(57)【要約】本開示は、ビグリカンレベルまたはビグリカン活性の異常と関連する疾患または状態；例えば、ジストロフィン会合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の不安定に起因する、細胞質膜の不安定と関連する障害；ＭｕＳＫの活性化またはアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集の異常から結果として生じる障害を含めた、シナプスまたは神経筋接合部の異常と関連する障害のためのビグリカン療法に対する患者の応答を予測する方法であって、ユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性を決定するステップを含む、応答を予測する方法を提供する。このような疾患の例には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、神経筋障害、および神経障害が含まれる。本出願はまた、ビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤などの組合せ治療剤も提供する。
2014508920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビグリカン療法に対する患者の応答を予測する方法であって、前記患者のユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比較して低いかどうかを決定するステップを含み、前記基準レベルと比べて低下していないユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性は、前記患者がビグリカン療法に応答する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項２】
ビグリカン療法の効果をモニタリングする方法であって、ビグリカン療法を受容している患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップを含み、膜会合ユートロフィンの増大したレベルは、前記ビグリカン療法が有効であることを示す、方法。
【請求項３】
前記ビグリカン療法が、配列番号９と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビグリカン療法が、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ビグリカン療法が、配列番号１０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記ビグリカン療法が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記ビグリカン療法が、配列番号１１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記ビグリカン療法が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ビグリカンポリペプチドの患者の用量を調整する方法であって、第１の用量のビグリカンポリペプチドを患者に投与するステップと、前記患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップと、膜会合ユートロフィンの前記量を所定の標的レベルと比較するステップと、前記ビグリカンポリペプチドの前記用量を、前記測定されたレベルと前記標的レベルとの間の差違に応じて調整するステップとを含む、方法。
【請求項１０】
ビグリカンポリペプチドの活性を測定する方法であって、前記ビグリカンポリペプチドを、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、ビグリカンポリペプチドを施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの増大した量は、ビグリカン活性の指標となる、方法。
【請求項１１】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号９と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号１０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号１１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１７】
ビグリカン関連状態の治療剤を同定する方法であって、被験化合物を、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、前記被験化合物を施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量の増大により、前記化合物がビグリカン関連状態の治療剤であることが示される、方法。
【請求項１８】
前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性（ｍｙｔｏｎｉｃ）ジストロフィーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験細胞が筋細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む治療用組成物。
【請求項２２】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号９またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号１３またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
ビグリカンポリペプチド、ならびに抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、ｎＮＯＳ系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの１または複数を含む治療用組成物。
【請求項２５】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号９またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項２６】
前記抗炎症薬が、ロフェコキシブ（Ｒｏｆｅｃｏｘｉｂｍ）またはセレコキシブである、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項２７】
筋肉量を増大させる前記薬剤が、ＡＣＥ−０３１、ＡＭＧ−７４５、またはＭＹＯ−０２９である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項２８】
ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる前記薬剤が、ＢＭＮ−１９５である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、ＳＭＴ  Ｃ１１００である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
ｎＮＯＳ系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項３１】
筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、ＭＧ５３、またはＣａｖ３である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項３２】
筋再生を増大させる前記薬剤が、ＡＣＥ−０３１またはＡＭＧ−７４５である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項３３】
線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項３４】
エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、ＡＶＩ−４６５８、ＰＲＯ５１、またはＰＲＯ４４である、請求項２４に記載の治療用組成物。
【請求項３５】
ビグリカン関連状態を処置する方法であって、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者にビグリカンポリペプチドを含む有効量の組成物およびユートロフィンポリペプチドを共時投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号９またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号１３またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ビグリカン関連状態を処置する方法であって、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者に有効量の（ｉ）ビグリカンポリペプチドを含む組成物、ならびに（ｉｉ）抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、ｎＮＯＳ系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの１または複数を共時投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号９またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗炎症薬が、ロフェコキシブまたはセレコキシブである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
筋肉量を増大させる前記薬剤が、ＡＣＥ−０３１、ＡＭＧ−７４５、またはＭＹＯ−０２９である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる前記薬剤が、ＢＭＮ−１９５である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、ＳＭＴ  Ｃ１１００である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
ｎＮＯＳ系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、ＭＧ５３、またはＣａｖ３である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
筋再生を増大させる前記薬剤が、ＡＣＥ−０３１またはＡＭＧ−７４５である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、ＡＶＩ−４６５８、ＰＲＯ５１、またはＰＲＯ４４である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
ビグリカン関連状態を処置する方法であって、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを、ビグリカン関連状態の処置を必要とするヒト患者に１〜４週間ごとに投与するステップを含む、方法。
【請求項５０】
前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ビグリカンポリペプチドの前記量が、０．１〜１．５ｍｇ／ｋｇである、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１０年１２月２７日に出願された米国仮出願第６１／４２７，４６８号の利益を主張する。この参照された出願の全体の教示は、参考として本明細書に明確に援用される。
【０００２】
政府の助成金
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金ＨＤ２３９２４、ＡＲ５７６９８、ＲＲ１５５７８、ＮＳ０６４２９５、Ｐ２０  ＲＲ０１８７５７、ＫＯ８  ＨＬ０７２３３２、ＡＲ  ４８８７１およびＥＹ  ０１３８６２の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットでＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０１１年１２月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＢＵＲＦ０１３ＷＯ１．ｔｘｔと名付けられ、５９，２４０バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
ジストロフィン会合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）は、細胞骨格を細胞外マトリックスへと連結し、筋細胞／細胞膜の完全性を維持するのに必要である。コアＤＡＰＣは、細胞骨格の足場分子であるジストロフィンと、ジストログリカンおよびサルコグリカンによる膜貫通サブ複合体とからなる。ＤＡＰＣはまた、少なくとも部分的にはそれと会合したシントロフィンを介して、鍵となるシグナル伝達分子を細胞表面へと局在化させることにも用いられる（非特許文献１；非特許文献２）。ジストロフィンまたはサルコグリカンのうちのいずれかにおける変異は、筋細胞膜の破断、筋線維の喪失、および線維化を特徴とする筋ジストロフィーを結果としてもたらす（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８７年．  Ｃｅｌｌ．、５１巻：９１９頁；  ＳｔｒａｕｂおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９７年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．、１０巻：１６８頁）。さらに、細胞表面においてＤＡＰＣと会合する細胞外マトリックスタンパク質であるラミニンα２における変異は、主要な先天性筋ジストロフィーの基盤である（Ｈｅｌｂｌｉｎｇ−Ｌｅｃｌｅｒｃら（１９９５年）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、１１巻：２１６頁）。
【０００５】
α−ジストログリカン／β−ジストログリカンサブ複合体は、ＤＡＰＣにおける極めて重要な構造的連関を形成する。膜貫通β−ジストログリカンおよび全体が細胞外のα−ジストログリカンは、共通の前駆体に対するタンパク質分解による切断を介して生じる（Ｉｂｒａｇｈｉｍｏｖら（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５５巻：６９６頁；  Ｂｏｗｅら（１９９４年）、Ｎｅｕｒｏｎ、１２巻：１１７３頁）。β−ジストログリカンの細胞質内テールがジストロフィンに結合する一方で、高度にグリコシル化したムチン様のα−ジストログリカンは、アグリン、ラミニン、およびペルレカンを含めた複数のＥＣＭエレメントに結合する（ＥｒｖａｓｔｉおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９３年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２２巻：８０９頁；  Ｂｏｗｅら（１９９４年）、Ｎｅｕｒｏｎ．、１２巻：１１７３頁；  Ｇｅｅら（１９９４年）、Ｃｅｌｌ、７７巻：６７５頁；  Ｈｅｍｌｅｒ（１９９９年）、Ｃｅｌｌ、９７巻：５４３頁）。ジストログリカンが欠損するマウスは、これらの構造を形成することができず、発育の極めて早期に死亡するので、マトリックスタンパク質へのこの結合は、基底膜を構築するのに不可欠であると考えられる（Ｈｅｎｒｙ，  Ｍ．  Ｄ．およびＫ．  Ｐ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９９８年）、Ｃｅｌｌ．、９５巻：８５９頁）。β−ジストログリカンは、シグナル伝達アダプター分子であるＧｒｂ２に結合することが可能であり、ｐ１２５ＦＡＫと間接的に会合する（Ｙａｎｇら（１９９５年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７０巻：１１７１１頁；  Ｃａｖａｌｄｅｓｉら（１９９９年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７２巻：０１６４８頁）。これらの結合特性は、ジストログリカンはまた、シグナル伝達分子を細胞表面へと局在化させるのにも用いられうることを示唆する。
【０００６】
複数系列の証拠は、ジストログリカンはまた、神経筋接合部の形成、特に、シナプス後の分化においても機能することを示唆する。明確さのために、本明細書では、神経筋接合部の構成要素を概括する。神経筋接合部（ＮＭＪ）または神経筋シナプスの主要な構造的特色とは、運動ニューロンおよび筋肉のそれぞれのシナプス前およびシナプス後における特化、介在するシナプスの基底膜、およびシュワン細胞に特化したキャップである（Ｓａｌｐｅｔｅｒら（１９８７年）、「Ｔｈｅ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ）。シナプス前装置は、シナプス小胞の規則的配列であって、そのサブセットが、活性帯域において細胞膜と融合し、筋肉におけるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）により認識されるアセチルコリンを放出し、最終的に筋肉の電気的活性化および収縮を結果としてもたらす準備ができているシナプス小胞の規則的配列を顕徴とする（Ｈｅｕｓｅｒら（１９８１年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８８巻：５６４頁）。これらの帯域から５０ｎｍのシナプス間隙を隔ててすぐのところに、接合部後褶曲部の稜部がある。これらの稜部にはＡＣｈＲが密生し、ＡＣｈＲは、１μｍ２当たりの分子＞１０，０００個の密度に達しうる（Ｆｅｒｔｕｃｋら（１９７６年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、６９巻：１４４頁）。アセチルコリンの狭小なシナプス間隙への、局在化されて緊密に制御された分泌が、シナプス後膜における高ＡＣｈＲ密度と組み合されることにより、ニューロンと筋肉との間の迅速で信頼のおけるシナプス伝達が確保される。重症筋無力症において見られる機能的ＡＣｈＲ数の減少など、これらの特化の攪乱は、消耗性であり致死的であることが多い臨床転帰をもたらしうる（Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓら（１９９２年）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、５巻：６３８頁）。
【０００７】
シナプス基底膜（ＳＢＬ）は、シナプス前膜とシナプス後膜との間に挟まれ、神経筋接合部の構造、機能、および制御に重要な分子を含有する（Ｂｏｗｅ，  Ｍ．ＡおよびＦａｌｌｏｎ，  Ｊ．Ｒ．（１９９５年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１８巻：４４３頁；  Ｓａｎｅｓら（１９９９年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２巻：３８９頁）。ＳＢＬは、特化したラミニン、プロテオグリカン、およびコラーゲンを含めた細胞外マトリックス分子の明確なセットからなる（Ｈａｌｌら（１９９３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、１０巻：（増刊号）９９頁）。ＳＢＬはまた、ＡＣｈＥ、ニューレグリン、およびアグリンを含めた、シナプスの構造および機能の制御に不可欠な分子も含有する。したがって、ＳＢＬは、シナプスの局在化された分化の維持に特化した構造、ならびに制御分子に不可欠な貯蔵場所のいずれとしても用いられる。
【０００８】
シナプス後膜の分子組成は、かなり詳細に公知である。上記で言及した通り、最も豊富な膜タンパク質はＡＣｈＲである。細胞質ゾルのＡＣｈＲに会合したタンパク質であるラプシン（以前は４３ｋＤタンパク質として公知であった）は、この受容体と共に化学量論レベルで存在し、細胞質ゾルのＡＣｈＲドメインと細胞骨格との間に鍵となる連結を形成する可能性が高い（Ｆｒｏｅｈｎｅｒら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７７巻：１９５頁；  Ｇａｕｔａｍら（１９９５年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７７巻：２３２頁）。シナプス後膜はまた、その一部または全部がニューレグリン受容体として用いられるｅｒｂＢ２〜４（Ａｌｔｉｏｋら（１９９５年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４巻：４２５８頁；  Ｚｈｕら（１９９５年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４巻：５８４２頁）、ＡＣｈＲ、および神経−筋肉間の情報伝達に不可欠な他の分子にも富む。細胞骨格のエレメントは、２つのサブセットへと広く群分けすることができる。ジストロフィンおよびユートロフィンは、ＤＡＰＣのメンバーであり、膜貫通ヘテロマーである、α−ジストログリカン／β−ジストログリカンを介してシナプスの基底膜へと連結される。シナプス後の細胞骨格はまた、α−アクチニン、ビンクリン、タリン、パキシリン、およびフィラミンを含めた複数の局所的な接着関連分子にも富む（Ｓａｎｅｓら（１９９９年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２巻：３８９頁）。後者のタンパク質は、おそらく、それらの一部がシナプスにおいて濃縮されているインテグリンを介して、細胞外マトリックスと直接的または間接的に情報伝達する（Ｍａｒｔｉｎら（１９９６年）、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、１７４巻：１２５頁）。アクチンは、細胞骨格分子のセットの両方と会合する（Ｒｙｂａｋｏｖａら（１９９６年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３５巻：６６１頁；  Ａｍａｎｎら（１９９８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７３巻：２８４１９〜２３頁；  Ｓｃｈｏｅｎｗａｅｌｄｅｒら（１９９９年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１１巻：２７４頁）。これらのタンパク質の特化したセットの機能については、以下で考える。
【０００９】
α−ジストログリカンは、シナプス組織化分子であるアグリン（Ｂｏｗｅら（１９９４年）、Ｎｅｕｒｏｎ．、１２巻：１１７３頁；  Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉら（１９９４年）、Ｃｅｌｌ．、７７巻：６６３頁；  Ｇｅｅら（１９９４年）、Ｃｅｌｌ．、７７巻：６７５頁；  Ｓｕｇｉｙａｍａら（１９９４年）、Ｎｅｕｒｏｎ．、１３巻：１０３頁；  Ｏ’Ｔｏｏｌｅら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、９３巻：７３６９頁）（ＦａｌｌｏｎおよびＨａｌｌ（１９９４年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１７巻：４６９頁において総説されている）に結合し、β−ジストログリカンは、ＡＣｈＲ会合タンパク質であるラプシンに結合する（Ｃａｒｔａｕｄら（１９９８年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７３巻：１１３２１頁）。さらに、低レベルのジストログリカンを発現する筋細胞では、シナプス後膜にクラスター化するアグリン誘導性ＡＣｈＲが著しく減少する（Ｍｏｎｔａｎａｒｏら（１９９８年）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１８巻：１２５０頁）。この過程におけるジストログリカンの正確な役割は未知である。現在入手可能な証拠は、ジストログリカンが、主要なアグリン受容体の一部ではなく、むしろ、シナプス後特化の組織化において構造的な役割を果たしうることを示唆する（Ｇｅｓｅｍａｎｎら（１９９５年）、Ｂｉｏｌ．、１２８巻：６２５頁；  Ｇｌａｓｓら（１９９６年）、Ｃｅｌｌ．、８５巻：５１３頁；  Ｊａｃｏｂｓｏｎら（１９９８年）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１８巻：６３４０頁）。
【００１０】
神経筋接合部の形成において重要な役割を果たす別の分子は、チロシンキナーゼ受容体であり、アグリンに応答してリン酸化するＭｕＳＫである。しかし、アグリンはＭｕＳＫに結合せず、アグリンがいかにしてＭｕＳＫを刺激するのかは不明である。共受容体の存在が示唆されている。抗体の架橋形成によるＭｕＳＫの活性化は、培養された筋管におけるＡＣｈＲのクラスター化を誘導するのに十分であり（Ｘｉｅら（１９９７年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：７６８頁；ならびにＨｏｐｆおよびＨｏｃｈ（１９９８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７３巻：６４６７頁）、構成的に活性なＭｕＳＫは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてシナプス後の分化を誘導しうる（Ｊｏｎｅｓら（１９９９年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９巻：３３７６頁）。しかし、ＭｕＳＫのリン酸化は、アグリン誘導性ＡＣｈＲのクラスター化に必要ではあるが、十分ではない。
【００１１】
ジストログリカン機能の領野は、筋肉をはるかに超えた範囲に及ぶ。上記で言及した通り、ジストログリカン欠損マウスは、筋分化のはるか以前に死亡する。驚くべき展開において、筋細胞以外の細胞におけるα−ジストログリカンは、ラッサ熱ウイルスおよび脈絡髄膜炎熱ウイルスの受容体として機能し（Ｃａｏ、Ｗ．ら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８２巻：２０７９頁）、シュワン細胞におけるα−ジストログリカンは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅの共受容体として機能する（Ｒａｍｂｕｋｋａｎａら（１９９８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８２巻：２０７６頁）ことが示されている。ジストログリカンはまた、脳においても豊富であるが、その機能は理解されていない（Ｇｏｒｅｃｋｉら（１９９４年）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：１５８９頁；  ＳｍａｌｈｅｉｓｅｒおよびＫｉｍ（１９９５年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７０巻：１５４２５頁）。
【００１２】
α−ジストログリカンは、３つの公知のドメインを含む。アミノ末端ドメインは、自立的な球形の立体構成へとフォールディングする（Ｂｒａｎｃａｃｃｉｏら（１９９５年）、Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．、３６８巻：１３９頁）。３つのタンパク質のうちの真ん中のタンパク質は、セリンおよびトレオニンに富み、高度にグリコシル化している（Ｂｒａｎｃａｃｃｉｏら（１９９７年）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４６巻：１６６頁）。実際、α−ジストログリカンのコアの分子量は約６８ｋＤａであるが、天然の分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、そのサイズが種および組織供給源に応じて１２０〜１９０ｋＤａの範囲にわたる多分散バンドとして泳動する（ＥｒｖａｓｔｉおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９３年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２２巻：８０９頁；  Ｂｏｗｅら（１９９４年）、Ｎｅｕｒｏｎ．、１２巻：１１７３頁；  Ｇｅｅら（１９９４年）、Ｃｅｌｌ．、７７巻：６７５頁；  Ｍａｔｓｕｍｕｒａら（１９９７年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７２巻：１３９０４頁）。α−ジストログリカンのグリコシル化は、おそらく、この３つのタンパク質のうちの真ん中のタンパク質において生じ、そのラミニン結合特性およびアグリン結合特性に不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｒｅｎｍａｎら、Ｃｅｌｌ．（１９９６年）８４巻：７５７〜７６７頁
【非特許文献２】Ｂｒｅｄｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９８年）９５巻：１４５９２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ジストログリカンおよびＤＡＰＣは、筋肉ならびに他の組織の多様な過程において極めて重要な役割を果たすことが明らかである。ジストログリカンおよび／またはＤＡＰＣの機能を調節するための診断剤および治療剤ならびに方法を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン療法に対する患者の応答を予測する方法であって、患者のユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比較して低いかどうかを決定するステップを含み、ユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比べて低くなければ、患者がビグリカン療法に応答する可能性が高いことが示される方法を提供する。
【００１６】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン療法の効果をモニタリングする方法であって、ビグリカン療法を受容している患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップを含み、膜会合ユートロフィンレベルが高ければ、ビグリカン療法が有効であることが示される方法を提供する。
【００１７】
特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチドの患者の用量を調整する方法であって、第１の用量のビグリカンポリペプチドを患者に投与するステップと、患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップと、膜会合ユートロフィンの量を所定の標的レベルと比較するステップと、ビグリカンポリペプチドの用量を、測定されたレベルと標的レベルとの間の差違に応じて調整するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチドの活性を測定する方法であって、ビグリカンポリペプチドを、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、ビグリカンポリペプチドを施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、被験細胞における膜会合ユートロフィンの増大した量は、ビグリカン活性の指標となる方法を提供する。
【００１９】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態の治療剤を同定する方法であって、被験化合物を、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、被験化合物を施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、被験細胞における膜会合ユートロフィンの量の増大により、化合物がビグリカン関連状態の治療剤であることが示される方法を提供する。
【００２０】
ビグリカン関連状態は、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態でありうる。筋ジストロフィーは、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性（ｍｙｔｏｎｉｃ）ジストロフィーでありうる。被験細胞は、筋細胞でありうる。
【００２１】
特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む治療用組成物を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、配列番号１３またはその断片と少なくとも９０％同一である、請求項２１に記載の組成物。
【００２３】
特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチド、ならびに抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、ｎＮＯＳ系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの１または複数を含む治療用組成物を提供する。
【００２４】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、それを必要とする患者にビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む有効量の組成物を共時投与するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量の（ｉ）ビグリカンポリペプチドを含む組成物、ならびに（ｉｉ）抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、ｎＮＯＳ系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの１または複数を共時投与するステップを含む方法を提供する。
【００２６】
抗炎症薬は、例えば、ロフェコキシブ（Ｒｏｆｅｃｏｘｉｂｍ）またはセレコキシブでありうる。筋肉量を増大させる薬剤は、例えば、ＡＣＥ−０３１、ＡＭＧ−７４５、またはＭＹＯ−０２９でありうる。ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる薬剤は、例えば、ＢＭＮ−１９５でありうる。ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤は、例えば、ＳＭＴ  Ｃ１１００でありうる。ｎＮＯＳ系の活性を増大させる薬剤は、例えば、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートでありうる。筋細胞膜の修復を促進する薬剤は、例えば、ジスフェリン、ＭＧ５３、またはＣａｖ３でありうる。筋再生を増大させる薬剤は、例えば、ＡＣＥ−０３１またはＡＭＧ−７４５でありうる。線維化を低下させる薬剤は、例えば、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬でありうる。エクソンスキッピングを促進する薬剤は、例えば、ＡＶＩ−４６５８、ＰＲＯ５１、またはＰＲＯ４４でありうる。
【００２７】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを、それを必要とするヒト患者に１〜４週間ごとに投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドを１〜２週間ごと、２〜３週間ごと、または３〜４週間ごとに投与する。一部の実施形態では、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、２０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、１００ｍｇ／ｋｇ／２００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを投与する。
【００２８】
特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇのビグリカンポリペプチドを、それを必要とするヒト患者に１〜４週間ごとに投与するステップを含む方法を提供する。例えば、ビグリカンの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇでありうる。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドを１〜２週間ごと、２〜３週間ごと、または３〜４週間ごとに投与する。
【００２９】
一部の実施形態では、ビグリカン関連状態は、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である。筋ジストロフィーは、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーでありうる。
【００３０】
一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号９と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号１０と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号１１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本開示は、前出の態様および実施形態のうちのいずれかの全ての組合せのほか、「発明を実施するための形態」および「実施例」で示される実施形態のうちのいずれかによる組合せも想定する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、野生型マウスおよびビグリカンヌルマウスにおけるユートロフィンレベルおよびユートロフィンの局在化を示す図である。未成熟ｂｇｎ−／ｏマウスの筋鞘では、ユートロフィンが低減される。（Ａ）Ｐ１４のコンジェニックＷＴ（上パネル）ＤＪＳおよびｂｇｎ−／ｏ（下パネル）マウスから大腿四頭筋を摘出し、切片化し、同じスライドガラス上にマウントし、ジストロフィンおよびユートロフィンについて免疫染色したことを示す図である。これらの発育しつつあるビグリカンヌルマウスでは、ユートロフィンの発現が、ＷＴマウスと比較して低下するのに対し、ジストロフィンの発現は、検出可能には変化しない（スケールバー＝２５μｍ）。（Ｂ）筋鞘におけるユートロフィン発現の定量化を示す図である。「材料および方法」で記載される通りに、Ａで調製されたユートロフィン染色した筋切片の画像を収集し、接合部周囲の筋鞘で免疫染色されたユートロフィンレベルを測定した。各遺伝子型に由来する３匹ずつの動物の各々に由来する合計５０片の筋鞘節を解析した。ｂｇｎ−／ｏ筋の切片では、ユートロフィンの免疫反応が、ＷＴと比較して２８％低下した（ｂｇｎ−／ｏ：０．７２±０．０３、ＷＴ：１．０±０．０４、対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＜０．０００１；各遺伝子型３匹ずつのマウスに由来するｎ＝１５０の筋鞘節）。（Ｃ）接合部周囲の筋鞘におけるジストロフィンの定量化を示す図である。Ｂにおける通りに、ジストロフィンを染色した切片を画像化および測定した。ジストロフィンの免疫反応は、Ｐ１４のＷＴ切片とｂｇｎ−／ｏ切片とで同等であった（ｂｇｎ−／ｏ：１．０１±０．０３、ＷＴ：１．００±０．０３、対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．７６）。（Ｄ）Ｐ１４のＷＴマウスおよびｂｇｎ−／ｏマウスにおけるユートロフィン転写物についての定量的リアルタイムＰＣＲ解析を示す図である。全ＲＮＡは、ＷＴマウスおよびｂｇｎ−／ｏマウスに由来する大腿四頭筋から抽出し、ｃＤＮＡ合成のために用いた。ユートロフィンｍＲＮＡの発現は、ＷＴ筋およびｂｇｎ−／ｏ筋で識別不能であった（ＷＴ：１．０±０．２６、ｂｇｎ−／ｏ：０．９９±０．０９、各遺伝子に由来するｎ＝３ずつの動物）。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ｒｈＢＧＮによる処置が、培養された筋管における膜会合ユートロフィンタンパクおよびγ−サルコグリカンタンパク質を増大させることを示す図である。（Ａ）表示される通り、培養されたｂｇｎ−／ｏ筋管を、１ｎＭのｒｈＢＧＮまたは媒体と共に８時間にわたりインキュベートしたことを示す図である。ユートロフィンおよびγ−サルコグリカン（γ−ＳＧ）についてプローブされた膜画分のウェスタンブロットが示される。ｒｈＢＧＮによる処置後において、ユートロフィンおよびγ−サルコグリカンの両方の発現が増大することに注意されたい。（Ｂ）Ａにおける通りに、ｂｇｎ−／ｏ筋管を処置し、全細胞抽出物を調製したことを示す図である。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ユートロフィンおよびアクチン（ローディング対照）について免疫ブロット処理した。ユートロフィンの総タンパク質レベルは、非処置培養物とｒｈＢＧＮにより処置された培養物とで同様であった。（Ｃ）非処置の培養ｂｇｎ−／ｏ筋管およびｒｈＢＧＮにより処置された培養ｂｇｎ−／ｏ筋管についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。ｒｈＢＧＮによる処置は、ユートロフィン転写物のレベルを約３０％低下させた（非処置：１±０．１０；ｒｈＢＧＮによる処置：０．７±０．０６；対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０２；各々３連ずつのフラスコを伴うｎ＝６ずつの別個の実験）。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、ｒｈＢＧＮによる処置が、ｍｄｘマウスの筋鞘におけるユートロフィンを上方制御することを示す図である。（Ａ）Ｐ１９においてｒｈＢＧＮまたは媒体の単回腹腔内注射を施された、Ｐ３３のｍｄｘ同腹仔マウスに由来する大腿四頭筋のユートロフィン免疫染色を示す図である（スケールバー＝２５μｍ）。（Ｂ）末梢有核線維の筋鞘における免疫染色レベル（例えば、Ａにおける矢印）を示す図である。４匹の動物の各々に由来する合計１００片の筋鞘節を解析した（２匹の同腹仔による対であり、１つの対当たり１匹はｒｈＢＧＮを注射した動物であり、もう１匹は媒体を注射した動物である）。ｒｈＢＧＮを注射した動物に由来する切片では、筋鞘のユートロフィン免疫反応が、媒体を注射した動物の場合と比較して＞２．５倍であった（対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＜０．０００１）。（Ｃ）媒体を注射したｍｄｘマウスまたはｒｈＢＧＮを注射したｍｄｘマウス由来のユートロフィン転写物についてのｑＲＴ  ＰＣＲ解析を示す図である。媒体を注射した対照と比較した、ｒｈＢＧＮで処置したマウスにおけるユートロフィン転写物のレベルに有意差は見られなかった（対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０５７；ｎ＝８の媒体で処置したマウスおよびｎ＝６のｒｈＢＧＮで処置したマウス）。（Ｄ）ｒｈＢＧＮによる処置が、筋膜画分におけるユートロフィンの発現を増大させることを示す図である。単一の同腹仔群に由来する、Ｐ１６およびＰ３８（左側の対）またはＰ１６、Ｐ３８、およびＰ６３（右側の対）のｍｄｘマウスに、ｒｈＢＧＮまたは媒体を注射した。最後の注射の３週間後に筋肉を採取した。（Ｅ）ｒｈＢＧＮによる処置が、γ−サルコグリカンの発現を増大させることを示す図である。ｍｄｘマウスに、Ｐ１４に始まる３週間間隔で、ｒｈＢＧＮまたは媒体単独を注射した。１５週齢のときに筋肉を採取し、γ−サルコグリカンについて免疫ブロットを施した。ｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウスに由来する膜画分では、γ−サルコグリカンが、媒体で処置した動物の場合と比較して多い。
【図４】図４は、ｒｈＢＧＮが、ｍｄｘマウスの筋鞘におけるＤＡＰＣの構成要素を上方制御することを示す図である。Ｐ１８のｍｄｘマウスにｒｈＢＧＮまたは媒体を注射し、３２Ｐにおいて筋肉を採取した。媒体で処置した動物またはｒｈＢＧＮで処置した動物に由来するＴＡの切片を、実施例９で記載される表示のＤＡＰＣの構成要素に対する抗体で免疫染色した。ｒｈＢＧＮによる処置は、ｍｄｘマウスにおける筋鞘のγ−サルコグリカン、β２−シントロフィン、およびｎＮＯＳの発現を増大させる。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、全身投与されたｒｈＢＧＮが、ｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗することを示す図である。（Ａ）Ｐ１８において媒体（上パネル）または１００μｇのｒｈＢＧＮ（下パネル）を腹腔内注射し、Ｐ３８において採取した、同腹仔のｍｄｘマウスに由来する横隔膜のＨ＆Ｅで染色した切片を示す図である。（右側パネル）拡大図である。ｒｈＢＧＮを注射したマウスと比較した、媒体を注射したマウスに由来する筋肉における広範な壊死／再生領域および単核細胞浸潤に注意されたい（スケールバー＝５０μｍ）。（Ｂ）ｒｈＢＧＮの投与は、ｍｄｘ筋におけるＣＮＦ比率を、媒体を注射した同腹仔と比較して低下させる（単回注射：「材料および方法」）。ＣＮＦの百分率は、Ｈ＆Ｅ染色した横隔膜切片により決定した。ｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウスの中心核筋線維は、媒体を注射したｍｄｘマウスと比較して約５０％少なかった（媒体を注射した動物およびｒｈＢＧＮを注射した動物のそれぞれについて１７．７％±２．８および９．６％±１．７；媒体を注射した動物のｎ＝１３およびｒｈＢＧＮを注射した動物のｎ＝１１；対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０２８）。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、ｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウスにおける筋肉の生理学的改善を示す図である。ｍｄｘマウスに、Ｐ１４に始まる３週間間隔で、ｒｈＢＧＮ（注射１回当たり２５μｇ：腹腔内）または媒体を注射し、１５週齢のときに組織を採取した。（Ａ）媒体または（Ｂ）ｒｈＢＧＮを注射したｍｄｘマウスに由来するＥＤＬ筋についての、代表的な１〜５回目のＥＣＣを示す図である。（Ｃ）媒体で処置したｍｄｘマウス（６．４±１．２％；１２．４±１．９％；１８．４±２．３％；２２．２±７％；ｎ＝１６）およびｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウス（３．９±０．３％；７．５±０．５％；１１．６±０．８％；１４．９±１．２％；ｎ＝１６）のそれぞれについての、１回目のＥＣＣと、２回目、３回目、４回目、および５回目のＥＣＣとの間のＥＣＣ力の低下の比較を示す図である。２回目、３回目、４回目、および５回目の収縮では、媒体で処置したｍｄｘマウスについてのＥＣＣと、ｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウスについてのＥＣＣとの間の力の低下に有意差が認められた（それぞれ、Ｐ＝０．０５、０．０２、０．０１、０．０２；対応のないスチューデントのｔ検定）。（Ｄ）媒体で処置したｍｄｘマウスおよびｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウスにおける１回目のＥＣＣと５回目のＥＣＣとの間の力の低下の平均を示す図である（それぞれ、２２．２±２．７％対１４．９±１．２％；Ｐ＝０．０２；各群における筋肉のｎ＝１６；対応のないスチューデントのｔ検定）。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、全身送達されたｒｈＢＧＮを循環中で検出することが可能であり、これが筋肉に局在化することを示す図である。（Ａ）腹腔内送達後に、血清中でｒｈＢＧＮを検出したことを示す図である。マウスには１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＢＧＮを腹腔内注射し、注射の３０分後、１時間後、および２４時間後に血清を回収した（群１つ当たりの動物のｎ＝３〜４）。実施例９で記載する通りに、２部位ＥＬＩＳＡを実施した。注射されなかったマウスに由来する血清には、ビグリカン（内因性）が検出されなかった。しかし、組換えタンパク質を全身注射した後では、ｒｈＢＧＮが、血清中で容易に検出された（スケールバー＝５０μｍ）。（Ｂ）全身送達されたｒｈＢＧＮは、筋肉に安定的に局在化することを示す図である。Ａｌｅｘａ５５５−ｒｈＢＧＮ（実施例９）を成体ｍｄｘマウスへと腹腔内注射し、４８時間後に横隔膜を摘出した。内因性ラミニンは、間接的免疫蛍光法により検出した。全身送達されたＡｌｅｘａ５５５−ｒｈＢＧＮは、筋線維周囲の細胞外マトリックスに局在化する。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ｒｈＢＧＮによる処置が、ｍｄｘマウスの前脛骨の筋鞘におけるユートロフィンの発現を増大させることを示す図である。（Ａ）ｒｈＢＧＮまたは媒体の腹腔内注射を１回施されたｍｄｘマウスに由来するＴＡ筋のユートロフィン免疫染色を示す図である。全身送達されたｒｈＢＧＮは、ｍｄｘマウスのＴＡにおけるユートロフィンの発現を、媒体を注射したマウスと比較して増大させる。（Ｂ）ｒｈＢＧＮで処置したマウスに由来するＴＡ筋におけるユートロフィン発現の増大の定量化を示す図である（１．７４倍の増大、＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの対応のないｔ検定；各群につき３つずつの筋肉に由来する筋鞘節のｎ＝３００）（スケールバー＝２５μＭ）。
【図９】図９は、ｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘマウスにおけるクレアチンキナーゼレベルを示す図である。Ｐ１８において１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２３）、２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１２）、または１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１１）のｒｈＢＧＮまたは媒体単独（ｎ＝２４）の単回注射を施された３２Ｐのｍｄｘマウスにおけるクレアチンキナーゼレベルを示す図である。ｒｈＢＧＮで処置したマウスは、ＣＫレベルの低下傾向を示したが、結果は、統計学的有意性（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＞０．０５）に達しなかった。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ｒｈＢＧＮが、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−二重ＫＯ動物におけるジストロフィー性病態に対抗できないことを示す図である。（Ａ）Ｐ１９において、ジストロフィンおよびユートロフィンの両方を欠く変異体マウス（ｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−）に、組換えｒｈＢＧＮまたは媒体を注射した。３週間後、横隔膜を単離し、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。これらの二重ＫＯ動物に特徴的な広範にわたる筋病態（単核細胞浸潤領域および中心核筋線維の壊死／再生巣）は、ｒｈＢＧＮを注射した動物と媒体を注射した動物とで同等であった（スケールバー＝５０μｍ）。（Ｂ）ｒｈＢＧＮの投与は、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−マウスにおけるＣＮＦを減少させないことを示す図である。ｒｈＢＧＮを注射したｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−および媒体を注射したｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−に由来するＨ＆Ｅで染色した横隔膜切片により、中心核筋線維の百分率を決定した（媒体を注射したマウスのｎ＝２およびｒｈＢＧＮを注射したマウスのｎ＝３；対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．４５）。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、ｒｈＢＧＮが、ｍｄｘマウスにおいて十分に忍容されることを示す図である。（Ａ）Ｐ１４のｍｄｘマウスに、３週間間隔で３カ月間にわたり、ｒｈＢＧＮまたは媒体を注射したことを示す図である。１５週間後に組織を採取し、秤量した。総体重と比べた全ての器官および筋肉の重量を、ｍｇ／ｇ単位でプロットする（群１つ当たりの動物のｎ＝８；＊Ｐ＜０．０５；対応のないスチューデントのｔ検定）。（Ｂ）ｒｈＢＧＮで処置したマウスにおける肝機能および腎機能を示す図である。１、２、または１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＢＧＮまたは媒体だけを腹腔内注射を施した３２Ｐのｍｄｘマウスから血清を回収した。ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、または総ビリルビンの血清レベルの有意な変化は認められなかった。
【図１２】図１２は、ビグリカン構造についての概略図である。成熟ビグリカンには存在しないプレプロ領域は、配列番号９のアミノ酸１〜３７に対応し；Ｎ末端のシステインに富む領域は、配列番号９のアミノ酸３８〜８０に対応し；ＬＲＲ領域は、配列番号９のアミノ酸８１〜３１４近傍に対応し；Ｃ末端のシステインに富む領域は、配列番号９のアミノ酸３１５〜３６８に対応する。丸は、硫酸コンドロイチン側鎖の接合部位を表す。「Ｓ−Ｓ」は、鎖内ジスルフィド結合を示す。
【図１３】図１３は、ビグリカンの非グリカン化形態（ＮＧ）およびプロテオグリカン形態（ＰＧ）を示す図である。最終物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した後、クーマシー染色を施した。ラダーの分子量をゲルの左側に示す。ゲルの左側の矢印は、ビグリカンの非グリカン化（ＮＧ）形態を示し、ゲルの右側の明色の矢印は、ビグリカンのプロテオグリカン形態（ＰＧ）を示す。
【図１４】図１４は、ビグリカンのＮＧ形態およびＰＧ形態についての解析を示す図である。最終物質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００Ｐｒｏｔｅｉｎ８０チップアッセイにより解析した。ウェル１つ当たり２μｇずつの全タンパク質をロードした。上側パネルは、シュードゲル画像を示す図である。下側パネルは、基準物質および各試料の電気泳動図である。下方の４ｋｄのピークおよび上方の９５ｋｄのピークは、チップの較正のために用いられる系のピークである。
【図１５】図１５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンについての解析を示す図である。最終物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した後、クーマシー染色を施した。ラダーの分子量をゲルの左側に示す。上記の各レーンは、ＳＡと称するＨｉｓ−ビグリカン（Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ）の二重変異体を、２つの異なる量でゲルへとロードしたことを示す。
【図１６】図１６は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００によるＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンについての最後の解析を示す図である。２μｇのＨｉｓ−ビグリカン（Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ８０チップへとロードした。左側パネルは、シュードゲル画像である。右側パネルは、電気泳動図を示す。下方の６ｋｄのバンドおよび上方の９５ｋｄのバンドは、較正のために用いられる系のピークである。
【図１７】図１７は、組換え非グリカン化（ＮＧ）ビグリカンおよびＳ５Ａ−Ｓ１０Ａ変異体のビグリカンについてのウェスタンブロット解析を示す図である。試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で泳動させ、ニトロセルロース膜へと移し、ビグリカン抗体でプローブした。「ｓｅｒ−ａｌ」と印づけられたレーンは、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａのビグリカンを含有する。アミノ酸位置は、成熟タンパク質のアミノ酸位置を示す。
【図１８】図１８は、細胞培養物によるバイオアッセイにおけるＮＧおよびＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンの生体活性を示す図である。上パネル：初代培養のニワトリ筋管を、１Ｕの精製アグリンおよび多様な濃度のＮＧまたはＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンで処置したことを示す図である。次いで、記載されている通りに（Ｎａｓｔｕｋら、１９９１年、ＰＭＩＤ、１６６０２８６）、３連の培養物中の筋管節１つ当たりのＡＣｈＲクラスターの数をカウントした。アグリン単独により誘導されるＡＣｈＲクラスター化のレベルを水平の点線で示す。下パネル：ＡＣｈＲのクラスター化に対するＰＧ、ＮＧ、およびＳ５Ａ−Ｓ１０Ａの効果を示す図である。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂは、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンが、ｍｄｘマウスにおける筋損傷を軽減することを示す図である。（ａ）Ｐ１８のｍｄｘマウスに、毎週１回２週間にわたり媒体またはＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンを腹腔内注射し、血清クレアチンキナーゼ（ｓＣＫ）レベルを測定したことを示す図である。ビグリカンを注射した動物では、ｓＣＫレベルが２分の１未満に低減された（ｐ＜０．０１；ｎ＝４）。（ｂ）Ｐ１８およびＰ２５のｍｄｘマウスに、表示量のｈｉｓタグづけしたＳ５Ａ−Ｓ１０Ａ組換えヒトビグリカン（Ｔ２−ｒｈＢＧＮ）を注射したことを示す図である。Ｐ３２において血清を採取した（ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．００２；＊対のある事後比較：ｐ＜０．０５）。
【図２０】図２０は、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ  ｒｈＢＧＮの機能的有効性を示す図である。ｍｄｘマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＳＡ−ｒｈＢＧＮを、表示される間隔で３カ月間にわたり投与した。単離筋について遠心性収縮を測定した。
【図２１】図２１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＡ−ｒｈＢＧＮの筋線維に対する効果を示す図である。Ｐ１８のｍｄｘマウスに表示用量のＳＡ−ｒｈＢＧＮを注射し、ヒラメ筋について中心局在核を伴う筋線維の百分率を決定した。２週間後に横隔膜筋についても同じ測定を実施した。
【図２２】図２２ＡおよびＢは、ビグリカンヌルマウスの筋組織へのビグリカンの投与が、ＶＩ型コラーゲンレベルを回復させることを示す図である。Ａ．注射された組換えビグリカンが、筋細胞表面へと局在化することを示す図である。この画像は、５０μｇの精製組換えビグリカンであるプロテオグリカンを注射した４日後における、ビグリカン抗体による、ビグリカンヌルマウスに由来する右側大腿四頭筋の免疫標識を示す２つの視野を示す。墨汁沈着物を示す視野についての光学顕微鏡法を、上パネルに示す。注射された精製組換えビグリカンであるプロテオグリカンは、抗体２Ａ５で検出した。下パネルは、上パネルと同じ視野におけるビグリカン免疫蛍光法を示し、注射されたビグリカンが筋内に存続し、筋線維膜へと局在化することを示す。６匹の動物において同様の結果が観察された。Ｂ．注射された組換えビグリカンが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶＩ型コラーゲンレベルを上方制御することを示す図である。この画像は、５０μｇの精製組換えビグリカンであるプロテオグリカンを注射した４日後に示される、ＶＩ型コラーゲンに対する抗体による、ビグリカンヌルマウスの右側大腿四頭筋の免疫標識を示す２つの視野を示す。同じ視野についての光学顕微鏡法は、墨汁沈着物を示す（注射部位を同定する）。下パネルは、上パネルと同じ視野におけるコラーゲン免疫蛍光法を示し、注射された精製組換えビグリカンであるプロテオグリカンが、筋線維膜におけるＶＩ型コラーゲンの発現を上方制御することを示す。６匹の動物において同様の結果が観察された。
【図２３】図２３は、ビグリカンの組換えＮＧ形態、組換えＰＧ形態、および組換えＳＡ形態についてのレクチンブロットアッセイの結果を示す図である。上パネルは、Ｐｏｎｃｅａｕ染色およびレクチンブロット法についての画像である。下パネルは、結果の概要を示す図である。
【図２４】図２４は、ビグリカンのＮＧ形態およびＳＡ形態についてのＮ結合型グリコシル化解析の結果を示す図である。
【図２５】図２５は、タグ付けされていない変異体のビグリカンを精製する、プロトコールの第１のステップを示す図である。この捕捉ステップでは、アニオン交換カラムを用いた。挿入図のクーマシーゲルは、ビグリカンが第１のピークで溶出したことを示す。
【図２６】図２６は、タグ付けされていない変異体のビグリカンを精製する、プロトコールの第２のステップを示す図である。この精製ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてバルクの不純物を除去する。挿入図のクーマシーゲルは、ビグリカンが第１のピークで溶出したことを示す。
【図２７】図２７Ａ〜Ｂは、タグ付けされていないＴ２ビグリカンが、ｍｄｘマウスにおけるｓＣＫおよび中心核の百分率を低減することを示す図である。Ｐ１８のｍｄｘマウスに、表示用量の（タグ付けされていない）Ｔ２−ｒＭｕＢＧＮを、毎週（２週間にわたり）注射した。血清を採取し、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。切片のモンタージュを収集し、断面（モンタージュ１枚当たり約６００〜１０００本の筋線維）内の全ての筋線維を、実験条件に対して盲検とされた作業者が中心核について評価した。タグ付けされていないＴ２ビグリカンによる処置は、２、５、および１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｓＣＫレベルの有意な低減（Ｐ＜０．０５；ダネットの事後多重比較検定による１元配置ＡＮＯＶＡ解析；１群当たりの動物のｎ＝５〜７）を結果としてもたらした。中心核は、１０ｍｇ／ｋｇで投与された動物において５４％低減された（ｐ＝０．０４；スチューデントのｔ検定；１群当たりの動物のｎ＝５〜７）。
【図２８】図２８は、Ｔ２ビグリカンによるｍｄｘマウスの処置が、ユートロフィンの発現を増大させることを示す図である。Ｐ１８のｍｄｘマウスに、表示用量の（タグ付けされていない）Ｔ２−ｒＭｕＢＧＮを、毎週（２週間にわたり）注射した。大腿四頭筋に由来するＫＣｌで洗浄した膜画分を、記載されている通りに（Ａｍｅｎｔａら、２０１１年）調製し、ウェスタンブロット法を介してユートロフィンのタンパク質レベルを検出し、Ｓｔｏｒｍシステムにより定量化した。２ｍｇ／ｋｇのＴ２−ｒＭｕＢＧＮによる処置は、ユートロフィンの発現を１．５倍に増大させた（Ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定；群１つ当たりの動物のｎ＝４〜５）。
【図２９】図２９は、Ｔ２ビグリカンによるｍｄｘマウスの処置が、筋機能を向上させることを示す図である。Ｐ１８のｍｄｘマウスに、表示用量のＴ２−ｒＭｕＢＧＮを、毎週１回ずつ１２週間にわたり注射した。遠心性収縮により動物の筋機能を解析した。２ｍｇ／ｋｇのＴ２−ｒＭｕＢＧＮにより処置された動物では、筋機能が６３％向上した（ｐ＝０．００７；群１つ当たりの動物のｎ＝３〜４）。
【図３０】図３０は、細胞培養物によるバイオアッセイにおけるＴ２ビグリカンの用量反応関係を示す図である。培養された筋管を、１Ｕのアグリンに加えた表示濃度のＴ２  ｒＨｕＢＧＮにより１６時間にわたり処置した。次いで、各点（カバースリップ３枚中の節のｎ＝３０）について、筋管節１つ当たりのＡＣｈＲクラスターの数を定量化した。１Ｕのアグリン単独により観察される活性レベルを点線で示す。「Ｕの逆数」とは、用量反応曲線の種類を表すことに注意されたい。曲線による近似は、非線形方程式を用いるＰｒｉｓｍにより実施した。０．００８〜０．２５６μｇ／ｍｌ（０．２〜７．９ｎＭ）の範囲の濃度で、活性の強化が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
Ｉ．概観
本開示は、機能不全性のＤＡＰＣと関連する疾患もしくは状態、細胞構造の不安定、神経筋接合部もしくはシナプスにおける欠陥、またはＶＩ型コラーゲン欠損を処置および／または防止するための、ビグリカンを含有する組成物および方法を提供する。このような疾患には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、他のミオパシー、神経筋障害、および神経障害が含まれるがこれらに限定されない。
【００３４】
本開示の特定の態様は、ビグリカン治療剤がユートロフィンの細胞膜への適正な局在化を促進し、ユートロフィンが欠如するとビグリカン治療剤の有効性が低減することの新規の発見に基づく。結果として、本開示は、特に、ユートロフィンのレベル、局在化、または機能をアッセイすることにより、ビグリカン療法が成功する可能性が高いかどうかを決定する方法を提供する。
【００３５】
さらに、ＤＡＰＣおよびジストログリカンの広範な組織分布を考慮すると、ビグリカンは、細胞膜を介するシグナル伝達を制御し、かつ／または筋細胞以外の細胞の細胞膜の完全性を維持するのに役割を果たす可能性が高い。例えば、ジストログリカンまたは他のＤＡＰＣの構成要素は、脳、腎臓、および心臓において豊富である。したがって、本開示は、より一般に、ビグリカンを含有する組成物およびビグリカンポリペプチドが相互作用する膜タンパク質複合体、例えば、ＤＡＰＣまたはＭｕＳＫ受容体の異常と関連する疾患または障害を予測する方法を提供する。
【００３６】
ジストログリカンは、微生物（例えば、ラッサ熱ウイルスおよび脈絡髄膜炎熱ウイルス）が細胞に侵入するのに用いられる受容体であることが知られているので、本明細書で記載されるビグリカンを含有する治療剤および予測法は、このような微生物による感染との関連で用いることができる。特殊な作用機構に限定されることを望まずに述べると、ビグリカン治療剤は、微生物のジストログリカンへの結合を妨害または阻害しうる。
【００３７】
ヒトビグリカン（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：４５７１頁（１９９６年）では「骨の低分子プロテオグリカン」とされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ０４５９９；配列番号９）およびシビレエイの発電器官から単離されたＤＡＧ−１２５のいずれも、ＤＡＰＣの構成要素と相互作用することが示されている。２つのタンパク質の間の配列相同性および類似の生物学的活性（本明細書でさらに記載される）に基づき、ヒトビグリカン（配列番号９）は、シビレエイＤＡＧ−１２５のヒトオーソログでありうると考えられる。代替的に、シビレエイＤＡＧ−１２５のヒトオーソログは、ヒトビグリカンと高度に関連するタンパク質でもありうる。明確さのために述べると、本明細書で用いられる「ビグリカン」という用語は、ヒトビグリカン（配列番号９）およびシビレエイＤＡＧ−１２５のほか、それらの相同体も包含することを意図する。
【００３８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）とは、少年のうちの約１：３，５００が罹患する遺伝疾患であり、彼らの大半は、２０歳代半ばまでに死亡する（１）。ＤＭＤは、ジストロフィンにおける変異であって、ジストロフィン会合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）と称する、筋細胞表面における構造分子およびシグナル伝達分子の集合体の構築および機能の不完全を結果としてもたらす変異により引き起こされる（２〜４）。現在のところ、ＤＭＤの主要な病態を標的とする処置は見られない。
【００３９】
ＤＭＤの１つの魅力的な治療法は、ジストロフィンの相同体であるユートロフィンの上方制御を介する筋細胞膜の安定化である。トランスジェニック体でユートロフィンを過剰発現させると、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態がレスキューされ、これにおける機能が回復される（５〜７）。成熟筋では、ユートロフィンの発現が、神経筋および筋腱間接合部に制約される。しかし、発生しつつある筋肉および再生しつつある筋肉では、ユートロフィンが、筋線維全体にわたり発現する（８〜１０）。これらの観察は、発生しつつある筋肉におけるユートロフィンの発現を正常に制御する経路を集結させれば、発症しつつあるＤＭＤを処置するための生産的な手法でありうる可能性を提起する。
【００４０】
細胞外マトリックスタンパク質であるビグリカンは、発生しつつある筋肉において重要な役割を果たす。ヒトおよびマウスのいずれでも、ビグリカンは、未成熟筋および再生しつつある筋肉において最も高度に発現する（１１、１２）。ビグリカンは、ＤＡＰＣの構成要素であり、ＤＡＰＣにおいて、ビグリカンは、α−ジストログリカン（１３）ならびにα−サルコグリカンおよびγ−サルコグリカン（１４）に結合する。ビグリカンは、特に、未成熟筋における、サルコグリカンのほか、ジストロブレビン、シントロフィン、およびｎＮＯＳの発現を制御する。最後に、ビグリカンは、適時の筋再生に重要である（１１）。
【００４１】
局所送達された組換えヒトビグリカン（ｒｈＢＧＮ）は、ｂｇｎ−／ｏ筋の細胞外マトリックスへと組み込まれ、そこで少なくとも２週間にわたり存続し、複数のＤＡＰＣの構成要素の発現をレスキューする（１５）。これらの結果は、ｒｈＢＧＮが、ジストロフィンを欠く筋肉の機能を増強することを示唆する。本明細書において、本発明者らは、未成熟ビグリカンヌル（ｂｇｎ−／ｏ）マウスにおいてユートロフィンが下方制御され、培養筋管においてｒｈＢＧＮが膜会合ユートロフィンを上方制御することを示す。ｒｈＢＧＮは、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスへと全身送達することができ、そこでｒｈＢＧＮが筋鞘におけるユートロフィンおよび他のＤＡＰＣの構成要素を上方制御し、筋病態を改善し、機能を向上させることが重要である。複数系列の証拠は、ビグリカンがユートロフィンを細胞膜へと動員することにより作用することを示す。したがって、ｒｈＢＧＮは、ＤＭＤの治療剤として用いることができる。
【００４２】
ＩＩ．定義
便宜のため、明細書、実施例、および付属の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味を以下に示す。
【００４３】
本明細書で用いられる「ＧＡＧ」とは、本明細書では二糖単位の反復からなる非分枝状の多糖長鎖である「ムコ多糖」と互換的に用いられるグリコサミングリカンを指す。２つの糖のうちの１つは、常にアミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）である。グリコサミングリカンは、プロテオグリカン分子を形成するコアタンパク質のセリン残基と共有結合的に連結される。
【００４４】
「糖タンパク質」という用語は、ポリペプチド鎖へと共有結合的に接合された１または複数の炭水化物基を含有するタンパク質を指す。典型的に、糖タンパク質は、重量で１％〜６０％の、組成が可変的な多数の比較的短鎖で分枝状のオリゴ糖鎖の形態にある炭水化物を含有する。糖タンパク質とは対照的に、プロテオグリカンは、はるかに高分子であり（最大数百万ドルトン）、多くの非分枝状のグリコサミングリカン長鎖の形態にある、重量で９０％〜９５％の炭水化物を含有する。
【００４５】
「ビグリカン」という用語は、ヒトビグリカンまたはシビレエイＤＡＧ−１２５の少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドを指す。好ましいビグリカンには、シビレエイＤＡＧ−１２５（配列番号１〜３のうちの少なくとも１つを含む）、ヒトビグリカン（配列番号９）のほか、これらの相同体および断片が含まれる。好ましい相同体は、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、およびなおより好ましくは、少なくとも約９８または９９％の同一性を有するタンパク質またはペプチドである。なおより好ましい相同体は、ヒトビグリカンまたはシビレエイＤＡＧ−１２５と特定の百分率の相同性（または同一性）を有し、これらの分子の少なくとも１つの生物学的活性を有する相同体である。ビグリカンという用語は、全長ビグリカンに限定されず、また、ビグリカンの少なくとも１つの活性を有する断片（部分）も包含する。本明細書で用いられるビグリカンという用語は、ＧＡＧ側鎖を伴うポリペプチドの形態およびＧＡＧ側鎖を伴わないポリペプチドの形態の両方を指す。
【００４６】
「野生型のヒトビグリカン」という用語は、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：４５７１頁（１９８９年）において記載されているタンパク質であって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ０４５９９および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。野生型のヒトビグリカンタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号７および配列番号８としてのそのオープンリーディングフレームに示されている。
【００４７】
「ビグリカン関連ポリペプチド」という用語は、ビグリカンの少なくとも１つの活性を有する特定のポリペプチドを指し、この用語は、野生型ビグリカンを包含しない。野生型ビグリカンおよびビグリカン関連ポリペプチドのいずれも、「ビグリカン治療剤」という用語の中に包摂される。
【００４８】
「ビグリカンコア」という用語は、ＧＡＧ鎖を包含しないビグリカンを指す。
【００４９】
本明細書で記載される、「ビグリカン関連治療剤」という用語は、ビグリカン様のポリペプチドであって、このポリペプチドが、グリコサミングリカン（ＧＡＧ）側鎖を欠く（すなわち、これが野生型のグリカン化部位を欠くために）ように、野生型のビグリカンタンパク質（例えば、シビレエイＤＡＧ−１２５または哺乳動物ビグリカン、好ましくはヒトビグリカン）の２つのグリカン化されたセリン残基に対応する２つのアミノ酸残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（好ましくは、グリシンまたはアラニンなどのアルキル側鎖を伴うアミノ酸）により置換されているポリペプチドを指す。加えて、ビグリカン関連治療剤は、野生型ビグリカンの特徴および生物学的活性のうちの１または複数を有する。例えば、ビグリカン関連治療剤は、以下の特徴のうちの１または複数を有しうる：約３５〜約５５ｋＤａの分子量；配列番号１〜６のうちの１もしくは複数、または配列番号９、１０、もしくは１１のうちの残基３８〜３６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列；および対応する定義の下に上記で列挙したビグリカンの生物学的活性のうちの１または複数。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＷＯ２０１１／１４６４８０号では、多数のビグリカン関連治療剤が記載されている。ビグリカン関連治療剤とは、ビグリカン治療剤の１つの種類である。
【００５０】
「ビグリカン治療剤」という用語は、本明細書で記載され、野生型ビグリカンの少なくとも１つの生物学的活性を有するビグリカンポリペプチドの部分もさらに包含する。「ビグリカン治療剤」という用語  はまた、ペプチド模倣剤もしくはその誘導体、またはビグリカン様のポリペプチドをコードする核酸も包含する。
【００５１】
「ビグリカンの生物学的活性」とは、細胞膜の完全性を維持する能力；細胞膜におけるＤＡＰＣを安定化させる能力；ＤＡＰＣの１または複数の構成要素に結合する能力；  例えば、α−ジストログリカンへの結合（野生型のヒトビグリカンなど、特定のビグリカンの場合）、α−サルコグリカンまたはγ−サルコグリカンなど、サルコグリカン構成要素への結合；ＭｕＳＫへの結合；ＶＩ型コラーゲンへの結合；  シナプス後の分化を刺激することなどにより神経筋接合部の形成を刺激すること；ＡＣｈＲの凝集、例えば、アグリンに誘導されるＡＣｈＲの凝集の強化；ＤＡＰＣの構成要素、例えば、サルコグリカンのリン酸化；ＭｕＳＫのリン酸化を刺激すること、またはアグリンに誘導されるＭｕＳＫのリン酸化を強化すること；ユートロフィンレベルを上昇させること；およびユートロフィンの細胞膜への局在化を促進することのうちの１または複数を指すことを意図する。特定の実施形態では、ビグリカンが、ＭｕＳＫ、α−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、およびＶＩ型コラーゲンに結合するが、α−ジストログリカンには結合しない。
【００５２】
「ビグリカン核酸」という用語は、ビグリカンタンパク質をコードする核酸、例えば、配列番号９を有するタンパク質をコードする核酸を指す。
【００５３】
本明細書では、「異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）」という用語が、「異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）」と互換的に用いられ、野生型の分子もしくは活性または正常な分子もしくは活性と異なる分子または活性を指す。
【００５４】
「ＤＡＰＣ」という用語は、ジストロフィン、α−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカン、ならびにサルコグリカンによる膜貫通複合体を含む膜複合体である「ジストロフィン会合タンパク質複合体」を指す。
【００５５】
「サルコグリカン」は、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、およびε−サルコグリカンを包含する異なる形態で存在する。特定のサルコグリカンは、特定の組織に特異的である、例えば、α−サルコグリカンおよびδ−サルコグリカンは骨格筋特異的である。
【００５６】
「ジストロフィン会合タンパク質」には、α−ジストログリカン、ジストロブレビン、サルコスパン、およびシントロフィンなどのタンパク質または糖タンパク質が含まれる。
【００５７】
「ＡＣｈＲ」という用語は、アセチルコリン受容体を指す。
【００５８】
「ＳＬＲＰ」という用語は、ロイシンリッチリピートによる低分子のプロテオグリカンを指す。
【００５９】
本明細書で「筋特異的キナーゼ」と互換的に用いられる「ＭｕＳＫ」という用語は、正常筋および除神経筋のほか、心臓、脾臓、卵巣、または網膜を含めた他の組織においてを発現するタンパク質チロシンキナーゼを指す（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．ら、１９９５年、Ｎｅｕｒｏｎ、１５巻：５７３〜５８４頁を参照されたい）。チロシンキナーゼは、代替的に「除神経筋キナーゼ」に代わり、「Ｄｍｋ」とも称している。したがって、ＭｕＳＫおよびＤｍｋという用語は、互換的に用いることができる。このタンパク質は、チロシンキナーゼのＴｒｋファミリーと関連すると考えられ、さらに米国特許第５，８１４，４７８号において記載されている。
【００６０】
本明細書で用いられる「ＭｕＳＫ活性化分子」という用語は、分化した筋細胞の文脈でＭｕＳＫ受容体のリン酸化を誘導することが可能な分子を指す。１つのこのような活性化分子は、アグリンである。
【００６１】
ポリペプチドに適用される「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップの重みを用いるＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより最適に配列決定された場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント以上の配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンであり；アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６２】
「筋芽細胞」とは、他の筋芽細胞と融合することにより、最終的に骨格筋線維へと発生する筋管をもたらす細胞である。この用語は、場合によって、骨格筋線維の直前の前駆体として認識可能な全ての細胞について用いられる。代替的には、この用語は融合が可能な有糸分裂後細胞に取り置いて、他の細胞を推定筋芽細胞と称する。
【００６３】
「筋原線維」とは、太いフィラメントおよび細いフィラメントの規則的配列からなり、収縮装置を構成する、横紋筋の長い円筒形の細胞小器官である。
【００６４】
「筋管」とは、一部の末梢に位置する、筋原線維を含有する長型の多核細胞（３つ以上の核）である。筋管は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、筋芽細胞の融合により形成され、最終的に、末梢に位置する核を有し、それらの細胞質の大半が筋原線維で満たされている成熟筋線維へと発生する。
【００６５】
「ユートロフィン」（ジストロフィン会合タンパク質）とは、成体筋の神経筋接合部近傍に局在化するジストロフィンの常染色体相同体（３９５ｋＤのサイズ）であるが、ジストロフィンの非存在下において（すなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて）、ユートロフィンはまた、筋鞘の細胞質面上にも配置される。ユートロフィンのヒトｍＲＮＡ配列を配列番号１２として示し、ヒトユートロフィンのポリペプチド配列を配列番号１３として示す。配列番号１２および１３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ６９０８６．１の下に見出すことができる。
【００６６】
本明細書で用いられる「トランスフェクション」という用語は、核酸を介する遺伝子移入による、核酸、例えば、発現ベクターのレシピエント細胞への導入を意味する。本明細書では、「形質導入」という用語を、核酸によるトランスフェクションが、ウイルスによる核酸の送達を介する場合に一般に用いる。本明細書で用いられる「形質転換」とは、細胞による外因性ＤＮＡまたは外因性ＲＮＡの取込みの結果として細胞の遺伝子型が変わる過程を指し、例えば、形質転換された細胞は、ポリペプチドの組換え形態を発現させるか、または導入された遺伝子に由来するアンチセンスの発現の場合、組換えタンパク質の自然発生形態の発現を破壊する。
【００６７】
本明細書で用いられる「トランス遺伝子」という用語は、細胞へと導入された核酸配列を指す。トランス遺伝子を導入した細胞に由来する娘細胞もまた、トランス遺伝子を含有するという（それが欠失していない限り）。トランス遺伝子は、例えば、部分的または全体的に異種のポリペプチド、すなわち、トランスジェニック動物もしくはそれが導入される細胞に対して外来であるか、またはトランスジェニック動物もしくはそれが導入される細胞の内因性遺伝子と相同であるが、それが挿入される（例えば、天然遺伝子の場所と異なる場所に挿入される）細胞のゲノムを変化させるような形で、動物のゲノムへと挿入するようにデザインされるかまたは挿入されるポリペプチドをコードしうる。代替的に、トランス遺伝子はまた、エピソーム内にも存在しうる。トランス遺伝子には、１または複数の転写制御配列および選択されたコード配列を最適に発現させるのに必要でありうる他の任意の核酸（例えば、イントロン）が含まれうる。
【００６８】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。適切なベクターは、自己複製および／またはそれらが連結された核酸の発現が可能なベクターである。本明細書では、それらを作動的に連結した遺伝子の発現を方向付けることが可能なベクターを、「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、それらのベクター形態では染色体に結合しない環状二本鎖のＤＮＡループを一般に指す、「プラスミド」の形態にあることが多い。プラスミドが、最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、別段に指定しない限り、本明細書では、「ベクター」が、「プラスミド」を意味する。しかし、本開示はまた、同等な機能を果たす他の形態の発現ベクターであって、本明細書に後続する当技術分野において公知となるベクターも提供する。
【００６９】
本明細書で用いられる「〜に由来する」という語句は、所与の配列から選択されるペプチド配列またはヌクレオチド配列を示す。名付けられた配列に由来するペプチド配列またはヌクレオチド配列は、親配列と比べて少数の修飾を含有することが可能であり、大半の場合、親配列に存在するアミノ酸残基またはアミノ酸塩基対のうちの約１５％未満であり、好ましくは約１０％未満であり、多くの場合は約５％未満の欠失、置換、または挿入を表す。ＤＮＡの場合、２つのＤＮＡ分子が、互いと選択的にハイブリダイズすることが可能であれば、１つのＤＮＡ分子はまた、別のＤＮＡ分子に由来するとも考えられる。
【００７０】
「キメラ」、「融合」、および「複合」という用語は、天然では、天然以外のように直接的に（共有結合的に）連結されているのが見出されないという意味で互いに異種の、少なくとも２つの構成要素部分を含有するタンパク質、ペプチドドメイン、もしくはヌクレオチド配列、または分子を示すのに用いられる。より具体的に述べると、これらの構成要素部分は、天然の同じ連続ポリペプチドまたは遺伝子には見出されず、少なくともキメラタンパク質または複合ドメインに存在する同じ順序もしくは配向性で、または同じ間隔では見出されない。このような物質は、少なくとも２つの異なるタンパク質もしくは遺伝子に由来するか、または同じタンパク質もしくは遺伝子の少なくとも２つの隣接しない部分に由来する構成要素を含有する。複合タンパク質、およびそれらをコードするＤＮＡ配列は、それらが、天然では、天然以外のように直接的に（共有結合的に）併せて連結されているのが見出されない少なくとも２つの構成部分を含有するという意味で組換えである。
【００７１】
「調節する」という用語は、阻害することまたは刺激することを指す。
【００７２】
「シナプス後膜の活性化」という用語は、神経筋接合部における、一般に、神経細胞から筋細胞へのシグナル伝達による刺激を指す。活性化は通常、神経筋接合部の細胞膜におけるＡＣｈＲの凝集の刺激および／またはＭｕＳＫのリン酸化を包含する。活性化は、シナプス後分化の誘導を結果としてもたらす。
【００７３】
対象に関する「処置すること」という用語は、対象の疾患または障害の少なくとも１つの症状を改善することを指す。処置することとは、疾患または状態を治癒させることの場合もあり、それを改善することの場合もあるが、その少なくとも特定の症状を軽減することでありうる。
【００７４】
ＩＩＩ．治療用ビグリカンポリペプチド
本明細書で開示される方法および組成物では、野生型のビグリカン治療剤を用いる場合もあり、変異体のビグリカン治療剤を用いる場合もある。このような治療剤は、例えば、形質細胞膜の完全性を維持するのに用いることができ、特に、ジストロフィン会合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）を安定化させるビグリカン治療剤は、これらの膜において用い、これにより膜の崩壊を防止することができる。ビグリカン治療剤はまた、シナプス後膜の分化を刺激することなどにより、神経筋接合部の形成も刺激し、より一般に、ビグリカン治療剤は、シナプス形成を刺激する。
【００７５】
特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、野生型ビグリカンポリペプチドまたはその断片である。例えば、このポリペプチドは、配列番号９の配列またはその活性部分を含みうる。一部の実施形態では、このポリペプチドが、配列番号９を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、グリコサミングリカン（ＧＡＧ）側鎖を含まない。
【００７６】
一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸３８〜３６５と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８、または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸３８〜３６５と同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、厳密な条件下で配列番号８とハイブリダイズする核酸によりコードされる。
【００７７】
他の特定の実施形態では、ビグリカンポリペプチドがグリコサミングリカン（ＧＡＧ）側鎖を含まないように、ビグリカンポリペプチドが、２つのセリン残基（例えば、配列番号９の残基４２および４７における）において少なくとも２つのアミノ酸残基の置換を含む変異体のビグリカンポリペプチドなどのビグリカンポリペプチドである。例えば、変異体のビグリカンポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列またはその断片を含みうる。配列番号１０とは、コンセンサス配列であって、残基４２および４７が、各々独立に非存在の場合もあり、セリンまたはトレオニンを除く任意のアミノ酸の場合もあるコンセンサス配列である。特定の実施形態では、配列番号１０の残基４２および４７のいずれもが存在する。特定の実施形態では、変異体のビグリカンポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列またはその断片を含む。配列番号１１は、配列番号９と類似するが、変異Ｓ４２ＡおよびＳ４７Ａを包含する。
【００７８】
一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８、もしくは９９％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、２つのセリン残基が、配列番号９の残基４２および４７に対応する位置にある。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号９における１または複数のＬＲＲを含む。
【００７９】
ビグリカン治療剤は、１または複数の有用な生物学的活性を有しうる。好ましい実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、ユートロフィンの細胞膜との会合を増大させる。好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、ユートロフィンのタンパク質レベルを上方制御する。一部の実施形態では、ビグリカン治療剤が、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを上方制御しない。特定の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、細胞における筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）を活性化させる。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、アグリンに誘導されるＭｕＳＫのリン酸化を強化する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、ＭｕＳＫに結合する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、α−サルコグリカンおよび／またはγ−サルコグリカンに結合する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、サルコグリカンのリン酸化を誘導する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、アグリンに誘導されるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）のクラスター化を強化する。
【００８０】
対象のビグリカンポリペプチドは、任意の適切な技法を用いて生成させることができる。当技術分野では、多数のこのような技法が周知である。例えば、ビグリカンをコードするＤＮＡ配列の修飾は、部位指向的変異誘発を使用して１または複数のヌクレオチドを変化させることにより達成することができる。刊行物（Ｃａｒｔｅｒら、１９８６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２３７巻（１号）：１〜７頁；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）により例示される通り、当技術分野では一般に、部位特異的変異誘発法が周知である。察知される通り、この技法では典型的に、一本鎖形態および二本鎖形態のいずれにおいて存在するファージミドベクターも使用する。代替的に、変異体は、ＰＣＲ（商標）を用いることにより生成させることもできる。部位指向的変異誘発において有用である典型的なベクターには、Ｍ１３ファージ（Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９８１年）またはｐＵＣ  １１９などのベクターが含まれる。これらのベクターは、市販品が容易に入手可能であり、それらの使用は一般に当業者に周知である。当技術分野では代替的に、二本鎖プラスミドまたはファージミドなどを使用する部位指向的変異誘発法も周知であり、これらもまた用いることができる。
【００８１】
特定の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、ＤＡＰＣの１または複数の構成要素に結合する。好ましい実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、適正なユートロフィンの細胞膜への局在化を促進する。ビグリカン治療剤はまた、α−サルコグリカンなど、サルコグリカンの構成要素に結合することも好ましい。なおより好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、例えば、α−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、およびδ−サルコグリカンから選択されるサルコグリカン複合体の構成要素に結合する。ビグリカンポリペプチドが結合するサルコグリカンの構成要素は、α−サルコグリカンであることが好ましい。一般に、治療用ビグリカンペプチドは、ＤＡＰＣの１または複数の構成要素に接触し、例えば、これにより、複合体を安定化させ、筋ジストロフィーにおいて見られる異常など、ＤＡＰＣ複合体の異常から結果として生じる細胞膜の不安定化を軽減する。
【００８２】
特定の実施形態では、ビグリカン治療剤は、ＭｕＳＫ、α−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、およびＶＩ型コラーゲンに結合するが、α−ジストログリカンには結合しない。ビグリカンがα−ジストログリカンに結合することが可能でない実施形態においてもなお、ビグリカンがα−ジストログリカンに間接的に影響を及ぼしうる機構がやはり存在する。以下の機構は、非結合理論と考えるべきである：１）ビグリカンはＶＩ型コラーゲンに結合し、アルファ−ＤＧの他のリガンドを動員することが可能である；この機構は、筋肉または筋肉以外の組織において生じうること、２）ビグリカンは、ＭｕＳＫに結合し、したがって、間接的にα−ジストログリカンを動員しうること、および３）ビグリカンは二量体化することが公知であるので、α−ジストログリカンに結合することが可能でない変異体のビグリカンは、内因性のビグリカンであるプロテオグリカンとヘテロ二量体化し、したがって、α−ジストログリカンを動員しうること。
【００８３】
他の実施形態では、ビグリカン治療剤が、受容体チロシンキナーゼであるＭｕＳＫに結合する。このような化合物は、ＭｕＳＫおよび／またはサルコグリカン複合体の構成要素、例えば、α−サルコグリカンに結合しうる。好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、ＭｕＳＫを活性化させ、α−サルコグリカンおよび／またはγ−サルコグリカンのリン酸化を誘導する。
【００８４】
対象のビグリカン治療剤は、上記で列挙した分子のうちの１または複数に特異的に結合する、すなわち、対象のビグリカン治療剤は、有意にまたは検出可能なレベルで他の分子に結合して、細胞において望ましくない効果を生成させないことが好ましい。ビグリカン治療剤は、上記で列挙した分子のうちの１または複数に、１０−６Ｍ以下の解離定数で、およびなおより好ましくは１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、または１０−１３Ｍ以下の解離定数で結合することが好ましい。解離定数は、当技術分野で周知の方法により決定することができる。
【００８５】
当技術分野では、ビグリカン治療剤のＤＡＰＣの構成要素またはＭｕＳＫへの結合レベルを決定するか、または、例えば、これらの分子に結合する化合物のライブラリーのメンバーを同定するための結合アッセイが公知であり、また、本明細書でもさらに記載される。また、このようなアッセイにおいて用いられるＤＡＰＣの構成要素またはＭｕＳＫを調製する方法も公知である。このような構成要素は、組織から単離することもでき、それらがタンパク質である場合は、組換えまたは合成により調製することもできる。それらのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは刊行物から入手可能である。
【００８６】
他の好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、ＤＡＰＣの１または複数の構成要素および／またはＭｕＳＫに結合しうることに加えて、または、その代わりに、１または複数のビグリカンの生物学的活性を示す。例えば、ビグリカン治療剤は、ＡＣｈＲの凝集を誘導すること、および／またはアグリンに誘導されるチロシンによるＭｕＳＫのリン酸化を刺激することを含め、神経筋接合部の形成、特に、シナプス後膜の分化を刺激しうる。
【００８７】
特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、低濃度における強化および高レベルにおける脱強化を伴う二相的な形でのアグリンに誘導されるＡＣｈＲのクラスター化を強化する。場合によって、ビグリカン治療剤は、高濃度においてアグリンに誘導されるＡＣｈＲのクラスター化を阻害しない。
【００８８】
特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて筋損傷を軽減する。
【００８９】
ビグリカン治療剤は、タンパク質またはその誘導体の場合もあり、ペプチド模倣剤またはその誘導体の場合もあり、核酸（例えば、変異体のビグリカンポリペプチドをコードする核酸）の場合もある。ペプチド模倣剤は、例えば、ビグリカン（ｂｉｇｌｙａｎ）の構造に基づいて調製することができる。一般に、ビグリカン治療剤は、要請される特徴、例えば、α−サルコグリカンおよび／またはＤＡＰＣの他の構成要素への結合を示す。
【００９０】
特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、以下のアミノ酸配列：ＩＱＡＩＥＦＥＤＬ（配列番号１）；ＬＧＬＧＦＮＥＩＲ（配列番号２）；およびＴＳＹＨＧＩＳＬＦＮＮＰＶＮＹＷＤＶＬ（配列番号３）、またはこれらのアミノ酸配列が得られたシビレエイタンパク質の哺乳動物オーソログに由来するアミノ酸配列など、これらに関連するアミノ酸配列のうちの１または複数を含む。ビグリカン治療剤は、これらの配列の３つ全てまたはこれらに関連する配列を含有することが好ましい。例えば、ビグリカン治療剤は、ヒトビグリカンの一部である以下のアミノ酸配列：ＩＱＡＩＥＬＥＤＬ（配列番号４）；ＬＧＬＧＨＮＱＩＲ（配列番号５）；およびＡＹＹＮＧＩＳＬＦＮＮＰＶＰＹＷＥＶＱ（配列番号６）のうちの１または複数を含みうる。
【００９１】
シビレエイＤＡＧ−１２５を包含する組成物、およびシビレエイＤＡＧ−１２５を用いる方法は本開示の範囲内にあるが、好ましい組成物および方法は、本明細書ではシビレエイＤＡＧ−１２５のオーソログと称する、脊椎動物を含めた哺乳動物によるシビレエイＤＡＧ−１２５の相同体に関する組成物および方法である。シビレエイＤＡＧ−１２５の好ましいオーソログは、ヒトオーソログ、齧歯動物オーソログ、マウスオーソログ、イヌオーソログ、ネコオーソログ、ヒツジオーソログ、およびウシオーソログである。ＤＡＧ−１２５の哺乳動物によるオーソログが、ビグリカンである。
【００９２】
シビレエイＤＡＧ−１２５の哺乳動物による他のオーソログは、配列番号１〜３のうちの１または複数をコードするヌクレオチド配列を含有するプローブを伴うスクリーニングライブラリーを介して単離することができる。シビレエイＤＡＧ−１２５の哺乳動物によるオーソログをクローニングするための他の多数の方法も利用可能である。例えば、シビレエイＤＡＧ−１２５に対する抗体を生成させ、哺乳動物による発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。クローニングされるタンパク質の、シビレエイＤＡＧ−１２５の哺乳動物によるオーソログとしての同定は、シビレエイＤＡＧ−１２５を使用する実施例において記載されているアッセイと同じ生物学的アッセイを実施することにより、確立することができる。
【００９３】
したがって、本明細書で提示されるポリペプチドはまた、それぞれ、それらがヒアルロナンと相互作用する能力のため、またはそれらのグリコサミングリカンの種類のために、また「非凝集型または低分子のデルマタン硫酸プロテオグリカン」とも称する、低分子のロイシンに富むプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのメンバーでもありうる。ＳＬＲＰは、それらのタンパク質およびゲノムの組織化に基づき、３つのクラスへと組織化される。全てのＳＬＲＰは、いずれかの側で低分子のシステインクラスターが隣接する、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有する中央ドメインにより特徴づけられる。ＳＬＲＰは、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｉｏｚｚｏら（１９９８年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７巻：６０９頁において記載されている。
【００９４】
ＳＬＲＰタンパク質のコアは、約３５〜４５ｋＤの範囲にあり、最もＮ末端において１つまたは２つのＧＡＧ鎖を接合させている。ＳＬＲＰタンパク質コアの一般的構造は、ジスルフィド結合したシステインを保存したドメインで挟まれる、６〜１０のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）によるタンデム配列からなる。グリコシル化の程度およびＧＡＧ鎖の数に応じて、天然の分子量は、約１００〜２５０ｋＤの範囲にわたる。それらの配列の相同性に基づき、Ｉｏｚｚｏ、前出は、ＳＬＲＰが、１）ビグリカンおよびデコリン；２）フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、ＰＲＥＰＬＰ、およびオステオアドヘリン；ならびに３）エピフィカンおよびオステオグリシンからなる３つのクラスへと群分けされることを提起している。ＳＬＲＰタンパク質コアの最も説得的な特色は、ＬＲＲである。このような反復配列（ＳＬＲＰにおいて２４アミノ酸ずつ）は、多種多様な細胞内文脈、膜貫通文脈、および細胞外文脈におけるタンパク質間相互作用を媒介する（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ（１９９４年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、１９巻：４１５〜２１頁）。例えば、ｔｒｋＢにおけるニューロトロフィン結合部位は、ＬＲＲである（Ｗｉｎｄｉｓｃｈら（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻：１１２５６〜６３頁）。反復配列は、α螺旋に続き、アンチパラレルに配列されたベータシートの一般的構造を有すると考えられるが、ＳＬＲＰではこの順序が可逆化されうることを、配列解析は示唆している（Ｈｏｃｋｉｎｇら（１９９８年）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．、１７巻：１〜１９頁）。各反復配列の保存された残基がそれらの二次的な構造を決定する一方、介在するアミノ酸がリガンド結合の特異性を決定する可能性が高い。
【００９５】
本明細書の方法および組成物において用いるのに適するＳＬＲＰには、ビグリカンおよびデコリンなど、クラスＩ  ＳＬＲＰの変異体が含まれる。α−ジストログリカンに結合することが示された（例えば、米国特許第６，８６４，２３６号を参照されたい）、シビレエイプロテオグリカンであるＤＡＧ−１２５の部分的なアミノ酸配列は、ヒトビグリカンに対して強い相同性を示す：合計３７アミノ酸長の配列中で７８％の同一性が見出された。齧歯動物、ブタ、およびヒトに由来するビグリカンは、＞９５％同一である。ヒトに由来するデコリンとビグリカンとは、５５％だけ同一である。このような相同性は、デコリンおよびビグリカンが、共有される機能および固有の機能の両方を有することと符合する。したがって、シビレエイＤＡＧ−１２５は、ヒトビグリカンのアミノ酸配列により酷似するアミノ酸配列を有するが、ビグリカンとデコリンとの構造および機能の類似性に基づき、デコリンおよびその誘導体も本明細書の方法を実施するのに用いることができる。
【００９６】
多様な種に由来するビグリカンおよびデコリンの遺伝子およびタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどで公表されている。例えば、ヒトビグリカンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ０４５９９（Ｆｉｓｈｅｒら（１９８９年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：４５７１頁において記載されている、骨の低分子プロテオグリカンＩ（ビグリカン）をコードするヒトｈＰＧＩ；配列番号７〜９）、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｍ６５１５４の下に見出すことができ；ウシビグリカンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ０７９５３の下に見出すことができ；ラットビグリカンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｕ１７８３４の下に見出すことができ、マウスビグリカンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ２０２７６およびＸ５３９２８の下に見出すことができ；ヒツジビグリカンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０３４８４２の下に見出すことができ；ヒトデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｍ１４２１９において見出すことができ；ウサギデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｉ４７０２０において見出すことができ；ニワトリデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ２８６７５において見出すことができ；ウマデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０３８において見出すことができ；ウシデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ２１７９３において見出すことができ；ヒツジデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ１２５０４１において見出すことができ；ラットデコリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｑ０１１２９において見出すことができる。ビグリカンおよびデコリンならびに他のＳＬＲＰの配列は、ＧｅｎＢａｎｋで見出すことができる。
【００９７】
デコリンおよびビグリカンはそれぞれ、１つおよび２つのグリコサミングリカン（ＧＡＧ）鎖を有する。それらの組成物は組織特異的であり、多数のレベルで制御することができる（Ｈｏｃｋｉｎｇら（１９９８年）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ、１７巻：１〜１９頁）。例えば、皮膚および軟骨に由来するビグリカンのＧＡＧが主にデルマタン硫酸であるのに対し、骨において合成されるビグリカンは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ヘパラン硫酸側鎖は、報告されていない。タンパク質コアおよび細胞型の両方が、これらのＳＬＲＰの異なるグリコシル化に寄与する。
【００９８】
特定の具体的な実施形態では、ビグリカン治療剤が、融合タンパク質を包含する。例えば、ビグリカンポリペプチドまたはその断片は、免疫グロブリン部分と融合させることができる。代替的に、融合タンパク質は、プロテオグリカンの２つ以上の部分の間の組合せ、例えば、デコリン分子の部分へと融合させたビグリカン分子の部分でもありうる。
【００９９】
特定の具体的な実施形態では、ビグリカン治療剤が、ビグリカンの部分および断片を包含する。部分は、少なくとも５、１０、１５、または２０アミノ酸長であることが典型的である。好ましい部分は、ＤＡＰＣの構成要素との相互作用など、生物学的活性を及ぼすのに十分である。部分は、タンパク質の１または複数の特定のドメインを含む場合もあり、これらからなる場合もある。ビグリカンおよびデコリンのドメインは、２つのシステインに富む領域（成熟ビグリカンのＮ末端およびＣ末端の４０〜５０アミノ酸に組み入れられる）およびロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を包含する。「ＬＲＲ領域」とは、反復配列を含有し、アミノ酸８１〜３１４から本質的になるビグリカンの領域を指す。本明細書では、各個別の反復配列を「ＬＲＲ」と称する。ＬＲＲは、タンパク質間相互作用を媒介すると考えられ、したがって、ＤＡＰＣおよびシナプス後膜を安定化させるのに十分でありうる。少なくとも、ビグリカンがＭｕＳＫに結合するという観察に基づくなら、ＬＲＲは、ビグリカンのＭｕＳＫとの相互作用を媒介することに関与し、ＭｕＳＫのリン酸化を媒介することに関与しうると考えられる。
【０１００】
具体的な実施形態では、本開示は、サルコグリカンへの結合が可能なビグリカンの部分からなるビグリカン治療剤を提供する。ヒトビグリカンのα−サルコグリカン結合ドメインは、成熟ビグリカンタンパク質のＮ末端ドメイン、すなわち、アミノ酸３８〜８０に位置し、より具体的に述べると、配列番号９のアミノ酸３８〜５８に位置することが示されている。また、Ｃ末端のシステインに富むドメインがγ−サルコグリカンとの相互作用を媒介することも示されている。したがって、ビグリカン治療剤は、Ｎ末端またはＣ末端のシステインに富むドメイン、すなわち、配列番号９のアミノ酸３８〜８０および３１５〜３６８からなるビグリカンの部分（断片）を包含しうる。本明細書ではまた、特定のビグリカンドメインの組合せも開示される。例えば、ビグリカンの断片は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、または２００のアミノ酸からなりうる。ビグリカン治療剤の短鎖部分を「ミニビグリカン治療剤」と称する。
【０１０１】
野生型のヒトビグリカンは、３６８アミノ酸（配列番号９）からなり、そのうちのアミノ酸１〜１９は、シグナルペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１７０２；およびＦｉｓｈｅｒら、前出）を構成する。したがって、シグナルペプチドを伴わない野生型のヒトビグリカンは、配列番号９のアミノ酸２０〜３６８からなる。成熟ビグリカンタンパク質は、配列番号９のアミノ酸３８〜３６８からなるが、アミノ酸１〜３７はプレプロペプチドなので、プロセシングにおいて切断される。アミノ酸３８〜８０は、Ｎ末端のシステインに富む領域に対応する。ロイシンリッチリピート領域に対応するアミノ酸８１〜３１４の近傍は、約２４または２３アミノ酸の１０回の反復配列を含有する。ヒトビグリカンをコードするｃＤＮＡにおけるオープンリーディングフレームは、配列番号７のヌクレオチド１２１〜１２２７に対応し、配列番号８として表される。ビグリカンの成熟形態をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のヌクレオチド２３２〜１２２７である。
【０１０２】
ビグリカン治療剤は、ビグリカンコアの成熟形態と関連しうる、すなわち、ビグリカンコアの２つのグリカン化されたセリンが欠失しているか、または本明細書で記載される他のアミノ酸で置換されているという条件で、シグナルペプチドが脱落している場合もあり、シグナルペプチドを伴う全長ビグリカンの場合もある。
【０１０３】
当技術分野では、化合物が野生型ビグリカンタンパク質の生物学的活性を有するかどうかを決定する方法が公知である。野生型ビグリカンタンパク質の生物学的活性とは、ユートロフィンの細胞膜への局在化を促進する能力；細胞膜の完全性を維持する能力；細胞膜におけるＤＡＰＣを安定化させる能力；ＤＡＰＣの１または複数の構成要素に結合する能力；例えば、α−ジストログリカンに結合する能力、α−サルコグリカンなど、サルコグリカンの構成要素に結合する能力；α−サルコグリカンのリン酸化；ＭｕＳＫへの結合；シナプス後の分化を刺激することなどにより神経筋接合部の形成を刺激する、ＶＩ型コラーゲンへの結合；ＡＣｈＲ凝集の刺激する；ＭｕＳＫのリン酸化の刺激およびアグリン誘導性ＭｕＳＫのリン酸化の強化のうちの１または複数を指すことを意図する。このような方法は、上記の活性のうちの１または複数を有する化合物を同定するための、化合物のスクリーニングライブラリーにさらに適応させることができる。
【０１０４】
細胞膜の破断、例えば、「漏洩膜」の存在は、例えば、Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３８４巻：３４９頁；およびＳｔｒａｕｂら（１９９７年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３９巻：３７５頁において記載されている通りに、クレアチンキナーゼの放出またはＥｖａｎｓブルー色素の吸収を測定するアッセイにより決定することができる。
【０１０５】
ビグリカン治療剤はまた、多様な動物モデル、特に、ジストロフィン陰性であるｍｄｘマウス（例えば、米国特許第７，６１２，０３８号を参照されたい）においても調べることができる。
【０１０６】
好ましいビグリカン治療剤は、ＳＬＲＰ、例えば、ビグリカン、またはそのオーソログのヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、またはなおより好ましくは少なくとも約９９％同一なヌクレオチド配列またはその部分によりコードされる。
【０１０７】
本明細書で開示される好ましい核酸は、ビグリカンコアの２つのグリカン化されたセリンが欠失しているか、または本明細書で記載される他のアミノ酸で置換されているという条件で、ＳＬＲＰ、例えば、ビグリカン（例えば、ヒトビグリカンをコードする配列番号７または８）もしくはＤＡＧ−１２５またはそのオーソログ、その断片のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、およびなおより好ましくは少なくとも約９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を包含する。一実施形態では、この核酸が、配列番号１〜３または配列番号４〜６もしくは９のうちの１または複数を含有するポリペプチドをコードする。
【０１０８】
本開示の別の態様は、厳密な条件下でビグリカン治療剤、例えば、配列番号１〜６もしくは９のうちの１もしくは複数またはこれらの相補体を有するポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性の条件、例えば、約４５℃で６．０倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃で２．０倍濃度のＳＳＣによる洗浄は、当業者に公知であるか、または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６において見出すことができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０倍濃度のＳＳＣによる低度な厳密性乃至５０℃で約０．２倍濃度のＳＳＣによる高度な厳密性から選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温である約２２℃の低度な厳密性の条件から、約６５℃の高度な厳密性の条件へと上昇させることができる。温度および塩の両方を変化させることもでき、温度または塩濃度を一定に保ちながら、他の変数を変えることもできる。好ましい実施形態では、ビグリカンポリペプチドをコードする核酸が、中程度に厳密な条件下で、例えば、約２．０倍濃度のＳＳＣおよび約４０℃で、配列番号１〜６のうちの１つもしくはその相補体をコードする核酸、またはＳＬＲＰをコードする核酸に結合する。特に好ましい実施形態では、本開示による核酸は、高度な厳密性の条件下で、配列番号７もしくは８またはその相補体を有する核酸など、配列番号１〜６または９のうちの１つをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【０１０９】
当技術分野では、本明細書で開示されるポリペプチドおよび核酸を調製する多様な方法が周知である。例えば、ポリペプチドまたは核酸を組織から単離することもでき、化合物を組換えまたは合成により生成させることもできる。組織から単離されたタンパク質は、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、および最も好ましくは、少なくとも約９９％の純度である。したがって、好ましいポリペプチドは、そこからポリペプチドを抽出した物質のうちの約１％未満、および、なおより好ましくは約０．１％未満を含有する。
【０１１０】
治療用ビグリカンポリペプチドはまた、組換えにより生成させることもできる。典型的には、タンパク質をコードする遺伝子をプラスミドまたはベクターへと挿入し、次いで、結果として得られる構築物を適切な細胞へとトランスフェクトし、次いで、ここで、タンパク質を発現させ、最終的にここからタンパク質を精製する。ビグリカンを生成させ、これを精製する方法は、Ｍｅｒｃａｄｏら（「Ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ，  ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ，  ａｎｄ  ｎＮＯＳ」、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、２００６年）において論じられている。ビグリカンポリペプチドはまた、実施例１２の方法により精製することもできる。一部の実施形態では、実施例１２の方法を、さらなる精製ステップと組み合わせる。これらのステップでは、例えば、イオン交換樹脂を使用する。
【０１１１】
したがって、本開示はさらに、開示されるタンパク質を生成させる方法にも関する。例えば、対象のタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、タンパク質を発現させるのに適切な条件下で培養することができる。タンパク質は、分泌シグナル配列を組み入れることにより分泌させることができ、タンパク質を含有する細胞と培地との混合物から単離することができる。代替的に、タンパク質を細胞質内に保持し、細胞を採取し、溶解させ、タンパク質を単離することもできる。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および（典型的に）細胞副産物を包含する。当技術分野では、細胞の培養に適する培地が周知である。タンパク質は、細胞培養培地から単離することもでき、宿主細胞から単離することもでき、これらのいずれから単離することもできる。当技術分野では、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびタンパク質の特定のエピトープに特異的な抗体によるイムノアフィニティー精製を含めた、タンパク質を精製する技法が公知である。
【０１１２】
したがって、治療用ビグリカンポリペプチドのコード配列は、微生物細胞過程または真核細胞過程を介してタンパク質の組換え形態を生成させるのに用いることができる。ポリヌクレオチド配列を発現ベクターなどの遺伝子構築物へとライゲーションし、真核生物（酵母、鳥類、昆虫、または哺乳動物）または原核生物（細菌細胞）である宿主へと形質転換またはトランスフェクトすることは、標準的な手順である。
【０１１３】
組換えタンパク質を生成させるための発現媒体には、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、本融合タンパク質を発現させるのに適するベクターには、以下の種類のプラスミド：ｐＢＲ３２２に由来するプラスミド、ｐＥＭＢＬに由来するプラスミド、ｐＥＸに由来するプラスミド、ｐＢＴａｃに由来するプラスミド、およびＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞において発現させるためのｐＵＣに由来するプラスミドが含まれる。
【０１１４】
酵母において組換えタンパク質を発現させるための多数のベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、遺伝子構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへと導入するときに有用なクローニング媒体および発現媒体である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｏａｃｈら（１９８３年）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍ．  Ｉｎｏｕｙｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、８３頁を参照されたい）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉの存在によりＥ．ｃｏｌｉで複製することができ、酵母２ミクロンプラスミドの複製決定因子により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで複製することができる。加えて、アンピシリンなどの薬物耐性マーカーも用いることができる。
【０１１５】
タンパク質は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス系）でも生成させることができ、原核細胞でも生成させることができる。
【０１１６】
ビグリカン治療剤を生成させるのに用いうる細胞は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化またはスルホン化を触媒する酵素のレベルおよび／または活性を上昇させるようにさらに改変することもできる。例えば、細胞を、スルホトランスフェラーゼ、例えば、コンドロイチンスルホトランスフェラーゼ、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ６ＳＴ；  Ｆｕｋｕｔａら（１９９５年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７０巻：１８５７５頁）、またはＮａｓｔｕｋら（１９９８年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８巻：７１６７頁において記載されている神経系に関与するスルホトランスフェラーゼ（ＮＳＩＳＴ）をコードする発現構築物で形質転換または共トランスフェクトすることができる。
【０１１７】
好ましい実施形態では、ビグリカンまたはユートロフィンなど、本明細書で記載される組換えタンパク質を、共免疫沈降研究および結合研究を容易とする、エピトープタグしたタンパク質として生成させる。例えば、本明細書で記載されるタンパク質は、牛痘ウイルス／Ｔ７バクテリオファージ発現系を用いて、真核細胞により生成させることができる。ビグリカンポリペプチド、例えば、成熟ビグリカンタンパク質をコードする組換え牛痘ウイルスであるｖＢＧＮ４は、Ｔ７ファージプロモーターの制御下でポリヒスチジン融合タンパク質として発現させることができ、例えば、Ｈｏｃｋｉｎｇら（１９９６年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１巻：１９５７１〜７頁において記載されている通り、ＨＴ−１０８０細胞およびＵＭＲ１０６細胞により発現させることができる。
【０１１８】
不死化細胞系、例えば、ビグリカン陰性細胞系などの筋細胞系は、Ｊａｔら、ＰＮＡＳ（１９９１年）、８８巻：５０９６〜１００頁；  Ｎｏｂｌｅら（１９９２年）、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２巻：３９〜４６頁において記載されている通りに得ることができる。一実施形態では、Ｈ−２Ｋｂ／ｔｓＡ５８トランスジェニックマウスを用いる。このマウスは、インターフェロン誘導性プロモーター（このマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒで入手可能である）の制御下にある熱不安定性の不死化遺伝子（ＳＶ４０ラージＴ抗原のｔｓＡ５８変異体）を保有するヘテロ接合体である。この遺伝子を含有する細胞を培養すると、それらは、３３℃、インターフェロンの存在下で無際限に増殖する。しかし、温度を３９℃へと上げ（この温度では、ｔｓＡ５８抗原が非機能的となる）、インターフェロンを除去すると、細胞は分裂を停止する。
【０１１９】
この方法は、星状細胞、破骨細胞、小柱網、および結腸上皮細胞を含めた多種多様な細胞型を成長させるのに用いられている（Ｃｈａｍｂｅｒｓら（１９９３年）、ＰＮＡＳ、９０巻：５５７８〜８２頁；  Ｇｒｏｖｅｓら（１９９３年）、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、１５９巻：８７〜１０４頁；  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら（１９９３年）、ＰＮＡＳ、９０巻：５８７〜９１頁；  Ｎｏｂｌｅら（１９９５年）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、４巻：２１５〜２５頁；  Ｔａｍｍら（１９９９年）、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔａｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．、４０巻：１３９２〜４０３頁）。この技法は、筋細胞系を生成させるのに十分に適する。例えば、１つの研究だけで、６５例の個別の筋細胞系が、新生仔〜４週齢の範囲の動物から派生している（Ｍｏｒｇａｎら（１９９４年）、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、１６２巻、４８６〜９８頁）。これらの細胞系は、最大８０世代にわたり維持された。注目すべきは、これらの細胞系が、培養物中で非許容条件へとシフトさせた場合に限り筋管を形成したのではなく、また、宿主マウスへと植え込んだ場合にも筋肉を形成したことである。Ｈ−２Ｋｂ／ｔｓＡ５８トランスジェニック法はまた、Ｄ．Ｇｌａｓｓらによっても用いられてＭｕＳＫ−／−  筋細胞系を生成させた（Ｓｕｇｉｙａｍａら（１９９７年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３９巻：１８１〜９１頁）。
【０１２０】
条件付きの不死化細胞系を生成させるために、特定の変異を有するマウス、例えば、ビグリカンまたはＭｕＳＫが欠損するマウスを、ヘテロ接合体のＨ−２Ｋｂ／ｔｓＡ５８トランスジェニックマウスと交配させることができる。完全な活性に要請される遺伝子のコピーは１つだけなので、この交配は、単純である。次いで、新生仔動物に由来する筋細胞を播種し、許容条件下で（３３℃で、インターフェロンを伴う）成長させることができる。次いで、増殖する細胞をクローニングし、各系列に由来する試料を非許容温度へと移し、それらが筋管を形成する能力について調べることができる。野生型；デコリン−／−；ビグリカン−／ｏ；およびデコリン−／−ビグリカン−／ｏの細胞系は、この技法を用いて得ることが可能な細胞系の例である。
【０１２１】
ビグリカン治療剤で対象を処置する特定の方法は、本明細書で記載されるタンパク質の対象への投与を含む。しかし、タンパク質はまた、対象おいて遺伝子治療法を介して生成させることもできる。したがって、例えば、ベクターが筋細胞に侵入し、そこで発現することが可能であるように、対象の筋内に、治療用ビグリカンタンパク質をコードするベクターの注射を施すことができる（例えば、対象が筋ジストロフィーを有する場合）。代替的に、ベクターはウイルスベクターであることも可能であり、これがウイルスカプシドと共に施されるとウイルスは細胞、例えば、筋細胞に感染し、これによりベクターを送達する。当技術分野では、遺伝子治療のための方法およびベクターが周知である。例示的な方法を以下に示す。
【０１２２】
好ましい哺乳動物用発現ベクターは、細菌におけるベクターの伝搬を容易にするための原核細胞の配列、および真核細胞内で発現する１または複数の真核細胞の転写単位の両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ  に由来するベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適する哺乳動物用発現ベクターの例である。これらのベクターの一部を、原核細胞および真核細胞のいずれにおいても、複製および薬物耐性による選択を容易にする、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドに由来する配列により改変する。代替的に、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰに由来するベクター、およびｐ２０５）など、ウイルスの派生体も、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に用いることができる。他のウイルス（レトロウイルスを含めた）発現系の例は、以下の遺伝子治療用送達系についての記載において見出すことができる。当技術分野では、プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される多様な方法が周知である。原核細胞および真核細胞の両方ならびに遺伝子組換え手順に適する他の発現系については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）、１６および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系を用いることにより組換え融合タンパク質を発現させることも所望でありうる。このようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬに由来するベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷに由来するベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃに由来するベクター（ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩを含有するβ−ｇａｌなど）が含まれる。
【０１２３】
さらに他の実施形態では、対象遺伝子を、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルス１を含めたウイルスベクター、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドへと挿入することにより、対象の発現構築物を派生させることができる。下記でより詳細に記載する通り、対象の発現構築物についてのこのような実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおける多様な遺伝子治療プロトコールにおける使用がとりわけ想定される。
【０１２４】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて外因性遺伝子を特にヒトへと導入するのに最適な組換え遺伝子送達系であると理解される。これらのベクターは、遺伝子の細胞への効率的な送達をもたらし、導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定的に組み込まれる。レトロウイルスを用いるための主要な要件は、特に、細胞集団における野生型ウイルス拡大の可能性に関するそれらの使用の安全性を確保することである。複製欠損のレトロウイルスだけを生成させる特化した細胞系（「パッケージング細胞」と称する）の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増大させており、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とする遺伝子導入における使用について十分に特徴づけられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．Ｄ．（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：２７１頁を参照されたい）。したがって、レトロウイルスのコード配列の一部（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を、ビグリカンタンパク質をコードする核酸で置換して、レトロウイルスを複製欠損とした組換えレトロウイルスを構築することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスをビリオンへとパッケージングし、これを、標準的技法により、ヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞に感染させるのに用いることができる。組換えレトロウイルスを生成させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、このようなウイルスを細胞に感染させるためのプロトコールは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９年）、９．１０〜９．１４節、および他の標準的な実験室用マニュアルにおいて見出すことができる。適切なレトロウイルスの例には、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが含まれる。同種指向性のレトロウイルス系および両種指向性のレトロウイルス系のいずれを調製するのにも適するパッケージングウイルス系列の例には、ＣＲＩＰ、Ｃｒｅ、Ψ２、およびＡｍが含まれる。レトロウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、多様な遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含めた多くの異なる細胞型へと導入するのに用いられてきた（例えば  Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１３９５〜１３９８頁；  ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻：６４６０〜６４６４頁；  Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻：３０１４〜３０１８頁；  Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：６１４１〜６１４５頁；  Ｈｕｂｅｒら（１９９１年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８８巻：８０３９〜８０４３頁；  Ｆｅｒｒｙら（１９９１年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８８巻：８３７７〜８３８１頁；  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１８０２〜１８０５頁；  ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：７６４０〜７６４４頁；  Ｋａｙら（１９９２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３巻：６４１〜６４７頁；  Ｄａｉら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：１０８９２〜１０８９５頁；  Ｈｗｕら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻：４１０４〜４１１５頁；  米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０５３４５号；ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい）。
【０１２５】
さらに、ウイルス粒子表面におけるウイルスパッケージングタンパク質を修飾することにより、レトロウイルスの感染スペクトルを制限し、結果として、レトロウイルスベースのベクターの感染スペクトルを制限することが可能なことが示されている（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２５２３４号、同第ＷＯ９４／０６９２０号、および同第ＷＯ９４／１１５２４号を参照されたい）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルを修飾するための戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体の、ウイルスのｅｎｖタンパク質への連結（Ｒｏｕｘら（１９８９年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８６巻：９０７９〜９０８３頁；  Ｊｕｌａｎら（１９９２年）、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、７３巻：３２５１〜３２５５頁；およびＧｏｕｄら（１９８３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６３巻：２５１〜２５４頁）；細胞表面リガンドの、ウイルスのｅｎｖタンパク質への連結（Ｎｅｄａら（１９９１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻：１４１４３〜１４１４６頁）が含まれる。連結は、タンパク質または他の分子種（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質へと転換するラクトース）による化学的架橋形成の形態でありうるほか、融合タンパク質（例えば、単鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）を生成させることを介する場合もある。この技法は、感染を特定の組織型に制限するかまたは他の形で方向付けるのに有用であるが、また、同種指向性ベクターを両種指向性ベクターへと転換するのにも用いることができる。
【０１２６】
別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルスに由来するベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、対象の遺伝子産物はコードするが、通常の溶解性ウイルスの生活環におけるその複製能力の点では不活化されるように操作することができる（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６１６頁；  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻：４３１〜４３４頁；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁を参照されたい）。アデノウイルス株のＡｄ型５ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。特定の状況において、組換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞に感染することが可能でなく、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）、前出）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：６４８２〜６４８６頁）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０巻：２８１２〜２８１６頁）、および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：２５８１〜２５８４頁）を含めた、多種多様な細胞型に感染させるのに用いうるという点で有利でありうる。さらに、これらのウイルス粒子は、比較的安定であり、精製および濃縮に適し、上記の通り、感染性のスペクトルに影響を及ぼすように改変することができる。加えて、導入されるアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含有される外来のＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムへは組み込まれず、エピソームにとどまり、これにより、導入されたＤＮＡ（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）が宿主ゲノムに組み込まれる状況において、挿入による変異誘発の結果として生じうる潜在的な問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲノムの外来のＤＮＡに対する保有用量は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（最大で８キロ塩基）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前出；  Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５７巻：２６７頁）。現在用いられており、したがって、本明細書で記載される方法において用いるのにも好適な、最も複製欠損性が大きなアデノウイルスベクターは、ウイルスのＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルスの遺伝子物質のうちの８０％も保持している（例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９７９年）、Ｃｅｌｌ、１６巻：６８３頁；  Ｂｅｒｋｎｅｒら、前出；およびＧｒａｈａｍら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅ．Ｊ．  Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１年）、７巻、１０９〜１２７頁を参照されたい）。挿入されるキメラ遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａ  プロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、および関連するリーダー配列、ウイルスのＥ３プロモーター、または外因的に付加されたプロモーター配列の制御下でありうる。
【０１２７】
本明細書で開示される遺伝子を送達するのに有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを要請する、自然発生の欠損ウイルスである（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２年）、１５８巻：９７〜１２９頁を参照されたい）。アデノ随伴ウイルスはまた、そのＤＮＡを非分裂細胞へと組み込むことが可能であり、高頻度の安定的な組込みを呈示しうる少数のウイルスのうちの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、７巻：３４９〜３５６頁；  Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：３８２２〜３８２８頁；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６２巻：１９６３〜１９７３頁を参照されたい）。３００塩基対を含有するに過ぎないＡＡＶのベクターは、パッケージングおよび組込みが可能である。外因性ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂに制限される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁において記載されているＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞へと導入するのに用いることができる。ＡＡＶベクターを用いて、多様な核酸が、異なる細胞型へと導入されている（例えば  Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８１巻：６４６６〜６４７０頁；  Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁；  Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８年）、Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２巻：３２〜３９頁；  Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５１巻：６１１〜６１９頁；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６８巻：３７８１〜３７９０頁を参照されたい）。
【０１２８】
遺伝子治療において適用されうる他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、牛痘ウイルス、および複数のＲＮＡウイルスに由来している。特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼組織の細胞において組換え遺伝子を存続させるための固有の戦略をもたらしうる（Ｐｅｐｏｓｅら（１９９４年）、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、３５巻：２６６２〜２６６６頁）。
【０１２９】
動物の組織において治療用ビグリカンタンパク質を発現させるには、上記で例示した導入法などのウイルス導入法に加えてまた、非ウイルス的方法も使用されうる。大半の非ウイルス的遺伝子導入法は、哺乳動物細胞により用いられる、高分子の取込みおよび細胞内輸送のための通常の機構に依拠する。特定の実施形態では、非ウイルス遺伝子送達系が、標的とされた細胞が遺伝子を取り込むためのエンドサイトーシス経路に依拠する。この種類の例示的な遺伝子送達系には、リポソーム誘導系、ポリリシンコンジュゲート、および人工のウイルスエンベロープが含まれる。
【０１３０】
代表的な実施形態では、対象のタンパク質をコードする遺伝子を、それらの表面に正の電荷を保有し、（場合によって）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ付けされたリポソーム（例えば、リポフェクチン）に封入することができる（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２年）、Ｎｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉ  Ｇｅｋａ、２０巻：５４７〜５５１頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６３０９号；日本特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許公開第ＥＰ−Ａ−４３０７５号）。例えば、筋細胞、神経細胞、または心細胞に対するリポフェクションは、特異的な組織会合抗原に対するモノクローナル抗体でタグ付けされたリポソームを用いて実行することができる（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２年）、Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｉｒ．、３２巻：８７３〜８７６頁）。
【０１３１】
さらに別の例示的な実施形態では、遺伝子送達系が、ポリリシンなどの遺伝子結合剤により架橋される抗体または細胞表面リガンドを含む（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０４７０１号、同第ＷＯ９２／２２６３５号、同第ＷＯ９２／２０３１６号、同第ＷＯ９２／１９７４９号、および同第ＷＯ９２／０６１８０号を参照されたい）。例えば、ポリカチオン、例えば、ポリリシンへとコンジュゲートした抗体を含む可溶性のポリヌクレオチド担体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特殊な細胞にトランスフェクトするのに、対象遺伝子構築物のうちのいずれかを用いることができる（米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。また、エンドソーム構造からの遺伝子の逸出を増強する薬剤を用いて、エンドサイトーシスを介する対象の核酸構築物の有効な送達を改善しうることも察知されるであろう。例えば、全アデノウイルスまたはインフルエンザＨＡ遺伝子産物の融合性ペプチドを、ＤＮＡを含有するエンドソームの効率的な崩壊を誘導する送達系の一部として用いることができる（Ｍｕｌｌｉｇａｎら（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０〜９２６頁；  Ｗａｇｎｅｒら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：７９３４頁；  およびＣｈｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０巻：２１２２頁）。
【０１３２】
例えば、米国特許第５，６７９，６４７号およびＣａｒｓｏｎらによる関連の特許、ＷＯ９０／１１０９２、ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻：１４６５頁において記載されている通りに、ビグリカンポリペプチドをコードする核酸はまた、「ネイキッド」ＤＮＡとしても対象に投与することができる。
【０１３３】
臨床状況では、遺伝子送達系を、多数の方法のうちのいずれかにより患者へと導入することができる。例えば、遺伝子送達系による医薬調製物は、例えば、静脈内注射を介して全身に導入することができ、標的細胞への構築物の特異的な形質導入は、主に、遺伝子送達媒体、遺伝子の発現を制御する転写制御配列による細胞型または組織型の発現、またはこれらの組合せによりもたらされるトランスフェクションの特異性から生じる。他の実施形態では、動物への導入が極めて局在化されているので、組換え遺伝子の初回送達はいっそう制限される。例えば、遺伝子送達媒体は、カテーテルを介して（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）導入することもでき、定位注射を介して（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９１巻：３０５４〜３０５７頁）導入することもできる。
【０１３４】
治療用ビグリカンペプチドをコードする遺伝子は、構成的プロモーターの制御下に置くこともでき、誘導的プロモーターの制御下に置くこともできる。当技術分野では、これらが周知である。
【０１３５】
ＩＶ．ユートロフィンタンパク質およびユートロフィン転写物
ユートロフィンとは、発生しつつある筋肉において高レベルで発現するジストロフィンの相同体である。ユートロフィンは、成体筋の神経筋接合部近傍に局在化するが、ジストロフィンの非存在下において（すなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて）、ユートロフィンはまた、筋鞘の細胞質面上にも配置される。トランスジェニック体でユートロフィンを過剰発現させると、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態がレスキューされ、これにおける機能が回復される（５〜７）。成熟筋では、ユートロフィンの発現が、神経筋および筋腱間接合部に制約される。しかし、発生しつつある筋肉および再生しつつある筋肉では、ユートロフィンが、筋線維全体にわたり発現する（８〜１０）。
【０１３６】
ヒトユートロフィンは、Ｃ末端のシステインに富む領域が高度に保存された、３４３３アミノ酸のタンパク質である。ユートロフィンは、ＷＷドメイン、ＥＦハンド、およびＺＺドメインを含有する（Ｈｎｉａ  Ｋら、「ＺＺ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ：  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２００７年２月１日；４０１巻（３号）：６６７〜７７頁）。ＷＷドメインは、２つの保存されたトリプトファン残基を含有するタンパク質間相互作用ドメインである。ＺＺドメインは、予測される亜鉛フィンガーモチーフを含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドがヒトユートロフィンである。一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、配列番号１３またはその活性断片を含む。一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、配列番号１３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の同一性を有する配列またはその活性断片を含む。特定の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、無傷のＺＺドメイン、および無傷のＥＦハンドドメイン、および／または無傷のＷＷドメインを有する。
【０１３８】
ユートロフィンのヒトｍＲＮＡ配列を配列番号１２として示し、ヒトユートロフィンのポリペプチド配列を配列番号１３として示す。配列番号１２および１３はまた、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ６９０８６．１（２００８年１０月７日）の下にも見出すことができる。ヒトユートロフィンの配列はまた、受託番号：ＣＡＡ４８８２９（２００８年１０月７日）の下にも見出すことができる。ヒトユートロフィンをコードするゲノムＤＮＡ配列はまた、公表されているデータベース、例えば、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅの第６染色体の位置６ｑ２４（遺伝子座タグ：ＲＰ１１−３５２Ｅ１３．１）においても入手可能である。当業者は、モデル生物のユートロフィン配列を容易に決定することができる。公表されているデータベースでは、複数のモデル生物のユートロフィン配列が入手可能である。例えば、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓのユートロフィン配列は、受託番号：ＮＰ＿０３５８１２の下に入手可能である。
【０１３９】
当業者は、本明細書における開示を最新技術と組み合わせて用いて、患者がユートロフィンを欠損しているかどうかを決定することができる。まず、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを決定することができる。例えば、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルは、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、ドットブロット、またはサザンブロットにより測定することができる。本明細書では、ユートロフィンのｍＲＮＡ配列を配列番号１２として提示するが、当業者は、この配列に対するプライマーまたはプローブを容易にデザインすることができる。加えて、ユートロフィンのタンパク質レベルも、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはタンパク質マイクロアレイを介して測定することができる。ユートロフィン抗体は、例えば、Ｍｅｒｃａｄｏ  ＭＬら（２００６年）、「Ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ，  ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ，  ａｎｄ  ｎＮＯＳ」、ＦＡＳＥＢにおいて記載されている通りに入手可能である。他のユートロフィン抗体も作製することができ、当技術分野では、抗体を作製する多数の技法が公知である。ユートロフィンのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを決定する方法については、実施例４で論じる。
【０１４０】
加えて、患者におけるユートロフィン遺伝子のＤＮＡ配列を決定して、変異を同定することもできる。例えば、サンガーによる配列決定法、ダイターミネーター法、大規模並列処理特徴配列決定法、４５４パイロシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定法、およびＳＯＬｉＤ配列決定法などの多様なハイスループット配列決定法を用いることができる。また、例えば、公知のユートロフィンのＳＮＰ、欠失、または挿入を含有するプローブを用いて、ハイブリダイゼーション法を介してＤＮＡ配列をアッセイすることもできる。また、公知のユートロフィンのＳＮＰ、欠失、または挿入で終止するプライマーを用いるプライマー伸長法も用いることができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、ユートロフィンの欠損についてのアッセイが、患者がユートロフィン遺伝子座において既に公知の特異的な損傷を有するかどうかをアッセイするステップを包含する。ユートロフィン遺伝子座における例示的な遺伝子損傷は、Ｔａｂｅｔ  ＡＣら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ６ｑ２４．２ｑ２５．３  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ  ＵＴＲＮ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｒｔｈｒｏｇｒｙｐｏｓｉｓ」、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ．、２０１０年７月；１５２Ａ巻（７号）：１７８１〜８頁）において開示されている。
【０１４２】
ユートロフィンの機能性についての複数のアッセイが公知である。例えば、ユートロフィンを、ジストログリカンへの結合についてアッセイすることができる。別のユートロフィンについての機能的アッセイは、シントロフィンタンパク質を介する、ユートロフィンのＮａ（ｖ）１．５との会合について検討する（Ａｌｂｅｓａ  Ｍら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  Ｎａｖ１．５  ｂｙ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．、２０１０年１１月３日、［印字版に先行するＥｐｕｂ版］）。加えて、ユートロフィンは、細胞極性制御キナーゼであるＰＡＲ−１ｂへの結合についてもアッセイすることができる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋら、「Ｔｈｅ  ８ｔｈ  ａｎｄ  ９ｔｈ  ｔａｎｄｅｍ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｆ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｆｏｒｍ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌａｒｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  ＰＡＲ−１ｂ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１０年１月１日；３９１巻（１号）：８１２〜７頁）。
【０１４３】
ＶＩ．処置法
本開示は、筋障害、神経筋障害、神経障害、およびＶＩ型コラーゲン関連障害を含めた障害を処置するための治療法および予防法を提供する。治療法は、疾患または障害の少なくとも１つの症状を消失させるかまたは少なくとも軽減し、好ましくは疾患または障害を治癒させることを意図する。予防法には、疾患または障害の出現を防止することを意図する方法、すなわち、疾患または障害の出現に対して効力を及ぼすことを意図する方法が含まれる。
【０１４４】
野生型ビグリカンは、α−ジストログリカンおよびサルコグリカン（ｓａｒｏｃｏｇｌｙｃａｎｓ）に結合し、これにより、ＤＡＰＣの多様な構成要素の間のリンクとして機能することが示された。さらに、ビグリカンレベルは、ジストロフィンを欠くマウス（筋ジストロフィーのモデルであるｍｄｘマウス）の筋細胞において高いことも見出された。筋細胞におけるジストロフィンの非存在は、細胞膜を不安定化させることが公知であるので、ジストロフィン陰性の筋細胞におけるビグリカンの上方制御は、ジストロフィンの非存在に対する補償機構でありうる。したがって、特定の実施形態では、本開示は、細胞膜の不安定性または組織化、特に、細胞膜におけるＤＡＰＣの異常から結果として生じる不安定性と関連する疾患または障害を防止および処置する方法を提供する。ＤＡＰＣは筋細胞膜において見出されるので、本明細書の方法を用いて処置しうる疾患には、筋ジストロフィーおよび筋萎縮などの筋疾患が含まれる。
【０１４５】
この点で、筋ジストロフィーを処置し、潜在的に治癒させる１つの有望な方途は、ユートロフィンの発現の制御に基づく内因性補償機構の活性化である。ユートロフィンは、多数の構造的特性および機能的特性をジストロフィンと共有するジストロフィンの相同体である。しかし、正常な筋肉およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋肉のいずれにおいても、ユートロフィンは、筋膜のある画分：神経筋接合部および筋腱間接合部だけで発現する。膜のバルクは、ユートロフィンを有さない。しかし、動物モデルでは、ジストロフィンを欠く筋肉においてユートロフィンの発現を強制すると、筋膜におけるＤＡＰＣの回復およびジストロフィー性表現型のレスキューがもたらされることが示されている。ユートロフィン遺伝子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において正常であることが多いので、筋肉においてその発現を活性化し、かつ／または筋膜をその標的とする方法であれば、ＤＡＰＣを膜へと戻し、したがって、筋細胞の健康を促進することに用いられうるであろう。逆に、ユートロフィンの発現が完全に破壊された患者では、ビグリカン療法が有効であるとは期待されない。しかし、活性ユートロフィンのレベルが異常に低い患者でも、ビグリカン療法は、ユートロフィンレベルを増大させ、かつ／またはその局在化を正常化することにより、有効でありうる。さらに、一部の実施形態では、患者のユートロフィンレベルが低いことを示す試験により、この患者をビグリカン治療剤とユートロフィン治療剤との組合せで処置すべきことも示されている。
【０１４６】
それらのうちの多くが本発明者らによりなされた観察から生じる複数系列の証拠は、低分子のロイシンリッチリピートによるプロテオグリカンであるビグリカンであれば、ユートロフィンの発現および局在化を制御する方法において用いうることを示す。タンパク質であるアグリンは、ユートロフィン発現の上方制御を引き起こし、それを、細胞表面における特定のドメインに局在化するように方向付けうることが裏付けられている。アグリンのシグナル伝達受容体は、受容体チロシンキナーゼであるＭｕＳＫである。アグリンはまた、培養された筋管におけるα−サルコグリカンおよびγ−サルコグリカンのチロシンのリン酸化も誘導しうることが観察されている。ビグリカンはまた、α−サルコグリカンおよびγ−サルコグリカンのチロシンのリン酸化を制御しうることも観察された。さらに、受容体チロシンキナーゼであるＭｕＳＫは、これらのタンパク質の、このビグリカンに誘導されるチロシンのリン酸化にも要請される。さらに、ビグリカンは、ＭｕＳＫにも結合しうる。これらの観察は、ビグリカンが、直接的に作用して、筋細胞表面におけるユートロフィンを含めたＤＡＰＣを組織化しうることを示す。
【０１４７】
したがって、本出願は、ユートロフィンを上方制御し、ユートロフィンの局在化を正常化し、ＭｕＳＫを活性化し、かつ／またはサルコグリカンのリン酸化を誘導するビグリカン治療剤によるこれらの障害の処置を提供する。
【０１４８】
例示だけを目的として述べると、ビグリカン治療剤（例えば、ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド模倣剤）は、筋ジストロフィー、筋萎縮、または他の状態を伴う患者へと送達して、内因性のユートロフィン遺伝子の発現を上方制御し、かつ／またはユートロフィンの筋膜への局在化を促進することができる。このような実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドを、ポリペプチドの形態またはそれ自体で送達することもでき、例えば、ヒト化抗体配列または類似する担体実体へと融合させた融合タンパク質の一部として送達することもできる。治療用ビグリカンポリペプチドは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、または治療用ビグリカンポリペプチドをコードする核酸配列を患者へと導入する他のモダリティーを含めた核酸ベースの方法を介して送達することができる。ビグリカン治療剤の送達は、ユートロフィンの発現の増大および筋細胞表面への局在化の制御を方向付け、同時に、ジストロフィン会合タンパク質複合体の残余部分を回復させることにより、筋線維を内部から癒すのに用いられうる。
【０１４９】
さらに、ＤＡＰＣはまた他の細胞型においても見出されるので、本開示はまた、任意のＤＡＰＣの異常と関連する疾患を処置する方法も提供する。例えば、ＤＡＰＣは脳に存在し、加えて、アグリンがアルツハイマー病を伴う患者の老人斑において見出されているので、本明細書で記載される方法により、神経疾患もまた処置または防止することができる。さらに、本明細書で記載される方法により神経障害を処置または防止しうるという適応は、筋ジストロフィーを伴う患者はまた、末梢神経系および中枢神経系の障害を患うことも多いという観察に基づく。したがって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者のうちの約３分の１は、精神障害、特に、精神遅滞を有する。したがって、ジストロフィンは、神経系において役割を果たすと考えられ、よって、ＤＡＰＣも、神経系において役割を果たすと考えられる。
【０１５０】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者はまた、横隔膜問題も有することから、横隔膜におけるジストロフィンの役割が示され、おそらくはＤＡＰＣの役割も示される。したがって、本明細書で記載される組成物および方法はまた、横隔膜の異常と関連する障害においても適用される。
【０１５１】
本出願は、ビグリカンに対する患者の応答を予測する方法であって、患者がいくつかの疾患のうちの１または複数を有する方法を開示する。このような疾患には、ビグリカンが異常である疾患だけでなく、より一般に、ビグリカンにより改善しうるかまたは治癒させうる欠陥と関連する任意の疾患または状態も含まれる。特に、ビグリカン治療剤が少なくとも部分的に、欠損した構成要素から結果として生じる欠陥を治癒させうるという条件で、疾患は、ＤＡＰＣの任意の構成要素またはこれと会合した構成要素における欠陥または異常であって、これにより、例えば、細胞膜の不安定を結果としてもたらす欠陥または異常を特徴としうる。特に、疾患には、ビグリカン治療剤の存在によりより安定とされうるＤＡＰＣの不安定と関連する任意の疾患が含まれる。
【０１５２】
さらに、ビグリカンは、神経筋接合部の形成、特に、アグリンに誘導されるシナプス後膜の分化に対する刺激を媒介することで公知の受容体であるＭｕＳＫに結合し、これをリン酸化して、アグリンに誘導されるＡＣｈＲの凝集を強化し、ビグリカン陰性マウスの筋管におけるアグリンに誘導されるＡＣｈＲの凝集の欠損を、筋管へのその付加を介して是正することが示されたので、本開示はまた、神経筋障害など、神経筋接合部の疾患または障害に関する方法も提供する。例えば、これらの疾患は、本明細書で開示されるビグリカンによる組合せ治療剤のうちの１つで処置することができる。加えて、ユートロフィンについてのアッセイを用いて、患者が、神経筋障害など、神経筋接合部の疾患または障害のためのビグリカン療法に応答するかどうかを決定することもできる。
【０１５３】
Ａ．例示的な疾患および障害
本明細書の組成物および方法は、多種多様なビグリカン関連障害に用いることができる。特に、本明細書の方法を用いて、ビグリカン療法に対する患者の応答を予測することができるが、この場合、患者は、ビグリカン療法で処置可能な任意の適切な疾患を有する。本明細書では、筋ジストロフィーおよび運動ニューロン病を含めた、このような疾患の多数の例が提示される。
【０１５４】
特定の細胞型の細胞膜の不安定化または不適正な組織化を特徴とする疾患または障害には、神経系病変を伴わない筋力低下および筋萎縮を特徴とする遺伝子変性ミオパシーの群である、筋ジストロフィー（ＭＤ）が含まれる。３つの主要な種類は、偽肥大性（デュシェンヌ型、ベッカー型）ＭＤ、肢帯型ＭＤ、および顔面肩甲上腕型ＭＤである。例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮は、筋細胞膜の破断を特徴とする、すなわち、筋ジストロフィーおよび筋萎縮は、ＤＡＰＣの構成要素、すなわち、ジストロフィンにおける変異から結果として生じると考えられる漏洩膜を特徴とする。また、サルコグリカンの変異も、筋ジストロフィーおよび漏洩膜を結果としてもたらすことが公知である。したがって、本開示は、ジストロフィンおよび／もしくはサルコグリカン、またはＤＡＰＣの他の構成要素における変異と関連する疾患、特に、筋ジストロフィーとの関連で、ビグリカン治療剤に対する患者の応答を予測する方法を提供する。本開示はまた、本明細書の組合せ治療剤を用いて、ジストロフィンおよび／もしくはサルコグリカン、またはＤＡＰＣの他の構成要素における変異と関連する疾患、特に、筋ジストロフィーを処置する方法も提供する。
【０１５５】
ジストロフィンの異常は、軽度のベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）および重度のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のいずれの一因ともなる。ＢＭＤでは、ジストロフィンは作られるが、サイズおよび／または量が異常である。患者は、軽度〜中程度の筋力低下を示す。ＤＭＤでは、タンパク質が作られず、患者は１３歳までに車椅子が欠かせなくなり、通常２０歳までに死亡する。
【０１５６】
別の種類のジストロフィーには、臨床的発症が早期である極めて障害惹起的な筋疾患であり、重度の新生児性低血圧症の最も高頻度の原因でもある、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が含まれる。その症状は、出生時または生後最初の数カ月間において感知され、運動マイルストーンの遅れ、重度で早期の拘縮、および関節変形と関連することが多い筋緊張の低下からなる。疾患の早期段階で血清クレアチンキナーゼが正常値の３０倍まで上昇し、次いで、急速に低下する。筋生検の組織学的変化は、筋線維のサイズにおける大きなばらつき、少数の壊死性線維および再生しつつある線維、筋内膜コラーゲン組織の顕著な増大、および特定の微細構造的特色の消失からなる。ＣＭＤの診断は、臨床的描像および筋生検の形態的変化に基づくが、他の筋障害が類似の臨床病態的特色を呈示しうるので、これを確実に下すことはできない。ＣＭＤとして分類される疾患群内では、多様な形態が個別化されている。２つの一般的な形態は、西欧型および日本型であり、後者は、重度の精神障害と関連し、通常福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）と称する。
【０１５７】
近年、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）の１つの形態が、ラミニンアルファ２鎖遺伝子の変異により引き起こされるものとして特徴づけられている。ラミニンは、ＤＡＰＣと会合するタンパク質である。したがって、本開示はまた、通常ＤＡＰＣと会合する分子の異常と関連する疾患に対するビグリカン療法の効果を予測する方法も提供する。本開示はまた、本明細書の組合せ治療剤を用いて、通常ＤＡＰＣと会合する分子の異常と関連する疾患を処置する方法も提供する。
【０１５８】
他の筋ジストロフィーには、臨床的および遺伝子的に異質な障害のクラスを表す肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）が含まれる。これらのジストロフィーは、常染色体優性形質または常染色体劣性形質として受け継がれる。常染色体優性形態であるＬＧＭＤ１Ａが、５ｑ３１−ｑ３３へとマップされる（Ｓｐｅｅｒ，  Ｍ．  Ｃ．ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、５０巻：１２１１頁、１９９２年；  Ｙａｍａｏｋａ，  Ｌ．  Ｙ．ら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．  Ｄｉｓｏｒｄ．、４巻：４７１頁、１９９４年）一方、常染色体劣性形態に関与する６つの遺伝子は、１５ｑ１５．１（ＬＧＭＤ２Ａ）（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｓ．ら、Ｃ．  Ｒ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｐａｒｉｓ、３１２巻：１４１頁、１９９１年）、２ｐ１６−ｐ１３（ＬＧＭＤ２Ｂ）（Ｂａｓｈｉｒ，  Ｒ．ら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：４５５頁、１９９４年）、１３ｑ１２（ＬＧＭＤ２Ｃ）（Ｂｅｎ  Ｏｔｈｍａｎｅ，  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、２巻：３１５頁、１９９２年；  Ａｚｉｂｉ，  Ｋ．ら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、２巻：１４２３頁、１９９３年）、１７ｑ１２−ｑ２１．３３（ＬＧＭＤ２Ｄ）（Ｒｏｂｅｒｄｓ，  Ｓ．  Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ、７８巻：６２５頁、１９９４年；  ＭｃＮａｌｌｙ，  Ｅ．  Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、９１巻：９６９０頁、１９９４年）、４ｑ１２（ＬＧ１ＭＤ２Ｅ）（Ｌｉｍ，  Ｌ．  Ｅ．ら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、１１巻：２５７頁、１９９４年；  Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ，  Ｃ．  Ｇ．ら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、１１巻：２６６頁、１９９５年）へとマップされ、最も近年に５ｑ３３−ｑ３４（ＬＧＭＤ２Ｆ）（Ｐａｓｓｏｓ−Ｂｕｅｎｏ，  Ｍ．  Ｒ．ら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、５巻：８１５頁、１９９６年）へとマップされた。ＬＧＭＤ２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅを伴う患者は、ガンマ−サルコグリカン、アルファ−サルコグリカン、およびベータ−サルコグリカンのそれぞれをコードする遺伝子の変異から結果として生じるサルコグリカン複合体の構成要素が欠損する。ＬＧＭＤ２Ａの一因となる遺伝子は、筋特異的なカルパインとして同定されているが、ＬＧＭＤ１Ａ、２Ｂ、および２Ｆの一因となる遺伝子は、なおも未知である。
【０１５９】
さらに他の種類の筋ジストロフィーには、遠位部における筋力低下の緩徐な進行を特徴とする、成体後期に発症する常染色体優性ミオパシーである、ウェランダー遠位型ミオパシー（ＷＤＭ）が含まれる。この障害は、遠位部における遺伝性ミオパシーのモデル疾患と考えられている。この疾患は、染色体２ｐ１３と連関している。別の筋ジストロフィーは、近年クローニングされた、遺伝子記号をＤＹＳＦとする遺伝子であるジスフェリンの変異により引き起こされる遠位型筋ジストロフィーである、三好型ミオパシーである（Ｗｅｉｌｅｒら（１９９９年）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、８巻：８７１〜７頁）。さらに他のジストロフィーには、遺伝性遠位型ミオパシー、良性先天性筋緊張低下症、中心核病、ネマリンミオパシー、および筋細管（中心核）ミオパシーが含まれる。
【０１６０】
ビグリカン治療剤を用いて処置または防止しうる他の疾患には、ビグリカン治療剤により処置すると萎縮が停止するかまたは緩徐化されるという条件で、組織の萎縮、例えば、筋ジストロフィーから結果として生じる筋萎縮以外の筋萎縮を特徴とする疾患が含まれる。さらに、本開示はまた、組織の萎縮、例えば、筋萎縮を可逆化する方法も提供する。これは、萎縮した組織にビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤を含む組成物、またはこれらの治療剤を個別に含む別個の組成物を施すことなど、例えば、患者をビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤により処置することにより、達成することができる。
【０１６１】
筋萎縮は、神経外傷に起因する脱神経（筋によるその神経との接触の喪失）；変性性神経障害、代謝性神経障害、もしくは炎症性神経障害（例えば、ギラン−バレ症候群）、末梢神経障害、または環境における毒素もしくは薬物により引き起こされる神経への損傷（ｄａｍａｇｅ）から結果として生じる場合がある。別の実施形態では、筋萎縮が、運動ニューロン障害に起因する脱神経から結果として生じる。このような運動ニューロン障害には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病）；小児性脊髄性筋萎縮症および若年性脊髄性筋萎縮症、ならびに多巣性伝導ブロックを伴う自己免疫性運動神経障害を含めた成人性運動ニューロン疾患が含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態では、筋萎縮が、長期にわたる不使用から結果として生じる。このような廃用性萎縮は、脳卒中、脊髄損傷（ｉｎｊｕｒｙ）に起因するまひ；外傷（骨折、捻挫、または脱臼など）に起因する骨格の固定または病臥の長期化が含まれるがこれらに限定されない状態から生じうる。さらに別の実施形態では、筋萎縮が、がんおよび他の慢性疾病による悪液質、空腹、または横紋筋融解症が含まれるがこれらに限定されない代謝性ストレスまたは栄養不全、甲状腺障害および糖尿病などであるがこれらに限定されない内分泌障害から結果として生じる。
【０１６２】
筋組織の萎縮および壊死は、罹患組織の線維化を随伴することが多いので、萎縮または壊死の可逆化または阻害はまた、線維化の阻害または可逆化も結果としてもたらしうる。
【０１６３】
加えて、ビグリカン治療剤は、後天性（中毒性または炎症性）ミオパシーを処置するのに有用でありうる。炎症性筋疾患の帰結として生じるミオパシーには、多発性筋炎および皮膚筋炎が含まれるがこれらに限定されない。中毒性ミオパシーは、アミオダロン（ａｄｉｏｄａｒｏｎｅ）、クロロキン、クロフィブラート、コルヒチン、ドキソルビシン、エタノール、ヒドロキシクロロキン、有機リン酸エステル、ペルヘキシリン（ｐｅｒｉｈｅｘｉｌｉｎｅ）、およびビンクリスチンが含まれるがこれらに限定されない薬剤に起因しうる。
【０１６４】
神経筋ジストロフィーには、筋強直性ジストロフィーが含まれる。筋強直性ジストロフィー（ＤＭ；またはスタイナート病）とは、常染色体優性の神経筋疾患であり、成人が罹患する筋ジストロフィーの最も一般的な形態である。ＤＭの臨床的描像は十分に確立されているが、例外的に可変的である（Ｈａｒｐｅｒ，  Ｐ．  Ｓ．、「Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」、２版、Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８９年）。一般には、筋強直、進行性の筋力低下、および筋損耗を伴う筋疾患であると考えられているが、ＤＭは、他の多様な系における異常を特徴とする。ＤＭ患者は、心伝導障害、平滑筋病変、睡眠過剰、白内障、グルコース反応の異常、ならびに、男性では、早期の脱毛および精巣萎縮を患うことが多い（Ｈａｒｐｅｒ，  Ｐ．  Ｓ．、「Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」、２版、Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８９年）。場合によっては診断するのが困難な最も軽微な形態は、中高年において見られ、筋病変をほとんどまたは全く伴わない白内障を特徴とする。筋強直および筋力低下を示す古典的な形態は、成年早期および青年期に発症する頻度が最も高い。先天的に生じる最も重度の形態は、全般的な筋形成不全、精神遅滞、および新生児死亡率の高さと関連する。この疾患および罹患する遺伝子は、米国特許第５，９５５，２６５号においてさらに記載されている。
【０１６５】
別の神経筋疾患は、脊髄性筋萎縮症（「ＳＭＡ」）であり、小児ではデュシェンヌ型筋ジストロフィーに次いで２番目に最も一般的な神経筋疾患である。ＳＭＡとは、乳幼児が主に罹患する消耗性神経筋障害を指す。この障害は、脊髄の後角細胞としてもまた公知である下位運動ニューロンの変性により引き起こされる。正常な下位運動ニューロンは、筋肉を刺激して収縮させる。神経変性は、刺激を低減し、これにより、筋組織を萎縮させる（例えば、米国特許第５，８８２，８６８号を参照されたい）。
【０１６６】
上記の筋ジストロフィーおよびミオパシーは、骨格筋の障害である。しかし、本開示はまた、平滑筋の障害、例えば、肥大型心筋症、拡張型心筋症、および拘束型心筋症を含めた心筋症にも関する。少なくとも特定の平滑筋、例えば、心筋は、サルコグリカンに富む。サルコグリカンにおける変異は、心筋レベルにおける筋鞘の不安定性を結果としてもたらしうる（例えば、Ｍｅｌａｃｉｎｉ（１９９９年）、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２２巻：４７３頁を参照されたい）。例えば、サルコグリカンを変異させた動物モデルは、心筋クレアチンキナーゼの上昇を示す。特に、デルタ−サルコグリカン（Ｓｇｃｄ）ヌルマウスは、心筋および骨格筋における組織学的顕徴としての巣状の壊死領域を伴う心筋症を発症することが示されている。動物はまた、骨格および心膜におけるサルコグリカン−サルコスパン（ＳＧ−ＳＳＰＮ）複合体の非存在も示した。血管平滑筋におけるＳＧ−ＳＳＰＮ複合体の喪失は、冠血管系の異常と関連した。したがって、血管平滑筋におけるＳＧ−ＳＳＰＮ複合体の崩壊は、血管機能を攪乱し、これにより心筋症が誘発され、筋ジストロフィーが悪化する（Ｃｏｒａｌ−Ｖａｚｑｕｅｚら（１９９９年）、Ｃｅｌｌ、９８巻：４６５頁）。
【０１６７】
デルタ−サルコグリカン陰性マウスと同様に、γ−サルコグリカンを欠くマウスは、幼年で顕著なジストロフィー性の筋変化を示した（Ｈａｃｋら（１９９８年）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１４２巻：１２７９頁）。これらのマウスは、２０週齢までに心筋症を発症し、若年で死亡した。さらに、γ−サルコグリカンを欠く骨格筋では、アポトーシス性の筋核が豊富であったことから、プログラム細胞死が筋線維変性に寄与することが示唆される。Ｅｖａｎｓブルー色素による生体染色は、γ−サルコグリカンを欠く筋肉が、ジストロフィン欠損筋において見られる膜の分断と同様な膜の分断を発症することを明らかにした。また、γ−サルコグリカンが失われると、α−サルコグリカンおよびε−サルコグリカンは部分的に保持されるが、ベータ−サルコグリカンおよびデルタ−サルコグリカンは二次的に低減することも示されたことから、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、およびδ−サルコグリカンが１つの単位として機能することが示される。細胞膜複合体の他の構成要素が機能的であるからには、ビグリカン治療剤の存在により複合体は安定化されうるであろう。
【０１６８】
動物モデルに加えて、ヒトにおける特定の心筋症が、ジストロフィン、ジストログリカン、またはサルコグリカンにおける変異と連関している。例えば、ジストロフィンは、Ｘ結合型拡張型心筋症の一因となる遺伝子として同定されている（Ｔｏｗｂｉｎ  Ｊ．Ａ．（１９９８年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０巻：１３１頁、およびこの文献における参考文献）。この場合、ジストロフィン遺伝子は、臨床的に明らかな骨格筋ミオパシーを伴わない心筋症を結果としてもたらす５’側変異を含有した（Ｂｉｅｓら（１９９７年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２９巻：３１７５頁）。
【０１６９】
さらに、心筋症はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィンの変異と関連する）、または肢帯型筋ジストロフィーなど、他の種類の筋ジストロフィーを有する対象おいても見出された。例えば、拡張型心筋症は、常染色体優性の１症例、および進行した常染色体劣性患者または散発性患者の３例（このうちの２例は、α−サルコグリカンが欠損することが見出された）において存在した。これらの患者３例のうちの２例および他の３例は、ジストロフィン異常症に特徴的であることが公知なＥＣＧの異常を示した。アルファサルコグリカンの非存在と拡張型心筋症の存在との間の強い関連が見出された。常染色体優性の６例では、房室（ＡＶ）伝導障害が認められ、年齢と共に、かつ、筋力低下の同時的存在下において重症度が増大した。これらの患者のうちの特定例では、ペースメーカーの植え込みが必要であった（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｏｉ（１９９８年）、Ｈｅａｒｔ、７９巻：７３頁を参照されたい）。
【０１７０】
ビグリカン治療剤はまた、心筋症、例えば、ウイルスに由来する拡張型心筋症、例えば、エンテロウイルス感染、例えば、Ｂ３型コクサッキーウイルス感染から結果として生じる拡張型心筋症を処置または防止するのにも用いることができる。精製されたコクサッキーウイルスのプロテアーゼ２Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養された筋細胞に対するコクサッキーウイルスの感染時においても、感染したマウス心臓においてもジストロフィンを切断し、ジストロフィン機能の障害をもたらすことが示されている（Ｂａｄｏｒｆｆら（１９９９年）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、５巻：３２０頁）。ジストロフィンの切断は、ジストロフィンと会合した糖タンパク質であるα−サルコグリカンおよびβ−ジストログリカンの破壊を結果としてもたらす。したがって、心筋症は、ビグリカン治療剤を、例えば、ジストロフィンまたはこれと会合したタンパク質を破壊することにより心筋症を引き起こすウイルスに感染した対象への投与を介して、防止または可逆化しうるであろう。ビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤の組合せを投与すれば、罹患した心細胞の細胞膜を再安定化させるかまたは再組織化しうるであろう。
【０１７１】
一部の実施形態では、ビグリカン治療剤を用いて神経筋障害である重症筋無力症を処置することができる。
【０１７２】
したがって、ビグリカン治療剤はまた、心筋症などの平滑筋障害を防止または処置し、心平滑筋組織の萎縮および／または壊死を停止させるのにも用いることができる。この処置はまた、筋細胞の生存を促進するのにも用いることができる。したがって、本明細書の方法を用いて、平滑筋障害および心筋障害との関連でビグリカン療法に対する患者の応答を予測することができる。
【０１７３】
ビグリカン治療剤で処置しうる神経障害には、多発性筋炎および神経原性障害が含まれる。処置しうる別の神経疾患は、アルツハイマー病である。
【０１７４】
本明細書の方法で処置しうる他の疾患には、プロテオグリカンが異常なレベルで存在するか、または正常な対象における活性と比べて異常な活性を有する疾患が含まれる。例えば、疾患または障害は、例えば、細胞膜の不安定を結果としてもたらす、ビグリカンレベルの低下により引き起こされうるであろう。代替的に、疾患または障害は、例えば、ＭｕＳＫの過剰刺激またはＡＣｈＲの過剰凝集（下記を参照されたい）を結果としてもたらす、ビグリカンのレベルまたは活性の異常な上昇からも結果として生じうるであろう。
【０１７５】
本明細書の方法で処置しうるかまたはビグリカン応答性について評価しうるさらに他の疾患または障害には、プロテオグリカンと別の分子（ＤＡＰＣ分子またはＭｕＳＫ分子以外の分子）、例えば、Ｃ１ｑなどの補体因子との相互作用の異常と関連する疾患または障害が含まれる。例えば、Ｃ１ｑは、ビグリカンと相互作用することが示されている（Ｈｏｃｋｉｎｇら（１９９６年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻：１９５７１頁）。また、Ｃ１ｑの細胞表面への結合が、食作用の増強およびスーパーオキシドの生成の刺激を含めた多数の生物学的活性を媒介することも公知である。したがって、ビグリカンはＣ１ｑに結合するので、ビグリカン治療剤を用いて、Ｃ１ｑの、細胞表面におけるその受容体への結合を阻害して、このような生物学的活性のうちの１または複数を阻害することができる。加えて、Ｃ１ｑまたは他の補体構成要素と細胞表面との相互作用を阻害するビグリカン治療剤はまた、補体を介する細胞およびこのような細胞を含有する組織の壊死を阻害するのにも用いることができる。
【０１７６】
さらに、本出願は、微生物、例えば、ウイルスによる細胞の感染を防止または阻害する方法も提供する。例えば、ジストログリカンは、それを介して特定の微生物が真核細胞に侵入する受容体であることが示されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８年）、２８２巻：２０７９頁）。したがって、対象に、微生物が結合するジストログリカン分子上の部位を直接的または間接的に結合不能とする化合物を投与することにより、微生物の細胞への侵入を阻害することができる。この方法を用いて、例えば、ラッサ熱ウイルスの感染およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の感染のほか、オリベロスウイルスおよび茂原ウイルスを含めた他のアレナウイルスによる感染を防止または阻害することができる。可溶性のα−ジストログリカンは、ＬＣＭＶ感染およびＬＦＶ感染の両方から防護することが示された（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８年）、２８２巻：２０７９頁）。したがって、本明細書で開示されるビグリカンによる組合せ治療剤を用いて、ビグリカンに関連する感染性疾患を処置することができる。
【０１７７】
疾患を処置するのに最も適切なビグリカン治療剤を選択するには、例えば、筋ジストロフィーを有する、例えば、患者から確立された細胞培養物に加えて、多様な動物モデルを用いることもできる。特に、ＤＡＰＣの構成要素の変異または非存在と関連する筋ジストロフィーまたは心筋症を防止または処置するのに用いられる治療剤を同定するには、これらのタンパク質の変異形を有するか、これらのタンパク質をコードする遺伝子にヌル変異を有するマウスを用いることができる。例えば、デルタ−サルコグリカンなどのサルコグリカンが破壊されたマウスを用いることができる。このようなマウスは、例えば、Ｃｏｒａｌ−Ｖａｚｑｕｅｚら（１９９９年）、Ｃｅｌｌ、９８巻：４６５頁において記載されている。代替的に、ジストロフィンが欠損するマウス（ｍｄｘマウス）、またはα−サルコグリカンもしくはγ−サルコグリカンが欠損するマウスも用いることができる。このようなマウスは、本明細書および文献において記載されている。さらなるマウスは、当技術分野で公知の方法により作製することができる。治療剤を同定するための例示的な実施形態では、異なる治療剤をδ−サルコグリカンヌルマウスに投与し、心機能を研究することにより、治療剤の効果を評価する。この目的で用いうる別の動物モデルは、ゲノムの欠失のためにδ−サルコグリカンを発現しない心筋症性ハムスターである。このラットは、常染色体劣性心筋症の動物モデルであり、Ｓａｋａｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９９年）、４４巻：１２４頁においてさらに記載されている。
【０１７８】
米国特許第７，７５９，３１４号で論じられている通り、ビグリカン治療剤はまた、ＶＩ型コラーゲン障害を処置するのにも用いることができる。米国特許第７，７５９，３１４号では、ビグリカンヌルマウスが、免疫蛍光法により決定されるＶＩ型コラーゲンレベルの顕著な低減を呈示することが示された。実施例１１で示す通り、ＶＩ型コラーゲンを欠損するマウスへのビグリカンの投与は、筋肉におけるＶＩ型コラーゲンレベルの上昇を結果としてもたらした。したがって、本明細書で記載されるビグリカンによる組合せ治療剤はまた、ＶＩ型コラーゲンレベルを増大させ、これにより、ＶＩ型コラーゲン障害を処置するのにも用いることができる。さらに、本明細書の方法を用いて、ＶＩ型コラーゲン障害のためのビグリカン療法に対する患者の応答を予測することもできる。
【０１７９】
一般に、ＶＩ型コラーゲン障害とは、対象がもたらすＶＩ型コラーゲンのレベルまたは活性が、ゼロではないが低い障害である。一部の実施形態では、この障害は、ＶＩ型コラーゲン活性を低減するが、完全には消失させない変異を特徴とする。一部の実施形態では、障害が、ＶＩ型コラーゲンの安定性の低減を特徴とする。特定の実施形態では、障害が、ＶＩ型コラーゲンタンパク質のゼロではないが低いレベルを特徴とする。例えば、ヘテロ接合性の変異（例えば、ハプロ不全）は、ＶＩ型コラーゲンレベルの低下を結果としてもたらし得る。ビグリカン治療剤の投与は、ＶＩ型コラーゲンのレベルを増大させ、これにより、ＶＩ型コラーゲン障害を処置すると期待される。
【０１８０】
したがって、本明細書で開示される方法により処置されうる特殊なＶＩ型コラーゲン障害には、以下が含まれる。ベスレムミオパシーは、少なくとも部分的には、ＶＩ型コラーゲン遺伝子における変異により引き起こされる。一部の実施形態では、ベスレムミオパシーが、ハプロ不全により引き起こされる（Ｐｅｐｅ  Ｇら、「ＣＯＬ６Ａ１  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｅｔｈｌｅｍ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００６年１月；５９巻（１号）：１９０〜５頁；  Ｂａｋｅｒら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｂｅｔｈｌｅｍ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＶＩ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００７年１０月；６２巻（４号）：３９０〜４０５頁）。ＶＩ型コラーゲンの機能はまた、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィーにおいても損なわれる。ベスレムミオパシーと同様に、ＵＣＭＤ患者は、ＶＩ型コラーゲンの野生型コピーを有しうる（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｌｌｅｂｒｅｒａら、「Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＶＩ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ，  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  １４  Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ＣＯＬ６Ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．、２００６年１０月；１６巻（９〜１０号）：５７１〜８２頁）。特定の実施形態では、本明細書で記載されるビグリカン治療剤を投与することにより、ＶＩ型コラーゲン関連障害を処置することができる。
【０１８１】
ＶＩ．治療用組成物の有効用量および投与
対象に、薬学的有効量のビグリカンまたはビグリカン関連治療剤を、ユートロフィン治療剤などの第２の治療剤と共時投与することにより、対象おける上記の疾患または障害を処置または改善することができる。本明細書で用いられる「共時投与」とは、両方の薬剤が、処置される組織において同時に有効量で存在するように、２つの薬剤を患者に投与する治療レジメンを指す。２つの薬剤は、同時に投与する（例えば、同じ組成物による場合もあり、別個の組成物による場合もある）こともでき、別個の時点に投与する（いずれの順序による場合もある）こともでき、なおまた、異なる投与方式を介して投与することもできる。例えば、ビグリカン治療剤の投与は、第２の治療剤（例えば、ユートロフィン治療剤）の投与に、数分間〜数日間の範囲の間隔で先行する場合もあり、後続する場合もある。特定のこのような実施形態では、ビグリカン治療剤と第２の治療剤（ユートロフィン治療剤など）とを、互いから約１分間、約５分間、約１０分間、約３０分間、約６０分間、約２時間、約４時間、約６時間、８時間、約１０時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、もしくは約４８時間、またはこれを超える時間以内に投与することができる。ビグリカンは、投与２週間後のマウス筋組織においても検出しうるため（実施例３を参照されたい）、一部の実施形態では、ビグリカンを、第２の治療剤の少なくとも２週間前に投与し、第２の治療剤を投与するときもなお有効レベルで存在させることができる。一部の実施形態では、ビグリカン治療剤の投与と第２の治療剤の投与とを、互いから約１分間、約５分間、約３０分間、なおまたは約６０分間以内に行う。
【０１８２】
特定の実施形態では、ある場合には、ビグリカン治療剤の投与と第２の治療剤の投与とが互いから約６０分間以内である一方、他の場合には、ビグリカン治療剤の投与と第２の治療剤の投与とが互いから数日間以内であるように、ビグリカン治療剤と第２の治療剤（ユートロフィン治療剤など）とを、異なる投与レジメン（例えば、ビグリカン治療剤は、例えば、１〜４週間ごとに１回だけ投与する一方、第２の治療剤は毎日投与する；代替的に、ビグリカン治療剤は毎日１回投与しうる一方、第２の治療剤は３週間ごとに１回だけ投与しうる）により投与することができる。
【０１８３】
疾患が、高レベルまたは高度な活性のビグリカンにより引き起こされるのか、低レベルまたは低度な活性のビグリカンにより引き起こされるのかに応じて、疾患を有する対象に、アゴニストのビグリカン治療剤またはアンタゴニストのビグリカン治療剤を投与する。当業者は、本明細書の疾患のうちのいずれかを処置するのにどの治療剤を投与すべきかを予測しうるであろうが、試験を実施して、投与するのに適切な治療剤を決定することもできる。このような試験では、例えば、疾患の動物モデルを用いることができる。代替的に、疾患が、例えば、ビグリカンまたはユートロフィンにおける変異に起因する場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に取り組み、変異の影響を決定することもできる。これにより、この種の変異を有する対象には、どの種の治療剤を投与すべきかを決定することが可能となる。
【０１８４】
ビグリカン治療剤を対象へと投与する別の方式は、対象の治療用ビグリカンタンパク質を発現および分泌する細胞を調製し、この細胞をマトリックスへと挿入し、このマトリックスを対象の所望の場所へと投与することを介する。したがって、本開示に従い操作される細胞はまた、例えば、宿主生物または患者へと植え込む前に、治療用タンパク質を生成させるために、従来の生体適合性の材料および方法を用いてカプセル化することもできる。例えば、Ｈｇｕｙｅｎら、「Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉａｂｌｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｈｏｓｔ」、米国特許第５，３１４，４７１号（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；  ＵｌｕｄａｇおよびＳｅｆｔｏｎ、１９９３年、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．、２７巻（１０号）：１２１３〜２４頁（ＨｅｐＧ２細胞／ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート膜）；  Ｃｈａｎｇら、１９９３年、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、４巻（４号）：４３３〜４０頁（ｈＧＨ／免疫保護的で選択透過性のアルギン酸マイクロカプセルを発現するマウスＬｔｋ細胞；  Ｒｅｄｄｙら、１９９３年、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１６８巻（４号）：１０８２〜３頁（アルギン酸）；  ＴａｉおよびＳｕｎ、１９９３年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、７巻（１１号）：１０６１〜９頁（ｈＧＨ／アルギン酸−ポリ−Ｌ−リシン−アルギン酸膜を発現するマウス線維芽細胞  ）；  Ａｏら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔａｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．、２７巻（６号）：３３４９、３３５０頁（アルギン酸）；  Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．、２７巻（６号）：３３８９頁（アルギン酸）；    Ｌａｋｅｙら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．、２７巻（６号）：３２６６頁（アルギン酸）；  Ｋｏｒｂｕｔｔら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．、２７巻（６号）：３２１２頁（アルギン酸）；  Ｄｏｒｉａｎら、米国特許第５，４２９，８２１号（アルギン酸）；  Ｅｍｅｒｉｃｈら、１９９３年、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、１２２巻（１号）：３７〜４７頁（ポリマーでカプセル化されたＰＣ１２細胞）；  Ｓａｇｅｎら、１９９３年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１３巻（６号）：２４１５〜２３頁（半透過性ポリマー膜によりカプセル化され、ラット脊髄のくも膜下腔へと植え込まれた、ウシクロム親和性細胞）；  Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９４年、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、１２６巻（２号）：１５１〜８頁（ポリマーでカプセル化され、サルへと植え込まれた、ラットＰＣ１２細胞；また、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ、ＷＯ９２／１９５９５も参照されたい）；  Ｓａｖｅｌｋｏｕｌら、１９９４年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７０巻（２号）：１８５〜９６頁（カプセル化され、抗体を生成させる、ハイブリドーマ；カプセル化され、多様なサイトカインを発現するトランスフェクト細胞系）；  Ｗｉｎｎら、１９９４年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９１巻（６号）：２３２４〜８頁（ポリマー製免疫隔離デバイスによりカプセル化されてラットへと植え込まれ、ヒト神経増殖因子を発現する操作されたＢＨＫ細胞）；  Ｅｍｅｒｉｃｈら、１９９４年、Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１８巻（５号）：９３５〜４６頁（ポリマーでカプセル化され、ラットへと植え込まれた、ＰＣ１２細胞）；  Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、１９９４年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９１巻（２３号）：１０８９８〜９０２頁（ポリマーでカプセル化されてサルへと植え込まれ、ｈＮＧＦを発現する操作されたＢＨＫ細胞）およびＢｕｔｌｅｒら、ＷＯ９５／０４５２１（カプセル化されたデバイス）を参照されたい。次いで、細胞を、カプセル化形態で、動物宿主へと導入することができ、好ましくは哺乳動物へと導入することができ、より好ましくはそれを必要とするヒト対象と導入することができる。カプセル化物質が半透過性であり、カプセル化された細胞が生成させる分泌タンパク質の宿主への放出を可能とすることが好ましい。多くの実施形態では、半透過性のカプセル化が、カプセル化された細胞を、カプセル化された細胞が導入される宿主生物から免疫隔離する。これらの実施形態では、カプセル化された細胞が、１または複数の治療用タンパク質を、宿主種から発現する場合もあり、かつ／またはウイルスタンパク質もしくは宿主種以外の種に由来するタンパク質から発現する場合もある。
【０１８５】
代替的に、ビグリカン治療剤は、治療用ビグリカンタンパク質をコードする核酸である。したがって、それを必要とする対象には、特殊な組織、例えば、ジストロフィー性組織を特異的に標的としうる対象のタンパク質をコードする、ある用量のウイルスベクターを施すことができる。ベクターは、ネイキッド形態で投与することもでき、ウイルス粒子として投与することもできる（本明細書でさらに記載される）。この目的で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的の組織および細胞を修飾するために多様な技法が開発されている。トランスフェクション、および、場合によっては、ウイルスの宿主への組込みを可能とする上記のウイルスベクターなど、多数のウイルスベクターが開発されている。例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻、７５２９〜７５３３頁；  Ｋａｎｅｄａら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、３７５〜３７８頁；  Ｈｉｅｂｅｒｔら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、３５９４〜３５９８頁；  Ｈａｔｚｏｇｌｕら（１９９０年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６５巻、１７２８５〜１７２９３頁およびＦｅｒｒｙら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻、８３７７〜８３８１頁を参照されたい。ベクターは、注射、例えば、静脈内注射もしくは筋内注射を介して投与することもでき、吸入を介して投与することもでき、他の非経口方式を介して投与することもできる。また、リポソームを伴う複合体、または注射、カテーテル、もしくは遺伝子銃を介するＤＮＡの投与など、ウイルス以外の送達法も用いることができる。
【０１８６】
さらに別の実施形態では、細胞を対象から得、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて改変し、同じ対象または異なる対象へと導入する。治療剤化合物のさらなる投与方法を以下に示す。
【０１８７】
特定の実施形態では、ビグリカン治療剤を、マウスにおいて有効であった２、５、および１０ｍｇ／ｋｇの用量（実施例１３および１４を参照されたい）と同等な用量まで投与した。動物用量をヒト用量へと転換するための１つの尺度は、体表面積に基づくが、これは、インターネット上のｆｄａ．ｇｏｖ／ｏｈｒｍｓ／ｄｏｃｋｅｔｓ／９８ｆｒ／０２ｄ−０４９２−ｇｄｌ０００１−ｖｏｌ１．ｐｄｆにおける「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ：  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」において記載されている。この刊行物は、マウス用量を１２．３で除してヒト用量に到達することを推奨している。この変換係数を用いると、２、５、および１０ｍｇ／ｋｇのマウス用量に対応するヒト用量は、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．４１ｍｇ／ｋｇ、および０．８１ｍｇ／ｋｇである。したがって、一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドの投与用量が、０．１６〜０．８１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドの用量が、０．１〜１．５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１．２ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．２〜１．０ｍｇ／ｋｇ、または０．５〜１．５ｍｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、用量が、０．１〜１．２ｍｇ／ｋｇである。これらの用量は、例えば、１〜４週間ごとに、１〜２週間ごとに、２〜３週間ごとに、または３〜４週間ごとに投与することができる。
【０１８８】
Ａ．毒性
実施例８は、ｒｈＢＲＮがマウスに及ぼす毒性が低いことを示す。また、実施例８のアッセイを用いて、他のビグリカン治療剤の毒性を決定することもできる。ビグリカン治療剤の毒性および治療的有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学手順、例えば、ＬＤ５０（モデル生物集団のうちの５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療的に有効な用量）を決定するための手順により判定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を呈示する化合物が好ましい。毒性の副作用を呈示する化合物も用いうるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を軽減するためには、罹患組織部位をこのような化合物の標的とする送達系をデザインするように注意を払うべきである。
【０１８９】
細胞培養物によるアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて用いられる用量の範囲を処方するのに用いることができる。特に、ＡＣｈＲの凝集を強化するために治療剤を投与する場合は、刺激が所望される場合は刺激を、阻害が所望される場合は阻害を結果としてもたらす用量を確立することが望ましい。次いで、医学的試験において試験を継続することができる。このような化合物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。本明細書の方法で用いられる任意の化合物の場合、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度の範囲を達成することができる。このような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１９０】
Ｂ．医薬組成物
本開示に従い用いられる医薬組成物は、生理学的に許容される１または複数の担体または賦形剤を用いる従来の方式で調合することができる。したがって、治療剤およびそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、例えば、注射、吸入、もしくは送気を介する（口腔または鼻腔を介する）投与、または、経口投与、口腔内投与、非経口投与、もしくは直腸内投与のために調合することができる。
【０１９１】
このような療法では、ビグリカンによる組合せ治療剤を、全身投与および局所投与または局部化投与を含めた多様な投与負荷のために調合することができる。技法および処方は、一般に「Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出すことができる。全身投与の場合、筋内注射、静脈内注射、腹腔内注射、および皮下注射を含めた注射を用いることができる。注射用には、ビグリカン治療剤を、例えば、ハンクス液またはリンゲル液など、生理学的に適合性の緩衝液中の溶液に調合することができる。加えて、化合物を固体形態で調合し、使用の直前に再溶解または懸濁させることもできる。また、凍結乾燥形態も含まれる。
【０１９２】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、トウモロコシアルファデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または保湿剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など、薬学的に許容される賦形剤と共に、従来の手段により調製される錠剤またはカプセルの形態を取りうる。錠剤は、コーティングすることができる。当技術分野では、錠剤をコーティングする方法が周知である。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることもでき、使用前に水または他の適する媒体で構成するための乾燥製品として存在させることもできる。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または可食性水素化脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシアゴム）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または画分化された植物油）；および防腐剤（例えば、安息香酸メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）など、薬学的に許容される添加剤と共に、従来の手段により調製することができる。調製物はまた、必要に応じ、緩衝塩、芳香剤、着色剤、および甘味剤も含有しうる。
【０１９３】
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出をもたらすのに適した形で調合することができる。口腔内投与では、組成物は、従来の方式で処方される錠剤またはトローチの形態を取ることができる。吸入を介する投与では、ビグリカン治療剤を、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスの使用を伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの提示の形態で送達するのが簡便である。加圧型エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを施すことにより決定することができる。吸入器または注入器において用いられる、化合物の粉末ミックスおよびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースを含有する、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを調合することができる。
【０１９４】
化合物は、注射を介する、例えば、ボーラス注射または連続注入を介する非経口投与のために調合することができる。注射用の処方物は、防腐剤を添加した単位剤形、例えば、アンプルまたは複数回投与用の容器により提示することができる。組成物は、油性媒体中または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ることが可能であり、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの調合剤を含有しうる。代替的に、有効成分は、使用前に適切な媒体、例えば、滅菌の発熱物質非含有水で構成するための粉末形態でありうる。
【０１９５】
化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなど、従来の坐剤ベースを含有する坐剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物に調合することもできる。
【０１９６】
既に記載した処方物に加えて、化合物はまた、デポ剤調製物として調合することもできる。このような長期作用型処方物は、植え込み（例えば、皮下への植え込みまたは筋内への植え込み）により投与することもでき、筋内注射により投与することもできる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料と共に（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）調合することもでき、イオン交換樹脂と共に調合することもでき、可溶性の低い誘導体、例えば、可溶性の低い塩として調合することもできる。
【０１９７】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段を介しても可能である。経粘膜投与用または経皮投与用の処方物では、透過する障壁に適切な浸透剤を用いる。当技術分野では、このような浸透剤、例えば、経粘膜投与では胆汁塩およびフシジン酸誘導体が一般に公知である。加えて、洗浄剤を用いて、透過を容易にすることもできる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーを介する場合もあり、坐剤を用いる場合もある。局所投与では、当技術分野で一般に公知である通り、ビグリカン治療剤を、軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームへと調合する。洗浄液を局所的に用いて、損傷または炎症を処置し、治癒を加速化させることもできる。
【０１９８】
臨床状況では、本明細書で記載されるビグリカンおよび／またはユートロフィンをコードする治療剤遺伝子の遺伝子送達系を、当技術分野ではそれらの各々がよく知られた多数の方法のうちのいずれかを介して患者へと導入することができる。例えば、遺伝子送達系による医薬調製物は、例えば、静脈内注射を介して全身に導入することができ、標的細胞への構築物の特異的な形質導入は、主に、遺伝子送達媒体、受容体遺伝子の発現を制御する転写制御配列による細胞型もしくは組織型の発現、またはこれらの組合せによりもたらされるトランスフェクションの特異性から生じる。他の実施形態では、組換え遺伝子の初回送達の制約が大きく、動物への導入は極めて局部化される。例えば、遺伝子送達媒体は、カテーテルを介して（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）導入することもでき、定位注射を介して（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４年）、ＰＮＡＳ、９１巻：３０５４〜３０５７頁）導入することもできる。遺伝子治療用構築物内のビグリカンタンパク質をコードする遺伝子は、電気穿孔により、例えば、Ｄｅｖら（（１９９４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ、２０巻：１０５〜１１５頁）により記載される技法を用いて送達することができる。
【０１９９】
ＤＮＡを筋細胞へと送達する方式には、米国特許第５，８５８，３５１号において記載されているベクターなど、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いる方式が含まれる。代替的に、遺伝子は、Ｗｏｌｆｆら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻：１４６５〜１４６８頁；  Ａｃｓａｄｉら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：８１５〜８１８頁；  ＢａｒｒおよびＬｅｉｄｅｎ（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１５０７〜１５０９頁により記載されるプラスミドＤＮＡなどのプラスミドＤＮＡの直接注射によっても筋肉へと送達されている。しかし、この投与方式の結果としてもたらされる発現レベルは一般に、持続的ではあるが一般に低い。低くはあるが持続的な発現レベルは、本明細書の方法を実施するのに有効であると予測される。
【０２００】
遺伝子治療用構築物または遺伝子治療用ポリペプチドによる医薬調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子送達系またはポリペプチドから本質的になる場合もあり、遺伝子送達媒体または遺伝子送達化合物が組み込まれた徐放マトリックスを含む場合もある。代替的に、完全な遺伝子送達系を、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で生成させうる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を生成させる１または複数の細胞も含みうる。
【０２０１】
所望の場合、組成物は、有効成分を含有する１または複数の単位剤形を含有しうるパックまたは分注デバイスにより提示することもできる。例えば、パックは、ブリスターパックなど、金属製またはプラスチック製の箔を含みうる。パックまたは分注デバイスは、投与のための指示書を伴いうる。
【０２０２】
ＶＩＩ．ビグリカンによる組合せ治療剤のさらなる例示的な使用
ビグリカン治療剤はまた、ユートロフィン（ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）ポリペプチドなど、第２の治療剤と組み合わせた、細胞または組織培養物（例えば、成長しつつある器官系）に対する栄養補助物質としても用いることができる。任意の細胞型がこれらの栄養補助物質から利益を得る可能性がある。培養物へと添加される化合物の量は、小スケールの実験において、例えば、細胞または器官を、量を増大させる特定のビグリカンと共にインキュベートすることにより決定することができる。好ましい細胞には、真核細胞、例えば、筋細胞または神経細胞が含まれる。
【０２０３】
他の好ましい組織には、萎縮性組織が含まれる。したがって、このような組織を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、有効量のビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤などの第２の治療剤と共にインキュベートして、組織の萎縮を可逆化することができる。一実施形態では、萎縮性組織を対象から得、この組織を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、組織の萎縮を可逆化するのに十分な量のビグリカン治療剤およびユートロフィンなどの第２の治療剤と共に、組織の萎縮を可逆化するのに十分な時間にわたり培養し、次いで、この組織を、同じ対象または異なる対象に再投与することができる。
【０２０４】
代替的に、ビグリカン治療剤および第２の治療剤を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、筋ジストロフィー、またはビグリカン治療剤で処置しうる他の疾患を有する対象から得られる細胞または組織の培養物に添加して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるそれらの成長または生存を向上させることもできる。筋ジストロフィーまたは他の疾患を有する対象に由来する脳細胞または筋細胞などの細胞を維持する可能性は、例えば、疾患を処置する治療剤を開発するのに有用である。
【０２０５】
ＶＩＩＩ．組合せ治療剤
特定の実施形態では、ビグリカンを第２の治療剤と組み合わせる。一部の実施形態では、第２の治療剤がユートロフィンポリペプチドである。一部の実施形態では、治療剤が、抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、ｎＮＯＳ系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤である。
【０２０６】
ビグリカン治療剤は、任意の適切な抗炎症薬と組み合わせることができる。例示的な抗炎症剤には、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）およびセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）が含まれる。他の抗炎症剤および抗炎症剤のクラスには、副腎皮質ステロイド（コルチゾール、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、６Ｕ−メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾン）、非ステロイド剤、およびプロドラッグ（サリチル酸誘導体、すなわち、アスピリン）；パラアミノフェノール誘導体、すなわち、アセトアミノフェン；インドールおよびインデン酢酸（インドメタシン、スリンダクト、およびエトダルク）、ヘテロアリール酢酸（トルメチン、ジクロフェナク、およびケトロラク）、アリールプロピオン酸（イブプロフェンおよび誘導体）、アントラニル酸（メフェナム酸およびメクロフェナム酸）、エノール酸（ピロキシカム、テノキシカム、フェニルブタゾン、およびオキシフェンタトラゾン）、ナブメトン、および金化合物（オーラノフィン、金チオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム）が含まれる。
【０２０７】
ビグリカン治療剤は、筋肉量を増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。薬剤は、例えば、ＭＹＯ−２９（Ｐｆｉｚｅｒ）またはその類似体もしくは相同体など、ミオスタチンを阻害する抗体でありうる。筋肉量を増大させる他の例示的な薬剤には、ＡＣＥ−０３１（Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ）、ＡＭＧ−７４５（Ａｍｇｅｎ）、およびこれらの類似体、ならびにミオスタチンおよび関連のＴＧＦβファミリーメンバーを中和する他の薬剤が含まれる。
【０２０８】
ビグリカン治療剤は、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ユートロフィンのｍＲＮＡレベルを増大させる例示的な薬剤には、また、ＢＭＮ−１９５（ＢｉｏＭａｒｉｎ）とも称するＳＭＴ  Ｃ１１００（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｃｏｒｐ．）、およびユートロフィンをコードする外因性核酸が含まれる。
【０２０９】
ビグリカン治療剤は、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる例示的な薬剤には、ＳＭＴ  Ｃ１１００（また、ＢＭＮ−１９５とも呼ばれる）、Ｌ−アルギニン、およびモルシドミンが含まれる。
【０２１０】
ビグリカン治療剤は、ｎＮＯＳ系の活性を増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ｎＮＯＳ系の活性を増大させる例示的な薬剤には、タダラフィル（Ｃｉａｌｉｓ）、バルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ）、シルデナフィルシトレート（Ｖｉａｇｒａ）、およびＬ−アルギニンが含まれる。
【０２１１】
ビグリカン治療剤は、筋細胞膜の修復を促進する任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。筋細胞膜の修復を促進する例示的な薬剤には、組換えジスフェリン（Ｂａｎｓａｌ  Ｄら、「Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００４年４月；１４巻（４号）：２０６〜１３頁）、組換えＭＧ５３（Ｗａｎｇ  Ｘら、「Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｙ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＭＧ５３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｐａｉｒ」、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．、２０１０年７月９日；１０７巻（１号）：７６〜８３頁；  Ｅｐｕｂ、２０１０年５月１３日）、または組換えＣａｖ３（Ｃａｉ  Ｃら、「ＭＧ５３  ｎｕｃｌｅａｔｅｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ」、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００９年１月；１１巻（１号）：５６〜６４；  Ｅｐｕｂ、２００８年１１月３０日）が含まれる。
【０２１２】
ビグリカン治療剤は、筋再生を増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。筋再生を増大させる例示的な薬剤には、ＡＣＥ−０３１（Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ）およびＡＭＧ−７４５（Ａｍｇｅｎ）が含まれる。
【０２１３】
ビグリカン治療剤は、線維化を低下させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。当業者には、線維化関連の障害のための多様な処置が公知である。処置には、抗炎症剤、コルチコステロイド、ペニシラミン、およびコルヒチンが含まれる。例えば、Ｂｅｅｒｓ，  ＭＨおよびＢｅｒｋｏｗ，  Ｒ編、「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ」、７版、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９９９年を参照されたい。一部の実施形態では、抗線維化療法には、線維化促進因子アンタゴニストおよび／または抗線維化剤の投与が含まれる。このようにして、抗線維化療法は、例えば、阻害性抗体を用いて、線維芽細胞、線維芽細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血系単球前駆体分化、ならびに線維性組織の形成および維持を標的としうる。限定せずに述べると、本発明の療法の一部としてのアンタゴニストにより標的とされうる線維化促進因子には、β型形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β１〜５を含めたＴＧＦ−β）、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、インターロイキンファミリーのメンバー（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１３）、アルファ型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、１型単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、エンドセリン１、アンジオテンシンＩＩ、レニン、レプチン、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７）、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１、および線維性組織の形成、成長、または維持を促進するかまたはこれらと関連することが公知である他の因子が含まれる。特定の実施形態では、抗線維化療法が、線維化促進因子のうちの１または複数を指向する抗体を包含しうる。他の選択される実施形態では、可溶性受容体が、標的のリガンドについて、その対応する天然の細胞受容体と競合するように、抗線維化療法は、線維化促進因子および／またはサイトカインのうちの１または複数の受容体の可溶性形態を包含しうる。特定の実施形態では、抗線維化療法が、線維化促進因子および／またはサイトカインのうちの１または複数との関連でアンチセンスの少なくとも１つの配列を含有する、１または複数のオリゴリボヌクレオチドを包含しうる。特定の実施形態では、線維化促進因子アンタゴニストを、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、またはＢＭＰ−７（ＯＰ−１）など、抗線維化効果を有することが公知のサイトカインで置換することもでき、これらで増強することもできる。例えば、ＩＦＮ−γ１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）；ヒトインターフェロン）は、１４０アミノ酸の単鎖ポリペプチドである。ＩＦＮ−γ１ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えにより作製され、非グリコシル化される（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら（１９８４年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５９巻：６７９０〜６７９７頁）。一部の実施形態では、抗線維化薬が、ＨＴ−１００（Ｈａｌｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）など、ハロフジノン類似体である。
【０２１４】
ビグリカン治療剤は、ジストロフィン転写物におけるエクソンスキッピングを促進する任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進する例示的な薬剤には、ＡＶＩ−４６５８（ＡＶＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＲＯ５１およびＰＲＯ４４（Ｐｒｏｓｅｎｓａ  ａｎｄ  ＧＳＫ）が含まれる。Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  Ｈら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、２００９年９月；１１７５巻：７１〜９頁ではまた、エクソンスキッピングを媒介するアンチセンス治療剤も記載されている。
【実施例】
【０２１５】
本発明は、いかなる形であれ限定的なものとしてみなされるべきではない以下の実施例によりさらに例示される。本出願全体で引用される全ての参考文献（論文の参考文献、交付された特許、公開された特許出願を含めた）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２１６】
別段に示さない限り、本発明の実施は、当技術分野内にある、細胞生物学、細胞培養法、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ法、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９年）；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、１９８７年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）；「ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６年）を参照されたい。
【０２１７】
実施例１  内因性のビグリカンは未成熟筋におけるユートロフィンの発現を制御する
生後１４日目（Ｐ１４）、ユートロフィンは、シナプス周囲の筋鞘において高度に発現する（図１Ａ）（９）。ビグリカンの存在下および非存在下におけるユートロフィンの発現レベルを比較するために、本発明者らは、ｂｇｎ−／ｏマウスおよび年齢を適合させたコンジェニック対照に由来する筋切片を免疫染色した。全ての場合において、変異体の切片およびＷＴ切片を、同じスライドガラスガラス上にマウントし、併せて染色し、同時に画像化した（「材料および方法」）。図１Ａは、ｂｇｎ−／ｏ筋内のシナプス周囲の筋鞘では、ユートロフィンの発現が低下するのに対し、筋鞘におけるジストロフィンの発現は変化しなかったことを示す。各遺伝子型に由来する３匹ずつの動物の各々に由来する５０の筋鞘節を定量化したところ、ユートロフィンレベルが約２８％低下することが示された（図１Ｂ；ｂｇｎ−／ｏ：０．７２±０．０３、ＷＴ：１．０±０．０４、対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＜０．０００１）。これに対して、筋鞘におけるジストロフィンの発現には有意差が見られなかった（図１Ｃ；ｂｇｎ−／ｏ：１．０１±０．０３、ＷＴ：１．００±０．０３、対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．７６）。とりわけ、ユートロフィン転写物の量は、Ｐ１４におけるｂｇｎ−／ｏ筋と比較したＷＴにおいて識別不能であった（以下の本文および図１Ｄ）。これらの結果は、筋鞘におけるユートロフィンタンパク質の発現が、ビグリカンの非存在下では選択的に低下することを示す。
【０２１８】
実施例２  ｒｈＢＧＮによる処置は培養筋細胞における膜会合ユートロフィンを上方制御する
次に、本発明者らは、ユートロフィンの筋鞘との会合の制御におけるビグリカンの役割についてより正確に詳述するために、細胞培養系に目を転じた。本発明者らは、１ｎＭのｒｈＢＧＮでｂｇｎ−／ｏ筋管を刺激し、ウェスタンブロット法を介して膜画分中のユートロフィンレベルおよびγ−サルコグリカンレベルを評価した。図２Ａに示される通り、ｒｈＢＧＮによる処置は、これらの膜画分中のユートロフィンタンパク質およびγ−サルコグリカンタンパク質を上方制御する。他方、ｒｈＢＧＮによる処置の後、ユートロフィン転写物のレベルは低減された（非処置：１±０．１０；ｒｈＢＧＮによる処置：０．７±０．０６；対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０２；各々において３連ずつのフラスコによるｎ＝６の別個の実験）。したがって、膜におけるユートロフィンタンパク質の発現の上方制御は、その転写物レベルの上昇とは関連しない。
【０２１９】
上記の結果は、ビグリカンは、翻訳の増大、安定性の増大、および／またはユートロフィンの膜へのターゲティングを伴う機構を介してユートロフィンタンパク質を制御しうることを示唆する。これらの可能性を識別するため、本発明者らは、対照培養物中およびビグリカンで処置した培養物中のユートロフィンの総タンパク質レベルを評価した。図２に示される通り、ユートロフィンの総タンパク質レベルは、処置された筋管および処置されなかった筋管において識別不能である。膜結合画分が増大する条件下では、ユートロフィンの総細胞タンパク質の変化を検出できないことから、ビグリカンによりユートロフィンの膜との会合が制御されることが示される。
【０２２０】
実施例３  ｒｈＢＧＮの全身送達
ユートロフィンの膜への動員におけるビグリカンの役割は、内因性のビグリカンおよび筋内送達されたｒｈＢＧＮのいずれも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＤＡＰＣタンパク質を制御しうる（１５）ことを示す前出の結果と併せてまとめると、ｒｈＢＧＮがＤＭＤの治療剤でありうることを示唆する。この実験は、ｒｈＢＧＮが全身送達されうることを示す。捕捉ＥＬＩＳＡは、ｒｈＢＧＮが、腹腔内送達の３０および６０分後における循環中で容易に検出されることを示した（図７Ａ）。内因性のビグリカンを発現する組織において組換えタンパク質を検出するために（１３）、本発明者らは、動物にＡｌｅｘａ−５５５へとコンジュゲートしたｒｈＢＧＮを腹腔内注射した。図７Ｂに示される通り、注射の４８時間後、このｒｈＢＧＮは、筋細胞外マトリックスにおいて容易に検出される。これらの観察は、循環する組換えタンパク質が筋へと分配され、そこで、ＥＣＭと安定的に会合することを示す。この結果は、ｂｇｎ−／ｏマウスにおける単回筋内注射後少なくとも２週間にわたり、筋内送達されたｒｈＢＧＮが筋内で安定であるという本発明者らのかつての知見（１５）と合致する。この知見はまた、ｍｄｘマウスにおける単回注射の２週間後に観察されるｒｈＢＧＮの有効性とも符合する（以下で論じる）。まとめると、これらの知見は、ｒｈＢＧＮは全身送達することが可能であり、長期間にわたり筋肉に局在化しうることを示す。
【０２２１】
実施例４  ｒｈＢＧＮはｍｄｘマウスにおいてユートロフィンおよび他のＤＡＰＣの構成要素を上方制御する
次に、本発明者らは、ｒｈＢＧＮがｍｄｘマウスにおいてユートロフィンを上方制御しうるかどうかを問うた。ｒｈＢＧＮの単回腹腔内投与を約Ｐ１８のｍｄｘマウスへと送達し、２週間後に筋鞘におけるユートロフィンレベルを評価した。再生しつつある筋肉線維ではユートロフィンの発現が一過性に増大し（１６）、シナプス領域およびシナプス周囲領域で濃縮されることが知られている（８、１７）ため、本発明者らは、本発明者らの解析を、再生していない（末梢有核）筋線維のシナプス外域へと制約した。図３ＡおよびＢに示される通り、ｒｈＢＧＮによる処置は、ｍｄｘマウスの大腿四頭筋の筋鞘におけるユートロフィンの発現を、＞２．５倍に増大させた（媒体による処置：１．０±０．０５、ｒｈＢＧＮによる処置：２．５±０．０８、対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＜０．０００１、各群から２匹ずつの動物に由来する筋鞘節のｎ＝２００）。
【０２２２】
筋鞘におけるユートロフィンレベルはまた、前脛骨筋においても有意に上昇した（媒体：１．０±０．１、ｒｈＢＧＮ：１．７±０．１、対応のないスチューデントのｔ検定；各群から３匹ずつの動物に由来する筋鞘節のｎ＝３００）。また、γ−サルコグリカン、β２−シントロフィン、およびｎＮＯＳのレベルも、ｒｈＢＧＮの単回投与後の筋鞘において増大した（図４）。本発明者らは、α−シントロフィンレベルの変化を観察しなかった。γ−サルコグリカンおよびｎＮＯＳの増大は、細胞培養物における本発明者らの観察であって、ｒｈＢＧＮによる処置が、膜におけるこれらのタンパク質レベルを増大させた観察と合致する（図２）（１５）。さらに、ｂｇｎ−／ｏマウスでは、これらのタンパク質のほか、β２シントロフィンも制御異常である（１４、１５）。膜画分についてのウェスタンブロット法により、ｒｈＢＧＮによる処置は、ｍｄｘマウスにおけるユートロフィンおよびγ−サルコグリカンのいずれのレベルを増大させることの証拠がさらにもたらされた（図３ＣおよびＤ）。まとめると、これらの結果は、ｒｈＢＧＮによる処置は、ユートロフィンタンパク質およびＤＡＰＣタンパク質の発現を筋鞘に回復させることを示す。
【０２２３】
ｒｈＢＧＮで処置したｍｄｘにおけるユートロフィン転写物のレベルは変化しなかった（図３Ｃ）。この知見は、本発明者らのｂｇｎ−／ｏ筋によるｉｎ  ｖｉｖｏの結果および細胞培養の結果（図１および２）と合致し、ｒｈＢＧＮが、ｍｄｘマウスにおける転写後レベルのユートロフィンを制御することを示す。最後に、これらの結果は、ｒｈＢＧＮの効果が、６〜１３週間にわたる処置による複数回投与後にも観察しうることを示す（図３ＤおよびＥ）。まとめると、これらの免疫組織学的結果および生化学的結果は、全身送達されたｒｈＢＧＮが、ジストロフィー性マウスの膜におけるユートロフィンおよび他のＤＡＰＣタンパク質を上方制御しうることを示す。
【０２２４】
実施例５  ｒｈＢＧＮはｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態を軽減する
ｒｈＢＧＮがｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗するかどうかを決定するために、本発明者らはまず、約Ｐ１８のｍｄｘマウスにｒｈＢＧＮまたは媒体単独の単回腹腔内投与を行い、２または３週間後に筋肉を組織学的に評価した。図５Ａ（上パネル）は、媒体を注射したマウスに由来する横隔膜の切片が、高比率の中心核線維（ＣＮＦ）ならびに壊死／再生巣および単核細胞浸潤領域を含めた特徴的なジストロフィー性病態を提示することを示す（１８）。驚くべきことに、ｒｈＢＧＮによる処置の結果、ｒｈＢＧＮで処置したマウスに由来する筋肉において観察されるＣＮＦ比率が、約５０％低減された（媒体を注射した動物およびｒｈＢＧＮを注射した動物のそれぞれについて１７．７％±２．８および９．６％±１．７；対応のないスチューデントのｔ検定、Ｐ＝０．０２８、媒体を注射した動物のｎ＝１３およびｒｈＢＧＮを注射した動物のｎ＝１１；図５Ｂ）。本発明者らはまた、１、２、または１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＢＧＮを施されたマウスにおいて、筋損傷のマーカーである血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルも評価した。他の研究者らにより報告されている通り（１８）、ベースラインのＣＫレベルには実験間でかなりのばらつきが認められた。本発明者らは、これらの動物において、ＣＫレベルの低下への傾向を観察したが、データは統計学的有意性に到達しなかった（図９）。まとめると、これらの知見は、ｒｈＢＧＮによる処置が、ｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態を軽減することを示す。
【０２２５】
実施例６  ｒｈＢＧＮの有効性はユートロフィン依存的である
本発明者らは次に、ｒｈＢＧＮがｍｄｘマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗する能力が、ユートロフィンに依存するかどうかを問うた。ユートロフィンがｍｄｘマウスにおけるｒｈＢＧＮの作用に必要であるならば、ユートロフィンおよびジストロフィンの両方についてのマウス変異体の病態は、ｒｈＢＧＮの投与により影響されないであろう。図１０は、ｒｈＢＧＮまたは媒体を単回注射した後のｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−マウスにおいて再生した筋線維の組織学的特徴および数が、識別不能であったことを示す。したがって、少なくとも一部のユートロフィンは、ｒｈＢＧＮの高度な治療的有効性に必要である。
【０２２６】
実施例７  ｒｈＢＧＮによる処置はｍｄｘマウスにおける筋機能を向上させる
ＤＭＤの有効な処置は、筋機能を向上させる。ＤＭＤにおける筋線維病態、機能不全、および死亡の主要な原因のうちの１つは、収縮誘導性損傷に対する感受性の増大である。このような筋損傷は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、複数回の逐次的な遠心性（伸展）収縮（ＥＣＣ）の各回の後にもたらされる力を測定することにより評価することができる（１９、２０）。これらのｅｘ  ｖｉｖｏのｍｄｘ筋では、損傷に対する感受性が、一連のＥＣＣ後における力の低下の増大により証拠立てられる。本発明者らは、ｍｄｘマウスに、１５週齢まで３週間間隔（Ｐ１４に始まる）でｒｈＢＧＮまたは媒体を注射し、既に記載される通りに筋肉生理を測定した（２１、２２）。各回の連続ＥＣＣの後における力の低下量の低減により示される通り、ｒｈＢＧＮによる処置により、筋機能の測定値についての成績が改善された（図６ＣおよびＤ）。この改善は頑健であり、２回目のＥＣＣ以降統計学的に有意であった（図６Ｃ）。本発明者らは、発生した比力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ）の量を含め、筋機能の他のパラメータの変化は観察しなかった（表１）。このような生理学的改善のプロファイル（比力の変化を伴わない損傷に対する抵抗性の増大）は、ＡＡＶによるマイクロジストロフィン（Ｒ４〜Ｒ２３）の送達（２３）またはヘレグリンによる処置（２４）で観察されるプロファイルと類似する。したがって、ｒｈＢＧＮによる処置は、ｍｄｘマウスにおける筋機能を向上させる。
【０２２７】
【表１】
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実施例８  ｒｈＢＧＮはｍｄｘマウスにおいて十分に忍容される
本発明者らは、処置の３カ月後でもなお、ｍｄｘマウスにおけるｒｈＢＧＮ投与の有害な効果を観察していない。器官重量は、長年および広範にわたり受容されている薬理学的毒性の尺度である（２５、２６）。図１１Ａに示される通り、肝臓、腎臓、肺、または脾臓の重量に有意差は認められなかった。心臓の重量は８％減少した。動物の全体重は、媒体を投与した動物とｒｈＢＧＮを投与した動物とで同等であった。また、筋重量も、ｒｈＢＧＮで処置した動物において１７％大きいヒラメ筋を例外として変化しなかった。さらに、腎機能不全または肝機能不全の徴候も観察されなかった：１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の単回投与時には、血清クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、またはビリルビンのレベルの有意な変化は認められなかった（図１１Ｂ）。
【０２２８】
実施例９  実施例１〜８の材料および方法
ビグリカン
既に記載される通りに、非グリカン化組換えヒトビグリカン（ｒｈＢＧＮ）を、哺乳動物細胞において生成させ、精製した（１５）。この形態は、ＧＡＧ側鎖を欠く。Ａｌｅｘａ５５５タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、この蛍光剤をｒｈＢＧＮへとコンジュゲートした。
【０２２９】
動物および注射
全てのプロトコールは、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる同意および承認の下で実行した。単回注射では、Ｐ１６〜１９のマウスに２０ｍＭのトリス２５μＬ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．２％のＣＨＡＰＳ中に１００μｇのｒｈＢＧＮ、または媒体（２０ｍＭのトリス、０．５ＭのＮａＣｌ、０．２％のＣＨＡＰＳ）の腹腔内注射を施した。複数回注射されるマウスには、１００μｇのｒｈＢＧＮまたは媒体のさらなる腹腔内注射を３週間間隔で施した。最終回の注射の１３〜２５日後にマウスを捕獲した。追跡研究のため、成体ｍｄｘマウスにＡｌｅｘａ５５５で標識したｒｈＢＧＮの腹腔内注射を施し、４８時間後に横隔膜を摘出した。
【０２３０】
組織学的特徴および免疫組織化学的特徴
既に記載される通りに（１５）凍結切片を調製および染色した。ｂｇｎ−／ｏ解析では、Ｐ１４コンジェニックのｂｇｎ−／ｏ切片およびＷＴ切片を同じスライドガラスにマウントし、同時に免疫染色し、同じセッションで同一の曝露を用いて、冷却したＣＣＤカメラにより画像化した。注射されたマウス（媒体およびｒｈＢＧＮ）に由来する比較のための全ての切片もまた、併せてマウントし、染色し、画像化した。切片は、Ｎｉｋｏｎ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００顕微鏡およびＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＩＰ  ＬａｂスペクトルソフトウェアまたはＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）により収集される画像を用いて観察した。ユートロフィンおよびジストロフィンの免疫反応の強度は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）またはＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて定量化した。本発明者らはまた、間質腔における構造であって、一部の実験においてユートロフィンの増大を示す血管でありうる構造も観察した（図３）。これらの構造は、本発明者らの測定値には組み入れなかった。筋鞘節の平均（ａｖｅｒａｇｅ）ピクセル強度を測定し、これらから平均（ｍｅａｎ）のバックグラウンド（各状態に由来する筋鞘以外の領域を測定することにより決定する）を減じた。平均（ａｖｅｒａｇｅ）バックグラウンドレベルは、状態間で識別不能であった。ｍｄｘマウスにおける解析は、各状態２匹ずつのマウスに由来する大腿四頭筋および各状態３匹ずつのマウスに由来するＴＡにおいて実施した。ＣＮＦの百分率を記録するため、Ｈ＆Ｅ染色した切片内の壊死／再生巣を別として、全ての断面化された筋線維を、２０倍の対物レンズ下でカウントした（筋切片１個当たり２７０〜１，９１３本の線維）。
【０２３１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析
ユートロフィン転写物のレベルは、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。培養法、溶解物の調製、および膜画分、ならびにウェスタンブロットによる解析は、以下で詳述される標準的な手順を介する。
【０２３２】
筋肉生理
前述の通り、ｍｄｘマウスに、ｒｈＢＧＮ（動物１匹当たり２５μｇずつ）または媒体を、Ｐ１４に始めて３週間ごとに腹腔内注射し、３．５カ月齢のとき、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＥＤＬ筋の生理学的特性を解析した（２１、２２）。筋長は、最大の単収縮応答を達成するように調整し、この長さ（Ｌｏ）を測定した。最大上刺激を７００ミリ秒とし、総伸展を１０回の平均Ｌｏとし、伸展速度を０．５Ｌｏ／秒とする標準的なＥＣＣプロトコールによる各強縮について、遠心性収縮力の減少を計算した。上記の通りにＥＤＬ切片を得、画像を収集した。断面積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて測定した。
【０２３３】
ウェスタンブロット解析
細胞膜調製物のために、ビグリカンヌル筋管をＰＢＳ中で洗浄し、組織培養フラスコから掻爬し、解剖緩衝液（０．３Ｍのスクロース、ｐＨ７．４の３５ｍＭトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤混合物；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中でホモジナイズした。試料を、４℃、７，０００×ｇで５分間にわたり遠心分離した。次いで、上清を、４℃、３８，０００×ｇで６０分間にわたり遠心分離することにより、膜を回収した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。ビグリカンヌル筋管から全タンパク質を抽出するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で２５分間にわたり可溶化し、溶解物を１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。大腿四頭筋および大腿二頭筋に由来する膜画分は、既に記載される通りに（Ｍｅｒｃａｄｏ  ＭＬら（２００６年）、「Ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ，  ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ，  ａｎｄ  ｎＮＯＳ」、ＦＡＳＥＢ  Ｊ）調製した。
【０２３４】
細胞画分または筋画分は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質をニトロセルロース膜へと導入した。全タンパク質染色（ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ｓｔｏｒｍ  Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により画像化した。ブロットを一次抗体と共にインキュベートした後、ヤギ抗マウスＩｇＧをＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へとコンジュゲートした。シグナルは、Ｓｔｏｒｍ  Ｉｍａｇｅｒを用いるＥＣＬ  ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。
【０２３５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
注射されたｍｄｘ動物に由来するビグリカンヌル筋不死化細胞系および大腿四頭筋からのＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、精製されたＲＮＡを、ｃＤＮＡへと転換した。ｑＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７３００リアルタイムサーモサイクラーにおいてＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。プライマーは、ＤＳ  Ｇｅｎｅプライマーデザインソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を用いてデザインした。正規化のためにＡＴＰシンターゼを用いた。データ解析は、検量線法（Ｂｉｇｇａｒ  ＷＤら（２００４年）、「Ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：  Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ、１４巻：４７６〜４８２頁）を用いて実施した。
【０２３６】
用いたプライマーは、以下の通りであった：ＡＴＰＳアーゼのフォワードプライマー：５’−ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’（配列番号１４）；ＡＴＰＳアーゼのリバースプライマー：５’−ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧ（配列番号１５）；ユートロフィンのフォワードプライマー：５’−  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＣＣ（配列番号１６）；ユートロフィンのリバースプライマー：  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  Ｃ（配列番号１７）（ｇｉ１１０４３１３７７；３’ＵＴＲ：塩基１０３８３〜１２３８２の間）。
【０２３７】
動物
Ｃ３Ｈバックグラウンドにおけるコンジェニックのビグリカンヌルマウスを、前述の通り（Ｍｅｒｃａｄｏら、２００６年）に発生させ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＷＴ  Ｃ３Ｈと比較した。Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−ｍｄｘ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ−／−マウスは、記載されている（Ｍａｎｎ  ＣＪら（２００１年）、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８巻：４２〜４７頁）通りに飼育した。
【０２３８】
抗体
以下の一次抗体を用いた：抗ユートロフィンモノクローナル抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、ウサギ抗ユートロフィン抗体（Ｓ．Ｆｒｏｅｈｎｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡにより恵与される）、Ｑ：２ウサギ抗ジストロフィン抗体（Ａｂｃａｍ）、抗γ−サルコグリカンモノクローナル抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）、ウサギ抗ラミニン抗体（Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗β２−シントロフィン抗体（ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ  ＪＣら（２００７年）、「Ｌｏｃａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＰＲＯ０５１」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５７巻：２６７７〜２６８６頁）、およびウサギ抗ｎＮＯＳ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。抗ビグリカンモノクローナル抗体（２Ａ５）（Ｍｅｒｃａｄｏら、２００６年）、およびウサギ抗ビグリカン抗体（Ｂｏｗｅ  ＭＡ、Ｍｅｎｄｉｓ  ＤＢ、Ｆａｌｌｏｎ  ＪＲ（２０００年）、「Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａｌｐｈａ−ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｓｃｌｅ」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１４８巻：８０１〜８１０頁）の特異性は、ウェスタンブロット（Ｍｅｒｃａｄｏら、２００６年、Ｂｏｗｅら、２０００年、Ｒａｆｉｉ  ＭＳら（２００６年）、「Ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａｌｐｈａ−  ａｎｄ  ｇａｍｍａ−ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０９巻：４３９〜４４７頁）、およびＥＬＩＳＡ（実施例３）により確立し、これらの試薬をビグリカンヌル試料において調べたところ、反応性は観察されなかった。以下の二次抗体を用いた：  Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ５５５ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ、およびＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ。
【０２３９】
細胞培養物
不死化ビグリカンヌル細胞は、既に記載されている通りに（Ｍｅｒｃａｄｏら、２００６年）成長させた。細胞を４〜５日間にわたり分化させ、次いで、分化培地中に１ｎＭのｒｈＢＧＮで８時間にわたり処置した。
【０２４０】
血清化学反応
心穿刺によりｒｈＢＧＮを注射したマウスおよび媒体を注射したマウスから血液を回収し、３，３００ＲＰＭで１０分間にわたりスピンして血清を分離した。血清クレアチンキナーゼ、ＢＵＮ、クレアチニン、ＡＳＴ、および総ビリルビンの解析は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｄａｖｉｓ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。
【０２４１】
血清におけるｒｈＢＧＮの検出
成体Ｃ５７／Ｂ６マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＢＧＮを腹腔内注射し、注射の３０分間、１時間、および２４時間後に心穿刺により血液を回収した（条件１つ当たりのマウスのｎ＝３〜４）。対照実験は、同等なレベルのｒｈＢＧＮが血漿中に存在する（注射の１時間後に０．１２μｇ／ｍＬ；ｎ＝２）ことを示した。結合部位が２つのＥＬＩＳＡでは、プレートをマウス抗ビグリカン抗体でコーティングし、ブロッキングし、血清試料または基準物質ビグリカン希釈液と共にインキュベートした後、ウサギ抗ビグリカン抗体およびヤギ抗ウサギＨＲＰ抗体と共にインキュベートした。アッセイの感度は、約５ｎｇ／ｍＬであった。
【０２４２】
実施例１０  異なるビグリカン形態の調製および特徴づけ
ビグリカンは、プロテオグリカン（ＰＧ）形態および非グリカン化（ＮＧ）形態のいずれとしても発現する細胞外マトリックスタンパク質である。ビグリカン（ｂｉｇｌｙｖａｎ）のプロテオグリカン形態は、セリン５またはセリン１０（番号付けは、成熟ポリペプチドの配列に基づく）において付加されうる１つまたは２つのグリコサミングリカン側鎖を含有する。
【０２４３】
本発明者らは、組換えＤＮＡ法を用いて、ビグリカンの変異体形態であって、ＧＡＧ付加部位でありうる２つのセリンをアラニンへと変異させた変異体形態を創出した。この変異体を、「Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ」、または「ＳＡ」と称する。本発明者らはまた、野生型構築物も作製した。全ての構築物は６−ＨＩＳタグ付けされ、ヒトビグリカン配列に基づいた。接頭辞である「Ｈｉｓ」を用いて、このタグの存在を示す。
【０２４４】
本発明者らは、３つのビグリカン形態（ＰＧ、ＮＧ、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ）を生成させ、解析した。全てのビグリカン形態は、ＨＥＫ２９３細胞により作製し、ニッケルクロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとの組合せにより精製した。図１３および１４に示される通り、これらの調製物は、＞９０％の純度であった。具体的に、図１３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した後、クーマシー染色を施した、ビグリカンの非グリカン化（ＮＧ）形態およびプロテオグリカン形態（ＰＧ）を示す。図１４は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００  Ｐｒｏｔｅｉｎ８０チップアッセイにより解析した、ビグリカンのＮＧ形態およびＰＧ形態についての解析を示す。ビグリカンのＮＧ形態では、見かけの質量が５５．９ｋｄであり、純度は９２．６％であった。ビグリカンのＮＧ形態とＰＧ形態との混合物では、見かけの質量が５８．９ｋｄであり、純度は７４％であった。ビグリカンのＰＧ形態では、見かけの質量が６０ｋｄであり、純度は決定されなかった。
【０２４５】
また、図１５および１６で示す通り、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ調製物の純度も＞９０％であった。具体的に、図１５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した後、クーマシー染色を施したＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンについての解析を示す。図１６は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００によるＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンについての最後の解析を示す。見かけの質量は４６．３ｋｄであり、純度は９３．２％であった。
【０２４６】
ウェスタンブロットデータは、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａが、ＳＤＳゲル上において、ＮＧより速く泳動することを示し、これは、Ｓ５および／またはＳ１０におけるＯ結合型グリコシル化の存在と符合する（図１７）。図１７は、組換え非グリカン化（ＮＧ）ビグリカンおよびＳ５Ａ−Ｓ１０Ａ変異体のビグリカンについてのウェスタンブロット解析を示す。試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で泳動させ、ニトロセルロース膜へと移し、ビグリカン抗体でプローブした。「ｓｅｒ−ａｌ」とは、ＧＡＧ付加部位の両方に対する二重変異体（Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ）である。アミノ酸位置は、成熟タンパク質のものである。Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ変異体の泳動は、（野生型の）非グリカン化体より速かったことに注意されたい。これらのデータは、非グリカン化体におけるセリンの一方または両方が修飾されていることを示す。図１５におけるＮＧ試料の相対的泳動は、この図を作成するのに用いられたゲル系のために、図１３および１４における相対的泳動と比較して異なることに注意されたい。ＮＧ試料の全ては、同じ系で分離すると同じ泳動を示す。
【０２４７】
ガスクロマトグラフィーによるＮＧおよびＳ５Ａ−Ｓ１０Ａの総炭水化物についてのグリコシル解析は、それらの間には大きな差違が見られることを明らかにした（表２）。とりわけ、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａのグリコシル化の全体は、ＮＧにおけるグリコシル化の５７％であった。ＮＧにおいてはイズロン酸またはグルクロン酸が検出されなかったことから、ＮＧ調製物中にはＧＡＧが存在しなかったことが示される。比較のために述べると、イズロン酸およびグルクロン酸のいずれも、高度にＰＧプロテオグリカンに富む（以下の表２を参照されたい）。
【０２４８】
ＧＣ−ＭＳによりグリコシル組成物を決定する方法（表２）を、以下の通りに実行した。単糖組成物の解析に割り当てられた試料（非透析試料についての情報に基づき、約１２５μｇとされる）を、ねじ式栓のついた試験管に入れ、内部基準物質としての１０μｇイノシトールを添加し、凍結乾燥させた。次いで、１００℃で２時間にわたる、メタノール中に３ＭのＨＣｌを伴うメタノリシスの後に、メタノール中のピリジンおよび酢酸無水和物による再Ｎ−アセチル化（アミノ糖を検出するため）を介して、乾燥させた試料からメチルグリコシドを調製した。前出のメタノリシスステップおよび再Ｎ−アセチル化ステップを２回にわたり反復した。次いで、試料を、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により８０℃で０．５時間にわたりペル−Ｏ−トリメチルシリル化（ＴＭＳ）した。これらの手順を、既にＭｅｒｋｌｅおよびＰｏｐｐｅ（１９９４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２３０巻：１〜１５頁；  Ｙｏｒｋら（１９８５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１８巻：３〜４０頁において記載されている通りに実行した。Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＥＣ−１溶融シリカキャピラリーカラム（３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）を装備し、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ５９７０ＭＳＤへとインターフェースされた、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ５８９０ガスクロマトグラフにより、ＴＭＳメチルグリコシドについての解析を実施した。
【０２４９】
【表２】
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ビグリカンの異なる形態を、レクチンブロット法によりさらに特徴づけた（図２３）。組換えビグリカン（ｂｉｌｇｙｃａｎ）試料であるＮＧ（非グリカン化体）、ＰＧ（プロテオグリカン）、ＳＡ（変異体）、および対照のＢＳＡ、カルボキシペプチダーゼＹ（ａ）、トランスフェリン（ｂ）、およびアシアロフェツイン（ｄ）をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓにより染色した。フェツイン（ｃ）は、おそらくこの糖タンパク質が高度にグリコシル化およびシアリル化しているため、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓではほとんど染色されなかった。ＰＧは、ＭＡＡおよびＤＳＡで染色された。ＳＡは、ＧＮＡおよびＭＡＡでわずかに染色され、ＳＮＡおよびＤＳＡで強く染色された。これらの結果は、ＮＧタンパク質およびＳＡタンパク質におけるグリカンが、末端のマンノース、ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃおよびＧａｌβ（１〜４）ＧｌｃＮＡｃまたは末端ＧｌｃＮＡｃへと（２〜６）および（２〜３）連結されたシアル酸を有するのに対し、ＰＧタンパク質のグリカンは、ＧａｌおよびＧａｌβ（１〜４）ＧｌｃＮＡｃまたは末端のＧｌｃＮＡｃ構造へと（２〜３）連結されたシアル酸を含有することを示す。
【０２５０】
ＤＩＧグリカン差別化キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてレクチンブロット法を実行した。略述すると、試料および対照をニトロセルロース膜へとブロットした（１μｇの試料、陽性対照、および陰性対照）。膜をブロッキング溶液中に浸漬した（キットにより供給される）後、ＴＢＳ中１μｇ／ｍｌのジゴキシゲニンで標識したレクチンと共にインキュベートした。７５０ｍＵのアルカリホスファターゼとコンジュゲートした二次抗体としてのヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体および発色試薬としてのニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートを用いて結合活性を画像化した。カルボキシペプチダーゼＹ（ａ：ＧＮＡ陽性）、トランスフェリン（ｂ：ＳＮＡ陽性）、フェツイン（ｃ：ＭＡＡ陽性）、およびアシアロフェツイン（ｄ：ＰＮＡおよびＤＳＡ陽性）を陽性対照として用いた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照として用いた。Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色を、膜におけるタンパク質を検出するために用いた。
【０２５１】
加えて、異なるビグリカン形態におけるＮ結合型グリコシル化の位置を決定した（図２４）。ＳＡタンパク質には、２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位が認められ、Ａｓｎ２４８およびＡｓｎ２８８が、Ｎ−グリコシル化のＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔコンセンサス配列内に見出される。ＳＡ変異体のビグリカンをトリプシンで消化し、グリコシル化したアスパラギン残基をアスパラギン酸残基へと転換するＨ２１８Ｏ中のＰＮＧアーゼＦで、糖ペプチドを脱グリコシル化した。グリコシル化したペプチドは、対応するグリコシル化されていないペプチドと比較して質量３Ｄａの増大を示す。親質量リストモニタリング法およびＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔアルゴリズムを用いるデータベース検索を伴うＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介して、ＳＡのグリコシル化部位であるＡｓｎ２４８およびＡｓｎ２８８はグリコシル化していることが示された。ＳＡに由来するＮ結合型グリコシル化部位のペプチドについての概要を図２４に示す。これらの結果は、ＳＡの２つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が完全にグリコシル化していることを示す。ＳＡにおけるアミノ酸の番号付けが、ＮＧのアミノ酸の番号付けと異なることは注意に値する。しかし、Ｎ−グリコシル化部位を含めたペプチド配列は、２つの試料間で同一であり、ＮＧ試料の番号付けは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて見出される番号付けと符合する。
【０２５２】
Ｎ結合型グリコシル化の解析を実施するために、５０マイクログラムのＳＡビグリカンを、５５℃、２５ｍＭのＤＴＴで１時間にわたり還元し、暗所内、９０ｍＭのヨードアセトアミドで４５分間にわたりカルボキシアミドメチル化した。乾燥させた透析試料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）中で再懸濁させ、２５℃、２．５μｇのトリプシンで２０時間にわたり消化した。１００℃で５分間にわたりトリプシンを脱活性化させた後、次いで、試料を、３６μＬの１８Ｏ水（Ｈ２１８Ｏ）および１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３２μＬ中に２μｇのＰＮＧアーゼＦで脱グリコシル化した。
【０２５３】
標識したペプチドを２００μＬの移動相Ａ（水中に０．１％のギ酸）と共に再懸濁させ、次いで、試料を、高圧窒素ボンベ装置内、１，０００ｐｓｉ（約５ｕＬの負荷）で１０分間にわたり、Ｃ１８リバースプライマー相樹脂（１０．５ｃｍ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）によりセルフパッキングさせて、ナノスプレーテイパードキャピラリーカラム／エミッター（３６０×７５×１５μｍ、ＰｉｃｏＦｒｉｔ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）へとロードし、次いで、流速約５００ｎＬ／分で１６０分間にわたり移動相Ｂを増大させる直線勾配を介して、質量分析器へと直接分離した。
【０２５４】
ナノスプレーによるイオン供給源を装備したＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を実施した。ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔアルゴリズム（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、結果として得られるデータを、組換えＳＡ配列に照らして検索した。ＳＥＱＵＥＳＴパラメータは、前駆体イオン質量の公差３０．０ｐｐｍおよびモノアイソトピック質量によるフラグメントイオンの公差０．８Ｄａを許容するように設定した。トリプシンペプチドには、最大２つの逸失した内部切断部位が許容され、５７．０２１４６Ｄａ、１５．９９４９Ｄａ、および２．９８８２６Ｄａを差別化する修飾が、システインのアルキル化、メチオニンの酸化、およびアスパラギン酸の１８Ｏ標識のそれぞれに許容された。
【０２５５】
ＮＧ試料では、第１のステップを除く上記の手順の全てに従った。４０マイクログラムのＮＧを、５５℃、２５ｍＭのＤＴＴで１時間にわたり還元し、暗所内、９０ｍＭのヨードアセトアミドで４５分間にわたりカルボキシアミドメチル化した。乾燥させた透析試料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）中で再懸濁させ、２５℃、２μｇのトリプシンで２０時間にわたり消化した。１００℃で５分間にわたりトリプシンを脱活性化させた後、次いで、試料を、３６μＬの１８Ｏ水（Ｈ２１８Ｏ）および１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３２μＬ中に２μｇのＰＮＧアーゼＦで脱グリコシル化した。
【０２５６】
まとめると、これらのデータは、ビグリカンの「非グリカン化」形態およびＳＡ変異体形態は、一部の炭水化物部分を含有するが、これらは、ビグリカンのプロテオグリカン形態とは異なることを示す。
【０２５７】
ＮＧとＳ５Ａ−Ｓ１０Ａとについての生体活性の比較は、異なる活性を示した。Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａが、二相的な応答（強化および脱強化）を示すのに対し、ＮＧは、三相的な応答（強化、脱強化、および阻害）を示す（図１８）。図１８（上パネル）は、細胞培養物によるバイオアッセイにおけるＮＧおよびＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンの生体活性を示す。初代培養のニワトリ筋管を、１Ｕの精製アグリンおよび多様な濃度のＮＧまたはＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンで処置した。次いで、記載されている通りに（Ｎａｓｔｕｋら、１９９１年、ＰＭＩＤ、１６６０２８６）、３連の培養物中の筋管節１つ当たりのＡＣｈＲクラスターの数をカウントした。アグリン単独により誘導されるＡＣｈＲクラスター化のレベルを水平の点線で示す。Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａは、低濃度（≦０．０５μｇ／ｍｌ）では強化を示し、高濃度の全てでは脱強化を示すことに注意されたい。これに対して、ＮＧビグリカンは、≦０．０５μｇ／ｍｌでは強化を示すが、次いで、高濃度では脱強化および阻害を明示する。ＳＡおよびＮＧと比較して、ＰＧは、ＡＣｈＲのクラスター化に対して著しく異なる効果を示す（下パネルを参照されたい）。
【０２５８】
本発明者らは、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性であることを見出した。Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａのｍｄｘマウスへの全身注射は、血清クレアチンキナーゼレベルの測定により評価される筋細胞の損傷を軽減した（図１９）。図１９は、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンが、ｍｄｘマウスにおける筋損傷を軽減することを示す。Ｐ１８のｍｄｘマウスに、毎週１回２週間にわたり媒体またはＳ５Ａ−Ｓ１０Ａビグリカンを腹腔内注射し、血清クレアチンキナーゼ（ｓＣＫ）レベルを測定した。ビグリカンを注射した動物では、ｓＣＫレベルが２分の１未満に低減された（Ｐ＜０．０１；ｎ＝４）。
【０２５９】
図２０は、Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ  ｒｈＢＧＮの機能的有効性を示す。ｍｄｘマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＳＡ−ｒｈＢＧＮを、表示される間隔で３カ月間にわたり腹腔内注射した。単離筋について遠心性収縮を測定した。筋長は、最大の単収縮応答を達成するように調整し、この長さ（Ｌｏ）を測定した。最大上刺激を７００ミリ秒とし、総伸展を１０回の平均Ｌｏとし、伸展速度を０．５Ｌｏ／秒とする標準的なＥＣＣプロトコールによる各強縮について、遠心性収縮力の減少を計算した。筋機能の向上における用量頻度反応関係は、図２０に明らかである。
【０２６０】
図２１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＡ−ｒｈＢＧＮの筋線維に対する効果を示す図である。Ｐ１８のｍｄｘマウスに表示用量のＳＡ−ｒｈＢＧＮを腹腔内注射し、ヒラメ筋について中心局在核を伴う筋線維の百分率を決定した。２週間後に横隔膜筋についても同じ測定を実施した。既に記載される通りに（Ｍｅｒｃａｄｏら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２００６年）、凍結切片を調製および染色した。切片は、Ｎｉｋｏｎ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００顕微鏡およびＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＩＰ  Ｌａｂスペクトルソフトウェア（Ｆａｉｒｆａｘ、ＶＡ）またはＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）により収集される画像を用いて観察した。中心局在核の百分率を記録するため、Ｈ＆Ｅ染色した切片内の壊死／再生巣を別として、全ての断面化された筋線維を、２０倍の対物レンズ下でカウントした。
【０２６１】
実施例１１  ビグリカンの投与はＶＩ型コラーゲンレベルが欠損するマウスにおけるＶＩ型コラーゲンレベルを増大させる
野生型ＶＩ型コラーゲンを伴うビグリカンヌルマウスでは、ＶＩ型コラーゲンレベルが低減される。組換えビグリカンがｉｎ  ｖｉｖｏのこの系におけるＶＩ型コラーゲンレベルを回復させる有効性を調べるため、レスキュー法を用いた。組換えビグリカンをビグリカンヌルマウスの筋内へと注射し、ＶＩ型コラーゲンの発現を評価した。精製された組換え非グリカン化ビグリカンまたはプロテオグリカンを、５週齢のビグリカンヌル動物（合計６匹の動物）の右側大腿四頭筋へと注射した。動物内比較を可能とするため、媒体単独を左側大腿四頭筋へと注射した。各例では、溶液中に１．０％の墨汁を包含させることにより、注射部位を画像化した。図２２ａは、注射された組換えビグリカンであるプロテオグリカンが、筋周膜および筋外膜の注射部位に適切に局在化することを示す。
【０２６２】
注射されたビグリカンは、ビグリカンヌル筋におけるＶＩ型コラーゲンの発現に対して顕著な効果を及ぼした。注射の４日後までに、本発明者らは、ビグリカンによる染色領域と緊密に共局在化するＶＩ型コラーゲン発現の増大を観察した（図２２ｂ）。媒体を注射した筋肉では、ＶＩ型コラーゲンの上方制御が観察されなかった（データは示さない）。また、ＶＩ型コラーゲンの発現は、非グリカン化ビグリカンポリペプチドによっても上方制御された（データは示さない）。まとめると、これらの結果は、ビグリカンポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて筋肉へと送達することができ、そこで、間質および筋細胞表面におけるＶＩ型コラーゲンの発現レベルを増強しうることを示す。さらに、このレスキューは、ビグリカンの非グリカン化形態でも達成することができ、ビグリカンのプロテオグリカン形態でも達成することができる。
【０２６３】
実施例１２  Ｓ５Ａ−Ｓ１０Ａ  ｒｈＢＧＮの精製
タグ付けされていないＳ５Ａ−Ｓ１０Ａ  ｒｈＢＧＮを、以下のスキームにより精製した。第１に、変異体のビグリカンの凍結アリコートを、４℃で融解させた。完全に融解させたら、これらの試料を遠心分離して、任意の粒子状物質を除去した。次いで、０．４５μｍのシリンジフィルターを用いて上清を濾過した。次いで、濾過された試料を、脱イオン化水で１：３に希釈した。
【０２６４】
変異体のビグリカンを、１ｍＬ／分で、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＱＦＦ（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）アニオン交換カラムへと適用した。まず、カラムを、ＱＦＦ  Ａ緩衝液（ｐＨ８．５の２０ｍＭトリス；５０ｍＭのＮａＣｌ）中で平衡化した。結合しなかった試料は、ＱＦＦ  Ａを用いてカラムから洗い流し、試料の適用および洗浄時に４ｍＬの画分を回収した。変異体のビグリカンは、２つの段階勾配（４０カラム容量にわたる０〜５０％のＢ；５カラム容量にわたる５０〜１００％のＢ；ＱＦＦ  Ｂ緩衝液は、ｐＨ８．５の２０ｍＭトリス；１ＭのＮａＣｌからなる）のうちの第１の部分に溶出した。１ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびクーマシー染色のためにサンプリングした。変異体のビグリカンを含有する画分を、次の精製ステップのためにプールした。図２５は、アニオン交換による精製ステップのために得られた溶出プロファイルおよびクーマシー染色を示す。
【０２６５】
アニオン交換からプールされた画分を、１Ｍのクエン酸ナトリウムと１：１で混合し、最終クエン酸ナトリウム濃度を５００ｍＭとした。タンパク質を、１ｍＬ／分で、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＢｕｔｙｌＳ  ＦＦ（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）カラムへと適用した。まず、カラムを、ＨＩＣ  Ａ緩衝液（ｐＨ８．５の２０ｍＭトリス；２００ｍＭのＮａＣｌ；５００ｍＭのクエン酸ナトリウム）中で平衡化した。結合しなかった試料は、ＨＩＣ  Ａを用いてカラムから洗い流し、試料の適用および洗浄時に４ｍＬの画分を回収した。変異体のビグリカンは、２０カラム容量にわたる１００〜０％のＢにわたり溶出させた（ＨＩＣ  Ｂ緩衝液は、ｐＨ８．５の２０ｍＭトリス；２００ｍＭのＮａＣｌからなる）。０．７５ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析ならびに銀染色およびクーマシー染色の両方ためにサンプリングした。図２６は、ＨＩＣによる精製ステップのために得られた溶出プロファイルおよびクーマシー染色を示す。
【０２６６】
実施例１３  タグ付けされていないマウスビグリカンはマウスによる急性研究におけるジストロフィーマーカーを低減する
タグ付けされていないＴ２ビグリカンのマウス形態およびヒト形態を生成させて調べた。図２７に示される通り、Ｔ２ビグリカンによる処置は、全身注射された（合計２週間にわたり毎週１回）ｍｄｘマウスにおけるｓＣＫレベルおよび中心核レベルの有意な低減を結果としてもたらした。２、５、および１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｓＣＫレベルの有意な低減（Ｐ＜０．０５；１群当たりの動物のｎ＝５〜７；ダネットの事後多重比較検定による１元配置ＡＮＯＶＡ解析）が認められた。１０ｍｇ／ｋｇで、ｓＣＫレベルは４．５分の１に低減された。処置された動物ではまた、中心核の百分率も低減された。１０ｍｇ／ｋｇの用量で、横隔膜ＣＮの百分率は、５４％低減された（ｐ＝０．０４；スチューデントのｔ検定；１群当たりの動物のｎ＝５〜７）。また、２および５ｍｇ／ｋｇの用量で、有効性への傾向（ｐ≒０．０６）も観察された。
【０２６７】
図２８で示す通り、２ｍｇ／ｋｇのＴ２  ｒＭｕＢＧＮは、大腿四頭筋に由来する膜画分中のユートロフィンのタンパク質レベルを１．５倍に上昇させた（Ｐ＜０．０５；群１つ当たりの筋肉のｎ＝４〜５）。このアッセイにおいて、本発明者らは、ビグリカンを全身注射された（２週間にわたり毎週１回）マウスに由来する大腿四頭筋からＫＣｌで洗浄した膜を調製した。Ｓｔｏｒｍ画像化システムを用いるウェスタンブロットにより、ユートロフィンレベルを定量化した。
【０２６８】
これらの実験は、タグがビグリカンの治療的有効性に必要でないことを確認する。
【０２６９】
実施例１４  タグ付けされていないマウスビグリカンはマウスによる長期研究におけるジストロフィー性病態を軽減する
Ｔ２ビグリカンは、ＥＣＣにより判定される筋機能を向上させた。図２９で示す通り、２ｍｇ／ｋｇのＴ２−ｒＭｕＢＧＮによりｍｄｘマウスを処置した（１２週間にわたり毎週１回）結果、遠心性収縮による損傷に対する抵抗性が、媒体を注射した対照と比較して６３％向上した（ｐ＝０．００７；１群当たりの動物のｎ＝３〜４）。
【０２７０】
実施例１５  細胞培養物によるバイオアッセイにおいて用いられるヒトビグリカンの用量反応曲線
タグ付けされていないＴ２ビグリカンの用量範囲を、細胞培養物によるバイオアッセイによりアッセイした。図３０で示す通り、Ｔ２ビグリカンは、アグリンに誘導されるＡＣｈＲのクラスター化活性を、濃度範囲：０．００８〜０．２５６μｇ／ｍｌ（約０．２〜７ｎＭ）で３０倍超強化する。０．５１２μｇ／ｍｌ（１４ｎＭ）の高用量では、反応が、ほぼベースラインに戻る。本発明者らは、タグ付けされたｒＨｕＢＧＮ、タグ付けされたＴ２  ｒＨｕＢＧＮおよびタグ付けされていないＴ２  ｒＨｕＢＧＮ、ならびにＴ２  ｒＭｕＢＧＮを含め、本発明者らが調べたＧＡＧ側鎖を欠く全ての組換えビグリカンによる類似する用量反応プロファイルを観察した。
【０２７１】
タグ付けされていないＴ２ビグリカンは、マウスモデルにおいて、「Ｕの逆数」による同様の用量反応曲線を示す。図２７〜２９は、２０ｍｇ／ｋｇの用量より低用量（２および１０ｍｇ／ｋｇ）で高い有効性を示す。２および１０ｍｇ／ｋｇの用量は、３つの短期アッセイ（２週間にわたる処置）全て（ｓＣＫ、ＣＮ、ユートロフィン）のほか、長期（１２週間にわたる処置）のＥＣＣ測定においても有効性を示した（図２７〜２９）。しかし、ｓＣＫアッセイおよびＣＮアッセイのいずれにおいても、２０ｍｇ／ｋｇの用量では、ベースラインへの復帰がみられた。ユートロフィン反応およびＥＣＣでも同様の傾向が観察された。興味深いことに、これらの後者２つの例では、２ｍｇ／ｋｇの用量が、１０ｍｇ／ｋｇの用量に勝った。
【０２７２】
Ｔ２／ＮＧビグリカンについてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける用量反応プロファイルと細胞培養物による用量反応プロファイルとの一致は、この反応が、ビグリカンの固有な薬理学的特性に起因することを示唆する。このような薬理学的特徴に対する１つの蓋然的な説明は、Ｔ２／ＮＧビグリカンに対する高アフィニティーの結合部位および低アフィニティーの結合部位の存在である。また、二相的な応答が二量体としてのビグリカンの作用を反映する可能性もある（Ｓｃｏｔｔら、ＪＢＣ、２００６年）。用量反応曲線は、二量体がその（１または複数の）リガンドを架橋することが可能な好ましい濃度を反映しうるであろう。
【０２７３】
さらにまとめると、実施例１３〜１５は、ヒトビグリカンおよびマウスビグリカンのいずれもが、マウスモデルにおいて生理学的に関与性の効果を生成させることを例示する。これらの実験は、ビグリカンが、一部のアミノ酸配列の変化にかかわらず、その治療活性を保持することを示す。
【０２７４】
同等物
当業者は、単に日常的な実験を用いて、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、または確認しうるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包摂されることを意図する。
【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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