(57)【要約】  【課題】  脊椎動物被験体におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の処置または予防のための組成物および方法が提供される。  【解決手段】  前記方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を減少させるかもしくは排除するかもしくはその再発を予防するのに有効な量で組成物を前記脊椎動物被験体に投与することを提供し、かつ／または前記タンパク質に対する免疫応答を誘導する。脊椎動物におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の処置または予防のための方法も提供される。  【選択図】      図１５
2014515594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体またはそのフラグメントを含む組成物であって、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群から選択される組成物。
【請求項２】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体またはそのフラグメントを含む組成物であって、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項３】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成るから選択される単離された抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体またはそのフラグメントであって、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を含む抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントはポリクローナル抗体である抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントはモノクローナル抗体である抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントはヒト抗体である抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントは、（ａ）免疫グロブリン分子全体；（ｂ）ｓｃＦｖ；（ｃ）キメラ抗体；（ｄ）Ｆａｂフラグメント；（ｅ）Ｆ（ａｂ’）２；および（ｆ）ジスルフィド連結されたＦｖから成る群から選択されるものである抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、（ａ）ヒトＩｇＭ定常ドメイン；（ｂ）ヒトＩｇＧ１定常ドメイン；（ｃ）ヒトＩｇＧ２定常ドメイン；（ｄ）ヒトＩｇＧ３定常ドメイン；（ｅ）ヒトＩｇＧ４定常ドメイン；および（ｆ）ヒトＩｇＡ１／２定常ドメインから成る群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含むものである抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、（ａ）ヒトＩｇカッパー定常ドメイン；および（ｂ）ヒトＩｇラムダ定常ドメインから成る群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含むものである抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントは少なくとも１×１０９Ｍの親和性定数（Ｋａｆｆ）で抗原に結合するものである抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントは少なくとも１×１０１０Ｍの親和性定数（Ｋａｆｆ）で抗原に結合するものである抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜２のいずれか一項記載の組成物において、さらに、
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ、毒素Ｂに結合する抗体、ならびに毒素Ａおよび毒素Ｂに結合する抗体の組み合わせから成る群から選択されるメンバーを含むものである組成物。
【請求項１４】
請求項１〜２のいずれか一項記載の組成物において、さらに、
抗生物質を含むものである組成物。
【請求項１５】
請求項１４記載の組成物において、前記抗生物質はメトロニダゾールまたはバンコマイシンである組成物。
【請求項１６】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患の処置方法であって、それを必要とする被験体に、前記疾患を減少させるかまたは予防するのに有効な量の請求項１〜２のいずれか一項記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患の処置方法であって、それを必要とする被験体に、前記疾患を減少させるかまたは予防するのに有効な量の請求項３〜４のいずれか一項記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患の処置方法であって、それを必要とする被験体に、前記疾患を減少させるかまたは予防するのに有効な量の請求項１３記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の方法において、前記組成物は静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または経口的に投与されるものである方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法において、前記組成物は静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、または筋肉内（ＩＭ）、または経口的に投与されるものである方法。
【請求項２１】
請求項１８記載の方法において、前記組成物は静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、または筋肉内（ＩＭ）、または経口的に投与されるものである方法。
【請求項２２】
請求項１６記載の方法において、前記組成物は前記被験体の体重の１キログラムあたり１〜１００ミリグラムの範囲内の量で投与されるものである方法。
【請求項２３】
請求項１７記載の方法において、前記組成物は前記被験体の体重の１キログラムあたり１〜１００ミリグラムの範囲内の量で投与されるものである方法。
【請求項２４】
請求項１８記載の方法において、前記組成物は前記被験体の体重の１キログラムあたり１〜１００ミリグラムの範囲内の量で投与されるものである方法。
【請求項２５】
受動免疫の方法であって、有効量の請求項１〜２のいずれか一項記載の組成物を動物に投与する工程を含む方法。
【請求項２６】
受動免疫の方法であって、有効量の請求項３〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントを動物に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
被験体において免疫応答を誘導する方法であって、ある量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアント、および薬学的に許容可能なアジュバントを、前記被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群から選択される方法。
【請求項２８】
被験体において免疫応答を誘導する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアント、および薬学的に許容可能なアジュバントを、前記被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を含む方法。
【請求項２９】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する必要のある被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法であって、ある量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアント、および薬学的に許容可能なアジュバントを、前記被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群から選択される方法。
【請求項３０】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する必要のある被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメント、および薬学的に許容可能なアジュバントを、前記被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を含む方法。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか一項記載の方法において、前記薬学的に許容可能なアジュバントはインターロイキン１２または熱ショックタンパク質である方法。
【請求項３２】
請求項２７〜３０のいずれか一項記載の方法において、前記投与は経口的、鼻腔内、静脈内、または筋肉内である方法。
【請求項３３】
請求項２７〜３０のいずれか一項記載の方法において、前記バリアントは変異体である方法。
【請求項３４】
請求項２７〜３０のいずれか一項記載の方法において、前記バリアントは融合タンパク質である方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法において、前記融合タンパク質はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列を含むものである方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列はＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、およびＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントから成る群から選択されるものである方法。
【請求項３７】
請求項３４記載の方法において、前記融合タンパク質は、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤならびにそれらのフラグメントから成る群のメンバー、または配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、および配列ＩＤ番号１０ならびにそれらのフラグメントから成る群のメンバーと前記群の別のメンバーとの融合物である方法。
【請求項３８】
有効免疫量の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアント、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物であって、前記組成物は、被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する免疫応答を誘導するのに有効であり、前記単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群から選択されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物。
【請求項３９】
有効免疫量の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアント、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物であって、前記組成物は、被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する免疫応答を誘導するのに有効であり、前記単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３８または３９記載の組成物において、前記組成物は薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含むものである組成物。
【請求項４１】
請求項４０記載の組成物において、前記薬学的に許容可能なアジュバントは水中油型エマルションを含むものである組成物。
【請求項４２】
請求項４０記載の組成物において、前記薬学的に許容可能なアジュバントはＩＳＡ−２０６およびＱｕｉｌＡである組成物。
【請求項４３】
請求項４０記載の組成物において、前記薬学的に許容可能なアジュバントはインターロイキン１２または熱ショックタンパク質である組成物。
【請求項４４】
請求項３８または３９記載の方法において、前記バリアントは変異体である方法。
【請求項４５】
請求項３８または３９記載の方法において、前記バリアントは融合タンパク質である方法。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記融合タンパク質はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列を含むものである方法。
【請求項４７】
請求項４６記載の方法において、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列は、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、およびＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントから成る群から選択されるものである方法。
【請求項４８】
請求項４５記載の方法において、前記融合タンパク質は、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤならびにそれらのフラグメントから成る群のメンバー、または配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、および配列ＩＤ番号１０ならびにそれらのフラグメントから成る群のメンバーと前記群の別のメンバーとの融合物である方法。
【請求項４９】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する必要のある被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントをコードするある量の核酸、および薬学的に許容可能なアジュバントを、前記被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群から選択される方法。
【請求項５０】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する必要のある被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法であって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントをコードするある量の核酸、および薬学的に許容可能なアジュバントを、前記被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含み、前記核酸は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする方法。
【請求項５１】
請求項４９または５０記載の方法において、前記バリアントは変異体である方法。
【請求項５２】
請求項４９または５０記載の方法において、前記バリアントは融合タンパク質である方法。
【請求項５３】
請求項５２記載の方法において、前記融合タンパク質はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列を含むものである方法。
【請求項５４】
請求項５３記載の方法において、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列は、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、およびＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントから成る群から選択されるものである方法。
【請求項５５】
請求項５２記載の方法において、前記融合タンパク質は、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群のメンバー、または配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、および配列ＩＤ番号１０から成る群のメンバーと前記群の別のメンバーとの融合物である方法。
【請求項５６】
ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤから成る群から選択されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントをコードする単離された核酸。
【請求項５７】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはバリアントをコードする単離された核酸であって、前記核酸は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項５８】
請求項５６または５７記載の核酸において、前記バリアントは変異体である核酸。
【請求項５９】
請求項５６または５７記載の核酸において、前記バリアントは融合タンパク質である核酸。
【請求項６０】
請求項５９記載の核酸において、前記融合タンパク質は前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列を含むものである核酸。
【請求項６１】
請求項６０記載の核酸において、前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列は、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、およびＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントから成る群から選択されるものである核酸。
【請求項６２】
請求項５９記載の核酸において、前記融合タンパク質は、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｌｉＤならびにそれらのフラグメントから成る群のメンバー、または配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、および配列ＩＤ番号１０ならびにそれらのフラグメントから成る群のメンバーと前記群の別のメンバーとの融合物である核酸。
【請求項６３】
請求項５６または５７記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６４】
請求項６３記載の発現ベクターにおいて、前記発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである発現ベクター。
【請求項６５】
請求項６４記載の発現ベクターにおいて、前記哺乳動物発現ベクターはＣＭＶプロモーターを含むものである発現ベクター。
【請求項６６】
請求項６３記載の発現ベクターにおいて、前記発現ベクターはｐｃＤＮＡ３００２ＮｅｏまたはｐＥＴ３２ａである発現ベクター。
【請求項６７】
請求項６３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６８】
請求項６７記載の宿主細胞において、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＮＳＯ−１、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、またはＰＥＲ．Ｃ６である宿主細胞。
【請求項６９】
請求項６３記載の発現ベクターにおいて、前記発現ベクターは細菌発現ベクターである発現ベクター。
【請求項７０】
請求項６９記載の発現ベクターにおいて、前記発現ベクターはｐＥＴ３２ａである発現ベクター。
【請求項７１】
請求項６７記載の宿主細胞において、前記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである宿主細胞。
【請求項７２】
請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントにおいて、前記抗体またはそのフラグメントは芽胞発芽を阻害するかまたは遅延させるものである抗体またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陽性菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる脊椎動物被験体における感染の処置または予防のための組成物および方法に関する。感染を減少させるか、排除するか、またはその再発を予防するのに有効な量でタンパク質を前記脊椎動物被験体に投与するための方法が提供される。生物におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の処置または予防のための方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、ヒト集団の２〜５％に存在するヒトの腸の共生グラム陽性菌である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、休眠中であるがなおも感染性である芽胞および毒素を産生する代謝的に活性な栄養細胞（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）として存在する（ｅｘｉｓｉｔｉｎｇ）ことができる二相性の生活環を有する。腸に少数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが存在するのは無症候性である；しかしながら、特に高齢者では、細菌の異常増殖によって重篤かつ生命を危うくする疾患が生じ得る。抗生物質処置によって正常な腸管内菌叢が完全に除去されると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる異常増殖が生じ得る。したがって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、抗生物質関連下痢の主な原因であり、結腸の広汎性炎症である偽膜性大腸炎をもたらし得る。病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、いくつかの公知の毒素を産生する。そのような２つの毒素である腸毒素（ｅｎｔｒｏｔｏｘｉｎ）（毒素Ａ）および細胞毒（毒素Ｂ）が、感染患者に見られる下痢および炎症に関与する。
【０００３】
入院またはナーシングホームでの滞在は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対するリスクを高める。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ獲得の割合は、入院期間が２週間までの患者では１３％および入院期間が４週間より長い患者では５０％であると見積もられている。したがって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、ありふれた院内病原体であり、世界中の入院患者の罹患および死亡の主な原因である。この生物は、耐熱性の芽胞を形成するので、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、長期間にわたって病院またはナーシングホームの環境に残存できる。いったん芽胞を経口摂取してしまうと、それらは、その耐酸性のおかげで胃を通過して生き延びる。芽胞は、結腸に達して胆汁酸に曝露されると栄養細胞に成長し得る。
【０００４】
感染の初回エピソードに対して処置された患者の２５％においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の再発が起きるので、最初の処置の後の当該疾患の再発は、ありがちな問題である。このことは、前記生物が芽胞として、休眠中の抗生物質耐性（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）状態で残存できるという事実が主因である。
【０００５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を処置するための現行の治療は、前記生物の生活環の栄養相を標的にしている。これらの処置には、バンコマイシン（ｖａｎｏｍｙｃｉｎ）またはメトロニダゾールなどの抗生物質が含まれる。フルオロキノロン系抗生物質（例えば、シプロフロキサシンおよびレボフロキサシン）の使用は、困ったことに、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの新しい強毒性の抗生物質耐性株を出現させた。特に再発の予防のための他の処置は、非病原性生物（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）を用いて腸管内菌叢を回復させるプロバイオティクスの使用などの予防的アプローチを含む。代謝機能または重要な病原性因子に影響する変異を同定することによって、Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ系の生ワクチンが開発されている。Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５（１９９２）３２８−３４２．
現在までのワクチンの試みは、ＡおよびＢ毒素ならびに栄養細胞表面タンパク質（ＳＬＰＡｓ）、代謝的に活性な細菌によって産生されるすべてのタンパク質に焦点を合わせてきた。したがって、現在のすべての治療が、栄養期の細菌による一次感染には対処しているが、休眠中であるがなおも感染性である芽胞からの再発を標的にしていない。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのますます有毒になっていく薬剤耐性株によって引き起こされる感染症が出現する可能性に鑑みて、この生物の生活環の不応性芽胞期を標的にすることに基づいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患の発生およびその再発を処置または予防するための有効なワクチン組成物または抗体処置に対する満たされていないニーズが残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
脊椎動物被験体におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の処置または予防のための組成物および方法が本明細書中に記載される。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントに結合する抗体またはフラグメントを含む組成物を提供し、前記芽胞ポリペプチドまたはフラグメントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得る。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントに結合する抗体またはフラグメントを含む組成物を提供し、前記芽胞ポリペプチドまたはフラグメントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を有し得る。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントに結合する単離された抗体またはフラグメントを提供し、前記ポリペプチドまたはフラグメントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得る。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントに結合する抗体またはフラグメントを提供し、前記ポリペプチドまたはフラグメントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を有し得る。
【００１１】
最初の４つの態様の様々な実施形態において、前記抗体またはフラグメントは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、免疫グロブリン分子全体、ｓｃＦｖ；キメラ抗体；Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２；またはジスルフィド連結されたＦｖであり得る。
【００１２】
最初の４つの態様の他の実施形態において、前記抗体またはフラグメントは、ヒトＩｇＭ定常ドメイン；ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、またはヒトＩｇＡ１／２定常ドメインであり得る重鎖免疫グロブリン定常ドメインを有し得る。
【００１３】
最初の４つの態様の他の実施形態において、前記抗体またはフラグメントは、ヒトＩｇカッパー定常ドメインまたはヒトＩｇラムダ定常ドメインであり得る軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを有し得る。
【００１４】
最初の４つの態様のなおもさらなる実施形態において、前記抗体またはフラグメントは、少なくとも１×１０９Ｍまたは少なくとも１×１０１０Ｍの親和性定数（Ｋａｆｆ）で抗原に結合し得る。
【００１５】
最初の４つの態様の追加の実施形態において、前記抗体またはそのフラグメントは、芽胞発芽を阻害し得るかまたは遅延させ得る。
【００１６】
第１および第２の態様のいくつかの実施形態において、前記組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ、毒素Ｂに結合する抗体または毒素Ａおよび毒素Ｂに結合する抗体の組み合わせも含み得る。第１および第２の態様の追加の実施形態において、前記組成物は、抗生物質（例えば、メトロニダゾールまたはバンコマイシン）も含み得る。
【００１７】
最初の４つの態様の組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患の処置を必要とする被験体に、前記疾患を減少させるかまたは予防するのに有効な量の前記組成物を投与することによるそのような処置方法において使用され得、その有効な量は、前記被験体の体重１キログラムあたり１〜１００ミリグラムの範囲内の量であり得る。前記組成物は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または経口的に投与され得る。
【００１８】
最初の４つの実施形態の他の態様において、前記組成物は、有効量の前記組成物を動物に投与することによる受動免疫の方法において使用され得る。
【００１９】
第５の態様において、本発明は、ある量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアント（それらは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得る）および薬学的に許容可能なアジュバントを、被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で前記被験体に投与することによる、前記被験体において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００２０】
第６の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアント（それらは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を有し得る）および薬学的に許容可能なアジュバントを、被験体において免疫応答を誘導するのに有効な量で前記被験体に投与することによる、前記被験体において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００２１】
第７の態様において、本発明は、ある量のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアント（それらは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得る）および薬学的に許容可能なアジュバントを、処置を必要とする被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与することによる、前記被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法を提供する。
【００２２】
第８の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメント（それらは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を有し得る）および薬学的に許容可能なアジュバントを、処置を必要とする被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与することによる、前記被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法を提供する。
【００２３】
第５から第８の態様の様々な実施形態において、薬学的に許容可能なアジュバントは、インターロイキン１２または熱ショックタンパク質である。他の実施形態において、投与は、経口的、鼻腔内、静脈内、または筋肉内である。他の実施形態において、前記バリアントは、融合タンパク質であり得る変異体である。前記融合タンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列、例えば、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、またはＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントを含み得る。あるいは、前記融合タンパク質は、タンパク質ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、もしくはＦｌｉＤおよびそれらのフラグメントまたは配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、もしくは配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのフラグメントのいずれか１つと前記タンパク質の群の別のメンバーとの融合物であり得る。
【００２４】
第９の態様において、本発明は、有効免疫量の単離されたポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供し、前記組成物は、被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する免疫応答を誘導するのに有効であり、前記単離されたポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントを含む。
【００２５】
第１０の態様において、本発明は、有効免疫量の単離されたポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供し、前記組成物は、被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する免疫応答を誘導するのに有効であり、前記単離されたポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
第９および第１０の態様の様々な実施形態において、前記組成物はさらに、水中油型エマルション、ＩＳＡ−２０６、ＱｕｉｌＡ、インターロイキン１２、または熱ショックタンパク質であり得る薬学的に許容可能なアジュバントを含む。これらの態様のさらなる実施形態において、前記バリアントは、融合タンパク質であり得る変異体である。前記融合タンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列、例えば、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、またはＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントを含み得る。あるいは、前記融合タンパク質は、タンパク質ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、もしくはＦｌｉＤおよびそれらのフラグメントまたは配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、もしくは配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのフラグメントのいずれか１つと前記タンパク質の群の別のメンバーとの融合物であり得る。
【００２７】
第１１の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアント（それらは、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得る）をコードするある量の核酸および薬学的に許容可能なアジュバントを、そのような処置を必要とする被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与することによる、前記被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法を提供する。
【００２８】
第１２の態様において、本発明は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列を有するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントをコードするある量の核酸および薬学的に許容可能なアジュバントを、処置を必要とする被験体において感染を減少させるかまたは予防するのに有効な量で前記被験体に投与することによる、前記被験体においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を減少させるかまたは予防する方法を提供する。
【００２９】
第１１および第１２の態様の様々な実施形態において、前記薬学的に許容可能なアジュバントは、水中油型エマルション、ＩＳＡ−２０６、ＱｕｉｌＡ、インターロイキン１２、または熱ショックタンパク質であり得る。これらの態様のさらなる実施形態において、前記バリアントは、融合タンパク質であり得る変異体である。前記融合タンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列、例えば、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、またはＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントを含み得る。あるいは、前記融合タンパク質は、タンパク質ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、およびＦｅ−Ｍｎ−ＳＯＤならびにそれらのフラグメントまたは配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、もしくは配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのフラグメントのいずれか１つと前記タンパク質の群の別のメンバーとの融合物であり得る。
【００３０】
第１３の態様において、本発明は、ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、またはＦｌｉＤであり得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントをコードする単離された核酸を提供する。
【００３１】
第１４の態様において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリペプチドまたはフラグメントまたはバリアントをコードする単離された核酸を提供し、前記核酸は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、または配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。
【００３２】
第１３および第１４の態様の様々な実施形態において、前記バリアントは、融合タンパク質であり得る変異体である。前記融合タンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの配列、例えば、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４、またはＴｃｄＡのＣ末端受容体結合フラグメントを含み得る。あるいは、前記融合タンパク質は、タンパク質ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、ＢｃｌＡ３、Ａｌｒ、ＳｌｐＡパラログ、ＳｌｐＡ  ＨＭＷ、ＣＤ１０２１、ＩｕｎＨ、Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ、もしくはＦｌｉＤおよびそれらのフラグメントまたは配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、もしくは配列ＩＤ番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのフラグメントのいずれか１つと前記タンパク質の群の別のメンバーとの融合物であり得る。
【００３３】
第１３および第１４の態様のなおもさらなる実施形態において、前記核酸は、細菌または哺乳動物発現ベクターであり得る発現ベクター内に含まれている。哺乳動物発現ベクターの例としては、ＣＭＶプロモーターを含むベクターが挙げられる。他の哺乳動物発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３００２ＮｅｏまたはｐＥＴ３２ａが挙げられる。細菌発現ベクターの例としては、ｐＥＴ３２ａが挙げられる。これらの態様のいくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞での発現の場合、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＮＳＯ−１、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、またはＰＥＲ．Ｃ６、および細菌での発現の場合、Ｅ．ｃｏｌｉ）内に含めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＢｃｌＡ３−ｐｃＤＮＡ３００２ＮｅｏにＢｃｌＡ３インサートが存在することを確認するためのＡｓｃＩおよびＨｐａＩによる前記プラスミドの制限消化を示している。前記ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドから取り出されるＢｃｌＡ３の予想サイズは、１．６ｋｂであり、空のｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドは、６．８ｋｂである。（レーン１：未消化のＢｃｌＡ３−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド；レーン２：消化したＢｃｌＡ３−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、精製ＢｃｌＡ３タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析を示している。ＢｃｌＡ３でトランスフェクトされた上清を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＨｉｓＴＲＡＰ  Ｎｉカラムにおいて精製した。溶出したタンパク質を、濃縮前の１５μＬの体積でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した（左）。（レーン１：精製ＢｃｌＡ３タンパク質）。前記タンパク質の予想サイズは、４４ｋＤａである。第２のゲル（右）は、８μｇのタンパク質を用いて泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、発現されたタンパク質のＨｉｓタグに対する抗体をプローブとして探索した（レーン１：精製ＢｃｌＡ３タンパク質−８μｇ）。
【図２Ａ】図２Ａは、Ａｌｒ−ｐｃＤＮＡ３００２ＮｅｏにＡｌｒインサートが存在することを確認するためのＡｓｃＩおよびＨｐａＩによる前記プラスミドの制限消化を示している。前記ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドから取り出されるＡｌｒの予想サイズは、１．３ｋｂであり、空のｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドは、６．８ｋｂである。（レーン１：未消化のＡｌｒ−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド；レーン２：消化したＡｌｒ−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、精製Ａｌｒタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。Ａｌｒでトランスフェクトされた上清を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＨｉｓＴＲＡＰ  Ｎｉカラムにおいて精製した。溶出したタンパク質を、ベータ−メルカプトエタノール（２ＭＥ）有りおよび無しで、２μｇでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した（左）（レーン１：精製Ａｌｒタンパク質−２μｇ；レーン２：精製Ａｌｒタンパク質−２μｇ＋２ＭＥ）。前記タンパク質の予想サイズは、４５ｋＤａである。タンパク質＋／−２ＭＥの差を誇張するために、第２のゲル（右）は約３０μｇのタンパク質を用いて泳動した（レーン３：精製Ａｌｒタンパク質−２μｇ；レーン４：精製Ａｌｒタンパク質−２μｇ＋２ＭＥ）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、精製Ａｌｒタンパク質のウエスタンブロット解析を示している。Ａｌｒでトランスフェクトされた上清を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＨｉｓＴＲＡＰ  Ｎｉカラムにおいて精製した。溶出したタンパク質を、ベータ−メルカプトエタノール（２ＭＥ）有りおよび無しで、２μｇでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填し、次いで、ニトロセルロース膜に転写し、抗ｈｉｓ抗体（１：３０００）をプローブとして探索した（レーン２：精製Ａｌｒタンパク質−２μｇ；レーン３：精製Ａｌｒタンパク質−２μｇ＋２ＭＥ）。前記タンパク質の予想サイズは、４５ｋＤａである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＳｌｐＡパラ−ｐｃＤＮＡ３００２ＮｅｏにＳｌｐＡパラログインサートが存在することを確認するためのＡｓｃＩおよびＨｐａＩによる前記プラスミドの制限消化を示している。前記ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドから取り出されるＳｌｐＡパラログの予想サイズは、１．９ｋｂであり、空のｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドは、６．８ｋｂである。（レーン１：未消化のＳｌｐＡパラ−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド；レーン２：消化したＳｌｐＡパラ−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、精製ＳｌｐＡパラログのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析を示している。ＳｌｐＡパラログでトランスフェクトされた上清を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＨｉｓＴＲＡＰ  Ｎｉカラムにおいて精製した。溶出したタンパク質を、ベータ−メルカプトエタノール（２ＭＥ）有りおよび無しで、２μｇでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した（左および中央）。（レーン１：精製ＳｌｐＡパラログタンパク質−２μｇ；レーン２：精製ＳｌｐＡパラログタンパク質−２μｇ＋２ＭＥ）。前記タンパク質の予想サイズは、８４ｋＤａである。別のゲル（右）において、２μｇのタンパク質を用いて泳動し、それをニトロセルロース膜に転写し、発現されたタンパク質のＨｉｓタグに対する抗体をプローブとして探索した（レーン４：精製ＳｌｐＡパラログタンパク質−２μｇ）。
【図４】図４Ａは、ＣＤ１０２１−ｐｃＤＮＡ３００２ＮｅｏにＣＤ１０２１インサートが存在することを確認するためのＡｓｃＩおよびＨｐａＩによる前記プラスミドの制限消化を示している。前記ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドから取り出されるＣＤ１０２１の予想サイズは、１．８ｋｂであり、空のｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドは、６．８ｋｂである。（レーン１：未消化のＣＤ１０２１−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド；レーン２：消化したＣＤ１０２１−ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミド）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、精製ＣＤ１０２１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。ＣＤ１０２１でトランスフェクトされた上清を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＨｉｓＴＲＡＰ  Ｎｉカラムにおいて精製した。溶出したタンパク質を、２μｇでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した（レーン１：精製ＣＤ１０２１タンパク質；レーン２：精製ＣＤ１０２１タンパク質＋２ＭＥ）。グリコシル化無しの前記タンパク質の予想サイズは、６５ｋＤａである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、精製ＣＤ１０２１のウエスタンブロット解析を示している。別のゲルを、２μｇのタンパク質を用いて泳動し、それをニトロセルロース膜に転写し、発現されたタンパク質のＨｉｓタグに対する抗体をプローブとして探索した（左のブロットのレーン１：精製ＣＤ１０２１タンパク質＋２ＭＥ；右のブロットのレーン１：精製ＣＤ１０２１タンパク質）。
【図５】図５は、組換えＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａフラグメント４および毒素Ｂフラグメント１領域ならびにＴｃｄ  ＡおよびＢ毒素の全体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。（Ａ）コロイドブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の毒素Ａフラグメント４（レーン１）。毒素Ａフラグメント４の予想サイズは、１１４ｋＤａである。（Ｂ）抗Ｈｉｓをプローブとして探索したウエスタン免疫ブロット上の毒素Ｂフラグメント１（レーン１）。毒素Ｂフラグメント１の予想サイズは、８２ｋＤａである。（Ｃ）コロイドブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の毒素Ｂ全体（レーン１）および毒素Ａ全体（レーン２）。毒素Ａに対する予想サイズは、３０８ｋＤａであり、毒素Ｂの予想サイズは、２７０ｋＤａである。
【図６】図６は、精製ＦｌｉＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。ＦｌｉＤでトランスフェクトされた上清を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用してＨｉｓＴＲＡＰ  Ｎｉカラムにおいて精製した。溶出したタンパク質を、２μｇでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した（レーン１：精製ＦｌｉＤタンパク質＋２ＭＥ；レーン２：精製ＦｌｉＤタンパク質）。グリコシル化無しの前記タンパク質の予想サイズは、５５ｋＤａである。
【図７】図７は、マウス血清中のＣＤ１０２１抗体とＡＴＣＣ４３２５５由来の単離されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図８】図８は、マウス血清中のＦｌｉＤ抗体とＡＴＣＣ４３２５５株由来の単離されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図９】図９は、マウス血清中のＡｌｒ抗体とＡＴＣＣ４３２５５株由来の単離されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１０】図１０は、マウス血清中のＢｃｌＡ３抗体とＡＴＣＣ４３２５５株由来の単離されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１１】図１１は、マウス血清中のＦｌｉＤ抗体と精製Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＦＬｉＤタンパク質との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１２】図１２は、マウス血清中のＡｌｒ抗体と精製Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ａｌｒタンパク質との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１３】図１３は、マウス血清中のＢｃｌＡ３抗体と精製Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＢｌｃＡ３タンパク質との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１４】図１４は、マウス血清中のＣＤ１０２１抗体と精製Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＣＤ１０２１タンパク質との結合を検出するＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図１５】図１５は、ＡＴＣＣ４３２５５の芽胞発芽に対する抗芽胞抗体の抑制効果を調べる発芽アッセイの結果を示している。
【図１６】図１６は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のクマシーブルー染色を示している。
【図１７】図１７は、ウサギ抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ｐＡｂをプローブとして探索したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のウエスタンブロットを示している。
【図１８】図１８は、Ａｌｒで免疫されたマウス由来の血清をプローブとして探索したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のウエスタンブロットを示している。
【図１９】図１９は、ＢｃｌＡ３で免疫されたマウス由来の血清をプローブとして探索したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のウエスタンブロットを示している。
【図２０】図２０は、ＣＤ１０２１で免疫されたマウス由来の血清をプローブとして探索したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のウエスタンブロットを示している。
【図２１】図２１は、ＦｌｉＤで免疫されたマウス由来の血清をプローブとして探索したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のウエスタンブロットを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、概して、グラム陽性生物であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる脊椎動物被験体における細菌感染を予防または処置するための組成物および方法に関する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する免疫応答を誘導するための方法が提供される。前記方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染または保菌（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃａｒｒｉａｇｅ）を減少させるか、排除するか、または予防するのに有効な量で、それを必要とする脊椎動物被験体にタンパク質または薬剤を投与する工程を提供する。
【００３６】
被験体においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法が提供され、前記方法は、単離されたポリペプチド（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原）およびアジュバントを含む組成物を、前記被験体において前記免疫応答を誘導するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含む。前記方法は、受動免疫において使用するためまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染もしくは感染の再発を予防するワクチンの成分として使用するための抗体の作製のために使用され得る。
【００３７】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生体系に限定されず、それらは当然のことながら変化し得ると理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の態様のことだけを説明する目的であって、限定であると意図されていないことも理解されるべきである。本明細書および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のことを示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「約」は、量、時間の長さなどのような測定可能な値のことを指しているとき、特定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、なおもより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％のばらつきを包含する（そのようなばらつきが、開示される方法を実施するのに適切であるとき）と意味されている。
【００３９】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料が、本発明を試験するための実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００４０】
「脊椎動物」、「哺乳動物」、「被験体」、「哺乳動物被験体」、または「患者」は、交換可能に使用され、それらは、哺乳動物（例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類）ならびに実験動物（例えば、ウサギ、ラット、およびマウス）、ウシ、ウマ、ヤギ、および他の動物のことを指す。動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物（例えば、マウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、鳥類の種、アヒル、ガチョウ、ブタ、ニワトリ、両生類、および爬虫類）が含まれる。
【００４１】
用語「アジュバント」は、特定の抗原または抗原の組み合わせに対する免疫応答を高めるように非特異的な様式で作用する物質、したがって、例えば、任意の所与の組成物において必要な抗原の量および／または目的の抗原に対して適切な免疫応答を発生させるのに必要な注射の頻度を減少させる物質のことを指す。例えば、Ａ．Ｃ．Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｊ．Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌ．Ｓｏｃ．（１９７９）２６：６１９−６３０を参照のこと。そのようなアジュバントは、下記でさらに説明される。用語「薬学的に許容可能なアジュバント」は、被験体に安全に投与でき、かつ薬学的使用にとって許容可能であるアジュバントのことを指す。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、「コロニー形成」は、哺乳動物の腸管におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在のことを指す。
【００４３】
「保菌」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅなどの細菌が、正常な被験体を病気にさせずに前記被験体において増殖できるプロセスである。保菌は、環境、宿主、および病原体の非常に複雑な相互作用である。様々な因子が、疾患に対して無症候性の保菌を指示する。ゆえに、本発明の観点は、保菌の処置または予防を含む。
【００４４】
「処置する」または「処置」は、（ｉ）感染もしくは再感染の防止、例えば、予防または（ｉｉ）目的の疾患の症状の減少もしくは排除、例えば、治療のことを指す。「処置する」または「処置」は、目的のポリペプチド、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原またはこれらの抗原に対して生じた抗体を含む組成物の投与のことを指し得る。前記組成物による被験体の処置は、感染のリスクを防止し得るかもしくは低下させ得、かつ／または目的のポリペプチドに対する免疫応答を誘導し得る。処置は、症状の予防的な抑制もしくは軽減（疾患の発生を予防するかもしくは遅延させるか、またはその臨床症状もしくは不顕性症状の顕性化を予防する）または前記疾患が顕れた後の症状の治療的な抑制もしくは軽減であり得る。
【００４５】
「予防する」または「予防」は、ポリペプチドまたは抗体組成物による予防的投与またはワクチン接種のことを指す。
【００４６】
「治療有効量」または「細菌感染を減少させるかまたは排除するのに有効な量」または「有効量」は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を予防するため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染に関連する症状の少なくとも１つを軽減する（例えば、緩和する、低減させる、減少させる）ため、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原に対する免疫応答を誘導するために十分なポリペプチドまたは抗体の量のことを指す。化合物の投与の利益が損害にまさる限り、前記組成物の投与がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染の症状を排除することは、必須ではない。同様に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染に関する用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書中で使用されるとき、前記被験体の状態のいくらかの軽減または改善が前記組成物の投与によって影響されるだけで、必ずしも前記被験体の感染が治癒することまたはそのすべての臨床的徴候が排除されることを意味しないと意図されている。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答」は、免疫細胞の生化学的変化（免疫細胞の遊走、標的細胞の殺滅、ファゴサイトーシス、抗体、免疫応答の他の可溶性エフェクターの産生などを生じる）をもたらす外部または内部の刺激（例えば、抗原、細胞表面受容体、サイトカイン、ケモカイン、および他の細胞）に対する免疫系細胞の応答のことを指す。
【００４８】
「防御免疫」または「防御免疫応答」は、前記被験体が、組成物に対して有効な免疫応答（ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を開始して、その後、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に曝露された際または当該細菌でチャレンジされた際に、前記被験体がその感染と戦うことができることを意味すると意図されている。したがって、防御免疫応答は、通常、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対するその後の曝露による被験体間の罹患率および死亡率を減少させる。防御免疫応答は、通常、前記被験体におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌によるコロニー形成も減少させる。
【００４９】
「有効な免疫応答」は、抗原、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原に対する前記被験体の免疫応答を誘起させる応答（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）のことを指す。特に、この用語は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌または抗原に対するその後の曝露からの任意のレベルの防御を意味すると意図されており、前記防御の形態が、死亡率の低下であるか、腹部膨満もしくは下痢などの症状の減少であるか、再発の予防であるか、または前記疾患の他の任意の有害な影響の減少であるかなどに関係なく、また、前記防御が部分的であるか完全であるかを問わず、前記任意のレベルは、被験体の集団においていくらか有益なレベルである。「有効な免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原と遭遇した後の宿主の組織および細胞の関与によって特徴付けられる。それは、一般に、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖を伴い、それにより、抗体の合成もしくは細胞媒介性反応の発生またはその両方をもたらす」。Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，「Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  １１７（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ  ｅｄ．，１９８５）。言い換えると、有効な免疫応答は、感染によってまたは本発明の場合のように組成物の投与によって免疫原に曝露された後に宿主によって開始される。能動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への予め形成された物質（例えば、抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン−２）の移入」によって獲得される受動免疫と対比され得る。同文献。
【００５０】
「受動免疫」は、概して、予め作製された抗体の形態で１つの個体から別の個体に有効な体液性免疫を移すことを指す。したがって、受動免疫は、抗体の移入によって達成され得る短期間の免疫化の形態であり、当該抗体は、可能性のあるいくつかの形態、例えば、ヒトまたは動物の血漿または血清として、静脈内（ＩＶＩＧ）または筋肉内（ＩＧ）で使用するための動物またはヒトのプールされた免疫グロブリンとして、免疫された被験体由来または疾患から回復中のドナー由来の動物またはヒトの高力価のＩＶＩＧまたはＩＧとして、およびモノクローナル抗体として投与され得る。受動移入は、疾患発生の予防のために予防的に、ならびにいくつかのタイプの急性感染の処置において、使用され得る。典型的には、受動免疫から得られた免疫は、短い時間しか継続せず、即時型防御をもたらすが、身体は記憶しないので、その患者は、後で同じ病原体に感染するリスクがある。
【００５１】
ポリペプチド
用語「ポリペプチド」または「ペプチド」は、ポリマーの長さに関係ないアミノ酸のポリマーのことを指す；したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含められる。この用語は、ポリペプチドの発現後の修飾も特定しないかまたは排除せず、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドは、ポリペプチドという用語に明確に包含される。その定義には、アミノ酸の１もしくはそれ以上のアナログ（例えば、天然に存在しないアミノ酸、無関係の生体系にだけ天然に存在するアミノ酸、哺乳動物系由来の改変されたアミノ酸などを含む）、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の修飾（天然に存在する修飾および天然に存在しない修飾の両方）を含むポリペプチドも含まれる。
【００５２】
用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離されたペプチド」は、その起源または由来の起源の理由で、（１）その天然状態ではそれらを伴っている天然に関連する成分を伴っていないか、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含んでいないか、（３）異なる種の細胞によって発現されているか、または（４）天然には存在しない、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。したがって、化学的に合成されたまたは本来の起源である細胞と異なる細胞系で合成されたペプチドは、その天然に関連する成分から「単離されている」。タンパク質は、当該分野で周知のタンパク質精製法を用いた単離によっても、天然に関連する成分を実質的に含まない状態にされ得る。
【００５３】
本発明の意味の範囲内の用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」、「抗原」、または「抗体」は、概して被験体において免疫応答を誘導することができるまたは抗体の場合には抗原に結合することができるという文脈において生物学的活性を示すバリアント、アナログ、オルソログ、ホモログ、および誘導体、ならびにそれらのフラグメントを含む。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対応するかまたはバリアントタンパク質に対応する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原またはそのフラグメント（ｆｒａｇｅｍｅｎｔｓ）から得られたアミノ酸配列、すなわち、少数のアミノ酸が置換、付加、または欠失されているが本質的には同じ免疫学的特性を保持する天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列を含む。さらに、そのように得られた一部は、特にＮおよびＣ末端において、適切な化学反応が行われた後にポリペプチドまたはフラグメントを立体構造的に制約できるようにするおよび／または免疫原性担体に結合できるようにするアミノ酸によってさらに改変され得る。本発明のポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のアミノ酸配列（本質的にその免疫学的特性を損なわずにアミノ酸が欠失、挿入、または置換されている）から得られる機能的に活性なバリアントポリペプチドを包含し、すなわち、そのような機能的に活性なバリアントポリペプチドは、実質的なペプチド生物学的活性を保持する。典型的には、そのような機能的バリアントポリペプチドは、配列ＩＤ番号１〜４におけるアミノ酸配列などのアミノ酸配列と相同、好ましくは、高度に相同なアミノ酸配列を有する。
【００５５】
１つの実施形態において、そのような機能的に活性なバリアントポリペプチドは、配列ＩＤ番号１〜４から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す。ポリペプチドの場合の配列類似性（配列同一性とも呼ばれる）は、典型的には配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換、欠失、および他の改変（保存的アミノ酸置換を含む）に割り当てられた類似性の基準を用いて類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、デフォルトのパラメータを用いて使用することにより、密接な関係があるポリペプチド（例えば、異なる生物種由来の相同ポリペプチド）間または野生型タンパク質とそのムテイン間の配列相同性または配列同一性を決定できる「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを有する。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨のパラメータを使用する、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１におけるプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列間の最良の重複領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００））。異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと本発明の配列を比較する際の代替のアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを使用する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照のこと。
【００５６】
機能的に活性なバリアントは、天然に存在する機能的に活性なバリアント（例えば、対立遺伝子バリアント（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）および種バリアント（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ））および天然に存在しない機能的に活性なバリアント（例えば、突然変異誘発法または直接合成法によって生成され得るもの）を含む。
【００５７】
機能的に活性なバリアントは、例えば、本明細書中に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｒｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し得、なおも生物学的活性を保持し得る。この比較がアラインメントを必要とする場合、それらの配列は、相同性が最大になるようにアラインメントされる。生物学的活性、例えば、免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｐｏｎｓｅ）を誘導する能力が、本明細書中に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｒｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原と実質的に類似である限り、変異の部位は、前記配列の任意の箇所に存在し得る。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を生成する方法に関する指針は、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供されており、そこでは、変化に対するアミノ酸配列の寛容を研究するための主要なストラテジーが２つ存在することが教示されている。第１のストラテジーは、進化のプロセス中の自然淘汰によるアミノ酸置換の寛容を利用する。異なる種のアミノ酸配列を比較することによって、種間で保存されているアミノ酸位置が同定され得る。これらの保存されたアミノ酸は、おそらくタンパク質の機能にとって重要である。対照的に、自然淘汰による置換が許容されているアミノ酸位置は、タンパク質の機能にとって重要でない位置であることを示唆する。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は、改変ポリペプチドの特定の免疫原性活性を維持しつつ改変できる。
【００５８】
第２のストラテジーは、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子操作を使用して、タンパク質の機能にとって重要な領域を同定する。例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発が使用され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。次いで、得られたバリアントポリペプチドは、特定の生物学的活性について試験され得る。
【００５９】
Ｂｏｗｉｅらによると、これらの２つのストラテジーは、驚いたことにタンパク質がアミノ酸置換に寛容であることを明らかにした。当該著者らはさらに、どのアミノ酸の変化が、当該タンパク質におけるある特定のアミノ酸位置において許容的である可能性があるかを示唆している。例えば、最も埋もれているまたは内側の（タンパク質の三次構造内で）アミノ酸残基が、非極性側鎖を要求するのに対し、表面または外側の側鎖の特徴は、広く保存されていることはほとんどない。
【００６０】
タンパク質のアミノ酸に変異を導入する方法は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。
【００６１】
変異は、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの商業的に入手可能なキットを使用するかまたは直接、ペプチド合成によっても導入され得る。ペプチドの機能に有意に影響しないアミノ酸を置換することによる、前記ペプチドに対する機能的に活性なバリアントの作製は、当業者によって達成され得る。
【００６２】
本発明のポリペプチドにおいて行われ得るアミノ酸置換のタイプは、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。保存的置換によって２もしくはそれ以上のアミノ酸配列が互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、前記置換の保存的性質を補正するために上方調整される。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７−３１（１９９４）を参照のこと。
【００６３】
類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；および７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６４】
あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５（１９９２）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変更である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変更である。
【００６５】
機能的に活性なバリアントは、ハイブリダイゼーション法を用いても単離され得る。簡潔には、目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原をコードする核酸配列の全部または一部に対して高い相同性を有するＤＮＡを使用して、機能的に活性なペプチドが調製される。ゆえに、本発明のポリペプチドは、機能的に等価であり、かつＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原のいずれか１つをコードする核酸またはその相補鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、実体も含む。当業者は、容易に入手可能なコドン表を使用して、本発明のペプチドをコードする核酸配列を容易に決定できる。よって、これらの核酸配列は、本明細書中に提示されない。
【００６６】
機能的に活性なバリアントをコードする核酸分子は、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、または抗体、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原をコードする核酸分子ＤＮＡの一部をプローブとして使用する、ＰＣＲなどの遺伝子増幅法によっても単離され得る。
【００６７】
本発明では、本発明のいくつかのポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗原、または抗体を組み合わせて使用してよいと考えられるべきである。可能性のあるすべてのタイプの組み合わせが構想され得る。例えば、好ましくは、本明細書中に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原から選択される１種より多いポリペプチドを含む抗原が使用され得る。いくつかの実施形態において、前記抗原は、１もしくはそれ以上の芽胞抗原を、毒素ＡまたはＢなどの栄養細胞から得られる抗原と組み合わせて含み得る。同じ配列が、同じポリペプチド分子上においていくつかのコピーで使用され得るか、または異なるアミノ酸配列のペプチドが同じポリペプチド分子上で使用される；前記異なるペプチドまたはコピーは、互いに直接融合され得るか、または適切なリンカーによって間隔があけられ得る。本明細書中で使用されるとき、用語「多量体化（ポリ）ペプチド」は、異なるまたは同じアミノ酸配列のポリペプチドが単一のポリペプチド分子上に存在する両方のタイプの組み合わせのことを指す。したがって、２〜約２０個の同一および／または異なるペプチドが、単一の多量体化ポリペプチド分子上に存在し得る。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗原は、天然の起源から得られ、細菌の起源から単離される。したがって、本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗原は、標準的なタンパク質精製法を用いて、起源から単離され得る。
【００６９】
あるいは、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、化学的に合成され得るかまたは組換えＤＮＡ法を用いて生成され得る。例えば、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、当該分野で周知の固相法によって合成され得る。好適な合成は、「Ｔ−ｂｏｃ」または「Ｆ−ｍｏｃ」法を使用することによって行われ得る。環状ペプチドは、完全に自動化された装置において、周知の「Ｆ−ｍｏｃ」法およびポリアミド樹脂を使用する固相法によって合成され得る。あるいは、当業者は、当該プロセスを手動で行うのに必要な研究室手順を承知している。固相合成のための手法および手順は、ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって出版されたＥ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄによる「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）（１９８９）およびＤ．Ａｎｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（ｅｄ．Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ），ｃｈａｐｔｅｒ  ７，ｐｐ９１−１７１に記載されている。
【００７０】
あるいは、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の手法を使用して好適な発現系において発現され得る発現ベクターに導入された後、目的の発現されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が単離または精製され得る。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫の発現系が、当該分野において利用可能であり、そのような任意の発現系を使用できる。選択的に、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、無細胞翻訳系において翻訳され得る。
【００７１】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原に対応する核酸配列を用いることにより、オリゴヌクレオチドプローブを設計することもでき、前記核酸配列を用いることにより、他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ変異株または他の細菌種由来の遺伝子についてゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーを調製するためのならびに核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングのための基礎的なストラテジーは、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｖｏｌ．Ｉ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照のこと。スクリーニングされたライブラリー由来のクローンが、ポジティブハイブリダイゼーションによって同定されると、特定のライブラリーインサートが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ遺伝子またはそのホモログを含むことが、制限酵素解析およびＤＮＡ配列決定によって確認され得る。次いで、それらの遺伝子は、標準的な手法、および所望であればＰＣＲアプローチまたは全長配列の一部を欠失させるために使用される制限酵素を用いてさらに単離され得る。
【００７２】
あるいは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローニングではなく合成的に調製され得る。当該ＤＮＡ配列は、特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、当該配列が発現のために使用される場合、意図される宿主にとって好ましいコドンが選択される。その完全な配列は、標準的な方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、完全なコード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【００７３】
いったん所望のタンパク質に対するコード配列が調製または単離されると、それらは、任意の好適なベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。数多くのクローニングベクターが、当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、選択できる問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそれらを形質転換できる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．ｃｏｌｉグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびウシパピローマウイルス（哺乳動物細胞）が挙げられる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，前出を参照のこと。所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、この発現構築物を含むベクターによって形質転換された宿主細胞においてＲＮＡに転写されるように、前記遺伝子を、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌の発現の場合）、および選択的にオペレーター（本明細書中で「調節」領域と集合的に呼ばれる）の支配下に置くことができる。前記コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含むことがあるかまたは含むことはない。リーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて宿主によって除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号明細書；同第４，４２５，４３７号明細書；同第４，３３８，３９７号明細書を参照のこと。ベクターの例としては、ｐＥＴ３２ａ（＋）およびｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏが挙げられる。
【００７４】
宿主細胞の増殖に対してタンパク質配列の発現の制御を可能にする他の制御配列も望ましい場合がある。制御配列は、当業者に公知であり、例としては、調節性化合物の存在を含む化学的または物理的な刺激に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする配列が挙げられる。他のタイプの制御エレメントも、前記ベクター、例えば、エンハンサー配列に存在し得る。
【００７５】
前記調節配列および他の制御配列は、上に記載されたクローニングベクターなどのベクターに挿入する前にコード配列にライゲートされ得る。あるいは、前記コード配列は、調節配列および適切な制限酵素認識部位をすでに含んでいる発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【００７６】
場合によっては、コード配列が適切な方向で；すなわち、適切な読み枠を維持するように調節配列に結合され得るように前記コード配列を改変する必要がある場合がある。タンパク質の変異体またはアナログを生成することも望ましい場合がある。変異体またはアナログは、当該タンパク質をコードする配列の一部の欠失、配列の挿入、および／または当該配列内の１もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。部位特異的突然変異誘発などのヌクレオチド配列を改変するための手法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出に記載されている。
【００７７】
次いで、前記発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞が形質転換される。いくつかの哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、それらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、これに限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳＯ−１細胞、ならびにその他の細胞を含む。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）も、本発現構築物とともに使用されることが見出される。本発明において有用な酵母宿主は、これに限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。バキュロウイルス発現ベクターとともに使用するための昆虫細胞は、これに限定されるものではないが、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｍｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉを含む。
【００７８】
目的のポリヌクレオチド、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原を有する発現ベクターは、ＤＮＡワクチン接種を必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種のために当業者が通常使用するベクターでもあり得る。ＤＮＡワクチン接種は、例えば、初回の宿主抗原投与および／または目的の抗原による追加抗原投与のために任意の様式で使用され得る。ＤＮＡワクチン接種および関連する手法の全般的な特徴は、当該分野で周知である。ＤＮＡベクターの適切な投与量も、免疫応答が目的の抗原に対して発生しているかおよび／または細菌のチャレンジに対する防御が宿主において確立されているかを測定するための詳細に明らかにされた手法を用いて、容易に決定され得る。
【００７９】
選択される発現系および宿主に応じて、上に記載された発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、目的のタンパク質が発現する条件下で培養することによって、本発明のタンパク質が生成される。次いで、前記タンパク質は、前記宿主細胞から単離され、精製される。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当該分野の技術範囲内である。
【００８０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原タンパク質配列は、公知のアミノ酸配列または目的の遺伝子のＤＮＡ配列から得られるアミノ酸配列を使用する、固相ペプチド合成などの化学合成によっても生成され得る。そのような方法は、当業者に公知である。例えば、固相ペプチド合成法についてはＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）およびＧ．Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｅ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐｐ．３−２５４；ならびに伝統的な溶液合成についてはＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４）およびＥ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，前出，Ｖｏｌ．１を参照のこと。対象の抗原の小さいフラグメントが目的の被験体において免疫学的応答を惹起することができる場合、ペプチドの化学合成が好ましいことがある。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、複数の遺伝子の存在、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプライシング事象、ならびに選択的翻訳および翻訳後（ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）事象の結果として生じるポリペプチドも含み得る。ポリペプチドは、当該ペプチドが天然の細胞において発現される際に存在するのと実質的に同じ翻訳後修飾を生じる系、例えば、培養細胞、または天然の細胞において発現される際に存在する翻訳後修飾、例えば、グリコシル化もしくは切断の変更もしくは脱落を生じる系において発現され得る。
【００８２】
本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗原は、本明細書中に開示されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原配列の一部ではない他の異なるアミノ酸配列（例えば、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列）または免疫原性担体、ならびにタンパク質精製において有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡ）を含む融合タンパク質として生成され得る。本発明の１種より多いポリペプチドは、融合タンパク質として存在し得る。前記異種ポリペプチドは、例えば、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗原は、相同アミノ酸配列を含む融合タンパク質としても生成され得る。本発明の実施において有用な融合タンパク質の例は、これに限定されるものではないが、本明細書中に記載されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原と、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ＡまたはＢの一部、例えば、ＴｃｄＡのＮ末端触媒ドメイン、ＴｃｄＢのＮ末端触媒ドメイン、またはＴｃｄＢのＣ末端フラグメント４との融合物を含む。前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原またはそのフラグメントはまた、本発明における使用に適した融合タンパク質を形成するように互いに融合され得る。
【００８３】
ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ芽胞タンパク質
任意の種々のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞タンパク質を本発明の実施において使用してよい。そのような芽胞タンパク質は、最近配列決定されたいくつかの株（ａ  ｎｕｍｂｅｒ  ｓｔｒａｉｎｓ）の全ゲノム配列を含む公知のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ配列を検索することによって同定され得る。本発明の実施において有用な芽胞タンパク質のさらなる例は、文献にも記載されている。例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１：５５５−８８（２００７）を参照のこと。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞タンパク質の代表的な例としては、下記に記載されるものが挙げられる。
【００８４】
ＢｃｌＡタンパク質（ＢｃｌＡ１、ＢｃｌＡ２、およびＢｃｌＡ３を含む）は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞のエキソスポリウムの形成に関わるコラーゲン様タンパク質である。エキソスポリウムは、芽胞殻を取り囲み、芽胞の抵抗性に寄与する。表面に露出したエキソスポリウムタンパク質などの標的は、治療にとって優良な潜在的標的である。例えば、ＢｃｌＡタンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓにおいてオルソログを有し、ＢｃｌＡによる免疫化が、発芽を阻害することによって動物においてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ芽胞コロニー形成からの防御を示すことが示されている。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢｃｌＡ配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（ＢｃｌＡ１、Ａ２、およびＡ３に対して、それぞれ領域４０２５４７〜４０４１４５；３６８９４４４〜３６９１０８４；および３８０７４３０〜３８０９４６６）を有するタンパク質を含む。
【００８５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにおけるＡｌｒ（アラニンラセマーゼ）タンパク質は、栄養制限培地中に存在する芽胞の数と発芽を結びつけるクオラムセンシングタイプの機構に関わるエキソスポリウム酵素である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種にはオルソロガスタンパク質も存在し、当該タンパク質は、胞子形成の後期に存在することおよび成熟前の発芽を抑制することにより当該細菌の生存を促進するために必要であると示されている。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＡｌｒ配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（領域３９３６３１３〜３９３７４７０）を有するタンパク質を含む。
【００８６】
ＳｌｐＡタンパク質は、芽胞上の主な表面抗原であるＳ層をコードする。ＳｌｐＡタンパク質は、患者において強力な血清ＩｇＧ応答を誘導すると示されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏ．，５５：６９−８３（２００６）を参照のこと）。当該タンパク質は、Ｎ末端（ＬＭＷ）部分およびＣ末端（ＨＭＷ）部分に分けられる。ＳｌｐＡ  ＨＭＷタンパク質は、高度に保存されているので、標的として魅力的である。
【００８７】
ＳｌｐＡパラログタンパク質は、高ＭＷのＳｌｐＡサブユニットのアミノ酸配列に関係する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０におけるオープンリーディングフレームの大きなファミリー（パラログ）のことを指す。このアミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの２つの細胞壁結合型タンパク質であるＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ＣＷＬＢ／ＬｙｔＣ）およびそのエンハンサー（ＣＷＢＡ／ＬｙｔＢ）と４５％相同である（保存的置換を含む）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの高ＭＷのＳＬＰサブユニットがアミダーゼ活性を示すので、その配列相同性は、機能的相関を有する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから類推して、当該相同ドメインは細胞壁への固着を媒介するので、細胞壁の成分の１クラスを識別すると示唆されている。このことと一致して、多くのｓｌｐＡパラログが、典型的なシグナル配列をコードすることから、それらが分泌型または膜結合型であると示唆される。これまでに同定された２９個のｓｌｐＡパラログのうち、１２個が、ｓｌｐＡを取り囲む密に配置されたクラスターとして位置しており、そのすべてが同じ方向で転写されることから、協調した制御および関連した機能の可能性が示唆される。ｓｌｐＡのすぐ３’の６個のｓｌｐＡ様遺伝子（ＯＲＦ２〜７）が、栄養成長中に転写されることが示されている。ＣＯＧ２２４７推定細胞壁結合ドメイン。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｓｌｐＡ配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（領域３１５７３０４〜３１５９１７５；３１６２１７２〜３１６４４４８）を有するタンパク質を含む。推定細胞壁結合ドメインであるＣＯＧ２２４７は、下記の実施例３に示される。
【００８８】
ＣＤ１０２１（ＣｏｔＨ）タンパク質は、抗体を産生させるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞上に見られる仮定タンパク質である。このタンパク質は、表面に露出しているので、治療にとって優良な標的になり得る。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＤ１０２１配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＭ１８０３５５（領域１１９１７２５〜１１９３６３２）を有するタンパク質を含む。
【００８９】
ＩｕｎＨは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅがオルソログを有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのエキソスポリウムに見られる酵素であるイノシン加水分解酵素をコードする。この酵素は、芽胞（ｓｏｐｒｅ）発芽の開始において役割を有すると示唆されている。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＩｕｎＨ配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（領域１８６６５８０〜１８６７５４８）を有するタンパク質を含む。
【００９０】
Ｆｅ−Ｍｎ−ＳＯＤまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、スーパーオキシドから酸素および過酸化水素への不均化を触媒するがゆえに細胞における重要な抗酸化防御である酵素の１クラスである。多くの細菌が、鉄およびマンガンを有する当該酵素の形態を含む。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＦｅ−Ｍｎ−ＳＯＤ配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿０１３３１６（領域１８０２２９３〜１８０２９９７）を有するタンパク質を含む。
【００９１】
ｆｌｉＤ遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの鞭毛のキャップタンパク質（ＦｌｉＤ）をコードする。このタンパク質は、インビトロおよびインビボにおいて接着性を有すると示されており、特に、粘液への接着において役割を有すると示されている。ＦｌｉＤに対する抗体レベルが、ＣＤＡＤを有する患者の群に対してコントロール群において有意に高かったことが示されていることから、当該タンパク質が、宿主の防御機構において役割を果たし得る免疫応答を誘導できると示唆される。別の研究は、当該タンパク質が、試験された１７個の臨床分離株のうち１５個に存在すると示したことから、それがほとんどの株に存在すると示唆される。同じ研究は、異なる臨床分離株を有する１７人の患者のうち、１５人がＦｌｉＤに対する抗体を有することも示した。本発明の実施において使用され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＦｌｉＤ配列の代表的な例は、これに限定されるものではないが、ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｑ９ＡＨＰ４、ＡＦ２９７０２４、ＡＦ２９７０２５、ＡＦ２９７０２６、ＡＦ２９７０２７、およびＡＦ２９７０２８を有するタンパク質を含む。
【００９２】
表１は、本発明の実施において使用され得るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原タンパク質の例示的なアミノ酸配列を提供している。下記に提供される例示的な配列のバリアントおよびフラグメントもまた本発明によって包含されることが理解される。
【００９３】
【表１】
2014515594.tif 000003
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【００９４】
表２は、表１のタンパク質をコードする核酸配列を提供している。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
宿主の免疫化および抗体の作製
いくつかの実施形態において、いったんＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原が過剰発現され、精製されると、その抗原は、免疫応答を誘発するために宿主に送達するための免疫原として調製される。前記宿主は、生物工学的スクリーニングアッセイにおいて有用であり、かつ免疫原を投与されたときに回収可能な抗体を産生できる、当該分野で公知の任意の動物（例えば、これに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウマ、サル、ヒヒ、およびヒト）であり得る。１つの態様において、前記宿主は、トランスジェニックであり、ヒト抗体を産生し、例えば、ヒト抗体レパートリーを発現するマウスであり、それによって、ヒトの治療法の開発が大きく促進される。
【００９７】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」は、任意の免疫グロブリンまたはインタクトな分子、ならびに特定のエピトープに結合するそれらのフラグメントのことを指す。そのような抗体は、これに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、抗体全体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’フラグメント、および／またはＦ（ｖ）部分、ならびにそれらのバリアントを含む。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含むすべてのアイソタイプがこの用語に包含される。
【００９８】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体フラグメント」は、具体的には、親抗体の抗原結合機能を保持する、当該抗体の完全配列の不完全なまたは単離された部分のことを指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。
【００９９】
インタクトな「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬの各々は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、以下の順序で配置されている３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主の組織または因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体という用語は、結合能を保持する、インタクトな抗体の抗原結合部分を含む。結合の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９））；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１００】
本明細書中で使用されるとき、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨの抗体融合分子のことを指す。Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、それらを単一のタンパク質鎖として生成させることができる合成リンカーによって連結され得、その単一のタンパク質鎖では、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと）を形成している。そのような一本鎖抗体は、用語「抗体」フラグメントの言及に含められ、組換え法またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製され得る。
【０１０１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ヒト配列抗体」は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発またはインビボにおける体細胞変異によって導入される変異）を有し得る。そのような抗体は、例えば、ＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号パンフレットおよび同第００／３７５０４号パンフレットに記載されているように、非ヒトトランスジェニック動物において産生され得る。しかしながら、用語「ヒト配列抗体」は、本明細書中で使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（例えば、ヒト化抗体）を含むと意図されていない。
【０１０２】
また、組換え免疫グロブリンも生成され得る。Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７号明細書（この参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる）；およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）を参照のこと。
【０１０３】
本明細書中で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成の抗体分子の調製物のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（存在する場合）を有する、単一の結合特異性を示す抗体のことを指す。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られる、不死化細胞に融合されたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１０４】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原」は、抗体の産生を促し、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。それは、本開示において、用語「免疫原」と交換可能に使用され得る。厳密に言えば、免疫原は、免疫系から応答を誘発する物質であるのに対し、抗原は、特定の抗体に結合する物質と定義される。抗原またはそのフラグメントは、特定の抗体と接触する分子（すなわち、エピトープ）であり得る。あるタンパク質またはあるタンパク質のフラグメントが、宿主動物を免疫するために使用されるとき、当該タンパク質の数多くの領域が、抗原（当該タンパク質上の所与の領域または３次元構造）に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る（すなわち、免疫応答を誘発し得る）。抗原は、これに限定されるものではないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞タンパク質およびそれらのフラグメントを含み得る。
【０１０５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、当該抗体が、よりヒト抗体に酷似し、かつなおも元の結合能を保持するように、非抗原結合領域中および／または抗原結合領域中のアミノ酸配列が変更された少なくとも１つの抗体分子のことを指す。
【０１０６】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによって「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，８１：６８５１−６８５５（１９８４），この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を作製するために開発された手法を使用することができる。例えば、自己誘導物質に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子が、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングされ得る。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である。
【０１０７】
さらに、ヒト化抗体を作製するための手法が開発されている（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書および米国特許第５，２２５，５３９号明細書（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ：ＣＤＲｓ）と呼ばれる３つの超可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」領域から成る。簡潔には、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１もしくはそれ以上のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である。
【０１０８】
あるいは、一本鎖抗体を作製するために報告された手法が、本開示の免疫原性結合体に対する一本鎖抗体を作製するために適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、その結果、一本鎖ポリペプチドが生じる。抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は、周知の方法によって実質的にインタクトな抗体分子に対するそれぞれパパインおよびペプシンのタンパク分解性反応によって調製され得る。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号明細書を参照のこと。Ｆａｂ’抗体分子部分も、周知であり、それは、メルカプトエタノールを用いるような２つの重鎖部分を連結しているジスルフィド結合の還元、および得られたタンパク質メルカプタンの、ヨードアセトアミドなどの試薬によるアルキル化に従って、Ｆ（ａｂ’）２部分から生成される。
【０１０９】
抗体アッセイ
宿主を免疫し、免疫原に対する免疫応答を誘発させた後、所望の抗体が産生されているかを判定するためにスクリーニングアッセイを行うことができる。そのようなアッセイは、目的の抗体をアッセイしてその特異性および親和性を確かめる工程およびそれらの抗体が他のタンパク質と交差反応するかを判定する工程を含み得る。
【０１１０】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗原とその対応する抗体との間の相互作用のことを指す。前記相互作用は、結合分子（すなわち、抗原またはエピトープ）によって認識されるタンパク質の特定の構造の存在に依存する。結合が特異的であるためには、その結合は、バックグラウンド抗原ではなく目的のエピトープの抗体結合性を必要とするはずである。
【０１１１】
いったん抗体が産生されると、それらは、目的の抗原に特異的であることを確かめるためおよび他の抗原と任意の交差反応性を示すかを判定するためにアッセイされる。そのようなアッセイを行う１つの方法は、米国出願公開第２００４／０１２６８２９号（その内容は、明確にこの参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような血清スクリーニングアッセイである。しかしながら、品質管理のためにアッセイする他の方法は、当業者の技術範囲内であり、ゆえに、それらも本開示の範囲内である。
【０１１２】
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメント、バリアント、もしくは誘導体は、抗原に対する結合親和性に関しても記載または明記され得る。抗原に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に測定され得る（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；および本明細書中に記載される方法を参照のこと）。種々の条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定される場合、測定された特定の抗体抗原相互作用の親和性は、変動し得る。したがって、親和性の測定値および他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）は、好ましくは、抗体および抗原の標準液ならびに標準化された緩衝液を用いて得られる。
【０１１３】
親和性結合定数（Ｋａｆｆ）は、以下の式：
【数１】
2014515594.tif 000016
【０１１４】
を用いて決定することができ、ここで：
【数２】
2014515594.tif 000017
【０１１５】
である。
【０１１６】
［ｍＡｂ］は、未結合の抗原部位（ｆｒｅｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｉｔｅｓ）の濃度であり、［ｍＡｇ］は、２つの異なる抗原濃度（すなわち、［ｍＡｇ］ｔおよび［ｍＡｇ’］ｔ）において測定されたときの、未結合のモノクローナル結合部位（ｆｒｅｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）の濃度である（Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍ  Ｍｅｔｈ，１００：１７３−１７９（１９８７））。
【０１１７】
抗体に対する用語「高親和性」は、少なくとも約１×１０７リットル／モルまたは少なくとも約１×１０８リットル／モルまたは少なくとも約１×１０９リットル／モルまたは少なくとも約１×１０１０リットル／モルまたは少なくとも約１×１０１１リットル／モルまたは少なくとも約１×１０１２リットル／モルまたは少なくとも約１×１０１３リットル／モルまたは少なくとも約１×１０１４リットル／モルまたはそれ以上の平衡結合定数（Ｋａｆｆ）のことを指す。「高親和性」結合は、抗体アイソタイプごとに異なり得る。平衡解離定数であるＫＤは、抗体親和性を記載するために使用される用語でもあり、Ｋａｆｆの逆数である。
【０１１８】
アジュバント
本発明の組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原タンパク質の１もしくはそれ以上の免疫原性をさらに高めるアジュバントを含み得る。そのようなアジュバントは、ペプチドまたはペプチドの組み合わせに対する免疫応答を高めるように作用し、ゆえに本組成物中で必要な抗原の量および／または適切な免疫応答を発生させるために必要な注射の頻度を減少させる、任意の化合物を含む。好適なアジュバントは、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける使用に適したものを含む。ヒトにおいて使用され得る公知の好適なアジュバントの例は、必ずしもこれに限定されるものではないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａ抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６４：７１３；国際公開９０／０３１８４号パンフレット、同第９６／１１７１１号パンフレット、同第００／４８６３０号パンフレット、同第９８／３６７７２号パンフレット、同第００／４１７２０号パンフレット、同第０６／１３４４２３号パンフレット、および同第０７／０２６１９０号パンフレットを参照のこと）、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子、ＱｕｉｌＡ、インターロイキンなどを含む。これに限定されるものではないが動物実験を含む動物用途の場合、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、ならびに細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中に含むＲＩＢＩを使用することができる。
【０１１９】
本組成物の有効性を高めるさらに例示的なアジュバントは、これに限定されるものではないが、（１）水中油型エマルション製剤（ムラミルペプチド（下記を参照のこと）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激物質を含むかまたは含まない）、例えば、（ａ）マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化される、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および０．５％Ｓｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）を含む（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）に共有結合されたムラミルトリペプチドを選択的に含む）、ＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  &  Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５のＣｈａｐｔｅｒ１０）、（ｂ）サブミクロンエマルションにマイクロ流動体化されるかまたはより大きな粒径のエマルションを生成するようにボルテックスされる、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック保護ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１もしくはそれ以上の細菌細胞壁成分（例えば、モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ））を含む、ＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）；（２）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，マサチューセッツ州Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）、Ａｂｉｓｃｏ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ，スウェーデン）、またはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，オーストラリア））が使用され得るか、またはそれらから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体）（このＩＳＣＯＭＳはさらなる界面活性剤を欠く場合がある））、例えば、国際公開００／０７６２１号パンフレット；（３）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開９９／４４６３６号パンフレット）など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（５）選択的に、肺炎球菌のサッカリドとともに使用されるとき実質的にミョウバンの非存在下での、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４、例えば、国際公開００／５６３５８号パンフレット；（６）例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルションと３ｄＭＰＬとの組み合わせ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００，１９，６１８−６２２；Ｋｒｉｅｇ  Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ２００１  ３：１５−２４；Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９７，９４，１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０，８７０−８７６；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９７，１８６，１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉ  ｅ／  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，１６，１２１６−１２２４、Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５７，１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５６，４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１６７，７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５７，２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，１４７，１７５９−１７６４；Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５７，４９１８−４９２５；Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５７，５３９４−５４０２；Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０，４７５５−４７６１；およびＹｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０，５８９８−５９０６；国際特許出願国際公開９６／０２５５５号パンフレット、同第９８／１６２４７号パンフレット、同第９８／１８８１０号パンフレット、同第９８／４０１００号パンフレット、同第９８／５５４９５号パンフレット、同第９８／３７９１９号パンフレット、および同第９８／５２５８１号パンフレット］、すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド（当該シトシンはメチル化されていない）を含むオリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、国際公開第９９／５２５４９号パンフレット；（９）オクトキシノールと組み合わされるポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性物質（国際公開第０１／２１２０７号パンフレット）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性物質と組み合わされるポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性物質（国際公開第０１／２１１５２号パンフレット）；（１０）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（国際公開第００／６２８００号パンフレット）；（１１）免疫賦活薬および金属塩粒子、例えば、国際公開第００／２３１０５号パンフレット；��１２）サポニンおよび水中油型エマルション、例えば、国際公開第９９／１１２４１号パンフレット；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（選択的に＋ステロール）、例えば、国際公開第９８／５７６５９号パンフレット；（１４）Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕｔａｒｎｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含む、ムラミルペプチドなどの本組成物の有効性を高める免疫刺激物質として作用する他の物質、（１５）天然のまたは合成された、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するリガンド（例えば、Ｋａｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，ｐ１５５２−９に記載されているような）（ポリＩ：ＣなどのＴＬＲ３リガンド、ならびにＨｉｌｔｏｎｏｌおよびＡｍｐｌｉｇｅｎなどの類似の化合物を含む）を含む。
【０１２０】
アジュバントは、例えば、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン（ａｖｒｉｄｉｎｅ）、水性アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、キトサン系アジュバント、および任意の様々なサポニン）、油、および当該分野で公知の他の物質（例えば、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、ＬＰＳ、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、およびそれらの組み合わせ）（Ｓｃｈｉｊｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１２：４５６）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌｐｈｌｅｉ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）（米国特許第４，７４４，９８４号明細書）、Ｍ．ｐｈｌｅｉ  ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、Ｍ−ＤＮＡ−Ｍ．ｐｈｌｅｉ細胞壁複合体（ＭＣＣ）も含み得る。例えば、本明細書中で乳化剤として働き得る化合物は、天然および合成の乳化剤、ならびに陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性の化合物を含む。前記合成の化合物のうち、陰イオン性乳化剤は、例えば、ラウリン酸およびオレイン酸のカリウム、ナトリウム、およびアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩（すなわち、金属石鹸）、ならびにラウリル硫酸ナトリウムなどの有機スルホネートを含む。合成陽イオン性物質は、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌｔｒｈｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｌｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含み、合成非イオン性物質は、グリセリルエステル（例えば、モノステアリン酸グリセリル）、ポリオキシエチレングリコールエステルおよびエーテル、ならびにソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノパルミチン酸ソルビタン）およびそれらのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）によって例証される。天然の乳化剤には、アカシア、ゼラチン、レシチン、およびコレステロールが含まれる。
【０１２１】
他の好適なアジュバントは、油性成分（例えば、単一の油、油の混合物、油中水型エマルション、または水中油型エマルション）を用いて形成され得る。前記油は、鉱油、植物油、または動物油であり得る。鉱油または油性成分が鉱油である水中油型エマルションが、好ましい。この点において、「鉱油」は、蒸留法によってペトロラタムから得られる液体炭化水素の混合物と本明細書中で定義される；当該用語は、「流動パラフィン」、「流動ワセリン」、および「白色鉱油」と同義である。当該用語は、「軽油」、すなわち、ペトロラタムの蒸留によって同様に得られるが白色鉱油よりもわずかに低い比重を有する油を含むとも意図されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。特に好ましい油性成分は、ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ネブラスカ州Ｒａｌｓｔｏｎから入手可能なＥＭＵＬＳＩＧＥＮ  ＰＬＵＳ（商標）という商品名で販売されている水中油型エマルション（軽油ならびに保存剤として０．０５％ホルマリンおよび３０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む）である。好適な動物油は、例えば、タラ肝油、ハリバ油（ｈａｌｉｂｕｔ  ｏｉｌ）、メンハーデン油、オレンジラフィー油、およびサメ肝油（これらのすべてが、商業的に入手可能である）を含む。好適な植物油は、これに限定されるものではないが、カノーラ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、落花生油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油などを含む。
【０１２２】
あるいは、いくつかの脂肪族窒素塩基がアジュバントとして前記ワクチン製剤とともに使用され得る。例えば、公知の免疫学的アジュバントには、アミン類（ｍｉｎｅｓ）、四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン、およびチオウロニウム（Ｇａｌｌ，Ｄ．（１９６６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１：３６９−３８６）が含まれる。具体的な化合物としては、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）（Ｋｏｄａｋから入手可能）およびＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジイン（「アブリジン」）が挙げられる。免疫学的アジュバントとしてのＤＤＡの使用は、報告されている；例えば、Ｋｏｄａｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５６（１）：１−５（１９８６）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５（３）：１６３−１８７（１９９０）；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７：１２３−１３２（１９８８）；Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８（２）：２５６−２６２（１９８９）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９７（２）：１５９−１６４（１９８７）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５８（２）：２４５−２５０（１９８６）；およびＩｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６８（３）：２０１−２０８（１９８２）を参照のこと。アブリジンは、周知のアジュバントでもある。例えば、ワクチンアジュバントとしての、概してΝ，Ν−高級アルキル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンの使用および特にアブリジンの使用を記載しているＷｏｌｆｆ，ＩＩＩらに対する米国特許第４，３１０，５５０号明細書を参照のこと。Ｂａｂｉｕｋに対する米国特許第５，１５１，２６７号明細書およびＢａｂｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５９：５７−６６もまた、ワクチンアジュバントとしてのアブリジンの使用に関する。
【０１２３】
前記ワクチンとともに使用するためのアジュバントは、ＤＤＡを含むＥＭＵＬＳＩＧＥＮ  ＰＬＵＳ（商標）アジュバントの改変型である「ＶＳＡ３」である（米国特許第５，９５１，９８８号明細書（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１２４】
本発明の観点におけるペプチドの１もしくはそれ以上を含む組成物は、当業者に周知の手法（これに限定されるものではないが、混合、超音波処理、およびマイクロ流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｔｉｏｎ）を含む）を用いて本組成物調製物および前記アジュバントを均一かつ完全に混和することによって調製され得る。前記アジュバントは、好ましくは、本組成物の約１０〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２０〜４０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約２０〜３０％もしくは３５％（ｖ／ｖ）、またはこれらの範囲内の任意の整数を構成する。
【０１２５】
医薬組成物
本発明の観点は、有効免疫量の単離されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原タンパク質またはそのような抗原性タンパク質をコードする単離された核酸および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供し、前記組成物は、脊椎動物被験体においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を減少させるか、排除するか、または予防するのに有効である。さらなる態様は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する受動免疫を提供するための、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原タンパク質に対する抗体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２６】
本発明の組成物は、注射可能物質として、液体の溶液もしくは懸濁液として、または注射前に液体ビヒクルで溶解もしくは懸濁するのに適した固体の形態として、通常、調製される。前記調製物は、乳化される固体の形態、またはリポソームビヒクルもしくは持続送達のために使用される他の粒状担体に被包された活性成分としても調製され得る。例えば、前記ワクチンは、油性エマルション、油中水型エマルション、水中油中水型エマルション、部位特異的エマルション、長時間残存（ｌｏｎｇ−ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ）エマルション、粘着性エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、リポソーム、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子、および様々な天然または合成ポリマー（例えば、非吸収性不透過性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル共重合体およびＨｙｔｒｅｌ（登録商標）共重合体）、膨潤性ポリマー（例えば、ヒドロゲル）、または吸収性ポリマー（例えば、コラーゲンおよびある特定のポリ酸またはポリエステル（例えば、ワクチンの徐放を可能にする吸収性縫合糸を作製するために使用されるもの））の形態であり得る。
【０１２７】
ポリペプチドは、哺乳動物被験体に送達するための組成物に製剤化される。当該組成物は、単独で、および／または薬学的に許容可能なビヒクルもしくは賦形剤と混合された状態で、投与される。好適なビヒクルは、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、前記ビヒクルは、組成物の場合はその組成物の有効性を高める微量の補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント）を含み得る。好適なアジュバントは、上に記載されたものである。本発明の組成物は、補助的物質（例えば、薬理学的物質、サイトカイン、または他の生物学的応答変更物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ））も含み得る。
【０１２８】
さらに、例えば、１もしくはそれ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原を含む組成物は、中性または塩の形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）とともに形成される酸付加塩（活性なポリペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）を含む。遊離カルボキシル基から形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）からも得ることができる。
【０１２９】
そのような剤形を調製する実際の方法は、公知であるか、または当業者に明らかだろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ，最新版を参照のこと。
【０１３０】
本組成物は、有効量のタンパク質を含むように製剤化され、その正確な量は、当業者によって容易に決定され、前記量は、処置される動物および当該動物の免疫系が抗体を合成する能力に依存する。投与される組成物または製剤は、処置される被験体において所望の状態を達成するのに適切な量の１もしくはそれ以上の分泌タンパク質を含む。本発明の場合、タンパク質を含む組成物の治療有効量は、約０．０５〜１５００μｇのタンパク質、好ましくは約１０〜１０００μｇのタンパク質、より好ましくは約３０〜５００μｇ、最も好ましくは約４０〜３００ｐｇ、またはこれらの値の間の任意の整数を含む。例えば、本発明のペプチドは、約０．１μｇ〜約２００ｍｇ、例えば、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの用量で被験体に投与され得、例えば、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、および／または１年後に選択的な追加免疫が行われる。予防目的の場合、各投与におけるペプチドの量は、典型的な被ワクチン接種者において有意な有害副作用無しに免疫防御応答を誘導する量として選択される。初回のワクチン接種の後、適切な間隔をあけて被験体に１回または数回の追加免疫を行うことがある。任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、種々の因子（使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路および排出速度、薬物の組み合わせ、ならびに治療を受けている特定の疾患の重症度を含む）に依存することが理解される。
【０１３１】
投与経路は、これに限定されるものではないが、経口的、局所的、皮下、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、経皮的、および真皮下を含む。投与経路に応じて、１投与あたりの体積は、好ましくは約０．００１〜１０ｍｌ、より好ましくは約０．０１〜５ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜３ｍｌである。組成物は、被験体の年齢、体重、および状態、使用される特定のワクチン製剤、ならびに投与経路にとって適切なスケジュールおよび時間にわたって、単回処置または複数回処置（追加免疫）で投与され得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明に係るポリペプチドまたは医薬組成物の単回投与が行われる。他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドまたは医薬組成物の複数回投与が行われる。投与の頻度は、種々の因子のいずれか、例えば、症状の重症度、所望の免疫防御の程度、当該組成物が予防目的で使用されるのかまたは治療目的で使用されるのかなどに応じて変動し得る。例えば、いくつかの実施形態において、本発明に係るペプチドまたは医薬組成物は、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、１週間おきに（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おきに（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日に２回（ｑｉｄ）、または１日に３回（ｔｉｄ）投与される。本発明の組成物が、予防目的で使用されるとき、それらは一般に、初回刺激および追加刺激の投与の両方のために投与される。追加刺激の投与は、適切に間隔があけられるか、または好ましくは、年１回もしくは循環する抗体のレベルが所望のレベル未満に低下するようなときに投与されることが予想される。追加刺激の投与は、当初の免疫原性担体分子の非存在下における前記ペプチドから成ることがある。そのような追加免疫構築物は、代替の免疫原性担体を含んでもよいし、いかなる担体も含まなくてもよい。そのような追加免疫組成物は、アジュバント有りまたは無しで製剤化され得る。
【０１３３】
本発明に係るポリペプチドの投与の持続時間、例えば、ペプチドが投与される期間は、種々の因子のいずれか、例えば、患者の応答などに応じて変動し得る。例えば、ポリペプチドは、約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１ヶ月〜約２ヶ月、約２ヶ月〜約４ヶ月、約４ヶ月〜約６ヶ月、約６ヶ月〜約８ヶ月、約８ヶ月〜約１年、約１年〜約２年、もしくは約２年〜約４年の範囲の期間、またはそれ以上にわたって投与され得る。
【０１３４】
任意の好適な医薬送達手段を使用して、脊椎動物被験体に本組成物を送達することができる。例えば、従来の針注射器、スプリングまたは圧縮ガス（空気）注射器（Ｓｍｏｏｔに対する米国特許第１，６０５，７６３号明細書；Ｌａｕｒｅｎｓに対する同第３，７８８，３１５号明細書；Ｃｌａｒｋらに対する同第３，８５３，１２５号明細書；Ｍｏｒｒｏｗらに対する同第４，５９６，５５６号明細書；およびＤｕｎｌａｐに対する同第５，０６２，８３０号明細書）、液体ジェット注射器（Ｓｃｈｅｒｅｒに対する米国特許第２，７５４，８１８号明細書；Ｇｏｒｄｏｎに対する同第３，３３０，２７６号明細書；およびＬｉｎｄｃａｎｅｒらに対する同第４，５１８，３８５号明細書）、および粒子注射器（ＭｃＣａｂｅらに対する米国特許第５，１４９，６５５号明細書およびＳａｎｆｏｒｄらに対する同第５，２０４，２５３号明細書）のすべてが、本組成物の送達にとって適切である。
【０１３５】
ジェット注射器が使用される場合、液体ワクチン組成物の単回ジェットが、高圧かつ高速、例えば、１２００〜１４００ＰＳＩで排出されることにより、皮膚に穴を開け、免疫化に適した深さまで浸透する。
【０１３６】
前記組成物または核酸またはポリペプチドまたは抗体は、薬学的に許容可能な担体（賦形剤）と併用されることにより、薬理学的組成物を形成し得る。薬学的に許容可能な担体は、本発明の医薬組成物の吸収速度またはクリアランス速度を例えば安定させるか、または高めるかもしくは減じるように作用する生理的に許容可能な化合物を含み得る。生理的に許容可能な化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、前記ペプチドもしくはポリペプチドのクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤、あるいは他の安定剤および／または緩衝剤を含み得る。界面活性剤もまた、リポソーム担体を含む医薬組成物の吸収を安定させるためまたは高めるかもしくは減じるために使用され得る。薬学的に許容可能な担体ならびにペプチドおよびポリペプチドに対する製剤は、当業者に公知であり、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照のこと。
【０１３７】
他の生理的に許容可能な化合物は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または微生物の増殖もしくは作用を防止するために特に有用な保存剤を含む。様々な保存剤が周知であり、それには、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。当業者は、生理的に許容可能な化合物を含む薬学的に許容可能な担体の選択が、例えば、本発明のペプチドまたはポリペプチドの投与経路およびその特定の生理化学的な特徴に依存することを認識するだろう。
【０１３８】
１つの態様において、前記組成物が水溶性である場合、前記組成物または核酸、ペプチド、ポリペプチド、もしくは抗体の溶液は、薬学的に許容可能な担体、例えば、水性担体に溶解される。経腸的、非経口的、または経粘膜的な薬物送達のための製剤において使用され得る水溶液の例としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ハンクス溶液、リンガー溶液、デキストロース／食塩水、グルコース溶液などが挙げられる。前記製剤は、生理学的状態に近づけるために必要であるとき、薬学的に許容可能な補助物質（例えば、緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含み得る。添加物は、殺菌剤または安定剤などのさらなる活性成分も含み得る。例えば、前記溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、またはオレイン酸トリエタノールアミンを含み得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌法によって滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、または凍結乾燥され得、その凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌された水溶液と混和される。これらの製剤中のペプチドの濃度は、大きく変動することがあり、選択される特定の投与様式および患者のニーズに従って、主に、液量、粘性、体重などに基づいて選択される。
【０１３９】
経腸的（経口）投与の場合は、固体製剤が使用され得る。それらは、例えば、丸剤、錠剤、散剤、またはカプセルとして製剤化され得る。固体組成物の場合、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の無毒性固体担体が使用され得る。経口投与の場合、通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙された担体）のいずれかおよび一般に１０％〜９５％の活性成分（例えば、ペプチド）を組み込むことによって、薬学的に許容可能な無毒性組成物が形成される。非固体製剤も、経腸的投与のために使用できる。前記担体は、石油、動物油、植物油、または合成起源の油を含む様々な油、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などから選択され得る。好適な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが挙げられる。
【０１４０】
組成物または核酸、ポリペプチド、もしくは抗体は、経口的に投与されるとき、消化から保護され得る。これは、前記核酸、ポリペプチド、もしくは抗体をある組成物と複合体化してそれを酸性のおよび酵素的な加水分解に対して抵抗性にすることによって、または前記核酸、ペプチド、もしくはポリペプチドをリポソームなどの適切に抵抗性の担体の中に詰めることによって、達成できる。消化から化合物を保護する手段は、当該分野で周知である。例えば、Ｆｉｘ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０−１７６４，１９９６；Ｓａｍａｎｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９−１３５，１９９６；治療薬の経口送達のための脂質組成物を記載している米国特許第５，３９１，３７７号明細書を参照のこと（リポソーム送達は、下記でさらに詳細に論じられる）。
【０１４１】
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものでもあり得る。経粘膜的または経皮的投与の場合、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、前記製剤中で使用され得る。そのような浸透剤は、当該分野で広く公知であり、それらとしては、例えば、経粘膜的投与の場合、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、浸透を促進するために界面活性剤が使用され得る。経粘膜的投与は、点鼻薬によるものまたは坐剤を使用するものであり得る。例えば、Ｓａｙａｎｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１３：８５−１８４，１９９６を参照のこと。局所的な経皮的投与の場合、前記薬剤は、軟膏、クリーム、膏薬、粉末、およびゲルに製剤化される。経皮的送達系は、例えば、パッチも含み得る。
【０１４２】
本発明の観点としての組成物または核酸、ポリペプチド、もしくは抗体は、前記製剤を内部に送達できる持続送達または徐放機序でも投与され得る。例えば、生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ）ミクロスフェアもしくはカプセルまたはペプチドの持続送達が可能な他の生分解性ポリマー構造が、本発明の製剤に含められ得る（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３−１５７，１９９８を参照のこと）。
【０１４３】
吸入の場合、本発明の観点としての組成物または核酸、核酸、ポリペプチド、もしくは抗体は、当該分野で公知の任意のシステム（乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、空気ジェット噴霧器、噴霧システムなどを含む）を用いて送達され得る。例えば、Ｐａｔｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：１４１−１４３，１９９８；例えば、Ｄｕｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、Ａｒａｄｉｇｒｎ（カリフォルニア州Ｈａｙｗａｒｄ）、Ａｅｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）などによる、ポリペプチド高分子用の製品および吸入送達系を参照のこと。例えば、前記医薬製剤は、エアロゾルまたはミストの形態で投与され得る。エアロゾル投与の場合、前記製剤は、微粉化された形態で、界面活性物質および噴霧剤とともに供給され得る。別の態様では、呼吸組織に前記製剤を送達するためのデバイスは、前記製剤を気化させる吸入器である。他の液体送達系としては、例えば、空気ジェット噴霧器が挙げられる。
【０１４４】
本発明の医薬を調製する際、薬物動態および体内分布を変化させるために種々の製剤の改変を用いることおよび操作することができる。薬物動態および体内分布を変化させるためのいくつかの方法が、当業者に公知である。そのような方法の例としては、物質（例えば、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム、下記を参照のこと）、炭水化物、または合成ポリマー（上で論じられたもの））から構成されるベシクル中での本発明の組成物の保護が挙げられる。薬物動態の一般的な考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ３７〜３９を参照のこと。
【０１４５】
本発明の組成物または核酸、ポリペプチド、もしくは抗体は、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、全身的、局部的、または局所的に（例えば、腫瘍に直接または腫瘍に向かって）；動脈内、鞘内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、胸膜腔内、局所的、経口、または局所投与、皮下、気管内（例えば、エアロゾルによって）、または経粘膜的（例えば、頬側、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻の粘膜）に、単独でまたは医薬組成物として送達され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓを参照のこと。例えば、特定の器官に焦点を合わせた「局部的作用」の場合、１つの投与様式は、例えば、特定の器官、例えば、脳およびＣＮＳに焦点を合わせた動脈内または鞘内（ＩＴ）注射を含む（例えば、Ｇｕｒｕｎ，Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ．８５：３１７−３２３，１９９７を参照のこと）。例えば、本発明の核酸、ペプチド、またはポリペプチドを直接脳に送達することが望まれる場合で好ましい場合、頚動脈内注射。高い全身投与量が必要である場合、非経口投与が好ましい送達経路である。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓに詳細に記載されている。Ｂａｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８０：６５−７５，１９９７；Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５２：３１−３８，１９９７；Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：５０７−５１５，１９９７もまた参照のこと。
【０１４６】
１つの態様において、本発明の組成物または核酸、ポリペプチド、もしくは抗体を含む医薬製剤は、脂質単層または二重層、例えば、リポソームに組み込まれる。例えば、米国特許第６，１１０，４９０号明細書；同第６，０９６，７１６号明細書；同第５，２８３，１８５号明細書；同第５，２７９，８３３号明細書を参照のこと。本発明の観点は、本発明の水溶性の核酸、ペプチド、またはポリペプチドが、前記単層または二重層の表面に付着した製剤も提供する。例えば、ヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソームにペプチドが付着され得る（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：７０５−７０８，１９９５を参照のこと）。リポソームまたは任意の形態の脂質膜（例えば、平面脂質膜またはインタクトな細胞、例えば、赤血球の細胞膜）が使用され得る。リポソーム製剤は、静脈内、経皮的（例えば、Ｖｕｔｌａ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：５−８，１９９６を参照のこと）、経粘膜的、または経口的な投与を含む任意の手段によるものであり得る。本発明は、本発明の核酸、ペプチド、および／またはポリペプチドがミセルおよび／またはリポソーム内に組み込まれた医薬品も提供する（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：２３−２８，１９９４；Ｗｏｏｄｌｅ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：２６０−２６５，１９９２を参照のこと）。リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法に従って調製され得、それらは、当該分野で周知でもある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７−２１０，１９９５；Ａｌｖｉｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５−３１，１９９５；Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７，１９８０、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、および同第４，８３７，０２８号明細書を参照のこと。
【０１４７】
１つの態様において、前記組成物は、身体からの急速な排出から前記タンパク質を保護する担体を用いて調製される（例えば、植込錠およびマイクロカプセル化された送達系を含む放出制御製剤）。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。そのような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかである。当該材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容可能な担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているような当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１４８】
投与を容易にするためおよび投与量を均一にするために、投薬単位形態（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）で経口または非経口組成物を製剤化することが有益である。本明細書中で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位のことを指す；各単位は、要求される薬学的担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性な化合物を含む。
【０１４９】
そのような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を測定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって測定され得る。毒性効果と治療効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞に対する潜在的な損害を最小にし、それにより、副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意すべきである。
【０１５０】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するためのある範囲の投与量を製剤化する際に使用され得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性無しにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。その投与量は、使用される剤形および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物の場合、治療的に有効な用量は、最初は細胞培養アッセイから見積もられ得る。例えば、炎症または望ましくない炎症を伴う障害の動物モデルにおいて、細胞培養物において測定されたＩＣ５０（すなわち、最大半量の症状阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成する用量が製剤化され得る。そのような情報を用いることにより、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、一般に標識された物質の例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。研究、例えば、前臨床プロトコルにおいて有用な動物モデルは、当該分野で公知であり、例えば、Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２５：３５−４５，２００３）およびＮｉｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４（１２）：１２３−５３，２０００）に記載されたものなどの炎症性障害についての動物モデルである。
【０１５１】
本明細書中で定義されるとき、抗体などのワクチン組成物、タンパク質、またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効な投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、もしくは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。前記タンパク質またはポリペプチドは、約１〜１０週間、例えば、２〜８週間、約３〜７週間、または約４、５、もしくは６週間にわたって、１日または１週間あたり１回または数回投与され得る。場合によっては、前記投与量は、数ヶ月間またはそれ以上にわたって必要とされ得る。当業者は、ある特定の因子（これに限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む）が、被験体を効果的に処置するために必要とされる投与量およびタイミングに影響し得ることを認識するだろう。さらに、治療有効量の薬剤（例えば、タンパク質またはポリペプチド（抗体を含む））での被験体の処置は、単回の処置を含み得るか、または好ましくは、ひと続きの処置を含み得る。
【０１５２】
抗体の場合、前記投与量は、一般に、約１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体は、一般に、ヒトの体内で他の抗体よりも長い半減期を有する。したがって、より少ない投与量およびより低い頻度の投与が可能であることが多い。脂質化などの修飾を用いることにより、抗体を安定化すること、ならびに取り込みおよび組織透過（例えば、脳への）を増加させることができる。抗体を脂質化するための方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４：１９３，１９９７）に記載されている。
【０１５３】
本発明の観点は、有効免疫量の単離されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を包含し、前記組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を減少させるかまたは排除するために脊椎動物被験体において有効である。
【０１５４】
前記医薬組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含められ得る。
【０１５５】
本明細書中に記載される化合物は、本明細書中に記載される任意の処置方法において使用するための医薬の調製のために使用され得る。
【０１５６】
前記医薬組成物は、通常、滅菌された実質的に等張性のものとして、かつ米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の適正製造規範（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＭＰ）のすべての規制を全面順守して、製剤化される。
【０１５７】
処置レジメン：薬物動態
本発明の医薬組成物態様は、投与方法に応じて種々の単位剤形で投与され得る。典型的なワクチン組成物または核酸、ペプチド、およびポリペプチド、ならびに抗体医薬組成物に対する投与量は、当業者に周知である。そのような投与量は、典型的には助言的な性質のものであり、特定の治療的背景または患者の寛容に応じて調整される。これを達成するのに適切な核酸、ペプチド、またはポリペプチドの量は、「治療的に有効な用量」と定義される。この用途にとって有効な投与スケジュールおよび投与量、すなわち、「投与レジメン」は、種々の因子（疾患または状態のステージ、疾患または状態の重症度、患者の全般的な健康状態、患者の身体状態、年齢、医薬製剤、および活性物質の濃度などを含む）に依存する。ある患者に対する投与レジメンを計算する際、投与様式も考慮される。前記投与レジメンは、薬物動態、すなわち、医薬組成物の吸収速度、バイオアベイラビリティ、代謝、クリアランスなども考慮しなければならない。例えば、最新のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ｅｇｌｅｔｏｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：１４３１−１４３９，１９９７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０を参照のこと。
【０１５８】
治療上の用途では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染のリスクがあるかまたは活動性感染に罹患している患者に、当該状態またはある疾患および／もしくはその合併症を少なくとも部分的に停止するかまたは妨害するのに十分な量で組成物が投与される。例えば、１つの態様において、静脈内（ＩＶ）投与に対する可溶性ペプチド医薬組成物の投与量を含むワクチン組成物は、数時間（典型的には、１、３、または６時間）にわたって投与される約０．０１ｍｇ／ｈｒ〜約１．０ｍｇ／ｈｒであり得、それは、数週間にわたって間欠サイクルで反復され得る。特に当該薬物が血流ではなく隔離された部位（例えば、体腔または器官の内腔、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ））に投与されるとき、上記よりもかなり高い投与量（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌまでの範囲）が使用され得る。
【０１５９】
処置方法
本発明の組成物を投与することによって、ある障害のリスクがある（またはそれに対して感受性の）被験体を処置する予防的方法と治療的方法の両方、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を予防もしくは処置する方法も本明細書中に記載される。
【０１６０】
予防的方法
本発明の観点は、有効免疫量のタンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与することによって、被験体において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染もしくは保菌またはその両方を予防または処置するための方法に関し、前記組成物は、脊椎動物被験体においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を減少させるかまたは排除するために有効である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染および保菌によって引き起こされるかもしくはそれに関与する障害または望ましくない症状のリスクがある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知であるような診断または予後診断アッセイの任意の組み合わせによって識別され得る。通常、そのような障害は、胃腸障害（例えば、腹部膨満、下痢、および腹痛）を伴う。予防薬としての前記物質の投与は、前記物質の非存在下の症状と比べて前記症状が予防されるか、遅延されるか、または減少するように、症状が顕れる前に行われ得る。
【０１６１】
治療的方法
本発明の観点は、有効免疫量のタンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与することによって、被験体において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染または保菌を予防または処置するための方法に関し、前記組成物は、脊椎動物被験体においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を減少させるかまたは排除するために有効である。別の実施形態において、有効量の抗体および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与することによって、被験体において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染または保菌を予防または処置するための方法に関し、前記組成物は、脊椎動物被験体においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の感染を減少させるかまたは排除するために有効である。
【０１６２】
キット
本発明は、前記組成物、例えば、核酸、発現カセット、ベクター、細胞、ポリペプチド、および抗体を有するキットを提供する。前記キットは、本明細書中に記載されるような本発明の方法および使用法を教示する指示材料も有し得る。
【０１６３】
本発明を実施するための特定の態様の以下の例は、例証目的のためだけに提供されており、決して本発明の範囲を限定すると意図されていない。
【実施例１】
【０１６４】
実施例１：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＢｃｌＡ３タンパク質の発現および精製
強毒性株Ｒ２０２９１由来のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＢｃｌＡ３配列を、ＮＣＢＩ公的データベース（アクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（領域：３８０７４３０〜３８０９４６６））から得た。標準的な分子生物学的方法を用いて、ＢｃｌＡ３遺伝子のシグナルペプチドおよび膜貫通領域を除去し、ＨＡＶＴ２０リーダー配列、Ｈｉｓタグ、およびＫｏｚａｋ配列を付加した後、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を用いて、当該構築物をｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドにクローニングした（配列ＩＤ番号２３）。続いて、ＢｃｌＡ３の前記配列を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した。
【０１６５】
ＢｃｌＡ３に対応するプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｇｉｇａキットを使用して、グリセロールストックから増殖させた培養物から抽出した。前記プラスミドＤＮＡの同一性を、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素による制限消化によって確認した（図１Ａを参照のこと）。
【０１６６】
ＢｃｌＡ３タンパク質の大規模発現のためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞において大規模トランスフェクション（３００ｍｌ）を行った。合計３×１０８細胞を３００μｇのＢｃｌＡ３プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後および７日後に遠心分離によって上清を回収した。トランスフェクトされた上清を、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣを使用してＮｉカラム（ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（ＦＰＬＣ手順については表３を参照のこと）。溶出されたタンパク質の緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換し、ＢＣＡアッセイによってタンパク質濃度を測定した。合計１６ｍｇのタンパク質が、３００ｍｌの培養物から精製された。精製されたタンパク質を、サイズ測定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、それを、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとして探索することにより、Ｈｉｓタグを含む正しいサイズのタンパク質が得られていたかを確認した（図１Ｂを参照のこと）。予測サイズよりも大きいタンパク質が得られ、それはおそらく、当該タンパク質が哺乳動物細胞内での発現によってグリコシル化されたことに起因することを本発明者らは見出した。当該タンパク質の同一性をさらに確認するために、質量分析を使用した。
【０１６７】
表３：トランスフェクトされた上清のＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰ精製のための手順
【表３】
2014515594.tif 000018
2014515594.tif 000019
【実施例２】
【０１６８】
実施例２：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ａｌｒタンパク質の発現および精製
強毒性株Ｒ２０２９１由来のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ａｌｒ配列を、ＮＣＢＩ公的データベース（アクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（領域：３９３６３１３〜３９３７４７０））から得た。標準的な分子生物学的方法を用いて、Ａｌｒ遺伝子のシグナルペプチドおよび膜貫通領域を除去し、ＨＡＶＴ２０リーダー配列、Ｈｉｓタグ、およびＫｏｚａｋ配列を付加した後、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を用いて、当該構築物をｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドにクローニングした（配列ＩＤ番号２４）。続いて、Ａｌｒの前記配列を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した。
【０１６９】
Ａｌｒに対応するプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｇｉｇａキットを使用して、グリセロールストックから増殖させた培養物から抽出した。前記プラスミドＤＮＡの同一性を、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素による制限消化によって確認した（図２Ａを参照のこと）。
【０１７０】
Ａｌｒタンパク質の大規模発現のためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞において大規模トランスフェクション（３００ｍｌ）を行った。合計３×１０８細胞を３００μｇのＡｌｒプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後および７日後に遠心分離（室温において３０００ｒｐｍで１５分間）によって上清を回収した。トランスフェクトされた上清を、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣを使用してＮｉカラム（ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（ＦＰＬＣ手順については表３を参照のこと）。溶出されたタンパク質の緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換し、ＢＣＡアッセイによってタンパク質濃度を測定した。合計３４ｍｇのタンパク質が、３００ｍｌの培養物から精製された。溶出されたタンパク質が、当該タンパク質が濃縮されるにつれて濃くなる異なる黄色であるという事実は興味深かった。精製されたタンパク質を、サイズ測定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、それを、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとして探索することにより、Ｈｉｓタグを含む正しいサイズのタンパク質が得られていたかを確認した（図２Ｃを参照のこと）。当該タンパク質は、正しいサイズに泳動したが、前記抗Ｈｉｓタグ抗体に結合せず、これは当該タンパク質のフォールディングに起因し得ることを本発明者らは見出した。本発明者らは、より大きいバンドが非還元サンプルにおいて観察され、当該ゲルがベータ−メルカプトエタノールで処理されたサンプルでは正しいサイズのバンドに分離されたので、タンパク質の凝集が生じている可能性があることを証明した（図２Ｂ）。当該タンパク質の同一性を確認するために、質量分析を使用した。
【実施例３】
【０１７１】
実施例３：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＳｌｐＡパラログタンパク質の発現および精製
強毒性株Ｒ２０２９１由来のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＳｌｐＡパラログ配列を、ＮＣＢＩ公的データベース（アクセッション番号：ＦＮ５４５８１６（領域：３１５７３０４〜３１５９１７５））から得た。標準的な分子生物学的方法を用いて、ＳｌｐＡパラログ遺伝子のシグナルペプチドおよび膜貫通領域を除去し、ＨＡＶＴ２０リーダー配列、Ｈｉｓタグ、およびＫｏｚａｋ配列を付加した後、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を用いて、当該構築物をｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドにクローニングした（配列ＩＤ番号２５）。続いて、ＳｌｐＡパラログの前記配列を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した。
【０１７２】
ＳｌｐＡパラログに対応するプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｇｉｇａキットを使用して、グリセロールストックから増殖させた培養物から抽出した。前記プラスミドＤＮＡの同一性を、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素による制限消化によって確認した（図３Ａを参照のこと）。
【０１７３】
ＳｌｐＡパラログタンパク質の大規模発現のためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞において大規模トランスフェクション（３００ｍｌ）を行った。合計３×１０８細胞を３００μｇのＳｌｐＡパラログプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後および７日後に遠心分離（室温において３０００ｒｐｍで１５分間）によって上清を回収した。トランスフェクトされた上清を、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣを使用してＮｉカラム（ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（ＦＰＬＣ手順については表３を参照のこと）。溶出されたタンパク質の緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換し、ＢＣＡアッセイによってタンパク質濃度を測定した。合計１４ｍｇのタンパク質が、３００ｍｌの培養物から精製された。精製されたタンパク質を、サイズ測定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、それを、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとして探索することにより、Ｈｉｓタグを含む正しいサイズのタンパク質が得られていたかを確認した（図３Ｂを参照のこと）。当該タンパク質は、８４ｋＤａという正しいサイズに泳動したが、前記抗Ｈｉｓタグ抗体に結合せず、これは当該タンパク質のフォールディングに起因し得ることを本発明者らは見出した。当該タンパク質の同一性を確認するために、質量分析を使用した。
【実施例４】
【０１７４】
実施例４：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＣＤ１０２１タンパク質の発現および精製
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＣＤ１０２１核酸配列を、ＮＣＢＩ公的データベース（アクセッション番号：ＡＭ１８０３５５（領域：１１９１７２５〜１１９３６３２；国際公開第２００９／１０８６５２号パンフレットもまた参照のこと）から得た。標準的な分子生物学的方法を用いて、ＣＤ１０２１遺伝子のシグナルペプチドおよび膜貫通領域を除去し、ＨＡＶＴ２０リーダー配列、Ｈｉｓタグ、およびＫｏｚａｋ配列を付加した後、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を用いて、当該構築物をｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドにクローニングした（配列ＩＤ番号２６）。続いて、ＣＤ１０２１の前記核酸配列を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した。
【０１７５】
ＣＤ１０２１に対応するプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｇｉｇａキットを使用して、グリセロールストックから増殖させた培養物から抽出した。前記プラスミドＤＮＡの同一性を、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素による制限消化によって確認した（図４Ａを参照のこと）。
【０１７６】
ＣＤ１０２１タンパク質の大規模発現のためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞において大規模トランスフェクション（３００ｍｌ）を行った。合計３×１０８細胞を３００μｇのＣＤ１０２１プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後および７日後に遠心分離（室温において３０００ｒｐｍで１５分間）によって上清を回収した。トランスフェクトされた上清を、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣを使用してＮｉカラム（ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（ＦＰＬＣ手順については表３を参照のこと）。溶出されたタンパク質の緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換し、ＢＣＡアッセイによってタンパク質濃度を測定した。合計１０ｍｇのタンパク質が、３００ｍｌの培養物から精製された。精製されたタンパク質を、サイズ測定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、それを、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとして探索することにより、Ｈｉｓタグを含む正しいサイズのタンパク質が得られていたかを確認した（図４Ｃを参照のこと）。予測サイズより大きいタンパク質が得られ、それはおそらく、当該タンパク質が哺乳動物細胞内での発現によってグリコシル化されたことに起因することを本発明者らは見出した。当該タンパク質の同一性をさらに確認するために、質量分析を使用した。
【実施例５】
【０１７７】
実施例５：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＦｌｉＤタンパク質の発現および精製
ＦｌｉＤ遺伝子をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＲ２０２９１株から取り出し、それは、いくつかの株（ＡＴＣＣ４３２５５、６３０、およびＣＤ１９６）の間で８８％保存されていると判定された。標準的な分子生物学的方法を用いて、ＦｌｉＤ遺伝子のシグナルペプチドおよび膜貫通領域を除去し、ＨＡＶＴ２０リーダー配列、Ｈｉｓタグ、およびＫｏｚａｋ配列を付加した後、ＡｓｃＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を用いて、当該配列をｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏプラスミドにクローニングした（配列ＩＤ番号３０）。続いて、ＦｌｉＤの前記核酸配列を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した。
【０１７８】
前記プラスミドＤＮＡを、グリセロールストックから増殖させた培養物から抽出した。前記プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｇｉｇａキットを使用して抽出した。大量のＦｌｉＤタンパク質を得るためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞において大規模トランスフェクション（３００ｍｌ）を行った。合計３×１０８細胞を３００μｇのＦｌｉＤプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後および７日後に遠心分離（室温において３０００ｒｐｍで１５分間）によって上清を回収した。トランスフェクトされた細胞の上清を、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ  ＦＰＬＣを使用してＮｉカラム（ＨｉｓＴＲＡＰ  ＨＰ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した（ＦＰＬＣ手順については表３を参照のこと）。溶出されたタンパク質の緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換し、ＢＣＡアッセイによって濃度を測定した。合計６８ｍｇのタンパク質が、３００ｍｌの培養物から精製された。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動して、そのサイズを確認した（図６を参照のこと）。当該タンパク質は、５５ｋＤａであると予測されたが、しかしながら、予想された約６５ｋＤａよりも大きいサイズに泳動した。そのより大きいサイズは、当該タンパク質が哺乳動物細胞によってグリコシル化されたことに起因し得るかまたは二量体化に起因し得る。質量分析によって、当該タンパク質が、ＦｌｉＤタンパク質であると同定された。
【実施例６】
【０１７９】
実施例６：マウスにおけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原に対する抗体の作製
抗体産生のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）中の２〜５０μｇの組換えタンパク質（または筋肉内（ｉｍ）注射による、抗原をコードするＤＮＡ）と、投与経路に応じて、等体積のフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カナダオンタリオ州Ｏａｋｖｉｌｌｅ）または別の好適なアジュバントとを混合したものを、５〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの対（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎまたは別の供給源由来）の皮下または腹腔内に接種する（１日目）。ＰＢＳ中の２〜２５μｇの組換えタンパク質（またはｉｍ注射によるＤＮＡ）と等量の好適なアジュバント（フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）とを混合したものを、２１、３５、および５０日目に皮下（またはｉｐ）に追加免疫注射する。当該マウスに、ＰＢＳ中の０．５〜５μｇの組換えタンパク質の最後の追加免疫をｉｐ、ｉｖ（またはＤＮＡの場合はｉｍ）で行い、３日後に屠殺する。
【０１８０】
好適な９６ウェルまたは類似のプレート（例えば、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ，Ｎａｌｇｅ−ＮＵＮＣ，ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）を使用して、Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）に記載されているように、前記接種プロトコル中に前記マウスから回収された血清を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または他の好適なアッセイによって、前記抗原または芽胞全体に対する血清ＩｇＧ応答をモニターする。当該アッセイプレートは、組換え抗原またはネガティブコントロールとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくは別の好適なタンパク質で、各々１ウェルあたり７５〜１０００ｎｇでコーティングされる。いったん十分なＩｇＧ力価が検出されたら（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおける、バックグラウンドよりも少なくとも３〜５倍高い４０５ｎｍにおけるＯＤ）、当該マウスに最後のプッシュブースト（ｐｕｓｈ  ｂｏｏｓｔ）を投与し、屠殺する。脾臓および／またはリンパ節を単離し、記載されているように（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）ハイブリドーマの作製および増殖を行う。続いて、ｍＡｂの回収、濃縮およびアイソタイピングを、以前に記載されているように（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）行う。
【０１８１】
あるいは、ＣＤ３８＋またはＣＤ１３８＋リンパ芽球を、単一細胞選別またはバルク選別（ＦＡＣＳによるか、または適切なカラムを用いて）を用いて単離し、回収されたＲＮＡを、ファージまたはカセットを使用する、ｍＡｂに対する発現スクリーニングのために使用する。免疫血清および免疫前血清（ＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡで１：２０００希釈されたもの）を、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして使用する。ＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰまたは別の好適なカラムを製造者の指示書（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）に従って使用して、前記ｍＡｂを精製する。緩衝液をＰＢＳに交換した後、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキットを製造者の指示書（Ｐｉｅｒｃｅ，イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）に従って使用して、ｍＡｂ濃度を測定する。必要に応じて、適切なＢ細胞感作を示唆する高力価ＩｇＧ応答を誘発するためにトランスジェニックマウスにさらなる追加免疫を投与することができる。
【実施例７】
【０１８２】
実施例７：ウサギにおけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原に対する抗体の作製
抗体産生のために、２匹のウサギにおいて、０日目に事前採血を行った後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）中の５０〜２００μｇの組換えタンパク質と等体積のフロイント完全アジュバントとを混合したものを皮下に（ＳＱ）免疫する。ＰＢＳ中の２０〜１００μｇの組換えタンパク質と等量のフロイント不完全アジュバントとを混合したものを、２８、４７、および６６日目に皮下に追加免疫する。当該ウサギの異なる４つの部位に；後四半身に２ヶ所および肩甲骨に２ヶ所免疫する。穏やかな乳化を可能にするルアーロック（ｌｕｅｒ−ｌｏｋ）コネクターを使用して免疫注射を調製する。当該ウサギにおいて、５９日目に試験採血および７８日目に最後の採血を行う。前記最後の採血は、当該動物が麻酔下である状態で行う。
【０１８３】
好適な９６ウェルプレート（例えば、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ，Ｎａｌｇｅ−ＮＵＮＣ，ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）を用いて、試験採血中にウサギから回収された血清を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または他の好適なアッセイによって、前記タンパク質に対する血清Ａｂ応答をモニターする。前記プレートは、組換えタンパク質またはネガティブコントロールとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくは他のタンパク質で、両方とも１ウェルあたり７５〜１０００ｎｇでコーティングされる。免疫血清および免疫前血清（ＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡで１：２０００希釈されたもの）は、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして機能する。いったん十分なＡｂ価が検出されたら（ＥＬＩＳＡアッセイにおける、バックグラウンドよりも少なくとも３〜５倍高い４０５ｎｍにおけるＯＤ）、当該ウサギに最後の追加免疫を投与し、最後の採血を行う。前記力価が十分でない場合、当該ウサギは、さらなる追加免疫を投与される。プロテインＡカラムを使用して前記最後の採血からｐＡｂを精製し、その後、緩衝液をＰＢＳに交換し、ｐＡｂ濃度を測定する。
【実施例８】
【０１８４】
実施例８：ハムスターにおけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原（能動免疫）の防御作用の試験
ゴールデンシリアンハムスター（雌，６〜７週齢）を、芽胞抗原をコードするＤＮＡ（１０μｇ／ハムスター）で２回（Ｖ１、Ｖ２、それぞれ１および２８日目）およびそれぞれの組換えタンパク質（１０μｇ／ハムスター）で１回（Ｖ３，３５日目）、免疫する（ｉ．ｄ．）。下記の線図を参照のこと。抗体産生を試験するために各ワクチン接種後に採血を行う（ＥＬＩＳＡ）。最後のワクチン接種の１週間後、ハムスターをクリンダマイシン（３０ｍｇ／ｋｇ，経口）で処置する。抗生物質処置の１２時間後に、動物の経口胃内に（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＢ１株の１００個の芽胞（０．２ｍｌの食塩水中）をチャレンジし、臨床的徴候について毎日モニターする。不可逆的な瀕死状態を示している任意の動物を人道的理由のために安楽死させ、残りの生存ハムスターをチャレンジの７日後に安楽死させる。臨床的徴候、生存率、および安楽死させた時点において盲腸に回収された芽胞の数を測定することによって、防御を評価する。防御抗原は、当該日数にわたって、回収される芽胞の数の減少ならびに芽胞の排出（ｓｐｏｒｅ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ）の減少を引き起こし、生存の改善をもたらすと予測される。
【０１８５】
【化１】
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【０１８６】
【実施例９】
【０１８７】
実施例９：ハムスターにおけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原に対する抗体の防御作用の試験
Ａ．初回チャレンジモデル
芽胞抗原に対するｍＡｂの防御能を試験するために、合計４日間にわたって（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞の投与の７２、４８、２４、および０時間前に）単独または併用でｉ．ｐ．送達される前記抗体（５０ｍｇ／ｋｇ／日）でハムスターを処置する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ１株の１００個の芽胞の経口胃内送達の１２時間前にクリンダマイシンを動物の腹腔内に注射する。すべてのハムスターが疾患のために死亡するかまたは疾患の症状が無くなるまで、死亡について毎日ハムスターを観察する。抗体が単独で提供されるとき、それらは、生存を５０％上昇させると予測され、この防御は、５日目の後に減弱し得る（２０％）。抗体処置は、剖検時の便中のＣＦＵを１ｌｏｇ減少させるとも予測される。さらに、併用療法は、２日目に防御を９５％に高め、ならびに当該研究全体にわたって有意な防御（５０％）をもたらし、ＣＦＵを２ｌｏｇ減少させると予測される。
【０１８８】
Ｂ．再発モデル
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを排除する抗生物質での処置は、栄養型細菌を殺滅するが、芽胞を残す。これは、再発性感染の根底にある主な問題であり、患者は、抗生物質処置間にＣＤＡＤのエピソードを有する。前記抗体が再発の状況において死亡を阻止するか否かを判定するために、ハムスター再発モデルを用いることができる（Ｂａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。このモデルでは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ疾患から保護するバンコマイシンでハムスターを処置するが、バンコマイシン処置が中断されると、ハムスターは、疾患を再発する。ハムスターに上記のようにクリンダマイシンを投与し、１２時間後に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＢ１株の芽胞を経口胃内にチャレンジする（１００，０００ＣＦＵ）。芽胞をチャレンジした日およびその後２日間にわたって毎日、バンコマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を提供する。芽胞チャレンジ後の２〜６日目にｍＡｂの組み合わせで（５０ｍｇ／ｋｇ／日）ハムスターを処置する。前記組み合わせによる処置は、バンコマイシンだけを投与されたハムスターの４０％と比べて、前記ハムスターの７０％において再発を阻止すると予測される。処置は、細菌の排出を減少させるとも予測される（バンコマイシン（ｖａｎｃｏｕｍｙｃｉｎ）単独群における１ｌｏｇに対して２ｌｏｇ）。前記ｍＡｂが個別に使用されたときも、生存が改善されると予測されるが、４５％という生存および便中に回収されるＣＦＵの１ｌｏｇという低下であり、それほど有意ではない。
【実施例１０】
【０１８９】
実施例１０：ｍＡｂを産生させるための芽胞抗原によるマウスの免疫化
ｍＡｂを産生させるために芽胞抗原でマウスを免疫した。各抗原群は、４匹のマウスを有し、それらに、５μｇ／マウスのＣｐＧを含む７０％ＰＢＳ＋３０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の１０μｇ／マウスの精製抗原をｉ．ｐ．で免疫／追加免疫した。前記マウスにおいて、最初の免疫の後、１週間あたり１回にて３回追加免疫を行った。最後の採血の前に、前記マウスにおいて最後の追加免疫（ＰＢＳ中、４μｇ／マウス）を行った。次いで、芽胞抗原に対するｍＡｂを含む血清を特徴付ける。
【実施例１１】
【０１９０】
実施例１１：インビトロでの芽胞抗原ｍＡｂの特徴付け
１）ＥＬＩＳＡ検出。このアッセイは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原で免疫されたマウス由来の抗体と芽胞抗原および芽胞全体との結合を試験するために行われた。抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞（ＡＴＣＣ４３２５５）ポリクローナル抗体を、当該アッセイに対するポジティブコントロールとして使用する。
【０１９１】
ａ）芽胞全体のＥＬＩＳＡ。芽胞のアリコートを解凍し、コーティング緩衝液で１０５芽胞／ｍｌの濃度に希釈した。１００μｌの体積の芽胞（１０４芽胞／ウェル）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えた。前記プレートを密閉し、室温で一晩放置した。
【０１９２】
翌日、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄して、付着していない任意の芽胞を除去した。密閉されたプレートを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中の５％脱脂乳（３００μｌ／ウェル）を用いて３７℃で１．５時間、ブロッキングした。ブロッキングの後、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄して、ブロッキング緩衝液を除去した。１次抗体（免疫されたマウス由来のマウス血清）を、１／１００の希釈から開始して１：２で段階希釈した。ポジティブコントロールとして使用した抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ）は、１／１０００に希釈した。前記抗体希釈物を前記プレートの適切なウェルに充填した（１００μｌ／ウェル）。前記プレートを密閉し、３７℃で１時間放置してインキュベートした。１°Ａｂインキュベートの後、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄して、未結合１°Ａｂを除去した。任意の結合１°Ａｂを検出するために、適切な２次抗体を、推奨される製造者の希釈で使用し、前記プレートの適切なウェルに充填した（１００μｌ／ウェル）。前記プレートを密閉し、３７℃で１時間放置してインキュベートした。２°Ａｂインキュベートの後、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄して、未結合２°Ａｂを除去した。任意の結合抗体を検出するために、ペルオキシダーゼ基質を各ウェルに充填し（１００μｌ／ウェル）、１０〜３０分間、室温の暗所に放置してインキュベートした。インキュベート後、停止液（５０μｌ／ウェル）を使用して反応を停止し、前記プレートを４５０ｎｍで読み出した。
【０１９３】
結果：芽胞全体のＥＬＩＳＡは、図７、８、９、および１０に示されるように、様々な芽胞抗体が、単離されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞株ＡＴＣＣ４３２５５に結合したことを示した。
【０１９４】
ｂ）芽胞抗原のＥＬＩＳＡ。前記芽胞抗原を、０．０３μｇ／μＬの濃度にコーティング緩衝液で希釈した。１００μｌの体積の前記希釈物を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えた。前記プレートを密閉し、室温で一晩放置した。
【０１９５】
翌日、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて３回洗浄して、任意の未結合抗原を除去した。密閉されたプレートを、１％ＢＳＡ（３００μｌ／ウェル）を用いて室温で少なくとも１．５時間、ブロッキングした。ブロッキングの後、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて３回洗浄して、ブロッキング緩衝液を除去した。１次抗体（免疫されたマウス由来のマウス血清）を、１／５０の希釈から開始して１：２で段階希釈した。ポジティブコントロールとして使用した抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞ポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ）は、１／５０の希釈から開始して１：２で段階希釈した。前記抗体希釈物を前記プレートの適切なウェルに充填した（１００μｌ／ウェル）。前記プレートを密閉し、室温で少なくとも１時間放置してインキュベートした。１°Ａｂインキュベートの後、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて３回洗浄して、未結合１°Ａｂを除去した。任意の結合１°Ａｂを検出するために、適切な２次抗体を、推奨される製造者の希釈で使用し、前記プレートの適切なウェルに充填した（１００μｌ／ウェル）。前記プレートを密閉し、室温で少なくとも１時間放置してインキュベートした。２°Ａｂインキュベートの後、前記プレートを、１回の洗浄あたり３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴを用いて３回洗浄して、未結合２°Ａｂを除去した。任意の結合抗体を検出するために、アルカリホスファターゼ基質を各ウェルに充填し（１００μｌ／ウェル）、少なくとも１時間、室温の暗所に放置してインキュベートした。前記プレートを４０５ｎｍで読み出した。
【０１９６】
結果：前記芽胞抗原のＥＬＩＳＡの結果は、図１１〜１４に示されるように、マウスにおいて産生された芽胞抗体が精製Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原に結合することを示唆する。
【０１９７】
２）発芽アッセイ。このアッセイは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原で免疫されたマウスから得られた血清を芽胞発芽の阻害についてスクリーニングするために行われた。当該アッセイの前提は、芽胞が発芽する時間とともに、読み出されるＯ．Ｄ．が低下するはずであるということである。血清中の抗体が発芽を阻害する場合、Ｏ．Ｄ．は未処理の芽胞と比べて経時的にゆっくり低下するはずである。当該アッセイに対するポジティブコントロールとして抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞（ＡＴＣＣ４３２５５）ポリクローナル抗体を使用する。
【０１９８】
精製されたばかりの芽胞を使用して芽胞懸濁液（１０７芽胞／処置）を調製し、それを６０℃の水浴において２０分間、加熱によって活性化し、次いで、室温に冷却した。前記芽胞を２分間超音波処理して、任意の凝集塊を破壊する。２００μｌの体積の前記懸濁液を新しいチューブに移し、１μｌのｐＡｂを加えた。前記チューブを氷上で３０分間インキュベートした。次いで、前記チューブに発芽培地（８００μｌのＢＨＩＴ−Ｇ）を加え、内容物をキュベットに移した。前記キュベットを、１時間にわたって１０分毎に読み出す（Ｏ．Ｄ．＠６００ｎｍ）。読み出しと読み出しの間、前記キュベットをシェーカー上において（５０ｒｐｍ）３７℃でインキュベートする。
【０１９９】
結果：前記ｐＡｂを用いた発芽アッセイは、芽胞を認識する抗体が、発芽の開始を遅延させることができることを示す（図１５）。
【実施例１２】
【０２００】
実施例１２：ウエスタンブロット試験
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原で免疫されたマウス由来の抗体の、芽胞表面上に発現されたタンパク質に対する認識を試験するために、ウエスタンブロットを行った。
【０２０１】
ＳＤＳ抽出緩衝液および尿素抽出緩衝液を使用することによって、ＡＴＣＣ４３２５５芽胞からタンパク質抽出物を調製した。前記タンパク質抽出物を、４つの組換え芽胞抗原タンパク質の混合物とともに２枚の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動した。一方のゲルは、クマシーブルーで染色してタンパク質バンドを可視化した；他方のゲルは、ニトロセルロース膜に転写し、抗芽胞全体ポリクローナルＡｂでブロットした。尿素抽出物を、別個のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動した；各個別のゲルを、異なる芽胞抗原で免疫されたマウス由来の血清でブロットした。
【０２０２】
ａ）タンパク質抽出。ＡＴＣＣ４３２５５芽胞（３×１０７）をＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのＳＤＳ抽出緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８；２５％グリセロール；２％ＳＤＳ；５％β−メルカプトエタノール、および０．０１％ブロモフェノールブルー）で再懸濁し；サンプルを１５分間煮沸し、０．２μｍフィルターに通して芽胞を除去した。
【０２０３】
ＡＴＣＣ４３２５５芽胞（３×１０７）をＰＢＳで洗浄し、１ｍＬの尿素抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の、８Ｍ尿素および１０％β−メルカプトエタノール）で再懸濁し；サンプルを１０分毎にボルテックスして３０℃で２時間インキュベートし、０．２μｍフィルターに通して芽胞を除去した。
【０２０４】
ｂ）ウエスタンブロット：ｉ）転写：事前浸漬されるフィルターパッド、ニトロセルロース、およびＷｈａｔｍａｎ紙を、１×転写緩衝液中に２０分間置いた。前記ゲルを、１×転写緩衝液中の前記フィルターパッド、ニトロセルロース、およびＷｈａｔｍａｎ紙と５分間平衡化した。２〜８℃で１時間、１００Ｖにおいて転写を行った。ｉｉ）染色：前記膜を、室温において１時間、５％脱脂乳でブロッキングした。前記膜を室温のＴＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄した。前記膜を、タンパク質の面を上にして、２０ｍＬの１°抗体（１：１０００）溶液の入った容器に入れ、２〜８℃で１８〜２４時間インキュベートした。前記膜を室温のＴＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄した。次いで、前記膜を、タンパク質の面を上にして、２０ｍＬの２°抗体（１：１００００）溶液の入った容器に入れ、室温で２時間インキュベートした。前記膜を室温のＴＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄した。ｉｉｉ）検出：ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ錠を冷凍庫から取り出し、室温に温めた。２錠を２０ｍＬ（２×）のＬＷに入れ、溶解するまでボルテックスした。前記膜を、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴとともに、およそ３０秒間または所望の強度に達するまでインキュベートした。次いで、過剰染色を防ぐために、前記膜を大量のＬＷで洗浄した。前記膜を乾燥させ、この後の参照のために光を避けて保管した。
【０２０５】
結果：前記ウエスタンブロットは、図１６〜２１に示されるように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞抗原で免疫されたマウスにおいて産生された抗体が、芽胞タンパク質を認識することを示した。
【０２０６】
本発明の特定の態様が記載および例証されてきたが、そのような態様は、単なる本発明の例証であって、添付の請求項に従って解釈される本発明を限定しないとみなされるべきである。
【０２０７】
本明細書で引用された刊行物および特許出願のすべてが、各個別の刊行物または特許出願がすべての目的のためにこの参照により組み込まれると明確かつ個別に示されたかのように、この参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
前述の本発明は、理解を明瞭にする目的で例証および例のつもりでいくらか詳細に記載されたが、本発明の教示に鑑みて、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変を行うことができることが当業者には容易に明らかになるだろう。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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