(57)【要約】本発明は、３つの分離カラムのみを必要とする連続クロマトグラフィープロセスのために好適な方法および装置に関する。プロセスは、２つのクロマトグラフィーのステップを含む２ステップの手順である。第１のクロマトグラフィーのステップ（キャプチャー）は、交互に、および逐次的に、２つの分離カラム上で行われ、第２のクロマトグラフィーのステップ（ポリッシング）もまた逐次的に、第３のカラムおいて行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
−  いずれも同じクロマトグラフィーマトリックスを有する２つの分離ユニットＡ１およびＡ２、ならびに、前記分離ユニットＡ１およびＡ２のクロマトグラフィーマトリックスとは異なるクロマトグラフィーマトリックスを有する分離ユニットＢ；全ての分離ユニットは流体入口および流体出口を有し、それにより、少なくとも前記分離ユニットＡ１の流体出口と前記分離ユニットＢの流体入口との間の流体接続、および前記分離ユニットＡ２の流体出口と前記分離ユニットＢの流体入口との間の流体接続が存在する、
−  前記分離ユニットＡ１の出口と前記分離ユニットＢの流体入口との間の流体連通と、前記分離ユニットＡ２の出口と前記分離ユニットＢの流体入口との間の流体連通との間で切り替えることを可能にする、分離ユニットＡ１およびＡ２と分離ユニットＢとの間の流体接続における少なくとも１つの弁、
−  少なくとも２つのバッファーリザーバ、および少なくとも２つのポンプ、
−  試料溶液を含むリザーバであって、前記分離ユニットＡ１およびＡ２の入口と流体接続にある、前記リザーバ、
を含む装置。
【請求項２】
分離ユニットＡ１およびＡ２が、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換、ミックスモードカチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有することにより特徴づけられる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
分離ユニットＢが、カチオン交換、ミックスモードアニオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有することにより特徴づけられる、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
分離ユニットＡ１およびＡ２がアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢがカチオン交換、ミックスモードアニオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有することにより特徴づけられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
分離ユニットＡ１およびＡ２がカチオン交換またはミックスモードカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢがアニオン交換またはミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有することにより特徴づけられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
分離ユニットＡ１の流体出口と分離ユニットＡ２の流体入口との間の接続線、および分離ユニットＡ２の流体出口と分離ユニットＡ１の流体入口との間の接続線をさらに含むことにより特徴づけられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
分離ユニットＡ１およびＡ２の出口と分離ユニットＢの流体入口との間の接続線において流体入口を含むことにより特徴づけられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
３つの分離ユニットのうちの１つの出口と少なくとも流体接続にあるウイルス不活化バッファーを有するさらなるリザーバを含むことにより特徴づけられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
３つの分離ユニットのうちの１つの出口と少なくとも流体接続にある、定置洗浄のためのバッファーを有する少なくとも１つのさらなるリザーバを含むことにより特徴づけられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置を用いて、試料中の１または２以上の不純物から標的分子を精製する方法であって、以下のステップ：
−  試料が分離ユニットＡ１上にロードされる間に（ここで、試料は、標的分子が分離ユニットＡ１に結合することを可能にする第１のｐＨおよび伝導率にある）、分離ユニットＡ２は、その時間の少なくとも一部において、分離ユニットＡ２上にロードされた標的分子が分離ユニットＢ上に溶離して分離ユニットＡ２が再平衡化されるように、分離ユニットＢと流体連通にあるように、ならびに、試料が分離ユニットＡ２上にロードされる間に（ここで、試料は、標的分子が分離ユニットＡ２に結合することを可能にする第１のｐＨおよび伝導率にある）、分離ユニットＡ１は、その時間の少なくとも一部において、分離ユニットＡ１上にロードされた標的分子が分離ユニットＢ上に溶離し、分離ユニットＡ１が再平衡化されるように、分離ユニットＢとの流体連通にあるように、試料を分離ユニットＡ１およびＡ２上に交互にロードすること、
−  分離ユニットＢの流体出口から標的分子を回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
標的分子が抗体であることにより特徴づけられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料を分離ユニットＡ１上にロードする間に、分離ユニットＡ１の流体出口がその時間の少なくとも一部において分離ユニットＡ２の流体入口との流体連通にあり、分離カラムＡ１から浸出し始めた分離カラムＡ２に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にすること、ならびに、試料を分離ユニットＡ２上にロードする間に、分離ユニットＡ２の流体出口が、その時間の少なくとも一部において分離ユニットＡ１の流体入口との流体連通にあり、分離カラムＡ２から浸出し始めた分離カラムＡ１に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にすることにより特徴づけられる、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス不活化バッファーを、分離ユニットＡ１に標的分子をロードした後で分離ユニットＡ１に、ならびに、分離ユニットＡ２に標的分子をロードした後で分離ユニットＡ２に、ポンプで通過させることにより特徴づけられる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
分離ユニットＡ１から未結合の試料を洗い流す間に、分離ユニットＡ２は、その時間の少なくとも一部において、試料溶液を含有するリザーバおよび分離ユニットＡ１と流体連通にあり、分離ユニットＡ２から未結合の試料を洗い流す間に、分離ユニットＡ１は、その時間の少なくとも一部において、試料溶液を含有するリザーバおよび分離ユニットＡ２と流体連通にあることにより特徴づけられる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
試料が清澄化された試料であることにより特徴づけられる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つの分離カラムのみを必要とする連続クロマトグラフィープロセスのために好適な方法および装置に関する。前記プロセスは、２つのクロマトグラフィーのステップを含む２ステップの手順である。第１のクロマトグラフィーステップ（キャプチャー）は、好ましくは２個の分離カラムにおいて、交互に、および逐次的に行い、第２のクロマトグラフィーステップ（ポリッシング）もまた、第３のカラムにおいて逐次的に行う。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
大規模で経済的なタンパク質の精製は、バイオテクノロジーおよび製薬の産業において、ますます重要な問題となっている。典型的には、タンパク質は、目的のタンパク質についての遺伝子を含む組換プラスミドの挿入によりそのタンパク質を生成するように操作された哺乳動物または細菌の細胞株のいずれかを用いて、細胞培養により生成される。用いられる細胞株は、生きた生物であるので、それらに、糖、アミノ酸、および通常は動物血清の調製物から供給される増殖因子を含有する、複雑な増殖培地をフィードしなければならない。細胞にフィードされた化合物の混合物からの、および細胞自体の副産物からの、ヒト治療剤としての使用のために十分な純度までの所望のタンパク質の分離は、恐るべき挑戦を提起する。
【０００３】
細胞デブリからのタンパク質の精製のための手順は、最初に、タンパク質の発現の部位に依存する。幾つかのタンパク質は、細胞から周囲の増殖培地中へと直接的に分泌させられる。他のものは細胞内で作られる。後者のタンパク質について、精製プロセスの第１のステップは細胞の溶解を含み、これは、機械的剪断、浸透圧ショックまたは酵素処理を含む多様な方法により行うことができる。かかる破壊により、細胞の全内容物がホモジェネート中に放出され、さらに、それらの小さなサイズの所為で取り除くことが困難な細胞内フラグメントを生成する。それらは一般に遠心分離により、または濾過により、取り除かれる。同じ問題は、より小さな規模であるが、直接的に分泌されるタンパク質に関しても、タンパク質生成の実行の過程における細胞の自然死および細胞内宿主細胞タンパク質の放出に起因して生じる。
【０００４】
結果として、現在用いられる典型的な精製プロセスは、以下のステップを含む：
−  細胞内タンパク質を回収するための細胞の溶解、または、分泌型タンパク質の場合は培地からのタンパク質の回収、
−  目的のタンパク質を含有する清澄化された試料を得るための、例えば分画遠心分離または濾過を用いる細胞デブリの除去、
−  試料中の他のタンパク質および多様な他の不純物から目的のタンパク質を分離するための、マルチステップのプロセスにおける多様なクロマトグラフィー媒質の使用。
【０００５】
クロマトグラフィー技術は、典型的には、タンパク質の混合物を、それらの電荷、疎水性の程度またはサイズに基づいて分離する。これらの技術の各々について幾つかの異なるクロマトグラフィー樹脂が利用可能であり、それにより関与する特定のタンパク質に対する精製スキームの正確な調整が可能になる。これらの分離方法の各々の本質は、タンパク質を長いカラムに沿って異なる速度において移動させることができ、これにより、それらがカラムをさらに通過するにしたがって増大する物理的分離を達成することができること、または、タンパク質を分離媒質に選択的に接着させることができ、それにより、次いで異なる溶媒により差次的に溶離させることができることである。一部の例において、不純物が特異的にカラムに接着し、目的のタンパク質が接着しない場合に、所望のタンパク質は不純物から分離される。すなわち、目的のタンパク質は、「フロースルー」中に存在する。
【０００６】
交換可能な対イオンにちなんで名づけられるイオン交換クロマトグラフィーは、イオン化可能な分子の精製に適用可能な手順である。イオン化された分子は、その荷電された基と、固相支持マトリックスに付着した逆に荷電された分子との非特異的静電相互作用により、固相とより強力に相互作用するイオン化された分子を遅延させることに基づいて、分離される。各々の型のイオン化された分子の正味の電荷、およびマトリックスに対するそのアフィニティーは、荷電された基の数、各々の基の電荷、および荷電された固相マトリックスとの相互作用について競合する分子の性質に従って変化する。これらの差異は、イオン交換クロマトグラフィーによる多様な分子型の分解をもたらす。イオン交換クロマトグラフィーを用いる典型的なタンパク質精製において、宿主細胞に由来する多くのタンパク質の混合物（哺乳動物細胞培養におけるものなど）を、イオン交換カラムに適用する。結合していない分子を洗い流した後で、段階的または勾配的な様式においてｐＨ、対イオン濃度などを変化させることなどにより条件を調整し、固相から、非特異的に保持または遅延されたイオン化された目的のタンパク質を放出させ、それを、異なる電荷の特徴を有するタンパク質から分離する。アニオン交換クロマトグラフィーは、そのｐＨにおいて、および特定の分離プロセスの条件下においての、固相マトリックスに付着した正に荷電された分子との相互作用についての、目的のアニオン分子と負の対イオンとの競合を含む。対照的に、カチオン交換クロマトグラフィーは、そのｐＨにおいて、および特定の分離プロセスの条件下においての、固相マトリックスに付着した負に荷電された分子についての、目的のカチオン分子と正の対イオンとの競合を含む。ミックスモードイオン交換クロマトグラフィーは、同じステップにおけるカチオンおよびアニオン交換クロマトグラフィー用媒質の組み合わせの使用を含む。特に、「ミックスモード（mixed-mode）」とは、カチオン交換および／またはアニオン交換と疎水性相互作用部分との混合物が共有結合している固相支持マトリックスを指す。
【０００７】
精製されるべきタンパク質と固定されたキャプチャー剤との間の特異的な構造的に依存的な（すなわち、空間的に相補的な）相互作用を利用するアフィニティークロマトグラフィーは、抗体などの幾つかのタンパク質についての標準的な精製の選択肢である。例えばプロテインＡは、Ｆｃ領域を含む抗体などのタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーのために有用な吸着剤である。プロテインＡは、Staphylococcus aureasからの４１ｋＤの細胞壁タンパク質であって、抗体のＦｃ領域に高いアフィニティー（ヒトＩｇＧに対して約１０-8Ｍ）で結合するものである。その一般的な用途にも関わらず、アフィニティークロマトグラフィーは、治療用タンパク質を精製するために必要な工業的な規模においては特に、高価である。
【０００８】
さらなるクロマトグラフィー的方法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）である。
したがって、典型的な精製プロセスとして、異なる遠心分離および濾過のステップ、ならびに、アフィニティークロマトグラフィー（AC）、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）、逆相クロマトグラフィー（RPC）、および順相クロマトグラフィー（NPC）などの少なくとも３つのクロマトグラフィーによる分離技術が挙げられる。通常、指名された技術の各々は、クロマトグラフィーによる分離の実行の前に試料の調製をもたらす、異なる操作（バッファー、ｐＨ、伝導率）条件を必要とする。より効率的および経済的な精製プロセスは、１つの精製の列における多様なクロマトグラフィーのモードの直接的な組み合わせにより、精製ステップの間の試料のフォールディング／調製ステップを取り除くことにより、達成することができる。
【０００９】
単純なバッチクロマトグラフィー技術は、工業的適用においてよく受容されているが、この技術は、その長い処理時間および高い運用コスト（例えば、大量の溶媒、高価な樹脂およびハードウェア）のために高価である。この技術はまた、運用条件に対して感受性である（例えば生成物のタイター、滞留時間およびフィード速度）（生成物の損失は、８０％の動的結合能力値から始まる）。
【００１０】
幾つかの代替的な半連続的技術もまた開発された。すなわち、それらは２つまたは３つの異なるクロマトグラフィーのモードを接続するが、連続的なフィードを有することを可能にしない。
WO 2011/037522は、出口を入口に接続した少なくとも２つの分離ユニットを含む分離システムを開示する。全てのカラムは直列に接続される。
WO 2011/017514は、保持タンクまたはバッファー交換ステップを必要としない、アフィニティークロマトグラフィーステップと２つのイオン交換クロマトグラフィーステップとの組合せを開示する。
しかし、より効率的および経済的な解決の必要性がなお存在する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の簡単な説明
驚くべきことに、本発明者らは、分離ユニット（カラム）の接続しか必要としないのみならず、連続的なフィードを可能にするシステムを見出した。このことは、少なくとも２つのキャプチャーカラムを提供することにより達成される。
本発明は、したがって、以下を含む装置に関する：
−  いずれも同じクロマトグラフィーマトリックスを有する２つの分離ユニットＡ１およびＡ２、ならびに分離ユニットＡ１およびＡ２のクロマトグラフィーマトリックスとは異なるクロマトグラフィーマトリックスを有する分離ユニットＢ；全ての分離ユニットは流体入口および流体出口を有し、それにより、少なくとも分離ユニットＡ１の流体出口と分離ユニットＢの流体入口との間の流体接続、および分離ユニットＡ２の流体出口と分離ユニットＢの流体入口との間の流体接続が存在する（図２、３および４における接続線Ｃ−Ｐ）。
−  分離カラムＡ１の流体出口と分離カラムＢの流体入口との間の流体連通と、分離カラムＡ２の流体出口と分離カラムＢの流体入口との間の流体連通との間で、切り替えを可能にする、分離カラムＡ１およびＡ２と分離カラムＢとの間の流体接続における少なくとも１つの弁。
−  少なくとも２つのバッファーリザーバおよび少なくとも２つのポンプであって、それにより、バッファーリザーバが、少なくとも分離ユニットＡ１およびＡ２の入口と流体接続にあり、ポンプが、リザーバから分離ユニットへの液体の輸送に用いられる。
−  試料溶液を含むリザーバ（試料のフィード）であって、分離ユニットＡ１の入り口およびＡ２と流体接続にあるもの。
【００１２】
一態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２は、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックスまたはミックスモードカチオン交換マトリックスを有する。
別の態様において、分離ユニットＢは、カチオン交換、ミックスモードアニオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の態様において、分離ユニットＢは、カチオン交換およびアニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、またはカチオンおよびミックスモードアニオン交換マトリックス、またはミックスモードカチオン交換マトリックスおよびアニオン交換マトリックスを含む、マトリックスの混合物を有する。
【００１３】
好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはアニオン交換またはミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはアニオン交換とカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスとの混合物を有する。
【００１４】
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢは、アニオン交換とミックスモードカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスとの混合物、またはカチオン交換とミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスとの混合物、またはミックスモードカチオン交換とミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスとの混合物を有する。
【００１５】
別の好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はカチオン交換またはミックスモードカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはアニオン交換またはミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
【００１６】
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアニオン交換またはミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはカチオン交換またはミックスモードカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
【００１７】
別の好ましい態様において、２つの分離ユニットＡ１およびＡ２は、いずれも、分離ユニット出口において少なくとも１つの流体選択弁を有し、それにより、分離ユニットＡ１およびＡ２の出口における流体選択弁の少なくとも１つのチャネルは、分離ユニットＢの出口と接続し（接続線を介して）、分離ユニットＡ１と分離ユニットＢとの間、および分離ユニットＡ２と分離ユニットＢとの間の流体連通の制御（開始および停止）を可能にする。
【００１８】
別の好ましい態様において、分離ユニットＢは、分離ユニット出口において流体選択弁を有する。
別の好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２は、いずれも、分離ユニット入口において少なくとも１つの流体選択弁を有する。
【００１９】
好ましい態様において、装置はさらに、分離ユニットＡ１の流体出口と分離ユニットＡ２の流体入口との間の接続線、および分離ユニットＡ２の流体出口と分離ユニットＡ１の流体入口との間の接続線を含み（図２、３および４における接続線Ｆ−Ｆ）、それにより、分離ユニットＡ１の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の流体連通、ならびに、分離ユニットＡ２の出口と分離ユニットＡ１の入り口との間の流体連通を可能にする。非常に好ましい態様において、少なくとも１つの弁は、分離ユニットＡ１の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の接続線において位置し、少なくとも１つの弁は、分離ユニットＡ２の出口と分離ユニットＡ１の入り口との間の接続線において位置する。典型的には、弁は、分離ユニットＡ１およびＡ２の出口の近傍、および／または分離ユニットＡ１およびＡ２の入口の近傍に位置する。
【００２０】
別の好ましい態様において、装置は、分離ユニットＡ１の流体出口と分離ユニットＡ２の流体入口との間に２本の接続線、ならびに、分離ユニットＡ２の流体出口と分離ユニットＡ１の流体入口との間に２本の接続線（図４における接続線Ｆ−ＦおよびＷ−Ｆ）を含み、それにより、分離ユニットＡ１の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の流体連通、ならびに、分離ユニットＡ２の出口と分離ユニットＡ１の入り口との間の流体連通を可能にする。非常に好ましい態様において、弁は、分離ユニットＡ１およびＡ２の入口および出口の近傍に位置し、接続線は、これらの弁から開始する。
【００２１】
別の好ましい態様において、少なくとも２つのバッファーリザーバは、分離ユニットＡ１およびＡ２の入口と流体接続にある。１または２以上の弁および／またはさらなる流体入口が、バッファーリザーバと分離ユニットＡ１およびＡ２の入口との間の接続線中に位置していてもよい。
【００２２】
別の好ましい態様において、装置はさらに、分離ユニットＡ１およびＡ２の流体入口の前、好ましくは、分離ユニットＡ２の流体出口と分離ユニットＡ１の流体入口との間の接続線の前、ならびに分離ユニットＡ１の流体出口と分離ユニットＡ２の流体入口との間の接続線の前に、１または２以上のさらなる流体入口を含む。
【００２３】
別の好ましい態様において、装置は、カラムＢの流体入口の前に、さらなる流体入口を含み、このことは、好ましくは、１または２以上のリザーバへの接続線が、カラムＡ１およびＡ２の出口とカラムＢの入口との間の接続線において、カラムＢの流体入口の前に位置することを意味する。
別の好ましい態様において、装置は、３つの分離ユニットのうちの１つの出口と少なくとも流体接続にあるウイルス不活化バッファーを有するさらなるリザーバを含む。
【００２４】
本発明はさらに、試料中の１または２以上の不純物から標的分子を精製する連続的方法に関し、該方法は、以下のステップ：
−  試料が分離ユニットＡ１にロードされる間に（ここで、試料は、標的分子が分離ユニットＡ１に結合することを可能にする第１のｐＨおよび伝導率にある）、分離ユニットＡ２は、少なくとも部分的に、
分離ユニットＡ２上にロードされた標的分子が分離ユニットＢ上に溶離され、分離ユニットＡ２が再平衡化されるように、分離ユニットＢと流体連通にあり、試料が分離ユニットＡ２上にロードされる間に（ここで、試料は、標的分子が分離ユニットＡ２に結合することを可能にする第１のｐＨおよび伝導率にある）、分離ユニットＡ１は、少なくとも部分的に、標的分子が分離ユニットＢ上に溶離され、分離ユニットＡ１が再平衡化されるように、分離ユニットＢと流体連通にあるように、試料を分離ユニットＡ１およびＡ２上に交互にロードすること、
−  分離ユニットＢの流体出口から標的分子を回収すること。
を含む。
【００２５】
好ましい態様において、標的分子は抗体である.
好ましい態様において、試料は、分離ユニットＡ１または分離ユニットＡ２のいずれかに交互に、連続的にロードされる。
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２は、結合および溶離モードにおいて実行され、分離ユニットＢは、フロースルーモードにおいて実行される。
【００２６】
別の好ましい態様において、試料を分離ユニットＡ１上にロードする間に、分離ユニットＡ１の流体出口は、少なくとも部分的に、分離ユニットＡ２の流体入口と流体連通にあり、分離ユニットＡ１から浸出し始めた分離ユニットＡ２に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にする。ならびに、試料を分離ユニットＡ２上にロードする間に、分離ユニットＡ２の流体出口は、好ましくは少なくとも部分的に、分離ユニットＡ１の流体入口と流体連通にあり、分離ユニットＡ２から浸出し始めた分離ユニットＡ１に結合するべき標的分子のキャプチャーを可能にする。
【００２７】
別の好ましい態様において、未結合の試料を分離ユニットＡ１から洗い流す間に、分離ユニットＡ２は、少なくとも部分的に、試料溶液を含有するリザーバおよび分離ユニットＡ１と流体連通にある。すなわち、分離ユニットＡ２に、ユニットＡ１から溶離する未結合の試料およびリザーバから出て来る試料溶液を、同時にロードする。ならびに、未結合の試料を分離ユニットＡ２から洗い流す間に、分離ユニットＡ１は、試料溶液を含有するリザーバおよび分離ユニットＡ２と流体連通にある。
【００２８】
別の好ましい態様において、分離ユニットＢが分離ユニットＡ１と流体連通にある間に、それはまた、バッファーリザーバとも流体連通にある。
ならびに、分離ユニットＢが分離ユニットＡ２と流体連通にある間に、それはまた、バッファーリザーバとも流体連通にある。
【００２９】
好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２に標的分子をロードした後で、ウイルス不活化バッファーを、分離ユニットＡ１およびＡ２に、ポンプで通過させる。
別の態様において、分離ユニットＢが結合／溶離モードで実行される場合、当該ユニットに標的分子をロードした後で、ウイルス不活化バッファーを、分離ユニットＢにポンプで通過せる。
【００３０】
好ましい態様において、本発明の方法に供される試料は、清澄化された試料である。すなわち、試料を分離ユニットＡ１またはＡ２上にロードする前に、以下の１または２以上に供することによりそれを清澄化する：遠心分離、濾過および／または沈下。
非常に好ましい態様において、遠心分離、濾過および／または沈下による清澄化の前に、試料を沈澱剤で処理する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明による装置の好ましい態様の模式図を示す。それは、２つのキャプチャー分離ユニット（CIEX）、１つのポリッシング分離ユニット（AIEX）、リザーバ（CIP、VI、E.A、E.B、Dil.、Feed、CIP、E.A、E.B）、ならびに接続線、弁、ポンプおよび検出器を示す。
【００３２】
【図２】図２、３および４は、本発明による装置の異なる態様を模式的に示す。図２は、必須の特徴に主に限定されるが、例えば、分離ユニットＢの前のさらなる流体入口（入口Ｃ）を有する、セットアップを示す。
【００３３】
【図３】図３は、分離ユニットＡ１の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の流体接続、ならびに、分離ユニットＡ２の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の流体接続（接続線Ｆ−Ｆ）をさらに含むセットアップを示す。
【００３４】
【図４】図４は、分離ユニットＡ１の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の流体接続を可能にする２つの接続線、ならびに、分離ユニットＡ２の出口と分離ユニットＡ２の入り口との間の流体接続を可能にする２つの接続線（接続線Ｆ−Ｆ、接続線Ｗ−Ｆ）を有するセットアップを示す。
【００３５】
【図５】図５は、３つのキャプチャー分離ユニットＡ１、Ａ２およびＡ３、ならびに２つのポリッシング分離ユニットＢ１およびＢ２を有する、本発明による装置の態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それら自体は変更されてもよいことが理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、文脈が明らかに異なることを示さない限りにおいて、単数形「a」「an」および「the」は、複数形の参照対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「a ligand」への言及は、複数のリガンドを含み、「an antibody」への言及は、複数の抗体を含み、他も同様である。
【００３７】
他に定義されない限りにおいて、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語を、本明細書において記載されるような本発明の目的のために定義する。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、用語「標的分子」は、試料中の１または２以上の不純物から単離、分離または精製されるべき、任意の分子、物質もしくは化合物、またはそれらの混合物を指す。好ましい態様において、標的分子はタンパク質、または１もしくは２以上のタンパク質の混合物である。非常に好ましい態様において、標的分子は抗体である。
【００３９】
用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。典型的には、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有しており、前記鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されている。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、単量体形態で存在しても多量体形態で存在してもよく、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体、および／または単量体、二量体もしくは多量体形態で存在するＩｇＡ抗体であってもよい。抗体はまた、多選択性抗体（例えば二選択性抗体）、および、それらがリガンド特異的結合ドメインを保持するかまたはそれを含むように改変される限り、抗体フラグメントを含んでもよい。用語「フラグメント」とは、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。フラグメントは、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントはまた、組換え的手段により得ることができる。組換えにより生成される場合、フラグメントは、単独で、または融合タンパク質と称されるより大きなタンパク質の一部として、発現させることができる。例示的なフラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントが挙げられる。例示的な融合タンパク質として、Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。本発明により、融合タンパク質はまた、用語「抗体」により包含される。
【００４０】
上で議論されるように、一部の態様において、抗体は、タンパク質含有Ｆｃ領域、例えば免疫グロブリンである。一部の態様において、Ｆｃ領域含有タンパク質は、別のポリペプチドまたはそのフラグメントに融合した免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、組換えタンパク質である。例示的なポリペプチドとして、例えば以下が挙げられる：レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンα鎖；インスリンβ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；VIIIC因子、IX因子、組織因子およびフォン・ウヴィルブラント因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血系増殖因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ランテス（RANTES：regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（MIP−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンα鎖；リラキシンβ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；DNase；ＩｇＥ；細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原（CTLA）（例えば、CTLA-4）；インヒビン；アクチビン；血管内非増殖因子（VEGF）；ホルモンまたは増殖因子のための受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（NT-3、NT-4、NT-5またはNT-6）などの神経栄養因子、またはNGF−βなどの神経増殖因子；血小板由来増殖因子（PDGF）；αFGFおよびβFGFなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（EGF）；TGF−βl、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４またはTGF−β５を含むTGF−アルファおよびTGF−βなどのトランスフォーミング増殖因子（TGF）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（IGF-IおよびIGF-II）；des(l-3)-IGF-I（脳IGF-I）、インスリン様増殖因子阻害タンパク質（IGFBP）；CD3、CD4、CD8、CD 19 CD20、CD34、およびCD40などのCDタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（BMP）；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（CSF）
、例えばM-CSF、GM-CSFおよびG-CSF；インターロイキン（IL）、例えば、IL-1〜IL-10；スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜（surface membrane）タンパク質；崩壊促進因子；例えばAIDSエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；CDl Ia、CDl Ib、CDl Ic、CD 18、ICAM、VLA-4およびVCAMなどのインテグリン；HER2、HER3またはHER4受容体などの腫瘍関連抗原；ならびに上で列記されるポリペプチドのいずれかのフラグメントおよび／またはバリアント。さらに、本発明による抗体は、上で列記されるポリペプチドのいずれかに特異的に結合する任意のタンパク質またはポリペプチド、そのフラグメントまたはバリアントである。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、および他に記述されない限り、用語「試料」は、標的分子を任意の組成物または混合物を指す。試料は、生物学的ソースまたは他のソースから誘導することができる。生物学的ソースとして、植物および動物細胞、組織または器官などの真核生物または原核生物のソースが挙げられる。試料はまた、標的分子と混合されて見出される希釈剤、バッファー、洗剤、および混入する種、デブリなどを含んでもよい。試料は、「部分的に精製され」ていても（すなわち、濾過ステップなどの１または２以上の精製ステップに供されていても）、または、標的分子を生成する宿主細胞または生物から直接的に得てもよい（例えば、試料は、収集された細胞培養液を含んでもよい）。
【００４２】
用語「不純物」または「混入物」とは、本明細書において用いられる場合、任意の外来のまたは好ましくない分子を指し、本発明のプロセスを用いて１または２以上の外来のまたは好ましくない分子から分離されている標的分子を含む試料中に存在し得る、DNA、RNA、１または２以上の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質、および１または２以上の添加物などの生物学的巨大分子を含む。さらに、かかる不純物は、本発明の方法に先立って行われてもよいステップにおいて用いられる任意の試薬を含んでもよい。
【００４３】
用語「精製する」、「分離する」、または「単離する」は、本明細書において交換可能に用いられ、標的分子および１または２以上の不純物を含む組成物または試料からの標的分子の純度の程度を増大させることを指す。典型的には、標的分子の純度の程度は、組成物からの少なくとも１つの不純物を（完全にまたは部分的に）取り除くことにより、増大する。
【００４４】
用語「フロースループロセス」、「フロースルーモード」、および「フロースルークロマトグラフィー」は、本明細書において交換可能に用いられ、試料中に１または２以上の混入物と共に含有される少なくとも１つの生成物（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）は、クロマトグラフィー用樹脂または媒質を貫流する（flow through）ことを意図されるが、一方、少なくとも１つの潜在的な混入物または不純物は、当該クロマトグラフィー用樹脂または媒質に結合する、生成物分離技術を指す。「フロースルーモード」は、一般に、均一濃度の操作（すなわち、クロマトグラフィープロセスの間に移動相の組成物が変化しない）である。
【００４５】
請求される方法による幾つかの態様において、および本明細書において記載される例において記載されるように、方法は、例えば、フロースルーモードにおいて行われるアニオンおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィーステップを使用する。
【００４６】
用語「結合および溶離モード」および「結合および溶離プロセス」は、本明細書において交換可能に用いられ、試料中に含有される少なくとも１つの生成物（標的分子）（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）をクロマトグラフィー用樹脂または媒質に結合させて、それをその後に溶離させる、生成物分離技術を指す。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、用語「リザーバ」とは、本明細書において用いられる場合、任意の容器、タンクまたはバッグであって、本発明の方法を行う場合に用いられるべき任意のバッファー、または本発明の方法において用いられるであろう任意の他の液体を貯蔵するために用いることができるものを指す。さらに、「リザーバ」は、任意の容器、タンクまたはバッグであって、プロセスステップのアウトプット（例えば、カラムからの溶出液）を収集するために用いることができるものを指す。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、用語「インライン希釈（inline dilution）」とは、バッファー交換ステップまたはインラインでの溶液条件の調整を指し、これは、典型的には、多くの従来のプロセスにおける保持タンクの使用に対する代替である。典型的なインライン希釈において、２つの溶液を、移動の間に、パイプまたはミキシング容器、濾過デバイスまたは装置中での溶液の混合を用いて混合または滴定してもよい。例えば、伝導率を低下させるために、溶液を別のより低い伝導率の溶液と混合することにより、溶液を希釈する必要がある場合もある。バッファー交換は、ダイアフィルトレーション、限外濾過などの濾過デバイスの補助により達成することができる。請求される発明による幾つかの態様において、方法は、タンパク質を生成するための改善されたプロセスを提供し、これにより、バッファー交換ステップの必要性が取り除かれる。
【００４９】
用語「クロマトグラフィー」とは、混合物中に存在する他の分子から目的の分析物（例えば標的分子）を分離する任意の種類の技術を指す。通常、標的分子は、移動相の影響下において、または結合および溶離プロセスにおいて、混合物の個々の分子が固定媒体中を通って移動する速度の差異の結果として、他の分子から分離される。
【００５０】
用語「マトリックス」または「クロマトグラフィーマトリックス」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、任意の種類の吸着剤、樹脂または固相であって、分離プロセスにおいて、混合物中に存在する他の分子から標的分子（例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域を含有するタンパク質）を分離するものを指す。通常、標的分子は、移動相の影響下において、または結合および溶離プロセスにおいて、混合物の個々の分子がマトリックス中を通って移動する速度の差異の結果として、他の分子から分離される。非限定的な例として、カラムまたはカートリッジ中に入れることができる、粒子性、モノリス性または繊維性の樹脂ならびに膜が挙げられる。マトリックスを形成するための材料の例として、多糖（アガロースおよびセルロースなど）；ならびにシリカ（例えば孔が制御されたガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子および上のいずれかの誘導体などの他の機械的に安定なマトリックスが挙げられる。本発明の方法のために好適な典型的なマトリックス型の例は、カチオン交換樹脂、アフィニティー樹脂、アニオン交換樹脂またはミックスモード樹脂である。
【００５１】
「リガンド」とは、クロマトグラフィーマトリックスに付着して、当該マトリックスの結合特性を決定する官能基である。「リガンド」の例として、限定されないが、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、thiophilic相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基、およびミックスモード基（前述のものの組み合わせ）が挙げられる。本明細書において用いることができる幾つかの好ましいリガンドとして、限定されないが、スルホプロピル、スルホン酸などの強力なカチオン交換基；トリメチル塩化アンモニウムなどの強力なアニオン交換基；カルボン酸などの弱いカチオン交換基；N5NジエチルアミノまたはDEAEなどの弱いアニオン交換基；フェニル、ブチル、プロピル、ヘキシルなどの疎水性相互作用基；ならびに、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬなどのアフィニティー基が挙げられる。
【００５２】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」とは、標的タンパク質（例えば、目的のＦｃ領域を含有するタンパク質または抗体）が、当該標的タンパク質に対して特異的であるリガンドに特異的に結合するタンパク質分離技術を指す。かかるリガンドは、一般に、生物特異的リガンドとして言及される。一部の態様において、生物特異的リガンド（例えば、プロテインＡまたはその機能的バリアント）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合し、溶液が当該クロマトグラフィーマトリックスに接触した際に、当該液中の標的タンパク質にアクセス可能である。標的タンパク質は、一般に、クロマトグラフィーのステップの間、生物特異的リガンドに対するその特異的結合アフィニティーを保持するが、一方、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、当該リガンドに対して、感知できるほどには、または特異的には、結合しない。固定されたリガンドに対する標的タンパク質の結合により、標的タンパク質を固相材料上に固定されたリガンドに特異的に結合させたままで、混入しているタンパク質またはタンパク質不純物をクロマトグラフィーマトリックスに通過させることが可能になる。特異的に結合した標的タンパク質を、次いで、活性形態において、固定されたリガンドから、好適な条件下（例えば、低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合するリガンドなど）において取り除き、前にカラムを通過させられた混入タンパク質またはタンパク質不純物フリーで、溶離バッファーによりクロマトグラフィーカラムを通過させる。そのそれぞれの特異的結合タンパク質、例えば抗体を精製するために、任意の成分をリガンドとして用いてよい。しかし、本発明による多様な方法において、プロテインＡを、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質のためのリガンドとして用いる。生物特異的リガンド（例えばプロテインＡ）からの標的タンパク質（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）の溶離のための条件は、当業者により、容易に決定され得る。一部の態様において、プロテインＧもしくはプロテインＬまたはそれらの機能的バリアントを、生物特異的リガンドとして用いてもよい。一部の態様において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質への結合、生物特異的リガンド／標的タンパク質コンジュゲートを洗浄または再平衡化するために、プロテインＡなどの生物特異的リガンドを、５〜９のｐＨ範囲において用い、その後、約４またはそれより低いｐＨを有する、少なくとも１つの塩を含有するバッファーにより溶離する。
【００５３】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」とは、目的の溶質または分析物が、混合物中の溶質不純物または混入物より高くまたは低く、荷電された化合物と非特異的に相互作用するように、混合物中の目的の溶質または分析物（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）が、固相イオン交換材料に結合（共有結合によるものなど）した荷電された化合物と相互作用する、クロマトグラフィーのプロセスを指す。混合物中に混入している溶質は、イオン交換材料のカラムから、目的の溶質より速くまたは遅く溶離するか、目的の溶質に相対的に樹脂に結合するかまたはこれから取り除かれる。「イオン交換クロマトグラフィー」は特に、カチオン交換、アニオン交換およびミックスモードイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）に結合させ、その後溶離させても（カチオン交換は、クロマトグラフィーまたは「CIEX」に結合して溶離する）、あるいは、標的分子がカラムを貫流する間に、不純物に優先的に結合してもよい（カチオン交換フロースルークロマトグラフィーFT-CIEX）。アニオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）に結合させて、その後溶離しても、標的分子がカラムを貫流する間に、不純物に優先的に結合してもよい。幾つかの態様において、および本明細書において記載される例において示されるように、アニオン交換クロマトグラフィーステップは、フロースルーモードにおいて行われる。
【００５４】
句「イオン交換マトリックス」とは、負に荷電（すなわちカチオン交換樹脂）または正に荷電（すなわちアニオン交換樹脂）されたクロマトグラフィーマトリックスを指す。電荷は、例えば共有結合により、１または２以上の荷電されたリガンドをマトリックスに付着させることにより、提供することができる。代替的に、またはさらに、電荷はマトリックスの固有の特性であってもよい（例えば、全体的な負の電荷を有するシリカについての場合のように）。
【００５５】
「カチオン交換マトリックス」とは、負に荷電したクロマトグラフィーマトリックスを指し、これはしたがって、固相の上または中を通過する水溶液中のカチオンとの交換のための遊離のカチオンを有する。固相に付着してカチオン交換樹脂を形成する負に荷電されたリガンドは、例えばカルボン酸またはスルホン酸であってよい。市販のカチオン交換樹脂として、カルボキシメチルセルロース、アガロース上に固定されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、SP-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）またはSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE（商標）、Pharmacia製）およびアガロース上に固定されたスルホニル（例えばS-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）、Pharmacia製）が挙げられる。好ましいものは、Fractogel（登録商標）EMD SO3、Fractogel（登録商標）EMD SE Highcap、Eshmuno（登録商標）SおよびFractogel（登録商標）EMD COO（Merck）である。
【００５６】
「ミックスモード」マトリックスは、標的分子および／または不純物と相互作用することができる少なくとも２つの型の官能基を担持する、クロマトグラフィーマトリックスである。かかる官能基は、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、thiophilic相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基およびバイオアフィニティー基であってよい。本発明において用いられるべき好ましいミックスモードマトリックスは、少なくともアニオン交換およびカチオン交換基またはミックスモードイオン交換マトリックスを担持するマトリックスである。「少なくとも２つの型の官能基を担持する」とは、一態様において、少なくとも２つの型の異なる官能基により共有的に修飾された１つの型のマトリックスが提供されることを意味する。また、ミックスモードマトリックスは、各々が少なくとも１つの官能基を有する２または３以上の異なるマトリックスの組み合わせから作ることも可能であり、それにより、当該組み合わせは、１つの分離ユニットにおけるマトリックスを組み合わせることにより現実化される。この場合、ミックスモードマトリックスは、各々のマトリックスが少なくとも１つの官能基を担持する２つの異なるマトリックスの混合物であっても、例えば、両方が分離ユニット中で容易に混合することができる吸着剤粒子の形態において存在する、カチオン交換マトリックスとアニオン交換マトリックスとの混合物であってもよい。また、第１のマトリックスで充填された１つのカラムと第２のマトリックスで充填された別のカラムとを、試料液が両方のマトリックスを貫流するように、１つの分離ユニットを組み合わせることも可能である。
【００５７】
「ミックスモードイオン交換マトリックス」とは、カチオン性および／またはアニオン性ならびに疎水性の部分で共有的に修飾されているクロマトグラフィーマトリックスを指す。市販のミックスモードイオン交換樹脂は、シリカゲル固相支持マトリックスに付着した弱いカチオン交換基、低濃度のアニオン交換基、および疎水性リガンドを含有する、BAKERBOND ABX（商標）（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）である。ミックスモードカチオン交換マトリックスは、典型的には、カチオン交換基および疎水性部分を有する。好適なミックスモードカチオン交換マトリックスは、Capto（登録商標）MMC（GE Healthcare）およびEshmuno（登録商標）HCX（Merck）である。
ミックスモードアニオン交換マトリックスは、典型的には、アニオン交換基および疎水性部分を有する。好適なミックスモードアニオン交換マトリックスは、Capto（登録商標）Adhere（GE Healthcare）である。
【００５８】
用語「アニオン交換マトリックス」は、本明細書において、正に荷電した、例えばそれに付着した四級アミノ基などの１または２以上の正に荷電されたリガンドを有する、クロマトグラフィーマトリックスを指す。市販のアニオン交換樹脂として、DEAEセルロース、QAE SEPHADEX（商標）およびFAST Q SEPHAROSE（商標）（Pharmacia）が挙げられる。好ましい材料は、Fractogel（登録商標）EMD TMAE、Fractogel（登録商標）EMD TMAE highcap、Eshmuno（登録商標）QおよびFractogel（登録商標）EMD DEAEである。
【００５９】
用語「プロテインＡ」および「Prot A」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、そのネイティブのソースから回収されたプロテインＡ、合成で（例えば、ペプチド合成により、または組換え技術により）生成されたプロテインＡ、および、Ｆｃ領域などのＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するそれらのバリアントを包含する。プロテインＡは、Repligen、PharmaciaおよびFermatechから市販で購入することができる。プロテインＡは、一般に、クロマトグラフィーマトリックス上に固定される。用語「ProA」はまた、プロテインＡが共有結合するクロマトグラフィー用固体支持マトリックスを含有する、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスまたはカラムを指す。
【００６０】
本発明による方法において用いられるプロテインＡの機能的誘導体またはバリアントは、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧｌのＦｃ領域について、少なくともＫ＝１０”８Ｍ、および好ましくはＫ＝１０”９Ｍの結合定数により特徴づけることができる。結合定数についてのかかる値を遵守する相互作用は、本文脈において「高アフィニティー結合」と称される。好ましくは、プロテインＡのかかる機能的誘導体またはバリアントは、天然のドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその操作された変異体であってＩｇＧ結合機能を保持しているものから選択される、野生型プロテインＡの機能的ＩｇＧ結合ドメインの少なくとも一部を含む。
また、一点付着（single-point attachment）を可能にするように操作されたプロテインＡの誘導体またはバリアントもまた、請求される方法におけるアフィニティークロマトグラフィーステップにおいて用いることができる。
【００６１】
一点付着は、一般に、タンパク質部分が、単一の共有結合を介してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラフィー支持材料に付着することを意味する。かかる一点付着はまた、ＮまたはＣ末端の近傍、またはタンパク質折り畳みの外周のどこかにおける、暴露されたアミノ酸位置に、すなわちループにおいて位置する、好適な反応性残基の使用によっても起こる。好適な反応性基は、例えばスルフヒドリルまたはアミノ官能基である。
【００６２】
用語「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は、本明細書において、アフィニティークロマトグラフィーのために好適なリガンドを担持するクロマトグラフィーマトリックスを指すように用いられる。典型的には、リガンド（例えば、プロテインＡまたはその機能的バリアント）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合しており、溶液がクロマトグラフィーマトリックスと接触した際に、溶液中の標的分子に対してアクセス可能である。アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの一例は、プロテインＡマトリックスである。
【００６３】
用語「結合する」とは、本明細書において、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有するタンパク質）とマトリックスに付着したリガンド（例えば、固相マトリックスまたは樹脂に結合したプロテインＡ）との間の相互作用を記載するために用いられる場合、例えば、結合部位におけるタンパク質およびリガンドの構造の空間的相補性と、結合部位における静電力、水素結合、疎水力、および／またはファンデルワールス力との組み合わせ効果を通しての、一般的には可逆的なリガンドへの標的分子の結合を指す。一般に、空間的相補性が高いほど、および結合部位における他の力が強いほど、タンパク質のそのそれぞれのリガンドに対する結合特異性は高くなるであろう。特異的結合の非限定的な例として、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−コファクター結合、金属イオンキレート、DNA結合タンパク質−DNA結合、調節タンパク質−タンパク質相互作用などが挙げられる。理想的には、アフィニティークロマトグラフィーにおいては、特異的結合は、遊離溶液（free solution）中で、約１０”４〜１０”８Ｍのアフィニティーにより起こる。
【００６４】
用語「洗剤」とは、ポリソルベート（例えばポリソルベート20または80）；ポリクサマー（例えばポリクサマー188)；Triton；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；メチルココイルナトリウム−、またはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；およびMONAQU AT（商標）シリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson、N. J.）などの、イオン性および非イオン性界面活性剤を指す。有用な洗剤は、ポリソルベート20（TWEEN 20（登録商標））またはポリソルベート80（TWEEN 80（登録商標））などのポリソルベート、またはオクタン酸などの多様な酸である。
【００６５】
「バッファー」は、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化を耐容する溶液である。例えばバッファーの所望されるｐＨに依存して使用することができる多様なバッファーは、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems、Gueffroy, D.編、Calbiochem Corporation（1975年）において記載される。バッファーの非限定的な例として、MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、およびアンモニウムバッファー、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明によれば、用語「バッファー」または「溶媒」は、分離ユニットをロード、洗浄および再平衡化するために用いられる任意の液体組成物について用いられる。
【００６６】
分離カラムを「ロードする」場合、バッファーは、標的分子を含む試料または組成物（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）および１または２以上の不純物を、クロマトグラフィーカラム（例えば、アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム）上にロードするために用いられる。バッファーは、標的分子はクロマトグラフィーマトリックスに結合するが、一方、理想的には全ての不純物は当該カラムに結合せずそれを貫流するような、伝導率および／またはｐＨを有する。
【００６７】
標的分子を「貫流させる」ために分離カラムを「ロードする」場合、バッファーは、標的分子を含む試料または組成物（例えば、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質）および１または２以上の不純物を、クロマトグラフィーカラム（例えば、アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム）上にロードするために用いられる。バッファーは、標的分子はクロマトグラフィーマトリックスに結合せずカラムを貫流するが、一方、理想的には全ての不純物は当該カラムに結合するような伝導率および／またはｐＨを有する。
【００６８】
用語「再平衡化する」とは、標的分子をロードする前にクロマトグラフィーマトリックスを再平衡化するためのバッファーの使用を指す。典型的には、ローディングバッファーは、再平衡化のために用いられる。
【００６９】
クロマトグラフィーマトリックスを「洗浄する」により、適切なバッファーをマトリックスの中または上を通過させることが意味される。典型的には、洗浄は、標的分子を溶離させる前に、マトリックスから弱く結合した混入物を取り除くために用いられる。
【００７０】
この場合において、典型的には、洗浄バッファーおよびローディングバッファーは同じである。ウイルス不活化バッファーが用いられる場合、それは、標的分子を溶離させる前に、特定の存在するウイルスを不活化するために用いられる。この場合において、典型的には、ウイルス不活化バッファーは、ローディングバッファーとは異なる。なぜならば、それは、洗剤を含有するか、または異なる特性（ｐＨ／伝導率／塩およびそれらの量）を有する場合があるからである。
【００７１】
クロマトグラフィーマトリックスから分子（例えば、目的のポリペプチドまたは不純物）を「溶離させる」とは、クロマトグラフィー樹脂上のリガンド部位について目的の分子と競合するバッファーなどの溶液の条件を変更することにより、それから分子を取り除くことを意味する。非限定的な例は、バッファーがイオン交換材料上の荷電された部位について分子と競合するように、イオン交換材料を取り囲むバッファーのイオン強度を変更することにより、イオン交換樹脂から分子を溶離させることである。
【００７２】
用語「ウイルス不活化」、または「VI」は、本明細書において交換可能に用いられ、物理化学的手段を通してウイルスが細胞に感染することをできなくし得るか、またはウイルスの機能を阻害し得る、任意のプロセスを指す。典型的なウイルス不活化方法として、限定されないが、低ｐＨ処置（例えば、ｐＨ４．５より低い、４．０より低い、または３．８より低い）、熱処置、界面活性剤および照射による処置（例えば、紫外光暴露）が挙げられる。一部の態様において、ウイルス不活化方法は、レトロウイルスを対象とする。
【００７３】
ある態様において、低ｐＨ条件をウイルス不活化のために用いる。なぜならば、かかる条件は典型的にウイルスの脂質エンベロープを破壊し、それによりウイルスを不活化するからである。
ある態様において、特定の界面活性剤を用いる。なぜならば、それらは典型的にウイルスを破壊し、それによりウイルスを不活化するからである（Tween、Triton X-100、SDSなど）。
【００７４】
本発明によれば、「分離ユニット」は、クロマトグラフィーによる分離ステップを行うことができる設備である。分離ユニットは、典型的には、吸着剤マトリックスで充填されたクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィーカートリッジである。クロマトグラフィーカラムは、当業者に公知である。それらは、典型的には、液体入口および液体出口のための末端接続器具（end-fitting）を備えたカラムチューブを含む。カラムチューブは、好適なクロマトグラフィーマトリックスで充填される。
【００７５】
本発明によれば、「連続的（continuous）」プロセスとは、バッチモードにおいては実行されないプロセスである。本発明による連続的プロセスにおいて、新たな試料は、１度のみならず、逐次的に、分離ユニットＡ１または分離ユニットＡ２のいずれかに対して交互に、短い間隔を開けて、または好ましくはその間に間隔を開けずに、分離ユニットＡ１またはＡ２上にロードされる。
本発明によれば、「逐次的（sequential）」とは、２回または２回より多くである。
【００７６】
本発明によれば、「接続線」は、それらを通して液体を流すために好適である任意のチューブ、パイプまたはチャネルである。接続線は、１または２以上の弁により断続されてもよい。接続線は、直線状であっても分枝状であってもよい。
本発明によれば、装置の２つの部分が「流体接続にある」場合、それは、装置の２つの部分の間に、液体が一方の部分から他方へ流れることができるような接続線が存在することを意味する。この接続線は、直接的であっても、１または２以上の弁により、分離ユニットまたは装置の他の部分により、断続されてもよい。用語「流体接続にある」とは、永続的である流体接続を包含するが、それはまた、永続的でなく、接続線を通る液体のフローが、必要な場所であればどこでも開始して停止することができるように、例えば１または２以上の弁により断続される接続線から作られるものも包含する。典型的には、流体接続にある装置のほとんどの部分は、永続的でない流体接続を有する。例えば、バッファーリザーバが分離ユニットと流体接続にある場合、これは、カラムへのバッファーのフローは、必要である場合に実現することができるが、典型的には、必要な時に液体のフローを停止させ、必要な時に開始させることができるように、リザーバと分離ユニットとの間の接続線において位置する少なくとも１つの弁が存在することを意味する。
液体のフローは、実際には、液体接続にある装置の２つの部分の間で実現され、それにより、液体は、２つの部分の間の接続線を貫流し、これらの２つの部分は、「流体連通（fluid communication）」にある。その結果、「流体連通」は、本発明によれば、「流体接続（fluid connection）」が、液体を接続線を貫流することにより実際に用いられる状態を説明する。システムの２つの部分が部分的に流体連通にある場合、それは、流体連通が永続的でなく、液体は、一方の部分から他方へ永続的には流動せず、時間の一部のみ流動することを意味する。典型的には、システムの２つの部分の間の液体のフローは、液体のフローを指揮する弁の補助により開始および／または停止される。
【００７７】
「流体入口」または「入口」は、液体の導入を可能にする任意の手段である。分離ユニット入口は、例えば、接続線を接続することができる、クロマトグラフィーカラムの末端接続器具である。入口はまた、接続線における液体の導入を提供する弁であってもよい。入口はまた、接続線の末端であってもよい。
【００７８】
「出口」または「流体出口」は、液体の除去を可能にする任意の手段である。分離ユニット出口は、例えば、接続線を接続することができる、クロマトグラフィーカラムの末端接続器具である。出口はまた、接続線における液体の導入を提供する弁であってもよい。出口はまた、接続線の末端であってもよい。
【００７９】
「流体選択弁」は、任意の接続された液体とシステムの部分との間で選択的に流体連通を可能にする任意の手段である。流体選択弁は、例えば、接続線を接続することおよび選択的に選択することができる、分離ユニット入口より前にある弁であって、選択された線と分離ユニット入口との間の流体連通を可能にすることができるものである。流体選択弁は、例えば、接続線を接続することおよび選択的に選択することができる、分離ユニット出口の後にある弁であって、選択された線と分離ユニット出口との間の流体連通を可能にすることができるものである。流体選択弁はまた、接続線における液体の導入を提供する弁であってもよい。流体選択弁はまた、接続線の末端であってもよい。
【００８０】
「溶媒選択弁」は、任意の接続された溶媒リザーバとシステムの部分との間で選択的に流体連通を可能にする、流体選択弁である。溶媒選択弁は、例えば、溶媒リザーバから接続線を接続することができ、選択的に選択することができる、溶媒ポンプより前にある弁であって、選択された溶媒とポンプとの間の流体連通を可能にするものである。
「流体選択弁」および「溶媒選択弁」は、同一の型のものであっても異なる型のものであってもよい。
【００８１】
溶媒送達システムは、液体の送達を可能にするシステムである。典型的には、装置の溶媒送達システムは、少なくとも１つのリザーバ、および、液体をリザーバからリザーバと液体接続にある装置の別の部分へと輸送する少なくとも１つのポンプを含む。当業者には公知であるが、液体がリザーバから分離ユニットへと移動される時は毎回、これは、ポンプの補助により行われる。ポンプはまた、２または３以上のリザーバから来る２または３以上の液体の流れを混合するために用いることができる。
【００８２】
発明の詳細な説明
本発明は、３つの分離カラムのみを必要とする連続クロマトグラフィープロセスのために好適な方法および装置を、初めて提供する。プロセスは、２つのクロマトグラフィーのステップを含む２ステップの手順である。装置が３つの分離ユニットを有する場合、第１のクロマトグラフィーのステップ（キャプチャー）は、２つの分離ユニット上で交互に逐次的に行われ、第２のクロマトグラフィーのステップ（ポリッシング）もまた、第３の分離ユニット上で交互に逐次的に行われる。同じクロマトグラフィーマトリックスを有する最初の二つの分離ユニットに、試料を交互にロードする。すなわち、ユニットの一方に試料をロードする間に、同時に、他方のユニットを、平衡化、洗浄、標的分子の溶離などの他のプロセスステップに供してもよい。最初の二つのユニットのマトリックスとは異なるクロマトグラフィーマトリックスを有する第３の分離ユニットに、最初の二つのユニットから溶離する標的分子をフィードする。最初の二つのユニットは逐次的にロードされるので、それらはまた、逐次的に溶離される。すなわち、一方のユニットをロードする間に、他方の、既にロードされているユニットを、随意に洗浄し、次いでこのユニットから、好ましくは第３のユニットへの直接的なフィードを可能にする溶離バッファーで、標的分子を溶離する。
第３のユニット上で第２のクロマトグラフィーによる分離を行った後で、精製された標的分子を次いで、第３のユニットの流体出口から回収することができる。
【００８３】
本発明による方法および装置は、第１の次元の分離ユニットの高いローディングを可能にし、これは、高い動的結合能力、および、滞留時間を短縮するより速いスループットをもたらす。
【００８４】
さらに、本発明による方法および装置は、典型的にはさらなる条件付けなしで、第１の分離次元（キャプチャー）を第２の分離次元（ポリッシング）に接続することを可能にする。なぜならば、キャプチャーされた生成物は、好ましくは、第２の（ポリッシング）次元に適合する条件において、第１の次元から溶離されるからである。
【００８５】
本発明による方法は、異なるクロマトグラフィーモード、例えば、AIEXポリッシングと組み合わせたCIEXキャプチャー、CIEXポリッシングと組み合わせたProt Aキャプチャー、およびCIEXポリッシングと組み合わせたAIEXキャプチャーに、概念および技術的解決を変更することなく、適用することができる。したがって、それは、経済的であるのみならず、広範な標的分子（例えば２−１４からのｐＩを有するバイオ医薬品分子）の精製のために好適な強力な精製技術でもある。
【００８６】
好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の好ましい態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
【００８７】
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはカチオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢはミックスモードクロマトグラフィーマトリックスを有する。
【００８８】
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有し、分離ユニットＢは、ミックスモードカチオンおよびアニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、またはミックスモードアニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーマトリックス、またはミックスモードカチオンおよびミックスモードアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有する。
別の態様において、分離ユニットＡ１およびＡ２はカチオン交換マトリックスを有し、分離ユニットＢはミックスモードクロマトグラフィーマトリックスを有する。
【００８９】
本発明による装置の模式図を、図２において示す。図２において、分離ユニットＡ１およびＡ２の出口と分離ユニットＢの出口との間の接続線は、接続線Ｃ−Ｐと名づけられる。
本発明による装置は、３つの分離ユニット、同じクロマトグラフィーマトリックスを有する２つのキャプチャー分離ユニットＡ１およびＡ２、ならびに１つのポリッシング分離ユニットＢを含む。分離ユニットの他に、それは、典型的には、少なくとも２つのポンプ、１または２以上の弁、液体接続およびリザーバを含む。それはさらに、フィルターユニット、検出ユニット、およびクロマトグラフィーによる分離手順において必要とされる化合物または好適であり得る他の機器を含んでもよい。
本発明による装置は、従来のクロマトグラフィーシステムであっても単回使用システムであってもよい。それは、カラム、弁、リザーバ、およびクロマトグラフィーシステムにおいて典型的に使用される他の設備を含む。分離ユニットは、例えば、それぞれのクロマトグラフィーマトリックスで充填されたステンレススチールカラム、プラスチックカラムまたはガラスカラムであってもよく、溶媒入口および出口のために好適な末端接続器具を有していてもよい。
【００９０】
幾つかの態様において、本発明による装置は、３つより多くの分離ユニットを含み、例えば、同じクロマトグラフィーマトリックスを有する３または４つのキャプチャー分離ユニット、および、同じクロマトグラフィーマトリックスであるがキャプチャー分離ユニットのマトリックスとは異なるクロマトグラフィーマトリックスを有する２または３つのポリッシング分離ユニットを含んでもよい。例示的な態様において、それは、以下：
−  ２つのポリッシング分離ユニットＢ１およびＢ２と組み合わせた、２つのキャプチャー分離ユニットＡ１およびＡ２、
−  １つのポリッシング分離ユニットＢと組み合わせた、３つのキャプチャー分離ユニットＡ１、Ａ２およびＡ３、
−  ２つのポリッシング分離ユニットＢ１およびＢ２と組み合わせた、３つのキャプチャー分離ユニットＡ１、Ａ２およびＡ３、
を含んでもよい。
【００９１】
好ましい態様において、本発明による装置は、５つの分離ユニット、同じクロマトグラフィーマトリックスを有する３つのキャプチャー分離ユニットＡ１、Ａ２およびＡ３、ならびに、２つのポリッシング分離ユニットＢ１およびＢ２を有する。
【００９２】
分離ユニットＡ１の流体出口または分離ユニットＡ２の流体出口または分離ユニットＡ３の流体出口のいずれかが、分離ユニットＢの出口１と、または分離ユニットＢの出口２と、流体連通し得ることを確実にするために、少なくとも１つの弁が、分離ユニットＡ１、Ａ２およびＡ３の流体出口と、分離ユニットＢ１およびＢ２の流体入口との間に位置する。好ましくは、各々の分離ユニットＡ１およびＡ２およびＡ３の出口の後に位置する弁が存在し、これが、分離ユニットＢの出口１と、または分離ユニットＢの出口２との流体連通を可能にする。装置はまた、少なくとも２つのバッファーリザーバおよび少なくとも２つのポンプを含み、これはまた溶媒送達システムとも称され、例えばローディング、洗浄および標的分子の溶離のために必要とされるバッファーの貯蔵および供給を提供する。典型的には分離ユニットＡ１、Ａ２およびＡ３は、少なくとも１つのバッファーリザーバに接続された少なくとも１つの流体入口を有し、分離ユニットＢ１およびＢ２は、少なくとも１つのバッファーリザーバに接続された少なくとも１つの流体入口を有する。典型的には、分離ユニットＢ１およびＢ２は、少なくとも１つの流体出口を有する。
【００９３】
非常に好ましい態様において、本発明による装置は、３つの分離ユニット、同じクロマトグラフィーマトリックスを有する２つのキャプチャー分離ユニットＡ１およびＡ２、ならびに１つのポリッシング分離ユニットＢを有する。
【００９４】
以下において、装置および方法の説明を、同じクロマトグラフィーマトリックスを有する２つのキャプチャー分離ユニットＡ１およびＡ２、ならびに１つのポリッシング分離ユニットＢを有する装置に焦点を当てる。これは、限定的であることを意味せず、説明をより包括的にするためのものである。当業者は、説明をまた、上記のような３つより多くのユニットを有するシステムにトランスファーすることができる。
【００９５】
分離ユニットＡ１の流体出口または分離ユニットＡ２の流体出口のいずれかが分離ユニットＢの出口と流体連通することを確実にするために、少なくとも１つの弁が、分離ユニットＡ１およびＡ２の流体出口と、分離ユニットＢの流体入口との間に位置する。
【００９６】
装置はまた、少なくとも２つのバッファーリザーバおよび少なくとも２つのポンプを含み、これはまた、溶媒送達システムとも称され、例えばローディング、洗浄および標的分子の溶離のために必要とされるバッファーの貯蔵および供給を提供する。典型的には、各々のクロマトグラフィーのステップのために、クロマトグラフィーのステップ、１つのローディングバッファーおよび１つの溶離バッファーが必要とされる。
【００９７】
本発明の一態様において、装置は、結合および溶離バッファーのための２つのバッファーリザーバ、バッファーＡのための１つのリザーバ、およびバッファーＢのための１つのリザーバのみを含む。バッファーＡは、ローディングバッファーであり、したがって、標的分子が分離ユニットＡ１／Ａ２上にキャプチャーされる条件を提供する第１の次元のための結合バッファーである。さらに、バッファーＡは、標的分子が分離ユニットＢから溶離される条件を提供する第２の次元のための溶離バッファーである。バッファーＢは、第１の次元（分離ユニットＡ１／Ａ２）のための溶離バッファーであるが、第２の次元（分離ユニットＢ）のための結合バッファーである。
【００９８】
他の態様において、装置は、他のバッファー、定置洗浄、ウイルス不活化などのためのさらなるリザーバを含んでもよい。
典型的には、リザーバと分離ユニットとは、接続線、弁およびポンプを介して接続される。ポンプの前の溶媒の選択のための好ましい溶媒選択弁は、６つの溶媒入口、および直接的にポンプに接続され得る１つの溶媒出口を有する弁である。蠕動ポンプ、均一濃度ポンプ、勾配ポンプ、高圧ポンプなど、低圧ポンプなどを含む、溶媒のフローを保証する任意のポンプを用いることができる。システム部分の入口の前における液体の導入の選択のための好ましい流体選択弁は、６つの流体入口、およびシステム部分の入口に接続することができる１つの出口を有する弁である。システム部分の出口の後ろにおける液体の除去の選択ための好ましい流体選択弁は、６つの流体出口、およびシステム部分の出口に接続することができる１つの入口を有する弁である。
【００９９】
１つの好ましい態様において、装置はさらに、２つのキャプチャー分離ユニットＡ１とＡ２との間に、カラムＡ１の出口とカラムＡ２の入口との間の液体接続、およびその逆を可能にする接続線を含む。この態様の模式図を、図３において示し、ここで、さらなる接続線は、接続線Ｆ−Ｆと名づけられる。このセットアップは、第１のキャプチャー分離ユニットから（ローディングの最後に）浸出した生成物の、第２の分離ユニット（再平衡化されたばかりであり、キャプチャーのための準備ができている）上でのキャプチャーが可能にする。このことが、標的分子の損失を伴わずに、より高いスループットおよび結合能力を使用することを可能にする。
【０１００】
好ましい態様において、任意の選択されたキャプチャー分離ユニットに対する連続的な試料のフィードを保証するために、溶媒送達システムを、２つのキャプチャー分離ユニットＡ１とＡ２との間の接続線、好ましくは試料溶媒送達システムに接続する。
【０１０１】
別の好ましい態様において、装置はさらに１または２以上の検出器を含む。検出器は、試料の質の分析、モニタリングなどのための、カラム間の試料移動の制御のために用いることができる。検出器は、好適な場所であればどこに位置してもよく、典型的には、それらは分離カラムの流体入口の前、および／または流体出口の後に位置する。好適な検出器の例は、ｐＨ検出器、ＵＶ検出器、赤外線検出器または伝導率を測定する検出器である。
【０１０２】
好ましくは、検出器は、全ての分離カラムの流体入口の前および流体出口の後に位置する。このセットアップは、分離ユニット間の試料の移動の制御を確実にする。
【０１０３】
別の好ましい態様において、装置はさらに、コンピューターシステムを含む。検出器ならびにポンプおよび弁は、コンピューターシステムに接続される。このコンピューターシステムは、ポンプおよび弁および検出器の制御を可能にする。好ましくは、コンピューターシステムは、装置が部分的にまたは完全に自動化されたモードにおいて用いられることを可能にするソフトウェアおよびアルゴリズムを含む。
【０１０４】
別の好ましい態様において、さらなる流体入口、すなわち、好ましくは１または２以上のリザーバへの接続線は、分離ユニットＢの流体入口の前に位置する。図２、３および４において、このさらなる入口は、入口Ｃと名づけられる。典型的には、さらなる流体入口は、分離ユニットＡ１およびＡ２の出口の後、および分離ユニットＢの流体入口の前に位置する。好ましくは、それは、分離ユニットＡ１およびＡ２の出口と分離ユニットＢの流体入口との間の接続線において位置する弁の後、および分離ユニットＢの流体入口の前に位置する。このことにより、カラムＢが、分離ユニットＡ１およびＡ２からの溶出液によってのみフィードされるのではなく、さらなるバッファーまたは試薬、例えばインライン希釈については、溶離、平衡化、定置洗浄、ウイルス不活化などによってもまたフィードされ得ることを確実にする。
【０１０５】
別の好ましい態様において、装置はさらに、定置洗浄のためのさらなるリザーバを含む。定置洗浄（cleaning in place：CIP）は、当業者に公知の技術である。定置洗浄は、クロマトグラフィーマトリックスからの、非常に緊密に結合、沈澱または変性した物質の除去である。かかる混入物がクロマトグラフィーマトリックスから除去されないと、それらはカラムのクロマトグラフィー特性に影響を及ぼして、結合能力およびその後の実行における結果を低下させる場合があり、これは、サイクルの間の混入物または生成物のキャリーオーバーをもたらす。
標準的なCIPプロトコルは、典型的には、１〜５の洗浄、および、以下のような材料を含む１〜３カラム容積の水性バッファーを含む：
−  ６Ｍの塩酸グアニジン
−  １０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＯＨ
−  １０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＣｌ、
−  ５０ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａ２ＳＯ４、
−  １５０ｍＭのリン酸溶液、
−  ６Ｍの尿素、
−  ２０％のエタノール、
−  ２０％のエタノールおよび０．５Ｍの酢酸、
−  ２０％のエタノールおよび２Ｍの酢酸、
−  １％のTweenまたはTriton（登録商標）界面活性剤X-100など。
ＮａＯＨ等の材料の濃度、カラム上でのＣＩＰバッファーの接触時間、ならびにＣＩＰを行う頻度は、当業者により調整および決定され得る。
【０１０６】
本発明による装置は、好ましくは、CIPバッファーを含有する少なくとも１つのリザーバを有する。CIPバッファーは、好適である場合は、全ての分離ユニットのCIPのために用いることができる。したがって、バッファーリザーバは、全ての分離ユニットと、CIPバッファーのフローが、カラムの各々に対して独立して向けることができるように、液体接続にある。別の態様において、装置は、２つの異なるCIPバッファーを有する２つのリザーバを含む。一方のリザーバは、分離ユニットＡ１およびＡ２との流体接続にあり、それにより分離ユニットＡ１および分離ユニットＡ２へのフローが独立して実現され、他方のリザーバは、分離ユニットＢと流体接続にある。定置洗浄は、各々の分離サイクルの後で行うことができる。典型的にはCIPは、試料に依存して、したがって分離ユニットを汚染している可能性がある混入物の量および型に依存して、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回の分離サイクル毎にその後に行われる。当業者は、CIPは省略してもよく、単回使用システムのために劇的に単純化することができる事実を知っている。
【０１０７】
別の好ましい態様において、装置は、ウイルス不活化（VI）のためのさらなるリザーバを含む。不純物の精製、特にウイルスの不活化および除去は、バイオ医薬化合物生成における主要な役割を果たしている。なぜならば、バイオ医薬化合物化合物中のウイルスレベルは、FDAにより規制されているからである。さらなる精製ステップにおいてウイルス不活化を行うことが可能であり、ここで、バイオ医薬化合物に依存して、ウイルス不活化は、例えば、溶媒／洗剤による不活化、低温殺菌、酸性ｐＨによる不活化、またはＵＶによる不活化により行うことができる。
【０１０８】
本発明による装置および本発明による手順を用いる場合、精製プロセスにウイルス不活化を含めることもまた可能である。このために、分離ユニットＡ１およびＡ２または分離ユニットＢのいずれかまたは全ての分離ユニットは、ウイルス不活化バッファーを含有するさらなるリザーバと流体接続にある。ウイルス不活化バッファーは、次いで、分離ユニットを貫流し、ここで、標的分子が前記分離ユニットのマトリックス上に結合する間に、ウイルス不活化が行われる。好ましくは分離ユニットは、低ｐＨまたは洗剤のいずれかまたは両方によるウイルス不活化のためのリザーバに接続され、好ましくは、ウイルス不活化ステップは、カチオン交換マトリックス上で行われる。ウイルス不活化がキャプチャーユニットＡ１およびＡ２上で行われる場合、ウイルス不活化バッファーを含有するリザーバは、分離ユニットＡ１および分離ユニットＡ２へのフローを独立して実現することができるような方法で、分離ユニットＡ１およびＡ２と流体接続にある。ウイルス不活化がポリッシングユニットＢ上で行われる場合、ウイルス不活化バッファーを含有するリザーバは、分離ユニットＢと流体接続にある。統合された低ｐＨによるウイルス不活化のために好適なバッファーは、酸性ｐＨを有するバッファー、好ましくは、３〜４のｐＨを有するバッファーである。好適なバッファーの例は、酢酸、グリシンおよび他のものである。統合された界面活性剤によるウイルス不活化のために好適なバッファーは、少なくとも１つの界面活性剤または洗剤を有するバッファーである。好適な洗剤の例は、オクタン酸、TweenまたはTriton界面活性剤X-100である。ウイルス不活化ステップを行うために、標的分子は、「カラム上で」、すなわちそれが分離ユニットのマトリックス上に結合しているうちに、精製ステップの合計数の減少をもたらす。なぜならば、典型的にはクロマトグラフィーステップに加えて行われるプールにおけるウイルス不活化が回避されるからである。
【０１０９】
好ましい態様において、装置は、貯留のためのいかなるリザーバも含まない。既知のクロマトグラフィーによる分離手順において、しばしば、第１のカラムから溶離する画分であって標的分子を含有するものを全て、それらを第２のクロマトグラフィーカラム上にロードとする前に、最初にプールする。本発明の方法および装置はかかる貯蔵を必要としないセットアップを提供することが見出された。好ましくは、ローディングおよび洗浄の後で標的分子が分離ユニットＡ１またはＡ２から溶離される場合、標的分子を含有する全ての溶出液は、貯蔵することなく直接的に、分離ユニットＢの出口に対して向けられ、分離ユニットＢ上にロードされる。
このことが、さらに、精製プロセスをスピードアップする。このために、分離ユニットＡ１およびＡ２は、この接続を切断するいかなるリザーバもなしに、分離ユニットＢには流体接続にある。これは、装置が、上記のような結合および溶離のための２つのバッファーリザーバのみを含む場合に、特に好ましい。分離モードが、２つより多くのバッファーの使用を必要とする場合、分離ユニットＢの流体入口の前に、インライン希釈およびバッファー交換のために用いることができるさらなる流体入口（上記のようなもの）を導入することにより、貯蔵をまた回避することができる。
【０１１０】
一態様において、装置は、１つのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有する２つの分離ユニット、およびイオン交換、好ましくはカチオン交換マトリックスを有する１つの分離ユニットを含む。好適なアフィニティーマトリックスは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインｒ官能基を有するマトリックスである（例えばProsep（登録商標）Highcap（Merck Millipore）、Prosep（登録商標）Ultra Plus（Merck Millipore）、Poros（登録商標）Prot A（Life Technologies）、A650F (Tosoh）、MabSelect（登録商標）Sure（GE））。好適なカチオン交換マトリックスは、限定されないが、スルホプロピル、スルホン酸などの強力なカチオン交換基を有するマトリックス（Fractogel EMD（登録商標）SO3、Fractogel EMD（登録商標）SE highcap（Merck）、Eshmuno（登録商標）S（Merck） SP-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）またはSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE（商標）、Pharmacia製）、または、限定されないが、カルボン酸などの弱いカチオン交換基を有するFractogel（登録商標）EMD Carboxy（Merck）のようなマトリックスである。
【０１１１】
別の態様において、装置は、カチオン交換マトリックスを有する２つの分離ユニット、およびアニオン交換マトリックスを有する１つの分離ユニットを含む。
好適なカチオン交換マトリックスは、限定されないが、スルホプロピル、スルホン酸などの強力なカチオン交換基を有するか、または限定されないが、カルボン酸などの弱いカチオン交換基を有するマトリックスであり、上述のものである。
好適なアニオン交換マトリックスは、限定されないが、四級アミノ基などの１または２以上の正に荷電されたリガンドを有するマトリックスである。
市販のアニオン交換樹脂として、DEAEセルロース、QAE SEPHADEX（商標）およびFAST Q SEPHAROSE（商標）（Pharmacia）、Fractogel（登録商標）TMAE (M)、Fractogel（登録商標）TMAE HC (M)またはEshmuno（登録商標）Q（Merck）が挙げられる。
【０１１２】
別の態様において、装置は、アニオン交換マトリックスを有する２つの分離ユニットおよびカチオン交換マトリックスを有する１つの分離ユニットを含む。好適なカチオン交換マトリックスおよびアニオン交換マトリックスは、上に列記されている。
【０１１３】
全ての態様において、また、ミックスモードマトリックスは、イオン交換マトリックスならびにその組み合わせの代わりに用いることができる。一例は、アニオン交換官能基と疎水性官能基との組合せ（Capto Adhere（GE Healthcare）、またはカチオン交換官能基と疎水性官能基との組み合わせ（Capto （商標）MMC（GE Healthcare）、Eshmuno（登録商標）HCX（Merck KGaA）、POROS（登録商標）XS（Applied Biosystems）など）である。
【０１１４】
図１は、本発明による装置の好ましい態様を示す。カラムＡ１およびＡ２は、「CIEX」と称され、これら２つのカラムが、同じクロマトグラフィーマトリックス、例えばカチオン交換樹脂を有することを示している。カラムＢは、AIEXと称され、このカラムがアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを有してもよいことを示唆する。伝導率検出器（「Cond.」）は、３つ全てカラムの流体入口の前に位置する。ＵＶおよびｐＨ検出器（「UV, pH」）は、３つ全てカラムの流体出口において位置する。カラムＡ１およびＡ２は、定置洗浄（「CIP」）、ウイルス不活化（「VI」）、ローディングバッファー（「E.A」）、溶離バッファー（「E.B」）、希釈バッファー（「Dil.」）および試料のフィード（「フィード」）のための６つのリザーバに接続される。カラムＢは、定置洗浄（「CIP」）、ローディングバッファー（「E.A」）、溶離バッファー（「E.B」）のための３つのリザーバに接続される。カラムＡ１／Ａ２のために用いられる好ましい溶離バッファーは、カラムＢのために用いられるローディングバッファーと同じであり、逆もまた然りである。リザーバおよびカラムは、接続線を介して接続される。好ましくは、全ての接続線は、少なくとも１回、液体の流動を制御することができるように、弁により断続される。液体輸送は、ポンプの補助により実現される。
【０１１５】
本発明はさらに、標的分子および１または２以上の不純物を含む試料からの標的分子の連続精製のための方法を提供する。本発明の方法は、それぞれの本発明の装置において行われる。好適な装置の模式図を、図２、３および４において示す。方法は、逐次的に繰り返すステップを含む。試料が分離ユニットＡ１上にロードされる間に、標的分子が分離ユニットＢ上に溶離されて分離ユニットＡ２が再平衡化されるように、分離ユニットＡ２が少なくとも部分的に分離ユニットＢと流体連通にあるように、ならびに、試料が分離ユニットＡ２上にロードされる間に、標的分子が分離ユニットＢ上に溶離されて分離ユニットＡ１が再平衡化されるように、分離ユニットＡ１が少なくとも部分的に分離ユニットＢと流体連通にあるように、第１のクロマトグラフィー次元のための分離ユニットＡ１およびＡ２に、連続的に逐次的に、試料をロードする。
【０１１６】
さらに、第２のクロマトグラフィーステップは、分離ユニットＢ上で行われ、これは、分離ユニットＢの流体出口からの精製された標的分子の回収をもたらす。
【０１１７】
本発明の方法を確実に連続モードで作動させるために、２つのクロマトグラフィーによる分離ステップの速度を調節する必要がある。典型的には、標的分子が分離ユニットＡ１または分離ユニットＡ２のいずれかから溶離される度に、分離ユニットＢが新たなローディングのための準備ができているように、第２のクロマトグラフィーのステップにおける分離ユニットＢ上でのローディング、クロマトグラフィーによる分離および再平衡化は、分離ユニットＡ１およびＡ２上でのローディング、クロマトグラフィーによる分離および再平衡化よりも早い。さもなくば、分離ユニットＡ１またはＡ２からの標的分子の溶離は、分離ユニットＢがローディングのための準備ができるまで遅延されるか、または、第２の分離ユニットＢ２が、システム中に統合される場合がある。
【０１１８】
本発明による方法を行う場合、分離ユニットＡ１／Ａ２から分離ユニットＢへ標的分子を溶離することとは、標的分子を含有する画分全体、または画分の一部のみを、分離ユニットＢ上にロードすることができることを意味する。不純物の量を減少させるために、標的分子を含有する画分の、不純物をほとんど含まない部分のみを、分離ユニットＢ上にロードすることが得策である場合もある。また、プロセスの制御において純度および他の特性を分析するために、第１の分離ステップの後で、標的分子画分の部分を取り去ることも可能である。
【０１１９】
以下において、例示的な態様をさらに記載する。装置の成分の標識は、図２において用いられる標識を参照する。
Ａ）両方のクロマトグラフィーステップ（キャプチャーおよびポリッシング）において標的分子がそれぞれの分離ユニットのマトリックスに結合する態様（結合−結合モード）：
【０１２０】
一態様において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１２１】
ｂ）試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
連続モードについて、好ましくは、ステップａ）およびｂ）を、少なくとも２回繰り返す。
【０１２２】
好ましい態様において、試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上へ入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードする（ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、ローディングの最後において、すなわちローディングがほぼ終了したときに、妥当な損失なしで特に高い量の結合した標的分子を達成することを可能にする）間に、分離ユニットＡ２から浸出し始めた、分離ユニットＡ１に結合するべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、分離ユニットＡ２の出口を、接続線Ｆ−Ｆを通して分離ユニットＡ１の入り口に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が多すぎることが検出された場合はすぐに、試料のフィードを、分離ユニットＡ２から分離ユニットＡ１へと切り替える。一方、Ａ１上の標的分子を洗浄し、分離ユニットＢ上に溶離させる。分離ユニットＡ１の再平衡化の後で、その入口を分離カラムＡ２の出口に接続し、分離ユニットＡ１から浸出し始めた標的分子を、確実に分離ユニットＡ２に結合させる。
【０１２３】
２つの分離ユニットＡ１およびＡ２のこの特異的な中間接続は、分離ユニットＡ１およびＡ２を非常に高い量の標的分子でロードすることにより、時間を接続するというユニークな可能性を提供する。既知のクロマトグラフィーシステムにおいて、典型的には、カラムは６０〜８０％の動的結合能力までロードされる。２つの分離ユニットＡ１およびＡ２の特異的な中間接続を有する本発明による装置および方法は、標的分子を損失することなく、分離ユニットＡ１およびＡ２を、８０％より高い動的結合能力まで、好ましくは８０〜９５％の動的結合能力まで、ロードする可能性を提供する。クロマトグラフィー媒質の動的結合能力は、実際の流動条件下において、未結合のタンパク質の著しい発生が生じる前に、当該媒質が結合するであろう標的分子の量である。
【０１２４】
試料を分離ユニットＡ１上にロードする場合、特に、ローディングがほぼ終了して、標的分子が分離ユニットの外に浸出し始めた場合は、他の手段で収集して試料のフィードに入れなければならないであろう標的分子が、直接的に分離ユニットＡ２上にフィードされるように、分離ユニットＡ１の出口を分離ユニットＡ２の入り口に連結することができる。当業者は、分離ユニットＡ１への試料のフィードを停止して、試料のフィードを分離ユニットＡ２へ切り替えるための最良の時点を決定することができる。同時にまた、分離ユニットＡ１の出口の分離ユニットＡ２の入り口への接続を断続し、分離ユニットＡ２を試料のフィードでさらにロードしつつ、分離ユニットＡ１を洗浄し、次いで分離ユニットＢの出口と接続し、標的分子を分離ユニットＢ上に溶離させる。分離ユニットＡ１の再平衡化の後で、それを再び分離ユニットＡ２の出口に接続して、試料のローディングの終了時においてカラムＡ２から浸出し得る標的分子をキャプチャーする。
【０１２５】
この態様のために好適な装置の模式図を、図３において示す。図３において示される模式図による装置を用いて、本発明の方法は、例えば以下のように行うことができる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１２６】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１２７】
ｃ）試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１２８】
ｄ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
連続モードについて、好ましくは、ステップａ）〜ｄ）を、少なくとも２回繰り返す。
【０１２９】
本発明による方法を行う以下の方法により、洗浄中に未結合の標的分子を溶離させることにしばしば起因する標的分子の損失を減少させることができることを見出した：
【０１３０】
好ましい態様において、洗浄中に、分離ユニットＡ２（またはＡ１、それぞれ）を、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通して、高い量の結合した標的分子に対してロードした後で、未結合の標的分子を分離ユニットＡ１に洗い流し、妥当な損失なしで未結合の標的分子を移動する。すなわち、ローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２の出口を、分離ユニットＡ２から洗い流された分離ユニットＡ１に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、例えば接続線Ｗ−Ｆを通して、分離ユニットＡ１の入り口に接続する（図４を参照）。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、流体連通を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除く。一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードしつつ、分離ユニットＡ２上の標的分子をさらに洗浄し、分離ユニットＢ上に溶離させる。分離ユニットＡ２の再平衡化の後で、その入口を、分離カラムＡ１の出口に接続し、分離ユニットＡ１から浸出し始めた標的分子を、確実に分離ユニットＡ２に結合させる。
【０１３１】
２つの分離ユニットＡ１およびＡ２のこの特異的な接続は、時間を節約し、それらを洗浄することによる標的分子の損失を回避するというユニークな可能性を提供する。既知のクロマトグラフィーシステムにおいて、典型的には、カラム洗浄分画は、取り除かれて廃棄されるか、リザーバをフィードするために回収される。本発明による装置および方法は、この好ましい精製プロセスを用いることにより、少ない標的分子の損失、好ましくは標的分子の合計の２〜３％までの損失により、分離ユニットＡ１およびＡ２を洗浄する可能性を提供する。
【０１３２】
この態様のために好適な装置の模式図を、図４において示す。図４において示される模式図による装置を用いて、本発明の方法は、例えば以下のように行うことができる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１３３】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１３４】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０１３５】
ｄ）試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢは、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続される。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１３６】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１３７】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
連続モードについて、好ましくは、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも２回繰り返す。
【０１３８】
Ｂ）第１のクロマトグラフィーステップ（キャプチャー）において、標的分子がそれぞれの分離ユニットのマトリックスに結合し、第２のクロマトグラフィーのステップ（ポリッシング）において、標的分子が当該マトリックスに弱く結合するかまたは結合しないが不純物は結合する態様において（結合−フロースルーモード）：
【０１３９】
一態様において、第１のクロマトグラフィー次元のための分離カラムＡ１およびＡ２に、試料が分離カラムＡ１上にロードされる間に、標的分子が分離カラムＢ上に溶離され、カラムＡ２が再平衡化されるように、分離カラムＡ２が少なくとも部分的にカラムＢと流体接続にあるように、ならびに、試料が分離カラムＡ２上にロードされる間に、標的分子が分離カラムＢ上に溶離され、カラムＡ１が再平衡化されるように、分離カラムＡ１が少なくとも部分的にカラムＢと流体接続にあるように、連続的に、逐次的に、試料をロードする。
さらに、フロースルーモードにおける第２のクロマトグラフィーステップは、分離カラム上で行われ、これにより、分離カラムＢの流体出口からの精製された標的分子の回収がもたらされる。
【０１４０】
本発明の方法を確実に連続モードにおいて作動させるために、結合・溶離（bind-and elute）クロマトグラフィーによる分離ステップの溶離条件を、カラムＢにおいて行われるフロースルーステップのためのローディング条件に調整する必要がある。分離ユニットＢ上でのローディングのために好適な条件下において分離ユニットＡ１およびＡ２から標的分子を溶離させることが可能でない場合、典型的には、カラムＢに対する標的分子の弱結合条件または非結合条件に調整するために、入口Ｃを用いることができる。至適および一定の弱結合または非結合性能を得るために、ｐＨおよび伝導率などの一定の溶液特性が必要である。このことは、例えばインライン希釈またはバッファー交換により、分離ユニットＡ１またはＡ２からの入口Ｃを介しての標的分子の溶離を条件付けしながら、行われる。
【０１４１】
ときに、バイオ医薬製品の精製は、非常に類似した不純物からの標的分子の分離を含み、弱イオン交換クロマトグラフィーなどの高感度の分離方法が必要とされる。本発明の方法により、標的タンパク質について、結合溶離モードにおけるアフィニティー分離、および弱結合または非結合条件（フロースルー）におけるアニオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。このことは、非常に強力なツールであることが示された。特に、このフロースルーポリッシングのための幾つかのマトリックスの組み合わせは、カチオン交換もしくはアニオン交換または疎水性官能基およびそれらの混合物などの幾つかの異なる官能基により不純物を吸着することを介して、要求される生成物の純度を達成することを可能にする。
【０１４２】
フロースルークロマトグラフィーステップのためにまた、活性炭などの非常に弱いイオン交換マトリックスまたは弱いミックスモードマトリックスを用いることも可能である。炭素質材料、活性炭、およびフロースルー精製プロセスにおけるそれらの使用についてのさらなる詳細は、米国仮特許出願第61/575349号において見出すことができ、これは、本明細書により参考として援用される。以下において、例示的な態様をさらに記載する。装置の成分の標識は、図２において用いられる標識を参照する。
【０１４３】
一態様において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質またはミックスモード媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件下における分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、分離ユニットＢはバッファーＢにより再平衡化される。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１４４】
ｂ）試料を、分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質またはアフィニティー材料）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質またはミックスモード媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件における分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、分離ユニットＢをバッファーＢにより再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
連続モードについて、好ましくは、ステップａ）およびｂ）を、少なくとも２回繰り返す。
【０１４５】
好ましい態様において、組成物を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードし（ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、ローディングの最後において、すなわちローディングがほぼ終了したときに、妥当な損失なしで特に高い量の結合した標的分子を達成することを可能にする）、一方で、分離ユニットＡ２から浸出し始めた、分離ユニットＡ１に結合するべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、分離ユニットＡ２の出口を、接続線Ｆ−Ｆを通して分離ユニットＡ１の入り口に接続する（図３を参照）。分離ユニットＡ２からの標的分子が多すぎることが検出された場合はすぐに、試料のフィードを、分離ユニットＡ２から分離ユニットＡ１へと切り替える。一方、Ａ１上の標的分子を洗浄し、分離ユニットＢ上に溶離させる。分離ユニットＡ１の再平衡化の後で、その入口を分離カラムＡ２の出口に接続し、分離ユニットＡ１から浸出し始めた標的分子を、確実に分離ユニットＡ２に結合させる。
【０１４６】
２つの分離ユニットＡ１およびＡ２のこの特異的な中間接続は、分離ユニットＡ１およびＡ２を非常に高い量の標的分子でロードすることにより、時間を節約するというユニークな可能性を提供する。既知のクロマトグラフィーシステムにおいては、典型的には、カラムは、６０〜８０％の動的結合能力までロードされる。本発明による装置および方法は、分離ユニットＡ１およびＡ２を、８０％より高い動的結合能力まで、好ましくは８０〜９５％の動的結合能力まで、ロードする可能性を提供する。
【０１４７】
この態様のために好適な装置の模式図を、図３において示す。図３において示される模式図による装置を用いて、本発明の方法は、例えば以下のように行うことができる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質またはミックスモード媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件下における分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、バッファーＢで分離ユニットＢを再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１４８】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１４９】
ｃ）試料を、分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質またはアフィニティー材料）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質またはミックスモード媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件における分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、バッファーＢで分離ユニットＢを再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１５０】
ｄ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
連続モードについて、好ましくは、ステップａ）〜ｄ）を、少なくとも２回繰り返す。
【０１５１】
好ましい態様において、分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）が、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通して、妥当な損失なしで、特に高い量の結合した標的分子に対してロードされ、ここで組成物が、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させることを可能にする第１のｐＨおよび伝導率にあった場合、未結合の標的分子を分離ユニットＡ１に洗い流し、妥当な損失なしで未結合の標的分子を移動する。すなわち、ローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２から洗い流された分離ユニットＡ１に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、分離ユニットＡ２の出口を、接続線Ｗ−Ｆを通して分離ユニットＡ１の入り口に接続する（図４を参照）。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除く。一方、分離ユニットＡ２上の標的分子をさらに洗浄し、分離ユニットＢ上に溶離させながら、標的分子をさらに分離ユニットＡ１上にロードする。分離ユニットＡ２の再平衡化の後で、その入口を分離カラムＡ１の出口に接続し、分離ユニットＡ１から浸出し始めた標的分子を、確実に分離ユニットＡ２に結合させる。
【０１５２】
２つの分離ユニットＡ１およびＡ２のこの特異的な中間接続は、時間を節約し、それらを洗浄することによる標的分子の損失を回避する、ユニークな可能性を提供する。既知のクロマトグラフィーシステムにおいては、典型的には、カラム洗浄分画は、取り除かれて廃棄されるか、リザーバをフィードするために回収される。本発明による装置および方法は、好ましい精製プロセスにおいて、僅かな標的分子の損失、好ましくは標的分子の合計の２〜３％までの損失により、分離ユニットＡ１およびＡ２を洗浄する可能性を提供する。
【０１５３】
この態様のために好適な装置の模式図を図４において示す。図４において示す模式図による装置を用いて、本発明の方法は、例えば以下のように行うことができる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料またはアフィニティー材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件下における分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、バッファーＢで分離ユニットＢを再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１５４】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１５５】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０１５６】
ｄ）試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件における分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、バッファーＢで分離ユニットＢを再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１５７】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１５８】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
連続モードについて、好ましくは、ステップａ）〜ｆ）を、少なくとも２回繰り返す。
【０１５９】
本発明の方法において、好ましくは、ｐＨ依存的な結合および溶離を提供するバッファーが用いられることが見出されている。特に分離ユニットＡ１およびＡ２からの標的分子の溶離は、ローディングバッファーのｐＨとは異なるｐＨを有する溶離バッファーを使用する場合に、より効率的であり、より速いことが見出されている。言い換えると、溶離プロフィールは、ローディングバッファーのｐＨとは異なるｐＨを有する溶離バッファーを用いる場合に、より有利である。ｐＨ勾配による溶離が、特に好ましい。ｐＨ依存的な結合および溶離のために好適なバッファーは、当業者に公知である。好適なバッファーの組み合わせの例は、PBS−グリシン、酢酸−TRISなどである。
【０１６０】
好ましい態様において、本発明の方法は、バッファーＡが、標的分子が分離カラムＡ１／Ａ２上でキャプチャーされる条件を提供する第１の次元のためのローディングバッファーとなるような、２つのみのローディングバッファーおよび溶離バッファー、バッファーＡおよびバッファーＢのみの使用を含む。さらに、バッファーＡは、標的分子が分離カラムＢから溶離される条件を提供する第２の次元のための溶離バッファーである。バッファーＢは、第１の次元（カラムＡ１／Ａ２）のための溶離バッファーであるが、第２の次元（カラムＢ）のためのキャプチャーバッファーである。
【０１６１】
分離ユニットＡ１およびＡ２が、Prot Aマトリックスなどのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを有する場合、結合バッファー（バッファーＡ）は、典型的には、６〜８のｐＨおよび１０ｍＭ〜２Ｍの塩濃度（典型的な塩は、リン酸塩、酢酸塩、塩化物塩などである）を有する。好ましいものは、６．８〜７．３のｐＨおよび５０ｍＭ〜１Ｍの塩濃度を有する結合バッファーである。溶離バッファーは、典型的には、２〜５のｐＨおよび２０ｍＭ〜２００ｍＭの塩濃度（典型的な塩は、グリシン、酢酸塩などである）を有する。好ましいものは、２．５〜４．５のｐＨおよび２０ｍＭ〜５０ｍＭの塩濃度を有する溶離バッファーである。例えば、溶離バッファーが４のｐＨを有する場合、分離ユニットＡ１およびＡ２のProt Aマトリックスから標的分子を溶離させるために好適なこのバッファーは、カチオン交換マトリックスを有する分離ユニットＢ上に標的分子をロードするためにも好適である。
【０１６２】
分離ユニットＡ１およびＡ２がカチオン交換マトリックスを有する場合、結合バッファーは、典型的には、４〜７のｐＨおよび１０ｍＭ〜３００ｍＭの塩濃度（典型的な塩は、リン酸塩、酢酸塩、ＮａＣｌなどである）を有する。好ましいものは、４．５〜６のｐＨおよび２０ｍＭ〜１００ｍＭの塩濃度を有する結合バッファーである。溶離バッファーは、典型的には、７〜１０のｐＨおよび１０ｍＭ〜３００ｍＭの塩濃度（典型的な塩は、TRIS、PBS、ＮａＣｌである）を有する。好ましいものは、８〜９のｐＨおよび１０ｍＭ〜１５０ｍＭの塩濃度を有する溶離バッファーである。例えば溶離バッファーが８．５のｐＨを有する場合、分離ユニットＡ１およびＡ２のカチオン交換マトリックスから標的分子を溶離させるために好適なこのバッファーはまた、アニオン交換マトリックスを有する分離ユニットＢ上に標的分子をロードするためにも好適である。
【０１６３】
分離ユニットＡ１およびＡ２がアニオン７〜１０のｐＨおよび交換マトリックスを有する場合、結合バッファーは、典型的には、１０ｍＭ〜３００ｍＭの塩濃度（典型的な塩は、TRIS、PBS、ＮａＣｌである）を有する。好ましいものは、７．５〜９．５のｐＨおよび１０ｍＭ〜３００ｍＭの塩濃度を有する結合バッファーである。溶離バッファーは、典型的には、４〜７のｐＨおよび１０ｍＭ〜１００ｍＭの塩濃度（典型的な塩は、PBS、酢酸塩、ＮａＣｌなどである）を有する。好ましいものは、４．５〜６．５のｐＨおよび１０ｍＭ〜１００ｍＭの塩濃度を有する溶離バッファーである。例えば溶離バッファーが５．５のｐＨを有する場合、分離ユニットＡ１およびＡ２のアニオン交換マトリックスから標的分子を溶離させるために好適なこのバッファーはまた、カチオン交換マトリックスを有する分離ユニットＢ上に標的分子をロードするためにも好適である。
【０１６４】
好ましい態様において、本発明の方法に供される試料は、清澄化された試料である。すなわち、試料は、分離ユニットＡ１またはＡ２上にロードされる前に、清澄化ステップに供される。
清澄化ステップは、１または２以上の可溶性および／または不溶性の不純物を標的から分離することを意図している。例えば、細胞および細胞デブリのような不溶性不純物を試料から取り除き、これにより、溶液中の標的分子ならびに他の可溶性不純物を含有する液体をもたらす。清澄化ステップは、以下の１または２以上を、単独でまたは任意の組み合わせにおいて含んでもよい：遠心分離、沈下および／または濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過（tangential flow filtration）またはデプス濾過（depth filtration）。好ましくは、清澄化ステップは、遠心分離を含まず、濾過および／または沈下のみを含む。好ましい態様において、濾過は、デプス濾過である。
【０１６５】
一部の態様において、デプスフィルター（デプスフィルター）は、１または２以上の不溶性不純物を取り除くために用いられる。デプスフィルターは、単に媒質の表面上のみならず媒質全体において粒子を保持するための、多孔質濾過媒質を用いるフィルターである。かかるデプスフィルターの一般的なクラスは、結合（または他の手段で固定）されて、複雑な、入り組んだ流路の迷路を形成する線維のランダムマトリックスを含むものである。これらのフィルターにおける粒子の分離は、一般に、線維マトリックスによる捕捉、またはこれへの吸着をもたらす。細胞培養ブロスおよび他の原料の生物学的処理のための最も頻繁に用いられるデプスフィルター媒質は、通常、セルロース繊維、DE（珪藻土）などのフィルター補助剤、および正に荷電された樹脂結合剤からなる。
【０１６６】
多孔質デプスフィルターが異方性である場合に、粒子性不純物の一次除去において特に良好な結果が達成されることが見出されている。一部の態様において、孔は、＞約２５μｍと評価される名目孔サイズを有する。一部の態様において、デプスフィルターは、少なくとも２つの段階的な不織布の層を含み、ここで、段階的な層は、約０．３ｃｍ〜約３ｃｍの合計の厚みを有する。
【０１６７】
一部の態様において、デプスフィルターは、不織布、セルロースおよび珪藻土の段階的な層の複合体を含む。不織布は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ナイロンまたはそれらの組み合わせを含む。
例示的なデプスフィルターは、本明細書において参考として援用される米国仮出願第61/571994号において見出すことができる。
一部の態様において、遠心分離および／またはタンジェンシャルフロー濾過ステップは、デプス濾過ステップに先立ち用いられる。代替的に、遠心分離および／またはタンジェンシャルフロー濾過ステップを必要とすることなく、デプス濾過ステップを行うことができる。
【０１６８】
一態様において、遠心分離および／または濾過および／または沈下による清澄化に先立ち、試料を、沈澱組成物で前処理して、望ましくない混入物を沈澱させて試料から取り除く。沈澱組成物は、少なくとも、試料からHCP’s、DNA、ホルモンなどの混入物を沈澱させることができる沈澱剤を含む。沈澱剤は、水性および／または可溶性の状態から非水性および／または不溶性の状態への化合物の沈澱を引き起こすか、あるいは、溶液から微粒子を凝集（aggregate）および凝集（agglutinate）させて、液相からのそれらの沈下および溶液の濁度の減少をもたらす
【０１６９】
好適な沈澱剤の例は、有機酸（例えばオクタン酸）、無機酸（例えばＨＣｌ）、ｐＨを酸性に向かって実質的に低下させる他の酸性剤、塩（例えば安息香酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなど）、酸性溶媒中で沈澱する他の一価の塩または有機酸である。沈澱剤の他の例は、カプリル酸などの短鎖脂肪酸である。穏和に酸性な条件においては、カプリル酸などの短鎖脂肪酸の付加は、典型的には、非ＩｇＧタンパク質を沈澱させるが、一方、ＩｇＧは沈澱しない。
【０１７０】
他の好適な沈澱剤は、多価電解質ポリマーである（例えば、本明細書において参考として援用される国際PCT特許出願第WO2008/091740号を参照）。
好ましい態様において、１または２以上の不純物を沈殿させるために、刺激応答性ポリマーを用いる。かかる刺激応答性ポリマーの例は、例えば、本明細書において参考として援用される米国公開第20080255027号、同第20090036651号、同第20090232737号および同第20110020327号において見出すことができる。刺激応答性ポリマーは、一般に、ｐＨ、温度および／または塩濃度などの特定のプロセス条件のセットの下で、水ベースの溶媒中で可溶性であり、かかる条件のうちの１または２以上の変化により不溶性となり、その後沈澱する。例示的な刺激応答性ポリマーとして、限定されないが、ポリアリルアミン、ベンジル基で修飾されたポリアリルアミン、またはポリビニルアミンおよびベンジル基で修飾されたポリビニルアミンが挙げられ、ここで、刺激はリン酸またはクエン酸である。
【０１７１】
沈澱組成物はさらに、洗剤（Triton X-100、triton X-114、NP-40、Tween-20、OTD、SDS、CHAPS、および／またはポリエチレングリコール（PEG）（PEG-1000、PEG 10000）および／またはポリビニルアルコールおよび／または多価電解質を含んでもよい。
沈澱した混入物を、次いで、試料を分離ユニット上にロードする前に、清澄化により試料から取り除く。
好ましい態様において、沈澱の後に、遠心分離のステップを行うことなくデプス濾過を行い、清澄化された試料を提供する。
【０１７２】
好ましい態様において、試料の清澄化は、その期間の少なくとも一部の間、本発明の方法によるクロマトグラフィー精製と同時に行う。言い換えれば、標的分子を含有する液体試料は、清澄化の後は、全試料の容積が清澄化されるまで待つために、プールタンク中には貯蔵されないが、清澄化された試料が清澄化プロセスからもたらされるとすぐに、それを連続的に本発明の方法のための試料溶液として用い、分離ユニットＡ１またはＡ２上にロードする。
したがって、本発明の方法はまた、清澄化された試料溶液を用いる場合は、試料溶液の全溶液を貯蔵することができるプールタンクの使用を必要としない。好ましくは、プールタンクを用いないか、試料溶液の全容積の２５％未満、好ましくは１０％未満を貯蔵することができるプールタンクのみを用いる。
【０１７３】
一部の態様において、分離ユニットＢ上で第２のクロマトグラフィーのステップを行った後で、１または２以上のさらなるフロースルー精製ステップを行ってもよい。このために、分離ユニットＢの出口は、１または２以上のさらなる分離ユニットと流体接続にある。インライン希釈および／またはバッファー交換の可能性を確実にするために、分離ユニットＢの出口と第１のさらなる分離ユニットの入口との間、および／または、随意に後に続くさらなる分離ユニット（典型的には直列に接続される）との間の接続線において、１または２以上の弁が位置してもよい。さらなるフロースルーデバイスのマトリックスは、典型的には、以下から選択される：
−  活性炭
−  カチオン交換
−  ミックスモード
−  分子ふるい
−  アニオン交換
【０１７４】
本発明による方法からもたらされる精製された標的分子を、さらに、処方／無菌化／濃縮のステップなどのさらなるプロセスステップに供してもよく、ここで、標的分子を含有する溶液を無菌化し、所望のバッファー中で所望の濃度となるように処方する。
【０１７５】
以下の例において、本発明による方法のさらなる態様を列記する：
CIEXキャプチャーおよびAIEXポリッシングを含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）上に、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ１−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡ１の再平衡化ステップのために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、指名された洗浄、再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１７６】
ｂ）試料を、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）上に、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を、妥当な損失なしで、高い量の結合した標的分子まで、分離ユニットＡ１に結合させることを可能にする；一方、分離ユニットＡ１から浸出し始めた、分離ユニットＡ２に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、直接的に、分離ユニットＡ１を分離ユニットＡ２に接続して、ここで、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続して、未結合の分子を取り除く；一方、分離ユニットＢを、例えば分離ユニットＢの再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続しつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ＝Ｗに接続する。
【０１７７】
ｃ）組成物を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、出口Ｂを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡ１の再平衡化ステップのために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、指名された洗浄、再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１７８】
ｄ）組成物を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を、妥当な損失なしで、高い量の結合した標的分子まで、分離ユニットＡ２に結合させることを可能にする；一方、分離ユニットＡ２から浸出し始めた、分離ユニットＡ１に結合するべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、直接的に、分離ユニットＡ２を分離ユニットＡ１に接続し、ここで、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、未結合の分子を取り除く；一方、分離ユニットＢを、例えば分離ユニットＢの再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続しつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、抗体をアニオン交換材料上に結合させ溶離させるために、抗体溶液を第３のバッファーでインライン希釈して溶離する。
好ましくは、ステップａ）〜ｄ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０１７９】
一態様において、方法は、CIEXキャプチャー、ハイスループットおよびAIEXポリッシングを含む。
CIEXキャプチャー、ハイスループット、およびAIEXポリッシングを含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１８０】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１８１】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０１８２】
ｄ）試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡの再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１８３】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１８４】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
好ましくは、ステップａ）〜ｆ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０１８５】
一態様において、方法は、CIEXキャプチャー、ウイルス不活化およびAIEXポリッシング（結合＆溶離または貫流）を含む。
CIEXキャプチャー、ウイルス不活化およびAIEXポリッシングを含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）組成物を分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＣによるウイルス不活化、第３のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡ２の再平衡化ステップのために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、指名された洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１８６】
ｂ）組成物を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＣによるウイルス不活化、第３のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡ１の再平衡化ステップのために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、指名された洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
好ましくは、ステップａ）〜ｂ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０１８７】
一態様において、方法は、CIEXキャプチャー、ハイスループット、ウイルス不活化およびAIEXポリッシングを含む。CIEXキャプチャー、ハイスループット、ウイルス不活化およびAIEXポリッシングを含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１８８】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１８９】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０１９０】
ｄ）試料を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換材料）上に入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２（例えばカチオン交換媒質）に結合させ、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばカチオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ１の再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばアニオン交換媒質）に接続し、直接的に標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢは、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続される。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１９１】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１９２】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
好ましくは、ステップａ）〜ｆ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０１９３】
一態様において、方法は、ProtAキャプチャー、CIEXポリッシング（結合＆溶離）およびウイルス不活化を含む。ProtAキャプチャー、CIEXポリッシング（結合＆溶離）およびウイルス不活化を含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下のステップを行うことにより、行うことができる：
ａ）組成物を、分離ユニットＡ１（例えばProtAカラムアフィニティーマトリックス）上に、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させて、未結合の分子を出口Ａ１−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ２（例えばProtA材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡ１の再平衡化ステップのために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、指名された洗浄、再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に連結し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＣによるウイルス不活化、およびバッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、フィーディング、洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１９４】
ｂ）組成物を、分離ユニットＡ１上に、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を、妥当な損失なしで、高い量の結合した標的分子まで、分離ユニットＡ１に結合させることを可能にする；一方、分離ユニットＡ１から浸出し始めた、分離ユニットＡ２に結合すべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、直接的に、分離ユニットＡ１を分離ユニットＡ２に接続して、ここで、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続して、未結合の分子を取り除く；一方、分離ユニットＢを、例えば分離ユニットＢの再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続しつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続する。
【０１９５】
ｃ）組成物を、分離ユニットＡ２（例えばProtA材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ（例えばProtA媒質）、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばアフィニティー材料）を、結合した標的分子を第１のｐＨにおけるバッファーＡにより洗浄すること、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離ユニットＡ１の再平衡化ステップのために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、指名された洗浄、および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａに接続し、指名された溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、第３のｐＨにおけるバッファーＣによるウイルス不活化、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化ステップのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、ここで、フィーディング、洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１９６】
ｄ）組成物を、分離ユニットＡ２（例えばアフィニティー材料）上に入口Ａ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を、妥当な損失なしで、高い量の結合した標的分子まで、分離ユニットＡ２に結合させることを可能にする；一方、分離ユニットＡ２から浸出し始めた、分離ユニットＡ１に結合するべき標的分子のキャプチャーを可能にするために、直接的に分離ユニットＡ２を分離ユニットＡ１に接続し、ここで、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続して、未結合の分子を取り除く；一方、分離ユニットＢを、例えば分離ユニットＢの再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続しつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続する。
好ましくは、ステップａ）〜ｄ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０１９７】
一態様において、方法は、ProtAキャプチャー、ハイスループットおよびCIEXポリッシングを含む。ProtAキャプチャー、ハイスループットおよびCIEXポリッシングを含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばProtAアフィニティーマトリックス）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること、ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばProtAアフィニティーマトリックス）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０１９８】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０１９９】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０２００】
ｄ）試料を、分離ユニットＡ２（例えばProtAアフィニティーマトリックス）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、（例えばProtAアフィニティーマトリックス）未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばProtAアフィニティーマトリックス）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０２０１】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０２０２】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
好ましくは、ステップａ）〜ｆ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０２０３】
一態様において、方法は、結合−溶離モードにおけるProtAキャプチャー、およびフロースルーモードにおけるハイスループットおよびミックスモードポリッシングを含む。ProtAキャプチャー、ハイスループット、およびミックスモードポリッシングを含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を分離カラムＡ１（例えばProtAアフィニティーマトリックス）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばProtAアフィニティーマトリックス）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばミックスモード媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件下における分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、バッファーＢで再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０２０４】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０２０５】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０２０６】
ｄ）試料を、分離ユニットＡ２（例えばProtAアフィニティーマトリックス）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、（例えばProtAアフィニティーマトリックス)未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばProtAアフィニティーマトリックス）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を出口Ａ１−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子が分離ユニットＢに弱く結合するかまたは結合しないことを可能にする条件における分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディングのために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続し、その後、バッファーＢで再平衡化する。再平衡化ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、フィーディングステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０２０７】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０２０８】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
好ましくは、ステップａ）〜ｆ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０２０９】
一態様において、方法は、AIEXキャプチャー、ハイスループット、CIEXポリッシング（結合＆溶離）およびウイルス不活化を含む。AIEXキャプチャー、ハイスループット、CIEXポリッシング（結合＆溶離）およびウイルス不活化を含む例示的な手順において、本発明による方法は、以下により行われる：
ａ）試料を、分離カラムＡ１（例えばアニオン交換材料）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードすること。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする；一方、分離カラムＡ２（例えばアニオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ａ（例えば溶媒送達システム）と接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を出口Ａ２−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ２からの標的分子のフィーディングと、その後のバッファーＢによる洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０２１０】
ｂ）ローディングがカラムＡ１上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ１に結合させ、未結合の標的分子を、接続線Ｆ−Ｆを直接的に通してカラムＡ２へ移動し、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０２１１】
ｃ）分離ユニットＡ１のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ１からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ１を、接続線Ｗ−Ｆにより入口Ｂを通しロードされる分離ユニットＡ２に接続する。分離ユニットＡ１から標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ１出口を出口位置Ａ１−Ｗに切り替えて、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子をさらに分離ユニットＡ２上にロードして、出口Ａ２−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
【０２１２】
ｄ）試料を、分離ユニットＡ２（例えばアニオン交換材料）上に、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してフィードする。ここで、組成物は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ（例えばアニオン交換材料）、未結合の分子を出口Ａ２−Ｗを通して取り除くことを可能にする；一方、分離ユニットＡ１（例えばアニオン交換材料）を、第１のｐＨにおけるバッファーＡによる結合した標的分子の洗浄、第２のｐＨにおけるバッファーＢによる結合した標的分子の溶離、およびバッファーＡによる分離カラムＡ２の再平衡化のために、入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）に接続する。洗浄および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｃ−Ｐを通して分離ユニットＢ（例えばカチオン交換媒質）に接続し、直接的に、標的分子を分離ユニットＢに移動する；一方、分離ユニットＢを、標的分子を分離ユニットＢに結合させることを可能にする条件における、分離ユニットＡ１からの標的分子のフィーディング、バッファーＢによる洗浄、ウイルス不活化バッファーによるウイルス不活化ステップ、バッファーＡによる標的分子の溶離、およびバッファーＢによる再平衡化のために、入口Ｃ（例えば溶媒送達システム）に接続する。フィーディング、洗浄、ウイルス不活化および再平衡化のステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｗに接続し、溶離ステップを行いつつ、分離ユニットＢを出口Ｂ−Ｐに接続して、精製された標的分子（例えば抗体）を取り除く。
【０２１３】
ｅ）ローディングがカラムＡ２上でほぼ終了した場合、それをさらに入口Ｂ（例えば溶媒送達システム）を通してロードする。ここで、試料は、第１のｐＨおよび伝導率にあり、このことが、標的分子（例えば抗体）を分離ユニットＡ２に結合させ、未結合の標的分子を、直接的に接続線Ｆ−Ｆを通してカラムＡ１に移動し、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除くことを可能にする。同時に、カラムＢを、再平衡化のために入口Ｃに接続する。
【０２１４】
ｆ）分離ユニットＡ２のローディングが終了した場合、分離ユニットＡ２からの未結合の標的分子を、入口Ａを用いて洗浄しつつ、分離ユニットＡ２を、接続線Ｗ−Ｆにより、入口Ｂを通してロードされる分離ユニットＡ１に接続する。分離ユニットＡ２からの標的分子が少なすぎることが検出された場合はすぐに、接続を断続し、カラムＡ２の出口を出口位置Ａ２−Ｗへ切り替え、未結合の分子を取り除き、一方、標的分子を、さらに分離ユニットＡ１上にロードし、出口Ａ１−Ｗを通して未結合の分子を取り除く。
好ましくは、ステップａ）〜ｆ）は逐次的に行われ、すなわち、それらは同じ順序において２回または３回以上行われる。
【０２１５】
本発明による装置および方法は、抗体などの標的分子の精製のための、時間を節約する２ステップのクロマトグラフィーの手順のための可能性を、初めて提供する。特有の選択性が必要とされる場合、手順を、例えばアフィニティーキャプチャーおよびカチオン交換ポリッシングを用いて行い、アフィニティー吸着剤を回避する場合は、精製プロセスを、カチオンキャプチャーおよびアニオンポリッシング、またはアニオンキャプチャーおよびカチオンポリッシングを用いるイオン交換クロマトグラフィーによるアフィニティークロマトグラフィーステップ（Prot A）の交換を介して行う。このことは、より長い樹脂使用時間、定置洗浄、安価な樹脂、および複数のバイオ医薬化合物へのその適用性の利点を有する。
【０２１６】
カラム上でのウイルス不活化を介したこの精製プロセスの最適化により、処理時間を短縮することができる。しばしば、処理時間は、時間の半分まで、またはそれより短く短縮される。
上および下で引用される全ての出願、特許および刊行物、ならびに、2011年10月4日に出願された対応するＥＰ出願EP 11008021.5、ならびに、2012年6月29日に出願された米国仮出願61/666,338の刊行物は、本明細書により参考として援用される。
【０２１７】
例
以下の例は、本発明の実際の適用を代表する。
１．
溶液の全成分の１７％（分析SECにより）を構成する０．９ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有するモノクローナル抗体細胞培養溶液（ここで、HCPの量は抗体６０００００ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）であった）を、第１のモードにおいてEshmuno（商標） S樹脂（カラムＡ１およびＡ２に類似する）および第２のモードにおいてCapto（商標） Adhere（カラムＢに類似する）上で、以下の条件下において精製した。クロマトグラフィー条件：第１のモード−３３．５ｍｌのEshmuno（商標） S樹脂を、１６×１５０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を含有する２５ｍＭのリン酸バッファーで、３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。第２のモード−３３．５ｍｌのCapto（商標） Adhere樹脂を、１６×１５０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで、２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ９）を含有する５０ｍＭのTRISバッファーで、１５ｍｌ／分（５００ｃｍ／時間）において、平衡化した。試料を調製するために：モノクローナル抗体細胞培養溶液を水で１：２に希釈し、１０分間撹拌しながら０．５％カプリル酸を添加した。形成された沈澱を、さらに２０分間沈下させた。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、ｐＨ５．５まで約６ｍＳ／ｃｍの伝導率において滴定した。３０００ｍｌの試料をEshmuno（商標） Sカラム上にロードし、カラムを次いで２５ｍＭの酢酸（ｐＨ４．６）で洗浄した。次いで、カラムを２５ｍＭのリン酸（ｐＨ６．３）で洗浄した。流速を次いで３００ｃｍ／時間（１０ｍｌ／分）まで減少させ、５０ｍＭのTRIS、２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ〜７．５）までの直線勾配における１０カラム容積により、Capto（商標） Adhereカラム上へ抗体を溶離させた（伝導率：約３．３ｍＳ／ｃｍ）。５０ｍＭのTRISバッファーによるインライン希釈を用いて、溶離溶液のｐＨ値を８．５まで増大させた。Capto（商標） Adhereカラムを次いで、５０ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ８．５）で逐次的に洗浄し、１０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのリン酸および２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．５）までの直線勾配における１０カラム容積により抗体を溶離させた。溶離された画分は、３．２ｍｇ／ｍｌの抗体を含有し、これは全成分の９９．９％を構成し（分析SECによる）、ここで、HCPの量は抗体３３ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）であった。溶離の後で、両方のカラムを、１ＭのＮａＣｌで、次いで１ＭのＮａＯＨでストリップした。
【０２１８】
２．カチオンキャプチャー＋アニオンフロースルー
溶液の全成分の１７％（分析SECにより）を構成する０．９ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有するモノクローナル抗体細胞培養溶液（ここで、HCPの量は抗体６０００００ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイSP 2/0による）であった）を、第１のモードにおいてEshmuno（商標） S樹脂（カラムＡ１およびＡ２に類似する）および第２のモードにおいてFractogel（商標） TMAE (M)（カラムＢに類似する）上で以下の条件下において精製した。クロマトグラフィー条件：第１のモード−３３．５ｍｌのEshmuno（商標） S樹脂を、１６×１５０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ４．５）で、３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。第２のモード−３３．５ｍｌのFractogel（商標） TMAE (M)樹脂を、１６×１５０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．６）を含有する５０ｍＭのTRISバッファーにより、１５ｍｌ／分（５００ｃｍ／時間）において平衡化した。試料を調製するために：モノクローナル抗体細胞培養溶液を水で１：２に希釈し、１０分間撹拌しながら０．５％カプリル酸を添加した。形成された沈澱を、さらに２０分間沈下させた。得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、ｐＨ５．５まで約６ｍＳ／ｃｍの伝導率において滴定した。３０００ｍｌの試料をEshmuno（商標） Sカラム上にロードし、カラムを次いで２５ｍＭの酢酸（ｐＨ４．６）で洗浄した。次いで、カラムを２５ｍＭのリン酸（ｐＨ６．３）で洗浄した。流速を次いで３００ｃｍ／時間（１０ｍｌ／分）まで減少させ、１０カラム容積の、１００ｍＭのTRIS、２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ〜８．５）（伝導率：約４．６ｍＳ／ｃｍ）によりFractogel（商標） TMAE (M)カラム上へ抗体を溶離させた。１００ｍＭのTRISバッファーによるインライン希釈を用いて、溶離溶液のｐＨ値を８．６に保持した。Fractogel（商標） TMAE (M)カラムを次いで、５０ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ８．５）で逐次的に洗浄し、残った抗体を２カラム容積で洗浄した。フロースルー画分は、２．８ｍｇ／ｍｌの抗体を含み、これは全成分の９９．９％を構成し（分析SECによる）、ここで、HCPの量は、抗体３０ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）。Eshmuno（商標） Sのための溶離およびFractogel（商標） TMAE (M)カラムのための洗浄の後で、両方のカラムを、１ＭのＮａＣｌで、次いで１ＭのＮａＯＨによりストリップした。
【０２１９】
３．ProtAキャプチャー＋カチオンポリッシング
溶液の全成分の１７％（分析SECによる）を構成する０．９ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有するモノクローナル抗体細胞培養溶液（ここで、HCPの量は抗体６０００００ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイSP 2/0による）であった）を、第１のモードにおいてProsep（登録商標）Ultra Plus樹脂（カラムＡ１およびＡ２に類似する）および第２のモードにおいてEshmuno（商標） S（カラムＢに類似する）上で、以下の条件下において精製した。クロマトグラフィー条件：第１のモード−３３．５ｍｌのProsep Ultra（登録商標）Plus樹脂を、１６×１５０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有する２５ｍＭのリン酸バッファーで、３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。第２のモード−３３．５ｍｌのEshmuno（商標） S樹脂を、１６×１５０ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ４．０）で３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。試料を調製するために：モノクローナル抗体細胞培養溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、ｐＨ７．２まで約１６ｍＳ／ｃｍの伝導率において滴定した。１５００ｍｌの試料をProsep（登録商標）Ultra Plusカラム上にロードし、カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。流速を次いで３００ｃｍ／時間（１０ｍｌ／分）まで減少させ、１０カラム容積の、２０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ〜５．０）（伝導率：約３．６ｍＳ／ｃｍ）で、Eshmuno（商標） Sカラム上に抗体を溶離させた。１０ｍＭのグリシンバッファーによるインライン希釈を用いて、溶離溶液のｐＨ値を〜５．５に保持した。Eshmuno（商標） Sカラムを次いで、１０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ４．０）で逐次的に洗浄し、２０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）までの直線勾配における１０カラム容積により抗体を溶離させた。溶離画分は、４．５ｍｇ／ｍｌの抗体を含み、これは全成分の９９．９％（分析SECによる）を構成し、ここでHCPの量は抗体４０ｎｇ／ｍｇであった（酵素免疫測定アッセイSP 2/0により）。溶離の後で、Prosep Ultra Plusカラムを、０．１５ＭのＨ３ＰＯ４で、Eshmuno（商標） Sカラムを１ＭのＮａＣｌで、次いで１ＭのＮａＯＨでストリップした。
【０２２０】
４．ProtAキャプチャー＋ミックスイオン交換フロースルー
溶液の全成分の１０％（分析SECによる）を構成する１．２５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有するモノクローナル抗体細胞培養溶液（ここで、HCPの量は抗体２５００００ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイCHOによる）であった）を、第１のモードにおいてProsep（登録商標）-vA High Capacity樹脂（カラムＡ１およびＡ２に類似する）、ならびに第２のモードにおいてEshmuno（商標） SおよびFractogel（登録商標）TMAE Hicap（カラムＢに類似する）上で、以下の条件下において精製した。クロマトグラフィー条件：第１のモード−１７．３ｍｌのProsep（登録商標）-vA High Capacity樹脂を１６×８．６ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．０）で３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。第２のモード−１６．７５ｍｌのEshmuno（商標） S樹脂を１６×７５ｍｍカラム中に充填し、１６．７５ｍｌのFractogel（登録商標）TMAE Hicap樹脂を１６×７５ｍｍカラム中に充填し、両方のカラムを１つの分離ユニットにおいて組み合わせた；この分離ユニットを次いで、２０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．４）で３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。試料を調製するために：モノクローナル抗体細胞培養溶液を、０．８μｍおよび０．２μｍの孔を有するデプスフィルターを通して濾過し、約１８ｍＳ／ｃｍの伝導率においてｐＨ７．２まで滴定した。２２０ｍｌの試料をProsep（登録商標）-vA High Capacityカラム上にロードし、カラムを次いで５００ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。流速を次いで３００ｃｍ／時間（１０ｍｌ／分）まで減少させ、１０カラム容積の、２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ〜４．０）（伝導率：約３．６ｍＳ／ｃｍ）でEshmuno（商標） S/ Fractogel（登録商標）TMAE Hicapカラム上に抗体を溶離させた。１００ｍＭのTRISバッファーによるインライン希釈を用いて、溶離溶液のｐＨ値を〜７．４に保持した。貫流した画分は、５．６７ｍｇ／ｍｌの抗体を含有し、これは全成分の９９．９％（分析SECによる）を構成し、ここでHCPの量は、＜５０ｎｇ／ｍｇの抗体であった（酵素免疫測定アッセイCHOによる）。溶離の後で、Prosep（登録商標）-vA High Capacityカラムを０．１５ＭのＨ３ＰＯ４で、およびEshmuno（商標） S／Fractogel（登録商標）TMAE Hicapカラムを１ＭのＮａＣｌで、および次いで１ＭのＮａＯＨでストリップした。
【０２２１】
５．ProtAキャプチャー＋ミックスモードフロースルー
溶液の全成分の１０％（分析SECによる）を構成する１．２５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を有するモノクローナル抗体細胞培養溶液（ここで、HCPの量は抗体２５００００ｎｇ／ｍｇ（酵素免疫測定アッセイCHOによる）であった）を、第１のモードにおいてProsep（登録商標）-vA High Capacity樹脂（カラムＡ１およびＡ２に類似する）、ならびに第２のモードにおいてEshmuno（商標） SおよびFractogel（登録商標）TMAE Hicap（カラムＢに類似する）上で、以下の条件下において精製した。クロマトグラフィー条件：第１のモード−１７．３ｍｌのProsep（登録商標）-vA High Capacity樹脂を１６×８．６ｍｍカラム中に充填した；カラムを次いで２０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．０）で３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。第２のモード−１６．７５ｍｌのCapto（商標） Adhere樹脂を１６×７５ｍｍカラム中に充填し、１６．７５ｍｌのCapto（商標） MMC樹脂を１６×７５ｍｍカラム中に充填し、両方のカラムを１つの分離ユニットにおいて組み合わせた；この分離ユニットを次いで、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．４）で３０ｍｌ／分（１０００ｃｍ／時間）において平衡化した。試料を調製するために：モノクローナル抗体細胞培養溶液を、０．８μｍおよび０．２μｍの孔を有するデプスフィルターを通して濾過し、約１８ｍＳ／ｃｍの伝導率においてｐＨ７．２まで滴定した。２２０ｍｌの試料をProsep（登録商標）-vA High Capacityカラム上にロードし、カラムを次いで５００ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのTRISバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。流速を次いで３００ｃｍ／時間（１０ｍｌ／分）まで減少させ、１０カラム容積の、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ〜４．０）（伝導率：約７．６ｍＳ／ｃｍ）で、Capto（商標） Adhere/ Capto（商標） MMCカラム上に抗体を溶離させた。１００ｍＭのTRISバッファーによるインライン希釈を用いて、溶離溶液のｐＨ値を〜７．２に保持した。貫流した画分は、６．１５ｍｇ／ｍｌの抗体を含有し、これは全成分の９９．９％（分析SECによる）を構成し、ここでHCPの量は、＜３０ｎｇ／ｍｇの抗体であった（酵素免疫測定アッセイCHOによる）。溶離の後で、Prosep（登録商標）-vA High Capacityカラムを０．１５ＭのＨ３ＰＯ４で、Capto（商標） Adhere/ Capto（商標） MMCカラムを１ＭのＮａＣｌおよび次いで１ＭのＮａＯＨでストリップした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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