(57)【要約】【課題】  アミノチアゾールＭｙＤ８８特異的阻害剤の製薬学的な使用を提供する。【解決手段】  本発明は、アミノチアゾールＭｙＤ８８特異的阻害剤の製薬学的な使用を提供するものであり、免疫抑制剤、抗炎症剤、虚血再かん流傷害後の保護剤、および内毒素血症および敗血症の予防薬を製剤する際に使用する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭｙＤ８８（骨髄分化タンパク質８８）のアミノチアゾール系特異的阻害剤であって、前記特異的阻害剤は免疫調節剤として作用すると共に、下記の化学式により表わされ、
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前記ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤は、臓器移植後の拒絶反応を減少させると共に、免疫寛容を誘導および維持するために、免疫抑制剤を含む薬剤を製剤するために使用され、
前記ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤は、慢性炎症の治療のための抗炎症剤として使用され、
前記ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤は、自己免疫疾患の治療のために、自己免疫薬剤の製剤のために使用され、
前記ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤は、虚血再かん流傷害の治療のための保護剤の製剤で使用され、
前記ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤は、内毒素血症および敗血症の予防のための予防薬の製剤で使用される
ことを特徴とするアミノチアゾール系特異的阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学および科学研究の分野における免疫促進剤としてのＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤を使用に関し、特に、抗移植拒絶反応、抗自己免疫疾患、抗虚血再かん流傷害、抗慢性炎症、および抗内毒素血症の治療でのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命体の免疫系の抑制的調節は、臓器移植による拒絶反応、自己免疫疾患、慢性炎症、虚血再かん流傷害などの複数の疾患を治療するのに重要な要素である。免疫系の調節は、様々な態様から開始することができる。研究のホットスポットとして、先天性免疫応答は、免疫学的な抑制を認識するのに優れた目標である。
【０００３】
臓器免疫応答には、先天的免疫性および後天的免疫性を含む。優れた特異的認識能力および高い有効応答結果により、後天的免疫性は常に、主要な研究対象および介在標的となっている。これまでの免疫応答は、後天的免疫系の第１刺激信号および第２刺激信号がＮＦ−κＢを活性し、活性ＮＦ−κＢは核に入り複写を開始して、細胞が様々な炎症性因子を合成および分泌するのを可能にすると共に、一連の免疫応答を刺激するものとして認識されている。現用の抗拒絶剤は、所望する免疫系に作用する。先天的免疫性は、ウィルスやバクテリア感染および異質な臓器の侵入に対する生命体の先天的な保護障壁と考えられている。最近の研究の殆どにおいて、先天的免疫系は移植免疫、自己免疫疾患、虚血性傷害などで重要な役割を果たすことが分かっている。先天的免疫系では、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が主な役割を果たしており、研究の焦点となっている。少なくとも１４セットのＴＬＲサブタイプが発見されており、これらのＴＬＲサブタイプセットは、ＡＰＣ免疫細胞などに殆ど分散させられる。全てのサブタイプセットは、ＴＬＲ３を除く信号を伝達するために、骨髄分化タンパク質８８（ＭｙＤ８８）を使用しなければならない。多くの研究によれば、様々な内因性および外因性の危険因子が先天性免疫系のＴＬＲ各々を活性化させるとともに、ＭｙＤ８８の鍵分子を介する信号伝達を促し、最終的にはＮＦ−κＢを活性化させる。続く免疫反応は、先のものと同様である。
【０００４】
要約すると、ＭｙＤ８８は先天性免疫において、鍵分子の中心点である。ＭｙＤ８８を阻止することは、先天性免疫系の主要な反応を阻止することであり、それにより対応する免疫抑制効果が生じる。薬剤がＭｙＤ８８に介入して阻止することができるとすると、ＴＬＲ経路の一次信号はこの薬剤によって阻止されてしまい、一連の免疫調節が形成され、これは免疫療法で最も良い構想の一つである。
【０００５】
多くの研究論文が発行されており、ＭｙＤ８８の重要性および治療効果を実証しているが、ＭｙＤ８８を阻止する薬剤は発見されていない。介入するＭｙＤ８８の遺伝子ノックアウトなどの他の方法を、臨床治療で適用することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、ＴＬＲ／ＭｙＤ８８に関する一連の重要な研究を行い、移植免疫でのＴＬＲの重要な役割を確かめ、ＭｙＤ８８分子の阻止が移植免疫の耐性誘発および維持を可能にすることを発見した。後の研究において、本発明者は薬剤学チームと共同し、ある種のＭｙＤ８８の特異的阻害剤、即ちアミノチアゾール系小分子化合物（ＴＪ−Ｍ２０１０と呼ぶ）を合成し、繰り返しスクリーニングを行った。この小分子化合物は、ＭｙＤ８８分子の重要な活性部位と特異的に結合することができるので、競合的な組み合わせを形成して、対応するＭｙＤ８８の信号伝達を阻止することができる。従って、ＭｙＤ８８の特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、抗移植拒絶反応、抗自己免疫疾患、抗虚血再かん流傷害、抗慢性炎症、および抗内毒素血症に適用可能である。このようにして、この小分子の適用が開始され、様々な関連する先天性免疫疾患を治療するために、この小分子を含む新しい薬剤が開発される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的の一つは、様々な免疫疾患を治療するべく、先天性免疫系においてＭｙＤ８８分子を抑制するために、ＭｙＤ８８の特異的阻害剤として機能するアミノチアゾール系小分子化合物のグループを提供することである。本発明の特定の技術的構想を達成するための基礎としては、先天性免疫系でのＭｙＤ８８分子の抑制作用により、アミノチアゾール系ＭｙＤ８８分子類似物が、抗移植拒絶反応、抗自己免疫疾患、抗虚血再かん流傷害、抗慢性炎症、および抗内毒素血症の治療に用いられる。
【０００８】
本明細書で言及するＭｙＤ８８タンパク質は、２つの構造的ドメイン、即ちｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ドメイン（ＴＩＲ）およびデスドメイン（ＤＤ）を含む。ＴＩＲドメインはＭｙＤ８８のホモ二量体化および下流側ＩＲＡＫ１またはＩＲＡＫ４の活性化のための材料ベースである。ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの位相構造の分析から、ＭｙＤ８８の特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０のグループが合成された。ＴＪ−Ｍ２０１０は、ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインと特異的に結合し、ＴＩＲドメインの機能に介入することが可能であることから、ＭｙＤ８８のホモ二量体化が抑制され、ＭｙＤ８８の活性が阻止され、ＭｙＤ８８変換経路が遮断され、ＮＦ−κＢの活性が不可能となり、炎症反応が阻止される。従って、ＭｙＤ８８の阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、関連する炎症および免疫疾患の治療において極めて重要である。
【０００９】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤（骨髄分化タンパク質８８）は、免疫調節剤として作用する特異的阻害剤であり、以下の化学式によって表わされる。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【００１０】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、小分子を有すると共に安定的な構造を備え、且つ細胞膜を貫通することができ、更にインビトロおよびインビボで適用が可能である。
【００１１】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、免疫抑制剤を含む薬剤を製剤するために、ＮＦ−κＢ阻害剤として使用される。
【００１２】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、臓器移植後に、拒絶反応を減少させると共に、免疫寛容を誘発し維持するために、免疫調節剤として使用される。
【００１３】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、慢性炎症腸疾患およびぜんそくなどの慢性炎症を治療するための免疫調製剤として使用される。
【００１４】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、エステマトーデスなどの自己免疫疾患を治療するための免疫調製剤として使用される。
【００１５】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、心筋梗塞、再植、移植後の虚血再かん流傷害の阻止など、虚血再かん流傷害の治療用免疫調製剤として使用されると共に、臓器保存液および細胞保存液の製剤に使用される。
【００１６】
ＭｙＤ８８のアミノチアゾール系特異的阻害剤は、内毒素血症および敗血症を防ぐための免疫調製剤として使用される。
【００１７】
本発明の有利な点としては、新しい化合物ＴＪ−Ｍ２０１０のグループがＭｙＤ８８特異的阻害剤の実験に適用され、且つ、抗移植拒絶反応、抗自己免疫疾患、抗虚血再かん流傷害、抗慢性炎症、および抗内毒素血症において明らかな効果を有する。新化合物ＴＪ−Ｍ２０１０は効果的な免疫抑制剤、免疫寛容誘発剤、免疫寛容維持剤、抗炎症剤、および免疫調製剤である。この新しい化合物は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を効果的に阻止すると共に、ＤＣ細胞（樹枝状細胞）の成熟を阻止することができる。ＤＣ細胞の成熟は、自己免疫性心筋炎、実験的自己免疫ブドウ膜炎症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、エリテマトーデスなどの様々な自己免疫疾患の重症段階の一つであることが判明している。ＭｙＤ８８の阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、このような疾患の治療に使用することができる。ＭｙＤ８８経路の阻害は、明らかに虚血性再かん流傷害の保護的機能を有することから、ＭｙＤ８８の阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、心筋梗塞、再植、移植後の虚血性再かん流傷害の阻止に使用することができ、また臓器保存剤、細胞保存剤、また他の態様で使用することができる。インビトロ実験の結果によれば、ＭｙＤ８８の阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、ＭｙＤ８８の経路を阻止することにより、移植組織の炎症性因子を効果的に低下させることが示されており、これは、ＭｙＤ８８阻害剤が炎症性因子と密接に関連し、ＭｙＤ８８阻害剤が様々な炎症性疾患を治療するための効果的な手段となり得ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】心臓同種移植片の生存曲線を示す図。
【図２】植皮片の生存曲線を示す図。
【図３】ＴＪ−Ｍ２０１０がＴ細胞の活性を低下させると共に、ＬＰＳおよびＣｐＧによって刺激される刺激分子ＣＤ８０の増加を阻止することを示す図。
【図４】ＴＪ−Ｍ２０１０が糖尿病の発生を低下させることを示す曲線図。
【図５】ＴＪ−Ｍ２０１０が被移植体のリンパ球サブセットに影響することを示すブロック図。
【図６】ＴＪ−Ｍ２０１０がマウスの腎臓ＩＲＩの生存率を向上させることを示す図。
【図７】ＴＪ−Ｍ２０１０がマウスの腎臓ＩＲＩの腎機能を保護することを示す図。
【図８】ＴＪ−Ｍ２０１０がＤＣ活性化を促すためのＣｐＧを減衰させる時のＴ細胞の増殖を示すグラフ。
【図９】実時間定量ＰＣＲ分析によりＴＪ−Ｍ２０１０が移植片の炎症因子を減少させることを示す図（ＩＬ−１β，ＴＮＦ−α，ＩＬ−６の三種類の炎症因子の相対レベル）。
【図１０】ＴＪ−Ｍ２０１０が肺炎モデルの炎症細胞の浸出を減少させることを示す図。
【図１１】ＴＪ−Ｍ２０１０が肺炎モデルの炎症因子の浸出を減少させることを示す図。
【図１２】内毒素および敗血症により生じる致死実験の生存曲線を示す図。
【００１９】
図１において、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ｂｌ／６は２種類のマウスである。Ｂａｌｂ／ｃからＣ５７ｂｌ／６への心臓移植は、一般コントロールグループ、ＣＭＣ溶媒コントロールグループ、およびＴＪ−Ｍ２０１０実験グループに分けられる。Ｃ５７ｂｌ／６からＣ５７ｂｌ／６への心臓移植は同種コントロールグループである。
【００２０】
図２は、同種異系植皮コントロールグループ（拒絶反応時間が８〜１０日であると報告されている）、単独ＴＪ−Ｍ２０１０グループ、単独ＭＲ１グループおよび混合試薬グループ（ＴＪ−Ｍ２０１０＋ＭＲ１）を含む。
【００２１】
図３（ａ）は、ＴＪ−Ｍ２０１０が用量依存的にＴ細胞の活性を減少させることを示す。図３（ｂ）は、ＴＪ−Ｍ２０１０がＬＰＳ、ＣｐＧおよび心筋組織のホモジネートによって刺激される刺激分子ＣＤ８０の増加を阻止することを示す。図３（ｃ）は、ＴＪ−Ｍ２０１０が用量依存的にＤＣ表面への刺激分子ＣＤ８０の発現を減少させることを示す。図３（ｄ）は、ＴＪ−Ｍ２０１０が用量定量的にマクロファージ表面への刺激分子ＣＤ８０の発現を減少させることを示す。
【００２２】
図４において、実験グループは、ＭｙＤ８８ＫＯ  ＮＯＤマウスのグループ、ＭｙＤ88ＫＯ／＋ＮＯＤマウスのグループ、ＴＪ−Ｍ２０１０＋ＮＯＤマウスのグループを含む。
【００２３】
図５は、異なる受容体グループ、（同系グループ、治療グループ、コントロールグループ）における脾臓リンパ球サブセットを示しており、結果として、ＴＪ−Ｍ２０１０治療グループにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔの細胞パーセントが顕著に増加する。
【００２４】
図６において、実験グループはＭＹＤ８８ＫＯ、ＴＪ−Ｍ２０１０、ＣＭＣ、コントロールグループを含み、各々８匹のマウスを有する。Ｉ／Ｒコントロールグループ、Ｉ／Ｒビークルコントロールグループ、Ｉ／ＲＴＪ−Ｍ２０１０実験グループ。
【００２５】
図１０（ａ）および図１０（ｂ）は、気管支の肺胞における細胞数および好中球枢夫々を表わす。
【００２６】
図１１（ａ）は、肺細胞におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性を表わし、図１１（ｂ）は、肺細胞におけるインターロイキン６の濃度を表わす。
【００２７】
図１２（ａ）は、内毒素によって生じる致死実験の生存曲線を表わし、図１２（ｂ）は、敗血症によって生じる致死実験の生存曲線を表わす。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２８】
抗移植拒絶反応におけるＴＪ−Ｍ２０１０の使用および免疫寛容の誘導
【００２９】
１）ＴＪ−Ｍ２０１０はマウスの心臓移植モデルに使用された。
【００３０】
実験は以下の４グループで行われた。
【００３１】
ブランクコントロールグループ（心臓移植を除き任意の治療を行わない）、ＣＭＣグループ（ビークルコントロールグループ）、同種移植片グループ（理論的に２つの遺伝子的に同一の個体間の移植は拒絶反応を伴わず、本グループは長期に亘り生存可能である）、およびＴＪ−Ｍ２０１０投与グループ（効果検出グループ）。各グループの特定の治療は以下のとおりである。
【００３２】
ブランクコントロールグループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの心臓はＣ５７ｂｌ／６マウスの腹腔に移植された。
【００３３】
ＣＭＣコントロールグループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの心臓はＣ５７ｂｌ／６マウスの腹腔に移植され、心臓移植の０から６日前に、２００μＬのＴＪ−Ｍ２０１０を含まないカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液（０．５％ＣＭＣ）が腹腔内注射により投与された。
【００３４】
同種移植片グループ：Ｃ５７ｂｌ／６マウスの心臓は遺伝子的に同一のＣ５７ｂｌ／６マウスの腹腔に移植された。手術後、特別な治療は行われなかった。
【００３５】
ＴＪ‐Ｍ２０１０投与グループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの心臓はＣ５７ｂｌ／６マウスの腹腔に移植された。心臓移植の０から６日前に、ＣＭＣに溶融したＴＪ−Ｍ２０１０が腹腔内注射により投与され、その投与量は１５０ｍｇ／ｋｇであった。
【００３６】
実験結果を、（図１に示す）生存曲線グラフに示す。ブランクコントロールグループの拒絶反応期間は、基本的に報告された文献と同じで、約８日間であった。ＣＭＣコントロールグループには差がなかった。同種移植片グループは長期間生存し、ＴＪ−Ｍ２０１０投与グループの心臓移植の平均生存期間は約２０日間であり、これはコントロールグループよりも明らかに長い。
【００３７】
２）共刺激分子（抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（ＭＲ１））と組み合わせたＴＪ−Ｍ２０１０阻害剤は、マウスの皮膚移植モデルに使用された。
【００３８】
実験には５つのグループを用いた。同種皮膚移植コントロールグループ（文献で報告された拒絶反応期間は８から１０日間であった）、同系皮膚移植コントロールグループ、ＴＪ−Ｍ２０１０単独投与グループ、ＭＲ１単独投与グループ、およびＴＪ−Ｍ２０１０＋ＭＲ１投与グループ。
【００３９】
特定の治療は以下のとおりであった。
【００４０】
同種皮膚移植コントロールグループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮膚はＣ５７ｂｌ／６マウスの背中に移植された。手術後０〜３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、および１５日目に、０．５％のＣＭＣが腹部注射により投与され、その投与量は各日につき２００μＬであった。
【００４１】
同系皮膚移植コントロールグループ：Ｃ５７ｂｌ／６マウスの皮膚はＣ５７ｂｌ／６マウスの背中に移植され、手術後、特別な治療は行わなかった。
【００４２】
ＴＪ−Ｍ２０１０単独投与グループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮膚はＣ５７ｂｌ／６マウスの背中に移植された。０．５％のＣＭＣに溶解したＴＪ−Ｍ２０１０は、手術後０から３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、および１５日目に、腹部注射により投与され、その投与量は１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。
【００４３】
ＭＲ１単独投与グループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮膚はＣ５７ｂｌ／６マウスの背中に移植された。ＭＲ１は、手術後０日目、１日目、３日目、７日目、および１４日目に、腹部注射により投与され、その投与量は各日につき２００μｇ／日であった。
【００４４】
ＴＪ−Ｍ２０１０＋ＭＲ１投与グループ：Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮膚はＣ５７ｂｌ／６マウスの背中に移植された。０．５％のＣＭＣに溶解したＴＪ−Ｍ２０１０は、手術後０〜３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、および１５日目に、腹部注射により投与され、その投与量は１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。一方、ＭＲ１は、手術後０〜３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、および１５日目に腹部注射により投与され、その投与量は各日につき２００μｇ／日であった。
【００４５】
実験結果を、（図２に示す）生存曲線グラフに示す。同種皮膚移植コントロールグループでは、皮膚移植の拒絶反応期間は、報告された文献のものと略同じで、約１０日であった。
【００４６】
ＴＪ−Ｍ２０１０単独投与グループおよびＭＲ１単独投与グループの皮膚移植拒絶反応期間は約１０日であり、統計的な差はなかった。皮膚移植後のＴＪ−Ｍ２０１０＋ＭＲ１投与グループにおいて皮膚移植の生存期間は約１５０日であった（文献では、１００日よりも長い生存期間は免疫寛容を示すことについて言及していた）。
【００４７】
従って、ＴＪ−Ｍ２０１０およびＭＲ１の単独使用は、皮膚移植の免疫寛容誘導に顕著な作用をもたらさないが、ＴＪ‐Ｍ２０１０およびＭＲ１を組み合わせて使用すると、顕著な作用をもたらし、免疫寛容を誘導するのが困難であった皮膚移植が、長期に亘り生存するのを可能にした。
【００４８】
実験結果から、ＭｙＤ８８阻害剤は、移植後の抗拒絶反応および免疫寛容の誘導に明らかな効果をもたらし、特別な免疫抑制剤、免疫寛容誘導剤（短期間の投与が、皮膚移植の免疫寛容を誘導するのが困難であった移植グループの長期生存に貢献した）、または免疫寛容維持剤（ウィルス感染により引き起こされる拒絶反応に対する寛容など）として作用した。その特別な機能は、現在使用されている免疫抑制剤と置き換えることが不可能である。
【実施例２】
【００４９】
自己免疫疾患の治療におけるＭｙＤ８８阻害剤の使用
【００５０】
フローサイトメトリからのインビトロの実験結果によれば、ＭｙＤ８８阻害剤は、自己免疫疾患の治療のために、ＤＣ細胞の成熟を阻止できた。
【００５１】
インビトロ実験は以下の工程を含む。１．ＴＪ−Ｍ２０１０はＢＡＬＢ／ｃマウスからの骨髄細胞に投与された。骨髄細胞膜は破壊された。次に、骨髄細胞は（１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を加えた）ＲＰＭＩ１６４０媒体で培養され、骨髄細胞濃度は２×１０  ６／ＭＬに制御された。
【００５２】
２．細胞は４８時間培養され、懸濁細胞は除去された。６日目に、懸濁細胞および半接着細胞が回収された。
【００５３】
３．ＤＣ細胞は５０ｍＭのＴＪ−Ｍ２０１０に加えられ、１時間培養された。次に、媒体には、壊死心筋の上清、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２０ｍｇ／ｍＬ）およびＣｐＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）が加えられ、１２時間培養された。
【００５４】
４．フロー抗体ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８０、ＣＤ８６が、検査のために加えられた。
【００５５】
ＴＪ−Ｍ２０１０は、ＴＬＲ刺激（ＬＰＳ，ＣｐＧ）により生じるＲＡＷ２６４．７細胞内における共刺激分子ＣＤ８０の増加を阻害した。従って、ＴＪ−Ｍ２０１０はＴＬＲシグナル伝達経路を効果的に遮断し、細胞の免疫反応を阻止した。
【００５６】
図３（ｃ）および図３（ｄ）の実験プロセスは以下のとおりであった。
【００５７】
Ｒａｗ２６４．７：４８ウェルプレート、細胞数は９＊１０５／ウェルであった。各ウェルには１ｍＬの培養系が加えられた。様々な濃度のＴＪ−Ｍ２０１０が加えられ、細胞は２時間前培養された。次にＣＰＧが加えられた。最終濃度は４０μｇ／ｍＬであった。細胞はＣＯ２培養器内において、３７℃の温度で１２時間培養された。フロー抗体ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８０およびＣＤ８６が、検査のために加えられた。
【００５８】
ＤＣ：４８ウェルプレート、細胞数は１＊１０６／ウェルであった。各ウェルには１ｍＬの培養系が加えられた。様々な濃度のＴＪ−Ｍ２０１０が加えられ、細胞は２時間前培養された。次に、ＬＰＳが加えられた。最終濃度は１μｇ／ｍＬであった。細胞は、ＣＯ２培養器内において、３７℃の温度で１２時間培養された。フロー抗体ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８０およびＣＤ８６が、検査のために加えられた、図３（ｂ）および図３（ｃ）から、ＴＪ−Ｍ２０１０はＤＣ細胞の発現への阻害効果があり、小食細胞の細胞表面ＣＤ８０は一定範囲の濃度と相互に関連することが分かった。
【００５９】
図３は、ＬＰＳおよびＣｐＧによって活性される共刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６の増加に対するＴＪ−Ｍ２０１０の阻害を示す。
【００６０】
上記検査結果によれば、ＭｙＤ８８はＣＤ８０の発現を低下させると共に、ＤＣ細胞の成熟を阻害することができることを示す。ＤＣ細胞の成熟は、自己免疫性心筋症、実験的自己免疫ブドウ膜炎症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、エリテマトーデスに至る重大な段階の一つであることが分かっている。従って、ＭｙＤ８８はこれらの疾患の治療を可能にした。
【００６１】
インビトロ実験−本発明でもたらされるＭｙＤ８８−／−およびＴＪ−Ｍ２０１０のＩ型糖尿病モデル設定への影響
【００６２】
インビトロ実験は以下の工程を含む。
【００６３】
１．実験グループ：ＭｙＤ８８ＫＯ  ＮＯＤマウス、ＭｙＤ８８ＫＯ／＋ＮＯＤマウス、ＴＪ−Ｍ２０１０投与ＮＤＯマウス
【００６４】
２．ＴＪ−Ｍ２０１０投与ＮＯＤマウス：０．５％のＣＭＣに溶解したＴＪ‐Ｍ２０１０が腹腔内に０〜３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目に注射される１日前に、抗原が注射され、その投与量は１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。
【００６５】
３．各グループにはマイコバクテリア抗原が注射され、その濃度が連続的に監視された。
【００６６】
４．各グループにはクリアーグレードで、３０週間供給された。その後、尾の静脈血が空ではない腹部から回収され、血糖が２度連続して検査された。糖尿病モデルの標準は、両方の血糖≧２２ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００６７】
Ｉ型糖尿病の発症曲線グラフを図４に示す。
【００６８】
結果として、ＭｙＤ８８ヘテロ接合グループについて、Ｉ型糖尿病の発生は、時間の経過とともに増加した。ＭｙＤ８８ＫＯホモ接合グループでは、Ｉ型糖尿病は発生しなかった。ＴＪ−Ｍ２０１０グループのＩ型糖尿病の発生は、ＭｙＤ８８ＫＯホモ接合グループと同等であった。従って、ＭｙＤ８８経路は、Ｉ型糖尿病と密接に関連した。ＭｙＤ８８経路を遮断することは、糖尿病の発生を減少させることであるから、ＭｙＤ８８ＴＪ−Ｍ２０１０小分子阻害剤は、Ｉ型糖尿病の治療に効果的であった。
【実施例３】
【００６９】
虚血再かん流傷害の予防及び治療でのＭｙＤ８８阻害剤の使用
【００７０】
インビトロ実験：フローサイトメトリを使用することにより、（同系および同種）抗原により刺激された移植体の脾臓でのリンパ球サブセットの分析、およびＴＪ−Ｍ２０１０を投与された移植体の生体内部でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の分析
【００７１】
インビトロ実験は、以下の工程を含むものであった。
【００７２】
１．様々なグループ（同系および同種）の移植体の脾臓はすりつぶされ、リンパ球が分離させられた。
【００７３】
２．フロー抗体ＡＰＣ標識ＩＦＮ−γ、ＡＰＣ標識ＩＬ−１７、ＡＰＣ標識ＣＤ２５、ＰＥ標識Ｆｏｘｐ３が、フローサイトメトリに加えられた。
【００７４】
３．（同系および同種）抗原により刺激された移植体の脾臓のリンパ球サブセット、およびＴＪ−Ｍ２０１０が投与された移植体の生体内部のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の比が、フローサイトメトリを使用して分析された。
【００７５】
図５に示すように、ＴＪ−Ｍ２０１０が投与された移植体の生体内部のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の比は明らかに増加したが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７のレベルは、ＣＭＣコントロールグループのものよりもかなり低かった。
【００７６】
ＭｙＤ８８阻害剤ＴＪ‐Ｍ２０１０の投与後、抗原（同系および同種）により刺激された移植体の脾臓におけるリンパ球サブセットの分析、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の比によれば、ＴＪ−Ｍ２０１０の使用によりＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の比が増加して、移植マウスの免疫寛容状態が変化した。多くの文献によれば、免疫抑制作用により、制御性Ｔ細胞は炎症の進行、炎症因子および前炎症因子の除去、ならびに虚血再かん流サイトカインの架橋を制御することができるので、結果的に傷害に至る。従って、ＴＪ−Ｍ２０１０の使用は、ＴＬＲ信号を阻害し、ＮＦ−κＢを活性から阻止し、炎症因子（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７）の発現を低減させて、傷害の軽減を可能にする。
【００７７】
インビボ実験：腎臓の虚血再かん流傷害を軽減させるためのＭｙＤ８８経路の遮断
【００７８】
インビボ実験は以下の工程を含むものであった。
【００７９】
１．実験は以下のグループを含む：一般的なＣ５７ｂｌ／６グループ、ＣＭＣビークルグループ、ＭＹＤ８８ＫＯグループ、およびＴＪ−Ｍ２０１０グループ。各グループは、虚血再かん流により治療された８匹のマウスを有する。各マウスには麻酔薬が投与され、左側の腎臓が血管クランプにより遮断され、３１℃の温度で８０分間サーモスタットで保存された。その後、血管クランプが取り除かれ、右側の腎臓が除去され、更に腹部が縫合された。血液は２４時間回収され、ＢＵＮおよびＣｒ検出が行われた。
【００８０】
２．ＴＪ−Ｍ２０１０グループおよびＣＭＣグループ：０．５％のＣＭＣに溶解したＴＪ−Ｍ２０１０は、手術当日および手術前日夫々に、腹腔内注射により投与され、投与量は１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。ＣＭＣグループには、０．５％のＣＭＣ溶液２００μＬが投与された。
【００８１】
３．マウスの生存期間が観察され、生存曲線が図に記された。血液試料が回収され、ＢＵＮおよびＣｒ検出が行われた。
【００８２】
４．実験結果によれば、腎臓のＩＲＩ後に、ＴＪ−Ｍ２０１０はマウスの生存率を著しく高め、腎臓の機能に優れた保護作用をもたらした。
【００８３】
結果を図６および図７に示す。
【００８４】
ＭｙＤ８８経路の遮断は、虚血再かん流傷害に明らかな保護作用をもたらしたことから、ＭｙＤ８８の阻害剤は、移植者を心筋梗塞、再植および移植後の虚血再かん流傷害から防ぐ際に、また臓器保存溶液、細胞保存溶液、および他の態様において適用可能であった。
【実施例４】
【００８５】
慢性炎症の治療におけるＭｙＤ８８阻害剤の使用
【００８６】
インビトロ実験：ＣｐＧを抑制することによりＤＣ細胞の活性を弱める際の、ＴＪ−Ｍ２０１０の作用下での、移植体のＴ細胞の増殖および炎症因子の実時間定量ＰＣＲ分析
【００８７】
インビトロ実験は以下の工程を含むものであった。
【００８８】
１．Ｂａｌｂ／ｃマウスの大腿骨が提供され、骨髄細胞が分離されてＧＭＳ−ＣＳＦおよびＩＬ−４サイトカインに加えられ、骨髄派生ＤＣが培養された。
【００８９】
２．骨髄派生ＤＣ細胞は６日間培養された。その後、細胞は破砕され、未熟なＤＣ細胞が分離された。遠心分離機にかけられ、次に細胞は媒体１６４０に再懸濁された。
【００９０】
３．マイトマイシンが加えられた（最終濃度は５０μｇ／ｍＬに制御された）。次に媒体１６４０は３７℃の水槽で１５分間処理された。その後、媒体１６４０は再度洗浄され、細胞が計数された。
【００９１】
４．Ｃ５７ｂｌ／６マウスの脾臓が回収され、リンパ球分離媒体を用いてリンパ球が分離され、計数された。
【００９２】
５．Ｃ５７ｂｌ／６マウスの脾臓のリンパ球はＣＦＳＥを用いて標識が付された。
【００９３】
６．Ｂａｌｂ／ＣマウスからのＤＣ細胞およびＣ５７ｂｌ／６マウスの脾臓のリンパ球には、混合リンパ球培養が行われた。グループは以下のとおりに分けられた。
【００９４】
ブランクグループ：ＣＰＧおよびＴＪ−Ｍ２０１０のいずれも、混合リンパ球培養の間に、媒体に加えられなかった。
【００９５】
コントロールグループ：混合リンパ球培養の間に、媒体にＣＰＧが加えられたがＴＪ−Ｍ２０１０は加えられなかった。
【００９６】
実験グループ１：ＣＰＧおよびＴＪ−Ｍ２０１０の両方が、混合リンパ球培養の間に、媒体に加えられ、ＴＪ−Ｍ２０１０の投与量は１０μＭであった。
【００９７】
実験グループ２：ＣＰＧおよびＴＪ−Ｍ２０１０の両方が、混合リンパ球培養の間に、媒体に加えられ、ＴＪ−Ｍ２０１０の投与量は２０μＭであった。
【００９８】
実験グループ３：ＣＰＧおよびＴＪ―Ｍ２０１０の両方が、混合リンパ球培養の間に、媒体に加えられ、ＴＪ−Ｍ２０１０の投与量は４０μＭであった。
【００９９】
１．混合リンパ球培養は３日目まで培養され、細胞が回収され、且つＣ５７ｂｌ／６マウスのリンパ球増殖がフローサイトメトリを用いて検出された。
【０１００】
フローサイトメトリの結果を図７に示す。
【０１０１】
結果から、ＴＪ−Ｍ２０１０の投与量の増加に伴い、（表面にＣＤ４４の標識が付された）Ｔ細胞の増殖が低下することが分かった。
【０１０２】
実験結果によれば、ＴＪ−Ｍ２０１０は、ＣｐＧを弱体化させることによりＤＣ細胞の活性を阻害して、Ｔ細胞の増殖を抑制することが可能であった。
【０１０３】
実時間定量ＰＣＲは以下の工程を含むものであった。１．ＴＲＩｚｏｌ法により、（同系および同種）抗原により刺激された受容体からＲＮＡ全体が抽出された。
【０１０４】
２．ＲＡＮ全体はｃＤＮＡに逆転写され、２段階のＲＴ−ＰＣＲが行われた。
【０１０５】
３．標準曲線がグラフに記され、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６の相対レベルが得られた。
【０１０６】
移植体の炎症因子（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）の実時間定量ＰＣＲ分析を図９に示す。
【０１０７】
実験結果によれば、ＴＪ−Ｍ２０１０グループにおいて、心臓移植後の移植体の炎症因子のレベルは、コントロールグループよりも著しく低く、また統計学的に著しい差が生じた。
【０１０８】
インビトロ実験から、ＭｙＤ８８の阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は、対応する経路を阻害することにより、移植後に移植体の炎症因子を効果的に低下させた（ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のレベルはＣＭＣ同種移植グループよりも著しく低かった）。つまり、ＭｙＤ８８の阻害剤ＴＪ−Ｍ２０１０は移植体の炎症因子と密接に関連しており、従って、様々な炎症疾患を治療するのに有効な方法となり得る。
【０１０９】
インビトロ実験：気管支炎症反応を低下させるためのＭｙＤ８８経路の遮断
【０１１０】
インビトロ実験は以下の工程を含むものであった。
【０１１１】
１．動物は以下のグループに分けられた。Ｃ５７ｂｌ／６（Ｂ６）ＮａＣｌグループ（点鼻により２００ｍＬの投与量が投与された）、Ｃ５７ｂｌ／６（Ｂ６）ＢＬＭグループ、ＴＪ−Ｍ２０１０ＢＬＭグループ（０．５％のＣＭＣに溶解したＴＪ−Ｍ２０１０が０〜３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目に腹腔内注射され、その投与量は１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄであった）。
【０１１２】
２．ＢＬＭ（ブレオマイシン）の点鼻による肺炎モデル設定：気管麻酔がケタミンキシラジン４０μＬを用いて行われ、ＢＬＭ硫酸塩が点鼻により投与された（投与量は３００μｇまたは１５ｍｇ／ｋｇであった）。
【０１１３】
３．細胞およびサイトカインが気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）により回収された：気管支が開放され、プラスチック製スリーブが挿入されて、３７℃の温度の０．３ｍＬのＰＢＳにより洗浄が行われた。その後、洗浄溶液は抽出（洗浄溶液の９５％以上が抽出）され、抽出は１０回繰り返された。洗浄溶液は２つの部分に分けられた：一方の部分はサイトカインの検出に用いられ（６００ｇの洗浄溶液が１０分間遠心分離機にかけられ、上清が検出のために−８０℃の温度で保存された）、他方の部分は（４℃の温度での再懸濁のためにより下層の０．４ｍＬと合わせて）細胞計数に用いられた。
【０１１４】
４．肺ホモジネートでの細胞およびサイトカイン検出：ＢＡＬ後、肺全体が回収され、すり潰され、遠心分離機にかけられた。ＭＰＯ検出のために、上清が回収され、−８０℃の温度で保存された。
【０１１５】
５．肺ＭＰＯ活性検出：右側の心臓から肺を完全に洗浄するために、塩水が使用された。肺は均質化され、上清が分離された。１ｍＬのＰＢＳ（０．５％のＨＴＡＢおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含む）が再懸濁および沈降のために加えられた。結果的に得られた混合物は再度遠心分離機にかけられ、５０μＬの上清が試験管に移され（２００μＬのＰＢＳ−ＨＴＡＢ−ＥＤＴＡ，２ｍＬのＨＢＳＳ、濃度が１．２５ｍｇ／ｍＬである１００μＬのＯジアニシジン二塩酸塩、１００μＬの０．０５％のＨ２Ｏ２）、１５分間維持された。試験管は次に３７℃の温度の渦槽に移され、１００μＬの１％のＮａＮ３を用いて、反応が停止され、４６０ｎｍのＭＰＯ吸収値が検出された。
【０１１６】
６．細胞計数：ＭＧ−１Ｌを用いて４分間染色が行われ、９５％のＧＳ−５００で８分間行われ、細胞が染色されて計数された。
【０１１７】
７．サイトカイン検出：ＩＬ−６レベルがＥＬＩＳＡにより検出された。
【０１１８】
８．統計的分析：統計的差異のＵテストおよび分析
【０１１９】
図９に示すとおり、集積した好中球およびリンパ球のレベルは、ＭＹＤ８８−／−マウスの気管支炎の間に減少した。
【０１２０】
実験グループ：Ｂ６ＮａＣＬグループ、Ｂ６ＢＬＭグループ、およびＴＪ−Ｍ２０１０ＢＬＭグループ。各グループには４匹のマウスを含む。
【０１２１】
集積した好中球は、ＴＪ−Ｍ２０１０の気管支肺胞で著しく減少した。
【０１２２】
（ａ）に示すとおり、１日目、７日目、および１１日目の総細胞は、ＷＴマウスグループおよびＴＪ−２０１０ＢＬＭグループには統計的な差異が存在した。
【０１２３】
（ｂ）に示すとおり、ＷＴマウスの気管支肺胞での好中球数は２４時間でピーク値に達し、７日間継続し、更に１１日目で戻ったが、ＴＪ−Ｍ２０１０グループの気管支肺胞での好中球数は明らかに減少した。
【０１２４】
図１１に示すとおり、ＢＬＭ誘導の肺炎の症状は、炎症細胞および炎症因子の減少により示すとおり、ＴＪ−Ｍ２０１０ＢＬＭグループでは軽減された。
【０１２５】
図１１（ａ）に示すとおり、肺組織のＭＰＯ因子のレベル（７日目に検出された）は低下した。
【０１２６】
図１１（ｂ）に示すとおり、肺組織のＩＬ−６のレベル（２４時間目に検出された）は低下した。
【０１２７】
炎症細胞の集積および炎症因子の放出の実験結果から、ＢＬＭ誘導の肺炎の症状は、ＴＪ−Ｍ２０１０ＢＬＭグループでは著しく軽減されたことから、ＴＪ−Ｍ２０１０の抗炎症作用が示された。
【実施例５】
【０１２８】
内毒素血症および敗血症の治療へのＭｙＤ８８阻害剤の使用
【０１２９】
パート１：内毒素血症のマウスでの死亡率へのＭｙＤ８８阻害剤の影響の観察。マウスは無作為に２つのグループ、ビークルコントロールグループおよびＴＪ−Ｍ２０１０治療グループに分けられた。各グループには２０匹のマウスを含む。ＴＪ−Ｍ２０１０治療グループのマウスはＴＪ−Ｍ２０１０（０．５％のＣＭＣ、２５ｍｇ／ｍＬ）が胃内投与され、ＴＪ−Ｍ２０１０の投与量は２５０ｍｇ／ｋｇ（各々２００μＬ）に制御された。ビークルコントロールグループのマウスには０．５％のＣＭＣ（各々２００μＬ）が投与された。各マウスは一日に一回投与され、３日間連続投与された。胃内投与後３日目に、ＬＰＳが腹腔内注射され、マウスの生存が１２時間毎に観察され、連続して３日間観察された。生存曲線グラフを図１２（ａ）に示す。
【０１３０】
図１２（ａ）に示すとおり、ＭｙＤ８８の２つの阻害剤は、内毒素血症による死亡を効果的に遅らせることが可能であり、内毒素血症による死亡率を低下させた。
【０１３１】
パート２：敗血症のマウスの死亡率へのＭｙＤ８８の阻害剤の影響の観察。マウスは無作為に擬似手術グループ、モデリンググループ、ＭｙＤ８８阻害剤治療グループに分けられた。擬似手術グループに開腹縫合が行われたのを除き、モデリンググループおよびＭｙＤ８８阻害剤治療グループに盲腸結紮および穿孔手術（ＣＬＰ）が行われると共に敗血症マウス設定が複製された。手術１時間後に、２００μＬの０．５％のＣＭＣまたは２５０ｍｇ／ｋｇ（２００μＬ）のＴＪ−Ｍ２０１０が１２時間毎に投与され、連続４回投与された。マウスの生存状態が１２時間毎に観察され、連続７２時間の観察が行われた。生存曲線グラフを図１２（ｂ）に示す。
【０１３２】
図１２（ｂ）に示すとおり、ＭｙＤ８８の阻害剤は、敗血症マウスの生存期間の長期化および死亡率の低下を明らかに改善した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【国際調査報告】
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