(57)【要約】ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は賦形剤とを有する生又は不活化の組換えワクチンであって、ウイルスベクターは、α及び／又はγインターフェロンの産生増加に起因して細胞免疫応答を発生させることができ、また急速に複製することができ、ＰＲＲＳにおけるＯＲＦ５及びＯＲＦ６のヌクレオチド配列を挿入したウイルスであることを特徴とする、該ウイルスベクターについて記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α及び／又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができ、また急速複製を行うことができるウイルスベクターであって、ＰＲＲＳウイルスに対して抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、ことを特徴とするウイルスベクター。
【請求項２】
前記ウイルスベクターは、パラミクソウイルスである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記パラミクソウイルスは、あらゆる血清型、遺伝子型のパラミクソウイルスから選択され、
前記パラミクソウイルスは、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含み、
逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する１１７位置からフェニルアラニンを除去し、またＱ１１４位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去することが可能なパラミクソウイルス、又は
トリ感染アブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスから選択される、
請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスから選択される、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項４に記載のパラミクソウイルスベクター。
【請求項６】
前記ニューカッスル病ウイルスは、ＬａＳｏｔａ株、Ｂ１株、ＱＶ４株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択される、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
外因性ヌクレオチド配列は、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６及びその組合せから選択される、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
前記ＯＲＦ５は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：１の配列を有し、前記ＯＲＦ６は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：２の配列を有する、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
α及び／又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができ、また急速複製を行うことができるウイルスベクターであって、ＰＲＲＳウイルスに対して抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、該ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は賦形剤とを含む、ことを特徴とする組換えワクチン。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターのウイルスは、パラミクソウイルスである、請求項９に記載の組換えワクチン。
【請求項１１】
前記パラミクソウイルスは、生又は不活化のウイルスである、請求項１０に記載の組換えワクチン。
【請求項１２】
前記パラミクソウイルスは、あらゆる血清型、遺伝子型のパラミクソウイルスから選択され、
前記パラミクソウイルスは、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含み、
逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する１１７位置からフェニルアラニンを除去し、またＱ１１４位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去することが可能なパラミクソウイルス、又は
トリ感染アブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスから選択される、
請求項１１に記載の組換えワクチン。
【請求項１３】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスから選択される、請求項１２に記載の組換えワクチン。
【請求項１４】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項１３に記載の組換えワクチン。
【請求項１５】
前記ニューカッスル病ウイルスは、ＬａＳｏｔａ株、Ｂ１株、ＱＶ４株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択される、請求項１４に記載の組換えワクチン。
【請求項１６】
外因性ヌクレオチド配列は、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６及びその組合せから選択される、請求項９に記載の組換えワクチン。
【請求項１７】
前記ＯＲＦ５は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：１の配列を有し、前記ＯＲＦ６は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：２の配列を有する、請求項１６に記載の組換えワクチン。
【請求項１８】
前記薬学的に許容可能な担体は、好適には、含水溶液又はエマルションとした、請求項９に記載の組換えワクチン。
【請求項１９】
前記薬学的に許容可能な担体は、水−油、油−水、又は水−油−水型のエマルションから選択される、請求項１８に記載の組換えワクチン。
【請求項２０】
前記薬学的に許容可能な担体は、水−油−水型のエマルションである、請求項１９に記載の組換えワクチン。
【請求項２１】
抗原反応を得るのに必要なウイルス濃度は、１０６．０〜１０１０．０ＤＩＥＰ５０％／ｍＬである、請求項９に記載の組換えワクチン。
【請求項２２】
抗原反応を得るのに必要なウイルス濃度は、１０８．０〜１０９．５ＤＩＥＰ５０％／ｍＬである、請求項２１に記載の組換えワクチン。
【請求項２３】
組換えワクチンは、筋肉内、鼻腔内、又は皮下を経由するにより散布、噴霧又は飲料水内で投与する、請求項９に記載の組換えワクチン。
【請求項２４】
組換えワクチンは、筋肉内経由で投与する、請求項２３に記載の組換えワクチン。
【請求項２５】
請求項９記載の組換えワクチンを使用する方法であって、前記組換えワクチンをＰＲＲＳ制御に使用する、使用方法。
【請求項２６】
請求項９記載の組換えワクチンをＰＲＲＳ制御に使用する方法であって、前記組換えワクチンを２回投与した後に、免疫付与された動物の肺病変部位が１２％未満となるようにする、使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ：porcine reproductive and respiratory Syndrome）を予防及び制御するのに使用する技術、より具体的には、ＰＲＲＳウイルスに対する抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列をインサートしたウイルスベクター組換えワクチン、並びに薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は賦形剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ｖＰＲＲＳ：porcine reproductive and respiratory Syndrome virus）は、ＲＮＡグループ、アルテリウイルス科アルテリウイルス属に属するエンベロープを持ったウイルスである。そのサイズは約４６０ｎｍであり、そのウイルスゲノムはＲＮＡらせん構造に確実に含まれ、この結果７個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：open reading frame）、すなわち、ＯＲＦ１ａ，ＯＲＦ１ｂ，ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７があり、この結果７個の構造タンパク質（ｇｐ２ａ，２ｂ〜５，Ｍ及びＮ）及び少なくとも１３個の非構造タンパク質（ｎｓｐ１ａ，ｎｓｐ１ｂ〜ｎｓｐ１２）の組合せとなり、それぞれがｖＰＲＲＳを形成する特異的機能を有する。このウイルスは免疫調節作用を示し、とくに、免疫応答を開始し、また免疫応答の方向に参加する役割を担う単球／マクロファージに選択的に影響を及ぼす。このウイルスには、γインターフェロン（ＩＦＮγ）の産生を減少させ、無力化しようとする抗体の産生を遅らせ、また免疫学的おとりを産生することによって、免疫応答を変化させる能力があることが分かっている（Yoo et al., 2009; Patel et al., 2009; Chen et al., 2009; Lalit, 2009）。ｖＰＲＲＳは高い抗原変容性を有するため、それに戦うためのワクチン接種戦略に基づく従来方法を使用するのは困難であった。このため、感染拡散及び感染による結果と闘う生物学的能力を開発する世界的な努力が行われており、またこのことを達成する最良の選択肢として、ウイルスの遺伝子操作生成物が挙げられる（Lara, 2010）。この意味で、何らかの保護を付与することができるウイルスサブユニットも研究が続けられており、ＯＲＦ５及びＯＲＦ６が、少なくとも部分的にウイルスの毒性の原因になっていることから、その使用に期待が持てることが分かってきた（Kim et al., 2009; Zuckerman et al., 2007）。ただし、免疫が生の（複製し続けている）生成物で得られ、生の生成物が接種（抗原投与）による保護を与える唯一のものであり、この保護は接種後におけるウイルス血症の減少によって測定される。２００５年にＯＲＦ５のグリコシル化（糖化）の改変によってＯＲＦ５ミュータント（突然変異体）が開発され、これらはイムノゲン（免疫原）として検査され、ＧＰ５の低グリコシル化がｖＰＲＲＳの能力を増大させ、活発な抗体無力化を誘発することが分かった（Ansari et al., 2005）。
【０００３】
ＯＲＦ５に特異的なケースにおいて、アミノ酸残基１〜２５間の領域は、アメリカ産分離株とヨーロッパ産分離株との間で高い多様性を有するとともに、各大陸産における株領域の超可変領域はアミノ酸末端配列近傍のアミノ酸２６と３９との間でグループ分けされる。
【０００４】
ＯＲＦ５配列における変化は、ブタ流産大量死症候群（ＳＡＭＳ：swine abortion and mortality syndrome）、又は中国で見られた「高熱」症候群のような疾患の特異な大発生を招く結果となりうる（Ferrari et al, 2003; Martelli, 2003）。
【０００５】
現在市販されているＰＲＲＳに対するワクチンは弱毒化ウイルスを含むが、ブタに感染する可能性があり、病気発症及び免疫学的タメージが、とくに投薬を受けていない動物（以前に被曝されていないと高度に罹患し易い）に現れるという欠点がある。さらに、このワクチンウイルスは突然変異し、それ自身が血中の現存ウイルスと組換えを起こし、これにより、ウイルスの新たな遺伝的変異を生ずるおそれがあることが分かってきた。同様に、研究によれば、弱毒化ワクチンは病気を予防するには不十分であることが分かってきており、さらに、抗ｖＰＲＲＳの抗体は、抗体依存増強（ＡＤＥ：antibodies dependent enhancement）の増強メカニズム及び／又はｖＰＲＲＳによる免疫学的作用に含まれることが予め分かっており（Thanawongnuwech and Suradhat, 2010）、このことは、期待に反して、ワクチン接種した動物はＰＲＲＳ疾患の影響をより受け易くなるおそれがある。
【０００６】
上述のことから、この病気に対する組換えワクチンに関する特許がいくつかある。
【０００７】
米国特許第７，７２２，８７８号は、抗ＰＲＲＳ組換えワクチンについて記載しており、この場合、ｖＰＲＲＳのＯＲＦ１部分を単独で又は他のＯＲＦと組合せて有するベクターにより構成する。これらのワクチンは、動物に免疫応答を誘発し、またｖＰＲＲＳ感染によって生ずる重症度及び病状を防止及び軽減するのに有用である。これらのワクチンの効率を決定するため、肺の病斑の個数、ｖＰＲＲＳの特徴を測定したところ、肺病斑の４７％もの減少を達成したことが分かった。
【０００８】
米国特許第５，８８８，５１３号においては、スペインで分離されたｖＰＲＲＳのＯＲＦ２〜ＯＲＦ７に対応する組換えタンパク質が記載されており、この組換えタンパク質はバキュロウイルス発現系で産生され、またワクチン製剤に使用することができるものである。
【０００９】
中国特許出願公開第１５５４７６６号及び中国特許出願公開第１８００３７５号は、抗ＰＲＲＳ組換えワクチンについて記載しており、この場合、ベクターとしてアデノウィルスを使用する。中国特許出願公開第１７７８９２６号はｖＰＲＲＳのＯＲＦ５改変遺伝子について記載しており、これはこの病気に対するワクチン調製に使用することができる。
【００１０】
米国特許第７，０４１，４４３号においては、ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスのポリヌクレオチド及びポリペプチドについて記載しており、これらを使用して免疫遺伝子組成を調製するもので、またこれらは、数個の配列から選択したポリヌクレオチドを含む弱毒化した又は不活化したｖＰＲＲＳを構成する。
【００１１】
他方、米国特許第６，２０７，１６５号は、生殖器及び／又は呼吸器の病理に含まれ、それらのうちの１つがＰＲＲＳである病原体作用因子に対抗するブタワクチン接種用多価ワクチン製剤について記載している。このワクチンは、少なくとも３種のワクチンを含み、各ワクチンはそれぞれ、プラスミド及びブタの病原体結合価を有する遺伝子を含み、ＰＲＲＳの場合、この遺伝子はＥ遺伝子、ＯＲＦ３遺伝子又はＭ遺伝子とすることができる。
【００１２】
最後に、米国特許第５，９９８，６０１号は、ｖＰＲＲＳのＶＲ−２３３２株のヌクレオチド配列について記載しており、この場合、このヌクレオチド配列におけるＯＲＦ又はフラグメントに対してコーディングすることができ、またこのヌクレオチド配列から派生したワクチンについても記載している。
【００１３】
上述のように、従来技術に記載されたワクチンは病気の影響を抑制するのに供されてきたが、現在に至るまで、病気を十分有効に抑制するｖＰＲＲＳ予防レベルには達していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，７２２，８７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８８８，５１３号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第１５５４７６６号明細書
【特許文献４】中国特許出願公開第１８００３７５号明細書
【特許文献５】中国特許出願公開第１７７８９２６号明細書
【特許文献６】米国特許第７，０４１，４４３号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２０７，１６５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９９８，６０１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従来技術の欠点に鑑み、本発明の目的は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）に対抗する有効なウイルスベクター組換えワクチンを得ることにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、全ＰＲＲＳウイルスに基づくワクチンよりも迅速な免疫応答を発生する抗ＰＲＲＳのウイルスベクター組換えワクチンを得ることにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、ＰＲＲＳを抑制するウイルスベクター組換えワクチンの使用法を得ることにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、ＰＲＲＳウイルスに対する抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入したウイルスベクターを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この目的を達成するため組換えワクチンを発明したもので、本発明の組換えワクチンは、α及び／又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができ、また急速に複製を行うことができるウイルスベクターであって、好適には、ニューカッスル病ウイルスをベースとし、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６及びこれらの組合せから選択してＰＲＲＳのヌクレオチド配列を挿入した、該ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は賦形剤とを含む。
【００２０】
新規な態様を考慮した本発明の特徴は、特許請求の範囲に特別に定義した。しかし、その若干の実施形態、特徴並びに若干の目的及び利点は、添付図面とともに以下の詳細な説明を読むことによって、よりよく理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明による抗ＰＲＲＳ不活化ワクチンで免疫されたブタにおける体重増加を、市販のワクチンと比較して示すグラフである。
【図２】本発明による抗ＰＲＲＳ生ワクチンで免疫されたブタにおける体重増加を、市販のワクチンと比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明を開発する間に、驚くべきことに、α及び／又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができるウイルスベクターであって、急速複製を行うことができ、ＰＲＲＳウイルス（ｖＰＲＲＳ）の抗原部位をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、該ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は賦形剤とを含む組換えワクチンによれば、ブタ繁殖・呼吸障害症候群に対抗する適切な保護を行えることが分かった。
【００２３】
ウイルスベクターとしては、生（活動している）又は不活化（死んでいる）の状態のもとを使用することができる。不活化によって、ウイルスベクターとして作用し、またｖＰＲＲＳの抗原部位をコーディングするヌクレオチド配列を有する組換えウイルスは、複製能力を失うと理解される。不活化は既知の物理的又は化学的な処理手順によって、好適には、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトンでの化学的不活化によって行う（動物間流行病学会のオフィス・インターナショナル、２００８年、ニューカッスル病、陸生動物の診断検査及びワクチンのＯＩＥマニュアル、動物間流行病学会のオフィス・インターナショナル、フランス、第５７６〜５８９頁参照）。逆に活性又は生ウイルスは、複製能力を保持していると理解される。
【００２４】
好適には、使用するウイルスベクターは、任意のパラミクソウイルスから選択したパラミクソウイルスとすることができ、あらゆる血清型、遺伝子型のパラミクソウイルスから選択でき、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含むパラミクソウイルスから選択できる。同様に、逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する１１７位置からフェニルアラニンを除去し、またＱ１１４位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去したパラミクソウイルス、又はトリ感染アブラウイルス、例えば、ニューカッスル病ウイルス若しくはセンダイウイルスに含まれるパラミクソウイルスを使用することができる。より好適には、ウイルスベクターは、ニューカッスル病ウイルスであり、このウイルスベクターはレントジェニック株又はメソジェニック株から選択し、例えば、ＬａＳｏｔａ株、Ｂ１株、ＱＶ４株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択すると好適である。好適には、ＬａＳｏｔａ株から組換えウイルスを選択する。
【００２５】
ｖＰＲＲＳの抗原部位をコーディングするヌクレオチド配列に関しては、従来幾つかの
ＯＲＦ配列が記載されており、ＯＲＦ５及びＯＲＦ６の配列は、米国特許第５，８８８，５１３号明細書及び米国特許第７，０４１，４４３号明細書、並びに中国特許出願公開第１７７８９２６号明細書に記載されているように、抗ＰＲＲＳワクチンを産生するのに使用することができる。本発明の場合、使用するヌクレオチド配列は、配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：１(ＯＲＦ５）、配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：２(ＯＲＦ６）及びこれらの組合せから選択する。
【００２６】
本発明によるワクチンのウイルスベクターは、パラミクソウイルスによるウイルスベクターに挿入し、予め増幅してある関心のあるヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅することによって調製することができる。挿入は分子生物学的クローニング（クローン作成）技術を使用して実施することができる。このようにして得られた感染性クローンは、細胞培養に核酸導入され、組換えウイルスを発生させる。
【００２７】
成長に適切な任意の系、例えば、ＳＰＦニワトリの胚、市販の細胞株、又はウイルス成長用にとくに設計した細胞株で、抗原反応を達成するのに必要なウイルス濃度、好適には、１０６．０〜１０１０．０ＤＩＥＰ５０％／ｍＬ、より好適には１０８．０〜１０９．５ＤＩＥＰ５０％／ｍＬに達するまでウイルスは複製する。生ワクチンの実施形態では、自然にレントジェニック型ワクチンとなる活性ウイルス、又は従来既知の手順で不活化したウイルスを使用する。他方、ワクチンが不活化したものであるとき、抗原反応を達成するのに必要なウイルス濃度に達した後、ウイルスを不活化する。好適には、不活化は、従来既知の物理的又は化学的手順によって行い、好適には、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトン又はバイナリ・エチレンアミン（Ｂ.Ｅ.Ｉ．）で化学的不活化する。
【００２８】
本発明によるワクチンの薬学的に許容可能な担体は、好適には、含水溶液又はエマルションである。より好適には、使用する担体は、水−油、油−水、又は水−油−水（ＷＯＷ）型のエマルションであり、好適には、水−油−水型エマルションである。ワクチン投与に関しては、筋肉内、鼻腔内、又は皮下に、散布、噴霧又は飲料水内で行うことができ、各場合において、ブタにとって適切な、また生ワクチンか不活化ワクチンかに基づいて適切な手段及び形式を使用し、また好適には、筋肉内又は鼻腔内経由で、より好適には筋肉内経由で投与する。
【００２９】
本発明は、以下に説明する実施例からよりよく理解できるであろうが、これら実施例は本発明の好適な実施形態をよりよく理解させることができる単なる例示的なものであり、他の説明しない既存の実施形態が上述の説明に基づいて実施できることを意味するものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
ニューカッスル病ＬａＳｏｔａベクターの産生
ニューカッスル病ウイルスにおける株ＬａＳｏｔａのゲノム（全遺伝情報）のクローンを作成し、これにより、ウイルスベクターを発生させるために、先ず、中間ベクター、いわゆる「ｐＳＬ１１８０ＮＤＶ／ＬＳ」を生成した。この目的のため、ニューカッスル病ウイルスにおける株ＬａＳｏｔａの全ウイルスＲＮＡ抽出をトリアゾール方法で実施した。精製ＲＮＡからウイルスゲノムのｃＤＮＡ（complementary DNA）の合成を、テンプレート（鋳型）として前もって精製した全ＲＮＡを使用して行った。ニューカッスル病ウイルスのゲノムからすべての遺伝子のクローンを作成する目的で（１５，１８３塩基対（ｂｐ））、「オーバーラップ」する端部を有し、また凝集性のある制限部位を有する７個のフラグメント（断片）をＰＣＲによって増幅した。フラグメント１（Ｆ１）はヌクレオチド（ｎｔ）１〜１７５５をカバーし、Ｆ２はｎｔ１〜３３２１にわたり、Ｆ３はｎｔ１７５５〜６５８０を有し、Ｆ４は６１５１〜１０２１０にわたり、Ｆ５はｎｔ７３８１〜１１３５１を含み、Ｆ６は１１３５１〜１４９９５にわたり、Ｆ７はｎｔ１４７０１〜１５１８６を有する。７個のフラグメントのアセンブリは、結鎖標準技術を使用してｐＧＥＭ−ｐＳＬ１１８０と称されるクローン化ベクター内で行ったが、このことはニューカッスル病ＬａＳｏｔａゲノムの再構築を可能にし、クローン作成後にＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に単独制限部位Ｓａｃｌｌを有し、このベクターウイルス領域における関心のある任意の遺伝子のクローン作成（クローニング）に有用である。
【００３１】
実施例２
ｖＰＲＲＳからのＯＲＦ５及びＯＲＦ６遺伝子のクローニング
ｖＰＲＲＳからＯＲＦ５及びＯＲＦ６遺伝子のクローンを作成するため、全ウイルスＲＮＡ抽出をトリアゾール方法で実施した。つぎに、この精製した全ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成し、またＰＣＲ技術によってＰＲＲＳウイルスからのこの遺伝子を、特定のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。ＯＲＦ５及びＯＲＦ６遺伝子を、後にフェルメンタス社製のｐＪＥＴベクター内にクローニング標準技術を使用して挿入し、プラスミド：ｐＪＥＴＯＲＦ５／ＯＲＦ６を得た。
【００３２】
実施例３
プラスミドpNDV-LS(wt)Orf5/6を産生するpSL1180NDV/LSベクターのSacll部位内におけるｖＰＲＲＳからのＯＲＦ５及びＯＲＦ６遺伝子のクローニング
Ａ：plntNhe中間ベクターの産生
ニューカッスル病と称されるＯＲＦ５及びＯＲＦ６遺伝子の５′末端におけるＧＥ／ＧＳから転写配列を導入する目的で、新しい中間ベクター、いわゆるplntNheを形成し、この形成は、ＧＥ／ＧＳ配列のＰＣＲ初期増幅によって、ニューカッスル病ゲノムを鋳型として使用し、またこれら配列をｐＧＥＭ−Ｔ内に後で挿入することによって行った。
【００３３】
Ｂ：ベクターplntNheに対するＯＲＦ５及びＯＲＦ６遺伝子のサブクローニング
plntNheプラスミドをＳｐｅｌ−Ｈｐａｌで消化し、つぎにplntNhe内にクローンを形成し、plntNhe56プラスミドを得た。
【００３４】
Ｃ：ベクターpSL1180NDV/LSに対するGE/GS-ORF5/6のサブクローニング
plntNhe56プラスミドをNhel酵素で消化し、pSL1180NDV/LSプラスミドをSacllで消化した。消化生成物を削り取り、相溶性結合部位を残し、またGE/GS-ORF5/6領域を精製し、pNDV/LSのSacll部位に挿入し、pNDV-LS(wt)Orf5/6と称される感染クローンを得た。
【００３５】
実施例４
細胞培養内での組換えウイルスrNDV-LS(wt)Orf5/6の産生
Hep-2及びA-549細胞をMAV-7ウイルスに感染多重度１で感染させた。３７゜Ｃ、５％ＣＯ２大気中で１時間の培養後、細胞にpNDV-LS(wt)Orf5/6クローンからのＤＮＡを１マイクログラム（μｇ）導入し、これとともに双方の細胞タイプにおける組換えの産生に必要なウイルスタンパク質Ｐ，ＮＰ及びＬのコーディングを行う発現プラスミドｐＮＰ，ｐＰ及びｐＬからのＤＮＡを０.２μｇ導入した。核酸導入後４４時間して、双方の細胞タイプで得られた組換えウイルスを回収（集菌）し、生後１０日目のＳＰＦニワトリ胚に注入し、産生ウイルスを増殖させた。回収したアラントイド（allantoid）液体をプレートアッセイによってベロ細胞内で滴定し、ワクチンを調製するのに使用する最終組換えウイルスを生じた。
【００３６】
実施例５
vPRRSからのＯＲＦ５及びＯＲＦ６インサートを持つニューカッスル病LaSota組換えウイルスを有するワクチン：pNDV-LS(wt)Orf5/6vacの製造方法
種の産生から開始し、ニワトリの特定病原体未感染（ＳＰＦ：free of specific pathogens）の孵化（胚含有）卵に予め決定した感染ドーズを接種した。胚を３７゜Ｃで７２時間にわたり培養し、生死を毎日モニタリングした。この時間経過後、生きている胚を１日から翌日にかけて、好適には２４時間冷凍し、アミノアラントイド（aminoallantoid）液体（ＦＡＡ）を無菌条件の下で回収し、遠心分離によって浄化した。ＦＡＡを検査にかけてその純度、無菌度及びＤＩＥＰ力価を決定した。
【００３７】
生ワクチン及び不活化ワクチンを水−油−水型エマルション内で調製した。油相を調製するため、Ｓｐａｎ８０及びＴｗｅｅｎ８０タイプの鉱油及び界面活性剤を使用した。水相を調製するため、ＦＡＡを防腐作用のある溶液（チメロサール）に混合した。エマルションを調製するため、水相をゆっくりと油相に一定の撹拌をしながら添加した。ホモジナイザ又はコロイド化ミルを使用して特定粒度にした。
【００３８】
上述のワクチンを、最小の１０８.０ＤＩＥＰ５０％０.５ｍＬとなるよう調剤し、ブタ１頭につき２．０ｍＬの投与量で使用できるようにした。
【００３９】
上述の手順に従って、ＯＲＦ５及びＯＲＦ６の遺伝子を有するベクター（pSL1180NDV/LS）内で実験的組換えワクチン、いわゆるpNDV-LS(wt)Orf5/6vacを産生し、アジュバントなしの生形態（実施例５Ａ）、水−油水型アジュバントを有する生形態（実施例５Ｂ）、及び水−油水型アジュバントを有する不活化形態（実施例５Ｃ）で検査し、すべてのケースで２回の投与で適用した。
【００４０】
実施例６
組換えワクチンpNDV-LS(wt)Orf5/6vacの効能の生体内評価
本発明によるワクチンの有効性を決定するため、またこれらワクチンが市販のワクチンよりも効果的であることを実証するため（１投与で適用）、その有効性を検査した。
【００４１】
ＰＲＲＳの病原体活性ウイルスを４５分あたり１０６.０ＤＩＣＣ５０％ｍＬの投与量で使用し、異なる実験で抗原投与し、ワクチンの有効性を測定した。
【００４２】
この目的のため、１０４頭の生後３〜５週間のＳＰＦブタを使用し、これらブタは、個別番号を重複させて耳タグに付し、計量し、また表１に従って９つの処置グループにランダムに割り当てた。
【００４３】
【表１】
2014515925.tif 000002
【００４４】
ブタを負圧の隔離室内に収容し、治療前に３日間順応させた。すべてのグループに対して、動物に市販の飼料を給餌し、生活用飲み水を自由に与え、飼料及び飲み水は添加物及び／又は抗生物質がないものとした。同様に、空気濾過システム及び気密シールを各部屋に配置した。ブタは、実施例５Ａ〜５Ｃによって得られた本発明によるワクチン（pNDV-LS(wt)Orf5/6 vac）を、１回のブタ投与につき２．０ｍＬを使用し、０日目及び１４日目に接種して免疫付与した。比較目的のため、他のグループには、ＰＲＲＳに対して一般的に使用されている市販のワクチン（Ingelvac(登録商標)PRRS MLV）をブタ１頭につき２．０ｍＬの１回投与で接種して免疫付与した。
【００４５】
ワクチン接種日は「接種日後ゼロ」（ＤＰＶ０）と指定した。同様に血液サンプルをすべてのグループにおける動物から大静脈穿刺によって、以下の日取りで採取した。すなわち、ＤＰＶ０，ＤＰＶ７，ＤＰＶ１４，ＤＰＶ２１，ＤＰＶ２８，ＤＰＶ３５，ＤＰＶ４２及びＤＰＶ４９（殺処分）。
【００４６】
陰性対照グループを除くすべてのグループにおけるすべてのブタにおける抗原投与は、ＤＰＶ３５（ＤＰＤＦ０）に行った。攻撃ウイルスは、ブタに割り当てられた室内に噴霧によって投与した。ＤＰＶ４９すなわちＤＰＤＦ１４に、すべてのグループにおけるすべてのブタを殺処分し、検視を受けた。ワクチンの有効性を検認するため、免疫付与したブタにおける成長能力及び肺の病変割合を評価した。
【００４７】
肺の病変割合
異なるグループからのブタをＤＰＤＦ１４に電気ショック及び血抜きによって殺処分し、次いで検視した。依然として気管に取り付いていた状態で送気した肺を切除した。左右の肺葉の肺尖部、左右の肺葉の心臓寄り部、左肺の上葉端縁、右肺葉の横隔膜寄り下葉部及び中葉部に対して評価した。損傷の有無に基づいて、組織サンプルを罹患臓器から収集した。ｖＰＲＲＳによる感染を示唆する顕微鏡的損傷部は、面積測定法（Ciprian et al., 1988, Lara et al., 2008）で決定し、この結果を下記の表に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
表から分かるように、異なった変数（生、アジュバントを含む生、及びアジュバントを含む不活化）のワクチンpNDV-LS(wt)/Orf5/6投与によれば、陽性対照に比べると肺病変減少率を６７％にも達する割合にするすることができるとともに、市販のワクチンを使用した陽性対照では、肺病変の割合が３０％も増えている。このことは、従来技術で知らされていることと一致している（Thanawongnuwech and Suradhat, 2010）。
【００５０】
血清学
すべてのグループにおける動物から採取した血液サンプルを使用して血清学的検査を行い、基礎サンプル、抗原投与前日サンプル、及び殺処分当日サンプルに対応するものを選択した。セロコンバージョン検査を、製造業者の指示書に従って、ＩＤＥＸＸのELISA Herd Check PRRS 2XRを使用して行った。得られた結果は以下の表に示す。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
上述の結果は、予想通り、すべてのＳＰＦブタの基礎サンプリングは陰性であった。抗原投与の時点でセロコンバージョンした唯一のグループはIngelvac PRRS MLVで免疫付与されたものであり、一方、セロコンバージョンのないものは本発明ワクチンで免疫付与されたあらゆるグループで検出された。この結果は、市販で入手可能なＥＬＩＳＡキットのみが、実施例５Ａ〜５Ｃのワクチンのいずれにも存在しないＯＲＦ７によってコーディングされたヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体応答を検出するからである。
【００５３】
殺処分当日に関しては、市販のワクチンを投与されたグループが血清反応陽性のままであり、残りのグループは血清反応陰性であることが分かり、このことは、抗原投与と殺処分との間の経過時間が短く、使用した抗原ウイルスのセロコンバージョン時間が不十分であったことに起因する。しかし、抗原投与グループにおけるウイルスの存在は、ＰＣＲ検査によって確認された。
【００５４】
同様に、pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vacに対するセロコンバージョンを検出する目的で、上述の血清サンプルを使用する場合、ＨＩ検査は、従来既知の方法を使用して行った。得られた結果を以下の表で示す。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
表から分かるように、検査を開始する時点でＳＰＦブタは、異なった実施例（Ｅ：５Ａ〜５Ｃ）におけるpNDV-LS(wt)/Orf5/6 vacワクチンに対して完全に陰性であった。しかし、抗原投与前日の時点で本発明ワクチンを接種したグループでは完全なセロコンバージョンが見られ、ワクチン接種した動物の１００％が、使用した処置に従う異なる抗体力価で血清反応陽性を示すとともに、陰性対照、陽性対照及び市販のワクチンで免疫付与されたグループ血清反応陰性のままであった。殺処分当日では、pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vacのワクチン接種したグループが動物１００％において１００％のセロコンバージョンを維持し、残りのグループは陰性のままであった。
【００５７】
上述のことから、増大したインターフェロンα及び／又はγに起因する細胞免疫応答を発生することができ、また急速複製を可能にするウイルスベクターを選択することの効能が効果的なワクチン生成の解決法であることを示している。
【００５８】
成長能力
目標到達した発育を生ずる目的で、ブタは、殺処分検視の研究における開始時、研究中、及び終了時に個別に軽量した。図１から分かるように、市販ワクチンに比べて、アジュバントを含む不活化した実施例５Ｃのワクチン（pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vac）を使用するとき、ブタの体重増加（ｗ）に僅かな増加が見られた。
【００５９】
一方、生ワクチンで免疫を付与されたブタに関しては（図２参照）、アジュバントの有無に係わらず、（pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vac）をワクチン接種した動物の体重増加は、市販ワクチンのものと比べて相当大きいことが分かる。
【００６０】
これら実験によれば、本発明の成功を裏付けるものであり、なぜなら、本発明のワクチンは市販ワクチンよりもセロコンバージョンする時間に明らかな優位性を示し、したがって、ブタの肺病変の大幅な減少から見てよりよい保護レベルを達成していることを示しているからである。このことから、産生パラメータにおける改善がワクチン非接種動物に比べてなされた。同様に、現場の病原体ウイルス又は既存の市販活性ワクチンによって生ずるのとは異なった、測定可能な血清学的応答を誘発し、このことは、本発明による組換えワクチンがＤＩＶＡ（Differentiation of infected from vaccinated Animals）のパラメータに合致することを意味する。
【００６１】
本発明の特定の実施形態を示しまた説明したが、ウイルスベクターとして使用するウイルス及び使用するエマルション又は担体のタイプに多くの変更を加えることができることを強調しなければならない。したがって、本発明は、従来技術及び特許請求の範囲を除いて限定されるべきものではない。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月6日(2013.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタにおける細胞の免疫応答を発生することができるウイルスベクターであって、該ウイルスベクターは、ＰＲＲＳウイルスに対して抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を含むパラミクソウイルスである、ウイルスベクター。
【請求項２】
前記パラミクソウイルスは、あらゆる血清型、遺伝子型のパラミクソウイルスから選択され、
前記パラミクソウイルスは、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含み、
逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する１１７位置からフェニルアラニンを除去し、またＱ１１４位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去することが可能なパラミクソウイルス、又は
トリ感染アブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスから選択される、
請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスから選択される、請求項２記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項３記載のパラミクソウイルスベクター。
【請求項５】
前記ニューカッスル病ウイルスは、ＬａＳｏｔａ株、Ｂ１株、ＱＶ４株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択される、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
外因性ヌクレオチド配列は、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６及びその組合せから選択される、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記ＯＲＦ５は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：１の配列を有し、前記ＯＲＦ６は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：２の配列を有する、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
ＰＲＲＳに対する組換えワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスに対して抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を含むパラミクソウイルスのウイルスベクターと、創薬的に容認可能な媒剤、アジュバント及び／又は添加剤とを含む、ワクチン。
【請求項９】
前記パラミクソウイルスは、生又は不活化のウイルスである、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記パラミクソウイルスは、あらゆる血清型、遺伝子型のパラミクソウイルスから選択され、
前記パラミクソウイルスは、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含み、
逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する１１７位置からフェニルアラニンを除去し、またＱ１１４位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去することが可能なパラミクソウイルス、又は
トリ感染アブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスから選択される、
請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスから選択される、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ニューカッスル病ウイルスは、ＬａＳｏｔａ株、Ｂ１株、ＱＶ４株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択される、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
外因性ヌクレオチド配列は、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６及びその組合せから選択される、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ＯＲＦ５は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：１の配列を有し、前記ＯＲＦ６は配列(ＳＥＱ)ＩＤ番号(ＮＯ)：２の配列を有する、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記薬学的に許容可能な担体は、好適には、含水溶液又はエマルションとした、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記薬学的に許容可能な担体は、水−油、油−水、又は水−油−水型のエマルションから選択される、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記薬学的に許容可能な担体は、水−油−水型のエマルションである、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
抗原反応を得るのに必要なウイルス濃度は、１０６．０〜１０１０．０ＤＩＥＰ５０％／ｍＬである、請求項８に記載のワクチン。
【請求項２０】
抗原反応を得るのに必要なウイルス濃度は、１０８．０〜１０９．５ＤＩＥＰ５０％／ｍＬである、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項８記載のワクチンを使用する方法であって、前記ワクチンをＰＲＲＳ制御に使用する、ワクチンの使用方法。
【請求項２２】
ＰＲＲＳを制御するために、前記ワクチンを２回投与した後に、免疫付与された動物の肺病変部位が１２％未満となるようにする、請求項２１に記載のワクチンの使用方法。
【請求項２３】
ワクチンは、筋肉内、鼻腔内、又は皮下を経由するにより散布、噴霧又は飲料水内で投与する、請求項２１に記載のワクチンの使用方法。
【請求項２４】
ワクチンは、筋肉内経由で投与する、請求項２１に記載のワクチンの使用方法。
【国際調査報告】
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