(57)【要約】  増大されたＹａｐ１転写因子活性を含む、増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母であって、増加した含油率が、非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較したものである、トランスジェニック油性酵母が本明細書に記載される。増大されたＹａｐ１転写因子活性は、前記転写因子と、前記転写因子を活性化することができるタンパク質との相互作用を増大することにより、又は両者の組合せにより、Ｙａｐ１転写因子を過剰発現することによって起こる。これらの酵母株を用いる方法も記載される。
2014505472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大されたＹａｐ１転写因子活性を含む、非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較して増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母株。
【請求項２】
増大されたＹａｐ１転写因子活性が、Ｙａｐ１転写因子活の過剰発現、前記転写因子と前記転写因子を活性化することができるタンパク質との相互作用を増大すること、又は両者の組合せによって起こる、請求項１に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項３】
前記転写因子を活性化することができる前記タンパク質が、Ｇｐｘ３、Ｙｂｐ１及びＴｓａ１からなる群から選択される、請求項２に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項４】
Ｙａｐ１転写因子が、転写因子活性を有し、かつ、
ａ）ｂＺＩＰロイシンジッパーモチーフ；
ｂ）少なくとも６つのアミノ酸で隔てられた少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン；及び
ｃ）少なくとも８つのアミノ酸で隔てられた少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン、
を含むポリペプチド、をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項５】
Ｙａｐ１転写因子の配列が、配列番号２及び配列番号４からなる群から選択される、請求項４に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項６】
Ｇｐｘ３タンパク質が、
ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用してＹａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドは、配列番号２６［ＳｃＧｐｘ３］又は配列番号２８［ＹｌＧｐｘ３］からなる群から選択される配列と比較してＢＬＡＳＴＰアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％アミノ酸同一性を有する、前記ヌクレオチド配列；
ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２５［ＳｃＧｐｘ３］又は配列番号２７［ＹｌＧｐｘ３］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＮアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列；又は、
ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体と前記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である前記相補体、
を含む、請求項３に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項７】
Ｔｓａ１タンパク質が、
ａ）前記Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドは、配列番号３４［ＳｃＴｓａ１］又は配列番号３６［ＹｌＴｓａ１］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＰアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％アミノ酸同一性を有する、前記ヌクレオチド配列；
ｂ）前記Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号３３［ＳｃＴｓａ１］又は配列番号３５［ＹｌＴｓａ１］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＮアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列；又は、
ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の前記ヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体と前記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である、前記相補体、
を含む、請求項３に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項８】
Ｙｂｐ１タンパク質が、
ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用してＹａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドは、配列番号３８［ＳｃＹｂｐ１］又は配列番号４０［ＹｌＹｂｐ１］からなる群から選択される、前記ヌクレオチド配列；又は、
ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用してＹａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチド配列は、保存ドメインの分析方法に基づき、ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒ＿Ｙｂｐ２スーパーファミリーに分類される、前記ヌクレオチド配列；又は、
ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の前記ヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体と前記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である、前記相補体、
を含む、請求項３に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項９】
トランスジェニック油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、及びリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属に由来する、請求項１に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１０】
トランスジェニック油性酵母が、ヤロウィア・リポリティカである、請求項８に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１１】
トランスジェニック油性酵母が、少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸を産生する、請求項１に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１２】
油性酵母中の含油率を増加させる方法であって、
ａ）（ｉ）Ｙａｐ１転写因子；
（ｉｉ）前記転写因子を活性化することができるタンパク質；
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択されるタンパク質を過剰発現させるように前記油性酵母を改変するステップ；並びに
ｂ）非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較して含油率の増加をもたらすような好適な条件下で、前記油性酵母を増殖させるステップ、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２８，６５５号明細書の利益を主張する。上記の文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、生物工学の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、増大したＹａｐ１転写因子活性を含む油性酵母株であって、その結果、増加した含油率をもたらす油性酵母株に関する。
【背景技術】
【０００３】
活性酸素種［「ＲＯＳ」］は、酸素を含む化学的に反応性の分子であり、不対原子価殻電子を含む。ＲＯＳ、例えば、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン、及び過酸化水素［「Ｈ２Ｏ２」］は、例えば、呼吸の際に、水への酸素の不完全な還元により、細胞内で好気的代謝の副産物として頻繁に生成されている。ＲＯＳはまた、放射線、光、金属、及び酸化還元活性剤への暴露によって脂肪酸のβ酸化中にも生成される。ＲＯＳは、細胞の酸化還元状態を撹乱し、細胞の成分（脂質、タンパク質、及びＤＮＡなど）に有毒なダメージを引き起こしうることから、細胞は、ＲＯＳのレベルを感知し、酸化ストレスの作用から細胞を保護し、細胞の健全性が維持されるように、シグナルを伝達する様々な手段を備えていなければならない。
【０００４】
典型的には、ＲＯＳのレベルは、グルタチオン還元−酸化（レドックス）サイクル及びチオレドキシン系の使用によって制御され、これにより、ＮＡＤＰＨから電子が受け取られて、Ｈ２Ｏ２を水に還元するのに使用される。より具体的には、電子は、ＮＡＤＰＨからチオレドキシンレダクターゼを経てチオレドキシン、次いでペルオキシレドキシン、そしてＨ２Ｏ２に移されて、水が得られる。この経路における複数の遺伝子の調節は複雑である。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＨ２Ｏ２に対する適応応答は、少なくとも１６７のタンパク質の発現の変化を伴うことがわかっている（Ｇｏｄｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２２４８０−２２４８９（１９９８））。
【０００５】
酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＨ２Ｏ２のレベルを感知する手段の１つは、酸化ストレス応答のマスター転写因子、すなわち転写因子タンパク質Ｙａｐ１に基づくシグナル伝達経路に依存する。Ｈ２Ｏ２ストレスに応答して、少なくとも１つの分子内ジスルフィド結合の形成、Ｔｓａ１及びＧｐｘ３のようなペルオキシレドキシンにより触媒され、かつＹｂｐ１のような他のタンパク質によって促進される反応に基づき、Ｙａｐ１の多段階配座変化が起こる。この活性酸化形態では、Ｙａｐ１は、少なくとも３２の異なるタンパク質（細胞の抗酸化防御及びグルタチオン／ＮＡＤＰＨ再生に関与するものを含む）の大きなレギュロンの発現を制御する（Ｌｅｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１６０４０−１６０４６（１９９９））。Ｙａｐ１制御のチオレドキシンを用いた酵素還元によって、Ｙａｐ１の不活性化が起こり、このようにして自動調節の作用機序がもたらされる。機能性Ｙａｐ１タンパク質が欠如したＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の変異株は、Ｈ２Ｏ２による消滅に対し過敏性である。
【０００６】
二重結合を多く持つ脂肪酸ほど、脂質過酸化を被りやすいことがわかっている。従って、多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］は、複数の二重結合を含み、それらの間に、特に反応性の水素を有するメチレン−ＣＨ２−基が存在するため、ＲＯＳによる酸化的分解をより受けやすい。Ａｖｅｒｙ，Ａ．Ｍ．及びＳ．Ｖ．Ａｖｅｒｙ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３３７３０−３３７３５（２００１））は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｇｐｘ１Δ／ｇｐｘ２Δ／ｇｐｘ３Δ変異体が、ＰＵＦＡαリノレン酸を添加した培地［「ＡＬＡ」；１８：３］（ＡＬＡは、全膜脂肪酸の６０％までを含むことができる）中で増殖するのに欠陥があることを報告しており；ｇｐｘ１Δ、ｇｐｘ２Δ及びｇｐｘ３Δ変異体はまた、膜脂質への外因性１８：３のゆっくりとした組込み速度のために作用は遅れたものの、１８：３に対する毒性も示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＯＳは、好気的代謝を実施する細胞中に頻繁に生成されており、しかも、ＲＯＳは、細胞障害及び細胞死を招く可能性があることから、当業者は、組換えにより作製された生物のＲＯＳからの防御能力を増強する方法を理解している。これは、特に、微生物油を産生する生物に該当することである。というのは、特定の菌株において、これらの油を産生中にＲＯＳが生成されると、収量の低下及び／又は微生物油生産の効率の低下を招きうるからである。
【０００８】
増大されたＹａｐ１転写因子活性を有すると同時に、ＰＵＦＡを生成するように油性酵母を作製することにより、脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］及び平均ＰＵＦＡ力価［「ＰＵＦＡ％ＤＣＷ」］の両方の増加が達成されることがわかっている。
本発明は、非トランスジェニック油性酵母細胞の含油率と比較して増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態において、本発明は、増大されたＹａｐ１転写因子活性を含む、増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母に関し、ここで、増加した含油率は、非トランスジェニック油性酵母細胞の含油率と比較したものである。
【００１０】
第２の実施形態では、増大されたＹａｐ１転写因子活性は、Ｙａｐ１転写因子を過剰発現すること、前記転写因子と前記転写因子を活性化することができるタンパク質との相互作用を増大すること、又は両者の組合せによって起こる。
【００１１】
第３の実施形態では、転写因子を活性化することができるタンパク質は、Ｇｐｘ３、Ｙｂｐ１及びＴｓａ１からなる群から選択される。
【００１２】
第４の実施形態では、Ｙａｐ１転写因子は、転写因子活性を有し、かつ以下：（ａ）ｂＺＩＰロイシンジッパーモチーフ；（ｂ）少なくとも６つのアミノ酸で隔てられた少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン；及び（ｃ）少なくとも８つのアミノ酸で隔てられた少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン、
を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
第５の実施形態では、Ｇｐｘ３タンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このポリペプチドは、配列番号２６［ＳｃＧｐｘ３］又は配列番号２８［ＹｌＧｐｘ３］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＰアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％アミノ酸同一性を有する）；（ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列は、配列番号２５［ＳｃＧｐｘ３］又は配列番号２７［ＹｌＧｐｘ３］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＮアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％配列同一性を有する）；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体（この相補体と上記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である）。
【００１４】
第６の実施形態では、Ｔｓａ１タンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このポリペプチドは、配列番号３４［ＳｃＴｓａ１］又は配列番号３６［ＹｌＴｓａ１］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＰアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％アミノ酸同一性を有する）；（ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列は、配列番号３３［ＳｃＴｓａ１］又は配列番号３５［ＹｌＴｓａ１］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＮアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％の配列同一性を有する）；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体（この相補体と上記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である）。
【００１５】
第７の実施形態では、Ｙｂｐ１タンパク質は、以下を含む：（ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このポリペプチドは、配列番号３８［ＳｃＹｂｐ１］又は配列番号４０［ＹｌＹｂｐ１］からなる群から選択される）；（ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このポリペプチド配列は、保存ドメインの分析方法に基づき、ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒ＿Ｙｂｐ２スーパーファミリーに分類される）；又は（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体（この相補体と上記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である）。
【００１６】
第８の実施形態では、トランスジェニック油性酵母細胞は、以下からなる群から選択される属：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、及びリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）に由来する。好ましくは、トランスジェニック油性酵母は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ：ヤロウィア・リポリティカ）である。
【００１７】
第９の実施形態では、トランスジェニック油性酵母細胞は、少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸を産生する。
【００１８】
第１０の実施形態では、本発明は、油性酵母中の含油率を増加する方法に関し、この方法は、以下のステップを含む：
ａ）（ｉ）Ｙａｐ１転写因子；
（ｉｉ）上記転写因子を活性化することができるタンパク質；
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せ
からなる群から選択されるタンパク質を過剰発現させるように油性酵母を改変するステップ；並びに
ｂ）非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較して、含油率の増加をもたらすような好適な条件下で、油性酵母を増殖させるステップ。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＸ３［「ＳｃＧＰＸ３」］が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１［「ＳｃＹａｐ１」］を活性化する作用機序を示す図である。ＳｃＧＰＸ３は、Ｃｙｓ３６及びＣｙｓ８２を含み、これらは、分子間ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成するか、又は還元されて、チオール基（−ＳＨ）を含む。ＳｃＹａｐ１は、Ｎ末端及びＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン（各々黒色で示す）を含み；これらＣｙｓリッチドメイン内のＣｙｓ３０３、Ｃｙｓ３１０及びＣｙｓ３１５並びにＣｙｓ５９８、Ｃｙｓ６２０及びＣｙｓ６２９は、６つの鉛直の黒線として示す。Ｃｙｓ３６ＳｃＧｐｘ３のチオール基（−ＳＨ）は、Ｈ２Ｏ２と反応して、水の放出及びスルフェン酸（−ＳＯＨ）の形成をもたらす。続いて、−ＳＯＨは、ＳｃＹａｐ１（還元形態）のＣｙｓ５９８の−ＳＨと縮合して、分子間ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成し、次に、ＳｃＹａｐ１のＣｙｓ３０３とＣｙｓ５９８間の分子内ジスルフィド結合に変換されて、これにより、酸化ＳｃＹａｐ１タンパク質に配座の変化を引き起こす。
【図２】ＳｃＹＡＰ１（配列番号２）とＹｌＹＡＰ１（配列番号４）の配列比較を示す。ＳｃＹＡＰ１の６９〜１１５位（ＹｌＹＡＰ１の１１５〜１６６位に対応する）の下線を引いた太字の塩基性アミノ酸は、ＤＮＡ結合のためのｂＺＩＰドメインの塩基性領域を示す。ＳｃＹＡＰ１の８７位、９４位、１０８位、及び１１５位（ＹｌＹＡＰ１の１３８位、１４５位、１５９位及び１６６位に対応する）で、アラインメントの上方に星印で示した太字のロイシン残基は、ｂＺＩＰドメインのロイシンジッパーモチーフである。ＳｃＹＡＰ１の３０３位、３１０位、３１５位、５９８位、６２０位及び６２９位（ＹｌＹａｐ１の３０９位、３１６位、４８３位、５０位５及び５１４位に対応する）のボックスで囲んだシステイン残基は、分子間及び分子内相互作用に重要である（又は恐らく重要である）。
【図３】（Ａ）ｐＹＲＨ６０；及び（Ｂ）ｐＹＲＨ６１のプラスミドマップを提供する。
【図４】増加するＨ２Ｏ２濃度、すなわち０ｍＭから５０ｍＭへのＨ２Ｏ２条件下で、ＹＰＤプレートでのＨ２Ｏ２感受性アッセイの結果を示す。（Ａ）はＹ．リポリティカ株Ｙ４１８４（対照）及びＹ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）細胞の増殖を比較する。（Ｂ）は、プラスミドｐＲＳ３１６（対照）又はｐＹＲＨ６１のいずれかで形質転換したＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４３（対照）及びＢＹ４７４３（ｙａｐ１Δ）細胞の増殖を比較する。
【図５】（Ａ）ｐＹＲＨ４３；及び（Ｂ）ｐＹＲＨ６５のプラスミドマップを提供する。
【図６】ＳｃＧＰＸ３（配列番号２６）とＹｌＧＰＸ３（配列番号２８）の配列比較を示す。ＳｃＧｐｘ３の３６位、６４位及び８２位（ＹｌＧｐｘ３の４２位、７０位及び８８位に対応する）のボックスで囲んだシステイン残基は、分子間及び分子内相互作用に重要である（又は恐らく重要である）。
【図７】ＳｃＴｓａ１（配列番号３４）とＹｌＴｓａ１（配列番号３６）の配列比較を示す。ＳｃＴｓａ１の４８位及び１７１位（ＹｌＴｓａ１の４８位及び１６９位に対応する）のボックスで囲んだシステイン残基は、分子間及び分子内相互作用に重要である（又は恐らく重要である）。
【図８】ＳｃＹｂｐ１（配列番号３８）とＹｌＹｂｐ１（配列番号４０）の配列比較を示す。
【図９】ＳｃＹｂｐ１（配列番号３８）、ＹｌＹｂｐ１（配列番号４０）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）Ｙｂｐ１［「ＣｇＹｂｐ１」］（配列番号４３）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４０  Ｙｂｐ１［「ＫｌＹｂｐ１」］（配列番号４４）、シェフェルソミセス・スチピチス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ  ６０５４  Ｙｂｐ１［「ＳｓＹｂｐ１」］（配列番号４５）、ジゴサッカロミセス・ロキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）ＣＢＳ  ７３２  Ｙｂｐ１［「ＺｒＹｂｐ１」］（配列番号４６）、及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４  Ｙｂｐ１［「ＣａＹｂｐ１」］（配列番号４７）同士の配列比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２１〜１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ：Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列一覧要件（Ｒｕｌｅｓ  ５．２及び４９．５（ａ−ｂｉｓ）、及びＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓのＳｅｃｔｉｏｎ２０８及びＡｎｎｅｘ  Ｃ）に従う。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに用いる記号及びフォーマットは、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２２に記載の規則に従う。
【００２１】
配列番号１〜４７は、表１に同定するように、遺伝子、タンパク質（若しくはその部分）、プライマー又はプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００２２】
表１．核酸及びタンパク質配列番号の概要
【表１】
2014505472.tif 000003
2014505472.tif 000004
【００２３】
本明細書に引用するすべての特許、特許出願、及び刊行物は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
【００２４】
本明細書において、多数の用語及び略称を用いる。以下に、それらの定義を記載する。
【００２５】
「オープンリーディングフレーム」は、「ＯＲＦ」と略記する。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略記する。
「アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」は、「ＡＴＣＣ」と略記する。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略記する。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略記する。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略記する。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略記する。
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と略記する。
「質量パーセント」は、「ｗｔ％」と略記する。
「活性酸素種」は、「ＲＯＳ」と略記する。
「過酸化水素」は、「Ｈ２Ｏ２」と略記する。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文面で明確に別途記載していない限り、複数形の指示内容も含む。従って、例えば、「１つの細胞」と言うとき、１つ以上の細胞、並びに当業者には公知のその同等物なども含まれる。
【００２７】
「転写因子」とは、ＤＮＡ調節エレメントと相互作用して、構造遺伝子の発現又は第２調節遺伝子の発現に作用するタンパク質（又はそのタンパク質をコードするＤＮＡ）を指す。さらに具体的には、転写因子（単独で又は他のタンパク質との複合体でのいずれか）は、例えば、転写開始の活性化又は抑制によって、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写に影響を与える。転写因子は、それらが調節する遺伝子に隣接するＤＮＡの特定の配列に結合する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含みうる。
【００２８】
「Ｙａｐ１転写因子活性」とは、Ｙａｐ１転写因子、すなわち、酸化ストレス応答を制御する細胞経路に関与するＡＰ−１ファミリーの転写制御因子の結果として起こる活性を指す。増大したＹａｐ１転写因子活性によって、１つのファミリーのタンパク質の調節が行われるが、これは、典型的には、ＲＯＳに対する耐性の増大を可能にする（例えば、Ｈ２Ｏ２ストレスが起こった場合）。本明細書に記載する本発明によれば、増大したＹａｐ１転写因子活性は、含油率の増加をもたらす。
【００２９】
「Ｙａｐ１転写因子活性」とは、Ｙａｐ１転写因子活性を有する転写因子を指す。一般に、このようなタンパク質は、以下を有していなければならない：（ａ）ｂＺＩＰロイシンジッパーモチーフ；（ｂ）少なくとも６つのアミノ酸で隔てられた少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン；及び（ｃ）少なくとも８つのアミノ酸で隔てられた少なくとも２つのシステイン残基の配列を有するＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン。
【００３０】
「ｂＺＩＰロイシンジッパーモチーフ」は、以下（ｉ）約１４〜１６アミノ酸におよぶ塩基性ＤＮＡ結合領域（すなわち、アルギニン及びリシン残基を含む）；及び（ｉｉ）隣接するロイシンリッチジッパー領域（すなわち、二量体化を可能にする均一に間隔をあけたロイシンを含む）を含むものとして特徴付けられる（Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．Ｃ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  １：ｂＺＩＰ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅ，２：１０１−１６８（１９９５））。一般的には、ロイシン残基は、７アミノ酸の間隔で配置されているが、メチオニン、イソロイシン、バリン及びフェニルアラニンのような他の疎水性アミノ酸は、ロイシンと一緒にジッパーを形成することが報告されている。
【００３１】
用語「ＳｃＹＡＰ１」（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１８２３６２．１）は、配列番号２によりコードされる、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃから単離されるＡＰ−１ファミリーのＹａｐ１転写因子を指す。ＧｅｎＢａｎｋにアノテーションがつけられているように、ＳｃＹＡＰ１は、Ｈ２Ｏ２により、酸化ストレス耐性に必要であり、ジスルフィド結合の多段階形成及び細胞質から核への移行を介して活性化される。ＳｃＹＡＰ１はまた、カドミウムに対する抵抗性も媒介する。
【００３２】
用語「ＹｌＹＡＰ１」（配列番号４；ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５０４９４５）は、本明細書に記載の配列番号３によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されたＹａｐ１転写因子を指す。
【００３３】
用語「Ｙａｐ１転写因子を活性化することができるタンパク質」とは、Ｙａｐ１転写因子の酸化を促進するような様式で、Ｙａｐ１転写因子と相互作用するタンパク質を指し、これにより、この転写因子は、少なくとも１つの分子内ジスルフィド結合を含み、このようにして「活性化状態」となる。Ｙａｐ１転写因子を活性化することができる好ましいタンパク質としては、Ｙａｐ１結合タンパク質（Ｙｂｐ１）並びにペルオキシレドキシンタンパク質、Ｇｐｘ３及びＴｓａ１が挙げられるが、これを、本明細書に記載の本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【００３４】
「Ｙａｐ１結合タンパク質」又は「Ｙｂｐ１」は、Ｙａｐ１転写因子と結合する結合タンパク質を指す。Ｇｕｌｓｈａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６（３９）：３４０７１−３４０８１（２０１１））に記載されているように、Ｙａｐ１とＹｂｐ１は、細胞内で直接相互作用するようであるが、相互作用の部位又はドメインの詳しい位置決定はまだ達成されていない。
【００３５】
用語「ＳｃＹｂｐ１」（配列番号３８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００９７７５．１）は、本明細書に記載の配列番号３７によってコードされる、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃから単離されたＹａｐ１結合タンパク質を指す（Ｖｅａｌ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（３３）：３０８９６−３０９０４（２００３）；Ｇｕｌｓｈａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、前掲）。ＧｅｎＢａｎｋにアノテーションが付けられているように、ＳｃＹｂｐ１は、「転写因子Ｙａｐ１ｐの特定のシステイン残基の酸化に必要であり、ストレスに応答してＹａｐ１ｐの核局在化を起こすタンパク質」として機能する。
【００３６】
用語「ＹｌＹｂｐ１」（配列番号４０；ＹＡＬＩ０Ｂ０３７６２ｇ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５００４６９．１）は、本明細書では、配列番号３９によりコードされる、ヤロウィア・リポリティカから単離されたＹａｐ１結合タンパク質を指す。
【００３７】
「ペルオキシレドキシンタンパク質」又は「Ｐｒｘタンパク質」は、酸化還元活性システイン残基を含む。触媒作用中、この酸化還元活性システインは、スルフェン酸に酸化され（例えば、Ｈ２Ｏ２により）、分解システイン残基と共に縮合して、ジスルフィドを形成する（分解システイン残基は、同じＰｒｘ分子内か、又は別のＰｒｘ分子内に存在し、二量体形成をもたらす）。このジスルフィド結合は、チオレドキシンによって還元され、活性Ｐｒｘを再生する。従って、Ｐｒｘタンパク質は、チオオレドキシン及びチオレドキシンレダクターゼを介してＮＡＤＰＨから電子を受け取り、酸化還元サイクルにおいて活性である。Ｔ．Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（７）：４４６４−４４７２（２００９））によって記載されているように、発芽酵母においてチオレドキシン依存的ペルオキシダーゼ活性を示すタンパク質としては、５つのＰｒｘファミリータンパク質［すなわち、Ｔｓａ１、Ｔｓａ２、Ｐｒｘ１、Ａｈｐ１、Ｄｏｔ５］及び２つのグルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｐｘ）様タンパク質［すなわち、Ｇｐｘ２、Ｇｐｘ３］が挙げられるが、「Ｐｒｘ」は、本明細書では、Ｐｒｘタンパク質及びＧｐｘ様タンパク質の両方を指すのに用いられる。Ｙａｐ１転写因子を活性化することができる好ましいＰｒｘタンパク質としては、Ｇｐｘ３及びＴｓａ１がある。
【００３８】
用語「ＳｃＧｐｘ３」（配列番号２６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１７９５５９．１；Ｅ．Ｃ．１．１１．１．１５）は、配列番号２５によってコードされる、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃから単離されたチオールペルオキシダーゼを指す。ＧｅｎＢａｎｋにアノテーションが付けられているように、ＳｃＧｐｘ３は、細胞内Ｈ２Ｏ２レベルを感知して、Ｙａｐ１ｐ転写因子にレドックスシグナルを伝達するためのヒドロペルオキシド受容体として機能する。
【００３９】
用語「ＹｌＧｐｘ３」（配列番号２８；ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｐ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５０３４５４）は、本明細書に記載の配列番号２７によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカから単離されたチオールペルオキシダーゼを指す。
【００４０】
用語「ＳｃＴｓａ１」（配列番号３４；Ｅ．Ｃ．１．１１．１．１５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０１３６８４）は、本明細書に記載の配列番号３３によってコードされる、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃから単離したチオレドキシンペルオキシダーゼを指す（Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，４１２（１）：７３−８０（２００８））。ＧｅｎＢａｎｋにアノテーションが付けられているように、ＳｃＴｓａ１は、ペルオキシレドキシン（ＰＲＸ）２−Ｃｙｓサブファミリーに属し、ペルオキシレドキシンは、「チオール特異的抗酸化（ＴＳＡ）タンパク質として機能し、これは、Ｈ２Ｏ２、ペルオキシニトリル、及び有機ヒドロペルオキシドを還元することによって、そのペルオキシダーゼ活性により細胞内での保護的役割を付与する」。
【００４１】
用語「ＹｌＴｓａ１」（配列番号３６；ＹＡＬＩ０Ｂ１５１２５ｇ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５００９１５．１）は、本明細書に記載の配列番号３５によってコードされる、ヤロィア・リポリティカから単離されたチオレドキシンペルオキシダーゼを指す。
【００４２】
一般に、用語「油性」とは、エネルギー源を油の形態で蓄積する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。この過程では、油性微生物の細胞含油率は、概ねシグモイド曲線に従い、脂質の濃度は、後期対数又は初期安定成長期の最大値に達するまで増加し、その後、後期安定及び死滅期の間に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。本出願の目的のために、用語「油性」は、油として、その乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の少なくとも約２５％を蓄積することができる微生物を指す。
【００４３】
用語「油性酵母」とは、油を生成することができる（すなわち、そのＤＣＷの約２５％超の油を蓄積することができる）酵母として分類される油性微生物を指す。油性酵母の例としては、何ら限定されないが、以下の属：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。酵母のＤＣＷの約２５％を超える油を蓄積することができる能力は、組換え操作の取り組み又は生物の天然の能力によって達成されうる。
【００４４】
用語「トランスジェニック油性酵母」とは、概して、形質転換手順の結果としての、外来又は異種核酸フラグメントを含む油性酵母を指す。しかし、本発明の目的のために、用語「トランスジェニック油性酵母」は、特に、形質転換手順の結果としての、外来又は異種核酸フラグメントを含む油性酵母を指すが、ここで、外来又は異種核酸フラグメントの発現によって、油性酵母中のＹａｐ１転写因子活性の増大が起こる。従って、例えば、本明細書に記載する本発明のトランスジェニック油性酵母は、Ｙａｐ１転写因子又はＹａｐ１転写因子を活性化することができるタンパク質のいずれかをコードするキメラ遺伝子を過剰発現するように遺伝子的に改変してもよく、ここで、Ｙａｐ１転写因子又はＹａｐ１転写因子を活性化することができるタンパク質は、ネイティブ遺伝子（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）又は外来遺伝子のいずれかである。
【００４５】
対照的に、本明細書において、非トランスジェニック油性酵母とは、トランスジェニック油性酵母中のＹａｐ１転写因子活性増大をもたらす外来又は異種核酸で形質転換されておらず、従って、この特定の外来又は異種核酸が欠如していること以外はトランスジェニック油性酵母と同じ遺伝子型を有する油性酵母を指す。明瞭にするために、本明細書に記載する本発明の非トランスジェニック油性酵母は、少なくとも１つの外来又は異種核酸を発現してもよいが、これによって、Ｙａｐ１転写因子活性の増大は生じない。
【００４６】
「形質転換」とは、宿主生物中への核酸分子の移入を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよいし；又は、これは、宿主生物のゲノムに組み込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」若しくは「組換え体」又は「形質転換生物」若しくは「形質転換体」と呼ばれる。
【００４７】
用語「脂質」とは、任意の脂溶性（すなわち、親油性）の、天然に存在する分子を指す。脂質についての概説は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書（その表２を参照のこと）に記載されている。
【００４８】
用語「油」とは、２５℃で液体である脂質物質を指し；また、油は、疎水性であるが、有機溶媒には可溶性である。油性生物において、油は、全脂質の大部分を占める。「油」は、主にトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］から構成されるが、他の中性脂質、リン脂質及び遊離脂肪酸を含んでいてもよい。油中の脂肪酸組成と全脂質の脂肪酸組成は、概ね類似しており；従って、全脂質中の脂肪酸濃度の増加又は減少は、油中の脂肪酸濃度の増加又は減少に対応し、その逆も然りである。
【００４９】
「中性脂質」は、細胞内で、貯蔵脂肪としての脂肪体中に一般にみられる脂質であり、細胞のｐＨで、脂質が荷電基をまったく持っていないためにそう呼ばれる。一般に、中性脂質は、水に対して親和性がなく、完全に非極性である。中性脂質は、一般に、脂肪酸を含むグリセロールのモノ−、ジ−、及び／又はトリエステルを指し、それぞれ、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール若しくはトリアシルグリセロールとも呼ばれ、あるいは、集合的に、アシルグリセロールと呼ばれる。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が起こらなければならない。
【００５０】
用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］とは、グリセロール分子にエステル化した３つの脂肪アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖の多価不飽和及び飽和脂肪酸、並びに、より短鎖の飽和及び不飽和脂肪酸を含みうる。
【００５１】
本明細書において、用語「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］とは、所与のサンプル（例えば、バイオマス又は油でよい）中で塩基エステル交換方法（当分野では公知の）によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化することができる全ての細胞脂肪酸の総和である。従って、総脂肪酸には、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びＴＡＧなど）由来の脂肪酸、及び極性脂質画分（例えば、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン画分など）由来の脂肪酸が含まれるが、遊離脂肪酸は含まれない。
【００５２】
用語「全脂質含有率」及び「含油率」は、本明細書では、置換え可能に用いられ、ＴＦＡの測度として、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］のパーセントで表される細胞の脂質／油含有率を指すが、全脂質含油率は、ＦＡＭＥの測度として、ＤＣＷのパーセント［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として概算することもできる。従って、全脂質含油率［ＴＦＡ％ＤＣＷ］は、例えば、ＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸（ミリグラム）に相当する。
【００５３】
本発明のトランスジェニック油性酵母の含油率は、同等の増殖条件（例えば、炭素源の種類／量、窒素源の種類／量、炭素：窒素比、ミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産期の長さ、油蓄積期の長さ、及び細胞回収の時期／方法）下で、本発明の非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較しなければならない。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであり、これは、合成、非天然、又は改変されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなるものであってもよい。
【００５５】
アミノ酸又はヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動での評価、又はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いたコンピューター自動化配列比較及び同定のいずれかによって、当該ポリペプチド又は遺伝子を推定的に同定する上で、十分な量のポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、既知のタンパク質又は遺伝子に対して相同的なものとしてポリペプチド又は核酸配列を推定的に同定するためには、１０個以上の隣接したアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の隣接したヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定の配列依存的方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離（例えば、細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に用いることができる。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での増幅プライマーとして用いて、これらのプライマーを含む特定の核酸フラグメントを取得することもできる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、その配列を含む核酸フラグメントを具体的に同定及び／又は単離するのに十分な量の配列を含む。
【００５６】
用語「相補的」とは、逆平行配向でアラインメントしたとき、ワトソン・クリック塩基対合が可能なヌクレオチド塩基の２つの配列同士の関係を表す。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンは、チミンと塩基対合することができ、また、シトシンは、グアニンと塩基対合することができる。
【００５７】
「コドンの縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の改変を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者であれば、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用頻度において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分認識している。従って、宿主細胞での発現改善のための遺伝子を合成する場合、コドン使用の頻度が、宿主細胞の優先されるコドン使用の頻度に近似するように、遺伝子を設計することが望ましい。
【００５８】
「合成遺伝子」は、当業者には公知の手順を用いて、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックからアセンブリングすることができる。これらのビルディングブロックは、連結及びアニーリングされて、遺伝子セグメントを形成し、次にこれらが、酵素によりアセンブリングされて、遺伝子全体を構築する。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを表すように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整することができる。当業者であれば、コドン使用が、宿主によって優先されるコドンに偏っている場合の、遺伝子発現成功の可能性を理解している。優先されるコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて行うことができる。例えば、Ｙ．リポリティカのコドン使用プロフィールは、米国特許第７，１２５，６７２号明細書（本明細書に参照として組み込む）に記載されている。
【００５９】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指すが、これは、コード領域だけを指す場合もあり、あるいは、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）及び後続の調節配列（３’非コード配列）を含むこともある。「ネイティブ遺伝子」とは、それ自身の調節配列と共に天然に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、ネイティブ遺伝子ではない任意の遺伝子を指し、天然には一緒に存在しない調節配列及びコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然に存在するのとは異なる様式で配列された調節配列及びコード配列を含みうる。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム内でのその天然の位置にあるネイティブ遺伝子を指す。「外来」遺伝子（又は「外因性」遺伝子）とは、遺伝子移入により、宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非ネイティブ生物に挿入されたネイティブ遺伝子、ネイティブ宿主内の新しい位置に導入されたネイティブ遺伝子、又はキメラ遺伝子を含みうる。「トランスジーン」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の優先されるコドン使用の頻度を模倣するように設計されたコドン使用の頻度を有する遺伝子である。
【００６０】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００６１】
「好適な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置して、結合したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造を挙げることができる。
【００６２】
「プロモーター」とは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターは、その全体が、ネイティブ遺伝子に由来するものであっても、又は天然に存在する異なるプロモーターに由来する様々なエレメントから構成されるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当業者であれば、様々なプロモーターが、異なる組織若しくは細胞型において、又は異なる発生段階で、又は異なる環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指令しうることは理解されよう。ほとんどの細胞型においてほとんどいつでも遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。また、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全には規定されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同じプロモーター活性を有しうることも認識されよう。
【００６３】
用語「３’非コード配列」、「転写終結因子」及び「ターミネーター」は、本明細書において置換え可能に用いられ、コード配列の３’側下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列、並びに、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を与えることができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化認識シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分の付加に影響を与えることを特徴とする。３’領域は、結合したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を与えうる。
【００６４】
用語「機能的に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、核酸配列と単一の核酸フラグメントの結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に作用することができる場合、そのコード配列と機能的に連結されている。すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に機能的に連結することができる。
【００６５】
本明細書で用いる場合、用語「発現」とは、センス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指す。また、発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００６６】
「安定な形質転換」とは、遺伝学的に安定した遺伝をもたらす（すなわち、核酸フラグメントが、「安定に組み込まれる」）、宿主生物のゲノム（核及び細胞小器官ゲノムのいずれも含む）への核酸フラグメントの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」とは、宿主生物の核、又はＤＮＡ含有細胞小器官への核酸フラグメントの移入を指し、これによって、組込み又は安定な遺伝を伴わない遺伝子発現が起こる。
【００６７】
用語「プラスミド」及び「ベクター」とは、細胞の中心代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多いと共に、通常、環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態をしている染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージ若しくはヌクレオチド配列であってよく、また、任意の供給源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、ここで、いくつかのヌクレオチド配列は結合されているか、又は細胞に発現カセットを導入することができる特有の構造に組換えられている。
【００６８】
用語「発現カセット」とは、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要なコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）及び後続の調節配列（３’非コード配列）を含む、ＤＮＡのフラグメントを指す。従って、発現カセットは、典型的に、以下から構成される：１）プロモーター配列；２）コード配列（すなわち、オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」））；及び３）３’非翻訳領域（すなわち、ターミネーター）（これは、真核生物では、通常、ポリアデニル化部位を含む）。発現カセットは、クローニング及び形質転換を促進するために、通常、ベクター内に含有させる。各宿主について適正な調節配列が用いられている限り、異なる発現カセットを、様々な生物（細菌、酵母、植物及び哺乳動物の細胞など）に形質転換させることができる。
【００６９】
用語「配列分析ソフトウエア」とは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピューターアルゴリズム又はソフトウエアプログラムを指す。「配列分析ソフトウエア」は、市販のものであってもよいし、独立に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウエアとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：１）ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；及び５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。本願に関して、配列分析ソフトウエアが分析のために用いられる場合、分析の結果は、別途記載のない限り、言及したプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されたい。本明細書で用いる場合、「デフォルト値」とは、最初に初期化する際、ソフトウエアに初めから設定されている任意のセットの値又はパラメーターを意味する。
【００７０】
核酸又はポリペプチド配列に関連して、「配列同一性」又は「同一性」とは、指定の比較ウィンドウにわたって最大限に一致するようにアラインメントされたとき、同一である２つの配列中の核酸塩基又はアミノ酸残基を指す。従って、「配列同一性のパーセンテージ」又は「％同一性」とは、比較ウィンドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。パーセンテージは、両配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチ位置の数を取得し、このマッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算される。
【００７１】
「％同一性」又は「％類似性」を決定するための方法は、一般公開されているコンピュータープログラムに体系化されている。％同一性及び％類似性は、以下を含む公知の方法によって容易に計算することができるが、これらに限定されるわけではない：１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）。
【００７２】
配列アラインメント及び％同一性又は類似性の計算は、相同性配列を検出すべく設計された様々な比較方法を用いて、決定することができる。
【００７３】
配列の多重アラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント方法」を用いて実施することができるが、この方法は、同アルゴリズムの複数の変種、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＶアラインメント方法」及び「ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント方法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載、ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２））や、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラム（前掲）にみいだされるものを包含する。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを用いた配列のアラインメント後、プログラム中の「配列距離」表を調べることによって、「％同一性」を取得することができる。
【００７４】
用語「保存ドメイン」又は「モチーフ」とは、進化的に関連するタンパク質のアラインメントされた配列に沿って、特定の位置で保存されているアミノ酸の１セットを意味する。相同性タンパク質同士で、他の位置のアミノ酸は変動しうるが、特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、又は活性に必須のアミノ酸を意味する。これらは、タンパク質相同体のファミリーのアラインメントされた配列における、高度な保存によって識別されるため、新しく決定された配列のタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かを決定するための識別因子、又は「シグネチャー」として用いることができる。
【００７５】
用語「保存ドメインの分析方法」とは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［「ＮＣＢＩ」］の「Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎｓ」ツールを指すが、これは、ＣＤ検索を用いて、タンパク質配列内の保存ドメインを検出する（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｂｒｙａｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（Ｗ）３２７−３３１（２００４）；Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７（Ｄ）２０５−２１０（２００９）；及びＭａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９（Ｄ）２２５−２２９（２０１１））。
【００７６】
用語「ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒ＿Ｙｂｐ２スーパーファミリー」とは、Ｐｆａｍタンパク質データベースに記載されているタンパク質のＰｆａｍ０８５６８ファミリーを指す（Ｆｉｎｎ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２８１−Ｄ２８８（２００８））。
【００７７】
本明細書で用いる標準的組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当分野では公知であり、以下：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，により、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ  Ｊ．Ｂｅｎｎａｎ  Ｍ  Ｌ及びＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，により、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  （１９８４）；並びに、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，により、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【００７８】
アクチベータータンパク質１［「ＡＰ−１」］は、少なくとも３つの異なる癌原遺伝子ファミリー：Ｊｕｎ（ｃ−Ｊｕｎ、ｖ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ）、Ｆｏｓ（ｃ−Ｆｏｓ、ｖ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、ＦｏｓＢ２、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２）及び活性化転写因子（Ｂ−ＡＴＦ、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３／ＬＲＦ１）ファミリーの産物であるサブユニットから構成されるヘテロ二量体タンパク質である転写因子である。ＡＰ−１は、様々な刺激（例えば、サイトカイン、成長因子、ストレス、並びに細菌及びウイルス感染など）に応答して遺伝子発現を調節する。従って、ＡＰ−１は、ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡとして記載される配列を有する、ＡＰ−１認識エレメントを含む遺伝子の転写を上方制御することにより、多数の細胞プロセスを制御する。ＡＰ−１は、塩基性アミノ酸領域を介して上記のＤＮＡ配列に結合するのに対し、二量体構造は、ロイシンジッパーにより形成される。
【００７９】
ＹＡＰ１は、Ｓ．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＰ−１同等物であり、酸化ストレス応答についてのマスター転写因子として機能するという結論が出されている（Ｍｏｙｅ−Ｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，：２８３−２９２（１９８９））（配列番号２）。構造的には、このタンパク質は、ロイシンリッチジッパー領域及び隣接する塩基性領域（すなわち、アルギニン及びリシン残基を含む）、さらにはＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン（すなわち、Ｃｙｓ３０３、Ｃｙｓ３１０及びＣｙｓ３１５）並びにＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン（すなわち、Ｃｙｓ５９８、Ｃｙｓ６２０及びＣｙｓ６２９）から構成されるｂＺｉｐ構造モチーフを有する。
【００８０】
機能的に、少なくとも１つの分子内ジスルフィド結合が、Ｈ２Ｏ２ストレスに応答して、Ｃｙｓ３０３とＣｙｓ５９８の間に形成され、これは、Ｙａｐ１の多段階の配座変化及びＹａｐ１の核蓄積（核外搬出シグナルに対する改変による）を引き起こす。この活性酸化形態では、Ｙａｐ１は、少なくとも３２の異なるタンパク質の大きなレギュロンの発現を制御するが、このようなタンパク質としては、細胞抗酸化因子並びにグルタチオン及びペントースリン酸経路の酵素がある（Ｌｅｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１６０４０−１６０４６（１９９９））。Ｙａｐ１−制御チオレドキシンによる酵素的還元によって、Ｙａｐ１の非活性化が起こり、このようにして、自動制御の作用機序がもたらされる。
【００８１】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙａｐ１の酸化は、Ｈ２Ｏ２に直接応答して起こるのではなく；構成的に発現されたチオールペルオキシダーゼタンパク質（例えば、Ｇｐｘ３；配列番号２６）が、Ｈ２Ｏ２シグナルを伝達し、これによって、Ｙａｐ１内に分子内ジスルフィド結合の形成の触媒が起こる（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２７００２−２７００９（１９９９）；Ｄｅｌａｕｎａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１１：４７１−４８１（２００２））。このグルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｐｘ）様タンパク質のＣｙｓ３６は初め、ジスルフィド結合によってＹａｐ１のＣｙｓ５９８と架橋するが、このジスルフィド結合は、Ｙａｐ１分子内ジスルフィド結合に変換される（図１：Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：４４６４−４４７２（２００９）；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２７：６７５−６８８（２００７）から再現）。Ｙａｐ１と反応しないＧｐｘ３タンパク質は、Ｈ２Ｏ２を直接水に還元することができるため、ＧＰＸ３タンパク質のＣｙｓ３６及びＣｙｓ８２の間に分子内ジスルフィド結合の形成が起こる。また、Ｙａｐ１活性化のためのＧｐｘ３とは独立した経路も周知である（Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ，Ｍｅｄ．，３５：８８９−９００（２００３））。
【００８２】
Ｇｐｘ３の他に、少なくとも１つの酸化還元活性システイン残基を含む、１組の他のペルオキシレドキシン（Ｐｒｘ）タンパク質もＹａｐ１転写因子を活性化することができると考えられる（直接又は間接的手段により）。特に、Ｔ．Ｔａｃｈｉｂａｎａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（７）：４４６４−４４７２（２００９））は、発芽酵母中にチオレドキシン依存的ペルオキシダーゼ活性を有するものとして、５つのＰｒｘファミリータンパク質［すなわち、Ｔｓａ１、Ｔｓａ２、Ｐｒｘ１、Ａｈｐ１、Ｄｏｔ５］と、２つのＧｐｘ様タンパク質［すなわち、Ｇｐｘ２、Ｇｐｘ３］を同定している（これらのすべてを、本明細書では包括的にＰｒｘタンパク質と呼ぶ）。これらのタンパク質が、Ｙａｐ１と相互作用する厳密な性質については研究が続けられている。Ｔ．Ｔａｃｈｉｂａｎａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：４４６４−４４７２（２００９））は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｓａ１（配列番号３４）が、Ｃｙｓ−４８及びＣｙｓ−１７１に基づき、Ｇｐｘ３と類似の様式で、Ｙａｐ１と相互作用することを報告している。
【００８３】
Ｙａｐ１とＹｂｐ１が相互作用する厳密な作用機序は不明だが、Ｙｂｐ１は、Ｙａｐ１転写因子の活性化にも影響を及ぼすことが明らかにされている。Ｇｕｌｓｈａｎ，Ｋ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６（３９）：３４０７１−３４０８１（２０１１））は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びカンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）の両方において、Ｙｂｐ１とＹａｐ１の間の相互作用を研究し、「Ｙａｐ１とＹｂｐ１は、細胞中で直接相互作用するようである．．．これら２つのタンパク質の相互作用モチーフをさらに位置決定しようとする取り組みは失敗した」と報告している。この中で、Ｙａｐ１とＹｂｐ１の相互作用には、複数の低親和性相互作用が含まれているようであり、Ｙａｐ１の酸化は、Ｙｂｐ１パートナーからの折りたたまれたタンパク質の放出をトリガーするようであると仮定されている。また、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＹｂｐ１の過剰生産もＨ２Ｏ２耐性の増大をもたらすと報告されている。
【００８４】
酸化ストレス応答の作用機序は、比較的よく保存されており（種によっていくらか差があるが）、Ｙａｐ１ｐ相同体、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）中のＣａｐ１ｐ、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）中のＰａｐ１もまた、酸化ストレスに応答して、いくつかの抗酸化遺伝子を転写により調節することが知られている（Ｉｋｎｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｋ．Ｓｈｉｏｚａｋｉ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５６９：１３−２７（２００５））。しかし、油性酵母において酸化ストレス応答が機能する手段については、これよりはるかに特性決定されていない。油性酵母は、油合成及び蓄積を自然にすることができ、総含油率は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の約２５％超、より好ましくはＤＣＷの約３０％超、より好ましくはＤＣＷの約４０％超、さらに好ましくはＤＣＷの約５０％超、そして最も好ましくはＤＣＷの約６０％超を含みうる（ここで、この油蓄積の割合は、本明細書に記載の本発明に従い、酵母中のネイティブＹａｐ１転写因子活性を増大するあらゆる取り組みに先立つものである）。様々な酵母が、そのまま油性酵母として分類されるが、別の実施形態では、非油性生物を遺伝子的に改変することにより、油性にすることができ、そのような生物として、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母がある（国際出願公開第２００６／１０２３４２号パンフレットを参照）。
【００８５】
典型的に油性酵母として識別される属として、限定されないが、以下のものが挙げられる：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、及びリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）。より詳細には、油合成酵母の例として、以下を挙げることができる：ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス・スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルクエリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（限定されないが、例えば、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２及び／又はＬＧＡＭＳ（７）１と称されるヤロウィア・リポリティカ株（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））。
【００８６】
好気的代謝を行う他の生物、従って、ＲＯＳ（呼吸中に水への酸素の不完全な還元によって発生する）に対する防御に依存する他の生物と同様に、無条件的好気性油性酵母もまた酸化ストレスを感知し、これに応答する様々な手段を必要とする。本発明では、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の相同体Ｙａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１及び／又はＹｂｐ１遺伝子が、以下の表にまとめるように、油性酵母、ヤロウィア・リポリティカに同定されている。各タンパク質対のアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８１）多重配列アラインメント（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて実施した。
【００８７】
表２．Ｙａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１及びＹｂｐ１相同体
【表２】
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【００８８】
驚くことに、Ｙ．リポリティカＹａｐ１［「ＹｌＹａｐ１」］及びＧｐｘ３［「ＹｌＧｐｘ３」］タンパク質を過剰発現させることにより、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させると、トランスジェニックＹ．リポリティカは、非トランスジェニックＹ．リポリティカ中の含油率と比較して、増加した含油率（ＴＦＡ％ＤＣＷとして測定される）を有することがわかった。
【００８９】
従って、本発明は、増大したＹａｐ１転写因子活性を含む、増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母に関し、ここで、前記増加した含油率は、非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較したものである。
【００９０】
本明細書では、増大したＹａｐ１転写因子活性が酸化ストレスに対する抵抗性を増強させるため、増加した含油率がトランスジェニック油性酵母に観察されると仮定する。こうした酸化ストレスに対する抵抗性の増強の１つの有益な成果は、脂質過酸化からの保護の増大であり、これによって、トランスジェニック油性酵母中の油／脂質含油率増加がもたらされる。脂質分子の中でも、ＰＵＦＡは特にＲＯＳに対して敏感であり、脂質の過酸化に対する脂肪酸の感受性は、脂肪アシル鎖不飽和の度合いに応じて増加することが明らかにされた（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３０：２７７−２９０（１９９５））。脂質の過酸化は、膜の完全性に作用する極性ヒドロペルオキシドの生成によって、細胞生存性に影響を及ぼすことがわかっている（Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｎ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓ．Ｖ．Ａｖｅｒｙ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（４）：５３９−５４５（１９９７）；Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｎ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓ．Ｖ．Ａｖｅｒｙ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（８）：２９７１−２９７６（１９９７））。しかし、これまで、含油率におけるＹａｐ１転写因子過剰発現の効果を証明した研究はなかった。
【００９１】
好ましくは、本発明のトランスジェニック油性酵母は、非トランスジェニック油性酵母の含油率より少なくとも１０〜２５％高い含油率を産生することができる。より好ましくは、含油率の増加は、非トランスジェニック油性酵母の含油率より、少なくとも２５〜４５％高く、最も好ましくは、含油率の増加は、非トランスジェニック油性酵母の含油率より、少なくとも４５〜６５％高い。従って、当業者は、含油率の増加が、非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較して、１０％から１００％以上までの任意の整数のパーセンテージ（又はその分数）であってよく、すなわち、具体的には、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の含油率の増加を含むことを理解されよう。
【００９２】
前述したように、微生物油には、トリアシルグリセロール（長鎖の多価不飽和及び／又は飽和脂肪酸と、より短鎖の飽和及び／又は不飽和脂肪酸を含む）、並びにその他の中性脂質、リン脂質及び／又は遊離脂肪酸が含まれる。
【００９３】
一実施形態では、増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母におけるＹａｐ１転写因子活性の増大は、Ｙａｐ１転写因子の過剰発現によって起こる。好適なＹａｐ１転写因子は、好ましくは、転写因子活性を有し、かつ以下：
ａ）ｂＺＩＰロイシンジッパーモチーフ；
ｂ）少なくとも６つのアミノ酸によって隔てられる少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン；及び
ｃ）少なくとも８つのアミノ酸によって隔てられる少なくとも２つのシステイン残基の配列を含むＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン、
を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
ｂＺＩＰロイシンジッパーモチーフは、約１４〜１６アミノ酸におよぶ塩基性ＤＮＡ結合領域（すなわち、アルギニン及びリシン残基を含む）と、隣接するロイシンリッチジッパー領域（すなわち、二量体化を可能にする均一な間隔で配置されたロイシンを含む）を含む（Ｈｕｒｓｔ，Ｈ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅ，２：１０１−１６８（１９９５））。
【００９５】
１つの好ましいＹａｐ１転写因子は、配列番号４に示されるように、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙａｐ１［「ＹｌＹａｐ１」］ポリペプチド配列である。代替的実施形態では、ＳｃＹＡｐ１（配列番号２）又は表４（実施例１）に示す配列のいずれかであり、あるいは、その相同体若しくはコドン最適化誘導体も本発明で用いることができる。
【００９６】
別の実施形態では、増加した含油率を有するトランスジェニック油性酵母におけるＹａｐ１転写因子活性の増大は、転写因子と、転写因子を活性化することができるタンパク質との相互作用を増大することによって（すなわち、転写因子を活性化することができるタンパク質自体を過剰発現させることによって）達成する。好ましくは、転写因子を活性化することができるタンパク質は、Ｇｐｘ３、Ｙｂｐ１及びＴｓａ１からなる群から選択される。
【００９７】
例えば、好適なＧｐｘ３タンパク質は、以下を含む：
ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このポリペプチドは、配列番号２６［ＳｃＧｐｘ３］又は配列番号２８［ＹｌＧｐｘ３］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＰアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する）；
ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列は、配列番号２５［ＳｃＧｐｘ３］又は配列番号２７［ＹｌＧｐｘ３］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＮアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％の配列同一性を有する）；又は
ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体（この相補体と上記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である）。
【００９８】
好適なＧｐｘ３タンパク質は、少なくとも１つの酸化還元活性システイン残基、例えば、ＳｃＧｐｘ３（配列番号２６）のＣｙｓ３６及びＣｙｓ８２を含む。
【００９９】
好ましくは、Ｇｐｘ３をコードするポリペプチド配列は、配列番号２８（「ＹｌＧｐｘ３」）に示される。別の実施形態では、Ｇｐｘ３をコードするポリペプチド配列は、配列番号２６又は配列番号２８と比較して、ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％の配列同一性を有する。すなわち、このポリペプチドは、上記の配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有しうる。別の実施形態では、表９（実施例５）に記載の配列、又はその相同体若しくはコドン最適化された誘導体を本発明で用いてもよい。
【０１００】
同様に、好適なＴｓａ１タンパク質は、以下を含む：
ａ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このポリペプチドは、配列番号３４［ＳｃＴｓａ１］又は配列番号３６［ＹｌＴｓａ１］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＰアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する）；
ｂ）Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列は、配列番号３３［ＳｃＴｓａ１］又は配列番号３５［ＹｌＴｓａ１］からなる群から選択される配列と比較して、ＢＬＡＳＴＮアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％の配列同一性を有する）；又は
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列の相補体（この相補体と上記ヌクレオチド配列は、同じ数のヌクレオチドから構成され、１００％相補的である）。
【０１０１】
好適なＴｓａ１タンパク質は、少なくとも１つの酸化還元活性システイン残基、例えば、ＳｃＴｓａ１（配列番号３４）のＣｙｓ４８及びＣｙｓ１７１を含む。
【０１０２】
好ましくは、Ｔｓａ１をコードするポリペプチド配列は、配列番号３６（「ＹｌＴｓａ１」）に示される。別の実施形態では、Ｔｓａ１をコードするポリペプチド配列は、配列番号３４又は配列番号３６と比較して、ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント方法に基づき、少なくとも７０％の配列同一性を有する。すなわち、このポリペプチドは、上記の配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有しうる。別の実施形態では、表１２（実施例９）に記載の配列、又はその相同体若しくはコドン最適化された誘導体を本発明で用いてもよい。
【０１０３】
好適なＹｂｐ１タンパク質は、Ｙａｐ１転写因子と相互作用して、Ｙａｐ１転写因子活性を増大させることができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このポリペプチド配列は、保存ドメインの分析方法に基づき、ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒ＿Ｙｂｐ２スーパーファミリーに分類される。
【０１０４】
好ましくは、Ｙｂｐ１をコードするポリペプチド配列は、配列番号４０に示される（「ＹｌＹｂｐ１」）。別の実施形態では、ＳｃＹｂｐ１（配列番号３８）又は表１３若しくは表１４に記載の配列（実施例１０、すなわち配列番号４３〜４８を含む）のいずれか、又はそれらの相同体若しくはコドン最適化誘導体を本発明で用いてもよい。
【０１０５】
明瞭にするために、トランスジェニック油性酵母中のＹａｐ１転写因子活性の増大は、ネイティブＹａｐ１転写因子、外来Ｙａｐ１転写因子、この転写因子を活性化することができるネイティブタンパク質、この転写因子を活性化することができる外来タンパク質、又はこれらの任意の組合せの過剰発現によって達成することができる。過剰発現は、例えば、多コピープラスミドを用いて、宿主細胞に適切な遺伝子のさらなるコピーを導入することによって起こりうる。このような遺伝子は、それらのコードされた機能の活性増大をもたらす適切な調節配列と一緒に、染色体に組み込んでもよい。標的遺伝子は、非ネイティブプロモーター又は改変されたネイティブプロモーターの制御下に置かれるように改変してもよい。外因性プロモーターは、変異、欠失、及び／又は置換により、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変することができる。
【０１０６】
前述したように、目的の油性酵母の発現のために、上に記載したＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１タンパク質のいずれか１つを、コドン最適化するのが望ましい。例えば、Ｙ．リポリティカにおける発現のために、表４、９、１２、１３若しくは１４に記載の配列のいずれかをコドン最適化することができる。これは、Ｙ．リポリティカコドン使用プロフィールの以前の決定、優先されるコドンの同定、及び「ＡＴＧ」開始コドンの周囲の共通配列の決定に基づいて実施可能である（米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照）。
【０１０７】
別の実施形態では、配列分析ソフトウエアを用いて、同じ又は別の種においてＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１相同体を検索するために、表４、９、１２、１３若しくは１４に記載の配列、又はそれらの部分を用いることもできる。一般に、このようなコンピューターソフトウエアは、様々な置換、欠失、及びその他の改変物に、相同性の度合いを割り当てることによって、類似の配列をマッチさせる。ソフトウエアアルゴリズム、例えば、低複雑配列フィルター及び以下のパラメーター：期待値＝１０、マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いたＢＬＡＳＴＰアラインメント方法の使用は、表４、９、１２、１３若しくは１４に記載のＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１若しくはＹｂｐ１タンパク質を、核酸若しくはタンパク質配列のデータベースと比較して、好ましい生物内での類似した既知の配列を同定するための手段として公知である。
【０１０８】
既知の配列のデータベースを綿密に調べるためのソフトウエアアルゴリズムの使用は、一般公開されているＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１配列に対して比較的低い％同一性を有する相同体、例えば、表４、９、１２、１３若しくは１４に記載のものを単離するのに特に適している。一般公開されているＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１配列に対して少なくとも約７０％〜７５％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の同一性を有するＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１相同体については、単離が比較的容易であることが推定できる。さらに、少なくとも約８５％〜９０％の同一性である配列は、特に単離に適しており、また、少なくとも約９０％〜９５％の同一性である配列は、最も容易に単離される。
【０１０９】
また、いくつかのＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１相同体は、これら酵素に特有のモチーフを用いることによって単離されている。当業者には理解されるように、これは、複数の保存配列モチーフを共有しているものの、互いに比較的低い配列相同性を共有する転写因子について、特に有用である。モチーフ（例えば、ｂＺＩＰロイシンリッチジッパーモチーフの塩基性ＤＮＡ結合領域及び隣接するロイシンリッチジッパー領域、Ｙａｐ１転写因子のＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン及びＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン）は、タンパク質相同体のファミリーのアラインメントされた配列における高い保存の度合いによって同定される。特有の「シグネチャー」として、これらは、新たに決定された配列を含むタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かを決定することができる。同様に、Ｇｐｘ３及びＴｓａ１相同体は、タンパク質配列内の相対的位置が保存されている少なくとも１つの酸化還元活性システイン残基を含むと予想される。これらのモチーフは、新しい相同性遺伝子の迅速な同定のための診断ツールとして有用である。
【０１１０】
同じ又は別の種に由来する相同性タンパク質をコードする遺伝子を単離するのに、本明細書に記載する、又は公開文献に記載されているＹａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１核酸フラグメントのいずれを用いてもよい。配列依存的プロトコルを用いた相同性遺伝子の単離が当分野では公知である。配列依存的プロトコルの例として、限定されないが以下のものが挙げられる：１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２）ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５））；又は鎖置換型増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））などの各種核酸増幅技術の使用により例示されるもの；並びに、３）ライブラリー構築方法及び相補性によるスクリーニング方法。
【０１１１】
本発明はまた、油性酵母中の含油率を増加する方法にも関し、この方法は、以下を含む：
ａ）（ｉ）Ｙａｐ１転写因子；
（ｉｉ）上記転写因子を活性化することができるタンパク質；
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ii）の組合せ
からなる群から選択されるタンパク質を過剰発現させるように油性酵母細胞を改変するステップ；及び
ｂ）非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較して増加した含油率をもたらすのに適した条件下で、油性酵母を増殖させるステップ。
【０１１２】
当業者は、以下の事項を記載する標準的情報資源を認識するであろう：１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの高分子の構築、操作及び単離についての具体的条件及び手順；２）組換えＤＮＡフラグメント及び組換え発現構築物の作製；３）クローンのスクリーニング及び単離。上に引用したような、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｓｉｌｈａｖｙ、及びＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。
【０１１３】
一般に、組換え発現構築物に組み込む配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、並びに形質転換細胞と非形質転換細胞を分離する提案された方法に応じて異なる。典型的には、ベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択マーカー、及び自律的複製又は染色体組込みを可能にする配列を含む。好適な発現カセットは、典型的に、プロモーター、選択された遺伝子（例えば、その発現によって、Ｙａｐ１転写因子活性の増大が起こるポリペプチドをコードする遺伝子）のコード配列、及びターミネーター（すなわち、キメラ遺伝子）を含む。好ましくは、いずれの制御領域も、形質転換した宿主細胞に由来する。
【０１１４】
本明細書に記載する本発明のポリペプチドをコードするＯＲＦの発現を指令することができる実質的にあらゆるプロモーター（すなわち、ネイティブ、合成、又はキメラ）が好適であるが、Ｙ．リポリティカ由来の転写及び翻訳領域が特に有用である。発現は、誘導又は構成的方式で達成することができる。誘導発現は、目的の遺伝子（例えば、Ｙａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１）に機能的に連結された調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって達成することができ、また、構成的発現は、目的の遺伝子に機能的に連結された構成性プロモーターの使用によって達成することができる。
【０１１５】
ターミネーターは、プロモーターを取得した遺伝子の３’領域、又は異なる遺伝子に由来するものでよい。多数のターミネーターが周知であり、これらは、その由来する同じ属及び種、並びに異なる属及び種のいずれで使用する場合でも、多種の宿主において満足に機能する。ターミネーターは、通常、特定の特性のためにというより、便宜上選択される場合が多い。好ましくは、ターミネーターは、酵母遺伝子に由来する。また、当業者は、ターミネーターを設計及び合成するための入手可能な情報を利用できることから、ターミネーターは合成のものであってもよい。ターミネーターは、必要ではない場合もあるが、その存在は極めて好ましい。
【０１１６】
限定する意図はないが、組換えＹ．リポリティカで使用するのに好ましいプロモーター及びターミネーターは、以下の文献に教示されているものである：米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１０−００６８７８９−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１１−００５９４９６−Ａ１号明細書、米国仮特許出願第６１／４６９，９３３号明細書（代理人整理番号：ＣＬ４７３６ＵＳＰＲＶ、２０１１年３月３１日出願）、米国仮特許出願第６１／４７０，５３９号明細書（代理人整理番号：ＣＬ５３８０ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月１日出願）、米国仮特許出願第６１／４７１，７３６号明細書（代理人整理番号：ＣＬ５３８１ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月５日出願）、及び米国仮特許出願第６１／４７２，７４２号明細書（代理人整理番号：ＣＬ５３８２ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月７日出願）。尚、上記文献の各々の開示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。より具体的には、好ましいプロモーターとして、以下が挙げられる：ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＭ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１、ＥＸＰ１、ＤＧＡＴ２、ＥＬ１、ＡＬＫ２、及びＳＰＳ１９。
【０１１７】
高い発現率を達成するために、多くの専門化した発現ベクターが作製されている。このようなベクターは、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性及び位置、並びに宿主細胞からの分泌を制御する特定の特性を調節することによって作製される。これらの特性として、以下のものが挙げられる：関連転写プロモーター及びターミネーター配列の性質；コピー及びクローン化遺伝子の数（ここで、単一の発現構築物に追加コピーをクローン化してもよいし、及び／又はプラスミドコピー数を増加するか、若しくはクローン化した遺伝子のゲノムへの多重組込みにより、追加コピーを宿主細胞に導入してもよい）；遺伝子が、プラスミド由来か、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれているか；宿主生物におけるタンパク質の翻訳及び正しい折りたたみの効率；宿主細胞内のクローン化遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質の固有安定性；並びにクローン化遺伝子内のコドン使用（その頻度が、宿主細胞の優先コドン使用の頻度に近似するように）。
【０１１８】
油性酵母での発現に好適なＤＮＡカセット（例えば、プロモーター、その発現によって、Ｙａｐ１転写因子活性の増大が起こるポリペプチド［例えば、Ｙａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１又はＹｂｐ１」をコードするＯＲＦ及びターミネーターを含む、キメラ遺伝子を含む）をいったん取得したら、宿主細胞において自律的複製が可能なプラスミドベクターに導入するか、又はこのキメラ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをゲノムに直接組み込む。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム内でランダムに実施してもよいし、あるいは、特定の遺伝子座に組換えをターゲティングするのに十分なゲノムとの相同性の領域を含む構築物を用いて、ターゲティングしてもよい。構築物を内在性遺伝子座にターゲティングする場合には、転写及び翻訳調節領域の全部又は一部を内在性遺伝子座によって付与することもできる。
【０１１９】
目的のキメラ遺伝子を含む構築物は、任意の標準的技術によって油性酵母に導入することができる。こうした技術には、形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］）、パーティクルガン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、又は目的の遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法が含まれる。Ｙ．リポリティカに適用可能な、さらに詳細な教示としては、以下の文献がある：米国特許第４，８８０，７４１号明細書及び米国特許第５，０７１，７６４号明細書、並びにＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））。好ましくは、宿主のゲノムへの線状ＤＮＡフラグメントの組込みは、Ｙ．リポリティカ宿主細胞の形質転換において有利である。ゲノム内の複数の位置への組込みは、高レベルの遺伝子発現が所望されるとき、特に有用となりうる。好ましい遺伝子座としては、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に教示されているものがある。
【０１２０】
用語「形質転換（された）」、「形質転換体」又は「組換え体」は、本明細書において置換え可能に用いられる。形質転換された宿主は、発現構築物の少なくとも１つのコピーを有するが、発現カセットがゲノムに組み込まれたか、増幅されたか、又は複数のコピー数を有する染色体外エレメントに存在するのかに応じて、２つ以上を有しうる。形質転換宿主細胞は、導入された構築物に含まれるマーカーについての選択によって同定することができる。あるいは、多くの形質転換技術は、多数のＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するため、個別のマーカー構築物を所望の構築物と一緒に共形質転換することもできる。典型的には、形質転換宿主は、選択培地（抗生物質を含んでもよいし、又は、非形質転換宿主の増殖に必要な因子、例えば、栄養素又は成長因子が欠如していてもよい）上で増殖するそれらの能力について選択する。導入されるマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を付与したり、又は必須成長因子若しくは酵素をコードしたりすることができるため、これらが形質転換宿主に発現されると、選択培地上で増殖が可能になる。形質転換宿主の選択はまた、発現されたマーカータンパク質を直接又は間接的のいずれかで検出することができる場合にも、行うことができる。さらに別の選択技術は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、及び国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている。
【０１２１】
油性酵母に組み込まれたＤＮＡフラグメントの安定性は、個々の形質転換体、受容株及び用いたターゲティングプラットフォームに応じて変動する。従って、所望の発現レベル及びパターンを展示する株を取得するために、特定の組換え微生物宿主細胞の複数の形質転換体をスクリーニングしなければならない。ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウエスタン分析、表現型分析又はＧＣ分析が、好適なスクリーニング方法である。
【０１２２】
本発明で用いるのに好適な宿主細胞は、上に定義したように、そのＤＣＷの約２５％を超える油を蓄積することができる油性酵母である。本明細書のある実施形態では、油性酵母宿主は、野生型株であり；別の実施形態では、油性酵母宿主は、ネイティブのＹａｐ１転写因子活性レベルに影響を及ぼさない発現構築物による形質転換に事前に供された形質転換株又は組換え株である。例えば、ある実施形態では、油性酵母は、少なくとも１つの目的の非ネイティブ産物を産生することができるように、事前に改変されており、目的の好適な非ネイティブ産物の例としては、例えば、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオール及びヒドロキシエステル、キノン由来の化合物並びにレスベラトロールが挙げられるが、これらに限定する意図はない。
【０１２３】
油性酵母は、その微生物油内に「多価不飽和脂肪酸」（又は「ＰＵＦＡ」）を産生しうる（天然の能力又は遺伝子改変のいずれかにより）ことに留意されたい。ＰＵＦＡ、特にω−３及びω−６ＰＵＦＡに関連する健康効果は、十分に立証されているが、これらの分子は、複数の二重結合を含み、その間に、特に反応性の水素を有するメチレン−ＣＨ２−基が存在することから、細胞内で脂質過酸化を特に被りやすい。より具体的には、ＰＵＦＡは、本明細書において、少なくとも１８個の炭素原子と、２個以上の二重結合を有する脂肪酸を指す。用語「脂肪酸」は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な長さの長鎖脂肪酸（アルカノン酸）を指すが、より長い又はより短い鎖長の酸も周知である。主な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法によって表すが、ここで、Ｘは、特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」との違い、「一価不飽和脂肪酸」」と「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］との違い、並びに「ω−６脂肪酸」［「ｎ−６」］と「ω−３脂肪酸」［「ｎ−３」］の違いについて、さらに詳細には、米国特許第７，２３８，４８２号明細書（参照として本明細書に組み込む）に記載されている。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、表３には、ω−３及びω−６ＰＵＦＡ並びにそれらの前駆体の化学名及び一般名、さらには一般に用いられている略称が記載されている。
【０１２４】
しかし、ＰＵＦＡのいくつかの例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：リノール酸［「ＬＡ」、１８：２  ω−６］、γリノール酸［「ＧＬＡ」、１８：３  ω−６］、エイコサジエン酸［「ＥＤＡ」、２０：２  ω−６］、ジホモγリノール酸［「ＧＬＡ」、２０：３  ω−６］、アラキドン酸［「ＡＲＡ」、２０：４  ω−６］、ドコサテトラエン酸［「ＤＴＲＡ」、２２：４  ω−６］、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」、２２：５  ω−６］、αリノール酸［「ＡＬＡ」、１８：３  ω−３］、ステアリドン酸［「ＳＴＡ」、１８：４  ω−３］、エイコサトリエン酸［「ＥＴＡ」、２０：３  ω−３］、エイコサテトラエン酸［「ＥＴｒＡ」、２０：４  ω−３］、エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」、２０：５  ω−３］、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−３」、２２：５  ω−３］及びドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」、２２：６  ω−３］。
【０１２５】
ＰＵＦＡ生産のためのＹ．リポリティカの株を作製することに多大な労力が投じられてきた。例えば、米国特許第７，２３８，４８２号明細書では、上記の酵母においてω−６及びω−３脂肪酸を生産する実現可能性が証明された。米国特許第７，９３２，０７７号明細書は、組換え体による総脂肪酸の２８．１％ＥＰＡの生産を立証し；米国特許第７，５８８，９３１号明細書は、組換え体による総脂肪酸の１４％ＡＲＡの生産を立証し；米国特許第７，５５０，２８６号明細書は、組換え体による総脂肪酸の５％のＤＨＡの生産を立証し；また、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、ＥＰＡ生産のための最適化組換え株を記載し、組換え体による総脂肪酸の５５．６％のＥＰＡの生産を立証している。米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書には、さらに最適化された組換えＹ．リポリティカ株が記載されており、この株は、ＴＦＡの５０％以下のＥＰＡを含み、しかも、リノール酸に対するＥＰＡの比（ＴＦＡの重量％として測定）が少なくとも３．１である微生物油を産生する。形質転換体Ｙ．リポリティカは、ＰＵＦＡ産生のためのデサチュラーゼ（すなわち、Δ−１２デサチュラーゼ、Δ−６デサチュラーゼ、Δ−８デサチュラーゼ、Δ−５デサチュラーゼ、Δ−１７デサチュラーゼ、Δ−１５デサチュラーゼ、Δ−９デサチュラーゼ、Δ−４デサチュラーゼ、）及びエロンガーゼ（すなわち、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ及びΔ−９エロンガーゼ）遺伝子の様々な組合せを発現する。
【０１２６】
表３に、上に引用した参照文献に記載されている特定のＹ．リポリティカ株のいくつか（ここで、前記株はデサチュラーゼとエロンガーゼの様々な組合せを有する）についての情報を記載する。これらは、本明細書に記載の本発明で好適な宿主細胞として用いることができる株の例であるが、特定の株及び産生された特定のＰＵＦＡ（若しくはその量）は、本発明を何ら限定するものではないことは理解すべきである。
【０１２７】
表３．ω−３／ω−６ＰＵＦＡを産生するように改変された典型的アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の脂質プロフィール
【表３】
2014505472.tif 000006
2014505472.tif 000007
【０１２８】
表３注釈: 「用語「脂質プロフィール」及び「脂質組成物」は、置き換え可能であり、特定の脂質画分（例えば、全脂質又は油）中に含まれる個別の脂肪酸の量を指し、その量は、ＴＦＡの重量％として表される。混合物中に存在する個別の脂肪酸の総和は１００でなければならない。
用語「総脂肪酸」（「ＴＦＡ」）とは、所定のサンプル（例えば、バイオマス又は油であってよい）中での塩基エステル交換方法（当分野では公知の）によって、脂肪酸メチルエステル（「ＦＡＭＥ」）に誘導体化することができる全ての細胞脂肪酸の総和を指す。従って、総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びトリアシルグリセロール）由来の脂肪酸及び極性脂質画分由来の脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。全脂質中の１脂肪酸の濃度は、ここでは、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］、例えば、ＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所定の脂肪酸のミリグラムとして表される。本明細書に別途明示されていない限り、全脂質に対する所定の脂肪酸のパーセントについて述べるとき、これは、％ＴＦＡとして表される脂肪酸の濃度に相当する（例えば、全脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに相当する）。
脂肪酸は、以下のものである：１６：０（パルミチン酸塩）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（リノール酸）、１８：３（ＡＬＡすなわち、αリノール酸）、ＧＬＡ（γリノール酸）、２０：２（ＥＤＡすなわち、エイコサジエン酸）、ＤＧＬＡ（ジホモ−γリノール酸）、ＡＲＡ（アラキドン酸）、ＥＴＡ（エイコサテトラエン酸）、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）及びＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）。」
【０１２９】
当業者には、少なくとも１種のＰＵＦＡを産生する油性酵母中の活性酸素種［「ＲＯＳ」］を低減する手段が、特に望ましいことは明らかであろう。従って、本発明の一実施形態は、増加した含油率を有し、少なくとも１種のＰＵＦＡを産生するトランスジェニック油性酵母に関し、前記トランスジェニック油性酵母は、増大したＹａｐ１転写因子活性を含み、ここで、増加した含油率は、非トランスジェニック油性酵母の含油率と比較したものである。Ｙａｐ１転写因子活性自体の過剰発現による、又はＹａｐ１転写因子を活性化することができるタンパク質（例えば、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１、Ｙｂｐ１）の過剰発現によるＹａｐ１転写因子活性の増大は、さらに、乾燥細胞重量の質量パーセント［％ＤＣＷ］として表される、細胞中の所定のＰＵＦＡの含油率増加ももたらしうる。
【０１３０】
例えば、ＥＰＡ生産性又はＥＰＡ力価［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］の測定値は、以下の式に従って決定する：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）／１００。主としてＥＰＡを産生する、表３に記載した株のいずれにおいても、酵母中のＹａｐ１転写因子活性の増大をもたらす遺伝子操作によって、含油率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］の増加及びＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］の増加の両方が達成されると予想される。
【０１３１】
好ましい実施形態では、少なくとも１種のＰＵＦＡを産生する本発明のトランスジェニック油性酵母は、非トランスジェニック油性酵母（すなわち、そのＹａｐ１転写因子活性が増大されていない）中のＤＣＷの質量パーセントとしての所定のＰＵＦＡの含油率より、少なくとも１０〜２５％高い含油率の所定のＰＵＦＡを産生することができる。より好ましくは、所定のＰＵＦＡの増加は、少なくとも２５〜４５％であり、最も好ましくは、所定のＰＵＦＡの増加は、少なくとも４５〜６５％超である。従って、当業者であれば、ＤＣＷの質量パーセントとしての所定のＰＵＦＡの増加が、１０％から１００％以上の任意の整数のパーセンテージ（又はその分数）であってよく、すなわち、具体的には、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％でありうることを理解されよう。
【０１３２】
形質転換宿主細胞は、キメラ遺伝子（例えば、その発現が、Ｙａｐ１転写因子活性の増大をもたらすポリペプチド［例えば、Ｙａｐ１、Ｇｐｘ３、Ｔｓａ１、Ｙｂｐ１］をコードする）の発現を最適化し、最大かつ最高の経済的収量の微生物油を生産する条件下で、増殖させることができる。一般に、最適化することができる培地条件としては、以下のものが挙げられる：炭素源の種類及び量、窒素源の種類及び量、炭素：窒素比、様々なミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス産生期の長さ、油蓄積期の長さ、細胞回収時期及び方法。油性酵母は、複合培地（例えば、酵母エキス−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ））又は増殖に必要な成分が欠如しているため、所望の発現カセットの選択を強制する規定の最少培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（酵母窒素原礎培地）（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で増殖させる。
【０１３３】
本明細書に記載の方法及び宿主細胞のための発酵培地は、好適な炭素源を含んでいなければならず、このようなものとして、米国特許第７，２３８，４８２号明細書及び米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書に教示されているものがある。本発明で使用する炭素源が、多様な炭素含有供給源を含みうることが考慮されるが、好ましい炭素源は、糖、グリセロール及び／又は脂肪酸である。最も好ましいものは、１０〜２２個の炭素を含むグルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトース及び／又は脂肪酸である。
【０１３４】
窒素は、無機（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）又は有機（例えば、尿素、グルタミン酸、又は酵母エキス）供給源から供給してよい。スクロース及び窒素源に加えて、発酵培地は、好適な鉱物、塩、補因子、バッファー、ビタミン、並びに微生物の増殖及び微生物油産生に必要な酵素経路の促進に好適な、当業者には公知の他の成分も含む。特に、脂質及びＰＵＦＡの合成を促進する複数の金属イオン（例えば、Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ６１−９７（１９９２））。
【０１３５】
本発明において好ましい増殖培地は、一般の市販されている調製培地、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）である。その他の規定又は合成増殖培地を用いてもよく、特定の微生物の増殖に適した培地は、微生物学又は発酵科学の分野の当業者には周知であろう。発酵に好適なｐＨの範囲は、典型的に、約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、初期増殖条件の範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は、好気性又は嫌気性条件下で行ってよいが、微好気性条件が好ましい。
【０１３６】
典型的には、代謝状態は、増殖と脂肪の合成／貯蔵の間で「均衡」していなければならないため、油性酵母細胞中の高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、２段階発酵方法が必要である。従って、最も好ましくは、油性酵母細胞中のＰＵＦＡの生産には、２段階発酵方法を使用する。この方法は、増殖中の様々な好適な発酵方法設計（すなわち、バッチ、供給バッチ及び連続方式）及び研究と同様に、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載されている。
【０１３７】
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の実施例１０はまた、組換えＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ(ヤロウィア・リポリティカ）Ｙ４３０５（その最大生産量は、１６２時間にわたって、１２．１ＥＰＡ％ＤＣＷ［すなわち、ＥＰＡ％ＴＦＡとＬＡ％ＴＦＡの比３．０３で、５５．６ＥＰＡ％ＴＦＡ］）の２−Ｌ発酵に必要なパラメーターの詳細な説明も記載している。この開示内容は、種培養物を生成するための凍結培養物から接種材料を調製し、最初に、高細胞密度まで急速な増殖を促進する条件下で酵母を培養した後、脂質及びＰＦＡ蓄積を促進するように（窒素飢餓及びグルコースの連続的供給により）酵母を培養するための手段の説明を含む。温度（３０〜３２℃に制御）、ｐＨ（５〜７に制御）、溶解酸素濃度及びグルコース濃度などのプロセス変量は、一貫したプロセス実施及び最終ＰＵＦＡ油品質を保証するために、標準操作条件に従って、監視及び制御した。特に、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の実施例１０のデータは、組換え微生物宿主細胞の油プロフィールが、発酵の実施自体、培地条件、プロセスパラメーター、スケールアップなど、さらには、培地のサンプリングを行う特定の時点に応じて変動することを証明するのに有用である。従って、上記文献に記載の特定の作製株は、様々な脂質含有率及び組成（すなわち、ＥＰＡ％ＴＦＡ、ＬＡ％ＴＦＡ及びＥＰＡ：ＬＡ比に基づき）を有する微生物油を産生することができた。
【０１３８】
これらの因子は、本明細書に記載のトランスジェニック油性酵母を培養する場合、いずれか特定の発酵実施中に酵母の完全な能力を発揮させるために、考慮すべきである。含油率を比較しようとする場合、トランスジェニック油性酵母及び非トランスジェニック油性酵母を増殖させて、類似した条件下でサンプリングすべきである。
【０１３９】
本明細書のある態様では、一次産物は、油性酵母バイオマスである。そのまま、バイオマスからの微生物油の分離及び精製は必要ないこともある（すなわち、全細胞バイオマスが製品である）。
【０１４０】
しかし、特定の最終使用及び／又は製品形態は、部分的精製バイオマス、精製油、及び／又はその精製脂質画分を得るために、バイオマスから微生物油の部分的及び／又は完全な分離／精製を必要とする場合もある。例えば、ＰＵＦＡは、宿主微生物において、遊離脂肪酸として、又は、アシルグリセロール、リン脂質、硫脂質若しくは糖脂質のようなエステル化形態で存在する可能性があり、当分野では公知の様々な手段によって宿主細胞から抽出することができる。抽出技術、品質分析及び合格基準についての概説が、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（５／６）：４６３−４９１（１９９２））にある。また、下流プロセシングについての簡単な説明は、Ａ．Ｓｉｎｇｈ及びＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１−３１２（１９９７））にも記載されている。
【０１４１】
一般に、微生物バイオマスからの微生物脂質及び／又はＰＵＦＡの回収及び精製方法は、有機溶剤を用いた抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書及び第５，６４８，５６４号明細書）、音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を用いて）、鹸化、並びにプレス、ビードビーターのような物理的手段、又はこれらの組合せを含みうる。さらに詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示を参照されたい。
【０１４２】
ω−３及び／又はω−６脂肪酸、特に、例えば、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを含む多くの食品及び飼料製品がある。長鎖ＰＵＦＡを含む微生物バイオマス、ＰＵＦＡを含む一部精製された微生物バイオマス、ＰＵＦＡを含む精製微生物油、及び／又は精製ＰＵＦＡは、食品及び飼料製品において本配合物の健康効果を付与する役割を果たすと考えられる。より具体的には、ω−３及び／又はω−６脂肪酸を含む油は、様々な食品及び飼料製品での使用に適しており、こうした製品として、限定されないが、食料類似品、食肉製品、穀物製品、焼成食品、スナック食品、及び乳製品がある（米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書を参照）。また、飼料製品には、動物用途のものも含まれる。
【０１４３】
本組成物を配合物に用いて、医療栄養、補助食品、乳児用調製粉乳及び医薬品を含む医療食に健康効果を付与することもできる。食品加工及び食品配合の分野の当業者は、どのようにして本発明の油の量及び組成物を食品又は飼料製品に添加することができるかを理解されよう。このような量は、本明細書において、「有効」量と呼び、これは、食品又は飼料製品、製品が補充しようとする食事、又は医療食若しくは医療栄養で矯正又は治療しようとする健康状態に応じて変動する。
【０１４４】
本組成物を配合物に用いて、医療栄養、補助食品、及び医薬品を含む医療食に動物の健康効果を付与することもできる。
【実施例】
【０１４５】
略称の意味は次の通りである：「ｓｅｃ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」は、時間を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「μＭ」は、マイクロモルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモルを意味し、「Ｍ」は、モルを意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」は、マイクロモルを意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し、「Ｕ」は、単位を意味し、「ｂｐ」は、塩基対を意味し、「ｋＢ」は、キロベースを意味する。
【０１４６】
発現カセットの名称
発現カセットの構造は、「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記系によって表し、Ｘは、プロモーターフラグメントを、Ｙは、遺伝子フラグメントを、またＺは、ターミネーターフラグメントをそれぞれ示しており、これらはすべて、互いに機能的に連結されている。
【０１４７】
ヤロウィア・リポリティカ(Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換及び培養
Ｙ．リポリティカ株ＡＴＣＣ＃２０３６２は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ株を、以下に示す配合に従う複数の培地において２８〜３０℃で通常通り増殖させた。
【０１４８】
合成完全培地［「ＳＣ」］培地（毎リットル）：硫酸アンモニウムを含み、アミノ酸を含まない６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ；２０ｇのグルコース；ウラシルを含まない１．９ｇ／Ｌの酵母合成ドロップアウト培地用添加物。
【０１４９】
高グルコース培地［「ＨＧＭ」］（毎リットル）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４及び５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調節の必要なし）。
【０１５０】
合成デキストロース培地［「ＳＤ」］培地（毎リットル）：硫酸アンモニウムを含み、アミノ酸を含まない６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ；２０ｇのグルコース。
【０１５１】
発酵培地［「ＦＭ」］培地（毎リットル）：アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＹＮＢ；６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４；１．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４−七水和物；５ｇ／Ｌの酵母エキス；２％炭素源（この場合、炭素源は、グルコース又はスクロースのいずれかである）。
【０１５２】
Ｙ．リポリティカの形質転換は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載のように実施した。尚、この文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【０１５３】
ヤロィア・リポリティカ(Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のために、遠心分離により細胞を回収し、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．及びＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載のように、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドを用いた脂質エキスのエステル交換により、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製した（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））後、３０−ｍＸ０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを取り付けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブンの温度を１７０℃（２５分保持）から、３．５℃／分で１８５℃にした。
【０１５４】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、蒸留水で１回洗浄した後、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で真空下５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）と既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）をサンプルに添加し、次に、サンプルを渦動させ、５０℃で３０分搖動した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌと４００μｌのヘキサンを添加した後、サンプルを渦動及びスピンさせた。上部の層を取り出して、ＧＣにより分析した。
【０１５５】
あるいは、Ｌｉｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載の塩基触媒エステル交換方法の改変を、発酵又はフラスコサンプルのいずれかからのブロスサンプルの常用的分析に用いた。具体的には、ブロスサンプルを室温の水で急速に解凍した後、計量（０．１ｍｇまで）して、０．２２μｍ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心分離管フィルター（カタログ番号８１６１）を備える、タールを塗った（ｔａｒｒｅｄ）２ｍＬ微量遠心分離管中に導入した。事前に決定したＤＣＷに応じて、サンプル（７５〜８００μｌ）を用いた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４３０遠心分離機を用いて、１４，０００ｒｐｍで５〜７分、又はブロスを除去するのに必要な時間だけ、サンプルを遠心分離した。フィルターを取り外し、液体を排出した後、約５００μｌの脱イオン水をフィルターに添加して、サンプルを洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再度取り外して、液体を排出した後、フィルターを再挿入した。次に、上記の管を遠心分離機に再挿入し、今回は上部を開放して、約３〜５分乾燥させた。次いで、フィルターを管上部で約半分に切断し、新しい２ｍＬ丸底Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（カタログ番号２２３６３３５−２）に挿入した。
【０１５６】
適切な道具でフィルターを管の底に押すが、その際、この道具は、切断したフィルターコンテナーの縁に触れるだけで、サンプル又はフィルター材料には触れないようにする。トルエン中の既知量のＣ１５：０ＴＡＧ（前記）を添加し、次に、５００μｌの新たに調製した１％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液を添加した。サンプルペレットを適切な道具で十分に破砕し、管を密閉した後、５０℃のヒートブロック（ＶＷＲカタログ番号１２６２１−０８８）内に３０分配置した。次に、これらの管を少なくとも５分冷却させた。続いて、４００μｌのヘキサン及び５００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を添加した後、管を２ｘ６秒渦動させて、１分間遠心分離した。約１５０μｌの上部（有機）層を挿入によりＧＣバイアル中に導入し、ＧＣによって分析した。
【０１５７】
ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、それらの保持時間により、既知の脂肪酸と比較して識別し、既知量の内部標準（Ｃ１５：０ＴＡＧ）とＦＡＭＥピーク面積を比較することによって定量した。従って、１μｇのＣ１５：０ＴＡＧは、０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（μｇ）［「μｇＦＡＭＥ」］は、式：（指定の脂肪酸のＦＡＭＥピークの面積／標準ＦＡＭＥピークの面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ）に従い計算し、また、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇＦＡ」］は、式：（指定の脂肪酸のＦＡＭＥピークの面積／標準ＦＡＭＥピークの面積）＊（標準Ｃ１５：０ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３に従い計算する。０．９５０３の換算係数は、大部分の脂肪酸（０．９５〜０．９６）について決定された値の概算であることに留意されたい。
【０１５８】
脂質プロフィールは、ＴＦＡのｗｔ％として個々の脂肪酸の量をまとめたものであるが、これは、個々のＦＡＭＥピークの面積を全ＦＡＭＥピーク面積の和で割り、これに１００をかけることにより決定した。
【０１５９】
フラスコアッセイによるヤロウィア・リポリティカ(Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の全脂質含有率及び組成の分析
Ｙ．リポリティカの特定の株の全脂質含有率及び組成を分析するために、フラスコアッセイを以下のように実施した。具体的には、新たに線状に塗った細胞の１ループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖させた。ＯＤ６００ｎｍを測定し、細胞のアリコートを１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬのＦＭ培地において最終ＯＤ６００ｎｍが０．３になるまで添加した。２５０ｒｐｍ及び３０℃の振盪インキュベーター中で２日経過した後、６ｍＬの培養物を遠心分離により回収し、これを１２５ｍＬフラスコ中の２５ｍＬＨＧＭに再懸濁させた。２５０ｒｐｍ及び３０℃の振盪インキュベーター中で５日経過後、１ｍＬのアリコートを脂肪酸分析（前記）に用い、また、１０ｍＬを乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］決定のために乾燥させた。
【０１６０】
ＤＣＷ決定のために、１０ｍＬの培養物をＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機内のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ローターにおいて４０００ｒｐｍで５分の遠心分離により回収した。ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁させた後、前述のように再回収した。洗浄したペレット２０ｍＬの水に再懸濁させた後、予め計量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁物を８０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
【０１６１】
細胞の全脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を計算して、ＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］として表す各脂肪酸の濃度及び乾燥細胞重量のパーセント［「ＥＰＡ％ＤＣＷ「］として表すＥＰＡ含有率を作表したデータと一緒に考察した。
【０１６２】
実施例１
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１に対して相同性を有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定
「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＬａＢＲＩ，Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）（また、Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３０（６９９５）：３５−４４（２００４）も参照）の一般公開のＹ．リポリティカタンパク質データベースに対して、クエリー配列としてＳｃＹａｐ１を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙａｐ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１８２３６２；配列番号１）［「ＳｃＹａｐ１」］に対するオーソログを同定した。
【０１６３】
すべてのＹ．リポリティカタンパク質の中で、ＳｃＹａｐ１に対して最高の相同性（期待値：１．８ｅ−１８）を有するタンパク質配列、ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５０４９４５；配列番号４）に「ＹｌＹａｐ」という名称を与えた。ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐは、「ＡＰ−１様転写因子に関連するｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｑ９Ｐ５Ｌ６アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＮＣＵ０３９０５．１にやや類似する」というアノテーションが付けられていた。
【０１６４】
ＳｃＹａｐ１と推定ＹｌＹａｐのアラインメントを図２に示す。いずれのタンパク質も塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）モチーフを有し、これは、７アミノ酸の間隔で規則正しく配置された複数のロイシン残基を特徴とするロイシンジッパーに隣接する塩基性アミノ酸が豊富なＮ末端塩基性領域に対応する。図に関しては、太字で下線が引かれたアルギニン及びリシンアミノ酸残基は、塩基性領域に対応し；星印は、ロイシンジッパー内のロイシン残基の各々を強調している。鉛直のボックスは、ＳｃＹａｐ１のＮ末端Ｃｙｓリッチドメイン（すなわち、配列番号２のＣｙｓ３０３、Ｃｙｓ３１０及びＣｙｓ３１５に対応する）及びＣ末端Ｃｙｓリッチドメイン（すなわち、配列番号２のＣｙｓ５９８、Ｃｙｓ６２０及びＣｙｓ６２９に対応する）を強調している。これらの残基の５つは、ＹｌＹａｐに保存されている。Ｔｏｏｎｅ及びＪｏｎｅｓ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，９：５５−６１（１９９９））に論じられているように、ｂＺＩＰドメイン及びシステインリッチドメインは、ＡＰ−１ファミリータンパク質に特徴的である。
【０１６５】
ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐ（配列番号４）をコードするタンパク質配列、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２６＋（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１−５１０９（２００５））を用いて、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（すべての非重複ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、ＮＣＢＩ’ｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＰｒｏｊｅｃｔからのＲｅｆＳｅｑタンパク質配列、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ［「ＰＤＢ」］タンパク質配列データベース、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ［「ＰＩＲ」］タンパク質配列データベース及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ［「ＰＲＦ」］タンパク質配列データベースを含む）内に類似性を有する配列を同定するために、検索を実施した。
【０１６６】
配列番号４が最高の類似性を有する配列をまとめたＢＬＡＳＴＰ比較の結果は、％同一性、％類似性及び期待値に従って記録することができる。「％同一性」は、２つのタンパク質の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージとして定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質の間で同一であるか又は保存されたアミノ酸のパーセンテージとして定義される。「期待値」は、マッチの統計的有意性を推定し、所定のスコアと共に、このサイズのデータベースの検索において全く偶然に期待されるマッチの数を具体的に記載する。
【０１６７】
ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐ（配列番号４）に対する類似性を共有するものとして、多数のタンパク質が同定された。表４に、「２ｅ−１３」以上の期待値と、具体的にそのタンパク質を同定したという（すなわち、仮想タンパク質へのヒットは除外して）アノテーションを有するこれらのヒットの要約の一部を記載するが、これは本明細書の開示内容を限定するものとして考えるべきではない。表４に記載するタンパク質は、配列番号４と１３〜８７％のクエリーカバレッジ（ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を共有する。
【０１６８】
表４．ＹｌＹａｐ１（配列番号４）に対して類似性を共有する遺伝子
【表４】
2014505472.tif 000008
2014505472.tif 000009
2014505472.tif 000010
【０１６９】
ＢＬＡＳＴＰ検索によれば、ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐ（配列番号４）は、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿００１５４７３２１）由来の、仮想タンパク質ＢＣ１Ｇ＿１４０９４と、３０％同一性及び４７％類似性、並びに期待値１ｅ−４１で、最高の類似性を共有した。
【０１７０】
既知の機能を有するタンパク質のうち、最高ヒットは、以下のものに対してであった：３０％同一性及び４６％類似性、並びに期待値２ｅ−３９を有するアルスロデルマ・オタエＣＢＳ  １１３４８０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿００２８４７２５９．１）由来のＣｈａｐ１；３１％同一性及び４６％類似性、並びに期待値１ｅ−３７を有するカエトミウム・サーモフィルムのサーモフィルム変種（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ  ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ  １４９５由来の推定Ａｐ−１様転写因子；並びに、４８％同一性及び６４％類似性、並びに期待値２ｅ−２７を有するトウモロコシごま葉病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＳ６４３１３）由来のＣｈａｐ１。Ｃｈａｐ１は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙａｐ１の機能性相同体として知られている（Ｓ．Ｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，４（２）：４４３−４５４（２００５））。
【０１７１】
前述の分析に基づき、配列番号３は、Ｙ．リポリティカのＹａｐ１転写因子（「ＹｌＹａｐ１」）（タンパク質配列は、配列番号４として示される）をコードすると仮定された。
【０１７２】
ＹｌＹａｐ１が、他のｂＺＩＰ転写因子とこのように比較的低い％同一性及び類似性を共有するのは驚くことではない。例えば、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＣｇＡＰ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ  ４４６９９６）は、Ｙａｐ１の機能性オーソログとして明確に特性決定されている（Ｃｈｅｎ，Ｋ．−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３８６（１−２）：６３−７２（２００７））。共有される機能性にもかかわらず、Ｃｈｅｎらは、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＣｇＡＰ１ｐが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙａｐ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ０１３７０７）に対してわずか３７％のアミノ酸同一性、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＫｌＡＰ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ５６０９５）に対して３０％の同一性、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ＣＡＰ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＤ００８０２）に対して２６％の同一性、また、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）Ｐａｐ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＡ６６１７０ｐ）に対して１９％の同一性を示したが、それでも尚、特に、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＣｇＡＰ１ｐとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙａｐ１同士の同一性は、ｂＺｉｐドメイン（７３％同一性）、Ｎ末端システインリッチドメイン（７５％同一性）及びＣ末端システインリッチドメイン（８５％同一性）において、特に高いことを報告している。
【０１７３】
従って、上に記載した配列分析にもかかわらず、ＹｌＹａｐ１が、ＳｃＹａｐ１と相同的な様式で機能することを確認するために、さらなる機能性分析が必要であった。
【０１７４】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＡＰ１ノックアウト株Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）における過酸化水素感受性の増大
この実施例では、ヤロウィア・リポリティカのＥＰＡ産生作製株、Ｙ４１８４Ｕ（実施例７、後述）由来の染色体ＹＡＰ１遺伝子の発現を下方制御するための、構築物ｐＹＲＨ６０（図３Ａ；配列番号５）の使用を説明する。ＹＡＰ１ノックアウト構築物フラグメントによるＹ．リポリティカ株の形質転換により、Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）を得た。ＹＡＰ１ノックアウトが、酸化ストレス感受性並びに蓄積脂質レベル及びＥＰＡ産生に及ぼす影響を決定し、比較した。具体的には、ＹＡＰ１のノックアウトは、ネイティブＹａｐ１がノックアウトされていない細胞と比較して、Ｈ２Ｏ２に対する過敏性を引き起こした。
【０１７５】
株Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）の作製
プラスミドｐＹＲＨ６０は、プラスミドｐＹＰＳ１６１に由来し、これは、米国特許出願公開第２０１０−００６２５０２号明細書（その中の実施例２、図５Ａ、配列番号４０）に記載されており、以下の構成要素を含んだ：
【０１７６】
表５．プラスミドｐＹＰＳ１６１（配列番号６）の説明
【表５】
2014505472.tif 000011
【０１７７】
Ｙ．リポリティカＹＡＰ１遺伝子（「ＹＩＡＰ１」；配列番号３）の９４０ｂｐ５’プロモーター領域（配列番号７）で、ｐＹＰＳ１６１（配列番号６）のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩフラグメントを置換し、ＹＩＹＡＰ１遺伝子の１１６４ｂｐ３’ターミネーター領域（配列番号３２）で、ｐＹＰＳ１６１のＰａｃｌ／ＳｐｈＩフラグメントを置換することにより、ｐＹＲＨ６０（配列番号５；図３Ａ）を作製した。
【０１７８】
Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕを、ＹＡＰ１ノックアウト構築物ｐＹＲＨ６０（配列番号５）の精製４．７ｋＢ  ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩフラグメントで形質転換した（一般的方法）。
【０１７９】
ｙａｐ１欠失を有する細胞をスクリーニングするため、対照として用いるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）翻訳伸長因子遺伝子ＴＥＦ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０５４５１０）と共に、ＹＩＹａｐ１について定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲプライマー、並びにＹＡＰ１遺伝子及び対照ＴＥＦ１遺伝子をターゲティングするＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアバージョン２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて設計した。具体的には、リアルタイムＰＣＲプライマーＹｌ−ＥＦ−１２１４Ｆ（配列番号８）、Ｙｌ−ＥＦ−１２７０Ｒ（配列番号９）、ＹＡＰ１−３４６Ｆ（配列番号１０）及びＹＡＰ１−４０９Ｒ  （配列番号１１）、さらにはＹＡＰ１−３６６Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭ（商標）−ＣＧＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ（商標）（ヌクレオチド配列は、配列番号１３として示される）を設計した。ＴａｑＭａｎプローブＹＬ−ＥＦ−ＭＧＢ−１２３５Ｔ（すなわち、５’６−ＦＡＭ（商標）−ＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＴＡＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ（商標）（このヌクレオチド配列は、配列番号１２として示される）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから取得した。ＴａｑＭａｎ蛍光プローブの５’末端には、６−ＦＡＭ（商標）蛍光レポーター色素が結合しているのに対し、３’末端は、ＴＡＭＲＡ（商標）クエンチャーを含む。ＰＣＲプライマー及びＹＡＰ１プローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から取得した。
【０１８０】
５０μｌの水に１コロニーを懸濁させることにより、ノックアウト候補ＤＮＡを作製した。ＴＥＦ１及びＹＡＰ１の反応は、各サンプルについて、同じリアルタイムＰＣＲウェル中で、３回繰り返して実施した。リアルタイムＰＣＲ反応は、１反応当たり総量２０μｌについて、１０ｐモルのフォワード及びリバースプライマー（すなわち、Ｙｌ−ＥＦ−１２１４Ｆ、Ｙｌ−ＥＦ−１２７０Ｒ、ＹＡＰ１−３４６Ｆ及びＹＡＰ１−４０９Ｒ、前述）の各々、並びに２．５ｐモルのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（すなわち、ＹＬ−ＥＦ−ＭＧＢ−１２３５Ｔ及びＹＡＰ１−３３６Ｔ、前掲）、１０μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ−−Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓ（登録商標）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（カタログ番号：ＰＮ４３２６６１４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｌのコロニー懸濁液及び８．５μｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ遊離水を含んだ。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、以下の条件下で実施した：９５℃で１０分の初期変性に続き、９５℃で１５秒の変性を４０サイクル後、６０℃で１分のアニーリング。
【０１８１】
６−ＦＡＭ（商標）蛍光をモニターすることにより、各サイクル中、自動的にリアルタイムデータを収集した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ指示マニュアル（ＡＢＩ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に従い、データ基準化のために、ＴＥＦ１遺伝子閾値サイクル（ＣＴ）値を用いて、データ分析を実施した。ＹＡＰ１遺伝子についての検出可能なシグナルがなく、かつＴＥＦ１についてのＣＴ値≦３０を有するノックアウトクローンを同定した。
【０１８２】
前述した方法により、ｙａｐ１ノックアウトとしてスクリーニングされたコロニーの１つを同定した。Ｙ４１８４ＵのＹ．リポリティカｙａｐ１Δ変異体をＲＨＹ２４０と名付けた。
【０１８３】
ノックアウト株Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）を用いたＨ２Ｏ２感受性アッセイ
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、Ｙａｐ１が欠失した株は、Ｈ２Ｏ２による障害に対して過敏性であった。この表現型は、酸化ストレス防御遺伝子、例えば、ＴＲＲ１（細胞質チオレドキシンレダクターゼ）、ＴＲＸ２（チオレドキシン）、ＧＬＲ１（グルタチオンレダクターゼ）、及びＧＳＨ１（γ−グルタミルシステインシンテターゼ）などの誘導を制御する上でのＹａｐ１の役割に関連している。酸化ストレス調節因子としての推定ＹｌＹａｐ１の機能を試験するために、Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）をＨ２Ｏ２感受性アッセイに付した。
【０１８４】
Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）及びＹ４１８４（対照）細胞をＳＣ培地での指数的成長相（ＯＤ６００：約０．５）まで増殖させてから、新鮮なＳＣ培地でＯＤ６００：約０．０１まで希釈した。希釈した培養物のアリコート（１００μｌ）を新鮮なＨ２Ｏ２と一緒に、最終濃度０〜５０ｍＭで、３０℃で１時間インキュベートし、各サンプルからの７μｌをＹＰＤプレートに点在させた。細胞をＹＰＤプレート上で、３０℃にて２日間さらに増殖させた。
【０１８５】
Ｙ４１８４Ｕ（ｙａｐ１Δ）細胞は、対照株Ｙ４１８４より、はるかに高いＨ２Ｏ２に対する感受性を示した（図４Ａ）。この結果は、ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐに対応するＹｌＹａｐ１が、Ｙ．リポリティカにおいて酸化ストレス防御に重要であり、ＳｃＹａｐ１の機能性相同体であるという仮説を支持するものである。
【０１８６】
実施例３
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１ノックアウト株ＢＹ４７４３（ｙａｐ１Δ）におけるヤロウィア・リポリティカＹＡＰ１の過剰発現
この実施例では、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｙａｐ１Δ株において、推定ＹｌＹａｐ１（配列番号４）を過剰発現させて、酸化ストレス感受性への影響を評価するための、動原体プラスミドｐＹＲＨ６１（図３Ｂ；配列番号１４）の使用を説明する。具体的には、ＹｌＹＡＰ１の過剰発現は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｙａｐ１Δ株において、Ｈ２Ｏ２に対する過敏性の機能相補をもたらした。
【０１８７】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）過剰発現プラスミドｐＹＲＨ６１の構築
プラスミドｐＹＲＨ６１は、プラスミドｐＲＳ３１６（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：１９−２７（１９８９））、すなわち、選択マーカーとしてＵＲＡ３を含む動原体プラスミドに由来する。ｐＹＲＨ６１は、以下の成分を含んでいた：
【０１８８】
表６．プラスミドｐＹＲＨ６１（配列番号１４）の説明
【表６】
2014505472.tif 000012
【０１８９】
具体的には、プライマーＹｌ．Ｙａｐ１−Ｆ−Ｓｐｅｌ（配列番号１５）及びＹａｐ１−Ｒ（配列番号１６）を用いて、Ｙ．リポリティカゲノムからのＰＣＲにより、ＹｌＹＡＰ１遺伝子の１．６ｋＢフラグメントを増幅した。反応混合物は、１μｌのゲノムＤＮＡ、各１μｌのプライマー（２０μＭストックから）、２μｌの水、及び４５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。増幅を以下のように実施した：９５℃で５分の初期変性に続いて、９５℃で６０秒の変性を３５サイクル、５５℃で６０秒のアニーリング後、６８℃で１８０秒の伸長。７２℃で７分の最終伸長を実施した後、４℃で反応を停止した。ＰＣＲ反応から、１．６ｋｂのＤＮＡフラグメントが得られた。
【０１９０】
増幅した遺伝子をＳｐｅＩ／ＮｏｔＩで消化してから、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＢＡ１遺伝子［「ＳｃＦＢＡ１」］の６０１ｂｐの５’プロモーター領域（配列番号１７）及びＳｃＦＢＡ１の１０２２ｂｐの３’ターミネーター領域（配列番号１８）と一緒に、ｐＲＳ３１６（配列番号１９）にクローン化することにより、ｐＹＲＨ６１（配列番号１４；図３Ｂ）を作製した。従って、ｐＹＲＨ６１は、キメラＳｃＦＢＡ１：：ＹｌＹＡＰ１：：ＳｃＦＢＡ１遺伝子を含んだ。
【０１９１】
ｐＹＲＨ６１を発現するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を用いたＨ２Ｏ２感受性アッセイ
酸化ストレス感受性にＹｌＹａｐ１が及ぼす影響を評価するために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４３（ＭＡＴａ／αｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０  ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０／ＭＥＴ１５  ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０）及びその同質遺伝子ｙａｐ１Δ株ＢＹ４７４３（ｙａｐ１Δ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから取得）をｐＲＳ３１６（対照ベクター）又はｐＹＲＨ６１で形質転換した。
【０１９２】
細胞を、ウラシルが欠如したＳＣ培地において指数的成長相（ＯＤ６００：約０．５）まで増殖させてから、新鮮なＳＣ培地でＯＤ６００：０．０１まで希釈した。希釈した培養物のアリコート（１００μｌ）を新鮮なＨ２Ｏ２と一緒に、最終濃度０〜５０ｍＭで、３０℃で１時間インキュベートし、各サンプルからの７μｌをＹＰＤプレートに点在させた。点在した細胞を、３０℃にて２日間、ＹＰＤプレート上でさらに増殖させた。
【０１９３】
図４Ｂは、Ｈ２Ｏ２感受性アッセイの結果を示す。具体的には、上部２列は、ＢＹ４７４３形質転換体（すなわち、対照ベクター又はｐＹＲＨ６１のいずれかを含む）であり、下部２列は、ＢＹ４７４３（ｙａｐ１Δ）形質転換体（すなわち、対照ベクター又はｐＹＲＨ６１のいずれかを含む）である。
【０１９４】
図４Ｂに示すように、対照プラスミドｐＲＳ３１６で形質転換したＢＹ４７４３ｙａｐ１Δ株は、対照又はｐＹＲＨ６１のいずれかを含む同質遺伝子ＢＹ４７４３野生型より、Ｈ２Ｏ２ストレスに対してはるかに高い感受性を示した。ＹｌＹａｐ１をＢＹ４７４３ｙａｐ１Δ株に過剰発現させると、細胞は、対照プラスミドを含むＢＹ４７４３ｙａｐ１Δ株より、酸化ストレスに対してはるかに抵抗性が高くなったが、これは、ＹｌＹａｐ１（配列番号４）が、酸化ストレスに対する抵抗性を付与したことを示している。
【０１９５】
本実施例の結果は、ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐに対応するＹｌＹａｐ１が、ＳｃＹａｐ１の機能性相同体であり、酸化ストレス防御に関連するという仮説を支持するものである。
【０１９６】
実施例４
Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４及びＹ９５０２におけるヤロウィア・リポリティカＹＡＰ１の過剰発現
この実施例では、過剰発現構築物ｐＹＲＨ４３（図５Ａ；配列番号２０）の合成並びにＹ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（実施例７）及びＹ９５０２Ｕ（実施例８）へのその形質転換を説明する。蓄積脂質レベルにＹｌＹＡＰ１過剰発現が及ぼす影響を決定及び比較した。具体的には、ＹｌＹＡＰ１過剰発現は、ネイティブＹａｐ１レベルを操作していない細胞と比較して、全脂質（総乾燥細胞重量のパーセント［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］として表す総脂肪酸として測定した）の増大をもたらした。
【０１９７】
Ｙ．リポリティカ過剰発現プラスミドｐＹＲＨ４３の構築
プラスミドｐＹＲＨ４３は、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（米国特許第７，９４３，３６５号明細書の実施例６に記載されており、この文献は、参照として本明細書に組み込む）に由来する。プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓは、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ５Ｓ：：ＰＥＸ２０遺伝子を含み、ここで、（ｉ）ＦＢＡＩＮｍは、フルクトース−二リン酸アルドラーゼ酵素をコードするｆｂａ１遺伝子のＹ．リポリティカ上流のプロモータであり（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）；（ｉｉ）ＥａＤ５Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来し、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）での発現のためにコドン最適化された合成Δ−５デサチュラーゼであり、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素部位によってフランキングされている；（ｉｉｉ）ＰＥＸ２０は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＰＥＸ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０５４６１３）由来のＰＥＸ２０ターミネーター配列である。
【０１９８】
プライマーＹａｐ１−Ｆ（配列番号２１）及びＹａｐ１−Ｒ（配列番号１６）を用いて、Ｙ．リポリティカゲノムからのＰＣＲにより、ＹｌＹＡＰ１遺伝子の１．６ｋＢフラグメントを増幅した。反応混合物は、１μｌのゲノムＤＮＡ、各１μｌのプライマー（２０μＭストックから）、２μｌの水、及び４５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。増幅を以下のように実施した：９５℃で５分の初期変性に続いて、９５℃で１秒の変性を３５サイクル、５５℃で１秒のアニーリング後、６８℃で３秒の伸長。７２℃で７分の最終伸長を実施した後、４℃で反応を停止した。ＰＣＲ反応から、１．６ｋｂのＤＮＡフラグメントが得られた。
【０１９９】
増幅した遺伝子をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩで消化してから、これを用いて、ｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩフラグメントを置換することにより、ｐＹＲＨ４３を作製した。従って、ｐＹＲＨ４３は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＹＡＰ１：：ＰＥＸ２０遺伝子を含んだ。
【０２００】
定量的リアルタイムＰＣＲによる形質転換株Ｙ４１８４Ｕ＋ＹＡＰ１及びＹ９５０２Ｕ＋Ｙａｐ１の同定
プラスミドｐＹＲＨ４３をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで切断し、４．４ｋＢフラグメントを単離して、これをＹ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（実施例７）及びＹ９５０２Ｕ（実施例８）への形質転換（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）のために用い、これによって、株Ｙ４１８４Ｕ＋ＹＡＰ１及びＹ９５０２Ｕ＋Ｙａｐ１を作製した。
【０２０１】
ＹｌＹＡＰ１の過剰発現は、実施例２に記載したものと同様に、対照としてヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＴＥＦ１遺伝子を用いて、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施することにより確認した。
【０２０２】
ゲノムＤＮＡの希釈シリーズと、以下に詳述するＰＣＲ条件を用いたリアルタイム定量のために、プライマーを定量した。設定した各プライマー及びプローブについて得られたＣＴ値対ｌｏｇ  ｎｇ  ＤＮＡを用いて線形回帰分析を実施したところ、効率が、９０〜１１０％内にあることを確認した。
【０２０３】
株Ｙ４１８４Ｕ＋ＹＡＰ１及びＹ９５０２Ｕ＋Ｙａｐ１からのｃＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、まずＲＮＡを単離することにより作製した。次に、ＤＮａｓｅ（カタログ番号：ＰＮ７９２５４，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて室温で１５分にわたり、２μｇのＲＮＡを処理することによって残留ゲノムＤＮＡを除去した後、７５℃で５分不活性化した。ｃＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号：ＰＮ  ４３６８８１３）からのＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、製造業者の推奨プロトコルに従い、１μｇの処理済ＲＮＡから作製した。
【０２０４】
ＹｌＴＥＦ１及びＹｌＹＡＰ１のリアルタイムＰＣＲ反応は、各サンプルについて、個別に３回繰り返して実施した。リアルタイムＰＣＲ反応は、１反応当たり総量２０μｌについて、各０．２μｌのフォワード及びリバースプライマー（１００μＭ）（すなわち、ｅｆ−３２４Ｆ［配列番号２２］、ｅｆ−３９２Ｒ［配列番号２３］、ＹＡＰ１−３４６Ｆ［配列番号１０］及びＹＡＰ１−４０９Ｒ［配列番号１１］）、０．０５μｌの各ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（１００μＭ）（すなわち、ｅｆ−３４５Ｔ［すなわち、５’６−ＦＡＭ（商標）−ＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴ−ＴＡＭＲＡ（商標）；ここで、このヌクレオチド配列は、配列番号２４として示される］及びＹＡＰ１−３３６Ｔ［すなわち、５’６−ＦＡＭ（商標）−ＣＧＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ（商標）；ここで、ヌクレオチド配列は、配列番号１３として示される］）、１０μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ−−Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓ（登録商標）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（カタログ番号：ＰＮ４３２６６１４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｌの希釈ｃＤＮＡ（１：１０）、並びに８．５５μｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ遊離水を含んだ。反応は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、以下の条件下で実施した：９５℃で１０分の初期変性に続き、９５℃で１５秒の変性を４０サイクル後、６０℃で１分のアニーリング。各サンプルの負の逆転写ＲＮＡ対照をＴＥＦ１プライマーセットと一緒に泳動させて、ゲノムＤＮＡの非存在を確認した。リアルタイムデータを実施例２に記載のように収集した。
【０２０５】
この分析に基づき、Ｙ４１８４Ｕ＋Ｙａｐ１株が、Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照株のそれと比較して、約２．９倍高いＹｌＹＡＰ１遺伝子の発現レベルを示すことが結論付けられ、プラスミドｐＹＲＨ４３の機能性が確認された。
【０２０６】
形質転換株Ｙ４１８４Ｕ＋ＹＡＰ１中の脂質含有率及び組成
Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）及び株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｙａｐ１を同等の油性条件下で増殖させた。より具体的には、油性条件は、まず、２５ｍＬのＳＤ培地（開始ＯＤ６００：約０．３）において、３０℃で４８時間好気的に培養物を増殖させた後、遠心分離により細胞を回収することによって達成した。次いで、ペレットを２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁させて、２５０ｒｐｍ及び３０℃のシェーカーインキュベーター中で５日間インキュベートした。
【０２０７】
Ｙ．リポリティカＹ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）対照及びＹ４１８４Ｕ＋Ｙａｐ１株について、細胞のＤＣＷ、全脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの質量パーセント［「％ＴＦＡ」］として表される各脂肪酸の濃度及びＥＰＡ生産性（すなわち、乾燥細胞重量のそのパーセント［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］として表されるＥＰＡ含有率）を以下の表７に示すが、平均値は灰色で強調し、「Ａｖｅ」として示した。脂肪酸の略称は以下の通りである：ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、及びエイコサペンタン酸（「ＥＰＡ」、２０：５）。
【０２０８】
表７．Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）及び株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｙａｐ１中の脂質含有率及び組成
【表７】
2014505472.tif 000013
【０２０９】
Ｙ４１８４Ｕにおける、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐに対応するＹｌＹＡＰ１（配列番号４）の過剰発現によって、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比較して、脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］が約１２％増加し、平均ＥＰＡ力価［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］が約１５％増加した。
【０２１０】
形質転換株Ｙ９５０２Ｕ＋ＹＡＰ１中の脂質含有率及び組成
Ｙ．リポリティカ株Ｙ９５０２（対照）及び株Ｙ９５０２Ｕ＋Ｙａｐ１（３つの単離菌）を前述した同等の油性条件下で、２回繰り返して増殖させた。表８に、ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、％ＴＦＡとして表す各脂肪酸の濃度、及びＥＰＡ％ＤＣＷを表７と同じ形式でまとめる。
【０２１１】
表８．Ｙ．リポリティカ株Ｙ９５０２及び株Ｙ９５０２Ｕ＋Ｙａｐ１中の脂質含有率及び組成
【０２１２】
【表８】
2014505472.tif 000014
Ｙ９５０２Ｕにおける、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｆ０３３８８ｐに対応するＹｌＹＡＰ１（配列番号４）の過剰発現によって、株Ｙ９５０２と比較して、脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］が約１６％増加し、平均ＥＰＡ力価［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］が約１５％増加した。
【０２１３】
従って、ヤロウィア・リポリティカのＰＵＦＡ産生株におけるＹｌＹＡＰ１の過剰発現は、酸化ストレスに対する抵抗性の増大をもたらしたようである。酸化ストレスに対する抵抗性増大の１つの有益な成果は、脂質過酸化からの保護の強化であり、これによって、脂質及びＰＵＦＡ含有率が増加した。
【０２１４】
実施例５
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＸ３に対して相同性を有するヤロウィア・リポリティカ遺伝子の同定
「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＬａＢＲＩ，Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）（また、Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３０（６９９５）：３５−４４（２００４）も参照）の一般公開のＹ．リポリティカタンパク質データベースに対して、クエリー配列としてＳｃＧｐｘ３を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、ヤロウィア・リポリティカにおいて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇｐｘ３（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＮＭ＿００１１７９５５９；配列番号２６）［「ＳｃＧｐｘ３」］に対するオーソログを同定した。
【０２１５】
Ｙ．リポリティカタンパク質の中で、ＳｃＧｐｘ３に対して最高の相同性（期待値：４ｅ−６８）を有するタンパク質配列、ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５０３４５４；配列番号２８）に「ＹｌＧｐｘ３」という名称を与えた。ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｐは、ＧｅｎＢａｎｋで「細胞内ヒドロペルオキシドレベルを感知して、レドックスシグナルをＹａｐ１ｐ転写因子に伝達するヒドロペルオキシド受容体として機能する、ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ４０５８１サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＩＲ０３７ｗ  ＨＹＲ１（ＹＫＬ０２６Ｃのオーソログ）チオールペルオキシダーゼに高度に類似する」というアノテーションが付けられていた。
【０２１６】
ＳｃＧｐｘ３と推定ＹｌＧｐｘ３のアラインメントを図６に示す。鉛直のボックスは、分子間及び分子内相互作用（Ｄｅｌａｕｎａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１１：４７１−４８１（２００２））に重要な、ＳｃＧｐｘ３のＣｙｓ３６及びＣｙｓ８２を強調している。これらの残基は、ＹｌＧｐｘ３に保存されている。
【０２１７】
実施例１に記載した方法に従い、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース内に類似性を有する配列を同定するために、ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｐ（配列番号２８）をコードするタンパク質配列を用いて、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２６＋検索を実施した。
【０２１８】
ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｐ（配列番号２８）に対する有意な類似性を共有するとして、多数のタンパク質が同定された。表９に、「８ｅ−７２」以上の期待値と、具体的にそのタンパク質を同定したという（すなわち、仮想タンパク質及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のタンパク質へのヒットは除外される）アノテーションを有するこれらのヒットの概要の一部を記載するが、これは本明細書の開示内容を限定するものとして考えるべきではない。表９に記載するタンパク質は、配列番号２８と９３〜９５％のクエリーカバレッジ（ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を共有した。
【０２１９】
表９．ＹｌＧｐｘ３（配列番号２８）に対して類似性を共有する遺伝子
【表９】
2014505472.tif 000015
2014505472.tif 000016
【０２２０】
ＢＬＡＳＴＰ検索に基づき、ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｐ（配列番号２８）は、アッシビヤ・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＮＰ＿９８５５０９）由来の仮想タンパク質と、７３％同一性及び８６％類似性、並びに期待値１ｅ−８５で、最高の類似性を共有した。既知の機能を有するタンパク質のうち、最高のヒットは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＰ＿００２４９１８０３、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）と改名）由来のチオールペルオキシダーゼ（同一性７１％及び類似性８９％、並びに期待値８ｅ−８５）であり、次に、ＳｃＧＰＸ３（同一性７２％及び類似性８６％、並びに期待値７ｅ−８４）であった。
【０２２１】
前述の分析に基づき、配列番号２７は、Ｙ．リポリティカのＧｐｘ３チオールペルオキシダーゼ（「ＹｌＧｐｘ３」）（タンパク質配列は、配列番号２８として示される）をコードすると仮定された。
【０２２２】
実施例６
Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４におけるヤロウィア・リポリティカＧＰＸ３の過剰発現
この実施例では、過剰発現構築物ｐＹＲＨ６５（図５Ｂ；配列番号２９）の合成並びにＹ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（実施例７）へのその形質転換を説明する。ＹｌＧＰＸ３の過剰発現が蓄積脂質レベルに及ぼす影響を決定及び比較した。具体的には、ＹｌＧＰＸ３の過剰発現は、ネイティブＧｐｘ３レベルを操作していない細胞と比較して、全脂質（総乾燥細胞重量のパーセント［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］として表される総脂肪酸として測定される）の増大をもたらした。
【０２２３】
Ｙ．リポリティカ過剰発現プラスミドｐＹＲＨ６５の構築
プライマーＧＰＸ３−Ｆ（配列番号３０）及びＧＰＸ３−Ｒ（配列番号３１）を用いて、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２のゲノムＤＮＡから、ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｇをコードする５１０ｂｐフラグメントを増幅した。反応混合物は、１μｌのゲノムＤＮＡ、各１μｌのプライマー（２０μＭストックから）、２μｌの水、及び４５μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。増幅は、以下のように実施した：９５℃で５分の初期変性に続いて、９５℃で６０秒の変性を３５サイクル、５５℃で６０秒のアニーリング後、６８℃で６０秒の伸長。７２℃で７分の最終伸長サイクルを実施した後、４℃で反応を停止した。ＰＣＲ反応から、０．５１ｋｂのＤＮＡフラグメントが得られた。
【０２２４】
次に、増幅した遺伝子をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで切断してから、これを用いて、以下の成分を含むｐＹＲＨ６５（図５Ｂ；配列番号２９）を作製した：
【０２２５】
表１０．プラスミドｐＹＲＨ６５の説明
【表１０】
2014505472.tif 000017
【０２２６】
形質転換株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｇｐｘ３における脂質含有率及び組成
プラスミドｐＹＲＨ６５をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで切断して、３．３ｋＢフラグメントを単離し、Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕの形質転換に用い、これにより、株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｇｐｘ３を作製した。
【０２２７】
Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）（対照）及び株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｇｐｘ３を同等の油性条件下で（実施例４に記載のように）増殖させた。表１１に、ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、％ＴＦＡとして表す各脂肪酸の濃度、及びＥＰＡ％ＤＣＷを、表７で用いたものと類似の形式でまとめる。
【０２２８】
表１１．Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋)及び株Ｙ４１８４Ｕ＋Ｇｐｘ３中の脂質含有率及び組成
【表１１】
2014505472.tif 000018
【０２２９】
Ｙ４１８４Ｕにおける、遺伝子座ＹＡＬＩ０Ｅ０２３１０ｇに一致するＹｌＧＰＸ３（配列番号２７）の過剰発現によって、株Ｙ４１８４Ｕ（Ｕｒａ＋）と比較して、脂質含有率［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］が約４７％増加し、平均ＥＰＡ力価［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］が約４０％増加した。
【０２３０】
従って、ヤロウィア・リポリティカのＰＵＦＡ産生株におけるＹｌＧｐｘ３の過剰発現は、酸化ストレスに対する耐性の増大をもたらしたようである。酸化ストレスに対する耐性増大の１つの有益な成果は、脂質過酸化からの保護の強化であり、これによって、脂質及びＰＵＦＡ含有率が増加した。
【０２３１】
実施例７
高ＥＰＡ産生のためのヤロウィア・リポリティカ株Ｙ４１８４及びＹ４１８４Ｕの作製
実施例４及び６での宿主として、Ｙ．リポリティカ株Ｙ４１８４Ｕを用いた。株Ｙ４１８４Ｕは、Ｙ．リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するものであり、Δ−９エロンガーゼ／Δ−８デサチュラーゼ経路の発現による全脂質に対して、高いＥＰＡを産生することができる。この株は、Ｕｒａ表現型を有し、その構築については、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレット（本明細書に参照として組み込む）の実施例７に記載されている。
【０２３２】
株Ｙ４１８４Ｕの作製には、以下の株を必要とした：Ｙ２２２４、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６Ｕ、Ｙ４０６９、Ｙ４０８４、Ｙ４０８４Ｕ１、Ｙ４１２７（２００７年１１月２９日にアクセッション番号：ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８８０２で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託）、Ｙ４１２７Ｕ２、Ｙ４１５８、Ｙ４１５８Ｕ１、Ｙ４１８４。
【０２３３】
野生型ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２に関する株Ｙ４１８４（全脂質の３０．７％ＥＰＡを産生）の最終遺伝子型は、以下のものであった：不明１−、不明２−、不明４−、不明５−、不明６−、不明７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：Ｒｄ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ。
【０２３４】
上に挙げた略称は以下の通りである：ＭＥ３Ｓは、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）由来の、コドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］であり、；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラリシス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ−９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ユーグレナ・グラリシス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の、コドン最適化Δ−９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・グラリシス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］由来の、合成変異Δ−８デサチュラーゼ［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）由来の、コドン最適化Δ−１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＥｇＤ５は、ユーグレナ・グラリシス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ−５デサチュラーゼ［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＥｇＤ５Ｓは、ユーグレナ・グラリシス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の、コドン最適化Δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＲＤ５Ｓは、ペリジウム種［Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．］ＣＣＭＰ６２６由来の、コドン最適化Δ−５デサチュラーゼ［米国特許第７，６９５，９５０号明細書］であり；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマータム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ−１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマータム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）由来の、コドン最適化Δ−１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；並びにＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ  ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］である。
【０２３５】
最後に、株Ｙ４１８４のＵｒａ３遺伝子を破壊するために、構築物ｐＺＫＵＥ３Ｓ（国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレット、その中の配列番号７８）を用いて、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を株Ｙ４１８４中のＵｒａ３遺伝子に組み込むことにより、それぞれ、株Ｙ４１８４Ｕ１（全脂質の１１．２％ＥＰＡ）、株Ｙ４１８４Ｕ２（全脂質の１０．６％ＥＰＡ）及び株Ｙ４１８４Ｕ４（全脂質の１５．５％ＥＰＡ）が得られた（集合的に、Ｙ４１８４Ｕ）。
【０２３６】
国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットは、増殖条件の違いによる、Ｙ４１８４（３０．７％）とＹ４１８４Ｕ（平均１２．４％）において定量されたＥＰＡ％ＴＦＡの相違を記載している。
【０２３７】
実施例８
高ＥＰＡ産生のためのヤロウィア・リポリティカ株Ｙ９５０２及びＹ９５０２Ｕの作製
実施例４で、宿主として、Ｙ．リポリティカ株Ｙ９５０２Ｕを用いた。株Ｙ９５０２Ｕは、Ｙ．リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するものであり、Δ−９エロンガーゼ／Δ−８デサチュラーゼ経路の発現による全脂質と比較して高いＥＰＡを産生することができる。この株は、Ｕｒａ表現型を有する。
【０２３８】
ヤロウィア・リポリティカ株Ｙ９５０２の遺伝子型
株Ｙ９５０２の作製は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。Ｙ．リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する株Ｙ９５０２は、Δ−９エロンガーゼ／Δ−８デサチュラーゼ経路の発現による全脂質に対して約５７．０％ＥＰＡを産生することができた。
【０２３９】
野生型ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２に関する株Ｙ９５０２の最終遺伝子型は、以下のものであった：Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、不明１−、不明２−、不明３−、不明４−、不明５−、不明６−、不明７−、不明８−、不明９−、不明１０−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー）、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６。
【０２４０】
上に用いた略称で、実施例７に記載していないものは以下の通りである：ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）由来の、コドン最適化Δ−８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプティラ種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９由来の、コドン最適化Δ−９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）を、Δ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前掲）に連結することにより作出されたＤＧＬＡシンターゼ［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、Δ−９エロンガーゼ遺伝子（「ＥｇＤ９ｅＳ」）（前掲）を、Δ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前掲）に連結することにより作出したＤＧＬＡシンターゼ［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］であり；ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）由来の、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］をΔ−８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前掲）に連結することにより作出したＤＧＬＡシンターゼ［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］であり；ＥｇＤ５Ｍ及びＥｇＤ５ＳＭは、ユーグレナ・グラリシス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の変異体ＨＰＧ（配列番号４１）モチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含む合成変異体Δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＥａＤ５ＳＭは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）由来の、変異体ＨａＧＧ（配列番号４２）モチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含む合成変異体Δ−５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］であり；ＭＣＳは、リゾビウム・レグノサルムｂｖ．ビシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ）３８４１由来の、コドン最適化マロニル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］であり、並びにＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）由来の、コドン最適化リゾホスファジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，８７９，５９１号明細書］である。
【０２４１】
株Ｙ９５０２中の全脂質含量及び組成を詳細に分析するために、フラスコアッセイを以下のように実施し、そこで、細胞を２段階で、合計７日にわたり増殖させた。分析に基づき、株Ｙ９５０２は、３．８ｇ／Ｌ  ＤＣＷ、３７．１ＴＦＡ％ＤＣＷ、２１．３ＥＰＡ％ＤＣＷを産生し、脂質プロフィールは以下の通りであった（ここで、各脂肪酸の濃度は、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］として表す）：１６：０（パルミチン酸塩）−２．５、１６：１（パルミトレイン酸）−０．５、１８：０（ステアリン酸）−２．９、１８：１（オレイン酸）−５．０、１８：２（ＬＡ）−１２．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−３．５、ＤＧＬＡ−３．３、ＡＲＡ−０．８、ＥＴｒＡ−０．７、ＥＴＡ−２．４、ＥＰＡ−５７．０、その他−７．５。
【０２４２】
ヤロウィア・リポリティカ株Ｙ９５０２Ｕの遺伝子型
株Ｙ９５０２のＵｒａ３遺伝子を破壊するために、ＳａｌＩ／ＰａｃＩ消化構築物ｐＺＫＵＭ（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、その中の表１５、配列番号１３３及び図８Ａを参照）を用いて、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓに従い、Ｕｒａ３変異遺伝子を株Ｙ９５０２のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計２７の形質転換体（８つの形質転換体を含む第１群、８つの形質転換体を含む第２群、及び１１の形質転換体を含む第３群から選択される）を最少培地＋５−フルオロオロチン酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］選択プレートで増殖させ、３０℃で２〜５日維持した。ＭＭ＋５−ＦＯＡは、（リットル当たり）：２０ｇのグルコース、６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジン及び、１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づいて（供給業者から受領する各バッチ内で変動が起こるため）、適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を含む。
【０２４３】
さらなる実験により、第３群の形質転換体だけが、実際のＵｒａ表現型を有することが明らかになった。
【０２４４】
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから、Ｕｒａ細胞をこすり取り、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓに従い、脂肪酸分析に付した。これにより、ＧＣ分析から、第３群のＭＭ＋５−ＦＯＡプレートで増殖させたｐＺＫＵＭ形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０及び＃１１中の２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％及び２９．６％ＥＰＡのＴＦＡが、それぞれ存在することが明らかになった。これら７つの株は、それぞれ株Ｙ９５０２Ｕ１２、Ｙ９５０２Ｕ１４、Ｙ９５０２Ｕ１７、Ｙ９５０２Ｕ１８、Ｙ９５０２Ｕ１９、Ｙ９５０２Ｕ２１及びＹ９５０２Ｕ２２（集合的に、Ｙ９５０２Ｕ）と称する。
【０２４５】
実施例９
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｓａ１遺伝子に対して相同性を有するヤロウィア・リポリティカ遺伝子の同定
「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＬａＢＲＩ，Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）（また、Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３０（６９９５）：３５−４４（２００４）も参照）の一般公開Ｙ．リポリティカタンパク質データベースに対して、クエリー配列としてＳｃＴｓａ１を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、ヤロウィア・リポリティカにおいて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｓａ１（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＮＰ＿０１３６８４；配列番号３４）［「ＳｃＴｓａ１」］に対するオーソログを同定した。
【０２４６】
Ｙ．リポリティカタンパク質の中で、ＳｃＴｓａ１に対して最高の相同性（期待値１ｅ−８２）を有するタンパク質配列、ＹＡＬＩ０Ｂ１５１２５ｇ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５００９１５．１；配列番号３６）に「ＹｌＴｓａ１」という名称を与えた。ＹＡＬＩ０Ｂ１５１２５ｇは、ＧｅｎＢａｎｋで「ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ３４７６０サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＭＬ０２８ｗ  ＴＳＡ１（ＹＤＲ４５３Ｃのオーソログ）チオレドキシンペルオキシダーゼに高度に類似し、リボソーム関連及び遊離細胞質抗酸化因子の両方として作用する」というアノテーションが付けられていた。
【０２４７】
ＳｃＴｓａ１と推定ＹｌＴｓａ１のアラインメントを図７に示す。鉛直のボックスは、分子間及び分子内相互作用に重要な、ＳｃＴｓａ１のＣｙｓ４８及びＣｙｓ１７１を強調している（Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：４４６４−４４７２（２００９））。前者のＣｙｓ残基は、ＹｌＴｓａ１に保存されているが、後者は、ＳｃＴｓａ１と比較すると、ＹｌＴｓａ１において２アミノ酸上流に転位している。
【０２４８】
実施例１に記載した方法に従い、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース内に類似性を有する配列を同定するために、ＹＡＬＩ０Ｂ１５１２５ｇ（配列番号３６）をコードするタンパク質配列を用いて、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２６＋検索を実施した。
【０２４９】
ＹＡＬＩ０Ｂ１５１２５ｇ（配列番号３６）に対する有意な類似性を共有するとして、多数のタンパク質が同定された。表１２に、「２ｅ−１０２］以上の期待値と、具体的にそのタンパク質を同定したという（すなわち、仮想タンパク質へのヒットは除外される）アノテーションを有するこれらのヒットの概要の一部を記載するが、これは本明細書の開示内容を限定するものとして考えるべきではない。表１２に記載するタンパク質は、配列番号３６と９５〜１００％のクエリーカバレッジを共有する。
【０２５０】
表１２．ＹｌＴｓａ１（配列番号３６）との類似性を共有する遺伝子
【表１２】
2014505472.tif 000019
2014505472.tif 000020
【０２５１】
ＢＬＡＳＴＰ検索によれば、ＹＡＬＩ０Ｂ１５１２５ｇ（配列番号３６）は、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）ＡＴＣＣ  ４２７２０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＰ＿００２６１６３５５．１）由来のＴｓａ１ペルオキシレドキシンと、８１％同一性及び９２％類似性、並びに期待値４ｅ−１１７で、最高の類似性を共有し、次に、メエロジーマ・グイリエルモンディ（Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ６２６０由来のＴＳＡ１ペルオキシレドキシン（８０％同一性及び９１％類似性、並びに期待値３ｅ−１１５）であった。
【０２５２】
前述の分析に基づき、配列番号３５は、Ｙ．リポリティカのＴＳＡ１ペルオキシレドキシン（「ＹｌＴｓａ１」）（このタンパク質配列は、配列番号３６として示される）をコードすると仮定された。
【０２５３】
本明細書において、ヤロウィア・リポリティカのＰＵＦＡ産生株におけるＹｌＴｓａ１の過剰発現は、酸化ストレスに対する耐性の増大をもたらすと想定される。酸化ストレスに対する耐性増大の１つの有益な成果は、脂質過酸化からの保護の強化であり、これによって、脂質及びＰＵＦＡ含有率が増加することになる。
【０２５４】
実施例１０
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙｂｐ１遺伝子に対して相同性を有するヤロウィア・リポリティカ遺伝子の同定
「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＬａＢＲＩ，Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）（また、Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３０（６９９５）：３５−４４（２００４）も参照）の一般公開Ｙ．リポリティカタンパク質データベースに対して、クエリー配列としてＳｃＹｂｐ１を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、ヤロウィア・リポリティカにおいて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙｂｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＮＰ＿００９７７５．１；配列番号３８）［「ＳｃＹｂｐ１」］に対するオーソログを同定した。
【０２５５】
Ｙ．リポリティカタンパク質の中で、ＳｃＹｂｐ１に対して最高の相同性（期待値５ｅ−２２）を有するタンパク質配列、ＹＡＬＩ０Ｂ０３７６２ｇ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿５００４６９．１；配列番号４０）に「ＹｌＹｂｐ１」という名称を与えた。ＹＡＬＩ０Ｂ０３７６２ｇは、ＧｅｎＢａｎｋで「有糸分裂進行を媒介する、ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ５３１６９サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＧＬ０６０ｗ  ＹＢＰ２（ＹＢＲ２１６Ｃのオーソログ）中心動原体関連タンパク質にやや類似する」というアノテーションが付けられていた。
【０２５６】
ＳｃＹｂｐ１と推定ＹｌＹｂｐ１のアラインメントを図８に示すが、両タンパク質の間にはほとんど配列保存がみとめられない。
【０２５７】
実施例１に記載した方法に従い、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース内に類似性を有する配列を同定するために、ＹＡＬＩ０Ｂ０３７６２ｇ（配列番号４０）をコードするタンパク質配列を用いて、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２６＋検索を実施した。
【０２５８】
ＹＡＬＩ０Ｂ０３７６２ｇ（配列番号４０）に対する類似性を共有するとして、複数のタンパク質が同定された。表１３に、「２ｅ−３７」以上の期待値と、具体的にそのタンパク質を同定したという（すなわち、仮想タンパク質及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のタンパク質へのヒットは除外される）アノテーションを有するこれらのヒットの概要の一部を記載するが、これは、本明細書の開示内容を限定するものとして考えるべきではない。表１３に記載するタンパク質は、配列番号４０と７４〜９３％のクエリーカバレッジ（ｑｕｅｒｙ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を共有する。
【０２５９】
表１３．ＹｌＹｂｐ１（配列番号４０）との類似性を共有する遺伝子
【表１３】
2014505472.tif 000021
【０２６０】
ＢＬＡＳＴＰ検索によれば、ＹＡＬＩ０Ｂ０３７６２ｇ（配列番号４０）は、クラビスポラ・ルシタニエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）ＡＴＣＣ  ４２７２０（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＰ＿００２６１８９２１．１）由来の仮想タンパク質ＣＬＵＧ＿０００８０と、２８％同一性及び４８％類似性、並びに期待値１ｅ−５４で、最高の類似性を共有した。
【０２６１】
既知機能を有するタンパク質のうち、最高のヒットは、３０％同一性及び４９％類似性、並びに期待値６ｅ−５３のシェフェルソミセス・スチピチス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ  ６０５４（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＰ＿００１３８６９４１．２）であり、次に、２８％同一性及び４７％類似性、並びに期待値３ｅ−４８のカンジダ・テヌイス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｅｎｕｉｓ）ＡＴＣＣ１０５７３（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＥＧＶ６３３４２．１）由来のＹＡＰ１結合タンパク質２であった。
【０２６２】
前述の分析に基づき、配列番号３９は、Ｙ．リポリティカのＹＡＰ１結合タンパク質（「ＹｌＹｂｐ１」）（タンパク質配列は、配列番号４０として示される）をコードすると仮定された。
【０２６３】
ＹｌＹｂｐ１をさらに評価するために、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８１）多重配列アラインメント（図９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて、配列番号４０に示すタンパク質配列を、以下の表１４に示すタンパク質とアラインメントした。これらのタンパク質の各々は、Ｙｂｐ１の相同体をコードすることが仮定される。
【０２６４】
表１４．ＹｌＹｂｐ１（配列番号４０）とアラインメントしたタンパク質
【表１４】
2014505472.tif 000022
【０２６５】
アラインメントの視覚検査では、タンパク質の間には、比較的わずかな配列保存領域しか観察されなかった。しかし、ＣＤ検索（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｂｒｙａｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（Ｗ）３２７−３３１（２００４）；Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７（Ｄ）２０５−２１０（２００９）；及びＭａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９（Ｄ）２２５−２２９（２０１１））を用いて、タンパク質配列内に検出された保存ドメインを観察するために、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［「ＮＣＢＩ」］の「Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎｓ」ツールを用いた分析時には、７タンパク質の各々が、ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒ＿Ｙｂｐ２スーパーファミリー（Ｐｆａｍ０８５６８；中心動原体に一体的に関与するタンパク質のファミリーとして記載される）内に含まれていた。従って、この明確な特徴は、他の生物由来の他のＹｂｐ１タンパク質を同定する手段として有用となりうる。
【０２６６】
本明細書において、ヤロウィア・リポリティカのＰＵＦＡ産生株におけるＹｌＹｂｐ１の過剰発現は、酸化ストレスに対する耐性の増大をもたらすことが仮定される。酸化ストレスに対する抵抗性増大の１つの有益な成果は、脂質過酸化からの保護の強化であり、これによって、脂質及びＰＵＦＡ含有率が増加することになる。
【図１】
2014505472.tif 000023
【図２Ａ】
2014505472.tif 000024
【図２Ｂ】
2014505472.tif 000025
【図３Ａ】
2014505472.tif 000026
【図３Ｂ】
2014505472.tif 000027
【図５Ａ】
2014505472.tif 000028
【図５Ｂ】
2014505472.tif 000029
【図６】
2014505472.tif 000030
【図７】
2014505472.tif 000031
【図８Ａ】
2014505472.tif 000032
【図８Ｂ】
2014505472.tif 000033
【図９Ａ】
2014505472.tif 000034
【図９Ｂ】
2014505472.tif 000035
【図９Ｃ】
2014505472.tif 000036
【図９Ｄ】
2014505472.tif 000037
【図９Ｅ】
2014505472.tif 000038
【図４】
2014505472.tif 000039
【配列表】
2014505472000001.app
【国際調査報告】
2014505472.tif 000040