(57)【要約】本開示は、部分的には、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子を保有しかつその中で前述の遺伝子が発現されるレトロウイルスベクターで感染された少なくとも１つの又はセットの初代哺乳類上皮細胞を含む哺乳類前立腺癌細胞系に向けられる。この前立腺細胞系の用途としては、前立腺癌の免疫応答性動物モデル、不死化初代哺乳類上皮細胞のインビトロ生成のための方法、前立腺癌を有するヒト対象が転移に冒されているか又は転移を発症する恐れがあるかを判定する方法、癌を発症するか又は癌の転移の恐れがある対象において、治療に対して感受性がある癌を予防するか又は癌の転移を阻害する方法、並びにＣＣＲ５及び／又はそのリガンドの少なくとも１つの上昇したレベルを有する癌細胞の増殖又は生存能力を選択的に妨害する候補化合物を同定する方法が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子を保有しかつその中で前記遺伝子が発現されるレトロウイルスベクターで感染された、少なくとも１つの又はセットの初代哺乳類上皮細胞を含む、哺乳類前立腺癌細胞系。
【請求項２】
前記初代哺乳類上皮細胞が、初代ネズミ上皮細胞を含む、請求項１に記載の哺乳類前立腺癌細胞系。
【請求項３】
前記初代哺乳類上皮細胞が、免疫応答性マウスに由来する、請求項１及び２のいずれかに記載の哺乳類前立腺癌細胞系。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の前記哺乳類前立腺癌細胞系で移植された免疫応答性非ヒト哺乳類を含む、ヒト前立腺癌の動物モデル。
【請求項５】
前記非ヒト哺乳類が、ラット、モルモット、及びマウスなどの齧歯類、並びにブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、及びウシなどの家畜動物からなる群から選択される、請求項４に記載の動物モデル。
【請求項６】
前記非ヒト哺乳類が、齧歯類である、請求項４に記載の動物モデル。
【請求項７】
前記非ヒト哺乳類が、マウスである、請求項４及び５のいずれかに記載の動物モデル。
【請求項８】
前記非ヒト哺乳類が、ＦＶＢ／Ｎマウスである、請求項４〜６のいずれかに記載の動物モデル。
【請求項９】
前立腺腫瘍を発症する免疫応答性遺伝子組換えマウスであって、前記前立腺腫瘍が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子のセットの１つ以上の分子遺伝子シグネチャー特性を産生する、免疫応答性遺伝子組換えマウス。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の不死化初代哺乳類上皮細胞のインビトロ生成のための方法であって、前記方法が、初代哺乳類上皮細胞を、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターで感染させて、感染した細胞を提供することを含み、前記初代哺乳類上皮細胞が、前記レトロウイルスベクターによって、並びに前記ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせが前記感染した細胞中で発現される条件下で、感染されることが可能である、方法。
【請求項１１】
前立腺癌に冒されたか又は前立腺癌を有する疑いがあるか又は前立腺癌を発症する恐れのある対象において、前立腺癌を診断するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前立腺癌に冒されたか又は前立腺癌を有する疑いがあるか又は前立腺癌を発症する恐れのある対象から生物学的テストサンプルを提供することと、
（ｂ）遺伝子発現パターンに基づいて、前記対象から得られた生物学的テストサンプル中の少なくとも１つの生物学的マーカーのレベルを決定することであって、前記遺伝子発現パターンが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の発癌遺伝子のセットと関連する、ことと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生物学的マーカーのレベルを、対照サンプル中の前記生物学的マーカーのレベルと比較することと
を含み、
前記対照サンプル中の前記生物学的マーカーのレベルに対する前記テストサンプル中の前記生物学的マーカーの上昇したレベルが、前記対象における前立腺癌の存在の診断指標である、方法。
【請求項１２】
前記遺伝物質が前記前立腺癌に由来するか、又は前立腺、尿、及び血液を含む前立腺に関連するバイオフルイドに由来する、請求項１１に記載の前立腺癌を診断するための方法。
【請求項１３】
前立腺癌／腫瘍を、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の発癌遺伝子のセットの遺伝子発現パターン特性を有する異なる前立腺癌サブクラスに分類する方法であり、前記方法が、
（ａ）前立腺癌／腫瘍サンプルを提供することと、
（ｂ）前記サンプル中の遺伝子発現パターンに由来する分子遺伝子マーカー又は前記発癌遺伝子の１つ以上のセットの活性を検出することと、
（ｃ）前記検出するステップ（ｂ）の結果に基づいて、前記前立腺腫瘍を、癌／腫瘍サブクラスに属するものとして分類することと
を含む方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｃ）の分類するステップが、前記サンプル中の前記分子遺伝子マーカーを前記前立腺癌の組織病理学的悪性度に相関させることを含む、請求項１３に記載の前立腺癌／腫瘍を分類する方法。
【請求項１５】
前記前立腺癌サブクラスが、ｃ−Ｍｙｃ発癌遺伝子の遺伝子発現パターン特性を有する、請求項１３に記載の前立腺癌／腫瘍を分類する方法。
【請求項１６】
前記前立腺癌サブクラスが、Ｈａ−Ｒａｓ発癌遺伝子の遺伝子発現パターン特性を有する、請求項１３に記載の前立腺癌／腫瘍を分類する方法。
【請求項１７】
前記前立腺癌サブクラスが、ＮｅｕＴ発癌遺伝子の遺伝子発現パターン特性を有する、請求項１３に記載の前立腺癌／腫瘍を分類する方法。
【請求項１８】
前記前立腺癌サブクラスが、ｃ−Ｓｒｃ発癌遺伝子の遺伝子発現パターン特性を有する、請求項１３に記載の前立腺癌／腫瘍を分類する方法。
【請求項１９】
臨床試験のために前立腺腫瘍を有する対象を層別化する方法であって、前記方法が、
（ａ）前立腺腫瘍を有する対象に由来するサンプルを提供することと、
（ｂ）前記サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することであって、前記遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ことと、
（ｃ）前記検出するステップ（ｂ）の結果に基づいて、臨床試験のために前記対象を層別化することと
を含む方法。
【請求項２０】
前記（ｃ）における層別化するステップが、前記（ｂ）における検出するステップの結果を、対照サンプルから得られた結果と比較した後に実行される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前立腺癌／腫瘍を有する対象のために治療を選択する方法であって、前記方法が、
（ａ）前立腺癌／腫瘍を有する対象に由来するサンプルを提供することと、
（ｂ）前記サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することであって、前記遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ことと、
（ｃ）前記検出するステップ（ｂ）の結果に基づいて、治療を選択することと
を含む方法。
【請求項２２】
前記（ｃ）における選択するステップが、前記（ｂ）における検出するステップの結果を、対照サンプルから得られた結果と比較した後に実行される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を１つ以上の外因性発癌遺伝子で形質転換し、細胞を少なくとも１回分裂させることによって生成された非天然発生細胞であって、前記細胞が、外因性発癌遺伝子を含有するベクターによって形質転換されたヒト細胞であり、１つ以上の外因性発癌遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、非天然発生細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、初代哺乳類上皮細胞である、請求項２３に記載の非天然発生細胞。
【請求項２５】
癌を有する対象のために治療を選択する方法であって、
（ａ）癌の治療の必要がある対象から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載の前記遺伝子シグネチャーをコードする核酸の発現レベル又はその修飾を決定することと、
（ｂ）前記決定された遺伝子シグネチャーに基づいて、前記対象のための治療を選択することであって、前記遺伝子シグネチャーが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ２及びＳｒｃからなる群から選択される発癌遺伝子に由来する、ことと
を含む方法。
【請求項２６】
前立腺癌を有するヒト対象が転移に冒されているか又は転移を発生する恐れがあるかを決定する方法であって、
（ａ）前立腺癌を有するか又は前立腺癌を発症する恐れがあるヒト対象から生物学的サンプルを取得することと、
（ｂ）前記サンプル中のＣＣＲ５の発現レベル及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの発現レベルを決定することと
を含み、
前記サンプル中のＣＣＲ５及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの発現レベルが、対照の発現レベルよりも高い場合、前記ヒト対象が転移に冒されているか又は転移を発生する恐れがある可能性が高いことを示唆する、方法。
【請求項２７】
癌を発症するか又は癌の転移の恐れがある対象において、治療に感受性がある癌を予防するか又は癌の転移を阻害する方法であって、その必要がある前記対象にＣＣＲ５拮抗剤を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記ＣＣＲ５拮抗剤が、マラビロク又はビクリビロクである、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＣＲ５拮抗剤が、肝臓、脳、膀胱、肺、副腎、腎臓、骨及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の器官への腫瘍転移を阻害する、請求項２７又は２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＣＣＲ５及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの上昇したレベルを有する癌細胞の増殖又は生存能力を選択的に妨害する候補化合物を同定する方法であって、前記方法が
候補化合物を、ＣＣＲ５及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの上昇したレベルを有する癌細胞と接触させることと、
ＣＣＲ５及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの上昇したレベルを有する前記癌細胞の増殖又は生存能力が、ＣＣＲ５及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの上昇したレベルを有さない対照細胞に比較して減少する場合、次いで、
前記候補化合物を、ＣＣＲ５及び／又はそのリガンド（例えば、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の少なくとも１つの上昇したレベルを有する癌細胞の増殖又は生存能力を妨害する化合物として同定することと
を含む、方法。
【請求項３１】
ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの発癌遺伝子をコードするレトロウイルス中でのネズミ上皮及び前立腺上皮細胞の形質導入に由来する１つ以上の前立腺癌細胞系のセットにおいて、ＣＣＲ５発現をダウンレギュレーションするためのインビボの方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項４〜８のいずれかに記載の動物モデルに候補化合物を投与することと、
（ｂ）前記動物モデルにおけるＣＣＲ５  ＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルを測定することであって、前記動物モデルにおけるＣＣＲ５発現のレベルが、前記候補化合物で処置されない対照動物モデルにおけるＣＣＲ５発現のレベルよりも低い、ことと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
前立腺癌を含む癌を診断しかつ治療するための方法及び組成物が提供される。本発明の特定の態様は、前立腺癌の診断、研究、治療的層別化、及び治療に有用な方法及び組成物に関する。本発明において更に提供されるものは、これら方法で使用され得る細胞及び遺伝子組換えの非ヒト哺乳類である。
【０００２】
連邦政府によって支援された研究開発に関する声明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金番号第Ｒ０１ＣＡ７０８９６号、同第Ｒ０１ＣＡ７５５０３号、同第Ｒ０１ＣＡ８６０７２号、同第Ｐ３０ＣＡ５６０３６号、及び同第Ｒ０１ＣＡ１３２１１５−０２の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、世界中において極めて重要な健康問題である。癌の検出及び療法において進歩がみられるが、予防及び／又は治療のためのワクチン又は他の一般的に有効な方法は、現時点で利用可能なものはない。一般的に化学療法又は手術及び放射線療法の組み合わせに基づく現在の療法は、多くの患者で不適切であることを証明し続けている。
【０００４】
例えば、前立腺癌は、合衆国及び世界中の男性にとって重要な健康問題である。この疾患の検出及び治療において進歩がみられるが、前立腺癌は、合衆国では毎年２２１，０００人を超える男性が発症し、男性の癌関連死の重要な原因のままである。北アメリカの男性については、前立腺癌を発症する生涯確率は、４．６％の死亡リスクで、現在１９．６％である。前立腺癌は、２００９年には世界全体で約２５０，０００件の死亡の原因であった。
【０００５】
前立腺癌の予防又は治療のためのワクチン又は他の一般的に有効な方法は、現時点で利用可能なものはない。この疾患の管理は、現在、早期診断（定期的前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）試験を通しての）並びに手術、放射線療法、化学療法及びホルモン療法などの種々の治療の１つ以上を含む場合がある積極的治療の組み合わせに依存する。特定の前立腺癌のための治療コースは、組織構造及び疾患拡大の解析を含む種々の予知診断パラメータに基づく。しかしながら、スクリーニングのための現行基準であるＰＳＡの使用は、ＰＳＡ試験が高い偽陽性及び偽陰性率を有するために、至適レベル以下の治療決定をもたらす。約４，５００万件のＰＳＡ試験が、約２７％の特異度で、２００９年に米国で実施された。昨年、米国では、ＰＳＡの上昇に基づいて前立腺の約１００万個の生検が採取され、これらから２５０，０００個の腫瘍が同定された。前立腺癌患者において観察される高死亡率は、この疾患の治療、診断及び予防における改善の必要性を示唆している。
【０００６】
ＰＳＡ試験の使用における別の複雑な要素は、ＰＳＡスクリーニングに対する医者の推奨が異なることである。ある医者は５０歳以上の男性に毎年のスクリーニングを推奨し、一部の医者は前立腺癌の高リスクを有する男性に４０歳又は４５歳でスクリーニングを開始するよう助言する。更に他の医者は、定期的なスクリーニングに対して警告する。典型的には、４．０ｎｇ／ｍＬより低いＰＳＡレベルは正常と考えられる。しかしながら、２つの報告の観点では、参照されたＰＳＡレベルは任意でありかつ無効であると考えられ、この報告の１つは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＩＭらによる（"Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｅｖｅｌ＜ｏｒ＝４．０ｎｇ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ"，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４，３５０（２２），２２３９−２２４６）（非特許文献１）であり、他方は、Ｓｍｉｔｈ  ＤＳらによる（"Ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：Ｔｈｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，"Ｃａｎｃｅｒ  １９９７，８０（９），１８５３−１８５６）（非特許文献２）である。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＩＭらによると、前立腺癌は、４．０ｎｇ／ｍＬ以下のＰＳＡレベルを有する男性の１５．２％で診断された。これらの男性の１５％で、又は全体で約２．３％が悪性度の高い癌を有した。Ｓｍｉｔｈ  ＤＳらによると、４．１と９．９ｎｇ／ｍＬとの間のＰＳＡレベルを有する男性の２５〜３５％で、かつ前立腺生検を受けた人で、前立腺癌を有することが確認されたが、一方残りの男性の６５〜７５％が前立腺癌を有さなかった。したがって、特定の正常な又は異常なＰＳＡレベルは存在しない。
【０００７】
更に、前立腺癌再発及びに治療耐性に関与する分子メカニズムも未だよくわかっていない。アンドロゲンアブレーション療法は、６０％〜８０％の初回応答率をもたらす（Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ，及びＳａｗｙｅｒｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｉ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５，２３，８２５３−８２６１（非特許文献３）を参照）。患者の大部分は、アンドロゲン拮抗薬療法を受けるが、その後再発する。早期診断は、根治的手術のための機会を提供するが、根治的前立腺摘出術を受けた男性の約３０％が再発し、微小転移性病態に帰する。したがって、疾患の初期ステージで転移性悪性の分子ドライバを検出し及び／又は未然に防ぐことができる医療介入の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＩＭらによる（"Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｍｏｎｇ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｅｖｅｌ＜ｏｒ＝４．０ｎｇ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ"，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４，３５０（２２），２２３９−２２４６）
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ  ＤＳらによる（"Ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：Ｔｈｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，"Ｃａｎｃｅｒ  １９９７，８０（９），１８５３−１８５６）
【非特許文献３】Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ，及びＳａｗｙｅｒｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｉ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５，２３，８２５３−８２６１
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本発明は、発癌遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターで感染された、初代哺乳類上皮細胞のセットの少なくとも１つ以上を含む哺乳類前立腺癌細胞系を提供する。ある実施形態では、この発癌遺伝子は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、この中で、前述の発癌遺伝子又は遺伝子の組み合わせが発現される。この哺乳類前立腺癌細胞系は、初代ネズミ上皮細胞を含む任意の好適な哺乳類細胞を含むことができる。この初代哺乳類上皮細胞は、ラット及びマウスを含む免疫応答性齧歯類を含む、任意の免疫応答性哺乳類に由来することができる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子のセットの１つ以上で形質転換された癌細胞系を移植された免疫応答性哺乳類を含む癌の動物モデルを提供する。
【００１１】
一実施形態では、本発明の哺乳類前立腺癌細胞系を使用して生み出された免疫応答性遺伝子組換えマウスが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子のセットの１つ以上の発現レベルに基づいて、検出可能な分子遺伝子シグネチャーを作成することが可能な前立腺腫瘍を発症する。
【００１２】
更に別の態様では、本発明は、不死化された初代哺乳類上皮細胞のインビトロ生成のための方法を提供し、この方法は、初代哺乳類上皮細胞を、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターで感染させることを含み、前述の初代哺乳類上皮細胞は、前述のレトロウイルスベクターによって感染されることが可能であり、この条件下で、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせが前述の感染された細胞内で発現される。
【００１３】
他の態様では、本発明は、前立腺癌を診断するための方法を提供し、この方法は、（ａ）前立腺癌に冒されたか又は前立腺癌を有する疑いがあるか又は前立腺癌を発症する恐れのある対象から生物学的テストサンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子の１つ以上のセットがｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、テストサンプル中の少なくとも１つの生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルを判定することと、（ｃ）前述のテストサンプル中の前述の少なくとも１つの生物学的マーカー又は前述の分子遺伝子シグネチャーのレベルを、対照サンプル中の生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルと比較することと、を含み、前述の対照サンプル中の生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルに対する前述のテストサンプル中の生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルの上昇は、前述の対象における前立腺癌の存在の診断指標である。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は、前立腺腫瘍を含む癌を分類する方法を提供し、この方法は、（ａ）癌腫瘍又は前立腺腫瘍サンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することと、（ｃ）検出ステップ（ｂ）の結果に基づいて、腫瘍サブクラスに属するものとしてこの前立腺腫瘍を分類することと、を含む。
【００１５】
他の態様では、本発明は、臨床試験のために、前立腺腫瘍を含む癌腫瘍を有する対象を層別化する方法を提供し、この方法は、（ａ）癌腫瘍又は前立腺腫瘍を有する対象に由来のサンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＥｒｂＢ２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することと、（ｃ）この検出ステップの結果に基づいて、臨床試験のために対象を層別化することと、を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、前立腺腫瘍を有する対象のための治療を選択する方法を提供し、この方法は、（ａ）前立腺腫瘍を有する対象に由来のサンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することと、（ｃ）この検出ステップの結果に基づいて、治療を選択することと、を含む。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、１つ以上の外因性発癌遺伝子で細胞を形質転換し、この細胞を少なくとも１回分裂させることによって生成された非自然発生細胞を提供し、ここにおいて、この細胞は１つ以上の外因性発癌遺伝子を含有するベクターによって形質転換された哺乳類細胞であり、１つ以上の外因性発癌遺伝子は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
前立腺上皮細胞の発癌遺伝子形質転換は、ケモカイン受容体５型（「ＣＣＲ５」）及びそのリガンド（ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ７）の発現の増加に関連する転移性細胞を誘導することが発見されている。連日の経口ＣＣＲ５拮抗剤マラビロクでの転移における減少によって証明されたように、このＣＣＲ５受容体は、骨転移に機能的に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】発癌遺伝子形質導入ＰＥＣ系が軟寒天中にコロニーを形成することを示す。
【図２】アレイＣＧＨによって判定された４つの発癌遺伝子細胞系におけるコピー数異常を示す。
【図３】前立腺上皮細胞系が免疫応答性マウスで増殖することを示す。
【図４】発癌遺伝子形質転換前立腺上皮細胞腫瘍が、肺に転移することを示す。
【図５】マイクロアレイ遺伝子発現の階層的クラスタリングを示す。
【図６】前立腺腫瘍中のｃ−Ｍｙｃ−及びＨａ−Ｒａｓに特異的な発癌遺伝子シグネチャーが、他の組織中で保存されることを示す。
【図７】遺伝子発現が、無再発生存を有する発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系に相関性があることを示す。
【図８】遺伝子発現が、無再発生存を有する発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系に相関性があることを示す。
【図９】低分化前立腺腺癌の組織学的特徴を示す。
【図１０】同系前立腺癌細胞系の３Ｄマトリゲル浸潤のＳｒｃによる増強を示し、ここで、図１０Ａは創傷を示す細胞移動の創傷アッセイを示し、図１０ＢはＮ＝３の別個の実験についての閉鎖の定量化を示し、図１０Ｃはマトリゲル中で前立腺癌細胞系を使用する３−Ｄ浸潤アッセイを示し、並びに、図１０ＤはＰＥＣ系（ＰＥＣ―ＮｅｕＴ、ＰＥＣ−Ｒａｓ、及びＰＥＣ−Ｓｒｃ）についての３つの個別の実験からの浸潤の平均距離±ＳＥＭを示す。
【図１１】同系前立腺癌細胞系腫瘍が血管性であることを示し、ここで、図１１Ａは、腫瘍体積を定量化するための正規化した光子束を使用する、３つの細胞系のそれぞれに関して１×１０５個の細胞の皮下接種後、３週間にわたって定量化した、ＮＣＲヌードマウスにおける皮下腫瘍増殖を示し、図１１Ｂは、フォン・ウィルブランド因子（ＷＦ）についての免疫組織化学染色を示し、これはＲａｓ細胞系の増強したＶＷＦ染色を有する細胞系の血管分布状態を示している。
【図１２】前立腺癌細胞系が転移を発生することを示す。Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現するベクターで形質導入されたＰＥＣ細胞系が、ＦＶＢマウスの心室に注射され、インビボの生物ルミネセンス信号が毎週定量化された実験からの結果は、以下のように提示される。図１２Ａは、前立腺上皮細胞の心臓内注射後２週間での典型的な全身の生物ルミネセンス画像を示し、図１２Ｂは、同系前立腺癌細胞系の心臓内注射後のマウスにおける脳転移の典型的画像を示し、図１２Ｃは、腫瘍を有するマウスの比率として示された、生物ルミネセンス撮像（ＢＬＩ）の定量化（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６）を示し、図１２Ｄは、同系細胞系のそれぞれの転移性脳腫瘍負荷の測定値としての平均総陽子束を示し、図１２Ｅは、ＰＥＣ−Ｓｒｃ及びＰＥＣ−ＮｅｕＴの心臓内注射の２週間後に形成された脳転移のヘマトキシリン及びエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色及び脳内の前立腺上皮細胞の存在を裏付けてサイトケラチン１４（「ＣＫ１４」）染色を示す。
【図１３】前立腺腫瘍細胞系の肝臓転移を示す。Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現する同系ＰＥＣ細胞系がＦＶＢマウスの心室に注射され、インビボの生物ルミネセンス信号が定量化される実験からの結果は、以下のように提示される。図１３Ａは、肝臓腫瘍を有するマウスのパーセンテージを示し、図１３Ｂは、光子束によって決定された腫瘍サイズを示し、図１３Ｃは、肝臓転移を示す典型的マウス画像を示し、図１３Ｄは、腎臓腫瘍を有するマウスのパーセンテージを示し、図１３Ｅは、光子束による腎臓腫瘍のサイズを示し、並びに、図１３Ｆは、腎臓転移の典型的画像を示す。
【図１４】同系前立腺癌細胞系が、溶骨性骨転移を発生することを示し、図１４Ａは、Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現するＰＥＣ細胞系の心臓内注射を受け、インビボの生物ルミネセンス信号が定量化されたＦＶＢマウスの典型的インビボ画像を示し、図１４Ｂは、腫瘍を有するマウスの比率としての生物ルミネセンス撮像（ＢＬＩ）の定量化（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６）を示し、並びに図１４Ｃは、光子束上の腫瘍質量のサイズを示す。
【図１５】溶骨性前立腺癌骨転移のＳｒｃによる増強を示す。ＦＶＢマウスがＰＥＣ−Ｓｒｃの心臓内注射後２週間で溶骨性骨病巣を発症した実験からの結果が、以下のように提示される。図１５Ａは、骨中の腫瘍面積が、ＰＥＣ−Ｒａｓ及びＰＥＣ−ＮｅｕＴと比較してＰＥＣ−Ｓｒｃ群において著しく増加したことを示し、図１５Ｂは、細胞の心臓内注射前（ｔ０）及び注射後１４日（ｔ１４）の典型的Ｘ線像を示す。図１５Ｃは、骨−腫瘍境界面における骨芽細胞（矢印）の存在を裏付ける酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（「ＴＲＡＰ」）染色を示し、図１５Ｄは、その後形成された骨転移のＨ＆Ｅ染色を示し、図１５Ｅは、ＣＫ１４染色を示し、並びに、図１５Ｆは、ＣＫ８染色を示し、ＣＫ１４染色及びＣＫ８染色の双方ともに、骨内の上皮細胞の存在を裏付けるものである。
【図１６】溶骨性前立腺癌細胞系が、ＣＣＬ５及びオステオポンチン（「ＯＰＮ」）受容体の機能を発現することを示し、図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰＥＣ細胞系上でのＣＣＲ５発現の蛍光活性化セルソータ（「ＦＡＣＳ」）解析を示し、図１６Ｅ及び１６Ｆは、ＣＤ４４リガンドとしてのＯＰＮ及びＣＣＲ５リガンドとしてのＣＣＬ５を使用して実施されたＰＥＣ−Ｓｒｃ細胞系のマトリゲル浸潤アッセイを示し、図１６Ｇは、平均値＋ＳＥＭとして定量化されたＰＥＣ−Ｓｒｃ細胞系のマトリゲル浸潤を示し、図１６Ｆは、組織培養中の前立腺腫瘍細胞系のケモカイン受容体及びリガンド遺伝子発現を示し、並びに図１６Ｇは、組織培養における発現と比較された、皮下移植後のサイトカイン受容体及びリガンドの相対存在比を示す。
【図１７】脊髄の溶骨性前立腺癌転移を遮断するＣＣＲ５拮抗剤を示す。Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現するベクターで形質導入されたＰＥＣ細胞系が、ＦＶＢマウスの心室に注射され、インビボ生物ルミネセンス信号が２週間後に定量化された実験からの結果が、図１６Ａ〜１６Ｄに示され、図１７Ａは、各群からのマウスの典型的例を示し（マウスは経口マラビロク（８ｍｇ／ｋｇ）又は対照で処置された）、図１７Ｂは、総腫瘍質量の容量分析としての光子束を示し、図１７Ｃは、マウスの下肢骨の質量を示し（データは、各群中のＮ＝８の別個のマウスに関する平均値＋ＳＥＭであり、Ｐ＜０．０５）、並びに、図１７Ｄは、マウスの下肢骨の質量の典型的Ｘ線画像を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｈは、Ｘ線解析と相関性があるフッ素−１８、フッ化ナトリウム（「Ｆ−１８−ＮａＦ」）撮像が、脊椎転移の存在を立証したことを示す。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、マラビロクの連日の経口治療が、脊椎転移を＞９０％まで低減したことを示す。
【図２０】ｔＰＥＣ細胞系マイクロアレイからのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ここで本発明の主題は、その中で典型的実施形態が示される、添付の図面及び実施例を参照して、以下により完全に説明されるであろう。しかしながら、本発明の主題は、種々の形態で具体化され得るが、これらは本明細書に記載される実施形態に限定するものとして解釈されるべきではない。むしろ、これら実施形態は、当業者に説明し、かつ当業者が実施可能であるよう提供されている。異なる旨を特記しない限り、本明細書に記載の全ての技術的及び科学的用語は、本発明の主題が関連する分野の当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００２１】
Ｉ．動物モデル及び細胞系
癌及び特に前立腺癌などの疾患のための新しい治療は、動物における新しい試験の実験手順を必要とする。これら試験の実験手順は、免疫応答性（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）（又は「免疫応答性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」）動物で移植され得る前立腺癌細胞系の欠乏によって制限されてきた。免疫系がヒト前立腺癌の発症及び進行において重要な役割を果たすために、このことは重要である。前立腺癌を有する患者を治療するために有用な新しい薬剤をスクリーニングするために、免疫応答性動物において試験され得る前立腺癌細胞系を開発することが必要であり、これは、組織学によりヒトの疾患を反映し、ヒトの疾患で起こるような肺及び骨への転移を含むインビボでの同一タイプの行動を起こす。
【００２２】
したがって、本発明の態様は、哺乳類を含めるヒト及び非ヒト動物を含む免疫応答性、又は免疫応答性動物で移植され得る癌細胞系を提供する。例示的な非ヒト哺乳類としては、例えば、ラット、モルモット、及びマウス等の齧歯類、及びブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ及びウシ等の家畜動物が挙げられる。
【００２３】
体内の任意の型の細胞は癌の供給源であり得るために、任意の好適な型の癌細胞系が、本発明で使用され得る。好適な癌型としては、癌腫（上皮細胞の癌）、肉腫（骨、筋肉又は他の結合組織の癌）、リンパ腫（リンパ系の癌）、白血病（血液細胞又は血液前駆体細胞の癌）及び黒色腫（色素を提供する細胞の癌）が挙げられる。
【００２４】
一実施形態では、前立腺癌細胞系が提供され、ここでは前立腺癌細胞系は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターで感染された初代哺乳類上皮細胞のセットの少なくとも１つ以上を含み、前述の発癌遺伝子又は遺伝子の組み合わせが発現される。
【００２５】
一実施形態では、マウス前立腺癌細胞系が提供され、ここではネズミ前立腺癌細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択された発癌遺伝子が形質導入される。好適なマウス前立腺癌細胞系は、初代ネズミ上皮細胞中で発癌遺伝子が発現されることが可能な条件下で、発癌遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターで初代ネズミ上皮細胞を感染させることによって得ることができる。
【００２６】
ヒトの癌の遺伝子組換え免疫応答性マウスモデルは、例えば、特に遺伝子組換えマウスがインサイチューで（すなわち、ヒトの腫瘍に非常に類似した環境で並びに正常な免疫系の設定において）腫瘍を形成するために、異種移植モデルよりもヒトの癌をより反映する能力を有する。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、免疫応答性非ヒト哺乳類は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせを含む本明細書に記載の発癌遺伝子の１つ以上を発現するよう、更に癌を発症するよう操作される。
【００２７】
研究においてヒト癌の遺伝子組換えマウスモデルを使用することのいくつかの利点がある。例えば、小動物Ｘ線コンピュータ断層映像法（マイクロＣＴ）が、比較的安価でかつ血管及び血管新生を前臨床的に可視化するための高度に定量的な三次元法としても腫瘍の進行を監視するために使用され得る。かかる方法を使用して、生存するマウスにおける前臨床治療的トライアル中に、血管分布状態の迅速かつ正確な判定を達成することが可能である。マイクロＣＴでの腫瘍判定は、データの迅速な定量的ビジュアル描写並びに腫瘍血液体積、血管密度、血管口径変化、分岐の度合い、及びセグメント化分析を使用するねじれの定量的解析を可能にする。
【００２８】
本発明における使用に好適である免疫応答性マウスの例としては、（無作為交配種ＣＤ１、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＰＱ）、Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ（Ｂ６）、Ｃ５７ＢＩ／６×１２９／Ｊ  Ｆ１（Ｆ１、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）、ＦＶＢ／Ｎ、Ｃ５７ＢＶ６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＮＤ４が挙げられる。
【００２９】
好ましい実施形態では、ＦＶＢ／Ｎマウスが、本発明による遺伝子組換えマウスモデルを構築するのに使用される。ＦＶＢ／Ｎマウスは、本明細書で意図され及び／又は記載されるほとんどの遺伝子組換え実験及び遺伝子解析に好適である。同系交配されたＦＶＢ／Ｎ種は、強力な生殖能力及び一様に大型の同腹子によって特徴付けられ、ＦＶＢ／Ｎの受精卵は、大型の明瞭な前核を含有し、これはＤＮＡの微量注入を容易にする。
【００３０】
本発明の哺乳類前立腺癌細胞系を使用して作製された免疫応答性遺伝子組換えマウスは、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子のセットの１つ以上の発現レベルに基づいて、検出可能な分子遺伝子シグネチャーを作成する。
【００３１】
転移は、癌患者における死亡の主な原因である。現行の化学療法的抗癌治療は、患者の体内の癌細胞の数を減少させる目的の細胞障害剤、ホルモン剤又は免疫調整剤を使用する。しかしながら、大部分の転移性細胞は抗癌剤に対して抵抗性であり、したがって、現在利用可能な薬剤は、他の組織又は器官への癌細胞の播種性転移を有効に停止させないことを示す証拠を裏付けている。癌療法分野における多数のかつ広範囲にわたる革新的療法にもかかわらず、大部分の転移性腫瘍を治療するための有効な方法は目下のところ存在しない。
【００３２】
「ベクター」又は「構築物」とは、インビトロ又はインビボのいずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子又は分子の複合体を指す。送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子療法のための着目配列を含むことができる。ベクターとしては、例えば、トランソポゾン及び他の部位特異的移動性要素、ウイルスベクター、（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、パピローマウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、フォーミーウイルス及びレトロウイルスのベクター、並びに偽型ウイルスを含む）、リポソーム及び他の脂質含有複合体、並びに宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を仲介することが可能である他の巨大分子複合体（例えば、ＤＮＡコーティングされた金粒子、ポリマー−ＤＮＡ複合体、リポソーム−ＤＮＡ複合体、リポソーム−ポリマー−ＤＮＡ複合体、ウイルス−ポリマー−ＤＮＡ複合体（例えば、アデノウイルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体）、並びに抗体−ＤＮＡ複合体が挙げられる。ベクターはまた、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現をさらに調整する、若しくはベクターが導入される細胞に有益な特性を他の方法で提供する他の成分又は機能を含むこともできる。かかる他の成分としては、例えば、細胞に結合する又は細胞を標的とすることに影響を与える成分（細胞型又は組織特異的結合を仲介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の吸収に影響を与える成分、吸収後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（核への局在化を仲介する薬剤など）、及びポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が挙げられる。かかる成分はまた、取り込まれてベクターによって送達された核酸を発現している細胞を検出し又は選択するよう使用され得る検出可能な及び／又は選択可能なマーカーなどのマーカーを含んでもよい。かかる成分は、ベクターの固有の特徴部として提供され得る（結合及び吸収を仲介する成分又は機能を有する特定のウイルスベクターの使用など）か、又はかかる機能をもたらすようベクターが改変され得る。多種多様なかかるベクターが当該技術分野で既知であり、一般的に利用可能である。ベクターが宿主細胞中で維持される場合、ベクターは、有糸分裂中に自律的構造として細胞によって安定的に複製され得るか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか、又は宿主細胞の核又は細胞質内に維持され得るかのいずれかある。
【００３３】
ヒト前立腺癌は、発癌遺伝子信号伝達を反映する遺伝子構造及びシグネチャー内に埋め込まれている。本発明の細胞系は、これら発癌遺伝子シグナル伝達経路の１つ以上を有利に反映し、したがって、例えば発癌遺伝子に特異的な化合物又は核酸に基づく療法のテストを容易にする。特に、本明細書に提供されるような前立腺癌細胞系は、発癌遺伝子に特異的な化合物又は核酸に基づく療法のテスト及び／又はそれらのスクリーニングに有用である。
【００３４】
好適な発癌遺伝子に特異的な阻害剤の例としては、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ｃ−Ｓｒｃ、及びＥｒｂＢ２発癌遺伝子対する阻害剤が挙げられる。臨床用途又は開発段階にある、ＥｒｂＢｓを標的とするいくつかの好適な抗癌剤としては、ＥｒｂＢ族に対するキメラ又はヒト化モノクローナル抗体の部類に入るもの及び小分子ＥｒｂＢチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。このキメラ又はヒト化モノクローナル抗体としては、リガンド結合及びリガンド依存性受容体活性化を抑制する抗体（例えば、ＥｒｂＢ１のリガンド結合サブドメインＩＩＩを標的とするセツキシマブ）、リガンド非依存性受容体活性化を妨害する抗体（例えば、ＥｒｂＢ２のサブドメインＩＶを標的とするトラスツズマブ）、及び受容体ヘテロ二量体化を抑制する抗体（例えば、ＥｒｂＢ２のサブドメインＩＩ中の二量体化ループ周辺の領域を標的にする抗−ＥｒｂＢ２抗体のペルツズマブ）が挙げられる。例示的な小分子ＥｒｂＢチロシンキナーゼ阻害剤としては、２つのＥｒｂＢ１に特異的なチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ／イレッサ及びエルロチニブ（これらは、非小細胞肺癌の治療に承認されている）、並びに二重ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２阻害剤であるラパチニブが挙げられ、このラパチニブは、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）として市販され、進行した又は転移性乳癌を有する患者の治療にカペシタビンと組み合されること、及びＨＥＲ２を過発現するホルモン受容体陽性転移性乳癌を有する閉経後の女性の治療に、レトロゾールと組み合されることが示されている。
【００３５】
他のＥｒｂＢ２受容体阻害剤としては、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ＰＬＣ）、並びにモノクローナル抗体ＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ）及び２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ）が挙げられる。例示的ＥｒｂＢ２阻害剤としてはまた、国際公開公報第１９９８／０２４３４号（１９９８年１月２２日発行）、同第１９９９／３５１４６号（１９９９年７月１５日発行）、同第１９９９／３５１３２号（１９９９年７月１５日発行）、同第１９９８／０２４３７号（１９９８年１月２２日発行）、同第１９９７／１３７６０号（１９９７年４月１７日発行）、同第１９９５／１９９７０号（１９９５年７月２７日発行）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日発行）、及び同第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日発行）に記載されるものが挙げられ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明で有用なＥｒｂＢ２受容体阻害剤はまた、１９９９年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／１１７，３４１号及び１９９９年１月２７日に出願された同第６０／１１７，３４６号にも記載され、これらの双方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本発明で有用なｃ−Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、国際公開公報第１９９６／１００２８号、同第１９９７／２８１６１号、同第１９９７／３２８７９号及び同第１９９７／４９７０６号で全般的にかつ具体的に開示された化合物が挙げられ、これらは、ピロロピリミジン（特にピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）、プリン、ピラゾ−ピリミジン（特に、ピラゾ［３，４−ｄ］ピリミジン）、ピラゾピリミジン（特に、ピラゾ［３，４−ｄ］ピリミジン）及びピリドピリミジン（特にピリド［２，３−ｄ］ピリミジンの構造部位類に属するものが挙げられる。例示的化合物は、以下の式Ｉ〜ＩＶの化合物を含む。
2014518610.tif 000002
【００３７】
上記化合物は、引用された文献に記載されるように調製されかつ投与され得る。式Ｉの化合物は、国際公開公報第１９９６／１００２８号に記載されるよう調製されかつ製剤化され得る。式ＩＩの化合物及びその調製は、国際公開公報第１９９７／１６５４２号の実施例１１１ｃ３に記載されている。式ＩＶの化合物は、これに類似した方法で調製され得る。後者の化合物の双方は、国際公開公報第１９９７／１６４５２号に記載されているように製剤化され得る。式ＩＩＩの化合物は、Ｒ．Ｇａｍｅｓら著，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４（Ｓｕｐｐｌ．１），１９９９、Ｓ４８７によって説明されている。
【００３８】
追加の有用な化合物（例えば、ＰＰ１）は、Ｔ．Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｆ．Ｓｉｃｈｅｒｉら著，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１９９９（３）、６３９，６４７；Ｊ．Ｍ．Ｈａｍｂｙら著，Ｉ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０，１９９７，２２９６−２３０３；Ｒ．Ｌ．Ｐａｎｅｋら著，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８３，１９９７，１４３３−１４４４；及びＳ．Ｒ．Ｋｌｕｔｃｈｋｏら著，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，１９９８，３２７６−３２９２によって記載されている。
【００３９】
他のｓｒｃ阻害剤としては、ＳＫＩ６０６が挙げられ、これはボスチニブ（Ｗｙｅｔｈによる）及び化合物ダサチニブとしても知られ、更に国際公開公報第２０００／６２７７８号及び米国特許第６，５９６，７４６号で開示されているＳｐｙｒｃｅｌ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによる）としても知られる。これらｓｒｃ阻害剤の全ては、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
小分子ｃ−Ｍｙｃ阻害剤としては、ビフェニル−２−イル−（７−ニトロベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イルアミンとしても既知の１００７４−Ｇ５；Ｑｕａｒｆｌｏｘｉｎ（ＣＸ−３５４３としても既知）；及びビフェニル−２−イル−（７−ニトロベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イルアミンとしても既知の１００７４−Ｇ５が挙げられる。ＣＸ−３５４３は、報告によれば、ｃ−Ｍｙｃを含む特異的発癌遺伝子の転写を調整する四重鎖ＤＮＡ二次構造であるｃ−Ｍｙｃ四重鎖へ結合することによって、ｃ−Ｍｙｃ活性を抑制する。
【００４１】
他のｃ−Ｍｙｃ阻害剤としては、米国特許出願公開第２００７／０２０３１８８号（２００７年８月３０日発行）で開示される化合物が挙げられる。これらｃ−Ｍｙｃ阻害剤は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
更に別の態様では、本発明は、不死化初代哺乳類上皮細胞のインビトロ生成のための方法を提供し、この方法は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発癌遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターで初代哺乳類上皮細胞を感染させて、感染細胞を提供することを含み、ここで前述の初代哺乳類上皮細胞は、前述のレトロウイルスベクターに感染されることが可能であり、この条件下で、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせが前述の感染細胞中で発現される。
【００４３】
任意の好適な遺伝子送達システムが、本発明で使用され得る。好適な遺伝子送達システムの特定の例としては、レトロウイルス及びアデノウイルス発現システムが挙げられる。レトロウイルス仲介遺伝子導入は、血液細胞増殖、分化、及び生物学的機能に及ぼすそれらの機能の分析を含む種々の様々な理由で、造血細胞を含む種々の細胞系においてタンパク質を発現するために広範囲に使用されている。特に、ネズミ幹細胞ウイルス（「ＭＳＣＶ」）レトロウイルス発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃによる）は、ネズミ又はヒト造血性、胚幹（ＥＳ）細胞、及び胚性癌（ＥＣ）細胞を含む多能性細胞中に標的遺伝子を導入しかつそこで発現するために最適化されているベクターを含有する。アデノウイルス発現システムの特定の例としては、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）アデノウイルス発現システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）が挙げられ、これは、例えば、分裂する又は非分裂の哺乳類細胞のいずれかで、着目の標的遺伝子（複数可）を送達しかつ一過性に発現させるために使用され得る複製する能力のないアデノウイルスの作製に有用である。
【００４４】
ＩＩ．使用方法
別の態様において、本発明は、前立腺癌を診断するための方法を提供し、この方法は、（ａ）前立腺癌に冒されたか、又は前立腺癌を有すると疑われるか、又は前立腺癌を発症する恐れがある対象から生物学的テストサンプルを提供することと、（ｂ）前立腺癌の診断に関連するテストサンプルパターンにおける遺伝子発現に基づいて、少なくとも１つの生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルを判定することと、（ｃ）前述のテストサンプル中の前述の少なくとも１つの生物学的マーカー又は前述の分子遺伝子シグネチャーのレベルを、対照サンプル中の生物学的マーカーのレベル又は分子遺伝子シグネチャーのレベルと比較することと、を含み、前述の対照サンプルにおける生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルに対する前述のテストサンプル中の生物学的マーカー又は分子遺伝子シグネチャーのレベルの上昇は、前述の対象における前立腺癌の存在の診断指標である。
【００４５】
一実施形態において、生物学的試験体は、患者から得られる条件のもとに、腫瘍に由来する核酸を含有する。核酸は、生検によって、又は尿中の腫瘍に由来の細胞から、又は患者の血液中に分泌された遺伝子シグネチャーの結果として生成されたタンパク質中のいずれかで腫瘍から誘導され得る。
【００４６】
更に別の態様では、本発明は、前立腺腫瘍を分類する方法を提供し、この方法は、（ａ）前立腺腫瘍サンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子がｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することと、（ｃ）検出ステップの結果に基づいて、腫瘍サブクラスに属するものとして、前立腺腫瘍を分類することと、を含む。
【００４７】
一態様では、本発明は、臨床試験のために、前立腺腫瘍を含む癌腫瘍を有する対象を層別化する方法を提供し、この方法は、（ａ）癌腫瘍又は前立腺腫瘍を有する対象に由来するサンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子がｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＥｒｂＢ２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することと、（ｃ）検出ステップの結果に基づいて、臨床試験のために、対象を層別化することと、を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、対象は、分子遺伝子シグネチャー及び／又は分子遺伝子シグネチャーに関連した機能的経路の存在に基づく下位カテゴリに層別化される。
【００４９】
一実施形態では、分子遺伝子シグネチャーは、癌腫瘍、特に前立腺癌腫瘍を有する対象に由来するテストサンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に基づき、ここで遺伝子の１つ以上のセットが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５０】
別の態様では、本発明は、前立腺腫瘍を有する対象のための治療を選択する方法を提供し、この方法は、（ａ）前立腺腫瘍を有する対象に由来するサンプルを提供することと、（ｂ）遺伝子がｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される中で、サンプル中の遺伝子のセットの１つ以上の遺伝子発現パターン又は活性に由来する分子遺伝子シグネチャーを検出することと、（ｃ）検出ステップ（ｂ）の結果に基づいて、治療を選択することと、を含む（すなわち、発癌遺伝子に基づく療法は、患者の腫瘍における腫瘍シグネチャーに基づいて提供される）。
【００５１】
更に別の態様では、本発明は、１つ以上の外因性発癌遺伝子で細胞を形質転換し、細胞に少なくとも１回分裂させることによって、非自然発生細胞を提供し、ここで、この細胞は、１つ以上の外因性発癌遺伝子を含有するベクターによって形質転換されたヒト細胞
であり、この１つ以上の外因性発癌遺伝子は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＮｅｕＴ、ｃ−Ｓｒｃ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。このシグネチャーは、前立腺癌に由来の遺伝物質−すなわち、前立腺、尿、血液又は他のバイオ試験体を含む前立腺に関するバイオフルイドに適用され得る。このシグネチャーはまた、他の癌型、特に乳癌で見られるような癌型にも適用され得る。ｃ−Ｍｙｃシグネチャーの場合、このシグネチャーは、前立腺腫瘍において及び遺伝子組換えマウス（図７Ｃ）の乳腺におけるｃ−Ｍｙｃの遺伝子組換え発現に由来の乳房腫瘍においての双方で見られる。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、前立腺癌に冒されたか又は前立腺癌を有することが疑われるか又は前立腺癌を発症する恐れがある対象からの生物学的サンプルを得ること、並びにこの生物学的サンプルからの遺伝物質が、本明細書に記載されるような遺伝子シグネチャーを有するかどうかを判定することによって、癌を特定することを含む。一実施形態では、生物学的サンプルは、前立腺生検に由来する。別の実施形態では、この生物学的サンプルは、前立腺、尿、血液又は他の生物試験体を含む前立腺に関するバイオフルイドに由来する。別の実施形態では、本発明の方法は、遺伝子シグネチャー同定のために、尿サンプルを採取する前に、前立腺をマッサージすることを含む。別の実施形態では、この方法は、上記記載のような他の流体を含む。
【００５３】
新しい治療は、動物における新しい試験の実験手順を必要とする。これら試験は、免疫応答性動物中に移植され得る前立腺癌細胞系の欠乏によって制限されてきた。免疫系は、ヒト前立腺癌の発症及び進行において重要な役割を果たす。前立腺癌を有する患者を治療するための新薬のスクリーニングを可能にするために、組織学によってヒトの疾患を反映する、並びにヒトの疾患で起こるような肺及び骨への転移を含むインビボでの同一のタイプの行動を反映する免疫応答性動物において試験され得る前立腺癌細胞系を開発することが必要である。免疫応答性マウスで使用され得るこれら細胞系の作製に関する方法が、追補３で記載される。
【００５４】
当該技術分野で既知であるように、オリゴヌクレオチド配列は、細胞に導入されることができる。トランスフェクション、電気穿孔法、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子並びにウイルス及び非ウイルスベクター、並びに当該技術分野で既知の他の手段が、オリゴヌクレオチド配列を細胞に送達させるために使用され得る。選択される送達の方法は、少なくとも処理される細胞及び細胞の場所に依存するであろうし、これは当業者には既知であろう。局在化は、リポソームを方向付ける特異的マーカーをその表面上に有するリポソームによって、標的細胞を含有する組織への注射を直接受けることによって、標的細胞、特異的受容体仲介取り込み、ウイルスベクター、又は同類物と空間的近接性で結合されたデポ剤を有することによって達成され得る。発癌遺伝子は、形質導入又はトランスフェクションによって、細胞中に導入されることができる。形質導入は、レトロウイルス又は他のウイルス送達システムのいずれかを使用して実行され得る。
【実施例】
【００５５】
マウス、細胞培養、化学薬品及び試薬。
遺伝子組換えマウスを使用する実験手順は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学の倫理委員会によって承認された。マウスはＦＶＢ系統であった。マウスの前立腺上皮細胞培養を、１２週齢の雄のマウスの前立腺から単離し、既に報告された［４２］ように維持し、各遺伝子型の少なくとも３つの系で２５継代培養後に分析した。ベクターｐＢＡＢＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ中で、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ、ＮｅｕＴのいずれかをコードするレトロウイルス発現ベクターによる細胞の形質導入は、既に報告された［４３、４４］通りであった。
【００５６】
細胞増殖アッセイ。
細胞を、各サンプルが同じものを３部×７日で、１×１０４細胞／ウェルの濃度で、２４ウェルプレートに播種した。形質転換細胞を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地中で増殖させて、同時に対照ＰＥＣ細胞を前立腺上皮初代培養培地中で培養した。２４時間毎に細胞を採取し、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁させて、等容量の０．４％のトリパンブルーを加え、５分後に、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｃｏｕｎｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｃ１０２２７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって細胞を計数した。
【００５７】
軟寒天中のコロニー形成。
細胞（３×１０３／ｍｌ）を、懸濁皿（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中、０．３％の軟寒天（Ｓｉｇｍａ）に播種した。コロニーを０．０４％の酢酸クリスタルバイオレットによって染色し、２週間のインキュベーション後に、垂直型顕微鏡下で計数した。
【００５８】
腫瘍形成アッセイＩ。
１００μｌの容量中１×１０６細胞を、７〜８週齢のＦＶＢ雄マウスに皮下注射した。細胞懸濁液を、２０容量％のＢＤマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）と混合し、１０−７細胞／ｍｌの最終細胞濃度を得た。腫瘍増殖を、１週間に２回、ノギスによって測定した。（１６日後に採取されたＮｅｕＴ−誘導腫瘍を除いては）３０日後に腫瘍サンプルを採取した。
【００５９】
細胞培養、トランスフェクション、形質導入、発現ベクター。
Ｈａ−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ、及びＮｅｕＴ発癌遺伝子で形質転換されたＰＥＣ（前立腺上皮細胞）系を生成し、Ｌｕｃ２遺伝子を含有するレンチウイルスベクターでトランスフェクトし、安定な生物ルミネセンス性癌細胞系を産生した。Ｌｕｃ２−トマトレッド発現ベクターは、既に報告されている（Ｌｉｕ，Ｈら著，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０，１０７，１８１１５−１８１２０）。同系ＰＥＣ系を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持し、５％のＣＯ２中３７℃で培養した。
【００６０】
創傷治癒アッセイ。
細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で、１２−ウェルプレート上で集密状態まで増殖させた。単層細胞をＰ１０マイクロピペットの先端で傷つけた。採点の直後に細胞をＰＢＳで洗浄し、血清フリーＤＭＥＭを加えた（１６）。細胞移動を２０時間監視し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡システムを使用して、９時間、１２時間、１５時間及び２０時間の時点で写真を撮影した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を解析した。
【００６１】
サイトカインアレイ解析。
ニトロセルロース膜上にスポットされたマウスサイトカインアレイを、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈから入手した。細胞を血清フリーＤＭＥＭ中で４８時間培養することによって、調整培地を調製した。次いで、調整培地中の分泌したサイトカインの判定に関する製造業者の使用説明書に従って、膜を処理した（Ｋａｔｉｙａｒ，Ｓ．ら著，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７，２７，１３５６−１３６９を参照）。
【００６２】
腫瘍形成アッセイＩＩ。
１２週齢の雄のｎｕ／ｎｕマウスを、３％のイソフルランに曝すことによって、麻酔処理した。麻酔したマウスは、背側脇腹下の皮下注射によって、５０μＬのカルシウム及びマグネシウムを欠如したダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）及び５０μＬのＢＤマトリゲル膜ベースメント（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＢｅｄＦｏｒｄ，ＭＡ）中に懸濁させた１×１０６個の細胞の投与を受けた。注射は、２７Ｇ１／２針を使用して実施した。既報（１８）のような方法を使用して腫瘍切除が行われるまで、腫瘍の進行を、週に１回の生物ルミネセンス測定によって追跡した。３匹のマウスを一度に背中側から監視した。表示された画像からの関心領域（ＲＯＩ）が腫瘍部位又は転移病巣の周辺で描かれ、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量化した。腫瘍サンプルを３週間後に採取した。マウスを伴う全ての実験は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学のＩＡＣＵＣの承認の下で実行した。
【００６３】
実験的転移アッセイ。
８週齢の雄のＦＶＢマウスを、３％のイソフルランに曝すことによって、麻酔処理した。１００μＬのＤＰＢＳ中に懸濁された２×１０５個の癌細胞を、マウスの心臓の左心室に注射した。注射は、３０Ｇ１／２の針及び１ｍＬの注射器を使用して実施した。全身循環系における細胞の存在を確認するために、ＩＶＩＳ  ＬＵＭＩＮＡ  ＸＲシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ  ＭＡ）を使用して、動物を撮像した。動物の体全体に分布した全身的生物ルミネセンスによって、心臓内注入が成功を収めたことが示された。適切に注入されなかったマウスを、この試験から除外した。マウスをインビボ撮像するために、ルシフェラーゼの基質であるＤルシフェリン（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍＬで、体重のグラム当たり１０μＬのルシフェリン原溶液の１０μＬ（製造業者の推奨）の腹腔内注射によって、動物に投与し、３％のイソフルランに曝すことによって、麻酔処理した。Ｄ−ルシフェリン注射後１０〜１５分で、動物をＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ  ＭＡ）のカメラボックスの内側に配置し、２．５％のイソフルランの連続的曝露を受けさせた。撮像時間は、転移性病変の生物ルミネセンスに応じて、５秒（後期時点について）から５分（初期時点について）までの範囲であった。１匹のマウスだけが、腹側で撮像された。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェアを使用して、結果を解析した。生体外ＢＬＩについては、Ｄ−ルシフェリンを、３００μｇ／ｍＬの最終濃度までＰＢＳ中で希釈し、撮像前に新たに単離した器官を２〜３分間浸漬するよう使用した。動物実験は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学のＩＡＣＵＣによって承認されたものであった。
【００６４】
骨転移のＸ線撮影解析及びＣＴ。
骨転移の発生を、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＸＲ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｘ線撮影によって監視した。マウスを麻酔処理し、腹臥位で配置し、Ｘ線で５分間露光させた。マラビロク（ＣＣＲ５の拮抗剤）の投与。雄のＦＶＢマウスに、癌細胞の接種前５日から、並びにｉｃ注射後安楽死まで、８ｍｇ／ｋｇのマラビロク（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ）の毎１２時間の経口投与を受けさせた。この薬剤は、５％のＤＭＳＯ及び０．５％の１Ｎ−ＨＣｌを含有する水に溶解した。対照マウスを同一の投与計画で維持し、ビヒクルの同一注射容量を受けさせた。
【００６５】
浸潤アッセイ。
三次元浸潤アッセイを、既報のように実施した。簡単に言うと、１．６７ｍｇ／ｍｌのラット尾コラーゲンＩ型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１００ｍｌを、２４−ウェルの８ｍｍの孔のトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）の上部チャンバにピペットで入れた。トランスウェルを３７℃で一晩インキュベートし、コラーゲンを凝固させた。次いで３０，０００個の細胞をトランスウェル膜の下部に播種し、付着させた。血清フリー増殖培地を下部チャンバに配置し、一方、上部チャンバの培地中で、１０ｕｇ／ｍｌのオステオポンチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、又は１５ｎｇ／ｍｌのＣＣＬ５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、若しくは１０％のＦＢＳを化学誘因因子として使用した。次いで、細胞を、３日間にわたって、上記コラーゲンを通してフィルタ全体で化学誘因した。細胞を４％のホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳ中０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで透過性にして、次いで、４０ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で２時間染色した。蛍光を、Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔにおいて、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ倒立共焦点顕微鏡を使用して、フィルタ下部から１０×の倍率で、共焦点セクション（１つのセクションは２０ｍｍおきに）によって解析した。
【００６６】
組織学的解析。
腫瘍サンプル及び軟組織を、４％のパラ−ホルムアルデヒド（ＰＦＡ，Ｆｉｓｈｅｒ）中で固定し、パラフィン埋め込みのために処理し、断片化し、Ｈ＆Ｅ及び免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行った。骨を４％のＰＦＡ中で４℃、７２時間固定し、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）中、４℃で７日間脱石灰し、パラフィン中に埋め込んだ（１９）。腫瘍切片上のｖＷＦ染色を、ＫＣＣのＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって実施した。管腔前立腺上皮細胞からの基底部前立腺上皮細胞を識別するための骨及び脳サンプル上の抗原回収処理を実施することなく、脱パラフィン処理及び再水和後にＣＫ１４（Ｃｏｖａｎｃｅ）ＰＲＢ−１５５Ｐ及びＣＫ８（クローン１Ｅ８、Ｃｏｖａｎｃｅ）ＭＭＳ−１６２Ｐ染色を実施した。転移性病巣と緻密骨（５）との間の表面における活性破骨細胞を同定するために、製造業者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって指示されたように、脱パラフィン処理及び再水和後にＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ）染色を実施した（２０）。破骨病巣領域中の線維性骨を同定するために、四色法を骨上で実施した（５、２１）。肉腫を癌腫から識別するために、（ＲＶ２０２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）染色を脳サンプルのみで実施した。
【００６７】
レーザー捕獲マイクロ解剖及びＲＮＡ抽出。
皮膚及び筋肉を除去した後の全脳及び下肢を、最適な切断温度媒体（ＯＣＴ化合物Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）中でフラッシュ冷凍し、−８０℃で保存した。低温維持装置内で組織を薄片に切り分け、膜スライドＮＦ  １．０ＰＥＮ上に載せた。ＰＡＬＭマイクロビームシステム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）及びＰＡＬＭ  Ｒｏｂｏ  ｖ４．２ソフトウェアを使用して、ＬＣＭを実施した。凍結した切片をクレシルバイオレット（ＬＣＭ染色キット、Ａｍｂｉｏｎ）で染色した。ＲＮＡの品質を保証するために、捕獲は染色ステップから２時間以内で完了した。接着キャップ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）中に回収された組織を、キャップを下して−８０℃で直接保存した。捕獲された細胞を細胞溶解し、製造元の推薦通りにＲＮＡ抽出した（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ  Ｑｉａｇｅｎ）。（Ｂｏｓ，Ｐ．Ｄ．ら著，Ｎａｔｕｒｅ  ２００９，４５９，１００５−１００９；及びＷａｎｇ，Ｗ．Ｚら著，ＢＭＣ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００９，１０，６９を参照）。ＫＣＣにおけるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＲＮＡの整合性をチェックした。ＲＮＡ品質評価は、ＲＮＡ整合性数（ＲＩＮ）に基づく。
【００６８】
マイクロアレイ解析法。
前処理及び示差的発現解析。マイクロアレイデータを、バックグラウンド補正を使用して前処理し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅバージョン１．１［Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ］内のロバストマルチチップ解析（ＲＭＡ）ワークフローを使用して、変位値正規化及び集計をＭｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ遺伝子発現マイクロアレイ上で実施した。Ｐｅｃ対照細胞系に対して対比較を実施することによって、示差的に発現された遺伝子を４つの過発現細胞系のそれぞれに関して同定した。これら比較は、１％の偽発見率カットオフ及び２倍変化カットオフで、マイクロアレイ有意差解析（ＳＡＭ）を使用して実施した。
【００６９】
ウェスタンブロット。
ウェスタンブロットアッセイを、指示されたように、ＰＥＣ細胞で実施した。細胞をペレット状にし、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で補充された緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０）中で細胞溶解した。ウェスタンブロットに使用された抗体はＡＲ（Ｈ−２８０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。
【００７０】
ＣＧＨデータ要約。
ＣＧＨデータから、脳及び骨から回収された転移性Ｓｒｃ形質転換細胞について、発癌遺伝子で形質転換された細胞系に対して、コピーの獲得及び消失を決定した。ゲノムコピー変異領域をゲノムセグメントとして同定し、ここでは、転移性Ｓｒｃ形質転換細胞系の全ての３つの複製サンプルが、Ｓｒｃ形質転換細胞系に対して獲得及び消失を示した。獲得及び消失の頻度をマウスゲノムに対してプロットすることによって、コピー数データを要約した。
【００７１】
ＰＥＴ撮像。
動物の撮像を、施設内動物管理使用委員会にしたがって実施した。等張溶液中のフッ素−１８，フッ化ナトリウム（Ｆ−１８−ＮａＦ）をＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）から入手した。１５０μｌ中２１０±９．５４μＣｉのＦ−１８−ＮａＦを麻酔未処理のマウスに外側尾静脈を通して注射した。１時間後に、９８．５％のＯ２中１．５％の硫黄くん蒸で動物を麻酔処理し、ＩｎｖｅｏｎマイクロＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｓｔａｔｅ，ＩＬ）で撮像した。平均で１５０万カウントの高空間分解能（半値幅１ｍｍで）及び感度（＞１０％）ＰＥＴスキャナーを、１０分間の撮像で得た。５つの反復及び８つのサブセットを有する順序付きサブセット推定値最大化３次元（３Ｄ）アルゴリズムを確認のために使用した。
【００７２】
統計解析。
群間の比較を、両側ｔ検定によって解析した。Ｐ＜０．０５の差は、統計的に有意であると考えられた。全ての解析は、ＳＰＳＳ  １１．５ソフトウェアで行った。データは平均値±ＳＥＭとして表した。
【００７３】
マイクロアレイ解析法。前処理及び示差的発現解析。
マイクロアレイデータを、バックグラウンド補正を使用して前処理し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅバージョン１．１［Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ］内のロバストマルチチップ解析（ＲＭＡ）［４５］ワークフローを使用して、変位値正規化及び集計をＭｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ遺伝子発現マイクロアレイ上で実施した。ＰＥＣ対照細胞系に対して対比較を実施することによって、示差的に発現された遺伝子を、４つの過発現細胞系、ｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ、及びｖ−Ｓｒｃのそれぞれに関して同定した。これら比較は、１％の偽発見率カットオフ及び２倍変化カットオフで、マイクロアレイ有意差解析（ＳＡＭ）を使用して実施した。
【００７４】
線維芽細胞及び乳腫瘍乳癌細胞系との比較。
４つの発癌遺伝子過発現細胞系の示差的発現パターンを、発癌遺伝子で形質導入された線維芽細胞及び誘導された乳腫瘍を含む既に公開されたデータセット［４６］に対して比較した。このデータセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｕｒｉｎｅ  １１ＫマイクロアレイＡ及びＢセット上で作成され、Ｈａ−Ｒａｓ−過発現サンプル、ｃ−Ｍｙｃ過発現サンプル並びに正常な対照を含有する。Ｈｕａｎｇら［４６］からの生データ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ＣＥＬファイル）を公開ウェブサイトから入手した。このＣＥＬファイルを、ミシガン大学カスタムＣＤＦウェブサイトからの更新されたプローブセット定義（Ｅｎｔｒｅｚプローブセットバージョン１２、２００９年７月３０日付）を有するＲＭＡを使用して処理した［４７］。このデータセットから合計で６１４３個の遺伝子を、遺伝子記号にマップし、比較解析に使用した。１０％のＦＤＲカットオフでＳＡＭを使用して、示差的発現解析を実施し、対照に対してＲａｓ及びＭｙｃ細胞系に特異的な示差的に調整された遺伝子を同定した。このデータセットで同定された示差的に発現された遺伝子を、４つの発癌遺伝子過発現細胞系に対して比較した。
【００７５】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して、感度及び特異度を診断及びｃ−Ｍｙｃシグネチャーとの相関におけるＰＳＡに関する識別値の範囲全体にわたってプロットした［２９−３１］。ＰＳＡの評価については、異常ＰＳＡ及び臨床的転移性事象を有するサンプルを真陽性と考え、異常ＰＳＡを有し臨床的転移性事象を有さないサンプルを偽陽性と考えた。ｃ−Ｍｙｃシグネチャーの評価については、このシグネチャーとの高い相関性及び臨床的転移性を有するサンプルを、真陽性と考え、低い又は負の相関及び臨床的転移性事象を有するサンプルを偽陽性と考えた。
【００７６】
４つの発癌遺伝子で形質転換された前立腺癌細胞系のそれぞれに独占的な遺伝子シグネチャーを、２つの既に公開された前立腺データセットに対して比較した。ｌｏｇ２正規化されたｍＲＮＡ発現データの１８５個のサンプルを含む第１のデータセットを、ＭＳＫＣＣ前立腺癌データベースウェブサイト（００）からダウンロードした［２０］。このＭＳＫＣＣデータセット中の遺伝子プロファイルを、中央値の中央に置き、ピアソンの相関を、各ＭＳＫＣＣサンプルと各発癌遺伝子に特異的なシグネチャーに関するｌｏｇ２倍変更プロファイルとの間で計算した。遠隔転移サンプルを含有する第２の前立腺癌データセットは、以前にＭＳＫＣＣ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手され、サンプルを、［３３］に記載されるように処理した。簡単に言うと、２００９年７月３０日付（バージョン１２）のカスタムＣＤＦｓで、ロバストマルチチップ平均（ＲＭＡ）手順［４５］を使用して、マイクロアレイサンプルを処理した［４７］。
【００７７】
前立腺癌の臨床的特性との比較。
４つの発癌遺伝子過発現細胞系の発現パターンを、Ｌａｐｏｉｎｔｅらによって既に公開された［３］、疾患ステージ、悪性度、及び再発を含む臨床的特性に関する発現データに対して比較した。このデータセットを、公開ウェブサイトからダウンロードした。このデータセットは、腫瘍悪性度、腫瘍ステージ及び疾患再発を含むアノテーションを備えた５１５３個のプローブセット及び１１２個の前立腺癌サンプルを含有する。プローブセットアノテーションを、７／９／２００９日付のＡｒｒａｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ＧＰＬ３０４４アノテーションファイルを使用して更新した［４８］。遺伝子記号アノテーションを欠如するプローブセットを排除し、並びに少なくとも２５％の欠測値を有するプローブセットも排除し、結果的に３３２７個の独特な遺伝子に関する４２３２個の特徴をもたらした。進行ステージ対初期ステージ、高悪性度対低悪性度、及び再発対無再発疾患に関して、２５％のＦＤＲカットオフでのＳＡＭを使用して、示差的発現解析を実施した。このデータセットで同定された示差的に発現された遺伝子を、４つの発癌遺伝子過発現前立腺癌細胞系に対して比較を行った。ＬａＰｏｉｎｔｅデータセットからの示差的に発現された遺伝子と我々のデータにおける遺伝子との間の重複における有意性を、超幾何学テストを使用して評価した。
【００７８】
４つの発癌遺伝子過剰発現細胞系からの少なくとも２倍の変化カットオフを満たす全てのアップレギュレートされた遺伝子を、無再発生存に関する臨床データを備える既に公開されたマイクロアレイデータセット［１１］を使用して、疾患再発に対するそれらの関係について検討した。［１１］で記載されるようなＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ．５．０で処理されたマイクロアレイデータセット、及び各前立腺サンプルに関する臨床的データを、著者のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｄｗａｙｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／Ｇｌｉｎｓｋｙ−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ２．ｈｔｍｌ）の追加情報セクションからダウンロードした。データを４つの細胞系のそれぞれに関してｌｏｇ２変換し、複数のプローブセットを有する遺伝子を、これらを一緒に平均し、これらを最大の自由度で尺度化することによって処理した。最低の５０ｔｈパーセンタイル内の自由度を有する遺伝子をこの分析から除外した。再発データセットにおける４つの細胞系の過発現シグネチャーのそれぞれについての平均発現を使用して、高発現群（上位２５パーセンタイル）及び低発現群（下位７５パーセンタイル）にこの集団を分けた。無再発生存曲線を、高及び低発現集団についてプロットし、対数順位検定を使用して、有意なｐ値を計算した。
【００７９】
発癌遺伝子で形質転換された前立腺癌細胞系が接触非依存性増殖をもたらす。
初代前立腺上皮細胞を、ＦＶＢマウスの腹側前立腺から確立した（図１Ａ）。細胞を、単一の異なる発癌遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ（Ｖ−１２）、ｖ−Ｓｒｃ及びＮｅｕＴ（ＥｒｂＢ２の活性化変異体））をコードするレトロウイルス発現ベクターで形質導入した。前立腺上皮細胞の細胞形態を４週間の期間にわたって変更させた（図１Ｂ）。発癌遺伝子が形質導入された細胞の個々のコロニーを選択し、特性評価した。細胞増殖アッセイを細胞計測によって実行した（図１Ｃ）。初代前立腺上皮細胞と比較して、それぞれの発癌遺伝子が形質導入された細胞系で実質的な増殖優位性を観察した。
【００８０】
ウェスタンブロット解析を実施して、ＰＥＣを形質導入するために使用された発癌遺伝子のそれぞれの相対的発現を検討した。発癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ、ＥｒｂＢ２及びｖ−Ｓｒｃの存在をウェスタンブロットにより特定した。各発癌遺伝子の存在量の増加は、各細胞系に特異的であった（図２Ａ）。Ｓｒｃの相対的存在量は、初代ＰＥＣに比べて細胞系のそれぞれで増加し、ｖ−Ｓｒｃ形質転換ＰＥＣでは他の腫瘍細胞系（より短い露出、図２Ａ）と比べて約２倍大きかった。線維芽細胞又はネズミ上皮細胞の発癌遺伝子形質転換は、固体寒天中の接触非依存性増殖をもたらす。発癌遺伝子形質導入ＰＥＣ細胞系を、軟寒天中の増殖に関して試験した。コロニーサイズ及びコロニー数を各発癌遺伝子について特性評価した（図２Ｂ）［２７］。非形質転換ＰＥＣは、既報［２７］のように、軟寒天中の増殖に失敗した。発癌遺伝子形質導入は、コロニーのサイズ及び数を増加させた（図２Ｃ、Ｄ）。
【００８１】
前立腺癌細胞系の肺転移。
腫瘍形成試験をＦＶＢマウスで行った。１×１０６細胞の皮下注射は、腫瘍増殖をもたらした。ノギスで継続測定を行った。前立腺腫瘍細胞系のそれぞれは、免疫応答性マウスにおいて皮下で増殖した。ｃ−Ｍｙｃ、Ｈａ−Ｒａｓ及びｖ−Ｓｒｃで形質転換したＰＥＣｓについては、増殖は持続した（図３Ａ）。摘出した腫瘍は、低分化前立腺の組織学的特徴（図３Ｃ、追補１）を有して、出血性であった（図３Ｂ）。フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）についての腫瘍の免疫染色は、血管新生を確認し、Ｈａ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍中の著しく大きなＶＷＦ染色を示した（追補２Ａ、Ｂ）。腫瘍を、ＣＫ５、ＡＲ、ＭＵＣ１及びＭＧＫ（ＰＳＡのネズミ相同体）について染色した（追補２Ｃ）。肺転移を、材料及び方法（図４Ａ）に記載されたように、組織病理学評価によって解剖で特性化した。初代ＰＥＣに由来の肺転移の数は、Ｈａ−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ及びｃ−Ｍｙｃ亜系で増加した（図４Ｂ）。
【００８２】
前立腺癌細胞系における発癌遺伝子特異的分子シグネチャー。
前立腺上皮細胞中の特異的発癌遺伝子によって規制される分子遺伝子伝達経路を更に特性化するために、発癌遺伝子形質転換ＰＥＣ細胞系からｍＲＮＡを調製した。マイクロアレイ解析は、２２１１５個の遺伝子から合計で２６３５個の遺伝子を同定し、非形質転換前立腺上皮細胞対照サンプルと比較する場合、これらは、発癌遺伝子過剰発現細胞系における発現で著しく変更された（少なくとも２倍の変更）（図５）。それらの発現と著しく異なる（少なくとも２倍の変更）ものとして同定された遺伝子のヒートマップを図５に示す。ヒートマップの列は、独特な遺伝子を表し、これは、全ての４つの発癌遺伝子誘導細胞系についてアップレギュレーション及びダウンレギュレーションのそれらのパターンで表示される。相当数のアップレギュレート及びダウンレギュレートされた遺伝子が、全ての４つの細胞系で共有された（群１；２５１個の遺伝子）。例えば群１は、示差的発現パターンを全ての４つの細胞系に対して共有する遺伝子を含有し、一方群１５は、その示差的発現がＳｒｃ細胞系に特異的である遺伝子を含有する。Ｈａ−Ｒａｓに特異的なアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを有する遺伝子が最もよく見られ（群１４；５８４個の遺伝子）、続いてｃ−Ｍｙｃ特異的遺伝子（群８；３３２遺伝子）、ＮｅｕＴ特異的遺伝子（群１２；２７７個の遺伝子）、及びｖ−Ｓｒｃ特異的遺伝子（群１５；２１５個の遺伝子）であった。
【００８３】
高悪性度におけるネズミ前立腺発癌遺伝子発現シグネチャー及び進行ステージヒト前立腺癌。
前立腺「発癌遺伝子発現シグネチャー」を、初代前立腺上皮細胞と比較して特異的発癌遺伝子によって、発現レベルで著しく変更された遺伝子並びに発現で特徴的に変更された遺伝子として定義した（図５）。したがって、特定された発癌遺伝子発現シグネチャーを、他の公開されたデータベースから取得された遺伝子シグネチャーと比較し、他の十分研究された疾患表現型及び細胞系に対する類似性を特定した。進行ステージ対初期ステージの前立腺癌、高悪性度対低悪性度の前立腺癌、再発対無再発前立腺癌における示差的発現を表す遺伝子シグネチャーに対して比較を実施した［３］。進行ステージ／初期ステージ、高悪性度／低悪性度、及び再発／無再発の前立腺癌表現型を表す遺伝子シグネチャーヒートマップ［３］（図６Ａ、Ｂ）を左側に示し、右側のヒートマップは、前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーにおいて示差的に発現される遺伝子を表している。図６〜８のヒートマップは、示差的に発現される「発癌遺伝子発現シグネチャー」の範囲内の遺伝子のパーセンテージでラベルされている。前立腺癌細胞系で発現される遺伝子と疾患表現型の遺伝子シグネチャーとの間の類似性の統計的有意性に関するＰ値を示す。Ｐ値は超幾何分布に基づき、これら遺伝子が無作為に選択される場合、これらが疾患表現型において示差的に発現される確率を表す。低いｐ値は、単に偶然に発生する可能性が低い、発癌遺伝子細胞系と疾患表現型との間の類似性の度合いを示している。
【００８４】
「高悪性度」前立腺癌遺伝子シグネチャーは、６１個の初代前立腺腫瘍から既に決定されている［３］。図６Ａは、前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーからの３４個の遺伝子が、高悪性度遺伝子シグネチャーと共通であったことを示している（ｐ＝２．９７×１０−５）。それぞれの発癌遺伝子誘導前立腺癌細胞系については、この細胞系に寄与する重要な遺伝子の比率を示す。例えば、前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーと高悪性度疾患との間の重複は、ｃ−Ｍｙｃ（４７％）、ＮｅｕＴ（５３％）、Ｈａ−Ｒａｓ（７１％）、及びｖ−Ｓｒｃ（６２％）における重要な遺伝子である遺伝子の組み合わせを含有する。図６Ｂは、前立腺発癌遺伝子シグネチャーと進行ステージ遺伝子シグネチャーとの間で共通であった７２個の遺伝子を示す（ｐ＝４．１３×１０−８）。これら結果は、前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーと高悪性度疾患との間の類似性の有意な割合（ｐ＝２．９７×１０−５）並びに発癌遺伝子発現シグネチャーと進行ステージ疾患表現型との間の類似性の有意な割合（ｐ＝４．１３×１０−８）を示唆している。
【００８５】
前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーと、Ｌａｐｏｉｎｔｅらによって同定された［３］再発／無再発疾患シグネチャーとの間の有意な重複はなかった。前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーをＬａｐｏｉｎｔｅのデータと比較した場合、Ｈａ−Ｒａｓ細胞系は、高悪性度疾患との最高レベルの類似性（７１％）を獲得したが、一方ｖ−Ｓｒｃ細胞系は、進行ステージ疾患と最高の類似性（６７％）を示した。
【００８６】
前立腺癌上皮細胞中のｃ−Ｍｙｃ特異的遺伝子発現シグネチャーが線維芽細胞及び乳腫瘍中のｃ−Ｍｙｃシグネチャーに類似する。
先の研究において、我々は、線維芽細胞（３Ｔ３細胞）を形質転換するよう使用された発癌遺伝子に特異的であり、ｃ−Ｍｙｃ又はＨａ−Ｒａｓにより誘導された乳腫瘍において再利用される遺伝子発現シグネチャーを同定した［２８］。先に画定されたｃ−Ｍｙｃ及びＨａ−Ｒａｓ誘導分子シグネチャーを、前立腺癌上皮細胞中でこれら発癌遺伝子によって誘導された遺伝子発現シグネチャーと比較した。図７Ａ中のヒートマップは、ｃ−Ｍｙｃ形質導入線維芽細胞（図７Ａ）、ｃ−Ｍｙｃ誘導乳腫瘍（図７Ｃ）（左手側ヒートマップ）及びｃ−Ｍｙｃ誘導前立腺発癌遺伝子発現シグネチャー（図７Ｃ）（右手側のヒートマップ）の間で遺伝子を共有したことを示す。有意な重複を、前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーとマウス線維芽細胞中のｃ−Ｍｙｃ形質導入によって示唆的に調整された遺伝子（１０８個の遺伝子、超幾何的ｐ＝５．８４×１０−１２）、又は乳腫瘍（３６３遺伝子、超幾何的ｐ＝７．５９×１０−１２）との間で同定した。前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーの範囲内において、ｃ−Ｍｙｃ細胞系は、Ｍｙｃ形質導入線維芽細胞（９２％）（図７Ａ）及びｃ−Ｍｙｃ誘導乳腫瘍（８５％）（図７Ｃ）の双方との類似性の最大の比率を示した。
【００８７】
Ｈａ−Ｒａｓ形質導入線維芽細胞に対する前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーの比較（図７Ｂ）。前立腺発癌遺伝子発現シグネチャーと、マウス線維芽細胞中のＲａｓ発癌遺伝子形質導入時に示差的に発現された遺伝子との間で、有意な重複を特定した（６４個の遺伝子、超幾何的ｐ＝５．６５×１０−９）。驚くべきことに、Ｈａ−Ｒａｓ形質転換前立腺上皮細胞系は、ｖ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｍｙｃ、及びＮｅｕＴ細胞系よりもＨａ−Ｒａｓ形質導入線維芽細胞シグネチャーと低い共通性（５２％）を示した（図７Ｃ）。
【００８８】
転移性疾患を同定するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（図７Ｄ）を使用して、ＰＳＡ及びｃ−Ｍｙｃシグネチャーの識別可能性を評価した。
ＲＯＣ曲線は、ＰＳＡの診断的能力［２９、３０］並びに転移性疾患を同定するためのその能力［３１］を評価するよう以前に使用された。ＭＳＫＣＣ  ＰＣａサンプルにおいて、ｃ−ＭｙｃシグネチャーＲＯＣ曲線は、ＲＯＣ曲線下の面積で明確であるように、ＰＳＡよりも良好な感度／特異性特性を呈した。ＲＯＣ曲線下の面積は、２つの条件間［３２］を識別するための変数の能力を表し、ｃ−Ｍｙｃシグネチャーが血清ＰＳＡレベルよりも転移性疾患のより良好な判別子として作動することを示唆している。
【００８９】
ｃ−Ｍｙｃシグネチャーは転移性前立腺癌と相関する。
全てのサンプルを、公に利用可能な前立腺癌データセットから入手した［１１、２０、３３］。この比較は、ｃ−Ｍｙｃシグネチャーが、進行ステージの腫瘍でより明白である、腫瘍サンプルのサブセットにおける正相関を示し、正常前立腺組織と反相関することを示した（図７Ｅ）。これとは対照的に、Ｈａ−Ｒａｓ及びｖ−Ｓｒｃシグネチャーは、正常前立腺組織内の発現プロファイルとほぼ一貫して相関し、腫瘍サンプル間のそれらの相関性は、不均一である。
【００９０】
ヒト前立腺癌における前立腺発癌遺伝子誘導遺伝子発現及び無再発生存。
発癌遺伝子形質転換細胞系において発現される遺伝子とヒト前立腺癌からの生存率との間の関係を検討するために、既知の臨床的無再発生存時間を有するヒト前立腺腫瘍サンプルの既に公開されたマイクロアレイデータセットを使用した［１１］。この公開されたデータセットにおける遺伝子は、４つの発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系のそれぞれでアップレギュレートされたものに相当し、これを用いて、高発現（上位２５ｔｈパーセンタイル）又は低発現（下位７５ｔｈパーセンタイル）に割り当てた。カプラン・マイヤー解析を使用して、これら遺伝子の高発現対低発現に関連する無再発生存における差を評価した。図８Ａは、発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系中でアップレギュレートされた、Ｇｌｉｎｓｋｙのデータセットからのヒト前立腺癌サンプル中の遺伝子の発現プロファイルを示すヒートマップを提供する。４つの前立腺発癌遺伝子細胞系のそれぞれで高度に発現された遺伝子は、予後不良との有意な関連性を有した（ｐ＜０．００５）（図８Ｂ、Ｅ）。
【００９１】
図面の説明
図１：発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系の確立。
（Ａ）（Ｉ）ＦＶＢマウス、（ＩＩ）前立腺を使用して、位相差顕微鏡によって示されるような初代前立腺上皮細胞（ＰＥＣ）を確立した（１２週齢の雄ＦＶＢマウス腹側前立腺）。（Ｂ）実施された方法及び異なる発癌遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ）によって形質導入されたＰＥＣに由来の発癌遺伝子誘導細胞系の位相差顕微鏡像の図式的表現である。選択されかつ特性評価された発癌遺伝子で形質導入されたＰＥＣに由来の個々のコロニーの写真である。（Ｃ）細胞計測によって決定されたＰＥＣ系の増殖曲線である。データは、Ｎ＞３の別個の実験の平均値±ＳＥＭである。
【００９２】
図２：発癌遺伝子形質導入ＰＥＣ系が軟寒天中でコロニーを形成する。
（Ａ）それぞれの発癌遺伝子誘導ＰＥＣの３つの別個のクローンウェスタンブロット解析が抗体を示すことを、表示されたようなｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ及びｖ−Ｓｒｃの検出に使用した。ＧＤＩは、タンパク質負荷対照として使用した。（Ｂ）発癌遺伝子形質導入ＰＥＣの軟寒天アッセイである。非形質転換ＰＥＣは、軟寒天中の増殖に失敗した。（Ｃ）、（Ｄ）発癌遺伝子形質導入ＰＥＣ系からのコロニーのサイズ（Ｃ）及び数（Ｄ）を、Ｎ＞５の別個の実験の平均値±ＳＥＭとして示した。
【００９３】
図３：前立腺上皮細胞系が免疫応答性マウスで増殖する。
（Ａ）ノギス測定で決定されたＰＥＣ腫瘍直径をＦＶＢマウスにおける接種後の日数として示す。Ｎ＞５の別個の実験についての直径平均値±ＳＥＭ。ＮｅｕＴ腫瘍は、２週間にわたって増殖した後にサイズで減少した。（Ｂ）発癌遺伝子誘導系に由来の腫瘍を表す写真である。ＮｅｕＴ誘導腫瘍を細胞注入後１５日で採取した。（Ｃ）ヘマトキシリン及びエオシン、並びに（Ｄ）ＰＥＣのＶＷＦ染色が局所的血管分布状態を有する低分化の前立腺腺癌を示している。
【００９４】
図４：発癌遺伝子形質転換前立腺上皮細胞が肺に転移する。
（Ａ）肺転移の典型的例を示す、腫瘍移植後のネズミの肺のヘマトキシリン及びエオシン染色である。（Ｂ）肺転移の頻度を、マウスｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ及びｖ−Ｓｒｃ  ＰＥＣ群について、皮下注射後５週間で検出した。割合はＨａ−Ｒａｓ及びｖ−Ｓｒｃ群で１００％の頻度であった。
【００９５】
図５：マイクロアレイ遺伝子発現の階層的クラスタリング。
（Ａ）４つの異なる発癌遺伝子で形質転換された細胞系の３つの別個のクローンの２つの方法の階層的クラスタリングの概要である。初代（非形質転換）ＰＥＣとの比較を示す。移動平均値をＴ検定統計のためにプロットする。ＦＶＢマウスを同数のＰＥＣで静脈内注射した。示差的に発現された遺伝子を、４つの発癌遺伝子を過発現する細胞系のそれぞれで、アップレギュレーション及びダウンレギュレーションのパターンに編成する。データは、合計でＮ＝３０のマウスに関するＮ＞３の別個の実験の平均値±ＳＥＭである。
【００９６】
図６：高悪性度及び進行ステージのヒト前立腺癌に関連する遺伝子。
４つの発癌遺伝子形質転換ＰＥＣ系で示差的に発現された遺伝子のヒートマップであり、（Ａ）は高悪性度対低悪性度前立腺癌において、（Ｂ）は進行ステージ対初期ステージの前立腺癌において示差的に発現された遺伝子のヒートマップである［３］。左手側のヒートマップは、前立腺癌の高悪性度及び進行ステージのシグネチャーを表し、一方右側のヒートマップは、４つの前立腺癌細胞系の少なくとも１つにおいて示差的に発現される遺伝子を表す。それぞれの個々の前立腺癌細胞系内で示差的に発現される遺伝子のパーセンテージを、高悪性度及び進行ステージ表現型との類似性の度合いに関するｐ値と共に、対応の欄に示す。
【００９７】
図７：前立腺腫瘍中のｃ−Ｍｙｃ及びＨａ−Ｒａｓに特異的な発癌遺伝子シグネチャーが線維芽細胞中で保存される。
（Ａ）及び（Ｂ）のヒートマップは、発癌遺伝子誘導前立腺癌細胞系並びにｃ−Ｍｙｃ及びＨａ−Ｒａｓ形質転換線維芽細胞（３Ｔ３細胞系）において示差的に発現される遺伝子を示す［４６］。左手側のヒートマップは、形質導入線維芽細胞遺伝子シグネチャーを表し、一方右側のヒートマップは、４つの前立腺癌細胞系の少なくとも１つにおいて示差的に発現される遺伝子を表す。（Ｃ）のヒートマップは、ｃ−Ｍｙｃ前立腺癌細胞系で示差的に発現される遺伝子とそれぞれのｃ−Ｍｙｃ誘導されたマウス乳腫瘍サンプル中で示差的に発現される遺伝子の共通部分を示す［４６］。左手側のヒートマップは、腫瘍サンプル遺伝子シグネチャーを表し、一方右側のヒートマップは、前立腺癌細胞系で示差的に発現される遺伝子を表す。各前立腺細胞系ヒートマップの下部に示されたｐ値は、前立腺と乳癌データセットとの間の重複の有意性を表す。（Ｄ）転移性疾患を同定するためのＰＳＡ（橙色）及びｃ−Ｍｙｃシグネチャー（緑色）の有用性に関するＲＯＣ曲線である。ｘ−軸は、偽陽性率（１−特異性）を表し、ｙ−軸は真陽性率（感度）を表す。点線は、識別能がないことを表す。（Ｅ）ヒートマップは、４つの前立腺癌細胞系シグネチャーのそれぞれとＭＳＫＣＣ前立腺癌データセット中のサンプルとの間の一致性を示す。赤色は、正のピアソン相関を示し、一方青色は負のピアソン相関を示す。
【００９８】
図８：発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系の遺伝子発現が無再発生存と相関する。
（Ａ）発癌遺伝子形質導入前立腺癌細胞系においてアップレギュレートされたヒト前立腺癌サンプルの発現プロファイル［１１］である。ヒートマップの下部に沿うバーは、４つの発癌遺伝子形質導入細胞系のそれぞれでアップレギュレートされた遺伝子に基づいて、サンプルが高発現（上位２５パーセンタイル）又は低発現（下位７５パーセンタイル）を有するかどうかを示す。（Ｂ）ｃ−Ｍｙｃがアップレギュレートされた遺伝子、（Ｃ）ＮｅｕＴがアップレギュレートされた遺伝子、（Ｄ）Ｈａ−Ｒａｓがアップレギュレートされた遺伝子、（Ｅ）ｖ−Ｓｒｃがアップレギュレートされた遺伝子について、高発現集団及び低発現集団をカプラン・マイヤー曲線が示している。
【００９９】
追補２：ＶＷＦ染色。
（Ａ）血管新生のマーカーとしてのＶＷＦについてのＰＥＣ腫瘍の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色である。各細胞系に関するＶＷＦについてのＩＨＣの典型的例である。（Ｂ）血管の相対的集中を、４つの発癌遺伝子で誘導されたマウス前立腺腫瘍に関して示す。発癌遺伝子誘導前立腺腫瘍からのＶＷＦ染色の定量化である。データは、Ｎ＞３の別個の腫瘍についての平均値±ＳＥＭである。ＮｅｕＴ群において、血管集中はより低く、Ｈａ−Ｒａｓ群の血管分布状態はより大きい（ｐ＜０．０１）。
【０１００】
追補３：発癌遺伝子で形質転換された前立腺癌細胞系の作製法。
（Ａ）マウス前立腺上皮細胞培養
初代培養のための培地は、Ｆ−１２  ５００ｍｌ、１０％のＦＢＳ、インスリン  ５ｕｇ／ｍｌ、ＥＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン  １ｕｇ／ｍｌ、トランスフェリン  ５ｎｇ／ｍｌ、ウシ下垂体抽出物３０ｕｇ／ｍｌ、１Ｘ  ペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ．）、及び１Ｘ  ゲンタマイシンを含有した。１２週齢のＦＶＢマウスに由来のマウス前立腺（腹側前立腺）を除去し、ＰＢＳ中で洗浄し、カミソリを使用して数分間にわたり、６ｃｍのプレート内で細断した。細断した組織を、０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液に加え、プレートを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータ中に１６時間配置した。消化された組織をＰＢＳで洗浄し、得られた細胞ペレットを、培地を使用して再懸濁させて、次いで１０ｃｍの細胞プレートに置いた。
【０１０１】
（Ｂ）ｐＢＡＢＥ−ＩＲＥＳ−ｃＭｙｃ、ｐＢＡＢＥ−ＩＲＥＳ−ＮｅｕＴ、ｐＢＡＢＥ−ＩＲＥＳ−ｈ−ＲＡＳ、ｐＢＡＢＥ−ＩＲＥＳ−ｖＳｒｃプラスミドで形質転換されたマウス前立腺上皮細胞
リン酸カルシウム沈降法によって、ｐＢＡＢＥ−ＩＲＥＳ−標的遺伝子を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＤＮＡ及びＣａＣｌ２をＨＢＳ緩衝液中で混合し、混合物を１ｍｌの最終容量に構成し、これをＲＴで２０分間放置させた。次いでこの混合物を２９３Ｔ細胞に混合して、細胞をインキュベータ内で５時間配置し、次いでインキュベーション培地を除去し、新しい培地に交換した。４８時間後に、２９３Ｔ細胞の上澄みを回収し、同一容量の新しい培地と混合し、得られた混合物を、０．４５ｕｍのフィルタで濾過した。次いで、ポリブレン（最終濃度８ｕｇ／ｍｌ）を混合物に加え、次いでこれを１継代培養した前立腺上皮細胞に加えた。感染から更に４８時間後に、培地を除去し、新しい培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ）に交換した。
【０１０２】
（Ｃ）選択された陽性クローン
ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、及び１Ｘ  ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ．からなる培養培地に、ピューロマイシンを加え、最終濃度を１〜２ｕｇ／ｍｌに構成した。陰性細胞が死滅するまで、細胞をピューロマイシンで少なくとも１ヶ月繰り返し処理し、発癌遺伝子発現を伴う陽性クローンを残した。クローンが十分に大きくなったら、クローニングシリンダ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ，カタログ番号＃ＴＲ−１００４）によって取り上げ、細胞を適切にマークした。次いで細胞を少なくとも２５継代培養した。組織培養軟寒天中の増殖アッセイ、インビボ移植、転移、マイクロアレイ及び組織病理検査で特性評価した。
【０１０３】
図１は、軟寒天中のコロニーからの発癌遺伝子で形質導入されたＰＥＣ系を示す。図１Ａは、異なる発癌遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ）により形質導入された発癌遺伝子誘導細胞系の位相差顕微鏡像を示す。選択されかつ特性評価された発癌遺伝子形質導入ＰＥＣに由来の個々のコロニーの写真である。図１Ｂは、細胞計測によって決定されたＰＥＣ系の増殖曲線を示す。データは、Ｎ＞３の別個の実験の平均値±ＳＥＭである。図１Ｃ及び１Ｄは、ｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ及びｖ−Ｓｒｃの検出のための、表示されたような抗体による各発癌遺伝子誘導ＰＥＣ３つの別個のクローンのウェスタンブロット解析を記載し、図１Ｄは、基底（ＣＫ５）対管腔（ＣＫ８）前立腺癌のマーカーを記載する。ＧＤＩは、タンパク質負荷対照として使用する。図１Ｅは、発癌遺伝子形質導入ＰＥＣの軟寒天アッセイを記載する。非形質導入ＰＥＣは、軟寒天中での増殖に失敗した。発癌遺伝子形質導入ＰＥＣからのコロニーのサイズ（図１Ｅ）及び数（図１Ｆ）は、Ｎ＞５の別個の実験の平均値±ＳＥＭとして示されている。
【０１０４】
図２は、アレイＣＧＨによって評価された４つの発癌遺伝子細胞系中のコピー数異常を示す。図２Ａは、コピー獲得又は消失領域を共有する４つの細胞系のパーセンテージがゲノム位の関数として示されることを図示する。図２Ｂは、４つの細胞系のそれぞれについてのコピー獲得（赤色）又は消失（青色）の領域がゲノム位の関数として示されることを図示する。図２ＣにおいてＭＫＳＣＣ前立腺癌データベース（右手側に列記）における増幅と対応して、発癌遺伝子が、４つの発癌遺伝子細胞系の中で、ｍＲＮＡ過発現（赤色）、ＤＮＡ増幅（黄色）、又はその両者（紫色）で特定される。図２Ｄでは、腫瘍抑制遺伝子が、ＭＫＳＣＣ前立腺癌データベース（右手側に列記）におけるコピー消失と対応して、４つの発癌遺伝子細胞系の中で、ｍＲＮＡ過小発現（青色）、ＤＮＡコピー消失（桃色）、又はその両者（橙色）で特定される。図３では、前立腺上皮細胞系が免疫応答性マウスで増殖することを示す。
【０１０５】
図３Ａにおいて、ノギス測定によって決定されたＰＥＣ腫瘍直径が、ＦＶＢ  ３０マウスでの接種後の日数と示される。直径は、Ｎ＞５の別個の実験に関して平均値±ＳＥＭで示される。図３Ｂは、発癌遺伝子誘導細胞系に由来の典型的腫瘍の写真を示す。ＮｅｕＴ誘導腫瘍を、細胞注入後１５日で採取した。図３Ｃは、低倍率及び高倍率でのヘマトキシリン及びエオシン染色を示す（追補データ１〜４も参照）。
【０１０６】
図４は、肺に転移した発癌遺伝子で形質転換された前立腺細胞腫瘍を示す。図４Ａは、肺転移の典型的例を例証する腫瘍移植後のネズミの肺のヘマトキシリン及びエオシン炎色を示す。図４Ｂは、皮下注射後５週間で、ｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ及びｖ−Ｓｒｃ  ＰＥＣ群について、肺転移の発症頻度がマウスで検出されたことを示す。割合は、Ｈａ−Ｒａｓ及びｖ−Ｓｒｃ群では１００％の頻度であった。
【０１０７】
図５は、マイクロアレイ遺伝子発現の階層的クラスタリングを示す。図５Ａは、４つの異なる発癌遺伝子で形質転換された細胞系の３つの別個のクローンの２つの方法の階層的クラスタリングの概要を示す。初代（非形質転換）ＰＥＣとの比較が示される。示差的に発現された遺伝子が、４つの発癌遺伝子を過発現する細胞系のそれぞれにおけるアップレギュレーション及びダウンレギュレーションのパターンに編成される。データは、合計でＮ＝３０マウスについてＮ＞３の別個の実験の平均値±ＳＥＭである。４つの発癌遺伝子で形質転換されたＰＥＣ系中で示差的に発現された遺伝子並びに（図５Ｂ）高悪性度対低悪性度の前立腺癌及び（図５Ｃ）進行ステージ対初期ステージの前立腺癌で示差的に発現された遺伝子のヒートマップである。左手側のヒートマップは、前立腺癌高悪性度及び進行ステージのシグネチャーを表し、一方右手側のヒートマップは、４つの前立腺癌細胞系で示差的に発現される遺伝子を表す。それぞれの個々の前立腺癌細胞系内で示差的に発現されるこれら遺伝子のパーセンテージは、高悪性度及び進行ステージの表現型との類似性の度合いに関するｐ値と共に、それぞれの欄で示される。
【０１０８】
図６は、前立腺腫瘍におけるｃ−Ｍｙｃ及びＨａ−Ｒａｓに特異的な発癌遺伝子シグネチャーが、他の組織中で保存されることを示す。ヒートマップは、発癌遺伝子誘導前立腺癌細胞系中で示差的に発現される遺伝子を示し、図６ＡではＨａ−Ｒａｓ前立腺癌細胞系を、図６Ｂではｃ−Ｍｙｃ線維芽細胞（３Ｔ３細胞系）を示す。図６Ｃでは、ヒートマップは、ｃ−Ｍｙｃ前立腺癌細胞系中及びマウス乳腫瘍サンプル中で示差的に発現される遺伝子の共通部分を示す。各前立腺細胞系ヒートマップの下部に示されたｐ値は、前立腺及び線維芽細胞／乳腫瘍シグネチャーの間の重複の有意性を表す。図６Ｄは、ｃ−Ｍｙｃシグネチャーの正準相関分析に基づく分類子が、Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ２００４データセットにおいて、ｘ−軸に沿って、ヒト腫瘍（赤色）を正常組織（水色）から識別することを示す。分類子性能に関するＲＯＣ曲線が、Ｅ）Ｌａｐｏｉｎｔｅ  ２００４データセット及びＦ）Ｔａｙｌｏｒ  ２０１０  ＭＳＫＣＣデータセットについて、それぞれ０．９９０及び０．９７７のＡＵＣ値で、示されている。
【０１０９】
図７は、発癌遺伝子形質転換前立腺癌細胞系の遺伝子発現が、無再発生存に相関することを示す。図７Ａは、発癌遺伝子が導入された前立腺癌細胞系中でアップレギュレートされたヒト前立腺癌サンプル（１３）の発現プロファイルを示す。ヒートマップの下部に沿ったバーは、サンプルが、４つの発癌遺伝子形質転換細胞系のそれぞれでアップレギュレートされた遺伝子に基づいて、高発現（上位２５パーセンタイル）又は低発現（下位７５パーセンタイル）を有するかどうかを示す。（図７Ｂ）ｃ−Ｍｙｃがアップレギュレートされた遺伝子についての高発現又は低発現集団に関して、カプラン・マイヤー曲線が示される。
【０１１０】
図８は、発癌遺伝子形質導入前立腺癌細胞系の遺伝子発現が、無再発生存と相関することを示す。
【０１１１】
図９は、低分化前立腺腺癌の組織学的特徴を示す。
【０１１２】
図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｒｃが同系前立腺癌細胞系の３Ｄマトリゲル侵入を増強することを例証する。同系前立腺癌細胞系は、発癌遺伝子ＮｅｕＴ、Ｈａ−Ｒａｓ、又はｃ−Ｓｒｃのいずれかをコードするレトロウイルス中のネズミ上皮及び前立腺上皮細胞の形質導入から誘導された。図１０Ａに示すように、これら細胞は、ＮｅｕＴ系で最も迅速な創傷閉鎖をもたらして、創傷に移動する能力をもたらした。図１０Ａが、細胞移動を示す創傷の創傷アッセイを示すと同時に、図１０Ｂは、Ｎ＝３の別個の実験についての創傷閉鎖の定量化を示す。図１０Ｃは、マトリゲル中の前立腺癌細胞系を使用する３−Ｄ浸潤アッセイを示す。図１０Ｄは、ＰＥＣ系（ＰＥＣ−ＮｅｕＴ、ＰＥＣ−Ｒａｓ、及びＰＥＣ−Ｓｒｃ）に関する３つの個別の実験からの侵入の距離の平均値±ＳＥＭを示す。図１０Ｃ及び１０Ｄで示すように、マトリゲルへの侵入は、ｃ−Ｓｒｃ形質導入系でより有効であった。示された結果の統計的解析は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた。
【０１１３】
図１１Ａ及び１１Ｂは、同系前立腺癌細胞系腫瘍が血管性であることを例証する。図１１Ａでは、腫瘍体積を定量化するための正規化光子束を使用して、ＮＣＲヌードマウスにおける皮下腫瘍増殖を、３つの細胞系（ＰＥＣ−ＮｅｕＴ、ＰＥＣ−Ｒａｓ、及びＰＥＣ−Ｓｒｃ）のそれぞれについて１×１０５個の細胞の皮下接種後３週間にわたって定量した。ＰＥＣ系についての３つの個別実験からの平均サイズ±ＳＥＭを示す。増強したＳｒｃキナーゼ活性を伴って、これら細胞系は、ＮＣＲヌードマウスにおいて皮下腫瘍として増殖し、光子束によって決定されたような相対的サイズは、Ｒａｓ−誘導系中でのより急激な増殖を示唆した。データの統計的解析は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた。
【０１１４】
図１１Ｂでは、フォン・ウィルブランド因子（ＷＦ）についての免疫組織化学染色が、Ｒａｓ系のＶＷＦ染色が増加を伴い、細胞系の血管分布状態を示した。言い換えると、Ｒａｓ系の腫瘍増殖速度の増強は、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）染色の増加によって立証されるように、血管新生の増加に関連した。
【０１１５】
図１２Ａ〜１２Ｅは、前立腺癌細胞系が転移を発症することを例証する。トマト−レッド細胞を、各細胞系について１６匹のマウスの左心室に注射した。異種移植実施後１４日に、生物ルミネセンス画像を取得し、定量化した。マウスの典型的インビボ画像を図１２Ａに示す。示すように、心臓の左心室を介しての（Ｉ．Ｃ．注射）動脈循環への腫瘍の導入時に、注射の２週間以内に、腫瘍は急激に、肝臓、脳、膀胱、副腎及び腎臓を含む複数の器官内に発生した。
【０１１６】
図１２Ｂは、同系前立腺癌系の心臓内注射後のマウスの脳転移の典型的画像を示す。図１２Ｃは、腫瘍を有するマウスの比率としての生物ルミネセンス撮像（ＢＬＩ）の定量化（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６）を示す（分散の自由度についてのウェルチの補正によるスチューデントのｔ検定を使用して、統計的比較を実施した）。
【０１１７】
図１２Ｄは、同系細胞系のそれぞれについての転移性脳腫瘍負荷の測定値としての平均総光子束を示す（データは平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５である）。
【０１１８】
図１２Ｅは、ＰＥＣ−Ｓｒｃ及びＰＥＣ−ＮｅｕＴの心臓内注射の２週間後に形成されたＨ＆Ｅ染色を示す。更に、ＣＫ１４染色も、脳内の前立腺上皮細胞の存在（矢印）を実証した。
【０１１９】
フォトニック放射は、Ｒａｓ及びＳｒｃ前立腺細胞系で注射されたマウスの脳における転移を立証した。ＮｅｕＴ系で注射されたマウスの脳では、転移発生の頻度が低かった。マウスの中での転移の相対的頻度は、マウスではＨａ−Ｒａｓ及びＳｒｃ系の１００％が腫瘍を発生することを示し、相対的腫瘍負荷は、Ｒａｓでは１×１０９であり、ｃ−Ｓｒｃでは５×１０８であり、これに対してＮｅｕＴでは１×１０４であった。図３Ｅに示すように、Ｒａｓ又はＳｒｃ  ＰＥＣ系で注射されたマウスの脳転移の組織学的解析は、主要な組織構造が腺癌であることを示した。
【０１２０】
図１３Ａ〜１３Ｃは、前立腺腫瘍細胞系の肝臓転移を例証する。Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現する同系ＰＥＣ系をＦＶＢマウスの心室に注射し、インビボ生物ルミネセンス信号を定量した。図１２Ａは、肝臓腫瘍を有するマウスのパーセンテージを示す。Ｒａｓ及びＳｒｃ  ＰＥＣ系で注射されたマウスにおける肝転移は、肝臓転移を発症した（動物の〜１００％で）。ＮｅｕＴ腫瘍は皮下で増殖したが、肝臓転移を発症しなかった。図１２Ｂは、光子束によって決定された腫瘍サイズを示し、図１３Ｃは、肝臓転移を示す典型的マウスの画像を示す。
【０１２１】
Ｒａｓ及びＳｒｃ誘導系で注射されたマウスにおいて、腎臓転移を特定した。図１３Ｄは、腎臓腫瘍を有するマウスのパーセンテージを示す。図１３Ｅは、光子束により決定された腎臓腫瘍のサイズを示し、図１３Ｆは、腎臓転移の典型的画像を示す。
【０１２２】
図１４Ａ〜１４Ｃは、溶骨性骨転移を発生する同系前立腺癌細胞系を示す。図１４Ａは、Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現するＰＥＣ系の心臓内注射を受けたＦＶＢマウスの典型的インビボ画像を示し、インビボ生物ルミネセンスを定量化した。
【０１２３】
図１４Ａに示すように、マウスの骨転移は、本質的に溶骨性であった。図１４Ｂは、腫瘍を有するマウスの比率としてのＢＬＩの定量化を示す（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６）。図示したように、ｃ−Ｓｒｃ腫瘍で注射されたマウスの１００％が、骨転移を発生し、Ｈａ−Ｒａｓのうち６５％、及びＮｅｕＴのうちでは１５％が発生した。骨の光子束は、ｃ−Ｓｒｃ腫瘍で５×１０７の総光子束で劇的に増強され、これに対してＨａ−Ｒａｓでは１×１０６であり、ＮｅｕＴでは１×１０４であった。図１４Ｃは、光子束上の腫瘍質量のサイズを示す。前立腺腫瘍の溶骨性骨病巣の組織学的解析は、原発腫瘍に類似する腺癌であることを立証した。
【０１２４】
図１５Ａ〜１５Ｆは、Ｓｒｃが溶骨性前立腺癌骨転移を増強することを例証する。ＦＶＢマウスは、ＰＥＣ−Ｓｒｃの心臓内注射の２週間後に、溶骨性骨病巣を発生した。図１５Ａは、骨の腫瘍面積が、ＰＥＣ−Ｒａｓ及びＰＥＣ−ＮｅｕＴ群と比べて、ＰＥＣ−Ｓｒｃ群において著しく増加したことを示す。腫瘍の面積は、ｃ−ＳｒｃではＲａｓ駆動腫瘍に比べて６倍大きかった。
【０１２５】
図１５Ｂは、細胞の心臓内注射前（ｔ０）及び１４日後（ｔ１４）の典型的Ｘ線画像を示す。転移性腫瘍と同時に存在した低密度領域（矢印）は、溶骨性病巣を示している。この骨病巣は、２週間で、溶骨性病巣として、主として骨端軟骨接合部で認められた。
【０１２６】
組織学的解析は、骨転移の部位での腺癌を確認した。図１５Ｃで示した酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（「ＴＲＡＰ」）染色は、骨−腫瘍境界面における骨芽細胞（矢印）の存在を確認した。図１５Ｄは、その後形成された骨転移のヘマトキシリンエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色を示す。図１５Ｅ及び１５Ｆは、双方ともに骨内の上皮細胞の存在を確認する、それぞれサイトケラチン（ＣＫ）１４染色及びＣＫ８染色を示す。
【０１２７】
図１６Ａ〜１６Ｇは、溶骨性前立腺癌細胞系が、ＣＣＬ５及びオステオポンチン（「ＯＰＮ」）受容体の機能を発現すること例証している。図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰＥＣ系上のＣＣＲ５発現の蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）解析を示す。示すように、ＣＣＲ５特異的抗体を使用するＦＡＣＳ解析は、ＰＥＣ系中のＣＣＲ５受容体の存在を確認した。
【０１２８】
図１６Ｅ及び１６Ｆは、ＣＤ４４リガンドとしてＯＰＮを及びＣＣＲ５リガンドとしてＣＣＬ５を使用し、平均値＋ＳＥＭとして定量化されたＰＥＣ−Ｓｒｃ系のマトリゲル侵入アッセイの結果を示す（図１６Ｇ）。図１６Ｄ及び１６Ｅで示すように、ＯＰＮ又はＣＣＲ５の添加は、マトリゲルへのＰＥＣの浸潤を増強した。組織との比較については、発癌遺伝子で形質転換されたＰＥＣ中のインビボ腫瘍遺伝子発現を、同系統のマウスの背側腹側前立腺におけるインビボでの発現と比較した。図１６Ｆは、組織培養中の前立腺腫瘍細胞系のケモカイン受容体及びリガンドの遺伝子発現を示す。また、図１６Ｇは、皮下移植後の前立腺腫瘍細胞系のケモカイン受容体及びリガンドの遺伝子発現を示す。この遺伝子発現は、サイトカイン及びケモカインのインビボでの顕著なアップレギュレーションを示した。ＣＣＲ５及びＣＣＲ２の特異的アップレギュレーションが、ｃ−Ｍｙｃ、ＮｅｕＴ及びＳｒｃ  ＰＥＣ系で観察された。受容体リガンドＣＣＬ２、ＣＣＬ７、及びＣＣＬ８のアップレギュレーションが観察された（２〜３倍）。ＣＣＬ７、ＣＣＬ８及びＣＣＬ５は、ＣＣＲ５に関するリガンドであり、ＣＣＬ８及びＣＣＬ５は、ＣＣＲ１に関するリガンドである（図１５Ｈ）。これら試験は、赤色の四角でマークされた組織培養と比較してのインビボでのＰＥＣ腫瘍中のサイトカイン受容体及びリガンド発現の誘導を示唆する。
【０１２９】
したがって、ＰＥＣ系が組織培養に対してインビボで増殖される場合、マイクロアレイベースの遺伝子発現プロファイルは、ＣＣＲ５シグナル伝達モジュールの活性化を示した。
【０１３０】
ＣＣＬ２はＣＣＲ２及びＣＣＲ４に結合する。ＣＣＲ５及びそのリガンドであるＣＣＬ５、ＣＣＬ７及びＣＣＬ８がインビボにおいてＰＥＣ中で誘導されたので、ＣＣＲ５拮抗剤が前立腺癌の増殖に及ぼす効果が検討された。
【０１３１】
図１７Ａ〜１７Ｄは、ＣＣＲ５拮抗剤が、脊髄溶骨性前立腺癌転移を遮断することを例証している。Ｌｕｃ２−トマト−レッド融合タンパク質を発現するベクターで形質導入されたＰＥＣ系を、ＦＶＢマウスの心室に注射し、２週間後にインビボで生物ルミネセンス信号を定量化した。マウスは、経口マラビロク（８ｍｇ／ｋｇ）又は対照で処置された。図１７Ａは、各群からのマウスの典型的例を示す。図１７Ｂは、総腫瘍質量の容量分析としての光子束を示し、図１７Ｃは、マウスの下肢の骨質量を示す。示したデータは、各群におけるＮ＝８の別個のマウスについて平均値＋ＳＥＭ、Ｐ＜０．０５である。
【０１３２】
図１７Ａ及び１７Ｂに示したように、ＣＣＲ５拮抗剤のマラビロク（８ｍｇ／ｋｇ  経口）が、総身体転移性負荷を＞５０％まで低減し、骨転移を＞５０％まで低減した（図１７Ｃ及び１７Ｄを参照）。更に、Ｘ線解析と相関性を示すフッ素―１８、フッ化ナトリウム（「Ｆ−１８−ＮａＦ」）撮像が、脊椎転移の存在を立証した（図１８Ａ〜１８Ｈ）。マラビロクの連日経口投与が、脊椎転移を＞９０％まで低減した（図１９Ａ〜１９Ｂ）。
【０１３３】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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