(57)【要約】  免疫学的染色のための試料を調製するための構成物および方法が提供される。構成物は、界面活性剤を含む第１の溶液およびカオトロピック剤を含む第２の溶液を含むキットを含む。方法は、細胞または組織などの試料を、界面活性剤を含む第１の溶液と接触させて、次に試料を、カオトロピック剤を含む第２の溶液と接触させるステップを含む。方法は抗原賦活化のために過度の加熱を必要とせず、それ故、試料の細胞の形態を維持する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）界面活性剤を含む第１の溶液と、
ｂ）カオトロピック剤を含む第２の溶液と
を含むキット。
【請求項２】
前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記第１の溶液が、約０．０１％から約１％のＳＤＳを含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記第１の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＳＤＳを含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記第１の溶液が、約０．１％のＳＤＳを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記第１の溶液が、水溶液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８】
前記カオトロピック剤が、カオトロピック塩である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
前記カオトロピック塩が、チオシアン酸塩または過塩素酸塩である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記チオシアン酸塩が、チオシアン酸グアニジンである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記第２の溶液が、約３Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記過塩素酸塩が、過塩素酸リチウムである、請求項９に記載のキット。
【請求項１５】
前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記第２の溶液が、約３Ｍの過塩素酸リチウムを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記第２の溶液が、弱い界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
前記弱い界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記非イオン性界面活性剤が、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第２の溶液が、約０．０１％から約１％のＮＰ−４０を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記第２の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＮＰ−４０を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記第２の溶液が、約０．１％のＮＰ−４０を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記第２の溶液が、水溶液である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記キットが、抗原に特異的に結合する抗体をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗原が、核抗原である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記抗原が、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ｐ１６、およびＫｉ６７からなる群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記キットが、ペルオキシダーゼブロッキング剤、タンパク質ブロッキング剤、抗体の前記抗原に対する結合を検出するための化学物質、対比染色剤、ブルーイング剤、および使用説明書をさらに含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
抗体結合を検出するための前記化学物質が、色原体と、標識されたポリマーにコンジュゲートされた二次抗体とを含み、色原体は３’，３’−ジアミノベンジジンを含み、標識されたポリマーはデキストランポリマーにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記対比染色剤が、ヘマトキシリンを含む、請求項２８または２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記ブルーイング剤が、トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびアジ化ナトリウムを含む溶液を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
陽性対照試料をさらに含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
パパニコロウ（Ｐａｐ）染色のための試薬をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
Ｐａｐ染色のための試薬が、ＥＡ５０およびオレンジＧを含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
免疫学的染色のための試料を調製する方法であって、
ｃ）試料を界面活性剤を含む第１の溶液に接触させるステップと、
ｄ）試料をカオトロピック剤を含む第２の溶液に接触させるステップと
を含む方法。
【請求項３６】
前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の溶液が、約０．０１％から約１％のＳＤＳを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＳＤＳを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の溶液が、約０．１％のＳＤＳを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の溶液が、水溶液である、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記カオトロピック剤が、カオトロピック塩である、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記カオトロピック塩が、チオシアン酸塩または過塩素酸塩である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記チオシアン酸塩が、チオシアン酸グアニジンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の溶液が、約３Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記過塩素酸塩が、過塩素酸リチウムである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の溶液が、約３Ｍの過塩素酸リチウムを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の溶液が、弱い界面活性剤をさらに含む、請求項３５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記弱い界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記非イオン性界面活性剤が、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２の溶液が、約０．０１％から約１％のＮＰ−４０を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第２の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＮＰ−４０を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の溶液が、約０．１％のＮＰ−４０を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記第２の溶液が、水溶液である、請求項３５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記試料を、前記第１の溶液と共に少なくとも１分間インキュベートする、請求項３５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記試料を、前記第１の溶液と共に約１分から約１２０分間インキュベートする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料を、前記第１の溶液と共に約１０分から約６０分間インキュベートする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料を、前記第１の溶液と共に約１９分間インキュベートする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記試料を、前記第１の溶液中において室温でインキュベートする、請求項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記試料を、前記第１の溶液と共に加熱する、請求項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記試料を、前記第１の溶液と共に約２０℃から約６０℃でインキュベートする、請求項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記試料を、前記第１の溶液と共に約３７℃から約５５℃でインキュベートする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記試料を、前記第１の溶液と共に約５０℃でインキュベートする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料を、前記第２の溶液と共に少なくとも１分間インキュベートする、請求項３５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記試料を、前記第２の溶液と共に約１分から約１２０分間インキュベートする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記試料を、前記第２の溶液と共に約１０分から約６０分間インキュベートする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料を、前記第２の溶液と共に約１９分間インキュベートする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記試料を、前記第２の溶液と共に室温でインキュベートする、請求項３５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記試料を、前記第２の溶液と共に加熱する、請求項３５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記試料を、前記第２の溶液と共に約３０℃から約６０℃でインキュベートする、請求項３５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記試料を、前記第２の溶液と共に約３７℃から約５５℃でインキュベートする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記試料を、前記第２の溶液と共に約５０℃でインキュベートする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記試料を、第１の溶液と接触させた後、第２の溶液と接触させる前に洗浄する、請求項３５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記試料を、緩衝生理食塩水で洗浄する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記緩衝生理食塩水が、トリス緩衝生理食塩水である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
抗体を使用して前記試料中の抗原を検出するステップをさらに含む、請求項３５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗原が、核抗原である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗原が、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ｐ１６、およびＫｉ６７からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記試料が、子宮頸部の試料である、請求項３５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記試料が、細胞または組織を含む、請求項３５〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記試料の形態学的分析を実行するステップをさらに含む、請求項３５〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
試料をパパニコロウ（Ｐａｐ）染色するステップをさらに含む、請求項３５〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピトープを抗体結合のためにさらに接触しやすくすることにより、タンパク質の検出を向上させる方法および構成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織および細胞の試料の固定は、タンパク質の架橋に起因して、免疫染色に関して、タンパク質に基づくエピトープを不活性に、または利用しがたくさせる。抗原賦活化（ＡＲ）は、標的エピトープを免疫染色のために接触しやすくするプロセスである。固定により引き起こされた架橋の問題を克服すれば、タンパク質の三次構造内に埋没した標的エピトープを、一次抗体との結合のために接触しやすくできる。抗原賦活化はまた、有利なことに、抗原の検出に対する閾値を下げて、それにより検出に必要な抗体の量を減少させ、バックグラウンド染色を減少させて、偽陰性の結果の発生を最少化する。それ故、免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫細胞化学（ＩＣＣ）のプロトコルは、免疫染色の強度を増強するための、および関心のある抗原を回復させるための前処理ステップをしばしば含む。
【０００３】
免疫染色のための多くの既存の前処理ステップは、免疫染色のための試料を調製するために、関心のある細胞または組織試料を、種々の溶液（例えば、緩衝剤、ＥＤＴＡ、酸、塩基、界面活性剤）中において約８０℃以上の高温でインキュベートすることを含む。これらのタイプの試料前処理法は非常に発展しており、組織試料を処理するために最適化されている。組織は、処理の高温に耐えて形態を維持することができ、その理由は、これらの組織が、しばしばホルマリン中で固定され、次いで切片作製およびＩＨＣ処理に先だってパラフィン中に包埋され、組織切片が周囲の間質組織構造の支持を維持するためである。細胞診検体は、組織試料と同程度には固定されず、通常はパラフィン中に包埋されず、高熱前処理中に細胞の形態を維持するための間質支持材料を含有しない。したがって、エピトープ露出の増大および一次抗体への利用しやすさに役立つ高熱前処理方法は、細胞診検体の細胞の形態を崩壊させる。
【０００４】
それ故、抗原賦活化に効果的でありながら、細胞の形態を維持させる前処理方法および構成物が、細胞診試料の処理に、特に、免疫染色のための調製に必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
免疫染色のための試料を調製するための構成物および方法が、本明細書において提供される。本明細書中で開示される構成物は、界面活性剤を含む第１の溶液と、カオトロピック剤を含む第２の溶液とを含むキットを含む。これら２種の溶液の用途は、細胞または組織などの試料を、第１の溶液と、次いで第２の溶液と順に接触させることにより、タンパク質エピトープを回復することにある。露出した抗原は、次に抗体に対する結合に利用することができ、当技術分野において公知の任意の方法を使用して検出することができる。本開示の方法および構成物により、過度の加熱をしない抗原賦活化が可能になり、したがって細胞の形態の維持が可能になる。
【０００６】
以下の実施形態は本発明に含まれる。
１．ａ）界面活性剤を含む第１の溶液と、ｂ）カオトロピック剤を含む第２の溶液とを含むキット。
【０００７】
２．前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、実施形態１に記載のキット。
【０００８】
３．前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、実施形態２に記載のキット。
【０００９】
４．前記第１の溶液が、約０．０１％から約１％のＳＤＳを含む、実施形態３に記載のキット。
【００１０】
５．前記第１の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＳＤＳを含む、実施形態４に記載のキット。
【００１１】
６．前記第１の溶液が、約０．１％のＳＤＳを含む、実施形態５に記載のキット。
【００１２】
７．前記第１の溶液が、水溶液である、実施形態１〜６のいずれか１項に記載のキット。
【００１３】
８．前記カオトロピック剤が、カオトロピック塩である、実施形態１〜７のいずれか１項に記載のキット。
【００１４】
９．前記カオトロピック塩が、チオシアン酸塩または過塩素酸塩である、実施形態８に記載のキット。
【００１５】
１０．前記チオシアン酸塩が、チオシアン酸グアニジンである、実施形態９に記載のキット。
【００１６】
１１．前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、実施形態１０に記載のキット。
【００１７】
１２．前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、実施形態１１に記載のキット。
【００１８】
１３．前記第２の溶液が、約３Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、実施形態１２に記載のキット。
【００１９】
１４．前記過塩素酸塩が、過塩素酸リチウムである、実施形態９に記載のキット。
【００２０】
１５．前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、実施形態１４に記載のキット。
【００２１】
１６．前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、実施形態１５に記載のキット。
【００２２】
１７．前記第２の溶液が、約３Ｍの過塩素酸リチウムを含む、実施形態１６に記載のキット。
【００２３】
１８．前記第２の溶液が、弱い界面活性剤をさらに含む、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【００２４】
１９．前記弱い界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、実施形態１８に記載のキット。
【００２５】
２０．前記非イオン性界面活性剤が、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）である、実施形態１９に記載のキット。
【００２６】
２１．前記第２の溶液が、約０．０１％から約１％のＮＰ−４０を含む、実施形態２０に記載のキット。
【００２７】
２２．前記第２の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＮＰ−４０を含む、実施形態２１に記載のキット。
【００２８】
２３．前記第２の溶液が、約０．１％のＮＰ−４０を含む、実施形態２２に記載のキット。
【００２９】
２４．前記第２の溶液が、水溶液である、実施形態１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【００３０】
２５．前記キットが、抗原に特異的に結合する抗体をさらに含む、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【００３１】
２６．前記抗原が、核抗原である、実施形態２５に記載のキット。
【００３２】
２７．前記抗原が、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ｐ１６、およびＫｉ６７からなる群から選択される、実施形態２５に記載のキット。
【００３３】
２８．前記キットが、ペルオキシダーゼ阻害試薬、タンパク質ブロッキング剤、抗体の前記抗原に対する結合を検出するための化学物質、対比染色剤、ブルーイング剤、および使用説明書をさらに含む、実施形態２５〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【００３４】
２９．抗体結合を検出するための前記化学物質が、色原体と、標識されたポリマーにコンジュゲートされた二次抗体とを含み、色原体は３’，３’−ジアミノベンジジンを含み、標識されたポリマーはデキストランポリマーにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、実施形態２８に記載のキット。
【００３５】
３０．前記対比染色剤が、ヘマトキシリンを含む、実施形態２８または２９に記載のキット。
【００３６】
３１．前記ブルーイング剤が、トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびアジ化ナトリウムを含む溶液を含む、実施形態２８〜３０のいずれか１項に記載のキット。
【００３７】
３２．陽性対照試料をさらに含む、実施形態２５〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【００３８】
３３．パパニコロウ（Ｐａｐ）染色のための試薬をさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【００３９】
３４．Ｐａｐ染色のための試薬が、ＥＡ５０およびオレンジＧを含む、実施形態３３に記載のキット。
【００４０】
３５．免疫学的染色のための試料を調製する方法であって、
ａ）試料を界面活性剤を含む第１の溶液に接触させるステップと、
ｂ）試料をカオトロピック剤を含む第２の溶液に接触させるステップと
を含む方法。
【００４１】
３６．前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、実施形態３５に記載の方法。
【００４２】
３７．前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、実施形態３６に記載の方法。
【００４３】
３８．前記第１の溶液が、約０．０１％から約１％のＳＤＳを含む、実施形態３７に記載の方法。
【００４４】
３９．前記第１の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＳＤＳを含む、実施形態３８に記載の方法。
【００４５】
４０．前記第１の溶液が、約０．１％のＳＤＳを含む、実施形態３９に記載の方法。
【００４６】
４１．前記第１の溶液が、水溶液である、実施形態３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【００４７】
４２．前記カオトロピック剤が、カオトロピック塩である、実施形態３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【００４８】
４３．前記カオトロピック塩が、チオシアン酸塩または過塩素酸塩である、実施形態４２に記載の方法。
【００４９】
４４．前記チオシアン酸塩が、チオシアン酸グアニジンである、実施形態４３に記載の方法。
【００５０】
４５．前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、実施形態４４に記載の方法。
【００５１】
４６．前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、実施形態４５に記載の方法。
【００５２】
４７．前記第２の溶液が、約３Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む、実施形態４６に記載の方法。
【００５３】
４８．前記過塩素酸塩が、過塩素酸リチウムである、実施形態４３に記載の方法。
【００５４】
４９．前記第２の溶液が、約０．３Ｍから約３０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、実施形態４８に記載の方法。
【００５５】
５０．前記第２の溶液が、約１Ｍから約１０Ｍの過塩素酸リチウムを含む、実施形態４９に記載の方法。
【００５６】
５１．前記第２の溶液が、約３Ｍの過塩素酸リチウムを含む、実施形態５０に記載の方法。
【００５７】
５２．前記第２の溶液が、弱い界面活性剤をさらに含む、実施形態３５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【００５８】
５３．前記弱い界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、実施形態５２に記載の方法。
【００５９】
５４．前記非イオン性界面活性剤が、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）である、実施形態５３に記載の方法。
【００６０】
５５．前記第２の溶液が、約０．０１％から約１％のＮＰ−４０を含む、実施形態５４に記載の方法。
【００６１】
５６．前記第２の溶液が、約０．０５％から約０．５％のＮＰ−４０を含む、実施形態５５に記載の方法。
【００６２】
５７．前記第２の溶液が、約０．１％のＮＰ−４０を含む、実施形態５６に記載の方法。
【００６３】
５８．前記第２の溶液が、水溶液である、実施形態３５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【００６４】
５９．前記試料を、前記第１の溶液と共に少なくとも１分間インキュベートする、実施形態３５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【００６５】
６０．前記試料を、前記第１の溶液と共に約１分から約１２０分間インキュベートする、実施形態５９に記載の方法。
【００６６】
６１．前記試料を、前記第１の溶液と共に約１０分から約６０分間インキュベートする、実施形態６０に記載の方法。
【００６７】
６２．前記試料を、前記第１の溶液と共に約１９分間インキュベートする、実施形態６１に記載の方法。
【００６８】
６３．前記試料を、前記第１の溶液中において室温でインキュベートする、実施形態３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００６９】
６４．前記試料を、前記第１の溶液と共に加熱する、実施形態３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００７０】
６５．前記試料を、前記第１の溶液と共に約２０℃から約６０℃でインキュベートする、実施形態３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００７１】
６６．前記試料を、前記第１の溶液と共に約３７℃から約５５℃でインキュベートする、実施形態６５に記載の方法。
【００７２】
６７．前記試料を、前記第１の溶液と共に約５０℃でインキュベートする、実施形態６６に記載の方法。
【００７３】
６８．前記試料を、前記第２の溶液と共に少なくとも１分間インキュベートする、実施形態３５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【００７４】
６９．前記試料を、前記第２の溶液と共に約１分から約１２０分間インキュベートする、実施形態６８に記載の方法。
【００７５】
７０．前記試料を、前記第２の溶液と共に約１０分から約６０分間インキュベートする、実施形態６９に記載の方法。
【００７６】
７１．前記試料を、前記第２の溶液と共に約１９分間インキュベートする、実施形態７０に記載の方法。
【００７７】
７２．前記試料を、前記第２の溶液と共に室温でインキュベートする、実施形態３５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【００７８】
７３．前記試料を、前記第２の溶液と共に加熱する、実施形態３５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【００７９】
７４．前記試料を、前記第２の溶液と共に約３０℃から約６０℃でインキュベートする、実施形態３５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【００８０】
７５．前記試料を、前記第２の溶液と共に約３７℃から約５５℃でインキュベートする、実施形態７４に記載の方法。
【００８１】
７６．前記試料を、前記第２の溶液と共に約５０℃でインキュベートする、実施形態７５に記載の方法。
【００８２】
７７．前記試料を、第１の溶液と接触させた後、第２の溶液と接触させる前に洗浄する、実施形態３５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【００８３】
７８．前記試料を、緩衝生理食塩水で洗浄する、実施形態７７に記載の方法。
【００８４】
７９．前記緩衝生理食塩水が、トリス緩衝生理食塩水である、実施形態７８に記載の方法。
【００８５】
８０．抗体を使用して前記試料中の抗原を検出するステップをさらに含む、実施形態３５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【００８６】
８１．前記抗原が、核抗原である、実施形態８０に記載の方法。
【００８７】
８２．前記抗原が、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ｐ１６、およびＫｉ６７からなる群から選択される、実施形態８０に記載の方法。
【００８８】
８３．前記試料が、子宮頸部の試料である、実施形態３５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【００８９】
８４．前記試料が、細胞または組織を含む、実施形態３５〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【００９０】
８５．前記試料の形態学的分析を実行するステップをさらに含む、実施形態３５〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【００９１】
８６．試料をパパニコロウ（Ｐａｐ）染色するステップをさらに含む、実施形態３５〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【００９２】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下に示す本発明の説明でさらに詳細に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】抗Ｋｉ６７抗体で免疫染色した、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）の高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）がある子宮頸部細胞試料の像を示す図である。免疫染色に先だって、試料を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中５０℃で１９分間インキュベートし、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄して、次に３Ｍ過塩素酸リチウム（ＬｉＣｌＯ４）／０．１％ノニルフェニルポリエトキシ−エタノール（ＮＰ−４０）中５０℃で１９分間インキュベートした。試料を、パパニコロウ（Ｐａｐ）染色で対比染色した。
【図２】抗Ｋｉ６７抗体で免疫染色したＳｉＨａ（ヒト子宮頸部扁平上皮癌）細胞の像を示す図である。免疫染色に先だって、細胞を０．１％ＳＤＳ中５０℃で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して、次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中５０℃で１９分間インキュベートした。細胞をＰａｐ染色で対比染色した。
【図３】抗ｐ１６抗体で免疫染色した、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）のＨＳＩＬ子宮頸部細胞診試料の像を示す図である。免疫染色に先だって、試料を０．１％のＳＤＳ中５０℃で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して、次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中５０℃で１９分間インキュベートした。試料をＰａｐ染色で対比染色した。
【図４】抗ｐ１６抗体で免疫染色したＳｉＨａ細胞の像を示す図である。免疫染色に先だって、細胞を０．１％のＳＤＳ中５０℃で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して、次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中５０℃で１９分間インキュベートした。細胞をＰａｐ染色で対比染色した。
【図５】２種の抗ＭＣＭ２抗体および１種の抗ＭＣＭ７抗体で免疫染色したパラフィン包埋扁桃組織の組織学的切片の像を示す図である。扁桃組織は、１０％ホルムアルデヒド中で少なくとも２４時間固定して、次にパラフィン中に包埋した後、切片にした。免疫染色に先だって、切片は０．１％のＳＤＳ中５０℃で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中５０℃で１９分間インキュベートした。
【図６】パラフィンで包埋した２種の抗ＭＣＭ２抗体および１種の抗ＭＣＭ７抗体で免疫染色した子宮頸部上皮内新生物３（ＣＩＮ３）組織の組織学的切片の像を示す図である。子宮頸部組織は、１０％ホルムアルデヒド中で少なくとも２４時間固定して、次にパラフィン中に包埋した後切片にした。免疫染色に先だって、切片を０．１％のＳＤＳ中５０℃で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して、次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中５０℃で１９分間インキュベートした。
【図７】２種の抗ＭＣＭ２抗体および１種の抗ＭＣＭ７抗体で免疫染色した、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）がある子宮頸部細胞診試料の像を示す図である。免疫染色に先だって、試料を０．１％のＳＤＳ中室温で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して、次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中室温で１９分間インキュベートした。試料をＰａｐ染色で対比染色した。
【図８】２種の抗ＭＣＭ２抗体および１種の抗ＭＣＭ７抗体で免疫染色した、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）のある子宮頸部細胞診試料の像を示す図である。免疫染色に先だって、試料を０．１％のＳＤＳ中室温で１９分間インキュベートし、ＴＢＳで洗浄して次に３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０中室温で１９分間インキュベートした。試料をＰａｐ染色で対比染色した。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
タンパク質エピトープを露出させることによる、免疫学的染色のための試料を調製するための構成物および方法を開示する。該構成物は、界面活性剤を含む第１の溶液（前処理溶液１）およびカオトロピック剤を含む第２の溶液（前処理溶液２）を含むキット、を含む。該方法は、試料を、界面活性剤を含む第１の前処理溶液と、次にカオトロピック剤を含む第２の前処理溶液と接触させることを含む。試料が調製されてエピトープが露出すれば、抗原を抗体と接触させて抗原抗体結合を検出する当技術分野において公知の任意の方法を使用して、抗原を検出することができる。本明細書で開示した２溶液法により、細胞の形態を維持しながら、過度の加熱なしで免疫学的染色のために十分な抗原賦活化が可能になる。このことは、過度の加熱に敏感で、しばしば抗原賦活化が必要になる細胞診試料にとって特に有用である。抗原賦活化過程中における細胞の形態の維持は、これより後に細胞の形態を評価する試料にとって重要である。例えば、本明細書で開示した構成物および方法は、標準的パパニコロウ対比染色と組み合わせて、子宮頸部の細胞診試料中の（１以上の）抗原を検出するために使用することができる。
【００９５】
本明細書で開示した構成物および方法は、免疫学的染色のための試料の調製を指向する。免疫学的染色または免疫染色とは、試料を少なくとも１種の抗体と接触させて、抗原抗体結合を検出するために当技術分野において公知の任意の方法を使用して、試料中の対応する抗原に対する抗体の結合を検出するプロセスのことを指す。免疫学的染色の例として、組織試料内の抗原が検出される免疫組織化学、および細胞試料内の抗原が検出される免疫細胞診が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の構成物および方法は、免疫学的染色のための試料の調製に効果的であり、それは、染色プロセスで使用される抗体のその抗原に対する接近を可能にするための試料の改変に関連する。そのような改変として、細胞膜および幾つかの場合には核膜の膜透過処理、固定剤により誘発されたタンパク質架橋の切断（例えば、アルデヒド固定により惹起されたメチレンブリッジ；例えば、Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｅｄｓａｌｌ（１９４５）  Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２：２７７；Ｐｅａｒｓｅ（１９８０）  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｖｏｌ．１；Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３：８４５を参照されたい）、およびタンパク質抗原の変性が挙げられる。抗体の抗原に対する接近を可能にする、免疫学的染色のための試料を調製するプロセスも、本明細書において、抗原賦活化または前処理とも称する。
【００９６】
本明細書において使用される用語「抗原」は、抗原活性を有するポリペプチドを指す。「抗原活性」とは、抗体の産生に使用されるべきポリペプチドの能力を指す。本明細書で開示した方法および構成物は、細胞表面であっても細胞外であっても発現した、核および細胞質の任意のタイプの抗原を検出するための試料を調製するために使用することができる。幾つかの実施形態において、本明細書で開示した構成物および方法は、核抗原の免疫学的染色を増強するために使用することができ、したがって細胞膜および核膜の両方を透過性にすることができる。本明細書で開示した方法を使用して免疫染色され得る核抗原の例として、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、およびＭＣＭ１０、およびトポイソメラーゼＩＩなどのミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で開示した方法を使用して免疫染色することができる抗原の追加の例として、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびｐ５３が挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態の幾つかにおいて、本明細書で開示した方法は、ＥＲ、ＰＲ、ｐ５３、およびＫｉ６７を含む抗原の一群を免疫染色するために使用することができる。他の実施形態において、本明細書で開示した構成物および方法は、ｐ１６またはＫｉ６７の免疫学的染色の増強に効果的である。
【００９７】
本明細書で開示した構成物および方法は、免疫学的染色のための試料を調製するために、２種の溶液を使用する。本明細書において使用される用語「溶液」は、少なくとも２種の物質の混合物を指す。用語「溶液」は、均一な混合物に限定されず、本明細書においては、秩序相を含む混合物と同様に、より無秩序な相を含む混合物も指して使用される。例えば、水または他の極性液体中に界面活性剤を含む溶液は、溶液中のミセルの秩序相または自由な界面活性剤分子もしくはイオンの無秩序相、またはそれらの組合せを含有することができる。幾つかの実施形態において、第１のまたは第２の前処理溶液または両方の前処理溶液は、水溶液である。本明細書において使用される用語「水溶液」は、水を含む混合物を指す。これらの実施形態において、界面活性剤またはカオトロピック剤は、または両方とも、水中に分散または溶解しており、それらは追加の成分を含んでいてもいなくてもよい。他の実施形態において、界面活性剤またはカオトロピック剤、または両方は水以外の極性液体に分散または溶解される。
【００９８】
本明細書で開示した構成物および方法は、界面活性剤を含む第１の溶液（前処理溶液１）を含み、幾つかの実施形態においては、第２の溶液（前処理溶液２）も界面活性剤を含む。本明細書において使用される用語「界面活性剤」、「表面活性剤」および「洗剤」は、本明細書において互換的に使用することができ、液体の表面張力を減少させることができる分子を指す。界面活性剤は、親水性と疎水性両方の性質を有し、したがって、水または非極性溶媒のどちらの中でもある程度溶解され得る。界面活性剤は、４通りの基本的な群：すなわち、カチオン性、アニオン性、非イオン性、および双性イオン性に分類される。如何なる理論または作用機構にも束縛されず、第１の前処理溶液中における、および幾つかの実施形態においては第２の前処理溶液中における界面活性剤の存在が細胞膜の、および幾つかにおいては核膜の膜透過処理に寄与すると考えられる。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤も、タンパク質の疎水性内部に浸透してタンパク質の電荷分布を平衡化させ、それによりタンパク質を変性させて、エピトープの露出および一次抗体への利用しやすさを増大させる。
【００９９】
本明細書で開示した方法および構成物の幾つかの実施形態において、第１の前処理溶液は、アニオン性界面活性剤を含む。アニオン性界面活性剤は、水溶液に溶解または分散したときに正味の負電荷を有する界面活性剤である。代表的アニオン性界面活性剤の例として、ラウリル硫酸アンモニウムおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの硫酸アルキル；ラウレス硫酸ナトリウムおよびミレス硫酸ナトリウムなどの硫酸アルキルエーテル；ジオクチルナトリウムスルホスクシネートなどのドキュセート；ペルフルオロオクタンスルホネートおよびペルフルオロブタンスルホネートなどのスルホネートフッ素系界面活性剤；アルキルベンゼンスルホネート；アルキルアリールエーテルホスフェート；アルキルエーテルホスフェート；脂肪酸塩およびステアリン酸ナトリウムなどのアルキルカルボン酸塩；ラウロイルサルコシン酸ナトリウム；ペルフルオロノナネートおよびペルフルオロオクタノエートなどのカルボキシレートフッ素系界面活性剤；セチル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸エステル塩；ドデシルスルホン酸ナトリウムおよびアルキルアリルスルホン酸塩などのアルキルスルホン酸塩；ステアリン酸ナトリウム；デオキシコール酸ナトリウム；およびラウロイルサルコシン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
他の実施形態において、第１の前処理溶液中の界面活性剤は、カチオン性（すなわち、水溶液中に溶解または分散したときに正味の正電荷を有する）、非イオン性（すなわち、水溶液中に溶解または分散したときに電荷を有しない）、または双性イオン性（すなわち、水溶液中に溶解または分散したときに正味の中性電荷を有するが、界面活性剤分子内の異なった位置に負電荷および正電荷の両方を有する）である。
【０１０１】
ある実施形態において、第１の前処理溶液は、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｉｌｓｕｌｆａｔｅ）またはラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（ＳＬＳ）とも称されるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。ＳＤＳは、硫酸基に付いた１２個の炭素尾部からなり、分子式はＮａＣ１２Ｈ２５ＳＯ４である。これらの実施形態の幾つかにおいて、第１の前処理溶液は、約０．００１％から約１０％のＳＤＳを含み、約０．００１％、約０．０５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、および約０．００１％と約１０％の間の他のそのような値のＳＤＳを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、第１の前処理溶液は約０．０１％から約１％のＳＤＳを含む。他の実施形態において、第１の前処理溶液は、約０．０５％から約０．５％のＳＤＳを含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、第１の前処理溶液は、約０．１％のＳＤＳを含む。
【０１０２】
本明細書で開示した構成物および方法で利用される第２の前処理溶液は、カオトロピック剤を含む。本明細書において使用される用語「カオトロピック剤」とは、水素結合、ファンデルワールス力、および疎水性相互作用などの非共有結合の力により媒介される分子内相互作用を不安定化させる能力を有する物質を指し、それはタンパク質などの非極性化合物が、水溶液に溶解しやすくなることを可能にする。如何なる理論または作用機構にも束縛されず、第２の前処理溶液中のカオトロピック剤は、水分子をタンパク質の内部に浸透させ、および非極性側鎖を溶媒和させ、それにより未変性コンホメーションを通常は安定化している疎水的相互作用を破壊することにより、生物学的膜の溶解およびタンパク質の変性に寄与すると考えられる。本明細書で開示した方法および構成物における使用に適したカオトロピック剤の例として、カオトロピック塩、尿素、およびチオ尿素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、第２の前処理溶液はカオトロピック塩を含む。本明細書において使用される用語「カオトロピック塩」とは、本明細書において他の箇所で定義したカオトロピック剤として機能し得るカチオンおよびアニオンを含むイオン化合物を指す。一般的に、それは、カオトロピック塩のカオトロピック性に寄与する塩のアニオンである。タンパク質に溶媒和するそれらの能力に基づいてイオンを順序づける、ホフマイスターシリーズにおけるイオンの位置（例えば、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ（１８８８）  Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：２４７−２６０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｒｅｍｅｒ（２００６）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １０：６５８−６６３を参照されたい。これらの各文献は、その全体が本明細書に組込まれる）は、カオトロピック塩を、本明細書で開示した構成物および方法で使用するために選択するために使用することができる。ＳＣＮ−、ＣｌＯ４−、Ｉ−、ＣｌＯ３−、およびＢｒ−などのホフマイスターシリーズで後ろの方に現れるイオンが、より大きいカオトロピック性を有すると期待されるであろう。したがって、幾つかの実施形態において、カオトロピック塩は、ＳＣＮ-（チオシアン酸イオン）、ＣＮＳ-、ＣｌＯ３−、ＣｌＯ４-（過塩素酸イオン）、Ｉ-、Ｂｒ-、ＮＯ３−、Ｃｌ−、ＣＨ３ＣＯ２-（酢酸イオン）からなる群から選択されるアニオンを含む。本明細書で開示した方法および構成物で使用するために適したカオトロピック塩の代表的な例として、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジン、および過塩素酸リチウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
特定の実施形態において、カオトロピック塩は、チオシアン酸塩または過塩素酸塩であり、それらはカチオンおよびアニオンを含む塩に当てはまり、この場合アニオンは、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）または過塩素酸イオン（ＣｌＯ４−）である。これらの実施形態の幾つかにおいて、カオトロピック塩は過塩素酸塩である。本明細書で開示した方法および構成物で使用するために適した過塩素酸塩の例として、過塩素酸アンモニウム（ＮＨ４ＣｌＯ４）、過塩素酸セシウム（ＣｓＣｌＯ４）、過塩素酸リチウム（ＬｉＣｌＯ４）、過塩素酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣｌＯ４）２、過塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ４）、過塩素酸ルビジウム（ＲｂＣｌＯ４）、過塩素酸銀（ＡｇＣｌＯ４）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、過塩素酸カルシウム（Ｃａ（ＣｌＯ４）２）、および過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ４）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、第２の前処理溶液中のカオトロピック塩は過塩素酸リチウム（ＬｉＣｌＯ４）である。
【０１０５】
第２の前処理溶液が過塩素酸リチウムを含むこれらの実施形態の幾つかにおいて、過塩素酸リチウムは、第２の前処理溶液中で約０．３Ｍから約３０Ｍの濃度で存在し、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約４Ｍ、約５Ｍ、約６Ｍ、約７Ｍ、約８Ｍ、約９Ｍ、約１０Ｍ、約１１Ｍ、約１２Ｍ、約１３Ｍ、約１４Ｍ、約１５Ｍ、約１６Ｍ、約１７Ｍ、約１８Ｍ、約１９Ｍ、約２０Ｍ、約２１Ｍ、約２２Ｍ、約２３Ｍ、約２４Ｍ、約２５Ｍ、約２６Ｍ、約２７Ｍ、約２８Ｍ、約２９Ｍ、および約３０Ｍを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、第２の前処理溶液は、約１Ｍから約１０Ｍの過塩素酸リチウムを含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、第２の前処理溶液は、約３Ｍの過塩素酸リチウムを含む。
【０１０６】
他の実施形態において、第２の前処理溶液中に存在するカオトロピック塩は、チオシアン酸塩である。本明細書で開示した方法および構成物で使用するために適したチオシアン酸塩の例として、チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）、チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）、チオシアン酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＣＮ）、およびチオシアン酸グアニジン塩（Ｃ２Ｈ６Ｎ４Ｓ；チオシアン酸グアニジニウムとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、カオトロピック塩はチオシアン酸グアニジンであり、それは、グアニジニウムカチオン（ＣＨ６Ｎ３＋）およびチオシアン酸アニオン（ＳＣＮ−）を含む。
【０１０７】
第２の前処理溶液がチオシアン酸グアニジンを含むこれらの実施形態の幾つかにおいて、チオシアン酸グアニジンは、第２の前処理溶液中で約０．３Ｍから約３０Ｍの濃度で存在し、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約４Ｍ、約５Ｍ、約６Ｍ、約７Ｍ、約８Ｍ、約９Ｍ、約１０Ｍ、約１１Ｍ、約１２Ｍ、約１３Ｍ、約１４Ｍ、約１５Ｍ、約１６Ｍ、約１７Ｍ、約１８Ｍ、約１９Ｍ、約２０Ｍ、約２１Ｍ、約２２Ｍ、約２３Ｍ、約２４Ｍ、約２５Ｍ、約２６Ｍ、約２７Ｍ、約２８Ｍ、約２９Ｍ、約３０Ｍ、および約０．３Ｍから約３０Ｍの間の他のそのような値を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、第２の前処理溶液は、約１Ｍから約１０Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、第２の前処理溶液は、約３Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む。
【０１０８】
ある実施形態においては、カオトロピック剤に加えて、第２の前処理溶液は弱い界面活性剤を含む。本明細書において使用される用語「弱い界面活性剤」とは、哺乳動物細胞を溶解することはできるが、細胞の形態を維持するまたは細胞の形態に対して最小の影響しか有しない界面活性剤または界面活性剤の濃度を指す。弱い界面活性剤の例として、非イオン性または双性イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、弱い界面活性剤は、細胞の形態を、ある濃度で変えることができるが（例えば、アニオン性界面活性剤）、第２の前処理溶液中に、界面活性剤が細胞の形態に対して最小の影響しか有しないように十分低い濃度で存在する界面活性剤分子であってもよい。
【０１０９】
双性イオン性界面活性剤は、水溶液中に溶解または分散したときに正味の中性電荷を有するが、負および正電荷の両方を界面活性剤分子内の異なった位置に有する界面活性剤である。本明細書で開示した方法および構成物で使用するために適した双性イオン性界面活性剤の代表的な例として、第一級、第二級、または第三級アミンまたは３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）などのスルホネートと対になった第四級アンモニウムカチオン、ベタインおよびアミノ酸などのカルボン酸塩、またはレシチンなどのリン酸塩に基づくものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
非イオン性界面活性剤は、水溶液中に溶解または分散したときに電荷を有しない界面活性剤である。本明細書で開示した方法および構成物で使用するために適した非イオン性界面活性剤の代表的な例として、ポリエトキシ化ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）化合物）、例えば、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ＰＯＥソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ＰＯＥソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、およびＰＯＥソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）などを含むがこれらに限定されないポリソルベート；ソルビタン誘導体（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）化合物）；エチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）化合物、ポロキサマーとしても知られている）；ポリオキシエチレンエーテル化合物、例えば、ポリオキシエチレンステアリルエーテル（ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテルとしてもおよび商品名Ｂｒｉｊ（登録商標）７００により知られている）を含むがこれらに限定されないＢｒｉｊ（登録商標）ファミリーのものなど；ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標））などのポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル；ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル；オクチルグルコシドなどのグルコシドアルキルエーテル；グリセリンアルキルエーテル；ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル；ノニルフェノキシルポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）タイプＮＰ−４０としても知られている）；および脂肪族アルコールのエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、第２の前処理溶液は、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰ−４０）を含む。第２の前処理溶液がＮＰ−４０を含むこれらの実施形態の幾つかにおいて、ＮＰ−４０は、第２の前処理溶液中に、約０．００１％、約０．０５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、および約０．００１％と約１０％の他のそのような値を含むが、それらに限定されない約０．００１％から約１０％の濃度で存在する。ある実施形態において、第２の前処理溶液は、約０．０１％から約１％のＮＰ−４０を含む。他の実施形態において、第２の前処理溶液は、約０．０５％から約０．５％のＮＰ−４０を含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、第２の前処理溶液は、約０．１％のＮＰ−４０を含む。
【０１１２】
したがって、幾つかの実施形態において、第２の前処理溶液は、約３Ｍの過塩素酸リチウムまたはチオシアン酸グアニジンおよび約０．１％のＮＰ−４０の水溶液を含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、この第２の前処理溶液は、免疫学的染色のための試料を調製するための約０．１％のＳＤＳの水溶液を含む第１の前処理溶液と組み合わせて使用される。
【０１１３】
本明細書において開示した２種の前処理溶液は、免疫学的染色のための試料の調製で使用される。本明細書において使用される用語「試料」は、生物学的試料またはタンパク質の発現が検出され得る生物学的材料から得られた試料を指す。生物学的試料の例として、細胞（細胞診試料および培養細胞を含む）、組織、生検、スメア、ならびに体液、例えば、血液、リンパ液、尿、唾液、および婦人科の液体などが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的試料は、例えば、洗浄、領域の掻き取りまたは綿棒によるぬぐい取りにより、または体液を吸引する注射針の使用による種々の技法により患者から得ることができる。種々の生物学的試料を収集する方法は、当技術分野において周知である。
【０１１４】
試料は、固定しなくてもよく、または当技術分野において公知の任意の方法もしくは固定剤を使用して固定してもよい。本明細書で開示した構成物および方法における使用に適した固定剤の例として、メチレンブリッジの形成を通してタンパク質間の共有結合を作り出すアルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルマリン）などの架橋固定剤（例えば、ＦｒｅｎｃｈおよびＥｄｓａｌｌ（１９４５）  Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２：２７７；Ｐｅａｒｓｅ（１９８０）  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｖｏｌ．１；Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３：８４５を参照されたい）；アルコール（例えば、エタノール、メタノール）およびアセトンなどの沈殿固定剤；四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸、および過マンガン酸カリウムなどの酸化剤；Ｂ−５およびＺｅｎｋｅｒ’ｓなどの水銀剤；およびピクリン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、試料は組織試料を含む。組織試料は、組織を凍結するかまたはパラフィンもしくはエポキシもしくはアクリル系樹脂に包埋した後、切片にすることを含む当技術分野において公知の任意の方法を使用して調製することができる。ある実施形態において、組織試料は、約１０％ホルムアルデヒドを含む溶液中で約２４時間固定した後、切片にされる。
【０１１６】
特定の実施形態において、試料は、子宮頸部細胞を、子宮頸部組織試料としてまたは特に液体を主体にした調製において懸濁液中の子宮頸部細胞として含む。幾つかの実施形態において、子宮頸部試料は、例えば、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  （ＣＹＴＹＣ、Ｉｎｃ．）などの液体を主体にした細胞検体調製指針にしたがって収集される。子宮頸部試料は、拡大して調べるためにガラススライドに移すことができる。これらの実施形態の幾つかにおいて、患者の子宮頸部試料は、例えば、ＳｕｒｅＰａｔｈ（商標）収集バイアル（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）中などの液体培地に収集される。さらに分析するために、ＰｒｅｐＳｔａｉｎ（商標）システム（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）などの自動化処理装置が、細胞を液体培地から収集して、それらをガラススライド上に単層で沈着させるために使用される。
【０１１７】
一実施形態において、子宮頸部試料は、収集されて処理され、本明細書において引用により組込まれる米国特許第５，３４６，８３１号で説明されているように、単層試料で提供されるであろう。単層法は、細胞診の材料の単層を、カチオンで電荷を帯びた基材上に作製する方法に関する。該方法は、細胞診の材料を遠心分離により密度勾配で分離するステップ、細胞診の材料の詰め込まれたペレットを作製するステップ、細胞診の材料のペレットを混合するステップ、混合したペレットから所定の体積の部分標本を引き出すステップ、その部分標本および所定の体積の水を、取り外せるようにカチオンで電荷を帯びた基材に固定した沈降容器中に入れるステップ、細胞診の材料を重力下で基材上に定着させるステップ、細胞診の材料の定着後、沈降容器から水を除去するステップを含む。自動化分析のために、沈降容器は、基材から取り外すことができる。解凝集は、注射器による吸引吐出の繰り返し、トリプシン処理、超音波処理、振盪、ボルテックス処理などの当技術分野において公知の任意の方法によるか、またはその内容を引用により本明細書に組込まれる米国特許第５，３１６，８１４号に記載されたデバイスの使用によることができる。
【０１１８】
スライド検体は、固定しても固定しなくてもよく、調製に続いて直ちに分析してもよく、または後で分析するために貯蔵してもよい。幾つかの実施形態において、調製されたスライドは、約９５％エタノール中において最低で２４時間貯蔵される。あるいは、他の実施形態において、スライドは、本明細書において開示した第１の前処理溶液（すなわち、界面活性剤を含む溶液）中で貯蔵される。
【０１１９】
免疫学的染色のための試料を調製する本明細書で開示した方法にしたがって、試料は最初に、界面活性剤を含む第１の前処理溶液と、および次にカオトロピック剤を含む第２の前処理溶液と接触させ、幾つかの実施形態においては、弱い界面活性剤と接触させられる。試料は、試料が溶液と接触する結果になる任意の方法を使用して、本明細書で開示した前処理溶液と接触させることができる。それ故、幾つかの実施形態においては、前処理溶液を、試料を溶液で覆うような様式で、試料に加えることができる。あるいは、試料を、前処理溶液に加えることもでき、および幾つかの実施形態においては、試料を、溶液中に浸漬することができる。
【０１２０】
幾つかの実施形態においては、試料を、第１の前処理溶液と少なくとも１分間インキュベートする。他の実施形態においては、試料を第１の前処理溶液と、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０分、および約１分と約１２０分の間の他のそのような値を含むがこれらに限定されない、約１分間から約１２０分間インキュベートする。特定の実施形態においては、試料を第１の前処理溶液と約１０分間から約６０分間インキュベートする。これらの実施形態の幾つかにおいては、試料を、界面活性剤を含む第１の前処理溶液と約１９分間インキュベートする。
【０１２１】
他の実施形態において、第１の前処理溶液は、試料の、特に固定された試料のための貯蔵緩衝液としても供することができ、その場合試料は、第１の前処理溶液中で、少なくとも約２４時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約７日、約２週間、約１カ月、約１年またはそれを超えて貯蔵される。
【０１２２】
試料は、第１の前処理溶液中において室温でインキュベートすることができ、または加熱を適用することができる。したがって、幾つかの実施形態において、第１の前処理溶液における試料のインキュベーション温度は、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、および約２０℃と約６０℃の間の他のそのような値を含むがこれらに限定されない約２０℃から約６０℃である。ある実施形態においては、試料を、第１の前処理溶液と約３７℃から約５５℃の温度でインキュベートする。これらの実施形態の幾つかにおいて、インキュベーション温度は約５０℃である。
【０１２３】
特定の実施形態においては、試料を第１の前処理溶液と約５０℃で約１９分間インキュベートする。これらの実施形態の幾つかにおいて、第１の前処理溶液は、約０．１％のＳＤＳを含む水溶液である。
【０１２４】
界面活性剤を含む第１の前処理溶液中における試料のインキュベーションに続いて、試料を、カオトロピック剤と、幾つかの実施形態においては弱い界面活性剤とを含む第２の前処理溶液と接触させる。このことは、第１の前処理溶液から試料から取り出してまたは溶液を試料から除去して、次に試料を第２の前処理溶液に移すかまたは第２の溶液を試料に適用することにより達成することができる。試料から第１の前処理溶液を除去するかまたは第１の前処理溶液から試料を取り出すのに続いて、第２の前処理溶液と接触させる前に、試料を洗浄して残留している第１の前処理溶液を除去してもよい。
【０１２５】
本明細書において使用される用語「洗浄」は、試料に関する場合、試料を第１のまたは第２の前処理溶液以外の溶液と一時的に接触させて、微量の前処理溶液の活性成分（例えば、界面活性剤、カオトロピック剤）を除去することを指す。幾つかの実施形態において、洗浄溶液は水または緩衝生理食塩水である。細胞のおよび分子の生物学的方法のために使用される種々の緩衝食塩水が当技術分野において公知であり、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、およびトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が挙げられるがこれらに限定されない。幾つかの実施形態において、試料は、第１の前処理溶液の除去後、試料を第２の前処理溶液と接触させる前に、トリス緩衝生理食塩水で洗浄される。試料は、１回以上洗浄溶液で洗浄することができる。
【０１２６】
次に、試料を、カオトロピック剤および幾つかの実施形態においては弱い界面活性剤を含む第２の前処理溶液と接触させる。幾つかの実施形態においては、試料を第２の前処理溶液と少なくとも１分間インキュベートする。他の実施形態においては、溶液を、第２の前処理溶液と、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０分、および約１分と約１２０分の間の他のそのような値を含むがこれらに限定されない約１分間から約１２０分間インキュベートする。特定の実施形態においては、試料を、第２の前処理溶液と約１０分間から約６０分間インキュベートする。これらの実施形態の幾つかにおいては、試料を第２の前処理溶液で約１９分間インキュベートする。
【０１２７】
試料は、第２の前処理溶液中において室温でインキュベートすることができ、または加熱を適用することができる。したがって、幾つかの実施形態において、第２の前処理溶液における試料のインキュベーション温度は、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、および約２０℃と約６０℃の間の他のそのような値を含むがこれらに限定されない約２０℃から約６０℃である。ある実施形態においては、試料を、第２の前処理溶液と約３７℃から約５５℃の温度でインキュベートする。これらの実施形態の幾つかにおいて、インキュベーション温度は約５０℃である。
【０１２８】
特定の実施形態においては、試料を第２の前処理溶液と約５０℃で約１９分間インキュベートする。これらの実施形態の幾つかにおいては、試料を、第１の前処理溶液と約５０℃で約１９分間インキュベートした後、第２の前処理溶液でインキュベートする。
【０１２９】
当業者は、第１の、第２の、または第１および第２の前処理溶液によるインキュベーション温度およびインキュベーション時間は、免疫染色のために調製される試料のタイプおよび試料が固定された程度に応じて変化することを理解するであろう。例えば、架橋固定剤で固定されたこれらの試料は、アルコールで固定された試料と比較して、第１の、第２の、または第１および第２の前処理溶液によるさらに高い温度またはさらに長いインキュベーション時間を必要とすることもある。さらに、パラフィン包埋組織試料は、細胞診試料よりも、第１の、第２の、または第１および第２の前処理溶液によるさらに高いインキュベーション温度およびさらに長いインキュベーション時間に、細胞の形態に影響を受けることなく耐えることができることもある。
【０１３０】
試料を第１および第２の前処理溶液と接触させることにより試料を調製してしまえば、該方法は、調製された試料中の抗原を、抗体を使用して検出するために当技術分野において公知の任意の方法を使用することをさらに含んでもよい。用語「抗体」および「抗体（複数）」は、天然に生ずる形態の抗体および組み替え抗体、例えば、単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体および多特異的抗体など、ならびに少なくとも抗原性の結合部位を有する前出の全ての断片および誘導体を広く包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートしたタンパク質または化学的部分を含んでいてもよい。
【０１３１】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特性を有する糖タンパク質である。抗体は抗原に特異的な結合を示すが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、低いレベルでリンパ系により、および増大したレベルで骨髄腫により産生される。
【０１３２】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、完全に会合した抗体、抗原に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）、および前出を含む組み替えペプチドを包含する。
【０１３３】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、少量存在するかもしれない自然に生ずることが可能な変異を例外として、集団を構成する個々の抗体が同一であることを意味する。
【０１３４】
「抗体断片」は、完全な抗体の一部分、好ましくは、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、単一の抗原結合部位を各々有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる同一の抗原結合断片が２つ、および残余の「Ｆｃ」フラグメント（その名は容易に３５結晶化する能力を反映する）が生ずる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、まだ抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生ずる。
【０１３５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。二本鎖Ｆｖ種において、この領域は、１つの重鎖と１つの軽鎖とのダイマーの緊密な非共有結合の会合をした可変ドメインからなる。単鎖Ｆｖ種においては、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが、フレキシブルペプチドリンカーにより共有結合で連結していてもよく、その結果軽鎖と重鎖とが二本鎖Ｆｖ種における構造と類似の「ダイマー」構造で会合することができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬダイマーの表面上における抗原結合部位を画定するのはこの配置においてである。集団的に、６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、Ｆｖの半分であり、抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含む）でさえ、全結合部位より弱い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１３６】
Ｆａｂフラグメントも、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ部から１つまたは複数のシステインを含有する重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２〜３個の残基が付加されることにより、Ｆａｂ’断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が自由チオール基を担持するＦａｂ’についての本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。
【０１３７】
ポリクローナル抗体は、適当な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類）をタンパク質免疫原で免役することにより調製することができる。免疫された対象における抗体力価は、免疫されたタンパク質を使用して酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）などの標準的技法により経時的にモニターすることができる。免疫後の適当なときに、例えば、抗体力価が最高であるときに、抗体産生細胞を対象動物から得て、最初Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓｅｌｌ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ技法などの標準的技法により、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。ハイブリドーマを作製する技法は周知である（一般的に、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）；Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ＮＹ）；およびＬｅｒｎｅｒ（１９８１）  Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２を参照されたい）。
【０１３８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代替法として、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンのライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を、関心のあるタンパク質についてスクリーニングすることによりモノクローナル抗体を同定および単離して、それにより関心のあるタンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを発生させてスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａの組み替えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰθのファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。それに加えて、抗体ディスプレイライブラリーの発生およびスクリーニングにおいて使用するために特に対応できる方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；９２／０９６９０；および９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４に見出される。
【０１３９】
試料と第１および第２の前処理溶液とのインキュベーションに続いて、抗体とのインキュベーションの前に、試料は、適当なブロッキング剤、例えば、過酸化水素などのペルオキシダーゼブロッキング剤を使用してブロッキングすることができる。幾つかの実施形態において、試料は、抗体の非特異的結合を防止するために、タンパク質ブロッキング剤を使用してブロッキングされる。タンパク質ブロッキング剤は、例えば、精製されたカゼインを含むことができる。
【０１４０】
次に抗体、特に関心のある抗原に対するモノクローナル抗体を、試料とインキュベートする。免疫染色手順で２種以上の抗体を使用してもよい。２種以上の抗体が使用される場合、これらの抗体は、単一の試料に、個々の抗体試薬として順にまたは抗体カクテルとして同時に加えてもよい。あるいは、個々の各抗体を、同じ患者からの別の試料に加えて、生じるデータをプールしてもよい。
【０１４１】
抗体結合を検出する技法は、当技術分野において周知である。関心のある抗原に対する抗体結合は、抗体結合のレベル、すなわち、抗原の発現レベルに対応する検出可能なシグナルを発生する化学試薬の使用により検出することができる。抗原抗体結合の検出に使用することができる検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性材料、発光性材料、生物発光性材料、および放射性材料が挙げられるが、これらに限定されない。適当な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適当な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適当な蛍光性材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光性材料の例としてルミノールが挙げられ；生物発光材料の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；および適当な放射性材料の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１４２】
幾つかの実施形態において、抗体結合は、標識されたポリマーにコンジュゲートした二次抗体の使用により検出される。標識されたポリマーの例として、ポリマー−酵素複合体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの複合体中の酵素は、典型的には、抗原抗体結合部位における色原体の沈着を触媒するために使用され、それにより関心のある抗原の発現レベルに対応する細胞染色を生ずる。特に興味ある酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。市販の抗体検出系、例えばＤａｋｏのＥｎｖｉｓｉｏｎ＋システムおよびＢｉｏｃａｒｅのＭｅｄｉｃａｌ’ｓ  Ｍａｃｈ  ３システムなどが、本発明を実行するために使用することができる。
【０１４３】
特定の実施形態において、抗原に対する抗体結合は、二次抗体にコンジュゲートしたＨＲＰ標識ポリマーの使用により検出される。抗体結合は、マウスモノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬、およびマウスプローブ試薬に結合するＨＲＰにコンジュゲートしたポリマーの使用により検出することもできる。試料は、色原体の３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して抗体結合を染色し、次にヘマトキシリンおよび、場合により、水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０などのブルーイング剤を用いて対比染色される。本発明の幾つかの態様において、試料は、細胞検査技師および／または病理学者により顕微鏡で検査されて細胞染色を評価される。あるいは、試料は、自動化された顕微鏡により、または陽性に染色された細胞の同定を容易にするコンピュータソフトウェアの補助で人により検査することができる。
【０１４４】
抗体染色の検出に関して、当技術分野においては、生物学的試料中の複数の分子種の量を定量的に決定するビデオ顕微鏡およびソフトウェアの方法も存在し、存在する各分子種は特異的な色を有する代表的染料マーカーにより表示される。そのような方法は、比色分析法としても当技術分野において公知である。これらの方法において、ビデオ顕微鏡は、試料の像を、特定の関心のある抗原の存在を視覚的に示すために染色した後、提供するために使用される。これらの方法の幾つか、例えば、引用により本明細書に組込まれるＭａｒｃｅｌｐｏｉｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願第０９／９５７，４４６号およびＭａｒｃｅｌｐｏｉｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願第１０／０５７，７２９号に開示されたものなどは、存在する各分子の種の相対量を、代表的な色の染料マーカーの存在に基づいて決定する撮像システムおよび関連するソフトウェアの使用を開示しており、各分子の種の相対量は、それぞれ、撮像システムおよび関連するソフトウェアにより決定されるこれらの色の染料マーカーの光学的密度または透過率の値により示される。これらの技法は、その成分の色部分に「分解した」単一のビデオ像を使用して、染色された生物学的試料中の各分子の種の相対量を定量的に決定する。
【０１４５】
さらに、細胞内における抗原の所在も、免疫学的染色方法における重要な考慮すべき事柄である。核、細胞、または膜の染色パターンを示すタンパク質は、形態学的に確認することができ、免疫組織化学的方法に適している。しかしながら、細胞のおよび膜の染色では、免疫細胞化学アッセイにおける子宮頸部疾患の重要な形態学的特性（例えば、細胞に対する核の比）を同定することが困難になる。対照的に、核中で発現した核染色パターンを示すタンパク質は、抗体染色の検出を容易にして形態学的分析も可能にする。したがって、幾つかの実施形態において、核中で選択的に発現したタンパク質だけが、本明細書で開示した前処理および免疫染色手順を使用して検出される。
【０１４６】
当業者は、抗体力価および検出化学の最適化が、特定の抗体についてのシグナル対ノイズ比を最大化するために必要であることを理解するであろう。関心のある抗原に対する特異的結合を最大にし、および非特異的結合（または「バックグラウンド」）を最小にする抗体濃度が決定されるであろう。抗体力価および検出条件を最適化するアッセイのデザインは、標準的であり、十分当業者の日常的能力の範囲内である。
【０１４７】
さらに、当業者は、本明細書で開示した方法を実施するために使用される特定の抗体の濃度が、その抗原に対する抗体の結合時間および特異性のレベルのような要因に依存して変化することを理解するであろう。その上、複数の抗体が使用される場合、必要とされる濃度は、抗体が試料に適用される順、すなわち、カクテルとして同時にであるかまたは個々の抗体試薬として順にであるかにより影響され得る。さらに、関心のある抗原に対する抗体結合を視覚化するために使用される検出の化学は、所望のシグナル対ノイズ比を生ずるように最適化されなければならない。
【０１４８】
本明細書で開示した前処理方法は、試料の細胞の形態の維持を可能にする。それ故、幾つかの実施形態において、試料の形態学的特性を評価することができる。例えば、免疫染色は、従来の方法からの全ての形態学的情報が保存されるように、従来のＰａｐ染色と組み合わせることができる。この様式において、引用によりその全体が本明細書に組込まれる米国特許第７，５１０，８３８号に開示されたものなどの特異的バイオマーカーの検出は、Ｐａｐスメア試験の高い偽陰性率を減少させることができて、多数の自動化されたスクリーニングを促進することができる。幾つかの実施形態において、免疫染色手順は、従来のＰａｐ染色と組み合わされて単一の方法になる。組み合わされた免疫細胞化学およびＰａｐ染色法は、高度子宮頸部疾患において選択的に過発現した両方のバイオマーカーおよび細胞形態の可視化を、単一の試料で可能にする（例えば、子宮頸部細胞の単層を含む顕微鏡スライド）。組み合わされた免疫細胞化学およびＰａｐ染色法は、特に従来のＰａｐ試験によって正常、ＬＳＩＬ、またはＡＳＣＵＳと誤って分類されていた場合に、より正確な同定および高度子宮頸部疾患の診断を可能にすることができる。
【０１４９】
当業者は、この組み合わされた方法のための染色パラメータ（例えば、インキュベーション時間、洗浄条件、色原体／染色濃度、その他）は、免疫染色出力（例えば、色原体染色）とＰａｐ染色の間の十分な対比が得られるように、最適化される必要があることを理解するであろう。染色パラメータを最適化するためのアッセイデザインは標準的であり、十分当業者の日常的能力の範囲内である。
【０１５０】
さらに、当業者は、本発明の方法における任意のまたは全てのステップは、人により実行されるか、あるいは、例えば、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）またはＢｉｏｃａｒｅ  Ｎｅｍｅｓｉｓ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ）を使用して自動化された方式で実施できることを理解するであろう。したがって、試料調製、試料染色、および抗原発現検出のステップは自動化することができる。
【０１５１】
本明細書で開示した構成物は、本明細書で開示した免疫染色の前処理方法を実施するためのキットを含む。これらのキットは、界面活性剤（幾つかの実施形態において、ＳＤＳなどのアニオン性界面活性剤である）を含む第１の溶液と、カオトロピック剤（幾つかの実施形態において、チオシアン酸グアニジンなどのチオシアン酸塩、または、過塩素酸リチウムなどの過塩素酸塩である）および幾つかの実施形態においては弱い界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０）を含む第２の溶液とを含む。
【０１５２】
幾つかの実施形態において、キットは、抗原に特異的に結合する抗体をさらに含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、キットは、少なくとも２種の別の抗原の発現を特異的に検出する２種以上の抗体をさらに含む。各抗体は、キット中で、個々の試薬として、または別法では異なった関心のある抗原に対する全ての抗体を含む抗体カクテルとして提供することができる。
【０１５３】
キットは、抗原に対する抗体の結合を検出するための化学物質と、幾つかの実施形態においては、対比染色剤と、場合により、陽性の染色細胞の同定を容易にするブルーイング剤とをさらに含むことができる。一実施形態において、キットは、ＨＲＰ標識されたポリマーにコンジュゲートした二次抗体を含む。コンジュゲートした酵素と適合性の色原体（例えば、ＨＲＰ標識された二次抗体の場合にはＤＡＢ）、および、非特異的染色をブロッキングするための過酸化水素などの溶液が、さらに提供される。他の実施形態において、抗原に対する抗体結合は、マウスモノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬を使用して、次にマウスプローブ試薬に結合するＨＲＰとコンジュゲートしたデキストランポリマーを添加することにより検出される。そのような検出試薬は、例えばＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌから市販されている。
【０１５４】
本発明のキットは、ペルオキシダーゼブロッキング剤（例えば、過酸化水素）、タンパク質ブロッキング剤（例えば、精製されたカゼイン）、および、対比染色剤（例えば、ヘマトキシリン）をさらに含むことができる。ブルーイング剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０およびアジ化ナトリウムを添加した水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ、ｐＨ７．４）が陽性染色細胞の検出を容易にするためにキット中でさらに提供されてもよい。
【０１５５】
陽性および／または陰性対照は、本発明にしたがって使用される試薬の活性を確認しおよび用法を正すために、キット中に含まれてもよい。対照は、関心のある抗原の存在について、陽性また陰性のいずれであるか知られている組織切片、ガラススライド上に固定された細胞などの試料を含んでいてもよい。特定の実施形態において、陽性対照はＳｉＨａ細胞を含む。これは高異数三倍体（ｈｙｐｅｒｔｒｉｐｌｏｉｄ）の、かつ、ＨＰＶ−１６感染について陽性のヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株であり、それ故、高度子宮頸部疾患状態におけるバイオマーカーの過剰発現のための陽性対照として役立つ。ＳｉＨａ対照細胞は、本明細書で開示したキット中で調製されたスライドとしてまたはスライド調製に適合した細胞懸濁液として提供することができる。対照のデザインおよび使用は標準的であり、十分当業者の日常的能力の範囲内である。
【０１５６】
本明細書で開示した前処理方法および免疫染色とＰａｐ染色の組み合わされた方法を実施するためのキットも、本発明に包含される。そのようなキットは、本明細書において上に記載した前処理ステップ、免疫染色手順のために必要な試薬、ならびに従来のＰａｐ染色のための試薬、特にＥＡ５０およびオレンジＧを含む。
【０１５７】
本明細書において開示したキットは、用手のおよび自動化された前処理および免疫染色技法の両方に適合する。任意のまたは全てのキット試薬は、外部の環境からそれらを保護する入れ物の中で、例えば密封したコンテナ中で提供することができる。
【０１５８】
用語「ａ」または「ａｎ」存在物は存在物の１つまたは複数を指すことに留意すべきである。例えば、「ａｎ抗体」は１種または複数の抗体を表すと理解される。正確な意味で、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【０１５９】
本明細書および請求項の全体を通して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、特に断りのない限り、排除的でない意味で使用される。
【０１６０】
本明細書において使用される用語「約」は、値を指している場合、特定の量から、幾つかの実施形態においては±５０％、幾つかの実施形態においては±２０％、幾つかの実施形態においては±１０％、幾つかの実施形態においては±５％、幾つかの実施形態においては±１％、幾つかの実施形態においては±０．５％、および幾つかの実施形態においては±０．１％の変動を含むことが意図されており、それは、そのような変動は、開示された方法を実施しまたは開示された構成物を使用するために適当であるためである。
【０１６１】
さらに、量、濃度、または他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられた場合、範囲が別々に開示されているかどうかに関わらず、これは、任意の上の範囲の限界または好ましい値と任意の下の範囲の限界、または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を特異的に開示していると理解すべきである。数値の範囲が本明細書において挙げられている場合、特に断らない限り、範囲は、それらの終点を、および範囲内の全て整数および端数を含むことが意図される。本明細書で開示した対象の事物の範囲が、範囲を定めるときに挙げた特異値に限定されることは意図されない。
【０１６２】
特に断らない限り、本明細書において使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明に関連する当業者により共通的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書におけるのと同様な任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料は本明細書に記載されている。
【０１６３】
以下の例は、例示として提供するが、限定するものではない。
【実施例】
【０１６４】
＜例１．抗原賦活化溶液の分析およびインキュベーション温度＞
歴史的に、組織を主体にした大部分の抗原賦活化（ＡＲ）技法は、高熱、約１００℃および／または種々の溶液を用いる処理を利用してきた。ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）の子宮頸部細胞診試料中の抗原ＭＣＭ２およびＭＣＭ７を検出するためのＡＲ手順を、全体が引用により本明細書に組込まれる米国特許第７，５９５，３８０号（２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９抗ＭＣＭ２抗体）および第７，６３２，４９８号（２Ｅ６．２抗ＭＣＭ７抗体）に開示された３種の抗体のカクテルを使用して、細胞形態を維持するために、複数のＡＲ溶液およびインキュベーション温度を調べることにより、細胞診検体の適当な免疫染色を確保しつつ、本明細書において以下に記載したように最適化した。
【０１６５】
広範囲の、可能性のあるＡＲ（前処理）溶液（ｎ＝４３）をＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の細胞診検体で試験して、どの溶液が、３種の抗体のカクテル（２種の抗ＭＣＭ２抗体および１種の抗ＭＣＭ７抗体）を用いる免疫染色に対して、高度子宮頸部疾患を検出する陽性効果を有するかを決定した。試験溶液および初期観察を以下にグループ分けした。
【０１６６】
・酵素（例えば、ペプシン、トリプシン）（ｎ＝６）  細胞の形態を崩壊させ、免疫活性においては実質的増大なし。
・酸および塩基（ｎ＝４）  実質的免疫活性は観察されない。
・有機溶媒／その他（ｎ＝９）  実質的免疫活性は観察されない。
・緩衝剤（例えばＥＤＴＡ、クエン酸塩）およびカオトロピック塩（ｎ＝１５）  強いカオトロピック塩、特に過塩素酸リチウム（ＬｉＣｌＯ４）の単独、および幾つかの界面活性剤との組合せが、形態を保存して強い免疫活性を示した。他のものは免疫活性の限られた上昇を示した。
・界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｂｒｉｊ３５）（ｎ＝９）  大部分は免疫染色における実質的増大を示さなかった。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）は、単独で、および幾つかのカオトロピック塩溶液の活性との組合せで、免疫染色において、中程度の上昇を示した。
【０１６７】
有望な活性を示した前処理溶液の組合せをさらに試験した。ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の試料について最適のＭＣＭ２／ＭＣＭ７免疫染色および細胞の形態という結果になった前処理プロセスは、２ステップの手順を含み、それらの手順では、細胞を最初に０．１％のＳＤＳで処理し、続いて３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０でインキュベートした。この２ステップのプロセスは、２通りの別の抗原賦活化機構を強化して免疫活性を増強する。ＳＤＳおよびＮＰ−４０は両方ともに界面活性剤であり、如何なる理論または作用機構にも束縛されないが、ＳＤＳおよびＮＰ−４０の主な作用機構は、細胞膜および核膜の両方の透過率を増大させることであると考えられる。３種抗体カクテルのタンパク質標的（ＭＣＭ２およびＭＣＭ７）は細胞核内にあり、それ故一次抗体は、細胞膜と核膜の両方を通過する必要がある。これらの細胞の構造の透過率を増大させることは、一次抗体の両障壁を透過して標的抗原に達する能力を助ける。如何なる理論または作用機構にも束縛されないが、２溶液前処理方法の第２の作用機構は、強いタンパク質変性剤、特異的にカオトロピック塩の使用によるタンパク質の変性であると考えられる。カオトロピック塩は、内部のタンパク質結合を乱し、その結果タンパク質の３次構造を開き、遮蔽された標的エピトープの利用しやすさを増大させることにより、この作用を発揮する。
【０１６８】
本明細書の例１における以下に記載した残りの実験において、抗原賦活化プロセスでは、前処理溶液１（０．１％のＳＤＳ）および前処理溶液２（３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０）を利用した。次に、試料のために、各溶液で最適のインキュベーション温度および時間を決定した。
【０１６９】
高温（８０℃以上）は、組織を主体にした免疫組織化学（ＩＨＣ）のための大部分の抗原賦活化手順で共通である。加熱は、組織固定中に惹起された架橋結合を破壊することを促進する。大部分のＩＨＣ手順における現行の加熱方法は、水浴、マイクロ波オーブンおよび／または圧力釜を含む。組織は、これらの過酷なＡＲ処理に耐えることができ、その理由は、それらが、ホルムアルデヒド溶液を使用して固定されていること、および組織が、組織構造および細胞形態の保存を助ける支持間質の細胞材料を含むことである。対照的に、細胞検体は、一般的に固定されていないかまたは軽く固定されており、また伴う間質の支持がない離散的細胞で構成されており、そのような試料は、標準的な高温のＡＲ処理に敏感になる。ＡＲ溶液を用いるＡＲ温度およびインキュベーション時間の範囲を試験して、最適の細胞の形態を維持しながら適当な免疫染色を生じさせる温度および時間を決定した。
【０１７０】
ＡＲ温度の範囲を、３種抗体カクテル（２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９抗ＭＣＭ２抗体および２Ｅ６．２抗ＭＣＭ７抗体）を使用してＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の子宮頸部細胞診試料について調べた。前処理溶液１および前処理溶液２で順次１０から３０分の範囲の時間、および３０℃から８０℃の温度範囲でインキュベートした９０個の子宮頸部細胞診試料の分析を実施した。全てのスライドを、資格のある細胞検査士が評価した。免疫染色を示す異常な子宮頸部細胞のパーセンテージを、各試料の細胞の形態と同様に記録した。形態は、１〜３の尺度で記録し、１は許容できない（形態学的崩壊が存在）および３は最適である（標準的ＡＲ方法との差なし）。本明細書において提供した試験例の各々において比較として使用し、および本明細書において「スチーマー法（ｓｔｅａｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）」とも称される標準的ＡＲの方法は、以下のステップからなるものであった。すなわち、１）スチーマーまたは水浴中で０．５％Ｓａｎｄｏｐａｎ  ＬＳ（ナトリウムラウレス−１３−カルボキシレート）を入れたコプリンジャーを９５℃を超える温度に加熱するステップ；２）スライドを、加熱された０．５％Ｓａｎｄｏｐａｎ  ＬＳ溶液中に２０分間浸漬するステップ；および３）コプリンジャーを熱供給源から取り出すステップおよび該ジャーを１０分間冷えるに任せてから免疫染色手順に進むステップ。
【０１７１】
データは、５５℃以下の抗原賦活化温度で処理した全ての子宮頸部試料は、正常子宮頸部細胞の形態の最適の保存を保ったが、一方８０℃の抗原賦活化温度では崩壊した子宮頸部細胞の形態が生じたことを示した（表１を参照されたい）。
【表１】
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【０１７２】
抗原賦活化温度の追加の検討を行って、３７℃から６０℃の絞ったＡＲ温度範囲を調べた。これらの検討は、扁平上皮細胞の周縁部の僅かなカーリングなどの微妙な細胞の特徴が、６０℃のインキュベーション温度で明確になることを示した。表２は、３７℃または６０℃のいずれかのＡＲ温度で合計１時間処理した１２個の対応済みの子宮頸部細胞診検体のデータを含む。試料をＡＲ溶液１中６０℃で３０分間、およびＡＲ溶液２中６０℃で３０分間インキュベーション後、細胞質のフォールディングが明らかになった。それ故、６０℃がＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の試料についての抗原賦活化溶液でインキュベートするための上方の温度の限界であると決定された。
【表２】
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【０１７３】
６０℃という上方のＡＲ温度限界は、インキュベーションの長さに依存しない。６０℃で１５、３０または６０分間、前処理溶液１および前処理溶液２の各々の中でインキュベートしてプールした高度の子宮頸部検体は、細胞質のカーリング（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃｕｒｌｉｎｇ）を示したが、一方、３７℃または４２℃のいずれかで同じ時間インキュベートした検体では、形態学的崩壊がなかった（表３を参照されたい）。これらのデータは、標準的液体に基づくＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）のＰａｐと同等の最適の細胞の形態を確保するために、６０℃未満のＡＲ温度を維持する重要なデザインの制約を裏付ける。
【表３】
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【０１７４】
ＡＲの検討は、細胞の形態が、４２℃と５５℃の温度範囲の間で維持され得ることを示す。ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の試料について、２種の抗ＭＣＭ２抗体と１種の抗ＭＣＭ７抗体の３種抗体カクテルを使用する追加の検討をするために、５０℃のＡＲ温度を選択したが、それは、最適の免疫染色を生じ、６０℃という上方温度限界より十分低かったためである。
【０１７５】
＜例２．子宮頸部細胞診試料における高熱前処理法を用いる２ステップ前処理法の免疫染色および形態に対する効果の比較＞
この試験では、第２のインキュベーションステップのために２種の異なったカオトロピック塩溶液を使用する２ステップ前処理法を、互いにおよび高熱を利用する前処理方法（すなわち、例１に記載したスチーマー法）と比較した。
【０１７６】
これらの実験においては、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の子宮頸部細胞診検体は、内部で開発したＰｒｅｐＳｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｐａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）を使用して加工処理し、染色のために沈着させた（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）。２ステップの前処理方法で処理したこれらの試料について、スライドは特別にデザインしたスライド加熱トレイで５０℃に加熱して、前処理溶液１（０．１％のＳＤＳ）を適用し、スライドを５０℃で１９分間インキュベートした。細胞は標準的トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）溶液で洗浄した。次に、前処理溶液２（３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０または３Ｍのチオシアン酸グアニジン／０．１％ＮＰ−４０のいずれか）を加えて、細胞をさらに１９分５０℃でインキュベートした。３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０を含む前処理溶液２（または前処理溶液２でインキュベートしたこれらの試料）は、本明細書においてＬｉＣｌＯ４と称し、および３Ｍのチオシアン酸グアニジン／０．１％ＮＰ−４０を含む前処理溶液２（または溶液２とインキュベートしたこれらの試料）は、本明細書においてＧＴと称する。このインキュベーションに続いて、スライドを再びＴＢＳで洗浄し、免疫染色のためにＭＣＭ２／ＭＣＭ７と３種抗体の組合せ（２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９抗ＭＣＭ２抗体および２Ｅ６．２抗ＭＣＭ７抗体）で処理してＰｒｅｐＳｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）装置でＰＡＰ対比染色した。次にスライドのカバーを外して細胞学者および／または細胞病理学者が検査した。
【０１７７】
表４に、これらの検討で分析した４８１個の子宮頸部細胞診試料の特性を示す。
【表４】
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【０１７８】
２ステップ抗原賦活化法を使用して処理した試料において、免疫応答に対する感度または特異性またはバックグラウンドに関して、ＬｉＣｌＯ４とＧＴ溶液２の間で統計的に差はない。チオシアン酸グアニジンで処理した試料では、過塩素酸リチウムと比較して感度が２．１１％向上したが、２処理法は同じ特異性という結果であった（表５を参照されたい）。過塩素酸リチウムで処理した試料より多くのチオシアン酸グアニジン処理した試料が、かすかなバックグラウンド染色を有した。
【表５】
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【０１７９】
スチーマー法に対して２ステップ前処理法を使用して調製したこれらの試料を比較すると、ＣＩＮ２＋の場合に対する免疫染色について陽性または陰性であったこれらの試料については統計的な差はなかった。しかしながら、データは、細胞免疫陽性率（％）の分布に関して統計的に差を示した。特に、スチーマー法対ＧＴ（７７ｖｓ．４３）およびスチーマー法対ＬｉＣｌＯ４（７７ｖｓ．３６）によって免疫染色された異常細胞が５０％を超える場合について増加が見られた（表６および７を参照されたい）。
【表６】
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【表７】
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【０１８０】
チオシアン酸グアニジン処理した試料と過塩素酸リチウム処理した試料との間で、細胞免疫陽性率（％）の分布に関して統計的に差はなかった。ＣＩＮ２＋の場合について、過塩素酸リチウム処理した試料よりもチオシアン酸グアニジン処理した試料において、２５パーセントを超える陽性細胞の例が多かった（１２１ｖｓ．１１７）（表８を参照されたい）。ＨＳＩＬ／ＣＩＮ２＋の場合について、過塩素酸リチウム処理した試料と比べてチオシアン酸グアニジン処理した試料において５０％を超える異常な細胞免疫染色の症例が増加した（２８ｖｓ．２３）（表９を参照されたい）。比較において、スチーマー法を使用して調製した場合、ＨＳＩＬ／ＣＩＮ２＋の症例の１４％（１２／８４）が７５％を超える陽性を有した（表１０を参照されたい）。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１８１】
スチーマー法または本明細書において開示した２ステップ前処理法を使用して調製した子宮頸部細胞診試料の形態を検査すると、結果は、細胞学分類の分布に関して統計的な差（ｐ＜０．０００１）があることを示した。チオシアン酸グアニジン処理は、スチーマー法よりも２１多いＡＳＣＵＳ＋の症例および３９多いＨＳＩＬ症例を分類し、および過塩素酸リチウム処理は、スチーマー法よりも３０多いＡＳＣＵＳ＋の症例および５２多いＨＳＩＬの症例を分類した（表１１〜１４を参照されたい）。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０１８２】
スチーマー法によりＮＩＬＭと分類された１６０症例中、過塩素酸リチウム処理は、チオシアン酸グアニジンより８例多い細胞学的に異常な症例を同定した（３２ｖｓ．２４）（表１５を参照されたい）。スチーマー法によりＡＳＣＵＳ＋と分類された３１９症例中、チオシアン酸グアニジン処理は、過塩素酸リチウム処理より６例多いＡＳＣＵＳを分類した（４９ｖｓ．４３）（表１６を参照されたい）。さらに、スチーマー法によりＨＳＩＬ＋と分類された１３４症例中、過塩素酸リチウム処理は、チオシアン酸グアニジンより３例多いＨＳＩＬを分類した（１２９ｖｓ．１２６）。
【表１５】
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【表１６】
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【０１８３】
全体として、グアニジンチオシアン酸塩および過塩素酸リチウム処理はスチーマー法と比較して細胞の形態を崩壊させなかった。さらに、２ステップ前処理法で処理した腺細胞および萎縮性の試料は、スチーマー法を使用して加工処理したものより少ない免疫染色を示した。２ステップの抗原賦活化方法は、スチーマー法と比較して免疫／臨床的性能を低下させなかったが、スチーマー法で加工処理したこれらの試料と比較して免疫陽性であった細胞のパーセンテージにおいて低下が観察された。ＮＩＬＭおよびＣＩＮ２が確認された症例について、２ステップ前処理法は細胞学の分類の等級を上げた。
【０１８４】
例３．子宮頸部細胞診試料における２ステップ前処理プロセスを使用する抗原Ｋｉ６７およびｐ１６の検出
これらの実験で、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の子宮頸部細胞診検体を、内部で開発したＰｒｅｐＳｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｐａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）を使用して加工処理し、染色のために沈着させた。細胞沈着に続いて、特別にデザインしたスライド加熱トレイ上でスライドを５０℃に加熱してＡＲ溶液１（０．１％のＳＤＳ）を適用し、スライドを５０℃で１９分間インキュベートした。細胞を標準的トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）溶液で洗浄した。次にＡＲ溶液２（３Ｍ  ＬｉＣ１Ｏ４／０．１％ＮＰ−４０）を加えて、細胞をさらに１９分５０℃でインキュベートした。このインキュベーションに続いて、スライドを再びＴＢＳで洗浄し、免疫染色のために加工処理して、ＰｒｅｐＳｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔでＰＡＰ対比染色した。次にスライドのカバーを外して細胞学者および／または細胞病理学者が検査した。抗Ｋｉ６７または抗ｐ１６抗体で免疫染色した子宮頸部細胞診試料の代表的結果を、図１および３に、それぞれ示す。ＳｉＨａ細胞を同様に処理して抗Ｋｉ６７（図２）または抗ｐ１６抗体で免疫染色した（図４）。
【０１８５】
例４．２ステップ前処理プロセスを使用する扁桃および子宮頸部組織におけるＭＣＭ２およびＭＣＭ７の検出
扁桃および子宮頸部組織試料を１０％ホルムアルデヒド中で少なくとも２４時間固定して、次にパラフィン中に包埋した後切片にした。組織切片を溶液１（０．１％のＳＤＳ）と５０℃で１９分間インキュベートした。切片をＴＢＳで洗浄し、次に溶液２（３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％ＮＰ−４０）中において５０℃で１９分間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、組織切片を再びＴＢＳで洗浄し、３種抗体カクテル（２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９抗ＭＣＭ２抗体および２Ｅ６．２抗ＭＣＭ７抗体）を用いる免疫染色およびＰｒｅｐＳｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上のＰＡＰ対比染色のために加工処理した。免疫染色した代表的な扁桃組織および子宮頸部組織を図５および６に、それぞれ示す。これらの結果は、本明細書において開示した２ステップ前処理プロセスが、組織試料からの抗原を効果的に回復させることができて、効果的な免疫染色が生じることを示す。
【０１８６】
例５．加熱なしで２ステップ前処理プロセスを使用する子宮頸部細胞における核抗原の検出
ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）の低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）および高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）子宮頸部細胞診検体を、抗原賦活化のために、例３で記載したように試料を前処理溶液１（０．１％のＳＤＳ）中で１９分間インキュベートし、続いてＴＢＳで洗浄し、前処理溶液２（３ＭのＬｉＣｌＯ４／０．１％のＳＤＳ）中で１９分間インキュベートすることにより加工処理した。しかしながら、例３で記載した実験と対照的に、２種の前処理溶液でのインキュベーションステップ中、外部からの加熱は試料に適用しなかった。それ故、前処理溶液１および２を用いるインキュベーションステップは、室温で実施した。
【０１８７】
前処理に続いて、試料を３種抗体カクテル（２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９抗ＭＣＭ２抗体および２Ｅ６．２抗ＭＣＭ７抗体）で免疫染色してＰＡＰ対比染色した。代表的試料を図７（ＬＳＩＬ）および図８（ＨＳＩＬ）に示す。これらのデータは、本明細書で開示した２ステップ前処理法の、加熱なしの場合でさえ、細胞診試料の細胞の形態を維持しながらエピトープを効果的に露出させるという予期せぬ効果を示している。
【０１８８】
本明細書中で言及した全ての公開資料および特許出願は、本発明に関連する当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の各刊行物または特許出願が具体的におよび個々に引用により示されたのと同程度に、引用により本明細書に組込まれる。
【０１８９】
本明細書において説明した本発明の多くの改変および他の実施形態が、前出の記載および関連する図面で提示した教示の利益を有する、これらの発明が関連する当業者には思い浮かぶであろう。それ故、本発明は開示した特定の実施形態に限定されないこと、および改変および他の実施形態は実施形態の前出のリストおよび添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特定の用語が本明細書において使用されているが、それらは、総称的および記述的意味でのみ使用されており、限定する目的のためではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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