(57)【要約】本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含む食品産物、特に発酵食品およびプロバイオティクス食品に関する。これらの微生物は、具体的には、病原性が非常に低く、ヒトによる消費に関して安全性が高いと特徴付けられる。さらに、前記食品産物を、特に発酵によって生成するための方法、ならびにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの適切な細菌株が提供される。特定の実施形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物は、ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１、それに由来する微生物またはＣＴＣ１ホモログである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含む食品産物。
【請求項２】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物が、ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１、それに由来する微生物またはＣＴＣ１ホモログである、請求項１に記載の食品産物。
【請求項３】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物が、以下の特性：
ａ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｂ）ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％、より好ましくは１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；ならびに／または、
ｃ）短鎖脂肪酸を産生することができること；ならびに／または
ｄ）摂取された後にヒトの胃内および必要に応じて腸内の条件で生存することができること；ならびに／または
ｅ）以下の安全特性：
（ｉ）抗生物質であるメトロニダゾール、メロペネムおよび／もしくはクリンダマイシンに対して感受性であること；
（ｉｉ）プラスミドＲＰ４（ＤＳＭ３８７６）および／もしくはプラスミドｐＳＣ１０１（ＤＳＭ６２０２）を含有しないこと；
（ｉｉｉ）β−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡおよび／もしくはｃｆｘＡを含有しないこと；
（ｉｖ）ビルレンス因子であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの多糖Ａおよび／もしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのエンテロトキシンＢｆｔおよび／もしくはｏｍｐＷ遺伝子によりコードされる「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」を含有しないこと；
（ｖ）細胞外デオキシリボヌクレアーゼ活性、細胞外コンドロイチナーゼ活性、細胞外ヒアルロニダーゼ活性および／もしくは細胞外ノイラミニダーゼ活性のいずれも示さないこと；および
（ｖｉ）該ヒト結腸の上皮細胞に付着しないこと
の１つもしくは複数を有すること；ならびに／または
ｆ）表面炭水化物構造を安定および／もしくは均一に発現すること
の１つまたは複数を有する、請求項１または２に記載の食品産物。
【請求項４】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物を、消費者に微生物約１０６〜約１０１３個の日用量をもたらす量または濃度で含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の食品産物。
【請求項５】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物を、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の食品産物。
【請求項６】
発酵食品、プロバイオティクス食品、機能性食品、栄養補助食品および食品添加物からなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の食品産物。
【請求項７】
食品原材料を、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物が添加されることを特徴とする発酵用スターター培養物と組み合わせる、発酵食品を生成するための方法。
【請求項８】
以下の特性：
ａ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物が、単独で、もしくは別のスターター培養物と組み合わせて、スターター培養物として使用されること；
ｂ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の該微生物を、発酵中もしくは発酵後に発酵食品に添加すること；および／または
ｃ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の該微生物が、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態もしくは溶解された形態で使用されること；
ｄ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の該微生物を、原材料１ミリリットル当たり少なくとも細胞１０６個の量で、好ましくは原材料１ミリリットル当たり細胞約１０９〜１０１０個の量で添加すること
の１つまたは複数を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下の方法のステップ：
−前記食品原材料に、必要に応じてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含有するスターター培養物を接種するステップ；
−少なくとも１つの糖、好ましくはグルコースを添加するステップ；および
−発酵用該スターター培養物を含有する該食品原材料を、好ましくは嫌気条件下でインキュベートするステップ
の少なくとも１つを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物が、以下の特性：
ａ）ＣＴＣ１（ＤＳＭ２３９６４）、それに由来する微生物もしくはＣＴＣ１ホモログであること
ｂ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｃ）ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％、より好ましくは１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；ならびに／または、
ｄ）短鎖脂肪酸を産生することができること；ならびに／または
ｅ）摂取された後にヒトの胃内および必要に応じて腸内の条件で生存することができること；ならびに／または
ｆ）以下の安全特性：
（ｉ）抗生物質であるメトロニダゾール、メロペネムおよび／もしくはクリンダマイシンに対して感受性であること；
（ｉｉ）プラスミドＲＰ４（ＤＳＭ３８７６）および／もしくはプラスミドｐＳＣ１０１（ＤＳＭ６２０２）を含有しないこと；
（ｉｉｉ）β−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡおよび／もしくはｃｆｘＡを含有しないこと；
（ｉｖ）ビルレンス因子であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの多糖Ａおよび／もしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのエンテロトキシンＢｆｔおよび／もしくはｏｍｐＷ遺伝子によりコードされる「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」を含有しないこと；
（ｖ）細胞外デオキシリボヌクレアーゼ活性、細胞外コンドロイチナーゼ活性、細胞外ヒアルロニダーゼ活性および／もしくは細胞外ノイラミニダーゼ活性のいずれも示さないこと；および
（ｖｉ）該ヒト結腸の上皮細胞に付着しないこと
の１つもしくは複数を有すること
の１つまたは複数を有する、請求項７から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７から１０までのいずれか一項に記載の方法によって得ることができる発酵食品。
【請求項１２】
ＤＳＭ２３９６４として寄託された菌株ＣＴＣ１の微生物、それに由来する微生物またはＣＴＣ１ホモログ。
【請求項１３】
ＣＴＣ１に由来する前記微生物または前記ＣＴＣ１ホモログが、以下の特性：
ａ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物であること；
ｂ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｃ）ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％、より好ましくは１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；ならびに／または、
ｄ）短鎖脂肪酸を産生することができること；ならびに／または
ｅ）摂取された後にヒトの胃内および必要に応じて腸内の条件で生存することができること；ならびに／または
ｆ）以下の安全特性：
（ｉ）抗生物質であるメトロニダゾール、メロペネムおよび／もしくはクリンダマイシンに対して感受性であること；
（ｉｉ）プラスミドＲＰ４（ＤＳＭ３８７６）および／もしくはプラスミドｐＳＣ１０１（ＤＳＭ６２０２）を含有しないこと；
（ｉｉｉ）β−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡおよび／もしくはｃｆｘＡを含有しないこと；
（ｉｖ）ビルレンス因子であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの多糖Ａおよび／もしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのエンテロトキシンＢｆｔおよび／もしくはｏｍｐＷ遺伝子によりコードされる「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」を含有しないこと；
（ｖ）細胞外デオキシリボヌクレアーゼ活性、細胞外コンドロイチナーゼ活性、細胞外ヒアルロニダーゼ活性および／もしくは細胞外ノイラミニダーゼ活性のいずれも示さないこと；および
（ｖｉ）該ヒト結腸の上皮細胞に付着しないこと
の１つもしくは複数を有すること
の１つまたは複数を有する、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の微生物を含む組成物。
【請求項１５】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、少なくとも１つの食品原材料を含む組成物または加工された食品材料に添加するステップを含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の食品産物を生成するための方法。
【請求項１６】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物が、請求項１２または１３に記載の微生物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物の、食品産物を生成するための、特に発酵用のスターター培養物としての使用。
【請求項１８】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記微生物が、請求項１２または１３に記載の微生物である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を含む食品産物に関する。具体的には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含む食品産物が提供される。さらに、本発明は、発酵におけるこれらの微生物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細菌を不可欠な構成要素または生成補助物として含有する食品産物は長い間、当技術分野で公知である。具体的には、発酵食品、例えば、ヨーグルト、チーズ、生ソーセージ、および発酵させて酸味を呈した野菜などは我々の栄養の不可欠な構成要素である。発酵食品を生成するためには、例えば、自然発酵を使用する、または微生物を食品原材料に特異的に添加する種々の方法が用いられている。現行の発酵方法は、具体的には、それぞれの食品原材料（例えば、ヨーグルトまたはチーズを生成するための乳）にスターター培養物を添加することに基づく。スターター培養物により、従来の生成プロセスに対して種々の利益がもたらされる。一例として、生成の不備が少なくなること、および生成プロセスが短縮されることにより、経済的損失が防がれる。さらに、原材料が通常よりよく反応し得る。種々のスターター培養物の混合物も利用することができるので、味覚、安全性、および均一性に関する結果がよりよいことも多い。他のやり方では生成プロセスへの標的化介入を伴わなければ可能にならない産物を生成することができる。
【０００３】
微生物は発酵プロセスに決定的に影響を及ぼすので、発酵プロセスに適した微生物を開発し、選択することが、公知の発酵プロセスを発展させ、改良することの本質的な目的である。例えば、最終産物の芳香、酸性化の程度および／または色は使用される微生物の代謝活性により決定される。さらに、微生物は、健康状態または代謝に正に影響を及ぼす場合に栄養の分野に大きな潜在性を有する。消費者の健康に正に影響を及ぼす発酵食品の公知の例は、プロバイオティクス食料品を含む。プロバイオティクスとは、十分な量で消費された場合に消費者に対して健康促進効果を有する生育可能な微生物の調製物である。プロバイオティクス乳酸菌が最も長く使用されているが、酵母および他の種も使用されている。
【０００４】
今日使用されている大多数のプロバイオティクス菌株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属し、ほんの少数がＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのような他の属に属する。主要な理由は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは発酵食品に一般に見いだされ、したがって、ヒトに対して安全であると一般に認識されていることである。ヒトにおいて伝統的でない種を使用するという提案には、一般に、潜在的な有害作用に対する懸念が多く惹起される。したがって、現行のプロバイオティクス菌株は、主にそれらの主流の許容性について選択され、選択プロセスでは、はるかによい健康性を有する潜在的な菌株が除外される。
【０００５】
例えば、ヒト結腸の微生物叢の２０％〜最大４０％を占めるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の微生物は、一般に、発酵のために、またはプロバイオティクス菌株としては使用されていない。特定のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種はヒトの健康に有益な多くの機能を保有することが公知であるので、これは驚くべきことである。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、炭水化物の発酵、窒素を含む物質の利用、ならびに胆汁酸および他のステロイドの生体内変換に関与する独特の代謝活性を保有する。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、免疫調節効果を伴う特定の多糖抗原を含有すること、ならびに宿主の免疫系の発生ならびに病原体および疾患と戦うその能力の維持に強力に関与することが示されている。
【０００６】
しかし、いくつかのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌株は、特別な条件下で重度の腸管外感染症の発生に関与し得る。したがって、いくつかの菌株は日和見病原体に分類され、安全性への懸念がいくらか生じ得る。例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｒｔｕｓ微生物は微生物の安全性カテゴリーの一番下には分類されず、したがって、潜在的な病原性の危険性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これを考慮して、本発明の目的の１つは、高い安全性基準を満たし、したがって、ヒトが消費するために安全に使用することができる微生物を含む食品産物である。特に、１つの目的は、プロバイオティクス食品を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を食品産物、特に発酵食品およびプロバイオティクス食品における食品添加物または食品成分として有利に使用することができることを見いだした。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含有する食品産物は、生育可能な形態または生育不能な形態のいずれかで使用される前記微生物によってもたらされる種々の有利な性質を有する。特に、これらの微生物の病原性は非常に低く、したがって、ヒトによる消費に関して高度に安全であり、また、好都合な短鎖脂肪酸を産生する。
【０００９】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の新規の種であり、Chassardら（「Bacteroides  xylanisolvens  sp.  Nov.,  a  xylan-degrading  bacterium  isolated  from  human  faeces」；International  Journal  of  Systematic  and  Evolutionary  Microbiology（２００８年）；５８巻、１００８〜１０１３頁）に初めて記載された。これは、ヒト糞便から単離することができるキシラン分解性グラム陰性バチルス属細菌であり、したがってヒト共生微生物である。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）にＤＳＭ１８８３６として寄託され、そこから公的に入手可能である。しかし、食品産物へのその使用はまだ当技術分野において公知ではない、または提案されていない。
【００１０】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物は病原性を有さず、したがって、具体的には、ヒトに消費された場合に有害な副作用を引き起こす高い危険性を伴わずに消費することができることを実証することができた。さらに、病原性が低いので、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物の製造、流通および市販に関する法的規制による重大な制限はなく、したがって、ほとんど労力をかけずに履行することができる。具体的には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０００／５４／ＥＣおよびＧｅｒｍａｎ「Ｂｉｏｓｔｏｆｆｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇ」に従って、リスク群１の生物学的因子に分類される。リスク群１は４つのリスク群で最も低く、ヒト疾患を引き起こしそうにない生物学的因子に関する。他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの種の微生物も含めた多くの他の微生物はより高いリスク群に分類される（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓは、リスク群２の生物学的因子である）。
【００１１】
したがって、第１の態様では、本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含む食品産物を提供する。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、食品原材料を、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物が添加されることを特徴とする発酵用スターター培養物と組み合わせる、発酵食品産物を生成するための方法を提供する。さらに、前記方法によって得ることができる、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含む発酵食品が提供される。
【００１３】
第３の態様では、本発明は、ＤＳＭ２３９６４として寄託された菌株ＣＴＣ１の微生物、それに由来する微生物またはＣＴＣ１ホモログを提供する。
【００１４】
さらに、実施例において実証されている通り、特に、本発明による微生物は、最も重要なビルレンス因子であるプラスミドＤＮＡ材料ならびに関連する細胞外酵素および病原性因子の大部分について陰性であり、ヒト結腸の上皮細胞に付着しない。さらに、本発明による微生物は、マウスにおける毒物学的試験で有害作用を示さず、また、３週間にわたって８．５＊１０１１ＣＴＣ１までの日用量を摂取したヒトにおいていかなる特質の有害作用も示さなかった。したがって、本発明による微生物は、非常に高い安全性基準を満たし、望ましくない副作用の危険性を伴わずにヒトが消費することができる。さらに、本発明による微生物は、種々の抗生物質に対して感受性であることが好ましく、したがって、必要であれば容易かつ有効に排除することができる。
【００１５】
さらに、本発明による微生物が、産物の品質についてのマーカーとして使用することができる安定かつ均一な細胞表面、具体的には表面炭水化物構造の安定かつ均一な発現を示すことを実証することができた。表面特性、特にその炭水化物構造を本発明による微生物を含有する微生物の培養物の均一性についてのマーカーとして使用することができ、かつ／または培養物中の本発明による微生物の量についてのマーカーとして使用することができる。
【００１６】
さらに、本発明者らは、本発明による微生物が短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができることを見いだした。微生物の炭水化物発酵の最終産物として産生される短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は健康促進性を有し得る。例として、プロピオン酸は、潜在的なコレステロール低下効果および抗脂質生成効果を有することが報告された。プロピオン酸は、満腹をさらに刺激し得、また、酢酸および酪酸と一緒に抗がん効果を示す。
【００１７】
第４の態様では、本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、少なくとも１つの食品原材料を含む組成物または加工した食品材料に添加するステップを含む、本発明の第１の態様による食品産物を生成するための方法を提供する。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物の、食品産物を生成するため、具体的には、発酵用のスターター培養物としての使用が提供される。
【００１８】
以下の記載および添付の特許請求の範囲から、本発明の他の目的、特徴、利点および態様が当業者に明らかになる。しかし、適用の好ましい実施形態が示されている以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、単に例示として示されていることが理解されるべきである。以下を読むことにより、開示されている本発明の主旨および範囲に入る種々の変化および改変が当業者には容易に明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物が、食品産物に使用するため、具体的にはヒトによる消費に適していることを見いだした。したがって、第１の態様では、本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含む食品産物を対象とする。
【００２０】
本発明によると、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物とは、具体的には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属し、好ましくは以下の特性：
ａ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ１８８３６またはＤＳＭ２３９６４として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｂ）ＤＳＭ１８８３６またはＤＳＭ２３９６４として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；
ｃ）以下の特性：
ｉ）ＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓと同様に、デンプンを分解することができないこと；
ｉｉ）マンニトール、特にＤ−マンニトール、メレジトースおよび／もしくはソルビトール、特にＤ−ソルビトールを使用および／もしくは代謝する能力、ならびに／またはグリセロールから酸を産生する能力を有すること；
ｉｉｉ）グルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼ活性を発現すること；
ｉｖ）インドールを産生することができないこと；
ｖ）カタラーゼ活性を示さないこと
の１つもしくは複数を有すること；
ｄ）以下の特性：
ｉ）嫌気性微生物であること；
ｉｉ）非胞子形成性であること；
ｉｉｉ）非運動性であること；および
ｉｖ）グラム陰性であること
の１つもしくは複数を有すること
の１つまたは複数を有する微生物を指す。
【００２１】
上で定義されている基準ａ）〜ｄ）の少なくとも２つまたは少なくとも３つ、より好ましくは全てが満たされることが好ましい。
【００２２】
「ＤＮＡ間の関連性」という用語は、具体的には、De  Leyら（１９７０年）  Eur.  J.  Biochem.  １２巻、１３３〜１４２頁またはHussら（１９８３年）Syst.  Appl.  Microbiol.  ４巻、１８４〜１９２頁によるＤＮＡ間ハイブリダイゼーション／復元アッセイによって測定される、２つの微生物のゲノムＤＮＡまたはＤＮＡ全体の類似性の百分率を指す。具体的には、ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイをＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅによって実施することが好ましい。一実施形態では、ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイを下の実施例１．３に記載の通り実施する。
【００２３】
「１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性」という用語は、具体的には、第１の微生物の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の核酸配列の領域と第２の微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列の対応する領域との間の、同一のヌクレオチドの百分率を指す。領域は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００個の連続したヌクレオチド、少なくとも３００個の連続したヌクレオチドまたは少なくとも４００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくは約４８０個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。一実施形態では、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列の領域は、それぞれ配列番号１および配列番号２またはそれらの相補配列の配列と隣接している。
【００２４】
好ましい実施形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物は、少なくとも１つの表面炭水化物構造を安定および／または均一に発現する。表面炭水化物構造を安定に発現している微生物とは、具体的には、微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または約１００％が表面炭水化物構造を発現している、微生物の一群を指す。表面炭水化物構造を均一に発現している微生物とは、具体的には、微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または約１００％が、表面炭水化物構造を、平均発現レベルと５０％以下、好ましくは４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下または１０％以下で異なる発現レベルで発現している、微生物の一群を指す。表面炭水化物構造を発現している微生物とは、具体的には、表面炭水化物構造を当技術分野で公知の適切な方法によって検出可能な量で含む微生物を指す。
【００２５】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができることが好ましい。微生物の炭水化物発酵の最終産物として産生される短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は健康促進性を有し得る。例として、プロピオン酸は、潜在的なコレステロール低下効果および抗脂質生成効果を有することが報告された。プロピオン酸は、満腹をさらに刺激し得、また、酢酸および酪酸と一緒に抗がん効果を示し得る。好ましい実施形態では、本発明による微生物は、プロピオン酸、酢酸、コハク酸、ギ酸および乳酸からなる群から選択される１種または複数種のＳＣＦＡを産生することができる。本発明による微生物はプロピオン酸および／または酢酸を産生することができることが好ましい。好ましい実施形態では、これらのＳＣＦＡは、微生物を含有する本発明による食品産物中にも存在する。本発明による食品産物がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を生育可能な形態で含むある特定の実施形態では、前記微生物は、食品産物が消費された後に消費者の体内で前記ＳＣＦＡをなお産生することができる。
【００２６】
好ましい実施形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、具体的には胃の通過の条件で、および好ましくは具体的には摂取後のヒトの腸の少なくとも一部の通過の条件で生存することができる。具体的には、ヒトの胃内の条件で生存するとは、胃液中で、微生物を含む組成物中、具体的には本発明による食品産物中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも８５％が少なくとも１８０分にわたって生存することを指す。さらに、ヒトの腸内の条件で生存するとは、腸液中で、微生物を含む組成物中、具体的には本発明による食品産物中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が少なくとも２４０分にわたって生存することを指す。
【００２７】
好ましい実施形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は以下の安全特性：
（ｉ）抗生物質であるメトロニダゾール、メロペネムおよび／またはクリンダマイシンに対して感受性であること；
（ｉｉ）プラスミドＲＰ４（ＤＳＭ３８７６）および／またはプラスミドｐＳＣ１０１（ＤＳＭ６２０２）を含有しないこと；
（ｉｉｉ）β−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡおよび／またはｃｆｘＡを含有しないこと；
（ｉｖ）ビルレンス因子であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの多糖Ａおよび／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのエンテロトキシンＢｆｔおよび／またはｏｍｐＷ遺伝子によりコードされる「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」を含有しないこと；
（ｖ）細胞外デオキシリボヌクレアーゼ活性、細胞外コンドロイチナーゼ活性、細胞外ヒアルロニダーゼ活性および／または細胞外ノイラミニダーゼ活性のいずれも示さないこと；ならびに
（ｖｉ）ヒト結腸の上皮細胞に付着しないこと
の１つまたは複数を有する。
【００２８】
好ましい実施形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、
ａ）２０１０年９月１日に、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）においてｔｈｅ  Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によりブタペスト条約の要件に従って受託番号ＤＳＭ２３９６４の下で寄託されたＣＴＣ１（ＤＳＭ２３９６４）、
ｂ）ＣＴＣ１に由来する微生物、または
ｃ）ＣＴＣ１ホモログ
である。
【００２９】
ＣＴＣ１（ＤＳＭ２３９６４）は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種に属する。ＣＴＣ１は、幅０．４〜０．５μｍであり、一般に長さ１〜２μｍであり、Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ寒天上でコロニーが成長し、１８時間後に環状の乳白色の隆起した凸状の表面を伴って直径２〜３ｍｍになる、厳密に言えば嫌気性、非胞子形成性、非運動性かつグラム陰性の桿状細菌であることが好ましい。
【００３０】
ＣＴＣ１に由来する微生物および／またはＣＴＣ１ホモログは、以下の特性：
ａ）上で定義されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの種に属すること；
ｂ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｃ）ＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、および最も好ましくは約１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；
ｄ）短鎖脂肪酸を産生することができること；
ｅ）上に開示されている安全特性のうちの１つもしくは複数を有すること；ならびに／または
ｆ）ヒトの胃内および／もしくは腸内の条件で生存すること
の１つまたは複数を有することが好ましい。
【００３１】
上で定義されている基準ａ）〜ｆ）の少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つ、最も好ましくは全てが満たされることが好ましい。
【００３２】
「（１つの）微生物」という用語は、本明細書で使用される場合、ただ１つの単細胞生物ならびに多数の単一の単細胞生物を指す場合がある。例えば、「Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の（１つの）微生物」という用語は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の１つの単一のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ細菌細胞ならびにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の複数の細菌細胞を指す場合がある。「Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の（１つの）微生物」および「（１つの）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物」という用語は本明細書では同義に使用される。一般に、「（１つの）微生物」という用語は、多数の細胞を指す。具体的には、前記用語は、少なくとも１０３個の細胞、好ましくは少なくとも１０４個の細胞、少なくとも１０５個または少なくとも１０６個の細胞を指す。
【００３３】
本発明による「食品産物」という用語は、任意の食用品、具体的には、ヒトおよび／または動物の栄養、好ましくはヒトの栄養のために使用することができる任意の産物を指す。食品産物は、単離された栄養分、栄養補助食品および遺伝子操作された食品に特有の食事、ハーブ産物、ならびに加工食品、例えば、発酵食品、穀類、スープ、および飲料に及び得る。食品産物という用語は、具体的には、ヒトまたは動物が経口的に摂取することができる任意の栄養分、栄養分の組成物または製剤、例えば、これだけに限定されないが、種々の形態、例えば、これだけに限定されないが、カプセル、タブレット、エマルション、粉末、液体、ならびに任意の食品または飲料の形態で、またはその一部として経口的に適用することができる栄養分、栄養添加物、食品添加物、栄養補助食品、臨床用食品、非経口用食品、経腸用食品、特定用途食品、特定保健用食品または機能性食品を指す。特別な場合には、食品産物は、非経口的に与えることができる（非経口用食品）。食品産物は、それ自体で、または少なくとも１つの他の成分と混合して与えることができる。食品産物それ自体、またはそれと少なくとも１つの他の成分との混合物をそれ自体で、または食品または飲料と混合して与えることができる。食品産物という用語は、任意の食品、具体的には、発酵食品、飲料、カプセル、タブレット、エマルション、粉末、または液体も意味する。ある特定の実施形態では、食品産物により、全体的な健康への利益がもたらされる。具体的には、食品産物はプロバイオティクスであってよい。
【００３４】
本発明による食品産物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、消費者に微生物約１０６〜約１０１３個の日用量をもたらす量または濃度で含むことが好ましい。日用量は、微生物２．８＊１０１２個、好ましくは微生物２．３＊１０１２個を超えないこと、および／または微生物少なくとも１０８個、好ましくは少なくとも微生物１０９個であることが好ましい。具体的には、日用量は、微生物約１０１０〜約１０１２個の範囲内である。食品産物は、それぞれが上記のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物の日用量を含む単回単位用量の形態であることが好ましい。
【００３５】
本発明による食品産物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で含有してよい。前記微生物は、非病原性形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で使用することが好ましい。
【００３６】
第２の態様では、本発明は、食品原材料を、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物が添加されることを特徴とする発酵用スターター培養物と組み合わせる、発酵食品を生成するための方法を対象とする。
【００３７】
本発明による「発酵食品」とは、具体的には、微生物の作用によって生成または保存された食品を指す。具体的には、細菌の使用を伴う発酵プロセスが含まれる。本発明による方法によって生成することができる産物の非限定的な例示的な一覧としては、発酵乳産物、例えば、酸ホエイ、凝乳／酸乳、ゼラチン、クリームチーズ、ソフトチーズ、カットチーズ、ハードチーズ、プロセスチーズ、クワルク、凝乳由来のチーズ、加熱チーズ、ケフィア、イメール、アブラン（ａｖｒａｎ）、糖蜜、ヨーグルト、フルーツヨーグルト、スイートホエイ、ホエイバター、フレッシュチーズ、モッツアレッラ、フェタチーズ、粉末ホエイ、サワークリーム、生クリーム、マスカルポーネ、スメタナ、サワークリーム、発酵バター、バター、バターオイル、半脂肪バター（ｓｅｍｉ−ｆａｔ  ｂｕｔｔｅｒ）、弱発酵バター（ｍｉｌｄｌｙ  ｓｏｕｒｅｄ  ｂｕｔｔｅｒ）、生ソーセージ、例えば、サラミまたは塩漬け肉（ｓａｌｔｙ  ｍｅａｔ）など、カカオ、コーヒー、サワードウおよび発酵野菜（ｓｏｕｒｅｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）、例えば、ザワークラウトなどが挙げられる。食品原材料は、生成しようとする発酵食品産物に応じて選択される。
【００３８】
発酵食品を生成するための本発明による方法では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、単独で、または発酵に適した別の微生物と組み合わせて、スターター培養物として使用することができる。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、発酵中に食品原材料に、または発酵後に発酵食品に添加することができる。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物をスターター培養物として使用しない場合には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で添加することが好ましい。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を生育可能な形態で添加する場合には、これらが最終的な発酵食品において繁殖することができないようにすることができる。これは、例えば、微生物に照射することまたは加熱によって実現することができる。微生物を死滅させることが好ましい。
【００３９】
発酵食品を生成するための本発明による方法は、以下の方法のステップ：
−食品原材料に、必要に応じてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を含有するスターター培養物を接種するステップ；
−少なくとも１つの糖、好ましくはグルコースを添加するステップ；および
−発酵用スターター培養物を含有する食品原材料を、好ましくは嫌気条件下でインキュベートするステップ
の少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００４０】
発酵食品を生成するための本発明による方法では、上記のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を添加することが好ましい。さらに、生成された発酵食品は、本出願による食品産物に関して上に記載されている特徴のうちの１つまたは複数を有することが好ましい。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物およびそれを含む食品産物の上記の開示、特徴および複数の実施形態を参照されたい。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物は、原材料１ミリリットル当たり少なくとも細胞１０６個の量で、好ましくは原材料１ミリリットル当たり細胞約１０９〜約１０１０個の量で、より好ましくは原材料１ミリリットル当たり約１＊１０９〜約７＊１０９個の細胞の量で添加することが好ましい。
【００４１】
さらに、本発明は、発酵食品を生成するための本発明による方法によって得ることができる発酵食品を提供する。
【００４２】
第３の態様では、本発明は、ＤＳＭ２３９６４として寄託された菌株ＣＴＣ１の微生物、それに由来する微生物またはＣＴＣ１ホモログを提供する。菌株ＣＴＣ１の微生物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物に関して上に記載されている特徴のうちの１つまたは複数を有することが好ましい。
【００４３】
具体的には、本発明による微生物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物である。好ましい実施形態では、本発明による微生物は、ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ１８８３６またはＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示す。さらに、本発明による微生物は、ＤＳＭ１８８３６またはＤＳＭ２３９６４として寄託されたＣＴＣ１に対して少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％または少なくとも９９．５％、より好ましくは１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すことが好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明による微生物は、以下の特性：
ｉ）ＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓと同様に、デンプンを分解することができないこと；
ｉｉ）マンニトール、特にＤ−マンニトール、メレジトースおよび／もしくはソルビトール、特にＤ−ソルビトールを使用および／もしくは代謝する能力、ならびに／またはグリセロールから酸を産生する能力を有すること；
ｉｉｉ）グルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼ活性を発現すること；
ｉｖ）インドールを産生することができないこと；
ｖ）カタラーゼ活性を示さないこと
の１つまたは複数を有する。
【００４５】
さらに、本発明による微生物は、非胞子形成性であり、非運動性であるグラム陰性、嫌気性微生物であることが好ましい。本発明による微生物は、具体的には上記の通り、短鎖脂肪酸を産生することができ、かつ／または、具体的には上記の通り、摂取された後に、ヒトの胃内および必要に応じて腸内の条件で生存することができることが好ましい。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明による微生物は、以下の安全特性：
（ｉ）抗生物質であるメトロニダゾール、メロペネムおよび／またはクリンダマイシンに対して感受性であること；
（ｉｉ）プラスミドＲＰ４（ＤＳＭ３８７６）および／またはプラスミドｐＳＣ１０１（ＤＳＭ６２０２）を含有しないこと；
（ｉｉｉ）β−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡおよび／またはｃｆｘＡを含有しないこと；
（ｉｖ）ビルレンス因子であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの多糖Ａおよび／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのエンテロトキシンＢｆｔおよび／またはｏｍｐＷ遺伝子によりコードされる「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」を含有しないこと；
（ｖ）細胞外デオキシリボヌクレアーゼ活性、細胞外コンドロイチナーゼ活性、細胞外ヒアルロニダーゼ活性および／または細胞外ノイラミニダーゼ活性のいずれも示さない；ならびに
（ｖｉ）ヒト結腸の上皮細胞に付着しないこと
の１つまたは複数を有する。
【００４７】
本発明による微生物は、具体的には、その天然の環境に存在していないことが好ましい単離された微生物である。具体的には、微生物はヒトの体内に存在しておらず、ヒトまたは動物の体内に存在していないことが好ましい。一実施形態によると、本発明による微生物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種に属さない微生物を含む組成物から単離されたものである。一実施形態によると、本発明による微生物は、本発明による微生物の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％、最も好ましくは約１００％を含む培養物中に存在するまたはそれから得られる。
【００４８】
さらに、本発明は、本発明による微生物を含む組成物を提供する。本発明による微生物の特性に関しては、上記の開示を参照されたい。組成物中の微生物の８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、および最も好ましくは約１００％が本発明による微生物であることが好ましい。一実施形態によると、組成物中の微生物は、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で存在する。一実施形態によると、前記組成物は細胞培養物である。
【００４９】
組成物は、少なくとも１０３個の本発明による微生物、より好ましくは少なくとも１０４個、少なくとも１０５個または少なくとも１０６個の本発明による微生物を含むことが好ましい。
【００５０】
第４の態様では、本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物を、少なくとも１つの食品原材料を含む組成物または加工された食品材料に添加するステップを含む、食品産物、特に本発明の第１の態様による食品産物を生成するための方法を提供する。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物の、食品産物を生成するための、特に発酵用のスターター培養物としての使用が提供される。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物の特性に関しては、上記の開示を参照されたい。
【００５１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、本明細書で使用される場合、その文字通りの意味に加えて、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という表現も包含し、明確にそれを指す。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、明確に列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」主題が、別の要素を含まない実施形態、ならびに明確に列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」主題が、別の要素を包含する可能性がある、および／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、「有する（ｈａｖｅ）」という表現は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現と、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という表現も包含し、明確にそれを指すと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本発明による微生物ＣＴＣ１および種々の参照微生物の制限分析を示す図である。結果により、ＣＴＣ１がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種であることが支持される。
【図２】図２は、プラスミドおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡ、ｃｆｘＡおよびｃｅｐＡの決定を示す図である。（Ａ）プラスミド：単離されたプラスミドＤＮＡそれぞれ２０μｇをローディングした。レーン：１、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ３８７６；３、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ６２０２；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４。（Ｂ）ｃｆｉＡ遺伝子：レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＴＡＬ３６３６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；４、陰性対照。（Ｃ）ｃｆｘＡ遺伝子：レーン：１および６、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＭＮ７；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＭＮ２３；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；５、陰性対照。（Ｄ）ｃｅｐＡ遺伝子：レーン：１および６、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＭＮ２３；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；レーン５、陰性対照。
【図３】図３は、ビルレンスコード遺伝子であるｂｆｔ、ｗｃｆＲ、ｗｃｆＳ、およびｏｍｐＷの決定を示す図である。（Ａ）ｂｆｔ遺伝子：レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８；４、陰性対照。（Ｂ）ｗｃｆＲ遺伝子：レーン：１、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ２１５１；５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＴＡＬ３６３６；７、陰性対照。（Ｃ）ｗｃｆＳ遺伝子：レーン：レーン：１、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ２１５１；５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＴＡＬ３６３６；７、陰性対照。（Ｄ）ｏｍｐＷ遺伝子：レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＤＳＭ１９０２４；４、陰性対照。
【図４】図４は、菌株ＤＳＭ２３９６４とＣａｃｏ−２細胞の結合の分子分析を示す図である。（Ａ）ＧＡＰＤＨおよびスクロースイソマルターゼ。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）；２、１日目；３、３日目；４、６日目；５、８日目；６、１０日目；７、１３日目；８、１４日目、９、陰性対照。（Ｂ）菌株ＤＳＭ２３９６４およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６の検出。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、１回目の洗浄ステップ後の菌株ＤＳＭ２３９６４；３、６回目の洗浄ステップ後の菌株ＤＳＭ２３９６４；４、菌株ＤＳＭ２３９６４＋Ｃａｃｏ−２細胞；５、１回目の洗浄ステップ後のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；６、６回目の洗浄ステップ後のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６＋Ｃａｃｏ−２細胞；８、Ｃａｃｏ−２細胞；９、菌株ＤＳＭ２３９６４；１０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；１１、陰性対照。（Ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの検出。レーン：１、１回目の洗浄ステップ後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６；２、６回目の洗浄ステップ後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６；３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６＋Ｃａｃｏ−２細胞；４、Ｃａｃｏ−２細胞；５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６；６、陰性対照；７、１００ｂｐのＤＮＡラダー。
【図５−１】図５は、９０日間の経口毒性試験中のマウスの体重および摂食量を示すグラフである。（Ａ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｂ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｃ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。（Ｄ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。群当たりの平均値：１日当たり動物当たり、群１（０）、群２（１×１０６）、群３（１×１０７）、群４（１×１０８）のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４のＣＦＵ、および群５（１×１０１１）の低温殺菌したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４。統計的有意性はＰ≦０．０１によって示された。値はダネット検定によった。
【図５−２】図５は、９０日間の経口毒性試験中のマウスの体重および摂食量を示すグラフである。（Ａ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｂ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｃ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。（Ｄ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。群当たりの平均値：１日当たり動物当たり、群１（０）、群２（１×１０６）、群３（１×１０７）、群４（１×１０８）のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４のＣＦＵ、および群５（１×１０１１）の低温殺菌したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４。統計的有意性はＰ≦０．０１によって示された。値はダネット検定によった。
【図６】図６は、マルチプレックス種特異的ＰＣＲによる、注射溶液中のコンタミネーションの検出を示す図である。レーン：１、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４）；２、溶液２（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、１×１０９個）；３、溶液３（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４、１×１０９個）；４、溶液４（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、１．５×１０８個）；５、溶液５（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４、１．５×１０８個）；６、溶液６（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、５×１０６個）；７、溶液７（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４、５×１０６個）、８、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１）；９、溶液１（対照群）。コンタミネーション対照：レーン１０、９０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１と１０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４の混合物；レーン１１、１０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１と９０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４の混合物。レーン１２、１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【図７】図７は、穿刺した膿瘍から単離したＤＮＡの種特異的ＰＣＲを示す図である。（Ａ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４を注射した動物の膿瘍におけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの検出。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；２〜３、群３（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４、４．６×１０９個）；４〜５、群５（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４、６．９×１０８個）；６〜７、群７（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４、２．３×１０７個）；８、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４）；９、陰性対照（水）。（Ｂ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１を注射した動物の膿瘍におけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの検出。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；２〜３、群２（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、４．６×１０９個）；４〜５、群４（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、６．９×１０８個）；６〜７、群６（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、２．３×１０７個）、８、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１）；９、陰性対照（水）；１０、１ｋｂのＤＮＡラダー（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
本発明による微生物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の別個の菌株である
【００５４】
１．１  分類学的分析１：１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性
【００５５】
菌株ＣＴＣ１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（４８０塩基）を、ユニバーサルプライマーである２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１））および５１９ｒ（５’−ＧＷＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ−３’（配列番号２））を使用したＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用することによって精製し、ＤＮＡ濃度および産物のサイズを、Ｌｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を使用することによって推定した。ＰＣＲ産物について、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００キャピラリーシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の仕様に従って使用して配列決定した。ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年）およびｍｅｇａＢＬＡＳＴプログラム（Ｚｈａｎｇら、２０００年）によって、有効に（ｖａｌｉｄｌｙ）公開された原核生物の名称を伴う標準菌株のデータベース（Chunら、２００７年）に対して系統発生の近隣（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）の同定を最初に行った。次いで、ＥｚＴａｘｏｎサーバー（http://www.eztaxon.org/;Chunら、２００７年）で実行するグローバルアラインメントアルゴリズムを使用してペアワイズ配列類似性を算出するために、最高スコアの５０配列を選択した。得られた複数の配列アラインメントを、プログラムＭＥＧＡバージョン５（Tamura、２００７年）を使用することによって手動で補正して、アラインメントギャップおよび不明確な塩基を取り除き、プログラムＭＥＧＡバージョン５（Tamura、２００７年）を用い、近隣結合法（Saitou  &  Nei、１９８７年）に従って系統樹を構築した。
【００５６】
菌株ＣＴＣ１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列解析により、この菌株がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６（１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性１００％）と共に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＡＴＣＣ８４８３（９７．５％）と共に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＡＴＣＣ２９１４８（９４．２％）と共に、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５（９２．２％）と共にクラスターを形成することが示された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の相違（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）において類似性値が≧９７％であることが種を正確に説明するために有意であることが一般に認識されている（Stackebrandt  &  Goebel、１９９４年）。しかし、Stackebrandt  &  Ebers（２００６年）は、この値は、「種」の説明の質および精度を犠牲にすることなく９８．７〜９９％まで増加させることが可能であること、かつこの値が分類学者の助けとなり得ると推奨した。
【００５７】
１．２  分類学的分析２：全ゲノムのＤＮＡ間ハイブリダイゼーション
ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションは、分類学におけるゴールドスタンダードであると考えられている。ＣＴＣ１菌株の全ゲノムを、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５の全ゲノムとのハイブリダイゼーションにかけた（これらの分析は、ＤＭＳＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）において、ＤＭＳＺによって実行された。簡単に述べると、比較しようとする各菌株のバイオマテリアル３ｇをＤＮＡ調製のために使用した。単離されたＤＮＡの純度を分析し、ＤＮＡを、フレンチプレスを使用してせん断し、高温で変性させた（１００℃、１０分）。ＤＮＡは、２００ｋＤａから６００ｋＤａの間のサイズを有し、主要な画分が約４５０＋／−１００ｋＤａである断片にせん断することが好ましい。各菌株のＤＮＡならびに両方の菌株のＤＮＡの等濃度の混合物（試料中の最終的なＤＮＡ濃度は基本的に同一であり、好ましくは約２０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの間、特に約３０μｇ／ｍｌである）の復元を、２６０ｎｍにおける吸光度を用いて分光光度的に測定した。溶液をＤＮＡの融解温度を下回る温度２５℃まで直ちに冷却することによって復元を開始し、測定を３０分にわたって実施した。ＤＮＡ関連性を、単一の細菌株および両方の菌株のＤＮＡの混合物のそれぞれのＤＮＡの復元曲線の種々の傾きから算出した。具体的には、復元速度ｖ’を１分当たりの吸光度の減少（ΔＡ／ｔ）として決定し、結合の程度（Ｄ）、すなわちＤＮＡ関連性をＤｅ  Ｌｅｙら（上記を参照されたい）によって示された式に従って算出した：
【数１】
2014524260.tif 000002
式中、Ｄは結合の程度（％）であり、ｖ’ｍは混合物の復元速度であり、ｖ’Ａは第１の菌株のＤＮＡの復元速度であり、ｖ’Ｂは第２の菌株のＤＮＡの復元速度である。
【００５８】
全ゲノムのハイブリダイゼーションの結果が表１に示されている：
【００５９】
【表１】
2014524260.tif 000003
【００６０】
１．３  分類学的分析３：微生物学的な特徴付けおよび生化学的な特徴付け
【００６１】
菌株ＤＳＭ２３９６４は、絶対嫌気性、非胞子形成性、非運動性かつグラム陰性であると同定することができた。短桿状細胞または桿状細胞は幅０．４〜０．５μｍであり、長さは一般に１〜２μｍの範囲で様々であった。１８時間後にＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ寒天（Ｏｘｏｉｄ）で成長したコロニーは直径２〜３ｍｍであり、環状の乳白色の隆起した凸状の表面を有した。最初の生化学的分析により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ種（Ｄａｔａｂａｎｋ  ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に対して９１％の類似性が示された。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓとは対照的に、菌株ＤＳＭ２３９６４はデンプンを利用することや、インドールを産生することができず、また、カタラーゼ活性を示さなかった。単離された細菌およびそれらの構成的な酵素および基質利用プロファイルの生化学的同定を、迅速ＩＤ３２ＡおよびＡＰＩ２０Ａ生化学キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の指示に従って使用することによって実施した。菌株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６の化学分類学的分析の結果が表２に要約されている。菌株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６はどちらも同一の生化学プロファイルを有した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１は、グリセロール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールおよびＤ−メレジトースの利用により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６とは区別し得た。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６についての結果とは対照的に、グルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼ活性を示した。他の部分では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６はロイシンアリールアミダーゼ活性を発現することができたが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１はそれができなかった。したがって、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６とは区別し得た（表２）。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６についての結果とは対照的に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９は酵素活性についての試験において多数の陽性の結果を示した。
【００６２】
【表２】
2014524260.tif 000004
【００６３】
菌株：１：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１；２：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６；３：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５；４：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６；５：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９；６：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６。特性は、「＋」：陽性反応；「−」：陰性反応としてスコア化されている。
【００６４】
１．４  無作為に増幅された多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）パターンおよび遺伝子型解析
【００６５】
ＣＴＣ１がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種と別個の菌株であるかどうかを試験するために、ＲＡＰＤアッセイを実施した。鋳型ＤＮＡを増幅するために、４つの異なるランダムプライマーを別々の反応に使用した（各反応ではただ１つのプライマーを使用した）。ＰＣＲ反応混合物（５０μｌ）は、Ｔａｑ緩衝液（１６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭのトリスＨＣｌ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＭのプライマー、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび２μｌの鋳型ＤＮＡを含有した。ＰＣＲプログラムは、９５℃で５分、９５℃で１分を３５サイクル、５０℃で１分および７２℃で１分、最後に７２℃で６分であった。全てのプライマーについてのバンドパターンを１％アガロースゲルで分析した。したがって、各鋳型ＤＮＡについて、４つの異なるバンドパターン（各プライマーについて１つ）を得た。
【００６６】
ＣＴＣ１をＲＡＰＤ分析に供し、結果を参照細菌であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種（ＤＳＭ１８８３６）、Ｂａｃｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ種（ＤＳＭ１７５６５）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ種（ＤＳＭ１８９６）の結果と比較した（１つの例示的なプライマーについては図１を参照されたい）。結果は、ＣＴＣ１が、公知のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株ＤＳＭ１８８３６と同一ではない別個の菌株であることを実証している。
【００６７】
１．５  要約
【００６８】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性、全ゲノムのＤＮＡ間ハイブリダイゼーションおよび生化学的特徴付けの結果により、単離された微生物ＣＴＣ１がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のものであることが実証された。さらに、ＲＡＰＤ分析により、ＣＴＣ１が、公知のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株とは異なる特異的かつ別個のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株であることが示された。
【００６９】
（実施例２）
刺激された胃液および腸液の影響
【００７０】
胃腸管の通過を模倣するために、ＣＴＣ１細菌に、模擬の胃液および腸液の作用を受けさせた。ＣＴＣ１菌株の生存率は胃液中では１８０分後に９０％超であり、腸液に２４０分間曝露させた後には９６％超であった。
【００７１】
（実施例３）
ビルレンス因子の分析
【００７２】
３．１  ＣＴＣ１の抗生物質抵抗性
【００７３】
いくつかの抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の分析により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１菌株は、ペニシリンＧ、アンピシリンおよびメズロシリン（meziocillin）のようなβ−ラクタム系薬物に対して抵抗性であることが明らかになった。しかし、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１菌株はメトロニダゾール、メロペネムおよびクリンダマイシンのような通常の抗生剤に対しては感受性であり、また、β−ラクタマーゼ阻害剤を添加することによりβ−ラクタム系薬物に対する感受性が回復した。
【００７４】
３．２  ＣＴＣ１におけるプラスミドの検出
【００７５】
ＣＴＣ１菌株におけるプラスミドの潜在的な存在を調査するために、ＣＴＣ１から、ならびに対照菌株、それぞれ低コピープラスミドＲＰ４（６０ｋｂ）およびｐＳＣ１０１（９．４ｋｂ）を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ３８７６、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ６２０２の両方からプラスミドＤＮＡ材料を単離した。２６０ｎｍにおけるプラスミドＤＮＡ濃度の測定により、ＣＴＣ１のプラスミド調製物中にＤＮＡが存在しないことが明らかになった。プラスミド調製物をアガロースゲルで泳動することにより、対照菌株由来の低コピープラスミドの両方が単離されたこと、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１由来の検出可能なプラスミド材料が存在しないことが確認された（図２Ａ）。
【００７６】
３．３  ＣＴＣ１のゲノムにおけるβ−ラクタマーゼ遺伝子ｃｆｘＡ、ｃｅｐＡおよびｃｆｉＡの同定
【００７７】
ＣＴＣ１菌株のβ−ラクタマーゼ活性を特徴付けるために、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に関して公知のβ−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡ、ｃｆｘＡ、およびｃｅｐＡのそれぞれに対して特異的なＰＣＲアッセイを実行した。結果は、菌株ＣＴＣ１が排他的にｃｅｐＡ遺伝子を含有することを示す（図２Ｂ〜Ｄ）。
【００７８】
３．４  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属におけるビルレンス因子をコードする遺伝子
【００７９】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ多糖Ａ（ＰＳ  Ａ）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓエンテロトキシンＢｆｔはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の最も重要なビルレンス因子である。エンテロトキシンＢｆｔの存在について調査するために、ｂｆｔ遺伝子に対して特異的なＰＣＲを実施した。ＰＳ  Ａの場合、ＰＳ  Ａの生合成遺伝子の上流に位置する高度に保存されたオープンリーディングフレームであるｕｐａＹ、ｕｐａＺに対して、ならびに、最も重要な遺伝子である、アミノトランスフェラーゼをコードするｗｃｆＲおよびグリコシルトランスフェラーゼをコードするｗｃｆＳに対して特異的なＰＣＲを設計した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８とは対照的に、ＣＴＣ１菌株はｂｆｔ遺伝子を保有しない。遺伝子ｗｃｆＲ、ｗｃｆＳおよびオープンリーディングフレームであるｕｐａＹとｕｐａＺの両方も検出することができなかった（図３Ａ〜Ｃ）。
【００８０】
さらに、ＩＢＤの発生に関与する可能性があるビルレンス因子である「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」をコードする遺伝子ｏｍｐＷの存在について分析した。ＣＴＣ１菌株ではｏｍｐＷコード遺伝子を検出することはできなかった（図３Ｄ）。
【００８１】
３．５  ＣＴＣ１の細胞外酵素および病原性因子の決定
【００８２】
ノイラミニダーゼに加えて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属のいくつかの菌株が、感染プロセスに関与し得るコラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼおよびいくつかのプロテアーゼを含めた望ましくない細胞外酵素を産生することが記載された。最も関連の深い細胞外酵素活性を、ＰＣＲ（ノイラミニダーゼ）または酵素アッセイによって分析した。ＣＴＣ１菌株は、デオキシリボヌクレアーゼ活性、コンドロイチナーゼ活性、ヒアルロニダーゼ活性、およびノイラミニダーゼ活性を示さず、弱いβ−溶血活性およびコラゲナーゼ活性のみを示す。
【００８３】
３．６  Ｃａｃｏ−２細胞へのＣＴＣ１の接着
【００８４】
Ｃａｃｏ−２細胞を培養し、分化を誘導した。結果は、ＧＡＰＤＨの発現レベルは分化の間一定であったが、スクラーゼイソマルターゼのレベルは分化の間に増加したことを実証している。顕微鏡観察により、Ｃａｃｏ−２細胞が１４日後に単層としてよく分化したことが確認された。嫌気条件下で３時間共にインキュベーションした後の、細菌と分化したＣａｃｏ−２細胞の結合を、連続的な洗浄ステップの上清に対して、および最終的にはこすり取ったＣａｃｏ−２細胞に対して実施した種特異的なＰＣＲによって分析した。陽性対照とは対照的に、第１の洗浄ステップの上清において当然検出することができたＣＴＣ１細胞は、その後の上清でもこすり取ったＣａｃｏ−２細胞でも検出することができなかった。これは、ＣＴＣ１細胞がヒト結腸の上皮細胞に付着しないことを示している（図４）。
【００８５】
（実施例４）
毒物学的試験
【００８６】
４．１  生存能力アッセイ
【００８７】
凍結乾燥および再水化後のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣＴＣ１（ＤＳＭ２３９６４）の生存能力をいくつかの独立した実験で分析した。最低の同定生存率により、４×１０９ＣＦＵ／ｇの生育可能な細菌の最小濃度が示された。この濃度は、「利用可能な濃度」として許容された。
【００８８】
４．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異原性試験（エイムス試験）
【００８９】
この試験は、ＣＴＣ１またはそれらの発酵生成物の任意の毒性または変異原性の影響を検出するために実施した。プレート当たり細菌０．２８ｍｇから２８．５ｍｇの範囲の生育可能な細菌の５つの用量またはプレート当たり低温殺菌した細菌５９ｍｇの１つの用量を、それぞれ代謝活性化あり、およびなしで行った２つの独立した実験において使用した。代謝活性化ありおよびなしの５つの試験菌株のいずれの濃度についても、また、それぞれプレート組み込み（ｐｌａｔｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびプレインキュベーション様式のどちらの試験形式においても、対照のカウントと比較して細胞傷害性の徴候も復帰変異体コロニー数の増加も観察されなかった。
【００９０】
４．３  染色体異常誘発活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ染色体異常アッセイ）
【００９１】
試験に使用したＣＴＣ１の最高濃度は、最大の妥当な濃度であると考えられる培養培地１ｍｌ当たり生育可能な細菌２．８ｍｇおよび培養培地１ｍｌ当たり低温殺菌した細菌５．９ｍｇであった。代謝活性化の不在下では、陰性対照において観察された染色体異常の平均発生率（ギャップを除いて）は４時間曝露させた後、および２４時間曝露させた後に、それぞれ１．０％または０．５％であった。生育可能なＣＴＣ１および低温殺菌したＣＴＣ１のいずれの濃度でも、４時間曝露させた後、および２４時間曝露させた後に異常な細胞のいかなる統計的に有意な増加も生じなかった（０．５％〜２．５％）。対照的に、陽性対照は、４時間曝露させた後、および２４時間曝露させた後に、それぞれ１０．５％および１７．５％の異常な細胞の増加を示した。代謝活性化の存在下では、陰性対照において観察された染色体異常の平均発生率（ギャップを除いて）は、４時間曝露させた後に０．５％であった。さらに、生育可能なＣＴＣ１および低温殺菌したＣＴＣ１のいずれの濃度でも、異常な細胞のいかなる統計的に有意な増加も生じず、２つの独立した実験において、それぞれ０．０％および１．５％であった。陽性対照は、４時間後に、２つの実験においてそれぞれ１３．５％および１６．５％の異常な細胞を示した。代謝活性化ありまたはなしでの実験において、試験したＣＴＣ１濃度の全てについて、品目関連の倍数性や核内倍加は認められなかった。さらに、以前の結果を確認して、代謝活性化ありまたはなしでの実験において、試験したＣＴＣ１の濃度のいずれにおいても細胞傷害性の徴候は認められなかった。
【００９２】
４．４  マウスにおける９０日経口毒性試験
【００９３】
この試験の目的は、ＣＴＣ１を経口摂取することに何らかの毒物学的影響があるかどうかを決定することであった。Ｃｒｌ：ＮＭＲＩマウス（雄５０匹、雌５０匹）を５つの試験群（群当たり雄１０匹、雌１０匹）に割り当て、日用量の細菌を胃管栄養法によって９０日間にわたって経口投与した。１日当たり動物当たり１×１０６〜１×１０８ＣＦＵまたは１×１０１１個の低温殺菌したＣＴＣ１の作用を試験した。結果が図５に示されている。９０日の試験の間、対照群の場合と同様に、生育可能なＣＴＣ１または低温殺菌したＣＴＣ１で処置した群のいずれにおいても死亡は認められなかった。処置したマウスおよび処置していないマウスはいずれも、その挙動または外観にいかなる変化も示さなかった。さらに、機能的な観察では、いかなる試験品目に関連する影響も示されず、運動性、糞便の硬さ、および水分消費量ならびに体重増加および摂食量に、実験期間全体を通して処置群と対照群との間で有意差は示されなかった。血液学的検査では、いずれの試験用量レベルの生育可能なＣＴＣ１および低温殺菌したＣＴＣ１でも、試験品目に関連する影響は示されず、対照群と処置したマウスの群との間に統計的有意差は観察されなかった。臨床的な生化学的値および眼科学的検査により、生育可能なＣＴＣ１および低温殺菌したＣＴＣ１の両方について、いずれの群、いずれの用量レベルにおいても試験品目に関連する変化がないことが明らかになった。さらに、肉眼での死後分析により、試験品目に関連する病変や異常がないことが明らかになった。最後に、全ての臓器の広範囲にわたる詳細な病理組織学的分析により、処置群と対照群との間に差異がないことが明らかになった。
【００９４】
４．５  ＣＴＣ１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける病原性（膿瘍形成）
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腹腔内膿瘍形成モデルは、日和見細菌株の病理的性質を調査するために広く受け入れられているモデルである（McConvilleら、１９８１年；Onderdonkら、１９８４年；Thadepalliら、２００１年）。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６９７１またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２３９６４（ＣＴＣ１）の新鮮な一晩細菌培養物を使用した。体重１ｋｇ当たり２．３×１０７〜４．６×１０９ＣＦＵ、５０％（ｗ／ｗ）のオートクレーブしたラット糞便、および１０％（ｗ／ｖ）の硫酸バリウムを含有する混合物をマウスの腹腔内に注射した。注射した後、各品目の生存能力、細菌の濃度および純度を、残りの材料において遡及的に決定した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよび／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの存在を同定するために、Liuら（２００３年）により記載されているマルチプレックス種特異的ＰＣＲを確立した。このマルチプレックスＰＣＲにより、一方の種が非常に低い比率を占めるコンタミネーションの状況にある種の両方を同定することも可能になった。本発明者らは、単一の試験品目のそれぞれが、求められる細菌株を含有し、他の種が混入していないことを確認した（図６参照）。それぞれの試験品目を適切な寒天上にプレーティングし、それを好気性条件下でインキュベートすることにより、さらなる潜在的なコンタミネーションを分析した。４８時間インキュベートした後にいかなる単一のコロニーも検出することはできなかった。２つの別々の実験において、高用量のＣＴＣ１を注射したマウスでは、陰性対照（硫酸バリウム＋滅菌ラット糞便）よりも多くのまたはより大きな膿瘍の発生は誘導されなかった。対照的に、高濃度のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６９７１では、より多くの、より大きな膿瘍の形成が誘導された。７日後に、滅菌条件下で動物当たり２つの膿瘍を取得し、内容物を穿刺し、ＤＮＡ抽出に供した。本発明者らは、種特異的なＰＣＲによって、膿瘍におけるＣＴＣ１またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１の存在を評価した（図７）。それぞれ体重１ｋｇ当たり２．３×１０７〜４．６×１０９個のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓを注射した群２、群４および群６から単離した全ての膿瘍においてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６９７１を検出することができた。対照的に、注射した細菌の濃度とは関係なく、分析した膿瘍のいずれにおいてもＣＴＣ１を検出することはできなかった。ＣＴＣ１を注射したマウスについてのこれらの結果により、この菌株が膿瘍の形成を誘導しないこと、およびこの菌株が実際にはｉ．ｐ．注射後に免疫系によって直ちに完全に根絶されることが明白に示された。
【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図２（Ｄ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図３（Ｄ）】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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