(57)【要約】本発明は、既知のリガンド結合部位とは異なる受容体の結合部位を標的とするSmo受容体または関連受容体のリガンドである一般式(I)のキノリノン誘導体の、Smo受容体または関連受容体の調節剤を特定するため、ヘッジホッグシグナル伝達経路の特徴付けおよび診断のためのための研究ツールとしての使用に関する；本発明は、一般式(I)の前記誘導体を含むキットにも関する。2014500957.tif 000023【選択図】なし
2014500957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘッジホッグシグナル伝達経路を特徴付けるための研究ツールとしての、次の一般式(I)：
【化１】
2014500957.tif 000022
（式中、
- Xは、オルト、メタまたはパラ位において、-H、-OH、-NH2、ハロゲン原子、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、アルコキシ基、3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはアリール基を表し；
- R8は、X基を有する炭素以外の炭素上のオルト、メタまたはパラ位において、-(C=O)-NH-R1、-(C=O)-O-R1または-NH-(C=O)-R1を表し；
- Wは、-H、-OH、-NH2またはハロゲン原子を表し；
- R1、R2およびR3は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して；
- 水素原子；または
- 1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基（1以上の2重もしくは3重結合で任意に不飽和であり、1以上のヘテロ原子、1以上のハロゲン原子または1以上のアリールもしくはヘテロアリール基で任意に置換される）；または
- 3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル（1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基またはアルコキシ基で任意に置換される）
を表し；
- R4、R5、R6およびR7は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、-H、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、アルコキシ基、または3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキルから選択され；
R3およびR4は、それらを有するキノリン環の隣接する窒素および炭素原子と一緒になって5-もしくは6-員環を形成するように縮合することができると解釈される）
の少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２】
一般式(I)の化合物が、
- プロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 1):
- エチル 4-(1-ベンジル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 2):
- エチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 3):
- 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (化合物 4):
- ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 5):
- tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 6):
- ベンジル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 7):
- N-(4-ブチルカルバモイル)フェニル)-1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド (化合物 8):
- イソプロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 9)
から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
次の工程：
a) [Smo-一般式(I)の化合物]複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式(I)の化合物の少なくとも1つとを接触させ；
b) Smoothened受容体、一般式(I)の前記化合物および試験分子を接触させ；
c) 工程b)で回収されたSmoothened受容体を[Smo-一般式(I)の化合物]複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し；そして
d) Smoothened受容体との相互作用が測定される前記試験分子を選択する
を含む、Smoothened受容体のSmo2結合部位のリガンドをスクリーニングおよび／または特定するための方法。
【請求項４】
前記工程a)が液相で行われ、該工程が次の工程：
a) [Smo-一般式(I)の化合物]複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式(I)の化合物の少なくとも1つとを接触させ；
b) Smoothened受容体、一般式(I)の前記化合物および試験分子を接触させ；
c) 場合により1以上の試験分子および／または一般式(I)の前記化合物に結合させた、前記Smoothened受容体を回収し；
d) 工程c)で回収されたSmoothened受容体を[Smo-一般式(I)の化合物]複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し；そして
e) 相互作用が測定される前記試験分子を選択する
を含むことを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
工程a)が固体担体上で行われることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、Smo2結合部位に結合しないSmoothened受容体リガンドを特定することができる方法であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
その方法が、請求項3〜6のいずれか1つに記載の1つの方法の工程と追加の工程：
− Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞と前記の選択された分子とを接触させ、そして
− 前記細胞の前記細胞応答を誘導することができる分子を選択する
とを含むことを特徴とする、Smoothened受容体アゴニストを特定するための方法。
【請求項８】
次の工程：
a) 前記細胞応答を誘導するために、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞を、請求項1または請求項2で定義された一般式(I)の化合物の少なくとも1つと一緒に培養し；
b) 工程a)の最後で得られる細胞を試験分子と接触させ；
c) 前記細胞の前記細胞応答の阻害を誘導する分子を選択する
を含む、Smoothened受容体アンタゴニスト分子を特定するための方法。
【請求項９】
次の工程：
a) 前記細胞応答を誘導するために、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞を、請求項1で定義された一般式(I)の化合物の少なくとも1つと一緒に培養し；
b) 工程a)の最後で得られる細胞を試験分子と接触させ；
c) Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞の細胞応答の増大を誘導する分子を選択する
を含む、Smoothened受容体活性化の増強を誘導することができるアンタゴニスト分子を特定するための方法。
【請求項１０】
少なくとも機能的Smoothened受容体と請求項1または請求項2で定義された一般式(I)の化合物の少なくとも1つを含むキット。
【請求項１１】
次の工程：
a) 試験細胞を請求項1または請求項2で定義された一般式(I)の標識された化合物と接触させ；
b) 前記試験細胞の受容体に少しも結合していない、一般式(I)の前記標識された化合物を除くために前記細胞を洗浄し；
c) 標識された細胞を検出する
を含む、Smoothened受容体を発現している、腫瘍細胞のような細胞を特定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知のリガンド結合部位とは異なる受容体の結合部位を標的とするSmo受容体または関連受容体のリガンドである一般式(I)のキノリノン誘導体の、Smo受容体または関連受容体の調節剤を特定するための、ヘッジホッグシグナル伝達経路の特徴付けおよび診断のための研究ツールとしての使用に関する；本発明は、一般式(I)の前記誘導体を含むキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分化に好ましい経路である、ヘッジホッグ経路を調節する化合物は、胚もしく成体起源の幹細胞または多能性細胞の分化を促進するために用いられることができる利点を有する。疾病もしくは外傷後または年齢で損傷される組織の修復は、種々の細胞型に分化する能力を保持する幹細胞または前駆細胞をますます使用する。これらの細胞は、生物学的機能を回復させるために組織を新しくすることができる貯蔵所を構成する。間葉系幹細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞または造血支援(hematopoiesis-supporting)間質細胞を生じることができる。
【０００３】
一般的に、これらの細胞を選択された表現型に向ける技術は、面倒で（発現ベクターを用いる細胞の形質転換およびいくつかの遺伝子を発現させることが必要）、分化を誘導する小さい合成分子の使用のような代替の解決法が、有望な筋道を形成するであろう。
【０００４】
ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達分子は、多くの組織の形態形成および脳の発達においてならびに細胞増殖においても基本的な役割を果たすシグナル伝達経路を活性化する分泌タンパク質であり、成体の場合、組織維持および修復に関与するようである(Ingham and McMahon 2001; Wechlser-Reya and Scott 2001; Marti and Bovolenta 2002; Lum and Beachy 2004; Varjosalo and Taipale 2008)。
【０００５】
Hhタンパク質は、その前駆体のC-末端領域によって触媒される分子内開裂を受ける、約45 kDaの未完成な(immature)前駆体の形態で合成される。この開裂は、公知の付加機能を有しない25 kDaのC-末端フラグメントおよびそのC-末端側終端に結合したコレステロール分子を有する19 kDaの活性なアミノ-末端フラグメントを生じる。このN-末端フラグメントは、Hhタンパク質の公知のシグナル伝達活性の全てを有する。
【０００６】
Hhタンパク質シグナル伝達経路は、3つの主な構成要素： Patched負の調節因子(Ptc)およびSmoothened活性化因子(以後、区別なしにSmoまたはSmoothenedと表示される)から構成されるHhリガンド、膜貫通受容体回路、ならびに転写エフェクターを調節する細胞質複合体からなる。
【０００７】
哺乳動物において、12回膜貫通領域を含む糖蛋白質である、細菌のトランスポーターと相同のPtc1およびPtc2をそれぞれコードする2つのPtc遺伝子がある。Gタンパク質共役受容体ファミリーのタンパク質をコードするSmo遺伝子の産物は、公知の内因性リガンドを有しない。ヘッジホッグ経路の調節の正確なメカニズムは、まだ完全に解明されていない。Hhの非存在下、PtcはSmoの本質的な活性をブロックするように思われる。PtcへのHhの結合が、この阻害を解除し、Smoによるシグナルの変換を可能にするように思われる。PtcによるSmoの活性の調節のメカニズムは、Ptcによって輸送される分子およびSmoと相互作用する分子を含みうる(Taipale et al. 2002)。Gli転写因子の活性化は、Smoの活性から生じる事象のカスケードに関与する。I型膜貫通タンパク質HIP(ヘッジホッグ相互作用タンパク質)は、Hh分子のもう一つの受容体を構成し、前記経路の負の調節体を構成する(Ho and Scott 2002)。特に、dispatched (DispA)のような他の遺伝子は、可溶型のHhタンパク質の細胞外メジウム(medium)中への放出および蓄積に関与するように思われる(Ma et al. 2002)。つい最近、CdoおよびBocのようなその他の膜タンパク質が、Shhに結合でき、その効果を増強できると記載されている(Ma et al. 2008)。
【０００８】
最初はショウジョウバエで立証された、Hhタンパク質およびその関連した変換経路は、脊椎動物および無脊椎動物で保存されている。ただ1つのHh相同体がショウジョウバエには存在するのに対して、哺乳動物において、3つのHh相同体：ソニック(Shh)、インディアン(Ihh)およびデザート(Dhh)が存在する。これら3つの相同体の間で、Shhが、発達中のその幅広い発現プロファイルのために最も一般的に研究されている。Shhは、腹側中線(脊髄運動ニューロン、ドーパミン作動性またはコリン作動性ニューロン)に沿ういくつかの神経型の初期の表現型を特定すること(specifying)および腹側脊髄からの乏突起膠細胞前駆体の発生を誘導することにより神経管の腹側化に関与する(McMahon et al. 2003)。さらに、Shhは、GABA作動性およびドーパミン作動性ニューロンの生存を誘導し、セロトニン作動性前駆体の死へ向かわせ、そして、MPPトキシンによって引き起こされるドーパミン作動性ニューロンの死を防ぐ。最後に、それは、早期出生後小脳(early post-natal cerebellum)における顆粒細胞前駆体の増殖を誘導する。Hhファミリーのその他のメンバーは、それらの部分について、骨組織(Ihh)、精巣および末梢神経(Dhh)の発達にそれぞれ関与する。さらに、Shhで得られた結果は、DhhおよびIhhにも当てはまる。
【０００９】
胚発達の間のヘッジホッグタンパク質シグナル伝達経路の調節的役割は、広く研究されている：Hhは、正常な組織を維持および修復する工程、ならびに増殖と分化の時空間的な調節と関連しており、それゆえ、発達する組織が適当な細胞型ならびに血管新生および神経支配の適当な度合いを有する正しい大きさに達することを可能にする。Hhの機能の本質的な役割が、ヒトの胎児におけるこのシグナル伝達経路における欠陥の劇的な結果、例えばShh変異体で観察される全前脳症によって明らかにされている(Traiffort et al. 2004)。
【００１０】
Shh経路は、脊髄および成体の脳で確認されており、ここでは該分子のアミノ末端活性型が、早期出生後の期間に遭遇するより高いレベルで多くの領域で発現されている(Traiffort et al. 1999; Traiffort et al. 2001; Coulombe et al. 2004)。
【００１１】
成体でのShhの役割は完全に解明されていないが、幹細胞の維持および再生への関与がますます研究されている(Charytoniuk et al. 2002; Ahn and Joyner 2005; Stecca and Ruiz i Altaba 2009)。これらの幹細胞は、脳室下帯(SVZ)および海馬の顆粒細胞下帯(SGZ)を含む成体の脳のいくつかの領域で確認されている。これらは、一生の間、それぞれ嗅球および顆粒細胞層へ移動する能力を有する新しい前駆細胞を提供する。限定された病態下、これらの細胞は、それらの経路から損傷区域へ逸脱することができる。さらに、Shhは、SVZの神経前駆細胞上で化学走化性活性(chemoattractive activity)を有し、その効果はSmo阻害剤によりブロックされる(Angot et al. 2008)。Shhは、SGZの神経前駆細胞の増殖も刺激する(Lai et al. 2003)が、その結果は、SVZの結果では意見が分かれている。さらに、マウスの側脳室に注入されたShhは、大脳皮質中の乏突起膠細胞前駆体の数を増加させることも可能にし、それは、前記経路の活性化が、脱髄疾患における治療的興味を深くすることができることを示唆する(Loulier et al. 2006)。
【００１２】
最後に、パーキンソン病のモデルまたは末梢神経疾患のモデルで観察されるような病態下、Shhは、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンの軸索突起を保持することまたは坐骨神経の損傷後の運動回復に要する時間を減少することが可能である(Pepinsky et al. 2002; Tsuboi and Shults 2002)。
【００１３】
Shhシグナル伝達経路の機能不全は、多くの癌、具体的には皮膚の基底細胞癌および脳の髄芽腫に関連している。これらの腫瘍は、最も一般的に、ヘッジホッグ経路の過剰活性化に起因する、ヘッジホッグ経路の種々の関与物の変異に関係がある(Beachy et al. 2004; Scales and de Sauvage 2009)。より一般的には、これらの腫瘍の位置は、胚発達の間の該経路の構成要素の発現の部位と密接に相関する。限定しない例として、乳癌、髄膜腫、グリア芽腫、消化管癌（特に胃癌）、前立腺癌、卵巣線維腫および類皮腫、横紋筋肉腫、小細胞肺癌、ならびに口腔扁平上皮癌が挙げられうる。最近になって、Shhは乾癬に関連している。
【００１４】
多くの生理的プロセスにおけるHhタンパク質シグナル経路の必須の役割、および結果としてその機能不全に関連する病態の重要性のため、この経路の構成要素は、この経路を調節する、すなわち活性化または阻害することができ、それゆえ増殖、分化、遊走および生存(アポトーシス)を含む発達および／または分化した細胞と幹細胞の活性をインビトロおよび／またはインビボで、胚または成体において正あるいは負に調節することができる新規な分子の開発の標的を表す。
【００１５】
そのような分子、特に阻害性分子は、ヘッジホッグ経路の過剰活性化に関係する腫瘍：神経組織腫瘍（髄芽腫、原始神経外胚葉腫瘍、グリア芽腫、髄膜腫および乏突起膠腫）、皮膚腫瘍（基底細胞癌、毛包上皮腫）、筋肉および骨組織の腫瘍（横紋筋肉腫、骨肉腫）ならびにその他の組織（腎臓、膀胱）の腫瘍の値用に有用である。
【００１６】
そのような分子、特に刺激性分子は、Hh経路を含む神経変性タイプの病態(パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、多発性硬化症、運動ニューロン疾患)、およびHhシグナル伝達経路の調節が有益でありうる疾患、例えば糖尿病の治療にも有用である。
【００１７】
そのような分子は、組織、限定しないが、例えば神経組織［中枢神経系(脳)および末梢神経系(感覚、運動、交感神経のニューロン)］、骨、軟骨、精巣、肝臓、脾臓、小腸、膵臓、腎臓、平滑筋および骨格(squelletial)筋、心臓、肺、皮膚および体毛系、粘膜、血液細胞および免疫系の細胞の形成、再生、修復および／または活性の増加を誘導するための、Hh経路の非調節に関係する組織機能不全を含む多くの急性、亜急性または慢性で遺伝的もしくは後天性の病態の内科的あるいは外科的な治療(形成手術または癒合手術、組織または臓器の移植)においても有用である。これらの病態の限定しない例としては、特に神経傷害および関係する神経筋の疾患、糖尿病、脱毛症、熱傷、潰瘍形成(皮膚および粘膜)および精子形成障害が挙げられる。
【００１８】
ヘッジホッグ経路の活性を調節することができる種々の分子が特定されている（これらの分子のいくつかの構造は、以下に示される）：
−Pctタンパク質に作用する経路を刺激するHhタンパク質および誘導されたポリペプチド；
【００１９】
−オキシステロールから誘導されたアゴニスト(Corcoran and Scott 2006)およびSAGのようなより小さな有機分子(Chen et al. 2002)；Hh分子Ag1.2 (Frank-Kamenetsky et al. 2002)あるいはSmo受容体でのその活性が確立されているプルモルファミン(Sinha and Chen 2006)。最近、より活性なAg1.2誘導体が記載されている(Brunton et al. 2009)；
【００２０】
−ヘッジホッグ経路を阻害する窒素含有または無窒素の複素環式有機分子（国際出願WO 2007/054623、WO 2007/059157、WO 01/74344、WO 01/19800、WO 01/26644、WO 02/30421、WO 2005/033288、WO 2005/042700、WO 2008/014291およびWO 2007/120827参照）；このタイプの化合物が現在臨床試験中である（WO 2006/028958に記載されたGDC-0449）；
【００２１】
−ベンズアミダゾール誘導体（WO 2008/075196）;
−前記経路を阻害する、Veratrum sppから抽出された植物ステロイド（シクロパミン、ジェルビン等）およびそれらの誘導体（国際特許および出願US 6 432 970、WO 99/52534、WO 01/27135、US 6 291 516、WO 00/41545およびWO 02/30462ならびにTaipale et al., 2000およびBerman et al. 2002参照)。しかしながら、シクロパミンは、哺乳動物の胎児に全前脳症および単眼症を引き起こす催奇形性薬剤であり、他の植物ステロイド誘導化合物の哺乳動物に対して毒性がないことは、まだ立証されていない；
【００２２】
−ミフェプリストン (17β-ヒドロキシ-11β-(4-ジメチルアミノフェニル)-17α-(プロピ-1-イニル)エストラ-4,9-ジエン-3-オン)（RU-486またはRU-38486としても公知（出願FR 03/00646参照)）は、そのHhタンパク質シグナル伝達経路活性における阻害活性が立証されている；
【００２３】
−ヘッジホッグタンパク質シグナル伝達経路を阻害する、N-アシルチオウレアおよびN-アシルウレア分子（出願FR 08/02302参照)。
【００２４】
【化１】
2014500957.tif 000003
【００２５】
ヘッジホッグ経路の調節剤である化合物の構造：
SAG化合物は、前記経路のアゴニストであるのに対して、シクロパミン、Cur61414、GDC-0449、SANT-1、MRT-14、MRT-79およびMRT-81はアンタゴニストであり；これらの全ての化合物はSmo受容体に結合する。
【００２６】
ヘッジホッグ経路調節分子は、任意に公知化合物との競争の結合実験によって示すことが可能となったので、主にSmoothenedタンパク質に作用し；多くの最近の公表文献は、Smo受容体の構造変化の証拠を提供し、これらの調節剤のいくつかは、これらの構造の1つまたはもう1つに優先的に作用すると思われる。
【００２７】
Smo受容体によるHhシグナルの伝達および該標的遺伝子の活性化は、この受容体の一次繊毛への輸送(trafficking)に関係すると思われる。この輸送は、Hhそれ自身、ならびにSAGのような小さい刺激性分子(Rohatgi et al. 2007)あるいはシクロパミンのような小さな阻害性分子までもの作用によって刺激されうる。逆に、その他の阻害剤は、前記受容体の前記繊毛への転移を妨げる(Rohatgi et al. 2009; Wang et al. 2009; Wilson et al. 2009)。後者の著者は、前記繊毛に発現される受容体は、鞭毛内輸送(IFT輸送)系によって細胞内供給源から本質的に生じること提唱している(Wang et al. 2009)。
【００２８】
小さい分子を用いるこれらのデータは、Rohatgiらが2工程モデル：繊毛への転移の工程およびその後の受容体の活性化の第2工程を提案することをもたらした。これらの2つの工程は、種々のアンタゴニストがそれぞれの工程を別個にブロックすることができるので、薬理学的に区別されうる(Rohatgi et al. 2009)。同様に、Wilsonらは、Smoが、その位置および繊毛へのその輸送に影響を及ぼすいくつかの活性または不活性な構造で存在することを提唱する(Wilson et al. 2009)。
【００２９】
分子的観点から、Zhaoらは、Smoの不活性型は、細胞質尾部のアルギニン クラスター(cluster)によって維持される分子の静電相互作用によって維持されることを示している。Hhの作用に続いて、受容体はリン酸化され、これらの相互作用は分断される。次いで、構造変化が起こり、Smoの活性化に必要である細胞質尾部の2量化を誘導する(Zhao et al. 2007)。
【００３０】
これらの著者は、特異なリン酸化によって阻害されるアルギニン クラスターの数によって、Smo受容体は、Hhシグナル伝達の分子加減抵抗器(molecular rheostat)として働くことができることを提唱する。
【００３１】
Smo受容体の構造は、特に、薬理化合物の作用と関係があると思われる。該受容体の2つの公知のアンタゴニスト：SANT-1およびSANT-2は、該受容体の別個の部位にアロステリックに作用することが、最近示されている(Rominger et al. 2009)。さらに、SAGアゴニスト上のメチルをプロピルまたはアリルに単純に変えることが、Smo受容体の構造を調節することによって、この分子を強力なアンタゴニスト(IC50 = 20-70 nM、SANT75、SANT74)に変換することができることを公表している(Yang et al. 2009)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明者らは、分化を活性化するキノリン誘導体である新規な化合物を発見した；これらの化合物によって誘導される生物活性は、SAG、Smoアゴニストと比較して異なる薬理学的特徴を有するSmoアンタゴニストによって阻害され、それは、これらの化合物がSAGの結合部位とは異なる結合部位に作用することを立証している。
【００３３】
これらの化合物は、次の一般式(I)によって定義される：
【化２】
2014500957.tif 000004
【００３４】
（式中、
- Xは、オルト、メタまたはパラ位において、-H、-OH、-NH2、ハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、(アルコキシ基のアルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基、3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはアリール基を表し；
【００３５】
- R8は、X基を有する炭素以外の炭素上のオルト、メタまたはパラ位において、-(C=O)-NH-R1、-(C=O)-O-R1または-NH-(C=O)-R1を表し；
- Wは、-H、-OH、-NH2またはハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素を表し；
【００３６】
- R1、R2およびR3は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して；
- 水素原子；または
- 1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基（1以上の2重もしくは3重結合で任意に不飽和であり、OおよびSのような1以上のヘテロ原子、1以上のハロゲン原子または1以上のアリールもしくはヘテロアリール基、好ましくはピリジン基で任意に置換される）；または
- 3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル（1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基または(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基で任意に置換される）
を表し；
【００３７】
- R4、R5、R6およびR7は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、-H、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基、または3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロペンチルもしくはシクロヘキシルから選択され；
R3およびR4は、それらを有するキノリン環の隣接する窒素および炭素原子と一緒になって5-もしくは6-員環を形成するように縮合することができると解釈される）。
【００３８】
本発明のために、「アルキル」の用語は、1〜10個の炭素原子、好ましくは3〜8個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖状の飽和炭化水素ベースの脂肪族基を意味することが意図される。
【００３９】
「分枝」の用語は、1〜6個の炭素原子を有する少なくとも1つのアルキル基、例えばメチルまたはエチルを、直鎖のアルキル鎖が有していることを意味する。
【００４０】
好ましくは、一般式(I)の化合物は、R3基が、3〜8個の炭素原子を有するアルキル基、例えばヘキシル基であり；R2基が、水素原子または1〜3個の炭素原子を有するアルキル基であり；R4、R5、R6およびR7基は、水素原子または1〜3個の炭素原子を有するアルキル基を表すようなものである。
【００４１】
「ハロゲン原子」の用語は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素原子を意味することが意図され；臭素および塩素の意味が好ましい。
【００４２】
「アリール基」の用語は、少なくとも1つの芳香環から誘導されるいずれかの官能基または置換基を意味することが意図され；フェニル、ベンジルシクロブテン、ペンタレン、ナフタレン、ベンジルフェニルおよびアントラセン基が挙げられうる。
【００４３】
「ヘテロアリール基」の用語は、前で定義された芳香環の少なくとも1つから誘導され、かつP、S、OおよびNから選択されるヘテロ原子を少なくとも1つ含む、いずれかの官能基または置換基を意味することが意図され;ヘテロアリール基の中で、フラン、ピリジン、ピロール、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、ベンゾチオフェン、ベンゾ[c]チオフェン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プリンおよびアクリジン基が挙げられうる。
【００４４】
したがって、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路を特徴付けるための研究ツールとしての、前で定義された一般式(I)の化合物の使用に関する。
【００４５】
一般式(I)の化合物として、非限定的に、次の化合物が特に挙げられうる：
- プロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 1):
【化３】
2014500957.tif 000005
【００４６】
- エチル 4-(1-ベンジル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 2):
【化４】
2014500957.tif 000006
【００４７】
- エチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 3):
【化５】
2014500957.tif 000007
【００４８】
- 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (化合物 4):
【化６】
2014500957.tif 000008
【００４９】
- ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 5):
【化７】
2014500957.tif 000009
【００５０】
- tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 6):
【化８】
2014500957.tif 000010
【００５１】
- ベンジル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 7):
【化９】
2014500957.tif 000011
【００５２】
- N-(4-ブチルカルバモイル)フェニル)-1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド (化合物 8):
【化１０】
2014500957.tif 000012
【００５３】
- イソプロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 9):
【化１１】
2014500957.tif 000013
【００５４】
本発明に基づく一般式(I)の化合物は、図1に示される合成スキームに従って製造される。
図1の合成スキームに従って、第1の工程において、アニリンが、キノリノンカルボキシレートを得るためにマイクロウエーブ照射下、トリエチル メタン トリカルボキシレートと縮合され；次に、該キノロンが、カルボキシアミドキノリノンエステルを得るためにマイクロウエーブ照射下、4-tert-ブチルアニリンと縮合され；次の工程は、酸を得るためにこれらの化合物のエステル官能基をけん化することからなり、該酸が、実施例に示される種々の変更のための出発点である。
【００５５】
以下において、SAGが結合するSmo受容体の部位はSmo1と呼ばれ、一般式(I)の化合物が結合するSmo受容体の部位はSmo2と呼ばれる。
さらに、一般式(I)のこれらの化合物は、Hhタンパク質シグナル伝達経路または多能性細胞もしくは全能細胞を維持するかまたは分化させることに関与する他の経路、例えばWnt、Nocht、TGF-βまたはBMP経路に作用することができる。
【００５６】
それゆえ、これらの化合物は、これらのシグナル伝達経路の新しい調節剤を発見するためおよびSmo受容体または関連受容体の種々の型を検出しこれらの種々の型を調節することができる分子を特定するための両方のツールとして非常に有用であることが判る。
【００５７】
ヘッジホッグ経路の調節剤のための種々のスクリーニング方法が知られている：
− 系列または初代培養の細胞応答：細胞分化(C3H10T1/2)、細胞増殖(小脳の初代顆粒細胞)を用いる方法 (以下の実施例参照)；
【００５８】
− 標的受容体の膜貫通領域に作用する蛍光化合物(Bodipycyclopamine)との競争を用いる方法 (US 2007/0218775);
− 前記経路に関連するレポーター遺伝子を用いる方法 (Taipale et al. 2000, Nature, 406, 1005-9)；
【００５９】
− 試験化合物の存在または非存在下、Ptc-Hh相互作用を測定することによりHh活性を検出するアッセイ (US 2005/0282231)；
− Smoの下流に作用するHh経路の阻害剤を特定するため、Sufuおよびレポーター欠損細胞を用いるアッセイ (WO 2006/080894)。
【００６０】
したがって、本発明は、研究ツールとして、特にSmo2結合部位に結合することによってSmoothenedと相互作用することができる分子を特定するための一般式(I)の化合物の少なくとも1つの使用に関する。
【００６１】
特に、本発明は、Smoothened受容体のSmo2結合部位のリガンドをスクリーニングするためおよび／または特定するための方法に関し、その方法は次の工程を含む：
a) [Smo-一般式(I)の化合物]複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式(I)の化合物の少なくとも1つとを接触させ；
b) Smoothened受容体、一般式(I)の前記化合物および試験分子を接触させ；
c) 工程b)で回収されたSmoothened受容体を[Smo-一般式(I)の化合物]複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し；そして
d) Smoothened受容体との相互作用が測定される前記試験分子を選択する
を含む。
【００６２】
工程a)は、Smoothened受容体を発現する細胞または機能的Smoothened受容体を含む膜の抽出物、特に、Rivoyre et al.によって記載された方法(FEBS Letters 579, 2005, 1529-1533)を用いて得ることができる、機能的ヒトSmoothened受容体を有する酵母膜の抽出物を用いて行うことができる。
【００６３】
工程a)がSmoothened受容体を発現する細胞を用いて行われるとき、前記受容体の発現は、構成的(constitutive)(受容体が細胞によって自然に発現される)であるか、細胞の形質転換から生じるその他のいずれかであり、それゆえ、それは同種または異種のSmoothened受容体を発現または過剰発現する。このSmoothened受容体は、それに野生型受容体と異なる生化学的または薬理学的性質を付与する変異体を有することもできる。
【００６４】
一般式(I)のいずれかの化合物が、本発明の方法を行うために用いられることができる；しかしながら、それは、特にSmoothened受容体に対するその親和性により、当業者によって選択されうる。
【００６５】
工程a)は、液相中または適当な固体担体上で行われる；当業者は、例えば膜抽出物の形態または精製されたタンパク質の形態でのSmoothened受容体を用いるかどうかによって、実施のこれらの様式を選択して適応させるであろう。
【００６６】
工程a)が液相中で行われるとき、液相スクリーニング法は次の工程に従って行われる：
a) [Smo-一般式(I)の化合物]複合体を得るため、Smoothened受容体と一般式(I)の化合物の少なくとも1つとを接触させ；
b) Smoothened受容体、一般式(I)の前記化合物および試験分子を接触させ；
c) 場合により1以上の試験分子および／または一般式(I)の前記化合物に結合させた、前記Smoothened受容体を回収し；
d) 工程c)で回収されたSmoothened受容体を[Smo-一般式(I)の化合物]複合体と比較することによって、前記Smoothened受容体と前記試験分子との相互作用を検出し；そして
e) 相互作用が測定される前記試験分子を選択する。
【００６７】
工程a)は、Smoothened受容体を含む膜抽出物を用いて行うことができ、次いでそれを一般式(I)の化合物および試験分子とインキュベートし；次いで該混合物を遠心分離にかけ；遠心分離後得られるペレットを緩衝液中に再懸濁させ、次いで非特異的相互作用を除くために再度遠心分離にかける。次いで、試験分子のSmoothened受容体への結合を、蛍光を測定するかまたは一般式(I)の化合物の標識化による放射活性を測定するかのいずれかにより分析する：
【００６８】
− 液相スクリーニング法の一つの変形によれば、一般式(I)の前記化合物を予め標識化する。標識化は、先行技術の慣用の方法に従って、3H、11C、14C、32P、35S、125I、99mTc、18F、64Cu、76Br、124I、13N、15Oあるいは123Iのような放射性同位体の組み込みにより放射活性となり得る。一般式(I)の化合物の標識化は、当業者に公知の方法に従って、蛍光体を前記化合物に結合させることからもなりうる；標識は、通常、検出される放射性原子によって選択される放射線画像装置を用いるか、蛍光を測定することにより検出されうる。その場合、Smoothened受容体と1以上の試験分子との間の相互作用を検出する工程d)は、工程c)で回収されるSmoothened受容体の（放射活性によるかまたは蛍光による）標識を、[Smo-一般式(I)の化合物]複合体のそれと比較することによって行われる；選択される分子は、工程c)で回収されるSmoothened受容体の標識が[Smo-一般式(I)の化合物]複合体のそれより弱いものである。
【００６９】
− 液相スクリーニング法のもう1つの変形によれば、相互作用の検出は、[Smo-一般式(I)の化合物]複合体の位置を工程c)で回収されるSmoothened受容体のそれと比較することによるクロマトグラフィーによって行われる；もし位置が同じであれば、そのときはSmoothened受容体と試験分子との間の相互作用はなく；逆に、位置における差は、相互作用を示す；そのときは、試験分子とSmoothened受容体との間の相互作用が、Smo2結合部位で実際に起きていることを確認することが望ましい。
【００７０】
あるいは、本発明によるスクリーニング法の工程a)は、適当な固体担体上で行われうる。
「固体担体」の用語は、特に、酵素、抗体、ペプチド、微生物、生物組織、脂質、核酸等のような生物学的単位(biological entity)を含む膜からなる、試験分子との結合を可能にするバイオセンサー、およびリガンドのタンパク質受容体への結合のような生物学的シグナルを測定可能な物理的シグナル、例えば電気化学的(電流測定、電位差測定、電気伝導度測定の)、光学的(光)、圧電性または熱量測定のシグナルに変換することを可能にするトランスデューサーを意味することが意図される。本件の場合、膜上に結合された生物学的単位はSmoothened受容体であり；並行して行われる2つの実験において、固体担体上のSmoothened受容体が一般式(I)の化合物および一般式(I)の前記化合物と試験分子との混合物と接触させられ、これらの実験のそれぞれにおいて得られるシグナルが比較され、該シグナルの変更を誘導する分子が選択される。
【００７１】
例として、固体担体は、プラズモン共鳴によって結合を検出するためのバイオセンサーであり、その使用は、バイオセンサーの表面での質量の変化により、タンパク質とそのリガンドとの間の相互作用を視覚化し特徴付けること(親和定数、会合定数および解離定数)を可能にする。質量のこの変化は、バイオセンサーの表面でのプラズモン共鳴の角度における変化により測定され、放射性標識されたリガンドまたは蛍光リガンドを必要としない。
【００７２】
固体担体でのスクリーニング法が、Smoothened受容体を含む膜抽出物と一緒に行われるとき、これらの抽出物は脂溶性バイオセンサー上への注入により結合される。脂溶性バイオセンサーが用いられるとき、膜抽出物は、膜受容体とリガンドとの間の相互作用を追跡することができるデキストランに共有結合により結合された脂溶性基に結合する(Pourshafie MR, Marklund B-I and Ohlson S (2004) Binding interactions of Escherichia coli with globotetraosylceramide (globoside) using a surface Plasmon resonance biosensor. J.Microbiol. Meth., 58, 313-320; Wikstrom A and Deinum J (2007) Probing the interaction of coagulation factors with phospholipid vesicle surface plasma resonance. Anal. Biochem. 362, 98-107)。
【００７３】
したがって、本発明の変形によれば、プラズモン共鳴によって結合を検出するためのバイオセンサーは、その上へのSmoothened受容体を含む膜の調製が注入によって結合されるBiacore「センサーチップ(sensorchip) L1」疎水性バイオセンサー(GE Healthcare)のような脂溶性バイオセンサーである。
【００７４】
固体担体でのスクリーニング法が、精製されたSmoothened受容体と一緒に行われるとき、該受容体は、リガンドが該レセプターに結合するとき、レセプターが結合される接続部分(interface)の指標における変化を検出することにある表面プラズモン共鳴を測定するためのバイオセンサーに結合もされる。
【００７５】
一つの態様の変形によれば、固体担体でのスクリーニング法は、Smo2結合部位に結合しないSmoothened受容体リガンドを特定することもできる；これらのリガンドの作用の活性化または阻害は、次の方法によって特徴付けられる。
【００７６】
本発明は、Smoothened受容体アゴニスト、特にSmo2結合部位に結合するものを特定するための方法にも関し、それはリガンド特定法に対して記載された工程に加えて、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞と特定されたリガンドを接触させることおよび該細胞の該細胞応答を誘導することができるアゴニスト分子を選択する追加の工程を含む。
【００７７】
Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞は、アルカリホスファターゼ活性により測定可能な細胞分化でSmoothened受容体の活性化に応答する間葉細胞(例えばC3H10T1/2)；細胞増殖でSmoothened受容体の活性化に応答する小脳の初代顆粒細胞；成体の脳もしくは神経前駆の幹細胞または発達の間もしくは成体中の組織に存在するその他の前駆細胞の系列または初代培養から選択され、例えば、それらに対する細胞応答は、Gliファミリーの転写因子をコードするような遺伝子またはヘッジホッグ経路により活性化される遺伝子であるPatchedもしくはHipをコードするその他の遺伝子のような遺伝子の誘導からなるうる。
【００７８】
特に、本発明によるアゴニストを特定するための方法は、細胞応答として、フォルスコリンの存在下、試験化合物によるホスファターゼ活性の誘導を評価することによって行われうる（実施例IIのパート2参照、そこで、SAGのように化合物1が骨形成を刺激することができることが示されている）；化合物1（アゴニスト）はホスファターゼ活性を誘導するためのポジティブコントロールとして役立つことができる。
【００７９】
本発明は、Smoothened受容体アンタゴニスト分子を特定するための方法にも関し、次の工程を含む：
a) 細胞応答を誘導するために、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞を一般式(I)の化合物の少なくとも1つと一緒に培養し；
b) 工程a)の最後で得られる細胞を試験分子と接触させ；
c) 前記細胞の前記細胞応答の阻害を誘導する分子を選択する。
この方法の例は、以下の実験の部（実施例II）に示される。
【００８０】
Smoothened受容体アンタゴニスト活性を試験することが求められる分子は、特に、SmoothenedのSmo2結合部位に結合するリガンドであって、本発明によるリガンドを特定する前記の方法のいずれか1つによって特定される。
【００８１】
この同じ方法は、一般式(I)の化合物によって誘導されるSmoothened受容体の活性化の増強を誘導することができる分子を特定するためにも用いることができる；「増強」の用語は、一般式(I)の化合物によって誘導される活性化の度合いを増加させる分子の能力を意味することが意図される。それゆえ、Smoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞の細胞応答を増大することを誘導する分子が、選択されるであろう。
【００８２】
本発明は、本発明による方法を行うためのキットにも関し、それは、少なくとも機能的Smoothened受容体と少なくとも1つの一般式(I)の化合物を含む。機能的Smoothened受容体は、膜抽出物の形態かあるいはSmoothened受容体の活性化後に細胞応答を示す細胞のいずれかで存在する。
【００８３】
Smoothened受容体と一般式(I)の化合物との間の結合を含む実験は、次のものを特徴付けて特定するためにも用いることができる：
− Smo2結合部位が活性である構造でSmoothened受容体を発現している新しい細胞型；または
− Smoothened受容体に関連する受容体のような、分化に関与するその他の受容体。
【００８４】
次に、本発明は、Smoothened受容体を発現している、腫瘍細胞のような細胞を特定する方法に関し、次の工程を含む：
a) 試験細胞を一般式(I)の標識された化合物と接触させ；
b) 前記試験細胞の受容体に少しも結合していない、一般式(I)の前記標識された化合物を除くために前記細胞を洗浄し；
c) 標識された細胞を検出する。
【００８５】
本化合物は、細胞分化、増殖、細胞死、遊走もしくは細胞生存、または細胞がまだ獲得したことがない性質もしくは状態を取得することができるその他のものに関与する新しい受容体もしくは受容体の新しい形態を特定し特徴付けるためにも用いることができる。
【００８６】
本発明のもう1つの変形によれば、一般式(I)の化合物は、Smo2結合部位でのSmoothened受容体の活性化の因果関係を研究するための研究ツールとして用いられる。そのような研究は、例えば、一般式(I)の化合物と接触させることによる活性化の前および後の細胞によってメッセンジャーRNAおよび／またはタンパク質の発現プロファイルを比較することにある；該研究は、さらに、1つから誘導されかつ同じ細胞型の2つのグループの細胞、1つのグループの細胞は一般式(I)の化合物で、他方はSmo1以外の結合部位に結合することが知られているSmoアゴニストで活性化された細胞のメッセンジャーRNAおよび／またはタンパク質の発現プロファイルを比較することからなる。
【００８７】
mRNA定量化法は、遺伝子のファミリーまたは細胞によって発現されたその他の全ての遺伝子の発現パターンを解析することができる方法でありえ；ミクロRNA転写の調節も解析されうる。
【００８８】
細胞のこの生化学的または分子的特徴付けが、一般式(I)の化合物に感受性な腫瘍細胞を特定するために用いられ、それに続く段階で、一般式(I)の化合物に感受性な腫瘍の診断方法を開発するために用いられる。
【００８９】
一般式(I)の化合物は、Smo受容体の変異体の生物学的機能を特徴付けるためにも用いられる；この特徴付けは、Smo変異体の発現のためのベクターで細胞を形質変換し、Smo変異体を発現する前記細胞への一般式(I)の化合物の効果を観察することによって行うことができる。
【００９０】
前記の取り決め(arrangement)に加えて、本発明は、以下の記載から現れるであろうその他の取り決めも含み、それは、本発明による一般式(I)の化合物の薬理学的性質を示す実施例および次の添付の図にも言及する：
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】一般式(I)の化合物の合成スキームを表す。
【図２】一般式(I)の化合物の刺激活性。C3H10T1/2細胞の骨形成分化における、化合物1およびSAGに対する用量作用曲線。415 nmでのODで表されるアルカリホスファターゼ活性は、前記分化を示す。一つの実験は3〜5で行われた。
【図３】化合物1の活性はSmoアンタゴニストによって阻害される。C3H10T1/2 細胞を、化合物1 (1μM)および表示されたHh経路アンタゴニストの増大濃度の存在下、6日間インキュベートした。
【図４】化合物6の活性はSmoアンタゴニストによって阻害される。化合物6 (3μM)の活性は、図2で示されるアンタゴニストによって阻害された。
【図５】SmoアンタゴニストによるSAGの活性の阻害。SAG (0.1μM)の活性は、図2で示されるアンタゴニストによって阻害された。SAG化合物はSmo1結合部位に結合する。
【図６】フォルスコリンは、Smo2部位を刺激する化合物1に対する応答を増強し、Smo1部位を刺激するSAGのそれを減少する。C3H10T1/2間葉系幹細胞を、フォルスコリン(Fsk)の0.3、3または10μMの存在下、1μMでの化合物1(A)または0.3μMでのSAG(B)で処理した。アルカリホスファターゼ酵素活性は、ODとして示される。代表実験は3で行われた。4反復の平均±SEM。
【図７】IWR1化合物は、化合物1の活性を阻害し、SAGの活性に影響を及ぼさない。C3H10T1/2間葉系幹細胞を、IWR1の10μMの存在(白色のバー)または非存在下(灰色のバー)下、1μMでの化合物1または0.1μMでのSAGで処理した。アルカリホスファターゼ酵素活性は、ODとして示される。代表実験は3で独立して行われた。4反復の平均±SEM。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９２】
実施例１：一般式(I)の種々の化合物の合成
エチル 1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシレートの製造
【化１２】
2014500957.tif 000014
【００９３】
コンデンサーを備えた丸底フラスコ中、メタントリカルボン酸トリエチルエステル (1.35 ml, 6.4 mmol)の溶液に、N-ヘキシルアニリン (355 mg, 2 mmol)を加える。得られる反応混合物をCEM Discoveryマイクロウエーブオーブン中に入れ、開放した丸底フラスコ中で照射し、次いで生成されるエタノールを溜去する（パラメータは次のとおりである：出力 = 250 W、温度 = 225℃、実行時間 = 5分、保持時間 = 15分）。
【００９４】
マイクロウエーブ加熱後、粗反応混合物を、4:1で石油エーテル：酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーカラムで精製する。得られる結晶の生成物を乾燥し、本化合物：収量 = 430 mg (69%)を得る。
【００９５】
1H NMR (CDC13): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.64 (m, 1H), 7.27-7.19 (m, 2H), 4.48 (q, J = 8Hz, 2H), 4.18 (t, J=8Hz, 2H), 1.72-0.86 (m, 14H).
【００９６】
I.A. tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物6)
【化１３】
2014500957.tif 000015
【００９７】
エチル 1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシレート (159 mg, 0.5 mmol)およびtert-ブチル 4-アミノベンゾエート (193 mg, 1 mmol)を無水トルエン (4 ml)中に懸濁し、開放の容器を用いてマイクロウエーブ加熱した（パラメータは次のとおりである：出力 = 200 W、温度 = 120℃、実行時間 = 7分、保持時間 = 10分）。
【００９８】
反応の最後で、溶媒の2/3をコンデンサーなしで蒸発させる。粗反応混合物を4:1の石油エーテル：酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーカラムにより精製する。得られる結晶の生成物を乾燥し、標記の化合物：収量 = 195 mg (84%)を得る。
【００９９】
1H NMR (DMSO): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.90-7.75 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.25 (bs, 2H), 1.60 (bs, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H).
【０１００】
I.B. 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (化合物 4)
【化１４】
2014500957.tif 000016
【０１０１】
0℃に冷却したトリフルオロ酢酸(TFA)の溶液に、tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (83 mg, 0.18 mmol)を少しずつ加え、該混合物を3時間反応させる。得られる粗生成物を、白色の結晶固体が生じるまでエチルエーテルで洗浄する。生成物を乾燥し、収量61 mg (83%)を得る。
【０１０２】
1H NMR (DMSO): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.97-7.65 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.27 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H).
【０１０３】
I.C. ベンジル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 7)
【化１５】
2014500957.tif 000017
【０１０４】
4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (41 mg, 0.1 mmol)のTHF溶液を0℃に冷却し、ベンジル アルコール (21 mg, 20 μl, 0.2 mmol)をEDCI (19 mg, 0.1 mmol)およびジメチルアミノピリジン (3 mg, 0.02 mmol)と一緒に加える。反応混合物を終夜撹拌する。有機層を水で洗浄し、減圧下に蒸発させる。粗生成物を4:1 石油エーテル：酢酸エチルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製し、収量30 mg (60%)を得る。
【０１０５】
1H NMR (DMSO): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 8.04 (d, J=8Hz, 2H), 7.83 (d, J=8Hz, 3H), 7.68 (d, J=8Hz, 1H), 7.46-7.25 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 5.30 (s, 2H), 4.28 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.41-1.15 (m, 6H), 0.84 (bs, 3H).
【０１０６】
実施例 II − SAG化合物が作用する部位(Smo1)とは異なる特定の結合部位(Smo2)に一般式(I)の化合物が結合することの実証
本発明による一般式(I)の化合物の分化の刺激に対する効果を、インビトロで多能性線維芽細胞株C3H10T1/2を分析することにより測定した。
この活性化は、Hh経路アンタゴニストとして前に記載された化合物、より具体的にはSmo受容体アンタゴニストにより阻害される。さらに、これらの薬剤は、Hh経路アゴニストであるSAG (Chen et al. 2002)によって用いられるものとは区別されるシグナル伝達様式を有する。
【０１０７】
1) 材料と方法
一般式(I)の化合物による分化の活性化
試験された一般式(I)の化合物は、化合物1および6：
【化１６】
2014500957.tif 000018
であり、それらはジメチルスルホキシド中、2.5 mMの濃度に溶解され、次いで、用いられるまで-20℃の温度で保存された。
【０１０８】
多能性線維芽細胞株C3H10T1/2 (ATCC)は、ATCCによって推奨される条件下で培養された。これらの細胞の分化の刺激は、ChenらおよびFrank-Kamenetskyらによって記載された方法(Chen et al. 2002; Frank-Kamenetsky et al. 2002)に従って、化合物の増大濃度を用いて行った。一般式(I)の化合物による活性化は、細胞株の分化を引き起こし、該細胞株がアルカリホスファターゼを発現することを可能にする。したがって、アルカリホスファターゼ活性の測定によって化合物の活性を測定することができた。比較として、SAG化合物 (Chen et al. 2002)、Smo活性剤の活性を、一般式(I)の化合物を試験するために用いられたのと同じ条件下で試験した。
【０１０９】
C3H10T1/2細胞を、ウエル当たり5×103 細胞の密度で96ウエルプレートに播種し、24時間後、10%のウシ胎仔血清が追加されたDMEM培地中、10 nM〜10 μMの範囲の濃度で試験化合物を添加した。試験は4反復で行った。次いで、プレートを5% CO2の雰囲気下、37℃の温度で5-6日間インキュベートした。次いで細胞を冷たいリン酸緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水：PBS)中で洗浄し、次いで、0.9%のNaClおよび0.2%のTriton X-100を含む50 μlの溶液中、4℃での超音波処理により溶解した。
【０１１０】
次いで、得られた溶解物中のアルカリホスファターゼを、Pepinskyらによって記載された方法(Pepinsky et al. 1998)に従って測定した。100 μmの反応緩衝液 (200 mM Tris-HCL; pH 10.5; 0.4 Mの2-アミノ-2-メチルプロパノールおよび8 mMのMgCl2)と50 μlの基質 (4 mMのジナトリウム p-ニトロフェニル ホスフェート)の溶液を添加後、該溶解物を37℃で30-60分間インキュベートし、次いで光学密度を415 nmの波長で読み取った。.
【０１１１】
ヘッジホッグ経路アンタゴニストによる分化の阻害
阻害実験のため、Cur61414 (Frank-Kamenetsky et al. 2002)、シクロパミン (Incardona et al. 1998)、GDC-0449 (Romer et al. 2004)、それから分子 MRT-14, MRT-79, MRT-80およびMRT-81 (特許出願FR 08/02302)のような前記のSmo阻害剤の増大濃度(0.1 nM〜30 μM)の存在下、分化を刺激するため、化合物 1 (1 μM)、化合物 6 (3 μM)またはSAG (0.1 μM)を用いた。これらの化合物は、100% エタノール (Cur61414、シクロパミン)またはジメチルスルホキシド (化合物 MRT-14、MRT-79、MRT-80、MRT-81およびGDC-0449)に溶解し、次いで-20℃で保存した。
【０１１２】
フォルスコリンおよびIWR1の活性
フォルスコリンの存在下の実験のため、フォルスコリン(Sigma)の増大濃度(1、3および10 μM)の存在下、分化を刺激するため、化合物1 (1 μM)およびSAG (0.3 μM)を用いた。一方、1 μMでの化合物1または0.1 μMでのSAGによる活性化に対して、IWR1 化合物(Sigma)を10 μMで用いた。アルカリホスファターゼ活性は前記のように測定された。
【０１１３】
2) 結果
2-1. 化合物1および6による分化の活性化
化合物1および6が、C3H10T1/2多能性細胞において骨形成を刺激する能力を有することが実証された。この分化は、分化6日後のアルカリホスファターゼの誘導に関連する。図2は、C3H10T1/2細胞の刺激に対して、化合物1および並列して作成されたSAGの用量作用曲線を表す。化合物1は、同様の親和性でSmoアゴニストSAGのそれよりも大きい最大刺激を得ることを可能にする。
【０１１４】
2-2. Smoothenedアンタゴニストによる化合物1および6の活性の阻害
化合物1の活性は、Smo受容体アンタゴニストによって阻害される(図3)。それは、シクロパミン、Cur61414、GDC-0449または化合物MRT-14およびMRT-81のような公知のアンタゴニストの増大濃度の存在下、化合物1によって誘導されるアルカリホスファターゼ活性の段階的阻害に反映される。
【０１１５】
化合物6も、Smoアンタゴニストによって阻害されうる特性を有する(図4)。2つの化合物1および6において、試験されたアンタゴニストの活性を比較するとき、これら2つの骨形成刺激剤に対する大きな薬理学的類似が注目される。このことは、これらの化合物に関して作用が同一の様式であることを提示している。
【０１１６】
2つの化合物1および6に対する、Smoアンタゴニストの親和性が測定され、表Iに示される。それらは、アゴニスト化合物によって誘導される生物学的応答の50%を阻害することができる濃度に相当するIC50として表される。化合物MRT-14およびMRT-81は、2つの化合物に対して非常に近い値を有して、その応答に対して良好な親和性を示す。化合物1および6に対して、MRT-14の親和性は、それぞれ0.32および0.4 μMであり、一方、両化合物に対するMRT-81のそれは0.06 μMである。逆に、シクロパミン、Cur61414およびGDC-0449は、これらの化合物に対してほとんど親和性を有しない(IC50 = 2-10 μM)。
【０１１７】
【表１】
2014500957.tif 000019
【０１１８】
表 I：Smo2部位に対するヘッジホッグ経路アンタゴニストの親和性
C3H10T1/2細胞の分化は、化合物1 (1 μM)および6 (3 μM)で誘導されるアルカリホスファターゼによって測定される。IC50値は、図3および4に示される阻害曲線から誘導される。4反復での2〜6での平均 ( SEM。
【０１１９】
化合物1および6は、Smo2結合部位に結合し、それらの結合は、同じ親和性を有するヘッジホッグ経路アンタゴニストによってブロックされる。
【０１２０】
2-3. Smo1およびSmo2部位に対するSmoothenedアンタゴニスト活性の比較
化合物1で行われたものと並行して、0.1 μMのSAGの存在下、前記アンタゴニストに対する用量作用曲線も作成された(図5)。SAG化合物は、Smo1と呼ばれる結合部位に作用する。これら2つの化合物に対するアンタゴニストの薬理学の比較が表IIに示される。
【０１２１】
SAGまたは化合物1による刺激に対するSmoアンタゴニストの活性が比較されるとき、得られる最大阻害およびその親和性(IC50)の両方の観点で重要な差異が存在する。第1の注目すべき差異は、化合物1に対して10 μMで観察されたシクロパミン、Cur61414およびGDC-0449によるより弱い阻害であるのにに対して、これらの化合物はSAGの存在での完全な阻害を可能にする。
【０１２２】
【表２】
2014500957.tif 000020
【０１２３】
表 II：Smo1およびSmo2部位に対するヘッジホッグ経路アンタゴニストの活性の比較
化合物1およびSAG化合物によってC3H10T1/2細胞に誘導される間葉系幹細胞の細胞分化を測定する応答は、化合物1 (1 μM)およびSAG化合物 (0.1 μM)によって誘導されるアルカリホスファターゼ活性によって測定される。IC50値は、図3および5に示される阻害曲線から誘導される(4反復の2〜6の独立した実験の平均 ( SEM)。
【０１２４】
SAG化合物および化合物1は、Smo1およびSmo2結合部位にそれぞれ結合する。それらの結合は、ヘッジホッグ経路アンタゴニストによりブロックされる(4反復の2〜6の独立した実験の平均 ( SEM)。
【０１２５】
化合物MRT-14およびMRT-81それと化合物SANT-1は、類似の値で、(SAGにより刺激される)Smo1部位および(化合物1により刺激される)Smo2部位に対して同程度の親和性を示す。一方、その他のヘッジホッグ経路アンタゴニストは、Smo2部位よりSmo1部位に対してずっと選択的である(Cur61414、GDC-0449)。逆に、化合物MRT-81およびMRT-79は、Smo1部位よりSmo2部位に対してより選択的である。このことは、SAGおよび化合物1で得られる化合物のIC50値の間の比が計算されると明らかにされる(表III)。
【０１２６】
【表３】
2014500957.tif 000021
【０１２７】
表 III：Smo1およびSmo2部位に対するヘッジホッグ経路アンタゴニストの選択性
(SAG, 0.1 μMで刺激される)Smo1部位および(化合物1, 1 μMで刺激される)Smo2部位に対するアンタゴニストのIC50値が、表IおよびIIにおけるように評価された(2〜6の実験で得られたIC50値の平均の比)。
【０１２８】
Smo2部位と比較してSmo1部位に対して、300倍以上の選択性がGDC-0449で、17倍の選択性がCur61414で観察されるのに対して、SANT-1はSmo1およびSmo2部位に対して類似の活性を保持する。 逆に、化合物MRT-81、MRT-55およびMRT-79は、Smo2部位に対して、それぞれ1.3、2.5および12.5倍より選択的である。前記化合物のこの特異性は、意義深いことであり、Smo1およびSmo2結合部位のレベルでの重要な薬理学的な差異を立証している。
【０１２９】
2-4. Smo1とSmo2部位は異なる活性化のメカニズムを示す
フォルスコリンによる化合物1およびSAGの活性の調節
一般式(I)の化合物およびSAGは、別個の経路により作用する。実際、フォルスコロンは、間葉系幹細胞におけるHh経路によって誘導される骨形成の阻害剤であることが知られている(Wu et al. 2004)。以下の試験の目的は、この特性が一般式(I)の化合物にも適用できるかどうかを決めることである。
【０１３０】
C3HT10T1/2細胞の分化は、フォルスコリンの存在下、化合物1によって刺激された。図6、パネル(A)に示されるようよう、フォルスコリンが化合物1への応答において増強効果を有することを明示しているのに対して、フォルスコリンはSAG化合物の活性を阻害することを明示している(B)。それゆえ、これら2つの骨形成刺激剤は、別個の経路により作用する。フォルスコリンののこの効果は、一般式(I)のその他の化合物に対しても見られた。
【０１３１】
IWR1化合物、Wnt経路アンタゴニストによる、化合物1およびSAGの活性の調節
化合物1およびSAGにおけるフォルスコリンの活性の差は、一般式(I)の化合物の活性に関与する他の細胞内経路への探求に導いた。Hh経路に加えて、C3H10T1/2細胞の分化は、例えば、Wnt、Nocht、TGF-βまたはBMP経路のようなシグナル伝達経路によって刺激される。Wnt経路に関して、カノニカル(canonical)経路の活性化は、TCF/LEF遺伝子の転写の活性に関与するβ-カテニンの活性化を誘導する。Wntリガンドの非存在下、β-カテニンはリン酸化され、次いで分解される。最近、axin2を安定化し、β-カテニンの破壊をもたらす分子IWR1が発見された(Chen et al. 2009)。axin2および／またはβ-カテニンが、化合物1によって誘導されるシグナルの変換に関与することができるかどうかを決定するためにこの阻害剤が用いられた。
【０１３２】
IWR1は、1 μMの濃度で用いられた化合物1の活性を60%減ずることができるのに対して、SAGのそれは変えなかった(図7)。IWR1化合物を用いた化合物1の用量作用曲線は、 アルカリホスファターゼ阻害に対して、IC50 = 2.5 μMを推定することを可能にした。この値は、Wnt形態形成経路の阻害を測定する試験(TCF/ルシフェラーゼ受容体遺伝子を用いる誘導試験)により決定されたIWR1の親和性(Chen et al., Nat Chem Biol, 2009)に一致する。
【０１３３】
この実験は、一般式(I)の化合物の作用がaxin2タンパク質を含むことを示している。β-カテニンの活性の制御におけるaxin2タンパク質の役割が、これらの化合物によって誘導される生物活性は、β-カテニン経路を含みうることを提示している。この経路は、例えば結腸直腸癌のような多重病態と関連する。さらに一般的には、それは、胚および成体の組織中の幹細胞の維持に関与し、それは神経新生を調節し、遺伝病に関与する(Freeseらによる2010年の総説を参照)。それゆえ、Smo2結合部位をブロックすることができる選択的化合物の特定は、非常に興味がある。
【０１３４】
結論
これらの実験は、Smo1もしくはSmo2部位の一方または他方、あるいは両方の部位に作用する特定の構造を示す細胞分化アンタゴニストを特定および選択するために、一般式(I)の化合物を用いることができることを実証している。式(I)の化合物によって誘導されるその他の生物学的応答（増殖、遊走、アポトーシス、遺伝子誘導等）の特定が、これらのSmo2結合部位を調節する化合物を特定するための試験の開発を可能にするであろう。これらの新規な化合物は、健康な個体または病状に罹患している個体におけるこれらの種々の応答を調節することを可能にするであろう。
【０１３５】
参考文献
Ahn, S. and A. L. Joyner (2005). "In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog." Nature 437(7060): 894-7.
Angot, E., K. Loulier, et al. (2008). "Chemoattractive activity of sonic hedgehog in the adult subventricular zone modulates the number of neural precursors reaching the olfactory bulb." Stem Cells 26(9): 2311-20.
Beachy, P.A., S.S. Karhadkar, et al. (2004). "Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis." Nature 432(7015): 324-31.
Berman, D. M., S. S. Karhadkar, et al. (2002). "Medulloblastoma growth inhibition by hedgehog pathway blockade." Science 297(5586): 1559-61.
Brunton, S. A., J. H. Stibbard, et al. (2009). "Potent agonists of the Hedgehog signaling pathway." Bioorg Med Chem Lett 19(15): 4308-11.
【０１３６】
Charytoniuk, D., E. Traiffort, et al. (2002). "Intrastriatal sonic hedgehog injection increase Patched transcript levels in the adult rat subventricular zone." Eur J Neurosci 16(12): 2351-7.
Chen, B., M. E. Dodge, et al. (2009). "Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer." Nat Chem Biol 5(2): 1007.
Chen, J. K., J. Taipale, et al. (2002). "Small molecule modulation of Smoothened activity." Proc Natl Acad Sci U S A 99(22): 14071-6.
Corcoran, R. B. and M. P. Scott (2006). "Oxysterols stimulate Sonic hedgehog signal transduction and proliferation of medulloblastoma cells." Proc Natl Acad Sci U S A 103(22): 8408-13.
Coulombe, J., E. Traiffort, et al. (2004). "Hedgehog interacting protein in the mature brain: membrane-associated and soluble forms." Mol Cell Neurosci 25(2): 323-33.
【０１３７】
Frank-Kamenetsky, M., X. M. Zhang, et al. (2002). "Small-molecule modulators of Hedgehog signaling: identification and characterization of Smoothened agonists and antagonists." J Biol 1(2): 10.
Freese, J. L., D. Pino, et al. "Wnt signaling in development and disease." Neurobiol Dis 38(2): 148-53.
Ho, K. S. and M. P. Scott (2002). "Sonic hedgehog in the nervous system: functions, modifications and mechanisms." Curr Opin Neurobiol 12(1): 57-63.
Incardona, J. P., W. Gaffield, et al. (1998). "The teratogenic Veratrum alkaloid cyclopamine inhibits sonic hedgehog signal transduction." Development 125(18): 3553-62.
Ingham, P. W. and A. P. McMahon (2001). "Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles." Genes Dev 15(23): 3059-87.
【０１３８】
Lai, K., B. K. Kaspar, et al. (2003). "Sonic hedgehog regulates adult neural progenitor proliferation in vitro and in vivo." Nat Neurosci 6(1): 21-7.
Loulier, K., M. Ruat, et al. (2006). "Increase of proliferating oligodendroglial progenitors in the adult mouse brain upon Sonic hedgehog delivery in the lateral ventricle." J Neurochem 98(2): 530-42.
Lum, L. and P. A. Beachy (2004). "The Hedgehog response network: sensors, switches, and routers." Science 304(5678): 1755-9.
Ma, G., Y. Xiao, et al. (2008). "Recent progress in the study of Hedgehog signaling." J Genet Genomics 35(3): 12937.
Ma, Y., A. Erkner, et al. (2002). "Hedgehog-mediated patterning of the mammalian embryo requires transporter-like function of dispatched." Cell 111(1): 63-75.
【０１３９】
Marti, E. and P. Bovolenta (2002). "Sonic hedgehog in CNS development: one signal, multiple outputs." Trends Neurosci 25(2): 89-96.
McMahon, A. P., P. W. Ingham, et al. (2003). "Development roles and clinical significance of hedgehog signaling." Curr Top Dev Biol 53: 1-114.
Pepinsky, R. B., R. I. Shapiro, et al. (2002). "Long-acting forms of Sonic hedgehog with improved pharmacokinetic and pharmacodynamic properties are efficacious in a nerve injury model." J Pharm Sci 91(2): 371-87.
Pepinsky, R. B., C. Zeng, et al. (1998). "Identification of a palmitic acid-modified form of human Sonic hedgehog." J Biol Chem 273(22): 14037-45.
Rohatgi, R., L. Milenkovic, et al. (2009). "Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process." Proc Natl Acad Sci U S A 106(9): 3196-201.
【０１４０】
Rohatgi, R., L. Milenkovic, et al. (2007). "Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium." Science 317(5836): 372-6.
Romer, J. T., H. Kimura, et al. (2004). "Suppression of the Shh pathway using a small molecule inhibitor eliminates medulloblastoma in Ptc1(+/-)p53(-/-) mice." Cancer Cell 6(3): 229-40.
Rominger, C. M., W. L. Bee, et al. (2009). "Evidence for allosteric interactions of antagonist binding to the Smoothened receptor." J Pharmacol Exp Ther 329(3): 995-1005.
Scales, S. J. and F. J. de Sauvage (2009). "Mechanisms of Hedgehog pathway activation in cancer and implications for therapy." Trends Pharmacol Sci 30(6): 303-12.
Sinha, S. and J. K. Chen (2006). "Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened." Nat Chem Biol 2(1): 29-30.
【０１４１】
Stecca, B. and A. Ruiz i Altaba (2009). "A GLI1-p53 inhibitory loop controls neural stem cell and tumour cell numbers." Embo J 28(6): 663-76.
Taipale, J., J. K. Chen, et al. (2000). "Effects of oncogenic mutations in Smoothened and Patched can be reversed by cyclopamine." Nature 406(6799): 1005-9.
Taipale, J., M. K. Cooper, et al. (2002). "Patched acts catalytically to suppress the activity of Smoothened." Nature 418(6900): 892-7.
Traiffort, E., D. Charytoniuk, et al. (1999). "Discrete localizations of hedgehog signalling components in the developing and adult rat nervous system." Eur J Neurosci 11(9): 3199-214.
Traiffort, E., C. Dubourg, et al. (2004). "Functional characterization of sonic hedgehog mutations associated with holoprosencephaly." J Biol Chem 279(41): 42889-97.
【０１４２】
Traiffort, E., K. L. Moya, et al. (2001). "High expression and anterograde axonal transport of aminoterminal sonic hedgehog in the adult hamster brain." Eur J Neurosci 14(5): 839-50.
Tsuboi, K. and C. W. Shults (2002). "Intrastriatal injection of sonic hedgehog reduces behavioral impairment in a rat model of Parkinson's disease." Exp Neurol 173(1): 95-104.
Varjosalo, M. and J. Taipale (2008). "Hedgehog: functions and mechanisms." Genes Dev 22(18): 2454-72.
Wang, Y., Z. Zhou, et al. (2009). "Selective translocation of intracellular Smoothened to the primary cilium in response to Hedgehog pathway modulation." Proc Natl Acad Sci U S A 106(8): 2623-8.
Wechsler-Reya, R. and M. P. Scott (2001). "The developmental biology of brain tumors." Annu Rev Neurosci 24: 385-428.
【０１４３】
Wilson, C. W., M. H. Chen, et al. (2009). "Smoothened adopts multiple active and inactive conformations capable of trafficking to the primary cilium." PLoS One 4(4): e5182.
Wu, X., J. Walker, et al. (2004). "Purmorphamine induces osteogenesis by activation of the hedgehog signaling pathway." Chem Biol 11(9): 1229-38.
Yang, H., J. Xiang, et al. (2009). "Converse conformational control of Smoothened activity by structurally related small molecules. J Biol Chem 284(31): 20876-84.
Zhao, Y., C. Tong, et al. (2007). "Hedgehog regulates Smoothened activity by inducing a conformational switch." Nature 450(7167): 252-8.
【図１】
2014500957.tif 000024
【図２】
2014500957.tif 000025
【図３】
2014500957.tif 000026
【図４】
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【図５】
2014500957.tif 000028
【図６】
2014500957.tif 000029
【図７】
2014500957.tif 000030
【国際調査報告】
2014500957.tif 000031
2014500957.tif 000032
2014500957.tif 000033
2014500957.tif 000034
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