(57)【要約】  本発明は、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）タンパク質の活性を調節する化合物および潜伏エプスタイン・バーウイルス感染を処置する方法におけるそれらの使用を包含する。Ｒ７は、置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジル、またはピリミジニル基である。本発明の化合物を薬学的に許容し得る担体と混合して含む医薬組成物もまた、提供し、本発明の組成物によりエプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）タンパク質の活性を調節し、潜伏エプスタイン・バーウイルス感染を処置する方法としても提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2014517847.tif 000016
式中、
ＸはＯまたはＮＨであり、および
Ｒ１は置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジルまたはチアゾール基である、
で表される化合物。
【請求項２】
式ＩＩ
【化２】
2014517847.tif 000017
式中、
Ｒ２は＝Ｏまたは２Ｈであり、
Ｒ３はＣＲ４、置換されたまたは無置換のピリジル基、ピリミジニル基、フェニルモルホリン基、オキサゾール基、または
【化３】
2014517847.tif 000018
であり、
Ｒ４は置換されたまたは無置換のフェニル基であり、および
Ｒ５およびＲ６は独立してハロゲン基、置換されたまたは無置換の低級アルキル基、または置換されたまたは無置換のメトキシ基であり、ただし、Ｒ２が＝Ｏであり、Ｒ５がＨであるとき、Ｒ６はＣｌ、Ｃ（ＣＨ３）３、またはＣＦ３ではない、
で表される化合物。
【請求項３】
式ＩＩＩ
【化４】
2014517847.tif 000019
式中、
Ｒ７は置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジル、またはピリミジニル基である、
で表される化合物。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の化合物を薬学的に許容し得る担体と混合して含む、医薬組成物。
【請求項５】
エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）タンパク質の活性を調節する方法であって、ＥＢＮＡ１タンパク質の活性が調節されるよう、ＥＢＮＡ１タンパク質を請求項１、２または３に記載の化合物の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項６】
潜伏エプスタイン・バーウイルス感染を処置する方法であって、対象の潜伏エプスタイン・バーウイルス感染が処置されるよう、処置が必要な対象に請求項４に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
潜伏エプスタイン・バーウイルス感染が、癌に関連する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
この出願は、2011年5月24日出願の米国仮出願第61/489,293号の利益を主張し、その教示を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、いくつかのリンパおよび上皮細胞悪性腫瘍の発癌性補助因子である（Kieff (2007) Epstein-Barr Virus and its Replication, 5th ed. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia; Rickinson & Kieff (2007) Epstein-Barr Virus, 5th ed. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia; Young & Rickinson (2004) Nat. Rev. Cancer 4:757-68）。ＥＢＶは、バーキットリンパ腫および鼻咽頭細胞腫（ＮＰＣ）の風土性の(endemic)形態の大多数と関連する。ＥＢＶはまた、約５０％の全てのホジキン疾患腫瘍生検、胃細胞腫のいくつかの形態、甲状腺腫瘍、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ならびに大多数の免疫抑制関連非ホジキンリンパ腫およびリンパ増殖性疾患において見つかる。ほとんどのＥＢＶ関連腫瘍は、形質転換細胞の核に潜伏ウイルスゲノムをマルチコピーエピソームとして宿す。潜伏感染中、ＥＢＶは、子孫ウイルス粒子を作り出さないが、宿主細胞の生存および増殖を促進する限られた一連のウイルス遺伝子産物を発現する。
【０００３】
増殖細胞において、潜伏ウイルスゲノムの維持は、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）タンパク質の機能に依存する（Leight & Sugden (2000) Rev. Med. Virol. 10:83-100）。ＥＢＮＡ１は、増殖細胞および腫瘍に見つかる全ての種類のＥＢＶ潜伏感染において発現する。ＥＢＮＡ１は、ＥＢＶ感染による初代Ｂリンパ球の不死化に必要不可欠であり（Humme, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10989-94）、ｓｉＲＮＡ枯渇によるまたはドミナントネガティブ変異体の異所性発現によるその阻害は、感染細胞死の原因となる（Kennedy, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14269-14274; Yin & Flemington (2006) Virology 346:385-93）。
【０００４】
ＥＢＮＡ１は、ＥＢＶ潜伏感染のターゲット阻害の候補である。ＥＢＮＡ１は、全てでないにしろ、ほとんどのＥＢＶ関連悪性腫瘍において、常に発現する（Thorley-Lawson & Gross (2004) N. Engl. J. Med. 350:1328-37）。ＥＢＮＡ１は、ウイルスゲノム維持におよび感染細胞生存に必要不可欠である（Kennedy, et al. (2003) 上記参照; Yin & Flemington (2006) 上記参照）。最も重要なことに、ＥＢＮＡ１は、明確に定義された生化学的および構造的特性を有するウイルス−コード化タンパク質である。ＥＢＮＡ１は、２つの主要な機能ドメイン、カルボキシ末端ＤＮＡ結合ドメイン、およびアミノ末端染色体テザリングドメインから構成される（Leight & Sugden (2000) 上記参照; Wang, et al. (2006) Mol. Cell Biol. 26:1124-34）。ＤＮＡ結合ドメインは、ウイルス性のプラスミド複製起点（ＯｒｉＰ）との相互作用に必要不可欠である（Yates, et al. (1985) Nature 313:812-815）。ＯｒｉＰは、ＥＢＮＡ１が１８ｂｐパリンドローム配列をホモダイマーとして結合させる一連の３０ｂｐ反復から構成される（Ambinder, et al. (1990) J. Virol. 64:2369-79; Rawlins, et al. (1985) Cell 42:859-68）。ＤＮＡ結合およびダイマー化の接点は、アポ−およびＤＮＡ−結合形態における高分解能Ｘ線回折によって解決された（Bochkarev, et al. (1996) Cell 84:791-800; Bochkarev, et al. (1995) Cell 83:39-46）。
【０００５】
ＥＢＮＡ１の既知の細胞ホモログはない一方、ＥＢＮＡ１の三次元構造は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の全体構造と似ており（Bochkarev, et al. (1995) 上記参照）、ＨＰＶのＤＮＡ複製起点にてＥＢＮＡ１と類似の機能を有する。タンパク質構造予測プログラムは、ＥＢＮＡ１およびＥ２が、ＥＢＮＡ１と多くの機能的特性を共有するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ＬＡＮＡタンパク質と似た構造的折り畳みを共有することを示唆しており、上記特性は、ＫＳＨＶ ｏｒｉＰのＤＮＡ結合およびエピソーム維持を含む（Garber, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:27401-11）。これらの所見は、ＥＢＮＡ１が、ヒトゲノムにおいて明白なオルソログを有しないウイルス起点結合タンパク質のファミリーの一員であり、したがって、ウイルス潜伏複製および持続の阻害剤にとって魅力的なターゲットであることを示し得ることを示唆している。
【０００６】
タンパク質−ＤＮＡ結合活性を特異的に阻害する小分子の同定は、いくらかの成功を収めている（Bowser, et al. (2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:5652-5; Kiessling, et al. (2006) Chem. Biol. 13:745-51; Mao, et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:12819-30; Rishi, et al. (2005) Anal. Biochem. 340:259-71）。過去１０年にわたる従来の創薬の費用効率の悪いおよび時間のかかるプロセスのため、ハイスループットバーチャルスクリーニング（ＨＴＶＳ）が、伝統的なＨＴＳへの魅力的および補完的アプローチとして浮上してきた。ＨＴＶＳは典型的に、タンパク質ターゲットの高分解能結晶構造のコンピュータによるスクリーニング用テンプレートとしての利用可能性に依存する。何年にもわたり、ＨＴＶＳは、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、チミジル酸、インフルエンザの血球凝集素、および寄生性プロテアーゼなどのターゲットに対する生物活性分子の成功した同定に利用されてきた（Siddiquee, et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7391-7396; Vangrevelinghe, et al. (2003) J. Med. Chem. 46:2656-2662）。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ
【化１】
2014517847.tif 000002
【０００８】
式中、
ＸはＯまたはＮＨであり、
Ｒ１は置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジルまたはチアゾール基であり、
Ｒ２は＝Ｏまたは２Ｈであり、
Ｒ３はＣＲ４、置換されたまたは無置換のピリジル基、ピリミジニル基、フェニルモルホリン基、オキサゾール基、または
【化２】
2014517847.tif 000003
であり、
【０００９】
Ｒ４は置換されたまたは無置換のフェニル基であり、
Ｒ５およびＲ６は独立してハロゲン基、置換されたまたは無置換の低級アルキル基、または置換されたまたは無置換のメトキシ基であり、ただし、Ｒ２が＝Ｏであり、Ｒ５がＨであるとき、Ｒ６はＣｌ、Ｃ（ＣＨ３）３、またはＣＦ３ではない、
で表され、および
Ｒ７は置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジル、またはピリミジニル基である、
で表される化合物を特徴とする。本発明の化合物を薬学的に許容し得る担体と混合して含む医薬組成物もまた、提供し、本発明の組成物によりエプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）タンパク質の活性を調節し、潜伏エプスタイン・バーウイルス感染を処置する方法としても提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
蛍光偏光（ＦＰ）ベースのハイスループットスクリーニングおよび電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）が、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）の小分子阻害剤を同定するために行われた。これらのアッセイにおいて同定された化合物が、ＥＢＮＡ１の高選択的阻害剤であることが見出された。これらの化合物、ならびにそれらの類似体および誘導体は、ＥＢＶに対する治療剤として使用するための新しいＥＢＮＡ１阻害剤としての機能を果たす。したがって、本発明は、本明細書において同定された化合物および潜伏エプスタイン・バーウイルス感染を処置することにおけるそれらの使用を特徴とする。
【００１１】
本発明の化合物は、共通のベンゾフラン構造を共有することが見出された。より具体的に、本発明の化合物は、式Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩの構造を有した。
【化３】
2014517847.tif 000004
【００１２】
式中、
ＸはＯまたはＮＨであり、
Ｒ１は置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジルまたはチアゾール基であり、
Ｒ２は＝Ｏまたは２Ｈであり、
Ｒ３はＣＲ４、置換されたまたは無置換のピリジル基、ピリミジニル基、フェニルモルホリン基、オキサゾール基、または
【化４】
2014517847.tif 000005
であり、
【００１３】
Ｒ４は置換されたまたは無置換のフェニル基であり、
Ｒ５およびＲ６は独立してハロゲン基、置換されたまたは無置換の低級アルキル基、または置換されたまたは無置換のメトキシ基であり、ただし、Ｒ２が＝Ｏであり、Ｒ５がＨであるとき、Ｒ６はＣｌ、Ｃ（ＣＨ３）３、またはＣＦ３ではなく、および
Ｒ７は置換されたまたは無置換のフェニル、ピリジル、またはピリミジニル基である。
【００１４】
「低級アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ブチル、ｎ−ヘキシルなどの１〜６個の炭素原子を含有する分枝または非分枝飽和一価炭化水素基を意味することが意図される。
【００１５】
例示的な置換基は、ハロゲン（すなわち、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、低級アルキル、エトキシ、メトキシ、ヒドロキシ、アミン、アミド、ニトロ、ニトロソ、アルデヒド、カルボキシル、スルフヒドリル、およびカルボノチオイルを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
式Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩの例示的な化合物を、表２に示す。かかる化合物を、医薬組成物、薬学的に許容し得る誘導体、または薬学的に許容し得る塩として調製することができ、単独でまたは対象化合物の単位用量を含むキットの形態で組み合わせて提供することができる。かかるキットにおいて、単位用量を含有する容器に加えてあるのは、化合物（単数または複数）の使用および使用に付随する利益を説明する情報添付文書であろう。
【００１７】
本発明の化合物の「薬学的に許容し得る誘導体」は、塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒、水和物またはそれらのプロドラッグを含む。かかる誘導体は、当業者によってかかる誘導体化のための既知の方法を使用して直ちに調製され得る。生成された化合物は、動物またはヒトに実質的な毒性作用なく投与され得、それらは、薬学的に活性であるか、またはプロドラッグである。
【００１８】
化合物の「薬学的に許容し得る塩」は、薬学的に許容し得、親化合物の所望の薬理学的活性を有する塩を意味する。かかる塩は、以下のものを含む：（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸類と形成される、あるいは酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸類と形成される、酸付加塩、あるいは（２）親化合物にある酸性プロトンを金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、またはアルミニウムイオンにより置き換えるとき、またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位させるときに形成される塩。
【００１９】
本明細書に具体的に開示された化合物に加えて、本発明はまた、ＥＢＮＡ１活性を調節する前記化合物の類似体および誘導体に関する。概して、ＥＢＮＡ１三次元結晶構造は本願化合物の構造と組み合わせて、ＥＢＮＡ１阻害活性がある試験化合物用にデザインまたはスクリーニングするために使用することができ、デザインまたはスクリーニングする化合物は、ＥＢＮＡ１の活性を調節するその能力について試験することができる。ある態様において、スクリーニングは、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインの残基と試験化合物との間の相互作用の検出に基づくさまざまなin silico、in vitroおよび／またはin vivoアッセイを使用して行われる。
【００２０】
本発明との関連で、ＥＢＮＡ１とは、エプスタイン・バー核抗原１タンパク質のことをいう。ＥＢＮＡ１は、例えば、GENBANK Accession No. YP_401677に記載され、本明細書では、配列番号：１において規定されている。全長ＥＢＮＡ１タンパク質は、本発明に従って使用することができ、または代わりに、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインを、使用することができる（すなわち、アミノ酸残基４５４〜６０７）。本発明の目的のために、ＥＢＮＡ１に関してはまた、ＥＢＮＡ１の合成変異型、ならびにＥＢＮＡ１のフラグメントを含む。合成変異型は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、本明細書に開示されたＥＢＮＡ１と相同性があり、ＤＮＡとの結合能を有するものを含む。より好ましくは、かかる変異型は、本明細書中に提供されたＥＢＮＡ１の配列に対応するが、１または２以上の、例えば、１〜１０、または１〜５のアミノ酸の置換、欠損または挿入を有する。ＥＢＮＡ１のフラグメントおよびそれらの変異型は、好ましくは１００および５００の間の長さのアミノ酸残基または１５０および３００の間の長さのアミノ酸である。例示的なフラグメントは、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインを包含するおよそ１５０のアミノ酸残基を含む。
【００２１】
本発明によれば、分子デザイン技法を、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ポケットの１または２以上のアミノ酸に結合する能力がある阻害および刺激化合物を含む類似体および誘導体をデザイン、同定および合成するために用いることができる。ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ポケットの構造を、ＥＢＮＡ１タンパク質の潜在的なモジュレーターを同定するために、GRAM、DOCK、HOOKまたはAUTODOCKなどのドッキングプログラムを使用して、コンピュータモデリングとあわせて使用することができる（Dunbrack, et al. (1997) Folding& Design 2:27-42）。この手順は、例えば、どれくらいよく化合物の形状および化学構造がＤＮＡ結合ドメインを補完するかを解明するための、または化合物を本明細書に開示された阻害剤の結合と比較するための、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ポケットへの化合物のコンピュータフィッティングを含むことができる。コンピュータプログラムをまた、ＥＢＮＡ１タンパク質およびエフェクター化合物の誘引、反発および立体障害を推定するために用いることができる。一般的に、フィットがきつくなるにつれて、立体障害がより低くなり、引力がより大きくなり、特異性がより大きくなり、これらは、他のクラスのタンパク質よりはむしろＥＢＮＡ１タンパク質と相互作用する可能性が高い特異的エフェクター化合物にとって重要な特徴である。
【００２２】
化学プローブアプローチを、代替的にまたは追加的に、ＥＢＮＡ１モジュレーターまたはエフェクターのデザインにおいて用いることができる。例えば、Goodford（(1985) J. Med. Chem. 28:849）は、異なる化学プローブ、例えば、水、メチル基、アミン窒素、カルボキシル酸素および水酸基を用いてＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインを精査するために使用することができるＧＲＩＤ（Molecular Discovery Ltd., Oxford, UK）などのいくつかの市販のソフトウェアパッケージを記載している。そうして、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインおよび各プローブ間の相互作用に好ましい部位が決定され、得られる三次元パターンから、推定的補完分子を、作り出すことができる。
【００２３】
本発明の化合物の類似体および誘導体もまた、より有効な阻害剤または活性剤を決定するために、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインの三次元構造を目視検査することにより、デザインすることができる。この種類のモデリングは一般的に、「マニュアル」ドラッグデザインとよばれる。マニュアルドラッグデザインは、「Ｏ」などのグラフィックス可視化プログラムを使用した目視検査および分析を用いることができる（Jones, et al. (1991) Acta Crystallographica Section A A47:110-119）。最初に、エフェクター化合物が、マニュアルドラッグデザインによって選択される。そして、そうしてデザインされた構造的類似体は、可能性が最も高い有効な候補をより良く定義するために、コンピュータモデリングプログラムによって修正することができる。既知の阻害分子といくらかの類似性があり得る無数の化合物のバリエーションを合成するおよびスクリーニングすることは不可能であり得ることから、潜在的な候補の数の低減は有用である。かかる分析は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発において有効であることが示されている（Lam, et al. (1994) Science 263:380-384; Wlodawer, et al. (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:543-585; Appelt (1993) Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48; Erickson (1993) Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128）。
【００２４】
三次元データベースを検索するのに好適なプログラムは、MACCS-3DおよびISIS/3D（Molecular Design Ltd, San Leandro, CA）、ChemDBS-3D（Chemical Design Ltd., Oxford, UK）、およびSybyl/3 DB Unity（Tripos Associates, St Louis, MO）を含む。化合物の選択およびデザインに好適なプログラムは、例えば、DISCO（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）、Catalyst（Bio-CAD Corp., Mountain View, CA）およびChemDBS-3D（Chemical Design Ltd., Oxford, UK）を含む。
【００２５】
本発明の化合物の類似体および誘導体は、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインの全てまたは一部に結合することができ、本願化合物よりも、より潜在的で、より特異的で、より毒性が低くおよびより有効であり得る。デザインされた化合物はまた、あまり有力ではないかもしれないが、in vivoおよび／またはin vitroでより長い半減期を有し、したがってin vivoおよび／またはin vitroで長期間ＥＢＮＡ１活性を調節するのにより有効であり得る。かかるデザインされたモジュレーターは、例えば、ＥＢＮＡ１を活性化するか、またはＥＢＮＡ１活性を阻害し、腫瘍形成を防止するのに有用である。
【００２６】
本発明はまた、その天然基質および／または本明細書に開示された化合物と類似の方法でＥＢＮＡ１に結合させることができる化学物質または化合物のための小分子データベースをコンピュータによりスクリーニングするための分子デザイン技法の使用を提供する。かかるコンピュータによるスクリーニングは、ＤＮＡ結合ドメインの１または２以上のアミノ酸の残基と相互作用するさまざまな基を同定することができ、本発明のモジュレーターを合成するのに用いることができる。
【００２７】
In vitro （すなわち、溶液中）スクリーニングアッセイもまた、本発明に包含される。例えば、かかるアッセイは、溶液中に基質（例えば、ＤＮＡプローブ）を有するまたは有しないＥＢＮＡ１またはＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、本明細書に記載のもの）を組み合わせることおよび類似体または誘導体がＥＢＮＡ１  ＤＮＡ結合活性を阻止または増強することができるかどうかを決定することを含む。この点において、in vitro スクリーニングアッセイを、類似体または誘導体の存在下または不存在下におけるＤＮＡ結合を監視するために行うことができる。本発明のこの面にしたがって、本発明は、類似体または誘導体のＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインへの結合を実証するためのＦＰベースのアッセイおよび／またはＥＭＳＡの使用を包含する。かかるアッセイは、当該技術分野において日常的に実施され、本明細書中により詳細に開示される。
【００２８】
類似体または誘導体のためのデザインまたはスクリーニング後、類似体または誘導体を、そのin vivoのＥＢＮＡ１の活性を調節する能力について、続いて試験する。これは、本明細書に開示された細胞ベースのレポーターアッセイなどの従来のアッセイを使用してまたはＥＢＶゲノムコピー数維持を決定することにより、行うことができる。
【００２９】
本発明の化合物、類似体または誘導体の効力をさらに評価するために、当業者は、潜伏ＥＢＶ感染に関わるあらゆる特定の疾患または傷害のモデルシステムを、急性、亜慢性および慢性研究において、化合物の吸着、分布、代謝および排出ならびにその潜在的な毒性を評価するために利用することができることを、十分理解するであろう。例えば、エフェクターまたはモジュレーター化合物を、例２に開示されたモデルであるヒトリンパ異種移植片を担持するｂｅｉｇｅ／ｎｕｄｅ／ｘｉｄマウス（Dosch, et al. (1991) Internation. Immunol. 3:731-35）またはヒトリンパ球を移植されたＳＣＩＤマウス（Rowe, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:147-158）を使用するＥＢＶモデルにおいて試験することができる。最終的に、本発明の化合物の安全性および効力を、ヒト臨床試験において評価する。
【００３０】
本発明の化合物は、さまざまな用途がある。ＥＢＮＡ１タンパク質は、ウイルス複製、ゲノム維持およびウイルス遺伝子発現に不可欠な全てのＥＢＶ関連腫瘍において発現する。ＥＢＮＡ１の転写因子様機能はまた、腫瘍形成中に一般に異常調節される経路に関わる細胞遺伝子の発現への影響へと及ぶ。したがって、一態様において、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合活性の阻害剤は、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合の破壊によりウイルス複製を阻害する。多くの場合、ウイルス複製の阻害は腫瘍形成の阻害と一致する。したがって、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合活性の阻害剤は、特定のＥＢＶ関連腫瘍における、ＥＢＶ潜伏感染が原因のヒトの疾患または状態の処置のために有効な治療剤であろう。ウイルス遺伝子の制御に加えて、ＥＢＮＡ１は、宿主細胞遺伝子発現を制御することが示されている。例えば、ＥＢＮＡ１は、Ｂ細胞においてＣＤ２５、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２およびＣＣＬ２０の発現（Baumforth, et al. (2008) Am. J. Pathol. 173:195-204; Kube, et al. (1999) J. Virol. 73:1630-1636; Srinivas & Sixbey (1995) J. Virol. 69:8155-8158）、および上皮細胞における翻訳、転写および細胞情報伝達に関わる細胞遺伝子の差次的(differential)制御（O'Neil, et al. (2008) J. Gen. Virol. 89:2833-2842; Wood, et al. (2007) Oncogene 26:4135-4147）を誘導することを示している。
【００３１】
さらに、ＥＢＮＡ１は、細胞をインターフェロン誘導ＳＴＡＴ１活性化に過敏にさせるＳＴＡＴ１発現を増強し、ＴＧＦβ１経路における情報伝達を調節し、血管新生および転移に関わる宿主細胞機構の増強をもたらすＡＰ−１活性を増加させる（O'Neil, et al. (2008) 上記参照; Wood, et al. (2007) 上記参照）。したがって、ＥＢＮＡ１を活性化する化合物は、病因を研究するためおよび宿主細胞遺伝子発現へのＥＢＮＡ１の効果を分析するために、ＥＢＶの溶解サイクルを誘導するのに有用である。一般的に、本発明の分子は、細胞または生物におけるＥＢＮＡ１活性を増加または減少させるのに望ましいときにいつでも使用することができる。
【００３２】
したがって、本発明の化合物、類似体および誘導体は、ＥＢＮＡ１を調節する（すなわち、阻止または阻害する、あるいは増強または活性化させる）方法における用途を見出す。かかる方法は、ＥＢＮＡ１の活性が調節されるよう、ＥＢＮＡ１を本発明の化合物、類似体または誘導体の有効量とin vitroまたはin vivoで接触させることに関わる。エフェクターまたはモジュレーター化合物の有効量は、化合物と接触しないＥＢＮＡ１と比較したときにＥＢＮＡ１の活性を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減させるまたは増加させる量である。かかる活性は、ＥＢＮＡ１の活性を検出するためのレポーターベースのアッセイによりまたはＤＮＡ基質を用いた競合的結合アッセイにおいて監視することができる。本発明にとくに包含される化合物は、本明細書中に、例において提供される。
【００３３】
当業者は、ＥＢＮＡ１の活性を調節することが、モデルシステムにおけるＥＢＮＡ１情報伝達現象の選択的分析において、ならびにＥＢＮＡ１潜伏感染が関わる疾患、状態、および傷害の防止または処置において、有用であり得ることを、十分理解することができる。特定の疾患または傷害の防止または処置における使用のための化合物の選択は、特定の疾患または傷害に依存するであろう。例えば、ＥＢＮＡ１は、癌に関わり、したがって、ＥＢＮＡ１を阻害する化合物は、バーキットリンパ腫、鼻咽頭細胞腫、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、胃細胞腫のいくつかの形態、甲状腺腫瘍、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、および免疫抑制関連非ホジキンリンパ腫を含むが、これらに限定されない癌の防止または処置において有用であろう。さらに、ＥＢＶは、慢性疲労症候群の病因に関与する疑いがあり（Lerner, et al. (2004) In Vivo 18:101-6）、ＥＢＮＡ１の阻害を、この状態の処置においても使用してもよい。
【００３４】
したがって、本発明はまた、潜伏エプスタイン・バーウイルス感染を防止または処置する方法を提供する。かかる処置には、処置が必要な対象に本明細書に開示されたＥＢＮＡ１阻害化合物の有効量（例えば、表２参照）を含有する医薬組成物を投与することが関わる。ほとんどの場合、これは、ヒトであろうが、農業動物、例えば、家畜および家禽、およびコンパニオンアニマル、例えば、イヌ、ネコおよびウマ、の処置は、本明細書中で明示的にカバーされている。
【００３５】
本明細書中において使用される用語「処置する」および「処置」は、状態または症状を治癒し、状態または疾患の確立を防止し、またはそうでなければ状態または疾患または他の望ましくない症状の進行を防止し、妨害し、遅らせ、または食い止めるあらゆるおよび全ての使用のことをいう。
【００３６】
本明細書中において使用される用語「有効量」は、その意味の範囲内で、所望の効果を提供するための、剤または化合物の非毒性であるが十分な量を含む。必要とされる正確な量は、処置される種、対象の年齢および一般的な状態、処置する状態の重症度、投与する特定の剤および投与方法などの要因に依存して、対象によって異なる。この点において、ある場合には、適切な「有効量」は、日常の実験のみを使用して、当業者により決定され得る。
【００３７】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、薬学的に許容し得る塩および複合体の形態であることができ、薬学的に許容し得る担体にて、適切な用量で提供することができる。かかる医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法により調製することができ、当該技術分野において周知の担体を含有することができる。かかる方法および成分の一般的に認識された概要は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000である。薬学的に許容し得る担体、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料、は、対象化合物の、１つの器官、または身体の一部から、他の器官、または身体の一部への運搬または輸送に関わる。各担体は、処方物の他の成分と適合し、処置する対象に有害ではないという意味で、許容し得るものでなければならない。
【００３８】
薬学的に許容し得る担体としての機能を果たす材料の例は、以下のものを含む：乳糖、ブドウ糖およびショ糖などの糖、コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体、トラガント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、ｐＨ緩衝液、ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物、ならびに製剤で用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、フレーバー剤および香料剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在することができる。
【００３９】
本発明の組成物は、標準の医療行為にしたがい、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内注射によって）、局所（頬側および舌下を含む）、経口、鼻腔内、膣内または直腸内投与することができる。
【００４０】
選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出または代謝速度、処置期間、用いられる特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および既往歴を含むさまざまな要因、ならびに医療分野において周知の同様の要因に依存するであろう。
【００４１】
当該技術分野において通常の知識を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を直ちに決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低い化合物の用量から開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加することができる。これは、当業者の技能の範囲内であると考えられ、最適な投薬を決定するために特定の化合物または同様の化合物について既存の文献を確認することができる。
【００４２】
ＥＢＶ潜伏感染の処置に加えて、本明細書に開示された化合物が、同様のＤＮＡ結合ドメインを有する他のウイルスの阻害に同等に好適であろうことが想定される。例えば、ＥＢＮＡ１は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の全体構造と似ており（Bochkarev, et al. (1995) 上記参照）、ＨＰＶのＤＮＡ複製起点でＥＢＮＡ１と類似の機能を有する。タンパク質構造予測プログラムは、ＥＢＮＡ１およびＥ２が、ＫＳＨＶ  ｏｒｉＰのＤＮＡ結合およびエピソーム維持を含む、ＥＢＮＡ１と多くの機能特性を共有するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ＬＡＮＡタンパク質に似ている構造的折り畳みを共有することを示す（Garber, et al. (2002) 上記参照）。したがって、本明細書に開示された方法にしたがって同定されたエフェクターもまた、ＬＡＮＡおよびＥ２タンパク質の活性の調節において、ならびにＫＳＨＶおよびＨＰＶと関連する疾患の処置において有用であり得る。
【００４３】
本発明を、以下の非限定の例によって、より詳細に説明する。
例１：化合物の平行合成
【００４４】
【化５】
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【００４５】
【化６】
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【００４６】
スキーム１〜７にしたがい合成された化合物の置換基を、表１に載せる。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
３−ニトロ−ベンゾフランに加えて、以下の構造を含むが、これらに限定されない他のコア構造もまた、検討する。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
例２：材料および方法
組換えＥＢＮＡ１  ＤＢＤの発現および精製。ＤＮＡ結合ドメインをコードするＥＢＮＡ１のアミノ酸４５４〜６０７（GENBANK Accession No. YP_401677; 配列番号：１）を、大腸菌におけるヘキサヒスチジン融合タンパク質として発現した。発現を、Ｒｏｓｅｔｔａ２細胞において０．３ｍＭのＩＰＴＧを用いて３時間２５℃で誘導した。可溶性タンパク質を、標準の方法にしたがい、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース経由で回収および精製した（Frangioni & Neel (1993) Anal. Biochem. 210:179-87）。結合タンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、４０ｍＭのイミダゾールおよび１０％グリセロールを用いて十分に洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液中での溶出前にＥＢＮＡ１に結合した非特異性ＤＮＡを解離した。溶出タンパク質のピーク分画を、貯蔵し(pool)、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％のグリセロール、および０．２ｍＭのＰＭＳＦに対して透析した。
【００５１】
ＦＰアッセイ。ＦＰアッセイは、２つの高親和性半部位を有する非パリンドローム部位（5’-GGG TAG CAT ATG CTA TCT aga tag cat atg cta ccc-3’; 配列番号：２）を有するプローブを用いた。このプローブは、ＥＭＳＡ（電気泳動移動度シフトアッセイ）において同様の効率でＥＢＮＡ１に結合したが、ＦＰ（蛍光偏光）アッセイにおいて著しく良好に行われた。２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、および５ｎＭのＣＹ５標識ＥＢＮＡ１  ＢＳ  Ｈａｉｒｐｉｎ（ｏｐｌ  ３０１６）または５ｎＭのＦＩＴＣ標識ＥＢＮＡ１  ＢＳ  Ｈａｉｒｐｉｎ（ｏｐｌ  ４６２４）を含有し、２４６〜１００ｎＭの精製したＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインを含むまたは含まない反応混合物を調製した。この溶液を、３０分間室温でインキュベートし、確実に結合させた。３０μＬのこの溶液を、BIOTEK MICROFLO Select Dispenserを使用して化合物を含む試験プレートの各ウェルに分注した。そして、プレートを、１６５×ｇで遠心分離し、確実にウェル内にて溶液が澄むようにし、３０分間２５℃でインキュベートした。そして、プレートを、PERKIN ELMER 2104 Multilabel Readerを使用して分析した。
【００５２】
ＥＭＳＡアッセイ。２０％のグリセロール、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、および１０ｎＭのＣＹ５標識ＥＢＮＡ１  ＢＳ  Ｈａｉｒｐｉｎ（ｏｐｌ  ３０１６）を含有し、２４６ｎＭの精製したＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインを含むまたは含まないＥＭＳＡ反応緩衝液を調製した。この溶液を、２０分間室温でインキュベートし、確実に結合させた。３０μＬのこの溶液を、ＤＭＳＯ中０．５μＬの試験化合物を含有するエッペンドルフチューブに分注し、続いて混合した。そして、サンプルを、６％のポリアクリルアミドゲルにロードし、９０分間１７０Ｖで電気泳動させた。そして、ゲルを、General Electric TYPHOON Imagerを使用して蛍光スキャンした。
【００５３】
ＦＰスクリーニング。初回スクリーニングのために、ＤＭＳＯ中に再懸濁させた２μｌの試験化合物を、黒いPERKIN ELMER OPTIPLATEにおける三つ(triplicate)のウェル中に５０ｍＭの濃度でプレートし(plate)、３０μＬの反応溶液中に再懸濁したとき３．３３ｍＭの最終濃度を達成した。プレートを、本明細書中に記載したＦＰアッセイを使用してアッセイした。具体的に、３０μｌの前もって作られたＥＢＮＡ１：ＣＹ５−またはＦＩＴＣ−ＤＮＡヘアピン複合体を、候補化合物を含有するウェルに分注した。１時間室温でのインキュベーション後、蛍光偏光（ＥＸ：６２０、ＥＭ：６８０）を、ENVISION XCITE Multilabel Reader（PERKIN ELMER）を使用して測定した。ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合のパーセント阻害を、アッセイプレートの対照ウェルに対する各化合物について計算した（すなわち、％阻害＝（ｍＰＭａｘ−ｍＰＣｍｐｄ）／（ｍＰＭａｘ−ｍＰｍｉｎ）×１００）。逆重畳積分により、結果を、４つのカテゴリーに層化した：活性（すなわち、ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合の＞１５％阻害を示し、水平および垂直次元両方において特定のウェルにきれいに位置した(map)生理活性化合物）、不明瞭（すなわち、いずれかの次元において２または３以上のウェルに位置した生理活性化合物）、オーファン（すなわち、直交的一致を、第二の次元において同定することができなかった）、および不活性（ＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合活性の＜１５％阻害）。
【００５４】
ＩＣ５０の決定。ＩＣ５０値を決定するために、１００％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中各化合物の１０点３倍滴定を、PERKIN ELMER JANUSを使用して１０ｍＭの初期濃度から開始して２回行い、マスタープレートを作製した。このマスタープレートから、０．５μＬを、PERKIN ELMER JANUSを用いて黒いPERKIN ELMER OPTIPLATE試験プレートにまたは手作業でエッペンドルフチューブに移した。プレートを、本明細書中のＦＰアッセイを使用してアッセイし、チューブを、上述のＥＭＳＡプロトコルを使用してアッセイした。
【００５５】
ＥＢＮＡ１転写抑制解除アッセイ。２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍプレートにおいて、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中に播種した。細胞を接着させるための１８時間３７℃でのインキュベーションに続き、５０〜７０％コンフルエンスの細胞を、プレートあたり４０μＬのLIPOFECTAMINE（INVITROGEN）を使用してトランスフェクトした。細胞を、プレートあたり４μｇのＱｐ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｎ１８５２）および０．１２５μｇのＥＢＮＡ１発現プラスミド（Ｎ８０３）または４μｇのＱｐ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｎ１８５２）および０．１２５μｇの対照プラスミド（Ｎ７９９）（ＥＢＮＡなし）と共にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、トリプシンを用いずに採取し、１２００ＲＰＭで５分間遠心分離し、１ミリリットルあたり１００，０００細胞の濃度で１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。４０μＬのこの溶液（４０，０００細胞）を、BIOTEK MICROFLO Select Dispenserを使用して白いプレートの各ウェルに分注した。試験化合物を、添加し、上述のとおり、１２５μＭ〜２ｎＭの最終濃度の範囲を達成した。細胞を、３７℃で４８時間インキュベートし、採取し、PROMEGA STEADY-GLOルシフェラーゼシステムを使用してルシフェラーゼ活性について分析し、PERKIN ELMER 2104 Multilabel Readerを使用して読み取った。
【００５６】
ＥＢＶ−陽性選択的死滅アッセイ。化合物がＥＢＶ−陽性細胞を選択的に死滅させるかを決定するために、ＥＢＶ−陽性細胞（LCLs, Mutu1, Raji）の生存率を、ＥＢＶ−陰性細胞（ＤＧ７５またはＢＣＢＬ１）と比較した。細胞を、１ミリリットルあたり１００，０００細胞の濃度で再懸濁し、４０μｌ（４０，０００細胞）の再懸濁物を、３８４−ウェルの透明なプレートの各ウェルに分注した。試験化合物（０．５μｌ）を、各ウェルに添加し、１２５μＭ〜２ｎＭの最終濃度の範囲を達成した。細胞を３７℃で７２時間化合物と共にインキュベートした後、細胞を、PROMEGA MTS試薬を使用して分析し、PERKIN ELMER 2104 Multilabel Readerを使用して読み取った。
【００５７】
異種移植片マウスモデルアッセイ。In vivoでの化合物の効力を試験するために、異種移植片マウスモデルを、免疫不全ＮＯＤ  ＳＣＩＤ（NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl）マウス（The Jackson Laboratory）において開発した(develop)。Ｍｕｔｕ  ＬＣＬ細胞を、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを恒常的に発現したレンチウイルス（Ｎ１８９３）を用いて形質導入し、フローサイトメーターを使用して選別し、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現する細胞の集団を単離した。五百万の形質導入されたＭｕｔｕ  ＬＣＬ  ＧＦＰ／ルシフェラーゼ−陽性細胞を、１００μｌの滅菌ＰＢＳに懸濁させ、６週齢の雌のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスの右側腹部内に皮下注射した。試験化合物を、ビヒクル（水中５％のｎ−メチルピロリドン、４５％のSOLUTOL HS 15、および５０％の1% LUTROL F 68）中に処方し、滅菌ろ過した。試験化合物を、１日１回７、９，および１１日に腹腔内投与した。９、１４、１８、２１、２３，および２５日に、腫瘍の大きさを、IVIS Imagerを使用して測定した。これらの測定のために、各動物を、イソフルランを用いて麻酔し、体重１グラムあたり２５０μｌの１５ｍｇ／ｍｌのストックのホタルＤ−ルシフェリンカリウム塩（GOLD BIOTECHNOLOGY, #LUCK1G, DPBS中に溶解）を腹腔内注射した。２０分後、マウスを、XENOGEN IVIS imager（CALIPER LIFESCIENCES）内に置き、腫瘍の大きさを、全光束を測定値として使用して読み取った。
【００５８】
例３：化合物の活性
化合物を、本明細書に開示された細胞ベースのアッセイにおける活性についてスクリーニングした。化合物のＩＣ５０値を、表２に載せる。
【００５９】
【表３】
2014517847.tif 000010
【００６０】
【表４】
2014517847.tif 000011
【００６１】
【表５】
2014517847.tif 000012
【００６２】
【表６】
2014517847.tif 000013
【００６３】
【表７】
2014517847.tif 000014
【００６４】
【表８】
2014517847.tif 000015
【国際調査報告】
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