(57)【要約】    細胞において細胞内標的部位に対し原子力間顕微鏡のチップを位置決めする方法が提供される。包括的に言えば、本方法は、ａ）原子力間顕微鏡の蛍光チップを、蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞上で、該チップが標的部位の上方にくるように位置決めするステップと、ｂ）蛍光顕微鏡を用いて前記チップ及び／又は前記標的部位の遠位端の画像を取得しながら、前記チップを前記標的部位に向けて動かすステップと、ｃ）前記蛍光顕微鏡において前記標的部位及び前記チップの遠位端の双方の焦点が合っているとき、前記チップの前記動きを制動するステップと、を含む。また、本方法を実行する顕微鏡システムも提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）原子力間顕微鏡の蛍光チップを、蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞上で、該チップが標的部位の上方にくるように位置決めするステップと、
ｂ）蛍光顕微鏡を用いて前記チップ及び／又は前記標的部位の遠位端の画像を取得しながら、前記チップを前記標的部位に向けて動かすステップと、
ｃ）前記蛍光顕微鏡において前記標的部位及び前記チップの遠位端の双方の焦点が合っているとき、前記チップの前記動きを制動するステップと、
を含む、細胞において細胞内標的部位に対し原子力間顕微鏡のチップを位置決めする方法。
【請求項２】
前記標的部位及び前記チップの前記遠位端は、それらが互いの１００ｎｍ以内にあるとき焦点が合っている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的部位に対する前記チップの前記位置決めは、前記制動後に維持される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記位置決めは、フィードバック制御ループを用いて能動的に維持される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記チップは、前記蛍光性の細胞内標的部位の前記蛍光から区別可能な波長において蛍光を発する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標的部位は蛍光タンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的部位は標識結合パートナを用いて標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標識結合パートナは、標識オリゴヌクレオチド、抗体又はアプタマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は蛍光染料を用いて染色される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記動かすステップ中に原子力を監視するステップであって、前記チップが前記細胞の膜を貫通するときを判断する、監視するステップを更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記制動するステップの後、前記標的部位に近接した位置において前記チップから材料を堆積させるステップを更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記材料は、オリゴヌクレオチド、小分子又はタンパク質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記材料が堆積された後、前記細胞を観察するステップを更に含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記制動するステップの後、前記チップを用いて前記標的部位に近接した位置から材料を除去するステップを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記材料は核酸又はタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記材料が前記細胞から除去された後、該材料を解析するステップを更に含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記位置決めするステップａ）は手動で行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
顕微鏡システムであって、
ａ）蛍光チップを備える原子力間顕微鏡と、
ｂ）蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞を配置するサンプルプレートと、
ｃ）蛍光顕微鏡と、
を備え、該システムは自動的に、ａ）前記蛍光チップが前記細胞の上方に位置決めされた後、該チップを前記サンプルプレートに向けて動かし、ｂ）前記蛍光顕微鏡において前記チップの遠位端及び前記蛍光性の細胞内標的部位の双方の焦点が合っているとき、前記サンプルプレートの動きを制動するように構成される、顕微鏡システム。
【請求項１９】
前記チップを前記細胞の上方に位置決めする光学顕微鏡を更に備える、請求項１８に記載の顕微鏡システム。
【請求項２０】
フィードバック制御ループを用いて前記標的部位に対する前記チップの前記位置決めを能動的に維持するように構成される、請求項１８又は１９に記載の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）は、走査に用いられ、或る特定の用途では試料表面を貫通するのに用いられる鋭いチップ（プローブと呼ばれる場合もある）を端部に有するカンチレバーを含む。カンチレバーは通常、シリコン又は窒化シリコンであり、チップはナノメートル単位の曲率半径を有する。チップがサンプル表面に近接すると、チップとサンプルとの間の力によってフックの法則に従ってカンチレバーのたわみが生じる。用途に応じて、この力は、例えばカンチレバーの上面からフォトダイオードのアレイ内に反射されるレーザースポットを用いてカンチレバーのたわみを検出することによって測定することができるが、他の方法も知られている。例えば、或る特定の事例では、カンチレバーは、歪みゲージとしての役割を果たすピエゾ抵抗素子を含むように製造することができる。ホイートストンブリッジを用いて、（たわみに起因した）ＡＦＭカンチレバーにおける歪みを測定することができる。
【発明の概要】
【０００２】
細胞において細胞内標的部位に対し原子力間顕微鏡のチップを位置決めする方法が提供される。包括的に言えば、本方法は、ａ）原子力間顕微鏡の蛍光チップを、蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞上で、該チップが標的部位の上方にくるように位置決めするステップと、ｂ）蛍光顕微鏡を用いて前記チップ及び／又は前記標的部位の遠位端の画像を取得しながら、前記チップを前記標的部位に向けて動かすステップと、ｃ）前記蛍光顕微鏡において前記標的部位及び前記チップの遠位端の双方の焦点が合っているとき、前記チップの前記動きを制動するステップと、を含む。また、本方法を実行する顕微鏡システムも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】例示的なシステムを概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明を更に詳細に説明する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変化させることができることを理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定することを意図していないことも理解すべきである。
【０００５】
或る値の範囲が提示される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上明確に他の指示がない限り下限の単位の１０分の１までの、その間の値の各々、及びその記載の範囲内における任意の他の記載の値又はその間の値が、本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【０００６】
他に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料を使用することもできるが、好ましい方法及び材料は、ここで記載されるものである。
【０００７】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が各々参照により本明細書の一部をなすものとすることが具体的に及び個別に示されているかの如く、引用することにより本明細書の一部をなし、それとの関連で刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するように引用することにより本明細書の一部をなすものとする。いずれの刊行物の引用も、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明を理由としてかかる刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。さらに、提示される刊行日は、実際の刊行日と異なる可能性があり、実際の刊行日を個別に確認する必要がある可能性がある。
【０００８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数表記（"a", "an", and "the"）は、文脈上明確に他の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。特許請求の範囲がいかなる任意の要素をも排除するように起案されている可能性があることに更に留意する。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の記載との関連における「のみ（"solely", "only"）」等のような排他的な専門用語の使用、又は「除く（negative）」限定の使用に関する先行基礎の役割を果たすことを意図している。
【０００９】
本開示を読めば当業者に明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々が、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴部から容易に分離することができ、又はこれと組み合わせることができる別々の構成要素及び特徴部を有する。いずれの記載の方法も、記載される事象の順番で、又は論理的に考えられる任意の他の順番で実施することができる。
【００１０】
本明細書において用いられるとき、そうではないと示されない限り、１つの物体の別の物体に対する動きを示すのに用いられる全ての用語は、第１の物体が第２の物体に対して動かされるとき、第１の物体が動かされる場合があるか、第２の物体が動かされる場合があるか、双方の物体が動かされる場合があるという点で、相対的な語であるように意図される。さらに、「上方」、「下方」、「上」及び「下」等の語は、重力に対する位置を暗に意味するように意図されるものではない。
【００１１】
本方法は一般的に、図１に概略的に示す顕微鏡システム等の顕微鏡システムと合わせて用いることができる。顕微鏡システム２は、原子力間顕微鏡（カンチレバー４及びチップ７、並びにオプションの光源５（例えばレーザ）及びオプションの検出器６からなる）を含む。カンチレバー４は、チップ７が、サンプルプレート１０上に存在する細胞８に近接するように位置決めされる。サンプルプレート１０は、例えば透明なスライド又は細胞を安定して保持することができる他の物体とすることができる。サンプルプレートはホルダ１２によって所定の位置に保持される。ホルダ１２は、ｘ軸、ｙ軸及びｚ軸におけるサンプルプレートの動きを容易にすることができるアクチュエータを有し、ｘ軸及びｙ軸はサンプルプレートに対し平面であり、ｚ軸はプローブのチップに向かう方向にある。示されるように、カンチレバー４に加えられる力は、光線１４の偏向を測定することによって測定することができるが、力を測定する他の方法も知られている。システムは蛍光顕微鏡１６も含み、蛍光顕微鏡１６はチップ７及び細胞８から放出される蛍光を検出することが可能である。チップ７及び細胞８における蛍光体は光源１８によって励起される。示されるように、蛍光顕微鏡は、チップ７及び細胞８から放出される蛍光を見るのに、オプションのディスプレイ２０を有するコンピュータ２２に接続される。システムは、オプションでフィードバック制御システム２４を含むことができ、フィードバック制御システム２４は、例えば、蛍光顕微鏡１６によって取得された画像に応じてサンプルプレート及びカンチレバーチップを特定の位置に自動的に動かすか又はそこに維持することができる。図１に示す素子は代替構成をとることができる。
【００１２】
特定の実施形態では、顕微鏡システムは、ａ）蛍光チップを含む原子力間顕微鏡と、ｂ）蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞をその上に配置することができるサンプルプレートと、ｃ）蛍光顕微鏡とを備え、このシステムは自動的に、ａ）蛍光チップが細胞の上方に位置決めされた後、そのチップをサンプルプレートに向けて動かし、ｂ）蛍光顕微鏡においてチップの遠位端及び蛍光性の細胞内標的部位の双方の焦点が合ったとき、ステージを制動するように構成される。或る特定の事例では、蛍光顕微鏡を用いてチップを細胞の上方のｘ−ｙ平面に位置決めすることができる。特定の実施形態では、システムはフィードバック制御ループを用いて標的部位に対するチップの位置決めを能動的に維持するように構成される。
【００１３】
システムは、蛍光を用いて細胞内標的部位（例えば対象の生体分子を含む場合がある）に対し原子力間顕微鏡チップの「焦点を合わせる」方法を提供する。１つの実施形態では、原子力間顕微鏡チップ及び細胞内標的部位の双方が蛍光体で標識される。蛍光顕微鏡を用いてｚ軸において見るとき、すなわち顕微鏡、蛍光チップ及び蛍光性の細胞内標的部位が位置合わせされた位置から見るとき、チップ及び標的部位の双方の焦点は、互いに近接しているときにのみ合う。或る特定の実施形態では、標的部位及びチップの遠位端は、互いの約２００ｎｍ以内（例えば、所望の結果に応じて、互いの約１００ｎｍ以内、互いの５０ｎｍ以内又は約５０ｎｍ以内）にあるとき、焦点が合う。原子力間顕微鏡チップ及び細胞における細胞内標的部位からの２つの蛍光性信号の共局在性によって、それらの２つが３つ全ての軸において同じ空間の向きで直接位置合わせされていることが保証される。
【００１４】
特定の実施形態では、第１の位置決めステップは手動で行うことができる。このステップでは、チップの遠位端は、ｘ−ｙ平面において細胞内標的部位の上部に、例えばｘ−ｙ平面において２００ｎｍ以内、約１００ｎｍ以内又は約５０ｎｍ以内まで位置決めすることができる。次に、サンプルプレートをｚ軸において（ステッピング又は連続運動によって）チップに向けて動かすことができる。特定の実施形態では、このステップの間、チップに加えられる力を監視し、チップが細胞膜、細胞原形質膜又は細胞内膜を貫通するときを判断することができる。チップの動きは、蛍光顕微鏡においてチップの遠位端及び標的部位の双方の焦点が合ったときに制動することができる。特定の事例では、上記標的部位に対するチップの位置は、チップの動きが制動された後に維持することができる。この位置決めは、フィードバック制御ループを用いて能動的に維持することができる。特定の事例では、蛍光顕微鏡はまず細胞内標的部位に焦点を合わせられ、焦点外のチップは焦点が合うまで細胞内に動かされる。これは（例えばモニタで画像を見ることによって）手作業で行うこともできるし、自動で行うこともできる（この場合、部位及びチップの双方の焦点が合っているか否かをコンピュータが判断する）。
【００１５】
「焦点が合っている」とみなされるものは、チップと標的部位との間の所望の距離に応じて変動する場合がある。特定の実施形態では、顕微鏡の光学特性は所望の被写界深度を与えるように変更することができ、この被写界深度によってチップ及び標的部位の双方の焦点が合うことになる距離が決まる。焦点が合っている物体の検出は、既知の方法を用いて、例えばパッシブオートフォーカス法を用いて自動化することができる。オートフォーカス法は、例えば、位相検出法若しくはコントラスト測定法、又はそのような既知の方法から容易に適応させることができる方法を含む。
【００１６】
細胞内標的部位（例えば細胞小器官構造又は細胞内の他の構造）は、多岐にわたる方法を用いて蛍光標識することができる。一実施形態では、細胞は蛍光性融合タンパク質を生成するように操作することができる。或る特定の事例では、融合タンパク質は細胞内の部位に対するタンパク質を標的にする標的配列、例えば核、小胞体、ミトコンドリア又は細胞内の何らかの他の構造を含むことができる。蛍光タンパク質が用いられる場合、蛍光タンパク質は、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質又はそれらの任意の変異体とすることができる。変異体には、蛍光強度を高めることによって得られるＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰの変異体が含まれる。そのようなレポータタンパク質は、例えばオワンクラゲ属、ディスコーマ属（Discoma）、プチロサルカス属（Ptilosarcus）又はウミシイタケ属由来のＧＦＰの蛍光タンパク質から取り出すことができる。これらのタンパク質はよく知られている。
【００１７】
代替的な実施形態では、細胞内の部位は蛍光標識された結合パートナ、例えば蛍光標識されたオリゴヌクレオチド、抗体又はアプタマーを用いて標識することができ、標識方法が知られている。他の実施形態では、細胞は構造特異染色を用いて染色することができ、それらのうちの多くが知られている。
【００１８】
チップは、例えば蛍光ビーズをチップに結合するか、又は蛍光染料をチップに直接結合することによって蛍光性にすることができる。例えば反応性アミン、アルデヒド、チオール又はエポキシ基等を用いて分子を固体支持体に結合する化学反応がよく知られている。一実施形態では、チップの表面上でアミノ基又は他の反応基を水酸基に共有結合し（例えばエタノールアミン又は３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いる）、次に染料、例えばＦＩＴＣを、例えばＮＨＳ化学反応を介して反応基に結合することによって、チップを最初に官能基化することができる。予め官能基化されたチップを、例えばNanoAnd More社（ドイツ）から購入することができ、官能基化のために用いることができる例示的な化学反応は、例えばHinterdorfer他（Proc. Natl. Acad. Sci. 2003 93, 3477-3481)、Riener他（Anal. Chim. Acta 2003 479, 59-75.）、Riener他（Anal. Chim. Acta 2003 497, 101-114）、Klein （Chem. Phys. Chem. 2003 4, 1367-1371）、Kamruzzahan他（Bioconjugate Chem. 2006 17, 1473-1481）及びEbner他（Bioconjugate Chem. 2007 18, 1176-1184）に記載されている。特定の実施形態では、チップの先端（例えば遠位２０ｎｍ〜５０ｎｍ）のみが標識される。これは、例えば、チップを蛍光体の薄い層でコーティングされた基板上に下ろすことによって行うことができ、チップは基板上の蛍光体の深さまでしか反応しないはずである。一実施形態では、ＡＦＭチップは表面上を通るとき、反応染料の薄い層と反応することができる。別の実施形態では、アミン官能基化されたＡＦＭチップ全体がバルク反応においてＮＨＳ−ビオチンと反応し、基板はストレプトアビジンでコーティングされた蛍光ビーズの単相で非共有的にコーティングされる。
【００１９】
適切な蛍光染料には、キサンテン染料、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（略記ＦＡＭ及びＦで一般的に知られる）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ又はＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ又はＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ又はＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５又はＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６又はＧ６）及びローダミン１１０等のフルオレセイン染料及びローダミン染料；シアニン染料、例えばＣｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７染料；クマリン、例えばウンベリフェロン；ベンズイミド染料、例えばヘキスト３３２５８；フェナントリジン染料、例えばＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ；エチジウム染料；アクリジン染料；カルバゾール染料；フェノキサジン染料；ポルフィリン染料；ポリメチン染料、例えばＣｙ３、Ｃｙ５等のシアニン染料；ＢＯＤＩＰＹ染料及びキノリン染料が含まれる。本出願において一般的に用いられる、対象の特異蛍光体には、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３及びＣｙ５等が含まれる。一実施形態では、チップは、細胞内標的部位の蛍光から区別可能な波長で蛍光を放出する蛍光体を用いて標識されるべきである。多くのそのような組合せが知られている。
【００２０】
細胞の内容物を操作する（例えば細胞の内部に材料を堆積させるか又は細部の内部から材料を抽出するか、又は細胞内成分を細胞内で移動させる）のに原子力間顕微鏡を用いることができる。そのような方法の例は、例えば、Chen他（Proc. Natl. Acad. Sci 2007  103: 8218-8222）、Cuerrier他（Biochem. Biophys. Res. Comm. 2007 355: 632-636）、Nawarathna他（Appl. Physics Lett. 2009 95: 083117）、Lamontagne他（Eur. J. Physiol. 2008 456: 61-70）、Meister他（Nano. Lett. 2009 9: 2501-2507）及びOsada他（J. Nanobiotechnology 2003 1:2-9）に記載されており、それらの参考文献は、全ての目的で、特にＡＦＭを適用することができる用途の開示の目的で、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２１】
一実施形態では、本方法は、チップの動きが制動された後、標的部位に近接した位置にあるチップから材料を堆積させることを含むことができる。これらの実施形態では、チップは蛍光性であることに加えて、材料、例えばオリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば抗体）、又は刺激（例えばｕｖ光等）に応答してチップから細胞内に誘導的に放出することができる別の分子を含むように変更することができる。材料が堆積された後、例えば表現型の変化に関して細胞を観察することができる。別の実施形態では、本方法は、チップの動きが制動された後、標的部位から材料を除去することを含むことができる。これらの実施形態では、除去される材料は、例えば核酸（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）又はタンパク質とすることができる。材料が除去された後、除去された材料を解析することができる。いくつかの実施形態では、細胞を観察して、材料の除去によって表現型が生じるか否かを判断することができる。或る特定の実施形態では、チップは細胞から引き抜くことができる。
【００２２】
細胞操作方法は多くの場合に、ｚ軸における、特に細胞内の標的部位に対する原子力間顕微鏡のチップの正しい位置決めを必要とする。上記で説明した方法は、装置上の固定位置に対して測定される、Ｚ軸における所定の位置に原子力間顕微鏡を単に動かす現行の方法よりも優れていると考えられる。一方、標的部位のｚ軸位置は細胞間で変動する場合があり、したがって従来技術による方法は不定の結果を与える場合がある。
【００２３】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が各々引用することにより本明細書の一部をなすものとすることが具体的に及び個別に示されているかの如く、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。いずれの刊行物の引用も、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明を理由としてかかる刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。
【００２４】
前述の発明を理解の明確化の目的で説明及び例示として幾分詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、それに対して或る特定の変更及び修正を行うことができることが、本発明の教示に鑑みて当業者には容易に明らかとなる。
【図１】
2014518396.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月7日(2014.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）原子力間顕微鏡の蛍光チップを、蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞上で、該チップが標的部位の上方にくるように位置決めするステップと、
ｂ）蛍光顕微鏡を用いて前記チップ及び／又は前記標的部位の遠位端の画像を取得しながら、前記チップを前記標的部位に向けて動かすステップと、
ｃ）前記蛍光顕微鏡において前記標的部位及び前記チップの遠位端の双方の焦点が合っているとき、前記チップの前記動きを制動するステップと、
を含む、細胞において細胞内標的部位に対し原子力間顕微鏡のチップを位置決めする方法。
【請求項２】
前記標的部位に対する前記チップの前記位置決めは、前記制動後にフィードバック制御ループを用いて維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的部位は蛍光タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的部位は、標識オリゴヌクレオチド、抗体又はアプタマーから選択される標識結合パートナを用いて標識される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は蛍光染料を用いて染色される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記制動するステップの後、前記標的部位に近接した位置において前記チップから材料を堆積させるステップを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記材料が堆積された後、前記細胞を観察するステップを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記制動するステップの後、前記チップを用いて前記標的部位に近接した位置から材料を除去するステップを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記材料が前記細胞から除去された後、該材料を解析するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
顕微鏡システムであって、
ａ）蛍光チップを備える原子力間顕微鏡と、
ｂ）蛍光性の細胞内標的部位を含む細胞を配置するサンプルプレートと、
ｃ）蛍光顕微鏡と、
を備え、該システムは自動的に、ａ）前記蛍光チップが前記細胞の上方に位置決めされた後、該チップを前記サンプルプレートに向けて動かし、ｂ）前記蛍光顕微鏡において前記チップの遠位端及び前記蛍光性の細胞内標的部位の双方の焦点が合っているとき、前記サンプルプレートの動きを制動するように構成される、顕微鏡システム。
【国際調査報告】
2014518396.tif 000004
2014518396.tif 000005