(57)【要約】  油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；ω−３］を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないω−３油濃縮物であって、前記濃縮物は、全脂肪酸の重量パーセントとして計測して３０〜７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を有し、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油から得られ、及び前記微生物油は、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる。また、かかるエイコサペンタエン酸濃縮物の作製方法も開示される。
2014511406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物であり、前記濃縮物は全脂肪酸の質量パーセントとして計測して３０〜７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油から得られる濃縮物であって、
前記微生物油が、乾燥細胞質量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる、エイコサペンタエン酸濃縮物。
【請求項２】
前記油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸が、
ａ）酸、トリグリセリド、エステル又はそれらの組み合わせ；及び、
ｂ）エチルエステル
からなる群から選択される形態である、請求項１に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
【請求項３】
前記微生物油が、
ａ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測して約１〜約２５質量パーセントのリノール酸を含み；及び、
ｂ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも１．２である、
請求項１に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
【請求項４】
前記微生物油が、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得られる、請求項１に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
【請求項５】
請求項１に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物又はその誘導体を含む医薬生成物。
【請求項６】
油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物の作製方法であって、
ａ）全脂肪酸の質量パーセントとして計測して３０〜７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞質量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ；及び、
ｂ）ステップ（ａ）の前記エステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を得るステップ
を含む方法。
【請求項７】
前記油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含むエイコサペンタエン酸濃縮物が、
ａ）酸、トリグリセリド、エステル又はそれらの組み合わせ；及び、
ｂ）エチルエステル
からなる群から選択される形態である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物油は、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも１．２である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物油が、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ａ）のエステル交換した油が、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、分留、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により高濃度化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）のエステル交換した油が、少なくとも２つの方法の組み合わせによって高濃度化され、前記第１の方法が分留を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
環境汚染物質を実質的に含まない、請求項１に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
【請求項１３】
油の質量パーセントとして計測して少なくとも７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を作製するための、乾燥細胞質量の約２５％超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油であって、全脂肪酸の質量パーセントとして計測して３０〜７０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を有し、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油の使用。
【請求項１４】
前記微生物油が濃縮されていない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物油。
【請求項１５】
前記微生物油が、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物油。
【請求項１６】
前記エイコサペンタエン酸濃縮物が、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない、請求項１５に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，８５４号明細書、及び２０１１年５月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４８７，０１９号明細書の利益を主張し、これらの出願は、本明細書によって全体として参照により援用される。
【０００２】
本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］を含むω−３油濃縮物に関し、より詳細には、油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのＥＰＡを含み、且つシス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］を実質的に含まないＥＰＡ濃縮物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ω−３脂肪酸、例えば、α−リノレン酸［「ＡＬＡ」］（１８：３）、ステアリドン酸［「ＳＴＡ」］（１８：４）、エイコサテトラエン酸［「ＥＴｒＡ」］（２０：３）、エイコサトリエン酸［「ＥＴＡ」］（２０：４）、エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］（２０：５）、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］（２２：５）及びドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］（２２：６）などで食事を補うことにより得られる健康上の利益は広く認識されており、多くの臨床研究並びに他の既発表の一般文献及び特許文献によって裏付けられている。例えば、ω−３脂肪酸は、心血管疾患のリスク要因、特に軽度の高血圧症、高トリグリセリド血症に対して、及び凝固第ＶＩＩ因子リン脂質複合体活性に対して、有益な作用があることが見出されている。
【０００４】
エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；ω−３］に関して、この特定の脂肪酸の臨床的及び薬学的価値は十分に確立されている（特許文献１及び２）。ＥＰＡは、生物学的に活性なプロスタグランジンの生合成において重要な中間体である。加えて、ＥＰＡの以下の薬理作用が知られている：１）血小板凝固阻害作用（血栓溶解作用）；２）血中中性脂肪降下作用；３）血中超低密度リポタンパク質［「ＶＬＤＬ」］コレステロール及び低密度リポタンパク質［「ＬＤＬ」］コレステロール降下作用並びに血中高密度リポタンパク質［「ＨＤＬ」］コレステロール（抗動脈硬化作用）上昇作用；４）血液粘性降下作用；５）血圧降下作用；６）抗炎症作用；及び、７）抗腫瘍作用。このように、ＥＰＡは、血中コレステロール及びトリグリセリドを降下させるための自然な手法を提供する。
【０００５】
ＥＰＡ摂取量の増加は、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性障害（例えば関節リウマチ）、肺疾患及び腎疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満症、潰瘍性大腸炎、クローン病、神経性食欲不振症、火傷、変形性関節症、骨粗鬆症、注意欠陥多動障害、及び結腸直腸癌の初期において有益である、又は好ましい効果があることが示されている。例えば、非特許文献１のレビュー、及び非特許文献２を参照のこと。最近の知見では、統合失調症などの精神障害の治療におけるＥＰＡの使用も確認されている（特許文献３及び４）。結果として、ＥＰＡは、機能性食品（ニュートラシューティカルズ）、医療食品、乳幼児栄養、バルク栄養、化粧品及び動物の健康に関連する製品に用いられている。
【０００６】
ω−３脂肪酸の分野における研究は豊富にあるが、しかしながら多くの先行研究は、個々の長鎖ω−３脂肪酸（例えば、ＥＰＡ及びＤＨＡ）が代謝的及び機能的に互いに異なり、従って各々が特異的な生理学的機能及び生物学的活性を有し得るという認識を欠いている。
【０００７】
この機構的明確さの欠如は、主として、臨床研究では純粋ＥＰＡ又は純粋ＤＨＡを使用するのに対し、種々のω−３脂肪酸混合物を含有する魚油を使用する結果である［例えばメンヘーデン、タラ肝臓、イワシ及びカタクチイワシ由来の油の脂肪酸組成は、約０．９：１〜１．６：１のＥＰＡ：ＤＨＡ比を有する油を含む（非特許文献３内のデータに基づく）］。加えて、魚油は相当量のコレステロールも含有し、従って魚油を日常的に摂取するとコレステロールの取込みが増加するため、血中脂質値のいかなる低下も相殺される。
【０００８】
ＯＭＡＣＯＲ（登録商標）の商標で販売され、現在はＬＯＶＡＺＡ（商標）として知られる医薬組成物があり［特許文献５〜７］（Ｐｒｏｎｏｖａ  Ｂｉｏｃａｒｅ  Ａ．Ｓ．，Ｌｙｓａｋｅｒ，ノルウェー）、これは、ＤＨＡ及びＥＰＡのエチルエステルの組み合わせである。各カプセルが約４３０ｍｇ／ｇ〜４９５ｍｇ／ｇのＥＰＡと、３４７ｍｇ／ｇ〜４０３ｍｇ／ｇのＤＨＡとを含有し、総ω−３脂肪酸は９０％（ｗ／ｗ）［「重量比」］である。
【０００９】
高用量のω−３脂肪酸には有意なトリグリセリド降下特性があることが知られている。米国では、空腹時トリグリセリドが５００ｍｇ／ｄｌを超える患者におけるトリグリセリドの降下に対し、１日４カプセルのω−３エチルエステル濃縮製剤が食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により承認されている。これらの１グラムカプセルは、各々が４６５ｍｇのＥＰＡと３７５ｍｇのＤＨＡとを含有し、４カプセル以内で合計１日量は１，８６０ｍｇのＥＰＡ及び１，５００ｍｇのＤＨＡとなる。この用量のこの製剤は、１日４０ｍｇのシンバスタチンを服用中のトリグリセリド値が２００〜５００ｍｇ／ｄｌの対象で、プラセボと比べてトリグリセリド値を２９．５％低下させ、ＨＤＬコレステロールを３．４％上昇させる（両方ともｐ＜０．０５）ことが報告されている（非特許文献４）。トリグリセリド値が５００ｍｇ／ｄｌを超える対象では、さらに大幅なトリグリセリドの低下が観察される。また、約１２００ｍｇ／日の用量のＤＨＡによりトリグリセリド値が約２５％有意に降下し得ることも実証されている（非特許文献５；６）。
【００１０】
ＬＯＶＡＺＡ（商標）及び純粋ＥＰＡのいずれもがトリグリセリドを降下させることが示されているが、ＬＯＶＡＺＡ（商標）は、ＬＤＬコレステロールが上昇するという好ましくない結果と関連付けられており、一方、純粋ＥＰＡの補給がこの効果をもたらすことはない。この違いは、ＬＯＶＡＺＡ（商標）におけるＤＨＡの存在に起因し得ると考えられる。従って、ＥＰＡを単独で用いて心血管に関する利益を実現できるものと思われるため、ＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないω−３治療法が好ましい。
【００１１】
個別の脂肪酸それぞれの薬理効果の区別を可能にする、実質的に純粋なＥＰＡを用いた研究、及びそれとは別に実質的に純粋なＤＨＡを用いた研究は、ほとんど実施されていない。一つの例外は日本ＥＰＡ脂質介入試験（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ＥＰＡ  Ｌｉｐｉｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ）［「ＪＥＬＩＳ」］であり、これには、９８％超精製ＥＰＡエチルエステル［ＥＰＡ−ＥＥ」］（持田製薬株式会社）をスタチンと併用した大規模無作為化比較試験が含まれた（非特許文献７；８）。ＥＰＡ＋スタチンの投与を受けている患者の心血管イベントが、スタチン単独の投与を受けている患者に対して１９％低下したことが見出された。これは、ＥＰＡそれ自体が心保護的であるという強力な裏付けを提供する；ＤＨＡを用いた同様の試験は報告されていない。
【００１２】
いくつかの引用文献が、様々な製薬目的で高度に精製されたＥＰＡ組成物の使用を記載している。例えば：ｉ）１９８１年１２月９日に公開された特許文献８は、血栓塞栓性病態の治療におけるＥＰＡの使用を記載し、ここでは脂肪酸組成の少なくとも５０重量％がＥＰＡでなければならない；ｉｉ）特許文献９は、少なくとも９０％のＥＰＡ、好ましくは９５％のＥＰＡを含み、且つ５％未満、より好ましくは３％未満がＤＨＡの形態である医薬調製物を開示している；ｉｉｉ）特許文献１０（持田製薬株式会社）は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ［「ＨＭＧ−ＣｏＡ」］レダクターゼ阻害薬との併用投与時に脳卒中の再発低下に有用な高純度ＥＰＡ−ＥＥ［日本で商標エパデール（登録商標）及びエパデール（登録商標）Ｓとして販売されている］の投与について記載している；ｉｖ）２０１０年８月１９日に公開された特許文献１１は、高トリグリセリド血症を治療するためのＥＰＡ−ＥＥの使用を記載している；ｖ）２０１０年１２月２３日に公開された特許文献１２は、少なくとも９６重量％を含む超高純度ＥＰＡの投与による、スタチン療法中の対象においてトリグリセリドを降下させる方法を記載している；及び、ｖｉ）特許文献１３は、ＥＰＡの投与により、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２［「Ｌｐ−ＰＬＡ２」］値を維持し又は降下させ、易破裂性アテローム硬化性病変を安定化させ、炎症の指標を下げ、及びヒトにおけるＴｏｔａｌ  Ｏｍｅｇａ−３  ｓｃｏｒｅ（商標）を上昇させる方法について記載している。
【００１３】
ＥＰＡ及び他の長鎖多価不飽和（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒｅｄ）脂肪酸は、極めて類似した物理的特性（例えば、類似の蒸気圧、溶解度、及び吸着特性）を有するため、ＥＰＡを高純度に分離及び精製することは複雑である。様々な天然の供給源由来の脂肪酸混合物のＥＰＡ含有分を高濃度化する様々な方法（例えば、低温結晶化、尿素アダクト形成、分留、高圧液体クロマトグラフィー、銀塩処理、超臨界二酸化炭素［「ＣＯ２」］クロマトグラフィー、向流カラムによる超臨界ＣＯ２分画、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー等及びそれらの組み合わせ）が公知である。
【００１４】
例えば、数種の紅藻類及び緑藻類並びに海洋性珪藻類由来のＥＰＡを高濃度化する下流処理方法が、以下に示すとおり記載されている。
（ｉ）非特許文献９は、微細紅藻類ポルフィリディウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）からの精製を記載している。
（ｉｉ）非特許文献１０は、微細藻類からの多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］、例えばＥＰＡの精製手段のレビューを提供している。
（ｉｉｉ）特許文献１４は海洋性クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の抽出法を開示し、ここでは得られた脂質組成物を溶媒分画に供することで中性脂肪が除去され、それにより極性脂質組成物が提供された。この極性脂質組成物を加水分解に供して遊離させた脂肪酸が回収され、それにより少なくとも６０重量％のＥＰＡを有する脂肪酸組成物が提供された。この脂肪酸組成物が尿素処理され、ＥＰＡ含有量が９３．０％まで高濃度化された。ＤＨＡ含有量は開示されなかった。
（ｉｖ）特許文献１５は、珪藻ニッチア・レビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）の酵素加水分解脂質からのＥＰＡ組成物の回収について記載し、これにより脂肪酸含有量は５０〜６０％のＥＰＡを含み、アラキドン酸［「ＡＲＡ」、ω−６］は５．５％未満で、ＤＨＡは実質的に含まなかった。例証はされていないが、ＥＰＡを９５％〜９９％までさらに精製し、ＡＲＡを１％未満及びＤＨＡを０．１％未満とし得ることが示唆された。
【００１５】
同様に、多くの参考文献が魚油由来の（又は魚油から得られた脂肪酸エチルエステルの混合物由来の）ＥＰＡの精製について記載している。例えば：
（ｉ）非特許文献１１は、ω−３  ＰＵＦＡエステルの実験規模の高速液体クロマトグラフィー［「ＨＰＬＣ」］を記載している。
（ｉｉ）特許文献１６は、エチルエステルへのエステル交換と、続く尿素処理及び分留を記載している。得られた生成物は、９２．９％のＥＰＡ及び２．０％のＤＨＡを含むことが報告された。
（ｉｉｉ）特許文献１７は、少なくとも３つの蒸留塔のシステムを用いる低圧分留を開示している。この生成物は、Ｃ２０の鎖長を有する脂肪酸［「Ｃ２０」］を９９．９％含
み、ここでＣ２０画分の８８％はＥＰＡであった。Ｃ２０画分の尿素処理によりＥＰＡ含有量は９３％に増加した。
（ｉｖ）特許文献１８は、（ａ）脂肪酸エチルエステル混合物を、（１）固定床式クロマトグラフィー又は（２）溶媒が超臨界圧で流体である多段階向流カラム分画のいずれかによって処理するステップ、及び少なくとも１つのＰＵＦＡ高濃度化画分を回収するステップを含む精製方法を開示している。この方法はまた、（ｂ）処理ステップで回収された画分を、疑似移動床式連続向流クロマトグラフィーによるさらなる分画に供するステップ、及び精製されたＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ混合物が含まれる少なくとも１つの画分を回収するステップも含む。８８％ＥＰＡ及び０．８％ＤＨＡ、及び＞９３％ＥＰＡの画分（ＤＨＡ含有量は開示されなかった）が得られた。
（ｖ）特許文献１９は、９９．９％のＣ２０を含み、そのうち８２．７７％がＥＰＡであった濃縮エステル混合物を生成するための高真空下での精密蒸留を開示している。ＥＰＡ高濃度化混合物を高速液体クロマトグラフィーに供すると、９９．５％のＥＰＡを有する油が得られた（ＤＨＡは具体的には報告されなかったが、＞Ｃ２０の酸合計は０．３０％であった）。
（ｖｉ）特許文献２０は、複数の抽出カラムを用いた超臨界ＣＯ２抽出による魚油エチルエステルの精製を開示している。４１．１％ＥＰＡ及び１７．３％ＤＨＡを含む脂肪酸エステル出発混合物から、９０．８％ＥＰＡ及び０．３５％ＤＨＡを含む生成物が得られた。
（ｖｉｉ）特許文献２１は、魚油に由来する脂肪酸エステルを３塔蒸留法で分画することによる８２％ＥＰＡの主画分の生成を開示している。この主画分が銀塩処理によってさらに精製され、９８．５％のＥＰＡ−ＥＥが得られた。
（ｖｉｉｉ）特許文献２２は、５０％のＥＰＡ−ＥＥ含有量及び１．２％の最大アラキドン酸含有量を有する脂肪酸エステルの混合物から出発して、超臨界ＣＯ２を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーにより少なくとも９５％純度のＥＰＡ−ＥＥを調製する方法を開示している。
（ｉｘ）特許文献２３は、供給混合物からＰＵＦＡ生成物を回収するためのクロマトグラフ分離方法を開示し、これは、アルコール水溶液を溶離液として含む複数の連結されたクロマトグラフィーカラムを有する疑似移動床式又は実際の移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合物を導入するステップを含み、ここでこの装置は、少なくとも第１のゾーンと第２のゾーンとを含む複数のゾーンを有し、各ゾーンが抽出物の流れと抽残物の流れとを有して、ここから前記複数の連結されたクロマトグラフィーカラムからの液体を収集することができ、及びここで（ａ）極性がより高い成分と共にＰＵＦＡ生成物を含む抽残物の流れが第１のゾーンのカラムから収集されて、第２のゾーンの隣接しないカラムに導入され、及び／又は（ｂ）極性がそれほど高くない成分と共にＰＵＦＡ生成物を含む抽出物の流れが第２のゾーンのカラムから収集されて、第１のゾーンの隣接しないカラムに導入され、前記ＰＵＦＡ生成物は各ゾーンにおいて供給混合物の種々の成分から分離される。様々な魚油由来の供給原料の精製により、８５〜９８％超のＥＰＡ  ＥＥが生成された。特許文献２４は、魚油から高純度でＥＰＡ及びＤＨＡを回収する方法を実証したが、この開示はまた、「遺伝子修飾された植物、動物及び酵母を含む微生物から得られた油を含めた合成供給源」から分画に好適な供給混合物を得ることができるとも述べている。さらに、「所望のＰＵＦＡ生成物がＥＰＡである場合、遺伝子修飾された酵母が特に好適である」。
【００１６】
最後に、特許文献２５が、６０％のＥＰＡを含有する脂肪酸混合物を銀塩処理により高濃度化して９６．０％のＥＰＡを含む生成物がもたらされることを開示している。銀塩処理を繰り返すと、ＥＰＡ含有量は９８．５％までさらに増加した。他の構成脂肪酸のアイデンティティも、６０％ＥＰＡ出発混合物の供給源も開示されなかった。
【００１７】
天然の海洋性供給源（例えば、魚、藻類）からＥＰＡを精製するときに生じる一つの懸念は、これらの微生物中に、生物濃縮の結果として比較的高濃度の環境汚染物質が同時に存在することである。こうした環境汚染物質は、ポリ塩化ビフェニル［「ＰＣＢ」］（ＣＡＳ番号１３３６−３６−３）、臭素化難燃剤、農薬（例えば、トキサフェン及びジクロロジフェニルトリクロロエタン［「ＤＤＴ」］及びその代謝物）、及び海洋環境に存在する潜在的に有害及び／又は有毒な他の有機化合物などの有毒成分である。特許文献２６は、脂肪又は魚油などの油を含む混合物中の環境汚染物質の量を低減する方法を開示している。
【００１８】
しかしながら、汚染物質の懸念とは別に、地球規模の乱獲という点で見て、天然の海洋性供給源からＥＰＡを精製する環境影響もまた考慮しなければならない。現在、水産養殖用の飼料組成物は全世界の魚油供給量の約８７％を脂質供給源として使用していると推定される。年間の魚油生産量は１年あたり１５０万トンを超えては増加していないため、各産業は（急成長する水産養殖業を含め）、魚油の供給材料として有限の原料である遠洋性魚類に頼り続けることはできない。多くの組織が、魚油の利用可能性及び持続可能性に関する上記に指摘した限界を認識し、生成物及びそれが用いられる各産業におけるこの成分の重要な利益を維持しながらも魚油への依存を減らす代替的な成分を探している。従って、持続可能な供給源からの食用ＥＰＡ濃縮物の生成は、海洋性供給源に比べ、肯定的な環境影響を有し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３３１，５６８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６２４，１９５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５０２，０７７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６５６，６６７号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６９８，５９４号明細書
【特許文献８】英国特許出願第１，６０４，５５４号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００８−０２００５４７号明細書
【特許文献１０】米国特許第７，４９８，３５９号明細書
【特許文献１１】国際公開第２０１０／０９３６３４  Ａ１号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２０１０／１４７９９４  Ａ１号パンフレット
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１１−０１７８１０５−Ａ１号明細書
【特許文献１４】米国特許第４，６１５，８３９号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２０１０／００６９４９２号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，３７７，５２６号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，２１５，６３０号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，７１９，３０２号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，８４０，９４４号明細書
【特許文献２０】特開平９−３１００８９号公報（ＪＰ１９９７３１００８９）
【特許文献２１】特開平９−３０２３８０号公報（ＪＰ１９９７３０２３８０）
【特許文献２２】国際公開第０１／３６３６９  Ａ１号パンフレット
【特許文献２３】国際公開第２０１１／０８０５０３  Ａ２号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第２００１／０８０５０３号  Ａ２パンフレット
【特許文献２５】米国特許第５，１８９，１８９号明細書
【特許文献２６】米国特許第７，７３２，４８８号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】ＭｃＣｏｌｌ，Ｊ．，ＮｕｔｒａＣｏｓ，２（４）：３５−４０（２００３）
【非特許文献２】Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ａ．ら，Ｈｅａｌｔｈｆｕｌ  Ｌｉｐｉｄｓ所収，Ｃ．Ｃ．Ａｋｏｈ及びＯ．−Ｍ．Ｌａｉ編，ＡＯＣＳ：Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ，２００５，第１６章
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第２版；Ｆ．Ｄ．Ｇｕｎｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ｌ．Ｈａｒｗｏｏｄ及びＦ．Ｂ．Ｐａｄｌｅｙ編；Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，１９９４
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．，２９：１３５４−１３６７（２００７）
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．，１６（３）：２３６−２４３（１９９７）
【非特許文献６】Ｂｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．ら，Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，１２２：１２９７−１３０５（２００４）
【非特許文献７】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．及びＨ．Ｏｒｉｇａｓａ，Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，１４６：６１３−６２０（２００３）
【非特許文献８】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．ら，Ｌａｎｃｅｔ，３６９：１０９０−１０９８（２００７）
【非特許文献９】Ｃｏｈｅｎら（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８（１）：１６−１９（１９９１））
【非特許文献１０】Ｍｅｄｉｎａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，１６（３）：５１７−５８０（１９９８））
【非特許文献１１】Ｂｅｅｂｅら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，４５９：３６９−３７８（１９８８））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
治療剤としてのＥＰＡの高まる有益性及び増大する需要に鑑みて、改良されたＥＰＡ供給源、並びに適切な薬学的濃度にＥＰＡを高濃度化する調製方法が必要とされている。好ましくは、食用とすることが意図される濃縮ＥＰＡ油は、実質的にＤＨＡを含まず、且つ実質的に環境汚染物質を含まない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
一実施形態において、本発明は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］を含み、且つドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物に関し、前記濃縮物は、全脂肪酸の重量パーセントとして計測して３０〜７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油から得られ、ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる。
【００２３】
第２の実施形態において、微生物油は：
ａ）全脂肪酸の重量パーセントとして計測して約１〜約２５重量パーセントのリノール酸を含み；及び、
ｂ）全脂肪酸の重量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも１．２である。
【００２４】
第３の実施形態において、微生物油は、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油である。
【００２５】
第４の実施形態において、本発明は、本発明のエイコサペンタエン酸濃縮物を含む医薬生成物に関する。
【００２６】
第５の実施形態において、本発明は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物の作製方法に関し、前記方法は、
ａ）全脂肪酸の重量パーセントとして計測して３０〜７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ；及び、
ｂ）ステップ（ａ）のエステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を得るステップ
を含む。
【００２７】
ステップ（ｂ）のエステル交換した油は、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、分留、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により高濃度化され得る。
【００２８】
第６の実施形態において、本発明の方法は、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が少なくとも１．２である微生物油の使用に関する。さらに、微生物油は、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油であってもよい。
【００２９】
第７の実施形態において、本発明のエイコサペンタエン酸濃縮物は、環境汚染物質を実質的に含まない。
【００３０】
第８の実施形態において、本発明は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を作製するための、全脂肪酸の重量パーセントとして計測して３０〜７０重量パーセントのエイコサペンタエン酸を有し、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油の使用に関し、
ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の約２５％超を油として蓄積する微生物から得られる。
【００３１】
第９の実施形態において、上記の実施形態のいずれかにおける微生物油は、濃縮されていない。
【００３２】
第１０の実施形態において、上記の実施形態のいずれかにおける微生物油は、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない。
【００３３】
第１１の実施形態において、本発明のエイコサペンタエン酸濃縮物は、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない。
【００３４】
生物寄託物
以下の生物材料は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託されており、以下の名称、受託番号及び寄託日を有する。
【００３５】
【表１】
2014511406.tif 000003
【００３６】
上掲の生物材料は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に基づき寄託された。掲載される寄託物は、指示される国際寄託機関に少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に伴い一般に利用可能となる。寄託物が利用可能かどうかは、政府の行為によって付与される特許権を逸脱して本発明の実施許可をなすものではない。
【００３７】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される方法に係るＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２に由来した。同様に、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される方法に係るＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８２５９に由来した。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の方法の概要を、フローチャートの形式で提供する。具体的には、微生物の発酵により未処理微生物バイオマスを生成し、これは場合により機械的に処理され得る。未処理微生物バイオマスの油を抽出すると、残渣バイオマスと抽出油とが得られる。抽出油を直接エステル交換して高濃度化することにより、油の重量パーセント［「ｗｔ％」］として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物を生成することができる；又は、抽出油は初めに、ｉ）脱ガム、リファイニング、脱色、脱臭等による精製；又は、ｉｉ）短行程蒸留（ＳＰＤ）を用いた蒸留のいずれかを行ってもよい。
【図２】ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する様々なヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の展開を図示する。
【図３】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＺＫＵＭ；及び、（Ｂ）ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
配列表
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願に関する要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件（規則第５．２条及び第４９．５条（ａの２）、及び実施細則第２０８条及び付録Ｃ）に従う。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに使用する記号及び形式は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定められる規則に準拠する。
【００４０】
配列番号１〜８は、表１に特定されるとおり、遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、タンパク質（又はその一部分）、又はプラスミドである。
【００４１】
【表２】
2014511406.tif 000004
【００４２】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、全体として参照により援用される。
【００４３】
以下の定義を提供する。
【００４４】
「エイコサペンタエン酸」は「ＥＰＡ」と略記される。
【００４５】
「米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は「ＡＴＣＣ」と略記される。
【００４６】
「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ」と略記される。
【００４７】
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略記される。
【００４８】
「全脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略記される。
【００４９】
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略記される。
【００５０】
「エチルエステル」は「ＥＥ」と略記される。
【００５１】
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略記される。
【００５２】
「重量パーセント」は「ｗｔ％」と略記される。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「発明」又は「本発明」は、特許請求の範囲及び本明細書に記載されるとおりの本発明の全ての態様及び実施形態を指すよう意図され、任意の特定の実施形態又は態様に限定されるものとして読まれてはならない。
【００５４】
用語「医薬品」は、本明細書で使用されるとき、米国内で販売される場合に連邦食品・医薬品・化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）の第５０３条又は第５０５条によって規制されることになる化合物又は物質を意味する。
【００５５】
用語「エイコサペンタエン酸濃縮物」又は「ＥＰＡ濃縮物」は、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないω−３油を指す。油濃縮物は、全脂肪酸のｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油から得られ、ここで前記微生物油は、以下に詳述するとおり、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる。少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡは、遊離脂肪酸、トリグリセリド（例えばＴＡＧ）、エステル、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。エステルは、最も好ましくはエチルエステルの形態である。
【００５６】
用語「微生物バイオマス」は、微生物発酵からの微生物細胞材料を指し、この細胞材料はＥＰＡを含む。微生物バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズした細胞、部分的に加水分解した細胞材料、及び／又は部分的に精製した細胞材料（例えば、微生物によって生成された油）の形態であってもよい。好ましい実施形態では、微生物バイオマスは、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え操作された株など、商業的に相当な量でＥＰＡを生成する生成宿主の発酵からの消費後の又は使用済みの微生物細胞材料を指す。
【００５７】
用語「未処理微生物バイオマス」は、溶媒による抽出前の微生物バイオマスを指す。場合により、未処理微生物バイオマスは、溶媒で抽出する前に、機械的処理（ｍｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（例えば、バイオマスの乾燥、バイオマスの破壊、又はそれらの組み合わせによる）に供されてもよい。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「残渣バイオマス」は、溶媒（例えば、無機又は有機溶媒）で少なくとも１回抽出された、ＥＰＡを含む微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。
【００５９】
用語「油」は、２５℃で液体の、通常は多価不飽和の脂質物質を指す。油性生物では、油が全脂質の大部分をなし、主にトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］から構成されるが、他の中性脂質、リン脂質及び遊離脂肪酸もまた含有し得る。かかる油の中の特定の脂肪酸を精製又は高濃度化した後、その油は様々な化学的形態で（例えば、トリアシルグリセロール、アルキルエステル、塩又は遊離脂肪酸の形態で）存在し得る。油の脂肪酸組成及び全脂質の脂肪酸組成は、概して類似している；従って、全脂質におけるＰＵＦＡ濃度の増加又は低下が、油におけるＰＵＦＡ濃度の増加又は低下に対応することとなり、及び逆もまた同じである。
【００６０】
用語「抽出油」又は「粗製油」は（本明細書ではこれらの用語を同義的に使用することができるとおり）、油を合成した生物などの他の細胞材料から分離されている油を指す。抽出油は多種多様な方法によって得られ、そのうち最も単純なものは、物理的手段のみを伴う。例えば、様々なプレス構成（例えば、スクリュー、エキスペラー、ピストン、ビーズビーター等）を使用する機械的な破砕により、油を細胞材料と分離することができる。或いは、油の抽出は、様々な有機溶媒（例えばヘキサン）による処理、酵素抽出、浸透圧ショック、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えば、ＣＯ２抽出）、鹸化及びこれらの方法の組み合わせによって行うこともできる。抽出油のさらなる精製又は濃縮は任意選択である。
【００６１】
用語「微生物油」は総称であり、従って、以下にさらに定義するとおり、非濃縮微生物油又は濃縮微生物油のいずれも指し得る。
【００６２】
用語「非濃縮微生物油」は、抽出によって得られた微生物油において１つ以上の脂肪酸が実質的に高濃度化されていないことを意味する。換言すれば、微生物の細胞材料から分離されていてもよい「非濃縮微生物油」の脂肪酸組成は、微生物によって生成されたままの油の脂肪酸組成と実質的に同様である。従って、本明細書で利用される非濃縮微生物油は、これらの油を生成する微生物が少なくとも３０〜７０ＥＰＡ％ＴＦＡを含む脂肪酸組成を有するため、少なくとも３０〜７０ＥＰＡ％ＴＦＡを含む。非濃縮微生物油は、非濃縮抽出油又は非濃縮精製油であってもよい。
【００６３】
当業者は理解し得るとおり、３０ＥＰＡ％ＴＦＡ未満の微生物油から出発して、その微生物油が本発明のＥＰＡ濃縮物の作製に用いるのに十分な量のＥＰＡ％ＴＦＡを含むようにそれを処理することが可能である。
【００６４】
用語「精製油」は、リン脂質、微量金属、遊離脂肪酸、有色化合物、微量の酸化生成物、揮発性化合物及び／又は臭気化合物、及びステロール（例えば、エルゴステロール、ブラシカステロール、スチグマステロール、コレステロール）などの不純物の濃度が、抽出油中の不純物の濃度と比較して低下した微生物油を指す。精製プロセスは、典型的には、特定の１つ又は複数の脂肪酸が実質的に高濃度化されるようには微生物油を濃縮又は高濃度化せず、従って精製油はほとんどの場合に濃縮されていない。
【００６５】
用語「蒸留」は、沸騰液体混合物のその揮発度の差に基づく混合物の分離方法を指す。蒸留は単位操作であり、すなわち物理的分離プロセスである。
【００６６】
用語「短行程蒸留」［「ＳＰＤ」］は、極高真空下で操作する分離方法を指し、ここでＳＰＤ装置は蒸発器に近接して内部凝縮器を備え、従って蒸発後の蒸留しようとする材料からの揮発性化合物が短い距離しか移動せずに表面に凝縮する。結果として、この分離方法による熱分解は最小限である。
【００６７】
用語「ＳＰＤ精製油」は、１つ以上のＰＵＦＡを含むトリアシルグリセロール画分を含有する微生物油であって、ＳＰＤ条件下で少なくとも１回蒸留プロセスを受けた油を指す。この蒸留プロセスにより、ＳＰＤ前の油中のステロール含有量と比較して、ＳＰＤ精製油中のステロールの量が低下する。ＳＰＤはエチルエステル、メチルエステル及び遊離脂肪酸を濃縮し得るが、このプロセスは典型的にはＴＡＧを濃縮しない（例えば、超高温で操作して、ひいてはそれがＴＡＧの分解をもたらさない限り）。抽出油中のＰＵＦＡの大部分はＴＡＧの形態であり、且つＳＰＤプロセスは典型的には、特定の１つ又は複数の脂肪酸が実質的に高濃度化されるようにはＴＡＧを濃縮せず、ＳＰＤ精製油は、本明細書に記載される目的上、ほとんどの場合に濃縮されていないと考えられる。
【００６８】
用語「エステル交換」は、酸性又は塩基性触媒によって触媒される化学反応を指し、ここでは脂肪酸のあるエステルが、その脂肪酸の別のエステルに変換される。
【００６９】
用語「高濃度化」は、非濃縮微生物油中の１つ以上の脂肪酸の濃度と比べて、微生物油中のその１つ以上の脂肪酸の濃度を増加させるプロセスを指す。従って、本明細書において考察されるとおり、ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含む微生物油を高濃度化又は濃縮することで、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含むＥＰＡ濃縮物が生成される。
【００７０】
用語「脂肪酸」は、約Ｃ１２〜Ｃ２２（又はＣ１２〜Ｃ２２、ここで数字は鎖中の炭素［「Ｃ」］原子の総数を指す）の様々な鎖長の長鎖脂肪族系酸（アルカン酸）を指し、しかしながらより長い鎖長の酸及びより短い鎖長の酸のいずれも知らている。主な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法で表され、ここでＸは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、及び「ω−６脂肪酸」［「ω−６」又は「ｎ−６」］と「ω−３脂肪酸」［「ω−３」又は「ｎ−３」］の区別に関するさらなる詳細は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書（これは本明細書によって参照により本明細書に援用される）に提供される。
【００７１】
本明細書でＰＵＦＡを記載するのに用いられる命名法を表２に示す。「略記法」と題される欄には、ω基準系を使用して炭素の数、二重結合の数及びω炭素に最も近い二重結合の、ω炭素（本目的上、これが１と付番される）から数えた位置を示す。表中の残りは、ω−３及びω−６脂肪酸及びそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体を通じて用いられる略称及び各化合物の化学名を要約する。
【００７２】
【表３】
2014511406.tif 000005
【００７３】
従って、用語「エイコサペンタエン酸」［「ＥＰＡ」］は、シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸の一般名である。この脂肪酸は２０：５  ω−３脂肪酸である。用語ＥＰＡは、本開示で使用されるとき、特に具体的に言及されない限り、酸又は酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など）を指し得る。例えば「ＥＰＡ−ＥＥ」は、具体的にはＥＰＡエチルエステルを指し得る。
【００７４】
「ドコサヘキサエン酸」［「ＤＨＡ」］は、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸の一般名である；この脂肪酸は２２：６  ω−３脂肪酸である。用語ＤＨＡは、本開示で使用されるとき、特に具体的に言及されない限り、酸又は酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など）を指し得る。
【００７５】
「ノナデカペンタエン酸」［「ＮＤＰＡ」］は、シス−５，８，１１，１４，１７−ノナデカペンタエン酸の一般名である；この脂肪酸は１９：５  ω−２脂肪酸である。「ヘネイコサペンタエン酸」［「ＨＰＡ」］は、シス−６，９，１２，１５，１８−ヘネイコサペンタエン酸の一般名である；この脂肪酸は２１：５  ω−３脂肪酸である。これらの脂肪酸はいずれも魚油によく見られる。魚油から生成された濃縮ＥＰＡは、最終的なＥＰＡ組成にこれらの脂肪酸を不純物として含有することが多い（例えば、米国特許出願公開第２０１０−０２７８８７９号明細書及び国際公開第２０１０／１４７９９４  Ａ１号パンフレットを参照のこと）。用語ＮＤＰＡ及びＨＰＡは、本開示で使用されるとき、特に具体的に言及されない限り、それぞれの酸又は酸の誘導体（例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など）を指し得る。
【００７６】
用語「脂質」は、任意の脂溶性（すなわち親油性）の天然に存在する分子を指す。脂質の全般的な概説が、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に提供される（そのなかの表２を参照のこと）。
【００７７】
用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］は、グリセロール分子にエステル結合した３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡ及び飽和脂肪酸、並びにそれより短鎖の飽和及び不飽和脂肪酸を含み得る。生体では、グリセロール骨格がＰＵＦＡ分子の貯蔵のための又は輸送中の安定化を促進するため、ＴＡＧは主要な脂肪酸貯蔵単位である。対照的に、遊離脂肪酸は急速に酸化される。
【００７８】
「脂肪酸エチルエステル」［「ＦＡＥＥ」］は、概して、エステル化又はエステル交換のプロセスで遊離脂肪酸又はその誘導体をエタノールと反応させることにより合成的に誘導される脂質の化学的形態を指す。
【００７９】
用語「全脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、本明細書では、例えば微生物バイオマス又は油であってよい所与の試料中の、塩基性エステル交換法（当該技術分野において公知のとおりの）により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化することのできるあらゆる細胞脂肪酸の合計を指す。従って、ＴＦＡには、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びＴＡＧを含む）及び極性脂質画分（例えば、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン画分を含む）からの脂肪酸が含まれ、しかし遊離脂肪酸は含まれない。
【００８０】
細胞の「全脂質含有量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の百分率としてのＴＦＡの尺度であるが、しかしながら全脂質含有量は、ＤＣＷの百分率としてのＦＡＭＥ［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］の尺度として近似することができる。従って、全脂質含有量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば、ＤＣＷ１００ミリグラムあたりの全脂肪酸のミリグラム数と等価である。
【００８１】
全脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書では、ＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］、例えば、ＴＦＡ１００ミリグラムあたりの所与の脂肪酸のミリグラム数として表される。この計測単位は、微生物細胞中及び微生物油中における例えばＥＰＡの濃度を記載するために用いられる。
【００８２】
油中の脂肪酸エステル（及び／又はそれぞれ脂肪酸及び／又はトリグリセリド）の濃度は、油の重量パーセント［「％油」］、例えば油１００ミリグラムあたりの所与の脂肪酸エステル（及び／又はそれぞれ脂肪酸及び／又はトリグリセリド）のミリグラム数として表される。この計測単位は、ＥＰＡ濃縮物中におけるＥＰＡの濃度を記載するために用いられる。
【００８３】
ある場合には、細胞中における所与の１つ又は複数の脂肪酸の含有量を、その乾燥細胞重量の重量パーセント［「％ＤＣＷ」］として表すことが有用である。従って、例えば、ＥＰＡ％ＤＣＷは、以下の式に従い決定され得る：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００。しかしながら、その乾燥細胞重量の重量パーセント［「％ＤＣＷ」］としての細胞中における所与の１つ又は複数の脂肪酸の含有量は、（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００として近似することができる。
【００８４】
用語「脂質プロファイル」及び「脂質組成」は同義に扱うことができ、特定の脂質画分、例えば全脂質又は油に含まれる個々の脂肪酸の量を指し、ここでその量は、ＴＦＡの重量パーセントとして表される。混合物中に存在する個別の脂肪酸それぞれの合計は１００でなければならない。
【００８５】
用語「油性」は、そのエネルギー源を脂質の形態で貯蔵する傾向をもつ生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，所収：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。油性微生物は、その乾燥細胞重量の約２５％超を油として蓄積することも珍しくない。油性微生物中の細胞性の油又はＴＡＧの含有量は概してＳ字形曲線に従い、ここでは脂質の濃度が、後期対数増殖期又は初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次に後期定常期及び死滅期の間に徐々に低下する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ及びＷａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９−２５（１９９１））。
【００８６】
用語「油性酵母」は、油を作る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、何ら限定されるものではないが、以下の属が挙げられる：ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）。
【００８７】
用語「ＤＨＡを実質的に含まない」は、約０．０５重量パーセント以下のＤＨＡを含むことを意味する。従って、ＥＰＡ濃縮物は、油のｗｔ％として計測してＤＨＡ（遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、及びそれらの組み合わせの形態）の濃度が約０．０５ｗｔ％以下のＤＨＡである場合、ＤＨＡを実質的に含まない。同様に、微生物油は、ＴＦＡのｗｔ％として計測してＤＨＡの濃度が約０．０５ｗｔ％以下のＤＨＡである場合、ＤＨＡ（遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、及びそれらの組み合わせの形態）を実質的に含まない。
【００８８】
用語「ＮＤＰＡを実質的に含まない」及び「ＨＰＡを実質的に含まない」は、用語「ＤＨＡを実質的に含まない」について上記に提供されるが、但しそれぞれ脂肪酸ＮＤＰＡ又はＨＰＡをＤＨＡに代用した定義と同様である。
【００８９】
用語「環境汚染物質を実質的に含まない」は、油又はＥＰＡ濃縮物が、それぞれ、環境汚染物質を含まないか、又は環境汚染物質を含んでいても高々痕跡量に過ぎないことを意味し、ここで環境汚染物質には、ポリ塩化ビフェニル［「ＰＣＢ」］（ＣＡＳ番号１３３６−３６−３）、ダイオキシン、臭素化難燃剤及び農薬（例えば、トキサフェン及びジクロロジフェニルトリクロロエタン［「ＤＤＴ」］及びその代謝物）などの化合物が含まれる。
【００９０】
本発明は、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物に関し、前記濃縮物は、ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油から得られ、ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる。ＥＰＡ濃縮物は、好ましくは環境汚染物質を実質的に含まない及び／又は好ましくはＮＤＰＡ及びＨＰＡからなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を実質的に含まない。
【００９１】
本発明は上記に関連するが、微生物油それ自体を得るために有用であり得る関連プロセスの概要は理解されるであろう（但しこれは、本明細書における発明を限定するものとして解釈されてはならない）。図１にフローチャートの形式で図示するとおり、ほとんどのプロセスは微生物発酵から開始され、ここでは特定の微生物が、成長及びＰＵＦＡ生成を可能にする条件下で培養される。適切なタイミングで微生物細胞が発酵槽から回収される。少なくとも３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないこの未処理微生物バイオマスは、乾燥、破壊、ペレット化等の様々な機械的な処理に供されてもよい。次に未処理微生物バイオマスの油抽出が実施され、残渣バイオマス（例えば細胞残屑）と抽出油とが生じる。次に抽出油を直接エステル交換して高濃度化すると、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が生成され得る；又は抽出油は、初めに精製し、次にエステル交換及び高濃度化に供してもよい。例えば精製油は、ｉ）脱ガム、リファイニング、脱色、及び／又は脱臭等により；又は、ｉｉ）短行程蒸留（ＳＰＤ）条件を用いる蒸留によって精製ＴＡＧ画分（すなわちＳＰＤ精製微生物油）とステロールを含む留出画分とを生じさせることにより、生成することができる。図１のこれらの態様の各々を、以下でさらに詳細に考察する。
【００９２】
本明細書の発明において有用な微生物油は、典型的には微生物発酵により提供される微生物バイオマスに由来する。様々な油性微生物（真菌、藻類、ユーグレナ藻、ストラメノパイル、酵母又は任意の他の単細胞生物など）を微生物発酵で成長させて、ＴＦＡのｗｔ％として計測して少なくとも３０ｗｔ％のＥＰＡを含有する脂質を生成することができる。従って、天然に存在するものか、又は組換えかに関わらず、その乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する任意の微生物であって、ＴＦＡのｗｔ％として計測して少なくとも３０ｗｔ％のＥＰＡを生成する能力を有する微生物が、本明細書に記載される高濃度化プロセスで用いるのに好適な微生物油供給源を提供し得る。好ましくは、微生物は高度なＥＰＡ生成能力を有し、ここで前記生成は、好ましくは微生物宿主の少なくとも約３０〜５０ＥＰＡ％ＴＦＡ、より好ましくは少なくとも約５０〜６０ＥＰＡ％ＴＦＡ、及び最も好ましくは少なくとも約６０〜７０ＥＰＡ％ＴＦＡである。
【００９３】
他方で、ＴＦＡのｗｔ％として計測して少なくとも３０ｗｔ％未満のＥＰＡの生成能力である油性微生物もまた、好適な非濃縮微生物油供給源を提供することができ、この非濃縮微生物油は、本発明のＥＰＡ濃縮物の作製に用いるため、ＴＦＡのｗｔ％として計測して少なくとも３０ｗｔ％のＥＰＡを含むように処理／濃縮され得る。
【００９４】
微生物は必ず、少なくともＥＰＡを含まなければならないが、生物中にはまた、例えば、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモγリノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、及びこれらの混合物などの、様々な他の多価不飽和脂肪酸も存在し得る。
【００９５】
ＥＰＡは、従属栄養珪藻類のキクロテラ・エスピー（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）及びニッチア・エスピー（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）（米国特許第５，２４４，９２１号明細書）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）及びシュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）の種（米国特許第５，２４６，８４１号明細書）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）の糸状菌類（米国特許第５，２４６，８４２号明細書）、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、及びＭ．ヒグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）（米国特許第５，４０１，６４６号明細書）、及びナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）の真正眼点藻類（Ｋｒｉｅｎｉｔｚ，Ｌ．及びＭ．Ｗｉｒｔｈ，Ｌｉｍｎｏｌｏｇｉｃａ，３６：２０４−２１０（２００６））を含めた様々な非油性及び油性微生物で自然に生成されるが、組換え手段を用いた微生物ＥＰＡ生成には、天然の微生物供給源からの生成と比べていくつかの利点があるものと予想される。
【００９６】
組換え微生物は、宿主における新しい生合成経路の導入、望ましい経路の過剰発現により、及び／又は望ましくない経路の抑制により、宿主の天然に存在する微生物脂肪酸プロファイルを変化させて、それにより所望のＰＵＦＡ（又はそのコンジュゲート形態）の生成レベルの増加、及び望ましくないＰＵＦＡの生成の低下をもたらすことができるため、油の生成に好ましい特性を有し得る。第二に、組換え微生物は、特別な用途を有し得る特定の形態のＰＵＦＡを提供することができる。加えて、培養条件を制御することにより、特に、微生物が発現する酵素用の特定の基質供給源を提供することによるか、又は化合物を添加する／望ましくない生化学的経路が抑制されるように遺伝子操作することにより、微生物油の生成を操作することができる。従って、例えば、そのように生成されたω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比を改良したり、又は他のＰＵＦＡ下流又は上流生成物（例えばＤＨＡ）の多量の蓄積なしに特定のＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の生成を操作したりすることが可能である。高度に制御された培養条件はまた、このような組換え微生物から得られる微生物油が環境汚染物質を含まないことを確実にする。
【００９７】
従って、例えば、ＥＰＡを作る天然の能力を欠いている微生物を、適切なＰＵＦＡ生合成経路遺伝子、例えばΔ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ及びＣ１８／２０エロンガーゼの導入により、ＰＵＦＡ生合成経路を発現するように操作することができ、しかしながら、導入される具体的な酵素（及びそれらの酵素をコードする遺伝子）は、決して本明細書の本発明を限定するものではないことが認識されなければならない。
【００９８】
例として、数種の酵母が、ＥＰＡを生成するように組換え操作されている。例えば、非油性酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（米国特許第７，７３６，８８４号明細書）及び油性酵母のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，９３２，０７７号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書）における研究を参照のこと。これらの例は、本明細書における限定として解釈されてはならない。
【００９９】
一部の実施形態では、微生物宿主細胞が油性である場合に利点が認められる。油性酵母は、天然で油を合成及び蓄積する能力を有し、ここでは細胞乾燥重量の約２５％より高く、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％より高く、及び最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％より高い総油含有量が含まれ得る。代替的実施形態において、非油性酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を油性になるよう遺伝子修飾することで、細胞乾燥重量の２５％超の油を生成できるようにし得る（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
【０１００】
典型的に油性酵母と特定される属としては、限定はされないが、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。より具体的には、例示的な油合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ウチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類されていた）が挙げられる。
【０１０１】
例として、本明細書における好ましい実施形態では、ＴＦＡのｗｔ％として計測して少なくとも３０ｗｔ％のＥＰＡを含む微生物油の供給源は、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の操作された株由来である。より好ましくは、例えば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書（この一部は、少なくとも約４３．３ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない非濃縮微生物油を生成する）及び米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書（この一部は、少なくとも５０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない非濃縮微生物油を生成する）に記載される株から得られる微生物油である。また、本明細書では、これらの組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株のいずれかがさらなる遺伝子操作改良（本明細書の実施例５に記載されるものなど）に供されてもよく、ひいては本明細書に記載される組成物及び方法に好適な微生物油供給源となり得ることも企図される。従って、好ましい微生物油は、ＥＰＡの生成用に操作された、組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の微生物バイオマスから得られ、ここで微生物油は：
ａ）ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まず；
ｂ）ＴＦＡのｗｔ％として計測して約１〜約２５ｗｔ％のリノール酸を含み；
ｃ）ＴＦＡのｗｔ％として計測したＥＰＡの、ＴＦＡのｗｔ％として計測したリノール酸に対する比が少なくとも１．２であり；及び、
ｄ）好ましくはＮＤＰＡ及び／又はＨＰＡを実質的に含まない。
【０１０２】
より具体的には、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書が、最適化された組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における高度ＥＰＡ生成について記載している。少なくとも約４３．３ＥＰＡ％ＴＦＡを含み、約２３．６ＬＡ％ＴＦＡ未満（１．８３のＥＰＡ：ＬＡ比）及び約９．４オレイン酸％ＴＦＡ未満である微生物油を生成する能力を有する株が開示されている。好ましい株はＹ４３０５であり、これは３３．２ＥＰＡ％ＴＦＡを生成する能力を有し、発酵の途中のＥＰＡ：ＬＡ比は１．２５で、その最大生成は５５．６ＥＰＡ％ＴＦＡ、３．０３のＥＰＡ：ＬＡ比であった。概して、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書のＥＰＡ生成株は、以下のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んだ：ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；ｄ）Δ１７デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；ｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；ｆ）Ｃ１６／１８エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び、ｇ）場合により、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ［「ＣＰＴ１」］をコードする少なくとも１つの遺伝子。この経路は宿主細胞に遺伝子操作されるため、ＥＰＡのＤＰＡへの伸長（Ｃ２０／２２エロンガーゼにより触媒される）及びＤＰＡのＤＨＡへの不飽和化（Δ４デサチュラーゼにより触媒される）のための適切な酵素活性を欠くことに起因して、ＤＨＡが同時に生成されることがない。この開示もまた、概して、これらの操作された酵母株から得られる微生物油及びその油濃縮物について記載した。
【０１０３】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株の誘導体が米国特許出願第１２／８５４４４９号明細書（代理人整理番号「ＣＬ５１４３ＵＳＮＡ」、２０１０年８月１１日に出願され、且つ本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載され、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５  Ｆ１Ｂ１株として知られる。２リットル発酵で成長させると（米国特許出願公開第２００９−００９３５４−Ａ１号明細書の実施例１０と同様のパラメータ）、Ｙ４３０５株の平均ＥＰＡ生成率［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株の５０〜５２と比較したとき、５０〜５６であった。Ｙ４３０５株の平均脂質含有量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、Ｙ４３０５−Ｆ１Ｂ１株の２８〜３２と比較したとき、２０〜２５であった。従って、脂質含有量はＹ４５０３−Ｆ１Ｂ１株で２９〜３８％増加し、ＥＰＡ生成率に対する影響は最小限であった。
【０１０４】
米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１０−０３１７７３５−Ａ１号明細書は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載される株と比べて、ＥＰＡ％ＴＦＡ及びＥＰＡ：ＬＡ比に基づくとさらに改良された微生物油を生成する能力を有する最適化された組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を教示する。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に詳述されるとおりω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を発現することに加え、これらの改良株は、ａ）少なくとも１つのマルチザイムを含み、ここで前記マルチザイムは、少なくとも１つの脂肪酸Δ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸Δ９エロンガーゼ［「ＤＧＬＡシンターゼ」］を有するポリペプチドを含むこと；ｂ）場合により、マロニルＣｏＡシンテターゼ又はアシル−ＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］からなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むこと；ｃ）発現が下方制御されている少なくとも１つのペルオキシソームバイオジェネシス因子タンパク質を含むこと；ｄ）少なくとも約５０ＥＰＡ％ＴＦＡを生成すること；及び、ｅ）少なくとも約３．１のＥＰＡ：ＬＡ比を有することによって区別される。
【０１０５】
具体的には、少なくとも約５０ＥＰＡ％ＴＦＡを有することに加え、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１０−０３１７７３５−Ａ１号明細書の改良された最適化Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中、又はそれからの抽出油中の脂質プロファイルは、ＥＰＡ％ＴＦＡのＬＡ％ＴＦＡに対する比が少なくとも約３．１であり得る。改良された最適化組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株によって生成される脂質はまた、ＧＬＡ、ＮＤＰＡ、ＨＰＡ又はＤＨＡが０．０５％未満であり、且つ飽和脂肪酸含有量が約８％未満であることによっても区別される。飽和脂肪酸（すなわち１６：０及び１８：０）の割合がこのように低いことは、ヒト及び動物の双方に有益である。
【０１０６】
最近になって、米国特許出願第１３／２１８７０８号明細書（代理人整理番号ＣＬ５４１１ＵＳＮＡ、２０１１年８月２６日出願、本明細書によって参照により本明細書に援用される）が、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される株と比べて、ＥＰＡ生成率の増加（すなわち、ＥＰＡ％ＤＣＷの増加として計測される）に基づくと改良された微生物油を生成する能力を有するさらに改良された最適化組換え微生物宿主細胞を記載している。ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子であって、少なくとも１つのマルチザイム（ここで前記マルチザイムは、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されるとおりの、少なくとも１つの脂肪酸Δ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸Δ９エロンガーゼ［「ＤＧＬＡシンターゼ」］を有するポリペプチドを含む）を含む遺伝子を発現し、且つ発現が下方制御されている少なくとも１つのペルオキシソームバイオジェネシス因子タンパク質（米国特許出願公開第２００９−０１１７２５３−Ａ１号明細書及び同第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されるとおり）を含むことに加え、この出願に開示される改良された組換え微生物宿主細胞は、
１）少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有する少なくとも２つのポリペプチドを含むこと；
２）少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＰＤＡＴ」］活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むこと；
３）場合により、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する少なくとも１つの合成突然変異体Δ９エロンガーゼポリペプチドを含むこと；及び、
４）ＤＣＷのｗｔ％として計測して少なくとも２５ｗｔ％のＥＰＡを含む微生物油を生成すること
によってさらに区別される。
【０１０７】
ＰＵＦＡ生合成経路を油性酵母に導入する手段は公知であるため、当業者は本発明の方法が、上記に記載されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株にも、また本発明を実証している種（すなわち、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））又は属（すなわち、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ））にも限定されないことを理解するであろう。代わりに、ＴＦＡのｗｔ％として計測して少なくとも３０ｗｔ％のＥＰＡを生成する能力を有する任意の油性酵母又は任意の他の好適な油性微生物、例えば、真菌、藻類、ユーグレナ藻、ストラメノパイル、又は任意の他の単細胞生物であって、そこから得られる微生物油が微生物の乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積するものが、本方法において等しく有用であり得る。
【０１０８】
ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油を生成するため、油を生成する微生物は、ＥＰＡの生成を最適化することが微生物学又は発酵科学の技術分野の当業者に公知の標準的な条件下で成長させ得る。遺伝子操作された微生物に関して、微生物は、キメラ遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＣＰＴ１タンパク質、マロニルＣｏＡシンテターゼ、アシルトランスフェラーゼ等をコードするもの）の発現を最適化し、且つ最も高く最も経済的なＥＰＡ収率を生じる条件下で成長させ得る。典型的には微生物には、炭素及び窒素源が、微生物の成長及び／又はＥＰＡの生成を可能にする数多くの追加的な化学薬品又は物質と共に与えられる。発酵条件は、上記の引用に記載されるとおり用いられる微生物に依存し得るとともに、得られるバイオマスにおいて高含量のＰＵＦＡとなるよう最適化され得る。
【０１０９】
一般に、培地条件は、炭素源の種類及び量、窒素源の種類及び量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生成段階の長さ、油蓄積段階の長さ並びに細胞を回収するタイミング及び方法を改良することにより最適化され得る。
【０１１０】
より具体的には、発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書及び米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に教示されるものなどの、好適な炭素源を含まなければならない。操作されたＥＰＡ生成微生物の成長に利用される炭素の供給源は多種多様な炭素含有供給源を包含し得ることが企図されるが、好ましい炭素源は、糖類、グリセロール及び／又は脂肪酸である。最も好ましくは、グルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトース及び／又は１０〜２２個の炭素を含有する脂肪酸である。例えば、発酵性炭素源は、転化スクロース（すなわち、スクロースの加水分解によって得られる等しい部数のフルクトースとグルコースとを含む混合物）、グルコース、フルクトース及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができ、但しグルコースは転化スクロース及び／又はフルクトースとの組み合わせで用いられるものとする。
【０１１１】
窒素は、無機供給源（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）又は有機供給源（例えば、尿素又はグルタミン酸塩）から供給されてもよい。適切な炭素源及び窒素源に加え、発酵培地はまた、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、ビタミン及び油性酵母の成長及びＥＰＡ生成に必須の酵素経路の促進に好適な当業者に公知の他の成分も含有しなければならない。脂質及びＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えば、Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２及びＭｇ＋２）に特に注意が払われる（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ及びＲ．Ｃｏｌｉｎ編ｐｐ  ６１−９７（１９９２））。
【０１１２】
好ましい成長培地は、酵母窒素原基礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定又は合成成長培地もまた用いることができ、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の成長に適切な培地は、微生物学又は発酵科学の技術分野の当業者には公知であろう。発酵に好適なｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、ここではｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期成長条件の範囲として好ましい。発酵は好気性又は嫌気性条件下で行われてもよい。
【０１１３】
典型的には、油性酵母細胞における高度のＰＵＦＡの蓄積には、成長と脂肪の合成／貯蔵との間の代謝状態が「平衡」しなければならないため、二段階プロセスが必要である。従って、最も好ましくは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥＰＡの生成には二段階発酵プロセスが必要である。この手法は、様々な好適な発酵プロセス設計（すなわち、バッチ、フェドバッチ及び連続）及び成長の間の考慮事項と同様に、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載されている。
【０１１４】
微生物によって所望の量のＥＰＡが生成されると、発酵培地を処理してＰＵＦＡを含む微生物バイオマスを得ることができる。例えば、発酵培地をろ過又は他の方法で処理して、水性成分の少なくとも一部を除去してもよい。発酵培地及び／又は微生物バイオマスは、さらに処理し得る；例えば、微生物バイオマスは、低温殺菌するか、又は他の手段によって処理することにより、微生物油及び／又はＰＵＦＡ生成物に害を及ぼし得る内因性の微生物酵素の活性を低下させてもよい。微生物バイオマスは、例えばバイオマスの乾燥、バイオマスの破壊（例えば細胞溶解による）、バイオマスのペレット化、又はそれらの組み合わせにより、機械的に処理してもよい。微生物バイオマスは、例えば所望の含水量まで乾燥させて粒状化又はペレット化することで容易に取り扱えるようにし、及び／又は例えば、ビーズビーター、スクリュー押出し等の物理的手段によって機械的に破壊して、細胞含有分とのより高い接触性を提供してもよい。この微生物バイオマスは、これらの機械的処理工程のいずれかの後であっても、油の抽出はまだ行われていないため、未処理微生物バイオマスと称され得る。
【０１１５】
微生物バイオマスを機械的に処理する好ましい方法の一つが、米国仮特許出願第６１／４４１，８３６号明細書（代理人整理番号ＣＬ５０５３ＵＳＰＲＶ、２０１１年２月１１日に出願された）及び米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号明細書（代理人整理番号ＣＬ５０５３ＵＳＮＡ（本願と同時出願された）（各々、参照により本明細書に援用される）に記載されている。具体的には、この方法には、油を吸収することが可能な粉砕助剤（例えば、シリカ、ケイ酸塩）を伴う乾燥させた酵母の二軸スクリュー押出しによる破壊されたバイオマス混合物の提供と、続いて結合剤（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、可溶性デンプン）を前記破壊されたバイオマス混合物とブレンドすることによる、固体ペレットを形成することが可能な固化可能な混合物の提供、及びその後の固化可能な混合物からの固体ペレット（例えば、約１ｍｍ直径×６〜１０ｍｍ長さのもの）の形成（「ペレット化」）が関わる。
【０１１６】
任意選択の機械的処理（ｍｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）の後、微生物油は概して（必須ではないが）、油の抽出により、油を生成した微生物中に存在し得る他の細胞材料と分離される。
【０１１７】
油の抽出は、様々な有機溶媒（例えば、ヘキサン、イソヘキサン）、酵素抽出、浸透圧ショック、超音波抽出、超臨界流体抽出（例えば、ＣＯ２抽出）、鹸化及びこれらの方法の組み合わせで処理することによって行われ得る。これらのプロセスにより、残渣バイオマス（すなわち、細胞残屑等）と、好ましくはＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない抽出油とが生じ得る。
【０１１８】
超臨界流体抽出を用いる場合、任意の好適な超臨界流体又は液体溶媒を用いてＥＰＡ含有油をバイオマスと分離し得る（例えば、ＣＯ２、テトラフルオロメタン（ｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、イソブタン、イソブテン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、及びこれらの混合物、但し、超臨界流体は全ての試薬及び生成物に対して不活性であるものとする）；より好ましい溶媒には、ＣＯ２又はＣ３〜Ｃ６アルカン（例えば、ペンタン、ブタン、及びプロパン）が含まれる。最も好ましい溶媒は、ＣＯ２を含む超臨界流体溶媒である。この抽出では脂肪酸組成は濃縮されず、従って回収される抽出油は非濃縮微生物油である。
【０１１９】
好ましい実施形態では、米国特許出願公開第２０１１−０２６３７０９−Ａ１号明細書（本明細書によって参照により本明細書に援用される）に開示されるとおりの超臨界二酸化炭素抽出が実施される。この特殊な方法は、未処理の破壊された微生物バイオマスを油抽出に供することにより、リン脂質を含む残渣バイオマスを除去し、次に得られた抽出物を少なくとも１回分画して、少なくとも１つのＰＵＦＡを含む精製された脂質組成を有する抽出油を得るもので、ここで精製された脂質組成は、未処理の破壊された微生物バイオマスの油組成と比べてＴＡＧが高濃度化されている。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない抽出油は、場合によりさらなる精製ステップを受ける。例えば、当業者は、脱ガム（例えば、それによりリン脂質、微量金属及び遊離脂肪酸を除去する）、リファイニング、脱色（例えば、それにより有色化合物及び微量の酸化生成物を吸着する）、及び／又は脱臭（例えば、それにより揮発性化合物、臭気化合物及び／又はさらなる有色化合物を除去する）の手順に精通しているであろう。これらの方法のいずれも、微生物油中のＥＰＡ濃度を実質的に高濃度化しないため、これらのプロセスの生成物は、たとえ精製された形態であっても、なお典型的には非濃縮微生物油と見なされる。この油中のＥＰＡ及び他のＰＵＦＡは、主としてその天然のトリグリセリド形態のままである。
【０１２１】
或いは、ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない抽出油を蒸留して水分及び例えばステロールを除去することが望ましい場合もある。ステロールは、細胞の膜透過性において機能するもので、あらゆる主要な生物集団から単離されているが、単離される優勢なステロールには多様性がある。高等動物において優勢なステロールはコレステロールである一方、高等植物ではβ−シトステロールが一般に優勢なステロールである（しかしながらこれは多くの場合にカンペステロール及びスチグマステロールを伴う）。微生物に見られる１つ又は複数の優勢なステロールに関する一般化は、その組成が特定の微生物種に依存するため、さらに困難である。例えば、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）はエルゴステロールを優勢に含み、モルティエレラ属（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ）の真菌はコレステロール及びデスモステロールを優勢に含み、及びシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のストラメノパイルはブラシカステロール及びスチグマステロールを優勢に含む。ステロール（例えばエルゴステロール）は、特に低い貯蔵温度ではＴＡＧから相分離し、それにより微生物油に望ましくない混濁が生じることが観察されている。
【０１２２】
米国仮特許出願第６１／４４１，８４２号明細書（代理人整理番号ＣＬ５０７７ＵＳＰＲＶ、２０１１年２月１１日に出願された）及び米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号明細書（代理人整理番号ＣＬ５０７７ＵＳＮＡ（本願と同時出願された）（各々、参照により本明細書に援用される）は、ステロール含有抽出油中のステロール含有量を低減する方法を記載し、この方法は、ステロール含有微生物油を短行程蒸留（ＳＰＤ）の蒸留器に通す少なくとも１回のパスを含む。
【０１２３】
市販のＳＰＤ蒸留器は、化学工業の技術分野で周知されている。好適な蒸留器は、例えばＰｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）から入手可能である。ＳＰＤ蒸留器は蒸発器と内部凝縮器とを含む。典型的な蒸留は、蒸発器の温度、凝縮器の温度、蒸留器への油の供給速度及び蒸留器の真空レベルによって制御される。
【０１２４】
当業者は理解し得るとおり、ＳＰＤ蒸留器に通すパス回数は、ステロール含有微生物油の水分レベルに依存し得る。水分含有量が低い場合、シングルパスでＳＰＤ蒸留器に通せば十分であり得る。しかしながら好ましくは、蒸留は、２回以上の連続してステロール含有抽出油をＳＰＤ蒸留器に通すパスを含むマルチパスプロセスである。最初のパスは、典型的には約１〜５０トル圧、及び好ましくは約５〜３０トルのもと、比較的低い蒸発器の表面温度、例えば約１００〜１５０℃で実施される。これにより、残留水及び低分子量有機材料が蒸留され、脱水された油が得られる。次に脱水した油を、蒸発器をより高温とし、及びより低圧で蒸留器に通すと、ＳＰＤに供されない油と比較したときステロールが高濃度化された留出画分と、ステロールの量が低下したＴＡＧ含有画分とがもたらされる。ＴＡＧ含有画分のさらなるパスを行って蒸留器に通し、ステロールをさらに除去してもよい。好ましくは、ステロール含有微生物油中のステロール画分と比較したとき、ステロール画分の量の減少が少なくとも約４０％〜７０％、好ましくは少なくとも約７０％〜８０％、及びより好ましくは約８０％超となるように、十分なパスが実施される。
【０１２５】
より好ましくは：ｉ）ＳＰＤ条件は、３０ｍトル以下、及び好ましくは５ｍトル以下の真空レベルにおけるステロール含有微生物油の少なくとも１回のパスを含む；ｉｉ）ＳＰＤ条件は、約２２０〜３００℃、及び好ましくは約２４０〜２８０℃における少なくとも１回のパスを含む；及び、ｉｉｉ）ＳＰＤ条件は、３００℃以下、及びより好ましくは２８０℃以下の蒸発器温度を有する。
【０１２６】
ＳＰＤプロセスにより、ＳＰＤに供されていないステロール含有微生物油組成と比較したときステロール画分が低下して透明度が向上したＴＡＧ含有画分（すなわちＳＰＤ精製油）が得られる。透明度の向上とは、油に混濁又は不透明性がないことを指す。ステロール含有微生物油は、約１０℃を下回る温度で保存すると、油中のステロールレベルが上昇することに起因して濁るようになる。蒸留プロセスがステロール画分の大部分を除去する働きをし、従って得られるＴＡＧ含有画分は存在するステロールの量が減少しているため、約１０℃で保存しても透明なまま、又は実質的に透明なまま保たれる。油の透明度の評価に用い得る試験方法は、米国油脂化学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ：ＡＯＣＳ）の「Ｃｏｌｄ  Ｔｅｓｔ」と題されるＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｃ  １１−５３である（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＯＣＳ，第６，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ，２００９、参照により本明細書に援用される）。
【０１２７】
驚くことに、蒸留プロセスにおけるステロールの除去は、プロセス前後のＰＵＦＡ含有分の評価に基づけば、顕著な油の分解なしに達成することができる。
【０１２８】
ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない精製微生物油であるＴＡＧ含有画分の回収は、蒸発器を通るパスの完了後に、好適な容器に画分を分流することにより達成されてもよい。
【０１２９】
微生物油（すなわち、抽出油又は精製油）の脂肪酸は、典型的にはトリグリセリド又はリン脂質などの生物学的形態である。これらの形態の脂肪酸プロファイルを高濃度化することは困難であるため、通常、微生物油の個々の脂肪酸は、当業者に公知の技術を用いたエステル交換によって遊離され得る。脂肪酸エステル混合物は、エステル交換前の微生物油と実質的に同じ脂肪酸プロファイルを有するため、エステル交換プロセスの生成物はなお、典型的に非濃縮微生物油（すなわち、エステル形態）と見なされる。
【０１３０】
ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油の高濃度化により（ここで微生物油は、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる）、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない油濃縮物（すなわち「ＥＰＡ濃縮物」）が得られる。具体的には、微生物油のエチル又は他のエステルは、分留、尿素アダクト形成、短行程蒸留、向流カラムによる超臨界流体分画、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、酵素分離及び銀塩処理、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせなどの当該技術分野で一般的に用いられる方法により、ＥＰＡを高濃度化し、分離することができる。
【０１３１】
従って、本明細書には、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物を作製する方法も提供され、前記方法は、
ａ）ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ；及び、
ｂ）ステップ（ａ）のエステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物を得るステップ
を含む。
【０１３２】
例えば、本明細書の実施例には、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の、ＴＦＡのｗｔ％として計測して５８．２％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない非濃縮精製微生物油が提供される。この非濃縮微生物油は、実施例２で尿素アダクト形成方法によって高濃度化され、その結果、得られるＥＰＡ−ＥＥ濃縮物は、油のｗｔ％として計測して７６．５％のＥＰＡ−ＥＥを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないものとなる。同様に実施例３は、同じ非濃縮微生物油の液体クロマトグラフィーによる高濃度化を実証し、ここで得られるＥＰＡ−ＥＥ濃縮物は、油のｗｔ％として計測して８２．８％又は９５．４％のＥＰＡ−ＥＥを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないものとなる。実施例４は、同じ非濃縮微生物油の超臨界流体クロマトグラフィーによる高濃度化を実証し、油のｗｔ％として計測して８５％又は８９．８％のＥＰＡ−ＥＥを含む、ＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られる。
【０１３３】
実施例５では、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の、ＴＦＡのｗｔ％として計測して５６．１％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない代替的な非濃縮ＳＰＤ精製微生物油が提供される。実施例６におけるこの微生物油の高濃度化は分留によって行われ、それにより、油のｗｔ％として計測して７３％のＥＰＡ−ＥＥを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が生じる。分留は、有利には、油中に存在するより低分子量のエチルエステルの多く（すなわち、限定はされないが、実施例６の微生物油中の優勢にはＣ１８）を除去する。
【０１３４】
実施例８では、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の、ＴＦＡのｗｔ％として計測して５４．７％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まない代替的な非濃縮ＳＰＤ精製微生物油が提供される。この微生物油の高濃度化は、分留及び液体クロマトグラフィーによって行われ、それにより、油のｗｔ％として計測して９７．４％のＥＰＡ−ＥＥを含み、且つＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が生じる。当業者は、高濃度化プロセス（例えば、分留、尿素アダクト形成、短行程蒸留、向流カラムによる超臨界流体分画、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、酵素分離及び銀塩処理、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー）の他の組み合わせを利用して本発明のＥＰＡ濃縮物を生じさせてもよいことを理解するはずである。
【０１３５】
例えば、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物を作製することが特に有利であってよく、前記方法は、（ａ）ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含む微生物油のエステル交換反応；（ｂ）より低分子量の、すなわちＣ１４、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸を含むエチルエステルの多くを除去するための分留を含む最初の高濃度化プロセス；及び、（ｃ）尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる高濃度化プロセスを含む。微生物油試料中のＣ１４、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸濃度が分留の結果として下がると、続く高濃度化プロセスが促進され得る。
【０１３６】
当業者は認識するであろうとおり、エチルエステル形態の、上記に記載されるＥＰＡ濃縮物のいずれも、必要であれば他の形態、例えばメチルエステル、酸又はトリアシルグリセリド、又は任意の他の好適な形態又はそれらの組み合わせに容易に変換することができる。ある誘導体から別の誘導体へのＰＵＦＡの化学的変換手段については周知されている。例えば、トリグリセリドは、鹸化により開裂された酸のナトリウム塩に変換し、さらに酸性化により遊離脂肪酸に変換することができ、及びエチルエステルは、グリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することができる。従って、ＥＰＡ濃縮物は最初はエチルエステルの形態であると予想されるが、これは決して限定を意図したものではない。従って、ＥＰＡ濃縮物中の、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、及びそれらの組み合わせの形態のＥＰＡを指すことができ、ここでエステルは、最も好ましくはエチルエステルの形態である。
【０１３７】
当業者は、微生物油の任意の好ましいＥＰＡ高濃度化レベルがもたらされ、それによりＥＰＡ濃縮物が、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを有するように、プロセス条件を最適化し得ることを理解するであろう（しかしながらＥＰＡ純度の増加はＥＰＡの収率に反比例することが多い）。従って、当業者は、ＥＰＡのｗｔ％が、７０％から１００％以下の任意の整数の百分率（又はその分数）、すなわち、具体的には、油のｗｔ％として計測して７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％のＥＰＡであってよいことを理解するであろう。
【０１３８】
より具体的には、本発明の一実施形態では、油のｗｔ％として計測して少なくとも８０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が提供される。別の実施形態では、油のｗｔ％として計測して少なくとも９０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が提供される。そして、さらに別の実施形態では、油のｗｔ％として計測して少なくとも９５ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が提供される。
【０１３９】
好ましい実施形態では、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない、上記に記載されるＥＰＡ濃縮物は、ＮＤＰＡを実質的に含まず、且つＨＰＡを実質的に含まないものとしてさらに特徴付けることができる。
【０１４０】
いかなる特定の応用にも限定されないが、本発明のＥＰＡ濃縮物は医薬品としての使用に特に良好に適している。当業者に周知されているとおり、ＥＰＡは、カプセル、錠剤、顆粒、飲料中に分散させることができる散剤、又は別の固形経口剤形、液体（例えばシロップ）、ソフトゲルカプセル、コーティングされたソフトゲルカプセル又は他の好都合な剤形、例えばカプセル中の経口液体で投与されてもよい。カプセルは、ハードシェル又はソフトシェルであってよく、ゼラチン又は菜食主義者向けの供給源であってもよい。ＥＰＡはまた、注射又は注入に好適な液体中に含まれてもよい。
【０１４１】
加えて、ＥＰＡはまた、１つ以上の不活性な医薬品成分（本明細書で一般に「賦形剤」としても知られる）と組み合わせて投与してもよい。非活性成分は、例えば、使用に際して安全、便利、及び他の形で許容可能な、適用可能で効果的な製剤となるよう有効成分を可溶化、懸濁、増粘、希釈、乳化、安定化、保存、保護、着色、香味付け、及び造形する働きをする。
【０１４２】
賦形剤としては、限定はされないが、界面活性剤、例えばモノカプリル酸プロピレングリコール、長鎖脂肪酸のグリセロール及びポリエチレングリコールエステルの混合物、ポリエトキシ化ヒマシ油、グリセロールエステル、オレオイルマクロゴールグリセリド、プロピレングリコールモノラウレート、ジカプリル酸／ジカプリン酸プロピレングリコール、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、共溶媒、例えばエタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、及び油、例えばヤシ油、オリーブ油又はベニバナ油を挙げることができる。界面活性剤、共溶媒、油又はそれらの組み合わせの使用は、概して製剤技術分野で公知であり、及び当業者であれば理解し得るとおり、任意の好適な界面活性剤を本発明及びその実施形態と併せて用いることができる。
【０１４３】
組成物の用量濃度、用量スケジュール及び投与期間は、目的の作用を発現させるのに十分でなければならず、例えば、剤形、投与経路、１つ又は複数の症状の重症度、体重、年齢などに応じて適宜調整され得る。経口投与する場合、組成物は１日３回の分割用量で投与されてもよく、しかしながら組成物は、或いは単回用量又はいくつかの分割用量で投与されてもよい。
【実施例】
【０１４４】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示として提供されるに過ぎないことが理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、且つその趣旨及び精神から逸脱することなく本発明の様々な変更及び改良を行って、それを様々な利用及び条件に適合させることができる。
【０１４５】
実施例１
全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の５８．２％のＥＰＡを含む微生物油の調製
本実施例は、ＥＰＡの生成用に操作された、組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油の単離について記載する。その後この微生物油は、以下の実施例２〜４に記載するとおり、様々な手段によって高濃度化した。
【０１４６】
具体的には、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株を、約６１．８ＥＰＡ％ＴＦＡの生成が可能となるように組換え操作し、二段階フェドバッチ法を用いて培養した。次に得られた微生物バイオマスからイソヘキサン溶媒によって微生物油を単離し、精製すると、５８．２ＥＰＡ％ＴＦＡを含む濃縮されていないトリグリセリドリッチの精製油が得られた。
【０１４７】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の遺伝子型
Ｙ８６７２株の生成は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来するＹ８６７２株は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により、全脂質に対して約６１．８％のＥＰＡを生じる能力を有した。
【０１４８】
Ｙ８６７２株の最終的な遺伝子型は、野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対して、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、不明１−、不明２−、不明３−、不明４−、不明５−、不明６−、不明７−、不明８−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡＣＯ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、及びＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
【０１４９】
上記の発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により表され、ここでＸはプロモーター断片を示し、Ｙは遺伝子断片を示し、及びＺはターミネーター断片を示し、これらは全て、互いに作動可能に連結されている。略称は以下のとおりである：ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］；ＦｍＤ１２Ｓは、Ｆ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］；ＭＥ３Ｓは、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子であり［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］；ＥｇＤ９ｅＳは、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子であり［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］；ＥｇＤ８Ｍは、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成突然変異体Δ８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来するコドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプティエラ・エスピー（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９  Δ９エロンガーゼに由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）を、Δ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前掲）に連結することにより作成されるＤＧＬＡシンターゼであり［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］；ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍは、Δ９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前掲）をΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前掲）に連結することにより作成されるＤＧＬＡシンターゼであり［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］；ＥｇＤ５Ｍ及びＥｇＤ５ＳＭは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成突然変異体Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］であり［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］；ＥａＤ５ＳＭは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成突然変異体Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］であり［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］；ＰａＤ１７Ｓは、Ｐ．アファニデルマタム（Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子であり［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］；及びＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１に由来するコドン最適化マロニル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子である［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］。
【０１５０】
Ｙ８６７２株における全脂質含有量及び組成の詳細な分析のため、フラスコアッセイを行い、ここでは細胞を二段階で合計７日間成長させた。分析に基づけば、Ｙ８６７２株は３．３ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生じ、細胞の全脂質含有量は２６．５［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含有量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は１６．４であり、及び脂質プロファイルは以下のとおりであった（各脂肪酸の濃度はＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする）：１６：０（パルミテート）−２．３、１６：１（パルミトオレイン酸）−０．４、１８：０（ステアリン酸）−２．０、１８：１（オレイン酸）−４．０、１８：２（ＬＡ）−１６．１、ＡＬＡ−１．４、ＥＤＡ−１．８、ＤＧＬＡ−１．６、ＡＲＡ−０．７、ＥＴｒＡ−０．４、ＥＴＡ−１．１、ＥＰＡ−６１．８、その他−６．４。
【０１５１】
発酵及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株バイオマスからの微生物油の抽出
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株の凍結培養物から、振盪フラスコに接種材料を調製した。インキュベーション期間後、この培養物を使用してシード発酵槽に接種した。シード培養物が適切な目標細胞密度に達したところで、次にそれを使用してより大きい発酵槽に接種した。発酵は二段階フェドバッチ法であった。第１の段階では、高細胞密度に至る急速な成長を促進する条件下で酵母を培養した；培養培地は、グルコース、様々な窒素源、微量金属及びビタミンを含んだ。第２の段階では、酵母を窒素飢餓状態にしてグルコースを連続的に供給することにより、脂質及びＰＵＦＡ蓄積を促進した。温度（３０〜３２℃で制御される）、ｐＨ（５〜７で制御される）、溶存酸素濃度及びグルコース濃度を含むプロセス変数を監視し、標準的な動作条件により制御して、一貫したプロセスパフォーマンス及び最終的なＰＵＦＡ油品質を確保した。
【０１５２】
発酵技術分野の当業者は、発酵ランそれ自体、培地条件、プロセスパラメータ、スケールアップ等、並びに培養物をサンプリングする特定の時間点に応じて、特定のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の油プロファイルにばらつきが起こり得ることを承知しているであろう（例えば、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書を参照のこと）。
【０１５３】
発酵後、酵母バイオマスを脱水及び洗浄することにより塩及び残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小限に抑えた。続くドラム乾燥により水分を５％未満に低下させ、未処理微生物バイオマスを短期間保管及び輸送する間の油の安定性を確保した。
【０１５４】
次に微生物バイオマスを、イソヘキサン溶媒を伴う機械的破壊に供し、バイオマスからＥＰＡリッチ微生物油を抽出した。残渣バイオマス（すなわち細胞残屑）を除去し、溶媒を蒸発させて、抽出油を得た。抽出油をリン酸を使用して脱ガムし、２０ボーメ度の苛性剤で精製して、リン脂質、微量金属及び遊離脂肪酸を除去した。シリカ及び粘土による脱色を用いて、有色化合物及び微量の酸化生成物を吸着させた。最後の脱臭ステップで揮発性化合物、臭気化合物及びさらなる有色化合物をストリッピングして、その天然のトリグリセリド形態のＰＵＦＡを含む非濃縮精製微生物油を得た。
【０１５５】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株由来の微生物油の特徴付け
以下のガスクロマトグラフィー［「ＧＣ」］方法を用いて、非濃縮精製油の脂肪酸組成を分析した。具体的には、トリグリセリドを、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用するエステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に変換した。得られたＦＡＭＥを、トルエン／ヘキサン（２：３）に希釈した後、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）のＯＭＥＧＡＷＡＸ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラムを取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０  ＧＣを使用して分析した。オーブン温度は５℃／分で１６０℃から２００℃に上昇させ、次に１０℃／分で２００℃から２５０℃（１０分間維持）に上昇させた。
【０１５６】
ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、既知のメチルエステル［「ＭＥ」］と比較したときのそれらの保持時間により同定し、それらのＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部標準（Ｃ１５：０トリグリセリド、試料でのエステル交換手順を通じて取った）との比較により定量化した。従って、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（ｍｇ）［「ｍｇ  ＦＡＭＥ」］は、以下の式に従い計算される：（特定の脂肪酸のＦＡＭＥピークの面積／１５：０  ＦＡＭＥピークの面積）＊（内部標準Ｃ１５：０  ＦＡＭＥのｍｇ数）。次にＦＡＭＥの結果を、１．０４２〜１．０５２の適切な分子量変換係数で除すことにより、対応する脂肪酸のｍｇ数に対して補正することができる。
【０１５７】
個別の脂肪酸それぞれの量をＴＦＡの重量パーセントとして要約する脂質プロファイルを、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の合計で除して１００を乗じることにより決定した。
【０１５８】
非濃縮Ｙ８６７２精製油に関してＧＣ分析から得られた結果を、以下の表３に示す。精製油は５８．２ＥＰＡ％ＴＦＡを含有し、ＤＨＡは検出不能であった（すなわち＜０．０５％）。
【０１５９】
【表４】
2014511406.tif 000006
【０１６０】
実施例２
尿素アダクト形成による微生物油の高濃度化
この例は、実施例１の非濃縮精製油を尿素アダクト形成によって高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大７８％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られ得ることを実証する。
【０１６１】
ＫＯＨ（２０ｇ）を、初めに３２０ｇの無水エタノールに溶解した。次に溶液を実施例１の非濃縮精製油１ｋｇと混合し、約６０℃に４時間加熱した。反応混合物を分液漏斗中に一晩放置しておき、完全に相分離させた。下側のグリセロール画分を除去した後、少量のシリカを上側のエチルエステル画分に添加して過剰な石ケンを除去した。エタノールを真空下約９０℃で回転蒸発により除去すると、透明だが薄茶色のエチルエステルが得られた。
【０１６２】
このエチルエステル（２０ｇ）を４０ｇの尿素及び１００ｇのエタノール（９０％水溶液）と約６５℃で混合した。混合物は、透明な溶液に変わるまでこの温度に維持した。次に混合物を室温に冷却して約２０時間保ち、尿素結晶及びアダクトを形成させた。次に固形物をろ去し、液体画分を回転蒸発させてエタノールを除去した。回収されたエチルエステル画分を、１回目及び次に２回目の２００ｍＬの温水洗浄で洗浄した。溶液のｐＨを初めに３〜４に調整した後、水性画分をデカントで除去した。次にエチルエステル画分を乾燥させて残留水を除去した。
【０１６３】
エチルエステル画分中の脂肪酸エチルエステル［「ＦＡＥＥ」］濃度を決定するため、実施例１に先述したものと同じＧＣ条件及び計算を用いて、トルエン／ヘキサン（２：３）に希釈した直後にＦＡＥＥを分析し、ＦＡＭＥ濃度を決定した。方法上、以下の点のみ変更した：ｉ）内部標準としてＣ１５：０の代わりにＣ２３：０ＥＥを使用した；及び、ｉｉ）１．０４２〜１．０５２の分子量変換係数は不要であった。
【０１６４】
しかしながら、ＥＰＡエチルエステル［「ＥＰＡ−ＥＥ」］は、上記のものから少し変更した手順に供した。具体的には、既知の濃度及び純度の参照ＥＰＡ−ＥＥ標準を、分析試料において予想されるほぼ同量のＥＰＡ−ＥＥ、並びに同量のＣ２３：０ＥＥ内部標準を含むように調製した。試料中のＥＰＡ−ＥＥの正確な量（ｍｇ）は、以下の式に従い計算される：（ＥＰＡ−ＥＥピークの面積／Ｃ２３：０ＥＥピークの面積）×（較正標準におけるＣ２３：０ＥＥピークの面積／較正標準におけるＥＰＡ−ＥＥピークの面積）×（較正標準におけるＥＰＡ−ＥＥ  ｍｇ数）。全ての内部標準及び参照標準は、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃから入手した。
【０１６５】
このようにして、高濃度化された油画分、すなわちＥＰＡ濃縮物においてＦＡＥＥ濃度を決定した。具体的には、尿素アダクト形成による非濃縮精製油の高濃度化により、表４に示されるとおりの、油の重量パーセントとして計測して７７％のＥＰＡエチルエステルを有し、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られた。
【０１６６】
【表５】
2014511406.tif 000007
【０１６７】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して７７％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないこのＥＰＡ濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のＥＰＡ濃縮物を生じさせ得る（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る）ことを理解するであろう。従って、例えば、７７％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない、トリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができる。
【０１６８】
実施例３
液体クロマトグラフィーによる微生物油の高濃度化
この例は、実施例１の非濃縮精製油を液体クロマトグラフィー方法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大９５．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られ得ることを実証する。
【０１６９】
実施例１の非濃縮精製油を、実施例２に記載されるものと同様の方法を用いて、但しある小さい変更を伴い（すなわち、塩基性触媒として水酸化カリウムの代わりにナトリウムエトキシドを使用）、エチルエステルにエステル交換した。
【０１７０】
次にこのエチルエステルを、Ｅｑｕａｔｅｑ（Ｉｓｌｅ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ，スコットランド）により、その液体クロマトグラフ精製技術を用いて高濃度化した。様々な程度の高濃度化を達成した（例えば、以下の試料＃１及び試料＃２の例示的データを参照のこと）。従って、非濃縮精製油を液体クロマトグラフィーによって高濃度化すると、表５に示されるとおりの、油の重量パーセントとして計測して９５．４％のＥＰＡエチルエステルを有し、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られた。
【０１７１】
【表６】
2014511406.tif 000008
【０１７２】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して８２．８％のＥＰＡエチルエステル又は９５．４％のＥＰＡエチルエステルのいずれかを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないこのＥＰＡ濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のＥＰＡ濃縮物を生じさせ得る（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る）ことを理解するであろう。従って、例えば、８２．８％のＥＰＡエチルエステル又は９５．４％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない、トリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができる。
【０１７３】
実施例４
超臨界流体クロマトグラフィーによる微生物油の高濃度化
この例は、実施例１の非濃縮精製油を超臨界流体クロマトグラフ［「ＳＦＣ」］法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大８９．８％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られ得ることを実証する。
【０１７４】
実施例１の非濃縮精製油を、ナトリウムエトキシドを塩基性触媒として用いてエチルエステルにエステル交換し、次に吸着カラムによって処理することにより超臨界ＣＯ２に不溶性であった化合物を除去した。次に処理したエチルエステル油をＫ．Ｄ．Ｐｈａｒｍａ（Ｂｅｘｂａｃｈ，ドイツ）により、その超臨界クロマトグラフ技術を用いて精製した。様々な程度の高濃度化を達成した（例えば、以下の試料＃１及び試料＃２の例示的データを参照のこと）。従って、非濃縮精製油をＳＦＣにより高濃度化すると、表６に示されるとおりの、油の重量パーセントとして計測して８５％及び８９．８％のＥＰＡエチルエステルを有し、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られた。
【０１７５】
【表７】
2014511406.tif 000009
【０１７６】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して８５％のＥＰＡエチルエステル又は８９．８％のＥＰＡエチルエステルのいずれかを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないこのＥＰＡ濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のＥＰＡ濃縮物を生じさせ得る（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る）ことを理解するであろう。従って、例えば、８５％のＥＰＡエチルエステル又は８９．８％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない、トリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができる。
【０１７７】
実施例５
全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の５６．１％のＥＰＡを含む微生物油の調製
本実施例は、ＥＰＡの生成用に操作された、組換えヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油の単離について記載する。その後この微生物油は、以下の実施例６に記載するとおり、分留により高濃度化した。
【０１７８】
具体的には、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株を、約５８．７ＥＰＡ％ＴＦＡの生成が可能となるように組換え操作し、二段階フェドバッチ法を用いて培養した。次に乾燥させることによってバイオマスから微生物油を単離し、抽出し（押出し、ペレット化及び超臨界流体抽出の組み合わせによる）、短行程蒸留によって精製すると、５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含む濃縮されていないトリグリセリドリッチのＳＰＤ精製油が得られた。
【０１７９】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の遺伝子型
Ｙ９５０２株の生成は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来するＹ９５０２株は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により、全脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを生成する能力を有した（図２）。
【０１８０】
Ｙ９５０２株の最終的な遺伝子型は、野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対して、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、不明１−、不明２−、不明３−、不明４−、不明５−、不明６−、不明７−、不明８−、不明９−、不明１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０１８１】
実施例１で定義されていない略称は、以下のとおりである：ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼに由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］をΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前掲）に連結することにより作成されたＤＧＬＡシンターゼであり［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］；及び、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である［米国特許第７，８７９，５９１号明細書］。
【０１８２】
Ｙ９５０２株における全脂質含有量及び組成の詳細な分析のため、フラスコアッセイを行い、ここでは細胞を二段階で合計７日間成長させた。分析に基づけば、Ｙ９５０２株は３．８ｇ／Ｌの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を生じ、細胞の全脂質含有量は３７．１［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］であり、乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含有量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は２１．３であり、及び脂質プロファイルは以下のとおりであった（各脂肪酸の濃度はＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］とする）：１６：０（パルミテート）−２．５、１６：１（パルミトオレイン酸）−０．５、１８：０（ステアリン酸）−２．９、１８：１（オレイン酸）−５．０、１８：２（ＬＡ）−１２．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−３．５、ＤＧＬＡ−３．３、ＡＲＡ−０．８、ＥＴｒＡ−０．７、ＥＴＡ−２．４、ＥＰＡ−５７．０、その他−７．５。
【０１８３】
Ｙ９５０２株からのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の生成
Ｙ９５０２株からのＺ１９７８株の展開については、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願第１３／２１８５９１号明細書（代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＮＡ、２０１１年８月２６日に出願された）及び同第１３／２１８７０８号明細書（代理人整理番号ＣＬ５４１１ＵＳＮＡ、２０１１年８月２６日に出願された）に記載されている（本明細書の図２もまた参照のこと）。
【０１８４】
具体的には、Ｙ９５０２株のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図３Ａ；配列番号１；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｕｒａ３突然変異遺伝子をＹ９５０２株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の方法に従い形質転換を実施した。合計２７個の形質転換体（８個の形質転換体を含む第１の群、８個の形質転換体を含む第２の群、及び１１個の形質転換体を含む第３の群から選択された）を、５−フルオロオロチン酸［「ＦＯＡ」］プレート上で成長させた（ＦＯＡプレートは、リットルあたり以下を含む：２０ｇグルコース、６．７ｇ酵母窒素原基礎培地、７５ｍｇウラシル、７５ｍｇウリジン及び１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験（供給業者から受け取った各バッチ内で変動が起こるため）に基づく適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））。さらなる実験から、第３の群の形質転換体のみが実質的なＵｒａ−表現型を有することが決定された。
【０１８５】
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のため、細胞を遠心によって収集し、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載されるとおり脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を、脂質抽出物のナトリウムメトキシドによるエステル交換により調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．及びＮｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを取り付けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で１７０℃（２５分間維持）から１８５℃であった。
【０１８６】
直接の塩基性エステル交換のため、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、１回蒸留水で洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで５〜１０分間真空乾燥した。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）及び既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に添加し、次に試料をボルテックス処理し、５０℃で３０分間揺動させた。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌ及び４００μｌヘキサンを添加した後、試料をボルテックス処理及びスピンにかけた。上側の層を取り出し、ＧＣにより分析した（上記）。ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを同定して実施例１の方法に従い定量化し、脂質プロファイルも同様にした。
【０１８７】
或いは、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載される塩基触媒エステル交換法の変法を用いて、発酵又はフラスコ試料のいずれかからのブロス試料をルーチン分析した。具体的には、ブロス試料を室温の水で急速解凍し、次に０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心管フィルタ（カタログ番号８１６１）を備える風袋を量った（ｔａｒｒｅｄ）２ｍＬ微量遠心管に（０．１ｍｇとなるように）量り取った。予め決定されたＤＣＷに応じて試料（７５〜８００μｌ）を使用した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４３０遠心機を使用して、試料を１４，０００ｒｐｍで５〜７分間又はブロスの除去に必要な長さだけ遠心する。フィルタを取り出し、液体を抜き、及び約５００μｌの脱イオン水をフィルタに添加して試料を洗浄した。遠心により水を除去した後、フィルタを再び取り出し、液体を抜き、そのフィルタを再び挿入した。次に管を遠心機に再び挿入し、このときは上蓋を開放したまま約３〜５分乾燥させた。次にフィルタを管のほぼ２分の１のところまでで切断し、新しい２ｍＬ丸底エッペンドルフ試験管（カタログ番号２２  ３６  ３３５−２）に挿入した。
【０１８８】
切断したフィルタ容器の周縁部のみと接触し、試料又はフィルタ材料とは接触しない適切な道具で、フィルタを管の底まで押し込んだ。トルエン中の既知量のＣ１５：０ＴＡＧ（上記）を添加し、及び新しく作製したメタノール溶液中１％ナトリウムメトキシド５００μｌを添加した。試料ペレットを適切な道具で強く砕き、管を閉じて５０℃の熱ブロック（ＶＷＲカタログ番号１２６２１−０８８）に３０分間置いた。次に管を少なくとも５分間放冷した。次に、水溶液中の４００μｌのヘキサン及び５００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌを添加し、管を２回×６秒間ボルテックスし、１分間遠心した。約１５０μｌの上層（有機層）を、インサートを備えるＧＣバイアルに入れ、ＧＣによって分析した。
【０１８９】
ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、既知の脂肪酸と比較したときのその保持時間により同定し、そのＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部標準（Ｃ１５：０ＴＡＧ）と比較することにより定量化した。このように、任意の脂肪酸ＦＡＭＥ［「μｇ  ＦＡＭＥ」］の近似量（μｇ）は以下の式に従い計算され：（特定の脂肪酸のＦＡＭＥピークの面積／標準ＦＡＭＥピークの面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ数）、一方、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇ  ＦＡ」］は、以下の式に従い計算される：（特定の脂肪酸のＦＡＭＥピークの面積／標準ＦＡＭＥピークの面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ数）＊０．９５０３（Ｃ１５：０ＴＡＧの１μｇは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため）。０．９５０３の変換係数は、ほとんどの脂肪酸について決定される値（これは０．９５〜０．９６の範囲である）の近似値であることに留意されたい。
【０１９０】
ＴＦＡのｗｔ％としての個別の脂肪酸それぞれの量を要約する脂質プロファイルを、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の合計で除して１００を乗じることにより決定した。
【０１９１】
このようにして、ＧＣ分析から、群３のｐＺＫＵＭ形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０及び＃１１にそれぞれ、ＴＦＡの２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％及び２９．６％のＥＰＡがあったことが示された。これらの７株を、それぞれ、Ｙ９５０２Ｕ１２株、Ｙ９５０２Ｕ１４株、Ｙ９５０２Ｕ１７株、Ｙ９５０２Ｕ１８株、Ｙ９５０２Ｕ１９株、Ｙ９５０２Ｕ２１株及びＹ９５０２Ｕ２２株（まとめて、Ｙ９５０２Ｕ株）と命名した。
【０１９２】
次に、１つのΔ９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、及び１つのΔ９エロンガーゼ突然変異遺伝子を、Ｙ９５０２Ｕ株のヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２１）に組み込んで、コンストラクトｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ（図３Ｂ；配列番号２）を生成した。ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎプラスミドは以下の成分を含んだ：
【０１９３】
【表８】
2014511406.tif 000010
【０１９４】
ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ９５０２Ｕ１７株の形質転換に使用した。形質転換細胞を最少培地［「ＭＭ」］プレートに置き、３０℃で３〜４日間維持した（最少培地はリットルあたり以下を含む：２０ｇグルコース、１．７ｇアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地、１．０ｇプロリン、及びｐＨ６．１（調整不要））。単一コロニーをＭＭプレートに再びストリークし、次に３０℃で液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により収集し、高グルコース培地［「ＨＧＭ」］に懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した（高グルコース培地はリットルあたり以下を含む：８０グルコース、２．５８ｇ  ＫＨ２ＰＯ４及び５．３６ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整不要））。細胞を上記の脂肪酸分析に供した。
【０１９５】
ＧＣ分析から、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎを含む選択された９６個のＹ９５０２Ｕ１７株のほとんどが、ＴＦＡの５０〜５６％のＥＰＡを生じたことが示された。ＴＦＡの約５９．０％、５６．６％、５８．９％、５６．５％、及び５７．６％のＥＰＡを生じた５株（すなわち、＃３１、＃３２、＃３５、＃７０及び＃８０）を、それぞれＺ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０及びＺ１９８１と命名した。
【０１９６】
これらのｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ形質転換株の最終的な遺伝子型は、野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対して、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、不明１−、不明２−、不明３−、不明４−、不明５−、不明６−、不明７−、不明８−、不明９−、不明１０−、不明１１−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６であった。
【０１９７】
Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株及びＺ１９８１株におけるＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０６１２）のノックアウトは、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎによる形質転換で作製されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０１９８】
Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株及びＺ１９８１株のＹＰＤプレートからの細胞を成長させて、以下の方法に従い全脂質含有量及び組成について分析した。
【０１９９】
特定のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における全脂質含有量及び組成の詳細な分析のため、以下のとおりフラスコアッセイを実施した。具体的には、新しくストリークした細胞の１ループを３ｍＬ発酵培地［「ＦＭ」］の培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩成長させた（発酵培地はリットルあたり以下を含む：６．７０ｇ／Ｌ酵母窒素原基礎培地、６．００ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、２．００ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．５０ｇ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２０ｇグルコース及び５．００ｇ酵母エキス（ＢＢＬ））。ＯＤ６００ｎｍを計測し、細胞のアリコートを、最終ＯＤ６００ｎｍが０．３になるまで、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地に添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、培養物の６ｍＬを遠心により回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、１ｍＬのアリコートを使用して脂肪酸分析（上記）を行い、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を測定するため１０ｍＬを乾燥させた。
【０２００】
ＤＣＷの測定のため、１０ｍＬの培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心機のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータにおいて４０００ｒｐｍで５分間遠心することにより回収した。ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁し、再び上記のとおり回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水に再懸濁し、予め秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を真空オーブンにおいて８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
【０２０１】
細胞の全脂質含有量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］が計算され、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含有量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を集計するデータと併せて考慮される。
【０２０２】
従って、以下の表８は、フラスコアッセイにより決定するときの、Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株及びＺ１９８１株の全脂質含有量及び組成を要約する。具体的には、この表は、細胞の総乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含有量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含有量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を要約する。
【０２０３】
【表９】
2014511406.tif 000011
【０２０４】
続いてＺ１９７８株を部分的ゲノムシーケンス（米国特許出願第１３／２１８５９１号明細書）に供した。この研究により、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに４個の
（６個でない）Δ５デサチュラーゼ遺伝子が組み込まれたことが決定された（すなわち、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、及びＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ）。
【０２０５】
発酵並びに乾燥させた未処理Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株バイオマスの押出し及びペレット化による破壊
実施例１に記載されるとおり、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株培養物を発酵させ、微生物バイオマスを回収して乾燥させた。次に乾燥した未処理バイオマスを二軸スクリュー押出機に供給した。具体的には、バイオマスと１５％の珪藻土（Ｃｅｌａｔｏｍ  ＭＮ−４又はＣｅｌｉｔｅ  ２０９、ＥＰ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＬＬＣ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）との混合物を予備混合し、次にＺＳＫ−４０ｍｍ  ＭＣ二軸スクリュー押出機（Ｃｏｐｅｒｉｏｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  ＆  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ドイツ）に４５．５ｋｇ／時の速度で供給した。２６．５％スクロースで作製した水／スクロース溶液を、押出機の破壊ゾーンの後に１４７ｍＬ／分の流量で注入した。押出機は２０〜２３％トルク範囲で２８０ｒｐｍで動作させた。得られた破壊酵母粉末を最終水冷却バレルで３５℃に冷却した。次に、多孔ドームダイ１ｍｍ径×１ｍｍ厚スクリーンと共に組み立て、且つ８２ＲＰＭに設定したＬＣＩドーム型造粒機  モデル番号ＴＤＧ−８０（ＬＣＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）に、押し出された湿潤粉末を供給した。４５５〜６００ｋｇ／時（乾燥時速度）で押出物を形成した。試料を、１００℃に維持される１１５０標準立方フィート毎分［「ｓｃｆｍ」］の空気流量の０．５０ｍ２の乾燥ゾーンと、１８℃で推定５００〜６００ｓｃｆｍの空気流量で動作する０．２４ｍ２の冷却ゾーンとを備える振動流動層乾燥機（ＦＢＰ−７５、Ｃａｒｍａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＩＮ）で乾燥させた。約１ｍｍ径×６〜１０ｍｍ長さの乾燥したペレットは、２５〜３０℃の範囲で乾燥機を出て、Ｏ’Ｈａｕｓ含水量分析器（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）で測定した最終的な水分含有量は５〜６％であった。
【０２０６】
押し出された酵母バイオマスの油抽出
押し出された酵母ペレットを、超臨界流体相二酸化炭素（ＣＯ２）を抽出溶媒として使用して抽出し、非濃縮抽出油を生じさせた。具体的には、酵母ペレットを３２０Ｌステンレス鋼抽出槽に装入し、ポリエステル発泡体ろ過マット材（Ａｅｒｏ−Ｆｌｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ＩＮ）のプラグ間に充填した。槽を密閉し、次に熱交換器（予熱器）を通して市販の圧縮機（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）でＣＯ２を計り、縦型抽出槽に供給して、破壊された酵母のペレットから非濃縮抽出油を抽出した。抽出温度は予熱器によって制御し、抽出圧力は、抽出槽と分離槽との間に位置する自動制御弁（Ｋａｍｍｅｒ）により維持した。ＣＯ２及び油抽出物をこの制御弁を介してより低圧に膨張させた。膨張した溶液から、分離器内の沈殿物として油抽出物を収集した。分離器における膨張したＣＯ２相の温度は、分離器の上流に位置するさらなる熱交換器の使用により制御した。このより低圧のＣＯ２流は分離槽の上から出て、フィルタ、凝縮器、及び質量流量計を通って圧縮機に戻り、再利用される。油抽出物は分離器から定期的に排出し、生成物として収集した。
【０２０７】
抽出槽には、初めに約１５０ｋｇの押し出された酵母ペレットを装入した。次にペレットから超臨界流体ＣＯ２により、５０００ｐｓｉｇ（３４５バール）、５５℃、及び出発酵母ペレット１ｋｇあたり４０〜５０ｋｇのＣＯ２の範囲の溶媒対供給量比で、非濃縮抽出油が抽出された。分離槽から約３７．５ｋｇの非濃縮抽出油が収集され、そこに各約１０００ｐｐｍの２つの抗酸化剤、すなわちＣｏｖｉ−ｏｘ  Ｔ７０（Ｃｏｇｎｉｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，カナダ）及びＤａｄｅｘ  ＲＭ（Ｎｅａｌａｎｄｅｒｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，カナダ）を添加した。
【０２０８】
ＳＰＤ条件下での蒸留
非濃縮抽出油を脱ガスし、次に１２ｋｇ／時の供給量を用いて６インチ分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）に通して残留水を除去した。蒸発器及び凝縮器の表面温度は、それぞれ１４０℃及び１５℃に設定した。真空は１５トルに維持した。
【０２０９】
脱水した抽出油を１２ｋｇ／時の供給量で２回目の分子蒸留器に通し、留出物中の望ましくない低分子量化合物、例えばエルゴステロール及び遊離脂肪酸を除去した。真空を１ｍトルに下げ、蒸発器の表面温度は２４０℃〜２７０℃に維持した。トリアシルグリセロール含有画分（すなわちＳＰＤ精製油）が得られ、そのステロールは、非濃縮抽出油中のステロール含有量と比べて減少していた。この非濃縮ＳＰＤ精製油を、４０℃未満に冷却してから包装した。
【０２１０】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株由来のＳＰＤ精製油の特徴付け
エステル交換後、実施例１の方法に従いＺ１９７８株由来の非濃縮ＳＰＤ精製油の脂肪酸組成を分析した。ＳＰＤ精製油は、以下の表９に示すとおり、５６．１ＥＰＡ％ＴＦＡを含み、ＤＨＡは検出不能であった（すなわち＜０．０５％）。
【０２１１】
【表１０】
2014511406.tif 000012
【０２１２】
実施例６
微生物油の分留による高濃度化
この例は、実施例５の非濃縮ＳＰＤ精製油を分留法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大７４％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られ得ることを実証する。
【０２１３】
実施例５の非濃縮微生物油２５ｋｇを５０Ｌガラスフラスコに添加した。次に７．９ｋｇの無水エタノール及び５８０ｇのナトリウムエトキシド（エタノール中２１％）をフラスコに添加した。この混合物を約８５℃で最低３０分間加熱還流した。薄層クロマトグラフィー法により反応を監視し、ここでは油の希釈試料をシリカプレートにスポッティングし、酢酸／ヘキサン／エチルエーテル溶媒混合物を使用して分離した。未反応ＴＡＧからなるスポットをヨウ素染色で検出した。検出可能なスポットが全くない、又は僅かしかないことが、反応の完了を表すと見なした。反応のエンドポイントに達した後、混合物を５０℃未満に冷却し、相分離させた。グリセロールを含有する下層を分離し、廃棄した。上側の有機層を２．５Ｌの５％クエン酸で洗浄し、次に回収した有機層を５Ｌの１５％硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。水相を再び廃棄し、エチルエステル相をエタノールと共に回転蒸発器において約６０℃で蒸留して、残留水を除去した。エチルエステル形態の約２５ｋｇの油を回収した。
【０２１４】
次にエチルエステルを４インチハイブリッドワイプトフィルム及び分画システム（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）に５ｋｇ／時の供給量で供給し、ＥＰＡエチルエステルを高濃度化した。蒸発器温度は０．４７トルの真空下、約２７５℃に設定した。充填カラムの加熱温度は約１４６℃であった。低分子量エチルエステル、主にＣ１８を、塔頂部からの軽量画分として除去した。抽出されたＥＰＡエチルエステルを重量画分として回収し、主に色及び重合物を取り除くため２回目の蒸留にかけた。２回目の蒸留は、６インチ分子蒸留器（ＰＯＰＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ）において２０ｋｇ／時の供給量で実施した。蒸発器は約２０５℃で動作させ、内部凝縮器温度は約１０℃、且つ真空は０．０１トルに設定した。約７〜１０ｗｔ％のエチルエステルが除去され、透明な淡色のＥＰＡ濃縮物が得られた。最終的なＥＰＡ濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して７４％ＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まなかった。
【０２１５】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して７４％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないこのＥＰＡ濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のＥＰＡ濃縮物を生じさせ得る（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る）ことを理解するであろう。従って、例えば、７４％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない、トリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができる。
【０２１６】
実施例７
ＥＰＡ濃縮物は環境汚染物質を実質的に含まない
この例は、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物、及びＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡを実質的に含まない微生物油のいずれも、環境汚染物質を実質的に含まないことを実証する。
【０２１７】
実施例１に記載されるとおり、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８６７２株由来の同等の非濃縮精製油試料を調製した。非濃縮抽出油中のポリ塩化ビフェニル［「ＰＣＢ」］（ＣＡＳ番号１３３６−３６−３）、ポリ塩化ジベンゾジオキシン［「ＰＣＤＤ」］及びポリ塩化ジベンゾフラン［「ＰＣＤＦ」］の、ｍｇ／ｇ数の世界保健機関国際毒性当量（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）［「ＷＨＯ  ＴＥＱ」］として測定した濃度を、ＥＰＡ法  １６６８  Ｒｅｖ  Ａに従い決定した。極めて低い又は検出不能レベルの環境汚染物質が検出された。
【０２１８】
上記の結果に基づけば、本明細書では、実施例１の非濃縮抽出油及び実施例５の非濃縮ＳＰＤ精製油のＰＣＢ、ＰＣＤＤ、及びＰＣＤＦの濃度もまた、極めて低い又は検出不能レベルの環境汚染物質を含むものと思われる。同様に、本明細書では、実施例２、３、４及び６の、それぞれ尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、ＳＦＣ及び分留によって高濃度化されたＥＰＡエチルエステル濃縮物もまた、それら自体が環境汚染物質を実質的に含まない非濃縮油から生成されたものであるため、極めて低い又は検出不能レベルの環境汚染物質を含むはずであると仮定される。
【０２１９】
より具体的には、表１０は、実施例２、３、４及び６のＥＰＡ濃縮物中のＰＣＢ、ＰＣＤＤ、及びＰＣＤＦの予想ＴＥＱレベルを記載する。比較のため、米国特許第７，７３２，４８８号明細書に記載される汚染物質がストリッピングされた魚油中の同じ化合物の濃度もまた掲載する。米国特許第７，７３２，４８８号明細書は、これらの環境（ｅｎｖｉｏｒｍｅｎｔａｌ）汚染物質を許容レベルに低減する特別な処理方法を提供していることが注記される。
【０２２０】
【表１１】
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【０２２１】
上記に示すとおり、実施例２、３、４及び６のＥＰＡエチルエステル濃縮物は、米国特許第７，７３２，４８８号明細書の汚染物質がストリッピングされた魚油と比べて、ＰＣＢ、ＰＣＤＤ及びＰＣＤＦのレベルが低い。実際に、ＰＣＤＦの汚染物質レベルは、用いられる分析方法の検出限界未満になることが予想される。
【０２２２】
実施例８
微生物油の分留及び液体クロマトグラフィーによる高濃度化
この例は、非濃縮精製油を分留法と液体クロマトグラフィー法との組み合わせを用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大９７．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まないＥＰＡ濃縮物が得られ得ることを実証する。
【０２２３】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株から非濃縮精製油を得た（上記実施例５；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書もまた参照のこと）。具体的には、実施例５に記載されるとおり、この株を培養し、回収し、押出し及びペレット化により破壊し、超臨界流体相ＣＯ２を用いて抽出した。次に非濃縮抽出油をＳＰＤ条件下で精製した（実施例５）。
【０２２４】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株由来のＳＰＤ精製油の特徴付け
Ｙ９５０２株由来の非濃縮ＳＰＤ精製油の脂肪酸組成を、実施例１の方法に従い分析した。ＳＰＤ精製油は、以下の表１１に示すとおり、５４．７ＥＰＡ％ＴＦＡを含み、且つＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡは検出不能であった（すなわち、＜０．０５％）。
【０２２５】
【表１２】
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【０２２６】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株由来のＳＰＤ精製油の高濃度化
ＳＰＤ精製油を、実施例３に記載されるのと同様の方法を用いてエチルエステルにエステル交換し、さらに実施例５に記載されるとおり分留に供した。分留したＥＰＡ濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して７１．９％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まなかった（以下の表１２の「分留後」と題される欄を参照のこと）。
【０２２７】
次に分留したエチルエステルを、Ｅｑｕａｔｅｑ（Ｉｓｌｅ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ，スコットランド）により、その液体クロマトグラフ精製技術を用いて高濃度化した。分留したＥＰＡ濃縮物の液体クロマトグラフィー（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ）による高濃度化から、油の重量パーセントとして計測して最大９７．４％のＥＰＡエチルエステルを有し、且つＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まない最終ＥＰＡ濃縮物が得られた（以下の表１２の「液体クロマトグラフィー高濃度化後」と題される欄を参照のこと）。
【０２２８】
【表１３】
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【０２２９】
当業者は、油の重量パーセントとして計測して９７．４％のＥＰＡエチルエステルを含み、且つＤＨＡ、ＮＰＤＡ及びＨＰＡを実質的に含まないこのＥＰＡ濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のＥＰＡ濃縮物を生じさせ得る（すなわち、ＥＰＡエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る）ことを理解するであろう。従って、例えば、９７．４％のＥＰＡエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のｗｔ％として計測して少なくとも７０ｗｔ％のＥＰＡを含み、且つＤＨＡ、ＮＰＤＡ及びＨＰＡを実質的に含まない、トリグリセリド形態のＥＰＡ濃縮物を得ることができる。
【０２３０】
加えて、ＥＰＡの生成用に操作された組換えヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の任意の微生物バイオマスから、本明細書の発明の方法により調製されるＥＰＡ濃縮物は、ＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まないものと予想されることが注記される。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株から得られた微生物油に基づく上記で得られた結果は（ここでは最終ＥＰＡ濃縮物が、ＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡを実質的に含まない）、実施例１及び実施例５から得られた微生物油から調製されるＥＰＡ濃縮物から予想し得る。乾燥細胞重量の２５％超を油として蓄積するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から得られた、ＴＦＡのｗｔ％として計測して３０〜７０ｗｔ％のＥＰＡを含む初期微生物油中にＤＨＡ、ＮＤＰＡ及びＨＰＡ不純物が存在しないため、そこから生成されるＥＰＡ濃縮物中にもまた、脂肪酸不純物は存在しないであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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