(57)【要約】  本出願は、機能的ペプチドの分野に、さらに特定すると制御されたタンパク質凝集の分野に属する。本発明は、特許請求の範囲において定義されるペプチド構造の分子ならびに治療的適用のためおよび診断用に、さらに農業バイオ分野においてと工業バイオテクノロジーにおいてなどの他の適用においてそのような分子を使用する方法を開示する。前記分子は、細菌性、真菌性およびウイルス性疾患などの感染を治癒させるおよび／または安定化するために使用することが可能であるが、非感染性のヒトおよび動物疾患においても有用である。前記分子は、タンパク質バイオマーカーの検出のためおよび種々の疾患の予後と診断のためにも使用することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択され、
ｎが１の場合は、
−Ｘ１およびＸ２は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個または２個のアミノ酸であり、
−Ｙ１は一続きの６個から１１個の連続するアミノ酸であり、
−その少なくとも７５％は疎水性アミノ酸であり、
−前記アミノ酸の少なくとも５０％は脂肪族またはＦ残基であり、
−Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＨ残基は存在せず、
−Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、ＡまたはＴ残基は１個以下存在し、
−ＹまたはＦ残基は３個以下存在し、
−２個の連続する同一の非脂肪族残基は存在せず、
−連続する同一の脂肪族残基は２個以下存在し、
−２個の連続する非芳香族極性残基は存在せず、
−同一の残基は５０％以下存在し、
−最初のおよび／または最後の残基は脂肪族またはＦ残基であり、
−ＡおよびＧ残基の合計は２個以下であり、
−Ａ、ＧおよびＳ残基の総割合は２５％以下であり、
−Ｃ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷ残基の総割合は２５％以下であり、
−Ｖ以外の小残基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｔから選択される）の総割合は２５％以下である］
の分子。
【請求項２】
Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉが、それぞれ、１個または２個のアミノ酸である、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
少なくとも１つの、もっとも特定するとすべてのＹｉが、一続きの４個から１３個のアミノ酸、特に５個から９個のアミノ酸、さらに特定すると６個または７個のアミノ酸である、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
少なくとも１つのＹｉが、タンパク質に天然に存在する一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸である、請求項１から３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項５】
タンパク質に天然に存在する前記少なくとも１つの一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸が、そのゲノム中に前記タンパク質がコードされている生物中の前記タンパク質にしか含まれない、請求項４に記載の分子。
【請求項６】
タンパク質に天然に存在する前記少なくとも１つの一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸が、そのゲノム中に前記タンパク質がコードされている生物の１つよりも多いタンパク質中に存在しているおよび／または１つよりも多い生物のタンパク質中に存在している、請求項４に記載の分子。
【請求項７】
タンパク質に天然に存在する前記少なくとも１つの一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸において、前記一続きの長さが少なくとも６個のアミノ酸である場合は１個または２個のアミノ酸が置換されており、前記長さが６個未満のアミノ酸である場合は１個のアミノ酸が置換されている、請求項４から６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
置換が、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＰから選択される残基で行われている、請求項７に記載の分子。
【請求項９】
少なくとも２つの、特にすべてのＹｉが、タンパク質に天然に存在する一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸である、請求項４から８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのＹｉが、同じタンパク質に存在する、特に前記少なくとも２つのＹｉが同一である、請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのＹｉが、異なるタンパク質に由来する、請求項９に記載の分子。
【請求項１２】
少なくとも１つの、特にそれぞれのＹｉの全電荷が１より高くない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１３】
少なくとも１つの、特にそれぞれのＹｉにおける荷電残基の数が１より多くない、請求項１２に記載の分子。
【請求項１４】
Ｚｉがそれぞれ、０から２０までの一続きの同一または同一でない単位であり、アミノ酸、単糖類、ヌクレオチドまたはモノマーである単位から独立して選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１５】
少なくとも１つの、特にすべてのＺｉが、同じ性質の０から１０までの単位、特に同じ性質の０から５までの単位である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１６】
Ｚｎが０単位である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１７】
少なくとも１つの、特にＺｎを除くすべてのＺｉが、特にＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳから選択される配列を有するペプチドまたはポリペプチドリンカー；ＰＥＧリンカーおよびＴｔｄｓリンカーの群から選択されるリンカーである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１８】
全長が６０個のアミノ酸を超えない、請求項１から１７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１９】
ｎが１である、特にｎが１であり、Ｙ１が６個から１０個までの一続きのアミノ酸であり、Ｚ１が一続きの０単位である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２０】
ｎが２であり、Ｚ１がリンカーであり、Ｚ２が存在しない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２１】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２２】
分子の可溶性を増加させる部分をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２３】
可溶性を増加させる部分が、ＰＥＧ、ペプチドまたはタンパク質ドメインから選択される、請求項２２に記載の分子。
【請求項２４】
可溶性を増加させる標識または部分が、リンカーを介して、特にＺｉリンカーを通じて分子に融合されている、請求項２１から２３に記載の分子。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の分子をコードする核酸分子、特に人工遺伝子である核酸分子。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸分子または請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２８】
請求項２５に記載の核酸分子または請求項２６に記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック生物、もっとも特定すると非ヒト哺乳動物生物。
【請求項２９】
植物または植物細胞または植物種子である、請求項２７に記載の細胞または請求項２８に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３０】
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
を有する少なくとも１つの分子
ならびに医薬として許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
タンパク質の生物学的機能を下方調節するための方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択され、
ｎが１の場合は、Ｙ１は一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸であり、Ｚ１はアミノ酸リンカーではない］
の分子に前記タンパク質を接触させることを含む、前記方法。
【請求項３２】
薬物または診断薬として使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択され、
ｎが１の場合は、Ｙ１は一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸である。］
の分子。
【請求項３３】
癌の治療に使用するための、請求項３２に記載の分子。
【請求項３４】
ＡＭＤの治療に使用するための、請求項３２に記載の分子。
【請求項３５】
炎症性疾患の治療に使用するための、請求項３２に記載の分子。
【請求項３６】
必要とする対象において癌を治療するまたは予防する方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が癌に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
を有する分子を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
抗病原体化合物として使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定するとＲ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは病原生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の分子。
【請求項３８】
必要とする対象において病原生物の感染を治療するまたは予防する方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、病原生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
病原体が、ウイルス生物である、請求項３７に記載の分子または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
病原体が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、マイコバクテリア、真菌、酵母およびカビから選択される微生物である、請求項３７に記載の分子または請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
病原生物が、薬剤耐性株またはバリアントである、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の分子または方法。
【請求項４２】
病原生物を死滅させる、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の分子または方法。
【請求項４３】
病原生物の増殖および／または繁殖を、病原生物を死滅させることなく阻害する、請求項３７から４２のいずれか一項に記載の分子または方法。
【請求項４４】
病原生物のタンパク質が、必須タンパク質である、請求項３７から４３のいずれか一項に記載の分子または方法。
【請求項４５】
病原生物のタンパク質が、バイオフィルム形成に関与している、バイオフィルム形成を治療するまたは予防する、請求項３８から４４のいずれか一項に記載の分子または方法。
【請求項４６】
バイオフィルム形成が、カテーテルまたはステントなどの埋め込み型装置上である、請求項４５に記載の分子または方法。
【請求項４７】
表面上での微生物バイオフィルム増殖を予防する、阻害するまたは逆戻りさせる方法であって、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の分子に表面を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４８】
表面が、カテーテルまたはステントなどの埋め込み型装置の表面である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子で少なくとも部分的に被覆された埋め込み型装置。
【請求項５０】
新しい阻害および／または検出化合物を求めてスクリーニングする方法であって、
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つのタンパク質において同定する段階、
ｂ）構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定したタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された分子を段階ａ）のタンパク質に接触させる段階ならびに
ｄ）前記タンパク質の機能および／または凝集を評価する段階
を含む、前記方法。
【請求項５１】
段階ａ）のタンパク質が、阻害化合物に対する既知の標的ではない、請求項５０に記載の方法を含む、阻害化合物に対する新しい標的を同定する方法。
【請求項５２】
少なくとも１つのタンパク質が、病原生物のタンパク質であり、段階ｄ）における前記タンパク質の機能および／または凝集を評価することが、前記病原生物の生存、繁殖および／または増殖を評価することにより実行される、新しい抗病原体化合物を求めてスクリーニングする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
段階ａ）において同定された４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域が、病原生物の１つよりも多いタンパク質に存在する、請求項５２に記載の方法を含む、新しい抗病原体化合物を同定する方法。
【請求項５４】
４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域が、１つよりも多い病原生物の少なくとも１つのタンパク質に存在する、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の方法を含む、新しい抗病原体化合物を同定する方法。
【請求項５５】
試料中のタンパク質を検出する方法であって、
ａ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは検出されるタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に、前記タンパク質を含有すると疑われる試料を接触させる段階、
ｂ）前記タンパク質と反応した分子の存在を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項５６】
検出されるタンパク質に天然に存在する少なくとも１つのＹｉが、前記試料中の前記タンパク質にしか含まれない、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記分子が検出可能な標識を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
段階ｂ）における検出が、検出可能な標識の検出による、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
段階ｂ）における検出に先立って、タンパク質と反応した分子とタンパク質と反応していない分子の、または分子と反応したタンパク質と分子と反応していないタンパク質の分離をさらに含む、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
検出が、直接的であるまたは間接的である、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
タンパク質と反応した分子の存在を検出することが、前記タンパク質の検出により実行される、請求項５５から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
検出が定性的、半定量的または定量的である、請求項５５から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
試料が対象由来、特に動物または植物対象由来、さらに特定すると哺乳動物対象由来、もっとも特定するとヒト対象由来である、請求項５５から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
試料が生物由来ではない、請求項５５から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量が疾患状態を示す、請求項５５から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
タンパク質が、ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αから選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量を状態と相互に関連付ける段階ｃ）をさらに含む、請求項５５から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量を対象における疾患状態と相互に関連付ける段階ｃ）をさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６９】
疾患状態の診断に使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ａ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは前記疾患状態の指標であるタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子。
【請求項７０】
植物または植物細胞または植物種子中のタンパク質の生物学的機能を下方調節するための方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは植物、植物細胞または植物種子中のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の分子に前記タンパク質を接触させることを含む前記方法。
【請求項７１】
分子が、組換えベクター上に存在するヌクレオチド配列であって、植物細胞、植物種子または植物に導入されると、前記植物細胞、植物種子または植物においてポリペプチドを産生する前記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の分子または請求項２６に記載のベクターおよびバッファーを含むキット。
【請求項７３】
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも２つの分子を含む固体支持体。
【請求項７４】
分子がリンカーを通じて固体支持体に連結されている、請求項７３に記載の固体支持体。
【請求項７５】
少なくとも２つの分子が少なくとも２つの異なる分子である、請求項７３または７４に記載の固体支持体。
【請求項７６】
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する少なくとも１つの分子
ならびに農学的に許容される担体
を含む、農薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、機能的ペプチドの分野に、さらに特定すると制御されたタンパク質凝集の分野に属する。本発明は、特許請求の範囲において定義されるペプチド構造の分子ならびに治療的適用のためおよび診断用に、さらに農業バイオ分野においてと工業バイオテクノロジーにおいてなどの他の適用においてそのような分子を使用する方法を開示する。前記分子は、細菌性、真菌性およびウイルス性疾患などの感染を治癒させるおよび／または安定化するために使用することが可能であるが、非感染性のヒトおよび動物疾患においても有用である。前記分子は、タンパク質バイオマーカーの検出のためおよび種々の疾患の予後と診断のためにも使用することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質凝集は、タンパク質がミスフォールディングの後に凝集反応を起こし、不溶性の凝集塊となることにより引き起こされる。タンパク質凝集は、基本的に、多くの同一タンパク質分子が難溶性の高次の集合体を形成し、最終的に沈殿する自己会合過程である。そのこの集合体は一般に、巨視的形態に基づいて、秩序凝集体または無秩序凝集体のどちらかに分類される。生理的条件下では、ほとんどどんなタンパク質も高濃度で誘導されて不定形凝集体を形成することができるが、同じ条件下で、はるかに小さい組のタンパク質は高秩序のβシートが豊富なアミロイド繊維を形成する。しかし、顕微鏡レベルでは、これらの２種類の凝集体間の区別はさらに微妙である。不定形凝集体は、非特異的な疎水性接触を通じて互いに粘着するミスフォールドされたタンパク質のクラスターというだけではない。むしろ、それらはクロスβ構造も豊富にあることが多く、その形成傾向は疎水性とだけではなく二次構造傾向および電荷とも相互に関連し、特定の形成機構を示唆している（Ｃｈｉｔｉら、ＰＮＡＳ  ９９：１６４１９−１６４２６頁（２００２）；Ｃｈｉｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：８０５−８０８頁（２００３）；Ｃｈｉｔｉら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：１３７−１４３頁（２００２））。一方では、天然様スペクトル特性および酵素活性まで保持している不定形凝集体と繊維の両方が報告されているので、報告されている凝集体と繊維がすべてβ構造が豊富にあるというわけではない。これらの場合、凝集は、タンパク質ダイマーにおいてよく見られるように、三次元ドメイン交換などのオリゴマー形成の他の機構により起こることが提唱されている（Ｒｏｕｓｓｅａｕら、ＰＮＡＳ  ９８：５５９６−５６０１頁、２００１；ＬｉｕおよびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １１：１２８５−１２９９頁、２００２）。タンパク質凝集への重点的取組みは大半が、広範なヒト疾患が１つまたは極めて限られた数のタンパク質で構成されたタンパク質沈着物に特徴付けられているという知見に影響されている。
【０００３】
正常な可溶性タンパク質の立体構造的に変化した不溶性タンパク質への変換が原因として関連性があることが知られているような疾患の例は、例えば、アルツハイマー病および脳アミロイド血管症におけるアミロイドベータペプチド、パーキンソン病のレビー小体におけるαシヌクレイン沈着物、クロイツフェルト−ヤコブ病におけるプリオン、筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼならびに前頭側頭型認知症およびピック病における神経原線維変化のタウの出現である。今までのところ、タンパク質凝集は主に、好ましからざる病因性現象として研究されてきたのであり、クロスβ媒介凝集がもっとも頻繁に起こる生物学的に関連のある凝集機構であることが現在広く受け入れられている。タンパク質凝集は非特異的疎水性相互作用により媒介される秩序のない過程であると長い間見なされてきたが、特にアミロイド凝集は多くの例で基本的に特異的自己会合過程であることは今や明らかである。インビトロでもインビボでも形成される凝集体は一般に、１つの特定のタンパク質が豊富にあり、凝集はインビトロでの自発的過程であるが、細胞環境ではこの過程はシャペロンにより活発に制御されている。ミスフォールドされたタンパク質が凝集するもっとも一般的な機構は、同一タンパク質由来の特定のポリペプチドセグメントが自己会合して成長していく分子間ベータシートになることにある（例えば、Ｍａｋｉｎら、ＰＮＡＳ  １０２（２）：３１５−２０頁（２００５）；Ｓａｗａｙａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４７（７１４３）：４５３−７頁（２００７））。これらの凝集核形成セグメントは一般に短く、５−１５残基からなり、利用可能な生物物理学アルゴリズムを使用して正確に予想することが可能である。個々の鎖が相互作用して分子間ベータシートを形成し、この構造が凝集体の骨格を形成することを示すデータが現在豊富に存在する。凝集する配列は球状タンパク質ではごくありふれており、α、β、α＋βおよびα／βタンパク質中にほぼ同じ頻度で存在する（ＳＣＯＰ分類：Ｌｏ  Ｃｏｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２５７−２５９頁（２０００））（Ｌｉｎｄｉｎｇら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：３４５−３５３頁（２００４））。凝集するタンパク質から凝集核形成セグメントを非凝集タンパク質に移植すると、凝集傾向と凝集体構造の両方が前者から後者に移されることを実証する移植実験により明らかにされているように、これらの短い凝集を起こしやすいストレッチだけでタンパク質の凝集を誘導するのに十分である（Ｅｓｔｅｒａｓ−Ｃｈｏｐｏら、ＰＮＡＳ  １０２：１６６７２−１６６７７頁、２００５）。
【０００４】
凝集感受性タンパク質配列は球状タンパク質構造の存在と交換に支払われる代償であり、三次側鎖相互作用は主に疎水性コアで起こるので、この領域にまたがるタンパク質ストレッチは一般に凝集する傾向があると考えることができる。しかし、天然の球状タンパク質では、凝集を起こしやすいタンパク質ストレッチは一般にタンパク質構造により隔離されておりそれによって自己会合から保護されているので、凝集は一般に問題ではない。一方、タンパク質翻訳とフォールディングの間または細胞ストレスもしくは不安定化変異の場合、部分的にアンフォールドされた状態は自己会合して凝集およびアミロイドーシスを誘導する可能性がはるかに高くなる。
【０００５】
大半のタンパク質はこれらの一次構造内に凝集を起こしやすいペプチド配列を宿しているので、また凝集は配列特異的であるので、選ばれた標的タンパク質の凝集の特異的誘導のための一般的戦略を開発するのは可能であることが以前首尾よく明らかにされた（ＷＯ２００７０７１７８９参照）。後者の方法では、標的タンパク質は、短い標的特異的凝集を起こしやすいペプチド（すなわち、選ばれた標的タンパク質由来のベータ凝集領域；驚くべきことに、タンパク質から取られた短い凝集核形成領域に曝露されるだけで凝集の十分な条件になることが実証された。）を示している担体に曝露された。この担体（可溶化部分と命名される、例えば、ＷＯ２００７０７１７８９の図１およびその説明文参照）は、この領域が標的に曝露される前にβ凝集領域の凝集を防ぐのに、したがって、その安定性にも不可欠であった。
【０００６】
担体または可溶化部分が溶解しているままであることを必要とせずそれでも共凝集によりタンパク質の機能を首尾よく阻害する改良されたインターフェラー分子をさらに提供することが有利だと考えられる。そのような分子の方が合成も産生も簡単だと考えられる。さらに、分子が一方ではそれ自体として可溶性のままであり、一方では標的タンパク質の凝集を誘導することができることを可能にする構造決定因子を正確に定義することが有利だと考えられる。その上、安定な分子間ベータ凝集体形成を都合の良い動力学で誘導することができる分子は、診断および治療適用（「赤」バイオテクノロジー）にならびに農業バイオテク適用（「緑」バイオテクノロジー）、海洋性および淡水性生物への適用（「青」バイオテクノロジー）、工業（「白」）バイオテクノロジーにおいてまたは研究使用に極めて有用である可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７１７８９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｉｔｉら、ＰＮＡＳ  ９９：１６４１９−１６４２６頁（２００２）
【非特許文献２】Ｃｈｉｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：８０５−８０８頁（２００３）
【非特許文献３】Ｃｈｉｔｉら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：１３７−１４３頁（２００２）
【非特許文献４】Ｒｏｕｓｓｅａｕら、ＰＮＡＳ  ９８：５５９６−５６０１頁、２００１
【非特許文献５】ＬｉｕおよびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １１：１２８５−１２９９頁、２００２
【非特許文献６】Ｍａｋｉｎら、ＰＮＡＳ  １０２（２）：３１５−２０頁（２００５）
【非特許文献７】Ｓａｗａｙａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４７（７１４３）：４５３−７頁（２００７）
【非特許文献８】Ｌｏ  Ｃｏｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２５７−２５９頁（２０００）
【非特許文献９】Ｌｉｎｄｉｎｇら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：３４５−３５３頁（２００４）
【非特許文献１０】Ｅｓｔｅｒａｓ−Ｃｈｏｐｏら、ＰＮＡＳ  １０２：１６６７２−１６６７７頁、２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、接触すると選択されたタンパク質の凝集を引き起こすための改良された分子（本明細書ではインターフェラー分子とさらに命名される。）を提供する。これらの改良されたインターフェラー分子はそれ以上可溶化部分の存在を必要とせず、同時に安定な特性を保持し（すなわち、早発凝集を防ぐため）、それでも標的タンパク質との共凝集を引き起こすことができる。早発凝集では、前記分子は、標的タンパク質の凝集または阻害を達成することができないような形でそれら自体と凝集することを意味する。驚くべきことに、ベータシート形成ポテンシャルが低い配列または残基（すなわち、凝集破壊残基）が隣接する凝集誘導配列の方が可溶性であるだけでなく、同時に極めて効率的で特異的でもある凝集誘導特性をも保持していることが見出された。本明細書に記載された分子は、１つよりも多い凝集誘導領域を有することがあり、次にこれらの領域はそれぞれに凝集破壊残基が隣接しており、もっとも特定すると凝集誘導領域はリンカーにより分離されている。標的にされたタンパク質が生物学的に活性であるまたは機能的である場合、凝集を誘導すると典型的に前記タンパク質は機能的に阻害されることになる。添付されている実施例から明らかになるように、本発明の改良されたインターフェラーは、重要な治療および診断適用ならびに農業バイオ、白バイオテクにおいておよび研究ツールとしての適用を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、第一の態様によれば、次の構造、
（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子が提供される。
【００１１】
特にｎ＝１である分子では、追加の制限が適用されることがある。例えば、ｎが１である分子について想定される一組の制限は以下の通りである、
−Ｘ１およびＸ２は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個または２個のアミノ酸であり、
−Ｙ１は一続きの６個から１１個の連続するアミノ酸であり、
−その少なくとも７５％は疎水性アミノ酸であり、
−前記アミノ酸の少なくとも５０％は脂肪族またはＦ残基であり、
−Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＨ残基は存在せず、
−Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、ＡまたはＴ残基は１個以下存在し、
−ＹまたはＦ残基は３個以下存在し、
−２個の連続する同一の非脂肪族残基は存在せず、
−連続する同一の脂肪族残基は２個以下存在し、
−２個の連続する非芳香族極性残基は存在せず、
−同一の残基は５０％以下存在し、
−最初のおよび／または最後の残基は脂肪族またはＦ残基であり、
−ＡおよびＧ残基の合計は２個以下であり、
−Ａ、ＧおよびＳ残基の総割合は２５％以下であり、
−Ｃ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷ残基の総割合は２５％以下であり、
−Ｖ以外の小残基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｔから選択される）の総割合は２５％以下である。
【００１２】
Ｚｉは個々のＸ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ単位間のリンカーであり、Ｚｎは前記分子の一端部の任意リンカーであるので、式（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎは式（Ｚｉ−Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ）ｎ［式中、Ｚ２からＺｎはそれぞれリンカーであり、Ｚ１はリンカーまたは非存在から独立して選択される］と同等であることは当業者であれば理解する。Ｚｎ（または同等のＮ−末端Ｚ１）は非存在であると記述する代わりに、この部分は存在しない、すなわち、Ｚｎはリンカーであるまたは存在しない（または略さなければ、Ｚｉはそれぞれ独立して選択されるリンカーであり、Ｚｎ（もしくは同等のＮ−末端Ｚ１）はリンカーであるもしくは存在しない）と言うこともできる。
【００１３】
したがって、代わりの式は、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ）ｎであり、Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉ、Ｙｉ、ｉならびにｎは上で定義された通りであり、ｎ単位は独立して選択されるリンカーと互いに融合されている、とすることもできる。前記分子は追加のリンカーをＮ−および／またはＣ−末端にさらに含むこともある。この式によれば、リンカーはｉ番目の単位のＸ２ｉ部分とそれに続く（ｉ＋１）番目の単位のＸ２ｉ−１部分間に存在し、前記分子には全部で（ｎ−１）個のリンカーが存在し（すなわち、ＺｉからＺｎ−１またはＺ２からＺｎ）、最後のリンカー（それぞれＺｎまたはＺ１）はリンカーであるまたは存在しない。前記式を言い換えるさらに別の形は、Ｚ０−（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉ、Ｙｉ、ｉならびにｎは上で定義された通りであり、Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚ０とＺｎの両方はリンカーまたは非存在から独立して選択される（すなわち、前記分子はＣ−もしくはＮ−末端リンカー、なしまたは両方を有する。）］である。
【００１４】
前記分子は典型的に上記の構造からなるが、分子は基本的にその構造からなることも想定されている。これは、特定の実施形態によれば、前記分子は、追加のアミノ酸、特に１個から１０個のアミノ酸、さらに特定すると１個から５個のアミノ酸をＮ−またはＣ−末端に含有することができる（すなわち、追加のアミノ酸にＮ−またはＣ−末端融合している）ことを意味する。そのような追加のアミノ酸は、ｎが少なくとも２である実施形態で特に想定されている。前記追加のアミノ酸は特定のプロファイルを特に有していない、すなわち、Ｙｉ部分（単数または複数）などの疎水性ストレッチではない、言い換えると、前記追加のアミノ酸は５０％未満の疎水性残基を含有するまたは前記追加のアミノ酸は番号が付けられたＸ部分を構成する残基から選択されるだけではない。しかし、いくつかの例では、特にＸ部分が荷電アミノ酸を含有しない場合は、これには１個または２個の疎水性アミノ酸が追加的に隣接している（Ｙ部分に隣接していないＸ部分の側に）ことが想定されている。これは特に、（非荷電）Ｘ部分および疎水性アミノ酸が、タンパク質中のＹｉ部分と一致する配列に隣接しているタンパク質配列と同一である、言い換えると、タンパク質配列に配列が一致する前記分子中の一部がＹｉ部分に加えて少なくとも１つのＸ部分を含む場合に当てはまる。しかし、もっとも特定すると、前記分子は、Ｎ−末端もＣ−末端もＸ部分で終わる。
【００１５】
上述のように、上記の式ではｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加する。言い換えると、ｉは１で始まって、ｎに達するまで繰り返されるごとに１ずつ増加していくまたはｉは繰り返し数であり（１からｎまでの整数である）。
【００１６】
したがって、前記式は次の構造、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１（すなわち、ｎ＝１）、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２（すなわち、ｎ＝２）、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｘ６−Ｚ３（すなわち、ｎ＝３）、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｘ６−Ｚ３−Ｘ７−Ｙ４−Ｘ８−Ｚ４（すなわち、ｎ＝４）および
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｘ６−Ｚ３−Ｘ７−Ｙ４−Ｘ８−Ｚ４−Ｘ９−Ｙ５−Ｘ１０−Ｚ５（すなわち、ｎ＝５）［式中、番号が付けられたＸ、ＹおよびＺはそれぞれ上で定義された通りである］を包含している。
【００１７】
前記分子は線形であることに留意すべきであり、念のために、前記Ｙｉ部分は標的にされるタンパク質に接触させることが可能である。枝分かれした線形分子（少なくとも２つの繰り返しＸ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ単位はリンカーを通じて別のＸ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ単位に独立して結合されている。）および環状分子は、前記Ｙｉ部分が他の分子に到達できる限りにおいてのみ想定されている。
【００１８】
上記式中のＹｉは凝集誘導配列であり、これはベータ凝集誘導配列であることを意味する。もっとも特定すると、前記配列は非アミロイドベータ凝集配列である（不定形ベータ凝集配列と呼ばれることもある）。アミロイドと非アミロイドベータ凝集は、高次構造の点で、凝集動力学の点でおよび凝集に適したタンパク質配列の点で異なる（Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１１８−１２６頁、２００６）。実際、アミノ酸選好は、不定形クロスβ凝集体よりもアミロイド繊維においての方がはるかに位置特異的になる。例えば、アミロイドヘキサペプチドでは、いくつかのアミノ酸型のみが高次アミロイド構造に適合性であるために、３位および４位は極端に選択的である。一方、ほとんどどんな残基型もアミロイド形成を可能にするために、１位、２位および６位ははるかに許容性である（Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｐａｚら、ＰＮＡＳ  １０１：８７−９２頁、２００４）。これとは対照的に、配列全体がβ伸長立体構造になる十分な傾向を有し、十分に疎水性であるおよび／または電荷が中性である限り、ほとんどどんな残基もβ凝集が起こるヘキサペプチドのどの位置にでも収容することが可能である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｃａｍｉｌｌａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１３０２−１３０６頁、２００４）。したがって、アミロイド形成配列の方がβ凝集配列よりも位置特異的であるが、極性および荷電残基に許容性でもある。このことは、両方の過程の動力学に影響を及ぼすことにもなる。その厳密性が低い立体構造上の必要条件のせいで、β凝集は一般にアミロイドーシスよりもはるかに速い。しかし、高次クロスβアミロイド構造に適合する配列と不定形クロスβ凝集体を形成する配列を分けるのはきわどい境界線しかないことに留意されたい（Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｐａｚら、ＰＮＡＳ  １０１：８７−９２頁、２００４；Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１１８−１２６頁、２００６）。本明細書では不定形凝集が主に想定されているが、一部の設定におけるように、アミロイド凝集は望ましくなく（したがって、排除すべきである）、多くの適用では、凝集体の性質は問題ではない。したがって、アミロイド凝集体も想定されている。
【００１９】
極性および荷電残基への制約を考慮して、上で定義された配列は、高いベータ凝集傾向（これは、例えば、ＴＡＮＧＯ、Ｚｙｇｇｒｅｇａｔｏｒ、等などのアルゴリズムを使用して決定することができる。）、特に非アミロイドベータ凝集傾向を有することが見出された。
【００２０】
本明細書に記載された分子に特異的であるのは、凝集誘導配列（高いベータシート形成ポテンシャルを有する）に、ベータシート形成ポテンシャルが低いまたは「破壊」ベータシート、いわゆるゲートキーパー残基さえ有する残基が隣接していることである。前記式中には番号が付けられたＸ部分がある。驚くべきことに、そのような特定の残基により境界を定められている凝集誘導配列はそのようなゲートキーパーが隣接していない配列よりも可溶性であるだけでなく、同時に極めて優れた特異的凝集誘導特性をも保持していることが見出された。タンパク質中では凝集を防ぐために疎水性配列が極性または荷電残基で分散していると一般に考えられているので、とりわけ後者は驚異である。本明細書に記載された分子では、隣接ゲートキーパーは、いわば、凝集誘導配列が対象のタンパク質に適切に提示されることを保証している。特定の機構に縛られることなく、これは、ゲートキーパー残基と対象のタンパク質間の安定に寄与する相互作用（例えば、水素結合または電荷相補性）により助けられている可能性がある。これにより、相互作用の特異性も増加することがある。凝集傾向は環境により一部決定され、上に収載された特性は特に生理的条件下で、例えば、生理的ｐＨ範囲で想定されていることに留意されたい。例えば、タンパク質の検出は非生理的条件下で起こり得るように、これは、前記方法は生理的条件に制限されているということを含意しない。
【００２１】
Ｘ２ｉ−１とＸ２ｉは、１個から４個の独立して選択される特定のアミノ酸、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱの連続するストレッチである。これらのアミノ酸はすべて使用することが可能であるが、疎水性Ｙｉストレッチにはまれにしか存在しないまたは存在さえしない残基、特に荷電および／または非疎水性残基、特にＲ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＱおよびＧ（Ｇは典型的に疎水性残基と見なされているが、側鎖がなくそのサイズが小さいことはＧが特にベータシート凝集に有利に働くわけではないことを意味する点に留意されたい。）、さらに特定するとＲ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、ＰおよびＨ（すなわち、Ｈまたはプロリンを含む荷電残基）、さらに特定するとＲ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰ（すなわち、荷電残基またはプロリン、プロリンはその特定の側鎖のせいでねじれを誘導し、良好な破壊ペプチドである。）、もっとも特定するとＲ、ＫおよびＰ（正の残基またはプロリン）またはＲおよびＰ（非疎水性正の残基またはプロリン）を使用する場合に、もっともよい結果が得られる。代わりに、Ｒ、ＤおよびＰはゲートキーパーとして想定されており、Ｒは（疎水性）Ｋよりもかさばった非疎水性残基であり、したがってベータシート形成により破壊的である。Ｄの方が小さいが、その電荷はペプチドまたはタンパク質の骨格により近く無効にするのはより困難である。非常に特定の実施形態によれば、もっとも特定するとｎが１の場合、Ｋはゲートキーパーとして想定されておらず、したがって、Ｘ部分のアミノ酸はＲ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱまたはこれらのサブセットから選択される。
【００２２】
さらに説明することになるが、ｎ＝１の実施形態では、追加の制限が前記分子に適用されることがある。これは、これらの分子が非機能的であるからではなく、むしろ先行技術が、ここに記載されたのと同じ一般構造を有するペプチドの性質の分子を（異なる目的で）既に記載している可能性があるからである。発明を実施するための形態において記載されているように、制限は特に特定の部分において想定される残基の長さおよび性質に関するものである。これらのより厳格な制限は典型的にｎ＝１の場合の分子について必要になるだけであるが、これらの制限はｎ＝２（またはさらに高いｎ）でも想定されている。
【００２３】
特定の実施形態によれば、Ｘ２ｉ−１とＸ２ｉはそれぞれ、１個または２個のアミノ酸である。残基は凝集配列から離れているほど前記分子を溶解させておくのに果たしている役割は小さくなる。別のしかし排他的ではない実施形態によれば、Ｘ２ｉ−１とＸ２ｉはそれぞれ２以下の全電荷を有する。代わりに、両方のＸ部分のアミノ酸の全数は５個以下、特に４個以下である。代わりの実施形態は、疎水性Ｙ領域を取り囲む両方のＸ部分の全電荷は５未満、特に４以下であることを提供する。この段落の実施形態は、もっとも特定するとｎが１である分子またはｎが２である分子について想定されている。
【００２４】
本明細書の前記式中に記載されたＹｉは、ベータ凝集配列である。さらに特定すると、Ｙｉは、４個から１７個、特に４個から１６個または４個から１５個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択される、前記連続するアミノ酸の独立して選択されるストレッチである。特に、前記配列中にはＰ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない。しかし、極めて特定の実施形態によれば、正味電荷がゼロである限り（すなわち、それらの電荷が正反対であれば）、Ｒ、Ｋ、ＤおよびＥから選択される２個の残基が存在することもある。疎水性ストレッチではＲよりもＫの方が想定されているので、Ｋ、ＤおよびＥから選択される２個の残基がＹｉ部分に存在することがある。これらの実施形態では電荷がゼロである必要があるので、これは、２個の荷電残基が存在し、そのうちの１個はＫ残基でもう一方はＤおよびＥ残基から選択されると述べることと同等である。追加の具体的な実施形態によれば、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤもしくはＥ残基のどれもＹｉ部分に存在せずまたは相補的電荷を有する２個の荷電残基が存在する（そのため正味電荷はゼロである）。
【００２５】
凝集配列の長さは典型的に、望ましい特異性、合成の容易さおよび対象のタンパク質の配列により影響されることになる。特定の実施形態によれば、少なくとも１つ、特にすべてのＹｉは、一続きの４個から１７個のアミノ酸、４個から１６個のアミノ酸、４個から１５個のアミノ酸、４個から１４個のアミノ酸、４個から１３個のアミノ酸、特に４個から１１個のアミノ酸、４個から１０個のアミノ酸、４個から９個のアミノ酸または４個から８個のアミノ酸である。追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチの長さは少なくとも５個のアミノ酸である。したがって、少なくとも１つ、特にすべてのＹｉは、一続きの５個から１３個のアミノ酸、特に５個から１１個のアミノ酸、５個から１０個のアミノ酸、５個から９個のアミノ酸または５個から８個のアミノ酸である。追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチの長さは少なくとも６個のアミノ酸である。したがって、少なくとも１つ、特にすべてのＹｉは、一続きの６個から１３個のアミノ酸、特に６個から１１個のアミノ酸、６個から１０個のアミノ酸、６個から９個のアミノ酸または６個から８個のアミノ酸である。もっとも特定すると、少なくとも１つ、特にすべてのＹｉは、一続きの６個または７個のアミノ酸である。１６個のアミノ酸よりも短いそのようなストレッチは、ｎが１である実施形態において特に想定されている。１６個のアミノ酸より長いストレッチ（例えば、２０個のアミノ酸まで）は可能であるが、対象のタンパク質に対し特異性を加えることはほとんどなく（図２参照）、合成の難しさおよび経費を増加させならびに前記分子の可溶性を減少させることに留意されたい。合成および取扱いの容易さは、ｎが１または２である分子が本明細書において特に想定されている理由でもある。しかし、トランスジェニックアプローチではまたは前記分子が組換え的に産生される場合、長さははるかに（経費）制限要因ではなくなり、特にこれらのアプローチでは、もっと長い分子を用いて取り組むことも想定されている。
【００２６】
タンパク質を特に配列依存的な様式で特異的に下方調節することができる分子を提供することが目的である。したがって、具体的な態様によれば、分子中のＹｉのうちの少なくとも１つは、タンパク質に天然に存在する連続する一続きと同一である一続きの４個から１６個のアミノ酸である。追加の具体的な態様によれば、分子中の１つよりも多いＹｉでは、特に分子中の２つのＹｉまたは少なくとも２つのＹｉでは、もっとも特定すると、分子中のすべてのＹｉでは、このことが当てはまる。想定されている異なる長さもこの実施形態に適用される。
【００２７】
これは、非アミロイドベータ凝集が配列特異的であるという驚くべき所見に依存している。実際、アミロイド凝集に反して、配列全体がβ伸長立体構造になる十分な傾向を有し、十分に疎水性であるおよび／または電荷が中性である限り、ほとんどどんな残基もβ凝集が起こるどの位置にでも収容することが可能であるので、不定形ベータ凝集は配列特異的ではなく、疎水性および水素結合相互作用に依拠していたことが一般的に受け入れられていた。驚くべきことに、複雑な混合物におけるタンパク質の特異的凝集（阻害および／または検出）のためにその配列を使用することができる限り、所与の配列の凝集傾向は、別の疎水性配列を用いるより同一配列ストレッチを用いる方がはるかに高い。
【００２８】
特定の実施形態によれば、タンパク質に天然に存在する前記少なくとも１つの一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸は、そのゲノム中に前記タンパク質がコードされている生物（または種）中の前記タンパク質にしか含まれない。言い換えると、前記配列は、前記生物／種のプロテオーム中の１つの他のタンパク質配列とのみ一致するまたは同一である。その結果、そのような分子が前記種の生物に投与されると、そのタンパク質だけが下方調節されることになる。
【００２９】
代わりの実施形態によれば、前記配列は必ずしも前記タンパク質にしか含まれないわけではないが、前記生物または種にしか含まれない。本明細書に記載された分子が１つより多い異なる種（例えば、微生物の混合物）に同時に投与され、１つの種においてしかタンパク質（複数可）が下方調節される必要がない場合（例えば、病原体種を標的にするが、有益な生物には干渉しない）は、このことが想定されることがある。追加の特定の実施形態によれば、前記配列は前記タンパク質にしか含まれず、前記生物／種にしか含まれない。
【００３０】
種の代わりに、上記の考慮すべき点は、生物の属、科、目または綱にも適用することができるが、配列保存および類のない配列を見出す可能性は分類学的階級が高くなるに従って減少する。
【００３１】
さらに他の代わりの実施形態によれば、タンパク質に天然に存在する前記少なくとも１つの一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸は、そのゲノム中に前記タンパク質がコードされている前記生物または種の１つよりも多いタンパク質中に存在している。すなわち前記配列は、前記生物／種のプロテオーム中の１つよりも多い他のタンパク質配列と一致するまたは同一である。これにより、１つよりも多いタンパク質を下方調節することが可能になる。さらに別の（非排他的な）代案は、前記配列ストレッチは１つよりも多い生物／種のタンパク質に存在することである。したがって、前記配列は、少なくとも２つの異なる生物／種のプロテオーム中の少なくとも１つの他のタンパク質配列と一致するまたは同一である。これにより、１つよりも多い生物におけるタンパク質の下方調節が可能になる。これは、交差反応性に（例えば、異なる種の対象において１つの分子の使用を可能にするために）有用になることが可能である。しかし、これは１つの分子のみを対象に投与しつつ（特に感染性の）生物においてタンパク質を同時下方調節するためにも特に想定されている。両方の組合せ、すなわち前記ストレッチは１つよりも多いタンパク質および１つよりも多い生物／種に存在する、も当然のことながら想定されている。ここで、種は生物の属、科、目または綱で置き換えることも可能である。
【００３２】
１つよりも多いタンパク質または１つよりも多い生物／種を標的にすることは、少なくとも２つのＹｉ領域であって、前記Ｙｉ領域の少なくとも２つが少なくとも２つの異なるタンパク質中のストレッチと一致するおよび／または少なくとも２つの異なる生物／種／等中のストレッチと一致するＹｉ領域を有する分子を使用して達成することも可能であることに留意すべきである。前記少なくとも２つのＹｉ領域は（それぞれ独立して）タンパク質もしくは生物にのみ含まれるまたは１つよりも多いタンパク質もしくは生物に存在することができる。
【００３３】
典型的に、タンパク質に天然に存在する一続きと同一であるＹｉストレッチは、前記タンパク質のストレッチと完全に同一になる。しかし、いくつかの例では、同一ではないが密接に関連している配列、すなわち１つまたは２つの置換を有する配列を使用できることが想定されている。特異性を維持するために、非保存的置換では、６個未満のアミノ酸のＹｉストレッチでは、１つのアミノ酸相違のみが許容されることが想定されている。少なくとも６個のアミノ酸（特に、少なくとも７個または少なくとも８個のアミノ酸）の配列では、１個または２個のアミノ酸を置換することができる。したがって、具体的な実施形態によれば、少なくとも１つのＹｉは、そのＹｉの長さが６個未満のアミノ酸である場合は天然に存在するタンパク質中のストレッチとは１つ以下のアミノ酸置換で異なりまたは少なくとも１つのＹｉは、そのＹｉの長さが少なくとも６個のアミノ酸である場合は天然に存在するタンパク質中のストレッチとは１つもしくは２つのアミノ酸置換で異なる。そのような例では、前記置換は典型的に対象のタンパク質に存在するストレッチと比較される（すなわち、前記Ｙｉストレッチは、１つ（または２つ）のアミノ酸置換を除いて対象のタンパク質に存在するストレッチと同一である。）。当業者であれば理解するように、（特に非保存的）置換を行うと特異性が変化する（すなわち、ストレッチを生物中の別のタンパク質のストレッチと同一にする）ことがあるので、変化したターゲティングが望ましくない場合はこうしたことが起きているのかどうかを確認するべきである。（いくつかの例では、１つよりも多いタンパク質を標的にするのが望ましいことがある、下記も参照。）確実に置換を行っても特異性がひどく失われることがないように、置換は前記Ｙｉ領域の１つまたは２つのみで行われるのが好ましい。具体的な実施形態によれば、置換されたアミノ酸を有するＹｉ領域が存在する場合は、置換が起きていない少なくとも１つの他のＹｉ領域が存在する。
【００３４】
特定の実施形態によれば、前記置換は、ゲートキーパー残基で、特にＲ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｑから選択される、さらに特定するとＲ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定するとＲ、ＫおよびＰ残基から選択される残基で行われる。
【００３５】
代わりの実施形態によれば、置換は保存的置換である。これは、タンパク質のファミリーを下方調節することが想定されており、タンパク質は、保存されているが同一ではない配列モチーフを共有している場合に想定される。そのような例では、これらの密接に関連しているタンパク質の凝集は、コンセンサス配列モチーフ（すなわち、類似しているが同一ではない配列であり、「類似している」は配列アライメントという文脈で使用されている）を使用して達成することができる。しかし、配列対応が１００％ではない場合の方が、凝集が効率的ではないことがあり得る。
【００３６】
さらに追加の代わりの実施形態によれば、置換は、凝集を増強するために、ベータシート傾向が相対的に低い残基とベータシート傾向がそれより高い残基の置換である。典型的に、チョウ−ファスマンＰ（ｂ−シート）スコアが１００未満である残基はＰ（ｂ−シート）スコアが１００を超える残基で置き換えることができる。
【００３７】
注目すべきことに、置換は常に同数の残基で行われ、欠失または挿入は特異的ベータ凝集を無効にすることになる。
【００３８】
具体的な実施形態によれば、ｎは１よりも多く（すなわち、２から５）、１つよりも多いＹｉ領域が分子中に存在することを意味する（少なくとも２、最大５）。タンパク質を標的にするために、そのタンパク質中のストレッチと同一のＹｉ領域が１つだけ前記分子中に存在する必要がある。追加のＹｉ領域は、例えば、合成凝集誘導配列でもよい。しかし、典型的にタンパク質を検出するまたは下方調節するための特定の実施形態によれば、ｎが１よりも多い場合、少なくとも２つ、特にすべてのＹｉは、タンパク質に天然に存在する一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸である。（ストレッチごとに独立して、上記考慮すべき点が適用される。）追加の特定の実施形態によれば、前記少なくとも２つのＹｉは同じタンパク質に存在する。このせいで、タンパク質を凝集させる可能性が増加する。追加の特定の実施形態によれば、前記少なくとも２つのＹｉは部分的に重複している。対象のタンパク質が分子のＹｉ領域の基準を満たす長いストレッチを有する場合、これが当てはまることがある。この場合、分子の１つのＹｉはタンパク質中のストレッチの一部と一致しており、別のＹｉは同じストレッチの別の部分的に重複している一部と一致することがある。さらに追加の特定の実施形態によれば、前記少なくとも２つのＹｉは同一である。したがって、２つのＹｉ領域が同じタンパク質中のストレッチと一致する場合、前記２つの領域は同一であっても異なっていてもよい。
【００３９】
しかし、代わりの実施形態では、前記少なくとも２つのＹｉを使用して１つよりも多いタンパク質のターゲティングを達成することができることが想定されている。したがって、これらの実施形態では、前記少なくとも２つのＹｉは（少なくとも２つの）異なるタンパク質に由来する、すなわちその長さにわたって前記少なくとも２つのＹｉの配列は少なくとも２つの異なるタンパク質配列と一致するまたは同一である。タンパク質の数はＹｉ領域の数と同じになることはできるが、当然のことながら、例えば４つのＹｉ領域を使用して２つの異なるタンパク質を標的にすることもあり得る。
【００４０】
同様に、代わりの実施形態によれば、前記少なくとも２つのＹｉを使用して１つよりも多い生物／種のターゲティングを達成することができる。したがって、これらの実施形態では、前記少なくとも２つのＹｉは（少なくとも２つの）異なる生物／種に由来し、すなわち前記少なくとも２つのＹｉの配列は、少なくとも２つの異なる生物／種のプロテオーム中の少なくとも１つの他のタンパク質配列と一致するまたは同一である。ここで、種は生物の属、科、目または綱で置き換えることも可能である。
【００４１】
上述のように、β凝集配列はアミロイド形成配列ほど極性特に荷電残基の存在に許容性ではない。したがって、具体的な実施形態では、少なくとも１つのＹｉ特に少なくとも２つのＹｉさらに特定するとそれぞれのＹｉの全電荷は１より高くない。追加の具体的な実施形態によれば、少なくとも１つのＹｉ特に少なくとも２つのＹｉさらに特定するとそれぞれのＹｉにおける荷電残基の数は１より多くない。しかし、もっとも特定すると、Ｙｉ部分の荷電残基またはプロリンの数はゼロである。
【００４２】
上記の式で概説したように、本明細書に記載された分子はリンカー部分、Ｚｉも含有する。特定の実施形態によれば、前記分子は内部リンカーのみを含有し、Ｎ−およびＣ−末端リンカーは含有しない。したがって、具体的な実施形態では、Ｚｎは非存在である（またはゼロ連結単位のリンカーである）。
【００４３】
リンカー部分の性質は本発明にとって重要ではないが、長く柔軟なリンカーは使用しない方が好ましい。特定の実施形態によれば、Ｚｉはそれぞれ、０から２０の一続きの同一または同一でない単位であって、アミノ酸、単糖、ヌクレオチドまたはモノマーである前記単位から独立して選択される。同一でない単位は、同じ性質の同一でない単位（例えば、異なるアミノ酸またはいくつかのコポリマー）であることが可能である。同一でない単位は、異なる性質の同一でない単位、例えば、アミノ酸とヌクレオチド単位を有するリンカーまたは２つ以上の異なるモノマー種を含むヘテロポリマー（コポリマー）であることも可能である。特定の実施形態によれば、少なくとも１つ、特にＺｎ以外のそれぞれのＺｉの長さは少なくとも１単位である。他の特定の実施形態によれば、Ｚｎは０単位である。特定の実施形態によれば、Ｚｎ以外のすべてのＺｉリンカーは同一である。追加の実施形態によれば、Ｚｉ部分はすべて同一である。
【００４４】
具体的な実施形態によれば、少なくとも１つ、特にすべてのＺｉは、同じ性質の０から１０単位、特に同じ性質の０から５単位である。特定の実施形態によれば、少なくとも１つのＺｉ部分、特にＺｎを除くすべてのＺｉ部分はペプチドまたはポリペプチドリンカーである。そのようなリンカーの特に想定されている配列には、ＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳが含まれるがこれらに限定されない。リンカーは化学的性質のものでも可能である。特に想定されている化学的リンカーには、ＰＥＧおよびＴｔｄｓ（ａｋａ４，７，１０−トリオキサトリデカン−１３−スクシンアミド酸）が含まれる。
【００４５】
典型的に、長いリンカーは使用されない。しかし、Ｙｉ部分が１つよりも多いタンパク質の凝集誘導領域と一致する特定の実施形態によれば、長いリンカーを使用することがあることが想定されている。実際、確実に前記分子が１つよりも多いタンパク質と（例えば、同時に）相互作用することができるようにするために、前記相互作用が立体障害のせいで妨げられないように、異なるターゲティングＹｉ部分間の距離を増加させることが有益になることもある。これらの例では、Ｚｉリンカーは、０から１００の一続きの同一もしくは同一でない単位であって、アミノ酸、単糖、ヌクレオチドもしくはモノマーである前記単位または０から９０、０から８０、０から７０、０から６０、０から５０、０から４０、０から３０または０から２０の前記単位であってもよい。特に、Ｚｉリンカーの最小長は少なくとも１単位、少なくとも２単位、少なくとも３単位、少なくとも４単位または少なくとも５単位である。
【００４６】
Ｙｉ部分が２つの異なるタンパク質の凝集領域と同一である場合は、前記分子は二重特異性と呼ばれる（３つのタンパク質では、三重特異性、など）。
【００４７】
具体的な実施形態によれば、本明細書に記載された分子の全長は６０個、５５個または５０個のアミノ酸を超えない。さらに特定すると、その長さは４０個のアミノ酸、３０個のアミノ酸、２５個のアミノ酸または２０個のアミノ酸さえ超えない。
【００４８】
特に想定されている分子は、ｎ＝１またはｎ＝２の分子、例えば、次の構造、Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１（すなわち、ｎは１）［式中、Ｘ１およびＸ２は全部で５個以下のアミノ酸であり、Ｙ１は一続きの４個から１０個のアミノ酸であり、Ｚ１は一続きの０単位である］およびＸ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２（すなわち、ｎは２）［式中、Ｚ１はリンカーであり、Ｚ２は非存在である］を有する分子である。
【００４９】
前記分子は他の部分をさらに含むことができる（またはこれにさらに融合させることができる）。分子は検出可能な標識をさらに含むことが特に想定されている。検出可能な標識は、Ｎ−もしくはＣ−末端でまたは内部でさえ前記分子に融合させることができる（例えば、リンカーを通してまたはリンカーは検出可能な標識として使用することができる。）。代わりに、検出可能な標識は、前記分子のＸ−Ｙ−Ｚ部分の１つ以上における１個以上の標識されたアミノ酸（例えば、蛍光的にまたは放射性的に標識されたアミノ酸）の使用を指すことができる。
【００５０】
タンパク質中の領域と同一であるＹｉ部分は前記タンパク質を特異的に標的にすることができるので（その配列が、そのゲノム中に前記タンパク質がコードされている生物中の前記タンパク質にしか含まれないという条件で）、その分子に結合させることができる別の部分は小分子または薬物であり、そのためこの小分子または薬物は、これを送達する必要がある適切なタンパク質、細胞内コンパートメント、細胞型などを標的にすることができる。これらの例では、Ｙｉ領域の少なくとも１つは、薬物または小分子を送達する必要がある場所に存在するタンパク質の配列と同一であることになる。
【００５１】
前記分子に結合させることができる別の部分は前記分子の可溶性を増加させる部分である。そのような部分は当技術分野で周知であり、例にはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）もしくはＰＥＧ誘導体、ペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインが含まれるがこれらに限定されない。当業者であれば決定することができるように、前記部分の性質は前記適用に依拠することになる。
【００５２】
Ｚｎが存在する実施形態では、検出可能な標識（または、可溶化タグのような他の部分）はＺｎリンカー部分に融合させることができることに留意されたい。（この表記は、タグがＣ−末端に付加されることを必然的に伴うと考えられるが、Ｎ−末端タグも想定されており、これは同等の表記（Ｚｉ−Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ）ｎ［式中、Ｚ２からＺｎはそれぞれリンカーであり、Ｚ１はタグが融合されているリンカーである］と一致する。）
【００５３】
他の部分が前記分子に融合されている例では、これらの部分は前記分子から取り除くことができることが特定の実施形態において想定されている。典型的には、これは特異的なプロテアーゼ切断部位を組み込むことまたは同等のアプローチを通じて実行されることになる。前記切断部位は別個に組み込まれてもよいし、外部Ｚｎリンカー（または前記部分がＮ−末端である場合は外部Ｚ１リンカー）の不可欠な一部であってもよい。極めて具体的な実施形態によれば、前記部分は内部Ｚｉリンカーの一部であってもよいし、Ｚｉリンカー全体でさえあってもよい。
【００５４】
多くの典型的適用では、本明細書に記載されたインターフェラー分子は、それ自体を使用するまたは添加することができる。しかし、極めて特定の態様によれば、これらの分子は前記分子をコードする核酸として提供されることが想定されている。言うまでもなく、これらの実施形態によるインターフェラー分子は、コードされることができる必要があるために、完全にポリペプチドの性質である。すなわちインターフェラー分子内に存在する番号が付けられたＸ、ＹおよびＺ部分はすべてポリペプチドの性質である。
【００５５】
したがって、これらの実施形態によれば、上記の構造、特に次の構造、
（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子をコードする（またはコードする配列を有する）核酸分子が提供される。
【００５６】
核酸配列は、必要な変更を加えれば、本明細書に記載されたすべての制限および変動を有する分子をコードすることが特に想定されている。したがって、コードされているポリペプチドは基本的に本明細書に記載された通りである、すなわちインターフェラー分子について記述されこの態様に適合する変動は、核酸配列によりコードされているポリペプチドの変動としても想定されている。例として、ＸまたはＹ部分の配列または長さを特定する実施形態は核酸にコードされていることと適合するが、Ｚ部分が非アミノ酸性質である実施形態は適合しない。
【００５７】
具体的な実施形態によれば、コードされているポリペプチド配列は天然に存在しないポリペプチドである。追加の特定の実施形態によれば、核酸分子は人工遺伝子である。核酸態様はもっとも特定するとトランスジェニック発現を利用する適用に適しているので、特に想定されている実施形態は、核酸分子（または人工遺伝子）が別の部分に、特に遺伝子産物の可溶性および／または安定性を増加させる部分をコードする追加の核酸に融合している実施形態である。実際、ペプチドのトランスジェニック発現は、その産物の急速な分解のせいで困難になることがある。
【００５８】
この態様において、本明細書に記載された分子をコードする（またはコードする配列を有する）ような核酸分子を含む組換えベクターも提供される。これらの組換えベクターは理想的に、対象の核酸配列を下方調節されるタンパク質が発現される細胞の内部に運び入れ前記細胞において核酸の発現を推進する媒介物として適している。組換えベクターは細胞内で別個の実体として（例えば、プラスミドまたはウイルスもしくは非ウイルス担体として）存続してもよいし、細胞のゲノムに組み入れられてもよい。
【００５９】
したがって、本明細書に記載された分子をコードする（またはコードする配列を有する）核酸分子を含むまたはそのようなインターフェラー分子をコードする核酸分子を含有する組換えベクターを含む細胞が本明細書で提供される。前記細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。後者の場合、細胞は酵母、藻類、植物または動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物またはヒト細胞）でもよい。特定の実施形態によれば、細胞は細胞株として提供される。
【００６０】
しかし、細胞は生物の一部（または、例えば、幹細胞）であってもよい。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載された分子をコードする（またはコードする配列を有する）核酸分子を含むまたはそのようなインターフェラー分子をコードする核酸分子を含有する組換えベクターを含む非ヒトトランスジェニック生物が提供される。前記生物は任意の生物（微生物を含む）でよい。トランスジェニック生物は非ヒト哺乳動物生物であることが特に想定されている。さらに他の代わりの実施形態によれば、トランスジェニックアプローチは、例えば疾患の動物モデルにおける標的確認のために非ヒト動物で使用される。これは、哺乳動物（例えば、トランスジェニックマウス）もしくは他の脊椎動物においてまたは非脊椎動物、例えば線虫（例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））もしくはショウジョウバエ（例えば、Ｄ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））においてでもよい。
【００６１】
代わりの特定の実施形態によれば、トランスジェニックアプローチ（すなわち、直接ポリペプチドとしての代わりに核酸にコードされているインターフェラー分子の提供）は植物において使用するのに特に適している。したがって、本明細書に記載された核酸分子、人工遺伝子または組換えベクターを含有する植物または植物細胞または植物種子が本明細書で提供される。または、本明細書で提供される細胞またはトランスジェニック生物は、植物、植物細胞もしくは植物種子である。
【００６２】
追加の態様によれば、本明細書に記載された分子は、タンパク質の機能を下方調節するまたは阻害するために使用することができる。典型的には、これはそのタンパク質の凝集を誘導することにより達成される。これらの実施形態によれば、タンパク質の機能を下方調節するための方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に前記タンパク質を接触させることを含む前記方法が提供される。
【００６３】
特に、ｎが１の分子では、追加の制限が適用されることがある。例えば、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、１個から４個ではなく１個または２個のアミノ酸であることが可能である。Ｘ１およびＸ２は、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅから選択してもよい。Ｙ１部分の長さは適合させ得る。
【００６４】
これらの制限のうち分子の下方調節をもたらすのに必要なものはないが、これらの制限は特にうまく働く実施形態を説明する。ｎが１の場合にタンパク質を下方調節する方法についても想定されている特定の制限は、Ｙ１が一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸であることである。別の特定の制限（これは、本明細書の大半の制限と同様に、組み合わせることができる。）は、Ｚ１がアミノ酸リンカーではないことである。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｚ１は非存在（すなわち、０単位のリンカー）である。
【００６５】
前記分子では、上記と同じ考慮すべき点および制限が適用される。特に、機能の下方調節が達成される限り、前述のように、タンパク質に存在するＹｉの１つまたは２つの置換は許容できることに留意すべきである。
【００６６】
追加の特定の実施形態によれば、疾患状況においてタンパク質を下方調節するためのまたは診断を下すためのこれらの方法が提供される。これは、これらの実施形態では、薬物または診断薬として使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり（またはｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し）、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１５個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子と言うのに等しい。
【００６７】
ここで、ｎが１である場合、Ｙ１は一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸であることも特に想定されている。さらに、ｎが１である場合、Ｚ１はアミノ酸リンカーではないことが特に想定されている。追加の実施形態によれば、Ｚ１は非存在である。
【００６８】
本明細書で使用されているように、方法と使用は交換可能である場合が多い、すなわち薬物として使用するための分子またはさらに特定すると、特定の疾患の治療において使用するための分子は、前記分子の使用（例えば、前記分子に接触させる）を含む疾患の治療のための方法と同等であり、疾患の治療を目的とする薬物の製造のための前記分子の使用と同等である。したがって、「第二医薬用途」クレーム、「治療法」クレームおよびいわゆる「スイス式」クレームは本明細書では交換可能的に使用され、それらのうちの１つが収載されている場合、残りのクレームも同様に含意している。
【００６９】
前記分子は薬物もしくは診断薬としてまたは治療もしくは診断方法において使用するために提供されるので、前記分子は医薬品として提供できることも想定されている。したがって、本明細書に記載された分子を含む医薬組成物が提供される。特に、前記医薬組成物は次の構造、
（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１５個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する少なくとも１つの分子
ならびに医薬として許容される担体を含む。
【００７０】
さらに特定すると、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１５個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きの４個から１５個の連続するアミノ酸であり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する少なくとも１つの分子
ならびに医薬として許容される担体
を含む、医薬組成物が提供される。
【００７１】
もっとも特定すると、前記医薬組成物では、前記分子のうちの少なくとも１つのＹｉが、前記組成物が投与されることになる対象において下方調節されるタンパク質に存在する。これは、このタンパク質がその対象のゲノム中にコードされていることを含意しないことに留意されたい。実際、感染に罹っている対象では、感染性生物のタンパク質を標的にするが対象のタンパク質それ自体は標的にしない分子が投与されることが想定されている。
【００７２】
特定の実施形態によれば、前記分子は凍結乾燥した形態で生理バッファーと一緒に提供することができる。特定の実施形態によれば、前記医薬組成物は、液体の場合、生理的ｐＨ、特にｐＨ５から９の間、さらに特定するとｐＨ６からｐＨ８の間で提供される。
【００７３】
具体的な実施形態では、前記分子を使用して、疾患状況において下方調節される必要がある（１つ以上の）タンパク質を下方調節することができる。
【００７４】
したがって、疾患の治療または予防において使用するための、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり（またはｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し）、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が疾患に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【００７５】
前述のように、前記分子が疾患の治療または予防において使用するために提供されるとは、それを必要とする対象において疾患を治療するまたは予防する方法であって、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり（またはｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し）、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が疾患に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与することを含む前記方法が提供されると言うのに等しい。
【００７６】
これの別の同等な表現の仕方は、この構造を有する分子の使用は疾患の治療を目的とする薬物を製造するために提供される、である。
【００７７】
対象は、特に動物、さらに特定すると哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、マウス、ラット、サル、他の霊長類、など）、もっとも特定するとヒトである。
【００７８】
特に想定されている疾患には、癌、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および炎症が含まれるがこれらに限定されない。したがって、前記分子は、少なくとも１つのＹｉが、その発現または過剰発現がそれぞれ癌、ＡＭＤまたは炎症／炎症性疾患に関連するタンパク質に天然に存在する一続きである疾患の治療のために提供することができる（またはこれらの疾患を治療するための方法もしくはこれらの疾患の治療を目的とする薬物の製造のための分子の使用が提供される。）。
【００７９】
もっとも特定すると、癌において下方調節されるタンパク質はＶＥＧＦＲ−２またはＥＧＦＲである。もっとも特定すると、ＡＭＤにおいて下方調節されるタンパク質もＶＥＧＦＲ−２である。炎症性疾患において下方調節についてもっとも特定して想定されているタンパク質には、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βが含まれる。
【００８０】
追加の態様によれば、前記分子は感染性疾患における薬物として使用される。すなわち前記分子を使用して対象において感染を引き起こす生物、すなわちウイルス、細菌、真菌またはマダニ、ダニ、線虫、扁虫、等などの大寄生生物のような生物においてタンパク質の機能を下方調節する。したがって、抗病原体化合物として使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、病原生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【００８１】
これは、それを必要とする対象において病原体感染を予防するまたは治療する方法であって、
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、病原生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与すること
を含む前記方法が提供されると言うのに等しい。
【００８２】
別の同等の表現法は、この構造を有する分子の使用は、病原生物の感染を治療することを目的とする薬物を製造するために提供される、である。
【００８３】
極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉ領域は、そのＹｉ領域の正味電荷がゼロである限り、正確に２個の荷電残基（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅから選択される）を含有していてもよい。しかし、さらに特定すると、Ｙｉ領域はいかなる荷電残基（またはついでに言えばプロリン）も含有しない。
【００８４】
病原体はウイルス生物であってもよい。したがって、抗ウイルス薬として使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、ウイルス生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【００８５】
これは、それを必要とする対象においてウイルス感染を予防するまたは治療する方法であって、
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、ウイルス生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与すること
を含む前記方法が提供されると言うのに等しい。
【００８６】
別の同等の表現法は、この構造を有する分子の使用は、ウイルス生物の感染を治療することを目的とする薬物を製造するために提供される、である。
【００８７】
特に、前記分子は抗微生物剤として使用される。したがって、抗微生物薬として使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり（またはｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し）、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【００８８】
これは、それを必要とする対象において微生物感染を予防するまたは治療する方法であって、
次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与すること
を含む前記方法が提供されると言うのに等しい。
【００８９】
別の同等の表現法は、この構造を有する分子の使用は、微生物の感染を治療することを目的とする薬物を製造するために提供される、である。
【００９０】
これらの方法の追加の段階には、病原生物、ウイルス生物または微生物の存在を評価すること（または測定すること）が含まれてもよい。
【００９１】
病原体が微生物である特定の実施形態によれば、微生物のタンパク質は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、マイコバクテリア、原生動物、古細菌、真菌（例えば、酵母およびカビ）から選択される微生物のタンパク質である。さらに特定すると、微生物のタンパク質は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、マイコバクテリアおよび真菌のタンパク質である。
【００９２】
特定の実施形態によれば、病原生物は薬物耐性生物、株またはバリアントである。したがって、病原生物のタンパク質は、薬物耐性生物、株またはバリアント由来のタンパク質である。実施例のセクションで示されるように、分子をこれらの生物に向けて投与すれば、それでもこれらの生物に効果を及ぼすことになる。
【００９３】
薬物耐性の特定の例は抗生物質耐性である。特定の実施形態によれば、微生物のタンパク質は、抗生物質耐性生物、株またはバリアント由来のタンパク質である。実施例のセクションで示されるように、分子をこれらの生物に向けて投与すれば、それでもこれらの生物に効果を及ぼすことになる。さらに特定すると、本明細書に記載された分子が少なくとも１０日間で一日少なくとも１回投与される投与方法が提供される。特に、この治療計画は抗生物質耐性の発生を伴うことはない。したがって、これらの実施形態は、この範囲にわたる時間内でのＭＩＣ値が４倍を超えて増加することはないし、２倍にもならないことを予測している。もっとも特定すると、長期投与中、特定の微生物についてのインターフェラー分子のＭＩＣ値は特定の微生物についてのインターフェラー分子の臨床ブレークポイントよりも低いままであることが想定されている。
【００９４】
具体的な実施形態によれば、前記分子を使用して病原生物（例えば、微生物）を死滅させることができるまたは前記方法により病原生物（例えば、微生物）が死滅させられる。さらに追加の具体的な実施形態によれば、前記分子は病原生物（例えば、微生物）を、特に１時間以内にまたは３０分以内に迅速に死滅させるのに成功する。代わりの実施形態によれば、前記分子を使用する方法は、病原生物（例えば、微生物）の増殖および／または繁殖を前記生物を死滅させることなく阻害する。この文脈でのウイルスも「生きた」生物と見なされ、例えば、ウイルス力価の減少はウイルス生物を死滅させることの指標であり、例えば、ウイルス力価の安定化は繁殖の阻害の指標である。
【００９５】
特定の実施形態によれば、病原生物／ウイルス生物／微生物のタンパク質は必須タンパク質である、すなわち前記生物は前記タンパク質が枯渇している場合、生存することができない。他の（非排他的な）特定の実施形態によれば、病原生物（例えば、微生物）のタンパク質はバイオフィルム形成に関与している。追加の実施形態によれば、病原生物（例えば、微生物）のタンパク質がバイオフィルム形成に関与している、バイオフィルム形成を治療するまたは予防する方法が提供される。さらに追加の実施形態によれば、バイオフィルム形成は物体、特にカテーテルまたはステントなどの埋め込み型装置上である。
【００９６】
したがって、これらの実施形態によれば、表面上での微生物バイオフィルム増殖を予防する、阻害するまたは逆戻りさせる方法であって、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは微生物のタンパク質に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に表面を接触させることを含む前記方法が提供される。
【００９７】
もっとも特定すると、微生物のタンパク質はバイオフィルム形成に関与するタンパク質である。バイオフィルム形成が予防される、阻害されるまたは逆戻りさせられる表面は、生物表面でも非生物表面でも可能である。特に想定されている表面は、カテーテルまたはステントの表面などの埋め込み型装置の表面である。
【００９８】
非生物表面に関して、本明細書に記載された分子で被覆された装置も本発明の範囲内に想定されている。装置の被覆は、直接分子を装置に塗ることにより実行される。代わりに、前記分子は（クロス）リンカーを使用して装置上に被覆することが可能である。装置は完全に被覆することができる（例えば、装置を前記分子の溶液に浸すことにより）または装置の一部だけを被覆することができる。装置は、微生物中に存在するタンパク質、特にバイオフィルム形成に関与するタンパク質に対する分子で被覆されることが特に想定されている。
【００９９】
したがって、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子で少なくとも部分的に被覆された埋め込み型装置が提供される。
【０１００】
追加の態様によれば、新しい化合物を求めてスクリーニングする方法が提供される。これらの化合物は本明細書に記載された分子であり、阻害化合物または検出における化合物として使用することができる。スクリーニング法は、
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つのタンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定したタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された分子を段階ａ）のタンパク質に接触させる段階ならびに
ｄ）前記タンパク質の機能および／または凝集を評価する段階
を含む。
【０１０１】
これらの方法は特定の利点を有する、すなわち、これらの方法は、生物のプロテオームのどのタンパク質でも使用してよいので、不偏のスクリーニングのために使用することができる。代わりに、前記方法は選択的スクリーニングのために、例えば新しい標的（すなわち、阻害化合物によりまだ標的にされていないタンパク質）を見出すために使用することができる。これらの実施形態によれば、段階ａ）のタンパク質は阻害化合物に対する既知の標的ではない。
【０１０２】
段階ｃ）において前記分子とタンパク質を接触させることは、例えば試験管またはプレートにおいて精製されたタンパク質を用いて、全くインビトロであってよい。しかし、前記方法は細胞系においても使用することができ、段階ｂ）において作製される分子は、例えば、前記分子を細胞株に添加することによりタンパク質に接触させることができる。前記分子をタンパク質に接触させることになる方法は、これが天然条件下でのまたはインビトロ条件下での前記タンパク質の利用能を決定することになるので、例えば前記タンパク質が存在している生物または細胞に依拠することになる。
【０１０３】
機能は、例えば適したレポーター読出しを使用して評価することができる。スクリーニングが阻害化合物ではなく検出化合物を求めるものである場合、前記化合物の存在または凝集を検出することは典型的に機能的なものではなく読出しになる。しかし、同じ化合物を阻害と検出の両方のために使用することができることが想定されている（例えば、実施例４参照）。
【０１０４】
これらの方法は改良された化合物を求めるスクリーニングのためにも使用することができる（新しい化合物を求めてスクリーニングするだけの代わりに）。例えば、阻害化合物が既知の場合、例えばＸ部分に使用される残基を変化させることにより、異なるリンカーを試すことにより、Ｙｉ部分を短くするまたは長くすることにより、などでこの化合物の変種をスクリーニングすることができる。
【０１０５】
抗病原体化合物を求めるスクリーニングでは（すなわち、段階ａ）におけるタンパク質が病原生物のタンパク質である）、接触は、とりわけ病原微生物では、前記分子を病原生物に添加するまたは投与することにより実行することが可能であることが特に想定されている。その上特に想定されているのは、前記少なくとも１つのタンパク質が病原生物のタンパク質である場合、段階ｄ）におけるタンパク質の機能および／または凝集を評価することは、前記病原生物の生存、繁殖および／または増殖を評価することにより実行してよいことである。
【０１０６】
ここでも、段階ａ）において同定された４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域は病原生物の１つよりも多いタンパク質に存在していてもよい。１つよりも多いタンパク質がこのようにして標的にされるので、これによりおそらく成功の機会は増加することになる。
【０１０７】
同様に、段階ａ）において同定された４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域は、１つよりも多い病原生物の少なくとも１つのタンパク質に存在していてもよい。これにより、例えば広域抗生物質に類似する同じ化合物を用いて１つよりも多い病原生物のターゲティングが可能になる。
【０１０８】
追加の態様によれば、新しい抗微生物化合物を求めてスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は、
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つの微生物タンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり（またはｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し）、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定した微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも１つの分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された少なくとも１つの分子を、そのゲノム中に段階ａ）のタンパク質がコードされている微生物に添加する段階ならびに
ｄ）微生物の生存および／または増殖もしくは繁殖を評価する段階
を含む。
【０１０９】
生存を評価する際に、ＭＩＣ値を決定することができる。抗微生物活性のある化合物を同定するために、すなわち分子をヒットとして分類するために、ＭＩＣは特に１００μｇ／ｍｌ未満であるべきである。
【０１１０】
抗微生物化合物の新しい標的を同定する方法を扱う実施形態では、段階ａ）における微生物タンパク質は、抗生物質の既知の標的ではないことが特に想定されている。このために、同定された化合物は、異なる標的に取り組むので、組合せ療法で特に有用になると考えられる。
【０１１１】
別の特定の利点は、スクリーニング法は、興味深い標的としての特定のタンパク質に対する選択バイアスなしで実施することができることである。実際、微生物の全プロテオームを解析することができ、適した配列を本明細書に記載された分子内に使用して有効性について試験することができる。これは新しい標的を生み出す高い見込みがある。さらに、そのような解析が実行される場合、段階ａ）において同定された領域はプロテオームにおいて１回よりも多く存在する領域であることが想定されている。さらに特定すると、段階ａ）において同定された４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域は微生物の１つよりも多いタンパク質に存在する。
【０１１２】
多くの例では、１つよりも多い微生物を標的にすることが望ましい（例えば、広域抗微生物薬）ので、段階ａ）において同定された４個から１５個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域は１つよりも多い微生物のタンパク質または少なくとも１つのタンパク質に存在することも保証することが可能である。
【０１１３】
もっとも特定すると、本明細書で標的にされる微生物は病原微生物である。有益な微生物（例えば、対象の腸管内菌叢における有益な微生物）は確実に死滅させないようにするため、微生物において同定されたストレッチが病原生物（複数可）に特異的であり有益な微生物に存在しないかどうかを確認することができる。
【０１１４】
追加の態様によれば、前記分子は検出においてまたは診断薬として使用される。したがって、検出および診断のための方法が提供される。したがって、試料中のタンパク質を検出する方法であって、
ａ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり（またはｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し）、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは検出されるタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の１つの（すなわち、少なくとも１つの）分子に、前記タンパク質を含有すると疑われる試料を接触させる段階、
ｂ）前記タンパク質と反応した分子の存在を検出する段階
を含む前記方法が提供される。
【０１１５】
試料はそれ自体として提供することができるまたは前処理することができる。検出は直接的でも間接的でも可能であり（すなわち、反応したまたは未反応部分のどちらかが検出される。）、前記分子（例えば、標識された分子）またはタンパク質（例えば、（未）反応部分の検出）の検出を通じて実行することができる。検出法の性質は本発明にとって重要ではなく、当業者に公知のどんな適した方法でも使用してもよい（例えば、抗体ベースの、質量ベースの、吸着ベースの、など）。
【０１１６】
特定の実施形態によれば、検出されるタンパク質に天然に存在する少なくとも１つのＹｉは、前記試料中の前記タンパク質だけに含まれる。したがって、例えば、ヒト起源の試料では、検出されるタンパク質にも存在する配列は、ヒトゲノム中に１回だけコードされている（または、ヒトプロテオーム中に１回だけ存在する）、すなわち、検出されるタンパク質（をコードする配列）中に１回だけコードされている。この特有性は必ずしも必要ではないが（例えば、異なるタンパク質が同一の凝集配列を有しており一緒に検出される場合、異なるタンパク質はそれでも、例えばサイズに基づいてさらに区別することができる。）、前記特有性は検出を容易にすると特に想定されている。「前記試料において」部分はタンパク質ストレッチの特有性を決定するのに重要であり、例えば、前記試料が前処理されている場合、複雑な混合物におけるまたは異なる（微）生物由来の試料における検出より含有するタンパク質の差異が少ない可能性がある。
【０１１７】
極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉ領域は、そのＹｉ領域の正味電荷がゼロである限り、正確に２個の荷電残基（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅから選択される）を含有していてもよい。しかし、さらに特定すると、Ｙｉ領域はいかなる荷電残基（またはついでに言えばプロリン）も含有しない。
【０１１８】
本検出法は確立している方法、典型的には抗体ベースの検出法と高度に類似していることに留意するべきである。その顕著な相違は特定の分子の使用である。実際、本明細書に記載された検出法では、本明細書で定義された分子は抗体と類似する役割を果たすことに留意するべきである。したがって、通常、抗体ベースである検出法では、本明細書に記載された分子は少なくとも１つの抗体に取って代わることができる。例えば、少なくとも１つのＹｉが検出されるタンパク質に天然に存在する一続きである分子は、検出アッセイにおいて一次抗体に取って代わることができ（「一次インターフェラー」と標識することができ）、Ｙｉが検出のために使用される一次抗体に天然に存在するストレッチである分子は、二次抗体に取って代わることができる。代わりに、二次インターフェラー分子は一次抗体に融合したタグまたは標識に向けることができるまたは「一次インターフェラー」もしくはこれに融合した部分に向けることができる。抗体の場合と同じように、「一次インターフェラー」は捕捉剤としての機能も果たすことができ、検出の残りは抗体を用いて（または、例えば別の一次インターフェラーおよび抗体を用いて）起こる。この設定は通常、サンドイッチアッセイと呼ばれる。
【０１１９】
具体的な実施形態によれば、検出のために使用される分子は検出可能な標識を含む。追加の具体的な実施形態によれば、段階ｂ）における検出は検出可能な標識の検出を通じてである。
【０１２０】
特定の実施形態によれば、前記方法は、段階ｂ）における検出に先立って前記タンパク質と反応した分子と前記タンパク質と反応していない分子の分離をさらに含む。代わりに、前記方法は、段階ｂ）における検出に先立って、前記分子と反応したタンパク質と前記分子と反応していないタンパク質の分離を含んでいてもよい。
【０１２１】
段階ｂ）における検出は、直接的でも間接的、例えば、分子の未反応部分の検出を通じてでも可能である。検出は定性的、半定量的または定量的でも可能である。
【０１２２】
特定の実施形態によれば、試料は対象由来、特に動物または植物対象由来、さらに特定すると哺乳動物対象由来、もっとも特定するとヒト対象由来である。
【０１２３】
しかし、タンパク質を含有することができるどんな試料でも使用してよく、特定の実施形態によれば、試料は生物由来ではない。これは特に、例えば解析が産物の純度のためまたは食糧や餌中のタンパク質の検出のためまたは水中の汚染タンパク質を検出するため、などで実行される白バイオテクにおける適用に当てはまる。
【０１２４】
タンパク質を検出することは前記方法の最後の段階であることが可能であるが、多くの場合、検出されるタンパク質の存在（または非存在または量）を特定の状態と相互に関連付ける次の段階が後に続くことができる。例えば、既に述べた白バイオテク適用では、タンパク質の存在は、例えば、植物物質由来の試料における汚染または純度を示すことがあるし、検出されるタンパク質の量はどの系列が特定の産物をもっとも多く産生するのか、例えばさらなる育種のための植物を選択するのに使用し得る情報を示すことがある。
【０１２５】
具体的な実施形態によれば、試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量は疾患状態の指標である。そのような疾患状態は、例えば疾患の存在、疾患の非存在、疾患の進行（例えば、悪性度、転移、薬物療法に対する応答、再発）であることが可能である。疾患状態に関連するタンパク質の例、例えばバイオマーカーは、当技術分野で十分立証されている。そのようなタンパク質の非限定的例には、ＣＲＰ（炎症をモニターするのに使用されることが多い）およびＰＳＡ（前立腺癌の初期検出に使用される）ならびにＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αがあり、これらも炎症マーカーである。追加の具体的な実施形態によれば、これらの方法は、試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量を対象における疾患状態と相互に関連付ける段階ｃ）をさらに含む。マーカーからも分かるように、診断のために特に想定されている疾患は癌および炎症性疾患である。
【０１２６】
同等物として、疾患状態の診断に使用するための、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは前記疾患状態の指標であるタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０１２７】
ここでも、癌と炎症性疾患は特に想定されている２種類の疾患である（または同様の、疾患（例えば、癌、炎症性疾患）のための診断薬を製造するための分子の使用が提供される。）。
【０１２８】
例えば、インビトロ診断薬が本明細書で想定されているように、本明細書に記載された少なくとも１つの分子（そのような分子をコードする核酸分子または本明細書に記載された組換えベクターを含む）および少なくとも適したバッファーを含むキットも提供される。
【０１２９】
キットの特別な形態として、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］の少なくとも２つの分子を含有する固体支持体を提供することができる。
【０１３０】
特定の実施形態によれば、前記分子はリンカーを通じて固体支持体に連結されている。前記少なくとも２つの分子は典型的に少なくとも２つの異なる分子であることになる。固体支持体の特定の例には、マイクロアレイ、プレコートプレート、ナノ粒子およびチップ上のラボ装置が含まれるがこれらに限定されない。これらの装置の多くは１つよりも多いタンパク質（多くの場合、同時に数十までまたは数百までのタンパク質も）を検出するのに使用されるので、少なくとも５分子、少なくとも１０分子、少なくとも２０分子、少なくとも５０分子、少なくとも１００分子、少なくとも２００分子、少なくとも５００分子または少なくとも１０００分子を含む固体支持体が提供されることが想定されている。
【０１３１】
追加の具体的な態様によれば、前記分子を使用して、植物、植物細胞または植物種子中のタンパク質の機能を下方調節する。したがって、植物または植物細胞または植物種子中のタンパク質の生物学的機能を下方調節するための方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは前記植物、植物細胞または植物種子中のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に前記タンパク質を接触させることを含む前記方法が提供される。
【０１３２】
もっとも特定すると、前記分子は、組換えベクター上に存在するヌクレオチド配列であって、植物細胞、植物種子または植物に導入されると、前記植物細胞、植物種子または植物においてポリペプチドを産生する前記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである。
【０１３３】
極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉ領域は、そのＹｉ領域の正味電荷がゼロである限り、正確に２個の荷電残基（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅから選択される）を含有していてもよい。しかし、さらに特定すると、Ｙｉ領域はいかなる荷電残基（またはついでに言えばプロリン）も含有しない。
【０１３４】
農薬組成物も提供される。これらの組成物は、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する少なくとも１つの分子
ならびに農学的に許容される担体を含む。
【０１３５】
農薬組成物では、少なくとも１つのＹｉは特に、植物、植物細胞もしくは植物種子内のまたは上のタンパク質に天然に存在する一続きになる。これは植物（典型的には前記農薬組成物がその上にまたはその近くに適用される植物）のタンパク質でもよいし、植物上に存在することがある植物害虫のタンパク質でもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】アミノ酸特性に応じてアミノ酸をグループ化したベン図。ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅおよびＢａｒｔｏｎ、ＣＡＢＩＯＳ、９、７４５−７５６、１９９３から適応した。
【図２】種々の生物のプロテオームにおける所定のペプチド長に関する固有配列の割合。図を作製するために、生物のゲノム配列を採取し、ゲノムにコードされる長さがＸである全ペプチドを生成し、次に、各ペプチドの発生頻度を計数し、固有の画分（すなわち、固有の配列対この長さの全配列）をプロットする。
【図３】誘導条件および抑制条件下でのＡｌｓ３凝集因子構築物を発現する菌株の成熟バイオフィルムの定量。成熟バイオフィルムは、コハク酸塩（白バー）またはＹＮＢ、４％Ｄ−グルコース（黒バー）において、４８時間、シリコーン製正方形ディスク上で増殖させた。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４を対照として用いた。Ａｌｓ３ｐインターフェラーを発現する組換え菌株は、対照と比較して誘導された場合、バイオフィルム形成能を有意に減少させた（＊ｐ＜０．００１）。定量はＣＦＵ計数によって行われ、データは対照（１００％）と比較して、生存細胞の割合として表示される。標準偏差は、２つの独立した実験から計算された。
【図４】誘導されたカンジダ・アルビカンスインターフェラー構築物は、接着減少（パネルＡ）と上皮細胞株ＴＲ−１４６への浸潤（パネルＢ）を実証した。
【図５】候補ペプチドＦ９はバイオフィルム形成の強力な阻害をもたらす。種々の濃度（２５０μＭ、５０μＭおよび１０μＭ）のペプチドＥ１（ＲＮＧＩＶＩＶＡＴＴＲ（配列番号７））、ペプチドＥ２（ＲＬＱＱＹＴＬＬＬＩＹＬＳＶＡＴＡＫ（配列番号８））、およびペプチドＦ９（ＲＫＬＬＦＮＬＧＳＲＮＧＩＶＩＶＡＴＴＲ（配列番号９））の存在下において、９６ウェルのポリスチレンウェルプレート上でのカンジダ・アルビカンスＳＣ５３１４のバイオフィルム形成。（Ａ）ペプチドは、カンジダ接着期にのみ添加され、成熟バイオフィルム生成は、新鮮なＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳにおいて継続させた。一方、（Ｂ）において、ペプチドは、接着期間を含む、バイオフィルム生成の全期間中に存在していた。バイオフィルムをＸＴＴ還元アッセイによって定量した。対照（１００％）は、最終濃度が１％であるＤＭＳＯを含む新鮮な培地のみを含んだ。ペプチドＥ１およびＦ９の存在は、バイオフィルム形成の有意な減少をもたらした（＊ｐ＜０．００１）。データは、対照（１００％）と比較して、ペプチド処理されたカンジダ細胞の代謝活性の割合を表す。標準偏差は、３つの独立した実験から計算された。ペプチドの各濃度を３点測定にて試験した。
【図６】ペプチドＦ９は、カンジダ・アルビカンスＳＣ５３１４接着およびポリスチレン上のバイオフィルム形成を低下させた。（Ａ）ペプチドＦ９（５０μＭ、１０μＭ、および２．５μＭ）の存在下での９６ウェルのポリスチレンプレート上のＣ．アルビカンスＳＣ５３１４の接着。ＸＴＴ還元アッセイは、３７℃にて、９０分の接着後に行われた。（Ｂ）接着期間中、種々の濃度のペプチドで前処理されたカンジダ細胞のインビトロにおける成熟バイオフィルム形成。さらなるバイオフィルム生成（４８時間）は、ＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳにおいて継続した。対照試料は、１％ＤＭＳＯ（１００％）で処理された。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δを対照として用いた。ペプチドＦ９は、接着およびさらなる成熟バイオフィルムの生成を有意に減少させた（＊ｐ＜０．００１）。データは、対照（１００％）と比較して、接着（９０分）または４８時間のバイオフィルム形成後、ペプチド処理されたカンジダ細胞の代謝活性の割合を表す。標準偏差は、５つの独立した実験から計算された。各濃度のペプチドを３点測定にて試験した。
【図７】ペプチド処理されたカンジダ・アルビカンスＳＣ５３１４細胞は、インビボでポリウレタンのカテーテルにバイオフィルムを形成する能力を減少させた。Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４細胞を３７℃にて接着期間（９０分）にペプチドＦ９（５０μＭ）の存在下でインキュベートした。その後、カテーテルを洗浄し、皮下に移植した。バイオフィルムは、６日間形成された。Ｃ．アルビカンスａｌｓ１Δ／ａｌｓ１Δａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δを対照として用いた。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは野生型と同様にバイオフィルムを形成した。ペプチドＦ９を用いた接着期間中のカンジダ細胞の処理は、より少ないインビボの成熟バイオフィルム形成をもたらした（＊ｐ＜０．００１）。データは、デバイスごとに得られたＬｏｇ１０ＣＦＵの平均値として示されている。合計で２０個のデバイスを試験した。各実験において、２匹の動物を菌株または条件ごとに使用した。
【図８】ペプチドＦ９は、ポリウレタンのカテーテルに接着するカンジダ・アルビカンスＳＣ５３１４の能力を減少させた。Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４細胞が接着期間（３７℃にて９０分）中にペプチドＦ９（５０μＭ）で処理された。デバイスを洗浄し、接着したカンジダ細胞の定量をＣＦＵカウントにより行った。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３ΔおよびＣ．アルビカンスａｌｓ１Δ／ａｌｓ１Δａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは、対照と比較して接着が有意に少なかった（＊ｐ＜０．００１）。ペプチドＦ９で処理された野生型カンジダ細胞は、未処理細胞と比較して接着性が低下することを実証した（＊ｐ＜０．００１）。データは、接着期間後にデバイスごとに得られたＬｏｇ１０ＣＦＵの平均値として示されている。合計で９個のカテーテルは、試験された菌株または条件ごとに使用された。
【図９】ペプチドＦ９は、接着し、上皮細胞に浸潤するカンジダ・アルビカンスＳＣ５３１４の能力を低下させる。３種の濃度（５０μＭ、１０μＭおよび２．５μＭ）のペプチドＦ９は、上皮細胞株ＴＲ−１４６への、Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４接着期間（１時間）（Ａ）および浸潤（３時間）（Ｂ）中に投与された。上皮細胞内の真菌細胞の接着および浸潤する部分は、カルコフルオールホワイトを用いて染色し、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体を用いて対比染色された。カバースリップを落射蛍光により観察した。接着した細胞の割合は、カバースリップの表面全体に広がった１００個の領域上の接着したカンジダ細胞の平均として計算された。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δの接着および浸潤能力は有意に減少した（＊ｐ＜０．００１）。Ｃ．アルビカンス細胞に浸潤する割合は、接着細胞の総数で内在化された細胞数を除することによって決定された。少なくとも１００個の真菌細胞が各カバースリップ上でカウントされた。標準偏差は、３つの独立した実験から計算され、ペプチドの各濃度を２点測定において試験した。
【図１０】野生型、ホモ接合欠失変異体およびＣｎｂ１形質転換体は、通常のプロモーターを誘導／抑制する条件において同様の表現型を有する。培地にＳＤＳ（０．０１％）を添加することによってストレスが誘導される場合、形質転換体は、プロモーターの抑制条件（ＳＤ培地）における野生型に類似している表現型を示し、一方、プロモーター誘導条件（ＳＣＡＡ培地）における表現型は、ホモ接合欠失変異体とともにより大きな類似性を示した。示されたデータは、４つの構築物に対して代典型的なものである。
【図１１】最小阻害濃度（ＭＩＣ）および２×ＭＩＣにおける、異なるインターフェラー分子で処理されたＳ．エピデルミデス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関する死滅動力学。
【図１２】Ｓ．アウレウスＡＴＣＣにおける耐性発現のモニタリング。
【図１３】ＭＲＳＡにおける長期耐性発現研究。赤色の線と矢印は、１日の培地からのペプチドの採取に起因したＣ３０に対する耐性において因子２の降下を示す。
【図１４】インターフェラーペプチドの溶血特性。
【図１５】サブＭＩＣにて１５日間培養されたＳ．アウレウスに関する耐性曲線。
【図１６】異なる濃度のペプチドインターフェラーＣ３０とＨｉｔ５０におけるヒト胎児腎臓細胞からの乳酸脱水素酵素の放出。
【図１７】２種の抗菌ペプチドインターフェラー（化合物３０とＨｉｔ５０）の存在下での２４時間のインキュベーション期間後のヒト上皮腎臓細胞株の回復率。図は、１００μｇ／ｍｌのＨｉｔ５０を用いて処理されたＨＥＫ細胞の９０％回復を示す。増殖阻害は、インターフェラーペプチド（インターフェラーペプチドの可溶化に使用された緩衝液は超純水中の５０％ＤＭＳＯであった。）に起因するというよりはむしろ、緩衝液としてのＤＭＳＯの存在に起因している。
【図１８】所定時間内に様々なインターフェラーペプチドで処理された細胞の緑色蛍光強度測定。リゾスタフィン（図の上段）は、非常に急速にスタフィロコッカスの細胞壁を破壊することで知られ、急速な細胞内容物の放出をもたらすため、ここでは溶解制御を表す。図の下のラインは緩衝液を表す。
【図１９】様々な濃度のインターフェラーペプチドＣ３０で処理された細胞の緑色蛍光強度（Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ）の測定。
【図２０−１】未処理の細菌（Ａ）、Ｃ３０（２５μｇ／ｍｌ）で処理された細菌の膜電位（ＤｉＯＣ２赤色／緑色蛍光ドットプロット）。
【図２０−２】ＤＭＳＯ処理された細菌（Ｂ）、ＣＣＣＰ対照によって脱分極化された細菌（Ｃ）、Ｃ３０（２５μｇ／ｍｌ）で処理された細菌の膜電位（ＤｉＯＣ２赤色／緑色蛍光ドットプロット）。
【図２０−３】０分の時間点（Ｄ）および５分の時間点（Ｅ）で測定されたＣ３０（２５μｇ／ｍｌ）で処理された細菌の膜電位（ＤｉＯＣ２赤色／緑色蛍光ドットプロット）。
【図２０−４】リゾスタフィンで処理された細菌（Ｇ）、１５分の時間点（Ｆ）で測定されたＣ３０（２５μｇ／ｍｌ）で処理された細菌の膜電位（ＤｉＯＣ２赤色／緑色蛍光ドットプロット）。
【図２１】異なる濃度の化合物Ｃ３０で処理されたＳ．アウレウスへのチオフラビンＴアミロイド診断用色素の結合。培地中に可溶化されたペプチドインターフェラーＣ３０もまた、特定のバックグラウンド蛍光を与えることに留意されたい。
【図２２】濃度増加させた化合物Ｃ３０で処理された細菌細胞へのコンゴーレッドアミロイド診断用色素の結合。
【図２３】未処理のバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（左パネル）および５分間（右パネル、上段）または２０分間（右パネル、下段）３×ＭＩＣにて化合物Ｃ３０で処理されたバチルス・セレウスのＳＥＭ顕微鏡写真。はっきりとした内容物の放出を伴う、処理細胞の明らかな細胞壁の縮小がある。さらに、細胞は短縮しているようであり、これらは細胞分裂が妨げられていることを示す。目に見える微細孔がなく、細胞表面にはクレーターも存在しない。
【図２４】未処理（Ａ）およびＣ３０処理（Ｂ）のスタフィロコッカス・アウレウスＡＴＣＣのＳＥＭ顕微鏡写真。分裂隔壁を含む多数の細胞において明らかな差があり、これは、Ｃ３０で処理された細胞において分裂が妨げられていることを示唆する。１時間の処理後、いくつかの細菌細胞は、それらの内容物を喪失し始めている。
【図２５】２０分の処理後に固定された、Ｃ３０処理（右パネル）およびＤＭＳＯ処理（左パネル）のスタフィロコッカス・アウレウスの透過型電子顕微鏡写真。細胞は、丸く無傷であり、明確な細胞膜を有している。いくつかのメソゾーム様構造が処理された細胞集団において見ることができる（矢印で示す）。
【図２６】４×ＭＩＣにて２０分間、Ｃ３０で処理されたスタフィロコッカスのＴＥＭ顕微鏡写真。細胞質内容物が縮小を開始するが、しかし、明らかな細胞溶解は観察することができない。ＤＮＡ領域は、非常に高い電子密度を有し、これは、アポトーシスの後期兆候であるＤＮＡの凝縮を示唆している。
【図２７】ＦＩＴＣ−タグ化されたＣ３０に曝露されたスタフィロコッカス・アウレウスの免疫標識された超薄切片（上の２行、画像ＡからＦ）、およびペプチド切片に曝露されていない免疫標識された超薄切片（下の行、非標識画像）の透過型電子顕微鏡写真。赤い矢印は、ペプチド凝集体を示す。ペプチド処理された細胞の隔壁は、不規則な形状を示し、細胞分裂が非対称である。ペプチドは、細胞と細胞質にある凝集体によって取り込まれる。
【図２８】ペプチドＨｉｔ１（配列：ＲＷＶＳＭＬＬＲＲＧＳＲＷＶＳＭＬＬＲＲ（配列番号３１））とＨｉｔ５７Ａ（配列：ＲＦＦＩＧＬＳＲＲＧＳＲＩＱＡＹＬＹＲＲ（配列番号７８））は、感染した細胞の単層における細菌数を効果的に減少させた。すべての化合物は１００μｇ／ｍｌで使用した。
【図２９】抗ＣｌｐＣペプチドで探査されたブロット。
【図３０】異なる濃度のペプチドを含むスポットのストレプトアビジン−ＨＲＰシグナル強度。
【図３１】好中球減少マウスの大腿モデルにおけるスタフィロコッカス・アウレウスＭＲＳＡ３２６に対して静脈内および腹腔内に送達されたバンコマイシン対化合物Ｃ３０の有効性。
【図３２−１】１０μＭ（パネルＡ）の抗ウイルスインターフェラー、タミフルまたはＰＢＳで処理された細胞の多段階ウイルス増殖曲線。Ｈｐｉ、感染後の時間。
【図３２−２】１０μＭ（パネルＢ）または１μＭ（パネルＣ）の抗ウイルスインターフェラー、タミフルまたはＰＢＳで処理された細胞の多段階ウイルス増殖曲線。Ｈｐｉ、感染後の時間。
【図３２−３】１μＭ（パネルＤ）の抗ウイルスインターフェラー、タミフルまたはＰＢＳで処理された細胞の多段階ウイルス増殖曲線。Ｈｐｉ、感染後の時間。
【図３３】すべてのまたは一部のミニレプリコン成分のトランスフェクション後の相対ルシフェラーゼ活性。「Ｍｘ１」：すべてのミニレプリコン成分に加えて、Ｍｘ１用の発現ベクターもまたトランスフェクトされた。
【図３４−１】異なるウイルスタンパク質に対して指向されたＰＡ特異的又はＰＢ２−特異的インターフェラーの存在下での相対ルシフェラーゼ活性。Ｒ−ＧＳ、Ｒ−ＰＰ、Ｄ−ＰＰ、Ｒ−ＰＳは、使用されたゲートキーパーの性質（ハイフン前）と内部リンカー（ハイフン後）を示す。
【図３４−２】異なるウイルスタンパク質に対して指向されたＰＢ１特異的又はＮＰ−特異的インターフェラーの存在下での相対ルシフェラーゼ活性。Ｒ−ＧＳ、Ｒ−ＰＰ、Ｄ−ＰＰ、Ｒ−ＰＳは、使用されたゲートキーパーの性質（ハイフン前）と内部リンカー（ハイフン後）を示す。
【図３５】ミニレプリコンアッセイに関与しない異なる内部ウイルスタンパク質（Ｍ１およびＮＳ１）に対して指向されたインターフェラーの存在下での相対ルシフェラーゼ活性。対照値＝１。Ｒ−ＰＰ、Ｄ−ＰＰ、Ｒ−ＰＳは、使用されたゲートキーパーの性質（ハイフン前）および内部リンカー（ハイフン後）を示す。
【図３６】特異的インターフェラーによる検出技術の図式的概略。
【図３７】完全な細菌ＢＬ２１細胞溶解物からのウェスタンブロットおよびβ−ＧａｌのＰｅｐＢｌｏｔ分析。レーン１は、ウサギポリクローナル抗β−Ｇａｌ抗体による検出を示す；レーン２は、Ｔａｎｇｏ１ペプチドインターフェラー（ｂ〜ＲＬＡＶＶＬＱＲ（配列番号７９））による検出を示す；レーン３は、Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラー（ｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号８０））による検出を示す；およびレーン４は、オフターゲットペプチドインターフェラー（ｂ〜ＲＰＩＴＶＮＰＰＦＲ（配列番号８１））との相互作用を示す。メンブレンは、１００秒間、化学発光ＨＲＰ基質で曝露された。上の矢印は、ブロット上のβ−Ｇａｌタンパク質の予測位置を示す。下の矢印は、おそらく遊離ＳＲＰである非特異的結合生産物を示す。
【図３８】全ＢＬ２１細胞溶解物からのβ−Ｇａｌへのｗｔおよび変異Ｔａｎｇｏ２ペプチド結合特異性のＰｅｐＢｌｏｔ分析：レーン１−ｗｔペプチド（ｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号８０））；レーン２−ｍｕｔ １ペプチド（ｂ〜ＲＶＰＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号８２））；レーン３−ｍｕｔ ２ペプチド（ｂ〜ＲＶＩＰＷＳＬＧＮＲ（配列番号８３））；およびレーン４−ｍｕｔ ３ペプチド（ｂ〜ＲＶＩＰＥＳＬＧＮＲ（配列番号８４））。メンブレンは、１００秒間、化学発光ＨＲＰ基質に曝露された。矢印は、メンブレンストリップ上のβ−Ｇａｌの位置を示す。
【図３９】全ＢＬ２１細胞溶解物からのβ−ＧａｌへのＴａｎｇｏ２ペプチド（ｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号８０））結合動力学のＰｅｐＢｌｏｔ分析。メンブレンにおいて分離されたタンパク質は、異なる時間点について結合緩衝液中のＴａｎｇｏ２インターフェラーペプチドに曝露された：レーン１−ペプチドへの曝露なし；レーン２−３０秒；レーン３−５分；レーン４−１０分；レーン５−１５分；レーン６−３０分；レーン７−４５分；およびレーン８−６０分のインキュベーション。メンブレンは、１００秒間、化学発光ＨＲＰ基質で曝露された。矢印はメンブレンストリップ上のβ−Ｇａｌの位置を示す。
【図４０】非誘導の完全ＢＬ２１細胞溶解物において急増した種々のβ−ｇａｌタンパク質レベルの解析。検出は、（Ａ）Ｔａｎｇｏ２ペプチドのインターフェラー（ｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号８０））によるＰｅｐＢｌｏｔおよび（Ｂ）ウサギポリクローナル抗β−Ｇａｌ抗体によるＷＢを用いて達成された。レーン１−β−Ｇａｌなし；レーン２−１１．６ｎｇのβ−Ｇａｌ；レーン３−５８ｎｇのβ−Ｇａｌ；レーン４−１１６ｎｇのβ−Ｇａｌ；レーン５−２９０ｎｇのβ−Ｇａｌ；レーン６−５８０ｎｇのβ−Ｇａｌ；レーン７−８７０ｎｇのβ−Ｇａｌ；およびレーン８−１１６０ｎｇのβ−Ｇａｌ。メンブレンは、１００秒間、化学発光ＨＲＰ基質で曝露された。矢印はメンブレン上のβ−ｇａｌの位置を示す。
【図４１】非誘導の完全ＢＬ２１細胞溶解物において急増した異なるβ−ｇａｌタンパク質レベルのＴａｎｇｏ２ペプチドインターフェラー（ｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号８０））（丸印のある黒色線）と抗β−Ｇａｌ抗体（三角印の赤色線）のＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ検出シグナル密度の比較。
【図４２】隣接レーンにおける血清タンパク質の存在下での完全なＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）溶解物におけるβ−ｇａｌのインターフェラーペプチドに基づくＰｅｐＢｌｏｔ検出の特異性におけるゲートキーパー残基の影響。検出は、競合プラットフォームで行われ、レーン１は、７％臨床血清を含む各メンブレンであり、レーン２は完全Ｅ．コリＢＬ２１細胞溶解物中のβ−ｇａｌである。ペプチドは、両末端上でビオチンにより標識され、Ｔｔｄｓリンカーによって連結された。分離した血清およびＥ．コリのタンパク質を含むメンブレンは、１５分間、２５ｎＭのインターフェラーペプチド、次にＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートされ、１２０秒間、化学発光ＨＲＰ基質に曝露された。血清について観察された高いＭＷバンドはＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートの交差反応に起因することに留意されたい。
【図４３】β−Ｇａｌに結合する種々のペプチドの親和性を比較する実験センサーグラム：Ｔａｎｇｏ１（赤色）；Ｔａｎｇｏ２（緑色、最上の曲線）；オフターゲットペプチド（黄色）；および緩衝液参照（黒色）。ペプチド（１μＭ）はそれぞれ接触した後の表面の再生段階と同じチップ上に流していることに留意されたい。
【図４４】β−Ｇａｌに結合するｗｔおよび変異Ｔａｎｇｏ２ペプチドの親和性を比較する実験センサーグラム：Ｔａｎｇｏ２ｗｔ（赤色、最上の曲線）；Ｔａｎｇｏ２Ｍｕｔ １（緑色）；Ｔａｎｇｏ２Ｍｕｔ ２（黄色）；Ｔａｎｇｏ２Ｍｕｔ ３（青色）；および緩衝液参照（黒色）。ペプチド（１μＭ）がそれぞれ接触した後の表面の再生段階と同じチップ上に流していることに留意されたい。
【図４５】センサーチップ上に固定化されたβ−Ｇａｌに結合するペプチド、（Ｈｉｓ）６〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲは（配列番号８０）の動力学的分析からの近似データの代表的なセンサーグラム。実線は実験センサーグラムであり、応答に重ね合わされた点線は近似曲線である。下から上への検体濃度は、０．５μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭおよび４．０μＭであった。中央の曲線（２μＭ）は２点測定で実施された。ペプチドはそれぞれ接触した後の表面の再生段階と同じチップ上に流していることに留意されたい。
【図４６】β−Ｇａｌに結合する単一のＴａｎｇｏ２（実線）とタンデムなＴａｎｇｏ２（破線）ペプチドの親和性を比較する実験センサーグラム。緩衝液参照を点線で示す。ペプチド（１μＭ）はそれぞれ接触した後の表面の再生段階と同じチップ上に流していることに留意されたい。
【図４７】β−ｇａｌとのＴａｎｇｏ１ペプチド（三角）およびＴａｎｇｏ２ペプチド（正方形）の共凝集動力学の比較。インターフェラーペプチドとβ−Ｇａｌの濃度は１０μＭであった。黒丸は、ペプチドの非存在下でのβ−ｇａｌを表す。矢印は、それぞれの時間点でのＤＬＳを用いて測定した粒子の流体力学半径（ＲＨ）を指す。
【図４８】β−ｇａｌとの単一のＴａｎｇｏ２ペプチド（正方形）およびタンデムリピートのＴａｎｇｏ２ペプチド（三角）の共凝集動力学の比較。インターフェラーペプチドとβ−ｇａｌの量は１０μＭであった。黒丸は、ペプチドの非存在下でのβ−ｇａｌを表す。矢印は、それぞれの時間点でのＤＬＳを用いて測定した粒子の流体力学半径（ＲＨ）を指す。
【図４９】β−ｇａｌとのＴａｎｇｏ２ペプチドの共凝集の動力学に対するペプチド濃度の効果。ペプチド：β−ｇａｌのモル比は、１：５（三角形）、１：２（正方形）および１：１（菱形）であった。黒丸は、ペプチドの非存在下でのβ−ｇａｌを表す。矢印は、それぞれの時間点でのＤＬＳを用いて測定した粒子の流体力学半径（ＲＨ）を指す。
【図５０】フルオレセイン蛍光に非蛍光基質ＦＤＧを切断するβ−ｇａｌの酵素活性におけるＴａｎｇｏ２インターフェラーペプチドの効果。最大の蛍光強度は、インターフェラーを含まない１０μＭの天然のβ−Ｇａｌ、次に１０μＭのβ−Ｇａｌ＋１μＭのペプチドインターフェラー、次に１０μＭのβ−Ｇａｌ＋５μＭのペプチドインターフェラーを用いて得られる。１０μＭのβ−Ｇａｌ＋１０μＭペプチドインターフェラーの条件では蛍光は観察されなかった。
【図５１】２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６．８）中の天然のβ−Ｇａｌ（実線）およびβ−Ｇａｌ−Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの共凝集懸濁（点線）の減衰全反射ＦＴ−ＩＲスペクトル。
【図５２】２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６．８）中の天然のβ−Ｇａｌ（実線）およびβ−Ｇａｌ−Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの共凝集懸濁（点線）のＣＤスペクトル。
【図５３】（Ａ）天然のβ−Ｇａｌおよび（Ｂ）β−Ｇａｌ−Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの共凝集のＥＭ。
【図５４】ペプチドインターフェラー、ｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８５）（パネルＡ）およびウサギモノクローナル抗ＰＳＡ抗体（パネルＢ）を用いたＰＳＡのＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ分析。メンブレンは、５％ヒト血清中に急増した１．５５μｇのＰＳＡを含む。矢印は、ブロット上のＰＳＡの位置を示す。インターフェラーペプチドおよび抗ＰＳＡ抗体を有するメンブレンは、それぞれ１８０秒間および１０秒間、化学発光ＨＲＰ基質で曝露された。ＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢにおいて顕著な高分子バンドは、それぞれＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートおよび二次抗体−ＨＲＰの非特異的結合によるものである。
【図５５】インターフェラーペプチド、ｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号８６）（パネルＡ）およびウサギモノクローナル抗ＣＲＰ抗体（パネルＢ）を用いた５％ヒト血清において急増した１．２５μｇのＣＲＰのＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ分析。インターフェラーペプチドおよび抗ＣＲＰ抗体を有するメンブレンは、それぞれ６０秒間および１０秒間、化学発光ＨＲＰ基質で曝露された。矢印はブロットにおけるＣＲＰの位置を示す。インターフェラーおよび抗体ブロットにおいて顕著な高分子バンドは、それぞれＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートおよび二次抗体−ＨＲＰの非特異的結合による。
【図５６】ペプチドインターフェラー、ｂ〜ＲＷＳＦＹＬＬＹＹＴＲ（配列番号８７）（パネルＡ）および抗β−２Ｍ抗体（パネルＢ）を用いた５％ヒト血清において急増した０．６μｇのβ−２ＭのＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ分析。インターフェラーペプチドおよび抗β−２Ｍ抗体を有するメンブレンは、それぞれ１８０秒間および１０秒間、化学発光ＨＲＰ基質に曝露された。矢印はブロットにおけるβ−２Ｍの位置を示す。
【図５７】ウサギモノクローナル抗ＣＲＰ抗体を用いたＷＢおよびインターフェラーペプチド（ｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号８６））を用いたＰｅｐＢｌｏｔによる臨床血清試料中のＣＲＰ検出。
【図５８】インターフェラーペプチド（ｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号８６））を用いたＰｅｐＢｌｏｔによる、２０人の患者の臨床血清試料におけるＣＲＰ検出（上段パネル）。免疫比濁アッセイによって決定された臨床血清中のＣＲＰ濃度は、１μｇ／ｍｌから３１７μｇ／ｍｌの範囲であった。下段パネルは、ペプチドｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号８６）によって検出されたＣＲＰバンドシグナル密度対臨床検査室での免疫比濁アッセイを用いて独立して決定された濃度のプロットを示す。
【図５９】（Ａ）ペプチドｂ〜ＲＷＱＶＬＡＳＤ（配列番号８８）（レーン２）およびｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８５）（レーン３）を用いたＰｅｐＢｌｏｔによるヒト精漿中に分泌されたＰＳＡの検出。ＰＳＡのＣ末端配列に特異的なモノクローナル抗体（ＥＰ１５８８Ｙ）のＷＢをレーン１に示す。（Ｂ）タンデムリピートのインターフェラーペプチドｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８９）を用いたＰＳＡ検出。ビオチン（ｂ）は「Ｔｔｄｓ−ＡＰＡＡ」（配列番号７７）リンカーによってペプチドに連結され、２つの凝集配列は「ＧＳＧＳＡＰＡＡ」（配列番号９０）リンカーによって連結された。単一およびタンデムリピートのペプチド濃度は、それぞれ２５０ｎＭおよび２５０ｐＭであることに留意されたい。メンブレンは、３６秒間、化学発光ＨＲＰ基質に曝露された。
【図６０】５％ヒト血清中に急増した５μｇのＩＬ１βのＰｅｐＢｌｏｔ（すなわち、インターフェラーに基づく）検出。
【図６１】５％ヒト血清中に急増した５μｇのＴＮＦαのＰｅｐＢｌｏｔ検出。
【図６２】ペプチドｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号９１）を用いた完全なＥ．コリ細胞溶解物において急増したβ−ｇａｌの異なるレベルの定量的検出。ビオチン（ｂ）は「Ｔｔｄｓ−ＡＰＡＡ」（配列番号７７）リンカーによってペプチドに連結され、２つの凝集配列は「ＧＳＧＳＡＰＡＡ」（配列番号９０）リンカーによって連結された。
【図６３】β−Ｇａｌとのペプチドｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号９１）の相互作用の動力学的特徴付け。標的タンパク質のβ−Ｇａｌの濃度は３１ｐＭから１μＭの範囲であった。
【図６４】ＣＲＰとのペプチドｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号９２）の相互作用の動力学的特徴付け。標的タンパク質ＣＲＰの濃度は３７μＭから５８２ｍＭの範囲であった。
【図６５】「Ｒ」に隣接した単一のインターフェラーペプチド（上段パネル）または「Ｒ」に隣接したタンデムリピートのインターフェラーペプチド（下段パネル）のマイクロアレイを用いることによる臨床血清中のＣＲＰ検出。Ｘ軸はスポットされたペプチドを示し、Ｙ軸はシグナル対ノイズ比を示す。血清中のＣＲＰ濃度は３１７μｇ／ｍｌであった。
【図６６】Ａ、ｍＶＥＧＦＲ２でトランスフェクトされ、次に異なる供給源からのペプチドの存在下または非存在下で一晩飢餓を受け、５分間、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたＨｅｋ２９３細胞のリン酸化および全ＥＲＫ１／２のウェスタンブロット分析。Ｂ、Ａにおいて示されたペプチドのいくつかについてのリン酸化対全ＥＲＫ１／２のレベルの比の定量。
【図６７】ＶＥＧＦＲ２受容体に対するペプチドＢ８の特異性。指示された濃度でのＤＭＳＯまたはペプチドＢ８の存在下で一晩飢餓後にＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）で５分間刺激されたＨｅＬａ細胞におけるリン酸化されたＥＲＫ１／２のウェスタンブロット分析。ＶＥＧＦＲ２に対して指向されたペプチドによって誘発されたＥＲＫ１／２リン酸化の減少は観察することができなかった。
【図６８】ＤＭＳＯ（上段パネル）または１０μＭのペプチドＢ８（下段パネル）のいずれかで処理されたＨＥＫ２９３細胞において発現されたｍＶＥＧＦＲ２の免疫組織化学的染色。
【図６９】対照、抗ＶＥＧＦＲ２のインターフェラーペプチドまたは抗ＶＥＧＦＲ２  ｍＡｂで処理されたマウスの眼における新血管形成。Ｙ軸は、病変の全境界領域のＴＲＩＴＣ陽性面積％を示す。
【図７０】ＥＧＦＲに対して指向されたペプチドの存在下または非存在下でのＥＧＦ刺激によるＨｅＬａ細胞におけるＥＲＫ１／２のリン酸化レベル。Ｙ軸は、陰性対照に対して補正されたリン酸化−ＥＲＫレベルを示す。Ａ５、ＲＷＧＬＬＬＡＬＲＰＰＲＷＧＬＬＬＡＬＲ（配列番号９３）；Ａ１１、ＲＴＧＹＬＹＩＳＲＰＰＲＴＧＹＬＹＩＳＲ（配列番号９４）；Ａ１２、ＲＩＩＳＡＶＶＧＲＰＰＲＩＩＳＡＶＶＧＲ（配列番号９５）；Ｂ９、ＤＶＷＳＹＧＶＴＤＰＰＤＶＷＳＹＧＶＴＤ（配列番号９６）；Ｂ１０、ＤＩＴＧＹＬＹＩＤＰＰＤＩＴＧＹＬＹＩＤ（配列番号９７）；Ｂ１１、ＤＬＬＧＩＳＬＴＤＰＰＤＬＬＧＩＳＬＴＤ（配列番号９８）；Ｂ１２、ＤＷＧＬＬＬＡＬＤＰＰＤＷＧＬＬＬＡＬＤ（配列番号９９）の配列。
【図７１】ｈＴＮＦによる刺激後の異なる時間点でのＡ２０（ウェスタンブロット、上段パネル）およびＩＬ−８（ＥＬＩＳＡ、中段パネル）またはＩＬ−６（バイオアッセイ、下段パネル）誘導。
【図７２】血清不含培地および２％ＤＭＳＯ（図中のＤＭＳＯ）による処理と比較した、ＴＮＦ刺激後に異なるインターフェラーで処理されたＡ５４９細胞のＩＬ−８レベルの相対的誘導。ＡとＢは、２つの独立した実験の結果を示す。
【図７３】血清不含培地および２％ＤＭＳＯ（図中のＤＭＳＯ）による処理と比較した、ＴＮＦ刺激後に異なるインターフェラーで処理されたＡ５４９細胞のＩＬ−６レベルの相対的誘導。
【図７４−１】（ａ）ＢＩＮ２のＴＡＮＧＯプロット図；ピークはＢＩＮ２タンパク質内で凝集するもっとも高い傾向を有するペプチド配列を表す。（ｂ）Ｎ末端でＧＦＰに融合した凝集のブースターを含むベイト２４９発現ベクターの模式図。（ｃ）異なるリンカーおよび隣接配列（ａａ配列が示される。）を含むが、凝集のいずれのブースターも含まないベイト２４９発現ベクターの表示。
【図７４−２】（ａ）ＢＩＮ２のＴＡＮＧＯプロット図；ピークはＢＩＮ２タンパク質内で凝集するもっとも高い傾向を有するペプチド配列を表す。（ｂ）Ｎ末端でＧＦＰに融合した凝集のブースターを含むベイト２４９発現ベクターの模式図。（ｃ）異なるリンカーおよび隣接配列（ａａ配列が示される。）を含むが、凝集のいずれのブースターも含まないベイト２４９発現ベクターの表示。
【図７５】（ａ−ｅ）各パネルの上部に示されたＧＦＰを発現する構築物で一過性に形質転換された、Ｎ．ベンサミアナ（ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）によるアグロインフィルトレーション処理された葉における凝集体形成のＣＬＳＭ評価。表皮細胞は、ＧＦＰ陽性であるが、主に核周辺領域に異なる局在化パターンを示す。白い矢印は、不溶性の封入体を示す。サイズバー：１０μｍ。
【図７６】上段パネル：３５ＳＢＩＮ２ＧＦＰとｐＭＤＣベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄを発現する菌株を用いた共注入から４、５日後のＮ．ベンサミアナ表皮細胞のＣＬＳＭ画像。下段パネルで：ＩｍａｇｅＪ  ＭＢＦソフトウェアによって行われた共局在化定量を表す対応する画像。各写真のマンデル重複係数（０＜Ｒ＜１）が示されている；サイズバーは５０μｍを表す。
【図７７】Ｎ．ベンサミアナにおいて３５Ｓ：：ＢＩＮ２：ＨＡとともに共発現される３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰバリアントの共免疫沈降。左パネル、抗ＧＦＰビーズとともに４時間のインキュベーション後の植物タンパク質抽出物の未結合画分のウェスタンブロット検出、および抗ＨＡ抗体（左上パネル）または抗ＧＦＰ抗体（左下パネル）を用いた検出。右パネル、抗ＨＡ（右上パネル）または抗ＧＦＰ抗体（右下パネル）を用いた免疫沈降（ＩＰ）されたビーズの検出。
【図７８】（ａ−ｄ）３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ構築物を発現するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）８Ｄ．Ａ．Ｓ．Ｔ３実生のＣＬＳＭ画像。子葉の表皮細胞（ａ）、胚軸の表皮細胞（ｂ）および根細胞（ｃ）は核周囲の凝集を示す（白色の矢印）。根端は、明確な細胞質凝集を示さず、弱いＧＦＰシグナルを示す（ｄ）。（ｅ−ｈ）３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰ構築物を発現するアラビドプシス８Ｄ．Ａ．Ｓ．Ｔ３実生のＣＬＳＭ画像。子葉の表皮細胞（ｅ）、胚軸の表皮細胞（ｆ）および根細胞（ｇ）は細胞質凝集を示す。根端が弱いＧＦＰ強度を示す（ｈ）。サイズバーが示されている。
【図７９】（ａ−ｄ）３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ構築物を発現するアラビドプシス８Ｄ．Ａ．Ｓ．Ｔ３実生のＣＬＳＭ画像。明確な凝集は植物組織において視認されないが、ほんの弱いＧＦＰ発現が子葉の細胞（ａ）、胚軸の細胞（ｂ）および根端（ｄ）において視認される。根細胞（ｃ）において、球状体の形態の不溶性凝集体の存在が証明される（白色の矢印）。（ｅ−ｈ）３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰ構築物を発現するアラビドプシス８Ｄ．Ａ．Ｓ．Ｔ３実生のＣＬＳＭ画像。ベイトは、根細胞（ｇ）においてのみ核周囲の凝集を示すいずれかの植物組織において発現される。サイズバーが示されている。
【図８０】抗ＧＦＰ抗体とともにインキュベートされた８Ｄ．Ａ．Ｓ．のアラビドプシス実生の免疫金標識した超薄切片のＴＥＭ評価。（ａ）挿入図に拡大された、標識された細胞質繊維状材（ａ）を示す３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰを発現する胚軸脈管柔細胞。（ｂ−ｃ）細胞質ゾルにおける（ｂ）およびゴルジ層板に近い（ｃ）ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰのクラスター化された標識を示す根の伸長域細胞の詳細。（ｄ）挿入図に拡大された、核周囲の標識を証明するベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰを発現する子葉柵状細胞。（ｅ）細胞質ゾルにおけるベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄの細胞質標識を示す根の伸長域細胞。サイズバーが示されている。
【図８１−１】（Ａ）野生型（Ｃｏｌ−０）植物抽出物と比較した、ＢＩＮ２  ベイト２４９株を安定に発現するトランスジェニックアラビドプシス植物からのタンパク質抽出物中の高分子量複合体（枠内）の天然ＰＡＧＥおよび抗ＧＦＰ検出。（Ｂ）３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰ、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ、３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰを発現するトランスジェニック植物からの免疫沈降された材料におけるＦＴ−ＩＲ分光。
【図８１−２】（Ａ）野生型（Ｃｏｌ−０）植物抽出物と比較した、ＢＩＮ２  ベイト２４９株を安定に発現するトランスジェニックアラビドプシス植物からのタンパク質抽出物中の高分子量複合体（枠内）の天然ＰＡＧＥおよび抗ＧＦＰ検出。（ｃ）３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰを発現するトランスジェニック植物からの免疫沈降された材料におけるＦＴ−ＩＲ分光。１６１６と１６８０（黒色の矢印）の値で増加した吸光度は、β−シート凝集体の存在を示す。
【図８２−１】（ａ）長日光周期下での８日間インビトロで垂直で、および１．５カ月間土壌において増殖されたＣｏｌ−０と比較した、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰのアラビドプシス実生の表現型。系統あたり５０個の８Ｄ．Ａ．Ｓ．の実生の平均における根と胚軸の長さの定量も表される。（ｂ）Ｃｏｌ−０および３倍のＧＳＫ群ＩＩ  Ｔ−ＤＮＡ変異体（ｔｒＧＳＫｓｌｌ ｋ．ｏ．）と比較した、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰアラビドプシス４Ｄ．Ａ．Ｓ．実生系統のブラジナゾール（Ｂｒａｚｚｉｎａｚｏｌｅ）耐性用量応答アッセイ。系統あたり５０個の実生の平均における胚軸の長さの対応する定量をグラフに表す。
【図８２−２】（ａ）長日光周期下での８日間インビトロで垂直で、および１．５カ月間土壌において増殖されたＣｏｌ−０と比較した、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰのアラビドプシス実生の表現型。系統あたり５０個の８Ｄ．Ａ．Ｓ．の実生の平均における根と胚軸の長さの定量も表される。（ｂ）Ｃｏｌ−０および３倍のＧＳＫ群ＩＩ  Ｔ−ＤＮＡ変異体（ｔｒＧＳＫｓｌｌ ｋ．ｏ．）と比較した、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰアラビドプシス４Ｄ．Ａ．Ｓ．実生系統のブラジナゾール（Ｂｒａｚｚｉｎａｚｏｌｅ）耐性用量応答アッセイ。系統あたり５０個の実生の平均における胚軸の長さの対応する定量をグラフに表す。
【図８２−３】（ａ）長日光周期下での８日間インビトロで垂直で、および１．５カ月間土壌において増殖されたＣｏｌ−０と比較した、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰのアラビドプシス実生の表現型。系統あたり５０個の８Ｄ．Ａ．Ｓ．の実生の平均における根と胚軸の長さの定量も表される。（ｂ）Ｃｏｌ−０および３倍のＧＳＫ群ＩＩ  Ｔ−ＤＮＡ変異体（ｔｒＧＳＫｓｌｌ ｋ．ｏ．）と比較した、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰアラビドプシス４Ｄ．Ａ．Ｓ．実生系統のブラジナゾール（Ｂｒａｚｚｉｎａｚｏｌｅ）耐性用量応答アッセイ。系統あたり５０個の実生の平均における胚軸の長さの対応する定量をグラフに表す。
【図８３−１】ａ）長日条件下、インビトロにおいて成長させた８Ｄ．Ｏ．のアラビドプシス実生における、ＢＲ生合成遺伝子ＤＷＦ４とＣＰＤおよびＢＲ反応性ＮＡＣ転写因子（Ａｔ５ｇ４６５９０）の遺伝子の相対的発現レベル。ｂ）同じ実験条件において測定されたシャペロン遺伝子（ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０−１、）発現レベル。それぞれの場合において、ｍＲＮＡ量は、参照遺伝子としてのＣＤＫＡ１レベルに対して標準化された。
【図８３−２】ａ）長日条件下、インビトロにおいて成長させた８Ｄ．Ｏ．のアラビドプシス実生における、ＢＲ生合成遺伝子ＤＷＦ４とＣＰＤおよびＢＲ反応性ＮＡＣ転写因子（Ａｔ５ｇ４６５９０）の遺伝子の相対的発現レベル。ｂ）同じ実験条件において測定されたシャペロン遺伝子（ＨＳＰ１０１、ＨＳＣ７０−１、ＨＳＣ７０−２およびＨＳＣ７０−３）発現レベル。それぞれの場合において、ｍＲＮＡ量は、参照遺伝子としてのＣＤＫＡ１レベルに対して標準化された。
【図８４】アラビドプシス植物における３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ細胞毒性のＴＥＭ超微細構造評価。Ｃｏｌ−０（ａ、ｃ）および変異体（ｅ、ｇ）における胚軸と根細胞間の低倍率の比較を示す。Ｃｏｌ−０（ｂ、ｄ）および変異体（ｆ、ｈ）における同領域の高倍率顕微鏡写真。サイズバーが示されている。
【図８５】上段パネル：２４時間誘導後の３５Ｓ：：ＢＩＮ２−ＧＦＰおよびｐＭＤＣ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ ＲＦＰを発現する８Ｄ．Ａ．Ｓ．のアラビドプシス実生のＣＬＳＭ画像。下段パネル：ＩｍａｇｅＪ  ＭＢＦソフトウェアによって行われた共局在化定量を表す対応する画像。各写真のマンデル重複係数（０＜Ｒ＜１）が示されている。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
定義
本発明は、特定の実施形態に関して、またある種の図を参照して説明されることになるが、本発明はそれらに限定されることはなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号もその範囲を限定すると解釈されないものとする。記載されている図は図解的なものにすぎず、非限定的なものである。図において、要素の一部のサイズは、説明目的のために誇張されていることがあり、目盛通りに描かれていないことがある。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本説明および特許請求の範囲において使用されている場合、前記用語は他の要素または段階を排除していない。単数名詞に言及する場合に不定冠詞または定冠詞、例えば「１つ（「ａ」または「ａｎ」）」、「その（ｔｈｅ）」が使用されているところでは、何か他に具体的に記述されていなければ、これはその名詞の複数形を含む。
【０１３８】
さらに、本説明におけるおよび特許請求の範囲における用語第一の、第二の、第三の、などは類似する要素を区別するために使用され、必ずしも順次的なまたは経時的順番を説明するためではない。そのように使用されている用語は適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は本明細書に記載されているまたは図解されている以外の順序で運用することが可能であることを理解すべきである。
【０１３９】
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためだけに提供される。本明細書において具体的に定義されていなければ、本明細書で使用されている用語はすべて、本発明の技術分野の当業者にとり有すると考えられるのと同じ意味を有する。実行者らは、当技術分野の定義および用語では、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に指針を仰いでいる。本明細書で提供される定義は、当業者に理解されているよりも範囲が狭いと解釈されるべきではない。
【０１４０】
本明細書に記載されたベータ凝集誘導または凝集核形成分子は「インターフェラー」または「インターフェラー分子」と呼ばれることもある。この用語により、本明細書に記載されたゲートキーパー含有分子（すなわち、Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉ部分を有する分子）が意図されており、したがって前記用語はＷＯ２００７０７１７８９において使用されている「インターフェラー」と同義ではない。したがって、本明細書で使用されている「インターフェラー」は、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ構造を有する分子と読まれるべきである。用語「インターフェラーペプチド」は、それらが完全にペプチド性質の場合に使用されることもある。用語「ベイト」も同義語として使用されることもあるが、これは凝集領域それ自体にも言及することがある。本明細書に記載されたインターフェラー分子は天然に存在しない分子である。前記分子は合成（人工のという意味で）であり、タンパク質断片を包含することを意図しない（特異的配列必要条件のせいで、生物中に見出される天然のタンパク質断片はこの定義に該当することになる可能性は低い。）。
【０１４１】
本明細書で使用されているように、用語「疎水性アミノ酸」とは、以下の１３個のアミノ酸、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）、スレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）のことである。用語「脂肪族アミノ酸」とは、Ｉ、ＬまたはＶ残基のことである。用語「荷電アミノ酸」とは、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）（両方とも正に荷電している）およびアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）（両方とも負に荷電荷している）のことである。ヒスチジンは、その側鎖の窒素を酸性条件下でプロトン化することができるために、正に荷電していると言われることもあるが、本明細書では他の方法で明確に記述されていなければ、荷電アミノ酸下にあると想定されていない。これは、生理的条件下での正電荷はＲまたはＫ残基の正電荷に匹敵せず、本明細書において重要なのは生理的条件下での電荷であるからである。
【０１４２】
本出願全体を通じて、アミノ酸の標準一文字表記法が使用されることになる。典型的に、用語「アミノ酸」とは「タンパク質新生アミノ酸」、すなわちタンパク質に天然に存在するアミノ酸のことである。もっとも特定すると、アミノ酸はＬ異性体型である。Ｄアミノ酸も想定されているが、典型的に異なる凝集傾向がある。
【０１４３】
語句「タンパク質に天然に存在する一続きのＸ個の連続するアミノ酸」とは、本明細書で使用されている場合、Ｘは数字であるが、これらのＸ個のアミノ酸は、生物のタンパク質中、途切れない一続きとして、同じ順序で存在していることである。言い換えると、前記一続きはＸ個の残基の長さにわたりタンパク質の正確な配列と一致する。
【０１４４】
一続きのアミノ酸の「全電荷」は、正に荷電したアミノ酸の数の合計引く負に荷電したアミノ酸の数の合計またはその逆である。本明細書で使用されているように、全電荷は常に絶対値である。したがって、ストレッチが例えば、１個の正に荷電した残基と３個の負に荷電したアミノ酸を含有する場合、そのストレッチの全電荷は２である。
【０１４５】
本出願において使用されている用語「モノマー」は他のモノマーに化学的に結合してポリマーを形成することがある原子または小分子である。これは、アミノ酸（そのポリマーはポリペプチドまたはタンパク質である）、ヌクレオチド（そのポリマーは核酸である）または単糖（例えば、グルコース、そのポリマーはデンプン、グリコーゲンもしくはグルコース；またはキシロース、これはポリマーとしてキシランを有する。）などの天然モノマーのことでもよい。しかし、もっとも特定すると、モノマーはこれら３種の範疇以外では有機分子を指すために本明細書では使用され、これらの有機分子は、例えば塩化ビニルまたはイソプレンなどの合成または他の天然ポリマーを形成することができる。もっとも特定して想定されるモノマーはエチレンオキシドであり、そのオリゴマーまたはポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）と呼ばれることもある。
【０１４６】
モノマーという文脈では、「同じ性質の単位」は同じ一般構造のモノマーを指すために本明細書では使用されているが、必ずしも同一ではない。例えば、２つの異なるアミノ酸は同じ性質の単位であるが、アミノ酸と単糖は異なる性質の単位である。
【０１４７】
本明細書で使用されている「対象」は典型的に「動物対象」と「植物対象」の両方のことである。「動物対象」は、脊椎生物、さらに特定すると哺乳動物、もっとも特定するとヒトを指すために本明細書では使用されている。特に想定されている哺乳動物対象は、イヌ、ネコ、ウサギ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、マウス、ラット、モルモット、ロバ、ラバ、ケナガイタチ、ピグミーゴート、ポットベリーなどのペットとして飼われている哺乳動物、カナリア、インコ、オウム、ニワトリ、シチメンチョウなどの鳥類ペット、トカゲ、ヘビ、カメ、ウミガメなどの爬虫類ペットならびに魚、サンショウウオおよびカエルなどの水生ペットである。他の特に想定されている動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、サル、ケナガイタチおよびヒツジなどの毒物分析のために使用される種である。その上特に想定されているのは、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ウシ（乳牛）、シカ、ロバ、ガヤル、ヤギ、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ポニー、トナカイ、ヒツジ、スイギュウおよびヤクなどの家畜動物である。本明細書で使用されている「植物対象」とは、植物界由来の生物のことである。特に想定されている植物には、トウモロコシ、コメ、コムギ、ダイズ、オオムギ、モロコシ、アワ、カラスムギ、ライムギ、ライコムギ、ソバ、キノア、フォニオ、ヒトツブコムギ、デュラムコムギ、ジャガイモ、コーヒー、ココア、キャッサバ、茶、ゴムノキ、ココヤシ、アブラヤシ、サトウキビ、サトウダイコン、バナナの木、オレンジの木、パイナップルの木、リンゴの木、ナシの木、レモンの木、オリーブの木、ピーナッツの木、サヤインゲン、レタス、トマト、ニンジン、ズッキーニ、カリフラワー、ナタネ、ジャトロファ属（ｊａｔｒｏｐｈａ）、マスタード、ホホバ、アマ、ヒマワリ、緑藻類、ジュート、ワタ、アサ（または、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）の他の系統）、キャノーラまたはタバコなどのしかしこれらに限定されない換金作物（すなわち、利益のために栽培される作物）が含まれる。
【０１４８】
本出願全体を通じて使用されている「生物」とは、任意の連続する生体系（例えば、動物、真菌、微生物または植物）ならびにウイルス（これらはタンパク質を含有する別個の実体（「連続する系」でもあるので）のことである。特に想定されている生物は対象（上記参照）であり、対象ではない想定されている生物には、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）種またはカエノルハブディティス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）種のような無脊椎生物が含まれる。その上特に想定されているのは、微生物および／または病原生物である。
【０１４９】
本明細書で使用されている「感染」とは、寄生生物または病原体種（生物）による宿主生物（典型的には対象）のコロニー形成のことである。感染病原体または寄生生物は宿主の資源を使用して繁殖しようとし、多くの場合感染症を生じる。「感染症」とは、疾患に罹った対象または生物内または上での外部生物（病原体）の存在により引き起こされる任意の種類の疾患を指すために本明細書では使用されている。感染は通常、ウイルス、プリオン、細菌およびウイロイドのような微生物または小寄生生物により引き起こされると見なされているが、大寄生生物および真菌のようなもっと大きな生物も感染させることができる。感染を引き起こすことができる生物は本明細書では「病原体」（疾患を引き起こす場合）および「寄生生物」（宿主生物を犠牲にして利益を得、それによって明らかな疾患が存在していなくても宿主生物の生物学的適合性を減少させる場合）と呼ばれ、ウイルス、細菌、真菌、原生生物（例えば、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ））および原生動物（例えば、プラスモジウム、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ））（小寄生生物）ならびに蠕虫などの大寄生生物（例えば、回虫、フィラリア、鉤虫、ギョウチュウおよび鞭虫のような線虫または条虫および吸虫のような扁虫）、さらにマダニおよびダニなどの外寄生生物が含まれるがこれらに限定されない。寄生ダニ類、すなわち宿主生物を不妊化するまたは死滅させる寄生生物は用語寄生生物内に想定されている。前記分子を宿主生物を通じてではなく外寄生生物に直接投与することができる特定の実施形態によれば、外寄生生物は感染を引き起こす寄生生物という意味には含まれないことが想定されている。
【０１５０】
感染症は、動物である、特に哺乳動物である、もっとも特定するとヒトである対象について使用されることが多いが、感染症は植物にも適用されることが本明細書では想定されている（とりわけ、生物中の疾患に言及する場合）ことに留意されたい。実際、植物病原体も植物において感染を引き起こすことができ、真菌（例えば、アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、バシディオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、オオミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ））、細菌、フィトプラズマ（Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、ウイルス、線虫、原生動物および寄生植物が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５１】
本出願において使用されている「有害生物」または「植物害虫」とは、植物、特に農業において使用される植物に損傷を与える生物のことである。用語「植物害虫」は、前記有害生物が植物を標的にすることを意味するのに使用され、必ずしも前記有害生物が植物種であるとは限らないことに留意されたい。実際、有害生物は特に動物（植物を食べるまたは破壊する脊椎動物または無脊椎動物）、他の植物（作物雑草および寄生植物）、微生物およびウイルスである。もっとも特定すると、有害生物は無脊椎動物である（例えば、昆虫（農業有害昆虫、鑑賞用植物の害虫、森林の害虫、ヒト、動物または植物病原体の媒介昆虫を含む））。例には、アブラムシ、毛虫、ハエ、スズメバチなど、線虫（土壌中で自由生活をしているまたは特に根瘤線虫、ダイズ嚢胞線虫およびジャガイモ嚢胞線虫などの植物の根に寄生する種）、ダニ（例えば、クモダニ、ホコリダニおよびフシダニ）および腹足類（デロセラス属種（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ  ｓｐｐ．）、ミラックス属種（Ｍｉｌａｘ  ｓｐｐ．）、タンドニア属種（Ｔａｎｄｏｎｉａ  ｓｐ．）、リマックス属種（Ｌｉｍａｘ  ｓｐｐ．）、アリオン属種（Ａｒｉｏｎ  ｓｐｐ．）およびベロニセラ属種（Ｖｅｒｏｎｉｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）などのナメクジならびにヘリックス属種（Ｈｅｌｉｘ  ｓｐｐ．）、セルヌエラ属種（Ｃｅｒｎｕｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、テバ属種（Ｔｈｅｂａ  ｓｐｐ．）、コチリセラ属種（Ｃｏｃｈｌｉｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アカチナ属種（Ａｃｈａｔｉｎａ  ｓｐｐ．）、スクシネア属種（Ｓｕｃｃｉｎｅａ  ｓｐｐ．）、オバクラミス属種（Ｏｖａｃｈｌａｍｙｓ  ｓｐｐ．）、アンフィブリマ属種（Ａｍｐｈｉｂｕｌｉｍａ  ｓｐｐ．）、ザクリシア属種（Ｚａｃｈｒｙｓｉａ  ｓｐｐ．）、ブラディバエナ属種（Ｂｒａｄｙｂａｅｎａ  ｓｐｐ．）およびポマセア属種（Ｐｏｍａｃｅａ  ｓｐｐ．）などのカタツムリを含む）、病原真菌（アスコミセテス（例えば、フサリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、チエラビオプシス属種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、ベルチシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マグナポルテ属種（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐｐ．））、バシディオミセテス（例えば、リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、ファコスポラ属種（Ｐｈａｋｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、プッシニア属種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ．））および真菌様オオミセテス（例えば、ピシウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）およびフィトフトラ属種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．）を含む）、細菌（例えば、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．）ならびにザントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）およびシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）などのプロテオバクテリア）、フィトプラズマ、スピロプラズマ、ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルスおよびカリフラワーモザイクウイルス）ならびに原生動物が含まれるがこれらに限定されない。用語「有害生物」は、特に微生物とウイルスでは、感染関連「病原体」および「寄生生物」と著しい重複を示す。しかし、植物害虫では、植物を主食とする外寄生生物およ��（無脊椎）動物は常に前記定義に含まれる。
【０１５２】
「非感染性疾患」は感染性疾患ではないすべての疾患である、すなわち病原体により引き起こされることがなく、ヒトからヒトへ共有され得ない疾患である。非感染性疾患は、環境、栄養障害、生活様式選択または遺伝のいずれかにより引き起こされることがあり、例えば、大半の形態の癌、喘息および心臓疾患を含む。もっとも特定して想定される種類の非感染性疾患は、前記疾患に罹った生物の自己のタンパク質により引き起こされる生理障害である（例えば、異常発現を通じてまたは変異を通じて）。
【０１５３】
本出願において使用されているように、用語「薬物耐性」とは、疾患または状態を治癒させる際の薬物の有効性の減少のことである。特に、前記用語は病原体が獲得する耐性という文脈において適用される。生物が１つよりも多い薬物に耐性である場合、生物は多剤耐性であると言われる。本明細書で使用されている用語「抗生物質耐性」は、微生物が抗生物質への曝露を乗り切ることができる薬物耐性の一種である。抗生物質耐性を実際に決定するために、臨床ブレークポイントを使用することができる。抗生物質ブレークポイントは、成功する抗生物質療法を予想するための最大ＭＩＣ（最小阻害濃度、インキュベーション後の微生物の目に見える増殖を阻害することになる抗微生物薬の最低濃度）閾値である。抗生物質投与間隔中、この閾値のまたは未満のＭＩＣを有する生物は、（少なくとも）阻害されるまたは死滅させられると期待される。言い換えると、所与の生物に対する抗生物質のＭＩＣ値が所与の微生物に対するその抗生物質のブレークポイント値よりも高い場合、前記微生物は耐性であると言われる。臨床ブレークポイントは、ヨーロッパでは抗微生物薬感受性試験欧州委員会（ＥＵＣＡＳＴ）により試験されモニターされており、ブレークポイント値はそのサイトで見出すことができる。臨床ブレークポイントはまた、米国では臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）により別個に決定されており、これらはＦＤＡにより承認されている。
【０１５４】
薬物、特に抗生物質耐性は自然耐性であることが可能であり（例えば、薬物により標的にされるタンパク質は前記生物に存在していないからである）または獲得耐性であることが可能である（例えば、薬物により標的にされている遺伝子中に存在することができる変異を通じてまたは、例えば排出ポンプの活性を増加させ、そのために薬物（例えば、抗生物質）を微生物から取り除くことができる変異により）。代わりに、（抗生物質では）特定の抗生物質に耐性である微生物はその抗生物質に感受性である微生物（同じまたは異なる種由来）と遺伝情報を交換し、それによって感受性生物が耐性になることを意味する遺伝子水平伝播を通じて、耐性を獲得することができる。
【０１５５】
「バイオフィルム」は、本明細書で使用されているように、細胞が互いにおよび／または表面に接着する微生物の凝集体である。これらの接着細胞は、一般に様々な立体配置の細胞外ＤＮＡ、タンパク質および多糖類で構成されている自己生産マトリックス内に埋め込まれていることが多い。バイオフィルムは、多くの異なる種類の微生物、例えば、細菌、古細菌、原生動物、真菌および藻類を含有することができる。しかし、単種バイオフィルムも存在する。バイオフィルムに棲む微生物は通常、フィルムの濃密で保護された環境の結果として、同じ種の浮遊性の（プランクトン様の）微生物とは著しく異なる特性を有している。例えば、濃密な細胞外マトリックスおよび細胞の外層が群集の内部を保護しているので、洗浄剤と抗生物質に対する耐性が増加していることが観察される場合が多い。バイオフィルムは、カテーテル、ステント、人工心臓弁および子宮内避妊器具などの埋め込み型装置の不活性な表面上に形成されることが可能であるために、バイオフィルム形成はインプラント手術で遭遇することが多い問題である。
【０１５６】
本明細書で使用されている用語「配列同一性」とは、比較のウィンドウにわたりヌクレオチド対ヌクレオチドに基づいてまたはアミノ酸対アミノ酸に基づいて配列が同一である程度のことである。
【０１５７】
したがって、「配列同一性の百分率」は、比較のウィンドウにわたり２つの最適に整列させた配列を比較し、同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列中に存在する位置の数を決定して対応する位置の数を出し、対応する位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００をかけて配列同一性の百分率を出すことにより計算される。本発明の目的のために、「配列同一性」は、ソフトウェアに付いている参照マニュアルに使用されている標準デフォルトを使用するＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ｗｉｎｄｏｗｓ用２．５版；Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手可能である）により計算される「対応百分率」を意味すると理解されることになる。「類似性」とは、同一であるまたは保存的置換を構成するアミノ酸の百分率数のことである。類似性はＧＡＰなどの配列比較プログラムを使用して決定してもよい（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、３８７−３９５頁）。このようにして、本明細書に引用されている配列に類似するまたは実質的に異なる長さの配列は、アライメントへのギャップの挿入により比較してもよく、そのようなギャップは、例えばＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定される。
【０１５８】
本明細書で使用されている「マイクロアレイ」とは、固体基板上の２Ｄアレイのことである。マイクロアレイは多重アッセイ、すなわち単回アッセイにおいて複数の分析物（数十またはそれよりも多くまで）を同時に測定する、としての機能を果たすことができる。マイクロアレイは、マイクロフルイディクスを利用するチップ上のラボ装置であることが可能である。固体基板として、典型的にガラススライドまたはシリコン薄膜ジェルが使用されるが、他の材料も使用することが可能である（例えば、ニトロセルロース、プラスチック、など）。本明細書に提示されている分子はタンパク質に結合するので、分子で被覆されたマイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイ、タンパク質結合マイクロアレイまたはタンパク質チップと呼ぶこともできる。タンパク質マイクロアレイは一般に、生物医学的適用において使用されて、生体試料中のタンパク質の存在および／または量（相対的定量化と呼ばれる）を決定する。典型的に、本明細書に記載されたマイクロアレイでは、本出願の分子は、マイクロアレイ上にスポットされるまたは合成される捕捉分子として使用される。
【０１５９】
前記分子の構造
一般的構造
本明細書で提供される分子は、以下の式
（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれ独立して選択されるリンカーであり、Ｚｎはリンカーであるまたは非存在である］
を用いて記載することができる。
【０１６０】
したがって、この式は次の構造、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１（すなわち、ｎ＝１）、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２（すなわち、ｎ＝２）、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｘ６−Ｚ３（すなわち、ｎ＝３）、
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｘ６−Ｚ３−Ｘ７−Ｙ４−Ｘ８−Ｚ４（すなわち、ｎ＝４）および
Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２−Ｘ５−Ｙ３−Ｘ６−Ｚ３−Ｘ７−Ｙ４−Ｘ８−Ｚ４−Ｘ９−Ｙ５−Ｘ１０−Ｚ５（すなわち、ｎ＝５）［式中、番号が付けられたＸ、ＹおよびＺはそれぞれ上で定義された通りである。］を包含している。
【０１６１】
Ｙｉ部分：凝集−核形成領域
これらの分子中の番号が付けられたＹｉ部分はベータ凝集誘導領域である。すなわちこれらの領域は、特に標的タンパク質に接触させた場合、前記分子の凝集を誘導する原因となる。ここで、これらの領域の配列制約をさらに詳細に説明することにする。完全長タンパク質の凝集の動力学についての変異研究により、凝集とβシート傾向、疎水性および電荷などの物理化学的特性間の簡単な相関関係が明らかにされた。これにより、タンパク質のアミノ酸配列中で凝集を起こしやすい領域を同定するコンピュータアルゴリズムの開発が促進された。これらの１つが、ＤｏｂｓｏｎらのＺｙｇｇｒｅｇａｔｏｒアルゴリズムであり（Ｐａｗａｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５０：３７９−３９２頁（２００５））、前記アルゴリズムは、所与のアミノ酸配列の凝集傾向スコアを類似の長さの一組の配列について計算された平均傾向と比較することにより凝集を起こしやすい配列を同定する。一方、統計力学アルゴリズムＴＡＮＧＯ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｃａｍｉｌｌａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１３０２−１３０６頁（２００４））は、アミノ酸は凝集状態に完全に埋没しているという仮提により補われて（これはアミノ酸が完全に脱溶媒和されエントロピー的に制約されることを意味する。）、上記の物理化学的パラメータの平衡を保つ。入力配列から、ＴＡＮＧＯは広範囲な断片試料を生じ、この断片試料を巡ってヘリックスまたはヘアピン形成などの競合する構造的傾向が検討される。次に、前記断片はすべてグローバルパーティションサムに均衡が保たれ、これにより大部分が凝集体を形成する配列領域の同定が可能になる。ＴＡＮＧＯアルゴリズムは、一組の１７６個の実験的に確認されたペプチドについて９０％を超える精度を有している（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｃａｍｉｌｌａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１３０２−１３０６頁（２００４））。重要なことに、ＺｙｇｇｒｅｇａｔｏｒアルゴリズムもＴＡＮＧＯもペプチドおよび変性タンパク質についてうまく機能する。
【０１６２】
球状タンパク質では、部分的にフォールディングされた分子は、天然状態に再フォールディングすることも凝集状態にミスフォールディングすることもできる。その結果、両反応は競合し、その動力学の正確な理解は、フォールディングまたはミスフォールディング／凝集という観点から最終成果を予想するのに不可欠である。したがって、本発明という文脈では、凝集の誘導に動力学的に有利に働く配列を同定することが重要である。
【０１６３】
もっとも特定すると、前記配列は非アミロイドベータ凝集配列である（不定形ベータ凝集配列と呼ばれることもある）。アミロイドと非アミロイドベータ凝集は、高次構造の点で、凝集動力学の点でおよび凝集に適したタンパク質配列の点で異なる（Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１１８−１２６頁、２００６）。ＴＡＮＧＯまたはＺｙｇｇｒｅｇａｔｏｒにより予想されるβ凝集の配列空間をアミロイドーシスの配列空間と比較すると（例えば、Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  ｌａ  ＰａｚおよびＳｅｒｒａｎｏ、ＰＮＡＳ  １０１：８７−９２頁、２００４などの実験的研究から導かれる）、類似点が明らかになるが、両方の過程間の興味深い相違も明らかになる。実際、アミロイド形成と不定形クロスβ凝集の両方が、β鎖立体構造に適合するアミノ酸組成を必要とするので、配列空間の重複が期待されることになる。しかし、不定形クロスβ凝集体の構造は明確に定義されておらず、高度な柔軟性により特徴付けられると思われる。一方、アミロイド繊維の構造は準結晶性である。その結果、アミノ酸選好は不定形クロスβ凝集体よりもアミロイド繊維における方がはるかに位置特異的になる。配列空間における重複を考慮すると、具体的な実施形態は、少なくとも１つのＹｉ部分のベータ凝集配列は少なくとも不定形ベータ凝集には適していることを予測する。これらの実施形態によれば、不定形ベータ凝集が想定されておりアミロイド凝集は追加で起こってもよいし起こらなくてもよく、少なくとも非アミロイドベータ凝集が存在する限り、これは重要ではない。
【０１６４】
その厳密性が低い立体構造上の必要条件のせいで、β凝集は一般にアミロイドーシスよりもはるかに速いが、急速なアミロイドーシスも観察されている。β凝集体は繊維形成に至る経路上の前駆体として観察されることが多いので、これらの前駆体凝集体の安定性はアミロイドーシスの動力学に強い影響を与えることになる。極性アミロイド形成配列は、酵母プリオンタンパク質において観察されるように、はるかに低いβ凝集傾向を有することになり、したがってアミロイドーシスの動力学にとりはるかに有利になる。要約すると、不定形クロスβ凝集とアミロイドーシスは共通に起こることができ、両方の過程の安定性および動力学は、両方の過程の構造的必要条件がどの程度満たされるかにより決定されることになる。
【０１６５】
したがって、凝集の誘導に動力学的に有利に働くために、ベータ凝集配列だけでなく、非アミロイドベータ凝集配列も使用するのが望ましい。したがって、特定の実施形態では、少なくとも１つのＹｉ領域はアミロイドベータ凝集配列ではない。このようにして、標的タンパク質の急速凝集を達成することができる。一般に高度に疎水性の配列は不定形クロスβ凝集体を形成する強い傾向を有するが、立体的制約のせいでアミロイド繊維を形成しない。一方、一般により極性の配列ほどアミロイド繊維を形成する可能性が高くなる。これら２つの極端の間で、全域の挙動がおそらく観察されることになる。Ｔａｎｇｏアルゴリズムは、特に、高い凝集傾向および低いアミロイド傾向を有するベータ凝集配列を同定するのに非常に適している。実際、前記アルゴリズムはアミロイド傾向とベータ凝集傾向に別個のスコアを与える。
【０１６６】
Ｔａｎｇｏアルゴリズムは、他の文献にさらに詳細に記載されている（特に、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｃａｍｉｌｌａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１３０２−１３０６頁（２００４）、とりわけ１３０５および１３０６頁の方法セクションは参照により本明細書に具体的に組み込まれている。ＴＡＮＧＯアルゴリズムの較正および試験に使用される方法およびデータセットに関するさらなる詳細は同論文の補注１および２も参照されたい、さらに多くの背景はＷＯ２００７０７１７８９にも見出すことができる。）。手短に言えば、ペプチドの自己会合領域を予想するために、ＴＡＮＧＯは位相空間の分配関数を計算するだけである。特定のアミノ酸配列の凝集傾向を見積もるために、以下の仮定が立てられる、（ｉ）秩序のあるベータシート凝集体では、主二次構造はベータ鎖である、（ｉｉ）凝集過程に関与している領域は完全に埋没しており、したがって全溶媒和コストとゲインを支払い、エントロピーはいっぱいであり、それらの水素結合ポテンシャルを最適化する（すなわち、凝集体中に作られた水素結合の数は、アクセプターにより補償されるドナー基の数に関係している。過剰なドナーまたはアクセプターは満たされていないままである。）、（ｉｉｉ）選択されたウィンドウ内の相補的電荷は有利な静電気的相互作用を確立し、ウィンドウ内部、さらに外部でもペプチドの全体の正味電荷は凝集を嫌う。ＴＡＮＧＯはインターネット上でアクセスすることができる。
【０１６７】
配列ストレッチの高Ｔａｎｇｏスコアは、典型的に高い（および動力学的に有利な）ベータ凝集傾向を有する配列と一致する。したがって、それほど極性がなく完全に疎水性である「高ｔａｎｇｏスコアリング配列」の配列空間は、理想的なＹｉ（またはベータ凝集誘導、凝集核形成）部分を定義する。
【０１６８】
上で概説した式による分子において、Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択される場合に、最良の凝集特性は得られる。（しかし、それらが１個の正に荷電した残基および１個の負に荷電した残基である場合、２個のＲ、Ｋ、Ｄ、Ｅ残基が存在していてもよいことは言及しておくべきである。）極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉ領域は、そのＹｉ領域の正味電荷がゼロである限り、正確に２個の荷電残基（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅから選択される）を含有していてもよい。しかし、さらに特定すると、Ｙｉ領域はいかなる荷電残基（またはついでに言えばプロリン）も含有しない。
【０１６９】
この必要条件によれば、Ｙｉストレッチ中のアミノ酸の少なくとも５０％は疎水性アミノ酸である、すなわちＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ａ、ＣおよびＧから選択されるアミノ酸である。追加の特定の実施形態によれば、アミノ酸の少なくとも６０％は疎水性アミノ酸である、アミノ酸の少なくとも２／３は疎水性アミノ酸である、少なくとも７０％は疎水性アミノ酸である、少なくとも７５％は疎水性アミノ酸である、少なくとも８０％は疎水性アミノ酸である、少なくとも８５％は疎水性アミノ酸である、少なくとも９０％は疎水性アミノ酸である、少なくとも９５％は疎水性アミノ酸であるまたはアミノ酸のすべてさえ疎水性アミノ酸である。代わりに、Ｙｉストレッチ中の少なくとも３個のアミノ酸は疎水性アミノ酸である、特に少なくとも４個は疎水性アミノ酸である、さらに特定すると少なくとも５個は疎水性アミノ酸である、少なくとも６個または６個よりも多いまでも疎水性アミノ酸であると言える。
【０１７０】
収載されている疎水性アミノ酸の一部はベータ凝集を誘導するのにより良好に適している（これが前記配列に追加の必要条件が存在する理由である。）。特定の実施形態によれば、疎水性アミノ酸はＧを包含していない（その側鎖が小さすぎるためである）。他の特定の実施形態によれば、疎水性アミノ酸はＣを包含していない（考えられるジスルフィド架橋形成の結果として事態を複雑にする可能性があるからである）。さらに他の特定の実施形態によれば、疎水性アミノ酸はＫを包含していない（この残基の正電荷を考慮して）。さらに他の特定の実施形態によれば、疎水性アミノ酸はＨを包含していない（この残基の部分的な正電荷を考慮して）。したがって、具体的な実施形態は、Ｙｉストレッチ中の疎水性アミノ酸はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択されることを予測している。
【０１７１】
それぞれのＹｉストレッチでは、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＦ（脂肪族残基またはＦ）から選択される少なくとも１個の残基が存在する、もっとも特定すると、１個よりも多いそのような残基が存在する。Ｙｉストレッチ中の残基のうちの１個だけがＩ、Ｌ、ＶまたはＦ残基である場合、前記ストレッチ中の少なくとも１個の残基はＹ、Ｗ、Ｍ、ＴまたはＡから選択される。さらに特定すると、これらの実施形態では、少なくとも２個の残基はＹ、Ｗ、Ｍ、ＴまたはＡから選択される。極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の少なくとも２個の残基はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、ＹおよびＷから（すなわち、脂肪族または非荷電芳香族残基から）選択される。他の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の少なくとも３個の残基はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択される。追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の少なくとも４個の残基はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択される。他の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも４０％はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択される。追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも５０％はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択される。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも５０％はＩ、Ｌ、Ｖ、ＦおよびＹから選択される（すなわち、脂肪族残基またはＦまたはＹである）。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも５０％はＩ、Ｌ、ＶおよびＦから選択される（すなわち、脂肪族またはＦ残基である）。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも５０％は脂肪族残基である、すなわちＩ、ＬおよびＶから選択される。代わりの具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも６０％はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択される。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも６０％はＩ、Ｌ、Ｖ、ＦおよびＹから選択される（すなわち、脂肪族残基またはＦまたはＹである）。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも６０％はＩ、Ｌ、ＶおよびＦから選択される（すなわち、脂肪族またはＦ残基である）。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基の少なくとも６０％は脂肪族残基である、すなわちＩ、ＬおよびＶから選択される。さらに追加の代わりの実施形態によれば、前記残基の少なくとも３分の２はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、ＴおよびＡから選択されるまたは特にＩ、Ｌ、Ｖ、ＦおよびＹから選択されるまたはさらに特定するとＩ、Ｌ、ＶおよびＦから選択される（すなわち、脂肪族またはＦ残基である）またはＹｉストレッチ中の残基の少なくとも３分の２は脂肪族残基である（すなわち、Ｉ、ＬおよびＶから選択される）。代わりに、Ｙｉストレッチ中の少なくとも３個のアミノ酸、特に少なくとも４個のアミノ酸、さらに特定すると少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個または６個よりも多いアミノ酸までもが上記残基から選択されると言える。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の少なくとも３個のアミノ酸はＩ、Ｌ、ＶまたはＦから選択され、特に少なくとも４個のアミノ酸は脂肪族残基またはＦであり、さらに特定すると少なくとも５個のアミノ酸はＩ、Ｌ、ＶまたはＦ残基である。さらに追加の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の少なくとも３個のアミノ酸は脂肪族残基である、Ｙｉストレッチ中の少なくとも４個のアミノ酸は脂肪族残基であるまたはＹｉストレッチ中の少なくとも５個の残基は脂肪族残基である。
【０１７２】
他の具体的な実施形態によれば、ある種の疎水性残基の数はＹｉストレッチにおいて制限される。例えば、１つの（すなわち、少なくとも１つ、最大それぞれの）Ｙｉストレッチでは、１個以下のＣ残基が存在する。他の具体的な実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のＨ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のまたは２個以下のＧ残基が存在し、特に１個以下のＧ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のまたは２個以下のＴ残基が存在し、特に１個以下のＴ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のまたは２個以下のＭ残基が存在し、特に１個以下のＭ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のまたは２個以下のＷ残基が存在し、特に１個以下のＷ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のまたは２個以下のＡ残基が存在し、特に１個以下のＡ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、Ｙｉストレッチには１個以下のまたは２個以下のＹ残基が存在し、特に１個以下のＹ残基が存在する。他の実施形態に関して、これらの実施形態は排他的ではないことに留意されたい。すなわちこれらの制約のうちの２つ以上の組合せは所与のＹｉストレッチに適用されることがある。
【０１７３】
言うまでもなく、一定数以下の特定の残基が存在する場合、これらの特定の残基が１個も存在しないことが常に起こり得る。
【０１７４】
荷電アミノ酸ならびにプロリンは、典型的に所与のＹｉストレッチのベータ凝集ポテンシャルを減少させる。典型的に１個の荷電残基もしくはプロリンまたは特定の実施形態によれば、電荷が正反対である場合には２個の荷電アミノ酸は許容することができるが、ＹｉストレッチにはＰ、Ｒ、Ｋ、ＤおよびＥ残基はない。代わりに、前記ストレッチは１個以下のＰ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基（すなわち、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤおよびＥから選択される１個以下の残基）を含有する。極めて具体的な実施形態によれば、前記ストレッチは１個のＫ残基を含有していてもよいが、Ｐ、Ｒ、ＤまたはＥ残基は含有しない（リジン残基の疎水性を考慮して）。特定の実施形態によれば、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ残基はＹｉ領域に存在しない。追加の特定の実施形態によれば、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＨ残基はＹｉストレッチに存在しない。これは、Ｈ残基は部分的に正に荷電することができ、中性のＹｉ領域が一般に好ましいからである。
【０１７５】
少なくとも１つ（最大それぞれ）のＹｉ領域は最大電荷１を担っている、さらに特定すると電荷を担っていないことが特に想定されている。さらに特定すると、荷電残基の数は１を超えない、もっとも特定すると少なくとも１つ（特にそれぞれ）のＹｉ領域には荷電残基は存在しないことが想定されている。
【０１７６】
他の非排他的実施形態によれば、Ｙｉストレッチは、荷電残基を含有しない場合でも、７５％を超える極性非荷電残基、すなわちＹ、Ｗ、Ｔ、Ｑ、Ｓ、ＮおよびＨ（Ｃはここでは極性残基と見なされておらず、Ｈは荷電残基と見なされていない。）から選択される残基も含有しない。さらに特定すると、Ｙｉストレッチは６７％を超える極性非荷電残基を含有せず、さらに特定するとＹｉストレッチは６０％を超える極性非荷電残基を（または６０％未満の極性非荷電残基でさえ）含有しない。言い換えると、ストレッチが多くのＹ、ＷまたはＴ残基（これらは極性非荷電および疎水性である。）を有する場合でも、それでも無極性残基が十分に存在する必要がある。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチは５０％を超える極性非荷電残基を含有しない。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチは４０％を超える極性非荷電残基を含有しない。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチは３分の１を超える極性非荷電残基を含有しない。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチは２５％を超える極性非荷電残基を含有しない。
【０１７７】
非疎水性極性非荷電残基（すなわち、Ｓ、ＮおよびＱ）はＹｉ領域に存在していてもよいが、それらの数は制限されるのが好ましい。他の具体的な実施形態によれば、１個以下のＱ残基が存在する。他の具体的な実施形態によれば、１個以下のＮ残基が存在する。代わりの実施形態によれば、１個以下または２個以下のＳ残基がＹｉストレッチに存在し、特に１個以下のＳ残基が存在する。
【０１７８】
非芳香族極性非荷電残基（すなわち、Ｓ、Ｎ、ＴおよびＱ）はＹｉ領域に存在していてもよいが、前記残基は互いに隣接していない（すなわち、２つの連続する非芳香族極性非荷電残基は存在しない。）ことが特に想定されている。
【０１７９】
上記のことから明らかなように、特定の理由で特定の残基の存在を制限することが有益であることがある。残基の基の合計を制限することが有益であることもある。特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基はＣ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される残基を６０％を超えて含有しない。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基はＣ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される残基を５０％を超えて含有しない。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基はＣ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される残基を４０％を超えて含有しない。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基はＣ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される残基を３分の１を超えて含有しない。特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基はＣ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される残基を２５％を超えて含有しない。
【０１８０】
さらに他の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチは、これが荷電残基またはプロリンを含有しない場合でも、７５％未満のＶ以外の小残基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｎから選択される）、さらに特定すると６７％未満のＶ以外の小残基、さらに特定すると６０％未満のＶ以外の小残基も含有する。言い換えると、ストレッチが多くのＴおよびＡ残基を有する場合でも、それでも大きな疎水性残基が十分に存在する必要がある。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域中の残基のうちの５０％以下（５０％を含む）はＶ以外の小残基である。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域中の残基のうちの４０％以下はＶ以外の小残基である。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域中の残基のうちの３分の１（すなわち、３３．３３．．．％）以下はＶ以外の小残基である。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域中の残基のうちの２５％以下はＶ以外の小残基である。
【０１８１】
特に、小残基の数はＹｉストレッチにおいて制限されることが想定されている。Ｃはジスルフィド架橋形成に関与していない場合は、小残基と見なすことができるが、小残基はＡ、ＧおよびＳ残基であることが特に想定されている。特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基のうちの５０％以下がＡ、ＧおよびＳ残基である。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基のうちの４０％以下がＡ、ＧおよびＳから選択される。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基のうちの３分の１以下がＡ、ＧおよびＳから選択される。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中の残基のうちの２５％以下がＡ、ＧおよびＳ残基から選択される。
【０１８２】
代わりにまたはさらに、小残基の数は制限されることがある。これは特に非極性ＡおよびＧ残基に当てはまる。特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中のＡおよびＧ残基の総数は４個以下である。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中のＡおよびＧ残基の総数は３個以下である。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中のＡおよびＧ残基の総計は２個以下である。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチ中のＡおよびＧ残基の総計は１個以下である。
【０１８３】
配列特異的凝集を達成するために、凝集を誘導するために選択されるＹｉ部分は十分な配列複雑度を有することが想定されている。これは、特定のアミノ酸が多すぎる配列は配列特異的凝集に特に適していないことを意味する。例えば、ポリロイシンストレッチは典型的に配列特異的凝集を達成しない（たとえポリロイシンストレッチは十分に疎水性であり凝集することがあるとしても）。したがって、特定の実施形態によれば、３個以下の連続する同一アミノ酸がＹｉストレッチに存在する。さらに特定の実施形態によれば、２個以下の連続する同一アミノ酸がＹｉストレッチに存在する。具体的な実施形態によれば、脂肪族アミノ酸のみがＹｉストレッチにおいて同じアミノ酸に隣接していてもよい。すなわちこれらの実施形態によれば、２個の連続するＩ、ＬまたはＶアミノ酸のみがＹｉストレッチに存在することができる。追加の特定の実施形態によれば、３個以下の連続する同一の脂肪族アミノ酸はＹｉ領域に存在していてもよい。さらに追加の特定の実施形態によれば、２個以下の連続する同一の脂肪族アミノ酸はＹｉ領域に存在していてもよい。したがって、これらの実施形態によれば、２個の同一脂肪族アミノ酸のみがＹｉストレッチにおいて互いに隣接していてもよい。
【０１８４】
代わりのしかし排他的ではない実施形態によれば、単一の非脂肪族アミノ酸はＹｉストレッチにおいて３回を超えて存在しない（すなわち、非脂肪族残基について同一アミノ酸の数はＹｉストレッチにおいて３個に制限される。）。追加の特定の実施形態によれば、単一の非脂肪族アミノ酸はＹｉストレッチにおいて２回を超えて（または２回）存在しない。追加の特定の実施形態によれば、単一の非脂肪族アミノ酸はＹｉストレッチにおいて１回を超えて存在しない。代わりの実施形態によれば、単一の脂肪族アミノ酸はＹｉストレッチにおいて３回を超えて存在しない。追加の実施形態によれば、単一の脂肪族アミノ酸はＹｉストレッチにおいて２回を超えて存在しない。
【０１８５】
他の特定の実施形態によれば、特定のアミノ酸はＹｉストレッチ中の残基のうちの５０％超を占めることはない（すなわち、Ｙｉストレッチの半分以下は特定のアミノ酸で構成されている。）。追加の特定の実施形態によれば、単一のアミノ酸はＹｉストレッチ中の残基のうちの４０％超を占めることはない。さらに追加の特定の実施形態によれば、アミノ酸はＹｉストレッチ中の残基のうちの３分の１超を占めることはない。
【０１８６】
さらに他の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチはジアミノ酸リピートで構成されることはなく、含有することさえない。ジアミノ酸リピートは、２個の同一でない残基の３つ以上または２つ以上のリピートさえも意味する。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチはトリアミノ酸リピートで構成されることはなく、含有することさえない。トリアミノ酸リピートは、これらのうちの少なくとも２個は同一でない３個の残基の３つ以上または２つ以上のリピートさえも意味する。例として、イソロイシンおよびトリプトファンはＹｉ領域において完全に受け入れ可能であるが、排他的にＩＷまたはＩＩＷリピートで構成されているＹｉ領域は配列特異的凝集に特に適していないことにもなる。配列特異的凝集はこれらの配列のいずれについても除外されていないが、もっと複雑な配列を使用して特異的凝集を達成する方が好ましいことに留意されたい。
【０１８７】
凝集ストレッチの長さは典型的に、望ましい特異性と疎水性配列の合成のコストと容易さ間のトレードオフである。図２に示されるように、配列は所与の生物のプロテオーム内で比類するものがないほど長い必要はない。例えば、タンパク質に存在する５個のアミノ酸の長さを有する配列の６０％は、ヒトにしか含まれない（すなわち、そのような配列の４０％のみが１回よりも多く存在する。）。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのそれほど複雑ではないゲノムを有する生物では、ゲノムにコードされている５個のアミノ酸の配列の８０％超が他には含まれない。特異性の増加が止まることが前記図から見て取ることが可能であり、そのため特異性を達成するのに非常に長い配列を使用する必要はまれにしかない。特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域は少なくとも５個の残基を含有する。さらに追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域は少なくとも６個の残基を含有する。他の非排他的な特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域は最大で１２個の残基を含有する。さらに追加の実施形態によれば、Ｙｉ領域は最大で１１個の残基を含有する。さらに追加の具体的な実施形態によれば、Ｙｉ領域は最大で１０個の残基を含有する。
【０１８８】
いくつかの例では、所与の生物にしか含まれないわけではない配列を用いて取り組むのが望ましいこともある。これは、例えば、病原生物の増殖を阻害するおよび／またはそれを死滅させる方が１つの特定のタンパク質のみを標的にするよりも重要である、（非自己）病原体に向けられた適用に当てはまる。前記図から見て取ることができるように、ベータ凝集ストレッチは典型的にこれらの実施形態ではより短く、そのためにより多くのタンパク質を標的にすることができる。
【０１８９】
Ｙｉストレッチの不必要な伸長を避けるために、特定の実施形態によれば、ＹｉストレッチのＮ−および／またはＣ−末端残基は、特にβ凝集を受け入れることができる残基、特にＩ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択される残基であることが想定されている。追加の特定の実施形態によれば、ＹｉストレッチのＮ−および／またはＣ−末端残基（すなわち、Ｎ−およびＣ−末端残基から選択される少なくとも１つまたは最初のおよび／もしくは最後の残基）は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、ＹおよびＷから選択される。追加の特定の実施形態によれば、ＹｉストレッチのＮ−および／またはＣ−末端残基はＩ、Ｌ、Ｖ、ＦおよびＹから選択される。さらに追加の特定の実施形態によれば、ＹｉストレッチのＮ−および／またはＣ−末端残基はＩ、Ｌ、ＶおよびＦから選択される。さらに追加の特定の実施形態によれば、ＹｉストレッチのＮ−および／またはＣ−末端残基はＩ、ＬおよびＶから選択される（すなわち、脂肪族残基である）。追加の特定の実施形態によれば、これらの制限はＹｉストレッチのＮ−およびＣ−末端残基の両方に適用される。
【０１９０】
特に配列依存的な様式でタンパク質を特異的に下方調節することができる分子を提供することが目的であるために、分子中のＹｉの少なくとも１つが、タンパク質に天然に存在する連続する一続きと同一の一続きの４個から１７個（特に４個から１６個または４個から１５個）のアミノ酸である分子が特に想定されている。タンパク質中のこの連続するストレッチはＹｉ部分の同族領域であると言うことができる。追加の具体的な態様によれば、このことは、分子中の１つよりも多いＹｉについて、特に分子中の２つのＹｉまたは少なくとも２つのＹｉについて、もっとも特定すると分子中のすべてのＹｉについて当てはまる。しかし、極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉはタンパク質に天然に存在する一続きと同一でない。これは、例えば、Ｙｉが人工タグ中の配列と同一である人工タグを有するタンパク質について想定されている。人工配列設計により配列の凝集傾向を決定するのにより大きな自由度が与えられるので、そのようなタグは有用であることが可能である。このようにして、明確な核凝集領域のないタンパク質を標的にすることが実行可能になる。
【０１９１】
少なくとも１つのＹｉストレッチは特異性を与えるので、このストレッチが１個または２個のアミノ酸の繰り返しストレッチ（例えば、ポリロイシンストレッチまたは交互に現れるロイシンとバリン）（の一部）と一致しないことがいくつかの実施形態では特に想定されている。これは、特にｎ＝１である実施形態について当てはまる。追加の特定の実施形態によれば、Ｙｉストレッチはその配列中に少なくとも３個の異なるアミノ酸を含有する。
【０１９２】
しかし、特定の実施形態によれば、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する連続する一続きと同一であり、同じ分子中の少なくとも１つの他のＹｉはそのゲノム中に標的タンパク質がコードされている生物におけるタンパク質中のストレッチと同一でない。後者のＹｉは典型的に「ブースター」配列、すなわち非常に高い凝集傾向を有することが知られている配列である。この配列は凝集の動力学を改良するまたはもっと低い濃度で確実に標的タンパク質の凝集が起こる／開始されるようにすることができる。そのような配列は合成でも可能でありまたは別の生物／種に存在する配列（すなわち、配列ストレッチと同一であるまたは高度に類似している）に由来することも可能である。
【０１９３】
１つのタンパク質の特異的ターゲティングが想定されている場合、タンパク質に天然に存在する少なくとも１つの一続きの４個から１５個の連続するアミノ酸は、確実に生物中の１つのタンパク質だけが実際に標的にされるように、そのゲノム中に前記タンパク質がコードされている生物（または種）中の前記タンパク質にしか含まれないべきである（すなわち、前記生物／種のプロテオーム中で他には含まれないべきである）。前記唯一性は典型的に、特定のゲノム（すなわち、下方調節されるタンパク質が存在する生物のゲノム）において必要なだけである。実際、前記配列がインターフェラーが投与されない（または、インターフェラーがその標的に到達することができない）別の生物に存在する場合、これは問題とはならない。このことは、異なる生物、典型的には微生物または病原生物中のタンパク質が標的にされることが問題とはならない例にも適用される。
【０１９４】
特に、病原体を標的にするまたは感染を治療するもしくは安定化する場合、１つよりも多いタンパク質を標的にしてもよいことが想定されることもある。これらの場合、前記タンパク質配列は生物のゲノムにしか含まれない必要はない。しかし、前記配列はそれでも前記生物または種にしか含まれないことがある。これは、本明細書に記載された分子が１つよりも多い異なる種（例えば、微生物の混合物）に同時に投与されるが、１つの種においてのみタンパク質（複数可）が下方調節される必要がある場合に想定されることがある（例えば、病原体種を標的にするが、非病原生物または有益な生物には干渉しない。例えば、このことは、例えば、抗微生物タンパク質を標的にするインターフェラー分子をヒト対象に投与する場合にも適用され、そのような場合には、Ｙｉ部分の配列はヒトタンパク質の配列と同一でないまたは少なくともインターフェラーが接触することができるヒトタンパク質と同一でないべきであることに留意されたい。）。追加の特定の実施形態によれば、前記配列は前記タンパク質にしか含まれず、前記生物／種にしか含まれない。
【０１９５】
種の代わりに、上記の考慮すべき点は、生物の属、科、目または綱にも適用することができるが、配列保存および類のない配列を見出す可能性は分類学的階級が高くなるに従って減少する。
【０１９６】
存在する少なくとも２つのＹｉ部分（ｎが少なくとも２である実施形態において）は同一でもよく（すなわち、同じタンパク質（複数可）を標的にする、本明細書では「縦列反復ペプチド」と呼ばれることもある）、異なっているが同じタンパク質に存在していてもよく（同じタンパク質を異なる形で標的にする、すなわち、少なくとも２つの異なる「アグレトープ」または凝集領域が標的にされる「バイアグレトープ」インターフェラー）、異なっていて異なるタンパク質に存在していてもよい（生物中の１つよりも多いタンパク質を標的にする（すなわち、真の二重特異性インターフェラー）またはインターフェラーが１つよりも多い（微）生物に投与されるもしくは接触させられる場合、異なる生物中のタンパク質を標的にする）。「生物に投与する」は間接的投与でもよいことに留意されたい。例えば、病原体の場合、インターフェラーは宿主生物（典型的には対象、植物または動物対象のどちらか）に投与されて病原生物を標的にすることが想定されている。これらの例におけるインターフェラー分子は、病原生物中に存在する少なくとも１つの凝集配列を含有することになり、この配列が存在するタンパク質を凝集させることを目標にしているので、これは「前記分子を病原生物に投与する」として解釈するべきであり、この点に関して重要なのは接触すること（標的に到達すること）であることは、当業者には明らかである。
【０１９７】
一般に、特異的ターゲティングを達成するために、Ｙｉ領域と対象のタンパク質中の配列ストレッチ間の完全な対応が想定されている。しかし、いくつかの例では、同一ではないが密接に関連している配列、すなわち１つまたは２つの置換を有する配列を使用できることが想定されている。特異性を維持するために、非保存的置換では、６個未満のアミノ酸のＹｉストレッチでは、１つのアミノ酸相違のみが許容されることが想定されている。少なくとも６個のアミノ酸（特に、少なくとも７個または少なくとも８個のアミノ酸）の配列では、１個または２個のアミノ酸を置換することができる。代わりに、Ｙｉと対象のタンパク質中の凝集ストレッチ間の配列同一性は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれよりもさらに高い。保存的置換の場合は、Ｙｉと対象のタンパク質中の凝集ストレッチ間の配列同一性は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれよりもさらに高い。
【０１９８】
当業者であれば理解するように、（特に非保存的）置換を行うと特異性が変化する（すなわち、ストレッチを生物中の別のタンパク質のストレッチとまたはインターフェラーが接触することが可能な別の生物中のタンパク質のストレッチと同一にする）ことがあるので、変化したターゲティングが望ましくない場合はこうしたことが起きているのかどうかを確認するべきである。（いくつかの例では、１つよりも多いタンパク質を標的にするのが望ましいことがある、下記も参照。）
【０１９９】
保存的置換は、アミノ酸を生化学的特性が類似する（例えば、脂肪族である、芳香族である、正に荷電している、など）側鎖を有する他のアミノ酸で置換することであり、当業者には周知である。次に、非保存的置換は、アミノ酸を生化学的特性が類似していない側鎖を有する他のアミノ酸で置換することである（例えば、疎水性残基を極性残基で置き換える）。保存的置換は典型的に、もう同一ではないがそれでも高度に類似している配列を生じることになる。
【０２００】
置換を導入する理由は様々であり得る。特定の実施形態によれば、置換はゲートキーパー残基で、特にＲ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｑから選択される、さらに特定するとＲ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定するとＲ、ＫおよびＰ残基から選択される残基で行われる。これは可溶性を改良するもしくは自己凝集を減少させる（疎水性Ｙｉ領域のベータシート形成ポテンシャルを「破壊すること」により）ためにまたは凝集は維持しつつ特異性を減少させるために想定されてもよい（これは実施例３において例証されている。）。そのような置換は一般に特異性を減少させるが、いくつかの実施形態では、これは凝集誘導配列にもっと容易に接近できる（疎水性領域を「広げること」により）ように想定されてもよい。これは特に、特異性よりも凝集の方が好まれる実施形態（例えば、抗微生物薬適用において）に当てはまる。
【０２０１】
代わりの実施形態によれば、置換は保存的置換である。これは、タンパク質のファミリーを下方調節することが想定されており、タンパク質は、保存されているが同一ではない配列モチーフを共有している場合に想定される。そのような例では、これらの密接に関連しているタンパク質の凝集は、コンセンサス配列モチーフ（すなわち、類似しているが同一ではない配列であり、「類似している」は配列アライメントという文脈で使用されている）を使用して達成することができる。しかし、配列対応が１００％ではない場合の方が、凝集が効率的ではないことがあり得る。
【０２０２】
置換を検討する別の理由は、配列の固有の凝集傾向を増加させることである。例えば、特定の残基をもっと高いベータシート傾向または凝集ポテンシャルを有する残基で置き換えることを検討することが可能である。これは必ずしも保存的置換ではない。ベータシート傾向または凝集ポテンシャルを決定する方法は当技術分野で周知である。例として、特定の残基のベータシート傾向はチョウ−ファスマンパラメータを考慮に入れて決定することができる（Ｃｈｅｎら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７（Ｓｕｐｐｌ  ４）：Ｓ１４、２００６）。Ｐ（ｂ−シート）スコアが１００未満である１個以上の残基は、Ｐ（ｂ−シート）が１００スコアを超える残基で置き換えることができる。チョウ−ファスマン法において高スコアリングベータシート残基は（降順に）、バリン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、スレオニン、システイン、グルタミンおよびメチオニンである。特に、ベータシート形成ポテンシャルを増加させるために、バリンまたはイソロイシンを用いた置換が想定されている。当然のことながら、特異性は常に確認するべきであり、ここで再び、特異性よりも凝集の方が好まれる適用のために置換が特に想定されている。
【０２０３】
Ｙｉ部分がタンパク質に存在するストレッチと同一である必要がある場合、特定の凝集誘導配列を、タンパク質配列において一見して（上記の指針を使用して）またはこれらの必要条件を満たす配列ストレッチを同定する特定のアルゴリズムを使用して同定することができる。同じまたは他の方法またはアルゴリズムを使用すれば、配列が他のタンパク質にも存在する（または他の生物のゲノム中にコードされている）かどうかを確認することが可能である。
【０２０４】
タンパク質中のそのような配列を同定する１つの特に簡単な方法は、まずベータ凝集予想アルゴリズムを使用し（好ましくは生物物理学的パラメータを考慮に入れて）、上記の配列制限に基づいてもっとも適当な配列を選択することによる。ＴａｎｇｏおよびＺｙｇｇｒｅｇａｔｏｒはそのようなアルゴリズムの例として既に収載されたが、Ｂｒｙａｎら、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．５（３）：ｅ１０００３３３、２００９；Ｃａｆｌｉｓｈ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０（５）：４３７−４４頁、２００６；Ｃｏｎｃｈｉｌｌｏ−Ｓｏｌｅら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ８：６５頁、２００７；Ｇａｌｚｉｔｓｋａｙａら、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２９；２（１２）：ｅ１７７、２００６；Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔら、ＰＮＡＳ  １０７（８）：３４８７−９２頁、２０１０；Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｔｒｏｈら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７（３）：２３７−４２頁、２０１０；Ｒｏｊａｓ  Ｑｕｉｊａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５（１４）：４６３８−５２頁、２００６；Ｓａｉｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４３（４）：１２６２−７１頁、２００６；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５：１８頁、２００５；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４（１０）：２７２３−３４頁、２００５；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３８０（２）：４２５−３６頁、２００８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＰＮＡＳ  １０３（１１）：４０７４−８頁、２００６；Ｔｒｏｖａｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０（１０）：５２１−３頁、２００７；ＹｏｏｎおよびＷｅｌｓｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１３（８）：２１４９−６０頁、２００４；Ｚｉｂａｅｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１６（５）：９０６−１８頁、２００７により記載されたアルゴリズムを含むがこれらに限定されないさらに多くのアルゴリズムが当技術分野で記載されている。これらの多くは主にアミロイド凝集配列に関わっており、不定形ベータ凝集に関わっているだけではないことに留意されたい。前に説明したように、反応の動力学と条件が対象のタンパク質の凝集に有利に働く限り、両方の形態の凝集重複の配列空間（Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１１８−１２６頁、２００６）および両方の形態の凝集が想定されている。しかし、典型的に、そのようなアルゴリズムは、本明細書で定義されたＹｉ配列制限を満たさない極性ストレッチ（例えば、酵母プリオンタンパク質に存在するストレッチ）も同定することがある。
【０２０５】
Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉ部分：ゲートキーパー残基
本明細書に記載されたインターフェラー分子では、凝集誘導配列は、ベータ凝集ポテンシャルが低い１個から４個の特定のアミノ酸（Ｘｉ部分）が両側で隣接している。これらはゲートキーパー残基と呼ばれることもあり（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４１：５７５−５８８頁、２００４）、インターフェラー分子が（特に標的タンパク質に接触するのに先立って）自己凝集することを防ぐのに不可欠である。
【０２０６】
タンパク質の天然状態では、凝集は天然に存在する荷電残基により阻止されるまたは妨害されることが多いが、例えば、凝集配列セグメントの側面のプロリンおよびグリシンにも阻止されるまたは妨害される。これらはゲートキーパー残基、すなわち必ずしもその天然状態を安定化するわけではないが、例えば、立体的または静電気的衝突により好ましからざるミスフォールドされたまたは凝集した状態の形成を妨げる残基として効果的に作用する。凝集を起こしやすい配列に荷電残基であるプロリンまたはグリシンを導入すると凝集が減少することも何回か報告されている。プロリンとグリシンの凝集妨害特性は、主にそれらの構造破壊特性に由来する。同一荷電残基も、自己集合すると生じる大きな反発力のせいで、凝集を妨害するのに非常に効果的である。興味深いことに、天然では、強く凝集する配列の側面にはグルタミン酸およびアスパラギン酸よりもアルギニンおよびリジンの方が好まれる（Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５５：１０３７−１０４７頁、２００６）。この選好の理由は、電荷に加えて、アルギニンおよびリジンははるかに大きな立体構造エントロピーも有しており、濃密に詰まった凝集体中でアルギニンおよびリジンを固定化するのは非常に負担が大きくなるからである可能性がある。
【０２０７】
ＷＯ２００７０７１７８９出願では、そのようなゲートキーパーは凝集傾向を減少させると述べられていた。インターフェラーと所与の標的タンパク質との共凝集を最適化するために、インターフェラーに含まれる標的タンパク質の自己会合領域はゲートキーパー残基が凝集促進残基で置き換えられるように変異させることが可能である。言い換えると、ゲートキーパーの存在は望ましくないと見なされていた。
【０２０８】
この時点で、驚くべきことに、Ｙｉ部分を構成する強いベータ凝集領域では、前記領域にゲートキーパー（すなわち、２つの番号が付けられたＸ部分）を隣接させると実際それらの自己凝集傾向が減少するが、完全長タンパク質の凝集を誘導するそれらの能力に実質的に干渉することはないことが実証されていた。一方では、高い疎水性および内因性の凝集傾向にもかかわらず、これらの分子はそれでも溶解したままであり、他方では前記分子中に与えられるゲートキーパーの効果は（完全長）タンパク質と前記分子の共凝集を妨げないことは驚きである。この特色の類のない組合せにより、本明細書で提供される分子は誘導されたタンパク質凝集を達成するのに特に適する。
【０２０９】
これらのゲートキーパー残基は特に、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱ残基から選択される。アラニン残基も使用してよいが、これらの残基はＹｉ部分にも存在することができるので、本明細書で使用されているＸ部分はＡ残基だけで構成されることはないことが特に想定されている。さらに具体的には、Ａ残基はＸ部分の別の一部がＲ、Ｋ、Ｐ、ＤまたはＥから選択される少なくとも１個の残基である場合にのみゲートキーパーとして使用されることが想定されている。
【０２１０】
ＧおよびＰの例外はあるが、これらはすべて極性残基であることに留意されたい。ＧおよびＰ残基は、これらの特定の側鎖構造（プロリン）またはその欠如（グリシン）のせいで良好なゲートキーパーである。Ｓ、Ｈ、ＮおよびＱは極性残基であるが、ベータ凝集ストレッチでは低い数では許容することができる（上記参照）。類似の考慮すべき点はＧ残基について適用される。
【０２１１】
特定の実施形態によれば、隣接するＸ部分の残基はこれらの隣接部分間のＹｉ部分には存在しない残基である。
【０２１２】
これらの例では、Ｘ部分は典型的にＲ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、ＰおよびＨから選択される１個から４個のアミノ酸である。さらに特定すると、Ｘ部分はＲ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸である。さらに特定すると、Ｘ部分はＲ、ＤおよびＰから選択される。Ｐは、ベータシート構造を非常に効率的に破壊するので、ゲートキーパーのこの選択に残ることに留意されたい。しかし、特定の実施形態によれば、とりわけｎが１の場合、Ｐはゲートキーパーとして想定されていない。
【０２１３】
通常、１個または２個のアミノ酸で、ベータシートを破壊し、前記分子を溶解させておくのに十分である。短いＸ部分ほど、それらの「ゲートキーパー」機能、すなわち疎水性Ｙ部分を区分するおよび／または提示するのに効率的であるままで合成の容易さおよびコストの点で有益である。したがって、いくつかの特定の実施形態では、Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉがそれぞれ、１個または２個のアミノ酸である（互いから独立して選択することができる）。
【０２１４】
同様に、電荷が制限されているペプチドは、対象のタンパク質との相互作用を容易にし、それでも水素結合の可能性を提供し、静電反発力の危険を減少させることがある。したがって、代わりのしかし排他的ではない実施形態によれば、Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉのそれぞれが２以下の総電荷を有する。代わりに、両方のＸ部分のアミノ酸の総数は５以下であり、特に４以下である。代わりの実施形態は、疎水性Ｙ領域を取り囲む両方のＸ部分の総電荷は５未満であり、特に４以下であることを提供する。この段落の実施形態はもっとも特定するとｎが１である分子またはｎが２である分子について想定されている。
【０２１５】
Ｙｉ部分は荷電残基を含有しないことが特に想定されているので、前記分子の総電荷は典型的にｎが１である場合は５を超えず、ｎが２の場合は１０を超えないことになる。ｎが２である分子では、前記分子の総電荷は２から１０の間、さらに特定すると２から８の間、さらに特定すると４から８の間、さらに特定すると２から６の間（例えば、３、４、５）、４、５または６などの４から６の間であることが特に想定されている。前記電荷は分子間に大体均等に分配されている、すなわちＸ部分はすべて類似する電荷を有する（言い方を変えれば、分子に含有されるＸ部分間の電荷の相違は特に１以下である）ことが特に想定されている。具体的な実施形態によれば、前記分子は中性ではない、すなわち電荷をいくらか含有する。これは、荷電部分が典型的に、特異性を獲得するのに、すなわち前記分子のＹｉ部分をほぼ完全に同一のまたは完全に同一のポリペプチドストレッチとのみ相互作用させるのに役立つことになるからである。さらに、前記電荷は、前記分子の自己会合および早発凝集（すなわち、標的の共凝集なしで）を防ぐのを助けることがある。したがって、具体的な実施形態では、少なくとも１つの（最大それぞれの）番号が付けられたＸ部分は１または２の電荷を有する。無駄を出さないために、Ｘ部分は主としてまたは排他的に前記部分内の同一荷電残基で特に構成されている。Ｘ２ｉ−１部分が一致するＸ２ｉ部分の電荷とは異なる符号の電荷を有することは起こり得る。
【０２１６】
特定の実施形態によれば、Ｙｉ領域を取り囲むＸ２ｉ−１とＸ２ｉは同一である。追加の実施形態によれば、前記分子内のＸ２ｉ−１はそれぞれがＸ２ｉのそれぞれと同一である。さらに追加の実施形態によれば、前記分子内のＸ２ｉ−１とＸ２ｉはすべてが同一である。他の具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの、特にすべてのＸ２ｉ−１の残基は一致するＸ２ｉの残基の配列順の鏡映を作る。すなわち、Ｘ２ｉ−１のゲートキーパー残基が例えばＮ−Ｐである場合（すなわち、プロリンアミノ酸のアスパラギンアミノ酸Ｎ−末端）、Ｘ２ｉの残基はＰ−Ｎである（プロリン残基のアスパラギンＣ−末端）。
【０２１７】
代わりの実施形態によれば、少なくとも１つの、特にすべてのＸ２ｉ−１の電荷はその一致するＸ２ｉと同じ符号を有する。追加の具体的な実施形態によれば、少なくとも１つの、特にすべてのＸ２ｉ−１の電荷は一致するＸ２ｉの電荷と同一である。同一荷電残基の方が自己会合を通じた凝集を強く妨害する。他の実施形態によれば、前記分子のすべてのＸ部分の電荷は中性であるまたは同じ符号を有する、のどちらかである。これは前記分子間の静電気引力を妨げるのを助けることがある。
【０２１８】
いくつかの極めて具体的な実施形態によれば、Ｙｉ領域に隣接する少なくとも１つのＸ部分の少なくとも一部は対象のタンパク質にも存在する。実際、タンパク質中の疎水性配列にはゲートキーパー残基が隣接して、凝集を防いでいることが多い。少なくとも１つのＹｉがタンパク質に天然に存在する配列と同一である具体的な実施形態によれば、前記分子のＸ部分でＹｉに隣接している少なくとも１つのゲートキーパーはタンパク質に存在するゲートキーパー残基と同一である。このことは特に、Ｙｉ配列がタンパク質中のゲートキーパー間の完全な配列と一致しており、そのために前記分子の配列が、少なくとも１つのＹｉストレッチおよび前記Ｙｉストレッチに隣接する少なくとも１つのＸストレッチの少なくとも一部ではタンパク質の配列と一致している例で当てはまる。このことは、天然に隣接するゲートキーパー（複数可）がそれほど強くない、すなわち、例えばＮまたはＳなどのＹｉストレッチの一部であることも可能である残基であるタンパク質にも特に適用される。したがって、前記分子と対象のタンパク質の配列が、前記分子のＹｉストレッチよりも少なくとも１個のアミノ酸分長い連続する領域にわたり一致する（すなわち、タンパク質中の凝集配列の少なくとも１つの隣接するゲートキーパーが前記分子に含まれる。）。
【０２１９】
代わりの特定の実施形態によれば、ゲートキーパー部分はＹｉ部分とタンパク質中のその同族領域との相互作用を容易にするまたは安定化することが想定されている。これは、タンパク質中の凝集領域に（Ｎ−および／またはＣ−末端側で）隣接する残基が電荷を担っている場合に当てはまることがある。類似する電荷による反発の機会を減らし、したがって相互作用の機会を最大にするために、Ｘ２ｉ−１および／またはＸ２ｉゲートキーパーの電荷はタンパク質中の隣接配列の電荷に相補的であるように選択することができる。これを例を用いて説明すると、酵母中のカルシニューリンタンパク質（実施例１．５参照）は、タンパク質配列中に荷電残基が隣接する２つの凝集誘導領域を有する。前記２つのタンパク質領域は以下の通りである、ＮＫＬＲ  ＦＡＦＮＩＹ  ＤＩＤＲＤ（配列番号１００）およびＧＮＧＥ  ＬＦＩＶＭ  ＫＭＭＶ（配列番号１０１）（２つの凝集領域（下線部）がそれらのＮ−またはＣ−末端の４個または５個の隣接残基と共に示されている。）。ＮＫＬＲ（配列番号１０２）は２個の正に荷電したアミノ酸を有し、ＤＩＤＲＤ（配列番号１０３）の正味電荷はマイナス２である（３個の負に荷電したＤ残基、１個の正のＲ残基）。したがって、ゲートキーパー部分が相補的電荷を有する実施形態では、ＦＡＦＮＩＹ（配列番号１０４）のＮ−末端のＸ部分は負に荷電しているべきであり、Ｃ−末端側のＸ部分は正に荷電しているべきである。ＬＦＩＶＭ配列（配列番号１０５）では、その反対が適用される、すなわち、この配列にはそのＮ−末端側では負電荷がカルシニューリンタンパク質において隣接しており、そのカルボキシ末端では正のＫ残基が隣接している。したがって、相補的ゲートキーパーを有する分子はＮ−末端に正電荷を他方の端部には負電荷を有する。実施例１．５では、これは構築物６および７に当てはまる。
【０２２０】
ＤＩＤＲＤ（配列番号１０３）例から明らかなように、反対の電荷が隣接領域に存在していてもよい。正味電荷を決定するために、典型的に前記配列に隣接する７個以下のアミノ酸、好ましくは、５個、４個または３個などのさらに少ないアミノ酸が考慮に入れられる。次に、正味電荷はこのストレッチにおける残基の電荷の合計である。凝集誘導ストレッチに直に隣接する残基は実際の電荷により重要な寄与をすることが多い。したがって、例えば、正に荷電した残基が凝集配列に直に隣接しており、負の残基が、例えば４個のアミノ酸さらに下流または上流にある場合、直に隣接する残基からの荷電効果ははるかに強くなるので、その側面は中性ではなく正に荷電していると見なすことができる。もっとも特定の実施形態によれば、凝集を起こしやすい配列に直に隣接している残基だけが天然の配列の電荷を決定するのに考慮に入れられる。
【０２２１】
Ｚｉ部分：リンカー
上記の式で概説したように、本明細書に記載された分子はリンカー部分、Ｚｉも含有する。特定の実施形態によれば、前記分子は内部リンカーのみを含有し、Ｎ−またはＣ−末端リンカーは含有しない（本明細書で使用されている式（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎは式（Ｚｉ−Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ）ｎと同等であり、Ｚ２からＺｎはそれぞれリンカーであり、Ｚ１はリンカーまたは非存在から独立して選択されることを思い出されたい。）。言い換えると、前記分子はこれらのＮ−およびＣ−末端の両方にゲートキーパー残基（すなわち、Ｘ部分）を有する。これは以下の式、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ）ｎ「式中、ｎ、ｉ、Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉならびにＹｉは上で定義された通りであり、前記部分は任意のリンカー部分を使用することにより互いに融合している］の分子と一致する。外部（Ｎ−および／またはＣ−末端）リンカーは、例えば他の部分を前記分子に融合させるのに使用してもよいので、これはＺ０−（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉ、Ｙｉ、ｉならびにｎは上で定義された通りであり、Ｚ０は任意のＮ−末端リンカー部分であり、Ｚ１からＺｎ−１はリンカーであり、Ｚｎは任意のＣ−末端リンカー部分である］として書くこともできる。
【０２２２】
したがって、具体的な実施形態では、Ｚｎは非存在である（またはゼロ連結単位のリンカーである）。
【０２２３】
リンカー部分の性質は本発明にとって重要ではないが、長く柔軟性のあるリンカーは典型的には使用しない。特定の実施形態によれば、Ｚｉはそれぞれが、単位がアミノ酸、単糖、ヌクレオチドまたはモノマーである、０から２０の同一のまたは同一でない単位のストレッチから独立して選択される。同一でない単位は、同じ性質の同一でない単位（例えば、異なるアミノ酸またはいくつかのコポリマー）であることが可能である。同一でない単位は、異なる性質の同一でない単位、例えば、アミノ酸とヌクレオチド単位を有するリンカーまたは２つ以上の異なるモノマー種を含むヘテロポリマー（コポリマー）であることも可能である。特定の実施形態によれば、少なくとも１つ、特にＺｎ以外のそれぞれのＺｉの長さは少なくとも１単位である。他の特定の実施形態によれば、Ｚｎは０単位である。特定の実施形態によれば、Ｚｎ以外のすべてのＺｉリンカーは同一である。追加の実施形態によれば、Ｚｉ部分はすべて同一である。
【０２２４】
アミノ酸、単糖およびヌクレオチドならびにモノマーは当技術分野におけるのと同じ意味を有する。モノマーの特定の例には、天然モノマーの模倣体、例えば非タンパク質新生のまたは天然に存在しないアミノ酸（例えば、カルニチン、ＧＡＢＡおよびＬ−ＤＯＰＡ、ヒドロキシプロリンおよびセレノメチオニン）、ペプチド核酸モノマー、などが含まれることに留意されたい。他の適したモノマーの例には、エチレンオキシド、塩化ビニル、イソプレン、乳酸、エチレン、プロピレンなどのオレフィン、ポリマー中に存在するアミド（例えば、アクリルアミド）、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンモノマー、エチレン酢酸ビニルおよびポリマー形成が可能である他の有機分子が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２５】
代わりの実施形態によれば、リンカー単位は、カルボジイミドカップリングにより作製されるリンカーなどの化学リンカーである。適したカルボジイミドの例には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が含まれるがこれらに限定されない。別の特に想定されている化学リンカーは、４，７，１０−トリオキサトリデカンコハク酸（４，７，１０−トリオキサトリデカンスクシンアミド酸と命名されることもある）またはＴｔｄｓである。
【０２２６】
具体的な実施形態によれば、少なくとも１つ、特にすべてのＺｉは、同じ性質の０から１０単位、特に同じ性質の０から５単位である。リンカーに柔軟性がある場合、短いリンカーを使用することが特に想定されている。短いリンカーを使用すれば、これにより２つのＹｉストレッチは対象のタンパク質（複数可）に接近しにくくなると考えられるので、同じ分子の２つのＹｉストレッチが折り畳まれるのを妨げる。確実に１つの分子の異なるＹｉストレッチが互いに相互作用することができないようにすることによっても、分子の可溶性は増加する。特定の実施形態によれば、リンカーが短いために前記Ｙｉストレッチは逆並列の様式でのフォールディングができなくなる。例えば、アミノ酸では、完全に曲がるために少なくとも３個または４個のアミノ酸が必要となるので、４個以下または３個以下のアミノ酸のリンカーが特に想定されている。これはアミノ酸の性質にも依拠するので、特定の構造傾向またはＧ、ＳおよびＰなどのねじれ構造の傾向がないアミノ酸の使用が特に想定されている。特定の実施形態によれば、少なくとも１つのＺｉ部分、特にＺｎを除くすべてのＺｉ部分はペプチドまたはポリペプチドリンカーである。そのようなリンカーの特に想定されている配列には、ＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳが含まれるがこれらに限定されない。アミノ酸で構成されるＺｉ部分では、一次構造（例えば、リンカーの配列は特定の構造への強い傾向のない多くのアミノ酸を含む。）を考慮に入れることができるが、二次または三次構造も考慮に入れることができる。例えば、特定の二次構造を形成しないまたは（線形）アルファへリックスを形成するアミノ酸を選択することができる。または、安定な三次構造ではＹｉ部分が接近しにくくなることがあるので、安定な三次構造を形成しないようにアミノ酸を選択することができる。アミノ酸リンカーはランダムコイルを形成することがある。別の特に想定されているリンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわちモノマーエチレンオキシド基のオリゴマーまたはポリマーである。ＰＥＧオリゴマーは、モノマー単位の数、例えばＰＥＧ２、ＰＥＧ３または（ＰＥＧ）４を示して略記されることが多い。特定の実施形態によれば、少なくとも１つのＺｉ部分はＰＥＧオリゴマー（要するにＰＥＧ）である。追加の特定の実施形態によれば、Ｚｉ部分はすべてＰＥＧ部分である。さらに代わりの実施形態によれば、少なくとも１つのＺｉ部分、特にＺｎを除くすべてのＺｉ部分はＰＥＧリンカーである。
【０２２７】
リンカーは好ましくは、同じ分子のＹｉ部分の逆並列の相互作用を防ぐくらい短い。しかし、多くの例では、たとえリンカーの長さによってこれが可能になると考えられるとしても、逆並列ベータシートの形成は好まれないことに留意されたい。例えば、Ｙｉが次のＹｉ（すなわち、Ｙｉ＋１）と同じ配列を有しこの配列が対称ではない分子では、ベータシートは形成されないことになる。そのような分子では、リンカーはＹｉストレッチが平行の様式でフォールディングするのを妨げるのに十分短いべきであり、そのようなリンカーの長さはＹｉストレッチの長さおよび２つのヘアピンカーブを作るのに必要な単位の量（すなわち、Ｙｉを平行に配置することができるのに必要な最小長）に依拠する。注目すべきことに、これは分子のフォールディングを可能にする柔軟性のあるリンカーに適用される。リンカーが強固で１つの分子の異なるＹｉ領域を互いに接触させることができない（すなわち、互いに相互作用することができない）ことを保証することができる場合、リンカーの長さは実際には重要ではない。そのような例では、リンカーの長さは２０単位を超えることができるが、典型的には長さは実用上の理由で制限されることになる。
【０２２８】
他のリンカーよりもさらに長いリンカーが好まれる１つの特定の例は、少なくとも２つの異なるタンパク質、特に同じ生物中の２つの異なるタンパク質が標的にされる（すなわち、Ｙｉ部分が１つよりも多いタンパク質の凝集誘導領域と一致する。）例である。確実に前記分子が１つよりも多いタンパク質と（例えば、同時に）相互作用することができるようにするために、前記相互作用が立体障害のせいで妨げられないように、異なるターゲティングＹｉ部分間の距離を増加させることが有益になることもある。これらの例では、Ｚｉリンカーは、０から１００の一続きの同一もしくは同一でない単位であって、アミノ酸、単糖、ヌクレオチドもしくはモノマーである前記単位または０から９０、０から８０、０から７０、０から６０、０から５０、０から４０、０から３０または０から２０の前記単位であってもよい。特に、Ｚｉリンカーの最小長は少なくとも１単位、少なくとも２単位、少なくとも３単位、少なくとも４単位または少なくとも５単位である。
【０２２９】
もっと長いリンカーが使用される場合、少なくとも１つのＹｉ領域が導き出されるタンパク質の配列と同一でないことが好ましい。極めて特定の実施形態によれば、２０単位を超えるリンカーはペプチド性リンカーではなく、すなわち単位はアミノ酸ではない。代わりの実施形態によれば、もっと長いリンカーは、リピートモチーフを含有するペプチド性リンカー（例えば、ＧＳ、ＧＧＳ、ＰＰリンカーまたはモノ、ジ、トリアミノ酸リピートを含有する他のリンカー）以外の、ペプチド性リンカーであることが可能である。特に、リンカーは基本的に、二次ポリペプチド構造、例えばアルファへリックスまたはベータシートのストレッチがない。ポリペプチド二次構造のモチーフになりやすいポリペプチドリンカーのいかなる傾向も、リンカー端部が享有する空間的自由度を必ず制限することになる。
【０２３０】
分子構造に関する総論
数え切れないほどのペプチドが当技術分野で既に記載されてきたので、前記一般式の分類に入るペプチド性構造を有するいくつかの分子、特にｎが１の分子が（異なる目的のために）当技術分野で既に記載されている可能性がある（しかし、我々が知っている限り、そういう事実はない。）。こういう理由で、特にｎが１の場合の分子に対する製品クレームの範囲は、これらの分子を適用することが可能である使用および方法の範囲とは異なることになると我々は予測している。したがって、ｎが１の場合の実施形態では、ｎが少なくとも２である実施形態での場合と比べて、Ｘ部分はより厳密に（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐのみからまたは例えば、Ｋを排除して、上記参照）選択されること、Ｘ部分はより短く（例えば、１個または２個のアミノ酸）、Ｋ残基だけで存在することはないこと、Ｙ部分はより短く（例えば、１３個、１１個または１０個以下のアミノ酸の長さ）、異なる長さの範囲（例えば、５個から１２個のアミノ酸または５個から１０個のアミノ酸）から選択されるまたはより厳密に選択される（例えば、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅのような特定の残基、例えば、６０％を超える疎水性が非存在である、など）ことが予測される。
【０２３１】
特に想定されている分子は、次の構造、Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１（すなわち、ｎは１）［式中、Ｘ１およびＸ２は全部で５個以下のアミノ酸であり、Ｙ１は一続きの４個から１０個のアミノ酸であり、Ｚ１は一続きの０単位である］およびＸ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２（すなわち、ｎは２）［式中、Ｚ１はリンカーであり、Ｚ２は非存在である］を有する分子である。
【０２３２】
ｎ＝１である実施形態について想定されている制限の特定の組合せには、
−Ｘ１およびＸ２は互いに等しく、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個または２個のアミノ酸であり、
−Ｙ１は一続きの６個から１０個の連続するアミノ酸であり、その少なくとも３個は疎水性であり、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＨ残基は存在せず、Ｃ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷ残基の総計は１個以下であり、そのうち６０％未満がＶ以外の小アミノ酸であり（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、Ｔ、Ｄから選択される）、２個以下の連続する同一のアミノ酸が存在し、非脂肪族残基は２回を超えて存在せず、最初のおよび／または最後の残基は脂肪族またはＦ、Ｙ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択される、
が含まれる。
【０２３３】
ｎ＝１である別の特定の組合せは、
−Ｘ１およびＸ２は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個または２個のアミノ酸であり、
−Ｙ１は一続きの６個から１１個の連続するアミノ酸であり、その少なくとも７５％は疎水性アミノ酸であり、前記アミノ酸の少なくとも５０％は脂肪族またはＦ残基であり、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥまたはＨ残基は存在せず、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、ＡまたはＴ残基は１個以下存在し、ＹまたはＦ残基は３個以下存在し、２個の連続する同一の非脂肪族残基は存在せず（すなわち、２個の連続するＹもしくはＦ残基は存在せずまたはＩ、ＬおよびＶのみが連続する同一の残基であることができる。）、連続する同一の脂肪族残基は２個以下存在し、２個の連続する非芳香族極性残基は存在せず（すなわち、Ｓ、Ｎ、ＴおよびＱから選択される）、同一の残基は５０％以下存在し、最初のおよび／または最後の残基は脂肪族またはＦ残基であり、ＡおよびＧ残基の合計は２個以下であり、Ａ、ＧおよびＳ残基の総割合は２５％以下であり、Ｃ、Ｍ、Ｎ、ＱおよびＷ残基の総割合は２５％以下であり、Ｖ以外の小残基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｔから選択される）の総割合は２５％以下である、
である。
【０２３４】
いくつかの特定の実施形態によれば、Ｚ１は存在しない（すなわち、Ｚ１はゼロ単位である。）。他の実施形態によれば、Ｚ１も存在し、Ｎ−またはＣ−末端でもよい。
【０２３５】
注目すべきことに、これらの組合せは特に想定されており、実際によく機能する化合物の配列空間を説明するが、これらの制限は、現在請求されている化合物と先行技術に記載されている化合物との間に重複がないことを保証することを主に意図する。これらの制限が厳密すぎることまたは一部の制限は厳密すぎ他の制限はそれほど厳密ではないことが十分にあり得る。したがって、これらの基準のうちのどの１つの基準でも個々の部分について上に記載されている境界に従って変更してもよいことおよび／または前記基準の一部は除外するまたは他の制限で置き換えてもよいことおよび／または他の制限を加えてもよいことが想定されている。
【０２３６】
他の部分
前記分子は他の部分をさらに含むことができる（または他の部分にさらに融合させることができる）。すべての部分では、融合物またはリンカーの性質は、前記部分とアグリゲーター分子がこれらの特定の機能を発揮することができる限り、本発明にとって重要ではない。特定の実施形態によれば、前記分子に融合されている部分は切り離すことができる（例えば、プロテアーゼ認識部位を有するリンカー部分を使用することにより）。このようにして、前記部分の機能と前記分子を分離することができ、これはもっと大きな部分にとりまたは前記部分が特定の時点後でもはや必要ではなくなる実施形態（例えば、タグを使用する分離段階後切り離されるタグ）にとり特に興味深いことがある。
【０２３７】
前記分子は検出可能な標識をさらに含むことが特に想定されている。検出可能な標識は、Ｎ−もしくはＣ−末端でまたは内部でも前記分子に融合させることができる（例えば、リンカーを通じてまたはリンカーは検出可能な標識として使用することが可能である。）。代わりに、検出可能な標識は、前記分子のＸ−Ｙ−Ｚ部分の１つ以上における１個以上の標識されたアミノ酸（例えば、蛍光的にまたは放射性的に標識されたアミノ酸）の使用を指すことができる。
【０２３８】
Ｚｎが存在する実施形態では、検出可能な標識はＺｎリンカー部分に融合させることができることに留意されたい。（この表記は、前記タグがＣ−末端に付加されることを必ず伴うと考えられるが、Ｎ−末端タグも想定されている、これは、（Ｚｉ−Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ）ｎ［式中、Ｚ２からＺｎはそれぞれリンカーであり、Ｚ１は前記タグが融合しているリンカーである］という同等の表記と一致する。）
【０２３９】
しかし、検出可能な標識が融合しているリンカーの性質は、特に長さの制約に関して、前記分子中で使用されるリンカーの性質とは著しく異なることがあるので、このようにして標識される分子を、Ｚｎ部分が存在せず別個のリンカーを使用して検出可能な標識が前記分子に融合している分子と呼ぶのが好ましいことがある。実際、タグを前記分子に付加するのに使用されるリンカーは長いだけでなく柔軟性があってもよい。しかし、検出可能な標識が前記分子に結合される実際の方法は本発明にとって重要ではなく、典型的には使用される標識の性質および／または標識化の目的（要求される近接を決定することがある）に依拠することになる。原則として、標識を検出することができる限り、タンパク質様性質の分子のためのいかなる既知の標識でも使用することが可能であることに留意されたい。特に想定されている標識には、タグ、蛍光標識、酵素基質、酵素、量子ドット、（常）磁性があってもよいナノ粒子、放射標識、光ラベルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０２４０】
他の部分の場合と同じように、前記分子は２つの端部を有しているので、前記分子はそのＮ−およびＣ−末端の両方で別の部分（例えば、標識）に融合させることが想定されている。これら２つの標識は同一でも（より強いシグナルを発する）異なっていても（異なる検出目的のために）可能である。標識などの部分はＺ０および／もしくはＺｎリンカーを通じてまたはもっと長いリンカーを通じて融合させることができる。
【０２４１】
特定の実施形態によれば、検出可能な標識はＧＥＰでもビオチンでもない。他の特定の実施形態によれば、ビオチンまたはＧＦＰは検出可能な標識になることができる。
【０２４２】
他の特定の実施形態によれば、前記分子は、例えばインビボでのそれらの半減期を伸ばすために、他の部分に融合させてもよい。安定性を増加させることは別として、そのような部分は、これらが融合されている分子の可溶性も増加させることがある。ゲートキーパー（番号が付けられたＸ部分）の存在は、前記分子の早発凝集を防ぎ、前記分子を溶解させておくのに原則として十分であるが、可溶性を増加させる（すなわち、凝集を防ぐ）部分をさらに付加すれば、前記分子のもっと容易な取扱いが可能になり、特に安定性および保存期間を改良することがある。そのような部分の周知の例はＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である。この部分は、リンカーならびに安定化部分として使用することができるので、特に想定されている。他の例には、ペプチドおよびタンパク質もしくはタンパク質ドメインまたは全タンパク質でさえも（例えば、ＧＦＰ）が含まれる。これに関して、ＰＥＧのように、１つの部分は異なる機能または効果を有することができることに留意すべきである。例えば、フラッグタグ（配列  ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０６））は標識として使用することが可能なペプチド部分であるが、その電荷密度のせいで可溶化を増強することにもなる。ペグ化は、多くの場合、バイオ医薬品の可溶性を増加させることが既に実証されている（例えば、ＶｅｒｏｎｅｓｅおよびＭｅｒｏ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２００８；２２（５）：３１５−２９頁）。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインタグを対象の分子に付加することは、当技術分野で広範に記載されてきた。例には、シヌクレイン由来のペプチド（例えば、Ｐａｒｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４；１７：２５１−２６０頁）、ＳＥＴ（可溶性増強タグ、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ２００４；３６：２０７−２１６頁）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ−ユーティリゼーション物質（ＮｕｓＡ）、小ユビキチン様モディファイアー（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、ジスルフィド結合Ｃ（ＤｓｂＣ）、１７キロダルトンタンパク質（Ｓｋｐ）、ファージＴ７タンパク質キナーゼ断片（Ｔ７ＰＫ）、プロテインＧ  Ｂ１ドメイン、プロテインＡ  ＩｇＧ  ＺＺリピートドメインおよび細菌免疫グロブリン結合ドメイン（Ｈｕｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．；２８７（７）：４４６２−９頁、２０１２）が含まれるがこれらに限定されない。当業者であれば決定することができるように、タグの性質はその適用に依拠することになる。例えば、本明細書に記載された分子のトランスジェニック発現のために、前記分子をもっと大きなドメインに融合させて細胞機構による早発分解を防ぐことを想定してもよい。他の適用は、前記分子の特性をあまり変化させないようにもっと小さな可溶化タグ（例えば、３０個未満のアミノ酸または２０個未満のアミノ酸またはさらに１０個よりも少ないアミノ酸）に融合させることを想定してもよい。
【０２４３】
半減期を伸ばすことは別として、分子は他のまたは追加の薬物動態および薬力学特性を変化させる部分に融合させてもよい。例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、アルブミン結合ドメインまたは合成アルブミン結合ペプチドと融合させると、異なる治療タンパク質の薬物動態および薬力学を改良することは公知である（ＬａｎｇｅｎｈｅｉｍおよびＣｈｅｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．；２０３（３）：３７５−８７頁、２００９）。使用されることの多い別の部分は、抗体の断片結晶化可能領域（Ｆｃ）である。これらの部分の性質は本発明にとって重要ではなく、当業者であれば適用に応じて決定することができる。
【０２４４】
特定の実施形態によれば、前記分子は、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、セルロースビーズ、磁気ビーズ、シリカビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ミクロスフィア、ガラスビーズもしくはどんな固体支持体（例えば、ポリスチレン、プラスチック、ニトロセルロース膜、ガラス）であれまたはＮｕｓＡタンパク質に融合されることはない。（しかし、これらの融合物は可能であり、具体的な実施形態では、これらの融合物も想定されていることに留意されたい。）
【０２４５】
また、本明細書に記載された分子と組み合わせて想定されている他の部分は、ターゲティング部分である。例えば、前記分子は、例えば、所与の標的に対する特異性を有する抗体、ペプチドまたは小分子に融合させてもよく、前記分子は標的の部位で凝集を開始する（この場合、Ｙｉ領域（複数可）は、同じもしくは異なる標的タンパク質に存在する配列と同一の配列を有することになるまたは前記配列は高い凝集傾向を有する配列であることになる。）。これは、ＷＯ２００８１４８７５１において概説されている戦略に類似している。本発明の分子と組み合わせることができる考えられる標的部分（ＷＯ２００８１４８７５１では「結合領域」または「結合ドメイン」とも命名されている）の広範な一覧表は、ＷＯ２００８１４８７５１の３頁目（２６行目から始まる）および４頁目（３４行目で終わる）に記載されており、用語「結合領域」または「結合ドメイン」は典型的に標的タンパク質と相互作用をする分子を指している。ある種の場合は、結合ドメインは化学化合物であり（例えば、少なくとも１つの標的タンパク質に対する親和性を有する小化合物）、ある種の他の場合は、結合ドメインはポリペプチド、ある種の他の場合は、結合ドメインはタンパク質ドメインである。タンパク質結合ドメインは、全タンパク質構造のうち、自己安定化しタンパク質鎖の残りとは独立して折り重なることが多いエレメントである。結合ドメインは長さが変わり、約２５アミノ酸から５００アミノ酸までおよびそれよりも多い。多くの結合ドメインはフォールドに分類することができ、認識可能な、同定可能な３−Ｄ構造体である。一部のフォールドは多くの異なるタンパク質でよく見られるので、特別な名称が与えられている。非限定的例は、ロスマンフォールド、ＴＩＭバレル、アルマジロリピート、ロイシンジッパー、カドヘリンドメイン、デスエフェクタードメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、ｓｒｃ相同２ドメイン、ＢＲＣＡ１のＢＲＣＴドメイン、Ｇタンパク質結合ドメイン、Ｅｐｓ１５相同（ＥＨ）ドメインおよびｐ５３のタンパク質結合ドメインである。抗体は、超可変ループ領域、いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を通じて媒介される特異性を有する特異的結合タンパク質の天然のプロトタイプである。一般に抗体様スキャフォールドは特異的バインダーとしてよく機能することが判明しているが、ＣＤＲ様ループを示す強固なスキャフォールドというパラダイムに厳格に忠実であるのは必須ではないことが明らかになった。抗体に加えて、多くの他の天然タンパク質はドメイン間の特異的高親和性相互作用を媒介する。免疫グロブリンの代替物は新規の結合（認識）分子を設計するための魅力的な出発点を提供してきた。用語スキャフォールドは、本発明において使用されているように、特異的標的タンパク質への結合を与える変化したアミノ酸または配列挿入物を担持することができるタンパク質フレームワークのことである。スキャフォールドを操作することとライブラリーを設計することは互いに相互依存するプロセスである。特異的バインダーを得るために、スキャフォールドのコンビナトリアルライブラリーを作製しなければならない。これは通常、適切なアミノ酸位置でコドンをランダム化することにより、縮重コドンまたはトリヌクレオチドのどちらかを使用することにより、ＤＮＡレベルで実行される。コンビナトリアルライブラリーディスプレイには、広く多様な起源および特徴を有する広範囲の異なる非免疫グロブリンスキャフォールドが現在使用されている。これらの一部は抗体のｓｃＦｖとサイズが匹敵する（約３０ｋＤａ）が、それらの大多数ははるかに小さい。リピートタンパク質に基づくモジュラースキャフォールドは繰り返し単位の数に応じてサイズが変化する。例の非限定的一覧表は、ヒト第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくバインダー、リポカリンに基づくバインダー、ＳＨ３ドメインに基づくバインダー、ノッチンファミリーのメンバーに基づくバインダー、ＣＴＬＡ−４に基づくバインダー、Ｔ細胞受容体、ネオカルチノスタチン、炭水化物結合モジュール４−２、テンダミスタット、クニッツドメイン阻害剤、ＰＤＺドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン（ＳＨ２）、サソリ毒、昆虫デフェンシンＡ、植物ホメオドメインフィンガータンパク質、細菌酵素ＴＥＭ−１ベータラクタマーゼ、スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡのＩｇ結合ドメイン、イー・コリコリシンＥ７免疫タンパク質、イー・コリシトクロムｂ５６２、アンキリンリピートドメインを含む。所与の標的タンパク質に対する特異性を有する化合物、環状および線形ペプチドバインダー、ペプチドアプタマー、多価アビマー（ａｖｉｍｅｒ）タンパク質または小モジュラー免疫医薬品、受容体または共受容体に対する特異性を有するリガンド、ツーハイブリッド解析において同定されたタンパク質結合パートナー、ビオチン−アビジン高親和性相互作用の特異性に基づく結合ドメイン、シクロフィリン−ＦＫ５０６結合タンパク質の特異性に基づく結合ドメインも結合ドメインとして含まれる。特定の炭水化物構造に対する親和性を有するレクチンも含まれる。
【０２４６】
注目すべきことに、前記分子がターゲティング部分に融合されている実施形態では、少なくとも１つのしかし最大それぞれのＹｉ部分は合成配列、さらに特定すると、前記分子が投与される生物のタンパク質に存在しない配列であることが具体的に想定されている。実際、そのような例では、ターゲティング部分融合インターフェラー分子の有核凝集によりインサイツで（標的タンパク質が到達すると）凝集の核形成をすることを想定してもよい。
【０２４７】
しかし、前記分子それら自体が特異的配列認識を通じてそれらの標的を見出すことができるので、ターゲティング部分は必要ではないことに留意されたい。したがって、代わりの実施形態によれば、前記分子はターゲティング部分として効果的に使用し、薬物、毒素または小分子などの他の部分へさらに融合させることが可能である。前記分子を特異的タンパク質（例えば、特定の細胞型または細胞コンパートメントのみに存在するタンパク質）を標的にすることにより、これらの化合物は特異的細胞型／コンパートメントを標的にすることができる。したがって、例えば、毒素を癌細胞に選択的に送達することができるまたは薬物を細胞質に送達することができる。
【０２４８】
さらに他の実施形態によれば、前記分子は、細胞透過（または細胞移動）を媒介する配列をさらに含むことができる、すなわち前記分子が、細胞透過性配列の組換えまたは合成付着を通じてさらに改変される。インターフェラー分子（例えば、ポリペプチドのような）は、融合または化学結合タンパク質を原核または真核細胞内に形質導入するのを容易にする配列にさらに融合させるまたは化学結合させてもよい。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）配列は当技術分野で周知であり、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質、ポリアルギニン配列、ペネトラチンおよびｐｅｐ−１が含まれるがこれらに限定されない。さらに他の一般に使用される細胞透過性ペプチド（天然でも人工ペプチドでも）は、例えばＳａｗａｎｔおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．６（４）：６２８−４０頁、２０１０；Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（６）：６４９−５４頁、２０１０およびＬｉｎｄｇｒｅｎおよびＬａｎｇｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６８３：３−１９頁、２０１１に開示されている。
【０２４９】
ＣＰＰに典型的なのがそれらの電荷なので、本明細書に記載されたいくつかの荷電分子は細胞に入るのにＣＰＰを必要としないことがあり得る。実際、実施例において示されるように、シグナルペプチドまたは細胞内領域を標的にすることが可能であり、これには前記分子が細胞に取り込まれ、これがＣＰＰへの融合なしで起こる必要がある。
【０２５０】
他の部分が前記分子に融合されている例では、これらの部分は前記分子から取り除くことができることが特定の実施形態において想定されている。典型的には、これは特異的なプロテアーゼ切断部位を組み込むことまたは同等のアプローチを通じて実行されることになる。これは特に、前記部分が大きなタンパク質である場合に当てはまり、そのような場合は、前記部分は、本明細書に記載された方法のうちのいずれかにおいて前記分子を使用することに先立って（例えば、前記分子の精製中に）切り離してもよい。切断部位は別個に組み込まれてもよいし、外部Ｚｎリンカー（または前記部分がＮ−末端である場合は外部Ｚ１リンカー）の不可欠な一部であってもよい。極めて具体的な実施形態によれば、前記部分は内部Ｚｉリンカーの一部であってもよいし、Ｚｉリンカー全体でさえあってもよい。例として、ｎ＝２である分子は次の構造、Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４［式中、Ｚ１（一部または全体）はヘキサヒスチジン配列である］を有することができ、次にこれはリンカーでもあり検出配列でもある。こうしたことは可能であるが、これをすると分子自体が決断されると考えられるので、それらの例では通常、切断部位は組み入れられない。追加の部分が内部に融合されている実施形態によれば、長さが制限されている（３０、２０または１０個未満のアミノ酸、上記参照）非タンパク質性（例えば、ＰＥＧ）またはペプチド配列のみが可溶化部分として想定されることに留意されたい。そうでなければ、前記タンパク質ドメインは凝集の導入に干渉するおそれがある。
【０２５１】
具体的な実施形態によれば、本明細書に記載された分子の全長は５０個のアミノ酸を超えない。さらに特定すると、前記長さは４０個のアミノ酸、３０個のアミノ酸、２５個のアミノ酸または２０個のアミノ酸さえ超えない。前記分子が追加の部分に融合されている追加の具体的な実施形態によれば、長さ制限は全分子のうちの（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ部分のみに適用される（したがって、例えば、標識には適用されない）。したがって、切断部位が前記分子に組み入れられている場合、長さ制約は典型的に切断後の長さに適用される。
【０２５２】
完全にタンパク質性である分子では、前記分子は核酸として、例えば本明細書に記載された少なくとも１つの分子をコードする配列を含む組換えベクターとして提供できることが想定されている。
【０２５３】
分子の特定の用途
さらなる態様によれば、本明細書に記載された分子はタンパク質の機能を下方調節または阻害するために使用され得る。典型的に、このことはそのタンパク質の凝集を誘導することによって達成される。これらの実施形態によれば、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に前記タンパク質を接触させることを含む、タンパク質の機能を下方調節するための方法が提供される。
【０２５４】
もっとも特定すると、ｎが１である実施形態において、Ｙ１は一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸である。これらの実施形態によれば、Ｚ１は非存在（すなわち一続きの０単位）であってもよい。代替の実施形態によれば、Ｚ１はアミノ酸リンカー以外のリンカーである。さらに他の代替の実施形態によれば、Ｚ１は本明細書に想定された任意のリンカーであってもよい（すなわちさらなる制限をＺ１に適用しない。）。
【０２５５】
分子に関して、上記と同じ考慮および制限を適用する。特に、機能の下方調節が達成される限り、タンパク質で発生するＹｉにおける１つまたは２つの置換が先に記載したように許容され得ることが留意されなければならない。しかしながら典型的に、Ｙｉは同一である。
【０２５６】
分子は、ホワイトバイオテクノロジー（または工業バイオテクノロジー）、レッドまたは医学バイオテクノロジー、グリーンまたは農業バイオテクノロジー、ブルー（または水性）バイオテクノロジーを含む、全範囲の分野にわたって使用され得る。これらの分子は、タンパク質を阻害するために使用されてもよく、同様にタンパク質を検出するために使用されてもよく、このことはこれらの分野のすべてにおける。理解されるように、分子が対象に投与される用途は分野にわたって顕著な類似性を示す。すなわち、医学的用途（動物対象）および農学的用途（植物対象）の両方において、細分割が感染用途および非感染用途に対してなされてもよい。
【０２５７】
インターフェラー（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｒ）についての医学的用途
本明細書に記載された分子に関して医学的用途の２つの大きな分野、すなわち感染性疾患および非感染性疾患が存在する。これらの用途間の大きな相違は、感染性疾患の状況において、インターフェラー分子は典型的に、感染を引き起こす病原体（複数も含む）の少なくとも１つのタンパク質を標的とするが、このインターフェラー分子は通常、対象に投与され、この対象のプロテオームは標的とされない（すなわちＹｉの一続きは病原体のプロテオームの１つに対応するが、感染を有する対象のプロテオームにおいて存在しない。）。しかしながら、病原体の直接標的も想定される（例えば外部寄生虫による感染を治療する場合）。
【０２５８】
非感染性障害において、インターフェラー分子は典型的に、インターフェラーが投与される対象に存在する少なくとも１つのタンパク質を標的とする。
【０２５９】
非感染性疾患および感染性疾患の同じ考慮（生物に対する投与および前記生物におけるＹｉの一続きのプロテオーム中の存在）は植物におけるインターフェラーの用途に当てはまるが、これらは典型的に医学的用途と見なされない。それ故、同様の方法が植物で実施され得るが（さらに参照のこと）、このセクションに記載された方法はこれらが典型的に植物対象よりむしろ動物対象に関与するので医学的方法と見なされる。
【０２６０】
さらに特定の実施形態によれば、これらの方法は、疾患状況においてタンパク質を下方調節するため、または診断を行うために提供される。このことは、これらの実施形態において、医薬または診断薬として使用するための次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択され、
ここでｎが１である場合、Ｙ１は一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸である（およびさらなる特定の実施形態によれば、Ｚ１はアミノ酸リンカーではない）］
の分子が提供されることと同等である。
【０２６１】
本明細書で使用された場合、方法および使用はしばしば交換可能である。すなわち医薬として使用するための分子または特定の疾患の治療に使用するための分子は、分子の使用（例えば分子と接触させること）を含む、疾患を治療するための方法と同等である。
【０２６２】
特定の実施形態によれば、分子が医薬または診断薬として使用される場合、これらの分子は導入遺伝子としてではなく、投与される外因性分子として使用されることが想定される。このことはまた、医薬として使用されない分子にも当てはまる。代替の実施形態によれば、分子は導入遺伝子および外因性分子として投与されてもよい。
【０２６３】
分子が導入遺伝子（すなわち分子をコードする核酸）として投与される場合、これらの実施形態に係るインターフェラー分子がコードされ得ることを必要とするので、これらは完全にポリペプチドの性質であることは言うまでもない。すなわち、インターフェラー分子に存在するすべての番号が付けられたＸ、ＹおよびＺ部分はポリペプチドの性質である。トランスジェニック送達が想定される医学的用途としては、限定されないが、遺伝子治療法（例えばレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を使用する）または幹細胞用途が挙げられる。
【０２６４】
それ故、これらの実施形態によれば、次の構造、
（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子をコードする核酸配列が提供される。
【０２６５】
核酸配列が、必要な変更を加えて、本明細書に記載されたすべての制限および変更を用いて分子をコードすることが特に想定される。それ故、コードされたポリペプチドは本質的には本明細書に記載されたようである。すなわち、この態様と適合するインターフェラー分子について述べた変更もまた、核酸配列によってコードされたポリペプチドについての変更と想定される。例として、ＸまたはＹ部分の配列または長さを特定する実施形態は核酸においてコードされることと適合し、Ｚ部分が非アミノ酸の性質である実施形態は適合しない。
【０２６６】
特定の実施形態によれば、コードされたポリペプチド配列は天然に存在しないポリペプチドである。さらに特定の実施形態によれば、核酸配列は人工遺伝子である。核酸の態様はトランスジェニック発現を使用する用途においてもっとも特に好適であるので、特に想定された実施形態は、核酸配列（または人工遺伝子）が別の部分、特に遺伝子産物の溶解性および／または安定性を増加させる部分に融合された実施形態である。実際に、ペプチドのトランスジェニック発現は時々、産物の急速分解に起因して困難になり得る。
【０２６７】
それ故、分子の用途に関与するすべての方法および使用はまた、分子がこれらの分子をコードする核酸配列として提供され、これらの分子は核酸配列から発現される方法および使用も含むことが留意されなければならない。
【０２６８】
本明細書に記載された分子をコードするこのような核酸配列を含む組換えベクターもまた、この態様において提供される。これらの組換えベクターは理想的には下方調節されるタンパク質が発現され、細胞内の核酸の発現を駆動する前記細胞の内部の目的の核酸配列を運搬するためのビヒクルとして適している。組換えベクターは、細胞中の別個の実体として（例えばプラスミドとして）存続してもよいまたは細胞ゲノム内に組み込まれてもよい。組換えベクターは、とりわけ、プラスミドベクター、バイナリーベクター、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクターおよびウイルスベクターを含む。それ故、分子がこれらの分子をコードする核酸配列を有する組換えベクターとして提供され、これらの分子が組換えベクターにおいて提供された核酸配列から発現される方法および使用もまた、本明細書に包含される。
【０２６９】
したがって、本明細書に記載された分子をコードする核酸配列を含むまたはこのようなインターフェラー分子をコードする核酸配列を含有する組換えベクターを含む細胞が本明細書で提供される。細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であってもよい。真核生物細胞の場合、この真核生物細胞は酵母、藻類、植物または動物細胞（例えば昆虫、哺乳動物またはヒト細胞）であってもよい。それ故、分子がこれらの分子をコードする核酸配列を有する細胞として提供され、これらの分子が細胞中に提供された核酸配列から発現される方法および使用もまた、本明細書に包含される。このことは例えば幹細胞療法における場合であり得る。
【０２７０】
トランスジェニックアプローチは医学的用途に限定されないことは留意すべきである。非常に特定の実施形態によれば、ポリペプチドとして直接の代わりに核酸中でコードされたインターフェラー分子の提供は、以下に説明するように植物における使用に特に適している。
【０２７１】
したがって、本明細書に記載された核酸配列、人工遺伝子または組換えベクターを含有する植物または植物細胞または植物種子が本明細書に提供される。
【０２７２】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのインターフェラー分子を含む医薬または医薬組成物を産生または製造するための方法、およびさらに前記少なくとも１つのインターフェラー分子を医薬として許容される担体と混合するための方法を提供する。すなわち、医薬として使用するためのインターフェラーが提供されるまたはインターフェラーを含有する医薬組成物が提供される。
【０２７３】
好ましい実施形態において、インターフェラー分子はポリペプチドであり（このことは存在するすべてのリンカー部分、Ｚｉがポリペプチドの性質であることを意味する。）、化学合成により作製され得るまたは代替として組換えタンパク質として作製され得る（医学的使用のためのインターフェラー分子の特徴はまた、適用可能な場合、非医学的使用についても想定されることに留意すべきである。）。
【０２７４】
「ポリペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合により一緒に結合されたポリマーを指し、代替としてペプチドと称した。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用されてもよい。加えて、非天然アミノ酸、例えば、ベータ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子をコードしない一般的に遭遇するアミノ酸もまた、本発明に使用されてもよい。インターフェラーに使用したアミノ酸のすべてまたは一部は、Ｄ−異性体またはＬ−異性体のいずれであってもよい。加えて、他のペプチド模倣剤も本発明に有用である。我々は、Ｓｉｌｌｅｒｕｄ  ＬＯおよびＬａｒｓｏｎ  ＲＳ（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．６（２）：１５１−６９からタンパク質間相互作用についてのアンタゴニストとしてペプチド模倣剤の開発および使用の概説を特に参照し、本明細書に組み込む。さらに、Ｄ−アミノ酸が回転の特徴（特にグリシンの場合）を安定させるためにペプチド配列に加えられてもよい。別のアプローチにおいて、（アルファ、ベータ、ガンマまたはデルタジペプチドなどのアルファ、ベータ、ガンマまたはデルタ回転の模倣が、ペプチドにおける構造モチーフおよび回転の特徴を模倣するために利用されてもよく、同時にタンパク質分解から安定性を提供し、例えば立体配座の安定性および溶解性などの他の特性を向上させるために利用されてもよい。
【０２７５】
組換えインターフェラーは、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞またはトランスジェニック動物もしくは植物を含む適切な発現系を使用して製造され得る。組換えインターフェラーは、ほぼ同質である任意の従来のタンパク質またはペプチドの精製手順により精製されてもよいおよび／または添加物と混合されてもよい。さらに別の実施形態において、前記インターフェラーは化学修飾ポリペプチドである。化学合成は設計により他の小分子のコンジュゲーションまたは非天然アミノ酸の組み込みを可能にする。特定の実施形態において、ペプチドインターフェラーへの小分子のコンジュゲーションは、抗腫瘍療法のための標的細胞毒性薬の発展している分野においてこれらの分子の潜在用途を導き得る。非天然アミノ酸のペプチドへの組み込みは、高親和性、高特異性の分子認識を開発するための小分子医化学アプローチに類似した、より広い化学的多様性についての可能性を広げる。非天然アミノ酸はまた、ペプチドをプロテアーゼ（例えば血清または胃）に認識できないようにすることによってペプチドインターフェラーの急速分解を防止できる。さらに別の実施形態において、本発明のインターフェラー分子はＤ−アミノ酸などの修飾アミノ酸または化学修飾アミノ酸を含む。さらに別の実施形態において、前記インターフェラーは天然アミノ酸および非天然アミノ酸の混合物からなる。さらに別の実施形態において、ペプチドの半減期はグリコシル化（Ｈａｕｂｎｅｒ  Ｒ．ら（２００１）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２、３２６−３３６）、ポリエチレングリコールとのコンジュゲーション（ＰＥＧ化、Ｋｉｍ  ＴＨら（２００２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３、２３１１−２３１７を参照のこと）または血清アルブミンと会合するようにペプチドを操作すること（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＭＦら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２、２８８３−２８８６を参照のこと）などの修飾により延長され得る。インターフェラー分子を含む医薬組成物の投与は、経口、吸入、経皮または非経口（静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、髄腔内および皮下を含む）投与によってもよい。インターフェラーのための送達方法の特に好ましい例は、経皮パッチ（Ｈｅｎｒｙ  Ｓら（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７、９２２−９２５）、イオントフォレーシス（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙら（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９１、３５０−３６１）、ソノフォレーシス（Ｂｏｕｃａｕｄ  Ａら（２００２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ８１、１１３−１１９）、エアロゾル（Ｄｕｄｄｕ  ＳＰら（２００２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９、６８９−６９５）、トランスフェルソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）またはリポソーム（Ｇｕｏ  Ｊら（２０００）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．７、１１３−１１６）である。インターフェラーは、単独で投与されてもよいまたは好ましくは医薬組成物として処方されてもよい（このことはインターフェラー単独で投与することまたは医薬組成物として処方されることを含む方法が提供されることを意味する。）。
【０２７６】
インターフェラーまたはこの医薬として許容される塩は、単位用量経口、非経口、経皮または吸入組成物などの単位用量組成物の形態で投与されることが好ましい。このような組成物は混合により調製され、適切には経口、吸入、経皮または非経口投与に適合され、それ自体は、錠剤、カプセル剤、経口液体製剤、粉末剤、顆粒、トローチ剤、再構成可能な粉末剤、注射可能および注入可能（ｉｎｆｕｓａｂｌｅ）な液剤または懸濁剤または坐剤またはエアロゾルの形態であってもよい。
【０２７７】
分子は医薬もしくは診断薬として使用するため、または治療もしくは診断の方法において提供されるので、これらの分子は薬剤として提供され得ることも想定される。したがって、本明細書に記載された分子を含む医薬組成物が提供される。特に、医薬組成物は次の構造、
（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する少なくとも１つの分子および医薬として許容される担体を含む。
【０２７８】
より特定すると、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する少なくとも１つの分子および医薬として許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【０２７９】
ｎが１である実施形態において、Ｙ１は典型的に一続きの４個から１１個の連続するアミノ酸であり、Ｚ１はアミノ酸リンカーではない（またはさらに非存在であってもよい）。
【０２８０】
もっとも特定すると、医薬組成物において、分子の少なくとも１つのＹｉは組成物が投与される対象において下方調節されるタンパク質に存在する。このことは、このタンパク質がその対象のゲノム内でコードされることを意味するものではないことを留意すべきである。実際に、感染を患っている対象に関して、対象自体のタンパク質ではなく、感染性生物のタンパク質を標的とする分子が投与されることが想定される（再び、同様の考慮が、植物対象に投与される組成物、すなわち農薬組成物に当てはまることを留意すべきである。これらは植物タンパク質または感染性生物のタンパク質のいずれも標的にできる。）。
【０２８１】
本発明はまた、本発明の１つ以上のインターフェラーを含有する医薬組成物に関する。これらの組成物は、これらを必要とする患者への投与により所望の薬理学的効果を達成するために利用されてもよい。本発明の目的に関して、患者は、特定の病態または疾患の治療を必要とする、ヒトを含む哺乳動物である。したがって、本発明は、医薬として許容される担体および医薬として有効な量の本発明のインターフェラーまたはこの塩からなる医薬組成物を含む。医薬として許容される担体は好ましくは、有効成分の効果的な活性と一致する濃度で比較的非毒性であり、患者に無害である担体であるので、担体に起因するいかなる副作用も有効成分の有益な効果を無効としない。インターフェラーの医薬として有効な量は好ましくは、治療される特定の病態に関して結果を生じるまたは影響を与える量である。本発明のインターフェラーは、即時、遅延および持続放出製剤、経口、非経口、局所、経鼻、眼科的（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃａｌｌｙ）、光学的、舌下、直腸的、経膣的などを含む、任意の有効な従来の単位投薬形態を使用して、当該技術分野において周知である医薬として許容される担体と共に投与されてもよい。
【０２８２】
経口投与に関して、インターフェラーは、カプセル剤、丸薬、錠剤、トローチ、トローチ剤、溶解剤、粉末剤、液剤、懸濁剤または乳剤などの固体または液体製剤に製剤化されてもよく、医薬組成物を製造するための当該技術分野で公知の方法に従って調製されてもよい。固体単位投薬形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤ならびに乳糖、スクロース、リン酸カルシウムおよびコーンスターチなどの不活性充填剤を含有する、通常、硬殻ゼラチン型または軟殻ゼラチン型であり得るカプセル剤であってもよい。
【０２８３】
別の実施形態において、本発明のインターフェラーは、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、ジャガイモデンプン、アルギン酸、コーンスターチおよびグアーガム、トラガカントガム、アカシアなどの投与後の錠剤の崩壊および溶解を支援することを目的とする崩壊剤、錠剤顆粒の流動性を改良し、錠剤押し抜き機および穿孔機の表面への錠剤物質の付着を防ぐことを目的とする潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、染料、着色剤およびペパーミント、冬緑油などの矯味矯臭剤または錠剤の審美的な質を高め、これらの錠剤を患者により許容されるようにすることを目的とするチェリー香味料と組み合わせて乳糖、スクロースおよびコーンスターチなどの従来の錠剤基剤を用いて錠剤化されてもよい。経口液体投薬形態に使用するのに適した賦形剤は、医薬として許容される界面活性剤、懸濁剤または乳化剤を付加してまたは付加せずのいずれかで、リン酸二カルシウムならびに水およびアルコールなどの希釈剤、例えばエタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコールを含む。種々の他の材料が被覆として存在してもよいまたはそうでなければ投薬単位の物理的形状を修飾するために存在してもよい。例えば錠剤、丸薬またはカプセル剤はシェラック、糖またはこの両方で被覆されてもよい。
【０２８４】
分散性粉末剤および顆粒は水性懸濁液の調製に適している。これらは分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１種以上の防腐剤との混合物中に有効成分（すなわち少なくとも１つのインターフェラー）を与える。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は既に上に述べたものにより例示される。さらなる賦形剤、例えば上記したものの甘味剤、香味剤および着色剤も存在してもよい。
【０２８５】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルションの形態であってもよい。油性相は、流動パラフィンなどの植物油または植物油の混合物であってもよい。適切な乳化剤は、（１）アカシアガムおよびトラガカントガムなどの天然に存在するガム、（２）ダイズおよびレシチンなどの天然に存在するリン脂質、（３）脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、（４）前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。エマルションはまた、甘味剤および矯味矯臭剤を含有してもよい。
【０２８６】
油性懸濁剤は、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物油中または流動パラフィンなどの鉱油中に有効成分を懸濁することにより製剤化されてもよい。油性懸濁剤は、例えばミツロウ、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有してもよい。懸濁剤はまた、１種以上の防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル、１種以上の着色剤、１種以上の矯味矯臭剤およびスクロースまたはサッカリンなどの１種以上の甘味剤を含有してもよい。シロップ剤およびエリキシル剤が、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤と共に製剤化されてもよい。このような製剤はまた、粘滑剤およびメチルパラベンおよびプロピルパラベンなどの防腐剤ならびに矯味矯臭剤および着色剤を含有してもよい。本発明のインターフェラーはまた、好ましくは、石鹸もしくは洗浄剤などの医薬として許容される界面活性剤、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁剤または乳化剤および他の医薬補助剤を付加したまたは付加していない、滅菌液または水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、エタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、２，２−ジメチル−１，１−ジオキソラン−４−メタノールなどのグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００などのエーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは脂肪酸グリセリドまたはアセチル化脂肪酸グリセリドなどの液体の混合物であり得る医薬担体と共に生理学的に許容される希釈剤中のインターフェラーの注射可能な投薬量として、非経口、すなわち皮下、静脈内、眼内、髄膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌｌｙ）、筋肉内または腹腔内に投与されてもよい。
【０２８７】
本発明の非経口製剤に使用され得る油の例は、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ペトロラタムおよび鉱油である。適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸およびミリスチン酸が挙げられる。適切な脂肪酸エステルは、例えばオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルである。適切な石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウムおよびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な洗浄剤としては、陽イオン洗剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、アルキルピリジニウムハロゲン化物およびアルキルアミンアセテート、陰イオン洗剤、例えばアルキル、アリールおよびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリド硫酸塩ならびにスルホスクシネート、非イオン性洗剤、例えば脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリ（オキシエチレン−オキシプロピレン）またはエチレンオキシドもしくはプロピレンオキシドコポリマーならびに両性洗剤、例えばアルキル−ベータ−アミノプロピオネートおよび２−アルキルイミダゾリン第四級アンモニウム塩ならびに混合物が挙げられる。
【０２８８】
本発明の非経口組成物は典型的に溶液中に約０．５重量％から約２５重量％の有効成分を含有する。防腐剤および緩衝剤もまた、有益に使用されてもよい。注射部位における炎症を最小化または除去するために、このような組成物は好ましくは約１２から約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する非イオン性界面活性剤を含有してもよい。このような製剤中の界面活性剤の量は好ましくは約５重量％から約１５重量％の範囲である。界面活性剤は上記のＨＬＢを有する単一成分であってもよいまたは所望のＨＬＢを有する２種以上の成分の混合物であってもよい。非経口製剤に使用された界面活性剤の例は、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレエートおよびプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、エチレンオキシドと疎水性塩基との高分子量付加物のクラスである。
【０２８９】
医薬組成物は無菌の注射可能な水性懸濁剤の形態であってもよい。このような懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムなどの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤、レシチンなどの天然に存在するリン脂質、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカ−エチレンオキシセタノール、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートまたはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る分散剤または湿潤剤を使用して公知の方法に従って製剤化され得る。
【０２９０】
無菌の注射可能製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能溶液または懸濁液であってもよい。利用され得る希釈剤および溶媒は、例えば水、リンガー溶液、生理食塩水および等張グルコース溶液である。加えて、無菌不揮発性油が溶媒または懸濁化媒体として慣例的に利用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油が利用されてもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射可能な製剤に使用されてもよい。
【０２９１】
本発明の組成物はまた、薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、薬物を、常温で固体であるが直腸温で液体であるので直腸内で溶解して薬物を放出する適切な非炎症賦形剤と混合することにより調製されてもよい。このような材料は、例えばカカオ脂およびポリエチレングリコールである。
【０２９２】
本発明の方法に利用される別の製剤は経皮送達装置（「パッチ」）を利用する。このような経皮パッチは、制御した量の本発明のインターフェラーの連続注入または不連続注入を提供するように使用されてもよい。医薬品を送達するための経皮パッチの構築および使用は当該技術分野において周知である（例えばＵＳ５，０２３，２５２を参照のこと）。このようなパッチは医薬品の連続送達、パルス送達、またはオンデマンド送達のために構築されてもよい。非経口投与のための制御放出製剤としては、当該技術分野で公知であるリポソーム、ポリマーミクロスフェアおよびポリマーゲル製剤が挙げられる。機械的送達装置によって患者に医薬組成物を導入することが望まれてもよいまたは必要とされてもよい。医薬品を送達するための機械的送達装置の構築および使用は当該技術分野において周知である。例えば薬物を脳に直接投与するための直接的な技術は通常、血液脳関門をバイパスするために患者の脳室系への薬物送達カテーテルの配置を含む。身体の特定の解剖学的領域への薬剤の送達のために使用される、１つのこのような埋め込み型送達システムはＵＳ５，０１１，４７２に記載されている。
【０２９３】
本発明の組成物はまた、必要に応じてまたは要望に応じて、一般に担体または希釈剤と称される、他の従来の医薬として許容される配合剤を含有してもよい。適切な投薬形態においてこのような組成物を調製するための従来の手段が利用されてもよい。このような成分および手段としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている次の参考文献：Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８、５２（５）、２３８−３１１；Ｓｔｒｉｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｍａｒｋｅｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ（１９９９）−Ｐａｒｔ−１」ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９、５３（６）、３２４−３４９；およびＮｅｍａ，Ｓ．ら、「Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９７、５１（４）、１６６−１７１に記載されているものが挙げられる。
【０２９４】
組成物の目的とする投与経路のためにその組成物を製剤化するために必要に応じて使用され得る一般に使用されている薬剤成分としては以下が挙げられる：
−酸性化剤（例として、限定されないが、酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、硝酸が挙げられる。）、アルカリ化剤（例として、限定されないが、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロラミンが挙げられる。）、吸着剤（例として、限定されないが、粉末セルロースおよび活性炭が挙げられる。）、エアロゾル推進剤（例として、限定されないが、二酸化炭素、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｆ２ＣｌＣ−ＣＣｌＦ２およびＣＣｌＦ３が挙げられる。）、空気置換剤（例として、限定されないが、窒素およびアルゴンが挙げられる。）、抗真菌性保存剤（例として、限定されないが、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウムが挙げられる。）、抗菌性保存剤（例として、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀およびチメロサールが挙げられる。）、酸化防止剤（例として、限定されないが、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシレートナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。）、結合剤（例として、限定されないが、ブロックポリマー、天然ゴムおよび合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコーン、ポリシロキサンおよびスチレン−ブタジエンコポリマーが挙げられる。）、緩衝剤（例として、限定されないが、メタリン酸カリウム、リン酸二カリウム、酢酸ナトリウム、無水クエン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム二水和物が挙げられる。）、担体剤（例として、限定されないが、アカシアシロップ、芳香性シロップ、芳香性エリキシル、チェリーシロップ、カカオシロップ、オレンジシロップ、シロップ、トウモロコシ油、鉱油、ピーナッツ油、ゴマ油、静菌性の塩化ナトリウム注射液および静菌性の注射用水が挙げられる。）、キレート化剤（例として、限定されないが、エデト酸二ナトリウムおよびエデト酸が挙げられる。）、着色剤（例として、限定されないが、ＦＤ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２０、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６、ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．２、Ｄ＆Ｃ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．８、カラメルレッドおよび酸化鉄レッドが挙げられる。）、
−清澄化剤（例として、限定されないが、ベントナイトが挙げられる。）、
−乳化剤（例として、限定されないが、アカシア、セトマクロゴール、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン５０モノステアレートが挙げられる。）、
−カプセル化剤（例として、限定されないが、ゼラチンおよび酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。）、
−香味剤（例として、限定されないが、アニス油、桂皮油、ココア、メントール、オレンジ油、ペパーミント油およびバニリンが挙げられる。）
−軟釈剤（例として、限定されないが、グリセロール、プロピレングリコールおよびソルビトールが挙げられる。）、
−研磨剤（例として、限定されないが、鉱油およびグリセリンが挙げられる。）、
−油（例として、限定されないが、ラッカセイ油、鉱油、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油および植物油が挙げられる。）、
−軟膏基剤（例として、限定されないが、ラノリン、親水軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、流動パラフィン、親水性流動パラフィン、白色軟膏、黄色軟膏およびローズ水軟膏が挙げられる。）、
−透過促進剤（経皮送達）（例として、限定されないが、モノヒドロキシまたはポリヒドロキシアルコール、１価または多価アルコール、飽和または不飽和脂肪アルコール、飽和または不飽和脂肪酸エステル、飽和または不飽和ジカルボン酸、精油、ホスファチジル誘導体、セファリン、テルペン、アミド、エーテル、ケトンおよび尿素が挙げられる。）、
−可塑剤（例として、限定されないが、フタル酸ジエチルおよびグリセロールが挙げられる。）、
−溶媒（例として、限定されないが、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、グリセロール、イソプロパノール、鉱油、オレイン酸、ピーナッツ油、精製水、注射用水、注射用滅菌水、および洗浄用滅菌水が挙げられる。）、
−硬化剤（例として、限定されないが、セチルアルコール、セチルエステルワックス、マイクロクリスタリンワックス、パラフィン、ステアリルアルコール、白色ワックスおよび黄色ワックスが挙げられる。）、
−坐剤基剤（例として、限定されないが、カカオ脂およびポリエチレングリコール（混合物）が挙げられる。）、
−界面活性剤（例として、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、ノノキシノール１０、オクストキシノノール９、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウムおよびモノパルミチン酸ソルビタンが挙げられる。）、
−懸濁化剤（例として、限定されないが、寒天、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、メチルセルロース、トラガカントガムおよびビーガムが挙げられる。）、
−甘味剤（例として、限定されないが、アスパルテーム、デキストロース、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトールおよびスクロースが挙げられる。）、
−錠剤付着防止剤（例として、限定されないが、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクが挙げられる。）、
−錠剤結合剤（例として、限定されないが、アカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮可能糖、エチルセルロース、ゼラチン、グルコース液、メチルセルロース、無架橋ポリビニルピロリドンおよびα化デンプンが挙げられる。）、
−錠剤およびカプセル剤賦形剤（例として、限定されないが、第二リン酸カルシウム、カオリン、乳糖、マンニトール、微結晶セルロース、粉末状セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトールおよびデンプンが挙げられる。）、
−錠剤被覆剤（例として、限定されないが、グルコース液、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースおよびシェラックが挙げられる。）、
−直打錠賦形剤（例として、限定されないが、第二リン酸カルシウムが挙げられる。）、
−錠剤崩壊剤（例として、限定されないが、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース、ポラクリリン（ｐｏｌａｃｒｉｌｌｉｎ）カリウム、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムおよびデンプンが挙げられる。）、
−錠剤滑剤（例として、限定されないが、コロイド状シリカ、コーンスターチおよびタルクが挙げられる。）、
−錠剤潤滑剤（例として、限定されないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ステアリン酸およびステアリン酸亜鉛が挙げられる。）、
−錠剤／カプセル剤不透明化剤（例として、限定されないが、二酸化チタンが挙げられる。）、
−錠剤光沢剤（例として、限定されないが、カルナウバロウおよび白ロウが挙げられる。）、
−増粘剤（例として、限定されないが、ミツロウ、セチルアルコールおよびパラフィンが挙げられる。）、
−等張化剤（例として、限定されないが、デキストロースおよび塩化ナトリウムが挙げられる。）、
−粘度増加剤（例として、限定されないが、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムおよびトラガカントガムが挙げられる。）、および
−湿潤剤（例として、限定されないが、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびステアリン酸ポリオキシエチレンが挙げられる。）。
【０２９５】
本発明に係る医薬組成物の非限定的な例は以下のように示され得る：
−滅菌ＩＶ溶液：本発明の所望のインターフェラーの５ｍｇ／ｍＬ溶液は無菌の注射用水を用いて作製されてもよく、必要に応じてｐＨが調整される。この溶液は、１−２ｍｇ／ｍＬへと無菌の５％デキストロースを用いて投与用に希釈され、約６０分間かけてＩＶ注入として投与される。
−ＩＶ投与用の凍結乾燥粉末剤：（ｉ）凍結乾燥粉末として、本発明の所望のインターフェラー、１００−１０００ｍｇ、（ｉｉ）クエン酸ナトリウム、３２−３２７ｍｇ／ｍＬ、および（ｉｉｉ）デキストラン４０、３００−３０００ｍｇを用いて無菌製剤が調製され得る。この製剤は、無菌の注射可能な生理食塩水またはデキストロース５％によって、１０から２０ｍｇ／ｍＬの濃度に再構成し、これをさらに生理食塩水またはデキストロース５％によって０．２−０．４ｍｇ／ｍＬへと希釈し、ＩＶボーラスまたはＩＶ点滴で１５−６０分かけて投与される。
−筋肉内懸濁液：以下の溶液または懸濁液が筋肉内注射用に調製され得る：
５０ｍｇ／ｍＬの本発明の所望の水不溶性（または水溶性）インターフェラー
５ｍｇ／ｍＬのカルボキシメチルセルロースナトリウム
４ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ８０
９ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム
９ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール。
【０２９６】
硬殻カプセル：標準的な２片の硬ゼラチンカプセルに、有効成分粉末１００ｍｇ、乳糖１５０ｍｇ、セルロース５０ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム６ｍｇを充填することにより、多数の単位カプセル剤が調製される。
【０２９７】
軟ゼラチンカプセル：ダイズ油、綿実油またはオリーブ油などの消化可能な油中に有効成分の混合物が調製され、融解したゼラチン内に容積型ポンプによって注入し、有効成分１００ｍｇを含有する軟ゼラチンカプセルを形成させる。このカプセルは洗浄され、乾燥される。有効成分は、ポリエチレングリコール、グリセリンおよびソルビトールの混合物中に溶解され、水混和性医薬混合物が調製され得る。
【０２９８】
錠剤：投薬単位が有効成分１００ｍｇ、コロイド状二酸化ケイ素０．２ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｍｇ、微結晶セルロース２７５ｍｇ、デンプン１１ｍｇおよび乳糖９８．８ｍｇとなるように、慣用の手順により多数の錠剤が調製される。嗜好性を高め、洗練さおよび安定性を改善するまたは吸収を遅らせるために、適切な水性および非水性の被覆が適用され得る。
【０２９９】
即時放出錠剤／カプセル剤：これらは慣用および新規の方法により製造された固体の経口投薬形態である。これらの単位は、医薬の即時溶解および送達のために、水なしで経口的に服用される。有効成分は、糖、ゼラチン、ペクチンおよび甘味剤などの成分を含有する液体中で混合される。これらの液体は、凍結乾燥および固相抽出法により、固形の錠剤またはカプレットに固体化される。薬物インターフェラーは、粘弾性および熱可塑性の糖およびポリマーまたは発泡性成分と共に圧縮され、水を必要としない即時放出を意図した多孔質のマトリックスを作製できる。
【０３００】
特定の実施形態において、インターフェラーは制御放出非経口製剤に製剤化される。インターフェラーの投与に適用され得るこのような制御放出非経口送達系の非限定的なリストとしては、油性注射、インプラント、リポソーム、ナノ粒子、ＰＥＧ化、ミクロスフェアおよびポンプが挙げられる。特定の実施形態において、固体脂質ナノ粒子がインターフェラーのための担体系として開発されてもよい。別の特定の実施形態において、インターフェラーはマイクロカプセル化されてもよい。ミクロスフェアは理想的には直径が約１２５μｍ未満である自由流動性粉末であり、このミクロスフェアは、１８ゲージニードルまたは２０ゲージニードルを使用した従来の注射器を用いて注射用の適切な水性ビヒクル中に懸濁されてもよい。このような使用のためのもっとも有望なポリマーはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリ（オルトエステル）およびポリ無水物である。ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）は、酸触媒反応または塩基触媒反応により加水分解して天然の代謝産物であるグリコール酸および乳酸を生成する生分解性ポリマーである。ＰＬＧＡはＦＤＡに承認されている。
【０３０１】
特定の実施形態によれば、分子は生理学的緩衝液を用いて凍結乾燥形態で提供されてもよい。特定の実施形態によれば、液体である場合、医薬組成物は、生理学的ｐＨ、特にｐＨ５から９の間、さらに特定するとｐＨ６からｐＨ８の間で提供される。
【０３０２】
本明細書で使用された場合、「投与する」という用語は、目的のタンパク質（複数も含む）を分子と接触させる目的を有する。例えば感染性疾患の場合、投与することは、タンパク質（複数も含む）が凝集するはずである生物とは異なる生物に対してであってもよいことに留意されたい。細胞内投与は、例えばリポソーム担体もしくはナノ粒子によりまたは注射により担体媒介性送達を介してであってもよい。さらに別の代替の実施形態において、凝集分子は細胞透過（または細胞転移）を媒介する配列により細胞に進入できる。細胞転移の場合、凝集分子は細胞透過配列の組換えまたは合成付着によりさらに修飾される。
【０３０３】
併用療法
特定の実施形態において、本発明のインターフェラーは、唯一の医薬品として投与されてもよいまたは併用が許容されない副作用を引き起こさない１種以上の他の医薬品と併用して投与されてもよい。本発明はまた、このような併用にも関する。例えば、本発明のインターフェラーは、公知の抗菌剤（例えば抗真菌剤または抗生物質）または他の適応剤などならびにそれらの混合物および組合せと併用されてもよい。
【０３０４】
本文書全体を通して述べている、「治療する」または「治療」という用語は、例えば癌などの疾患または障害の病態などに対抗する、軽減する、減少する、緩和する、改善することを目的とする対象の管理またはケアで慣例的に使用されている。治療は、非感染性障害についてと同様に感染性疾患についても両方、適用され得る。
【０３０５】
用量および投与：
標準的な毒性試験によっておよび哺乳動物における上記で特定した病態の治療を決定するための標準的な薬理学アッセイによってならびにこれらの結果を、これらの病態を治療するために使用される既知の医薬の結果と比較することによって、（実施例において特に真菌感染、細菌感染またはウイルス感染、特にカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）感染、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）感染およびインフルエンザウイルス感染において示したように）感染性疾患の治療または非感染性疾患（実施例に示したように癌、ＡＭＤおよび炎症など）の治療に有用なインターフェラーを評価することが知られている標準的な実験技術に基づいて、本発明のインターフェラーの有効用量が、各々の望まれる適応症を治療するために容易に決定され得る。これらの病態の１つの治療に投与される有効成分の量は、特定のインターフェラーおよび利用される投薬単位、投与様式、治療期間、治療される患者の年齢および性別ならびに治療される病態の性質および程度などの考慮に応じて広範に変えてもよい。
【０３０６】
投与される有効成分の総量は通常、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。臨床的に有用な投与スケジュールは１日１回ないし３回の投与から、４週ごとに１回の投与までの範囲である。加えて、患者が一定期間にわたり投薬を受けない「休薬期間」は、薬理効果と耐性との間の全体的バランスに有益であり得る。投薬単位は、約０．５ｍｇから約１５００ｍｇの有効成分を含有してもよく、１日１回以上、または１日１回よりも少なく投与されてもよい。静脈内、筋肉内、皮下および非経口注射を含む注射ならびに点滴技術の使用による平均の１日の投与量は好ましくは０．０１から２００ｍｇ／ｋｇ全体重である。平均の１日の直腸投与量レジメンは好ましくは０．０１から２００ｍｇ／ｋｇ全体重である。平均の１日の膣投与量レジメンは好ましくは０．０１から２００ｍｇ／ｋｇ全体重である。平均の１日の局所投与量レジメンは好ましくは１日１回から４回の間で投与される０．１から２００ｍｇである。経皮濃度は好ましくは０．０１から２００ｍｇ／ｋｇの１日用量を維持するのに必要とされるものである。平均の１日の吸入投与量レジメンは好ましくは０．０１から１００ｍｇ／ｋｇ全体重である。好ましくは、吸入用の組成物は、嗅ぎ薬もしくはエアロゾルもしくは噴霧器用の溶液としてまたは吹送用の超微粉末として単独でまたは乳糖などの不活性担体と併用して投与のために気道に提供される。このような場合、活性インターフェラーの粒子は、適切には５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば２から５ミクロンの間などの１から５ミクロンの間の直径を有する。代替として、３０から５００ｎｍの間の粒径を有する被覆されたナノ粒子が使用されてもよい。好ましい吸入用量は、０．０５から２ｍｇ、例えば０．０５から０．５ｍｇ、０．１から１ｍｇまたは０．５から２ｍｇの範囲である。
【０３０７】
各患者の具体的な初期および継続投与量レジメンは、担当の診断者により決定された病態の性質および重症度、利用された特定のインターフェラーの活性、患者の年齢および全身状態、投与時間、投与経路、薬物排出速度、薬物の組合せなどに応じて変化することは当業者に自明である。所望の治療様式および本発明のインターフェラーまたはその医薬として許容される塩もしくはエステルもしくは組成物の投与回数は、慣用の治療検査を使用して当業者により確認され得る。
【０３０８】
特定の実施形態において、本発明の医薬は、食肉目（ｃａｒｎｉｖｏｒｅ）（例えばイヌおよびネコ）、齧歯目（ｒｏｄｅｎｔｉａ）（例えばマウス、モルモットおよびラット）、ウサギ目（ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）（例えばウサギ）および霊長目（ｐｒｉｍａｔｅｓ）（例えばヒト、チンパンジーおよびサル）を含む、哺乳動物のクラスに投与される。
【０３０９】
一般的な方法のように、組成物は通常、関与する医療に使用するための書かれたまたは印刷された指示書が付随している。
【０３１０】
本発明はまた、１種以上の原子が、通常、天然に見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子と置換されているという事実を除いて、本明細書に定義したものと同一の同位体で標識されたインターフェラーを含む。本発明のインターフェラー内に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１１Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌが挙げられる。本発明のインターフェラーおよび前記インターフェラーの医薬として許容される塩または上述の同位体および／もしくは他の原子の他の同位体を含有する本発明のインターフェラーおよび前記インターフェラーの医薬として許容される塩は本発明の範囲内である。本発明の特定の同位体で標識されたインターフェラーは、例えば３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものであり、薬物および／または基質組織分布アッセイに有用である。トリチウム化した、すなわち３Ｈおよび炭素−１４、すなわち１４Ｃ同位体は、それらの調製および検出可能性の容易さのために特に好ましい。さらに、重水素、すなわち２Ｈなどのより重い同位体での置換は、より高い代謝的安定性、例えばインビボ半減期の増加または低下した必要用量に起因して特定の治療上の利点を与えることができ、それにより、一部の状況において、本発明の式Ｉの同位体で標識されたインターフェラーが通常、同位体で標識されていない試薬を容易に入手可能な同位体で標識された試薬と置換することによって、以下の実施例に開示された手順を実施することにより調製され得ることが好適であり得る。
【０３１１】
上述のように、分子は非感染性疾患および感染性疾患の両方を治療するために適用されてもよい。第１の実施形態によれば、本発明の分子は、癌、炎症性疾患または特定のタンパク質の異常発現に関連する免疫関連障害（例えば特定のタンパク質の過剰発現または特定のタンパク質のスプライス変異もしくは特定のタンパク質の変異型の（過剰）発現、膜アンカータンパク質の（過剰）発現、（変異体）膜貫通タンパク質の（過剰）発現、分泌タンパク質（例えば血液または血漿中に存在するプロテアーゼ、抗体またはサイトカイン）の（過剰）発現、細胞外マトリックス（例えばマトリックス金属タンパク質または膜貫通タンパク質（例えば増殖因子受容体）中のタンパク質の（過剰）発現によるなどの（非感染性）疾患の治療のため（代替として（非感染性）疾患を治療するための医薬の製造のため）に使用され得る。「異常発現」という用語は、例えば癌の場合、発癌性増殖因子の（過剰）発現を指し、その用語はまた、ドミナントネガティブ受容体もしくは変異受容体の発現または血液中の流出受容体（ｓｈｅｄｄｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発生または体液中のサイトカインもしくは増殖因子の発現（もしくは過剰発現）を含む。特定の実施形態において、「異常発現」とは、翻訳後に修飾されたタンパク質の不要な存在または翻訳後でない修飾されたタンパク質の望ましくない存在を指す。翻訳後修飾は修飾アミノ酸の生理化学的特性を変え、それ自体でそれらの修飾アミノ酸は、もっとも強い凝集傾向を有する形態を特異的に標的とすることに利用され得る所与のポリペプチドセグメントの凝集傾向を変化させる可能性を有する。このため、翻訳後修飾がベータ−凝集領域の凝集傾向を著しく低下させる場合、干渉が非修飾タンパク質でもっとも効果的になる。対照的に、翻訳後修飾がベータ−凝集領域の凝集傾向を増加させる場合、干渉が修飾タンパク質でもっとも効果的になる。疎水性単独に基づいて、リン酸化およびグリコシル化などの修飾が凝集傾向を低下させるのに対して、脂質付着が凝集傾向を増加させると推定される。
【０３１２】
特定の実施形態において、分子は、疾患状況において下方調節されることを必要とする（１種以上の）タンパク質を下方調節するために使用され得る。このようなタンパク質は典型的にその過剰発現が疾患と関連する、好ましくは疾患の原因となるタンパク質である（例えばＶＥＧＦＲ−２は、過剰発現が癌およびＡＭＤと原因として関連付けられるタンパク質であり、ＥＧＦＲは、過剰発現が癌と原因として関連付けられるタンパク質であり、ＴＮＦは過剰発現が炎症と原因として関連付けられるタンパク質である。）。しかしながら、このタンパク質はまた、疾患状況においてのみ発現され、通常、細胞／組織／対象が健康である場合、標的とされる細胞／組織／対象において発現されないタンパク質であり得る（例えばＰｌＧＦは成体組織において通常発現されないタンパク質であるが、これは腫瘍において発現される。）。下方調節されるタンパク質はまた、疾患の原因となるタンパク質（例えばリガンドが疾患と関連する場合、受容体）の（典型的に下流の）同じシグナル伝達経路にあるタンパク質であってもよく、それにより、異常シグナルが停止され得る。
【０３１３】
したがって、疾患の治療、安定化または予防に使用するために構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が前記疾患に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３１４】
特に治療されるべき想定された疾患としては、限定されないが、癌、ＡＭＤおよび炎症性疾患が挙げられる。それ故、癌の治療、安定化または予防に使用するために構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が癌に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３１５】
同様に、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療、安定化または予防に使用するための構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現がＡＭＤに関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３１６】
同じように、炎症性疾患の治療、安定化または予防に使用するための構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が炎症性疾患に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３１７】
もっとも特定すると、癌またはＡＭＤにおいて下方調節されるタンパク質はＶＥＧＦＲ−２である。代替として、癌において下方調節されるタンパク質はＥＧＦＲ２である。炎症性疾患において下方調節され得る特定のタンパク質としてはＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βが挙げられる。
【０３１８】
前に述べたように、このことは、それを必要とする対象における疾患（特にそれぞれ癌、ＡＭＤまたは炎症性疾患）を治療、安定化または予防する方法であって、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が疾患（特にそれぞれ癌、ＡＭＤまたは炎症性疾患）に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与することを含む、方法が提供されるということと等価である。
【０３１９】
または、スイス型の形式において、疾患（特にそれぞれ癌、ＡＭＤまたは炎症性疾患）を治療、安定化または予防するための医薬を製造するための構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、その発現または過剰発現が疾患（特にそれぞれ癌、ＡＭＤまたは炎症性疾患）に関連するタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子の使用が提供される。
【０３２０】
これらの３つの等価の製剤が特許法の異なる国家基準に従うように含まれる。
【０３２１】
対象は特定すると動物、さらに特定すると哺乳動物（例えばネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、マウス、ラット、．．．）、もっとも特定するとヒトである。同様に他の対象も想定される（定義を参照のこと）。
【０３２２】
しかしながら、これらの方法はまた、特に植物における疾患を治療するために哺乳動物以外の生物に適用されてもよいことに留意すべきである（さらに参照のこと）。
【０３２３】
特定の実施形態において、インターフェラー分子は、増殖因子または増殖因子受容体または膜貫通受容体キナーゼ（例えばチロシンキナーゼ受容体）に向けられる。非限定的な例のリストとして、ＰＤＧＦ−ベータタンパク質（および特定のインターフェラーが、望ましくないＰＤＧＦ−ベータ発現により特徴付けられた障害、例えば精巣癌および肺癌を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、Ｅｒｂ−Ｂタンパク質（および特定のインターフェラーが、望ましくないＥｒｂ−Ｂ発現により特徴付けられた障害、例えば乳癌を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、ＶＥＧＦタンパク質（および特定のインターフェラーが、望ましくないＶＥＧＦ発現、例えば食道癌、結腸癌もしくは病的血管新生を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、ＥＧＦＲタンパク質（および特定のインターフェラーが、望ましくないＥＧＦＲ発現により特徴付けられた障害、例えば乳癌を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、ＷＮＴ−１タンパク質（および特定のインターフェラーが、望ましくないＷＮＴ−１発現、例えば基底細胞癌を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕタンパク質（およびインターフェラーが、望ましくないＨｅｒ２／Ｎｅｕ発現により特徴付けられた障害、例えば乳癌を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、アルファｖ−インテグリンタンパク質（およびインターフェラーが、望ましくないアルファｖ−インテグリンにより特徴付けられた障害、例えば脳腫瘍もしくは上皮性起源の腫瘍を有する対象を治療するために使用されてもよい。）、Ｆｌｔ−１受容体タンパク質（およびインターフェラーが、望ましくないＦｌｔ−１受容体により特徴付けられた障害、例えば癌および関節リウマチを有する対象を治療するために使用されてもよい。）が含まれる。特定のインターフェラーのさらに他の例は、インテグリンのコリガンド、例えばＶＬＡ４、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、セレクチンもしくはそのコリガンド、例えばＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン（ＥＬＡＭ）、Ｌ−セレクチンもしくはＰ−セレクチン糖タンパク質−（ＰＳＧＬ１）、補足系の成分、例えばＣ３、Ｃ５、Ｃ３ａＲ、Ｃ５ａＲ、Ｃ３転換酵素、Ｃ５転換酵素、ケモカインもしくはその受容体の機能、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＩｇＥ、ＳＣＹＡ１１もしくはＣＣＲ３、イオンチャネルの成分、Ｇタンパク質共役型受容体の成分に対する特異性を用いてまたは神経伝達物質受容体もしくはそのリガンドの機能を用いて設計されてもよい。
【０３２４】
別の態様によれば、特に想定される医学的用途は、感染性疾患における医薬として本明細書に提供された分子の使用である。
【０３２５】
それ故、抗病原性（または抗感染性）薬物として使用するための次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、病原生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３２６】
特定の実施形態によれば、分子が抗菌薬として使用される。それ故、抗菌剤として使用するための次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３２７】
それ故、インターフェラーの使用は、動物およびヒト細菌性病原体による感染、動物およびヒト菌類病原体についての感染ならびに動物およびヒト寄生性病原体についての感染の治療を考慮する。動物およびヒト病原体の非排他的なリストは、ＵＳ特許８，０８８，８８８の表１Ａ（８頁で開始して１５頁で終わる）に見出される。動物および菌類病原体の非排他的なリストは、ＵＳ特許８，０８８，８８８の表１Ｂ（１５頁で開始して１８頁で終わる）に見出される。動物およびヒト寄生性病原体の非排他的なリストは、ＵＳ特許８，０８８，８８８の表１Ｃ（１８頁で開始して２０頁で終わる）に見出される。ＵＳ特許８，０８８，０００の表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃはその全体を参照により本明細書に組み込む。
【０３２８】
別の特定の実施形態によれば、分子は抗ウイルス薬として使用される。それ故、抗ウイルス剤として使用するための次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、ウイルス生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３２９】
別の等価の製剤は、これらの分子の使用が病原体感染（またはそれぞれ微生物感染もしくはウイルス感染）を治療するための医薬の製造のために提供されること、すなわちスイス型の請求項である。
【０３３０】
このことはまた、それを必要とする対象における病原体感染を予防または治療する方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、病原体のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与することを含む方法が提供されるということと等価である。
【０３３１】
または、抗菌剤の場合、これは、それを必要とする対象における微生物感染を治療するために提供された方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与することを含む、方法と等価である。
【０３３２】
または、抗ウイルス剤の場合、これは、それを必要とする対象におけるウイルス感染を治療するために提供された方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは、ウイルス生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
を有する分子を対象に投与することを含む、方法と等価である。
【０３３３】
方法のさらなる段階は、病原性（例えば微生物、ウイルス）生物の存在の評価（または測定）（例えば病原性生物の増殖、複製または生存のモニタリング）を含んでもよい。
【０３３４】
本明細書で使用された場合、「微生物」とは、グラム陽性細菌（例えばスタフィロコッカス属種、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）などの球菌、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などの桿菌）、グラム陰性菌（例えばエシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）（例えばトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）などのトレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）などのボレリア属種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、モリキューテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）（すなわちマイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）などの細胞壁を有さない細菌）、抗酸菌（ａｃｉｄ−ｆａｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）（例えばマイコバクテリウム・ツベルクロサム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｕｍ）などのマイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ノカルジア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ））などの細菌を指してもよい。「微生物」はまた、真菌（酵母菌（ｙｅａｓｔ）および糸状菌（ｍｏｕｌｄ）など、例えばカンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、コクシジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヒストプラスマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ニューモシスティス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）またはトリコフィートン属種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、原生動物（例えばプラスモディウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、エントアメーバ属種（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ジアルジア属種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、トキソプラズマ属種（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、クリプトスポリジウム属種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、トリコモナス属種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、トリパノソーマ属種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ））および古細菌を包含する。特定の実施形態によれば、微生物のタンパク質は、細菌、真菌または原生動物から選択される微生物のタンパク質である。さらに特定すると、タンパク質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、マイコバクテリア、モリキューテス、原生動物または真菌のうちの１つである。さらに特定すると、タンパク質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、マイコバクテリアまたは酵母菌および糸状菌などの真菌のタンパク質である。
【０３３５】
本明細書で等価物として使用された、「ウイルス生物」または「ウイルス」は、生物の生細胞内でのみ複製できる小感染因子である。これらは、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ））、ｓｓＤＮＡウイルス（例えばパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ））、ｄｓＲＮＡウイルス（例えばレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ））、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えばピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ））、（−）ｓｓＲＮＡウイルス（例えばオルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ））、ｓｓＲＮＡ−ＲＴ（逆転写）ウイルス、すなわちライフサイクルにおいてＤＮＡ中間体を有する（＋）センスＲＮＡを有するウイルス（例えばレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ））およびｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（例えばヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ））を含む。ウイルスの特定のクラスは、細菌に感染し、ウイルスの遺伝物質（ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）を注入するウイルスである、バクテリオファージ（または手短に言えばファージ）である。ファージは特に海水中に豊富にあり、多くの海洋細菌はファージに感染している。バクテリオファージは、細菌が使用される工業プロセスにおいて（例えばヨーグルト、チーズなどの食品生産において）問題を表す場合がある。
【０３３６】
非ヒト動物においてウイルス感染を治療するまたはウイルス感染性を阻害することを対象とする方法において、動物ウイルスは好ましくは、ウシエンテロウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ブタエンテロウイルスＢ（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｂ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、ウシ鼻炎Ｂウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、ユンガンウイルス（ｌｊｕｎｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ウマ鼻炎Ｂウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、アイチウイルス（ａｉｃｈｉ  ｖｉｒｕｓ）、ウシコブウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｋｏｂｕｖｉｒｕｓ）、ブタテッショウウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ブタサペロウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ）、サルサペロウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ）、トリサペロウイルス（ａｖｉａｎ  ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ）、トリ脳脊髄炎ウイルス（ａｖｉａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、アヒルＡ型肝炎ウイルス（ｄｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）もしくはサルエンテロウイルスＡ（ｓｉｍｉａｎ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ａ）などのピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ボーダー病ウイルス（ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウシのウイルス性下痢（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉａｒｒｈｅａ）もしくはブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）などのペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）、ウマ動脈炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｌｅｖａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）もしくはサル出血熱ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）などのアルテリウイルス（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、ウシコロナウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ブタコロナウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ネココロナウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）もしくはイヌコロナウイルス（ｃａｎｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）などのコロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヘンドラウイルス（ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ニパーウイルス（ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ）、イヌジステンパーウイルス（ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ニューキャッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）およびウシＲＳウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）などのパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡ型ウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＢ型ウイルス（ｉｎｆｌｕｅ���ｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）もしくはインフルエンザＣ型ウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）などのオルソミクソウイルス、ブルータングウイルス（ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）などのレオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）もしくはウシヘルペスウイルス１型（ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）などのヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、アフリカブタコレラウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）などのアスファウイルス（ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ウシ免疫不全ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ウシ白血病ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ネコ白血病ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（Ｊａａｇｓｉｅｋｔｅ  ｓｈｅｅｐ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）もしくはヤギ関節炎脳炎ウイルス（ｃａｐｒｉｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）などのレトロウイルス、黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ｔｉｃｋ  ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）もしくはウシウイルス性下痢ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ）などのフラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）または狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）などのラブドウイルスから選択される。
【０３３７】
ヒトにおいてウイルス感染を治療するまたはウイルス感染性を阻害することを対象とする方法において、ヒトウイルスは好ましくは、アデノウイルス、アストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ブニヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス、フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルスまたはトガウイルスから選択される。好ましい実施形態において、アデノウイルスとしては、限定されないが、ヒトアデノウイルスが挙げられる。好ましい実施形態において、アストロウイルスとしては、限定されないが、ママストロウイルス（ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ヘパドナウイルスとしては、限定されないが、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ヘルペスウイルスとしては、限定されないが、単純ヘルペスウイルスＩ型（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ）、単純ヘルペスウイルス２型（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２）、ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ロゼオロウイルス（ｒｏｓｅｏｌｏｖｉｒｕｓ）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、パポーバウイルスとしては、限定されないが、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）およびヒトポリオーマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ポックスウイルスとしては、限定されないが、痘瘡ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、牛痘ウイルス（ｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、サル痘ウイルス（ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、天然痘ウイルス（ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、偽牛痘ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、丘疹口内炎ウイルス（ｐａｐｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、タナポックスウイルス（ｔａｎａｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、ヤバサル腫瘍ウイルス（ｙａｂａ  ｍｏｎｋｅｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）および伝染性軟属腫ウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、アレナウイルスとしては、限定されないが、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサウイルス（ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、マクポウイルス（ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）およびフニンウイルス（ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ブニヤウイルスとしては、限定されないが、ハンタウイルス（ｈａｎｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ナイロウイルス（ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）、オルソブニヤウイルス（ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）およびフレボウイルス（ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、カリシウイルスとしては、限定されないが、ベシウイルス（ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）、ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ）などのノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）およびサポウイルス（ｓａｐｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、コロナウイルスとしては、限定されないが、ヒトコロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の病原因子）が挙げられる。好ましい実施形態において、フィロウイルスとしては、限定されないが、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）およびマールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、フラビウイルスとしては、限定されないが、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マリーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ロシア春夏脳炎ウイルス（Ｒｕｓｓｉａｎ  ｓｐｒｉｎｇ−ｓｕｍｍｅｒ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ）、キャサナス森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｓ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）およびポーワッサン脳炎ウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、オルソミクソウイルスとしては、限定されないが、インフルエンザＡ型ウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ａ）、インフルエンザＢ型ウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｂ）およびインフルエンザＣ型ウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｃ）が挙げられる。好ましい実施形態において、パラミクソウイルスとしては、限定されないが、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス（ｒｕｂｕｌａ  ｖｉｒｕｓ）（流行性耳下腺炎（ｍｕｍｐｓ））、モルビリウイルス（ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）（麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ））、ヒトＲＳウイルス（ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）などの肺炎ウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）および亜急性硬化性全脳炎ウイルス（ｓｕｂａｃｕｔｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ピコルナウイルスとしては、限定されないが、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス��ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルスＡ（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ）、コクサッキーウイルスＢ（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ｂ）、Ａ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）およびエネテロウイルス（ｅｎｅｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、レオウイルスとしては、限定されないが、コロラドダニ熱ウイルス（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｔｉｃｋ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）およびロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、レトロウイルスとしては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）などのレンチウイルスおよびヒトＴリンパ球向性ウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＴＬＶ）が挙げられる。好ましい実施形態において、ラブドウイルスとしては、限定されないが、狂犬病ウイルスなどのリッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）および伝染性造血器壊死症ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。好ましい実施形態において、トガウイルスとしては、限定されないが、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ  ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）および西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）などのアルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）ならびに風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【０３３８】
特定の実施形態によれば、病原生物のタンパク質は、薬物耐性病原体、薬物耐性株または薬物耐性バリアント由来のタンパク質である。薬物耐性は、いくつかの病原体、特にウイルスおよび微生物で生じることが知られている。
【０３３９】
薬物耐性の特定の例は抗生物質耐性であるので、さらに特定の実施形態によれば、微生物のタンパク質は、抗生物質耐性生物、抗生物質耐性株もしくは抗生物質耐性バリアント由来のタンパク質であるまたは同様に抗生物質耐性生物で発生するタンパク質である。実施例のセクションも参照のこと。本発明の分子は既知の抗生物質と完全に異なる作用機構を有する（すなわち本発明の分子は微生物の標的タンパク質を凝集する。）ので、抗生物質耐性生物はこれらの分子に対して耐性がないと想定される。さらに、タンパク質のほとんどの疎水性領域はタンパク質の保存された部分であるので、抗生物質耐性（または抗菌剤耐性）が従来の抗生物質に対するより、これらの分子に対してゆっくり発生すると想定される。実際に特定の実施形態によれば、方法は、ＭＩＣ値を顕著に増加させない、分子の長期投与を含む。それ故、本明細書に記載された分子が、少なくとも１０日の間、少なくとも１日に１回または１４日の間、少なくとも１日に１回投与される、投与方法が提供される。特に、この治療レジメンは抗生物質耐性の発生を伴わない。それ故、これらの実施形態は、時間内にこの範囲にわたってＭＩＣ値が４倍より多く増加しないまたは倍増しないことを予測する。もっとも特定すると、長期投与の間、特定の微生物についてのインターフェラー分子のＭＩＣ値は、特定の微生物についてのインターフェラー分子の臨床ブレークポイント未満のままであると想定される。
【０３４０】
特定の実施形態によれば、分子は病原体（例えば微）生物を死滅させるために使用され得るまたは方法は病原体（例えば微）生物の死滅を引き起こす。なおさらなる特定の実施形態によれば、分子は、特に１時間以内または３０分以内で病原体（微）生物の迅速な死滅を成功させる。迅速な殺菌効果（または微生物に対する迅速な死滅効果）により、単剤療法においてさえも良好な臨床結果が得られる（Ｆｉｎｃｈら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；４６（６）：１７４６−５４、２００２）だけでなく、抗菌療法の期間および入院の長さも短くでき、同様に低下した耐性発現に寄与することができる。このことは例えば迅速に死滅させるフルオロキノロン抗生物質に関して示されている（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．；６４（３）：３７８−８８、２０１０）。
【０３４１】
代替の実施形態によれば、分子を使用する方法は、病原体を死滅させずに、この病原体（例えば微生物またはウイルス）生物の増殖および／または複製を阻害する。
【０３４２】
特定の実施形態によれば、微生物のタンパク質は必須タンパク質である。すなわち生物はそのタンパク質を枯渇すると生存できない。他の（非排他的な）特定の実施形態によれば、微生物のタンパク質はバイオフィルム形成に関与する。バイオフィルム形成は十分に特徴付けられた現象であり、バイオフィルム形成に関与する複数のタンパク質は、当業者に認識されているように同定されているおよび／または特徴付けされている。これらのタンパク質は微生物種によって異なってもよい（または同種であってもよいが、異なる名前を有する）。このようなタンパク質の例としては、限定されないが、Ｈｗｐ１、タンパク質のＡｌｓファミリー（特にＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））、ＥＰＡ遺伝子ファミリー、ＡＷＰ１−４遺伝子ファミリーおよびＰＷＰ遺伝子（特にＣ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ））によりコードされたタンパク質、ｈｍｓＨＦＲＳ、ｇｍｈＡ、ｙｒｂＨ、ｗａａＡＥ−ｃｏａＤ、ｈｍｓＴ、ｈｍｓＰ、ｓｐｅＡ、ｓｐｅＣ、ｎｇｈＡ、ｒｃｓＡ、ｒｃｓＣ、ｒｃｓＤＢ、ｐｈｏＰＱ遺伝子によりコードされたエルシニアタンパク質（ＺｈｏｕおよびＹａｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ２０１１の表１を参照のこと）、ｉｃａＡＤＢＣ、ｉｃａＲ、ｓａｒ、ａｇｒ、ｒｂｆ、ｓｉｇｍａ（Ｂ）遺伝子によりコードされたスタフィロコッカスタンパク質が挙げられる。
【０３４３】
さらなる実施形態によれば、微生物のタンパク質がバイオフィルム形成に関与する、バイオフィルム形成を治療または予防する方法が提供される。なおさらなる実施形態によれば、バイオフィルム形成は、対象物、特にカテーテルまたはステントなどの埋め込み型装置上に存在する。
【０３４４】
それ故、これらの実施形態によれば、表面上の微生物のバイオフィルム増殖を予防、阻害または逆戻りさせる方法であって、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは微生物のタンパク質に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に表面を接触させることを含む、方法が提供される。
【０３４５】
もっとも特定すると、微生物のタンパク質はバイオフィルム形成に関与するタンパク質である。バイオフィルム形成が予防される、阻害されるまたは逆戻りされる表面は生物表面または非生物表面であってもよい。特に、表面は、身体自体に由来するまたは埋め込み型装置に由来するなどの身体内の外因性対象物に由来する対象の身体上または対象の身体内にあってもよい。
【０３４６】
対象における微生物感染を予防または治療することを主に想定されるが、分子は、同様に対象の身体の表面上または対象の身体の外部の物体上の（病原体）微生物の存在を予防または改善するための抗菌剤として使用されてもよいことが留意されるべきである。この適用は主に、高価値材料または滅菌材料、例えば埋め込み型装置に使用される材料の被覆を目的とする。したがって、カテーテルまたはステントなどの埋め込み型装置の表面上の微生物バイオフィルム増殖を予防する、阻害するまたは逆戻りさせる方法が提供される。
【０３４７】
よって、被覆された装置もまた、本発明の範囲内と想定される。装置の被覆は分子を装置に適用することにより直接行われてもよい。代替として、分子は、（クロス）リンカーを使用して装置上に被覆されてもよい。装置は、（例えば分子溶液中に装置を浸漬することにより）完全に被覆されてもよいまたは装置の一部のみが被覆されてもよい。装置は、微生物中に存在するタンパク質、特にバイオフィルム形成に関与するタンパク質に対して分子で被覆されることが特に想定される。しかしながら、装置は、他のタンパク質に向けられた分子で（または二重特異性であり、異なるＹｉ部分を介して微生物のタンパク質および別のタンパク質を標的とする分子で）被覆されることもまた想定される。例えば、装置の埋め込みはしばしば、局在化した有害な免疫反応を引き起こし得る。これらは、これらの免疫反応に関与したタンパク質を標的とした分子で（または例えば２種の異なるタンパク質に対する二重特異性分子で）装置の少なくとも一部を被覆することにより対抗され得る。別の例として、（特定のバイオフィルムを形成する）真菌および細菌の同時感染に対抗するために、装置の少なくとも一部は真菌タンパク質を標的とした分子で被覆されてもよく、細菌タンパク質を標的とした分子で（または真菌タンパク質および細菌タンパク質に対して（少なくとも二重）特異性である分子で）部分的に被覆されてもよい。
【０３４８】
それ故、構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子で少なくとも部分的に被覆される装置（特に埋め込み型装置）が提供される。
【０３４９】
もっとも特定すると、少なくとも１つのＹｉは、微生物のタンパク質、特にバイオフィルム形成に関与するタンパク質中に天然に存在する一続きである。
【０３５０】
スクリーニング方法
さらなる態様によれば、細胞株（限定されないが、ヒト細胞株、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株および植物細胞株を含む）、病原体または微生物中の新規化合物をスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は、標的についての事前の知識がなくても、研究下で細胞株もしくは生物の増殖、複製もしくは生存に対する効果を有する化合物またはタンパク質機能を阻害するおよび／または前記細胞株もしくはタンパク質中でタンパク質を凝集する化合物の迅速同定を可能にする。しかしながら、凝集による下方調節は配列特異的であるので、作業化合物の配列は標的の迅速同定を可能にする。それ故、これらのスクリーニング方法を使用して新規化合物が得られ得るだけでなく、これらのスクリーニング方法はまた、新規薬物標的の同定を可能にする。この理由のために、疾患に合わせた細胞株（例えば癌細胞株またはさらに腫瘍から直接単離された細胞など）を使用することもまた、特に興味深くなり得る。
【０３５１】
このようなスクリーニング方法は
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つのタンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定した少なくとも１つのタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも１つの分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された少なくとも１つの分子を、段階ａ）のタンパク質に添加する段階ならびに
ｄ）タンパク質の機能および／または凝集を評価する段階
を含む。
【０３５２】
特に、スクリーニング方法は細胞系において実施されるまたは病原体で直接実施される。これらの方法は
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つの、細胞株、病原体もしくは微生物のタンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定すると、Ｒ、ＫおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定した少なくとも１つの、細胞株、病原体もしくは微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも１つの分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された少なくとも１つの分子を、そのゲノム中に段階ａ）のタンパク質がコードされている細胞株、病原体もしくは微生物に添加する段階ならびに
ｄ）細胞株、病原体もしくは微生物の生存および／または増殖もしくは繁殖を評価する段階
を含む。
【０３５３】
上述のように、所望の場合、方法は、細胞株、病原体もしくは微生物の生存、増殖および／または複製に影響を与える分子のＹｉ配列（段階ｂで合成した）を、段階ａ）において同定したタンパク質と関連付けて、標的とされるタンパク質を同定する段階をさらに含んでもよい。しかしながら、この関連付ける段階は抗病原体化合物に必要とされず、抗病原体化合物が、標的とされる正確なタンパク質を知ることより病原体の生存、複製または増殖の阻害に成功するという点がより重要であり得る。
【０３５４】
標的生物の生存、増殖または複製の阻害は、病原生物（例えば微生物またはウイルス生物）を主に想定するので、これらの方法は新規抗病原体（例えば抗菌性または抗ウイルス性）化合物を求めてスクリーニングするのに特に適している。
【０３５５】
それ故、特定の実施形態によれば、新規抗病原体化合物を求めてスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を病原体の少なくとも１つのタンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定した病原生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも１つの分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された少なくとも１つの分子を、そのゲノム中に段階ａ）のタンパク質がコードされている病原生物に添加する段階ならびに
ｄ）病原生物の生存および／または増殖もしくは繁殖を評価する段階
を含む。
【０３５６】
特定の実施形態によれば、新規抗菌体化合物をスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つの微生物タンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定した微生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも１つの分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された少なくとも１つの分子を、そのゲノム中に段階ａ）のタンパク質がコードされている微生物に添加する段階ならびに
ｄ）微生物の生存および／または増殖もしくは繁殖を評価する段階
を含む。
【０３５７】
生存を評価する際に、ＭＩＣ値が決定され得る。抗菌活性を有する化合物を同定するため、すなわち的中として分子を分類するために、ＭＩＣは、特に１００μｇ／ｍｌより低くなるはずである、さらに特定すると５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌより低くなるはずである、またはもっとも特定すると１０μｇ／ｍｌより低くなるはずである（例えば５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌなど）。
【０３５８】
ＭＩＣ値は典型的にμｇ／ｍｌで表すが、本化合物の分子量は平均して、古典的な抗生物質化合物の分子量より顕著に高いことが留意されるべきである。実際に、少なくともＸ部分およびＹ部分内のアミノ酸の存在に起因して、および１つより多い「単位」が分子内に存在し得る（すなわちｎは１つより大きい整数であり得る。）という事実に起因して、抗生物質は典型的に２００−７００ダルトンの範囲の分子量を有するが、分子量は典型的に１０００ダルトンより（非常に）高い。結果として、類似したモル濃度は、非常に高い分子量を与え、それ故、非常に高いＭＩＣ値を与える。つまり、有効な抗菌効果を決定するために、μｇ／ｍｌ値のモル当量を計算する（および例えばこれらと他の抗生物質についてのモル値とを比較する）ことは興味深くなり得る。
【０３５９】
さらに特定の実施形態によれば、新しい抗ウイルス性化合物をスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は、
ａ）４個から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１つの脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記領域を少なくとも１つのウイルスタンパク質において同定する段階、
ｂ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５までであり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは段階ａ）において同定したウイルス生物のタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の少なくとも１つの分子を合成する段階、
ｃ）段階ｂ）において作製された少なくとも１つの分子を、段階ａ）のタンパク質がコードされるゲノムのウイルス生物に添加する段階ならびに
ｄ）ウイルス生物の生存および／または増殖もしくは複製を評価する段階
を含む。
【０３６０】
典型的に、ウイルスに関して、生存は感染細胞に対する効果（例えば生存）を評価することによって間接的に測定され得る。この間接的な方法はまた、他の病原性生物に適用されてもよい。しかしながら、直接的な方法がより定量的であるので、これらが通常好ましい。ウイルスに関して、ウイルス価が決定されてもよい。代替として、唯一の特定のウイルスタンパク質が存在し、レポータータンパク質がウイルス複製または「生存」に対する効果の指標である、ミニレプリコン系が設定されてもよい。
【０３６１】
注目すべきことは、新規の抗病原体化合物を同定する方法としてスクリーニング方法が本明細書に記載されるが、当業者は、これらの方法がまた、もっとも効果的な化合物を選択するために非病原性タンパク質を対象とする新規化合物を同定するのに使用されてもよいことを容易に理解する。例えば、タンパク質を下方調節することによって疾患を治療することが想定される分子は最初に、適切な読出しを用いて細胞または動物モデルにおける有効性についてスクリーニングされてもよい（但し、少なくとも１つのＹｉの一続きに対応する領域の配列保存が、化合物が投与されるべき細胞または動物モデルおよび生物において同じ化合物を使用するのに十分である。）。このことは、例えば異なるベータ−凝集領域を含有するタンパク質について行われてもよいまたはベータ−凝集領域の最適な組合せを同定するために行われてもよい。
【０３６２】
実際、病原性生物の増殖、複製および／または生存に影響を与える（その結果として、感染性疾患の治療に使用されてもよい）分子についてのスクリーニング方法と同様に、方法は、非感染性疾患に使用され得る分子をスクリーニングするために使用されてもよい。方法は、（例えば標的活性に連結されたレポーターを有するまたは細胞の生存について標的の存在に依存する細胞株中でスクリーニングすることによって）既知の標的に対するもっとも効果的な化合物を同定するために使用されてもよいまたは新規標的を同定するために使用されてもよい。新規標的を同定することは、細胞死はレポーターアッセイに依存しないので、細胞死が読み出され得る用途に特に当てはまる。しかしながら、方法はレポーターアッセイが同様に利用可能である経路において新規標的を同定するために使用されてもよい。
【０３６３】
本明細書に提示されたスクリーニング方法は既存のスクリーニング方法よりかなりの利点を提供する。一方で、これらのスクリーニング方法は無作為なスクリーニングではなく、それ故、首尾良い化合物を産生する可能性が高い。他方で、これらのスクリーニング方法は、標的化が完全に配列ベースである場合、効果的なスクリーニングに利用可能である標的タンパク質の３Ｄ構造を必要としない。新規標的を同定することは、抗菌剤または抗生物質に関する特定の問題であることが知られている。
【０３６４】
同定した化合物が効果的であり、副作用を有さないことを確認するために、特に脊椎動物、もっとも特に哺乳動物系に対する化合物の毒性が試験されるべきである。また、非関連タンパク質（例えば新規抗生物質分子が同定される場合、非微生物タンパク質）を標的することを回避するために、交差反応が試験されるべきである。このことは、まず第一に、例えばＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントプログラムによって、段階ａ）において同定される配列を、化合物（例えば抗菌性化合物または抗ウイルス性化合物）が投与される生物／種属の配列と比較することによって容易に行われ得る。（抗感染適用に使用される）病原体に向けられた分子について、この分子に存在する病原性（例えば微生物）タンパク質における一続きと同一である１つ以上のＹｉ部分は、分子が投与される（典型的に哺乳動物、特にヒト）生物／対象のゲノム内でコードされないことが特に想定される。
【０３６５】
抗病原性（例えば抗微生物）化合物に対する新規標的を同定する方法を含む実施形態において、段階ａ）における病原性（例えば微生物）タンパク質は、薬物（例えば抗生物質）に対する既知の標的ではないことが特に想定される。このことにより、異なる標的が対処されるので、同定された化合物が併用療法において特に有用となる。さらに、標的が薬物（抗生物質など）に対する既知の標的でない場合、薬物（抗生物質）耐性はまだ発生していない。
【０３６６】
別の特定の利点は、スクリーニング方法が、興味のある標的として特定のタンパク質に対する選択バイアスを有さずに実施され得ることである。実際に、生物（または細胞株）の全プロテオームが分析されてもよく、適切な配列が本明細書に記載された分子内で使用されてもよく、有効性について試験されてもよい。このことにより、新規標的を得る可能性が高くなる。さらに、このような分析が行われる場合、特に抗病原性適用に関して、段階ａ）において同定される領域はプロテオームにおいて１回より多く発生する領域であることが想定される。より特定すると、段階ａ）において同定される４から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域は病原性（例えば微生物またはウイルス）生物の１つより多いタンパク質で発生する。
【０３６７】
実際に、多くの場合に感染に直面する場合、１種より多い病原性生物を標的とすることが望まれる。このことは、例えばしばしば広範囲の抗菌剤が使用される、微生物による感染において明らかである。これにより、感染性生物の正確な同定を知らなくても感染に対処できる。この方法において、段階ａ）において同定される４から１６個の連続するアミノ酸の少なくとも１つの領域が１種より多い微生物のタンパク質または少なくとも１つのタンパク質において発生することもまた保証され得る。
【０３６８】
もっとも特定すると、本明細書で標的とされる微生物は病原性微生物である。有益な微生物（例えば対象の腸管内菌叢中の有益な微生物）が殺傷されないことを確認するために、微生物において同定された一続きが病原性生物（複数も含む）に特異的であり、有益な微生物において発生しないかどうかが検査されてもよい。
【０３６９】
単離、枯渇、検出および診断
別の実施形態において、本発明は、試料から特異的タンパク質を単離する方法であって、前記試料を少なくとも１つのインターフェラー分子と接触させる段階および前記試料から得られる同時に凝集したインターフェラー−タンパク質複合体を単離する段階を含む、方法を提供する。すなわち、インターフェラー分子は標的タンパク質を切り離して捕捉する結合剤として作用する。このインターフェラー分子は検出が必要であるすべての分野において（例えば汚染物質のレベルを測定するホワイトバイオテクノロジー（ｗｈｉｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ）において、例えばバイオマーカーまたは代謝産物のレベルを測定するレッドバイオテクノロジーまたはグリーンバイオテクノロジーなどにおいて）使用され得る。
【０３７０】
さらなる実施形態において、試料に対する特異的タンパク質を単離する方法は、前記試料からの前記少なくとも１つのタンパク質の分離をさらに含む。試料からの少なくとも１つのタンパク質の分離の１つの適用は試料からの非常に豊富なタンパク質の除去（または枯渇）である。実際に、タンパク質標的発見および検証における主要な課題は、複合タンパク質試料（例えば血漿、尿、脳脊髄液）を特に分析する方法および微量標的（すなわち非常に少ない量の標的）を測定する方法である。典型的に、豊富なタンパク質はしばしば少ない量のタンパク質より６から１０桁多く濃縮される。それ故、特定の場合、非常に豊富なタンパク質は、医学的に重要である微量タンパク質を検出し、測定するために除去されなければならない。アルブミン、ＩｇＧ、抗トリプシン、ＩｇＡ、トランスフェリンおよびハプトグロビンはヒト血清において約９０％の総タンパク質含有量を構成するので、これらの望ましくない豊富なタンパク質を迅速に枯渇させ、少ない量の低分子量タンパク質バイオマーカーを曝露させる診断ツールが非常に必要とされている。いくつかの方法が当該技術分野で既に使用されている：１）豊富なタンパク質標的を捕捉し、分離する親和性試薬として免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、２）卵黄免疫グロブリン（ＩｇＹ）は免疫化トリの卵黄から単離されるＩｇＧ様抗体である、３）前分取が、元の混合物中の特定のタンパク質を除去するために異なる画分内にタンパク質の混合物を分離するために使用される、および４）プロテインＡおよびプロテインＧはＩｇＧ抗体に対する特異性を有する細菌細胞壁タンパク質であり、それ故、プロテインＡおよびＧ親和性樹脂はＩｇＧの除去を提供する、および５）ＩｇＧ−マイクロビーズおよびＩｇＹマイクロビーズがタンパク質検出に使用される。
【０３７１】
別の特定の実施形態において、少なくとも１つのタンパク質を単離する方法は、前記分子−タンパク質複合体中の少なくとも１つのタンパク質の検出をさらに含む。検出は、例えば電気泳動、カラムクロマトグラフィー、濾過、静電気引力、磁力または常磁性体引力、質量分析などによってインターフェラー分子−標的タンパク質複合体（複数も含む）を分離することによって実施され得る。
【０３７２】
さらなる態様によれば、特許請求の範囲にさらに規定されるインターフェラー分子は検出において使用されるまたは診断薬として使用される。それ故、特許請求の範囲にさらに規定されるインターフェラー分子は診断方法において使用されてもよい。したがって、検出方法および診断方法が提供される。
【０３７３】
それ故、試料中のタンパク質を検出する方法であって、
ａ）次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは検出されるタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子に、前記タンパク質を含有すると疑われる試料を接触させる段階、
ｂ）前記タンパク質と反応した分子の存在を検出する段階
を含む方法が提供される。
【０３７４】
試料はそれ自体として提供されてもよいまたは前処理されてもよい。段階ｂ）における「タンパク質と反応した分子」は、タンパク質と反応している分子（すなわちリアルタイム検出）とタンパク質と反応した分子の両方を想定する。これらの分子はタンパク質とまだ接触していてもよいまたはもう接触していなくてもよい。この検出はまた、タンパク質を通じて、すなわち分子と反応したタンパク質の存在を検出することによって行われてもよい。検出は、両方の場合、（反応した分子またはタンパク質を測定することによって）直接的であってもよいまたは（反応していない画分を測定することによって）間接的であってもよい。
【０３７５】
特定の実施形態によれば、検出されるタンパク質に天然に存在する少なくとも１つのＹｉは前記試料中の前記タンパク質にしか含まれない。それ故、例えばヒト由来の試料において、検出されるタンパク質に存在する配列もまた、ヒトゲノム中に１回のみコードされる（またはヒトプロテオーム中に１回のみ存在する）、すなわち検出されるタンパク質（をコードする配列）中に１回のみコードされる。例えば異なるタンパク質が同じ配列を有し、一緒に検出される場合、この一意性は常に必要というわけではないが、これらは例えばサイズに基づいてまださらに識別され得る、すなわち検出を容易にすることが特に想定される。「前記試料中」という部分は、タンパク質の一続きの一意性を識別するのに重要である：例えば試料が前処理される場合、複合混合物中または異なる（微）生物由来の試料中の検出よりほとんど異ならないタンパク質を含有する可能性が高い。
【０３７６】
本検出方法は、確立された方法、典型的に抗体ベースの検出方法と非常に類似していることが留意されるべきである。顕著な相違は特定の分子の使用である。実際に、本明細書に記載された検出方法において、本明細書に定義される分子は抗体と類似した役割を果たすことが留意されるべきである。それ故、通常、抗体ベースである検出方法において、本明細書に記載された分子は少なくとも１つの抗体と置換してもよい。例えば少なくとも１つのＹｉが検出されるタンパク質に天然に存在する一続きである分子は、検出アッセイにおいて一次抗体と置換してもよく（および「一次インターフェラー」と標識されてもよく）、Ｙｉが検出に使用される一次抗体に天然に存在する一続きである分子は二次抗体と置換してもよい。代替として、二次インターフェラー分子は一次抗体に融合されるタグまたは標識に向けられてもよいまたは「一次インターフェラー」もしくはこれに融合される部分に向けられてもよい。
【０３７７】
特定の実施形態によれば、検出に使用される分子は検出可能な標識を含む。さらに特定の実施形態によれば、段階ｂ）における検出は検出可能な標識の検出による。
【０３７８】
特定の実施形態によれば、方法は、段階ｂ）における検出に先立って、タンパク質と反応した分子とタンパク質と反応していない分子の分離をさらに含む。検出に先立って、分子と反応したタンパク質と分子と反応していないタンパク質の分離という反対もまた行われてもよい。その２つは典型的に実験の設定、例えばタンパク質または分子が固定されるかどうかに応じて分離される。
【０３７９】
段階ｂ）における検出は直接的または例えば分子の反応していない画分の検出を通じて間接的であってもよい。検出は定性的（例えばタンパク質が存在するかどうか）、半定量的（例えば多かれ少なかれタンパク質が存在する）または定量的（例えばどのくらいのタンパク質が存在するか）であってもよい。
【０３８０】
特定の実施形態によれば、試料は、対象由来、特に哺乳動物対象由来、もっとも特定するとヒト対象由来である。しかしながら、原則として、凝集核形成領域を含有する任意のタンパク質が検出されてもよく、それ故、試料源は任意の生物（例えば植物、昆虫、病原体、哺乳動物）に由来してもよい。試料はタンパク質を含有する限り、試料は生物由来である必要すらない。例えば試料はタンパク質（例えばホルモン、エストロゲン）の存在が測定される流体（例えば水、ビール）試料であってもよいまたは試料は食品試料または飼料試料であってもよい。生物に由来する試料に関して、検出される試料およびタンパク質は同じ種属由来である必要はないことを述べておくことは重要である。例えば病原体の存在を検出する場合、試料は対象または植物から得られることに対して、検出されるタンパク質は病原体（例えばウイルスまたは微生物）由来であることが想定される。
【０３８１】
一般的に、診断方法は次の段階：ｉ）検査段階（データの収集、すなわち試料中のタンパク質バイオマーカーの定性的検出または定量的検出）、ｉｉ）得られたデータと標準的な値（例えば非疾患対象由来の試料由来）との比較、ｉｉｉ）得られたデータと基準データとの間の任意の有意な偏差の発見（すなわちデータを比較することによる）およびｉｖ）偏差を特定の臨床像（動物対象）または状態（植物対象）に帰属させる段階を含む。これらの段階はまた、通常の検出方法と考慮されてもよいことに留意されたい。この場合、段階ｉｖ）において得られた状態は疾患状態ではないが、例えば汚染物質が存在する。
【０３８２】
したがって、特定の実施形態において、試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量は疾患状態（または健康）の指標である。このような疾患状態は、例えば疾患の存在、疾患の非存在（すなわち健康の発見）、疾患の進行（例えば悪性度、転移、治療に対する反応）であってもよい。疾患状態に関連するタンパク質、例えばバイオマーカーの例は当該技術分野において十分に立証されている。それ故、試料中のタンパク質バイオマーカー（すなわち、疾患状態のタンパク質指標）を検出するための方法であって、前記タンパク質バイオマーカーに対する特異性を有する少なくとも１つのインターフェラーに前記試料を接触させる段階、場合によって、前記試料から得られた同時に凝集したインターフェラー−タンパク質バイオマーカー複合体を単離する段階および前記インターフェラー−タンパク質バイオマーカーを検出する段階を含む、方法が提供される。タンパク質バイオマーカーは、疾患の発症を予測し、疾患を診断し、疾患の進行をモニターし、治療に対するその反応性に関して予後を提供するために診療所において（すなわち治療に対する反応、有害事象および薬物間相互作用を予測する際に、ならびに基礎的リスクを規定する際に）使用されることが多くなっている。ヒト対象についてのバイオマーカーの周知の例としては、前立腺癌（の早期検出）について前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、消化管癌について癌胎児性抗原、全身性炎症についてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、関節リウマチについてリウマチ因子、抗環状シトルリンペプチド抗体（抗ＣＣＰ）、関節損傷についてＭＭＰ−３およびアルツハイマー病についてアミロイドベータ抗体が挙げられる。タンパク質バイオマーカーは、これらの高い安定性およびこれらを研究する広範囲の技術のためにｍＲＮＡマーカーより理論的に良い。バイオマーカー研究における対象の急激な増加は、現代の医療業務において新規な予測産物、診断産物および予後産物の開発を促しており、バイオマーカーはまた、新規薬物の発見および開発においてますます重要な役割を果たしてきている。タンパク質バイオマーカーは体液（例えば血清、尿、血液、唾液、涙、ＣＳＦ、滑液、血液、乳頭吸引液、腹水、精液、汗、腫瘍生検（ｔｕｍｏｕｒ  ｂｉｏｐｔ））中で同定されてもよい。バイオマーカーは予測または予後のカテゴリーに分けられてもよい。予後バイオマーカーは、生存、（例えば特定の療法に対する）反応および再発などの転帰の可能性と関連する。予測バイオマーカーは発生する事象に先立って存在するバイオマーカーであり、このバイオマーカーはその転帰を予測する。予測バイオマーカーは陽性または陰性のいずれであってもよい。バイオマーカーは疾患を診断するために使用されるだけでなく、患者の選択または追跡にも使用されてもよい。研究が継続するにつれて、癌、心臓疾患、神経疾患、代謝性疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患などの疾患領域の管理においてバイオマーカーが果たすことができる役割について我々の理解が発展した。
【０３８３】
本発明のインターフェラー分子および方法を用いて検出され得るタンパク質バイオマーカーの非限定的なリストとしては、（ＷＯ２００５０９８４４５に記載されているような）肺癌バイオマーカーの診断、（ＷＯ２００５０３４７２７のような）頭頸部扁平上皮癌の診断、（ＷＯ２００９０４６２６７のような）腹部大動脈瘤の診断、（ＷＯ２００４０２９５７５におけるような）ＨＴＬＶ介在性疾患の診断、（ＷＯ２００９０３９０２３におけるような）乳腺管癌の診断、（ＷＯ２００４０３０５１１におけるような）前立腺癌の診断、（ＷＯ２００６０２０５６７におけるような）閉塞性睡眠時無呼吸の診断、（ＷＯ２０１００３３９９３におけるような）ゲフィチニブで治療したＧＢＭ患者の予後、（ＷＯ２００６０６０７９９におけるような）筋萎縮性側索硬化症の発症および／または進行の診断、（ＷＯ２００８０１４３１４におけるような）軽度認識障害およびアルツハイマー病の診断、（ＵＳ２０１００３２３３７４におけるような）肝線維症の診断、（ＥＰ２２０７０３３におけるような）神経系損傷の診断、（ＷＯ２００７０６６１２９におけるような）骨格筋障害の検出、（ＷＯ２００６０２０５６７におけるような）閉塞性睡眠時無呼吸の診断、（ＷＯ２００５２４６３におけるような）悪性乳癌の診断、（ＷＯ２０１００７８４０３におけるような）泌尿器系障害の診断、（ＷＯ２００９１４６９１５におけるような）発生的毒性および胎児毒性のインビトロ検査、（ＷＯ２００９１０２７２９におけるような）膠芽細胞腫の予後および治療結果、（ＷＯ２００８１４０４６３におけるような）放射線障害および曝露の評価、（ＵＳ２００５０２０２４８５におけるような）肝癌の検出、（ＵＳ２００５０１５８７４５におけるような）鼻咽頭癌の検出、（ＷＯ２００３０５７０１４におけるような）卵巣癌の検出、（ＷＯ２０１１０１４３４９におけるような）乾癬性関節炎を患っている患者における抗ＴＮＦ−アルファ抗体に対する臨床反応の予測、（ＵＳ２０１１００２１３７０におけるような）口腔癌および歯周病の同定についての唾液バイオマーカーの検出、（ＷＯ２０１０１１５０７７におけるような）バレット食道および食道腺癌の診断、（ＷＯ２０１０１１３１８５におけるような）心房細動および卒中の診断、（ＷＯ２０１００９３８６９におけるような）同種移植片拒絶の予測、（ＷＯ２０１００７７７２２におけるような）強直性脊椎炎を患っている患者における抗ＴＮＦ抗体に対する臨床反応の予測、（ＷＯ２０１００６８７４７におけるような）間質性膀胱炎の診断、（ＵＳ２０１００２９２１３１におけるような）敗血症の診断および予後、（ＵＳ２００９０１５５８４２におけるような）異時性の結腸直腸癌についての予後、（ＷＯ２００４０４３４４４におけるような）ニメスリドを用いたＡＬＳの治療のモニタリングが含まれる。
【０３８４】
バイオマーカータンパク質が検出される（すなわち分子内の少なくとも１つのＹｉが疾患状態の指標であるタンパク質に天然に存在する一続きである。）、さらに特定の実施形態によれば、これらの方法は、上記で概説した段階ａ）およびｂ）に加えて、試料中で検出されるタンパク質の存在、非存在または量を対象における疾患状態と関連付ける段階ｃ）を含む。
【０３８５】
等価物として、疾患状態の診断に使用するための次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは前記疾患状態の指標であるタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の分子が提供される。
【０３８６】
同様の方法が植物の疾患状態を決定するために植物において使用されてもよいことに留意されたい。
【０３８７】
上記の方法の特定の実施形態は感染の存在を診断することである。この実施形態によれば、疾患状態（すなわち感染）のタンパク質指標は病原体のタンパク質（感染の原因であるので感染の指標）である。したがって、前記病原体による感染の診断に使用するための次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉは病原体に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の方法が提供される。
【０３８８】
再び、これらの診断方法は対象および植物（または感染が存在し得る他の生物）に適用されてもよい。
【０３８９】
しかしながら、診断は常に疾患状態である必要はない。上述のように、検出方法は、（典型的に工業バイオテクノロジーにおいて出くわすような）対象に由来していない試料中のタンパク質レベルを決定するために使用されてもよいまたは検出方法は、これが疾患に関連していない生物の試料中のタンパク質（例えば代謝産物）レベルを決定するために使用されてもよい。このことは特に、植物バイオテクノロジーの場合、もっとも特定するとトランスジェニック植物に関する場合である。実際に、例えば植物が有用なタンパク質のもっとも高い発現レベルを有することまたは植物が有害なタンパク質もしくは口に合わない植物にするタンパク質をほとんど発現しないことまたは植物がストレス状態に対してより良い反応を有することを評価するために、高いまたは低いタンパク質レベルを測定することは有用であり得る。
【０３９０】
インビトロ診断が本明細書で想定されているので、本明細書に記載された少なくとも１つの分子および少なくとも適切な緩衝液を含むキットも提供される。このようなキットは理想的には、使用される特異的検出プロトコルに適合される。キットは、本明細書に記載された任意の医薬組成物または農薬組成物を含有してもよい。また、キットは、１つ以上の装置、典型的には、場合によって本明細書に記載された分子で予め被覆された固体支持体（例えばプレート、マイクロアレイ、ナノ粒子、．．．）などの、タンパク質の検出に使用される装置を含有してもよい。キットは使用するための指示書をさらに含有してもよい。明らかに、キットは診断的適用または検出的適用に制限される必要はない。しかしながら、植物または動物対象の治療に提供されるキットの場合、キットは場合によって実験装置というよりむしろ投与目的のための装置（例えば注射器、噴射ノズルを有する容器）を含む。
【０３９１】
従来技術において、タンパク質レベル（またはタンパク質バイオマーカー）を評価する様々な異なる方法は既知であり、タンパク質レベルを評価するための１つの代表的および簡便な種類のプロトコルはＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて、目的のタンパク質（またはタンパク質バイオマーカー）に特異的である１種以上の抗体が、選択された固体表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどのタンパク質親和性を示す表面上に固定されてもよい。不完全に吸着された材料を除去するために洗浄した後、アッセイプレートウェルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは粉乳溶液などの試験試料に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的「遮断」タンパク質で被覆される。これにより、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断が可能となるので、表面上の抗原の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドが減少する。未結合の遮断タンパク質を除去するために洗浄した後、固定化表面は免疫複合体（抗原／抗体）形成を誘導する条件下で試験される試料と接触される。このような条件は、非特異的バックグラウンドの減少を支援する傾向もある、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ＴｗｅｅｎまたはＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中のＢＳＡまたはウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）などの希釈剤を用いて試料を希釈することおよび約２５°−２７℃（しかし他の温度が使用されてもよい。）のオーダーの温度で約２−４時間、試料をインキュベートさせることを含む。インキュベーション後、抗血清と接触した表面は非免疫複合体化材料を除去するように洗浄される。例示的な洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００またはホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄を含む。次いで免疫複合体形成の発生および量が、結合した免疫複合体を、一次抗体と異なる標的に対する特異性を有する二次抗体に供することおよび二次抗体の結合を検出することによって決定されてもよい。特定の実施形態において、二次抗体は関連酵素、例えば適切な発色基質とのインキュベーション時に着色沈殿物を生じる、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを有する。例えばウレアーゼまたはペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧが、一定時間および免疫複合体形成の発生に好適である条件（例えばＰＢＳ／ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳ含有溶液中で室温にて２時間のインキュベーション）下で利用されてもよい。二次抗体とのこのようなインキュベーションおよび未結合材料を除去するために洗浄した後、標識の量が、例えばウレアーゼ標識の場合、尿素およびブロモクレゾールパープルなどの発色基質、またはペルオキシダーゼ標識の場合、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）およびＨ２Ｏ２などの発色基質とのインキュベーションにより定量される。次いで定量は、色生成の程度を測定すること、例えば可視スペクトル分光光度計を使用することにより達成される。代替として、前述の形式は試料をアッセイプレートに最初に結合することによって変更されてもよい。次いで、一次抗体はアッセイプレートとインキュベートされ、そ���後、一次抗体に対する特異性を有する標識した二次抗体を使用して結合した一次抗体が検出される。代替として、試料中の１種以上のタンパク質バイオマーカーのレベルを測定するための非ＥＬＩＳＡベースの方法が利用されてもよい。代表的な例としては、限定されないが、質量分析、プロテオミクスアレイ、ｘＭＡＰ（商標）ミクロスフェア技術、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学が挙げられる。本発明の方法および実施例のセクションでさらに例示される方法によれば、一次抗体はタンパク質バイオマーカーに結合する特異的インターフェラーに置換される。特定の実施形態において、このようなインターフェラーは検出分子により標識される。
【０３９２】
特定の実施形態において、特異的インターフェラー（複数も含む）が固定される固体基板は、広範囲の材料から作製されてもよく、広範囲の形状、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、計深棒、樹脂粒子などで作製されてもよい。基板は、信号対雑音比を最大化するように選択されてもよく、バックグラウンド結合を最小化するように選択されてもよく、また分離の容易性およびコストに関して選択されてもよい。洗浄は、使用される基板にもっとも適した方法、例えばリザーバからビーズまたは計深棒を除去すること、マイクロタイタープレートウェルなどのリザーバを空にすることもしくは希釈することまたはビーズ、粒子、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｉｃ）カラムもしくはフィルターを洗浄溶液もしくは溶媒でリンスすることによって行われてもよい。
【０３９３】
特定の実施形態において、特異的タンパク質バイオマーカーの検出は定量的である。別の特定の実施形態において、特異的タンパク質バイオマーカーの検出は定性的である。このように、検出が定性的である場合、方法は、読み取りまたは評価、例えばタンパク質バイオマーカーがアッセイされる試料中に存在するか否かの判断を提供する。さらに他の実施形態において、方法は、タンパク質バイオマーカーがアッセイされる試料中に存在するかどうかの定量的検出、すなわち標的分析物の実際の量または相対存在量の評価または判断を提供する。このような実施形態において、定量的検出は絶対的であってもよいまたは方法が試料中の２種以上の異なるタンパク質バイオマーカーを検出する方法である場合、相対的であってもよい。このように、試料中のタンパク質バイオマーカーを定量することに関して使用される場合、「定量する」という用語は絶対的または相対的定量を意味し得る。絶対的定量は、１種以上の対照タンパク質バイオマーカーの既知の濃度（複数も含む）の算入およびタンパク質バイオマーカーの検出したレベルと既知の対照タンパク質バイオマーカーとを（例えば標準曲線の生成により）相互参照することによりなされてもよい。代替として、相対的定量は、例えば互いに対する、２種以上の異なるタンパク質バイオマーカーの各々の相対的定量を提供するために２種以上の異なるタンパク質バイオマーカー間の検出したレベルまたは量の比較によりなされてもよい。
【０３９４】
特定の実施形態において、１種のみのタンパク質バイオマーカーの検出が評価される。さらに他の実施形態において、２種以上、例えば約３種以上、約１０種以上、約１５種以上のタンパク質バイオマーカーの発現が評価される。これが行われ得る典型的な方法はタンパク質結合マイクロアレイを使用することである（以下を参照のこと）。
【０３９５】
このような実施形態において、予測、診断または特徴付けが、当業者の監視評価、すなわち特定の疾患の発症の当業者の予測、対象の疾患の当業者の診断または対象の疾患の予後の当業者の特徴付けを含む記載された報告書を提供すること、すなわち生成することによって提供されてもよい。それ故、対象の方法は監視評価の結果を提供する報告書を生成または出力する段階をさらに含んでもよく、この報告書は電子媒体（例えばコンピュータモニター上の電子表示）の形態、または有形的表現媒体（例えば紙または他の有形的表現媒体に印刷された報告書）の形態で提供され得る。本明細書に記載した場合、「報告書」とは、対象の監視評価およびその結果に関する目的の情報を提供する報告要素を含む電子または有形的文書である。対象の報告書は完全または部分的に電子的に生成されてもよい。対象の報告書は、１）試験施設に関する情報、２）サービスプロバイダー情報、３）患者データ、４）試料データ、５）ａ）利用される基準値およびｂ）試験データ（この試験データは例えばタンパク質レベルの測定を含んでもよい）を含む様々な情報を含み得る評価報告書、６）他の特徴のうちの１つ以上をさらに含んでもよい。
【０３９６】
報告書は試験施設についての情報（この情報は試料収集および／またはデータ生成が行われた病院、診療所または実験室に関連する。）を含んでもよい。試料収集は、対象から、流体試料、例えば血液、唾液、尿など、組織試料、例えば組織生検などを得ることを含んでもよい。データ生成は、異なる対象中で異なって発現されるまたは異なるレベルで存在する１種以上のバイオマーカーについてのポリペプチドバイオマーカー濃度のレベルを測定することを含んでもよい。
【０３９７】
多くの実施形態において、対象は、食肉目（例えばイヌおよびネコ）、齧歯目（例えばマウス、モルモットおよびラット）、ウサギ目（例えばウサギ）および霊長目（例えばヒト、チンパンジーおよびサル）を含む、哺乳動物のクラス内である。特定の実施形態において、動物または宿主、すなわち対象（本明細書で患者とも称した）はヒトである。
【０３９８】
本明細書の以前で説明したように、もっとも広範に使用される生物学的検出技術は抗体の使用に基づく。抗体は、他の分子の形状および生理化学的性質に基づいてこれらの他の分子を認識し、結合する。抗体はタンパク質の複合混合物の存在下で少量の標的タンパク質を検出するのに非常に適している。本発明は、インターフェラー分子の使用が、標的タンパク質を特異的に捕捉するための（認識要素としての）抗体の使用の代替であることを示す。実際に、インターフェラー分子は、抗体が典型的に使用される多くの用途に使用されてもよい。ほんの数例を挙げると、診断、ミクロ分析、科学捜査および病原体の特異的検出での用途が想定される。本発明の検出および分離用途に関して、インターフェラー分子が担体（または支持体）に結合されることが好都合であり得る。支持体は、プラスチックまたはニトロセルロースまたはクロマトグラフィーカラムなどの平面であってもよいが、好ましくはミクロスフェアビーズなどのビーズである。インターフェラー分子を結合する目的に役立つ、様々な種類のビーズおよびミクロスフェアについての一般的な考察は、ＵＳ６６８２９４０の９および１０頁に記載されており、参照により本明細書に明確に組み込まれる。特定の実施形態において、インターフェラー分子は、炭水化物タイプの担体、例えばセルロースまたはアガロースに結合される。インターフェラーはグルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて前記炭水化物担体に結合され得る。別の特定の実施形態において、担体は、セルロース、ガラスまたは合成ポリマーであってもよい。インターフェラーと担体との間の共有結合は、インターフェラーおよびアジドのアミノ酸残基、カルボジイミド、イソシアネートまたはインターフェラーに存在する他の化学誘導体を介して実施されてもよい。
【０３９９】
さらに別の特定において、担体は多孔質のシラン処理したガラスマイクロビーズである。インターフェラーは、シリカ原子に化学結合したグリシドキシプロピルシラン基の過ヨウ素酸塩酸化により形成されるアルデヒド基に対してそのペプチドアミン基を介して（シッフ反応後の水素化ホウ素ナトリウムでの還元により）担体に共有結合されてもよい（このカップリングはＳｐｏｒｔｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５２、２０１３−２０１８に記載されている。）。
【０４００】
特定の実施形態において、担体はインターフェラーが架橋されるタンパク性フィルムにより封入される（ＵＳ４４７８９４６における担体に関する請求項１から５０および実施例を参照のこと）。
【０４０１】
別の特定の実施形態において、支持体は蛍光ラテックス粒子などの蛍光ビーズである。特許ＵＳ４５５００１７およびその特許における特に４頁は蛍光ビーズの製造に使用され得る蛍光化合物を記載している。
【０４０２】
別の特定の実施形態において、ビーズは種々のサイズであり、また、蛍光色素を含有してもよいまたは蛍光色素で含浸されてもよい。ビーズの種々のサイズおよび色素のために、複数のタンパク質が単一反応において検出され、定量されてもよい。このようなビーズを開発するための手順はＵＳ６１５９７４８に記載されている。
【０４０３】
さらに別の特定の実施形態において、ビーズとインターフェラーとの間のカップリングは、ポリ（スレオニン）、ポリ（セリン）、デキストランまたはポリ（エチレングリコール）を介する。ＵＳ６３９９３１７の実施例６、７、８および９は、このカップリングがどのように実施され得るかを例示している。
【０４０４】
さらに別の特定の実施形態において、支持体は電磁ビーズである。電磁ビーズ、電磁ビーズとタンパク物質との間のカップリングおよびそれらの使用は出願ＵＳ６４８９０９２の８頁に記載されている。
【０４０５】
さらなる態様によれば、支持体はマイクロアレイである。これらはタンパク質の多重検出に特に想定される。したがって、本明細書に記載した分子を含むマイクロアレイが提供される。すなわち、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ、［式中、
−ｎは１から５であり、ｉは１からｎまでであり、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在しない、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、少なくとも１つのＹｉはタンパク質に天然に存在する一続きであり、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される。］
の少なくとも２つの分子を含むマイクロアレイが提供される。
【０４０６】
特定の実施形態によれば、分子はリンカー（例えば本明細書に記載したＺ０部分）を通じてマイクロアレイに結合される。マイクロアレイはアレイ、チップ、ビーズ、プレート、ブロットなどであってもよい。
【０４０７】
他の特定の実施形態によれば、少なくとも２つの分子は少なくとも２つの異なる分子である。特定すると、分子の少なくとも１つのＹｉ領域は少なくとも２つの分子間で異なる。さらに特定すると、第１の分子の少なくとも１つのＹｉ領域は、第２の分子の少なくとも１つの他のＹｉ領域が対応する一続きと異なるタンパク質であるタンパク質中の一続きと同一である。
【０４０８】
植物での適用
本明細書に記載した分子はまた、植物、植物細胞または植物種子におけるタンパク質の機能を下方調節するために使用されてもよい。ここでまた、このことは非感染および感染状況に適用する、すなわち植物タンパク質を標的とするまたは植物中もしくは植物上の病原体の病原タンパク質を標的とすることに留意されたい。したがって、植物または植物細胞または植物種子中のタンパク質の生物学的機能を下方調節するための方法であって、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ、［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在せず、少なくとも１個のＹｉは前記植物、植物細胞もしくは植物種子中または前記植物、植物細胞もしくは植物種子上のタンパク質に天然に存在する一続きである、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の分子に前記タンパク質を接触させる段階を含む、方法が提供される。
【０４０９】
方法のさらなる段階はタンパク質と非天然に存在する分子との間で発生する分子間ベータ凝集を含んでもよく、それにより、タンパク質の生物学的機能を下方調節する。動物対象と対照的に植物対象は動かないので、これらは、特に外部寄生虫および病原体（すなわち害虫）による感染にかかりやすい。実際に、多くの感染種は、これらの病原性作用を与えるために、必ずしも、植物に侵入するわけではないまたは感染の初期段階の間に侵入しない（例えばまた、なぜなら植物は、病原体が植物内部に入ることを難しくする、消化系および細胞壁を有さないからである。）。それ故、「植物、植物細胞または植物種子上のタンパク質」とは典型的に、植物、植物細胞または植物種子上に存在する別の生物のタンパク質を意味する。例としては、限定されないが、線虫、アブラムシ、ダニ、毛虫、ナメクジ、カビなどのタンパク質が挙げられる。これらの生物は植物のいずれかの部分に存在してもよいことに留意されたい（例えば線虫は典型的に植物の根を通じて感染するのに対して、アブラムシは一般に茎および葉などの植物の緑色の部分に存在する。）。
【０４１０】
それ故、方法は、（例えば高生産率またはストレス耐性などの特定の性質を得るためまたは非感染性疾患状況において）植物中の植物タンパク質の生物学的機能を下方調節する方法および（感染性疾患の場合のように）植物中または植物上の害虫生物のタンパク質の生物学的機能を下方調節する方法に細分されてもよい。
【０４１１】
前者の方法（植物または植物細胞または植物種子中の植物タンパク質の生物学的機能を下方調節するために提供される）は、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ、［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在せず、少なくとも１個のＹｉは前記植物、植物細胞もしくは植物種子のタンパク質に天然に存在する一続きである、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の分子に前記タンパク質を接触させる段階を含む。
【０４１２】
（植物または植物細胞または植物種子中の植物害虫生物のタンパク質の生物学的機能を下方調節するための）後者の方法は、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ、［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在せず、少なくとも１個のＹｉは前記植物、植物細胞もしくは植物種子中または前記植物、植物細胞もしくは植物種子上に存在する害虫生物のタンパク質に天然に存在する一続きである、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
の分子に前記タンパク質を接触させる段階を含む。
【０４１３】
本明細書で使用された場合、「植物」という用語は、全植物、植物の祖先および子孫ならびに種子、芽、茎、葉、根（塊茎を含む）、花および組織および器官を含む植物の一部を包含し、上述の各々は目的の遺伝子／核酸を含む。「植物」という用語はまた、植物細胞、浮遊培養物、カルス組織、胚、分裂組織部位、配偶体、胞子体、花粉および小胞子も包含し、再度、上述の各々は目的の遺伝子／核酸を含む。
【０４１４】
本発明の方法において特に有用な植物としては特に、とりわけ、カエデ属種（Ａｃｅｒ  ｓｐｐ．）、マタタビ属種（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、トロロアオイ属種（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、アガベ・シサラナ（Ａｇａｖｅ  ｓｉｓａｌａｎａ）、カモジグサ属種（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アグロスチス・ストロニフェラ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、アリウム属種（Ａｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ヒユ属種（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、アンモフィラ・アレナリア（Ａｍｍｏｐｈｉｌａ  ａｒｅｎａｒｉａ）、アナナス・コモサス（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、バンレイシ属種（Ａｎｎｏｎａ  ｓｐｐ．）、アピウム・グラベオレンス（Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ラッカセイ属種（Ａｒａｃｈｉｓ  ｓｐｐ）、パンノキ属種（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｓｐｐ．）、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、カラスムギ属種（Ａｖｅｎａ  ｓｐｐ．）（例えば、アベナ・サチバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、アベナ・ファツア（Ａｖｅｎａ  ｆａｔｕａ）、アベナ・ビザンチナ（Ａｖｅｎａ  ｂｙｚａｎｔｉｎａ）、アベナ・ファツアｖａｒ．サチバ（Ａｖｅｎａ  ｆａｔｕａ  ｖａｒ．  ｓａｔｉｖａ）、アベナ・ヒブリダ（Ａｖｅｎａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、アベルホア・カランボラ（Ａｖｅｒｒｈｏａ  ｃａｒａｍｂｏｌａ）、ホウライチク属種（Ｂａｍｂｕｓａ  ｓｐ．）、ベニンカサ・ヒスピダ（Ｂｅｎｉｎｃａｓａ  ｈｉｓｐｉｄａ）、バーソレチア・エクセルサ（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ  ｅｘｃｅｌｓｅａ）、ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）（例えば、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カブ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）［キャノーラ、アブラナ、ナバナ（ｔｕｒｎｉｐ  ｒａｐｅ）］）、カダバ・ファリノーサ（Ｃａｄａｂａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カンナ・インディカ（Ｃａｎｎａ  ｉｎｄｉｃａ）、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、トウガラシ属種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、カレックス・エラータ（Ｃａｒｅｘ  ｅｌａｔａ）、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カリッサ・マクロカルパ（Ｃａｒｉｓｓａ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）、ペカン属種（Ｃａｒｙａ  ｓｐｐ．）、カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、クリ属種（Ｃａｓｔａｎｅａ  ｓｐｐ．）、セイバ・ペンタンドラ（Ｃｅｉｂａ  ｐｅｎｔａｎｄｒａ）、シチョリウム・エンディビア（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｅｎｄｉｖｉａ）、ニッケイ属種（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｓｐｐ．）、シトルラス・ラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）、シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココス属種（Ｃｏｃｏｓ  ｓｐｐ．）、コーヒーノキ属種（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、コロカシア・エスクレンタ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コラノキ属種（Ｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、シナノキツナソ属種（Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｓｐ．）、コリアンドルム・サティブム（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ハシバミ属種（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ｓｐｐ．）、サンザシ属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ  ｓｐｐ．）、クロカス・サティバス（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、カボチャ属種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｓｐｐ．）、キュウリ属種（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓｐｐ．）、チョウセンアザミ属種（Ｃｙｎａｒａ  ｓｐｐ．）、ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、ヌスビトハギ属種（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ディモカルプス・ロンガン（Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ  ｌｏｎｇａｎ）、ヤマノイモ属種（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐｐ．）、カキノキ属種（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ  ｓｐｐ．）、ヒエ属種（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｓｐｐ．）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）（例えば、エラエイス・ギネエンシス（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、エラエイス・オレイフェラ（Ｅｌａｅｉｓ  ｏｌｅｉｆｅｒａ））、エレウシン・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、エラグロスティス・テフ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｆ）、エリアンサス属種（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、エリオボトリア・ジャポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ユーカリ属種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐ．）、エウゲニア・ユニフローラ（Ｅｕｇｅｎｉａ  ｕｎｉｆｌｏｒａ）、ソバ属種（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｓｐｐ．）、ブナ属種（Ｆａｇｕｓ  ｓｐｐ．）、フェスツカ・アルンディナセア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、キンカン属種（Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、フラガリア属種（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｓｐｐ．）、ギンコ・ビローバ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、グリシン属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｐｐ．）（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ソヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ  ｈｉｓｐｉｄａ）またはソヤ・マックス（Ｓｏｊａ  ｍａｘ））、ゴシッピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヒマワリ属種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ヘメロカリス・フルバ（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ  ｆｕｌｖａ）、ハイビスカス属種（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓｐｐ．）、オオムギ属種（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｓｐｐ．）（例えば、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、イポモエア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ）、クルミ属種（Ｊｕｇｌａｎｓ  ｓｐｐ．）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ラチルス属種（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、リナム・ウシタチシマム（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、リッチ・キネンシス（Ｌｉｔｃｈｉ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ハス属種（Ｌｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ルッファ・アクタングラ（Ｌｕｆｆａ  ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）、ルピナス属種（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ルズラ・シルバチカ（Ｌｕｚｕｌａ  ｓｙｌｖａｔｉｃａ）、トマト属種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｓｐｐ．）（例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、リコペルシコン・リコペ���シカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ）、マクロチローマ属種（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ  ｓｐｐ．）、リンゴ属種（Ｍａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、マルピギア・エマルギナタ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａ  ｅｍａｒｇｉｎａｔａ）、マメア・アメリカーナ（Ｍａｍｍｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、キャッサバ属種（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｓｐｐ．）、マニカラ・ザポタ（Ｍａｎｉｌｋａｒａ  ｚａｐｏｔａ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、シナガワハギ属種（Ｍｅｌｉｌｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ハッカ属種（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｐ．）、ミスカンタス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ツルレイシ属種（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｓｐｐ．）、モルス・ニグラ（Ｍｏｒｕｓ  ｎｉｇｒａ）、バショウ属種（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、タバコ種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）、オリーブ属種（Ｏｌｅａ  ｓｐｐ．）、オプンティア属種（Ｏｐｕｎｔｉａ  ｓｐｐ．）、オルニトプス属種（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、オリザ属種（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｐ．）（例えば、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ラティフォリア（Ｏｒｙｚａ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ））、パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、パニクム・ビルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パッシフローラ・エドゥリス（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ）、パスチナカ・サティバ（Ｐａｓｔｉｎａｃａ  ｓａｔｉｖａ）、チカラシバ属種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐ．）、ワニナシ属種（Ｐｅｒｓｅａ  ｓｐｐ．）、ペトロセリナム・クリスパム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ファラリス・アルンディナセア（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、インゲンマメ属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フレウム・プラテンセ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、ナツメヤシ属種（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｓｐｐ．）、フラグミテス・オーストラリス（Ｐｈｒａｇｍｉｔｅｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ホオズキ属種（Ｐｈｙｓａｌｉｓ  ｓｐｐ．）、マツ属種（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ピスタシア・ベラ（Ｐｉｓｔａｃｉａ  ｖｅｒａ）、エンドウ属種（Ｐｉｓｕｍ  ｓｐｐ．）、イチゴツナギ属種（Ｐｏａ  ｓｐｐ．）、ハコヤナギ属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、プロソピス属種（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｓｐｐ．）、サクラ属種（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｐｐ．）、パンジロウ属種（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、プニカ・グラナツム（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）、ピルス・コミュニス（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コナラ属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ラファヌス・サティブス（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、レウム・ラバルバルム（Ｒｈｅｕｍ  ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）、スグリ属種（Ｒｉｂｅｓ  ｓｐｐ．）、リシヌス・コミュニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、キイチゴ属種（Ｒｕｂｕｓ  ｓｐｐ．）、サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．）、ニワトコ属種（Ｓａｍｂｕ���ｕｓ  ｓｐｐ．）、セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ゴマ属種（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｓｐｐ．）、シナピス属種（Ｓｉｎａｐｉｓ  ｓｐ．）、ナス属種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｐ．）（例えば、ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラヌム・インテグリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）またはソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属種（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｓｐｐ．）、シジジウム属種（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マンジュギク属種（Ｔａｇｅｔｅｓ  ｓｐｐ．）、タマリンドゥス・インディカ（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ  ｉｎｄｉｃａ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、トリフォリウム属種（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、トリプサカム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、トリチコセケル・リンパウイ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ  ｒｉｍｐａｕｉ）、コムギ属種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）（例えば、トリチカム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ）、トリチカム・ツルギドゥム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ヒベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍａｃｈａ）、トリチカム・サチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、トリチカム・モノコッカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）またはトリチカム・バルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、トロパエオルム・ミヌス（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍｉｎｕｓ）、トロパエオルム・マジャス（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍａｊｕｓ）、スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ソラマメ属種（Ｖｉｃｉａ  ｓｐｐ．）、ササゲ属種（Ｖｉｇｎａ  ｓｐｐ．）、ビオラ・オドラータ（Ｖｉｏｌａ  ｏｄｏｒａｔａ）、ブドウ属種（Ｖｉｔｉｓ  ｓｐｐ．）、ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ジザニア・パルストリス（Ｚｉｚａｎｉａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ナツメ属種（Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｓｐｐ．）などを含むリストから選
択される、飼料もしくはマメ科植物飼料を含む単子葉植物および双子葉植物、観賞植物、食用作物、木または低木が挙げられる。
【０４１５】
本明細書で使用された植物害虫は特に、農業、園芸、森林、庭園および余暇施設において遭遇する、昆虫、クモ類、蠕虫類、真菌類、ウイルス、細菌、線虫および軟体動物である。本発明に係る組成物は、通常の感受性および耐性がある種に対してならびにすべてまたは一部の発育段階に対して活性がある。これらの植物害虫としては、門：節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）：特にクモ類（ａｒａｃｈｎｉｄ）の綱から、例えばアカルス属種（Ａｃａｒｕｓ  ｓｐｐ．）、アケリア・シェルドニ（Ａｃｅｒｉａ  ｓｈｅｌｄｏｎｉ）、アクロプス属種（Ａｃｕｌｏｐｓ  ｓｐｐ．）、アクルス属種（Ａｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、アムブリュオンマ属種（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｓｐｐ．）、アムピテトラニュクス・ウィエンネンシス（Ａｍｐｈｉｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｖｉｅｎｎｅｎｓｉｓ）、アルガス属種（Ａｒｇａｓ  ｓｐｐ．）、ボオピルス属種（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ブレウィパルプス属種（Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ  ｓｐｐ．）、ブリュオビア・プラエティオサ（Ｂｒｙｏｂｉａ  ｐｒａｅｔｉｏｓａ）、ケントルロイデス属種（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、コリオプテス属種（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、デルマニュッスス・ガッリナエ（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、デルマトパゴイデス・プテロニュッシウス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ）、デルマトパゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、デルマケントル属種（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｓｐｐ．）、エオテトラニュクス属種（Ｅｏｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、エピトリメルス・ピュリ（Ｅｐｉｔｒｉｍｅｒｕｓ  ｐｙｒｉ）、エウテトラニュクス属種（Ｅｕｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、エリオピュエス属種（Ｅｒｉｏｐｈｙｅｓ  ｓｐｐ．）、ハロティデウス・デストルクトル（Ｈａｌｏｔｙｄｅｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ヘミタルソネムス属種（Ｈｅｍｉｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ  ｓｐｐ．）、フュアロンマ属種（Ｈｙａｌｏｍｍａ  ｓｐｐ．）、イクソデス属種（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ラトロデクトゥス属種（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ロクソスケレス属種（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、メタテトラニュクス属種（Ｍｅｔａｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ヌペルサ属種（Ｎｕｐｈｅｒｓａ  ｓｐｐ．）、オリゴニュクス属種（Ｏｌｉｇｏｎｙｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、オルニトドルス属種（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）、オルニトニュッスス属種（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、パノニュクス属種（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ピュッロコプトルタ・オレイウォラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ  ｏｌｅｉｖｏｒａ）、ポリュパゴタルソネムス・ラトゥス（Ｐｏｌｙｐｈａｇｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ  ｌａｔｕｓ）、プソロプテス属種（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、リピケパルス属種（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、リゾグリュプス属種（Ｒｈｉｚｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｓｐｐ．）、サルコプテス属種（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、スコルピオ・マウルス（Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ）、ステノタルソネムス属種（Ｓｔｅｎｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ  ｓｐｐ．）、タルソネムス属種（Ｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ  ｓｐｐ．）、テトラニュクス属種（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ワエヨウィス属種（Ｖａｅｊｏｖｉｓ  ｓｐｐ．）、ワサテス・リュコペルシキ（Ｖａｓａｔｅｓ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）が挙げられる。
【０４１６】
他の例は、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）（プティラプテラ（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ））の目から、例えばダマリニア属種（Ｄａｍａｌｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、ハエマトピヌス属種（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、リノグナトゥス属種（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ペディクルス属種（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、プティルス・プビス（Ｐｔｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ）、トリコデクテス属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．）である。
【０４１７】
さらに他の例は、唇脚目（Ｃｈｉｌｏｐｏｄａ）の目から、例えばゲオピルス属種（Ｇｅｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、スクティゲラ属種（Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ  ｓｐｐ．）である。
【０４１８】
さらに他の例は、コウチュウ目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアカリュンマ・ウィッタトゥム（Ａｃａｌｙｍｍａ  ｖｉｔｔａｔｕｍ）、アカントスケリデス・オブテクトゥス（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、アドレトゥス属種（Ａｄｏｒｅｔｕｓ  ｓｐｐ．）、アゲラスティカ・アルニ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ  ａｌｎｉ）、アグリオテス属種（Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．）、アルピトビウス・ディアペリヌス（Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓ  ｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ）、アムピマッロン・ソルスティティアリス（Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ  ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ）、アノビウム・プンクタトゥム（Ａｎｏｂｉｕｍ  ｐｕｎｃｔａｔｕｍ）、アノプロポラ属種（Ａｎｏｐｌｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．）、アントノムス属種（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．）、アントレヌス属種（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ  ｓｐｐ．）、アピオン属種（Ａｐｉｏｎ  ｓｐｐ．）、アポゴニア属種（Ａｐｏｇｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、アトマリア属種（Ａｔｏｍａｒｉａ  ｓｐｐ．）、アッタゲヌス属種（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ブルキディウス・オブテクトゥス（Ｂｒｕｃｈｉｄｉｕｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ブルクス属種（Ｂｒｕｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、カッシダ属種（Ｃａｓｓｉｄａ  ｓｐｐ．）、ケロトマ・トリフルカタ（Ｃｅｒｏｔｏｍａ  ｔｒｉｆｕｒｃａｔａ）、ケウトルリュンクス属種（Ｃｅｕｔｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、カエトクネマ属種（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、クレオヌス・メンディクス（Ｃｌｅｏｎｕｓ  ｍｅｎｄｉｃｕｓ）、コノデルス属種（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）、コスモポリテス属種（Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ  ｓｐｐ．）、コステリュトラ・ゼアランディカ（Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ  ｚｅａｌａｎｄｉｃａ）、クテニケラ属種（Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ  ｓｐｐ．）、クルクリオ属種（Ｃｕｒｃｕｌｉｏ  ｓｐｐ．）、クリュプトリュンクス・ラパティ（Ｃｒｙｐｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｌａｐａｔｈｉ）、キュリンドロコプトュルス属種（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ  ｓｐｐ．）、デルメステス属種（Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ  ｓｐｐ．）、ディアブロティカ属種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｐ．）、ディコクロキス属種（Ｄｉｃｈｏｃｒｏｃｉｓ  ｓｐｐ．）、ディロボデルス属種（Ｄｉｌｏｂｏｄｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）、エピラクナ属種（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｓｐｐ．）、エピトリクス属種（Ｅｐｉｔｒｉｘ  ｓｐｐ．）、ファウスティヌス属種（Ｆａｕｓｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ギッビウム・プシュッロイデス（Ｇｉｂｂｉｕｍ  ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ）、ヘッルラ・ウンダリス（Ｈｅｌｌｕｌａ  ｕｎｄａｌｉｓ）、ヘテロニュクス・アラトル（Ｈｅｔｅｒｏｎｙｃｈｕｓ  ａｒａｔｏｒ）、ヘテロニュクス属種（Ｈｅｔｅｒｏｎｙｘ  ｓｐｐ．）、フュラモルパ・エレガンス（Ｈｙｌａｍｏｒｐｈａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、フュロトルペス・バイユルス（Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ  ｂａｊｕｌｕｓ）、フュペラ・ポスティカ（Ｈｙｐｅｒａ  ｐｏｓｔｉｃａ）、フュポテネムス属種（Ｈｙｐｏｔｈｅｎｅｍｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクノステルナ・コンサングイネア（Ｌａｃｈｎｏｓｔｅｒｎａ  ｃｏｎｓａｎｇｕｉｎｅａ）、レマ属種（Ｌｅｍａ  ｓｐ���．）、レプティノタルサ・デケムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、レウコプテラ属種（Ｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．）、リッソロプトルス・オリュゾピルス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）、リクスス属種（Ｌｉｘｕｓ  ｓｐｐ．）、ルペロデス属種（Ｌｕｐｅｒｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、リュクトゥス属種（Ｌｙｃｔｕｓ  ｓｐｐ．）、メガスケリス属種（Ｍｅｇａｓｃｅｌｉｓ  ｓｐｐ．）、メラノトゥス属種（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、メリゲテス・アエネウス（Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ  ａｅｎｅｕｓ）、メロロンタ属種（Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ  ｓｐｐ．）、ミグドルス属種（Ｍｉｇｄｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、モノカムス属種（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ  ｓｐｐ．）、ナウパクトゥス・クサントグラプス（Ｎａｕｐａｃｔｕｓ  ｘａｎｔｈｏｇｒａｐｈｕｓ）、ニプトゥス・ホロレウクス（Ｎｉｐｔｕｓ  ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ）、オリュクテス・リノケロス（Ｏｒｙｃｔｅｓ  ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）、オリュザエピルス・スリナメンシス（Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ  ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ）、オリュザパグス・オリュザエ（Ｏｒｙｚａｐｈａｇｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、オティオッリュンクス属種（Ｏｔｉｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、オクシケトニア・ユクンダ（Ｏｘｙｃｅｔｏｎｉａ  ｊｕｃｕｎｄａ）、パエドン・コクレアリアエ（Ｐｈａｅｄｏｎ  ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ）、ピュッロパガ属種（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｓｐｐ．）、ピュッロトレタ属種（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｐｐ．）、ポピッリア・ヤポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、プレムノトリュペス属種（Ｐｒｅｍｎｏｔｒｙｐｅｓ  ｓｐｐ．）、プロステパヌス・トルンカトゥス（Ｐｒｏｓｔｅｐｈａｎｕｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ）、プシュッリオデス属種（Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、プティヌス属種（Ｐｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、リゾビウス・ウェントラリス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｓ  ｖｅｎｔｒａｌｉｓ）、リゾペルタ・ドミニカ（Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ  ｄｏｍｉｎｉｃａ）、シトピルス属種（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、スペノポルス属種（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ステゴビウム・パニケウム（Ｓｔｅｇｏｂｉｕｍ  ｐａｎｉｃｅｕｍ）、ステルネクス属種（Ｓｔｅｒｎｅｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、シュムピュレテス属種（Ｓｙｍｐｈｙｌｅｔｅｓ  ｓｐｐ．）、タニュメクス属種（Ｔａｎｙｍｅｃｕｓ  ｓｐｐ．）、テネブリオ・モリトル（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）、トリボリウム属種（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、トロゴデルマ属種（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、テュキウス属種（Ｔｙｃｈｉｕｓ  ｓｐｐ．）、クシロトレクス属種（Ｘｙｌｏｔｒｅｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ザブルス属種（Ｚａｂｒｕｓ  ｓｐｐ．）である。
【０４１９】
さらに他の例は、トビムシ目（Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）の目から、例えばオニュキウルス・アルマトゥス（Ｏｎｙｃｈｉｕｒｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ）である。
【０４２０】
さらに他の例は、倍脚目（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）の目から、例えばブラニウルス・グットゥラトゥス（Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ  ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）である。
【０４２１】
さらに他の例は、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の目から、例えばアエデス属種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アグロミュザ属種（Ａｇｒｏｍｙｚａ  ｓｐｐ．）、アナストレパ属種（Ａｎａｓｔｒｅｐｈａ  ｓｐｐ．）、アノペレス属種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、アスポンドュリア属種（Ａｓｐｈｏｎｄｙｌｉａ  ｓｐｐ．）、バクトロケラ属種（Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ  ｓｐｐ．）、ビビオ・ホルトゥラヌス（Ｂｉｂｉｏ  ｈｏｒｔｕｌａｎｕｓ）、カッリポラ・エリュトロケパラ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌａ）、ケラティティス・カピタタ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）、キロノムス属種（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．）、クリュソミュイア属種（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、クリュソプス属種（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ  ｓｐｐ．）、コクリオミュイア属種（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、コンタリニア属種（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、コルドュロビア・アントロポパガ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ  ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、クレクス属種（Ｃｕｌｅｘ  ｓｐｐ．）、クリコイデス属種（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、クリセタ属種（Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｓｐｐ．）、クテレブラ属種（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ  ｓｐｐ．）、ダクス・オレアエ（Ｄａｃｕｓ  ｏｌｅａｅ）、ダシュネウラ属種（Ｄａｓｙｎｅｕｒａ  ｓｐｐ．）、デリア属種（Ｄｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、デルマトビア・ホミニス（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、ドロソピラ属種（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、エキノクネムス属種（Ｅｃｈｉｎｏｃｎｅｍｕｓ  ｓｐｐ．）、ファンニア属種（Ｆａｎｎｉａ  ｓｐｐ．）、ガステロピルス属種（Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、グロッシナ属種（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｓｐｐ．）、ハエマトポタ属種（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ  ｓｐｐ．）、フュドレッリア属種（Ｈｙｄｒｅｌｌｉａ  ｓｐｐ．）、フュレミュイア属種（Ｈｙｌｅｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、フュッポボスカ属種（Ｈｙｐｐｏｂｏｓｃａ  ｓｐｐ．）、フュポデルマ属種（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、リリオミュザ属種（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ  ｓｐｐ．）、ルキリア属種（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｐｐ．）、ルトゾミア属種（Ｌｕｔｚｏｍｉａ  ｓｐｐ．）、マンソニア属種（Ｍａｎｓｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、ムスカ属種（Ｍｕｓｃａ  ｓｐｐ．）、ネザラ属種（Ｎｅｚａｒａ  ｓｐｐ．）、オエストルス属種（Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、オスキネッラ・フリト（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ  ｆｒｉｔ）、ペゴミュイア属種（Ｐｅｇｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、プレボトムス属種（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ  ｓｐｐ．）、ポルビア属種（Ｐｈｏｒｂｉａ  ｓｐｐ．）、ポルミア属種（Ｐｈｏｒｍｉａ  ｓｐｐ．）、プロディプロシス属種（Ｐｒｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｓｐｐ．）、プシラ・ロサエ（Ｐｓｉｌａ  ｒｏｓａｅ）、ラゴレティス属種（Ｒｈａｇｏｌｅｔｉｓ  ｓｐｐ．）、サルコパガ属種（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｓｐｐ．）、シムリウム属種（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ストモクシス属種（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｓｐｐ．）、タバヌス属種（Ｔａｂａｎｕｓ  ｓｐｐ．）、タンニア属種（Ｔａｎｎｉａ  ｓｐｐ．）、テタノプス属種（Ｔｅｔａｎｏｐｓ  ｓｐｐ．）、ティプラ属種（Ｔｉｐｕｌａ  ｓｐｐ．）である。
【０４２２】
さらに他の例は、異翅目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアナサ・トリスティス（Ａｎａｓａ  ｔｒｉｓｔｉｓ）、アンテスティオプシス属種（Ａｎｔｅｓｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、ボイセア属種（Ｂｏｉｓｅａ  ｓｐｐ．）、ブリッスス属種（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、カロコリス属種（Ｃａｌｏｃｏｒｉｓ  ｓｐｐ．）、カムピュロンマ・リウィダ（Ｃａｍｐｙｌｏｍｍａ  ｌｉｖｉｄａ）、カウェレリウス属種（Ｃａｖｅｌｅｒｉｕｓ  ｓｐｐ．）、キメクス属種（Ｃｉｍｅｘ  ｓｐｐ．）、コッラリア属種（Ｃｏｌｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）、クレオンティアデス・ディルトゥス（Ｃｒｅｏｎｔｉａｄｅｓ  ｄｉｌｕｔｕｓ）、ダシュヌス・ピペリス（Ｄａｓｙｎｕｓ  ｐｉｐｅｒｉｓ）、ディケロプス・フルカトゥス（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ）、ディコノコリス・ヘウェッティ（Ｄｉｃｏｎｏｃｏｒｉｓ  ｈｅｗｅｔｔｉ）、ドュスデルクス属種（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エウスキストゥス属種（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｐｐ．）、エウリュガステル属種（Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ヘリオペルティス属種（Ｈｅｌｉｏｐｅｌｔｉｓ  ｓｐｐ．）、ホルキアス・ノビレッルス（Ｈｏｒｃｉａｓ  ｎｏｂｉｌｅｌｌｕｓ）、レプトコリサ属種（Ｌｅｐｔｏｃｏｒｉｓａ  ｓｐｐ．）、レプトグロッスス・ピュッロプス（Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｐｈｙｌｌｏｐｕｓ）、リュグス属種（Ｌｙｇｕｓ  ｓｐｐ．）、マクロペス・エクスカワトゥス（Ｍａｃｒｏｐｅｓ  ｅｘｃａｖａｔｕｓ）、ミリダエ（Ｍｉｒｉｄａｅ）、モナロニオン・アトラトゥム（Ｍｏｎａｌｏｎｉｏｎ  ａｔｒａｔｕｍ）、ネザラ属種（Ｎｅｚａｒａ  ｓｐｐ．）、オエバルス属種（Ｏｅｂａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペントミダエ（Ｐｅｎｔｏｍｉｄａｅ）、ピエスマ・クワドラタ（Ｐｉｅｓｍａ  ｑｕａｄｒａｔａ）、ピエゾドルス属種（Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）、プサッルス属種（Ｐｓａｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、プセウダキュスタ・ペルセア（Ｐｓｅｕｄａｃｙｓｔａ  ｐｅｒｓｅａ）、ロドニウス属種（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｓｐｐ．）、サルベルゲッラ・シングラリス（Ｓａｈｌｂｅｒｇｅｌｌａ  ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スカプトコリス・カスタネア（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ  ｃａｓｔａｎｅａ）、スコティノポラ属種（Ｓｃｏｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．）、ステパニティス・ナシ（Ｓｔｅｐｈａｎｉｔｉｓ  ｎａｓｈｉ）、ティブラカ属種（Ｔｉｂｒａｃａ  ｓｐｐ．）、トリアトマ属種（Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｓｐｐ．）である。
【０４２３】
さらに他の例は、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアキュルトシポン属種（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｏｎ  ｓｐｐ．）、アクロゴニア属種（Ａｃｒｏｇｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、アエネオラミア属種（Ａｅｎｅｏｌａｍｉａ  ｓｐｐ．）、アゴノスケナ属種（Ａｇｏｎｏｓｃｅｎａ  ｓｐｐ．）、アレウロデス属種（Ａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アレウロロブス・バロデンシス（Ａｌｅｕｒｏｌｏｂｕｓ  ｂａｒｏｄｅｎｓｉｓ）、アレウロトリクスス属種（Ａｌｅｕｒｏｔｈｒｉｘｕｓ  ｓｐｐ．）、アムラスカ属種（Ａｍｒａｓｃａ  ｓｐｐ．）、アヌラピス・カルドゥイ（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ  ｃａｒｄｕｉ）、アオニディエッラ属種（Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アパノスティグマ・ピン（Ａｐｈａｎｏｓｔｉｇｍａ  ｐｉｎ）、アピス属種（Ａｐｈｉｓ  ｓｐｐ．）、アルボリディア・アピカリス（Ａｒｂｏｒｉｄｉａ  ａｐｉｃａｌｉｓ）、アスピディエッラ属種（Ａｓｐｉｄｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アスピディオトゥス属種（Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、アタヌス属種（Ａｔａｎｕｓ  ｓｐｐ．）、アウラコルトゥム・ソラニ（Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、ベミシア属種（Ｂｅｍｉｓｉａ  ｓｐｐ．）、ブラキュカウドゥス・ヘリクリュシイ（Ｂｒａｃｈｙｃａｕｄｕｓ  ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｉｉ）、ブラキュコルス属種（Ｂｒａｃｈｙｃｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ブレウィコリュネ・ブラッシカエ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、カッリギュポナ・マルギナタ（Ｃａｌｌｉｇｙｐｏｎａ  ｍａｒｇｉｎａｔａ）、カルネオケパラ・フルギダ（Ｃａｒｎｅｏｃｅｐｈａｌａ  ｆｕｌｇｉｄａ）、ケラトワクナ・ラニゲラ（Ｃｅｒａｔｏｖａｃｕｎａ  ｌａｎｉｇｅｒａ）、ケルコピダエ（Ｃｅｒｃｏｐｉｄａｅ）、ケロプラステス属種（Ｃｅｒｏｐｌａｓｔｅｓ  ｓｐｐ．）、カエトシポン・フラガエフォリイ（Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ）、キオナスピス・テガレンシス（Ｃｈｉｏｎａｓｐｉｓ  ｔｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、クロリタ・オヌキイ（Ｃｈｌｏｒｉｔａ  ｏｎｕｋｉｉ）、クロマピス・ユグランディコラ（Ｃｈｒｏｍａｐｈｉｓ  ｊｕｇｌａｎｄｉｃｏｌａ）、クリュソムパルス・フィクス（Ｃｈｒｙｓｏｍｐｈａｌｕｓ  ｆｉｃｕｓ）、キカドゥリナ・ムビラ（Ｃｉｃａｄｕｌｉｎａ  ｍｂｉｌａ）、コッコミュティルス・ハッリ（Ｃｏｃｃｏｍｙｔｉｌｕｓ  ｈａｌｌｉ）、コックス属種（Ｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、クリュプトミュズス・リビス（Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ  ｒｉｂｉｓ）、ダルブルス属種（Ｄａｌｂｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ディアレウロデス属種（Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ディアポリナ属種（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｓｐｐ．）、ディアスピス属種（Ｄｉａｓｐｉｓ  ｓｐｐ．）、ドロシカ属種（Ｄｒｏｓｉｃｈａ  ｓｐｐ．）、ドュサピス属種（Ｄｙｓａｐｈｉｓ  ｓｐｐ．）、ドュスミコックス属種（Ｄｙｓｍｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エムポアスカ属種（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｐｐ．）、エリオソマ属種（Ｅｒｉｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）、エリュトロネウラ属種（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ  ｓｐｐ．）、エウスケリス・ビロバトゥス（Ｅｕｓｃｅｌｉｓ  ｂｉｌｏｂａｔｕｓ）、フェッリシア属種（Ｆｅｒｒｉｓｉａ  ｓｐｐ．）、ゲオコックス・コッフェアエ（Ｇｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｆｆｅａｅ）、ヒエログリュプス属種（Ｈｉｅｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ホマロディスカ・コアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ  ｃｏａｇｕｌａｔａ）、フュアロプテルス・アルンディニス（Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ  ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、イケリュア属種（Ｉｃｅｒｙａ  ｓｐｐ．）、イディオケルス属種（Ｉｄｉｏｃｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）、イディオスコプス属種（Ｉｄｉｏｓｃｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、ラオデルパクス・ストリアテッルス（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ  ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）、レカニウム属種（Ｌｅｃａｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、レピドサペス属種（Ｌｅｐｉｄｏｓａｐｈｅｓ  ｓｐｐ．）、リパピス・エリュシミ（Ｌｉｐａｐｈｉｓ  ｅｒｙｓｉｍｉ）、マクロシプム属種（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ｓｐｐ．）、マハナルワ属種（Ｍａｈａｎａｒｖａ  ｓｐｐ．）、メラナピス・サッカリ（Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ）、メトカルフィエッラ属種（Ｍｅｔｃａｌｆｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、メトポロピウム・ディロドゥム（Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ  ｄｉｒｈｏｄｕｍ）、モネッリア・コスタリス（Ｍｏｎｅｌｌｉａ  ｃｏｓｔａｌｉｓ）、モネッリオプシス・ペカニス（Ｍｏｎｅｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｐｅｃａｎｉｓ）、ミュズス属種（Ｍｙｚｕｓ  ｓｐｐ．）、ナソノウィア・リビスニグリ（Ｎａｓｏｎｏｖｉａ  ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ）、ネポテッティクス属種（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｓｐｐ．）、ニラパルワタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）、オンコメトピア属種（Ｏｎｃｏｍｅｔｏｐｉａ  ｓｐｐ．）、オルテジア・プラエロンガ（Ｏｒｔｈｅｚｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ）、パラベミシア・ミュリカエ（Ｐａｒａｂｅｍｉｓｉａ  ｍｙｒｉｃａｅ）、パラトリオザ属種（Ｐａｒａｔｒｉｏｚａ  ｓｐｐ．）、パルラトリア属種（Ｐａｒｌａｔｏｒｉａ  ｓｐｐ．）、ペムピグス属種（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｓｐｐ．）、ペレグリヌス・マイディス（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ  ｍａｉｄｉｓ）、ペナコックス属種（Ｐｈｅｎａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プロエオミュズス・パッセリニイ（Ｐｈｌｏｅｏｍｙｚｕｓ  ｐａｓｓｅｒｉｎｉｉ）、ポロドン・フムリ（Ｐｈｏｒｏｄｏｎ  ｈｕｍｕｌｉ）、ピュッロクセラ属種（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ  ｓｐｐ．）、ピンナスピス・アスピディストラエ（Ｐｉｎｎａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｄｉｓｔｒａｅ）、プラノコックス属種（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プロトプルウィナリア・ピュリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｐｕｌｖｉｎａｒｉａ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プセウダウラカスピス・ペンタゴナ（Ｐｓｅｕｄａｕｌａｃａｓｐｉｓ  ｐｅｎｔａｇｏｎａ）、シュードコックス属種（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プシュッラ属種（Ｐｓｙｌｌａ  ｓｐｐ．）、プテロマルス属種（Ｐｔｅｒｏｍａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ピュリッラ属種（Ｐｙｒｉｌｌａ  ｓｐｐ．）、クワドラスピディオトゥス属種（Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、クウェサダ・ギガス（Ｑｕｅｓａｄａ  ｇｉｇａｓ）、ラストロコックス属種（Ｒａｓｔｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ロパロシプム属種（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｓｐｐ．）、サイッセティア属種（Ｓａｉｓｓｅｔｉａ  ｓｐｐ．）、スカポイデス・ティタヌス（Ｓｃａｐｈｏｉｄｅｓ  ｔｉｔａｎｕｓ）、スキザピス・グラミヌム（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、セレナスピドゥス・アルティクラトゥス（Ｓｅｌｅｎａｓｐｉｄｕｓ  ａｒｔｉｃｕｌａｔｕｓ）、ソガタ属種（Ｓｏｇａｔａ  ｓｐｐ．）、ソガテッラ・フルキフェラ（Ｓｏｇａｔｅｌｌａ  ｆｕｒｃｉｆｅｒａ）、ソガトデス属種（Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、スティクトケパラ・フェスティナ（Ｓｔｉｃｔｏｃｅｐｈａｌａ  ｆｅｓｔｉｎａ）、テナラパラ・マラユエンシス（Ｔｅｎａｌａｐｈａｒａ  ｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、ティノカッリス・カリュアエフォリアエ（Ｔｉｎｏｃａｌｌｉｓ  ｃａｒｙａｅｆｏｌｉａｅ）、トマスピス属種（Ｔｏｍａｓｐｉｓ  ｓｐｐ．）、トクソプテラ属種（Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．）、トリアレウロデス属種（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、トリオザ属種（Ｔｒｉｏｚａ  ｓｐｐ．）、テュプロキュバ属種（Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ  ｓｐｐ．）、ウナスピス属種（Ｕｎａｓｐｉｓ  ｓｐｐ．）、ウィテウス・ウィティフォリイ（Ｖｉｔｅｕｓ  ｖｉｔｉｆｏｌｉｉ）、ジギナ属種（Ｚｙｇｉｎａ  ｓｐｐ．）である。
【０４２４】
さらに他の例は、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアクロミュルメクス属種（Ａｃｒｏｍｙｒｍｅｘ  ｓｐｐ．）、アタリア属種（Ａｔｈａｌｉａ  ｓｐｐ．）、アッタ属種（Ａｔｔａ  ｓｐｐ．）、ディプリオン属種（Ｄｉｐｒｉｏｎ  ｓｐｐ．）、ホプロカムパ属種（Ｈｏｐｌｏｃａｍｐａ  ｓｐｐ．）、ラシウス属種（Ｌａｓｉｕｓ  ｓｐｐ．）、モノモリウム・パラオニス（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、ソレノプシス・インウィクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ）、タピノマ属種（Ｔａｐｉｎｏｍａ  ｓｐｐ．）、ウェスパ属種（Ｖｅｓｐａ  ｓｐｐ．）である。
【０４２５】
さらに他の例は、等脚目（Ｉｓｏｐｏｄａ）の目から、例えばアルマディッリディウム・ウルガレ（Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、オニスクス・アセッルス（Ｏｎｉｓｃｕｓ  ａｓｅｌｌｕｓ）、ポルケッリオ・スカベル（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ  ｓｃａｂｅｒ）である。
【０４２６】
さらに他の例は、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばコプトテルメス属種（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｐ．）、コルニテルメス・クムランス（Ｃｏｒｎｉｔｅｒｍｅｓ  ｃｕｍｕｌａｎｓ）、クリュプトテルメス属種（Ｃｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｐ．）、インキシテルメス属種（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｐ．）、ミクロテルメス・オベシ（Ｍｉｃｒｏｔｅｒｍｅｓ  ｏｂｅｓｉ）、オドントテルメス属種（Ｏｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｐ．）、レティクリテルメス属種（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｐ．）である。
【０４２７】
さらに他の例は、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアクロニクタ・マイヨル（Ａｃｒｏｎｉｃｔａ  ｍａｊｏｒ）、アドクソピュエス属種（Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｓｐｐ．）、アエディア・レウコメラス（Ａｅｄｉａ  ｌｅｕｃｏｍｅｌａｓ）、アグロティス属種（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｐｐ．）、アラバマ属種（Ａｌａｂａｍａ  ｓｐｐ．）、アミュエロイス・トランシテッラ（Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、アナルシア属種（Ａｎａｒｓｉａ  ｓｐｐ．）、アンティカルシア属種（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｓｐｐ．）、アルギュロプロケ属種（Ａｒｇｙｒｏｐｌｏｃｅ  ｓｐｐ．）、バラトラ・ブラッシカエ（Ｂａｒａｔｈｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ボルボ・キンナラ（Ｂｏｒｂｏ  ｃｉｎｎａｒａ）、ブックラトリクス・トゥルベリエッラ（Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ）、ブパルス・ピニアリウス（Ｂｕｐａｌｕｓ  ｐｉｎｉａｒｉｕｓ）、ブッセオラ属種（Ｂｕｓｓｅｏｌａ  ｓｐｐ．）、カコエキア属種（Ｃａｃｏｅｃｉａ  ｓｐｐ．）、カロプティリア・テイウォラ（Ｃａｌｏｐｔｉｌｉａ  ｔｈｅｉｖｏｒａ）、カプア・レティクラナ（Ｃａｐｕａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｎａ）、カルポカプサ・ポモネッラ（Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、カルポシナ・ニポネンシス（Ｃａｒｐｏｓｉｎａ  ｎｉｐｏｎｅｎｓｉｓ）、ケマトビア・ブルマタ（Ｃｈｅｍａｔｏｂｉａ  ｂｒｕｍａｔａ）、キロ属種（Ｃｈｉｌｏ  ｓｐｐ．）、コリストネウラ属種（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｓｐｐ．）、クリュシア・アムビグエッラ（Ｃｌｙｓｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、クナパロケルス属種（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）、クネパシア属種（Ｃｎｅｐｈａｓｉａ  ｓｐｐ．）、コノポモルパ属種（Ｃｏｎｏｐｏｍｏｒｐｈａ  ｓｐｐ．）、コノトラケルス属種（Ｃｏｎｏｔｒａｃｈｅｌｕｓ  ｓｐｐ．）、コピタルシア属種（Ｃｏｐｉｔａｒｓｉａ  ｓｐｐ．）、キュディア属種（Ｃｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、ダラカ・ノクトゥイデス（Ｄａｌａｃａ  ｎｏｃｔｕｉｄｅｓ）、ディアパニア属種（Ｄｉａｐｈａｎｉａ  ｓｐｐ．）、ディアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、エアリアス属種（Ｅａｒｉａｓ  ｓｐｐ．）、エクドュトロパ・アウランティウム（Ｅｃｄｙｔｏｌｏｐｈａ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、エラスモパルプス・リグノセッルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、エルダナ・サッカリナ（Ｅｌｄａｎａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、エピスティア属種（Ｅｐｈｅｓｔｉａ  ｓｐｐ．）、エピノティア属種（Ｅｐｉｎｏｔｉａ  ｓｐｐ．）、エピピュアス・ポストウィッタナ（Ｅｐｉｐｈｙａｓ  ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、エティエッラ属種（Ｅｔｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、エウリア属種（Ｅｕｌｉａ  ｓｐｐ．）、エウポエキリア・アムビグエッラ（Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、エウプロクティス属種（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｓｐｐ．）、エウクソア属種（Ｅｕｘｏａ  ｓｐｐ．）、フェルティア属種（Ｆｅｌｔｉａ  ｓｐｐ．）、ガッレリア・メッロネッラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、グラキッラリア属種（Ｇｒａｃｉｌｌａｒｉａ  ｓ��ｐ．）、グラポリタ属種（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔｈａ  ｓｐｐ．）、ヘドュレプタ属種（Ｈｅｄｙｌｅｐｔａ  ｓｐｐ．）、ヘリコウェルパ属種（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐｐ．）、ヘリオティス属種（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｓｐｐ．）、ホフマンノピラ・シュードスプレテッラ（Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｒｅｔｅｌｌａ）、ホモエオソマ属種（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）、ホモナ属種（Ｈｏｍｏｎａ  ｓｐｐ．）、フュポノメウタ・パデッラ（Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｐａｄｅｌｌａ）、カキウォリア・フラウォファスキアタ（Ｋａｋｉｖｏｒｉａ  ｆｌａｖｏｆａｓｃｉａｔａ）、ラピュグマ属種（Ｌａｐｈｙｇｍａ  ｓｐｐ．）、ラスペイレシア・モレスタ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、レウキノデス・オルボナリス（Ｌｅｕｃｉｎｏｄｅｓ  ｏｒｂｏｎａｌｉｓ）、レウコプテラ属種（Ｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．）、リトコッレティス属種（Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ  ｓｐｐ．）、リトパネ・アンテンナタ（Ｌｉｔｈｏｐｈａｎｅ  ａｎｔｅｎｎａｔａ）、ロベシア属種（Ｌｏｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．）、ロクサグロティス・アルビコスタ（Ｌｏｘａｇｒｏｔｉｓ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、リュマントリア属種（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｓｐｐ．）、リュオネティア属種（Ｌｙｏｎｅｔｉａ  ｓｐｐ．）、マラコソマ・ネウストリア（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ）、マルカ・テストゥラリス（Ｍａｒｕｃａ  ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ）、マメストラ・ブラッシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、モキス属種（Ｍｏｃｉｓ  ｓｐｐ．）、ミュティムナ・セパラタ（Ｍｙｔｈｉｍｎａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ニュムプラ属種（Ｎｙｍｐｈｕｌａ  ｓｐｐ．）、オイケティクス属種（Ｏｉｋｅｔｉｃｕｓ  ｓｐｐ．）、オリア属種（Ｏｒｉａ  ｓｐｐ．）、オルタガ属種（Ｏｒｔｈａｇａ  ｓｐｐ．）、オストリニア属種（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、オウレマ・オリュザエ（Ｏｕｌｅｍａ  ｏｒｙｚａｅ）、パノリス・フランメア（Ｐａｎｏｌｉｓ  ｆｌａｍｍｅａ）、パルナラ属種（Ｐａｒｎａｒａ  ｓｐｐ．）、ペクティノポラ属種（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．）、ペリレウコプテラ属種（Ｐｅｒｉｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．）、プトリマエア属種（Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ  ｓｐｐ．）、ピュッロクニスティス・キトレッラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ）、ピュッロノリュクテル属種（Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ピエリス属種（Ｐｉｅｒｉｓ  ｓｐｐ．）、プラテュノタ・ストゥルタナ（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ  ｓｔｕｌｔａｎａ）、プロディア・インテルプンクテッラ（Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ）、プルシア属種（Ｐｌｕｓｉａ  ｓｐｐ．）、プルテッラ・クシロステッラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、プライス属種（Ｐｒａｙｓ  ｓｐｐ．）、プロデニア属種（Ｐｒｏｄｅｎｉａ  ｓｐｐ．）、プロトパルケ属種（Ｐｒｏｔｏｐａｒｃｅ  ｓｐｐ．）、プセウダレティア属種（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｐｐ．）、シュードプルシア・インクルデンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ピュラウスタ・ヌビラリス（Ｐｙｒａｕｓｔａ  ｎ��ｂｉｌａｌｉｓ）、ラキプルシア・ヌ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｎｕ）、スコエノビウス属種（Ｓｃｈｏｅｎｏｂｉｕｓ  ｓｐｐ．）、スキルポパガ属種（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ  ｓｐｐ．）、スコティア・セゲトゥム（Ｓｃｏｔｉａ  ｓｅｇｅｔｕｍ）、セサミア属種（Ｓｅｓａｍｉａ  ｓｐｐ．）、スパルガノティス属種（Ｓｐａｒｇａｎｏｔｈｉｓ  ｓｐｐ．）、スポドプテラ属種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．）、スタトモポダ属種（Ｓｔａｔｈｍｏｐｏｄａ  ｓｐｐ．）、ストモプテリュクス・スブセキウェッラ（Ｓｔｏｍｏｐｔｅｒｙｘ  ｓｕｂｓｅｃｉｖｅｌｌａ）、シュナンテドン属種（Ｓｙｎａｎｔｈｅｄｏｎ  ｓｐｐ．）、テキア・ソラニウォラ（Ｔｅｃｉａ  ｓｏｌａｎｉｖｏｒａ）、テルメシア・ゲンマタリス（Ｔｈｅｒｍｅｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ティネア・ペッリオネッラ（Ｔｉｎｅａ  ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ）、ティネオラ・ビッセリエッラ（Ｔｉｎｅｏｌａ  ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ）、トルトリクス属種（Ｔｏｒｔｒｉｘ  ｓｐｐ．）、トリコパガ・タペトゼッラ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｇａ  ｔａｐｅｔｚｅｌｌａ）、トリコプルシア属種（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｓｐｐ．）、トゥタ・アブソルタ（Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ）、ウィラコラ属種（Ｖｉｒａｃｈｏｌａ  ｓｐｐ．）である。
【０４２８】
さらに他の例は、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアケタ・ドメスティクス（Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ブラッタ・オリエンタリス（Ｂｌａｔｔａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ブラッテッラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ディクロプルス属種（Ｄｉｃｈｒｏｐｌｕｓ  ｓｐｐ．）、グリュッロタルパ属種（Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐａ  ｓｐｐ．）、レウコパエア・マデラエ（Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ  ｍａｄｅｒａｅ）、ロクスタ属種（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｓｐｐ．）、メラノプルス属種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペリプラネタ属種（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ｓｐｐ．）、プレクス・イッリタンス（Ｐｕｌｅｘ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）、スキストケルカ・グレガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）、スペッラ・ロンギパルパ（Ｓｕｐｅｌｌａ  ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）である。
【０４２９】
さらに他の例は、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）の目から、例えばケラトピュッルス属種（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、クテノケパリデス属種（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、トゥンガ・ペネトランス（Ｔｕｎｇａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、クセノプシュッラ・ケオピス（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｃｈｅｏｐｉｓ）である。
【０４３０】
さらに他の例は、コムカデ目（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）の目から、例えばスクティゲレッラ属種（Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）である。
【０４３１】
さらに他の例は、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアナポトリプス・オブスクルス（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ  ｏｂｓｃｕｒｕｓ）、バリオトリプス・ビフォルミス（Ｂａｌｉｏｔｈｒｉｐｓ  ｂｉｆｏｒｍｉｓ）、ドレパノトリス・レウテリ（Ｄｒｅｐａｎｏｔｈｒｉｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、エンネオトリプス・フラウェンス（Ｅｎｎｅｏｔｈｒｉｐｓ  ｆｌａｖｅｎｓ）、フランクリニエッラ属種（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ヘリオトリプス属種（Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｐｓ  ｓｐｐ．）、ヘルキノトリプス・フェモラリス（Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ  ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）、リピポロトリプス・クルエンタトゥス（Ｒｈｉｐｉｐｈｏｒｏｔｈｒｉｐｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔｕｓ）、スキルトトリプス属種（Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ  ｓｐｐ．）、タエニオトリプス・カルダモニ（Ｔａｅｎｉｏｔｈｒｉｐｓ  ｃａｒｄａｍｏｎｉ）、トリプス属種（Ｔｈｒｉｐｓ  ｓｐｐ．）である。
【０４３２】
さらに他の例は、シミ目（Ｚｙｇｅｎｔｏｍａ）（＝シミ目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ））の目から、例えばレピスマ・サッカリナ（Ｌｅｐｉｓｍａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、テルモビア・ドメスティカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）である。
【０４３３】
別の実施形態において、特に二枚貝綱（Ｂｉｖａｌｖｉａ）の綱から軟体動物門（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）の害虫、例えばドレイッセナ属種（Ｄｒｅｉｓｓｅｎａ  ｓｐｐ．）もまた重要な植物の害虫である。
【０４３４】
別の実施形態において、マキガイ綱（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）の綱の害虫、例えばアニオン属種（Ａｎｉｏｎ  ｓｐｐ．）、ビオムパラリア属種（Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）、ブリヌス属種（Ｂｕｌｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、デロケラス属種（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ  ｓｐｐ．）、ガルバ属種（Ｇａｌｂａ  ｓｐｐ．）、リュムナエア属種（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｐｐ．）、オンコメラニア属種（Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ  ｓｐｐ．）、ポマケア属種（Ｐｏｍａｃｅａ  ｓｐｐ．）、スッキネア属種（Ｓｕｃｃｉｎｅａ  ｓｐｐ．）が重要な植物の害虫である。
【０４３５】
さらに別の実施形態において、線形動物門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｎｅｍａｔｏｄａ）からの植物の害虫が重要な植物の害虫、すなわち植物寄生性線虫であり、それ故、植物に損傷を引き起こす植物寄生性線虫を意味する。植物線虫は植物寄生性線虫および土壌に生存している線虫を包含する。植物寄生性線虫としては、限定されないが、クシフィネマ属種（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ロンギドルス属種（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）およびトリコドルス属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）などの外部寄生虫、チレンクルス属種（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）などの半寄生虫、プラチレンクス属種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ラドフォルス属種（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）およびスクテロネルナ属種（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｒｎａ．  ｓｐｐ．）などの体内移行性内部寄生虫、ヘテロデラ属種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）、グロボデラ属種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）およびメロイドジネ属種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．）などの定在性寄生虫ならびにジチレンクス属種（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、アフェレンコイデス属種（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）およびヒルシュマニエラ属種（Ｈｉｒｓｈｍａｎｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）などの茎および葉内部寄生虫が挙げられる。加えて、有害な根寄生性土壌線虫は、ヘテロデラまたはグロボデラ属のシスト−形成性線虫および／またはメロイドジネ属の根瘤線虫である。これらの属の有害な属種は、例えばメロイドジネ・インコグナタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎａｔａ）、へテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（大豆シスト線虫）、グロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄａ）およびグロボデラ・ロストチエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（ポテトシスト線虫）である。植物の害虫として重要であるさらに他の重要な属は、ロチレンクルス属種（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、パラトリクロドルス属種（Ｐａｒａｔｒｉｃｌｏｄｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）、プラチレンクス・ペネトランス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、ラドロフス・シムリ（Ｒａｄｏｌｏｐｈｕｓ  ｓｉｍｕｌｉ）、ジチレンクス・ジスパシ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｄｉｓｐａｃｉ）、チレンクルス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、クシフィネマ属種（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ブルサフェレンクス属種（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）など、特にアフェレンコイデス属種、ブルサフェレンクス属種、ジチレンクス属種、グロボデラ属種、ヘテロデラ属種、ロンギドルス属種、メロイドジネ属種、プラチレンクス属種、ラドフォラス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）、トリコドルス属種、チレンクルス・セミペネトランス、クシフィネマ属種を含む。
【０４３６】
さらに別の実施形態において、植物の害虫はウイルスであり、本発明の方法は植物におけるウイルス感染を治療することまたはウイルス感染性を阻害することを対象とし、植物ウイルスは、アルファモウイルス（ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ）、アレキシウイルス（ａｌｌｅｘｉｖｉｒｕｓ）、アルファクリプトウイルス（ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、アヌラウイルス（ａｎｕｌａｖｉｒｕｓ）、アプスカウイロイド（ａｐｓｃａｖｉｒｏｉｄ）、アウレウスウイルス（ａｕｒｅｕｓｖｉｒｕｓ）、アベナウイルス（ａｖｅｎａｖｉｒｕｓ）、アイサンウイロイド（ａｙｓｕｎｖｉｒｏｉｄ）、バドナウイルス（ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）、ベゴモウイルス（ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ベニウイルス（ｂｅｎｙｖｉｒｕｓ）、ベタクリプトウイルス（ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、ベタフレキシウイリダエ（ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）、ブロモウイルス（ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ビモウイルス（ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ）、カピロウイルス（ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）、カルラウイルス（ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）、カルモウイルス（ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ）、カウリモウイルス（ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）、カベモウイルス（ｃａｖｅｍｏｖｉｒｕｓ）、チェラウイルス（ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、クロステロウイルス（ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、コカドウイロイド（ｃｏｃａｄｖｉｒｏｉｄ）、コレウイロイド（ｃｏｌｅｖｉｒｏｉｄ）、コモウイルス（ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）、クリニウイルス（ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ククモウイルス（ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）、クルトウイルス（ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）、シトルハブドウイルス（ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ジアントウイルス（ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ）、エナモウイルス（ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ）、ウムブラウイルス＆Ｂ型サテライトウイルス（ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ  ＆  Ｂ−ｔｙｐｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｖｉｒｕｓ）、ファバウイルス（ｆａｂａｖｉｒｕｓ）、フィジウイルス（ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ）、フロウイルス（ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス（ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）、ホスツウイロイド（ｈｏｓｔｕｖｉｒｏｉｄ）、イダエオウイルス（ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ）、イラルウイルス（ｉｌａｒｖｉｒｕｓ）、イポモウイルス（ｉｐｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ルテオウイルス（ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）、マクロモウイルス（ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ）、マクルラウイルス（ｍａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓ）、マラフィウイルス（ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ）、マストレウイルス（ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）、ナノウイルス（ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）、ネクロウイルス（ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ）、ネポウイルス（ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ）、ヌクレオルハブドウイルス（ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、オレアウイルス（ｏｌｅａｖｉｒｕｓ）、オフィノウイルス（ｏｐｈｉｏｖｉｒｕｓ）、オリザウイルス（ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ）、パニコウイルス（ｐａｎｉｃｏｖｉｒｕｓ）、ペクルウイルス（ｐｅｃｌｕｖｉｒｕｓ）、ペツウイルス（ｐｅｔｕｖｉｒｕｓ）、フィトレオウイルス（ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ポレロウイルス（ｐｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ポモウイルス（ｐｏｍｏｖｉｒｕｓ���、ポスピウイロイド（ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄ）、ポテックスウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）、ポチウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、リモウイルス（ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ）、サドワウイルス（ｓａｄｗａｖｉｒｕｓ）、ＳｂＣＭＶ様ウイルス（ＳｂＣＭＶ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、セクイウイルス（ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ）、ソベモウイルス（ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ）、テヌイウイルス（ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）、ＴＮｓａｔＶ様サテライトウイルス（ＴＮｓａｔＶ−ｌｉｋｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、トポクウイルス（ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ）、トスポウイルス（ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）、トリコウイルス（ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ）、トリチモウイルス（ｔｒｉｔｉｍｏｖｉｒｕｓ）、ツングロウイルス（ｔｕｎｇｒｏｖｉｒｕｓ）、チモウイルス（ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ）、ウムブラウイルス（ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ）、バリコサウイルス（ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓ）、ビチウイルス（ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ）またはワイカウイルス（ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ）から選択される。
【０４３７】
さらに別の実施形態において、植物の害虫は植物病原性真菌であってもよく、このような植物真菌としては、限定されないが、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ジプロジア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エリシフェ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、マクロフォミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、フォマ（Ｐｈｏｍａ）、フィマトトリカム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、フィトフィトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）、プチニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、プチウム（Ｐｕｔｈｉｕｍ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、ピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、セロチウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）、チエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）、ウンキヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）、およびベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の属からなる群から選択されるものが挙げられる。本発明のインターフェラーを用いて治療され得る植物真菌感染の特定の例としては、穀物におけるエリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ウリ科植物におけるエリシフェ・シコラセアラム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）およびスファエロテカ・フリジネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、リンゴにおけるポドスファエラ・レウコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、つる植物におけるウンシヌラ・ネカター（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｎｅｃａｔｏｒ）、穀物におけるプチニア属種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐ．）、綿、ジャガイモ、コメおよび芝におけるリゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、穀物およびサトウキビにおけるウスチラゴ属種（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐ．）、リンゴにおけるベンツリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）（黒星病）、穀物におけるヘルミントスポリウム属種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、コムギにおけるセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、コムギにおけるセプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、オオムギにおけるリンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｅｃａｌｉｓ）、イチゴ、トマトおよびブドウにおけるボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（灰色カビ病）、ラッカセイにおけるセルコスポラ・アラキジコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）、タバコにおけるペロノスポラ・タバシナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａ）または種々の農作物における他のペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、コムギおよびオオムギにおけるシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、オオムギにおけるピレノフェラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｅｒａ  ｔｅｒｅｓ）、コメにおけるピリクラリア・オリザエ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、ジャガイモおよびトマトにおけるフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、種々の植物におけるフサリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）（フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）など）および種々の植物におけるベルチシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、ブドウにおけるプラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）、果物および野菜におけるアルタナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．）、キュウリにおけるシュードペロノスポラ・クベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、バナナにおけるマイコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、ヒヨコマメにおけるアスコチタ属種（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｐ．）、アブラナにおけるレプトスファエリア属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）および種々の農作物におけるコレオトリカム属種（Ｃｏｌｌｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）が挙げられる。
【０４３８】
さらに別の特定の実施形態において、植物の害虫は、限定されないが、アシドボラクス・アベナエ亜属種アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ａｖｅｎａｅ）（コメの褐縞細菌病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｒｏｗｎ  ｓｔｒｉｐｅ）を生じる）、アシドボラクス・アベナエ亜属種カトレイエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｔｔｌｅｙａｅ）（カトレアの褐斑細菌病を生じる）、アシドボラクス・コンジャシ・コンニャク（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｋｏｎｊａｃｉ  Ｋｏｎｎｙａｋｕ）（白葉枯病を生じる）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（メロンの毛根を生じる）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（根頭癌腫病を生じる）、ブルコルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）（カーネーションの斑点細菌病を生じる）、ブルコルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）（カーネーションの青枯病を生じる）、ブルコルデリア・カペシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）（シンビジウムの褐斑細菌病を生じる）、ブルコルデリア・グラジオリｐｖ．グラジオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ  ｐｖ．  ｇｌａｄｉｏｌｉ）（グラジオラスのいもち病を生じる）、ブルクホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）（コメのモミ枯細菌病を生じる）、ブルコルデリア・プランタリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）（コメの細菌性種子枯病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｂｌｉｇｈｔ）を生じる）、クラビバクター・ミシガネンシス亜属種ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）（トマトの潰瘍病を生じる）、クラビバクター・ミシガネンシス亜属種セペドニカス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）（ジャガイモの輪腐病を生じる）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）（ジャガイモの粘液性腐敗（ｓｌｉｍｙ  ｒｏｔ）を生じる）、クルトバクテリウム・フラクムファシエンス（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ）（タマネギの潰瘍病を生じる）、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（西洋ナシの火傷病を生じる）、エルウィニア・アナナス（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｎａｎａｓ）（コメの細菌性内えい褐色化を生じる）、エルウィニア・カロトボラ亜属種アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）（ジャガイモの黒脚病を生じる）、エルウィニア・カロトボラ亜属種カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）（野菜の細菌性軟腐病を生じる）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）（タロイモの細菌性種子枯病を生じる）、エルウィニア・クリサンテミｐｖ．ゼアエ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅ��ｉ  ｐｖ．  ｚｅａｅ）（コメの細菌性腐蹄症を生じる）、エルウィニア・ヘルビコラｐｖ．ミレティアエ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ｐｖ．  ｍｉｌｌｅｔｔｉａｅ）（フジの細菌性瘤を生じる）、シュードモナス・シコリー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）（キクの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・コルゲート・ピッチ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔｅ  Ｐｉｔｈ）（トマトの壊死を生じる）、シュードモナス・フスコバギナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）（コメの鞘褐色腐敗病を生じる）、シュードモナス・マルギナリスｐｖ．マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ  ｐｖ．  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）（キャベツの軟腐病を生じる）、シュードモナス・ルブリスバルビカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｕｂｒｉｓｕｂａｌｂｉｃａｎｓ）（サトウキビの斑状縞を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．アプタタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ａｐｔａｔａ）（サトウダイコンの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．アトロプルプレア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ａｔｒｏｐｕｒｐｕｒｅａ）（ライグラスのかさ枯病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．カスタネアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｃａｓｔａｎｅａｅ）（クリの潰瘍病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．グリシネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｇｌｙｃｉｎｅａ）（ダイズの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）（キュウリの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．マクリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ）（キャベツの細菌性黒斑病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．モリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｍｏｒｉ）（クワの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．モルスプルノラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｍｏｒｓｐｒｕｎｏｒｕｍ）（プラムの潰瘍病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．オリザエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｏｒｙｚａｅ）（コメのかさ枯病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．ファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）（インゲンマメのかさ枯病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．ピシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｐｉｓｉ）（エンドウの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．セサミ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｓｅｓａｍｅ）（ゴマの斑点細菌病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．ストリアファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｓｔｒｉａｆａｃｉｅｎｓ）（オートムギの細菌性縞枯病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ��ｖ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ）（小レッドビーズの細菌性褐斑病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．タバシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｔａｂａｃｉ）（タバコの野火病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．テアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｔｈｅａｅ）（茶の細菌性新芽枯病を生じる）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）（トマトの細菌性斑点病を生じる）、シュードモナス・ビリジフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）（インゲンマメの細菌性褐斑病を生じる）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（青枯病を生じる）、ラタイバクター・ラタイ（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ  ｒａｔｈａｙｉ）（オーチャードグラスの細菌性胴枯病を生じる）、ストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ）（ジャガイモのそうか病を生じる）、ストレプトマイセス・イポモエア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｉｐｏｍｏｅａ）（サツマイモの瘡痂病を生じる）、キサントモナス・アルビリネアンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｉｌｉｎｅａｎｓ）（サトウキビの白い筋を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．セレアリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃｅｒｅａｌｉｓ）（ライムギの細菌性の筋を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（黒斑病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃｉｔｒｉ）（柑橘類の癌腫病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．ククルビタエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）（キュウリの細菌性褐斑病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．グリシネス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズの葉焼病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｓｔｕｌｅ）を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．インカナエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｉｎｃａｎａｅ）（幹の黒斑病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．）（綿マルバセアラム（ｃｏｔｔｏｎ  ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ）の角斑病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．）（マンゴーの潰瘍病を生じる）、マンギッフェラエインジカエ・キサントモナス・カンペストリスｐｖ．メレア（Ｍａｎｇｉｆｅｒａｅｉｎｄｉｃａｅ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｍｅｌｌｅａ）（タバコの細菌性斑点病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．）（グレートナイグロマキュランスゴボウ（ｇｒｅａｔ  ｎｉｇｒｏｍａｃｕｌａｎｓ  ｂｕｒｄｏｃｋ）の斑点細菌病を生じる）、���サントモナス・カンペストリスｐｖ．ファセオリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｐｈａｓｅｏｌｉ）（インゲンマメの葉焼病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．ピシ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｐｉｓｉ）（インゲンマメの細菌性菌核病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．プルニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｐｒｕｎｉ）（モモの細菌性穿孔病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．ラファニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｒａｐｈａｎｉ）（ダイコンの斑点細菌病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．リシニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｒｉｃｉｎｉ）（トウゴマの斑点細菌病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．テイコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｔｈｅｉｃｏｌａ）（茶の潰瘍病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）（オーチャードグラスの斑点細菌病を生じる）、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）（トマトの斑点細菌病を生じる）、キサントモナス・オリザエｐｖ．オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．  ｏｒｙｚａｅ）（コメの細菌性黒葉枯病を生じる）を含む、植物病原性細菌である。
【０４３９】
植物において、分子はそれ自体として投与されてもよいが、トランスジェニックアプローチを使用することが特に想定される。これらの場合、方法は、次の構造、（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎ、［式中、
−ｎは１から５までの整数であり、ｉは繰り返されるごとに１からｎまで増加し、
−Ｘ２ｉ−１およびＸ２ｉはそれぞれ、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱから選択される１個から４個の連続するアミノ酸、さらに特定すると、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸、もっとも特定すると、Ｒ、ＤおよびＰから選択される１個から４個のアミノ酸から独立して選択され、
−Ｙｉはそれぞれ、一続きの４個から１６個の連続するアミノ酸であって、その少なくとも５０％が疎水性アミノ酸であり、少なくとも１個の脂肪族残基またはＦが存在し、存在する脂肪族残基またはＦが１個だけの場合は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の他の残基がＹ、Ｗ、Ａ、ＭおよびＴから選択され、Ｐ、Ｒ、Ｋ、ＤまたはＥ残基が１個以下存在し、好ましくは存在せず、少なくとも１個のＹｉは植物、植物細胞もしくは植物種子中のタンパク質（または植物病原体のタンパク質）に天然に存在する一続きである、前記連続するアミノ酸から独立して選択され、
−Ｚｉはそれぞれリンカーであり、Ｚｎはリンカーまたは非存在から独立して選択される］
を有する分子をコードする非天然に生じる核酸配列を使用する。
【０４４０】
次いで上記の方法は、植物もしくは植物細胞もしくは植物種子中の植物タンパク質の生物学的機能を下方調節するため（または植物もしくは植物細胞もしくは植物種子それぞれの害虫生物のタンパク質の生物学的機能を下方調節するため）の方法であって、前記植物、植物細胞または植物種子を、上記で概説した構造を有する分子をコードする（すなわち少なくとも１つの）非天然に存在する核酸配列で形質転換する段階を含む、方法として再形成されてもよい。
【０４４１】
代替として、方法は、植物もしくは植物細胞もしくは植物種子中の植物タンパク質の生物学的機能を下方調節するため（または植物もしくは植物細胞もしくは植物種子それぞれの害虫生物のタンパク質の生物学的機能を下方調節するため）の方法であって、前記植物、植物細胞または植物種子中で、上記に概説した構造を有する分子をコードする非天然に存在する核酸配列を発現する段階を含む、方法として再形成されてもよい。
【０４４２】
特定の実施形態によれば、コードされたポリペプチド配列は非天然に存在するポリペプチドである。さらなる特定の実施形態によれば、核酸配列は人工遺伝子である。人工遺伝子は典型的に次の作動可能に連結されたＤＮＡエレメント、ａ）植物発現プロモーター、ｂ）上記の分子をコードする核酸（特定するとＤＮＡ）配列ならびにｃ）前記植物の細胞中で機能する転写終結およびポリアデニル化信号を含む３’末端領域を含む。
【０４４３】
核酸の態様はトランスジェニック発現を使用する用途にもっとも特に適しているので、核酸配列（または人工遺伝子）が、別の部分、特定すると遺伝子産物の溶解性および／または安定性を増加させる部分に融合される実施形態が特に想定される。実際に、ペプチドのトランスジェニック発現は時々、産物の急速分解に起因して困難になり得る。それ故、人工遺伝子は次の作動可能に連結されたＤＮＡエレメント、ａ）植物発現プロモーター、ｂ）インターフェラー分子の溶解性を高める（凝集を防ぐ）部分に融合されたインターフェラー分子をコードする核酸ならびにｃ）前記植物の細胞中で機能する転写終結およびポリアデニル化信号を含む３’末端領域を含む。
【０４４４】
またこの態様において、本明細書に記載された分子をコードするこのような核酸配列を含む組換えベクターも提供される。これらの組換えベクターは理想的に、下方調節されるタンパク質が発現される細胞内の目的の核酸配列を保有し、前記細胞中の核酸の発現を駆動するビヒクルとして適している。組換えベクターは細胞中の別個の実体として（例えばプラスミドとして）存在してもよいまたは細胞のゲノム内に組み込まれてもよい。
【０４４５】
もっとも特定すると、分子は組換えベクターに存在するヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであり、このポリペプチドは、植物細胞、植物種子または植物中に導入されると、前記植物細胞、植物種子または植物中で前記ポリペプチドを産生する。これらの場合、タンパク質と非天然に存在する分子との間の接触は前記植物または植物細胞中の前記非天然に存在する分子の発現により生じる。それ故、タンパク質の生物学的機能はインターフェラー分子の発現により下方調節される。
【０４４６】
したがって、本明細書に記載された核酸配列、人工遺伝子または組換えベクターを含有する植物または植物細胞または植物種子が本明細書に提供される。このような配列を含む植物プロトプラストも本明細書で想定される。
【０４４７】
本発明において、「植物発現プロモーター」は植物細胞におけるコード配列セグメントの発現を媒介する調節エレメントを含む。植物における発現に関して、核酸分子は適切なプロモーターに作動可能に連結されなければならないまたは適切なプロモーターを含まなければならず、このプロモーターは時間内に正確な点においておよび必要な空間的発現パターンにより遺伝子を発現する。機能的に同等のプロモーターの同定に関して、候補プロモーターのプロモーター強度および／または発現パターンは、例えばプロモーターをレポーター遺伝子に作動可能に連結することならびに植物の様々な組織においてレポーター遺伝子の発現レベルおよびパターンをアッセイすることにより分析されてもよい。適切な周知のレポーター遺伝子としては、例えばベータ−グルクロニダーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼが挙げられる。ベータ−グルクロニダーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定することによってプロモーター活性がアッセイされる。次いでプロモーター強度および／または発現パターンは参照プロモーターのもの（本発明の方法に使用したものなど）と比較されてもよい。代替として、プロモーター強度は、ｍＲＮＡレベルを定量することによってまたはオートラジオグラムの濃度測定分析を用いたノーザンブロット法、定量的リアルタイムＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲ（Ｈｅｉｄら、１９９６  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：９８６−９９４）などの当該技術分野において公知の方法を使用して、本発明の方法に使用した核酸のｍＲＮＡレベルを、１８Ｓ  ｒＲＮＡなどのハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較することによってアッセイされてもよい。一般に、「弱いプロモーター」とは、低レベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターを意図する。「低レベル」とは、細胞当たり約１／１０，０００個の転写物から約１／１００，０００個の転写物から、約１／５００，００００個の転写物のレベルを意図する。逆に、「強いプロモーター」は、高レベルまたは細胞当たり約１／１０個の転写物から約１／１００個の転写物から約１／１０００個の転写物でコード配列の発現を駆動する。一般に、「中型の強さのプロモーター（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、強いプロモーターより低レベルで、特にすべての例において３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターの制御下での場合、得られたレベル未満のレベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターを意図する。
【０４４８】
本明細書で使用された場合、「作動可能に連結された」という用語は、プロモーター配列が目的の遺伝子の転写を開始できるように、プロモーター配列と目的の遺伝子との間の機能的連結を意味する。
【０４４９】
「構成的プロモーター」とは、必ずしもすべてではないが、ほとんどの増殖期および発生期の間ならびに少なくとも１つの細胞、組織または器官におけるほとんどの環境条件下で転写活性するプロモーターを指す。「ユビキタス」プロモーターは生物の実質的にすべての組織または細胞中で活性である。発生的に調節されたプロモーターは、特定の発生段階の間または発生の変化を受ける植物の一部において活性である。誘導プロモーターは、化学物質（概説に関して、Ｇａｔｚ  １９９７、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：８９−１０８を参照のこと）、環境もしくは物理的刺激に反応して転写開始を誘導もしくは増加させるまたは「ストレス誘導性」、すなわち植物が様々なストレス状態に曝露される場合に活性化され得るまたは「病原体誘導性」すなわち植物が様々な病原体への曝露に曝露される場合に活性化され得る。器官特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターは、葉、根、種子組織などの特定の器官または組織において転写を優先的に開始できるプロモーターである。例えば、「根特異的プロモーター」は、植物の任意の他の部分を実質的に排除して植物の根において優先的に転写活性するが、これらの他の植物の部分においていくらかの漏出性発現も依然として可能にする、プロモーターである。特定の細胞のみにおいて転写を開始できるプロモーターは本明細書で「細胞特異的」と称される。種特異的プロモーターは種子組織において優先的に転写活性するが、（漏出性発現の場合）必ずしも種子組織においてのみで転写活性しなくてもよい。種子特異的プロモーターは、種子発生の間および／または発芽の間、活性であってもよい。種子特異的プロモーターは内胚乳／糊粉／胚芽特異的であってもよい。種子特異的プロモーターの例は、Ｑｉｎｇ  ＱｕおよびＴａｋａｉｗａ（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．２、１  １３−１２５、２００４）に与えられており、その開示は完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で定義された場合、緑色組織特異的プロモーターは、植物の任意の他の部分を実質的に排除して緑色組織において優先的に転写活性するが、これらの他の植物の部分においていくらかの漏出性発現も依然として可能にする、プロモーターである。
【０４５０】
「ターミネーター」という用語は、一次転写産物の３’プロセシンングおよびポリアデニル化ならびに転写終結をシグナル伝達する転写単位の末端においてＤＮＡ配列である制御配列を包含する。ターミネーターは、天然遺伝子由来、様々な他の植物遺伝子由来またはＴ−ＤＮＡ由来であってもよい。加えられるターミネーターは、例えばノパリンシンターゼまたはオクトピンシンターゼ遺伝子由来、または代替として別の植物遺伝子由来またはあまり好ましくはないが任意の他の真核性遺伝子由来であってもよい。
【０４５１】
「選択可能マーカー」、「選択可能マーカー遺伝子」または「レポーター遺伝子」は、この遺伝子が本発明の核酸構築物でトランスフェクトまたは形質転換される細胞の同定および／または選択を促進するように発現される細胞に表現型を与える任意の遺伝子を含む。これらのマーカー遺伝子は一連の異なる原理によって核酸分子の成功した転移の同定を可能にする。適切なマーカーは、新規代謝的特性を導入するまたは視覚選択を可能にする抗生物質または除草剤抵抗性を与えるマーカーから選択されてもよい。選択可能なマーカー遺伝子の例は、抗生物質（ネオマイシンおよびカナマイシンをリン酸化するｎｐｔｌｌまたはハイグロマイシンをリン酸化しているｈｐｔまたは例えばブレオマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、スペクチノマイシンまたはブラストサイジンに対して抵抗性を与える遺伝子など）に対して、除草剤（例えばＢａｓｔａ（登録商標）に対して抵抗性を与えるｂａｒ、グリホサートに対して抵抗性を与えるａｒｏＡまたはｇｏｘまたは例えばイミダゾリノン、ホスフィノトリシンまたはスルホニル尿素に対して抵抗性を与える遺伝子）に対して抵抗性を与える遺伝子または代謝産物特性を与える遺伝子（植物が唯一の炭素源としてマンノースもしくはキシロースの利用のためにキシロースイソメラーゼを使用することを可能にするｍａｎＡまたは２−デオキシグルコースに対する抵抗性などの非栄養性マーカーなど）を含む。視覚マーカー遺伝子の発現は色（例えばβ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳまたはその着色基質、例えばＸ−Ｇａｌを有するβ−ガラクトシダーゼ）、発光（ルシフェリン／ルシフェラーゼ系など）または蛍光（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰおよびその誘導体）の形成を生じる。このリストは少数の可能なマーカーのみを表す。当業者はこのようなマーカーをよく知っている。生物および選択方法に応じて異なるマーカーが好ましい。核酸の植物細胞内への安定的または一過的組み込みの際に、少数のみの細胞が外因性ＤＮＡを受け入れ、所望の場合、使用した発現ベクターおよび使用したトランスフェクション技術に応じて外来性ＤＮＡをそのゲノム内に組み込むことが知られている。これらの要素を同定し、選択するために、選択可能なマーカー（上記のマーカーなど）をコードする遺伝子が通常、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞内に導入される。これらのマーカーは例えば変異体において使用されてもよく、これらの遺伝子は例えば従来の方法による欠失により機能しなくなる。さらに、選択可能なマーカーをコードする核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む同じベクター上で宿主細胞内に導入されてもよいまたは本発明の方法において使用されてもよいまたは他に別個のベクターにおいて使用されてもよい。導入した核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は例えば選択により同定され得る（例えば選択可能なマーカーを組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ。）。
【０４５２】
マーカー遺伝子、特に抗生物質または除草剤に対する抵抗性に関する遺伝子はもはや必要とされないまたは核酸が首尾良く導入されると、トランスジェニック宿主細胞において望まれないので、核酸を導入するための本発明に係るプロセスは有益にはこれらのマーカー遺伝子の除去または切除を可能にする技術を利用する。１つのこのような方法は同時形質転換として知られているものである。同時形質転換法は同時に形質転換するための２つのベクターを利用し、第１のベクターは本発明に係る核酸を保有し、第２のベクターはマーカー遺伝子（複数も含む）を保有する。大部分の形質転換細胞が両方のベクターを受け入れるまたは植物の場合、両方のベクターを（形質転換細胞の４０％以下またはそれ以上）含む。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）による形質転換の場合、形質転換細胞は通常、ベクターの一部のみ、すなわち通常、発現カセットを表す、Ｔ−ＤＮＡに隣接した配列を受け入れる。マーカー遺伝子は続いて交配を実施することによって形質転換植物から除去されてもよい。別の方法において、トランスポゾン内に組み込まれたマーカー遺伝子が所望の核酸と一緒の形質転換のために使用される（Ａｃ／Ｄｓ技術として知られている）。形質転換細胞はトランスポーゼース源と交配されてもよいまたは形質転換細胞は一過的または安定的にトランスポーゼースの発現を与える核酸構築物で形質転換される。一部の場合（約１０％）、形質転換が首尾良く行われると、トランスポゾンは宿主細胞のゲノムから飛び出し、損失する。さらにいくらかの場合、トランスポゾンは異なる位置に飛び出す。これらの場合、マーカー遺伝子は交配を実施することによって取り除かれなければならない。微生物学において、このような事象の検出を可能にするまたは容易にする技術が開発された。さらなる有益な方法は組換え系として知られているものに依存し、この利点は交配による除去が施され得ることである。この種のもっともよく知られた系はＣｒｅ／Ｉｏｘ系として知られているものである。Ｃｒｅ１はｌｏｘＰ配列間に位置する配列を除去するリコンビナーゼである。マーカー遺伝子がｌｏｘＰ配列間に組み込まれる場合、形質転換がリコンビナーゼの発現により首尾良く行われると、このマーカー遺伝子は除去される。さらなる組換え系はＨＩＮ／ＨＩＸ、ＦＬＰ／ＦＲＴおよびＲＥＰ／ＳＴＢ系である（Ｔｒｉｂｂｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、２０００：２２２５５−２２２６７；Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１４９、２０００：５５３−５６６）。本発明に係る核酸配列の植物ゲノム内への部位特異的組み込みが可能である。
【０４５３】
本発明の目的のために、「トランスジェニック」、「導入遺伝子」または「組換え体」は、例えば核酸配列、発現カセット、遺伝子構築物もしくは核酸配列を含むベクターまたは核酸配列で形質転換された生物に関して、本発明に係る発現カセットまたはベクターを意味する。
【０４５４】
それ故、本発明の目的のためのトランスジェニック植物は、上記のように、本発明の方法に使用される核酸（例えば人工遺伝子）が、前記植物のゲノム内に存在しないもしくは前記植物のゲノムに由来しないまたは前記植物のゲノム内に存在するが、前記植物のゲノム内のそれらの天然の遺伝子座に存在せず、核酸が相同的または非相同的に発現されることを可能にすることを意味すると理解される。しかしながら、上述のように、トランスジェニックはまた、本発明に係る核酸または本発明の方法に使用される核酸が植物のゲノム内のそれらの天然の位置に存在するが、配列は天然の配列に関して修飾されており、および／または天然配列の調節配列が修飾されていることを意味する。トランスジェニックは好ましくは、ゲノム内の非天然の遺伝子座における本発明に係る核酸の発現、すなわち核酸の相同発現または非相同発現が起こることを意味すると理解される。好ましいトランスジェニック植物は本明細書に述べられている。
【０４５５】
「発現」または「遺伝子発現」という用語は、特異的遺伝子（複数も含む）または特異的遺伝子構築物の転写を意味する。特に「発現」または「遺伝子発現」という用語は、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡのタンパク質への後の翻訳を有するか有さないかに関わらず、遺伝子（複数も含む）または遺伝子構築物の構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡへの転写を意味する。プロセスはＤＮＡの転写および得られたｍＲＮＡ産物のプロセシングを含む。
【０４５６】
本明細書で使用された場合、「高発現」または「過剰発現」という用語は元の野生型発現レベルに付加的である発現の任意の形態を意味する。本発明の目的のために、元の野生型発現レベルはまた、ゼロであってもよいすなわち発現が存在しなくてもよいまたは測定できない発現であってもよい。
【０４５７】
遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させるための方法は当該技術分野において十分に立証されており、例えば適切なプロモーター（本明細書の以前に記載した）により駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして役立つ単離した核酸が、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現を上方制御するように非相同でない形態のポリヌクレオチドの適切な位置（典型的に上流）に導入されてもよい。ポリペプチド発現が所望される場合、一般にポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含むことが望まれる。ポリアデニル化領域は、天然遺伝子由来、様々な他の植物遺伝子由来またはＴ−ＤＮＡ由来であってもよい。付加される３’末端配列は、例えばノパリンシンターゼもしくはオクトピンシンターゼ遺伝子由来であってもよいまたは代替として別の植物遺伝子由来であってもよいまたはあまり好ましくないが任意の他の真核性遺伝子由来であってもよい。イントロン配列もまた、サイトゾルに蓄積する成熟メッセージの量を増加させるために５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または部分的コード配列のコード配列に付加されてもよい。植物および動物の両方の発現構築物における転写単位内へのスプライス可能なイントロンの包含は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方で１０００倍までのレベルまで遺伝子発現を増加させることが示されている（ＢｕｃｈｍａｎおよびＢｅｒｇ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５；Ｃａｌｌｉｓら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：１１８３−１２００）。遺伝子発現のこのようなイントロン増大は典型的に、転写単位の５’末端に近接して配置される場合、最大になる。トウモロコシイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２および６、ブロンズ（Ｂｒｏｎｚｅ）−１イントロンの使用は当該技術分野において公知である。一般的な情報に関して、Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １  １６，ＦｒｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。
【０４５８】
「導入」または「形質転換」という用語は、本明細書で述べられた場合、転移のために使用した方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞内への転移を包含する。器官形成によるか胚形成によるかに関わらず、後でクローン増殖できる植物組織は、本発明の遺伝子構築物およびこの遺伝子構築物から再生された全植物で形質転換され得る。選択した特定の組織は、形質転換される特定の種に利用可能であり、この形質転換される特定の種に最適であるクローン増殖系に応じて変化する。例示的な組織標的としては、葉、花盤、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば頂端分裂組織、腋芽および根分裂組織）、誘導性分裂組織（例えば子葉分裂組織および胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは宿主細胞内に一過的または安定的に導入されてもよく、例えばプラスミドとして組み込まれずに維持されてもよい。代替として、ポリヌクレオチドは宿主ゲノム内に組み込まれてもよい。次いで、得られた形質転換植物細胞は当業者に公知の方法で形質転換植物を再生するために使用されてもよい。
【０４５９】
外来遺伝子の植物のゲノム内への転移は形質転換と呼ばれる。植物種の形質転換は現在、かなり慣用の技術である。有益には、いくつかの形質転換法のいずれかが目的の遺伝子を適切な原細胞内に導入するために使用されてもよい。植物組織または植物細胞からの植物の形質転換および再生について記載した方法は一過的形質転換または安定的形質転換のために利用されてもよい。形質転換法は、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ取り込みを増加させる化学物質、植物内へのＤＮＡの直接注入、粒子ガン衝撃、ウイルスまたは花粉を使用する形質転換およびマイクロプロジェクションの使用を含む。方法は、プロトプラストについてのカルシウム／ポリエチレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６、７２−７４；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  Ｉら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８：３６３−３７３）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  Ｒ．Ｄ．ら（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  ３、１０９９−１１０２）、植物材料内へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  Ａら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２０２：１７９−１８５）、ＤＮＡまたはＲＮＡ被覆粒子衝撃（Ｋｌｅｉｎ  ＴＭら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０）、（非組み込みの）ウイルスによる感染などから選択されてもよい。トランスジェニック作物を含むトランスジェニック植物は好ましくは、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換により産生される。有益な形質転換法は植物体における形質転換である。この目的を達成するために、例えばアグロバクテリウムを植物種子に対して作用させるまたは植物分裂組織にアグロバクテリウムを接種することが可能である。本発明に従い、形質転換したアグロバクテリウムの懸濁液をインタクトな植物または少なくとも花原基に作用させることが特に役立つことが証明されている。
【０４６０】
植物は、処理した植物の種子が得られるまで続けて成長させる。（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９８）１６、７３５−７４３）。コメのアグロバクテリウム属媒介形質転換の方法は、下記のいずれかに記載の方法などの、コメの形質転換の周知の方法を含む：欧州特許出願ＥＰ１１９８９８５、ＡｌｄｅｍｉｔａおよびＨｏｄｇｅｓ（Ｐｌａｎｔａ  １９９：６１２−６１７、１９９６）；Ｃｈａｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２（３）：４９１−５０６、１９９３）、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ６（２）：２７１−２８２、１９９４）、これらの開示は完全に説明されたかのように参照により本明細書に組み込まれる。トウモロコシの形質転換の場合、好ましい方法は、Ｉｓｈｉｄａら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（６）：７４５−５０、１９９６）またはＦｒａｍｅら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２９（１）：１３−２２、２００２）のいずれかに記載の方法であり、これらの開示は完全に説明されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。前記方法は、Ｂ．Ｊｅｎｅｓら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．１、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｓ．Ｄ．ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）１２８−１４３およびＰｏｔｒｙｋｕｓ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）２０５−２２５）に例としてさらに記載されている。発現される核酸または構築体は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンシスの形質転換に適切なベクター、例えば、ｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎら（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２−８７１１）内にクローニングされる。このようなベクターにより形質転換されたアグロバクテリアは、その後、シロイヌナズナのようなモデルとして使用される植物などの植物、例としてタバコ植物などの作物の形質転換のための公知の様式に、例えば、傷ついた葉または刻んだ葉をアグロバクテリアの溶液に浸し、その後それらを適切な培地において培養することによって使用できる。アグロバクテリウム・ツメファシエンシスを用いた植物の形質転換が、例えば、ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒによるＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６、９８７７により記載され、または特に、Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．１、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｓ．Ｄ．ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３、１５−３８頁により公知である。
【０４６１】
その後、無傷の植物に再生されなければならない体細胞の形質転換に加えて、植物分裂組織の細胞、特に配偶子に生育するそれらの細胞もまた形質転換できる。この場合、形質転換された配偶子は天然の植物の生育をたどり、トランスジェニック植物を生じる。それ故、例えば、シロイヌナズナの種子をアグロバクテリアを用いて処理し、種子が、特定の部分が形質転換された、したがってトランスジェニックな生育中の植物から得られる［Ｆｅｌｄｍａｎ，ＫＡおよびＭａｒｋｓ  ＭＤ（１９８７）．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２０８：１−９；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｋ（１９９２）．Ｃ  Ｋｏｎｃｚ、Ｎ−Ｈ  ＣｈｕａおよびＪ  Ｓｈｅｌｌ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ、２７４−２８９頁］。代替の方法は、花序の反復除去およびロゼットの中心の切除部位と形質転換されたアグロバクテリアとのインキュベーションに基づき、それによって、形質転換された種子を同様にのちの時点で得ることができる（Ｃｈａｎｇ（１９９４）．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：５５１−５５８；Ｋａｔａｖｉｃ（１９９４）．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２４５：３６３−３７０）。しかし、特に有効な方法は、減圧浸潤法および「フローラルディップ」法などのその変形である。シロイヌナズナの減圧浸潤の場合、減圧下で無傷の植物をアグロバクテリアの懸濁液を用いて処理し［Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ，Ｎ（１９９３）．ＣＲ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｐａｒｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、３１６：１１９４−１１９９］、一方、「フローラルディップ」法の場合、生育中の花の組織を、界面活性剤により処理されたアグロバクテリアの懸濁液と一緒に少しの間インキュベートする［Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪおよびＢｅｎｔ  ＡＦ（１９９８）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６、７３５−７４３］。両方の場合に、トランスジェニック種子の特定の集団を収穫し、これらの種子は、上記の選択的条件下で成長した非トランスジェニック種子とは識別可能である。加えて、母方から遺伝する色素体は、大部分の作物において導入遺伝子が花粉に流入する危険性を減少または排除するので、色素体の安定した形質転換が有利である。葉緑体ゲノムの形質転換は、概して、Ｋｌａｕｓら、２００４［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（２）、２２５−２２９］に概略的に表示されている方法によって達成される。簡潔に言うと、形質転換される配列を、葉緑体ゲノムに相同な隣接配列の間に、選択可能なマーカー遺伝子と一緒に、クローニングする。これらの相同な隣接配列は、プラストーム内に部位特異的統合に向かう。色素体の形質転換は、多数の様々な植物種に関して記載されており、概要は、Ｂｏｃｋ（２００１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｓｔｉｄｓ  ｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｓｅｐ２１；３１２（３）：４２５−３８またはＭａｌｉｇａ，Ｐ（２００３）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１、２０−２８に示されている。さらなるバイオテクノロジーの進歩が、無マーカー色素体形質転換体の形態で近年報告されており、これらは一時的に共組込みされたマーカー遺伝子により作製できる（Ｋｌａｕｓら、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（２）、２２５−２２９）。
【０４６２】
遺伝子組換え植物細胞は、技術者によく知られたすべての方法を介して再生できる。適切な方法は、Ｓ．Ｄ．ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ、ＰｏｔｒｙｋｕｓまたはＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒによる上記の刊行物に見出すことができる。
【０４６３】
概して形質転換後、植物細胞または細胞のグループは、対象となる遺伝子とともに同時移入される、植物の発現可能な遺伝子によりコードされる、一種以上のマーカーの存在に関して選択され、その後、形質転換された材料を植物全体に再生する。形質転換植物の選択のために、形質転換により得られた植物材料は一般に、形質転換された植物が、非形質転換植物と識別できるような選択条件に供される。例えば、上記の様式において得られた種子を植え付け、初期成長期間後、スプレーによる適切な選択に供することができる。さらなる可能性は、滅菌後適切な場合、形質転換された種子だけが植物に成長できるように、適切な選択剤を使用して寒天プレート上で種子を成長させることにある。代替として、形質転換された植物を、上記の一種などの選択可能なマーカーの存在に関してスクリーニングする。
【０４６４】
ＤＮＡの転移および再生後、推定上形質転換された植物を、例えば、サザン分析を使用して、対象となる遺伝子の存在、コピー数および／またはゲノムの組織化に関してさらに評価することができる。代替的にはまたは追加的に、新しく導入されたＤＮＡの発現レベルはノーザン分析および／またウエスタン分析を使用してモニターすることができ、双方とも当業者に周知の技術である。
【０４６５】
作製された形質転換植物は、クローン増殖または伝統的な育種技術などの様々な手段により繁殖させることができる。例えば、第１世代（またはＴ１）形質転換植物は自家受粉でき、ホモ接合性の第２世代（またはＴ２）形質転換体を選択し、Ｔ２植物は、その後伝統的な育種技術を介してさらに繁殖させることができる。作製された形質転換生物は、様々な形態をとり得る。例えば、これらは、形質転換細胞および非形質転換細胞のキメラ、クローン性形質転換体（例えば、発現カセットを含有するように形質転換されたすべての細胞）、形質転換組織および非形質転換組織のグラフト（例えば、植物において、非形質転換の接ぎ穂にグラフトされた形質転換された根茎）であってもよい。
【０４６６】
適切な対照植物の選択は実験設定の慣用の部分であり、目的の遺伝子を有さない対応する野生型植物または対応する植物を含んでもよい。対照植物は典型的に同じ植物種またはさらにアッセイされる植物と同じ種類である。対照植物はまた、アッセイされる植物の無接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ）であってもよい。無接合体は分離により導入遺伝子を欠く個体である。本明細書で使用された場合、「対照植物」とは、全植物だけでなく、種子および種子部分を含む、植物部分も指す。
【０４６７】
「発現カセット」という用語は、植物細胞に加えて、原核生物、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物細胞を含む任意の細胞中で、インビトロまたはインビボで構造的または誘導的に本発明の核酸配列を発現する目的のための任意の組換え発現系を指す。この用語は線形発現系および環状発現系を含む。この用語はすべてのベクターを含む。カセットはエピソームを維持してもよいまたは宿主細胞ゲノム内に組み込んでもよい。発現カセットは自己複製能力を有してもよいまたは有さなくてもよい（すなわち細胞中で一過性発現のみを駆動する）。この用語は組換え核酸の転写に必要とされる最小エレメントのみを含有する組換え発現カセットを含む。
【０４６８】
代替の実施形態によれば、分子は導入遺伝子としてではなく、それ自体で植物に投与される。植物は消化系を有さないので、本明細書で、投与するという用語は特にまた、分子の局所適用（植物中というよりむしろ植物上に分子を提供する）または間接投与経路（例えば、土壌中に分子を提供し、それによりこれらの分子は植物の根により吸収され得る）も想定する。この投与経路は植物感染に対処するのに特に適しているが、これはまた、植物タンパク質を下方調節するのにも適用されてもよい。
【０４６９】
分子は農薬としてそれ自体で提供されてもよい。しかしながら、典型的に、植物に使用するための分子（またはこれらの分子をコードする核酸）は、（医薬として許容される担体というよりむしろ）農学的に許容される担体と一緒に組成物として提供されてもよい。「農学的に許容される担体」とは、植物、植物種子、植物細胞または植物プロトプラストへのインターフェラー分子の局所または全身投与に安全に使用され得る固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。農芸化学的に許容される担体と併用した本明細書に記載した植物に適用するための分子はまた、農薬製剤または農薬組成物と称される。本明細書で使用された場合、「農薬製剤」とは、場合によって農薬の最適分散、噴霧化、葉湿潤、分布、保持および／または摂取に好都合な１種以上の添加剤と共に有効成分（すなわち、少なくとも、本明細書に記載された分子）を含む、農業使用または園芸使用のための組成物を意味する。非限定的な例として、このような添加剤は、希釈剤、溶媒、補助剤、界面活性剤、湿潤剤、展着剤、油、粘着剤、浸透剤、緩衝剤、酸性化剤、消泡剤またはドリフト抑制剤である。本明細書で使用された場合、「農薬」は、化合物またはすぐに使える化合物製剤だけでなく、外部因子により活性化され得る、不活性形態の前駆体も含む。非限定的な例として、前駆体は、虫害による植物創傷により引き起こされたｐＨ変化により、真菌の攻撃により引き起こされた酵素作用によりまたは温度変化もしくは湿度変化により活性化されてもよい。本明細書で使用された場合、農薬は、農作物（農業）における使用に適しているおよび／または農作物（農業）における使用を目的とする薬剤（例えば殺虫剤、成長調節剤、栄養剤／肥料、忌避剤、枯れ葉剤など）を含むだけでなく、温室作物（園芸／草花栽培）における使用を意図する薬剤（例えば殺虫剤、成長調節剤、栄養剤／肥料、忌避剤、枯れ葉剤など）ならびにさらに個人庭園における使用、家庭での使用（例えば家庭での使用のための除草剤または殺虫剤）、有害生物防除作業者（例えば雑草防除など）による使用などの非作物での使用に適しているおよび／またはこれらの使用を目的とする薬剤もまた含む。好ましくは、前記農薬または農薬の組合せは、除草剤（例えば雑草のタンパク質に向けられたＹｉ領域を有する分子）、殺虫剤（例えば昆虫のタンパク質に向けられたＹｉ領域を有する分子）、殺菌剤（例えばカビのタンパク質に向けられたＹｉ領域を有する分子）、殺線虫剤（例えば線虫のタンパク質に向けられたＹｉ領域を有する分子）、殺生物剤（例えば病原体のタンパク質に向けられたＹｉ領域を有する分子）または植物成長調節化合物（例えば分子が投与される植物のタンパク質に向けられたＹｉ領域を有する分子）からなる群から選択される。追加の有効成分（本明細書に記載された分子ではない）は特に、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、微量栄養素または植物成長調節化合物から選択される。特に、本発明のこのような農薬組成物は、１種以上の農薬が適切にはカプセル化され、封入され、埋め込まれ、組み込まれまたはそうでなければ含まれている、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、リポソームまたはベシクルなどと、前記結合部位に存在するもしくは前記結合部位中に存在する１種以上の抗原に結合するための１種以上の結合ドメインを各々含むまたは植物もしくは植物の葉、茎、花、果実、球根もしくは塊茎など）の植物の部分上に前記１種以上の結合部位を形成する１種以上の標的剤とを含んでもよい。担体に結合した、連結したもしくはそうでなければ付着したまたは担体と会合した１種以上の標的剤を有する担体は、保存されてもよく、例えば噴霧、注入、滴下、ブラッシング、滴下被覆または任意の他の適切な技術によって、（必要な場合、さらなる希釈後に）植物、１種以上の植物の部分（葉、茎、根、果実、球果、花、球根または塊茎など）または植物の周囲（例えば植物が成長する土壌）に適用されてもよい（濃縮）溶液、懸濁液、分散系またはエマルションを提供するように、適切な液体媒体（水または別の水媒体、有機媒体または油性媒体など）中に溶解されてもよく、乳化されてもよく、懸濁されてもよくもしくは分散されてもよくまたはそうでなければ含まれてもよい。そのうえで、組成物は、好ましくは標的とされた方法でこの組成物に含まれる標的剤（複数も含む）の部分を形成する１種以上の結合ドメインを介して、結合部位において結合できるまたは結合部位（または前記結合部位に存在するもしくは前記結合部位中に存在する１種以上の抗原またはトリコーム、気孔、表皮、皮目、刺、針またはワックス層などの前記結合部位を形成する１種以上の抗原）に結合できる。そのうえで、農薬はこれらが所望の農薬作用（複数も含む）を提供できるように、（例えば担体の分解またはマイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、リポソームまたはベシクルなどの壁を通る受動輸送に起因して）担体から放出される。担体の使用に対する代替として、農薬または農薬の組合せもまた、標的剤が連結されているまたは結合できる適切な被覆または（外側）層が提供されている（小さな）粒子の形態で提供されてもよく、これはさらに、粒子の物理的完全性または安定性を安定化または改善するのにも役立つことができる。別の代替として、農薬または農薬の組合せは適切には、標的剤が連結されているまたは結合できる賦形剤または結合剤と混合されてもよく、これはさらに、粒子の物理的完全性または安定性を安定化または改善するのにも役立つことができる。このような被覆された粒子または複合粒子は好ましくはスラリー、湿潤ケーキまたは遊離流動性の粉末、錠剤、カプセルもしくは液体濃縮物（エマルション、懸濁剤、分散剤など）の形態である。
【０４７０】
特定の実施形態、特定の構造ならびに材料および／または分子が本発明に係る細胞および方法のために本明細書で説明されたが、形態および詳細の種々の変化または修飾が本発明の範囲および精神から逸脱せずになされてもよいことが理解される。以下の実施例は特定の実施形態をよりよく示すために提供され、これらは本出願を限定すると見なされるべきではない。本出願は特許請求の範囲のみにより限定される。
【実施例】
【０４７１】
以下の実施例において、インターフェラー技術の異なる応用が強調される。感染症の治療における本発明の分子の有用性は、抗真菌、抗菌および抗ウイルス応用に関連する、それぞれ実施例１から３に例証されている。実施例１は、バイオフィルムの成長がどのように治療または予防され得るかについて詳述し、また、酵母におけるストレス耐性の下方調節を示す。実施例２は、哺乳動物細胞に対して毒性ではないが、抗生物質耐性種を含む複数の細菌種を効率的に死滅することができることを示す。さらに、実施例２は、感染症を治療するためのペプチドのインビボ投与の実施可能性を示す。実施例３は、異なるインフルエンザウイルスタンパク質に対して指向されたインターフェラー分子の同定を特徴付ける。
【０４７２】
本発明の分子がタンパク質（細菌タンパク質からヒトタンパク質までの範囲）の検出に使用することができる異なる方法、およびこれが複雑な試料中のバイオマーカーを検出することによって、どのように疾患の診断に適用し得るかを実施例４に示す。
【０４７３】
実施例５は、癌およびＡＭＤに関与する２つの周知の受容体チロシンキナーゼの特異的凝集を示すことによって、非感染性疾患への応用を詳述する。また、本明細書に記載されているインターフェラー分子を用いて免疫機能を調節する概念も示される。
【０４７４】
最後に、実施例６は、本発明の分子がまた、植物におけるタンパク質の下方調節を達成するために適用され得ることを示す。
【０４７５】
１．抗真菌応用
１．１  導入
カンジダ・アルビカンスは、正常なヒト微生物叢の一部を形成し、これは健常者の粘膜表面上で増殖する。感受性宿主において、この真菌生物は粘膜と血行性播種疾患の両方を引き起こす可能性がある。宿主に固着し、疾患を誘導するＣ．アルビカンスに関して、これは、生物および非生物表面に接着し、宿主細胞に浸潤し、鉄を得ることができなければならない。Ｃ．アルビカンスの菌糸特異的表面タンパク質Ａｌｓ３は、タンパク質の凝集素様配列（Ａｌｓ）ファミリーのメンバーであり、これらのプロセスのすべてにおいて重要である（Ｈｏｙｅｒ  ＬＬら、（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３３（６）：４５１−９）およびＬｉｕ  Ｙら、（２０１１）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ．１０（２）：１６８−７３）。接着因子としての機能に関して、Ａｌｓ３は、上皮細胞、内皮細胞および細胞外マトリックスタンパク質への接着を媒介する。また、それは人工装具表面上のバイオフィルム形成に重要な役割を果たす。Ａｌｓ３は、２つの既知のＣ．アルビカンスのインベイシン（ｉｎｖａｓｉｎ）の一つである。それはＥ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンなどの宿主細胞受容体に結合し、それによって生物を取り込むように宿主細胞を誘導する。また、Ａｌｓ３は、宿主細胞のフェリチンに結合し、Ｃ．アルビカンスが鉄供給源としてこのタンパク質を利用できるようにする。その複数の機能およびインビボでのその高い発現レベルのため、Ａｌｓ３はカンジダ感染症と闘う有望な標的として考えられている。本実施例において、本発明者らは、本発明の製造物および方法をＡｌｓ３タンパク質を具体的に標的とするように適用した。
【０４７６】
１．２  特異的Ａｌｓ３インターフェラーの細胞内発現
β−凝集予測アルゴリズムＴＡＮＧＯを用いて、高凝集形成能を有する配列として、Ａｌｓ３（配列番号２に示される）に由来する配列ＬＱＱＹＴＬＬＬＩＹＬＳＶＡＴＡＫ（配列番号１）を同定した。この１７個のアミノ酸残基（配列番号１）は、配列番号２のアミノ酸２−１８に対応し、細胞内のインターフェラー構築物におけるベイト（ｂａｉｔ）配列として採用された。ＱＱおよびＫは、天然のゲートキーパー（ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ）残基（Ｘ１およびＸ２部分）として作用し、ＹＴＬＬＬＩＹＬＳＶＡＴＡ（配列番号１０７）は、この場合のＹ１領域である。配列番号１をコードするＤＮＡ配列は、Ｃ．アルビカンスに最適化されたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子およびポリリンカー配列とフレームを合わせられ、さらに凝集因子ブースター（ａｇｇｒｅｇａｔｏｒ  ｂｏｏｓｔｅｒ）およびＨＡタグをコードするＤＮＡ配列に遺伝子組換え的に結合させたＣ．アルビカンス発現ベクターｐＰＣＫ１−ＧＦＰ（Ｂａｒｅｌｌｅら、（２００４）Ｙｅａｓｔ  ２１（４）：３３３−４０）にクローニングされた。このいわゆるブースター配列（ＲＫＬＬＦＮＬ（配列番号６８））は、凝集する高い傾向を有する人工配列である。配列ＲＫＬＬＦＮＬ（配列番号６８）は、ＤｎａＫ結合を示し、シグマ因子３２（ＭｃＣａｒｔｙ  Ｊ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５６，８２９−８３７参照）由来の適合配列（野生型配列はＲＫＬＦＦＮＬ（配列番号６９）である。）である。完全な融合構築物の発現は、ＰＣＫ１プロモーターの制御下にあった。ＰＣＫ１遺伝子は、グルコースによって抑制され、酸またはコハク酸などの糖新生の炭素源によってＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする（Ｌｅｕｋｅｒら、（１９９７）Ｇｅｎｅ  １９２：２３５−２４０）。
【０４７７】
配列番号２：カンジダ・アルビカンスのＡｌｓ３のアミノ酸配列
【０４７８】
【化１】
2014514917.tif 000002
【０４７９】
プラスミドは、発現カセットを含み、Ｃ．アルビカンスＣＡＩ４株（ＦｏｎｚｉおよびＩｒｗｉｎ（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４：７１７−７２８）の形質転換前にＲＰＳ１０遺伝子座で線状化された。形質転換体を生成し、発現カセットを含むことをＰＣＲ分析によって確認した。３つの独立した形質転換体ＡＦＡ１６ａ、ＡＦＡ１６ｂとＡＦＡ１６ｃ（ＧＦＰ＋ブースター＋ベイト配列を発現する）を後の実験に使用した。陰性対照として、同じプラスミドを含むが、特定のベイト配列を欠損している組換え体を用いた。これは、対照菌株ＡＦＡ１５ａ（ＧＦＰ＋ブースターを発現する）をもたらした。ベイトペプチドの局在化を特定するためにＧＦＰ発現を用いた。すべての菌株は、抑制条件下で一晩増殖させた。次に、細胞は、４％Ｄ−グルコースが補足されたＹＮＢ培地（ｐＨ６．５）（プロモーター抑制条件）またはカザミノ酸が補足された同培地（プロモーター誘導条件）に移された。本発明者らは、１時間、２時間、３時間および５時間後にＧＦＰ蛍光アッセイを介してインターフェラー構築物の発現を追跡した。抑制条件下では、ＧＦＰ蛍光を検出することができなかった（データ示さず）。
【０４８０】
Ｃ．アルビカンスＡＦＡ１５ａは、細胞コンパートメント内の直接的な局在化というよりはむしろ、細胞内の拡散したＧＦＰシグナルの存在を示した。しかしながら、インターフェラー構築物を含む組換えＣ．アルビカンス株は、細胞質ゾル内の抗Ａｌｓ３タンパク質凝集体として特定される断続的な遺伝子座を示した。この現象は、誘導から既に２時間後に示され、後の時間点内で増えた。経時的に、点の量が細胞あたり１から３個の範囲で増加した。後の時間点は、焦点の同じ比率を示し、５時間後に得られたものと同様であった（データを示さず）。これは、短いインターフェラーベイト配列の存在が凝集の誘導を引き起こすことを示した。
【０４８１】
１．２．１  インビトロにおけるバイオフィルム形成
Ａｌｓ３は接着およびバイオフィルム形成に重要であることが知られているため、本発明者らはまた、インビトロで行われたバイオフィルム実験において組換え株を用いた。出発の仮説は、インターフェラー構築物を発現するＣ．アルビカンス株が、Ｃ．アルビカンスＡＬＳ３欠失変異体を用いて得られたものと比較して、接着およびバイオフィルム形成において類似した表現型を有するということであった。インターフェラーを発現する組換え株は、シリコーンの正方形ディスク上でインビトロでのバイオフィルムを形成するそれらの能力について試験された。成熟バイオフィルム（４８時間）は、炭素源としてのコハク酸または４％Ｄ−グルコースのいずれかを用いて、ＹＮＢ（ｐＨ６．５）における増殖後に得られた。その後、蛍光顕微鏡によりバイオフィルムアーキテクチャを評価した。Ｃ．アルビカンスＡＦＡ１５ａは４８時間以内に増殖し、誘導条件または抑制条件における増殖とは独立して、シリコーン表面全体にわたって、堅牢な接着と成熟バイオフィルムのアーキテクチャをもたらすことが観察された。重要なことには、Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４（野生型Ｃ．アルビカンス、Ｇｉｌｌｕｍら、（１９８４）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９８：１７９−１８２によって参照される）は、ＡＦＡ１５ａと同等な成熟バイオフィルムを生成させた（データを示さず）。他方、Ａｌｓ３インターフェラー構築物の発現誘導は、いずれの接着細胞も含まない黒色の領域によって特徴付けられる、接着およびバイオフィルム形成の強力な減少をもたらした。このような未発達なバイオフィルム生成は、ホモ接合Ａｌｓ３変異体Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δによって生じたものに類似している。ＹＮＢ、４％Ｄ−グルコースにおいて増殖された場合、３つすべての独立した形質転換体は、ＡＦＡ１５ａと同種の成熟バイオフィルムを形成することができた。蛍光顕微鏡に加えて、バイオフィルムはコロニー形成単位（ＣＦＵ）により定量された。データを図３に示す。
【０４８２】
バイオフィルムの定量は、ＧＦＰ蛍光顕微鏡から得られた観察と明確に一致していた。期待されたように、対照株（Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４およびＡＦＡ１５ａ）は、２つの増殖条件下で成熟バイオフィルムを生成した。対照的に、Ｃ．アルビカンスＡｌｓ３のインターフェラーを発現する組換え体は、野生型菌株と比較して、バイオフィルムを有意に形成しなかった（ｐ＜０．００１）（ほぼ８０％阻害が観察された。）。一方、抑制条件下で増殖させた場合、これらはその機能を獲得し、対照菌株と同様のバイオフィルムを生成した（ほぼ１００％のバイオフィルム形成）。これらの結果は、Ａｌｓ３の誘導されたタンパク質凝集がこの機能の喪失をもたらし、インターフェラーを発現する組換え体がＣ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δ株で得られたものと同様の表現型を有するという事実を支持する。
【０４８３】
１．２．２  ヒト上皮細胞の接着および浸潤
接着において役割を有することに加えて、Ａｌｓ３はまたヒト上皮細胞および内皮細胞の浸潤に関与している。したがって、次の段階において、本発明者らは、Ｃ．アルビカンス対照株（ＳＣ５３１４およびＡＦＡ１５ａ）のヒト上皮細胞に接着および浸潤する組換えＣ．アルビカンス株の能力を研究し、インターフェラー（ＡＦＡ１６ａ、ＡＦＡ１６ｂおよびＡＦＡ１６ｃ）を発現する組換え菌株を誘導／抑制条件において一晩増殖させた。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δを対照として用いた。カンジダと上皮細胞の接触は１時間後に評価され、一方、浸潤は３時間後にモニターされた。接着および浸潤した真菌細胞の割合を図４ＡおよびＢに示す。
【０４８４】
Ａｌｓ３のインターフェラー構築物を発現するカンジダ・アルビカンス株の上皮細胞株ＴＲ−１４６に接着（Ａ）および浸潤（Ｂ）する能力。菌株は、コハク酸塩が補足されたＹＮＢ（ｐＨ６．５）（白色バー）または４％Ｄ−グルコースが補足されたＹＮＢ（ｐＨ６．５）（黒色バー）において一晩インキュベートされた。両方のアッセイは、ＮａＨＣＯ３、Ｄ−グルコース、ピルビン酸Ｎａおよびグルタミンを含む、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ中で行われた。接着は１時間、一方、浸潤は３時間、ともに３７℃にて５％ＣＯ２で行われた。接着したカンジダ細胞は、カルコフルオールホワイトで染色され、接着した細胞の割合は、カバースリップの表面全体にわたって広がった１００領域の接着したカンジダ細胞の平均として計算された。Ｃ．アルビカンス細胞を浸潤する割合は、接着細胞の総数で内在化された細胞数を除することによって決定された。少なくとも１００個の真菌細胞は、各カバースリップ上でカウントされた。Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４を対照株（１００％）として用い、Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δを陰性対照として用いた。対照と比較した、インターフェラー構築物を発現する菌株の上皮細胞に対する接着／浸潤間の有意な差は、ｐ＜０．００１（＊）によって決定された。標準偏差は、２つの独立した実験から計算された。
【０４８５】
Ｃ．アルビカンスにおけるＡｌｓ３特異的インターフェラーの誘導は、図４Ａに示すように、４０％から５０％の範囲で上皮細胞への接着減少へと導いた。この差は統計学的に有意である（ｐ＜０．００１）。組換え株のＡＦＡ１６ａがａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δと同じ低レベルで接着したことは特筆すべきである（図３Ａ参照）。期待されるように、抑制条件下で増殖された組換え体（すなわちＡｌｓ３タンパク質インターフェラーは生成されない）は、対照菌株と同様に挙動した。ＡＦＡ１５ａ株は、使用された条件とは無関係に、Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４と匹敵する接着能を示した。次に、Ａｌｓ３インターフェラー構築物を担持する組換え体は、誘導条件において増殖させた場合、約４０％の浸潤の減少を示し、一方、抑制条件において増殖させた場合、それらの機能を獲得した（図４Ｂ参照）。期待したように、Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは、上皮細胞に浸潤しなかった（ｐ＜０．００１）。
【０４８６】
本実施例において、本発明者らは、組換え手法が、対象とする特定のタンパク質の標的化されたタンパク質凝集を研究するためにさらに用いることができる信頼性のあるシステムであることを示す。
【０４８７】
１．３  Ｃ．アルビカンスへのＡｌｓ３インターフェラーペプチドの外的応用は接着およびバイオフィルム形成を減少する
Ａｌｓ３タンパク質は細胞壁に局在化しているため、本発明者らは、カンジダ細胞へのＡｌｓ３特異的インターフェラーの外的応用によって特異的Ａｌｓ３凝集を誘導する可能性を調べた。組換え発現カセット（ＹＴＬＬＬＩＹＬＳＶ（配列番号７０））に使用される配列に加えて、ＴＡＮＧＯアルゴリズムは、Ａｌｓ３において強力な凝集傾向を有する追加のアミノ酸配列を明らかにした。このようにして、またノナペプチドＮＧＩＶＩＶＡＴＴ（配列番号７１）およびペプチドＴＷＬＣＧＬＩＴＬＬＳＬＦ（配列番号７２）は、高い凝集能（５０％から９９％の凝集傾向の範囲）を有することが予期された。これらのＴＡＮＧＯ配列のいくつ誘導体を設計、合成および試験した。表１は、使用された２３種のペプチドを示す。
【０４８８】
本出願において提案されている一般式に言及することによって分子の設計を明確にするために、Ｅ１およびＥ２は、ｎ＝１である分子である。Ｅ１について、Ｘ１およびＸ２はそれぞれアルギニン残基であり、Ｙ１はＡｌｓ３タンパク質に存在する一続きの９残基であり、Ｚ１は存在しない。これは、同等に、Ｘ１がＲＮＧであり、Ｘ２はＲであり、Ｙ１はＡｌｓ３タンパク質に存在する連続したヘプタペプチド配列であるものとして記載し得ることに留意されたい。しかしながら、ＮＧがＡｌｓ３配列（配列番号２参照）における隣接残基であり、ノナペプチドはＹｉストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）の要件を満たすため、前者の表記法が好ましい。Ｅ２について、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＫであり、Ｙ１はＡｌｓ３タンパク質に存在する一続きの１６残基であり、Ｚ１は存在しない。
【０４８９】
Ｆ９はｎ＝２である分子である。Ｘ１はＲＫであり、Ｘ２はＧであり、Ｙ１は合成配列であり、Ｚ１はＳであり、Ｘ３およびＸ４はそれぞれのアルギニン残基であり、Ｙ２はＡｌｓ３タンパク質に存在する一続きの９残基であり、Ｚ２は存在しない（すなわち、この分子の第二の部分はＥ１と同一である。）。この分子において、Ｘ１およびＹ１は一緒に、高い凝集傾向を有するシグマ因子３２（ＭｃＣａｒｔｙ  Ｊ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５６，８２９−８３７参照）由来の人工的な配列を形成することに留意されたい。
【０４９０】
次の２０個のペプチドはすべて、ｎ＝２である類似した設計を有し、すべてのＸ部分は単一残基であり、Ｙ１およびＹ２はともにＡｌｓ３タンパク質に生じる配列であり、Ｚ１はＧＳリンカーであり、Ｚ２は存在しない。
【０４９１】
【表１】
2014514917.tif 000003
2014514917.tif 000004
【０４９２】
最適なＡｌｓ３候補インターフェラーについての最初のスクリーニングおよび探索は、３種の濃度（２５０μＭ、５０μＭおよび１０μＭ）で全ペプチドの投与による、９６ウェルのポリスチレンプレート上のＣ．アルビカンスＳＣ５３１４接着アッセイに基づいていた。この接着アッセイを用いて得られた結果に基づいて、本発明者らはまた、成熟バイオフィルム生成におけるペプチドの効果を試験した。最適候補のインターフェラーペプチ
ドの最終的な選択は、試験されたペプチドの最低濃度（１０μＭまたは２．５μＭ）によ
って引き起こされた接着および成熟バイオフィルム形成の減少を示す結果に基づいていた。３つの適切なインターフェラーペプチドの例を図５Ａおよび５Ｂに示す。
【０４９３】
試験された２３種のペプチドインターフェラーのうち、ペプチドＦ９は、非常に低い濃度を用いたときでさえ、インビトロで成熟バイオフィルム生成に対して最良の活性を示した（ｐ＜０．００１）（図５を参照）。図５に示されたデータに基づいて、ペプチドＦ９（ＲＫＬＬＦＮＬＧＳＲＮＧＩＶＩＶＡＴＴＲ（配列番号９））をさらなる実験のために選択した。ペプチドＦ９の主な凝集因子配列は、高い凝集能を有するＮＧＩＶＩＶＡＴＴ（配列番号７１）である。ペプチドＦ９とは別に、ペプチドＥ１（ＲＮＧＩＶＩＶＡＴＴＲ（配列番号７））もまた、より高い濃度（２５０μＭおよび５０μＭ）を用いた場合、インビトロで成熟バイオフィルムの生成に対して有意な活性を明確にした。
【０４９４】
１．３．１  接着およびバイオフィルム生成におけるインターフェラーＦ９の最適濃度の決定
最初の結果（図５参照）は、最初のスクリーニング条件（２５０μＭ、５０μＭ、１０μＭ）で使用したとき、インビトロでの成熟Ｃ．アルビカンスのバイオフィルムに対してインターフェラーペプチドＦ９の有望な活性を示した。次の段階において、ペプチドＦ９の低濃度（５０μＭ、１０μＭおよび２．５μＭ）もまた試験された。最初に、本発明者らは、接着期間（３７℃にて９０分）中にペプチドＦ９の効果を解明した。その後、本発明者らは、４８時間、ペプチドの非存在下で、新鮮なＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳで培地を交換することによって、さらなるバイオフィルム生成においてその効果を試験した。両方のアッセイは、９６ウェルのポリスチレンプレートで行われ、ＸＴＴ還元アッセイによって定量された（材料および方法の節を参照）。結果を図６ＡおよびＢに示す。
【０４９５】
図６Ａに示すように、最低濃度（２．５μＭ）のインターフェラーペプチドＦ９でさえ、既にカンジダ細胞の接着性を大幅に減少させた（ｐ＜０．００１）。さらに、より高い濃度のインターフェラーペプチドＦ９（５０μＭおよび１０μＭ）は、ほぼ完全にカンジダの接着を無効にした。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δを対照として用いた。驚くべきことに、ＡＬＳ３ノックアウト菌株は、Ｆ９インターフェラーペプチド処理された野生型細胞よりも良好な接着性を依然として示すことが分かった。可能な機構に限定されず、１つの尤もらしい説明は、インターフェラーペプチドＦ９がＡｌｓ３だけでなく、付加的にカンジダ・アルビカンスのホモロガスＡｌｓ１およびＡｌｓ５タンパク質のベータ凝集を引き起こすということであり得る。
【０４９６】
図５Ｂにおいて上記で示したように、接着を含む、完全なＣ．アルビカンスのバイオフィルム生成中（すなわち、４８時間の期間中）ペプチドＦ９の連続投与は、成熟バイオフィルム形成の強力な減少をもたらした。一方、本明細書において図６Ｂに示したように、Ｃ．アルビカンス細胞は、接着期間中にのみペプチドＦ９で処理されたことを示す。成熟バイオフィルムは、ペプチドを含まない新鮮なＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳ中において形成された。重要なことには、ペプチドインターフェラーＦ９は、Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δ株と同様にバイオフィルムを形成するカンジダ細胞の能力を減少させた。試験された高濃度（５０μＭ）はほぼ９０％のバイオフィルム阻害を引き起こし、一方、低濃度（１０μＭおよび２．５μＭ）は、４０％から５０％のバイオフィルム生成の減少を引き起こした（ｐ＜０．００１）。本発明者らは、インターフェラーペプチドＦ９がＣ．アルビカンスのバイオフィルム生成の２つの異なる実験条件に効率的に干渉することができたと結論付けている。
【０４９７】
次の段階において、本発明者らはまた、インビボでＣ．アルビカンスのバイオフィルム生成中にインターフェラーペプチドＦ９の潜在的な阻害的役割を調べた。本発明者らは、材料および方法の節においてさらに概説したように、ラットにおけるインビボでの皮下のＣ．アルビカンスのバイオフィルムモデル（すなわち、ポリウレタンの３重ルーメンカテーテル片内に形成させたインビボでのバイオフィルム）を使用した。ただ１つの濃度のペプチドＦ９（すなわち５０μＭ）を実験条件で試験した。ペプチドは、基質へのカンジダの初期接着（９０分、３７℃）中にエクスビボで投与された。その後、カテーテルを洗浄し、ラットの皮下に移植した。バイオフィルムは、移植の６日後に試験され、ＣＦＵによって定量された。これらの分析の結果を図７に示す。
【０４９８】
ペプチド処理されたカテーテルのカテーテル断片あたりで得られた平均ＣＦＵ±ＳＤ（２．２５±１．０８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片）は、対照のカテーテルから得られたカンジダ細胞の量（３．６９±０．４２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片）とは有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。重要なことには、２０個のうちの４個のペプチド処理されたカテーテル（２０％）が、実際の臨床におけるカンジダ感染の判定のための閾値である２．０ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片未満を含んでいた（Ｍｅｒｍｅｌら、（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３２：１２４９−１２７２）。Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは、未処理の野生型細胞と類似したバイオフィルム能を示した（３．３０±０．５５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片）が、しかし、Ｃ．アルビカンスａｌｓ１Δ／ａｌｓ１Δａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは、低ＣＦＵ値によって証明されるように、インビボでの皮下バイオフィルムモデルにおいてバイオフィルムを有意に形成しなかった（１．４６±１．２４ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片）（ｐ＜０．００１）。ペプチドＦ９の強力な活性は、接着期間中のペプチドの効果から生じている場合がある。したがって、本発明者らはまた、ポリウレタン基質上のＣ．アルビカンス接着中のペプチドＦ９の活性を試験した（図８）。
【０４９９】
ペプチドＦ９を用いたカンジダ細胞の処理は、対照（３．０６±０．３９ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片）と比較して、ポリウレタンデバイス（２．１８±０．１２ｌｏｇ１０ＣＦＵ／カテーテル断片）への接着を有意に減少させた（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ポリスチレンへのカンジダ接着性で得られたデータと一致している。これは、Ａｌｓ３のタンパク質凝集がバイオフィルム生成の初期段階中に現れたことを示唆する。期待した通り、Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３ΔおよびＣ．アルビカンスａｌｓ１Δ／ａｌｓ１Δａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは、野生型菌株と比較して有意に小さいポリウレタン接着能力を示した（ｐ＜０．００１）。
【０５００】
１．３．２  カンジダ・アルビカンスに対するインターフェラーＦ９の特異性
インターフェラーペプチドＦ９の特異性は、インビトロでのバイオフィルム形成阻害に関して、遠縁のカンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、すなわちカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）ＡＴＣＣ２００１と比較して、Ｃ．アルビカンスについて調べられた。Ｆ９ペプチドのベータ凝集配列（ＮＧＩＶＩＶＡＴＴ（配列番号７１））は、Ｃ．グラブラタに存在しない−Ｃ．グラブラタにおいてもっとも密接に関連する配列はＮＧＶＶＩＶＡＡＴ（配列番号７３）である。カンジダ・グラブラタは、ポリスチレンおよびポリウレタン上で、インビトロにおいて効率的なバイオフィルムを形成することが示された。本発明者らは、インビトロにおいて９６ウェルのポリスチレンプレート上でＣ．グラブラタの接着およびバイオフィルム形成におけるＦ９の効果を試験した。バイオフィルムはＸＴＴ還元アッセイによって定量され、その結果は、ペプチドＦ９がＣ．グラブラタ接着およびバイオフィルム生成に干渉しないことを指摘した。これらのデータは、接着と成熟バイオフィルム生成に対するペプチドＦ９の効率が配列依存的であり、非常に特異的であるという事実を支持している。
【０５０１】
１．３．３  インターフェラーペプチドＦ９の適用はまた上皮細胞に接着および浸潤するＣ．アルビカンスの能力を低下させる
本明細書において上記で検討したように、Ｃ．アルビカンスＡｌｓ３はまた上皮細胞および内皮細胞への接着および浸潤において役割を果たす。本発明者らは、Ａｌｓ３特異的インターフェラーを発現する組換え株が、インターフェラー誘導条件下で上皮細胞株に接着および浸潤する能力を有意に減少させたことを示した（実施例１．２．２）。ここで、本発明者らは、上皮細胞へのＣ．アルビカンスＳＣ５３１４の接着および浸潤におけるインターフェラーペプチドＦ９の外的適用の効果を調べた。それに加えて、カンジダ細胞は、接着（１時間）または浸潤（３時間）中にペプチドＦ９の存在下で、ヒト細胞（上皮細胞株ＴＲ−１４６）とともにインキュベートされた。接着および内在化された細胞の量は、落射蛍光を用いてカウントすることによって決定された。結果は図９に示す。
【０５０２】
期待した通り、Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δは、上皮細胞に接着および浸潤する能力を有意に減少させた（６０％）（ｐ＜０．００１）。Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４の接着および浸潤におけるペプチドＦ９の効果は濃度に依存することを示した（図９）。最高濃度（５０μＭ）は、対照（ペプチドなし）と比較して、カンジダ接着を４０％減少させた。低濃度（１０μＭおよび２．５μＭ）は、それぞれ約２０％−１５％の効果を引き起こした。接着に加えて、本発明者らはまた浸潤におけるペプチドＦ９の効果を決定した。高濃度（５０μＭ）のペプチドＦ９は浸潤を３４％減少させ、一方、中間濃度（１０μＭ）は浸潤を１５％低減させた。最低濃度（２．５μＭ）は浸潤にいずれの影響もなかった（１００％）。接着がＦ９の添加により影響を明確に受けたのに対し、浸潤への影響はそれほど明確ではなかった。特定の理論に拘束されるものではないが、浸潤は、異なる追加の機構によって生じる可能性があり、そのいくつかはＡｌｓ３への依存が小さいものである可能性があることが知られている。
【０５０３】
１．３．４  Ａｌｓ３に対するＦ９ペプチドインターフェラーの特異性
これまでに記載してきた点において、本発明者らは、ペプチドＦ９は、インビトロおよびインビボでのバイオフィルム形成中においても、また上皮細胞への接着および浸潤においても、生体材料（シリコーン正方形ディスク、ポリスチレンおよびポリウレタン）へのＣ．アルビカンス接着に有意な効果を引き起こすことを示してきた。これらの結果は、Ａｌｓ３が標的化されるという事実を指摘しているが、依然として、Ａｌｓ３が特異的に標的化されるか否かを実証されるべきであった。特異性を実証するために、本発明者らは、利用可能なＡｌｓ３特異的抗体と競合して、蛍光顕微鏡によって、ペプチドＦ９投与時にＣ．アルビカンス細胞の表面上にＡｌｓ３の存在を検出することを決定した。Ａｌｓ３は、主に菌糸細胞上に発現され、したがって、菌糸形成は最初に２０分間誘導された。異なる濃度のペプチドＦ９（５０μＭ、１０μＭ、および２．５μＭ）を４５分間、菌糸細胞に投与した。その後、細胞を洗浄し、ＡＬＳ３抗血清の存在下で６０分間、３０℃にてインキュベートし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲート形成させた二次抗ウサギＩｇＧを用いて対比染色した。１％ＤＭＳＯで処理されたカンジダ細胞を対照として使用した。染色された細胞は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を検出するためのフィルターセットを用いて、落射蛍光により視覚化された。インターフェラーペプチド処理されたカンジダ細胞は、濃度依存的に抗ＡＬＳ３抗体結合と効率的に競合し得ることが分かった。したがって、最高濃度（５０μＭ）のペプチドＦ９で処理されたカンジダ細胞は、対照（ペプチドなし、１％ＤＭＳＯのみが添加された。）と比較して、ＡＬＳ３抗血清結合の約５０％の減少を実証した。さらにまた、中間濃度（１０μＭ）はＡｌｓ３抗体に結合するカンジダ細胞の能力を減少させた。これらのデータはまた、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）アプローチにおいて、抗ＡＬＳ３抗体に結合するインターフェラーペプチド処理されたＣ．アルビカンスＳＣ５３１４細胞の能力を測定することによって定量された。蛍光顕微鏡と比較して、この方法は、たった１００００個のカンジダ細胞からの蛍光シグナルを検出することを可能にした。ＦＡＣＳデータは、顕微鏡画像から得られた観察を明確に支持した。ペプチドＦ９（５０μＭ）で処理されたＣ．アルビカンス菌糸細胞は、対照と比較して、有意に減少した蛍光シグナル量（５４％）を示した（ｐ＜０．００１）。さらに、中間濃度（１０μＭ）はまた、ＡＬＳ３抗血清結合を顕著に減少させ（４５％）、一方、最低濃度（２．５μＭ）もまた、１０％の減少を引き起こした。このようにして、データは、ペプチドＦ９がＡｌｓ３を特異的に標的とし、Ｆ９濃度依存的に低下させた抗ＡＬＳ３抗体結合によって特徴付けられた菌糸細胞上のＡｌｓ３量の有意な減少をもたらすＡｌｓ３の凝集を誘導することを示す。
【０５０４】
１．４  インターフェラー被覆された医療用デバイスはＣ．アルビカンスのバイオフィルム形成を予防する
カンジダ・アルビカンスは、一般的に、バイオフィルムに感染させたカテーテルにおいて診断される。カンジダ属種は、尿カテーテルや血管カテーテルから義歯、人工股関節、人工膝関節および人工発声器具、さらにペースメーカーに至る多種多様な医療機器にバイオフィルムを形成することができる。カンジダにより感染し得る移植されるこの広範囲の生体材料は、シリコーン、ポリスチレンおよびポリウレタンなどのプラスチック材料を含む多種の基質に接着する能力に反映されている。これらの医療機器の感染は、しばしば、それらの機能の喪失をもたらし、全身性感染の供給源を構成する可能性がある。Ｃ．アルビカンスのバイオフィルムは、しばしば、一般的な抗真菌治療に対して非常に耐性があるため、しばしば、感染したデバイスを除去する必要がある。耐性の機構は十分に確立されていないが、薬剤の真菌細胞への接近の制限は１つの可能な説明となる。上記の実施例において、本発明者らは、代替のアプローチは、基質（例えば、シリコーン（実施例１．２．１）、ポリスチレン（実施例１．３．２）およびポリウレタン（実施例１．３．２）へのＣ．アルビカンスの接着を干渉させること、すなわち、成熟バイオフィルムを防除する代わりに、バイオフィルムの形成を予防することであることを示してきた。本発明者らの現在のアプローチにおいて、本発明者らは、Ｆ９ペプチドインターフェラーと共有結合されるカテーテル材料を調製中である。固体支持体にペプチドを共有結合させる方法は、当該技術分野において報告されている。これらのインターフェラー結合カテーテルの性能は、セクション１．６．７．２の材料および方法に従って、実施例１．３．２に記載されているインビボのラットモデルにおいて評価される。
【０５０５】
１．５  トランスジェニック分子を用いたカルシニューリンの下方調節
カンジダ・アルビカンスにおいて、Ｈｓｐ９０は、病原性および抗真菌剤への耐性に関与した必須の高度に保存されたシャペロンである。セリン／スレオニン特異的ホスファターゼであるカルシニューリン（ＣＮＢ１）はＨｓｐ９０の標的であり、ｃｎｂ１のホモ接合欠失変異体はストレスに感受性である。このようにして、本明細書において提示されている分子を用いて、カルシニューリンタンパク質を標的とすることが決定された。
【０５０６】
Ｃｎｂ１凝集誘導分子の設計
カルシニューリンの調節サブユニットのＴＡＮＧＯ分析は凝集傾向にある２つの領域を明らかにした。予期されたタンパク質配列ＦＡＦＮＩＹ（配列番号１０４）およびＬＦＩＶＭ（配列番号１０５）は、それぞれ４０％および９６％のβ凝集傾向を示す。これらの２つの短い配列は、トランスジェニックアプローチを用いてＣＮＢ１を下方調節するためのいくつかの異なる構築物を設計するために使用された。構築物は、次の構造：
プロモーター−ｙＥＧＦＰ−ＨＡタグ（配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１０８））−アミノ酸リンカー（配列ＭＡＱＷ（配列番号１０９））−構造（Ｘ２ｉ−１−Ｙｉ−Ｘ２ｉ−Ｚｉ）ｎを有する分子
を有していた。ここで、ｎ＝５であり、さらに、
Ｘ１＝ＱＮ
Ｙ１＝ＳＴＬＩＶＬ（配列番号１１０）
Ｘ２＝Ｑ
Ｚ１＝０
Ｘ３＝Ｎ
Ｙ２＝ＳＴＶＩＦ（配列番号１１１）
Ｘ４＝Ｅ
Ｚ２＝Ｑ
Ｘ５＝Ｎ
Ｙ３＝ＳＴＶＩＦ（配列番号１１１）
Ｘ６＝ＥＱＮ
Ｚ３＝ＫＰＡＧＡＡＫＰＧＡＡＧ（配列番号１１２）
Ｘ７、Ｙ４、Ｘ８、Ｚ４、Ｘ９、Ｙ５、Ｘ１０は、表２に示されるものに従って変更され；Ｚ５は非存在である。
【０５０７】
【表２】
2014514917.tif 000005
【０５０８】
連続して記載するが、例えば構築物番号１がコードする配列は、このようにして以下のようである：
【０５０９】
【化２】
2014514917.tif 000006
【０５１０】
これらの構築物において使用される分子は、本質的には、２種の凝集誘導領域を含む：Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、凝集を促進する合成（すなわち、カンジダに生じず／ＣＮＢ１の一部ではない）配列として機能し、一方、Ｙ４およびＹ５は、特異性を確実にするＣＮＢ１タンパク質において同定された２つの凝集性領域である。
【０５１１】
形質転換体の特性
これらの構築物を担持する形質転換体の初期の特徴付けは、（ｃｎｂ１Δ変異体が感受性である）様々な種類のストレスへの耐性についてインビボでの試験によって行われた。構築物は、グルコースを含む培地（合成デキストロース（ＳＤ）培地）において抑制され、糖新生条件（合成カザミノ酸（ＳＣＡＡ）培地）において誘導されるＰＣＫ１プロモーターの制御下に置かれた。図１０に示すように、形質転換体は、実際には培地中のＳＤＳの存在により感受性であり、これは、凝集因子タンパク質が誘導される場合のみで行われる。ストレスが存在しないときには増殖への影響は観察されず、これは、観察された表現型が構築物の発現に連結された非特異的な効果または毒性効果によるものではないことを示す。
【０５１２】
４つの異なる形質転換体は、Ｘ８とＸ９ゲートキーパーおよびＺ４リンカーの性質（および電荷）において異なり、およびそれだけで異なる。しかしながら、これらはすべて、カルシニューリンの下方調節に典型的な同じ表現型を共有する。そのようにして、この実験設定において、ゲートキーパーの電荷およびリンカーの性質は、二番目に重要なだけである−システムは、これらのバリアントに関係なく、標的タンパク質の下方調節を達成するために十分堅牢である。
【０５１３】
４つの構築物はすべて、同じＣＮＢ１凝集誘導性領域（すなわち、ＦＡＦＮＩＹ（配列番号１０４）およびＬＦＩＶＭ（配列番号１０５））を同じ順番で共有し、この順番は、これらの領域がカルシニューリンタンパク質において生じるのと同じくＮ末端からＣ末端の順番であるため、これらの凝集決定領域の順番が重要であるかどうかを試験することが決定された。
【０５１４】
これは、表３に示されるように、Ｙ４およびＹ５領域だけが交換される構築物を作製することによって評価された。
【０５１５】
【表３】
2014514917.tif 000007
【０５１６】
形質転換体５から８はまた、同じアッセイを用いてＳＤＳに対する感受性について試験された。形質転換体のすべては、構造物１から４を有するものと同じように挙動した。すなわち、表現型は、プロモーター抑制条件における野生型酵母のものと類似し、プロモーター誘導条件におけるホモ接合ｃｎｂ１欠失変異体のものと類似している。これは、本発明者らにとって、少なくともこの実験設定において、凝集誘導領域の順番は、特定の下方調節を達成させるために不可欠なものではなく、領域が標的タンパク質において生じる順序と同一である必要はないことを結論付けさせる。
【０５１７】
両領域が特定の凝集に貢献するかどうかを確認するために、Ｙ４およびＹ５が同一である（したがって、ＬＦＩＶＭ（配列番号１０５）またはＦＡＦＮＩＹ（配列番号１０４）のいずれかに対応する）構築物もまた試験された。これらの形質転換体は同じ表現型を示したが（すなわち、いずれかの領域の存在だけがカルシニューリンの下方調節を達成するのに十分である。）、それほどではない（すなわち、試験されたすべての形質転換体において、表現型が観察されたわけでなく、これは、おそらく特異的な凝集を誘導するために必要とされるより高い閾値発現レベルのためである）。したがって、タンパク質を標的とする同じタンパク質において２つの異なる凝集誘導領域の組み合わせは有益であると考えられる。
【０５１８】
１．６  抗真菌適用に対する材料および方法
１．６．１  動物および免疫抑制
インビボ実験に使用した動物は、２００ｇの特定の無菌雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（サン・ジャンビエ、フランス）であった。すべての動物は、標準の随意食餌を与えられ、全実験手順の前および全実験手順中、最大２４時間までそれらの飲料水に１ｍｇ／Ｌのデキサメタゾン（オルガノン、オランダ）を用いて免疫抑制された。テトラサイクリン（１ｇ／Ｌ）またはアンピシリン（０．５ｇ／Ｌ）を水に添加し、細菌感染を最小にした。すべての動物実験は、実験動物の保護と健康に関する欧州規則に従って維持され、カトリック大学ルーベンの動物倫理委員会によって承認された。
【０５１９】
１．６．２．対象とするタンパク質−Ａｌｓ３を凝集する高い傾向を有するペプチドに基づく治療薬
Ａｌｓ３ｐの交差ベータ凝集を引き起こす高い傾向を有するＣ．アルビカンスに特異的なペプチドに基づく治療薬は、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）によって合成された。非常に精製されたペプチド（＞９０％、ＨＰＬＣによって検出された純度）は、凍結乾燥形態で配送され、使用前に−２０℃に維持された。各ペプチドのストック溶液は、最終濃度が１０ｍＭ−２０ｍＭになるように、超純水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の５０％ＤＭＳＯにおいて調製された。３つの異なる濃度（５０μＭ、１０μＭおよび２．５μＭ）の陽性ペプチドＦ９は、すべてのアッセイにおいて試験された。ペプチドを含む実験は、自己凝集を低下させるために低接着性プラスチック材料（Ｂｉｏｐｌａｓｔｉｃｓ、オランダ）において行われた。
【０５２０】
１．６．３  酵母培養条件
一般的に、酵母細胞は、他に記載がなければ、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトンおよび２％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースを含むリッチＹＰ培地（ＹＰＤ）中で３０℃にて連続的に振とうしながら一晩培養された。インビトロおよびインビボのＣ．アルビカンスのバイオフィルム実験前に、細胞は、ＹＰＤ固体培地（１．５％（ｗ／ｖ）寒天を含む）上で一晩３７℃にて増殖させた。凝集因子構築物を担持する菌株は、コハク酸、カザミノ酸（プロモーター誘導条件）が補足されたまたは４％Ｄ−グルコース（プロモーター抑制条件）が補足された、アミノ酸および硫酸アンモニウム（ｐＨ６．５）（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）を含む酵母窒素ベース（ＹＮＢ）において増殖させた。真菌の増殖における凝集因子ペプチドの潜在的な効果を研究するために、細胞は、３０℃にて５０μＭ濃度の各ペプチドの存在下でインキュベートされた。対照試料中のＤＭＳＯの最終濃度は１％を超えなかった。試料を１時間毎に回収し、細胞密度を６００ｎｍにて分光光度計（ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて測定した。
【０５２１】
１．６．４．酵母から菌糸への遷移
カンジダ細胞をＹＰＤ培地で一晩増殖させ、２回洗浄し、さらに３０℃にて２時間（飢餓周期）滅菌水中でインキュベートした。次に、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌに調整し、細胞は、ペプチド（５０μＭ）の有無による、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｆ７５２４、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を含むＹＰ培地またはＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）においてインキュベートされた。培養物は、１．５時間−２時間、３７℃にてインキュベートされた。真の菌糸対出芽酵母の割合は、４０倍の倍率での光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｔａｒ  ｐｌｕｓ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）によって決定された。
【０５２２】
１．６．５．最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定
抗真菌剤の浮遊細胞の最小阻害濃度（ＭＩＣ）はＮＣＣＬＳ  Ｍ２７−Ａ３（２００８）に従って決定された。要約すると、Ｃ．アルビカンス株はＹＰＤプレート上で一晩３０℃にて増殖させた。カンジダ細胞懸濁液（１−５×１０６細胞／ｍｌ）はＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳ培地において調製された。細胞はさらに１：５０に希釈され、このような懸濁液から、１００μｌのカンジダ細胞を９６ウェルのポリスチレンプレートの各ウェルに適用した。次に、試験される異なる濃度の抗真菌剤を含む１００μｌを添加した。対照ウェルはカンジダ細胞を含み、そこではＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳだけが添加された。細胞を２日間増殖させ、抗真菌剤の有効性を分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４）を用いて４９０ｎｍにて細胞の光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。データはＭＩＣ５０およびＭＩＣ９５として決定され、それぞれ５０％または９５％の真菌増殖を阻害する薬剤の最小阻害濃度を表す。
【０５２３】
１．６．６．最小抗真菌活性（ＭＦＣ）の決定
最小抗真菌活性（ＭＦＣ）は、Ｃａｎｔｏｎら、（２００９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｊｕｌ；５３（７）：３１０８−１１によって報告されているように決定された。抗真菌活性を有する唯一の薬剤であるためである。ＭＦＣは、本試験においてアニデュラファンギンが抗真菌活性を有する唯一の薬物であるため、アニデュラファンギンにつてのみ定義された。要約すると、異なる濃度の抗真菌薬を用いて前処理された１００μｌのカンジダ細胞懸濁液をＹＰＤプレートに播種し、さらに３７℃にて２４時間インキュベートした。ＭＦＣは、９９％の増殖阻害の結果として決定された。
【０５２４】
１．６．７．Ｃ．アルビカンスのバイオフィルムモデル
１．６．７．１  インビトロにおけるＣ．アルビカンスのバイオフィルムシステム
インビトロでのＣ．アルビカンスのバイオフィルムは、３種の生体材料、すなわち平底９６ウェルポリスチレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ドイツ）、シリコーン（ＣＳ  Ｈｙｄｅ、ＵＳＡ）およびポリウレタンの３重ルーメン静脈カテーテル（２．４ｍｍ径）（Ａｒｒｏｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅａｄｉｎｇ、ＵＳＡ）上で研究された。バイオフィルムの設定前に、シリコーンを小さな正方形片（１ｃｍ×１ｃｍ）に切断し、ポリウレタンを１ｃｍ片に切断した。シリコーンまたはポリウレタンのデバイスは、９９％ＦＢＳ（Ｆ７５２４、Ｓｉｇｍａ）中で一晩３７℃にてインキュベートされた。細胞を洗浄し、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。１×１０７細胞／ｍｌまたは５．１０４細胞／ｍｌのカンジダ懸濁液はＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳ培地、コハク酸塩（ｐＨ６．５）またはＹＮＢ培地、４％Ｄ−グルコース中で調製された。合計では、１ｍｌの細胞懸濁液が２４ウェルプレートに配置されたシリコーンディスクまたはポリウレタンカテーテルに添加され、１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルのポリスチレンプレートに接種した。基質への細胞の接着は、静的条件下（接着期間）、３７℃にて９０分間インキュベーションすることによって達成された。その後、未接着のカンジダ細胞は、１×ＰＢＳを用いた洗浄段階を２回行うことにより除去し、４８時間から１４４時間、３７℃にて新鮮な培地中に沈められた（成熟バイオフィルム）。その後、バイオフィルムは１×ＰＢＳで２回洗浄し、定量された。
【０５２５】
１．６．７．２  インビボの皮下Ｃ．アルビカンスのバイオフィルムシステム
新しい皮下モデルにおけるインビボでのＣ．アルビカンスのバイオフィルム生成の実験スケジュールをスキーム１に図解する。
【０５２６】
【化３】
2014514917.tif 000008
【０５２７】
Ｃ．アルビカンス細胞をＹＰＤプレート上で一晩３７℃にて増殖させ、洗浄し、１×ＰＢＳ中に再懸濁した。カンジダ細胞懸濁液（５．１０４細胞／ｍｌ）は、カウントすることによってＲＰＭＩ１６４０−ＭＯＰＳ培地中に調製された。１ｃｍのセグメントに切断したポリウレタンの３重ルーメン静脈カテーテル（２．４ｍｍ径）（Ａｒｒｏｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅａｄｉｎｇ、ＵＳＡ）は、３７℃にてＦＢＳ中で一晩インキュベートされた。血清で被覆されたカテーテルは、１ｍｌのカンジダ細胞懸濁液中で９０分間、３７℃にてインキュベートされた（接着期間）。接着期間後、カテーテルは、（Ｖａｎ  Ｗｉｊｎｇａｅｒｄｅｎら、（１９９９）Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈ  ４４：６６９−６７４）に報告されるように、ラットの皮膚の下に移植される前に、１×ＰＢＳで２回洗浄された。麻酔は、エンフルランガス（Ａｌｙｒａｎｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の短期間の吸入により実施された。ラットは、エンフルラン（２０％）と酸素（８０％）の気体混合物によって、インプラント手順中に睡眠を維持した。ラットの腰部を剃毛し、７０％アルコール中の０．５％クロルヘキシジンを用いて消毒した。１０ｍｍ切開が縦方向になされ、皮下組織を注意深く解剖し、３つの皮下トンネルを作製した。最大１０個のカテーテル断片を移植した。切開部を外科用ステープラー（Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）、ＵＳＡ）を用いて閉じ、７０％アルコール中の０．５％クロルヘキシジンで消毒した。バイオフィルムは４８時間および１４４時間形成された。カテーテルの外植のために、ラットをＣＯ２吸入により安楽死させた。皮膚を消毒し、カテーテル断片を皮下組織の下から取り出し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、定量し、可視化した。インビボにおけるカンジダのバイオフィルム生成中のＡｌｓ３ｐの凝集を促進するペプチドの効果を同様に特徴付けた。血清で被覆されたポリウレタン断片は、接着期間（９０分、３７℃）中に、５０μＭの濃度の陽性ペプチドＦ９および陰性ペプチドＦ９ ｎｅｇａｔ、ｐ１３およびｐ２０の存在下でカンジダ細胞（５×１０４細胞／ｍｌ）とともにインキュベートされた。その後、未接着細胞は、２回の洗浄段階によって除去された。カテーテルは、上述したように、免疫抑制ラットの背側に皮下移植された。バイオフィルムは、ＣＦＵカウントによってインプラントの６日後に研究された。
【０５２８】
１．６．８．バイオフィルム定量法
１．６．８．１．ＸＴＴ還元アッセイ
インビトロにおけるバイオフィルム内のカンジダ細胞の代謝活性がＸＴＴ還元アッセイを用いて研究された。この方法は、４９０ｎｍにて分光光度計によって測定される代謝的に活性な細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによりＸＴＴホルマザンに還元される特異的な基質−ＸＴＴ（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）の比色変化に基づく。ＸＴＴ作業溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）は滅菌した１×ＰＢＳで調製され、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。使用前に、メナジオンは、最終濃度１μＭにてＸＴＴ溶液に添加された。この溶液をボルテックスし、１００μｌを、バイオフィルムを含む各ウェルに適用し、暗所で３−５時間３７℃にてインキュベートした。比色変化の強度は、４９０ｎｍにて分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４）により測定された。カンジダ細胞を含まないＸＴＴ−メナジオン溶液をブランクとして使用した。
【０５２９】
１．６．８．２  真菌バイオフィルムのバイオマスの定量
インビトロおよびインビボにおいて外植されたカテーテルのカテーテルルーメン内に形成された真菌のバイオフィルムのバイオマス量は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によって決定された。要約すると、インビトロでの基質およびインビボでのバイオフィルムからのカテーテルを水浴超音波装置（Ｂｒａｎｓｏｎ  ２２１０）中で１０分間、４００００Ｈｚにて超音波処理し、さらに１×ＰＢＳ中で３０秒間ボルテックスした。元の試料と１：１０の希釈物をいつものように２点測定でＹＰＤプレート上に播種した。ＣＦＵを３７℃にて２日後にカウントした
１．６．９．顕微鏡によるカンジダバイオフィルムの視覚化
１．６．９．１  蛍光顕微鏡
蛍光顕微鏡前に、接着したバイオフィルムを有するインビトロおよびインビボのカテーテルは、縦方向に切断され、５０μｇ／ｍｌカルコフルオールホワイト（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を含む１×ＰＢＳ緩衝液中で２０分間インキュベートされた。これらのデバイスは、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２蛍光顕微鏡を用いて観察された。画像は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを用いたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍ  ＨＲｍカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ソーンウッド、ＮＹ）により取得した。
【０５３０】
１．６．９．２  走査型電子顕微鏡
カテーテル（縦方向に切断）は、顕微鏡前に、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の３％グルタルアルデヒドで固定された。カテーテルは、固定溶液から取り出され、一晩乾燥させた。マウントされた試料は、金を用いてスパッターコーティングされ、ＸＬ３０  ＥＳＥＭ  ＦＥＧ走査型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）において観察された。
【０５３１】
１．６．９．３  共焦点レーザー走査顕微鏡
縦方向に切断され、固定されたカテーテルは、１時間３７°Ｃにて５０μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ（コンカナバリンＡ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートされた。共焦点画像は、ＬＳＭ５１０／ＣｏｎｆｏＣｏｒ２システム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、イエナ、ドイツ）を用いて取得され、分析された。アルゴンレーザー（６Ａ、５０％に調整された音響光学チューナブルフィルター）は４８８ｎｍの励起光（コンカナバリンＡ−Ａｌｅｘａ４８８蛍光用）を与えた。励起光は、ダイクロイックミラー（ＨＦＴ４８８）によって反射され、Ｐｌａｎ−ＮｅｏＦｌｕａｒ  ２０×ＮＡ０．５対物レンズを介して焦点が合わせられた。蛍光発光は、５０５ｎｍのロングパスフィルターおよび１エアリーユニットピンホールを通過させた。先に、バイオフィルム厚が評価され、第一に、成熟バイオフィルムの３次元（３−Ｄ）写真を捕捉した。約２００セクションは、全バイオフィルムのアーキテクチャを介して行われた。次に、バイオフィルム厚は、蛍光シグナルがもはや測定されなくなった領域まで、蛍光シグナルがその最大の半分を超える強度を獲得する領域の外縁から推定された。
【０５３２】
１．６．１０．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光顕微鏡
細胞を固定せずに直接使用し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡を用いて観察した。ＧＦＰをＵＶ光源およびロングパスＧＦＰフィルターで可視化した。画像は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを用いたＱｕａｎｔｉｘ電荷結合デバイスカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ソーンウッド、ＮＹ）により取得された。
【０５３３】
１．６．１１．Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δ発芽管を用いたウサギＡＬＳ３抗血清の吸収
ＡＬＳ３抗体の凍結乾燥形態は、５００μｌの滅菌水中で再構成された。抗血清は、蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳのためにそれを使用する前に、Ｃ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δ発芽管により吸収された。１×１０６細胞／ｍｌを含む３つのフラスコは、Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＰＡＡ、オーストリア）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で９０分間、３７℃にて発芽させた。発芽管は、マイクロ遠心管に分けられ、ＡＬＳ３抗血清と混合され、穏やかに振とうしながら氷上で１時間インキュベートされた。その後、細胞を遠心分離し、新鮮なＣ．アルビカンスａｌｓ３Δ／ａｌｓ３Δ発芽管を含む別のフラスコに上清を移した。この手順は合計３回繰り返された。ＡＬＳ３抗血清は少量（２０μｌ）に分注され、−８０℃にて保存された。抗体の特異性は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３５０  ＦＸ、マンハイム、ドイツ）により確認された。
【０５３４】
１．６．１２．上皮細胞の増殖および分化
元々は、頬粘膜由来の上皮細胞株ＴＲ−１４６の扁平上皮癌腫は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロンドンから入手された。ＴＲ−１４６細胞は、正常なヒト頬粘膜と比較して、多くの類似性を示す細胞の重層を形成することができる（Ｒｕｐｎｉａｋら、（１９８５）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ７５：６２１−３５）。ＴＲ−１４６細胞は、抗生物質および抗真菌剤を含まないが、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を含み、ＮａＨＣＯ３、Ｄ−グルコース、ピルビン酸Ｎａおよび安定したグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で定期的に増殖させた（４−２０継代）。細胞は、３７℃にて５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて維持された。接着および浸潤実験について、１×１０５個のＴＲ−１４６細胞は、予め２４ウェルプレートに設置された１２ｍｍ径のガラス製カバースリップ上に播種された。
【０５３５】
１．６．１３．接着アッセイ
Ｃ．アルビカンス株は、液体ＹＰＤ、コハク酸（ｐＨ６．５）またはＹＮＢ（４％Ｄ−グルコース）中で３０℃にて振とうインキュベーターにおいて一晩増殖させた。カンジダ細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＣＳを含まないが、ＮａＨＣＯ３、Ｄ−グルコース、ピルビン酸Ｎａおよび安定したグルタミンを含有するＤＭＥＭ中で最終濃度が１×１０５細胞／ｍｌとなるように決定された。ＴＲ−１４６を１２ｍｍスライドガラス上で増殖させ、カンジダ細胞を植菌した。異なる濃度の陽性ペプチドＦ９（５０μＭ、１０μＭおよび２．５μＭ）および陰性ペプチドＦ９ ｎｅｇａｔ、１３と２０（５０μＭ）は上皮細胞へのカンジダ接着について試験された。接着アッセイは１時間、３７℃、５％ＣＯ２にて行われた。接着後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、未接着の細胞を除き、次に、４％パラホルムアルデヒドを用いて３０分間室温にて固定した。１×ＰＢＳで広範囲にすすいだ後、細胞を水中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において５分間浸透させ、次に、カルコフルオールホワイト（１：１００希釈）を用いて１５分間で染色し、さらに水で３回、１０分間、３０℃にて１８０ｒｐｍで洗浄した。カバースリップを顕微鏡スライド上に反転させてマウントし、カルコフルオールホワイト（ＤＡＰＩ用フィルター）（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３５０  ＦＸ、マンハイム、ドイツ）を検出するためのフィルターセットを用いて落射蛍光下で定量した。接着した細胞の割合は、カバースリップの表面全体に広がった１００個の領域における接着したカンジダ細胞の平均として計算された。
【０５３６】
１．６．１４．浸潤アッセイ
先の６．２．１５に記載されているように、ＴＲ−１４６細胞株の単層をカンジダ細胞に感染させた。３７℃、５％ＣＯ２にてカンジダ細胞とともに単層の３時間のインキュベーション後、上皮細胞上の培地を吸引し、上皮細胞と関連しない真菌細胞を除去するために、単層を１×ＰＢＳで３回すすいだ。次に、上皮細胞を２０分間、３７℃にて、４％Ｈｉｓｔｏｆｉｘ（Ｒｏｔｈ）で固定した。表面に接着した状態のすべての真菌細胞をウサギ抗Ｃ．アルビカンスポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ドイツ）（１：２０００希釈）を用いて１時間染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコンジュゲートされた二次抗ウサギＩｇＧ（１：５０００希釈）を用いて対比染色した。１×ＰＢＳを用いて広範囲にすすいだ後、水中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において５分間、細胞を浸透させた。さらに、上皮細胞内の真菌細胞の接着部分と浸潤部分は、カルコフルオールホワイト（１：１００希釈）を用いて１５分間染色し、水で３回、１０分間、３０℃、１８０ｒｐｍにて洗浄した。カバースリップはスライドガラス上に反転してマウントされ、染色された細胞は、カルコフルオールホワイト（ＤＡＰＩ用フィルター）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３５０  ＦＸ、マンハイム、ドイツ）を検出するためのフィルターセットを用いて落射蛍光で視覚化された。Ｃ．アルビカンス細胞に浸潤する割合は、接着細胞の総数で内在化した細胞数を除することによって決定された。少なくとも１００個の真菌細胞を各カバースリップ上でカウントした。
【０５３７】
１．６．１５．蛍光顕微鏡および蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）によるＣ．アルビカンスＡＬＳ３抗体結合の検出
Ｃ．アルビカンス細胞の一晩培養物を回収し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。カンジダ細胞（２．５×１０６細胞／ｍｌ）は、ペプチドＦ９（５０μＭ、１０μＭおよび２．５μＭ）または陰性ペプチドＦ９ ｎｅｇａｔ、１３および２０（５０μＭ）の有無による、Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＰＡＡ、オーストリア）を含むＲＰＭＩ１６４０培地において調製された。カンジダ接着および菌糸誘導は、４５、６０または９０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて、１２ｍｍのスライドガラスまたはガラス製ペトリ皿（φ５ｃｍ）上で行われた。未接着細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、直ちに２０分間３７℃にて、４％Ｈｉｓｔｏｆｉｘ（Ｒｏｔｈ）で固定した。１×ＰＢＳを用いて広範囲にすすいだ後、細胞は、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で５分間浸透処理され、洗浄され、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）において２０分間ＲＴにてインキュベートされた。さらに、接着した細胞は、６０分間３０℃にて、ＡＬＳ３抗血清（１：５００希釈）の存在下でインキュベートされ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２０００希釈）とコンジュゲートされた二次抗ウサギＩｇＧで対比染色された。最終の洗浄段階後、カバースリップをスライドガラス上に反転してマウントし、染色された細胞は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を検出するためのフィルターセットを用いる落射蛍光（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３５０  ＦＸ、マンハイム、ドイツ）により視覚化された。最後に、細胞は、細胞スクレーパーを用いてカバースリップから脱着され、０．５ｍｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁された。菌糸の蛍光強度は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄ．ｃｏｍ）を用いて測定された。各菌株について１０，０００個の細胞の蛍光データを回収した。
【０５３８】
１．６．１６．スフェロプラストの単離およびポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色
カンジダ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）は、３７℃にてペプチドＦ９、Ｆ９ ｎｅｇａｔ、１３および２０（５０μＭ）の存在下で、ＹＰＤ培地中でインキュベートされた。細胞は、ペプチドの添加後の５分、３０分および６０分において回収され、４５００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心分離された。ペレットは、ザイモリアーゼを含まない１等容の消化緩衝液（２Ｍソルビトール、１ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５、０．５ＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄され、計量され、さらに、１０ｍｇのザイモリアーゼ２０Ｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）（５ｍｌ緩衝液／１ｇ細胞）を含有する消化緩衝液中で溶解させた。反応物は、消化緩衝液１ｍｌあたり１０μｌのβ−メルカプトエタノールが補足された。細胞は、３０分−４５分間、３７℃にてインキュベートされた。スフェロプラスト対無傷細胞は、少量の０．５％ＳＤＳ中で決定され、顕微鏡下で観察された。無傷細胞は、０．５％ＳＤＳの存在によって影響されなかったのに対して、スフェロプラストは、「ゴースト」だけを残した。スフェロプラストは、２０００ｒｐｍ、２分間、ＲＴにて遠心分離によって回収され、１．２Ｍ冷ソルビトールで２回洗浄された。重要なことには、スフェロプラストを単離するために使用されたすべての溶液は、プロテアーゼインヒビターミックス（完全ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）を含んでいた。最後に、スフェロプラストは、４％β−メルカプトエタノールが補足されたＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解され、５分間、６５℃にて煮沸された。ゲル上に充填する前に、試料を短時間、遠心分離した。タンパク質は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して、１２０Ｖの定電圧で分離された。電気泳動後、ゲルをプラスチックトレイに移し、タンパク質は、３０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸中で一晩、穏やかに振とうさせながら、０．２５％クーマシーブリリアントブルーにおいて染色された。タンパク質バンドが明確に視認できるようになるまで、ゲルを３０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％酢酸中で脱色した。
【０５３９】
１．６．１７．統計学的分析
統計分析のために、ステューデントｔ検定を用いた。結果は、ｐ＜０．００１のときに、統計学的に有意であると考えられた。抗真菌処理の統計学的有意性は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウェア）を用いて分析された。
【０５４０】
すべての実験は、２点測定で少なくとも３回繰り返された。インビトロでのＣ．アルビカンスの接着またはバイオフィルムアッセイは、各々、３点測定で５回繰り返された。インビボでのＣ．アルビカンスのバイオフィルムは、４回繰り返され、常に菌株あたり２匹の動物を含む。Ｃ．アルビカンスのバイオフィルムの感受性決定中に各濃度の薬物を４点測定で試験した。ＴＲ−１４６上皮細胞を含むすべての実験手順は５回の別々の機会に２点測定で行われた。ＦＡＣＳ分析およびＡＬＳ３抗体結合の決定は５回繰り返された。
【０５４１】
２．抗菌応用
２．１  導入
新生の抗生物質耐性は避けられない進化のプロセスである。これまで、重篤な感染症を引き起こす細菌の約９０％が利用可能な抗生物質のほとんどに耐性である。新しい抗生物質の大半は、従前の化合物の誘導体またはよく知られている分類に属する化合物の誘導体である。したがって、新規作用機序を有する抗菌剤が必要とされている。
【０５４２】
本実施例では、本発明者らは、スタフィロコッカス・エピデルミデスおよびスタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ株）の公に利用可能なゲノムの標的タンパク質に存在する凝集性配列に基づくインターフェラーペプチドのライブラリーを設計した。これらのゲノムは、これらの細菌株の臨床的関連性に基づいて；特に、病院の後天的な疾患との関連で選択された。本実施例において、本発明者らは、設計されたインターフェラーが、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）（ＶＲＥ）を含む広範囲なグラム陽性菌、さらにグラム陰性菌に対して、強力なインビトロおよびインビボ抗菌活性を有することを示してきた。本発明者らの結果は、凝集が、成功した抗菌戦略として役立つことができることを説得力をもって示している。これは、特に新生の多剤および全耐性株の観点から、院内疾患の治療のために重要な突破口である。
【０５４３】
２．２  インターフェラーペプチドライブラリーの一次スクリーニング、最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定
全５０種のインターフェラーペプチドは、スタフィロコッカス・エピデルミデスおよびスタフィロコッカス・アウレウスのゲノムによってコードされている複数のタンパク質に存在する凝集性領域の出現に基づいて設計された。これらのインターフェラーペプチドの設計のため、これらの領域の一部はまた、他の（遠縁）細菌種のタンパク質に存在する可能性がある。スクリーニングの試みにおいて、ツー段階手法は以下に従った：１）高濃度（７５−３００μｇ／ｍｌ）でのすべてのペプチドの初期スクリーニング、続く２）段階１）において実証された活性を有する、選択された一連の化合物について低濃度（＜７５μｇ／ｍｌ）でのスクリーニング。細菌は、新鮮な一晩のＴＳＡ−ヒツジ血液プレートから回収された個々のコロニーを用いて、振とうインキュベーター中で３７℃、５０ｍｌのＢＨＩにおける１６０ｒｐｍにて増殖させた。培養物は、約１×１０８細胞／ｍｌの密度まで増殖させ、次に、ＣＡＭＨＢ（Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ０．５）中で５×１０５細胞／ｍｌに希釈された。各ウェルは、１００μｌ（ＭＨＢを含む５０μｌのペプチド＋５０μｌの接種材料）を含んだ。最終細胞密度は１×１０５から５×１０５／ｍｌであった。細胞懸濁液の添加後、プレートを３７℃にて１８から２４時間インキュベートした。各ウェルの５９０ｎｍ（ＯＤ５９０）での光学密度は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ分光光度計（１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉｃｏｔｒ３）を用いてプレートを５秒振とうしてから測定された。ＭＩＣ値は、ウェル中の細菌の増殖を完全に阻害するために必要とされる最低濃度として読み取られた。各ウェルはまた、全く増殖が観察されなかったが、ＴＳＡ−ヒツジ血液寒天プレート上に配置され、３７℃にて一晩インキュベートされ、視覚的に検査された。
【０５４４】
これにより、スタフィロコッカスや他の細菌種に対して高い活性を有するいくつかの分子が得られた（表４参照）。Ｓ．アウレウスに対して活性であるように初期に設計された、表に示されている化合物に加えて、言及する価値があり、Ｓ．エピデルミデスに対して活性であるように設計された２つの分子は、Ｃ２９（配列：ＲＬＦＮＦＬＫＲＧＳＲＬＦＮＦＬＫＲ（配列番号３２）、すなわち、表４におけるＨｉｔ１１と同一のもの）、およびＣ３０（ＲＩＬＬＧＬＩＲＲＧＳＲＩＬＬＧＬＩＲＲ（配列番号１１５））である。
【０５４５】
【表４】
2014514917.tif 000009
【０５４６】
２．２．１．抗菌性化合物のスペクトル
表４において、ＭＩＣ活性（μｇ／ｍｌ）は、最初の初期スクリーニング後に選択された６つの異なるインターフェラーペプチドについて示されている。これらの分子の構造は、ｎが２であり、Ｘ１が１個のアミノ酸（Ｈｉｔ５０、ＨＩＴ１、Ｈｉｔ１１、Ｈｉｔ５７Ａ、Ｈｉｔ５０Ａ）または２個のアミノ酸（Ｈｉｔ１４）であり、Ｙ１が５個（Ｈｉｔ１１）または６個のアミノ酸（その他）、Ｘ２が２個のアミノ酸であり、Ｚ１が２個のアミノ酸リンカーであり、Ｘ３が１個のアミノ酸、Ｙ２が５個（Ｈｉｔ１１およびＨｉｔ５７Ａ）または６個のアミノ酸であり、Ｘ４が２個のアミノ酸であり、Ｚ２は存在しない、本願において概要されている式に対応する。Ｙ１およびＹ２は、同一または異なっていてもよいことに留意されたい。注目すべきは、５個のアミノ酸の配列を有するＹ部分において、隣接Ｋ残基が、Ｓ．アウレウスタンパク質中にも存在し、そのため、配列は、５個というよりは６個のアミノ酸全体で同一である。
【０５４７】
これらのインターフェラーペプチドは、元々、スタフィロコッカス・アウレウスＭＲＳＡ株を特異的に標的とするように設計された。他のグラム陽性菌のゲノムにおいて同じ凝集性配列（すなわち、ＴＡＮＧＯ配列）の存在に起因して、他の細菌種に対するインターフェラーペプチドの活性もあった。ペプチドインターフェラーＨＩＴ１は、広域スペクトルインターフェラーであることを示す。Ｈｉｔ１４は、設計される対象であった細菌株（すなわち、スタフィロコッカス・アウレウスＭＲＳＡ）により特異的なようである。Ｈｉｔ１１は、スタフィロコッカス種の両方に対して有効であるが、Ｓ．エピデルミデスに対してもっとも活性であり、これは、Ｙ領域の正確な配列がより頻繁にＳ．エピデルミデスのゲノムに存在するという事実と一致している。ＭＩＣ値（または最小阻害濃度）は、インキュベーション後に細菌の視認できる増殖を阻害する抗菌剤の最低濃度である。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、増殖を予防し、２４時間以内に接種を９９．９０％低減するペプチドの最低濃度として考慮した。ＭＢＣは、生存率を確認するための血液寒天プレート上で各ウェルの内容物を播種することによって確立された。さらに、ウェルの内容物はまた、新しいマイクロウェルプレート（ペプチドは添加されていない）のための接種として使用され、濁度の進行的な変化をさらに２４時間注意喚起した。ＭＢＣ値は、これらが殺菌剤であることを示唆するＭＩＣ値と同じであるまたはＭＩＣ値よりも２倍高かった。
【０５４８】
次の段階において、反復スクリーニング全体で高い活性（低いＭＩＣ）を維持したペプチドは、非常に精製され、スケールアップした形態で再配列され、いくつかのグラム陽性およびグラム陰性菌についてさらなる試験に供された。表５は、様々な細菌種について、化合物３０（Ｃ３０）のＭＩＣ値を示す。表５に見ることができるように、化合物３０は、ゲノムに凝集誘導性配列がコードされ、配列が化合物３０を設計するように用いられたスタフィロコッカス・エピデルミデスに対して非常に効果的であるだけでなく、他の臨床的に重要な病原体、例えば、メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）、Ｓ．アウレウスおよびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、院内病原エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、食中毒病原体群：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．セレウス、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対して非常に効果的である。抗生物質耐性株に対する活性は、抗生物質感受性株に対するのとちょうど同じくらいに高いことを見出すことは非常に有望である。これは、これらの抗微生物化合物の作用の全く新規な機構を示す。抗生物質耐性は、病院において主要な問題であるため、完全に異なる分子が臨床応用に大きな視点を提供する。
【０５４９】
本発明者らは、最近になって、Ｃ３０もまた、表４に示す化合物のいくつかのように、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に対して活性であることを見出した（表５には示されていない）。コリネバクテリウムの細胞壁組成がマイコバクテリアの細胞壁組成を模倣するため、コリネバクテリアに対する活性は、新しい抗結核ペプチド設計の観点から有望である。マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の細胞壁の構造が特に注目するに値するが、それは、原核生物の中で固有であり、細菌に関する病原性の主な決定要因であるためである。細胞壁複合体はペプチドグリカンを含むが、それ以外には、複合脂質から構成されている。マイコバクテリアの細胞壁の６０％以上が脂質である。ＭＴＢの細胞壁の脂質画分は、３つの主要な成分、ミコール酸、コード因子およびワックス−Ｄからなる。異常な構造を伴うマイコバクテリアの細胞壁の低い透過性は、現在、この抵抗性の主な因子であることが知られている。このようにして、親水性剤は細胞壁をゆっくりと横切り、これは、マイコバクテリアのポーリンが溶質の浸透性を可能にするには非効率的であり、低濃度で存在しているためである。親油性剤は、おそらく、異常に低い流動性および異常な厚さである脂質二重層によって減速される。
【０５５０】
グラム陰性菌に対するＣ３０の高いＭＩＣ値は、Ｃ３０の構造がタンデムインターフェラーペプチド（すなわち、２つの同一の凝集誘導性ストレッチ（２つの同一のＹ部分）を有するペプチド）であるという事実を反映している可能性がある。最近の証拠は、単一のインターフェラーペプチドもまた、グラム陰性菌に対して低いＭＩＣ値を提示することを示している。特定の作用機序に本発明を限定することなしに、これは、グラム陰性菌が、単一のインターフェラーペプチドと比較して、タンデムインターフェラーの浸潤を制限するそれらの細菌細胞壁において小さい細孔を有するという事実を指している可能性がある。しかしながら、凝集誘導性ストレッチを含むいくつかのタンパク質が存在し、これらのタンパク質群がグラム陽性菌およびグラム陰性菌において同一ではないことも留意されたい。このようにして、１つ以上の異なる標的タンパク質は、グラム陰性菌よりもグラム陽性菌に凝集されていることもあり得る。
【０５５１】
【表５】
2014514917.tif 000010
【０５５２】
２．２．２．ペプチド活性における純度および修飾の効果
本発明者らは、非常に純粋な形態で合成された場合に、インターフェラーペプチド活性の有意な（最大５倍）の改善を観察した。この改善された活性の結果を表６に示す。重要なことには、この活性の改善は、哺乳動物細胞に対する毒性を増加させない（データを示さない）。また、本発明者らは、ビオチンでタグ化されたインターフェラーペプチドが、非タグ化のインターフェラーペプチドと同程度に活性であることを見出した。後者は、異なる検出方法を用いることができることを意味する。
【０５５３】
【表６】
2014514917.tif 000011
【０５５４】
Ｈｉｔ２４は表に示されていない。Ｈｉｔ２４の配列（すなわち、ＲＲＬＦＮＦＬＫＲＧＳＲＬＦＮＦＬＫＲ（配列番号７４））は、Ｈｉｔ１１の修飾された配列であり（表４参照）、Ｈｉｔ２４は前方に二重のゲートキーパーを有する。それはすべての細菌に対しては試験されていないが、Ｓ．アウレウスＡＴＣＣ２９２１３（ＭＩＣ値１２．５μｇ／ｍｌ）、Ｓ．エピデルミデスＡＴＣＣ１２２２８（ＭＩＣ１．５μｇ／ｍｌ）およびグラム陰性Ｅ．クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）（２５μｇ／ｍｌ）に対して顕著な活性を有する。
【０５５５】
ビオチン化とは別に、インターフェラーのいくつかの他の修飾を試験した。これらはＣ３０に基づいており、Ｃ３０のＤ−アミノ酸バージョンを含む。
【０５５６】
試験された別の修飾は、ペプチドＣ３０のＰＥＧ化である。ペプチドＣ３０の異なる位置におけるＰＥＧの共有結合を試験した。これは、内部で（すなわち、Ｚｉリンカー部分として）およびＮ末端部分としての両方で使用された。ＰＥＧ導入の目的は、主に、インビボにおいて良好な化合物物の安定性および良好な溶解性を提供することであった。
【０５５７】
以下の化合物は、Ｃ３０配列（配列番号１１５）に基づいて合成された：
Ｐ２１７０：Ａｃ−ＲＩＬＬＧＬＩＲＲＧＳＲＩＬＬＧＬＩＲＲ−ＣＯＮＨ２、Ｃ３０のアセチル化およびアミド化バージョン。
【０５５８】
Ｐ２１７５：ＮＨ２−ＲＩＬＬＧＬＩＲＲ（Ｐｅｇ）２ＲＩＬＬＧＬＩＲＲ−ＣＯＮＨ２、凝集領域間のＺ１リンカーが、ＧＳアミノ酸配列の代わりに、２つのＰＥＧ単位（すなわち、エーテル結合によって連結された２つのエチレンオキシド単位）からなる、Ｃ３０のアミド化バージョン。
【０５５９】
Ｐ２１５１：ＮＨ２−ＲＩＬＬＧＬＩＲＲＧＳＲＩＬＬＧＬＩＲＲ−ＯＨ、正常なＣ３０であるが、異なる化学ペプチド合成を用いて調製された。
【０５６０】
Ｐ２１５３：ＮＨ２−（Ｐｅｇ）２ＲＩＬＬＧＬＩＲＲＧＳＲＩＬＬＧＬＩＲＲ−ＯＨ、２つのＰＥＧ単位にＮ末端に融合したＣ３０。これは、２つのＰＥＧ単位からなる追加のＺ０部分を有するＣ３０として表現することもできる。
【０５６１】
Ｐ２１５４：ＮＨ２−Ｐｅｇ３ＲＩＬＬＧＬＩＲＲＧＳＲＩＬＬＧＬＩＲＲ−ＯＨ、３つのＰＥＧ単位にＮ末端に融合したＣ３０。これは、３つのＰＥＧ単位からなる追加のＺ０部分を有するＣ３０として表現することもできる。
【０５６２】
ＤＡＡ：すべてのアミノ酸がＤアミノ酸であるＣ３０のＤ−アミノ酸バージョン。
【０５６３】
これらのペプチドは、元のスクリーニングと同じ方法で試験された。マイクロブロス希釈法は、ペプチド活性のスクリーニングのために使用されたＣＡＭＨＢ（ＥＭＥＡガイドラインに従う）において２倍希釈系列で使用され、濃度範囲は０．３μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌであった。
【０５６４】
結果を表７に示す。Ｐ２１７０およびＰ２１７５について、ペプチド合成中に得られた２つのピークに対応する２つの画分を試験した。これらは、それぞれ、Ｐ１およびＰ２として示されている。
【０５６５】
【表７】
2014514917.tif 000012
【０５６６】
表から見ることができるように、すべての修飾されたペプチドは、修飾されていないＣ３０に匹敵する抗菌活性を保持する。したがって、Ｄ−アミノ酸およびＰＥＧ化などの修飾は、本明細書に示される分子の活性に負の影響を及ぼさない。これは、ＭＩＣ値（したがって、抗菌活性）はＰＥＧ化の影響を受けていないことを特に助長している。
【０５６７】
２．２．３  非凝集対照ペプチド
凝集因子の設計原理を確認するために、本発明者らは、本明細書では「スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」ペプチドと呼ばれる対照ペプチドを構築した。これらは、元の凝集因子と同じアミノ酸から構成され（したがって、同一電荷を有する）が、順序は乱雑であり、そのため、これらは、明細書に示されている設計原理にもはや従わない。これらのペプチドは、細菌増殖または生存の阻害をもたらさない。
【０５６８】
２．２．４．１つよりも多い細菌タンパク質の標的化
上述したように、最初のスクリーニングは、スタフィロコッカス・エピデルミデスおよびスタフィロコッカス・アウレウスのゲノムによりコードされるタンパク質に存在する凝集性領域の同定に基づいていた。非常に有望な化合物であるＣ３０は、これらのゲノム内の１つよりも多いタンパク質に存在する凝集誘導配列を含むため、これは新しい化合物の設計に用いることができると仮定された。このようにして、次の段階において、本発明者らは、１つよりも多い予期された標的がＳ．エピデルミデスおよびＳ．アウレウスの細菌細胞（すなわち、これらの細菌のいずれかによりコードされる１つよりも多いタンパク質に存在するベータ−凝集配列を含む）において利用可能であるインターフェラーペプチドを設計した。このいわゆる「ｍｔｏｐ」インターフェラーペプチドスクリーニングは、抗菌インターフェラーペプチドの設計が、細菌細胞内で利用可能な多数の標的に基づくことができることを指示する非常に高いヒット率を示した（すなわち、特定のＴＡＮＧＯ領域を含む標的タンパク質が多くなるにつれて、インターフェラーを用いて殺菌効果を得る可能性が高くなる。）。これは論理的である。なぜなら、より多くのタンパク質が標的化されるにつれて、１つ以上のこれらのタンパク質の阻害が本質的な機能を阻害する機会が高くなるためである。表８は、細菌中の１つよりも多い標的タンパク質との直面に基づいて設計された二重特異性のインターフェラーペプチドのＭＩＣ活性を示す。表５において使用されているインターフェラーは、マイクロフォーマットで合成されたことに言及することが重要である；これは、本発明者らが、高純度のインターフェラーペプチドに対してインターフェラー活性の顕著な改善を期待していることを意味する。
【０５６９】
表５に列挙されている分子は、ｎが２であり、Ｘ１およびＸ４が２個のアミノ酸であり、Ｙ１およびＹ２が６個のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ３が１個のアミノ酸であり、Ｚ１が２個のアミノ酸リンカーであり、Ｚ２は存在しない、本出願において概要されている式に対応する。
【０５７０】
【表８】
2014514917.tif 000013
【０５７１】
２．３  インターフェラー分子の抗微生物死滅動力学
時間−死滅曲線を殺菌活性の動力学を研究するために得た。化合物Ｃ３０、Ｈｉｔ５０およびＣ２９（配列については上記参照）は、化合物のＭＩＣおよび２倍のＭＩＣ値にて、Ｓ．エピデルミデス株ＡＴＣＣ１２２２８およびＳ．アウレウスＡＴＣＣに対して試験された。化合物Ｃ３０は、５分以内に生菌数を１００％減少させ、一方、Ｈｉｔ５０は、同じインキュベーション時間後、生存数を約３ｌｏｇ単位減少させることが示され、両者はそのＭＩＣ値を等しくする濃度とした（図１１参照）。ＭＩＣ値を二倍にするために濃度を二倍にすることにより、より速い死滅をもたらしたので、すべてのペプチドは、濃度依存的な活性を示した。例えば、Ｃ２９についてはＣＦＵ／ｍｌの数を１倍減少するのに必要な時間は６０分（最小阻害濃度で）であり、２×ＭＩＣについてはほんの１０分であった。より速い殺菌効果を有する抗生物質は、一般的に、より効率的であると考えられ、このような化合物に対する耐性はよりゆっくりと生じるため、これは重要な効果である。
【０５７２】
２．４  抗菌性インターフェラーに対する細菌耐性の生成のモニタリング
インターフェラーＣ３０に対する耐性を生じさせるＳ．アウレウスの臨床株ＭＲＳＡ２０４の能力は、繰り返しの継代およびＭＩＣ決定により評価された。ある日に半分のＭＩＣにてＣ３０の存在下で増殖しているＳ．アウレウス細胞は、翌日、同化合物のＭＩＣアッセイにおいて使用された。このようにして、細菌細胞は、１５日間にわたって継代されながら、半分のＭＩＣ値で単一の化合物（すなわち、Ｃ３０）に継続的に曝露した。最初のＭＩＣの２分の１における１０回の継代は、ＭＩＣを２倍に高めるために必要とされるため、インターフェラーペプチドＣ３０への継続的な曝露は、耐性を生じさせる小さな傾向をもたらしただけであることを実証し得た。ＭＩＣ以下での９回の継代は、ＭＩＣが２倍に上昇される前に必要とされたが、しかしながら、この耐性は経時的に維持されるには成功せず、１２回の継代後、ＭＩＣはその元の値に戻った。図１５を参照されたい。同様の結果は、上記で列挙されたペプチドの他のものを用いて得られた。耐性が長期間（１５日の代わりに３１日）にわたってモニターされた場合、ＭＩＣ値のさらなる増加は観察されなかった（さらに以下参照）。
【０５７３】
対照的に、リファンピンのＭＩＣは、同じ期間全体で有意に増大する（１５日間で５１２倍程度）−リファンピンは、自発的染色体の点突然変異により非常に簡単に耐性が生じることが知られている薬剤である。試験されたペプチドと同様に、これらの条件下でのバンコマイシンのＭＩＣは、２倍に増加しただけであった；バンコマイシンは、一般的に、種間での水平方向の遺伝的伝達が除外される条件下で、自発的耐性の発現が生じる可能性がほとんどない抗生物質として見なされている。化合物が、タンパク質内部に埋め込まれている疎水性領域を標的とすることに言及することは価値がある。これはミスフォールドされた（非機能的）タンパク質を生じさせるため、これらの領域は、一般的によく保存され、容易に突然変異させ得ないと考えられている。特定の機構に束縛されることなしに、これは、観察された遅い耐性の発現に寄与する場合がある。
【０５７４】
耐性発現は確率過程であるため、本発明者らは、同じ微量液体希釈法（常に４点測定）を使用し、さらにアンピシリンおよびゲンタマイシンのような一般的な抗生物質を添加することによって、従前の実験を繰り返した。Ｃ３０とＣ２９の両方は、アンピシリンよりも非常に遅い耐性発現を示し、ＭＩＣ値はゲンタマイシンおよびアンピシリンに比べて顕著に小さく増加することを見ることができる（図１２）。ゲンタマイシンの初期ＭＩＣ値は化合物のものよりも低いため、倍の増加は、図に示すものよりもさらにはるかに顕著であることに留意されたい。
【０５７５】
第二シリーズの実験は、ＭＲＳＡ株３２６を用いた、所定濃度のペプチドＣ３０で補足された２ｍｌのＢＨＩブロスを接種することからなっていた。前述のように、毎日、ＭＩＣを試験した。培地中のペプチド濃度は、前日からのＭＩＣに従って調整され、そのため増殖培地は耐性の選択を支持した。これを３１日間、３回繰り返した。Ｃ３０についてのＭＩＣは、従前の実験中と同様の変動を示し、４倍を超えて増加することはなかった。実験の最終日に、ＭＩＣは１２．５μｇ／ｍｌであった。比較においては、アンピシリン処理された細胞についてのＭＩＣレベルは高く変動し、７倍まで増加した（実験終了時のＭＩＣ＝１００μｇ／ｍｌ）。一晩のインキュベーション中にアンピシリン濃度を増加させることによって、耐性細菌の選択およびＭＩＣレベルのさらなる増加をもたらし、一方、Ｃ３０濃度の増加は、耐性発現を加速させなかった。結果を図１３に示す。
【０５７６】
興味深いことに、培養からのＣ３０の除去は、ＭＩＣレベルを５０％減少させるまたは菌株の感受性に何ら影響を及ぼさない。
【０５７７】
２．５  抗菌性インターフェラーによって引き起こされる膜透過性
生きた微生物細胞の膜上におけるペプチドインターフェラーの効果は、膜非透過性のＤＮＡ結合色素Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて研究された。膜透過性は、蛍光の増加によってモニターされる色素の浸潤を可能にする。Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ核酸染色を用いて、経時的に細菌の膜透過性をモニターした（１５分の一定時間での２５μｇ／ｍｌの一定のインターフェラーペプチド濃度（図１８参照）およびペプチドの種々の濃度（図１９参照）による）。本発明者らは、最初の５分でＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ結合が急激に増加し、この時間点の後に安定になり、５分後にほんの僅かにさらに増加したことを観察した。このさらなる僅かな増加は、脂質パッキングにおける局所的な欠失を誘発し、さらに増大された透過性を引き起こす、細菌の脂質二重層への両親媒性インターフェラーペプチドの迅速な挿入に起因し得る。非常に効率的にスタフィロコッカスを溶解する溶解制御剤（リソスタフィン）と比較して、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎシグナルは、抗菌インターフェラーで処理された細菌については僅かに低かった。図１１は、３μｇ／ｍｌ（ほぼそのＭＩＣ値である）の化合物３０で処理されたＳ．アウレウスの死滅曲線は、これらの細菌を非常に急速に破壊することができたことを示す（死滅は濃度依存的であったためである）；したがって、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ結合における同等に速い立ち上がりは、膜溶解が作用機序である場合に生じることが期待された。しかしながら、これはそういう場合ではない。膜溶解が細胞死の主な原因ではないという仮説を支持するために、本発明者らは、一次ペプチド−標的相互作用に関与する細胞内標的を検証するためのプロテオミクスアプローチを用いて、および無傷細胞を示すために電子顕微鏡分析を用いて進めてきた。
【０５７８】
次の段階において、本発明者らは、ペプチドインターフェラーＣ３０の膜電位（ＭＰ）変化を研究した。それに加えて、ＢａｃＬｉｇｈｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。図２０は、化合物Ｃ３０で処理された細菌細胞において、わずか５分後に赤色蛍光の有意な減少が観察され、ＭＰの完全脱分極を示す等しい赤色：緑色比を表したことを示す。比較において、溶解制御（リゾスタフィン）は、非常に遅い膜の脱分極を示した。Ｃ３０で処理された細胞のドットプロットパターンは、脱分極制御に非常に類似している。これらのデータを合わせた場合、本発明者らは、５分間のＣ３０処理後に、ある程度まで膜透過性を示す、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ核酸染色の流入につながるＭＰにおける部分的崩壊があると仮定することができる。これらのインターフェラーによって引き起こされた脱分極は、濃度依存的であるというよりも時間依存的でることを示した（データを示さず）。これらの結果は、抗菌インターフェラーの迅速な殺菌作用機序をさらに証明する。
【０５７９】
２．６  細菌における凝集体の検出
凝集体は、２種のアミロイド診断色素（チオフラビン−Ｔおよびコンゴーレッド）を用いて抗菌インターフェラーで処理された細菌において視覚化された。チオフラビン−Ｔ蛍光は、ベータ−凝集構造の拡張シート立体構造に特異的なマーカーとして報告されている。この色素はアミロイド線維に結合すると、遊離色素と比較してＴｈ−Ｔの蛍光が非常に増強される。Ｔｈ−Ｔは、ペプチドインターフェラーが、細菌細胞内で凝集を誘導するかどうかを調べるために細菌アッセイにおいて使用された。対照として、本発明者らは、外部の自己凝集インターフェラーペプチドが疑似シグナルを与えていないことを確認するために、生理学的水において２倍希釈したペプチドインターフェラーのみを用いた。本発明者らは、インターフェラーペプチドで処理された細菌細胞中でのＴｈ−Ｔ色素結合の有意な濃度依存的な増加を明確に観察し（図２１参照）、これは、インターフェラーペプチドで処理された細菌細胞においてより多くのβ−シート構造の存在を示す。さらに、本発明者らはまた、コンゴーレッド（ＣＲ）が凝集したベータ構造と結合し（図２２参照）、この結合が４９０ｎｍから５４０ｎｍへとＣＲ最大吸光度における特徴的な変化を誘導することを示した。この実験は、Ｔｈ−Ｔ濃度依存的な結合実験を確認し、独立して、ペプチド処理中のβ−構造形成の増加を確認する。
【０５８０】
２．７  細菌におけるインターフェラーによって誘導される形態学的変化
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、インターフェラーペプチドによって誘導された細菌における超構造変化を調べた。スタフィロコッカスとバチルスの両方を比較のために使用した。なお、バチルス・セレウスおよびスタフィロコッカス・アウレウスはともに、抗菌インターフェラーＣ３０を用いた５分間の処理後、滑面および無傷な面を提示することが観察でき、それらのエンベロープには明らかなクレーター、孔および細孔を示さなかった。しかしながら、約２０分後、バチルスの表面が、スタフィロコッカスにおいてはおそらくその小さな丸いサイズに起因して見られなかった、処理後に皺および縮みを開始した。両方の細菌種において、細胞の内容物は、２０分間の処理後に既にバチルスにおいて（図２３、右パネル下段参照）、および１時間程度の後にスタフィロコッカス・アウレウスにおいて（図２４参照）、放出され始めた。健常な細胞分裂中に、バチルス・セレウスは、母細胞から分離しない、非常に長い鎖を形成する。しかしながら、ペプチドＣ３０で処理されたバチルス・セレウスの細菌細胞集団において、これらの長い鎖はあまり一般的ではなく、細胞分裂の阻害を示すことが記録された。同様の結論は、未処理の健常な細菌細胞と比較して、有意に少なく処理されたスタフィロコッカスが分裂隔壁を含むという事実から引き出すことができた。最後に、本発明者らは、ＳＥＭデータが急速溶解の欠如を示していると結論付けることができる。さらに、化合物３０はスタフィロコッカスを死滅させるのに５−１０分という短い時間を必要とすることが分かったので、本発明者らは、抗菌インターフェラーを用いた１時間の処理後でさえ、明確にその場合でない細菌細胞の非常に迅速な破裂を期待した。さらに本発明者らの仮説を支持するために、本発明者らはまた、Ｃ３０で処理されたスタフィロコッカスの超薄切片を調べた。また、これらの処理された細胞の透過型電子顕微鏡も、明らかな細胞質の収縮があるが、溶解の欠如を確認する（図２５および２６参照）。さらに、核酸の領域における電子密度の増加があり、これはその凝縮を示唆している。ＤＮＡ凝縮は、アポトーシス応答の後期段階の一つである。アポトーシス細胞死は、自己分解活性に関与する、ＭａｒＲファミリー転写調節因子の発現の３倍増加を明らかにした、本発明者らの二次元ゲル分析によって支持され得た。化合物３０で処理されたスタフィロコッカス・アウレウスの超薄切片の透過電子顕微鏡分析は、従前にメソゾームとして報告されていた膜構造（図２５の矢印を参照）を示した。
免疫電子顕微鏡分析
免疫標識された凝集因子の局在化は、透過型電子顕微鏡を用いて研究された。この目的のために、ペプチドＣ３０は、そのＮ末端に５（６）カルボキシフルオレセインで標識された（ＦＩＴＣタグ）。
【０５８１】
指数増殖期の細菌を３０分間ＦＩＴＣタグ化されたペプチド（２×ＭＩＣ値）で処理し、二重強力固定液（０．１ＭのＰ−緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド＋０．４％グルタルアルデヒド、ｐＨ＝７．４）を用いて１０分間、さらに単一の強力固定液（上記の半分）を用いて１時間固定した。いくつかの洗浄段階（Ｐ−緩衝液およびＰ−緩衝液／グリシン）後、ペレットを１２％ゼラチン／Ｐ−緩衝液に懸濁し、氷上でインキュベートし、小さな立方体に切断し、２．３Ｍショ糖中で一晩インキュベートするように設定した。試料は、標本ホルダーにマウントされ、液体窒素中で凍結され、ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｓ／ＦＣＳｃｒｙｏｕｌｔｙｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ）を用いて、−１００℃にてダイヤモンドナイフにより切断された。超薄片の解凍された切片をＦｏｒｍａｖａｒ−炭素被覆銅グリッド（４００メッシュ）上に配置し、グリシン−ＰＢＳを含む液滴上に毎回、１０分間、６回、切断部分を浮遊させた。次に、グリッドは、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中で５分間洗浄され、ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）でブロックされ、抗ＦＩＴＣヤギ一次抗体（Ａｂｃａｍ）（ＰＢＳ緩衝液中で１：１０００に希釈）の液滴中で３０分間インキュベートされ、ＰＢＳ緩衝液中で５回洗浄され、ＰＢＳ緩衝液中で１：５０に希釈されたウサギ抗ヤギタンパク質−Ａ−金コンジュゲート（５ｎｍ；ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＥＭ  Ｒａｇ５）とともに３０分間インキュベートされた。次いで、切断部分は、ＰＢＳ中で５分間、６回、およびｄｄＨ２Ｏ中で３回洗浄された。グリッドは、氷上で酢酸ウラニル−メチルセルロース（１％）で５分間染色され、注意深く乾燥され、８０ｋＶの加速電圧で操作するＪＥＯＬ  ＪＥＭ２１００透過型電子顕微鏡を用いて観察された。異なる制御手順において、抗体の主要な非特異的結合は検出されなかった。バックグラウンド標識は、最小限の問題であり、時間の大部分は、タンパク質−Ａ−金インキュベーション後の不十分な洗浄段階に結び付き、最適化された。
【０５８２】
３０分間の曝露後、ＦＩＴＣ−Ｃ３０ペプチドは、細菌の細胞質に主に存在し、凝集体の形態で一緒にクラスター化された（図２７、赤色の矢印）。非特異的な結合は観察されなかったため、免疫金標識された粒子はペプチドの存在を表す。これらの結果はペプチドの細胞内活性を確認する。さらに、ペプチドで処理された細胞は、明らかに阻害された分裂プロセスを有している。未処理のスタフィロコッカスと比較した場合、ペプチド処理された細胞の分裂は非対称である；隔壁もまた、非常に厚く、それらの縁も失っていた。興味深いことに、凝集体クラスターは、細胞の一部においてのみ見ることができ、これは、凝集体の継承に対する進化的圧力を示唆し、Ｅ．コリにおいて従前報告されたプロセスである（Ｒｏｋｎｅｙ，Ａ．、Ｍ．Ｓｈａｇａｎら（２００９）「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｓ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｅｓ  ｂｙ  ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３９２（３）：５８９−６０１；Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ａ．Ｂ．、Ｒ．Ｍａｄｄｅｎら、（２００８）「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ．」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５（８）：３０７６−３０８１．）。
【０５８３】
処理された細菌の形態素分析および膜透過性研究は、インターフェラーペプチドが細菌の細胞質膜にそれ自体を挿入し、急速な膜の脱分極およびその完全性の欠失をもたらすことを示唆しているようである。特定の機構に束縛されることなしに、これは、それらの作用の殺菌モードではなく、むしろ「副作用」であるように考えられる。インターフェラーペプチドは、細菌のゲノムにおいて、インターフェラー分子中にも存在するβ−凝集領域をコードする細菌にのみ活性である。インターフェラーは、それらの標的の凝集を誘導し、細胞死をもたらすことができる。したがって、細胞内の標的凝集および膜効果の組み合わせが、細菌の迅速な細胞死をもたらすことが仮定される。
【０５８４】
２．８  哺乳動物細胞における抗菌性インターフェラーの毒性
２．８．１溶血アッセイ
真核細胞上の非選択的な溶解活性から選択的な抗菌活性を区別するために、本発明者らは、ヒト赤血球を用いて、もっとも活発なインターフェラーペプチドの溶解能力を測定した。図１４に示すように、化合物：Ｃ２９、Ｈｉｔ５７Ａ、Ｈｉｔ５０およびＨｉｔ２４は、臨床的に関連した濃度で有意な溶血活性を示さず、一方、ペプチドＣ３０およびＨｉｔ１は、２５μｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌの間の範囲でＨＤ５０ｓ（５０％の赤血球が溶解される濃度）を有した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎは、陽性対照として使用され、ＲＢＣの１００％の溶解を引き起こす。インターフェラーペプチドは、それらのＭＩＣ値で主要な溶血を示さず（表４参照）、いくつかのインターフェラーペプチドは、１００μｇ／ｍｌの高い濃度でさえ非溶血性であることを実証することができた。
【０５８５】
２．８．２  哺乳動物細胞におけるアラマーブルーアッセイおよび乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイ
インターフェラーペプチドＨｉｔ５０と比較した場合、異なる濃度の抗菌インターフェラーペプチドＣ３０で処理されたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞は、高いレベルのＬＤＨ放出をもたらした。細胞外ＬＤＨの濃度依存的増加が観察され、これは、これらのペプチドが原形質膜の完全性のいくらかの欠失を引き起こしたことを示す。図１６は、ペプチドインターフェラーＣ３０が、５０μｇ／ｍｌまたはそれを超えて使用された場合、５０％よりも高くＬＤＨ放出を引き起こし、一方、ペプチドインターフェラーｈｉｔ５０は、同濃度でほんの５％のＬＤＨ放出を引き起こしたことを示す（表４参照）。
【０５８６】
アラマーブルーアッセイは、ペプチドの存在下で、経時的に細胞増殖回復の全割合のモニタリングが可能であった。大部分のペプチドインターフェラー（１００μｇ／ｍｌと同程度に高い濃度）について、本発明者らは、哺乳動物細胞の８０−１００％が３−２４時間以内に全増殖回復を示すことを見出した。図１７は、２種のペプチドインターフェラーについてのヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株）におけるアラマーブルー細胞毒性を示す。高濃度のＣ３０によって引き起こされるＬＤＨ放出にも関わらず、１００μｇ／ｍｌより低い濃度を用いた場合、哺乳動物細胞の生存率がこの化合物の投与によって有意に影響を受けないことを見ることができる。データは、細菌について抗菌ペプチドインターフェラーの特異性を示し、哺乳動物細胞においては僅かな最小効果を有した。
【０５８７】
２．８．３  浸潤アッセイ
このアッセイにおいて、ＨＣＴ１１６細胞の単層（ヒト結腸腫瘍細胞株）はマイクロウェルプレートの底部で培養された。翌日、新鮮なＳ．アウレウスＡＴＣＣ２７８５３細菌が添加され（約１０６ＣＦＵ／ｍｌ）、陰性の未感染対照を含めた。感染の９０分後、異なる希釈のペプチドを添加し、培養物をさらに１時間インキュベートした。良好な細胞内の活性を有すると考えられるため、陽性対照としてゲンタマイシンを用いた。各ウェルは、任意の細胞外の細菌を取り除くために、予め加温した生理学的水で洗浄され、次に、哺乳動物細胞から捕捉されたすべての細菌を放出させるために、１％のＴｒｉｔｏｎで処理された。ウェルの内容物を連続希釈し、ＣＦＵカウント用のＴＳＡ寒天プレート上に播種した。このアッセイの結果を図２８に示す。
【０５８８】
注目すべきことには、ペプチド濃度は、同様の抗菌活性を維持しながら、さらに、１２．５μｇ／ｍｌ程度の低さに減少することができる。これは、おそらく、高濃度のペプチドで生じる毒性の副作用を回避することは興味深い。いずれにせよ、これらの結果は、凝集因子ペプチドが殺菌効果に関連する濃度で哺乳動物細胞によって許容され、培養されたヒト結腸腫瘍（ＨＣＴ−１１６）細胞に存在するＳ．アウレウスを標的とし得る（すなわち、それらが細胞に取り込まれ、殺菌効果を示す。）ことを示す。
【０５８９】
２．９  標的化されたタンパク質のプロテオーム分析
凝集技術は、短いアミノ酸ストレッチが、高い凝集傾向（例えばＴＡＮＧＯスコアによって評価される）を有し、標的タンパク質から誘導され、そのタンパク質の凝集を誘導することができるという仮定に基づいている。この仮説は、不溶性画分のショットガンプロテオーム分析によって確認された。本発明者らの凝集因子ペプチドがその標的との特異的相互作用を介して機能し、その凝集を引き起こすと仮定するとすれば、標的は不溶性画分に入ることが予期される。このため、本発明者らは、不溶性と可溶性の２つの画分に溶解物を分け、これらを未処理の細胞画分と比較することに決定した。処理（ＴＣ３０）と未処理（ＮＴ）の不溶性画分の両方に存在するタンパク質は、非特異的な自然に不溶性タンパク質のバックグラウンドを示すと仮定された。さらに、本発明者らは、処理と未処理の細菌の両方の可溶性画分を調べ、期待した通り、対象とするタンパク質は、未処理画分にのみ存在していた。これは、標的探索のための以下の基準を用いたことを意味する：
１）潜在的な凝集標的は、未処理細胞の不溶性画分におけるタンパク質を引いた、Ｃ３０処理された細胞の不溶性画分におけるタンパク質リストから得られたタンパク質である
２）Ｃ３０処理された細胞の可溶性画分におけるタンパク質を引いた、Ｃ３０処理された細胞の不溶性画分におけるタンパク質は、不溶性ＮＴ画分に存在せず、および可溶性ＮＴ画分に存在する場合のみ、およびそれがそのアミノ酸配列内のｔａｎｇｏ配列またはその一部を含む場合のみ潜在的な標的である。
【０５９０】
ＳＯＳＰＡ（ソウンオフショットガンプロテオーム解析）法によって、本発明者らは、凝集因子のそれぞれについて標的タンパク質を確認することができる。この方法で、本発明者らは、２種の細菌株：Ｓ．アウレウスおよびＢ．セレウスにおいて、化合物３０の標的をこれまでに確認してきた。両方の処理された種の不溶性画分は、インシリコで予期されたタンパク質：すなわち、実際に、そのＦＡＳＴＡ配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ６３ＨＢ８）内にＴａｎｇｏストレッチを含む、遺伝的コンピテンスＣｌｐＣ／ｍｅｃＢの負の調節因子を含んでいた。期待した通り、Ｃ３０の標的タンパク質は、ペプチド処理時に可溶性から不溶性画分にシフトした。
【０５９１】
さらに、本発明者らは、異なる画分をブロットし、特異的認識ペプチドを用いて標的検出のためにこれらのブロットを使用した。再度、本発明者らは、Ｃ３０処理されたバチルス・セレウスの不溶性画分において、標的タンパク質ＣｌｐＣ／ＭｅｃＢ（９０ｋＤａ）の存在を確認することができた（図２９）。
【０５９２】
総じてこれらの結果は、凝集因子が細菌膜（界面活性）と相互作用する能力を有するという本発明者らの仮説を証明するため、これらは、細菌の細胞質に浸透し、標的が接近可能なｔａｎｇｏ領域を有する場合、凝集因子はそれに結合し、それを凝集し、よって、さらなる反応カスケードを播種する。文献において既に述べられているように、凝集体は、脂質再配列および膜透過性化を引き起こす。広範囲の電子顕微鏡分析は、凝集因子が、外部からではなく、細胞内から膜に作用することを証明する。本発明者らは、凝集因子が、細胞質の標的タンパク質と後期には膜自体の両方に作用し、急速な細胞死をもたらすと結論付ける。
【０５９３】
また、ＳＯＳＰＡにより得られたデータは、二次元ゲル電気泳動を用いて確認することができた（データを示さず）。
【０５９４】
２．１０  抗菌性インターフェラーの血清安定性および血清中の検出
血清の存在下でのインターフェラー活性を評価するために、Ｓ．アウレウスのＭＩＣ値は、５０％ウシ胎児血清を含む培地中のいくつかの抗菌ペプチドインターフェラーについて確立された（上述）。期待されるように、表９は、ＭＩＣ値が、血清の存在下でやや高いが、重要なことには、インターフェラーペプチドは、抗菌インターフェラーペプチドの可能なインビボ使用を示すそれらの抗菌活性を保持していたことを示す。
【０５９５】
【表９】
2014514917.tif 000014
【０５９６】
血清中のペプチドを検出するために、ドットブロットアッセイを用いた。また、ペプチドは、ＰＢＳに希釈され、ブロットされ、および定量ガイドとして使用された。１００μｇ／ｍｌから開始して、ドットは、ペプチドを２倍希釈して、ニトロセルロース膜上にスポットされた。
【０５９７】
ペプチドがビオチン標識されたため、ストレプトアビジン−ＨＲＰをプロービング用に使用した。この方法は、３００μｇ／ｍｌと６μｇ／ｍｌ間の範囲における血清検出を首尾よく行うことを示唆する線形応答があった（図３０）。ペプチドの検出の詳細については、実施例４を参照されたい。
【０５９８】
２．１１  ラットおよびマウスにおける抗菌インターフェラーのインビボ毒性の予備的評価
インビボで抗菌ペプチドインターフェラーの毒性を評価するために、計量して約±３５０グラムである８匹の無菌フィッシャー雄性および雌性ラットは、緩衝液Ａ：ヒスチジン−酢酸塩（ｐＨ６．５）と緩衝液Ｂ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中のペプチドインターフェラーＣ３０で注射された。２匹のラットは、１．５ｍｇ／ｋｇの濃度で注射され、２匹は、３ｍｇ／ｋｇの濃度で注射された。これらは、尾静脈に単一の繰り返しをしない注射であった。ラットは、数日間にわたって観察されたが、死亡率も他の副作用も明らかに見えなかった。
【０５９９】
さらに、６週齢の雌性Ｓｗｉｓｓマウスの３グループは、１週間の期間にわたって用量増加したＣ３０を用いて注射された。Ｃ３０は、生理学的水に溶解され、１日あたり１回注入された。最初の３日においては、尾静脈に注射され（注射あたり１５０μｌ）、残りの２日間はＩＰ注射（注射あたり３００μｌ）であった。第一の用量は、３ｍｇ／ｋｇから始まり、毎日の用量を徐々に増加させた。対照グループは、同体積の生理食塩水を受けた。ＩＶ注射のために分析された最高用量は５０ｍｇ／ｋｇであり、ＩＰ注射では１００ｍｇ／ｋｇであった。ＩＶ注射されたマウスは、死亡率および他の視認される副作用の兆候を示さなかった。しかしながら、ＩＰ注射されたマウスは、最大用量の１００ｍｇ／ｋｇ後に皮下病変隆起を発症し、これは、ペプチド溶液があまりにも濃く、不溶性の凝集体を形成したことを示唆した。処理されたマウスおよび対照マウスの臓器は、さらに組織学的分析に供された。全５回の注射後、血液を眼窩穿刺により採取し、分析した。血液中に異常は見出せなかった。
【０６００】
２．１２  化合物Ｃ３０のインビボでの有効性
動物：
計量して２１から２４ｇの６週齢、特定病原体未感染のＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓ雌性マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、インディアナ州インディアナポリス）は、すべての研究のために使用された。すべての実験手順は、地方の動物実験の倫理委員会によって承認された。
【０６０１】
Ｓ．アウレウスＭＲＳＡ３２６株の好中球減少マウスの大腿モデル
マウスは、実験的感染前に４日間（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）および１日間（１００ｍｇ／ｋｇ）、シクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内に注入することによって好中球減少にさせた。従前の研究は、この処方が、５日間、このモデルにおける好中球減少症を生じさせることを示した。新たに播種したＳ．アウレウスＭＲＳＡ３２６のブロス培養物は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ）中で一晩増殖させた。ＰＢＳ中で１：４，０００に希釈後、接種の細菌数は１０６と２×１０６ＣＦＵ／ｍｌの範囲であった。マウスは、接種直前に約４％のイソフルランにより手短に麻酔された。細菌懸濁液（０．０５ｍｌ）を各大腿（約５×１０４ＣＦＵ）に筋内注射した。処理は、細菌の接種の２時間後、ｉ．ｖ．（静脈）またはｉ．ｐ．（腹腔内）経路を通じて開始された。グループあたり３匹の４グループをこの研究に用いた。
・グループＡは緩衝液のみを受け、感染４時間後に屠殺された
・グループＢは１５ｍｇ／ｋｇのＣ３０（全量１５０μｌ）でｉ．ｖ．処理され、感染４時間後に屠殺された
・グループＣは感染の２時間および４時間後に３０ｍｇ／ｋｇの２回のｉ．ｐ．注射を受け、感染６時間後に屠殺された
・グループＤは１５ｍｇ／ｋｇのバンコマイシンをｉ．ｖ．注射され、感染４時間後に屠殺された。
【０６０２】
処理後の種々の時点で、３匹のマウスのグループは、人道的にＣＯ２窒息により屠殺された。大腿の筋肉量を均質化し、氷冷ＰＢＳ中で１０分の１に希釈し、５連続希釈液の１０μｌ分注液を血液寒天上に播種した（大腿ホモジネートあたり３つの独立した希釈を繰り返した。）。３７℃にて一晩のインキュベーション後、ＣＦＵは、各大腿に対して列挙され、ｌｏｇ１０ＣＦＵ／大腿として表された。
【０６０３】
図３１に示されるように、化合物Ｃ３０は、１５ｍｇ／ｋｇのボーラスｉ．ｖ．用量として注入された場合、初期接種の増殖を６．９Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ減少させることを示した。比較において、同用量のバンコマイシンは、増殖を８．７Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ減少させた。腹腔内の二倍用量のＣ３０は、大腿におけるＣＦＵ減少に迅速な効果を示さなかった（実際に投与経路を考慮して期待される）。この送達経路のさらなる時間依存性の評価が必要である。また、実験は、感染６時間後に屠殺された動物の対照グループを欠いている。それにもかかわらず、細菌は、未処理マウスにおいて接種４時間以内に４．７Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ増大した（１．７倍）ことを考慮すると、接種６時間後、ＣＦＵ量は対数的にさらに増加すべきことが主張され得た。このため、ｉ．ｐ．送達をまだ止めるべきではない。
【０６０４】
３．抗ウイルス応用
季節性インフルエンザ、２００９パンデミックＨ１Ｎ１発生および薬剤（アダマンタンおよびノイラミニダーゼ阻害剤）耐性インフルエンザウイルスの拡散増加によって引き起こされた疾患の負担は、多くの種類のインフルエンザウイルスまたはそのバリアントを阻害することができ、季節性ウイルスの変動性を受けにくい新しい薬物に対する医学的必要性があることを示す。現在、Ｒｏｃｈｅによるタミフル（登録商標）およびＧＳＫによるリレンザ（登録商標）は、インフルエンザ治療においてもっとも一般的な処方薬である。両方の薬はノイラミニダーゼタンパク質を標的とする。循環するインフルエンザウイルスは、タミフル（登録商標）に対して急速に耐性を発現、臨床開発中の抗インフルエンザ薬は非常に限られた数しかない。
【０６０５】
したがって、広範な標的特異性を確保するために、インフルエンザタンパク質の保存領域に対してインターフェラーを設計することに決定された。重要なことに、インターフェラー技術の作用機序は、感染症に対して指向されるワクチンおよび他のすべての現在使用されている抗ウイルス介入戦略とは根本的に異なっている。すなわち、それは、タンパク質の折り畳みの本質的なプロセスを標的とし、したがって、全く新規な分子の介入およびウイルス適応性への選択圧を表す。また、これまでの阻害に適していなかった新しいウイルス標的の同定を可能にする。さらに、抗ウイルスインターフェラーが高い安定性挙動を示せば、鼻腔内または気管内スプレーもしくはエアゾルを通じたインターフェラーの送達は感染部位への局所投与を可能にし、したがって、現在の処方薬と比較して、インターフェラーの追加の利点をなおも明らかにすることがある。
【０６０６】
インターフェラーの設計について、ウイルスポリメラーゼのサブユニット（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）および核タンパク質（ＮＰ）に特に焦点を合わせた。これらのタンパク質は大幅に保存され、後者のウイルスタンパク質は、ＮＰ凝集を誘発することによってその抗ウイルス効果を発揮する低分子化合物に対する標的として最近同定されたが、この実験薬に対して元々耐性であるインフルエンザウイルスが存在する（Ｋａｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；２８（６）：６００−５）。要約すると、これらの保存されたタンパク質を標的とするインターフェラーは、現在利用可能な抗ウイルス薬に対するインフルエンザウイルスの耐性増加への回答を与える。
【０６０７】
異なるインフルエンザＡウイルスタンパク質に対して指向された一連の３６個のペプチドは、予備実験において評価された。Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、無血清培地中でインターフェラーとともに１時間、３７℃にてプレインキュベートした。その後、細胞は、ＮＩＢＲＧ−１４（Ｈ５Ｎ１株）ウイルスまたはＰＲ８（Ｈ１Ｎ１株）ウイルスで１６時間感染させた。選択されたタンパク質の各々についてもっとも有望なペプチドをさらなる評価のために選択した。これらのペプチドを表１０に示す。
【０６０８】
【表１０】
2014514917.tif 000015
【０６０９】
配列の前方にあるＯおよびＺは、それぞれ光標識およびリンカーを指す。Ｏは５（６）−カルボキシフルオレセインを表す。使用されるリンカーは、Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミン酸］であり、４，７，１０−トリオキサトリデカン−スクシン酸（スクシンアミン酸）またはＴｔｄｓと呼ばれることもある。したがって、分子の構造は、式：
標識−Ｚ１−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ２−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４に対応し、すなわち、ｎ＝２であり、標識およびＺ１は上記で定義されている通りであり、４つすべてのＸ部分は単一のＲ残基に等しく、Ｚ２はＧＳリンカーであり、Ｙ１＝Ｙ２であり、インターフェラー１を除いて表の最終欄に列挙された配列に等しく、ここで、Ｙ部分はＬＩＱＬＩＶＳ（配列番号１２４）である。この凝集領域について、Ｎ末端のゲートキーパー残基は、タンパク質中の隣接残基に等しい。すべての凝集領域は、それらが標的とするインフルエンザＡタンパク質に固有である。
【０６１０】
フォローアップ実験として、ＭＤＣＫ細胞は、２４ウェルフォーマットにおいてコンフルエントな単層に増殖させた。インターフェラー（２００ｍｇ）を４５μｌのＤＭＳＯに溶解し、２ｍＭのストック溶液を得た。７μｌのインターフェラーストックを４００μｌのＰＢＳに添加し、３５μＭ溶液を得た。細胞を無血清培地で洗浄し、その後、２５０μｌの新鮮な無血清培地および１００μｌのインターフェラーを添加した。１または１０μＭの濃度で細胞に適用されるように、インターフェラーを希釈した。次いで、細胞を４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。インターフェラーペプチドとともに４時間のプレインキュベーション後、細胞は１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＰＲ８ウイルスで接種された。接種物を除去し、トリプシン含有培地を添加した。試料は、０、８、１２、１６、２４および３６時間にてウイルス力価のために採取された。陽性対照として、細胞は、１μＭまたは１０ｎＭのタミフルで処理された。２点測定実験の結果を図３２に示す。
【０６１１】
図から見ることができるように、１０μＭにて、すべてのペプチドはウイルス複製を阻害する。１μＭにて、インターフェラー１および４は、ウイルス複製をなおも再現性よく阻害し、一方、インターフェラー２および３の効果はそれほど強くない。しかしながら、タミフルもまた一設定においてウイルス複製を完全には阻害しなかったことに留意されたい。
【０６１２】
本発明者らはまた、候補インターフェラーの潜在力を評価するために、より感受性のインフルエンザＡミニレプリコンアッセイを用いた。このシステムは、機能的ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰタンパク質の存在を必要とする。レポーターとして、アンチセンスホタルルシフェラーゼ構築物を用い、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰ用の発現プラスミドとともに哺乳動物細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの正規化は、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターを用いて行われた。対照実験では、４つすべての成分が存在したときにホタルルシフェラーゼのミニレプリコンがルシフェラーゼ活性を生じさせたことが確認され、これは、そのうちの一つが欠失していた場合、またはインフルエンザウイルス感染細胞の核においてウイルスｍＲＮＡの合成を阻害することによってインフルエンザウイルスに選択的な耐性を与えるマウスＭｘ１タンパク質をコードする発現ベクターが共トランスフェクトされる場合にはルシフェラーゼ活性は生じなかった（図３３）。
【０６１３】
読出しとしてこのシステムを用いて、本発明者らは、インターフェラー構築物の抗ウイルス活性を確認することができた。また、他の凝集配列を有するインターフェラーのように、異なるゲートキーパー（ＲまたはＤ）および／または異なるＺ２リンカー部分（ＧＳ、ＰＰまたはＰＳ）を有するこれらインターフェラーのバリエーションを試験した（図３４参照）。これらの構築物の配列を表１１に示す。
【０６１４】
【表１１】
2014514917.tif 000016
2014514917.tif 000017
2014514917.tif 000018
【０６１５】
対照として、ミニレプリコンアッセイに関与しない内部ウイルスタンパク質（Ｍ１およびＮＳ１）に対して設計されたインターフェラーについても試験し、これらは、実際には、ルシフェラーゼ活性の減少を示さなかった（図３５）。これらの無関係なインターフェラーの設計は、図に示されるゲートキーパーおよびＺ２リンカー（すなわち、内部リンカー、ここで、式はＺ１−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ２−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４である。）を有する、ポリメラーゼタンパク質およびＮＰに対して４つのインターフェラーのものと同一である。また、マトリックスタンパク質１および非構造タンパク質１に対するペプチドについての凝集配列およびペプチド配列を表１１に示す。
【０６１６】
したがって、インターフェラーペプチドは、各々のインフルエンザウイルスのポリメラーゼタンパク質および核タンパク質に対して設計することができる。これらのインターフェラーはインフルエンザＲＮＡ複製の減少に成功し、それは、標的の下方調節に特異的および依存的な効果であり、そのため、無関係な標的に対するインターフェラーは下方調節の達成には至らなかった。
【０６１７】
４．検出および診断
４．１  特異的なインターフェラーを用いたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の検出
４．１．１  特異的なインターフェラーペプチドの設計および合成
検出すべき標的の凝集核形成セグメント、すなわちβ−ガラクトシダーゼは、Ｔａｎｇｏアルゴリズムを用いて同定され、これは、３つの理化学的パラメータ、すなわち低い正味の電荷、高い疎水性およびβ−シート傾向に基づいて、タンパク質中のβ−凝集性領域を予測するための統計学的機械的アルゴリズムである。その後、これらは、これらの配列が高い凝集傾向を有することを確認するために、本願において概要されているＹｉ部分の要件について調べられた。Ｔａｎｇｏは、様々な二次構造要素を形成する一連の同様の配列に対して所定のアミノ酸配列の傾向を比較し、β−シート凝集体を形成するその能力に比例するスコア（０−１００）を割り当てる。総得点が５未満の配列のストレッチは凝集する傾向が低いと考えられ、５０を超えるものは強く凝集している。β−ｇａｌタンパク質配列（Ｍの開始残基を含まない配列番号３に示されている）から、ｔａｎｇｏ総得点が５０を超えるアミノ酸配列の２つのストレッチ、すなわち、配列番号３における残基７から１２（ＬＡＶＶＬＱ（配列番号７５、Ｔａｎｇｏ１）および配列番号３における残基４５３から４６０（ＶＩＩＷＳＬＧＮ（配列番号７６）、Ｔａｎｇｏ２）が選択され、１個以上のゲートキーパー残基（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＰｒｏ）で隣接される野生型配列を含む高純度（＞９５％）ペプチドの回収は、固相合成によって合成された。Ｔａｎｇｏ総得点が５未満を示す配列番号３からの残基１０６から１１３を含む配列ストレッチは、陰性対照として選択され、Ｔａｎｇｏアルゴリズムによって予期されたこのセグメントの貧弱な凝集傾向を確立した。さらに、ＶＩＩＷＳＬＧＮ（配列番号７６）（Ｔａｎｇｏ２−領域）を含む３つの変異インターフェラーバージョンを合成した。６つのインターフェラーペプチド（陰性対照配列またはバリアント（または変異）Ｔａｎｇｏ２−領域を含む特定されたＴａｎｇｏ領域を含む）の配列を表１２に示す。これら６ペプチドのＣ末端をアセチル化し、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）検出およびインビトロスクリーニングのためにＮ末端で、それぞれビオチンまたはポリヒスチジン（Ｈｉｓ）６タグを用いて標識した（実施例２参照）。
【０６１８】
配列番号３、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列。特定されたＴａｎｇｏ領域を太字で示す。
【０６１９】
【化４】
2014514917.tif 000019
【０６２０】
【表１２】
2014514917.tif 000020
【０６２１】
インターフェラーの名称は、以下の実施例の概略において使用するとき、第１欄に示され、配列は第２欄に示されている。これらのインターフェラー分子において、ｎは１であり、Ｘ１およびＸ２はＲ残基であり、Ｙ１は標的タンパク質の一続きの６（「Ｔａｎｇｏ１」）または８（「Ｔａｎｇｏ２」）残基であり、Ｚ１はＮ−末端アミノ酸リンカーＡＰＡＡ（配列番号７７）であり、この分子は検出可能な標識−この場合、ビオチン（ｂ）に融合されている。また、さらなる実験のために、ＴｔｄｓおよびＰＥＧなどの他のリンカーも使用され、ならびにＨＡ−タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１０８））、Ｆｌａｇ−タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０６））、およびＨｉｓタグ（ポリヒスチジン）などの異なる標識が使用されている−代表的な実験を示す。変異ペプチドは、標的タンパク質β−ｇａｌの配列と比較して、１つまたは２つの非保存的置換を有するＹ１領域を含む。
【０６２２】
本発明者らが以下ＰｅｐＢｌｏｔと呼ぶ、インターフェラーの使用によるタンパク質の一般的な検出方法の概略図を図３６に示す。
【０６２３】
４．１．２．β−ガラクトシダーゼに特異的なインターフェラーを用いたウェスタンブロットおよびＰｅｐＢｌｏｔ分析によるβ−ガラクトシダーゼの検出
β−ガラクトシダーゼを最初にＥ．コリで発現させた。それに加えて、発現構築物ｐＢａｄ βｇａｌ ＷＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したｐＢａｄベクター）を含むＥ．コリＢＬ２１細胞は、ＬＢ培地中で３７℃にて培養された。培養がＯＤ６００ｎｍ約０．６に達したとき、細胞は、０．２％アラビノースで誘導され、一晩３７℃にて増殖させた。並行して、β−Ｇａｌを発現しないコンピーテントＢＬ２１細胞を対照および滴定実験のために増殖させた。
【０６２４】
β−Ｇａｌを発現するＢＬ２１細胞（誘導条件下で増殖させた）の０．４ｍｌ懸濁液（ＯＤ６００ｎｍ  約１．２）を室温にて１０分間、５０００ｇで遠心分離した。上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤を含む、０．８ｍｌの細菌タンパク質抽出試薬（Ｂ−ＰＥＲ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を細菌ペレットに添加し、細胞を溶解するために３０秒間、ボルテックスで混合した。２１μｌの完全ＢＬ２１細胞溶解物に５μｌの５×ＳＤＳ試料泳動緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を添加し、９９℃にて３分間加熱した。この混合物（ウェルあたり２６μｌ）を１０ウェルのＮｕＰａｇｅ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに充填し、タンパク質を変性条件下で分離した。次に、分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写し、リン酸緩衝生理食塩水中の１％ＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ−Ｔ）で４℃にて一晩ブロックした。メンブレンの各レーンは切り出され、別々に、ウサギ抗β−Ｇａｌ抗体、ビオチン化されたＴａｎｇｏ１、ビオチン化されたＴａｎｇｏ２、またはビオチン化されたオフターゲットペプチドまたはビオチン化されたＴａｎｇｏ２変異ペプチドのいずれかとともにインキュベートされた。
【０６２５】
続く抗β−Ｇａｌ抗体を用いたβ−ｇａｌのウェスタンブロット（ＷＢ）検出についての手順は以下の通りであった。メンブレンの第１レーンを切り出し、ＰＢＳ−Ｔ中で穏やかに撹拌しながら１時間、ウサギポリクローナル抗β−Ｇａｌ抗体（１：１０００希釈）とともにインキュベートした。次に、これはＰＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄された。最終の洗浄後、メンブレンをＰＢＳ−Ｔで１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体（ＨＲＰ、１：５０００希釈）とともにインキュベートした。次いで、メンブレンのこのレーンはＰＢＳ−Ｔ３×１０分で洗浄され、最後に１０分間脱イオン水ですすいだ。メンブレンのレーンは化学発光ＨＲＰ基質試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露され、標的タンパク質はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを使用して視覚化された（図３７、レーン１参照）。
【０６２６】
ビオチン化されたインターフェラーペプチドを用いたβ−ｇａｌのＰｅｐＢｌｏｔ検出の手順（すなわち、ウェスタンブロットに類似したプロトコールであるが、検出試薬として抗体の代わりにインターフェラーを用いる）は以下の通りであった。ビオチン化されたペプチド（Ｔａｎｇｏ１、Ｔａｎｇｏ２、オフターゲットおよびＴａｎｇｏ２の変異体）の各々のストック溶液（１０μＭ）（表１２参照）を１００％ＤＭＳＯ中に調製した。ペプチドストックは、１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１００ｍＭトレハロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）に希釈され（１／４０）、最終濃度が２５０ｎＭのペプチドを得た。新たに調製されたペプチド溶液を直ちにメンブレンストリップに添加し、穏やかに室温にて撹拌した。１時間後、ペプチド溶液を捨て、メンブレンストリップを４×１０分間、１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）で洗浄した。次に、メンブレンストリップは、ビオチン親和性試薬（１：１００，０００希釈）であるＰＢＳ−Ｔ中のＨＲＰとコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＳＲＰ）とともに１時間、室温にてインキュベートされた。続いて、これは、ＰＢＳ−Ｔで３×１０分間の洗浄が行われ、最後に１０分間脱イオン水ですすがれた。メンブレンストリップは化学発光ＨＲＰ基質試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露され、標的タンパク質はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを使用して視覚化された。
【０６２７】
４．１．２．１  使用された異なるインターフェラーの選択性
図３７において、ウサギポリクローナル抗β−Ｇａｌの抗体を用いた完全細菌細胞溶解物からβ−ｇａｌのＷＢ検出、さらに、３種のインターフェラー：Ｔａｎｇｏ１ペプチド（ｂ〜ＲＬＡＶＶＬＱＲ（配列番号４４））とＴａｎｇｏ２ペプチド（ｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号４５））およびオフターゲットペプチド（ｂ〜ＲＰＩＴＶＮＰＰＦＲ（配列番号４６））を用いたＰｅｐＢｌｏｔによる検出の比較を示す。また、ここでは、ビオチンは標識として使用され、ＡＰＡＡ（配列番号７７）はアミノ酸リンカーとして使用された。Ｔａｎｇｏ１とＴａｎｇｏ２インターフェラーは高い特異性でβ−Ｇａｌに結合することが観察された（図３７参照）。Ｔａｎｇｏ１ペプチドはβ−ｇａｌと凝集する最強の傾向を示すことが予期されるが、これはＴａｎｇｏ２インターフェラーペプチドよりも弱い結合（レーン２参照）を示す。特定の作用機序に束縛されることなしに、１つの説明は、Ｔａｎｇｏ１ペプチドは、β−ｇａｌのＮ末端に対してあまり効率的でないが相互作用し、これは、このＮ末端がメンブレンストリップ上のβ−ｇａｌの固定化状態において利用性が小さいためであるということである。さらに、この非限定的な説明は、インビトロで遊離β−ｇａｌへの同じインターフェラーペプチド（すなわち、Ｔａｎｇｏ１ペプチド）の添加により、Ｔａｎｇｏ２ペプチドと比較して、より速い凝集動力学をもたらすという事実によって支持される（さらに以下参照）。図３７は、Ｔａｎｇｏ２ペプチドは、β−ｇａｌに特異的な抗体による検出に匹敵するシグナルとともにβ−ｇａｌに対する強い親和性を提示することを明らかに示す（レーン１とレーン３の比較）。オフターゲットのペプチドインターフェラーは、疎水性アミノ酸が導入されているが、配列の中心に１個よりも多いβ−シートブレーカーＰ残基の存在が効果的にβ−凝集を破壊する。約２０ｋＤａの位置のレーン４のバンドは、ペプチドの交差反応性の効果ではなく、ビオチンの非存在下（または低い利用可用性）でのストレプトアビジン（ＳＲＰ）の非特異的結合に起因している。以下の節において記載される実験は、主に、Ｔａｎｇｏ２配列に基づいている。
【０６２８】
４．１．２．２  インターフェラープローブの結合特異性
Ｔａｎｇｏ２のインターフェラーペプチドとβ−Ｇａｌの相互作用の特異性を評価するために、追加のペプチドを用いた検出実験を行った。第一に、本発明者らは、非凝集性であるが、疎水性β−Ｇａｌペプチド（Ｐ１０６ＩＴＶＮＰＰＦ１１３）を用いてβ−Ｇａｌを精査し、対応するプローブペプチドｂ〜ＲＰＩＴＶＮＰＰＦＲ（配列番号４６）とβ−Ｇａｌは相互作用しないことを見出した（上記参照、図３７、レーン４）。第二に、本発明者らは、配列が、無関係な細菌タンパク質およびヒトタンパク質におけるＴＡＮＧＯを用いて同定された凝集領域に対応する４つのプローブペプチドを採用した。これは、ヒトサイクリン依存性キナーゼ４阻害剤Ｂ（配列ｂ〜ＦＬＤＴＬＶＶＬＨＲＡ（配列番号１７５））、ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ、配列ｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８５））およびともにスタフィロコッカス・エピデルミデスから採取されたプロリンデヒドロゲナーゼ（ＰＤ、ｂ〜ＲＦＦＩＡＬＳＲ（配列番号１７６））とＣｌｐＢ  ＡＴＰアーゼ（ｂ〜ＲＩＬＬＧＬＩＲ（配列番号１７７））由来のビオチン標識されたペプチドを用いて行われた。後者の３つのプローブの設計は、ｎ＝１、Ｘ１＝Ｘ２＝１個のＡｒｇ残基を有する分子に対応し、その間にＹ１配列を有する。第一プローブにおいて、ＦＬＤとＲＡは、元々、Ｙ１に対応するＴＬＶＶＬＨ（配列番号１７８）部分の隣接配列である。これらの隣接配列において、Ｄは、Ｘ１ゲートキーパーに対応し、ＲはＸ２ゲートキーパーに対応する。
【０６２９】
これらのペプチドのすべては、凝集傾向が必要であるが、特異的な相互作用に十分ではないことを示すβ−Ｇａｌに対応するバンドの特異的染色（データを示さない）を得ることができなかった。最後に、高得点のＴａｎｇｏ領域が他の残基との置換を容認し、それらの特性を維持するかどうかを試験するために、変異体を生成した。最初の事例では、「Ｉ」残基は、β−シートブレーカー「Ｐ」残基で置換され、「Ｉ」から「Ｐ」に変化させた２種の変異ペプチドを生成した（特異的配列については表１２参照）。さらに、「ＩＷ」を「ＰＥ」で置換した二重変異ペプチドの効果は、β凝集傾向における帯電したゲートキーパー残基の影響を研究するために使用された。凝集は、反発電荷を導入することによって抑制されることが期待される。図３８に示されている２つの単一の点突然変異ペプチド（ｂ〜ＲＶＰＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号４７）とｂ〜ＲＶＩＰＷＳＬＧＮＲ（配列番号４８））のＰｅｐＢｌｏｔ分析は、これらの変異体ペプチドは依然としてβ−Ｇａｌに効率的に結合することを示す。しかしながら、置換を導入することにより、オフターゲット結合が観察されることは明らかである。残り短い凝集誘導性ストレッチは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてβ−Ｇａｌタンパク質に固有のものではないため、これは非論理的ではない。さらに、帯電した残基の付加的な導入は、相互作用のほぼ完全な喪失をもたらす。これは、単一の点突然変異は結合特異性を抑制するには十分であるため、プローブ結合の高い配列特異性を実証し、一方、凝集傾向の抑制は、８０％の配列同一性にもかかわらず、完全に結合を無効にするのに十分である。これらのデータは、凝集傾向および配列マッチングがペプチド媒介性の相互作用の特異性に前提条件となり、膵島アミロイドポリペプチドのスクランブルされたまたは反転されたバージョンが互いにまたは野生型配列と交雑実生しないことを示し、単なる配列組成を超えた位置依存性を確認する最近の研究（Ｓａｂａｔｅ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０４：３３７−３５２、２０１０）に沿っているという本発明者らの仮説を裏付ける。
【０６３０】
４．１．２．３  結合におけるインターフェラーの動力学
完全ＢＬ２１細胞溶解物におけるβ−Ｇａｌに対するＴａｎｇｏ２ペプチドインターフェラー結合動力学（すなわち、インターフェラーと標的の間の接触時間）を研究するために、ペプチドを３０秒から１時間、メンブレンとともにインキュベートした。メンブレンは、選択的な時間間隔でインキュベーション緩衝液から取り出され、上述したようにさらに処理された。
【０６３１】
図３９は、完全な細菌ＢＬ２１細胞溶解物からのβ−Ｇａｌの検出が、ペプチドを用いた短時間枠（３０秒程度）のインキュベーションにおいて達成され得ることを示す。
【０６３２】
４．１．２．４  インターフェラーの使用に基づくＰｅｐＢｌｏｔ検出法の感度
インターフェラーペプチドに基づくＰｅｐＢｌｏｔ検出の感度を決定した。それに加えて、０．１ｐｍｏｌ（１１．６ｎｇ）から１０ｐｍｏｌ（１１６０ｎｇ）の濃度範囲におけるβ−Ｇａｌは、完全な非誘導のＢＬ２１細胞溶解物（ＯＤ６００ｎｍ  約０．６）に添加された。２１μｌの完全ＢＬ２１細胞溶解物に、５μｌの５×ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え、９９℃にて３分間加熱した。異なる濃度のβ−Ｇａｌを含む２６μｌのこの混合物を１０ウェルのＮｕＰａｇｅ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに充填し、変性条件下でタンパク質を分離した。続いて、分離されたタンパク質はニトロセルロースメンブレンに転写され、４℃にてＰＢＳ−Ｔ中の１％ＢＳＡとともに一晩ブロックした。インターフェラーとのさらなるインキュベーションおよび操作は、本明細書において先に記載される通りであった。図４０は、この実験の結果を示す。データから、サブピコモル量のβ−Ｇａｌ（５８ｎｇ程度）を検出することができ（図４０Ａのレーン２におけるβ−Ｇａｌの検出を参照）、これは抗体の検出限界に匹敵することは明らかである。さらに、得られたシグナルはまた、抗β−Ｇａｌ抗体検出に匹敵する（図４１）。
【０６３３】
４．１．２．５  ＰｅｐＢｌｏｔ検出の特異性
ＰｅｐＢｌｏｔ検出の特異性におけるゲートキーパー残基の影響を決定するために、本発明者らは、コアＴａｎｇｏ配列「ＶＩＩＷＳＬＧＮ」（配列番号７６）を用いて、標的タンパク質β−ｇａｌに対するインターフェラーペプチドを生成させた。それに加えて、３つのインターフェラーペプチドを生成した：１）ゲートキーパー残基を含まない、Ｃ末端において、ＧＳＧＳアミノ酸リンカー（ＶＩＩＷＳＬＧＮＧＳＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１７９））を介して、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０６））に連結された配列ＶＩＩＷＳＬＧＮ（配列番号７６）を有する。２）元々のゲートキーパー残基に隣接されたＴａｎｇｏ配列（ＲＤＲＮＨＰＳＶＩＩＷＳＬＧＮＥＳＧＨＧ（配列番号１８０））。３）相補的な極性「Ｓ」および「Ｅ」残基に位置した残基「Ｄ」および「Ｒ」を有する相補的に帯電したゲートキーパー残基（ＤＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号１８１））。最初の２つのペプチドは、ＷＯ２００７／０７１７８９に提供されているインターフェラーペプチドの定義に当てはまり、一方、３番目のペプチドは、本明細書において提供される構造的定義に従ったインターフェラー分子である。表１３に列挙されたすべてのペプチドは、二重にビオチン化（Ｎ末端とＣ末端の両方）され、Ｔｔｄｓリンカーによってインターフェラーペプチドに連結された。
【０６３４】
【表１３】
2014514917.tif 000021
【０６３５】
本発明者らは、競合ＰｅｐＢｌｏｔプラットフォームにおいてβ−ｇａｌに選択的に結合するペプチドの性能について試験した。この場合、７％の臨床血清を１つのレーンに入れ、完全なＥ．コリ溶解物中のβ−ｇａｌを他のレーンに入れた。各ビオチン化ペプチドのストック溶液（１０μＭ）を１００％ＤＭＳＯ中で調製した。ペプチドストックを１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１００ｍＭトレハロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）において希釈し（１／４００）、最終濃度が２５ｎＭであるペプチドを得た。新たに調製したペプチド溶液を直ちにメンブレンストリップに添加し、穏やかに室温にて撹拌した。１５分後、ペプチド溶液を捨て、メンブレンストリップを３×１０分間、１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．５）で洗浄し、さらに本明細書において先に記載されたように処理した。
【０６３６】
図４２は、インターフェラーペプチドに基づくＰｅｐＢｌｏｔ検出の特異性におけるゲートキーパー残基の影響を示す。３つすべてのペプチドは、β−ｇａｌに結合するが、これまでのところ、最良のプローブは、相補的に帯電したゲートキーパーを有するインターフェラーペプチドであった。このペプチドは、他の２つのペプチドと比較して、β−ｇａｌに強い相互作用を示し、血清中のタンパク質と交差反応しない。帯電相補性とＴａｎｇｏ配列のβシート傾向は、非常に特異的であるように見える有利な分子間結合に貢献する。一方、天然の側面を有するペプチドは、臨床血清中の非特異的バンドから明らかである低い特異性を提示する。データは、ＷＯ２００７／０７１７８９にも示されているように、ゲートキーパーが、標的タンパク質とのインターフェラーペプチド相互作用に必ずしも必要とされないことを示唆する。しかしながら、検出は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｈなどの極性アミノ酸およびβ−シートブレーカーＰを含んでもよい相補性隣接残基を有するペプチドを設計することによって高い特異性を達成するように微調整することができる。
【０６３７】
４．２  表面プラズモン共鳴を用いて研究されたインターフェラー−標的相互作用
このインビトロ実験において、異なるインターフェラーペプチドの親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりβ−ｇａｌへの結合について測定した。ＳＰＲ実験は、２５℃にて、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行われた。カップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびエタノールアミン−ＨＣｌ）はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入された。ＢＳＡおよびβ−ｇａｌは、それぞれ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入された。ペプチドをＪＰＴ，ＧｍｂＨで合成し、純度は＞９５％であった。タンパク質ＢＳＡおよびβ−Ｇａｌは、１０μｌ／分の流速にて、標準的なアミンカップリング化学によって、ＣＭ５センサーチップ上の参照チャネルと試料チャネルにそれぞれ固定された。カルボキシメチルデキストラン表面は、７分間、ＥＤＣとＮＨＳを１：１比率で注入することによって活性化された。タンパク質は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）において、最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈され、固定レベルが、ＢＳＡおよびβ−Ｇａｌのそれぞれについて４０００ＲＵまたは８０００ＲＵに到達するまで、活性化表面上に短いパルスで注入された。残りの反応性基は、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）でブロックされた。カップリングの完了後、表面を５０ｍＭのＮａＯＨおよび８Ｍ尿素の短いパルスで再生し、非共有結合したタンパク質を外した。再生後の固定レベルは、典型的には、参照チャネルと試料チャネルの両方で３５００ＲＵから４０００ＲＵの間であった。いくつかのインターフェラー（インターフェラーの配列については表１４を参照）：Ｔａｎｇｏゾーン１、Ｔａｎｇｏゾーン２、オフターゲット、Ｔａｎｇｏゾーン２変異体およびβ−Ｇａｌに結合するＴａｎｇｏゾーン２ペプチドのタンデムリピートの親和性は、２５℃において参照（ＢＳＡ）および試料（β−Ｇａｌ）表面全体にヘキサヒスチジンがタグ化されたペプチドを注入することによって調査された。ペプチドは、１μＭの濃度にて泳動緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０１５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）に溶解させ、３０μｌ／分の流速にて６０秒間注入され、次に６００秒間解離された。注入は、同一表面上、および独立して固定化された表面上で繰り返された。表面は、ｉ）５０ｍＭのＮａＯＨおよびｉｉ）８Ｍ尿素の３０秒パルスによって各サイクル間で再生され、次のサイクル前に４００秒間、安定させた。
【０６３８】
【表１４】
2014514917.tif 000022
【０６３９】
β−ｇａｌおよびＴａｎｇｏ２ペプチド（ＨＨＨＨＨＨＡＰＡＡＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号５４））の共凝集の動力学を２５℃にて調べた。泳動緩衝液に溶解されたペプチドは、濃度範囲（０−４μＭ、１つの内部複製を含む）において参照（ＢＳＡ）と試料（β−Ｇａｌ）表面全体に流速３０μｌ／分にて６０秒間注入され、次に、６００秒間解離させた。濃度系列は、同じ表面上（３回）、および独立して固定化された表面上で繰り返された。表面は、ｉ）５０ｍＭのＮａＯＨ、およびｉｉ）８Ｍ尿素の３０秒パルスによって各サイクル間で再生され、次のサイクル前に４００秒間、安定させた。
【０６４０】
すべてのセンサーグラムは、ｉ）参照表面において観察された応答のき引き算、およびｉｉ）緩衝液の注入について観察された応答の引き算によって、二重に参照を差し引かれ（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：２７９−２８４，１９９９）、後者は系統的なアーティファクトを除くためである。データは、同一の結合部位が拡大しているβ−シートで利用可能になる前に、溶液中のペプチドとチップ上のタンパク質の最初の遭遇、続く二段階の再配列を想定して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００ソフトウェアを用いて、３状態モデルに全体的に適合させた。
【０６４１】
ＳＰＲ分析から得られたデータの編集は、図４３から４６に示されている。
【０６４２】
β−Ｇａｌタンパク質は、Ｎ末端付近のＴａｎｇｏゾーン１（残基７から１２）の接近可能性を妨げることができるアミンカップリングによってセンサーチップ上に固定化された。ＳＰＲで観察されたＴａｎｇｏペプチド１とβ−Ｇａｌの弱い結合親和性は、このペプチドと相互作用させるための固定状態におけるタンパク質によって課せられた制限に起因している可能性がある。しかしながら、インビトロでのＴａｎｇｏ１ペプチドは、Ｔａｎｇｏアルゴリズム予測に従っているＴａｎｇｏ２ペプチドを比較して、溶液中の遊離β−Ｇａｌに高い親和性を示す。
【０６４３】
分析物（Ｔａｎｇｏ２ペプチド）濃度の関数としての装置の反応単位（ＲＵ）における変化を示すセンサーグラムは、図４５に示す。１：１の化学量論について計算されたＲＵｍａｘは約８０ＲＵであるが、しかしながら、本発明者らのデータはこの値を超え、安定性は、より高い濃度および長期の接触時間（＞１０分）においてさえも達成されない。これは、ペプチドがβ−Ｇａｌに結合した後、新しい結合部位がセンサーチップ表面上の凝集体の増大を可能にするように作られるためである。凝集体の増大をモデル化するために、単純な１状態または２状態の動力学は不十分であることが判明した。動力学データは、３状態モデルを含む多段階プロセスを用いてもっとも良好に表される。このモデルによれば、ペプチドは標的に可逆的にドッキングし、続いて、立体構造スイッチによって、最初のペプチドに結合し、結合部位をブロックする続くペプチドを受け入れるように位置が固定される。このモデルは、従前、ＳＰＲチップ上でアミロイド線維の伸長を記述する報告がなされている。３段階メカニズムについての計算されたｋａおよびｋｄは以下の通りであった：ｋａ１＝２．７４４Ｅ＋４、ｋａ２＝０．０２３５９、ｋａ３＝０．００５４９１およびｋｄ１＝０．４１２３、ｋｄ２＝０．０２５０９、ｋｄ３＝０．００２６５４。モデルの複雑さのために、本発明者らは、平衡結合定数Ｋａおよび平衡解離定数Ｋｄを計算することができなった。タンデムリピートペプチド（ｎ＝２であり、両方のＹ部分は同一ある。）を検体として用いる場合、動力学はさらにより複雑になる（図４６参照）。この分子内において、すべてのＸ部分は、単一のＲ残基であり、Ｚ１リンカーはＧＳＧＳＡＰＡＡ（配列番号９０）である（表１４参照）。
【０６４４】
４．３  インビトロの凝集動力学の決定
インビトロにおけるＴａｎｇｏ１ペプチド、Ｔａｎｇｏ２ペプチドおよびＴａｎｇｏ２ペプチドのタンデムリピートとβ−ｇａｌの共凝集は、室温での凝集体粒子の増大に起因して、３４０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の明らかな変化から、光散乱を介してモニターされた。インターフェラー−β−Ｇａｌの共凝集は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中の等モル濃度（１０μＭ）のＴａｎｇｏ１ペプチド、またはＴａｎｇｏ２ペプチド、またはＴａｎｇｏ２ペプチドのタンデムリピートとβ−Ｇａｌを添加し、試料を５０ｒｐｍで穏やかに撹拌することによって開始された。インターフェラーの配列を表１４に示す。
【０６４５】
凝集体の大きさを特徴付けるために、時間ゼロで、およびＴａｎｇｏ１ペプチド、またはＴａｎｇｏ２ペプチド、またはＴａｎｇｏ２ペプチドのタンデムリピート（表１４）との２時間の同時インキュベーション後のβ−Ｇａｌの流体力学的半径（ＲＨ）は、動的光散乱（ＤＬＳ）、ＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ、ドイツ）を用いて測定された。
【０６４６】
図４７は、高得点のＴａｎｇｏ１ペプチドが、インビトロでＴａｎｇｏ２ペプチドと比較して、溶液中の遊離β−Ｇａｌとのより速い共凝集動力学を示すことを示す。Ｔａｎｇｏ２ペプチドのタンデムリピートがβ−Ｇａｌに追加された場合、速い共凝集動力学が観察され、２時間後に形成された凝集体のサイズは、単一Ｔａｎｇｏ２ペプチドのものと比較して大きかった（図４８）。
【０６４７】
β−Ｇａｌの共凝集を開始する単一のＴａｎｇｏ２ペプチドの限界を評価するために、β−Ｇａｌとペプチドのモル比が１：０、１：０．２、１：０．５および１：１である一連の試料が、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中に調製された。β−Ｇａｌの濃度は１０μＭで一定に保たれ、一方、ペプチド量は、２μＭ、５μＭおよび１０μＭであった。インターフェラー−β−Ｇａｌの共凝集は、試料を５０ｒｐｍで穏やかに撹拌することによって開始された。
【０６４８】
光散乱およびＤＬＳ実験は、化学量論的濃度以下のペプチドが、β−Ｇａｌの凝集を誘導するのに十分であることを示した（図４９参照）。このようにして形成された視認できる凝集体は、８Ｍ尿素または６ＭのＧｄＨＣｌに可溶性でなかった。
【０６４９】
４．４．β−ｇａｌ酵素機能的ノックアウト
β−Ｇａｌの酵素機能におけるＴａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの効果を研究するために、触媒活性がこのペプチドとのインキュベーションの前後において測定された。酵素機能の読出しは、基質フルオレセイン−ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）を用いて行われ、この基質は非蛍光であるが、β−Ｇａｌによって酵素的に切断されると、蛍光フルオレセインが、触媒活性に比例した強度で遊離される。図５０は、β−ガラクトシダーゼの酵素活性におけるＴａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの濃度増加の効果を示す。等モル濃度の酵素およびインターフェラーは、酵素活性の完全な阻害（言い換えれば、完全な共凝集による機能的なノックアウト）をもたらすことは明らかである。
【０６５０】
４．５  単離されたβ−ｇａｌ−Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの共凝集体の構造
不溶性β−ｇａｌ−Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの共凝集体を２時間同時インキュベーション後に単離した。単離された凝集体は、上清が２８０ｎｍにて無視できる吸光度を示すまで、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で繰り返し洗浄し、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法、円偏光二色性（ＣＤ）および電子顕微鏡（ＥＭ）を用いて構造的特徴付けのための緩衝液に懸濁させた。
【０６５１】
天然のβ−ｇａｌのＦＴＩＲスペクトルは、βシートに富んだ二次構造要素の特徴である１６３８ｃｍ−１でのアミドＩピークを示し、これは、Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーとの共凝集により分子間β−シート形成に起因して１６２８ｃｍ−１にシフトする（図５１）。天然のβ−ｇａｌ溶液のＣＤスペクトルは、α＋β構造クラスの特徴を示し、一方、負のバンドである約２１８ｎｍを有する共凝集体懸濁液スペクトルは、天然のタンパク質構造の完全な喪失と凝集したβシートへのシフトを示唆する（図５２）。最後に、単離されたβ−ｇａｌ−Ｔａｎｇｏ２ペプチドインターフェラーの共凝集体のＥＭは、形成された凝集体が実際に非晶質である（したがって、アミロイド生成性でなはい）ことを示す（図５３）。
【０６５２】
４．６．インターフェラーの診断的応用：血清中の３種のタンパク質バイオマーカーの検出
以下の実施例において、本発明者らは、診断的応用のためにインターフェラーの使用の実施可能性を実証する。それに加えて、３つの医学的に関連したバイオマーカーをヒト血清における検出のための例として選択した：１）アミノ酸配列が配列番号４に示される前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、２）アミノ酸配列が配列番号５に示されるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および３）アミノ酸配列が配列番号６に示されるβ−２−ミクログロブリン（β−２Ｍ）。配列は、それらのシグナルペプチドなしで示されている。特定のインターフェラーを設計するために使用されたＴａｎｇｏ領域は、それぞれのアミノ酸配列において下線が引かれていることに留意されたい。バイオマーカー特異的なインターフェラーの配列を表１５に示す。
【０６５３】
配列番号４：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のアミノ酸配列
【０６５４】
【化５】
2014514917.tif 000023
【０６５５】
配列番号５：Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のアミノ酸配列
【０６５６】
【化６】
2014514917.tif 000024
【０６５７】
配列番号６：β−２−ミクログロブリン（β−２Ｍ）のアミノ酸配列
【０６５８】
【化７】
2014514917.tif 000025
【０６５９】
【表１５】
2014514917.tif 000026
【０６６０】
タンパク質バイオマーカーの検出のためのメンブレンを以下のように調製した。２１μｌの５％ヒト血清（Ｌｏｎｚａ）に、５０ｐｍｏｌの標的タンパク質バイオマーカー（それぞれ１．５５ｎｇのＰＳＡ、１．２５ｎｇのＣＲＰおよび０．６ｎｇのβ−２Ｍ）を添加し、これをＤＴＴ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の有無により、５μｌの５×ＳＤＳ泳動緩衝液と混合し、８２℃にて３分加熱した。ＰＳＡまたはＣＲＰまたはβ−２Ｍを含むこの混合物の２６μｌを１０ウェルのＮｕＰａｇｅ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに充填し、タンパク質を変性または還元変性条件下で分離した。次に、分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、ＰＢＳ−Ｔ中の１％ＢＳＡを用いて、一晩４℃にてブロックした。
【０６６１】
４．６．１  ヒト血清において急増したＰＳＡのＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ検出
ＰＳＡ−特異的ビオチン化ペプチド（配列については表１５参照）のストック溶液（１０μＭ）を１００％ＤＭＳＯ中に調製した。ペプチドストックは、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１００ｍＭトレハロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．０）に希釈され（１／４０）、最終濃度が２５０ｎＭのペプチドを得た。新たに調製されたペプチド溶液を直ちにメンブレンストリップに添加し、穏やかに室温にて撹拌した。１時間後、ペプチド溶液を捨て、メンブレンを４×１０分間、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．０）で洗浄した。次にメンブレンは、ビオチン親和性試薬（１：１００，０００希釈）であるＰＢＳ−Ｔ中のＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートとともに１時間、室温にてインキュベートされた。続いて、これは、ＰＢＳ−Ｔで３×１０分間の洗浄が行われ、最後に１０分間脱イオン水ですすがれた。ヒト血清中に急増したＰＳＡのＷＢ検出について、メンブレンは、ＰＳＡのｃ末端ペプチドに特異的な（１：５０００）ウサギモノクローナル抗ＰＳＡ抗体（ＥＰ１５８８Ｙ、Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートした。次に、これは、ＨＲＰにコンジュゲートされた（１：３０，０００）ヤギポリクローナル抗ウサギ抗体で染色された。メンブレンを化学発光ＨＲＰ基質試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露され、標的タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを用いて可視化させた。
【０６６２】
図５４は、インターフェラーペプチドであるｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８５）検出（パネルＡ）とＰＳＡについての抗体検出（パネルＢ）間の比較を示す。ＰＳＡのＷＢ分析は、ゲル泳動状態に応じて複数のバンドを表示することが示されている。非還元変性条件において、２つのバンドが観察され、還元変性条件において（示されない）、複数の断片が内部開裂に起因して現れる（Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．２０：７９−８５，１９９９）。
【０６６３】
４．６．２  ヒト血清において急増したＣＲＰのＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ検出
ビオチン化ペプチドのストック溶液（１０μＭ）を１００％ＤＭＳＯ中に調製した。ペプチドストックは、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１００ｍＭトレハロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．０）に希釈され（１／４０）、最終濃度が２５０ｎＭのペプチドを得た。新たに調製されたペプチド溶液を直ちにメンブレンストリップに添加し、穏やかに室温にて撹拌した。６０分後、ペプチド溶液を捨て、メンブレンを４×１０分間、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．０）で洗浄した。次にメンブレンは、ビオチン親和性試薬（１：３０，０００希釈）であるＰＢＳ−Ｔ中のＨＲＰとコンジュゲートされたＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎとともに１時間、室温にてインキュベートされた。続いて、これは、ＰＢＳ−Ｔで３×１０分間の洗浄が行われ、最後に１０分間脱イオン水ですすがれた。ヒト血清中に急増したＣＲＰのＷＢ検出は、（１：２０００）ウサギモノクローナル抗ＣＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ）を１時間インキュベートすることによって行われた。次に、これは、ＨＲＰにコンジュゲートされたヤギ（１：３０，０００）ポリクローナル抗ウサギ抗体で染色された。メンブレンは化学発光ＨＲＰ基質試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露され、標的タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを用いて可視化させた。ブロットを図５５に示す。
【０６６４】
４．６．３  ヒト血清において急増したβ−２ＭのＰｅｐＢｌｏｔおよびＷＢ検出
β−２Ｍ（配列については表１５参照）に特異的なビオチン化ペプチドインターフェラーのストック溶液（１０μＭ）を１００％ＤＭＳＯ中に調製した。ペプチドストックは、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、１００ｍＭトレハロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．０）に希釈され（１／４０）、最終濃度が２５０ｎＭのペプチドインターフェラーを得た。新たに調製されたペプチドインターフェラー溶液を直ちにメンブレンストリップに添加し、穏やかに室温にて撹拌した。３０分後、ペプチドインターフェラー溶液を捨て、メンブレンを４×１０分間、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ５．０）で洗浄した。次にメンブレンは、ビオチン親和性試薬（１：１００，０００希釈）であるＰＢＳ−Ｔ中のＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートとともに１時間、室温にてインキュベートされた。続いて、これは、ＰＢＳ−Ｔで３×１０分間の洗浄が行われ、最後に１０分間脱イオン水ですすがれた。
【０６６５】
ＷＢによってヒト血清において急増したβ−２Ｍを検出するために、メンブレンを（１：５０００）ウサギモノクローナル抗β−２Ｍ抗体（Ａｂｃａｍ）とともに１時間インキュベートし、ＨＲＰにコンジュゲートされた（１：３０，０００）ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて染色した。次に、メンブレンストリップは化学発光ＨＲＰ基質試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露され、標的タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを用いて可視化させた。この分析の結果を図５６に示す。
【０６６６】
４．６．４  急増しない複雑なヒト試料におけるＣＲＰおよびＰＳＡの検出
本アプローチが、Ｅ．コリ溶解物というよりは他の供給源、組成物および複雑性のプロテオームを用いて、自然に分泌または漏洩したタンパク質を検出するための臨床状況における定量的検出にも適用できるかどうかを探索するために、本発明者らは、関連する複雑な試料中のヒトタンパク質バイオマーカー、すなわち、ヒト血清中のＣＲＰおよび精漿中のＰＳＡを検出するアッセイを設計した。ＣＲＰは、炎症に関して広く使用されているバイオマーカーであり、本発明者らに、独立した免疫比濁アッセイに基づくＣＲＰの決定が利用可能であった臨床血清試料の豊富な供給源を与える。
【０６６７】
血清中のＣＲＰ検出について、ＣＲＰに固有であるプローブペプチドｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号８６）を選択した。血清中のＣＲＰの検出は、低い（１μｇ／ｍｌ）および高い（３１７μｇ／ｍｌ）のＣＲＰを含む、２人の患者の臨床試料を用いて行われた。血清試料は、ＭｉｌｌｉＱ水中で７％に希釈され、５×ＳＤＳ泳動緩衝液と混合され、８２℃にて５分間加熱された。変性されたタンパク質を４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに移し、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−Ｔ）中の１％ＢＳＡでブロックした。メンブレンは、１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．１）、１００ｍＭトレハロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２．５％ＤＭＳＯに処方された２５０ｎＭのｂ〜ＲＩＬＩＦＷＳＲ（配列番号８６）ペプチドとともに２５℃にて１時間撹拌された。１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．１）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０ですすいだ後、メンブレンをＳＲＰ−ＨＲＰコンジュゲートで染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを用いて視覚化した。
【０６６８】
ＣＲＰの免疫ブロット検出は、穏やかな撹拌下でウサギモノクローナル抗ＣＲＰ抗体（１：２０００）を用いて達成された。１時間後、メンブレンをＰＢＳ−Ｔですすぎ、１時間ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にコンジュゲートされたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体で染色し、化学発光試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ｆｅｍｔｏ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露し、タンパク質はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ画像化システムを用いて視覚化した。結果を図５７に示す。
【０６６９】
次に、本発明者らは、臨床血清試料中のＣＲＰを検出するために、本発明者らのプローブペプチドの診断的有用性を評価するために進めた。２０人の患者（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ、Ｌｅｕｖｅｎ）の血液試料を標準プロトコールにしたがって処理し、血清を分離し、免疫比濁アッセイおよびＰｅｐＢｌｏｔを採用する標準的な実験室診断を用いてＣＲＰを分析した。ＣＲＰ濃度は、マウスモノクローナル抗ＣＲＰ抗体に結合されたラテックス粒子を用いた免疫比濁に基づく方法によって測定された。試験は、Ｈｉｔａｃｈｉ／Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｐシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）で行われた。
【０６７０】
図５８に示される２０個の臨床試料のＰｅｐＢｌｏｔ分析は、ＣＲＰの分子量に対応する明確に定義されたバンドに特異的な染色を示した。これらのバンドの強度の定量は、同じ試料について独立して行った標準的な臨床免疫比濁アッセイから得られたデータと十分に比較する。
【０６７１】
次に、本発明者らは、前立腺で合成し、精液中に分泌され、前立腺癌のバイオマーカーとして使用されるプロテアーゼの組織カリクレインファミリーのメンバーであるＰＳＡを検出するためのＰｅｐＢｌｏｔアッセイを設計した。本発明者らは、Ｔａｎｋｇｏによって予測される配列Ｗ１４ＱＶＬＶＡＳ２０および配列Ｑ３４ＷＶＬＴＡＡ４０を標的とするペプチドを合成した（表１５参照）。
【０６７２】
男性志願者から精液を回収し、室温で液化させた。２時間後、精液は、精子細胞から血漿を分離するために１０，０００×ｇで１５分間遠心分離された。１０％精漿試料は、変性ゲル電気泳動を用いて非還元条件下で分画し、次に、ＰＶＤＦメンブレンに転写させ、血清電気泳動に関して記載されたプロトコールを用いてブロックした。メンブレンのレーンは、別々に、１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．１）、１００ｍＭトレハロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２．５％ＤＭＳＯに処方された２５０ｎＭのペプチドｂ〜ＲＷＱＶＬＡＳＤ（配列番号８８）またはペプチドｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８５）または２５０ｐＭのタンデムリピートペプチドｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８９）とともに２５℃にて１時間撹拌された。メンブレンを１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．１）、０．０５％ｔｗｅｅｎ  ２０においてすすぎ、ＨＲＰコンジュゲートされたＳＲＰで染色し、ＥＣＬシステムで視覚化した。並行して、精漿中のＰＳＡのＷＢ検出は、ＰＳＡのｃ末端ペプチドに特異的な（１：５０００）ウサギモノクローナル抗ＰＳＡ抗体（ＥＰ１５８８Ｙ、Ａｂｃａｍ）とともにメンブレンをインキュベートすることによって行われた。続いて、これは、ＨＲＰにコンジュゲートされたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体で染色され、ＥＣＬシステムを用いて視覚化された。
【０６７３】
図５９Ａにおいて見ることができるように、ペプチド（ｂ〜ＲＷＱＶＬＡＳＤ（配列番号８８）およびｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８５））は、ＰＳＡのＣ末端配列に特異的であるモノクローナル抗体によって同定された約３０ｋＤａの見かけの分子量でタンパク質バンドに蓄積された。両ペプチドは、抗体と匹敵するレベルまでＰＳＡを検出することができる。ＷＱＶＬＡＳペプチドのＤゲートキーパーは、タンパク質配列における隣接残基に相補的な電荷を提供するように選択されることに留意されたい。興味深いことに、強いバンドシグナルは、有意に低い濃度（２５０ｐＭ）のタンデムリピート（ｎ＝２であり、両方のＹ部分は同一である。）インターフェラーペプチドｂ〜ＲＱＷＶＬＴＡＡＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＱＷＶＬＴＡＡＲ（配列番号８９）をプローブとして用いて達成することができる（図５９Ｂ）。この分子において、すべてのＸ部分は、単一のＲ残基であり、Ｚ１リンカーはＧＳＧＳＡＰＡＡ（配列番号９０）である。この結果は、バイオマーカー検出が、繰り返し凝集配列（すなわち、ｎが少なくとも２である配列であり、そのうち、少なくとも２つのＹｉは互いに同一であり、およびタンパク質中の領域に同一である）を用いて増幅することができ、プローブファンは溶液中でさらに希釈され得ることを示唆する。さらなる確認として、本発明者らは、Ｎ末端配列決定としてトリプシン消化および質量分析を行い、バンドの主成分としてＰＳＡを確認した。
【０６７４】
４．６．５  ヒト血清中のサイトカインインターロイキン１−β（ＩＬ１β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の検出
５μｇのサイトカインインターロイキン１−β（ＩＬ１β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の各々は、５％ヒト血清中で別々に添加され、４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いた電気泳動によって分離され、ＰＶＤＦメンブレンに転写され、ＰＢＳ−Ｔ中の１％ＢＳＡを用いてブロックされた。対照として、血清試料に隣接する１レーンは５μｇのＩＬ１βまたは５μｇのＴＮＦαのみのいずれかを含んでいた。
【０６７５】
ＩＬ１βは、ペプチド（ｂ〜ＲＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＤ（配列番号１８４）およびｂ〜ＫＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＤ（配列番号１８５））を用いて検出された。ペプチドの１０μＭストック溶液をＤＭＳＯ中で別々に調製し、調製緩衝液（１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭトレハロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）において希釈した。メンブレンは、ペプチド処方物とともに２５℃にて１時間穏やかに撹拌された。１０ｍＭのＭＥＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．４）の緩衝液中で４回すすいだ後、メンブレンは、ビオチン親和性試薬であるＨＲＰにコンジュゲートされたＳＲＰで染色された。このＰｅｐＢｌｏｔ検出の結果を図６０に示す。
【０６７６】
ＴＮＦα検出について、１０μＭのペプチド（ｂ〜ＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＰ（配列番号１８６）、ｂ〜ＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＨ（配列番号１８７））は、調製緩衝液（１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのトレハロース、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ６．５）中で別々に希釈（１／４０）され、メンブレンとともに２５℃にて１時間穏やかに撹拌された。１０ｍＭのＭＥＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ６．５）緩衝液中で４回すすいだ後、メンブレンは、ビオチン親和性試薬であるＨＲＰにコンジュゲートされたＳＲＰで染色された。インターフェラーペプチドを用いたＴＮＦα検出のＰｅｐＢｌｏｔデータを図６１に示した。
【０６７７】
４．７  ＥＬＩＳＡを用いたタンパク質の定量的検出
さらに診断技術における本技術の応用を探索するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡのような定量的プラットフォームに選択的タンパク質マーカーの標的化された凝集を組み込んだ。このアプローチにおいて、対象とするタンパク質マーカーを検出するためのペプチドプローブの選択性および感度をマイクロタイタープレート中の複合培地で調べた。最初に、本発明者らは、誘導していないＥ．コリ溶解物においてβ−ｇａｌを滴定し、９６ウェルマイクロタイタープレートで全細胞溶解物を捕捉した。次に、捕捉されたタンパク質は、タンデムリピートペプチドである、β−ｇａｌに対して生じさせたｂ〜ＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲＧＳＧＳＡＰＡＡＲＶＩＩＷＳＬＧＮＲ（配列番号９１）を用いて探査された。（タンデムリピートは、ｎ＝２であり、両方のＹ部分が同一であること（ここではＶＩＩＷＳＬＧＮ（配列番号７６））を意味する。）この分子において、すべてのＸ部分は単一Ｒ残基であり、Ｚ１リンカーはＧＳＧＳＡＰＡＡ（配列番号９０））である。ＳＲＰをコンジュゲートしたＨＲＰは、二次試薬として機能し、シグナルは４５０ｎｍで比色アッセイによって検出された。本発明者らの結果は、図６２に示されるように、全細胞溶解物のβ−Ｇａｌの濃度に対して良好な相関を示す。（このデータは、実施例２に示されるドットブロットアッセイにおけるＣｌｐＣタンパク質の検出と同様であることに喚起されたい（図３０）。）
４．８  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔセンサーを用いたタンパク質の定量的検出
代替のアプローチとして、標識フリーアッセイセットアップを試み、β−ＧａｌおよびＣＲＰに対して生じさせたタンデムリピートプローブペプチドをセンサープローブに固定したＢｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）技術（Ｏｃｔｅｔ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いた。０．０１５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および３ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝６．８）に可溶化させた組換えタンパク質バイオマーカー（β−ｇａｌおよびＣＲＰ）をマイクロウェルプレート内に滴定し、次に、標的ペプチドとの相互作用は、直接的にＯｃｔｅｔ機器を用いて読み出された（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）。センサーの高感度は、分析物のピコモル濃度を検出し得ることを意味する。これらの結果（β−ＧａｌおよびＣＲＰについてそれぞれ図６３および６４に示される）は、ペプチドに基づくアッセイが、既存の技術プラットフォームに容易に組み込むことができる臨床診断において、ヒトバイオマーカーを含むバイオマーカーの定量的検出を行う可能性を有することを示唆する。
【０６７８】
４．９  タンパク質を検出するためのペプチドマイクロアレイ
実施例４．８におけるセンサープローブへのインターフェラーの被覆と同様に、初期実験は、本明細書に記載されているインターフェラーペプチドが、セルロースメンブレンに共有結合的に固定化され、タンパク質検出（ＰｅｐＳｐｏｔ（商標）プラットフォーム（ＪＰＴ、ＧｍｂＨ）に基づくアッセイ）のために用いられ得ることを示した。これは、同時に複数のタンパク質の検出を可能にする（５０個以上のプローブを一緒に使用した。データを示さず）。
【０６７９】
これらのペプチドが他のマイクロアレイフォーマットにおいても使用可能かどうかを評価するために、予備実験を行い、ＰｅｐＳｔａｒ（商標）ペプチドマイクロアレイ（ＪＰＴ、ＧｍｂＨ）の使用によってスライドガラス上にペプチドマイクロアレイを設計した。ペプチドは、１０種の標的に対して設計された：これらのペプチドには、Ｈｉｔ１、Ｈｉｔ５７（実施例２参照）、β−Ｇａｌ、ｐ５３、ｐ１６、ＣＳ（クエン酸シンターゼ）、ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＳＥＧＮ（Ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｉｎ）およびＡ２ＭＧ（α−２−マクログロブリン）に対するペプチドが含まれる。ペプチドを合成し、５種のピンサイズ：６２．５μｍ、１６５μｍ、２６５μｍ、３３５μｍおよび４００μｍでスライドガラス上にスポット（５００μｍｏｌ）した。ビオチンの３点測定スポット（６２．５μｍ）は、マーカーとして、各ピンサイズと一緒に配列に含まれた。
【０６８０】
様々なバリエーションのペプチドを試験した：自然なゲートキーパー残基（すなわち、Ｙｉ部分を含む短いタンパク質断片）で挟まれたペプチド、両側でＡｒｇゲートキーパーによって挟まれたＹｉ部分（すなわち、ｎ＝１、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｒ）およびＡｒｇゲートキーパーを含むタンデムリピートを有するペプチド（すなわち、ｎ＝２、すべてのＸ部分がＲに等しく、Ｙ１＝Ｙ２）。さらに、「単一」ペプチド−ただ１つだけＹ部分を有するもの−は、２つの異なるリンカーの長さを用いてスライドガラスに連結された。各スライドガラスは、３反復したペプチドを有する。
【０６８１】
すべてのペプチドの概要を表１６に示す。自然に挟まれたペプチドについて、短いリンカーは、配列ＧＳ（１個または２個の残基、次にＹｉ部分が続く）からなっていた。長いリンカーはＧＳＰＧＳＰＧＳ（配列番号１８８）である。単一のインターフェラーペプチドについて、短いリンカーは、配列ＧＳＡ（１個のＲ残基、第１のゲートキーパーが続く）からなっていて、長いリンカーはＧＳＰＧＳＰＧＳＡ（配列番号１８９）である。タンデムリピートペプチドについて、ＧＡまたはＧＡＳをリンカーとして使用した。
【０６８２】
３１７μｇ／ｍｌのＣＲＰを含む患者の血清試料をインキュベーション前にＰＢＳ−Ｔ中で１０％に希釈した。３００μｌの１０％血清をスライド上にピペットで取り、次に、ガラススリップで覆い、１時間３７℃にてインキュベートした。スライドをＰＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄し、１：１０００希釈のウサギモノクローナル抗ＣＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ）とともに１時間インキュベートし、次に、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ）で標識された１：１０００のヤギ抗ウサギ抗体ともにインキュベートした。ビオチンマーカーを視覚化するために、追加段階を含み、この場合、スライドをＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４にコンジュゲートされたＳＲＰとともにインキュベートした。スライドは、４８８ｎｍおよび５９４ｎｍのチャネルにて、ＧｅｎｅＰｉｘ４４００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）スキャナーを用いてスキャンされた。
【０６８３】
【表１６】
2014514917.tif 000027
2014514917.tif 000028
【０６８４】
長いリンカーを有する「Ｒ」を挟んだペプチドおよび「Ｒ」を挟んだタンデムペプチドの結果を図６５に示す。
【０６８５】
これが単なる予備実験であったとしても、それはさらなる最適化を必要とし、結果は有望である。予想されていたように、最低濃度のＣＲＰについての結果は、決定的でない（データを示さず）。しかしながら、より高濃度のＣＲＰについて、最大シグナル対ノイズ比を相対的に示すペプチドは、ＣＲＰの単一のインターフェラーペプチドおよびＣＲＰタンデムリピートペプチドである。さらに、これらはまた、マイクロアレイスライドの各々について最大シグナルであり、両方のシグナルは２．５を超えるシグナル対ノイズ比を有する。
【０６８６】
天然の配列を使用することは、効率的なＣＲＰ検出をもたらすようではない。特定の機構に束縛されることなく、これは、少なくとも部分的には、ＣＲＰ凝集部分に隣接する天然の配列は反対電荷（負のＥ残基がＮ−末端、正のＫ残基がＣ末端である）を含むという事実に起因する場合がある。このような場合において、同一電荷による反発力と反対電荷による引力を避けるために（換言すると、ペプチドが、逆配向に押す電荷に起因して正確に整列しないことを避けるために）、ゲートキーパーにおける電荷の相補性を提供することがより良い場合がある。
【０６８７】
さらなる最適化（例えば、他のリンカーは、ゲートキーパー残基のバリエーション、処方、スライドの前処理、動力学、温度および他のプロトコール変数）は、さらに良好な結果を与えることが考えられ、これは、インターフェラーペプチドが、臨床血清などの複雑な試料において複数の分析物を検出するためのマイクロアレイフォーマットにおいて使用され得ることを示す。
【０６８８】
５．非感染の医学的応用
５．１  成長ホルモン受容体の標的化された凝集
５．１．１  導入
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）スーパーファミリーは、癌治療薬開発のための主要な標的である（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；９（１）：２８）。現在の抗癌治療は、大部分、上皮細胞増殖因子レセプターのメンバーなどのキナーゼを標的とし、通常、同様に抗血管新生効果をもつ。しかしながら、それは、通常、特異的であるこれらの分子の各々に対する阻害剤を同定するために困難な作業を残す。
【０６８９】
したがって、本発明者らは、本明細書に記載されている分子を用いてＲＴＫを標的とすることを目的とした。具体的に凝集を誘導するように設計された一連のペプチドをスクリーニングすることによって、これらのレセプターを介した機能的シグナル伝達を阻害することができるＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ２に対して指向されるいくつかの新規ペプチドが同定された。
【０６９０】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、とりわけ血管新生に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。１、２および３と番号付けされたＶＥＧＦレセプターの３つの主要なサブタイプが存在する。これらのうち、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲまたはＦｌｋ−１としても知られる）は、ＶＥＧＦに対する大部分の既知の細胞応答を仲介するようである。ＶＥＧＦＲ−２へのＶＥＧＦの結合により活性化される経路の一つは、Ｅｒｋ１／２のリン酸化をもたらすＥＲＫ経路である。癌における血管新生の重要性を考慮すると、ＶＥＧＦＲ−２の異なる阻害剤は、現在、抗癌薬としての可能性について試験されている（例えば、Ｇｕｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０；１８０６（１）：１０８−２１；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１１（５）：３１１−９；ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ：Ｓｐｒａｔｌｉｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１１；１３（２）：９７−１０２；ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ：Ｍｏｒａｂｉｔｏら、Ｄｒｕｇｓ  Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）．２０１０；４６（９）：６８３−９８）。さらに、抗ＶＥＧＦＲ２化合物はまた、脈絡膜血管新生に対抗して加齢黄斑変性症の治療にも有望であることを示す（Ｍｉａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６；３４５（１）：４３８−４５；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００８；３３（１１）：１００２−１０；ＣｈａｐｐｅｌｏｗおよびＫａｉｓｅｒ、Ｄｒｕｇｓ．２００８；６８（８）：１０２９−３６）。
【０６９１】
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥｒｂＢファミリーのレセプターチロシンキナーゼである。ＥｒｂＢファミリーの４つのメンバーは同定されている；ＥＧＦＲ（別名ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＥＧＦＲ２（ＥｒｂＢ２のまたはＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）。ＥＧＦＲシグナル伝達は、細胞外リガンド結合ドメインへのリガンド結合によって開始される。リガンドへのタンパク質の結合は、レセプターの二量体化およびチロシン自己リン酸化を誘導し、細胞増殖をもたらす。この遺伝子の突然変異は肺癌に関連付けられ、この遺伝子の増幅または過剰発現は、ある種の攻撃性タイプの乳癌の発症と進行において重要な役割を果たすことが示されている。近年では、疾患治療の重要なバイオマーカーおよび標的となるものとして考えられるようになってきた。例えば、ＥＧＦＲ２は、モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎとして市販される）の標的である。
【０６９２】
これらのレセプターに対する凝集ペプチドは、既に本明細書に詳述されるように設計された。これらは、Ｄ−またはＲ−ゲートキーパー残基（番号付けされたＸ部分）のいずれかに挟まれた２つのコア凝集配列（タンパク質配列の凝集コアから取られたＹｉ部分）からなる。ほとんどの場合、Ｙｉ部分は同一であるが（「タンデムリピート」ペプチド）、一部では、Ｙｉ部分はレセプターの２つの異なる凝集ドメインに対応する。ｎ＝２であるこれらの分子について、Ｚ１部分は、凝集に利用可能である両方のコアドメインを確保するプロリンに富化したリンカーである。
【０６９３】
５．１．２  インターフェラーペプチドを用いたＶＥＧＦＲ２の標的化
異なるインターフェラーペプチドは、マウスＶＥＧＦＲ２タンパク質（シグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域または細胞質領域内）における凝集性領域の発生に基づいて設計された。リガンド結合時のＶＥＧＦＲシグナル伝達に干渉するペプチドの能力を試験するために、以下のアッセイを行った。最初に、ｍＶＥＧＦＲ２は、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞において過剰発現させた。ＨＥＫ２９３細胞は、内因性ＶＥＧＦＲ２を欠損している。細胞は、ＤＭＳＯ中の１０または２０μＭのペプチド（または担体対照）の存在下で、一日増殖させ、次に一晩飢餓状態にされた。次に、細胞は、飢餓／ペプチド培地中で５分間、２５ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦで刺激され、ＭＡＰキナーゼリン酸化カスケードを介した下流シグナル伝達は、ＥＲＫ１／２リン酸化と総ＥＲＫ１／２レベルの両方を研究することによって分析された。これは、ウェスタンブロットまたはより定量的なＥＬＩＳＡのいずれかを用いて評価された。
【０６９４】
ペプチドのアレイを設計し、ナノモルスケールでＪＰＴ  ＧｍｂＨによって合成した。ペプチドはマウスＶＥＧＦＲ２のいくつかの凝集ゾーンを標的とした。このペプチドの正確な配列を表１７に示す。各ペプチドを５ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、使用後、−２０℃にて凍結保存した。
【０６９５】
【表１７】
2014514917.tif 000029
【０６９６】
試験は、最初に、マイクロスケール上で合成されたペプチドを用いて行われ、処理後にＥＲＫ１／２のリン酸化を有意に（すなわち、７５％を超えて）減少させる２つのペプチドを得た（３つの独立した実験の結果、データを示さず）。ＥＲＫのリン酸化における最大効果を繰り返して示すこれらのペプチドは、高純度のペプチドとして順序付けられ、同じアッセイにおいて再試験された。異なるスケールアッププロトコールを比較するために、ペプチドは、２つの供給源：ＪＰＴ  ＧｍｂＨ、ベルリンおよびＫｒｉｓ  Ｇｅｖａｅｒｔ教授（ゲント大学）の研究室から入手された。これらの高純度ペプチドの２つについての結果を図６６に示す。
【０６９７】
ペプチド生成物の各々は、同等に有力であることが判明した。ペプチドＢ８は、配列ＤＬＡＶＡＬＷＦＤＰＰＤＬＡＶＡＬＷＦＤ（配列番号２４１）を有し、ペプチドＢ１２は、ＤＭＩＳＹＡＧＭＤＰＰＤＭＩＳＹＡＧＭＤ（配列番号２４９）を有する。これらの分子の構造は、ｎが２であり、Ｘ１からＸ４が１個のアミノ酸（すなわち、Ｄ）であり、Ｙ１が７個のアミノ酸であって、Ｙ２と同一であり、Ｚ１が２個のアミノ酸リンカー（すなわち、ＰＰ）であり、Ｚ２が存在しない、本願に概要されている式に対応する。Ｂ８のＹ部分（ＬＡＶＡＬＷＦ（配列番号２７８））は、予測されたＶＥＧＦＲ２のシグナルペプチドの配列の一部に対応し、Ｂ１２のＹ部分（ＭＩＳＹＡＧＭ（配列番号２７９）は、ＶＥＧＦＲ２の細胞外配列の一部と同一である。７個のアミノ酸配列の両方は、マウスゲノムに固有にコードされ、すなわち、これらの７個の連続アミノ酸ストレッチは、他のマウスタンパク質ではなくｍＶＥＧＦＲ２にのみ見出されることに留意されたい。特定の機構に束縛されることなしに、Ｂ８ペプチドはシグナルペプチドを標的とするため、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の翻訳時（すなわち、シグナルペプチドが切断される前）に阻害が生じる可能性がもっとも高く、これは、このペプチドが細胞によって内在化されることを示す。
【０６９８】
図６６Ａに示されるように、両ペプチドはほぼ完全にＥＲＫ１／２リン酸化を無効するが、総ＥＲＫ１／２レベルに干渉しない。この効果はペプチドの５μＭで既に観察されている。リン酸化されたＥＲＫの比率が存在する総ＥＲＫに対してプロットされている場合、インターフェラー分子の添加は、ほぼ完全にＶＥＧＦＲ−２のリガンドによって誘導されるシグナル伝達を無効にし：この比率は、刺激されていない細胞の範囲であり、同量のＶＥＧＦであるが、インターフェラーペプチドなしで刺激されたものよりも非常に低いことが分かる（図６６Ｂ）。
【０６９９】
同定されたペプチドの特異性を評価するために、一連のペプチドは、Ｂ８またはＢ１２ペプチドの配列に基づいて設計されたが、コア凝集領域においてプロリン残基を有する追加の変異を含んでいた。これらの「不活化」ペプチドを用いても、ＥＲＫ１／２のリン酸化の有意な減少を示さなかった（データを示さず）。
【０７００】
次の段階として、ＶＥＧＦＲ２ペプチドの特異性を試験するために、本発明者らは、ＥＧＦＲファミリーに対するこれらの交差反応性を試験した。したがって、ＨｅＬａ細胞は、ペプチドＢ８およびＢ１２で処理され、次いでＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。この設定において、Ｂ８およびＢ１２は、ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害せず、これは、これらのペプチドは、（ｉ）ＶＥＧＦＲ２に特異的であり、（ｉｉ）ＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ２がほぼ同一のシグナル伝達カスケードを使用するため、一般的な細胞活動およびＥＲＫ１／２カスケードに直接影響を与えないことを示す。
【０７０１】
ペプチド阻害の細胞機構をよりよく理解するために、細胞が、細胞内局在を追跡する抗ＶＥＧＦＲ２抗体を用いて染色された予備実験を実施した。図６８に見ることができるように、対照処理された細胞において、ＶＥＧＦＲ２は、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜上に主に存在していた。しかしながら、１０μＭのペプチドＢ８で細胞を一晩処理した後、ＶＥＧＦＲ２分子はもはや細胞表面上に存在しなかったが、ほとんどはおそらく凝集されたＶＥＧＦＲ２を含む細胞内小胞に存在していた。
【０７０２】
このようにして、これらの実験が示しているように、インターフェラーペプチドを用いて、単一のタンパク質の機能を特異的に標的とし、該タンパク質の機能を阻害することができる（この点に関して、Ｂ８のＬＡＶＡＬＷＦ（配列番号２７８）配列はヒトゲノムにおいてコードされず（したがって、ＨＥＫ２９３細胞に存在しない）、Ｂ１２のＭＩＳＹＡＧＭ（配列番号２７９）配列は、ヒトにおいてＶＥＧＦＲ２に固有である（しかし、通常は、ＨＥＫ２９３細胞において発現しない）ことに留意されたい。）。癌およびＡＭＤの病理学におけるＶＥＧＦＲ−２の確立された役割およびＶＥＧＦＲ−２阻害に焦点をあてた臨床試験を考慮すると、本明細書に記載されているもののようなペプチドは、これらの疾患の治療に高い潜在力を有している。Ｂ１２ペプチドに用いられる（マウス）配列はヒトＶＥＧＦＲ−２にも存在しているので、このペプチドは交差反応性を示し、ヒトの治療に使用できることが期待される。
【０７０３】
５．１．２．１  脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおけるＶＥＧＦＲ２の阻害
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の最終段階の深刻な病理学的結果の一つである。いくつかの方面からの証拠は、ＡＭＤ患者の網膜におけるＶＥＧＦシグナル伝達レベルの増加を伴い、ＶＥＧＦＲ２の阻害は、ＣＮＶモデルにおいて血管新生を阻害することが示されている。ＶＥＧＦＲ２に対して指向されたインターフェラーペプチドが、インビボでＶＥＧＦＲ２の機能を阻害し得るかどうかを試験するために、これらのペプチドが、血管新生のマウスモデル（すなわち、レーザー誘導のＣＮＶ）において評価された。このモデルは、以前に報告されている（Ｌａｍｂｅｒｔら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ；１５：１０２１−１０２７、２００１）。
【０７０４】
要約すると、実験設定は以下の通りであった：
３回のレーザーによる火傷は、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの右眼に１日目に施された。１日目および３日目、１μｌのＤＭＳＯ（陰性対照）、Ｂ８−ＦＩＴＣもしくはＢ１２−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネートで標識されたインターフェラーペプチド）またはＤＣ１０１（抗ＶＥＧＦＲ−２ｍＡｂ、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３１：４６３−４７５、２００７）。インターフェラーペプチドは、注射前に超音波処理された、ＤＭＳＯ中の５ｍＭ溶液として提供された。５日目に、目はＴＲＩＴＣ−デキストランで灌流され、マウスは、安楽死および解剖され、次に、網膜のフラットマウントを行った。写真を撮影し、病変の総面積に対する血管％を決定した。結果を図６９に示す。
【０７０５】
図から見ることができるように、インターフェラーによる処理に応じて血管新生が明確に減少している。効果はまだＤＣ１０１のものほど大きくはないが、これは非常によく特徴付けられた抗体であり、一方、ペプチドはまだ最適化されていない。これは、実際の血管新生と炎症応答の間により良い区別を可能にするため、実験は、できる限り反復投与により、１４日間の時間経過にわたって繰り返される。
【０７０６】
５．１．３  インターフェラーペプチドによるＥＧＦＲ２の標的化
ＥＧＦＲ２ペプチドは、ヒトＥＧＦＲ２レセプターを標的とするように設計される。このようにして、これらのアッセイに関して、ＨｅＬａ細胞を最初に使用し、それは、これらの細胞がＥＧＦＲ１とＥＧＦＲ２を内因的に発現するためである。ＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）による刺激後、ＥＲＫ１／２のリン酸化も誘導され、その結果、ＶＥＧＦＲ２について記載されたのと同様のアッセイを使用することができる。
【０７０７】
ＶＥＧＦＲ２の場合と同様に、ペプチドのアレイを設計し、ナノモルスケールでＪＰＴによって合成した。各々は、ヒトＥＧＦＲ２（ＥｒｂＢ２またはＨＥＲ２）におけるいくつかの凝集ゾーンを標的とする。ペプチドの正確な配列を表１８に示す。各ペプチドを５ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、使用後、−２０℃にて凍結維持した。
【０７０８】
【表１８】
2014514917.tif 000030
2014514917.tif 000031
【０７０９】
ＥＧＦＲ２について、同様のスクリーニングをＶＥＧＦＲ２の場合と同様に行った。しかしながら、時間のかかるウェスタンブロット法を用いる代わりに、ホスホ−と全ＥＲＫ１／２の両方を検出することができるＥＬＩＳＡプロトコールを使用した。ＥＧＦシグナル伝達を有意に繰り返して減少させた３つのペプチドを同定した：ＲＷＧＬＬＬＡＬＲＰＰＲＷＧＬＬＬＡＬＲ（配列番号９３）（Ａ５と呼ばれ、シグナル伝達ペプチドを標的とする）、ＲＴＧＹＬＹＩＳＲＰＰＲＴＧＹＬＹＩＳＲ（配列番号９４）（Ａ１１と呼ばれ、細胞外ドメインを標的とする）およびＲＩＩＳＡＶＶＧＲＰＰＲＩＩＳＡＶＶＧＲ（配列番号９５）（Ａ１２と呼ばれ、膜貫通ドメインを標的とする）。結果を図７０に示す。
【０７１０】
阻害が不完全であるとしても、阻害効果は有意である。これは、ＨｅＬａ細胞における他のＥＧＦＲの発現によるものである可能性があり（Ｍａｓｕｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８４；４４（３）：１００２−７）、これはまた、ＥＲＫリン酸化を介してシグナル伝達を行い、本ペプチドによって標的とされない。
【０７１１】
５．２  抗炎症応用
核因子（ＮＦ）−カッパーＢ経路は、免疫において重要な役割を有し、不適切なＮＦ−カッパーＢ経路活性は、多数の自己免疫疾患および炎症性疾患と関連付けられている。複数の機構は、通常、ＮＦ−κＢ経路の活性化の適切な終端を確実にする。この状況において、細胞内のユビキチン編集タンパク質Ａ２０（腫瘍壊死因子アルファ誘導性タンパク質３またはＴＮＦＡＩＰ３としても知られる）は、複数の刺激に応答してＮＦ−カッパーＢシグナル伝達の負のフィードバック調節の主要なプレーヤーである。
【０７１２】
免疫応答の調節におけるインターフェラーの潜在性を評価するために、インターフェラーペプチドを用いてＮＦ−κＢ経路（例えば、Ａ２０）に関与するタンパク質を阻害することを決定した。
【０７１３】
Ａ２０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）誘導性アポトーシスを調節し、最近の遺伝学的研究が、ヒトＡ２０遺伝子座におけるいくつかの突然変異と免疫病理学、例えばクローン病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬および１型糖尿病との間の明確な関連性を実証しているため（Ｖｅｒｅｅｃｋｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；３０（８）：３８３−９、２００９）、このタンパク質は、ＮＦ−κＢ経路の調節において、原則の最初の証明のために選択された。
【０７１４】
この目的のために、ＴＮＦ−αに応答したＡ２０誘導の動力学を決定した。Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株）は、１０００ＩＵ／ｍｌのヒトＴＮＦで刺激された。刺激後の０、１、３、６および８時間に、上清は、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−８の存在を確認され、バイオアッセイを用いてＩＬ−６の存在を確認された（ＩＬ−８およびＩＬ−６の発現は、ＴＮＦ刺激によるＮＦ−κＢ誘導性応答である。）。同時に、細胞を溶解し、Ａ２０は、ウェスタンブロットを用いて溶解物中に検出された。
【０７１５】
ＩＬ−６は、７ＴＤ１細胞の増殖応答に基づいてアッセイされた（Ｂｅｙａｅｒｔ，Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ，Ｖａｎ  ＲｏｙおよびＦｉｅｒｓ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １９９１）。要約すると、Ａ５４９細胞は、ＴＮＦを用いて指示された時間、処理され、上清が採取され、増殖に関してＩＬ−６に依存する７ＴＤ１細胞を処理するために使用される。標準として、既知量の組換えＩＬ−６が使用される；増殖を比較することによって、ＩＬ−６の量を推定することができる。
【０７１６】
結果を図７１に示す。
【０７１７】
ＩＬ−８誘導は、ＩＬ−６もはっきりと誘導される、刺激後６時間でピークに達する。したがって、Ａ２０発現およびＮＦ−κＢシグナル伝達に対するＡ２０のインターフェラーの活性を試験するために、Ａ５４９細胞を、２０μＭのＡ２０のインターフェラー（ＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯ２％のみを含有する無血清培地で希釈）とともに２０時間プレインキュベートした。１０００ＩＵ／ｍｌで６時間刺激した後のＴＮＦ、同じＩＬ−８ＥＬＩＳＡ、ＩＬ−６のバイオアッセイおよびＡ２０  ＷＢを行った。
【０７１８】
試験されたすべてのペプチドは、同じ一般式Ｘ１−Ｙ−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４（すなわち、ｎ＝２であり、外部リンカーなし）を有し、ここで、Ｘ部分は単一のＲ残基である。ペプチドを表１９に示す。
【０７１９】
【表１９】
2014514917.tif 000032
【０７２０】
ＥＬＩＳＡアッセイ（２つの独立した実験）の結果を図７２に示す。図から見ることができるように、ほぼすべてのインターフェラーは、ＮＦ−κＢシグナル伝達活性の指標として、ＴＮＦ刺激に応じてＩＬ−８レベルを有意に増加させることに成功した。Ａ２０は細胞質タンパク質であるため、インターフェラーペプチドは、経路を阻害することができるように細胞に浸潤させる必要がある。同様に、それほど顕著ではないが、結果は、Ｘ部分はすべて単一のＤ残基である、同じインターフェラーを試験した場合に得られた（示さず）。ウェスタンブロットは、Ａ２０タンパク質レベルの減少を示すが、これは定量化するにはより困難であり、さらなる最適化を必要とする（データを示さず）。代表的なＩＬ−６バイオアッセイの結果を図７３に示し、これらはＩＬ−８アッセイを用いて得られた結果と非常に類似している。
【０７２１】
これらの結果は、ＮＦ−κＢ経路によって調節される免疫応答に影響を及ぼす実施可能性を示す。次の段階において、ＴＮＦに対して設計されたペプチドは、ＴＮＦ誘導性シグナルの阻害を評価するために使用される。試験されるインターフェラーペプチドの例は、ＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＤＰＰＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＤ（配列番号３１７）、ＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＲＰＰＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＲ（配列番号３１８）、ＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＰＰＰＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＰ（配列番号３１９）およびＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＨＰＰＲＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＨ（配列番号３２０）である。
【０７２２】
６．植物における応用
６．１  導入
植物体においてタンパク質干渉技術を試験するために、ブラシノステロイド（ＢＲ）シグナル伝達経路の細胞質プレーヤーが選択された。ＢＲは、血管分化、老化、男性の生殖能力、開花、光形態形成、生物的および非生物的ストレスに対する耐性を含む、臓器の成長と植物の生育に関与する多くの細胞プロセスに影響を及ぼすステロイドホルモンである（ＢａｊｇｕｚおよびＨａｙａｔ（２００９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４７（１）：１−８）。また、それらは、分げつ数、葉の大きさおよび葉の角度として作物における農学的に興味深い特性に作用している（Ｍｏｒｉｎａｋｅ  Ｙら、（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４１（３）：９２４−３１）。一例として、ＢＲホルモンレベルを制御する酵素であるステロールＣ−２２ヒドロキシラーゼの組織特異的な発現は、コメにおける登熱を高めることができる（Ｗｕ  ＣＹら、（２００８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２０（８）：２１３０−４５）。
【０７２３】
アラビドプシスにおいて、ＢＲは、ＢＲ結合により活性化され、続いて起こるリン酸転移イベントを誘導するＢＲＩ１関連レセプターキナーゼ１（ＢＡＫ１）と関連付けられる、原形質膜のロイシンに富化したリピート（ＬＲＲ）レセプター様キナーゼ（ＲＬＫ）のブラシノステロイド非感受性１（ＢＲＩ１）によって把握され、このイベントによって、完全に活性化されたＢＲＩ１がさらにＢＲ−シグナリングキナーゼ（ＢＳＫ）をリン酸化することができる。次に、リン酸化ＢＳＫは、レセプター複合体から解放され、ＢＲＩ１サプレッサー１（ＢＳＵ１）リン酸化物に結合し、おそらくその活性を増大する。活性化されたＢＳＵ１は、ブラシノステロイド非感受性２（ＢＩＮ２）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）ファミリーに属する他のキナーゼをそのホスホチロシン残基を脱リン酸化することによって阻害する。非リン酸化型ＢＩＮ２は、核において、活性な非リン酸化型ブラシナゾール耐性１（ＢＺＲ１）とＢＺＲ２／ｂｒｉ１−ＥＭＳ−サプレッサー１（ＢＺＲ２／ＢＥＳ１）転写因子を蓄積させる。活性なＢＺＲ１およびＢＺＲ２／ＢＥＳ１は、ＢＲ標的遺伝子発現を調節するゲノムＤＮＡに結合し、それにより植物の成長および生育を調節する。
【０７２４】
この経路において、タンパク質干渉技術を用いて干渉することによって農学的に興味深い表現型の変化が生じると本発明者らが期待していたように、良好な推定標的がＢＲの負の調節因子ＢＩＮ２において同定された。この目的を達成するために、タンパク質凝集のノックアウト効率は、葉の形と草丈として成長パラメータを採点することによって観察された表現型変化と相関していた。密植条件下で高い収率を与える、コメノックアウトブラシノステロイドシグナリング変異体において示されているため、これらのパラメータは、穀物収量において重要な農学的効果を有する。
【０７２５】
本研究において、２つの主要な生物学的な疑問を扱う；第一に、植物においてβ−凝集現象を視覚化および評価することができるかどうか、次に、ベイトを凝集することによって対象とする特異的タンパク質の標的化がその機能的ノックアウトを証明することによって達成可能かどうかということである。
【０７２６】
６．２  ＢＩＮ２インターフェラーを発現する構築物の設計
ＧＳＫ３様キナーゼＢＩＮ２は、発現された凝集ペプチド（すなわちインターフェラーペプチド）によって標的化を容認し得るその細胞質と核局在化のために、適切な植物標的として選択された。本発明者らは、ＴＡＮＧＯアルゴリズムを用いて、ＢＩＮ２一次アミノ酸配列内の２つの短いアミノ酸性ストレッチ（図７４ａ参照）を特定した。アルゴリズムは、これらの２つのベータ凝集性アミノ酸配列が５０％を超えて凝集する傾向を有することを予測した。これらのインターフェラーペプチドは、本明細書においてベイトとしてもさらに命名されているが、ＢＩＮ２領域の４４−５５ａａ（ベイト４４）をカバーし、キナーゼドメインの２４９−２５７ａａ（ベイト２４９）にある。実験的な理由のために、本発明者らは、ベイト２４９に本発明者らの研究を集中させることを決めた。ＢＩＮ２凝集を誘導するために、ベイト２４９がＣ末端でｅＧＦＰ蛍光タンパク質に融合されたいくつかの構築物は、植物の二成分発現ベクターにおいて遺伝子操作された。これらのベイト２４９発現構築物は、正に荷電したアミノ酸の有無により遺伝子操作された（本明細書ではゲートキーパーとして命名された）；ゲートキーパーを含む構築物は「ベイト２４９Ｒ」として命名され、これらのゲートキーパーを含まない構築物は「ベイト２４９」として命名された。後者の構築物は、発現されたベイトの細胞質局在を高める点においてゲートキーパー残基の役割を評価するために作製された。さらに、凝集プロセスを高めることで知られている合成配列（本明細書ではブースターとして命名された）は、リンカー配列（特定の配列を図７４ｂに示す。）を介して、ベイトとｅＧＦＰの間に挿入された。このようにして、「ベイト２４９Ｒ」構築物は、さらなる部分に融合された、ｎ＝１である、すなわち式Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１の、インターフェラー分子に対応する。Ｘ１およびＸ２の両方がＲであり、Ｙ１が配列ＱＬＶＥＩＩＫＶＬ（配列番号３２１）であり、Ｚ１が配列ＫＰＡＧＡＡＫＰＧＡＡＧ（配列番号１１２）を有するアミノ酸リンカーであり、さらなる部分が凝集ブースター配列および検出のためのＧＦＰ部分である。
【０７２７】
凝集ペプチドのどの生化学的特徴が、凝集体形成および特異的標的の達成により最適であるのかを評価するために、ベイト２４９の異なるバリアントもまたさらに遺伝子操作された。ＢＩＮ２タンパク質におけるベイト配列を天然に隣接する５−７ａａによって挟まれ、単一コピー（ベイト２４９ＮＦと命名された）またはタンデムリピート（ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄと命名された）のいずれかに挿入された、ベイト２４９を発現する２つの構築が生成された。この第二セットのベクターにおいて、凝集のブースターを挿入しなかった（図７４ｃ参照）。これらの場合において、天然の隣接残基の一部がゲートキーパーとして作用する。したがって、ベイト２４９ＮＦは、ｎ＝１である、すなわち式Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１の、インターフェラー分子に対応し、ここで、Ｘ１はＤ（隣接するＥＮＡＶＤ（配列番号３２２）配列の最後のアミノ酸）であり、Ｘ２はＧ（隣接するＧＴＰＴＲＥＥ（配列番号３２３）配列の最初のアミノ酸）であり、Ｙ１は配列ＱＬＶＥＩＩＫＶＬ（配列番号３２１）であり、Ｚ１は配列ＡＧＳＰＫＧＡＰＡＡＫＧＳＧＡ（配列番号３２４）を有するアミノ酸リンカーであり、分子はＺ１リンカーを介して検出するためのＧＦＰ部分に融合されている。ベイト２４９ＮＦ  Ｔａｎｄは２単位のベイト２４９ＮＦから構築される（すなわち、ｎ＝２、またはＸ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｚ１−Ｘ３−Ｙ２−Ｘ４−Ｚ２であり、Ｘ１＝Ｘ３、Ｘ２＝Ｘ４、Ｙ１＝Ｙ２、Ｚ１＝Ｚ２、Ｚ２リンカーを介してＧＦＰ部分に融合されている）。
【０７２８】
６．３  Ｎ．ベンサミアナ葉における一過性発現によるベイト２４９凝集の視覚化
植物における凝集体の形成を誘導するための異なるベイトの能力は、初期には、ニコチアナ・ベンサミアナ葉におけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介性浸潤を介してベイトを過剰発現させることによって、一過性発現系において共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で確認されている。ベイト２４９ベクターにおけるゲートキーパーが存在しないことによって、細胞質発現よりはむしろ不溶性の封入体の形成が強く誘導されることが観察された（図７５ａに見られる）。反対に、この効果と遊離ＧＦＰ局在パターンを比較することによって明確に示されるように、ベイト２４９Ｒは非常に強い細胞質の核周囲の凝集を誘導した（図７５ｂ、ｅ参照）。検出されたシグナルはベイト２４９の場合よりも均一であり、封入体は特定されず、これはゲートキーパー残基の重要性を示す。本研究で用いられた第２セットの構築物は、両バージョンにおいて核周囲の凝集体の明確な存在を示し、タンデムリピートにおいてベイトを発現する構築物（ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ）は、ＣＬＳＭを用いて観察されるように、もっとも強い凝集構築物であった（図７５ｃ、ｄ参照）。これらの構築物において、ベイト配列に追加された余分な隣接アミノ酸（ゲートキーパーを含む）は、細胞質凝集を達成する上で重要な役割を果たすようである。
【０７２９】
６．４．  ベイト２５９はＮ．ベンサミアナ細胞におけるＢＩＮ２標的タンパク質と共局在化および物理的に相互作用する
ＢＩＮ２のＮ．ベンサミアナ葉とベイト２４９における一時的な共局在化アッセイは、ベイト標的化とその標的に向けた共凝集傾向の迅速な指示を有するように行われた。それに加えて、葉は、ＣＬＳＭレベルで観察されるようにベイト２４９の最強の凝集バージョンを発現するＡ．ツメファシエンス株とともに共注入された。すなわち、ＲＦＰ蛍光タンパク質に融合されたベイト２４９ＮＦ ＴａｎｄおよびｅＧＦＰに融合されたＢＩＮ２であった。ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄの発現は、続く蛍光顕微鏡評価の２４時間前に誘導された。注入の４−５日後の葉のＣＬＳＭ分析は、０．８より高い値を有する培養された共局在のマンデル係数によるよりも、発現パターンを重ねることによって、ともに証明されたベイトと標的の間の明確な共局在化を示した。共局在の細胞質凝集体の形成はまた、蛍光顕微鏡において評価された（図７６参照）。
【０７３０】
次の段階において、ベイト−ＧＦＰタンパク質とＢＩＮ２標的の間の共局在およびタンパク質凝集のＣＬＳＭ確認後、一過性発現系におけるそれらの安定した物理的相互作用はまた、共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）実験によって評価された。特異的なＢＩＮ２抗体の不足を回避するため、標的タンパク質は、Ｎ末端で血球凝集素（ＨＡ）免疫学的タグに融合された。次に、Ｎ．ベンサミナの葉は、異なるベイト２４９−ＧＦＰを発現するベクターを用いて形質転換されたアグロバクテリウム菌株と共注入され、ＢＩＮ２−ＨＡは、３５Ｓプロモーターの制御下で発現させた。ゲートキーパー（および凝集のブースターを含む）および単一およびタンデムリピート（ブースターを含まない）の有無による両方のベイト２４９を試験した。ｃｏ−ＩＰ実験は、抗ＧＦＰアガロース結合ビーズによってＧＦＰタグ化ベイトのプルダウンによって行われ、続くウェスタンブロット検出は、抗ＨＡモノクローナル抗体を用いて達成された。異なる陰性対照が使用された：ｉ）ビーズへのＧＦＰの非特異的結合について試験するために、遊離ＧＦＰをコードするベクターがＢＩＮ２ＨＡと共注入された；ｉｉ）ビーズへの合成ブースターの非特異的結合について試験するために、ブースターとＧＦＰに融合されたリンカー配列だけをコードするベクターは遺伝子操作され、ＢＩＮ２−ＨＡとともに共注入された；ｉｉｉ）ビーズへのＢＩＮ２タンパク質またはＨＡタグのいずれかの非特異的結合について試験するために、ＢＩＮ２−ＨＡ構築物は単独で注入された；ｉｖ）さらに野生型植物抽出物は追加の陰性対照として用いられた。ｃｏ−ＩＰ実験は、ＢＩＮ２を用いて試験されたベイト２４９のいずれかのバージョンについて陽性の相互作用を指示し、それによって、ベイトおよび標的は、特異的な生化学的相互作用の形成、すなわち、交差−β−シートを媒介した凝集を介して相互作用し得ることを強く実証している（図７７参照）。この結果は、２つのパートナー間の物理的相互作用がインビボ系で発生するという概念の証拠を生成することにより、共局在アッセイで観察されたのかを確認した。
【０７３１】
６．５．アラビドプシストランスジェニック植物におけるタンパク質凝集の効率の評価
いくつかのＧＦＰタグ化されたベイト２４９発現構築物の形質転換後、凝集効率はまた、トランスジェニックアラビドプシス植物においてモニターされた。
【０７３２】
誘導された凝集因子複合体の評価は、各ホモ接合型系統におけるＣＬＳＭ顕微鏡でのＧＦＰ蛍光タンパク質の画像化によって評価された。
【０７３３】
３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰを発現する系統は、様々な実生組織（子葉、葉柄、胚軸および根）において、明確な核周囲凝集を有する最強の細胞内ＧＦＰ発現パターンを示した（図７８ａ−ｄ、ｅ−ｈ参照）。
【０７３４】
対照的に、３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰ構築物を含むアラビドプシス植物について、ゲートキーパーが存在しないことによって、レポータータンパク質の弱い発現をもたらす、アラビドプシス細胞における任意の細胞質内に局在化された凝集体の発現、およびこれらの細胞における円形の不溶性体の形成が弱まり、ニコチアナの一過性に形質転換された葉において観察されたものと同様であった。３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰ発現パターンは、タンデムにおいてベイトよりも弱かった（図７９ａ−ｈ参照）。上記の理由のため、構築物３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰは、さらなる機能分析のために考慮されなかった。
【０７３５】
細胞内レベルでアラビドプシス細胞における３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰの局在化パターンを調べるために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、これらの構造物を安定に発現している播種後（Ｄ．Ａ．Ｓ．）の８日目の実生について行われた。さらなる分析のために選択された系統の細胞質のベイト−ＧＦＰ局在化パターンは、免疫金標識実験によって確認された。このアプローチにおいて、抗ＧＦＰ抗体を用いて３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ系統における胚軸および根細胞の標識は、主に根の伸長領域に属する細胞の細胞質ゾルにおいて、ベイトの特定の細胞内局在化をもたらした。凝集タンパク質は、クラスター化された凝集というよりは線維構造の両方において配置されているようであり、これは、凝集体が細胞において様々な形状を取得し得ることを示す（図８０ａ−ｃ）。ゴルジ層板は、代わりに、メンブレン様構造（すなわち、ＥＲ）（図８０ｂ）においてより豊富であるように見える金粒子（図８０ｃ参照）から遊離された。遊離の細胞質ベイト２４９ＲＧＦＰタンパク質の存在もほとんど見られなかった。３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰについて、大規模な細胞質と核周囲局在化は、子葉の柵状細胞および根の伸長域細胞において観察され、固有の凝集因子複合体の形状は、検出されなかった（図８０ｄ−ｅ）。
【０７３６】
凝集因子タンパク質レベルの生化学的な確認は、ネイティブ−ＰＡＧＥ電気泳動およびその後の抗ＧＦＰモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析によって、それぞれアラビドプシスの形質転換された系統について評価された（図８１ａ参照）。
【０７３７】
次に、凝集体の生化学的性質は、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）後、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光法によってさらに分析された。ＦＴ−ＩＲスペクトルから１６１６および１６８０λ値において２つのピークが明らかに示され、これは、高含有量のβ−シートが、その細胞内局在パターンが異なることに加えて３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰ系統において凝集することを示す（図８１ｂ参照）。３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰ系統について、１６１６と１６８０の吸収値における僅かな増加が検出され、従前に分析された系統より小さい程度ではあるが、免疫沈降された材料においてβ−シート含有量を示した（図８１ｃ）。
【０７３８】
６．５．１  トランスジェニックアラビドプシス植物の表現型
次に、ホモ接合ベイト２４９を発現する系統は、ＢＩＮ２におけるノックダウンが起きていたことを示す表現型の出現について、インビトロと土壌の両方においてさらに分析された。３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰトランスジェニック実生は、垂直にインビトロで８日間成長させ、非形質転換系統Ｃｏｌ−０よりも長い根と胚軸を持っていた；この観察はまたＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた定量化によって確認された（図８２ａ）。実施された統計学的評価は、Ｃｏｌ−０とトランスジェニック系統の間で統計学的有意性を示した。土壌で成長させた１カ月齢のトランスジェニック植物はまた、Ｃｏｌ−０に関して、より大きな個体となった（図８２ａ）。３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰのトランスジェニック実生は、インビトロおよび土壌条件のいずれにおいてもＣｏｌ−０との表現型の違いを示さず、さらなる分析に含めなかった。
【０７３９】
次の段階において、ＢＩＮ２の機能がその特定の凝集によって影響を受けるさらなる証拠を与えるために、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰ系統は、ブラシノステロイド生合成阻害剤であるブラシナゾール（ＢＲＺ）に対する耐性について調べられた。陽性対照として、ＢＩＮ２およびその２つの近縁のホモロガス（ａｔｓｋ２２とａｔｓｋ２３）における三重ノックアウト変異体を用いた（Ｖｅｒｔ  ＧおよびＣｈｏｒｙ  Ｊ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０８９）：９６−１００）。本発明者らは、ＢＩＮ２の機能が影響を受ける場合、それは、少なくとも部分的にブラシナゾールに耐性である植物をもたらすことに期待した（三重変異体（Ｖｅｒｔ  ＧおよびＣｈｏｒｙ  Ｊ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０８９）：９６−１００）はブラシナゾールに耐性であることに留意されたい。）。本発明者らは、トランスジェニック系統が、胚軸の長さの観点で定量されたように、阻害剤であるブラシナゾールに対して部分的な耐性を示したことを実際に示すことができた（図８２ｂ参照）。
【０７４０】
６．５．２  トランスジェニックアラビドプシス植物における遺伝子発現の変化
ＢＲ関連ＤＷＦ４およびＣＰＤ遺伝子発現における定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析において、本発明者らは、２つの凝集因子系統においてＤＷＦ４の発現レベルの減少を実証した。ＣＰＤ遺伝子発現の場合、効果は３５Ｓ：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ：ＧＦＰについてのみ観察され、フィードバック阻害、このようにして、活性化されたＢＲシグナル伝達を示す（図８３ａを参照）。したがって、ＮＡＣファミリー由来のＢＲ反応性転写因子の相対的発現レベルの分析は、３５Ｓ：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ：ＧＦＰ構築物の僅かな発現増加を示した（図８３ａ参照）。
【０７４１】
ＢＲ関連遺伝子に加えて、シャペロンタンパク質の発現の誘導におけるトランスジェニックアラビドプシス系統における３５Ｓ：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰ発現の効果もまたモニターされた。興味深いことに、２つの凝集因子系統ではあるが、特にタンデムリピートにおいてベイト２４９（３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック植物は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０−１、ＨＳＰ１０１、ＨＳＣ７０−１、ＨＳＣ７０−２およびＨＳＣ７０−３遺伝子のより高い（誘導性）発現レベルを示した（図８３ｂ参照）。
【０７４２】
６．５．３  トランスジェニックアラビドプシス植物の形態学的評価
さらに、トランスジェニック系統の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）レベルでの形態学的評価は、細胞内レベルで凝集因子構築物の可能な細胞毒性効果をモニターするために行われた。このアプローチを用いると、細胞や細胞内小器官の大きさおよび形状における固有の変化は、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ系統の異なる組織において観察することができなかった（図８４参照）。時折、多量のプラストグロブリ（ｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｉ）がトランスジェニック系統の葉緑体において見出された。後者の現象は、通常、存在する場合において、ナイロンメッシュ上でインビトロの成長条件によって引き起こされ得たストレスの指標である。ＴＥＭの評価はまた、凝集のブースターを含まないタンデムリピートにおけるベイト２４９を発現するホモ接合系統について行われる。
【０７４３】
安定に形質転換されたアラビドプシス系統における標的タンパク質とベイトの共局在を評価するために、本発明者らは、３５Ｓ：：ＢＩＮ２−ＧＦＰと、誘導可能なプロモーター下で発現するｔａｇＲＦＰ蛍光タンパク質に融合された、強く発現される凝集因子バリアントベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ（ｐＭＤＣ：：ベイト２４９ＮＦ ＴａｎｄＲＦＰ）の間の共局在を視覚化することを目的とした。この目的を達成するために、最良の３５Ｓ：：ＢＩＮ２−ＧＦＰを発現する系統は、エストラジオール誘導性ｐＭＤＣ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＲＦＰ構築物を用いて超形質転換された。共局在アッセイは、２４時間のベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ誘導後に一次形質転換体について行われ、次に、ＣＬＳＭで分析された。８つのＤ．Ａ．Ｓ．形質転換実生の共焦点解析は、ベイトおよび標的の明確な重複する局在化パターンを示した（図８５参照）。観察された共局在化の強度はまた、処理されたすべての写真について１に近いマンデル係数を与えた特別な目的のソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ  ＭＢＦ）を用いて定量され、これは、ベイトと標的タンパク質の間に高い共局在化が生じたことを意味する。
【０７４４】
形態学的変化に関して、興味深いことに、予備実験は、ベイト２４９タンデム構築物の発現がｂｒｉ１−５変異体の表現型を救出したことを示した。ＢＩＮ２発現の減少は、ｂｒｉ１−５変異体の表現型を救出することが予期される（ＬｉおよびＮａｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１２９９−１３０１、２００２）。
【０７４５】
６．６  植物の実施例のための材料および方法
６．６．１．植物適合性ゲートウェイベクターにおけるベイト２５９凝集因子のクローニング
ＴＡＮＧＯ予測ツール（ｈｔｔｐ：／／ｔａｎｇｏ．ｓｗｉｔｃｈｌａｂ．ｏｒｇ／）を用いることによって、ＢＩＮ２タンパク質における２つの異なるベイト領域（４４−５５ａａ：ＲＶＶＧＴＧＳＦＧＩＶＦＫ（配列番号３２５）；２４９−２５７ａａ：ＱＬＶＥＩＩＫＶＬ（配列番号３２１））を標的とする２つの凝集因子ペプチドは最初に選択された。ＢＩＮ２領域の２４９−２５７ａａについては、凝集因子構築物は、正に荷電したアルギニン残基によって表される、隣接するゲートキーパーを有する場合（ベイト２４９Ｒ：ＲＱＬＶＥＩＩＫＶＬＲ（配列番号３２６））と有しない場合（ベイト２４９：ＱＬＶＥＩＩＫＶＬ（配列番号３２１））の両方について設計された。
【０７４６】
それぞれのベイト配列は、Ｃ末端に、ＰＣＲ分析によって、凝集の合成配列ブースター（ＱＷＱＮＳＴＬＩＶＬＱＮＳＴＶＩＦＥＱＮＳＴＶＩＦＥＱＮ（配列番号３２７））に融合され、フレキシブルなリンカー配列ＫＰＡＧＡＡＫＰＧＡＡＧ（配列番号１１２）を導入した。
【０７４７】
ベイトアミノ酸性修飾がＢＩＮ２タンパク質のより良好な標的へと導き得る検査の原理を用いることによって、ベイト２４９を発現する他の２つのベクターが作製された。ベイト２４９は、ＢＩＮ２における２４９−２５７ａａ領域（ベイト２４９ＮＦ：ＥＮＡＶＤＱＬＶＥＩＩＫＶＬＧＴＰＴＲＥＥ（配列番号３２８））を天然に挟む５−７ａａ、およびＢＩＮ２タンパク質配列の先頭に対応する６個のアミノ酸（ＭＡＤＤＫＥ（配列番号３２９））を添加することによって修飾された。フレキシブルなリンカー配列は、ＡＧＳＰＫＧＡＰＡＡＫＧＳＧＡ（配列番号３２４）に変更され、ブースター配列が除去される。１つの構築物において、ベイトは、タンデムリピート（ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ：ＥＮＡＶＤＱＬＶＥＩＩＫＶＬＧＴＰＴＲＥＥＥＮＡＶＤＱＬＶＥＩＩＫＶＬＧＴＰＴＲＥＥ（配列番号３３０））に挿入された。得られたＤＮＡ配列は、ｐＤＯＮＲ２２１エントリーベクターにクローニングされたゲートウェイであった。配列の確認後、インサートは、３５ＳプロモーターおよびＣ末端でｅＧＦＰ蛍光タグに融合された異種配列を含む植物のバイナリーベクターを生成させるために、ｐｋ７ＷＧ２，０（Ｋａｒｉｍｉら、２００７）デスティネーションベクターに移された。また、ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄは、エストラジオール誘導性プロモーター（ＣｕｒｔｉｓおよびＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ、２００３）を含むＧａｔｅｗａｙ  ｐＭＤＣ−ｍ１３ＧＷベクターにクローニングされ、異種配列は、Ｃ末端でｔａｇＲＦＰ蛍光タンパク質に融合され、挿入された（ｐＭＤＣ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ｔａｇＲＦＰ）。３５Ｓ：：ＢＩＮ２−ＨＡベクターは、３５ＳプロモーターおよびＣ末端でＨＡ蛍光タグに相同組換えにより融合された異種配列を含む植物のバイナリーベクターを生成するために、ｐＫＷＧ２，０デスティネーションベクターを用いることによって遺伝子操作された。
【０７４８】
６．６．２．植物材料および成長条件
Ｎ．ベンサミアナ植物は、２１℃にて４５日間、１６Ｌ／８Ｄ光周期下で、土壌において直接成長させられ、開花前に浸潤された。
【０７４９】
アラビドプシス・タリアーナＬ．（Ｈｅｙｈｎ）（コロンビア生態型、Ｃｏｌ−０）の実生は、２日間、４℃にて層別化され、２２℃にて１６時間／８時間の明暗サイクルにおいて、１％ショ糖および０．８％寒天を含む、垂直方向に半強度であるＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（Ｄｕｃｈｅｆａ）上の正方形プレートに発芽させ、ここで、光強度は、指示された場合を除き、クールホワイト蛍光管（Ｓｐｅｃｔｒａｌｕｘ  Ｐｌｕｓ  ３６Ｗ／８４０；ラジウム）によって供給される８０から１００ｍＥ／ｍ２／ｓであった。２１日間インビトロで成長させた実生は、同様の光と温度条件である成長室の土壌に移された。以下の突然変異系統がこの研究で使用された：ｂｉｎ２−３／ａｔｓｋ２２／ａｔｓｋ２３の３重変異体（ＶｅｒｔおよびＣｈｏｒｙ  ２００６）。本研究で使用された前述のトランスジェニック系統は、ｐＢＩＮ２：：ＢＩＮ２−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ＢＩＮ２−ＧＦＰ（ＶｅｒｔおよびＣｈｏｒｙ、２００６）である。ブラシナゾール（ＢＲＺ）はＴＣＩ  ＥＵＲＯＰＥ  Ｎ．Ｖ．（ベルギー）から購入され、２４−エピブラシノリド（ＢＬ）はＦｕｊｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（日本）から購入された。ｐＭＤＣ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＲＦＰの発現は、２４時間、２０μＭエストラジオール（Ｓｉｇｍａ）を添加または浸潤することによって誘導された。
【０７５０】
６．６．３．植物の形質転換
安定したＡ．タリアーナのトランスジェニック植物を生成させるために、遺伝子操作された構築物をＡ．ツメファシエンスＣ５８Ｃ１株に形質転換した。次に、形質転換された細菌株の懸濁液を用いて、Ａ．タリアーナＣｏｌ−０野生型花芽を浸漬させた。一次形質転換体は、抗生物質による選択培地上で形質転換された花の種子を発芽させることによって選択した。次世代の３：１分離分析を介して、ホモ接合トランスジェニック系統をさらに単離した。
【０７５１】
アグロインフィルトレーションについて、Ｎ．ベンサミアナの葉は、ベクター３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰ、３５Ｓ：：ベイト２４９−ＧＦＰ、３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ−ＧＦＰ、３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰ、ｐＭＤＣ：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＲＦＰ、およびトマトブッシースタントウイルス由来のサイレンシング阻害タンパク質ｐ１９（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）をコードする３５Ｓ：：Ｐ１９で形質転換されたＡ．ツメファシエンス株Ｃ５８Ｃ１（ｐＣＨ３２）を用いて注入された。
【０７５２】
菌株は、針なしの注射器を用いて、若干の変更を含むが従前に公開されたプロトコール（Ｅｎｇｌｉｓｈら、１９９６）に従って、Ｎ．ベンサミアナの葉の背軸側に共浸潤するために使用された。要約すると、細菌は、１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ５．５）および２０μＭアセトシリンゴンを含むＹＥＢ培地中で一晩、２８℃にて増殖された。光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．８になった時点で、細菌をペレット化し、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭアセトシリンゴン中に再懸濁し、浸潤前の３時間、室温にて維持した。
【０７５３】
６．６．４．画像化および画像分析
実生は、２０倍または６０倍の水浸レンズ、ＮＡ１．２を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  １０００）で画像化した。画像分析は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０−ＡＳＷソフトウェアで行われた。共局在化実験については、マンデルオーバーラップ係数の計算はＩｍａｇｅＪ  ＭＢＦソフトウェアで行われた。
【０７５４】
６．６．５．電子顕微鏡のための組織固定化および免疫学的標識
形態学的研究について、実生の播種後（Ｄ．Ａ．Ｓ．）の８日目、３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰの子葉、胚軸および根の断片（１−２ｍｍ２）は、３％パラホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒドの固定液に浸漬し、０．１Ｍのカコジル酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．２）中の１．５％Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６を含む１％ＯｓＯ４を用いて後固定された。試料は、一連の段階的エタノールで脱水され、５０％エタノール段階で２％酢酸ウラニルを用いたバルク染色を含み、次に、スパー樹脂に包埋された。超薄切片は、ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＵＣ６）を用いて作製され、酢酸ウラニル中、２０℃にて４０分間、鉛染色において２０℃にて１０分間、Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＡＣ２０において後染色された。グリッドは、８０ｋＶで操作するＪＥＭ  １０１０透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、東京、日本）を用いて観察された。
【０７５５】
免疫細胞化学的検出について、８Ｄ．Ａ．Ｓ．の実生の３５Ｓ：：ベイト２４９Ｒ−ＧＦＰおよび３５Ｓ：：ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄ−ＧＦＰの子葉、胚軸および根の断片（１−２ｍｍ２）は、０．１Ｍカコジル酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．２）中の２．５％パラホルムアルデヒドおよび０．３％グルタルアルデヒドの固定液に浸漬された。試料は、一連の段階的エタノールを介して脱水し、ＬＲ−ホワイト、ハードグレード（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎ）中で３日にわたって４℃にて段階的に浸潤させ、次に、カプセルに包埋させた。重合は、ＵＶ照射によって、２４時間４℃、続いて１６時間６０℃にて行われた。金干渉色の超薄切片はウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＵＣ６）で切断され、ホルムバール被覆された銅スロットグリッド上に回収された。免疫標識のすべての段階は、室温にて湿潤チャンバー中で行われた。グリッドは、２５μｌのブロッキング溶液（５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））上で３０分間、ひっくり返して浮かせ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで５回、各回５分間洗浄された。１：５０希釈（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）における一次抗体の抗ＧＦＰウサギ（ＡｂＣａｍ）の６０分間のインキュベーション後、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで５回、各回５分間洗浄した。グリッドは、ＰＡＧ１０ｎｍの１：６０希釈（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ユトレヒト大学、オランダ）とともにインキュベートされ、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳおよび二重蒸留水で２回、各回５分間洗浄された。切片は、酢酸ウラニル中、２０℃にて４０分間、クエン酸鉛中、２０℃にて１０分間、Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＡＣ２０において後染色された。グリッドは、８０ｋＶで操作するＪＥＭ  １０１０透過型電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ  Ｌｔｄ．、東京、日本）を用いて観察された。
【０７５６】
６．６．６．電気泳動およびウェスタンブロット
総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）は、アラビドプシスの８Ｄ．Ａ．Ｓ．実生から抽出され、またはＮ．ベンサミアナのアグロインフィルトレートされた葉の断片は、乳鉢で粉砕され、氷冷した０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）ですすがれ、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）が添加された。次に、ホモジネートを２０分間、４℃にて２０，０００ｘｇで遠心分離した。上清をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｍｉｃｒｏ  Ａｓｓａｙキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ヘラクレス、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてタンパク質含有量について定量した。
【０７５７】
共免疫沈降実験は、製造業者の使用説明書に従って、アガロース結合抗ＧＦＰビーズ（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ）を用いて行われた。
【０７５８】
全タンパク質抽出物またはＩＰ生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ）またはＢＮ−ＰＡＧＥ（ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかによって、製品マニュアルに従い分画された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、約６０μｇのＴＳＰは、１％ＳＤＳおよび０．１ＭのＤＴＴの存在下で、９５℃にて１０分間変性され、ＴＧＳ泳動緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシンおよび０．１％ＳＤＳ）中の１０％、１２％または１５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分画された。メンブレンは、免疫ブロッティング前に４℃にてＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂乳を用いて一晩ブロックされた。
【０７５９】
ＢＮ−ＰＡＧＥについて、タンパク質抽出物は、３−１２％のＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル上に充填される前に、２０％グリセロールおよび５ｍＭクーマシーＧ−２５０を添加された。電気泳動は、５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓおよび５０ｍＭトリシン（さらに陰極緩衝液中の０．００４％クーマシーＧ−２５０を添加）を含む泳動緩衝液中で、一定電圧（１００Ｖ）下、２１℃にて１２０分間行われた。タンパク質は、ポリフッ化ビニリデンメンブレンに転写され、分子量マーカー（ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を表示するためにクーマシーＧ−２５０で染色された。８％酢酸による２０分間の固定後、ポリフッ化ビニリデンメンブレンは空気乾燥され、１００％メタノールで脱色された。メンブレンは、免疫ブロッティング前に、ＴＢＳ中の４％ＢＳＡを用いて４℃にて一晩ブロックされた。
【０７６０】
メンブレン上でＨＡタグ化されたＢＩＮ２またはＧＦＰタグ化されたベイト２４９、ベイト２４９Ｒ、ベイト２４９ＮＦ、ベイト２４９ＮＦ Ｔａｎｄを検出するために、一次抗体（ラット抗ＨＡ、Ｒｏｃｈｅ；マウス抗ＧＦＰ、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｓ）は、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）および３％（ｗ／ｖ）脱脂乳中で、それぞれ１：１，０００または１：５，０００に希釈され、１時間室温にてインキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔで４回すすいだ後、メンブレンは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートされたヤギ抗ラットＩｇＧ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で染色され、および／または電気化学的発光システムで視覚化された。
【０７６１】
６．６．７．ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡは、０．５ＭＳ培地に指示されたように処理された全８Ｄ．Ａ．Ｓ．実生から抽出され、ＲＮＡは、供給者の使用説明書に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出され、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１００分光光度計で定量された。ポリ（ｄＴ）ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、総ＲＮＡの１μｇから調製された。ＰＣＲは、３８４ウェル反応プレート上で行われ、ここでは、１０分間、９５℃で加熱され、次に４５サイクルの１０秒間、９５℃での変性、１５秒間、それぞれ６０℃および７２℃でのアニーリングおよび伸長が行われた。標的の定量は、表２０に列挙された特異的プライマー対を用いて行われた。すべてのＰＣＲは３つの技術反復で行われ、少なくとも２つの生物学的反復が各試料について使用された。シャペロン発現分析について、Ｔａｑｍａｎプライマー三量体は、Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入された。ｑＲＴ−ＰＣＲは、Ｆａｍフルオロフォアの検出を用いたＢｉｏｒａｄ  ｉＱ５装置において、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ混合物を用いて行われた。相対的な発現レベルは、ＣＤＫＡおよびＥＦ発現レベルに対して正規化された。
【０７６２】
【表２０】
2014514917.tif 000033
【０７６３】
６．６．８．ＦＴ−ＩＲ分光法
フーリエ変換赤外分光法は、従前に報告されるように（Ｘｕら）、ＢｉｏＡＴＲ  ＩＩセル（Ｂｒｕｋｅｒ）を備えたＴｅｎｓｏｒ  ３７  ＦＴ−ＩＲ分光計で行われた。要約すると、検出器は液体窒素で冷却され、Ｂｉｏ−ＡＴＲ  ＩＩセルは、結果を妨げる可能性がある水蒸気を最小限に抑えるために乾燥空気の連続流によってパージされた。各測定の前後に、ＡＴＲセルの結晶をエタノールと水で洗浄した。試料は、緩衝液で覆われた結晶からなるバックグラウンドに対して測定された。
【図１】
2014514917.tif 000034
【図２】
2014514917.tif 000035
【図３】
2014514917.tif 000036
【図４】
2014514917.tif 000037
【図５】
2014514917.tif 000038
【図６】
2014514917.tif 000039
【図７】
2014514917.tif 000040
【図８】
2014514917.tif 000041
【図９】
2014514917.tif 000042
【図１０】
2014514917.tif 000043
【図１１】
2014514917.tif 000044
【図１２】
2014514917.tif 000045
【図１３】
2014514917.tif 000046
【図１４】
2014514917.tif 000047
【図１５】
2014514917.tif 000048
【図１６】
2014514917.tif 000049
【図１７】
2014514917.tif 000050
【図１８】
2014514917.tif 000051
【図１９】
2014514917.tif 000052
【図２０−１】
2014514917.tif 000053
【図２０−２】
2014514917.tif 000054
【図２０−３】
2014514917.tif 000055
【図２０−４】
2014514917.tif 000056
【図２１】
2014514917.tif 000057
【図２２】
2014514917.tif 000058
【図２３】
2014514917.tif 000059
【図２４】
2014514917.tif 000060
【図２５】
2014514917.tif 000061
【図２６】
2014514917.tif 000062
【図２７】
2014514917.tif 000063
【図２８】
2014514917.tif 000064
【図２９】
2014514917.tif 000065
【図３０】
2014514917.tif 000066
【図３１】
2014514917.tif 000067
【図３２−１】
2014514917.tif 000068
【図３２−２】
2014514917.tif 000069
【図３２−３】
2014514917.tif 000070
【図３３】
2014514917.tif 000071
【図３４−１】
2014514917.tif 000072
【図３４−２】
2014514917.tif 000073
【図３５】
2014514917.tif 000074
【図３６】
2014514917.tif 000075
【図３７】
2014514917.tif 000076
【図３８】
2014514917.tif 000077
【図３９】
2014514917.tif 000078
【図４０】
2014514917.tif 000079
【図４１】
2014514917.tif 000080
【図４２】
2014514917.tif 000081
【図４３】
2014514917.tif 000082
【図４４】
2014514917.tif 000083
【図４５】
2014514917.tif 000084
【図４６】
2014514917.tif 000085
【図４７】
2014514917.tif 000086
【図４８】
2014514917.tif 000087
【図４９】
2014514917.tif 000088
【図５０】
2014514917.tif 000089
【図５１】
2014514917.tif 000090
【図５２】
2014514917.tif 000091
【図５３】
2014514917.tif 000092
【図５４】
2014514917.tif 000093
【図５５】
2014514917.tif 000094
【図５６】
2014514917.tif 000095
【図５７】
2014514917.tif 000096
【図５８】
2014514917.tif 000097
【図５９】
2014514917.tif 000098
【図６０】
2014514917.tif 000099
【図６１】
2014514917.tif 000100
【図６２】
2014514917.tif 000101
【図６３】
2014514917.tif 000102
【図６４】
2014514917.tif 000103
【図６５】
2014514917.tif 000104
【図６６】
2014514917.tif 000105
【図６７】
2014514917.tif 000106
【図６８】
2014514917.tif 000107
【図６９】
2014514917.tif 000108
【図７０】
2014514917.tif 000109
【図７１】
2014514917.tif 000110
【図７２】
2014514917.tif 000111
【図７３】
2014514917.tif 000112
【図７４−１】
2014514917.tif 000113
【図７４−２】
2014514917.tif 000114
【図７５】
2014514917.tif 000115
【図７６】
2014514917.tif 000116
【図７７】
2014514917.tif 000117
【図７８】
2014514917.tif 000118
【図７９】
2014514917.tif 000119
【図８０】
2014514917.tif 000120
【図８１−１】
2014514917.tif 000121
【図８１−２】
2014514917.tif 000122
【図８２−１】
2014514917.tif 000123
【図８２−２】
2014514917.tif 000124
【図８２−３】
2014514917.tif 000125
【図８３−１】
2014514917.tif 000126
【図８３−２】
2014514917.tif 000127
【図８４】
2014514917.tif 000128
【図８５】
2014514917.tif 000129
【配列表】
2014514917000001.app
【国際調査報告】
2014514917.tif 000130
2014514917.tif 000131
2014514917.tif 000132
2014514917.tif 000133
2014514917.tif 000134
2014514917.tif 000135