
筋原線維を用いた実験：筋フィラメント弛緩は、正常な心臓機能の重要な構成要素である；心室は、十分な拡張期充満を可能にするため、収縮後急速に弛緩しなければならない。この重要なプロセスは、病的状態において、多くの場合変化する。大きな拡散距離を有するスキンド肉柱において弛緩を評価することは難しい。しかし、筋原線維調製物は、小さな拡散距離を有し、msタイムスケールでの急速な溶液交換及び力測定が可能であり、無傷の細胞のCa2+トランジェントとは独立して、筋原線維の活性化及び弛緩についてcTnC変異体を評価することが可能である。別々の実験において、刺激プロトコル後に、cTnC変異体でトランスフェクトした心筋を切って筋原線維調製物を作製し、力発生速度（kact）及びkTRのCa2+依存性、並びに遅い弛緩速度（kREL、slow）及び速い弛緩速度（kREL、fast）を測定する。ラット心筋原線維中に交換されるWT、L48Q及びI61Q cTnCがこれらのパラメーターにどのような影響を及ぼすかの例を図19に示す。パネルBは、L48Q cTnCを用いた場合のkREL、slow及び50％弛緩時間における、小さいが有意な増加を示す。これは、培養心筋細胞でのデータと対立するようである（表10）。見かけ上の差は、以下により説明され得る：1）等尺性対非負荷条件、2）活性化Ca2+の異なる量及び経時変化、3）筋原線維に組み込まれるcTnC％の差、4）筋フィラメントリン酸化の差、又は5）弛緩動態に影響を及ぼすことが公知のADP、Pi又はpHの差。筋原線維研究では、我々は、独立して、［ATP］、［ADP］、［Pi］、［Ca2+］、pH及び筋フィラメントタンパク質のリン酸化（PKA、PKC、ホスファターゼなど）を変更でき、全ての条件は心臓で変動し、無傷の心臓調製物で調節することが難しいものである。この技術の重要な強みは、力発生及び弛緩が、同じプロトコルで研究され、等容性（等尺性）期の心臓収縮（kact）及び拡張（kREL）に関連性を有する測定を提供することである。
【０１６４】
［実施例22］
タンパク質プロファイリング：全ての条件下、収縮機能、Ca2+トランジェント、SRスパーク活性及び／又はCa2+負荷の変化は、表12のプロトコル条件と適合する高密度細胞培養物由来の、筋フィラメントタンパク質（cTnI、cTnT、MLC−2、cMyBP−C及びTm）、SRタンパク質（PLB、RyR）及び筋線維鞘タンパク質（PMCA、L型Ca2+チャネル）の存在量及びリン酸化と相関する。タンパク質発現の変化は、RT−PCR及びウエスタンブロット分析を用いて測定される。SRタンパク質画分は、既報の方法に従って調製される53−56（二重下線）。cTnC変異体組込みの分析は、トランスフェクトされた細胞由来の筋原線維調製物をウエスタンブロットすることにより実施される。形質導入されたタンパク質の同定は、AVベクターについては、cDNA上のC末端ヒスチジンタグ（His−タグ）により可能である；AAV6ベクターは、同じ目的でC末端c−mycタグを含む。SDS−PAGEはタンパク質化学量論を提供し、ウエスタンブロットは、cTnC対His−タグ又はc−myc抗体を用いて、レシオメトリック分析のためにプローブされる（図20のような例）。リン酸化の変化は、Pro−Q Diamond（タンパク質含量のためのSypro Ruby染色とともに）及びウエスタンブロット分析を用いて測定される。図21は、筋フィラメントタンパク質リン酸化が、WTとI61Q cTnC形質導入心筋細胞とで異ならないことを示しており、これは、I61Q cTnCによる短縮の減少（表10）が、トロポニンCa2+結合及びSR Ca2+放出の変化に起因することを示唆する。部位特異的セリン及びスレオニン残基リン酸化について、我々は、質量分析のためにサンプルを送ることが可能である。
【０１６５】
［実施例23］
実施例19〜22で概説を述べる系統的な一連の研究は、心臓の細いフィラメントのCa2+結合の変化が、種々の条件下、収縮及びCa2+ホメオスタシスにどのような影響を及ぼすか、及び反応が、タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）によってどのように媒介され得るかについての詳細な情報をもたらす。我々は、心筋細胞において、筋フィラメントCa2+結合の変化と、Ca2+ホメオスタシスの制御とは直接的な関係を有すると予期する。いくつかの予期される結果及び潜在的仮説は以下のとおりである：
【０１６６】
L48Q cTnC：L48Q cTnCは、静止した心筋細胞の筋フィラメントCa2+感受性を増加させ（表9）、静止心筋細胞のCa2+トランジェントに殆ど影響を及ぼすことなく短縮を増加させた（表10）一方、1 Hz刺激を24時間行うと、両方とも増加し、さらにCa2+トランジェント減衰も加速した（図17）。これは、刺激が、in vitroにおける筋線維鞘及びSRのCa2+挙動に主に影響を及ぼし得る一方、L48Q cTnCは、筋フィラメントの挙動に主に影響を及ぼすことを示唆する。従って、我々は、刺激歴が、おそらくSR／筋線維鞘タンパク質リン酸化を介して、力及び短縮の増加とともに、SR機能（Ca2+負荷、CICRなど）に影響を及ぼすと予期する。例えば、刺激歴後のCa2+トランジェント振幅及び再隔離の増加は、それぞれ、RyR及びPLBのリン酸化の増加に起因し得る57,58（二重下線）。このように、我々は、β−アドレナリン刺激が、刺激歴を有するものよりも、非刺激の細胞に影響を及ぼすと予期する。我々は、クロスブリッジ（CB）阻害剤が、I61Q cTnCで見られたものにと同様にSR機能を低下させ、収縮性も低下させる（図11；表10）と予期する。まとめると、これは、筋フィラメントの力学挙動（又はCa2+緩衝能力）は、SR Ca2+放出自体の電気刺激とは対照的に、刺激収縮の間にSR機能に影響を及ぼすとの仮説を示唆する。そうであるなら、CB阻害は、CB数は負荷とともに増加することから、非負荷の心筋細胞よりも、無傷の肉柱の負荷収縮に影響を及ぼすはずである。L48Q cTnCは、Ca2+トランジェントに殆ど影響を及ぼさないため、我々は、非刺激の細胞のSR機能、筋フィラメント若しくはSRタンパク質含量、又はリン酸化はほとんど又は全く変化しないと予期する。これは、刺激歴によって異なり得、また無傷の肉柱においては、より多きな筋フィラメントCa2+感受性及びCB活性に起因して異なり得る。
【０１６７】
I61Q及びL57Q cTnC：L57Q及びI61Q cTnCは、静止した心筋細胞の筋フィラメントCa2+感受性、短縮及びCa2+トランジェント振幅を減少させた（表10）。これは、筋フィラメント活性が、SR機能の変化を進め得る（刺激歴でも見られるとおり）という先に記載の仮説（前記パラグラフ）を支持する。結果は、Ca2+トランジェントの低下をもたらす特定の力学的変化の決定に役立つ。例えば、L57Q又はI61Q cTnCの場合にSR Ca2+放出が低下したことは、キナーゼ活性の低下又はホスファターゼ活性の増強に起因して、RyRリン酸化が低下したことを示唆する。あるいは、これらのcTnC変異体は、SR Ca2+負荷（PLBリン酸化の低下を介して）の変化を進め得、またCa2+トランジェント振幅も低下させ得る。そうであるなら、β−アドレナリン刺激は、WT又はL48Q cTnCと比較して、I61Q又はL57Q cTnCトランスフェクト細胞において、SR機能及びCa2+トランジェントの増加に大きな効果を有し得る。より高い刺激頻度（測定の間、0.5 Hzに対して2〜3 Hz）は、CICR及び細いフィラメントへのCa2+結合を高めることによって収縮性を増加させ、次にSR負荷及び機能を変化させ得ると予期される。刺激歴（1 Hz）が類似の効果を提供するかどうか確かめることは興味深い。［Ca2+］extの増加は、CICRメカニズムを強めることにより、Ca2+トランジェント及びSR機能に対するL57Q又はI61Q cTnCの効果を改善すると予期される。
【０１６８】
弛緩：培養心筋細胞での弛緩はcTnC変異体による影響を殆ど受けないものの、無傷の肉柱の弛緩は、cTnC変異体による影響を受けると予期される。これは、培養心筋細胞における収縮は負荷されていない一方、肉柱は等尺性収縮を受けるためである。従って、cTnC Ca2+結合特性は、負荷収縮の間により顕著な効果を有し、弛緩動態は、クロスブリッジサイクリング速度、及び虚血において変化するATP加水分解基質／産物の条件によって主に決定される59−64（二重下線）。単収縮（twitch）弛緩が、cTnC変異体により影響を受けるならば、最大下（Ca2+）活性化筋原線維の弛緩速度（特に、kREL、slow）も同様に影響を受けると予期される。筋原線維実験により、弛緩の変化が、SR機能ではなく筋フィラメント挙動に起因するかどうかを決定することも可能である。
【０１６９】
［実施例24］
AAV6−cTnCベクター及びトランスジェニックマウスを用いて、心臓機能に対するcTnC変異体の急性及び慢性の効果を研究する。筋フィラメント機能における急性変化に対する反応を決定するために、心臓特異的プロモーター（cTnT455）を有するAAV6−cTnC変異体（WT、L48Q、L57Q又はI61Q）を正常成体マウスに尾静脈又は眼内眼球孔注入を介してトランスフェクトする。並列実験は、成体となるまでMHCプロモーターを抑制することにより、L48Q cTnC及びI61Q cTnCトランスジェニックマウスを用いて実施する。追加の研究は、正常な心臓の発生及び機能に対するこれらcTnC変異体の効果を決定するために、プロモーターを抑制しないマウスを用いて実施する。この目的の範囲を制限するために、我々は、主に成体マウスでの研究に焦点をあてる。しかし、いずれかの機能変化の発症及び進行を決定するために、1、2、3及び6月齢で心エコー検査評価を行う。複数の動物に、イソプロテレノールを用いたβ−アドレナリン刺激を介してストレスを与える。心エコー検査後、複数の動物にはMillarカテーテルプロトコルを用いた血行動態測定を受けさせ、その他は安楽死させて、拍動振動プロトコル、又は無傷若しくはスキンド肉柱調製物、培養心筋細胞若しくは筋原線維調製物のために心臓を解剖する。
【０１７０】
［実施例25］
心エコー検査。in vivo心臓機能評価は、心エコー検査を用いて非侵襲的に実施する。傍胸骨長軸像を用いて、左心室流出路の流速及び流出路断面積（CSA）を測定し、一回拍出量（SV＝CSA×時間速度積分値（大動脈流速面積））及び心拍出量（CO＝SV×心拍数）を計算する65（二重下線）。心室中央（乳頭筋）レベルでの短軸2−D像を用いて、左心室収縮末期径（LVESD）及び拡張末期径（LVEDD）、前壁及び後壁（PW）径のMモード測定を得る。これらを用いて、パーセント短縮率［（LVEDD−LVESD）／LVEDD×100％］及び左心室壁質量（wall mass）［1.05（IVS厚さ+LVEDD+PW厚さ）］を計算する66,67（二重下線）。クオリティコントロールは、2つの異なるセッション間での単独のリーダー、及び複数の画像についての測定を得る二人の盲検リーダーについて、観察者内変動及び観察者間変動を決定することにより達成される。
【０１７１】
［実施例26］
In Vivo生理学。心臓収縮性のリアルタイム評価、並びにFrank−Starling及び圧力−容積関係の変化は、小型インピーダンス／微圧計カテーテル（Millar Instruments）を用いて実施する。血流力学パラメーターとしては、心拍数、拡張末期圧及び収縮末期圧、+dP／dt、−dP／dt、一回仕事量（SW）対拡張末期容積（EDV）の勾配（slope）、及び心室圧減衰の時定数が含まれる。これらの拍動パフォーミングパラメーターは、同様の前負荷及び後負荷下、マウス心臓の収縮／弛緩パラメーターのダイナミクス研究において、in vitro拍動心臓（下記参照）、肉柱及び筋原線維測定と比較して優れている可能性がある。
【０１７２】
［実施例27］
In Vitro拍動心臓（working heart）。心エコー検査後、動物実験の最終時点において、in vivoでの評価が難しい、ポンプパフォーマンス及び変動させた前負荷及び後負荷（±イソプロテレノール）に反応する能力を評価するために、複数の心臓を摘出し、拍動心臓装置（Experimetria）にのせる。次いで、形態学的及び組織学的分析のためにこれらの心臓を処理する。図16Dは、正常心臓と比較して、梗塞したラット心臓において、前負荷に対する反応（出力）の減少を示す。
【０１７３】
［実施例28］
肉柱、心筋細胞及び筋原線維。エンドポイント心エコー検査後、複数の心臓を摘出し、心室を以下のために調製する：1）無傷又はスキンド肉柱の解剖、2）培養心筋細胞、又は3）筋原線維調製物。実験的測定は上述のとおり実施する。
【０１７４】
［実施例29］
形態学的及び組織学的分析：in vitro拍動心臓測定のために使用するものを含む、複数の解剖心臓を、よく確立された手順に従って、重量分析のために採取し、固定し、包埋し、染色（H&E、マッソントリクローム、ピクロシリウスレッド）する27,68（二重下線）。切片を、肥大（細胞及び心室）及び拡張のサインについて評価する。潜在的線維症を評価するために、％コラーゲン面積を、円偏光下、トータルピクセルの％として、ピクロシリウスレッド陽性ピクセルの数により画像から定量化する。形質導入心臓の連続切片は、AAV6−cTnC変異体処理後のin vivo及びin vitro機能の変化と相関させるため、パーセントmCherry（又はmyc−タグ）陽性細胞の定量化のためにImageJを用いて分析する。
【０１７５】
［実施例30］
実施例24〜29で概要を述べた体系的な一連の研究は、in vivoにおいて、収縮の筋フィラメントCa2＋感受性に影響を及ぼす短期間及び長期間の心臓の変異への適応（内在的（intrinsic）適応は、一定のパラクリン及びホルモン変動を受ける）についての詳細な情報をもたらす。筋フィラメントのCa2+感受性を変化させるcTnC変異体は、心臓機能、SR機能及び筋フィラメント／SRタンパク質プロファイルに対して、異なる急性対慢性効果を有すると予期される。心不全が、β−アドレナリン反応性の下方制御（並びにPKC発現及び標的リン酸化の上方制御69−71（二重下線））と関連する一方、I61Q cTnCは、心臓ポンプ機能を増加させようとして、短期間でβ−アドレナリン媒介性の効果を増加させ得ると予期される。同様に、L48Q cTnCの場合の心臓収縮性の増加（図12）は、β−アドレナリン反応性の低下を導き得る。さらに、L48Q cTnCでの短期間におけるポンプ（in vivo）及び心臓組織収縮（in vitro）の増加のFrank−Starling機構は、収縮活性化が顕著に改善され、細いフィラメント活性化に対するCBの貢献がほとんど必要とされないことから、鈍化し得る72（二重下線）。I61Q cTnCについて、Frank−Starling機構は、無傷のままであり得るが、ポンプ機能全体としては減少しているようである。トランスジェニック動物では、これらの影響は、筋フィラメント収縮性の変化を補償するSRタンパク質含量及び／又はリン酸化の長期にわたる適応を介して、無効にされ得る。
【０１７６】
我々は、筋フィラメントCa2+感受性の変化自体が、肥大型又は拡張型の心室機能及び形態学的表現型を生じ得るかどうかを直接試験する。我々は、これは、AAV6−cTnC形質導入の相対的に短い曝露では生じないが、L48Q cTnC（肥大）及びI61Q（拡張）を有するトランスジェニックマウスが老化すると、ある程度生じ得るとの仮説を立てる。これらのcTnC変異体曝露歴のそれぞれについて、SR／筋線維鞘及び筋フィラメントタンパク質のリン酸化プロファイルに差が生じることが予期される。
【０１７７】
［実施例31］
我々は、梗塞心臓に対するL48Q cTnCの効果、並びに、R92W／L cTnC変異を有する若齢及び成体マウスに対するI61Q（又はL57Q）cTnCの効果を調べる。梗塞心臓。L48Q cTnCが、心筋梗塞後の心臓機能を改善し得るかどうかを調べるために、梗塞手術をしてから3〜7日後、機能欠損の程度を特徴づけるための心エコー検査の後、AAV6−L48Q cTnCでマウスをトランスフェクトする。最初の心エコー評価は、機能の増加を調べるのに最良の時点を調べるため、トランスフェクションしてから1、2、4及び8週間後に実施する。また、ベクター用量研究を行って、最適な治療レジメンを決定し、これを筋原線維へのL48Q cTnCの組込み測定と関連づける（上記に示す）。正常マウスへの低用量（0.6×1012）の注入（図12）は、駆出率の増加に非常に効果的であった。次いで、複数の動物において、Millarカテーテル実験を介して、in situ血流力学特性を測定する（上記のとおり）。拍動心臓、無傷及びスキンド肉柱、培養心筋細胞、並びに単離筋原線維に対するin vitro研究のために、追加の動物を使用する。上記のとおり、これらの研究に必要とされる動物の数を制限するために、どの調製物が最も有益であるかを決定し、測定の大部分をそれに集中させる。L48Q cTnCが、左心室機能の喪失を予防するかどうかを決定するために、別々の動物セットに対し、梗塞手術前にAAV6−L48Q cTnCをトランスフェクトする。In vitroでの拍動心臓実験のために使用するものを含む、いくつかの解剖心臓を重量分析のために得、固定し、包埋し、染色し、肥大及び線維症のサインについて評価する（上記のとおり）。梗塞心臓の連続切片をImageJを用いて分析し、AAV6−L48Q cTnCトランスフェクション後のin vivo及びin vitro機能の変化と相関させるため、梗塞サイズ及び％mCherry陽性細胞を定量化する。
【０１７８】
［実施例32］
R92W／L cTnTトランスジェニックマウス。R92W／L cTnTマウスを1月齢にてAAV6−I61Q（又はL57Q）cTnCでトランスフェクトし、これらの変異体が、2ヶ月で報告される機能的表現型（心臓機能の低下、筋フィラメントCa2+感受性の増加、及びSR機能（PLB ser16、17リン酸化と関連する58,73（二重下線））の低下を含む）を低下又は排除するかどうかを決定する。R92W心臓は、R92Lを用いた遅い誘導（10ヶ月）と比較して、心筋症マーカー（心房性ナトリウム利尿因子、α−骨格筋アクチン）を早期（2ヶ月）に誘導するので、我々は、5〜6月齢のR92Lマウスもトランスフェクトして、R92Lマウスにおいて、より遅い治療が、後期の軽度の肥大を低下又は排除するかどうかを決定する。心エコー分析は、I61Q（又はL57Q）cTnCの安定的な発現及び筋フィラメントへの組込みが生じることが確立されている時点（図12）で実施する。複数のマウスを1歳まで隔月で追跡調査して、心臓機能に対してAAV6の治療効果が持続するかどうかを決定する。測定のエンドポイントにて、複数の動物をin situ血流力学測定（上記のとおり）のために使用し、その他は、拍動心臓、無傷及びスキンド肉柱、培養心筋細胞及び単離筋原線維（上記のとおり）に対するin vitro研究に使用する。
【０１７９】
［実施例33］
心エコーストレイン分析。Mモード測定に加えて、電流心エコートランスデューサーは、高機能評価に十分な分解能を提供する。これは、in vitro測定にin vivo相関性を与える、収縮期及び拡張期のセグメントのストレイン及びストレイン速度の測定を含み、心室壁コンプライアンス及び（適切な）壁運動に対する追加の機能的パラメーターを提供する。これは、正常、梗塞心臓及びR92W／L HCM心臓に対するcTnC変異体の影響を研究するために有益である。ストレインは、元のストレスを受けていない大きさの心筋から、伸展（lengthening）、圧迫、又は短縮による長さの変化を表し77,78（二重下線）、ストレイン速度は、対象となる2つの時点の間における経時的な大きさの変化を測定する。スペックルトラッキングは、超音波ビームにより生じる独特のグレースケールのスペックルを与え、その独特のパターンを用いて、ソフトウェアにより、心臓1サイクルの間のスペックル移動速度に基づき、ストレイン及びストレイン速度を計算する79,80（二重下線）。例となるスペックルトラッキング研究（図22）は、高血糖マウスにおける収縮期及び拡張期心臓機能を示す。スペックルトラッキングは、従来の心エコー検査と同様に、短軸像を用いて得られるので、いずれの追加の研究も必要とされない。
【０１８０】
筋フィラメントCa2+感受性の増加（L48Q cTnC）は、梗塞心臓の心臓パフォーマンスを増加させ、心不全の進行を遅らせると予期される。これは、慢性β−アドレナリン刺激の低下により生じ得る。そうであるなら、L48Q cTnC形質導入梗塞心臓と、非処理梗塞心臓との間で、α−及びβ−アドレナリン媒介性タンパク質リン酸化に反映される、副交感神経と交換神経の緊張のバランスに時間依存性の差が見られると予期される。
【０１８１】
R92W cTnTマウスについて、1ヶ月でのI61Q cTnCの形質導入は、2月齢で見られるR92W cTnTの有害作用を少なくとも部分的には無効とし、最終的には、心臓パフォーマンスの増加をもたらすと予期される。これは、SRタンパク質（例えば、PLBなど）のリン酸化の変化及びSR Ca2+負荷に起因し得、これらは、加齢とともにこれらマウスの適応反応で生じることが示されている（58）。同様に、R92L cTnTマウスにおけるI61Q cTnCの遅い形質導入（5〜6月齢にて）は、SRタンパク質のリン酸化も変化させ、機能を改善し、肥大型反応を遅延させると予期される。
【０１８２】
［実施例34］
培養成体ラット心筋細胞の刺激収縮に対する、R1R2及び［dATP］上昇の効果も特徴づけた。アデノウイルス（AV）ベクター。R1又はR2サブユニットのいずれかと、緑色蛍光タンパク質（GFP）に対する第二の発現カセットを発現する、CMVプロモーターにより駆動されるAVベクター（約250粒子／細胞）で心筋細胞を約48時間形質導入することにより、R1R2過剰発現を誘導した。また、形質導入／レポーターコントロールとして、GFPのみのAVベクターも作製した。R1R2過剰発現の程度を決定するために、新生児ラット心筋細胞を、同一条件下、AVベクターで形質導入し、タンパク質レベルをウエスタンブロット分析で決定した。ローディングコントロールとしてGAPDHを使用し、R1（図23A）及びR2（図23B）は、それぞれ、24倍及び46倍増加した。HPLC分析により、これは、GFP形質導入心筋細胞よりも、細胞［dATP］を約10倍（0.35 nmol／mg  タンパク質）増加させたことが示される（図23C）。これは、このAV粒子負荷について、複数の細胞バッチにわたって一致した（8〜12倍の範囲）。この効果はロバストである一方、［dATP］は、通常、アデニン三リン酸ヌクレオチド全体の＞0.2％を占めることから、［dATP］の上昇は、アデニンヌクレオチドプールのわずか約1〜1.5％を表すにすぎない。これは、心筋細胞収縮性の有意な増加には、少量のdATPしか必要とされないことを示唆する。
【０１８３】
［実施例35］
R1R2過剰発現は心筋細胞収縮性を高める。例となるトレース（図24）は、ビデオ長さ検出及び蛍光イメージング（IonOptix）を用いた場合、AV−R1R2形質導入が、最大細胞内Ca2+を増加させることなく（B；Fura−2）、非常に高い心筋細胞短縮（A）をもたらしたことを示す。0.5 Hz（25℃）で刺激した＞50細胞（各条件）のデータを表14に要約し、AV−R1R2トランスフェクションが、Ca2+トランジェント振幅又は基底レベルに影響を及ぼすことなく、短縮を約50％増加させ、短縮及び弛緩速度を約100％増加させたことを示す。これは、収縮の高まりが、主として、筋フィラメントに対する効果によるものであることを示唆する。R1R2過剰発現は、Ca2+トランジェントマグニチュードを変化させなかった一方、50％（DT50）及び90％（DT90）減衰までの時間は短くなったことから、SR Ca2+再取り込み又はNa+／Ca2+交換輸送体（NCX）媒介性の流出が高まったことが示唆される。これらの結果は、1及び2 Hz刺激でも同様に一致した。
【０１８４】
【表１４】
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【０１８５】
［実施例36］
R1R2過剰発現は、梗塞心臓由来の心筋細胞の収縮性を「救う（rescues）」。成体ラットにおいて、左冠動脈下行枝の結紮により心筋梗塞を誘導した。4週間後、成体ラット心筋細胞を培養し、次いで、AV−R1R2又はAV−GFPのいずれかで48時間トランスフェクトした。機能の喪失は、細胞単離前のin vivo心エコー検査を介して確認した（図34）。図25は、コントロール細胞（梗塞なし）と比較して、梗塞心臓由来の心筋細胞では、短縮マグニチュード（A）及び速度（B）が減少し、弛緩時間（C）が増加し、Ca2+トランジェント振幅（D）が減少したことを示す。
【０１８６】
これらの効果は、AV−R1R2形質導入（梗塞＋R1R2）により救われた。興味深いことに、R1R2過剰発現は、正常心筋細胞におけるCa2+トランジェントマグニチュードに対し何の効果も有さなかったが、梗塞細胞においては、コントロールレベルまでマグニチュードを増加させた。これは、R1R2過剰発現が、梗塞細胞において、SR Ca2+貯蔵及び／又は放出に対して有意な効果を有することを示唆しており、この作用の背景にあるメカニズムは、以下で提案するように、より詳細な調査を必要とする。
【０１８７】
［実施例37］
In vivo研究。R1R2過剰発現が心臓機能にどのような影響を及ぼすかを決定するために、アデノウイルス−AV−R1R2（+GFP）又はAV−GFP（のみ；コントロール）（各グループについて4〜6）を尾静脈又は心臓へ直接注入するかのいずれかにより、C57／Bl6マウスをトランスフェクトした。図26Aは、両方の方法がともに、注入4日後において、コントロールと比較して、左心室（LV）短縮率（FS）を増加させたことを示す。この増加は、拡張については変化することなく、収縮の間のLV内径が低下したことによるものであり、大きな心室の収縮（心室の拡張ではない）を示唆する。図26Bは、注入されたLVを示し、拡大領域（右側）により、緑色蛍光（GFP由来）によって示される局所的な形質導入領域（矢印）が実証される。意義深いことに、たとえ心臓のごく一部が直接注入により形質導入されたとしても、機能において大きな全体的な増加があった（図26A、右棒）。
【０１８８】
追加の研究にて、心拍数及び／又は一回拍出量が影響を受けるかどうかを決定する。提案研究のために、全ての実験について、TG−R1R2マウスのためのバックグラウンド系統であるFVB／Nマウスを使用する。また、長期の構造的適応が存在するかどうかも決定する。初期研究は、全体的に（gross）心臓の形態学的相違は存在しない（心臓重量：体重の比率、並びに心室の厚さ及び質量は類似する）ことを示すが、細胞肥大、筋原線維密度などは、決定されるべきである。
【０１８９】
［実施例38］
心筋を介したdATPの拡散は、AAV6−R1R2形質導入の有効性を増加させ得る。AV−R1R2の直接注入を用いた場合、AV−R1R2形質導入領域が小さいにも関わらず（LV容積の＜1％がGFP＋であった）、FSの大きな増加が観察されたことを驚きであった。これは、ごく一部の心筋細胞がR1R2を過剰発現し、得られたdATPが、ギャップジャンクションを介して非形質導入細胞に拡散し、その結果、より広範囲の収縮性の増加がもたらされたことを示唆する。ギャップジャンクションを介したATPの拡散は、他にも報告されている33,34。この考えを試すために、我々は、蛍光標識dATPを培養hESC心筋細胞に注入し、周囲の細胞への経時的な拡散を観察した（図35A、B）。固定後の細胞染色は、ギャップジャンクションカップリングの証拠であるコネキシン43陽性であった。我々は、拡散の定量分析を提供し、ギャップジャンクションの遮断が、dATPの移動も遮断することを実証するため、これらの研究を継続している。我々はまた、AV−R1R2を形質導入した（dATPドナー）ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（hESC−CM）と非形質導入（レシピエント）hESC−CMを共培養した。非形質導入細胞を解離し、ウイルスで形質導入したコホートの一つと共培養した。形質導入後48時間にて、ビデオ顕微鏡（IonOptix）により、共培養物を画像化し、収縮パラメーターを評価した。図35Cは、AV−R1R2−形質導入筋細胞（「dATPドナー細胞」、青色トレース）及びそれらと共培養したGFP−null筋細胞「「WT dATPレシピエント細胞」、赤色トレース）がともに、AV−GFP−形質導入筋細胞（「コントロールドナー細胞」、緑色トレース）又はそれらのGFP−nullパートナー（「コントロールレシピエント細胞」、黒色トレース）のいずれかのものよりも、有意に大きな細胞短縮を有したことを示す。これは、R1R2を過剰発現するdATPドナー細胞が、合わされたレシピエント心筋細胞の収縮特性を高め得ることを実証する。心臓機能の有意な改善には、心臓全体にわたる細胞／組織の高度なR1R2形質導入は必要とされ得ないとの示唆に対し、これまでのデータは十分説得力がある。
【０１９０】
［実施例39］
予備的なex vivo心臓機能。1のWT及び1のTG−R1R2マウス心臓について、Langendorff灌流の間、等容性収縮機能を記録した。LV圧力発生は、WT及びTG−R1R2心臓の両方において、LV容積の増加とともに増加し、正常なFrank−Starling反応を示した。しかし、LV圧力発生は、TG−R1R2心臓では全てのLV容積において上昇しており（図28A）、TG−R1R2動物におけるFSの増加（図27）により示されたポンプ機能の増加が確認された。LV圧力発生は、2 mMから4 mMに［Ca2+］が増加したことに反応して、TG−R1R2心臓でわずかに鈍化したが（図28B）、時間的変化の継続期間の間、WT心臓を上回る上昇を維持した。
【０１９１】
［実施例40］
31P NMRデータ。機能測定と同時に、心筋高エネルギーホスフェート含量（ホスホクレアチン、ATP、及びPi）を、ベースライン灌流の間、高［Ca2+］チャレンジとともに、31P NMRスペクトロスコピーにより測定した。WT（A）及びTG−R1R2（B）心臓について、NMRスペクトル（図29）を示す。これらのスペクトルにおいて、下部のトレースは、ベースラインのものであり、中央のトレースは、高［Ca2+］チャレンジ開始後10分のものであり、上部のトレースは20分のものである。重要なことに、ベースラインでのATP：心臓重量比は、WTとTG−R1R2心臓の間で同一であり（図29C、挿入図）、高［Ca2+］チャレンジを通じて変化しなかった。ATPに対するホスホクレアチン（PCr）の比率（図29C）は、TG−R1R2マウスにおいて、ベースラインでわずかに低かった一方、高［Ca2+］チャレンジ後に差はなかった。これは、主として、TG−R1R2マウスではPCr／ATP比率が維持された一方、WTマウスではPCr／ATP比率が低下したことによる。TG−R1R2心臓は、PCr／ATP比率がマッチする、高［Ca2+］チャレンジ20分後であっても、WT心臓よりも、非常に高いLV圧力を生じた点でこれは特に興味深い。急性及び慢性のR1R2過剰発現、並びに次の心筋梗塞＋／−R1R2過剰発現について、これらの観察を確認し、さらに展開させる。
【０１９２】
［実施例41］
AAV6構築物を用いた組織特異的標的化。AAV6構築物において、種々の遺伝子プロモーターにより駆動されるアルカリホスファターゼを用いて、組織特異性を評価した。表15は、2つの心臓特異的プロモーター（クレアチンキナーゼ7（CK7）及び心臓トロポニンT（cTnT455））と非特異的サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターとを、前脛骨筋（TA）におけるCK7に対して正規化した値で比較する。最も重要なことに、cTnT455は、心臓における高発現を導くが、他の組織での発現は皆無かそれに近い。この特異性は、非心臓組織におけるR1R2過剰発現作用の可能性を大きく低下させる。
【０１９３】
dATPは、マウス大動脈平滑筋の力発生に影響を及ぼさない。dATP上昇の潜在的な全身効果の研究を開始するため、我々は、Dr. Frank Brozovich（Mayo Clinic）と共同して、dATPが、マウス大動脈平滑筋収縮に影響を及ぼすかどうかを測定した。図30Aは、スキンド筋条片における連続した（back to back）収縮が、収縮基質として、dATPとATPとで異ならなかったことを示し、複数の実験データを図30Bに要約する。さらに、コントロール測定により、dATPが、アクチンと結合する平滑筋ミオシンを調節するミオシン軽鎖リン酸化のレベルを変化させなかったことが実証された（データ示さず）。
【０１９４】
【表１５】
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【０１９５】
［実施例42］
心臓特異的標的化のためのAAV6−R1R2。我々は、rAAV6ベクターを用いて、R1R2（及び［dATP］）の心臓レベルを急激（acutely）に増加させた。rAAV6ベクターの作製は、以前に記載されるとおりであった24*。簡単に述べると、心臓特異的プロモーター（cTnT455）を含む組換えAAVゲノムを用いてプラスミドを作製する。R1R2導入遺伝子発現カセットを、パッケージング／ヘルパープラスミドpDGM6とともに、CaPO4沈殿法によりHEK293細胞へと共トランスフェクションする。ベクターを培養物から集め、凍結融解し、上清を集める。アフィニティー精製にはHiTrapヘパリンカラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を使用する。ウイルスを、ショ糖密度勾配（40％）で、27,000 rpm（18時間、4℃）で遠心分離して濃縮し、Hanks液中、再可溶化する。ベクターゲノムは、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、SV40ポリアデニル化領域オリゴヌクレオチド32P末端標識プローブを用いて、プラスミド標準に対して決定し、qPCRにより確認する。
【０１９６】
AAV6構築物において、種々の遺伝子プロモーターにより駆動されるアルカリホスファターゼを用いて、心臓標的化構築物の選択性を評価する。表15は、2つの横紋筋特異的プロモーター（クレアチンキナーゼ7（CK7）及び心臓トロポニンT（cTnT455））と非特異的サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターとを、前脛骨筋（TA）におけるCK7に対して正規化した値で比較する。最も重要なことに、cTnT455は、心臓における高発現を導くが、他の組織での発現は皆無かそれに近く、従って、非心臓組織におけるR1R2過剰発現作用の可能性を大きく低下させる。
【０１９７】
【表１６】
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【０１９８】
図36Aは、このための予備的なウエスタンブロットの証拠を示し、ここで、AAV6−R1R2cTnT455注入（4.5 e13）マウス由来の心臓組織は、コントロールマウスの心臓と比較して、高いR1及びR2サブユニットを発現した。上部のバンドは非特異的染色であり、矢印がR1及びR2タンパク質を指す（分子量マーカー（示さず）により同定）ことに留意すべきである。重要なことに、肺におけるR1及びR2発現は、心臓と比較して極めて低く、骨格筋では変化しなかった。これは、非注入マウス（B）とAAV6−アルカリホスファターゼ注入マウス（紫色；C）36由来の心臓組織についての図36で実証され、AAV6−R1R2cTnT455が、安定した長期のR1R2過剰発現を提供するであろうことが示唆される。安定したAAV6導入遺伝子発現は、ラットでは12＋週間37、イヌでは少なくとも6＋ヶ月38（太字）、持続することも示されている。
【０１９９】
従って、我々は、AAV6−R1R2cTnT455注入用量、LVポンプ機能の増加の経時変化及び安定性、心臓組織R1R2レベル及び［dATP］の関係を調べるための研究を開始した。図37は、3月齢のマウス（グループあたりn＝6）に注入された、3つのベクター用量、すなわち、1.5 e13、4.5 e13及び1.35 e14 AAV6−R1R2cTnT455ベクターゲノム又は生理食塩水（コントロール）のLV機能に対する効果を示す。LV短縮率（FS）は、高用量では1週間後に、全ての用量では2週間後に、有意に増加し、6週間で同等の効果を有する。FSのマグニチュード増加は、約25〜50％であり、該効果は、相対的に低いベクター用量で達成可能であることを示す。
【０２００】
［実施例43］
トランスジェニックR1R2過剰発現マウス（TG−R1R2）。我々は、RRの両方のサブユニット（Rrm1及びRrm2）を過剰発現する二重トランスジェニック（bi-transgenic）マウスを利用する。図32は、心筋における両方のサブユニットの過剰発現を実証し、これらのTG−R1R2マウスについてのデンシトメトリー計算値は、野生型（WT）マウスの対応する値よりも、33.7±7.6（Rrm1）及び23.7±3.4（Rrm2）倍大きい25,26*。Rrm2について、上部のバンド（*）は非特異的であることに留意すべきである。内因性のRrm2タンパク質は、WT組織では検出不可能であるが、TG−R1R2マウスにおいては、バックグラウンドバンドの下のバンドとして現れる。心臓組織のdATPレベルは評価されていないものの、骨格筋では、［dATP］は約10倍増加し、酵素サブユニットでは、3.3±2.1（Rrm1）及び35.7±11.1（Rrm2）倍の対応する増加を有した。興味深いことに、このdATPの増加マグニチュードは、AV−R1R2でトランスフェクトした培養心筋細胞について測定したものと類似する（図23）。これらのTG−R1R2マウスの6〜8月齢での予備的な心エコー検査（3週連続で測定）により、平均＞50％の短縮率（FS）の増加、及び15％の拡張期LV内径（diastolic LV inner diameter；LVIDd）の減少が明らかとなった。図27に示すとおり、これらの差（WTコントロールとの）は、予備的なAV−R1R2注入実験についての値とマグニチュードで類似する。
【０２０１】
［実施例44］
心臓機能に対する細胞R1R2及び［dATP］上昇の急性効果を決定する。急激な（acute）R1R2過剰発現（AAV6−R1R2ベクターを介して）は、マウス心臓における［dATP］を増加させ、結果として、収縮及び拡張機能が増加すると予期される。これは、以下に反映される：1）急速な弛緩を伴う、心筋細胞及び筋原線維収縮の増加（一部には、クロスブリッジサイクリング動態の増加による）、2）エネルギー貯蔵を損なうことなく、心臓の基礎代謝が増加する、及び3）活動電位持続時間が変化しない又は低下する（Ca2+隔離が高まることによる）。
【０２０２】
心臓特異的プロモーターcTnT455（上記のとおり）を有するAAV6−R1R2、偽注入、及びコントロールとしてcTnT455のみを含むAAV6を尾静脈又は眼内眼球孔に注入して、正常成体FVB／Nマウスをトランスフェクトする。注入後、心エコー検査を毎週実施して（6週間まで（out to））、さらなる評価のために、最適な（最大効果）時点を決定する。初期研究では、心エコー検査と、それに続くin situ血流力学測定を用いてin vivoで心臓機能を特徴付けるか、あるいはエネルギー研究のためのLangendorff灌流心臓及びポンプパフォーマンスを評価するための拍動心臓装置を用いてex vivoで心臓機能を特徴づける。選択した時点にて、他のマウスを安楽死させ、無傷若しくはスキンド肉柱調製物、単離心筋細胞、筋原線維調製物、タンパク質分析及び（免疫）組織学のために心臓を解剖する。これらの測定は、急激なR1R2過剰発現を用いた心臓機能の変化について詳細な分子メカニズムを提供する。
【０２０３】
［実施例45］
臓器全体のマルチスケールメカニカル測定。全ての動物に対し心エコー検査（GE Vivid7）を実施する。傍胸骨長軸像を用いて、左心室（LV）流出路の流速及び流出路断面積（CSA）を測定し、一回拍出量（SV＝CSA×時間速度積分値（大動脈流速面積））及び心拍出量（CO＝SV×心拍数）を計算する31*。心室中央（乳頭筋）レベルでの短軸2−D像を用いて、LV収縮末期径（LVESD）及び拡張末期径（LVEDD）、前壁及び後壁（PW）径のMモード測定を得る。これらを用いて、短縮率［（LVEDD−LVESD）／LVEDD×100％］及びLV壁質量［1.05（IVS厚さ+LVEDD+PW厚さ）］を計算する32,33*。複数の動物は、小型インピーダンス／微圧計カテーテル（Millar Instruments）を用いて、心臓収縮性のリアルタイム評価（Frank−Starling及び圧力−容積関係）に供する。測定には、心拍数、拡張末期圧及び収縮末期圧、+dP／dt、−dP／dt、圧力動員（pressure recruitable）一回仕事量（すなわち、一回仕事量（SW）対拡張末期容積（EDV）の勾配）、収縮末期圧−容積関係、及び心室圧減衰の時定数（Tau）が含まれる。これらのパラメーターは、負荷された心臓の収縮／弛緩のダイナミクス研究において、in vitro拍動心臓測定、肉柱及び筋原線維測定と比較できる。両方のプロトコルは、急激なR1R2過剰発現でのアドレナリン反応性のポテンシャル変化を評価するために、ドブタミンの存在／不在下で実施される。他の動物は、ホルモン変動を潜在的に狂わせることのないin vitro Neely拍動心臓測定（Experimentria）に供して、前負荷／後負荷、及びアドレナリンの反応性についてさらなる情報を提供する。次いで、よく確立された手順に従い、心臓を重量分析のために採取し、固定し、包埋し、染色（H&E、マッソントリクローム、ピクロシリウスレッド）する27,68*。切片を、肥大、拡張及び線維症について評価する11,34*。心臓の連続切片は免疫組織化学に供し、in vivo及びin vitro機能と相関させるため、R1R2発現及び形質導入心筋細胞％を評価する。
【０２０４】
［実施例46］
肉柱、心筋細胞及び筋原線維のマルチスケールメカニカル測定。異なるマウスのグループについて、エンドポイントでの心エコー検査後、心臓を摘出し、心室を以下のいずれかのために調製する：1）無傷又はスキンド肉柱の解剖、2）培養心筋細胞、又は3）筋原線維調製物。
【０２０５】
肉柱。R1R2過剰発現が、in vivoで生じるように、様々なサルコメア長（SL）において、外部負荷下、無傷の肉柱の収縮にどのような影響を及ぼすかを測定する。薄い（＜120μm直径、約50μm深さ）肉柱を、刺激電極を含む酸素化灌流チャンバー中、力変換器とリニアモーターの間に置く35−37*。等尺性単収縮力、単収縮動態及びCa2+トランジェント（fura−2）、並びにそれらのSL依存性（Frank−Starling関係、SL＝1.9対2.2μm）は、標準的なKrebs−Henseleit液、95／5％ O2／CO2、37℃で、単離心筋細胞に関するプロトコルと同じプロトコル下で測定する38。スキンド肉柱を用いて、［Ca2+］、［dATP］及び［ATP］を微調整して、定常状態の筋フィラメント収縮を評価し、急激なR1R2過剰発現が、タンパク質アイソフォーム又はリン酸化の変化を介して、［dATP］とは独立して、筋フィラメント収縮を変化させるかどうかを調べる。
【０２０６】
単離成体心室心筋細胞。単離マウス心筋細胞は、様々な刺激頻度での収縮サイクル及びSR機能のハイスループット同時評価を可能にする7*。そのため、心筋細胞Ca2+トランジェント（fura−2）及び短縮／弛緩（長さ及びサルコメア長）を、ビデオ顕微鏡（IonOptix, Milton, MA）を用いて、0.5、1、2及び3 Hzにてモニタリングする。1）Ca2+誘発性Ca2+放出（CICR）を評価するため、変動細胞外［Ca2+］（［Ca2+］ext）、2）SR機能に対する収縮活性の影響を測定するため、筋フィラメントクロスブリッジ阻害剤（BDM、ブレビスタチンなど）、及び3）反応性（短縮、Ca2+放出／再取り込み）が変化するかどうかを測定するため、アドレナリンチャレンジ（α−（フェニレフリン）又はβ（イソプロテレノール））、の前後に測定する。活動電位（AP）特性、CICR、SR Ca2+ ATPase（SERCA）、NCX及び細胞膜Ca2+ ATPase機能を測定するための詳細な方法は以下に記載するとおりである。
【０２０７】
筋原線維。収縮活性化及び弛緩動態は、正常な心臓機能の決定に重要である。収縮の間、急速な心室圧力発生が、効果的な血液放出（拍動（working stroke））のために重要であり、拡張の間、心室は、十分な心室充満を可能にするため急速に弛緩しなければならない。これらの特性は、心臓疾患において、多くの場合変化する。スキンド肉柱では、拡散距離が大きいことにより、溶液交換の間の［Ca2+］平衡が遅れるので、筋原線維収縮及び弛緩のmsタイムスケールでの動態を評価することは難しい。筋原線維調製物は小さな拡散距離を有し、無傷の細胞のCa2+トランジェントとは独立して、急速な溶液の交換及び力測定を可能にする。このアプローチは以前にも使用されているが39,40*、新たな計測は、単一プロトコルで、単一の筋原線維力発生及び弛緩を測定することが可能である（図33）。これらの測定は、等容性（等尺性）期の弛緩（kact）及び拡張（kREL）に関連する。重要なことに、弛緩の遅速期（kREL、slow）及び急速期（kREL、fast）の両方をモニタリングできる。kREL、slow及び継続時間（tREL、slow）は、クロスブリッジ解離速度を反映すると考えられ41*、以前の研究により、dATPとともに速くなることが示されている1,5。従って、ATP又はdATP（又は変動ATP：dATP比）のいずれかを用いて、AAV6−R1R2トランスフェクト心臓とコントロール心臓との活性化及び弛緩動態を比較する。ATPのみの筋原線維実験では、R1R2過剰発現が、筋フィラメント収縮特性自体を変化させるかどうかを評価でき、一方で、dATPを用いた測定では、心筋細胞とコントロール細胞において、R1R2過剰発現で見られる急速な弛緩のクロスブリッジ成分を決定することができる。筋原線維研究ではまた、［ADP］、［Pi］、［Ca2+］、pH及び筋フィラメントタンパク質リン酸化（キナーゼ、ホスファターゼ）を独立して調節でき、全ての条件は心臓で変動し、代謝挙動と相関するが、無傷の心臓調製物で調節することが難しいものである。
【０２０８】
［実施例47］
電気生理学的測定及びCa2+ハンドリング。電気生理学は、37℃で維持され、ルーチンな技術を用いて1〜5 Hzで刺激された細胞にて評価される34,42−48*。APは、電流クランプモードで操作されるHEKA EPC−10増幅器を用いて、以前に記載されるように記録される。（EPC−10は、典型的な微小電極増幅器と同様の真の電圧フォロワ回路を有する49,50*）。細胞内ヌクレオチドの透析を予防するために、我々は、穿孔パッチ技術（一価イオンを通過させるが、約200ダルトンより大きな分子は通過させない51*）を使用し、全細胞の破裂が起こっているかどうかを知らせるためにピペット溶液に染料を含有させる（Straussら52*に倣う）。評価されるべきAPパラメーターには、立ち上がり速度、APD（50、70及び90％再分極で）、AP振幅、最大拡張期電位及び脱分極後の頻度が含まれる。［Ca2+］iイメージング実験について、細胞にfura−2又はfluo−4−AMを負荷し、次いで、Ionoptix CCD系システム、又はラインスキャンモードで操作するZeiss LSM510 META共焦点システムのいずれかを用いて画像化する。蛍光シグナルのキャリブレーションは、「pseudo−ratio」53*又はFmax54*法のいずれかを用いて実施する。全細胞［Ca2+］iトランジェントは、Ca2+流入、それに続くSR Ca2+放出の活性化（すなわち、Ca2+スパーク）及びCa2+クリアランスメカニズム（主としてNCX及びSERCA）からなる点に留意すべきである。従って、［Ca2+］iトランジェント変化の根底にあるメカニズムを理解するためには、これらの変動を別々に検証しなければならない。L型Ca2+電流（ICa）を介したCa2+流入は、NCX機能を排除するためNa＋を含まない溶液を用いて、電圧クランプ下で測定される55*。SR Ca2+放出に対する効果を探索するため、我々は以下の2つの標準的な方法を使用する：1）ECカップリングゲインファクターを決定するための、電圧依存性ICa及び［Ca2+］iトランジェントの同時測定56,57、及び2）局所的な放出イベント（すなわち、Ca2+スパーク）の高速共焦点イメージング57*。SR Ca2+負荷は、カフェイン技術を用いて測定する58,59*。NCX又はSR Ca2+ ATPase機能に対する効果を探るために、標準的な阻害剤及び条件を使用して、各フラックス（flux）を単離し、AP−及びカフェイン−誘発性［Ca2+］iトランジェント、及びNCX電流の動態を検証する57,60−62*。
【０２０９】
［実施例48］
心筋エネルギー代謝。代謝及び収縮は、以前に記載されるように63,64*、単離した灌流心臓において、多核NMRスペクトロスコピーを用いて同時に評価する。
【０２１０】
NMRスペクトロスコピー。摘出したマウス心臓を、以前に記載されるように63*、37℃にて一定の圧力（80 mm Hg）で灌流する。水を満たしたバルーンをLVに挿入し、拡張末期圧を5〜10 mm Hgに調整し、LV圧力及び心拍数を記録するために使用する。等容性収縮機能は、LV発生圧力×心拍数（ダブルプロダクト（rate pressure product）；RPP）として計算される。MVO2は、冠状動脈流量、並びに灌流液と肺流出路流出液とのPO2の差を測定することにより決定される。高い収縮パフォーマンスを引き出すために、灌流液［CaCl2］を2から4 mMに増加させる。31P NMRスペクトルは、ベースライン及び25分間の高作業負荷（workload）チャレンジの間に集め、次いで、液体窒素で冷却したWollenbergerトングでフリーズクランプする。炭素基質の相対的な酸化は、心臓を13C標識基質で灌流し、それに続いてフリーズクランプすることにより、ミトコンドリアについて決定される。13C NMRスペクトロスコピー及びアイソトポマー分析は、以前に記載されるように63,64*、組織抽出物を用いて実施される。
【０２１１】
31P NMRスペクトルのHPLCキャリブレーション。フリーズクランプした組織を用いて、以前に報告されるように65*、心筋のATP含量をHPLCにより決定する。HPLCにより得られる心筋のATP含量は、ブロットされる湿組織1 gあたり、0.48 mLの細胞内水含量及び0.15 gのタンパク質含量と仮定して、［ATP］に変換する。値は、各グループについて、ベースライン31P NMRスペクトルにおけるATPピーク領域を校正するために使用する。ベースライン条件下で得られたγ−ATPピークの領域を100％に設定し、全ての31P NMRスペクトルにおいて、全てのピークに対する参照値として使用する。
【０２１２】
ミトコンドリア生合成及び機能。ミトコンドリア呼吸アッセイは、ADP、呼吸のアンカプラー（FCCP）及び種々の阻害剤の存在下又は不在下、ピルベート／マレート（複合体I）、スクシネート（複合体II）及びパルミトイル−カルニチンとともに、単離ミトコンドリア、及び透過処理した筋原線維又は筋細胞を用いて実施する66,67*。鼓動している心臓のATP合成速度は、31P NMR磁化移動を用いて評価し、MVO2による概算と比較する63*。ミトコンドリア密度は、EMイメージにより評価し、キーとなるミトコンドリア酵素／タンパク質（クエン酸シンターゼ、COX、アコニターゼ及びVDAC）の活性又は発現を決定する。mtDNA含量及びその複製、並びにミトコンドリア生合成に伴う転写メカニズムは、記載されるように測定する68*。
【０２１３】
筋フィラメント及びSRタンパク質プロファイリング。全ての条件下、収縮機能、Ca2+トランジェント、SRスパーク活性及び／又はCa2+負荷の変化は、筋フィラメントタンパク質（cTnI、cTnT、MLC−2、cMyBP−C及びTm）、SRタンパク質（PLB、RyR）及び筋線維鞘タンパク質（NCX、PMCA、L型Ca2+チャネル）のアイソフォーム、存在量及びリン酸化と相関する。mRNA及びタンパク質発現の変化は、RT−PCR及びウエスタンブロット分析を用いて測定する。SRタンパク質画分は、既報の方法53−56に従って調製する。電気生理学的測定が変化を示す場合には、特異的抗体を用いてイオンチャネルを評価できる。R1R2発現の分析は、ウエスタンブロット（図23）又は免疫組織化学を介して実施され、実験的エンドポイントと相関する。cTnT455プロモーターの特異性は、骨格筋や肺などの非心臓組織におけるR1R2発現を測定することにより評価される。リン酸化は、Pro−Q diamond（Sypro Rubyタンパク質染色とともに）及びウエスタンブロット分析を用いてプロファイルされる。部位特異的セリン及びスレオニン残基リン酸化については、質量分析を実施できる。
【０２１４】
［実施例49］
実施例43〜48で概要を述べたこれらの体系的な研究は、短期間のR1R2過剰発現及び［dATP］の増加が、収縮特性、並びにCa2+及びエネルギーホメオスタシスにどのような影響を及ぼすかについて、詳細なマルチスケールの情報をもたらす。相対的に低用量のAAV6−R1R2は、メカニカル評価の全てのレベルで、機能を高めるのに十分であり得ると予期される。これらのマウスは、高められた心臓のβ−アドレナリン反応性を維持するか又は有すると予期される。これは、高められた心筋機能（［dATP］を介する）が、β−アドレナリン作動性刺激（adrenergic drive）の必要性を低減させる場合に生じ得る。さらに、この適応は、R1R2過剰発現のピーク後、より長い時点（3〜4週間）でより顕著であり、次いで、形質導入の減衰とともに低下すると予期される。適応のピークは、TG-R1R2動物において予期される長期の変化にアプローチし得る。［dATP］の増加に起因する、タンパク質の翻訳後修飾の機能的な効果は、基質としてATPを用いた、細胞／細胞内（subcellular）アッセイで評価する。これは、筋フィラメントCa2+感受性の増加（除膜肉柱）、活性化及び弛緩動態の増加（筋原線維）、及びCa2+再取り込み動態の増加（無傷の肉柱／心筋細胞）をもたらし得る。しかし、予備的な結果により示されるように（図28）、Frank−Starling関係が、in vivo又はin vitroのいずれかで、R1R2過剰発現とともに鈍化するとは予期されない。R1R2過剰発現は、無傷の心臓肉柱において、単離心筋細胞で観察された短縮率の増加と同様に、単収縮力を増加させる（Ca2+感受性増加の指標となる）と予期される。同様に、Ca2+トランジェントは、非処理の肉柱のマグニチュードと類似すると予期されるが、R1R2過剰発現肉柱においては、急速なCa2+減衰と同時に力の弛緩が増加し得る。R1R2過剰発現心筋由来の除膜肉柱は、収縮基質としてATPを用いた場合であっても、Ca2+感受性のわずかな増加を呈し得、これは、交感神経緊張の低下と、それに続く心臓トロポニンI及びミオシン結合タンパク質−Cのリン酸化の低下を反映し得る。In vitro AV−R1R2トランスフェクト心筋細胞で観察されたものと同様に、急速なCa2+トランジェント減衰以外にCa2+ハンドリングにおいて明らかな変化はないものと予期される。急速なCa2+トランジェント減衰は、以下に起因し得る：1）細いフィラメントのCa2+解離を漸増し、それによりコントロール筋細胞よりもすぐにCa2+を再隔離に利用可能にさせる、急速なクロスブリッジの解離を伴うサルコメア短縮の増加、及び2）Ca2+ハンドリングタンパク質（SERCA：ホスホランバン比、ホスホランバン及び／又は細胞膜Ca2+ ATPaseリン酸化）、又はエネルギー基質としてdATPを用いるCa2+ ATPaseポンプ（Ca2+隔離を増加させる）の変化。TG−R1R2心臓では、収縮機能が増加するにも関わらず、定常状態の高エネルギーホスフェート含量は、最小限の影響しか受けないという予備データ（図29）に一部基づいて、急激なR1R2過剰発現によって代謝挙動に大きな変化はないと予期される。
【０２１５】
［実施例50］
細胞R1R2及び［dATP］の増加の心臓機能に対する慢性的な効果を測定する。TG−R1R2マウスは、β−アドレナリン作動性刺激の低下とともに収縮機能の増加に適応し、拡張機能はCa2+ハンドリングメカニズムの適応により維持されると予期される。これは、1）弛緩の最小限の変化とともに、心筋細胞の収縮が増加すること、2）心臓代謝の適応（従って、野生型コントロールを超えて増加しない）、3）興奮−収縮連関が変化しないこと、及び4）β−アドレナリン刺激に対する反応性が増加すること、に反映される。
【０２１６】
慢性的なR1R2過剰発現を研究するために、生涯を通じて、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットの両方を高レベルで発現する二重トランスジェニックマウスモデル（TG−R1R2）を用いる。6月齢で成体マウスを研究することから始める。経時的な機能及び／又は適応の変化の進行を決定するために、若齢マウスを心エコー検査を用いて6月齢までモニタリングする。これらの測定から、研究するためのより早い時点を決定する。これらの時点において、上記で概要を述べたような実験評価の全てを行う。これらのマルチスケール測定は、慢性的なR1R2過剰発現による心臓機能における適応についての詳細な分子メカニズム、及び上記実験との比較を提供する。
【０２１７】
これらの研究は、内因性の適応が、一定のパラクリン及びホルモン変動を受けるin vivoでのR1R2過剰発現に対する長期間の心臓適応について、詳細な情報を提供する。R1R2過剰発現は、より大きなベースライン収縮性への適応を介してβ−アドレナリン反応性を増加させ得ると予期され、これは、短期間のR1R2過剰発現では生じない。Frank−Starling関係の鈍化は、予備的な結果（図28）に示されるように、また収縮活性化のSL依存性がdATPで維持されることから3*、R1R2過剰発現によってin vivo又はin vitroのいずれにおいても予期されない。心拍出量は、心拍数の低下（β−アドレナリン作動性刺激の低下）により維持され、一回拍出量の増加（dATPに起因する）を代償し得る。また、TG−R1R2マウスにおいて、肥大型又は拡張型の心室機能及び形態学的な表現型が見られるとは予期されず、予備的証拠は、これが起こらないことを示唆する。SR Ca2+負荷は、LV機能の増加が、高められた筋フィラメント活性に主として由来するよう、維持されると予期される。SR Ca2+ポンプ活性が慢性的に増加して、急速なCa2+トランジェント減衰が生じるならば、それは、より短いAPDをもたらすはずである。エネルギー保存（PCr、ATP）は維持され、高Ca2+チャレンジに対する反応は同様であるが上昇し、ミトコンドリア機能は、ATP及びdATPのミオシン利用が増加することにより、わずかに上昇すると予期される。要約すると、ベースライン機能は上昇するが、要求増加に応答する能力は、Ca2+ハンドリング及びエネルギーホメオスタシスの最小限の適応とともに、維持される、と予期される。
【０２１８】
［実施例51］
梗塞心臓の心臓機能に対する、細胞R1R2及び［dATP］上昇の効果を測定する。急激なR1R2過剰発現及び［dATP］の増加により、心臓パフォーマンスが改善され、少なくとも一時的には、梗塞心臓における心不全の進行が中断されると予期される。AV−R1R2形質導入が、梗塞ラット心臓由来の培養心筋細胞において、低下した収縮性及びCa2+トランジェント挙動を救った（図25）という有望な予備的証拠は、これが可能であり得ることを示唆する。筋フィラメントの収縮能の増加は、心臓機能を改善し、従って、心不全の進行と関連する慢性的なβ−アドレナリンシグナリング及びPKC媒介性リン酸化を減少させるはずである。一時的な機能の獲得（1回量のAAV6−R1R2を介して）が、持続的な改善を可能にする適応を導くかどうかを確かめることは興味深い。心不全は「エネルギー不足」であることも知られている69*。多数の臨床研究により、心不全が、アドレナリンレセプターアゴニストなどの高エネルギー治療により悪化し、ACEIやベータ遮断などのエネルギーセーブ治療により改善することが示されている。dATPの増加が、心筋エネルギー論に悪影響を及ぼさないことは非常に重要である。従って、予備的データにより、より高い収縮機能時に、高エネルギーホスフェート含量の変化が示されなかったことはエキサイティングである。これが、エネルギー代謝の障害が反復して観察される梗塞心臓の場合であるかどうかを決定する。
【０２１９】
AAV6−R1R2を用いて、梗塞心臓に対する急激なR1R2過剰発現の効果を研究する。心筋梗塞は、左冠動脈下行枝の永久結紮により達成される。ラットにおいて、これは、典型的には、短縮率の低下、収縮期及び拡張期の心室拡張（図34A〜C）を伴う、LV自由壁断面積の約20〜35％（全LV領域の10〜15％）の梗塞域をもたらし、前負荷増加に対する、拍動心臓における反応性の喪失（図34D）をもたらす。
【０２２０】
In vivo研究のデータは、培養心筋細胞を用いた初期の研究を支持する。当該研究では、梗塞5日後に、AAV6−R1R2をラットの心臓に直接注入した（上記のとおり）。形質導入後、心エコー検査を実施し（8週間まで）、結果を図38に示す。注入後1週間で、FSは既に改善され、2週間でFSは、偽手術した（梗塞なし）心臓におけるものと、梗塞＋ベクターとで同一であった。この回復は、研究を終了する8週間まで持続し、AAV6−R1R2の投与を用いた梗塞心臓における心臓機能の改善が実証された。
【０２２１】
急激なR1R2過剰発現が、LV機能喪失の予防に役立つかどうかを決定するため、別個の動物に対し、梗塞手術の1〜2週間前にAAV6−R1R2をトランスフェクトする。両方のプロトコルについて、複数のマウス又はラットを、Millarカテーテル実験を介したin situ血流力学特性のために得る（上記参照）。拍動心臓、無傷及びスキンド肉柱、培養心筋細胞、並びに単離筋原線維に対するin vitro研究のために、追加の動物を使用する。上記で概要を述べたように、これらの研究に必要とされる動物の数を制限するために、どの調製物が最も有益であるかを決定し、測定の大部分をそれに集中させる。複数の解剖心臓の重さを量り、固定し、包埋し、染色し、肥大及び線維症について評価する（上記）。連続切片を免疫組織化学に供して、in vivo及びin vitro機能の変化と相関させるため、R1R2発現及び浸透度を評価する。
【０２２２】
R1R2過剰発現及び［dATP］の増加は、分析のために選択した時点において、梗塞心臓の心臓パフォーマンスを改善すると予期される。高Ca2+チャレンジ、β−アドレナリン作動性刺激及び前負荷の増加に対する反応は改善される。図38で評価される心臓のin vitro Neely拍動心臓測定は、梗塞している心臓（心不全）の前負荷反応性は喪失（非処理）したが、ベクターを受けた梗塞心臓の前負荷反応性は、コントロール非梗塞心臓レベルまで回復したことを示しており、それにより、心臓機能の回復が実証される。図39（力はg・cm／分の単位で示す）を参照されたい。当該効果は、慢性的なβ−アドレナリン作動性刺激（血漿ホルモンをモニタリングすることにより評価できる）の低下により生じ得る。これは、改善された、1）Ca2+トランジェント、2）筋フィラメント収縮及び弛緩のマグニチュード及び動態、並びに3）エネルギープロファイルとして、マルチスケール分析に反映されるはずである。また、処理された心臓と非処理心臓の間に、α−及びβ−アドレナリン媒介性心筋細胞タンパク質リン酸化の差が見られることも予期される。
【０２２３】
前述の発明は、明確に理解する目的のため、例示及び例によって多少詳しく記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び修飾を実施し得ることを理解するであろう。加えて、本明細書中に提供した各参考文献は、各々の参考文献が参照によって個別に援用されたかのように同程度に前記参考文献の全体を参照により援用する。本出願と本明細書中に提供した参考文献の間に矛盾が存在している場合、本出願が優先されるべきである。
【０２２４】
【表１７】
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【０２２５】
【表１８】
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【０２２６】
【表１９】
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【０２２７】
【表２０】
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【０２２８】
【表２１】
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【０２２９】
【表２２】
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【０２３０】
【表２３】
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【０２３１】
【表２４】
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【０２３２】
【表２５】
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【０２３３】
【表２６】
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【０２３４】
【表２７】
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【０２３５】
【表２８】
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【０２３６】
【表２９】
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【０２３７】
【表３０】
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【０２３８】
【表３１】
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【０２３９】
【表３２】
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【０２４０】
【表３３】
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【０２４１】
【表３４】
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【０２４２】
【表３５】
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【０２４３】
【表３６】
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【０２４４】
【表３７】
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【０２４５】
【表３８】
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【０２４６】
【表３９】
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【０２４７】
【表４０】
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【０２４８】
【表４１】
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【０２４９】
【表４２】
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【０２５０】
【表４３】
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【０２５１】
【表４４】
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【０２５２】
【表４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３３】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２６】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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