(57)【要約】血管新生関連疾患の予防及び治療に関する組成物及び方法が提供される。また新規ヒト／マウスキメラエンドグリンを発現する新規ノックインマウス、そのようなマウスを作出するためのベクター、及び、新規ヒト／マウス導入遺伝子を含むマウス胚性幹細胞が含まれる。また、ヒト腫瘍血管新生や、過剰な血管系を有するヒト血管新生関連疾患の予防又は治療のための、抗血管新生薬として使用されうる、抗ヒトエンドグリンモノクローナル抗体（mAbs）が提供される。当該モノクローナル抗体はマウスエンドグリンと交差反応しない。また、ヒト腫瘍血管新生や過剰な血管系を有する血管新生関連疾患の予防又は治療のための、抗ヒトエンドグリンモノクローナル抗体を用いる方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離された抗体又はそのフラグメントであって、当該抗体又はそのフラグメントは、ヒトエンドグリンアミノ酸Asn121及びアミノ酸Ala378の間のヒトエンドグリンの領域と特異的に結合し、当該抗体はマウスエンドグリンと交差反応しない、分離された抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記フラグメントが、Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 単鎖(ScFv)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるフラグメントである、請求項１の抗体フラグメント。
【請求項３】
前記抗体がキメラ又はヒト化抗体である、請求項１の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトエンドグリンアミノ酸Asn121及びアミノ酸Ala378の間のヒトエンドグリン領域に対してエンドグリン結合特異性を有するマウス超可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域と可変領域配列を含むヒト化抗体である、請求項３の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、ヒトエンドグリンアミノ酸Ile217及びアミノ酸Ala378の間のヒトエンドグリンの領域についてエンドグリン結合特異性を有するマウス可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域配列とを含むキメラ化抗体である、請求項３の抗体。
【請求項６】
前記抗体又は前記フラグメントが、細胞傷害性薬剤に複合化される、請求項１の抗体又はフラグメント。
【請求項７】
薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項１の抗体又はそのフラグメントを含む組成物。
【請求項８】
hENGエクソン４，５，６，７及び８、及びその組み合わせから選択されるヒトエンドグリン（hENG）エクソンを含む組み換えベクターであって、マウスエンドグリン遺伝子の相同領域の相同置換に用いられるために好適である、ベクター。
【請求項９】
前記組み換えベクターが、hENG遺伝子のエクソン４，５，６，７及び８を含む、請求項８の組み換えベクター。
【請求項１０】
前記組み換えベクターが、マウスエンドグリン遺伝子配列と同一である配列の１又は複数の領域を含む、請求項８の組み換えベクター。
【請求項１１】
マウスエンドグリン遺伝子エクソン４，５，６，７及び８、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマウスエンドグリン遺伝子エクソンの置換を含むマウス胚性幹細胞であって、前記マウスエンドグリンエクソンがヒトエンドグリンエクソンの相同体で置換されている、マウス胚性幹細胞。
【請求項１２】
マウスエンドグリンエクソン５及び６が、ヒトエンドグリンエクソン５及び６でそれぞれ置換されている、請求項１１のマウス胚性幹細胞。
【請求項１３】
前記マウスエンドグリンエクソン４，５，６，７及び８が、ヒトエンドグリンエクソン４，５，６，７及び８でそれぞれ置換されている、請求項１１のマウス胚性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の参照＞
本出願は、２０１１年２月２３日に出願された合衆国仮出願６１／４４５，９７１及び２０１１年２月２３日に出願された合衆国仮出願６１／４４５，９７０の、参照によってここに援用されるそれぞれの開示について優先権を主張する。
【０００２】
＜連邦政府に支援される研究又は開発に関する記述＞
本発明は、合衆国国防省乳がん研究プログラムによって認められた助成金ＢＣ０２００４３に基づく政府支援を得てなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般的にがん治療に関し、より詳細には、抗がん及び抗血管新生治療において用いられるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
望ましくない血管新生を伴う疾患の予防及び治療に関する組成物や方法には、現存するニーズがある。血管新生は、内皮細胞上のエンドグリンの発現とある程度の関連がある。
【０００５】
［エンドグリン］
エンドグリンは、主に白血病細胞や内皮細胞に発現し、１６０キロダルトン（ｋＤ）又は１７０ｋＤの分子サイズを有するホモ二量体の腫瘍関連細胞膜抗原である（Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7898-7902; Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141: 1925-1933; Seon et al., 1997, Clin. Cancer Res. 3: 1031-1044）。内皮細胞上のエンドグリンの発現は、腫瘍関連血管やリンパ管内皮の内皮細胞の増殖で亢進される（Seon et al., 上記参照; Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634; Matsuno et al., 1999, Clin Cancer Res. 5: 371-382; Clasper et al., 2008, 68: 7293-7303）。エンドグリンは血管新生／血管発生に不可欠である（Li et al., 1999, Science 284: 1534-1537; Arthur et al., 2000, Dev. Biol. 217: 42-53）。また、ＴＧＦ−βの共受容体である（Cheifetz et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 19027-19030）。
【０００６】
マウスエンドグリンは分子サイズ約１８０キロダルトン（ｋＤ）の二量体としてキャラクタライズされている。ヒトエンドグリンは二種類の形態で存在する；１６０ｋＤのより小さなものと１７０ｋＤのより大きなもので、両者の違いはタンパク質の細胞質部分に見出される。エンドグリンは、細胞外領域と疎水性の膜貫通領域と細胞質尾部とを有する。マウスエンドグリンとヒトエンドグリンのヌクレオチド配列の比較によって、約７１〜７２％が相同であることが明らかになっている（St. Jacques et al., 1994, Endocrinol. 134:2645-2657; Ge and Butcher , 1994, Gene 158:2645-2657）。しかしながら、エンドグリンの膜貫通領域及び細胞質領域をコードするヒト及びマウスの配列は、９３〜９５％の相同性がある。つまり、細胞表面において抗体が配向する場所であろう細胞外領域をコードするヒト及びマウスの配列では、相同性は７０％をかなり下回る。ヒト及びマウスエンドグリンの間のアミノ酸配列の類似性は実質的なものにみえるが、細胞外領域で観察されるアミノ酸配列の相違は、ヒトエンドグリンあるいはマウスエンドグリンにユニークである、異なる抗原エピトープを作り出すのに十分である。その理由は、ペプチドエピトープにおいては、エピトープを含むアミノ酸配列や隣接アミノ酸配列のわずかな違いでさえ、エピトープの免疫原性に明らかな影響を与え得るからである（例えば、Vijayakrishnan et al., 1997, J. Immunol. 159:1809-1819を参照）。例えば、ペプチドにおける単一のアミノ酸の置換が、ペプチドの免疫原性に著しい変化を生じさせうる（Vijayakrishnan et al., 1997, 上記参照）。このようなペプチドエピトープにおける変化は、モノクローナル抗体の特異性に強い影響を与える。なぜならモノクローナル抗体は高い特異性を有するからである。
【０００７】
エンドグリンのモノクローナル抗体（モノクローナル抗体）
SN6は、ヒト白血病細胞の細胞膜の糖タンパク質混合物の腫瘍関連成分でマウスを免疫化することで得られる抗体である（Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902）。これは、ヒトエンドグリンを認識するマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体44G4は、ヒトプレＢ白血病細胞の全細胞懸濁液でマウスを免疫化して得られる抗体である（Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chern. 265:8361-8364）。これは、ヒトエンドグリンを認識するマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体MJ7/18は、炎症マウス皮膚でラットを免疫化して得られる抗体である（Ge and Butcher, 1994, 上記参照）。これはマウスエンドグリンを認識するモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体Tec-11は、ヒト臍静脈内皮細胞でマウスを免疫化して得られる抗体である（Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634）。これはヒトエンドグリンに制限された反応性を有するマウスモノクローナル抗体である。
【０００８】
抗エンドグリン抗体と様々な染色方法の使用によって、エンドグリンは例えば、非Ｔ細胞型（非Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄単球性白血病を含むヒト白血病などのヒト腫瘍細胞に中レベルで発現することが決定されてきた。加えて、エンドグリンは、血管肉腫、乳がん、盲腸がん、結腸がん、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、肺がん、メラノーマ、骨肉腫、卵巣がん、耳下腺腫瘍、咽頭がん、結腸Ｓ状部がんを含むヒト固形腫瘍や、胎盤に由来するヒト血管系において、中〜高レベルで発現することが決定されてきた。脾臓、胸腺、腎臓、肺及び肝臓由来の各種の正常なヒト成人組織片においては、エンドグリンに対してより低い程度の（弱い）内皮細胞染色性が観察された。
【０００９】
血管内皮細胞での増加したエンドグリン発現が、血管新生に関連する病理学的条件において報告されてきた。このような血管新生関連疾患は、多くのタイプのヒト固形腫瘍、関節リウマチ、胃潰瘍及び慢性炎症性皮膚病巣（例えば、乾癬、皮膚炎、Westphal et al., 1993, J. Invest. Dermatol. 100:27-34）を含む。
【００１０】
血管新生
血管新生は、新血管形成につながる新しい毛細血管の形成を含む。血管新生は、一連の連続ステップを含む複雑なプロセスであり、血管基底膜及び間質系マトリクスの細胞仲介性の分解、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖及び内皮細胞によるループ状毛細血管の形成を含む。固形腫瘍は血管新生依存的である；すなわち、小さな腫瘍がある直径に達すると、さらなる成長のために周囲の正常組織において血管新生を誘導することを必要とする。結果として生じる腫瘍の新血管形成は、より素早い成長と局所的な侵襲とを伴う。さらに、血管新生の増加は、転移の危険を高める。ゆえに、腫瘍の血管新生を阻害する抗血管新生治療は、腫瘍の成長を抑制または鎮静するであろう。
【００１１】
創傷治癒のような正常な生理学的過程では、当該過程が完了すれば血管新生は停止する。対照的に、腫瘍の血管新生は自己制限的ではない。さらに、ある病理学的（であり非悪性の）過程では、血管新生は以上に長く持続する。このような血管新生関連疾患は、関節リウマチ、皮膚炎を含む慢性炎症性疾患を含む。
【００１２】
ヒト固形腫瘍の抗血管新生治療及び血管標的治療
臨床的に不顕性のサイズ（例えば数ｍｍ３）を超えた固形腫瘍の増殖が進行するには、腫瘍血管新生として公知のプロセスである新しい血管の継続的な形成が必要である。腫瘍の成長と転移は血管新生依存性である。腫瘍は、腫瘍自身が成長するための栄養と酸素とを送達するための新しい毛細血管の成長を常に刺激しなくてはならない。従って、腫瘍血管新生（抗血管新生治療）又は腫瘍の既存血管の選択的破壊（血管標的治療）のいずれも、個体腫瘍を予防又は治療するための方法である。
【００１３】
新しい毛細血管の局所的なネットワークは、原発腫瘍が身体の他の部分に移転するためのルートを提供するものであるので、抗血管新生治療は、小さな個体腫瘍の形成を予防するために、あるいは、転移を防止するために重要である（例えばFolkman, 1995, Nature Medicine, 1:27-31を参照）。一方で、既存の血管を攻撃する血管標的治療は、血管系が既に損傷されている大きな腫瘍に最も効果的であるようである（例えばBicknell and Harris, 1992, Semin. Cancer Biol. 3:399-407を参照）。適切に選択されたモノクローナル抗体は腫瘍の血管内皮細胞を標的とでき、また、抗体依存性の細胞仲介性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）とアポトーシスの誘導とを含む幾つかの機構によって腫瘍の成長を阻害し、及び／又は、腫瘍を破壊することができる（Seon et al., 2011, Current Drug Delivery 8:135-143）。他のケースでは、モノクローナル抗体やそのフラグメントは、既存の血管系や新たに形成される腫瘍新生血管のいずれかに、抗血管新生治療や血管標的治療の方法（まとめて、“抗血管新生治療”という。）における治療組成物を送達するための手段として使用されうる。しかしながら、ヒトでの効果的な臨床応用を有すると思われるモノクローナル抗体を同定するために用いられうるツールにはニーズが存在し、また、このような抗体そのものにもニーズが存在する。
【００１４】
血管新生関連疾患のためのマウスモデル
血管新生のマウスモデルの使用は、治療薬の評価のために容認され、実証されてきている。なぜならそのモデルは、それぞれの疾患の特性や患者における治療薬の効果の予測について、臨床的なパラメータを反映することが示されてきたからである。これらのマウスモデルは次のものを含み、またそれらに制限されない：網膜新生血管形成のマウスモデル（Pierce et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:905-909）；関節リウマチのマウスモデル（MRL-lpr/lpr mouse model, Folliard et al., 1992, Agents Actions 36:127-135; mev mouse, Kovarik et al., 1994, J. Autoimmun. 7:575-88）；血管新生のマウスモデル（Majewski et al., 1994, Int. J. Cancer 57:81-85; Andrade et al., 1992, Int. J. EXp. Pathol., 73:503-13; Sunderkotter et al., 1991, Am. J. Pathol. 138:931-939）、皮膚炎マウスモデル（Maguire et al., 1982, J. Invest. Dermatol. 79:147-152）、乾癬マウスモデル（Blandon et al., 1985, Arch. Der.matol. Res. 277:121- 125; Nagano et al., 1990, Arch. Der.matol. Res. 282:459-462）。幾つかの抗ヒトエンドグリン（hENG）モノクローナル抗体（mAbs）が、抗血管新生治療のために潜在的に有用であることが知られている。これらのモノクローナル抗体は、K4-2C10（又はSN6fと呼ばれる）、D4-2G10（又はSN6aと呼ばれる）、Y4-2F1（又はSN6jと呼ばれる）及びP3-2G8（又はSN6kと呼ばれる）を含む。しかしながら、これらすべてのモノクローナル抗体は、マウスエンドグリンかマウス内皮細胞と交差反応する。しかしながら、これらの交差反応性は弱く、抗血管新生活性についての動物（マウス）におけるこれらのモノクローナル抗体の評価は、限られた条件下のみでなされうる（Seon et al., 2011）。すなわち、より多くの抗ヒトエンドグリンモノクローナル抗体によって標的とされうるヒトエンドグリンを発現する新規な動物モデルへのニーズがあり、同様に、新規で効果的な抗ヒトエンドグリンモノクローナル抗体そのものについてもニーズがある。本発明はこれらの、またその他のニーズに応える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7898-7902
【非特許文献２】Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141: 1925-1933
【非特許文献３】Seon et al., 1997, Clin. Cancer Res. 3: 1031-1044
【非特許文献４】Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634
【非特許文献５】Matsuno et al., 1999, Clin Cancer Res. 5: 371-382
【非特許文献６】Clasper et al., 2008, 68: 7293-7303
【非特許文献７】Li et al., 1999, Science 284: 1534-1537
【非特許文献８】Arthur et al., 2000, Dev. Biol. 217: 42-53
【非特許文献９】Cheifetz et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 19027-19030
【非特許文献１０】St. Jacques et al., 1994, Endocrinol. 134:2645-2657
【非特許文献１１】Ge and Butcher , 1994, Gene 158:2645-2657
【非特許文献１２】Vijayakrishnan et al., 1997, J. Immunol. 159:1809-1819
【非特許文献１３】Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902
【非特許文献１４】Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chern. 265:8361-8364
【非特許文献１５】Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634
【非特許文献１６】Westphal et al., 1993, J. Invest. Dermatol. 100:27-34
【非特許文献１７】Folkman, 1995, Nature Medicine, 1:27-31
【非特許文献１８】Bicknell and Harris, 1992, Semin. Cancer Biol. 3:399-407
【非特許文献１９】Seon et al., 2011, Current Drug Delivery 8:135-143
【非特許文献２０】Pierce et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:905-909
【非特許文献２１】Folliard et al., 1992, Agents Actions 36:127-135
【非特許文献２２】Kovarik et al., 1994, J. Autoimmun. 7:575-88
【非特許文献２３】Majewski et al., 1994, Int. J. Cancer 57:81-85;
【非特許文献２４】Andrade et al., 1992, Int. J. EXp. Pathol., 73:503-13
【非特許文献２５】Sunderkotter et al., 1991, Am. J. Pathol. 138:931-939
【非特許文献２６】Maguire et al., 1982, J. Invest. Dermatol. 79:147-152
【非特許文献２７】Blandon et al., 1985, Arch. Der.matol. Res. 277:121- 125
【非特許文献２８】Nagano et al., 1990, Arch. Der.matol. Res. 282:459-462
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、血管新生関連疾患の予防及び治療に関連する組成物及び方法を提供する。本発明は新規なヒト／マウスキメラエンドグリンを発現する新規なノックインマウスを提供することを含む。マウスは、ヒト腫瘍血管新生や過剰な血管新生によって少なくとも部分的にキャラクタライズされるヒト血管新生関連疾患の、抗血管新生治療において用いられうる抗ヒトエンドグリンモノクローナル抗体のin vivo有効性の評価のために有用である。様々な態様において、ノックインマウスのエンドグリン遺伝子は、ヒトエンドグリン（hENG）のエクソン４，５，６，７及び８、及びそれらの組み合わせを含む。トランスジェニックマウスを作出するための相同組み換えにおいて用いられるのに適したベクターが提供される。ノックインヒトエンドグリン遺伝子領域を含むマウス胚性幹細胞としても提供される。
【００１７】
本発明はまた、ヒト腫瘍血管新生や過剰な血管系を有するヒト血管新生関連疾患の予防又は治療のための抗血管新生薬として使用されうる、抗エンドグリンモノクローナル抗体を提供する。様々な態様において、モノクローナル抗体はマウスエンドグリンと交差反応しない。また、ヒトエンドグリンのエクソン４，５，６，７及び８のいずれかによってコードされるヒトエンドグリンの領域に特異的である。ある態様において、選択されるモノクローナル抗体はヒトエンドグリンエクソン４−８によってコードされるヒトエンドグリンの領域に特異的である。つまり当該モノクローナル抗体は、hENGのアミノ酸Asn121−Ala378全体を含むhENGの部分に特異的に結合しうる。
【００１８】
本発明はまた、ヒト腫瘍血管新生の予防又は治療のために、及び、過剰な血管新生を有する血管新生関連疾患のために、抗エンドグリンモノクローナル抗体を用いる方法を提供する。一般的に当該方法は、抗血管新生薬剤を必要とする個体に、１又は複数のモノクローナル抗体、又はそのhENG結合フラグメント、又はモノクローナル抗体から開発される免疫複合体を含む組成物を投与することを含む。各治療的使用において、本発明はモノクローナル抗体、そのhENG結合フラグメント、免疫複合体、及び他の治療薬を用いる、組み合わせ治療を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】我々の研究室で作出された８種の抗hENGモノクローナル抗体によって規定される、ヒトエンドグリン（hENG）のエピトープの直線状配列の図示である。SN6シリーズ抗hENGモノクローナル抗体及び対応するエクソンによって規定されるhENGエピトープの分子マップ。７つのポリペプチドフラグメントのそれぞれのアミノ末端のアミノ酸残基が示されている。フラグメント１でもあるマチュアな翻訳されたhENGのアミノ末端残基は、示されるようにGlu26である。マップは、１２種の抗hENGモノクローナル抗体と、hENGの全細胞外ドメインからなるフラグメントを含む、細菌で発現された８種の組み換えhENGポリペプチドフラグメントとの反応性に基づいて構成された（図１０参照）。ＳＮ６シリーズモノクローナル抗体レリバントがこの図に示されている。SN6kによって規定されるエピトープは、立体構造エピトープと推定される。我々によって今まで開発された１２種の抗hENGモノクローナル抗体の全てが、細胞外エピトープを規定している。ヒトＥＮＧ遺伝子の対応するエクソンが図に示されている。太字で示されるエクソン４〜エクソン８が、下記に詳述されるプランＡでのノックインマウスの作出において、マウスＥＮＧ遺伝子の対応するエクソンを置換するために用いられた。網掛け図とアミノ酸番号は、エピトープマッピングの検討のために合成されたペプチドを表示する。
【００２０】
【図２】図２は、hENGエクソン４−８ノックインベクターを図示する。hENGエクソン４−８は、human male BAC library RPCI-11から導かれた。５’アームと３’アームはBALB/cByJ BAC library CHORI-28から導かれた。
【００２１】
【図３】図３は、マウス野生型ENG遺伝子と、マウスENGエクソン４−８がhENGエクソン４−８で置換されている標的ENG遺伝子を図示する。また図３は、Neoマーカーの挿入を示す。遺伝子ターゲッティングは、遺伝子ノックインベクターをマウス胚性幹（ＥＳ）細胞にトランスフェクションすることによって実施された。正しくターゲッティングされたＥＳ細胞クローンは、図に示すようにＰＣＲとサザンブロットによってスクリーニングされた。これらの試験は、クローン２７と２２６が所望の標的遺伝子を含んでいることを示した。NeoMarkerは後に、標的遺伝子とCreを有する雄マウスと雌マウスを交配することによって、標的遺伝子から削除された。
【００２２】
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ホモ接合（＃５６）及びヘテロ接合（ヘミ接合；＃６４）マウスからの４Ｔ１マウス乳がん細胞における、ヒト／マウスキメラENGの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を図示する。コントロールとして、野生型マウスからの４Ｔ１腫瘍細胞におけるマウスENGもまた染色された。図４Ａ及び４Ｂに、４種の抗hENGモノクローナル抗体であるSN6h、SN6j、SN6d及びSN6fと、アイソタイプ適合コントロールIgG（MOPC195v；IgG1-κ）及びラット抗マウスENGモノクローナル抗体MJ7/18（ＢＤバイオサイエンス）である２種のコントロールの試験結果を示す。SN6h、SN6j、SN6d及びSN6fの全てが、ホモ接合及びヘテロ接合（ヘミ接合）マウスの両方でキメラENGとよく反応する。アイソタイプ適合コントロールIgGは、キメラ又は野生型ENGのいずれとも明確な反応性を示さない。抗マウスENGモノクローナル抗体は、ホモ接合マウスにおいてキメラENGと反応を示さないが、ヘテロ接合及び野生型マウスではマウスENGと強く反応する。これらのモノクローナル抗体及びコントロールIgGと同じＩＨＣ染色パターンが、異なるホモ接合（＃６３、＃６７及び＃７４）及びヘテロ接合（＃５４及び＃７０）マウスで観察された。これらのモノクローナル抗体及びコントロールIgGによるヒト／マウスキメラENGの同様のＩＨＣ染色が、ホモ接合（＃５７）及びヘテロ接合（＃８１）マウスからのCol26結腸腫瘍においても検出された。
【００２３】
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、図４Ａ及び４Ｂに示されていないさらに５種の抗hENGモノクローナル抗体であるSN6c、SN6i、SN6、SN6g及びSN6kによる４Ｔ１腫瘍におけるヒト／マウスキメラENGのＩＨＣ染色を図示している。SN6c、SN6i及びSN6は、ホモ接合及びヘテロ接合マウスの両方でヒト／マウスキメラENGとよく反応する。糖鎖エピトープを規定していると思われるSN6gは、ホモ接合マウスの腫瘍においてキメラENGと弱い反応をするが、ヘテロ接合マウスでは反応しない。図５Ａ及び５Ｂにおける、アイソタイプ適合コントロールIgG MOPC195v及び抗マウスENG（CD105）モノクローナル抗体の反応性のパターンは、図４Ａ及び４Ｂのそれと一致する。MOPC195vは、キメラENG及びマウスENGのどちらとも顕著な反応性を示さない。抗マウスENG（CD105）モノクローナル抗体は、ヘテロ接合及び野生型マウスの４Ｔ１腫瘍においてマウスENGとよく反応するが、ホモ接合マウスの腫瘍におけるキメラENGと反応しない。
【００２４】
【図６】図６Ａは、抗hENGモノクローナル抗体であるSN6j、SN6c又はSN6dによる、ヒト／マウスキメラENGを発現するノックインマウスの４Ｔ１乳がんの成長抑制を示している。コントロールはアイソタイプ適合コントロールIgG MOPC195vである。同じサイズの皮下腫瘍を作成されたマウスが、治療の開始時に４つの異なるグループに均等に分配された（各グループにおいてｎ＝７）。各グループの腫瘍が作成されたマウス個体は、アイソタイプ適合コントロールIgG、SN6j、SN6c又はSN6d 50μｇの静脈内投与によって処置された。図中の垂直の矢印が示すとおり、投与は３又は４日間隔（週２回）で繰り返された。図中、それぞれのグラフの線は、各グループの７匹のマウスの腫瘍体積の平均を表したものである。
【００２５】
図６Ｂは、抗hENGモノクローナル抗体であるSN6j、SN6c又はSN6dの１００μｇの静脈内投与による、ノックインマウスに作成された４Ｔ１腫瘍の成長の抑制を図示している。この図の実験は図６Ａと同様に実施されたが、図６Ａの５０μｇの代わりに、１００μｇのモノクローナル抗体又はコントロールIgGがノックインマウス個体に投与された。
【００２６】
【図７】図７は、抗hENGモノクローナル抗体によるノックインマウスに作成されたCol26結腸腫瘍の成長の抑制を図示する。同じサイズのCol26の皮下腫瘍を作成されたマウスは、治療の開始時に４つのグループに均等に配分された（各グループｎ＝６）。各グループの腫瘍を有するマウス個体は、抗hENGモノクローナル抗体であるSN6j、SN6c又はSN6d、又はアイソタイプ適合コントロールIgG MOPC195v（IgG1-κ）１００μｇの静脈投与によって処置された。投与は図に垂直の矢印で示されるように３又は４日間隔（週に２回）繰り返された。図における各グラフの線は、各マウスグループの６匹のマウスの腫瘍体積の平均を表す。抗hENGモノクローナル抗体で処置されたグループとコントロールIgGで処置されたグループとの間の腫瘍体積の違いに加えて、SN6j、SN6c及びSN6dそれぞれで処置された３つのマウスグループは、コントロールIgGで処置されたグループよりも長く生存した。
【００２７】
【図８】図８は、本発明の抗体によって認識されるエンドグリンの立体エピトープを決定するために、抗体分析によって得られた結果の図示的な説明である。
【００２８】
【図９】図９は、細胞の放射免疫測定によって測定された、SN6シリーズの抗エンドグリンモノクローナル抗体（mAbs）及び125Ｉ標識SN6の間の、競合抗体結合から得られる結果の図示である。
【００２９】
【図１０】図１０は、Ｓ−ＥＮＧ（Ａ）をコードするｃＤＮＡのオリゴヌクレオチドプライマー及び細胞で発現された組み換えＥＮＧフラグメント（Ｂ）を図示する。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲで、ＥＮＧタンパク質分子の細胞外ドメインの異なる部分をコードするＤＮＡフラグメントを合成するために使用された。パネルＡでプライマーの名前に続くカッコ内の数字は、５’末端からの位置である。純方向プライマーFW1は、逆方向プライマーRV1、RV2、RV3、RV4、RV5及びRV6それぞれと、パネルＢのENGフラグメントＩ、II、III、IV、Ｖ及びVIをコードするＤＮＡを合成するために、ＰＣＲで組み合わされた。順方向プライマーFW2は、ENGフラグメントVII及びVIIIをコードするＤＮＡを合成するために、逆方向プライマーRV5及びRV6とそれぞれ組み合わされた。フラグメントVIは細胞外ドメイン全長に対応しており、一方、他のフラグメントはENG分子の異なる部分に対応している。
【００３０】
【図１１】図１１は、抗ＥＮＧモノクローナル抗体を用いる組み換えＥＮＧフラグメントのウエスタンブロットを図示する。ブランクのプラスミドベクターpET-21d（+）、又は、８種のENGフラグメント（すなわちＩ〜VIII）のそれぞれをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターpET-21d（+）でトランスフェクションされたＩＰＴＧ誘導大腸菌BL21（DE3）から収穫された封入体が、８Ｍ尿素を含む緩衝液に溶解された。溶解されたポリペプチドフラグメントは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥの１５％ゲルで分画された。分離されたENGフラグメントは、１２種の抗ENGモノクローナル抗体のそれぞれを用いたウエスタンブロットで検出された。また、溶解された組み換えフラグメントは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、SN6a、SN6g及びSN6kと分離されたフラグメントとの反応性がウエスタンブロットで検出された。還元条件下でSN6、SN6b、SN6c、SN6d、SN6e、SN6f、SN6h、SN6I及びSN6jで明確な反応バンドが検出されたが、SN6a、SN6g及びSN6kでは検出されなかった。しかしながら、SN6aとSN6kは非還元条件下で別個のENGフラグメントと反応した。SN6a、SN6b及びSN6kの結果は、ここに示されていない。なぜならそれらはこの特許出願に関連しないためである。シアル酸を含有するエピトープを規定するSN6gは、還元又は非還元条件のどちらでも、細胞で発現された組み換えENGフラグメントのいずれとも反応しなかった。実験は繰り返され、同じ結果が観察された。
【００３１】
【図１２】図１２。図１０で説明されるエンドグリン（ENG）フラグメントの合成に用いられるＰＣＲプライマーの配列。それぞれのプライマーの配列番号は図に示されている。
【００３２】
【図１３Ａ】図１３Ａ。ノックインヒトエンドグリン（エクソン４−８；上パネル）のアミノ酸配列。この図のエクソン４のアミノ末端アミノ酸残基N1は、リーダー配列を含む全hENG分子のN121に対応する。ノックインヒトエンドグリン（エクソン５及び６；下パネル）のアミノ酸配列。この図のエクソン５のアミノ末端アミノ酸残基A1は、リーダー配列を含む全hENG分子のA175に対応する。それぞれのエクソンの配列番号は図に示される。
【００３３】
【図１３Ｂ】図１３Ｂ。エクソン４−８を含むヒトエンドグリン遺伝子のヌクレオチド配列（エクソン配列は下線で示されている）。配列番号が示されている。
【図１３Ｂ１】図１３Ｂの続き。
【図１３Ｂ２】図１３Ｂの続き。
【発明の詳細な説明】
【００３４】
本発明は、血管新生関連状態の予防及び／又は治療のための組成物及び方法に関する。
【００３５】
一つの局面において、本発明は、ヒトエンドグリンの特定の部分に特異的である抗体を含む組成物であって、当該抗体はマウス内皮細胞によって発現されるマウスエンドグリンと交差反応しないものである、組成物を提供する。ヒトエンドグリンの特定の部分に同様に特異的であるが、マウス内皮細胞によって発現されるエンドグリンとは交差反応しない抗体のフラグメントもまた、提供される。
【００３６】
他の局面において、本発明は、トランスジェニックマウスを作製するために好適な組成物を提供する。当該組成物は、相同的組み換えで用いるのに好適であるベクターを含み、キメラエンドグリンを発現したトランスジェニックマウスを作製することができる。特定の態様において、ベクターは、マウスエンドグリン遺伝子のエクソン4，5，6，7及び8又はそれらの組み合わせの、ヒトエンドグリン遺伝子の相同エクソンとの相同的置換のために適合されている。
【００３７】
本発明の他の局面において、望まれない血管新生に関連する状態の予防及び／又は治療のための方法が提供される。本発明は抗血管新生治療を必要とする個体に、モノクローナル抗体又はそのヒトエンドグリン（hENG）結合フラグメントを投与することを含む。抗体やそのhENG結合フラグメントには多様な改変が可能であり、下記で詳述される。血管新生関連疾患の治療方法は、ここに提供されるモノクローナル抗体及び／又はそのhENG結合フラグメントを使用することを含む、組み合わせ治療を含む。
【００３８】
「血管新生関連疾患」又は「血管新生関連状態」という文言はここで、血管新生が異常に長く続く、ヒトにおける特定の病理学的プロセスを意味する。このような血管新生関連疾患は、糖尿病性網膜症、成人黄斑変性症、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍及びヒト固形腫瘍の多くのタイプを含む。
【００３９】
「血管新生阻害剤」という文言はここで、血管新生を阻害するために機能するペプチド、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えベクター及び薬剤を含み、またこれらに制限されない物質の組成物を意味する。血管新生阻害剤は本技術分野で公知である。代表的な例は、スニチニブ、ソラフェニブ、ベバシズマブ（アバスチン）、パクリタキセル、o-（クロロアセチル-カルボミル）フマジロール（“TNP-470”又は”AGM1470”）、トロンボスポンジン-１、トロンボ-スポンジン-２、ヒト軟骨細胞由来血管新生阻害剤（“hCHIAMP”）、軟骨由来血管新生阻害剤、血小板因子-４、グロ-ベータ（gro-beta）、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０（“IP10”）、インターロイキン１２、Ro318220、トリシクロデカン-9-イル  キサントゲン酸塩（“D609”）、イルソグラジン、８，９−ジヒドロキシ−７−メチル−ベンゾ［ｂ］キノリジニウムブロミド（“GPA1734”）、メドロキシプロジェステロン、ヘパリンとコルチゾンの組み合わせ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ−アントラキノン、ハービマイシン、ウルソル酸及びオレアノール酸を含み、これらに制限されない。
【００４０】
「抗血管新生治療」という文言はここで、エンドグリンを発現する細胞を含む血管系を標的とする治療を意味して用いられる。エンドグリンは、休止状態の血管系と比較して、増殖している血管系においてより高いレベルで発現する。本発明で提供される治療的アプローチは、血管新生（つまり、新血管形成につながる新しい毛細血管の形成）に対抗すること及び／又は、既存の血管系や疾患状況との関連に対抗すること（例えば、血管標的治療）を指向しうる。
【００４１】
「抗体フラグメント」又は「そのフラグメント」という文言はここで、完全な抗体分子の一部分又は断片を意味するのに用いられ、当該フラグメントは抗原結合機能を維持している；つまり、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、単鎖Fv ("scFv")、Fd'及びFdフラグメントを意味する。モノクローナル抗体から様々なフラグメントを作出する方法は、当業者にはよく知られている（Pluckthurn, 1992, Immunol. Rev. 130:152-188）。
【００４２】
「免疫複合体」という文言はここで、本発明の抗エンドグリンモノクローナル抗体又はそのフラグメント（又は代替的に、ヒト血管内皮細胞を認識するが、マウスエンドグリンとの交差反応性を持たない抗エンドグリンモノクローナル抗体又はそのフラグメント）、及び、少なくとも一つの抗腫瘍薬剤又は少なくとも一つの血管新生阻害剤を含む複合体を意味する。このような抗腫瘍薬剤は公知であり、トキシン、ドラッグ、酵素、サイトカイン、放射性核種、光力学的薬剤及び血管新生阻害剤を含み、これらに制限されない。トキシンには、リシンＡ鎖、変異シュードモナスエクソトキシン、ジフテリアトキソイド、ストレプトニグリン、ボアマイシン、サポリン及びヨウシュヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質を含む。ドラッグにはダウノルビシン、メトトレキセート、カペシタビン、パクリタキセル及びカリケアミシンを含む。放射性核種には、放射性金属を含む。サイトカインには、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、インターロイキン、インターフェロン及び腫瘍壊死因子を含む。光力学的薬剤には、ポルフィリンおよびそれらの誘導体を含む。抗エンドグリンモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、少なくとも一つの抗腫瘍薬剤と複合化するための方法は、当業者には良く知られている（例えば、Ghetie et al., 1994, Pharmacal. Ther. 63:209-34でレビューされる抗体複合体）。これらの方法はしばしば、分子をカップリング又はリンクさせるために用いられるいくつかの入手可能なヘテロ二価試薬の一つを活用するものである。
【００４３】
「アイソタイプコントロールイムノグロブリン」という文言はここで、明細書及び請求項において、特異的（例えば、比較される抗体と同じ種として生育される）で、アイソタイプが適合されている（例えば、比較される抗体と同じイムノグロブリン（Ｉｇ）クラス及びサブクラスである）Ｉｇで、比較される抗体が結合特異性を有している抗原に対して特異性があるもの、を意味する。より詳しくは続く態様でより明らかになるだろう。
【００４４】
「腫瘍」という文言はここで、例えば、非Ｔ細胞型（非Ｔ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び骨髄単球性白血病を含むヒト白血病；及び、血管肉腫、乳がん、盲腸がん、結腸がん、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、肺がん、メラノーマ、骨肉腫、卵巣がん、耳下腺腫、咽頭がん、前立腺がん及び直腸Ｓ状部がんを含む、周囲血管系がエンドグリンを（同タイプの通常組織による発現と比較して）中〜高レベルで発現するヒト固形腫瘍などの、（同タイプの通常組織による発現と比較して）中〜高レベルでエンドグリンを発現する腫瘍を意味して用いられる。
【００４５】
従来の化学治療や放射線治療の弱点は、正常組織よりも、意図する標的や病変組織に治療薬を送達するための選択性に欠けることである。モノクローナル抗体は、より高い標的特異性で治療薬を送達し、そのため毒性を低減するように用いられてきた。マウスモノクローナル抗体やフラグメントの大部分が、ヒト化やキメラ化によって対応するヒト成分に置換された後、ヒト疾患を処置するために用いられてきた。
【００４６】
抗血管新生治療は、ヒト固形腫瘍の従来の化学治療や放射線治療に伴う主な問題の幾つかを克服するだろう。第一に抗血管新生治療は、薬剤耐性の獲得の問題を迂回することができるだろう。薬剤耐性腫瘍変異体は、腫瘍細胞の遺伝子的な不安定さゆえに簡単に生成する。しかしながら例えば血管内皮細胞のような遺伝子的に安定な通常細胞では、薬剤耐性の生成がきわめて起こり難い。さらに、抗血管新生治療は、上記の理由で腫瘍の不均質性の問題を克服するだろう。さらに、高分子量薬剤（例えばモノクローナル抗体や免疫複合体）が固形腫瘍に浸透するときの生理学的な障壁が、腫瘍細胞でなく腫瘍の血管系を標的とすることによって迂回されるだろう。これは、抗血管新生治療で送達される治療薬が、腫瘍細胞ではなく、腫瘍の血管を裏打ちしている血管内皮細胞に選択的に作用するからである（送達された治療薬は、接触によって腫瘍細胞に２次的に作用するかもしれないが）。血管内皮細胞は、高分子量薬剤／抗腫瘍薬剤の循環に直接的にアクセス可能である。さらに、全ての腫瘍関連血管の破壊は、効果的な抗血管新生治療のために必然ではない。これは、大多数の腫瘍細胞が、少数の毛細血管内皮細胞に決定的に依存しているからである。もしも毛細血管床が抗血管新生治療の結果としてダメージを受けるならば、想到数の腫瘍細胞が栄養と酸素の欠乏によって死滅するだろう。さらなる利点は、抗血管新生治療のために開発された１タイプの治療薬が、多くのタイプの固形腫瘍や血管新生関連疾患に適用されるであろうことだ。本発明は、血管新生関連疾患の予防及び／又は治療のために新しく開発された組成物及び方法を提供するための次のアプローチを含む。
【００４７】
トランスジェニックマウスを作出するための組成物
マウスの遺伝子の相同的置換（つまり遺伝子ノックイン）をするための組成物及び方法は、本技術分野でよく知られている。本発明はhENGコード配列を含むマウス胚性幹細胞（ＥＳ）を創出するために適したベクターを提供する。トランスジェニックＥＳは、キメラマウス／ヒトエンドグリンを発現し、ゆえに、本発明によって提供されるモノクローナル抗体及びhENGを含みまたそれらに制限されない抗血管新生薬剤の効果を研究するのに有用である、ノックインマウスを作出するのに用いられ得る。
【００４８】
一つの態様において、本発明はマウスエンドグリン遺伝子の部分を、hENG遺伝子の部分で置換するのに用いられるベクターを提供する。ベクター自体が、マウスエンドグリン遺伝子との相同的組み換えを促進するように適合される。一般的に、レシピエントの染色体において標的部位の相同的組み換えに用いるのに適合されたベクターは、当業者には公知の特徴を有する。これらの特徴は、例えば、よくキャラクタライズされたNeoマーカーなどの選択的マーカー、置換遺伝子部分がクローニングされ、また、置換が正確にターゲッティングされるように染色体の標的部分の遺伝子セグメントと同じ遺伝子セグメントを挿入するためのポリクローニング部位、ベクターのリニア化のための部位、例えばLoxPサイト等の、特定の組み換えイベントに関与する酵素によって認識される部位、及び、プロモータ配列を含み、これらに制限されない。hENGエクソン４，５，６，７及び８をマウス染色体に挿入するために好適な代表的なノックインベクターが、図２に示されている。hENG遺伝子のエクソン４〜８によってコードされるアミノ酸配列が図１３Ａに示される。一方、これらのエクソン自体と介在するヒトイントロンの配列が図１３Ｂに示され、エクソン配列に下線が引かれている。図１３Ａ（上方のパネルの配列）におけるアミノ末端のアミノ酸残基Ｎ１は、リーダー配列を含むhENGアミノ酸配列の全長の121番目のAsnである。一方、図１２Ａ（上方パネル）におけるカルボキシ末端アミノ酸は、リーダー配列を含むhENGアミノ酸配列の全長の278番目のAlaである。
【００４９】
このように、多様な態様において本発明は、マウスエンドグリン遺伝子の部分を、ヒトエンドグリン遺伝子の相同の部分で置換するために好適な組み換えベクターを提供する。特定の態様においてベクターは、エクソン４，５，６，７及び８のそれぞれが、ヒトエンドグリン遺伝子エクソン４，５，６，７及び８のそれぞれで置換されうるように設計されている。他の態様においてベクターは、マウスエクソンのいずれか１、２、又は３，４又は５箇所が、相同ヒトエクソンで置換されうるように適合されている。一つの態様において、ベクターはヒトエクソン５−６によって、コードされるマウスエンドグリンエクソン５−６のみが除去されるように設計されるのがよい。
【００５０】
当業者は、本発明のトランスジェニックＥＳ及び／又はトランスジェニックマウスを作出するのに用いられるベクターにおけるヒトエンドグリンエクソンの配列は、内因性のヒトエンドグリンエクソン配列と同じでありえることが認識できるだろう。しかしながら、遺伝子コードの冗長性ゆえに、ヒトエンドグリンエクソンは内因性のヒトエンドグリン配列と異なりうるし、また、ヒトエンドグリンエクソンは、ヒトエンドグリンエクソン４−８及びそれらのエクソンの全ての組み合わせによってコードされるヒトエンドグリンタンパク質の部分をコードするあらゆるヌクレオチド配列をも含みうる。イントロン配列はタンパク質のコードではないので、マウスイントロン配列に関するノックインベクターのイントロン配列の顕著な多様性が許容されると予測されている。特定のケースでは、ノックインベクター中のイントロン配列が、マウスエンドグリン遺伝子のイントロン配列と実質的に同じ長さであることが好ましい。
【００５１】
本発明のベクターを使用するために、一般的に、通常の技術を用いてＥＳが得られうる。また、ＥＳはその組み入れ能力と、導入遺伝子のジャームライントランスミッション（germ line transmission）を創出するように発生中の胚の生殖細胞系の一部になる能力ゆえに選択される。すなわち、そのようなことが可能であるいかなるＥＳ細胞又は細胞株も、本発明での使用に好適である。ＥＳ細胞にここに説明されるノックインベクターを導入することは、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びリン酸カルシウム処理を含む、本技術分野で周知の様々な方法を用いて達成されうる。選択されたＤＮＡ配列の導入のために、ノックインベクターが、選択された挿入方法に適切な条件下でＥＳ細胞に添加される。例えば、細胞がエレクトロポレーションされる場合、ＥＳ細胞とＤＮＡ構築物は、エレクトロポレーションの機械（エレクトロポレーター）を用い、メーカーの使用手順に従った電気パルスに曝される。エレクトロポレーションの後、細胞は適切な培養条件の下で再生させられる。続いて細胞はノックイン構築物の存在をスクリーニングされる。導入遺伝子を含む細胞（例えば相同的組み換え体）のスクリーニングは、例えば特異的プローブによるスクリーニングにより、又は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、又はサザンブロッティングにより、様々な方法でなされうる。いったん選択されると、ＥＳ細胞は凝集キメラを形成するように動物（例えばマウス）の胚盤胞にインジェクションされる（Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152を参照）。続いてキメラ胚は、適切な偽妊娠雌仮親動物に移植され、胚は“ノックイン”動物を創出するための期間に入る。生殖細胞系に相同的に組み換えられたＤＮＡを含む子孫は、標準的な技術を用いて同定されることができ、全細胞が相同的に組み換えられたＤＮＡを含む動物を生み出すために用いられうる。
【００５２】
マウスと胚性幹細胞
上記の組成物及び方法、又は他の適切なテクニックを用いることによって、本発明は新規なヒト／マウスキメラエンドグリンを安定的に発現するトランスジェニックマウスＥＳノックインマウスを提供する。我々は、本明細書で「プランＡ」及び「プランＢ」と称呼されて説明される、２種のキメラＥＮＧ遺伝子を開発した。
【００５３】
プランＡでは、hENGエクソン４−８を含むキメラENG遺伝子がデザインされ、構築されて、その翻訳されたキメラタンパク質は、我々の開発した１２種の抗hENGモノクローナル抗体のうちの数種（７種又は８種）によって標的とされた。プランＢでは、この発明と関連する我々が開発した１２種のモノクローナル抗体のうちの少し（２種か３種）によって標的とされると予測されるタンパク質をコードする、hENGエクソン５−６を含む、より小さなキメラ遺伝子を作出した。我々は、プランＡの大きなhENGタンパク質（258アミノ酸ポリペプチドの二量体と糖鎖を含む）を含むキメラENGは、マウスで十分に機能せず、マウスに血管発達の異常をもたらすかもしれないことを考慮して、プランＢを実行した。ENG欠損マウスが血管発達の異常によって死亡したこと（Li et al., 1999, Science 284: 1534-1537）、ヒトでのhENG変異が遺伝性出血性毛細管拡張症１型（ＨＨＴ１；McAllister et al., 1994, Nature Genetics 8: 345-351）に関連することは留意されるべきである。しかしながら我々は、プランＡ及びＢの両方を用いて作出されたノックインマウスが正常に成長すること、及び、出血性毛細管拡張症様の症状のいかなる徴候も示さないことを見出した。これらの結果は、キメラENGがマウスにおいて生理学的に機能することを意味する。
【００５４】
重要な次の疑問は、翻訳されたヒト／マウスキメラＥＮＧタンパク質が、血管新生作用の血管において効果的に発現されるかどうかということだった。我々は、ノックインマウスから採取した腫瘍組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によってこの疑問に取り組んだ。プランＡマウスの腫瘍（colon26及び4T1）の微小血管は、ＩＨＣ染色において、７種の抗hENGモノクローナル抗体(SN6, SN6c, SN6d, SN6f, SN6h, SN6i and SN6j)と強く反応し、１種の抗hENGモノクローナル抗体（SN6g）と弱く反応した。この結果は、プランＡノックインマウスの腫瘍は７又は８種の抗hENGモノクローナル抗体によって標的にされうることを示している。プランＡ及びプランＢマウスは、幅広い抗hENG薬剤をスクリーニングするのに有用である。例えば、プランＡノックインマウスは、in vivo 抗腫瘍効果に関して、反応性のある抗hENGモノクローナル抗体８種のうちの最良又は最良の２種をスクリーニングするために有用である。プランＡキメラENGのhENG部分は、多くの抗hENGモノクローナル抗体が指向する免疫優性エピトープを含むことに留意することが重要である。つまり、プランＡノックインマウスは、多くの抗hENGモノクローナル抗体又は他の抗hENG薬剤のin vivo 抗腫瘍効果を評価するために、価値を有する。さらにノックインマウスは、モノクローナル抗体及びそのhENG結合フラグメントの抗腫瘍効果を強化するための、他の治療薬と抗ENGモノクローナル抗体との適切な組み合わせを見出すために有用である。本発明は、安定的にヒト／マウスキメラENGを発現するノックインマウス、及び、キメラENGのhENG部分のみを認識し、抗血管新生治療において抗血管新生活性を示す抗ENGモノクローナル抗体／免疫複合体を初めて開示すると考えられる。
【００５５】
抗体
本発明の他の態様は、抗hENGモノクローナル抗体を提供する。抗体は、ノックインマウスのヒト／マウスキメラENGのhENG部分に発現されるエピトープに対する結合活性によってキャラクタライズされうるが、その活性は、特定の腫瘍血管系及び血管新生に特有である血管内皮細胞の増殖に限られる。これらのモノクローナル抗体は、臨床的な有効性、薬物動態、ヒトでの血管新生治療の潜在的な副作用を評価するために必要な研究を行うために、マウスモデルにおけるin vivo 有効性が評価される。８種のこのような抗エンドグリンモノクローナル抗体が本発明で試験された：ハイブリドーマクローンN13A1からのモノクローナル抗体SN6、クローンL41C8からのSN6c、クローンD31A2からのSN6d、K42CからのSN6f、クローンII2G6からのSN6g、クローンG42C2からのSN6h、クローンK21C7からのSN6i、クローンY42F1からのSN6j。これらのモノクローナル抗体の特性は図１、図８、図９及び表１に示される。
【００５６】
上記の説明及びここに示される例や図から、本発明はヒト腫瘍血管新生や、過剰な血管系によって少なくとも部分的にキャラクタライズされるヒト血管新生関連疾患の予防又は治療のための抗血管新生薬として使用されうる、様々な態様の抗hENGモノクローナル抗体を提供することが明らかになるだろう。このような血管新生関連疾患は、全てのヒト固形腫瘍、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症や、関節リウマチ、皮膚炎及び乾癬を含む慢性炎症性疾患を含み、またこれらに制限されない。
【００５７】
様々な態様において、モノクローナル抗体やそのhENG結合フラグメントはマウスエンドグリンと交差反応しない。モノクローナル抗体はヒトエンドグリンエクソン４，５，６，７及び８のいずれかによってコードされるヒトエンドグリンの領域に特異的でありうる。代表的なエクソン配列とそれらによってコードされるアミノ酸配列は、図１３Ａ及び１３Ｂで図示される。様々な態様において、モノクローナル抗体はヒトエンドグリンエクソン４−８によってコードされるヒトエンドグリンの領域に特異的であり、従って、それらは、hENGのアミノ酸N121~A378を全体的に含み又はそれから成るhENG部分に特異的に結合しうる。これらの特性の典型的な抗体が、図１に図解的に示される。本発明は、マウスエンドグリンと交差反応する、ＳＮ６ｆ及びＳＮ６ｊで示されるモノクローナル抗体を含まない。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された、それぞれＳＮ６ｆとＳＮ６ｊを産生するハイブリドーマＫ４２Ｃ１０及びＹ４２Ｆ１は、それぞれ寄託番号ＨＢ−１２１７２及びＨＢ−１２１７１として記録された。ある態様において、抗血管新生及び抗腫瘍処置で用いられるように提供される抗体は、ＳＮ６ｃ、ＳＮ６ｄ、ＳＮ６ｉ及びそれらの組み合わせを含む。ここで説明されるそれぞれのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、本発明の射程内である。
【００５８】
本発明の抗体の特定の例のキャラクタリゼーションが、図８及び９に示される。特に図８で、パネルＡは１２種のSN6シリーズの抗ENGモノクローナル抗体によって規定されるENGの立体エピトープマップである。このマップは、１）数個の125Ｉ標識SN6シリーズモノクローナル抗体を用いた逐次的な競合阻害試験、２）同時的な競合結合試験、及び、３）様々な酵素消化に対する個々のエピトープの感受性度合いの比較、を含む３種の異なる試験を行うことによって構築された。パネルＢは１１種のSN6シリーズモノクローナル抗体（SN6gを除く）によって規定されるエピトープの位置を示す、ENGの直線配列エピトープマップを示す。この図で示されるエピトープマッピングで用いられたアミノ末端及び／又はカルボキシ末端アミノ酸残基が、この図に示される。この図のアミノ酸残基は２５アミノ酸のリーダー配列を除いて番号が付されている。つまり、アミノ末端のアミノ酸はＥ２６ではなく、Ｅ１（Ｇｌｕ１）と示される。
【００５９】
図９は、細胞の放射線免疫活性を用いて測定された、SN6シリーズ抗エンドグリンモノクローナル抗体と125Ｉ標識SN6の間の、競合的な抗体結合実験の結果を示す。ＳＮ６シリーズ抗エンドグリンモノクローナル抗体のそれぞれによって規定される個々のエピトープの立体的位置を比較するために実行された試験の一つは、競合的な結合試験であり、その結果は図９に示される。左パネルの横軸は精製されたモノクローナル抗体（SN6、SN6a、SN6b、SN6j及びSN6k）、コントロールモノクローナル抗体（SN4d；IgG2a-κ）及びコントロールマウスIgG（MOPC195バリアント；IgG1-κ）のngである。右パネルの横軸は、SN6シリーズハイブリドーマ（SN6, SN6c, SN6d, SN6e, SN6f, SN6g, SN6h 及びSN6i）及びMOPC195バリアント形質細胞の腹水液の１０倍段階希釈の逆数に由来する相対濃度である。標的抗原はKM-3白血病細胞のエンドグリン（CD105）であった。この試験において、エンドグリンを発現したKM-3（未成熟Ｂ−系統白血病細胞株）細胞は、最初に、異なる濃度のＳＮ６シリーズモノクローナル抗体のそれぞれとコントロールマウスIgG又はコントロールモノクローナル抗体とインキュベートされ、続いて、125Ｉ標識SN6モノクローナル抗体が、予めインキュベートされたKM-3細胞と反応するようにされた。KM-3細胞をSN6（自己モノクローナル抗体；ポジティブコントロール）と予めインキュベーションすることは、続く125Ｉ標識SN6の結合を、最大でほぼ完全に阻害した。また、同様のKM-3細胞とSN6c又はSN6dとのプレインキュベーションは、続く125Ｉ標識SN6の結合を最大で約９０％阻害した。一方で、同様のKM-3細胞とSN6i又はSN6fとのプレインキュベーションは、続く125Ｉ標識SN6の結合を、最大でそれぞれ４７％及び４０％阻害した。つまり、SN6c及びSN6dによって規定されるエピトープは、SN6fによって規定されるエピトープ（SN6fエピトープという）と異なる立体位置にある。SN6iエピトープはSN6fエピトープと近いがSN6fエピトープと同じではない。より高濃度のSN6g及びSN6kとのプレインキュベーションは、ブロックを生じず、むしろ125Ｉ標識SN6の結合を高めることは興味深い。これは、KM-3細胞のエンドグリンへのSN6g及びSN6kの結合が、SN6エピトープがより露出するようなエンドグリン分子の立体構造変化を含むことによるのかもしれない。図９から、特定の態様において本発明で提供される抗体は、ヒトエンドグリンへのSN6の結合を競合的に阻害しうることが明らかだろう。
【００６０】
ある態様において本発明はSN6cと称される抗hENGモノクローナル抗体を提供するが、これは、ハイブリドーマクローンL41C8によって産生される。このモノクローナル抗体は、hENG遺伝子のエクソン７−８によってコードされるIle271とAla378の間のhENG領域のエピトープを規定する。このモノクローナル抗体はマウス内皮細胞と交差反応しない。
【００６１】
他の態様において本発明はSN6dと称される抗hENGモノクローナル抗体を提供し、これは、ハイブリドーマクローンD31A2によって産生される。このモノクローナル抗体は、hENG遺伝子のエクソン７−８によってコードされるIle271とAla378の間のhENG領域のエピトープを規定する。このモノクローナル抗体は、マウス内皮細胞と交差反応しない。
【００６２】
他の態様において、本発明はSN6iと称される抗hENGモノクローナル抗体を提供し、これは、ハイブリドーマクローンK21C7によって産生される。このモノクローナル抗体は、hENG遺伝子のエクソン７−８によってコードされるIle271とAla378の間のhENG領域のエピトープを規定する。このモノクローナル抗体も、マウス内皮細胞と交差反応しない。
【００６３】
本発明にはまた、ここに説明されるhENGと特異的に結合する抗体のフラグメントであって、マウスエンドグリンと交差反応しないものも含まれる。抗体フラグメントはFab、Fab'、(Fab')2、Fv、単鎖(ScFv)、二重特異性抗体（diabody）、多価抗体、１又は複数の抗体部分を含む融合タンパク質、及び、hENGに対して所望される特異性を有するがマウスエンドグリンとは交差反応しない抗原認識部位を含む、他のあらゆる修飾された免疫グロブリン分子を含み、またこれらに限定されない。
【００６４】
本発明はまた、ここに開示される抗体のキメラ、及び、部分的に又は完全にヒト化されたものも提供する。ヒト化及びキメラ抗体を作る方法は当分野で公知である。一つの態様において、ヒト化抗体は、ヒトエンドグリンアミノ酸N121とアミノ酸A378の間のヒトエンドグリン領域に結合特異性を有するマウス超可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域と可変領域配列とを含む。ある態様において、抗体は、ヒトエンドグリンアミノ酸N121とアミノ酸A378の間のヒトエンドグリン領域に結合特異性を有するマウス超可変領域と、ヒト免疫グロブリン（超可変領域を除く）の定常領域と可変領域配列とを含む。他の態様において、抗体は、ヒトエンドグリンアミノ酸Ile217とアミノ酸A378の間のヒトエンドグリン領域に結合特異性を有するマウス可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを含む、キメラ化抗体である。
【００６５】
本発明はまた、ここに説明されるモノクローナル抗体又はそのhENG結合フラグメントを、薬学的に許容されるキャリアとともに含む、組成物を提供する。治療的目的において使用されるためのこのような組成物は、モノクローナル抗体やそのフラグメントをあらゆる適切な薬学的に許容されるキャリアと混合することによって調製されうる。薬剤と混合するのに好適な幾つかの組成物が、次の本に見出される：The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins。
【００６６】
これらの薬剤は単独で使用されてもよいし、他の治療的薬剤も含む組成物でもよく、及び／又は、組み合わせ治療法において用いられてもよい。他の治療的薬剤は、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、パクリタキセル、カペチタビン、スニチニブ、ソフェラニブ及びベバチズマブ（アバスチン）を含み、またそれらに制限されない。
【００６７】
一つの態様において、本発明は免疫複合体を提供する。免疫複合体は、抗エンドグリンモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、少なくとも一つの抗腫瘍薬剤とのカップリングによって形成され、形成される免疫複合体は、特定の腫瘍血管系や血管新生が特徴的な血管内皮細胞の増殖に限定される選択的な免疫反応性を維持している。裸の抗hENGモノクローナル抗体又は免疫複合体が、抗血管新生治療を要する個体に投与されうる。
【００６８】
方法
様々な態様において、修飾された或いはされていないあらゆる抗体又はそのｈＥＮＧ結合フラグメントは、ここに説明されるマウスモデルを用いて試験されうる。この態様は、ヒト血管新生関連疾患の処置の候補となるかどうか決定するために試験抗体を試験するために好適である。本発明によって提供されるマウスモデルでの臨床的な有効性や薬物動態などの評価パラメータをもって、それから抗血管新生治療がヒトへの処置に「スケールアップ」されうる。マウスモデルからヒトへとモノクローナル抗体を含む治療的薬剤をスケールアップするための生理学的な基礎は、当分野で公知である（Baxter et al., 1995, Cancer Res. 55:4611-4622）。
【００６９】
本発明の他の態様は、血管新生関連疾患の予防及び／又は治療のために、本発明による抗hENGモノクローナル抗体又はそのhENG結合フラグメントを用いるための方法を含む。この点で、この方法は、処置を必要とする個体に対して予防及び／又は治療のために使用されうる。処置を必要とする個体は、血管新生関連疾患を診断され、疑われ、又は進行リスクのある個体でありうる。つまり、あらゆるヒト固形腫瘍や、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）及び慢性炎症性疾患（関節リウマチ、皮膚炎、乾癬を含む）からなる群から選択されるいずれかの疾患を、診断され、疑われ、進行リスクのある個体である。
【００７０】
当業者には、あらゆるモノクローナル抗体又はそのhENG結合フラグメントのための特定の投与レジメンの形態及び特性は、単独で用いられる場合も又は薬学製剤において、又は１又は複数の他の治療的薬剤との組み合わせにおいて用いられる場合も、処置される個体のサイズ、性別、健康状態及び年齢、また、その個体が有しており、リスクのある血管新生関連疾患のタイプやステージを考慮に入れて、投与経路や他の公知のバリエーションによって少なくとも部分的に決定づけられることが、認識されるだろう。このようなクライテリアに基づいて、当業者は、個体に投与する組成物の効果的な量を決定することができる。
【００７１】
所望により他の治療的薬剤に加えて、抗体又はそのhENG結合フラグメントを含む組成物は、経口、非経口、皮下、腹腔、肺内、鼻腔内、頭蓋内投与を含むあらゆる可能な方法及びルートで個体に投与されうる。非経口投与は、筋肉内、静脈内、腹膜内及び皮下投与を含む。本発明の方法は、化学治療、外科的介入、及び放射線治療を含む従来の抗がん治療に先立って、同時に、又は後に行うことができる。
【００７２】
続く説明及びここに示される実施例と図から明確になるように、ここに提供される抗hENGモノクローナル抗体は、ヒト／マウスキメラENGのhENG部分のエピトープに対して結合特異性を有し、腫瘍関連血管新生を阻止するため、また、既存の微小血管の拡張を阻害する（血管標的）ために用いられうる。この結果は、抗エンドグリンモノクローナル抗体又はそれを含む免疫複合体は、in vivo で腫瘍関連血管系を効果的に標的とできることを示すと考えられているので、本発明の他の態様は、ヒト血管系内皮細胞で発現するあらゆる抗エンドグリンモノクローナル抗体認識エンドグリンを活用する、抗血管新生治療である。より特定すると、本発明の抗ENGモノクローナル抗体はENGへの免疫反応性とin vivo での腫瘍関連血管系ターゲティングにおける治療的な有効性とを示すので、このようなモノクローナル抗体は、ヒト自身に対して、また、ヒト血管内皮細胞の表面のENGのみを認識するモノクローナル抗体に対して、ヒトにおける合理的に予想される有用性を持つ。
【００７３】
続く実施例は本発明を描写するために提示される。実施例はいかなる方法でも制限的な意図を持たない。
【実施例】
【００７４】
［実施例１］
この事例は、新規なヒト／マウスキメラエンドグリンを安定的に発現するノックインマウスの開発の説明を提供する。
【００７５】
我々の開発した１２種の抗hENGモノクローナル抗体は、免疫学及び生化学試験（例えば競合結合アッセイ）によって確認された、少なくとも８種の異なる立体エピトープを規定する。これらのモノクローナル抗体の、hENGのアミノ酸配列における特定の領域で規定されるエピトープ配列は、ENG分子の異なる部分に対応する組み換えポリペプチドフラグメントを用いて決定された。図１はエピトープ配列を示す。
【００７６】
我々はエクソン４−８によってカバーされるマウスENG（mENG）領域をヒト化した。なぜならこの領域は、我々がこれまでに作出した抗hENGモノクローナル抗体の多くによって規定されるエピトープを含むからである。加えて、エクソン７によってコードされるhENGタンパク質領域は、免疫優勢エピトープを含む。我々は、ｍＥＮＧのエクソン４−８を対応するｈＥＮＧのエクソンで標的置換するために用いられるターゲティングベクターを構築した（図２）。ターゲットのノックイン遺伝子はＰＣＲ及びサザンブロットで試験された。いずれの結果も、mENGのエクソン４−８がhENGエクソン４−８にうまく置換されたことを示した（図３）。ノックインマウスにおけるターゲット遺伝子のNeoマーカーは、Neo発現雄マウス（Neo-carrying male mice）を、Creデリーター雌マウス（Cre-deleter female mice）と交配することによって削除された。交配／繁殖を繰り返した後に、我々は、ヒト／マウスキメラENG遺伝子を有するがNeo及びCre遺伝子を有さない、所望のノックインマウスを得た。このことはＰＣＲとサザンブロット試験で確認された。同様の方法を用いて（プランＢ）、我々はmENGのエクソン５−６遺伝子を、対応するhENG遺伝子のエクソン５−６と置換した。
【００７７】
続いて我々は、翻訳されたヒト／マウスキメラENGタンパク質が血管新生の新生血管において有効に発現されているかどうかを試験した。我々はこの疑問について、ノックインマウスの腫瘍組織の免疫組織化学（IHC）染色によって取り組んだ（図４Ａ、４Ｂ、図５Ａ及び５Ｂ）。この際我々は、colon26 マウス結腸腺がん細胞又は4T1マウス乳がん細胞を、ノックインマウス及び野生型マウス（コントロール）の左脇腹皮下に接種した。作製された腫瘍は切除され、切除腫瘍における血管が、抗hENGモノクローナル抗体、アイソタイプ適合コントロールIgG及びコントロールモノクローナル抗体とのＩＨＣ染色によって試験された。colon26腫瘍と4T1腫瘍のいずれも、複数の抗hENGモノクローナル抗体との一貫性のあるＩＨＣ染色パターンを示した。６匹の異なるノックインマウスからの腫瘍が、一貫性のあるＩＨＣ染色パターンを示した。SN6jに加えて、他の６種全ての抗hENGモノクローナル抗体（SN6h、SN6、SN6c、SN6d、SN6f及びSN6i）も、ノックインマウスにおける腫瘍関連血管の効果的な免疫染色を示した。これらのエピトープ配列はエクソン４−８によってコードされるタンパク質配列領域に位置している（図１参照）。さらに、糖鎖エピトープを規定するＳＮ６ｇは弱く染色された。ＩＨＣ染色の例は図４Ａ,４Ｂ,５Ａ及び５Ｂに示される。
【００７８】
ＩＨＣ検討の結果は、我々の実験デザインの正当性を立証する。ノックインマウスは正常に成長し、健康である。結果は、作出されたキメラENGがマウスにおいて生理学的に機能することを示す。
【００７９】
［実施例２］
本実施例は、抗−抗hENGモノクローナル抗体の製造の説明を提供する。抗hENGモノクローナル抗体SN6は、ENG発現ヒト白血病細胞からの細胞膜糖タンパク質の腫瘍関連抗原濃縮画分でマウスを免疫化することにより産出された（Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7898-7902）。本発明の残る７種の抗hENGモノクローナル抗体は、精製ヒトエンドグリン（hENG）調製物でマウスを免疫化することによって産出された。ｈＥＮＧはヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞から精製された。細胞膜糖タンパク質は、以前に述べられた方法で、界面活性剤抽出及びレクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて分離された（参照によってここに援用される、Haruta and Sean, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7898-7902）。分離された糖タンパク質は、抗エンドグリンモノクローナル抗体SN6を含む免疫アフィニティーカラムに添加された（Seon et al., 1997, Clin. Cancer Res. 3:1031-1044）。カラムは0.5%タウロコール酸、0.15M塩化ナトリウム、2mM  EDTA、0.03%アジ化ナトリウム及び0.5Mフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する、25mM Tris−塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化された。結合した物質は、0.5%タウロコール酸、2mM  EDTA、0.03%アジ化ナトリウムを含有する50mMジエチルアミン−HCl（pH11.3）（“アルカリ緩衝液”）で溶出された。溶出液は直ちに１／１０量の0.5MTris−塩酸緩衝液（pH7.1）で中和された。溶出物は再度免疫アフィニティーカラムに添加され、結合物は、0.01%シトクロームｃ（12.4kDタンパク質）をさらに含むアルカリ緩衝液で溶出され、中和された。溶出物は透析され、限外ろ過（例えばＹＭ−１０膜で）を用いて濃縮された。この精製プロセスは４−６℃で実行された。hENGの精製は、モノクローナル抗体SN6を用いた固相放射線免疫アッセイによってモニターされ、ゲル電気泳動と銀染色によって確認された。結果物のhENG調製物は単一で、非還元条件下では170kDの主要な成分、還元条件では92kDであった。
【００８０】
第一の免疫化プロトコルにおいて、以前に開示された方法（Seon et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:845-849）の改変法に従って、２匹のメスBALB/Cマウスが単離hENGと免疫化された。簡潔には、0.5%タウロコール酸、0.15M塩化ナトリウム及びシトクロームｃ14μgを含む10mM Tris−塩酸緩衝液（pH7.5）の100μLに、hENG調製物10μgを含む抗原溶液が、等量のアジュバント（例えば完全フロイントアジュバント）と混合され、続いて各マウスの複数の場所に注入された。加えて、１×１０９の百日咳菌を含む生理食塩水100μLが異なる場所に注入された。アジュバントの抗原溶液の２つの追加免疫は皮下的に投与された。200μL生理食塩水と混合されたhENG調製物8μgを含む抗原溶液の40μLの最後の免疫接種は、腹腔内に投与された。最後の免疫接種の４日後に、脾臓が切除され、P3/NS1/1-Ag4-1（NS-1）マウス骨髄腫細胞株と融合された。細胞融合、ハイブリドーマのスクリーニング、及び、免疫グロブリンクラスの決定は以前に開示されたように（Haruta and Seon, 1986, 上記参照）実行された。第２の免疫化プロトコルにおいて、メスBALB/cマウスが第一方法で述べられたように単離されたhENGと免疫化されたが、百日咳菌の投与はしなかった。さらにキャラクタライズされる、それぞれ異なる抗hENGモノクローナル抗体１１種のハイブリドーマがこれらの免疫化によって産出された。
【００８１】
図４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂに示されるように、これらの免疫化プロトコルを用いて算出された１１種のうち７種のモノクローナル抗体が、ノックインマウスにおいて安定的に発現されるヒト／マウスキメラENGに対する結合特異性を示した。
【００８２】
［実施例３］
この実施例は抗hENGモノクローナル抗体のキャラクタリゼーションを提供する。モノクローナル抗体SN6f、SN6g、SN6h、SN6i及びSN6jは、実施例２で初めに説明された免疫化プロトコルを用いて作出された。一方、モノクローナル抗体SN6cおよびSN6dは、第２の免疫化プロトコルを用いて作出された。モノクローナル抗体ＳＮ６は、実施例２に述べられるように、ヒト白血病細胞からの細胞膜糖タンパク質腫瘍関連抗原濃縮画分を用いて作出された。細胞の放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）でそれらを様々な造血細胞株に対して試験することによって、及び、以前に開示された方法（Haruta and Sean, 1986, 上記参照）を用いたhENGの免疫沈降によって、これら８種のモノクローナル抗体それぞれの免疫活性の特異性がキャラクタライズされた。簡潔には、それぞれのハイブリドーマの培養液の1:9希釈液の20μLと2×105造血細胞がそれぞれのＲＩＡ試験で用いられた。マウス形質細胞腫IgG1及びIgG2ａがコントロールとしてアッセイに含まれた。免疫活性（＋）又は免疫活性非検出（−）の結果が、表１に示される。
【００８３】
【表１】
2014508523.tif 000003
【００８４】
本発明の抗エンドグリンモノクローナル抗体について表１で示されるように、また、抗ｈＥＮＧモノクローナル抗体ＳＮ６について以前に決定されたように、試験された未成熟Ｂ系統白血病細胞株（KM-3, REH, NALM-1, NALM-6 及び NALM-16）及び骨髄単球性白血病細胞株（ML-2, HL-60 及び U937）について免疫反応性が示された。しかしながらそれらは、成熟Ｂ系統白血病リンパ球細胞株（BALL-1, BALM-2, BALM-3, Daudi, Ramos, U698M, 及び SU-DHL-4）、Ｔ白血病細胞株（MOLT-4, JM, CCRF-CEM, CCRF-HSB2, Ichikawa, HPB-MLT 及び HUT-78）、ＥＢＶトランスフォームＢ細胞株（CCRF- SB, RPMI 1788 及び RPMI 8057）のいずれにも反応しなかった。免疫沈降アッセイでは、本発明の８種の抗hENGモノクローナル抗体のいずれもが、非還元条件下で170kDの成分として、非還元条件下で92kDの成分として沈降した。
【００８５】
８種のモノクローナル抗体SN6、SN6c、SN6d、SN6f、SN6g、SN6h、SN6i及びSN6jのそれぞれの免疫反応活性の特異性が、数種のヒト悪性腫瘍組織の組織化学染色においてこれらのモノクローナル抗体を用いることにより、さらにキャラクタライズされた。組織は、乳房、結腸、腎臓、肺及びリンパ節の悪性腫瘍組織を含んだ。組織は凍結され、続いて風乾され、アセトン固定され、本分野の標準的な方法に従って染色された。８種のモノクローナル抗体それぞれでの悪性組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色は、これらのモノクローナル抗体が試験された悪性組織の全てと関連する血管内皮と強く反応することを示した。一方、アイソタイプコントロールIgGは各組織でいかなる顕著な染色も示さなかった。
【００８６】
まとめると、本発明の抗hENGモノクローナル抗体は、それらの悪性腫瘍血管との反応性によって表されるように、ENG発現ヒト白血病リンパ細胞及びヒト血管内皮細胞への選択的な反応性によって示される、ENGに対する強い免疫反応性を示した。ENGは活発な血管新生が進行する内皮細胞の一次的な増殖関連マーカーであるので、本発明の抗hENGモノクローナル抗体は、ヒトにおける他の血管新生疾患における腫瘍血管や過剰な血管新生への選択的標的抗血管新生治療に使用されうる。
【００８７】
抗血管新生に対するあらゆる潜在的な新規薬剤については、ヒト患者を含む臨床的なトライアルに薬剤が供される前に、動物において安全性と効果を評価されることが好ましい。この点において、ヒト／マウスキメラENGを安定的に発現する開発されたノックインマウスと、本発明のノックインマウスにおけるキメラENGのhENG部分と特異的に反応するモノクローナル抗体は、これらのモノクローナル抗体やこれらのモノクローナル抗体を用いて形成される免疫複合体の安全性と効果を評価するために有用である。
【００８８】
本発明の８種類の抗hENGモノクローナル抗体の、ノックインマウスのヒト／マウスキメラENGのヒトENG部分との特異的な反応性が、図４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂに図示されるＩＨＣ染色試験によって示される。モノクローナル抗体SN6h、SN6j、SN6d及びSN6fが、ホモ接合及びヘテロ接合（ヘミ接合）ノックインマウスからの4T1腫瘍のヒト／マウスキメラENGと強い反応性を示して、強いＩＨＣ染色を見せた。しかしながら野生型マウスの4T1腫瘍におけるマウスENGとは顕著なＩＨＣ染色性を示さなかった（図４Ａ及び４Ｂ）。抗マウスENG（CD105）モノクローナル抗体は、ヘテロ接合及び野生型マウスにおけるマウスENGと強いＩＨＣ染色を示した（図４Ａ）。アイソタイプ適合コントロールIgGは、キメラENG又はマウスENGのどちらとも、明らかなＩＨＣ染色を全く示さなかった（図４Ａ）。図５Ａに示されるように、モノクローナル抗体SN6c、SN6i及びSN6は、SN6h、SN6j、SN6d及びSN6fと同じＩＨＣ染色パターンを示した。モノクローナル抗体SN6gはホモ接合マウスのキメラENGと弱いＩＨＣ染色を示した（図５Ｂ）。モノクローナル抗体SN6kはキメラ又はマウスENGのどちらとも顕著なＩＨＣ染色を示さなかった（図５Ｂ）。この一連の実験において、抗マウスENGモノクローナル抗体とコントロールIgGのＩＨＣ染色パターンは、図４Ａに示される上記の一連の実験と本質的に同じである（図５Ａ及び５Ｂ）。モノクローナル抗体は、4T1乳がんのキメラENGと強いＩＨＣ染色を示し、また、Col26結腸腫瘍のキメラENGと強いＩＨＣ染色を示す。この発見は、ENG発現パターンは多くの異なる固形腫瘍の血管新生の血管の間で共通であるという、以前の知見（Seon et al., 2011 , Curr. Drug Deliv. 8:135-143）と一致する。
【００８９】
まとめると、本発明の８種の抗hENGモノクローナル抗体いずれもが、本発明のノックインマウスにおけるヒト／マウスキメラENGのヒトENG部分と反応する。
【００９０】
［実施例４］
この実施例は、抗血管新生治療のための抗hENGの使用の説明を提供する。抗hENGモノクローナル抗体は静脈内投与（i.v.）以外の経路でも投与されうるが、描写される好ましい態様はモノクローナル抗体のi.v. 投与である。これはまず、治療のターゲットである血管新生を含む増殖する血管系であるからで、つまり、モノクローナル抗体のi.v. 投与は、投与の別経路が用いられるよりも素早く、ターゲットの血管系を満たすからである。加えて、静脈内投与の経路は、特定の組織をさらにターゲットとできる可能性を与える。つまり、この態様のバリエーションとして、ターゲットの血管新生の場所へとモノクローナル抗体を送達するためにカテーテルが使用されうる。例えば、腫瘍血管新生が抗血管新生治療のターゲットであれば、また、腫瘍が肝臓に位置していれば、モノクローナル抗体はカテーテルを用いて肝門静脈の中に送達されうる。このバリエーションにおいて、モノクローナル抗体の全身性の分散は当然少なく、つまり、抗血管新生治療からのあらゆる潜在的な副作用が最小化される。
【００９１】
抗hENGモノクローナル抗体SN6c、SN6d及びSN6jが、本発明の方法に従う抗血管新生治療を描写するために用いられた。３セットの治療プロトコルが、治療研究において用いられた。第一のプロトコルでは、4T1マウス乳がん細胞が、ヒト／マウスキメラENGを安定的に発現しているノックインマウスの脇腹に皮下的に（s.c.）接種された。同じサイズの触知可能な確定した腫瘍を有するマウスが、治療の始点で均等に４群（ｎ＝７）に分けられた。各群の確定した腫瘍を有する個々のマウスは、尾静脈を通じて、SN6c、SN6d、SN6j、又はアイソタイプ適合コントロールIgG（MOPC195v）50μgの静脈内投与によって処置された。投与は３又は４日の間隔（週２回）で繰り返された。マウスは、毎日観察され、腫瘍サイズと体重が２又は３日間隔で測定された（図６Ａに示される）。
【００９２】
第二のプロトコルでは、確定した4T1腫瘍を有する４群のノックインマウスが、第一のプロトコルと同様の方法で作出され処置されたが、SN6c、SN6d、SN6j、又はアイソタイプ適合コントロールIgGの静脈内投与は100μgとした（図６Ｂ）。
【００９３】
プロトコルの第三セットでは、Col26マウス結腸がん細胞がノックインマウスの脇腹に皮下的に接種された。同じサイズの触知可能な確定した腫瘍を有するマウスが、治療の始点で均等に４群（ｎ＝６）に分けられた。各群の確定した腫瘍を有する個々のマウスは、SN6c、SN6d、SN6j、又はアイソタイプ適合コントロールIgGの100μgを静脈内投与で処置された。投与は３又は４日間隔（週２回）で繰り返された。マウスは毎日観察され、腫瘍サイズと体重が２又は３日間隔で測定された。結果が図７に示される。マウスの生存を追跡すると、抗hENGモノクローナル抗体（SN6c、SN6d、SN6j）で処置されたマウスは、コントロールIgGで処置されたマウスよりも長期間生存した。
【００９４】
［実施例５］
本実施例はキメラ及びヒト化抗hENGモノクローナル抗体を用いる抗血管新生治療の説明を提供する。上述のhENGに対するモノクローナル抗体は、キメラ抗体とされることもでき、あるいは、部分的に又は完全にヒト化されることもできる。キメラ又はヒト化抗体を作るための適切な技術は本分野で公知である。キメラ及びヒト化抗体の作製及び使用の説明は、米国特許6,200,566号に示されており、その開示全体がここに参照により援用される。キメラ及びヒト化抗hENGモノクローナル抗体を用いる抗血管新生治療の方法は、マウス抗体を使用するそれらの方法と同じである。一般的に、キメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体は、ヒト抗マウス抗体の応答の発達を最小化する。また、ヒトでは、親の（parental）マウス抗体と比べてキメラ又はヒト化抗体は一般的に抗体の半減期がより長いことによって、キメラ又はヒト化抗体はヒトにおける薬物動態を変化させる。
【００９５】
［実施例６］
この実施例は、ここに説明される抗体のエピトープマッピングの説明を提供する。エンドグリンの立体エピトープを決定するため、我々は３つの異なる試験を行った：１）幾つかの125Ｉ−標識SN6シリーズモノクローナル抗体を用いた、連続的な競合阻害試験。２）同時の競合結合試験、及び、３）様々な酵素的分解に対する個々のエピトープの感受性度合いの比較。これらの試験の結果は、図８に図解的にまとめられる。
【００９６】
発明は、特定の態様（いくつかは好ましい態様である）を参照して具体的に示され、説明されたが、当業者には、ここに開示された本発明の思想及び射程から離れることなく、形態や詳細について多様な変形がなされうることが理解されるだろう。
【図１】
2014508523.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｂ１】
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【図１３Ｂ２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月5日(2013.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記抗体が、ヒトエンドグリンアミノ酸Asn121及びアミノ酸Ala378の間のヒトエンドグリンの領域についてエンドグリン結合特異性を有するマウス可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域配列とを含むキメラ化抗体である、請求項３の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
＜連邦政府に支援される研究又は開発に関する記述＞
本発明は、米国陸軍医学研究司令部（U.S. Army Medical Research and Material Command）によって認められたＤＡＭＤ１７−０３−１−０４６３に基づく政府支援を得てなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明はまた、ここに開示される抗体のキメラ、及び、部分的に又は完全にヒト化されたものも提供する。ヒト化及びキメラ抗体を作る方法は当分野で公知である。一つの態様において、ヒト化抗体は、ヒトエンドグリンアミノ酸N121とアミノ酸A378の間のヒトエンドグリン領域に結合特異性を有するマウス超可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域と可変領域配列とを含む。ある態様において、抗体は、ヒトエンドグリンアミノ酸N121とアミノ酸A378の間のヒトエンドグリン領域に結合特異性を有するマウス超可変領域と、ヒト免疫グロブリン（超可変領域を除く）の定常領域と可変領域配列とを含む。他の態様において、抗体は、ヒトエンドグリンアミノ酸N121とアミノ酸A378の間のヒトエンドグリン領域に結合特異性を有するマウス可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを含む、キメラ化抗体である。
【国際調査報告】
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