(57)【要約】本発明は、選択的細胞殺滅のための生物学的有効ヌクレオチド分子、その使用及び適用キットに関する。本発明の目的は、広範な適用範囲において生物の細胞を有効に、確実に且つ可能な限り効率的に殺滅することであって、自体公知の化学的、物理的、生化学的又は分子生物学的方法の問題点を生ぜしめないことにある。本発明によれば、生物学的有効ヌクレオチド分子（８）はその塩基配列が複数の遺伝子のｍＲＮＡ（７、９、１０、１１）に結合可能であるように設計されていて、その結合により細胞殺滅ストレス状態のための複数、特に多数の「オフターゲット」効果を誘起する。この「オフターゲット」効果により、細胞（２）は各遺伝子の発現を低減する分子の従来の使用に係らず非常に強い影響を受けるので、該細胞は死滅するか、或いは細胞（２）内でプログラムされた細胞死（アポトーシス）が開始される。これらの分子は特に腫瘍細胞やウイルス感染細胞、植物細胞、真菌細胞を選択的に殺滅するために用いられる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に選択的に影響を及ぼすためにｍＲＮＡと結合するように調節された少なくとも１種の塩基配列を有する生物学的有効ヌクレオチド分子であって、ヌクレオチド分子（８）の少なくとも１種の塩基配列は複数の遺伝子のｍＲＮＡ（３、４、５、６）と結合可能に設計されており、該ヌクレオチド分子が該遺伝子のｍＲＮＡ（３、４、５、６）に結合することにより、細胞殺滅ストレス状態をもたらすために細胞（２）に有毒に作用する複数、特に多数の「オフターゲット」効果を誘起することを特徴とする、生物学的有効ヌクレオチド分子。
【請求項２】
ヌクレオチドとしてＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、ＤＮＡ又はＬＮＡが使用され、その大きさは１０〜３００ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド分子（８）は、ｍＲＮＡに結合しなくともそれ自身で細胞内にストレス反応を誘起する特異的な塩基配列、例えばＡＡＡ、ＵＵＵ、ＧＣＣＡ、ＵＧＧＣ、ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ、ＵＧＵＧＵ、ＡＵＵＵＧ、ＧＵＵＵＵ、ＡＵＵＵＵ、ＣＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ又はＧＵＵＵＧを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子。
【請求項４】
前記ヌクレオチド分子（８）は、特に細胞（２）内導入のために分子、例えば細胞貫通ペプチドと結合しており、或いは試薬、例えばポリエチレンイミン、ナノ粒子又は脂質に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜３に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチド分子（８）は、塩基配列ＧＧＵＡ、ＣＧＵＣ、ＣＧＵＵ、ＣＣＡＡ、ＡＡＧＧ、ＧＧＵＧ、ＣＵＣＧ、ＣＵＣＣ、ＣＵＣＵ、ＣＵＵＡ、ＧＧＵＣ、ＧＧＵＵ、ＡＡＡＧ、ＡＡＡＣ、ＡＡＡＵ、ＡＡＧＡ、ＡＡＧＣ、ＡＡＧＵ、ＡＡＣＡ、ＡＡＣＧ、ＡＡＣＣ、ＡＡＣＵ、ＡＡＵＡ、ＣＵＵＵ，ＡＡＵＧ、ＡＡＵＣ、ＡＡＵＵ、ＡＧＧＡ、ＡＧＵＧ、ＡＧＵＣ、ＡＧＵＵ、ＡＣＡＡ、ＡＣＡＧ、ＡＣＡＣ、ＡＣＡＵ、ＡＣＧＡ、ＡＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＡＣＧＵ、ＡＣＣＡ、ＣＡＵＵ、ＣＧＡＡ、ＡＣＣＧ、ＡＣＣＣ、ＡＣＣＵ、ＡＣＵＡ、ＡＣＵＧ、ＡＣＵＣ、ＡＣＵＵ、ＡＵＡＡ、ＧＧＡＧ、ＧＧＡＣ、ＧＧＡＵ、ＧＧＧＡ、ＧＧＧＣ、ＧＧＧＵ、ＧＧＣＡ、ＧＧＣＧ、ＧＧＣＣ、ＧＧＣＵ、ＧＣＡＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＣ、ＧＣＡＵ、ＡＵＡＧ、ＡＵＡＣ、ＡＵＡＵ、ＡＵＧＡ、ＡＵＧＧ、ＡＵＧＣ、ＡＵＧＵ、ＡＵＣＡ、ＣＧＣＧ、ＣＧＣＣ、ＣＧＣＵ、ＡＵＣＧ、ＡＵＣＣ、ＡＵＣＵ、ＡＵＵＡ、ＡＵＵＧ、ＡＵＵＣ、ＡＵＵＵ、ＧＡＡＡ、ＧＡＡＧ、ＧＡＡＣ、ＧＡＡＵ、ＧＡＧＡ、ＧＡＧＧ、ＧＡＧＣ、ＧＡＧＵ、ＧＡＣＡ、ＧＡＣＧ、ＧＡＣＣ、ＧＡＣＵ、ＧＡＵＡ、ＧＡＵＧ、ＧＡＵＣ、ＧＡＵＵ、ＧＧＡＡ、ＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＧＣＧＣ、ＧＣＧＵ、ＧＣＣＡ、ＧＣＣＧ、ＧＣＣＣ、ＧＣＣＵ、ＧＣＵＡ、ＧＣＵＧ、ＧＣＵＣ、ＧＣＵＵ、ＧＵＡＡ、ＧＵＡＧ、ＧＵＡＣ、ＧＵＡＵ、ＧＵＧＡ、ＧＵＧＧ、ＧＵＧＣ、ＧＵＧＵ、ＧＵＣＡ、ＧＵＣＧ、ＧＵＣＣ、ＧＵＣＵ、ＧＵＵＡ、ＧＵＵＧ、ＧＵＵＣ、ＧＵＵＵ、ＣＡＡＡ、ＣＡＡＧ、ＣＡＡＣ、ＣＡＡＵ、ＣＡＧＡ、ＣＡＧＧ、ＣＡＧＣ、ＣＡＧＵ、ＣＡＣＡ、ＣＡＣＧ、ＣＡＣＣ、ＣＡＣＵ、ＣＡＵＡ、ＣＡＵＧ、ＣＡＵＣ、ＣＧＡＧ、ＣＧＡＣ、ＣＧＡＵ、ＣＧＧＡ、ＣＧＧＧ、ＣＧＧＣ、ＣＧＧＵ、ＣＧＣＡ、ＣＧＵＡ、ＣＧＵＧ、ＣＣＡＧ、ＣＣＡＣ、ＣＣＡＵ、ＣＣＧＡ、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＣＣＧＵ、ＣＣＣＡ、ＡＧＡＡ、ＡＧＡＧ、ＡＧＡＣ、ＡＧＡＵ、ＣＣＣＧ、ＣＣＣＵ、ＡＧＧＧ、ＡＧＧＣ、ＡＧＧＵ、ＡＧＣＡ，ＣＣＵＡ、ＣＣＵＧ、ＣＣＵＣ、ＣＣＵＵ、ＣＵＡＡ、ＣＵＡＧ、ＣＵＡＣ、ＣＵＡＵ、ＡＧＣＧ、ＡＧＵＡ、ＣＵＧＡ、ＣＵＧＧ、ＣＵＧＣ、ＣＵＧＵ、ＣＵＣＡ、ＣＵＵＧ、ＣＵＵＣ、ＡＧＣＣ及びＡＧＣＵの少なくとも１個を含むことを特徴とする、請求項１〜４の１項又は複数項に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子。
【請求項６】
ＧＵＣＵＡＵＣＡＧＣＡＣＡＡＵｔｔ（配列番号：１）、ＧＣＵＵＡＡＣＵＧＵＡＵＣＵＧＧＡＧＣｔｔ（配列番号：２）、ＵＵＡＡＣＵＧＵＡＵＣＵＧＧＡＧＣｔｔ（配列番号：３）、ＡＡＣＵＧＵＡＵＣＵＧＧＡＧＣｔｔ（配列番号：４）、ＧＣＵＣＡＣＣＡＡＵＧＧＡＧＡｔｔ（配列番号：５）、ＧＧＣＵＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡｔｔ（配列番号：６）及びＵＧＧＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＧＧＣｔｔ（配列番号：７）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の生物学的有効分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子を含む医薬品。
【請求項８】
腫瘍疾患又はウイルス誘発疾患の治療及び／又は予防に用いるための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子。
【請求項９】
真核細胞、特に動物細胞、植物細胞又は真菌細胞を選択的に殺滅するための、請求項１〜６に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子の使用。
【請求項１０】
ウイルス感染細胞を選択的に殺滅するための、請求項１〜６に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子の使用。
【請求項１１】
原核細胞を選択的に殺滅するための、請求項１〜６に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子の使用。
【請求項１２】
プロテアーゼ阻害剤と組み合わせて用いることを特徴とする、請求項１〜６に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子の使用。
【請求項１３】
請求項１〜５に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子を適用及び投与するための適用キットであって、
生物学的有効分子を含み、更なる成分も含むことができる少なくとも１個のアンプル（アンプルＡ）と、
例えば細胞貫通ペプチド、ナノ粒子、ポリエチレンイミン又は脂質のトランスフェクションシステムを有する少なくとも１個のアンプル（アンプルＢ）と、
前記生物学的有効分子に結合するための他の成分又はトランスフェクションシステムを含む少なくとも１個のアンプル（アンプルＣ）と、
アンプルＡ、Ｂの内容物のための希釈緩衝剤及び反応緩衝剤と、
１以上のカテーテル付き若しくはカニューレ付き注射器、及び標的細胞を含む媒体にアンプル内容物からなる混合物を注入するのに必要とされる他の器材と、
適用及び投与に関する指示書とを少なくとも含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的に細胞を殺滅可能な、ヌクレオチドからなる生物学的有効分子、その使用及び適用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物の細胞を選択的に殺滅する方法には紫外線、熱等の物理的手段（シエ・ＡＷ、ブライマー・ＰＡ、ミッチェル・ＴＪ、ゴスリー・ＤＧ「チャイニーズハムスター卵巣細胞内のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ部位における紫外光誘起変異に対する線量−反応の関係」ソマティック・セル・ジェネティックス、１９７５年１０月；１（４）：３８３〜９．；ガレスピー・ＥＨ、ギボンズ・ＳＡ「オートクレーブ及び実験室におけるその危険性と安全性」ジャーナルオブハイジーン（ロンドン）、１９７５年１２月；７５（３）：４７５〜８７）や細胞の構造自体を破壊する化学物質（例えば酸、アルカリ、ホルムアルデヒド）が利用されてきた（国家毒性プログラム、ホルムアルデヒドに対する発癌性物質背景文書に関する最終報告。Ｒｅｐ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  Ｂａｃｋｇｒ  Ｄｏｃ．  ２０１０年１月（１０〜５９８１）：ｉ−５１２．）。これらの手段は環境に悪影響を及ぼすことが多いため、生物自体には適用できない。生物内の細胞を殺滅するためには、細胞の生理的条件に強く影響を及ぼし、同細胞の死滅を誘導し得る生化学的手段（タンパク質阻害剤、拮抗薬、細胞増殖抑制剤等）が利用される（田中真二、有井滋樹「肝臓癌に対する分子標的治療の現況」基礎科学、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー、２０１０年６月；１５（３）：２３５〜４１．電子出版２０１０年５月２７日）。しかしながら、これら物質は全ての細胞に均等に作用するため、いずれの方法を採用しても生物において選択的に特異的細胞種を殺滅することはできない。
【０００３】
細胞に選択的に影響を及ぼす分子生物学的一手法は、短い２本鎖ＲＮＡの使用である。これらのいわゆるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）分子は、活性化後に標的遺伝子のｍＲＮＡと相互作用して、特殊なエンドリボヌクレアーゼと共に「ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）」というＲＮＡタンパク質複合体を形成することが知られている。ＲＩＳＣ複合体は標的ｍＲＮＡに結合し、エンドヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断する。このようにして遺伝子発現が阻害され、それにより標的タンパク質の産生が阻害される。
【０００４】
標的遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列部分に特異的な短い（１９〜２３ｂｐ）２本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を真核細胞に導入することによって遺伝子発現を阻害することは、既に開示されている（エルバシル・ＳＭら「２１ヌクレオチドＲＮＡの２本鎖が培養された哺乳動物細胞においてＲＮＡ干渉を媒介する」ネイチャー、２００１年５月２４日、４１１（６８３６）、４９４〜８；リウ・Ｙら「ペプチド核酸による細胞遺伝子発現の効率的なアイソフォーム選択的阻害」バオイオケミストリー、２００４年２月２４日、４３（７）、１９２１〜７；ＵＳ５，８９８，０３１Ａ；ＵＳ７，０５６，７０４Ｂ２）。
【０００５】
このような分子を用いると遺伝子の読み取りやｍＲＮＡの産生が阻害されず、ｓｉＲＮＡによって細胞固有のメカニズムが引き起こされて標的ｍＲＮＡが分解される。最終的には、上述のように、特異的タンパク質の産生は抑制されるが、他の遺伝子の発現が阻害されることはない（転写後遺伝子サイレンシング）。
【０００６】
現在、ｓｉＲＮＡを適用する際には、細胞における単一の遺伝子の発現を抑制することが追求される。そのため複数の遺伝子が同時に、或いは非特異的に排除される効果は望まれていない。従って、ｓｉＲＮＡの塩基配列は後者の効果が阻止されるように設計される。
【０００７】
同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的組織細胞の移送をｓｉＲＮＡで活性化する方法（池田ら「治療ｓｉＲＮＡのリガンド標的化デリバリー」、ファーマシューティカル・リサーチ２３巻８号、２００６年８月）、或いは細胞特異的に分解される短いペプチドの結合によって細胞特異性を達成する方法（ＷＯ２００８／０９８５６９Ａ２）も開発されている。これらの修飾ｓｉＲＮＡ分子を使用することにより、特定の細胞において選択的に遺伝子の発現を低減又は阻止することが可能となる。
【０００８】
使用したｓｉＲＮＡ塩基配列が、細胞の生存にとって重要な遺伝子に特異的である場合には細胞の死滅を誘起することができる。このプロセスは上述のメカニズムにより、必要に応じて細胞特異的に適用することができる。
【０００９】
しかしながら、単一の遺伝子又は少数の遺伝子を遮断しても、必ずしもこれらの細胞の死滅に至らないことが往々にしてあることが問題である。所望の効果を達成するには、特異的に複数の遺伝子を同時に遮断せねばならないことがある。例えば治療目的に適用するには、ｓｉＲＮＡ分子を用いて細胞を直接殺滅できれば望ましい。これによって特に上述の方法を利用して極めて特異的に腫瘍細胞又はウイルス感染細胞を殺滅できることになる。
【００１０】
更なる問題は、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞のゲノムに頻繁に変異が生じることである。この場合、使用したｓｉＲＮＡ分子が無効になることで意図した細胞への影響が得られないか、或いはｓｉＲＮＡ分子が効果的に使用されなくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】シエ・ＡＷ、ブライマー・ＰＡ、ミッチェル・ＴＪ、ゴスリー・ＤＧ「チャイニーズハムスター卵巣細胞内のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ部位における紫外光誘起変異に対する線量−反応の関係」ソマティック・セル・ジェネティックス、１９７５年１０月；１（４）：３８３〜９．
【非特許文献２】ガレスピー・ＥＨ、ギボンズ・ＳＡ「オートクレーブ及び実験室におけるその危険性と安全性」ジャーナルオブハイジーン（ロンドン）、１９７５年１２月；７５（３）：４７５〜８７
【非特許文献３】国家毒性プログラム、ホルムアルデヒドに対する発癌性物質背景文書に関する最終報告。Ｒｅｐ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  Ｂａｃｋｇｒ  Ｄｏｃ．  ２０１０年１月（１０〜５９８１）：ｉ−５１２．
【非特許文献４】田中真二、有井滋樹「肝臓癌に対する分子標的治療の現況」基礎科学、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー、２０１０年６月；１５（３）：２３５〜４１．電子出版２０１０年５月２７日
【非特許文献５】エルバシル・ＳＭら「２１ヌクレオチドＲＮＡの２本鎖が培養された哺乳動物細胞においてＲＮＡ干渉を媒介する」ネイチャー、２００１年５月２４日、４１１（６８３６）、４９４〜８
【非特許文献６】リウ・Ｙら「ペプチド核酸による細胞遺伝子発現の効率的なアイソフォーム選択的阻害」バオイオケミストリー、２００４年２月２４日、４３（７）、１９２１〜７；ＵＳ５，８９８，０３１Ａ；ＵＳ７，０５６，７０４Ｂ２
【非特許文献７】池田ら「治療ｓｉＲＮＡのリガンド標的化デリバリー」、ファーマシューティカル・リサーチ２３巻８号、２００６年８月
【非特許文献８】フェドロフ・Ｙら「ｓｉＲＮＡによるオフターゲット効果は毒性表現型を誘導できる」ＲＮＡ（２００６年）、１２：１１８８〜１１９６
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０９８５６９Ａ２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、広範な適用範囲で生物において細胞を有効に、確実に且つ可能な限り効率的に殺滅することであって、自体公知の化学的、物理的、生化学的又は分子生物学的方法の問題点を回避することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、例えばＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、ＤＮＡ又はＬＮＡをベースとする生物学的有効ヌクレオチド分子は、結合することにより細胞殺滅ストレス状態をもたらすための複数（特に多数）の「オフターゲット」効果を誘起する目的で、塩基配列を介して複数の遺伝子のｍＲＮＡに結合可能であるように設計されている。
【００１５】
本明細書において、「生物学的有効ヌクレオチド分子」という概念は、本明細書に記載する全ての条件下及び適用下で機能を発揮する全てのヌクレオチド分子を含む。特に本発明による生物学的有効ヌクレオチド分子は、いわゆる「オフターゲット」効果を誘起することによって機能する。本発明において、細胞殺滅ストレス状態を誘起する「オフターゲット」効果とは、遺伝子発現に依存しない細胞ストレスを誘起する生物学的な活動及びプロセスであって、１個の塩基配列が複数のターゲットｍＲＮＡ塩基配列を有することにより複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能な活動及びプロセスと理解されたい。
【００１６】
このストレス状態によって、従来のヌクレオチド分子、特にｓｉＲＮＡの使用とは無関係に、非特異的な塩基配列により細胞に強い影響を与えて各遺伝子の発現を低減することにより、細胞が死滅するか、或いは細胞内でプログラムされた細胞死（アポトーシス）が開始される。
【００１７】
前述のようなｍＲＮＡに結合するように調節された塩基配列を有するヌクレオチド分子、例えばｓｉＲＮＡをベースとする従来のヌクレオチド分子自体は確かによく知られているが、この塩基配列は、意図する標的遺伝子に選択的に結合することによって細胞内で所定の遺伝子操作を実現する。従って、結合対象の遺伝子に対応する細胞への影響を達成するために、この塩基配列はそれぞれ１種又は複数の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に調整されている。
【００１８】
これに対し、本発明において塩基配列は、この配列が結合可能な遺伝子のｍＲＮＡが実際に細胞内に存在するか否かに関わりなく、複数、特に多数の遺伝子のｍＲＮＡに連結できることを意図して設計されている。従って、本発明で意図されるｍＲＮＡへの結合の主なる目的は、前記の対象細胞の機能に向けられた遺伝子操作ではなく、特に多数の（本来任意の）ヌクレオチド分子のｍＲＮＡへの結合によって可能な限り多くの「オフターゲット」効果を誘起することである。しかし、これまで「オフターゲット」効果は標的遺伝子のみへの影響を達成するために可能な限り回避又は低減されてきた。逆に、可能な限り多くの「オフターゲット」効果をもたらすことによって、標的細胞が克服できないような大きなストレス状態を生み出すべきであり、その結果、前記標的細胞は、遺伝子発現の選択的な操作によってではなく、意図的な通常のストレスによって殺滅される。
【００１９】
本発明において、従来法における遺伝子結合に伴って発生する、特定遺伝子が細胞に及ぼす影響は二次的な作用である。この遺伝子由来の影響によって細胞への効果を更に増強することができる（本発明で意図された上述のストレス状態に加えて）。
【００２０】
従って本発明の塩基配列が結合可能な標的遺伝子の数は、細胞への影響のために意図された遺伝子操作の目標効果の数と一致するものではなく、また、少なくとも主要なものではなく、遺伝子結合によって達成可能な「オフターゲット」効果と、それにより細胞内に引き起こされるストレス状態の特定の標的効果の数によって決定される。
【００２１】
前記「オフターゲット」効果を創出するために、本発明の塩基配列は従来のように標的遺伝子とだけでなく、細胞中の可能な限り多種の標的遺伝子と一致するように選択される。これにより、多数の遺伝子に対して有害に作用するヌクレオチド干渉が生み出され、細胞の生理に大きな影響を与える。
【００２２】
本発明の使用は、細胞特異性を達成するための公知のメカニズム、及び例えばｓｉＲＮＡを安定化してヌクレオチド分子の細胞への取り込みを改善する公知の可能な方法と組み合わせることができる。
【００２３】
本発明の塩基配列は従来のｓｉＲＮＡとして使用することに限定されない。短い（１０〜２０ｂｐ）２本鎖若しくは１本鎖ＲＮＡ、長い（２０〜３００ｂｐ）２本鎖若しくは１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ又は化学的類似物（例えばＰＮＡ）も本発明の塩基配列として使用できる。
【００２４】
前記「オフターゲット」効果の誘導に加えて、生物学的有効ヌクレオチド分子の細胞に有害な作用は公知のストレス誘導塩基配列によって増強することができる（フェドロフ・Ｙら「ｓｉＲＮＡによるオフターゲット効果は毒性表現型を誘導できる」ＲＮＡ（２００６年）、１２：１１８８〜１１９６）。
【００２５】
適切なトランスフェクションシステム（例えばナノ粒子、ポリエチレンイミン又はリポソーム）によって、作用物質分子は自体公知の方法で細胞内に導入することができる。
【００２６】
更に、この分子構成体は細胞への輸送を改善するために、更には細胞の安定化又は検出のために、他の物質（例えば担体システムとしてのナノ粒子又は蛍光色素）に結合させることができる。
【００２７】
本発明の生物学的有効ヌクレオチド分子は、真核細胞、特に動物細胞や植物細胞、真菌細胞、並びにウイルス感染細胞及び原核細胞を選択的に殺滅するのに適している。
【００２８】
本生物学的有効ヌクレオチド分子はプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて使用することもできる。
【００２９】
本発明の有利な一態様は、生物学的有効ヌクレオチド分子を適用及び投与するための適用キットである。このキットは、少なくとも次の要素を含む：
生物学的有効分子を含み、更なる成分も含むことができる少なくとも１個のアンプル（アンプルＡ）と、
例えばナノ粒子、ポリエチレンイミン又は脂質のトランスフェクションシステムを有する少なくとも１個のアンプル（アンプルＢ）と、
前記生物学的有効分子に結合するための他の成分又はトランスフェクションシステムを含む少なくとも１個のアンプル（アンプルＣ）と、
アンプルＡ、Ｂ、Ｃの内容物のための希釈緩衝剤及び反応緩衝剤と、
１以上のカテーテル付き若しくはカニューレ付き注射器、及び標的細胞を含む媒体にアンプル内容物からなる混合物を注入するのに必要とされる他の器材と、
適用及び投与に関する指示書。
以下、図面を参照しつつ本発明の実施形態を詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】細胞内に導入され、あるｍＲＮＡに対して特異的であり、標的遺伝子の発現を阻害する公知のｓｉＲＮＡの概略図。
【図２】細胞内に導入され、可能な限り多種の非特異的なＲＮＡｉ効果（オフターゲット効果）を誘起する、本発明に係るｓｉＲＮＡの概略図。
【図３】細胞内に導入され、遺伝子発現の低減及びｍＲＮＡの分解を目的とせず、細胞内でｓｉＲＮＡの特異的な塩基配列部分によって誘発されるストレス反応による細胞死を目的とするｓｉＲＮＡの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
図１に公知のｓｉＲＮＡ１のメカニズムを示す。図１において、ｓｉＲＮＡ１は細胞２に導入され（矢印参照）、第１の遺伝子特異的なｍＲＮＡ３に結合するための特殊な塩基配列（明示せず）を有する。続いてｓｉＲＮＡ１がＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ（同様に明示せず）、これがｓｉＲＮＡ１を２本鎖に分割し、ｓｉＲＮＡ１のアンチセンス鎖がＲＩＳＣと共に第１のｍＲＮＡ３に付加する。続いて遺伝子特異的な第１のｍＲＮＡ３が切断及び断片化され、標的遺伝子の発現が第１のｍＲＮＡ３に基づいて阻害される（図１の分解された第１のｍＲＮＡ７参照）。続いてＲＩＳＣに固定化されたｓｉＲＮＡ１が他の細胞２内に存在する特異的な第１のｍＲＮＡ３に付加してこれも同様に分解する。このとき各ｓｉＲＮＡ１が一種のみの特異的な第１のｍＲＮＡ３に結合してこれを分解することが指向されている。第１のｍＲＮＡ３とは対照的に、細胞２内に存在する第２のｍＲＮＡ４、第３のｍＲＮＡ５及び第４のｍＲＮＡ６は、それぞれｓｉＲＮＡ１又はその塩基配列（明示せず）に影響されないので、ｍＲＮＡ４〜６に対する遺伝子の発現には変化がない。この方法は既によく知られている。
【００３２】
図２に、細胞２内に導入された本発明に係るｓｉＲＮＡ８のメカニズムを示す（同様矢印参照）。ここでも例として第１のｍＲＮＡ３、第２のｍＲＮＡ４、第３のｍＲＮＡ５及び第４のｍＲＮＡ６が存在する。
【００３３】
本発明のｓｉＲＮＡ８は（見易さのために明示せず）１以上の塩基配列ＧＧＵＡ、ＣＧＵＣ、ＣＧＵＵ、ＣＣＡＡ、ＡＡＧＧ、ＧＧＵＧ、ＣＵＣＧ、ＣＵＣＣ、ＣＵＣＵ、ＣＵＵＡ、ＧＧＵＣ、ＧＧＵＵ、ＡＡＡＧ、ＡＡＡＣ、ＡＡＡＵ、ＡＡＧＡ、ＡＡＧＣ、ＡＡＧＵ、ＡＡＣＡ、ＡＡＣＧ、ＡＡＣＣ、ＡＡＣＵ、ＡＡＵＡ、ＣＵＵＵ，ＡＡＵＧ、ＡＡＵＣ、ＡＡＵＵ、ＡＧＧＡ、ＡＧＵＧ、ＡＧＵＣ、ＡＧＵＵ、ＡＣＡＡ、ＡＣＡＧ、ＡＣＡＣ、ＡＣＡＵ、ＡＣＧＡ、ＡＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＡＣＧＵ、ＡＣＣＡ、ＣＡＵＵ、ＣＧＡＡ、ＡＣＣＧ、ＡＣＣＣ、ＡＣＣＵ、ＡＣＵＡ、ＡＣＵＧ、ＡＣＵＣ、ＡＣＵＵ、ＡＵＡＡ、ＧＧＡＧ、ＧＧＡＣ、ＧＧＡＵ、ＧＧＧＡ、ＧＧＧＣ、ＧＧＧＵ、ＧＧＣＡ、ＧＧＣＧ、ＧＧＣＣ、ＧＧＣＵ、ＧＣＡＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＣ、ＧＣＡＵ、ＡＵＡＧ、ＡＵＡＣ、ＡＵＡＵ、ＡＵＧＡ、ＡＵＧＧ、ＡＵＧＣ、ＡＵＧＵ、ＡＵＣＡ、ＣＧＣＧ、ＣＧＣＣ、ＣＧＣＵ、ＡＵＣＧ、ＡＵＣＣ、ＡＵＣＵ、ＡＵＵＡ、ＡＵＵＧ、ＡＵＵＣ、ＡＵＵＵ、ＧＡＡＡ、ＧＡＡＧ、ＧＡＡＣ、ＧＡＡＵ、ＧＡＧＡ、ＧＡＧＧ、ＧＡＧＣ、ＧＡＧＵ、ＧＡＣＡ、ＧＡＣＧ、ＧＡＣＣ、ＧＡＣＵ、ＧＡＵＡ、ＧＡＵＧ、ＧＡＵＣ、ＧＡＵＵ、ＧＧＡＡ、ＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＧＣＧＣ、ＧＣＧＵ、ＧＣＣＡ、ＧＣＣＧ、ＧＣＣＣ、ＧＣＣＵ、ＧＣＵＡ、ＧＣＵＧ、ＧＣＵＣ、ＧＣＵＵ、ＧＵＡＡ、ＧＵＡＧ、ＧＵＡＣ、ＧＵＡＵ、ＧＵＧＡ、ＧＵＧＧ、ＧＵＧＣ、ＧＵＧＵ、ＧＵＣＡ、ＧＵＣＧ、ＧＵＣＣ、ＧＵＣＵ、ＧＵＵＡ、ＧＵＵＧ、ＧＵＵＣ、ＧＵＵＵ、ＣＡＡＡ、ＣＡＡＧ、ＣＡＡＣ、ＣＡＡＵ、ＣＡＧＡ、ＣＡＧＧ、ＣＡＧＣ、ＣＡＧＵ、ＣＡＣＡ、ＣＡＣＧ、ＣＡＣＣ、ＣＡＣＵ、ＣＡＵＡ、ＣＡＵＧ、ＣＡＵＣ、ＣＧＡＧ、ＣＧＡＣ、ＣＧＡＵ、ＣＧＧＡ、ＣＧＧＧ、ＣＧＧＣ、ＣＧＧＵ、ＣＧＣＡ、ＣＧＵＡ、ＣＧＵＧ、ＣＣＡＧ、ＣＣＡＣ、ＣＣＡＵ、ＣＣＧＡ、ＣＣＧＧ、ＣＣＧＣ、ＣＣＧＵ、ＣＣＣＡ、ＡＧＡＡ、ＡＧＡＧ、ＡＧＡＣ、ＡＧＡＵ、ＣＣＣＧ、ＣＣＣＵ、ＡＧＧＧ、ＡＧＧＣ、ＡＧＧＵ、ＡＧＣＡ，ＣＣＵＡ、ＣＣＵＧ、ＣＣＵＣ、ＣＣＵＵ、ＣＵＡＡ、ＣＵＡＧ、ＣＵＡＣ、ＣＵＡＵ、ＡＧＣＧ、ＡＧＵＡ、ＣＵＧＡ、ＣＵＧＧ、ＣＵＧＣ、ＣＵＧＵ、ＣＵＣＡ、ＣＵＵＧ、ＣＵＵＣ、ＡＧＣＣ、ＡＧＣＵからなる鎖を含んでいる。図１の場合とは異なり、鎖内で結合された塩基配列の全体は、ｍＲＮＡ３〜６それぞれに分解的に作用するだけでなく、複数又は多数の、従って図２に示す全ｍＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ３〜６）に結合する。この場合、少なくとも１個の選択された塩基配列が複数又は図示された全ｍＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ３〜６）に結合するか、或いはそれぞれ１個の選択された塩基配列がそれぞれ選択的に１個の特異的なｍＲＮＡ３〜６に作用する。重要なことは、可能な限り多くの（最良の場合は全ての）ｍＲＮＡ３〜６がｓｉＲＮＡ８の連鎖（全ての塩基配列の全体）により結合及び分解される（図２の分解された第１〜第４のｍＲＮＡ７、９、１０、１１参照）。
【００３４】
前記多数のｍＲＮＡ分子（図２では単純化して単に４個のｍＲＮＡ分子が示されている）の分解により、（最良の場合は）１個のみの塩基配列を有するｓｉＲＮＡ８が複数又は多数の遺伝子の発現を阻害することによって（図２の分解されたｍＲＮＡ７、９、１０、１１参照）、複数又は多数の非特異的なＲＮＡｉ効果（オフターゲット効果）が誘起される。その目的は細胞２を殺滅することであり、細胞２はｓｉＲＮＡ８の強力な作用によって死滅する。
【００３５】
例として塩基配列（５’−３’）ＵＵＡＡＣＵＧＵＡＵＣＵＧＧＡＧＣｔｔ（配列番号：３）を有するｓｉＲＮＡ８により、サイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１、ＮＭ＿００３７４５．１）、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ、ＮＭ＿１５２６６７．２）、膜貫通タンパク質２１５（ＴＭＥＭ２１５、ＮＭ＿２１２５５８．２）及びＣＤ８１分子（ＣＤ８１、ＮＭ＿００４３５６．３）のｍＲＮＡを分解できる。
【００３６】
ｓｉＲＮＡ８の塩基配列ＡＡＣＵＧＵＡＵＣＵＧＧＡＧＣｔｔ（配列番号：４）はサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１、ＮＭ＿００３７４５．１）とＮ−アセチルノイラミン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ、ＮＭ＿１５２６６７．２）のｍＲＮＡに対して特異的に有効である。塩基配列ＧＧＣＵＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡｔｔ（配列番号：６）は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ、Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ、ＮＭ＿００２１２７．４）、グリセリンキナーゼ５（推定）（ＧＫ５、ＮＭ＿００１０３９５４７．１）及びＤＩＰ２（ディスコ相互作用タンパク質２ホモログＣ（ＮＭ＿０１４９７４．２）に特異的に作用する。
【００３７】
同様に塩基配列ＧＣＵＣＡＣＣＡＡＵＧＧＡＧＡｔｔ（配列番号：５）を有するｓｉＲＮＡ８は、補体成分（３ｂ／４ｂ）受容体１（クノップス血液群）（ＣＲ１、ＮＭ＿０００６５１．４）、転写変異体Ｓ、補体成分（３ｂ／４ｂ）受容体１（クノップス血液群）（ＣＲ１、ＮＭ＿０００５７３．３）、転写変異体Ｆ及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼα４（ＧＳＴＡ４、ＮＭ＿００１５１２．３）に特異的に作用する。
【００３８】
ｓｉＲＮＡ８の塩基配列の他の例としては、ピログルタミニルペプチダーゼＩ（ＰＧＰＥＰ１、ＮＭ＿０１７７１２．２）、ＲＡＰグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）３（ＲＡＰＧＥＦ３、ＮＭ＿００６１０５．５）、転写変異体２及びレチノイドＸ受容体α（ＲＸＲＡ、ＮＭ＿００２９５７．４）のそれぞれに対して有利な塩基配列ＵＧＧＣＵＧＧＣＵＧＧＣＵＧＧＣｔｔ（配列番号：７）、並びにシグナル伝達性転写因子３（急性期反応因子）（ＳＴＡＴ３、ＮＭ＿２１３６６２．１）、転写変異体３、シグナル伝達性転写因子３（急性期反応因子）（ＳＴＡＴ３、ＮＭ＿００３１５０．３）、転写変異体２、シグナル伝達性転写因子３（急性期反応因子）（ＳＴＡＴ３、ＮＭ＿１３９２７６．２）、転写変異体１、プロトカドヘリンα９（ＰＣＤＨＡ９、ＮＭ＿０１４００５．３）及びセセルニン３（ＳＣＲＮ３、ＮＭ＿０２４５８３．３）に対しての塩基配列ＧＵＣＵＡＵＣＡＧＣＡＣＡＡＵｔｔ（配列番号：１）が挙げられる。
【００３９】
また、具体的な遺伝子を対象とする上述のｓｉＲＮＡ８の塩基配列以外に、ヒトＲＮＡに対する相同性を有さず（従って直接の標的遺伝子を有さない）塩基配列を使用することもできる。この場合、従来技術において細胞ストレスを誘起することが知られている対応の塩基配列を使用できる。そのような塩基配列は、塩基配列ＧＣＵＵＡＡＣＵＧＵＡＵＣＵＧＧＡＧＣｔｔ（配列番号：２）を有することができる。
【００４０】
上述の塩基配列からわかるように、これらの３’末端に修飾ヌクレオチドが付加されている。本明細書における「ｔ」は２’−デソキシチミジンである。上に示した塩基配列では３’末端に２個の２’−デソキシヌクレオチドが付加されており、これらの末端ヌクレオチドは「ｔｔ」で表される。しかし、突出部自体の種類は本明細書に記載されたｓｉＲＮＡの本発明における作用にとって本質的ではないので、突出部の構造は「ｔｔ」突出部に限定されない。従って当業者であれば、他の公知の突出部も使用できる。
【００４１】
本発明に係る生物学的有効ヌクレオチド分子は医薬品として使用することもできる。例えば治療に適用する場合、本発明に係るｓｉＲＮＡ分子を用いて細胞を直接殺滅することができる。具体的には、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞のみを選択的に殺滅できる。従って、本発明の塩基配列、即ち前述した生物学的有効ヌクレオチド分子は、腫瘍疾患やウイルス誘発疾患の治療及び／又は予防に適用するために使用できる。本発明でいうウイルス誘発疾患は、例えばヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス又はＨＩＶウイルスによって誘発される疾患を含む。従ってウイルス誘発疾患は、肝炎、子宮癌又はＡＩＤＳ等の疾患を含む。
【００４２】
同様に本発明は、腫瘍疾患の治療及び／又は予防に適用するための本発明に係る生物学的有効ヌクレオチド分子を含む。本発明に係る医薬品で治療できる腫瘍疾患は、乳癌、卵巣癌、気管支癌、結腸癌、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、子宮頚腫瘍、前立腺癌、睾丸癌、骨腫瘍、腎臓癌、膵臓腫瘍、食道腫瘍、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫及び甲状腺リンパ腫を含む。
【００４３】
本発明による生物学的有効ヌクレオチド分子、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは、上述の他の好適な実施形態において必要に応じてプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。このプロテアーゼ阻害剤は当業者にとって従来技術から公知である。これらのプロテアーゼ阻害剤の例として、肝炎Ｃプロテアーゼの阻害剤又はＨＩＶプロテアーゼの阻害剤が挙げられるが、本発明においてはこれらに限定されない。
【００４４】
更に本発明による生物学的有効ヌクレオチド分子、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは他の好適な実施形態において、必要に応じて「薬理的に許容される担体」及び／又は溶剤と組み合わせて調製できる。薬理的に特に適した使用可能な担体は当業者に公知であり、例としては緩衝食塩溶液、水、エマルジョン（例えば油／水−エマルジョン）、種々の界面活性剤、無菌溶液等が挙げられる。
【００４５】
薬理的に許容される担体を含む本発明の医薬品は、公知の常法によって調製できる。これらの医薬品は各被験者に適切な用量で投与することができる。投与は経口又は非経口で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所、鼻腔内、気管支内又は皮内に、或いは動脈の所定の箇所にカテーテルを介して行うことができる。用量は、治療医により臨床的要因に応じて決定される。用量の調整は、例えば患者の身長や、体重、体表面積、年齢、性別、全身の健康状態、或いは特に服用手段、投与の時間と方法、場合によっては並行して投与される他の薬剤にも依存していることは当業者に公知である。用量は、通常０．０１〜１００００μｇの範囲であるが、この例示的な範囲を下回る又は上回る用量も、上述の要因を考慮すれば可能である。一般に本発明に係る医薬品製剤を定期的に投与する場合、用量は１日当り又は適用間隔当り１０ｎｇ〜１０ｍｇ単位の範囲である。該医薬品を静脈内に投与する場合、用量は体重１ｋｇ当り１ｎｇ／ｍｉｎ〜０．１ｍｇ／ｍｉｎの範囲であろう。
【００４６】
本発明の医薬品は局所又は全身に投与できる。非経口投与のための製剤は、無菌の水溶液又は非水溶液、サスペンジョン及びエマルジョンを含む。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び有機エステル化合物、例えば注射に適したオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール水溶液、エマルジョン、サスペンジョン、食塩水及び緩衝剤である。非経口担体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、リンゲル−乳酸塩及び結合油を含む。静脈内担体は、例えば液体補給剤、栄養補給剤及び電解質補給剤（例えばリンゲルブドウ糖をベースにしたもの）を含む。本発明による医薬品は、更に保存剤及び他の添加物、例えば抗菌性化合物、酸化防止剤、錯形成剤及び不活性ガスを含む。更に使用目的に応じ、例えばインターロイキン、成長因子、分化因子、インターフェロン、走化性タンパク質又は非特異的な免疫調節薬等の化合物を含むことができる。
【００４７】
更に、多数の遺伝子を効率的に阻害するため、或いは多数のｍＲＮＡを分解するために、ｓｉＲＮＡ８の若干の塩基配列を組み合わせて、同時に又は間隔をあけて投与でき、また、同一又は異なる濃度で使用できる。
【００４８】
図３に、前述の本発明に係るｓｉＲＮＡ８の毒性作用を更に増強できる追加的効果を示す。この場合、１以上の追加的塩基配列（例えばＡＡＡ（配列番号：８）、ＵＵＵ（配列番号：９）、ＧＣＣＡ（配列番号：１０）、ＵＧＧＣ（配列番号：１１）、ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ（配列番号：１２）、ＵＧＵＧＵ（配列番号：１３）、ＡＵＵＵＧ（配列番号：１４）、ＧＵＵＵＵ（配列番号：１５）、ＡＵＵＵＵ（配列番号：１６）、ＣＵＵＵＵ（配列番号：１７）、ＵＵＵＵＵ（配列番号：１８）又はＧＵＵＵＧ（配列番号：１９））はｓｉＲＮＡ１２に固定化されて、ｓｉＲＮＡ８が１以上のｍＲＮＡに結合することには起因しないストレス反応を細胞２内に誘起することが知られている。このような作用を有するこれらのｓｉＲＮＡ１２のヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ１２を細胞２内に導入された後、遺伝子の発現又はｍＲＮＡの分解を低減せず（図３に示されるこれらの塩基配列によって分解されないｍＲＮＡ３〜６参照）、細胞内に非特異的なストレス反応を誘起する。このストレス反応は図２で説明した作用に追加的にもたらされ、これよってより効果的に細胞２が死滅する。
【符号の説明】
【００４９】
１  ｓｉＲＮＡ
２  細胞
３  遺伝子特異的なｍＲＮＡ
４  遺伝子特異的なｍＲＮＡ
５  遺伝子特異的なｍＲＮＡ
６  遺伝子特異的なｍＲＮＡ
７  分解された遺伝子特異的なｍＲＮＡ
８  ｓｉＲＮＡ
９  分解された遺伝子特異的なｍＲＮＡ
１０  分解された遺伝子特異的なｍＲＮＡ
１１  分解された遺伝子特異的なｍＲＮＡ
１２  ｓｉＲＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
2014511173.tif 000005
【配列表】
2014511173000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月26日(2013.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
請求項１〜５に記載の生物学的有効ヌクレオチド分子を適用及び投与するための適用キットであって、
生物学的有効分子を含み、更なる成分も含むことができる少なくとも１個のアンプル（アンプルＡ）と、
例えば細胞貫通ペプチド、ナノ粒子、ポリエチレンイミン又は脂質のトランスフェクションシステムを有する少なくとも１個のアンプル（アンプルＢ）と、
前記生物学的有効分子に結合するための他の成分又はトランスフェクションシステムを含む少なくとも１個のアンプル（アンプルＣ）と、
アンプルＡ、Ｂ及びＣの内容物のための希釈緩衝剤及び反応緩衝剤と、
１以上のカテーテル付き若しくはカニューレ付き注射器、及び標的細胞を含む媒体にアンプル内容物からなる混合物を注入するのに必要とされる他の器材と、
適用及び投与に関する指示書とを少なくとも含むキット。
【国際調査報告】
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