(57)【要約】  本発明は、加齢に伴う機能障害の処置又は予防のためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
加齢に伴う機能障害の処置又は予防に使用するためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体。
【請求項２】
前記アゴニストがアペリンである、請求項１記載の使用のためのＡＰＪレセプターアゴニスト。
【請求項３】
加齢に伴う機能障害が筋肉減少症である、請求項１又は２記載の使用のためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体。
【請求項４】
患者から得られたサンプルにおけるアペリンの発現を検出することからなる工程を含む、患者が加齢に伴う機能障害に罹患する能力をエクスビボにおいて予測するための方法。
【請求項５】
前記アペリン発現が閾値と比較される、請求項４記載のエクスビボにおける方法。
【請求項６】
前記サンプルが血漿である、請求項４又は５記載のエクスビボにおける方法。
【請求項７】
加齢に伴う機能障害の処置の必要な被験者に、治療有効量のＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体を投与することを含む、加齢に伴う機能障害を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、加齢に伴う機能障害の処置又は予防に使用するためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体に関する。
【０００２】
発明の背景：
加齢に関連した機能障害は、加齢に関連したヒト臓器の機能低下として定義することができる。多くの機能障害が脳に出現し得、そして一部の変性疾患の原因となり得るが、また筋肉にも出現し得る。この場合、その筋肉の機能障害を有する人々は筋肉減少症に苦しむ。
【０００３】
筋肉減少症は、筋肉量、筋力及び筋機能の加齢に関連した低下として定義することができる（Waters, Baumgartner & Garry 2000; Vandervoort & Symons 2001）。筋肉減少症が存在しているということができる具体的なレベルの除脂肪体重又は筋肉量はないが（Roubenoff 2001）、筋肉量と筋力との間には強い関係が存在するので筋肉量のどのような減少も重要である（Roth, Ferrell & Hurley 2000）。筋肉減少症は４０代で始まるようであり、そして約７５歳以後に加速する（Waters, Baumgartner & Garry 2000）。加齢及び運動不足により、大半の萎縮症が、高負荷の嫌気的運動中に動員される速筋（ＦＴ）線維に見られる。筋肉減少症は殆どが運動不足の個体に見られるが、その一生を通じてよく運動し続けている個体でも明瞭に認められる。この所見は、運動不足が、筋肉減少症の唯一の要因ではないことを示唆する。現在の研究は、筋肉減少症の発症が多因子プロセスであるということを見つけている。多くの因子（運動不足、運動単位リモデリング、ホルモンレベルの低下、及びタンパク質合成の減少を含む）の全てが筋肉減少症の一因となり得る。
【０００４】
筋肉減少症は、適切な運動介入により部分的に元に戻すことができるが、独創的な筋肉減少症の処置を見つける必要がある。
【０００５】
アペリンは、遍在的に発現されているＧタンパク質共役レセプターであるＡＰＪの内因性リガンドとして同定されたペプチドである（Tatemoto K, Hosoya M, Habata Y, Fujii R, Kakegawa T, Zou MX, Kawamata Y, Fukusumi S, Hinuma S, Kitada C, Kurokawa T, Onda H, Fujino M. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor. Biochem Biophys Res Commun. Oct 251(2):471-6. 1998）。アペリンは、７７−アミノ酸プレプロペプチドとして合成され、これは種々のフラグメント（アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１３、及びＮ末端グルタミン酸から、酵素的分解を防ぎ従って生物学的活性を保存するピログルタミン酸への変換を伴う翻訳後［Ｐｙｒ１］アペリン−１３を含む）へと切断される（Tatemoto K, Hosoya M, Habata Y, Fujii R, Kakegawa T, Zou MX, Kawamata Y, Fukusumi S, Hinuma S, Kitada C, Kurokawa T, Onda H, Fujino M. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor. Biochem Biophys Res Commun. Oct 251(2):471-6. 1998）。脂肪細胞により分泌される因子として判明する以前（Boucher et al, Endocrinology, 2005）、アペリンは、心血管機能、免疫機能及び胃腸機能の調節などの種々の組織におけるいくつかの中枢作用及び末梢作用を奏功するだけではなく、体液の恒常性、血管生合成、種々の細胞型の増殖及び胚発生も奏功することが知られていた（例えば、米国特許第２００８／０１８２７７９号、米国特許第２０１０／０２２１２５５号又は米国特許第２００５／００７５２７５号を参照）。しなしながら、加齢に伴う機能障害におけるその役割はまだ同定されていなかった。
【０００６】
発明の要約：
本発明者らは、アペリンが、エネルギー代謝、特にミトコンドリアにおけるエネルギー機序において役割を果たすことを示す。本発明者らは、アペリンによる処置が、インシュリン耐性マウスの筋肉において、完全な脂肪酸酸化（ＦＡＯ）、グルコース輸送、ミトコンドリア酸化能及びミトコンドリア生合成を増加させることを示す。さらに、本発明者らは、骨格筋がアペリン作用にとっての主要な組織標的のように見えることを示し、その場所で増加した燃料の消費を媒介する。従って、アペリンは、ミトコンドリアにおけるエネルギー機序の問題に関連した疾病に使用することができる。
【０００７】
アペリンＫＯマウス及びアペリンによって慢性的に処置された野生型マウスを使用して、本発明者らは、ミオスタチン及びミオゲニンのような筋肉減少症のマーカーが、それぞれ老齢マウスにおいてダウンレギュレーション又はアップレギュレーションされたことを同定した。従って、アペリンを、加齢に伴う機能障害、特に筋肉減少症を処置するために使用するべきである。
【０００８】
この観点から、アペリンは、筋肉又は他のミトコンドリアの変化した組織（心臓、脳など）のミトコンドリアにおけるエネルギー機序を改善することに寄与することができ、従って、欠損筋肉及び脆弱な筋肉又は他の加齢に伴う欠損組織の動作を改善するように寄与することができる。従って、アペリンは、筋肉減少症の処置又は予防に、あるいは脆弱化症候群の処置又は予防に使用され得る。アペリンは又はッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群としても知られる早老症の処置又は予防にも使用され得る。
【０００９】
従って、本発明の第１の目的は、加齢に伴う機能障害の処置又は予防に使用するためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体に関する。
【００１０】
本発明の別の目的は、患者から得られたサンプル中におけるアペリンの発現を検出することからなる工程を含む、患者が加齢に伴う機能障害に罹患する能力をex vivoにおいて予測するための方法に関する。
【００１１】
発明の詳細な説明：
ＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体及びその使用
本発明の第１の目的は、加齢に伴う機能障害の処置又は予防に使用するためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体に関する。
【００１２】
本明細書において使用する「加齢に伴う機能障害」という用語は、代謝機能障害に至り、高齢者に観察されそして加齢と共に増加し、筋肉量の減少（筋肉減少症）、心臓効力の低下、神経変性などの加齢に関連した疾病に至る、ミトコンドリアの変化（数及び／又は機能）を示す。
【００１３】
好ましい態様において、加齢に伴う機能障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病もしくはハンチントン病のような脳の機能障害、又は筋肉の機能障害であり得る。
【００１４】
別の好ましい態様において、筋肉の機能障害は、骨格筋の機能障害、又は慢性もしくは急性の心不全のような心筋の機能障害であり得る。
【００１５】
さらに別の好ましい態様において、本発明による化合物は、筋肉減少症の処置のために使用される。
【００１６】
さらに別の好ましい態様において、本発明による化合物は、虚弱症候群の処置又は予防のために使用される。さらに別の好ましい態様において、本発明による化合物は、早老症の処置又は予防に使用される。
【００１７】
「ＡＰＪレセプター」という用語は、O'Dowd et al. (O'Dowd et al, 1993, Gene 136: 355360)によって最初に同定されたアペリンのレセプターを意味する。
【００１８】
本明細書において使用する「ＡＰＪレセプターアゴニスト」という用語は、ＡＰＪレセプター機能を促進することのできる、天然又は非天然の任意の化合物を指す。本発明のＡＰＪレセプターアゴニストの例としては、ポリペプチド、抗体、アプタマー及び有機小分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００１９】
ＡＰＪレセプターに対する試験化合物のアゴニスト活性は、当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。例えば、本発明のアゴニストは、ＡＰＪレセプターの機能を促進することができるので、アゴニストを、ＡＰＪレセプターの天然アゴニスト（すなわちアペリン）及びそのレセプターを使用してスクリーニングすることができる。典型的には、本発明のアゴニストは、ＡＰＪレセプターの機能を促進する物質をスクリーニングする方法を使用して得ることができ、これは、（ｉ）アペリンをＡＰＪレセプターと接触させる場合と、（ｉｉ）試験化合物をＡＰＪレセプターと接触させる場合とを比較することを含む。本発明のスクリーニング法では、例えば、（ａ）ＡＰＪレセプターに結合しているアペリンの量を、（ｉ）アペリンをＡＰＪレセプターと接触させた場合、及び（ｉｉ）アペリン及び試験化合物をＡＰＪレセプターと接触させた場合に測定し；そして、結果を比較するか；又は（ｂ）ＡＰＪレセプターによって媒介される細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸放出、アセチルコリン放出、細胞内Ｃａ２＋放出、細胞内ｃＡＭＰ産生、細胞内ｃＧＭＰ産生、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位の変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性）を、（ｉ）アペリンをＡＰＪレセプターと接触させた場合、及び（ｉｉ）試験化合物をＡＰＪレセプターと接触させた場合に測定し；そして、結果を比較する。典型的には、アペリンよりも高い又は少なくとも同程度のＡＰＪレセプターの促進をもたらす試験化合物を、その後、ＡＰＪレセプターアゴニストとして選択する。本発明のスクリーニング法の具体例としては、（１）標識アペリンをＡＰＪレセプターと接触させた場合、並びに標識アペリン及び試験化合物をＡＰＪレセプターと接触させた場合に、ＡＰＪレセプターに結合している標識アペリンの量を測定し；そして量を比較することを含む、ＡＰＪレセプターの機能を促進する物質をスクリーニングする方法；（２）標識アペリンを細胞又は膜画分と接触させた場合、並びに標識アペリン及び試験化合物を細胞又は膜画分と接触させた場合に、ＡＰＪレセプターを含む細胞又は前記細胞の膜画分に結合している標識アペリンの量を測定し、そして結合量を比較することを含む、ＡＰＪレセプターの機能を促進する物質をスクリーニングする方法；及び（３）標識アペリンをＡＰＪレセプターと接触させた場合、並びに標識アペリン及び試験化合物をＡＰＪレセプターと接触させた場合に、ＡＰＪレセプターをコードしているＤＮＡを有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現させたＡＰＪレセプターに結合している標識アペリンの量を測定し、そして結合量を比較することを含む、ＡＰＪレセプターの機能を促進する物質をスクリーニングする方法が挙げられる。そうした例において、アペリンよりも高い結合又は少なくとも同程度の結合をもたらす試験化合物を、その後、ＡＰＪレセプターアゴニストとして選択する。特に、化合物がＡＰＪレセプターアゴニストであるかどうかを決定するための方法は、Iturrioz X. et al. (Iturrioz X, Alvear-Perez R, De Mota N, Franchet C, Guillier F, Leroux V, Dabire H, Le Jouan M, Chabane H, Gerbier R, Bonnet D, Berdeaux A, Maigret B, Galzi JL, Hibert M, Llorens-Cortes C. Identification and pharmacological properties of E339-3D6, the first nonpeptidic apelin receptor agonist. FASEB J. 2010 May;24(5):1506-17. Epub 2009 Dec 29に記載されている。米国特許出願公開公報第ＵＳ２００５／０１１２７０１号はまた、ＡＰＪレセプターを含むアンジオテンシンレセプター様−１（ＡＰＪレセプター）に対するリガンドの同定のための試験システムを記載した。別の方法がまた、米国特許公開公報第ＵＳ６，４９２，３２４号に記載されている。
【００２０】
１つの態様において、ＡＰＪレセプターアゴニストは有機小分子である。「有機小分子」という用語は、一般的に医薬品に使用される有機分子と同等なサイズの分子を指す。前記用語は、生物学的巨大分子（例えばタンパク質、核酸など）を除外する。好ましい有機小分子のサイズは、約５０００Ｄａ以下、より好ましくは２０００Ｄａ以下、最も好ましくは約１０００Ｄａ以下である。
【００２１】
ＡＰＪレセプターアゴニストである有機小分子の例としては、欧州特許出願公開公報第ＥＰ１９０３００５２号及びIturrioz X. et al. (Iturrioz X, Alvear-Perez R, De Mota N, Franchet C, Guillier F, Leroux V, Dabire H, Le Jouan M, Chabane H, Gerbier R, Bonnet D, Berdeaux A, Maigret B, Galzi JL, Hibert M, Llorens-Cortes C. Identification and pharmacological properties of E339-3D6, the first nonpeptidic apelin receptor agonist. FASEB J. 2010 May;24(5):1506-17. Epub 2009 Dec 29に記載のものが挙げられる。典型的には、ＡＰＪレセプターアゴニストである有機小分子は、一般式（Ｉ）：
【化１】
2014534255.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、アリール基、アルキルアリール基、ヘテロアリール基又はアルキルヘテロアリール基であり、
Ｒ２は、水素原子又はアリール基であり、
Ｒ３及びＲ４は、水素原子又はヘテロシクロアルキル基を示し、ただし、Ｒ３及びＲ４は同時に水素原子を示すことはできず、そしてＲ３及びＲ４は両方共に、ヘテロシクロアルキル基の一部であることができ、
Ｒ５は、ｂｏｃ、ｆｍｏｃ、テキサスレッド、パテントブルーＶ、リサミン、及びローダミン１０１からなる群より選択された基を示し、
ｎは０〜１の整数であり、
Ｙは、−ＣＯ−（ＮＨ）ｎ’−Ａ−ＮＨ−基を示し、ここで
ｎ’は、０〜１の整数であり、
Ａは、−（ＣＨ２）ｎ''−、
−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ'''−（ＣＨ２）２−、
−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ’−、
−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ’−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ''−、
−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ’−、
−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ’−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ''−、
からなる群より選択された基であり、
ｎ''は、１〜２０の整数を示し、
ｎ'''は、１〜１０の整数を示し、
ｍ、ｍ’及びｍ''は、互いに独立して、１〜１５の整数を示し、
Ｘは、以下のリスト
【化２】
2014534255.tif 000003
から選択された基を示す）
を有する。
【００２２】
あるいは、ＡＰＪレセプターアゴニストは、抗体（前記用語は「抗体部分」も含む）からなり得る。
【００２３】
本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載された抗体又はその部分の１つの態様において、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【００２４】
本明細書に使用する「抗体」は、天然及び非天然の両方の抗体を含む。特に、「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにその一価及び二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、全合成抗体、一本鎖抗体、及びそのフラグメントを含む。抗体は、ヒト又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるために組換え法によってヒト化されていてもよい。
【００２５】
抗体は、従来の方法に従って調製される。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein（Nature, 256:495, 1975）の方法を使用して生成され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切な宿主動物を、適切な間隔で（例えば１週間に２回、１週間に１回、１か月に２回又は１か月に１回）、ＡＰＪの抗原形を用いて免疫化する。動物に、屠殺の１週間以内に最終「ブースト」の抗原を投与し得る。免疫化の最中に免疫アジュバントを使用することがしばしば望ましい。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、HunterによるTitermaxアジュバント、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１又はＱｕｉｌＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野において周知である。動物を、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって免疫化し得る。所与の動物に、複数の経路によって複数の形態の抗原を用いて免疫化し得る。
【００２６】
簡潔に言えば、抗原は、ＡＰＪ内の対象の抗原領域に対応する合成ペプチドとして提供され得る。免疫化措置の後、リンパ球を、前記動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器から単離し、そしてハイブリドーマを形成するためにポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞系と融合させる。融合後、細胞を、記載のように（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）、標準的な方法を使用して、融合対ではなくハイブリドーマの増殖に許容される培地中に置く。ハイブリドーマの培養後、細胞上清を、所望の特異性の抗体、すなわち、抗原に選択的に結合する抗体の存在について分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降法、及びウェスタンブロットが挙げられる。他のスクリーニング技術は当技術分野において周知である。好ましい技術は、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降法などの、コンフォメーション的に未変化で天然にフォールディングされた抗原と抗体の結合を確認するものである。
【００２７】
重要なことには、当技術分野においては周知のように、抗体分子のほんの小さな部分であるパラトープが、そのエピトープへの抗体の結合に関与している（一般的に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。Ｆｃ’及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原との結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された、又はｐＦｃ’領域を伴わずに産生された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれるが、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された、又はＦｃ領域を伴わずに産生された抗体は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれるが、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持している。さらに加工すると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖及びＦｄと呼ばれる抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させることなく、１０個までの異なる軽鎖と会合していてもよい）、そしてＦｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持している。
【００２８】
抗体の抗原結合部分内に、当技術分野において周知であるように、抗原のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びパラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的にClark, 1986; Roitt, 1991参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特定すると重鎖ＣＤＲＳは、主に、抗体の特異性に関与している。
【００２９】
哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域は、元来の抗体のエピトープ特異性を保持しつつ、同種又は異種特異的抗体の類似領域を用いて置換され得ることは当技術分野において現在十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲが、ヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合的に接続して機能的抗体を産生している、「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明瞭に顕現している。
【００３０】
本発明は、特定の態様において、ヒト化形の抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書において使用する「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくつかの、大半の、又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を記載している。ヒト化の方法としては、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第５，８５９，２０５号（これは参照により本明細書に組み入れられる）に記載されたものが挙げられるがそれらに限定されない。上の米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６１号及び国際公開公報第９０／０７８６１号はまた、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの可能な基準を提案している。最初の提案は、アクセプターのために、ヒト化しようとするドナー免疫グロブリンに対して珍しく相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体からの共通フレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が異常であり、そしてその位置のドナーアミノ酸がヒト配列にとって典型的であるならば、アクセプターよりむしろドナーアミノ酸が選択され得るというものであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３ＣＤＲのすぐ隣の位置では、アクセプターアミノ酸よりむしろドナーアミノ酸が選択され得るというものであった。第４の提案は、アミノ酸が抗体の３次元モデル内のＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測されそしてＣＤＲと相互作用することができると予測される、フレームワーク位置においてドナーアミノ酸残基を使用することであった。上の方法は、ヒト化抗体を製造するために当業者が使用することのできるいくつかの方法の単なる例である。当業者は、抗体ヒト化のための他の方法もよく知っているだろう。
【００３１】
ヒト化形の抗体の１つの態様において、ＣＤＲ領域外のいくつかの、大半の、又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくつかの、大半の、又は全てのアミノ酸は不変である。アミノ酸の少数の付加、欠失、挿入、置換又は修飾は、抗体が所与の抗原に結合する能力を消失しない限りにおいて許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元来の抗体と類似した抗原特異性を保持している。しかしながら、特定のヒト化の方法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）によって記載されたような「指向性進化」の方法を使用して増加させることができる。
【００３２】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の部位の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することによって調製することができる。例えば米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号、及びそれに引用された参考文献（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えばマウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。前記動物は、これらの動物の免疫化により対象の抗原に対する完全ヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むようにさらに改変されている。これらのマウス（例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Abgenix）、ＨｕＭＡｂマウス（Medarex/GenPharm））の免疫化後、モノクローナル抗体を標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それ故、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しない。
【００３３】
ヒト抗体を産生するためのin vitroにおける方法も存在する。これらには、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のin vitroにおける刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３４】
従って、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；キメラ抗体（Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体（ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦａｂフラグメント抗体（ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同的なヒト又は非ヒト配列によって置換されている）；及びキメラＦｄフラグメント抗体（ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列によって置換されている）を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体も含む。
【００３５】
種々の抗体分子及びフラグメントは、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含むがそれらに限定されない、一般的に知られている免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、そしてこれにはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３６】
別の態様において、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、軽鎖を天然的に欠失しているラクダ哺乳動物に見出され得るタイプの抗体の一本鎖重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは「ナノバディ（登録商標）」と呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００３７】
別の態様において、ＡＰＪレセプターアゴニストはアプタマーである。
【００３８】
アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物を示すクラスの分子である。アプタマーは、高い親和性及び特異性でもって実質的に全てのクラスの標的分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているように、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーにおいて、各メンバーは、独特な配列の最終的に化学的に修飾された線形オリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、使用及び利点は、Jayasena S.D., 1999に論評されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択されたＥ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって示されるコンフォメーション的に拘束された抗体可変領域からなる（Colas et al., 1996）。その後、前記したようなＡＰＪに対して指向されるアプタマーを発生させた後、当業者は容易にＡＰＪレセプター機能を促進するものを選択することができる。
【００３９】
別の態様において、ＡＰＪレセプターアゴニストはポリペプチドからなり得る。好ましくは、前記ポリペプチドは、アペリンそれ自体である。より好ましくは、ポリペプチドはアペリンポリペプチドである。
【００４０】
「アペリン」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして天然に存在するアペリン並びにその機能保存的変異体及び改変形を含む。アペリンは任意の起源に由来し得るが、典型的には哺乳動物（例えばヒト及び非ヒト霊長類）アペリン、より特定するとヒトアペリンである。アペリンタンパク質及びこのようなタンパク質をコードする核酸の配列は、当業者には周知である。アペリンは、７７−アミノ酸前駆体として合成され、そしてジスルフィド橋によって安定化された二量体として見られる（Lee DK, Saldivia VR, Nguyen T, Cheng R, George SR, O'Dowd BF. Modification of the terminal residue of apelin-13 antagonizes its hypotensive action.Endocrinology. Jan 146(1):231-6. 2005）。プレ−アペリンは、タンパク質分解による切断によって変換されて、種々のＣ末端フラグメント（アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１３、及び翻訳後に改変された（Ｐｙｒ１）アペリン−１３を含む) （全てがアペリンレセプターＡＰＪに対するアゴニストである）を産生する。これらのＣ末端フラグメントにおけるシステイン残基の欠失は、成熟ペプチドが単量体であることを示唆する。当業者は、これらの分子の配列を知っているので、任意のアペリンタンパク質又は遺伝子配列変異体を、それがアペリンの特性を有している限りにおいて使用することができることが理解されるべきである。
【００４１】
「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基を、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能を変化させることなく変化させているものであり、これには、アミノ酸を、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸で置換することが含まれるがそれらに限定されない。タンパク質中の保存されていると示されているアミノ酸以外のアミノ酸は異なっていてもよく、よって類似の機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列の類似率は変動し得、そして、Ｃｌｕｓｔｅｒ法によるなどのアラインメントスキームに従って決定されたように例えば７０％〜９９％であり得、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定されたように少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、そしてそれが比較される天然タンパク質又は親タンパク質と同じ又は実質的に類似した特性又は機能を有するポリペプチドを含む。
【００４２】
本発明によると、「アペリン」ポリペプチドという用語は、アペリン−１３Ｃ末端フラグメントを含む任意のポリペプチドを指す。従って、前記用語は、アペリン自体、又はアペリン−１７もしくはアペリン−３６フラグメントを含むそのフラグメントを包含する。
【００４３】
特定の態様において、本発明の治療法に使用されるアペリンポリペプチドは、その治療効力を改善させるように改変されていてもよいと考えられる。治療化合物のこのような改変は、毒性を減少させるために、循環時間を増加させるために、又は体内分布を改変させるために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、体内分布を改変させる多種多様な薬物キャリアビヒクルとの組合せによって有意に低減させることができる。
【００４４】
薬物のバイアビリティーを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの使用である。種々の水溶性ポリマーが、体内分布を改変させ、細胞による取り込み形態を改善し、生理学的バリアを通した透過性を変化させ、そして体内からのクリアランス速度を改変させることが示された。標的化又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上の吊り下がった基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されている。
【００４５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度な生体適合性及び改変のし易さから、薬物キャリアとして広く使用されている。種々の薬物、タンパク質及びリポソームへの付着が、滞留時間を改善し、そして毒性を低減させることが示された。ＰＥＧを、鎖の末端のヒドロキシル基を通して、そして他の化学的方法を介して活性薬剤に結合させることができる；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子あたり最大で２つの活性薬剤に制限されている。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーが新規生体材料として探究され、これはＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子あたり数多くの付着点というさらなる利点を有し（より多くの薬物がローディングされる）、そして多種多様な適用に適合するように合成的に設計することができる。
【００４６】
当業者は、薬物の効果的な改変のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧと三機能モノマー（例えばリジン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーがVectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）を、安定なウレタン結合を通してリジンのａ−及びｅ−アミノ基に連結する。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密に制御されそして予め決定された間隔で吊り下がった反応基（リジンのカルボン酸基）を与えつつ、ＰＥＧの所望の特性を保持している。吊り下がった反応基は、誘導体化、架橋、又は他の分子とのコンジュゲーションのために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーの間の切断可能な連結を変化させることによって、安定で長時間循環するプロドラッグを産生するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔、及びコンジュゲートの分子量あたりの薬物の量（ＰＥＧセグメントが小さければ小さい程、より多くの薬物がローディングされる）に影響を及ぼす。一般的に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量の増加は、コンジュゲートの循環半減期を増加させるだろう。それにも関らず、コンジュゲートは容易に分解可能でなければならないか、又は糸球体濾過の限界値を下回る分子量（例えば４５ｋＤａ未満）を有さなければならない。
【００４７】
さらに、循環半減期及び体内分布を維持するのに重要なポリマー骨格に、リンカーを使用することにより、標的組織において特異的なトリガーによって、典型的には酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで治療剤をプロドラッグ形で維持することができる。例えば、このタイプの組織により活性化される薬物送達は、特定の体内分布部位への送達が必要とされ、そして治療剤が病気の部位に又は病気の部位の近くに放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは当業者には公知であり、そして酵素動態学、活性酵素の普及、及び選択された疾病特異的な酵素の切断特異性に基づき得る（例えば、VectraMed, Plainsboro, N.J.によって確立された技術を参照）。このようなリンカーは、治療送達のために本明細書に記載されたアペリンポリペプチドの改変に使用され得る。
【００４８】
本発明によると、アペリンポリペプチドは、従来の自動ペプチド合成法によって、又は組換え発現によって産生され得る。タンパク質を設計及び製造するための一般的な原則は当業者には周知である。
【００４９】
本発明のアペリンポリペプチドは、溶液中又は固相支持体上で従来の技術に従って合成され得る。種々の自動合成機が市販されており、そして公知のプトロコールに従って使用することができる。本発明のアペリンポリペプチドはまた、Applied Biosystems Inc.のモデル４３３Ａなどの例示的なペプチド合成機を使用して固相技術によって合成することができる。自動ペプチド合成を通して又は組換え法を通して生成された任意の所与のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定され得る。各ペプチドの化学的確実性は、当業者には周知の任意の方法によって確立することができる。
【００５０】
自動ペプチド合成の代替法として、組換えＤＮＡ技術を使用することができ、選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、形質転換し、又は適切な宿主細胞にトランスフェクションし、そして本明細書で下記した発現に適した条件下で培養する。組換え法は、より長いポリペプチドを産生するために特に好ましい。
【００５１】
ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含有及び発現させるために、多種多様な発現ベクター／宿主系を使用し得る。これらとしては、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクションされた又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるがそれらに限定されない。当業者は、哺乳動物によるタンパク質の発現を最適化するための種々の技術を知っている。組換えタンパク質の産生において有用である哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２及び２９３細胞が挙げられるがそれらに限定されない。細菌、酵母及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコールは当業者に公知であり、そして本明細書において以下に簡潔に記載されている。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系もまた当業者には周知である。宿主細胞株は、タンパク質活性をもたらすのに有用であろう、発現されたタンパク質を加工する特定の能力又は特定の翻訳後修飾を生じる特定の能力に関して選択され得る。このようなポリペプチドの修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が挙げられるがそれらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、フォールディング及び／又は機能にとって重要であり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの種々の宿主細胞は、このような翻訳後活性のための特定の細胞機械及び特徴的な機序を有し、そして導入された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように選択され得る。
【００５２】
本発明のアペリンポリペプチドの組換え産生において、アペリン由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを使用することが必要である。このようなベクターを調製する方法並びにこのようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞を産生する方法は当業者には周知である。このような努力で使用されたポリヌクレオチド分子はベクターに接続され得、前記ベクターは、一般的に、選択マーカー及び宿主における増殖のための複製起点を含む。発現構築物のこれらのエレメントは当業者には周知である。一般的に、発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来するものなどの、適切な転写又は翻訳調節配列に作動可能に連結された所与のタンパク質をコードしているＤＮＡを含む。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳を制御する適切な配列が挙げられる。
【００５３】
「発現ベクター」、「発現構築物」又は「発現カセット」という用語は、本明細書全体を通して同義語として使用され、そして一部又は全部の核酸コード配列が転写されることのできる遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を含むことを意味する。
【００５４】
本発明のペプチド又はポリペプチドの発現に適切な発現ベクターの選択は、勿論、使用しようとする具体的な宿主細胞に依存し、そしてこれは当業者の技能範囲内である。哺乳動物発現ベクターの構築法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６及び国際公開公報第９１／１８９８２号に開示されている。
【００５５】
一般的に、本発明に有用なベクターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられるがそれらに限定されない。ウイルスベクターが好ましいタイプのベクターであり、そしてこれには以下のウイルス（レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス）の核酸配列が挙げられるがそれらに限定されない。命名されていないが当技術分野において知られている他のベクターも容易に使用することができる。
【００５６】
好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が対象の遺伝子により置換されている、非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に認可されている。最も有用なのは、複製欠損である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することはできない）レトロウイルスである。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける遺伝子の高効率の形質導入に全般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性遺伝子材料をプラスミドに組込む工程、パッケージング細胞系をプラスミドによってトランスフェクションする工程、パッケージング細胞系によって組換えレトロウイルスを産生する工程、組織培養培地からウイルス粒子を収集する工程、及びウイルス粒子を用いて標的細胞を感染する工程を含む）は当技術分野において周知である。
【００５７】
特定の適用のために好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスであり、これはヒトへの遺伝子療法における使用にすでに認可されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際に１２個の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られており、各々が異なる組織指向性を有する。組換えＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２に由来する。アデノ随伴ウイルス１型〜１２型は、複製欠損となるように遺伝子工学され得、そして多種多様な細胞型及び細胞腫に感染することができる。それはさらに、熱及び脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞への高い形質導入頻度；及び重複感染の阻害がなく、従って、複数回の形質導入が可能となるなどの、利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組込むことができ、これにより挿入突然変異の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入された遺伝子の発現のばらつきを最小限とすることができる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧がない下で、１００回以上の継代かけて組織培養液中で行なわれ、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノムへの組込みは、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能することができる。
【００５８】
他のベクターとしてはプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野において十分に記載されており、そして当業者には周知である。ここ数年間、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらはこのために特に利点がある。なぜなら、それらは多くのウイルスベクターと同じ安全性の懸念を有さないからである。しかしながら、宿主細胞と適合性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされている遺伝子からのペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者には周知である。さらに、プラスミドは、制限酵素及びライゲーション反応を使用してカスタム設計されることにより、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加することができる。プラスミドは、多種多様な非経口経路、粘膜経路及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射することができる。それはまた鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与することもできる。プラスミドは、水溶液中に与えられても、金粒子上に乾燥されていても、又は別のＤＮＡ送達システム（リポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）及びマイクロカプセル化を含むがそれらに限定されない）を伴っていてもよい。
【００５９】
発現は、宿主細胞における対象の核酸の発現を駆動するために使用され得るウイルス起源及び哺乳動物起源の両方のエンハンサー／プロモーターなどの適切なシグナルがベクター中に提供されることを必要とする。通常、発現される核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機械又は導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列を指す。ヌクレオチド配列は、調節配列が対象のタンパク質（すなわちアペリン、変異体など）をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合に作動可能に連結されている。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を指令するならば、所与のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。
【００６０】
同様に、「転写制御下」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置及び配向にあることを意味する。核酸の発現を駆動する任意のプロモーターを使用し得る。対象の核酸配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、標的細胞における核酸の発現を指令することができる限り、重要であるとは考えられていない。従って、ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞において発現されることのできるプロモーターに隣接して及びプロモーターの制御下に核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に言って、このようなプロモーターは、ヒト又はウイルスのプロモーターのいずれかを含み得る。共通のプロモーターとしては、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、［β］−アクチン、ラットインシュリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられ、その全てが当業者には周知でありそして容易に入手可能であるプロモーターであり、これを使用して対象のコード配列の高レベルの発現を得ることができる。対象のコード配列の発現を達成するために当技術分野において周知である他のウイルス性プロモーター又は哺乳動物細胞性プロモーター又はバクテリオファージプロモーターの使用も同様に考えられ、ただし、発現レベルは、対象のタンパク質の回収可能な収量を産生するに十分なものである。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション又は形質転換後の対象のタンパク質の発現レベル及び発現パターンを最適化することができる。誘導性プロモーターも使用することができる。
【００６１】
タンパク質の発現に使用される別の調節エレメントはエンハンサーである。これらは、ＤＮＡの同じ分子上の遠い位置に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝子エレメントである。発現構築物がｃＤＮＡ挿入断片を使用する場合、典型的には、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を起こすためにポリアデニル化シグナル配列を含めることが望ましい。選択されたトランスジェニック動物種の細胞によって認識される任意のポリアデニル化シグナル配列、例えばヒト又はウシ成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどが、本発明の実施に適切である。
【００６２】
ＡＰＪレセプターアゴニストとして使用することのできる他のポリペプチドとしては、米国特許第６，４９２，３２４号、米国特許第７，６３５，７５１号、米国特許第２０１０２２１２５５号又は米国特許第２００８１８２７７９号に記載されたものが挙げられる。
【００６３】
別の態様において、本発明は、加齢に伴う機能障害の処置又は予防に使用するためのアペリン模倣体に関する。
【００６４】
本明細書において使用する「アペリン模倣体」という用語は、アペリンに機能的に等価である分子を示し、これはすなわち、アペリンの生物学的活性の少なくとも１つ、例えば、アペリンの降圧効果又はアペリンの血漿グルコース低下効果を有する分子である。他の言葉で言えば、「アペリン模倣体」は、アペリン効果を模倣／再現することのできる分子を示す。
【００６５】
アペリン模倣体の活性は、当技術分野における任意の周知の方法によって決定することができる。例えば、アペリン模倣体となることのできる分子の能力は、アペリンのように血圧を低下させる能力並びに血糖を低下させる能力によって測定することができる。本発明のアペリン模倣体の血圧／血糖を減少させる能力は、アペリン模倣体に因る血圧／血糖の減少を評価するための簡単な試験を実施することによって当業者には明らかとなろう。
【００６６】
別の例において、アペリン模倣体は、血圧及び／又は血糖に対するその低下効果を遮断するアペリン阻害剤の能力に基づいて評価されるだろう。
【００６７】
本発明のさらなる目的は、加齢に伴う機能障害の処置又は予防に使用するためのＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体を含む薬学的組成物に関する。
【００６８】
典型的には、ＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体を、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと合わせて、治療用組成物を形成することができる。
【００６９】
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を発生しない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤は、無毒性の固形、半固形又は液体形の充填剤、希釈剤、封入剤又は任意のタイプの製剤化補助剤を指す。
【００７０】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を、単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形としては、経口投与形、例えば、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与形、エアゾール、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与形及び直腸投与形が挙げられる。
【００７１】
好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張で無菌の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であり得、これは場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水が添加されると、注射液の構成が可能となる。
【００７２】
注射使用に適した剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
【００７３】
遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００７４】
ＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体は、中性形又は塩形の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、そしてこれは無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【００７５】
キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長吸収は、組成物中への、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００７６】
無菌注射液は、必要な量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上に列挙した他のいくつかの成分と一緒に取り込み、その後、滅菌濾過することによって調製される。一般的には、分散液は、種々の無菌活性成分を、基本分散媒体と上に列挙した必要とされる他の成分とを含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分と以前に滅菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末が得られる。
【００７７】
製剤時に、溶液は、投与製剤に対して適合性の様式で、治療有効量で投与される。製剤は、種々の剤形で、例えば前記したタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【００７８】
水溶液での非経口投与のために、例えば、前記溶液は必要であれば適切に緩衝化し、そして液体希釈剤を、まず、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用することのできる無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知である。投与量の幾分の変更が、処置される被験者の状態に依存して必然的に起こるだろう。投与責任者が、いずれの事象においても、個々の被験者のための適切な用量を決定するだろう。
【００７９】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【００８０】
本発明のさらなる目的は、複数の化合物を、ＡＰＪレセプターアゴニストであるその能力について、又はアペリン模倣体であるその能力について試験する工程、及びＡＰＪレセプターアゴニストである又はアペリン模倣体である化合物を正に選択する工程からなる工程を含む、加齢に伴う機能障害の予防及び処置のための薬物をスクリーニングするための方法に関する。
【００８１】
ＡＰＪレセプターに対する化合物のアゴニスト活性を決定するための方法、又はアペリン模倣体の活性を決定するための方法が上記されている。
【００８２】
本発明の別の目的は、必要とする被験者に、前記したような治療有効量のＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体を投与することを含む、加齢に伴う機能障害を処置するための方法に関する。
【００８３】
特定の目的において、本発明は、必要とする被験者に、前記したような治療有効量のＡＰＪレセプターアゴニスト又はアペリン模倣体を投与することを含む、筋肉減少症を処置するための方法に関する。
【００８４】
さらに特定の目的において、ＡＰＪレセプターアゴニストはアペリンである。
【００８５】
本明細書において使用する「処置する」又は「処置」という用語は、このような用語が適用される疾患もしくは状態の進行を逆行、軽減、阻止、又は前記疾患もしくは状態の予防、あるいは、このような用語が適用される疾患もしくは状態の１つ以上の症状の進行の逆行、軽減、阻止、又は前記疾患もしくは状態の１つ以上の症状の予防を示す。
【００８６】
加齢に伴う機能障害を予測するための方法
第２の局面において、本発明は、患者から得られたサンプル中でアペリンの発現を検出することからなる工程を含む、加齢に伴う機能障害に患者が罹患する能力をex vivoにおいて予測するための方法に関する。
【００８７】
好ましい態様において、加齢に伴う機能障害は、脳の機能障害又は筋肉の機能障害であり得る。
【００８８】
別の好ましい態様において、筋肉の機能障害は、骨格筋又は心筋の機能障害であり得る。
【００８９】
好ましい態様において、加齢に伴う機能障害は筋肉減少症であり得る。
【００９０】
別の好ましい態様において、加齢に伴う機能障害は脆弱症候群であり得る。
【００９１】
典型的には、本発明によるサンプルは、血液、血漿、血清、リンパ液、生検サンプル又は尿サンプルであり得る。
【００９２】
上で使用したような「検出する」という用語は、対照と参照して又は参照することない、定性的及び／又は定量的検出（レベルを測定）を含む。典型的にはアペリンの発現は、例えばサンプルに実施されたＲＴ−ＰＣＲ又は免疫組織化学法によって測定され得る。
【００９３】
「対照」は健康被験者、すなわち、加齢に伴う機能障害を全く患っていない被験者であり得る。対照はまた、加齢に伴う機能障害を患う被験者であってもよい。好ましくは、前記対照は健康被験者である。
【００９４】
サンプル中のアペリン発現の検出はまた、アペリンタンパク質のレベルを測定することによって実施され得る。本出願において、「アペリンタンパク質のレベル」は、前記アペリンタンパク質の量又は濃度を意味する。
【００９５】
このような方法は、サンプルを、サンプル中に存在するアペリンタンパク質と選択的に相互作用することのできる結合対と接触させることを含む。結合対は、一般的には、抗体であり、これはポリクリーナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。
【００９６】
タンパク質の存在は、標準的な電気泳動技術及び免疫診断技術（イムノアッセイ、例えば競合、直接反応、又はサンドイッチ型アッセイなどを含む）を使用して検出することができる。このようなアッセイとしては、ウェスタンブロット；凝集試験；酵素標識及び酵素媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降法などが挙げられるがそれらに限定されない。反応は、一般的に、顕現させる標識、例えば蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識又は色素分子、又は抗原とそれと反応する抗体もしくは抗体群との間の複合体の形成を検出するための他の方法を含む。
【００９７】
前記のアッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合した固相支持体からの液相中の非結合タンパク質の分離を含む。本発明の実施に使用することのできる固相支持体は、ニトロセルロース（例えば膜又はマイクロタイターウェルの形態）；ポリビニルクロリド（例えばシート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリビニリデンフルオライド；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ；磁気応答性ビーズなどの基材を含む。
【００９８】
より具体的には、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、マイクロタイタープレートのウェルは、試験しようとするタンパク質に対する１セットの抗体でコーティングされている。マーカータンパク質を含む又は含むことが疑われるサンプルを、その後、コーティングされたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間後、プレートを洗浄して、結合していない部分を除去することができ、そして検出可能なように標識された二次結合分子を加える。二次結合分子を、任意の捕獲されたサンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、そして二次結合分子の存在を、当技術分野において周知の方法を使用して検出する。
【００９９】
１つの好ましい方法は、細胞又は特定のタンパク質、例えば組織抗原を検出するために、モノクローナル又はポリクローナル抗体を使用した免疫酵素反応に基づいた染色法である、免疫組織化学法を使用する。典型的には、免疫組織化学プロトコールは、以下の工程の少なくともいくつかを含む：
１）抗原賦活化（例えば圧力鍋にかける、プロテアーゼによる処理、電子レンジにかける、適切な緩衝液中での加熱などによって）；
２）一次抗体（すなわち抗アペリンタンパク質抗体）の適用及び洗浄；
３）一次抗体に結合する標識された二次抗体（しばしば、工程５での検出を可能とする二次抗体コンジュゲート）の適用及び洗浄；
４）増幅工程が含まれ得る；
５）検出試薬の適用（例えば、色原体、蛍光でタグ化された分子、又はアッセイに必要とされるレベル又は感度を達成するために適切なダイナミックレンジを有する任意の分子）；
６）対比染色を使用し得る、そして
７）定性的又は定量的分析のための、タンパク質の存在を可視化（肉眼又は自動分析システムのいずれかに対して）する検出システムを使用した検出。
【０１００】
対象のタンパク質を検出するための、種々の免疫酵素染色法が、当技術分野において公知である。例えば、免疫酵素的相互作用を、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又は種々の色原体、例えばＤＡＢ、ＡＥＣもしくはＦａｓｔ Ｒｅｄ；又は蛍光標識、例えばＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒなどを使用して可視化することができる。対比染色としては、このような染色が、使用された他の検出試薬及び可視化戦略と適合性である限り、Ｈ＆Ｅ、ＤＡＰＩ、ヘキストなどが挙げられ得る。当技術分野において公知であるように、増幅試薬を使用して、染色シグナルを増強し得る。例えば、チラミド試薬を使用し得る。本発明の染色法は、自動化、半自動化又は手動システムを含む、当業者には明らかであるような任意の適切な方法又はシステムを使用して達成することができる。
【０１０１】
本発明の方法は、アペリン発現レベルを閾値と比較することからなるさらなる工程を含み得る。
【０１０２】
典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に又は理論的に決定することができる。閾値はまた、当業者には認識されているように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択することができる。好ましくは、当業者は、本発明の方法に従って得られたアペリン発現レベルを、規定された閾値と比較し得る。
【０１０３】
好ましくは、前記閾値は、健康個体の、好ましくは健康であることが知られている個体の、すなわち重大な状況ではない、そして好ましくは加齢に伴う機能障害を患っていない個体の集団の平均アペリン発現レベルである。
【０１０４】
典型的には、当業者は、健康であることが知られている個体の集団からの、好ましくは１００人の健康個体からの統計学的サンプルの生物学的サンプル中のアペリン発現レベルを決定することができる。その後、得られたレベルの平均値を、周知の統計学的分析に従って決定することにより、アペリンの平均発現レベルが得られる。その後、前記数値を、正常と判断し、そして従って閾値を構成する。
【０１０５】
アペリン発現レベルをこの閾値と比較することによって、その後、医師は、加齢に伴う機能障害を予測することができる。従って、医師は、加齢に伴う機能障害に患う重大で生命を脅かす状態の被験者の適切な医学的治療を適合及び最適化することができるだろう。前記予測の決定は、フォローアップ治療及び臨床的決断を下すのに非常に適している。
【０１０６】
したがって、本発明は、患者が加齢に伴う機能障害にかかる能力を予測するための方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）前記被験者の生物学的サンプル中のアペリン発現レベルを決定する工程；
ｂ）健康個体、好ましくは１００人の健康個体の集団の生物学的サンプル中のアペリンの平均発現レベルを決定する工程；及び
ｃ）ａ）で得られた比を、ｂ）で得られた比と比較する工程。
【０１０７】
本発明はまた、アペリンの発現を検出するための手段を含む、加齢に伴う機能障害の予測のためのキットに関する。
【０１０８】
本発明によると、本発明のキットは、抗アペリンタンパク質抗体；前記アペリンタンパク質抗体に結合するシグナリングシステムと結合させた別の分子を含み得る。
【０１０９】
典型的には、抗体又は抗体の組合せは、すぐに使用できる溶液の形態である。１つの態様において、キットは、すぐに使用できる溶液を含む容器を含む。任意の他の形態が本発明によって包含され、そして当業者は、免疫組織化学法に使用するために前記形態を慣用的に適合させることができる。
【０１１０】
本発明はまた、加齢に伴う機能障害のためのバイオマーカーとしてのアペリンに関する。
【０１１１】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】筋肉遺伝子発現に対するアペリンによる慢性的処置の結果。マウスを、２８日間、アペリン（０．１μmol/kg/日）又はＰＢＳ（対照）を用いて処置又は処置しなかった。麻酔後、各筋肉を、液体窒素中で急速冷凍した。ｍＲＮＡ発現を、材料及び方法に記載したように定量した。
【図１Ｂ】筋肉遺伝子発現に対するアペリンによる慢性的処置の結果。マウスを、２８日間、アペリン（０．１μmol/kg/日）又はＰＢＳ（対照）を用いて処置又は処置しなかった。麻酔後、各筋肉を、液体窒素中で急速冷凍した。ｍＲＮＡ発現を、材料及び方法に記載したように定量した。
【図２】８０週令のＷＴ又はＣＭＶ−ＫＯアペリンマウスの筋形成に関与する因子の筋肉ｍＲＮＡ発現。８０週間後、マウスを安楽死させ、そして四頭筋を液体窒素中で急速冷凍した。ｍＲＮＡ発現を、材料及び方法に記載したように定量した。
【図３】筋肉減少症個体における血漿中アペリンの変動。
【図４Ａ】インシュリン耐性マウスの筋肉におけるパルミチン酸分配に対する、アペリンによる慢性的な処置の効果。Ａ：ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝８）マウスの筋肉ホモジネート中のＴＧ及びＤＡＧレベル。結果は平均±ＳＥＭである。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝１１）及びアペリン処置（ｎ＝１２）マウスの筋肉のＴＧへの［１４Ｃ］パルミチン酸の取り込みの測定。結果は平均±ＳＥＭである。Ｃ：研究設計及び方法に記載されたように測定された完全（左）及び不完全（右）ＦＡＯ。結果は、ＰＢＳ処置（ｎ＝１１）及びアペリン処置（ｎ＝９）マウスの平均±ＳＥＭである。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図４Ｂ】インシュリン耐性マウスの筋肉におけるパルミチン酸分配に対する、アペリンによる慢性的な処置の効果。Ａ：ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝８）マウスの筋肉ホモジネート中のＴＧ及びＤＡＧレベル。結果は平均±ＳＥＭである。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝１１）及びアペリン処置（ｎ＝１２）マウスの筋肉のＴＧへの［１４Ｃ］パルミチン酸の取り込みの測定。結果は平均±ＳＥＭである。Ｃ：研究設計及び方法に記載されたように測定された完全（左）及び不完全（右）ＦＡＯ。結果は、ＰＢＳ処置（ｎ＝１１）及びアペリン処置（ｎ＝９）マウスの平均±ＳＥＭである。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図４Ｃ】インシュリン耐性マウスの筋肉におけるパルミチン酸分配に対する、アペリンによる慢性的な処置の効果。Ａ：ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝８）マウスの筋肉ホモジネート中のＴＧ及びＤＡＧレベル。結果は平均±ＳＥＭである。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝１１）及びアペリン処置（ｎ＝１２）マウスの筋肉のＴＧへの［１４Ｃ］パルミチン酸の取り込みの測定。結果は平均±ＳＥＭである。Ｃ：研究設計及び方法に記載されたように測定された完全（左）及び不完全（右）ＦＡＯ。結果は、ＰＢＳ処置（ｎ＝１１）及びアペリン処置（ｎ＝９）マウスの平均±ＳＥＭである。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図５Ａ】ＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置は、筋肉におけるミトコンドリア酸化能及びミトコンドリア生合成を増加させた。Ａ：Ｓｔａｔｅ２及びＳｔａｔｅ３呼吸を、研究設計及び方法に記載したように、ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスのヒラメ骨格筋から調製された新鮮な透過処理された線維上で測定した。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスにおける種々のミトコンドリア複合体の代表的なウェスタンブロット（左）及び定量（右）。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｃ：ＰＢＳ処置（ｎ＝５）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｄ：ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝４）マウスのヒラメ筋における、リアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量。＊＊Ｐ≦０．０１。Ｅ：ＳＳ及びＩＭＦミトコンドリアにおける×６，０００倍率及び×２５，０００倍率での透過型電子顕微鏡像（左）。ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋からの切片領域に関するミトコンドリア数の定量（各マウスにおける３つの画像の分析）（右）。
【図５Ｂ】ＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置は、筋肉におけるミトコンドリア酸化能及びミトコンドリア生合成を増加させた。Ａ：Ｓｔａｔｅ２及びＳｔａｔｅ３呼吸を、研究設計及び方法に記載したように、ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスのヒラメ骨格筋から調製された新鮮な透過処理された線維上で測定した。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスにおける種々のミトコンドリア複合体の代表的なウェスタンブロット（左）及び定量（右）。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｃ：ＰＢＳ処置（ｎ＝５）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｄ：ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝４）マウスのヒラメ筋における、リアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量。＊＊Ｐ≦０．０１。Ｅ：ＳＳ及びＩＭＦミトコンドリアにおける×６，０００倍率及び×２５，０００倍率での透過型電子顕微鏡像（左）。ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋からの切片領域に関するミトコンドリア数の定量（各マウスにおける３つの画像の分析）（右）。
【図５Ｃ】ＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置は、筋肉におけるミトコンドリア酸化能及びミトコンドリア生合成を増加させた。Ａ：Ｓｔａｔｅ２及びＳｔａｔｅ３呼吸を、研究設計及び方法に記載したように、ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスのヒラメ骨格筋から調製された新鮮な透過処理された線維上で測定した。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスにおける種々のミトコンドリア複合体の代表的なウェスタンブロット（左）及び定量（右）。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｃ：ＰＢＳ処置（ｎ＝５）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｄ：ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝４）マウスのヒラメ筋における、リアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量。＊＊Ｐ≦０．０１。Ｅ：ＳＳ及びＩＭＦミトコンドリアにおける×６，０００倍率及び×２５，０００倍率での透過型電子顕微鏡像（左）。ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋からの切片領域に関するミトコンドリア数の定量（各マウスにおける３つの画像の分析）（右）。
【図５Ｄ】ＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置は、筋肉におけるミトコンドリア酸化能及びミトコンドリア生合成を増加させた。Ａ：Ｓｔａｔｅ２及びＳｔａｔｅ３呼吸を、研究設計及び方法に記載したように、ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスのヒラメ骨格筋から調製された新鮮な透過処理された線維上で測定した。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスにおける種々のミトコンドリア複合体の代表的なウェスタンブロット（左）及び定量（右）。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｃ：ＰＢＳ処置（ｎ＝５）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｄ：ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝４）マウスのヒラメ筋における、リアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量。＊＊Ｐ≦０．０１。Ｅ：ＳＳ及びＩＭＦミトコンドリアにおける×６，０００倍率及び×２５，０００倍率での透過型電子顕微鏡像（左）。ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋からの切片領域に関するミトコンドリア数の定量（各マウスにおける３つの画像の分析）（右）。
【図５Ｅ】ＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置は、筋肉におけるミトコンドリア酸化能及びミトコンドリア生合成を増加させた。Ａ：Ｓｔａｔｅ２及びＳｔａｔｅ３呼吸を、研究設計及び方法に記載したように、ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスのヒラメ骨格筋から調製された新鮮な透過処理された線維上で測定した。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）及びアペリン処置（ｎ＝７）マウスにおける種々のミトコンドリア複合体の代表的なウェスタンブロット（左）及び定量（右）。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｃ：ＰＢＳ処置（ｎ＝５）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｄ：ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝４）マウスのヒラメ筋における、リアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量。＊＊Ｐ≦０．０１。Ｅ：ＳＳ及びＩＭＦミトコンドリアにおける×６，０００倍率及び×２５，０００倍率での透過型電子顕微鏡像（左）。ＰＢＳ処置（ｎ＝４）及びアペリン処置（ｎ＝５）マウスのヒラメ筋からの切片領域に関するミトコンドリア数の定量（各マウスにおける３つの画像の分析）（右）。
【図６Ａ】筋肉におけるＦＡＯ及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの効果は、ＡＭＰＫ活性化に依存する。Ａ：インシュリン耐性マウスの筋肉におけるＰＢＳ（ｎ＝３）又はアペリン（ｎ＝４）処置後のリン酸化−ＡＭＰＫ及びリン酸化−ＡＣＣタンパク質発現。グラフは、定量データ（ｎ＝４）を示す。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）又はアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるマロニル−ＣｏＡ濃度。Ｃ：ＨＦＤ ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスにおける研究設計及び方法に記載のように測定された全ＦＡＯ。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。Ｄ：種々のマウスのヒラメ筋においてリアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量；各群においてｎ＝４。Ｅ：ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図６Ｂ】筋肉におけるＦＡＯ及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの効果は、ＡＭＰＫ活性化に依存する。Ａ：インシュリン耐性マウスの筋肉におけるＰＢＳ（ｎ＝３）又はアペリン（ｎ＝４）処置後のリン酸化−ＡＭＰＫ及びリン酸化−ＡＣＣタンパク質発現。グラフは、定量データ（ｎ＝４）を示す。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）又はアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるマロニル−ＣｏＡ濃度。Ｃ：ＨＦＤ ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスにおける研究設計及び方法に記載のように測定された全ＦＡＯ。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。Ｄ：種々のマウスのヒラメ筋においてリアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量；各群においてｎ＝４。Ｅ：ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図６Ｃ】筋肉におけるＦＡＯ及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの効果は、ＡＭＰＫ活性化に依存する。Ａ：インシュリン耐性マウスの筋肉におけるＰＢＳ（ｎ＝３）又はアペリン（ｎ＝４）処置後のリン酸化−ＡＭＰＫ及びリン酸化−ＡＣＣタンパク質発現。グラフは、定量データ（ｎ＝４）を示す。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）又はアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるマロニル−ＣｏＡ濃度。Ｃ：ＨＦＤ ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスにおける研究設計及び方法に記載のように測定された全ＦＡＯ。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。Ｄ：種々のマウスのヒラメ筋においてリアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量；各群においてｎ＝４。Ｅ：ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図６Ｄ】筋肉におけるＦＡＯ及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの効果は、ＡＭＰＫ活性化に依存する。Ａ：インシュリン耐性マウスの筋肉におけるＰＢＳ（ｎ＝３）又はアペリン（ｎ＝４）処置後のリン酸化−ＡＭＰＫ及びリン酸化−ＡＣＣタンパク質発現。グラフは、定量データ（ｎ＝４）を示す。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）又はアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるマロニル−ＣｏＡ濃度。Ｃ：ＨＦＤ ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスにおける研究設計及び方法に記載のように測定された全ＦＡＯ。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。Ｄ：種々のマウスのヒラメ筋においてリアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量；各群においてｎ＝４。Ｅ：ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図６Ｅ】筋肉におけるＦＡＯ及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの効果は、ＡＭＰＫ活性化に依存する。Ａ：インシュリン耐性マウスの筋肉におけるＰＢＳ（ｎ＝３）又はアペリン（ｎ＝４）処置後のリン酸化−ＡＭＰＫ及びリン酸化−ＡＣＣタンパク質発現。グラフは、定量データ（ｎ＝４）を示す。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝６）又はアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるマロニル−ＣｏＡ濃度。Ｃ：ＨＦＤ ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスにおける研究設計及び方法に記載のように測定された全ＦＡＯ。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。Ｄ：種々のマウスのヒラメ筋においてリアルタイムＰＣＲによって決定されたＣＯＸ１とシクロフィリンＡ ＤＮＡレベルの比として計算されたｍｔＤＮＡ量；各群においてｎ＝４。Ｅ：ＰＢＳ及びアペリン処置ＷＴ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスのヒラメ筋における遺伝子発現。結果は平均±ＳＥＭである；各群においてｎ＝４。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
【図７Ａ】アシルカルニチンレベル及びインシュリンにより刺激されたグルコース取り込みに対する、インシュリン耐性マウスの筋肉におけるアペリンによる慢性的な処置の効果。Ａ：長鎖種のアシルカルニチンレベルを、ＮＤを与えたマウス（ｎ＝５）、及びアペリン（ｎ＝８）又はＰＢＳ（ｎ＝７）で処置されたＨＦＤを与えたマウスにおいて測定した。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるインシュリンにより誘発されたグルコース取り込み。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。２−ＤＧ、２−デオキシグルコース；Ｐｒｏｔ、タンパク質。
【図７Ｂ】アシルカルニチンレベル及びインシュリンにより刺激されたグルコース取り込みに対する、インシュリン耐性マウスの筋肉におけるアペリンによる慢性的な処置の効果。Ａ：長鎖種のアシルカルニチンレベルを、ＮＤを与えたマウス（ｎ＝５）、及びアペリン（ｎ＝８）又はＰＢＳ（ｎ＝７）で処置されたＨＦＤを与えたマウスにおいて測定した。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。Ｂ：ＰＢＳ処置（ｎ＝７）及びアペリン処置（ｎ＝６）マウスのヒラメ筋におけるインシュリンにより誘発されたグルコース取り込み。結果は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ≦０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。２−ＤＧ、２−デオキシグルコース；Ｐｒｏｔ、タンパク質。
【０１１３】
実施例
実施例１：
材料及び方法
動物
マウスを、国立衛生医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）によって確立された原則及びガイドラインに従って取り扱った。Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスは、Harlan (Gannat, France)から入手した。ＣＭＶ−ＫＯアペリンマウスは、Genoway (Lyon, France)から入手した。マウスを、１２時間／１２時間の明暗サイクル（午前８時に点灯）の一定温度（２０〜２２℃）の加湿した（５０〜６０％）動物部屋で、食物及び水に自由に近付けるようにして慣用的に飼育した。マウスに、離乳から１０週令まで固形飼料を与え、その後、固形飼料で維持した（Research Diet, NJ）。
【０１１４】
アペリンによる処置
アペリンによる処置を、３１週令から３５週令のマウスに行なった。マウスに１日１回、２８日間、以前に記載されているように（Higuchi et al 2005; Yue et al 2010）アペリンの腹腔内注射液（０．１μmol/kg/日）を注射した。年齢の一致した対照マウスに、同じ期間中、ＰＢＳを注射した。全マウスを、摂食状態で最後のアペリンの腹腔内注射から２４時間後に屠殺した。腹腔内アペリン（０．１μmol/kg/日）のボーラス後に測定した血漿中アペリン濃度は、注射から１０分後に丁度２．５倍を超えて増加した。
【０１１５】
リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡ（１mg）を、ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ精製キット（Fermentas, USA）を使用して筋肉から単離した。全ＲＮＡを、ランダムヘキサマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Invitrogen, UK）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、以前に記載されているように（Boucher et al. 2005）実施した。
【０１１６】
結果
Ｉ．アペリンによる処置
１）ミオスタチン
【０１１７】
【表１】
2014534255.tif 000004
【０１１８】
２）ミオゲニン
【０１１９】
【表２】
2014534255.tif 000005
【０１２０】
３）ＭｙｏＤ
【０１２１】
【表３】
2014534255.tif 000006
【０１２２】
４）Ｍｙｆ５
【０１２３】
【表４】
2014534255.tif 000007
【０１２４】
ＩＩ．ＣＭＶ−ＫＯアペリン
【０１２５】
【表５】
2014534255.tif 000008
【０１２６】
結論
図１Ａ及びＢは、アペリンによる処置が、中年の年齢のマウスの大腿四頭筋におけるミオゲニン、ＭｙｏＤ及びＭｙｆ５などの筋原性マーカー発現を増加させたことを明瞭に実証する。平行して、この２８日間の処置は、これらの筋肉におけるミオスタチンの発現を減少させることができ、これは、筋形成におけるアペリンの有益な役割を確認する。
【０１２７】
図２は、マウスにおけるアペリンの欠失は（ＡＰＬ−ＣＭＶＫＯ）、筋肉の筋肉減少症のマーカーであるミオスタチンの僅かな増加を伴い、マウス大腿四頭筋における筋形成マーカー（ミオゲニン及びＭｙｆ５）の減少を促進することを示す（Kate T. Murphy, Rene Koopman, Timur Naim, Bertrand Leger, Jennifer Trieu, Chikwendu Ibebunjo, and Gordon S. Lynch. Antibody-directed myostatin inhibition in 21-mo-old mice reveals novel roles for myostatin signaling in skeletal muscle structure and function. The FASEB Journal 0892-6638/10/0024-4433を参照）。
【０１２８】
総合すると、これらの結果は、アペリンは、筋形成プロセスに関与し、そして加齢に伴う機能障害に対して戦うための可能性ある標的となり得ることを実証する。
【０１２９】
実施例２：
材料及び方法
ニューマン指数に従って筋肉減少症と診断された高齢の個体（ｎ＝３０）又は健康な高齢の個体（ｎ＝３０）の血漿中のアペリンを、市販のＥＬＩＳＡキット（Pheonix Pharmaceutical Inc., USA）によって単純盲検法で測定した。この指数は、付属器官の筋肉量及び脂肪量を考慮する。個体の四分位は、そのニューマン指数に従って実施し、そして極端な４分位数を選択して、筋肉減少症状態又は筋肉減少症ではない状態を決定した。
【０１３０】
結果及び考察
図３は、血漿中アペリンレベルは、筋肉減少症個体（ヒト）において有意に減少していることを示す。この減少は、肥満度指数又はインシュリンに相関しておらず、このことは、血漿中アペリンレベルは、加齢に伴う筋疾病の強力なバイオマーカーと考えることができることを示唆する。
【０１３１】
実施例３：筋肉代謝に対するアペリンの効果
材料及び方法
マウスを、ＩＮＳＥＲＭによって確立された原則及びガイドラインに従って取り扱った。Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型（ＷＴ）マウスはHarlan (Gannat, France)から入手した。筋肉特異的な不活性ＡＭＰＫを有するマウス（ＡＭＰＫ−ＤＮマウス）は、Moris J. Birnbaum博士（Howard Hughes Medical Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA）によって提供された。アペリン欠損（アペリン−／−）マウスは以前に記載されているように（１０）作成され、そしてＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに１０回超で戻し交配された。マウスを１２時間／１２時間の明暗サイクル（午前７時に点灯）の一定温度（２０〜２２℃）の加湿した（５０〜６０％）動物部屋で、食物及び水に自由に近付けるようにして慣用的に飼育した。Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ及びＡＭＰＫ−ＤＮマウスに、離乳から１０週令まで正常食を与え、その後、正常食（対照群）で維持するか、又は２０％のタンパク質、３５％の炭水化物及び４５％の脂肪を含む高脂肪食を与えた（Research Diets, New Brunswick, NJ）。アペリン処置は、２３週令の雄におけるインシュリン耐性の発症後に開始した。マウスに、２８日間、以前に記載されているように（７）、０．１μmol/kg/日のアペリン−１３（Phoenix Biotech）を腹腔内に１日１回注射した。年齢の一致した対照マウスに、同じ期間中、ＰＢＳを注射した。標準的なマウスもまた、２８日間の間、０．２μmol/kg/日の特異的ＡＰＪレセプターアンタゴニスト（Ｆ１３Ａ）（Phoenix Biotech）（１１）で、又はアペリンとＦ１３Ａとの組合せで処置した。全マウスを、摂食状態で最後のアペリン注射から２４時間後に殺滅した。高脂肪食マウスへのアペリン（０．１μmol/kgを腹腔内に）のボーラス後に測定された血漿中アペリン濃度は、注射から１０分後に２．４倍超で増加したが（注射前には４．１２±０．９６ｖｓ１．７３±０．２４ng/mL、ｎ＝５）、血漿中アペリン濃度は、処置終了時にＰＢＳ処置マウスとアペリン処置マウスとの間で差異はなかった。
【０１３２】
血漿測定
和光ＮＥＦＡキット（和光ケミカル）及びＰＡＰ１５０キット（bioMerieux）をそれぞれ用いて比色定量技術によって測定された血漿中脂肪酸（ＦＡ）及びＴＧ、並びに、血漿中レプチン、アディポネクチン（Quantikine; R&D Systems）及びアペリン（Phoenix Pharmaceuticals, Inc.）が、処置終了時に摂食状態で測定された。血糖値計（Accu-check; Roche Diagnostics）を用いて測定されたインシュリン血症（Mercodia, Uppsala, Sweden）及び糖血症が、断食状態で尾静脈からの血液で測定された。
【０１３３】
パルミチン酸の酸化及びエステル化
全ヒラメ筋又は脂肪組織におけるパルミチン酸の酸化が、以前に記載されているように決定された（１２）。前記組織を、１．５％ＦＡ非含有ＢＳＡ、５mmol/Lのグルコース、１mmol/Lのパルミチン酸、及び０．５μCi/mLの［１４Ｃ］パルミチン酸（PerkinElmer）を含む改変クレブス・ヘンセレイト緩衝液中で６０分間かけてインキュベーションした。インキュベーション終了時に、組織を取り出し、そして８００μLの溶解緩衝液中でホモジナイズした。完全酸化は、インキュベーション緩衝液を１mLの１mol/LのＨ２ＳＯ４を用いて酸性化することによって決定され、そして１４ＣＯ２を、封をしたガラスバイアル中の０．５mLのマイクロチューブ中に入れた水酸化ベンゼトニウム（Sigma-Aldrich）によって補足した。１２０分後、マイクロチューブを取り出し、そしてシンチレーションバイアル中に入れ、そして放射能を計測した（Cytoscint; MP Biomedicals）。合計で５００μLのホモジネートをガラスチューブに入れて、クロロホルム−メタノール（２：１）及び２mol/LのＫＣｌ−ＨＣｌで脂質を抽出した。遠心分離後、水相（５００μL）を液体シンチレーションによって定量して、酸に可溶性の代謝物の産生（不完全酸化）を決定し、そして有機相（２００μL）を使用して、以前に記載されているように（１２）パルミチン酸のエステル化を測定した。
【０１３４】
ミトコンドリアでのＯ２消費測定
Ｏ２の消費を、以前に記載されているように（１３、１４）、呼吸計（Oxygraph-2k; OROBOROS INSTRUMENTS, Innsbruck, Austria）を使用してヒラメ筋から調製された新鮮な透過処理された線維上で測定した。最初に、４mmol/Lのリンゴ酸塩混合物あたり２０mmol/Lのグルタミン酸を注入して、複合体Ｉの活性（ｇｍＳｔａｔｅ２）を評価した。その後、複合体Ｉを、５μmol/Lのロテノンの添加によって遮断した。その後、１０mmol/Lのコハク酸を加えて、複合体ＩＩの活性（ｓＳｔａｔｅ２）を評価した。Ｓｔａｔｅ３の呼吸が、１０mmol/LのＡＤＰのさらなる添加によって得られた。各状態についてのＯ２消費を、ＤａｔａＧｒａｐｈソフトウェアを使用して計算した。
【０１３５】
透過型電子顕微鏡
ヒラメ筋を切断して小さな破片とし、そして以前に報告されているように（１５）固定した。その後、組織を切断し、そして銅グリッド上に載せ、そして高分解能カメラを備えた日立ＨＵ１２Ａ透過型電子顕微鏡を用いて観察した。得られた写真をＬｕｃｉａＧソフトウェアを用いて分析した。
【０１３６】
ミトコンドリアＤＮＡ分析
全ＤＮＡを、市販のキット（DNeasy; QIAGEN）を使用してヒラメ筋から抽出した。ミトコンドリア（ｍｔ）ＤＮＡの含量を、以前に記載されているように（１５）、ミトコンドリアにコードされる遺伝子（ＣＯＸ１）と核にコードされている遺伝子（シクロフィリンＡ）の閾値サイクル比を測定することによって、リアルタイム定量ＰＣＲを使用して計算した。
【０１３７】
骨格筋アシルカルニチン、ジアシルグリセロール及びＴＧレベルアシルカルニチンの測定
筋ホモジネートの一部（２０μL）を、フィルター膜（Protein Saver 903 cards; Whatman）上にスポットした。その後、乾燥したスポットを、報告されているように（１７）処理した。簡潔に言えば、アシルカルニチンを、ブタノールＨＣｌの添加によって誘導体化し、そしてＮｅｏＧｒａｍＭＳＭＳ−ＡＡＡＣキット（PerkinElmer）の試薬を用いて処理した。遊離カルニチン及びアシルカルニチンを、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計によって定量した。データを、２７９５高速液体クロマトグラフィーモジュール及びＭａｓｓＬｙｎｘ４．１オペレーティングシステムによって制御されたデータシステムの備えられた、Micromass Quattro Micro API分光計（Waters, Milford, MA）を使用して得た。
【０１３８】
中性脂質（ジアシルグリセロール及びＴＧ）
筋肉（５〜１０mg）を、５mmol/LのＥＧＴＡあたり２mLのメタノール（２：１ｖ／ｖ）中でＦＡＳＴ−ＰＲＥＰ（MP Biomedicals）を用いてホモジナイズした。全１００μLを蒸発させ、乾燥ペレットを０．１mLのＮａＯＨ（０．１mol/L）中に一晩かけて溶解し、そしてタンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄアッセイを用いて測定した。０．９mLのホモジネートに対応する中性脂質を、Bligh and Dyer (18)に従って、クロロホルム／メタノール／水（２．５：２．５：２．１、ｖ／ｖ／ｖ）中で内部標準の存在下で抽出し、そして以前に記載されているように（１９）測定した。
【０１３９】
マロニル−ＣｏＡアッセイ
マロニル−ＣｏＡレベルを、以前に記載されているように（２０）凍結したヒラメ筋上で測定した。簡潔に言えば、筋肉をポッターを用いて氷上でホモジナイズし（１mol/LのＫＰＯ４及び１０mmol/LのＥＤＴＡを含む２５０μLのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１０mgの組織）、そしてその後、遠心分離にかけた。その後、上清（１００μL）を１時間かけて３７℃でアッセイ緩衝液（２．５mmol/Lのジチオトレイトール、０．２mmol/LのＮＡＤＰＨ、０．０１％の遊離ＦＡ ＢＳＡ、１３μmol/Lのアセチル−ＣｏＡ、及び０．６３μＣｉの３Ｈ−アセチル−ＣｏＡを含むリン酸緩衝液）（PerkinElmer）、及び２５ｍＵのＦＡシンターゼ（Marc Prentki博士, Centre Hospitalier de l'Universite de Montreal Research Centre, Montreal, Ontario, Canadaによって提供された）と共にインキュベーションした。反応を２５μLの過塩素酸を用いて停止させ、その後、エタノール及び石油酸を加えた。全４mLの上層を、２mLの水を含む新しいチューブに移し、そして遠心分離後、３mLの上層を乾燥させ、そして１０mLのシンチレーション液を添加した後に放射能を測定した。
【０１４０】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析を、４〜１２％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ／ＸＴゲル（Bio-Rad）上にサンプル（溶解した筋肉）をローディングし、そして１／１，０００の希釈率で使用される抗リン酸化−ＡＭＰＫ−α抗体（Ｔｈｒ１７２）、抗リン酸化−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ抗体（ＡＣＣ）（Ｓｅｒ７９）（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）又は抗ＯｘＰｈｏｓ抗体（MitoSciences, Mundolsheim, France）でプローブしておいたニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell Bioscience）に転写することによって以前に記載されているように（４）実施した。膜を、全タンパク質についてβ−アクチン抗体又はＡＭＰＫ抗体又はＡＣＣ抗体を用いてプローブした。
【０１４１】
タンパク質アッセイ
サンプルの濃度を、製造業者の指示に従ってＤＣタンパク質アッセイキット（Bio-Rad）を使用して決定した。
【０１４２】
リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡ（１μg）を、ＲＮＡ ＳＴＡＴ（AMS Technology, Lutterworth, U.K.）を使用して筋肉から単離し、そしてランダムヘキサマー及びSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen, Paisley, U.K.）を使用して逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、以前に記載されているように（１）実施した。１８ＳリボソームＲＮＡの分析を、リボソームＲＮＡ対照ＴａｑＭａｎアッセイキット（Applied Biosystems）を使用して実施して、遺伝子発現を規準化した。
【０１４３】
グルコース取り込み
筋肉を単離し、そして２mg/mLのＢＳＡ、２mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、及び２０mmol/LのＨＥＰＥＳを含むクレブス−ヘンセレイト緩衝液（ｐＨ７．４）中で１０分間プレインキュベーションした。その後、筋肉を４５分間、１００nmol/Lのインシュリンの非存在下又は存在下で以前に報告されているように（４）インキュベーションした。
【０１４４】
統計学的分析
データは平均±ＳＥＭとして提示する。群間の比較は、Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェア（GraphPad Software）を使用して種々のパラメーターに関して行なった。二元配置分散分析を適用して、処置と時間との間の相互作用を検出した。適切である場合には、対応のある又は対応のないスチューデントｔ検定を適用した。Ｐ＜０．０５の差異を統計学的に有意と判断した。
【０１４５】
結果及び考察
ＨＦＤ（高脂肪食）マウスの骨格筋脂質代謝に対するex vivoにおけるアペリンによる慢性的な処置の効果
ＨＦＤマウスにおけるアペリン処置は、ＰＢＳ処置と比較した場合、ＩＭＴＧ及びＤＡＧの量を減少させない（図４Ａ）。アペリンによる処置はまた、ＴＧへのパルミチン酸の取り込みの速度に対して全く影響を及ぼさない（図４Ｂ）。脂質の運命をさらに調査するために、完全及び不完全な［１４Ｃ］パルミチン酸の酸化の両方を評価した。アペリンによる慢性的な処置は、ＰＢＳ処置と比較した場合、ヒラメ筋において、［１４Ｃ］パルミテートからＣＯ２への完全な酸化を有意に増加させた（図４Ｃ）。興味深いことに、不完全な酸化は、アペリンによる慢性的な処置によって有意に増加しなかった（図４Ｃ）。さらに、ＨＦＤアペリン−／−マウスのヒラメ筋において、完全な酸化は増加しなかった（アペリン−／−マウスにおいてタンパク質１ｇあたり２４３．５±９．６ｖｓ１９８．４±５９．９nmolのＣＯ２が放出される、ｎ＝３〜４）。総合すると、これらの結果は、アペリンによる処置が、肥満及びインシュリン耐性マウスの骨格筋における完全なＦＡＯ（脂肪酸の酸化）を促進することを示す。
【０１４６】
筋肉ミトコンドリア活性及び密度に対するＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置の効果
アペリンの効果に対するさらなる洞察を得るために、ミトコンドリア呼吸をまず、新鮮な透過処理された筋肉線維で評価した。グルタミン酸／リンゴ酸により駆動されるミトコンドリア呼吸における差異は、ＰＢＳ処置マウスとアペリン処置マウスの間には全く見られず、このことは、複合体Ｉ活性は、アペリンによる処置によって影響を受けなかったことを示唆する（データは示していない）。しかしながら、コハク酸により駆動されるミトコンドリア呼吸は、対照と比較してアペリン処置マウスの線維においては有意により高く、このことは、ＦＡＯに由来する補酵素を使用する複合体ＩＩの酸化能の増加を示唆する（図５Ａ）。コハク酸及びアデニル酸により駆動される呼吸もまた、アペリン処置マウスにおいて有意により高く、このことは、酸化的リン酸化能は、アペリンによる処置後にヒラメ筋において増加したことを示す。複合体ＩＩ、ＩＩＩ及びＶのタンパク質発現もまた、アペリン処置マウスにおいて有意に増加した（図５Ｂ）。さらに、ミトコンドリア含量の定量マーカーである増加したクエン酸シンターゼ活性もまた、対照と比較してアペリン処置マウスの筋肉ホモジネートに見られた（２．６２±０．０２ｖｓ２．９１±０．０７μmol/分/mg（タンパク質）、ｎ＝７〜９；P＜０．００１）。ミトコンドリア生合成を媒介する転写コアクチベーターであるペルオキシソーム増殖剤活性化レセプターγコアクチベーター１−α（ＰＧＣ１−α）の発現もまた、アペリン処置マウスの筋肉において有意に増加し、一方、ＰＧＣ１−βの発現は改変されなかった（図５Ｃ）。さらに、ミトコンドリア酸化的リン酸化及びミトコンドリア生合成を増加させるように協奏して作用する、核呼吸因子１（ＮＲＦ１）及びミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）の発現もアップレギュレーションされた。総合すると、これらの結果は、アペリンによる処置に応答して、ミトコンドリア生合成は、インシュリン耐性マウスの骨格筋において増加したことを強く示唆する。この仮説を試験するために、本発明者らは、筋肉のｍｔＤＮＡ及び密度を測定した。ｍｔＤＮＡと核ＤＮＡの比は、ＰＢＳ処置マウスよりもアペリン処置マウスのヒラメ筋において有意により高かった（図５Ｄ）。さらに、電子顕微鏡は、アペリンによる処置は、全ミトコンドリア含量の最大の画分である筋原線維内（ＩＭＦ）ミトコンドリアの密度を有意に増加させたことを実証した（図５Ｅ）。ミトコンドリア超微細構造のより少ない逆の変化（マトリックスの減少した電子密度及びクリステの減少）がまた、アペリン処置マウスのヒラメ筋のＩＭＦミトコンドリア及び筋細胞膜下（ＳＳ）ミトコンドリアの両方に観察され（図５Ｅ）、これはミトコンドリア機能及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの効果を強化する。
【０１４７】
アペリンの作用機序をより深く研究するために、アペリン作用におけるＡＰＪレセプターの関与をまず決定した。この目的のために、マウスを、同じ期間中、アペリン単独で又はアペリン及び特異的ＡＰＪレセプターアンタゴニスト（Ｆ１３Ａ）のいずれかを用いて処理した。Ｆ１３Ａアンタゴニストは、機能的アンタゴニストとして挙動した。Ｆ１３Ａ／アペリンにより処置されたマウスの筋肉においては、ＦＡＯ及びミトコンドリア生合成は、アペリン処置マウスと比較して抑制され（データは示していない）、このことはアペリンがＡＰＪ活性化を通してその有益な作用を発揮することを示す。
【０１４８】
次に、アペリンの作用を媒介する際のＡＭＰＫの役割を調べた。なぜなら、アペリンは、骨格筋においてＡＭＰＫを活性化することが知られており、そしてＡＭＰＫはＦＡＯ及びミトコンドリア生合成の両方に関与しているからである。アペリンによる処置は、インシュリン耐性マウスの筋肉においてＡＭＰＫ及びＡＣＣの両方のリン酸化を有意に増加させた（図６Ａ）。ＡＣＣ活性の阻害（リン酸化亢進の結果として）は、結果として、アペリン処置マウスの筋肉におけるマロニル−ＣｏＡ濃度の有意な減少をもたらした（図６Ｂ）。さらに、ＨＦＤ ＷＴアペリン処置マウスで観察された増加したＦＡＯ及びミトコンドリア生合成は、ＨＦＤ ＡＭＰＫ−ＤＮアペリン処置マウスの筋肉において完全に鈍り、そしてＰＧＣ１−α、ＴＦＡＭ及びＮＲＦ１の過剰発現は減少した（図６Ｃ〜Ｅ）。従って、ＡＭＰＫはアペリンの直接的な標的であり、そしてＦＡＯ及びミトコンドリア生合成に対するアペリンの作用にとって必要とされる。
【０１４９】
ＨＦＤマウスにおけるアペリンによる慢性的な処置は、筋肉のインシュリン感受性を向上させる
アシルカルニチンは、不完全なＦＡＯから生じる基質の異化反応の副産物を示す。上昇したアシルカルニチンレベルは、肥満及びインシュリン耐性に関連していることが示された。長鎖アシルカルニチンは、ＮＤ対照マウスと比較して、ＨＦＤインシュリン耐性マウスのヒラメ筋のホモジネートにおいて上昇していた（図７Ａ）。ＨＦＤアペリン処置マウスにおいては、アシルカルニチンレベル、特にＣ１６：１及びＣ１８：１種は、ＨＦＤ ＰＢＳ処置マウスと比較した場合に減少していたことは興味深い。アペリンによる慢性的な処置は、ヒラメ筋において完全なＦＡＯを増加させたが不完全なＦＡＯは増加させなかったので、本発明者らは、得られた低レベルのアシルカルニチンは、筋肉における改善されたインシュリン感受性と相関すると仮定した。実際に、インシュリンにより刺激されたグルコース取り込みは、ＰＢＳ処置マウスと比較して、アペリン処置マウス筋肉において有意に増加した（図７Ｂ）。
【０１５０】
結論：
本発明者らは、アペリンによる慢性的な処置は、インシュリン耐性マウスの骨格筋において、完全なＦＡＯ、ミトコンドリア呼吸能及びミトコンドリア生合成を増加させることを示す。ミトコンドリアへの脂質の流入は、低下したアシルカルニチンレベルと関連し、このことはＦＡＯとトリカルボン酸サイクルとの間のより強固な共役を示唆する。このようなより強固な共役は、インシュリン感受性を高めるために重要であるようである。なぜなら、アペリン処置マウスの筋肉において、インシュリンにより刺激されたグルコース輸送の増加が観察されるからである。筋肉において増加したＦＡＯ及びミトコンドリア生合成並びに全体的な脂肪症の減少は、アペリンによる慢性的な処置で観察されたインシュリン感受性の全体的な改善に寄与し得る。
【０１５１】
アペリンによる慢性的な処置は、脂質及びグルコースの両方の代謝の回復をトリガーする。アペリンによる慢性的な処置は、増加したミトコンドリア生合成及びＦＡＯとトリカルボン酸サイクルの間のより強固な調和を通して、筋肉のミトコンドリア動作を最適化する。従って、アペリン又はアペリン模倣体のようなＡＰＪレセプターアゴニストは、加齢に伴う機能障害のようなミトコンドリア中のエネルギー機序の問題を伴う疾病の処置又は予防に、より特定すると骨格筋の機能障害（筋肉減少症のような）又は心筋の機能障害の処置又は予防に使用されるべきである。
【０１５２】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2014534255.tif 000009
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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