(57)【要約】カンジダ症及び他の真菌疾患に対するワクチンとしての有効性を示す幾つかの新しいペプチドを開発した。破傷風毒素に結合された真菌ペプチドに結合されたβ−マンノトリオースの新しい結合型ワクチンが、アジュバントを使用して又は使用せずにワクチンとして有効であることを示した。加えて、カンジダ感染に対する防御を提供するモノクローナル抗体を特定した。
2014515757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ症感染に対する防御用のワクチン組成物であって、ＰＲＩＧＧＱＲＥＬＫＫＩＴＥ（Ｍｅｔ６；配列番号２）及びＱＧＥＴＥＥＡＬＩＱＫＲＳＹ（Ｈｗｐ１；配列番号３）からなる群から選択される免疫学的有効量のペプチドを含み、前記ペプチドが、β−１，２−マンノトリオース及び薬学的に許容される担体に結合されていないワクチン組成物。
【請求項２】
１つ又は複数がアジュバントを更に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ミョウバンを更に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を更に含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、タンパク質担体に結合されている、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記タンパク質担体が、破傷風トキソイド及び破傷風トキソイドのＴＨエピトープからなる群から選択される、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
カンジダ症感染に対する防御用の結合型ワクチンであって、カンジダ細胞壁タンパク質に由来する免疫学的有効量のＴ細胞ペプチドを含み、前記ペプチドが、β−１，２−マンノトリオース及びタンパク質担体に結合されている結合型ワクチン。
【請求項８】
前記タンパク質担体が、破傷風トキソイド及び破傷風トキソイドのＴＨエピトープからなる群から選択される、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項９】
前記タンパク質担体が、破傷風トキソイドである、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞ペプチドが、配列番号１〜３及び８〜２０からなる群から選択されるペプチドである、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１である、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項１２】
１つ又は複数のアジュバントを更に含む、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項１３】
ミョウバンを更に含む、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項１４】
モノホスホリルリピドＡを更に含む、請求項７に記載の結合型ワクチン。
【請求項１５】
侵襲性真菌疾患に対する防御用のペプチドワクチンであって、配列番号８〜２０からなる群から選択される免疫学的有効量のペプチドを含むペプチドワクチン。
【請求項１６】
１つ又は複数のアジュバント更に含む、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項１７】
ミョウバンを更に含む、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項１８】
モノホスホリルリピドＡを更に含む、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項１９】
前記ペプチドが、タンパク質担体に結合されている、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項２０】
前記タンパク質担体が、破傷風トキソイド及び破傷風トキソイドのＴＨエピトープからなる群から選択される、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項２１】
前記タンパク質担体が、破傷風毒素である、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項２２】
前記ペプチドが、β−１，２−マンノトリオースに結合されている、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項２３】
前記ペプチドが、β−１，２−マンノトリオース及び破傷風トキソイドに結合されている、請求項１５に記載のペプチドワクチン。
【請求項２４】
カンジダ症に対する免疫の方法であって、そのような治療を必要性とする対象に請求項１〜２３のいずれか一項に記載のワクチンを接種することを含む方法。
【請求項２５】
カンジダ症を受動治療するための組成物であって、配列番号１〜３及び８〜２０からなる群から選択されるカンジダ細胞壁ペプチドと結合する免疫学的有効量のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体が、配列番号１と結合する、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記モノクローナル抗体が、Ｅ２−９である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
１つ又は複数の追加の抗真菌性化合物を更に含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記１つ又は複数の抗真菌性化合物が、ポリエン抗真菌剤、アゾール、アリルアミン、エキノキャンディン、アゾール、及びβ−（１，２）−マンノトリオースに特異的なモノクローナル抗体、及び配列番号１〜３及び８〜２０に特異的なモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
カンジダ症に対する受動免疫の方法であって、その必要性のある哺乳動物に、免疫学的有効量の請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項３１】
組成物であって、
Ｈ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａｓｙｎＴＧ、
ＡｃＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ、
ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ、
βＭａｎ３−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ、
破傷風トキソイドに結合されたＡｃＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ、及び
破傷風トキソイドに結合されたβＭａｎ３−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ
からなる群から選択される化合物のうちの１つ又は複数を含む組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、
Ｈ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａｓｙｎＴＧを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、
ＡｃＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、
ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、
βＭａｎ３−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、
破傷風トキソイドに結合されたＡｃＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物が、
破傷風トキソイドに結合されたβＭａｎ３−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨを含む、請求項３１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国法典第３５編第１１９条（ｅ）及び各国の該当する条約及び協定に基づき、２０１１年４月１日に出願された米国特許仮出願第６１／４７７，７３８号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ−ＮＩＡＩＤプログラム助成金ＰＯ１  ＡＩ０６１５３７に基づく国立衛生研究所からの国庫補助でなされたものである。米国政府は、本発明にある権利を有する。
【０００３】
本発明は、真菌感染症及び真菌性疾患に対する持続性免疫学的防御を誘導するための新しいペプチド及びペプチド結合型ワクチン、及び真菌感染症に対する迅速だが短期的防御を提供するための新しいモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００４】
多形性真菌カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）は、大多数の健常ヒトの胃腸管、膣、及び幾つかの皮膚領域に生息する共生生物である。しかしながら、この真菌は、ある条件下において、粘膜性カンジダ症から重篤な侵襲性カンジダ症に及ぶ様々な感染症を引き起こす場合がある（非特許文献１）。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、種々の形態のカンジダ症の最も一般的な原因であり続けているが（非特許文献２、非特許文献３）、他の幾つかのカンジダ種も重要な因子である。侵襲性疾患には、毎年数十億ドルの医療費、及び約４０％と推定される死亡率が伴う（非特許文献４、非特許文献５）。抗真菌剤の数が限られていること及びその毒性、並びに最も重要なことには、適切な抗真菌療法で治療されたカンジダ血症患者数のほとんど半数の予後が不良であることは、恐らくは能動及び受動免疫戦略による疾患予防に有利に作用する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【０００５】
カンジダに対する抗体の防御的役割には議論の余地があるが、この様式の防御を支持する証拠は増加しつつある。防御抗体の特異性は、Ｃ．アルビカンス細胞壁ポリサッカライド、タンパク質、及びペプチドに対してである（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。予防戦略として、疾患からの防御は、ワクチン接種及び事前に形成されたモノクローナル抗体の転移により、それぞれ能動的に又は受動的に獲得することができる。治療的処置の場合、実験的証拠は、事前に形成された抗体が、抗真菌剤の有効性を増強することができることを示している（非特許文献１４、非特許文献１５）。
【０００６】
Ｃ．アルビカンスに対する最初の完全合成グリコペプチドワクチンは、マウスにおいて播種性カンジダ症に対する防御を誘導した（非特許文献１６）。Ｃ．アルビカンス細胞壁タンパク質に見出される６つの推定上のＴ細胞ペプチドは、防御的なβ−１，２−マンノトリオース［β−（Ｍａｎ）３］グリカンエピトープと結合されて、グリコペプチド結合体を生成する。括弧の中に表示されているペプチドが、ヒトカンジダ症中に発現され、細胞壁に結合することにより誘導される６つのタンパク質には、以下のものが含まれる：フルクトース−二リン酸アルドラーゼ（Ｆｂａ）（ＹＧＫＤＶＫＤＬＤＹＡＱＥ；配列番号１）；メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（Ｍｅｔ６）（ＰＲＩＧＧＱＲＥＬＫＫＩＴＥ；配列番号２）；菌糸壁タンパク質−１（Ｈｗｐ１）（ＱＧＥＴＥＥＡＬＩＱＫＲＳＹ；配列番号３）；エノラーゼ（Ｅｎｏｌ）（ＤＳＲＧＮＰＴＶＥＶＤＦＴＴ；配列番号４）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐ１）（ＮＲＳＰＳＴＧＥＱＫＳＳＧＩ；配列番号５）；及びホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ１）（ＶＰＬＤＧＫＴＩＴＮＮＱＲＩ；配列番号６）（非特許文献１６）。この研究の目的は、上記ペプチドが、Ｔ細胞エピトープとしての役割を果たし、グリコペプチド結合体のグリカン部分に対する防御抗体応答を促進するだろうということだった。したがって、免疫プロトコールは、細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答ではなく、抗体に有利になるように設計され、抗体は、種々の結合体のグリカン部分及びペプチド部分の両方に対して産生された。すなわち、抗体産生を促進するＤＣに基づく免疫プロトコールにより、３つの複合糖質β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ、β−（Ｍａｎ）３−Ｍｅｔ６、及びβ−（Ｍａｎ）３−Ｈｗｐ１は、マウス生存及び低腎臓真菌量により明らかなように、真菌による血行負荷に対する防御を誘導した（非特許文献１６）。β−（Ｍａｎ）３−Ｅｎｏ１及びβ−（Ｍａｎ）３−Ｇａｐ１は、中程度の防御をもたらし、β−（Ｍａｎ）３−Ｐｇｋ１は、疾患をわずかに増強した。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体の場合、防御は、グリカン及びＦｂａペプチドに対する免疫により特異的に獲得された。天然タンパク質フルクトース１，６−二リン酸アルドラーゼ（Ｆｂａ１ｐ）は、フルクトース−１，６−ビスホスファートの、ジヒドロキシアセトンホスファート及びグリセルアルデヒド３−ホスファートへの可逆的切断を触媒し、幾つかの理由で、魅力的な抗真菌性標的となっている。第１に、この重要な酵素は、発酵性及び非発酵性炭素源の両方での増殖に必要とされており、したがって、Ｃ．アルビカンス及び他の病原性真菌の生存能にとって不可欠である（非特許文献１６）。第２に、真菌フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼは、ヒトフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼとは異なる。Ｃ．アルビカンスＦｂａ１ｐは、主に真菌及び原核生物に見出されるＩＩ型アルドラーゼのファミリーに属する（非特許文献１７）。対照的に、ヒト酵素は、Ｉ型アルドラーゼに属しており、ヒトアルドラーゼの配列は、真菌アルドラーゼの配列とは著しく異なる（非特許文献１７）。したがって真菌酵素にのみ特異的な免疫学的応答を達成することが可能であり得ると予想することは合理的である。実際、Ｆｂａ１４量体ペプチド配列（ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ；配列番号１）は、Ｃ．アルビカンスに特有である（非特許文献１２）。
【０００７】
特許文献１には、破傷風トキソイド又はＰ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）毒素Ａのいずれかに結合されたシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）リポポリサッカライドに由来するポリサッカライドを使用して合成されたポリサッカライドタンパク質結合型ワクチンが開示されている。
【０００８】
特許文献２、特許文献３、及び特許文献４には、β−１，２−結合トリ−マンノース残基を含む、Ｃ．アルビカンスの単離ホスホマンノタンパク質（phosphomannoprotein）細胞壁複合体に基づくカンジダ・アルビカンスのワクチンが開示されている。
【０００９】
特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８には、ホスホルマンナ（phosphormanna）エピトープを模倣するペプチド又はペプチドミモトープをコードするポリヌクレオチドに基づくワクチンが開示されており、カンジダ・アルビカンスの感染に対する受動免疫のための、ＭＡｂ  Ｂ６．１を含むモノクローナル抗体が開示されている。
【００１０】
特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、及び特許文献１４には、タンパク質担体破傷風トキソイドを含むタンパク質担体に結合されたβ−（１−２）−β−Ｄ−マンノピロース−トリオース（β−（Ｍａｎ）３又はβ−（１，２）−マンノトリオースとも呼ばれる）を含む天然Ｏ連結及びＳ連結オリゴ糖を含む免疫原性オリゴ糖組成物に基づく、カンジダ種に対するワクチンが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，７７１，１２７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５７８，３０９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４８８，９２９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３０，１４６号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３０９，６４２号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３９１，５８７号明細書
【特許文献７】米国特許第６，４０３，０９０号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／００７２７７５号明細書
【特許文献９】米国特許第７，７２２，８９０号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００６／００５８５０６号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００８／０１９３４８１号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１０／０２０９４４８号明細書
【特許文献１３】国際公開第０３／０９０７８７号
【特許文献１４】国際公開第２００６／０９６９７０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｅｇｇｉｍａｎｎ，Ｐ．、Ｊ．Ｇａｒｂｉｎｏ、及びＤ．Ｐｉｔｔｅｔ、２００３年、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３巻：６８５〜７０２頁
【非特許文献２】Ｊａｒｖｉｓ，Ｗ．Ｒ．及びＷ．Ｊ．Ｍａｒｔｏｎｅ、１９９２年、Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２９巻：１９〜２４頁
【非特許文献３】Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｒ．Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｄ．Ｈ．Ｃｕｌｖｅｒ、Ｒ．Ｐ．Ｇａｙｎｅｓ、及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、１９９８年、Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃａｒｅ  ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ  ８２巻：７８９〜７９３頁
【非特許文献４】Ｈｏｒｎ，Ｄ．Ｌ．、Ｄ．Ｎｅｏｆｙｔｏｓ、Ｅ．Ｊ．Ａｎａｉｓｓｉｅ、Ｊ．Ａ．Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｗ．Ｊ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ、Ａ．Ｊ．Ｏｌｙａｅｉ、Ｋ．Ａ．Ｍａｒｒ、Ｍ．Ａ．Ｐｆａｌｌｅｒ、Ｃ．Ｈ．Ｃｈａｎｇ、及びＫ．Ｍ．Ｗｅｂｓｔｅｒ、２００９年、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｄｉｄｅｍｉａ  ｉｎ  ２０１９  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｌｌｉａｎｃｅ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４８巻：１６９５〜１７０３頁
【非特許文献５】Ｈｓｕ，Ｆ．Ｃ．、Ｐ．Ｃ．Ｌｉｎ、Ｃ．Ｙ．Ｃｈｉ、Ｍ．Ｗ．Ｈｏ、及びＪ．Ｈ．Ｗａｎｇ、２００９年、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．４２巻：３７８〜３８４頁
【非特許文献６】Ｃａｓｓｏｎｅ，Ａ．，Ｆ．Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｉｓ、Ａ．Ｔｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉ、２００５年、Ａｎ  ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ、５巻：３７７〜３８２頁
【非特許文献７】Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｇ．Ｓ．Ｄｅｅｐｅ，Ｊｒ．、及びＢ．Ｓ．Ｋｌｅｉｎ、２００７年、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂａｔｉｎｇ  ｆｕｎｇａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５巻：１３〜２８頁
【非特許文献８】Ｍｏｃｈｏｎ，Ａ．Ｂ．及びＪ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ、２００５年、Ｉｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｎｅｅｄｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ？  Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．、４３巻：９７〜１１５頁
【非特許文献９】Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、２００５年、Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｍａｎｎａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、５巻：３８３〜３９２頁
【非特許文献１０】Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｉｓ，Ｆ．、Ｍ．Ｂｏｃｃａｎｅｒａ、Ｄ．Ａｄｒｉａｎｉ、Ｅ．Ｓｐｒｅｇｈｉｎｉ、Ｇ．Ｓａｎｔｏｎｉ、及びＡ．Ｃａｓｓｏｎｅ、１９９７年．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｍａｎｎａｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ａｓｐａｒｔｙｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｖａｇｉｎｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５巻：３３９９〜３４０５頁
【非特許文献１１】Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｒ．Ｃ．、Ｇ．Ｒｉｇｇ、Ｓ．Ｈｏｄｇｅｔｔｓ、Ｔ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｃ．Ｃｈａｐｍａｎ、Ｃ．Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｃ．Ｉｌｌｉｄｇｅ、及びＪ．Ｂｕｒｎｉｅ、２００３年、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｃｏｇｒａｂ，  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｕｎｇａｌ  ＨＳＰ９０、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４７巻：２２０８〜２２１６頁
【非特許文献１２】Ｘｉｎ，Ｈ．、Ｓ．Ｄｚｉａｄｅｋ、Ｄ．Ｒ．Ｂｕｎｄｌｅ、及びＪ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ、２００８年、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｂ−ｍａｎｎａｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５巻：１３５２６〜１３５３１頁
【非特許文献１３】Ｙａｎｇ，Ｑ．、Ｌ．Ｗａｎｇ、Ｄ．Ｎ．Ｌｕ、Ｒ．Ｊ．Ｇａｏ、Ｊ．Ｎ．Ｓｏｎｇ、Ｐ．Ｙ．Ｈｕａ、及びＤ．Ｗ．Ｙｕａｎ、２００５年、Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ  ｉｎ  Ｃ５７Ｂｌ／６  ｍｉｃｅ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３巻：４０８８〜４０９６頁
【非特許文献１４】Ｈａｎ，Ｙ．、２０１０年、Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＩｇＭ  ＭＡｂ  Ｂ６．１  ａｎｄ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１０巻：１５２６〜１５３１頁
【非特許文献１５】Ｎｏｏｎｅｙ，Ｌ．Ｍ．、Ｒ．Ｃ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、及びＪ．Ｐ．Ｂｕｒｎｉｅ、２００５年、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｇｒａｂ，ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ，ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ，ａｎｄ  ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｂｙ  ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ  ａｎｄ  ｔｉｍｅ−ｋｉｌｌ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５１巻：１９〜２９頁
【非特許文献１６】Ｒｏｄａｋｉ  Ａ、Ｙｏｕｎｇ  Ｔ、Ｂｒｏｗｎ  ＡＪ．、２００６年、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．、Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ、５巻：１３７１〜１３７７頁
【非特許文献１７】Ｍａｒｓｈ  ＪＪ及びＬｅｂｈｅｒｚ  ＨＧ．、１９９２年、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅｓ：ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｈｉｓｔｏｒｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１７巻：１１０〜１１３頁
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、カンジダ症に対する、及び幾つかのペプチドの場合は、潜在的な他の真菌疾患に対するワクチン開発として効力を示すカンジダ細胞壁タンパク質に基づく幾つかの新しいペプチドを設計した。これらペプチドワクチンの防御能力を、ヒトで認可されているアジュバントと共に製剤化されているか、又は防御抗体の産生を促進するＤＣに基づく免疫手法によるかに関わらず、ヒト播種性カンジダ症のマウスモデルにおいて評価した。ワクチンは、防御を付与した。加えて、Ｆｂａペプチド（配列番号１）を使用して、本発明者らは、ワクチン防御が、免疫マウスの血清中での抗Ｆｂａペプチド抗体の産生と関連していたことを示した。重要なことには、Ｆｂａペプチドは、ヒトにおいて免疫原性であると予想することができる。Ｆｂａペプチドに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ  Ｅ２−９）が、Ｆｂａ免疫マウスの脾細胞から単離され、受動転移実験のカンジダ症に対して防御性であることが示された。このモノクローナル抗体は、カンジダ症に対する短期的防御に使用することができる。また、本発明者らは、より一般的な真菌ワクチンであると考えられるＦｂａ又はＭｅｔ６（Ｆｂａ３（配列番号８）；Ｆｂａ４（配列番号９）；及びＭｅｔ６−２（配列番号１０）に基づくペプチドワクチンを設計し、これらのペプチドがワクチンとして効力を有することを示した。加えて、本発明者らは、様々な位置のアミノ酸をメチル化することにより（配列番号１１〜１９）、又は２つのシステイン残基を付加することにより（配列番号２０）Ｆｂａ配列を修飾した。これら修飾Ｆｂａは、ワクチンとしてある程度の有効性を示した。
【００１４】
加えて、本発明者らは、それを破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させることによりβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体を修飾して免疫原性を向上させ、ヒト使用に好適なアジュバントの使用を可能にすることにより、新しいワクチン結合体を開発した。修飾β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴは、単独で又はミョウバン若しくはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）アジュバントとの混合物としてのいずれかで、皮下（ｓ．ｃ．）経路によりマウスに投与された。アジュバントを用いてワクチン接種したマウス、又は驚くべくことにアジュバントを用いずにワクチン接種したマウスは、ロバストな抗体応答を起こすことにより良好に応答した。免疫群は、攻撃投与（チャレンジ）前にアジュバントのみ又はＤＰＢＳ緩衝液を受容した対照群と比較して、生存期間が延長され、腎臓真菌量が低減したことにより明らかなように、Ｃ．アルビカンスによる致死用量のチャレンジに対して高度な防御を示した。誘導された抗体が防御性であることを確認するために、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体に対して免疫されたマウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御を未感作マウスに転移させたが、Ｃ．アルビカンス吸収免疫血清は、転移しなかった。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチンにより誘導された同様の抗体応答及び防御が、近交系ＢＡＬＢ／ｃ及び非近交系Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスで観察された。ＴＴをグリコペプチド結合体に付加すると、追加のアジュバントを必要とせずにロバストな抗体応答を促進する新しい自己アジュバント性ワクチンがもたらされた。これは、播種性カンジダ症に対するワクチン設計にとって大きな利点である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】６つの合成ペプチド担体に基づくペプチドパルス処理ＤＣワクチンを使用して２回目の追加免疫を行った１４日後にＥＬＩＳＡにより試験した、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗体応答を示す図である。対照群は、ペプチドが使用されなかったか（ＤＣ＋ＣＦＡ：初回及び２回目の投与はＤＣ、最後の投与はＣＦＡ）又はＤＰＢＳのみが各注射時点で使用されたという点を除いて、初回刺激及び追加免疫と同じ投与計画が実施されたマウスで構成されていた。
【図１Ｂ】６つの合成ペプチド担体に基づくペプチドパルス処理ＤＣを使用し、致死用量の生菌Ｃ．アルビカンスでチャレンジしたＢＡＬＢ／ｃマウス免疫の生存率を示す図である。
【図１Ｃ】対照群のいずれかと比較して、６つのペプチドで免疫したマウスの腎臓一対当たりの生真菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）数を示す図である（ｐ＜０．００１）。各パネルのバーは、各群の腎臓一対当たりの平均ＣＦＵを示す。ＣＦＵアッセイの最低検出限度は、腎臓一対当たり５０ＣＦＵである。
【図２】２回目の追加免疫の１４日後に、ＥＬＩＳＡによりＣ５７ＢＬ／６マウスで測定された、Ｆｂａペプチドワクチンに対する抗体応答を示す図である。
【図３Ａ】樹状細胞手法によりＦｂａペプチドワクチンでワクチン接種を受け、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（ＳＣ５３１４）のチャレンジを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存曲線を示す図である。
【図３Ｂ】樹状細胞手法によりＦｂａペプチドワクチンでワクチン接種を受け、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（ＳＣ５３１４）のチャレンジを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの１腎臓当たりのＣＦＵを示す図である。
【図３Ｃ】樹状細胞手法によりＦｂａペプチドワクチンでワクチン接種を受け、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）のチャレンジを受けたマウスの生存曲線を示す図である。
【図３Ｄ】樹状細胞手法によりＦｂａペプチドワクチンでワクチン接種を受け、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）のチャレンジを受けたマウスの１腎臓当たりのＣＦＵを示す図である。
【図４Ａ】ＤＰＢＳ及びＤＣ＋ＣＦＡ対照マウスと比較して、Ｆｂａペプチド−ＤＣワクチン又はβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−パルス処理ＤＣのいずれかに対して免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）のチャレンジを受けたマウスの実験的播種性カンジダ症に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御応答を示す図である。図４Ａには、４群の生存率が示されている。
【図４Ｂ】ＤＰＢＳ及びＤＣ＋ＣＦＡ対照マウスと比較して、Ｆｂａペプチド−ＤＣワクチン又はβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−パルス処理ＤＣのいずれかに対して免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）のチャレンジを受けたマウスの実験的播種性カンジダ症に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御応答を示す図である。図４Ｂには腎臓のＣＦＵが示されている。図４Ｂ及び４Ｃの各パネルのバーは、各群のＣＦＵの平均を示し、各点は、個々のマウスを表す。
【図４Ｃ】ＤＰＢＳ及びＤＣ＋ＣＦＡ対照マウスと比較して、Ｆｂａペプチド−ＤＣワクチン又はβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−パルス処理ＤＣのいずれかに対して免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）のチャレンジを受けたマウスの実験的播種性カンジダ症に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御応答を示す図である。図４Ｃには、実験を生き残ったマウスの脳組織のＣＦＵが示されている。図４Ｂ及び４Ｃの各パネルのバーは、各群のＣＦＵの平均を示し、各点は、個々のマウスを表す。
【図５Ａ】初期マウス血清供与体、Ｃ．アルビカンスで吸収された後の血清を受容したマウス、及び対照ＤＰＢＳを受容したマウスと比較した、免疫１４日後に樹状細胞手法によりＦｂａペプチドに対して免疫した他のマウスに由来する血清を受容したマウスの、生存率を示す図である。
【図５Ｂ】初期マウス血清供与体、Ｃ．アルビカンスで吸収された後の血清を受容したマウス、及び対照ＤＰＢＳを受容したマウスと比較した、免疫１４日後に樹状細胞手法によりＦｂａペプチドに対して免疫した他のマウスに由来する血清を受容したマウスの、腎臓のＣＦＵを示す図である。
【図５Ｃ】対照マウス（ＤＰＢＳ）、Ｃ．アルビカンスで吸収された後のウサギ免疫血清を受容したマウス、及び抗体産生の前に採取したウサギ血清を受容したマウスと比較した、特異的抗Ｆｂａポリクローナル抗体（ＰＡｂ）を含有するウサギ免疫血清を受容したマウスの生存率を示す図である。
【図６Ａ】アジュバントのみ又は対照と比較した、ヒト認可アジュバントと共に投与したＦｂａペプチドワクチン（Ｆｂａ−ミョウバン及びＦｂａ−ＭＰＬの両方）を使用して免疫したマウスの応答を示す図である。図６Ａには、免疫１４日後に採取し、１：１００に希釈した血清試料のＥＬＩＳＡを使用して測定し、合成Ｆｂａ−ＭＡＰでコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡにより試験したＦｂａ抗体産生のレベルが示されている。
【図６Ｂ】アジュバントのみ又は対照と比較した、ヒト認可アジュバントと共に投与したＦｂａペプチドワクチン（Ｆｂａ−ミョウバン及びＦｂａ−ＭＰＬの両方）を使用して免疫したマウスの応答を示す図である。図６Ｂには、アジュバントのみ、対照、及びＦｂａペプチドを有するアジュバントで処理したマウスの生存曲線が示されている。
【図６Ｃ】アジュバントのみ又は対照と比較した、ヒト認可アジュバントと共に投与したＦｂａペプチドワクチン（Ｆｂａ−ミョウバン及びＦｂａ−ＭＰＬの両方）を使用して免疫したマウスの応答を示す図である。図６Ｃには、ＤＰＢＳ対照群又はアジュバント単独群と比較した腎臓一対当たりの生真菌単位（ＣＦＵ）の数値が示されている。
【図７Ａ】ＩｇＭと比較した、ＭＡｂ  Ｅ２−９及びＢ７−１８の分子サイズを示す図である。図７Ａには、還元条件下の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで示された、対応するサイズを有するＥ２−９及びＢ７−１８の重鎖及び軽鎖のサイズが示されている。
【図７Ｂ】ＩｇＭと比較した、ＭＡｂ  Ｅ２−９及びＢ７−１８の分子サイズを示す図である。図７Ｂには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＩｇＭ分子と一致する分子全体のサイズを示したためＩｇＭであると確認されたＥ２−９、Ｂ７−１８、及びＢ７−２２のアイソタイプが示されている。推定上のＩｇＭ五量体が、非還元条件下で実施された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットにより観察された。精製された抗Ｆｂａ  ＩｇＭ  ＭＡｂ（Ｅ２−９）の分子量は、９００ｋＤと推定された。
【図７Ｃ】ＭＡｂ  Ｅ２−９とＦｂａペプチドとの反応及び結合親和性を決定するための、阻害剤として合成Ｆｂａペプチドを使用した抗ＦｂａペプチドＭＡｂ  Ｅ２−９のＥＬＩＳＡ阻害データを示す図である。各点は、３回の測定の平均であり、示されているデータは、４回の独立実験の典型的な実験のものである。
【図８Ａ】酵母型及び菌糸型真菌を両方とも使用し、共焦点顕微鏡分析でＣ．アルビカンスの細胞表面にＦｂａペプチドを検出するためのＭＡｂ  Ｅ２−９の使用を示す図である。β−（Ｍａｎ）３に特異的であるＭＡｂ  Ｂ６．１を、陽性対照として使用した。
【図８Ｂ】ＭＡｂ  Ｂ６．１、Ｆｂａ  ＭＡｂ  Ｅ２−９、及び二次ＦＩＴＣ結合Ａｂのみを使用して、Ｃ．アルビカンスの細胞表面への結合を試験したフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図８Ｃ】重要な追加の陰性対照を使用して、Ｆｂａ又はβ−トリマンノースエピトープをいずれも発現するはずのない生菌サッカロマイセス・セレビシエに対する、ＭＡｂ  Ｅ２−９及びＢ６．１の結合を両方とも試験したフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図９Ａ】ｉ．ｖ．でのＣ．アルビカンスによるチャレンジの４時間前にＭＡｂ  Ｅ２−９（１６μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ）を投与し、別の０．２ｍｌのＭＡｂ  Ｅ２−９が、最初の投与の２４時間後に投与されたマウスの生存率を示す図である。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体で免疫したマウスを、生存の陽性対照として使用し、ＤＰＢＳ及びＣ．アルビカンス酵母細胞に吸収されたＭＡｂ  Ｅ２−９を、陰性対照として未感作マウスに投与した。
【図９Ｂ】ｉ．ｖ．でのＣ．アルビカンスによるチャレンジの４時間前にＭＡｂ  Ｅ２−９（１６μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ）を投与し、別の０．２ｍｌのＭＡｂ  Ｅ２−９が、最初の投与の２４時間後に投与されたマウスの腎臓ＣＦＵを示す図である。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体で免疫したマウスを、生存の陽性対照として使用し、ＤＰＢＳ及びＣ．アルビカンス酵母細胞に吸収されたＭＡｂ  Ｅ２−９を、陰性対照として未感作マウスに投与した。
【図１０Ａ】対照（ＤＣ−ＣＦＡ）、Ｆｂａ２−ＤＣ、Ｆｂａ２−ＤＣで免疫した後のＢＡＬＢ／ｃマウス、及び非免疫マウスから採取した血清の、ＥＬＩＳＡにより測定した抗体産生を示す図である。Ｆｂａ２を使用してＤＣをパルス処理し、Ｆｂａ−ＤＣを陽性対照として使用した。血清試料を各注射後に試験した。
【図１０Ｂ】対照（ＤＣ−ＣＦＡ）、Ｆｂａ２−ＤＣ、Ｆｂａ２−ＤＣで免疫した後のＢＡＬＢ／ｃマウス、及び非免疫マウスから採取した血清の、ＥＬＩＳＡにより測定した抗体産生を示す図である。Ｆｂａ２を使用してＤＣをパルス処理し、Ｆｂａ−ＤＣを陽性対照として使用した。血清試料を各注射後に試験した。陽性対照として、抗Ｆｂａ応答も試験した。その結果は、図１０Ｂに示されている。
【図１１】Ｃ．アルビカンスでのチャレンジ前に、Ｆｂａ−２ＤＣ、Ｆｂａ−ＤＣ、及び２つの対照、ＤＰＢＳ及びＤＣ−ＣＦＡで免疫したマウスの生存率を示す図である。
【図１２】対照（ＤＰＢＳ及びＣＦＡ−ＤＣ）及び４つのペプチド−ＤＣ（Ｆｂａ３−ＤＣ、Ｆｂａ４−ＤＣ、Ｍｅｔ６−２−ＤＣ、及びＦｂａ−ＤＣ）で免疫した後のＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した血清の、ＥＬＩＳＡにより測定した抗体産生を示す図である。
【図１３Ａ】Ｃ．アルビカンス細胞表面に発現される基本ペプチドに対する免疫血清中の抗体の結合を特異的に試験するためのフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。生真菌細胞を、免疫血清と反応させ、その後ヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体と反応させ、陰性対照の細胞を、Ｒｔ正常マウス血清（ＮＭＳ）と反応させた。陽性対照は、モノクローナル抗体ＭＡｂ  Ｂ６．１だった。
【図１３Ｂ】Ｃ．アルビカンス細胞表面に発現される基本ペプチドに対する免疫血清中の抗体の結合を特異的に試験するためのフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。生真菌細胞を、免疫血清と反応させ、その後ヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体と反応させ、陰性対照の細胞を、Ｒｔ正常マウス血清（ＮＭＳ）と反応させた。陽性対照は、モノクローナル抗体ＭＡｂ  Ｂ６．１だった。
【図１４】Ｆｂａ３−ＤＣ、Ｆｂａ４−ＤＣ、Ｆｂａ−ＤＣ、Ｍｅｔ６−２−ＤＣ、及び２つの対照ＤＰＢＳ及びＣＦＡ−ＤＣで免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンスでチャレンジしたマウスの生存率を示す図である。
【図１５】Ｆｂａ３−ＤＣ、Ｆｂａ４−ＤＣ、Ｆｂａ−ＤＣ、Ｍｅｔ６−２−ＤＣ、及び２つの対照ＤＰＢＳ及びＣＦＡ−ＤＣで免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンスでチャレンジしたマウスから採取した腎臓のＣＦＵを示す図である。
【図１６】Ｆｂａに基づく修飾ペプチドと、抗Ｆｂａ免疫血清及び非免疫マウス血清（ＮＭＳ）との反応を示す図である。ペプチドは、下記の表１に明記されており、図に示されている通りである。
【図１７】Ｆｂａペプチドに対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ａ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｂ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｃ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｄ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｅ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｆ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｇ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｈ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｉ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１８Ｊ】表１及び図１６に明記されている１０個の修飾Ｆｂａペプチドの各々に対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験したＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す図である。
【図１９】Ｆｂａ又は図１９に示されている修飾Ｆｂａペプチドの１つのいずれかを用いた２回目の追加免疫後のマウスに由来する免疫血清の抗Ｆｂａ応答を示す図である。
【図２０Ａ】異なる注射経路及び異なるアジュバントを使用し、Ｆｂａ又は修飾Ｆｂａペプチドの１つのいずれかを用いた２回目の追加免疫後のマウスに由来する免疫血清の抗Ｆｂａ応答を示す図である。図２０Ａでは、マウスは，ｉ．ｐ．注射により、ミョウバン中のペプチドを使用して免疫した。
【図２０Ｂ】異なる注射経路及び異なるアジュバントを使用し、Ｆｂａ又は修飾Ｆｂａペプチドの１つのいずれかを用いた２回目の追加免疫後のマウスに由来する免疫血清の抗Ｆｂａ応答を示す図である。図２０Ｂでは、マウスは，ｉ．ｐ．注射により、ミョウバン及びＭＰＬ中のペプチドを使用して免疫した。
【図２０Ｃ】異なる注射経路及び異なるアジュバントを使用し、Ｆｂａ又は修飾Ｆｂａペプチドの１つのいずれかを用いた２回目の追加免疫後のマウスに由来する免疫血清の抗Ｆｂａ応答を示す図である。図２０Ｃでは、マウスは，ｓ．ｃ．注射により、ミョウバン中のペプチドを使用して免疫した。
【図２０Ｄ】異なる注射経路及び異なるアジュバントを使用し、Ｆｂａ又は修飾Ｆｂａペプチドの１つのいずれかを用いた２回目の追加免疫後のマウスに由来する免疫血清の抗Ｆｂａ応答を示す図である。図２０Ｄでは、マウスは、ｓ．ｃ．注射により、ミョウバン及びＭＰＬ中のペプチドを使用して免疫した。
【図２１Ａ】ＤＰＢＳ、ＤＣ、ＣＦＡ、及びＤＣ＋ＣＦＡ対照マウスと比較して、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−パルス処理ＤＣのいずれかに対して免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）でチャレンジしたマウスの実験的播種性カンジダ症に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御応答を示す図である。図２１Ａには、５群の生存率が示されている。
【図２１Ｂ】ＤＰＢＳ、ＤＣ、ＣＦＡ、及びＤＣ＋ＣＦＡ対照マウスと比較して、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−パルス処理ＤＣのいずれかに対して免疫し、その後致死用量のＣ．アルビカンス原型株（３１５３Ａ）でチャレンジしたマウスの実験的播種性カンジダ症に対する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの防御応答を示す図である。図２１Ｂには、マウスの腎臓組織のＣＦＵが示されている。図２１Ｂの各パネルのバーは、各群のＣＦＵの平均を示し、各点は、個々のマウスを表わす。
【図２１Ｃ】チャレンジの前に生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した対照群又は免疫マウスと比較した、ＤＣ／ＣＦＡ法によりβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する血清、及び致死用量のＣ．アルビカンス株３１５３Ａでチャレンジする前にｉ．ｖ．投与した血清を投与した未感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスの応答を示す図である。図２１Ｃには、群の生存率が示されている。
【図２１Ｄ】チャレンジの前に生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した対照群又は免疫マウスと比較した、ＤＣ／ＣＦＡ法によりβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する血清、及び致死用量のＣ．アルビカンス株３１５３Ａでチャレンジする前にｉ．ｖ．投与した血清を投与した未感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスの応答を示す図である。図２１Ｄには、腎臓の真菌計数（ＣＦＵ）が示されている。
【図２１Ｅ】β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａを有するＤＣ／ＣＦＡワクチン接種を使用してワクチン接種し、研究で一般的に使用される臨床分離株であるＣ．アルビカンス株ＳＣ５３１４でチャレンジしたＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示す図である。対照は、チャレンジの前にＤＰＢＳ又はＤＣ−ＣＦＡのいずれかを投与したマウスであり、陽性対照は、３１５３Ａ株でチャレンジした群だった。
【図２２Ａ】単独で又はミョウバン若しくはＭＰＬアジュバントのいずれかと共に投与した２．５μｇのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの応答を示す図である。図２２Ａ及び２２Ｂは、合成β−（Ｍａｎ）３（図２２Ｂ）又はＦｂａペプチド（図２２Ａ）でコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡの結果である。
【図２２Ｂ】単独で又はミョウバン若しくはＭＰＬアジュバントのいずれかと共に投与した２．５μｇのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの応答を示す図である。図２２Ａ及び２２Ｂは、合成β−（Ｍａｎ）３（図２２Ｂ）又はＦｂａペプチド（図２２Ａ）でコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡの結果である。
【図２２Ｃ】単独で又はミョウバン若しくはＭＰＬアジュバントのいずれかと共に投与した２．５μｇのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの応答を示す図である。図２２Ｃには、同じマウスでの生存率が示されている。
【００１６】
【図２３Ａ】ＤＣ／ＣＦＡ又はミョウバンアジュバントのいずれかにより投与した１０μｇのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの応答を示す図である。図２３Ａ及び２３Ｂは、合成β−（Ｍａｎ）３（図２３Ｂ）又はＦｂａペプチド（図２３Ａ）でコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡの結果である。図２３Ｃには、同じマウスでの生存率が示されている。
【図２３Ｂ】ＤＣ／ＣＦＡ又はミョウバンアジュバントのいずれかにより投与した１０μｇのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの応答を示す図である。図２３Ａ及び２３Ｂは、合成β−（Ｍａｎ）３（図２３Ｂ）又はＦｂａペプチド（図２３Ａ）でコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡの結果である。
【図２３Ｃ】ＤＣ／ＣＦＡ又はミョウバンアジュバントのいずれかにより投与した１０μｇのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの応答を示す図である。図２３Ｃには、同じマウスでの生存率が示されている。
【図２４Ａ】Ｆｂａ−ＴＴのみ又はミョウバン若しくはＭＰＬ及び対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴでワクチン接種したマウスのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートは、Ｆｂａペプチド（図２４Ａ）又はβ−（Ｍａｎ）３（図２４Ｂ）でコーティングされていた。
【図２４Ｂ】Ｆｂａ−ＴＴのみ又はミョウバン若しくはＭＰＬ及び対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかのβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴでワクチン接種したマウスのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートは、Ｆｂａペプチド（図２４Ａ）又はβ−（Ｍａｎ）３（図２４Ｂ）でコーティングされていた。
【図２５Ａ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスの応答を示す図である。図２５Ａ及び２５Ｂは、Ｆｂａペプチド（図２４Ａ）又はβ−（Ｍａｎ）３（図２４Ｂ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで見られた抗体応答である。
【図２５Ｂ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスの応答を示す図である。図２５Ａ及び２５Ｂは、Ｆｂａペプチド（図２４Ａ）又はβ−（Ｍａｎ）３（図２４Ｂ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで見られた抗体応答である。
【図２５Ｃ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスの応答を示す図である。図２５Ｃには、マウスの生存率が示されている。
【図２５Ｄ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスの応答を示す図である。図２５Ｄには、腎臓一対当たりのＣＦＵが示されている。
【図２６Ａ】チャレンジの前に生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した対照群又は免疫マウスと比較した、ＤＣ／ＣＦＡ法によりβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスに由来する血清、及び致死用量のＣ．アルビカンス株３１５３Ａでチャレンジする前にｉ．ｖ．投与した血清を投与した未感作マウスの応答を示す図である。図２６Ａには、群の生存率が示されている。
【図２６Ｂ】チャレンジの前に生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した対照群又は免疫マウスと比較した、ＤＣ／ＣＦＡ法によりβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスに由来する血清、及び致死用量のＣ．アルビカンス株３１５３Ａでチャレンジする前にｉ．ｖ．投与した血清を投与した未感作マウスの応答を示す図である。図２６Ｂには、腎臓の真菌計数（ＣＦＵ）が示されている。
【図２７Ａ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの応答を示す図である。図２７Ａ及び２７Ｂは、Ｆｂａペプチド（図２７Ａ）又はβ−（Ｍａｎ）３（図２７Ｂ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで見られた抗体応答である。
【図２７Ｂ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの応答を示す図である。図２７Ａ及び２７Ｂは、Ｆｂａペプチド（図２７Ａ）又はβ−（Ｍａｎ）３（図２７Ｂ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで見られた抗体応答である。
【図２７Ｃ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの応答を示す図である。図２７Ｃには、マウスの生存率が示されている。
【図２７Ｄ】対照と比較した、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの応答を示す図である。図２７Ｄには、腎臓一対当たりのＣＦＵが示されている。
【図２８Ａ】Ｃ．アルビカンスの表面にワクチンエピトープの存在を検出するために分析されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチン接種マウスに由来する免疫血清の結果を示す図である。図２８Ａには、対照血清及びＭＡｂＢ６．１を使用したフローサイトメトリーの結果が示されている。
【図２８Ｂ】Ｃ．アルビカンスの表面にワクチンエピトープの存在を検出するために分析されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチン接種マウスに由来する免疫血清の結果を示す図である。図２８Ｂには、事前に吸収されたＭＡｂ  Ｂ６．１及び事前に吸収された免疫血清を使用した結果が示されている。
【図２８Ｃ】Ｃ．アルビカンスの表面にワクチンエピトープの存在を検出するために分析されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチン接種マウスに由来する免疫血清の結果を示す図である。図２８Ｃは、酵母型Ｃ．アルビカンスの表面及び菌糸型Ｃ．アルビカンスの表面にワクチンエピトープを検出するための共焦点顕微鏡分析の顕微鏡写真である。β−（Ｍａｎ）３に特異的であるＭＡｂ  Ｂ６．１を、陽性免疫蛍光対照として使用し、陰性対照として、Ｃ．アルビカンス３１５３Ａ酵母細胞で事前に吸収された免疫血清を使用した。
【図２９】複合糖質ワクチン（ＧＶ）又はマンノトリオース成分を欠如するペプチドワクチン（ＰＶ）のいずれかを合成するためのビルディングブロックを示す図である。
【図３０Ａ】複合糖質ワクチン（ＧＶ）又はマンノトリオース成分を欠如するペプチドワクチン（ＰＶ）の合成を更に示す図である。
【図３０Ｂ】複合糖質ワクチン（ＧＶ）又はマンノトリオース成分を欠如するペプチドワクチン（ＰＶ）の合成を更に示す図である。
【図３０Ｃ】複合糖質ワクチン（ＧＶ）又はマンノトリオース成分を欠如するペプチドワクチン（ＰＶ）の合成を更に示す図である。
【図３０Ｄ】複合糖質ワクチン（ＧＶ）又はマンノトリオース成分を欠如するペプチドワクチン（ＰＶ）の合成を更に示す図である。
【図３０Ｅ】複合糖質ワクチン（ＧＶ）又はマンノトリオース成分を欠如するペプチドワクチン（ＰＶ）の合成を更に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以前に、本発明者らは、播種性カンジダ症に対するカンジダ・アルビカンス防御マウスの細胞表面に、グリカンβ−１，２−マンノトリオース［β−（Ｍａｎ）３］に特異的な抗体があることを示した。更に、免疫原性グリコペプチド結合体を生成する試みにおいて、Ｃ．アルビカンス細胞壁タンパク質のＮ末端部分内にある６つの１４量体ペプチドをグリカンに結合させた。樹状細胞（ＤＣ）に基づく免疫手法によって、全てが免疫原性だった。６つの結合体のうちの３つは、マウスに高度な防護を誘導した。興味深いことには、その後に免疫するためのＤＣパルス処理に単独で使用すると、６つのペプチドは全て抗体応答を誘導したが、３つのペプチドが防御を誘導し、１つペプチド、特にＦｂａ（フルクトース−二リン酸アルドラーゼ由来）は、ロバストな防御応答を誘導し、本研究の焦点だった。本発明者らは、本明細書において、Ｆｂａペプチドは、下述のように様々なＨ−２ハプロタイプのマウス及びウサギに抗Ｆｂａ抗体を誘導したため、ＩＩ型ＭＨＣに限定されないことを示した。更に、このペプチドは、様々なＣ．アルビカンス株により引き起こされる疾患に対する防御を誘導した。Ｆｂａ免疫のためにＤＣではなくミョウバンを使用すると、部分的な防御が達成された。Ｆｂａワクチン接種マウスに由来する免疫血清の受動転移は、未感作マウスに防御を付与したが、真菌細胞で事前に吸収された免疫血清の受動転移は、防御を付与しなかった。また、本発明者らは、Ｆｂａペプチドに特異的なモノクローナル抗体Ｅ２−９（ＩｇＭ）は、マウスをカンジダ症から防御し、カンジダ感染症からの短期的防御を提供することができたことを示している。このモノクローナル抗体、又は他の新しいペプチドから単離されたモノクローナル抗体は、カンジダ感染症に対する防御をもたらす他の抗真菌性化合物と共に使用することができた。
【００１８】
また、本発明者らは、Ｆｂａ及びＭｅｔ６に基づいて、更なる真菌性疾患に対して使用するためのワクチンを設計し、それらペプチドを、Ｆｂａ２（配列番号７）、Ｆｂａ３（配列番号８）、Ｆｂａ４（配列番号９）、及びＭｅｔ６−２（配列番号１０）と命名した。これらは全てワクチンとしてある程度の効率性を示したが、Ｆｂａ２は、いくぶん他よりも効果的ではなかった。その後、本発明者らは、下記の表１に示されているように、様々な位置のアミノ酸をメチル化することにより（配列番号１１〜１９）、又は２つのシステイン残基を付加することにより（配列番号２０）Ｆｂａの配列を修飾した。これら修飾Ｆｂａペプチドも、ワクチンとしての有効性を示した。また、これらペプチドは、タンパク質担体、例えば破傷風トキソイド、又はアジュバントと共に投与して、ワクチンとしての有効性を増加させることができる。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）由来のペプチドを含む幾つかのペプチドワクチンは、破傷風毒素（６３、６４、６５）又は破傷風ＴＨエピトープ（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１０１５３４号）に共有結合で結合されている。
【００１９】
また、本発明者らは、免疫原性を向上させ、ヒト使用に好適なアジュバントの使用を可能にするために、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させることにより、以前に報告されているβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体（５３）を修飾した。ヒト使用に完全に適合する新しい免疫手順により、修飾β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴを、単独で又はミョウバン若しくはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）アジュバントとの混合物のいずれかで投与し、皮下（ｓ．ｃ．）経路によりマウスに投与した。アジュバントを用いてワクチン接種したマウス、又は驚くべきことにアジュバントを用いずにワクチン接種したマウスは、ロバストな抗体応答を起こすことにより、良好に応答した。下記に示されているように、免疫群は、チャレンジ前にアジュバントのみ又はＤＰＢＳ緩衝液を受容した対照群と比較して、生存期間が延長され、腎臓真菌量が低減することにより明らかなように、Ｃ．アルビカンスによる致死的チャレンジに対する高度な防御を示した。誘導された抗体が防御性であることを確認するために、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体に対して免疫されたマウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御を未感作マウスに転移させたが、Ｃ．アルビカンス吸収免疫血清は、転移させなかった。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチンより誘導された同様の抗体応答及び防御が、近交系ＢＡＬＢ／ｃ及び非近交系Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスで観察された。ＴＴをグリコペプチド結合体に付加すると、追加のアジュバントを必要とせずにロバストな抗体応答を促進する新しい自己アジュバント性ワクチンがもたらされた。これは、播種性カンジダ症に対するワクチン設計にとって大きな前進である。本発明者らは、β−（Ｍａｎ）３及びＴＴを上記で考察した他のペプチドに付加することに基づく結合体は、真菌感染症又は疾患に対する抗体応答及び防御を促進することになる自己アジュバント性ワクチンになるだろう。
【００２０】
その他
用語「ワクチン」は、哺乳動物に免疫応答を刺激し、したがって、免疫系が以前に遭遇した抗原を記憶する能力を含む、その哺乳動物の疾患又は感染症に対する抵抗性を付与するために使用される組成物又は化合物（抗原）を指す。抗体は、抗原に対する初回曝露の結果として生成され、その後の暴露に備えて保存される。
【００２１】
用語「アジュバント」は、抗原と組み合わせると、抗体形成細胞の局所的な流入に結び付く炎症性又は他の不定型応答を誘導することにより抗体産生を増強する非抗原性物質（水酸化アルミニウム及びモノホスホリルリピドＡ等）を指す。アジュバントは、少量の抗原に対する抗体の産生を増加させ、抗体産生の期間を延長し、記憶細胞応答を誘導する傾向があるため、ワクチン調製に治療的に使用される。
【００２２】
用語「免疫応答」は、外来性又は潜在的に危険な物質（抗原）、特に疾患性微生物に対する身体の反応を指す。この応答は、特殊白血球細胞（リンパ球）が、抗体として知られているタンパク質を産生することを含む。抗体は、抗原と反応して抗原を無害化する。抗体−抗原反応は、高度に特異的である。また、ワクチンは免疫応答を刺激する。
【００２３】
用語「免疫学的有効量」は、有効なワクチンに必要な免疫記憶を誘導するために求められる免疫応答誘導性物質の量を指す。
本発明の医薬組成物には、注射可能な組成物の形態で投与されるという利点がある。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液中のヒト血清アルブミンを含有していてもよい。他の薬学的に許容される担体には、塩、保存剤、緩衝剤等を含む水溶液、無毒性賦形剤が含まれる（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１５版、Ｅａｓｔｏｎ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．社、１４０５〜１４１２頁及び１４６１〜１４８７頁（１９７５年）及びＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＦＯＲＭＵＬＡＲＹ  ＸＩＶ、１４版、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ワシントンＤ．Ｃ．（１９７５年）。これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウム等の非経口媒体、リンゲルデキストロース等が含まれる。静脈内媒体には、液体及び栄養補充液が含まれる。医薬組成物の種々の成分のｐＨ及び正確な濃度は、当技術分野の日常的な技術により調整される。Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ、ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（７版）。
【００２４】
典型的には、そのようなワクチンは、液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。注射前に液体中の溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態を調製することもできる。また、製剤は、乳化されていてもよい。活性免疫原性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノール等、及びそれらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、又はワクチンの有効性を増強する免疫強化物質等の少量の補助物質を含有していてもよい。
【００２５】
アジュバントは、免疫防御抗体価又は細胞性免疫応答を増加させることができる。そのようなアジュバントには、これらに限定されないが、以下のものが含まれ得る：フロインド完全アジュバント、フロインド不完全フジュバント、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ａｄｊｕｖａｘ（Ａｌｐｈａ−Ｂｅｔａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、モノホスホリルリピドＡ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、ＭＰＬ＋ＴＤＭ（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｉｔｅｒｍａｘ（ＣｙｔＲｘ社）、毒素、トキソイド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、細菌細胞壁、サブユニット（細菌性又はウイルス性）、炭水化物部分（モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、オリゴ−、及びポリサッカライド）、種々のリポソーム製剤、又はサポニン。ミョウバンは、現在、ヒト患者に使用されるアジュバントである。種々のアジュバントの組合せを結合体と共に使用して、免疫原製剤を調製することができる。
【００２６】
ワクチンは、従来通り、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、経口、経鼻、非経口、又は粘膜免疫を刺激するために尿生殖路に直接、好ましくは局所的に投与される。更なる製剤が、他の投与方法に好適であり、それらには、経口製剤が含まれる。経口製剤には、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウム等の典型的な賦形剤が含まれる。組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する。
【００２７】
投与される用量は、必要とされる希釈剤、つまり担体又は媒体、及び特定の治療計画に伴う所望の治療効果をもたらすことが計算される活性物質の所定量に依存する。投与される量は、治療の回数及び量の両方に従って、治療しようとする対象、抗体を合成する対象の免疫系の能力、及びどの程度の防護が所望であるかに依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体によって様々である。しかしながら、好適な用量範囲は、個々の一対象当たり約１〜数百マイクログラムの活性成分である。また、初回投与及び追加免疫注射の好適な投与計画は様々であるが、典型的には、初回投与した後、１週間又は２週間の間隔で、１回又は複数回の追加注射又は投与を行う。防御を継続的させるために、年１回の追加免疫を行ってもよい。
【００２８】
抗真菌性化合物は、当技術分野で周知であり、幾つかの群に分類することができる：ポリエン抗真菌剤、アゾール、アリルアミン、エキノキャンディン、及び他の抗真菌性化合物。ポリエン抗真菌剤（複数の共役二重結合を有する化合物）の例には、アムホテリシンＢ、カンジシジン、ナイスタチン、ナタマイシン、及びリモシジンが含まれる。一般的に用いられるアゾール（５員有機環を有する化合物）の例には、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、及びクロトリマゾールが含まれる。アリアミン（allyamine）（スクアレン合成を阻害することによりエルゴステロール合成を阻害する化合物）の例には、ナフチフィン、テルビナフィン、及びアモロルフィンが含まれる。エキノキャンディン（細胞壁のグルカンの合成を阻害する化合物）には、アニデュラファンギン、カスポファンギン、及びミカファンギンが含まれる。他の一般的に使用される抗真菌性化合物には、グリセオフルビン及び５−フルオロサイトシンが含まれる。
【００２９】
セクションＡ：ペプチドワクチン
（実施例１）
物質及び方法
カンジダ株及び培養条件。Ｃ．アルビカンス３１５３Ａ及びＳＣ５３１４、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）（ＡＴＣＣ  ６２５８）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２００１）、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ  ９４６３）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；マナッサス、バージニア州）から取得し、グルコース−酵母抽出物−ペプトンブロス中で静止期の酵母細胞として３７℃で増殖させ、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、ミズーリ州）で洗浄及び懸濁して、適切な細胞濃度（５×１０６／ｍｌ）にし、それを使用して、以前に記述されているように（２５、２９）マウスを静脈内（ｉ．ｖ．）感染させた。また、Ｃ．アルビカンス株３１５３Ａを、血清抗体吸収、免疫蛍光染色、及びフローサイトメトリー分析に使用した。別様の指定がない限り、Ｃ．アルビカンス株３１５３Ａを、下記実施例でマウスのチャレンジに使用した。
【００３０】
マウス。５〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ、フレデリック、メリーランド州）を全体にわたって使用した。マウスは、動物設備で飼育され、動物実験は全て、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓの院内実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコールに従って実施した。別様の指定がない限り、下記では、ＢＡＬＢ／ｃマウスを実験に使用した。
【００３１】
マウス骨髄からの樹状細胞（ＤＣ）の分離及び培養。樹状細胞（ＤＣ）を、以前に記述されている方法に従って（４９、５３）、マウス骨髄から生成した。手短に言えば、供与体マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、それらの長骨及び脛骨を無菌的に取り出した。数ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を強制的に注入することにより骨髄を硬骨から洗い出し、無菌７０−ｍｍ細胞ストレーナーで穏やかにピペット操作することにより、集塊を除去又は分散した。赤血球細胞を４分間細胞溶解し（ＡＣＫ細胞溶解緩衝液、０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、残留骨髄細胞を、完全培地［ＣＭ、１０％ＦＢＳ（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、及び１００単位／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補完されたＲＰＭＩ−１６４０］に懸濁し、２×１０５細胞／ｍｌに調整し、５ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに配置し、４０ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦ及びｒｍＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の存在下で、３７℃、５％ＣＯ２にて最長９日間培養した。培養の４日目及び７日目に、同量の新しいＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４をウェルに添加した。別様の記載がない限り、試薬は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から商業的に購入した。
【００３２】
ペプチドでパルス処理した樹状細胞による免疫。以前に記述されているように（５３）、マウス樹状細胞（ＤＣ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて候補ペプチドワクチン抗原でパルス処理した。手短に言えば、６日目に、培養中のＤＣをペプチド抗原（１μＭ）でパルス処理した。７日目に、ＰＧＥ２（１０−７Ｍ）を、ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共に、２４時間添加した。９日目に、抗原パルス処理ＤＣをよく洗浄し、２００μｌのＤＰＢＳ中５×１０５個を、初回刺激用量としてマウスに腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。１４日目に、マウスを、新しい抗原パルス処理ＤＣでｉ．ｐ．追加免役し、２８日目に、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中の乳化された抗原（１０μｇ）を皮下（ｓ．ｃ．）投与して、２回目の追加免疫を行った。
【００３３】
ヒト認可アジュバント中のペプチドＦｂａによる免疫。Ｆｂａペプチドを、アジュバントとしてのミョウバン（水酸化アルミニウムゲル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はＭＰＬ（リピドＡ、モノホスホリル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）との混合物のいずれかとして投与した。１日目、２１日目、及び４２日目に、５０μｇミョウバン又は１０μｇＭＰＬのいずれかと共に、１００μｌの２．５μｇＦｂａペプチドをｓ．ｃ．注射することにより、マウスを免疫した。ＤＰＢＳ緩衝液又はアジュバントのみを投与したマウス群に由来する血清を、陰性対照として使用した。
【００３４】
血清学的アッセイ。血清の抗体価をＥＬＩＳＡで分析した。ＤＣに基づく免疫の場合、対照群は、初回刺激及び最初の追加免疫の際にＤＣのみが投与され、その後２回目の追加免疫の際にＣＦＡのみが投与されたか、又は３回の注射全てでＤＰＢＳのみが投与されたマウスで構成されていた。Ｆｂａペプチドがミョウバン又はＭＰＬと共に投与された場合、対照群は、アジュバントのみ又はＤＰＢＳ緩衝液が投与されたマウスだった。Ｆｂａペプチドを、そのリジンコアが、Ｆｂａペプチドエピトープのおよそ８個のコピーを提示した複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰ）に結合させた。合成Ｆｂａ−ＭＡＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、それを使用して９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、各免疫血清及び対照血清の試料の連続２倍希釈物を重複して試験した。各ウェルの発色は、二次抗体（ヤギ抗マウス多価Ｉｇ−ＨＲＰ）及び基質（Ｏ−フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２）により達成され、４９２ｎｍのＯＤを測定した。
【００３５】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）。ＭＡｂ  Ｅ２−９（ＩｇＭ）を産生するハイブリドーマクローンを、以前に記述されるように（５３）、Ｆｂａ−ＤＣ調製物でワクチン接種したマウスから生成した。手短に言えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、合成Ｆｂａペプチドでパルス処理したＤＣを注射することにより免疫して、上述のＦｂａペプチドに対する抗体の産生を刺激した。２回目の追加免疫の１０日後に、各動物から血清を採取して、後に犠牲し、脾臓を取り出し、単個細胞浮遊液を調製するために、最も高い抗Ｆｂａ力価を有する動物を決定した。標準的プロトコールにより、脾臓細胞とＳＰ２／０−ＡＧ１４ミエローマ細胞系の融合をポリエチレングリコールで促進することによって、ハイブリドーマクローンを確立した。ハイブリドーマクローンを、ＥＬＩＳＡにより特異的抗Ｆｂａ抗体の産生についてスクリーニングし、力価が最も高く、最も迅速に成長するクローンのみを選択し、その後、限界希釈法により３回以上のクローニングを行った。ＭＡｂ  Ｅ２−９と命名したＭＡｂを産生するクローンＥ２−９は、下述の方法により合成Ｆｂａペプチドを用いたＥＬＩＳＡ阻害により決定したところ、Ｆｂａペプチドと反応性だった。
【００３６】
ハイブリドーマ細胞系を、まず、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社）で補完された無抗生物質のＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）中で、３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で増殖させた。抗体産生の場合、ハイブリドーマクローンを、無抗生物質のＢＤ細胞ＭＡｂ無血清培地（しかし、１．１ｍｇウシ血清アルブミン／ｍｌを含有している）を用いてＣＥＬＬｉｎｅデバイス（ＢＤ社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で増殖させ、遠心ろ過デバイス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を使用して濃縮した。ＭＡｂ濃度は、試料の２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定することにより決定し、純度は、１０〜１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの分析により評価した。
【００３７】
阻害ＥＬＩＳＡ。Ｆｂａペプチドに対するＭＡｂ  Ｅ２−９の特異性は、以前に記述されているように（５２、５３）、阻害ＥＬＩＳＡにより決定した。手短に言えば、Ｆｂａ−ＭＡＰを、ＤＰＢＳ（５μｇ／ｍｌ）に溶解し、その溶液を使用して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした（１００μｌ、４℃で一晩）。ウェルを、ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％［容積／容積］を含有するＰＢＳ）で５回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン−ＰＢＳＴでブロッキングした。上述のように産生されたＭＡｂ  Ｅ２−９を、ＥＬＩＳＡ測定用に１０，０００まで連続希釈した。別様の記載がない限り、血清を、ＤＰＢＳで１：１００希釈に希釈して、ＥＬＩＳＡにより抗体の含有量を決定した。ＭＡｂ  Ｅ２−９を、Ｆｂａペプチド（阻害剤）（０．１μＭ〜１ｍＭの濃度でＰＢＳＴに溶解）と混合し、その結果生じた各濃度の溶液を、Ｆｂａ−ＭＡＰでコーティングしたマイクロタイターウェル（固相）に三重反復で添加し、２１〜２３℃で２時間インキュベートした。別様の記載がない限り、ウェルをコーティングするのに使用した試験抗原の濃度は、約５〜１０μｇ／ｍｌだった。ウェルを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＩｇＭに特異的なヤギ抗マウス重鎖をＨＲＰに結合し（ＰＢＳＴで１：１０，０００希釈）（Ｓｉｇｍａ社）、１００μｌを、対応するウェルに添加し、２１〜２３℃で１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳＴで５回洗浄し、その後、１００μｌの基質溶液（２５ｍｌの０．０５Ｍリン酸−クエン酸緩衝液［ｐＨ５．０］、２００μｌの５０ｍｇ／ｍｌＯ−フェニレンジアミン水溶液の［Ｓｉｇｍａ社］、及び１０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）を添加した。１０分間発色させ、１００μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより発色を停止させ、４９２ｎｍで測定を行った（マイクロタイタープレートリーダ、モデル４５０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、リッチモンド、カリフォルニア州）。阻害率は、阻害剤を含まない抗体を含有するウェルに対して算出した。
【００３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＭＡｂ  Ｅ２−９を、還元（β−メルカプトエタノール）条件下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２．５％ポリアクリルアミド）分析により評価して、抗体の重鎖及び軽鎖のサイズを決定した。Ｅ２−９がＩｇＭ五量体であることを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２．５％アクリルアミド／ビス及び０．５％アガロース）条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットで示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、タンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に転写した。ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）に溶解された５％脱脂乳で、膜を２時間ブロッキングした。膜をＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次Ａｂｓでプローブした。陽性シグナルを、ＥＣＬシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用して視覚化した。
【００３９】
免疫蛍光法及びフローサイトメトリー分析。Ｆｂａペプチドエピトープの酵母細胞での分布を、間接免疫蛍光法により決定した。２００マイクロリットルのＭＡｂ  Ｅ２−９（１ｍｌのＤＰＢＳ当たり１６μｇのＡｂタンパク質）を、ＤＰＢＳで予め３回洗浄したＣ．アルビカンス酵母細胞（５×１０６）のペレットに添加した。酵母細胞を、抗体調製物に懸濁し、回転振とうしながら室温（ＲＴ、２２〜２４℃）で１〜２時間インキュベートした。インキュベーション後、酵母細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（ｕ−鎖特異的；Ｓｉｇｍａ社）（原液、１ｍｇ／ｍｌ；作業用溶液、１ｍｌ  ＤＰＢＳ当たり２０μｇ）に懸濁し、上述のようにＲＴで０．５時間インキュベートした。酵母細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＤＰＢＳに懸濁した。細胞を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。酵母細胞表面におけるＦｂａペプチドエピトープの分布を、ＭＡｂ  Ｂ６．１エピトープの検出用に蛍光染色された酵母細胞で得られた分布と比較した。陰性対照には、無関係なアイソタイプ対照ＩｇＭ  ＭＡｂ  Ｓ−９（４５）の試験及びフルオレセイン標識ヤギ抗マウス二次抗体のみの使用が含まれていた。フローサイトメトリー分析の場合、最後のインキュベーション後、細胞を上述のように洗浄し、５００μｌのＤＰＢＳ緩衝液に懸濁した。フローサイトメトリーは、４８８ｎｍでのアルゴンレーザー励起を装備したＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥを使用して実施した。各試料中の細胞を１０，０００個分析した（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア）。
【００４０】
真菌チャレンジ及び防御の評価。２回目の追加免疫の２週間後、免疫マウス及び対照マウスを、上述のように及び以前に記述されているように（５３）調製された致死用量の生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞（０．１ｍｌのＤＰＢＳ中５×１０５個）で静脈内（ｉ．ｖ．）感染させた。受動免疫されたマウス（以下）も、同じチャレンジ用量を受容した。防御は、動物生存を８０〜１００日間モニターすることにより評価した。マウスが瀕死状態になったかどうかを１日２〜３回モニターした。瀕死状態は、活力が低下し、餌又は水に無関心であり、指で触っても反応がないことと定義した。瀕死であるとみなした時点でマウスを犠牲にし、マウスの腎臓（幾つかの実験では、脳）を、ＤＰＢＳでホモジナイズし、栄養寒天上に播種して、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。８０〜１００日後に実験を終了させ、その時点で生存していたマウスを全て犠牲にし、腎臓のＣＦＵを以前と同じように評価した。ＣＦＵアッセイの最低検出限度は、腎臓一対当たり５０ＣＦＵだった。
【００４１】
ポリクローナル抗体（ＰＡｂ）の受動転移。ワクチン接種マウスに由来する血清中の抗体が、能動免疫により誘導された防御の少なくとも部分的な原因であったか否かを決定するために、ワクチン接種マウスからポリクローナル抗血清（ＰＡｂ）を得て、貯留した。Ｆｂａパルス処理ＤＣで免疫したマウスに由来する免疫血清の貯留を、上述のようにＥＬＩＳＡで力価測定した。ＰＡｂ貯留を、−２０℃で保存するか、又はＣ．アルビカンス酵母細胞で吸収させて保存した。ウサギ抗Ｆｂａ血清の転移の場合、免疫前ウサギ血清を受容した１マウス群を、追加対照として使用した。試験の場合、マウスは、０．５ｍｌの完全に強力な免疫血清又は対照血清をｉ．ｐ．で受容した。４時間後に、全てのマウスにＣ．アルビカンス（５×１０５酵母細胞）をｉ．ｖ．でチャレンジした。動物は全て、最初の投与の２４時間後に、第２の用量（１００〜２００ｌ）の血清又は緩衝液をｉ．ｐ．で受容した。
【００４２】
腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によるＭＡｂの受動転移。ＭＡｂ  Ｅ２−９の予防効果は、上記のＰＡｂでの実験と同じ注射スケジュールにより試験した。対照マウスは、同容積のＤＰＢＳ希釈剤を受容した。濃縮ＭＡｂ  Ｅ２−９調製物をＤＰＢＳで希釈し、Ｆｂａ−ＭＡＰでコーティングしたマイクロタイタープレートに対して、ＥＬＩＳＡ力価を１０，０００とした。これは、１６μｇ／ｍｌの抗体とほぼ等しい。マウスに注射する前に、抗体溶液を１５，０００×ｇで１５分間遠心して、考え得る抗体凝集体を除去した。マウスでの試験の陰性対照物質は、Ｃ．アルビカンス酵母細胞で吸収されたＭＡｂ及びＤＰＢＳだった。各条件について、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）には、０．５ｍｌの試験ＭＡｂ又は対照物質を腹腔内投与し、その４時間後、１ミリリットルのＤＰＢＳ当たり５×１０６個の酵母細胞を含有する０．１ｍｌの懸濁液を静脈内に投与した。
【００４３】
統計分析。生存期間中央値を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法で統計的に評価した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン４）。全ての分析で、１群当たりのマウスは５匹であり（ｎ＝５）、両側ｔ検定を使用し、ほとんど全ての実験は、少なくとも２度繰り返した。
【００４４】
（実施例２）
３つの合成ペプチドによるワクチン接種は、マウスの播種性カンジダ症に対する抗体産生及び防御を誘導した。
【００４５】
Ｃ．アルビカンス担体ペプチドを、ヒト播種性カンジダ症の発病中に発現される細胞壁タンパク質から選択した（１１、４６、５３）。本発明者らは、６つの候補担体を選択した。その各々は、真菌の細胞壁に位置すると推定される、それぞれの完全タンパク質のＮ末端付近に位置する１４個アミノ酸で構成されていた（４６、５３）。括弧の中に示されているこの６つの候補担体ペプチドは、タンパク質フルクトース二リン酸アルドラーゼ（Ｆｂａ）；メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタマート（Ｍｅｔ６）；菌糸壁タンパク質−１（Ｈｗｐ１）；エノラーゼ（Ｅｎｏｌ）；グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐ１）；及びホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ１）に由来していた。各合成ペプチドを、合成グリカンβ−（Ｍａｎ）３に化学的に結合させて、免疫原性を試験するための６つのグリコペプチドワクチン構築体を生成した。これらグリコペプチド結合体のうちの３つ、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ、β−（Ｍａｎ）３−Ｍｅｔ６、及びβ−（Ｍａｎ）３−Ｈｗｐ１は、致死用量のＣ．アルビカンスでチャレンジした後、生存及び低腎臓真菌量により明らかなように高度な防御を誘導した（５３）。これら以前の結果により、本発明者らは、担体ペプチドに対する応答もまた防御に寄与したか否かを検討するに至った。以前に記述されているような（４９、５３）、抗体の産生を促進する抗原パルス処理樹状細胞（ＤＣ）に基づくワクチン戦略により、６つのペプチド全てを試験した。結果は図１Ａに示されている。
【００４６】
図１Ａ〜１Ｃには、ペプチドパルス処理ＤＣワクチンに対するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗体応答が示されている。初回刺激及び最初の追加免疫の場合の、樹状細胞（ＤＣ）に提示された６つの合成ペプチド担体で免疫したマウスに由来する血清を、２回目の追加免疫の場合には、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化し、ＥＬＩＳＡで試験して、ペプチドに対する抗体応答を調べた。対照群は、ペプチドが使用されなかったか（ＤＣ＋ＣＦＡ）又はＤＰＢＳのみが各注射時点で使用されたという点を除いて、初回刺激及び追加免疫と同じ投与計画が行われたマウスで構成されていた。図１Ａには、２回目の追加免疫の１４日後に、ワクチン接種動物の１群当たり５匹のマウスの各々及び２つの対照群の５匹のマウスの各々から採取し、１：１００希釈し、ＥＬＩＳＡで試験した血清試料の結果が示されている。ペプチドは全て、マウスに抗体応答を誘導することができた。図１Ｂには、３つのペプチドワクチンが、播種性カンジダ症に対する防御応答をマウスに誘導したことが示されている。致死用量の生菌Ｃ．アルビカンスでチャレンジした後、ペプチドＦｂａ、Ｈｗｐ１、及びＭｅｔ６をワクチン接種したマウスは、いずれの対照群よりも有意に長い期間生存した（Ｐ＜０．０５）。図１Ｃには、Ｆｂａ、Ｈｗｐ１、及びＭｅｔ６で免疫したマウスは、いずれの対照群と比較しても、大幅に低減されたか又は検出不能な（ＮＤ）腎臓一対当たりの生真菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）を示したことが示されている（ｐ＜０．００１）。Ｐｇｋ１で免疫したマウスも、対照と比較して、低減されたか又は検出不能な腎臓のＣＦＵを示した。各パネルのバーは、各群の腎臓一対当たりのＣＦＵの平均を示す。ＣＦＵアッセイの最低検出限度は、腎臓一対当たり５０ＣＦＵだった。
【００４７】
６つのペプチドは全て、各々に特異的な抗体の力価が高いことにより示されたように、それ自体が免疫原性であった（図１Ａ）。無作為配列の対照ペプチドを使用した。それらは、検出可能な特異的抗体応答を全く誘導しなかった（データ非表示）。加えて、種々の免疫−血清の各々とそれぞれの無関連ペプチドとの交差反応性の試験は、陰性だった（データ非表示）。また、６つの抗血清の各々は、間接免疫蛍光顕微鏡法により明らかなように、酵母型及び菌糸型の真菌と直接反応したが、陰性対照血清は、反応しなかった（データ非表示）。
【００４８】
興味深いことには、３つの担体ペプチドＦｂａ（配列番号１）、Ｍｅｔ６（配列番号２）、及びＨｗｐ１（配列番号３）は、真菌でチャレンジしたマウスの生存及び低腎臓真菌量により明らかなように、高度な防御を誘導した（図１Ｂ及び１Ｃ）。Ｆｂａ、Ｍｅｔ６、又はＨｗｐ１ペプチドワクチンを受容した免疫群は、８０日間にわたるチャレンジ後の観察期間中に４０〜８０％の生存を示し、致死用量の生菌真菌細胞をｉ．ｖ．チャレンジした後、ＤＰＢＳ及びアジュバントのみの対照と比較して、有意により長い期間生存した。この結論は、２つの他のペプチドＧａｐ１又はＥｎｏ１はいずれも、播種性カンジダ症に対する防御を誘導しなかったという長期観察により更に強化される（図１Ｂ）。重要なことには、Ｆｂａ、Ｍｅｔ６、及びＨｗｐ１に対して免疫された群の生存マウスは、死亡した動物と比較して（ｐ＜０．００１）、播種性カンジダ症の標的器官である腎臓中で、低いか又は検出不能でさえある生真菌単位（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を示した（図１Ｃ）。Ｇａｐ１又はＥｎｏｌ１のみで免疫されたマウスでは、腎臓の真菌量は、非免疫マウスと比較してわずかに少なかったが、その差は有意ではなかった。驚くべきことに、Ｐｇｋ１も単独で、ある程度の防御を誘導した。また免疫マウスは、対照と比較して低いか又は検出不能な肝臓ＣＦＵを示した。これは、β−（Ｍａｎ）３−Ｐｇｋ１免疫が実際には疾患を増強していたため（５３）、予想外だった。
【００４９】
（実施例３）
Ｆｂａペプチドは、ＭＨＣＩＩ限定のエピトープではない。
Ｆｂａペプチドを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで試験した。このマウスは、別の一般的近交系マウス系であるが、ＢＡＬＢ／ｃマウスとは異なるＭＨＣハプロタイプ及び免疫表現型を有する（３５）。これら２つの系統は、実験的播種性カンジダ症に対する抵抗性又は感受性が異なる（２〜４）。Ｔｈ１（Ｃ５７ＢＬ／６）又はＴｈ２（ＢＡＬＢ／ｃ）バイアスに関するマウス系統差に加えて、これら系統は、活性化されるマクロファージの能力が異なる（６）。上述のようなＢＡＬＢ／ｃマウスに使用した同じＤＣに基づく免疫手法により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＤＰＢＳ緩衝液又はＤＣ＋ＣＦＡを注射したマウスの対照群と比較して、単独で又は複合糖質として投与したＦｂａペプチドを用いて試験した。結果は、図２に示されている。
【００５０】
図２には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、Ｆｂａペプチドワクチン又は対照に対する抗体応答が示されている。２回目の追加免疫の１４日後に、免疫血清を、ＥＬＩＳＡにより試験して、Ｆｂａペプチドに対する抗体応答を調べた。ＥＬＩＳＡ力価は、合成ペプチドＦｂａ−ＭＡＰでコーティングされたプレートで測定したところ、２つの対照群と比較して、ペプチドに対して比較的強力な特異的抗体応答を示した。最初の追加免疫の後で、ＩｇＭからＩｇＧへのＦｂａ特異的抗体のアイソタイプスイッチが、免疫マウスに由来する血清で観察された（データ非表示）。
【００５１】
受動転移実験用に十分な抗血清を得るために、及びＦｂａペプチドが免疫学的に他の動物種に限定されるか否かを決定するために、本発明者らは、商業的業者（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）から、このペプチドに対するウサギ抗血清を得た。ウサギ免疫の前に、Ｆｂａを、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合させた。２匹のウサギの各々に由来する、力価が５１２，０００の抗Ｆｂａペプチド免疫血清を得た。これは、ＦｂａペプチドがＭＨＣ限定エピトープではなく、ヒトを含む他の哺乳動物で免疫原性であり得るという追加の証拠を示す（データ非表示）。
【００５２】
（実施例４）
Ｆｂａ−ＤＣワクチン接種は、様々なＣ．アルビカンス株でチャレンジしたマウスを防御する。
【００５３】
Ｆｂａペプチドパルス処理ＤＣによるワクチン接種が、異なるＣ．アルビカンス株でチャレンジしたマウスを防御するか否かを試験するために、本発明者らは、Ｃ．アルビカンスの最も一般に使用されている研究用の臨床分離株であるＣ．アルビカンス株ＳＣ５３１４（ＡＴＣＣ）で免疫マウスをチャレンジした。陽性対照として、同時に免疫した第２群のマウスを、Ｃ．アルビカンス株３１５３Ａでチャレンジした。結果は、図３Ａ〜３Ｄに示されている。
【００５４】
図３Ａ〜３Ｄには、Ｆｂａペプチドワクチンが、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、様々なＣ．アルビカンス株により引き起こされた播種性カンジダ症に対する防御応答を誘導したことが示されている。樹状細胞手法によるＦｂａペプチドでのワクチン接種は、真菌株に関わらず、対照群と比較して、実験的播種性カンジダ症に対する有意な防御をマウスに誘導した。図３Ａでは、致死用量のＣ．アルビカンス原型株（ＳＣ５３１４）でチャレンジしたワクチン接種マウスは、ＤＣ＋ＣＦＡ又はＤＰＢＳを受容した対照マウスと比較して、生存期間の有意な延長を示した（Ｐ＜０．０１）。生存データと一致して、免疫マウスは、対照マウスと比較して（Ｐ＜０．０１）、腎臓のＣＦＵが大幅に低減されたか又は検出不能だった（図３Ｂ）。免疫マウスをＣ．アルビカンス株３１５３Ａでチャレンジすると、同様の結果が得られた（図３Ｃ、生存曲線；及び図３Ｄ、腎臓のＣＦＵ）。
【００５５】
（実施例５）
ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスのワクチン効力：抗体価及び生存研究。
上記に示されているように（図２）、Ｆｂａペプチドも、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに強力な抗体応答を誘導した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｔｈ１応答を起こしやすい傾向があり、Ｔｈ２、及びしたがって抗体応答を起こしやすい傾向のあるＢＡＬＢ／ｃマウスよりも、播種性カンジダ症に対してより抵抗性であると推定される。したがって、Ｆｂａワクチンの一般的な効力を決定するために、免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、播種性カンジダ症から防御されていた否かを試験した。結果は、図４Ａ〜４Ｃに示されている。
【００５６】
図４Ａ〜４Ｃには、Ｆｂａペプチド−ＤＣワクチン又はβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａパルス処理ＤＣのいずれかに対してマウスを免疫した際の、実験的播種性カンジダ症に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御応答が示されている。図４Ａは、ペプチドで免役したマウスが、ＤＰＢＳ及びＤＣ＋ＣＦＡ対照マウスよりも、有意に長い期間生存した（Ｐ＜０．０１）ことを示す。図４Ｂ及び４Ｃには、実験を生き残った免疫マウスが、対照と比較して、腎臓（Ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）及び脳（Ｐ＜０．００１）（図４Ｃ）で、大幅に低減されたか又は検出不能な５０ＣＦＵ／ｇを超える生菌ＣＦＵを示すことが見出されたことが示されている。図４Ｂ及び４Ｃの各パネルのバーは、各群のＣＦＵの平均を示す。ＣＦＵの各値は、各個々のマウスを表わす。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ処理ＤＣ（３番目の欄）のデータポイントは、これらワクチン接種マウスのＣＦＵ数が、５０ＣＦＵ／ｇ未満だったため示されていない。Ｆｂａ−ＤＣの場合、１匹のマウスが、５０ＣＦＵ／ｇを超える脳ＣＦＵ示し、したがって、単一のデータ点が示されている。残りの４匹のマウスは、組織１ｇ当たり５０未満のＣＦＵを示した。
【００５７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスで観察されたように（５３）、Ｆｂａペプチドパルス処理ＤＣによるワクチン接種は、このマウス株に実験的播種性カンジダ症に対する防御を誘導した（図４Ａ）。具体的には、Ｆｂａペプチドワクチン接種は、ＤＰＢＳ対照又はアジュバントのみのワクチン接種の生存期間と比較して、ＢＡＬＢ／ｃ（５３）及びＣ５７ＢＬ／６マウスの両方の生存期間延長をもたらした。生存データと一致して、観察期間を生き残った免疫マウスは、真菌でｉ．ｖ．チャレンジ後に瀕死状態になった際に犠牲にされた対照と比較して、大幅に低減されたか又は検出不能な腎臓及び脳の生真菌単位ＣＦＵを示した（図４Ｂ及び４Ｃ）。
【００５８】
（実施例６）
抗Ｆｂａペプチド免疫血清は、未感作マウスに受動防護をもたらす。
誘導された抗Ｆｂａ抗体応答が、少なくとも部分的に防御の原因であるか否かという問いに答えるため、致死用量のＣ．アルビカンスをｉ．ｖ．でチャレンジする４時間前に、免疫マウスから抗血清を採取し、未感作マウスにｉ．ｐ．で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した。Ｆｂａペプチドパルス処理ＤＣで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。
【００５９】
図５Ａ〜５Ｃに示されているように、免疫マウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御の原因だった。免疫した１４日後に、樹状細胞手法によりＦｂａペプチドに対して免疫されたマウスから血清を採取した。免疫血清を貯留し、上記の実施例１に記載のように、実験的播種性カンジダ症に対する未感作マウスの受動防護を試験した。図５Ａには、生存曲線が示されており、Ｆｂａペプチドで免疫したマウスに由来する血清を受容したマウスでは、対照物質を受容した動物と比較して、播種性Ｃ．アルビカンス感染症に対する防御の増強が観察されたことが示されている。防御の陽性対照として使用した供与体マウスは、免疫血清を受容した未感作マウスと同様の生存曲線を示したことに留意されたい。転移前のＣ．アルビカンスでの吸収が、免疫血清の防御価値を取り去ったということも重要である。図５Ｂには、免疫マウス及び抗血清を受容したマウスは、ＤＰＢＳ緩衝液又はＣ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収されていた同じ血清を受容した対照群と比較して、有意に少数（Ｐ＜０．０００１）の真菌計数又は検出不能な腎臓ＣＦＵを示したことが示されている。図５Ｃには、特異的な抗Ｆｂａポリクローナル抗体（ＰＡｂ）を含有するウサギ免疫血清も、播種性カンジダ症に対するある程度の防御をマウスにもたらしたことが示されている。ウサギ免疫血清処理群は、吸収されたウサギ血清、又はウサギ免疫前血清、又はＤＰＢＳ緩衝液を受容した対照群と比較して、生存期間の延長を示した。
【００６０】
チャレンジ後、免疫マウス及び抗血清で処置したマウスは、２つの対照群と比較して生存期間の延長を示し（図５Ａ）、それと一致して、抗血清を受容したマウスは、腎臓の真菌計数を有意に低減させた（図５Ｂ）。このデータは、抗Ｆｂａペプチド抗体が、完全にとまではいかなくとも、少なくとも部分的に、真菌での致死的チャレンジに対する防御の原因であることを強く支持している。
【００６１】
市販のウサギ抗Ｆｂａ血清の場合、抗Ｆｂａ免疫血清及び免疫前血清の両方を、マウス脾細胞に吸収させて、ウサギ天然抗マウス細胞障害性抗体の可能性を除去した。陰性対照として、脾細胞吸収後、ウサギ抗Ｆｂａ免疫血清を、今度は生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞に再び吸収させて、Ｆｂａ特異的抗体を除去した。抗Ｆｂａ抗体価を、真菌細胞での吸着前後にＥＬＩＳＡにより試験した。Ｆｂａ抗体は、吸着後には、もはや検出可能ではなかった（データ非表示）。ウサギ抗血清で処置したマウスは、対照群と比較して、実験の終了時に４０％の生存率及び全生存期間の延長を示した（図５Ｃ）。これも、抗Ｆｂａ抗体がカンジダ症に対する防御に役割を果たしていることを支持する。ウサギ免疫血清による防御が、マウス抗Ｆｂａ血清と比較して比較的弱い理由は判明していないが、ウサギ抗体のＦｃＲエフェクター機能の効力がマウス系内ではより低いためであると考えることは十分に可能である（１）。
【００６２】
（実施例７）
ミョウバンと共に投与したＦｂａペプチドは、カンジダ症に対する中程度の防御を誘導する。
【００６３】
ワクチンをヒト使用により適切にするために、Ｆｂａペプチドを、２つのアジュバント：ミョウバン（水酸化アルミニウムゲル、Ｓｉｇｍａ社）又はＭＰＬ（リピドＡ、モノホスホリル、Ｓｉｇｍａ社）の１つとの混合物として投与した。１、２１、及び４２日目に、５０μｇミョウバン又は１０μｇ  ＭＰＬのいずれかと混合した２．５μｇのＦｂａペプチドを含有する０．２ｍｌを皮下（ｓ．ｃ．）注射することにより、マウスを免疫した。陰性対照群のマウスには、同様の容積のＤＰＢＳ緩衝液又はアジュバントのみを投与した。血清試料を、免疫１４日後に採取し、１：１００に希釈し、合成Ｆｂａ−ＭＡＰペプチドでコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡで試験した。結果は、図６Ａ〜６Ｃに示されている。
【００６４】
図６Ａ〜６Ｃには、ヒト用に認可されているミョウバンと共に投与したＦｂａペプチドワクチンで、播種性カンジダ症に対して免疫したマウスの応答が示されている。図６Ａには、免疫１４日後に採取し、１：１００に希釈した血清試料を使用してＥＬＩＳＡで試験し、合成Ｆｂａ−ＭＡＰでコーティングされたプレートでＥＬＩＳＡにより試験したＦｂａ抗体の量が示されている。最初の追加免疫後、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで調製したＦｂａペプチドで免疫したマウスに由来する免疫血清は、Ｆｂａペプチドに対する抗体応答が、ＤＰＢＳ又はアジュバントのみを受容した群に由来する血清の抗体応答よりも５〜８倍高いことを示した。図６Ｂには、マウスの生存率が示されおり、ＤＰＢＳ又はアジュバント非免疫対照と比較して、ミョウバンがアジュバントとして使用された場合は、中程度の防御免疫がＦｂａペプチドにより誘導され、ＭＰＬがアジュバントとして使用された場合は、わずかな防御が観察されたことが示されている。また、ミョウバン又はＭＰＬのみを受容したマウスでは、ＤＰＢＳと比較して、生存期間がわずかに延長されたが、その差は、統計的に有意ではなかった。図６Ｃには、Ｆｂａ−ミョウバン又はＦｂａ−ＭＰＬのいずれかで免疫したマウスは、ＤＰＢＳ対照群又はアジュバント単独群と比較して、有意に低減された腎臓一対当たりの生真菌単位（ＣＦＵ）が示されている（Ｐ＜０．０１）。
【００６５】
最初の追加免疫後、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで調製したＦｂａペプチドで免疫したマウスに由来する免疫血清は、いずれの調製物に対する抗体応答も、ＤＰＢＳ又はアジュバントのみを受容したマウスから得たバックグラウンド血清よりも５〜８倍高いことを示した。２回目の追加免疫の後、ＩｇＭからＩｇＧへのＦｂａ特異的抗体のアイソタイプスイッチが、免疫マウスに由来する血清で観察された（データ非表示）。これは、免疫記憶応答の誘導を示唆した。加えて、ワクチン接種群は、致死用量のＣ．アルビカンス細胞でチャレンジした後、２つの対照群と比較して、生存期間の延長を示したが（図６Ｂ）、防御は、ＤＣ＋ＣＦＡ手法により誘導されたものほど強力ではなかった。ミョウバンと共に投与したＦｂａペプチドで免疫したマウスは、４０％の生存率を示したが、ＭＰＬのみを有するＦｂａは、対照群と比較して、わずかな防御を誘導したに過ぎなかった。生存期間の延長に加えて、免疫マウスは、予想通り、腎臓の生真菌細胞を低減させた（図６Ｃ）。
【００６６】
（実施例８）
Ｆｂａモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、真菌細胞表面に結合する。
Ｆｂａペプチドに特異的なＭＡｂを、標準的ハイブリドーマ技術を使用することにより得た。細胞融合の後、特異的抗体を生成するハイブリドーマを、限界希釈法により４回クローニングし、そのうち４８個の抗Ｆｂａ  ＩｇＭクローン及び１２個の抗Ｆｂａ  ＩｇＧクローンを選択した。アイソタイプがイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）と決定されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｅ２−９、Ｂ７−１８、及びＢ７−２２を産生したクローンを、ＢＤ無血清培地中で選択及び増殖させた。
【００６７】
図７Ａ〜７Ｃには、ＭＡｂがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出され、ＭＡｂ  Ｅ２−９とのＦｂａ反応の特異性が、阻害ＥＬＩＳＡにより決定されたことが示されている。図７Ａでは、ＩｇＭ  ＭＡｂ（Ｅ２−９、Ｂ７−１８、及びＢ７−２２）を産生するクローンが、ＢＤ無血清培養中で選択及び増殖された。対応するサイズを有するＥ２−９及びＢ７−１８の重鎖及び軽鎖が、還元条件下の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで示された。図７Ｂでは、Ｅ２−９、Ｂ７−１８、及びＢ７−２２のアイソタイプが、ＩｇＭ分子と一致する全分子サイズを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されているように、ＩｇＭであることが確認されている。図７Ｂには、非還元条件下で実施された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットにより観察したところ、ＩｇＭ五量体が推定され、精製された抗Ｆｂａ  ＩｇＭ  ＭＡｂ（Ｅ２−９）の分子量が、９００ｋＤと推定されたことが示されている。図７Ｃには、抗ＦｂａペプチドＭＡｂ  Ｅ２−９のＥＬＩＳＡ阻害データが示されている。合成Ｆｂａペプチドを阻害剤として使用して、ＭＡｂ  Ｅ２−９とＦｂａペプチドとの反応及び結合親和性を決定した。各点は、３回の測定の平均であり、全て実験は、同様の結果をもたらしたが、示されているデータは、４回の独立実験のうちの典型的な実験のものである。５０％阻害濃度を達成するのに必要な阻害剤（Ｆｂａペプチド）の濃度は、約１０μｇ／ｍｌだった。還元条件下及びヤギ抗マウスＩｇＧＡＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ抗体で発色させたウエスタンブロットによるポリペプチド鎖の確認では、Ｅ２−９及びＢ７−１８の重鎖及び軽鎖は、それぞれ５０ＫＤａ及び２５ＫＤａの正しい対応サイズを示した（図７Ａ）。ＭＡｂのＩｇＭ五量体（約９００ＫＤａ）が、非還元ＳＤＳゲルから、ヤギ抗マウスＩｇＧＭＡ  ＨＲＰ抗体で発色させたウエスタンブロット分析により検出された（図７Ｂ）。クローンＥ２−９は、十分に増殖し、クローンＢ７−１８及びＢ７−２２と比較してより速く増殖し、高い力価の抗Ｆｂａ抗体を一貫して高度に産生した。したがって、Ｅ２−９を更なる研究に使用した。Ｆｂａペプチドに対するＥ２−９の反応は、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにより決定した（図７Ｃ）。このアッセイでは、可溶性合成ペプチドＦｂａは、ＭＡｂ  Ｅ２−９と固相Ｆｂａとの反応性を効果的に阻害した。
【００６８】
また、ＭＡｂ  Ｅ２−９は、Ｃ．アルビカンスの細胞表面のＦｂａペプチドとのその特異的反応性を確認するための間接免疫蛍光抗体検査により検出された。図８Ａには、ＭＡｂ  Ｅ２−９を使用して共焦点顕微鏡鏡分析で検出したところ、新しいＣ．アルビカンス酵母細胞及び菌糸並びにホルムアルデヒドで固定したＣ．アルビカンス酵母細胞及び菌糸の両方でＦｂａペプチドが示された。図８Ａに示されているように、ペプチドＦｂａは、真菌表面で発現され、Ｅ２−９は、酵母型及び菌糸型の真菌の両方に結合した。β−（Ｍａｎ）３に特異的であるＭＡｂ  Ｂ６．１を、陽性対照として使用した。図８Ｂでは、Ｃ．アルビカンス細胞表面に発現されたＦｂａペプチドとＭＡｂ  Ｅ２−９との結合を、フローサイトメトリー分析を使用することにより更に確認した。Ｃ．アルビカンス細胞表面エピトープβ−トリマンノースに特異的なＭＡｂ  Ｂ６．１と比較して、生菌Ｃ．アルビカンス細胞とのＭＡｂ  Ｅ２−９の反応性は、比較的わずかだった。図８Ｃでは、重要な追加の陰性対照により、ＭＡｂ  Ｅ２−９及びＢ６．１の結合が、Ｆｂａ又はβ−トリマンノースエピトープをいずれも発現するはずではない生菌サッカロマイセス・セレビシエで生じるか否かが試験された。いずれのＭＡｂも、Ｓ．セレビシエの細胞表面に結合しなかった。
【００６９】
豊富に発現される細胞表面エピトープ、β−１，２−マンノトリオースに結合し、播種性カンジダ症からマウスを防御する（２５、２８）ＭＡｂ  Ｂ６．１を、真菌細胞表面に結合するＩｇＭ抗体の陽性対照として使用した。ＭＡｂ  Ｅ２−９を他のカンジダ種に対して試験しても、交差反応性は検出されなかった（データ非表示）。これは、Ｆｂａ１４量体アミノ酸ペプチドは、以前に報告されているように（５３）、Ｃ．アルビカンスに特有であるはずであるため、予想通りであった。また、Ｃ．アルビカンスの細胞表面とのＭＡｂ  Ｅ２−９の反応性を、フローサイトメトリー分析により実証した（図８Ｂ）。また、ＭＡｂ  Ｂ６．１を、Ｃ．アルビカンス酵母細胞表面に結合する抗体の陽性対照として使用した。ＭＡｂ  Ｅ２−９は、野生型Ｃ．アルビカンス３１５３Ａと反応したが、予想通り、この抗体は、他のカンジダ種（Ｃ．グラブラタ及びＣ．クルセイ；データ非表示）又はＳ．セレビシエの単離株を標識しなかった（図８Ｃ）。
【００７０】
（実施例９）
ＩｇＭ  ＭＡｂ（Ｅ２−９）は、受動転移実験で、全身性カンジダ症に対する防御の増強を付与した。
【００７１】
上記の例では、Ｆｂａ−ＤＣワクチン手法又はミョウバンアジュバントに懸濁したペプチドでの免疫のいずれかにより誘導された抗Ｆｂａ抗体の防御能力が示された。Ｆｂａペプチドに特異的なモノクローナル抗体の発生は、ｉｎ  ｖｉｖｏで応用するための防御抗体の無制限供給をもたらす可能性を提供する。ＭＡｂ  Ｅ２−９を研究用に選択し、上述のように受動転移実験で試験し、ポリクローナル抗血清による防御を示した。結果は、図９Ａ〜９Ｂに示されている。
【００７２】
図９Ａ及び９Ｂは、抗Ｆｂａ  ＩｇＭ  ＭＡｂ（Ｅ２−９）が、播種性カンジダ症からマウスを防御したことを示した。細胞培養により産生されたＭＡｂ  Ｅ２−９が、実験的播種性カンジダ症からマウスを防御することができたことを確認するために、ＭＡｂ  Ｅ２−９（１６μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ）を、Ｃ．アルビカンスのｉ．ｖ．チャレンジの４時間前に未感作マウスに投与し、更に０．２ｍｌのＭＡｂ  Ｅ２−９を初回投与の２４時間後に投与した。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体で免疫したマウスを、生存の陽性対照として使用し、ＤＰＢＳ及びＣ．アルビカンス酵母細胞により吸収されたＭＡｂ  Ｅ２−９を、陰性対照として未感作マウスに投与した。図９Ａに示されているように、ＭＡｂ  Ｅ２−９を受容したマウスは、ＤＰＢＳ又は吸収されたＭＡｂ  Ｅ−９陰性対照群と比較して（Ｐ＜０．００１）、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで能動的に免疫した陽性対照群と同様の生存期間の延長を示した。加えて、未感作マウスへのＭＡｂ  Ｅ２−９の受動転移は、ＤＰＢＳ又は吸収されたＭＡｂ  Ｅ２−９を投与したマウスの真菌量と比較して（Ｐ＜０．００１）、腎臓真菌量を、能動的に免疫した生存マウスと同様のレベルに低減させた（図９Ｂ）。したがって、ＭＡｂ  Ｅ２−９のｉ．ｐ．投与を受容したマウスは、対照動物と比較して、生存期間の延長を示し、腎臓の真菌量を低減させた。重要なことには、受動防護は、転移の前にカンジダ細胞で吸収することによりＭＡｂを除去することにより妨げられた。これは、防御がＭＡｂ  Ｅ２−９によることを証明する強力な追加証拠を提供した。
【００７３】
したがって上記の例を要約すると、６つの誘導ペプチドは全て（配列番号１〜６）は、その後の免疫用にＤＣをパルス処理するために単独で使用した際に、抗体応答を誘導し、３つのペプチドＦｂａ（配列番号１）、Ｈｗｐ１（配列番号３）、及びＭｅｔ６（配列番号２）は、真菌でチャレンジしたマウスの生存及び低腎臓真菌量により明らかなように高度な防御を誘導した。ワクチン接種を受けたマウスは、非生存対照と比較して、明らかにより少ない腎臓真菌量を示した。実際、ＣＦＵ量は、３つのペプチドに対してワクチン接種したマウスの幾つかの腎臓では検出可能ではなかったが、これは、対照群では全く起こらなかった。生存期間の延長と、腎臓ＣＦＵの有意な低減又はクリアランスとの組み合わせは、ワクチンにより誘導された防御を示す強力な証拠を提供した。ロバストな抗体反応及び３つの防御性ペプチドの中で最も良好な防御を誘導した１つの特定のペプチドＦｂａを、新規ワクチン候補として更に研究した。Ｆｂａペプチドエピトープのみは、異なる系統のマウス及びウサギでの特異的抗体産生により示されるように免疫原性であるため、ＭＨＣ  ＩＩ限定的ではない。過免疫された動物は、抗体のＩｇＭ及びＩｇＧクラスを両方とも産生し、記憶細胞の産生及び長期間の免疫学的応答性の可能性を示唆した。
【００７４】
また、本発明者らは、ミョウバンをアジュバントとして使用して、ヒト使用により許容される製剤を用いて、播種性カンジダ症に対する防御を提供する有効なワクチン組成物を示した。Ｆｂａペプチド及びミョウバンの組み合わせで免疫したマウスは、非免疫対照と比較してより低い腎臓ＣＦＵ及び生存の増加という点で統計的に有意だった、播種性カンジダ症に対する防御を示した。Ｆｂａペプチドに特異的な抗体活性は、未感作マウスに防御を付与した全免疫血清の受動転移に関する実験により実証されたように、抗カンジダ防御の少なくとも部分的な原因であると考えられる。そのような防御は、対照出血前正常マウス血清によっては付与されず、免疫血清が、受動転移防御試験の前に真菌細胞により事前に吸収されていた場合には、防御は抑制された。また、Ｆｂａエピトープに特異的なＭＡｂ  Ｅ２−９の、播種性カンジダ症に対する防御能力を、ｉｎ  ｖｉｖｏで実証した。また、本発明者らは、Ｆｂａペプチドエピトープが、真菌細胞表面に発現され、抗体により接近可能であることを示した。したがって、付着の妨害は、調査すべき合理的な機序である。
【００７５】
Ｆｂａ１ｐは、発酵性及び非発酵性炭素源の両方での増殖に必要とされる重要な酵素であり、したがって、この酵素は、Ｃ．アルビカンス及び他のカンジダ種の生存能にとって不可欠である（４８）。しかしながら、Ｆｂａ１ｐは、野生型レベルの５％未満に枯渇しなければ、増殖を妨害することはない（４８）。Ｆｂａ１ｐ枯渇は、Ｃ．アルビカンスに対して殺滅効果ではなく静的効果を発揮すると考えられる。したがって、たとえ細胞表面でのＦｂａ１ｐの役割が未知であっても、Ｆｂａ１ｐに対する抗体が、患者に感染するＣ．アルビカンスの増殖を予防し得ることは考えられることである。したがって、ペプチド特異的なＭＡｂ  Ｅ２−９は、単独で又は他の抗真菌薬物と組み合わせて、播種性カンジダ症に対する免疫療法として使用される能力を示すことができる。免疫抑制された患者でワクチンを使用する場合の考え得る制限は、これら患者が、必ずしも防御応答を開始しない場合があるということであるが、防御抗体での受動免疫は、迅速で有効な予防手段又は治療手段でさえあり得る。この免疫学的予防の効力は、侵襲性カンジダ症の患者でＭｙｃｏｇｒａｂ及びアムホテリシンＢ（ＡｍｐＢ）を使用して示されているように、従来の抗真菌療法と組み合わせて使用すると増大させることができる（４４）。また、ＭＡｂ  Ｂ６．１は、ＡｍｐＢの治療効力を増強することが示された。これは、治療に必要な抗真菌剤の量を無毒レベルに低減することに結び付く場合がある（２４）。Ｅ２−９は、菌糸細胞表面に結合することが示された。これは、機能的なＦｂａエピトープが菌糸細胞表面の抗体に接近可能であることを示しているが、本発明者らの最近のデータは、免疫血清及びＭＡｂ  Ｅ２−９はいずれも、カンジダ酵母又は菌糸増殖の著しい阻害性を発揮しないことをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した（データ非表示）。本発明者らは、ＭＡｂ  Ｂ６−１及びＥ２−９の組み合わせが、マウスの防御免疫性を相乗効果的に誘導することができると考える。ＭＡｂ  Ｂ６．１抗体は、感染前に投与されると防御活性を示し、感染後に投与されると、わずかな治療活性を示した（２５）。ＭＡｂ  Ｂ６．１は、Ｃ．アルビカンスのホスホマンナン複合体の酸不安定成分であるβ−１，２−結合マンノトリオースに特異的である。このエピトープは、免疫蛍光法により明らかにされたコンフルエント分布パターンにより示されるように、主要な表面マーカーであると考えられる。播種性カンジダ症に対するＭＡｂ  Ｅ２−９の予防（preventive）又は予防（prophylactic）活性は、ＭＡｂ  Ｂ６．１の予防活性と比較されなかった。生存期間中央値に基づくと、両抗体は、同様の防御活性を示した。本発明者らは、これら２つの異なるＭＡｂは、防御の機序が異なる可能性があるため、相乗効果を発揮し、一緒に作用して強固な防御を実現することになると考える。
【００７６】
（実施例１０）
より一般的な真菌ワクチンの開発及び試験
ペプチド設計。上述のように、ヒトカンジダ症の発病中に細胞壁位置で発現することが知られていることに基づいて、６つの細胞壁タンパク質を考え得る担体として選択した。それらには、以下のものが含まれていた：菌糸壁タンパク質−１（Ｈｗｐ−１）；エノラーゼ（Ｅｎｏｌ）；ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ１）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐ−１）；フルクトース二リン酸アルドラーゼ（Ｆｂａ）；及びメチルテトラヒドロプテロイルトリグルタマート（Ｍｅｔ６）。エピトープ発見用アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｇｉｂｉｎ／ｔｏｏｌｓ／ａｎｔｉｇｅｎｉｃ＿ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｐｌ）を応用することにより、以下の１４量体ペプチドを選択して合成した。それらの全ては各タンパク質群のＮ末端付近に位置する：Ｈｗｐ１、ＱＧＥＴＥＥＡＬＩＱＫＲＳＹ（配列番号３）；Ｅｎｏ１、ＤＳＲＧＮＰＴＶＥＶＤＦＴＴ（配列番号４）；Ｐｇｋ１、ＶＰＬＤＧＫＴＩＴＮＮＱＲＩ（配列番号６）；Ｇａｐ１、ＮＲＳＰＳＴＧＥＱＫＳＳＧＩ（配列番号５）；Ｆｂａ、ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）；及びＭｅｔ６、ＰＲＩＧＧＱＲＥＬＫＫＩＴＥ（配列番号２）。合成ペプチドは、商業的に生成されたか（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）又は自動ペプチド合成機の使用により合成されて、β−マンナントリサッカライドエピトープに結合され、これら結合体に基づくワクチンの効力が報告された（５３）。
【００７７】
新しいペプチドは、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．グラブラタ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐ．ギリエルモンジィ（Ｐ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、及びＳ．セレビシエを含む、より幅広い真菌種に対して、ワクチンを有効にするために設計した。考え得る普遍的なエピトープを捜して、Ｆｂａタンパク質のＮ末端領域の更なる探索を実施した。複数の真菌種で発現されたＦｂａに基づく１４個アミノ酸のペプチドを特定した。これらペプチドの１つを「Ｆｂａ２」（ＦＡＩＰＡＩＮＶＴＳＳＳＴＶ）（配列番号７）と命名し、複数の真菌種により発現されることを見出した。
【００７８】
下記に示されているように、Ｆｂａ２を用いた初期研究は、防御の提供に関してはやや期待外れだった。したがって、より良好なエピトープを製作するために、フランキング配列をＦｂａ２に付加して、Ｆｂａ２の末端に５個の追加アミノ酸を含む１９個アミノ酸ペプチドであるＦｂａ３を製作した。Ｆｂａ３の配列は、ＦＡＩＰＡＩＮＶＴＳＳＳＴＶＶＡＡＬＥ（配列番号８）である。加えて、より短い９個アミノ酸ペプチドであるＦｂａ４を製作した。Ｆｂａ４の配列は、ＳＳＳＴＶＶＡＡＬ（配列番号９）である。加えて、Ｍｅｔ６に基づく新しいペプチドを、多数の真菌種での発現に基づいて設計し、Ｍｅｔ６−２と命名した。Ｍｅｔ６−２の配列は、ＹＤＱＶＬＤＬＳＬＬＦＮＡＩＰ（配列番号１０）である。これら４つの新しいペプチド、Ｆｂａ２、Ｆｂａ３、Ｆｂａ４、及びＭｅｔ６−２を、実施例１に上述されている方法により、ワクチンとしての有効性に関して試験した。
【００７９】
ワクチンとしてのＦｂａ２、Ｆｂａ３、Ｆｂａ４、及びＭｅｔ−６−２の効力：上記のペプチドが、抗体をＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導し、播種性カンジダ症に対する防御を提供する能力を、実施例１に記載の方法により試験した。上述のように多少の変更を加えて、骨髄からＤＣを生成した。手短かに言えば、安楽死させたマウスの長骨からＲＰＭＩ−１６４０で洗い流した骨髄を、穏やかにピペットし、７０−ｍｍ細胞ストレーナーでろ過して、細胞塊を解離させた。赤血球細胞を細胞溶解し（ＡＣＫ細胞溶解緩衝液、０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、残留骨髄細胞を、完全培地［「ＣＭ」、１０％ＦＢＳ（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、及び１００単位／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補完されたＲＰＭＩ−１６４０］に懸濁し、２×１０５細胞／ｍｌに調整し、５ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに配置し、４０ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦ及びｒｍＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の存在下で、３７℃、５％ＣＯ２にて最長９日間培養した。培養の４日目及び７日目に、同量の新しいＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４をウェルに添加した。
【００８０】
ＤＣ集団を単離するために、細胞を、２〜４ｍｌの暖かいＣＭに懸濁し、ＣＭ中の同容積の１４．５％（ｗ／ｖ）Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（Ｓｉｇｍａ社）に上乗せし、１２００×ｇで２０分間２２℃にて遠心分離した。遠心分離した後、界面の細胞を収集し、ＣＭで３回洗浄し、表現型分析及び機能分析にかけた。フローサイトメトリー分析、及びＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、及びＣＤ３ｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に特異的なＭＡｂの使用により、細胞の８０％超がＤＣだったことが示された。
【００８１】
免疫原及び免疫。ＤＣを、上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでワクチンを用いてパルス処理した。手短かに言えば、６日目に、培養中のＤＣを、目的の抗原（１μＭ）でパルス処理した。７日目に、ＰＧＥ２（１０−７〜１０−９Ｍ）を、ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）と共に、２４時間添加した。９日目に、抗原パルス処理ＤＣをよく洗浄し、２００μｌ  ＤＰＢＳ中の５×１０５個を、マウスに腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。１４日目に、マウスを、新しい抗原パルス処理ＤＣで追加免役し、２８日目に、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化された抗原（１０μｇ）で、２回目の追加免疫を行った。
【００８２】
免疫マウスに由来する免疫血清中の抗基本ペプチド抗体価の血清学アッセイ：血清の抗体価を、ＥＬＩＳＡ分析した。対照群は、初回刺激及び最初の追加免疫時にＤＣのみを投与し、その後２回目の追加免疫時にＤＰＢＳを投与したマウス、初回刺激及び最初の追加免疫時にＤＰＢＳ及び２回目の追加免疫時にＣＦＡのみを投与したマウス、３回の注射全てでＤＰＢＳのみを投与したマウス、又は初回刺激及び最初の追加免疫時にＤＣのみを投与し、その後２回目の追加免疫時にＣＦＡのみを投与したマウスで構成されていた。手短かに言えば、合成ペプチドを、１０μｇ／ｍｌでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。各々を使用して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、各免疫血清及び対照血清の試料の連続２倍希釈物を重複して試験した。各ウェルの発色は、二次抗体（ヤギ抗マウス多価イムノグロブリン−ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ社）及び基質（Ｏ−フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２）により達成し、光学密度（ＯＤ）を４９２ｎｍで決定した。
【００８３】
真菌チャレンジ及び防御の評価。２回目の追加免疫の２週間後、免疫マウス及び対照マウスを、致死用量の生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞（０．１ｍｌのＤＰＢＳ中５×１０５個）でｉ．ｖ．感染させた。受動免疫されたマウスも、同じチャレンジ用量を受容した。防御は、最長１２０日間動物生存をモニターすることにより、及び腎臓一対当たりのＣＦＵ数（平均±ＳＥ）を定量化することにより評価した。生存期間中央値（ＭＳＴ）を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法で統計的に評価した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン４）。全ての分析で、１群当たりのマウスは５匹であり（ｎ＝５）、両側ｔ検定を使用した。
【００８４】
ワクチンとしてのＦｂａ２：Ｆｂａ２を使用して、上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＣをパルス処理し、Ｆｂａ−ＤＣを陽性対照として使用した。血清試料を各注射後に試験した。陽性対照として、抗Ｆｂａ応答も試験した。図１０Ａに示されているように、Ｆｂａ２は、良好で特異的な抗体応答をＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導することができた。陽性対照として、抗Ｆｂａ応答も試験した。その結果は、図１０Ｂに示されている。
【００８５】
しかしながら、マウスに防御を提供する能力を試験すると、Ｆｂａ２ペプチドは、図１１に示されているように良好な防御を誘導しなかった。Ｆｂａ２で免疫したマウスは、ＤＣ＋ＣＦＡのみを注射した対照群と比較して、生存期間に有意差を示さなかった。
【００８６】
他の合成ペプチド。また、他の基本ペプチドが抗体応答を誘導する能力を試験した。図１２に示されているように、Ｆｂａ３、Ｆｂａ４、及びＭｅｔ６−２は、ＥＬＩＳＡにより試験すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗体応答を誘導することができた。しかし、抗Ｆｂａ応答と比較して、これら３つのペプチドに対する抗体応答は、それほど著しくはなかった。しかしながら、このより低い結果は、ＥＬＩＳＡによる抗Ｆｂａ応答の試験では、リジンコアがＦｂａペプチドエピトープの８つのコピーを担持する複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰ）に結合されたＦｂａペプチドでコーティングされたマイクロタイタープレートが使用されたことを反映している可能性がある。基本ペプチドで実施したように、プレートをコーティングするためにペプチドのみを使用する場合、抗体検出の感度がより低い場合がある。
【００８７】
Ｃ．アルビカンス細胞表面に発現される基本ペプチドに対する、免疫血清中の抗体の結合を特異的に試験するために、フローサイトメトリー分析法を使用した。生真菌細胞を免疫血清と反応させ、その後、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体と反応させた。陰性対照は、正常マウス血清と反応させた細胞で構成されていた。陽性対照は、豊富に及び均一に発現される細胞表面エピトープであるβ−マンノトリオースに特異的なモノクローナル抗体であるＭＡｂ  Ｂ６．１だった。これらのデータは、ペプチドＦｂａ、Ｆｂａ３、Ｆｂａ４、及びＭｅｔ６−２が、真菌表面で発現され、免疫血清中の抗体に接近可能であることを示す。したがって、Ｆｂａ３、Ｆｂａ４、Ｆｂａ、及びＭｅｔ６−２に対する抗体は、真菌細胞表面ペプチドに直接結合することができる。
【００８８】
また、基本ペプチドが、播種性カンジダ症に対する防御をマウスに誘導する能力を、上述のように試験した。Ｆｂａ３及びＭｅｔ６−２で免疫したマウスは、ＤＣ＋ＣＦＡのみを注射した対照群と比較して、非常に良好な生存率を示した（図１４）。実験は、チャレンジ後８０日の時点で終了させた。Ｆｂａ３及びＭｅｔ６−２ペプチドは、高度な防御を誘導し、生存率は８０％であり、Ｆｂａ４は、中程度の防御を誘導し、生存率は６０％だった。Ｆｂａ２を除く基本ペプチド（つまり、Ｆｂａ３、Ｆｂａ４、及びＭｅｔ６−２）で免疫した動物は全て、対照と比較して生存期間の有意な延長を示した。陽性対照は、播種性カンジダ症に対する最も高度な防御を誘導したＦｂａ−ＤＣだった。
【００８９】
免疫マウスを犠牲にし、腎臓を収集して、上述のように真菌感染を測定した。図１５に示されるように、ペプチドで免疫したマウスは、ＤＰＢＳ対照群及びＤＣ＋ＣＦＡ対照群と比較して（Ｐ＜０．０５）、腎臓一対当たりの生真菌単位（コロニー形成単位、ＣＦＵ）の低減を示した。
【００９０】
したがって、より多くの真菌種により発現されるペプチドの少なくとも３つは、Ｃ．アルビカンスチャレンジに対する、マウスでの有効なワクチンであることが示された。それらは、同じペプチドを発現する他の真菌種に対しても同様に有効である可能性が予想される。また、これらペプチドは、下述の方法によりβ−（Ｍａｎ）３グリカン及び／又は破傷風トキソイドに結合させて、ワクチンの有効性を増加させることができる。
【００９１】
（実施例１１）
メチル化Ｆｂａペプチドの設計及び使用
元のＦｂａワクチンをヒト使用により許容される製剤に移行させる試みでは、Ｆｂａペプチドに変更を加えた。第１に、Ｆｂａペプチドを、そのリジンコアがＦｂａペプチドエピトープの８個のコピーを担持する複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰ）に結合させた。第２に、Ｆｂａアミノ酸の部分的なＮ−メチルスキャニング、及びシステイン残基の挿入を適用した。この理論により束縛されることは望まないが、本発明者らは、これら修飾が、Ｆｂａペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期及び免疫原性を増加させることになると考える。ＭＡＰ実験は、期待外れだった（データ非表示）。Ｆｂａ誘導体の場合、ミョウバン及び／又はＭＰＬのいずれかをアジュバントとして使用した結果は、より有望だった。合成ペプチドは全て、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社により商業的に製作された。
【００９２】
Ｎ−メチルスキャニングを使用して、システイン残基をＦｂａの１４個アミノ酸ペプチドに導入して、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期及び免疫原性の増加を期待することができる部位を選択した。図１６及び下記の表１に示されているように、１１個のペプチドを商業的に合成した。ペプチド１は、元のＦｂａペプチド（配列番号１）である。ペプチド２〜９（配列番号１１〜１８）は各々、元のアミノ酸の１つがメチル化されていたが、表１に記載のように、その位置は様々であった。ペプチド１０は、２つのアミノ酸がメチル化されていた（配列番号１９）。ペプチド１１（配列番号２０）には、５位に１つ及び８位に１つと、２つの追加システインが挿入されていた。
【００９３】
【表１】
2014515757.tif 000003
これら修飾Ｆｂａペプチドを使用して、抗Ｆｂａ免疫血清との反応性を試験した。マイクロタイタープレートを、１１個のペプチドでコーティングし、抗Ｆｂａ血清を、これらＦｂａ誘導体との反応性について上述のように試験した。同じＥＬＩＳＡを使用して、免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体と１１個のペプチド全てとの反応を試験したが、プレートは、元のＦｂａペプチドの代わりにペプチド１〜１１でコーティングされていた。図１６に示されているように、修飾Ｆｂａペプチドは全て、元のＦｂａに特異的な抗体により認識された。これは、それらの全てが、免疫反応性を保持していたこと、及びワクチンの抗原として有用であり得ることを示す。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにより決定されるような、修飾Ｆｂａペプチドに対する免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体の特異性を試験した。Ｆｂａペプチドでの同じ試験の結果は、図１７に示されている。阻害剤として使用した元のＦｂａであるペプチド１は、陽性対照として含まれていた。図１７の阻害曲線は、他の修飾ペプチド２〜１１での曲線との比較の役目を果たす。図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、及び１８Ｄは、それぞれペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、及びペプチド５のＥＬＩＳＡ阻害アッセイの結果を示す。各メチル化ペプチドを、指定のアッセイで阻害剤として使用した。図１８Ａ〜１８Ｄに示されているように、図１７と比較して、１、２、３、又は５位のメチル化は、ペプチド−抗体結合にほとんど効果を示さないと考えられる。各群の反応は、用量依存的であり、免疫血清中の抗Ｆｂａ抗体が、修飾ペプチドに特異的だったことを示す。同様に、図１８Ｅ、１８Ｆ、１８Ｇ、及び１８Ｈに示されているように、それぞれ６、７、８、又は９位でのＦｂａペプチドのメチル化は、ペプチドに対する抗体の結合に著しい効果を示さなかった。最後に、図１８Ｉ及び１８Ｊに示されているように、それぞれペプチド１０（１位及び８位がメチル化）及びペプチド１１（５位及び８位に２つのシステインが挿入）は、良好に抗体と結合した。ペプチド１１の結合は、２つの追加システインを有しており、抗体とのＦｂａの結合部位が、ペプチドのカルボキシル部分に位置することを示している可能性がある。
【００９５】
修飾ペプチドで免疫したマウス血清のＥＬＩＳＡを使用して測定される抗体応答を試験するため、ペプチド１〜１１の１１群の１群当たり２匹のマウスを使用した。５０μｇミョウバンと混合した１５μｇペプチドをマウスに３回ｉ．ｐ．注射し、各注射は３週間の間隔をおいて行った。図１９に示されているように、修飾Ｆｂａペプチドは全て、抗体応答を誘導することができたが、応答は、Ｆｂａペプチド１ほど強力ではなかった。
【００９６】
修飾Ｆｂａペプチドは全て、異なる免疫経路（腹腔内（ｉ．ｐ．）又は皮下（ｓ．ｃ．））及びヒトで許容されるアジュバントの異なる組合せ（ミョウバンのみ又はミョウバン＋ＭＰＬ）を使用して、マウスで試験した。各実験は、１群当たり２匹のマウスを使用して行われ、どのペプチドが、ロバスト抗Ｆｂａ抗体応答を動物に誘導したかを試験するために実施した。図２０Ａには、ミョウバン中のペプチドを使用してｉ．ｐ．注射により、Ｆｂａ誘導体で免疫したマウスの抗Ｆｂａ抗体応答が示されている。図２０Ｂには、ミョウバン及びＭＰＬ中のペプチドを使用してｉ．ｐ．注射により、Ｆｂａ誘導体で免疫したマウスの抗Ｆｂａ抗体応答が示されている。図２０Ｃには、ミョウバン中のペプチドを使用してｓ．ｃ．注射により、Ｆｂａ誘導体で免疫したマウスの抗Ｆｂａ抗体応答が示されている。図２０Ｄには、ミョウバン及びＭＰＬ中のペプチドを使用してｓ．ｃ．注射により、Ｆｂａ誘導体で免疫したマウスの抗Ｆｂａ抗体応答が示されている。図２０Ａ〜２０Ｄに示されているように、修飾Ｆｂａペプチドは全て、抗体応答を誘導することができたが、応答は、元のＦｂａペプチドほど強力ではなかった。皮下の免疫経路及びミョウバン及びＭＰＬの組合せが、最も高い抗体応答を誘導した。幾つかのペプチドの場合、実際の抗体価を得るために血清を連続希釈した場合に、より良好な抗体応答が観察された。これら修飾ペプチドは、カンジダ症のワクチンとして使用することができる。また、これら修飾ペプチドは、下述の方法により、β−（Ｍａｎ）３グリカン及び／又は破傷風トキソイドに結合させて、ワクチンの有効性を増加させることができる。
【００９７】
セクションＢ：結合型ワクチン
（実施例１２）
物質及び方法
カンジダ・アルビカンス株。Ｃ．アルビカンス３１５３Ａ及びＳＣ５３１４（ＡＴＣＣ）を、グルコース−酵母抽出物−ペプトンブロス中で静止期酵母細胞として３７℃にて増殖させ、ダルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ社）で洗浄及び懸濁して適切な菌体濃度（５×１０６／ｍｌ）にし、それを使用して、記載のように［２５、２９］、マウスを静脈内（ｉ．ｖ．）感染させた。また、Ｃ．アルビカンス株３１５３Ａを、血清抗体吸収、免疫蛍光染色、及びフローサイトメトリー分析に使用した。
【００９８】
マウス系統。５〜７週齢の近交系統ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６並びに非近交系Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ（ＮＤ４）の雌マウス（ＮＣＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ又はＨａｒｌａｎ社）を使用した。マウスは、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓの院内実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコールに従って飼育及び処理された。
【００９９】
結合型ワクチンの合成。複合糖質ワクチン（ＧＶ）及びマンノトリオース成分を欠如する対照ワクチン（ＰＶ）を、図２９に要約されているように、先進的ビルディングブロックから合成した。図２９の化合物は、図３０Ａ〜３０Ｅに示されているより詳細な合成での付番化合物と一致するように付番されている。トリエチレングリコールスペーサ（化合物３）で誘導体化されたβ−１，２マンノトリオースを、以前に記述されているように合成した［６２］。Ｔ細胞１４量体ペプチド（Ｆｂａ）をペプチド合成機で構築し、トリエチレングリコールテザーをＣ末端に導入し、その後チオ酢酸残基によりその側鎖を誘導体化した単一リジン残基を導入した。これにより、ビルディングブロック２ａ又は２ｂを得た。ブロモアセタート基を、破傷風トキソイド（国立血清学研究所、コペンハーゲン）に存在するおよそ２０個のリジン残基に導入して、化合物５を得た。３を２ａと反応させ、その後、この産物を５と結合させることにより、ＧＶを構築した。２ｂを５と結合させることにより、ＰＶを調製した。この合成のより詳細な説明は、下記の実施例２１に示されている。
【０１００】
マウスの免疫。結合体β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ又はβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴを、頸部の項部の皮下（ｓ．ｃ．）位置に投与した。結合体は、単独で又はミョウバン（水酸化アルミニウムゲル、Ｓｉｇｍａ社）若しくはＭＰＬ（リピドＡ、モノホスホリル、Ｓｉｇｍａ社）のいずれかとの混合物として又は両アジュバントの組合せとして投与した。陰性対照群のマウスには、ＤＰＢＳ緩衝液又はアジュバントのみを投与した。免疫用量及びスケジュールは、１、２１、及び６２日目に、１００μｌの２．５μｇ又は１０μｇのいずれかの結合体のみ、又は５０μｇのミョウバン若しくは１０μｇのＭＰＬと共にいずれかの結合体を含有する混合物としてだった。幾つかの実験では、２つのアジュバントを併用し、初回刺激及び追加免疫用の抗原と混合した。血清試料を、各免疫の１４日後に採取し、ＥＬＩＳＡにより試験した。
【０１０１】
血清学的アッセイ。免疫血清の抗体価を、下述のように、各免疫後に分析した。力価は、各投与後に増加したが、最も重大な変化は、通常、最初の追加免疫の後に観察された。これは、種々の群間のワクチン応答の比較を示すために選択された結果である。
【０１０２】
ＤＣ／ＣＦＡに基づく免疫の場合、上述のように及び以前に記述されているように［５３］、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａワクチンを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＣをパルス処理した。マウスに初回刺激用量を投与し、１４日目に新しい抗原パルス処理ＤＣで追加免役し、２８日目に、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化した抗原（２．５μｇ）を皮下（ｓ．ｃ．）投与して２回目の追加免疫を行った。対照群は、初回刺激及び追加免疫時に、ＤＰＢＳ、ＤＣ、又はＤＣ＋ＣＦＡのみを投与したマウスで構成されていた。単独で又はミョウバン若しくはＭＰＬと共に投与したβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ、Ｆｂａ−ＴＴ、又はβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴの場合、対照群には、アジュバントのみ又はＤＰＢＳ緩衝液を投与した血清試料を、各免疫の１４日後に採取し、１：１００に希釈し、以前に記述されているように［５３］、Ｃ．アルビカンスに由来する細胞壁マンナン抽出物、又はＦｂａ−ＭＡＰペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、又はβ−（Ｍａｎ）３−ＢＳＡでコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡにより試験した。手短に言えば、主にマンナンで構成されているＣ．アルビカンスマンナン抽出物、又はＢＳＡに結合された合成β−（Ｍａｎ）３を、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）に４μｇ／ｍｌで溶解し、Ｆｂａ−ＭＡＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を、炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌで溶解した。各々を使用して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、各免疫血清及び対照血清の試料の連続２倍１：１００希釈物を重複して試験した。各ウェルの発色は、二次抗体であるヤギ抗マウス多価イムノグロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）ペルオキシダーゼ結合抗体（ＰＢＳＴで１：１０，０００希釈）（Ｓｉｇｍａ社）及び基質（Ｏ−フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２）で達成し、ＯＤ測定は、４９２ｎｍで決定した。希釈エンドポイントＥＬＩＳＡ力価を決定するために、血清をブロッキング緩衝液で連続２倍希釈したものを調製した。エンドポイントＥＬＩＳＡ力価は、陰性対照試料の平均ＯＤ＋標準偏差の２倍よりも少なくとも２倍大きなＯＤ測定値を示した最終血清希釈の逆数とした。
【０１０３】
抗体アイソタイプ及びサブクラスを決定するために、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス重鎖特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社、ペンシルバニア州）を、ブロッキング緩衝液で１：１０，０００希釈し、適切なウェルに添加し、その後、以前と同様にＯ−フェニレンジアミン基質及びＨ２Ｏ２を発色及び吸光度用に添加した。
【０１０４】
真菌チャレンジ及び防御の評価。２回目の追加免疫の２週間後、免疫マウス及び対照マウスを、上述のように及び以前に記載されているように［５３］調製された致死用量の生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞（０．１ｍｌのＤＰＢＳ中５×１０５個）でｉ．ｖ．感染させた。受動免疫されたマウス（以下）も、同じチャレンジ用量を受容した。防御は、動物生存を、実験に依存して５０〜１２０日間モニターすることにより評価した。マウスが瀕死状態になったかどうかをモニターした。瀕死状態は、活力が低下し、餌又は水に無関心であり、指で触っても反応がないことと定義した。瀕死であるとみなした時点でマウスを犠牲にし、マウスの腎臓を、ＤＰＢＳ中でホモジナイズし、栄養寒天上に播種して、真菌細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。５０〜１２０日後に実験を終了させ、その時点で生存していたマウスを全て犠牲にし、腎臓のＣＦＵを以前と同じように評価した。ＣＦＵアッセイの検出最低限度は、腎臓一対当たり５０ＣＦＵだった。
【０１０５】
免疫血清の受動転移。免疫血清を、ワクチン接種マウスから得て、貯留し、−２０℃で保存するか、又は凍結する前に、上述のように又は以前に記述されているように［５３、２５］Ｃ．アルビカンス３１５３Ａ酵母細胞で吸収させた。酵母で事前に吸収された免疫血清又はＤＢＰＳ緩衝液を、受動転移陰性対照として使用した。事前に吸収された免疫血清を試験し、β−（Ｍａｎ）３及びＦｂａペプチドの両方に対する抗体に陰性であることを、上述のようにＥＬＩＳＡで見出した。未感作ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０．５ｍｌの完全に強力な免疫血清又は対照血清又はＤＢＰＳ緩衝液を、腹腔内（ｉ．ｐ．）位置に受容した。４時間後、全てのマウスを、Ｃ．アルビカンス（５×１０５酵母細胞）でｉ．ｖ．チャレンジした。動物は全て、初回投与の２４時後に、第２の用量（２００μｌ）の血清又は陰性対照物質をｉ．ｐ．で受容した。感染マウスを、瀕死状態になった時点で犠牲にし、腎臓のＣＦＵを上記のように評価した。
【０１０６】
フローサイトメトリー分析及び免疫蛍光顕微鏡法。酵母細胞上におけるβ−（Ｍａｎ）３及びＦｂａペプチドエピトープの分布を、免疫血清を使用してフローサイトメトリー分析及び間接免疫蛍光法で決定した。１００マイクロリットルの免疫血清（１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳで１：１００希釈）を、ＤＰＢＳで予め３回洗浄したＣ．アルビカンス酵母細胞（５×１０６）のペレットに添加した。酵母細胞を、免疫血清［β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ免疫マウスに由来］調製物に懸濁し、室温（ＲＴ、２２〜２４℃）で回転振とうさせながら１〜２時間インキュベートした。インキュベーション後、酵母細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ−鎖特異的；Ｓｉｇｍａ社）（原液、１ｍｇ／ｍｌ；作業用溶液、１ｍｌのＤＰＢＳ当たり２０μｇ）に懸濁し、上述のようにＲＴで０．５時間インキュベートした。酵母細胞を、ＤＰＢＳで３回洗浄し、５００μｌのＤＰＢＳに懸濁した。フローサイトメトリーは、４８８ｎｍでのアルゴンレーザー励起を装備したＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥを使用して実施した。各試料中の細胞を１０，０００個分析した（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア）。
【０１０７】
免疫蛍光アッセイの場合、真菌細胞を上述のように免疫染色及び洗浄し、２００μｌのＤＰＢＳ緩衝液に懸濁した。細胞を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。酵母細胞表面におけるβ−（Ｍａｎ）３及びＦｂａペプチドエピトープの分布を、ＭＡｂ  Ｂ６．１エピトープを検出するために蛍光染色した酵母細胞で得られた分布と比較した。陰性対照には、無関係なアイソタイプ対照ＩｇＭ  ＭＡｂ  Ｓ−９［４５］が非反応性を示すこと（データ非表示）及びフルオレセイン標識ヤギ抗マウス二次抗体のみの使用が含まれていた。追加の対照として、上述のように調製した事前に吸収された免疫血清の、Ｃ．アルビカンス細胞表面への結合反応性を試験した。
【０１０８】
統計分析。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアで分析した（ＧｒａｐｈＰａｄ社）。ＥＬＩＳＡデータの統計的有意差は、カーブフィティング分析により評価した。Ｃ．アルビカンスチャレンジマウスの生存期間中央値及び生存率の差を、それぞれノンパラメトリック両側マン−ホイットニーＵ検定又はフィッシャー直接検定により分析した。生存曲線の差を、ログランク検定により評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験の両方でのＣＦＵ計数のデータを、両側スチューデントｔ検定により分析した。分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）の後でニューマン−クールズ事後検定を行うことにより、多重比較を実施した。
【０１０９】
（実施例１３）
異なるマウス系統での更なるＣ．アルビカンス株に対するβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合ワクチンの防御効力
以前に記述されているように、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合ワクチンは、Ｈ−２ｄ  ＭＨＣハプロタイプを発現し、Ｔｈ−２免疫学的バイアスを示す［３］ＢＡＬＢ／ｃマウス［５３］に、強力な抗体応答及び防御免疫を誘導した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｈ−２ｄ  ＭＨＣハプロタイプを発現し、Ｔｈ１応答を起こしやすい傾向があり、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりも、播種性カンジダ症に対してより抵抗性であると推定される［３］。Ｆｂａペプチドを使用して実施例５に上述されているように、免疫応答は、両マウス系統：ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６で類似していた。樹状細胞を、上述のように及び以前に記述されているように［５３］ｉｎ  ｖｉｔｒｏで導き出し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスで使用されたもの［５３］と同じ免疫ＤＣ／ＣＦＡ戦略を使用した。この戦略は、初回刺激投与し、その後２回の追加免疫行うことを含み、最後の追加免疫は、ＣＦＡ中で乳化されたワクチンを含んでいた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、２つのワクチンエピトープ、つまりβ−（Ｍａｎ）３及びＦｂａペプチドの各々に対する特異的抗体を産生することにより、ワクチンに応答した（データ非表示）。最初の追加免疫後、各エピトープに応答したＩｇＭからＩｇＧへのアイソタイプスイッチが生じた。免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、チャレンジ後１２０日間までに８０％の生存率を示し、ＤＰＢＳ緩衝液、ＤＣ、又はＤＣ＋ＣＦＡを投与した対照群のマウスと比較して、有意により長い期間生存した（ｐ＜０．００１）（図２１Ａ）。生存データは、腎臓ホモジネートのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の傾向と一致していた。すなわち、免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、真菌でのｉ．ｖ．チャレンジ後に瀕死状態になった時点で犠牲にした対照と比較して、大幅に低減されたか又は検出不能な腎臓ＣＦＵを示した（図２１Ｂ）。実際、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける防御は、本発明者らがＢＡＬＢ／ｃマウスで観察した防御［５３］と類似していた。
【０１１０】
抗体応答が防御の原因であったか否かという問いに答えるため、致死用量のＣ．アルビカンス株３１５３Ａでｉ．ｖ．チャレンジする４時間前に、別の群の免疫マウスから抗血清を採取し、未感作マウスにｉ．ｐ．で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した。ＤＣ／ＣＦＡ法によりβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。チャレンジ後、免疫マウス及び抗血清で処置したマウスは、２つの対照群と比較して、生存期間の延長を示し（ｐ＜０．０５）（図２１Ｃ）、抗血清を受容したマウスは、予想通り、腎臓の真菌数を有意に低減させた（ｐ＜０．０５）（図２１Ｄ）。これらデータは、抗体が、真菌での致死的チャレンジに対するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるワクチン誘導性防御の少なくとも部分的な原因であるという強力な証拠を提供する。
【０１１１】
Ｃ．アルビカンス株３１５３Ａは、本発明者らの以前の研究［７、１７、１９］で使用されていた。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａを用いたＤＣ／ＣＦＡワクチン接種が、Ｆｂａペプチドの場合の実施例４と同様に、別のＣ．アルビカンス株でチャレンジしたＣ５７ＢＬ／６マウスを防御するか否かを試験するために、本発明者らは、研究用に一般的に使用される臨床分離株であるＣ．アルビカンス株ＳＣ５３１４で免疫マウスをチャレンジした。陽性対照として、免疫マウスの群を３１５３Ａ株でチャレンジした。同様の防御パターンが、チャレンジ株に関わらず、両群のマウスで観察された（図２１Ｅ）。生存期間の延長に加えて、免疫群は、非免疫マウスと比較して、低減されたか又は検出不能な腎臓ＣＦＵを示した（データ非表示）。これらの結果は、Ｆｂａペプチド及びβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体の両方に類似しており、３１５３Ａ株でチャレンジしたＢＡＬＢ／ｃマウスで本発明者らが観察したものと類似していた［５３、５２］。上記の実験並びに実施例４及び５は、ワクチン誘導性抗体防御が、動物又は真菌株依存性でないことを示すため重要である。
【０１１２】
（実施例１４）
ミョウバン又はＭＰＬと混合したβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａでの免疫は、中程度の抗体応答及びわずかな防御を誘導した。
【０１１３】
ＤＣ／ＣＦＡに基づく免疫手法は、播種性カンジダ症からのマウスの防御に成功したが、ＤＣ及び完全フロインドアジュバントの使用は、ヒト使用には不適当である。ヒト使用に好適な新しいアジュバントを試験するために、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体を、ミョウバン又はＭＰＬアジュバントのいずれかとの混合物として、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。血清試料を、免疫の１４日後に採取し、１：１００に希釈し、合成β−（Ｍａｎ）３又はＦｂａ−ＭＡＰでコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡで試験した。最初の追加免疫後、ワクチン接種を受けたマウスに由来する免疫血清は、Ｆｂａペプチドに対して中程度の抗体応答（１／１００血清稀釈物のＯＤ値：０．７〜０．９）を示し（図２２Ａ）、β−（Ｍａｎ）３エピトープに対して比較的弱い抗体応答（１／１００血清稀釈物のＯＤ値：０．４５〜０．５５）を示した（図２２Ｂ）。図２２Ｃに示されているように、生存も、ＭＰＬ中のβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａを受容したマウスでわずかに延長され、ミョウバンをアジュバントとして使用した場合、ＤＰＢＳ又はアジュバント非免疫対照と比較して、わずかな防御が観察された。
【０１１４】
２回目の追加免疫後、β−（Ｍａｎ）３又はＦｂａ特異的抗体のいずれでも、ＩｇＭからＩｇＧへのアイソタイプスイッチは、免疫血清では低いか無視できる程度であった（データ非表示、結果は表２に要約）。これは、免疫記憶応答が生じなかったことを示唆した。加えて、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａワクチン接種群は、致死用量のＣ．アルビカンス細胞でチャレンジした後、２つの非免疫対照群と比較して、より長期の生存期間を示したが、それは有意ではなかった（ｐ＝０．７７）（図２２Ｃ）。
【０１１５】
【表２】
2014515757.tif 000004
抗体応答及び防御応答を増大させる試みでは、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体の用量を、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ＋ミョウバン製剤では、２．５μｇから１０μｇに増加させた。図２３Ａ〜２３Ｃには、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合ワクチンに対する免疫応答の誘導関して、アジュバントとしてのＤＣ／ＣＦＡ及びミョウバンの比較が示されている。血清試料を、免疫の１４日後に採取し、１：１００に希釈し、合成Ｆｂａ−ＭＡＰ又はβ−（Ｍａｎ）３でコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡで試験した。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ  ＤＣ／ＣＦＡで免疫したマウスに由来する免疫血清は、Ｆｂａペプチド（図２３Ａ）及びβ−（Ｍａｎ）３エピトープ（図２３Ｂ）の両方に対して、ミョウバン中のβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａを受容した群に由来する血清よりも大きな抗体価を示した。図２３Ｃに示されているように、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａパルス処理ＤＣにより、高度な防御が誘導され、ミョウバンをアジュバントとして使用した場合、ＤＰＢＳ、ＤＣ＋ＣＦＡ、又はミョウバンアジュバント非免疫対照と比較して、わずかな防御が観察された。
【０１１６】
抗Ｆｂａペプチド（図２３Ａ）及び抗β−（Ｍａｎ）３（図２３Ｂ）のレベルは、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ＋ＤＣ／ＣＦＡで免疫した対照動物に由来する血清中の抗体レベル（１／１００血清稀釈物のＯＤ値：１．７〜１．９）よりも顕著により低かった。同様に、エンドポイント希釈で力価を評価すると、陽性対照群に由来する免疫血清は、両エピトープに対して有意により大きな抗体応答を示した（表３、下記）。興味深いことには、たとえ１０マイクログラム用量に応答した両エピトープに対する抗体価が、２．５μｇ用量に対する応答よりも大きかったとしても、疾患防御は、ＤＣ／ＣＦＡ免疫手法により誘導された防御の程度ほどは観察されなかった（図２３Ｃ）。要約すると、最も大きな抗体応答は、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ＋ＤＣ／ＣＦＡを受容したマウスに生じた。また、その動物は、ＩｇＭ−ＩｇＧシフト（表３、下記）及び最も高度な防御［７］の証拠を示した。
【０１１７】
【表３】
2014515757.tif 000005
（実施例１５）
ワクチン、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴに破傷風トキソイド（ＴＴ）を付加することにより、ミョウバン又はＭＰＬの存在下での両エピトープに対する抗体応答が顕著に増強された。
【０１１８】
ヒト使用に好適なアジュバントの存在下でグリコペプチドワクチンの免疫原性を向上させる試みでは、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体を、破傷風トキソイドに結合させることにより修飾し、それをβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴと命名し、ペプチド結合Ｆｂａ−ＴＴと共に試験した。両結合体を、ミョウバン又はＭＰＬとの混合物として投与した。陰性対照群には、アジュバントのみ及びＤＰＢＳ緩衝液のみが含まれていた。図２４Ａ及び２５Ｂには、ミョウバン又はＭＰＬのいずれか中のβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴによるワクチン接種が、対照と比較して、感作マウスにおけるβ−（Ｍａｎ）３及びＦｂａペプチド特異的抗体力価を両方とも顕著に増加させたことが示されている。血清試料を、免疫の１４日後に採取し、１：１００に希釈し、細胞壁マンナン又はペプチドでコーティングされたプレートでのＥＬＩＳＡで試験した。β−（Ｍａｎ）３及びＦｂａに特異的なＭＡｂ  Ｂ６．１及びＥ２−９を、それぞれ陽性対照として使用した。
【０１１９】
最初の追加免疫後、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスは、Ｆｂａペプチド（図２４Ａ）及びβ−（Ｍａｎ）３エピトープ（図２４Ｂ）の両方に対してロバストな抗体応答を生成した。それらの力価は、Ｆｂａ−ＴＴを受容した群に由来する血清の力価よりも１００倍大きかった（ｐ＜０．００１）（表３、上記）。後者は、ＴＴを有していないミョウバン中のＦｂａを受容した動物とほぼ同じ応答を示した（図２４Ａ）。最初の追加免疫後、両エピトープに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体が、ミョウバン又はＭＰＬアジュバントが添加されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスの血清で検出されたが（表２）、非常に低レベルの抗Ｆｂａ  ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体が、アジュバント中のＦｂａ又はＦｂａ−ＴＴを受容したマウスの血清で検出された。エピトープに対する抗体は、陰性（つまり、アジュバント又はＤＰＢＳマウス）対照血清のいずれにおいても検出可能ではなかった（データ非表示）。実施例２１に記載の方法により結合されたＦｂａ−ＴＴは、良好な応答をもたらさなかったが、これは、Ｆｂａ及びＴＴ用に、わずか１つのタイプのリンカーを使用した初期実験に過ぎなかった。当技術分野で公知の他の方法（６３、６４、６５）による破傷風トキソイドの結合又は破傷風ＴＨエピトープとの結合（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１０１５３４号）は、より強力な応答をもたらす可能性のあるペプチド結合体を生成することができると考えられる。
【０１２０】
（実施例１６）
β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合ワクチンは、アジュバントの非存在下でさえ高い抗体応答及び防御を誘導した。
【０１２１】
β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチンの免疫原性が、追加のアジュバントに依存していたか否かを決定するために、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴを単独で投与し、それらマウスの応答を、ミョウバン又はＭＰＬとの混合物としてワクチンを受容したマウスと比較した。図２５Ａ〜Ｄには、播種性カンジダ症に対する抗体価及び防御により顕著に分析された、アジュバントを用いて又はアジュバントを用いずにβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体を使用した結果が示されている。ミョウバン又はＭＰＬのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスは、Ｆｂａペプチド（図２５Ａ）及びβ−（Ｍａｎ）３エピトープ（図２５Ｂ）の両方に対してロバストな抗体応答を発生させた。図２５Ｃには、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかをアジュバントとして使用した場合、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴにより防御免疫が誘導されたことが示されている。防御は、アジュバントを使用しなかった場合でさえ、ＤＰＢＳ又はアジュバント単独対照と比較して、ほとんど同じだった（Ｐ＜０．０１）。図２５Ｄには、免疫マウスは、対照群と比較して、低減されたか又は検出不能な腎臓一対当たりのＣＦＵを示したことが示された（Ｐ＜０．００１）。
【０１２２】
したがって、いずれかのアジュバントで調製されたワクチンを受容したマウスは、ロバストな抗体応答により予想通りに応答した。驚くべきことに、アジュバントを有していないβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴを受容したマウスは、ワクチン＋アジュバントを受容したマウスよりもほんのわずかに弱い応答を示したが、有意ではなかった（図２５Ａ及び２５Ｂ）。重要なことには、追加アジュバントを有する又は有していないβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合ワクチンでワクチン接種したマウスの３群は全て、Ｃ．アルビカンスでの致死的チャレンジに対する高度な防御を示した（図２５Ｃ）。誘導された防御免疫は、チャレンジの前にアジュバント又はＤＰＢＳ緩衝液のみを受容した対照群と比較して有意に延長された生存期間（ｐ＜０．００５）及び有意に低減された腎臓真菌量（ｐ＜０．００１）により明らかであった（図２５Ｄ）。これらの結果は、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチンの自己アジュバント活性の効力を示した。
【０１２３】
（実施例１７）
非ＤＣ／ＣＦＡ系の免疫手法により誘導された抗β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ免疫血清は、受動防護をもたらした。
【０１２４】
受動転移実験は、ＤＣ／ＣＦＡに基づく免疫手法により誘導された抗体が、播種性カンジダ症に対する防御の原因であることを示した。ワクチン誘導性抗体が、樹状細胞の使用に関わらず防御性であることを確認するために、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ（ミョウバン又はＭＰＬアジュバントを有する又は有していない）で免疫したマウスから免疫血清を採取及び貯留し、致死用量のＣ．アルビカンスでｉ．ｖ．チャレンジする４時間前に、未感作マウスにｉ．ｐ．で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌Ｃ．アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はＤＰＢＳ緩衝液のいずれかを投与した。β−（Ｍａｎ）３及びＦｂａエピトープに対する抗体を、酵母細胞での吸収前後で試験した。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体ワクチンで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。チャレンジ後、免疫陽性対照マウス及び抗血清で処置したマウスは、２つの陰性対照群と比較して生存期間の延長を示し（ｐ＜０．０１）（図２６Ａ）、誘導された抗体が防御性であり、それらの誘導は、免疫中の樹状細胞又はＣＦＡの使用に依存しなかったことが確認された。それと一致して、抗血清を受容したマウスは、チャレンジ前にＤＰＢＳ又は事前に吸収された血清を投与したマウスの感染量と比較して、有意により少数の腎臓真菌計数を示した（ｐ＜０．００１）（図２６Ｂ）。
【０１２５】
（実施例１８）
免疫は、ワクチン結合体中のいずれかの真菌エピトープに特異的な抗体のＩｇＭからＩｇＧへのアイソタイプスイッチを誘導した。
【０１２６】
ミョウバン又はＭＰＬと共に投与されたか又は単独で投与された場合のβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ修飾結合体により生成された抗体アイソタイプ応答に対して、ＤＣ／ＣＦＡに基づく免疫手法が使用された場合の抗体アイソタイプ応答を、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体により誘導されたグリカン及びペプチドエピトープの両方と比較した（表２、上記）。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ＋ＤＣ／ＣＦＡ及びβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスは、β−（Ｍａｎ）３エピトープ及びＦｂａペプチドの両方に対する抗体を産生し、アイソタイプ分析は、両エピトープに対するＩｇＭ及びＩｇＧサブクラスが免疫血清中に豊富にあることを明らかにし、これはＴ細胞依存性記憶免疫応答の誘導と一致している。
【０１２７】
真菌エピトープに特異的な抗体のアイソタイプ分布は、アジュバント系に依存して異なっていた（表２）。β−（Ｍａｎ）３に対するＩｇＭ及びＩｇＧ１応答は、アジュバントの存在に関わらず誘導され、グリカンエピトープに対するＩｇＧ２ａ応答は、ミョウバン又はＭＰＬを使用して又は使用せずにβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴにより誘導されたが、ＩｇＧ１は、ＤＣ／ＣＦＡ手法により免疫されたマウスにおいて検出可能だった唯一のサブクラスだった。ＭＰＬと混合したβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴで免疫したマウスのみが、グリカンエピトープに対するＩｇＧ２ｂ応答をもたらした。Ｆｂａペプチドに対する抗体ＩｇＭ及びＩｇＧ１アイソタイプ応答は、アジュバント系に関わらず、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａで免疫したマウスに類似していたが、ペプチドエピトープに特異的なＩｇＧ２ａは、ミョウバンを有するβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴによってのみ、又はアジュバントが使用されなかった場合に誘導された。ＭＰＬが試験アジュバントだった場合、ペプチドに対するＩｇＧ２ａアイソタイプは検出されなかった。播種性カンジダ症に対して観察された防御レベルは、ＤＣ／ＣＦＡ手法でグリカン−ペプチド結合体を用いて免疫したマウス、又はミョウバン若しくはＭＰＬを有する若しくは有していないグリカン−ペプチド−ＴＴで免疫したマウスでは類似していた。これにより、防御抗体が、主にＩｇＭ及びＩｇＧ１アイソタイプである可能性が高いことが示された。
【０１２８】
（実施例１９）
グリコペプチド−ＴＴ結合体は、非近交系マウスの播種性カンジダ症に対して免疫原性及び防御性である。
【０１２９】
播種性カンジダ症に対するβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合ワクチンの効力を、非近交系マウスでも実証した。ＭＰＬ及びミョウバンの組合せは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の至適活性化に結び付く局所的なサイトカイン応答を迅速に引き起こすことにより、ワクチン応答を増強することができるため、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体のみ又はミョウバン及びＭＰＬの両方との混合物で免疫した。陰性対照マウスを、アジュバントの組合せ又はＤＰＢＳのみで免疫した。非近交系Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ（０１Ｓ６０）マウスを、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体のみ、又はアジュバントミョウバン及びＭＰＬと混合したβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体で免疫し、対照マウスを、アジュバント（ミョウバン＋ＭＰＬ）のみ又はＤＰＢＳ緩衝液で免疫した。
【０１３０】
アジュバントを有する又は有していないβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴは、免疫された非近交系マウスに、β−（Ｍａｎ）３（図２７Ａ）及びＦｂａエピトープ（図２７Ｂ）の両方に対してロバストで一貫した抗体応答を誘導した。最終追加免疫の１４日後、免疫マウスを、上述のように、尾静脈を介して致死用量のＣ．アルビカンス３１５３Ａで感染させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスでの知見と同様に、単独で又はミョウバン及びＭＰＬと共に投与すると、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合ワクチンでワクチン接種した非近交系マウスは、感染マウス生存を顕著に改善した（図２７Ｃ）。ＤＰＢＳ又はアジュバントのみを受容した対照マウスと比較して生存期間が延長されたことから分かるように（Ｐ＜０．０１）、アジュバントを有する又は有していないβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴにより、防御免疫が誘導された。それと一致して、陰性対照と比較して、免疫マウスは、有意により低い腎臓生真菌細胞を示した（ｐ＜０．００１）（図２７Ｄ）。
【０１３１】
（実施例２０）
免疫血清中の抗体は、酵母型及び菌糸型のＣ．アルビカンスに結合する。
β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体で免疫した動物に由来する免疫血清は、フローサイトメトリー分析により示されたように、酵母型の細胞表面と特異的に反応する抗体を含有していた。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチン接種マウスに由来する免疫血清は、フローサイトメトリーにより示されたように、Ｃ．アルビカンスの表面にワクチンエピトープの存在を検出した。図２８Ａには、免疫血清中の抗体が、Ｃ．アルビカンス細胞表面に表現された両エピトープに結合し、Ｃ．アルビカンス細胞表面エピトープβ−（Ｍａｎ）３に特異的なＭＡｂ  Ｂ６．１の反応性に対する、免疫血清と生菌Ｃ．アルビカンス細胞との反応性が示されている。対照血清は、アジュバントのみを受容したマウスに由来する非免疫血清だった。図２８Ｂには、事前に吸収されたＭＡｂ  Ｂ６．１及び事前に吸収された免疫血清は、真菌細胞表面と反応しなかったことが示されている。図２８Ｃは、共焦点顕微鏡分析の顕微鏡写真であり、免疫血清中の抗体は、酵母型の表面にワクチンエピトープを検出したが、菌糸型のＣ．アルビカンスの表面とも反応したことが確認される。エピトープ提示は、β−（Ｍａｎ）３に特異的であり、陽性免疫蛍光対照として使用されたＭＡｂ  Ｂ６．１との真菌反応性によるものと類似していた。追加の陰性対照として、Ｃ．アルビカンス３１５３Ａ酵母細胞で事前に吸収された免疫血清は、Ｃ．アルビカンスの酵母型又は菌糸型のいずれとも反応しなかった。
【０１３２】
したがって、対照抗体ＭＡｂ  Ｂ６．１と規模が類似した蛍光シフトが、免疫血清の試験で観察された（図２８Ａ）。免疫血清のこの反応性は、Ｃ．アルビカンス酵母型での事前吸収により除去された（図２８Ｂ）。結合パターンは、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴのみで又はミョウバン若しくはＭＰＬのいずれかと混合してワクチン接種したマウスから採取した免疫血清と類似していた（データ非表示）。
【０１３３】
抗β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体免疫血清での免疫蛍光染色後の顕微鏡観察は、Ｃ．アルビカンス株３１５３Ａの酵母型及び糸状型の両方との反応性を示した（図２８Ｃ）。顕微鏡分析は、フローサイトメトリー結果を確認し、この観察を、菌糸型の真菌の包含に拡張した。特異的抗体反応性は、酵母型の真菌で事前に吸収された免疫血清による蛍光が存在しないことにより再び確認された（図２８Ｃ）。フローサイトメトリー分析のように、免疫血清の陽性反応は、グリカンエピトープに特異的であるＭＡｂ  Ｂ６．１の反応性と比較して優れていた［２６］。更に、極めて重要なことには、同じパターンのＣ．アルビカンス蛍光が、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴのみで又はミョウバン／ＭＰＬと混合してワクチン接種したマウスに由来する免疫血清で観察された。真菌との反応性は、アジュバントのみを投与したマウスに由来する血清又は未処置正常マウスに由来する貯留血清を試験しても観察されなかった。これらの知見に加えて、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体で免疫したマウスに由来する血清は、別のＣ．アルビカンス単離株（ＳＣ５３１４株）とも同様に反応した（データ非表示）。
【０１３４】
上記を要約すると、ワクチンの有効性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、Ｔｈ１応答の傾向が強く、播種性カンジダ症により抵抗性であるＣ５７ＢＬ／６マウスを含むことが示されている。防御抗体の産生を促進した同じＤＣ／ＣＦＡに基づく免疫プロトコールにより、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体は、ＢＡＬＢ／ｃ動物に見出されたのと同様のレベルの防御をＣ５７ＢＬ／６マウスに誘導した。更に、防御は、Ｃ．アルビカンスのチャレンジ株に関わらず観察された。ＢＡＬＢ／ｃマウスと同様に、２つの真菌エピトープに対する抗体を、Ｃ５７ＢＬ／６未感作マウスに受動転移すると、これら動物は、播種性カンジダ症から防御された。
【０１３５】
ヒト使用に許容される免疫手法を使用する場合に、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ結合体の免疫原性を増加させるため、結合体を破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させる効果を試験した。新しいグリコペプチドワクチン結合体であるβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴは、アジュバントとしてミョウバン又はＭＰＬのいずれかと共に投与すると、ロバストな抗体反応を誘導したため、高度に免疫原性であることが証明された。更に、２回目の追加免疫投与の前に、β−（Ｍａｎ）３及びＦｂａペプチドエピトープの両方に対して、ＩｇＭからＩｇＧ抗体へのアイソタイプスイッチが生じた。この結果は、記憶細胞応答を示し、長期的な免疫を誘導することができるワクチンであることを示した。最も重要なことには、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかと共に投与したβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体は、元のＤＣ／ＣＦＡ免疫手法［７］で観察された高レベルの防御と同等の播種性カンジダ症に対する防御を誘導した。
【０１３６】
また、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴを単独で投与し、ミョウバン又はＭＰＬのいずれかとの混合物としての結合体の投与と比較した。いずれかのアジュバントで調製されたβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体を受容したマウスは、ロバストな抗体応答を示ことにより予想通りに応答した。驚くべきことに、一切のアジュバントを有してないβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴを受容したマウスも、良好に応答した。ワクチン接種マウスの３群は全て、有意に増加した生存期間及び有意に低減されたか又は検出不能な犠牲時の腎臓真菌量により明らかなように、チャレンジの前にアジュバント又はＤＰＢＳ緩衝液のみを受容した対照群と比較して、Ｃ．アルビカンスでの致死的チャレンジに対する高レベルの防御を示した。更に、β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合体に対して免疫したマウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御を未感作マウスに転移させたが、Ｃ．アルビカンスで事前に吸収された免疫血清は、転移させなかった。これにより、誘導された抗体が防御性だったことが確認された。これらの結果は、ＴＴをワクチン結合体に付加することにより、追加のアジュバントを必要とせずに十分な自己アジュバント活性がもたらされたことを示しており、自己アジュバント性グリコペプチドをワクチンとして使用することが支持されている。
【０１３７】
また、Ｃ．アルビカンスで致死的チャレンジした後のマウスの生存延長に対するβ−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合ワクチンの効力は、非近交系マウスで実証された。β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴ結合ワクチンは、アジュバントが存在していなくともＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスで免疫原性であり、強力なグリカン及びペプチド特異的抗体を誘発し、カンジダ症に対する防御を誘導した。この非近交系マウスモデルでのワクチン媒介性防御は、腎臓のＣＦＵレベルの低減と関連していた。まとめると、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスでのワクチン効力により明らかなように、防御がＭＨＣバイアスを示したという証拠は見出されなかった。非近交系マウスでのワクチンの有効性は、この製剤がヒトでも同様に防御を誘導することができることを更に支持する。この理論により束縛されることは望まないが、本発明者らは、宿主が免疫学的に正常な場合、能動免疫の確立は、後の免疫不全事象の際にその宿主を防御することになると考える。
【０１３８】
β−（Ｍａｎ）３−Ｆｂａ−ＴＴワクチンにより誘導された特異的抗体の検出は、プレートのウェルが、抗グリカン抗体及び抗ペプチド抗体を検出するために、それぞれウシ血清アルブミンに結合されたβ−（Ｍａｎ）３又はＭＡＰ結合体としてのＦｂａペプチドのいずれかでコーティングされたＥＬＩＳＡにより決定した。グリカン及びペプチドエピトープの両方に対する応答の特異性を、遊離可溶性β−（Ｍａｎ）３又はＦｂａペプチドが、用量依存的な様式で免疫血清中の抗体結合を阻害した阻害ＥＬＩＳＡにより確認した（データ非表示）。実際の真菌細胞表面との特異的抗体の結合は、フローサイトメトリー分析により確認した。これにより、Ｃ．アルビカンス酵母型に対する結合が示され、酵母型及び菌糸型との抗体反応性が間接免疫蛍光法顕微鏡法により示された。
【０１３９】
ワクチンの一部としてグリカンを保持することの１つの利点は、以下の通りである：Ｆｂａペプチドは、Ｃ．アルビカンスに特有であるが（上記で報告されている修飾Ｆｂａを除く）、β−（Ｍａｎ）３に対する応答は、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）［２５］、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）［５９］、Ｃ．ギリエルモンジィ［６０］、及び大多数のＣ．グラブラタ株［６１］を含む、種々の他の臨床的に重要なカンジダ種による感染症に対する防御をもたらすと予想されるだろう。
【０１４０】
（実施例２１）
破傷風トキソイドに結合されたβ−ｍａｎトリサッカライド−Ｆｂａ及びＦｂａペプチドの合成
結合体６及び７の合成は、図２９及び図３０Ａ〜３０Ｅに示されている。トリサッカライドトリエチレングリコールリンカーを、Ｓ．Ｄｚｉａｄｅｋら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｎｋｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＨ−ｃｅｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１４巻、５９０８〜５９１７頁（２００８年）［６２］の化合物５について記載されているように合成した。（明確にしておくが、Ｄｚｉａｄｅｋらの化合物５は、本開示では代わりに化合物３と指定されており、本開示の化合物５は、Ｄｚｉａｄｅｋらの化合物５とは異なることに留意されたい。）
Ｆｂａペプチドを、まず固相ペプチド合成マトリックスにＬｙｓを結合させることにより合成した。α−アミノ基をＦｍｏｃで保護し、ε−アミノ基をｉｖＤｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロ−ヘキシリデン）−３−メチルブチル）で保護した。その後、新しいリンカーを使用して、トリエチレングリコールスペーサを導入した。その後、Ｆｂａペプチドを、この新しいリンカーのＮ末端に付加した。樹脂からの切断の前に、対照参照ペプチドを提供するために、Ｎ末端をＮ−アセチル化したか、又は化合物３と結合するためのチオールを提供するために、チオールプロピオン酸を付加したかのいずれかを行った。対照ペプチド及びグリコシル化ペプチドは両方とも、ｉｖＤｄｅ基を除去し、Ｓ−アセチルチオグリコール酸を、リジンのω−アミノ基に付加した。これにより、その後Ｆｂａペプチド１又はＭａｎ３−Ｆｂａペプチド４のいずれかを破傷風トキソイドに結合させることができる反応性Ｃ末端チオール基が提供された。破傷風トキソイドは、まずブロモアセタート基を、担体タンパク質の接近可能なリジン残基に導入し、その後それらを破傷風トキソイドペプチドと反応させることにより、結合用に活性化した。化合物１及び５を反応させることにより、対照結合体６を得た。グリコペプチド４を５と反応させることにより、ワクチン結合体７を得た。免疫及びチャレンジ実験に使用するための最終結合体は、化合物６及び７だった。
【０１４１】
試薬及び基本方法
酢酸（ＡｃＯＨ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から得た。ＨＰＬＣ用のＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、及びアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）は、Ｃａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｓ社から得た。ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）は、Ｍａｔｒｉｘ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社から得た。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から得た。Ｎｏｖａｓｙｎ  ＴＧＡ樹脂及びＮα−Ｆｍｏｃアミノ誘導体は、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社から得た。
【０１４２】
Ｆｍｏｃ保護トリエチレングリコールスペーサの合成は、Ｋｅｉｌ，Ｃ．Ｃｌａｕｓ、Ｗ．Ｄｉｐｐｏｌｄ、Ｈ．Ｋｕｎｚ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００１年  １１３巻、３７９頁、及びＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１年、４０巻、３６６頁［６６］に記載の手順に従った。脱イオン水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製イオン交換デバイスで準備した。ペプチド合成前及び合成後の両固体支持体の手作業による処理は、最上部にメス４５／５０フィッティングを有し、底部にはフィルターフリットにより覆われている２４／４０オス真空フィティングを有する球状２５０ｍＬペプチド合成反応器を用いて実施した（Ｓｃｈｏｔｔ社、ドイツ）。ＩＫＡ  Ｖｉｂｒａｘ  ＶＲボルテックス装置を使用して、手作業処理中、樹脂懸濁液を穏やかに撹拌した。Ｆｂａは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社のＡＢＩ  ４３３Ａ自動ペプチド合成機で合成した。
【０１４３】
Ｅｍｐｏｗｅｒ２ソフトウェア、Ｄｅｌｔａ６００溶媒送達システム、及びＷ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を装備したＷａｔｅｒｓ社製ＨＰＬＣシステムを、ＨＰＬＣ分析及び精製に使用した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ社製Ｃ１８（２）５μｍ  ＨＰＬＣカラムを、分析用及び調製用分離に使用した。分析用ＨＰＬＣ分離には、４．６ｍｍ×２５０ｍｍカラムで１ｍＬ分−１の移動相流速を使用した。調製用ＨＰＬＣ分離には、２１．５ｍｍ×２５０ｍｍカラムで１０ｍＬ分−１の流速を使用した。
【０１４４】
２１２ｎｍでのＵＶ吸光度を使用して、分析用及び精製用に、ペプチド誘導化合物の溶出を決定した。マトリックスイオン化レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して、所望のペプチド又はグリコ−ペプチド結合体を含有するＵＶ活性ＨＰＬＣ画分を特定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦには、ステンレス鋼板でシナピン酸マトリックスを使用した。このマトリックスから、プロトン化されナトリウム付加されたイオンとして、成分がイオン化及び脱離して同定される。
【０１４５】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａｓｙｎＴＧ
アルゴン雰囲気下で、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＡ樹脂（０．５ｇ、９０μｍ、公称能力  ０．２６ｍｍｏｌ／ｇ）を、メリフィールド反応器中の乾燥ＤＣＭ（５ｍＬ）で膨潤させた。２時間後、過剰ＤＣＭをろ過により除去し、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）を添加した。その後、樹脂を３０分間消化した。これと並行して、１５４（７．７当量）ＤＩＣを、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の１．１５０ｇ（１５．４当量）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨの冷却（０℃）溶液に、アルゴン下で滴加し、混合物を２０分間撹拌した。混合物を、減圧下で濃縮し、その結果生じた対称無水物を、白色固形物として単離した。その後、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）を添加し、その結果生じた溶液を、手動ペプチド反応器に移した。その後、８ｍｇ（０．５当量）ＤＭＡＰを添加して、樹脂のヒドロキシベンジル官能性に対する無水物の結合を触媒した。３時間後、樹脂を、１回１０ｍＬの乾燥ＤＭＦで５回洗浄し、その後１回１０ｍＬのＤＣＭで５回洗浄した。樹脂の負荷量を、以前に記述されているように決定した［５４］（０．２６ｍｍｏｌ／ｇ、１００％）。レジンを減圧下で１６時間乾燥した。残留乾燥樹脂の正味重量は、５４０ｍｇ（９４％）だった。
【０１４６】
Ｈ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａｓｙｎＴＧ
側鎖が保護された樹脂と結合したペプチドを、５４０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａＳｙｎＴＧから出発して、標準的迅速Ｍｏｃ０．１０ｍｍｏｌプロトコールの改良版を使用して、ＡＢＩ  ４３３Ａ自動合成機で構築した。機械的ボルテックス装置に設置したテフロン（登録商標）反応容器で、アミノ酸残基を、１５サイクルでＣ末端からＮ末端へと順次付加した。各サイクル中、先行するＮ末端Ｎα−Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中のピペリジン（２０％）溶液を使用した脱保護ステップでペプチド鎖から取り除き、その後結合ステップで、ペプチド鎖を１個アミノアシル残基分だけ伸長させた。未反応ペプチド鎖を、キャッピングステップでアセチル化し、試薬及び副産物を、次のサイクルを準備する洗浄ステップで取り除いた。Ｎα−Ｆｍｏｃ脱保護ステップの回数は、樹脂結合ペプチドをＮＭＰ中２０％ピペリジンで最大４回初期処理した後の溶出液中のＦｍｏｃ−ピペリジン付加物の検出に応じて、サイクル毎に異なっていた。各処理の後に形成されたＦｍｏｃ−ピペリジン付加物の濃度は、メタノールで希釈した脱保護溶出液の分割量を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製シリーズ２００ＵＶ検出器で測定した。２回目及び３回目の処理後、最初の処理後に測定した濃度の４．５％未満のシグナルが測定されると、終了が指示され、そのサイクルの脱保護が自動的に終了された。３回目の処理が、この条件を満たさなかった場合、合成機は、３００単位以下のシグナルが測定されるまで、各々８分間の追加処理を実施した。
【０１４７】
次に、密封テフロン（登録商標）カートリッジに保持された、１ｍｍｏｌの対応するＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を、３ｍＬのＮＭＰに溶解した。その後、０．９ｍｍｏｌのＨＢＴＵをカートリッジに添加して、１ｍｍｏｌ  ＨＯＢｔ及び２ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡの存在下で、対応するアミノアシルＨＯＢｔエステルを生成した。窒素ガス圧力により、活性エステルをカートリッジから樹脂に移動させ、その反応容器中の樹脂を機械的にボルテックスすることにより、固体支持体の浸透を加速させ、迅速な反応を促進させた。０．５Ｍ無水酢酸、０．０１４Ｍ  ＨＯＢｔ、及び０．１２９Ｍ  ＤＩＰＥＡのキャッピング溶液での処理を使用して、未反応ペプチド鎖を不活性化し、欠失配列の合成を防止した。合成は、Ｎα−Ｆｍｏｃ基が、以前に記述されている脱保護ステップにより取り除かれた最終サイクルで終了し、樹脂結合ペプチドを、ＮＭＰで、その後ＤＣＭでよく洗浄した。手動ペプチド反応器中で、樹脂を１０ｍＬ  ＤＣＭで５回及び１０ｍＬメタノールで５回処理し、その後減圧下で乾燥した。樹脂及び樹脂結合保護ペプチドの質量は、７０８ｍｇ（粗質量による収率は８０％）だった。
【０１４８】
ＡｃＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＫ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ（化合物１）
側鎖保護されたペプチドを保持する乾燥樹脂（３２０ｍｇ、４４μｍｏｌ）Ｈ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａｓｙｎＴＧを、手動ペプチド反応器中の５ｍＬ乾燥ＤＣＭで穏やかにかき混ぜた。その後、１２０ｍＬピリジン（１．５ｍｍｏｌ、３４当量）及び６０μＬ  Ａｃ２Ｏ（６３６μｍｏｌ、１４当量）を添加し、混合物を２時間撹拌しながら、Ｎ末端アミンをアセチル化した。その後、液相を反応器から排出し、樹脂を、１回１０ｍＬのＤＣＭで３回洗浄した。Ｃ末端リジン残基のｉｖＤｄｅ保護基を、３．３ｍＬのＤＭＦ中５％（ｗ／ｖ）ヒドラジンで３回、各々５分間処理することにより取り除いた。１回１０ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した後、２ｍＬ乾燥ＤＭＦ及び１５μＬ（８６μｍｏｌ、２．０当量）ＤＩＰＥＡに溶解した４０ｍｇ（１７３μｍｏｌ、３．９当量）のＮ−ヒドロキシサクシニミジルＳ−アセチル−チオアセタート（ＳＡＴＡ）を添加し、樹脂を１時間振とうした。溶液を反応容器から排出し、樹脂を、１回５ｍＬのＤＭＦで３回洗浄し、その後１回５ｍＬのＤＣＭで３回洗浄した。７ｍＬ  ＴＦＡ：４５０μＬ  Ｈ２Ｏ：４５０μＬ  ＴＩＳの混合物で樹脂を２時間処理することにより、ペプチドを固体支持体から切離し、同時に側鎖保護基を取り除いた。溶液を、反応器から１００ｍＬ丸底フラスコに排出し、樹脂を、１回１０ｍＬのＴＦＡで２回すすいだ。ロータリーエバポレータにより、ほとんどのＴＦＡを粗ペプチド溶液から除去した。室温、減圧下での揮発性化合物の除去を支援するために、１回５ｍＬのトルエンを３回フラスコに添加した。
【０１４９】
１５ｍＬのジエチルエーテルを０℃で添加することにより、ペプチドを析出させた。析出したペプチドは、フラスコに付着した白色固形物として出現した。上清をパスツールピペットで取り除き、ペプチドを１回１５ｍＬのジエチルエーテルで２回洗浄して不純物を除去した。粗ペプチドを、減圧下で一晩十分に乾燥した。粗ペプチドの最終質量は、５４ｍｇだった。その後、粗ペプチドを、０．１％ＴＦＡを有する７５％ＣＨ３ＣＮ及び２５％Ｈ２Ｏの溶液に溶解し、５０分間で７５：２５から６０：４０の０．１％ＴＦＡの調節剤を有するＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ勾配を用いて、逆相クロマトグラフィーにより精製した。溶出液を、２５．８から２７．２分まで収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、白色固形物、質量２６ｍｇ（１２μｍｏｌ、２７．１％）として化合物１を得た。
【０１５０】
ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ（化合物２）
４３３Ａ合成機中で、３３５ｍｇ（４６μｍｏｌ）の樹脂結合側鎖保護ペプチドＨ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ｉｖＤｄｅ）−ＮｏｖａｓｙｎＴＧを、ＤＣＭで、その後ＮＭＰで膨潤させた。その後、遊離アミノ末端を、Ｆｍｏｃ−アミノ酸の標準的プロトコールに従って、１ｍｍｏｌの３−（Ｓ−トリチル）−チオプロパン酸でアシル化し、ＨＢＴＵ溶液により活性化して、保護された樹脂結合ペンタデカペプチドを得た。ＤＭＦで、その後ＤＣＭで洗浄して、反応副産物を除去した。その後、ペプチド樹脂を、手動ペプチド反応器に移した。３．３ｍＬのＤＭＦ中５％（ｗ／ｖ）ヒドラジンで３回、各々５分間処理することにより、Ｃ末端リジン残基からｉｖＤｄｅ保護基を取り除いた。樹脂を、１回１０ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した。その後、２ｍＬ乾燥ＤＭＦ及び１５μＬ（８６μｍｏｌ、１．９当量）ＤＩＰＥＡに溶解した４４ｍｇ（１９０μｍｏｌ、４．１当量）のＮ−ヒドロキシサクシニミジルＳ−アセチル−チオアセタート（ＳＡＴＡ）を添加し、樹脂を１時間振とうした。溶液を反応容器から排出し、樹脂を、１回５ｍＬのＤＭＦで３回洗浄し、その後１回５ｍＬのＤＣＭで３回洗浄した。８．３ｍＬ  ＴＦＡ：４２０μＬ  Ｈ２Ｏ：４２０μＬ  ＴＩＳ：８３０μＬ  ＥＤＴの混合物で固体支持体を２時間処理することにより、側鎖保護基を取り除き、ペプチドを樹脂から切り離した。溶液を、反応器から１００ｍＬ丸底フラスコに排出し、樹脂を、１回１０ｍＬのＴＦＡで２回すすいだ。ロータリーエバポレータを使用して、ほとんどのＴＦＡを粗ペプチド溶液から除去した。室温、減圧下での揮発性化合物の除去を支援するために、１回５ｍＬのトルエンを３回フラスコに添加した。１５ｍＬのジエチルエーテルを０℃で添加することにより、ペプチドを析出させた。ペプチド析出物は、フラスコに付着した白色固形物だった。上清をパスツールピペットで取り除き、ペプチドを１回１５ｍＬのジエチルエーテルで２回洗浄して不純物を除去した。粗ペプチドを、減圧下で一晩十分に乾燥した。粗ペプチドの最終質量は、４０ｍｇ（１８．３μｍｏｌ、４１％）だった。粗ペプチドを、０．１％ＴＦＡを有する７５％ＣＨ３ＣＮ及び２５％Ｈ２Ｏの溶液に溶解し、５０分間で７５：２５から６５：３５の、０．１％ＴＦＡの調節剤を有するＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ勾配を用いて、逆相クロマトグラフィーにより精製した。溶出液を、３４．０から３５．２分まで収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、白色固形物、質量２４ｍｇ（１１μｍｏｌ、２４％）として化合物２を得た。
【０１５１】
βＭａｎ３−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ（化合物４）
１ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．９）及び２５０μＬメタノールの混合物を、減圧下で１０分間超音波処理することにより脱気し、その後アルゴンを拡散させた。脱気した緩衝溶液を使用して、２ｍＬ微量遠心バイアル中に、２．７ｍｇ（３．１μｍｏｌ）β−マンノシドアクリラート（化合物３）及び８．７ｍｇ（３．９μｍｏｌ、１．３当量）ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ（化合物２）を溶解した。混合物を、短期間遠心分離して、依然として未溶解の物質がないかどうかを評価し、その後暗所に２時間置いて反応させた。混合物を１０ｍｍ、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターでろ過し、未溶解の物質を除去し、その後混合物を、０．０２％酢酸を含有する８５：１５から６５：３５のＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ勾配を使用して、ＨＰＬＣにより直ちに精製した。グリコール−ペプチド結合体は、５０．５〜５２．３分で溶出された。この物質を収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、収量６．６ｍｇ（２．１μｍｏｌ、６９％）の表題化合物４を白色固形物として得た。
【０１５２】
破傷風トキソイドに対するペプチドＡｃＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨ及びβＭａｎ３−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＹＧＫＤＶＫＤＬＦＤＹＡＱＥ（配列番号１）−ＴＥＧ−Ｋ（ＳＡＴＡ）−ＯＨの結合
磁気撹拌子を有する４ｍＬガラスキンブルバイアルのＰＢＳ（１．３ｍＬ、ｐＨ７．４）中の単量体破傷風トキソイド（１０ｍｇ）に、２ｍｇのブロモ酢酸ＮＨＳエステルを添加した。バイアルを、アルミニウムホイルで包み、３時間磁気撹拌器に置いておいた。ブロモアセチル化破傷風トキソイド（化合物５）を、較正済みＧ２５カラムを用いてＰＢＳで精製した。収集画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製遠心ろ過ユニット（１０ｋＤａ）で約０．５ｍＬに濃縮し、溶液を、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製チューブに移した。Ｆｂａペプチド（化合物１）（６．５ｍｇ）を、０．５Ｍヒドロキシルアミン及び２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ（０．５ｍＬ、ｐＨ７．４）に溶解し、溶液を、ブロモアセチル化破傷風トキソイド、化合物５に添加した。チューブをアルミニウムホイルで包み、反転ミキサーに３７℃で２日間置いておいた。その後、結合体を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００カラム（２×１００ｃｍ）で精製した。結合体に対応する画分を収集し、ＰＢＳに対して透析し、濃縮した。
【０１５３】
グリコペプチドβＭａｎ３−Ｆｂａ化合物４（３．９ｍｇ）を、同じ手順を使用して、ブロモアセチル化破傷風トキソイド化合物５（４．４ｍｇ）に結合させた。
送達の前に、各結合体を、水で平衡化されたＧ−２５カラムで脱塩し、凍結乾燥した。
【０１５４】
Ｆｂａ−破傷風トキソイド結合体化合物６をもたらすペプチドの組み込みをＭＡＬＤＩで推定すると、平均値が１１．７であり、βＭａｎ３−Ｆｂａ−破傷風トキソイド結合体化合物７の場合は、組み込み平均値は５．５と決定された。つまり、破傷風トキソイドの１分子当たりの結合されたペプチド又はグリコペプチド分子の平均数は、１１．７（１１〜１２の範囲内にあるほとんどの値）又は５．５（５〜６の範囲内のほとんどの値）であると決定された。
【０１５５】
文献リスト
【表４】
2014515757.tif 000006
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本出願で引用された全ての参考文献の完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、以下の文献が参照により組み込まれる：（１）Ｈ．Ｘｉｎ、Ｊ．Ｃａｒｔｍｅｌｌ、Ｄ．Ｒ．Ｂｕｎｄｌｅ、及びＪ．Ｅ．Ｃｕｌｔｅｒ、「Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎ  ａｎｔｉ−Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｕｓｅ」、Ｇｏｒｄｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅでのポスター発表、２０１１年１月、ガルベストン、テキサス州；（２）Ｈ．Ｘｉｎ、Ｊ．Ｃａｒｔｍｅｌｌ、Ｄ．Ｒ．Ｂｕｎｄｌｅ、及びＪ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ、「Ａｎｔｉ−ｃａｎｄｉｄａｓｉｓ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」、第１１１回Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙでの抄録、ニューオーリンズ、ルイジアナ州、２０１１年５月２０〜２４日；（３）Ｈ．Ｘｉｎら、「Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｏｇｙ、１８巻、１６５６〜１６６７頁（２０１１年８月１０日に電子公開）；及びＨ．Ｘｉｎら、「Ｓｅｌｆ−ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ」、ＰＬｏＳに掲載決定、２０１２年。しかしながら、別様に相いれない矛盾がある場合には、本明細書が優先するものとする。
【図４Ｂ】
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【図１５】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｅ】
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【配列表】
2014515757000001.app
【国際調査報告】
2014515757.tif 000093