(57)【要約】  本発明は、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含み、かつ上記ＴＮＦαが強力に不活性化されている（これは、本製品が試験Ａの条件で、３０％未満の細胞溶解活性および／または１５０００を超える不活性化係数を示すことを意味する）免疫原性製品、それを含む乳濁液およびワクチンならびに前記免疫原性製品の調製方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含み、前記ＴＮＦαが強力に不活性化されている（これは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の前記製品が試験Ａの条件で、３０％未満の細胞溶解活性および／または１５０００を超える不活性化係数を示すことを意味する）免疫原性製品。
【請求項２】
前記製品は長期間不活性化されたままである（これは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の前記製品が試験Ｂの条件で、８０％未満の細胞溶解活性および／または５００を超える不活性化係数を示すことを意味する）、請求項１に記載の免疫原性製品。
【請求項３】
前記製品は、３００ｋＤａを超える遊離ＴＮＦαホモポリマーを含んでいてもよく、かつ前記製品が３００ｋＤａを超える遊離ＴＮＦαホモポリマーを含む場合、３００ｋＤａを超える遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合は、試験Ｃで測定した場合に総ＴＮＦαの３０％ｗ／ｗ未満である、請求項１または請求項２に記載の免疫原性製品。
【請求項４】
前記製品は凍結乾燥されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性製品。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製品、油および界面活性剤またはそれらの混合物を含む免疫原性乳濁液であって、前記乳濁液は油中水型エマルションまたは水中油型エマルションであり、前記油、前記界面活性剤および／または油および界面活性剤の混合物は医薬的に許容される賦形剤である免疫原性乳濁液。
【請求項６】
油とアジュバント好ましくはＩＳＡ５１である界面活性剤との混合物を含む、請求項５に記載の免疫原性乳濁液。
【請求項７】
請求項１〜４に記載の免疫原性製品または請求項５または６のいずれか１項に記載の乳濁液を含むワクチン組成物。
【請求項８】
ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含み、前記ＴＮＦαは強力に不活性化されている（これは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の前記製品が試験Ａの条件で、３０％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）製品の調製方法であって、
ａ）（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニンおよび（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、
ｂ）１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、
を含み、
工程ｂ）の後に、
ｃ）少なくとも６０ｍＭで少なくとも２４０時間〜少なくとも１２０ｍＭで少なくとも１４４時間の範囲の濃度／時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程、
ｄ）（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する工程、
ｅ）前記免疫原性製品を回収する工程、
を行うことを特徴とする方法。
【請求項９】
工程ａ）において、グルタルアルデヒドを、１〜５０ｍＭの濃度で１１０分超〜４００分未満、好ましくは２５ｍＭで２４０分間添加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）において、ホルムアルデヒドを、少なくとも２００ｍＭの濃度で少なくとも２４０時間、好ましくは２２０〜２７０ｍＭで少なくとも３００時間添加する、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｆ）での回収前に、３００ｋＤａ未満の分子量を有する物質を除去する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含み、前記ＴＮＦαは強力に不活性化されている（これは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の前記製品が試験Ａの条件で、３０％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）製品の調製方法であって、
ａ）（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニンおよび（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、
ｂ）１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、
ｃ）少なくとも６０ｍＭで少なくとも１４４時間〜少なくとも２５０ｍＭで少なくとも９６時間の範囲の濃度／時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程と、
を含み、
工程ａ）において、少なくとも２０ｍＭの濃度で１８時間を超える期間にわたってグルタルアルデヒドを添加し、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させた後、前記製品を回収することを特徴とする方法。
【請求項１４】
工程ｂ）後であって前記製品の回収前に、少なくとも２５０ｍＭで少なくとも４日間の濃度／時間反応条件でホルムアルデヒドを添加し、次いで、（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記製品の回収前に、少なくとも１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）のカットオフ値を有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程を行う、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療に使用される、それを必要としているヒトを含む動物に投与する工程を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ＴＮＦαの過剰産生に関連する前記疾患は、強直性脊椎炎、乾癬、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質および癌からなる群から選択される、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
請求項１〜４に記載の免疫原性製品を含む少なくとも１つのバイアル、注射用水を含む少なくとも１つのバイアルおよびアジュバントを含む少なくとも１つのバイアル、ならびに水溶液を得るために前記免疫原性製品と前記水とを混合する手段、前記溶液を前記アジュバントと接触させる手段および前記水溶液と前記アジュバントとの混合物を乳化させる手段とを含み、少なくとも１本の針をさらに含むキット。
【請求項１９】
請求項１〜４に記載の免疫原性製品、請求項５または６のいずれか１項に記載の乳濁液または請求項７に記載のワクチン組成物を含む医療機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性ＴＮＦαに対する抗体応答が求められる疾患の予防または治療の分野に関する。本発明は、哺乳類宿主に投与した場合に、前記哺乳類宿主において抗ＴＮＦα抗体産生を伴う免疫応答を誘導する新規な免疫原性製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、ホモ三量体の多面的サイトカインからなり、例えば関節リウマチ、炎症性腸疾患および乾癬などの疾患における炎症性刺激に応答して分泌される。
【０００３】
ＴＮＦαの病的活性が多くの注目を集めている。ＴＮＦαはいくつかの種類の腫瘍の壊死を引き起こすが、このサイトカインは、他の種類の腫瘍細胞の増殖を促進する。一般に、高レベルのＴＮＦαは死亡リスクの上昇と相関している。ＴＮＦαは、炎症由来の炎症性疾患および炎症由来でない炎症性疾患の両方に関与している。敗血症では、高量のＴＮＦαの放出により、高い死亡リスクを有する様々な体器官における深刻な機能不全が引き起こされる。異常なＴＮＦα産生は、様々な慢性および急性疾患の両方で認められる。ＴＮＦαの高レベルの内因性産生は、ＴＮＦα産生が一過性のものであっても、ショックおよび組織傷害、異化ホルモンの放出、血管漏出症候群、成人呼吸窮迫症、消化管壊死、急性腎管壊死、副腎出血、筋膜電位の減少、播種性血管内凝固および発熱を引き起こすことが知られている。ＴＮＦαの弱いが慢性的（過剰）な産生は、体重減少、食欲不振、タンパク異化、脂質枯渇、肝脾腫、心内膜下炎症、インスリン抵抗性、急性期タンパク質放出および内皮活性化を引き起こすことが知られている。
【０００４】
ＴＮＦαは、敗血症性ショック、癌、ＡＩＤＳ、移植拒絶反応、多発性硬化症、糖尿病、関節リウマチ、外傷、マラリア、髄膜炎、虚血再灌流障害および成人呼吸窮迫症候群を含む様々な疾患における媒介物質からなる。これは、抗ＴＮＦα療法を設計するために相当量の調査が行われてきた理由を説明している。
【０００５】
受動免疫療法ともいわれる抗ＴＮＦα療法の一種では、それを必要としている患者に抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の投与を行う。様々な抗ＴＮＦαモノクローナル抗体が現在臨床試験中であるか、抗ＴＮＦα関連疾患の医学的治療で既に実際に使用されている。以下の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体：アフェリモマブ（現在臨床試験が行われている）、セルトリズマブ（関節リウマチおよびクローン病に対して認可されている）、ゴリムマブ（関節リウマチ、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎に対して認可されている）、インフリキシマブ（関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、クローン病および潰瘍性大腸炎に対して認可されている）、およびアダリムマブ（関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、クローン病に対して認可されている）が挙げられる。
【０００６】
上に列挙した抗ＴＮＦαモノクローナル抗体は、ＴＮＦα関連疾患でのそれらの治療活性を証明している。しかし、これらのモノクローナル抗体は、一般的な治療用抗体の様々な公知の欠点を有しており、これらの欠点としては、モノクローナル抗体に対する宿主の抗体応答の誘導が挙げられ、これにより治療用抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の効力は急激に低下する。
【０００７】
モノクローナル抗体に代わる医学的抗ＴＮＦα戦略として、何人かの著者は、患者における抗ＴＮＦα抗体産生の誘導に基づく能動免疫療法の設計を提案している。例示としては、修飾ＴＮＦα分子を含むワクチンがＰＣＴ出願の国際公開第９８／４６６４２号に記載されている。このＰＣＴ出願に記載されている免疫原性化合物は、天然のアミノ酸配列の一部がＴ細胞エピトープを有する１つ以上のポリペプチドで置換された修飾ＴＮＦαタンパク質からなる。いくつかの実施形態では、前記修飾ＴＮＦα分子は、抗ＦｃγＲＩ抗体断片に結合されていてもよい。
【０００８】
国際公開第０２／１１７５９号は、例えばＶＥＧＦなどのサイトカインを活性化担体分子（例えば活性化ＫＬＨ）と結合させることを含む、サイトカインに対するワクチンについて記載している。この特許出願では、ＫＬＨをグルタルアルデヒドと接触させた後、ＶＥＧＦ溶液に添加する。得られる生成物中では、ＶＥＧＦサイトカインの生物活性は活性化されていない。
【０００９】
その際、２つの理由から、サイトカインの生物活性を中和しなければならないことが分かった。第一に、ＴＮＦαなどのいくつかのサイトカインは、それらの内因性状態では炎症や器官の変化を引き起こし、第二に、サイトカインの過剰産生条件下ではワクチンがさらなるサイトカイン源として生体内で認識されてはならないからである。
【００１０】
ＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０２４１８９号は、（ｉ）目的の抗原タンパク質と（ｉｉ）担体タンパク質との分子会合を含み、かつ（ｉ）および（ｉｉ）が共有結合で部分的に互いに結合され、かつ非共有結合で部分的に互いに結合されている免疫原性製品を開示している。このＰＣＴ出願には、主に非共有結合によって担体タンパク質と会合した目的の抗原分子の大きな数が、高い免疫原性を有する最終製品のための条件であることが開示されている。
【００１１】
ＰＣＴ出願の国際公開第２００７／０２２８１３号は、本出願人の名において、上記ＰＣＴ出願の国際公開第２００４／２４１８９号に開示されている対応する免疫原性化合物に認められるＴＮＦαの不活性化レベルと比較して、ＴＮＦαの不活性化が強められたＴＮＦα分子とＫＬＨ分子とのヘテロ複合体を含む免疫原性製品を開示している。より詳細には、当該実施例から、予め形成されたヘテロ複合体をホルムアルデヒドで９６時間〜１９２時間化学処理する工程を行った場合にＴＮＦαの細胞傷害活性の最適な不活性化が達成されることが分かった。特に、６６ｍＭの濃度で１９２時間を超える期間にわたってホルムアルデヒド処理工程を行うことにより、非常に安定であるが内因性ＴＮＦαに対して高い中和活性を有する抗体を誘導する能力が著しく低下した最終製品が得られることが明記されている。事実、上記特許出願では、不活性化をさらに進めた場合に、得られる製品の抗原性／免疫原性が必然的に著しく失われると評価されている。
【００１２】
現在、本出願人は、先行技術の製品には不活性化されたサイトカインが含まれているにも関わらず前記不活性化は完全に最適化されていなかったが、当業者がサイトカイン−担体タンパク質ワクチン中のサイトカインをさらに不活性化させることができないという技術的先入観を今では克服することができると考えている。
【００１３】
本発明の製品は、担体タンパク質に結合したサイトカインを含み、サイトカインがそれらの生物活性の大部分を失っていてもそれらの天然の免疫原性をなお保持している免疫原性製品である。従って、本発明の製品は、高度な安全性、ＴＮＦα生物活性の強力な不活性化処理、およびなお非常に良好な抗ＴＮＦα免疫原性を示す。
【発明の概要】
【００１４】
従って、本発明の１つの目的は、ＴＮＦαが強力に不活性化されている（これは、本製品が後述する試験Ａの条件で、３０％未満の細胞溶解活性および／または１５０００を超える不活性化係数を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む免疫原性製品、油および界面活性剤と組み合わせた前記製品を含む乳濁液、ならびに前記製品または乳濁液を含むワクチンを提供することである。一実施形態では、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の前記製品は、後述する試験Ａの条件で、３０％未満の細胞溶解活性および／または１５０００を超える不活性化係数を示す。
【００１５】
本発明では、「ＫＬＨに結合したＴＮＦα」という用語は、共有結合および／または非共有結合によりＴＮＦαをＫＬＨに結合することを意味する。
【００１６】
一実施形態によれば、本発明の製品は遊離ＴＮＦαホモポリマーを含んでいてもよく、３００ｋＤａを超える遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合が総ＴＮＦαの３０％未満ｗ／ｗであることが好ましい。遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合を試験Ｃに従って計算することが好ましい。
【００１７】
本発明は、不活性化をさらにより進めたものであり、本発明のワクチンを、ヒトの体温条件、すなわち生体内温度、典型的には３７℃で、必要な時間すなわち免疫が有効でなければならない時間の間ずっと不活性されたままにするものである。この点に関しては、欧州および米国薬局方に準拠して試験Ｂを設計した。本発明の意味において、「不活性なままである」または「長期間不活性である」という用語は、本製品が試験Ｂの条件で、８０％未満の細胞溶解活性を示し、かつ／または５００を超える不活性化係数を有することを意味する。
【００１８】
一実施形態によれば、貯蔵のために、本発明の製品またはワクチン組成物を凍結乾燥してもよい。
【００１９】
本発明は、本製品が乳濁液中にある本発明の製品の製剤にも関する。そのような乳濁液は、本発明の製品、油および界面活性剤または少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤との混合物を含む。
【００２０】
本発明は、１種以上の免疫アジュバントと組み合わせた、本明細書に記載されている製品を含むワクチン組成物にも関する。免疫アジュバントは、それと組み合わせられるか混合される本発明の製品またはワクチン組成物の免疫応答を増強させる任意の物質であってもよい。
【００２１】
本発明は、凍結乾燥した本発明の製品を含む少なくとも１つのバイアル、注射用水を含む少なくとも１つのバイアル、およびアジュバントを含む少なくとも１つのバイアル、ならびに水溶液を得るために本製品と水を混合する手段、前記溶液をアジュバントと接触させる手段およびアジュバントを含む水溶液の混合物を乳化する手段を含むキットにも関する。一実施形態によれば、前記手段は注射器である。上記キットは、少なくとも１本の針も含む。好ましくは、上記キットは２本の針を含む。
【００２２】
本発明は、本発明の製品または本発明のワクチン組成物を含む医療機器にも関する。
【００２３】
本発明は、ＴＮＦαが強力に不活性化されている（これは、本製品が試験Ａの条件で３０％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む製品の調製方法であって、
ａ）（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニンおよび（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、
ｂ）１０ｋＤａ未満または８ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、
を含み、
工程ｂ）の後に、
ｃ）少なくとも６０ｍＭで少なくとも１０日間（２４０時間）〜少なくとも１２０ｍＭで少なくとも６日間（１４４時間）の範囲の濃度／時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程であって、一実施形態では、ホルムアルデヒドを少なくとも２００ｍＭの濃度で少なくとも１０日間（２４０時間）添加し、好ましい実施形態では、３００時間を超える期間で、当該媒体中で２２０ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度になるようにホルムアルデヒドを添加する工程と、
ｄ）（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する工程と、
ｅ）前記免疫原性製品を回収する工程と、
を行うことを特徴とする方法にも関する。
【００２４】
工程ａ）では、少なくとも２０ｍＭで１２０分を超える、好ましくは２４０分を超える濃度／時間反応条件でグルタルアルデヒドを添加すると有利である。一実施形態によれば、１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する（工程ｂ）前に、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応（工程ａ）を停止させる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｆ）での回収前に、少なくとも１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）のカットオフ値を有する濾過膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過工程を行い、それにより１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）未満の分子量を有する物質を本製品から除去する。
【００２６】
本発明の変形形態では、ＴＮＦαが強力に不活性化された（これは、本製品が、試験Ａの条件で３０％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む製品の調製方法は、
ａ）（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニンおよび（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、
ｂ）１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、
ｃ）任意にホルムアルデヒドを添加する工程と、
を含み、
工程ａ）では、グルタルアルデヒドを、少なくとも２０ｍＭ、好ましくは２５ｍＭの濃度で１８時間を超える期間にわたって添加し、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加してグルタルアルデヒドとの反応を停止させた後、本製品を回収することを特徴とする。
【００２７】
一実施形態では、工程ｂ）の後であって本製品の回収前に、ホルムアルデヒドを少なくとも６０〜２４０ｍＭ／少なくとも４日間の範囲の濃度／時間反応条件で添加した後、（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態によれば、本製品の回収直前に、少なくとも１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）のカットオフ値を有する濾過膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過工程を行い、それにより１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）未満の分子量を有する物質を本製品から除去する。
【００２９】
本発明は、前記免疫原性製品が投与される宿主において抗ＴＮＦα抗体応答を誘導するのに有用な免疫原性製品の調製方法にも関する。製造された免疫原性製品は主に、ＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療のためのワクチン組成物に使用される。より具体的には、本発明は、ヒトを含む動物に本発明の製品、乳濁液またはワクチンを投与する工程を含む、ＴＮＦαの過剰産生に関する疾患の予防または治療方法に関する。ＴＮＦαの過剰産生に関連する上記疾患は、強直性脊椎炎、乾癬、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質および癌からなる群から選択されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
従って、第１の態様では、本発明は、ＴＮＦαが強力に不活性化されている（これは、本製品が後述する試験Ａの条件で、３０％未満、好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、さらにより好ましくは１０％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む免疫原性製品、油および界面活性剤と組み合わせた前記製品を含む乳濁液、ならびに前記乳濁液または前記製品を含むワクチン組成物を含む。
【００３１】
一実施形態では、後述する試験Ａの条件で、濃度が１００ｎｇ／ｍｌである本発明の免疫原性製品の細胞溶解活性を測定する。
【００３２】
本明細書に使用されている「ＴＮＦα」は、哺乳類の生物体に由来する任意のＴＮＦαを包含する。哺乳類のＴＮＦαは、ヒトＴＮＦα、ウマＴＮＦα、ネコＴＮＦα、イヌＴＮＦα、ウシＴＮＦα、ヒツジＴＮＦαおよびヤギＴＮＦαを包含し、それらは全て当業者によく知られており、それらをコードする対応するアミノ酸配列および核酸配列は、様々な核酸およびアミノ酸配列のデータベースなどに長年一般公開されている。例示として、ヒトＴＮＦα（ジェンバンク登録番号：ＣＡＡ２６６６９）、マウスＴＮＦα（ジェンバンク登録番号：ＣＡＡ６８５３０）、イヌＴＮＦα（ジェンバンク登録番号：ＡＢＪ５１９０９）、ウマＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ−００１０７５２８８）、ネコＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ−００１００９８３５）、雄ウシＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ−７７６３９１）、ブタＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ−００１１６６４９６）、ヤギＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＡＦ８７７４１）、ラットＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ０３６８０７）、ヒツジＴＮＦα（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ−００１０２００３１）を含む様々な哺乳類のＴＮＦαのアミノ酸配列が、ジェンバンクのデータベースおよびＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のデータベースで照会される。
【００３３】
一実施形態によれば、ＴＮＦαはヒトＴＮＦα分子である。ヒトＴＮＦαは、約１７ｋＤａ（１７．３５ｋＤａ）の３つのＴＮＦα分子の会合により形成されたホモ三量体のＴＮＦα分子からなる。
【００３４】
本発明によれば、試験Ａを使用して、本発明の製品におけるヒトＴＮＦαの生理活性の不活性化率を測定する。この試験は、アクチノマイシンＤの存在下でヒトＴＮＦαによって誘導されるマウスＬ９２９細胞の細胞溶解に基づく。この試験は、Ｔ０すなわち本製品が液状であって製造後１０日未満の間４℃で保存された状態で行う。
【００３５】
以下の方法に従って試験Ａを行う：Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ社製Ｎｏ．８５０１１４２５）を、１．５×１０４／ｃｍ２で、培地（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製Ｆ７５２４）、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ０７８１）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製Ｓ８６３６）を添加したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２６０４Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養して、サブコンフルエントな単層を得る。
【００３６】
次いで、Ｌ９２９細胞を回収し、２×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底培養プレート内の１００μｌの平板培地（２％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM
F12（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２７１９Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２１±１時間培養する。
【００３７】
６０μｌのアッセイ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＨＬ１（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＵＳ７７２０１））に希釈した６４００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量の本発明の製品（１２０μｌ）から本発明の製品の１０段階の２倍希釈系列を調製する。
【００３８】
使用する濃度単位は、ＴＮＦα当量濃度（実施例３）またはＢＣＡ試験を用いて測定した総タンパク質（実施例１３）であってもよい。
【００３９】
一実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した１〜５μｇの総タンパク質に相当し、好ましくはＢＣＡ試験を用いて測定した１．５〜２．４μｇの総タンパク質に相当する。一実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した１．５μｇの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した２．４μｇの総タンパク質に相当する。
【００４０】
一実施形態では、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第１の工程が１０ｋＤａのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第２の工程が１０ｋＤａのカットオフ値を有する場合、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した１．５μｇの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第１の工程が１０ｋＤａのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第２の工程が３００ｋＤａのカットオフ値を有する場合、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した２．４μｇの総タンパク質に相当する。
【００４１】
ＢＣＡタンパク質アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）に基づく界面活性剤適合処方である。この方法は、アルカリ性媒体中のタンパク質によるＣｕ２＋からＣｕ１＋への周知の還元（ビウレット反応）を、ビシンコニン酸を含有する珍しい試薬を用いる銅（Ｉ）のカチオン（Ｃｕ１＋）の高感度かつ高選択的な比色検出と組み合わせたものである。このアッセイの紫色の反応生成物は、ＢＣＡの２つの分子を１つの銅（Ｉ）イオンでキレート化することにより生成される。この水溶性複合体は、５６２ｎｍで、２０〜２０００μｇ／ｍｌの広い測定範囲にわたるタンパク質濃度の増加に比例する強い吸光度を示す。
【００４２】
ＴＮＦα当量濃度単位により、細胞バイオアッセイおよびＴＮＦαショックモデルで生体内において、同じＴＮＦα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：
［ＴＮＦα当量濃度］＝（プロセスの開始時におけるＴＮＦαの量）−１０％。
【００４３】
３００ｋＤａのカットオフによる最終濾過工程を本発明の製品の調製方法で行った場合、７５％のＴＮＦαが除去され（ＴＮＦαを放射標識した放射性試験で証明される）、ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：［ＴＮＦα当量濃度］＝［（開始時のＴＮＦαの量−１０％）−７５％］。なお、収率は製造プロセス中一貫している。標準物質（ヒトＴＮＦα、６．２４ｍｇ／ｍｌ、Boehringer Ingelheim社製０３０３０Ｒ１）の１０段階の３倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地中に８ｎｇ／ｍｌの濃度のヒトＴＮＦα（１２０μｌ）から調製する。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製ＴＮＦαのＥＣ５０は、１０〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００４４】
Ｌ９２９細胞の培養時間の終了時に、細胞をサブコンフルエントにしなければならない。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、５０μｌの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移す。
【００４５】
２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社製Ａ９４１５）を添加した５０μｌのアッセイ培地を各ウェルに添加する。
【００４６】
次いで、Ｌ９２９細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２０±１時間培養する。
【００４７】
培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いてＬ９２９細胞の生存率を評価する。前記方法の一例は、以下のとおりである：２０μｌ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）をウェルに添加し、そのプレートを３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートする。次いで、分光光度計を用いて４９０ｎｍでそのプレートを読み取る。
【００４８】
以下のように生存率（％）を計算する：
％＝１−［（ＯＤ製品−ＯＤＴＮＦα標準物質）／（ＯＤ細胞−ＯＤＴＮＦα標準物質）］
【００４９】
ＯＤ製品は、本発明の製品を含むウェルの光学濃度を表す。
【００５０】
ＯＤＴＮＦα標準物質は、２００ｎｇ／ｍｌの標準物質ＴＮＦαを含むウェルの光学濃度を表す。
【００５１】
ＯＤ細胞は、標準物質も本発明の製品も含まない対照ウェルの光学濃度を表す。
【００５２】
従って、当業者は、試験Ａから、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌおよび８００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量の被験製品の細胞溶解活性率を求めることができる。
【００５３】
以下に示すように、実施例３および実施例１３で試験Ａを行う。
【００５４】
本発明の一実施形態では、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度、より好ましくは４００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度、さらにより好ましくは８００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度の本製品は、３０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは７０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、好ましくは２５％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは７５％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは２０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは８０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは１５％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは８５％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、さらにより好ましくは１０％未満のＬ９２９細胞を死滅させる（これは９０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）（図１Ｂを参照）。
【００５５】
本発明の一実施形態では、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα濃度の本製品は、３０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは７０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、好ましくは２５％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは７５％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは２０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは８０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは１５％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは８５％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、さらにより好ましくは１０％未満のＬ９２９細胞を死滅させる（これは９０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）。
【００５６】
本明細書において上に記載されている試験Ａを使用して本製品のＥＣ５０および本製品の不活性化係数も求めることができる。ＥＣ５０は、５０％のＬ９２９細胞を死滅させるのに必要な本製品の濃度に相当する。不活性化係数は、以下のように計算することができる：ＥＣ５０製品／ＥＣ５０ＴＮＦα。
【００５７】
本発明の一実施形態では、本製品は、５００ｎｇ／ｍｌを超える、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌを超える、好ましくは２０００ｎｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０００ｎｇ／ｍｌを超える、さらにより好ましくは５０００ｎｇ／ｍｌを超えるＥＣ５０を示す。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、本製品は、１５０００を超える、好ましくは３００００を超える、さらにより好ましくは５００００を超える不活性化係数を示す。本発明の一実施形態では、本製品の不活性化係数は１０００００を超える。
【００５９】
本発明は、不活性化をさらにより進めたものであり、本発明のワクチンを、ヒトの体温条件、すなわち生体内温度、典型的には３７℃で、必要な時間すなわち免疫を有効にしなければならない時間の間ずっと不活性なままにするものである。この点に関しては、欧州および米国薬局方に準拠して試験Ｂを設計した。本発明の意味では、「不活性なままである」または「長期間不活性である」という用語は、本製品が試験Ｂの条件で８０％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する。
【００６０】
一実施形態では、後述する試験Ｂの条件で、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の本発明の免疫原性製品の細胞溶解活性を測定する。
【００６１】
本発明によれば、試験Ｂを使用して、ヒトの体温条件下に置いた場合の本発明の製品におけるヒトＴＮＦα生理活性の不活性化率を求める。上記試験は、アクチノマイシンＤの存在下でヒトＴＮＦαにより誘導されるマウスＬ９２９細胞の細胞溶解に基づいており、Ｔ６すなわち本製品が液状であって３７℃で６週間貯蔵された状態で行う。
【００６２】
以下の方法に従って試験Ｂを行う：Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ社製Ｎｏ．８５０１１４２５）を、１．５×１０４／ｃｍ２で、培地（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製Ｆ７５２４）、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ０７８１）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製Ｓ８６３６）を添加したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２６０４Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。
【００６３】
次いで、Ｌ９２９細胞を回収し、２×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底培養プレート内の１００μｌの平板培地（２％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM F12（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２７１９Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２１±１時間培養した。
【００６４】
本発明の製品の５段階の３倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＨＬ１（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＵＳ７７２０１））に希釈した６４００ｎｇ／ｍｌの本発明の製品（１２０μｌ）から調製した。
【００６５】
使用する濃度単位は、ＴＮＦα当量濃度（実施例４）またはＢＣＡ試験を用いて測定した総タンパク質（実施例１３）であってもよい。
【００６６】
一実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した１〜５μｇの総タンパク質に相当し、好ましくはＢＣＡ試験を用いて測定した１．５〜２．４μｇの総タンパク質に相当する。一実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した１．５μｇの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、ＢＣＡ試験を用いて測定した２．４μｇの総タンパク質に相当する。
【００６７】
一実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第１の工程が１０ｋＤａのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第２の工程が１０ｋＤａのカットオフ値を有する場合に、ＢＣＡ試験を用いて測定した１．５μｇの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、１μｇのＴＮＦα当量濃度は、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第１の工程が１０ｋＤａのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第２の工程が３００ｋＤａのカットオフ値を有する場合に、ＢＣＡ試験を用いて測定した２．４μｇの総タンパク質に相当する。
【００６８】
ＢＣＡタンパク質アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）に基づく界面活性剤適合処方である。この方法は、アルカリ性媒体中のタンパク質によるＣｕ２＋のＣｕ１＋への周知の還元（ビウレット反応）を、ビシンコニン酸を含有する珍しい試薬を用いた銅（Ｉ）のカチオン（Ｃｕ１＋）の高感度かつ高選択的な比色検出と組み合わせたものである。このアッセイの紫色の反応生成物は、１つの銅（Ｉ）イオンによるＢＣＡの２つの分子のキレート化によって生成される。この水溶性複合体は、５６２ｎｍで、２０〜２０００μｇ／ｍｌの広い測定範囲にわたるタンパク質濃度の増加に比例する強い吸光度を示す。
【００６９】
ＴＮＦα当量濃度により、細胞バイオアッセイおよびＴＮＦαショックモデルで生体内において、同じＴＮＦα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：
［ＴＮＦα当量濃度］＝（プロセスの開始時のＴＮＦαの量）−１０％。
【００７０】
本発明の製品の調製方法で３００ｋＤａのカットオフによる濾過の最終工程を行った場合、７５％のＴＮＦαが除去され（ＴＮＦαを放射標識した放射性試験で証明される）、ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：［ＴＮＦα当量濃度］＝［（開始時のＴＮＦαの量−１０％）−７５％］。なお、収率は製造プロセス中一貫している。標準物質（ヒトＴＮＦα、６．２４ｍｇ／ｍｌ、Boehringer Ingelheim社製０３０３０Ｒ１）の１０段階の３倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地中に８ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦα（１２０μｌ）から調製した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製ＴＮＦαのＥＣ５０は、１０〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００７１】
Ｌ９２９細胞の培養時間の終了時に、細胞はサブコンフルエントであった。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、５０μｌの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移した。
【００７２】
２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社製Ａ９４１５）を添加した５０μｌのアッセイ培地を各ウェルに添加した。
【００７３】
次いで、Ｌ９２９細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２０±１時間培養した。
【００７４】
培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いてＬ９２９細胞の生存率を評価する。前記方法の一例は、以下のとおりである：２０μｌ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）をウェルに添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートする。次いで、分光光度計を用いて４９０ｎｍでプレートを読み取る。
【００７５】
以下のように生存率（％）を計算する：
％＝１−［（ＯＤ製品−ＯＤＴＮＦα標準物質）／（ＯＤ細胞−ＯＤＴＮＦα標準物質）］
【００７６】
ＯＤ製品は、本発明の製品を含むウェルの光学濃度を表す。
【００７７】
ＯＤＴＮＦα標準物質は、２００ｎｇ／ｍｌの標準物質ＴＮＦαを含むウェルの光学濃度を表す。
【００７８】
ＯＤ細胞は、標準物質も本発明の製品も含まない対照ウェルの光学濃度を表す。
【００７９】
従って、当業者は、３７℃で６週間後に残った被験製品の細胞溶解活性率を試験Ｂから求めることができる。以下に示す実施例４および実施例１３で試験Ｂを行う。
【００８０】
本発明の一実施形態では、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の本製品は、８０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは２０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、好ましくは７０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは３０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは６０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは４０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、さらにより好ましくは５０％未満のＬ９２９細胞を死滅させる（これは５０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）。
【００８１】
本発明の一実施形態では、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度の本製品は、８０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは２０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、好ましくは７０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは３０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは６０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは４０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、さらにより好ましくは５０％未満のＬ９２９細胞を死滅させる（これは５０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）。
【００８２】
本発明の一実施形態では、３５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度の本製品は、９０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは１０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、好ましくは８０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは２０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは７０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは３０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは６０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは４０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、さらにより好ましくは５０％未満のＬ９２９細胞を死滅させる（これは５０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）。
【００８３】
本発明の一実施形態では、１０００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα当量濃度の本製品は、９０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは１０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、好ましくは８０％未満のＬ９２９細胞を死滅させ（これは２０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）、より好ましくは７０％未満のＬ９２９細胞を死滅させる（これは３０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であることを意味する）。
【００８４】
本明細書において上に記載されている試験Ｂを使用して、本製品のＥＣ５０および本製品の不活性化係数を求めることもできる。ＥＣ５０は、３７℃で６週間貯蔵した後に５０％のＬ９２９細胞を死滅させるのに必要な本製品の濃度に相当する。不活性化係数は、以下のように計算することができる：ＥＣ５０製品／ＥＣ５０ＴＮＦα。
【００８５】
本発明の一実施形態では、本製品は、３７℃下に６週間置いた場合に、１００ｎｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌを超える、より好ましくは５００ｎｇ／ｍｌを超えるＥＣ５０を示す。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、本製品は、３７℃下に６週間置いた場合に、５００を超える、好ましくは２０００を超える、より好ましくは５０００を超える、さらにより好ましくは１００００を超える不活性化係数を示す。
【００８７】
一実施形態によれば、本発明の製品は、遊離ＴＮＦαホモポリマーを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、前記ＴＮＦαホモポリマーは、１００ｋＤａを超える、好ましくは３００ｋＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、１００ｋＤａを超える、好ましくは３００ｋＤａを超える遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合は、総ＴＮＦαの３０％ｗ／ｗ未満である。
【００８８】
試験Ｃに従って、遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合を測定してもよい。
【００８９】
試験Ｃは、（１）抗ＴＮＦαモノクローナル抗体または抗ＫＬＨポリクローナル抗体のそれぞれでコーティングされた磁気ビーズを用いる免疫捕捉工程による遊離ＴＮＦαもしくはＫＬＨホモポリマーの精製および（２）特異的ＥＬＩＳＡによる遊離ＴＮＦαもしくはＫＬＨホモポリマーの定量に基づいている。
【００９０】
試験Ｃによれば、抗ＫＬＨもしくは抗ＴＮＦα抗体でコーティングされたビーズを調製する（そのような調製の例は、実施例５に説明されている）。コーティングされたビーズおよびコーティングされていないビーズを本製品と混合し、４℃で１２〜１６時間インキュベートする。次いで、上澄みを磁石で回収し、ＥＬＩＳＡで分析する。
【００９１】
次いで、３種類のＥＬＩＳＡを行う：
−  捕捉抗体および一次抗体が抗ＫＬＨ抗体であるＫＬＨ−ＫＬＨによるＥＬＩＳＡ、
−  捕捉抗体および一次抗体が抗ＴＮＦα抗体であるＴＮＦα−ＴＮＦαによるＥＬＩＳＡ、
−  捕捉抗体が抗ＫＬＨ抗体であり一次抗体が抗ＴＮＦα抗体であるかその逆であるＫＬＨ−ＴＮＦαによるＥＬＩＳＡ。
【００９２】
例えば、ビオチンで標識された検出抗体、ポリストレプトアビジンＨＲＰ増幅システムおよびｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を用いるような、当該技術分野で知られている任意の比色手段によって、ＥＬＩＳＡを発色させる。
【００９３】
ＥＬＩＳＡの結果の分析により、実施例５に示すように、本発明の製品中に存在する総ＴＮＦαとの比較によって遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合を求めることができる。
【００９４】
より好ましい実施形態では、本製品は、１００ｋＤａ未満の分子量（これはホモ三量体のＴＮＦα分子の二量体の見かけの分子量である）を有するＴＮＦαホモポリマーを含有していない。より好ましい実施形態では、本製品は、３００ｋＤａ未満の分子量（これはホモ三量体のＴＮＦα分子の六量体の見かけの分子量である）を有するＴＮＦαオリゴマーを含有していない。どんな理論にも関連づけたくはないが、本出願人は、１００ｋＤａ未満、一実施形態では３００ｋＤａ未満のＴＮＦαオリゴマーの除去により、ヒトおよび非ヒト哺乳類への使用に対する本製品の安全性を高め、最終免疫原性製品の免疫原性を高め得ることを示唆している。
【００９５】
［乳濁液およびそのような乳濁液を含有するワクチン組成物］
本発明は、本発明の製品の製剤にも関する。一実施形態では、本製剤は、本発明の製品を含有する液体製剤である。好適な液体製剤の例としては、例えば無菌溶液などの溶液、例えば無菌分散液などの分散液または乳濁液が挙げられる。別の実施形態では、本製剤は本発明の製品を含む固体製剤である。好適な固体製剤の例としては、例えば、本発明の製品を含む無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末などの粉末が挙げられるが、これに限定されない。
【００９６】
本発明のワクチン組成物は、前記製剤を含むか前記製剤で構成されていると有利である。
【００９７】
一実施形態では、本発明の製剤中の本発明に係る免疫原性製品の量は、前記製剤の総重量の０．０１％（ｗ／ｗ）超〜１％未満（ｗ／ｗ）である。
【００９８】
本発明は、本製品が乳濁液中に存在する本発明の製品の製剤にも関する。本発明のワクチン組成物が前記乳濁液を含むか前記乳濁液で構成されていると有利である。そのような乳濁液は、本発明の免疫原性製品、油および界面活性剤または少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤との混合物を含む。好ましくは、上記油または油／界面活性剤の混合物は、医薬的に許容される賦形剤である。より好ましくは、油と界面活性剤との混合物はアジュバントであり、さらにより好ましくは免疫アジュバントである。好ましいアジュバントはＩＳＡ５１である。使用し得る免疫アジュバントの別の例はＳＷＥ（スクアレン系水中油型エマルション）である。使用し得る免疫アジュバントの別の例はＳＷＥ−ａ（スクアラン系水中油型エマルション）である。本発明の乳濁液は、油中水型エマルションまたは水中油型エマルションであってもよい。
【００９９】
別の実施形態では、乳濁液中の本発明に係る免疫原性製品の量は、前記乳濁液の総重量の０．０１％（ｗ／ｗ）超〜１％未満（ｗ／ｗ）である。
【０１００】
［アジュバント］
本発明の乳濁液またはワクチン組成物は、アジュバント、特に免疫アジュバントを含んでいてもよい。一実施形態では、アジュバントの量は、ワクチン組成物の総重量の０．００００１％（ｗ／ｗ）〜１％、好ましくは０．０００１〜０．１％、より好ましくは０．００１〜０．０１％（ｗ／ｗ）である。
【０１０１】
上記ワクチン組成物に、例えば、フロインド不完全アジュバント、ミコール酸系アジュバント（例えば、トレハロースジミコール酸）、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ−Ｏｐａｃａ、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］もしくはＭＤＰ類似体などの糖タンパク質）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌から抽出されたもの）、連鎖球菌製剤（例えばＯＫ４３２）、Ｂｉｏｓｔｉｍ（商標）（例えば、01 K2）、欧州特許第１０９９４２号、欧州特許第１８０５６４号および欧州特許第２３１０３９号の「イスコム（ＩＳＣＯＭ）」、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、中性油（例えば、ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）、植物油（例えばアラキド油(arachid oil)、リポソーム、プルロニック（登録商標）ポリオール、Ｒｉｂｉアジュバント系（例えば、英国特許出願公開第Ａ２１８９１４１号を参照）、またはインターロイキン、特に細胞媒介性免疫を刺激するものなどの油系アジュバントを含む当業者によって知られている任意の好適なアジュバントを使用してもよい。放線菌目細菌属であるアミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）の抽出物からなる他のアジュバントについては、米国特許第４，８７７，６１２号に記載されている。さらに、登録商標を有するアジュバント混合物が市販されている。使用されるアジュバントは、投与される生物に部分的に依存している。投与するアジュバントの量は、動物の種類および大きさに依存している。最適用量は、常法によって容易に決定することができる。
【０１０２】
油中水型エマルションへの使用に適した油アジュバントは、鉱油および／または代謝可能な油を含んでいてもよい。鉱油は、バイオール（Ｂａｙｏｌ）（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）、およびドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ）（登録商標）６ＶＲ（ＳＥＰＰＩＣ社、フランス）（登録商標）などのドラケオールから選択してもよい。代謝可能な油は、ＳＰ油（以下に記載）、Emulsigen（MPV Laboratories社、ネブラスカ州ラルストン）、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）２６４，２６６，２６（Ｓｅｐｐｉｃ社、フランスのパリ）、ならびに落花生油および大豆油などの植物油、魚油であるスクアランおよびスクアレンなどの動物油、トコフェロールおよびその誘導体から選択してもよい。
【０１０３】
さらに、当該アジュバントは、アジュバントの約０．１〜２５体積％、より好ましくは約１〜１０体積％、さらにより好ましくは約１〜３体積％の量で１種以上の湿潤剤または分散剤を含んでいてもよい。湿潤剤または分散剤として、非イオン性界面活性剤が特に好ましい。有用な非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体、特にプルロニック（登録商標）という商標で市販されているＢＡＳＦ社（ニュージャージー州マウントオイーブ）から入手可能なものが挙げられる。他の有用な非イオン性界面活性剤としては、Tween 80（登録商標）という商標で市販されているモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのポリオキシエチレンエステルが挙げられる。本発明のワクチン組成物の一部として２種以上、例えば少なくとも２種の湿潤剤または分散剤をアジュバントに含めることが望ましい場合もある。
【０１０４】
数字の前の「約」という用語は、本明細書で使用されている場合、前記数字の値の±１０％を意味する。
【０１０５】
好適なアジュバントとしては、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポラニオン（ｐｏｌａｎｉｏｎ）、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）；ペプチド類、例えば、ムラミルジペプチド、アイメチルグリシン（ａｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、タフトシン、油乳濁液、ミョウバンおよびそれらの混合物などの当業者によって知られている界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の可能なアジュバントとしては、大腸菌易熱性毒素またはコレラ毒素のＢペプチドサブユニットが挙げられる(McGhee, J. R., et al., "On vaccine development," Sem.
Hematol., 30:3-15 (1993))。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の乳濁液またはワクチン組成物は、免疫アジュバントを含む。好適な免疫アジュバントの例としては、ＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ社）、ＳＷＥまたはＳＷＥ−ａ（ローザンヌ大学のワクチン製剤研究室(VFL:Vaccine Formulation Laboratory)によって提供されている）が挙げられる。
【０１０７】
［さらなる界面活性剤］
乳濁液を含む本発明に係るワクチン組成物の実施形態では、本ワクチン組成物は、免疫原性製品と１種以上の油性免疫アジュバント物質との組み合わせに加えて、１種以上の界面活性剤も含有することが好ましい。界面活性剤の例示的な実施形態としては、アラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）（ＳＥＰＰＩＣ社、フランス）という商標で販売されているモンタニド（登録商標）８０などのモノオレイン酸マンニドが挙げられる。
【０１０８】
一実施形態では、界面活性剤の量は、ワクチン組成物の総重量の０．００００１〜１％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０００１〜０．１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００１〜０．０１％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【０１０９】
［凍結乾燥した製品］
一実施形態によれば、貯蔵のために、本発明の製品またはワクチン組成物を凍結乾燥してもよい。従って、ワクチン組成物をフリーズドライ（凍結乾燥）形態で提供してもよい。前記実施形態では、本発明に係る免疫原性製品を１種以上の凍結乾燥補助物質と組み合わせる。様々な凍結乾燥補助物質が当業者によってよく知られている。凍結乾燥補助物質は、ラクトースおよびマンニトールなどの糖類を包含する。
【０１１０】
ワクチン組成物が界面活性剤を含む液体乳濁液として使用される凍結乾燥された組成物からなるそのような実施形態では、ワクチン組成物は、前記ワクチン組成物の総重量の０．１％（ｗ／ｗ）超〜１０％未満（ｗ／ｗ）の量の本発明に係る免疫原性製品を含むことが好ましい。
【０１１１】
［安定化剤］
いくつかの実施形態では、ワクチンを安定化剤と混合して、例えば、分解しやすいタンパク質を分解させないように保護して、ワクチンの貯蔵寿命を延ばしたり、凍結乾燥効率を高めたりしてもよい。有用な安定化剤は、ＳＰＧＡ(Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950))、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストランまたはグルコース）、タンパク質（アルブミン、カゼインまたはそれらの分解生成物など）、および緩衝液（例えばリン酸カリウムまたはリン酸二ナトリウムなどのアルカリ金属リン酸塩など）である。
【０１１２】
［投与経路］
本発明に係るワクチン組成物を、注射可能な方法、例えば、皮内、筋肉内、腹膜内もしくは皮下注射、あるいは例えば経皮送達などの局所的な方法を含む任意の従来の方法によって対象に投与して免疫してもよい。当該治療は、一定期間にわたる単回投与または複数回投与で構成されていてもよい。
【０１１３】
［剤形］
注射可能な使用に適した形態としては、無菌溶液もしくは分散液および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびチメロサールなどの各種抗菌薬および抗真菌薬をワクチン組成物に添加して、微生物による汚染に対する予防を講じることができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを含めることが好ましい。本組成物に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の持続的吸収を生じさせることができる。
【０１１４】
一実施形態によれば、本発明の凍結乾燥したワクチン組成物を注射用水に可溶化し、穏やかに混合した後、免疫アジュバント、好ましくはＩＳＡ５１を添加し、乳化のために混合物を穏やかに混合し、好適な注射器に充填する。使用し得る免疫アジュバントの別の例は、ＳＷＥまたはＳＷＥ−ａである。従って、本発明は、本発明のワクチン組成物が後から充填されるか予め充填された注射器などの医療機器にも関する。理想的には、乳濁液を即座に調製する。但し、乳濁液を含む注射器を２〜８℃で１０時間未満貯蔵することができる。この場合、注射前に手の間で摩擦により乳濁液を温めるべきである。
【０１１５】
［単位用量範囲］
好ましくは、ヒトへの使用または非ヒト哺乳類への使用が求められる場合、本発明に係るワクチン組成物の用量単位は、動物のために設計される場合は０．１〜１０００μｇの範囲であり、ヒトのために設計される場合は２０〜１０００μｇの範囲の量の免疫原性製品を含むことが好ましい。
【０１１６】
ヒトへの使用が求められる場合、本発明に係るワクチン組成物の典型的な用量単位は、好ましくは２０μｇ〜１０００μｇ、最も好ましくは２５μｇ〜６００μｇの範囲の量の免疫原性製品を含むことが好ましい。
【０１１７】
［作用機序］
本発明は、前記免疫原性製品が投与される哺乳類において、内因性サイトカインの免疫抑制特性、アポトーシス特性または血管新生特性を中和する抗体が誘導される体液性免疫応答などの免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性製品の調製方法にも関する。
【０１１８】
一実施形態では、それが投与される哺乳類において免疫応答を誘導する免疫原性製品の能力は、内因性ＴＮＦαを中和する抗体を誘導するその能力によって測定することができる。
【０１１９】
一実施形態では、中和試験（試験Ｄ）に従って、内因性ＴＮＦαを中和する抗体を誘導する能力を測定してもよい。
【０１２０】
以下の手順に従って、中和試験（試験Ｄ）を行う：Ｈａｙｗａｒｄらによって記載されているｈＴＮＦαトランスジェニックマウス(2007, BMC Physiology, Vol. 7 : 13-29)に、本発明のワクチン、本発明の乳濁液または本発明の免疫原性製品を含む組成物を筋肉内注射する。例えば、０日目（Ｄ０）、７日目（Ｄ７）および２８日目（Ｄ２８）などに、少なくとも１回、好ましくは２回、より好ましくは３回、マウスに筋肉内投与する。例えば、６１日目（Ｄ６１）、１１９日目（Ｄ１１９）および１９１日目（Ｄ１９１）などの免疫後数日目に血清を採取する。
【０１２１】
Ｌ９２９バイオアッセイを用いて、本発明の免疫原性製品で免疫されたｈＴＮＦαマウスからの血清の中和能を評価する。
【０１２２】
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ社製Ｎｏ．８５０１１４２５）を、１．５×１０４／ｃｍ２で、培地（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製Ｆ７５２４）、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ０７８１）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製Ｓ８６３６）を添加したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２６０４Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養して、サブコンフルエントな単層を得る。
【０１２３】
次いで、Ｌ９２９細胞を回収し、２×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底培養プレート内の１００μｌの平板培地（２％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM F12（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２７１９Ｆ）に播種し、加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２で２１±１時間培養する。
【０１２４】
血清を二つ組で試験する：１つのウェル当たり、使用希釈倍率（１／１００）以上である４倍に希釈した６０μｌの血清または３０μｌのアッセイ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＨＬ１（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＵＳ７７２０１））を添加した。被験血清および対照を６段階の２倍希釈系列で希釈する。
【０１２５】
アッセイ培地に希釈したヒトＴＮＦαサイトカインを、３０μｌ／ウェルで、使用濃度２．５ｎｇ／ｍＬ以上で、４倍に希釈した血清希釈プレートに添加し、このプレートを３７℃で９０分、４℃で３０分および室温で１５分インキュベートする。
【０１２６】
５０μｌの試料を９６ウェル平底培養プレートに移し、そこで細胞をサブコンフルエントにしなければならない。次いで、２μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤを添加した５０μｌのアッセイ培地を添加し、プレートを加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２で２０±１時間インキュベートする。
【０１２７】
次いで、１つのウェル当たり２０μｌのＭＴＳ／ＰＭＳ（１００ｍＬのＭＴＳおよび５ｍＬのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）を添加し、このプレートを加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。
【０１２８】
培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いてＬ９２９細胞の生存率を評価する。一例は、以下のとおりである：２０μｌ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）をウェルに添加し、このプレートを加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートする。次いで、分光光度計を用いて４９０ｎｍでこのプレートを読み取る。
【０１２９】
以下のように相対的細胞生存率を計算する：
中和率（％）＝（ＯＤ試験−ＯＤＴＮＦα標準物質）／（ＯＤ血清−ＯＤＴＮＦα標準物質）
【０１３０】
ＯＤ試験は、血清およびｈＴＮＦαを含むウェルの光学濃度を表す。
【０１３１】
ＯＤＴＮＦα標準物質は、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαのみを含むウェルの光学濃度を表す。
【０１３２】
ＯＤ血清は、血清のみを含む対照ウェルの光学濃度を表す。
【０１３３】
中和力価は、ｈＴＮＦα活性の５０％を中和する血清希釈の逆数として表す（すなわちＮＣ５０）。
【０１３４】
実施例１５で本発明の製品に対して中和試験を行い、本発明の製品がｈＴＮＦαに対して高い中和活性を有する抗体を誘導することが分かった。
【０１３５】
本発明は、本明細書において上に記載されているような免疫原性製品を前記哺乳類に投与することを含む、それを必要としている哺乳類において免疫応答を誘導する方法にも関する。一実施形態では、前記免疫応答は、内因性サイトカインの免疫抑制特性、アポトーシス特性または血管新生特性を中和する抗体が誘導される体液性免疫応答を含む。
【０１３６】
製造された免疫原性製品は、ＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患を予防または治療するためのワクチン組成物に主に使用される。より具体的には、本発明は、ＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療方法であって、ヒトを含む動物に、治療的有効量の本発明の製品、乳濁液またはワクチンを投与する工程を含む方法に関する。ＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患は、強直性脊椎炎、乾癬、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質および癌からなる群から選択されてもよい。本発明の１つの目的は、ＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療に使用される本明細書において上に記載されている本発明の製品、乳濁液またはワクチンである。
【０１３７】
従って、本発明のさらなる態様は、上に定義した免疫原性製品またはワクチン組成物の使用に関する。本発明のさらなる目的は、哺乳類において内因性ＴＮＦαの活性を中和する抗体の産生を誘導する方法であって、前記哺乳類に（ｉ）上に開示したワクチン組成物または（ｉｉ）上に記載した免疫原性製品を１種以上の免疫アジュバントと共に投与する工程を含む方法を提供することである。
【０１３８】
［キットおよび医療機器］
本発明は、以下を含むキットにも関する：
−  典型的には３ｍＬの本発明の凍結乾燥された製品を含む１つのバイアル（バイアルＮｏ．１）、
−  典型的には２ｍＬの注射用水を含む１つのバイアル（バイアルＮｏ．２）、
−  アジュバント、好ましくはＩＳＡ５１、ＳＷＥまたはＳＷＥ−ａを含む１つのバイアル（バイアルＮｏ．３）（このバイアルは３ｍＬのアジュバントを含むことができ、８ｍＬの容器であってもよい）、
−  １つの注射器、典型的には１ｍＬのBraun Injekt-F（登録商標）、
−  乳濁液の調製のための１本の針（針Ｎｏ．１）（この針は好ましくは２０Ｇ針である）、
−  注射、好ましくは筋肉内注射のための１本の針（針Ｎｏ．２）（この針は好ましくは２３Ｇ針である）。
【０１３９】
本発明は、以下を含むキットからのワクチンの調製方法にも関する：
（１）針Ｎｏ．１に接続した注射器を用いてバイアルＮｏ．２からバイアルＮｏ．１の中に注射用水を注入する、
（２）調製物が完全に可溶化するまで、バイアルＮｏ．１を１〜５分間穏やかに回す、
（３）同じ注射器および針を用いて、バイアルＮｏ．３からアジュバントを抜き出す。この注射器内容物をバイアルＮｏ．１の中に放出する、
（４）内容物を乳化させるのに十分な回数、典型的には３０回、全バイアル内容物をポンプで出し入れし、最終的に全乳濁液を抜き出す。
【０１４０】
注射前に、針Ｎｏ．１を好ましくは針Ｎｏ．２と交換し、注射器から空気を除去する。
【０１４１】
本発明は、本発明のワクチン組成物が事前に充填されたかこれから充填される注射器である医療機器にも関する。
【０１４２】
本発明は、本発明の製品または本発明のワクチン組成物が事前に充填されたバイアルまたはカープルを含む医療機器にも関する。
【０１４３】
［本発明の製品の調製方法］
本発明は、ＴＮＦαが強力に不活性化された（これは、本製品が試験Ａの条件で、３０％、好ましくは２５％、より好ましくは２０％、より好ましくは１５％、さらにより好ましくは１０％未満の細胞溶解活性を示すか１５０００を超える不活性化係数を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む製品を調製するための２つの方法（以下、「主要方法」および「変形方法」という）にも関する。１００ｎｇ／ｍｌの濃度について本発明の製品の細胞溶解活性を測定することが好ましい。
【０１４４】
両方法において、ＴＮＦα出発製品は、当該技術分野に記載されている様々な方法によって得られる組換え型ヒトＴＮＦαからなることが好ましい。例示として、ＴＮＦαは、ヒトＴＮＦαをコードする発現カセットがその中に挿入されたプラスミドによって形質転換されている大腸菌細胞により産生された組換え型ヒトＴＮＦαからなる。ＴＮＦα出発製品は、検出可能な量のエンドトキシンを含有していないことが最も好ましい。本発明の方法で使用するために、ＴＮＦαは、液体溶液、好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する緩衝液であることが好ましい。いくつかの実施形態では、ＴＮＦαを含有する液体溶液は、好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは０．５％（ｗ／ｗ）〜３％（ｗ／ｗ）の範囲の最終濃度のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）も含有する。一実施形態では、ＴＮＦαを含有する液体溶液は、液体溶液の総重量に対して０．１％（ｗ／ｗ）〜２％（ｗ／ｗ）の範囲の最終濃度、好ましくは１％（ｗ／ｗ）の最終濃度のＤＭＳＯも含有する。一実施形態では、ＴＮＦαを含有する液体溶液はＤＭＳＯを含有していない、すなわち０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含有する。ＤＭＳＯは、ＴＮＦα分子中に存在するグルタルアルデヒ反応基の利用能を増加させることができる周知の抗酸化化合物である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦαを含有する液体溶液は、１ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは３ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の最終濃度のＥＤＴＡも含有する。
【０１４５】
好ましくは、ＫＬＨ出発製品は、海洋性腹足類軟体動物の鍵穴カサガイのリンパから抽出された高度に精製されたＫＬＨからなり、前記ＫＬＨ出発製品は、検出可能な量のエンドトキシンを含有していないことが好ましい。天然に産生されたＫＬＨは一般に、２つの十量体からなる構造（２０個のサブユニットからなる非共有結合性管状組立体）からなり、各十量体単位は、サブユニットＫＬＨ１またはＫＬＨ２のホモポリマーからなる。ＫＬＨ１サブユニットの分子量が約３５０ｋＤａであり、ＫＬＨ２サブユニットの分子量が約３９０ｋＤａであることを考慮すると、ＫＬＨの２つの十量体は、約８×１０６Ｄａの分子量（ＭＷ）を有することが好ましい。
【０１４６】
ＴＮＦα＋ＫＬＨ＋グルタルアルデヒドの反応
第１の実施形態では、本発明の方法は、
（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する第１の工程（工程ａ）
を含む。
【０１４７】
グルタルアルデヒドとＫＬＨおよびＴＮＦαの両方が有する遊離アミノ基との反応により、工程ａ）の終了時に得られる製品は、それに関連するＴＮＦα分子を有するＫＬＨのモノマーおよびオリゴマーを含み、ここで、ＴＮＦα分子は、（ｉ）ＴＮＦαモノマーおよび（ｉｉ）ＴＮＦαオリゴマーを含む。
【０１４８】
工程ａ）の好ましい実施形態では、グルタルアルデヒドを添加する前に、最初にＴＮＦαおよびＫＬＨを適当な量で混合する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、工程ａ）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを１０：１〜４０：１の範囲のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合する。いくつかの好ましい実施形態では、工程ａ）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを３０：１〜４０：１の範囲のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合する。
【０１５０】
いくつかの好ましい実施形態では、工程ａ）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを３５：１〜４０：１の範囲のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合する。
【０１５１】
工程ａ）のいくつかの実施形態（以下、工程ａ１）という）では、反応混合物中に１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは２５ｍＭの最終濃度でグルタルアルデヒドを使用する。工程ａ）のいくつかの実施形態では、グルタルアルデヒドを、ＴＮＦαおよびＫＬＨと共に、１１０分超〜４００分未満、好ましくは約１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０および２４０分間インキュベートする。一実施形態では、グルタルアルデヒドを２５ｍＭで約１２０分間添加する。別の実施形態では、グルタルアルデヒドを２５ｍＭで約２４０分間添加する。
【０１５２】
グルタルアルデヒドとのインキュベーション工程ａ）を１８℃〜３７℃、好ましくは１８℃〜２７℃の範囲の温度で行うと有利である。
【０１５３】
グルタルアルデヒド反応後の失活
一実施形態によれば、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させてもよい。
【０１５４】
上記還元剤は、それらの還元的性質によりＴＮＦαまたはＫＬＨ遊離アミノ基のいずれとも反応していないグルタルアルデヒドの残った遊離アルデヒド基を還元する能力を有する当該技術分野で知られている還元剤のうちのいずれか１種で構成されていてもよい。上記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択してもよい。
【０１５５】
一実施形態によれば、前記失活化合物がアミノ酸である実施形態では、前記アミノ酸はグリシンからなる。グルタルアルデヒドとの反応を遮断するためにグリシンおよび／またはリジンが使用される工程ｂ）のいくつかの実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、選択されたアミノ酸を、反応混合物中に０．０１Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜０．５Ｍ、最も好ましくは０．０８Ｍ〜０．２Ｍ、例えば０．１Ｍの最終濃度で使用する。一実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、失活化合物とのインキュベーションを１分〜１２０分、好ましくは５分〜６０分、例えば１５分間行う。別の実施形態では、この工程を２０℃〜３０℃、好ましくは２３℃〜２７℃の温度で行う。
【０１５６】
本方法の工程ｂ）
この第１の実施形態では、本発明の方法は、工程ａ）を行い、次いで任意に上記失活反応を行った後に、
ｂ）１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程
である工程ｂ）を含む。
【０１５７】
工程ｂ）では、反応混合物中に存在する１０ｋＤａ未満の低分子化合物を除去する。これらの低分子化合物は主に、ＴＮＦαおよびＫＬＨのどちらとも反応していない過剰なグルタルアルデヒドおよび過剰な失活化合物分子ならびに内因性ＴＮＦαまたは天然のＫＬＨよりもサイズが小さい最終的なタンパク質分解生成物を包含する。
【０１５８】
工程ｂ）は、１０ｋＤａ未満の化合物を除去することができる任意の公知の技術に従って行ってもよく、そのような技術としては、１０ｋＤａのカットオフを有する透析膜を用いる透析または１０ｋＤａのカットオフを有する濾過膜を用いる濾過が挙げられる。例示として、工程ｂ）は、本明細書中の実施例に示すように、１０ｋＤａのカットオフを有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程で構成されていてもよい。望ましくない低分子化合物を含まない濾過保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、工程ｂ）の終了時に回収する。
【０１５９】
所望であれば、工程ｂ）は、工程ｂ）の終了時に得られる、反応混合物中に存在する最終的な化合物凝集体を除去する予備工程を含んでもよい。前記予備工程は、最終的に液体溶液で懸濁液中に存在する固体凝集体を除去するための従来の濾過工程、例えば、適当な濾過膜（例えば０．２μｍの孔径を有する濾過膜）を用いる濾過工程で構成されていてもよい。
【０１６０】
本方法の工程ｃ）
この第１の実施形態では、本発明の方法は、工程ｂ）を行った後に、
ｃ）少なくとも６０ｍＭで少なくとも２４０時間〜少なくとも１２０ｍＭで少なくとも１４４時間の範囲の濃度／時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する
工程ｃ）を含む。
【０１６１】
工程ｃ）は、指定された濃度および指定された期間でホルムアルデヒドを添加する工程からなる。工程ｃ）の終了時に得られる中間体生成物を、反応混合物中に少なくとも６０ｍＭ、好ましくは６０〜５００ｍＭ、より好ましくは１００〜３００ｍＭの濃度で少なくとも１０日間、好ましくは２４０〜５００時間、より好ましくは２８８〜３３６時間のホルムアルデヒド処理に供する。一実施形態では、工程ｃ）の終了時に得られる中間体生成物を、反応混合物中に少なくとも１２０ｍＭ、好ましくは１２０〜２７０ｍＭの濃度で少なくとも６日間（１４４時間）、好ましくは１４４〜５００時間、より好ましくは１４４〜３６０時間のホルムアルデヒド処理に供する。
【０１６２】
一実施形態では、工程ｃ）において、混合物中に２２０ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度で３００時間を超える期間にわたってホルムアルデヒド処理を行う。一実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、その期間は、３１０、３２０および３３０時間を超え、例えば３３６時間（１４日間）である。
【０１６３】
好ましくは、ホルムアルデヒドでの処理期間は、５００時間を超えないことが好ましく、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０および３６０時間未満の期間を包含する。
【０１６４】
工程ｃ）では、反応混合物中のホルムアルデヒドの濃度は、２００ｍＭを超えていることが好ましい。２００ｍＭを超えるホルムアルデヒドの濃度は、特に２２０、２３０、２４０および２５０ｍＭを超える濃度を包含する。一実施形態では、ホルムアルデヒドの濃度は２７０ｍＭ未満である。好ましい実施形態では、ホルムアルデヒドは、少なくとも２００ｍＭの最終濃度で少なくとも２４０時間、好ましくは２２０ｍＭ〜２７０ｍＭ、好ましくは２５０ｍＭで少なくとも３００時間添加する。
【０１６５】
工程ｃ）では、本明細書中の実施例に示すように、３０℃〜４２℃、例えば３７℃の温度で、ホルムアルデヒドとのインキュベーションを行うことが好ましい。
【０１６６】
先行技術の知識から予期していたとおり、前記ホルムアルデヒド処理により、本製品に顕著な構造変化が生じる。従って、この処理にも関わらず、本発明に係る方法によって得られる免疫原性製品に期待した抗ＴＮＦα免疫原性が得られることはいっそう驚きであった。
【０１６７】
本方法の工程ｄ）
本方法の工程ｄ）では、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を停止させる。
【０１６８】
上記還元剤は、それらの還元的性質によりＴＮＦαまたはＫＬＨの遊離アミノ基のいずれとも反応していないホルムアルデヒドの残った遊離アルデヒド基を還元する当該技術分野で知られている還元剤のうちのいずれか１種で構成されていてもよい。
【０１６９】
上記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択してもよい。
【０１７０】
一実施形態によれば、前記失活化合物がアミノ酸である実施形態では、前記アミノ酸はグリシンからなる。ホルムアルデヒドとの反応を遮断するためにグリシンおよび／またはリジンが使用される工程ｂ）のいくつかの実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、選択されたアミノ酸を、反応混合物中に０．０１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜１Ｍ、最も好ましくは０．２Ｍ〜０．８Ｍ、例えば０．３８Ｍの最終濃度で使用する。一実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、失活化合物とのインキュベーションを５分間〜１２０分間、好ましくは１０分間〜８０分間、例えば６０分間行う。別の実施形態では、１８℃〜３０℃、好ましくは１９℃〜２７℃の温度でこの工程を行う。
【０１７１】
１００ｋＤａ未満、好ましくは３００ｋＤａ未満の化学種の除去
工程ｄ）の後に、本発明の製品の回収を行ってもよい。
【０１７２】
但し、非常に好ましい実施形態によれば、工程ｄ）の後であって本製品の回収前に、さらなる工程を行う。この工程は、１００ｋＤａ、好ましくは３００ｋＤａ未満の分子量を有する物質の除去からなる。３００ｋＤａ未満の分子量を有する物質の除去は、３００ｋＤａ未満の分子量を有する物質を液体溶液から除去するための当該技術分野で知られている任意の技術によって当業者が行ってもよい。第１の実施形態では、使用される技術は、少なくとも１００ｋＤａ、または一実施形態では少なくとも３００ｋＤａのカットオフ値を有する濾過膜を用いて行われる濾過工程であり、これは限外濾過工程またはタンジェンシャルフロー濾過工程を包含する。第２の実施形態では、使用される技術は、少なくとも３００ｋＤａのカットオフ値を含む少なくとも１００ｋＤａのカットオフ値を有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程からなる。
【０１７３】
どんな理論にも関連づけたくはないが、本出願人は、驚くべきことに、この工程を行うことは本製品にとって有利であることに気付いた。特に、この工程により、ＫＬＨと反応していないＴＮＦαのホモポリマーが除去された。本方法のこの工程で５０％を超える最初のＴＮＦαを除去し得ること、ならびに予想外に、残った生成物が免疫原性に関する限りさらにより良好なものであることを観察した。
【０１７４】
凍結乾燥
任意に、使用前の長期貯蔵のために、本発明に係る最終免疫原性製品をさらに処理してもよい。本発明者らは、本発明の製品の凍結乾燥により、長期貯蔵に対するその安定性を高めることができ、かつＴＮＦαの生物学的不活性化の不可逆性を高めることができることが分かった。本発明に係る凍結乾燥された免疫原性製品を、その使用まで約２℃〜約２５℃の温度で、無菌および非発熱性密閉容器内で数ヶ月、例えば少なくとも６ヶ月間、変化させることなく貯蔵することができる。
【０１７５】
他の方法
本発明の変形形態では、ＴＮＦαが強力に不活性化された（これは、本製品が試験Ａの条件で、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で試験した場合に、３０％、好ましくは２５％、より好ましくは２０％、さらにより好ましくは１５％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む製品の調製方法は、
ａ）（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、
ｂ）１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、
を含み、
グルタルアルデヒドを、１８時間を超える、２０時間を超えるまたは２４時間を超える期間にわたって少なくとも２０ｍＭの濃度で添加し、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加してグルタルアルデヒドとの反応を停止させる工程ａ）の具体的な実施形態（以下、工程ａ２）という）を特徴とする。
【０１７６】
第１の実施形態では、次いで、本製品を回収する。
【０１７７】
工程ａ２）の好ましい実施形態では、グルタルアルデヒドの添加前に、最初にＴＮＦαおよびＫＬＨを適当な量で一緒に混合する。
【０１７８】
工程ａ２）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを１０：１〜４０：１のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合すると有利である。いくつかの好ましい実施形態では、工程ａ）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを３０：１〜４０：１のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合する。工程ａ２）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを３５：１〜４０：１のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合することが好ましい。
【０１７９】
この変形方法では、上記主要方法に記載されている「グルタルアルデヒド後の失活反応」に関する特徴を準用する。
【０１８０】
この変形方法では、工程ｂ）を行い、上記主要方法に記載した工程ｂ）に関する特徴、すなわち１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物の除去を準用する。
【０１８１】
第２の実施形態では、工程ｂ）後であって本製品の回収前に、ホルムアルデヒドを、少なくとも６０ｍＭで少なくとも４日間の濃度／時間反応条件で添加し、次いで、（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている工程ｄ）に関する特徴、すなわち「ホルムアルデヒド後の失活反応」を準用する。
【０１８２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本製品の回収の直前に、少なくとも１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）のカットオフ値を有する濾過膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過工程を行い、それにより１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）未満の分子量を有する物質を本製品から除去する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている「１００ｋＤａ未満、好ましくは３００ｋＤａ未満の化学種の除去」に関する特徴を準用する。
【０１８３】
任意に、使用前の長期貯蔵のために、本発明に係る最終免疫原性製品をさらに処理してもよい。この変形方法では、上記主要方法に記載されている凍結乾燥に関する特徴を準用する。
【０１８４】
本発明の別の変形形態では、ＴＮＦαが強力に不活性化された（これは、本製品が試験Ａの条件で、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で試験した場合に、３０％、好ましくは２５％、より好ましくは２０％、さらにより好ましくは１５％未満の細胞溶解活性を示すことを意味する）、ＫＬＨに結合したＴＮＦαを含む製品の調製方法は、
ａ）（ｉ）精製されたＴＮＦα、（ｉｉ）精製されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および（ｉｉｉ）グルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、
ｂ）１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、
ｃ）少なくとも６６ｍＭで少なくとも１４４時間〜少なくとも２５０ｍＭで少なくとも９６時間の範囲の濃度／時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程と、
を含み、
グルタルアルデヒドを、１８時間を超える、２０時間を超える、２４時間を超える、３６時間を超える、４８時間を超える、７２時間を超える、９６時間を超える期間にわたって少なくとも２０ｍＭの濃度で添加し、失活化合物、好ましくは（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させる工程ａ）の特定の実施形態（以下、工程ａ２）という）を特徴とする。
【０１８５】
第１の実施形態では、次いで、本製品を回収する。
【０１８６】
工程ａ２）の好ましい実施形態では、グルタルアルデヒドの添加前に、最初にＴＮＦαおよびＫＬＨを適当な量で一緒に混合する。
【０１８７】
工程ａ２）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを１０：１〜４０：１のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合すると有利である。いくつかの好ましい実施形態では、工程ａ）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを３０：１〜４０：１のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合する。工程ａ２）において、ＴＮＦαおよびＫＬＨを３５：１〜４０：１のＴＮＦα：ＫＬＨモル比で混合することが好ましい。
【０１８８】
この変形方法では、上記主要方法に記載されている「グルタルアルデヒド後の失活反応」に関する特徴を準用する。
【０１８９】
この変形方法では、工程ｂ）を行い、上記主要方法に記載されている工程ｂ）に関する特徴、すなわち１０ｋＤａ未満の分子量を有する化合物の除去を準用する。
【０１９０】
工程ｂ）後であって本製品の回収前に、少なくとも６０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１４０ｍＭ、１６０ｍＭで少なくとも６日間〜少なくとも２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭで少なくとも４日間の範囲の濃度／時間反応条件で、ホルムアルデヒドを添加する。
【０１９１】
次いで、（ｉ）還元剤ならびに（ｉｉ）リジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている工程ｄ）に関する特徴、すなわち「ホルムアルデヒド後の失活反応」を準用する。
【０１９２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本製品の回収の直前に、少なくとも１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）のカットオフ値を有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程を行い、それにより１００ｋＤａ（好ましくは３００ｋＤａ）未満の分子量を有する物質を本製品から除去する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている「１００ｋＤａ未満、好ましくは３００ｋＤａ未満の化学種の除去」に関する特徴を準用する。
【０１９３】
任意に、使用前の長期貯蔵のために、本発明に係る最終免疫原性製品をさらに処理してもよい。この変形方法では、上記主要方法に記載されている凍結乾燥に関する特徴を準用する。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】（Ａ）試験Ａによる製品の濃度の関数である細胞生存率（％）。（Ｂ）試験Ａによる製品の濃度の関数である細胞溶解活性率（％）。
【図２】（Ａ）試験Ａに従って測定した被験製品のＥＣ５０の比較。（Ｂ）試験Ａに従って測定した被験製品の不活性化係数の比較。
【図３】（Ａ）試験Ｂに係る製品の濃度の関数である細胞生存率（％）。（Ｂ）試験Ｂに係る製品の濃度の関数である細胞溶解活性率（％）。
【図４】（Ａ）試験Ｂに従って測定した被験製品のＥＣ５０の比較。（Ｂ）試験Ｂに従って測定した被験製品の不活性化係数の比較。
【図５】本発明の製品で免疫したマウスにおける抗ＴＮＦα抗体の力価。
【図６】マウス（致死ショックモデル）における毒性評価。
【図７】（Ａ）最終濾過後の本発明の製品のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル。（Ｂ）濾過後に得られた異なる画分における本発明の製品の存在の評価。
【図８】（Ａ）本発明の濾過した製品および濾過していない製品の免疫原性。（Ｂ）濾過した製品の濾液（Ｆ）に対する保持液（Ｒ）の免疫原性。
【図９】本発明のワクチンの投与後のマウスにおける関節炎の発症。
【図１０】本発明のワクチンで免疫した患者における抗ＴＮＦα抗体応答。
【図１１】本発明のワクチンで免疫した患者における臨床的寛解の状態。
【図１２】本発明のワクチンで免疫した血清陽性患者および血清陰性患者における臨床的寛解の状態。
【図１３】（Ａ）試験Ａによる製品の濃度の関数である細胞生存率（％）。（Ｂ）試験Ｂに係る製品の濃度の関数である細胞生存率（％）。
【図１４】（Ａ）試験Ｂに従って測定した被験製品のＥＣ５０の比較。（Ｂ）試験Ｂに従って測定した被験製品の不活性化係数の比較。
【図１５】時間の関数としての本発明のワクチンで免疫したマウスの血清の中和能。
【図１６】３５日目にＩＳＡ５１またはＳＷＥで乳化した本製品を投与した後の抗ヒトＴＮＦα抗体の産生。
【図１７】３５日目にＩＳＡ５１またはＳＷＥで乳化した本発明の製品で免疫したマウスの血清の中和能。
【図１８】（Ａ）試験Ａによる製品の濃度の関数である細胞生存率（％）。（Ａ）試験Ｂに係る製品の濃度の関数である細胞生存率（％）。
【実施例】
【０１９５】
実施例１：本発明の製品の調製
天然の形態のＫＬＨは、サブユニットＫＬＨ１またはＫＬＨ２のホモポリマーに対応する２つの十量体からなる構造（２０個のサブユニットからなる非共有結合性管状組立体）（ＫＬＨ１：ＫＬＨ２＝約０．９：１）である、分子量（ＭＷ）＝約８×１０６Ｄａ。天然のＫＬＨは、一貫した比率のより大きなＭＷの多量体およびより小さなＭＷの十量体も含む。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を海洋性腹足類軟体動物の鍵穴カサガイのリンパから抽出した後、ＧＭＰ条件で精製した。２〜８℃の温度の貯蔵条件で行った安定性アッセイの結果から、精製されたＫＬＨの貯蔵寿命は２〜８℃で３６ヶ月であることが分かった。
【０１９６】
組換え型ヒトＴＮＦαを、ＧＭＰ条件で大腸菌により産生した。
【０１９７】
３７０ｍｇのＴＮＦα尺度の本発明の製品のバッチを、以下の開発した製造プロセスを用いて製造した。
【０１９８】
ａ）グルタルアルデヒドとの結合
ＴＮＦαを、緩衝液（１３０ｍＭの二ナトリウム、リン酸水素、１３３ｍＭの塩化ナトリウムおよび６．６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）に希釈して、１．０５ｍｇ／ｍＬの溶液を得、１％ＤＭＳＯを添加する。２２±３℃で３０分間インキュベートした後、使用緩衝液（１００ｍＭの二ナトリウム、リン酸水素、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）を添加して、ＴＮＦα混合物を０．５１ｍｇ／ｍＬまで希釈する。
【０１９９】
濾過したＫＬＨを、ＵＶ濃度で１：０．５８のＴＮＦα：ＫＬＨ比（１個のモノマーのＫＬＨに対して３７個のモノマーのＴＮＦαであるモル比に相当する）により、ＴＮＦα溶液に添加する。
【０２００】
蠕動ポンプを用いて２．５％ｗ／ｖの原液から添加したグルタルアルデヒド（反応媒体中で２５ｍＭになるまで添加）との結合を行い、この溶液を２３±２℃で規定の時間にわたって混合する。
【０２０１】
ｂ）グリシンによる失活
反応系を０．１Ｍのグリシンで１５分間失活させた。
【０２０２】
ｃ）１回目のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ１）
Pall Minim II TFFシステムと、０．５ＭのＮａＯＨで殺菌し、かつ使用緩衝液で平衡させた１０ｋＤａの分子量カットオフを有する０．０２ｍ２のポリエーテルスルホン膜とを用いて、１回目のＴＦＦを行う。
【０２０３】
次いで、失活させた溶液を０．２２μｍ濾過によって浄化する。中間体を使用緩衝液で２回希釈した後、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）および１２体積の使用緩衝液で透析濾過する（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）。保持液を回収し、２０時間未満貯蔵する。
【０２０４】
ｄ）ホルムアルデヒドによる不活性化
規定の最終濃度に到達するまで、蠕動ポンプを用いてホルムアルデヒドを保持液に添加する。マグネチックスターラで溶液を毎日混合しながら、３７±２℃に設定したインキュベータ内で規定の時間にわたって不活性化反応を行う。
【０２０５】
ｅ）グリシンによる失活
次いで、反応系を０．３８Ｍのグリシンで１時間失活させる。
【０２０６】
ｆ）２回目のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ２）
Pall Minim II TFFシステムと、０．５ＭのＮａＯＨで殺菌し、かつ製剤緩衝液で平衡させた３００ｋＤａの分子量カットオフを有する０．０２ｍ２のポリエーテルスルホン膜とを用いて、２回目のＴＦＦを行う。
【０２０７】
失活させた溶液を０．２μｍ濾過で浄化する。中間体を約９００ｍＬの開始タンジェンシャルフロー体積を有するように濃縮し、次いで、１２体積の製剤緩衝液（１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３６．９ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を用いてＴＦＦで濾過して、ＴＮＦαの低分子量のホモポリマーおよび非反応性試薬を除去する。保持液を回収した後、ＢＣＡによって測定された濃度に基づく３００μｇ／ｍＬの理論濃度まで希釈し、次いで、０．２μｍ濾過して、本発明の製品を得る。
【０２０８】
実施例２：本発明のいくつかの製品の調製条件に関する記載および国際公開第２００７／０２２８１３号に記載されている製品との比較
【表１】
2014500267.tif 000002
【０２０９】
Ｂ１は、国際公開第２００７／０２２８１３号に記載されている製品に相当する。
【０２１０】
表１に記載されている条件で実施例１に記載されている方法によってＧＴＰ０９０２を得、ここでは、工程ｆ）において３００ｋＤａのカットオフによる２回目のタンジェンシャルフロー濾過を行った。ＧＴＰ０９０２は、ＧＭＰ臨床バッチである。
【０２１１】
実施例３：試験Ａによって示されるように本発明の製品は強力に不活性化されている
この試験を使用して、本発明の製品におけるヒトＴＮＦα生理活性の不活性化率を求める。
【０２１２】
上記試験は、アクチノマイシンＤの存在下でヒトＴＮＦαによって誘導されるマウスＬ９２９細胞の細胞溶解に基づいている。この試験をＴ０すなわち本製品が液状であって４℃で貯蔵された状態で行う。
【０２１３】
材料および方法
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ社製Ｎｏ．８５０１１４２５）を、１．５×１０４／ｃｍ２で、培地（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製Ｆ７５２４）、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ０７８１）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製Ｓ８６３６）を添加したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２６０４Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。
【０２１４】
次いで、Ｌ９２９細胞を回収し、２×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底培養プレート内の１００μｌの平板培地（２％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM F12（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２７１９Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２１±１時間培養した。
【０２１５】
本発明の製品の１０段階の２倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＨＬ１（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＵＳ７７２０１））に希釈した６４００ｎｇ／ｍｌ（ＴＮＦα当量）の本発明の製品（１２０μｌ）から調製した。
【０２１６】
使用する濃度単位はＴＮＦα当量濃度である。ＴＮＦα当量濃度により、細胞バイオアッセイおよびＴＮＦαショックモデルで生体内において、同じＴＮＦα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：［ＴＮＦα当量濃度］＝（プロセス開始時のＴＮＦαの量）−１０％。３００ｋＤａのカットオフによる濾過の最終工程を本発明の製品の調製方法で行った場合、７５％のＴＮＦαが除去され、（ＴＮＦαを放射標識した放射性試験で証明される）、ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：［ＴＮＦα当量濃度］＝［（開始時のＴＮＦαの量−１０％）−７５％］。なお、収率は製造プロセス中一貫している。
【０２１７】
標準物質（ヒトＴＮＦα、６．２４ｍｇ／ｍｌ、Boehringer Ingelheim社製０３０３０Ｒ１）の１０段階の３倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地中に８ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦα（１２０μｌ）から調製した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製ＴＮＦαのＥＣ５０は、１０〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【０２１８】
Ｌ９２９細胞の培養時間の終了時に、細胞はサブコンフルエントであった。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、５０μｌの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移した。
【０２１９】
２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社製Ａ９４１５）を添加した５０μｌのアッセイ培地を各ウェルに添加した。
【０２２０】
次いで、Ｌ９２９細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２０±１時間培養した。
【０２２１】
培養の終了時に、２０μｌ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）を添加し、このプレートを３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。
【０２２２】
次いで、ＤＹＮＥＸ社製分光光度計ＭＲＸＩＩを用いて、４９０ｎｍでこのプレートを読み取った。
【０２２３】
以下のように生存率（％）を計算した：
％＝１−［（ＯＤ製品−ＯＤＴＮＦα標準物質）／（ＯＤ細胞−ＯＤＴＮＦα標準物質）］
【０２２４】
ＯＤ製品は、本発明の製品を含むウェルの光学濃度を表す。
【０２２５】
ＯＤＴＮＦα標準物質は、２００ｎｇ／ｍｌの標準物質ＴＮＦαを含むウェルの光学濃度を表す。
【０２２６】
ＯＤ細胞は、標準物質および本発明の製品のどちらも含まない対照ウェルの光学濃度を表す。
【０２２７】
結果
製品Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ８０、Ｂ１１、Ｂ１４、Ｂ１４０およびＧＴＰ０９０２を表１に記載されている条件に従って製造し、試験Ａを行う前に１０日未満４℃および液状で貯蔵した。
【０２２８】
材料および方法の箇所に記載されているように、それらをＬ９２９バイオアッセイ（試験Ａ）で試験した。
【０２２９】
Ｌ９２９細胞の生存率（％）を測定し、結果を図１Ａおよび表２に示す。
【表２】
2014500267.tif 000003
【０２３０】
図１Ａは、本製品の漸増濃度の関数である細胞生存率（％）を示す。１００ｎｇ／ｍｌ濃度では、Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）は３１％の細胞を死滅させたが、本発明の製品は１０％未満の細胞を死滅させた。特に、Ｂ１４およびＧＴＰ０９０２は、１００ｎｇ／ｍｌで５％未満の細胞を死滅させた。
【０２３１】
図１Ｂは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の製品では、４０％未満の細胞がＢ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）の存在下で生存したが、本発明の製品の存在下で６０％を超える細胞が生存したことを示す。特に、１００ｎｇ／ｍｌのＢ１４およびＧＴＰ０９０２の存在下では、ほぼ９０％の細胞が生存した。
【０２３２】
結論として、本発明の製品は、試験Ａによって示されるように強力に不活性化されている。
【０２３３】
結果を、細胞増殖を５０％減少させるのに必要な本製品の濃度であるＥＣ５０としても分析した。
【０２３４】
図２Ａおよび表３は、Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）のＥＣ５０が、本発明の製品のＥＣ５０と比較して極めて低い（２００ｎｇ／ｍｌ未満）ことを示している。
【表３】
2014500267.tif 000004
【０２３５】
各製品の不活性化係数を以下のように計算した：ＥＣ５０製品／ＥＣ５０ＴＮＦα。
【０２３６】
図２Ｂおよび表４は、Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）が本発明の製品の不活性化係数（１００００超）と比較して極めて低い不活性化係数（４０００未満）を有することを示している。
【０２３７】
これらの結果は、本発明の製品がＢ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）よりも少なくとも２．５倍不活性であることを示している。特に、Ｂ１４およびＧＴＰ０９０２は、Ｂ１よりも１００００倍を超えて不活性である。
【表４】
2014500267.tif 000005
【０２３８】
実施例４：本発明の製品は、試験Ｂによって示されるように不活性化されたままである
この試験を使用して、不活性化されたワクチンに対して古典的になされるように製造した後に本製品を液状および３７℃で６週間貯蔵した場合の復帰（ＴＮＦα活性の再生）の程度を測定する。この試験を行って、本発明の製品の不活性化が投与時または投与後に安定なままであるかを確認する。
【０２３９】
材料および方法
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ社製Ｎｏ．８５０１１４２５）を、１．５×１０４／ｃｍ２で、培地（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製Ｆ７５２４）、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ０７８１）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製Ｓ８６３６）を添加したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２６０４Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。
【０２４０】
次いで、Ｌ９２９細胞を回収し、２×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底培養プレート内の１００μｌの平板培地（２％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM F12（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２７１９Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２１±１時間培養した。
【０２４１】
本発明の製品の５段階の３倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＨＬ１（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＵＳ７７２０１））に希釈した６４００ｎｇ／ｍｌ（ＴＮＦα当量）の本発明の製品（１２０μｌ）から調製した。
【０２４２】
使用する濃度単位は、ＴＮＦα当量濃度（実施例４）またはＢＣＡ試験を用いて測定した総タンパク質（実施例１３）である。ＴＮＦα当量濃度により、細胞バイオアッセイおよびＴＮＦαショックモデルで生体内において、同じＴＮＦα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：［ＴＮＦα当量濃度］＝（プロセス開始時のＴＮＦαの量）−１０％。
【０２４３】
本発明の製品の調製方法で３００ｋＤａのカットオフによる濾過の最終工程を行った場合、７５％のＴＮＦαが除去され（ＴＮＦαを放射標識した放射性試験で証明される）、ＴＮＦα当量濃度は、以下のように求められる：［ＴＮＦα当量濃度］＝［（開始時のＴＮＦαの量−１０％）−７５％］。なお、収率は製造プロセス中一貫している。
【０２４４】
標準物質（ヒトＴＮＦα、６．２４ｍｇ／ｍｌ、Boehringer Ingelheim社製０３０３０Ｒ１）の１０段階の３倍希釈系列を、６０μｌのアッセイ培地中に８ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦα（１２０μｌ）から調製した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製のＴＮＦαのＥＣ５０は、１０〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【０２４５】
Ｌ９２９細胞の培養時間の終了時に、細胞はサブコンフルエントであった。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、５０μｌの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移した。
【０２４６】
２μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社製Ａ９４１５）を添加した５０μｌのアッセイ培地を各ウェルに添加した。
【０２４７】
次いで、Ｌ９２９細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２０±１時間培養した。
【０２４８】
培養の終了時に、２０μｌ／ウェルのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（１００μｌのＭＴＳ／５μｌのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）を添加し、このプレートを３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。
【０２４９】
次いで、ＤＹＮＥＸ社製分光光度計ＭＲＸＩＩを用いて、４９０ｎｍでこのプレートを読み取った。
【０２５０】
実施例３に記載されているように、生存率（％）を計算した。
【０２５１】
結果
表１に記載されている条件に従って、製品Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ８０、Ｂ１１、Ｂ１４、Ｂ１４０およびＧＴＰ０９０２を製造し、試験Ｂを行う前に３７℃および液状で６週間貯蔵した。
【０２５２】
材料および方法の箇所に記載されているように、それらをＬ９２９バイオアッセイ（試験Ｂ）で試験した。
【０２５３】
Ｌ９２９細胞の生存率（％）を測定し、結果を図３Ａに示す。
【０２５４】
図３Ａおよび表５は、本製品の漸増濃度の関数である細胞生存率（％）を示す。１００ｎｇ／ｍｌ濃度では、Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）は９０％を超える細胞を死滅させたが、本発明の製品は６５％未満の細胞を死滅させた。特に、Ｂ１４およびＧＴＰ０９０２は、１００ｎｇ／ｍｌで約２０％の細胞を死滅させた。
【表５】
2014500267.tif 000006
【０２５５】
図３Ｂは、１００ｎｇ／ｍｌ濃度の製品では、Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）の存在下で１０％未満の細胞が生存したが、本発明の製品の存在下で３５％を超える細胞が生存したことを示している。特に、１００ｎｇ／ｍｌのＢ１４およびＧＴＰ０９０２の存在下では８０％を超える細胞が生存した。
【０２５６】
結論として、試験Ｂによって示されるように、本発明の製品は強力に不活性化されたままである。
【０２５７】
結果を、細胞増殖の５０％の減少に必要な製品の濃度であるＥＣ５０としても分析した。
【０２５８】
図４Ａおよび表６は、本発明の製品のＥＣ５０と比較してＢ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）のＥＣ５０が極めて低い（５０ｎｇ／ｍｌ未満）ことを示している。
【表６】
2014500267.tif 000007
【０２５９】
各製品の不活性化係数を以下のように計算した：ＥＣ５０製品／ＥＣ５０ＴＮＦα。
【０２６０】
図４Ｂおよび表７は、本発明の製品の不活性化係数と比較して、Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）が極めて低い不活性化係数（５００未満）を有することを示している。
【０２６１】
これらの結果は、本発明の製品がＢ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）よりも少なくとも３倍不活性なままであることを示している。特に、Ｂ１４およびＧＴＰ０９０２は、Ｂ１よりも３０倍を超えて不活性なままである。
【表７】
2014500267.tif 000008
【０２６２】
実施例５：本発明の製品中の遊離ＴＮＦαホモポリマーの存在の測定（試験Ｃ）
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（工程１）または抗ＫＬＨポリクローナル抗体（工程１）でコーティングした磁気ビーズを用いる免疫捕捉工程による選択的除去後に、ＴＮＦαおよびＫＬＨのホモポリマーを精製した。ビーズでコーティングした抗ＴＮＦα抗体を用いることにより、遊離ＴＮＦαホモポリマーおよび本発明の製品を上澄みから除去し、それにより特異的ＥＬＩＳＡ（工程２）により遊離ＫＬＨホモポリマーを定量することができた。同様に、ビーズでコーティングした抗ＫＬＨ抗体を用いることにより、遊離ＫＬＨホモポリマーおよび本発明の製品を上澄みから除去し、それにより特異的ＥＬＩＳＡ（工程２）により遊離ＴＮＦαホモポリマーを定量することができた。
【０２６３】
２種類の特異的ＥＬＩＳＡ法に基づく試験（それぞれ、ＴＮＦα−ＴＮＦαおよびＫＬＨ−ＫＬＨによるＥＬＩＳＡ）を用いて、本発明の製品中の遊離ＴＮＦαホモポリマーおよび遊離ＫＬＨホモポリマーの定量を行った。さらに、本発明の製品の試験試料からの完全な除去を制御するために、上澄みに対してＫＬＨ−ＴＮＦαによるＥＬＩＳＡを行った。
【０２６４】
抗ＫＬＨＡｂｓでコーティングした磁気ビーズを用いる免疫捕捉の原理
抗ＫＬＨ抗体でコーティングしたビーズを用いる免疫捕捉を用いて、ＴＮＦαのホモポリマーを、「ＴＮＦα−ＴＮＦα」ＥＬＩＳＡを用いて上澄み中で定量することができる。上澄み中の修飾ＴＮＦαのヘテロポリマーおよびホモポリマーの完全な除去は、「ＫＬＨ−ＫＬＨ」および「ＫＬＨ−ＴＮＦα」ＥＬＩＳＡにより信号が存在しないことによって示される。
【０２６５】
材料および方法
抗ＫＬＨまたは抗ＴＮＦα抗体に結合したビーズの調製
１．３×１０９ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）M270 Epoxy、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製１４３０２Ｄ）を、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまでＰＢＳで希釈し、１０分間インキュベートした。
【０２６６】
これらのビーズを磁石で洗浄した後、４８６μｌのホウ酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ９）に再懸濁した。
【０２６７】
最終濃度が１Ｍになるまで、３３３μｌの硫酸アンモニウム（３Ｍ）を添加した。
【０２６８】
次いで、１８２μｌの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（３Ｂ２／１Ｈ４／２Ｅ５−ＳＯ８０３８ｂ、２．２ｍｇ／ｍｌ）または２３５μｌの抗ＫＬＨポリクローナル抗体（Ｓ０３０．０７１２２．１、１．７ｍｇ／ｍｌ）を添加し、混合物を３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で回収した。
【０２６９】
反応および非特異的部位を遮断するために、２％ＢＳＡのリン酸緩衝食塩水１ｍｌを使用してビーズを懸濁した後、混合物を４℃で１２〜１６時間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で回収した。
【０２７０】
試験試料とのインキュベーション
コーティングしたビーズおよびコーティングしていないビーズ（２０ｍｇ／ｍｌ）を被験試料と混合し（１％ＢＳＡのリン酸緩衝食塩水に１μｇ／ｍｌで希釈した製品）、次いで、４℃で１２〜１６時間インキュベートした。次いで、上澄みを磁石で回収し、ＥＬＩＳＡで分析した。
【０２７１】
ＫＬＨ−ＫＬＨによるＥＬＩＳＡ
当該技術分野でよく知られているように、ＫＬＨ−ＫＬＨによるサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。捕捉抗体（アフィニティー精製した抗ＫＬＨウサギポリクローナル抗体（６００−４０１−４６６、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、１ｍｇ／ｍｌ））を１００ｎｇ／ウェルでコーティングした。一次抗体（アフィニティー精製した抗ＫＬＨビオチン化ウサギポリクローナル抗体（６００−４０６−４６６、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、１ｍｇ／ｍｌ））を２５ｎｇ／ｍｌで使用した。
【０２７２】
試料中のＫＬＨのホモポリマーの定量を、標準物質として修飾ＫＬＨを用いて測定した。希釈緩衝液での２倍希釈系列によって、標準濃度（４００〜１５．６２５ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２７３】
ポリストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／５０００）を使用して反応を検出し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液により複合体を発色させる。酵素反応の停止後、得られた色の強さを、分光光度法により４９０ｎｍで測定する（６５０ｎｍの参照フィルタ）。
【０２７４】
ＴＮＦα−ＴＮＦαによるＥＬＩＳＡ
当該技術分野でよく知られているように、ＴＮＦα−ＴＮＦαのサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。捕捉抗体（アフィニティー精製した抗ｈｕＴＮＦαヤギポリクローナル抗体（R&D system社、ＡＦ２１０ＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ））を１００ｎｇ／ウェルでコーティングした。一次抗体（アフィニティー精製した抗ｈｕＴＮＦαビオチン化ヤギポリクローナル抗体（R&D system社、ＢＡＦ２１０、０．５ｍｇ／ｍｌ））を７５ｎｇ／ｍｌで使用した。試料中のＴＮＦαのホモポリマーの定量を、標準物質として修飾ＴＮＦαを用いて測定した。標準濃度（１００〜０．３９１ｎｇ／ｍＬ）を２倍希釈系列により調製した。
【０２７５】
ポリストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／５０００）を使用して反応を検出し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液により複合体を発色させる。酵素反応の停止後、得られた色の強さを、分光光度法により４９０ｎｍで測定する（６５０ｎｍの参照フィルタ）。
【０２７６】
ＫＬＨ−ＴＮＦαによるＥＬＩＳＡ
当該技術分野でよく知られているように、ＫＬＨ−ＴＮＦαによるサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。捕捉抗体（アフィニティー精製した抗ＫＬＨウサギポリクローナル抗体（６００−４０１−４６６、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、１ｍｇ／ｍｌ））を１００ｎｇ／ウェルでコーティングした。一次抗体（アフィニティー精製した抗ｈｕＴＮＦαビオチン化ヤギポリクローナル（R&D system社、ＢＡＦ２１０、０．５ｍｇ／ｍｌ））を７５ｎｇ／ｍｌで使用した。
【０２７７】
ポリストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／５０００）を使用して反応を検出し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液により複合体を発色させる。酵素反応の停止後、得られた色の強さを、分光光度法により４９０ｎｍで測定する（６５０ｎｍの参照フィルタ）。
【表８】
2014500267.tif 000009
【０２７８】
光学濃度を、同じプレート上で行ったＴＮＦαの希釈系列の光学濃度と比較することにより、ＴＮＦα濃度Ａ、Ｃ、Ｅを測定する。
【０２７９】
光学濃度を、同じプレートで行ったＫＬＨの希釈系列の光学濃度と比較することにより、ＫＬＨ濃度Ｂ、Ｄ、Ｆを測定する。
【０２８０】
免疫捕捉なし（Ｉ）、抗ＴＮＦα抗体による免疫捕捉後（Ｇ）、および抗ＫＬＨ抗体による免疫捕捉後の光学濃度を比較することにより、対照（Ｇ，Ｈ，Ｉ）を測定する。
【０２８１】
Ｅは、遊離ＴＮＦαホモポリマーに相当する。
【０２８２】
Ｆは、遊離ＫＬＨホモポリマーに相当する。
【０２８３】
Ａは、ＴＮＦα−ＫＬＨホモポリマー＋遊離ＴＮＦαホモポリマーに相当する。
【０２８４】
Ｂは、ＴＮＦα−ＫＬＨホモポリマー＋遊離ＫＬＨホモポリマーに相当する。ＣおよびＧを除去対照として使用して、抗ＴＮＦα抗体を用いる免疫捕捉を用いてＴＮＦα−ＫＬＨホモポリマー＋遊離ＴＮＦαホモポリマーの完全な除去を確認する。ＤおよびＨを除去対照として使用して、抗ＫＬＨ抗体を用いる免疫捕捉を用いてＴＮＦα−ＫＬＨホモポリマー＋遊離ＫＬＨホモポリマーの完全な除去を確認する。
【０２８５】
結果
遊離ＴＮＦαホモポリマーの存在について、製品ＧＴＰ０９０２および他の臨床バッチを試験した。
【０２８６】
抗ＴＮＦαでコーティングしたビーズと混合した被験試料から得られた上澄みに対して行ったＫＬＨ−ＫＬＨによるＥＬＩＳＡにより、本製品ＧＴＰ０９０２中に遊離ＫＬＨホモポリマーが全く存在していないことが分かった。
【０２８７】
従って、遊離ＴＮＦαホモポリマーの割合を、Ｅ／Ａ×１００として計算した。
【０２８８】
結果を表８に示す。
【表９】
2014500267.tif 000010
【０２８９】
従って、その結果から、３００ｋＤａのカットオフによる濾過の最終工程を行う方法に従って得られた本発明の製品が、遊離ＫＬＨホモポリマーを全く含有しておらず、３０％未満の遊離ＴＮＦαホモポリマーを含有していることが分かった。
【０２９０】
実施例６：本発明の製品の免疫原性
材料および方法
Ｂａｌｂ／ｃの２つの群を、ＩＳＡ５１で乳化した１μｇ（ＴＮＦα当量）のＢ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ８０、Ｂ１４、Ｂ１４０またはＢ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）で免疫した。２つの群の間に１週間の遅れを設けて、０日目および２１日目に免疫を行った。２８日目に血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗ｈｕＴＮＦα抗体の存在について試験した。
【０２９１】
結果
図５に示すように、全ての製品により、高レベルの抗ＴＮＦα力価が得られた。
【０２９２】
結論として、本発明の製品は、製品Ｂ１と同じ免疫原性を有する。
【０２９３】
実施例７：本発明の製品の毒性
ＴＮＦα媒介性ショックアッセイで、本製品の毒性を評価した。
【０２９４】
材料および方法
このアッセイについては、Lehmann et al. JEM 1987, 165: 657-663に記載されている。
【０２９５】
簡潔に言うと、マウスに、２０ｍｇのＤ−ガラクトサミンおよび１１μｇのＴＮＦα（対照、４℃で貯蔵）または液状および３７℃で６週間貯蔵した１１μｇ（ＴＮＦα当量）の製品Ｂ１、Ｂ８０、Ｂ１４、Ｂ１４０を含有する１００μｌの溶液を腹膜内注射した。２４時間後に死亡率を評価した。
【０２９６】
結果
図６に示すように、製品Ｂ１（国際公開第２００７／０２２８１３号の製品）は、ＴＮＦαと同程度に致死的である。
【０２９７】
これに反して、本発明の製品は有毒ではなかった。
【０２９８】
Ｂｅｒｏｍｕｎ（登録商標）の公開医薬品審査報告書（ＥＰＡＲ）によって提供されている情報によれば、最大耐用量（ＭＴＤ）は１５０〜２００μｇ／ｍ２である。１．９ｍ２の平均体表に基づく場合、ＴＮＦαのＭＴＤは２８５μｇに相当する。
【０２９９】
本発明の製品の投与量は１８０μｇのタンパク質を表している。製造された異なるバッチに対する品質管理および安定性の結果では、復帰後の不活性化のレベルは常に、内因性ＴＮＦαと比較して１０，０００倍（４対数）を超えていた。従って、臨床用量（１８０μｇ）で投与されたＴＮＦαの活性は、重量な安全限界（１５８３３）を提供するＴＮＦαのＭＴＤよりも１５，０００倍低い１８ｎｇ未満である。臨床用量（３６０μｇ）で投与されたＴＮＦα活性は、重量な安全限界を提供するＴＮＦαのＭＴＤよりも７，５００倍低い３６ｎｇ未満に相当する。
【０３００】
実施例８：本プロセスの終了時に濾過工程を行った場合の本発明の製品の免疫原性
使用するＴＮＦαをＩ＊１２５で標識したこと以外はＧＴＰ０９０２条件で、実施例１に記載されている方法に従って本発明の製品を製造した。
【０３０１】
本発明の製品の製造プロセスの終了時に、異なるカットオフによるタンジェンシャルフロー濾過を行った（工程ｆ）。
【０３０２】
図７は、１０ｋＤａ、１００ｋＤａ、３００ｋＤａまたは５００ｋＤａの最終濾過後のＩ＊１２５で標識した製品のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示している。
【０３０３】
実施例５に記載されている方法に従って、濾過後に得られた異なる画分に対してＴＮＦα−ＫＬＨによるＥＬＩＳＡを行った。
【０３０４】
図８Ａは、本発明の製品は、濾液（１００ｋＤａ）中に存在しないが、濾液（３００ｋＤａ）中で検出可能になり始めることを示している。
【０３０５】
実施例６に記載されている方法に従って濾過したか濾過していない０．２μｇまたは０．５μｇの製品でマウスを免疫することにより、３００ｋＤａのカットオフにより濾過したか濾過していない本製品の免疫原性を評価した。
【０３０６】
図８Ａは、濾過した製品（２種類のバッチＤ１およびＤ２）により、より高レベルの抗ＴＮＦα力価が得られたことを示している。
【０３０７】
図８Ｂは、濾液に対する保持液の免疫原性の評価に相当し、３００ｋＤａの濾液が非免疫原性であることを示している。
【０３０８】
実施例９：本発明の製品を含む組成物の例
２種類の例示的な組成物を表９および表１０に記載する。
【表１０】
2014500267.tif 000011
【表１１】
2014500267.tif 000012
【０３０９】
実施例１０：本発明の製品を含むワクチンの例
本発明に係るワクチンの例を表１１に記載する。
【表１２】
2014500267.tif 000013
【０３１０】
実施例１１：ｈＴＮＦαトランスジェニックマウスにおける関節炎の治療
実施例１１は、非ヒト哺乳類におけるＴＮＦαの過剰産生に関連する疾患の治療のための本発明の製品の有効性を開示する。
【０３１１】
簡潔に言うと、Ｈａｙｗａｒｄら(2007, BMC Physiology, Vol. 7 : 13-29)によって記載されている１０匹のｈＴＮＦαトランスジェニックマウスからなる第１の群に、実施例１０に記載されているように調製したヒトＴＮＦα kinoidのＩＳＡ５１乳濁液からなるワクチン組成物を筋肉内注射した。４μｇのヒトＴＮＦα kinoidを含有する量のワクチン組成物をそれぞれ、０日目（Ｄ０）、７日目（Ｄ７）および２８日目（Ｄ２８）に筋肉内に投与した。１０匹のトランスジェニックマウスからなる第２の群に、第１の群のトランスジェニックマウスに注射したワクチン組成物の体積と同様の体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を筋肉内注射した。
【０３１２】
２つの群のマウスにおける平均関節炎スコアを求め、その結果を図９に示す。Ｌｅｅら(2009, J Pharmacol Sci, Vol. 109 : 211-221)によって記載されているように、平均関節炎スコアを測定した。
【０３１３】
その結果は、ＰＢＳを投与したマウスでは関節炎が急激に発症したが、本発明のワクチン組成物を投与した動物では関節炎が完全に遮断されたことを示している。
【０３１４】
実施例１２：クローン病の治療
実施例１２は、本発明の製品のクローン病患者における第Ｉ／ＩＩ相非盲検漸増用量「最適二段階」免疫試験手順を開示する。
【０３１５】
Ａ．臨床試験プロトコル
１．適応症／試験対象母集団
年齢が１８〜６５歳のクローン病患者を、３種類の用量の実施例１０に係る本発明のワクチンで免疫した。
【０３１６】
２．理論的根拠
本試験は、クローン病患者においてＩＳＡ５１アジュバントと組み合わせた本発明の候補製品の安全性、反応源性および免疫原性を評価するように設計されている。０日目、７日目および２８日目に投与する３種類の用量（６０μｇ、１８０μｇおよび３６０μｇ）で、３種類の用量のこれらの候補ｋｉｎｏｉｄに対する安全性プロファイルおよび免疫応答を評価した。
【０３１７】
３．試験設計
複数の試験機関にまたがる３群に関する国際的第Ｉ／ＩＩ相「最適二段階」非無作為化試験：
Ａ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせた本発明のワクチン（６０μｇの本発明の製品）を投与した３人の対象、
Ｂ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせた本発明のワクチン（１８０μｇの本発明の製品）を投与した９人の対象、
Ｃ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせた本発明のワクチン（３６０μｇの本発明の製品）を投与した９人の対象。
【０３１８】
４．試験期間
正の抗ＴＮＦα抗体応答（ベースラインに対して３倍の増加として定義）を示す全ての対象を、抗体力価が正常化されるまで、あるいは少なくとも１４０日目まで、安全性について追跡する。抗体応答を全く示さない対象は１４０日目まで追跡する。
【０３１９】
Ｂ．臨床試験の結果
第１に、臨床試験の結果は、本発明のワクチンで治療した患者の中に深刻な有害作用を経験したものは誰もいないことを示し、この結果から、ＴＮＦα生物活性が安定かつ不可逆的に不活性化されていることが十分に確認される。
【０３２０】
第２に、最初に選択された患者のうち臨床試験の途中で棄権したものは誰もいなかったことを強調しておく。特に、最初に選択された患者の中で予期しない感染症に罹患したものは誰もいなかった（副鼻腔炎の症例が１つ報告された）。
【０３２１】
さらに、図１０に示すように、ほぼ全ての患者において抗ＴＮＦα抗体応答を測定した：６０μｇでは３３％の患者、１８０μｇおよび３６０μｇではどちらも８９％の患者。
【０３２２】
図１０に示すように、６０μｇの低用量では、６５％を超える患者が免疫後４週目に７０％を超えるＣＤＡＩスコアの減少を呈したように（ＮａｂｅｒらによってThe Journal of Medicine, Vol. 61 (No. 4) : 105-110に記載されているように測定したＣＤＡＩ（クローン病活性指数）スコア値）、本発明のワクチンの治療的効果はクローン病患者において急速に現れる。
【０３２３】
さらに、図１１に示されている結果は、本発明のワクチンのクローン病患者への投与により、患者の大部分において臨床的寛解状態が誘導されることを示している。より詳細には、図１１は、６０μｇの最も低い用量について、３０％を超える患者が、注射後４週目および８週目に１５０未満のＣＤＡＩスコアを呈していることを示している。さらに、図１１は、１８０μｇの用量では、注射後８週目に、６７％の患者が１５０未満のＣＤＡＩスコア値を呈していることを示している。
【０３２４】
図１２は、８５％を超える抗ＴＮＦα血清陽性患者が７０点を超えるＣＤＡＩスコア値の減少を伴う治療効果を経験したことも示している。抗ＴＮＦα血清陽性患者の５５％超において寛解（１５０以下のＣＤＡＩスコア値）が観察されたが、抗ＴＮＦα血清陰性患者において寛解が認められたのは約１０％のみであったことも強調しておく。
【０３２５】
以下の表１２に示されているように、よく知られている治療用抗ＴＮＦαモノクローナル抗体であるインフリキシマブ、アダリムマブおよびセルトリズマブと比較した場合、高い割合の患者がクローン病の寛解を経験していることにより、本発明のワクチンの高い治療効果が例証されている。
【表１３】
2014500267.tif 000014
Targan 1997, NEJM, 340:1029-35
Rutgeerts 2004, Gastroenterology 126:402
Hanauer 2006, Gastroenterology 130(6):1929-30
Colombe 2007, Am Journ Gastroenterol. 102(sup2):5496-7
Schreiber 2007, NEJM 357(13)1357
【０３２６】
実施例１３：本発明の製品は、試験Ａによって示されるように強力に不活性化されており、試験Ｂによって示されるように不活性化されたままである。
実施例１に記載されている方法によって３種類のバッチ（８０８、９０１、９０３）を得、ここでは、工程ａ）を、２５ｍＭのグルタルアルデヒド最終濃度で２４０分間行い、工程ｃ）を２５０ｍＭのホルムアルデヒド最終濃度で１４日間行い、３００ｋＤａのカットオフによる濾過を工程ｆ）で行う。
【０３２７】
本製品は、液状および４℃で貯蔵するか３７℃で６週間貯蔵する。
【０３２８】
実施例３に従って試験Ａを行う。
【０３２９】
以下の結果は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって測定される総タンパク質濃度で表されている。
【０３３０】
ＢＣＡタンパク質アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）に基づく界面活性剤適合処方である。この方法は、アルカリ性媒体中のタンパク質によるＣｕ２＋からＣｕ１＋への周知の還元（ビウレット反応）と、ビシンコニン酸を含有する珍しい試薬を用いた銅（Ｉ）のカチオン（Ｃｕ１＋）の高感度かつ選択的な比色検出とを組み合わせたものである。このアッセイの紫色の反応生成物は、１つの銅（Ｉ）イオンによるＢＣＡの２つの分子のキレート化によって生成される。この水溶性複合体は、５６２ｎｍで、２０〜２０００μｇ／ｍｌの広い測定範囲にわたるタンパク質濃度の増加に比例する強い吸光度を示す。
【０３３１】
次いで、６０μｇの総タンパク質が２５μｇのＴＮＦα当量に相当することを確認した。
【０３３２】
結果を図１３Ａおよび表１３に示す。
【表１４】
2014500267.tif 000015
＊ｈＴＮＦαについて示されている割合は、３回のアッセイで得られた値の平均に相当する。
【０３３３】
本製品を試験Ａの条件で４℃で貯蔵する場合、８０％を超えるＬ９２９細胞が生存可能であり、これは、本製品が２０％未満の細胞溶解活性を示していることを意味する。
【０３３４】
各製品のＥＣ５０を計算すると、１０００００を超えていた。
【０３３５】
各製品の不活性化係数を計算すると、１０００００を超えていた。
【０３３６】
実施例４に従って試験Ｂを行う。
【０３３７】
以下の結果は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって測定される総タンパク質濃度で表されている。
【０３３８】
結果を図１３Ｂおよび表１４に示す。
【０３３９】
結果は、３７℃で６週間後に、５０％を超えるＬ９２９細胞が１０００ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で生存可能であったため、本製品が不活性化されたままであること（これは、本製品が５０％未満の細胞溶解活性を示していることを意味する）を示している。
【表１５】
2014500267.tif 000016
＊ｈＴＮＦαについて示されている割合は、３回のアッセイで得られた値の平均に相当する。
【０３４０】
図１４、表１５および表１６は、各製品について計算したＥＣ５０および不活性化係数を示す。
【０３４１】
３７℃で６週間貯蔵した場合、本製品は、５００を超えるＥＣ５０および１００００を超える不活性化係数を示す。
【表１６】
2014500267.tif 000017
【表１７】
2014500267.tif 000018
【０３４２】
ＥＣ５０ＴＮＦαは、イントラアッセイでのＴＮＦα値を用いて計算した。
【０３４３】
実施例１４：関節リウマチの治療
実施例１４は、本発明の製品の関節リウマチ患者におけるプラセボを対照とする第２相二重盲検漸増用量免疫試験のプロトコルを開示する。
【０３４４】
Ａ．臨床試験の手順(EudraCT 2009-012041-35)
１．適応症／試験対象母集団
少なくとも１種の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体に対する二次耐性を発現した年齢が１８〜７０歳の関節リウマチ患者を、３種類の用量の実施例１０に係る本発明のワクチンで免疫した。
【０３４５】
２．理論的根拠
本試験は、少なくとも１種の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体に対する二次耐性を発現した関節リウマチ患者においてＩＳＡ５１アジュバントと組み合わせた本発明の候補製品の安全性および臨床的有効性を評価するように設計されている。安全性プロファイルおよび３種類の用量のこれらの候補ｋｉｎｏｉｄに対する免疫応答を、０日目、７日目、および２８日目または０日目および２８日目に筋肉内に投与した３種類の用量（９０μｇ、１８０μｇおよび３６０μｇ）で評価した。
【０３４６】
３．試験設計
４群に関する複数の試験機関にまたがる対照を用いた国際的第２相無作為化二重盲検試験：
−  Ａ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせた本発明のワクチン（９０μｇの本発明の製品）を投与した６人の対象、
−  Ｂ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせた本発明のワクチン（１８０μｇの本発明の製品）を投与した１２人の対象、
−  Ｃ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせた本発明のワクチン（３６０μｇの本発明の製品）を投与した１２人の対象、
−  Ｄ群：アジュバントＩＳＡ５１と組み合わせたプラセボ（３０ｍｇのマンニトール）を投与した１０人の対象。
【０３４７】
４．試験期間
正の抗ＴＮＦα抗体応答（ベースラインに対して２倍の増加として定義）を示す全ての対象を、抗体力価が正常化されるまで、または少なくとも１４０日目まで、安全性について追跡する。抗体応答を全く示さない対象は１４０日目まで追跡する。
【０３４８】
Ｂ．臨床試験の結果
関連する深刻な有害事象は全く報告されなかった。少数の軽微な一過性の局所および全身反応について免疫後に記録した。
【０３４９】
臨床試験の予備データを以下に示すが、３６０μｇの用量についてのデータない。
【０３５０】
１．抗ＴＮＦα抗体
Ａ群（９０μｇの用量）の患者の５０％およびＢ群（１８０μｇの用量）の患者の８０％において抗ＴＮＦα抗体が誘導された。
【０３５１】
この結果は、本発明の製品の関節リウマチ患者への投与により、前記患者において抗ＴＮＦα抗体応答が誘導されることを示している。
【０３５２】
Ｃ群については、抗ＴＮＦα抗体は分析されていない。予期したとおり、Ｄ群では抗ＴＮＦα抗体は検出されなかった。
【０３５３】
２．ＣＲＰレベル
ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）は関節リウマチにおける炎症のマーカーである。８４日目にＣＲＰレベルを滴定した。結果はベースラインからの絶対変化の平均として表す（表１７を参照）。
【表１８】
2014500267.tif 000019
【０３５４】
表１７に示すように、ＣＲＰレベルは本発明の製品を投与した患者群で減少したが、プラセボを投与した患者では増加した。
【０３５５】
この結果は、本発明の製品が関節リウマチ患者における炎症に対して効果を有することを示している。
【０３５６】
３．ＡＣＲ２０
ＡＣＲ診断基準（ＡＣＲは米国リウマチ学会を表す）は、関節リウマチの治療の有効性を評価するための標準的な診断基準である。ＡＣＲ２０診断基準により、圧痛関節数または関節腫脹数ならびに以下の５つのパラメータ：急性期反応物質（例えば、赤血球沈降速度またはＣＲＰレベルなど）、患者による疾患活動性評価、医師による疾患活動性評価、患者による疼痛評価、および障害／機能度評価のうちの３つにおいて２０％の改善を示す患者の割合を数値化することができる。８４日目にＡＣＲ２０を評価した。
【０３５７】
結果は、ＡＣＲ２０応答を示す患者の数および割合として表す（表１８を参照）。
【表１９】
2014500267.tif 000020
【０３５８】
表１８に示すように、ＡＣＲ２０の応答を有する患者の割合は、プラセボを投与した患者よりも本発明の製品を投与した患者において高い。
【０３５９】
この結果は、本発明の製品が関節リウマチに対して治療的に有効であることを示している。
【０３６０】
実施例１５：本発明の製品で免疫したマウスからの血清の中和能
実施例１５は、本発明の免疫原性製品による、内因性ＴＮＦαの活性を中和する抗体の産生の誘導を測定する生体外細胞試験を開示する。
【０３６１】
Ｈａｙｗａｒｄら(2007, BMC Physiology,
Vol. 7 : 13-29)によって記載されている４匹のｈＴＮＦαトランスジェニックマウスに、実施例１０に記載されているように調製したヒトTNFα kinoidのＩＳＡ５１乳濁液からなるワクチン組成物を筋肉内注射した。４μｇのヒトTNFα kinoidを含有する量のワクチン組成物をそれぞれ、０日目（Ｄ０）、７日目（Ｄ７）および２８日目（Ｄ２８）に筋肉内に投与した。免疫後６１日目、１１９日目および１９１日目に血清を採取した。
【０３６２】
本発明の免疫原性製品で免疫したｈＴＮＦαマウスからの血清の中和能を、Ｌ９２９バイオアッセイを用いて評価した。
【０３６３】
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（Ｓｉｇｍａ社製Ｎｏ．８５０１１４２５）を、１．５×１０４／ｃｍ２で、培地（１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製Ｆ７５２４）、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ７５１３）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製Ｐ０７８１）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製Ｓ８６３６）を添加したＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２６０４Ｆ））に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。
【０３６４】
次いで、Ｌ９２９細胞を回収し、２×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル平底培養プレート内の１００μｌの平板培地（２％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM F12（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＢＥ１２７１９Ｆ））に播種し、加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２で２１±１時間培養した。
【０３６５】
血清を二つ組で試験した：１つのウェル当たり、使用希釈倍率（１／１００）以上である４倍に希釈した６０μｌの血清または３０μｌのアッセイ培地（２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加したＨＬ１（Ｃａｍｂｒｅｘ社製ＵＳ７７２０１））を添加した。被験血清および対照を６段階の２倍希釈系列で希釈した。
【０３６６】
アッセイ培地に希釈したヒトＴＮＦαサイトカインを、３０μｌ／ウェルで、使用濃度２．５ｎｇ／ｍＬ以上で、４倍に希釈した血清希釈プレートに添加し、このプレートを３７℃で９０分間、４℃で３０分および室温で１５分インキュベートした。
【０３６７】
５０μｌの試料を９６ウェル平底培養プレートに移し、そこで、細胞をサブコンフルエントにしなければならない。次いで、２μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤを添加した５０μｌのアッセイ培地を添加し、プレートを、加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２で２０時間±１時間インキュベートした。
【０３６８】
次いで、１つのウェル当たり２０μｌのＭＴＳ／ＰＭＳ（１００ｍＬのＭＴＳおよび５ｍＬのＰＭＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ５４３０）を添加し、このプレートを加湿インキュベータ中３７℃および５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。
【０３６９】
次いで、ＤＹＮＥＸ社製分光光度計ＭＲＸＩＩを用いて４９０ｎｍでこのプレートを読み取った。
【０３７０】
以下のように相対的細胞生存率を計算した：
中和率（％）＝（ＯＤ試験−ＯＤＴＮＦα標準物質）／（ＯＤ血清−ＯＤＴＮＦα標準物質）
【０３７１】
ＯＤ試験は、血清およびｈＴＮＦαを含むウェルの光学濃度を表す。
【０３７２】
ＯＤＴＮＦα標準物質は、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαのみを含むウェルの光学濃度を表す。
【０３７３】
ＯＤ血清は、血清のみを含む対照ウェルの光学濃度を表す。
【０３７４】
中和力価は、ｈＴＮＦα活性の５０％を中和する血清希釈の逆数として表した（すなわちＮＣ５０）。
【０３７５】
結果を図１５に示す。
【０３７６】
図１５は、本発明の製品がｈＴＮＦαを中和する抗体を誘導することができることを示している。中和力価は１１９日目で最大であり、ＮＣ５０は３０００を超えている。本発明の免疫原性製品の中和能は、製品Ｂ１(Le Buanec et al., PNAS, 2006, 103(51): 19442-7)の中和能よりも高い。
【０３７７】
実施例１６：本発明の免疫原性製品をＩＳＡ５１またはＳＷＥを含む乳濁液として注射した際に産生された抗ｈＴＮＦα抗体の力価および中和能
実施例１６は、ＩＳＡ５１またはＳＷＥを免疫アジュバントとして使用した際の本発明の免疫原性製品の免疫原性（図１６）および中和能（図１７）の比較を開示する。
【０３７８】
ＩＳＡ５１ｖｇは、油系アジュバントのモンタニド（登録商標）ＩＳＡ５１である。ＩＳＡ５１ｖｇは、植物由来の非イオン性界面活性剤であるモンタニド（登録商標）８０ｖｇと高度に精製された鉱油ドラケオール（登録商標）６ＶＲとからなる無菌の透明な液体である。ＩＳＡ５１ｖｇはＳｅｐｐｉｃ社（Air Liquide社の子会社）によって製造されている。
【０３７９】
ＳＷＥは、スクアレン系水中油型エマルション（組成：クエン酸塩緩衝液中にスクアレンが３．９％、Ｓｐａｎが０．４７％、Ｔｗｅｅｎ８０が０．４７％）である。ＳＷＥは、ローザンヌ大学（ＵＮＩＬ）のワクチン製剤研究室（ＶＦＬ）によって提供された。
【０３８０】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、０日目（Ｄ０）および２１日目（Ｄ２１）に、ＩＳＡ５１またはＳＷＥで乳化した２μｇの本発明の免疫原性製品（総タンパク質のμｇ）を含有する本発明のワクチン組成物で注射によって２回免疫した。
【０３８１】
実施例６に記載されているように、３５日目（Ｄ３５）に、ＩＳＡ５１またはＳＷＥで乳化した本発明の製品によって産生された抗ｈＴＮＦα抗体の力価を測定した。結果を図１６に示す。
【０３８２】
図１６は、ＩＳＡ５１またはＳＷＥを免疫アジュバントとして使用した際に、本発明の免疫原性製品の抗ヒトＴＮＦα抗体の力価が著しく異ならないことを示している（ウィルコクソン検定で求めたｐ値：０．０１８）。
【０３８３】
実施例１５に記載されているように、３５日目（Ｄ３５）に、ＩＳＡ５１またはＳＷＥで乳化した本発明の製品の中和活性を測定した。結果を図１７に示す。図１７は、ＩＳＡ５１またはＳＷＥを免疫アジュバントとして使用した際に、本発明の免疫原性製品がＴＮＦαを中和する抗体を誘導する能力が著しく異ならないことを示している（ウィルコクソン検定で求めたｐ値：０．０８９）。
【０３８４】
実施例１７：「変形方法」を用いた本発明の製品の調製
以下のようにＫｉｎｏｉｄを調製した。１ｍｇのｈＴＮＦαを、最初に１％ＤＭＳＯと共に使用緩衝液中で３０分間インキュベートし、２４時間（ＫＴ９４）または７２時間（ＫＴ１００）の２５ｍＭ（０．２５％）のグルタルアルデヒド処理によって、０．５８ｍｇのＫＬＨと結合させた。グリシンによる失活（０．１Ｍ、１５分間）によって反応を停止させた。中間体生成物を使用緩衝液中で１０ＫＤの膜で透析濾過した後、４日間の２５０ｍＭのホルムアルデヒド処理により不活性化させる。グリシン（０．３７Ｍ、１時間）による失活後、ＫｉｎｏｉｄをＰＢＳ中で３００ＫＤで濾過する。最終製品を０．２μｍ濾過により滅菌し、４℃で貯蔵する。
【０３８５】
ＫＴ９４およびＫＴ１００製品に対して、本明細書において上に記載されている試験Ａおよび試験Ｂを行った（図１８、表１９および表２０）。
【０３８６】
結果は、試験Ａでは１００ｎｇ／ｍｌ濃度の製品ＫＴ９４およびＫＴ１００が４％の細胞を死滅させたことにより、ＫＴ９４およびＫＴ１００は強力に不活性化されていることを示している。
【０３８７】
結果は、試験Ｂでは、１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＫＴ９４およびＫＴ１００において８０％を超える細胞が生存したことにより（２０％未満の細胞溶解活性）、ＫＴ９４およびＫＴ１００は強力に不活性化されたままであることを示している。
【表２０】
2014500267.tif 000021
【表２１】
2014500267.tif 000022
【図１】
2014500267.tif 000023
【図２】
2014500267.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
2014500267.tif 000027
【図６】
2014500267.tif 000028
【図７】
2014500267.tif 000029
【図８】
2014500267.tif 000030
【図９】
2014500267.tif 000031
【図１０】
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【図１１】
2014500267.tif 000033
【図１２】
2014500267.tif 000034
【図１３】
2014500267.tif 000035
【図１４】
2014500267.tif 000036
【図１５】
2014500267.tif 000037
【図１６】
2014500267.tif 000038
【図１７】
2014500267.tif 000039
【図１８】
2014500267.tif 000040
【国際調査報告】
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