(57)【要約】本発明は、プトレシンを生産する微生物、及びそれを用いたプトレシンの生産方法に関し、より具体的には、本発明は、オルニチンからアルギニンへの生合成経路を遮断し、細胞内のグルタメートの量を増加させ、グルタメートからオルニチンを生産する生合成経路の活性を増加させ、オルニチン脱炭酸酵素を外部から導入することにより、プトレシン生産能が付与された微生物、及び前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が内在的活性より低下するように改変され、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシンを生産する微生物。
【請求項２】
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項３】
前記グルタメート排出に関与するタンパク質が、配列番号３０のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項４】
タンパク質の活性低下が、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、２）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、及び４）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項５】
前記オルニチン脱炭酸酵素が、配列番号４０のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項６】
ＯＤＣの活性導入が、ＯＤＣをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたＯＤＣを導入する方法、及びＯＤＣをコードする塩基配列の変異体を導入する方法からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項７】
さらに、オルニチンの生合成に関与するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性よりも増加したものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項８】
前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤが、それぞれ配列番号３３、３５、３７及び３９のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項７に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項９】
タンパク質の活性増加が、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、３）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び４）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、請求項７に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１０】
コリネバクテリウム属微生物である、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１１】
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１０に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１２】
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカム（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）である、請求項１０に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１３】
（ｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が低下するように改変され、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシン生産能が付与された微生物を培養して培養物を得る段階と、
（ii）前記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収する段階とを含む、プトレシンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プトレシンを生産する微生物、及びそれを用いたプトレシンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミン（polyamine）はほとんどの生細胞内に存在する物質である。ポリアミンに属するスペルミジン（spermidine）やスペルミン（spermine）は、バクテリア、カビ、動物など様々な種で見出される。このようなスペルミジン及びスペルミンの代謝において、前駆物質であるプトレシン（putrescine又は1,4-butanediamine）はグラム陰性バクテリアやカビで見出され、様々な種に高濃度で存在するので、代謝経路で重要な役割を果たすものと考えられる。
【０００３】
プトレシンは、アジピン酸（adipic acid）と反応してポリアミドナイロン４，６を合成する重要な原料物質であり、加工プラスチックの重要な原料として用いるために、主にプロピレン（propylene）からアクリロニトリル（acrylonitrile）及びスクシノニトリル（succinonitrile）を経て化学合成法で生産される。この化学合成法は、エネルギー消費の多い触媒的酸化反応段階、シアン化物（cyanide）のような有毒化合物を用いる段階、高圧水素を用いる水素化反応段階などを含む３段階の工程からなる。プトレシンの化学工程による生産は、環境にやさしくなく、石油資源の枯渇問題を抱えている。よって、プトレシンの生産のために、より環境にやさしく、エネルギー消費を削減できるバイオマスを活用した方法が求められている。
【０００４】
微生物におけるプトレシン生合成経路は、グルタメートからオルニチンの合成まではアルギニン生合成経路と同一である。中間物質として生成されたオルニチンの脱炭酸（decarboxylation）によりプトレシンを合成する経路と、アルギニン（L-arginine）からアグマチン（agmatine）を経てプトレシンを合成する経路の２つの経路が知られている。これら２つの経路は、代謝に必要なエネルギーを生成し、または酸化ストレス耐性を付与する。微生物を用いたプトレシンの生産方法としては、大腸菌とコリネバクテリウムを形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開されている。大腸菌におけるプトレシンの生産方法は、オルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase）とグルタメートアセチルトランスフェラーゼ（glutamate acetyltransferase）の発現量が増加することによって成され得、プトレシンの分解又は利用経路であるスペルミジン、アセチルスペルミジン（acetylspermidine）合成経路を省略することによって高濃度のプトレシンを生産することができる（非特許文献１，特許文献１，特許文献２）。また、プトレシン合成経路を経ないコリネバクテリウム属菌株においては、大腸菌由来のオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の導入によりオルニチンからプトレシンを生産する方法と、大腸菌由来のアルギニン脱炭酸酵素とアグマチナーゼ（Agmatinase）遺伝子の導入によりアルギニンからプトレシンを生産する方法がある。現に、オルニチン経路を介したほうがアルギニン経路より約５０倍高いプトレシンを生産することができる（非特許文献２）。
【０００５】
一方、大腸菌は４４ｇ／Ｌのプトレシン存在下で成長でき、コリネバクテリウムグルタミカムは６６ｇ／Ｌの濃度で成長できることが確認されている。よって、大腸菌より高濃度のプトレシン存在下で成長できるコリネバクテリウム属微生物菌株を用いてプトレシン生産用菌株を開発することが効果的であることが予想される。
【０００６】
コリネバクテリウム属菌株は、アミノ酸、核酸、酵素、及び抗生物質類似体の生産に広く用いられる産業用微生物である。コリネバクテリウム属菌株において、アルギニン（L-arginine）はグルタメートからａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ形態に形成されたアルギニンオペロン（operon）構造の遺伝子から発現した酵素により合成される。アルギニン生合成に最も重要な役割を果たすアルギニンオペロンの遺伝子は、細胞内で合成されたグルタメート（L-glutamate）を基質として用いてアルギニンを合成する。図２はコリネバクテリウム属菌株においてグルタメートからアルギニンを合成する経路を示す図である。アルギニン合成経路において、ａｒｇＪはグルタメートをＮ−アセチルグルタメート（N-acetylglutamate）に変換させ、ａｒｇＢはＮ−アセチルグルタメートをＮ−アセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に変換させ、ａｒｇＣはＮ−アセチルグルタミルホスフェートをＮ−アセチルグルタメートセミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に変換させ、ａｒｇＤはＮ−アセチルグルタメートセミアルデヒドをＮ−アセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換させ、ａｒｇＪはＮ−アセチルオルニチンをオルニチンに変換させ、ａｒｇＦはオルニチンをシトルリン（L-citrulline）に変換させ、ａｒｇＧはシトルリンをアルギニノスクシネート（argininosuccinate）に変換させ、ａｒｇＨはアルギニノスクシネートをアルギニンに変換させる酵素をコードすることが知られている。
【０００７】
従来から公知のアルギニン生産菌株は、アルギニンオペロンに突然変異を導入したり、プロモーター（promoter）などの変異により、アルギニン生合成に関する酵素の発現量を増加させる方法が開発されている。そのうち、アルギニンオペロンの遺伝子の発現を調節して抑制するａｒｇＲと、アルギニン濃度により阻害されるａｒｇＢが、アルギニンの生産量を増加させるための標的として広く研究されている（特許文献３）。
【０００８】
プトレシン生合成経路のうち、グルタメートからオルニチンの合成まではアルギニン生合成経路と同一であり、合成されたオルニチンからオルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase, ODC）によりプトレシンが生成される。よって、プトレシンの高い生産能を有する菌株を作製するためには、プトレシンの前駆体物質であるオルニチンを十分に生産する必要がある。野生型大腸菌Ｗ３１１０のａｒｇＦとａｒｇＲが欠失した菌株においてグルタメートを添加するとオルニチン生産が２０％増加し、グルタメートからオルニチンへの経路以外に、グルタメートからプロリンを生成する経路の最初の段階に関与するガンマグルタミルキナーゼ（γ-glutamylkinase）をコードする遺伝子ｐｒｏＢを欠失させた場合もオルニチンが増加することが知られている。これは、グルタメートの量を増加させた場合にオルニチン生産に肯定的な影響を及ぼすことを示すものである。
【０００９】
オルニチンの前駆体であるグルタメートの高収率生産に関する研究は、コリネバクテリウムグルタミカムを対象に長期間にわたって進められている。そのうち、コリネバクテリウムグルタミカムのグルタメート排出能はビオチン（biotin）欠乏条件やペニシリンＧ（penicillin G）又は脂肪酸エステル界面活性剤の処理時に増加することが報告されており、これは細胞壁が損傷している場合はグルタメートが細胞質からより多く排出されることを示すものである。
【００１０】
コリネバクテリウムグルタミカム野生型菌株（Ｃｇｌ１３０３２）由来のＮＣｇｌ１２２１タンパク質はベタイン（betain）排出を促進し、大腸菌の機械受容チャネル（mechanosensitive channel）タンパク質であるｙｇｇＢとアミノ酸配列が類似することが知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０６／００５６０３号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０９／１２５９２４号
【特許文献３】韓国公開特許第２０１０−００６０９０９号公報
【特許文献４】韓国公開特許第２０１０−００１７５８１号公報
【特許文献５】韓国公開特許第２００９−００８２７０２号公報
【特許文献６】韓国登録特許第０６２００９２号公報
【特許文献７】韓国公開特許第２００８−００３４３３４号公報
【特許文献８】韓国公開特許第２００８−００７４２８６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Qian. ZD. et al., Biotechnol. Bioeng. 104:4，651-662, 2009
【非特許文献２】Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:4，859-868, 2010
【非特許文献３】EMBO J. (1982) 1:853-857
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような背景から、本発明者らはプトレシンをより高収率で生産できる菌株を開発するために鋭意研究を重ねた結果、オルニチンからアルギニンへの生合成経路を遮断し、細胞内のグルタメートの量を増加させ、グルタメートからオルニチンを生産する生合成経路の活性を増加させ、オルニチンからプトレシンを合成できる酵素であるオルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase）を外部から導入することにより、プトレシン過剰生産菌株を開発し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、プトレシン生産能が付与された微生物を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のプトレシン生産能が付与された微生物は、より効果的なプトレシン製造に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の形質転換されたコリネバクテリウムグルタミカムにおけるプトレシン生合成経路及び関連遺伝子を示す図である。
【図２】公知のコリネバクテリウムグルタミカムのアルギニン生合成経路を示す図である。
【図３】コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入ベクターｐＤＺベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
上記本発明の目的を達成するための一実施形態として、本発明は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が内在的活性より低下し、オルニチン脱炭酸酵素の活性が導入された、プトレシンを生産する微生物を提供する。
【００１９】
本発明における「オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase, OCT）」という用語は、カルバモイルリン酸とオルニチンの反応を介してシトルリンとリン酸を生成する触媒活性を示す酵素を意味し、尿素排出動物の肝臓だけでなく、植物や微生物にも存在し、微生物においてはアルギニンの合成過程に関与する。前記酵素は触媒機能部位と調節機能部位を含むが、前記調節機能部位にオルニチンが結合すると酵素の活性が阻害される。
【００２０】
大腸菌Ｋ１２株の場合は２種類（ａｒｇＦ，ａｒｇＩ）のＯＣＴを有し、大腸菌Ｂ及びＷ株を含む腸内微生物の場合はａｒｇＩに類似した１種類のＯＣＴを有する。ａｒｇＦ及びａｒｇＩによりコードされるＯＣＴは、アミノ酸配列は異なるが、同じ機能を有するアイソザイム（isoenzyme）であるといえる（非特許文献３）。コリネバクテリウム属微生物には、ａｒｇＦ遺伝子によりコードされるＯＣＴのみ存在する。ＯＣＴはオルニチンからアルギニンを合成する経路で作用するので、ＯＣＴの活性を低下させると、細胞内のオルニチンの生成量を増加させることができる。
【００２１】
本発明においては、プトレシンの前駆体であるオルニチンがアルギニンに変換されることを防ぐために、オルニチンからアルギニンに変換される経路が遮断されたコリネバクテリウム属微生物を提供するが、このために前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させた形質転換菌株を製造した。
【００２２】
ここで、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼは、特にこれに限定されるものではないが、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２３】
本発明における「相同性」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列の類似程度を意味し、相同性が十分に高いと、該当遺伝子の発現産物は同一又は類似の活性を有する。
【００２４】
本発明における「グルタメート排出に関与するタンパク質（glutamate exporter）」という用語は、細胞内で生成されたグルタメートを細胞外に排出する役割を果たすタンパク質であり、機械受容チャネル（mechanosensitive channels）の一種を意味する。
【００２５】
本発明においては、プトレシンの生産能が付与されたコリネバクテリウム属微生物を提供するが、このために前記プトレシンの前駆体であるオルニチンの合成の原料となるグルタメートを細胞外に放出するタンパク質をコードする遺伝子を欠失させ、細胞内のグルタメートの濃度を高いレベルに維持できる形質転換菌株を製造した。
【００２６】
オルニチンの前駆体であるグルタメートの細胞内含有量を増加させると、オルニチン生合成経路を促進することができるが、本発明においては、ＮＣｇｌ１２２１タンパク質の活性を低下させることにより、グルタメートの排出を減少又は除去することができる。
【００２７】
ここで、欠失したグルタメート排出に関与するタンパク質は、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号３０のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するタンパク質である。
【００２８】
前記タンパク質の活性低下は、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、２）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、又は４）それらの組み合わせなどを用いて行うことができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２９】
前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部又は全てを欠失させる方法は、細菌内の染色体挿入ベクターにより染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類により異なるが、具体的には１〜３００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個である。
【００３０】
また、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。
【００３１】
また、本発明の酵素をコードする、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記酵素の活性がより低下するように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【００３２】
前記プトレシンの前駆体であるオルニチンが細胞内に蓄積するように改変された微生物は、従来のオルニチン生産菌株の開発、すなわちアルギニン生合成経路の転写抑制因子であるａｒｇＲの機能をなくすか、低下させてオルニチンの生産を増加させ、さらにオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase）遺伝子を欠失させ、調節が解除されたＮ−アセチルグルタメートシンターゼ（N-acetylglutamate synthase）を導入してオルニチン生産を増加させる方法（特許文献３）とは異なるアプローチで製造された微生物である。
【００３３】
本発明における「内在的活性」という用語は、微生物が天然状態で有する酵素の活性状態を意味し、本発明においては微生物が天然に有するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性状態を意味し、本発明において「内在的活性よりも低下するように改変」されたとは、遺伝子の欠損又は突然変異により、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）が正常に作用せず、微生物が天然状態で有するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が低下した状態を意味する。
【００３４】
本発明における「オルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase, ODC）」とは、オルニチンを用いてプトレシンを生成する酵素を意味するが、前記ＯＤＣは補酵素としてピリドキサールホスフェート（Pyridoxal 5'-phosphate, PLP）を必要とし、ほとんどのグラム陰性菌に存在し、グラム陽性菌のうちラクトバシラス（Lactobacillus）のような腸内細菌の一部に存在する。大腸菌の場合、ＯＤＣをコードする遺伝子は２つあるが、そのうちの一方であるｓｐｅＣは持続的に一定濃度で発現し、他方のｓｐｅＦは特定条件（一定濃度以上のオルニチンの存在及び低いｐＨ条件）下で発現が誘導される遺伝子である。種によっては、大腸菌のように２種類のＯＤＣを有する種もあり、１種類しかない種もある。エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）などの種は２種類のＯＤＣ（ｓｐｅＣ，ｓｐｅＦ）を有し、エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）などの菌株は１種類のＯＤＣ（ｓｐｅＣ）を有する。乳酸菌の場合、ＯＤＣが１種類の遺伝子（ｓｐｅＦ）から発現され、低いｐＨやオルニチン（ornithine）とヒスチジン（histidine）が豊富な条件で発現が誘導されることが知られている。
【００３５】
前記ＯＤＣは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号４１のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列によりコードされるタンパク質である。
【００３６】
前述したように、微生物にオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性を導入することは当該分野で周知の様々な方法で行うことができるが、例えばＯＤＣをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたＯＤＣを導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の変異体を導入する方法などを用いることができ、前記ＯＤＣをコードする塩基配列を導入する場合は、この発現を調節するためのプロモーターとして配列番号４２のＣＪ７プロモーターを用いることが好ましい。
【００３７】
本発明の具体的な実施例においては、プトレシン生産能が付与されたコリネバクテリウム属微生物を提供し、このためにオルニチンからプトレシンを合成できるオルニチン脱炭酸酵素をコードする塩基配列を染色体内に導入し、プトレシンを生産できる形質転換菌株を製造した。
【００３８】
微生物により製造されたプトレシンは、大腸菌において、細胞内の分解経路により、スペルミジン（spermidine）、アセチルプトレシン（acetyl putrescine）、ガンマアミノ酪酸（g-aminobutyric acid, GABA）などに分解される。ＯＤＣは、ほとんどのグラム陰性菌に存在するが、コリネバクテリウム属微生物には存在しないことが知られている。よって、コリネバクテリウム属微生物を用いてプトレシン生産菌株を開発する場合、外来種のＯＤＣ導入は必要不可欠である。
【００３９】
本発明における「プトレシンの生産能が付与された微生物」又は「プトレシンを生産する微生物」という用語は、プトレシンの生産能がない母菌株にプトレシンの生産能が付与された微生物を意味するが、前記プトレシン生産能が付与されるか、又はプトレシンを生産する微生物は、特にこれらに限定されるものではないが、グルタメートからオルニチン合成までの生合成経路の強化のために、グルタメートをアセチルグルタメート（N-acetylglutamate）に変換するアセチルグルタメートシンターゼ、又はアセチルオルニチンをオルニチンに変換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートをアセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に変換するアセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタメートセミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に変換するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性よりも増加するようにさらに形質転換されてプトレシンの原料として用いられるオルニチンの生産性が向上し、オルニチン脱炭酸酵素（ｓｐｅＣ）をコードする遺伝子が導入されるように形質転換されて前記オルニチンを用いてプトレシンを生産できる微生物であることができる。
【００４０】
ここで、前記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）は、特にこれらに限定されるものではないが、好ましくはそれぞれ配列番号３３、３５、３７及び３９のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができ、これらの活性増加は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、３）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び４）それらの組み合わせにより増加するように改変する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法により行うことができる。
【００４１】
具体的には、微生物におけるタンパク質の活性を増加させるために、一般的に様々な方法を用いることができる。例えば、プラスミド導入、相同性組換え、接合、転位などを用いた形質転換によりポリヌクレオチドのコピー数を増加させたり、ポリヌクレオチドの発現調節配列を改変したり、ポリヌクレオチドの発現を増加させる調節因子をコードする遺伝子を増幅したり、ポリヌクレオチドの発現を減少させる調節因子をコードするポリヌクレオチドを破壊又は低減することにより、ポリヌクレオチドの発現量を増加させることができる。より具体的には、ポリヌクレオチドを含む遺伝子断片をコリネバクテリウム属微生物内で複製できる多重コピーベクターに作動可能に連結したり、染色体内に一つ又は複数のポリヌクレオチドのコピーを導入したり、ポリヌクレオチドのプロモーターを含む発現調節配列を活性が改良されたものに代替することができる。
【００４２】
例えば、ベクターｐＨＣ１３９Ｔを用いてａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群を微生物に形質転換し、野生型よりオルニチン生産能が非常に向上した微生物を製造するか、又は微生物の染色体内に存在するａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現を調節するプロモーター領域を改良して強化するか、もしくは改良された活性を示すプロモーターに置換してオルニチンまでの生合成経路を強化した微生物を用いることができる。特に、プロモーター領域を改良する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、染色体内のプロモーター置換は置換する領域の両末端の塩基配列と導入するプロモーターを染色体内の本来の位置と同じ形態に作製し、その後公知のｐＤＺベクターを用いた遺伝子欠失方法（特許文献５）と同様に行う方法を用いることができる。ここで、前記改良されたプロモーターは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号４２の塩基配列を有するｐｃｊ７（又はＰ（ＣＪ７））プロモーター（特許文献６）を用いることが好ましく、前記ｐＤＺベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、図３の切断地図で表されるベクターを用いることが好ましい。
【００４３】
本発明における「ベクター」という用語は、好適な宿主内で目的遺伝子を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。使用可能なベクターが特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。ｐＤＺベクターなどを用いることが好ましい。
【００４４】
一方、前記微生物は、特にこれらに限定されるものではないが、本発明の微生物は、プトレシン代謝経路を持たず、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性を示すエシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）、セレノモナス属（Selenomonas sp.）又はビブリオ属（Vibrio sp.）に属する微生物を形質転換させた微生物であってもよい。
【００４５】
好ましくは、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの活性を減少させるか、又は不活性にすることによりオルニチンが蓄積され、グルタメートエクスポーター（exporter）の活性を減少させるか、又は不活性にすることにより細胞内のグルタメート量が増加し、アルギニン生合成に関与するａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群の発現量を増加させてオルニチンを大量に生産し、オルニチンをプトレシンに変換するオルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase, ODC）の活性が外部から導入されてプトレシン生産能を有するように形質転換された微生物であってもよい。
【００４６】
コリネバクテリウム属微生物であることがが好ましく、コリネバクテリウムグルタミカムであることがより好ましい。具体的には、野生型菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はグルタメート過剰生産菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ（特許文献７）であってもよいが、これらに制限されるものではない。前記ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ菌株は、ＮＴＧなどの変異誘発物質により選別したグルタメート生産菌株（ＫＦＣＣ−１１０７４）に基づいてｃｇ２６２４（ＮＣＢＩ ＬＯＣＵＳ ＩＤ ＹＰ＿２２６６３６）、ｃｇ２１１５（ＮＣＢＩ ＬＯＣＵＳ ＩＤ ＹＰ＿２２６１７３）を欠失させたグルタメート過剰生産菌株である。
【００４７】
ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５の欠損に伴うグルタメート過剰生産のメカニズムは前記文献以前に明らかにされていないが、ｃｇ２６２４はｐｃａＲによりＩｃｌＲファミリーの調節タンパク質（IclR family regulatory protein）と命名されており、ｃｇ２１１５はｓｕｇＲにより糖代謝メカニズムの発現因子調節タンパク質（transcriptional regulators of sugar metabolism）と命名されている。
【００４８】
図２に示すオルニチンの合成経路から分かるように、オルニチンの生成量を増加させるためには、出発物質であるグルタメートの量を増加させ、合成されたオルニチンをアルギニンに変換させる経路を遮断し、オルニチンの生合成に関与する酵素の量や活性を増加させることが求められる。このように、オルニチンの生産性を向上させ、プトレシン代謝経路を持たない微生物に、オルニチンからプトレシンを生合成し得る酵素であるオルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase, ODC）をコードする遺伝子を導入し、過剰に生成されたオルニチンを用いて、プトレシンの生産性が付与された形質転換微生物を製造することができる。
【００４９】
本発明の一実施例によれば、ａｒｇＦ遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ）（実施例１）、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１）（実施例２）、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ））（実施例３−１）、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターを置換させたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ）（実施例３−２）、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードするｓｐｅＣ遺伝子が染色体に導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ））、前記菌株にａｒｇＣＪＢＤ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ））、並びにａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換され、ｓｐｅＣ遺伝子が染色体に導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ））をそれぞれ製造した。これらのプトレシン生産性を比較した結果、ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換され、ｓｐｅＣ遺伝子が染色体に導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ））が優れたプトレシン生産性を示すことが確認された（表７及び表８）。
【００５０】
よって、本発明者らは、プトレシン生産能に優れることが確認されたプトレシン生産菌株を「ＣＣ０１−００６４（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ））」と命名し、ブダペスト条約に基づいてソウル市西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０１０年１１月２４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐとして寄託した。
【００５１】
前記目的を達成するための本発明の他の態様によれば、本発明は、（ｉ）前記プトレシン生産能が付与された微生物を培養して培養物を得る段階と、（ii）前記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収する段階とを含むプトレシンの生産方法を提供する。
【００５２】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養方法、連続培養方法、半回分培養方法などで行われることが好ましく、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、最も好ましくはｐＨ６．８）に調整し、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持し、培養温度を２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養することが好ましい。前記培養により生産されたプトレシンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留し得る。
【００５３】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができ、窒素供給源として窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができ、リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができ、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、及びビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１：ａｒｇＦ遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株の作製
野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２と、ＮＴＧなどの変異体により選別したグルタメート生産菌株（ＫＦＣＣ−１１０７４）に基づいてｃｇ２６２４、ｃｇ２１１５を欠失させたグルタメート過剰生産菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ（特許文献７）から、オルニチンからアルギニンを合成する経路を防止するために、ａｒｇＦ欠失菌株を作製した。コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアルギニン生合成遺伝子はａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨ形態のオペロン構造で構成され、欠失の標的であるａｒｇＦ遺伝子（配列番号２７）が染色体上でオルニチン合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子と並んで存在するので、外側の部分に位置するａｒｇＤとａｒｇＲの塩基配列に基づいてａｒｇＦ部分を欠失させるためのプラスミドを作製することを試みた。
【００５６】
具体的には、前記ＡＴＣＣ１３０３２菌株のａｒｇＤ及びａｒｇＲの塩基配列に基づいて、ａｒｇＦのＮ末端外部の相同組換え（homologous recombination）断片、及びａｒｇＦのＣ末端外部の相同組換え断片を得た。ここで、ａｒｇＦのＮ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１及び２）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、３０秒の伸長を２８サイクル）、ａｒｇＦのＣ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号３及び４）を用いた同一条件のＰＣＲを行うことにより得られた（表１）。
【００５７】
【表１】
2014500728.tif 000003
【００５８】
前記得られたａｒｇＦのＮ末端外部の相同組換え断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理して切断し、前記ａｒｇＦのＣ末端外部の相同組換え断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理して切断することにより、それぞれの断片を得た。また、これら切断された各断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理して切断されたｐＤＺベクターに導入し、プラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）を得た。
【００５９】
前記得られたプラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）をＡＴＣＣ１３０３２菌株とＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ菌株に導入し、導入された菌株をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリン-β-D-ガラクトシド）を含むＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ３７ｇ／ｌ，ソルビトール９１ｇ／ｌ，アガー２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成し、前記形成したコロニーから青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−ａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選抜した。
【００６０】
前記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース１０ｇ／ｌ，ポリペプトン１０ｇ／ｌ，酵母エキス５ｇ／ｌ，牛肉エキス５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ，尿素２ｇ／ｌ，ｐＨ６．８）で振盪培養（３０℃，８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成した。形成したコロニーから比較的低い割合の白色のコロニーを選択し、ａｒｇＦが欠失した菌株を選抜した。
【００６１】
前記選抜された菌株から得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び４のプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、前記選抜された菌株に前記プラスミドｐＤＺａｒｇＦ（Ｋ／Ｏ）が導入されたことが確認され、前記選抜された菌株はａｒｇＦが欠失した菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ，ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ）であることが確認された。
【００６２】
実施例２：ａｒｇＦ遺伝子及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミカム菌株の作製
実施例１で得られたＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ菌株とＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ菌株からグルタメートエクスポーター遺伝子であるＮＣｇｌ１２２１遺伝子をさらに欠失させることにより、オルニチンの前駆体であるグルタメートの細胞内含有量を増加させた。
【００６３】
具体的には、前記ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＮＣｇｌ１２２１の塩基配列（配列番号２９）に基づいて、ＮＣｇｌ１２２１のＮ末端外部の相同組換え断片、及びＮＣｇｌ１２２１のＣ末端外部の相同組換え断片を得た。ここで、ＮＣｇｌ１２２１のＮ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号５及び６）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ、ＮＣｇｌ１２２１のＣ末端外部の断片は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号７及び８）を用いた実施例１と同一条件でＰＣＲを行うことにより得られた（表２）。
【００６４】
【表２】
2014500728.tif 000004
【００６５】
前記得られたＮＣｇｌ１２２１のＮ末端外部の相同組換え断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理して切断し、前記ＮＣｇｌ１２２１のＣ末端外部の相同組換え断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理して切断することにより、それぞれの断片を得た。また、これら切断された各断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理して切断されたｐＤＺベクターに導入し、プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）を得た。
【００６６】
前記得られたプラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦ菌株とＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦ菌株に導入し、導入された菌株をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成し、前記形成したコロニーから青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選抜した。
【００６７】
前記選抜された菌株をＣＭ培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成した。形成したコロニーから比較的低い割合の白色のコロニーを選択し、ＮＣｇｌ１２２１が欠失した菌株を選抜した。
【００６８】
前記選抜された菌株から得られた染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び８のプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、前記選抜された菌株に前記プラスミドｐＤＺ−ＮＣｇｌ１２２１（Ｋ／Ｏ）が導入されたことが確認され、前記選抜されたＮＣｇｌ１２２１が欠失した菌株をそれぞれＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１と命名した。
【００６９】
実施例３：ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株の作製
実施例３−１：ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子のクローニング及び形質転換体の製造
グルタメートからオルニチンを合成する経路に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤオペロン（プロモーター領域を含む，配列番号３１）のコピー数を増加させてオルニチン生成経路を強化するために、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ遺伝子（それぞれ配列番号３２、３４、３６、３８）が導入されたベクターを製造し、これを導入した形質転換体を製造した。
【００７０】
まず、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、プライマー（配列番号９及び１０）を用いたＰＣＲを行うことにより（９５℃、４０秒の変性、５５℃、４０秒のアニーリング、及び７２℃、１５０秒の伸長を３０サイクル）、４，９００ｂｐの大きさの遺伝子断片を得た。
【００７１】
【表３】
2014500728.tif 000005
【００７２】
前記得られた遺伝子断片を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望の大きさのバンドを溶出し、溶出したバンドに制限酵素であるＫｐｎＩ及びＸｂａＩを処理して断片を得た。前記得られた断片をｐＨＣ１３９Ｔ−ｇｆｐベクター（特許文献８）にクローニングし、発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）を製造した。
【００７３】
次に、菌株内のオルニチン生成量を増加させるために、前記製造した発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株とＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株に電気穿孔法で導入し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して形質転換体を選抜し、前記選抜された各形質転換体をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）と命名した。
【００７４】
実施例３−２：染色体内のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーター置換
グルタメートからオルニチンを合成する経路に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の調節解除により発現量を増加させるために、染色体内のａｒｇＣＪＢＤ自体のプロモーターを本出願人が新規開発したＣＪ７プロモーターに置換することを試みた。
【００７５】
まず、ＣＪ７プロモーターを含み、前記プロモーターの両末端部位は染色体上の本来の配列を有する相同組換え断片を得た。
【００７６】
具体的には、ＣＪ７プロモーターの５'末端部位はＡＴＣＣ１３０３２菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１１及び１２）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、３０秒の伸長を２８サイクル）、ＣＪ７プロモーターの部位はプライマー（配列番号１３及び１４）を用いた同一条件でＰＣＲを行うことにより得られ、ＣＪ７プロモーターの３'末端部位はプライマー（配列番号１５及び１６）を用いた同一条件でＰＣＲを行うことにより得られた。
【００７７】
【表４】
2014500728.tif 000006
【００７８】
前記得られたプロモーターの５'末端部位（ａｒｇＣ−Ｌ）を制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理し、ＣＪ７プロモーター領域を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで処理し、プロモーターの３'末端部位（ａｒｇＣ−Ｒ）を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで処理し、これら制限酵素で処理された各ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングし、プロモーターが置換された発現ベクターｐＤＺ−ＣＪ７（ａｒｇ）を製造した。
【００７９】
前記製造された発現ベクターｐＤＺ−ＣＪ７（ａｒｇ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株に電気穿孔法で導入し、形質転換体を製造した。前記製造された形質転換体をＣＭ培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、前記培養物を１０−４から１０−１０まで順次希釈し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンとＸ−ｇａｌを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。
【００８０】
ほとんどのコロニーが青色であるのに対して低い割合で出現する白色のコロニーを選別することにより、２次交差により最終的にａｒｇプロモーターがＣＪ７に置換された菌株を選抜し、前記菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１３及び１６）を用いたＰＣＲを行うことにより（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、６０秒の伸長を２８サイクル）、前記導入された発現ベクターｐＤＺ−ＣＪ７（ａｒｇ）により染色体内のａｒｇＣＪＢＤプロモーターが置換されていることが確認され、前記確認された菌株をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤと命名した。
【００８１】
実施例４：ｓｐｅＣ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株
オルニチンからプトレシンを合成するのに用いられる大腸菌のオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードするｓｐｅＣ遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカム菌株の染色体内の不活性化されたビオチン合成関連遺伝子内に導入した。
【００８２】
実施例４−１：ＯＤＣの遺伝子断片を含む発現ベクターの製造
大腸菌由来のｓｐｅＣ遺伝子（配列番号４０）をコリネバクテリウムグルタミカム菌株に導入するために、配列番号４２のＣＪ７プロモーターを用いて発現するようにクローニングした。
【００８３】
まず、ＣＪ７プロモーター領域は、ｐ１１７−ＣＪ７−ｇｆｐ（特許文献６）を鋳型とし、プライマー（配列番号１７及び１８）を用いたＰＣＲを行うことにより得られ（９４℃、４０秒の変性、５５℃、４０秒のアニーリング、及び７２℃、６０秒の伸長を３０サイクル）、ｓｐｅＣ遺伝子のコード部位は、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型とし、プライマー（配列番号１９及び２０）を用いたＰＣＲを同一条件で行うことにより得られた。
【００８４】
【表５】
2014500728.tif 000007
【００８５】
前記得られたＣＪ７プロモーター領域とｓｐｅＣ遺伝子のコード部位を制限酵素であるＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理し、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理されたｐＨＣ１３９Ｔ−ｇｆｐベクターにクローニングし、前記ＣＪ７プロモーターに続いてＯＤＣコード部位が連結された遺伝子を含む発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）を製造した。
【００８６】
実施例４−２：形質転換体の製造
コリネバクテリウム属微生物はビオチン合成関連遺伝子の一部が欠失しているので、大腸菌由来のｓｐｅＣ遺伝子をビオチン合成遺伝子のｂｉｏＡとｂｉｏＤ間に導入することを試みた。
【００８７】
具体的には、実施例４−１で製造した発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）に含まれるＰ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）遺伝子断片の両末端部位をコリネバクテリウム属微生物の染色体の相同組換え部位として用いることができるように、前記両末端がそれぞれｂｉｏＡ及びｂｉｏＤ塩基配列を有するようにクローニングした。このために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のゲノムを鋳型とし、プライマー（配列番号２１及び２２）を用いたＰＣＲを行うことにより（９４℃、４０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、６０秒の伸長を２８サイクル）ｂｉｏＡ遺伝子断片が得られ、同一鋳型とプライマー（配列番号２５及び２６）を用いたＰＣＲを同一条件で行うことによりｂｉｏＤ遺伝子断片が得られ、前記発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）を鋳型とし、プライマー（配列番号２３及び２４）を用いたＰＣＲを同一条件で行うことによりＰ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）遺伝子断片が得られた。
【００８８】
【表６】
2014500728.tif 000008
【００８９】
前記得られたｂｉｏＡ遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｃａＩで処理し、Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）遺伝子断片を制限酵素ＳｃａＩとＥｃｏＲＩで処理し、ｂｉｏＤ遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで処理し、これら制限酵素で処理された各ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングし、ｓｐｅＣ遺伝子を染色体内に導入するための発現ベクターｐＤＺ−ｂｉｏＡＤ−Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）を製造した。
【００９０】
前記製造された発現ベクターｐＤＺ−ｂｉｏＡＤ−Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）をＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１菌株、ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１、及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ菌株にそれぞれ電気穿孔法で導入することにより、それぞれの形質転換体を製造した。
【００９１】
前記製造されたそれぞれの形質転換体をＣＭ培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、前記培養物を１０−４から１０−１０まで順次希釈し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンとＸ−ｇａｌを含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。
【００９２】
ほとんどのコロニーが青色であるのに対して低い割合で出現する白色のコロニーを選別することにより、２次交差によりＰ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣが染色体内に導入された菌株をそれぞれ選抜した。前記選抜された各菌株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号２１及び２６）を用いたＰＣＲを行うことにより（９４℃、３０秒の変性、５５℃、３０秒のアニーリング、及び７２℃、１２０秒の伸長を２８サイクル）、前記導入された発現ベクターｐＤＺ−ｂｉｏＡＤ−Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）により染色体内のｂｉｏＡとｂｉｏＤ間にＰ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ遺伝子断片が挿入されたことが確認され、前記確認された菌株をそれぞれＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）、及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）と命名した。
【００９３】
また、実施例３−１で製造したｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）菌株及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）菌株に導入して製造した形質転換体をそれぞれＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）と命名した。
【００９４】
実施例５：ａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子欠失、ａｒｇＣＪＢＤ発現量増加、並びにｓｐｅＣ遺伝子導入によるプトレシン生産性の向上効果
実施例５−１：ＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウムグルタミカムベースのプトレシン生産能の確認
ＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウムグルタミカムベースの菌株において、ａｒｇＦ欠失、ＮＣｇｌ１２２１遺伝子欠失、ａｒｇＣＪＢＤ発現量増加及びｓｐｅＣ導入がプトレシンの生産に及ぼす効果を確認するために、実施例２〜４で製造した各菌株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【００９５】
具体的には、実施例２〜４で製造された各菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１（実験群１）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）（実験群２）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ（実験群３）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）（実験群４）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）／ＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）（実験群５）、及びＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）（実験群６））を１．８％（ｗ／ｖ）の寒天を含むＣＭＡ平板培地に塗抹して３７℃で２４時間培養し、前記培養した各菌株を１ｍＭのアルギニンを含む２５ｍｌの力価培地（２％（ｗ／ｖ）のグルコース、１％（ｗ／ｖ）のポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５％（ｗ／ｖ）の尿素、０．４％（ｗ／ｖ）のＫＨ２ＰＯ４、０．８％（ｗ／ｖ）のＫ２ＨＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４、１００μｇ／ｌのビオチン、及び１ｍｇ／ｌのチアミン）に接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養し、各培養物から生産されたオルニチンとプトレシンの濃度を測定して比較した（表７）。ここで、対照群としては遺伝的に改変されていない菌株ＡＴＣＣ１３０３２を用いた。
【００９６】
【表７】
2014500728.tif 000009
【００９７】
表７から分かるように、ａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失するか、又はａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現量が増加した場合、オルニチンは生産されたが、プトレシンは生産されなかった。これは、コリネバクテリウムグルタミカム菌株内に、オルニチンからプトレシンを合成する酵素であるオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）をコードするｓｐｅＣ遺伝子が存在しないことによるものと分析される。
【００９８】
一方、大腸菌に由来するｓｐｅＣ遺伝子が導入された実施例４−２で製造された３種の菌株では、オルニチンはほぼ存在せず、プトレシンは生産されることが確認されたが、これは大腸菌に由来するｓｐｅＣ遺伝子が導入され、そこから発現したＯＤＣがオルニチンからプトレシンを合成したことによるものと分析される。
【００９９】
また、実験群１〜３の菌株から生産されるオルニチンの生産量と、実験群１〜３の菌株にｓｐｅＣ遺伝子が導入された実験群４〜６の菌株から生産されるプトレシンの生産量を比較すると、プトレシンの生産量はオルニチンの生産量に比例することが確認された。また、外部のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子をさらに導入した場合より、内在的なａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現レベルを増加させた場合のほうが、オルニチンとプトレシンの生産量が向上することが確認された。
【０１００】
実施例５−２：グルタメート生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ菌株ベースのプトレシン生産能の確認
グルタメートを過剰生産するコリネバクテリウムグルタミカム菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐに基づいて、ａｒｇＦ欠失、ＮＣｇｌ１２２１遺伝子欠失、ａｒｇＣＪＢＤ発現量増加及びｓｐｅＣ導入がプトレシンの生産に及ぼす効果を確認するために、実施例２〜４で製造した各菌株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【０１０１】
具体的には、実施例２〜４で製造された各菌株（ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１（実験群１）、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１／ｐＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）（実験群２）、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ（実験群３）、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）（実験群４）、ＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）／ＨＣ１３９Ｔ−ａｒｇＣＪＢＤ（Ｃｇｌ）（実験群５）、及びＫＣＣＭ−１０７８５ＰΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ）（実験群６））を実施例５−１と同一条件で接種し、その後３０℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養し、各培養物から生産されたオルニチンの濃度を測定して比較した（表６）。ここで、対照群としては遺伝的に改変されていない菌株ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐを用いた。
【０１０２】
【表８】
2014500728.tif 000010
【０１０３】
表８から分かるように、グルタメート過剰生産菌株ベースでも、ａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失するか、又はａｒｇＦ及びＮＣｇｌ１２２１遺伝子が欠失し、ａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現量が増加した場合、オルニチンは生産されたが、プトレシンは生産されなかった。
【０１０４】
大腸菌に由来するｓｐｅＣ遺伝子が導入された実施例４−２で製造された３種の菌株でのみプトレシンが生産されることが確認されたが、これは大腸菌に由来するｓｐｅＣ遺伝子が導入され、そこから発現したＯＤＣがオルニチンからプトレシンを合成したことによるものと分析される。
【０１０５】
実験群１〜３の菌株から生産されるグルタメートとオルニチンを比較すると、菌株内で生成されるグルタメート量が減少する量に比例して、生成されるオルニチン量が増加する現象を示した。また、実験群１〜３の菌株から生産されるオルニチンの生産量と、実験群１〜３の菌株にｓｐｅＣ遺伝子が導入された実験群４〜６の菌株から生産されるプトレシンの生産量を比較すると、プトレシンの生産量はオルニチンの生産量に比例することが確認された。また、外部のａｒｇＣＪＢＤ遺伝子をさらに導入した場合より、内在的なａｒｇＣＪＢＤ遺伝子の発現レベルを増加させた場合のほうが、オルニチンとプトレシンの生産量が向上することが確認された。結論として、細胞内で生成されるグルタメート量が増加するに伴ってオルニチン量も増加し、最終的にプトレシン生成量も増加することが確認された。
【０１０６】
よって、本発明者らはプトレシン生産能に優れることが確認された実施例４−２で製造された菌株を「ＣＣ０１−００６４（ＡＴＣＣ１３０３２ΔａｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ））」と命名し、ブダペスト条約に基づいてソウル市西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０１０年１１月２４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐとして寄託した。
【０１０７】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関して、前記実施例は全ての面においてあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【０１０８】
2014500728.tif 000011
【図１】
2014500728.tif 000012
【図２】
2014500728.tif 000013
【図３】
2014500728.tif 000014
【配列表】
2014500728000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月29日(2013.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が内在的活性より低下するように改変され、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシンを生産する微生物。
【請求項２】
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項３】
前記グルタメート排出に関与するタンパク質が、配列番号３０のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項４】
タンパク質の活性低下が、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、２）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、及び４）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項５】
前記オルニチン脱炭酸酵素が、配列番号４１のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項６】
ＯＤＣの活性導入が、ＯＤＣをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたＯＤＣを導入する方法、及びＯＤＣをコードする塩基配列の変異体を導入する方法からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項７】
さらに、オルニチンの生合成に関与するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性よりも増加したものである、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項８】
前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤが、それぞれ配列番号３３、３５、３７及び３９のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、請求項７に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項９】
タンパク質の活性増加が、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、３）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び４）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、請求項７に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１０】
コリネバクテリウム属微生物である、請求項１に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１１】
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１０に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１２】
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカム（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）である、請求項１０に記載のプトレシンを生産する微生物。
【請求項１３】
（ｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性が低下するように改変され、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシン生産能が付与された微生物を培養して培養物を得る段階と、
（ii）前記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収する段階とを含む、プトレシンの生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、本発明は、前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法を提供することを目的とする。
[本発明1001]
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ1221）の活性が内在的活性より低下するように改変され、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシンを生産する微生物。
[本発明1002]
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号28のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1003]
前記グルタメート排出に関与するタンパク質が、配列番号30のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1004]
タンパク質の活性低下が、1）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全ての欠失、2）前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変、3）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列を改変、及び4）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1005]
前記オルニチン脱炭酸酵素が、配列番号40のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1006]
ＯＤＣの活性導入が、ＯＤＣをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたＯＤＣを導入する方法、及びＯＤＣをコードする塩基配列の変異体を導入する方法からなる群から選択されるものである、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1007]
さらに、オルニチンの生合成に関与するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼ又はオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性が内在的活性よりも増加したものである、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1008]
前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢ及びＡｒｇＤが、それぞれ配列番号33、35、37及び39のアミノ酸配列、又はそれと70％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものである、本発明1007のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1009]
タンパク質の活性増加が、1）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、2）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変、3）前記酵素の活性が増加するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列を改変、及び4）それらの組み合わせからなる群から選択される方法により行われるものである、本発明1007のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1010]
コリネバクテリウム属微生物である、本発明1001のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1011]
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである、本発明1010のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1012]
前記コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカム（ＫＣＣＭ11138Ｐ）である、本発明1010のプトレシンを生産する微生物。
[本発明1013]
（ｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタメート排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ1221）の活性が低下するように改変され、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の活性が導入された、プトレシン生産能が付与された微生物を培養して培養物を得る段階と、
（ii）前記培養された微生物又は培養物からプトレシンを回収する段階とを含む、プトレシンの生産方法。
【国際調査報告】
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