(57)【要約】  一態様において、試料からクロマチンを単離するための方法であって、この方法は、クロマチンを含む液体試料を、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスに通すことを含み、リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料からクロマチンを単離するための方法であって、クロマチンを含む液体試料を、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスに通す段階を含み、該リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合する、前記方法。
【請求項２】
前記硬質多孔性マトリックスが、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記硬質多孔性マトリックスが、フィルタディスク又はフリットの形態である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記硬質多孔性マトリックスが、分離カラム内に収容される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記硬質多孔性マトリックスが、スピンカラム内に収容される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記カラムが、疎水性マトリックスをさらに備える、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記液体試料が、遠心分離、重力又は減圧で、前記硬質多孔性マトリックスから吸引される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記液体試料が、免疫グロブリンが結合されるクロマチンを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、抗体、プロテインA、又はプロテインGを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、(i)前記硬質多孔性マトリックスに洗浄溶液を通す段階、(ii)会合されたタンパク質から、前記マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を分離する段階、及び、(iii)前記マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を検出する段階から選択される、1以上の段階をさらに含む、前記方法。
【請求項１１】
分離カラムであって、クロマチンを含む液体試料を保持するための室と、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスとを備え、該リガンドが、クロマチンと会合したタンパク質に結合することができ、かつ、該液体試料を該硬質多孔性マトリックスに通すことができるように、該硬質多孔性マトリックスが該室内に位置する、前記分離カラム。
【請求項１２】
前記硬質多孔性マトリックスが、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含む、請求項１１記載の分離カラム。
【請求項１３】
前記硬質多孔性マトリックスが、フィルタディスク又はフリットの形態である、請求項１１又は１２記載の分離カラム。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の分離カラムであって、前記硬質多孔性マトリックスが、該カラムの流出口の上に位置し、このため、前記室で保持された液体試料が、前記硬質多孔性マトリックスを通って、該カラムから流出することができ、これによって、前記硬質多孔性マトリックスにクロマチンが結合することにより、前記液体試料からクロマチンを単離する、前記分離カラム。
【請求項１５】
前記硬質多孔性マトリックスを通して、前記カラムから流出した液体を受け取るための回収容器をさらに備える、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の分離カラム。
【請求項１６】
疎水性マトリックスをさらに備える、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の分離カラム。
【請求項１７】
前記疎水性マトリックスが、前記硬質多孔性マトリックスと前記カラムの流出口との間に位置する、請求項１６記載の分離カラム。
【請求項１８】
スピンカラムである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の分離カラム。
【請求項１９】
前記リガンドが、免疫グロブリン、プロテインA、又はプロテインGを含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の分離カラム。
【請求項２０】
キットであって、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の分離カラムと、クロマチン免疫沈降アッセイを行うのに適した、1以上のバッファー、溶液又は試薬と、を備える、前記キット。
【請求項２１】
液体試料からクロマチンを単離するための、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の分離カラムの使用。
【請求項２２】
前記分離カラムが、クロマチン免疫沈降アッセイに使用される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記硬質多孔性マトリックスが、化学酸化によって生成された改質表面を備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記改質表面が、1以上の酸化酸による処理によって生成される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
複数の硬質多孔性マトリックスを備えるアレイが備えられ、かつ、それぞれの複数の液体試料が、該アレイ中の硬質多孔性マトリックスを通る、請求項１〜１０、２３又は２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アレイがマルチウェルプレートを備え、該プレート内のそれぞれのウェルが、請求項４記載の分離カラムを備える、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記硬質多孔性マトリックスが、化学酸化によって生成された改質表面を備える、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の分離カラム。
【請求項２８】
前記改質表面が、1以上の酸化酸による処理によって生成される、請求項２７記載の分離カラム。
【請求項２９】
請求項１１〜１９、２７又は２８のいずれか一項に記載の分離カラムを複数備える、アレイ。
【請求項３０】
マルチウェルプレート又はろ過マイクロプレートの形態である、請求項２９記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本発明は、クロマチン免疫沈降アッセイ方法、及びかかる方法に使用される分離カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
クロマチン免疫沈降(ChIP)は、DNA/タンパク質相互作用に関する研究に用いられる重要な技術である。ChIPの利点は、定義されたゲノム領域と共に、ChIPが、特異的なタンパク質の会合、又はこれらの修飾されたアイソフォームを分析するのに使用することができるということである。既存のChIP技術の総説は、O'Neill (2003)らによる「天然クロマチンNChIPの免疫沈降(Immunoprecipitation of native chromatin, NChIP)」Methods：A Companion to Methods in Enzymology 31:76-82に提供されている。ChIPは、生存細胞又は組織の内因性クロマチン上の特定の領域に、転写因子及び修飾されたヒストンなどのタンパク質が結合するか否かを判断するために用いることができる。
【０００３】
ChIPアッセイにおいて、DNA-タンパク質複合体（すなわち、クロマチン）の断片は、特異的なDNA-タンパク質相互作用を保持するような方法で調製される。その後、これらのクロマチン断片は、該複合体に含まれるタンパク質に対する抗体を使用して、免疫沈降させることができる。次いで、単離されたクロマチン画分を処理して、DNA及びタンパク質成分を分離することができる。その後、特定のタンパク質（すなわち、免疫沈降を誘導するのに使用された抗体に対するタンパク質）に関して単離されたDNA断片の同一性は、定義された配列のDNA断片の同定に用いられるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リアルタイムPCR、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション、直接配列決定、又は他の方法によって決定することができる。
【０００４】
したがって、クロマチン免疫沈降アッセイは、通常、次に示す5つの重要な段階を含む。すなわち、(i)細胞からの分析されるクロマチンの調製、(ii)抗体を使用するクロマチンの免疫沈降、(iii)沈殿したクロマチン断片の単離、(iv)沈殿物からのDNA回収、及び、(v) DNA分析である。
【０００５】
ChIP法には、主として、出発（供給）クロマチンがどのように調製されているかによって異なる、2つの主要な変異体がある。第1の変異体（NChIPと称する）は、標準法による細胞核のミクロコッカスヌクレアーゼ消化によって調製された天然クロマチンを使用する。第2の変異体（XChIPと称する）は、通常、超音波処理によるクロマチンの断片化の前に、増殖細胞へのホルムアルデヒドの添加によるクロマチン架橋を用いる。一部の研究者は、マイルドなホルムアルデヒド架橋を用い、続いてヌクレアーゼ消化を用い、また、UV照射を代替架橋技術として良好に利用している。
【０００６】
通常、クロマチン断片の免疫沈降は、DNAに結合される関心対象のタンパク質に対して特異的な抗体を使用して行われる。抗体結合クロマチン断片は、固相を使用して、試料から単離することができる。たとえば、抗体はそれ自体、クロマチンと接触するアガロース又は磁性ビーズなどの固相に直接結合することが可能である。または、溶液中に遊離した抗体は、固相に結合したプロテインA、プロテインG、又は抗免疫グロブリン抗体などの物質を使用して、クロマチン含有試料、そして、単離された抗体結合クロマチン断片に適用されてもよい。
【０００７】
この段階で使用される固相は、通常、ゲル型構造（通常、炭水化物アガロースベース）、又は磁性ビーズ（通常、ポリメタクリラート型重合体ベース）のいずれかである。いずれの場合も、該固相は、液体試料内に分散し、該固相にクロマチンを結合した後に、一部の手段によって試料から分離される必要がある。ゲル（たとえば、アガロース）は、遠心分離で沈降させて、ペレットを形成した後、吸引によって液体試料から分離することができる。磁性ビーズは、通常、液体試料が容器から吸引される間に、磁石を使用して、該ビーズを容器側に引き込むことによって分離される。
【０００８】
アガロースゲルの場合において、ペレット形成及び吸引段階は、試料の微量元素をすべて除去するために、数回繰り返す必要があり、これによって、不便であり、手間が掛かる。磁性ビーズの使用は、アガロースを使用するよりも通常速く、便利であるが、磁石と吸引を用いる分離段階は、依然として、相当な技能を必要とし、多くの時間を要する場合がある。さらに、両方法は、全手順を通じて蓄積し得る、種々の段階の生成物の損失に関与する。ゲル及びビーズによる必要な処理段階によって、十分な純度と共に、アッセイ間の十分な再現性を有した高度のDNA回収が困難になる。アガロースゲル及び磁性ビーズは、DNAとタンパク質の非特異的結合を生じやすく、また、生じるバックグラウンドシグナルを低減するのに十分な洗浄段階を提供するのは困難である。したがって、標準ChIPアッセイは、通常、単離されたDNA産物に関して不十分な特異性を提供する上、大量の試料を必要とする。また、かかる方法は、自動化するのが困難であり、ハイスループットスクリーニング用途に不適切である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、上述の課題の1以上を対処する、改良されたクロマチン免疫沈降アッセイ法の必要性がある。特に、感度が良く、特異的で、使用するのに便利な、試料からクロマチンを単離するための方法及び製品の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（概要）
したがって、一実施態様において、本発明は、試料からクロマチンを単離するための方法であって、該方法は、クロマチンを含む液体試料を、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスに通すことを含み、該リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合する、方法を提供する。
【００１１】
該硬質多孔性マトリックスは、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含むことが好ましい。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、フィルタディスク又はフリットの形態である。
【００１２】
一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、化学酸化によって生成された改質表面を備える。該改質表面は、1以上の酸化酸による処理によって生成されることが好ましい。
【００１３】
該硬質多孔性マトリックスは、たとえば、分離カラム（好ましくはスピンカラム）内に収容される。一実施態様において、該カラムは、疎水性マトリックスをさらに備える。
【００１４】
該液体試料は、遠心分離、重力又は減圧で、該硬質多孔性マトリックスから吸引されることが好ましい。
【００１５】
一実施態様において、該液体試料は、免疫グロブリンが結合されるクロマチンを含む。該リガンドは、たとえば、抗体、プロテインA、又はプロテインGを含んでいてもよい。
【００１６】
該方法は、(i)硬質多孔性マトリックスに洗浄溶液を通す段階、(ii)会合されたタンパク質から、該マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を分離する段階、及び、(iii)該マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を検出する段階から選択される、1以上の段階をさらに含むことが好ましい。
【００１７】
一実施態様において、複数の硬質多孔性マトリックスを備えるアレイが備えられ、かつ、それぞれの複数の液体試料は、該アレイ中の硬質多孔性マトリックスを通る。該アレイはマルチウェルプレートを備え、該プレート内のそれぞれウェルは、上に定義するような分離カラムを備えることが好ましい。
【００１８】
別の態様において、本発明は、クロマチンを含む液体試料を保持するための室と、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスとを備える、分離カラムを提供し、該リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合することができ、かつ、該液体試料を該硬質多孔性マトリックスに通すことができるように、該硬質多孔性マトリックスが該室内に位置する。
【００１９】
一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含むことが好ましい。該硬質多孔性マトリックスは、フィルタディスク又はフリットの形態であることが好ましい。
【００２０】
一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、化学酸化によって生成された改質表面を備える。該改質表面は、1以上の酸化酸による処理によって生成されることが好ましい。
【００２１】
一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、該カラムの流出口の上に位置する。該室で保持された液体試料は、該硬質多孔性マトリックスを通って、該カラムから流出できることが好ましく、これによって、該硬質多孔性マトリックスにクロマチンが結合することにより、該液体試料からクロマチンを単離することができる。
【００２２】
一実施態様において、該カラムは、該硬質多孔性マトリックスを通して、該カラムから流出した液体を受け取るための回収容器をさらに備える。該カラムは、疎水性マトリックスをさらに備えていてもよい。該疎水性マトリックスは、該硬質多孔性マトリックスと該カラムの流出口の間に位置することが好ましい。
【００２３】
一実施態様において、該分離カラムはスピンカラムである。該リガンドは、免疫グロブリン、プロテインA、又はプロテインGを含むことが好ましい。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、上に定義するような複数の分離カラムを備えたアレイを提供する。該アレイは、マルチウェルプレート又はろ過マイクロプレートの形態であることが好ましい。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、上に定義するような分離カラムと、クロマチン免疫沈降アッセイを行うのに適した、1以上のバッファー、溶液又は試薬とを備えるキットを提供する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、液体試料からクロマチンを単離するための、上に定義するような分離カラムの使用を提供する。通常、該分離カラムは、クロマチン免疫沈降アッセイに使用される。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の実施態様は、有利に、高い特異性及び感度によって、試料からクロマチン断片の単離を可能にする。さらに、硬質多孔性マトリックスに試料を通すことによって、該方法は、アガロース又は磁性ビーズを使用する従来法よりも、使用において非常に便利である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（自然落下カラム(gravity flow column)で）BioVyon（商標）-プロテインAを使用したChIPアッセイにおけるプレブロッキング(pre-blocking)段階の最適化試験からのPCR産物のリアルタイムPCR分析。RNAポリメラーゼIIに対するマウスモノクローナル抗体によるChIPアッセイは、NIH 3T3マウス線維芽細胞から得られた架橋細胞溶解物を使用して行った。ChIP法の後に回収されたDNAを、GAPDH TATAボックスを重複させるプライマーによりPCR増幅させた（詳細については表1を参照）。別個の3つの試験を行い、一般的試験の3回反復の定量を示す。BioVyon（商標）-プロテインAカラムのプレブロッキングを、プロテインA Sepharose（登録商標）のChIPプロトコールに記載された、LS（「低塩」）バッファー（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mMトリス-HCl、pH 8、150 mM NaCl）＋1 mg/ml BSA＋400 μgサケ精子DNA）を含む、プレブロッキング溶液によって行った。BioVyon（商標）-プロテインAカラムに、プレブロッキング溶液を充填し、+40℃で30分間インキュベートした後、排出させた。Ab=抗体を含む、No Ab=抗体を含まない。富化値は、対応する対照（抗体を使用しないChIPアッセイ）に対する、抗体を使用したChIPアッセイのRT-PCR値の比を表す。該富化値を挿入された表に示す。
【００２９】
【図２】ChIPアッセイにおけるBioVyon（商標）-プロテインA（自然落下カラムで）、プロテインA Sepharose（登録商標）、及びDynabeads（登録商標）プロテインAの比較を示す、リアルタイムPCR分析。実施例1に説明するように、ChIP DNAのリアルタイムPCR分析を行った。プロテインA Sepharose（登録商標）が関連する試験では、Upstate社のプロトコールを用いた。Dynabeads（登録商標）プロテインAについては、メーカーのプロトコールに従い、BioVyon（商標）-プロテインAについては、最適化されたChIPプロトコールを用いた。別個の3つの試験を行い、一般的試験の3回反復の定量を示す。エラーバーは標準偏差を示す。BioVyon（商標）-プロテインAと対照の間の特異的抗体を使用したChIP DNAにおける富化の相違は、抗体を使用しない富化（アスタリスクによって示す）以外は、すべての試験において統計的に有意であった(P＜0.05)。略語：「Ab」-図2Aの抗RNAポリメラーゼII抗体、及び図2Bの抗CTCFウサギポリクローナル抗体；「No ab」-抗体を含まない；「IgG」-非特異的マウスIgG、「アクチン」-抗アクチンマウスモノクローナル（無関連）抗体、「Hisタグ」-抗Hisタグウサギポリクローナル（無関連）抗体。A. マウスモノクローナル抗RNAポリメラーゼII抗体及びTATAボックスによるChIPアッセイのリアルタイムPCR分析。NIH 3T3マウス線維芽細胞の架橋細胞溶解物を、マウスモノクローナル抗RNAポリメラーゼII抗体によるChIPに使用した。対照試料については同時に実施し、該対照試料は、抗体、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル（無関連）抗体のいずれも含まない。ChIP法の後に回収されたDNAを、GAPDH TATAボックスを重複させるプライマーとのPCR反応で増幅させた（詳細については表1を参照）。B. 抗CTCFウサギポリクローナル抗体、及び種々のCTCF標的部位(CTS)によるChIPアッセイのリアルタイムPCR分析。MCF7乳癌細胞の架橋細胞溶解物を、抗CTCFウサギポリクローナル抗体によるChIPに使用した。対照試料については同時に実施し、該対照試料は、抗体、非特異的ウサギIgG、及び抗ウサギHisタグ（無関連）抗体のいずれかを含まない。ChIP法の後に回収されたDNAを、6つのCTS N部位Myc [10; 19]、PIM [15]、DM1 [20]、β-グロビン[21]、PLK [15]及びH19 [22; 23]を重複させるプライマーとのPCR反応で増幅させた（詳細については表1を参照）。
【００３０】
【図３】Sepharose及びBioVyon（商標）の化学構造。Sepharose二量体は、(A)に示すように、ガラクトースと3,6-アンヒドロ-L-ガラクトースとからなり、BioVyon単量体は、(B)に示すC2H4である。
【００３１】
【図４】化学エッチング前後の表面積の窒素吸着分析。窒素吸着分析（BET法）を用いて、BioVyon（商標）の表面積を決定した。これを、Gemini III 2375表面積アナライザー（Micromeritics社(Norcross, GA, USA)製）を使用して、特定の温度及び圧力で表面に吸着された窒素分子の質量を決定することによって行った。窒素吸着分析(n=3)を用いて、未処理、及び化学エッチングされたBioVyon（商標）の表面積の比較を示す。
【００３２】
【図５】BioVyon（商標）媒体の走査型電子顕微鏡(SEM)写真。焼結BioVyon（商標）の2つの試料を、日立S-520走査型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジーズ（東京、日本）製）を使用して、走査型電子顕微鏡観察に供した。パネルA：その間に明確に形成された細孔を有する焼結粒子の滑らかな表面構造を示す、2300倍拡大における未処理BioVyon（商標）のSEM。パネルB：付加的な表面積を提供する焼結粒子の窪みを有する表面構造を示す、2300倍拡大におけるエッチングされたBioVyon（商標）のSEM。
【００３３】
【図６】BioVyon（商標）のフォーマット。A. 種々の径を有する硬質BioVyon（商標）ディスク。B. BioVyon（商標）-プロテインA自然落下カラム。該カラムは、標準1 ml固相抽出(SPE)チューブと同じ寸法であり、およそ6 mmの径、2 mmの長さの硬質多孔性高密度ポリエチレン(HDPE)フリットを収容する。単一ディスク（上）と、複数の積層されたディスク（下）を有するカラムの例を示す。C. 流出口の上に位置した硬質多孔性マトリックス（BioVyon（商標）プロテインAディスクの形態）を備える、スピンカラム。
【００３４】
【図７】（自然落下カラムで）BioVyon（商標）-プロテインAを使用するChIPアッセイにおける洗浄段階及び洗浄剤濃度の最適化試験からのPCR産物のリアルタイムPCR分析。NIH 3T3マウス線維芽細胞から得られた架橋細胞溶解物を使用して、RNAポリメラーゼIIに対するマウスモノクローナル抗体によるChIPアッセイを行った。ChIP法の後に回収されたDNAを、GAPDH TATAボックスを重複させるプライマーとのPCR反応で増幅させた（詳細については表1を参照）。別個の3つの試験を行い、一般的試験の3回反復の定量を示す。Ab=抗体を含む、No Ab=抗体を含まない。富化値は、対応する対照（抗体を使用しないChIPアッセイ）に対する、抗体を使用したChIPアッセイのRT-PCR値の比を表す。A. プロトコールを用いて得られたChIP DNAのPCR産物の分析。これには、高塩(HS)バッファー：0.1 % SDS（又は0.2% SDS）、20 mM Tris/HCl pH 8.0、2 mM EDTA、500 mM NaCl、1% Triton X100による洗浄段階において、異なる濃度のSDS（0.1%又は0.2%）が含まれていた。プレブロッキング段階は、このプロトコールに含まれていた。富化値を挿入された表に示す。B. プロトコールを用いて得られたChIP DNAのPCR産物の分析。これには、異なる洗浄回数（3回及び6回）が含まれ、さらに、これは、LiClバッファーを含む洗浄段階を有するか、又は有しなかった。略語：LSバッファー（低塩バッファー）：10 mMトリス/Hepes pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl；MSバッファー（中塩バッファー(Medium salt buffer)）：0.1 % SDS、20 mM トリス/HCl pH  8.0、2 mM EDTA、150 mM NaCl、1% Triton X100；HSバッファー（高塩バッファー）：0.1 % SDS、20 mM トリス/HCl pH 8.0、2 mM EDTA、500 mM NaCl、1% Triton X100；LiClバッファー：250 mM LiCl、10 mMトリス/HCl pH 8.0、1 mM EDTA、1% Na-デオキシコラート。
【００３５】
【図８】（自然落下カラムで）BioVyon-プロテインAを使用して得られたChIPシグナルを、プロテインG磁性ビーズと直接比較した。同じ供給試料及び濃度のクロマチンを使用して、直接比較した場合、BioVyon-プロテインA法によって、DNAプルダウン(DNA pull down)%が約25倍増加した。
【００３６】
【図９】自然落下カラムの性能に対するBioVyonプロテインAスピンカラムの性能。疎水性フリットを有するスピンカラムの使用によって、自然落下カラムアッセイからスピンカラムアッセイまで良好な変移が可能になる。疎水性フリットと共に固定し、スピンカラムとして使用する場合、BioVyonプロテインA法によって、正確に同じDNAテンプレート試料及び抗体濃度を用いてこれらの自然落下相当物と比較した場合、DNAプルダウン%が2.3倍増加した。
【００３７】
【図１０】BioVyonスピンカラムの性能に対する疎水性フリットの影響。DNAプルダウン%による特異的(Ab)及びバックグラウンド(IgG)シグナルを、疎水性フリットを有するスピンカラム、及び疎水性フリットのないスピンカラムの場合と比較した。
【００３８】
【図１１】ハイスループット処理のフォーマット。複数のウェル（２）を備えたろ過マイクロプレート（１）を示し、それぞれのウェルは、本発明による分離カラムを備える。それぞれの分離カラムは、該カラムの流出口（４）の上に位置した、フィルタディスク又はフリット（３）の形態の硬質多孔性マトリックスを備える。該硬質多孔性マトリックスは、クロマチンと会合したタンパク質に結合するリガンドをその上に固定する。液体試料（５）は、マルチチャンネルピペット（７）、及び／又は自動（たとえば、ロボットの）液体処理システムを使用して、上部開口（６）を介してそれぞれのウェルに導入される。該液体試料は、真空、重力又は遠心力によって、ろ過マイクロプレートのそれぞれのウェルから吸引することができる。該試料を、該ろ過マイクロプレートのそれぞれのウェル中の硬質多孔性マトリックスに通し、該試料は、流出口（４）を介してそれぞれのウェルから流出し、該プレートのそれぞれのウェルの下に位置した回収容器（８）に収容される。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（詳細な説明）
一態様において、本発明は、試料からクロマチンを単離する方法に関する。「クロマチンを単離する」とは、通常、クロマチンが、マトリックスに結合するようになること（たとえば、クロマチンが、液体試料から都合よく分離されることができるように）を意味する。
【００４０】
（クロマチン）
クロマチンは、DNA及びタンパク質（主に、ヒストン）の複合体からなり、真核細胞でみられる染色体を構成する。クロマチンは、ユークロマチンとヘテロクロマチンの2つの状態で生じ、これらは異なる染色性であり、また、クロマチンは、細胞分裂中に巻き付き、折り畳まれて、中期染色体を形成する。クロマチンは、染色体又は他のクロマチン調製物の断片化によって生じたクロマチン断片を含む、核酸（通常、DNA）及び会合されたタンパク質のいずれかのかかる複合体を言及するのに本明細書で使用される。
【００４１】
（クロマチン免疫沈降）
通常、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイの一部として、該方法は行われる。「クロマチン免疫沈降アッセイ」という用語は、当業者に周知であり、少なくとも次に示す段階を含むことが好ましい。すなわち、(i)細胞からの分析されるクロマチンを含む液体試料の調製、(ii)抗体を使用するマトリックス上への液体試料中のクロマチンの免疫沈降、(iii)沈殿したクロマチンからのDNA回収、及び(iv)DNA分析である。ChIPアッセイは、NChIP又は上述のXChIPであってもよい。
【００４２】
（試料）
該液体試料は、クロマチンを含む生体源（たとえば、細胞を含む何れかの調製物）から調製することができる。該細胞は、組織試料、又は培養物で増殖させた細胞に由来し得る。該細胞は、哺乳動物細胞（好ましくは、ヒト細胞又はマウス細胞）を含むことが好ましい。
【００４３】
通常、該方法は、103〜109の細胞、たとえば、好ましくは107未満の細胞、106未満の細胞、又は105未満の細胞、好ましくは約104〜106の細胞のクロマチンを含む試料で行うことができる。１つの細胞は、通常、細胞当たり約6 pg（6×10-12 g）のDNAと、クロマチン中に等量のDNA及びタンパク質を含む。したがって、該方法は、たとえば、約0.6 μgのDNA、又は1.2 μgのクロマチン（これは、約100,000の細胞のDNA若しくはクロマチンの質量に等しい）を含む試料で行うことができる。
【００４４】
（クロマチン調製物）
本発明の実施態様において、細胞を含む調製物は、クロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)に供される。通常、クロマチンが調製物から最初に抽出され、クロマチン断片を含む液体試料が調製される。
【００４５】
一実施態様において、細胞は、核を得ることが可能な標準法を用いて、調製物から最初に採取される。たとえば、該細胞は、（たとえば、細胞溶解バッファー、又は超音波処理を用いて）破砕してもよく、これによって、該細胞から放出された核が得られる。核の放出後、該方法は、たとえば、ミクロコッカスヌクレアーゼ、又はさらなる超音波処理を用いて、クロマチンを放出させるために、核を消化する段階を含むことが好ましい。
【００４６】
別の実施態様において、該方法は、クロマチンを架橋する段階を含んでいてもよい。これは、たとえば、好ましくはクロマチンの断片化の前に、ホルムアルデヒドなどの適切な架橋剤の添加によって、いずれかの適切な手段で達成することができる。断片化は、超音波処理によって行ってもよい。ただし、ホルムアルデヒドは、断片化後に加えてもよく、次いで、ヌクレアーゼ消化を伴ってもよい。または、代替架橋法としてUV照射を用いることができる。
【００４７】
一実施態様において、細胞又は組織断片は、ホルムアルデヒドによって最初に固定して、タンパク質-DNA複合体を架橋する。細胞は、室温又は37℃で、5〜20分間（好ましくは10分間）、穏やかに振動させながら、ホルムアルデヒドと共にインキュベートすることができる。組織断片は、ホルムアルデヒドと共に、長いインキュベーション時間（たとえば、10〜30分（たとえば、15分））を必要とし得る。ホルムアルデヒドの濃度は、0.5〜10%（たとえば、1%）(v/v)であり得る。
【００４８】
一旦架橋反応が終了したら、架橋剤に等しいモル濃度のグリシンなどの架橋剤の阻害剤を使用して、架橋反応を停止することができる。架橋反応を停止する適切な時間は、室温で、2〜10分、好ましくは約5分であり得る。その後、細胞は、ナトリウム塩、EDTA、及びSDSなどの洗浄剤を含む溶解バッファーによって回収し溶解することができる。組織断片は、溶解前に均質化することができる。
【００４９】
その後、細胞又は均質化された組織混合物は、適切な長さのDNA断片を生じるように、機械的に又は酵素によって剪断することができる。通常、剪断クロマチン又はDNAの200〜1000 bpがChIPアッセイに必要である。DNAの機械的剪断は、噴霧又は超音波処理（好ましくは超音波処理）によって行うことができる。DNAの酵素剪断(enzymatic shearing)は、Mn塩の存在下でDNアーゼIの使用によって、又は、Mg塩の存在下でミクロコッカスヌクレアーゼの使用によって行い、ランダムDNA断片を発生させることができる。架橋DNA剪断の条件は、細胞、及び音波処理機器又は消化酵素の濃度に基づいて、最適化することができる。
【００５０】
一実施態様において、一旦DNA剪断が終了したら、細胞残屑は、遠心分離によって除去することができ、また、DNA-タンパク質複合体を含む上清が回収される。得られるのは、本発明の方法に使用することができるDNA（たとえば、DNA及びタンパク質が架橋するDNA）上にタンパク質が固定された、クロマチン断片を含む液体試料である。他の実施態様において、遠心分離段階を省略してもよく、すなわち、次に示す段階は、DNA剪断後に直接行われる。
【００５１】
（免疫沈降）
一旦タンパク質がクロマチン上に固定されたら、タンパク質-DNA複合体を免疫沈降させることができる。したがって、一旦クロマチンを含む試料が調製された場合、該方法は、クロマチンを免疫沈降させる段階を含むことが好ましい。免疫沈降は、クロマチン中に含まれ得る関心対象のタンパク質に対する適切な抗体の添加によって行われることが好ましい。
【００５２】
一実施態様において、該抗体は、該硬質多孔性マトリックス上に固定することができ、すなわち、該抗体は、クロマチンと会合したタンパク質に結合するリガンドである。本実施態様において、クロマチンと会合したタンパク質は、関心対象のタンパク質であり、これは、たとえば、クロマチン中のDNAに結合される。
【００５３】
他の実施態様において、溶液中に遊離した抗体は、クロマチン含有試料に最初に適用される。その後、抗体結合クロマチン断片は、抗体に結合する物質であって、該硬質多孔性マトリックスに結合する物質を使用して単離することができる。本実施態様において、該硬質多孔性マトリックスに結合されたリガンドは、プロテインA、プロテインG、又は抗免疫グロブリン（たとえば、抗IgG）抗体などの抗体を結合するいずれかの物質であってもよい。クロマチンと会合したタンパク質は、関心対象のタンパク質に対して特異的な抗体である。
【００５４】
該抗体は、クロマチンと会合したいずれかのタンパク質に結合することができる。一実施態様において、該抗体は、転写因子などの非ヒストンタンパク質、又は他のDNA結合タンパク質に対して免疫特異的である。または、該抗体は、ヒストンH1、H2A、H2B、H3及びH4、並びにこれらの種々の翻訳後修飾アイソフォーム及び変異体のいずれかに対して免疫特異的であってもよい。または、該抗体は、ヒストンアセチラーゼ若しくはデアセチラーゼ、又はDNAメチルトランスフェラーゼなどの、クロマチンの修飾に関与する酵素に対して免疫特異的であってもよい。さらに、ヒストンが、定義された酵素によって、たとえば、定義されたアミノ酸残基のアセチル化、メチル化、リン酸化、ADP-リボシル化、スモイル化、及びユビキチン化によって、インビボで翻訳後修飾され得ることが認識される。したがって、該抗体は、これらの翻訳後修飾物のいずれかに対して免疫特異的であってもよい。
【００５５】
（硬質孔性マトリックス）
本発明の実施態様では、場合により抗体によって結合された、クロマチンを含む液体試料は、硬質多孔性マトリックスに通される。
【００５６】
適切なマトリックスは当該分野で公知である。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、たとえば国際公開公報第2005/018803号に記載された、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含む。該マトリックスは、化学反応性であるか、又は官能化された改質表面を有し、該改質表面は、たとえば、場合によりリンカーによってリガンドを結合するのに適したペンダント官能基を備える。本発明のマトリックスは本質的に硬質である。
【００５７】
一実施態様において、該マトリックスは、ポリオレフィン又はビニル重合体などの熱可塑性ポリマーを含む。かかるポリオレフィンの例には、ポリエチレン及びポリプロピレンが含まれる。ビニル重合体の例には、ポリ酢酸ビニル(PVA)及びポリ塩化ビニル(PVC)が含まれる。好ましい重合体には、ポリエチレン又はポリプロピレンが含まれ、最も好ましくはポリエチレンが含まれる。他の実施態様において、該熱可塑性ポリマーは、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、又はポリアミド（ナイロン）であってもよい。
【００５８】
本明細書に使用する「重合体（ポリマー、高分子）」という用語には、一般に、ホモポリマー、共重合体（たとえば、ブロック共重合体、グラフト共重合体、ランダム共重合体、及び交互共重合体、三元共重合体など）、並びにこれらのブレンド及び変形が含まれるが、これらに限定されない。さらに、特に限定されない限り、「重合体」という用語には、分子のあらゆる幾何学的形態も含まれる。これらの形態には、とりわけ、アイソタクチック対称性、シンジオタクチック対称性、アタクチック対称性、及びランダム対称性が含まれる。
【００５９】
一実施態様において、該熱可塑性ポリマーはポリエチレン、又は、好ましくは少なくとも80%のポリエチレン、特に好ましくは少なくとも90%のポリエチレン、最も好ましくは少なくとも95%のポリエチレンを含む、共重合体若しくはブレンドである。
【００６０】
使用可能なポリエチレンの例には、商品名「Vyon」又は「BioVyon」で、Porvair Technology社(UK)によって製造された、高密度ポリエチレン及び超高分子量ポリエチレンが含まれる。また、該熱可塑性ポリマーは、当該分野において通常である、流れ調整剤、添加剤などを含んでいてもよい。
【００６１】
該マトリックスを形成するために焼結される熱可塑性ポリマー粒子は、一般に、該マトリックスの最終的な使用に適切な範囲のサイズを有する。該粒子は、球状で、概して球状であるか、又は、他の適切な規則的な形状若しくは不規則な形状であり得る。当業者は、マトリックスを備える粒子のサイズ、及びこれらの粒子が焼結される条件によって、マトリックスを通る流体通路の割合が、少なくとも一部において決定されるということを認識する。この点に関して他に考慮される可変要素には、分子サイズ、及び、マトリックスに結合されるいずれかの材料の他の特性が含まれる。
【００６２】
本明細書に使用する、「焼結熱可塑性ポリマー」という用語は、一般に、実際に重合体を液化することなく、熱及び振動の影響下で、単一単位となった、多くの熱可塑性ポリマー粒子をいう。したがって、該マトリックスは、流体の適用で維持される画定された構造を有する、複数の縮合熱可塑性ポリマー粒子を含む。また、「焼結熱可塑性ポリマー」は、一般に、構成粒子の縮合性質により本質的に硬質でもあり、すなわち、これは、本質的に圧縮不可能であり、また、これは、水溶液中で収縮又は膨脹しない。ただし、本発明のマトリックスを備えるシート又は膜などの本発明の一部の実施態様は、可撓性であってもよい。
【００６３】
熱可塑性ポリマーを焼結する方法は、当該分野で周知である。該方法には、たとえば、米国特許出願公開第2002/064413号、及び英国特許第2369796号に開示された方法が含まれる。
【００６４】
焼結後のマトリックスの細孔サイズは、所望の使用に適したその製造時に予め決定することができる。概して、該マトリックスの細孔サイズは、1〜1000 μm、1〜500 μm、500〜1000 μm、200〜700 μm、5〜100 μm、20〜40 μm、又は40〜80 μmであり得る。
【００６５】
焼結後に、該マトリックスは、化学反応性表面（たとえば、官能化表面（好ましくは不規則な表面））を提供するために改質される。この改質は、該マトリックスの表面積を増加させる。また、該改質は、表面に官能基も備え、該官能基は、リガンドの結合を容易にする。換言すると、該化学反応性表面は、改質表面であり、該改質表面は、該リガンドを、場合によりリンカーによって該表面に結合するのに適したペンダント官能基を備える。
【００６６】
多くの方法が、熱可塑性ポリマーの表面改質において知られている。この点に関して使用可能な好ましい3つの方法は、国際公開公報第2005/018803号に記載されているような、ガス血漿アミノ化、ガンマ線照射、及び化学酸化である。
【００６７】
該マトリックスは、化学酸化によって生成された改質表面を有することが好ましい。化学酸化法によって、熱可塑性ポリマー中の炭素結合の切断による中間不規則反応性官能基(intermediate irregular reactive function)が生じる。
【００６８】
該マトリックスの表面は、場合によりK2Cr2O7などの過酸化物塩の存在下で、1以上の酸化酸（たとえば、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、三酸化クロム及び硫酸からなる群より選択される酸）による処理によって改質されることが好ましい。
【００６９】
多くの戦略は、熱可塑性ポリマーの化学酸化に共通して用いられている。熱可塑性ポリマー表面の改質のみが所望される場合、これは、H2SO4中のK2Cr2O7などの過酸化物塩及び酸を使用し、表面の物理的構造に顕著な損失をもたらすことなく、比較的マイルドな化学酸化によって達成することができる。熱可塑性ポリマーの物理的浸食（塑性材料の表面改質前に、その結合能を増加させる塑性材料内部のトンネル及び孔）は、高濃度及び高温度で適用されたトリフルオロ酢酸などの強い腐食性酸(aggressive acid)による該可塑性ポリマーの処理によって達成することができる。
【００７０】
該マトリックスの表面に存在する官能基の種類は、これらを発生させるために用いられる反応の種類によって決定される。ほとんどの場合、カルボキシル基又はヒドロキシル基が生じる。また、アルデヒド基及びケト基も、反応の副生成物として生じる場合がある。カルボキシル基又はヒドロキシル官能基は、より安定し、潜在的に反応性の官能基（たとえば、アミン）に置換することができる。アミノ基は、熱可塑性ポリマー表面に直接化学的に導入するか、又は、スペーサー分子（リンカー）によって結合することができる。
【００７１】
該マトリックスの表面が官能化された後、1以上のリンカー又はスペーサーと該表面を反応させてもよい。かかる実体の機能は、(i)該マトリックス表面への所望のリガンドの結合を容易にすること、及び／又は、(ii)必要に応じて、リガンドを、該マトリックスの表面から一定距離を置いて配置できることである。
【００７２】
有利に、該改質表面は、化学的不活性を維持し、このため、非特異的バックグラウンド結合を顕著に低減させる。リンカー法は、いずれかの固定されたタンパク質の未変性コンフォメーション、さらに、かかるマトリックス上で精製されるいずれかのタンパク質をかなりの程度に維持するのに有用である。該マトリックス上の非切断性リンカー(non-cleavable linker)の利用によって、該マトリックスとタンパク質の恒久的な共有結合が可能になり、このため、該マトリックスからのいずれかの固定された分子の浸出を完全に低減することができる。
【００７３】
該リンカーは、該マトリックスの表面に結合されることが好ましい。該マトリックスの表面が改質された直後に、該リンカーが、該マトリックスの表面に結合されることが最も好ましい。
【００７４】
適切なリンカーの選択は、該マトリックスの表面官能化、及び該マトリックスに結合するリガンドによって決定される。かかるリンカーの多くは当該分野で公知である。特に、特定のリンカー又は直接固形支持体にポリペプチド又はDNA/RNA分子を結合するのに用いることができる反応は、当該分野で周知である。都合が良いことに、官能基は、その化学合成時にリガンドに導入することができる。潜在的な官能基には、エーテル、エステル、チオール、ジアルキルアミド、ヒドラジド、ジアミン、及び他の多くのものが含まれる。適切なリンカーは、前述の官能基のうちの1以上と反応可能な基を含むものである。たとえば、リガンドとリンカーの間のチオエーテル結合の形成を利用するリンカーは、一方の（リガンド）末端にチオール基を有し、他方の（リンカー）にブロモアセチル基を有し得る。
【００７５】
通常、該マトリックス上に固定されるリガンドは、生体分子であり、一般に、タンパク質（たとえば、抗体、プロテインA、又はプロテインG）である。一旦該マトリックスに結合されると、該生体分子の活性を維持することが重要である。このことによって、リンカー戦略の選択が制限される。これは、非変性（すなわち、生理又はマイルドな）条件を用いて、タンパク質をリンカーに結合する必要があるからである。すべてのリンカーは、かかる条件下で使用することができるとは限らない。タンパク質の生物活性は、特定の官能基の（基質への）接近性によって変化する場合があり、したがって、かかる基は、タンパク質を該マトリックスに結合するのに使用してはならない。さらに、潜在的な官能基の多くは、（たとえば、リン酸化、アセチル化などによって）翻訳後修飾され、このため、結合反応に利用可能ではない。
【００７６】
生物学的に活性のある分子及びリンカーの結合のための好ましい反応には、次に示すものが含まれる。
【００７７】
1)アミノ結合、又は、リンカーの末端のエステル官能基とタンパク質の第一アミン及び／又は第二アミンの反応による、リンカーとリガンド（たとえば、タンパク質）の間のアミド結合の形成。かかる反応は一般に信頼でき、また、固定されたタンパク質の活性は、非常にまれに影響を受けるにすぎない。また、該反応は、中性pH（第一アミンにおける）からpH 8.3（第二アミンにおける）前後までで行うことができる。さらに、該反応は、反応混合物中の遊離アミンを必要としない。
【００７８】
2)チオ結合、又は、マトリックス上に存在するチオールと、タンパク質から生じる別のチオールの間の共有結合の形成。この反応では、結合反応は可逆的であり、すなわち、リガンドは、2-メルカプトエタノール又はDTTによる還元後に、流体相に戻して除去することができる。このことは、たとえば、タンパク質間の相互作用の研究に対し非常に都合が良い場合がある。該反応は、結合において幾つかの特別の条件を必要とする。すなわち、溶液中に二価金属がないこと、及びタンパク質は、結合前に還元されたSH基を有する必要があることである。
【００７９】
3)カルボキシル結合、又は、マトリックス上の官能基とタンパク質のカルボキシ末端の間の共有結合の形成。多くのタンパク質が、天然に修飾される（すなわち、ブロックされた）C末端を有するので、この種の反応は、それほど効果的でなく、信頼できない。
【００８０】
一実施態様において、クロマチンと会合したタンパク質に結合するリガンドは、該マトリックスの表面に固定される。本実施態様において、焼結後のマトリックスは、非アミノ化又は本質的に非アミノ化である表面を備える。本方法では、酸化後（好ましくは酸化直後）に、スペーサーが、該マトリックス上のカルボキシル官能基と6-アミノヘキサン酸の反応で発生する。この反応は、カルボキシル官能基を固定したリンカーを生成する。重要なことに、このアプローチは、表面に結合されないアミンの発生を含まず、これによって、改質表面に結合する非特異的バックグラウンドが顕著に低減する。
【００８１】
該リンカーは、支持体と、該リガンドに結合するタンパク質との間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分長いリンカーが好ましい。また、リンカーは、リガンド結合部位間の十分に大きい距離を形成するために導入され、これによって、試薬への該リガンドの無制限の接近が提供され、さらに、該ポリマーの表面上のリガンドの凝集が妨げられる。
【００８２】
生物学的に活性のある分子の結合において、該リンカーの長さは、該リガンドと固形支持体の間の距離を決定する。この長さが、該リンカーによって結合される生体分子の官能基の活性に顕著に影響を与え得ることが示されている。該リンカーは、3〜11個の炭素原子を含むことが好ましく、3、4、5、6、7又は8個の炭素原子を含むことが最も好ましい。該リンカーは、切断性リンカー(cleavable linker)又は非切断性リンカーのいずれかであってもよい。「切断性リンカー(cleavable linker)」という用語は、リンカーによってマトリックスに結合されるリガンドの活性に影響を与えない条件下で、切断可能なリンカーを意味するものとする。
【００８３】
場合によりリンカーによって、該マトリックスに結合されるリガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合するいずれかの物質であり得る。通常、該リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、又はその断片（たとえば、モノクローナル、ポリクローナル、Fab、scFv）である。該リガンドは、抗体、たとえば、抗免疫グロブリン（たとえば、抗IgG）抗体、プロテインA、又はプロテインGに結合する物質を含むことが好ましい。または、該リガンドは、関心対象のタンパク質に結合する抗体を含み、たとえば、該リガンドは、抗ヒストン抗体であってもよい。
【００８４】
該マトリックスは一般に多孔性であり、すなわち、細孔又は空間は、液体が通ることができるマトリックス内に存在する。本発明のマトリックスは、いずれかの都合の良い物理的形態（たとえば、シート、フィルタ、膜、シリンダー、ファイバー、又はチューブ）を採用することができる。一つの好適な実施態様において、該マトリックスは、フィルタ、ディスク、又はフリットを含む。該マトリックスは、通常、吸着剤として（すなわち、その表面上のリガンドにより、クロマチンと会合したタンパク質を結合することによって）機能する。したがって、一部の実施態様において、該マトリックスは、フィルタ（たとえば、ディスク又はフリット）の物理的形態であってもよいが、該マトリックスは、通常のフィルタとして機能する必要はない。一実施態様において、該マトリックスは、吸着性ディスク又はフリットを含む。
【００８５】
該マトリックスは、別個の存在として提供されてもよいか、又は、別の実体の必須部分を形成してもよい。たとえば、該マトリックスは、カラム、遠心分離バイアル、カートリッジ、又はシリンジなどの分離デバイスに導入されてもよく、また、試料及び操作される後続処理に応じて、かかるデバイスの１以上は、連続した方法又は同じ方法で提供されてもよい。かかるデバイスは、手動、半自動又は完全自動様式であってもよい。
【００８６】
（分離カラム）
該硬質多孔性マトリックスは、その配置によって、液体試料を該マトリックスに通すことができる場合、いずれかの種類の容器内に収容することができる。該マトリックスは、分離カラム内に収容されることが好ましい。
【００８７】
一実施態様において、該分離カラムは、クロマチンを含む液体試料を保持するための室と、流出口とを備える。通常、該流出口は、カラムの下端に位置する。該カラムは、通常、カラムの上端に、液体試料を加えることができる開口を備える。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、該流出口の上に、すなわち、該室中の液体試料と該流出口の間に位置する。本実施態様において、該分離カラムとは、自然落下カラムを意味する。
【００８８】
一部の実施態様において、該カラムは、疎水性マトリックスをさらに備える。該疎水性マトリックスは、通常、結合リガンドを備えないが、他の点で、上述の硬質多孔性マトリックスであってもよい。たとえば、該疎水性マトリックスは、該硬質多孔性マトリックスと同様の材料（たとえば、焼結熱可塑性ポリマー粒子）から形成することができる。しかしながら、該疎水性マトリックスは、通常、改質されていない又は非誘導型の表面を有し、たとえば、該疎水性マトリックスは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基などの官能基を欠く。一部の実施態様において、該疎水性マトリックスは、ポリエチレンなどの熱可塑性ポリマーから形成され、通常、改質されていない表面を有していてもよい。親水性官能基がないことは、通常、その機能を果たすように（すなわち、所望の時間、カラム内の液体試料を保持するように）、該マトリックスを十分に疎水性にする。ただし、他の実施態様において、該疎水性マトリックスは、たとえば、ペルフルオロアルキル基などの疎水性官能基によって修飾されてもよい。
【００８９】
該疎水性マトリックスは、たとえば、フィルタ、ディスク、又はフリットの形態であってもよい。該疎水性マトリックスは、該硬質多孔性マトリックスと該カラムの流出口の間に位置してもよい。該疎水性マトリックスは、該マトリックスを通して、及び該カラムから外に該試料を流すことが所望されるまで、該カラム内の液体試料を保持するのに（すなわち、該カラムの室からの漏出を防ぐのに）有用であり得る。疎水性フリット又は重力によって液体流れを防ぐ他の手段を導入する実施態様において、該カラムとは、スピンカラムを意味する。
【００９０】
該分離カラムは、アッセイの性質、特に、該マトリックスから液体を吸引するのに用いられる方法に応じて、いずれかの適切な形態であってもよい。したがって、分離は、たとえば、自然落下カラム、真空カラム、又はスピンカラムであってもよい。一実施態様において、該分離カラムは、マイクロスピンカラムであり、たとえば、これは、テーブルトッマイクロ遠心器に使用するのに適した1.5 ml又は2.0 mlのマイクロ遠心管に適合する。通常、該カラムは、該硬質多孔性マトリックスを通して、該カラムから流出した液体を収容するための回収容器をさらに備える。
【００９１】
一実施態様において、本発明による複数の分離カラムを備えるアレイを提供する。たとえば、該分離カラムは、ハイスループットスクリーニングに適したマルチウェルプレートの一部を形成してもよい。一実施態様において、複数の分離カラムは、マルチウェルプレート（たとえば、ろ過マイクロプレート）内に備えられてもよく、それぞれの分離カラムは、該プレート内の個々のウェルに対応する。種々のマルチウェルプレートフォーマットが利用可能であり、該マルチウェルプレートフォーマットは、マルチチャンネルピペット、及び自動（たとえば、ロボットの）液体処理システムと互換性がある。たとえば、具体的な実施態様において、96、384又は1536ウェルフォーマットを使用することができ、すなわち、該マルチウェルプレートは、96、384又は1536分離カラムを備える。一実施態様において、図11に示すようなろ過マイクロプレートを使用することができる。
【００９２】
（マトリックスへの液体試料の通過）
マトリックスに液体試料を通すために、いずれの適切な方法を用いてもよい。一実施態様において、該液体試料は、たとえば分離カラムの上部開口を介して、最初に該分離カラムの室に加えられる。その後、該液体試料は、通常、該カラムの下端の流出口上に位置する、硬質多孔性マトリックスに通し、これによって、該カラムから流出させることができる。このように、該液体試料中に含まれるクロマチン断片は、該マトリックスを通す間に、リガンドに結合することができる。これによって、クロマチン断片が該液体試料から分離され、その後、該クロマチン断片は廃棄することができる。
【００９３】
本発明の実施態様において、該液体試料は、重力又は真空によって、遠心分離器の該マトリックスから吸引することができる。
【００９４】
一部の実施態様において、該液体試料は、たとえば、該カラムに該試料を加えた後、該カラムから該試料を回収する前に、適切な時間で該マトリックスと共にインキュベートされる。たとえば、該液体試料は、30秒から48時間、たとえば、1分から12時間、1分から2時間、5〜60分、又は約30分間、該マトリックスと共にインキュベートされてもよい。このインキュベーションの長さは、この反応の動力学に応じて、該リガンドがクロマチンに結合するのに十分な時間を考慮するために、変更してもよい。
【００９５】
該液体試料の容積は、該カラムの室の容積、及び該マトリックス（たとえば、フリット）の大きさに応じて変更してもよい。該マトリックスは多孔性であり、通常、約0.5の孔隙率を有してもよく、すなわち、該マトリックスの全容積の約50%は、内部空間である。一実施態様において、該マトリックスに完全に吸収されるように、液体試料が容積に加えられ、すなわち、該マトリックスの内部空間は、該液体試料の容積以上である。たとえば、スピンカラムに使用するのに適した多孔性マトリックスは、約7.2 mmの径及び約2 mmの厚さのディスクの形態であってもよい。かかるマトリックスの容積は約80 μlであり、該マトリックスは0.5の孔隙率が想定され、内部空隙容量が40 μl前後である。したがって、約40 μlの容積に該液体試料を加えることができる。疎水性マトリックスが該カラムに該液体試料を保持するのに使用される場合、該マトリックスは、該疎水性マトリックスに浸透するいずれかの液体を本質的に防ぐ程度に、十分疎水性であることが好ましい。
【００９６】
（洗浄）
該マトリックスから該液体試料を通した後、一実施態様において、該カラムを洗浄して、該マトリックスへの非特異的結合を低減させる。1以上の洗浄段階は、通常、該カラムに洗浄溶液を加え、該マトリックスに該洗浄溶液を通すことによって、行うことができる。
【００９７】
たとえば、該マトリックスは、高度なストリンジェンシーバッファー(stringency buffer)で洗浄して、非共有結合の相互作用を除くことができる。高度なストリンジェンシーバッファーは、たとえば、20〜50 mM トリス-HCl (pH 8.0)、1〜5 mM EDTA、0.1〜0.5% SDS、0.5〜1M NaCl、及び0.5〜1% Triton X-100を含み得る。または、洗浄バッファーは、0.5%のTween 20を含むPBS、又は、200 mM NaClと、Tween 20若しくはTriton X-100などの洗浄剤とを含む100 mMリン酸ナトリウムを含んでいてもよい。通常、該洗浄段階は、ストリンジェンシーを変更する一連のバッファー（たとえば、比較的低い塩濃度を含む低いストリンジェンシーバッファー、及び高い塩濃度の高いストリンジェンシーバッファー）を含む。
【００９８】
該洗浄バッファーは、少なくとも0.1%のSDSを含むことが好ましく、約0.2%のSDSを含むことがより好ましい。一実施態様において、該方法は、1つ、2つ又は3つの洗浄段階を含み、3つの洗浄段階を含むことが好ましい。該洗浄バッファーは、NaClを含むことが好ましく、LiClを含むことは好ましくない。
【００９９】
（架橋の反転）
試料が架橋DNA-タンパク質複合体を含む実施態様では、洗浄後に該架橋を反転させることができる。架橋反転用のバッファーは、架橋の反転を最大限にし、化学作用、生化学作用、及び熱力学作用から生じるDNA分解を最小化するように、最適化することができる。
【０１００】
たとえば、一実施態様において、架橋反転用のバッファーは、EDTA、SDS及びプロテイナーゼKを含み、これらは、DNAによって複合化されたタンパク質を効果的に分解し、DNアーゼIなどのヌクレアーゼによるDNAの分解を防ぐ。また、さらなるバッファーも、高濃度のナトリウム塩及びカリウム塩（たとえば、1 Mの塩化ナトリウム又は0.5 Mの塩化カリウム）を含んで使用することができる。かかるバッファーは、効果的に化学作用及び熱力学作用からのDNA分解を低減し(Marguet, E. Forturre, P, Extremophiles, 2: 115-122, 1998)、また、ホルムアルデヒド架橋の反転速度を上昇させることが実証されている。通常、架橋の反転は、たとえば50〜85℃で5分間から4時間、好ましくは65〜75℃で0.5〜1.5時間の高温で発生する。
【０１０１】
本発明の一部の実施態様において、架橋の反転段階は、該分離カラム内で発生させることができる。または、架橋の反転が種々の容器内で発生するように、該硬質多孔性マトリックス（たとえば、フィルタ又はフリットの形態のもの）を該分離カラムから除去することができる（たとえば、洗浄の前又は後に）。さらなる実施態様において、該マトリックスに結合されたクロマチンは、架橋の反転前に、該カラムから最初に溶出することができる。
【０１０２】
（DNA捕捉及び分析）
一旦架橋DNA-タンパク質複合体の反転が終了したら、DNAを捕捉して清浄化することができる。これは、フェノール-クロロホルム抽出の標準法によって、又は、さらなる固相（たとえば、高濃度の非カオトロピック塩の存在下における、二酸化ケイ素若しくはニトロセルロース）上でDNAを捕捉することによって、達成することができる。
【０１０３】
精製段階の後、単離されたDNA断片を分析し、これらの同一性を決定することができる。これは、PCRによって実現されることが好ましい。たとえば、分析段階は、適切なプライマーの使用を含んでいてもよく、これによって、PCR時において、核酸の長さが増幅される。当業者は、該方法が、特異的なPCRプライマーを調製することができる遺伝子又はいずれかのゲノムの領域を検出するために適用できることを認識する。PCR結果は、たとえば電気泳動ゲル上でみることができる。
【０１０４】
（用途）
本発明の方法には、ChIPアッセイが一般に用いられるいずれかのものを含む、多くの用途があってもよく、該方法は、種々の生体試料の種類に適用されてもよい。たとえば、該方法は、DNA/タンパク質相互作用を特性評価するために、種々の研究用途に用いられてもよい。ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、及び／又はDNAメチル化などの可変要素は、遺伝子発現の重要なレギュレーターであり、また、これらの変化は、細胞機能の変化又は機能障害、このため、疾患に関係する。ChIPアッセイは、かかるエピジェネティクマーカーの変化を検討するために用いることができるので、本発明の方法は、診断及び予後用途に、並びに治療レジメを適切にする指針として、適用することができる。
【０１０５】
したがって、一態様において、本発明の方法は、病状の診断又は予後に用いることができる。該方法は、たとえば、前立腺癌、子宮頸癌、若しくはホジキンリンパ腫などの癌、及び、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の診断又は予後に用いることができる。診断方法は、インビトロで行われることが好ましい。
【０１０６】
一実施態様において、該方法は、第1の試料と第2の試料を採取することと、各試料において、本発明によるChIPアッセイを行うことを含んでいてもよい。たとえば、該第1の試料は、正常な（対照）細胞を含み、また、該第2の試料は、罹患している疑いのある細胞を含んでいてもよい。かかる分析の結果の比較によって、該方法は、罹患しているか、又は罹患していない試料を分類するために、用いることができる。
【０１０７】
（キット）
本発明の方法に使用される成分は、場合により該方法を行うための説明書が同梱された、キットの形態で提供することができる。かかるキットは、たとえば、上述するような分離カラムと、場合により、クロマチン免疫沈降アッセイを行うための1以上のさらなる試薬とを備えていてもよい。該キットにおける包含物の一般的な試薬には、該液体試料の調製、クロマチンの架橋、該マトリックスの洗浄、架橋の反転、及び／又はDNA精製のための1以上のバッファー又は溶液が含まれる。
【０１０８】
本発明は、次に示す非限定例に関して説明される。
【実施例】
【０１０９】
（実施例）
（実施例1）
クロマチン免疫沈降(ChIP)は、DNA/タンパク質相互作用に関する研究の重要な技術である。しかしながら、ChIP法には限界があり、時間がかかり、一貫しない場合があり、さらに、ビーズベースの固相マトリックスへのDNAとタンパク質の非特異的結合を生じやすく、免疫沈降段階に用いられることが多い。本実施例において、ChIPアッセイのための多孔性ポリエチレンベースの固形支持体である、新しいマトリックス、BioVyon（商標）-プロテインAの有用性について検討した。2つの抗体及び7つのDNA遺伝子座を使用して行われたChIP試験では、BioVyon（商標）-プロテインAの性能は、ビーズベースのマトリックス、プロテインA Sepharose（登録商標）及びDynabeads（登録商標）プロテインAと比較して、顕著に良好であり、全アッセイで、大きな割合のDNAプルダウンであった。さらに、カラム内の硬質多孔性ディスクフォーマットによって、より少ない段階及びより少ない機器条件で、非常に容易にBioVyonマトリックスを使用することができ、これによって、ChIP試料を処理するために採用された時間が顕著に減少した。要約すると、BioVyon（商標）-プロテインAは、ChIPのカラム系アッセイ法、及び他の免疫沈降系法を提供する：BioVyon（商標）の硬質多孔性構造は、生成物の顕著な損失なく、速く強力なプロトコールを可能にする。
【０１１０】
（緒言）
クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは、現代分子生物学の重要な研究ツールである[1;2;3;4;5]。ChIPアッセイによって、転写機構の重要な調節成分である特定のタンパク質に特異的に結合される、DNA配列の研究及び同定が可能になる。ChIPアッセイは複合的な方法であり、これには、次に示す複数の段階が含まれる。すなわち、DNA/タンパク質架橋、超音波処理、架橋DNA/タンパク質複合体の免疫沈降(IP)、これらの複合体の捕捉、並びに、最終的な沈殿物からのDNA回収及びDNA分析。IP段階において、タンパク質成分に特異的な抗体を使用し、固形支持体に結合したプロテインA及び／又はプロテインGに対する免疫グロブリンの特異的な結合によって、免疫グロブリン/DNA/タンパク質複合体の捕捉を達成する[6]。DNA分析は、PCR、リアルタイムPCR、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション(ChIPChIP) [7;8]、又は直接配列決定(ChIP-Seq) [9]によって行うことができる。
【０１１１】
しかしながら、ChIPアッセイは、固有の問題により影響を受け、これによって、誤り、又は、ChIPデータの誤った解釈が生じることが多い[4]。これらの問題は、ChIPアッセイで最も重要な部分である、IP時に生じる。IPの2つの中心要素が、抗原/抗体複合体の結合のために使用される、ChIP DNA、抗体及び固形支持体の品質及び量を決定する。抗体は、非特異的結合に寄与し、DNAに結合されたタンパク質に対する低い親和性により、回収されたDNAの低い収率の原因である場合がある。しかしながら、固形支持体（特に、IP及びChIPアッセイに共通して使用されるプロテインA Sepharose（登録商標）ビーズなどのアガロースベースのマトリックス）への非特異的結合の大部分は、Sepharoseの表面で多様な化学基と反応する、DNA/タンパク質複合体によるものと考えられる。Sepharoseは、天然材料（海藻類）由来であり、非常に大きい表面積を有する化学的に非常に不均質の基本構造を有する（図3Aを参照）。
【０１１２】
プロテインA変異体の大きい表面積は、タンパク質を含むIPに非常に有用であることが分かったが、該表面積によって、ChIPアッセイのクロマチン標的におけるDNAへ高レベルの非特異的結合が可能になる傾向があり、これは、sepharoseとDNAの別々に荷電した表面間のイオン相互作用の結果として生じる場合がある。この問題を最小化するために、付加的なDNAプレブロッキング段階が、ChIPプロトコールにおいて推奨されることが多い。この段階において、いずれかの潜在的に活性のある結合部位をブロックするために、sepharoseベースの固形支持体は、IPの前に、非均質DNA/RNAと共に予めインキュベートされる。
【０１１３】
本実施例では、Porvair Filtration Group社(Fareham, UK)から入手可能な、多孔性高密度ポリエチレン(HDPE)ベースの代替マトリックス、BioVyon（商標）-プロテインAを使用した。BioVyon（商標）は、国際公開公報第2005/018803号に記載されているような方法を用いて製造することができる。BioVyon（商標）は、sepharoseと非常に異なる高分子化学特性を有する。すなわち、これは、炭化水素エチレンの繰り返し単位から構成された合成高分子であり、化学的に均質であり（図3Bを参照）、この構造は、それほど可変的でなく、非常に不活性であることである。BioVyon（商標）の表面を、酸化によって化学エッチングし、これによって、表面積が中程度増加し、リンカーとプロテインA分子の共有結合が可能になる（図4及び5を参照）。エッチング/酸化過程によって、ChIPアッセイに十分な濃度のプロテインAによって不活性な表面を残して、比較的低い表面濃度の（多糖に対する）酸化種が導入される。上述するBioVyon（商標）-プロテインAの化学構造によって、DNA/タンパク質複合体に対する非特異的結合の低減を示すことが予想される。さらに、基本化学構造のこの相違は、ChIPアッセイで生じ得る酸加水分解及び酸化過程時において、（プロテインA Sepharose（登録商標）と比較した）BioVyon（商標）-プロテインAの化学安定性の向上に寄与することもできる。
【０１１４】
BioVyon（商標）は、固体の形態であるが、硬質で、圧縮不可能である多孔性ディスクの形態で製造され、これをカラムに挿入する（図6を参照）。これによって、ビーズベースのマトリックスよりも、BioVyon（商標）マトリックスの取扱いが容易になり、基部に固定された正確な量のプロテインAによってカラムを調製することができる。ゲル再懸濁液は必要ではなく、また、BioVyon（商標）ベッドは、試薬及びバッファーの添加時に破壊されず、さらに、容器中へのビーズ吸引に関係する誤差も除去される。
【０１１５】
本実施例において、自然落下カラムでBioVyon（商標）-プロテインAを使用して、2つの異なる抗体及び複数のDNA遺伝子座によって、ChIPアッセイを行った。これらの結果を、同様の条件（プロテインA Sepharose（登録商標）、及びDynabeads（登録商標）プロテインA）下での他のマトリックスを使用して得られたChIPアッセイの結果と比較した。Dynabeads（登録商標）は、ポリアクリレートポリマー層でコーティングされた超常磁性粒子である。これらの試験から、ChIP、及び潜在的に他のIPに基づくアッセイにおける既存マトリックスに対して、BioVyon（商標）-プロテインAマトリックスが、関心を惹く選択肢を提供することを結論付けた。
【０１１６】
（材料及び方法）
細胞、NIH 3T3マウス線維芽細胞を、10%ドナー血清及び50 μg/mlゲンタマイシン（両者とも、Invitrogen社(San Diego, USA)製）を添加したDMEM（Lonza社(Basel, Switzerland)製）中に維持した。MCF7、ヒト乳癌細胞を、10% FBS（Biosera社(East Sussex, UK)製）及び50 μg/mlゲンタマイシンを添加したUltraglutamine 1（両者とも、Lonza社(Basel, Switzerland)製）と共に、RPMI-1640で培養した。
【０１１７】
ChIPアッセイのためのNIH 3T3細胞の溶解物を次に示すように調製した。およそ5×106の細胞を、75 cm2フラスコ中20 mlのDMEM培地で増殖させた。37℃で10分間、1%の最終濃度になるまで培地に加えたホルムアルデヒドによって細胞を処理して、DNA/タンパク質複合体を架橋した。次いで、NH4OHを、室温(RT)で5分間、0.5%の最終濃度になるまで培地に加えて、ホルムアルデヒドを中和した。その後、冷却PBSM（標準PBSバッファー＋2 mM MgCl2）を加え、細胞を遠心分離によって採取し、回収し、これを、再度冷却PBSMで2回洗浄した。
【０１１８】
次いで、細胞を、PBSM、0.5% Triton X-100中で溶解し、15分間氷上に置き、6000gで10分間の遠心分離によって核を回収した。ペレットを冷却PBSMで洗浄し、遠心分離し、NLB（10 mMトリス/Hepes pH 8.0、1 mM EDTA、2.5M NaCl、0.5 mM PMSF）中で再懸濁させ、そして、NLB（1:5 v/vペレット/NLB）中で氷上において20分間インキュベートした。その懸濁液は、次に示す割合（懸濁液/NLB＋1Mスクロース（1/10 v/v））で、NLB＋1Mスクロースクッション上で層状になり、これを、10000gで10分間遠心分離した。ペレットを、低塩バッファー及びLS（10 mMトリス/Hepes pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl）中で再懸濁させ、所望の長さ（400〜500 bp）のDNA断片が達成されるまで、Bioruptor（商標）（Wolf Laboratories 社(Pocklington, York, UK)製）を使用しパワー3で、氷上において1分の破損を伴う1分の爆発（5回）で超音波処理をした。その後、プロテアーゼインヒビターを次に示す濃度で溶解物に加えた。すなわち、アプロチニン800 nM、ベスタチン50 μM、ロイペプチン20 μM、ペプスタチン10 μM、AEBSF 1 mM、E64 15 μM（カタログ番号：78425 Thermo Scientific社製）であった。溶解物を-80℃で保存した場合、プロテアーゼインヒビターを解凍した溶解物に加えた。
【０１１９】
MCF7細胞の溶解物を次に示すように調製した。およそ5×106の細胞を、75 cm2フラスコ中20 mlのRPMI培地で増殖させた。培地を排出し、1 mlの加温PBSを細胞に加えた。DNA/タンパク質複合体を架橋するために、細胞を、回転台で振盪しながら、RTで10分間、1%のホルムアルデヒド（最終濃度）によって処理した。その反応物を、振盪しながら、RTで5分間、0.67Mのグリシン（最終容積）でクエンチした。
【０１２０】
その後、細胞を採取し、3500 rpmで5分間、遠心分離した。細胞ペレットを、2 mlの低張バッファー（10 mMトリス/HCl、pH 7.2、2 mM MgCl2、0.5% Triton X-100）中で再懸濁させ、10分間氷上に放置した。核を、4℃で5分間、5000 rpmで遠心分離した後に回収した。ペレットを、600 μlの溶解バッファー（50 mMトリス/HCl pH 8.0、10 mM EDTA、1% SDS）中で再懸濁させ、氷上で10分間放置し、所望の長さ（400〜500 bp）のDNA断片が達成されるまで、Bioruptor（商標）（Wolf Laboratories社(Pocklington, York, UK)製）を使用しパワー3で、氷上において1分の破損を伴う1分の爆発（15回）で超音波処理をした。試料を、4℃で10分間、13,000 rpmで遠心分離した。超音波処理した細胞懸濁液を、Upstate社の「ChIP希釈バッファー」（0.01% SDS、1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mMトリス/HCl、pH 8.0、167 mM NaCl）中で10倍に希釈した。その後、プロテアーゼインヒビターを、次に示す濃度で溶解物に加えた。すなわち、アプロチニン800 nM、ベスタチン50 μM、ロイペプチン20 μM、ペプスタチン10 μM、AEBSF 1 mM、E64 15 μM（カタログ番号：78425 Thermo Scientific社製）であった。溶解物を-80℃で保存した場合、プロテアーゼインヒビターを解凍した溶解物に加えた。
【０１２１】
本研究のための抗体は次に示すとおりであった。すなわち、以前にChIPアッセイに使用された、抗RNAポリメラーゼII（抗Pol II）(8WG16)マウスモノクローナル（Covance Research Products社(Princeton, New Jersey, USA)製）[10]、ゲノムワイドChIP分析に利用される、抗CTCFウサギポリクローナル（Upstate-Millipore社(Massachusetts, USA)製）（たとえば、[11;12]）、抗Hisタグウサギポリクローナル（Abcam plc社(Cambridge, UK)製）、抗βアクチンマウスモノクローナル（Sigma-Aldrich社(St Louis, USA)製）、マウス及びウサギIgG（Santa Cruz Biotechnology社(Santa Cruz, CA)製）であった。
【０１２２】
BioVyon（商標）-プロテインA自然落下カラムは、Porvair Filtration Group社(Fareham, UK)から入手した。該カラムは、標準1 ml固相抽出(SPE)チューブと同じ寸法であり、およそ6 mmの径、2 mmの長さの硬質多孔性HDPE BioVyon（商標）-プロテインAフリットを収容する（図6Bを参照）。選択的に表面をエッチングし、さらなる共有結合のために、カルボン酸固定基(anchor group)を提供する、選択酸化法を用いて、該フリットを、表面積を増加させるために化学処理した。エッチング工程によって生じた窪みは、エッチング前後の表面の微構造を比較した、図5ではっきりと見ることができる。該窪みの形成は、図4に示すような表面積の増加が原因であった。ChIPアッセイの免疫沈降段階の十分な機能性を提供するために、この工程によって表面を調整した。次いで、HDPEの表面に形成した固定基を、リンカーによってプロテインAに共有結合して、BioVyon（商標）-プロテインA固相を形成した。
【０１２３】
クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを、プロテインA Sepharose（登録商標）（Sigma-Aldrich社(St Louis, USA)製）ためのChIPキット（Upstate-Millipore社(Massachusetts, USA)製 ）のメーカーのマニュアルに従って、一部の改良を伴い、行った。BioVyon（商標）-プロテインAを含むChIP試験において、上述のプロトコールを、次に示す一部の改良を伴って適用した。すなわち、プロテインA Sepharose（登録商標）スラリーを、BioVyon（商標）-プロテインA自然落下カラムに代えた。Dynabeads（登録商標）プロテインA（Invitrogen社(San Diego, USA)製）によるChIPアッセイでは、メーカーのプロトコールに従った。3つの異なるマトリックスによるChIP試験の詳細なプロトコールは、次に示すとおりである。
【０１２４】
（プロテインA Sepharose（登録商標）によるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ）
プロテインA Sepharose（登録商標）によるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを、メーカーの説明書に従って、一部の改良を伴い、ChIPキット（Upstate社製）を使用して行った（Upstate社のChIPキットマニュアルから引用）。マウスNIH 3T3細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用した（それぞれの500 μlの溶解物当たり4 μg）。すなわち、抗Pol II、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体であった。ヒトMCF7細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用した（それぞれの500 μlの溶解物当たり100 μg）。すなわち、抗CTCF、非特異的ウサギIgG、及び抗Hisタグウサギポリクローナルであった。
【０１２５】
1. 各反応において、500 μlの希釈超音波処理細胞懸濁液を使用する。
【０１２６】
2. 供給のために、1%の希釈細胞懸濁液を保存する。
【０１２７】
3. 4℃で撹拌しながら、30分間、サケ精子DNA/プロテインA Sepharose-50%スラリー（SIGMA社製）を80 μl加えることによって、懸濁液をプレクリア(pre-clear)する。
【０１２８】
4. 「低塩」LSバッファー（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mMトリス-HCl、pH 8、150 mM NaCl）＋1 mg/ml BSA＋400 μgサケ精子DNAを含む、1 mlのプレブロッキング溶液によって、プロテインA Sepharose（登録商標）(0.2 ml)をプレブロッキングする。プロテインA Sepharose（登録商標）をプレブロッキング溶液と混合し、4℃で30分間、回転させながらインキュベートする。500 rpmで回転させ、上清を除去する。
【０１２９】
5. 短時間の遠心分離（1100 rpm、5分、4℃）によってビーズをペレット化し、上清画分を回収する。
【０１３０】
6. 免疫沈降抗体を溶解物に加え、4℃で3時間、回転させながらインキュベートする。
【０１３１】
7. 4℃で1時間、回転させながら、精子DNA/プロテインA Sepharose-50%スラリーを60 μl加えて、抗体/CTCF複合体を回収する。
【０１３２】
8. 遠心分離（4℃で1分間、1000 rpm）によってアガロースをペレット化する。
【０１３３】
9. 次に示すバッファー(1 ml)で、回転台において3〜5分間、慎重に複合体を洗浄する。すなわち、LS、「低塩」（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mMトリス-HCl (pH 8)、150 mM NaCl）、及び、HS、「高塩」（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mMトリス-HCl (pH 8)、500 mM NaCl）で洗浄し、「最終洗浄」（0.1% SDS、1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mMトリス-HCl、pH 8.0、167 mM NaCl）で2回洗浄し、最終的にTEで1回洗浄する。
【０１３４】
（DNAの溶出及び抽出）
1. 新たに調製した「溶出バッファー」（1% SDS、0.1M NaHCO3）を200 μl加える。
【０１３５】
2. 65℃で10分間インキュベートする。短時間撹拌する。5分間、最大速度でsepharoseビーズを沈降させ、上清画分（溶出液）を慎重に別のチューブに移す。この工程を2回繰り返す。
【０１３６】
3. 合わせた溶出液(400 μl)に5M NaCl(18 μl)を加え、エッペンドルフチューブを65℃で4〜5時間加熱して、架橋を反転させる。
【０１３７】
4. 10μlの0.5M EDTA、20 μl 1M トリス/HCl、pH 6.5 (6.8)、及び1.5 μlの14〜22 mg/ml プロテイナーゼKを、溶出液に加え、45℃で1時間インキュベートする。
【０１３８】
5. フェノール/クロロホルムを加えることによって、DNAを回収する。
【０１３９】
6. 40 μlのH2O中でペレットを再懸濁させる。
【０１４０】
（Dynabeads（登録商標）プロテインAによるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ）
Dynabeads（登録商標）プロテインAによるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを、メーカー（Invitrogen社）のマニュアルに従って、一部の改良を伴い、行った（Dynabeads（登録商標）プロテインAのInvitrogen社のマニュアルから引用）。マウスNIH 3T3細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用した（それぞれの500 μlの溶解物当たり4 μg）。すなわち、抗Pol II、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体であった。ヒトMCF7細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用した（それぞれの500 μlの溶解物当たり100 μg）。すなわち、抗CTCF、非特異的ウサギIgG、及び抗Hisタグウサギポリクローナルであった。
【０１４１】
工程は次に示すとおりであった。
【０１４２】
（1.1 Dynabeadsの調製）
1. ピペット操作によって、又はローラー上で回転させる（5分）ことによって、完全にDynabeadsを再懸濁させる。
【０１４３】
2. 50 μl (1.5 mg)のDynabeadsを試験管に移す。
【０１４４】
3. 上清が透明になるまで、磁石上で分離し、上清を除去する。
【０１４５】
4. 磁石から試験管を取り出す。
【０１４６】
5. 抗体(Ab)結合（第1.2節）に直接進行させる。
【０１４７】
（1.2 抗体(Ab)の結合）
6. 上述の工程4の試験管に、200 μl Ab*結合バッファー及び*洗浄バッファー中に希釈した抗体を加える。
【０１４８】
7. 室温で10分間回転させながらインキュベートする。
【０１４９】
8. 磁石に試験管を置き、上清を除去する。
【０１５０】
9. 磁石から試験管を取り出し、穏やかにピペット操作することによって洗浄して、200 μl Ab結合バッファー及び洗浄バッファー中でビーズを再懸濁させる。
【０１５１】
10. 免疫沈降（第2.3節）に直接進行させる。
【０１５２】
（1.3 標的抗原の免疫沈降）
11. 磁石に（工程10の）試験管を置き、上清を除去する。
【０１５３】
12. 抗原(Ag)を含む試料（通常、100〜1,000 μl）を加え、穏やかにピペット操作して、Dynabeads-Ab複合体を再懸濁させる。
【０１５４】
13. 室温で10分間、回転させながらインキュベートし、これによって、AgがDynabeads-Ab複合体に結合することができる。注：抗体の親和性に応じて、最適な結合のために、インキュベーション時間を増加させることが必要な場合がある。
【０１５５】
14. 磁石に試験管を置く。必要に応じて、さらなる分析のために、清浄なチューブに上清を移す。
【０１５６】
15. 各洗浄につき200 μlの洗浄バッファーを使用して、Dynabeads-Ab-Ag複合体を3回洗浄する。各洗浄時に磁石上で分離し、上清を除去し、穏やかにピペット操作することによって再懸濁させる。
【０１５７】
16. 100 μlの洗浄バッファー中でDynabeads-Ab-Ag複合体を再懸濁させ、清浄なチューブにビーズ懸濁液を移す。これは、試験管の壁に結合したタンパク質の共溶出を回避するために推奨される。
【０１５８】
17. 磁石に試験管を置き、上清を除去して、プロテインA Sepharose（登録商標）のためのプロトコールに説明するように、DNAの溶出及び抽出に進行させる（上述を参照）。
【０１５９】
*バッファー組成：
結合バッファー：PBS/Tween 20（1×PBS pH 7.4/0.02% Tween 20）
洗浄バッファー：PBS
【０１６０】
（BioVyon（商標）-プロテインA自然落下カラムによるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのための最適化されたプロトコール）
免疫沈降抗体を溶解物に加え、＋4℃で3時間、回転させながらインキュベートした。マウスNIH 3T3細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用した（それぞれの500 μlの溶解物当たり4 μg）。すなわち、抗Pol II、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体であった。ヒトMCF7細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用した（それぞれの500 μlの溶解物当たり100 μg）。すなわち、抗CTCF、非特異的ウサギIgG、及び抗Hisタグウサギポリクローナルであった。
【０１６１】
BioVyon（商標）-プロテインA自然落下カラムを、次に示すように調製した（カラムによるすべての操作は、自然落下によりRTで行った）。カラムを、蒸留水で最初に洗浄した後、1 mlのChIP希釈バッファー（0.01% SDS、1.1% Triton X100、1.2 mM EDTA、16.7 mMトリス/HCl、pH 8.0、167 mM NaCl）で3回洗浄した。次いで、細胞溶解物をカラムにかけ、次に示すように洗浄段階を行った。1 mlのLSバッファー（低塩バッファー：10 mMトリス/Hepes pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl）による3回の洗浄、1 mlのMSバッファー（中塩バッファー：0.1% SDS、20 mMトリス/HCl pH 8.0、2 mM EDTA、150 mM NaCl、1% Triton X100）による3回の洗浄、及び1 mlのHSバッファー（高塩バッファー、0.1% SDS、20 mMトリス/HCl pH 8.0、2 mM EDTA、500 mM NaCl、1% Triton X100）による3回の洗浄。DNAを、500 μlの溶出バッファー（7M尿素、50 mM 2-ME）で溶出し、その後、NaHCO3及びNaClをそれぞれ、最終濃度が0.1M及び0.5Mになるまで加え、エッペンドルフチューブを65℃で4〜5時間加熱して、架橋を反転させた。この段階後、25 μlの0.5M EDTA、50 μl 1M トリス/HCl、pH 6.5、及び1.5 μlの14〜22 mg/mlプロテイナーゼKを、溶出液に加え、チューブを45℃で1時間インキュベートした。次いで、DNAを、フェノール/クロロホルムによって抽出し、水相を回収し、2〜3容量のエタノールによって沈殿させた。20 ngのグリコーゲン（担体）を溶液に加えた。その後、これを、10,000 rpmで10分間、遠心分離し、DNAペレットを40 μlのH2O中で再懸濁させた。
【０１６２】
（リアルタイムPCR (Q-PCR)及びPCR反応）
PCR及びQ-PCRのためのプライマー及び条件を表1に記載する。以前に報告されているように、改良を加えて、リアルタイムPCR反応を行った[13]。簡潔には、反応成分を、3 μlの試料、200 nMの各プライマー、及び12.5 μlのSensiMix Plus SYBR Green PCRキット（Quantace社(London, UK)製）を含む、25 μlの混合物中に集めた。増幅、データ収集、及び分析を、Chromo4リアルタイムPCR（BioRad Laboratories社(California, USA)製）を使用して行った。解離曲線分析をPCR反応後の各試料で行い、予想された溶解曲線特性の単一のアンプリコンが得られることを確認した。沈殿DNAの量を、全供給クロマチンに関して算出し、次に示す式に従って、合計の割合として表した。すなわち、%供給=2ΔCt×100%（式中、ΔCt=Ct（供給）-Ct（免疫沈降）であり、また、Ctは、対応するPCR反応の平均閾値サイクルである。）であった。これらの試験を3回反復して行い、平均は%供給から求めた。
【０１６３】
【表１】
2014500499.tif 000002
【０１６４】
（統計解析）
統計解析は、対応のないStudentのt検定(unpaired Student's t-test)を用いて行った。確率が5%未満の信頼水準(P＜0.05)である場合、有意値が検出された。
【０１６５】
（結果及び考察）
BioVyon（商標）-プロテインAのために開発されたChIPプロトコールにおいて、IP段階は、この固形支持体による使用のための最適化が必要であった。本研究におけるChIPのためのモデル試験系として、マウスGAPDH遺伝子のプロモータ領域内のTATAボックスに対するRNAポリメラーゼIIの結合を検出するための以前に記載されたアッセイを選択した[10;14]。
【０１６６】
ルーチンChIPにおけるSepharoseビーズのプレブロッキングは、IP段階におけるSepharoseへのDNA/タンパク質複合体の非特異的結合を防ぐのに有用である。これは、本発明者らの試験で確認され、これによって、プレブロッキング段階の省略は、プロテインA-SepharoseビーズとDynabeads（登録商標）プロテインAの双方による高いバックグラウンドをもたらす（図1）。BioVyon（商標）-プロテインAカラムにおいて、プレブロッキング段階は、実際に、非特異的結合をわずかに増加させるにすぎなかった（図1）ので、ChIPプロトコールから除外した。
【０１６７】
次いで、洗浄バッファーの配合及び洗浄回数の変更によって、BioVyon（商標）-プロテインAカラムへの低い非特異的結合がさらに低減することができるか否かについて調査した。変性量を下回る（sub-denaturing）量のイオン洗浄剤（SDSなど）の導入は、プロテインA Sepharose（登録商標）によるChIP試験において、シグナル/バックグラウンド（抗体/抗体なし）の割合を向上させることが知られている。プロテインA Sepharose（登録商標）、Dynabeads（登録商標）プロテインA、及びBioVyon（商標）-プロテインA上のシグナル/バックグラウンド割合に影響を与えるSDSの濃度の増加について比較するために、SDS（0.1%及び0.2%）の2つの異なる濃度の洗浄溶液を、すべてのマトリックスのプレブロッキング段階が含まれる、プロトコールを用いて試験した。高濃度(0.2%)のSDSにおいて、プロテインA Sepharose（登録商標）及びBioVyon（商標）-プロテインAのシグナル/バックグラウンド割合が増加したが、Dynabeads（登録商標）プロテインAでは相当減少した（図7、パネルA）。
【０１６８】
また、ChIPアッセイの質に対する洗浄強度の影響についても検討した。これらの試験において、DNA/タンパク質複合体の結合後、カラムを種々の化学作用を有するバッファーで3回又は6回洗浄した。図7、パネルBに示すように、3回の洗浄が最適であり、6回の洗浄は、特異的なシグナルを相当に低減した。
【０１６９】
バッファー中にNaClの代わりにLiClを使用することによって、プロテインA Sepharoseビーズに対する核酸の非特異的結合が減少し得ることが過去に経験的に観察され、このため、LiClは、多くのChIPプロトコールに含まれている。しかしながら、BioVyon（商標）-プロテインAカラムを使用する、ChIPアッセイのこの段階は、非特異的バックグラウンド結合を減少させず、さらに、これによって、特異的なシグナルが顕著に減少した（図7、パネルB）。
【０１７０】
種々のバッファー組成で行われた一連の試験によって、BioVyon（商標）-プロテインAのための最適化されたプロトコールがもたらされ、該プロトコールは、(i)プレブロッキング段階が含まれない、及び、(ii)最適な洗浄条件が、LS、MS、HSバッファー（0.1% SDSをHSによる洗浄段階に使用）による3回の洗浄であり、NaClバッファーを選択して、LiClバッファーを手順から省略する、という点で、Upstateプロトコールとは異なっていた。
【０１７１】
ブロッキングの種々の影響、BioVyon（商標）-プロテインA、プロテインA Sepharose（登録商標）、及びDynabeads（登録商標）プロテインA上のLiCl及びSDSは、マトリックスの化学的性質の相違によって説明され得ると仮定した。これによって、より非特異的なDNA結合が、BioVyon（商標）-プロテインAよりも、プロテインA Sepharose（登録商標）、及びDynabeads（登録商標）プロテインAで生じると考えられる。
【０１７２】
その後、BioVyon（商標）-プロテインA、プロテインA Sepharose（登録商標）、及びDynabeads（登録商標）プロテインAは、同じ特異的抗体及び上述するようなDNA遺伝子座（図1）による、ChIPアッセイと同時に使用され、また、非特異的DNA結合の対照も含まれていた。これらの試験では、BioVyon（商標）-プロテインA、対照、及び他の2つのマトリックスの間の特異的な抗体によるChIP DNAの富化の相違は、統計的に有意であった(P＜0.05)（図2A）。DNAプルダウン（%供給）は、これらのアッセイにおける他のマトリックスよりも、BioVyon（商標）-プロテインAで顕著に高かった。
【０１７３】
別の抗体及び複数のDNA遺伝子座を含めてこれらの試験を拡大した。この視点から、転写因子、CTCF [15;16;17]は、ゲノムに多数の結合部位を有し、これらのうちの多くが特性評価され[15]、また、本発明者らの研究室は、CTCFに関する研究を専門とするので、理想的な候補である[11;18]。CTCF結合（標的）部位(CTS)は、CTCFに対する親和性が異なるので、ChIPアッセイで試験するのに十分な試験モデルを代表する。次に示す6つのヒトCTSを選択した。すなわち、N部位Myc [10;19]、PIM [15]、DM1 [20]、β-グロビン[21]、PLK [15]及びH19 [22;23]であった。DNAプルダウン（%供給）は、6つの遺伝子座すべての他のマトリックスよりも、BioVyon（商標）-プロテインAで高かった。BioVyon（商標）-プロテインAによるChIP DNAの富化は、CTS間で変化し、これは、CTCFに対する異なったCTSの親和性を反映した可能性が高かった（図2B）。BioVyon（商標）-プロテインAと全対照の間の特異的な抗体によるChIP DNAの富化は、統計的に有意であった(P＜0.05)。
【０１７４】
種々のDNA遺伝子座に対する非特異的対照の値が相当変化したことに留意するべきである。場合によっては、より非特異的な生成物が、IgG及び無関連抗体よりも抗体を含まないもので得られた。しかしながら、かかるパターンは異常でなく、文献に以前に報告された（たとえば、参考文献[24;25]を参照）。DNA結合部位（たとえば、塩基組成、アンプリコンの長さなど）の特定の機能の組合せが、マトリックスの特定の特性と共に、これらの相違の原因であり得る可能性がある。これらの試験からの実用的な勧告は、「抗体を含まない」対照を、ChIPアッセイにおいて注意して取り扱う必要があるということである。
【０１７５】
図2に示す絶対データは、その後、7つのDNA遺伝子座から抗体を含まない対照、及びIgG又は無関連抗体のいずれかを使用した2つの他の非特異的抗体対照まで、特異的なシグナルの富化の倍数(fold enrichment)を算出することによって、3つのマトリックスによるシグナル/バックグラウンド割合を評価するために使用した。これらの結果を表2に概説する。
【０１７６】
表2  3つのマトリックスでのChIP試験（図2に詳述）における抗体を含まない対照及び2つの非特異的対照、IgG及び無関連抗体に対する、7つのDNA遺伝子座からの特異的シグナルの富化の倍数。
【０１７７】
富化倍数値を、3つの対照のうちの1つで特異的シグナルの値を割ることによって算出し、このデータを表形式で示す（4未満の値を太字のイタリック体で示す）。
【０１７８】
【表２】
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【０１７９】
具体的には、4の富化倍数値を、ChIPアッセイが有効であるのに必要な適正値と考える場合、BioVyonは、評価された21のアッセイのうち20で有効であり、Dynabeadsは、評価された21のアッセイのうち16で有効であり、また、Sepharoseは、評価された21のアッセイのうち13で有効であるにすぎない（表2の4未満の富化値は、明確にするため、イタリック体で示す）。換言すると、実際に、いずれかのレベルのDNA富化（1を超える値）は、21すべてのアッセイで比較する場合、2つのビーズベースのマトリックスよりも、BioVyon（商標）-プロテインAで有効であることを示す。ChIPアッセイの複合体の性質を考慮すると、特定のChIP試験において、どのような富化倍数係数が、有用な情報を提供するのに必要であるかを決定するのは困難である。しかしながら、これらの結果は、BioVyonマトリックスが、この調査で比較された他の2つのマトリックスよりも大きな富化を常に提供することを示す。
【０１８０】
また、この比較による調査は、硬質BioVyonプロテインAカラムを使用する試験法が、相当容易に行われ、緩いビーズベースの他の2つのフォーマットのいずれかよりも、非常に迅速であることも実証した。BioVyonデバイスは、カラム内の硬質多孔性フリットに結合された固定量のプロテインAによって調製されることになっている。これによって、IP過程に使用される容器へのビーズベースのマトリックスの添加に関連する誤差をなくす可能性が直ちに除かれる。さらに、BioVyonカラムに関連する処理段階は、すべての事例において、より単純であり、試薬及びバッファー緩衝液は、いずれかのインキュベーション期間においてカラムに保持され、次いで、カラムから排出させられる。また、プロテインAに結合されたクロマチンも、BioVyonカラムの硬質多孔性フリット上に結合され、IPにおいて通常用いられる過程のうちのいずれかにおいて、カラムから喪失することがないが、ビーズは、すべての洗浄段階及び試薬混合段階（Sepharoseの遠心分離、及びDynabeadsの磁力分離）において、慎重に分離され、保存される必要がある。これによって、ビーズベースのIP過程は、多段階過程の各段階で、ビーズの損失（したがって、標的の損失）の可能性により、時間を非常に消費する。
【０１８１】
例として、複数の遠心分離、吸引、及び再懸濁段階を含む、Sepharoseビーズを使用するIP過程は、3時間を超える時間を要する場合がある。複数の磁力分離段階（吸引及び再懸濁）を含む、Dynabeadsを使用するIP過程は、30分を超える時間を要する場合がある。これに比べて、BioVyonを使用するIP過程は、10〜15分を要し、少ない洗浄段階（ビーズにおける各バッファーで6回の代わりに、各バッファーで3回）を必要とするにすぎず、また、分離や再懸濁を必要とせず、このため、全過程において同様の標的損失の危険性がない。
【０１８２】
さらに、上述の試験は、さらに過程を簡潔にし、ビーズ操作を必要とし標的損失の可能性があるビーズベースのマトリックスに関連した別の段階を排除する、BioVyonプロトコールにおいて、プレブロッキング段階が必要でないことも示唆する。また、「ChIPped」DNA断片が、ヌクレアーゼ活性に対して非常に感度が良く、このため、全体の処理時間のいずれかの低減によって、ヌクレアーゼによるDNA分解の可能性が減少することに留意することも重要である。
【０１８３】
要約すると、BioVyonマトリックスは、より大きなDNAプルダウン、富化性能の向上、及びより少ない処理段階による利用容易性をもたらし、これによって、標的損失をもたらし得る操作上の誤差の可能性を減少させる。BioVyonのこれらの特性は、マイクロChIP用途の開発、さらに、ChIPアッセイの自動化に非常に有益である[26;27;28;29]。したがって、BioVyon（商標）-プロテインAが、ChIP及び他のIPベースのアッセイに使用するビーズベースのマトリックスに代わる、誤差の可能性がなく、より使用しやすく、迅速に使用される、非常に関心を惹く選択肢であると考えることができることを結論付けた。
【０１８４】
（実施例2）
本実施例において、ChIPアッセイを、Q-PCR分析の標的遺伝子として、RNAポリメラーゼII、及び、単一の遺伝子座、ヒトGAPDHに対する単一の抗体を使用して行った。行った初期の比較は、磁性ビーズを免疫沈降段階でBioVyon自然落下カラムに置き換えた、推奨最適ChIPプロトコールの調整に焦点を置いた。結果は、BioVyon-プロテインA自然落下カラムが、これらの一般に使用される磁性ビーズ相当物よりも、IPに顕著に適した支持体であることを示す。さらなる試験では、自然落下カラムをスピンカラムに置き換えて、アッセイをさらに改良した。
【０１８５】
（材料及び方法）
（細胞培養物及び固定）
二次ヒト胸癌細胞系MCF-7を入手し、円形プラスチック14 cmペトリ皿（Invitrogen社製）上に7.5×106の密度で接種した。10%無血清(stripped serum)DMEM（Gibco社製）で増殖させ、該細胞は、24時間後に、80〜100%の集密度（15×106細胞）に達し、室温で10分間、20 mlの1%ホルムアルデヒド中に浸漬した。クロマチンを抽出し、免疫沈降のために、超音波処理によって調製した。
【０１８６】
（BioVyonプロテインA自然落下カラム及びプロテインG磁性ビーズを用いるスピンカラムを使用するChIPの比較）
断片化されたクロマチン試料を10 μg/μlに調整した後、RNA pol II特異的ウサギポリクローナル抗体(0.8 μg/μl)、又は、負の対照として正常な非結合ウサギIgGを使用して、免疫沈降に供した。回収されたDNAを、Q-PCRによって3回反復して分析した。プロテインG磁性ビーズを使用する方法を、推奨プロトコールを用いて行い、最適化されたバッファー組成（たとえば、上の実施例1を参照）を用いたBioVyon-プロテインAを使用する方法と比較した。クロマチン免疫沈降スラリーを、BioVyonカラム上に1時間インキュベートし、続いて、ローターの端部間で、4℃で3時間インキュベートした。
【０１８７】
（BioVyonスピンカラム）
BioVyon-プロテインAマトリックスを、小型のプラスチック製回転チューブ（Sigma社製）に適合させ（図6Cを参照）、2 mlの回収チューブに収容し、遠心力の利用を促進させて、自然落下とは対照的に、カラムからバッファー及び免疫沈降溶液を吸引した。疎水性フリット（焼結ポリエチレン粒子を含む硬質多孔性マトリックス）を、カラムのBioVyon-プロテインAフリットの下に配置し、遠心力をかける前後に生じる流れを除去した。
【０１８８】
自然落下法及びスピンカラム法では、共に、断片化されたクロマチン試料を10 μg/μlに調整し、RNA pol II特異的ウサギポリクローナル抗体(0.8 μg/μl)、又は、負の対照として正常な非結合ウサギIgGを使用して、免疫沈降に供した。回収されたDNAを、Q-PCRによって3回反復して分析した。BioVyon-プロテインAの最適なプロトコールの免疫沈降及び洗浄段階を、10000 rpmの遠心力を30秒間用いて、スピンカラム上で行った。免疫沈降スラリーを、3時間、ローター上で再度インキュベートした後、さらに1時間希釈されたカラムにかけた。
【０１８９】
（疎水性フリットの影響）
別個の試験において、2つのスピンカラムの違いを試験した。1つは、疎水性フリットをプロテインAカラムの下に配置して、生じる流れを除去するものであり、もう1つはフリットがないものであった。フリットのサイズは、スピンカラムで7.2 mmの径であった。
【０１９０】
断片化されたクロマチン試料を、10 μg/μlに調整し、RNA pol II特異的ウサギポリクローナル抗体(0.8 μg/μl)、又は、負の対照として正常な非結合ウサギIgGを使用して、免疫沈降に供した。回収されたDNAを、Q-PCRによって3回反復して分析した。免疫沈降スラリーを、3時間、ローター上で再度インキュベートした後、さらに1時間洗浄されたカラムにかけた。BioVyon-プロテインAスピンカラムの免疫沈降及び洗浄段階を、1000 rpmの遠心力を30秒間用いて行った。
【０１９１】
（結果）
（BioVyon-プロテインA自然落下カラム及びプロテインG磁性ビーズを使用するChIPの比較）
最適BioVyonプロテインA法を、プロテインG磁性ビーズを使用する最適ChIPプロトコールと比較し、達成されるシグナルプルダウンの面から有利に比較した。最適条件下において、BioVyon-プロテインAプロトコールは、GAPDH標的遺伝子に結合されたRNAポリメラーゼIIタンパク質を標的としたとき、厳密に同じMCF7乳癌細胞試料を使用して、DNAプルダウン%が約25倍増加した（図8を参照）。これは、ChIPシグナルの顕著な増加、及びChIP調査プロトコールをリードする現在の市場における顕著な改善を表す。
【０１９２】
（BioVyonスピンカラム法）
スピンカラムへの自然落下カラムの適応によって、ChIPプロトコールにおけるカラムの容易な取扱いが促進され、シグナルプルダウンが増加し得る。確実なスピンの洗浄は、自然落下を使用して喪失されていたカラムを通じる流れを捕捉する点で、本方法の効率を高める主な要因であると考えられる。
【０１９３】
図9は、疎水性フリットを含むスピンカラムの使用によって、自然落下カラムアッセイからスピンカラムアッセイまで良好な変移が可能になることを示す。疎水性フリットと共に固定し、スピンカラムとして使用する場合、BioVyonプロテインA法は、厳密に同じDNAテンプレート試料及び抗体濃度を用いて、自然落下相当物と比較すると、DNAプルダウン%が2.3倍増加した。
【０１９４】
（疎水性フリットの影響）
別個の試験において、2つのスピンカラムの違いを試験した。1つは、疎水性フリットを、カラムのBioVyon-プロテインAフリットの下に配置して、生じる流れを除去するものであり、もう1つは、疎水性フリットがないものであった。
【０１９５】
図10は、BioVyonスピンカラムの性能に対する疎水性フリットの影響を示す。疎水性フリットを使用する場合、抗体の存在下におけるDNAプルダウン%は、IgG（対照）試料よりも非常に大きく、このため、富化割合が改良される。
【０１９６】
（参考文献）
【化１】
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2014500499.tif 000005
2014500499.tif 000006
2014500499.tif 000007
【０１９７】
上の明細書に言及する刊行物はすべて、引用により本明細書中に組み込まれる。本発明の説明された方法及びシステムの種々の改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を、特定の好ましい実施態様に関して説明しているが、特許請求の範囲に記載された発明が、かかる特定の実施態様に過度に限定されるべきでないことが理解される。実際に、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者にとって明らかな発明を実施するための説明された様式の種々の改変は、次に示す特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
2014500499.tif 000008
【図２Ａ−Ｂ】
2014500499.tif 000009
【図３Ａ】
2014500499.tif 000010
【図３Ｂ】
2014500499.tif 000011
【図４】
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【図５Ａ】
2014500499.tif 000013
【図５Ｂ】
2014500499.tif 000014
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2014500499.tif 000016
【図６Ｃ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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