(57)【要約】  本発明は、タンパク質の生産方法に関し、前記本発明に係るタンパク質の生産方法によれば、本発明のマルチウェルプレートキットと、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いることで、従来の細胞培養によるタンパク質発現／抽出方法を用いて標的タンパク質を得る場合に比べて多数のタンパク質を迅速且つ簡単に得ることができ、反応ウェル間の偏差がなくて同様なタンパク質に対して再現性のある合成効率を得ることができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）無細胞タンパク質合成のための鋳型を製造する段階と、
（２）前記鋳型を無細胞タンパク質発現液に加えてタンパク質を発現する段階と、
（３）前記発現タンパク質にアフィニティータグ（affinity tag）と結合する磁性粒子を加えて標的タンパク質を付着する段階と、
（４）前記付着した標的タンパク質を磁性粒子から分離する段階と、を含むタンパク質の生産方法であって、
ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いて全自動化したシステムで標的タンパク質の発現および抽出を同時に行うことを特徴とする、タンパク質の生産方法。
【請求項２】
（ａ）無細胞タンパク質合成のための鋳型を希釈するための溶液と、（ｂ）前記鋳型から標的タンパク質を発現するための無細胞タンパク質発現液と、を有する第２マルチウェルプレートキット４２０´と、
（ｃ）前記標的タンパク質を付着するための磁性粒子溶液と、（ｄ）前記標的タンパク質溶出液と、（ｅ）前記磁性粒子に標的タンパク質を結合するための磁性粒子反応液および洗浄液と、を有する第１マルチウェルプレートキット４２０と、からなるマルチウェルプレートキット４２０´、４２０を用いることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項３】
前記無細胞タンパク質合成のための鋳型は、環状（circular form）ＤＮＡまたは線状（linear form）ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項４】
前記線状ＤＮＡは、
標的遺伝子を増幅することができ、５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有するように作製されたプライマーセットを用いて、サンプル内の標的遺伝子を増幅して１次反応物を得る段階と、
前記得た１次反応物に下記組成物Ａを含むＰＣＲ用プリミックス（premix）を用いて２次増幅する段階と、を行うことにより製造されることを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質の生産方法。
組成物Ａ：
（ａ）標的遺伝子の５´末端および３´末端の両末端に位置するupstream casette setおよびdownstream casetteset
（ｂ）前記cassetteの５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有する２次プライマーセット
【請求項５】
前記組成物Ａは、
標的遺伝子の５´末端および３´末端の両末端にアフィニティータグ（affinity tag）をコード化するためのcassette setを０．１〜０．５ｎｇ／μｌ含み、
前記cassette setの５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有する２次のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ０．１〜１．０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ含むことを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項６】
前記アフィニティータグ（affinity tag）が、ヒスチジンであることを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項７】
前記磁性粒子が、金属イオンを含むことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項８】
前記金属イオンが、ニッケルイオンであることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに無細胞タンパク質合成のための鋳型を注入する注入段階（Ｓ１０）と、
前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに鋳型を希釈するために注入されたＤＥＰＣ蒸留水を前記注入された鋳型に混合する第１混合段階（Ｓ２０）と、
無細胞タンパク質発現液と、前記第１混合段階の混合物とを混合する第２混合段階（Ｓ３０）と、
第２混合段階の混合物と、細胞破砕液とを混合してタンパク質合成反応液を製造する混合物製造段階（Ｓ４０）と、
ヒート部７２０を用いて前記混合物が入っている前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部を加熱して、前記特定の単位ウェル内のタンパク質合成反応液に熱を加える加熱段階（Ｓ５０）と、
磁性粒子反応混合物を準備する段階（Ｓ７０）と、
前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入されたタンパク質発現物を前記準備した磁性粒子混合物に注入するタンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）と、
前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入されたタンパク質発現物を磁性粒子と反応させる反応段階（Ｓ１２０）と、
前記タンパク質発現物と混合した混合物に磁場を印加して前記磁性粒子および磁性粒子に結合したタンパク質以外の混合物を除去する除去段階（Ｓ１４０）と、
前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルに注入された洗浄液を注入して、前記磁性粒子における標的タンパク質以外の不純物を洗浄する洗浄段階（Ｓ１５０）と、
前記洗浄液と混合した混合物に磁場を印加して、前記洗浄液と混合した混合物のうち前記標的タンパク質が付着した前記磁性粒子以外の混合物を除去する除去段階（Ｓ１７０）と、
前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルに注入された標的タンパク質溶出液を前記除去段階を経た混合物に注入して前記標的タンパク質を分離する標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）と、
前記混合物に磁場を印加して、前記磁性粒子から分離した標的タンパク質が含まれたタンパク質溶出液のうち前記磁性粒子以外の混合物である標的タンパク質含有溶液を得る標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）と、を含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質以外の不純物を洗浄する洗浄段階（Ｓ１５０）、および前記標的タンパク質が付着された磁性粒子以外の混合物を除去する除去段階（Ｓ１７０）を順に１回以上行うことを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
前記標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）は、前記標的タンパク質含有溶液をタンパク質保管用チューブ４４２‐３に注入する段階を含むことを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
前記磁性粒子が、ニッケルイオンが結合した磁性粒子であることを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の生産方法に関し、より詳細には、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いて全自動化したシステムで標的タンパク質の発現および抽出を同時に行うことを特徴とするタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質の発現方法として、主に、大腸菌や酵母のような細胞を用いて、細胞内に組み換えタンパク質の発現ベクターを形質転換し、細胞を培養してタンパク質を発現する方法が一般的に用いられている。この方法は、組み換えタンパク質を安定的に発現する菌株のスクリーニング過程を必要とし、細胞に対して毒性を示すタンパク質の場合には、タンパク質の発現が困難であるという欠点があって、一つのタンパク質を得るには少なくとも数日〜数ヶ月の時間がかかる。
【０００３】
近年、細胞を用いることなくテストチューブ内でタンパク質を合成する無細胞タンパク質の発現方法が注目を浴びており、これに関する様々な製品が開発されている。この方法は、チューブにタンパク質を発現するための鋳型ＤＮＡ（例：expression vector、PCR product）、細胞破砕液、発現液、およびＤＥＰＣ蒸留水を添加してから適正温度（３０〜４０℃）で適正時間（１〜３時間）反応させるとタンパク質が発現するシステムであって、細胞内で毒性を有するタンパク質も発現が可能であるという利点があり、上述した細胞を用いてタンパク質を発現する方法に比べ、所要時間を著しく短縮することができる。タンパク質発現のために適正温度および適正時間が必要な理由は、チューブ内でＤＮＡからＲＮＡが合成され、このＲＮＡからタンパク質が合成されるまでの全過程で酵素の活性が伴われなければならず、多数の酵素が活性化する温度である３０〜４０℃を維持したときに上述した反応が行われるためである。
【０００４】
組み換えタンパク質が発現したサンプルには多数のタンパク質が混在しているため、このサンプルから発現した組み換えタンパク質を容易に精製するためには、発現したタンパク質が特定の物質に対する親和力を有する必要がある。近年、主に、組み換えタンパク質にヒスチジンを結合した状態で発現させ、このヒスチジンおよび金属イオン（ニッケルイオン、コバルトイオンなど）の親和力を用いてタンパク質を精製する方法を用いており、これに関する様々な製品が販売されている。その中でも磁性粒子を用いる方法が広く用いられており、この方法は、磁性粒子の表面に存在する金属イオンが標的タンパク質のヒスチジンと結合して、多数のタンパク質から標的タンパク質のみを抽出する方法である。
【０００５】
しかし、前記従来技術は、収率が低く、高純度の精製が不可能で、且つ細胞培養による複雑なタンパク質発現の調節と非効率的な生産方法により、同様なタンパク質に対して再現性のある生産という根本的な問題は依然として解決できていない。
【０００６】
そのため、収率が高く、高純度の精製が可能で、且つ収率を高めるための技術だけでなく、同様なタンパク質に対して再現性のある合成効率の高いタンパク質の生産方法が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、これらの問題を解決するために、タンパク質の発現に対する調節が効率的で簡単な発現システムとこれを用いたタンパク質の生合成方法に関する鋭意研究を重ねた結果、標的タンパク質の発現および抽出を同時に行えることで従来より効率的で簡単なタンパク質の生産方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いて全自動化したシステムで標的タンパク質の発現および抽出を同時に行うことを特徴とするタンパク質の生産方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記タンパク質の生産方法において、無細胞タンパク質の発現方法と、アフィニティータグ（affinity tag）と結合する磁性粒子を用いるタンパク質の抽出方法とを結合して、標的タンパク質の発現および抽出を同時に行えるタンパク質合成キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、前記目的を達成するために、無細胞タンパク質の発現方法と、アフィニティータグ（affinity tag）と結合する磁性粒子を用いるタンパク質の抽出方法とを結合して、バイオニア社製のヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置に適用することにより、６時間内で最大１６種の標的タンパク質を合成して生産できるタンパク質の生産方法を提供する。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、（１）無細胞タンパク質合成のための鋳型を製造する段階と、（２）前記鋳型を無細胞タンパク質発現液に加えてタンパク質を発現する段階と、（３）前記発現タンパク質にアフィニティータグ（affinity tag）と結合する磁性粒子を加えて標的タンパク質を付着する段階と、（４）前記付着した標的タンパク質を磁性粒子から分離する段階と、を含むタンパク質の生産方法であって、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いて全自動化したシステムで標的タンパク質の発現および抽出を同時に行うことを特徴とするタンパク質の生産方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、（ａ）無細胞タンパク質合成のための鋳型を希釈するための溶液と、（ｂ）前記鋳型から標的タンパク質を発現するための無細胞タンパク質発現液と、を有する第２マルチウェルプレートキット４２０´と、（ｃ）前記標的タンパク質を付着するための磁性粒子と、（ｄ）前記標的タンパク質溶出液と、（ｅ）前記磁性粒子に標的タンパク質を結合するための磁性粒子反応液および洗浄液と、を有する第１マルチウェルプレートキット４２０と、を提供する。
【００１４】
また、本発明は、（１）無細胞タンパク質合成のための鋳型を製造する段階と、（２）前記鋳型を無細胞タンパク質発現液に加えてタンパク質を発現する段階と、（３）前記発現タンパク質にアフィニティータグ（affinity tag）と結合する磁性粒子を加えて標的タンパク質を付着する段階と、（４）前記付着した標的タンパク質を磁性粒子から分離する段階と、を含む、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたタンパク質の生産方法であって、前記方法は、（ａ）無細胞タンパク質合成のための鋳型を希釈するための溶液と、（ｂ）前記鋳型から標的タンパク質を発現するための無細胞タンパク質発現液と、を有する第２マルチウェルプレートキット４２０´と、（ｃ）前記標的タンパク質を付着するための磁性粒子と、（ｄ）前記標的タンパク質溶出液と、（ｅ）前記磁性粒子に標的タンパク質を結合するための磁性粒子反応液および洗浄液と、を有する第１マルチウェルプレートキット４２０と、を用いて、全自動化したシステムで標的タンパク質の発現および抽出を同時に行うことを特徴とするタンパク質の生産方法を提供する。
【００１５】
本発明において、前記無細胞タンパク質合成のための鋳型は、環状（circularform）ＤＮＡまたは線状（linear form）ＤＮＡを用いてもよい。好ましくは、前記環状ＤＮＡとしてはプラスミドＤＮＡを用いてもよく、線状ＤＮＡとしてはＰＣＲ産物（product）を用いてもよく、これに限定されない。
【００１６】
より詳細には、前記線状ＤＮＡは、標的遺伝子を増幅することができ、５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有するように作製されたプライマーセットとＰＣＲ用プリミックス（premix）を用いて、サンプル内の標的遺伝子を増幅して１次反応物を得る段階と、前記得た１次反応物に下記組成物Ａを含むＰＣＲ用プリミックス（premix）を用いて（以下、「ＰＣＲ用キット」とする）、２次増幅する段階と、を行うことにより製造されてもよい。［組成物Ａ］（ａ）標的遺伝子の５´末端および３´末端の両末端に位置するupstreamcasette setおよびdownstream casette set（ｂ）前記cassetteの５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有する２次プライマーセット
【００１７】
前記ＰＣＲ用プリミックス（premix）は、増幅反応に必要な成分が混合された混合物であって、デオキシヌクレオチド混合物（dNTP mixture）および緩衝液を含んでもよく、さらに、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。また、この混合物は、液状または乾燥状に製造されてもよい。
【００１８】
本発明において、線状ＤＮＡの製造の際に用いられるＰＣＲ用キットは、ＰＣＲ用プリミックス（premix）を含み、標的遺伝子の５´末端および３´末端の両末端にアフィニティータグ（affinity tag）をコード化するためのcassette setを０．１〜０．５ｎｇ／μｌ含み、前記cassette setの５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有する２次のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ０．１〜１．０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ含んでもよい。
【００１９】
本発明において、「カセット（cassette）」とは、ＤＮＡ断片に人為的に連結されるように短く合成された二本鎖のオリゴヌクレオチドを包括的に指す用語である。カセットの５´末端にはリン酸基がないため、二本鎖からなるカセットのうち一本鎖のみがゲノムＤＮＡに連結されることができる。
【００２０】
本発明において、「プライマー」とは、短い遊離３末端水酸基（free ３´ hydroxyl group）を有する一本鎖の塩基配列であって、相補的な核酸の鋳型（template）と塩基対（base pair）を形成することができ、核酸鋳型の鎖複製のための起点として機能する短い塩基配列を意味する。プライマーは、好適な緩衝液を用いて好適な温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ）のための試薬および相違する４種のｄＮＴＰの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。本発明のＰＣＲ用キットには、標的遺伝子のヌクレオチド配列に特異的なプライマーおよびカセット配列に特異的なプライマーが含まれる。
【００２１】
本発明において、前記ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置は、多数のピペット１４１、１４２が分離自在に装着され、前記装着された多数のピペット１４１、１４２にそれぞれ標的物質を含む生物学的サンプルを吸入および吐出するためのピペットブロック１００と、前記ピペットブロック１００を支持する固定本体２００と、前記固定本体２００に設けられて前記ピペットブロック１００を上下方向に移動させるピペットブロック上下移動手段と、前記固定本体２００を前後方向に移動させることで前記ピペットブロック１００を前後方向に移動させるピペットブロック前後移動手段と、前記固定本体２００の下部に位置し、隣接した２列のウェルからなる多数の単位ウェルを具備するマルチウェルプレートキット４２０´、４２０が搭載されるベースプレート４００と、前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の特定の単位ウェルに磁場を印加および解除するために、前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の前記特定の単位ウェルの下部に位置する磁場印加部７００と、前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の前記特定の単位ウェルを加熱するためのヒート部８１０と、を含むことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明において、前記ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置は、磁石が装着された磁石装着部および加熱のためのヒート部を上下方向に移動させることで、磁場の印加または解除とともに温度調節が可能であり、前記磁石装着部に形成された多数の単位ウェル引込溝が、マルチウェルプレートキットの単位ウェルの下部を包むように形成されて、反応効率をさらに高めることを特徴とする。
【００２３】
より詳細には、前記磁場印加部７００は、磁石７１１が装着される磁石装着部７１０と、前記磁石装着部７１０を上昇および下降させる昇降部７６０と、を含んでもよく、前記磁石装着部７１０の上面には、前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の前記特定の単位ウェルの下部が引き込まれるように単位ウェル引込溝７１３が形成され、前記ベースプレート４００には、前記磁石装着部７１０上昇の際に前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の前記特定の単位ウェルの下部が前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれるように単位ウェル露出孔４００‐３が形成されており、前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の前記特定の単位ウェルの下部は、前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれるように、隣接する前記マルチウェルプレートキット４２０´、４２０の単位ウェルの下部と所定距離離隔していてもよく、前記磁石７１１は、前記単位ウェル引込溝７１３の周辺部に挿着されてもよい。
【００２４】
本発明に係るタンパク質の生産方法は、前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに無細胞タンパク質合成のための鋳型を注入する注入段階（Ｓ１０）と、前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに鋳型を希釈するために注入された溶液を前記注入された鋳型に混合する第１混合段階（Ｓ２０）と、無細胞タンパク質発現液と、前記第１混合段階の混合物とを混合する第２混合段階（Ｓ３０）と、第２混合段階の混合物と、細胞破砕液とを混合してタンパク質合成反応液を製造する混合物製造段階（Ｓ４０）と、ヒート部７２０を用いて前記混合物が入っている前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部を加熱して、前記特定の単位ウェル内のタンパク質合成反応液に熱を加える加熱段階（Ｓ５０）と、磁性粒子反応混合物を準備する段階（Ｓ７０）と、前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入されたタンパク質発現物を前記準備した磁性粒子混合物に注入するタンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）と、前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入されたタンパク質発現物を磁性粒子と反応させる反応段階（Ｓ１２０）と、前記タンパク質発現物と混合した混合物に磁場を印加して前記磁性粒子および磁性粒子に結合したタンパク質以外の混合物を除去する除去段階（Ｓ１４０）と、前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルに注入された洗浄液を注入して、前記磁性粒子における標的タンパク質以外の不純物を洗浄する洗浄段階（Ｓ１５０）と、前記洗浄液と混合した混合物に磁場を印加して、前記洗浄液と混合した混合物のうち前記標的タンパク質が付着した前記磁性粒子以外の混合物を除去する除去段階（Ｓ１７０）と、前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルに注入された標的タンパク質溶出液を前記除去段階を経た混合物に注入して前記標的タンパク質を分離する標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）と、前記混合物に磁場を印加して、前記磁性粒子から分離した標的タンパク質が含まれたタンパク質溶出液のうち前記磁性粒子以外の混合物である標的タンパク質含有溶液を得る標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）と、を含むことを特徴とする。
【００２５】
より詳細には、本発明の前記注入段階（Ｓ１０）は、前記ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置に装着されている多数のピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＬに無細胞タンパク質合成のための鋳型を注入する段階であり、前記注入段階の後に第１混合段階（Ｓ２０）を行う。
【００２６】
前記第１混合段階（Ｓ２０）は、前記ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置に装着されている多数のピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入された無細胞タンパク質合成のための鋳型を希釈するためのＤＥＰＣ蒸留水Ｈを、前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＬに注入された前記無細胞タンパク質合成のための鋳型に混合する段階であり、前記第１混合段階の後に第２混合段階（Ｓ３０）を行う。
【００２７】
前記第２混合段階（Ｓ３０）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入された前記ＤＥＰＣ蒸留水と混合した前記無細胞タンパク質合成のための鋳型が注入された単位ウェルＬに、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＧに注入された無細胞タンパク質発現液を混合する段階であり、前記第２混合段階（Ｓ３０）の後に混合物製造段階（Ｓ４０）を行う。
【００２８】
前記混合物製造段階（Ｓ４０）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルに注入された前記ＤＥＰＣ蒸留水と混合した前記無細胞タンパク質合成のための鋳型が注入された単位ウェルＬに、前記細胞破砕液保管用チューブ４４２‐１に注入された細胞破砕液を混合してタンパク質合成反応液を製造する段階であり、前記混合物製造段階（Ｓ４０）の後に加熱段階（Ｓ５０）を行う。
【００２９】
前記加熱段階（Ｓ５０）は、第１加熱段階であって、前記磁石装着部７１０を上昇させて、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれた状態で、前記ヒート部７２０を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部を加熱して、前記特定の単位ウェルＬ内のタンパク質合成反応液に熱を加える段階であり、前記加熱段階（Ｓ５０）の後に第１タンパク質発現物の注入段階（Ｓ６０）をさらに行ってもよい。
【００３０】
前記さらに行われる第１タンパク質発現物の注入段階（Ｓ６０）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて、前記特定の単位ウェルＬ内のタンパク質合成反応液で反応が行われた１次タンパク質発現物を前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＪに注入する段階であり、前記第１タンパク質発現物の注入段階（Ｓ６０）の後に磁性粒子反応混合物を準備する段階（Ｓ７０）が行われる。
【００３１】
前記磁性粒子反応混合物を準備する段階（Ｓ７０）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルＡに注入された磁性粒子反応液と、前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルＦに注入された磁性粒子とを混合する段階であり、前記磁性粒子反応混合物を準備する段階（Ｓ７０）の後に、磁性粒子が混合された反応液の注入段階（Ｓ８０）、第１磁場印加段階（Ｓ９０）、および第１除去段階（Ｓ１００）を、順に、さらに行ってもよい。
【００３２】
前記さらに行われる磁性粒子が混合された反応液の注入段階（Ｓ８０）は、第２注入段階であって、前記磁石装着部７１０が下降した状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて、前記磁性粒子反応液と混合した混合物を前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬに注入する段階であり、前記２注入段階（Ｓ８０）の後に第１磁場印加段階（Ｓ９０）を行う。
【００３３】
前記第１磁場印加段階（Ｓ９０）は、前記磁石装着部７１０を上昇させて前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれるようにして、前記磁石装着部７１０から前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部に磁場を印加する段階であり、前記第１磁場印加段階（Ｓ９０）の後に第１除去段階（Ｓ１００）を行う。
【００３４】
前記第１除去段階（Ｓ１００）は、前記磁性粒子反応液と混合した混合物のうち前記磁性粒子および磁性粒子に付着された付着物が、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部に印加された磁場によって、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部の内壁に付着された状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記磁性粒子反応液と混合した混合物のうち前記磁性粒子および前記磁性粒子に付着された付着物以外の混合物を除去する段階であり、前記第１除去段階（Ｓ１００）を行った後、タンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）を行う。
【００３５】
前記タンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＪに注入された１次タンパク質発現物を前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＬに注入する段階であり、前記第２タンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）の後に反応段階（Ｓ１２０）を行う。
【００３６】
前記反応段階（Ｓ１２０）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＬに注入された２次タンパク質発現物を前記マルチウェルプレートキット４２０´の単位ウェルＬに注入された磁性粒子と反応させる段階であり、前記反応段階（Ｓ１２０）の後に第２磁場印加段階（Ｓ１３０）をさらに行ってもよい。
【００３７】
前記さらに行われる第２磁場印加段階（Ｓ１３０）は、前記磁石装着部７１０を上昇させて、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれるようにして、前記磁石装着部７１０から前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場を印加する段階であり、前記第２磁場印加段階（Ｓ１３０）の後に除去段階（Ｓ１４０）を行う。
【００３８】
前記除去段階（Ｓ１４０）は、第２除去段階であって、前記２次タンパク質発現物と混合した混合物のうち前記タンパク質が付着した前記磁性粒子が前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部に印加された磁場によって前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部の内壁に付着された状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記磁性粒子および磁性粒子に結合したタンパク質以外の混合物を除去する段階であり、前記第２除去段階（Ｓ１４０）の後に洗浄段階（Ｓ１５０）を行う。
【００３９】
前記洗浄段階（Ｓ１５０）は、前記磁石装着部７１０が下降した状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルに注入された洗浄液を前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬに注入して、前記磁性粒子から標的タンパク質以外の不純物を分離する段階であり、前記洗浄段階（１５０）の後に除去段階（Ｓ１７０）を行う。
【００４０】
前記除去段階（Ｓ１７０）は、第３除去段階であって、前記洗浄液と混合した混合物のうち前記標的タンパク質が付着した前記磁性粒子が、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部に印加された磁場によって前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部の内壁に付着された状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記洗浄液と混合した混合物のうち前記標的タンパク質が付着した前記磁性粒子以外の混合物を除去する段階であり、前記除去段階（Ｓ１７０）の後に標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）を行う。
【００４１】
前記標的タンパク質以外の不純物を洗浄する洗浄段階（Ｓ１５０）、および前記標的タンパク質が付着された磁性粒子以外の混合物を除去する除去段階（Ｓ１７０）を順に１回以上行ってもよく、前記洗浄段階（Ｓ１５０）の後に第３磁場印加段階（Ｓ１６０）をさらに行ってもよい。
【００４２】
前記さらに行われる前記第３磁場印加段階（Ｓ１６０）は、前記磁石装着部７１０を上昇させて、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれるようにして、前記磁石装着部７１０から前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場を印加する。
【００４３】
前記除去段階（Ｓ１７０）の後に行う標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）は、前記磁石装着部７１０が下降した状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記マルチウェルプレートキット４２０の単位ウェルに注入された標的タンパク質溶出液を前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬに注入して前記標的タンパク質を分離する段階であり、前記標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）の後に第４磁場印加段階（Ｓ１９０）をさらに行ってもよい。
【００４４】
前記さらに行われる前記第４磁場印加段階（Ｓ１９０）は、前記磁石装着部７１０を上昇させて、前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝７１３に引き込まれるようにして、前記磁石装着部７１０から前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルの下部に磁場を印加する段階であり、前記第４磁場印加段階（Ｓ１９０）の後に標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）を行う。
【００４５】
前記標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）は、前記磁性粒子から分離した標的タンパク質が含まれた標的タンパク質溶出液のうち前記磁性粒子が前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部に印加された磁場によって前記マルチウェルプレートキット４２０´の前記特定の単位ウェルＬの下部の内壁に付着された状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記磁性粒子から分離した標的タンパク質が含まれたタンパク質溶出液のうち前記磁性粒子以外の混合物である標的タンパク質含有溶液を得て標的タンパク質を生産することができる。
【００４６】
本発明において、前記標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）は、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記標的タンパク質含有溶液を前記ベースプレート４００に搭載されたタンパク質保管用チューブ４４２‐３に注入する段階を含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明において、前記磁性粒子は、標的タンパク質のアフィニティータグ（affinitytag）と結合する磁性粒子であって、より詳細には、金属イオンを含むものであり、好ましくは、ニッケルイオンが結合した磁性粒子であることを特徴とする。
【００４８】
本発明において、前記磁性粒子を用いるタンパク質の抽出方法と、無細胞タンパク質の発現方法とを結合して、これをバイオニア社製のヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置に適用することにより、６時間内で最大１６種の標的タンパク質を合成して生産することができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明に係るタンパク質の生産方法によれば、本発明のマルチウェルプレートキットと、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いることで、従来の細胞培養によるタンパク質発現／抽出方法を用いて標的タンパク質を得る場合に比べて多数のタンパク質を迅速且つ簡単に得ることができ、反応ウェル間の偏差がなくて同様なタンパク質に対して再現性のある合成効率を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置のベースプレートがケーシングに引き込まれた状態図である。
【図２】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置のピペットブロックの概路図を示す図である。
【図３】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置のピペットブロックの主要部の断面図である。
【図４】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置のケーシングが一部除去された斜視図である。
【図５】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置のベースプレートの使用状態図である。
【図６】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置の磁石装着部および昇降部の斜視図である。
【図７】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたタンパク質生産のための鋳型ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔの製造模式図を示す図である。
【図８】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたタンパク質の生産方法の模式図である。
【図９】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いた実験模式図である。
【図１０】本発明に係るヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたときに載置される第１マルチウェルプレートキットＡおよび第２マルチウェルプレートキットＢを示す図である（Ｇ列：無細胞タンパク質発現液が存在するウェル領域、Ｈ列：ＤＥＰＣ蒸留水が存在するウェル領域、Ｌ列：無細胞タンパク質合成のための鋳型が存在するウェル領域、Ａ〜Ｄ列：前記磁性粒子に標的タンパク質を結合するための磁性粒子反応液および洗浄液が存在するウェル領域、Ｅ列：標的タンパク質溶出液が存在するウェル領域、Ｆ列：標的タンパク質を付着するための磁性粒子が存在するウェル領域）。
【図１１】本発明に係るタンパク質の生産方法を用いて生産された標的タンパク質（ＧＦＰ）のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの確認結果を示す図である（Ｍ：バイオニア社製のＡｃｃｕＬａｄｄｅｒＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｌｏｗ）、Ｅ：発現されたＧＦＰサンプル、Ｐ：抽出されたＧＦＰサンプル、１〜１６：それぞれの単位ウェル内の反応したＧＦＰ合成タンパク質）。
【図１２】本発明に係るタンパク質の生産方法を用いて様々な鋳型ＤＮＡ別に生産された標的タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの確認結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、以下の実施例は、単に、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明が以下の実施例によって限定されないことは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。本発明の実施例で用いられた材料および方法などについて説明すると次のとおりである。
【００５２】
＜実施例１＞鋳型ＤＮＡの製造
（１）Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡの製造
タンパク質合成を行うために、鋳型ＤＮＡ‐ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを製造した。それぞれの遺伝子を遺伝子合成方法（ＮＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，２４８，２００‐２０３）により合成し、制限酵素処理を施した後、Ｅ．ｃｏｌｉ専用発現ベクターにクローニングした。
【００５３】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ専用発現ベクターとしては、ｐＢＩＶＴ（バイオニア社製、韓国）、ｐＩＶＥＸ（Ｒｏｃｈｅ社製、ドイツ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）、ｐＫ７、ｐＱＥなどを用いてもよく、これに限定されない。
【００５４】
また、前記Ｅ．ｃｏｌｉ専用発現ベクターは、発現ベクター内にアフィニティータグ（affinity tag）が含まれている必要がある。本実施例では、ヒスチジンタグ（histidinetag）が含まれた発現ベクターを用いているが、これに限定されず、他のタグ（tag）が含まれてもよい。
【００５５】
本実施例では、ＣａｌｍＬ３、ＲＮａｓｅＨ、ＤＵＳＰ３、ＣＡＴ、ＡｃＧＦＰ、ＥＦ‐Ｔｓ、ＶＦ、Ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ、ＢＭ３、遺伝子を用いている。
【００５６】
具体的に、遺伝子合成物質に対する制限酵素処理は、ＢａｍＨＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μｌ、ＮｏｔＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μｌ、１０Ｘ  ＡｃｃｕＣｕｔＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）２μｌ、遺伝子合成物質１０μｌ、滅菌蒸留水６μｌをそれぞれのチューブに加えて混合した後、３７℃で３時間静置して行った。Ｅ．ｃｏｌｉ専用発現ベクターに対する制限酵素処理は、ＢａｍＨＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μｌ、ＮｏｔＩ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）１μｌ、１０Ｘ  ＡｃｃｕＣｕｔＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）２μｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ専用発現ベクター１０μｌ、滅菌蒸留水６μｌをチューブに加えて混合した後、３７℃で３時間静置して行った。各制限酵素処理反応物からＡｃｃｕｐｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００５７】
２×  ｒａｐｉｄライゲーションバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）５μｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）、制限酵素処理遺伝子合成物質３μｌ、制限酵素処理ベクター１μｌをチューブに加えて混合した後、１６℃で１時間静置した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントセル（competentcell）１００μｌに前記の静置した反応液１０μｌを加えて氷上に３０分間放置した後、４２℃で９０秒間培養し、また氷上に５分間放置した。カナマイシン（kanamycin）が含まれたＬＢプレートに前記反応液を接種した後、３７℃で１６時間培養した。
【００５８】
白色のコロニーを採取してＬＢ液体培地１０ｍｌで１６時間程度培養した後、遠心分離して上澄み液は除去し、ＡｃｃｕＰｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いてペレットからプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、塩基配列分析を行って、各遺伝子合成方法によって合成された遺伝子であるが否かを確認し、タンパク質合成に用いるＤＮＡは、当該コロニーを培養して、同様な方法でプラスミドＤＮＡを確保した。プラスミドＤＮＡに対しては、ＵＶ分光計（Ｓｈｉｍａｚｕ社製、日本）を用いて濃度と純度を測定し、純度が１．８〜２．０であることを確認した。
【００５９】
（２）ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔの製造
タンパク質合成を行うために、鋳型ＤＮＡ‐ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔを製造した。ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔを作製するために、Ｔｗｏ‐ｓｔｅｐ  ＰＣＲの原理を適用した「ＰＣＲ用キット」を開発しており、ＰＣＲ産物（product）を作製する方法（図７参照）およびキットの構成品は下記表１のとおりである。
【００６０】
【表１】
2014524262.tif 000003
【００６１】
具体的に、まず標的遺伝子を増幅することができ、５´末端および３´末端に重複（overlapping）配列を有しているプライマーセットを作製して準備し、標的遺伝子を有しているサンプル（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、Ｔ  ｖｅｃｔｏｒなど）を鋳型とし、１次ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の際にキットで提供するＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘを用いて、反応条件として９４℃で５分間変性させた後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分を一周期とし、３０サイクル（cycle）に増幅し、最後に７２℃で５分間重合させる条件で反応を行った。次に、１次ＰＣＲ反応物をＡｃｃｕＰｒｅｐ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）またはＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いて精製して準備した。
【００６２】
前記１次ＰＣＲ反応物を鋳型とし、２次ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲを行って、最後にタンパク質合成のためのＰＣＲ産物を合成した。ＰＣＲ反応は、前記表１のキットで提供するカセットセットとプライマーセットおよび１次ＰＣＲ反応物を添加して行い、反応条件として９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で１分を一周期とし、３０サイクル（cycle）に増幅し、最後に７２℃で５分間重合させる条件で反応を行った。２次ＰＣＲ反応物をＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いて精製して準備した。
【００６３】
前記提供されるupstream cassetteおよびdownstream cassetteは、標的タンパク質に結合するアフィニティータグ（affinitytag）部分をコード化するオリゴヌクレオチドであって、より好ましくは、ヒスチジンタグ（histidinetag）を含む。
【００６４】
＜実施例２＞タンパク質発現用細胞破砕液の製造
（１）細胞培養
まず、大腸菌［ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、米国）］を３５０ｌの発酵槽（２×ＹＴ培地）で３７℃の温度で培養した。次に、吸光度（ＯＤ  ６００）０．５で１ｍＭのＩＰＴＧを加えてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させ、吸光度（ＯＤ  ６００）３．０〜６．０で培養を中断して遠心分離により細胞を回収し、‐５０℃で保管した。
【００６５】
（２）細胞破砕液の製造
回収した大腸菌１００ｇを５００ｍｌの洗浄液［１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｏＡｃ）ｐＨ８．２、１４ｍＭのＭｇ（ｏＡｃ）２、６０ｍＭのＫ（ＯＡｃ）、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．０５％（ｖ／ｖ）２‐メルカプトエタノール（２‐ＭＥ）］を加えて、よく洗浄（washing）し、また遠心分離（３,０００ＲＰＭ、３０分）するプロセスを３回繰り返して行った。洗浄が完了した後、大腸菌の重量を測定してから、重量の１．１倍の体積に該当する緩衝液［前記洗浄液から２‐ＭＥのみ除去］を加えて大腸菌を均一に溶かした後、細胞破砕機（Pressure CellHomogeniser、Stansted Fluid Power）を用いて所定の圧力（１６０〜２８０ＭＰａ）下で細胞を破砕した。
【００６６】
前記の細胞破砕液を高速遠心分離（１６,０００ＲＰＭ、３０分、４℃）により分離して上澄み液を回収し、これに前培養液［２９３．３ｍＭのＴｒｉｓ（ＯＡｃ）ｐＨ８．２、２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、１０．４ｍＭのＡＴＰ、２００ｍＭのクレアチン燐酸、４．４ｍＭのＤＴＴ、０．０４ｍＭのアミノ酸、２６．７ｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ］を細胞破砕液１０ｍｌ当たり３ｍｌずつ添加して３７℃で９０分間培養して前培養された溶液を作製した。次に、前記前培養された溶液を透析チューブ（１０ｋＤａ、Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ、Ｓｉｇｍａ社製、米国）に加えて、２０倍の緩衝液で４５分間４℃で４回透析して前培養後の異物を除去した後、透析チューブ内の溶液を遠心分離（１１,０００ＲＰＭ、２０分、４℃）してから、タンパク質合成のための細胞破砕液を製造した。この細胞破砕液は、マルチウェルプレートキットを製造するまでに‐７０℃で保管した。
【００６７】
＜実施例３＞無細胞タンパク質発現液の製造
無細胞タンパク質合成に必要なタンパク質発現液を製造した。
【００６８】
具体的に、無細胞タンパク質発現液［１１４ｍＭのＨｅｐｅｓ‐ＫＯＨ（ｐＨ８．２）、２．４ｍＭのＡＴＰ、各１．７ｍＭのＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、２ｍＭのＤＴＴ、９０ｍＭのＫ（Ｇｌｕ）、８０ｍＭのＮＨ４（ＯＡｃ）、１２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）、６８ｇ／ｍｌのフォリン酸（Ｌ‐５‐ホルミル‐５，６，７，８‐テトラヒドロ葉酸）、各１．５ｍＭの２０アミノ酸、２％のＰＥＧ８０００、６７ｍＭのクレアチン燐酸］を製造した。この発現液は、マルチウェルプレートキットを製造するまでに‐２０℃で保管した。
【００６９】
＜実施例４＞磁性粒子反応液および洗浄液の製造
タンパク質精製に用いられる磁性粒子は、磁性を帯びる鉄（Ｆｅ）粒子をシリカ（Silica）にコーティングし、末端をニッケル（Ｎｉ）でコンプレックス（complex）化した磁性粒子である。このような磁性粒子は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社などから購入可能である。この磁性粒子は、磁性を帯びる特性を用いて、より簡単なタンパク質精製が可能であり、これを用いて様々な分野への応用が可能であるという利点を有する。
【００７０】
標的タンパク質の抽出に必要な磁性粒子に標的タンパク質を結合するための磁性粒子反応液および洗浄液を製造した。具体的に、磁性粒子反応液および洗浄液［５０ｍＭのＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭの２‐メルカプトエタノール（２‐ＭＥ）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］を製造した。この溶液は、マルチウェルプレートキットを製造するまでに４℃で保管した。
【００７１】
＜実施例５＞タンパク質溶出液の製造
標的タンパク質抽出に必要なタンパク質溶出液を製造した。
具体的に、タンパク質溶出液［５０ｍＭのＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１Ｍのイミダゾール、５ｍＭの２‐メルカプトエタノール（２‐ＭＥ）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］を製造した。この溶液は、マルチウェルプレートキットを製造するまでに４℃で保管した。
【００７２】
＜実施例６＞マルチウェルプレートキットの製造
（１）細胞破砕液の分株および保管
前記実施例２で製造し保管中の細胞破砕液を氷で完全に溶かす。完全に溶けた細胞破砕液を８連チューブに各２００μｌずつ分株した後、‐７０℃で保管した。
【００７３】
（２）マルチウェルプレートキットの製造
前記実施例３〜５で製造した溶液を用いてマルチウェルプレートキットを製造した。
【００７４】
まず、図１０のＢを参照すると、第２マルチウェルプレートキット４２０´を製造した。具体的には、実施例３で製造した無細胞タンパク質発現液を氷で完全に溶かした後、図１０のＢにおけるマルチウェルプレートのＧ列にタンパク質発現液を各３５０μｌ分株し、Ｈ列にはＤＥＰＣ蒸留水（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を各２００μｌ分株した後、前記のマルチウェルプレートの上面をフィルムでシールして、‐２０℃で保管した。
【００７５】
次に、図１０のＡを参照すると、第１マルチウェルプレートキット４２０を製造した。具体的には、実施例４で製造した磁性粒子反応液および洗浄液を図１０のＡでマルチウェルプレート１のＡ〜Ｄ列に各１．２ｍｌずつ分株し、Ｅ列にはタンパク質溶出液を各２５０μｌ分株する。また、Ｆ列にはニッケルイオンが結合した磁性粒子（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を含む溶液を各５００μｌずつ分株し、前記のマルチウェルプレートの上面をフィルムでシールして、４℃で保管した。
【００７６】
＜実施例７＞ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたタンパク質発現／抽出方法
（１）タンパク質合成のための準備過程
本発明に用いられるヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置は、韓国登録特許１０２５１３５号、韓国公開特許２０１１‐００８１７１８号などに開示された装置またはＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）製品が用いられてもよく、これに限定されない。本実験では、ＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）製品を用いている。
【００７７】
ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたタンパク質発現／抽出方法は、図９の模式図のように行われる。具体的には、まず、実施例６の（１）で準備した細胞破砕液が分株されたチューブとマルチウェルプレートキットを冷凍庫から取り出して常温で完全に溶かす。次に、ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置ＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）の提供品６穴パンチで１、２番のマルチウェルプレートに穴を開ける。
【００７８】
前記実施例１で準備した鋳型ＤＮＡを第２マルチウェルプレート４２０´のＬ列に加える。次に、細胞破砕液とマルチウェルプレートをＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）の当該位置に装着する。タンパク質抽出溶液が満たされるｅｌｕｔｉｏｎ  ｔｕｂｅとフィルタチップを当該ラックに挿し込んで当該ラックの位置に装着した後、ｓｅｔ  ｕｐ  ｔｒａｙを押し入れて装置のドアを閉める。ＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）の電源を入れてプロトコル９０２を実行する。
【００７９】
この際、添加される前記鋳型ＤＮＡの量は、鋳型ＤＮＡの種類および大きさに応じて異なり、好ましくは、ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡの場合には１〜１０μｇ、ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔの場合には５００ｎｇ〜２μｇを添加する。
【００８０】
（２）ヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いたタンパク質発現／抽出過程
図８はヒート部および磁場印加部を備える生物学的物質の自動精製装置を用いて標的タンパク質の発現および抽出を同時に行うことを特徴とするタンパク質の生産方法のフローチャートである。
【００８１】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルへの無細胞タンパク質合成のための鋳型として標的ＤＮＡ注入段階（Ｓ１０）を有する。図１０のＢを参照すると、標的ＤＮＡ注入段階（Ｓ１０）では、ＤＮＡをマルチウェルプレート４２０´の単位ウェルＬに添加する。
【００８２】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルにＤＥＰＣ蒸留水を注入して混合する第１混合段階（Ｓ２０）を有する。特定の単位ウェルへのＤＥＰＣ蒸留水注入および混合段階（Ｓ２０）では、ピペット１４１、１４２（図３参照）を用いてマルチウェルプレート４２０´の単位ウェルＨに注入されたＤＥＰＣ蒸留水を前記特定の単位ウェルＬに注入する。これにより、ＤＥＰＣ蒸留水が前記特定の単位ウェルＬに注入された標的ＤＮＡと混合する。
【００８３】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルに無細胞タンパク質発現液を注入して混合する第２混合段階（Ｓ３０）を有する。前記第２混合段階（Ｓ３０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いてマルチウェルプレート４２０´の単位ウェルＧに注入された無細胞タンパク質発現液を前記特定の単位ウェルＬに注入する。これにより、無細胞タンパク質発現液が特定の単位ウェルＬで標的ＤＮＡ溶液と混合する。
【００８４】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルに細胞破砕液を注入して混合する混合物製造段階（Ｓ４０）を有する。前記混合物製造段階（Ｓ４０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて細胞破砕液が注入されたチューブ４４２‐１（図５参照）に注入された細胞破砕液を前記特定の単位ウェルＬに注入する。これにより、細胞破砕液が特定の単位ウェルＬで標的ＤＮＡおよび無細胞タンパク質発現液混合物と混合して、タンパク質合成反応液が製造される。
【００８５】
図５および図８を参照すると、第１加熱段階（Ｓ５０）を有する。前記加熱段階（Ｓ５０）では、磁石装着部７１０（図６参照）を上昇させて前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部が単位ウェル引込溝７１３（図６参照）に引き込まれた状態になるようにする。次に、ヒート部７２０（図６参照）を作動させて前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部を加熱し、前記製造されたタンパク質合成反応液でタンパク質の発現を促進する。加熱段階（Ｓ５０）で混合物内の酵素による反応が活性化して、標的ＤＮＡからＲＮＡ合成およびタンパク質発現が行われる。前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部は、前記ヒート部によって摂氏３０℃で３時間加熱されることができる。
【００８６】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルへの第１タンパク質発現物の注入段階（Ｓ６０）を有する。第１タンパク質発現物の注入段階（Ｓ６０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記第１加熱段階（Ｓ５０）を行った後、特定の単位ウェルである単位ウェルＬからタンパク質の発現が行われた混合物をマルチウェルプレート４２０´の単位ウェルＪに注入する。
【００８７】
図５および図８を参照すると、磁性粒子反応液と磁性粒子を混合する第３混合段階（Ｓ７０）を有する。前記第３混合段階（Ｓ７０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いてマルチウェルプレート４２０の単位ウェルＡに注入された磁性粒子反応液をマルチウェルプレート４２０の単位ウェルＦに注入して磁性粒子と混合する。これにより、磁性粒子の表面に対して、磁性粒子反応液によって平衡化が行われる。
【００８８】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルへの磁性粒子を注入、すなわち、磁性粒子反応液と混合した混合物を特定の単位ウェルに注入する注入段階（Ｓ８０）として第２注入段階を有する。前記注入段階（Ｓ８０）では、前記磁石装着部７１０が下降した状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記特定の単位ウェルＦの前記磁性粒子反応液と混合した混合物を前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬに注入する。
【００８９】
図５および図８を参照すると、第１磁場印加段階（Ｓ９０）を有する。第１磁場印加段階（Ｓ９０）では、前記磁石装着部７１０を上昇させて前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝に引き込まれるようにする。これにより、前記磁石装着部に装着された磁石７１１（図６参照）から前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部に磁場が印加される。
【００９０】
図５および図８を参照すると、第１除去段階（Ｓ１００）を有する。第１除去段階（Ｓ１００）は、第１磁場印加段階（Ｓ９０）によって前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部に磁場が印加された状態で行われる。より詳細には、第１除去段階（Ｓ１００）が行われる間に前記磁性粒子反応液と混合した混合物のうち前記磁性粒子反応液の磁性粒子は、磁場によって前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部の内壁に付着された状態を維持する。
【００９１】
また、第１除去段階（Ｓ１００）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記磁性粒子反応液と混合した混合物のうち前記磁性粒子以外の反応液を除去する。第１除去段階（Ｓ１００）で除去される反応液は、廃液筒４５０（図５参照）に排出されることができる。第１除去段階（Ｓ１００）が行われるにつれて、前記磁性粒子は前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬに残留する。
【００９２】
また、特定の単位ウェルへの磁性粒子が混合された反応液の注入段階（Ｓ８０）、第１磁場印加段階（Ｓ９０）、および第１除去段階（Ｓ１００）は、１回繰り返して行われてもよい。この場合、特定の単位ウェルへの磁性粒子が混合された反応液の注入段階（Ｓ８０）は、マルチウェルプレート４２０の単位ウェルＡに注入された磁性粒子反応液を前記特定の単位ウェルＬに注入する。次に、第１磁場印加段階（Ｓ９０）および第１除去段階（Ｓ１００）は、同じ方式で行われる。
【００９３】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルへの第２タンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）を有する。前記第２タンパク質発現物の注入段階（Ｓ１１０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記特定の単位ウェルＪのタンパク質発現物を前記特定単位ウェルＬに注入する。
【００９４】
図５および図８を参照すると、磁性粒子と第２タンパク質発現物とを混合した後、反応段階（Ｓ１２０）を有する。前記反応段階（Ｓ１２０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記特定の単位ウェルＬに注入された第２タンパク質発現物と磁性粒子が混合する。これにより、磁性粒子の表面にタンパク質発現物が結合する。
【００９５】
図５および図８を参照すると、第２磁場印加段階（Ｓ１３０）を有する。前記第２磁場印加段階（Ｓ１３０）では、前記磁石装着部７１０を上昇させて前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝に引き込まれるようにする。これにより、前記磁石装着部７１０に装着された磁石から前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場が印加される。
【００９６】
図５および図８を参照すると、第２除去段階（Ｓ１４０）を有する。前記第２除去段階（Ｓ１４０）は、第２磁場印加段階（Ｓ１３０）によって前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場が印加された状態で行われる。したがって、第２除去段階（Ｓ１３０）が行われる間に前記磁性粒子タンパク質発現物のうち磁性粒子および磁性粒子に結合したタンパク質は、磁場によって前記特定の単位ウェルＬの下部の内壁に付着された状態を維持する。
【００９７】
また、前記第２除去段階（Ｓ１４０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記磁性粒子タンパク質発現物のうち前記磁性粒子および磁性粒子に結合したタンパク質以外の混合物を除去する。第２除去段階（Ｓ１４０）で除去される混合物は、マルチウェルプレート４２０´の単位ウェルＫに排出されることができる。第２除去段階（Ｓ１４０）が行われるにつれて前記磁性粒子および磁性粒子に結合したタンパク質は、前記特定の単位ウェルＬに残留する。
【００９８】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルへの洗浄液を注入して洗浄する磁性粒子から標的タンパク質以外の不純物を分離する分離段階（Ｓ１５０）を有する。前記分離段階（Ｓ１５０）では、前記磁石装着部７１０が下降した状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いてマルチウェルプレート４２０の単位ウェルＢに注入された洗浄液を前記特定の単位ウェルＬに注入して混合し、前記磁性粒子から標的タンパク質以外の不純物を分離する。
【００９９】
図５および図８を参照すると、第３磁場印加段階（Ｓ１６０）を有する。前記第３磁場印加段階（Ｓ１６０）では、前記磁石装着部７１０を上昇させて前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝に引き込まれるようにする。これにより、前記磁石装着部７１０に装着された磁石７１１から前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場が印加される。
【０１００】
図５および図８を参照すると、第３除去段階（Ｓ１７０）を有する。前記第３除去段階（Ｓ１７０）は、前記第３磁場印加段階（Ｓ１６０）によって前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場が印加された状態で行われる。したがって、第３除去段階（Ｓ１７０）が行われる間に、前記洗浄液と混合した混合物のうち前記標的タンパク質が付着した磁性粒子は、磁場によって前記特定の単位ウェルＬの下部の内壁に付着された状態を維持する。
【０１０１】
また、前記第３除去段階（Ｓ１７０）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記洗浄液と混合した混合物のうち標的タンパク質が付着した磁性粒子以外の混合物を除去する。前記第３除去段階（Ｓ１７０）で除去される混合物は、マルチウェルプレート４２０´の単位ウェルＩに排出されることができる。第３除去段階（Ｓ１７０）が行われるにつれて、前記標的タンパク質が付着した前記磁性粒子は、前記特定の単位ウェルＬに残留する。
【０１０２】
前記特定の単位ウェルへの洗浄液を注入して洗浄する磁性粒子から標的タンパク質以外の不純物を分離する分離段階（Ｓ１５０）、第３磁場印加段階（Ｓ１６０）、および第３除去段階（Ｓ１７０）は、順に、数回繰り返して行われてもよく、第３段階（Ｓ１７０）で除去される混合物を前記廃液筒４５０に排出する。
【０１０３】
図５および図８を参照すると、特定の単位ウェルへのタンパク質溶出液を注入して標的タンパク質抽出する標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）を有する。前記標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）では、前記磁石装着部７１０が下降した状態で、前記ピペット１４１、１４２を用いてマルチウェルプレート４２０の単位ウェルＥに注入されたタンパク質溶出液を前記特定の単位ウェルＬに注入して混合し、前記磁性粒子から標的タンパク質を分離する。
【０１０４】
図５および図８を参照すると、第４磁場印加段階（Ｓ１９０）を有する。第４磁場印加段階（Ｓ１９０）は、特定の単位ウェルへのタンパク質溶出液を注入して標的タンパク質を抽出する標的タンパク質分離段階（Ｓ１８０）を行った後、所定時間が経過してから行われる。第４磁場印加段階（Ｓ１９０）では、前記磁石装着部７１０を上昇させて前記特定の単位ウェルＬの下部が前記単位ウェル引込溝に引き込まれるようにする。これにより、前記磁石装着部７１０に装着された磁石から前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場が印加される。
【０１０５】
図５および図８を参照すると、標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）を有する。前記標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）は、前記第４磁場印加段階（Ｓ１９０）によって前記特定の単位ウェルＬの下部に磁場が印加された状態で行われる。したがって、標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）が行われる間に前記磁性粒子から分離したタンパク質が含まれたタンパク質溶出液のうち前記磁性粒子は、磁場によって前記特定の単位ウェルである単位ウェルＬの下部の内壁に付着された状態を維持する。
【０１０６】
前記標的タンパク質含有溶液の取得段階（Ｓ２００）では、前記ピペット１４１、１４２を用いて前記磁性粒子から分離したタンパク質が含まれたタンパク質溶出液のうち前記磁性粒子以外の混合物である標的タンパク質含有溶液を前記ベースプレート４００に搭載されたタンパク質保管用チューブ４４２‐３に注入して保管する。
【０１０７】
（３）タンパク質合成キットを用いた実験の結果
前記実施例７の方法で本キットとＥｘｉＰｒｏｇｅｎＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）を用いて１６個の反応ウェルで同時にＧＦＰを合成したところ、図１１のような結果が得られる。具体的には、１０〜１２％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで確認した結果を示し、反応ウェル間の偏差がなくて同様なタンパク質に対して再現性のある合成効率が得られることを確認することができた。
【０１０８】
また、それぞれ異なる形態に作製された鋳型を用いて、それぞれ異なるタンパク質を合成したところ、図１２のような結果が得られた。
【符号の説明】
【０１０９】
１００…ピペットブロック、１１０…シリンジピンホルダ、１１２…案内ガイド、１２０…シリンジピン、１２０…シリンジピン、１３０…シリンジピン案内ブロック、１３１…シリンジピン案内孔、１３３…ピペット装着部、１３３‐１…連通孔、１３３‐２…密着リング、１３４…ピペット装着部、１３４‐１…連通孔、１３４‐２…密着リング、１４１…ピペット、１４２…ピペット、１５０…シリンジピン案内ブロック支持板、１５２…上下移動ナット、１６０…案内棒、１７１…シリンジピン調節モータ支持板、１７２…シリンジピン調節モータ、１７３…シリンジピン調節スクリュ、１８１…上部脱着板、１８２…脱着板、１８３…連結棒、１８４…突出棒、１８５…バネ、２００…固定本体、２３１…上下移動モータ、２３２…上下移動ベルト、２３３…上下移動スクリュ、２４１…前後移動スライダ、３００…ケーシング、３１０…前後移動支持棒、３１１…前後ガイダ、３５０…ドア、３２０…前後移動モータ、３３０…前後移動ベルト、３４０…紫外線ランプ、３６０…タッチスクリーン、４００…ベースプレート…、４０１…ハンドル、４２０´…マルチウェルプレート…、４２０…マルチウェルプレート…、４３０…ピペットラック、４４０…タンパク質保管用チューブラック、４５０…廃液筒、４４２‐１…細胞破砕液保管用チューブ、４４２‐３…タンパク質保管用チューブ…、７００…磁場印加部、７１０…磁石装着部…、７１１…磁石、７１３…単位ウェル引込溝…、７２０…磁石装着部支持台、７３０…ガイド棒…、７４０…ガイドブロック、７５０…引張バネ、７６０…昇降部、７６１…昇降モータ…、７６２…第１昇降軸、７６３…昇降カム…、７６４…第２昇降軸、７８０…高さ検知センサ…、７８１…センシング部、７８２…センシング標的部…、８１０…ヒート部、８１２…ヒート部固定板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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