(57)【要約】  本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とするIgY組成物、ならびにセリアック病、リウマチ、および/または小麦アレルギーの治療におけるこのIgY組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とするIgY組成物。
【請求項２】
配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するポリクローナルIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とする、請求項1に記載のIgY組成物。
【請求項３】
KD≦500nMにて配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とする、請求項1または2のいずれか一項に記載のIgY組成物。
【請求項４】
a)配列番号1のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて産卵家禽を免疫化する工程、
b)免疫化した家禽の卵を回収する工程、および
c)IgY組成物を調製する工程であって、回収した卵の卵黄を処理する工程
を含む方法を使用して得られることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のIgY組成物。
【請求項５】
前記産卵家禽の免疫化が、配列番号1、6、もしくは7のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1、6、もしくは7のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、または配列番号1のアミノ酸配列を含有するペプチドおよび配列番号5のアミノ酸配列を含有するペプチドを含むペプチドの混合物を用いて実施されることを特徴とする、請求項4に記載のIgY組成物。
【請求項６】
前記卵黄を処理する工程が、前記卵黄からIgY抗体を単離することを含むことを特徴とする、請求項4または5のいずれか一項に記載のIgY組成物。
【請求項７】
前記家禽が、ニワトリ、好ましくはSPFニワトリであることを特徴とする、請求項4、5または6のいずれか一項に記載のIgY組成物。
【請求項８】
請求項1から7のいずれか一項に記載のIgY組成物を含有する食品または食品添加物。
【請求項９】
請求項1から7のいずれか一項に記載のIgY組成物および少なくとも1つの医学的に適合可能なアジュバントを含有する医薬組成物。
【請求項１０】
請求項1から7のいずれか一項に記載のIgY組成物または請求項9に記載の医薬組成物を含有する容器および使用するための指示書を含むキット。
【請求項１１】
セリアック病、リウマチ、および/または小麦アレルギーの治療に使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のIgY組成物または請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項1から7のいずれか一項に記載のIgY組成物または請求項9に記載の医薬組成物が患者により自己投与されるものであることを特徴とする、請求項11に記載のIgY組成物または医薬組成物。
【請求項１３】
各々の自己投与が、グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品の予想されるまたは実際の摂取によりもたらされることを特徴とする、請求項12に記載のIgY組成物または医薬組成物。
【請求項１４】
各々の自己投与が、グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品の予想されるまたは実際の摂取の5時間前以降から摂取の5時間後以内の時間枠で行われることを特徴とする、請求項13に記載のIgY組成物または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とするIgY組成物、ならびにセリアック病、リウマチ、および/または小麦アレルギーの治療におけるこのIgY組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルテン過敏性もしくはグルテン性腸症、小児脂肪便症、または非熱帯性もしくは風土性スプルー、グルテン不耐性、または成人におけるヒューバー-ハーター病とも称される、セリアック病(ICD-10によれば、WHO 2006:K90.0型)は、多くの穀物中に見られるタンパク質である、グルテンに対する過敏性から生じる小腸粘膜の慢性疾患である。この不耐性は生涯残り、それは部分的に遺伝的に決定され、その原因は現在治療できない。
【０００３】
グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された(transglutaminated)食品は、腸上皮細胞を頻繁に広範に破壊する小腸粘膜の炎症を引き起こす。栄養素は吸収されにくく、腸内で消化されないままである。したがって、症状には、体重損失、下痢、嘔吐、食欲不振、疲労、過敏性、および特に小児期の間の成長障害が含まれる。その症状の重症度はかなり変化する場合があり、初期の診断をより困難にする。未治療のセリアック病は、非ホジキンリンパ腫および腸癌などの消化管の癌腫の危険性を増加させる。
【０００４】
一方、グルテンの多くの有害なペプチド断片が識別されている。それらは全て、アルコール可溶性部分(いわゆるプロラミン)に属し、グリアジンと称される。感受性のある個体において、これらのペプチド断片は腸粘膜および免疫系の複合反応をもたらす。小腸の粘膜細胞は増加した量の種々のクラスのHLA(HLA I、DR、およびDQ)を産生する。特定のグリアジンペプチドは増加した量で産生されるHLA-DQ2に結合する。この結合は、大量にペプチド中に存在するアミノ酸のグルタミンからのグルタミン酸形成の結果として増加する。グルタミン酸の形成は、組織トランスグルタミナーゼ酵素(tTG)により、特に組織トランスグルタミナーゼ2(tTG2)により媒介される。それは、tTG2修飾グルテンまたはグリアジンにより形成され、セリアック病の発症および疾患の進行と因果関係がある。この変化の結果として、グリアジンの対応する部分はHLAタンパク質の「ポケット」内により良く適合する。グリアジンペプチドおよびHLA-DQ2の複合体はCD4+Tヘルパー細胞に結合し、それらに、インターフェロン-γ、TNF-α、インターロイキン-6、およびインターロイキン-2などの多くの種々の炎症誘発メッセンジャー物質を産生させる。種々の抗体は炎症のさらなるプロセスにおいて形成される。グリアジンペプチド自体に対する抗体(グリアジン抗体、AGA)に加えて、自己抗原に対するいわゆる自己抗体が存在する。組織トランスグルタミナーゼ、特にtTG2が、主に関与する自己抗原として識別されている。
【０００５】
病態生理学的観点から、セリアック病はこれらの見識に基づいたアレルギーおよび自己免疫疾患の混合型であると理解されている。外因性タンパク質である、グリアジンに対する過敏性の形態のアレルギー成分は誘発要因を表すのに対して、身体の独自の構造に対する自己免疫反応が症状の重症度に関与する。最終的に、炎症プロセスは腸細胞のアポトーシスをもたらし、結局、程度の差はあるが、小腸絨毛の顕著な損失を導く。減少した吸収面の結果として、このように損傷した小腸粘膜は、供給された食物を血流内にもはや十分に移すことができない。
【０００６】
セリアック病の現在の治療は主にグルテンを含まない食事であり、すなわち、患者によるグルテンの摂取が回避される。患者がグルテンを含有するもしくはトランスグルタミン化された食品を摂取できる治療の形態、またはグルテンを含有するもしくはトランスグルタミン化された食品を不注意に摂取した場合に、患者にとってのそのような摂取の結果を軽減する治療の形態はまだ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 2011/039350 A1
【特許文献２】DE 10 2009 045 268.0
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rudiger Schade、Irene Behn、Michael Erhard:Chicken Egg Yolk Antibodies、Production and Application. Springer-Verlag、Berlin 2001
【非特許文献２】Remington's Pharmaceutical Science、20th ed.、2000、Mack Publishing Company
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、従来技術の1つまたは複数の不都合な点を低減または回避することである。より具体的には、本発明の目的は、セリアック病を治療するための新規薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とするIgY組成物を提供することにより達成される。本発明に係るIgY組成物は、例えば、
-  配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、
-  配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するこのようなIgY抗体の断片、および/または
-  配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するこのようなIgY抗体のFab断片
を含有してもよい。
【００１１】
WO 2011/039350 A1およびDE 10 2009 045 268.0から、配列番号1のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1のアミノ酸配列からなるこのようなペプチドが、このようなペプチドに結合する抗体と同様に知られている。WO 2011/039350 A1およびDE 10 2009 045 268.0は、セリアック病の診断におけるこのようなペプチドおよび抗体の使用を開示している。WO 2011/039350 A1およびDE 10 2009 045 268.0のどちらも、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY型の抗体はもちろん、ましてやセリアック病の治療に使用するためのそれらの適合性は開示していない。
【００１２】
本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を含有するペプチドを用いた産卵家禽の免疫化が、tTG2修飾グリアジンペプチド、すなわち、特に病理学的グリアジンペプチドに特異的に結合するIgY抗体の形成をもたらすという驚くべき発見に基づき、ここで、tTG2はグリアジンペプチド中に存在するアミノ酸のグルタミンからグルタミン酸を形成するために使用された。修飾されたグリアジンに対するIgY抗体の特異的結合の結果として、修飾されたグリアジンペプチドのそれぞれの部分は、HLAタンパク質の対応する結合部位にもはや適合しない。したがって、修飾されたグリアジンペプチドおよびHLA-DQ2の複合体は形成できず、病理学的シグナル鎖が遮断される。セリアック病症状の発現は予防または少なくとも軽減され得る。
【００１３】
配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab抗体を含有する本発明に係るIgY組成物は、セリアック病の治療における使用に適していることが見出された。セリアック病患者が、グルテンを含有するもしくはトランスグルタミン化された食品を摂取した場合、またはこのような摂取が予想され得る場合、本発明に係るIgY組成物の供給により、患者が、セリアック病の症状を発症することが予防され得るおよび/または予想されるセリアック病の症状の重症度を顕著に軽減できる。このことは、初めて、セリアック病を患っている患者が、グルテンを含有するもしくはトランスグルタミン化された食品を摂取した結果としてセリアック病の症状を発症することを予防または軽減できることを意味する。したがって、セリアック病を患っている患者は、例えば家族パーティーなどの少なくとも例外的な場合において、グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品を摂取し、通常の社会生活に加わる機会を与えられる。
【００１４】
本発明はIgY組成物に関する。本発明の目的に関して、IgY組成物は、IgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有する任意の組成物である。IgY組成物は他の成分を含んでもよい。
【００１５】
本発明に係るIgY組成物は、IgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有する。IgY抗体は、家禽、特にニワトリ、アヒル、およびガンに見出される抗体のクラスであり、それらは哺乳動物におけるIgG抗体との機能的等価物を表す。しかしIgGとは異なり、IgY抗体はプロテインAまたはプロテインGのそれぞれに結合せず、それらはまた、細胞Fc受容体にも結合しない。さらに、IgY抗体は補体系を活性化しない。IgY抗体は特に、(例えば栄養剤または医薬の形態で)哺乳動物への投与に良く適している。なぜなら、IgY抗体は典型的に、哺乳動物において抗原効果を有さず、したがって、複数回投与後でさえ、標的生物において問題のある免疫反応を誘発しないからである。
【００１６】
IgY抗体は、定常Fc領域および2つの可変Fab領域を有するIgYクラスのインタクトな断片化されていない抗体であると理解される。IgY抗体にその結合特異性を与える抗原結合部位(CDR=相補性決定領域)は可変Fab領域内に位置する。抗体の構造および抽出は当業者に公知であり、例えば、Rudiger Schade、Irene Behn、Michael Erhard:Chicken Egg Yolk Antibodies、Production and Application. Springer-Verlag、Berlin 2001に詳細に記載されている。本発明の目的に関して、「IgY抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナルIgY抗体の両方を含み、それらは、例えば、産卵家禽を免疫化し、続いて卵黄から単離することにより、またはクローニング、発現、および精製などの生物工学的プロセスを使用することにより産生され得る。ポリクローナルIgY抗体が好ましい。
【００１７】
IgY抗体の断片は、内在する抗体の抗原結合部位を含み、それぞれのインタクトなIgY抗体と実質的に同じ結合特異性を示すインタクトなIgY抗体の領域であると理解される。このような断片は、例えば、トリプシンなどの適切なプロテアーゼを使用してインタクトな抗体を切断することによって、例えば、酵素的に産生されてもよい。IgY抗体の断片はまた、生物工学的プロセスおよび/または機械的方法により産生されてもよい。それぞれのインタクトな抗体のFc部分が除去されているFab断片は断片の特別な形態を表す。「Fab断片」という用語は、1つのFab領域を有する断片および2つのFab領域(いわゆるF(ab)2断片)を有する断片の両方を含む。
【００１８】
本発明に係る組成物は、好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体、その断片、および/またはFab断片を含有する。ポリクローナルIgY抗体の利点は、それらが、ペプチド上で1つより多いエピトープを検出でき、それによりHLAタンパク質に対するtTG2修飾グリアジンの結合を特に効果的に阻害できることである。
【００１９】
本発明に係るIgY組成物は、それが、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有することを特徴とする。本発明に係るIgY組成物は、前記IgY組成物が、配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合できるIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明に係るIgY組成物は、好ましくは、KD≦500nMにて配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含有する。
【００２１】
本発明に係るIgY組成物は、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するIgY抗体、その断片、および/またはFab断片に加えて、配列番号5のヒトtTG2に特異的に結合する他のIgY抗体、その断片、および/またはFab断片を含むことが特に有益であると証明されている。
【００２２】
本発明に係るIgY組成物は、原則として、特異的IgY抗体またはIgY調製物もしくは組成物を産生するための公知の方法(例えば、Rudiger Schade、Irene Behn、Michael Erhard:Chicken Egg Yolk Antibodies、Production and Application. Springer-Verlag、Berlin 2001を参照のこと)を使用して産生できる。
【００２３】
方法は、
-  免疫化するために使用される抗原、例えばアミノ酸配列1および/または6を有するペプチドを用意する工程、
-  抗原を用いて産卵家禽を免疫化する工程、
-  免疫化した家禽の卵を回収する工程、
-  IgY組成物を調製する工程であって、回収した卵の卵黄を処理する工程
を含んでもよい。
【００２４】
本発明に係る方法において、配列番号1のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドが、産卵家禽を免疫化するための抗原として使用されてもよい。免疫化するためのペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に加えて、配列番号2、3および/または4のアミノ酸配列などの他のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、ペプチドは配列番号1、2、3、および/または4の配列の複数のコピーを含んでもよい。
【００２５】
配列番号1のペプチドに特異的なIgY抗体およびヒトtTG2に特異的に結合できるIgY抗体の両方を含むIgY組成物は、例えば、
-  第1の免疫化には配列番号1のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドが使用され、第2の免疫化にはヒトtTG2の少なくとも1つの断片を含む抗原が使用される、別々の免疫化に由来するIgY抗体部分を互いに混合すること、
-  配列番号1のペプチドおよびヒトtTG2の少なくとも1つの断片を含む抗原を含む混合物を免疫化に使用すること、または
-  配列番号1のアミノ酸配列および例えば融合タンパク質としてヒトtTG2の少なくとも1つの断片の両方を含むペプチドを免疫化に使用すること
により調製されてもよい。
【００２６】
配列番号1のアミノ酸配列に加えて、配列番号5のヒトtTG2の配列に由来する、少なくとも25個の後続するアミノ酸、好ましくは少なくとも100個の後続するアミノ酸の配列を含むペプチドを、免疫化のため、および/または本発明に係るIgY組成物を産生するために使用することもできる。ペプチドの部分である領域は、原則として、配列番号5のtTG2配列の任意の部分から選択されてもよい。配列番号1、2、3、および/または4の1つまたは複数のアミノ酸配列に加えて、ペプチドは、配列番号5のtTG2の1つもしくは複数の部分配列またはtTG2の全配列の1つもしくは複数のコピーをさらに含むことが好ましい。加えて、免疫化のためおよび/または本発明に係るIgY組成物を産生するためのペプチドは、Hisタグ、特に6xHisタグなどの他のアミノ酸を含んでもよい。特に、ペプチドは、配列番号6[配列番号5+2]もしくは配列番号7[配列番号5+2+2]の配列を含んでもよいまたは配列番号6[配列番号5+2]もしくは配列番号7[配列番号5+2+2]の配列からなってもよい。このような融合タンパク質を用いた免疫化の1つの利点は、単一免疫化において、配列番号1のペプチドに結合するIgY抗体およびヒトtTG2に結合し、遮断する抗体の両方を含有するポリクローナルIgY抗体部分が得られ得ることである。このように、二重効果が達成される。一方で、病原性tTG2修飾グリアジンが結合し、患者のHLAタンパク質に結合することを防ぎ、他方で、tTG2の酵素機能が阻害され、病原性tTG2修飾グリアジンの形成を防ぐ。
【００２７】
本発明に係る方法において、好ましい産卵家禽はニワトリ、アヒル、またはガンである。ニワトリの使用が特に好ましい。特定の病原体を含まないニワトリ(SPFニワトリ)が、可能な限り純粋である生産物を得るために使用されてもよい。
【００２８】
産卵家禽は一般的に公知の様式で抗原を用いて免疫化される。
【００２９】
免疫化した動物により産卵された卵は回収され、本発明に係るIgY組成物を調製するために使用される。
【００３０】
IgY組成物の調製は、所望または必要とされるレベルの純度に応じて複数の種々の工程を含んでもよい。最初に、IgY抗体を含有する卵黄が卵白から分離され得る。卵白から分離された卵黄は、本発明のIgY組成物として、例えば食品のための添加剤としていくつかの用途に既に使用されてもよい。より純粋なIgY組成物をさらに得るために、抽出した卵黄を処理することも可能である。例えば、IgY抗体は、親和性精製されてもよい、および/またはサイズ排除法を使用して卵黄の他の成分から分離されてもよい。当業者は、卵黄から特異的IgY抗体を単離し、それを精製するためのプロセスおよび方法を知っている。
【００３１】
本発明はまた、本発明に係る方法を使用して得たIgY組成物に関する。
【００３２】
本発明に係るIgY組成物は、例えば、
a)配列番号1のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて産卵家禽を免疫化する工程、
b)免疫化した家禽の卵を回収する工程、
c)IgY組成物を調製する工程であって、回収した卵の卵黄を処理する工程
を含む本発明に係る方法を使用して得られることを特徴とし得る。
【００３３】
産卵家禽は、配列番号1、6、もしくは7のアミノ酸配列を含有する、または配列番号1、6、もしくは7のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、または配列番号1のアミノ酸配列を含有するペプチドおよび配列番号5のアミノ酸配列を含有するペプチドを含むペプチド混合物を用いて免疫化されてもよい。
【００３４】
本発明の別の目的は、本発明に係るIgY組成物を含有する食品および食品添加物である。
【００３５】
本発明はまた、本発明に係るIgY組成物および任意選択で1つまたは複数の医学的に適合可能なアジュバントを含有する医薬組成物に関する。
【００３６】
本発明に係る医薬組成物は所望の投与方法に応じて異なる設計であってもよい。本発明に係るIgY組成物または本発明に係る医薬組成物は、それぞれ、経口投与用に製剤化されることが好ましい。経口投与用の製剤は、IgY組成物が改善された吸収のために腸内に移動できる腸溶コーティングによりIgY組成物が封入される製剤を含んでもよい。乾燥または液体形態でIgY組成物を含有する製剤はカプセルであってもよく、それにより製剤は胃の酸性環境中での早まった消化に抵抗でき、腸内の病変部位に移動できる。
【００３７】
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、本発明に係るIgY組成物および少なくとも1つの医学的に適合可能なアジュバントを含む。「アジュバント」という用語は、本明細書において、本発明に係るIgY組成物を除く全ての他の成分を示すために使用される。アジュバントは主に特定の投与方法に基づいて選択される。アジュバントは特に、生理学的に適合可能な担体物質、添加剤、および溶媒であると理解される。一般的に使用されるアジュバントは、Remington's Pharmaceutical Science、20th ed.、2000、Mack Publishing Companyに記載されている。アジュバントは使用される用量および濃度で無毒性である。インビボ投与用の組成物は当業者に公知のプロセスおよび方法を使用して調製され得る。
【００３８】
本発明に係るIgY組成物または本発明に係る医薬組成物を含有する容器および使用するための指示書を含むキットもまた、本発明の一部である。
【００３９】
本発明に係るIgY組成物または医薬組成物は、セリアック病、リウマチ、および/または小麦アレルギーの治療に使用されてもよい。全てのこれらの疾患において、tTG2修飾グリアジンは重要な役割を果たす。
【００４０】
本発明の目的に関して、「治療」という用語は、疾患、障害、もしくは病態またはこのような疾患、障害、もしくは病態の1つもしくは複数の症状の進行の反転、軽減、または阻害を示す。「治療」という用語はまた、未処置の対照集団または処置前の同じ哺乳動物と比較して、哺乳動物における疾患、障害、または病態の可能性、重症度、または発生の頻度を減少させることを指す場合もある。「治療」という用語はまた、疾患、障害、または病態の予防を指す場合もあり、疾患、障害、もしくは病態の発症の遅延もしくは予防、または疾患、障害、もしくは病態に関連する症状の遅延もしくは予防を含んでもよい。「治療」という用語はまた、疾患、障害、もしくは病態またはそのような疾患、障害、もしくは病態に関連する症状の重症度の減少を指す場合もある。
【００４１】
セリアック病を治療するための本発明に係るIgY組成物または医薬組成物の使用は、本発明に係る組成物が患者により投与されること(いわゆる自己投与)を特徴とし得る。このことにより、患者は、実際にそれを必要とする場合にのみ薬剤に曝露されることが確実にされる。患者は典型的に、グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品の摂取が予想され得る状況に関与するかどうかを前もって知っている。多くの場合、患者は、グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品を摂取するかどうかを通知される最適な状況にいる。これら全ての場合、患者は、本発明に係るIgY組成物または医薬組成物の用量を投与することにより無関係に反応できる。グルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品の患者の予想されるまたは実際の摂取によりもたらされる任意の自己投与が好ましい。自己投与は、好ましくは、特定の有用な効果を達成するためにグルテンを含有するまたはトランスグルタミン化された食品の予想されるまたは実際の摂取の5時間前以降から摂取の5時間後以内の時間枠で行われるべきである。
【００４２】
本発明は、セリアック病、リウマチ、および/または小麦アレルギーを治療する方法であって、本発明に係る有効量のIgY組成物または医薬組成物が患者に投与される、方法に関する。
【００４３】
本発明によれば、本発明に係るIgY組成物または医薬組成物は、好ましくは、有効量で投与される。「有効量」は、患者に投与される場合、問題のある疾患に対して測定可能な治療効果を引き起こす本発明に係る組成物の用量である。本発明において、患者に投与される場合、本発明に係る組成物の用量である有効量は、セリアック病、リウマチ、および/または小麦アレルギーの治療に対して治療効果を生じる。組成物は、好ましくは、1回の治療または投与につき5mg/kg体重以下の用量で投与される。特に、本発明に係る組成物は、1回の治療または投与につき0.1μg/kg〜5000μg/kg体重、好ましくは1回の治療または投与につき1μg/kg〜2000μg/kg体重の用量で投与されてもよい。急性副作用の発生を予防するために10mg/kg体重以下の最大累積1日用量で本発明に係る組成物を使用することが推奨される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】抗tTG-CD3-IgYおよび抗CD3-IgYニワトリ抗体による15人のセリアック病患者のセリアック病に特異的なIgAおよびIgG血清抗体の阻害を示す。
【図２】tTG2修飾小麦グリアジンに対する抗tTG-CD3-IgYおよびCD3-IgYの特異的結合を示す。
【図３】抗tTG-CD3-IgYによるtTG2の酵素活性の特異的阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
(実施例)
CD3、tTG、およびCD3tTGの調製および精製
配列番号4のCD3を、合成およびC末端リジン残基におけるビオチン化により調製した。
本明細書以下でtTGと称する、配列番号5のヒトtTG2を、組換え発現のための除去可能な6xHisタグを用いてベクター内でクローニングし、標準的なプロトコルに従って発現させ、Ni-NTAカラム精製を使用して単離し、6xHisタグを除去した。
本明細書以下でCDtTGと称する、配列番号6のCD3tTGを、組換え発現のためのC末端6xHisタグを用いてベクター内で同様にクローニングし、標準的なプロトコルに従って発現させ、Ni-NTAカラム精製を使用して単離し、Hisタグを除去した。
【００４６】
血清阻害試験
抗tTG-CD3-IgYおよび抗CD3-IgYニワトリ抗体による15人のセリアック病の患者のセリアック病に特異的なIgAおよびIgG血清抗体の阻害を検査した。CD3ペプチドELISAを、CD3特異的抗体を阻害するために開発し、そのCD3ペプチドELISAにおいて、ビオチン化CD3がニュートラアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに最初に結合し、その後以下のプロトコルに従った。
【００４７】
ニュートラアビジン-CD3ペプチドELISA
マイクロタイタープレートのウェルを最初に、PBS/5%MP緩衝液を用いて一晩遮断した。次いで毎回PBS緩衝液中の500pmol/ウェルを使用してビオチン化したペプチドを塗布した。2時間のインキュベーション後、CDR3/ニュートラアビジンでコーティングしたプレートを、PBS/0.1%Tweenを用いて4回洗浄し、PBS/2%MP中に1:800の希釈にて患者血清と1時間インキュベートした。その後、洗浄を4回繰り返し、続いて1:5000の希釈にてペルオキシダーゼがコンジュゲートした第2のAbを塗布した。またインキュベーションを1時間行った。最後に、洗浄を4回繰り返し、続いて基質を塗布した。青色が発生する反応を、0.5Mの硫酸を使用して5分後にクエンチした。620nMの参照波長に対して450nMの測定波長にてELISAリーダーを使用して、生じた黄色を光学的に測定し、マゲランソフトウェア(Magellan software)を使用して可視化した。100μL/ウェルを使用して各溶液を塗布した。遮断し、毎回300μL/ウェルを使用して洗浄工程の各々を実施した。ペプチド、患者血清、および第2のAbを有するマイクロタイタープレートをRTにて撹拌しながらインキュベートした。
【００４８】
遮断試験のために、プレートを、CD3コーティング後に30分間、100μLのPBS中の5μgのIgY(約0.5〜1μgの特異的CD3抗体に対応する)とインキュベートし、次いでPBS/0.1%Tweenを用いて4回洗浄した。
【００４９】
tTG-ELISAプロトコル:
tTG2-IgY阻害抗体を検出するために、特異的ELISAを開発し、その特異的ELISAにおいて、組換えtTG2を最初にMaxiSorbマイクロタイタープレート(Nunc)に結合し、続いて以下のプロトコルを使用した:A)結合緩衝液:100mMのTris、10mMのNaCl pH7.8、B)洗浄緩衝液:50mMのTris-HCl、150mMのNaCl、10mMのEDTA、0.1%のTween20  pH7.4、C)飽和緩衝液、50mMのTris-HCl、150mMのNaCl、0.5%のBSA、3%のスクロース  pH7.4、D)血清希釈緩衝液:50mMのTris-HCl、150mMのNaCl、0.5%のTween 20  pH7.4。
【００５０】
手順:
Nunc製のMaxiSorpプレート上のコーティング:コーティング量:tTG2を毎回0.5μg/ウェルの濃度にて使用した。コーティング体積:100μl/ウェル。全てのtTGを結合緩衝液A中で適切に希釈した。コーティングのために、プレートを4℃にて一晩インキュベートした。ブランクおよび第2のAb対照をELISA実施において一緒に扱った。ブランクおよび第2のAb対照のOD値をELISA評価において差し引いた。3×300μL/ウェルの洗浄緩衝液Bを用いたコーティング後にプレートを洗浄した。各洗浄工程は、3分間のELISA撹拌器での600rpmと同等である。その後、プレートをRTにて2時間、300μL/ウェルの飽和緩衝液を用いて遮断した。遮断試験のために、プレートを、tTGコーティング後、30分間、100μLの緩衝液D中で希釈した5μgのIgY(約0.5〜1μgの特異的CD3tTG抗体に対応する)とインキュベートし、次いで緩衝液Bを用いて洗浄した。
【００５１】
血清を血清希釈緩衝液D中で1:800に希釈し、遮断後に100μL/ウェルをプレート上に直接置いた。撹拌しながら1時間RTにてインキュベートし、5×300μL/ウェルの洗浄緩衝液Bを用いて洗浄した。第2のAb:Dakoによる-<hlgA>HRPを洗浄緩衝液B中で1:1500に希釈し、100μL/ウェルを使用し、洗浄緩衝液Bと同様に1:5000の希釈にてDakoによる-<hlgG>HRPおよび100μL/ウェルを使用した。撹拌しながらRTにて1時間インキュベートした。4×300μL/ウェルの洗浄緩衝液Bを用いて洗浄した。5分間、100μL/ウェルのTMB基質(セラムンブルーファスト(SeramunBlue fast))と反応させた。その後、100μL/ウェルのクエンチング溶液(0.5MのH2SO4)を用いてクエンチし、450nmにてELISAリーダーにおいて評価した。
【００５２】
この研究の過程でセリアック病患者の血清の第3の群である、陽性セリアック診断、様々な年齢、性別および病理学的特徴を有する15人の患者由来のヒト患者血清を利用した。使用した全ての血清の抗tTG2および抗CD3信号はカットオフ下で阻害した(図1を参照のこと)。
【００５３】
IgY精製
Gamenischらに従った最適化されたクロロホルムポリエチレングリコールプロトコルを、ニワトリ卵由来の組換え融合タンパク質のIgY抗体を改良し、迅速に精製するために使用した。第1の工程において、卵黄を卵白から分離する。次いで液体内部の卵黄を、ピペットを用いて卵黄嚢に穴を開けることにより滅菌濾紙上で分離し、50mLのファルコンチューブ内に移す。次いで移動させた卵黄を有する50mLのファルコンチューブを、PBS緩衝液を用いて25mLまで満たし、ボルテックスする。次いで卵黄-PBS混合物を20mLのクロロホルムと混合し、ボルテックスし、均一な混合物が得られるまで振盪する。10分間1200×gにて遠心分離した後、上清を遠心チューブ内に移し、ポリエチレングリコール6000(Fluka)を使用して12%(w/v)の最終濃度に設定する。10分間15700×gにて遠心分離した後、ペレットを、PBSを用いて再懸濁し、ウェスタンブロット試験またはELISAにおいてそれぞれのタンパク質またはペプチドとの反応性について一部を検査し、残りを-80℃にてクライオチューブバイアル内に保存する。
【００５４】
CD3tTGおよびCD3に対するポリクローナルIgY抗体の調製
大量のIgY抗体が卵黄Yから単離でき、少量のみの抗原が免疫化に必要とされるので、ポリクローナル抗体を調製するためのニワトリを選択した。250μLの溶出緩衝液中に存在した、100〜150μgの抗原(KLHおよび組換えtTG-CD3に結合したCD3ペプチド)を、免疫化工程ごとに使用した。この部分をフロイントアジュバントと等量で混合した。HisPur(商標)コバルト樹脂上で2回およびQSepharose(登録商標)高速流上で1回精製した組換え融合タンパク質を用いて筋肉注射により抗体を産生させるためにニワトリを刺激した。14および38日後に追加ワクチン接種を与えた。合計64日後にニワトリ卵を回収した。
【００５５】
購入した小麦グリアジン(Sigma)もまた、ウェルに結合させた(2μg)。グリアジンを8Mの尿素(60μg/mL)中に溶解し、それぞれの希釈物を調製した。結合後、タンパク質をトランスグルタミナーゼにより酵素的に修飾した。トランスグルタミナーゼはグルタミンの脱アミノ化を触媒する。これにより、グルタミンのグルタミン酸への変換が生じる。ELISAプレートを、修飾のためにPBS緩衝液を用いて洗浄した。100μLの修飾緩衝液を添加した後、20μLのtTG(250μg/mL)をピペット操作により添加し、37℃にて120μL/ウェルの量で沈殿させ、2時間インキュベートした。続いてPBSを用いて2×1分の洗浄工程を行った。
修飾緩衝液
TBS中に
10mMのDTT
10mMのCaCl2
【００５６】
その後、1時間の遮断を、5%粉乳/PBSの各々150μLを用いて実施した。続いてPBSを用いて2×1分の洗浄工程を行った。120μLの抗CD3および抗CD3-tTG IgY抗体を各々1:500および1:1000にて5%粉乳中で希釈し、ウェル内にピペット操作し、RTにて1時間インキュベートした。PBSを用いた4×1分の洗浄工程後、120μLのHRPが結合した二次抗体を5%粉乳中に添加した(抗CD3およびCD3tTGについて抗ニワトリ抗体1:2000)。インキュベーションを30分間実施した。次いで生成物を、PBSを用いて5×1分洗浄した。それぞれに100μLのTMBを5分間添加することにより免疫反応を可視化し、その後、100μLの0.5MのH2SO4を使用して反応を停止させた。その結果を、ELISAプレート光度計にて620nmの参照波長に対して450nMにて測定した。実施した全てのELISA試験において、インキュベーションおよび洗浄工程を、600rpmにて撹拌器(Titramax 1400、Heidolph)で実施した。全ての分析を二連で実施し、その後、対照を含めた。
【００５７】
その結果を図2に示す。抗CD3 IgYおよび抗CD3-tTG IgY抗体は小麦グリアジンのtTG修飾形態を特異的に検出するのに対して、抗CD3 IgYおよび抗CD3-tTG IgY抗体は、非病原性の未修飾グリアジンとの特異的反応性を示さない。未修飾グリアジンに対して向けられるIgY抗体は未修飾グリアジンに対する特異的結合を示すのに対して、tTG2修飾グリアジンはこの抗体により検出されない。
【００５８】
tTG2酵素活性試験
抗CD3-tTG IgY抗体の存在および非存在下でのtTGの酵素活性を、カゼインの組込みを測定することにより定量化した。カゼイン(17mM)を、全量100mLの0.1MのTris-HCl、0.15MのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5にて30mMのモノダンシルカダベリンとインキュベートした。Sigma製のモノダンシルカダベリン(N-(5-アミノペンチル)-5-ジメチルアミノ-1-ナフタレンスルホンアミドのウシa-カゼインへの組込みにより、ダンシル基の高い強度の蛍光を生じる。阻害研究に関して、抗CD3-tTG IgY抗体を1から2.5mgの範囲の種々の濃度にて含めた。37℃にて0.5mgのヒト組換えtTGを添加することにより反応を開始した。励起を360nmにて行い、蛍光分光光度計を使用して550nmにて蛍光の増加を測定した。対照抗体の添加に関与する実験に相関する残存活性の百分率としてtTG活性を算出した。
【００５９】
図3に示すように、抗CD3-tTG IgY抗体はtTG2を効果的に遮断できるのに対して、不適切なIgY対照抗体はtTG2活性に影響を及ぼさない。
【００６０】
抗CD3-tTG IgYはtTG2活性の95%超の阻害を示した。この阻害効果により、抗CD3-tTG IgY抗体が病理学的活性化およびT細胞の複製を遮断できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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