(57)【要約】  植物栽培部位における望ましくない植生を防除するための方法であって、前記部位において、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼもしくは突然変異型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(mut-HPPD)をコードするヌクレオチド配列および/またはクマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼもしくは突然変異型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(mut-HST)をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む植物を用意するステップと、前記部位に、有効量の前記除草剤を施用するステップとを含む前記方法を提供する。mut-HPPDを含む植物およびそのような植物を取得する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物栽培部位における望ましくない植生を防除するための方法であって、
a)前記部位において、
(i)クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼもしくは突然変異型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(mut-HPPD)をコードするヌクレオチド配列および/または
(ii)クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼもしくは突然変異型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(mut-HST)をコードするヌクレオチド配列
を含む少なくとも1つの核酸を含む植物を用意するステップ、ならびに
b)前記部位に、有効量の前記除草剤を施用するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
(i)のヌクレオチド配列が、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52の配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
(ii)のヌクレオチド配列が、配列番号47もしくは49の配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
植物が、(iii)除草剤耐性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのさらなる異種核酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
クマロン誘導体除草剤が1種以上の他のHPPDおよび/またはHST標的化除草剤と共に施用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52のヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む核酸によりコードされるmut-HPPDを用いることにより、または配列番号47もしくは49のヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む核酸によりコードされるmut-HSTを用いることにより、クマロン誘導体除草剤を同定するための方法。
【請求項７】
a)mut-HPPDをコードする核酸を含むトランスジェニック細胞または植物を作製するステップ、ここでmut-HPPDが発現され、
b)ステップa)のトランスジェニック細胞または植物および同じ品種の対照細胞または植物に、クマロン誘導体を施用するステップ、
c)前記試験化合物の施用後のトランスジェニック細胞または植物および対照細胞または植物の生長または生存能力を決定するステップ、および
d)トランスジェニック細胞または植物の生長と比較して対照細胞または植物に対して成長の低下を付与する試験化合物を選択するステップ、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性または耐性であるmut-HPPDをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
a)mut-HPPDをコードする核酸のライブラリーを作製するステップ、
b)細胞または植物中で前記核酸のそれぞれを発現させ、前記細胞または植物をクマロン誘導体で処理することにより、得られたmut-HPPDをコードする核酸の集団をスクリーニングするステップ、
c)mut-HPPDをコードする核酸の前記集団により提供される「クマロン誘導体」耐性レベルを、対照HPPDをコードする核酸により提供される「クマロン誘導体」耐性レベルと比較するステップ、および
d)対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較して、「クマロン誘導体」に対する有意に増大した耐性レベルを提供する少なくとも1つのmut-HPPDをコードする核酸を選択するステップ
を含む前記方法。
【請求項９】
ステップd)で選択されたmut-HPPDをコードする核酸が、対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較してクマロン誘導体除草剤に対する少なくとも2倍の耐性を提供する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抵抗性または耐性が、ステップa)のライブラリーの核酸配列を含むトランスジェニック植物を作製し、前記トランスジェニック植物を対照植物と比較することにより決定される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53の配列、またはその変異体もしくは誘導体を含むmut-HPPDをコードする単離された核酸。
【請求項１２】
核酸が、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法により同定可能である、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
野生型またはmut-HPPD核酸が、a)配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；b)配列番号47もしくは49に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；c)配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、もしくは48、50に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；d)a)〜c)のいずれかの少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；およびe)a)〜d)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、野生型またはmut-HPPD核酸により形質転換されたトランスジェニック植物細胞。
【請求項１４】
植物中での核酸の発現が、野生型品種の植物と比較してクマロン誘導体除草剤に対する植物の抵抗性の増大をもたらす、請求項１３に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１５】
アミノ酸配列が1個以上のアミノ酸位置において対応する野生型植物のHPPDのアミノ酸配列と異なり、位置236のアミノ酸がアラニン以外であり、位置411のアミノ酸がグルタミン酸以外であり、位置320のアミノ酸がロイシン以外であり、位置403のアミノ酸がグリシン以外であり、位置334のアミノ酸がロイシン以外であり、位置353のアミノ酸がロイシン以外であり、位置321のアミノ酸がプロリン以外であり、位置212のアミノ酸がバリン以外であり、および/または位置407のアミノ酸がグリシン以外であり、前記HPPDがその中で発現された場合、対応する野生型品種の植物と比較して除草剤耐性の増大を植物に対して付与する、配列番号2を含む突然変異誘発されたか、または組換えmut-HPPDを発現する植物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物、または請求項１４もしくは１５に記載の植物により産生される種子であって、野生型品種の種子と比較してクマロン誘導体除草剤に対する抵抗性の増大のための純粋種である、前記種子。
【請求項１７】
野生型品種の植物と比較してクマロン誘導体除草剤に対する抵抗性が増大したトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、
(a)植物細胞を、野生型またはmut-HPPD核酸を含む発現カセットで形質転換するステップ、および(b)該植物細胞から、クマロン誘導体除草剤に対する抵抗性が増大した植物を生成するステップ
を含み、野生型またはmut-HPPD核酸が、a)配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；b)配列番号47もしくは49に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；c)配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、48、50に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；d)a)〜c)のいずれかの少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；およびe)a)〜d)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、前記方法。
【請求項１８】
発現カセットが、植物において機能的である転写開始調節領域および翻訳開始調節領域をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその一部を同定または選択する方法であって、i)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその一部が、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体を含み、前記ポリヌクレオチドが選択マーカーとして用いられるmut-HPPDポリペプチドをコードし、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその一部が単離されたポリヌクレオチドをさらに含んでもよい、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその一部を用意するステップ、ii)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその一部を、少なくとも1つのクマロン誘導体化合物と接触させるステップ、iii)植物細胞、植物組織、植物またはその一部が、阻害化合物によって影響されるかどうかを決定するステップ、およびiv)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその一部を同定または選択するステップを含む、前記方法。
【請求項２０】
アミノ酸配列が1個以上のアミノ酸位置において対応する野生型植物のHPPDのアミノ酸配列と異なり、位置293のアミノ酸がグルタミン以外であり、位置335のアミノ酸がメチオニン以外であり、位置336のアミノ酸がプロリン以外であり、位置337のアミノ酸がセリン以外であり、位置363のアミノ酸がグルタミン酸以外であり、位置422のアミノ酸がグリシン以外であり、位置385のアミノ酸がロイシン以外であり、位置393のアミノ酸がイソロイシン以外であり、位置368のアミノ酸がロイシン以外であり、および/または位置421のアミノ酸がリシン以外であり、前記HPPDが、その中で発現された場合、対応する野生型品種の植物と比較して除草剤耐性の増大を植物に対して付与する、配列番号53を含む突然変異誘発されたか、または組換えmut-HPPDを発現する植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、除草剤に対する農業レベルの耐性を植物に付与するための方法に関する。特に、本発明は、「クマロン誘導体」除草剤に対する耐性が増大した植物に関する。より具体的には、本発明は、突然変異誘発および交雑育種および形質転換により「クマロン誘導体」除草剤に対する耐性が増大した植物を得る方法およびそれにより得られた植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレニルキノン、プラストキノンおよびトコフェロールの生合成における重要な酵素である4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(4-HPPD; EC 1.13.11.27)を阻害する除草剤は、1990年代初頭以来、選択的雑草防除に用いられてきた。それらは、その生合成経路において4-ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への変換を遮断する(Matringeら、2005, Pest Manag Sci., vol. 61:269-276; Mitchellら、2001, Pest Manag Sci. vol 57:120-128)。プラストキノンは、カロテノイド生合成における酵素フィトエンデサチュラーゼの必須のコファクターであると考えられている(BoegerおよびSandmann, 1998, Pestic Outlook, vol 9:29-35)。その阻害は、植物プラストキノンおよびビタミンEプールの枯渇をもたらし、漂白症状を誘導する。特に、光酸化に対する光化学系の保護因子としてのその機能におけるカロテノイドの喪失は、生長中の芽組織におけるクロロフィルおよび光合成膜の酸化的分解を誘導する。結果として、クロロプラストの合成および機能が阻害される(BoegerおよびSandmann, 1998)。酵素ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(HST)は、プラストキノン生合成経路におけるHPPD以後のステップを触媒する。HSTは、ホモゲンチジン酸を脱カルボキシル化し、また、ソラネシルジホスフェートからソラネシル基をそれに移すプレニルトランスフェラーゼであり、かくして、プラストキノンに向かう生合成経路に沿った中間体である2-メチル-6-ソラネシル-1,4-ベンゾキノール(MSBQ)を形成する。HST酵素は膜結合しており、それらをコードする遺伝子はプラスチド標的化配列を含む。
【０００３】
市販の4-HPPD阻害除草剤の最も重要な化合物クラスとしては、ピラゾロン、トリケトンおよびイソオキサゾールが挙げられる。これらの阻害剤は、安定なイオン双極子電荷移動複合体を形成することにより、活性部位における酵素に結合した鉄イオンへの基質4-ヒドロキシフェニルピルビン酸の結合を模倣する。4-HPPD阻害除草剤のうち、トリケトンスルコトリオンは、農業において用いられ、その作用機序が同定されたこの除草剤群の初めての例であった(Schulzら、1993, FEBS Lett. Vol 318:162-166)。トリケトンは、ブラシノキ植物であるカリステモン(Callistemon)種に由来する除草剤成分であるレプトスペルモンの誘導体であると報告されている(Leeら、1997, Weed Sci. Vol 45, 162-166)。
【０００４】
これらの分子のいくつかは、植物における反応の阻害が処理された植物の葉の白化および前記植物の死をもたらすため、除草剤として用いられてきた(Pallett, K. E.ら、1997 Pestic. Sci. 50 83-84)。HPPDが標的であり、技術水準において記載された除草剤は、特に、イソオキサゾール(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、米国特許第5,424,276号)、特に、トウモロコシのための選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル(EP496630、EP496631)、特に、2-シアノ-3-シクロプロピル-1-(2-SO2CH3-4-CF3フェニル)プロパン-1,3-ジオンおよび2-シアノ-3-シクロプロピル-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2フェニル)プロパン-1,3-ジオン、EP625505、EP625508、米国特許第5,506,195号に記載のものなどのトリケトン、特に、スルコトリオン、またはその他にピラゾリネートである。さらに、周知の除草剤であるトプラメゾンは、感受性植物種において4-HPPDを阻害する上記の漂白除草剤と同じ型の光毒性症状を惹起し、生長中の芽組織におけるクロロフィル喪失および壊死をもたらす。トプラメゾンは、ピラゾロンまたはベンゾイルピラゾールの化合物クラスに属し、2006年に商業的に導入された。発芽後に施用した場合、この化合物はトウモロコシにおける広範囲の一年草および広葉雑草を選択的に防除する。
【０００５】
「クマロン誘導体除草剤」に対する植物耐性は、いくつかの特許においても報告されている。国際特許出願WO2010/029311は、植物における除草剤耐性を惹起するためのHPPD核酸および/またはHST核酸の使用を一般的に記載する。WO2009/090401、WO2009/090402、WO2008/071918、WO2008/009908は、特定の「クマロン誘導体除草剤」および「クマロン誘導体除草剤」耐性植物系を具体的に開示する。
【０００６】
除草剤耐性植物を作製するための3つの主な戦略が利用可能である、すなわち、(1)除草剤、もしくはその活性代謝物を、非毒性生成物に転換する酵素、例えば、ブロモキシニルもしくはBastaに対する耐性のための酵素などを用いて除草剤を解毒すること(EP242236、EP337899)；(2)標的酵素を、除草剤、もしくはその活性代謝物に対する感受性が低い機能的酵素、例えば、グリホサートに対する耐性のための酵素などに突然変異させること(EP293356、Padgette S. R.ら、J.Biol. Chem., 266, 33, 1991)；または(3)その阻害剤の存在にも拘らず利用可能な十分な機能的酵素を有するために、この酵素の速度定数を考慮して、除草剤に関して十分である量の標的酵素を植物中で産生するように、感受性酵素を過剰発現させること。第3の戦略は、HPPD阻害剤に対して耐性である植物を上手く取得するために記載されたものであった(WO96/38567）。US2009/0172831は、アミノ酸配列がHPPD阻害剤除草剤化合物、特に、トリケトン阻害剤特異的HPPD突然変異体に抵抗性であるような酵素活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を開示する。
【０００７】
現在まで、先行技術は、少なくとも1つの突然変異HPPD核酸を含有するクマロン誘導体除草剤耐性植物を記載していなかった。また、先行技術はHPPD遺伝子が由来するゲノム以外のゲノム上に突然変異を含有するクマロン誘導体除草剤耐性作物植物も記載していない。従って、さらなるゲノムおよび種に由来するクマロン誘導体除草剤耐性遺伝子の同定が、当業界で必要である。クマロン誘導体除草剤などの除草剤に対する耐性が増大し、少なくとも1つの突然変異HPPD核酸を含有する作物植物も、当業界で必要である。また、そのような作物植物の近辺での雑草生長を防除するための方法も必要である。これらの組成物および方法は、作物植物を含む領域に除草剤を施用する場合の技術を超えるスプレーの使用を可能にするであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP418175
【特許文献２】EP470856
【特許文献３】EP487352
【特許文献４】EP527036
【特許文献５】EP560482
【特許文献６】EP682659
【特許文献７】米国特許第5,424,276号
【特許文献８】EP496630
【特許文献９】EP496631
【特許文献１０】EP625505
【特許文献１１】EP625508
【特許文献１２】米国特許第5,506,195号
【特許文献１３】WO 2010/029311
【特許文献１４】WO2009/090401
【特許文献１５】WO2009/090402
【特許文献１６】WO2008/071918
【特許文献１７】WO2008/009908
【特許文献１８】EP242236
【特許文献１９】EP337899
【特許文献２０】EP293356
【特許文献２１】WO96/38567
【特許文献２２】US2009/0172831
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Matringeら、2005, Pest Manag Sci., vol. 61:269-276
【非特許文献２】Mitchellら、2001, Pest Manag Sci. vol 57:120-128
【非特許文献３】BoegerおよびSandmann, 1998, Pestic Outlook, vol 9:29-35
【非特許文献４】Schulzら、1993, FEBS Lett. Vol 318:162-166
【非特許文献５】Leeら、1997, Weed Sci. Vol 45, 162-166
【非特許文献６】Pallett, K. E.ら、1997 Pestic. Sci. 50 83-84
【非特許文献７】Padgette S. R.ら、J.Biol. Chem., 266, 33, 1991
【発明の概要】
【００１０】
植物栽培部位における望ましくない植生を防除（コントロール）するための方法であって、
a)前記部位において、
(i)クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼもしくは突然変異型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(mut-HPPD)をコードするヌクレオチド配列および/または
(ii)クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼもしくは突然変異型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(mut-HST)をコードするヌクレオチド配列
を含む少なくとも1つの核酸を含む植物を用意するステップと、
b)前記部位に、有効量の前記除草剤を施用するステップと
を含む前記方法に関する本発明により、問題が解決される。
【００１１】
さらに、本発明は、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52のヌクレオチド配列、もしくはその変異体を含む核酸によりコードされたmut-HPPDを用いることにより、および/または配列番号47もしくは49のヌクレオチド配列もしくはその変異体を含む核酸によりコードされたmut-HSTを用いることにより、クマロン誘導体除草剤を同定するための方法に関する。
【００１２】
前記方法は、
a)野生型またはmut-HPPDをコードする核酸を含み、野生型またはmut-HPPDが発現されるトランスジェニック細胞または植物を作製するステップと、
b)クマロン誘導体除草剤を、a)のトランスジェニック細胞または植物および同じ品種の対照細胞または植物に施用するステップと、
c)前記試験化合物の施用後のトランスジェニック細胞または植物および対照細胞または植物の生長または生存能力を決定するステップと、
d)トランスジェニック細胞または植物の生長と比較して、対照細胞または植物に対して生長の低下を付与する試験化合物を選択するステップと
を含む。
【００１３】
別の目的は、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性または耐性であるmut-HPPDをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
a)mut-HPPDをコードする核酸のライブラリーを作製するステップと、
b)細胞または植物中で前記核酸のそれぞれを発現させ、前記細胞または植物をクマロン誘導体除草剤で処理することにより、得られたmut-HPPDをコードする核酸の集団をスクリーニングするステップと、
c)mut-HPPDをコードする核酸の前記集団により提供されるクマロン誘導体除草剤耐性レベルを、対照HPPDをコードする核酸により提供されるクマロン誘導体除草剤耐性レベルと比較するステップと、
d)対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較して、クマロン誘導体除草剤に対する有意に増大した耐性レベルを提供する少なくとも1つのmut-HPPDをコードする核酸を選択するステップと
を含む前記方法に関する。
【００１４】
好ましい実施形態においては、ステップd)で選択されたmut-HPPDをコードする核酸は、対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較して、クマロン誘導体除草剤に対する少なくとも2倍（フォールド）以上高い耐性を提供する。
【００１５】
ステップa)のライブラリーの核酸配列を含むトランスジェニック植物を作製し、前記トランスジェニック植物を対照植物と比較することにより、抵抗性または耐性を決定することができる。
【００１６】
別の目的は、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性または耐性であるmut-HPPDまたはmut-HSTをコードする核酸を含有する植物または藻類を同定する方法であって、
a)植物細胞または緑藻類の培養物におけるクマロン誘導体除草剤の有効量を同定するステップと、
b)前記植物細胞または緑藻類を、突然変異誘発剤で処理するステップと、
c)前記突然変異誘発細胞集団を、ステップa)で同定された有効量のクマロン誘導体除草剤と接触させるステップと、
d)これらの試験条件を生き延びる少なくとも1個の細胞を選択するステップと、
e)ステップd)で選択された細胞からHPPDおよび/またはHST遺伝子をPCR増幅し、配列決定し、そのような配列を、それぞれ野生型HPPDまたはHST遺伝子配列を比較するステップと
を含む、前記方法に関する。
【００１７】
好ましい実施形態においては、突然変異誘発剤は、メタンスルホン酸エチルである。
【００１８】
別の目的は、mut-HPPDをコードする単離された核酸であって、好ましくは、上記方法により同定可能である前記核酸に関する。
【００１９】
別の実施形態においては、本発明は、野生型もしくはmut-HPPD核酸により形質転換された植物細胞または野生型もしくはmut-HPPD核酸を発現する、好ましくは、過剰発現する植物を得るために突然変異された植物であって、前記植物細胞中での前記核酸の発現が植物細胞の野生型品種と比較してクマロン誘導体除草剤に対する抵抗性または耐性の増大をもたらす、前記植物に関する。
【００２０】
好ましい実施形態においては、本発明の植物細胞は、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52の配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む野生型またはmut-HPPD核酸により形質転換される。
【００２１】
別の実施形態においては、本発明は、本発明による植物細胞を含むトランスジェニック植物であって、植物中での核酸の発現がその植物の野生型品種と比較してクマロン誘導体除草剤に対する植物の抵抗性の増大をもたらす、前記トランスジェニック植物に関する。
【００２２】
本発明の植物は、トランスジェニックであっても、または非トランスジェニックであってもよい。
【００２３】
好ましくは、植物中での核酸の発現は、その植物の野生型品種と比較してクマロン誘導体除草剤に対する植物の抵抗性の増大をもたらす。
【００２４】
別の実施形態においては、本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物により産生された種子であって、その種子の野生型品種と比較してクマロン誘導体除草剤に対する抵抗性の増大のための純粋種である前記種子に関する。
【００２５】
別の実施形態においては、本発明は、野生型品種の植物細胞と比較してクマロン誘導体除草剤に対する耐性が増大したトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、植物細胞を、野生型またはmut-HPPD核酸を含む発現カセットで形質転換するステップを含む前記方法に関する。
【００２６】
別の実施形態においては、本発明は、(a)植物細胞を野生型またはmut-HPPD核酸を含む発現カセットで形質転換するステップと、(b)前記植物細胞から、クマロン誘導体除草剤に対する抵抗性が増大した植物を生成するステップとを含む、トランスジェニック植物を作製する方法に関する。
【００２７】
好ましくは、発現カセットは、植物において機能的である転写開始調節領域および翻訳開始調節領域をさらに含む。
【００２８】
別の実施形態においては、本発明は、選択マーカーとしての本発明のmut-HPPDの使用に関する。本発明は、形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその部分を同定または選択する方法であって、a)本明細書の以降に記載される本発明のmut-HPPDポリペプチドをコードする単離された核酸を含み、ポリペプチドが選択マーカーとして用いられ、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその部分が場合により、対象のさらなる単離された核酸を含んでもよい、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその部分を用意するステップと、b)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその部分を、少なくとも1つのクマロン誘導体阻害化合物と接触させるステップと、c)植物細胞、植物組織、植物またはその部分が阻害剤または阻害化合物により影響されるかどうかを決定するステップと、d)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはその部分を同定または選択するステップとを含む、前記方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、除草剤耐性に対するさらなる改善を設計するための分子モデリング研究において有用である、本明細書に記載の突然変異を含む精製されたmut-HPPDタンパク質において具体化される。タンパク質の精製方法は周知であり、市販の製品または例えば、Protein Biotechnology, WalshおよびHeadon (Wiley, 1994)に記載のような特殊設計された方法を用いて容易に達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】クラミドモナス・レインハードチ(Chlamydomonas reinhardtii)(Cr_HPPD1a、Cr_HPPD1b)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)(Pp_HPPD1)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)(Osj_HPPD1)、トリチカム・エスチバム(Triticum aestivum)(Ta_HPPD1)、ジー・メイズ(Zea mays)(Zm_HPPD1)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)(At_HPPD)、グリシン・マックス(Glycine max)(Gm_HPPD)およびビティス・ビニフェラ(Vitis vinifera)(Vv_HPPD)に由来するHPPD酵素のアミノ酸配列アラインメントおよび保存された領域を示す図である。*ゲノム配列決定計画に由来する配列。遺伝子座ID：GRMZM2G088396。**NCBI GenPept受託番号CAG25475に基づくアミノ酸配列。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２】HPPD/HST配列を用いるダイズ形質転換に用いられる植物形質転換ベクターのベクターマップを示す図である。
【図３】ホルデウム(Hordeum)野生型HPPD(HvHPPD、配列番号1/2)を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ(Arabidopsis)実生を用いる発芽アッセイを示す図である。植物を、(A)3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オールおよび(B)1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-3-(2,4,6-トリクロロ-3-ピリジル)ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール上で発芽させた。
【図４−１】ホルデウム野生型HPPD(配列番号2、事象LJ387およびAV4553)；シネコシスティス(Synechocystis)HPPD(配列番号20、事象LG6156)およびシロイヌナズナHPPD(配列番号53)突然変異M335H(事象HT1833)を発現するトランスジェニックT0ダイズ挿し木に対する除草剤噴霧試験を示す図である。非形質転換対照植物を、野生型として印を付ける。用いたクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オールである。
【図４−２】図４−１の続きである。
【００３１】
配列表
【表１】
2014534816.tif 000002
【００３２】
2014534816.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書において、冠詞「a」および「an」は、1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)のその冠詞の文法的目的語を指すために用いられる。
【００３４】
本明細書で用いられる単語「含む(comprising)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、記述される要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の含有を意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の排除を意味しないと理解されるであろう。
【００３５】
本発明者らは、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、または53を含む野生型または突然変異型HPPD酵素を過剰発現させることにより、植物の除草剤耐性または抵抗性を顕著に増大させることができることを見出した。
【００３６】
したがって本発明は、植物栽培部位における望ましくない植生を防除するための方法であって、
a)前記部位において、
(i)クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)もしくは突然変異型ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(mut-HPPD)をコードするヌクレオチド配列および/または
(ii)クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性もしくは耐性である野生型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(HST)もしくは突然変異型ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(mut-HST)をコードするヌクレオチド配列
を含む少なくとも1つの核酸を含む植物を用意するステップと、
b)前記部位に、有効量の前記除草剤を施用するステップと
を含む前記方法に関する。
【００３７】
用語「望ましくない植生の防除」は、雑草の殺傷および/またはさもなければ雑草の正常な生長の遅延もしくは阻害を意味すると理解されるべきである。雑草は、最も広い意味で、それらが望ましくない場所で生長する全ての植物を意味すると理解される。本発明の雑草としては、例えば、双子葉植物および単子葉植物の雑草が挙げられる。双子葉植物の雑草としては、限定されるものではないが、シナピス(Sinapis)属、レピジウム(Lepidium)属、ガリウム(Galium)属、ステラリア(Stellaria)属、マトリカリア(Matricaria)属、アンテミス(Anthemis)属、ガリンソガ(Galinsoga)属、シェノポジウム(Chenopodium)属、ウルティカ(Urtica)属、セネシオ(Senecio)属、アマランタス(Amaranthus)属、ポルツラカ(Portulaca)属、キサンチウム(Xanthium)属、コンボルブルス(Convolvulus)属、イポメア(Ipomoea)属、ポリゴナム(Polygonum)属、セスバニア(Sesbania)属、アンブロシア(Ambrosia)属、シルシウム(Cirsium)属、カルドゥウス(Carduus)属、ソンクス(Sonchus)属、ソラナム(Solanum)属、ロリッパ(Rorippa)属、ロタラ(Rotala)属、リンデルニア(Lindernia)属、ラミウム(Lamium)属、ベロニカ(Veronica)属、アブチロン(Abutilon)属、エメックス(Emex)属、ダツラ(Datura)属、ビオラ(Viola)属、ガレオプシス(Galeopsis)属、パパベル(Papaver)属、センタウレア(Centaurea)属、トリフォリウム(Trifolium)属、ラヌンクルス(Ranunculus)属、およびタラキサカム(Taraxacum)属の雑草が挙げられる。単子葉植物の雑草としては、限定されるものではないが、エキノクロア(Echinochloa)属、セタリア(Setaria)属、パニカム(Panicum)属、デジタリア(Digitaria)属、フレウム(Phleum)属、ポア(Poa)属、フェスツカ(Festuca)属、エレウシン(Eleusine)属、ブラキアリア(Brachiaria)属、ロリウム(Lolium)属、ブロムス(Bromus)属、アベナ(Avena)属、シペルス(Cyperus)属、ソルガム(Sorghum)属、アグロピロン(Agropyron)属、シノドン(Cynodon)属、モノコリア(Monochoria)属、フィンブリスチスリス(Fimbristyslis)属、サジタリア(Sagittaria)属、エレオカリス(Eleocharis)属、シルプス(Scirpus)属、パスパルム(Paspalum)属、イシェマム(Ischaemum)属、スフェノクレア(Sphenoclea)属、ダクチロクテニウム(Dactyloctenium)属、アグロスティス(Agrostis)属、アロペクルス(Alopecurus)属、およびアペラ(Apera)属の雑草が挙げられる。さらに、本発明の雑草は、例えば、望ましくない場所で生長している作物植物を含んでもよい。例えば、トウモロコシ植物がダイズ植物の田畑において望ましくない場合、ダイズ植物を主に含む田畑にある自生のトウモロコシ植物は雑草であると考えることができる。
【００３８】
用語「植物」は、それが有機材料に属し、植物界のメンバーである真核生物を包含することが意図されるため、その最も広い意味で用いられ、その例としては、限定されるものではないが、維管束植物、野菜、穀物、花、樹木、ハーブ、低木、草、つる植物、シダ類、コケ、菌類および藻類など、ならびに無性繁殖のために用いられる植物のクローン、分派、および部分(例えば、挿し木、管、芽、根茎、地下茎、茂み、樹冠、球根、球茎、塊茎、根茎、組織培養物中で産生された植物/組織など）が挙げられる。用語「植物」は、全植物、植物の祖先および子孫ならびに植物部分、例えば、種子、芽、茎、葉、根(塊茎を含む)、花、小花、果実、柄、雄しべ、葯、柱頭、花柱、子房、花弁、萼片、心皮、根端、根冠、根毛、葉毛、種子毛、花粉粒、小胞子、子葉、胚軸、上胚軸、木部、師部、柔組織、内胚乳、伴細胞、孔辺細胞、ならびに植物の任意の他の公知の器官、組織、および細胞、ならびに組織および器官をさらに包含し、上記の各々は、対象の遺伝子/核酸を含む。用語「植物」はまた、植物細胞、懸濁培養物、カルス組織、胚、分裂組織部位、配偶体、胞子体、花粉および小胞子も包含し、再度、上記の各々は対象の遺伝子/核酸を含む。
【００３９】
本発明の方法において特に有用である植物としては、上科緑色植物亜界に属する全ての植物、特に、単子葉植物および双子葉植物、例えば、特に、エイサー(Acer)属の種、アクチニジア(Actinidia)属の種、アベルモスクス(Abelmoschus)属の種、アガベ・シサラナ(Agave sisalana)、アグロピロン(Agropyron)属の種、アグロスティス・ストロニフェラ(Agrostis stolonifera)、アリウム(Allium)属の種、アマランタス(Amaranthus)属の種、アモフィラ・アレナリア(Ammophila arenaria)、アナナス・コモサス(Ananas comosus)、アノナ(Annona)属の種、アピウム・グラベオレンス(Apium graveolens)、アラキス(Arachis)属の種、アルトカルプス(Artocarpus)属の種、アスパラガス・オフィシナリス(Asparagus officinalis)、アベナ(Avena)属の種(例えば、アベナ・サティバ(Avena sativa)、アベナ・ファツア(Avena fatua)、アベナ・ビザンチナ(Avena byzantina)、アベナ・ファツア変種サティバ(Avena fatua var. sativa)、アベナ・ヒブリダ(Avena hybrida))、アベロア・カラムボラ(Averrhoa carambola)、バンブサ(Bambusa)属の種、ベニンカサ・ヒスピダ(Benincasa hispida)、ベルトレチア・エクセルセア(Bertholletia excelsea)、ベタ・バルガリス(Beta vulgaris)、ブラシカ(Brassica)属の種(例えば、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)、ブラシカ・ラパ(Brassica rapa)属の亜種[キャノーラ、ナタネ、アブラナ])、カダバ・ファリノサ(Cadaba farinosa)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)、カナ・インディカ(Canna indica)、カナビス・サティバ(Cannabis sativa)、カプシカム(Capsicum)属の種、カレックス・エラタ(Carex elata)、カリカ・パパヤ(Carica papaya)、カリッサ・マクロカルパ(Carissa macrocarpa)、カリヤ(Carya)属の種、カルタムス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)、カスタネア(Castanea)属の種、セイバ・ペンタンドラ(Ceiba pentandra)、シコリウム・エンディビア(Cichorium endivia)、シナモマム(Cinnamomum)属の種、シトルルス・ラナタス(Citrullus lanatus)、シトラス(Citrus)属の種、ココス(Cocos)属の種、コフィア(Coffea)属の種、コロカシア・エスクレンタ(Colocasia esculenta)、コラ(Cola)属の種、コルコルス(Corchorus)属の種、コリアンドラム・サティバム(Coriandrum sativum)、コリルス(Corylus)属の種、クラタガス(Crataegus)属の種、クロクス・サティバス(Crocus sativus)、ククルビタ(Cucurbita)属の種、ククミス(Cucumis)属の種、シナラ(Cynara)属の種、ダウクス・カロタ(Daucus carota)、デスモジウム(Desmodium)属の種、ジモカルプス・ロンガン(Dimocarpus longan)、ジオスコレア(Dioscorea)属の種、ジオスピロス(Diospyros)属の種、エキノクロア(Echinochloa)属の種、エレイス(Elaeis)属(例えば、エレイス・ギネンシス(Elaeis guineensis)、エレイス・オレイフェラ(Elaeis oleifera))、エレウシン・コラカナ(Eleusine coracana)、エラグロスティス・テフ(Eragrostis tef)、エリアンタス(Erianthus)属の種、エリオボトリヤ・ジャポニカ(Eriobotrya japonica)、ユーカリプタス(Eucalyptus)属の種、ユーゲニア・ユニフローラ(Eugenia uniflora)、ファゴピルム(Fagopyrum)属の種、ファガス(Fagus)属の種、フェスツカ・アルンジナセア(Festuca arundinacea)、フィクス・カリカ(Ficus carica)、フォルツネラ(Fortunella)属の種、フラガリア(Fragaria)属の種、ギンクゴ・ビロバ(Ginkgo biloba)、グリシン(Glycine)属の種(例えば、グリシン・マックス(Glycine max)、ソジャ・ヒスピダ(Soja hispida)またはソジャ・マックス(Soja max))、ゴシピウム・ヒルスタム(Gossypium hirsutum)、ヘリアンタス(Helianthus)属の種(例えば、ヘリアンタス・アヌウス(Helianthus annuus))、ヘメロカリス・フルバ(Hemerocallis fulva)、ハイビスカス(Hibiscus)属の種、ホルデウム(Hordeum)属の種(例えば、ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare))、イポメア・バタタス(Ipomoea batatas)、ジュグランス(Juglans)属の種、ラクツカ・サティバ(Lactuca sativa)、ラチルス(Lathyrus)属の種、レンス・クリナリス(Lens culinaris)、リナム・ウシタチシムム(Linum usitatissimum)、リッチ・キネンシス(Litchi chinensis)、ロータス(Lotus)属の種、ルファ・アクタングラ(Luffa acutangula)、ルピヌス(Lupinus)属の種、ルズラ・シルバティカ(Luzula sylvatica)、リコペルシコン(Lycopersicon)属の種 (例えば、リコペルシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum)、リコペルシコン・リコペルシカム(Lycopersicon lycopersicum)、リコペルシコン・ピリフォルム(Lycopersicon pyriforme))、マクロチロマ(Macrotyloma)属の種、マルス(Malus)属の種、マルピギア・エマルギナタ(Malpighia emarginata)、マメア・アメリカーナ(Mammea americana)、マンギフェラ・インディカ(Mangifera indica)、マニホット(Manihot)属の種、マニルカラ・ザポタ(Manilkara zapota)、メジカゴ・サティバ(Medicago sativa)、メリロタス(Melilotus)属の種、メンタ(Mentha)属の種、メスカンタス・シネンシス(Miscanthus sinensis)、モモルディカ(Momordica)属の種、モルス・ニグラ(Morus nigra)、ムサ(Musa)属の種、ニコチアナ(Nicotiana)属の種、オレア(Olea)属の種、オプンチア(Opuntia)属の種、オルニトプス(Ornithopus)属の種、オリザ(Oryza)属の種(例えば、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、オリザ・ラチフォリア(Oryza latifolia))、パニカム・ミリアセウム(Panicum miliaceum)、パニカム・ビルガタム(Panicum virgatum)、パシフロラ・エデュリス(Passiflora edulis)、パスチナカ・サティバ(Pastinaca sativa)、ペニセタム(Pennisetum)属の種、ペルセア(Persea)属の種、ペトロセリナム・クリスパム(Petroselinum crispum)、ファラリス・アルンジナセア(Phalaris arundinacea)、ファセオラス(Phaseolus)属の種、フレウム・プラテンセ(Phleum pratense)、フェニックス(Phoenix)属の種、フラグミテス・オーストラリス(Phragmites australis)、フィサリス(Physalis)属の種、ピヌス(Pinus)属の種、ピスタシア・ベラ(Pistacia vera)、ピサム(Pisum)属の種、ポア(Poa)属の種、ポプルス(Populus)属の種、プロソピス(Prosopis)属の種、プルヌス(Prunus)属の種、プシジウム(Psidium)属の種、プニカ・グラナタム(Punica granatum)、ピルス・コミュニス(Pyrus communis)、ケルクス(Quercus)属の種、ラファヌス・サティバス(Raphanus sativus)、レウム・ラバルバルム(Rheum rhabarbarum)、リベス(Ribes)属の種、リシヌス・コミュニス(Ricinus communis)、ルブス(Rubus)属の種、サッカルム(Saccharum)属の種、サリックス(Salix)属の種、サムブクス(Sambucus)属の種、セカレ・セレアレ(Secale cereale)、セサマム(Sesamum)属の種、シナピス(Sinapis)属の種、ソラナム(Solanum)属の種(例えば、ソラナム・ツベロサム(Solanum tuberosum)、ソラナム・インテグリフォリウム(Solanum integrifolium)もしくはソラナム・リコペルシカム(Solanum lycopersicum))、ソルガム・バイコロール(Sorghum bicolor)、スピナシア(Spinacia)属の種、シジギウム(Syzygium)属の種、タゲテス(Tagetes)属の種、タマリンダス・インディカ(Tamarindus indica)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)、トリフォリウム(Trifolium)属の種、トリプサカム・ダクチロイデス(Tripsacum dactyloides)、トリチコセカレ・リンパウイ(Triticosecale rimpaui)、トリチカム(Triticum)属の種(例えば、トリチカム・エスティバム(Triticum aestivum)、トリチカム・デュラム(Triticum durum)、トリチカム・ツルギダム(Triticum turgidum)、トリチカム・ハイベルナム(Triticum hybernum)、トリチカム・マチャ(Triticum macha)、トリチカム・サティバム(Triticum sativum)、トリチカム・モノコッカム(Triticum monococcum)もしくはトリチカム・ブルガレ(Triticum vulgare))、トロペオルム・ミヌス(Tropaeolum minus)、トロペオルム・マジュス(Tropaeolum majus)、バシニウム(Vaccinium)属の種、ビシア(Vicia)属の種、ビグナ(Vigna)属の種、ビオラ・オドラタ(Viola odorata)、ビティス(Vitis)属の種、ジー・メイズ(Zea mays)、ジザニア・パルストリス(Zizania palustris)、ジジファス(Ziziphus)属の種、アマランス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン、コーン、亜麻、ケール、レンティル、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、コメ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、茶および藻類を含む一覧から選択される、飼料もしくは飼い葉用マメ科植物、観葉植物、食用作物、樹木または低木が挙げられる。本発明の好ましい実施形態によれば、植物は作物植物である。作物植物の例としては、特に、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、コーン、アルファルファ、ナタネ、ワタ、トマト、ジャガイモまたはタバコが挙げられる。さらに好ましくは、植物は単子葉植物、例えば、サトウキビである。さらに好ましくは、植物は、穀類、例えば、コメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キビ、ライムギ、ソルガムまたはオートムギである。
【００４０】
好ましい実施形態においては、植物は、以後により詳細に説明される、野生型もしくはmut-HPPDおよび/または野生型もしくはmut-HSTトランスジーンを導入し、過剰発現させることにより、植物を組換え的に調製することを含むプロセスにより以前に作製されたものである。
【００４１】
別の好ましい実施形態においては、植物は、mut-HPPDおよび/またはmut-HSTを発現する植物細胞を得るために、植物細胞をin situ突然変異誘発にかけることを含むプロセスにより以前に作製されたものである。
【００４２】
本明細書に開示されるように、本発明の核酸は、除草剤耐性野生型もしくはmut-HPPDおよび/または野生型もしくはmut-HSTタンパク質をコードする遺伝子をゲノム中に含む植物の除草剤耐性を増強するのに有用である。そのような遺伝子は、本明細書の以後に記載されるように、内因性遺伝子であるか、またはトランスジーンであってもよい。
【００４３】
従って、他の実施形態においては、本発明は、植物の除草剤耐性または抵抗性を増大または増強する方法であって、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53を含む野生型またはmut HPPD酵素をコードする核酸を過剰発現させることを含む前記方法に関する。
【００４４】
さらに、特定の実施形態においては、本発明の核酸を、対象のポリヌクレオチド配列の任意の組合せと共に積み重ねて、所望の表現型を有する植物を作出することができる。例えば、本発明の核酸を、殺虫および/または殺昆虫活性を有するポリペプチド、例えば、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)毒素タンパク質(米国特許第5,366,892号; 第5,747,450号; 第5,737,514号; 第5,723,756号; 第5,593,881号; およびGeiserら、(1986) Gene 48: 109に記載されている)などをコードする任意の他のポリヌクレオチドと共に積み重ねることができる。
【００４５】
特に好ましい実施形態においては、植物は、(iii)例えば、5-エノールピルビルシキメート-3-リン酸合成酵素(EPSPS)、グリホサートアセチルトランスフェラーゼ(GAT)、シトクロムP450、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)、アセトヒドロキシ酸合成酵素(AHAS; EC 4.1.3.18、アセト乳酸合成酵素またはALSとしても知られる)、プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ(PPGO)、フィトエンデサチュラーゼ(PD)およびWO02/068607に開示されたジカンバ分解酵素からなる群より選択される除草剤耐性酵素をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのさらなる異種核酸を含む。
【００４６】
一般に、本明細書で用いられる用語「除草剤」は、植物を殺傷する、防除するか、またはさもなければ植物の生長を逆に改変する活性成分を意味する。除草剤の好ましい量または濃度は、「有効量」または「有効濃度」である。「有効量」および「有効濃度」は、それぞれ、類似する、野生型、植物、植物組織、植物細胞、または宿主細胞の成長を殺傷するか、または阻害するのに十分であるが、前記量は本発明の除草剤抵抗性植物、植物組織、植物細胞、および宿主細胞の成長を大幅には殺傷または阻害しない量および濃度を意図する。典型的には、除草剤の有効量は、対象の雑草を殺傷するために農業生産系において日常的に用いられる量である。そのような量は、当業者には公知である。除草剤活性は、本発明のクマロン誘導体除草剤が、生長の任意の段階で、または植える前もしくは発芽前に植物または植物の場所に直接施用された場合にそれらにより阻害される。観察される効果は、防除しようとする植物種、植物の生長段階、希釈および噴霧液滴サイズの施用パラメータ、固形成分の粒径、使用時の環境条件、用いられる特定の化合物、用いられる特定のアジュバントおよび担体、土壌の種類など、ならびに施用される化合物の量に依存する。これらの因子およびその他の因子を当業界で公知のように調整して、非選択的または選択的除草剤活性を促進することができる。一般に、雑草の最大防除を達成するために、相対的に未熟な望ましくない植生に対してクマロン誘導体除草剤を発芽後に施用することが好ましい。
【００４７】
「除草剤耐性」または「除草剤抵抗性」植物とは、通常は正常型または野生型の植物を殺傷するか、またはその生長を阻害するレベルで少なくとも1つの除草剤に対して耐性または抵抗性である植物を意図する。「除草剤耐性mut-HPPDタンパク質」または「除草剤抵抗性mut-HPPDタンパク質」とは、そのようなmut-HPPDタンパク質が、野生型mut-HPPDタンパク質のHPPD活性を阻害することが知られる除草剤の濃度またはレベルでHPPD活性を妨害することが知られる少なくとも1つの除草剤の存在下にある場合、野生型mut-HPPDタンパク質のHPPD活性と比較して、より高いHPPD活性を示すことを意図する。さらに、そのような除草剤耐性または除草剤抵抗性mut-HPPDタンパク質のHPPD活性を、本明細書では「除草剤耐性」または「除草剤抵抗性」HPPD活性と呼ぶことができる。
【００４８】
本発明にとって有用な「クマロン誘導体除草剤」は、以下の表2に記載の化合物を包含する。
【表２】
2014534816.tif 000004
【００４９】
2014534816.tif 000005
【００５０】
2014534816.tif 000006
【００５１】
2014534816.tif 000007
【００５２】
上記で参照された特許出願、特に、表2の化合物、1〜13番、およびその可能な置換基に関する開示は、参照により全体が本明細書に組込まれるものとする。
【００５３】
一実施形態においては、本発明にとって有用なクマロン誘導体除草剤は、式：
【化１】
2014534816.tif 000008
【００５４】
(式中、変数は以下の意味を有する：
Rは、O-RA、S(O)n-RAまたはO-S(O)n-RAであり；
RAは、水素、C1〜C4-アルキル、Z-C3〜C6-シクロアルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C2〜C6-アルケニル、Z-C3〜C6-シクロアルケニル、C2〜C6-アルキニル、Z-(トリ-C1〜C4-アルキル)シリル、Z-C(=O)-Ra、Z-NRi-C(O)-NRiRii、Z-P(=O)(Ra)2、NRiRii、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有し、基Raおよび/またはRbにより部分的または完全に置換されていてもよい3〜7員単環式または9もしくは10員二環式飽和、不飽和または芳香族ヘテロ環であり、
Raは、水素、OH、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、Z-C3〜C6-シクロアルキル、C2〜C8-アルケニル、Z-C5〜C6-シクロアルケニル、C2〜C8-アルキニル、Z-C1〜C6-アルコキシ、Z-C1〜C4-ハロアルコキシ、Z-C3〜C8-アルケニルオキシ、Z-C3〜C8-アルキニルオキシ、NRiRii、C1〜C6-アルキルスルホニル、Z-(トリ-C1〜C4-アルキル)シリル、Z-フェニル、Z-フェノキシ、Z-フェニルアミノまたはO、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有し、環式基が非置換であるか、または1、2、3もしくは4個の基Rbにより置換された5または6員単環式または9もしくは10員二環式ヘテロ環であり;
Ri、Riiは、互いに独立に、水素、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C3〜C8-アルケニル、C3〜C8-アルキニル、Z-C3〜C6-シクロアルキル、Z-C1〜C8-アルコキシ、Z-C1〜C8-ハロアルコキシ、Z-C(=O)-Ra、Z-フェニル、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有し、Zを介して結合した3〜7員単環式または9もしくは10員二環式飽和、不飽和または芳香族ヘテロ環であり；
RiおよびRiiは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有する5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式ヘテロ環を形成してもよく;
Rbは、互いに独立に、Z-CN、Z-OH、Z-NO2、Z-ハロゲン、オキソ(=O)、=N-Ra、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C2〜C8-アルケニル、C2〜C8-アルキニル、Z-C1〜C8-アルコキシ、Z-C1〜C8-ハロアルコキシ、Z-C3〜C10-シクロアルキル、O-Z-C3〜C10-シクロアルキル、Z-C(=O)-Ra、NRiRii、Z-(トリ-C1-C4-アルキル)シリル、Z-フェニルおよびS(O)nRbbであり；2個の基Rbは、炭素原子に加えて、3〜6個の環のメンバーを有する環を一緒になって形成してもよく、また、O、NおよびSからなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよく、非置換であるか、またはさらなる基Rbにより置換されていてもよく;
Rbbは、C1〜C8-アルキル、C2〜C6-アルケニル、C2〜C6-アルキニル、C2〜C6-ハロアルケニル、C2〜C6-ハロアルキニルまたはC1〜C6-ハロアルキルであり;
Zは、共有結合またはC1〜C4-アルキレンであり;
nは、0、1または2であり;
R1はシアノ、ハロゲン、ニトロ、C1〜C6-アルキル、C2〜C6-アルケニル、C2〜C6-アルキニル、C1〜C6-ハロアルキル、Z-C1〜C6-アルコキシ、Z-C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、Z-C1〜C4-アルキルチオ、Z-C1〜C4-アルキルチオ-C1〜C4-アルキルチオ、C2〜C6-アルケニルオキシ、C2〜C6-アルキニルオキシ、C1〜C6-ハロアルコキシ、C1〜C4-ハロアルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、S(O)nRbb、Z-フェノキシ、Z-ヘテロシクリルオキシ(式中、ヘテロシクリルは、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有する5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式飽和、部分不飽和または芳香族ヘテロ環であり、環式基は非置換であるか、またはRbにより部分的もしくは完全に置換される)であり;
Aは、NまたはC-R2であり;
R2、R3、R4、R5は、互いに独立に、水素、Z-ハロゲン、Z-CN、Z-OH、Z-NO2、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C2〜C8-アルケニル、C2〜C8-アルキニル、C2〜C8-ハロアルケニル、C2〜C8-ハロアルキニル、Z-C1〜C8-アルコキシ、Z-C1〜C8-ハロアルコキシ、Z-C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、Z-C1〜C4-アルキルチオ、Z-C1〜C4-アルキルチオ-C1〜C4-アルキルチオ、Z-C1〜C6-ハロアルキルチオ、C2〜C6-アルケニルオキシ、C2〜C6-アルキニルオキシ、C1〜C6-ハロアルコキシ、C1〜C4-ハロアルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、Z-C3〜C10-シクロアルキル、O-Z-C3〜C10-シクロアルキル、Z-C(=O)-Ra、NRiRii、Z-(トリ-C1〜C4-アルキル)シリル、S(O)nRbb、Z-フェニル、Z1-フェニル、Z-ヘテロシクリル、Z1-ヘテロシクリル(式中、ヘテロシクリルは、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有する5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式飽和、部分不飽和または芳香族ヘテロ環であり、環式基は非置換であるか、またはRbにより部分的もしくは完全に置換される)であり;
R2は隣接する炭素原子に結合した基と一緒になって、炭素原子に加えて、O、NおよびSからなる群より選択される1、2または3個のヘテロ原子を含んでもよく、さらなる基Rbにより置換されていてもよい5〜10員飽和または部分もしくは完全不飽和単環または二環を形成してもよく;
Z1は、共有結合、C1〜C4-アルキレンオキシ、C1〜C4-オキシアルキレンまたはC1〜C4-アルキレンオキシ-C1〜C4-アルキレンであり;
R6は水素、C1〜C4-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C1〜C4-アルコキシ、C1〜C4-アルキルチオ、C1〜C4-ハロアルコキシ、C1〜C4-ハロアルキルチオであり;
R7、R8は、互いに独立に、水素、ハロゲンまたはC1〜C4-アルキルであり;
Rxは、非置換であるか、または1〜5個の基Rbにより置換された、C1〜C6-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C1〜C2-アルコキシ-C1〜C2-アルキル、C2〜C6-アルケニル、C2〜C6-ハロアルケニル、C3〜C6-アルキニル、C3〜C6-ハロアルキニルまたはZ-フェニルであり;
基RA、ならびにR1、R2、R3、R4およびR5およびその置換基において、炭素鎖および/または環式基は基Rbにより部分的または完全に置換されていてもよい)
を有する上記の表2の13番の式の化合物、またはそのN-オキシドもしくは農学上好適な塩に関する。
【００５５】
別の実施形態においては、本発明にとって有用なクマロン誘導体除草剤は、
上記の式：
【化２】
2014534816.tif 000009
【００５６】
(式中、変数はWO2010/049270およびWO2010/049269に開示された通りである)
を有する上記の表2の1番および2番に関する。
【００５７】
さらに好ましい実施形態においては、本発明にとって有用なクマリン誘導体除草剤は、下記式(表2、8番)：
【化３】
2014534816.tif 000010
【００５８】
(式中、変数は、以下の意味を有する：
Rは、O-RA、S(O)n-RAまたはO-S(O)n-RAであり;
RAは、水素、C1〜C4-アルキル、Z-C3〜C6-シクロアルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C2〜C6-アルケニル、Z-C3〜C6-シクロアルケニル、C2〜C6-アルキニル、Z-(トリ-C1〜C4-アルキル)シリル、Z-C(=O)-Ra、Z-NRi-C(O)-NRiRii、Z-P(=O)(Ra)2、NRiRii、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有し、基Raおよび/またはRbにより部分的または完全に置換されていてもよい3〜7員単環式または9もしくは10員二環式飽和、不飽和または芳香族ヘテロ環であり、
Raは、水素、OH、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、Z-C3〜C6-シクロアルキル、C2〜C8-アルケニル、Z-C5〜C6-シクロアルケニル、C2〜C8-アルキニル、Z-C1〜C6-アルコキシ、Z-C1〜C4-ハロアルコキシ、Z-C3〜C8-アルケニルオキシ、Z-C3〜C8-アルキニルオキシ、NRiRii、C1〜C6-アルキルスルホニル、Z-(トリ-C1〜C4-アルキル)シリル、Z-フェニル、Z-フェノキシ、Z-フェニルアミノまたはO、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有し、環式基は非置換であるか、または1、2、3もしくは4個の基Rbにより置換された、5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式ヘテロ環であり;
Ri、Riiは、互いに独立に、水素、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C3〜C8-アルケニル、C3〜C8-アルキニル、Z-C3〜C6-シクロアルキル、Z-C1〜C8-アルコキシ、Z-C1〜C8-ハロアルコキシ、Z-C(=O)-Ra、Z-フェニル、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有し、Zを介して結合した3〜7員単環式または9もしくは10員二環式飽和、不飽和または芳香族ヘテロ環であり;
RiおよびRiiは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有する5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式ヘテロ環を形成してもよく;
Zは、共有結合またはC1〜C4-アルキレンであり;
nは、0、1または2であり;
R1は、シアノ、ハロゲン、ニトロ、C1〜C6-アルキル、C2〜C6-アルケニル、C2〜C6-アルキニル、C1〜C6-ハロアルキル、Z-C1〜C6-アルコキシ、Z-C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、Z-C1〜C4-アルキルチオ、Z-C1〜C4-アルキルチオ-C1〜C4-アルキルチオ、C2〜C6-アルケニルオキシ、C2〜C6-アルキニルオキシ、C1〜C6-ハロアルコキシ、C1〜C4-ハロアルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、S(O)nRbb、Z-フェノキシ、Z-ヘテロシクリルオキシ(式中、ヘテロシクリルは、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有する5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式飽和、部分不飽和または芳香族ヘテロ環であり、環式基は非置換であるか、またはRbにより部分的もしくは完全に置換される)であり;
Rbbは、C1〜C8-アルキル、C2〜C6-アルケニル、C2〜C6-アルキニル、C2〜C6-ハロアルケニル、C2〜C6-ハロアルキニルまたはC1〜C6-ハロアルキルであり、nは0、1または2であり;
Aは、NまたはC-R2であり;
R2は、Z1-フェニル、フェノキシまたはZ1-ヘテロシクリル(式中、ヘテロシクリルは、O、NおよびSからなる群より選択される1、2、3または4個のヘテロ原子を含有する5もしくは6員単環式または9もしくは10員二環式飽和、部分不飽和または芳香族ヘテロ環であり、環式基は非置換であるか、またはRbにより部分的もしくは完全に置換される);C1〜C8-アルキル、C2〜C4-ハロアルキル、C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルキル、C1〜C4-アルキルチオ-C1〜C4-アルキル、C2〜C8-アルケニル、C2〜C8-アルキニル、C2〜C8-ハロアルケニル、C2〜C8-ハロアルキニル、C2〜C6-アルコキシ、Z-C1〜C4-アルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、Z-C1〜C4-ハロアルコキシ-C1〜C4-アルコキシ、C2〜C6-ハロアルコキシ、C3〜C6-アルケニルオキシ、C3〜C6-アルキニルオキシ、C2〜C6-アルキルチオ、C2〜C6-ハロアルキルチオ、Z-C(=O)-Ra、S(O)1-2Rbbであり;
Z1は共有結合、C1〜C4-アルキレンオキシ、C1〜C4-オキシアルキレンまたはC1〜C4-アルキレンオキシ-C1〜C4-アルキレンであり;
Rbは、互いに独立に、Z-CN、Z-OH、Z-NO2、Z-ハロゲン、オキソ(=O)、=N-Ra、C1〜C8-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C2〜C8-アルケニル、C2〜C8-アルキニル、Z-C1〜C8-アルコキシ、Z-C1〜C8-ハロアルコキシ、Z-C3〜C10-シクロアルキル、O-Z-C3〜C10-シクロアルキル、Z-C(=O)-Ra、NRiRii、Z-(トリ-C1〜C4-アルキル)シリル、Z-フェニルおよびS(O)nRbbであり、2個の基Rbは、炭素原子に加えて、3〜6個の環のメンバーを有する環を一緒になって形成してもよく、また、O、NおよびSからなる群より選択されるヘテロ原子を含有してもよく、非置換であるか、またはさらなる基Rbにより置換されていてもよく;
R2は、隣接する炭素原子に結合した基と一緒になって、炭素原子に加えて、O、NおよびSからなる群より選択される1、2または3個のヘテロ原子を含んでもよく、さらなる基Rbにより置換されていてもよい5〜10員飽和または部分もしくは完全不飽和単環または二環を形成してもよく;
R3は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、C1〜C4-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C1〜C4-アルコキシ、C1〜C4-ハロアルコキシ、C2〜C4-アルケニル、C2〜C4-アルキニル、C2〜C4-アルケニルオキシ、C2〜C4-アルキニルオキシ、S(O)nRbbであり;
R4は、水素、ハロゲンまたはC1〜C4-ハロアルキルであり;
R5は、水素、C1〜C4-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C1〜C4-アルコキシ、C1〜C4-アルキルチオ、C1〜C4-ハロアルコキシ、C1〜C4-ハロアルキルチオであり;
R6、R7は、互いに独立に、水素、ハロゲンまたはC1〜C4-アルキルであり;
Yは、OまたはSであり;
Xは、O、SまたはN-Rxであり;
Rxは、水素、C1〜C6-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、C2〜C6-アルケニル、C3〜C6-アルキニル、Z-C3〜C10-シクロアルキル、C1〜C6-アルコキシ-C1〜C6-アルキル、C1〜C6-シアノアルキル、Z-フェニル、Z-C(=O)-Ra2またはトリ-C1〜C4-アルキルシリルであり;
Ra2は、C1〜C6-アルキル、C1〜C4-ハロアルキル、Z-C1〜C6-アルコキシ、Z-C1〜C4-ハロアルコキシまたはNRiRiiであり;
基RAおよびその置換基において、炭素鎖および/または環式基は、基Rbにより部分的または完全に置換されていてもよい)
を有するか、またはそのN-オキシドもしくは農学上好適な塩である。
【００５９】
本発明にとって有用なクマロン誘導体は、より広い品種の望ましくない植生の防除を得るために、1種以上の他のHPPDおよび/またはHST標的化除草剤と共に最良に施用されることが多い。他のHPPDおよび/またはHST標的化除草剤と共に用いられる場合、本明細書に開示される化合物を、他の除草剤(複数可)と共に製剤化する、他の除草剤(複数可)とタンク混合する、または他の除草剤(複数可)と連続的に施用することができる。
【００６０】
本発明のクマロン誘導体と共に有用であるいくつかの除草剤としては、ベンゾビシクロン、メソトリオン、スルコトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、4-ヒドロキシ-3-[[2-(2-メトキシエトキシ)メチル]-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-ビシクロ[3.2.1]-オクタ-3-エン-2-オン(ビシクロピロン)、ケトスピラドックスまたはその遊離酸、ベンゾフェナプ、ピラスルホトール、ピラゾリネート、ピラゾキシフェン、トプラメゾン、[2-クロロ-3-(2-メトキシエトキシ)-4-(メチルスルホニル)フェニル](l-エチル-5-ヒドロキシ-1H-ピラゾール-4-イル)-メタノン、(2,3-ジヒドロ-3,3,4-トリメチル-1,1-ジオキシドベンゾ[b]チエン-5-イル)(5-ヒドロキシ-1-メチル-1H-ピラゾール-4-イル)-メタノン、イソキサクロルトール、イソキサフルトール、α-(シクロプロピルカルボニル)-2-(メチルスルホニル)-β-オキソ-4-クロロ-ベンゼンプロパンニトリル、およびα-(シクロプロピルカルボニル)-2-(メチルスルホニル)-β-オキソ-4-(トリフルオロメチル)-ベンゼンプロパンニトリルが挙げられる。
【００６１】
好ましい実施形態においては、さらなる除草剤は、トプラメゾンである。
【００６２】
特に好ましい実施形態においては、さらなる除草剤は、
(1-エチル-5-プロパ-2-イニルオキシ-1H-ピラゾール-4-イル)-[4-メタンスルホニル-2-メチル-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-5-イル)-フェニル]-メタノン
【化４】
2014534816.tif 000011
【００６３】
または
(1-エチル-5-ヒドロキシ-1H-ピラゾール-4-イル)-[4-メタンスルホニル-2-メチル-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-5-イル)-フェニル]-メタノン
【化５】
2014534816.tif 000012
【００６４】
である。
【００６５】
上記化合物は、参照により全体が本明細書に組込まれるEP 09177628.6により詳細に記載されている。
【００６６】
さらに、本発明にとって有用な除草剤化合物を、作物植物が天然に耐性であるか、またはそれが上記の1種以上のさらなるトランスジーンの発現により抵抗性であるさらなる除草剤と共に用いることができる。本発明の化合物と共に用いることができるいくつかの除草剤としては、スルホンアミド系、例えば、メトスラム、フルメトスラム、クロランスラム-メチル、ジクロスラム、ペノキススラムおよびフロラスラム、スルホニルウレア系、例えば、クロリムロン、トリベヌロン、スルホメツロン、ニコスルフロン、クロルスルフロン、アミドスルフロン、トリアスルフロン、プロスルフロン、トリトスルフロン、チフェンスルフロン、スルホスルフロンおよびメツルフロン、イミダゾリノン系、例えば、イマザキン、イマザピック、イマゼタピル、イムザピル、イマザメタベンズおよびイマザモックス、フェノキシアルカン酸系、例えば、2,4-D、MCPA、ジクロルプロップおよびメコプロップ、ピリジニルオキシ酢酸系、例えば、トリクロピルおよびフルロキシピル、カルボン酸系、例えば、クロピラリド、ピクロラム、アミノピラリドおよびジカンバ、ジニトロアニリン系、例えば、トリフルラリン、ベネフィン、ベンフルラリンおよびペンジメタリン、クロロアセトアニリド系、例えば、アラクロル、アセトクロルおよびメトラクロル、セミカルバゾン系(オーキシン輸送阻害剤)、例えば、クロルフルレノールおよびジフルフェンゾピル、アリールオキシフェノキシプロピオネート系、例えば、フルアジホップ、ハロキシホップ、ジクロホップ、クロジナホップおよびフェノキサプロップならびに他の一般的な除草剤、例えば、グリホサート、グルホシナート、アシフルオルフェン、ベンタゾン、クロマゾン、フミクロラック、フルオメツロン、ホメサフェン、ラクトフェン、リヌロン、イソプロツロン、シマジン、ノルフルラゾン、パラコート、ジウロン、ジフルフェニカン、ピコリナフェン、シニドン、セトキシジム、トラルコキシジム、キンメラック、イソキサベン、ブロモキシニル、メトリブジンおよびメソトリオンが挙げられる。
【００６７】
さらに、本発明にとって有用なクマロン誘導体除草剤を、グリホサート耐性またはグルホシナート耐性作物に対して、グリホサートおよびグルホシナートと共に用いることができる。
【００６８】
さらに、上記開示に既に含まれていなければ、本発明にとって有用なクマロン誘導体除草剤を以下に由来する化合物と共に用いることができる：
(a)脂質生合成阻害剤群：
アロキシジム、アロキシジム-ナトリウム、ブトロキシジム、クレトジム、クロジナホップ、クロジナホップ-プロパルギル、シクロキシジム、シハロホップ、シハロホップ-ブチル、ジクロホップ、ジクロホップ-メチル、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ-エチル、フェノキサプロップ-P、フェノキサプロップ-P-エチル、フルアジホップ、フルアジホップ-ブチル、フルアジホップ-P、フルアジホップ-P-ブチル、ハロキシホップ、ハロキシホップ-メチル、ハロキシホップ-P、ハロキシホップ-P-メチル、メタミホップ、ピノキサデン、プロホキシジム、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ-エチル、キザロホップ-テフリル、キザロホップ-P、キザロホップ-P-エチル、キザロホップ-P-テフリル、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、ベンフレセート(Benfuresat)、ブチラット(Butylat)、シクロエート(Cycloat)、ダラポン、ジメピペレート(Dimepiperat)、EPTC、エスプロカルブ、エトフメセート(Ethofumesat)、フルプロパネート(Flupropanat)、モリネート(Molinat)、オルベンカルブ、ペブレート(Pebulat)、プロスルホカルブ、TCA、チオベンカルブ、チオカルバジル、トリアレート(Triallat)およびベルノレート(Vernolat)；
(b)ALS阻害剤群：
アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、ベンスルフロン-メチル、ビスピリバック、ビスピリバック-ナトリウム、クロリムロン、クロリムロン-エチル、クロルスルフロン、シノスルフロン、クロランスラム、クロランスラム-メチル、シクロスルファムロン、ジクロスラム、エタメツルフロン、エタメツルフロン-メチル、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フロラスラム、フルカルバゾン、フルカルバゾン-ナトリウム、フルセトスルフロン、フルメツラム、フルピルスルフロン、フルピルスルフロン-メチル-ナトリウム、フォラムスルフロン、ハロスルフロン、ハロスルフロン-メチル、イマザメタベンズ、イマザメタベンズ-メチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、ヨードスルフロン-メチル-ナトリウム、メソスルフロン、メトスラム、メツルフロン、メツルフロン-メチル、ニコスルフロン、オルトスルファムロン、オキサスルフロン、ペノキススラム、プリミスルフロン、プリミスルフロン-メチル、プロポキシカルバゾン、プロポキシカルバゾン-ナトリウム、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、ピラゾスルフロン-エチル、ピリベンゾキシム、ピリミスルファン、ピリフタリド、ピリミノバック、ピリミノバック-メチル、ピリチオバック、ピリチオバック-ナトリウム、ピロクススラム、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホメツロン-メチル、スルホスルフロン、チエンカルバゾン、チエンカルバゾン-メチル、チフェンスルフロン、チフェンスルフロン-メチル、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリベヌロン-メチル、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリフルスルフロン-メチルおよびトリトスルフロン；
(c)光合成阻害剤群：
アメトリン、アミカルバゾン、アトラジン、ベンタゾン、ベンタゾン-ナトリウム、ブロマシル、ブロモフェノキシム、ブロモキシニルならびにその塩およびエステル、クロロブロムロン、クロリダゾン、クロロトルロン、クロロクスロン、シアナジン、デスメジファム、デスメトリン、ジメフロン、ジメタメトリン、ジクワット、ジクワット-ジブロミド、ジウロン、フルオメツロン、ヘキサジノン、ロキシニルならびにその塩およびエステル、イソプロツロン、イソウロン、カルブチレート(Karbutilat)、レナシル、リヌロン、メタミトロン、メタベンズチアズロン、メトベンズロン、メトキスロン、メトリブジン、モノリヌロン、ネブロン、パラコート、パラコート-ジクロリド、パラコート-ジメチルサルフェート、ペンタノクロル、フェンメジファム、フェンメジファム-エチル、プロメトン、プロメトリン、プロパニル、プロパジン、ピリダフォル、ピリデート(Pyridat)、シデュロン、シマジン、シメトリン、テブチウロン、テルバシル、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、チアジアズロンおよびトリエタジン；
(d)プロトポルフィリノゲン-IX-オキシダーゼ阻害剤群：
アシフルオルフェン、アシフルオルフェン-ナトリウム、アザフェニジン、ベンカルバゾン、ベンズフェンジゾン、ビフェノックス、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、カルフェントラゾン-エチル、クロメトキシフェン、シニドン-エチル、フルアゾレート(Fluazolat)、フルフェンピル、フルフェンピル-エチル、フルミクロラック、フルミクロラック-ペンチル、フルミオキサジン、フルオログリコフェン、フルオログリコフェン-エチル、フルチアセット、フルチアセット-メチル、フォメサフェン、ハロサフェン、ラクトフェン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、ペントキサゾン、プロフルアゾール、ピラクロニル、ピラフルフェン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、チジアジミン、2-クロロ-5-[3,6-ジヒドロ-3-メチル-2,6-ジオキソ-4-(トリフルオロメチル)-1(2H)-ピリミジニル]-4-フルオロ-N-[(イソプロピル)メチルスルファモイル]ベンズアミド(H-1; CAS 372137-35-4)、[3-[2-クロロ-4-フルオロ-5-(1-メチル-6-トリフルオロメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4,-テトラヒドロピリミジン-3-イル)フェノキシ]-2-ピリジルオキシ]酢酸エチルエステル(H-2; CAS 353292-31-6)、N-エチル-3-(2,6-ジクロロ-4-トリフルオロメチルフェノキシ)-5-メチル-1H-ピラゾール-1-カルボキサミド(H-3; CAS 452098-92-9)、N-テトラヒドロフルフリル-3-(2,6-ジクロロ-4-トリフルオロメチルフェノキシ)-5-メチル-1H-ピラゾール-1-カルボキサミド(H-4; CAS 915396-43-9)、N-エチル-3-(2-クロロ-6-フルオロ-4-トリフルオロメチルフェノキシ)-5-メチル-1H-ピラゾール-1-カルボキサミド(H-5; CAS 452099-05-7)およびN-テトラヒドロフルフリル-3-(2-クロロ-6-フルオロ-4-トリフルオロ-メチルフェノキシ)-5-メチル-1H-ピラゾール-1-カルボキサミド(H-6; CAS 45100-03-7);
(e)漂白剤-除草剤群：
アクロニフェン、アミトロール、ベフルブタミド、ベンゾビシクロン、ベンゾフェナプ、クロマゾン、ジフルフェニカン、フルリドン、フルロクロリドン、フルルタモン、イソキサフルトール、メソトリオン、ノルフルラゾン、ピコリナフェン、ピラスルフトール、ピラゾリネート(Pyrazolynat)、ピラゾキシフェン、スルコトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、トプラメゾン、4-ヒドロキシ-3-[[2-[(2-メトキシエトキシ)メチル]-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジル]カルボニル]ビシクロ[3.2.1]オクタ-3-エン-2-オン(H-7; CAS 352010-68-5)および4-(3-トリフルオロメチルフェノキシ)-2-(4-トリフルオロメチルフェニル)ピリミジン(H-8; CAS 180608-33-7);
(f)EPSP-合成酵素阻害剤群：
グリホサート、グリホサート-イソプロピルアンモニウムおよびグリホサート-トリメシウム(スルホサート)；
(g)グルタミン合成酵素阻害剤群：
ビラナホス(ビアラホス)、ビラナホス-ナトリウム、グルホシナートおよびグルホシナート-アンモニウム；
(h)DHP合成酵素阻害剤群：アスラム；
(i)有糸分裂阻害剤群：
アミプロホス、アミプロホス-メチル、ベンフルラリン、ブタミホス、ブトラリン、カルベタミド、クロルプロファム、クロルタール、クロルタール-ジメチル、ジニトラミン、ジチオピル、エタルフルラリン、フルクロラリン、オリザリン、ペンジメタリン、プロジアミン、プロファム、プロピザミド、テブタム、チアゾピルおよびトリフルラリン；
(j)VLCFA阻害剤群：
アセトクロル、アラクロル、アニロホス、ブタクロル、カフェンストロール、ジメタクロル、ジメタナミド、ジメテナミド-P、ジフェナミド、フェントラザミド、フルフェナセット、メフェナセット、メタザクロル、メトラクロル、メトラクロル-S、ナプロアニリド、ナプロパミド、ペトキサミド、ピペロホス、プレチラクロル、プロパクロル、プロピソクロル、ピロキサスルホン(KIH-485)およびテニルクロル；
式2：
【化６】
2014534816.tif 000013
【００６９】
の化合物、特に好ましい式2の化合物は、
3-[5-(2,2-ジフルオロ-エトキシ)-1-メチル-3-トリフルオロメチル-1H-ピラゾール-4-イルメタンスルホニル]-4-フルオロ-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール(2-1); 3-{[5-(2,2-ジフルオロ-エトキシ)-1-メチル-3-トリフルオロメチル-1H-ピラゾール-4-イル]-フルオロ-メタンスルホニル}-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール(2-2); 4-(4-フルオロ-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-3-スルホニルメチル)-2-メチル-5-トリフルオロメチル-2H-[1,2,3]トリアゾール(2-3); 4-[(5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-3-スルホニル)-フルオロ-メチル]-2-メチル-5-トリフルオロメチル-2H-[1,2,3]トリアゾール(2-4); 4-(5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-3-スルホニルメチル)-2-メチル-5-トリフルオロメチル-2H-[1,2,3]トリアゾール(2-5); 3-{[5-(2,2-ジフルオロ-エトキシ)-1-メチル-3-トリフルオロメチル-1H-ピラゾール-4-イル]-ジフルオロ-メタンスルホニル}-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール (2-6); 4-[(5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-3-スルホニル)-ジフルオロ-メチル]-2-メチル-5-トリフルオロメチル-2H-[1,2,3]トリアゾール (2-7); 3-{[5-(2,2-ジフルオロ-エトキシ)-1-メチル-3-トリフルオロメチル-1H-ピラゾール-4-イル]-ジフルオロ-メタンスルホニル}-4-フルオロ-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール (2-8); 4-[ジフルオロ-(4-フルオロ-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロ-イソオキサゾール-3-スルホニル)-メチル]-2-メチル-5-トリフルオロメチル-2H-[1,2,3]トリアゾール (2-9)である;
(k)セルロース生合成阻害剤群：
クロルチアミド、ジクロベニル、フルポキサムおよびイソキサベン；
(l)脱共役除草剤群：
ジノセブ、ジノテルブならびにDNOCおよびその塩；
(m)オーキシン除草剤群：
2,4-Dならびにその塩およびエステル、2,4-DBならびにその塩およびエステル、アミノピラリドならびにその塩、アミノピラリド-トリス(2-ヒドロキシプロピル)アンモニウムおよびそのエステル、ベナゾリン、ベナゾリン-エチル、クロランベンならびにその塩およびエステル、クロメプロップ、クロピラリドならびにその塩およびエステル、ジカンバならびにその塩およびエステル、ジクロルプロップならびにその塩およびエステル、ジクロルプロップ-Pならびにその塩およびエステル、フルロキシピル、フルロキシピル-ブトメチル、フルロキシピル-メプチル、MCPAならびにその塩およびエステル、MCPA-チオエチル、MCPBならびにその塩およびエステル、メコプロップならびにその塩およびエステル、メコプロップ-Pならびにその塩およびエステル、ピクロラムならびにその塩およびエステル、キンクロラック、キンメラック、TBA(2,3,6)ならびにその塩およびエステル、トリクロピルならびにその塩およびエステル、ならびに5,6-ジクロロ-2-シクロプロピル-4-ピリミジンカルボン酸(H-9; CAS 858956-08-8)ならびにその塩およびエステル；
(n)オーキシン輸送阻害剤群：ジフルフェンゾピル、ジフルフェンゾピル-ナトリウム、ナプタラムおよびナプタラム-ナトリウム；
(o)他の除草剤群：ブロモブチド、クロルフルレノール、クロルフルレノール-メチル、シンメチリン、クミルロン、ダラポン、ダゾメット、ジフェンゾコート、ジフェンゾコート-メチルサルフェート、ジメチピン、DSMA、ダイムロン、エンドタールおよびその塩、エトベンザニド、フランプロップ、フランプロップ-イソプロピル、フランプロップ-メチル、フランプロップ-M-イソプロピル、フランプロップ-M-メチル、フルレノール、フルレノール-ブチル、フルルプリミドール、ホサミン、ホサミン-アンモニウム、インダノファン、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メタム、メリラジド、メチルブロミド、メチル-ダイムロン、メチルヨード(Methyljodid)、MSMA、オレイン酸、オキサジクロメフォン、ペラルゴン酸、ピリブチカルブ、キノクラミン、トリアジフラム、トリジファンおよび6-クロロ-3-(2-シクロプロピル-6-メチルフェノキシ)-4-ピリダジノール(H-10; CAS 499223-49-3)ならびにその塩およびエステル。
【００７０】
好ましい毒性緩和剤Cの例は、ベノキサコール、クロキントセット、シオメトリニル、シプロスルファミド、ジクロルミド、ジシクロノン、ジエトレート、フェンクロラゾール、フェンクロリム、フルラゾール、フルキソフェニム、フリラゾール、イソキサジフェン、メフェンピル、メフェネート(Mephenat)、ナフタル酸無水物、オキサベトリニル、4-(ジクロロアセチル)-1-オキサ-4-アザスピロ[4.5]デカン(H-11; MON4660、CAS 71526-07-3)および2,2,5-トリメチル-3-(ジクロロアセチル)-1,3-オキサゾリジン(H-12; R-29148、CAS 52836-31-4)である。
【００７１】
(a)〜(o)の群の化合物および毒性緩和剤Cは公知の除草剤および毒性緩和剤であり、例えば、The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/); B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbicides, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995を参照されたい。他の除草剤エフェクターは、WO 96/26202、WO 97/41116、WO 97/41117、WO 97/41118、WO 01/83459およびWO 2008/074991ならびにKramerら(編)、「Modern Crop Protection Compounds」、Vol. 1, Wiley VCH, 2007およびそこに引用された文献から公知である。
【００７２】
上記の化合物を、処理される作物に選択的であり、用いられる施用量でこれらの化合物によって防除される広範囲の雑草を補完する除草剤と共に使用することが一般的に好ましい。さらに、本発明の化合物と、他の補完的除草剤とを同時に、組合せ製剤として、またはタンク混合物として施用することが一般的に好ましい。
【００７３】
用語「mut-HPPD核酸」とは、野生型HPPD核酸から突然変異され、それが発現される植物に対して増大した「クマロン誘導体除草剤」耐性を付与する配列を有するHPPD核酸を指す。さらに、用語「突然変異ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(mut-HPPD)」とは、野生型一次配列、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、もしくは53のアミノ酸、またはその変異体、誘導体、ホモログ、オルソログ、もしくはパラログの、別のアミノ酸による置きかえを指す。表現「突然変異アミノ酸」は、別のアミノ酸により置きかえられるアミノ酸を指すように以下で用いられ、それによって、タンパク質の一次配列中の突然変異の部位を指定する。
【００７４】
好ましい実施形態においては、本発明のmut-HPPDポリペプチドは、配列番号2または配列番号53の突然変異アミノ酸配列を含む。
【００７５】
用語「mut-HST核酸」とは、野生型HST核酸から突然変異され、それが発現される植物に対して増大した「クマロン誘導体除草剤」耐性を付与する配列を有するHST核酸を指す。さらに、用語「突然変異ホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ(mut-HST)」とは、野生型一次配列、配列番号48または50のアミノ酸の、別のアミノ酸による置きかえを指す。表現「突然変異アミノ酸」は、他のアミノ酸により置きかえられるアミノ酸を指すように以下で用いられ、それによって、タンパク質の一次配列中の突然変異の部位を指定する。
【００７６】
いくつかのHPPDおよびその一次配列が技術水準において記載されており、特に、シュードモナス(Pseudomonas)などの細菌(Ruetschiら、Eur.J.Biochem., 205, 459-466, 1992、WO96/38567)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)(WO96/38567、Genebank AF047834)またはニンジン(WO96/38567、Genebank 87257)などの植物、コクシジオイデス(Coccicoides)(Genebank COITRP)のHPPD、シロイヌナズナ、アブラナ属(Brassica)、ワタ、シネコシスティス属(Synechocystis)、およびトマト(米国特許第7,297,541号)のHPPD、マウスまたはブタなどの哺乳動物のHPPDが挙げられる。さらに、人工HPPD配列が、例えば、米国特許第6,768,044号; 米国特許第6,268,549号に記載されている。
【００７７】
好ましい実施形態においては、(i)のヌクレオチド配列は、1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、もしくは52の配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む。
【００７８】
特に好ましい実施形態においては、本発明のmut-HPPD核酸は、配列番号1もしくは配列番号52の突然変異核酸配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む。
【００７９】
別の好ましい実施形態においては、(ii)のヌクレオチド配列は、配列番号47もしくは49の配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む。
【００８０】
さらに、当業者であれば、(i)または(ii)のヌクレオチド配列が、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、もしくは52のホモログ、パラログおよびオルソログ、ならびにそれぞれ、本明細書の以後に定義された配列番号47または49を包含することを理解するであろう。
【００８１】
配列(例えば、ポリペプチドまたは核酸配列、例えば、本発明の転写調節ヌクレオチド配列など)に関する用語「変異体」は、実質的に類似する配列を意味することが意図される。オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列については、変異体は、遺伝子コードの縮重性のため、天然タンパク質の同一のアミノ酸配列をコードするこれらの配列を含む。これらのものなどの天然の対立遺伝子変異体を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技術のような周知の分子生物学技術を用いて同定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的突然変異誘発により生成されるもの、およびオープンリーディングフレームについては、天然タンパク質をコードするもの、ならびに天然タンパク質と比較してアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものなどの、合成的に誘導されるヌクレオチド配列も含む。一般的には、本発明のヌクレオチド配列変異体は、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、47、または49のヌクレオチド配列に対する少なくとも30、40、50、60〜70%、例えば、好ましくは、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%〜79%、一般には、少なくとも80%、例えば、81%〜84%、少なくとも85%、例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%〜98%および99%のヌクレオチド「配列同一性」を有するであろう。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質のN末端および/もしくはC末端に対する1個以上のアミノ酸の欠失(いわゆる、トランケーション)もしくは付加；天然タンパク質中の1個以上の部位での1個以上のアミノ酸の欠失もしくは付加；または天然タンパク質中の1個以上の部位での1個以上のアミノ酸の置換により、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、または53のタンパク質から誘導されるポリペプチドを意図する。そのような変異体は、例えば、遺伝子多型またはヒトによる操作の結果生じてもよい。そのような操作のための方法は、当業界で一般的に公知である。
【００８２】
好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号52のヌクレオチド配列に対する少なくとも30、40、50、60〜70%、例えば、好ましくは71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%〜79%、一般には、少なくとも80%、例えば、81%〜84%、少なくとも85%、例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%〜98%および99%のヌクレオチド「配列同一性」を有するであろう。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチド分子およびポリペプチドは、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52、47、もしくは49に記載のヌクレオチド配列、または配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53、48、もしくは50に記載のアミノ酸配列と十分に同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド分子およびポリペプチドを包含することが認識される。本明細書で用いられる用語「十分に同一である」とは、第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一または等価である(例えば、類似する側鎖を含む)十分な、または最小数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有し、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインおよび/または共通の機能的活性を有することを指す。
【００８４】
「配列同一性」とは、2つの最適に整列されたDNAまたはアミノ酸配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントウインドウを通して不変である程度を指す。試験配列と参照配列との整列されたセグメントの「同一画分」は、2つの整列された配列により共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント中の成分の総数、すなわち、全参照配列または参照配列のより小さい規定部分で除算したものである。「同一性パーセント」は、同一画分に100を乗算したものである。比較ウインドウを整列させるための配列の最適アラインメントは当業者には周知であり、SmithおよびWatermanの部分相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipmanの類似性検索方法などの手段により、および好ましくは、GCG.Wisconsin Package(Accelrys Inc. Burlington、Mass.)の一部として利用可能なGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAなどの、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施により行うことができる。
【００８５】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」は、本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのポリマー性非分枝形態の、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはその両方の組合せのヌクレオチドを指す。
【００８６】
タンパク質の「誘導体」は、問題の非改変タンパク質と比較してアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有し、由来する非改変タンパク質と類似する生物活性および機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を包含する。
【００８７】
タンパク質の「ホモログ」は、問題の非改変タンパク質と比較してアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有し、由来する非改変タンパク質と類似する生物活性および機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を包含する。
【００８８】
欠失とは、タンパク質からの1個以上のアミノ酸の除去を指す。
【００８９】
挿入とは、タンパク質中の所定の部位に導入される1個以上のアミノ酸残基を指す。挿入は、N末端および/またはC末端融合物ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含んでもよい。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、約1〜10残基の規模のより、NまたはC末端融合物よりも小さいであろう。NまたはC末端融合タンパク質またはペプチドの例としては、酵母2ハイブリッド系において用いられるような転写活性化因子の結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージ外被タンパク質、(ヒスチジン)-6-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-タグ、プロテインA、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸リダクターゼ、Tag100エピトープ、c-mycエピトープ、FLAG(登録商標)-エピトープ、lacZ、CMP(カルモジュリン結合ペプチド)、HAエピトープ、プロテインCエピトープおよびVSVエピトープが挙げられる。
【００９０】
置換とは、タンパク質のアミノ酸の、類似する特性(類似する疎水性、親水性、抗原性、αヘリックス構造またはβシート構造を形成または破壊する傾向など)を有する他のアミノ酸による置きかえを指す。アミノ酸置換は、典型的には単一の残基のものであるが、ポリペプチド上に置かれる機能的制約に応じてクラスター化していてもよく、1〜10アミノ酸の範囲であってもよい；挿入は通常、約1〜10アミノ酸残基の規模のものであろう。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換表は、当業界で周知である(例えば、Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company(編)を参照されたい。
【表３】
2014534816.tif 000014
【００９１】
アミノ酸置換、欠失および/または挿入は、固相ペプチド合成などの当業界で周知のペプチド合成技術を用いて、または組換えDNA操作により容易に作製することができる。タンパク質の置換、挿入または欠失変異体を作製するためのDNA配列の操作のための方法は、当業界で周知である。例えば、DNA中の所定の部位に置換突然変異を作製するための技術は当業者には周知であり、M13突然変異誘発、T7-Gen in vitro突然変異誘発(USB、Cleveland、OH)、QuikChange Site Directed突然変異誘発(Stratagene、San Diego、CA)、PCR媒介性部位特異的突然変異誘発または他の部位特異的突然変異誘発プロトコルが挙げられる。
【００９２】
特に好ましい実施形態においては、配列番号53のHPPDの変異体を作製するための部位特異的突然変異誘発を、配列番号56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、および129からなる群より選択される1個以上のプライマーを用いることにより実行する。
【００９３】
結果として、別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、および129からなる群より選択される配列を含む単離された核酸に関する。
【００９４】
「誘導体」はさらに、対象のタンパク質などの、天然形態のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の非天然アミノ酸残基による置換、または非天然アミノ酸残基の付加を含んでもよいペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。タンパク質の「誘導体」はまた、天然形態のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、天然に変化した(グリコシル化、アシル化、プレニル化、リン酸化、ミリストイル化、硫酸化など)または非天然に変化したアミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを包含する。誘導体は、それが由来するアミノ酸配列と比較して1個以上の非アミノ酸置換または付加、例えば、アミノ酸配列に共有的または非共有的に結合したリポーター分子または他のリガンド、例えば、その検出を容易にするために結合したリポーター分子、および非天然アミノ酸残基天然タンパク質のアミノ酸配列と比較した非天然アミノ酸残基を含んでもよい。さらに、「誘導体」はまた、天然形態のタンパク質と、FLAG、HIS6またはチオレドキシンなどのタグペプチドとの融合物を含んでもよい(タグペプチドの概説については、Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003を参照されたい)。
【００９５】
「オルソログ」および「パラログ」は、遺伝子の先祖関係を記述するために用いられる進化的概念を包含する。パラログは、先祖遺伝子の複製を通じて生じた同じ種内の遺伝子である；オルソログは、種形成を通じて生じた、また、共通の先祖遺伝子から誘導される異なる生物に由来する遺伝子である。そのようなオルソログの例の非限定的一覧は、表1に示されている。
【００９６】
パラログおよびオルソログは、特定の基質のための結合ポケットまたは他のタンパク質との相互作用のための結合モチーフなどの、所与の部位に好適なアミノ酸残基を担持する異なるドメインを共有してもよい。
【００９７】
用語「ドメイン」は、進化的に関連するタンパク質の配列のアラインメントに沿って特定の位置で保存されたアミノ酸のセットを指す。他の位置のアミノ酸はホモログ間で変化してもよいが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または機能において必須である可能性があるアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーの整列された配列におけるその高い程度の保存により同定された場合、それらを識別子として用いて、問題の任意のポリペプチドが以前に同定されたポリペプチドファミリーに属するかどうかを決定することができる。
【００９８】
用語「モチーフ」または「コンセンサス配列」とは、進化的に関連するタンパク質の配列中の短い保存領域を指す。モチーフはドメインの高度に保存された部分であることが多いが、そのドメインの一部のみを含んでもよく、または保存されたドメインの外側に位置してもよい(モチーフのアミノ酸の全部が規定のドメインの外側にある場合)。
【００９９】
例えば、SMART (Schultzら(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunicら(2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244)、InterPro (Mulderら(2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318)、Prosite (BucherおよびBairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D.(編)、pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Huloら、Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004))、またはPfam (Batemanら、Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))などの、ドメインの同定のための専門家用データベースが存在する。タンパク質配列のin silico分析のための手段のセットがExPASyプロテオミクスサーバー(Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteigerら、ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))上で利用可能である。ドメインまたはモチーフを、配列アラインメントなどによる日常的な技術を用いて、ドメインまたはモチーフを同定することもできる。
【０１００】
比較のための配列のアラインメントのための方法は当業界で周知であり、そのような方法として、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAが挙げられる。GAPは、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する2つの配列の全体的(すなわち、完全配列に及ぶ)アラインメントを見出すためのNeedlemanおよびWunschのアルゴリズム((1970) J Mol Biol 48: 443-453)を用いる。BLASTアルゴリズム(Altschulら(1990) J Mol Biol 215: 403-10)は、2つ配列間の配列同一性パーセントを算出し、類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアはNational Centre for Biotechnology Information (NCBI)を介して公共的に利用可能である。ホモログは、例えば、ClustalW多配列アラインメントアルゴリズム(バージョン1.83)を、デフォルトペアワイズアラインメントパラメータ、およびパーセンテージでのスコアリング方法と共に用いて同定することができる。類似性および同一性の全体的パーセンテージを、MatGATソフトウェアパッケージ(Campanellaら、BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4: 29. MatGAT:タンパク質またはDNA配列を用いて類似性/同一性マトリックスを生成するアプリケーション)において利用可能な方法の1つを用いて決定することもできる。当業者には明らかであろうが、少しのマニュアル編集を実施して、保存されたモチーフ間のアラインメントを最適化することができる。さらに、ホモログの同定のために完全長配列を用いる代わりに、特定のドメインを用いることもできる。配列同一性の値を、デフォルトパラメータを用いる上記のプログラムを用いて、全核酸もしくはアミノ酸配列上で、または選択されたドメインもしくは保存されたモチーフ上で決定することができる。部分的アラインメントについては、Smith-Watermanアルゴリズムが特に有用である(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195-7)。
【０１０１】
本発明者らは驚くべきことに、1個以上の重要なアミノ酸残基を置換することにより、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53を有する野生型HPPD酵素の活性と比較して、除草剤耐性または抵抗性を顕著に増大させることができることを見出した。mut-HPPDの好ましい置換は、植物の除草剤耐性を増大させるが、ジオキシゲナーゼ活性の生物活性を実質的に影響されないままにするものである。
【０１０２】
従って、本発明の別の目的は、重要なアミノ酸残基が任意の他のアミノ酸により置換されたHPPD酵素、その変異体、誘導体、オルソログ、パラログまたはホモログに関する。
【０１０３】
一実施形態においては、HPPD酵素、その変異体、誘導体、オルソログ、パラログまたはホモログの重要なアミノ酸残基は、上記の表3に記載の保存されたアミノ酸により置換される。
【０１０４】
当業者であれば、以下に記載のアミノ酸の位置のすぐ近くに位置するアミノ酸を置換してもよいことを理解するであろう。かくして、別の実施形態においては、本発明のmut HPPDは、重要なアミノ酸からアミノ酸±3、±2または±1アミノ酸の位置が任意の他のアミノ酸により置換された、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53の配列、またはその変異体、誘導体、オルソログ、パラログもしくはホモログを含む。
【０１０５】
当業界で周知の技術に基づいて、所望の活性を有するさらなるmut-HPPD候補を検索することができる手段により、高度に特徴的な配列パターンを開発することができる。
【０１０６】
好適な配列パターンを適用することによりさらなるmut-HPPD候補の検索も、本発明により包含される。当業者であれば、本発明の配列パターンが前記パターンの2個の隣接するアミノ酸残基間の正確な距離により限定されないことを理解できるであろう。上記パターン中の2つの隣接物間のそれぞれの距離は、例えば、所望の活性に実質的に影響することなく、最大で±10、±5、±3、±2または±1アミノ酸の位置で互いに無関係に変化してもよい。
【０１０７】
本発明に従って得られた結晶学的データに基づく個々のアミノ酸残基の上記機能的および空間的分析と一致して、潜在的に有用な本発明のmut-HPPD候補に特徴的なユニークな部分アミノ酸配列を同定することができる。
【０１０８】
特に好ましい実施形態においては、配列番号2のmut-HPPDの変異体または誘導体は、以下の表4aから選択され、配列番号2のmut-HPPDの組合わせたアミノ酸置換は、表4bから選択される。
【表４】
2014534816.tif 000015
【０１０９】
上記の表に記載のもの以外の任意のアミノ酸を置換基として用いることができることが理解されるべきである。そのような突然変異体の官能性について試験するためのアッセイは当業界で容易に利用可能であり、それぞれ、本発明の実施例のセクションに記載される。
【０１１０】
好ましい実施形態においては、アミノ酸配列は、以下の位置：236、411、320、403、334、353、321、212、407の1個以上において配列番号2のHPPDのアミノ酸配列と異なる。
【０１１１】
これらのアミノ酸位置での相違の例としては、限定されるものではないが、以下の1つ以上が挙げられる：位置236のアミノ酸がアラニン以外である；位置411のアミノ酸がグルタミン酸以外である；位置320のアミノ酸がロイシン以外である；位置403のアミノ酸がグリシン以外である；位置334のアミノ酸がロイシン以外である；位置353のアミノ酸がロイシン以外である；位置321のアミノ酸がプロリン以外である；位置212のアミノ酸がバリン以外である；位置407のアミノ酸がグリシン以外である。
【０１１２】
いくつかの実施形態においては、配列番号2のmut HPPD酵素は、以下の1つ以上を含む：位置236のアミノ酸がロイシンである；位置411のアミノ酸がトレオニンである；位置320のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン、ヒスチジンまたはチロシンである；位置403のアミノ酸がアルギニンである；位置334のアミノ酸がグルタミン酸である；位置353のアミノ酸がメチオニンである；位置321のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンである；位置212のアミノ酸がイソロイシンまたはロイシンである；位置407のアミノ酸がシステインである。
【０１１３】
特に好ましい実施形態においては、配列番号2の本発明のmut HPPD酵素は、以下の1つ以上を含む：位置320のアミノ酸がアスパラギンである；位置334のアミノ酸がグルタミン酸である；位置353のアミノ酸がメチオニンである；位置321のアミノ酸がアルギニンである；位置212のアミノ酸がイソロイシンである。
【０１１４】
さらに特に好ましい実施形態においては、配列番号53のmut-HPPDの変異体または誘導体は以下の表4cから選択され、配列番号53のmut-HPPDの組合わせたアミノ酸置換は表4dから選択される。
【０１１５】
2014534816.tif 000016
【０１１６】
上記の表に記載のもの以外の任意のアミノ酸を置換基として用いることができることが理解されるべきである。そのような突然変異体の官能性について試験するためのアッセイは当業界で容易に利用可能であり、それぞれ、本発明の実施例のセクションに記載される。
【０１１７】
別の好ましい実施形態においては、アミノ酸配列は、以下の位置：293、335、336、337、363、422、385、393、368、421のうちの1個以上において配列番号53のHPPDのアミノ酸配列と異なる。
【０１１８】
これらのアミノ酸位置での相違の例としては、限定されるものではないが、以下の1つ以上が挙げられる：位置293のアミノ酸がグルタミン以外である；位置335のアミノ酸がメチオニン以外である；位置336のアミノ酸がプロリン以外である；位置337のアミノ酸がセリン以外である；位置363のアミノ酸がグルタミン酸以外である；位置422のアミノ酸がグリシン以外である；位置385のアミノ酸がロイシン以外である；位置393のアミノ酸がイソロイシン以外である；位置368のアミノ酸がロイシン以外である；位置421のアミノ酸がリシン以外である。
【０１１９】
いくつかの実施形態においては、配列番号53のHPPD酵素は、以下の1つ以上を含む：位置293のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ヒスチジン、アスパラギンまたはセリンである；位置335のアミノ酸がアラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、チロシン、セリン、トレオニンまたはシステインである；位置336のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンである；位置337のアミノ酸がアラニンまたはプロリンである；位置368のアミノ酸がメチオニンまたはチロシンである；位置363のアミノ酸がグルタミンである；位置421のアミノ酸がトレオニンである；位置422のアミノ酸がヒスチジン、メチオニン、フェニルアラニン、またはシステインである；位置385のアミノ酸がバリンまたはアラニンである；位置393のアミノ酸がアラニンまたはロイシンである。
【０１２０】
特に好ましい実施形態においては、配列番号53のHPPD酵素は、以下の1つ以上を含む：位置335のアミノ酸がチロシンまたはヒスチジンである；位置393のアミノ酸がロイシンである；位置385のアミノ酸がバリンである。
【０１２１】
別の特に好ましい実施形態においては、配列番号53のHPPD酵素は、以下の1個以上を含む：位置335のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、チロシン、ヒスチジン、好ましくはヒスチジンである；位置336のアミノ酸がアルギニンもしくはアラニン、好ましくは、アラニンである；および/または位置363のアミノ酸がグルタミンである。
【０１２２】
表1に記載のものなどの、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53のホモログ、オルソログおよびパラログと、対応する配列番号48または50との間で共有される保存された領域およびモチーフを同定することは、当業者の知識の範囲内にあるであろう。好適な結合モチーフであってよいそのような保存された領域が同定されたら、表4aおよび表4b、表4cおよび表4dに列挙されたアミノ酸に対応するアミノ酸を、任意の他のアミノ酸、好ましくは、表3に示された保存されたアミノ酸、より好ましくは、表4aおよび表4b、表4cおよび表4dに記載のアミノ酸により置換されるように選択することができる。
【０１２３】
さらに、本発明は、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、もしくは52のヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む核酸によりコードされたmut-HPPDを用いることによる、および/または配列番号47もしくは49のヌクレオチド配列、またはその変異体もしくは誘導体を含む核酸によりコードされたmut-HSTを用いることによる、クマロン誘導体除草剤を同定するための方法に関する。
【０１２４】
前記方法は、
a)mut-HPPDが発現される、mut-HPPDをコードする核酸を含むトランスジェニック細胞または植物を生成するステップと、
b)ステップa)のトランスジェニック細胞または植物および同じ品種の対照細胞または植物に、クマロン誘導体除草剤を施用するステップと、
c)前記クマロン誘導体除草剤の施用後に、トランスジェニック細胞または植物および対照細胞または植物の生長または生存能力を決定するステップと、
d)トランスジェニック細胞または植物の生長と比較して、対照細胞または植物に対する生長の低下を付与する「クマロン誘導体除草剤」を選択するステップと
を含む。
【０１２５】
「対照細胞」または「類似する、野生型の植物、植物組織、植物細胞または宿主細胞」とは、それぞれ、除草剤抵抗性特性および/または本明細書に開示される本発明の特定のポリヌクレオチドを欠く、植物、植物組織、植物細胞、または宿主細胞を意図する。従って、用語「野生型」の使用は、そのゲノム中に組換えDNAを欠く、および/または本明細書に開示されるものとは異なる除草剤抵抗性特性を有さない植物、植物組織、植物細胞、もしくは他の宿主細胞を含むと意図されない。
【０１２６】
別の目的は、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性または耐性であるmut-HPPDをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
a)mut-HPPDをコードする核酸のライブラリーを生成するステップと、
b)細胞または植物中でそれぞれの前記核酸を発現させ、前記細胞または植物をクマロン誘導体除草剤で処理することにより、得られたmut-HPPDをコードする核酸の集団をスクリーニングするステップと、
c)mut-HPPDをコードする核酸の前記集団により提供されるクマロン誘導体除草剤耐性レベルを、対照HPPDをコードする核酸により提供されるクマロン誘導体除草剤耐性レベルと比較するステップと、
d)対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較して、クマロン誘導体除草剤に対する耐性レベルの有意な増大を提供する少なくとも1つのmut-HPPDをコードする核酸を選択するステップと
を含む前記方法に関する。
【０１２７】
好ましい実施形態においては、ステップd)で選択されたmut-HPPDをコードする核酸は、対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較して、クマロン誘導体除草剤に対する細胞または植物の少なくとも2倍高い抵抗性または耐性を提供する。
【０１２８】
さらに好ましい実施形態においては、ステップd)で選択されたmut-HPPDをコードする核酸は、対照HPPDをコードする核酸により提供されるものと比較して、クマロン誘導体除草剤に対する細胞または植物の少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍高い抵抗性または耐性を提供する。
【０１２９】
ステップa)のライブラリーの核酸配列を含むトランスジェニック植物または宿主細胞、好ましくは、植物細胞を生成し、前記トランスジェニック植物を対照植物または宿主細胞、好ましくは植物細胞と比較することにより、抵抗性または耐性を決定することができる。
【０１３０】
別の目的は、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性または耐性であるmut-HPPDまたはmut-HSTをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する植物または藻類を同定する方法であって、
a)植物細胞または緑藻類の培養物中で、前記細胞の死を誘導するクマロン誘導体除草剤の有効量を同定するステップと、
b)前記植物細胞または緑藻類を突然変異誘発剤で処理するステップと、
c)前記突然変異誘発された細胞集団を、ステップa)で同定された有効量のクマロン誘導体除草剤と接触させるステップと、
d)これらの試験条件を生き延びる少なくとも1個の細胞を選択するステップと、
e)ステップd)で選択された細胞からHPPDおよび/またはHST遺伝子をPCR増幅し、配列決定し、そのような配列を、それぞれ野生型HPPDまたはHST遺伝子配列と比較するステップと
を含む前記方法に関する。
【０１３１】
好ましい実施形態においては、前記突然変異誘発剤は、エチルメタンスルホン酸(EMS)である。
【０１３２】
微生物、植物、菌類、藻類、混合培養物などの様々な異なる潜在的な起源生物ならびに土壌などのDNAの環境的起源から、mut-HPPDをコードするヌクレオチド配列を同定するための好適な候補核酸を取得するための当業者には周知の多くの方法が利用可能である。これらの方法は、特に、cDNAまたはゲノムDNAライブラリーの調製、好適な縮重性オリゴヌクレオチドプライマーの使用、既知の配列または相補性アッセイ(例えば、チロシン上での生長について)に基づくプローブの使用ならびに組換えまたはシャッフルされたmut-HPPDをコードする配列を提供するための突然変異誘発およびシャッフリングの使用を含む。
【０１３３】
候補および対照HPPDコード配列を含む核酸を、酵母、細菌宿主株、藻類またはタバコもしくはシロイヌナズナなどの高等植物中で発現させ、HPPDコード配列の固有の耐性の相対レベルを、様々な濃度の選択されたクマロン誘導体除草剤の存在下で形質転換株または植物の眼に見える指標となる表現型に従ってスクリーニングすることができる。用量応答およびこれらの指標となる表現型(褐色の形成、生長阻害、除草効果など)と関連する用量応答における相対的シフトは、例えば、GR50(50%生長低下濃度)またはMIC(最小阻害濃度)値を単位として都合良く表すことができ、値の増加は発現されたHPPDの固有の耐性の増加に対応する。例えば、大腸菌などの細菌の形質転換に基づく比較的迅速なアッセイにおいては、それぞれのmut-HPPDコード配列を、例えば、lacZプロモーターなどの制御可能なプロモーターの発現制御下でのDNA配列として発現させ、異なるHPPD配列の可能な限り比較可能なレベルの発現として得るためのコドン使用などの問題を、例えば、合成DNAの使用により適切に考慮することができる。代替的な候補HPPD配列を含む核酸を発現するそのような株を、場合により、チロシン添加培地中で、異なる濃度の選択されたクマロン誘導体除草剤上に塗布し、発現されたHPPD酵素の固有の耐性の相対レベルを、褐色の組織褐変症性色素沈着の形成の阻害に関する程度およびMICに基づいて見積もることができる。
【０１３４】
別の実施形態においては、候補核酸を植物材料中に形質転換してトランスジェニック植物を生成し、形態学的に正常な繁殖力のある植物に再生した後、選択されたクマロン誘導体除草剤に対する示差的耐性について測定する。カナマイシンなどの好適な選択マーカー、アグロバクテリウム(Agrobacterium)などに由来するバイナリーベクターおよび例えば、タバコ葉片からの植物再生を用いる形質転換のための多くの好適な方法が当業界で周知である。場合により、植物の対照集団を、対照HPPDを発現する核酸を用いて同様に形質転換する。あるいは、シロイヌナズナまたはタバコなどの非形質転換双子葉植物は、あらゆる場合において、それ自身の内因性HPPDを発現するため、これを対照として用いることができる。様々な一次植物形質転換事象またはその子孫の、表2から選択されるクマロン誘導体に対する除草剤耐性レベルの平均、および分布を、様々な異なる濃度の除草剤で、植物損傷、分裂組織漂白症状などに基づいて通常の様式で評価する。これらのデータを、例えば、x軸上にプロットされた「用量」およびy軸上にプロットされた「殺傷率」、「除草効果」、「緑植物の発芽数」などを有する用量/応答曲線から誘導されるGR50値を単位として表すことができ、GR50値の増加は、発現されたHPPDの固有の耐性レベルの増加に対応する。除草剤を、発芽前または発芽後に好適に施用することができる。
【０１３５】
別の目的は、上記で詳細に定義されたmut-HPPDをコードする単離された核酸に関する。好ましくは、核酸は上記で定義された方法により同定可能である。
【０１３６】
別の実施形態においては、本発明は、野生型もしくはmut-HPPD核酸により形質転換された植物細胞または野生型もしくはmut-HPPD核酸を発現する植物を得るために突然変異された植物細胞に関し、植物細胞中での核酸の発現は、野生型品種の植物細胞と比較して、除草剤、好ましくは、クマロン誘導体除草剤に対する抵抗性または耐性の増大をもたらす。
【０１３７】
用語「発現/発現すること」または「遺伝子発現」とは、特定の遺伝子または複数の特定の遺伝子または特定の遺伝子構築物の転写を意味する。用語「発現」または「遺伝子発現」は特に、mRNAのタンパク質へのその後の転写を含むか、または含まない、構造的RNA(rRNA、tRNA)またはmRNAへの1つまたは複数の遺伝子または遺伝子構築物の転写を意味する。そのプロセスは、DNAの転写および得られるmRNA産物のプロセッシングを含む。
【０１３８】
所望の効果、すなわち、本発明のクマロン誘導体除草剤に対して耐性または抵抗性である植物を得るために、少なくとも1つの核酸が当業者には公知の方法および手段によって「過剰発現」されることが理解されるであろう。
【０１３９】
本明細書で用いられる用語「発現の増加」または「過剰発現」とは、元の野生型発現レベルに対して付加的である任意の形態の発現を意味する。遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させるための方法は当業界で文書で十分に立証されており、例えば、適切なプロモーターにより誘導される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして役立つ単離された核酸を、非異種形態のポリヌクレオチドの適切な位置(典型的には、上流)に導入して、対象のポリペプチドをコードする核酸の発現を上方調節することができる。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失および/もしくは置換によりin vivoで変化させる(Kmiec、米国特許第5,565,350号; Zarlingら、WO9322443を参照されたい)か、または単離されたプロモーターを、本発明の遺伝子から適切な向きおよび距離で植物細胞中に導入して、遺伝子の発現を制御することができる。
【０１４０】
ポリペプチド発現が望ましい場合、ポリヌクレオチドコード領域の3'末端にポリアデニル化領域を含有させるのが一般に望ましい。ポリアデニル化領域は、天然遺伝子に由来する、様々な他の植物遺伝子に由来する、またはT-DNAに由来するものであってもよい。付加しようとする3'末端配列は、例えば、ノパリン合成酵素もしくはオクトピン合成酵素遺伝子に由来するか、またはあるいは、別の植物遺伝子、もしくはあまり好ましくはないが、任意の他の真核遺伝子に由来するものであってもよい。
【０１４１】
また、イントロン配列を5'非翻訳領域(UTR)または部分コード配列のコード配列に付加して、細胞質ゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増加させることもできる。植物および動物の両方の発現構築物中の転写ユニットへのスプライス可能なイントロンの含有は、mRNAおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現を、最大1000倍増加させることが示されている(BuchmanおよびBerg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callisら(1987) Genes Dev 1:1183-1200)。遺伝子発現のそのようなイントロン増強は、典型的には、転写ユニットの5'末端の近くに置かれた場合に最も大きい。トウモロコシイントロンAdh1-Sイントロン1、2および6、Bronze-1イントロンの使用が当業界で公知である。一般的な情報については、The Maize Handbook, Chapter 116, FreelingおよびWalbot(編)、Springer, N.Y. (1994)を参照されたい。
【０１４２】
本明細書で記載される用語「導入」または「形質転換」は、移動に用いられる方法とは関係なく、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの移動を包含する。器官形成によるにしても、または胚形成によるにしても、その後クローン増殖することができる植物組織を、本発明の遺伝子構築物で形質転換し、全植物をそれから再生させることができる。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種にとって利用可能であり、それに対して最適に適合させたクローン増殖システムに応じて変化するであろう。例示的な組織標的としては、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、存在する分裂組織(例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根分裂組織)、ならびに誘導分裂組織(例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織)が挙げられる。ポリヌクレオチドを宿主細胞中に一過的または安定的に導入し、例えば、プラスミドとして非組込み型として維持することができる。あるいは、それを宿主ゲノム中に組込むことができる。次いで、得られる形質転換植物細胞を用いて、当業者には公知の様式で形質転換植物を再生することができる。
【０１４３】
植物のゲノム中への外来遺伝子の移動は、形質転換と呼ばれる。植物種の形質転換は、現在ではほとんど日常的な技術である。有利には、いくつかの形質転換法のいずれかを用いて、好適な先祖細胞中に対象の遺伝子を導入することができる。形質転換および植物組織または植物細胞からの植物の再生について記載された方法を、一過的または安定的形質転換のために用いることができる。形質転換法は、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離DNA取込みを増加させる化合物、植物へのDNAの直接的注入、粒子銃ボンバードメント、ウイルスまたは花粉を用いる形質転換およびマイクロプロジェクションの使用を含む。方法は、プロトプラストのためのカルシウム/ポリエチレングリコール法(Krens, F.A.ら(1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu Iら(1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); プロトプラストのエレクトロポレーション(Shillito R.D.ら(1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); 植物材料中へのマイクロインジェクション(Crossway Aら(1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); DNAまたはRNA-被覆粒子ボンバードメント(Klein TMら(1987) Nature 327: 70)、(非組込み型)ウイルスを用いる感染などから選択することができる。トランスジェニック作物植物などのトランスジェニック植物を、好ましくはアグロバクテリウム媒介性形質転換により作製する。有利な形質転換法は、in plantaでの形質転換である。この目的のために、例えば、アグロバクテリウムを植物種子に対して作用させるか、または植物分裂組織にアグロバクテリウムを接種することができる。形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液を、無傷の植物または少なくとも花原基(flower primordia)に作用させることが、本発明に従って特に好都合であることが証明された。続いて、処理された植物の種子が得られるまで、植物を生長させる(CloughおよびBent, Plant J. (1998) 16, 735-743)。コメのアグロバクテリウム媒介性形質転換のための方法としては、コメ形質転換のための周知の方法、例えば、以下のいずれかに記載のものが挙げられる：欧州特許出願第EP 1198985 A1号、AldemitaおよびHodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chanら(Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993)、Hieiら(Plant J 6 (2): 271-282, 1994)(これらの開示は、あたかもそれが完全に説明されるように参照により本明細書に組込まれる)。トウモロコシ形質転換の場合、好ましい方法は、Ishidaら(Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996)またはFrameら(Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002)(これらの開示は、あたかもそれが完全に説明されるように参照により本明細書に組込まれる)のいずれかに記載された通りである。前記方法は、例えば、B. Jenesら、Techniques for Gene Transfer、Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization、S.D. KungおよびR. Wu(編)、Academic Press (1993) 128-143およびPotrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225にさらに記載されている。発現させようとする核酸または構築物を、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を形質転換するのに好適であるベクター、例えば、pBin19(Bevanら、Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711)中にクローニングする。次いで、そのようなベクターにより形質転換されたアグロバクテリウムを、例えば、傷を付けた葉または切り刻んだ葉をアグロバクテリウム溶液中に浸した後、それらを好適な培地中で培養することにより、シロイヌナズナ(アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)は本発明の��囲内にあり、作物植物として考慮されない)のようなモデルとして用いられる植物、または例えば、タバコ植物などの作物植物などの植物の形質転換のために公知の様式で用いることができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる植物の形質転換は、例えば、HofgenおよびWillmitzerにより、Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877に記載されているか、または特に、F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization、S.D. KungおよびR. Wu(編)、Academic Press, 1993, pp. 15-38から公知である。
【０１４４】
後に無傷の植物に再生させる必要がある、体細胞の形質転換に加えて、植物分裂組織の細胞、特に、配偶子に発生するこれらの細胞を形質転換することもできる。この場合、形質転換された配偶子は、天然の植物発生に従い、トランスジェニック植物を生じさせる。かくして、例えば、シロイヌナズナの種子をアグロバクテリウムで処理し、特定の割合が形質転換され、かくしてトランスジェニックとなる発生中の植物から、種子を取得する[Feldman, KAおよびMarks MD (1987)、Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992)、C Koncz、N-H ChuaおよびJ Shell(編)、Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]。代替的な方法は、花序の反復的除去およびロゼットの中心における切出し部位と形質転換されたアグロバクテリウムとのインキュベーションに基づくものであり、それによって形質転換された種子をより後の時点で同様に取得することができる(Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370)。しかしながら、特に有効な方法は、「フローラルディップ(floral dip)」法などの減圧浸潤法およびその改変である。シロイヌナズナの減圧浸潤の場合、無傷植物を減圧下でアグロバクテリウム懸濁液[Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199]で処理するが、「フローラルディップ」法の場合、発生中の花組織を、界面活性剤で処理されたアグロバクテリウム懸濁液と共に手短にインキュベートする[Clough, SJおよびBent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]。両場合とも、特定の割合のトランスジェニック種子が収穫され、上記の選択条件下で生長させることにより、これらの種子を非トランスジェニック種子から識別することができる。さらに、プラスチドは多くの作物において母方から遺伝され、トランスジーンが花粉を流出させる危険性を低下させるか、または排除するので、プラスチドの安定な形質転換が有利である。クロロプラストゲノムの形質転換は、一般的には、Klausら、2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]に体系的に示されたプロセスにより達成される。簡単に述べると、形質転換しようとする配列を、クロロプラストゲノムと相同なフランキング配列間に選択マーカー遺伝子と一緒にクローニングする。これらの相同なフランキング配列は、プラストームへの部位特異的組込みを指令する。プラスチド形質転換は、多くの異なる植物種について記載されており、ある概説はBock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38またはMaliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28に与えられている。さらなる生物工学的進歩が、一過的同時組込みマーカー遺伝子により作製することができるマーカーを含まないプラスチド形質転換体の形態で最近報告されている(Klausら、2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229)。遺伝的に改変された植物細胞を、当業者が精通しているあらゆる方法によって再生することができる。好適な方法を、S.D. KungおよびR. Wu, PotrykusまたはHofgenおよびWillmitzerによる上記刊行物中に見出すことができる。
【０１４５】
一般的には、形質転換後に、植物細胞または細胞群を、対象の遺伝子と共に同時に導入される植物により発現可能な遺伝子によりコードされた1つ以上のマーカーの存在について選択した後、形質転換材料を全植物に再生させる。形質転換植物を選択するために、形質転換において得られた植物材料は、原則として、形質転換植物を非形質転換植物から識別することができるような選択条件にかけられる。例えば、上記の様式で得られた種子を植え、初期の生長期間の後、噴霧による好適な選択にかけることができる。さらなる可能性は、種子を、必要に応じて滅菌した後、好適な選択剤を用いて寒天プレート上で生長させ、形質転換された種子のみが植物に生長することができるようにすることにある。あるいは、形質転換植物を、上記のものなどの選択マーカーの存在についてスクリーニングする。
【０１４６】
DNA導入および再生の後、推定される形質転換植物を、対象の遺伝子の存在、コピー数および/またはゲノム構成について、例えば、サザン分析を用いて評価することもできる。あるいは、またはさらに、新しく導入されたDNAの発現レベルを、ノーザンおよび/またはウェスタン分析を用いてモニタリングすることができ、両技術は当業者には周知である。
【０１４７】
生成された形質転換植物を、クローン増殖または古典的育種技術などの様々な手段により増殖させることができる。例えば、第1世代(またはT1)の形質転換植物を自家受粉させ、同型の第2世代(またはT2)の形質転換体を選択した後、T2植物を古典的育種技術によりさらに増殖させることができる。生成された形質転換生物は、様々な形態を取ってもよい。例えば、それらは形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ；クローン形質転換体(例えば、全細胞が発現カセットを含むように形質転換される)；形質転換および非形質転換組織(例えば、植物においては、非形質転換接ぎ穂に移植された形質転換された根茎)の移植であってもよい。
【０１４８】
好ましくは、野生型もしくはmut-HPPD核酸(a)または野生型もしくはmut-HST核酸(b)は、a)配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、もしくは52に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；b)配列番号47もしくは49に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；c)配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；d)a)〜c)のいずれかの少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；およびe)a)〜d)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
好ましくは、植物中での核酸の発現は、野生型品種の植物と比較して、除草剤、好ましくは、クマロン誘導体除草剤に対する植物の抵抗性の増大をもたらす。
【０１５０】
別の実施形態においては、本発明は、本発明による植物細胞を含む植物、好ましくはトランスジェニック植物であって、該植物中での核酸の発現が、野生型品種の植物と比較してクマロン誘導体除草剤に対する植物の抵抗性の増大をもたらす、前記植物に関する。
【０１５１】
本明細書に記載の植物は、トランスジェニック作物植物または非トランスジェニック植物のいずれかであってよい。
【０１５２】
本発明の目的のために、「トランスジェニック」、「トランスジーン」または「組換え」とは、例えば、核酸配列、発現カセット、該核酸配列を含む遺伝子構築物もしくはベクターまたは本発明による核酸配列、発現カセットもしくはベクターを用いて形質転換された生物に関して、
(a)本発明の方法において有用なタンパク質をコードする核酸配列、または
(b)本発明による核酸配列に機能し得る形で連結された遺伝子制御配列、例えば、プロモーター、または
(c)a)およびb)
が、その天然の遺伝的環境に位置しないか、または組換え方法により改変されており、例えば、1個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆転または挿入の形態を取る改変が可能である、組換え方法によるもたらされた全てのこれらの構築物を意味する。天然の遺伝的環境とは、元の植物における天然のゲノムもしくは染色体遺伝子座またはゲノムライブラリー中の存在を意味すると理解される。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然の遺伝的環境は、少なくとも部分的に保持されるのが好ましい。その環境は少なくとも一方の側で前記核酸配列に隣接し、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特に好ましくは少なくとも1000bp、最も好ましくは少なくとも5000bpの配列長を有する。天然に存在する発現カセット、例えば、核酸配列の天然のプロモーターと、上記で定義された本発明の方法において有用なポリペプチドをコードする対応する核酸配列との天然に存在する組合せは、この発現カセットが非天然の合成(「人工」)方法、例えば、突然変異処理などによって改変された場合、トランスジェニック発現カセットになる。好適な方法は、例えば、米国特許第5,565,350号またはWO00/15815に記載されている。
【０１５３】
かくして、本発明の目的のためのトランスジェニック植物は、上記のように、本発明の方法において用いられる核酸が前記植物のゲノム中でその天然の遺伝子座にはなく、その核酸を同種的に、または異種的に発現させることができることを意味すると理解される。しかしながら、記載のように、トランスジェニックはまた、本発明によるか、または本発明の方法において用いられる核酸が植物のゲノム中のその天然の位置にはないが、その配列が天然の配列に関して改変されていること、および/または天然の配列の調節配列が改変されていることも意味する。トランスジェニックは、好ましくは、ゲノム中の非天然位置での本発明による核酸の発現、すなわち、核酸の同種的または好ましくは、異種的発現が起こることを意味すると理解される。好ましいトランスジェニック植物は、本明細書に記載される。さらに、用語「トランスジェニック」とは、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドの全部または一部を含有する、任意の植物、植物細胞、カルス、植物組織、または植物部分を指す。多くの場合、組換えポリヌクレオチドの全部または一部は、それが代々伝えられるように、染色体または安定な染色体外エレメント中に安定に組込まれる。本発明の目的のために、用語「組換えポリヌクレオチド」とは、遺伝子工学により変化、再配置、または改変されたポリヌクレオチドを指す。例としては、任意のクローニングされたポリヌクレオチド、または異種配列に連結または結合されたポリヌクレオチドが挙げられる。用語「組換え」は、自発的突然変異などの天然に存在する事象、または非自発的突然変異誘発、次いで、選択的育種の結果生じるポリヌクレオチドの変化は指さない。
【０１５４】
非自発的突然変異誘発および選択的育種に起因して生じる突然変異を含有する植物は、本明細書では、非トランスジェニック植物と呼ばれ、本発明に含まれる。植物がトランスジェニックであり、複数のmut-HPPD核酸を含む実施形態においては、核酸は、異なるゲノムまたは同じゲノムに由来してもよい。あるいは、植物が非トランスジェニックであり、複数のmut-HPPD核酸を含む実施形態においては、核酸は異なるゲノムまたは同じゲノム上に位置する。
【０１５５】
特定の実施形態においては、本発明は、突然変異育種により作製された除草剤抵抗性植物を含む。そのような植物は、mut-HPPDおよび/またはmut-HSTをコードするポリヌクレオチドを含み、1つ以上の「クマロン誘導体除草剤」に対して耐性である。そのような方法は、例えば、植物または種子を、変異原、特に化学的変異原、例えば、エチルメタンスルホン酸(EMS)などに曝露し、少なくとも1つ以上のクマロン誘導体除草剤に対する耐性が増強された植物を選択することを含んでもよい。
【０１５６】
しかしながら、本発明は、化学的変異原EMSを含む突然変異誘発方法により作製された除草剤耐性植物に限定されない。当業界で公知の任意の突然変異誘発方法を用いて、本発明の除草剤抵抗性植物を作製することができる。そのような突然変異誘発方法は、例えば、以下の変異原：放射線、例えば、X線、ガンマ線(例えば、コバルト60もしくはセシウム137)、中性子(例えば、原子炉中でのウラン235による核分裂の生成物)、ベータ線照射(例えば、リン32もしくは炭素14などの放射性アイソトープから放射される)、および紫外線照射(好ましくは、250〜290nm)、および化学的変異原、例えば、塩基類似体(例えば、5-ブロモ-ウラシル)、関連化合物(例えば、8-エトキシカフェイン)、抗体(例えば、ストレプトニグリン)、アルキル化剤(例えば、硫黄マスタード、窒素マスタード、エポキシド、エチレンアミン、硫酸塩、スルホン酸塩、スルホン、ラクトン)、アジド、ヒドロキシルアミン、硝酸、またはアクリジンのうちのいずれか1つ以上の使用を含んでもよい。除草剤抵抗性植物を、除草剤抵抗性突然変異を含む植物細胞を選択するために組織培養法を使用した後、それから除草剤抵抗性植物を再生させることにより作製することもできる。例えば、米国特許第5,773,702号および第5,859,348号(両方ともその全体が参照により本明細書に組込まれる)を参照されたい。突然変異育種のさらなる詳細を、「Principals of Cultivar Development」、Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company(その開示は参照により本明細書に組込まれる)に見出すことができる。
【０１５７】
上記定義に加えて、用語「植物」は、成熟または発生の任意の段階にある作物植物、ならびに本文により別途明確に指摘されない限り、任意のそのような植物から取られたか、または誘導された任意の組織または器官(植物部分)を包含することが意図される。植物部分としては、限定されるものではないが、茎、根、花、胚珠、雄しべ、葉、胚、分裂組織領域、カルス組織、葯培養物、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、プロトプラストなどが挙げられる。
【０１５８】
本発明の植物は、少なくとも1つのmut-HPPD核酸または過剰発現された野生型HPPD核酸を含み、野生型品種の植物と比較してクマロン誘導体除草剤に対する耐性が増大している。本発明の植物は、2つ以上のゲノムを含んでもよいため、異なるゲノムに由来する複数の野生型またはmut-HPPD核酸を有してもよい。例えば、植物は、通常はAおよびBゲノムと呼ばれる、2つのゲノムを含む。HPPDは必要な代謝酵素であるため、それぞれのゲノムはHPPD酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子(すなわち、少なくとも1つのHPPD遺伝子)を有する。本明細書で用いられる用語「HPPD遺伝子座」とは、ゲノム上のHPPD遺伝子の位置を指し、用語「HPPD遺伝子」および「HPPD核酸」とは、HPPD酵素をコードする核酸を指す。各ゲノム上のHPPD核酸は、そのヌクレオチド配列において、別のゲノム上のHPPD核酸とは異なる。当業者であれば、遺伝的交配および/または当業者には公知の配列決定法もしくはエキソヌクレアーゼ消化法により、それぞれのHPPD核酸の起源となるゲノムを決定することができる。
【０１５９】
本発明は、1個、2個、3個以上のmut-HPPD対立遺伝子を含む植物であって、野生型品種の植物と比較してクマロン誘導体除草剤に対する耐性が増大した前記植物を含む。mut-HPPD対立遺伝子は、配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、52に定義されたポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体、配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53に定義されたポリペプチド、またはその変異体もしくは誘導体、ホモログ、オルソログ、パラログをコードするポリヌクレオチド、上記のポリヌクレオチドのいずれかの少なくとも60個の連続的ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および上記のポリヌクレオチドのいずれかと相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１６０】
「対立遺伝子」または「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体位置に位置する、別の形態の所与の遺伝子である。対立遺伝子変異体は、単一ヌクレオチド多型(SNP)、ならびに小挿入/欠失多型(INDEL)を包含する。INDELのサイズは通常、100bp未満である。SNPおよびINDELは、多くの生物の天然に存在する多型株において最も大きいセットの配列変異体を形成する。
【０１６１】
用語「品種」とは、ある栽培品種または品種を別の栽培品種または品種から識別するのに十分なものと当業者により受け入れられる特徴または形質の共通のセットの共有により定義されるある種内の植物群を指す。いずれの用語においても、任意の所与の栽培品種または品種の全植物が、全遺伝子もしくは分子レベルで遺伝的に同一であるか、または任意の所与の植物が全ての遺伝子座において同型であることを意味しない。栽培品種または品種は、純粋種の栽培品種または品種が自家受粉し、全ての子孫が特定の形質を含む場合、その形質について「純粋種」であると考えられる。用語「育種系統」または「系統」とは、ある育種系統または系統を別の育種系統または系統から識別するのに十分であると当業者によって受け入れられる特徴または形質の共通のセットの共有により定義される栽培品種内の植物群を指す。いずれの用語においても、任意の所与の育種系統または系統の全植物が全遺伝子もしくは分子レベルで遺伝的に同一であるか、または任意の所与の植物が全ての遺伝子座において同型であることを意味しない。育種系統または系統は、純粋種系統または育種系統が自家受粉し、全ての子孫が特定の形質を含む場合、その形質について「純粋種」であると考えられる。本発明においては、それらの形質は、植物または種子のHPPD遺伝子中の突然変異から生じる。
【０１６２】
また、mut-HPPDおよび/またはmut-HSTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の除草剤抵抗性植物は、有性生殖を含む従来の植物育種により植物の除草剤抵抗性を増大させるための方法においても有用である。この方法は、本発明の除草剤抵抗性植物である第1の植物を、第1の植物と同じ除草剤(複数可)に対して抵抗性であってもよいか、または第1の植物とは異なる除草剤(複数可)に対して抵抗性であってもよい第2の植物と交配することを含む。第2の植物は、第１の植物と交配した場合、生存能力のある子孫植物(すなわち、種子)を産生することができる任意の植物であってもよい。必須ではないが、典型的には、第1の植物と第2の植物は同じ種のものである。前記方法は、場合により、第1の植物のmut-HPPDおよび/またはmut-HSTポリペプチドと、第2の植物に特徴的な除草剤耐性とを含む子孫植物を選択することを含んでもよい。本発明のこの方法により作製された子孫植物は、第1もしくは第2の植物またはその両方と比較した場合、除草剤に対する抵抗性が増大している。第1の植物と第2の植物が異なる除草剤に対して抵抗性である場合、子孫植物は、第1および第2の植物の組合わせた除草剤耐性特性を有するであろう。
【０１６３】
本発明の方法は、第1の交配物の子孫植物を、第1または第2の植物と同じ系統または遺伝子型の植物に1世代以上戻し交配することをさらに含んでもよい。あるいは、第1の交配物または任意のその後の交配物の子孫を、第1または第2の植物とは異なる系統または遺伝子型のものである第3の植物と交配することができる。本発明はまた、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド分子、発現カセット、または形質転換ベクターで形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子、および非ヒト宿主細胞も提供する。そのような形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子、および非ヒト宿主細胞は、それぞれ、形質転換されていない植物、植物組織、植物細胞、または非ヒト宿主細胞を殺傷するか、またはその生長を阻害する除草剤のレベルで、少なくとも1つの除草剤に対する耐性または抵抗性が増強されている。好ましくは、本発明の形質転換された植物、植物組織、植物細胞、および種子は、シロイヌナズナおよび作物植物である。
【０１６４】
本発明の植物が、mut-HPPD核酸に加えて、野生型HPPD核酸を含んでもよいことが理解されるべきである。クマロン誘導体除草剤耐性系統は、複数のHPPDイソ酵素のうちの1つのみにおいて突然変異を含んでもよい。従って、本発明は、1つ以上の野生型HPPD核酸に加えて、1つ以上のmut-HPPD核酸を含む植物を含む。
【０１６５】
別の実施形態においては、本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物により産生された種子であって、野生型品種の種子と比較したクマロン誘導体除草剤に対する抵抗性の増大に関して純粋種である前記種子に関する。
【０１６６】
別の実施形態においては、本発明は、植物細胞を、上記で定義された野生型またはmut-HPPDをコードする核酸を含む発現カセットで形質転換するステップを含む、野生型品種の植物細胞と比較してクマロン誘導体除草剤に対する抵抗性が増大したトランスジェニック植物細胞を作製する方法に関する。
【０１６７】
別の実施形態においては、本発明は、(a)植物細胞を、野生型またはmut-HPPDをコードする核酸を含む発現カセットで形質転換するステップと、(b)植物細胞から、クマロン誘導体除草剤に対する抵抗性が増大した植物を生成するステップとを含む、トランスジェニック植物を作製する方法に関する。
【０１６８】
結果として、本発明のmut-HPPD核酸は、対象の植物中での発現のための発現カセット中で提供される。このカセットは、本発明のmut-HPPD核酸配列に機能し得る形で連結された調節配列を含む。本明細書で用いられる用語「調節エレメント」とは、機能し得る形で連結されたポリヌクレオチドの転写を調節することができるポリヌクレオチドを指す。それは、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、5'UTR、および3'UTRを含む。「機能し得る形で連結された」とは、プロモーターと第2の配列との間の機能的連結を意図し、プロモーター配列は第2の配列に対応するDNA配列の転写を開始、媒介する。一般に、機能し得る形で連結されたとは、連結される核酸配列が連続的であること、および2つのタンパク質コード領域を結合させるのに必要である場合は、連続的であり、同じ読み枠にあることを意味する。カセットは、生物中に同時形質転換される少なくとも1つのさらなる遺伝子をさらに含んでもよい。あるいは、さらなる遺伝子を、複数の発現カセット上に提供することができる。
【０１６９】
そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるmut-HPPD核酸配列の挿入のための複数の制限部位と共に提供される。発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【０１７０】
発現カセットは、転写の5'から3'の向きに、植物において機能的な転写および翻訳開始領域(すなわち、プロモーター)、本発明のmut-HPPD核酸配列、ならびに転写および翻訳終結領域(すなわち、終結領域)を含む。プロモーターは、植物宿主および/または本発明のmut-HPPD核酸配列に対して、天然であるか、もしくは類似するか、または外来もしくは異種であってよい。さらに、プロモーターは、天然配列であるか、またはあるいは、合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主に対して「外来」または「異種」である場合、そのプロモーターが導入される天然植物中にそのプロモーターが見出されないことが意図される。プロモーターが本発明のmut-HPPD核酸配列に対して「外来」または「異種」である場合、そのプロモーターが本発明の機能し得る形で連結されたmut-HPPD核酸配列のための天然または天然に存在するプロモーターではないことが意図される。本明細書で用いられる場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に機能し得る形で連結されたコード配列を含む。
【０１７１】
異種プロモーターを用いて本発明のmut-HPPD核酸を発現させるのが好ましいが、天然のプロモーター配列を用いることができる。そのような構築物は、植物または植物細胞中でのmut-HPPDタンパク質の発現レベルを変化させる。かくして、植物または植物細胞の表現型は変化する。
【０１７２】
終結領域は転写開始領域と共に天然であってよく、対象の機能し得る形で連結されたmut-HPPD配列と共に天然であってよく、植物宿主と共に天然であってよく、または別の供給源に由来してもよい(すなわち、プロモーター、対象のmut-HPPD核酸配列、植物宿主、またはそのいずれかの組合せに対して外来または異種である)。都合のよい終結領域は、オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終結領域などの、A.tumefeciensのTiプラスミドから利用可能である。また、Guerineauら(1991) MoI. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfaconら(1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogenら(1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroeら(1990) Gene 91: 151-158; Ballasら(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; およびJoshi (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639も参照されたい。必要に応じて、遺伝子を、形質転換植物中での発現の増大のために最適化することができる。すなわち、遺伝子を、改善された発現のために植物にとって好ましいコドンを用いて合成することができる。宿主にとって好ましいコドン使用の考察については、例えば、CampbellおよびGowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11を参照されたい。植物にとって好ましい遺伝子を合成するための方法は当業界で利用可能である。例えば、米国特許第5,380,831号および第5,436,391号、ならびにMurrayら(1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498(参照により本明細書に組込まれる)を参照されたい。
【０１７３】
細胞宿主中での遺伝子発現を増強するためのさらなる配列改変が公知である。これらのものは、疑似ポリアデニル化シグナル、エクソン-イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子発現にとって有害であり得る他のそのようなよく特性評価された配列をコードする配列の排除を含む。配列のG-C含量を、宿主細胞中で発現される既知の遺伝子を参照して算出された、所与の細胞宿主に関する平均レベルに調整することができる。可能な場合、予測されるヘアピン二次mRNA構造を回避するように配列を改変する。遺伝子発現を増強するためのヌクレオチド配列を、植物発現ベクター中で用いることもできる。これらのものとしては、トウモロコシAdhlのイントロン、intronl遺伝子(Callisら、Genes and Development 1: 1183-1200, 1987)、ならびにタバコモザイクウイルス(TMV)、トウモロコシ退緑斑紋ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルスに由来するリーダー配列(W-配列) (Gallieら、Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987およびSkuzeskiら、Plant MoI. Biol. 15:65-79, 1990)が挙げられる。トウモロコシのshrunken-1遺伝子座に由来する第1イントロンは、キメラ遺伝子構築物中での遺伝子の発現を増大させることが示されている。米国特許第5,424,412号および第5,593,874号は、遺伝子発現構築物中での特定のイントロンの使用を開示し、Gallieら(Plant Physiol. 106:929-939, 1994)も、イントロンが組織特異的に遺伝子発現を調節するのに有用であることを示している。mut-HPPD遺伝子発現をさらに増強または最適化するために、本発明の植物発現ベクターは、マトリックス結合領域(MAR)を含有するDNA配列を含んでもよい。次いで、そのような改変された発現系で形質転換された植物細胞は、本発明のヌクレオチド配列の過剰発現または構成的発現を示すことができる。
【０１７４】
発現カセットは、発現カセット構築物中に5'リーダー配列をさらに含んでもよい。そのようなリーダー配列は、翻訳を増強するように作用することができる。翻訳リーダーは当業界で公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、EMCVリーダー(脳心筋炎5'非コード領域)(Elroy-Steinら(1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:6126-6130); ポチウイルスリーダー、例えば、TEVリーダー(タバコエッチウイルス)(Gallieら(1995) Gene 165(2):233-238)、MDMVリーダー(トウモロコシ萎縮モザイクウイルス)(Virology 154:9-20)、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)(Macejakら(1991) Nature 353:90-94);アルファルファモザイクウイルスの外被タンパク質mRNAに由来する非翻訳リーダー(AMV RNA 4) (Joblingら(1987) Nature 325:622-625); タバコモザイクウイルスリーダー(TMV) (Gallieら(1989) in Molecular Biology of RNA, Cech(編) (Liss, New York), pp. 237-256); ならびにトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー(MCMV)(Lommelら(1991) Virology 81:382-385)が挙げられる。また、Della-Cioppaら(1987) Plant Physiol. 84:965-968も参照されたい。翻訳を増強することが知られる他の方法、例えば、イントロンなどを用いることもできる。
【０１７５】
発現カセットの調製において、様々なDNA断片を操作して、適切な向きの、および必要に応じて、適切な読み枠のDNA配列を提供することができる。この目的のために、アダプターもしくはリンカーを用いて、DNA断片を連結するか、または他の操作を含有させて、都合のよい制限部位、余分なDNAの除去、制限部位の除去などを提供することができる。この目的のために、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転移およびトランスバージョンを含有させることができる。
【０１７６】
いくつかのプロモーターを、本発明の実施において用いることができる。プロモーターを、所望の結果に基づいて選択することができる。核酸を、植物中での発現のために構成的、組織にとって好ましい、または他のプロモーターと組合わせることができる。そのような構成的プロモーターとしては、例えば、Rsyn7プロモーターのコアプロモーターならびにWO 99/43838および米国特許第6,072,050号に開示された他の構成的プロモーター; コアCaMV 35Sプロモーター(Odellら(1985) Nature 313:810-812); コメアクチン(McElroyら(1990) Plant Cell 2: 163-171); ユビキチン(Christensenら(1989) Plant MoI. Biol. 12:619-632およびChristensenら(1992) Plant MoI. Biol. 18:675-689); pEMU (Lastら(1991) Theor. Appl. Genet. 81:581- 588); MAS (Veltenら(1984) EMBO J. 3:2723-2730); ALSプロモーター(米国特許第5,659,026号)などが挙げられる。他の構成的プロモーターとしては、例えば、米国特許第5,608,149号; 第5,608,144号; 第5,604,121号; 第5,569,597号; 第5,466,785号; 第5,399,680号; 第5,268,463号; 第5,608,142号; および第6,177,611号が挙げられる。
【０１７７】
組織にとって好ましいプロモーターを用いて、特定の植物組織内での増強されたmut-HPPD発現を標的化することができる。そのような組織にとって好ましいプロモーターとしては、限定されるものではないが、葉にとって好ましいプロモーター、根にとって好ましいプロモーター、種子にとって好ましいプロモーター、および茎にとって好ましいプロモーターが挙げられる。組織にとって好ましいプロモーターとしては、Yamamotoら(1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamataら(1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansenら(1997) MoI. Gen Genet. 254(3):337-343; Russellら(1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehartら(1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Campら(1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevasciniら(1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamotoら(1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181- 196; Orozcoら(1993) Plant MoI Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; およびGuevara-Garciaら(1993) Plant J. 4(3):495-505が挙げられる。そのようなプロモーターを、必要に応じて、弱い発現のために改変することができる。一実施形態においては、対象の核酸を、発現のためにクロロプラストに対して標的化する。この様式で、対象の核酸がクロロプラストに直接挿入される場合、発現カセットは、対象の遺伝子産物をクロロプラストに指向させるクロロプラスト移行ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むクロロプラスト標的化配列をさらに含む。そのような移行ペプチドは当業界で公知である。クロロプラスト標的化配列に関して、「機能し得る形で連結された」とは、移行ペプチドをコードする核酸配列(すなわち、クロロプラスト標的化配列)を、本発明のmut-HPPD核酸に連結し、2つの配列が連続的であり、同じ読み枠にあるようにすることを意味する。例えば、Von Heijneら(1991) Plant MoI. Biol. Rep. 9: 104-126; Clarkら(1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppaら(1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romerら(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421;およびShahら(1986) Science 233:478-481を参照されたい。当業界で公知の任意のクロロプラスト移行ペプチドを、本発明の成熟mut-HPPDタンパク質をコードするヌクレオチド配列の5'末端にクロロプラスト標的化配列を機能し得る形で連結することにより、本発明の成熟mut-HPPDタンパク質のアミノ酸配列に融合することができる。クロロプラスト標的化配列は当業界で公知であり、リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ（Rubisco)のクロロプラスト小サブユニット(de Castro Silva Filhoら(1996) Plant MoI. Biol. 30:769-780; Schnellら(1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(エノールピルビル)シキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSPS)(Archerら(1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); トリプトファン合成酵素(Zhaoら(1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); プラストシアニン(Lawrenceら(1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); コリスミ酸合成酵素(Schmidtら(1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); および集光性葉緑素a/b結合タンパク質(LHBP) (Lamppaら(1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999)が挙げられる。また、Von Heijneら(1991) Plant MoI. Biol. Rep. 9: 104-126; Clarkら(1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppaら(1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romerら(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; およびShahら(1986) Science 233:478-481も参照されたい。
【０１７８】
クロロプラストの形質転換のための方法は、当業界で公知である。例えば、Svabら(1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:8526-8530; SvabおよびMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; SvabおよびMaliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照されたい。この方法は、選択マーカーを含有するDNAの粒子銃送達および相同組換えによるプラスチドゲノムへのDNAの標的化に依拠する。さらに、プラスチド形質転換を、核にコードされ、プラスチドを指向するRNAポリメラーゼの組織にとって好ましい発現によるサイレントプラスチド生成トランスジーンのトランス活性化により達成することができる。そのような系は、McBrideら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報告されている。クロロプラストに対して標的化される対象の核酸を、植物の核とこのオルガネラとの間のコドン使用の相違の原因となるクロロプラスト中での発現のために最適化することができる。この様式で、対象の核酸を、クロロプラストにとって好ましいコドンを用いて合成することができる。例えば、参照により本明細書に組込まれる米国特許第5,380,831号を参照されたい。
【０１７９】
好ましい実施形態においては、mut-HPPD核酸(a)またはmut-HPPD核酸(b)は、a)配列番号1、51、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、18、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、もしくは52に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；b)配列番号47もしくは49に示されるポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；c)配列番号2、5、8、11、14、17、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、53に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは誘導体；d)a)〜c)のいずれかの少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；およびe)a)〜d)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１８０】
好ましくは、発現カセットは、植物中で機能的である転写開始調節領域および翻訳開始調節領域をさらに含む。
【０１８１】
本発明のポリヌクレオチドは植物形質転換のための選択マーカー遺伝子として有用であるが、本発明の発現カセットは、形質転換細胞の選択のための別の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。本発明のものなどの選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択のために用いられる。マーカー遺伝子としては、限定されるものではないが、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(NEO)およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)をコードするもの、ならびにグルホシナートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および2,4-ジクロロフェノキシアセテート(2,4-D)などの除草剤化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。一般に、Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3 :506-511 ; Christophers onら(1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:6314-6318; Yaoら(1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) MoI Microbiol 6:2419-2422; Barkleyら(1980) in The Operon, pp. 177-220; Huら(1987) Cell 48:555-566; Brownら(1987) Cell 49:603-612; Figgeら(1988) Cell 52:713-722; Deuschleら(1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86:5400-5404; Fuerstら(1989) Proc. Natl Acad. ScL USA 86:2549-2553; Deuschleら(1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reinesら(1993) Proc. Natl Acad. ScL USA 90: 1917-1921; Labowら(1990) MoI Cell Biol 10:3343-3356; Zambrettiら(1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:3952-3956; Bairnら(1991) Proc. Natl Acad. ScL USA 88:5072-5076; Wyborskiら(1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics MoI Struc. Biol 10: 143- 162; Degenkolbら(1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidtら(1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossenら(1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:5547- 5551; Olivaら(1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavkaら(1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gillら(1988) Nature 334:721-724を参照されたい。そのような開示は、参照により本明細書に組込まれる。選択マーカー遺伝子の上記一覧は、限定を意味するものではない。任意の選択マーカー遺伝子を本発明において用いることができる。
【０１８２】
本発明は、上記のmut-HPPD核酸を含有する発現カセットを含む単離された組換え発現ベクターであって、宿主細胞中でのベクターの発現が、野生型品種の宿主細胞と比較したクマロン誘導体除草剤に対する耐性の増大をもたらす前記ベクターをさらに提供する。本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ある型のベクターは、さらなるDNAセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。別の型のベクターは、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能し得る形で連結される遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドは最も一般的に用いられる形態のベクターであるため、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」を互換的に用いることができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などのそのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【０１８３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現にとって好適な形態の本発明の核酸を含み、組換え発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に機能し得る形で連結された、1つ以上の調節配列を含むことを意味する。調節配列としては、多くの型の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、および特定の宿主細胞中でのみ、または特定の条件下でのみヌクレオチド配列の発現を指令するものが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいポリペプチドの発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入することによって、本明細書に記載の核酸によりコードされた、ポリペプチドまたはペプチド、例えば、融合ポリペプチドまたはペプチド(例えば、mut-HPPDポリペプチド、融合ポリペプチドなど)を産生させることができる。
【０１８４】
本発明の好ましい実施形態においては、mut-HPPDポリペプチドを、植物ならびに単細胞植物細胞(藻類など)の植物(Falciatoreら、1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251およびその参考文献を参照されたい)および高等植物(例えば、作物植物などの種子植物)に由来する植物細胞中で発現させる。mut-HPPDポリヌクレオチドを、トランスフェクション、形質転換または形質導入、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、アグロインフェクション、微粒子銃などの任意の手段によって植物細胞中に「導入」することができる。
【０１８５】
植物細胞などの宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法を、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)ならびにMethods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, GartlandおよびDavey(編), Humana Press, Totowa, New Jerseyなどの他の実験室マニュアルに見出すことができる。クマロン誘導体除草剤に対する耐性の増大はトウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、コメ、オオムギ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、ナタネおよびキャノーラ、キャッサバ、コショウ、ヒマワリおよびマンジュギク、ジャガイモ、タバコ、マス、およびトマトなどのナス科植物、ビシア種、エンドウ、アルファルファ、低木(コーヒー、カカオ、茶)、ヤナギ種、樹木(油ヤシ、ココナッツ)、多年草、および飼料作物のような様々な植物に遺伝されることが望ましい一般的な形質であるため、これらの作物植物は、本発明の1つのさらなる実施形態として遺伝子工学のための好ましい標的植物でもある。好ましい実施形態においては、植物は作物植物である。飼料作物としては、限定されるものではないが、ウィートグラス、カナリーグラス、ブロムグラス、ワイルドライグラス、ブルーグラス、オーチャードグラス、アルファルファ、サルフォイン、ミヤコグサ、アルサイククローバー、レッドクローバー、およびスイートクローバーが挙げられる。
【０１８６】
本発明の一実施形態においては、植物へのmut-HPPDポリヌクレオチドのトランスフェクションは、アグロバクテリウム媒介性遺伝子導入により達成される。当業者には公知の1つの形質転換法は、mut-HPPD核酸を含むアグロバクテリウム溶液中への開花植物の浸漬、次いで、形質転換された配偶子の育種である。アグロバクテリウム媒介性植物形質転換を、例えば、GV3101(pMP90)(KonczおよびSchell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396)またはLBA4404(Clontech)アグロバクテリウム・ツメファシエンス株を用いて実施することができる。形質転換を、標準的な形質転換および再生技術により実施することができる(Deblaereら、1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B.およびSchilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual、第2版 - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. およびThompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2)。例えば、ナタネを、子葉または胚軸形質転換により形質転換することができる(Moloneyら、1989, Plant Cell Report 8:238-242; De Blockら、1989, Plant Physiol. 91:694-701)。アグロバクテリウムのための抗生物質の使用および植物選択は、形質転換に用いられるバイナリーベクターおよびアグロバクテリウム株に依存する。ナタネ選択は通常、選択植物マーカーとしてカナマイシンを用いて行われる。亜麻へのアグロバクテリウム媒介性遺伝子導入を、例えば、Mlynarovaら、1994, Plant Cell Report 13:282-285により記載された技術を用いて実施することができる。さらに、ダイズの形質転換を、例えば、欧州特許第0424 047号、米国特許第5,322,783号、欧州特許第0397 687号、米国特許第5,376,543号、または米国特許第5,169,770号に記載の技術を用いて実施することができる。トウモロコシの形質転換を、粒子ボンバードメント、ポリエチレングリコール媒介性DNA取込みにより、またはシリコンカーバイドファイバー技術を介して達成することができる(例えば、FreelingおよびWalbot、「The maize handbook」、Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7を参照されたい)。トウモロコシ形質転換の特定例は、米国特許第5,990,387号に見出され、コムギ形質転換の特定例は、PCT公開第WO93/07256号に見出すことができる。
【０１８７】
本発明によれば、導入されるmut-HPPDポリヌクレオチドが非染色体自律レプリコン中に含まれるか、または植物染色体中に組込まれる場合、それは植物細胞中で安定に維持され得る。あるいは、導入されるmut-HPPDポリヌクレオチドは染色体外非複製ベクター上に存在し、一過的に発現されるか、または一過的に活性であってもよい。一実施形態においては、mut-HPPDポリヌクレオチドが染色体中に組込まれ、欠失、付加または置換を導入し、それによって、内因性HPPD遺伝子を変化させ、例えば、機能的に破壊し、mut-HPPD遺伝子を作出したHPPD遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製される、相同組換え微生物を作出することができる。相同組換えにより点突然変異を作出するために、DNA-RNAハイブリッドを、キメラ形成法として公知の技術において用いることができる(Cole-Straussら、1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330およびKmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247)。トリチカム種における他の相同組換え手順も当業界で周知であり、本明細書における使用にとって想定される。
【０１８８】
相同組換えベクターにおいては、mut-HPPD遺伝子を、HPPD遺伝子のさらなる核酸分子によりその5'および3'末端にフランキングさせ、ベクターにより担持される外因性mut-HPPD遺伝子と、微生物または植物中の内因性HPPD遺伝子との間で相同組換えを起こさせることができる。さらなるフランキングするHPPD核酸分子は、内因性遺伝子との相同組換えの成功にとって十分な長さのものである。典型的には、数百からキロベースまでの塩基対のフランキングするDNA(5'および3'末端の両方)を、ベクター中に含有させる(例えば、相同組換えベクターの説明については、Thomas, K. R.およびCapecchi, M. R., 1987, Cell 51:503またはフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)におけるcDNAに基づく組換えについては、Streppら、1998, PNAS, 95(8):4368-4373を参照されたい)。しかしながら、mut-HPPD遺伝子は通常、ほんのわずかのアミノ酸においてHPPD遺伝子と異なるため、フランキング配列は常に必要であるわけではない。相同組換えベクターを微生物または植物細胞中に導入し(例えば、ポリエチレングリコール媒介性DNAによる)、導入されたmut-HPPD遺伝子が内因性HPPD遺伝子と相同組換えした細胞を、当業界で公知の技術を用いて選択する。
【０１８９】
別の実施形態においては、導入された遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む組換え微生物を作製することができる。例えば、mut-HPPD遺伝子をlacオペロンの制御下に置くベクター上への該遺伝子の含有により、IPTGの存在下でのみmut-HPPD遺伝子の発現が可能になる。そのような調節系は、当業界で周知である。
【０１９０】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換的に用いられる。そのような用語は特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫にも適用されることが理解される。特定の改変は突然変異または環境的影響に起因してその後の世代で生じ得るため、そのような子孫は事実、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で用いられる用語の範囲内に依然として含まれる。宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってもよい。例えば、mut-HPPDポリヌクレオチドを、C.グルタミカム(C.glutamicum)などの細菌細胞、昆虫細胞、菌類細胞、または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)またはCOS細胞)、藻類、繊毛虫、植物細胞、菌類またはC.グルタミカムのような他の微生物中で発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、当業者には公知である。
【０１９１】
培養物中の原核または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞を用いて、mut-HPPDポリヌクレオチドを産生(すなわち、発現)させることができる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてmut-HPPDポリペプチドを産生させるための方法をさらに提供する。一実施形態においては、前記方法は、mut-HPPDポリペプチドが産生されるまで、好適な培地中で本発明の宿主細胞(mut-HPPDポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された細胞、またはゲノム中に野生型もしくはmut-HPPDポリペプチドをコードする遺伝子された細胞)を培養することを含む。別の実施形態においては、前記方法は、培地または宿主細胞からmut-HPPDポリペプチドを単離することをさらに含む。本発明の別の態様は、単離されたmut-HPPDポリペプチド、およびその生物活性部分に関する。「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはその生物活性部分は、組換えDNA技術により産生された場合はいくつかの細胞材料を、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化合物を含まない。用語「細胞材料を実質的に含まない」は、mut-HPPDポリペプチドが天然に、または組換え的に産生される細胞の細胞成分のいくつかからそれが分離された前記ポリペプチドの調製物を含む。一実施形態においては、用語「細胞材料を実質的に含まない」は、約30%(乾燥重量で)未満の非mut-HPPD材料(本明細書では「夾雑ポリペプチド」とも呼ばれる)、より好ましくは、約20%未満の非mut-HPPD材料、さらにより好ましくは、約10%未満の非mut-HPPD材料、および最も好ましくは、約5%未満の非mut-HPPD材料を有するmut-HPPDポリペプチドの調製物を含む。
【０１９２】
mut-HPPDポリペプチド、またはその生物活性部分が組換え産生される場合、それは培養培地を実質的に含まないのも好ましい、すなわち、培養培地は、ポリペプチド調製物の容量の約20%未満、より好ましくは約10%未満、および最も好ましくは約5%未満に相当する。用語「化学的前駆体または他の化合物を実質的に含まない」は、mut-HPPDポリペプチドが、該ポリペプチドの合成に含まれる化学的前駆体または他の化合物から分離される前記ポリペプチドの調製物を含む。一実施形態においては、用語「化学的前駆体または他の化合物を実質的に含まない」は、約30%未満(乾燥重量で)の化学的前駆体または非mut-HPPD化合物、より好ましくは、約20%未満の化学的前駆体または非mut-HPPD化合物、さらにより好ましくは、約10%未満の化学的前駆体または非mut-HPPD化合物、最も好ましくは、約5%未満の化学的前駆体または非mut-HPPD化合物を有するmut-HPPDポリペプチドの調製物を含む。好ましい実施形態においては、単離されたポリペプチド、またはその生物活性部分は、mut-HPPDポリペプチドが誘導されるのと同じ生物に由来する夾雑ポリペプチドを含まない。典型的には、そのようなポリペプチドは、例えば、C.グルタミカム、繊毛虫、藻類、または菌類などの、植物以外、または微生物中でのmut-HPPDポリペプチドの組換え発現により産生される。
【０１９３】
上記のように、本発明は、野生型品種の植物または種子と比較して、作物植物または種子のクマロン誘導体耐性を増大させるための組成物および方法を教示する。好ましい実施形態においては、作物植物または種子のクマロン誘導体耐性は、植物または種子が、好ましくは約1〜1000g ai ha-1、より好ましくは、20〜160g ai ha-1、最も好ましくは、40〜80g ai ha-1のクマロン誘導体除草剤施用に耐えることができるように増大する。本明細書で用いられる場合、クマロン誘導体除草剤施用に「耐える」とは、植物がそのような施用によって殺傷されないか、または損傷されないことを意味する。
【０１９４】
さらに、本発明は、表2に記載の少なくとも1つのクマロン誘導体除草剤の使用を含む方法を提供する。
【０１９５】
これらの方法においては、クマロン誘導体除草剤を、限定されるものではないが、種子処理、土壌処理、および葉面処理などの当業界で公知の任意の方法により施用することができる。施用前に、クマロン誘導体除草剤を、慣用的な製剤、例えば、溶剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、粉末、ペースト剤および粒剤に変換することができる。使用形態は、特定の意図される目的に依存する；いずれの場合も、本発明による化合物の細かく均一な分布を確保するべきである。
【０１９６】
クマロン誘導体除草剤に対する耐性が増大した植物を提供することにより、植物を雑草から保護するために様々な製剤を用いて、植物生長を増強し、栄養素との競合を低下させることができる。クマロン誘導体除草剤を、本明細書に記載の作物植物の周囲の領域における発芽前、発芽後、植付け前、植付け後、および植付け時の雑草防除のためにそれだけで用いることができるか、または他の添加物を含有するクマロン誘導体除草剤製剤を用いることができる。また、クマロン誘導体除草剤を、種子処理として用いることもできる。クマロン誘導体除草剤製剤中に見出される添加物としては、他の除草剤、洗剤、アジュバント、展着剤、固着剤、安定化剤などが挙げられる。クマロン誘導体除草剤製剤は、湿潤調製物または乾燥調製物であってもよく、限定されるものではないが、フロアブル粉末、乳剤、および液剤が挙げられる。クマロン誘導体除草剤および除草剤製剤を、従来の方法に従って、例えば、噴霧、注水、散布などにより施用することができる。
【０１９７】
好適な製剤は、PCT/EP2009/063387およびPCT/EP2009/063386に詳細に記載されており、それらは参照により本明細書に組込まれる。
【０１９８】
また、前記のことが本発明の好ましい実施形態に関するものであり、本発明の範囲から逸脱することなく、その中でいくつかの変更を行うことができることも理解されるべきである。本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらはいかなる意味でもその範囲に対して限定を課するものと解釈されるべきではない。それどころか、本明細書の説明を読んだ後、本発明の精神および/または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者が自身で提言することができる、様々な他の実施形態、その改変、および等価物を用いてもよいことが明確に理解されるべきである。
【０１９９】
(実施例)
【実施例１】
【０２００】
遺伝子合成およびサブクローニング
野生型または突然変異型HPPDをコードする遺伝子を、Geneart (Regensburg, Germany)またはEntelechon (Regensburg, Germany)により合成し、改変されたpET24D(Novagen)発現ベクター中にサブクローニングし、N末端Hisタグ付き発現構築物を得た。
【０２０１】
シロイヌナズナHPPDのクローニング
部分的シロイヌナズナAtHPPDコード配列(配列番号52)を、プライマーHuJ101およびHuJ102(表5)を用いて、シロイヌナズナcDNAから標準的なPCR技術により増幅する。
【表５】
2014534816.tif 000017
【０２０２】
PCR産物を、製造業者の説明書に従って、ベクターpEXP5-NT/TOPO(登録商標)(Invitrogen, Carlsbad, USA)中にクローニングする。得られるプラスミドpEXP5-NT/TOPO(登録商標)-AtHPPDを、プラスミドミニ調製を実施することにより大腸菌TOP10から単離する。N末端His6タグ付きAtHPPDをコードする発現カセットを、DNA配列決定により確認する。
【実施例２】
【０２０３】
組換えHPPD酵素の異種発現および精製
組換えHPPD酵素を、大腸菌中で産生させ、過剰発現させる。化学的にコンピテントなBL21(DE3)細胞(Invitrogen, Carlsbad, USA)を、製造業者の説明書に従って、pEXP5-NT/TOPO(登録商標)(実施例1を参照されたい)または他の発現ベクターを用いて形質転換する。形質転換された細胞を、37℃で6h、次いで25℃で24h、自己誘導培地(100μg/mlのアンピシリンを添加したZYM5032)中で増殖させる。8〜12のOD600(600nmでの光学密度)で、細胞を遠心分離(8000xg)により収穫する。細胞ペレットを、EDTA完全非含有プロテアーゼ阻害剤ミックス(Roche-Diagnostics)を添加した溶解バッファー(50mMリン酸ナトリウムバッファー、0.5M NaCl、10mMイミダゾール、pH7.0)中に再懸濁し、Avestin Pressを用いてホモジェナイズする。ホモジェネートを、遠心分離(40,000xg)により明澄化する。His6タグ付きHPPDまたは突然変異体を、製造業者の説明書に従って、Protino Ni-IDA 1000 Packed Column(Macherey-Nagel)上でのアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。精製されたHPPDまたは突然変異体を、10%グリセリンを添加した100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0に対して透析し、-86℃で保存する。タンパク質含量を、Bio-Radタンパク質アッセイ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)を用いてBradfordに従って決定する。酵素調製物の純度を、SDS-PAGEにより評価する。
【実施例３】
【０２０４】
HPPD活性に関するアッセイ
HPPDは、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸(4-HPP)およびO2から、ホモゲンチジン酸およびCO2を産生する。HPPDに関する活性アッセイは、逆相HPLCによるホモゲンチジン酸の分析に基づくものである。
【０２０５】
方法(A)
アッセイ混合物は、150mMのリン酸カリウムバッファーpH7.0、50mMのL-アスコルビン酸、1μMのFeSO4および7μgの精製酵素を1mlの全量中に含んでもよい。阻害剤を、それぞれ、20mMまたは0.5mMの濃度でDMSO(ジメチルスルホキシド)中に溶解する。この保存溶液から、DMSO中で連続5倍希釈液を調製し、これをアッセイにおいて用いる。それぞれの阻害剤溶液はアッセイ容量の1%を占める。かくして、最終阻害剤濃度は、それぞれ、200μM〜2.5nMまたは5μM〜63pMの範囲である。30minの予備インキュベーションの後、0.1mMの最終濃度で4-HPPを添加することにより、反応を開始させる。反応を、室温で120min進行させる。反応を、100μlの4.5Mリン酸の添加により停止させる。   
サンプルを、63mMリン酸で予め平衡化させたOasis(登録商標)HLBカートリッジ3cc/60mg(Waters)上で抽出する。3mlの63mMリン酸でL-アスコルビン酸を洗浄除去する。ホモゲンチジン酸を、63mMリン酸とメタノール(w/w)の1:1混合物1mlで溶出させる。   
10μlの溶出液を、溶離液として5mM H3PO4/15%エタノール(w/w)を用いて、Symmetry(登録商標)C18カラム(粒径3.5μm、寸法4.6x100mm；Waters)上での逆相HPLCにより分析する。   
ホモゲンチジン酸を電気化学的に検出し、ピーク面積を測定することにより定量する(Empowerソフトウェア；Waters)。阻害されなかった酵素活性を100%に設定することにより、活性を正規化する。   
IC50値を、非線形回帰を用いて算出する。
【０２０６】
方法(B)
アッセイ混合物は、150mMのリン酸カリウムバッファーpH7.0、50mMのL-アスコルビン酸、100μMのカタラーゼ(Sigma-Aldrich)、1μMのFeSO4および0.2ユニットの精製HPPD酵素を505μlの全量中に含んでもよい。1ユニットは、20℃で1分あたり1nmolのHGAを産生するのに必要とされる酵素の量と定義される。   
30minの予備インキュベーションの後、0.05mMの最終濃度で4-HPPを添加することにより、反応を開始させる。反応を、室温で45min進行させる。反応を、50μlの4.5Mリン酸の添加により停止させる。サンプルを、0.2μMの孔径のPVDF濾過装置を用いて濾過する。   
5μlの透明なサンプルを、90%の20mM NaH2PO4 pH2.2、10%メタノール(v/v)を用いるイソクラチック溶出により、UPLC HSS T3カラム(粒径1.8μm、寸法2.1x50mm；Waters)上で分析する。   
HGAを750mV(モード：DC；極性：陽性)で電気化学的に検出し、ピーク面積を積分することにより定量する(Empowerソフトウェア；Watars)。阻害剤を、0.5mMの濃度でDMSO(ジメチルスルホキシド)中に溶解する。この保存溶液から、連続5倍希釈液をDMSO中で調製し、これをアッセイにおいて用いる。それぞれの阻害剤溶液は、アッセイ容量の1%を占める。かくして、最終阻害剤濃度は、それぞれ、5μM〜320pMの範囲である。阻害されなかった酵素活性を100%に設定することにより、活性を正規化する。IC50値を、非線形回帰を用いて算出する。
【実施例４】
【０２０７】
野生型HPPD酵素のin vitroでの特性評価
上記実施例に記載されたか、または当業界で周知である方法を用いて、精製された組換え野生型HPPD酵素を、その動的特性およびHPPD阻害除草剤に対する感受性に関して特性評価する。見かけのミカエリス定数(Km)および最大反応速度(Vmax)を、基質阻害モデルを用いるソフトウェアGraphPad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, USA)を用いる非線形回帰により算出する。見かけのkcat値をVmaxから算出し、100%純度の酵素調製物を推測する。KmおよびIC50値の加重平均(標準誤差による)を、少なくとも3回の独立実験から算出する。競合的阻害に関するCheng-Prusoff式(Cheng, Y. C.; Prusoff, W. H. Biochem Pharmacol 1973, 22, 3099-3108)を用いて、解離定数(Ki)を算出する。
【０２０８】
除草剤耐性形質として用いられるHPPD酵素の現地性能は、HPPDに対する感受性のその欠如に依存するだけでなく、その活性にも依存する。除草剤耐性形質の潜在的な性能を評価するために、耐性指数(TI)を、以下の式：
【数１】
2014534816.tif 000018
【０２０９】
を用いて算出する。
【０２１０】
それぞれの形質の簡単な比較および順位付けが、ホルデウムHPPD上の全ての耐性指数を正規化することにより可能になる。
【０２１１】
in vitroアッセイにおいて得られるデータの例を、表6および表7に記載する。
【０２１２】
表6 シロイヌナズナおよびホルデウムのHPPD酵素に関する、4-HPPのミカエリス定数(Km)、代謝回転数(kcat)、触媒効率(kcat/Km)、解離定数(Ki）および耐性指数(TI)
【表６】
2014534816.tif 000019
【０２１３】
＊本実施例において用いられるクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤1)および1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-3-(2,4,6-トリクロロ-3-ピリジル)ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤2)である。
【表７】
2014534816.tif 000020
【０２１４】
＊本実施例において用いられるクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤1)および1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-3-(2,4,6-トリクロロ-3-ピリジル)ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤2)である。
【０２１５】
HPPD酵素を、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性であるものとして選択することができることが上記例から見ることができる。この酵素の耐性指数は、ベンチマーク酵素の耐性指数よりも高いことを観察することができる。例えば、ピクロフィルス(Picrophilus)のHPPDは、その耐性指数がホルデウムのHPPDに関するものよりはるかに高いため、本発明における除草剤耐性を付与する遺伝子として特に有用である。   
さらに、これらの例は、例えば、ピクロフィルスに由来するHPPD酵素に関する阻害剤1または阻害剤2の耐性指数は他のHPPD酵素の耐性指数よりもはるかに高いため、HPPD酵素をクマロン誘導体阻害剤1または阻害剤2に対する耐性を提供するものとして選択することができることを示している。   
クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性である任意のHPPD酵素は、このタンパク質が本文中で例示されないとしても、本発明の主題の一部であることが明らかである。
【実施例５】
【０２１６】
合理的突然変異誘発
構造生物学および配列アラインメントを用いて、「クマロン誘導体除草剤」の結合に直接または間接に関与し得る特定数のアミノ酸を選択した後、それらを突然変異誘発し、耐性HPPD酵素を得ることができる。
【０２１７】
(A)部位特異的突然変異誘発
PCRに基づく部位特異的突然変異誘発を、製造業者の説明書に従って、QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, Santa Clara, USA)を用いて行う。この技術には、それぞれの突然変異のために2つの化学的に合成されたDNAプライマー(フォワードおよびリバースプライマー)が必要である。AtHPPDの部位特異的突然変異誘発のために用いることができる例示的プライマー(配列番号52／53)を、表7に列挙する。
【表８】
2014534816.tif 000021
【０２１８】
2014534816.tif 000022
【０２１９】
HvHPPDの部位特異的突然変異誘発のために用いることができる例示的プライマー(配列番号1/2)を、表8に列挙する。
【表９】
2014534816.tif 000023
【０２２０】
突然変異プラスミドを、プラスミドミニ調製を実施することにより大腸菌TOP10から単離し、DNA配列決定により確認する。   
単一のアミノ酸置換の組合せを、段階的突然変異誘発手法により達成する。
【０２２１】
(B)ホルデウムHPPD突然変異体のin vitroでの特性評価
精製された突然変異HPPD酵素を、上記の方法により取得する。用量応答および反応速度測定を、記載されたHPPD活性アッセイを用いて実行する。見かけのミカエリス定数(Km)および最大反応速度(Vmax)を、基質阻害モデルを用いるソフトウェアGraphPad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, USA)を用いる非線形回帰により算出する。見かけのkcat値をVmaxから算出し、100%純度の酵素調製物を推測する。KmおよびIC50値の加重平均(標準誤差による)を、少なくとも3回の独立実験から算出する。競合的阻害に関するCheng-Prusoff式(Cheng, Y. C.; Prusoff, W. H. Biochem Pharmacol 1973, 22, 3099-3108)を用いて、解離定数(Ki)を算出する。
【０２２２】
除草剤耐性形質として用いられる最適化されたHPPD酵素の現地性能は、HPPD阻害除草剤に対する感受性のその欠如に依存するだけでなく、その活性にも依存する。除草剤耐性形質の潜在的な性能を評価するために、耐性指数(TI)を、以下の式：
【数２】
2014534816.tif 000024
【０２２３】
を用いて算出する。
【０２２４】
それぞれの形質の簡単な比較および順位付けが、それぞれの野生型HPPD上の耐性指数を正規化することにより可能になる。
【０２２５】
得られるデータの例を、表10および表11に記載する。
【表１０】
2014534816.tif 000025
【０２２６】
＊本実施例において用いられるクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤1)および1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-3-(2,4,6-トリクロロ-3-ピリジル)ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤2)である
【表１１】
2014534816.tif 000026
【０２２７】
＊ 本実施例において用いられるクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤1)および1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-3-(2,4,6-トリクロロ-3-ピリジル)ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤2)である。
【０２２８】
突然変異HPPD酵素の耐性指数は非改変野生型酵素の耐性指数よりも高いことがわかっているため、この突然変異体を、クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性であるものとして選択することができることが上記例から見ることができる。例えば、位置320(配列番号2)のLeuの、Hisへの交換は、阻害剤1および2の耐性指数の増大をもたらす。別の例は、阻害剤1の耐性指数の増大をもたらす、位置335(配列番号53)のMetの、Hisへの交換である。
【０２２９】
また、いくつかの単一部位の突然変異の選択された組合せが、一緒になって耐性指数の増大をもたらすことを観察することができる。   
クマロン誘導体除草剤に対して抵抗性であるHPPD酵素を得ることができるようにする任意の突然変異または突然変異の組合せは、このタンパク質が本文中で例示されないとしても、本発明の主題の一部であることが明らかである。
【実施例６】
【０２３０】
異種HPPDおよび/またはHST酵素を発現し、「クマロン誘導体除草剤」に対して耐性である植物の調製
安定に形質転換された植物の作製のための様々な方法が当業界で周知である。クマロン誘導体除草剤耐性ダイズ(Glycine max)またはトウモロコシ(Zea mays)植物を、Olhoftら(米国特許第2009/0049567号)により記載された方法により作製することができる。簡単に述べると、HPPDまたはHSTをコードするポリヌクレオチドを、Sambrookら(Molecular cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press)により記載されたような標準的なクローニング技術を用いてバイナリーベクター中にクローニングする。最終ベクター構築物は、プロモーター配列(例えば、ユビキチンプロモーター(PcUbi)配列)およびターミネーター配列(例えば、ノパリン合成酵素ターミネーター(NOS)配列)および抵抗性マーカー遺伝子カセット(例えば、AHAS)によりフランキングしたHPPDまたはHSTコード配列を含む(図3)。場合により、HPPDまたはHST遺伝子は、選択の手段を提供してもよい。実生外植片の一次結節にあるダイズの腋生分裂組織にDNAを導入するために、アグロバクテリウム媒介性形質転換が用いられる。アグロバクテリウムと共に接種および同時栽培した後、外植片を1週間の選択なしに芽誘導培地に移す。次いで、外植片を、1〜3μMのイマザピル(Arsenal)と共に3週間、芽誘導培地に移して、形質転換細胞を選択する。次いで、一次結節にある健康なカルス/芽パッド(pad)を有する外植片を、芽が伸長するか、または外植片が死滅するまで、1〜3μMのイマザピルを含有する芽伸長培地に移す。再生後、形質転換体を小さいポット中の土壌に移植し、生長チャンバーに入れ(16hの昼間/8hの夜間；25℃の昼間/23℃の夜間；65%の相対湿度；130〜150mE-2s-1)、続いて、Taqman分析によりT-DNAの存在について試験する。数週間後、健康な、トランスジェニック陽性の単一コピー事象を、より大きいポットに移植し、生長チャンバー中で生長させる。トウモロコシ植物の形質転換を、McElverおよびSingh(WO 2008/124495)により記載された方法により行う。HPPDまたはHST配列を含有する植物形質転換ベクター構築物を、アグロバクテリウム媒介性形質転換によりトウモロコシ未熟胚に導入する。形質転換された細胞を、0.5〜1.5μMのイマゼタピルを添加した選択培地中で3〜4週間選択する。トランスジェニック小植物を、植物再生培地上で再生させ、その後発根させる。トランスジェニック小植物を、培養混合物に移植し、温室中で成熟するまで生長させる前に、トランスジーンの存在についてTaqMan分析にかける。McElverおよびSingh(WO 2008/124495)により記載されたフローラルディップ法により、シロイヌナズナをHPPDまたはHST配列を用いて形質転換する。トランスジェニックシロイヌナズナ植物を、組込み遺伝子座数の分析のためにTaqMan分析にかける。   
オリザ・サティバ(コメ)の形質転換を、Pengら(米国特許第6,653,529号)により記載されたプロトプラスト形質転換により行う。   
HPPDまたはHST配列を含有するダイズ、トウモロコシ、コメおよびシロイヌナズナのT0またはT1トランスジェニック植物を、温室試験において「クマロン誘導除草剤」に対する耐性の改善について試験する。
【実施例７】
【０２３１】
温室実験
異種HPPDまたはHST酵素を発現するトランスジェニック植物を、温室実験においてクマロン誘導体除草剤に対する耐性について試験する。発芽前処理のために、微細散布ノズルを用いて播種した後、除草剤を直接施用する。容器に穏やかに注水して、発芽および生長を促進した後、植物が発根するまで透明なプラスチックフードで被覆する。このカバーは、試験植物が除草剤にとって損傷されていない限り、試験植物の均一な発芽を引き起こす。発芽後処理のために、試験植物を、最初は植物の習性に応じて3〜15cmの高さまで生長させ、その後でのみ、除草剤で処理する。この目的のために、試験植物を同じ容器中に直接播種し、生長させるか、またはそれらを最初は別々に生長させ、処置の数日前に試験容器中に移植する。
【０２３２】
T0植物の試験のために、挿し木を用いることができる。ダイズ植物の場合、挿し木のための最適な芽は、約7.5〜10cmの高さであり、少なくとも2個の結節が存在する。それぞれの挿し木を、元の形質転換体(母植物)から取得し、発根ホルモン粉末(インドール-3-酪酸、IBA)中に浸す。次いで、挿し木を、バイオドーム内部のオアシスウェッジ(oasis wedge)中に入れる。同時に、野生型挿し木も取得し、対照として用いる。挿し木を5〜7日間、バイオドーム中で保持した後、ポットに移植し、次いで、さらに2日間、生長チャンバー中に慣れさせる。続いて、挿し木を温室に移し、約4日間慣れさせた後、示されるような噴霧試験にかける。   
種に応じて、植物を10〜25℃または20〜35℃で保持する。試験期間は3週間以上に及ぶ。この時間に、植物を世話し、個々の処理に対するそれらの応答を評価する。除草剤損傷評価を、処理後2および3週間で行う。植物損傷を0〜9のスケールで等級付け、0は損傷なしであり、9は完全な死滅である。クマロン誘導体除草剤に対する耐性を、シロイヌナズナにおいて評価することもできる。この場合、トランスジェニックシロイヌナズナ植物を、48穴プレート中でクマロン誘導体除草剤に対する耐性の改善についてアッセイする。種子を、エタノール+水(体積で70+30)中で5min撹拌し、エタノール+水(体積で70+30)で1回洗浄し、滅菌脱イオン水で2回洗浄することにより表面滅菌する。種子を、水に溶解した0.1%寒天(w/v)中に再懸濁する。ウェルあたり4〜5個の種子を、半分の強度のMurashige Skoog栄養溶液、pH5.8(MurashigeおよびSkoog(1962) Physiologia Plantarum 15:473-497)からなる固形栄養培地上に塗布する。化合物をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、培地に添加した後、固化させる(最終DMSO濃度0.1%)。複数ウェルのプレートを、22℃、75%相対湿度および110μmol Phot*m-2*s-1で、14:10hの明：暗光周期で生長チャンバー中でインキュベートする。播種後7〜10日で、野生型植物との比較により生長阻害を評価する。HPPDおよび/またはHST配列を含むトランスジェニック植物の植物生長IC50値を、野生型植物のそれで除算することにより、耐性係数を算出する。さらに、T1およびT2トランスジェニックシロイヌナズナ植物を、温室試験においてクマロン誘導体除草剤に対する耐性の改善について試験することができる。除草剤損傷スコアリングを、処理の2〜3週間後に行い、0〜100%のスケールで等級付けし、0%は損傷なしであり、100%は完全な死滅である。
【０２３３】
得られるデータの例を、表12〜表13ならびに図3および図4に示す。
【表１２】
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【０２３４】
＊本実施例において用いられるクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤1)および1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-3-(2,4,6-トリクロロ-3-ピリジル)ピリド[3,2-c]チアジン-4-オール(阻害剤2)である。
【０２３５】
表13 トランスジェニックダイズ植物(T0挿し木)の温室試験。損傷評価を除草剤処理の2週間後に行った。
【表１３】
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【０２３６】
＊本実施例において用いられるクマロン誘導体除草剤は、3-[2,4-ジクロロ-3-(3-メチル-4,5-ジヒドロイソオキサゾール-5-イル)フェニル]-1-(2,2-ジフルオロエチル)-2,2-ジオキソ-ピリド[3,2-c]チアジン-4-オールである
** 印を付けた事象は半分の比率で試験する。
【０２３７】
HPPDをコードするポリヌクレオチドで形質転換された植物は非形質転換対照植物よりもクマロン誘導体除草剤によってあまり損傷されないことがわかっているため、植物に形質転換されたそのようなポリヌクレオチドを、クマロン誘導体除草剤に対する抵抗性を付与するものとして選択することができることを上記実施例から見ることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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