(57)【要約】  本発明は、ミセルアセンブリ、ミセルアセンブリを有する組成物ならびにミセルアセンブリおよびその組成物を調製する方法を包含する。本発明はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などのポリマーにコンジュゲートしたプロラミンタンパク質を包含し、コンジュゲートは、ミセルアセンブリを調製するのに用いることができる。本発明はさらに、本発明のコンジュゲートを用いて分子を封入する方法を包含する。ミセルアセンブリは、癌の治療、腫瘍のターゲティング、インビボでの薬物の毒性の低減、インビボでの封入薬剤の有効性の増大、封入薬剤の劣化からの保護および薬物または他の薬剤の水溶解度の向上などの様々な応用分野に用いることができる。
2014518842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの親水性部分に共有結合によりコンジュゲートした少なくとも１つの疎水性部分を含む両親媒性コポリマーを含む安定ミセルであって、前記少なくとも１つの疎水性部分は、ゼイン、グリアジン、ホルデイン、カフィリンおよびそれらの組合せからなる群から選択されるプロラミンタンパク質であり、水中の前記コポリマーの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、約０．０１５ｇ／Ｌから約０．０３５ｇ／Ｌまでの間にあり、前記安定ミセルは、生分解性親水性シェル−疎水性コア構造を有する、安定ミセル。
【請求項２】
前記両親媒性コポリマーを含むフィルムの水和により形成され、または前記両親媒性コポリマーを含む透析物から形成され、前記両親媒性コポリマーがブロックコポリマーまたはグラフトコポリマーである、請求項１に記載の安定ミセル。
【請求項３】
前記少なくとも１つの疎水性部分がゼインタンパク質であり、前記少なくとも１つの親水性部分がＰＥＧであり、前記ゼインタンパク質の表面アミノ基の少なくとも約５０％がペグ化されている、請求項１に記載の安定ミセル。
【請求項４】
前記ＰＥＧが少なくとも３，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３に記載の安定ミセル。
【請求項５】
ＰＥＧの分子量が約２０００Ｄａより大きい場合、前記安定ミセルの多分散性指数（ＰＤＩ）が約０．５未満である、請求項４に記載の安定ミセル。
【請求項６】
ＰＥＧの分子量が約１ｋＤａから２２０ｋＤａまでの間にある、請求項３に記載の安定ミセル。
【請求項７】
前記ミセルの粒子サイズが約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである、請求項３に記載の安定ミセル。
【請求項８】
１つまたは複数のカーゴ分子をさらに含み、前記１つまたは複数のカーゴ分子が、前記疎水性コア内に封入されている、共有結合もしくは非共有結合により前記疎水性部分と複合体を形成している、共有結合もしくは非共有結合により前記親水性部分と複合体を形成している、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の安定ミセル。
【請求項９】
前記１つまたは複数のカーゴ分子が薬物、タンパク質、核酸、ホルモン、受容体、診断薬、造影剤およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の安定ミセル。
【請求項１０】
前記薬物が約１〜７のＬｏｇＰを有する疎水性薬物である、請求項９に記載の安定ミセル。
【請求項１１】
前記薬物が抗酸化剤、抗炎症薬または抗癌薬であり、前記安定ミセルにより送達される前記薬物が前記安定ミセルの非存在下で送達される薬物と比較して低い毒性および高い有効性を示す、請求項９に記載の安定ミセル。
【請求項１２】
前記薬物がクルクミンまたはドキソルビシンである、請求項１１に記載の安定ミセル。
【請求項１３】
前記造影剤がナイルレッドである、請求項９に記載の安定ミセル。
【請求項１４】
前記薬物がレチノイドである、請求項９に記載の安定ミセル。
【請求項１５】
前記レチノイドがレチノール、１３−シスレチノイン酸、１３−トランスレチノイン酸、レチンアルデヒド、トレチノイン、イソトレチノイン、エトレトネート、アシトレチン、パルミチン酸レチニル、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトザンチン、ルテイン、ゼアキサンチンおよびそれらの組合せからなる群から選択され、前記疎水性コア中の前記レチノイドの光安定性ならびに加水分解安定性が遊離レチノイドと比較して向上している、請求項１４に記載の安定ミセル。
【請求項１６】
ブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）、カゼインまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項１４に記載の安定ミセル。
【請求項１７】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の安定ミセルおよび薬学的にまたは化粧品として許容される希釈剤、賦形剤または担体を含み、非免疫原性である医薬または化粧品組成物。
【請求項１８】
分散体、錠剤、カプセル剤、注射製剤、エアゾール製剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤またはシャンプー剤の形態である、請求項１７に記載の医薬または化粧品組成物。
【請求項１９】
安定ミセルを調製する方法であって、
プロラミンタンパク質およびモノアルキル化ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を水性アルコール溶媒に溶解して、第１の混合物を形成するステップと、
前記第１の混合物を加熱して、共有結合によりコンジュゲートしたペグ化プロラミンを形成し、場合によって、水性アルコール懸濁液中の前記ＰＥＧの過剰な反応性基を失活させるステップと、
緩衝液を前記第１の混合物に加えて、前記水性アルコール溶媒から前記ペグ化プロラミンを析出させ、前記ペグ化プロラミンを水溶液に対して透析するステップと、
得られた透析物を凍結乾燥するステップと、
凍結乾燥ペグ化プロラミンを水性アルコール溶媒に溶解して、第２の混合物を形成するステップと、
（ａ）前記第２の混合物を水性緩衝液に対して透析して、安定ミセルを形成するステップ、
または
（ｂ）前記第２の混合物を蒸発して、乾燥フィルムを形成し、前記フィルムを水性緩衝液で水和し、水和フィルムを音波処理して、安定ミセルを形成するステップ
のいずれかのステップとを含み、
水中の前記ペグ化プロラミンの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が約０．０１５ｇ／Ｌから約０．０３５ｇ／Ｌまでの間にある、方法。
【請求項２０】
前記安定ミセルを凍結乾燥して、乾燥粉末を形成するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
溶媒系に溶解した１つまたは複数のカーゴ分子を前記第１の混合物に加えて、１つまたは複数のカーゴ分子を負荷した複数の安定ミセルの形成をもたらすステップをさらに含み、前記１つまたは複数のカーゴ分子が、前記疎水性コア内に封入されている、共有結合もしくは非共有結合により前記疎水性部分と複合体を形成している、共有結合もしくは非共有結合により前記親水性部分と複合体を形成している、またはそれらの組合せであり、前記複数の安定ミセルがその中に含まれた１つまたは複数のカーゴ分子の特性を向上させ、その特性が、前記複数の安定ミセルの非存在下での前記１つまたは複数のカーゴ分子の特性と比較して、１つまたは複数のカーゴ分子の水溶解度を向上させること、１つまたは複数のカーゴ分子の化学的安定性を向上させること、１つまたは複数のカーゴ分子の薬効を向上させること、１つまたは複数のカーゴ分子の貯蔵寿命を向上させること、１つまたは複数のカーゴ分子の腫瘍蓄積を向上させること、１つまたは複数のカーゴ分子の皮膚浸透を向上させることおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記安定ミセルの封入効率が約６０％〜約９５％である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロラミンタンパク質がゼイン、グリアジン、ホルデイン、カフィリンまたはそれらの組合せからなる群から選択され、前記ＰＥＧが少なくとも３，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロラミンタンパク質がゼインである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
それを必要とする対象におけるＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）依存性多剤耐性（ＭＤＲ）型癌を治療する方法であって、前記対象における癌細胞を請求項１に記載の安定ミセルと接触させるステップを含む方法。
【請求項２６】
前記安定ミセルが、前記疎水性コア内に治療薬をさらに含み、前記安定ミセルが、前記安定ミセルの非存在下での前記薬物の取込みと比較して前記ＭＤＲ癌細胞への前記治療薬の取込みを増大させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数のカーゴ分子を持続的に放出させる方法であって、請求項８に記載の安定ミセルを生物学的媒体と接触させるステップを含み、前記カーゴ分子が安定ミセルから約１時間から約１４日間までの期間にわたり放出される、方法。
【請求項２８】
それを必要とする対象におけるＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）依存性多剤耐性（ＭＤＲ）型癌の治療用の薬剤を製造するための請求項１に記載の安定ミセルの使用。
【請求項２９】
それを必要とする対象における癌の治療用の薬剤を製造するための請求項１２に記載の安定ミセルの使用。
【請求項３０】
それを必要とする対象における皮膚障害の治療用の局所用薬剤を製造するための請求項１４に記載の安定ミセルの使用。
【請求項３１】
前記安定ミセルがブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）、カゼインまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記薬剤が皮膚に保持され、前記安定ミセルの非存在下での薬剤と比較して効果的に皮膚に浸透する、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記障害がざ瘡、脱毛、脂漏性湿疹、毛包炎、皮膚悪性腫瘍、乾癬、角化障害、皮膚変色、創傷および光老化からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記レチノイドによって誘発される皮膚刺激が前記安定ミセルの非存在下での薬剤の送達と比べて低減する、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
それを必要とする対象における治療薬の標的毛包送達用の薬剤を製造するための請求項１に記載の安定ミセルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に薬物送達技術に関し、より具体的にはナノミセル薬物送達システムに関し、疎水性水不溶性タンパク質および水溶性ポリマーを用いてそのようなシステムを調製する方法を含み、該ミセルは、ナノミセル薬物送達システムを調製するための両親媒性コンジュゲートを形成するための、プロラミンなどの疎水性水不溶性タンパク質に共有結合させることができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の親水性部分を含み得る。
【背景技術】
【０００２】
医薬化合物の約４０％が低い水溶解度を有し、これが、新薬が臨床試験を成功裏に終了することに対する主な制限因子となっている（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ（２００２），Ａｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖ  ５：８２−８５）。患者への送達を改善するために疎水性薬物を可溶化する多くのアプローチが用いられている。そのようなアプローチのいくつかの例は、粉砕、シクロデキストリンとの複合体形成、塩の形成および界面活性剤またはポリマーミセルの使用などである。これらのアプローチのそれぞれに特定の利点と欠点があり、したがって、薬物を可溶化する改善されたアプローチが切に求められている。
【０００３】
ポリマーミセルは、自己組織化両親媒性ブロックまたはグラフトコポリマーである。ポリマーミセルは、有望なコロイド薬物送達システムとして注目された（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００１，７３，１３７、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  １９９９，１６，３、およびＯｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，６，３）。これらのコロイド系において、疎水性ブロックは、一般的にコアを形成しており、親油性カーゴ分子の「マイクロコンテナ」を本質的に形成している（Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００１，４７，１１３）。ミセルの親水性の部分は、外側シェルを形成し、コアと外部水性環境との間の界面を安定化している。
【０００４】
界面活性剤ベースのミセルシステムと比較して、ポリマーベースのミセルは、より低い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）および低毒性などの明らかな利点を示し得る。これらの利点があるにもかかわらず、製剤の不適切な生分解性、生体適合性、封入効率、安定性、臨床的副作用ならびに公知のミセル製剤の調製に関連する困難および費用のため、公知のミセルシステムの使用は、多少限定的である。したがって、ミセル薬物送達システムに付随するいくつかの公知の利点を有するが、高い生体適合性を有し、調製するのにより容易で、さほど費用のかからないさらなるミセルシステムの必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、水不溶性化合物の送達のための新規なナノミセルプラットフォーム技術を提供する。また、疎水性水不溶性タンパク質および水溶性ポリマーを用いてミセルを調製する方法ならびに例えば、インビボでの薬物の送達のためにミセル組成物を使用する方法を提供する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の親水性部分をゼインなどの疎水性水不溶性タンパク質に共有結合させて、ナノミセル薬物送達システムを調製するための極めて有用な両親媒性コンジュゲートを形成することができる。
【０００６】
したがって、本発明は、生体適合性かつ生分解性コポリマーを含むミセルを提供し、該コポリマーは、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含み、該疎水性ブロックは、該親水性ブロックに共有結合によりコンジュゲートした疎水性プロラミンタンパク質を含み、該親水性ブロックは、少なくとも約３ｋＤａの分子量を有する親水性ポリエチレングリコール部分を含み、両親媒性コポリマーのプロラミンタンパク質鎖は、ミセルの内側に配向し、両親媒性コポリマーのポリエチレングリコール部分は、ミセルの外側に配向し、ミセルの直径は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである。
【０００７】
生体適合性かつ生分解性コポリマーは、グラフトコポリマーおよび／またはブロックコポリマーを含み得る。水中ミセルの臨界ミセル濃度は、例えば、２７℃で約０．０１５ｇ／Ｌ〜約０．０３５ｇ／Ｌ、約０．０２ｇ／Ｌ〜約０．０３ｇ／Ｌまたは約０．２５ｇ／Ｌであり得る。疎水性薬物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約１〜約７、または１〜７の整数の範囲のＬｏｇＰを有し得る。
【０００８】
疎水性プロラミンタンパク質は、ゼイン、グリアジン、ホルデイン、カフィリンまたはそれらの組合せであり得る。親水性ポリエチレングリコール部分は、約４ｋＤａ〜約２２０ｋＤａの分子量を有し得る。親水性ポリエチレングリコール部分は、約４ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子量を有し得る。
【０００９】
ミセルは、ミセルのコアに複数のカーゴ分子をさらに含み得る。カーゴ分子は、例えば、１つまたは複数の薬物、タンパク質、核酸、ホルモン、受容体、診断用薬、造影剤またはそれらの組合せなどであり得る。薬物は、抗酸化剤、抗炎症薬または抗癌薬であり得る。１つの実施形態において、薬物は、クルクミンまたはドキソルビシンである。別の実施形態において、造影剤は、ナイルレッドである。
【００１０】
別の実施形態において、薬物は、レチノイドである。適切なレチノイドの例としては、レチノール、１３−トランス−レチノイン酸（トレチノイン）、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン）、９−シス−レチノイン酸（アリトレチノイン）、レチンアルデヒド、エトレトネート、アシトレチン、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトザンチン、ルテイン、ゼアキサンチンまたはそれらの組合せなどがある。
【００１１】
本発明はまた、本明細書で述べる複数のミセルおよび薬学的にまたは化粧品として許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体を含む医薬または化粧品組成物を提供する。医薬または化粧品組成物は、例えば、分散体、錠剤、カプセル剤、注射用製剤、エアゾール製剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤またはシャンプー剤の形であり得る。
【００１２】
本発明はさらに、ミセルを調製する方法を提供する。該方法は、緩衝液を水性懸濁液に加えて、水性アルコール溶媒からペグ化プロラミンを析出させて、ペグ化プロラミンの水性分散体を形成するステップと、脱イオン水に対する透析により、アルコールならびに分散体中の未反応ＰＥＧおよびグリシンを除去するステップとを含み得る。
【００１３】
本発明はさらに、ペグ化プロラミンの水性懸濁液からアルコールを除去して、ペグ化プロラミンの乾燥フィルムを形成するステップと、ＰＥＧ−ゼインフィルムを水または緩衝液に再懸濁した後、例えば、非封入疎水性分子を除去するために脱イオン水に対して透析して、分散体のような、例えば、水および緩衝剤組成物中複数のミセルを得るステップとを含む、ミセルを調製する方法を提供する。この方法において、ゼインのペグ化の後、エタノールを例えば、ロータリーエバポレータ中での蒸発によって除去して、乾燥フィルムを形成することができる。次いで、乾燥フィルムを水で復元し、例えば、非封入疎水性化合物を除去するために脱イオン水に対して透析して、水相中ミセル形成することができる。
【００１４】
したがって、本発明はまた、ポリエチレングリコール化合物およびプロラミンタンパク質を水性アルコール溶媒に溶解して、第１の混合物を形成するステップと、ここでポリエチレングリコール化合物の１つの末端がモノアルキル化されており、第２の末端が反応性基を含み、ポリエチレングリコール化合物が少なくとも約３ｋＤａの分子量を有しており、第１の混合物を加熱して、水性懸濁液中でペグ化プロラミンを形成するステップと、場合によって、水性懸濁液中のポリエチレングリコール化合物の過剰な反応性基を失活させるステップと、脱イオン水に対する透析によってアルコールおよび分散体中の未反応ＰＥＧならびにグリシンを除去した後に凍結乾燥するステップとによって本明細書で述べるミセルを調製する方法を提供する。
【００１５】
方法の残りは、２つの経路の１つをたどり得る。１つの実施形態において、方法は、（ａ）ＰＥＧ−ゼインを水性アルコール溶媒に加えるステップと、脱イオン水に対する透析によってアルコールを除去して、緩衝剤および水組成物中複数のミセルを形成するステップとを含む。別の実施形態において、方法は、（ｂ）水性懸濁液のアルコールを除去して、ペグ化プロラミンの乾燥フィルムを形成するステップと、乾燥フィルムのペグ化プロラミンを水または緩衝液に再懸濁した後、例えば、非封入疎水性化合物を除去するために透析して、水相中ミセルを形成するステップとを含む。
【００１６】
したがって、調製されたならば、ペグ化プロラミンは、水性アルコール溶液に特定の濃度で溶解することができる。フィルム調製法に従う場合、アルコールを除去して、ＰＥＧ−ゼインフィルムを形成する。次いで、フィルムを脱イオン水で復元して、ＰＥＧ−ゼインミセルを形成する。次いで、この組成物を水に対して透析して、非封入化合物を除去することができる。水性分散体の形成後に、凍結乾燥により、ＰＥＧ−ゼインミセル粉末を得ることができる。
【００１７】
透析調製法に従う場合、脱イオン水に対して透析することによってアルコールを除去して、ミセルを形成する。次いで、水性分散体を凍結乾燥して、ＰＥＧ−ゼインミセル粉末を得ることができる。したがって、方法は、分散体のような組成物中複数のミセルを凍結乾燥して、粉末の形態の複数の単離ミセルを得るステップを含み得る。
【００１８】
調製法のいずれかにおいて、有用なカーゴ分子、例えば、治療薬または造影剤を溶媒系に溶解することができ、第１の混合物に加えて、薬物負荷ミセルのようなカーゴ負荷ミセルの形成をもたらすことができる。ミセルの封入効率は、約６０％〜約９５％であり得る。方法は、複数のミセルを緩衝液中に分散させて、薬物負荷ミセルの治療用組成物を得るステップを含み得る。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、細胞を本明細書で述べる複数のミセルと接触させ、それにより、細胞中の細胞Ｐ−ｐｇ排出ポンプを阻害するステップを含む細胞中の細胞Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｐｇ）排出ポンプを阻害する方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、細胞を本明細書で述べる複数のミセルと接触させ、それにより、薬剤耐性癌細胞における治療薬の取込みを増大させるステップを含む薬剤耐性癌細胞における治療薬の取込みを増大させる方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、親油性化合物を本明細書で述べるミセルに封入し、それにより、親油性化合物の水溶解度を増大させるステップを含む親油性化合物の水溶解度を増大させる方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、化合物を本明細書で述べるミセルに封入し、それにより、化合物の化学的安定性を増大させるステップを含む化合物の化学的安定性を増大させる方法を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、化合物を本明細書で述べるミセルに封入するステップと、生物学的媒体を封入化合物と接触させるステップとを含み、化合物が約１時間から約１４日間までの期間にわたってミセルから放出される、組成物からの化合物の持続放出をもたらす方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、対象または試料を本明細書で述べるミセルまたは組成物と接触させ、それにより、非免疫原性および生体適合性製剤を対象または試料に供給するステップを含む、化合物を非免疫原性および生体適合性製剤の状態で対象または試料に供給する方法を提供する。１つの態様において、そのような製剤は、封入化合物の全身循環を改善し得る。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、活性薬剤または造影剤を本明細書で述べるミセルに封入するステップと、皮膚をミセルを含む組成物と接触させ、それにより、活性薬剤または造影剤の皮膚浸透を、ミセルの非存在下での活性薬剤または造影剤の皮膚浸透と比較して増加させるステップとを含む、活性薬剤または造影剤の皮膚浸透および保持を増加させる方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、薬剤を本明細書で述べるミセルに封入するステップと、腫瘍を有する対象に複数のミセルを投与するステップとを含み、封入薬物が、ミセルの非存在下で対象に投与される薬物より大きい程度に腫瘍に蓄積する、薬剤の腫瘍蓄積を増大させる方法を提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、薬物を本明細書で述べるミセルに封入するステップと、腫瘍を有する対象に複数のミセルを投与するステップとを含み、封入薬物が、ミセルの非存在下で対象に投与される薬物より小さい程度に腫瘍を含まない組織に蓄積する、哺乳動物における腫瘍を含まない組織における薬物の蓄積を低くする方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、本明細書で述べる複数の負荷ミセルを対象に投与するステップを含み、薬物の有効性が、ミセルの非存在下での薬物の投与と比較して増大する、薬物の有効性を増大させる方法を提供する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書で述べる複数の負荷ミセルを対象に投与するステップを含み、薬物の毒性が、ミセルの非存在下での薬物の投与と比較して低下する、薬物の毒性を低くする方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、以下の式Ｉのコポリマーを提供する。
Ｚ−（ＰＥＧ）ｎ    （Ｉ）
【００３１】
ここで、Ｚは、プロラミンタンパク質であり、「ＰＥＧ」は、少なくとも約３ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール部分であり、ｎは、約１〜約１００または約５〜約５０である。プロラミンタンパク質は、例えば、白色ゼイン、黄色ゼイン、グリアジン、ホルデインまたはカフィリンであり得る。様々な分子量を有する様々なＰＥＧ部分をプロラミンにコンジュゲートさせることができる。例えば、ＰＥＧ部分の分子量は、１ｋＤａ〜約２２０ｋＤａ、約２ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約３ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約４ｋＤａ〜約１０ｋＤａまたは約５ｋＤａであり得る。
【００３２】
式Ｉは、プロラミンとＰＥＧとのグラフトコポリマーならびにプロラミンとＰＥＧとのブロックコポリマー（二元ブロックまたは三元コポリマーなどの多元コポリマー）を含み得る。例としては、以下の式ＩＩ〜Ｖなどが挙げられる。
Ｚ−ｇ−ＰＥＧ（グラフトコポリマー）    （ＩＩ）
Ｚ−ｂ−ＰＥＧ（二元ブロックコポリマー）    （ＩＩＩ）
Ｚ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｚ（三元ブロックコポリマー）    （ＩＶ）
ＰＥＧ−ｂ−Ｚ−ｂ−ＰＥＧ（三元ブロックコポリマー）    （Ｖ）
【００３３】
式Ｉのコポリマーは、例えば、疎水性治療薬の送達用などの薬物送達用途に用いることができる会合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を調製するための有用な中間体である。
【００３４】
本発明はさらに、Ｉ．Ｖ．製剤などの液体懸濁液、分散体または溶液中に本明細書で述べる複数のコポリマーまたはミセルを含む組成物を提供する。
【００３５】
本発明はまた、複数の式Ｉのコポリマーと分子（例えば、治療薬）とを溶媒または溶媒系中で組み合わせるステップと、式Ｉのコポリマーを分子の周りに凝集させて、封入体（すなわち、複数の式Ｉのコポリマーによって封入または囲まれた分子）を得るステップとを含む、本発明の封入体（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）を調製する方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、希釈剤および分子（例えば、治療薬）を取り囲む複数の式１のコポリマーから形成されたミセルを含む組成物を提供する。
【００３７】
本発明はまた、本発明の封入体（すなわち、ミセルにおけるような、複数の式Ｉのコポリマーによって封入または囲まれた治療薬）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。あるいは、治療薬を疎水性コアにおけるプロラミンおよび／または親水性ポリマーシェルとコンジュゲートまたは複合体形成させることができる。ミセルを複数の治療薬を封入するためにも用いることができ、かつ／または複数の治療薬をコアおよび／またはシェルと複合体形成／コンジュゲートさせることができる。治療薬に加えてまたはその代わりに、ミセルを用いて診断薬および／または造影剤などを運ぶことができる。
【００３８】
本発明はまた、式Ｉのコポリマーのミセルアセンブリの内部の治療薬を含んでいる、本発明の封入体を動物に投与するステップを含む、薬剤による治療を必要とする動物に治療薬を送達する方法を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、薬物療法用の本明細書で述べるミセル組成物の使用を提供する。薬物療法は、癌、例えば、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌または大腸癌を治療することであり得る。本発明はまた、そのような癌を治療するための薬剤の製造のための本明細書で述べるミセル組成物の使用を提供する。薬剤は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体を含み得る。
【００４０】
本発明はさらに、ざ瘡などの皮膚および毛包障害の治療を提供し、脱毛、脂漏性湿疹、毛包炎、皮膚悪性腫瘍、乾癬、角化障害、皮膚変色、創傷および光老化の治療に用いることができる。
【００４１】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある種の実施形態または様々な態様をさらに実証するために含まれている。一部の例では、本発明の実施形態は、本明細書に提示される詳細説明と組み合わせて添付の図面を参照することにより、最良に理解することができる。説明および添付した図面は、本発明のある特定の実施例またはある種の態様に焦点をあてることがあるが、当業者は、本実施例または態様の一部は、本発明の他の実施例または態様と組み合わせて使用することができることを理解しよう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】一実施形態による、薬物負荷ＰＥＧ−ゼインナノミセルの形成の概略図である。
【図２】一実施形態による、両親媒性ＰＥＧ−ゼインを調製するための一般的な工程を描いたフローチャートである。
【図３】一実施形態による、両親媒性ＰＥＧ−ゼインを調製するための具体的な工程を描いたフローチャートである。この図および他の図に列挙する具体的な量は、ある特定の実施形態を例示するためのものであり、当業者によって容易に認識されると思われるとおり、多くの変更形態を本明細書に記載した手順に適用することができる。
【図４】（ａ）ＦＴＩＲおよび（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーによる、ＰＥＧゼインコンジュゲートの物性を示す図である。ゼイン、ＰＥＧ−エステル、およびＰＥＧ−ゼイン（各５ｍｇ）のＦＴＩＲスペクトルを、ＮＩＣＯＬＥＴ  ３８０  ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＥＬＥＣＴＲＯＮ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、分解能２ｃｍ−１においてＺｎＳｅ結晶について記録した。各スペクトルは、平均１００スキャンとした。ＯＭＮＩＣソフトウェアを使用して、官能基のピーク位置を解析した。ＳＥＣは、ＨＰＬＣ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）システムで、ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ  ＢＩＳＥＰ  ＳＥＣ−Ｓ  ２０００  ４．６ｍｍｘ３０００カラム（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を用いて行った。試料は、移動相として７０％（ｖ／ｖ）のエタノールを使用し、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速を使用して分離した。カラム溶出液は、２８０ｎｍでモニターした。
【図５】（ａ）ＤＭＳＯおよび（ｂ）Ｄ２Ｏ中における、ＰＥＧ−ゼインの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。図５（ａ）では、３．５６ｐｐｍにＰＥＧのエチレン基が観察されており、また３．３６ｐｐｍに、タンパク質／アミドピークが観察されている。図５（ｂ）では、３．５６ｐｐｍにＰＥＧのエチレン結合が観察される一方、疎水性ゼインのコアはＤ２Ｏに溶解しないので、３．３６ｐｐｍのタンパク質／アミドピークは存在していない。
【図６】以下の希釈時における、ＰＥＧ−ゼインミセルの安定性を示す図である。１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ７．４中のＰＥＧ−ゼインミセル２ｍｇ／ｍＬのストック分散液を、２０、１００、２００、５００および１０００倍に希釈して、これらのミセルサイズを、粒径分析器（ＮＩＣＯＭＰ  ３８０  ＺＬＳ  Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）で測定した。これらのデータは、ミセルサイズが著しく変化しなかったので、ミセルは希釈時に安定していたことを示している。各データポイントは、３回の実験の平均値±ＳＤである。
【図７】３３９ｎｍおよび３３４ｎｍ（発光波長は３９０ｎｍである）の励起波長で、ペグ化ゼインの対数濃度（ｇ／Ｌ）に対してピレン（０．６μＭ）の吸光度比をプロットしたものを示す図である。ペグ化ゼインの濃度が増加するにつれて、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）におけるピレンの吸光強度が著しくシフトする。ペグ化ゼインのＣＭＣは、２７℃で０．０２５（ｇ／Ｌ）である。
【図８】マウスにおけるＰＥＧ−ゼインミセルのインビボ投与後の免疫応答を示す図である。血清中の抗ゼイン抗体（ｙ軸の光学密度）は、最初の投与量の３週間後、および追加抗原投与量の５週間後に測定した。生理食塩水またはＰＥＧ−ゼインミセル（１００μｇ／５０μＬ）をマウスに皮下投与した。結果を平均値±平均値の標準誤差（ｎ＝４）として表わす。ＰＥＧ−ゼインミセルはいかなる抗ゼイン抗体を生じることもなく、またその値は生理食塩水の対照に類似していた。
【図９】一実施形態による、薄膜法を使用する、クルクミン負荷ペグ化ゼインミセルを調製する工程を示す図である。
【図１０】一実施形態による、透析法を使用した、クルクミン負荷ペグ化ゼインミセルを調製する工程を示す図である。
【図１１】１％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで正に染色したクルクミン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。スケールは、１ｍｍ＝０．０５ｇｍである。
【図１２】非タッピングモードにおける、２μｍのスキャン速度でのクルクミン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。ｚスケール８８ｎｍ、０．３９Ｖおよび６１°で、左から右にそれぞれ、代表的な試料の２Ｄトポグラフィー、振幅像および位相像である。ＡＦＭで測定した１００個の粒子の平均粒子サイズは、９０±１０ｎｍであった。
【図１３】メタノール中、ｐＨ７．４のＰＢＳ（１０％メタノール）中のクルクミン（１０μｇ／ｍＬ）、およびｐＨ７．４のＰＢＳ中のクルクミン負荷ペグ化ゼインミセルのＵＶ可視スペクトルを示す図である。クルクミン負荷ＰＥＧゼインの吸光度は、メタノールに溶解しているクルクミンの吸光度に類似しており、クルクミン負荷ＰＥＧゼインミセルの水溶解度が向上していることを示している。
【図１４】メタノール中、ｐＨ７．４のＰＢＳ（１０％メタノール）中のクルクミン（１０μｇ／ｍＬ）、およびｐＨ７．４のＰＢＳ中のクルクミン負荷ペグ化ゼインミセルの蛍光スペクトルを示す図である。クルクミンの発光スペクトルのλｍａｘの、５４０ｎｍから５２５ｎｍへのシフトは、クルクミンがミセル中に捕捉（ｅｎｔｒａｐ）されていることを示している。クルクミンの水への溶解度がかなり向上することにより、ペグ化ゼインミセル中に捕捉された後の水中のクルクミン蛍光もまた著しく増大（約４倍）している。
【図１５】ゼイン、クルクミン、ブランクのＰＥＧゼイン、ｍＰＥＧ−エステルおよびクルクミン負荷ペグ化ゼインミセルの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムである。
【図１６】クエン酸緩衝液ｐＨ７．４中のＰＥＧ−ゼインミセル由来のクルクミンのインビトロ放出プロファイルを示す図である（平均値±ＳＥ、ｎ＝３）。本明細書に記載したとおりの透析方法によりクルクミン負荷ＰＥＧ−ゼインミセル（１ｍｇ／ｍＬ）を調製し、遠心分離器用の管中、１ｍＬのクエン酸緩衝液ｐＨ７．４中でインキュベートし、さらにこの懸濁液を、５０ｒｐｍの水平型振とう器の水浴中、３７℃に維持した。１２，０００ｒｐｍで１２分間、試料を遠心分離にかけた。次に、ＨＰＬＣを使用して、ＰＥＧ−ゼインミセルから放出されたクルクミンに関して、上澄み液を分析した。Ｃ１８カラム（ＷＡＴＥＲＳ（商標）、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ＭＡ、米国）を使用し、移動相はアセトニトリル６０％とクエン酸緩衝液４０％（５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ３．０に調整した１％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液）で構成した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎであり、検出波長は４２０ｎｍとした。放出検討は２４時間行なった。各データポイントは、３回の実験の平均値±ＳＤである。
【図１７】クルクミン（１０％ＤＭＳＯに溶解）およびクルクミンミセルのインビトロ細胞毒性プロファイルを示す図である。薬物耐性である、ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ薬物耐性ヒト卵巣癌細胞（ウェルあたり２０００個の細胞）を、７．８ｎＭから５００ｎＭの濃度範囲のクルクミン溶液またはクルクミンミセルで４日間処理した。５日目に、ＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性解析を行なった。データポイントは、平均値±ＳＥ（ｎ＝４）を表わす。クルクミン溶液（Ｃｕｒｃｕ−ｓｏｌｎ）およびクルクミンミセル（Ｃｕｒｃｕ−Ｍ）のＩＣ５０値は、それぞれ１０４ｎＭおよび３４ｎＭであった。
【図１８】縦型拡散セル中における、切除したブタの皮膚を使用した、遊離クルクミン（ｐＨ７．４のＰＢＳ中、１０％ＴＷＥＥＮ  ８０；図中、「Ｃ」として表わす）および封入クルクミン（ｐＨ７．４のＰＢＳ中；図中、「ＣＭ」として表わす）の、様々な処理期間後のインビトロ皮膚浸透を示す図である。切除したブタの皮膚を、縦型拡散セルの２つのコンパートメント間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（２０％エタノールでｐＨ７．４）から構成され、磁気ビーズを使用して撹拌した。上記皮膚を洗浄し、角質層（ＳＣ）を取り除くため、ＳＣＯＴＣＨ  ＴＡＰＥを使用して、１５〜２０回テープで貼り取った（ｔａｐｅ−ｓｔｒｉｐ）。９０％エタノールを使用して、テープはぎ取り物および残存皮膚（生表皮（ｖｉａｂｌｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）および真皮）からクルクミンを抽出した。皮膚およびレセプター相中のクルクミン量は、ＨＰＬＣ法により測定した。
【図１９】（ａ）遊離クルクミンで６時間処理した後のブタの皮膚および（ｂ）ＰＥＧ−ゼインミセル中に封入したクルクミンの共焦点蛍光ＸＺ光学走査画像（０〜１００μｍ深さ）、ならびに（ｃ）毛包（ｘｙ表面図）からのクルクミンミセルの浸透、ならびに（ｄ）角質層（ＳＣ）および生表皮における定量したクルクミンの蛍光ピクセル数を示す図である。ＳＣ０〜２０μｍ、および表皮２０〜１００μｍに関して、蛍光ピクセル数を定量するために、ＸＺ光学断面を使用した。
【図２０】一実施形態による、薄膜法を使用する、ドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルを調製する工程を示す図である。
【図２１】一実施形態による、透析法を使用した、ドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルを調製する工程を示す図である。
【図２２】１％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで正に染色したドキソルビシン負荷ＰＥＧゼインミセルの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。スケールは、１ｍｍ＝０．１１μｍである。
【図２３】非タッピングモードにおける、２μｍのスキャン速度でのドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を例示している図である。ｚスケール２２８ｎｍ、０．６４Ｖおよび７１°で、左から右に、代表的な試料の２Ｄトポグラフィー、振幅像および位相像である。１００個の粒子の平均粒子サイズは、１２５±１５ｎｍである。
【図２４】ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中のドキソルビシン（１０μｇ／ｍＬ）、９０％エタノール中のドキソルビシン、およびｐＨ７．４のＰＢＳ中のドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルのＵＶ可視スペクトルを、それぞれ例示している図である。ＰＥＧゼインミセル中のドキソルビシンの水溶解度が向上することにより、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインの吸光度は、９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解しているドキソルビシンの吸光度よりも大きい。
【図２５】ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中、９０％エタノール中のドキソルビシン（１０μｇ／ｍＬ）、およびｐＨ７．４のＰＢＳ中のドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルの蛍光スペクトルを、それぞれ示す図である。ドキソルビシンの水溶解度が著しく向上することにより、ペグ化ゼインミセル中に捕捉した後のｐＨ７．４のＰＢＳ中のドキソルビシン蛍光が著しく増大（約５０倍）している。
【図２６】ゼイン、ドキソルビシン、ブランクのＰＥＧゼイン、ｍＰＥＧ−エステルおよびドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムである。
【図２７】クエン酸緩衝液ｐＨ７．４中のＰＥＧ−ゼインミセル由来のドキソルビシンのインビトロ放出プロファイルを示す図である（ｎ＝３、±ＳＥＭ）。ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセル（１ｍｇ／ｍＬ）を、遠心分離器用の管中、１ｍＬのクエン酸緩衝液ｐＨ７．４中でインキュベートし、さらにこの懸濁液を、５０ｒｐｍの水平型振とう器の水浴中で、３７℃に維持した。１２，０００ｒｐｍで１２分間、試料を遠心分離にかけた。ＨＰＬＣ分析を使用して、ＰＥＧ−ゼインミセルから放出されたドキソルビシンに関して、上澄み液を分析した。Ｃ１８カラム（ＷＡＴＥＲＳ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ＭＡ、米国）を使用し、移動相は、トリフルオロ酢酸（０．１％（ｖ／ｖ））およびアセトニトリル５％（ｖ／ｖ）（３分まで、１１分まで８０％（ｖ／ｖ）、２２分まで５％（ｖ／ｖ））から構成され、１ｍＬ／ｍｉｎの流速とした。蛍光検出器を使用した（それぞれ、励起波長として５０５ｎｍ、および発光波長として５５０ｎｍ）。放出検討は、２４時間行なった。各データポイントは、３回の実験の平均値±ＳＤである。
【図２８】ドキソルビシン塩基（９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解）およびＰＥＧ−ゼインミセルのインビトロ細胞毒性プロファイルを示す図である。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（ウェルあたり２０００個の細胞）を、１５．６２ｎＭから１０００ｎＭの濃度範囲のドキソルビシン溶液（Ｄｏｘ−ｓｏｌｎ）およびドキソルビシン負荷ミセル（Ｄｏｘ  Ｍ）で４日間処理した。５日目に、ＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性分析を行なった。データポイントは、平均値±ＳＥ（ｎ＝４）を表わす。ドキソルビシンおよびドキソルビシンミセルのＩＣ５０値は、それぞれ１４８ｎＭおよび３０ｎＭであった。
【図２９】ドキソルビシン塩基（９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解）およびドキソルビシン負荷ＰＥＧゼインミセルのインビトロ細胞毒性プロファイルを示す図である。薬物耐性である、ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ薬物耐性ヒト卵巣癌細胞（ウェルあたり２０００個の細胞）を、３１．２５ｎＭから１０００ｎＭの濃度範囲のドキソルビシン溶液（Ｄｏｘ−ｓｏｌｎ）またはドキソルビシンミセル（Ｄｏｘ−Ｍ）で４日間処理した。５日目に、ＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性分析を測定した。データポイントは、平均値±ＳＥ（ｎ＝４）を表わす。ドキソルビシンおよびドキソルビシンミセルのＩＣ５０値は、それぞれ１２６ｎＭおよび２９ｎＭであった。
【図３０】ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞系へのドキソルビシン負荷ＰＥＧゼインミセルの細胞取込みに対する温度効果を示す図である。細胞を４℃で２時間、プレインキュベートした。２時間後、細胞をｐＨ７．４のＰＢＳによって２度洗浄し、ドキソルビシン負荷ＰＥＧゼインミセル（ドキソルビシン５μｇ／ｍＬに相当）により処理した。２時間後、この処理を解除し、細胞をｐＨ７．４の氷冷ＰＢＳにより２度洗浄し、ＨＰＬＣ分析を使用して細胞溶解物中のドキソルビシン含量を見積もった。対照群では、細胞を３７℃でインキュベートした。各値は平均値±ＳＥ（ｎ＝３）を表わす。４℃における細胞取込みは、３７℃における細胞取込みと比較するとかなり低かった（ｐ＜０．０５、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。
【図３１】ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞系（５００００個の細胞／プレート）における、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルおよびドキソルビシン溶液（５１Ｌｉｇ／ｍＬ）の細胞取込み速度を示す図である。データポイントは、３回の実験の平均値±ＳＥを表わす。
【図３２】抵抗性ヒト癌細胞中へのＰＥＧ−ゼインミセルの細胞取込み機構を示す図である。ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞（５０００個の細胞／ウェル）を、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８（１ｍｇ／ｍＬ、ポジティブ対照、Ｐ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を阻害することが知られているブロックコポリマー）、およびブランクのＰＥＧ−ゼインミセル（０．０５０ｍｇ／ｍＬ）で処理した。３７℃で３０分間インキュベートした後、５０μＬの０．２５μＭ／ＬカルセインＡＭを加えた。室温でマイクロプレートリーダー（４８５／５８９の励起／発光波長）を使用して、５分毎に１時間蛍光を測定した。Ｐ−ｇｐ阻害を以下のとおり算出した。％相対蛍光＝１００ｘ／（ＦＬ処理−ＦＬ未処理）／（ＦＬ未処理）。データポイントは、平均値±ＳＥ（ｎ＝８）を表わす。ブランクのＰＥＧ−ゼインミセルでは、より高いＰ−ｇｐ阻害が観察された。
【図３３】マウスの同種移植片乳房の腫瘍マウスモデルにおける、ドキソルビシン溶液およびドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセル（生理食塩水中）のインビボ生体分布を示す図である。腫瘍モデルは、ＪＣマウスの乳癌細胞を皮下注射することにより発症させた。ドキソルビシン溶液またはミセルを、尾部静脈注射（４．５ｍｇ／ｋｇ）によって与えた。処理投与３時間後に動物を犠牲にした。腫瘍および臓器を採集した。蛍光系のイソクラティックＨＰＬＣ法を使用して、腫瘍および臓器中のドキソルビシン濃度を測定した。ドキソルビシン含量を臓器重量に対して正規化した（ｎ＝３〜４、±ＳＥＭ）。ミセルは、腫瘍により多く分布しており、また他の臓器中の分布はかなり低かった。ドキソルビシンは、心毒性および腎毒性を引き起こすことが知られている。この結果は、ミセルによりドキソルビシンの効力の向上および毒性低下がもたらされることを示している。
【図３４】薬物耐性腫瘍の同種移植片マウス腫瘍モデルにおける、ドキソルビシン溶液およびドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルのインビボ抗癌効力を示す図である。皮下ＪＣマウス乳癌細胞を有する雌のＢＡＬＢ／Ｃを、本検討に使用した。０日目および７日目に、ドキソルビシン溶液またはミセルを静脈注射によりマウスに注射した（３ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍体積を隔日に測定した。腫瘍体積の低下率を、式（処理後の腫瘍体積／処理前の腫瘍体積）ｘ１００を使用して算出した。データは、平均値±ＳＥＭ（群あたりｎ＝４〜５）として表わし、＊は、他の処理に比べて、値がｐ＜０．０５で有意であることを示す。ドキソルビシンミセル群を除いて、他のすべての処理群で、マウスは７日後には生存していなかった。ドキソルビシンミセルを投与すると腫瘍の増殖は遅くなり、ミセル製剤の有効性がより高いことを示している。ＢＭとはブランクのミセルを指す。Ｄｏｘ−Ｓｏｌｎはドキソルビシン溶液を指す。また、Ｄｏｘ−Ｍはドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルを指す。
【図３５】同種異系の乳房腫瘍を有するＢＡＬＢ／Ｃマウスのカプラン−マイアー生存プロットを示す図である。０日目および７日目に、静脈注射（６ｍｇ／ｋｇ）により、ドキソルビシン溶液またはドキソルビシンミセルを、皮下ＪＣ腫瘍を有する雌のＢＡＬＢ／Ｃに分割投与量で注射した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ５ソフトウェアを使用して、動物の生存率をプロットした。データは群あたり４〜５匹の動物の平均値である。マウスの死亡率は、ドキソルビシンミセル（Ｄｏｘ−Ｍ）＜ドキソルビシン溶液（Ｄｏｘ−Ｓｏｌｎ）＜生理食塩水＜ブランクのミセル（ＢＭ）の順に増加した。このデータは、製剤の有効性の向上により、ドキソルビシンミセルが、生存率をより高くしたことを示している。
【図３６】一実施形態による、透析法を使用した、ナイルレッド負荷ペグ化ゼインミセルを調製する工程を示す図である。
【図３７】表皮および角質層中における、ナイルレッドの量を示す図である（ｎ＝３）。縦型拡散セル（ＰＥＲＭＥＧＥＡＲ（商標）、Ｈｅｌｌｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）の２つのコンパートメント間にはさんだ、皮膚採取した（ｄｅｒｍａｔｏｍｅｄ）ブタの皮膚を使用して、インビトロ検討を行なった。１００μＬの５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０溶液中のナイルレッド（２５０ｎｇ）、または水中のナイルレッド負荷ＰＥＧ−ゼインミセル（２５０ｎｇ）をドナーコンパートメントに添加した。レセプターコンパートメントは、３７℃に維持したｐＨ７．４のＰＢＳで構成され、磁気撹拌子を用いて撹拌した。６時間後、上記の皮膚を取り除き、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ３００（商標）、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｉｘ７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ社、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して、蛍光ピクセル数を測定した。ＦＬＵＯＶＩＥＷ（商標）ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して、角質層（０〜１５μｍ）および生表皮（２０〜１００μｍ）の蛍光強度について、光学断面（ｘｙｚ）を分析した。
【図３８】一実施形態による、透析法を使用したレチノール負荷ペグ化ゼインミセルを調製する一般的な工程を示すフローチャートである。図３８〜３９および図４３〜４６では、ＢＨＴとはブチル化ヒドロキシトルエン（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）を指す。
【図３９】一実施形態による、薄膜法を使用したレチノール負荷ペグ化ゼインミセルを調製する一般的な工程を示すフローチャートである。
【図４０】左から右に、遊離レチノールおよびレチノール負荷ナノミセルの水中分散性を示す図である。
【図４１】リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中における、ＰＥＧ−ゼインナノミセル由来のレチノールのインビトロ放出を示す図である。ＵＶ可視分光光度法により、３２０ｎｍでレチノール濃度を測定した。各データポイントは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）である。
【図４２】左から右に、遊離レチノール、凍結乾燥レチノールミセルを示す図である。この図は、純粋なレチノールが吸湿性の性質であること、およびレチノールミセルは非吸湿性の易流動性粉末であることを示している。
【図４３】通常の室内光下で保管した場合の、レチノール負荷ナノミセルの固体状態安定性を示す図である。透明なガラス製バイアル中に遊離レチノールおよびレチノールミセルを保存し、室内光に１週間暴露した。様々な時間ポイントにおいて残存しているレチノールをＵＶ可視分光光度法により３２０ｎｍ（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）で測定した。
【図４４】遮光下で保管した場合の、レチノール負荷ナノミセルの固体状態の安定性を示す図である。透明なガラス製バイアル中に遊離レチノールおよびレチノールミセルを保存し、１週間暗キャビネット中に保管した。様々な時間ポイントにおいて残存しているレチノールを、ＵＶ可視分光光度法により３２０ｎｍ（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）で測定した。
【図４５】通常の光下で保管した場合の、レチノール負荷ナノミセルの液体状態の安定性を示す図である。遊離レチノールおよびレチノールミセルをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に分散し、室内光で透明なガラス製バイアル中に１週間保管した。様々な時間ポイントにおいて残存しているレチノールを、ＵＶ可視分光光度法により３２０ｎｍ（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）で測定した。
【図４６】暗キャビネット内で光から保護して保管した場合の、レチノール負荷ナノミセルの液体状態の安定性を示す図である。遊離レチノールおよびレチノールミセルをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に分散し、暗キャビネット内で透明なガラス製バイアル中に１週間保管した。様々な時間ポイントにおいて残存しているレチノールを、ＵＶ可視分光光度法により３２０ｎｍ（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）で測定した。
【図４７】遊離レチノールおよびＰＥＧゼインミセル中に封入したレチノールによる処理後４８時間の終了時における、ブタの皮膚およびレセプター媒体中の施用レチノールの割合を示す図である。切除したブタの皮膚を、縦型拡散セルの２つのコンパートメント間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から構成され、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離レチノールまたは封入レチノールの分散液をドナー室に入れた。本検討の終わりに、皮膚およびレセプターコンパートメント中のレチノール濃度を、３Ｈ標識レチノールを用いた放射化学的方法によって測定した。皮膚は、レチノール濃度（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）を測定するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して消化した。
【図４８】遊離レチノールおよびレチノール封入ミセルによる処理後の４８時間の終了時における、ブタの皮膚およびレセプター媒体中の施用レチノールの割合を示す図である。切除したブタの表皮（Ｅｐｉ）を、縦型拡散セルの２つのコンパートメント間に配置した。一連の第２の実験では、ブタの表皮から角質層を切り出し、次にブタの表皮上に物理的に配置して（間にはさむ）本検討に使用した（Ｓａｎｄ）。皮膚上に遊離レチノールまたはレチノールミセルを施用し、この検討を４８時間行なった。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から構成され、磁気ビーズを使用して撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の遊離レチノールまたは封入レチノールの分散液をドナー室に入れた。検討の終わりに、皮膚およびレセプターコンパートメント中のレチノール濃度を、３Ｈ標識レチノールを用いた放射化学的方法によって測定した。皮膚は、レチノール濃度（平均値±ＳＤ、ｎ＝６）を測定するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して消化した。
【図４９】アルミニウム箔で覆ったガラス製バイアル中に、１か月の期間、室温および４９℃で保管した、レチノールミセルクリーム製剤の安定性を示す図である。該製剤の一定分量を一定間隔で取り出し、ＨＰＬＣを使用してレチノール含量を分析した。該製剤は安定なままであり、室温では何ら深刻な分解を示すことはなかった。各バイアルは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。
【図５０】ｐＨ７．４における、クリーム製剤由来の遊離レチノール（黒丸）およびレチノールミセル（黒三角）のインビトロ放出を示す図である。
【図５１】ヒトの皮膚中における、レチノールクリーム製剤のインビトロでの皮膚浸透を示す図である。
【図５２】遊離レチノールのクリーム製剤およびミセル封入レチノールクリーム製剤の施用後の、マウスにおける経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）値を示す図である。公知の皮膚刺激物であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）をポジティブ対照として使用し、またネガティブ対照群にはどの処理も施さなかった。
【図５３】ＳＫＨ−１無毛マウスにおける、処理６時間後の遊離レチノールおよびナノ粒子封入レチノールのインビボでの局所生体利用率を示す図である。
【図５４】ナイルレッド負荷カゼインミセルを調製する工程を例示している図である。
【図５５】遊離ナイルレッドおよびカゼインミセル中に封入したナイルレッドによる６時間処理後の異なる層の皮膚における、蛍光ピクセル数を示す図である。角質層（ＳＣ）０〜２０μｍ、および表皮２０〜１００μｍに関して、蛍光ピクセル数を定量するために、ＸＺ光学断面を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
ゼインは、疎水性植物タンパク質であり、プロラミンのファミリーに属し、水不溶性である。ゼインは、製薬、食品および化粧品産業において様々な物質の持続放出用のポリマーとして検討されてきた（Ｓｈｕｋｌａ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｙａｎ  （２００１），Ｉｎｄ  Ｃｒｏｐｓ  Ｐｒｏｄ  １３：１７１−１９２）。ゼインはまた、フィルムコート材料に、またミクロ粒子またはナノ粒子などの微粒子系を形成するために用いられてきた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、エーテル結合により連結された複数のエチレングリコール単位からなる、生体適合性のＦＤＡ承認済み水溶性ポリマーである。
【００４４】
出願者らは、図１に概略的に示すように、様々な両親媒性タンパク質コンジュゲートが自己組織化して、安定な生体適合性かつ生分解性ミセルアセンブリを形成し得ることを発見した。ミセルコアにカーゴ分子を含むまたは含まないミセルを形成させることができる。図２および図３に記述したようにゼインをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合させることができることも発見された。ブランク（薬物が負荷されていない）または薬物負荷ペグ化ゼインは、水性環境中で自己組織化して、疎水性コアおよび親水性シェルを有するナノミセル（約１００ｎｍ）を形成する。
【００４５】
他の疎水性タンパク質、例えば、植物、動物および合成供給源を含む様々な供給源由来のものをゼインの代わりに用いることができる。同様に、ポリビニルピロリドン、ポリグリコール酸および本明細書で述べるその他のものなどの他の水溶性ポリマーを疎水性タンパク質にコンジュゲートさせて、ナノミセルを調製することができる。様々な水不溶性の疎水性分子（例えば、治療薬または「薬物」）は、ナノミセルのコアの内部に封入することができ、ミセルのコロナにおける親水性ポリマー鎖は、人体のような水性環境において薬物を可溶化する助けとなる。さらに、対イオンで中和された荷電分子は、本明細書で述べるミセルの疎水性コアの内部に封入することができる。あるいは、荷電官能基が疎水性コアまたは親水性シェルに導入されている場合、荷電分子は、静力学的相互作用によりコアおよび／またはシェルと複合体形成させることができる。例えば、ミセルのコアおよび／またはシェルへのポリエチレンイミン、ポリリシンなどの陽イオンポリマーの結合を用いて、負に荷電したＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを複合体形成させることができる。同様に、親水性分子を化学的に修飾して（例えば、プロドラッグまたは塩の形に）、ミセルのコアに封入するための疎水性物質を得ることができる。実施形態において、タンパク質上の全電荷は、ｐＨをプロラミンのｐＩ以上または以下に調整することによって変化させることができる（例えば、ゼインのｐＩは、約５〜９であり、グリアジンのｐＩは、約６．８である）。
【００４６】
定義
本明細書で用いているように、列挙する用語は、以下の意味を有する。本明細書で用いる他のすべての用語および語句は、当業者が理解しているような通常の意味を有する。そのような通常な意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１のような技術辞書を参照することによって得ることができる。
【００４７】
本明細書における「１つの実施形態」、「実施形態」等への言及は、述べた実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分または特性を含み得るが、すべての実施形態が当態様、特徴、構造、部分または特性を必ずしも含むとは限らないことを意味する。さらに、そのような語句は、明細書の他の箇所において言及される同じ実施形態に当てはまり得るが、必ずしもそうとは限らない。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分または特性がある実施形態に関連して記述されている場合、明確に記述されているか否かにかかわりなく、そのような態様、特徴、構造、部分または特性を他の実施形態の対象とすることまたはそれに関連させることは当業者の知識の範囲内にある。
【００４８】
「含んでなる」、「含む」、「有する」、「含有する」、「特徴とする」という用語およびそれらの文法上の相当語句は、付加的、非列挙要素または方法ステップを排除しない包含的または無制限的用語であるが、より制限的用語である「からなる」および「から本質的になる」も含む。
【００４９】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に示されない限り、複数の対象物を含む。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」（例えば、薬物（ａ  ｄｒｕｇ））への言及は、化合物Ｘが複数の化合物Ｘを含むように、複数のそのような化合物を含む。さらなる例として、「ミセル（ａ  ｍｉｃｅｌｌｅｄ）」への言及は、複数のそのようなミセルを含んでいてよく、「分子」への言及は、複数の分子およびそれらの同等物への言及である。特許請求の範囲は、任意選択の要素を除外するように作成することができることにさらに留意されたい。したがって、このような記載は、請求項中の要素の詳述または「消極的」限定の使用に関連して「もっぱら」、「のみ」などのような排他的用語の使用の根拠となるものである。
【００５０】
「および／または」という用語は、この用語に関連する項目の任意の１つ、項目の任意の組合せ、または項目のすべてを意味する。「１つまたは複数」という語句は、特に、その用法に照らして読むとき、当業者によって容易に理解される。例えば、フェニル環上の１つまたは複数の置換基は、１つから５つを、または例えば、フェニル環が二置換を受けている場合には、１つから４つを意味する。
【００５１】
「約」という用語は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％または±２５％の変動を意味し得る。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５パーセントから５５パーセントまでの変動を有し得る。整数範囲については、「約」という用語は、示された整数より大きいおよび／または小さい１つまたは２つの整数を含み得る。本明細書で特に示さない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物または実施形態の機能性に関して同等である示された範囲に最も近い値、例えば、重量パーセントを含むものとする。さらに、本明細書で特に示さない限り、示された範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、範囲内の各個別の値または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を含む。
【００５２】
当業者により理解されるように、成分の量、分子量のような特性、反応条件などを表す数を含むすべての数は、近似値であり、場合によって、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解される。これらの値は、本明細書における記述の教示を利用する当業者が得ようとする所望の特性によって変化し得る。そのような値は、それらの各試験測定において見いだされる標準偏差に必然的に起因する変動を本質的に含むことも理解される。
【００５３】
当業者により理解されるように、特に書面による説明を行うという点におけるありとあらゆる目的のために、本明細書で示したすべての範囲は、ありとあらゆる可能な部分的範囲およびそれらの部分的範囲の組合せ、ならびに範囲を構成する個々の値、特に整数値も包含する。示された範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、範囲内の各個別の値、整数、小数または同一性を含む。示された範囲は、十分に記述され、同じ範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分または１０等分に分けられることを可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で述べる各範囲は、下３分の１、中間３分の１および上３分の１等に容易に分けることができる。
【００５４】
当業者により理解されるように、「最大で〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」、「より多い」、「またはそれ以上」などのすべての用語は、示される数を含み、上述のような部分的範囲にその後に分けることができる範囲を指す。同様に、本明細書で示したすべての比率もより広い比率の範囲内に入るすべての部分比率を含む。したがって、ラジカル、置換基について示した個別の値および範囲は、例示のみのためのものであり、それらは、ラジカルおよび置換基についての他の定義された値または定義された範囲内の他の値を排除しない。
【００５５】
当業者は、メンバーが、マーカッシュグループにおけるような、一般的な方法で一緒にグループ化される場合、本発明が、全体として列挙された全グループだけでなく、個別にグループの各メンバーおよび主グループのすべての可能なサブグループも包含することも容易に認識する。さらに、すべての目的のために、本発明は、主グループだけでなく、１つまたは複数のメンバーを欠く主グループも包含する。したがって、本発明は、示されたグループの１つまたは複数のメンバーの明確な除外を想定する。したがって、開示されたカテゴリーまたは実施形態に条件を適用することができ、それにより、１つまたは複数の示された要素、種または実施形態は、例えば、明確な消極的な限定に用いられるようなカテゴリーまたは実施形態から除外することができる。
【００５６】
「ゼイン」という用語は、プロラミンタンパク質のクラスを意味する。プロラミンは、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメおよびソルガムなどの様々な穀物ならびに他の植物および動物に見いだされる。プロラミンの他の例としては、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンなどがある。これらのプロラミンは、本明細書で述べる様々な実施形態においてゼインと交換することができる。ゼインは、高い割合のプロリン、グルタミンおよびアスパラギンなどの非極性アミノ酸で構成され、約２２〜２７ｋＤａの分子量を有する（Ｓｈｕｋｌａ，Ｚｅｉｎ：ｔｈｅ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｎ．Ｉｎｄ．Ｃｒｏｐｓ．Ｐｒｏｄ．１３，１７１−９２；２００１）。ゼインの典型的な試料は、約２０％のロイシン、１０％のプロリン、２１〜２６％のグルタミン、５％のアスパラギンおよび１０％のアラニンを有し得る。したがって、そのアミノ酸組成物の少なくとも約６１％が疎水性アミノ酸である。これらの疎水性アミノ酸は、タンパク質を水不溶性にする。ゼインは、生分解性の米国ＦＤＡ承認済みＧＲＡＳポリマー（連邦登録（１９８５）５０：８９９７〜８９９９）である。
【００５７】
ゼインは、コーングルテンミールから粉末として製造することができる。純粋なゼインは、無臭、無味、水不溶性で、食用に適するものであり、これらの特性のため、加工食品および医薬品の重要な成分となっている。ゼインを単離し、加工し、使用する方法は、当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｗｔｏｎ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，７９（１）：１−１８および国際公開第２０００／１３７１１２号（Ｐｅｒｕｍａら）を参照のこと。ゼインの「等級」は、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２５４，６７３号（Ｃｏｏｋら）に開示されているような様々な手段によって得られる白色ゼインおよび黄色ゼインを含む、様々な種類または形態のゼインを意味する。
【００５８】
「ＰＥＧ」または「ポリエチレングリコール」という用語は、エーテル結合により連結された複数のエチレングリコール単位で構成された水溶性で、生体適合性のＦＤＡ承認済みポリマーを意味する。ＰＥＧ鎖または部分の分子量は、鎖におけるエチレングリコール単位の数によって、約１ｋＤａから約２２０ｋＤａまで、例えば、約１ｋＤａから約１５ｋＤａまで変化し得る。ＰＥＧ部分は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨまたは（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＲ基と表すことができ、ここで、ｎは、２〜約１，０００であり、Ｒは、メチル、エチル、ｔ−ブチル、フェニルまたはベンジルなどのアルキル、アリールまたはアリールアルキルである。ＰＥＧ部分は、例えば、コハク酸エステルで活性化するとき、末端ヒドロキシル基を介してタンパク質に結合させることができる。
【００５９】
様々な実施形態において、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１ｋＤａから約２２０ｋＤａであり得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ基は、約１，０００〜約２０，０００、約４，５００〜約２０，０００、約５，０００〜約１８，０００、約５，０００〜約１２，０００または約４，０００〜約９，０００の分子量を有し得る。他の実施形態において、ＰＥＧ基は、約４，０００、５，０００、６，０００または７，０００の分子量を有し得る。ＰＥＧ基は、その末端において、アセチル基またはアルキル基、例えば、メチルもしくはエチル基などの保護基でキャッピングすることもできる。
【００６０】
異なる末端基を有するヘテロ２官能性ＰＥＧ基もペグ化に用いることができる。ヘテロ２官能性ＰＥＧ基の例としては、ＨＯ２Ｃ−ＰＥＧ−ＯＨ、ＨＣ（＝Ｏ）−ＰＥＧ−ＳＨなどがある。線状ＰＥＧ部分に加えて、ＰＥＧ鎖を含む分枝状部分もプロラミンのペグ化に用いることができる。ゼインにコンジュゲートさせることができる様々なＰＥＧ部分の例は、Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：４５９−４７６，２００２）によって記載されており、以下に示す。
【００６１】
ＰＥＧ２トリアジンに基づく分枝状ＰＥＧ基：
【００６２】
【化１】
2014518842.tif 000003
【００６３】
ここで、Ｒ−ＮＨ２のアミノ基は、プロラミンタンパク質の側鎖または末端基におけるアミノ基である。プロラミンタンパク質にコンジュゲートさせることができる他のＰＥＧ部分は、以下のものを含む：
１）分枝状ＰＥＧ（ＰＥＧ２）、
２）線状フォーク状ＰＥＧおよび／または
３）分枝状フォーク状ＰＥＧ
【００６４】
【化２】
2014518842.tif 000004
【００６５】
ここで、Ｙは、炭素分枝状部分を有する基であり、Ｘは、プロラミンタンパク質の原子、プロラミンタンパク質へのリンカーまたはプロラミンタンパク質の官能基である。
【００６６】
ポリエチレングリコール部分または他のポリ（アルキレンオキシド）は、当技術分野で周知の様々な技術によりゼインにコンジュゲートさせることができる（例えば、Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １０，１４５１−１４５８参照）。コンジュゲート形成の一例は、以下のスキームＡに示すように、ゼインのようなプロラミンタンパク質をメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネートのような活性化モノアルコキシル化ＰＥＧエステルと反応させて、エステルまたはアミド結合を形成することである。
【００６７】
スキームＡ  ゼイン（のグルタミン側鎖）のペグ化
【００６８】
【化３】
2014518842.tif 000005
【００６９】
上記のスキームＡに示すように、ｍ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを、ゼインのようなプロラミンにおけるグルタミン残基（および／またはアスパラギン残基）の１つまたは複数の末端アミン基にアミド結合の形成によりコンジュゲートさせることができる（Ｓｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉ  １０５，２８７７−２８８３）。他の実施形態において、アルギニンおよびヒスチジンにおけるアミン基を、アミドまたはカルバメート結合によりＰＥＧにコンジュゲートさせることができる。さらに、Ｎ末端アミノ酸をペグ化することができる。ＰＥＧカルボン酸、エステル、炭酸エステル、アルデヒドなどを含む、当技術分野で公知の様々なＰＥＧ誘導体をアミン基をペグ化するのに用いることができる。アスパラギン酸およびグルタミン酸におけるカルボン酸ならびにゼインにおけるＣ末端カルボン酸も、アミン、ヒドロキシルまたはカルボン酸をＰＥＧ基に結合させるための当技術分野で公知の他の官能基を有するＰＥＧを用いてＰＥＧにコンジュゲートさせることができる。ゼインにおけるシステインにおけるチオールも、例えば、ピリジルスルフィド、ビニルスルホン、マレイミドまたはヨードアセトアミドで官能基化したＰＥＧを用いてＰＥＧにコンジュゲートさせることができる。ゼインにおけるトレオニンおよびセリンも、当技術分野で周知の技術を用いてペグ化することができる。
【００７０】
ゼインにおける部位特異的ペグ化は、酵素を用いて達成することができる。例えば、以下のスキームＢに示すように、トランスグルタミナーゼを用いて、グルタミンにおける側鎖アミン基を選択的にペグ化することができる。同様に、選択的ペグ化は、アセチルガラクトシルアミントランスフェラーゼを用いたセリンまたはトレオニンにおけるヒドロキシル基の選択的グリコシル化とそれに続くシアリルトランスフェラーゼを用いたＰＥＧ−シアル酸のコンジュゲーションによって達成することができる（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １０，１４５１−１４５８）。
【００７１】
スキームＢ  酵素ペグ化
【００７２】
【化４】
2014518842.tif 000006
【００７３】
様々な実施形態において、各アルキレン基に２〜４個の炭素原子を含むアルキレンオキシド鎖などの他のアルキレンオキシドをポリエチレングリコールの代わりに用いることができる。メトキシ末端ポリ（アルキレンオキシド）などのアルコキシ末端ポリ（アルキレンオキシド）が適切な例であり、遊離ヒドロキシ末端をスクシンイミジルスクシネートなどの基で活性化することができる。いくつかの実施形態において、ポリ（アルキレンオキシド）鎖は、約２〜約１１０個の反復単位を、一般的に約５０〜約１１０個の反復単位を有し得る。
【００７４】
「生体適合性」という用語は、言及されたポリマーまたはコンジュゲートが、対象にインビボで投与された場合に重大な副作用を引き起こさないまたは誘発しないことを意味する。可能な副作用の例は、過度の炎症および／または過度もしくは有害免疫応答ならびに毒性を含むが、これらに限定されない。ゼインおよびポリエチレングリコールは、生体適合性化合物である。
【００７５】
「水性アルコール溶媒」という用語は、水と、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールまたはブタノール（１−ブタノール、２−ブタノール（ｓｅｃ−ブタノール）、イソブタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールを含む）などのアルコール溶媒の両方を含む溶媒系を意味する。一般的な水性アルコール溶媒系は、水中に５０％、７０％、９０％および９２％のエタノールを含む。
【００７６】
「安定」という用語は、コアが水との接触を有さないミセルのコアに当てはまる（例えば、実施例１のＰＥＧ−ゼインのコア−シェル構造参照）。
【００７７】
「接触」という用語は、細胞または分子レベルにおける例えば、溶液中の、反応混合物中の、インビトロでの、またはインビボでの例えば、生理学的反応、化学反応または物理的変化をもたらすことを含む、接触する、接触させる、または隣接もしくは近接させる行為を意味する。
【００７８】
「投与された」または「投与」という用語は、ミセルの治療上および診断上の使用の状況において用いられる場合、例えば、標的部位に治療薬を送達する目的のための選択される量のミセルのインビボまたはインビトロ環境への導入を意味し、含む。
【００７９】
「有効量」は、疾患、障害および／または状態を治療するのに、あるいは示された効果をもたらすのに有効な量を意味する。例えば、有効な量は、治療される状態または症状の進行または重症度を低減するのに有効な量であり得る。治療上有効量の決定は、当業者の十分に能力の範囲内にある。「有効量」という用語は、例えば、宿主における疾患または障害を治療もしくは予防するのに、あるいは疾患または障害の症状を治療するのに有効である、本明細書で述べるブランクもしくは薬物負荷ミセルの量を含むものとする。したがって、「有効な量」は、一般に、好ましい効果を奏する量を意味する。
【００８０】
「治療すること」、「治療する」および「治療」という用語は、（ｉ）疾患、病的状態もしくは病状が起こることを防ぐこと（例えば、予防）、（ｉｉ）疾患、病的状態もしくは病状を抑制することまたはその進行を止めること、（ｉｉｉ）疾患、病的状態もしくは病状を軽減すること、および／または（ｉｖ）疾患、病的状態もしくは病状に随伴する症状を低減することを含み得る。したがって、「治療する」、「治療」および「治療すること」という用語は、予防に拡大適用することができ、予防する、予防、予防すること、治療される状態または症状の進行または重症度の低下、停止または逆転を含み得る。したがって、「治療」という用語は、適宜、医学的、治療的および／または予防的投与を含み得る。
【００８１】
「抑制する」、「抑制すること」および「抑制」という用語は、疾患、感染、状態または細胞の群の成長または進行を遅くすること、停止させることまたは逆転させることを意味する。抑制は、例えば、治療または接触の非存在下で起こる成長または進行と比較して約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９９％より大きいことがあり得る。
【００８２】
「インビボ」という用語は、患者の身体などの対象の身体のまたは内部でを意味し、経口、口腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、非経口、皮下、局所、眼、肺および鼻投与経路を含むが、これらに限定されない様々な手段によるミセルの投与を含む。
【００８３】
「インビトロ」という用語は、対象または患者の身体の外部の環境を意味する。「対象」または「患者」という用語は、両方が個々の複合生物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００８４】
「治療薬」という用語および治療または薬効機能を意味する同様な用語は、当該小分子、巨大分子、タンパク質、核酸、成長因子、ホルモン、薬物、他の物質、細胞またはそれらの組合せが対象における疾患または状態の発症、経過および／または１つもしくは複数の症状に有益に作用することができ、疾患または他の状態を治療するための薬剤の製造にミセルとともに用いることができることを意味する。本明細書で述べるミセルへの封入のための適切な治療薬は、例えば、クルクミン、ドキソルビシンなどであるが、これらに限定されない疎水性治療薬およびナイルレッドなどの造影剤を含む。
【００８５】
疎水性物質：
本発明の実施に別の点で適する実際的にあらゆる疎水性物質は、様々な用途に用いることができる。本明細書で述べる両親媒性ポリマーは、粘稠化剤、滑剤、洗剤、界面活性剤および防汚剤としても用いることができる。両親媒性ポリマーは、染料、化粧品、顔料および医薬品用の乳化、分散または安定化剤として用いることができる。両親媒性ポリマーは、繊維製品の染色における乳化、分散または安定化剤としてならびに化粧品用の染料を封入するために特に有用であり得る。両親媒性ポリマーは、化粧品、医薬品、栄養補助食品、農薬、繊維製品および香料用の滑剤および封入材料として有用であり得る。
【００８６】
生物学的または薬学的に活性な疎水性物質に加えて、本明細書で述べる両親媒性ポリマーにより封入することができる他の疎水性分子は、診断薬、殺虫剤、農薬、除草剤、防腐剤、食品添加物、香料、染料、診断補助薬などを含む。本明細書で述べる両親媒性ポリマーにより封入することができる疎水性分子は、アビエチン酸、アセグラトン、アセナフテン、アセノクマロール、アセトヘキサミド、アセトメロクトール、アセトキソロン、アセチルジギトキシン、二臭化アセチレン、二塩化アセチレン、アセチルサリチル酸、アラントラクトン、アルドリン、アレキシトールナトリウム、アレトリン、アリルエステノール、硫化アリル、アルプラゾラム、アルミニウムビス（アセチルサリチレート）、アンブセタミド、アミノクロテノキサジン、アミノグルテチミド、塩化アミル、アンドロステンジオール、アネトールトリトン、アニラジン、アントラリン、アンチマイシンＡ、アプラスモマイシン、アルセノ酢酸（ａｒｓｅｎｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アシアチコシド、アステミゾール、オーロドクス、アーロチオグリカニド、８−アザグアニン、アゾベンゼン、バイカレイン、ペルーバルサム、トルーバルサム、バルバン、バックストロビン、ベンダザク、ベンダゾール、ベンドロフルメチアジド、ベノミル、ベンザチン、ベンゼストロール、ベンゾデパ、ベンゾキシキノン、ベンズフェタミン、ベンズチアジド、安息香酸ベンジル、ケイ皮酸ベンジル、ビブロカトール、ビフェノクス、ビナパクリル、ビオレスメトリン、ビサボロール、ビサコジル、ビス（クロロフェノキシ）メタン、ヨード次没食子酸ビスマス、次没食子酸ビスマス、タンニン酸ビスマス、ビスフェノールＡ、ビチオノール、ボルニル、ブロモイソ吉草酸、塩化ボルニル、イソ吉草酸ボルニル、サリチル酸ボルニル、ブロジファクム、ブロメタリン、ブロキシキノリン、ブフェキサマク、ブタミレート、ブテタール、ブチオベート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ヨードステアリン酸カルシウム、糖酸カルシム、ステアリン酸カルシウム、カポベン酸、カプタン、カルバマゼピン、カルボクロラール、カルボフェノチン、カルボクオン、カロテン、カルバクロール、ケファエリン、ケファリン、チャウルムーグリン酸、ケノジオール、キチン、クロルダン、クロルフェナク、クロルフェネトール、クロロタロニル、クロロトリアニセン、クロルプロチキセン、クロルキナルドール、クロモナル、シロスタゾール、シンコニジン、シトラール、クリノフィブレート、クロファジミン、クロフィブレート、クロフルカルバン、クロニトレート、クロピドール、クロリンジオン、クロキサゾラム、コロクソン、コルチコステロン、クマクロール、クマホス、クミトエートクレシルアセテート（ｃｏｕｍｉｔｈｏａｔｅ  ｃｒｅｓｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、クリミジン、クルホメート、クプロバム、シアメマジン、シクランデレート、シクラルバメートシマリン、シペルネトリル、ダプソン、デホスファミド、デルタメトリン、デオキシコルチココステロン酢酸塩、デソキシメタゾン、デキストロモラミド、ジアセタゾト、ジアリホル、ジアチモスルホン、デカプトン、ジクロフルアニ、ジクロロフェン、ジクロルフェナミド、ジコホル、ジクリル、ジクマロール、ジエントロール、ジエチルスチルベストロール、ジフェナミゾール、ジヒドロコデイノンエノールアセテート、ジヒドロエルゴタミン、ジヒドロモルフィン、ジヒドロタキステロール、ジメステロール、ジメチステロン、ジオキサチオン、ジフェナン、Ｎ−（１，２−ジフェニルエチル）ニコチンアミド、ジピロセチル、ジスルファミド、ジチアノン、ドキセニトイン、ドラゾキソロン、デュラパタイト、エディフェンホス、エモジン、エンフェナム酸、エルボン、エルゴコルニニン、四硝酸エリスリチル、ステアリン酸エリスロマイシン、エスイトリオール、エタベリン、エチステロン、エチルビスクムアセテート、エチルヒドロクプレイン、エチルメンタンカルボキサルニド、オイゲノール、オイプロシン、エキサラミド、フェババメート、フェナラミド、フェンベンダゾール、フェニペントール、フェニトロチオン、フェノフィブレート、フェンキゾン、フェンチオン、フェプラゾン、フリルピン、フィリキシン酸、フロクタフェニン、フルアニゾン、フルメキン、フルオコルチンブチル、フルオキシメステロン、フルロチル、フルタゾラム、フマギリン、５−フルフリル−５−イソプロピルバルビツル酸、フサフンギン、グラフェニン、グルカゴン、グルテチミド、グリブチアゾール、グリセオフルビン、炭酸ガイアコール、リン酸ガイアコール、ハルシノニド、ヘマトプロフィリン、ヘキサクロロフェン、ヘキセステロール、ヘキセチジン、ヘキソバルビタール、ヒドロクロロチアジド、ヒドロコドン、イブプロキサム、イデベノン、インドメタシン、ナイアシン酸イノシトール、ヨーベンザム酸、ヨーセタム酸、ヨージパム酸、ヨーメグラム酸、イポデート、イソメテプテン、イソノキシン、２−イソバレリルインダン−１，３−ジオン、ジョサマイシン、１１−ケトプロゲステロン、ラウロカプラム、二酢酸３−Ｏ−ラウロイルピリドキソール、リドカイン、リンダン、リノレン酸、リオチロニン、ルセンソマイシン、マンゼブ、マンデル酸、イソアミルエステル、マジンドール、メベンダゾール、メブヒドロリン、メビキン、メラルソプロール、メルファラン、メナジオン、吉草酸メチル、メフェノキサロン、メフェンテルミン、メフェニトイン、メプリカイン、メスタノロン、メストラノール、メスルフェン、メテルゴリン、メタラタール、メタンドリオール、メタキアロン、３−メチルコラントレン、メチルフェニデート、１７−メチルテストステロン、メチプラノロール、ミナプリン、ミオラール、ナフタロホス、ナフトピジル、ナフタレン、乳酸２−ナフチル、２−（２−ナフチルオキシ）エタノール、サリチル酸ナフチル、ナプロキセン、ネアルバルビタール、ネマデクチン、ニクロサミド、ニコクロネート、ニコモルフィン、ニフロキン、ニフロキサジド、ニトラクリン、ニトロメルゾール、ノガラマイシン、ノルダゼパム、ノルエタンドロロン、ノルゲストリエノン、オクタベリン、オレアンドリン、オレイン酸、オキサゼパム、オキサゾラム、オキセラジン、オキシタザイン（ｏｘｗｔｈａｚａｉｎ）、オキシコドン、オキシメステロン、酢酸オキシフェニスタン、パラヘルクアミド、パラチオン、ペモリン、四酢酸ペンタエリスリトール、ペンチルフェノール、ペルフェナジン、フェンカルバミド、フェニラミン、２−フェニル６−クロロフェノール、フェントルメチルバルビツル酸、フェニトイン、ホサロン、フタリスルファチアゾール、フィロキノン、ピカデックス、ピファルニン、ピケトフェン、ピプロゾリン、ピロザジル、プラフィブリド、プラウノトール、ポラププレジンク、ポリチアジド、プロベネシド、プロゲステロン、プロメゲストン、プロパニジド、プロパルギット、プロファム、プロクアゾン、プロチオナミド、ピリメタミン、ピリミタト、パモ酸ピルビニウム、ケルセチン、キンボロン、キザロホエチル、ラホキサニド、レシンナミン、ロシベリン、ルンネル、サレン、スカーレットレッド、シッカニン、シマジン、シメトリド、ソブゾキサン、ソラン、スピロノラクトン、スクアレン、スタノロン、スクラルフェート、スルファベンズ、スルファグアノール、スリファサラジン、スルホキシド、スルピリド、スキシブゾン、タルブタール、テルギド、テストステロン、テトラブロモクレゾール、テトラドリン、チアセタゾン、チオコルヒチン、チオクト酸、チオキノックス、チオリダジン、チラム、Ｎ−イソアミルカルバミン酸チミル、チオキシダゾール、チオキソロン、トコフェロール、トルシクレート、トルナフテート、トリクロサン、トリフルサール、トリパラノール、ウルソル酸、バリノマイシン、ベラパルニル、ビンブラスチン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゼンブシン、キシラジン、ザルトプロフェンおよびゼアラレノンを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明とともに用いるのに適する生物学的活性を有する特別なクラスの疎水性分子は、それらの同種受容体を含む、インターフェロン、成長因子、ホルモン等のような細胞間調節因子およびメディエーターである。本明細書で述べる両親媒性コンジュゲートは、インターフェロンの水不溶性のために問題のあるものと証明されたインターフェロンの効率的投与に特に有効であると考えられる。本明細書で述べるミセル製剤の局所剤形は、両親媒性ポリマーミセルによる疎水性物質の封入に帰せられる予想外に加速された速度の経皮送達を示し得る。したがって、生物学的または薬学的活性を有するポリマー封入疎水性物質は、ローション剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、バルム剤、軟膏剤などのような局所剤形として調製することができる。これらの組成物は、水溶液の形態、または水中油型もしくは油中水型乳剤の形態であり得る。これらの組成物は、注射による投与、肺投与および経口または鼻経路による投与を含む、様々な経路により患者に投与するために製剤化することができる。本明細書で述べるミセルを含むこれらの製剤は、周知の添加物を場合によって含む、他の点では通常の製剤であり、当技術分野で承認されている技術を用いて調製することができる。
【００８８】
可溶化技術
患者へのそれらの送達を改善するために疎水性薬物を可溶化するために多くのアプローチが用いられてきた。既存の可溶化技術の概要を下の表Ａに示す。表に市販製品および臨床開発において使用された可溶化技術の代表的な一覧のみを示す。
【００８９】
【表１】
2014518842.tif 000007
【００９０】
抗癌剤として臨床開発中および使用中のＰＥＧコンジュゲートの概要
活性物質（薬物）を粉砕することは、スケーラビリティー、低いバッチ変動および大量の薬物の取扱いに際しての高い柔軟性などのいくつかの利点がある。活性物質を粉砕することの欠点は、結晶性薬物のみに適用でき、ＧＲＡＳリストの立体／イオン安定化剤が必要である可能性があり、オストワルド熟成が起こる可能性があり、長時間の粉砕によって、不安定性につながる、非晶質組成物の形成がもたらされる可能性があることである。
【００９１】
β−シクロデキストリンなどの修飾シクロデキストリンは、ＧＲＡＳおよびＦＤＡ承認済み賦形剤である。しかし、シクロデキストリンは、ゲスト分子の構造と空洞サイズとの間の厳密な相関を必要とする。シクロデキストリンはまた、対応する結合定数が高すぎる場合には、ＡＤＭＥパラメーターを著しく変化させ得る。活性物質の塩は、水溶解度の改善もたらすために用いることができ、場合によって、薬物動態プロファイルを有利に変化させるために用いることができる。塩は、処理用の薬物の融点も上昇させ得る。しかし、塩の形成には、適切なイオン性基が必要であり、また活性物質の塩は、ＦＤＡによって新薬とみなされ、別個の承認を必要とすることがあり得る。塩は、塩酸塩との共通イオン効果ももたらすこともあり得、水和物および多形の形成の傾向を有し、かつ／または薬物動態を変化させる。
【００９２】
界面活性剤および／またはポリマーミセルは、希釈による沈殿の傾向がさほど大きくなく、望ましくない副作用が最小限であり、有用な薬物送達システムであることが見いだされた。しかし、多くのミセルシステムは、それらの成分界面活性剤に関連する様々な程度の毒性を有し、負荷容量は不十分であり得、可溶化能は低すぎることがあり得る。それらの表面活性のため、界面活性剤分子は、浸透し、生物学的膜を崩壊させる可能性も有し、溶血性であり得る。
【００９３】
ミセルの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、インビボでの投与後のそれらの構造安定性を決定づけるものであり、ポリマーミセルは、界面活性剤ミセルより高い構造安定性を有する。しかし、文献に報告されているポリマーミセルの大部分は、長たらしく、複雑な合成手順により個々のモノマー単位から調製される合成ブロックコポリマーである。
【００９４】
小分子薬物のペグ化は、薬物における官能基の数によって制限され得る。小薬物分子のペグ化は、構造制約ももたらすことがあり得、薬物の結合および治療活性に影響を及ぼし得る。さらに、ＰＥＧの限られたコンジュゲーション（すなわち、薬物分子当たり１つのＰＥＧ）およびポリマー薬物−コンジュゲートによる限られた薬物負荷のため、高度に疎水性の薬物の水溶解度の増加は、さほど大きくない。したがって、現在用いられている薬物送達技術の多くの欠点を克服するには、改善された薬物送達システムが必要である。
【００９５】
ミセルおよびその用途
本発明は、疎水性水不溶性タンパク質および水溶性ポリマーを用いてミセルを調製する方法に関する。例えば、合成ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、疎水性水不溶性植物タンパク質であるゼインに共有結合によりコンジュゲートさせることができる。両親媒性ペグ化ゼインは、約０．０２５ｇ／ＬのＣＭＣで水中に分散させるとき、疎水性コアおよび親水性シェルを有する自己組織化ミセルを自発的に形成することができる。ミセルの直径は、例えば、約１０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約７５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍまたは約８０ｎｍ〜約２００ｎｍであり得る。
【００９６】
約３ｋＤａ以上のポリエチレングリコールによるゼインの共有結合修飾の後にのみナノミセルが形成されることが見いだされた。約５ｋＤａのＰＥＧ部分は、ゼインにコンジュゲートさせる場合、ミセル形成に特に適することが見いだされた。
【００９７】
ゼインは高分子量タンパク質（約２２〜２７ｋＤａ）であるため、ペグ化ゼインは、他の大部分の公知のポリマーミセルより安定なミセルを形成する。ミセルの形成に必要な濃度は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）として公知である。ＣＭＣは、水または血清による希釈時のミセルの安定性を決定づける。これの点について、ＣＭＣが低いほど、ミセルの安定性が高い。例えば、ドデシル硫酸ナトリウムは、約２．３０４ｇ／ＬのＣＭＣを有する。ペグ化ゼインのＣＭＣは、いくつかの実施形態において、０．０２５±０．００９５ｇ／Ｌであり、これは、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリマーの分子量によって０．３から１９０ｇ／Ｌまでの間で変化する、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドから調製された市販のブロックコポリマーミセル（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標））ポリマーのＣＭＣ値より低い。
【００９８】
ＰＥＧ−ゼインミセルは、例えば、封入もしくは安定性を増大させるために、または付加的もしくは多様な機能を与えるために、他の界面活性剤またはポリマーと組み合わせて、混合ミセルシステムを形成することができる。混合ミセルを形成するために用いることができる界面活性剤は、ＢＲＩＪ３５、ＢＲＩＪ５８Ｐ、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ８０、ＳＰＡＮ８０などの非イオン性界面活性剤、または胆汁酸塩、ドデシル硫酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤、またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）などの陽イオン界面活性剤を含み得る。
【００９９】
ＰＥＧ−プロラミングラフトコポリマーまたはブロックコポリマーは、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（ポリプロピレンオキシド−ｂ−ポリエチレンオキシド）、ポリ乳酸−ｂ−ＰＥＧ、ポリカプロラクトン−ｂ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ｂ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ＰＥＧ−ｂ−ポリ（２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート）−ｂ−ポリ（−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート）、ＰＥＧ−ｂ−ポリアミノ酸、ポリアスパラギン酸−ｂ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ｂ−ポリプロピレンオキシド−ｂ−ポリエチレンオキシド、ポリ乳酸−ｂ−ポリエチレンオキシド−ｂ−ポリプロピレンオキシド、ポリビニルピロリドン−ｂ−ポリ乳酸−ｂ−ポリビニルピロリドン、ポリ（（アスパラギン酸３−ベンジル）−ｇ−ＰＥＧ、キトサン−ｇ−ポリカプロラクトン−ｇ−ＰＥＧなどを含む他のポリマーとの混合ミセルを形成するために用いることができる。
【０１００】
同様に、リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ−ジアシル脂質などの脂質も、ゼイン−ＰＥＧコンジュゲートとの混合ミセルを形成するために用いることができる。カゼインなどの天然ポリマーも、ＰＥＧ−ゼインとの混合ミセルを形成するために組み合わせることができる。上述の界面活性剤、脂質、天然および合成ポリマーは、代表的な例にすぎず、ミセル中の界面活性剤、ポリマーまたは脂質の組成は、ＰＥＧ−ゼインとの様々な混合ミセルを形成するために変化させることができる。
【０１０１】
難溶性化合物のペグ化ゼインミセルへの封入は、両成分を９０容積／容積％エタノールなどの水性アルコール溶媒に共溶解した後、疎水性ゼインコア内への疎水性化合物（「カーゴ分子」）の分配を可能にするのに十分な時間（例えば、一夜）にわたりインキュベートすることによって達成することができる。インキュベートした後、水性アルコール溶媒を蒸発により除去して、薄膜を形成することができる。膜を緩衝液で復元して、薬物負荷ミセルを回収することができる。
【０１０２】
難溶性化合物の両親媒性ＰＥＧ−ゼインへの封入は、両成分を水性アルコール溶媒（９０容積／容積％エタノール）に共溶解した後、疎水性ゼインコア中への疎水性化合物の分配を可能にするためにインキュベートすることによっても達成することができる。インキュベートした後、水性アルコール溶媒を例えば、水に対する徹底的な透析によって除去することができる。アルコールの完全な除去により、薬物負荷ミセルの形成がもたらされる。
【０１０３】
あるいは、凍結乾燥法を用いて、ＰＥＧ−ゼインミセルを調製することもできる。難溶性化合物及びＰＥＧ−ゼインを水／ｔｅｒｔ−ブタノール溶媒混合物に溶解した後、凍結乾燥により溶媒を除去することができる。凍結乾燥生成物を水性ビヒクルまたは緩衝液で復元することにより、ミセルが自発的に形成する。
【０１０４】
ペグ化プロラミンミセルは、多くの重要な用途を有する。例えば、それらは、約１〜６．５の範囲（オクタノール／水）またはそれ以上のＬｏｇＰを有する疎水性化合物などの製薬および関連産業にとって関心のある疎水性化合物の溶解度を増大させるために用いることができる。いくつかの実施形態において、約６０％〜約９５％の封入効率は、本明細書で述べるミセルを用いて達成することができる。本明細書で述べるミセルは、インビトロまたはインビボ環境における最長約１週間または最長約２週間にわたる封入カーゴ分子の持続放出をもたらし得る。
【０１０５】
ミセルのＣＭＣ、サイズおよび封入効率も、ペグ化の程度、用いるＰＥＧ部分の分子量（ｍ．ｗ．）およびミセルを調製するのに用いる薬物とポリマーとの比率を変化させることによって変化させることができる。例えば、ＣＭＣは、高分子量ＰＥＧを用いることにより低下させることができる。同様に、ＣＭＣは、ＰＥＧ−ゼインコンジュゲートにおけるＰＥＧ鎖の数を最適化することにより低下させることができる。薬物とＰＥＧ−ゼインとの比率がより低いことも、ミセルサイズがより小さくなることにつながり得る。他方で、薬物／ＰＥＧ−ゼイン比の増加により、封入効率およびミセルにおける負荷効率が増加し得る。ゼイン疎水性コアまたはＰＥＧシェルを架橋させることによっても負荷効率が増加し得る。架橋はまた、ミセルからのカーゴ分子の放出をさらに持続させるために用いることができる。さらに、ターゲティングリガンドの表面コンジュゲーションを用いて、ミセルを体内の特定の組織、例えば、癌組織に特異的に導くことができる。
【０１０６】
抗癌薬負荷ペグ化ゼインミセルは、ミセルを調製するときに、対象の抗癌薬を溶解ペグ化ゼインとともに溶解することによって調製することができる。これら薬物負荷ミセルは、抗癌薬の細胞取込みを著しく改善し、遊離の薬物より有効である。抗癌薬の細胞取込みは、ＨＰＬＣ分析を用いて細胞内薬物濃度を測定することによって判断することができる。図３０および３１ならびにそれらの説明を参照のこと。遊離薬物と比較した薬物負荷ミセルの有効性は、薬剤耐性ヒト癌細胞の細胞生存率を測定し、５０％の細胞を殺滅するのに必要な濃度を決定する（すなわち、ＩＣ５０値を決定する）ことによって評価することができる。薬物負荷ミセルは、遊離薬物より有意に低いＩＣ５０を有していた。例えば、図１７、２８および２９ならびにそれらの説明を参照のこと。
【０１０７】
ペグ化ゼインミセルに封入された抗癌薬が薬剤耐性癌に対して有効であることも驚くべきことに発見された。この発見は、Ｐ糖タンパク質排出ポンプの基質である蛍光マーカーであるカルセインアセトキシメチルエステル（カルセインＡＭ）を用いた薬剤耐性ヒト癌細胞の分析により見いだされた。ある種の癌におけるＰ糖タンパク質排出ポンプの過剰発現が薬剤耐性をもたらす。ミセルは、Ｐ糖タンパク質排出ポンプを抑制し、分光蛍光分析により測定されるカルセインの細胞内濃度を増加させることができた。図３２およびその説明を参照のこと。したがって、ＰＥＧ−ゼインミセルは、Ｐ糖タンパク質排出ポンプを抑制し、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌及び神経膠芽腫の薬剤耐性株などの薬剤耐性癌における抗癌薬の細胞取込みを増大させることができる。ミセルのコアにおける疎水性化合物の封入はまた、光線下で室温で保存した遊離薬物溶液または薬物負荷ミセル分散の種々の時期（例えば、最大１２時間まで）における薬物濃度を測定することによって判断されるように、環境要因による分解に対抗して不安定化合物を安定させるものである。薬物の濃度は、ＵＶ−可視分光法により測定した。
【０１０８】
さらに、ペグ化ゼインミセルは、疎水性薬物の水溶性／水分散性製剤を開発するのに用いることができる。ミセルはサイズが小さい（例えば、直径が約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ）ため、それらを例えば、疎水性薬物のＩＶ投与に用いることができる。それらは、非経口、経口、鼻、経皮、眼及び他の薬物投与経路による水不溶性薬物の生物学的利用能を改善するためにも用いることができる。凍結乾燥薬物（水不溶性薬物）負荷ミセルは、注射の前に水で容易に希釈することができる。凍結乾燥薬物負荷ミセルは、カプセルまたは他の適切な製剤マトリックスに組み込むことができる。投与後、ミセルが胃腸内の腸液中で形成し、水不溶性薬物の溶解度および吸収の増加をもたらす。さらに、ペグ化ゼインミセルは、生体適合性かつ生分解性であり、それにより、ヒトにおけるそれらの安全性プロファイルを向上させる。
【０１０９】
本発明の１つの態様において、ミセルは、治療および／または診断用ミセル製剤、例えば、抗癌薬含有ミセルとして用いることができる。そのようなミセルは、小分子薬、核酸、タンパク質、ワクチン、受容体、ホルモン、細胞、抗体、化学または他の作用因子もしくは物質などのしばしば治療薬である活性物質の標的送達および放出の時間的制御をもたらし得る。述べた治療方法に加えて、本発明は、染料、造影剤、プローブなどの診断薬を含むミセルを製造する手段を提供する。
【０１１０】
腫瘍への標的送達のために親水性シェルにターゲティングリガンドを結合させることなどの特定の用途のために、プロラミン−ポリマーコンジュゲートの修正を行うことができる。例えば、特定のターゲティングリガンドの受容体を過剰発現する癌細胞を標的とするために、葉酸、抗体などをＰＥＧシェルに結合させることができる。
【０１１１】
本明細書で述べた方法を用いて形成したゼインミセルは、特に体外の他の用途を有し得る。例えば、薬物負荷ペグ化ゼインミセルは、心血管および他の生物医学機器用のコーティング材料として用いることができる。薬物送達に関して本明細書で述べたが、ミセルは、食品、酪農および化粧品産業にとって関心のある分子を封入し、その放出を持続するためにも用いることができる。ヒト用薬物に加えて、動物用薬物もミセルに封入することができる。ペグ化ゼインミセルは、加水分解、酸化、光劣化および他の劣化反応などの劣化から分子を保護するために用いることができる。この利用は、製薬、食品、酪農、農業、栄養補助食品および化粧品産業にとって関心のある分子を含む。
【０１１２】
式Ｉの変形形態
式Ｉ〜Ｖは、さらなる実施形態を提供するためにさらに修飾することができる。ゼインを例として挙げる実施形態において、別の種類のプロラミンをゼインの代わりに用いて、別の実施形態を提供することができる。例えば、ゼイン（Ｚ）およびＰＥＧに加えて、他の疎水性（Ｘ）または親水性ポリマー（Ｙ）も式Ｉ〜Ｖのいずれかにコンジュゲートして、グラフトコポリマーまたはＡＢＣ型マルチブロックコポリマーを形成することができる。ここで、Ａ、ＢおよびＣは、異なるモノマー単位のポリマーブロック部分である。これらの変形形態の例としては、式ＶＩ〜ＩＸなどが挙げられる。
Ｚ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｘ（ＶＩ）
Ｚ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｙ（ＶＩＩ）
ＰＥＧ−ｂ−Ｚ−ｂ−Ｙ（ＶＩＩＩ）
ＰＥＧ−ｂ−Ｚ−ｂ−Ｘ（ＩＸ）
【０１１３】
ここで、Ｘは、疎水性ポリマー部分であり、Ｙは、親水性ポリマーであり、ＺおよびＰＥＧは、式Ｉについて定義したとおりである。
【０１１４】
一般式Ｉの親水性ポリマーＰＥＧは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デキストランなどの多糖などの他の親水性ポリマー（Ｙ）と置き換えることができる。同様に、疎水性ポリマー（Ｘ）は、プロラミン（例えば、ゼイン）にコンジュゲートすることができる。そのような疎水性ポリマー（Ｘ）は、例えば、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸、ポリプロピレンオキシド、ポリアスパラギン酸エステル、ポリグルタミン酸エステル、スペルミン、ポリリシン、またはポリメタクリル酸エステル、ポリジメチルアミノエチルアクリレートなどのポリアクリレートなどであり得る。脂肪酸もプロラミンにコンジュゲートして、疎水性コアを形成することができる。そのような脂肪酸の例としては、例えば、ステアリン酸、パルミチン酸、ホスファチジルエタノールアミンおよびオレイン酸などがある。
【０１１５】
プロラミン疎水性コアおよび／または親水性ＰＥＧシェルに他のおよび／または付加的な修飾を行うことができる。これらの修飾は、ｐＨ感受性ミセルを調製するためにポリヒドロキシエチルメタクリレート、または熱感受性ミセルを調製するためにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などの刺激応答エレメントをコアにコンジュゲートすることを含み得る。さらに、薬物の放出を制御するため、ならびに薬物の封入および負荷効率を増大させるために、プロラミン疎水性コアまたは親水性シェルを架橋させることができる（例えば、グルタルアルデヒド、ゲニピンまたはクエン酸などの架橋剤を用いて）。
【０１１６】
ミセルの医薬製剤
本明細書で述べるミセルは、治療用医薬組成物を調製するのに用いることができる。ミセルは、水性分散体の形態で、または凍結乾燥ミセルの乾燥粉末として組成物に加えることができる。本明細書で述べるミセルは、医薬組成物として製剤化し、ヒト患者などの哺乳類宿主に様々な形態で投与することができる。形態は、選択される投与経路、例えば、経口または非経口投与、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路に具体的に適合させることができる。
【０１１７】
本明細書で述べるミセルは、不活性希釈剤または同化性可食性担体などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて全身投与することができる。経口投与のために、ミセル分散体を硬性もしくは軟性シェルゼラチンカプセルに封入することができ、あるいは凍結乾燥ミセルを錠剤に圧縮するか、または患者／対象の食事の食品に直接組み込むことができる。ミセル分散体または凍結乾燥ミセルは、１つまたは複数の賦形剤と組み合わせることもでき、摂取用錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハなどの形態で用いることができる。そのような組成物および製剤は、一般的に少なくとも０．１重量％の活性治療または診断薬を含む。組成物および製剤中の薬剤の重量百分率は、異なる可能性があり、好都合には所定の単位剤形の重量の約２％から約６０％であってもよい。ミセルを含むそのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効投与レベルを得ることができるようなものである。
【０１１８】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下の１つまたは複数も含み得る。すなわち、トラガントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤ならびにステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤。ショ糖、果糖、乳糖もしくはアスパルテームなどの甘味料、またはペッパーミント、冬緑油もしくはチェリーフレーバーなどの着香料を加えることができる。単位剤形がカプセル剤の場合、それは、上記の種類の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含み得る。他の様々な物質がコーティングとして、または固形単位剤形の物理的形態を他の方法で改善するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などで被覆することができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、甘味料としてのショ糖または果糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料ならびにチェリーまたはオレンジフレーバーなどの着香料に加えてミセルを含み得る。単位剤形を調製するのに用いられる物質は、用いられる量で薬学的に許容され、実質的に非毒性であるべきである。さらに、ミセル分散体または凍結乾燥ミセルは、さらなる徐放性製剤及び機器に組み込むことができる。
【０１１９】
ミセル分散体は、静脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腫瘍周囲または注入もしくは注射により投与することができる。ミセルの分散体は、緩衝液と場合によって混合した水中で、または他の薬学的に許容される溶媒もしくはそれらの混合物で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、製剤は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含んでいてもよい。
【０１２０】
注射または注入に適する医薬剤形は、無菌水溶液、分散体、あるいは無菌注射溶液もしくは注入溶液または分散体の即時の調製に適合させたミセルを含む無菌粉末を含み得る。最終剤形は、無菌流体であり、製造および保存条件下で安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの適切な混合物を含む液体分散媒体であり得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンによりもたらすことができる。
【０１２１】
無菌注射溶液は、必要な量のミセルを、必要に応じて上で列挙した様々な他の成分を含む適切な溶媒に混入した後、ろ過滅菌することにより調製することができる。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は、ミセルとあらかじめ無菌ろ過した溶液中に存在するさらなる所望の成分の粉末を生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥技術を含み得る。
【０１２２】
局所投与については、例えば、固体、液体、ゲル、クリーム、軟膏またはペーストであり得る皮膚科学的に許容される担体と組み合わされた組成物または製剤としてミセルを皮膚に投与することが一般的に望ましい。有用な固体担体は、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微細固体を含む。有用な液体担体は、水、またはミセルを場合によって非毒性界面活性剤を用いて有効なレベルで分散させることができる、水−アルコール／グリコール／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ブレンドを含む。香料などの佐剤および付加的な抗菌薬は、所定の用途向けの特性を最適化するために加えることができる。流体組成物は、包帯および他の包帯剤に含浸させるために用いられる吸収性パッドから適用するか、またはポンプ型もしくはエアゾール噴霧器を用いて罹患部位上に噴霧することができる。
【０１２３】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾鉱物材料などの粘稠化剤も、使用者の皮膚に直接適用するための広げられるペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、せっけんなどを形成するために液体担体とともに用いることができる。
【０１２４】
皮膚に活性物質を送達するための皮膚科的組成物（例えば、薬剤負荷ミセル）の例は、当技術分野に公知である。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６０８，３９２号（Ｊａｃｑｕｅｔら）、第４，９９２，４７８号（Ｇｅｒｉａ）、第４，５５９，１５７号（Ｓｍｉｔｈら）および第４，８２０，５０８号（Ｗｏｒｔｚｍａｎ）を参照のこと。そのような皮膚科的組成物は、本明細書で述べるミセル製剤と組み合わせて用いることができる。
【０１２５】
本明細書で述べる薬物負荷ミセルの有用な用量は、それらのインビトロ活性および動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウスおよび他の動物における有効量のヒトへの外挿の方法は、当技術分野に公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９３８，９４９号（Ｂｏｒｃｈら）を参照のこと。治療における使用に要求されるミセル中に負荷される化合物または活性塩、プロドラッグまたはその誘導体の量は、選択される個別の化合物または塩によってだけでなく、投与経路、治療される状態の性質ならびに患者の年齢および状態によっても異なり、最終的には担当医師または臨床医の裁量による。
【０１２６】
治療薬負荷ミセルは、例えば、単位剤形当たり５〜１０００ｍｇ／ｍ２、好都合には１０〜７５０ｍｇ／ｍ２、最も好都合には５０〜５００ｍｇ／ｍ２の有効成分を含む単位剤形で好都合に投与することができる。所望の用量は、単一用量で、または例えば、１日当たり２、３、４もしくはそれ以上の分割量として適切な間隔で投与される分割量として好都合に提供することができる。分割量自体を例えば、多数のおおまかな間隔の離散的な投与にさらに分けることができる。
【０１２７】
本明細書で述べる薬物負荷ミセルは、有効な抗腫瘍薬であり、非ミセル封入抗腫瘍薬と比較したとき高い効力および／または低毒性を有し得る。本発明は、本明細書で述べる有効量の組成物を癌を有する哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における癌を治療する治療方法を提供する。哺乳動物は、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウシなどを含む。癌は、様々な種類の悪性新生物、例えば、大腸癌、乳癌、黒色腫及び白血病を指し、一般的に望ましくない細胞増殖、例えば、制御されていない増殖、分化の欠如、局所組織浸潤および転移によって特徴づけられる。
【０１２８】
癌を治療する本発明の化合物の能力は、当技術分野に周知のアッセイを用いることによって判断することができる。例えば、治療プロトコールの設計、毒性評価、データ解析、腫瘍細胞殺滅の定量化および可移植性腫瘍スクリーニングの使用の生物学的意味が公知である。
【０１２９】
以下の実施例は、上記の発明を例示するものであり、その範囲を狭めるものと解釈すべきではない。当業者は、実施例が本発明を実施し得る他の多くの方法を示唆することを容易に認識する。本発明の範囲内に留まりながら多くの変形形態及び修正形態を行うことができることを理解すべきである。
【実施例１】
【０１３０】
ペグ化ゼインの調製およびミセル形成
約８０ｎｍ〜約２００ｎｍの間のサイズ範囲分布を有するペグ化ゼインナノミセルを本明細書に記述したとおり調製した。図２および図３は、様々な実施形態によるＰＥＧ−ゼインの段階的な調製を例示している。メトキシＰＥＧ−スクシニミジルスクシネート（ｍ．ｗ．１０００、２０００または５０００Ｄａ）０．１ｇを、９０％エタノール５ｍＬ中の白色ゼイン０．１ｇに添加することによって、ペグ化ゼインを調製した。この混合物を特定の比（１：１、ｗ／ｗ）で、３７℃、３時間（５０ｒｐｍで撹拌）インキュベートした。３時間後、過剰のＰＥＧエステルを失活させるために、グリシン（１Ｍ）水溶液１ｍＬを添加した。次に、ペグ化ゼインを析出させるために、５ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。次に、室温（約２３℃）で２４時間、磁気撹拌器（１００ｒｐｍ）中で、析出したペグ化ゼインの分散液を脱イオン水に対して直接透析し（ｍ．ｗ．カットオフ＝約１０，０００Ｄａ）、遊離ＰＥＧ、グリシンおよびエタノールを除去した。得られた生成物を−８０℃に凍結し、次いで−４７℃、６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。
【０１３１】
ｍ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（５ｋＤａ）を使用して、ゼイン中のアミノ基とアミド結合を形成させた。コンジュゲートは、ＦＴＩＲを使用して確認した。ゼインのアミドＩおよびＩＩのタンパク質ピークは、１６５０ｃｍ−１および１５００〜１５４０ｃｍ−１でそれぞれ観察された。ＰＥＧのＮＨＳエステルピークは、１７４０ｃｍ−１に観察され、このピークはゼインとのコンジュゲート後に消失した（図４）。さらに、サイズ排除クロマトグラフによって（ＳＥＣ）このコンジュゲートの特性評価を行った。図４で分かるとおり、ＰＥＧ−ゼインコンジュゲートは７分で溶出し、ゼインは２３分で溶出した。一方、ＰＥＧは２９分で溶出した。
【０１３２】
様々な分子量のＰＥＧコンジュゲートゼインについて観察されたペグ化効率は、以下の表１に示されており、この効率はトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用して測定した。ゼイン中の表面アミノ基は、ペグ化に関与することが分かった。ＴＮＢＳアッセイを使用して、ペグ化前後のゼイン中の遊離アミノ基を見積もった。波長４４０ｎｍにおける吸光度に対して、純粋なゼインおよびペグ化ゼインの濃度を増加させて標準曲線を作成した。ペグ化効率は、以下の公式を使用して算出した。
ペグ化効率の％＝［ａ−ｂ／ａ］ｘ１００
【０１３３】
式中、ａ＝非ペグ化ゼインの濃度対吸光度の傾きであり、ｂ＝ペグ化ゼインの濃度対吸光度の傾きである。標準曲線を構成するために使用したゼインの濃度範囲は、０．３５７ｍｇ／ｍＬ〜１２ｍｇ／ｍＬであり、また相関係数は０．９９９４であった。
【０１３４】
【表２】
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【０１３５】
表２に示されるデータによって例示されるとおり、ＰＥＧ＞３０００Ｄａを使用して、より小さなサイズのＰＥＧ−ゼインミセルを形成した。図１に概略的に例示したとおり、ペグ化ゼインは水性環境中で自己組織化し、疎水性コアおよび親水性シェルを有するナノミセル（約１００ｎｍ）を形成する。
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
ＰＥＧ−ゼインのコア−シェル構造：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、ゼインとＰＥＧ５０００Ｄａの両方の疎水性および親水性部分に対応する１Ｈ  ＮＭＲ共鳴ピークが、ＮＭＲスペクトルにおいてはっきりと観察される（図５）：ＰＥＧメチレン共鳴の３．５６ｐｐｍ、およびタンパク質／アミド共鳴の３．３６ｐｐｍである。対照的に、Ｄ２Ｏ中では、ＰＥＧ共鳴ピークしか検出されず、ゼインピークは観察されなかった。この結果により、ＰＥＧ−ゼインミセルのコア−シェル構造が裏付けられた。重水（Ｄ２Ｏ）中では、ゼインが水に不溶なので、ゼインのタンパク質ピークは観察されない。しかし、ＰＥＧは水溶性なので、Ｄ２Ｏ中でＰＥＧピークが観察される。ＰＥＧ−ゼインミセルの場合、ＰＥＧブロックからなるシェルは、Ｄ２Ｏ中で良好に溶媒和物を形成し、それ故に、明瞭なＮＭＲスペクトルのピークを示す一方、ミセルのコアを構成しているゼインの共鳴ピークは、ミセルコア内部に溶媒および溶媒和作用が不足しているために、観察されなかった。しかし、ＤＭＳＯはミセルを可溶性にして分解させ、こうしてＰＥＧとタンパク質の両方を溶媒和することができ、これにより分子の両方の部分に対応するピークを記録することが可能になる（図５）。
【０１３８】
ミセル形成に必要な濃度は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）として知られている。このＣＭＣ値により、水によって希釈したときのミセルの安定性が決まる。ペグ化ゼインについてのＣＭＣは０．０２５±０．００９５ｇ／Ｌであり、この値は、プローブとしてピレンを用いて決定した（図７）。ゼインの分子量は比較的大きいので、ゼイン分子は、ゼインミセルがより低いＣＭＣ値であることによって示されるとおり、他のポリマーミセル（例えば図６を参照されたい）よりも安定なミセルを形成する。図６は、ペグ化ゼインの対数濃度（ｇ／Ｌ）に対して、３３９ｎｍおよび３３４ｎｍ（発光波長は３９０ｎｍである）の励起波長において、ピレン（０．６ＩＬＩＭ）の吸光度比をプロットしたものを例示している。ＣＭＣ（すなわち、ミセル形成濃度）において、ペグ化ゼインの濃度が増加するにつれて、ピレンの吸光度の強度が著しくシフトしている。
【０１３９】
緩衝液によって希釈した際に、ミセルの粒子サイズは大きく変化しておらず、このことはミセルの安定性を示している（図６）。調製したＰＥＧ−ゼインミセルは、マウスに皮下投与後、ゼイン特異性抗体が何ら存在しないことによって確認されたとおり、非免疫原性であった（図８）。ＰＥＧ−ゼインミセル中に負荷させた様々な疎水性化合物に関する粒子サイズおよび封入効率のまとめを、以下の表３に示す。
【０１４０】
【表４】
2014518842.tif 000010
【実施例２】
【０１４１】
ドキソルビシンを封入したペグ化ゼインミセル
ドキソルビシンは、とりわけ乳癌および卵巣癌の治療に広く用いられている抗癌薬である。しかし、ドキソルビシンの臨床使用は、骨髄抑制および慢性心毒性などの深刻な副作用によって制限されており、この副作用はうっ血性心不全をもたらす恐れがある（Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ（１９９７），Ｄｒｕｇｓ  ５４  Ｓｕｐｐｌ  ４：１−７）。ドキソルビシンの他の制限は、化学療法への耐性発現である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：４８−５８）。ドキソルビシンは、分子量（ｍ．ｗ．）が５４３．５、ＬｏｇＰが１．２を有しており、水にはほとんど不溶で、メタノール、エタノールおよびＤＭＳＯに可溶である。
【０１４２】
【化５】
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【０１４３】
低分子量の界面活性剤ミセルと比較すると、ポリマーミセルは、低臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）で一般により安定であり、分解はより遅く、負荷ドキソルビシンを一層長い期間保持することが可能になり、結局、より多くの薬物を標的部位に蓄積することを実現する。こうした選択的な受動標的（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）能は、浸透性および保持効果の向上によるものであり、血管構造の漏れおよび腫瘍組織中のリンパ排液の欠如から生じる（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６５：２７１−２８４）。
【０１４４】
水不溶性のドキソルビシン塩基は、その塩酸塩から抽出した。塩酸ドキソルビシン（０．０１２ｇ）を１００ｍＬの脱イオン水（０．２２μｍでろ過）に溶解し、１０分間磁気撹拌して、ドキソルビシンを完全に可溶化させた。１０のその溶液のｐＨは７．２であった。トリエチルアミン（０．２ｍＬ）を加え、次に３０分間磁気撹拌して均一な混合にした。得られた溶液のｐＨは１２であった。この水溶液にクロロホルム１００ｍＬを加えて、１５分間磁気撹拌した。得られたエマルションを分液漏斗中で激しく振り、クロロホルム層を回収した。この手順を３回繰り返し、塩基を完全に回収した。画分を一緒にして濃縮し、減圧下で乾燥した（ロータリーエバポレータ上）。この乾燥残渣をクロロホルム中に再溶解し、飽和塩化ナトリウム水溶液ですすいだ。丸底フラスコ中にクロロホルム層を分離し、ロータリーエバポレータ上で完全に濃縮して乾燥した。丸底フラスコ中のドキソルビシン塩基を、オーブン中（遮光条件下）、３７℃で４８時間維持し、完全に乾燥させた。生成物は、使用するまで４℃で保管した。
【０１４５】
図２０および図２１は、それぞれ薄膜法および透析法を使用する、ドキソルビシン負荷ＰＥＧゼインミセルの段階的な調製を例示している。薄膜法および透析法の両方において、ＰＥＧゼイン０．１ｇおよびドキソルビシン０．００１ｇを２０ｍＬの９０％エタノールに溶解した。この混合物を、３７℃で一晩インキュベートし（磁気撹拌子、５０ｒｐｍで撹拌）、ドキソルビシンを疎水性ゼインコア内に分配させた。一晩インキュベートした後、減圧下、回転式蒸発により水性アルコール溶媒を完全に留去し、薄いフィルムを形成した。ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの乾燥フィルムを、クエン酸緩衝液ｐＨ７．４中で復元し、５分間音波処理して均一な懸濁液を形成した。次に、磁気撹拌器中、この混合物を水に対して透析した（ｍ．ｗ．カットオフ＝約１０，０００Ｄａ）。
【０１４６】
透析法に関しては、一晩インキュベートした後、この混合物を磁気撹拌器（１００ｒｐｍ）中、室温、２４時間水に対して透析し（ｍ．ｗ．カットオフ＝約１０，０００Ｄａ）、いかなる残留物も除去した。次に、得られた生成物を−８０℃で凍結し、次いで−４７℃、６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した（図２１）。凍結乾燥生成物を、４℃の冷蔵条件下、デシケータ中に保管した。以下の表４は、それぞれ薄膜法および透析法を使用して調製したドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルの様々な特性を例示している。
【０１４７】
【表５】
2014518842.tif 000012
【０１４８】
遊離ドキソルビシン、封入ドキソルビシンの量、インビトロ放出検討の間の放出量、および細胞取込みを、蛍光検出器（励起として５０５ｎｍおよび発光波長として５５０ｎｍ）を用い、移動相がトリフルオロ酢酸（０．１％（ｖ／ｖ））およびアセトニトリル（３分まで５％（ｖ／ｖ）、１１分まで８０％（ｖ／ｖ）、および２２分まで５％（ｖ／ｖ））から構成される、１ｍＬ／ｍｉｎの流速のグラジエントＨＰＬＣを使用して定量した。
【０１４９】
【数１】
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【０１５０】
図２２および図２３はそれぞれ、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示している。
【０１５１】
ドキソルビシンは、水にはほとんど溶けない（１５ｎｇ／ｍＬ）。しかし、ペグ化ゼインミセルに組み込まれると、その溶解度が約１０００倍に向上した（１０μｇ／ｍＬ）。図２４は、リン酸緩衝液ｐＨ７．４中、９０％エタノール中のドキソルビシン、およびｐＨ７．４のＰＢＳ中のドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルのＵＶ可視スペクトルをそれぞれ例示している。ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインの吸光度は、９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解しているドキソルビシンの吸光度よりも高く、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセル（１０００倍向上）の水溶解度が向上したことを示している。
【０１５２】
図２５は、リン酸緩衝液ｐＨ７．４中、９０％エタノール中のドキソルビシンおよびｐＨ７．４のＰＢＳ中のドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルの蛍光スペクトルを、それぞれ示している。ドキソルビシンの溶解度が向上したことにより、ペグ化ゼインミセル中に捕捉された後のｐＨ７．４のＰＢＳ中のドキソルビシンの蛍光が著しく増大（約５０倍）している。ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを図２６に示す。ドキソルビシンの融解ピークが存在しないことは、ミセルのコア内部にドキソルビシンが封入されていることを示している。ＰＥＧ−ゼインミセル由来のドキソルビシンのインビトロ放出を、図２７に例示している。ドキソルビシンの放出は、約２４時間持続した。このように、ペグ化ゼインミセルはドキソルビシンの有望な担体である。
【０１５３】
本明細書に記述したとおりに調製したドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルの治療活性を、ドキソルビシン感受性ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）およびドキソルビシン耐性ヒト卵巣癌細胞（ＮＣｌ／ＡＤＲ／ＲＥＳ）、ならびにドキソルビシン感受性ヒト乳癌細胞系（ＭＣＦ−７）を対象に、インビトロ試験した。図２８は、ドキソルビシン（９０％エタノールに溶解）およびＭＣＦ−７細胞中のＰＥＧ−ゼインミセルのインビトロ細胞毒性プロファイルを例示している。ウェルあたり２０００個の播種密度の細胞を、７．８ｎＭ〜５００ｎＭの濃度のドキソルビシン溶液およびドキソルビシンミセルに暴露した。２４時間後、それぞれの薬物処理を解除した。細胞を氷冷リン酸緩衝液により２度洗浄し、新鮮な培地に交換した。培地を４８時間毎に交換した。５日目に、ＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性解析を行なった。
【０１５４】
ドキソルビシンミセルに対するＩＣ５０値は、純粋なドキソルビシン処理の半分であった。図２９は、ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞系における、ドキソルビシン塩基（９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解）およびＰＥＧ−ゼインミセルのインビトロ細胞毒性プロファイルを例示している。ウェルあたり２０００個の播種密度の細胞を、３１．２５ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度のドキソルビシン塩基およびドキソルビシンミセルに暴露した。２４時間後、それぞれの薬物処理を解除した。細胞を氷冷リン酸緩衝液により２度洗浄し、新鮮な培地に交換した。培地を４８時間毎に交換した。５日目に、ＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性解析を行なった。ドキソルビシンミセルに対するＩＣ５０値は、遊離ドキソルビシン処理よりも４分の１倍低かった。ヒト癌細胞系におけるドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルのインビトロ細胞毒性アッセイの結果は、ペグ化ゼインミセル中に負荷したドキソルビシンは、遊離ドキソルビシン溶液よりも有効性のかなり高い効力を有していることを示した。この効力の差異はドキソルビシン負荷ペグ化ゼインミセルと比較して、遊離薬物の細胞取込み速度には差があることに起因し得る。
【０１５５】
遊離ドキソルビシンは、濃度勾配に従う受動的拡散によって取り込まれる一方、ドキソルビシン負荷ミセルは、活発なエンドサイトーシス過程によって取り込まれる。図３０は、ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞系におけるドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの細胞取込みに対する温度効果を例示している。細胞を４℃で２時間、プレインキュベートした。２時間後、細胞をｐＨ７．４のＰＢＳによって２度洗浄し、ミセル（ドキソルビシン５μｇ／ｍＬに相当する量）により処理した。２時間後、この処理を解除し、細胞を氷冷ｐＨ７．４のＰＢＳにより２度洗浄し、ＨＰＬＣ分析を使用して、様々な時間間隔で細胞溶解物中のドキソルビシン含量を見積もった。
【０１５６】
細胞取込みは低温ではかなり減少し、ＰＥＧ−ゼインミセルの細胞取込みが、活発なエンドサイトーシス過程であることを示した。図３１は、ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞系における、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルおよびドキソルビシン溶液（ドキソルビシンまたはドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセル５μｇ／ｍＬ（５０００個の細胞／ウェル））の細胞取込み速度を例示している。時間ポイントのすべてにおいて、未加工（ｐｌａｉｎ）のドキソルビシン溶液と比較すると、ドキソルビシンミセルの方が、細胞取込みが多いことを観察した。さらに、ドキソルビシンミセルのエンドサイトーシス取込みは、抵抗性癌細胞における薬物排出ポンプに打ち勝ち、こうして薬効が高められた。
【０１５７】
図３２は、ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞における、Ｐ−ｇｐ活性（カルセインＡＭアッセイ）に対する、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８処理（１ｍｇ／ｍＬ）、およびブランクのＰＥＧゼインミセル（０．０５０ｍｇ／ｍＬ）の影響を例示している。カルセインＡＭは、非蛍光性であり、細胞中に容易に拡散する。カルセインはそうではないが、カルセインＡＭはＰ−ｇｐに対する基質である。Ｐ−ｇｐ阻害剤の存在下で、カルセインＡＭは細胞に入り、細胞内エステラーゼによってカルセインに変換される。細胞内のカルセイン濃度の増加に伴い、蛍光が増大した。図３２に例示されたデータから、ブランクのＰＥＧ−ゼインミセルでは、有意なＰ−ｇｐ阻害が観察されていることは明白である。標的リガンドが結合して、インビボ標的部位への、薬物負荷ＰＥＧ−ゼインナノミセルの送達を促進することもできる。
【０１５８】
図３３は、同種移植片マウス腫瘍モデルにおける、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルのインビボ生体分布を示している。本検討では、雌のヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用した。ＪＣマウスの乳癌細胞（１ｘ１０７個の細胞）をＰＢＳ中で分散し、皮下注射した。腫瘍体積が約１５０〜２００ｍｍ３に到達すると、ドキソルビシン溶液またはドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセル（３ｍｇ／ｋｇ）の静脈注射物を動物に与えた。３時間後、マウスを犠牲にし、臓器（肝臓、心臓、肺、脾臓、脳および腫瘍）を採取し、組織ホモジナイザーを使用して２ｍＬ脱イオン水中でホモジナイズした。ダウノルビシン（内部標準）１００ｎｇを添加後、組織ホモジネートを凍結乾燥した。
【０１５９】
乾燥組織を秤量して、振とう器を使用してメタノール／クロロホルム混合物（６５：３５）５ｍＬにより、室温、暗所で５時間抽出した。抽出物は４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。この上澄み液を窒素ガス下で蒸発させて、メタノール／アセトニトリル（５０：５０）で復元した。逆相ＨＰＬＣ法（２７（アセトニトリル）：７３（２０ｍＭリン酸水素カリウム（一塩基）緩衝液（ｐＨ：２．５））を使用し、蛍光検出器（励起波長５０５ｎｍおよび発光波長５５０ｎｍ）を使用して、臓器中のドキソルビシン量を定量した。臓器中のドキソルビシン量を、乾燥臓器ｍｇあたりの量（ｎｇ）として表した。
【０１６０】
図３０で観察し得るとおり、腫瘍中でより高い薬物蓄積が見られた一方、腫瘍中の遊離ドキソルビシン溶液の薬物蓄積はなかった。遊離ドキソルビシン溶液試料と比較すると、ドキソルビシンＰＥＧ−ゼインミセルでは、心臓組織および腎臓組織中の薬物濃度が著しく低かった。ドキソルビシン化学療法は、心臓および腎毒性によって制限されている。これらの結果は、ドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの腫瘍での蓄積が向上し、かつその毒性が低下していることを実証している。
【０１６１】
同種移植片の乳房腫瘍マウスモデルにおいて、腫瘍体積の変化を測定することにより、ドキソルビシンＰＥＧゼインミセルの効力を検討した。本検討では、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用した。ＪＣマウスの乳房腫瘍細胞（１ｘ１０７個の細胞）をＰＢＳ中で分散し、皮下注射した。腫瘍体積が約１５０〜２００ｍｍ３に到達すると、動物にドキソルビシン溶液またはドキソルビシン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルを２回の投与量（０日目および７日目に３ｍｇ／ｋｇ）で静脈に与えた。ノギスを使用して、腫瘍体積を測定した。
【０１６２】
図３４は、異なる処理後の腫瘍体積の増加を示している。図３４で分かるとおり、ドキソルビシンＰＥＧ−ゼインミセルでは、腫瘍体積の増加はずいぶん小さいものであった。ドキソルビシンＰＥＧ−ゼインミセルにより処理されたマウスはまた、他の処理群よりも長く生存した（図３５）。この結果は、ドキソルビシン負荷ＰＥＧゼインミセルの効力が向上していることを実証している。
【実施例３】
【０１６３】
クルクミンを封入したペグ化ゼインミセル
クルクミンはインドの香辛料であるウコンの主要なクルクミノイドであり、しょうがのファミリー（ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ））メンバーである。他の２種のクルクミノイドはデスメトキシクルクミンおよびビスデスメトキシクルクミンである。クルクミンは、少なくとも２つの互変異性体で存在することができ、そのエノール体が固相および溶液中においてエネルギー的により安定である。クルクミンは、分子量（ｍ．ｗ．）が３６８．４、ＬｏｇＰが２．５を有しており、水にはほとんど不溶で、メタノールに可溶である。
【０１６４】
【化６】
2014518842.tif 000014
【０１６５】
臨床試験では、多発性骨髄腫、膵臓癌、骨髄異形成症候群、結腸癌、乾癬およびアルツハイマー病を含む様々な疾患に対するクルクミンの効果が検討されている。インビトロおよび動物の研究により、クルクミンは抗腫瘍性、抗酸化性、抗関節炎性、抗アミロイド性、抗虚血性、および抗炎症性の性質、ならびに他の生物活性を有することが示されている（Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２００７，５９５：１−７５）。図９および図１０は、それぞれ薄膜水和法および透析法を使用する、クルクミン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの段階的な調製を例示している。薄膜水和法および透析法の両方において、ＰＥＧ−ゼイン０．１ｇおよびクルクミン０．００２ｇを２０ｍＬの９０％エタノールに溶解した。この混合物を、３７℃で一晩インキュベートし（５０ｒｐｍで撹拌）、クルクミンを疎水性ゼインのコア内に分配させた。次に、回転式蒸発装置を使用して、この水性アルコール溶媒を完全に留去して、フィルムを形成した。クルクミン負荷ＰＥＧゼインミセルの乾燥フィルムを、クエン酸緩衝液ｐＨ７．４で復元し、５分間音波処理して、均一な懸濁液を形成した。次に、この混合物を撹拌しながら（１００ｒｐｍ）、室温で２４時間、水に対して透析し（ｍ．ｗ．カットオフ＝約１０，０００Ｄａ）、遊離クルクミンを除去した。
【０１６６】
この透析方法では、一晩インキュベートした後、この混合物を磁気撹拌器（１００ｒｐｍ）中、室温で２４時間、水に対して透析し（ｍ．ｗ．カットオフ１０，０００Ｄａ）、遊離クルクミンを除去した。次に、得られた生成物を−８０℃で凍結し、次いで−４７℃、６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。この凍結乾燥生成物を、４℃でデシケータ内に保管した。
【０１６７】
下記の表５および表６はそれぞれ、薄膜法および透析法を使用して調製したクルクミン負荷ペグ化ゼインミセルの様々な特性を例示している。
【０１６８】
【表６】
2014518842.tif 000015
【０１６９】
【表７】
2014518842.tif 000016
【０１７０】
Ｃ１８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって、遊離クルクミンおよび封入クルクミンの濃度をアッセイした。移動相は、アセトニトリル６０％とクエン酸緩衝液（５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ３．０に調整した１％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液）４０％で構成された。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎであり、検出波長は４２０ｎｍとした。
【０１７１】
【数２】
2014518842.tif 000017
【０１７２】
図１１および図１２は、クルクミン負荷ＰＥＧゼインミセルの、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示している。クルクミンは、水にはほとんど溶けない（１１ｎｇ／ｍＬ）（Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ５９５：１−７５）。しかし、ペグ化ゼインミセルに組み込まれると、その溶解度が約２０００倍に向上する（２０μｇ／ｍＬ）。図１３は、１０％メタノール中のクルクミンおよびｐＨ７．４のＰＢＳ中のクルクミン負荷ペグ化ゼインミセルのＵＶ可視スペクトルである。クルクミン負荷ＰＥＧ−ゼインの吸光度は、１０％（ｖ／ｖ）メタノールに溶解しているクルクミンの吸光度に類似していることは、このスペクトルから明白である。したがって、ＰＥＧ−ゼインにより、クルクミンの水溶解度が約２０００倍とかなり向上した。図１４は、１０％メタノール中のクルクミンおよびｐＨ７．４のＰＢＳ中のクルクミン負荷ペグ化ゼインミセルの蛍光スペクトルである。クルクミンの発光スペクトルのＸｍａｘの、５４０ｎｍから５２５ｎｍへのシフトは、ミセル中にクルクミンが捕捉されていることを示している。さらに、クルクミンの水溶解度が向上したことにより、ペグ化ゼインミセル中に捕捉された後の水中におけるクルクミン蛍光が著しく増大（約４倍）している。コア内への封入により、加水分解や光分解などの環境作用因子（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｇｅｎｔ）に由来する分解に対してクルクミンが安定した。
【０１７３】
以下の表７は、光およびｐＨ変化がある状態における、クルクミン負荷ペグ化ゼインミセルの安定性を例示している。クルクミンがＰＥＧゼインミセル（半減期３１．８分）中に封入されると、その安定性は、未加工の溶液（半減期４分）（リン酸緩衝液ｐＨ７．４）と比較して、改善される。リン酸緩衝液ｐＨ５では、安定性の向上が際だっている（ミセル（ｔ１／２＝３６６分）と比較すると、半減期＝６．９分である）。
【０１７４】
【表８】
2014518842.tif 000018
【０１７５】
クルクミン負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを図１５に示す。クルクミンの融解ピークが存在しないことは、ミセルのコア内部にクルクミンが封入されていることを示している。ＰＥＧ−ゼインミセル由来のクルクミンのインビトロ放出を、図１６に示している。クルクミンの放出は、約２４時間持続した。クルクミンは抗癌活性および抗炎症活性を有することが知られているが、クルクミンの送達が、その貧弱な水溶性によって制限されている。ペグ化ゼインミセルは、クルクミンの適切な担体になり得る。図１７は、薬物耐性ヒト卵巣癌細胞（ＮＣｌ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞）における、クルクミン（１０％ＤＭＳＯに溶解）およびクルクミンミセル（７．４のＰＢＳ）のインビトロ細胞毒性を例示している。細胞（２０００個の細胞／ウェル）を、７．８ｎＭ〜５００ｎＭのクルクミンで４日間処理した。５日目に、ＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性解析を行なった。クルクミン負荷ミセルは、純粋なクルクミンよりも（３倍）強力であった。
【０１７６】
遊離クルクミンおよび封入クルクミンのインビトロ皮膚浸透。図１８で分かるとおり、クルクミンの皮膚浸透は、５〜２０倍向上した。遊離クルクミンとは異なり、クルクミンミセルの皮膚浸透は処理時間につれて向上した。かなりの施用投与量（５〜２０％）が皮膚に浸透しており、また、クルクミンは一層長い処理時間で、通り抜けてレセプター相に到達することさえあることを見いだした。
【０１７７】
図１９で分かるとおり、クルクミンミセルは、毛包に主として局在した（ｃ）。上記のことは、表面から皮膚内部１００μｍ深さへの筋（ｓｔｒｅａｋ）で蛍光が観察されている「ｂ」からも明らかである。ＰＥＧゼインミセルの局在化は、ざ瘡、脱毛、脂漏性湿疹、毛包炎および一部の皮膚癌などの毛包性疾患の治療に特に有用である。図１９（ｄ）は、角質層（０〜１５μｍ）および生表皮（２０〜１００μｍ）における、蛍光ピクセル数を示している。ミセル中へのクルクミンの封入は、クルクミンの皮膚浸透を著しく増加させており、各値は平均値±ＳＤ（ｎ＝４）である。切除したブタの皮膚を、縦型拡散セルの２つのコンパートメント間にはさんだ。レセプター媒体は、３７℃に維持したリン酸緩衝液（２０％エタノールでｐＨ７．４）から構成され、磁気ビーズを使用して撹拌した。遊離クルクミンまたは封入クルクミンを、６時間皮膚に施用した。本検討の終わりに皮膚を洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。ＩＭＡＧＥＪソフトウェアを使用し、蛍光ピクセル数を定量した。
【実施例４】
【０１７８】
ナイルレッドを封入したペグ化ゼインミセル
モデル疎水性染料としてナイルレッド（Ｓｈｅｉｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３５０：３１２−３１９）を使用し、皮膚送達ビヒクルとしてＰＥＧ−ゼインナノミセルの施用を検討した。
【０１７９】
【化７】
2014518842.tif 000019
【０１８０】
ナイルレッドは、分子量が３１８．４、ＬｏｇＰが５、および融点が２０３〜２０５℃を有する。ナイルレッドは、水にはほとんど不溶であるが、メタノール、エタノールおよびＤＭＳＯには可溶である。
【０１８１】
図３６は、一実施形態による、透析法を使用する、ナイルレッド負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの段階的な調製を例示している。ＰＥＧゼイン（０．１ｇ）および０．５ｍｇのナイルレッドを、９０％エタノール２０ｍＬに溶解した。この混合物を、３７℃で一晩インキュベートし（５０ｒｐｍで撹拌）、ナイルレッドを疎水性ゼインのコア内に分配させた。次に、この混合物を、室温で２４時間、水に対して透析し（ｍ．ｗ．カットオフ１０，０００Ｄａ）（１００ｒｐｍで撹拌）、いかなる残留物も除去した。得られた生成物を−８０℃で凍結し、次いで−４７℃、６０ｍＴｏｒｒの真空で１２〜１４時間凍結乾燥した。この凍結乾燥生成物を、４℃でデシケータに保管した。ナイルレッド負荷ＰＥＧ−ゼインミセルの特性は以下の表９に示している。
【０１８２】
【表９】
2014518842.tif 000020
【０１８３】
ナイルレッドは皮膚浸透を検討するために使用した親油性染料モデルである。調製したナイルレッド負荷ＰＥＧ−ゼインミセルは、平均粒子サイズ１６５ｎｍを有しており、多分散性指数（０．２１）は低かった。ＰＥＧゼインミセルは、良好な封入効率（７７％）を実現した。図３７は、ＰＥＧゼインミセルが皮膚浸透を向上する能力があること、および皮膚において疎水性化合物の保持を向上する能力があることを例示している。このデータはまた、治療薬および化粧剤（ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）用の皮膚送達ビヒクルとしてＰＥＧ−ゼインミセルの施用をも実証している。
【０１８４】
皮膚採取したブタの皮膚を使用して、表皮および角質層（ｎ＝３）で認められるナイルレッドの量を検討した。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｒａｎｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｔ  Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの屠畜場からブタの耳を得た。この耳は虐殺直後に採集して、水道水で洗浄した。背面側の毛は、バリカンを用いて取り除いた。メスとピンセットを使用して、その下の軟骨から皮膚をはぎ取った。鈍いメスを使用して、真皮側に付着している脂肪を注意深く取り除き、任意の目視可能な損傷について皮膚を観察した。
【０１８５】
モデルＢの電気デルマトーム（ＰＡＤＧＥＴＴ（商標）、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、３００μｍ厚さに皮膚採取した。フランツ拡散セル（ＰＥＲＭＥＧＥＡＲ（商標）、Ｈｅｌｌｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）中のドナーおよびレセプター室の間に皮膚採取したブタの皮膚をはさんだ。レセプター室をリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）６ｍＬで満たし、磁気撹拌子を使用して撹拌した。レセプター媒体を３７℃に維持した。ドナー室は、ナイルレッド（２５０ｎｇ）の５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ−８０溶液１００μＬ、および水中のナイルレッドミセル（ナイルレッド２５０ｎｇに相当）で充填した。６時間後、皮膚試料をＰＢＳによって洗浄し、共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によって分析するために、顕微鏡用スライド上にマウントした。
【０１８６】
角質層（ＳＣ）を上にした皮膚を、ＣＬＳＭ（ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ３００（商標）、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｉｘ７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ社、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して試験した。励起波長４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用して、ナイルレッドを励起した。画像は、ＰＬＡＮ−ＮＥＯＦＬＵＡＲ  ４０／０．８５対物レンズを使用して観察した。皮膚のｘｙｚ共焦点画像を、表面（ｚ＝０μｍ）から１００μｍまで、５μｍ／スキャンのステップサイズでスキャンした。画像はすべて、同じ光学アパーチャー、レンズおよびスキャン速度で得た。
【０１８７】
ブランクの皮膚は、自己蛍光を何ら示さなかった。３〜４枚の皮膚試料から、各代表的な画像を選び、各皮膚の３〜４つの異なる領域をスキャンした。ＦＬＵＯＶＩＥＷ（商標）ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して、光学断面（ｘｙｚ）を分析した。総ピクセル数を積分することによって、共焦点画像における蛍光強度分布を定量した。各皮膚について、少なくとも３〜４つの領域を分析した。ＳＣ（０〜１５μｍ）および生表皮（ＶＥ、２０〜１００μｍ）中のピクセル数は個別に計算した。ナイルレッドミセルによる皮膚の処理は、遊離ナイルレッド溶液と比較して、角質層と生表皮の両方への皮膚浸透がかなり向上していることを示した（図３７）。このデータは、ＰＥＧ−ゼインミセルを、治療薬または化粧剤を角質層または生表皮に送達させるために使用して、様々な皮膚状態を有効に治療することができることを示している。
【実施例５】
【０１８８】
追加のコンジュゲートおよびミセルの実施形態
本明細書に記載された様々なペグ化ゼインミセルも調製することができる。例えば、ゼインの代わりにグリアジン、ホルデインおよびカフィリンなどの他の疎水性プロラミンタンパク質を、ミセル形成用ペグ化タンパク質として使用してもよい。したがって、ペグ化グリアジンミセル、ペグ化ホルデインミセル、およびペグ化カフィリンミセルを調製して、本明細書に記載されているペグ化ゼインミセルと同様に使用することができる。
【０１８９】
さらに、ペグ化プロラミンコポリマーのＰＥＧ部位を、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、キトサン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、デキストランなどの多糖類などの他の水溶性ポリマーと交換することにより、他の両親媒性タンパク質コンジュゲートを調製することができる。こうした水溶性ポリマーは、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンなどの任意の疎水性プロラミンタンパク質にコンジュゲートして、ミセルへと自己組織化する両親媒性タンパク質コンジュゲートを形成することができる。溶解している治療薬の存在下でミセルが形成される場合、こうした様々な両親媒性タンパク質コンジュゲートから薬物負荷ミセルを調製することができ、またペグ化ゼインミセルに関して記載されているとおりに使用することができる。
【０１９０】
同様に、疎水性ポリマーは、プロラミンにコンジュゲートすることができる。このようなポリマーには、例えば、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ポリプロピレンオキシド、ポリアスパルテート、ポリグルタミン酸、スペルミン、ポリリシン、またはポリアクリレート（例えば、ポリメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルアクリレートなど）を挙げることができる。脂肪酸もまたプロラミンにコンジュゲートし、疎水性コアを形成することができる。このような脂肪酸の実施例には、ステアリン酸、パルミチン酸、ホスファチジルエタノールアミン、またはオレイン酸を挙げることができる。こうしたポリマーおよび／または脂肪酸は、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンなどの任意の疎水性プロラミンタンパク質にコンジュゲートして、ミセルへと自己組織化するタンパク質コンジュゲートを形成することができる。溶解している治療薬の存在下でミセルが形成される場合、こうした様々なタンパク質コンジュゲートから薬物負荷ミセルを調製することができ、またペグ化ゼインミセルに関して記載されているとおりに使用することができる。
【０１９１】
他の修飾またはさらなる修飾を、プロラミンの疎水性コア、またはＰＥＧシェルなどの親水性シェルに施すことができる。こうした修飾は、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどの刺激応答性要素をコアにコンジュゲートしてｐＨ感受性ミセルを調製すること、またはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）にコンジュゲートして感熱性ミセルを調製することを含むことができる。さらに、プロラミンの疎水性コアまたは親水性シェルは、例えば、グルタルアルデヒド、ゲニピン、クエン酸などの架橋剤を使用して架橋化し、薬物放出を制御することができ、また薬物封入収率および効率を向上することができる。
【実施例６】
【０１９２】
レチノイドの局所送達用プロラミンミセル
様々な皮膚科学的状態を治療するために、皮膚を経由するレチノールの局所送達向け新規ナノ担体が開発されてきた。レチノール（ビタミンＡ）およびその誘導体（レチノイド）は、生体において、表皮細胞の成長および分化、視力、免疫調節ならびに抗炎症作用を含む様々な生物機能に関与している（Ｓｕｍｍｅｒ，Ｊ  Ｎｕｔｒ  １３８：１８３５−１８３９，  ２００８）。特に、レチノールおよびその誘導体は、ざ瘡、乾癬、角化障害、皮膚変色および皮膚悪性腫瘍（皮膚癌およびメラノーマ）、ならびに創傷治癒および光老化を含む様々な皮膚科学的状態を治療するために広く使用されている（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８−３８８，１９９７）。レチノールは、しわを減らしてセルライトを治療するために、化粧用製剤中でも使用されている（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８−３８８，１９９７）。しかし、美容的および皮膚科学的な施用のためのレチノールの使用は、その貧弱な物理化学的性質および皮層刺激可能性によって、厳格に制限されている（Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３８：３２−３９，２００９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １４６：６５−７３，２００３）。
【０１９３】
【化８】
2014518842.tif 000021
【０１９４】
レチノールは脂溶性分子（ＬｏｇＰが６．２０）で、水溶性に乏しく、皮膚浸透性は限定的である。さらに、レチノールは光および水分の存在下ではかなり不安定であり（米国特許第５，８５１，５３８号（Ｆｒｏｉｘら）を参照されたい）、参照により本明細書にその全体が組み込まれている。レチノールの局所施用は、軽症の紅斑や角質層のめくれとして現れる重症な局所刺激を引き起こし、使用者間にコンプライアンスの非遵守（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）をもたらす（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １４６：６５−７３，２００３）。出願人らは、局所施用のための新規なタンパク質系ミセル中にレチノールを封入することにより、レチノールの送達問題の対処に成功した。
【０１９５】
本明細書に記述したとおり、トウモロコシタンパク質であるゼインから新規ナノ担体を開発した。ナノ担体の１つには、ゼインにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコンジュゲートさせたものが含まれる。ペグ化ゼインは、疎水性コアおよび親水性シェルを有する、自己組織化ナノミセルを形成する。ゼインは、皮膚角質（Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９：５０８３−５０８８，２００３）に対して疎水性を示し、したがって皮膚施用の有望な担体である。ゼインが疎水性であるので、ナノ粒子内部に疎水性レチノイドを封入するために使用することができる（例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれているＷＯ２００９／１３７１１２を参照されたい）、または疎水性レチノイドを封入するために本明細書に記載したミセルを使用して、水除去性（ｗａｔｅｒ  ｒｅｍｏｖａｂｌｅ）レチノイド製剤を実現することができる。
【０１９６】
出願人らは、封入効率が７９〜９１％で、サイズ範囲が１８０〜２２０ｎｍにある、レチノール負荷ナノミセルを調製した。レチノールをミセルに封入することにより、水溶性製剤になった。
【０１９７】
ＰＥＧ−ゼインナノミセルにより、水分および光誘発性の分解に対して、レチノールの固体状態および液体状態の安定性が著しく向上した。ＰＥＧ−ゼインナノミセルからのレチノールの放出は、最大２日間持続した。
【０１９８】
ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、遊離レチノールの水性分散液と比較して、レチノールの皮膚浸透を向上した。さらに、ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、美容的および皮膚科学的な施用のため、皮膚層中にレチノールを保持するのに使用することができる。ナノ担体に特有な態様は、ナノミセルがレチノールの局所送達に関する複数の市場課題に対処することができることである。こうした課題には、１）レチノールの水溶性および水分散性製剤、２）光および水分誘発性の分解に対するレチノールの安定性の向上、３）無色で、易流動性かつ非吸湿性のレチノール粉末、４）レチノールの徐放性製剤、５）皮膚浸透がより高く、かつ皮膚保持がより高いレチノール、および、６）非刺激性のレチノール製剤、を提供することが含まれる。
【０１９９】
ゼインは、米国ＦＤＡの承認を受けている、皮膚角質と特性の類似した生分解性タンパク質ポリマーであり、したがって皮膚と相性の良いナノ担体である。ＰＥＧは、米国ＦＤＡで承認を受けている水溶性ポリマーである。したがって、ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、レチノール用の水洗浄可能な局所用製剤を提供する。両親媒性ＰＥＧゼインミセルは、皮膚において、代替的な疎水性および親水性環境により、レチノールなどの疎水性薬物を輸送するための担体として働く。
【０２００】
レチノールの水溶解度は、ナノミセル中に封入後、著しく向上する。ゼインナノミセルからのレチノールの放出を持続することができ、これにより、用量がより少なくなり、かつ施用頻度が低減される。ゼインナノミセル中へのレチノールの封入により、レチノール製剤の貯蔵寿命が著しく向上する。ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、固体および半固体の製剤中のレチノールの流動性および分散性を向上する。レチノールは吸湿性の粘着性粉末であるので、ナノミセル中にレチノールを封入すると、取扱いの難しさおよびレチノールに関係する加工問題を克服することができる。
【０２０１】
ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、美容的および皮膚科学的な施用のために、レチノールの皮膚浸透および皮膚層中の保持を向上することができる。ゼインナノミセルは、美容的および皮膚科学的な施用のために、レチノールの皮膚浸透および皮膚層中の保持を向上することができる。ナノミセル中へのレチノールの封入は、レチノールの黄色をマスクする。これにより、レチノール製剤の美的な訴求点が改善され、黄色く着色する（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）ことを防止する。凍結乾燥ＰＥＧゼインナノミセルは、ゲル、クリーム、ローションおよび軟膏などの様々な局所用製剤マトリックスに容易に組み込むことができる。
【０２０２】
皮膚浸透の検討は、多くの重要な点でヒトの皮膚に似ている、はぎ取ったブタの皮膚を用いて行った（Ｓｉｍｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｉｂａｃｈ，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３：２２９−２３４，２０００）。マウスのインビボ検討は、ナノミセルがレチノールの皮層刺激を克服することができることをさらに実証している。現在の市販されている製剤の代わりにナノミセルを使用する利点には、次のものが含まれる。
１．可溶化。レチノールは水に不溶な疎水性化合物である。ＰＥＧ−ゼインナノミセル中にレチノールを封入したものは、水溶性／水分散性である。したがって、ナノミセルは、局所施用向けの水洗浄可能なレチノール製剤を開発するために使用することができる。一般に、水洗浄可能な製剤は、美容的および皮膚科学的な施用にとって好ましい。
２．安定化。レチノールは、水分および光の存在下では、かなり不安定である。これにより、レチノール製剤の貯蔵寿命、および施用中の製剤の効力が制限される。ＰＥＧ−ゼインナノミセル中にレチノールを封入すると、レチノール製剤の安定性および貯蔵寿命を著しく向上することができる。
３．徐放性。ＰＥＧ−ゼインナノミセルからのレチノール放出を持続することができる。放出は、２日から１週間まで持続することができる。これにより、レチノールの投与量および施用頻度が低減される。
４．皮膚浸透および保持。レチノールの皮膚浸透特性は乏しい。ナノミセルは、レチノールの皮膚浸透の向上をもたらす。施用に応じて、様々な皮膚科学的／美容的な施用のためのナノミセルを用い、皮膚層中にレチノールを保持することができる。
５．薬用美容的施用。レチノール負荷ミセルは、老化防止、抗しわ、およびセルライトの処置などの美容的施用に使用することができる。
６．皮膚科学的施用。レチノール負荷ナノミセルは、乾癬、ざ瘡、創傷治癒、ならびに皮膚癌およびメラノーマなどの皮膚悪性腫瘍などの様々な皮膚科学的状態に使用することができる。
７．有効性が高く安全な製剤。レチノール負荷ナノミセルの使用により、より有効性の高い治療になる。さらに、ナノミセル中にレチノールを封入すると、レチノールによって引き起こされる皮層刺激を著しく軽減する。レチノールの皮層刺激は、レチノールの美容的および皮膚科学的な施用にとって、コンプライアンスの非遵守に対する大きな問題である。
８．他のレチノイドを封入するためのプラットフォーム技術。レチノール、レチノイン酸およびそれらの誘導体を含む様々なレチノイドを、美容的および皮膚科学的な施用のためにプロラミンナノミセル中に封入することができる。封入に適している様々なレチノイドの例には、以下に限定されないが、レチノール、レチノイン酸（１３−トランスレチノイン酸（トレチノイン）、１３−シスレチノイン酸（イソトレチノイン）、９−シスレチノイン酸（アリトレチノイン））、レチンアルデヒド、エトレトネート、アシトレチン、パルミチン酸レチノール、カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトザンチン、ルテイン、およびゼアキサンチンなどのカロテノイドが含まれる。
９．併用療法。レチノールナノミセルは、他の薬物と一緒にして、日焼け防止、抗乾癬、抗ざ瘡および皮膚癌の製品などの他の製品に配合することができる。レチノールが封入されると、他の作用剤との相互作用を防ぐことになる。ナノミセル中に、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、抗炎症剤などの他の作用剤をレチノールと一緒に封入することもできる。
レチノール負荷ＰＥＧ−ゼインナノミセル。
【０２０３】
レチノール（Ｃ２０Ｉ−１３００、２８６．４５ｇ／ｍｏｌ）は、融点が６１〜６３℃、活性が３１００単位／ｍｇ、およびＬｏｇＰが６．２を有する。レチノールは水にほとんど不溶であり、エタノールには可溶または一部可溶であり、またクロロホルム、エーテルおよび石油精とは混和する。
【０２０４】
レチノールは、光老化、ざ瘡、創傷治癒、黒皮症  乾癬、皮膚癌、メラノーマおよび他の皮膚状態を含む様々な皮膚状態に使用されている薬用化粧剤／治療薬である（Ｏｒｆａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  ５３：３５８−３８８，１９９７）。レチノールは水溶性に乏しく、また光安定性に乏しい（Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３８：３２−３９，２００９、米国特許第５，８５１，５３８号（Ｆｒｏｉｘら）、これらは参照により本明細書にその全体が組み込まれている）。さらに、レチノールは皮層刺激も引き起こす（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  １４６：６５−７３，２００３）。出願人らは、レチノールの、新規ゼイン系ナノ粒子局所用製剤を開発した。ゼインは皮膚角質と類似の特性を有するので、局所用製剤において使用する賦形剤の皮層刺激を試験するためのモデルタンパク質として使用される（ゼイン試験）。皮膚角質との類似性により、ゼインナノ担体はレチノール用の優れた送達ビヒクルである。さらに、ＰＥＧは皮膚用製剤において、幅広く用いられている物質である。したがって、ＰＥＧゼインミセル中における疎水性ゼインおよび親水性ＰＥＧの組合せ物は、皮膚における代替的な疎水性および親水性領域を経て、皮膚を通して分子を輸送することができる両親媒性担体である。
【０２０５】
この実施例は、レチノール負荷ゼインナノミセルの調製および物性、すなわちＰＥＧゼインナノミセルを使用するレチノールの溶解度の改善、ＰＥＧゼインナノミセル中への封入によるレチノールの安定性の改善、ゼインミセルからのレチノールの徐放性、ゼインナノミセルがレチノールの皮膚浸透および皮膚保持を向上できること、ならびにレチノール自体と比較したレチノールミセル製剤の皮層刺激の消失または低減を実証する。
【０２０６】
１．レチノール負荷ナノミセルの調製。ＰＥＧゼイン、レチノールおよびＢＨＴを９０％エタノールに溶解し、３７℃で一晩インキュベートした。その後、この分散液を脱イオン水に対して透析し、遊離レチノールを除去した。次に、レチノール負荷ミセルを凍結乾燥した。「コールド（ｃｏｌｄ）」レチノールと一緒に、放射性同位体標識（３Ｈ）レチノールを本検討で使用した。ナノミセルのサイズは約１８０〜２２０ｎｍであり、その封入効率は、ＰＥＧ−ゼイン／薬物の比率およびＢＨＴ濃度に応じて、７９〜９１％であった。ＢＨＴの非存在下では、封入効率は＜３５％であった。表６（１０）−１は、透析法（例えば、図３８を参照されたい）および薄膜法（例えば、図３９を参照されたい）をそれぞれ使用して調製した、レチノール負荷ペグ化ゼインミセルの物性に関するデータを提示している。
【０２０７】
【表１０】
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【０２０８】
２．水溶液中のレチノールの溶解度／分散性の向上。遊離レチノールは水中で分散せず、作用剤の分散を試みた後にはバイアルの底に沈んだ（図４０）。一方、レチノール負荷ＰＥＧゼインナノミセルは、水中で容易に分散した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のレチノールの溶解度は、ナノミセル中への封入後に著しく向上した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のレチノール（レチノール当量）レチノールミセルの１０μｇ／ｍＬ試料は、２０％メタノール中の遊離レチノール１０μｇ／ｍＬに匹敵するＵＶ吸光度（３２０ｎｍ）を示した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のレチノール１０μｇ／ｍＬ分散液では、非常に小さな吸光度しか観察されなかった。
【０２０９】
３．ＰＥＧゼインナノミセルからのレチノール放出。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４のＰＢＳ）中で、ナノミセルからのレチノールの放出検討を行なった。レチノールの濃度を３２０ｎｍでＵＶ分光光度計を使用して分析し、放出検討を三連で行なった。図４１に示されるとおり、ナノミセルからのレチノール放出は、最大４８時間持続した。
【０２１０】
４．レチノール負荷ゼインナノミセルの安定性。レチノールは黄色粉末である。レチノールは、周囲条件では吸湿性であり、速やかに粘質になる。封入レチノールは、無色で、かつ易流動性で、さらに吸湿性がかなり低くなる（図４２）。図４２に示されているレチノール試料は鮮黄色であり、またナノミセル製剤は白く、封入によりレチノールの鮮黄色がマスクされることが実証された。ナノミセル製剤はまた、純粋なレチノールよりも易流動性が高い粉末になった。
【０２１１】
周囲条件下および暗所において、レチノールナノミセル製剤の安定性を、１週間検討した。レチノールおよびレチノール負荷ナノミセル（凍結乾燥粉末）の固体の安定性も１週間検討した。液体状体の安定性に関しては、遊離レチノールまたはレチノール負荷ナノミセルをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で分散し、ＵＶ分光法（３２０ｎｍ）を使用して、レチノール濃度を１週間測定した。レチノールは一次速度に従うことが分かり、半減期を求めた。表１０−３および表１０−４、ならびに図４３、４４、４５および４６に示されるとおり、以下の結果が得られた。
【０２１２】
ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、光分解および水分誘発性の分解からレチノールを保護した。封入レチノールは、固体状態および液体状態の遊離レチノールに比べて、安定性が向上していることを示した。抗酸化剤としてＢＨＴを含めると、封入レチノールの安定性はさらに向上した。最後に、ナノミセル中への封入によって、レチノールの貯蔵寿命が著しく向上した。
【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
【表１２】
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【０２１５】
５．レチノールおよび封入レチノールの皮膚浸透。切除したブタの耳の皮膚を使用し、フランツ拡散セルを使用して、レチノールおよび封入レチノールの皮膚浸透を検討した。「コールド」レチノールと一緒に、放射性同位体標識（３Ｈ）レチノールを本検討に使用した。放射化学分析を使用して、４８時間の終わりに皮膚ホモジネートおよびレセプター媒体中のレチノール量を見積もった。この実験は、６回（±ＳＤ）繰り返した。図４７で分かるとおり、封入レチノールは、皮膚中により多くのレチノールを保持した。ミセルは、レチノールの皮膚保持をおよそ５倍に増加させた。「皮膚中のレチノールとレセプター」の割合は、遊離レチノールおよびレチノールミセルに対して、それぞれ３と６．５であった。この結果は、ミセルによりレチノールの総合的な皮膚浸透および保持が向上することを示している。
【０２１６】
レチノール毛包標的を実証するために、皮膚サンドイッチモデルを使用した。サンドイッチ皮膚（図４８を参照されたい）では、表皮全体にはさまれた角質層によって、毛包経路（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙ）が遮断されている。サンドイッチ皮膚モデルでは、レセプターコンパートメントへ輸送されるレチノール量は、従来の皮膚表皮浸透検討と比べて、遊離レチノールとミセル封入レチノールの両方で低下した。しかし、ミセルからのレチノールの輸送に著しい低下が存在しており、このことはレチノールミセルのかなりの画分が、毛包を通って輸送されていることを示している。ざ瘡（ざ瘡は、主に毛包を由来とする）を治療するためにレチノールを使用することを考慮すると、レチノールミセルは、毛包中の疾患部位にレチノールを向かわせる利点を有することになる。
【０２１７】
要約すると、ＰＥＧ−ゼインナノミセルは、レチノールの水溶解度および分散性を著しく向上させた。ナノミセル中にレチノールを封入することにより、黄色の、粘質で、かつ吸湿性の粉末である遊離レチノールとは異なり、無色の易流動性粉末になった。ゼインナノミセルは、レチノールの放出を効果的に持続させた。レチノールの光安定性および加水分解安定性は、ゼインナノミセル中に封入することにより著しく向上し、抗酸化剤としてＢＨＴの添加によって上記安定性はさらに向上し、またＰＥＧゼインナノミセルはより多くのレチノールを皮膚に保持した。ナノミセルは、レチノールの皮層刺激を軽減することもできる。
【０２１８】
レチノールミセル用のクリーム製剤の調製。商用開発のための送達用皮膚製剤の実現可能性を実証するために、市販のクリーム基材（ＭＥＤＣＯ  Ｌａｂｓ）を使用して、遊離レチノールまたはゼインミセル中に封入したレチノールを配合した。クリーム基材はステアリルアルコール（１４％、セチルエステル（３．５％）、モノステアリン酸グリセリン（２％）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル（３％）、ソルビトール（１０％）、パルミチン酸イソプロピル（２％）、メチルパラベン（０．１６％）、プロピルパラベン（０．４％）および精製水（６５％）を含有している。０．１％に相当するレチノールを秤量して時計皿に移し、ガラス棒を使用して幾何学的希釈によって均一に混合した。以下に限定されないが、油−水クリーム剤、油中水型クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤などを含む他の製剤を使用してもよい。この混合物に３Ｈ−レチノール０．０５μＣｉを混ぜ、クリーム中で完全に混合した。最後に、調製したクリーム製剤を、ガラス製バイアルに移し、使用するまで保管した。
【０２１９】
【表１３】
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【０２２０】
レチノールミセルのクリーム製剤の安定性を、１か月間測定した（図４９を参照されたい）。図で示されるとおり、製剤は安定しているままであり、室温ではいかなる分解も示さなかった。
【０２２１】
クリーム製剤からのレチノールのインビトロ放出。放出検討用に縦型拡散セルの透析膜（ＭＷＣＯ約８，０００〜１０，０００Ｄａ）中に、クリーム基材約４０ｍｇおよびミセルクリーム剤を配置し、レセプター媒体をｐＨ７．４の緩衝液から構成した。レセプター媒体から試料を採集し、３Ｈレチノールを使用した放射化学法によって分析した。各データポイントは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。図５０で分かるとおり、ミセルのクリーム剤と比べて、純粋なクリーム剤からより多くのレチノールが放出している。
【０２２２】
インビトロ皮膚浸透。切除したヒトの皮膚を、縦型拡散セルの２つのコンパートメント間にはさんだ。レセプター媒体は３７℃に維持したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から構成され、磁気ビーズを使用して撹拌した。遊離レチノールまたはレチノール封入ミセルのクリーム製剤をドナー室に充填した。この製剤を６時間施用し、次に、この製剤を取り除いて、浸透の検討を４８時間継続した。検討の終わりに、皮膚およびレセプターコンパートメント中のレチノール濃度を、３Ｈ標識レチノールを用いた放射化学的方法によって測定した。レチノール濃度を測定するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して皮膚を消化した。図５１で分かるとおり、未加工のクリーム剤に関して、皮膚中よりもレセプターコンパートメント中の方に、多くのレチノールが存在した。対照的に、ミセルのクリーム剤は反対を示しており、この場合、レセプターコンパートメント中よりも皮膚中に、より多くのレチノールが認められた。
【０２２３】
レチノールおよび封入レチノールのクリーム製剤の皮層刺激。標準製剤対封入製剤の皮層刺激を、表１２に列挙したとおりの処理群を使用して、ＳＫＨ−１無毛マウスでインビボ試験することができた。
【０２２４】
【表１４】
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【０２２５】
レチノールクリーム製剤（０．１％（ｗ／ｖ）レチノールの０．５ｇに相当）をＳＫＨ−１無毛マウスの背中に５日（５）間、毎日施用した。製剤の施用前に、毎日、ＴＥＷＡメータ（Ｄｅｌｆｉｎ）を使用して、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）値を測定した。ＴＥＷＬの増加は皮層刺激の指標であり、図５２で分かるとおり、ミセル中へ封入されたレチノールは、皮層刺激を示すことはなく、かつネガティブ対照（すなわち、未処理）と同等であった。一方、遊離レチノールクリームは皮層刺激を示す。公知の皮膚刺激物であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を、ポジティブ対照として使用した。
【０２２６】
インビボ局所生体利用率。イソフルラン麻酔下で、クリーム製剤をマウスの背部の皮膚に施用した。動物を安楽死させた後、角質層を取り除くため、皮膚をＳＣＯＴＣＨ  ＴＡＰＥを使用してテープで貼り取った。３Ｈレチノールを使用した放射化学的分析によって、皮膚（角質層および表皮／真皮）および血液中のレチノールの量を測定した。図５３で分かるとおり、ミセル封入レチノールは皮膚に保持されており、血液中への全身的な吸収はなかった。値は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【実施例７】
【０２２７】
カゼインミセル
カゼインは適切な条件下でミセルを形成することができる乳タンパク質である。いくつかの研究では、送達ビヒクルとしてカゼインミセルの使用が記載されているが、カゼインミセルは、皮膚施用のための送達剤として使用されていない。カゼインはＰＥＧ−ゼインと一緒になって、新規な混合ミセルを形成することができる。
【０２２８】
レチノール負荷β−カゼインミセルを調製するための一般工程は以下のとおりである。βカゼイン（２０ｍｇ）およびレチノール（エタノール６００μＬ中０．１ｍｇ）を１０ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解することができる。この混合物を約３７℃で一晩、インキュベートし、次いで、１００ｍＴｏｒｒの真空下、−１００℃で凍結乾燥することができる（例えば、約２４時間）。得られたミセルの粉末は、約２〜８℃で長期間、デシケータ中に保管することができる。以下の表１３には、レチノール負荷β−カゼインミセルの様々な特性を例示している。レチノール負荷β−カゼインミセルの調製に関しては、レチノール濃度は、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。β−カゼイン濃度は約０．１５〜０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲であった。
【０２２９】
【表１５】
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【０２３０】
カゼインは、ナイルレッド含有ミセルを調製するために使用することもできる（図５４を参照されたい）。表１４は、このようなミセルの特性を提示している。
【０２３１】
【表１６】
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【０２３２】
図５５で分かるとおり、カゼインミセル中へのナイルレッドの封入により、ナイルレッドの皮膚浸透が著しく向上した。切除したブタの皮膚を、縦型拡散セルの２つのコンパートメント間にはさんだ。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から構成されるレセプター媒体は、３７℃に維持し、磁気ビーズを使用して撹拌した。遊離ナイルレッドまたは封入ナイルレッドを、６時間皮膚に施用した。本検討の終わりに皮膚を洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。ＩＭＡＧＥＪソフトウェアを使用して、ＳＣ（０〜１５μｍ）および生表皮（２０〜１００μｍ）における蛍光を定量した。各値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）である。ｐ＜０．０５で有意差がある。
【実施例８】
【０２３３】
医薬剤形
以下の製剤は、本明細書で記載したミセル製剤の治療的または美容的投与のために使用することができる、代表的な医薬剤形を例示しており、水性懸濁液または凍結乾燥粉末とすることができる（これ以降、「組成物Ｘ」と称する）。
【０２３４】
【表１７】
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【０２３５】
これらの製剤は、医薬的技術において周知の従来の手順によって調製することができる。上記の医薬組成物は、異なる量およびタイプの活性成分「組成物Ｘ」を取り込むための周知の医薬的技法に従って、変わり得ることが理解されよう。エアゾール製剤（ｖｉ）は、標準的な計量投与用エアゾールディスペンサと共に使用してもよい。さらに、特定の成分および割合は、例示目的のためのものである。対象となる剤形の望ましい特性に従って、成分は適切な当量に変えてもよく、割合は変動し得る。
【０２３６】
開示された実施形態および実施例を参照しながら、特定の実施形態を上で説明しているが、こうした実施形態は単なる例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。以下の特許請求の範囲で定義したとおり、本発明から逸脱することなく、より幅広い態様で、当技術分野の通常の技能に従い変更および修正をすることができる。
【０２３７】
すべての刊行物、特許、および特許書類は、個別に参照として組み込まれるかのごとく本明細書中に参照として組み込まれる。本発明は、様々な特定の実施形態、および好ましい実施形態、ならびに技術を参照して記載されている。しかし、本発明の趣旨および範囲内を保持しながら多数の変形および修正を行うことができると理解すべきである。本発明は、上記の実施例を参照しながら説明されるが、本発明の趣旨および範囲内に、修正および変形が包含されることが理解されよう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってしか限定されない。
【図１１】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【国際調査報告】
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