(57)【要約】生きた生物（例えば、動物）における酵素活性を検出するための組成物および方法が開示され、提供される。第一の実施形態では、化学発光性酵素プローブおよび近赤外（ＮＲ）ナノ粒子を含む組成物が開示される。さらなる実施形態では、この組成物は、ルミノール、および抗体、低分子、アパトマーもしくはポリペプチドを含み得る標的化部分をさらに含み得る。生きた動物における酵素活性をモニターする方法であって、該方法は、本発明の組成物を投与する工程であって、ここで前記ＮＩＲナノ粒子は、前記化学発光性酵素プローブから放出された化学発光に曝されると光を放出する、工程；該ＮＩＲナノ粒子から放出された光を検出し、それによって、該生きた動物における酵素活性をモニターする工程、を包含する、方法もまた提供される。
2014517913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光性酵素プローブおよび近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子を含む、組成物。
【請求項２】
前記化学発光性酵素プローブは、ルミノールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＮＩＲナノ粒子は、標的化部分をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的化部分は、抗体、抗体フラグメント、低分子、アパトマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
生きた動物における酵素活性をモニターする方法であって、該方法は、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程であって、ここで前記ＮＩＲナノ粒子は、前記化学発光性酵素プローブから放出された化学発光に曝されると光を放出する、工程；
該ＮＩＲナノ粒子から放出された光を検出し、それによって、該生きた動物における酵素活性をモニターする工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記化学発光性酵素プローブは、ルミノールを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＯＳ活性がモニターされる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
がんが検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素活性は、炎症応答の指標である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症応答は、肺の中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素活性は、腫瘍もしくは腫瘍転移の存在の指標である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
生きた動物におけるがんを検出する方法であって、該方法は、
化学発光性酵素プローブを該動物に投与する工程；
近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子を該動物に投与する工程であって、ここで該ナノ粒子は、該化学発光性酵素プローブから放出された化学発光に曝されると光を放出する、工程；
該ＮＩＲナノ粒子から放出された光を検出し、それによって、該生きた動物におけるがんをモニターする工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記がんは、固形腫瘍もしくは転移部位である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１１年４月１３日に出願された米国仮出願第６１／５１７，０９０号の利益を主張する。米国仮出願第６１／５１７，０９０号の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、生きている生物における酵素活性の評価において使用するための試薬の分野にある。特に、インビボでの酸化的ストレスに関連する酵素活性をモニターするための組成物および方法が本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
生きている生物から酵素活性の指標となる光を検出することは、疾患経路の同定、作用機構の決定、薬物化合物の効力評価、および生きた動物における疾患進行に対するリード候補の影響をモニターすることを可能にする、診断、創薬および医療における強力なツールである。例えば、ミエロペルオキシダーゼ活性の画像化は、酸化的ストレスをモニターすることについて記載されてきた。例えば、非特許文献１；非特許文献２；および特許文献１を参照のこと。これら方法は、ストレスを受けた組織中に好中球および単球／マクロファージが浸潤することによって炎症プロセスの間に産生される侵襲性の反応性酸素種を検出するために、外から供給されたルミノールを使用する。
【０００４】
インビボで酵素活性を画像化するためのさらなる方法としては、生物発光蛍光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５を参照のこと）、および光を生じるために外因性酵素（例えば、ルシフェラーゼ）を使用する、発光からの非結合励起による蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｕｎｂｏｕｎｄ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＦＵＥＬ）（例えば、Ｄｒａｇａｖｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０，第１０回国際ＥＬＭＩ大会（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）でのポスター発表を参照のこと）が挙げられる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（これは、分子の近さにおいて変化を生じる生物学的現象を調査する）は、外因性の励起光を使用する。
【０００５】
生理学的条件下で、低レベルの反応性酸素種および反応性窒素種は、細胞によって生成され、細胞シグナル伝達および脈管ホメオスタシスの維持において重要な役割を果たす。病的な炎症応答の間に、病的な炎症応答の間に、多量の反応性酸素種（ＲＯＳ）は、ストレスを受けた組織の好中球および単球／マクロファージの浸潤によって生成される。ＲＯＳ生成については、多くの経路が存在するが、そのうちの１つは、膜結合型酵素であるＮＡＤＰＨオキシダーゼ（これは、好中球および単球／マクロファージに豊富にある）を含む。炎症性刺激で刺激されると、上記ＮＡＤＰＨは、呼吸バーストを媒介し、Ｏ２をスーパーオキシドアニオン（Ｏ２°−）に変換し、上記アニオンは、その後、スーパーオキシド・ジスムターゼによって触媒されて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を形成する。過酸化水素と塩化物アニオンとのさらなる反応は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）によって触媒され、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）を生成する。ルミノールの存在下では、次亜塩素酸によるルミノールの酸化は、３−アミノフタレートの形成および付随する光の放出を生じる。この反応カスケードから生成された化学発光による光の放出は、スーパーオキシド生成およびミエロペルオキシダーゼ活性の読み取り値として利用され得る。
【０００６】
しかし、上記ルミノールおよび次亜塩素酸反応を画像化することによる酸化的ストレスの検出は、発光される光の波長が短いことに起因して、感度が制限されている。ルミノール酸化反応からの化学発光による光は、４２５ｎｍにおいてピーク放出を有する。クロロフォア（ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｒｅ）（例えば、ヘモグロビン）による伝達光の組織吸収は、スペクトルが４００〜６００ｎｍにある、より低い波長の光で最も顕著であることが、十分に確立されてきた。結果として、ルミノール媒介性化学発光は、組織を通って浸透する能力が制限されている。さらに、ＢＲＥＴおよびＦＵＥＬにおいて使用される外因性酵素に対する免疫応答についての懸念がある。ＦＲＥＴ画像化法もまた、上記外因性励起光が、検出に干渉する組織自己発光を引き起こし得るという点で問題である。
【０００７】
従って、生きている生物における酵素活性をモニターするための組成物および方法が未だ必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６２７８７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５：４５５−６１
【非特許文献２】Ｋｉｅｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  ４７：７６０−６
【非特許文献３】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  ２７：３８９−３９６
【非特許文献４】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１５１−１５６
【非特許文献５】Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４：３３９−３４３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（概要）
本発明は、酵素活性をモニターする化学発光性酵素反応を、近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子に組み合わせ、それによって、化学発光性プローブ単独と比較して、上記酵素活性の検出の増強を提供することによって生きている生物（例えば、動物）における酵素活性をモニターするための組成物および方法を包含する。
【００１１】
従って、一局面において、化学発光性酵素プローブおよび近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子を含む組成物が、本明細書において記載される。特定の実施形態において、上記化学発光性酵素プローブは、ルミノールおよび／もしくはルミノールの誘導体を含む。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかにおいて、上記ＮＩＲナノ粒子は、標的化部分（例えば、抗体、抗体フラグメント、低分子、アパトマーおよびポリペプチド）をさらに含み得る。
【００１２】
別の局面において、生きた動物における酵素活性をモニターする方法が本明細書において提供され、上記方法は、化学発光性プローブ（例えば、ルミノールもしくはルミノール誘導体）を上記動物に投与する工程；近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子を上記動物に投与する工程であって、ここで上記ナノ粒子は、上記化学発光性プローブから発せられた化学発光に曝されると発光する（例えば、ＮＩＲ）工程；ならびに上記ナノ粒子から発せられた光（例えば、ＮＩＲ）を検出し、それによって、上記生きた動物における酵素活性をモニターする工程を包含する。特定の実施形態において、ＲＯＳ活性は、酵素活性を決定するためにモニターされる。本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記ナノ粒子からの光の検出は、例えば、肺における、炎症（炎症応答）の指標である。
【００１３】
別の局面において、生きた動物における腫瘍を検出する方法が本明細書において提供され、上記方法は、化学発光性プローブ（例えば、ルミノールもしくはルミノール誘導体）を上記動物に投与する工程；近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子を上記動物に投与する工程であって、ここで上記ナノ粒子は、上記化学発光性プローブから発せられた化学発光に曝露されると光（例えば、ＮＩＲ）を発する工程；ならびに上記ＮＩＲナノ粒子から発せられた光（例えば、ＮＩＲ）を検出し、それによって、上記生きた動物における腫瘍を検出する工程を包含する。上記方法は、転移を検出するために使用され得る。
【００１４】
これらおよび他の実施形態は、本開示に鑑みて、当業者に容易に想起される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本明細書に記載されるとおりのナノ粒子吸収化学発光（ＮＡＣ）を示す模式図である。示されるように、外因性試薬は、酵素反応に由来する生成物（酵素による作用を受けた基質）と反応し、短波長の光（「ｈｖ１」）の放出を生じる。近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子の存在下では、短波長の光子は、吸収され、レッドシフトしたＮＩＲ光（例えば、７００〜９５０ｎｍ範囲においては、「ｈＶ２」）として上記ナノ粒子によって再発光される。
【図２Ａ】図２（パネルＡおよびパネルＢ）は、生きた動物におけるナノ粒子吸収化学発光を示す。図２Ａは、１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を気管内注射したマウスの画像である。ＬＰＳ送達３時間後に、マウスに、Ｌ０１２とＱＤ８００との混合物を静脈内注射して、それぞれ、５０ｍｇ／ｋｇ（プローブ）および１００ｐｍｏｌ（ナノ粒子）／マウスの投与量を達成した。図２Ａは、動物の画像を示し（動物の実験番号は、各画像の上に示される）、図２Ｂは、肺シグナルの定量を示すグラフである。画像化および定量の両方を、上記プローブの注射の５分後に行った。
【図２Ｂ】図２（パネルＡおよびパネルＢ）は、生きた動物におけるナノ粒子吸収化学発光を示す。図２Ａは、１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を気管内注射したマウスの画像である。ＬＰＳ送達３時間後に、マウスに、Ｌ０１２とＱＤ８００との混合物を静脈内注射して、それぞれ、５０ｍｇ／ｋｇ（プローブ）および１００ｐｍｏｌ（ナノ粒子）／マウスの投与量を達成した。図２Ａは、動物の画像を示し（動物の実験番号は、各画像の上に示される）、図２Ｂは、肺シグナルの定量を示すグラフである。画像化および定量の両方を、上記プローブの注射の５分後に行った。
【図３Ａ】図３（パネルＡ〜Ｃ）は、生きた動物の肺におけるＮＡＣ画像化を示す。動物を、３つの動物群に分けた。１つの動物群に、ルミノールおよびナノ粒子の混合物のみを静脈内投与した（「コントロール−ルミノール−Ｒ」と表示される、図３Ａの左パネルに示される４匹の動物）。第２の動物群に、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌ）を投与し、３時間後に、ルミノールのみで処置した（「ＬＰＳ−ルミノール」と表示される、図３Ａの中央パネルにおいて示される４匹の動物）。第３の動物群に、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌ）を与え、３時間後に、ルミノールおよびＱＤ８００（ＰＢＳ中に溶解）の混合物を静脈内注射して、それぞれ、２００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｐｍｏｌ／マウスの投与量を達成した（「ＬＰＳ−ルミノール−Ｒ」と表示される、図３Ａの右パネルに示される４匹の動物）。図３Ａは、注射直後に得られた画像（上のパネル，Ｔ＝０と表示）ならびにＬＰＳとルミノール／ナノ粒子の静脈内注射の３時間後でおよび５分間の曝露時間で得られた画像（下のパネル、Ｔ＝３時間と表示）を示す。図３Ｂは、肺炎症アッセイの結果を示すグラフであり、肺炎症が、ＬＰＳおよび上記ルミノール／ナノ粒子混合物で処置したマウス（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ−Ｒ」）においてのみ検出可能であったことを示す。各期間の最も左のバーは、コントロールを示す；中央のバーは、ＬＰＳ−ルミノール処置動物（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ」）を示し、最も右のバーは、ＬＰＳで処置し、３時間後にルミノールおよびＱＤ  ８００の混合物で処置した動物（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す。図３Ｃは、図３Ａに示される画像化結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３（パネルＡ〜Ｃ）は、生きた動物の肺におけるＮＡＣ画像化を示す。動物を、３つの動物群に分けた。１つの動物群に、ルミノールおよびナノ粒子の混合物のみを静脈内投与した（「コントロール−ルミノール−Ｒ」と表示される、図３Ａの左パネルに示される４匹の動物）。第２の動物群に、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌ）を投与し、３時間後に、ルミノールのみで処置した（「ＬＰＳ−ルミノール」と表示される、図３Ａの中央パネルにおいて示される４匹の動物）。第３の動物群に、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌ）を与え、３時間後に、ルミノールおよびＱＤ８００（ＰＢＳ中に溶解）の混合物を静脈内注射して、それぞれ、２００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｐｍｏｌ／マウスの投与量を達成した（「ＬＰＳ−ルミノール−Ｒ」と表示される、図３Ａの右パネルに示される４匹の動物）。図３Ａは、注射直後に得られた画像（上のパネル，Ｔ＝０と表示）ならびにＬＰＳとルミノール／ナノ粒子の静脈内注射の３時間後でおよび５分間の曝露時間で得られた画像（下のパネル、Ｔ＝３時間と表示）を示す。図３Ｂは、肺炎症アッセイの結果を示すグラフであり、肺炎症が、ＬＰＳおよび上記ルミノール／ナノ粒子混合物で処置したマウス（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ−Ｒ」）においてのみ検出可能であったことを示す。各期間の最も左のバーは、コントロールを示す；中央のバーは、ＬＰＳ−ルミノール処置動物（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ」）を示し、最も右のバーは、ＬＰＳで処置し、３時間後にルミノールおよびＱＤ  ８００の混合物で処置した動物（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す。図３Ｃは、図３Ａに示される画像化結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３（パネルＡ〜Ｃ）は、生きた動物の肺におけるＮＡＣ画像化を示す。動物を、３つの動物群に分けた。１つの動物群に、ルミノールおよびナノ粒子の混合物のみを静脈内投与した（「コントロール−ルミノール−Ｒ」と表示される、図３Ａの左パネルに示される４匹の動物）。第２の動物群に、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌ）を投与し、３時間後に、ルミノールのみで処置した（「ＬＰＳ−ルミノール」と表示される、図３Ａの中央パネルにおいて示される４匹の動物）。第３の動物群に、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇにおいて５０μｌ）を与え、３時間後に、ルミノールおよびＱＤ８００（ＰＢＳ中に溶解）の混合物を静脈内注射して、それぞれ、２００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｐｍｏｌ／マウスの投与量を達成した（「ＬＰＳ−ルミノール−Ｒ」と表示される、図３Ａの右パネルに示される４匹の動物）。図３Ａは、注射直後に得られた画像（上のパネル，Ｔ＝０と表示）ならびにＬＰＳとルミノール／ナノ粒子の静脈内注射の３時間後でおよび５分間の曝露時間で得られた画像（下のパネル、Ｔ＝３時間と表示）を示す。図３Ｂは、肺炎症アッセイの結果を示すグラフであり、肺炎症が、ＬＰＳおよび上記ルミノール／ナノ粒子混合物で処置したマウス（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ−Ｒ」）においてのみ検出可能であったことを示す。各期間の最も左のバーは、コントロールを示す；中央のバーは、ＬＰＳ−ルミノール処置動物（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ」）を示し、最も右のバーは、ＬＰＳで処置し、３時間後にルミノールおよびＱＤ  ８００の混合物で処置した動物（「ＬＰＳ＋Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す。図３Ｃは、図３Ａに示される画像化結果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４（パネルＡおよびパネルＢ）は、５０μｌのＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を気管内注射したマウスの肺におけるＮＡＣ画像化を示す。図４Ａの画像の上の数字は、動物の番号を言及し、マウス＃１は、陰性コントロールとして働く。ＬＰＳ送達の３時間後に、マウスに、ルミノールおよびＱＤ８００（ＰＢＳ中に溶解）の混合物を静脈内注射して、それぞれ、２００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｐｍｏｌ／マウスの投与量を達成した。化学発光がレッドシフトしたことを示すために、画像化を、ＮＩＲフィルタ（７８０ｎｍ、８００ｎｍ、８２０ｎｍ）を用いて行った。図４Ａは、上記動物を上記示されたフィルタを用いて撮影した画像を示し、レッドシフトしたＮＩＲ光が（８００ｎｍをピークとして）肺から発光されたことを示す。５００ｎｍフィルタを使用すると、ルミノールに由来するシフトしなかった光もまた、より低いレベルにおいて検出され得る。図４Ｂは、示された時点において、示されたフィルタを用いての、示された動物からの平均ＮＡＣシグナルを示すグラフである。各条件（時間およびナノメートル）において４つのバーがある。上記パネルのうちの各々の最も左のバーは、コントロールを示し（「１−コントロール」）、全ての条件において本質的にゼロである。左から２番目のバー（斜交平行線を付した）は、各条件において動物５（「５−Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す；右から２番目のバー（塗りつぶし）は、動物９（「９−Ｌｕｍ−Ｒ」）を示し、最も右のバー（水平線ハッチング）は、動物１０（「１０−Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す。
【図４Ｂ】図４（パネルＡおよびパネルＢ）は、５０μｌのＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を気管内注射したマウスの肺におけるＮＡＣ画像化を示す。図４Ａの画像の上の数字は、動物の番号を言及し、マウス＃１は、陰性コントロールとして働く。ＬＰＳ送達の３時間後に、マウスに、ルミノールおよびＱＤ８００（ＰＢＳ中に溶解）の混合物を静脈内注射して、それぞれ、２００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｐｍｏｌ／マウスの投与量を達成した。化学発光がレッドシフトしたことを示すために、画像化を、ＮＩＲフィルタ（７８０ｎｍ、８００ｎｍ、８２０ｎｍ）を用いて行った。図４Ａは、上記動物を上記示されたフィルタを用いて撮影した画像を示し、レッドシフトしたＮＩＲ光が（８００ｎｍをピークとして）肺から発光されたことを示す。５００ｎｍフィルタを使用すると、ルミノールに由来するシフトしなかった光もまた、より低いレベルにおいて検出され得る。図４Ｂは、示された時点において、示されたフィルタを用いての、示された動物からの平均ＮＡＣシグナルを示すグラフである。各条件（時間およびナノメートル）において４つのバーがある。上記パネルのうちの各々の最も左のバーは、コントロールを示し（「１−コントロール」）、全ての条件において本質的にゼロである。左から２番目のバー（斜交平行線を付した）は、各条件において動物５（「５−Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す；右から２番目のバー（塗りつぶし）は、動物９（「９−Ｌｕｍ−Ｒ」）を示し、最も右のバー（水平線ハッチング）は、動物１０（「１０−Ｌｕｍ−Ｒ」）を示す。
【図５Ａ】図５（パネルＡおよびＢ）は、肺炎症を画像化するためのＮＡＣの種々の例示的製剤を示す。３種の異なるナノ粒子を、ルミノールとともに別個に製剤化した。作業溶液は、指定されたルミノール−Ｒ（ルミノール−Ｑｄｏｔ８００）、ルミノール−Ｒ７００（ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）  ７００ＮＣ，  ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、およびルミノール６４０（Ｏｐｔｉｍｅｏｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のナノ粒子）である。マウスに、５０μｌのＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を気管内注射した。ＬＰＳ送達の３時間後に、マウスに、ルミノール−Ｒ、ルミノール−Ｒ７００、ルミノール−６４０をそれぞれ静脈内注射し、５分間にわたって画像化した（図５Ａ，Ｔ＝３時間）。図５Ｂは、示された時点での示された動物群からの平均ＮＡＣシグナルを示すグラフである。
【図５Ｂ】図５（パネルＡおよびＢ）は、肺炎症を画像化するためのＮＡＣの種々の例示的製剤を示す。３種の異なるナノ粒子を、ルミノールとともに別個に製剤化した。作業溶液は、指定されたルミノール−Ｒ（ルミノール−Ｑｄｏｔ８００）、ルミノール−Ｒ７００（ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）  ７００ＮＣ，  ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、およびルミノール６４０（Ｏｐｔｉｍｅｏｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のナノ粒子）である。マウスに、５０μｌのＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を気管内注射した。ＬＰＳ送達の３時間後に、マウスに、ルミノール−Ｒ、ルミノール−Ｒ７００、ルミノール−６４０をそれぞれ静脈内注射し、５分間にわたって画像化した（図５Ａ，Ｔ＝３時間）。図５Ｂは、示された時点での示された動物群からの平均ＮＡＣシグナルを示すグラフである。
【図６】図６（パネルＡ〜Ｃ）は、生きた動物における腫瘍転移の検出を示す画像である。Ｎｕ／Ｎｕマウスに、１００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ２細胞を心臓内注射した。３週間で、上記マウスを、ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後に、ＩＶＩＳスペクトルで画像化した。生体発光性腫瘍転移が、ルシフェリン注射後に、肺、膝関節および頭蓋領域において検出された（図６Ａ）。上記生物発光シグナルがバースラインレベルに戻っていた、ルシフェリン注射の２４時間後において、このマウスにルミノールを静脈内注射した。膝関節における腫瘍転移が、ルミノール注射後に検出された（図６Ｂ）。上記シグナルがバックグラウンドレベルに戻っていた、さらに２４時間後、ルミノールとＱＤ８００（ＰＢＳ中のルミノール−Ｒ）との混合物を静脈内注射し、そのマウスを、注射の５分後に画像化した。図６Ｃは、肺および膝関節におけるＮＡＣシグナルの感度の高い検出を示す。これらシグナルは、これら位置における腫瘍転移と相関しており、腫瘍が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本発明の実施は、別段示されなければ、当該分野の技術範囲内である、化学、生化学、および組換えＤＮＡ技術の従来法を使用する。このような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ａ．Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  １９９９，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９８，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ  ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，  １９９７，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００１７】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出および後掲に拘わらず、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００１８】
（１．定義）
本発明を記載するにあたって、以下の用語が使用され、以下に示されるように定義されることが意図される。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「前記、該、上記、この、その（ｔｈｅ）」は、その文脈がそうでないことを明らかに示すのでない限り、複数形への言及を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」への言及は、２種以上のこのような核酸の混合物を含む、などである。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ルミネッセンス」とは、エクセルギー的（ｅｘｅｒｇｉｃ）化学プロセスの励起生成物が、光の放出を伴ってその基底状態へと逆戻りする場合に生成される検出可能な電磁（ＥＭ）放射（一般に、ＵＶ、ＩＲもしくは可視光）をいう。「化学発光」は、化学反応から生じる発光である。「生物発光」は、基質および／もしくは酵素として、生物学的分子（もしくはその合成バージョンもしくはアナログ）を使用する化学反応から生じる化学発光である。従って、「生物発光」とは、生物学的分子（特に、タンパク質）による光の放出をいう。生物発光の必須の条件は、分子酸素（結合しているか、オキシゲナーゼの存在下で遊離しているかのいずれか）、ルシフェラーゼおよびＡＴＰ（これは、基質に対して作用する）、ルシフェリンである。生物発光は、基質（例えば、ルシフェリン）に対して作用し、上記基質を励起状態（これは、より低いエネルギーレベルに戻った際に、エネルギーを光の形態で放出する）へと変換するオキシゲナーゼである酵素もしくは他のタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）によって生成される。生物発光を生成するための基質および酵素としては、例えば、それぞれ、ルシフェリンおよびルシフェラーゼが挙げられる。上記ルシフェリンおよびルシフェラーゼは、任意の種に由来し得る。
【００２１】
「発光する（Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）」とは、化学反応を介して、もしくは放射線の吸収を介して光を生じることができることと定義される。
【００２２】
「動物」とは、本明細書で使用される場合、代表的には、非ヒト哺乳動物（家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭用の動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（齧歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモット）が挙げられる）；鳥類（家庭用の、野性の、および競技用の鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類、アヒル、ガチョウなど）が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない）をいう。上記用語は、特定の齢を示さない。従って、成体および新生仔の個体の両方が網羅されることが意図される。
【００２３】
「トランスジェニック動物」とは、遺伝的に操作された動物もしくは遺伝的に操作された動物の子孫をいう。トランスジェニック動物は、通常、少なくとも１種の関連しない生物に由来する（例えば、ウイルス、植物、もしくは他の動物に由来する）物質を含む。本発明の「非ヒト動物」は、脊椎動物（例えば、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、両生類、鳥類、魚類、昆虫類、爬虫類などを含む。用語「キメラ動物」とは、異種遺伝子が見いだされるか、または異種遺伝子が動物の全ての細胞ではないが一部の細胞において発現される動物をいうために使用される。
【００２４】
（２．一般）
上記組成物および方法を詳細に記載する前に、本開示は、特定の製剤にもプロセスパラメーターにも限定されず、よって、当然のことながら変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、限定することを意図していないこともまた、理解されるべきである。
【００２５】
本明細書に記載される方法および材料に類似のもしくは等価な多くの方法および材料が使用され得るものの、例示的な好ましい材料および方法が、本明細書において記載される。
【００２６】
本開示は、化学発光性酵素プローブを、ＮＩＲナノ粒子と組み合わせて含む組成物および方法に関連する。上記ＮＩＲナノ粒子は、インビボでの酵素活性の検出の増強のために、上記化学発光性プローブによって発せられた光をレッドシフトする。このナノ粒子吸収化学発光（「ＮＡＣ」といわれる）は、酵素活性（例えば、ＲＯＳ生成）についての読み取り値として役立ち得る。
【００２７】
記載される上記ＮＡＣ組成物および方法は、（例えば、ＢＲＥＴもしくはＦＵＥＬで必要とされるような）外因性酵素を使用することなく、インビボでの酵素活性の非常に高感度の検出を可能にし、それによって、宿主動物における外因性酵素に対する免疫応答の可能性を低下させるかもしくは排除する。同様に、ＮＡＣ組成物および方法は、外因性励起光を必要としないので、組織自己蛍光による霍乱（これは、検出能力の大きな妨害を構成する）を回避する。
【００２８】
従って、ＮＡＣ組成物は、化学発光性プローブ（例えば、ルミノール）とＮＩＲナノ粒子との混合物を使用して、内因性酵素反応からの生成物を成功裏に検出し得、広い範囲の疾患（種々の肺炎症状態（慢性閉塞性肺疾患、喘息）、アテローム性動脈硬化症、関節炎、腫瘍発生、敗血症および感染性疾患が挙げられる）の検出において有用である。化学発光性プローブにもナノ粒子にも毒性は全く検出されていない（Ｓｃｈｌｕｅｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：１６０６−１６１４；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｎｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １８：２００９−２０１４；  Ｒｏｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２５：５５−７１；  Ｍｏｇｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５３：２８３−３１８）ので、記載される上記組成物および方法はまた、動物研究（臨床応用が挙げられる）にとって有用である。
【００２９】
（試薬）
本明細書に記載される組成物は、化学発光性プローブ（例えば、ルミノール）およびＮＩＲナノ粒子の両方を含む。
【００３０】
酵素活性を検出する化学発光性プローブは、当該分野で周知であり、市販されている。化学発光性プローブの非限定的な例としては、ルミノール、ルシゲニン、トランス−１−（２’−メトキシビニル）ピレン、セレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）、テトラゾリウム塩（例えば、ニトロブルーテトラゾリウム塩）などが挙げられる。特定の実施形態において、上記化学発光性プローブは、ルミノールもしくはルミノールの誘導体である。
【００３１】
本明細書に記載されるＮＡＣ試薬はまた、ＮＩＲナノ粒子を含む。任意の適切なナノ粒子が、使用され得る。例えば、ＮＩＲ蛍光ナノ粒子（例えば、量子ドット）は、画像化追跡可能標的化プローブとして使用されてきた（Ｍｅｄｉｎｔｚ  ｅｔ．  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ４：４３５−４４６；  Ｐｉｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２６：６１１５−６１２３）；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：４１−４６，  ２００３；  Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ７：６２６−６３４；  Ｍｉｃｈａｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：５３８−５４４）。蛍光ナノ粒子標識プローブはまた、上記蛍光プローブの分布を可視化するためのインビボ画像化および上記蛍光プローブの標的化プロセスの助けを借りて、腫瘍標的化のために、ならびに薬物送達および創薬のために、使用されてきた（例えば、Ｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．  ９：２５７−８８を参照のこと）。最適な吸収および発光スペクトルが非常に近くにある有機性の発蛍光団とは異なり、蛍光ナノ粒子は、最適な放出光よりも短い光子の広い連続スペクトルによって励起されて、高い量子収量で、レッドシフトした光の発光を生じ得る。（例えば、  Ｂｒｕｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１３−２０１；  Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−２０１８を参照のこと）。実際に、蛍光ナノ結晶の青色増大吸収係数（ｂｌｕｅ−ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は、ＮＩＲ結晶が、より短い波長の青色光で効率的に励起されることを可能にする。従って、ルミノールが放出した青色光を蛍光ナノ粒子で捕捉し、これをＮＩＲ光にレッドシフトすることは、エネルギー移動の高い量子収量および上記ＮＩＲ光のよりよい組織浸透能力の両方に起因して、画像化検出の感度を増大させる。
【００３２】
適切なＮＡＣ試薬の非限定的な例としては、ルミノール−Ｑｄｏｔ８００、ルミノール−７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのｅＦｌｕｏｒ（登録商標）  ７００ＮＣを含む）およびルミノール−Ｒ６４０（Ｏｐｔｉｍｅｏｓからのナノ粒子を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。図５もまた、参照のこと。
【００３３】
上記ＮＩＲナノ粒子は、好ましくは、特定の組織へと標的化される。標的化部分の非限定的な例としては、ナノ粒子の表面に結合体化されたリガンドが挙げられる。これらリガンドとしては、抗体、操作された抗体フラグメント、タンパク質、ペプチド、低分子、およびアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない（Ａｌｅｘｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  ５：５０５−５１５）。
【００３４】
上記ＮＩＲナノ粒子および化学発光性プローブは、同時にもしくは逐次的に（任意の順序で）投与され得る。
【００３５】
（画像化）
本明細書で記載されるとおりにＮＡＣで処置される動物は、米国特許第５，６５０，１３５号および同第７，４４９，５６７号に記載されるように、ならびにＩＶＩＳTM  画像化システムの製造業者（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって提供される材料に記載されるように、便利に画像化される。
【００３６】
インビボ画像化は、裸眼もしくはカメラ用の任意のソート（スチール写真もしくはビデオ）を使用して行われ得る。特定の実施形態において、上記生物発光性シグナルを検出するために十分に感度が高くかつこれまた上記蛍光シグナルを検出するために十分に広いダイナミックレンジを有する、感度を高めたＣＣＤカメラ（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ）は、画像化に使用される。適切なカメラは、当該分野で公知であり、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＴＭソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して制御される統合型画像化システム（ＩＶＩＳTM  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
上記化学発光性プローブおよび／もしくはＮＩＲナノ粒子は、代表的には、生きた被験体における画像化のために、腹腔内腔もしくは静脈内に注射される。投与量が、条件（例えば、被験体のタイプなど）に基づいて決定され得ることは、当業者に明らかである。一般に、約１０〜３００ｍｇ／ｋｇ（もしくはその間の任意の値）のプローブおよび１０〜１００ｐｍｏｌ（もしくはその間の任意の値）のナノ粒子は、画像化のために投与される。
【００３８】
画像化は、直ちに行われ得る。あるいは、画像化は、一定期間（数秒間から数分間から数時間までの範囲に及ぶ）後に行われ得る。特定の実施形態において、上記被験体は、上記プローブおよび／もしくはＮＩＲナノ粒子の投与の５〜１０分もしくは１０〜３０分（またはその間の任意の値）後に、画像化される。他の実施形態において、上記被験体は、上記プローブおよび／もしくはＮＩＲナノ粒子の投与の３０〜６０分（もしくはその間の任意の値）以上後に、画像化される。複数の時点において複数の画像が撮られ得ることもまた、明らかである。
【００３９】
（キット）
本発明はまた、本明細書で記載される試薬を含み、本明細書で記載される方法を実施するためのキットを提供する。特に、これらキットは、代表的には、予め作製したＮＡＣ試薬もしくは個々の要素（例えば、ＮＩＲナノ粒子、化学発光性酵素プローブなど）を含む。上記キットは、必要に応じて、緩衝液および容器、ならびに本明細書に記載される方法を実施するための書面による説明書を含む。予めパッケージされた試薬の場合に、上記キットは、必要に応じて、測定なしで上記方法へと組み込まれる準備ができている、予め測定されたもしくは予め調薬された試薬（例えば、予め測定された流体アリコート、または上記キットのエンドユーザーによって容易に再構成され得る、予め秤量されたかもしくは予め測定された固体試薬）を含む。
【実施例】
【００４０】
（３．実験）
以下は、本開示を実施するための具体的実施形態の例である。上記例は、例示目的のみで提供され、本開示の範囲を限定することは決して意図していない。
【００４１】
（実施例１：肺組織における急性炎症応答の検出）
肺組織における急性炎症応答を、マウスへのＬＰＳの気管内送達によって誘導した。特に、ＬＰＳを、濃度１０ｍｇ／ｍｌになるように滅菌ＰＢＳ中に溶解した。ＬＰＳ（総体積５０μｌにおいて）を、２２ゲージ挿管でマウスに気管内送達した。ＬＰＳの最終用量は、１ｍｇ／ｋｇであった。ＬＰＳの送達後、ルミノールとナノ粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ８００）との混合物を、動物に静脈内送達した。画像化を、注射の５分後に行った。
【００４２】
図３に示されるように、フリーラジカル生成から得られたＮＡＣが、肺組織において検出された。ルミノールおよびナノ粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ８００）の混合物を投与した非処置コントロールマウスと比較した場合、肺組織からのＮＡＣシグナルの１６５倍増大が観察された。ルミノール単独を受けたＬＰＳ処置マウスは、コントロールマウスと比較して、肺シグナルの２倍増大を示したに過ぎなかった。本発明者らは、検出感度の増大が、ルミノールが放出した光の、ＮＩＲ範囲へのレッドシフトに起因した（ピークは、８００ｎｍにある）ことを確認した。
【００４３】
図４は、種々のＮＩＲフィルタを使用して得たＮＡＣ結果を示す。示されるように、レッドシフトしたＮＩＲ光が、ＬＰＳ／ルミノール／ナノ粒子投与後の肺から放出され、ピーク放出は、８００ｎｍにあった。５００ｎｍフィルタを使用すると、ルミノールからのシフトしない光もまた、低レベルながらも検出され得る。
【００４４】
図５は、異なるＮＡＣ製剤（ルミノール−Ｒ（ルミノール−Ｑｄｏｔ８００）、ルミノール−Ｒ７００（ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）  ７００ＮＣ，  ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、およびルミノール６４０（Ｏｐｔｉｍｅｏｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのナノ粒子）を含む）でのＮＡＣ結果を示す。
【００４５】
（実施例２：腫瘍の検出）
炎症は、腫瘍発生を含め、広い範囲の疾患プロセスに関与しているので、上記ＮＡＣ組成物および方法の有用性をまた、腫瘍検出について試験した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍の心臓内注射を介した全身転移モデルにおいて、肺および膝関節における転移性腫瘍発生をまた、ＮＡＣ組成物を使用して評価した。簡潔には、Ｎｕ／Ｎｕマウスに、１００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ２腫瘍細胞を心臓内注射した。３週間において、上記マウスを、ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の後に、ＩＶＩＳスペクトルで画像化した。生体発光性シグナルがベースラインレベルに戻っていた、ルシフェリン注射の２４時間後に、このマウスに、ルミノールを静脈内注射した。膝関節における腫瘍転移が検出された。上記シグナルがバックグラウンドレベルに戻っていた、さらに２４時間後に、ルミノールとＱＤ８００（ＰＢＳ中のルミノール−Ｒ）との混合物を静脈内注射し、上記腫瘍を、注射の５分後に画像化した。
【００４６】
図６に示されるように、生体発光性腫瘍転移を、ルシフェリンの最初の注射およびＩＶＩＳスペクトル画像化の後に、肺、膝関節および頭蓋領域において検出した（図６Ａ）。腫瘍転移がまた、ルミノール単独を使用して検出されていた（図６Ｂ）。図６Ｃに示されるように、高感度検出を、本明細書に記載されるとおりのＮＡＣ（ルミノール／ナノ粒子）組成物を使用して達成した。これらシグナルは、これら位置における腫瘍転移と相関し、腫瘍発生が引き起こす局所的な炎症応答および酸化的ストレスが、ルミノールと比較して遙かに増大した感度において、ＮＡＣで可視化され得ることを確認した。脾臓、腸における強いＮＡＣシグナルは、腫瘍転移に対するマウスの全身炎症応答を示し得る。従って、ＮＡＣ画像化は、生きている動物における酸化的ストレスを非弁別的に検出し得る。
【００４７】
従って、本明細書に記載される組成物および方法は、生きた動物における酵素活性を検出するために使用され得る。好ましい実施形態が、いくらか詳細に記載されてきたが、明らかなバリエーションは、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2014517913.tif 000011
【図５Ｂ】
2014517913.tif 000012
【図６】
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【国際調査報告】
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