(57)【要約】  本発明は、特に、少なくともヘマグルチニン遺伝子が突然変異体Ｄ２２２とオセルタミビルに耐性のあるノイラミニダーゼ遺伝子を含有するインフルエンザウイルスに対するワクチンに関する。前記インフルエンザウイルスワクチンには、特に人において特異的免疫反応を増加させる突然変異体を含んでいる。前記ウイルスはオセルタミビル及び超強毒菌に耐性のあるインフルエンザに対するワクチン生成に有効である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記で構成されるインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスワクチン
ａ）パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのウイルス１の分離株から派生したアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４を持つヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子分節、及び
ｂ）パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのウイルス１の分離株から派生したアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９を持つノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子分節。
【請求項２】
ＨＡ遺伝子分節が、ウイルス１の４分節（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＨＡ遺伝子分節が、パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスクレード７のＨＡ特定配列を持つ請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
ＨＡ遺伝子分節が、野生型パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスＤ２２２残基の突然変異体を持つ請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
ＨＡ遺伝子分節が、Ｄ２２２Ｅ突然変異体を持つ請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ＨＡ遺伝子分節が、野生型パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに関連するＳ２０３Ｔ突然変異体を持つ請求項４に記載のワクチン。
【請求項７】
ＨＡ遺伝子分節が、その他、Ｐ８３ＳとＩ３２１Ｖの突然変異体を一つ以上持つ請求項４に記載のワクチン。
【請求項８】
ＮＡ遺伝子分節が、ウイルス１の分節６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
ＮＡ遺伝子分節が、パンデミックインフルエンザＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの野生型に関連するＹ２７５Ｈ突然変異体を持つ請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
ＮＡ遺伝子分節が、その他、Ｉ１０６ＶとＤ２４８Ｎの突然変異体を一つ以上持つ請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
さらに、
ｃ）パンデミックインフルエンザＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの分離株から派生したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列を持つペプチドＭ１をコード化する基質遺伝子（ＭＡ）を持つ請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
ＭＡ遺伝子分節が、ウイルス１の分節７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
基質遺伝子（ＭＡ）分節が、パンデミックインフルエンザＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの分離株から派生したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のアミノ酸配列を持つペプチドＭ２をコードする請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
ペプチドＭ１が、Ａ１９８Ｐ突然変異体を持つ請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに応じて、手段の一つとして患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含むインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせる方法。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれかに応じて、一つの手段として患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含む超強毒なインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせる方法。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれかに応じて、一つの手段として患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含むオセルタミビルに抵抗力のあるインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせる方法。
【請求項１８】
請求項１から１４のいずれかに応じて、再構成ワクチンであるワクチン。
【請求項１９】
請求項１８に応じて、インフルエンザの再構成ウイルスが従来の再構成によって得られるワクチン。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれかに応じて、弱毒化生ワクチン又は不活化ワクチンであるワクチン。
【請求項２１】
請求項２０に記載の、経口又は経鼻投与できるように生成されるワクチン。
【請求項２２】
請求項１から１４のいずれかに応じて、一つの手段として、ウイルスキャリアと再構成インフルエンザウイルスの混合物、及び任意でアジュバントを含む超強毒インフルエンザウイルス株に対して患者に免疫を持たせるためのワクチンの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスに対するワクチン、特にＨ１Ｎ１亜型インフルエンザパンデミックウイルスの超強毒株に対するワクチンに関するものである。本発明は、ＨＡ及びＮＡ分節に突然変異体を保有するインフルエンザに対するワクチンの生成において有効なインフルエンザウイルス株を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザはオルソミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスを原因とする。ウイルスには、インフルエンザウイルスには原因となるＡ型、Ｂ型、Ｃ型の３種類がある。Ａ型インフルエンザは哺乳類（ヒト、豚、フェレット、馬）及び鳥に感染する。これは、世界中に流行したウイルスなので、人にとって重要な問題である。Ｂ型インフルエンザは（インフルエンザＢとしても知られている）、人だけに感染し、稀にインフルエンザが局地的に発生する。インフルエンザＣも人のみに感染し、感染者の多くが若者で、稀に重篤な病気となる。
【０００３】
インフルエンザＡ型ウイルスは、人や馬、豚、フェレット、鳥を含む広範な哺乳類に感染する。主な人病原体は、エピデミック及びパンデミックとなる。少なくともヘマグルチニン（Ｈ）の１５種類の血清及びノイラミニダーゼ（Ｎ）の９種類の血清が知られている。豚及び鳥は特に、これらと動物間での接触により人に伝播する可能性のあるウイルスの遺伝的多様性及び抗原的多様性の発生源を生み出す特に重要な保菌動物であると考えられている。インフルエンザＢ型ウイルスは哺乳類のみに感染し、病気の原因となるが、一般的にＡ型ほど深刻なものではない。Ａ型との違いは、Ｂ型が区別できる血清型を有していないことである。
【０００４】
インフルエンザＣ型ウイルスも人のみに感染するが、稀にしか病原とならない。このウイルスは遺伝的及び形態学的にＡ型とＢ型と異なる。
他の多くのウイルスと比較して、このインフルエンザゲノムは、ＤＮＡではなくＲＮＡから成る。このゲノムには８つの分節が含まれ、この８つの分節を含むウイルス粒子のみが成長できる。（ＳｔｅｉｎｈａｕｅｒＤＡ，  Ｄｋｅｈｅｌ  ＪＪ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  ３６：  ３０５−３３２）。
【０００５】
インフルエンザウイルスには４つの抗原が存在し、タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＡ）、マトリックス（Ｍ）及びヌクレオカプシド（ＮＰ）がある。ＮＰは、ヒトインフルエンザウイルスの分類ベースとなるＡ、Ｂ及びＣの３つの形態を有する特有の抗原である。マトリックスタンパク質（Ｍタンパク質）はヌクレオカプシドを囲み、粒子量の３５％〜４５％を形成する。表面に棒状突起状の表面糖タンパク質が２種類見られる。ヘマグルチニン（ＨＡ）はＨＡ１とＨＡ２の２つのサブユニットから形成されている。ウイルスがＨＡを介して細胞受容体に結合する。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の微粒子がエンベロープに微量に存在する。流行しているヒトインフルエンザウイルスは、１年から翌年にかけ突然変異する傾向があることは明白で、反復するエピデミックの原因となる。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、（８）分節に分かれているゲノムを有する稀な変わったウイルスの一つである。ゲノムの分節性も、異なる変わったウイルス間でのすべての遺伝子の変化を可能としている。（異なる２つのウイルスが同じ細胞に感染した場合、遺伝子分節の交換による）組み換えの潜在力を増幅する。すなわち、ある細胞が異なる２つのインフルエンザウイルスに感染した場合、分節は、それぞれ元のウイルスの分節を有する新たなウイルスを作り出すために再集合される可能性がある。これは、自然界において新しいインフルエンザウイルスの出現を早める原因になる。２つのウイルスが混合された結果として新しいゲノムが組み合わされる。このプロセスも研究所で複製できる（ワクチンウイルス作成のために使用される）。極東の豚で組み換えられる鳥とヒトのウイルスがヒトの悪性ウイルスの進化を可能としている。
【０００７】
インフルエンザウイルスの遺伝的可変性も、ワクチン設計、病原性、及び自然宿主から出現し世界的パンデミックを起こす新ウイルスの能力に対する潜在的で深刻な影響を有している。
２００９年のパンデミックウイルス（Ｈ１Ｎ１）は、世界中で進化し、パンデミックの過程で、初期の混合性クレードパターンから特定クレード（クレード７型）に変化した。このクレードから成るウイルスが世界中に飛散したパンデミックの主な要因であった。ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質配列中の突然変異体Ｓ２０３Ｔはクレード７型の分離株特有のものである。（Ｖａｌｌｉ  ＭＢ他。Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｈ１Ｎ１）２００９  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｔｅ  ｐｈａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２００９  ｐａｎｄｅｍｉｃ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．２０１０年３月３日：ＲＲＮ１１４９）。
【０００８】
突然変異体Ｓ２０３Ｔを含むクレード７の分離株のうち、ヘマグルチニンＨＡ１遺伝子配列において２２２位（ナンバリングＨ３で２２５）に相当するアミノ酸に変化が起こり、そこでアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変わり、重大な臨床結果に結びついている。２００９年４月から９月の間の異なる時間的測定点において、突然変異体Ｄ２２２ＧがＨ１  Ｎ１  ｐｄｍ分離株としてジェンバンクに登録された。（Ｃｈｅｎ  ＧＷ，  Ｓｈｉｈ  ＳＲ（２００９）Ｇｅｎｏｍｉｃ．ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｐａｎｄｅｍｉｃ（Ｈ１Ｎ１）２００９  ｖｉｒｕｓ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ）。
【０００９】
インフルエンザワクチンは、高度に変化するインフルエンザウイルスから身を守るための年ごとのワクチンである。季節性インフルエンザに対して注射される各ワクチンには、３つのインフルエンザウイルス、すなわち、ウイルスＡ（Ｈ３Ｎ２）、２００９年流行性ウイルスＨ１Ｎ１、そしてインフルエンザウイルスＢが含まれている。（ｗｗｗ．ｄｃｄ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｐｕｂｓ／ｖｉｓ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｖｉｓ−ｆｌｕ．ｐｄｆ）。しかし、対パンデミックインフルエンザワクチンは、ＨＡタンパク質に突然変異体Ｄ２２２Ｇを有するＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対して効果が弱いだけである。
【００１０】
従って、Ｈ１Ｎ１のＤ２２２Ｇ変異のウイルス株、及びそれに対する強い抗体を作る抗原が早急に必要である。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザウイルスの強い毒性を持ち、或いは／又はオセルタミビルに抵抗力のあるウイルスに対するワクチンの生成方法及び配合に関する。ＨＡのＤ２２２残基及びＮＡのＳ２７５残基において突然変異体を含むワクチンの配合を提供する。
【００１２】
本発明は、少なくとも、Ｈ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのパンデミックインフルエンザのウイルス１の分離株から派生したアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４を持つヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子分節、及び、Ｈ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのパンデミックインフルエンザのウイルス１の分離株から派生したアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９を持つノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子分節を含むインフルエンザウイルスを有するインフルエンザに対するウイルスワクチンを提供する。
【００１３】
特に実施例の一つにおいて、ＨＡ遺伝子分節は、ウイルス１の４分節（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ。ＨＡ遺伝子分節のいくつかにはＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのパンデミックインフルエンザクレード７のＨＡ特定配列が含まれる。
【００１４】
特に実施例の一つにおいて、ＨＡ遺伝子分節が、野生型パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのＤ２２２残基の突然変異体を含む。特に実施例の一つにおいて、ＨＡ遺伝子分節が、Ｄ２２２Ｅ突然変異体を含む。特に実施例のいくつかにおいて、ＨＡ遺伝子分節が、野生型パンデミックインフルエンザのＨ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに関連するＳ２０３Ｔ突然変異体を含む。
【００１５】
本発明は、ＨＡ遺伝子分節がその他、Ｐ８３ＳとＩ３２１Ｖの突然変異体を一つ以上含むワクチンに関する。
【００１６】
特に実施例の一つにおいて、ＮＡ遺伝子分節が、ウイルス１の分節６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を含む。ＮＡ遺伝子分節が、Ｈ１／Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの野生型パンデミックインフルエンザに関連するＹ２７５Ｈ変異を含む。
【００１７】
本発明は、ＮＡ遺伝子分節がＩ１０６ＶとＤ２４８Ｎの突然変異体を一つ以上含むワクチンに関する。
【００１８】
本発明のワクチンにはさらに、ｃ）Ｈ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのパンデミックインフルエンザのウイルス１の分離株から派生したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のアミノ酸配列を持つペプチドＭ１をコード化する基質遺伝子（ＭＡ）を含むことができる。
【００１９】
特に実施例の一つにおいて、ＭＡ遺伝子分節が、ウイルス１の分節７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を含む。
【００２０】
特に実施例のいくつかにおいて、基質遺伝子（ＭＡ）分節がＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのパンデミックインフルエンザのウイルス１の分離株から派生したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のアミノ酸配列を持ちながら、ペプチドＭ２をコード化する。特に実施例のいくつかにおいて、ペプチドＭ１がＡ１９８Ｐ突然変異体を含む。
【００２１】
本発明は、インフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせるためにここで示す方法に関してであり、手段の一つとして患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含む。
【００２２】
本発明は、超強毒なインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせるためにここで示す方法に関してであり、手段の一つとして患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含む。
【００２３】
本発明は、オセルタミビルに抵抗力のあるインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせるための方法に関してであり、手段の一つとして患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含む。
本発明は、ここで示されるワクチンに関してであり、そのワクチンは再構成ワクチンである。実施例のいくつかにおいて、インフルエンザの再構成ウイルスは従来の再構成手段で得られる。
【００２４】
本発明は、ここで示されるワクチンに関してであり、そのワクチンは弱毒化生ワクチン又は不活化ワクチンである。実施例のいくつかにおいて、このワクチンは、経口又は経鼻投与できるように生成される。
【００２５】
本発明は、超強毒インフルエンザウイルス株に対して患者に免疫を持たせるためのワクチンの生成方法に関してであり、手段の一つとして、ウイルスキャリアとここで説明するインフルエンザウイルスを混合し、任意でアジュバントを混合することを含む。
【００２６】
これらの観点は、以下の実施例、特にイラストを添付する実施例により明らかになるが、発明の新たな概念の考え方や発明範囲から離れることはないが、実施例に変動や変化が見られることがある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
以下の図は、本明細書の一部であり、本発明の一定の観点をより詳細に説明するために含まれている。これらの図をここで紹介する実施例詳述とともに参照すれば発明をより良い方法で理解できる。特許又は本申請にはカラーの図を１つ以上含む。当局は請求があった場合、その経費を負担すればカラーの図の付いた本特許又は公表文書のコピーを提供する。
【００２８】
【図１】リアルタイムＰＣＲによるウイルス負荷の定量化の例を示す。
【図２】リアルタイムＰＣＲによるＨ１Ｎ１亜型の検出用標本の配列を示す。
【図３Ａ】リアルタイムにおけるサーマルサイクラーＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ２．０のインターフェイスのグラフィック例を蛍光曲線で示す。
【図３Ｂ】リアルタイムにおけるサーマルサイクラーＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ２．０のインターフェイスのグラフィック例をＲＮＡｓｅＰ検出（ＲＰ）検出臨床標本で示す。
【図４Ａ】ベロ細胞株においてＨＺＦＬＵＪＡＬインフルエンザウイルスの順応を示す。前記ウイルスはベロ細胞において４つの継代培養まで効果的に複製することができた。
【図４Ｂ】ＭＤＣＫ細胞株においてＨＺＦＬＵＪＡＬインフルエンザウイルスの各順応フェーズを示す。ＨＺＦＬＵＪＡインフルエンザウイルスはＭＤＣＫ細胞において３つの継代培養の後で効果的に複製できた。
【図５】ＥＬＩＳＡによって検出されたＨ１  Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対する総抗体量を示す。
【図６Ａ】ＥＬＩＳＡによって血清で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＭ抗体を示す。
【図６Ｂ】ＥＬＩＳＡによって血清で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＧ抗体を示す。
【図７Ａ】ＥＬＩＳＡによって血清で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＧ２Ａ抗体を示す。
【図７Ｂ】ＥＬＩＳＡによって血清で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＧ２Ａの用量反応関数を示す。
【図８Ａ】ＥＬＩＳＡによって呼吸粘膜で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＡ抗体を示す。
【図８Ｂ】ＥＬＩＳＡによって呼吸粘膜で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＡの用量反応関数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に使用されている用語は、当分野内、本発明の文脈内、及び各用語が使用される特定文脈内では、一般用語である。本発明を記述するために使われる用語のいくつかは、後ほど、又は、本発明の記述に関して実施者への追加手引きを提供するため本明細書の他の文節で論じる。都合上、用語のいくつかはイタリック体及び／又は引用符などを使い、強調されている。用語に付された強調文字の利用は、その文字の視点や意味に影響するものではなく、その文脈において、強調に関わらず、用語の視点や意味は同じである。１つ以上の方法で同じものを表現している。
【００３０】
従って、ここで論じる用語は、言い換えたり、同義語を使用したりしているが、ここで特別に扱う必要性はない。特定の用語に対して同義語が使用されている。同義語を使用してもその他の同義語の使用を排除するものではない。ここで論じる用語例は、本明細書のいずれの箇所に使用する目的として、本発明をより理解しやすくするためである。同様に、本明細書に記載される複数の実施例は、本発明を限定するものではない。
【００３１】
特に定義がない限り、ここで使われる技術用語及び科学用語は、本発明に属する技術分野で理解されるものと同じ意味を持つ。対立がある場合、定義を含む本文書は、有効な参照文書となる。以下の参照文書は、技術に基づき、本発明で使われる用語の一般的な定義を提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．１９９３）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．１９９０）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ａｎｄ  Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｇｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。
【００３２】
一般的に、細胞及び繊維培養、分子生物学及びプロテイン、化学及びポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド交配、及びここに記述されるそれらの技術に関して使われる名称はよく知られており、技術分野で共通して使用されている。標準的技術は組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び組織変成向けに使用される（例：エレクトロポレーション及びリポフェクション）。製造者の仕様にもとづいて、或いは最新式で共通して得られたり、ここで記述されるように酵素反応や精製法が行われる。特に反する記載がない限り、本発明の実施には、技術分野内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組み換えＤＮＡ技術の従来の方法が使われ、これらの多くが説明のために本文書に記載される。このような技術は、以下のような文献で詳しく説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）。
【００３３】
亜型インフルエンザウイルスは、以下の表１に示すように８つの分節に分かれたマイナス鎖ＲＮＡから構成されるゲノムを有する。（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ  ＤＡ，Ｓｋｅｈｅｌ  ＪＪ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  ３６：３０５−３３２）。循環ヒト株は、年々突然変異体を蓄積する傾向があり、流行パンデミックを繰り返すことで知られている。しかし、ゲノムの分節性質も異なるウイルス株間で全遺伝子の交換ができる。インフルエンザウイルスの遺伝的可変性も、ワクチン設計、病原性、及び自然宿主から出現し世界的パンデミックを起こす新ウイルスの能力に対する潜在的で深刻な影響を有している。
2014511119.tif 000003
【００３４】
合計９５０個のウイルスが細胞培養により分離され、そこから毛細管シークエンシングにより部分配列が得られた、すなわち、１９３個のノイラミニダーゼ（ＮＡ）と１９７個のヘマグルチニン（ＨＡ）である。従って、ＮＡとＨＡはＨ１Ｎ１亜型において最もよく変化する配列であるため、コンピューターによる解析（系統発生解析及びＢＬＡＳＴ）では、３８６個すべて（ＨＡとＮＡシーケンス）が２０グループに分かれていることが示された。従って、各グループ代表メンバーの完全ゲノムは、パイロシークエンシング装置４５４チタニウムロシュ（ＲＯＣＨＥ）でパイロシークエンスされた。Ｈ１  Ｎ１亜型の合計２０個の完全ゲノムが得られ、各Ｈ１Ｎ１亜型は８個の遺伝子で構成されている。
【００３５】
シークエンシングデータは異なる３つの突然変異体を有する４つのウイルス分離体を示した。（ｉ）ＮＡ（オセルタミビル（登録商標））、ＨＡ（超強毒性）及びマトリックス分節に突然変異体を有する  Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックウイルス（ウイルス１）、（ｉｉ）  ＮＡ及びマトリックス分節に突然変異体を有する  Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックウイルス（ウイルス２）、（ｉｉｉ）マトリックス分節（ＭＡ）に突然変異体を有する  Ｈ１  Ｎ１亜型パンデミックウイルス（ウイルス３）、及び（ｉｖ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）分節に突然変異体を有する  Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックウイルス（ウイルス４）である。
【００３６】
アスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）に変わる２２２位（ナンバリングＨ３では２２５）に相当するアミノ酸においてヘマグルチニンＨＡ１遺伝子配列の変化は、重大な臨床結果と関連している。２００９年４月から９月の間の異なる時間的測定点において、突然変異体Ｄ２２２ＧがＨ１Ｎ１  ｐｄｍ分離株としてジェンバンクに登録された。（Ｃｈｅｎ  ＧＷ，Ｓｈｉｈ  ＳＲ（２００９）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｐａｎｄｅｍｉｃ（Ｈ１Ｎ１）２００９  ｖｉｒｕｓ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ）。
【００３７】
シアル酸−α２，３−ガラクトース（受容体α２，３）又はシアル酸−α２，６−ガラクトース（受容体α２，６）へのインフルエンザウイルスの選択的結合が親和性を決定し、受容体α２，３及びα２，６がそれぞれ下部気道細胞及び上部気道細胞において優勢である。（Ｓｈｉｎｙａ  Ｋ，Ｅｂｉｎａ  Ｍ．Ｙａｍａｄａ  Ｓ，Ｏｎｏ  Ｍ，Ｋａｓａｉ  Ｎ，Ｋａｗａｏｋａ  Ｙ．Ａｖｉａｎ  ｆｌｕ：ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００６；４４０（７０８３）：４３５−６）。
【００３８】
最近のマイクロアレイ解析では、ヘマグルチニン（ＨＡ）Ｄ２２２Ｇの置換により受容体α２，６を混合受容体α２，３／α２，６の特異性に変化させる可能性を示唆しており、これにより受容体α２，３への結合が増加し、病気を重篤化している。（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｊ，Ｂｌｉｘｔ  Ｏ，Ｇｌａｓｅｒ  Ｌ，Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＪＫ，Ｐａｌｅｓｅ  Ｐ，Ｐａｕｌｓｏｎ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃａｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｄｅｒｎ  ａｎｄ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．００６；３５５（５）：１１４３−５５）。この順位は、受容体の結合特異性に影響を与え、ウイルス１９１８（Ｉｄ．）の２つの変異ウイルスとの間のＤからＧの差は、混合α２−３／α２−６の特異性と結びついたシアル酸α２−６の優先変化と相関関係にある。すなわち、受容体α２−３発現細胞が多くある気道においてウイルスがより感染しやすくなる可能性があり、これにより超強毒性が生じる。
【００３９】
しかし、Ｄ２２２Ｇ置換を伴う重篤な症例と異なる系統発生グループは観察されなかった（Ｍａｋ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ２２２Ｇ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｏｆ  ２００９  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５，Ｉｓｓｕｅ  １，０８  Ａｐｒｉｌ  ２０１０）。
【００４０】
２２２位ＨＡ１において変異を有していることが観察されたウイルスはすべて、ＨＡ１（クレード７の特徴）においてＳ２０３Ｔ置換を特徴とするパンデミックＨ１Ｎ１ウイルスサブクレードに属する。これも、超強毒株及び他のＨ１Ｎ１亜型株に対して特有な抗原性領域をさらすアミノ酸の嚢で囲まれている。このサブクレードは、ヨーロッパ及び他の北半球地域でパンデミックウイルスの大部分を形成している。南半球に関しては、このサブクレードもかなり散らばった状態にある。
【００４１】
現在、ＷＨＯで閲覧可能な共有データを基にすると、Ｄ２２２Ｇ置換の有病率は１．８％以下である（ＨＡシーケンスの２７５５以上の内５２件を検出）。確認された致死例３６４件の内、２６件（７．１％）のウイルスがＤ２２２Ｇ置換を有していた。これらの症例において基本的医療潜在条件に関する臨床情報は限られている。Ｄ２２２Ｇ置換を有する２００９年のパンデミックウイルス（Ｈ１Ｎ１）は、ＷＨＯの推奨するワクチンウイルスである、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスに抗原的に類似している。
【００４２】
前述（Ｈ１Ｎ１）２００９年の亜型ウイルスの中に、（ｉ）ヘマグルチニン（ＨＡ）内にＧｌｙ２２２突然変異体、及び（ｉｉ）オセルタミビルへの耐性に関連したノイラミニダーゼ（ＮＡ）内にＴｙｒ２７５突然変異体が確認された（ＭｃＫｉｍｍ−Ｂｒｅｓｃｈｋｉｎ  ＪＬ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ２０００；４７：１−１７；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７（２００９）６３１７−６３２３）。従って、両方の突然変異体は重要な表現型（超強毒性及びオセルタミビルへの耐性）と関連しており、抗原性領域がこれらの突然変異体と関係している。本候補ワクチンは、両方の変異株とＨ１Ｎ１亜型野生型を効率的に認識できる。
【００４３】
Ｄ２２２Ｇウイルスの３変種は、オセルタミビルへの耐性に関係したノイラミニダーゼ（ＮＡ）内にＨ２７５Ｙ置換を有している。ＷＨＯ報告書。２００９年（Ｈ１Ｎ１）亜型インフルエンザパンデミックウイルスのヘマグルチニン内のＤ２２２Ｇのアミノ酸置換の予備検査。２００９年１２月２８日（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｓｗｉｎｅｆｌｕ／ｃｐ１６５＿２００９＿２８１２＿ｒｅｖｉｅｗ＿  ｄ２２２ｇ＿ａｍｉｎｏ＿ａｃｉｄ＿ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ＿ｉｎ＿ｈａ＿ｈ１ｎ１＿ｖｉｒｕｓｅｓ．ｐｄｆ）。
現在も使用されるパンデミックワクチンは超強毒性突然変異体、及びオセルタミビルへの抵抗力のある突然変異体を識別するが、突然変異体が受容体の結合くぼみに位置し、ヘマグルチニンＨ１の抗原部位になくても、スウェーデン感染症研究所及び当研究所で実施された事前抗原的特徴では、野生型Ｈ１Ｎ１の亜型パンデミック株と比較して現在のパンデミックワクチンに対する抗血清を含む変異ウイルスの顕著な減少反応が見られた。従って、現在のワクチンは、世界中に急速に拡大した新変異株を識別するために候補となっているワクチンほど効果的ではない。
【００４４】
ウイルスゲノムの分節７（マトリックス分節）の３’末端にある突然変異体は、インフルエンザ分節ＢＭと相似（６０％）していることを示す。この突然変異体は人において特異的免疫反応を増やし、Ｂ型インフルエンザから保護することもできることが以前に報告されていた。しかし、特にウイルスマトリックス及び核タンパク質抗原に対する細胞性免疫は感染を防ぐことはできないが、ウイルス除去や治癒には重要である。
【００４５】
４つのウイルス分離のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の特定により推察された。ウイルス１はＨＡ、ＮＡ及びＭＡタンパク質に関連する突然変異体を有していた。ウイルス２は、ＮＡ及びＭＡタンパク質に関連する突然変異体を有していた。ウイルス３はＮＡタンパク質に関連する突然変異体を有していた。ウイルス４はＭＡタンパク質に関連する突然変異体を有していた。
【００４６】
ＨＡ配列はＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザ配列の野生型に関連する突然変異体を求めて解析された。
【００４７】
分離株４株は、Ｈ１Ｎ１亜型パンデミック株のクレード７で優勢にあると思われるＰ８３ＳとＩ３２１Ｖの突然変異体を有していた。
【００４８】
ウイルス１も、（ｉ）特異的変異体Ｓ２０３Ｔのあるクレード７を持ち、（ｉｉ）ＨＡ配列の２２２位に突然変異体Ｄ２２２Ｅを持っている。２２２〜２２３位において、ウイルス１は野生型Ｄ−Ｑの代わりにＥ−Ｒアミノ酸を持っている。ウイルス１のＨＡ配列の完全な一致は亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質にある（Ａ／Ｎｏｖｇｏｒｏｄ／０１／２００９（Ｈ１Ｎ１））。
【００４９】
ウイルス１、２及び４は、野生型Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９の配列に関するＮＡ（６）分節のＩ１０６Ｖ、Ｄ２４８Ｎ、Ｙ２７５Ｈ残基に突然変異体を有している。突然変異体Ｙ２７５Ｈはオセルタミビルに抵抗力がある。これら３つの分離株に見られるＮＡ配列の完全な一致は他の分離株で見られる。
【００５０】
現在の野生型ワクチンは、これら特異領域にあるＨＡとＮＡ両方の突然変異体を有するウイルス１に対して効果が低い（Ｐｕｚｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｄ２２２Ｇ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｐａｎｄｅｍｉｃ（Ｈ１Ｎ１）２００９  ｖｉｒｕｓ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６（５）：８６３−８６５（２０１０）。超強毒性（ＨＡ領域においてＤ２２２Ｇ／Ｅ）とオセルタミビルに抵抗力（ＮＡ領域においてＹ２７５Ｈ）のある（ウイルス１のような）ウイルスから生まれたワクチンは、野生型Ｈ１Ｎ１のパンデミックワクチンの非効率性を克服でき、超強毒性ウイルスから守ることもオセルタミビルへの抵抗力のあるウイルスからも保護できる。
【００５１】
ウイルス１、２及び３は、野生型Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９の配列に関係するＭ１領域（分節７）に突然変異体Ａ１９８Ｐを有している。さらに、これら分離株３株にはＭ２領域でＤ３４相当の残基がない。
【００５２】
この突然変異体が細胞性免疫を増やしている（しかし感染を防いでいない）ことが報告されている。突然変異を起こした領域は、ＭＡ領域ではＢ型インフルエンザウイルスとの配列において６０％相似しており、この突然変異体を有するウイルス分離株に対して生成されたワクチンは、Ｂ型インフルエンザに対する免疫を生成することができる。
【００５３】
また、突然変異体Ｍ１は、ウイルス除去及び回復のための治療対象として使用することもできる。
【００５４】
本発明の方法は、インフルエンザウイルス感染に対して免疫を与えるためにここで説明したインフルエンザウイルスの抗原を使用している。抗原が派生する特異的ウイルスは、保護を与える特異的ウイルスと同じ又は異なることがあり、その理由として、特に同じウイルスのサブタイプ内で様々なインフルエンザウイルス分離株同士で干渉効果がおこることが知られている。
【００５５】
現在使用中のインフルエンザワクチンは、全粒子ワクチン（ＷＶ）又はスプリットワクチン（ＳＶ）（「分割」又は「精製された表面抗原」とも呼ばれる）と呼ばれる。ＳＶワクチンは、残存ウイルスの化学的不活性化に続いて、脂質を含むウイルスエンベロープを可溶化した洗剤により破壊された精製ウイルスを含んでいるのに対し、ＷＶワクチンはそのまま不活化ウイルスを含んでいる。またインフルエンザに対する弱毒ウイルスワクチンも開発中である。従来のワクチンを調合する方法については、Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｆ．＆  Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，４ｄ  Ｅｄ．（Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｄ．），１４６４−６５（２００１）を参照することもできる。
【００５６】
ワクチンがひとつ以上のインフルエンザ株を含む一方、異なる株は典型的に別々に培養され、ウイルスが採取され、抗原が調合された後に混合される。或いは、インフルエンザウイルスの異なる分離株の異なる分節は、多能性ワクチンを作るために組み合わされることもできる。本発明のプロセスで使われるインフルエンザウイルス（複数）は再集合体菌株であるか、逆遺伝学技術で得られたものでもよい。ウイルスは、弱毒化していたり、温度に敏感又は低温適応であってもよい。病原性株と非病原性株の残りの６又は７分節からＨＡ及びＮＡウイルス分節を含む再集合体ウイルス株を使用することができる。本発明による免疫原性組成物に使われるインフルエンザウイルス抗原は、生ウイルス状態であっても、又は好ましくは不活化ウイルス状態であってもよい。ウイルスの不活化は、通常、ホルマリン又はβ‐プロピオラクトンなどの化学処理を伴う。不活化ウイルスが使用される場合、抗原は全ウイルス、スプリットウイルス又はサブユニットウイルスであってもよい。スプリットウイルスは、サブビリオン調剤を製造するために界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、トリトンＸ−１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム等）でビリオン処理することによって得られる。サブユニットワクチンは、インフルエンザ表面抗原、すなわちヘマグルチニン及びノイラミニダーゼのいずれか、又は両方を含む。インフルエンザ抗原は、またビロソームの形態で表すこともできる。
【００５７】
抗原がインフルエンザウイルス（むしろインフルエンザウイルスの培養を伴わない組換え又は合成系で生成される代わりに）から生成される場合、ウイルスは卵又は細胞培養のいずれかで成長させることができる。病原体のない孵化卵の培養は、ワクチン作成のために培養されたインフルエンザウイルスの既存のルートであるが、細胞培養は最近の開発である。細胞培養が使われる場合、ウイルスワクチンは、通常、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞などの哺乳動物細胞内で培養される。これらの細胞株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（英語の頭文字からＡＴＣＣ）又はＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓで広く入手可能となっている。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６及びＣＲＬ−１５８７で様々な異なるベロ細胞を提供しており、また、カタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を提供している。ニワトリ胚線維芽細胞などニワトリ由来細胞株を含む鳥類細胞株の培養も可能である（ＣＥＦ）。
【００５８】
本発明の免疫原性組成物及び薬剤は患者への投与に適している。これにより、皮内注射、経皮投与及び局所投与などに限らず様々な方法で投与できる。これらの投与は皮膚剥削術と組み合わせてエメリー研磨紙やマイクロアブレシブを使用することもできる。
【００５９】
本発明の免疫原性組成物及び薬剤は好ましくはワクチンとして提示する。
【００６０】
本発明の組成物にはアジュバントを含むことができる。インフルエンザワクチンに使用されるアジュバントは、アルミニウム塩、キトサン、ＣｐＧ  ７９０９などのオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ、ＭＦ５９などの水中油型エマルション、水中油型又は油中水型エマルション、大腸菌の易熱性毒素及びその無毒化変異体、モノホスホリルリピッドＡ及びその派生３−Ｏ−脱アシル化、百日咳毒素の突然変異体、ムラミールジペプチドなどを含んでいる。
【００６１】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンの主要な免疫原であり、ワクチンの用量は通常、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）テストで測定されるのでＨＡレベルに関して標準化されている。低用量を使用しても（子ども、又はパンデミック状況等のため）、１／２（すなわち１株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４及び１／８の分数投与で使用されることがあるが、筋肉注射ワクチンには通常、１株当たりＨＡ約１５μｇを含めて使用されている。本発明の組成物には通常、インフルエンザ１株当たりＨＡ０．１〜８μｇが含まれているが、好ましくは、例えば、約７．５μｇ、約５μｇ、約３μｇ、約２．５μｇ、約２μｇ、約１．５μｇ、約１μｇ、約０．７５μｇ、約０．５μｇ、約０．４μｇ、約０．２μｇなどである。
【００６２】
筋肉注射ワクチンは用量０．５ｍｌが通常である。組成物には、チオマーサル又は２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含むことができる。しかし、組成物は水銀物質（すなわち、１μｇ／ｍｌ未満）を実質的に含まないことが好ましい、例えば、チオマーサルフリー。水銀を含有しないワクチンが好ましい。
【００６３】
インフルエンザウイルスが培養細胞によって増殖される時、微量の宿主細胞ＤＮＡがあっても良いが、本発明の組成物は好ましくは、用量あたり宿主細胞ＤＮＡの残存が１００ｐｇ未満である。汚染ＤＮＡは、クロマトグラフィーなど標準的精製手順を使用してワクチン生成の際に除去することができる。宿主細胞ＤＮＡの残存除去は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｄｎａｓｅなどを使用して、ヌクレアーゼ処理で高めることができる。ヘマグルチニン１０μｇ当たり宿主細胞ＤＮＡを１００ｐｇ未満含むワクチンが好ましく、同様に、用量０．２５ｍｌ当たり宿主細胞ＤＮＡを１００ｐｇ未満含むワクチンが好ましい。ヘマグルチニン５０μｇ当たり宿主細胞ＤＮＡを１００ｐｇ未満含むワクチンが好ましく、同様に用量ｍｌ当たり宿主細胞ＤＮＡを１００ｐｇ未満含むワクチンが好ましい。
【００６４】
本発明のワクチンは、単回投与免疫療法として提供することができる。また、それらは、プライム・ブースト法（初回免疫は、数週間又は数カ月以内に、類似抗原性の第２回目の接種が続くという意味）の主要要素として提供しても良い。
【００６５】
インフルエンザワクチンの免疫原性を試す方法は、当技術分野では周知されている。一つの方法は、以下の手順を含む。ａ）予防接種の直前に、血中抗体ＨＡ抗体の基準滴定用に患者の腕から静脈の血液１０ｍｌのサンプルを採取し、ｂ）その後すぐ、患者は、腕に投与される場合、採血した反対の腕にワクチンを１回接種し、ｃ）予防接種の約３週間後、前述患者から１０ｍｌの採血を行う。血清を血液サンプルから分離し、（必要な場合）−２０度で保管する。この血清は、血球凝集抑制（ＨＩ）又は一元放射溶血反応（ＳＲＨ）により関連株に対する抗ヘマグルチニン抗体試験にかける。陽性及び陰性血清は、基準調剤と同じく、公共の試験所で入手できる。抗体力価測定は２連で行われ、前後のワクチン接種の血清を同時に滴定する。各サンプルに割当てられた力価は、２つの独立した測定の幾何平均である（しかし、計算の目的として、ＨＩ＜１０（＝検出不可）のいずれの結果も５として表記し、ＳＲＨのマイナス結果のいずれも標準条件で４ｍｍ２と表記される。）
【００６６】
ＨＩ試験では、セロコンバージョンは予防接種前後の免疫力価≧４０の比率に相当し、さらに、抗体力価が顕著な増加（例：少なくとも４倍）に対応する。ＳＲＨ試験では、セロコンバージョンは、≧２５ｍｍ２の予防接種後のエリアに相当し、予防接種前のエリアに対して少なくとも５０％対応する。
【実施例】
【００６７】
本発明の実施形態では、例示的な機器、装置、方法及びそれらに関連する結果を以下に示すが、本発明の範囲を限定する意図はない。タイトル又はサブタイトルは読者の都合に合わせて実施例に使用しても良いが、決して本発明の範囲を制限するものではないことに留意されたい。さらに、本発明で特定の理論が提案され、示されるが、正しくても又は間違っていても、本発明がその特定の理論又は構想のいずれにも関係なく実施される場合、決して本発明の範囲を制限しない。
【００６８】
実施例１：細胞株
ベロ細胞は、微生物学、細胞生物学及びウイルス学において非常に良く研究され、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓から最初に分離し、広く使われている細胞株である。ウイルスワクチン（ロタウイルスとポリオウイルス）生成のために米国で承認され、さらに、狂犬病、レオウイルス及び日本脳炎ワクチン生成用に試され、また、いくつかの症例で認められた。我々は、重感染への感受性、及びワクチン生成にあたり望ましい特徴である発酵槽及び生物反応器の工業規模における増殖能力を理由に、この細胞株を選択した。
【００６９】
使用されるベロ細胞株は、ＡＴＣＣから購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて−７０度で保存した。細胞はＣＯＲＮＩＮＧの指示に従って解凍した。
【００７０】
実施例２：殺菌条件
バイオセキュリティーＩＩＩレベルで全ての設備は慎重に処理され、感染を避けるために監視されている。定期的に、部屋、材料、試薬及び機器に無菌試験を行う。細胞培養エリアは定期的に洗浄し、毎月消毒しており、エタノール７０％と塩素５％のベンザルを使って２４、４８及び７２時間ごとに消毒巡回を行なっている。これらの巡回の終了時に無菌試験を行い、液状チオグリコレート培地でアリコートを培養してすべての試薬を感染試験にかける。
【００７１】
実施例３：細胞増殖
ベロ細胞の増殖は、ポリスチレン細胞培養フラスコ（２５ｃｍ２，５０ｃｍ２及び７５ｃｍ２）で保存するなど物理的及び化学的条件に合わせて行われた。これらのフラスコも疎水性を減らすためガンマ線を通した。このような容器は効果的な細胞粘着と単分子層形成を可能にする。細胞を増殖させるため、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）のＭ１９９成長培地を用い、ウシ胎仔血清（ＢＦＳ）（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０％を添加した。生理的ｐＨの維持はフェノールレッドを用いて監視した。抗菌剤混合物（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢ）を加え、真菌汚染を抑制するために抗ＰＰＬＯも加えた。
【００７２】
細胞培養は３５度、ＣＯ２５％、湿度５％で行った。細胞質及び増殖を位相差顕微鏡でモニタリングし、これにより、細菌汚染又は真菌汚染を示した培養を廃棄することができる。
【００７３】
完全コンフルエンスを示すフラスコの細胞継代培養は以下の方法で行われる。
１．培地を取り除き、廃棄する。
２．トリプシン阻害剤を含む血清すべての残りを取り除くため０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液で細胞株を軽くすすぐ。
３．フラスコにトリプシン−ＥＤＴＡ液を２．０から３．０ｍｌ加えて、細胞層が（通常は５〜１５分以内）分散するまで倒立顕微鏡で細胞を観察する。
４．６．０から８．０ｍｌの完全増殖培地を加え、慎重にピペッティングにより細胞の吸引を行う。
５．新しい培養容器に細胞懸濁液の適切なアリコートを加える。
６．３７度で培養する。
【００７４】
８０％のコンフルエンスが得られた時、細胞を、１×１０６のＨＮ１亜型パンデミックウイルスで接種した。このコンフルエンスレベルは、Ｈ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスにより生じる細胞変性効果の観察に最適だった。
【００７５】
実施例４：ウイルス分離
ウイルス分離は、ベロ細胞（８０％コンフルエンス）を接種した２５ｃｍ２のフラスコで行われた。ウイルス分離のために、培地が取り除かれ、細胞を遠心分離し、そして細胞残屑を廃棄するため３回再懸濁した。臨床的にＨ１Ｎ１亜型インフルエンザと診断され、リアルタイムでＰＣＲにより確認された患者から得た綿棒サンプルから、細胞培養に５０μｌを接種し、そして、細胞表面にウイルスを付着させるために３０分間培養した。その後、Ｍ１９９を１％のＢＦＳで添加し、４０度４０分間培養した。
【００７６】
接種された培養は、位相差顕微鏡で細胞変性効果の有無を検出するためモニタリングされた。同時にウイルス負荷をリアルタイムＰＣＲによって測定した。１×１０６に達した時、培養は−８０度（ＤＭＳＯ  １０％）に凍結し、さらなる研究のために保管された。
【００７７】
実施例５：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるウイルス感染の確認と定量化
ウイルスＲＮＡは、前述のように、市販の装置（ＲＯＣＨＥ）を使用して、ベロ細胞培養から抽出し、その後、ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置を用いて分光光度法により定量化した。定量化（プラスミド内でクローン化したＨ１遺伝子の１０１〜１０６のコピー）を目的にインフルエンザ用基準を含み、リアルタイムＰＣＲによりＨ１Ｎ１亜型の検出のためサーモサイクラーＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（ＲＯＣＨＥ）でＣＤＣプロトコールを行った。ウイルス負荷の判定は、各サンプルに対して交差点形式で計算することによって行われた。図１は、ウイルス負荷の定量化の実施例を示す。
【００７８】
実施例６：サンプル選出
臨床及び疫学データに基づいて、シークエンシング用Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックの陽性サンプル３７６０個のうち計１９３個のサンプル。抽出のための臨床基準は、感染症の重症度、薬剤耐性及び臨床的異型性のシナリオ。そして、疫学基準は、場所、性別及び年齢に基づいた。選出されたサンプルは２００９年３月から１１月までに報告された最も集中した病巣４か所で採取された。サンプルは、ウイルス輸送培地の２．５ｍｌで再懸濁、及び調合され、均質５００μｌ、−７０度下で保存した。
【００７９】
実施例７：核酸の抽出
臨床サンプルの全核酸は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ（Ｒｏｃｈｅ）器具にＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）キットを用いてＥｘｔｅｒｎａｌ  Ｌｙｓｉｓプロトコールにより製造者の指示に従って分離し、脱イオン水（１００μ）で再懸濁した。すなわ、ＭａｇｎａＰｕｒｅ核酸カートリッジにサンプル５００μｌを置き、溶解バッファーを加えてから、全てのパラメータを設置し、開始した。ＲＮＡを抽出して後の解析のために−７０度下に置いた。
【００８０】
実施例８：リアルタイムＰＣＲによるＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザの検出
Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザの検出は２つの方法によって行われた。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅａｄｙ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍａｓｔｅｒ  ５３（Ｒｏｃｈｅ）キットを用いて、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅａｄｙ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１  Ｎ１検出セット（Ｒｏｃｈｅ）。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）器具を使用して、熱サイクル法によって次の条件を行った：５０度下で３０分；９５度下で１５分；９４度下で１５秒４５サイクル；及び６０度下で３０秒。
【００８１】
第二の方法は、亜型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）用のＲＴプロトコールの方法をリアルタイムＰＣＲで、前記プロトコールに記載されるプライマーとプローブ、及びｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅキットを用いた。熱サイクル法は、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ２．０（Ｒｏｃｈｅ）器具によって次の条件で行った：５０度下で５０分；９５度下で２分；９５度下で１５秒４５サイクル；及び５５度下で３０秒。
【００８２】
両方法の反応はすべて、製造者の指示に基づいて、全ＲＮＡ５μｌを用いて２０μｌの反応量で行われた。検出の両方法には内的コントロールが含まれた（Ｒｏｃｈｅ法向けにはミオスタチンのヒト遺伝子、ＣＤＣプロトコールにはＲＮＡ分解酵素Ｐ）。
【００８３】
各サンプルは、テストされ、リアルタイムＰＣＲは次のプローブを用いながら別に行われた。亜型インフルエンザ（ＩｎｆＡ）、一般の豚インフルエンザ（ＳｗＦｌｕ  Ａ）、豚のヘマグルチニン（ＳｗＨ１）及びＲＮＡ分解酵素Ｐ（ＲＰ）ヒト核酸用の内的コントロール。ポジティブ及びネガティブコントロールを加えた。
【００８４】
反応混合には、各プライマー０．８μΜ、各プローブ０．２μΜ、ＰＣＲ  １Ｘ溶解バッファー、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５Ｕが含まれていた。
【００８５】
図２は、サンプルの配列を示す。
【００８６】
増幅条件は以下となった。
逆転写：５０度／３０分
不活性化：１５度／２分
エクステンション：９５度／１５サイクル、及び５５度／３０サイクル
【００８７】
実施例９：データ解析
結果は、以下の要領によってＷＨＯ基準に基づいて解析した。
１．ネガティブコントロールには蛍光はあってはならない。
２．試験用サンプルは、ＲＰプローブに対して蛍光発光を示さなければならない。
３．ヒト核酸コントロールは、プローブＩｎｆＡ、ＳｗＦｌｕＡ及びＳｗＨ１に対して蛍光発光してはならない。
４．ポジティブコントロール（Ｈ１Ｎ１亜型核酸）は、全てのプライマー及びプローブに対して蛍光発光しなければならない。
５．基準がすべてクリアされたら、サンプルはポジティブとみなす。
【００８８】
図３Ａ及び図３Ｂは、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ２．０リアルタイムで蛍光カーブを示しながら、熱サイクラーのグラフィカル・インターフェースを示す。図３Ａ：臨床サンプル。図３Ｂ：ＲＮＡ分解酵素Ｐ（ＲＰ）検出。
【００８９】
実施例１０：シークエンシング
細胞培養によって計９５０個のウイルスを分離し、そのうち、ＡＢＩ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）シークエンシング器で毛細管シークエンシングを介して、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）１９３個の部分遺伝配列、及びヘマグルチニン（ＨＡ）１９７個の部分遺伝配列を得た。Ｈ１Ｎ１亜型ではＨＡ及びＮＡがより変動する配列であるため、コンピューターによる解析（系統発生解析及びＢＬＡＳＴ）は３８６個の配列（ＨＡ及びＮＡ配列）が２０個に分類できることを示したため、各分類グループの代表メンバーの完全ゲノムに対して４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｒｏｃｈｅ  Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＯＣＨＥ）装置でパイロシークエンスが行われた。
【００９０】
実施例１１：ニワトリ胚におけるインフルエンザウイルスの増殖
ベロ細胞においてインフルエンザワクチン向けの候補を増殖させる試みを何度も行った。しかし、それらの試みは、回収したウイルス量が少なかったため、最初の３代継代でも失敗した。これを考慮して、ＳＰＦ（特定病原体未感染）ニワトリ胚において１〜２代継代を行った。各候補となる０．１ｍｌの羊水で接種を行った。パンデミックインフルエンザ時期で事前に分離されていた他の４０ウイルスも加えて、その接種は、各ウイルスに対して卵を２個使って行った。
【００９１】
３５度下で３日してから、各感染各胚から羊水を抽出し、回収された液体は細胞残屑を取り除くために３０００ｘｇで遠心分離し、そして浮遊物はｑＲＴ−ＰＣＲによって解析し−８０度下で保存した。全ての手順は、バイオセキュリティーリスクを防ぐためにバイオセキュリティーレベルＩＩＩで要請される基準に従って行った。
【００９２】
胚内の継代後、ウイルス負荷は株３つに対して多く、そのうち１株は候補ウイルスであった。ＲＴ−ＰＣＲテストでさらに分離株１０株を検出したが、ウイルス負荷が低いことを示した。従って、他のＳＰＦニワトリ胚に対して再度接種を行ったが、この場合、接種は尿膜腔液で行った。培養の７２時間後に、前記の同条件に従って、尿膜腔液のみを回収しながら、ウイルスを抽出した。より少ない量をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析し、その残りは−８０度下で保管した。結果は、分離株１０株のうち６株は高いウイルス負荷を示しながら、効率的に増殖できることを示した。
【００９３】
カロリンスカ研究所の配列証明
ニワトリ胚の流行以前に、ｃＤＮＡウイルス株が、パイロシークエンス  ４５４  ＲＯＣＨＥシステムによって配列の検証をするためにカロリンスカ研究所へ送られた。バイオインフォマティクス解析は、我々の研究所が事前に特定した配列の確認を行った。
【００９４】
一次ウイルスの同定
インフルエンザワクチン用の候補ウイルスは、ＨＺＦＬＵＪＡＬと命名された。
【００９５】
ベロ細胞株で培養するためのインフルエンザウイルスの順応
候補ウイルス（ＨＺＦＬＵＪＡＬ）や胚から抽出した他の２つのウイルスをベロ細胞株で接種した。順応を得るために、培養の浮遊物を感染後７〜１０日で回収しながら数回継代を行った。各浮遊物は、ベロ細胞の新たな継代を感染させるために用いた。各継代のウイルス負荷を数量化した。図４Ａは、胚のウイルス負荷と同ウイルスの各継代培養の差を示す。前述図は、この組織細胞株に対するウイルス順応が４代目継代まで得られること明確に示している。
【００９６】
ＭＤＣＫ細胞株において増殖するためのインフルエンザウイルスの順応
ベロ細胞株だけがインフルエンザウイルスの基質として評価されたのではなく、ＭＤＣＫ細胞株もウイルス増殖のために用いられた。ベロ細胞の順応に適用した同じ手順でＭＤＣＫ細胞にも実施した。予備結果はニワトリ胚のウイルス負荷より高いウイルス負荷を得るため外見から判断して３継代だけを必要としなかったから前述細胞株に対してより良い順応を示した（図４Ｂ）。
【００９７】
ＨＺＦＬＵＪＡＬ一次ウイルスを取得するためのウイルス増殖
事前にベロ細胞株にて培養するためにならしたウイルスを増殖する目的で、ベロ細胞で４代継代の１クライオバイアルを解凍してから、１７５ｃｍ２のフラスコでベロ細胞を感染させるために用いた。ＣＯ２培養器に３３度下において１０日後、一次ウイルス１２０ｍｌを得た。そのウイルスは１０７ウイルス粒子／ｍｌより多いウイルス負荷だった（約１０７．７）。１ｍｌの一次ウイルスを含むクライオバイアル１２０個を得た。
【００９８】
一次ウイルスの品質管理
一次ウイルスに対して無菌テスト及び血球凝集テストを行った。前者のテストでは、一次ウイルスのクライオバイアル４個を解凍し、そのうちのクライオバイアル２個を、ＮＨチオグリコール酸培地１００ｍｌを含む２本のフラスコに接種するために用い、残りのクライオバイアル２個は、抗生物質のないＤＭＥＭ培地の接種に使った。両培地は、３５度下で８〜１５日間接種した。接種機関後、培地に増殖も変化も見られなかったので、無菌（バクテリア、カビ及び原虫が無い）とみなした。
【００９９】
血球凝集テストは、一次ウイルスのヘマグルチニン価を測定するために実施した。このテストでは、Ｕ型９６穴マイクロプレートに、１：２〜１：１０２４の一次ウイルスをＰＢＳ  ｐｈ＝７．４で連続希釈した。各希釈溶液をＰＢＳに、Ｏ型ヒト赤血球０．５％（ｖ／ｖ）の懸濁液と同じ量を加えた。前記マイクロプレートを４度下で２時間培養し、結果は１：８の赤血球凝集価を示した。
【０１００】
実施例１２：ＨＺＦＬＵＪＡＬワクチンを使用した前臨床予備テスト
前臨床予備テストウイルス不活化
前臨床予備テストの実施にあたり、一次ウイルスのクライオバイアル１個を解凍し、ＣＯ２培養器において３３度下で７日後、８０ｃｍ２のフラスコでベロ培養に感染させるために使用した。前記培養は、ホルマリン最終濃度０．０２％（ｖ／ｖ）によって３５度下で１８時間をかけて不活化した。ホルマリンは、４８時間以内にＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に対する４回の透析で除去した。その後、赤血球凝集価は、定量化し、再度１：８となった。不活化ウイルス懸濁液は２５μｌ当たり１０６のウイルス粒子に調整され、下記のグループにワクチンとして使用された。
【０１０１】
前臨床予備テスト用の動物モデル
前臨床予備テスト用に７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスを用いた。各グループは、Ｈｅｐａフィルターで覆われたラックに置いた。全ての動物は不要な苦痛を回避するよう取り扱った。プロトコールが完了した時点で全てのマウスを安楽死させた。
【０１０２】
前臨床予備テストでセロコンバージョン試験
各試験にマウス５匹の９グールプに対してセロコンバージョン試験を実施した。
グループ１：１０６ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋舌下投与
グループ２：１０６ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋筋内投与
グループ３：１０６ウイルス粒子＋舌下投与
グループ４：１０６ウイルス粒子＋筋内投与
グループ５：市販ワクチン＋舌下投与
グループ６：市販ワクチン＋筋内投与
グループ７：非ウシ胎仔血清ＤＭＥＭ＋舌下投与
グループ８：非ウシ胎仔血清ＤＭＥＭ＋筋内投与
グループ９：無治療
【０１０３】
前臨床予備テストにおける用量反応試験
用量反応試験は、各試験にマウス３匹の５グールプに対して実施した。
グループＡ：１０７ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋舌下投与
グループＢ：１０５ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋舌下投与
グループＣ：１０４ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋舌下投与
グループＤ：１０３ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋舌下投与
グループＥ：１０２ウイルス粒子＋トランスファーファクター＋舌下投与
【０１０４】
免疫化プロトコールの初めから、全てのマウスを４日間、免疫試験を行うためのバイオセキュリティー要件が揃っている動物実験室に置いた。順応時間後、体重、外見等の臨床データを記録し、免疫前に各マウスから抗凝固剤を使わずサンプル用の採血を行った。その後、各グループは、それぞれの薬の投与ルートによって接種された。各マウスの免疫後７日、１４日、２１日及び２８日目の血液を４サンプル取得した。
【０１０５】
血清が、血液サンプルの遠心分離によって得られ、Ｈ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対するＩｇＧ２抗体を検出するために使用された。さらに、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の分泌物を検出するために各マウスの分泌サンプルを採取した。
【０１０６】
実施例１３：ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンによって生成されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対する抗体の検出
ベロ細胞においてＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンとしてここで記載する例示的ワクチンを開発し、Ｈ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対する抗体を生成する能力を知るために試験を実施した。ベロ細胞においてＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯによって開発された抗原は、マウスにワクチンとして使用される抗体生成を誘発することができた。
【０１０７】
ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯ抗原に誘発された抗体価は、市販ワクチンよりも大きかった。図５は、ＥＬＩＳＡによって検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対する合計抗体を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした。
【０１０８】
図６Ａは、ＥＬＩＳＡ法により血清中で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＭ抗体を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、筋肉投与とした。
【０１０９】
トランスファーファクターが、ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンに添加されたとき、ＩｇＧ抗体価を５倍増加させ、同様に、トランスファーファクターは、免疫付与第１週中にＩｇＭ抗体価を３倍増加させた。図６Ｂは、ＥＬＩＳＡ法により血清中で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＧ抗体を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、筋肉投与とした。
【０１１０】
ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンの筋内投与は、舌下投与よりＩｇＧ２Ａ抗体の誘発が大きかったことを示した。図７Ａは、ＥＬＩＳＡ法により血清中で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＧ２Ａ抗体を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした。
【０１１１】
図７Ｂは、ＥＬＩＳＡ法より血清中で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＧ２Ａの用量反応を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、舌下投与とした。
ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンの筋内投与は、舌下投与に匹敵するＩｇＡ抗体の誘発を示した。図８Ａは、ＥＬＩＳＡ法により呼吸粘膜で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＡ抗体を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした（免疫付与２１日後）。
【０１１２】
図８Ｂは、ＥＬＩＳＡ法より呼吸粘膜で検出されたＨ１Ｎ１亜型パンデミックインフルエンザに対するＩｇＡの用量反応を示す。ＣＩＡＴＥＪ／ＯＰＫＯワクチンは、ベロ細胞、ＴＦ＝トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、７〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした（免疫付与２１日後）。
【０１１３】
参考文献
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Ｋｉｓｔｎｅｒ  Ｏ．，Ｈｏｗａｒｄ  Ｋ．，Ｓｐｒｕｔｈ  Ｍ．，Ｗｏｄａｌ  Ｗ．，Ｂｒｕｈｌ  Ｐ．，Ｇｅｒｅｎｃｅｒ  Ｍ．，Ｃｒｏｗｅ  Ｂ．，Ｓａｖｉｄｉｓ  Ｈ．，Ｌｉｖｅｙ  Ｉ．，Ｒｅｉｔｅｒ  Ｍ．，Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒ  Ｉ．，Ｔａｕｅｒ  Ｃ，Ｇｒｉｌｌｂｅｒｇｅｒ  Ｌ，Ｍｕｎｄｔ  Ｇ．，Ｆａｌｋｎｅｒ  Ｆ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｎｏｅｌ．２００７  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｖｅｒｏ）ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ（Ｈ５Ｎ１）ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｆｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ａｕｓｔｒｉａ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００７  １０；  ５（３２）．Ｐ．６０２８−６０３６．
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Ｒｙａｎ  Ｊｏｈｎ．Ｐｈ．Ｄ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９００  Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ  Ｓｔ．Ｌｏｗｅｌｌ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ．ＭＡ  ０１８５１．Ｐ．１−２４．
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【０１１４】
刊行物及び特許出願が個別に参照されるように、引用された全ての刊行物及び特許出願は本願明細書に援用される。
【０１１５】
本発明を、図面あるいは例示的な実施形態において説明したが、当業者は、以上の詳細な説明および図面並びに特許請求の範囲から、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の好適な実施例に変形および変更を施せることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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