(57)【要約】 本発明は、新規の二重特異性三鎖抗原結合ポリペプチドおよびそれらの作製および様々な疾患の治療および／または診断における使用に関しており、免疫エフェクター細胞を活性化する能力を有する二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）、および様々な疾患の診断および／または治療における、それらの使用にもまた、関連する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、および少なくとも一つの重鎖定常領域配列を含む、抗体重鎖および軽鎖の対、またはそれらの機能性断片、および
（ｂ）第二の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、ならびにＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ３領域を含む、重鎖抗体、
を含む、二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）。
【請求項２】
前記抗体重鎖および軽鎖の対が、第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域およびＣＨ１配列を含む、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項３】
前記抗体重鎖および軽鎖の対が、第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、ならびにＣＨ１およびＣＨ２配列を含む、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項４】
前記抗体重鎖および軽鎖の対が、第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３配列を含む、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項５】
前記抗体重鎖および軽鎖の対が、ヒンジ領域をさらに含む、請求項１、２、３または４に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項６】
前記抗体重鎖および軽鎖またはそれらの機能性断片が、互いに共有結合している、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項７】
前記抗体重鎖および軽鎖またはそれらの機能性断片が、ジスルフィド結合により結合している、請求項６に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項８】
前記重鎖抗体が、第二の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、およびＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ２領域を含む、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項９】
前記重鎖抗体が、ＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ３領域を含む、請求項８に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１０】
前記重鎖抗体が、ＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ４領域を含む、請求項９に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１１】
前記重鎖抗体が、ヒンジ領域を含む、請求項８、９または１０に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１２】
前記第一および第二の結合標的が、２つの異なる抗原である、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１３】
前記第一の抗原が、標的細胞により発現されている細胞表面抗原であり、前記第二の抗原が、エフェクター細胞により発現されている、請求項１２に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１４】
前記第一および第二の結合標的が、同一抗原の異なるエピトープである、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１５】
前記第一および第二の結合標的のうち少なくとも一つは、ＣＤ３複合体の一部分である、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１６】
前記第一および第二の結合標的のうち少なくとも一つは、ＣＤ３抗原である、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１７】
前記ＣＤ３抗原は、ＣＤ３エプシロンである、請求項１６に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１８】
ヒト化されている、またはヒトである、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡ。
【請求項１９】
請求項１の二重特異性ＴＣＡ、または請求項１２〜１８のいずれか一つを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１の二重特異性ＴＣＡを含有する容器、または請求項１９の医薬組成物および前記組成物を使用するためのユーザー向けの指示書、を含むキット。
【請求項２１】
前記抗体重鎖および軽鎖の対ならびに前記重鎖抗体を、単一宿主細胞中で発現することを含む、請求項１に記載の二重特異性ＴＣＡを作製するための方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記真核細胞が、哺乳類細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
癌の治療のための方法であって、前記癌と診断された対象に、請求項１の二重特異性ＴＣＡの有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記癌が、卵巣癌、乳癌、胃腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経系細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、メラノーマ、ミエローマ、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍および感染体に起因する新生組織形成からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１の二重特異性ＴＣＡの有効量を、必要としている対象に投与することを含む、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療のための方法。
【請求項２８】
請求項１の二重特異性ＴＣＡの有効量を、必要としている対象に投与することを含む、細菌、ウイルスまたは寄生虫に起因する感染性疾患の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の二重特異性三鎖抗原結合ポリペプチドおよびそれらの作製および様々な疾患の治療および／または診断における使用に関する。本発明は特に、免疫エフェクター細胞を活性化する能力を有する二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）、および様々な疾患の診断および／または治療における、それらの使用に関連する。具体的には、本発明は、ＣＤ３抗原複合体に対する結合親和性を有する二重特異性三鎖ポリペプチド、それらの作製、および癌免疫療法におけるそれらの使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
抗体による、免疫エフェクター細胞の活性化
身体の免疫システムは、感染、負傷および癌に対する防御としての役割を果たしている。二つの分離された、しかし相互に関連するシステム（液性免疫システムおよび細胞性免疫システム）が、共に機能し、身体を防御している。液性システムは、可溶性の因子（抗体と名付けられ、外来物であると身体に認識される産物を中和する）により媒介されている。対照的に、細胞性システムは、たとえばＴ細胞およびマクロファージ等の細胞（外来侵入物を除去および中和する）が関与している。
【０００３】
免疫応答の刺激にとって、Ｔ細胞の活性化は重要である。Ｔ細胞は免疫特異性を示し、細胞性免疫応答のほとんどを監督する。Ｔ細胞は抗体を分泌しないが、Ｂリンパ球による抗体分泌に必要とされる。Ｔ細胞活性化は、たとえばＴ細胞受容体複合体、およびＣＤ４またはＣＤ８分子等の、多くの細胞表面分子の関与を必要とする。抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）は、ジスルフィド結合ヘテロ二量体、アルファ鎖およびベータ鎖（α鎖およびβ鎖）またはガンマ鎖およびデルタ鎖（γ鎖およびδ鎖）を有する膜糖タンパク質から構成される。ＴｃＲは、ＣＤ３と規定される不変タンパク質の複合体と非共有結合される。
【０００４】
ＴｃＲは、抗原特異性を与え、ＣＤ３の構造は、Ｔ細胞に活性化シグナルを導入する。ＣＤ３複合体は、４つのサブユニットを含有している。ＣＤ３複合体は、２つのゼータサブユニット、一つのエプシロンサブユニット、およびガンマまたはデルタサブユニットのいずれかを含有し得る。抗原結合は、ＴＣＲ複合体の架橋結合および活性化をもたらす。Ｔ細胞受容体シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化およびＩＬ−２産生および複合体プロセスにおける他のサイトカインをもたらす。
【０００５】
ＴｃＲのリガンドは、たとえばウイルス感染細胞等の標的細胞の表面上にある、ＭＨＣ−ペプチド複合体である。標的細胞上のＭＨＣ−ペプチドが認識された後、Ｔ細胞は、標的細胞に対して細胞傷害またはアポトーシス効果を有することができる。特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）は、直接ウイルス感染細胞を除去することにより有利な効果を有することができる。この細胞性免疫応答の性能は、ウイルス感染と戦うこと、および腫瘍細胞を除去することにとって、特に好都合であり、重要である。
【０００６】
細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、ＴｃＲによるＭＨＣ−ペプチド複合体の認識無しに、ＣＤ３抗原との直接的な結合を介して、発生し得る。この代替的な活性化経路は、抗ＣＤ３抗体で得ることができる。非ヒトモノクローナル抗体は、マウス抗体ＯＫＴ３、ＳＰ３４、ＵＣＨＴ１または６４．１などに例示されるように、ＣＤ３鎖（サブユニット）の一部に対して開発されている。（たとえば、Ｊｕｎｅ, ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １３６：３９４５−３９５２（１９８６）、Ｙａｎｇ, ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １３７：１０９７−１１００ （１９８６）、およびＨａｙｗａｒｄ, ｅｔ ａｌ., Ｉｍｍｕｎｏｌ. ６４：８７−９２ （１９８８）を参照のこと）。
【０００７】
これら抗ＣＤ３抗体の多くはエプシロン鎖に結合し、高度に活性化されたＴ細胞の発生をもたらす。通常のモノクローナル抗体を用いる癌免疫療法では、Ｔリンパ球はＦｃガンマ受容体を有していないため、これらの細胞は活性化されない。その理由のため、二重特異性抗体（片腕はヒトＣＤ３を認識し、他の腕は腫瘍抗原を認識する）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび癌の動物モデルにおいて、高い細胞傷害性の可能性を有している。臨床試験において、ＢｉＴＥ抗体は、非ホジキンリンパ腫患者において、非常に低い用量で、有効であった（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１, ｐ９７４−９７７, ２００８）。最も低い有効量は、約０．０１５ｍｇ／ｍ２／日（一日毎の、体表面平方メートルあたりの、ミリグラム）であり、通常の抗体よりも、数桁低い。
【０００８】
ＣＤ３抗体は、例えば、米国特許第５，５８５，０９７号、第５，９２９，２１２号、第５，９６８，５０９号、第６，７０６，２６５号、第６，７５０，３２５号、第７，３８１，８０３号、第７，７２８，１１４号において開示されている。ＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体は、例えば、米国特許第７，２６２，２７６号、第７，６３５，４７２号および第７，８６２，８１３号において開示されている。
【０００９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、癌の検出および治療に対して、単一特異性抗体を超えるかなりの利点を示している。費用対効果の良い作製方法が無いこと、二重特異性ポリペプチドは安定性に欠けること、およびヒトにおいて半減期が長くないことによって、二重特異性抗体が商業的に広く利用されることが阻害されてきた。この数１０年間にわたって、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）を作製するために、多種多様な方法が開発されてきた。
【００１０】
第一世代のＢｓＭＡｂは、２つの重鎖および２つの軽鎖からなり、それぞれの１つが２つの異なる抗体からのものである。２つのＦａｂ領域は、２つの抗原に対して向けられている。Ｆｃ領域は２つの重鎖から作られ、免疫細胞上のＦｃ受容体と第３の結合部位を形成し、このことから、三機能性抗体とも呼ばれる（Ｈ. Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ １５５, ｐ ２１９−２２５, １９９５）。１つの細胞株における２つの異なる抗体の導入は、上清中に、重鎖および軽鎖の様々な組み合わせからなる、１０の異なるＩｇＧ分子の発現をもたらす。それゆえ、機能性のある二重特異性Ａｂの産生量は低く、精製はしばしば複雑となる。この欠点を克服するために、異なる種からの抗体が１つの細胞株において発現され、正確に対をなしたＡｂの発生が増加したことにより、ＢｓＭＡｂの産生が促進される。たとえば、種拘束的な重鎖および軽鎖の対の優先的な形成のために、ラットおよびマウス抗体を発現する細胞株は、機能性のある二重特異性抗体を分泌する。これらのラット／マウスＢｓＭＡｂの精製には、標準方法が用いられる。ラット／マウス混合ＢｓＭＡｂ（レモバブ、カツマキソマブ）は、ヒトへの使用を許可されている。これらの非ヒト（化）ＢｓＭＡｂ製品は、連続投与により、強力な免疫反応を引き起こし、その理由により、非慢性的な使用に対してのみ、使用が指示されている。カツマキソマブの活性機序は、一つのＦａｂがＥｐＣＡＭ（腫瘍抗原）に対して向けられ、他がＣＤ３（Ｔリンパ球抗原）に対して向けられるというものである。Ｆｃ領域はさらに、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞または樹状細胞等のような、Ｆｃ受容体を発現している細胞に結合する。つまり、腫瘍細胞は１つまたは２つの免疫系の細胞に結合され、次いで、破壊される。
【００１１】
二重特異性抗体の他のタイプは、ラット／マウス三機能性抗体の避けられない問題、例えば短い半減期、免疫原性およびサイトカイン放出による副作用等を克服するように設計されている。それらには化学的に結合されたＦａｂ（Ｆａｂ領域のみからなる）が含まれる。２つの化学的に結合されたＦａｂまたはＦａｂ２断片は、２つの異なる抗原に結合する人工抗体を形成し、それは二重特異性抗体の一種となっている。２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片（ＦａｂまたはＦａｂ２）は、チオエーテルのような化学的手段により産生および結合される（Ｇｌｅｎｎｉｅ, ＭＪ ｅｔ ａｌ., Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３９, ｐ２３６７-７５, １９８７）。典型的には、Ｆａｂの一つが腫瘍抗原（たとえばＣＤ３０）に結合し、他が免疫細胞表面上のタンパク質（たとえばマクロファージ上のＦｃ受容体、またはＴ細胞上のＣＤ３）に結合する。このようにして、腫瘍細胞は免疫細胞に結合し、破壊される。化学的に結合されたＦａｂを用いた臨床試験が癌治療に対して実施され、有望な結果が得られた（Ｐｅｔｅｒ Ｂｏｒｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ., Ｂｌｏｏｄ, Ｖｏｌ. １００, Ｎｏ. ９, ｐ３１０１−３１０７, ２００２）。この方法は生産コストが高いため、さらなる開発対象からは外されてしまった。
【００１２】
様々な多価人工抗体生産の他の方法が、２つの抗体の可変ドメインを組換え融合することにより開発されている。単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドにより結合された、イムノグロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性を目的にグリシンに富み、また、可溶性を目的にセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはＶＬのＮ末端をＶＨのＣ末端とのいずれかを結合することができる。二重特異性単鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）は、異なる特異性を有する２つのｓｃＦｖを結合することにより、改変することができる。２つのＶＨおよび２つのＶＬ領域を有する単鎖ペプチドが生産され、二価ｓｃＦｖを得る。これらの最も進んだ開発品として、二重特異性Ｔ細胞誘引物（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒｓ）（ＢｉＴＥ）として知られる、二重特異性タンデムｓｃＦｖがある。最初のＢｉＴＥ抗体は、一つのｓｃＦｖを介して、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞へ結合し、他のｓｃＦｖを介して、腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞へと結合する。たとえば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（ＭＴ１０３）は、非ホジキンリンパ腫および急性リンパ芽球性白血病の治療に対し開発中であり、ＣＤ１９（Ｂ細胞上に発現している表面分子）およびＣＤ３（Ｔ細胞上に発現している表面分子）を対象としている。同様にＭＴ１１０は、胃腸および肺癌の治療に対し開発中であり、腫瘍細胞上のＥｐＣＡＭ抗原およびＣＤ３を対象としている。同様の手法を使用して、メラノーマ（ＭＣＳＰ特異的ＢｉＴＥ）および急性骨髄性白血病（ＣＤ３３特異的ＢｉＴＥ）が標的とされている。他の可能性には、２つの可変領域にとって共に折り重なるには短すぎ（約５アミノ酸）、ｓｃＦｖの二量体化を強制するリンカーペプチドを有する二重特異性ｓｃＦｖの創出がある。このタイプは二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）として知られる（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ., Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ７７, ｐ１４０５-１２, １９９８）。さらに、これらのフォーマットは、２つの異なる抗原に対する特異性を有する様々な断片から構成され、この場合、これらは二重特異性の二特異性抗体のタイプである。これらすべての技術は、複数回投与後の免疫原性および短い半減期をもたらしうる非ヒト配列を有するタンパク質をもたらす。二重特異性の二特異性抗体およびＢｉＴＥＳは、それら自体では数時間から数日の短い有効期間を有する。対照的に、天然の抗体は、数週間の半減期を有する。
【００１３】
他の人工抗体プラットフォームは、Ｄｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）プラットフォーム技術（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ, Ｍａｒｙｌａｎｄ）である。この融合タンパク質技術は、約５５キロダルトンの単鎖ペプチド上にある異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を用いる。
【００１４】
ＳＣＯＲＰＩＯＮ療法（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ, Ｉｎｃ., Ｓｅａｔｔｌｅ, ＷＡ）は、単鎖タンパク質中の２つの抗原結合ドメインを組み合わせるプラットフォーム技術である。一つの結合ドメインは、イムノグロブリンＦｃ領域上のエフェクタードメイン塩基のＣ末端上にあり、二番目の結合ドメインはＮ末端上にある。
【００１５】
四価および二重特異性抗体様タンパク質は、２つのモノクローナル抗体から設計されるＤＶＤ−Ｉｇである（Ｗｕ, Ｃ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ２５, ｐ１２９０−１２９７, ２００７）。ＤＶＤ−Ｉｇ分子を構築するために、２つのｍＡｂのＶドメインが、短いリンカー（ＴＶＡＡＰ）により縦一列で、第一の抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）とＮ末端で融合され、次いで、他の抗体のＶＬおよびＣｋによりＤＶＤ−Ｉｇタンパク質軽鎖が形成される。同様に、２つのｍＡｂの重鎖の可変領域（ＶＨ）が、短いリンカー（ＡＳＴＫＧＰ）により縦一列で、第一の抗体とＮ末端で融合され、次いで、他の抗体および重鎖定常ドメインによりＤＶＤ−Ｉｇタンパク質重鎖が形成される（ＶＨ１／ＶＬ１）。すべての軽鎖および重鎖定常領域は、ジスルフィド結合された完全ＩｇＧ様分子の形成に重要であるため、ＤＶＤ−Ｉｇ構造中に保存される。哺乳類細胞とＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖および重鎖をコードする発現ベクターのコトランスフェクションは、約２００ｋＤａの分子量を有する単一種のＩｇＧ様分子の分泌をもたらす。この分子は現時点で、４つの結合部位（各ｍＡｂから２つ）を有する。
【発明の概要】
【００１６】
一つの態様において、本発明は、
（ａ）第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、および少なくとも一つの重鎖定常領域配列を含む、抗体重鎖および軽鎖の対、またはそれらの機能性断片、および
（ｂ）第二の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、ならびにＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４領域を含む、重鎖抗体、
を含む二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）に関する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、薬学的に受容可能な成分との混合物において、そのような二重特異性ＴＣＡを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
さらに他の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の二重特異性ＴＣＡを含有する容器、および当該二重特異性ＴＣＡまたは当該医薬組成物を使用するためのユーザー向けの指示書を含む、キットに関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、抗体重鎖および軽鎖の対ならびに重鎖抗体を、単一宿主細胞中で発現することを含む、本発明の二重特異性ＴＣＡを作製するための方法に関する。
【００２０】
様々な実施形態において、宿主細胞は原核細胞または哺乳類細胞等の真核細胞であり得る。
【００２１】
よりさらなる態様において、本発明は、癌の治療のための方法であって、上記癌と診断された対象に対し、本発明の二重特異性ＴＣＡの有効量を投与することを含む、方法に関する。
【００２２】
様々な実施形態において、癌は、卵巣癌、乳癌、胃腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経系細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、メラノーマ、ミエローマ、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍および感染体に起因する新生組織形成からなる群から選択される。
【００２３】
他の態様において、本発明は、本発明の二重特異性ＴＣＡの有効量を、必要としている対象に投与することを含む、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療のための方法に関する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の二重特異性ＴＣＡの有効量を、必要としている対象に投与することを含む、細菌、ウイルスまたは寄生虫に起因する感染性疾患の治療のための方法に関する。
【００２５】
すべての態様において、二重特異性ＴＣＡが、様々な実施形態において存在しうる。
【００２６】
ゆえに、一つの実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の抗体重鎖および軽鎖の対は、第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、ならびにＣＨ１配列を含む。
【００２７】
他の実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の抗体重鎖および軽鎖の対は、第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、ならびにＣＨ１およびＣＨ２配列を含む。
【００２８】
さらに他の実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の抗体重鎖および軽鎖の対は、第一の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３配列を含む。
【００２９】
他の実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の抗体重鎖および軽鎖の対は、ヒンジ領域をさらに含む。
【００３０】
さらなる実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の抗体重鎖および軽鎖、またはそれらの機能性断片は、互いに共有結合している。
【００３１】
より特定の実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の抗体重鎖および軽鎖、またはそれらの機能性断片は、ジスルフィド結合により結合している。
【００３２】
異なる実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の重鎖抗体は、第二の結合標的に特異的に結合する抗原結合領域、およびＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ２領域を、含む。
【００３３】
他の実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の重鎖抗体は、ＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ３領域をさらに含む。
【００３４】
さらに他の実施形態において、二重特異性ＴＣＡ中の重鎖抗体は、ＣＨ１領域を欠く場合において、ＣＨ４領域をさらに含む。
【００３５】
さらなる実施形態において、重鎖抗体は、ヒンジ領域をさらに含む。
【００３６】
さらなる複数の実施形態において、第一および第二の結合標的は、２つの異なる抗原、または同一抗原上の異なるエピトープでありうる。
【００３７】
よりさらなる実施形態において、本明細書の二重特異性ＴＣＡは、標的細胞により発現されている細胞表面抗原およびエフェクター細胞により発現されている抗原に結合し得る。
【００３８】
特定の実施形態において、第一および第二の結合標的の少なくとも一つは、ＣＤ３複合体の一部分、たとえばＣＤ３エプシロンである。
【００３９】
すべての実施形態において、本明細書の二重特異性ＴＣＡは、ヒト化され得るまたはヒトであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒト重鎖ポリペプチド、ヒトＩｇＧ抗体およびヒト二重特異性３鎖ポリペプチドの概略図。宿主細胞株における重鎖ポリペプチドおよびヒト抗体の共発現により、上清中にすべての３つの分子を得る。個々のポリペプチドの精製は、親和性（プロテインＡ）、サイズ排除クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーのような標準的タンパク質精製技術を用いて達成される。
【００４１】
発明の詳細な説明
定義
他で定義されない限り、本明細書において使用される技術、表記および他の科学的な専門用語のすべての用語は、本発明が関係する分野における当業者により普遍的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、普遍的に理解される意味を有する用語は、本明細書において、明確化および／または即時参考のために定義され、本明細書においてそのような定義の包含は、必ずしも、当分野において広く理解されるものに関して実体的な相違を表すとみなされるべきではない。本明細書において記述または参照される技術および手順は、一般に良く理解され、当分野の当業者により、慣習的な技法を用いて一般的に採用される。そのような技法には、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第二版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに記載されている、広く用いられている分子クローニング技法がある。また、たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ９３，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.がある。必要に応じて、市販されているキットおよび試薬の使用を含む手順が、特に断りの無い限り、メーカーの定義したプロトコールおよび／またはパラメータに従って、通常、行われる。
【００４２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形の「一つ」、「および」、および「その」は、他に文脈で明確に指定されない限り、複数の指示対象を含むことを留意しなければならない。
【００４３】
本明細書および特許請求の範囲を通じ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる」といった変形は、規定された整数または整数の群を含むことを意味するが、他の任意の整数または整数の群の排除は意味しないことを理解されたい。
【００４４】
本明細書において商標名が使用された場合、出願人は、商標名の製剤、ジェネリック薬および商標名製品の活性薬剤成分（単数または複数）を個々に含むことを意図する。
【００４５】
本明細書で言及されるすべての公表文献および他の参考文献は、参照により本明細書に援用され、当該公表文献が引用される箇所に関連し、本方法および／または材料が開示および記載される。本明細書に引用される公表文献は、本出願の出願日より前に開示されたものに対して引用される。本明細書において、発明の日の前、または優先日より早いという理由は、その公表文献に先行する権利を発明者は有しないという承認として、みなされはしない。さらに、実際の公表の日付は、示されているものとは異なりうるし、独立した立証が要求される可能性がある。
【００４６】
他で述べられない限り、本明細書で使用される以下の用語およびフレーズは、以下の意味を有することが意図される。
【００４７】
「抗原」という用語は、実体またはその断片を指し、抗体に結合、または細胞免疫反応を惹起することができる。免疫原は、抗原を指し、生命体、具体的には動物、より具体的にはヒトを含む哺乳類における免疫反応を引き起こすことができる。抗原という用語は、抗原決定基またはエピトープとして知られる領域を含む。
【００４８】
本明細書において使用される「免疫原性の」という用語は、免疫原の抗原に対して向けられる抗体の産生ならびに／またはＴ細胞および／もしくは他の反応性免疫細胞の活性化を引き起こす物質を指す。
【００４９】
免疫反応は、投与された免疫原性組成物に反応して個体が十分な抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞を産生する場合に、発生する。
【００５０】
本明細書において使用される免疫原性という用語は、レシピエントに投与された際の免疫反応（液性または細胞性の）を引き起こす抗原の能力の指標を指す。本発明は、対象となるヒトキメラ抗体またはヒト化抗体の免疫原性を減少させる方法に関連する。
【００５１】
本明細書において、「二重特異性」という用語は、２つの異なる抗原を認識する結合ポリペプチドを指すために用いられる。一つの実施形態において、「二重特異性」ポリペプチドは、三鎖であり、第一の抗原またはハプテンに対し特異的な第一の抗原結合部位を少なくとも一つ、および第二の抗原またはハプテンに対し特異的な第二の抗原結合部位を少なくとも一つ有することで、２つの異なる抗原を認識する抗原結合抗体様分子である。上記ポリペプチドは、組換えＤＮＡ法および／または化学合成により産生することができる。各抗原に対し２つ以上の認識部位を有する二重特異性ポリペプチドは、具体的に、この定義の中に含まれる。
【００５２】
本明細書において、「二重特異性三鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」という用語は、抗体様分子を指すために用いられ、抗体様分子は、抗原結合領域および少なくとも一つのＣＨドメインを含む、３つのポリペプチドサブユニット（うち２つはモノクローナル抗体の一つの重鎖および一つの軽鎖、またはそのような抗体鎖の機能性抗原結合断片を含む、または基本的に構成される、または、からなる）からなる、または基本的に構成される、または含む。この重鎖／軽鎖の対は、第一の抗原に対する結合特異性を有する。三番目のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインを欠く場合において、ＣＨ２および／またはＣＨ３および／またはＣＨ４ドメイン、および第二の抗原のエピトープまたは第一の抗原の異なるエピトープと結合する抗原結合ドメイン（そのような結合ドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変領域から誘導される、または配列同一性を有する）を含むＦｃ部分を含む重鎖のみの抗体を含む、または基本的に構成される、または、からなる。そのような可変領域の一部分は、ＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子セグメント、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによりコードされうる。可変領域は、再構成されたＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬまたはＶＬＪＬ遺伝子セグメントよりコードされうる。
【００５３】
抗体（イムノグロブリンとも呼ばれる）は、通常、２つの等しい重鎖および２つの等しい軽鎖を含む。重鎖および軽鎖のそれぞれは、可変であるアミノ末端ドメイン、および定常であるカルボキシ末端を含む。一つの重鎖（ＶＨ）由来の可変領域、および一つの軽鎖（ＶＬ）由来の可変領域は、ともに抗体の抗原結合部位を形成する。ゆえに、天然の抗体は通常、２つの抗原結合部位を有する。典型的には、２つの重鎖は定常領域（ＣＨ）でジスルフィド結合により互いに共有結合し、各重鎖は軽鎖（ＣＬ）の一つの定常領域に共有結合する。本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、マルチマー、多特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）および所望の生物活性を示す抗体断片に及ぶ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｊｏｕｒ. ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラまたは他種から誘導されたものであり得る。抗体は、具体的な抗原を認識および結合する能力のある免疫システムにより産生されるタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ, Ｃ., Ｔｒａｖｅｒｓ, Ｐ., Ｗａｌｐｏｒｔ, Ｍ., Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ （２００１）Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は通常、複数の抗体上のＣＤＲにより認識され、エピトープとも呼ばれる多くの結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する抗体は各々、異なる構造を有する。ゆえに、一つの抗原は、１つ以上の対応する抗体を有し得る。抗体は、全長イムノグロブリン分子または全長イムノグロブリン分子の免疫的に活性な部位（すなわち、対象標的またはその一部分の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子であり、そのような標的には、限定されないが、癌細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が含まれる）を含む。本明細書において開示されるイムノグロブリンは、任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはイムノグロブリン分子のサブクラスでありうる。イムノグロブリンは、任意の種から誘導することができる。しかし、一つの態様においては、イムノグロブリンはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギまたは鶏由来のものである。「可変の」という用語は、可変ドメインのある部位は、抗体間で配列が著しく異なり、特定の抗原に対する特定の抗体のそれぞれの結合および特異性に用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に等しくは分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメイン中の両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。より高度に保存されている可変ドメインの部位は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲを含有し、ベータシートの構造を主に有し、３つの超可変領域により結合され、ループ結合、ある場合においては、ベータシート構造の一部分を形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲのそばに近接して共に保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版. Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ, Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ, Ｂｅｔｈｅｓｄａ, Ｍｄ.を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接には関与しないが、たとえば抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与等の、様々なエフェクター機能を示す。
【００５４】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同一の抗体群（すなわち、群を構成する個々の抗体が、少量存在しうる可能性のある自然発生の変異を除き、同一である）から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる
異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体のそれぞれは、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混じることなく合成されうる点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同一の抗体群から得られた抗体の特徴を指し、いずれかの特定の方法による抗体産生が必要とされるとはみなされない。たとえば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（最初に、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５により記載）、または組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）により作製されてもよい。モノクローナル抗体は、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ, ３５２：６２４−６２８、 Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【００５５】
本明細書において、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体を明確に含み、キメラ抗体の重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種から誘導された、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と一致または同一である一方で、鎖の残りの部分は、他の種から誘導された、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と一致または同一であり、そのような抗体の断片もまた、所望の生物活性を示す限りは、同様である（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。本明細書において、対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（たとえば、旧世界ザル、類人猿等）から誘導された可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含有する、「霊長類化」抗体を含む。
【００５６】
本明細書において、「損なわれていない抗体」とは、分泌型ＩｇＧのＶＬおよびＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含有するものである。他のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＭまたはＩｇＡ）は、異なるＣＨドメインを有し得る。定常ドメインは、天然の配列定常ドメイン（たとえば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。損なわれていない抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、エフェクター機能とは、抗体のＦｃ定常領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害活性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、および細胞表面受容体のダウンレギュレーションが挙げられる。
【００５７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、損なわれていない抗体は、異なる「クラス」を割り当てられうる。損なわれていないイムノグロブリン抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）に分類され得る。抗体の異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニットの構造および３次元構成は、良く知られている。Ｉｇの構造は、ヒンジ修飾またはヒンジの無い構造を含む（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３−４０９０、  Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６７：７２４６−７２５６、米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号、米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号）。任意の脊椎動物由来の抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２つの明確に異なる型（κおよびλと呼ばれる）のうちの１つを割り当てられうる。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原が結合する原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は通常、「相補的決定領域」もしくは「ＣＤＲ」（たとえば、軽鎖可変ドメイン中の２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）残基、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）残基、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照））由来のアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（たとえば、軽鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）残基、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）残基、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ （１９８７）Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., １９６：９０１−９１７）由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５９】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片を産生し、各断片は、単一の抗原結合部位および、すぐに結晶化するというその能力を反映した名称である「Ｆｃ」断片残基を有している。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ´）２断片を産生し、その断片は２つの抗原結合部位を有し、架橋結合抗原の能力をいまだ有している。
【００６０】
「Ｆｖ」は、最小抗体断片であり、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有している。この領域は、非共有結合性にぴったりと会合した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。その二量体は、各可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を特徴づけるために相互作用するという構造になっている。トータルで、６つの超可変領域により抗体の抗原結合特異性がもたらされる。しかしながら、結合部位全体よりは親和性が低いが、単一の可変ドメイン（または抗原特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識、結合する能力を有している。
【００６１】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有している。Ｆａｂ´断片は、Ｆａｂ断片と異なり、重鎖ＣＨ１ドメイン（抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む）のカルボキシ末端で数残基の付加がある。Ｆａｂ´‐ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が少なくとも一つの遊離チオール基を有するＦａｂ´という意味である。Ｆ（ａｂ´）２抗体断片は、元々、Ｆａｂ´断片の対として産生されたものであり、それらの間にはヒンジシステインがある。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【００６２】
単鎖抗体を含む非ヒト（たとえばげっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、最小限の非ヒトイムノグロブリン由来の配列を含む、キメラ抗体（単鎖抗体を含む）である。ヒト化は、マウスの抗原結合情報を、非免疫原性のヒト抗体のアクセプターへと移す方法であり、治療に役立つ多くの薬剤をもたらしている。ヒト化の方法は、通常、マウス相補的決定領域（ＣＤＲ）の６つすべてをヒト抗体フレームワーク上へと移すことから開始される（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５）。ＣＤＲが移植されたこれら抗体は、通常、元々の抗原結合親和性を維持しておらず、実際のところ、親和性は大抵の場合において大幅に損なわれてしまっている。ＣＤＲに加えて、選択した非ヒト抗体フレームワーク残基もまた、特有のＣＤＲ構造を維持するよう組み込まれなければならない（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７）。移植されたＣＤＲの構造配置を支持するための、主要なマウスフレームワーク残基をヒトアクセプターに移転することで、抗原結合および親和性が復元することが示されている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７−４９９、Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４：４８７−４９９、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，２６２３−２６３２、Ｗｅｒｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５７：４９８６−４９９５、およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９−３８９）。ほとんどの部分で、ヒト化抗体はヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基を、所望の特異性、親和性および能力を有する、たとえばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基と置換している。いくつかの例においては、ヒトイムノグロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基と置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中にはない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改善させる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、超可変ループのすべて、または実質的にすべては、非ヒトイムノグロブリンのそれらに相当し、ＦＲのすべて、または実質的にすべては、ヒトイムノグロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体はまた、任意で、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）を少なくとも一部分で含み、典型的には、Ｆｃはヒトイムノグロブリンのものである。さらなる詳細は、米国特許第５，２２５，５３９号、第６，５４８，６４０号、第６，９８２，３２１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第６，４０７，２１３号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９を参照のこと。
【００６３】
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。「エフェクター機能」の例示として、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食、細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション等が挙げられる。そのようなエフェクター機能は通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（たとえば、抗体−可変ドメイン）と結合することが必要であり、たとえば本明細書の定義中に開示される様々な分析法を用いて評価することができる。
【００６４】
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然にあるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含有する。天然配列ヒトＦｃ領域として、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、および天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域ならびにそれらの自然発生変異体が挙げられる。
【００６５】
「Ｆｃ領域変異体」は、少なくとも一つのアミノ酸変異、好ましくは１つ以上のアミノ酸置換により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含有する。好ましくは、Ｆｃ領域変異体は、天然配列Ｆｃ領域または元のポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、たとえば、天然配列Ｆｃ領域中または元のポリペプチドのＦｃ領域中に、約１〜約１０アミノ酸置換、好ましくは、約１〜約５アミノ酸置換を有する。本明細書においてＦｃ領域変異体は、天然配列Ｆｃ領域および／または元のポリペプチドのＦｃ領域と、好ましくは少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは約９５％の相同性を有する。
【００６６】
２配列間の「相同性」は、配列同一性により決定される。もし、互いに比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一である、より短い配列の核酸残基の割合に関連する。配列同一性は、たとえばＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ向けバージョン８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等のコンピュータープログラムを使用して、従来方式でに決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１），４８２−４８９の部分相同性アルゴリズムを使用し、２配列間で最も高い配列同一性を有するセグメントを見つけることができる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が、本発明の参照配列と例えば９５％の同一性を有しているかどうかを決定する場合、パラメータは、好ましくは、同一性の割合が、参照配列の全長にわたり算出され、参照配列中のヌクレオチド総数の５％までの相同性ギャップが許可されるように調製される。Ｂｅｓｔｆｉｔを使用した場合、いわゆる任意のパラメータは、好ましくは、事前にセットされた値（「デフォルト」）のままである。所与の配列および上述の本発明の配列間の比較において現れる偏差は、たとえば、付加、欠失、置換、挿入または組換えによるものであり得る。そのような配列比較はまた、好ましくは、「ｆａｓｔａ２０ｕ６６」プログラム（バージョン２．０ｕ６６、１９９８年９月、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎおよびｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａによる、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３，６３−９８，と添付の実施例およびｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／もまた参照のこと）を用いて実行することができる。この目的のために、「デフォルト」パラメータ設定を用いてもよい。
【００６７】
「Ｆｃ領域含有抗体」という用語は、Ｆｃ領域を含有する抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによると、４４７残基）は、たとえば抗体の精製の間に、または抗体をコードする核酸の組換え作業により、除去される可能性がある。従って、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を伴う、または伴わない抗体を含有しうる。
【００６８】
本明細書に使用される「単鎖抗体」とは、抗原エピトープの結合する抗原結合ドメインを１つ以上含有する単鎖ポリペプチドを意味し、そのようなドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変領域と同一な配列由来である、または抗体重鎖または軽鎖の可変領域と同一な配列を有する。そのような可変領域の一部分は、ＶＨもしくはＶＬ遺伝子セグメント、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによりコードされ得る。可変領域は、再構成されたＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬまたはＶＬＪＬ遺伝子セグメントによりコードされ得る。Ｖ−、Ｄ−、およびＪ−遺伝子セグメントは、ヒトおよび様々な動物（鳥、魚、鮫、哺乳類、げっ歯類、非ヒト霊長類、ラクダ、ラマ、ウサギ等を含む）由来であり得る。
【００６９】
本明細書において使用される「重鎖のみ抗体」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」という用語は、重鎖ＣＨ２および／またはＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインを含むがＣＨ１ドメインは含まない単鎖抗体を意味する。一つの実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部およびＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部およびＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインが切断されている重鎖抗体もまた、本明細書に含まれる。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメイン、および少なくとも一つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）ドメインから構成されるが、ヒンジ領域はない。重鎖のみ抗体は、二量体の形態であることができ、２つの重鎖が、他方とジスルフィド結合、さもなければ共有結合または非共有結合で互いに結合している。重鎖抗体は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、他のサブクラスに属する抗体（たとえばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥサブクラス）もまた本明細書に含まれる。特定の実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプであり、特にＩｇＧ１サブタイプである。
【００７０】
重鎖抗体は、ラクダ科の動物（たとえばラクダおよびラマ）により産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３６３，４４６−４４８（１９９３））。これらの抗体は、２つの重鎖により構成されるが、軽鎖を欠いている。その結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインと呼ばれ、長さが約１２０アミノ酸のみである、天然で発生するもっとも小さく、損なわれていない抗原結合部位である（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２８５−２６２９０（２００１））。免疫化を通じて、高い特異性および親和性を有する重鎖抗体を、様々な抗原に対して作製することができ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７−４６（１９９９））、ＶＨＨ部分は、容易にクローン化され、酵母中に発現される（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１−２１（２０００））。それらの発現レベル、可溶性および安定性は、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖ断片よりも有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１４，  ５２１−５２６  （１９９７））。鮫もまた、ＶＮＡＲと呼ばれるその抗体中に、単一のＶＨ様ドメインを有することが示されている（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３−３５５４  （２００３）、Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５５，１８７−１９７（２００４）、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２５−３３（２００３））。
【００７１】
本明細書において、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、「特異的に結合する」または「特異的」である、重鎖のみ抗体および二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む抗体および結合分子は、他のいずれのポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、当該特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。
【００７２】
本明細書において、対象の抗原に「結合する」重鎖のみ抗体および二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む、抗体または結合分子は、十分な親和性で抗原に結合するものであり、当該抗体または結合分子は、抗原を標的とする診断剤および／または治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないものである。そのような実施形態において、抗体または他の結合分子の非標的抗原への結合の程度は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定されるように、１０％未満である。
【００７３】
「補体依存性細胞傷害活性」および「ＣＤＣ」は、補体の存在中での、標的の溶解を指す。補体活性化の機序は、補体システムの第一成分（Ｃ１ｑ）の、同種抗原と複合した分子（たとえば、抗体）への結合により開始される。
【００７４】
「結合親和性」は、通常、分子（たとえば、抗体または他の結合分子）の単一の結合部位と、その結合パートナー（たとえば、抗原または受容体）の間の非共有結合性の相互作用の強さの総計を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、当分野で普遍的な方法で計測することができ、本明細書に記載されるものを含む。低い親和性の抗体は、抗原（または受容体）に弱く結合し、容易に解離する傾向がある一方で、高い親和性の抗体は、抗原（または受容体）に、よりしっかりと結合し、結合した状態をより長く維持する。
【００７５】
「機能性」または「生物学的に活性な」抗体または結合分子（本明細書における重鎖のみ抗体および二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む）は、構造的な、調節的な、生化学的な、または生物物理学的な事象において、自然の活性を一つ以上、発揮する能力を有するものである。たとえば、機能性抗体または他の結合分子（たとえば、ＴＣＡ）は、抗原に特異的に結合する能力を有し得、その結合は、今度は、たとえばシグナル伝達または酵素活性等の、細胞性または分子的な事象を導く、または変化させ得る。機能性抗体または他の結合分子（たとえば、ＴＣＡ）はまた、受容体のリガンド活性化を妨害、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用し得る。抗体または他の結合分子（たとえば、ＴＣＡ）の、自然の活性を一つ以上発揮する能力は、適切なフォールディングおよびポリペプチド鎖のアセンブリを含む、いくつかの要因に依存する。
【００７６】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、結合された他の核酸を運搬する能力を有する核酸分子を指すよう意図されている。ベクターの一種には「プラスミド」があり、追加のＤＮＡセグメントが連結されうる環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの他のタイプには、ウイルスベクターがあり、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム内へ連結され得る。あるベクターは、導入された宿主細胞中で、自己複製する能力を有する（たとえば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって、宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、あるベクターは、操作可能に結合された遺伝子の発現を指揮する能力を有する。そのようなベクターは、本明細書において、「組み換え発現ベクター」（または、シンプルに「組み換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、もっとも普遍的に使用されるベクターの形態であるため、互換可能に用いてもよい。
【００７７】
本明細書において使用される、「宿主細胞」（または「組み換え宿主細胞」）という用語は、遺伝子的に変化した、または組換えプラスミドもしくはベクター等の外来ポリヌクレオチドの導入により、遺伝子的に変化させることができる細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞のみを指すのではなく、当該細胞の子孫細胞も指すことが意図されることを理解すべきである。突然変異または環境的な影響によって、若干の変異が次世代に発生する可能性があるため、当該子孫細胞は、実際には、元となる細胞と同一ではない可能性があるが、それでも、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００７８】
治療の目的上の「哺乳類」は、哺乳類として分類される任意の動物を指し、人類、非ヒト霊長類、家畜、ならびに動物園、スポーツまたはペットアニマル（たとえば、イヌ、馬、ネコ、ウシ等）が含まれる。定義内に具体的に含まれるのは、たとえばマウスおよびラット等のげっ歯類、ならびに遺伝子変換により抗体多様性を創出する動物である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
１．二重特異性三鎖抗体様分子（ＴＣＡ）
本発明は、新規の二重特異性抗体様分子（結合ポリペプチド）を開示し、たとえば、ヒトの疾患の治療および／または診断において有用性が見いだされる。新規二重特異性抗体様分子は、３つのポリペプチド鎖からなり、三鎖抗体（ＴＣＡ）と呼ばれる。そのようなポリペプチド鎖のうちの２つは、抗原結合ドメインを形成するために必要な抗体重鎖および軽鎖の少なくとも一部分、および少なくとも一つの抗体重鎖定常領域配列、すなわち、ＣＨ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３および／またはＣＨ４領域配列を含む。ある実施形態において、重鎖配列はまた、ヒンジ領域を含んでもよい。一つの実施形態において、２つのポリペプチド鎖は、第一の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体の一つの重鎖および一つの軽鎖である。
【００８０】
３つ目のポリペプチド鎖は、ＣＨ１ドメインが欠落する場合において、ＣＨ２および／またはＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインを含有するＦｃ部分、および第二の抗原のエピトープに結合する抗原結合ドメイン（そのような抗原ドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変領域由来であるか、または抗体重鎖または軽鎖の可変領域と同一配列を有する）を含有する、重鎖のみ抗体である。そのような可変領域の一部分は、ＶＨもしくはＶＬ遺伝子セグメント、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによりコードされ得る。可変領域は、再構成されたＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬまたはＶＬＪＬ遺伝子セグメントによりコードされ得る。Ｖ−、Ｄ−、およびＪ−遺伝子セグメントは、ヒトおよび様々な動物（鳥、魚を含むがこれらに限定されない）由来であり得る。第一および第二の抗原は、互いに異なり、すなわちＴＣＡは二重特異性である。
【００８１】
ある実施形態において、残りの配列が全長ＣＨ領域の機能を維持するのに十分であれば、ＣＨ領域を切断することができる。
【００８２】
二重特異性ＴＣＡは、化学合成により調製することができるが、典型的には、それらは、たとえば、単一組換え宿主細胞中で分子を作り出す、三鎖の共発現、またはたとえば重鎖ポリペプチドおよびヒト抗体等の抗体の共発現等の、組換えＤＮＡ技法により作製される。さらに、抗体重鎖および軽鎖はまた、単一のポリシストロニックな発現ベクターを用いて発現させることができる。ＴＣＡの抗体の構成要素はまた、ファージディスプレイにより産生することができる。単一宿主細胞における重鎖ポリペプチドおよび抗体の共発現は、上清中に３つの分子（抗体、重鎖ポリペプチドおよびＴＣＡ）を産生する。個々のポリペプチドの精製は、たとえば親和性（プロテインＡ）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィー等の標準的なタンパク質精製技術を用いて達成される。ＴＣＡは、サイズおよび疎水性において十分に異なるため、精製は標準方法を用いて行うことができる。
【００８３】
単一宿主細胞中で産生される抗体および重鎖ポリペプチドの量は、抗体の定常領域および重鎖の操作を通じて、最小化することができ、たとえば、自己互助作用により、ホモ二量体化がヘテロ二量体化よりも好まれる（たとえば、「突起を空洞へ」戦略（国際公開第９６／２７０１１号を参照のこと）等の可能性に対しては、国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）。ゆえに、本発明の他の態様は、組換え宿主におけるＴＣＡを産生するための方法を提供することであり、当該方法には、組換え宿主細胞中で少なくとも抗体および重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程を含み、上記抗体および上記重鎖ポリペプチドは、定常領域が十分に異なるため、ホモ二量体の形成を減少または阻害するが、ＴＣＡの形成は増加させる。
【００８４】
任意の非ヒトアミノ酸配列の無いＴＣＡが産生され得る。そのようなＴＣＡは、非免疫原性であり、ヒトにおける天然抗体と同様、長い半減期を有する安定した分子である。
【００８５】
従来のモノクローナル抗体と比較し、ＴＣＡの可能性は増加している。
【００８６】
一つの実施形態において、本発明は、２つの細胞表面抗原に結合するＴＣＡに関する。
【００８７】
本発明は、具体的には、ヒトＣＤ３に結合するＴＣＡに関する。たとえば、重鎖のみ抗体ポリペプチドは、重鎖および軽鎖またはそれらの機能性断片と組み合わされてもよく、少なくとも、モノクローナル抗体由来の抗原結合ドメインならびにＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのうちの少なくとも一つを含有する。重鎖のみ抗体は、ヒトＣＤ３に特異的であり得、一方でＴＣＡのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）部分は、癌細胞、たとえば、卵巣、乳房、胃腸、脳、頭および頚部、前立腺、大腸および肺癌等の細胞、ならびに、たとえば、白血病を含むＢ細胞腫瘍等の血液系腫瘍、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経系細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、メラノーマ、ミエローマ、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍、感染体に起因する新生組織形成、ならびに他の悪性腫瘍、病原体に感染した細胞、炎症および／または自己免疫を引き起こす自己反応性細胞等を含む標的細胞に特異的であり得る。ある実施形態において、ＴＣＡは、ＣＤ３および腫瘍抗原（たとえば、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ受容体、他の増殖因子受容体（たとえばＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２受容体）、Ｂ細胞マーカー（たとえばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ７２等）、Ｔ細胞マーカー（たとえばＣＤ２５、ＣＤ１１ｂ）、他の白血球表面マーカー（たとえばＣＤ３３またはＨＬＡ−ＤＲ等）、サイトカイン（たとえばＴＮＦ、インターロイキン）、これらのサイトカインに対する受容体（たとえばＴＮＦ受容体ファミリー等のメンバー））に対する結合特異性を有する。
【００８８】
他の実施形態において、本明細書における二重特異性ＴＣＡは、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体により発現されるタンパク質に対する結合特異性を有し得る。さらなる実施形態において、二重特異性ＴＣＡは、ウイルスに感染した細胞または感染細胞の表面上に発現したウイルスタンパク質またはウイルス粒子に特異的に結合する。さらなる実施形態において、二重特異性ＴＣＡは、細胞内寄生虫を有する細胞の表面上に発現された寄生虫タンパク質に特異的に結合する。
【００８９】
本発明の二重特異性ＴＣＡに含まれうる例示的な抗ＣＤ３モノクローナル抗体には、ＯＫＴ３（Ｏｔｈｏ）およびその変異体（非グリコシル化された変異体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体は完全なヒト抗体である。一般に、抗ＣＤ３抗体は、以下の特徴を一つ以上有している：抗体は、ＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）細胞には結合するが、ＣＤ３陰性（ＣＤ３−）細胞には結合しない；抗ＣＤ３抗体により、ＣＤ３もしくはＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の細胞表面の発現レベルまたは活性を変化（たとえば、減少）させることを含む抗原性の調節が誘導される。
【００９０】
たとえば、ＣＤ３特異的重鎖抗体は、たとえばリツキサン（登録商標）（Ｂ細胞腫瘍を含むＢ細胞上のＣＤ２０に特異的）、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ抗体）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、抗ＨＥＲ２抗体）等のｍＡｂの重鎖および軽鎖と組み合わせてもよい。ＣＤ３特異的単鎖ペプチドはまた、たとえばＰＭＳＡ（前立腺特異的膜抗原）等の他の腫瘍抗原に特異的な抗体と組み合わせることができる。ＣＤ３特異的単鎖ペプチドはまた、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、デングウイルスまたは他のウイルス感染細胞を認識する抗体と対になることができる。
【００９１】
本発明はまた、細胞表面抗原および可溶性抗原に結合するＴＣＡを開示する。
【００９２】
本発明はまた、２つの可溶性抗原、または１つの抗原（たとえば１つの可溶性抗原）上の２つの異なるエピトープに結合するＴＣＡに関する。ゆえに、たとえば、ＨＥＲ２抗原上またはＣＤ３上の２つの異なるエピトープに結合するＴＣＡは、具体的に本明細書に含まれる。
【００９３】
２つの可溶性抗原、または１つの可溶性抗原の２つのエピトープに結合するＴＣＡは、上記抗原と架橋することができる可能性がある。動物またはヒトにおいて、そのようなＴＣＡの投与は、循環系からの標的抗原の除去をもたらし得る。
【００９４】
２．ＴＣＡの組換え生産
上述のように、本明細書におけるＴＣＡは、典型的には組換えＤＮＡ技術（たとえば、単一組換え宿主細胞中で分子を作り上げる、三鎖の共発現等）により生産される。
【００９５】
本明細書におけるＴＣＡの組換え生産のために、三鎖をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製ベクターへ挿入される。所望の単鎖抗体をコードするＤＮＡは、従来方法（たとえば、抗体変異体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を用いて容易に単離および配列解析される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は、通常、以下の一つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【００９６】
選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識、および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）ものである。天然の抗体シグナル配列を認識、および処理しない原核宿主細胞に対しては、シグナル配列は、たとえばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱耐性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核細胞のシグナル配列により代用される。酵母分泌に対しては、天然のシグナル配列は、たとえば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセスおよびクリベロミセスα因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンズ  グルコアミラーゼリーダー、または国際公開第９０／１３６４６号に記載されるシグナルにより代用され得る。哺乳類細胞発現においては、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー（たとえば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が利用できる。
【００９７】
上記の前駆体領域に対するＤＮＡは、リーディングフレーム中で抗体をコードするＤＮＡへ結合される。
【００９８】
発現およびクローニングベクターの両方とも、一つ以上の選択宿主細胞中でベクターを複製させるための核酸配列を含有する。通常、クローニングベクター中では、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは無関係にベクターが複製できるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスで良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞中のクローニングベクターに有用である。通常、複製起源の構成要素は、哺乳類の発現ベクターには必須ではない（ＳＶ４０起点は、早期プロモーターを含有しているという理由だけで、主に利用され得る）。
【００９９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子（選択可能マーカーとも呼ばれる）を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン）への抵抗性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養要求欠損体を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは入手できない必須栄養素を供給するタンパク質（たとえば、桿菌に対し、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）をコードする。
【０１００】
選択スキームの一つの例は、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を利用する。成功裏に異種遺伝子で形質転換されたそれら細胞は、薬剤抵抗性を与えるタンパク質を産生し、ゆえに、選択レジメンを生き残る。そのような優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンの薬剤を使用する。
【０１０１】
哺乳類細胞に対する適切な選択可能マーカーの他の例として、抗体核酸を取り込むことができる細胞の識別を可能とするものがあり、たとえば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ（好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等がある。
【０１０２】
たとえば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、メトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合アンタゴニスト）を含有する培養培地中ですべての形質転換体を培養することにより、最初に識別される。野生型ＤＨＦＲが使用された場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１０３】
もう一つの方法として、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３´−ホスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等の他の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、たとえばアミノグリコシド系抗生物質（たとえばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）等の選択可能マーカーに対する選択剤を含有する培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１０４】
酵母での使用に対する適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：３９  （１９７９））中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である。ｔｒｐｌ遺伝子は、たとえば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１等の、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在により、次いで、トリプトファンの欠乏中での増殖による形質転換の検出に対する効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を担持する既知のプラスミドにより補完される。
【０１０５】
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クリベロマイセス属の酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔牛キモシンの大規模生産のための発現システムとして、クリベロマイセス・ラクチスが報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。クリベロマイセスの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミン分泌に対する安定した多コピー発現ベクターもまた、記載される。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０１０６】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物体に認識され、抗体核酸に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。原核細胞宿主での使用に適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、ベータラクタマーゼ、およびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ならびにｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知の細菌プロモーターは適切である。細菌システムにおける使用に対するプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに操作可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０１０７】
真核細胞のプロモーター配列は公知である。事実上、すべての真核細胞の遺伝子は、転写が開始される部位から約２５塩基上流に位置する、ＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見いだされる他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物の３´末端で、遺伝子はＡＡＴＡＡＡ配列であり、これはコーディング配列の３´末端へのポリＡテールの付加シグナルでありうる。これら配列のすべては、適切に真核生物発現ベクターへ挿入される。
【０１０８】
酵母宿主での使用に対する適切なプロモーター配列の例として、３−ホスフォグリセレートキナーゼ、またはたとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ−フルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ―スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等の他の解糖系酵素に対するプロモーターが挙げられる。増殖条件により調節される転写の付加的利点を有する誘導プロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域である。酵母発現における使用に対するベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号においてさらに記述されている。酵母のエンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに好都合に用いられる。
【０１０９】
宿主細胞システムと適合しているプロモーターであれば、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいのはサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスゲノムから得られたプロモーターにより、たとえばアクチンプロモーターまたはイムノグロブリンプロモーター等の異種哺乳類プロモーターから得られたプロモーターにより、ヒートショックプロモーターから得られたプロモーターにより、哺乳類宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写が調節される。
【０１１０】
ＳＶ４０ウイルスの早期および末期プロモーターは、ＳＶ４０制限断片（ウイルスの複製起点もまた含んでいる）として都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として都合よく得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして用いる哺乳類宿主におけるＤＮＡ発現のためのシステムは、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を、プロモーターとして用いることができる。
【０１１１】
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクター内へと挿入することにより増加される。現在では多くのエンハンサー配列が哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）から知られている。しかし典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点（１００〜２７０塩基対）の終末部位上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の終末部位上のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーター活性化のための強化要素については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７−１８（１９８２）もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５´または３´の位置でベクター内へ接合されてもよいが、プロモーターから５´の部位に位置することが好ましい。
【０１１２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。そのような配列は通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５´、および時には３´、非翻訳領域から利用できる。これらの領域には、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分でポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号、およびその中に記述される発現ベクターを参照のこと。
【０１１３】
たとえば、米国特許第４，７１３，３３９号に記載されるポリシストロニックな発現ベクターはまた、本明細書における二重特異性ＴＣＡのサブユニットの発現に使用することができる。ポリシストロニックな発現ベクターにおいて、サブユニットをコードしている配列は、適切な開裂部位により分離されていてもよい。
【０１１４】
本明細書におけるベクター中のＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ発現のための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または上記に記載される高度真核細胞である。この目的に適切な原核生物には、たとえば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス等の大腸菌属、たとえばネズミチフス菌等のサルモネラ属、たとえば霊菌等のセラチア属、赤痢菌等の腸内細菌、ならびに枯草菌およびバチラス・リケニフォルミス（たとえば、１９８９年４月１２日に発行された独国特許第２６６，７１０号に開示されたバチラス・リケニフォルミス４１Ｐ）等の桿菌、たとえば緑膿菌等のシュードモナス属、および放線菌、等の、グラム陰性またはグラム陽性の生物体等の、真正細菌が挙げられる。大腸菌のクローニング宿主の好ましいものは、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４株（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、たとえばＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ株、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）等の他の株も適切である。これらの例は実例であり、制限は意図されない。
【０１１５】
原核生物に加え、真核微生物（たとえば、糸状菌または酵母）も、抗体をコードするベクターに対するクローニング宿主または発現宿主として適切である。出芽酵母（または一般的なパン酵母）は、低度の真核生物の宿主微生物の中で、最も普遍的に用いられているものである。しかし、他の属、種および株の多く（たとえば、分裂酵母、たとえばクリベロマイセス・ラクチス、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クリベロマイセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５），クリベロマイセス・ウイケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、クリベロマイセス・ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クリベロマイセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびクリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等のクリベロマイセス宿主、ヤロウイア属（欧州特許第４０２，２２６号）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号）、カンジダ属、トリコデルマ  リイジア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）、アカパンカビ、たとえばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のシュワニオマイセス属、ならびにニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）等の糸状菌、ならびに偽巣性コウジ菌および黒色麹菌等のアスペルギルス宿主等）も一般に利用可能であり、本明細書において有用である。
【０１１６】
無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容可能な昆虫宿主細胞（たとえば、ヨトウガ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、セスジヤブカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ミバエ）およびカイコ等の宿主由来）が識別されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株が公に利用可能であり、たとえば、キンウワバ科ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株等があり、そのようなウイルスは本明細書において、本発明に従い、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用してもよい。綿、穀物、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用可能である。
【０１１７】
植物における合成ＴＣＡは、様々な方法で製造可能である。タバコ植物において抗体産生の最初の報告があり、（Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２：７６−７８）、蛾（概説として、Ｄｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｓｋｉ，２００８，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．，３１, ３−９を参照のこと）、藻類（概説として、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｙｆｉｅｌｄ，  ２００５，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ., ５, ２２５−２３５を参照のこと）および様々な双子葉および単子葉種（たとえば、タバコ、稲）において、抗体が発現されている。概説として、たとえばＤｅ  Ｍｕｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ８（５）：５２９−５６３を参照のこと。抗体を産生するトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞がまた記載され（Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２：７６−７８）、本目的に有用な植物には、穀物、トウモロコシ、タバコ、大豆、アルファルファ、稲等が挙げられる。たとえば植物細胞で使用可能な構造性プロモーターには、ＣａＭＶ  ３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター、アルゴバクテリウム属のプロモーターｎｏｓおよびｏｃｓがある。他の有用なプロモーターには、たとえばｒｂｃＳ等の軽めの誘導可能なプロモーターがある。組織特異性プロモーターは、たとえば種特異性であり、たとえばゼイン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、ベータファセオリン（ｂｅｔａｐｈａｓｅｏｌｉｎ）、ユビキチン由来のプロモーター、または塊茎特異性、葉特異性（たとえば、タバコで有用）、根茎特異性等でありうる。相同組み換えによりプラスチド細胞小器官を形質転換し、植物でタンパク質を発現させることもまた可能である。組換え植物もしくはそれらの一部分、または組換え植物細胞培養物中でのタンパク質の発現のための方法および手段は当業者に公知であり、たとえばＧｉｄｄｉｎｇｓ  ｅｔ  ａＩ，２０００、国際公開第  ０１／６４９２９号、国際公開第  ９７／４２３１３号、米国特許第５８８８７８９号，第６０８０５６０号において記載され、実際的なガイドラインとして、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．４９“Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｊｏｎｅｓ  Ｈ，１９９５を参照のこと。
【０１１８】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、ありふれた手段となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例には、ＳＶ４０を形質転換されたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎株（２９３または浮遊培養中で増殖サブクローニングされた２９３株、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９  （１９７７））、赤子ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１  （１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８  （１９８２））、ＭＲＣ細胞、ＦＳ４細胞およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【０１１９】
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選別、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に調製された標準栄養培地で培養される。
【０１２０】
たとえば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）等の市販培地が宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５  （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、または第５，１２２，４６９号、国際公開第  ９０／０３４３０号、  ８７／００１９５号、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される任意の培地を宿主細胞の培養培地として使用し得る。任意のこれらの培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（たとえばインスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子等）、塩（たとえばナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩等）、緩衝剤（たとえばＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（たとえばアデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（たとえばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬剤等）、微量元素（通常、マイクロモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）およびグルコースまたはエネルギー源相当物を補ってもよい。他の任意の必須補足物もまた、当業者に周知の適切な濃度で含まれてよい。たとえば、温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に従前に使用されたものであり、当業者に対し明白である。
【０１２１】
好ましい実施形態において、本発明の方法に従う宿主細胞は、ヒトイムノグロブリンを高度に発現する能力を有する。すなわち、上記宿主細胞中で単鎖をコードする核酸分子の増幅を必要とせずに、少なくとも１ｐｇ／細胞／日、好ましくは少なくとも１０ｐｇ／細胞／日、およびさらにより好ましくは少なくとも２０ｐｇ／細胞／日以上である。
【０１２２】
好ましくは、本発明に従う宿主細胞は、発現される各組換え核酸を、１〜１０コピーの間で、そのゲノム中に含有する。本分野において、たとえばＣＨＯ細胞中での対象タンパク質をコードする核酸配列のコピー数の増幅は、細胞による組換えタンパク質の発現レベルを増加するために用いることができる（Ｂｅｎｄｉｇ  Ｍ．Ｍ．（１９８８）  Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７：９１−１２７、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６６２−６６７、および米国特許第４，３９９，２１６号を参照のこと）。これは、今日、広く用いられている方法である。しかしながら、所望の高いコピー数および高度な発現レベルを有するクローンを樹立する前に、著しく時間を要する取組が必要とされ、さらに、発現カセットの高いコピー数（数百まで）を含むクローンは多くの場合、不安定である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ５８：７３−８４）。ゆえに、本発明の好ましい実施形態は、対象の二重特異性ＴＣＡの高度な発現のためにそのような増幅戦略を必要としない宿主細胞を使用することである。これは、本発明に従う単鎖抗体の混合物を一貫した方法で発現する宿主細胞の安定クローンの高速発生を可能とする。我々は、本発明に従う宿主細胞が得られ、サブクローニングされ、さらに、選択圧力無しに、本発明に従う単鎖抗体の混合物を一貫した方法で発現しながら、少なくとも約３０回の細胞分裂（群は二倍増殖）で増殖された証拠を提示する。ゆえに、ある態様において、本発明の方法には、少なくとも２０回、好ましくは２５回、より好ましくは３０回の群の二倍増殖で細胞を培養することが含まれ、他の態様において、本発明に従う宿主細胞は、少なくとも２０回、好ましくは２５回、さらに好ましくは３０回の群の二倍増殖を経て、それでもなお本発明に従うＴＣＡを発現する能力を有している。
【０１２３】
本発明に従う細胞により発現されたＴＣＡは、細胞から、または好ましくは細胞培養培地から、本分野の当業者に公知の一般的な方法により回収され得る。そのような方法には、沈殿、遠心、ろ過、ウイルスろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等のうち一つ以上が含まれる。
【０１２４】
３．医薬組成物
本発明の他の態様は、適切な薬学的に受容可能な担体と混合した状態で、本発明の一つ以上のＴＣＡを含有する医薬組成物を提供する。本明細書において使用される薬学的に受容可能な担体の例示として、アジュバント、固形担体、水、緩衝剤または治療組成物またはそれらの組み合わせを保持するために本分野で使用される他の担体があるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明に従って使用されるＴＣＡの治療製剤は、保管のために、任意の薬学的に受容可能な担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）と、所望の精製度を有する二重特異性ＴＣＡを混合することにより、たとえば凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。受容可能な担体、賦形剤または安定剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに対し非毒性であり、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（たとえばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシン、シクロヘキサノール、３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、たとえば血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリン等のタンパク質、たとえばポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物、たとえばＥＤＴＡ等のキレート剤、たとえばショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類、たとえばナトリウム等の塩形成対イオン、金属錯体（たとえば、亜鉛−タンパク質錯体）ならびに／または、たとえばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は滅菌されていなければならない。これは、滅菌フィルター膜を通過させるろ過により容易に達成される。
【０１２７】
持続的放出製剤が調合されてもよい。持続的放出製剤の適切な例として、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性基質が挙げられ、基質は、たとえばフィルムまたはマイクロカプセル等の加工品の形態である。持続的放出基質の例には、ポリエステル、ハイドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）等）、ポリラクチド、分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。
【０１２８】
抗ＣＤ３抗体製剤は、たとえば、米国特許出願公開第２００７００６５４３７号に開示されており、参照により本明細書に明示的に援用される。同様の製剤が本発明の二重特異性ＴＣＡに使用することができる。そのような製剤の主な構成成分は、３．０〜６．２の範囲で効果的なｐＨ緩衝剤、塩、界面活性剤および抗ＣＤ３特異性を有するＴＣＡの有効量である。
【０１２９】
４．治療および診断
本発明の他の態様は、ヒトまたは動物対象の治療または診断における使用のためのＴＣＡを提供する。ヒト対象（癌患者を含むがこれに限定されない）を本明細書の二重特異性ＴＣＡで治療する方法は、明確に本発明の範囲内である。他の態様において、本発明は、ヒトまたは動物対象における疾患または障害の治療または診断における使用のための薬剤調製にかかるＴＣＡの使用を提供する。ある実施形態において、疾患または病気は、たとえば卵巣癌、乳癌、胃腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、たとえば白血病を含むＢ細胞腫瘍等の血液系腫瘍、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経系細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、メラノーマ、ミエローマ、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍、感染体に起因する新生組織形成および他の悪性腫瘍等の癌等の、腫瘍である。
【０１３０】
癌免疫療法に加えて、本発明の二重特異性ＴＣＡは、たとえば、様々な自己免疫疾患および／または炎症性疾患（移植片拒絶およびＩ型糖尿病、または細菌、ウイルスもしくは寄生虫に起因する感染性疾患を含む）の治療における有用性を見出す。
【０１３１】
自己免疫疾患として、たとえば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫要素を伴うウイルス性疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ球増殖性疾患（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病−ヘルペス状皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病、小児皮膚筋炎、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症‐線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、小児慢性関節炎（スティル病）、小児リウマチ性関節炎、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血（ｐｅｍａｃｉｏｕｓ  ａｎｅｍｉａ）、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性強皮症（ＰＳＳ）、全身性強皮症（ＳＳ）としてもまた知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１３２】
炎症性疾患として、たとえば、慢性および急性炎症性疾患が挙げられる。炎症性疾患の例として、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主疾患、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、脳卒中、組織および器官の移植、脈管炎、糖尿病性網膜症およびベンチレーター誘導肺損傷が挙げられる。
【０１３３】
感染性疾患の例として、限定されないが、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス（ＩＮＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アフトウイルス、コクサッキーウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、デングウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、パピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、スイポックスウイルスおよびコロナウイルス等のウイルスに起因する疾患が挙げられる。
【０１３４】
感染性疾患のさらなる例として、限定されないが、たとえばアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、カルメット‐ゲラン桿菌、ブラストマイセス‐デルマチチジス、百日咳菌、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・レクタ、カンジダ・アルビカンス、キャプノサイトファガ類、トラコーマクラミジア、アイケネラコローデンス、赤痢アメーバ、エンテロコッカス類、大腸菌、ユーバクテリウム類、ヘモフィルス・インフルエンザ、アシドフィルス菌、リーシュマニア類、リステリア菌、ミコバクテリウム・バッカエ、淋菌、髄膜炎菌、ノカルジア類、パスツレラ・ムルトシダ、マラリヤ原虫、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インテルメディア、緑膿菌、ロチア・デントカリウス、腸チフス菌、ネズミチフス菌、霊菌、志賀赤痢菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、トレポネーマ・デンティコラ、トリパノソーマ・クルージ、コレラ菌および腸炎エルシニア等の病原菌に起因する疾患が挙げられる。
【０１３５】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例により例証される。
【実施例１】
【０１３６】
重鎖のみ抗体を発現する遺伝的操作ラットの作製
ＹＡＣおよびＢＡＣでの改変ヒトＩｇ遺伝子座の構築
【０１３７】
ヒトＩｇＨ遺伝子座が構築され、ラットＣ領域遺伝子の改変および接合を経て、いくつかの部分に集められ、次いで、ヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨ領域の下流に接合された。ヒトＶＨ遺伝子の別個のクラスターを伴う２つのＢＡＣ［ＢＡＣ３およびＢＡＣ６］が、次いで、接合された（ヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨラットＣ）断片をコードするＢＡＣと共に注入された。
【０１３８】
ラット定常領域に対して、３つのＢＡＣが識別された［Ｎ１２、Ｍ５およびＩ８］。これらは個々に削られ、削ったＭ５の５´と一致する１７０ｂｐの相同アームが、削ったＮ１２の３´末端に付加され、削ったＩ８の５´末端と一致する１００ｂｐの相同アームが、削ったＭ５の３´末端に付加された。これらの改変ＢＡＣは、組み立てられた場合、ラット定常（Ｃ）領域の大部分（Ｅ（エンハンサー）μ、ｓ（スイッチ）μ、Ｃμ、Ｃδ、ｓγ２ｂ、Ｃγ２ｂ、ｓε、Ｃε、ｓα、Ｃαおよび３’Ｅを含む）を含有する。削ったＮ１２およびＩ８にそれぞれ位置するラットＣμおよびラットＣγ２ｂのＣＨ１領域は、除去された。改変Ｎ１２およびＭ５は、次いで、連結され、ＢＡＣ  Ｎ１２Ｍ５を作った。これらのＢＡＣの改変は、Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ  組換え技術を用いて実行された。
【０１３９】
大腸菌における多様なＢＡＣの改変は、たとえばスイッチ配列およびエンハンサー等の繰り返し領域が頻繁に削除されたため、出芽酵母の重複末端と配列を環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）として編成する技術が開発され、その結果、上記ｃＹＡＣがＢＡＣに改造された。ＹＡＣの利点は、その大きなサイズ、酵母宿主における同種変更の容易さ、および配列の安定性が挙げられるが、一方で大腸菌で増殖されるＢＡＣは、調製および大量生産の容易さという利点を示す。さらに、詳細な制限酵素マッピングおよび配列解析が、ＹＡＣよりもＢＡＣにおいて、より良く達成できる。２つの自己複製する出芽酵母／大腸菌シャトルベクター（ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡおよびｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧ）が構築された。簡潔に述べると、出芽酵母ＣＥＮ４は、ｐＹＡＣ−ＲＣからＡｖｒＩＩ断片として切り出され（Ｍａｒｃｈｕｋ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  １９８８）、ＳｐｅＩ直線化ｐＡＰ５９９に結合された。得られたプラスミドは、ＵＲＡ３とＨｙｇＲの間にクローン化されたＣＥＮ４を含有する。このプラスミドから、ＣＥＮ４が後に続くＵＲＡ３を含有するＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩ断片、またはＣＥＮ４が後に続くＨｙｇＲを含有するＰｍ１Ｉ−ＳｐｈＩ断片が切り出され、ＡｐａＬＩおよびＢａｍＨＩ、またはＨｐａＩおよびＳｐｈＩで消化されたｐＢＡＣＢｅｌｏ１１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に結合され、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡおよびｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを得た。
【０１４０】
改変Ｉ８の制限酵素分析により、このＢＡＣのｓγ２ｂ領域が予測よりも２．５〜３ｋｂ短いことが明らかとなった。ＣμならびにＣγ２ｂ（Ｎ１２Ｍ５Ｉ８）でＣＨ１を欠く約１２５ｋｂのラットＣ領域を編成し、真の構成を維持するために、以下の精製断片を、等しいモルで混合した。改変Ｎ１２Ｍ５由来の５１ｋｂのＳｗａＩ−ＮｏｔＩ、改変Ｉ８中の短くなったｓγ２ｂ（従前にｐＢｅｌｏＢＡＣ１１にクローン化）を置き換えるための真のｓγ２ｂ領域を包含する６．５ｋｂのＸｂａＩ断片、改変Ｉ８由来の８１ｋｂのＮｒｕＩ断片、および相同アーム（６５ｂｐ）を、Ｎ１２のラットＪＨおよび、Ｉ８のラットＣ領域の３´末端（プライマーは３２１および３２２）のすぐ下流配列と対応する末端のいずれかを含むＰＣＲ増幅したｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡ。各断片がその近隣断片と５´および３´末端で、６５ｂｐ〜１５ｋｂで重複しているＤＮＡ混合物が、出芽酵母ＡＢ１３８０細胞に、標準的なスフェロプラスト形質転換手段を用いて形質転換され、ＵＲＡ＋クローンが選択された（Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ、１９９４）。形質転換に関連した酵母での相同組み換えを通じて、予測構成どおりのＮ１２Ｍ５Ｉ８を含有するｃＹＡＣが編成された。得られたｃＹＡＣの近隣断片の重複接合は、酵母ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いるＰＣＲ分析により確認された。精製後、ｃＹＡＣは、大腸菌ＤＨ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ、エレクトロポレーションを介して形質転換された。詳細な制限酵素マッピングおよび配列解析により、ＢＡＣ  Ｎ１２Ｍ５Ｉ８が正確であることが同定された。
【０１４１】
ＢＡＣ１は、３工程で改変され、削ったＢＡＣ１（ヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨ領域を含む）を得た。第一に、ＢＡＣ１はＰｖｕＩで部分的に消化され、再連結されヒトＶＨ６−１の上流配列が除去された。第二に、先の工程で得た短くなったＢＡＣ１が、ヒトＪＨｓのすぐ下流にあるＰａｃＩ部位ならびにベクター骨格中のＡｓｃＩ部位で消化され、４１ｋｂの断片が除去された。その後、ラットＪＨｓのすぐ下流に位置する２．５ｋｂの断片がラットゲノムＤＮＡから増幅され、両側にＰａｃＩおよびＡｓｃＩ部位を横付けた（プライマーは１４０および１４１）。改変Ｎ１２の５´末端への重複を提供する、このＰａｃＩ−ＡｓｃＩ断片は、ＰａｃＩおよびＡｓｃＩの二つの消化酵素で短くされたＢＡＣ１と結合され、削ったＢＡＣ１を得た。
【０１４２】
その後、ＢＡＣ３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８が、ｃＹＡＣ／ＢＡＣ戦略を介して構築された。このＢＡＣは、５’〜３’へ、以下の領域を含む。ＢＡＣ３の３’末端から１１．３ｋｂの配列（ラットゲノムへ共に注入する場合の、ＢＡＣ３への重複を提供する）、Ｎ１２Ｍ５Ｉ８の全体が後に続く、削ったＢＡＣ１の全体。好都合なことに、ＢＡＣ３の３’末端は、削ったＢＡＣ１の５’末端と５．５ｋｂ、重複している。３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８を編成するために、１１．３ｋｂのＢＡＣ３断片がＰＣＲで増幅され、次いで、削ったＢＡＣ１由来のＰｖｕＩ−ＡｓｃＩ断片、Ｎ１２Ｍ５Ｉ８の全体を包含するＭｌｕＩ断片、１１．３ｋｂのＢＡＣ３断片の５’末端およびＩ８の３’末端と対応する両末端で相同アームを備える増幅されたｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡと混合された。このＤＮＡ混合物を用いて、ＡＢ１３８０細胞へ形質転換された。形質転換で各断片が正しく結合されたことは、ＰＣＲ分析により確認された。編成された３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８領域をＢＡＣへと転換した後、制限酵素マッピングにより徹底的にチェックされた。ＢＡＣ３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８の重鎖遺伝子領域は、出芽酵母ＵＲＡ３遺伝子とともに、その３’末端で、ＮｏｔＩ断片として、完全に切り出すことができる。ラットゲノムへと結合された際、この大きなＤＮＡ断片中のＵＲＡ３の存在は、導入遺伝子の識別に役立つ。
【０１４３】
最後に、ＢＡＣ３のヒトＶＨ遺伝子座の５’末端に位置している１０．６ｋｂの断片が、プライマー４１１、４１２を用いて増幅され、そしてＢＡＣ６へと結合され、ＢＡＣ３との重複が提供された。この改変ＢＡＣはＢＡＣ６（＋３）と名付けられた。ＢＡＣ６のヒトＶＨ遺伝子座の３’末端は、高度な繰り返し配列を含んでおり、この領域の組換えを介した操作を非常に難しくしている。ゆえに、我々は、ＢＡＣ３断片をＢＡＣ６のベクター骨格へと結合することを選択した。これを達成するために、１０．６ｋｂのＢＡＣ３断片の３’末端、およびＢＡＣ６でヒトＶＨ遺伝子座の５’末端と重複している末端のいずれかに付加された６５ｂｐの相同アームを備えるｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ＋ＵＲＡベクターを、それぞれ、プライマー４２７と４１４を使用して増幅した。１０．６ｋｂのＢＡＣ３断片、増幅したｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ＋ＵＲＡおよび切断していないＢＡＣ６を等しいモルで含むＤＮＡ混合物を、出芽酵母ＡＢ１３８０のスフェロプラストへ形質転換し、ＵＲＡ＋形質転換体を選択した。ＰＣＲ分析を用いて、ＢＡＣ６のベクター骨格とＢＡＣ６ヒトＶＨ遺伝子座の５’末端の間に位置するｐＢｅｌｏ−ＢＡＣ＋ＵＲＡが後に続く、ＢＡＣ３断片が含まれる正しい結合体を識別した。このｃＹＡＣをＢＡＣへと改造した後、制限酵素マップで徹底的にチェックした。ＢＡＣ６（＋３）をＡｓｃＩで消化すると、完全なＢＡＣ６ヒトＶＨ遺伝子座およびその３’末端で１０．６ｋｂのＢＡＣ３断片重複を含有する約２２０ｋｂの断片が放出される。
【０１４４】
ＤＮＡ精製
消化後の直線状ＹＡＣ、環状ＹＡＣおよびＢＡＣ断片は、Ｅｌｕｔｒａｐ（商標）を用いる電気溶出（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）により，従来法で泳動された０．８％アガロースゲル、またはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）から切り出されたストリップから精製された。ＤＮＡの濃度は、大抵、約１００μｌの体積中で数ｎｇ／ｍｌであった。約２００ｋｂの断片については、ＤＮＡは沈殿され、マイクロインジェクション緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８および１００ｍＭ  ＮａＣｌ。ただしスペルミン／スペルミジンは無い）中に、所望の濃度で再溶解された。
【０１４５】
酵母からの環状ＹＡＣの精製は、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ  シリカベースの陰イオン交換レジン（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実行された。簡潔に述べると、スフェロプラストが、ザイモリエースまたはリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）を用いて作製され、沈殿された（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。次いで、細胞をアルカリ溶解させ、ＡＸ１００カラムに結合させ、低コピープラスミドに対するＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ法に記載されているように溶出した。混入した酵母の染色体ＤＮＡは、Ｐｌａｍｉｄ‐Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮａｓｅ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて加水分解され、次いでＳｕｒｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて最終的に浄化した。次いで、ＤＨ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の分注物を、環状ＹＡＣで形質転換し、ＢＡＣコロニーを得た。マイクロインジェクションのための挿入ＤＮＡ（１５０〜２００ｋｂ）のＢＡＣベクター（約１０ｋｂ）からの分離のために、セファロース４Ｂ−ＣＬを用いるろ過工程が使用された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１４６】
ゲル分析
精製されたＹＡＣおよびＢＡＣのＤＮＡは制限酵素および従来法の０．７％アガロースゲル分離により分析された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１）。５０〜２００ｋｂのより大きな断片は、ＰＦＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｃｈｅｆ  Ｍａｐｐｅｒ（商標））により、８℃で、０．５％ＴＢＥ中の０．８％ＰＦＣアガロースを用いて、１６時間、６Ｖ／ｃｍ、１０ｍＡ、２〜２０秒のスイッチタイムで分離された。精製により、得られた断片と配列分析から得られた予測サイズとの直接比較が可能となった。変化は、ＰＣＲおよび配列解析により分析された。
【０１４７】
マイクロインジェクション
非近交系のＳＤ／Ｈｓｄ系動物は、標準的なマイクロアイソレーターケージ中で、動物施設の適切な動物保護プロトコール（実験動物保護に対する認証評価およびアセスメントに関する協会（ＡＡＡＬＡＣ）により正式承認された）のもと、飼育された。ラットは、１４〜１０時間の明暗サイクルで、自由に食物と水を与えられて維持された。４〜５週齢のＳＤ／Ｈｓｄのメスのラットに、２０〜２５ＩＵのＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射し、４８時間後、非近交系のＳＤ／Ｈｓｄのオスとの交配の前に、２０〜２５ＩＵのｈＣＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射した。受精１細胞ステージの胚を、次のマイクロインジェクションのために回収した。操作された胚は、偽妊娠したＳＤ／Ｈｓｄのメスのラットに移送され、出産がなされた。
【０１４８】
組換えイムノグロブリン遺伝子座をコードする精製ＤＮＡが、マイクロインジェクション緩衝液（１０ｍＭスペルミンおよび１０ｍＭスペルミジンを含む）中に再懸濁された。ＤＮＡは、受精卵母細胞へ、０．５〜３ｎｇ／μｌの様々な濃度で注入された。
【０１４９】
ラットイムノグロブリン遺伝子に特異的なＺＦＮをコードするプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡが、受精卵母細胞へ、０．５〜１０ｎｇ／μｌの様々な濃度で注入された。
【０１５０】
Ｚｉｎｇ−ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
【０１５１】
ラットイムノグロブリン遺伝子に特異的なＺＦＮを作製した。
【０１５２】
ラットＣカッパに特異的なＺＦＮは、以下の結合部位を有した。
ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣtcgttgＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡ（配列番号１）
【０１５３】
ラットＪ遺伝子座配列に特異的なＺＦＮは、以下の結合部位を有した。
ＣＡＧＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣagctgaＧＴＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧ（配列番号２）および
ＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡgcagcＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴ（配列番号３）
【０１５４】
トランス遺伝子座を有するラット
非再構成構造中の人工重鎖イムノグロブリン遺伝子座を担持するトランスジェニックラットを作製した。含まれる定常領域遺伝子は、ＩｇＭ，ＩｇＤ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび３’エンハンサーをコードする。トランスジェニックラットのＲＴ−ＰＣＲおよび血清分析（ＥＬＩＳＡ）により、トランスジェニックイムノグロブリン遺伝子座の有効な再構成、および血清中の様々なアイソタイプの重鎖のみ抗体の発現が確認された。トランスジェニックラットの免疫化は、高い親和性の抗原特異的な重鎖のみ抗体の産生をもたらした。
【０１５５】
新規Ｚｉｎｇ−ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼのノックアウト技術
トランスジェニックラットにおける重鎖のみ抗体の産生をさらに最適化するために、不活性な内在性ラットイムノグロブリン遺伝子座をノックアウトしたラットが作製された。
【０１５６】
ラット重鎖イムノグロブリン重鎖の発現およびラット軽鎖の発現を不活性化するために、ＺＦＮをラット胚の単一細胞へマイクロインジェクションした。その後、胚は偽妊娠のメスのラットへ移送され、出産がなされた。変異した重鎖および軽鎖遺伝子座を有する動物は、ＰＣＲにより識別された。そのような動物の分析により、変異動物中のラットイムノグロブリン重鎖および軽鎖の発現が不活性化されているのが実証された。
【実施例２】
【０１５７】
ラットにおける抗原特異的重鎖のみ抗体の産生
ラットにおける抗原特異的重鎖のみ抗体の産生のために、重鎖のみ抗体を発現する遺伝子操作ラットを様々な方法で免疫化した。
【０１５８】
不活性化ウイルスでの免疫化
様々な異なるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ遺伝子を有するインフルエンザウイルスが、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡより提供される。保管ウイルスを、１０日齢の発育鶏卵の尿膜腔で増殖させ、超遠心法により１０％〜５０％のショ糖勾配を通して精製される。ウイルスはリン酸緩衝の生理食塩水中に再懸濁され、０．０５％ホルマリンで４℃で、２週間処理され、不活性化される。不活性化されたウイルスおよびミョウバン溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）が３：１の比率で混合され、免疫化の前に、室温で１時間、インキュベートされる。重鎖のみ抗体を発現する遺伝子操作ラットが、全不活性で免疫化される。
【０１５９】
タンパク質またはペプチドでの免疫化
免疫原（タンパク質またはペプチド）は、一般的に、滅菌生理食塩水で０．０５〜０．１５ｍｌに希釈され、アジュバントと組み合わされ、最終体積は０．１〜０．３ｍｌとなる。多くの適切なアジュバントが市販されている（すなわち、熱不活性化百日咳菌、水酸化アルミニウムゲル、ＱｕｉｌＡもしくはサポニン、細菌リポ多糖または抗ＣＤ４０）が、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）の活性を有するものはない。可溶性免疫原（たとえばタンパク質およびペプチド）の濃度は、最終調製物中で５μｇおよび５ｍｇの間で変化し得る。ＣＦＡでの免疫原の最初の免疫化（プライミング）は、腹腔内および／または皮下および／または筋肉内に投与される。もし損なわれていない細胞を免疫原として用いる場合、腹腔内および／または静脈内に注入するのが最も良い。細胞は生理食塩水で希釈され、１回の注射ごとに、１００万〜２０００万個の細胞が投与される。ラットの中で生き抜いた細胞は、最も良い免疫化の結果を生み出す。ＣＦＡでの免疫原での最初の免疫化の後、ＩＦＡでの二回目の免疫化（ブースター）が、通常は、４週間後に実行される。この順番により、高い親和性の抗体を産生するＢ細胞の発生がもたらされる。もし免疫原が弱いブースターである場合、強い液性応答が得られるまで２週間ごとに免疫化が施行される。免疫原の濃度は、ブースター免疫化におけるほうが低くすることができ、そして静脈内経路を用いることができる。２週間ごとにラットから血清を採取し、液性応答が測定される。
【０１６０】
抗ヒトＣＤ３ｅ抗体の作製のために、遺伝子操作ラットがヒスチジンでタグ化された組換えヒトＣＤ３ｅ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ，  Ｓｈｉｒｌｅｙ，  ＮＹ）で免疫化される。
【０１６１】
細胞での免疫化
ヒトジャーカット細胞を組織培養中で増殖させる。ヒトＣＤ３ｅの発現は、ジャーカット細胞とＯＫＴ３モノクローナル抗体とのインキュベーションにより分析される。その後、結合しなかったＯＫＴ３を、細胞洗浄により除去し、結合したＯＫＴ３を、蛍光結合抗マウスＩｇＧおよびフローサイトメトリー分析で検出する。
【０１６２】
Ｔｒａｎｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されるように、エレクトロポレーションにより、ラットＴ細胞ハイブリドーマに、ヒトＣＤ３をコードする真核細胞発現プラスミドをトランスフェクトする。ヒトＣＤ３を発現するトランスフェクタントを、ＦＡＣＳにより濃縮し、組織培養中で増殖させる。
【０１６３】
ＨＣＯ抗体を発現する遺伝子操作ラットを、３０×１０(６)のジャーカット細胞を腹腔内投与することにより免疫化する。最初の免疫化後の４および８週で、ラットを、ヒトＣＤ３を発現するラットＴ細胞で免疫化する。抗ヒトＣＤ３ｅ重鎖のみ抗体を発現する動物を、モノクローナル重鎖のみ抗ＣＤ３ｅ抗体の単離に用いる。
【０１６４】
ＤＮＡベースの免疫化プロトコール
遺伝子ワクチンまたは抗原をコードするＤＮＡの免疫化のための使用は、ラットにおける強い抗体応答発生の代替方法を表す。
【０１６５】
ＤＮＡ接種の経路は、一般に、皮膚、筋肉および抗原のトランスフェクションおよび発現をサポートする他の経路である。たとえばインフルエンザウイルスヘマグルチニン糖タンパク質または他のヒトもしくはウイルス抗原等の抗原を発現するよう設計された精製プラスミドＤＮＡが用いられる。ＤＮＡ接種の経路には、以下が挙げられる。静脈内（尾静脈）、腹腔内、筋肉内（両側大腿四頭筋）、経鼻、皮内（たとえば足裏）、および皮下（たとえば襟首）。一般に、１００μｌの生理食塩水中、１０〜１００μｇのＤＮＡが、接種部位ごとに投与されるか、または、細胞の取り込みおよびトランスフェクションを促進する、たとえば金粒子もしくは信頼できる製剤（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｅｌｌａｒｔ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝ｇｅｎｅｔｉｃ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ＆ｍｅｎｕ＝３．３）等の適切な媒体と投与される。免疫化スキームは、上述のプロトコールに類似しており、最初の免疫化とそれに続くブースター免疫化がある。
【０１６６】
重鎖のみ抗体の精製
抗体の精製のために、免疫化したラットから血液を採取し、血清または血漿を遠心により得て、凝集した細胞沈殿物を、血清抗体を含有する液体上相から分離する。血清または血漿からの抗体は、標準手段により精製される。そのような手段として、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および／または親和性クロマトグラフィーが挙げられる。ＩｇＧ精製のために、プロテインＡまたはプロテインＧを用いることができる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩ，１４２，３１４５，１９８９）。
【実施例３】
【０１６７】
抗体を発現するＢ細胞の、ラットからの単離
脾臓、リンパ節または末梢血からのＢ細胞の単離
単一細胞の懸濁液を、免疫化したラットの脾臓またはリンパ節から調製する。細胞は、赤血球の除去の後、またはＢ細胞およびメモリーＢ細胞、抗原特異的Ｂ細胞もしくはプラズマ細胞の単離の後で、さらなる濃縮を行うことなく使用することができる。濃縮はより良い結果をもたらし、最低限、赤血球の除去が推奨される。メモリーＢ細胞は、無用の細胞の除去および引き続くポジティブ選択により単離することができる。無用の細胞、たとえばＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、血小板および赤血球は、ＣＤ２，ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２３、ＣＤ３６、ＣＤ４３およびＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対する抗体のカクテルを用いて除去される。ＩｇＧまたはＣＤ１９に特異的な抗体を用いたポジティブ選択は、より高度に濃縮されたＢ細胞をもたらす（５０〜９５％の間）。抗原特異的Ｂ細胞は、蛍光マーカーおよび／または磁性ビーズでタグ化された抗原に細胞を露出させることにより得られる。その後、蛍光色素および／または磁性ビーズでタグ化された細胞は、ＦＡＣＳソーター（フローサイトメトリー、または蛍光活性化セルソーター［ＦＡＣＳ］）および／またはマグネットを使用して分離される。プラズマ細胞は表面Ｉｇをほとんど発現していない可能性があるため、細胞内染色を適用してもよい。ＩｇＭ陽性Ｂ細胞メモリー細胞が、ＩｇＭおよびＣＤ２７に特異的な抗体を用いて単離される。
【０１６８】
蛍光活性化細胞ソーティングによるＢ細胞の単離
ＦＡＣＳをベースとした方法を用いて、細胞が、その個々の特性により分離される。細胞が、単一細胞の懸濁液中にあることが重要である。免疫化されたラットの末梢血、脾臓または他の免疫器官から調製された単一細胞の懸濁液は、蛍光色素でタグ化された、たとえばＣＤ１９、ＣＤ１３８およびＣＤ２７等のＢ細胞マーカーに対して特異的な抗体と混合される。代わりの方法としては、細胞は、蛍光色素でタグ化された抗原とインキュベートされる。細胞濃度は、たとえばＰＢＳ等の適切な緩衝液中で、１００万〜２０００万細胞／ｍｌの間である。たとえば、メモリーＢ細胞は、ＣＤ２７陽性およびＣＤ４５Ｒ陰性の細胞を選択することにより単離することができる。プラズマ細胞は、ＣＤ１３８陽性およびＣＤ４５Ｒ陰性の細胞を選択することにより単離することができる。細胞をＦＡＣＳ装置にロードし、ゲーティングされた細胞を、培地を含む９６ウェルのプレート内または試験管内へと置く。必要に応じて、各蛍光色素に対する陽性対照を実験で用いることにより、バックグラウンドを除去し、コンペンセーションを算出することができる。
【０１６９】
骨髄からのＢ細胞の単離
骨髄プラズマ細胞（ＢＭＰＣ）は、免疫化した動物から、Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に記載のように単離する。収集した脛骨および大腿骨から筋肉および脂肪組織を除去する。脛骨および大腿骨双方の末端を外科用鋏で切り、骨髄を２６ゲージのインスリン注射器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ）でフラッシュアウトする。骨髄を、滅菌フィルターを通した緩衝液ｎｏ．１（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に回収する。骨髄細胞は、セルストレイナー（ＢＤ）を介したろ過により、機械的な破砕で回収し、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５０ｍｌの試験管内（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ）に回収する。骨髄細胞を、３３５ｇで１０分間、４℃で遠心する。上清をデカントし、細胞ペレットを３ｍｌの赤血球溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に再懸濁し、２５℃で５分間、緩やかに振盪する。細胞懸濁液は２０ｍｌのＰＢＳで希釈し、４℃で１０分間、３３５ｇで遠心する。上清をデカントし、細胞ペレットを１ｍｌの緩衝液ｎｏ．１中に再懸濁する。
【０１７０】
骨髄細胞懸濁液を、ビオチニル化した抗ＣＤ４５Ｒ抗体および抗ＣＤ４９ｂ抗体とインキュベートする。次いで、細胞懸濁液を、４℃で２０分間、回転させる。次いで、９３０ｇで、６分間、４℃で遠心し、上清を除去し、細胞ペレットを１．５ｍｌの緩衝液ｎｏ．１に再懸濁する。ストレプトアビジンを結合したＭ２８磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、メーカーのプロトコールに従い洗浄および再懸濁する。磁性ビーズ（５０μｌ）を、各細胞懸濁液に加え、混合物を４℃で２０分間、回転させる。次いで、細胞懸濁液をＤｙｎａｂｅａｄマグネット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に置き、上清（陰性分画、細胞がビーズに結合しなかった）を集め、ビーズに結合した細胞を捨てる。
【０１７１】
前洗浄したストレプトアビジンＭ２８０磁性ビーズを、３０分間、４℃で、磁性ビーズ混合物２５μｌあたり０．７５μｇの抗体で、ビオチニル化した抗ＣＤ１３８抗体とインキュベートする。次いで、ビーズをメーカーのプロトコールに従い洗浄し、緩衝液ｎｏ．１に再懸濁する。上述のように回収した陰性細胞分画（ＣＤ４５Ｒ＋およびＣＤ４９ｂ＋を喪失した細胞）を、５０μｌのＣＤ１３８結合マグネチックビーズとインキュベートし、懸濁液を４℃で３０分間、回転する。ＣＤ１３８＋結合細胞とビーズを、マグネットで単離し、緩衝液ｎｏ．１で３回洗浄し、陰性（ＣＤ１３８−）のビーズ非結合の細胞を捨てる。陽性ＣＤ１３８＋ビーズ結合細胞を集め、さらなる処理まで、４℃で保管する。
【実施例４】
【０１７２】
ハイブリドーマの作製
単離されたＢ細胞を、たとえばＸ６３またはＹＢ２／０細胞（Ｋｏｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５に記載）等のミエローマ細胞と融合することにより、不死化する。ハイブリドーマ細胞を選択培地中で培養し、抗体産生ハイブリドーマを限界希釈または単一細胞ソーティングにより作製する。
【実施例５】
【０１７３】
重鎖のみ抗体をコードするｃＤＮＡの単離
単離された細胞からｃＤＮＡ配列を作製
単離された細胞を、９３０ｇで、４℃で５分間、遠心する。細胞をＴＲＩ試薬で溶解し、全ＲＮＡをＲｉｂｏｐｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）中で、メーカーのプロトコールに従い、単離する。ｍＲＮＡを、ｄＴレジンおよびｐｏｌｙ（Ａ）ｐｕｒｉｓｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）で、メーカーのプロトコールに従い、全ＲＮＡから単離する。ｍＲＮＡの濃度は、ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で測定する。
【０１７４】
単離されたｍＲＮＡを、Ｍａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いた逆転写による、最初のｃＤＮＡ鎖の合成のために用いる。ｃＤＮＡ合成は、Ｒｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）のメーカーのプロトコールに従い、５０ｎｇのｍＲＮＡテンプレートおよびオリゴｄＴプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを開始することにより、行われる。ｃＤＮＡ構築の後、ＰＣＲ増幅を行い、重鎖のみ抗体を増幅する。プライマーのリストを、表１に示す。
【表１】
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【０１７５】
５０μｌのＰＣＲ反応は、０．２ｍＭのフォワードおよびリバースプライマーの混合物、５μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）、２μｌの非精製ｃＤＮＡ、１μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および３９μｌの再蒸留水からなる。ＰＣＲの温度サイクルのプログラムは、９２℃で３分、そして９２℃を１分、５０℃を１分、７２℃を１分の組み合わせで４サイクル、そして９２℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分の組み合わせで４サイクル、そして９２℃で１分、６３℃で１分、７２℃で１分の組み合わせで２０サイクル、７２℃で７分、４℃で保管である。ＰＣＲ遺伝子産物は、ゲル精製され、ＤＮＡ配列解析が行われる。
【実施例６】
【０１７６】
組換え重鎖のみ抗体のクローニングと発現
ＰＣＲ作製物を、プラスミドベクターへサブクローニングする。真核細胞中での発現のために、重鎖のみ抗体をコードしているｃＤＮＡを発現ベクター（Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に記載）へクローニングする。
【０１７７】
別の方法として、重鎖のみ抗体をコードする遺伝子を、プラスミドを産生するミニサークル（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に記載）にクローニングする。
【０１７８】
別の方法として、重鎖のみ抗体をコードする遺伝子を、改変熱力学平衡完全核精製ＰＣＲ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ＰＣＲ）（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を用いて重複しているオリゴヌクレオチドから合成し、真核生物発現ベクターへとクローニングする。
【０１７９】
別の方法として、重鎖のみ抗体をコードする遺伝子を合成し、プラスミドにクローニングする。
【０１８０】
人工染色体中で様々な重鎖のみ抗体をコードする複合発現カセットの編成のために、複合発現カセットを互いに結合させ、次いで、ＢＡＣベクター内へとクローニングし、細菌中で増殖させる。トランスフェクションのために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞が用いられる（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／１８２９００１５．ｐｄｆ）。別の方法として、結合された発現カセットをさらに酵母人工染色体腕と結合させ、酵母細胞中で増殖させる（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１８１】
プラスミド精製
約５ｍｌ、またはそれ以上の、一晩培養した細菌培養物からのプラスミドの単離のために、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入したＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドミニプレップキットを用いる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｉｏｌｏｇｙ／ｄｎａ−ａｎｄ−ｒｎａ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ−ｋｉｔ．ｈｔｍｌ）。これには、遠心により細菌細胞を採取することを含み、その後、アルカリ溶解が行われる。ＤＮＡは、次いで、カラム結合し、洗浄および溶出され、消化または配列解析に用いられる。
【０１８２】
ＢＡＣ精製
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＢＡＣ１００は、ＢＡＣ精製のために設計されたキットである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｔａｂｎｏ＝２＆ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｄ＝１８６８０２）。これのために、２００ｍｌ培養物から細菌が回収され、改変アルカリ／ＳＤＳ法を用いて溶解される。細菌溶解物は、ろ過により浄化され、平衡化されたカラムにロードされ、そのカラムにおいて、プラスミドＤＮＡは陰イオン交換レジンへ結合する。引き続く洗浄工程の後、精製プラスミドＤＮＡは、高塩濃度緩衝液中に溶出され、イソプロパノールで沈殿される。プラスミドＤＮＡは、さらなる利用のために、ＴＥ緩衝液中で再構築される。
【０１８３】
ＹＡＣ精製
消化後の直線状ＹＡＣ、環状ＹＡＣおよびＢＡＣ断片は、Ｅｌｕｔｒａｐ（商標）を用いる電気溶出（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）により，従来法で泳動された０．８％アガロースゲル、またはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）から切り出されたストリップから精製される。精製されたＤＮＡは沈殿し、所望の濃度で、緩衝液中に再溶解される。
【０１８４】
酵母からの環状ＹＡＣの精製は、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ  シリカベースの陰イオン交換レジン（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実行される。簡潔に述べると、スフェロプラストが、ザイモリエースまたはリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）を用いて作製、および沈殿される（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。次いで、細胞をアルカリ溶解させ、ＡＸ１００カラムに結合させ、低コピープラスミドに対するＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ法に記載されているように溶出される。混入した酵母の染色体ＤＮＡは、Ｐｌａｍｉｄ‐Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて加水分解され、次いでＳｕｒｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いて最終的に浄化される。次いで、ＤＨ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の分注物を、環状ＹＡＣで形質転換し、ＢＡＣコロニーを得る（上述を参照のこと）。ＢＡＣベクターＤＮＡ（約１０ｋｂ）からの挿入ＤＮＡ（１５０〜２００ｋｂ）の分離のために、セファロース４Ｂ−ＣＬでのろ過工程が用いられる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）
【０１８５】
プラスミドまたはＢＡＣ  ＤＮＡとの細胞のトランスフェクション
組換え重鎖のみ抗体の発現のために、Ａｎｄｒｅａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，１９８９、Ｂａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｔｔｏｎ，１９９７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ／ｃｂ３／ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌに記載されるように、真核細胞がトランスフェクトされる。重鎖のみ抗体を発現する細胞を、様々な選別法を用いて単離する。限界希釈または細胞ソーティングは、単一細胞の単離に用いられる。クローンは重鎖のみ抗体の発現について分析される。
【実施例７】
【０１８６】
ＣＤ３エプシロンと反応する一本重鎖ポリペプチドの産生
ＨＣＯＡラットを米国特許第７，７２８，１１４Ｂ２に記載のように免疫化する。
【０１８７】
ラットの脾臓細胞をミエローマ細胞と融合し、Ｂ細胞ハイブリドーマを抗ヒトＣＤ３ｅ抗体の発現に対してスクリーニングする。
【０１８８】
別の方法として、ラットＢ細胞を単離し、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９３，  １６０（１）：１１７−１２７に記載されるように、培養する。培養上清を、抗ヒトＣＤ３ｅ抗体の存在についてスクリーニングし、そのような抗体をコードするｃＤＮＡを、単離されたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより作製する。
【実施例８】
【０１８９】
二重特異性ＴＣＡの産生
ＣＨＯ細胞を抗体重鎖、抗体軽鎖および抗ＣＤ３重鎖のみ抗体をコードする３つの発現プラスミドとともにトランスフェクトする。ＴＣＡを発現するトランスフェクタントの選別に次いで、細胞をさらに組織培養培地中で増殖させる。培養上清から、プロテインＡクロマトグラフィーによりＴＣＡを精製し、次いで、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。
【０１９０】
精製された組換え重鎖のみ抗体の組成物は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０に記載の、分析陽イオン交換クロマトグラフィーおよび質量分析に基づく技術により、分析される。
【０１９１】
実施例のための参照文献
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Ｙａｎｇ  ＸＷ，  Ｍｏｄｅｌ  Ｐ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｔｚ  Ｎ  （１９９７）  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，  ８５９−８６５．
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【図１】
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【国際調査報告】
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