(57)【要約】  本発明は、水性溶液中に配合されたヒアルロン酸を、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤の使用であって、前記添加剤が、２０，０００ダルトン以上の分子量および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する１種または複数の多糖を含み、組成物中の前記多糖（複数可）およびヒアルロン酸の総濃度が、組成物に少なくとも５００ｃＰの粘度を与えることを特徴とする使用に関し、これは特に人間または動物に対する関節内、皮内または眼球内投与に好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性組成物中に配合されたヒアルロン酸を、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤の使用であって、該添加剤が、２０，０００ダルトン以上の分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する１種または複数の多糖を含み、組成物中の前記１種または複数の多糖およびヒアルロン酸が、組成物に少なくとも５００ｃＰの粘度を与えることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記組成物が、人間または動物の関節内、皮内または眼球内投与に好適であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記多糖が、ジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸が２×１０５ダルトン以上の分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸、および単独または混合物としての前記多糖が、それぞれ１：１０と１０：１との間の範囲の重量比率を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
２×１０５ダルトン以上の分子量を有するヒアルロン酸の水性組成物であって、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤として、２０，０００ダルトンを超える分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する少なくとも１種の多糖を含み、少なくとも５００ｃＰの粘度を有することを特徴とする、水性組成物。
【請求項７】
人間または動物の関節内、皮内または眼球内投与に好適である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸、および単独または混合物としての前記多糖が、それぞれ１：１０と１０：１との間の範囲の重量比率を有することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記多糖が、ジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
２０，０００ダルトンを超える分子量および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有し、最終的な組成物として少なくとも５００ｃＰの粘度を有する水性組成物中に配合されたヒアルロン酸を、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための多糖。
【請求項１１】
前記組成物が人間または動物の関節内、皮内または眼球内投与に好適である、請求項１０に記載の多糖。
【請求項１２】
ジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の多糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱または主としてヒアルロニダーゼのような酵素の分解作用に対して安定化されたヒアルロン酸組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は脊椎動物の全ての組織および生物流体中、特に結合組織中に存在する多糖である。ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンファミリーに属し、β１−４グリコシド結合により結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとグルクロン酸ナトリウムからなる二糖単位の繰り返しによって形成される、以下の構造の直鎖状で分岐のない多糖である。
【０００３】
【化１】
2014506876.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】１２０分まで(ｘ軸上の時間)で得られる粘度値(ｃＰで表す)残存率(％)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
ヒアルロン酸は１０４ダルトンと１０７ダルトンとの間の範囲の平均分子量を有する。例えば、７×１０６ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸が滑液中に存在する。
【０００６】
ヒアルロン酸およびその誘導体、特にナトリウム塩等のその塩は、治療目的に広く使用される。その高い粘度、レオロジー特性、生体適合性および完全な生分解性は、ヒアルロン酸の医療および皮膚科的用途への広範な使用を可能とする。本発明の権利範囲によれば、医療分野における用途の例としては、眼科手術における眼球内への注入、整形外科における滑液機能性修復のための関節内への注入、および美容術のための皮内充填剤を包含する。馬における関節内補充療法などのその他の用途の例が、獣医学分野において見出すことができる。
【０００７】
ヒアルロン酸の生理学的および物理化学的特性はその分子量と関係付けられる。滑液中に存在するような、十分に高い重量を有する高分子鎖は、衝撃吸収能力および潤滑特性の基礎となる高粘度を有する。
【０００８】
分解の場合における高分子鎖の分断によるなどの分子量の好ましからざる低下は、ヒアルロン酸の特徴的性質の喪失をもたらす。
【０００９】
ヒアルロン酸の分解の主たる因子は熱および特定の酵素、特にヒアルロニダーゼ酵素である。ヒアルロン酸を高温またはヒアルロニダーゼの作用に晒すことは、分子量および粘度の低下、並びにその結果としてヒアルロン酸の特徴的性質の低下を伴う多糖鎖の分断を引き起こす。
【００１０】
ヒアルロン酸の不安定性は、特に高分子量の多糖に特異的なレオロジー挙動を必要とする全ての用途に対してその使用を制限する。この理由により、ヒアルロン酸鎖を架橋することにより得られる半合成誘導体一式が開発されている。架橋誘導体は特にヒアルロニダーゼによる酵素分解に対してより耐性を有する。
【００１１】
共有結合により結合する架橋分子を挿入することでヒアルロン酸を構造的に修飾することにより、分解因子に対する不活性が増大する。しかし、実際は、このような方法では、天然産でも内在性でもなく、ヒアルロン酸に比較して生体適合性が著しく低い新しい高分子が得られる。架橋反応残渣の潜在的な存在と共に、この側面が、ヒアルロン酸のこれら架橋誘導体に対して生じ得る幾つかの好ましからざる副作用の理由であり、そのためこれらの使用が制限されている。
【００１２】
その安全性および特徴的な性質を損なう構造的な修飾なしに、向上した安定性を有するヒアルロン酸を得ることを可能とすることは、結果として、この多糖の理想的な使用を妨げる技術的課題のままである。
【００１３】
本発明によれば、驚くべきことに、特定の多糖物質をヒアルロン酸に添加することが、その一次構造に如何なる修飾も導入することなく、分解因子に対する安定性を向上させることが見出された。従って本発明は、水性組成物として配合されたヒアルロン酸を、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤の使用であって、前記添加剤が、２０，０００ダルトン以上の分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する１種または複数の多糖を含み、組成物中の前記多糖(複数可)およびヒアルロン酸が組成物に少なくとも５００ｃＰの粘度を与えることを特徴とする使用を提案する。
【００１４】
前記粘度は、ヒアルロン酸ベースの組成物を、特に人間および動物の両方の関節内、皮内または眼球内投与に対して好適にする。
【００１５】
本発明による更に興味ある用途分野は耳科手術、再生医学などであると思われる。
【００１６】
本発明はまた、特に関節内、皮内または眼球内の使用に対して好適な、このようにして安定化されたヒアルロン酸の水性組成物に関する。
【００１７】
本発明によれば、後述する実験結果により証明されるように、前記多糖と組み合わされたヒアルロン酸は向上した熱安定性を獲得し、低減された酵素分解速度を示す。
【００１８】
この安定化作用を果たす多糖は、２０，０００ダルトンを超える、好ましくは５０，０００ダルトンを超える分子量を有し、少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える、好ましくは２ｇ／ｌを超える濃度にて水に可溶であり、ヒアルロン酸と共に、５００ｃＰ以上である臨界的な粘度を有する最終的な粘性溶液を与える多糖から選択される。
【００１９】
得られる溶液の粘度は、中〜高粘度を有する溶液に対して有効に作用し得る好適な計測器で測定される。好適な計測器は、ブルックフィールド型回転粘度計や例えば回転円筒またはコーン／プレート測定系を備える粘度計などのせん断レオメータである。本願明細書の後述する例で報告する実験での測定において使用する計測器は、Ｃ−５０スピンドルを用いたブルックフィールド型レオメータＲ／Ｓ  ＣＰＳ＋である。
【００２０】
前記多糖は、好ましくは、ジェランガム、ｉ−カラギーナンなどの海藻から得られるカラギーナン、タマリンド種子キシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または混合物として選択される。
【００２１】
限定としてではなく例として、本発明による安定化されたヒアルロン酸を得るために使用することのできる市販の多糖は、Ｐｈｙｔａｇｅｌジェランガム、本出願人により製造されるＸｉｌｏｖｉｓｃ(登録商標)タマリンド種子キシログルカン、およびＧｌｙｌｏｉｄである。
【００２２】
高純度または商業グレード純度の単一の多糖、または２種以上の多糖の混合物を使用することができる。多糖またはそれらの混合物はヒアルロン酸に対して１対１０と１０対１との間の重量比率で添加される。そのため、安定化されたヒアルロン酸中において、添加される多糖の含有量は１０重量％と９０重量％の間の範囲となる。
【００２３】
本発明の目的に好適なヒアルロン酸は、好ましくは２×１０５ダルトン以上の分子量を有する。例えば、好ましいヒアルロン酸はＭＷ＝１．８×１０６ダルトンを有する。別の好ましいヒアルロン酸は、ＭＷ＝３×１０５ダルトンを有する。
【００２４】
対応する組成物の全体の動的粘度と共に示す以下の組成物の例は、本発明の説明を目的として提示するものであり、本発明を限定する目的ではない。
【実施例】
【００２５】
組成物の例
【００２６】
【表１】
2014506876.tif 000003
【００２７】
【表２】
2014506876.tif 000004
【００２８】
【表３】
2014506876.tif 000005
【００２９】
【表４】
2014506876.tif 000006
【００３０】
以下の応用実験例もまた、本発明の説明のみの目的で記載するものであり、本発明を限定する目的のものではない。以下に述べるように、添付の図面中の図は、特に後述の例１６と関連する線図を示す。
【００３１】
例１２−熱安定化
濃度１．６％のヒアルロン酸(以下の表中のＨＡ)単独の水溶液および表中に明記した多糖を添加した水溶液について、１２０℃、１時間の加熱の前後で動的粘度を測定し、比較する。粘度はヒアルロン酸の分子量と直接相関があり、その低下は熱分解に比例するため、この試験は重要な意味をもつ。溶液の粘度は、温度２５℃において、コーン／プレート系およびＣ−５０スピンドルを備えるブルックフィールド型Ｒ／Ｓ  ＣＰＳ＋レオメータを用い、速度勾配１６７．６ｓｅｃ−１にて測定する。測定値(センチポイズ、ｃＰ)は以下の表にまとめられる。
【００３２】
【表５】
2014506876.tif 000007
【００３３】
多糖の添加による粘度低下の制御は報告値から明白である。
【００３４】
例１３−オートクレーブ中での熱安定化
ヒアルロン酸(表中のＨＡ)の水溶液および多糖を添加したヒアルロン酸の水溶液の動的粘度を、オートクレーブ滅菌前後で測定し、比較する。粘度はヒアルロン酸の分子量と直接相関があり、その低下は熱分解に比例する。オートクレーブ中で適用した滅菌条件は、温度１２１±１℃、時間Ｆ０＝１３である。溶液の粘度は、温度２５℃において、コーン／プレート系およびＣ−５０スピンドルを備えるブルックフィールド型Ｒ／Ｓ  ＣＰＳ＋レオメータを用い、速度勾配１６７．６ｓｅｃ−１にて測定する。測定値(センチポイズ、ｃＰ)は以下の表にまとめられる。
【００３５】
【表６】
2014506876.tif 000008
【００３６】
多糖の添加による粘度低下の制御は報告値から明白である。
【００３７】
例１４−オートクレーブ中での熱安定化
ヒアルロン酸(表中のＨＡ)単独の水溶液の動的粘度の変化を測定し、タマリンド種子キシログルカンを添加したヒアルロン酸溶液と比較するが、その測定は、以下の表に明記するように、オートクレーブ滅菌前後に、様々なヒアルロン酸濃度、および様々なタマリンド種子キシログルカン濃度で行う。オートクレーブ中で適用した滅菌条件は、温度１２１±１℃、時間Ｆ０＝１３である。溶液の粘度は、温度２５℃において、コーン／プレート系およびＣ−５０スピンドルを備えるブルックフィールド型Ｒ／Ｓ  ＣＰＳ＋レオメータを用い、速度勾配１６７．６ｓｅｃ−１にて測定する。測定値（ｃＰ）は以下の表にまとめられる。
【００３８】
【表７】
2014506876.tif 000009
【００３９】
例１５−耐酵素安定化（ヒアルロニダーゼ）
濃度１．３３％のヒアルロン酸(以下の表中のＨＡ)の水溶液が調製され、濃度が共に１．３３％であるタマリンド種子キシログルカンを有するヒアルロン酸水溶液と比較される。それぞれの溶液９．５ｇに対して、１ｇの０．００６％ヒアルロニダーゼ酵素水溶液が添加される。得られる溶液の温度３７℃における時間に対する粘度変化が、コーン／プレート系およびＣ−５０スピンドルを備えるブルックフィールド型Ｒ／Ｓ  ＣＰＳ＋レオメータを用い、速度勾配１６７．６ｓｅｃ−１にて測定される。測定値(ｃＰ)は以下の表にまとめられる。
【００４０】
【表８】
2014506876.tif 000010
【００４１】
例１６−酵素安定化（ヒアルロニダーゼ）
前記の例において用いた方法に従った、粘度の同様の変化も測定し、以下のヒアルロン酸(ＨＡ)の水溶液と比較した；
−  ＨＡ単独、濃度１．２％
−  １．２％タマリンド種子キシログルカンを有する１．２％ＨＡ
−  ２．５％タマリンド種子キシログルカンを有する０．５％ＨＡ
−  １．２％ｉ−カラギーナンを有する１．２％ＨＡ。
【００４２】
添付の図面は、１２０分まで(ｘ軸上の時間)で得られる粘度値(ｃＰで表す)残存率(％)のグラフを示す。本発明により提案される全ての多糖の安定化効果が明確に示される。
【００４３】
結論として、上記に言及した実験的知見は、本発明による多糖をヒアルロン酸に添加すると、溶液粘度の実質的な安定化から実証されるように、ヒアルロン酸の分子量の有意な低下を引き起こすことなく、高温まで加熱できる溶液が生成することを実証している。
【００４４】
同様に、本発明による多糖と組み合わせたヒアルロン酸は、添加された多糖なしの相当するヒアルロン酸よりも、ヒアルロニダーゼ酵素によってはるかに緩慢に分解される。
【００４５】
上記記載および例から見て取れるように、本発明の目的は効果的に達成される。
【図１】
2014506876.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月21日(2013.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性組成物中に配合されたヒアルロン酸を、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤の使用であって、該添加剤が、２０，０００ダルトン以上の分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する１種または複数の多糖を含み、組成物中の前記１種または複数の多糖およびヒアルロン酸が、組成物に少なくとも５００ｃＰの粘度を与え、該多糖がジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記組成物が、人間または動物の関節内、皮内または眼球内投与に好適であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸が２×１０５ダルトン以上の分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸、および単独または混合物としての前記多糖が、それぞれ１：１０と１０：１との間の範囲の重量比率を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
２×１０５ダルトン以上の分子量を有するヒアルロン酸の水性組成物であって、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤として、２０，０００ダルトンを超える分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する少なくとも１種の多糖を含み、少なくとも５００ｃＰの粘度を有し、該多糖がジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする、人間または動物の関節内、皮内または眼球内投与のための水性組成物。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸、および単独または混合物としての前記多糖が、それぞれ１：１０と１０：１との間の範囲の重量比率を有することを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
２×１０５ダルトン以上の分子量を有するヒアルロン酸の水性組成物であって、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤として、２０，０００ダルトンを超える分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する少なくとも１種の多糖を含み、少なくとも５００ｃＰの粘度を有し、該多糖がジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする、眼科手術における眼球内への投与、または整形外科における滑液機能修復のための関節内への投与における使用のための水性組成物。
【請求項８】
２×１０５ダルトン以上の分子量を有するヒアルロン酸の水性組成物の、美容術のための皮内充填剤としての使用であって、該水性組成物が、熱またはヒアルロニダーゼなどの酵素の分解作用に対して安定化するための添加剤として、２０，０００ダルトンを超える分子量、および少なくとも１ｇ／ｌまたはそれを超える水溶性を有する少なくとも１種の多糖を含み、少なくとも５００ｃＰの粘度を有する水性組成物であり、該多糖がジェランガム、藻類由来のカラギーナン、タマリンド種子由来のキシログルカンおよびキサンタンガムから、単独または相互の混合物として選択されることを特徴とする使用。
【国際調査報告】
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