(57)【要約】  特にクロスドメイン結合機序でTACEに結合することによって、TACEに結合することができ、1種以上のその生物活性の拮抗剤として働くことができる、抗TACE(ADAM17)抗体を初めて当技術分野で開示する。クロスドメイン結合機序は、触媒ドメインとシステインリッチ/ジスインテグリンドメイン(Dis-Cys)の両方の残基がTACEへの抗体結合に関与し、抗体結合の特異性を向上させるのに、及び/又はTACE生物活性の阻害を向上させるのに役立つ。この抗体の治療的使用、特に癌治療のための使用を開示する。【選択図】図１
2014511372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的にTNF-α変換酵素(TACE)に結合してTACEの生物活性を阻害する、単離された抗体分子。
【請求項２】
抗体が、TACEの触媒ドメインとDis-Cysドメインの両方に結合することによってTACEの生物活性を阻害する、請求項1に記載の抗体分子。
【請求項３】
抗体分子がTACEによる基質の切断を阻害することができる、請求項1又は請求項2に記載の抗体分子。
【請求項４】
切断がインビトロ基質切断アッセイで測定され、前記基質が合成基質である、請求項3に記載の抗体分子。
【請求項５】
切断が細胞ベースのシェディングアッセイで測定され、前記基質が細胞表面に結合している、請求項3に記載の抗体分子。
【請求項６】
同一アッセイ条件下でN-TIMP-3よりも少なくとも2倍強力なTACEの阻害剤である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項７】
完全なTACE外部ドメインに対して、単離された触媒ドメインと比較して少なくとも2倍の親和優先性を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項８】
配列番号19に示すアミノ酸215〜651に少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドを含むTACEポリペプチドに結合することができる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項９】
抗体分子が、配列番号1のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR-H1を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
抗体分子が、配列番号2のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR-H2を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１１】
抗体分子が、配列番号3のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１２】
抗体分子が、配列番号4のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号4の配列を有するCDR-L1を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
抗体分子が、配列番号5のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号5の配列を有するCDR-L2を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１４】
抗体分子が、配列番号6のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号6の配列を有するCDR-L3を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１５】
配列番号1〜6のいずれか一つと比較した場合に、抗体分子のCDRのアミノ酸配列が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、請求項9〜14のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１６】
抗体分子のCDR配列中のアミノ酸置換、欠失又は挿入が以下のアミノ酸残基を保持する、請求項9〜14のいずれか一項に記載の抗体分子:
CDR-H1:SH31及びYH32
CDR-H2:SH52、SH56及びYH58
CDR-H3:PH98、YH100、TH100B及びWH100D
CDR-L1:QL27、SL28、IL29及びYL32
CDR-L2:HL49及びDL50
CDR-L3:SL91、FL92及びIL94
(Kabatのナンバリングに従って残基の番号が付けられる)。
【請求項１７】
それぞれ配列番号1、2及び3の配列を有するCDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3を含むVHドメイン、並びに/又はそれぞれ配列番号4、5及び6の配列を有するCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3を含むVLドメインを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１８】
配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するVHドメイン、及び/又は配列番号9のアミノ酸配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するVLドメインを含む、請求項17に記載の抗体分子。
【請求項１９】
抗体分子が完全な抗体、Fab断片、F(ab')2断片、scFv、ダイアボディ又はトリアボディである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２０】
抗体分子がヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体又はキメラ抗体である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２１】
全抗体である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体分子及び製薬上許容可能な添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
ヒト又は動物体の治療方法で使用するための、請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２４】
TACE媒介性の状態の治療方法で使用するための、請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２５】
TACE媒介性の状態の治療で使用するための医薬の製造における、請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体分子の使用。
【請求項２６】
請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体分子をそれを必要とする個体に投与することを含む、TACE媒介性の状態である個体の治療方法。
【請求項２７】
前記TACE媒介性の状態が癌、免疫関連障害、乾せん又は炎症若しくはアレルギーを基にする喘息などの疾患である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項２８】
前記癌が脳腫瘍、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌又は結腸直腸癌である、請求項27に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項２９】
前記免疫関連障害が関節リウマチである、請求項27に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３０】
抗体が化学療法剤と併せて又は放射線療法と併せて投与される、請求項23〜29のいずれか一項に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３１】
前記化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどのアルキル化剤、アントラサイクリン、タキサン及びビンカアルカロイドなどの植物アルカロイド、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート及びテニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤又はフルオロウラシル(5FU)である、請求項30に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３２】
抗体がEGFR経路の阻害剤と併せて投与される、請求項30に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３３】
前記EGFR経路の阻害剤が抗EGFR抗体又はEGFRキナーゼ阻害剤である、請求項32に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３４】
前記EGFR経路の阻害剤がセツキシマブ、パニツムマブ、イレッサ(ゲフィチニブ若しくはN-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリン-4-イルプロポキシ)キナゾリン-4-アミン)又はタルセバ(エルロチニブ若しくはN-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン)である、請求項33に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３５】
抗体がトラスツズマブと併せて投与される、請求項30に記載の、治療方法で使用するための抗体、使用又は方法。
【請求項３６】
ADAMファミリーメタロプロテイナーゼに特異的に結合する抗体分子を産生する方法であって、抗体が、メタロプロテイナーゼの触媒ドメインとDis-Cysドメインの両方に結合することによってADAMファミリーメタロプロテイナーゼのプロテアーゼ活性を阻害することができ、前記方法が、
(a)触媒ドメイン及びDis-Cysドメインを含むADAMファミリーメタロプロテイナーゼポリペプチドに結合することができる可変重鎖ドメインを含む抗体を同定するステップであって、触媒ドメインがADAMファミリーメタロプロテイナーゼの阻害剤に結合するステップ、
(b)ADAMファミリーメタロプロテイナーゼの単離された触媒ドメインに結合することができる可変軽鎖ドメインを含む抗体を同定するステップ、及び
(c)ステップ(a)で同定された可変重鎖ドメイン及びステップ(b)で同定された可変軽鎖ドメインを含む抗体分子を産生するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記ADAMファミリーメタロプロテイナーゼがTNF-α変換酵素(TACE)である、請求項36に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗TNF-α変換酵素(TACE)抗体分子及びその使用に関し、より詳細には、TACEの触媒ドメイン及びDis-Cysドメインに結合することによってその生物活性を阻害することができる抗TACE抗体分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
TNF-α変換酵素(TACE)(ジスインテグリン及びメタロプロテアーゼ17(ADAM17)としても知られる)は、種々の病理学的に重要な基質の切断に関与する膜結合メタロプロテアーゼである。最初に、膜結合性のpro-TNF-αの可溶化(その後に「エクトドメインシェディング」と呼ばれる過程)に関与する酵素として同定され、TACEは、上皮増殖因子受容体(EGFR)リガンド、細胞外ノッチ、細胞表面レセプター及び接着分子などの幅広い基質を切断することができることが、その後証明された。これらの基質の多くにとって、タンパク質分解性切断は不可欠な活性化イベントであるため、TACEは、癌及び関節リウマチの治療に対する魅力的な治療標的として浮上した。TACEの役割は、Murphy(Nature Reviews: Cancer、8(12): 929〜941、2008)で概説されている。
【０００３】
TNF-α制御におけるTACEの役割、及びそれ故に炎症性疾患治療の治療戦略としてのTACE阻害の潜在的な有用性がしばらく前から認識されており、多くの企業がTACEの小分子阻害剤を開発しようとしてきた。しかし、メタロプロテアーゼファミリーは高度に保存されており、選択的な小分子阻害剤の開発が重要な課題ということが分かっている。より広域スペクトルのメタロプロテアーゼ阻害剤を用いた初期の試みは毒性問題が生じやすいためこのファミリーの選択的な阻害剤を生成できることが望ましい。Mossら(Nature Clinical Practice、4(6): 300〜309、2008)を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Murphy、Nature Reviews: Cancer、8(12): 929〜941、2008
【非特許文献２】Mossら、Nature Clinical Practice、4(6): 300〜309、2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
選択的なTACE阻害剤を開発するための別の戦略は、抗体を用いて一般に達成可能な選択性を利用することであろう。しかし、TACEに結合する抗体が報告されており、市販品として入手可能ではあるが、通常とは異なり、これらのうちで拮抗活性を有するものは今までに一つもない。この例を挙げると、WO 96/041624はTACE酵素の同定を開示し、抗TACE抗体の産生を示唆するが、この出願において開示されている抗体はなく、まして拮抗抗体などの特異的な機能的性質を有する抗体はない。これは、TACE活性をブロックすることができる抗体をベースとした治療法の開発が当技術分野で未解決な問題のままであることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概して、本発明は、抗体産生に対してホリスティックなマルチドメインアプローチを用いて、TACEなどの複合プロテアーゼを特異的に阻害することができるという理解に基づく。この洞察を、次に、TACEに結合することができ、且つ当技術分野で初めて1種以上のその生物活性の拮抗剤として働くことができる抗体分子を産生するのに使用した。
【０００７】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、発明者らは、本発明の抗体分子は、クロスドメイン結合機序で抗体分子がTACEに結合するという点において独特な抗体結合機序を有すると考える。実施例で支持されるように、これは、触媒ドメイン及びシステインリッチ/ジスインテグリンドメイン(Dis-Cys)の両方の残基がTACEへの抗体結合に関与することを意味し、これは、抗体結合の特異性を向上させるのに役立つ及び/又はTACE生物活性の阻害を向上させるのに役立つ。
【０００８】
本発明の抗体分子は、触媒ドメイン及びDis-Cysドメインが完全なADAM外部ドメイン内で空間的に結合するという発明者らの洞察、特にTACEの「C字型」は、TACEの非触媒性カルボキシル末端Dis-Cysドメインがアミノ末端触媒ドメインに高分子が接触するのを部分的に妨害することを意味するという発明者らの洞察に従って設計された。そして次に、このことによって本発明者らは、触媒ドメインを広く拮抗し、一方では局所性Dis-Cys残基からさらなる特異性を同時に調達することによって、選択的なTACE阻害剤がこの空間的に連結されたマルチドメイントポロジーを利用することができると結論した。
【０００９】
より詳細に以下に記載するように、発明者らは、最初に、その可変重鎖(VH)ドメインを介してTACE非触媒性領域のみに結合した阻害性のヒト抗体(D1)を単離することによって、ADAMマルチドメイントポロジーを活用した。次に、D1-VHバイアス化scFvファージディスプレイライブラリーを用いて、TACE触媒ドメインに同時に結合することができる新しい可変軽鎖(VL)を選択的に単離した。得られた「クロスドメイン」ヒト抗体(D1(A12))は、最初のホリスティックなADAM外部ドメイン阻害剤であり、これまでに述べられた最も選択的に効力がある細胞表面TACE阻害剤である。
【００１０】
したがって第一の態様では、本発明は、特異的にTNF-α変換酵素(TACE)に結合し、TACEの生物活性を阻害する、単離された抗体分子を提供する。上記で説明したように、本発明者らは、本発明の抗体分子は、TACEの触媒ドメインとDis-Cysドメインの両方に結合することによって、TACEの生物活性を阻害することができると考える。例えば、本発明の抗体は、好ましくは、TACEによる基質の切断を阻害することができる。抗体の他の特徴及び性質を以下に記載する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で開示される抗体分子及び製薬上許容可能な添加剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、ヒト又は動物体の治療方法で使用するための、本明細書で開示される抗体分子を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、TACE媒介性の状態の治療方法で使用するための、本明細書で開示される抗体分子を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、TACE媒介性の状態の治療で使用するための医薬の製造における、本明細書で開示される抗体分子の使用を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で開示される抗体分子を、それを必要とする個体に投与することを含む、TACE媒介性の状態である個体の治療方法を提供する。
【００１６】
本発明の治療の医学的使用及び方法では、好ましくはTACE媒介性の状態は癌、免疫関連障害又は乾せんであり、より詳細には、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌若しくは結腸直腸癌などの癌、関節リウマチなどの免疫関連障害又は炎症若しくはアレルギーを基にする喘息などの疾患である。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、ADAMファミリーメタロプロテイナーゼに特異的に結合する抗体分子を産生する方法であって、この抗体がメタロプロテイナーゼの触媒ドメインとDis-Cysドメインの両方に結合することによって、ADAMファミリーメタロプロテイナーゼのプロテアーゼ活性を阻害することができ、この方法が、
(a)触媒ドメイン及びDis-Cysドメインを含むADAMファミリーメタロプロテイナーゼポリペプチドに結合することができる可変重鎖ドメインを含む抗体を同定するステップであって、触媒ドメインがADAMファミリーメタロプロテイナーゼの阻害剤に結合するステップ、
(b)ADAMファミリーメタロプロテイナーゼの単離された触媒ドメインに結合することができる可変軽鎖ドメインを含む抗体を同定するステップ、及び
(c)ステップ(a)で同定された可変重鎖ドメイン及びステップ(b)で同定された可変軽鎖ドメインを含む抗体分子を産生するステップ
を含む、上記方法を提供する。ADAMファミリーメタロプロテイナーゼの説明並びにその配列及び構造への言及は、Murphyら、Nature Reviews: Cancer、8: 929〜941、2008に提供されている。これは、いかにADAMファミリーメタロプロテイナーゼがDis-Cys及び触媒ドメインを含む共通のドメイン構造を有しているかを述べている。ADAMファミリーメタロプロテイナーゼ及びその代替名の例には、これらに限定されないがADAM8(Ms2、CD156a)、ADAM9(メルトリン-γ、MDC9)、ADAM10(クズバニアン(Kuzbanian)、MADM、sU17)、ADAM12(メルトリン-α)、ADAM15(メタルギジン(Metargidin)、MDC15)、ADAM17(TACE)、ADAM19(メルトリン-β、MADDAM)、ADAM28(MDCL、eMDCII、TECADAM)及びADAM33が含まれる。
【００１８】
本発明の実施形態を、限定ではなく例として添付の図面を参照してこれから記載する。しかし、本発明の様々なさらなる態様及び実施形態は、本開示に鑑みれば当業者には明白である。
【００１９】
本明細書で使用する「及び/又は」は、他のものの有無にかかわらず二つの特定の特徴又は成分のそれぞれの特定の開示と解釈されるべきである。例えば「A及び/又はB」は、あたかもそれぞれが本明細書で個々に示されるように、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBのそれぞれの特定の開示と解釈されるべきである。
【００２０】
文脈において別段示さない限り、上で示した特徴の説明及び定義は、本発明のいかなる特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実験の概要を示す図である。(A)ヒトTACE外部ドメインは、アミノ末端のメタロプロテアーゼ触媒ドメイン(ライトレッド)及びカルボキシル末端の非触媒性Dis-Cysドメイン(ライトブルー)から構成される(I-TASSERモデル)。本発明者らは、このマルチドメイントポロジーを活用して、二段階抗体ファージディスプレイを用いて最初の本当に特異的なADAM阻害剤を開発した。(B)(i)最初に、1次抗体ファージディスプレイ選別の間、小分子阻害剤CT1746を用いてTACEの外部ドメインの触媒部位をブロックした。これは、非標的性メタロプロテアーゼと交差反応し得る触媒クレフトエピトープを有する抗体の選別を防止した。(ii)1次選抜によって、阻害性のscFv抗体クローンD1がもたらされた。このscFvは、その可変重鎖(VH)ドメインを介してTACEのDis-Cysドメインと特異的に結合した。(iii)D1-VH-バイアス抗体ファージディスプレイライブラリーを作製して、新規ではあるがD1-VHによって与えられるTACE特異性を維持する可変軽鎖(ネオ-VL)を導入した。妨げられることなくTACE触媒部位に接触するネオ-VL鎖を提供するために、2次選別をCT1746なしで実施した。(iv)2次選抜によって、単離されたTACE触媒ドメインに結合することができるいくつかのネオ-VL scFvが同定された。D1-VHを介するDis-Cysドメイン結合のため、これらの「クロスドメイン」抗体はTACEに対するその厳密な特異性を維持していた。D1-VH-ネオ-VL scFvクローンA12(これ以降D1(A12))は、TACE外部ドメインに対して最高の親和性を示し、これは、これまでに述べられた最も選択的に効力がある細胞表面ADAM阻害剤である。
【図２】ScFv D1がVH-依存的TACE外部ドメイン阻害性ヒト抗体であることを示す図である。(A)組換えヒトTACE外部ドメイン(Arg215〜Arg651)を、用量設定した濃度のヒトD1 scFv又は天然のTACE阻害物質のN末端断片であるN-TIMP-3のいずれかとプレインキュベートした。クエンチ化蛍光ペプチド切断アッセイで、その後のTACEのタンパク質分解活性を測定した。D1は、N-TIMP-3に類似する効力でTACE外部ドメインのタンパク質分解を阻害する(IC50D1=5.4(±0.4)nM;(IC50N-TIMP-3=3.2(±0.2)nM))。(B)固定化されたTACE外部ドメイン及び触媒ドメイン(Arg215〜Ser474)を、用量設定した濃度のscFv D1及び抗触媒ドメインウサギポリクローナル抗体pAb33でプローブした。TACE媒介性ペプチド加水分解を阻害するその能力にもかかわらず、D1 scFvは、単離されたTACE触媒ドメインへ結合できなかった。(C)本発明者らは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)がどのようにしてTACEのDis-Cysドメインのジスルフィド結合を再編成することができるかについて以前に述べた。TACEの触媒ドメイン抗体pAb33及びscFv A9の結合は、TACE外部ドメインをPDI処理しても不変のままである。これに対して、Dis-Cys scFv D3及びscFv D1は、PDI処理後に全ての免疫反応性を失う(*)。(D)scFv D1 CDRのパラトープスキャニング変異誘発によって、VH-ドメインは主としてTACE外部ドメインの結合に関与することが明らかになった。これに対して、D1 VL-ドメインは、TACE外部ドメインの結合に関してほぼ完全に不要のようであった。
【図３】VL-交換によるTACEの触媒ドメイン結合の導入を示す図である。(A)scFv D1のVH-ドメインをナイーブな(naive)ヒトVLファージディスプレイライブラリーにクローニングして、用量設定した濃度のビオチン標識したTACE外部ドメインに対してCT1746なしで再選別した(溶液選別及び固相選別の両方)。選別したscFvをFLAG標識した発現ベクターにクローニングして、TACEの外部ドメイン結合に関して選抜した。上位30クローンを配列決定して重複物を除去し(21個が残った)、個々に発現させ、アフィニティー精製して、TACE外部ドメインと触媒ドメインの結合の両方に関して定量的に再選抜した[10nM]。多くのクローンに関して、ネオ-VL-ドメインは、TACE触媒ドメインに対する独立した結合を促進する。D1-VH-ネオ-VLクローン「A12」(*)(これ以降D1(A12))は、両方の抗原に対して最高の親和性を示した。(B)scFv D1と対照的に、scFv D1(A12)は、TACEのDis-CysドメインのPDI調節にかなり抵抗性である(=)。この挙動は、TACE触媒ドメインのエピトープを有する抗体と類似している。(C)単離されたTACE触媒ドメイン及び完全な外部ドメインに相互作用するN-TIMP-3(触媒クレフト結合阻害物質)並びにD1(A12)FAb(クロスドメイン結合阻害剤)の表面プラズモン共鳴(SPR)動力学的解析。N-TIMP-3の深い触媒クレフト中心は、単離されたTACE触媒ドメインへの良好な結合(KDCat=211(±32)pM)を支持するが、完全な外部ドメインへの結合は、非触媒性のTACEのDis-Cysドメインがさらに存在することによって著しく乱される(KDEcto=7,221(±84)pM)(ΔKD=KDCat/KDEcto=0.03)。これに対して、クロスドメインD1(A12)FAbは、単離された触媒ドメインと比べて完全な外部ドメインに対して>10倍の親和優先性を示す(KDEcto=461(±65)pM)(KDCat=5,210(±102)pM)(ΔKD=11.3)。(D)D1(A12)の逆ELISA研究は、類似する>10倍の親和性の相違(EC50D1(A12):Ecto=920(±19)pM;EC50D1(A12):Cat=11,120(±94)pM)(ΔEC50D1(A12)=EC50D1(A12):Cat/EC50D1(A12):Ecto=12.1)をもたらした。全ての±はSDを表す。
【図４Ａ】D1(A12)のパラトープスキャニング変異誘発を示す図である。(A)β炭素を越えて伸長する全てのD1(A12)scFvパラトープ残基をアラニンに個々に変異させ(n=30)、大腸菌(E. coli)で発現させて、アフィニティー精製した。完全なTACE外部ドメイン(IC50Ecto)と、単離された触媒ドメイン(IC50Cat)との両方に対する各変異体のIC50をクエンチ化蛍光ペプチドアッセイによって溶液中で決定した。加えて、「野生型」のD1(A12)scFv IC50(IC50WT)を、TACE外部ドメイン(IC50Ecto:WT)と触媒ドメイン(IC50Cat:WT)の両方について同一の方法を用いて同時に計算した。各変異体及び抗原に関して、その後のギブス自由エネルギー変化(ΔΔG)を計算した(ΔΔG=+RTln(IC50Ala/IC50WT))。多くの変異は両方の抗原についてD1(A12)IC50WTに対して有害であることが判明したが、いくつかはTACE外部ドメイン(*)又は触媒ドメイン(=)のいずれかに対する結合を特異的に変化させるように思われた。scFv D1のパラトープ変異誘発(図1(C))と相関して、D1(A12)可変重鎖(VH)中のいくつかの残基は、IC50Ecto:WTに寄与する。興味深いことに、残基SH31、YH32及びSH52(*)(Kabatのナンバリング)は、IC50Ecto:WTのみを支持し、IC50Cat:WTを達成するのに比較的不要であると思われる。これに対して、可変軽鎖(VL)のいくつかの残基はIC50Cat:WTに大いに寄与し(QL27、SL28、IL29、SL91及びFL92(=))、さらにIC50Ecto:WTを達成するのには不要であると思われる。D1(A12)Fvモデル(26)にマップした場合(右のy軸に詳しく示される色を用いて)、残基は、パラトープの極性末端でIC50抗原バイアスクラスターを示す(白色の破線)。
【図４Ｂ】D1(A12)のパラトープスキャニング変異誘発を示す図である。(B)各パラトープ変異体のEC50を固相ELISAによって計算して、ΔΔG(ΔΔG=+RTln(EC50Ala/EC50WT)を計算するのに用いた。(A)に記載されているパターンを繰り返しており、残基SH31、YH32及びSH52(*)はEC50Ecto:WTを支持し、残基QL27、SL28、IL29、SL91及びFL92(=)はEC50Cat:WTを支持する。特異的な抗原EC50バイアスを示す残基に加えて、CDR-H3内の全てのアラニン変異体は両抗原への結合を乱した。
【図５Ａ−Ｂ】D1(A12)がTACE外部ドメインのタンパク質分解の強力な阻害剤であることを示す図である。(A)100nMのTACEの完全な外部ドメイン又は単離された触媒ドメインのいずれかを、5μMのGST-TNF-α及び用量設定した濃度のD1(A12)FAbと混合した。37℃でインキュベートした後、各反応をSDS-PAGEで分離し、クマシー染色して、デンシトメトリーで個々のバンドを定量化した。3回の別々の実験由来の定量的な結果を、50μMのCT1746(CT)メタロプロテアーゼ阻害剤コントロールのパーセンテージとして示す。D1(A12)FAbは、組換えTNF-αの、TACE外部ドメイン(IC50Ecto=73.9(±3.2)nM) による切断と、より小さい効力で、単離された触媒ドメイン(IC50Cat=124.7(±6.2)nM)による切断との両方を阻害した。(B)組換えヒトTACE外部ドメイン及び触媒ドメインを、用量設定した濃度のD1(A12)FAb及び触媒クレフトに焦点を合わせたTACE阻害剤のN末端断片であるN-TIMP-3と個々にプレインキュベートした。その後のタンパク質分解活性をクエンチ化蛍光ペプチド切断アッセイで測定した。D1(A12)FAbは、N-TIMP-3に類似する効力でTACE触媒ドメインのタンパク質分解能力を阻害した。しかし、完全長組換えヒトTACE外部ドメインを両阻害剤とプレインキュベートした場合、D1(A12)FAbは、N-TIMP-3よりも>5倍強力であることが判明した(=)。
【図５Ｃ】D1(A12)がTACE外部ドメインのタンパク質分解の強力な阻害剤であることを示す図である。(C)TACE基質(TOV21G:TNF-α、IGROV1:TGF-α、PC3:AREG)が既知の発現をしている癌細胞及びHB-EGF-アルカリホスファターゼを安定的に過剰発現しているHeLa細胞を用いて、細胞表面TACE活性をアッセイした。各細胞株を、様々な濃度のD1(A12)ヒトIgG1、N-TIMP-3又はコントロールのヒト血漿IgGのいずれかで1時間前処理した後に、PMAで刺激した。可溶性のTACE産物を、サンドイッチELISA又はアルカリホスファターゼ活性によって馴化培地から定量化した。D1(A12)IgG1は、N-TIMP-3よりもおよそ5倍強力に細胞表面TACE活性を一貫して阻害した(*)。細胞表面TACE阻害は、(B)の酵素的データと直接的に相関する(すなわち*≒=)。完全なIC50データは、補足の表1で見ることができる。
【図６】予測TACE外部ドメイントポロジーを示す図である。(A)シグナルペプチド(S;白色)、プロドメイン(緑色)、フューリン切断部位(白抜きの矢印)、触媒ドメイン(赤色)、亜鉛配位ヒスチジン及びジスインテグリン-システインリッチ(Dis-Cys)ドメイン(青)の相対的位置を図示する、TACEの外部ドメイン(コンストラクトArg651)の1次元描写。(B)(A)で概説した表色系を用いる、TACE相同体の3次元表示。ADAM相同体のラッセルクサリヘビ蛇毒メタロプロテアーゼ(RVV-X)の結晶構造によって、触媒及びDis-Cysドメインとの間の緊密な空間的結合が報告されている。早期血管性アポトーシス誘導タンパク質(VAP)の結晶解析と組み合わせると、この構造学的証拠は、ADAMは「C字型」であるという考えを支持した。ごく最近、非触媒性のヒトADAM22外部ドメイン構造(カルボキシル末端EGF様ドメインを完全に備える、黄色)がこの考えを続けた。(C)TACEの構造学的なホモロジーモデリング(Edwardsら、2008)は、完全な外部ドメインが類似する「C字型」で存在しうることを明らかにする。そうしたモデルは、Dis-Cysドメインが、RVV-X及びADAM22と同様の様式で高分子がTACE触媒部位に接触するのを妨害することを示唆する。Dis-Cysドメインと触媒クレフトの密接な関係は、完全なTACE外部ドメインのタンパク質分解性が、単離された触媒ドメインのタンパク質分解性よりも、なぜ約10倍少ないかを説明し得る。さらに、このトポロジーはまた、TACE(及び多くの他のメタロプロテアーゼ)の天然タンパク質阻害物質である組織性メタロプロテアーゼ阻害物質3(TIMP-3)による、露出したTACE触媒ドメインの阻害が、「保護された」完全な外部ドメインの阻害よりも、なぜ顕著に優れているのかを説明し得る。
【図７Ａ−Ｂ】抗TACE外部ドメインヒトscFv抗体の単離を示す図である。(A)ビオチン標識したTACE外部ドメイン(CT1746あり)に対する2ラウンドの液相ファージディスプレイ選別に続いて、溶出したファージミド集団をpSANG10-3Fベクターに移して、個々のscFvを大腸菌で発現させた。各抗体をTACE外部ドメイン(CT1746なし)及びBSAに対してELISA選抜した。結果を、二つの抗原間のフォールドディファレンス(ΔA450=A450TACE/A450BSA)として表す。ΔA450≧10(破線)の全てのクローンを単離し、配列決定して重複物を除去し、個々に発現させて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。加えて、陰性コントロールクローン(B9)も進めた。(B)TACE外部ドメインに対する力価測定ELISAによって、11〜420nMにわたるEC50が明らかになった。
【図７Ｃ−Ｄ】抗TACE外部ドメインヒトscFv抗体の単離を示す図である。(C)500nMの精製リード抗体でプレインキュベーションした後の、1nMの組換えTACE外部ドメインのクエンチ化蛍光(QF)ペプチド活性によって、いくつかのscFvがいくらかの阻害能力を持つことが明らかになった(*)。(D)QF-ペプチド阻害が細胞表面TACE阻害につながることを検討するために、アルカリホスファターゼ(AP)標識したHB-EGFを過剰発現しているHeLa細胞を500nMの各scFvとプレインキュベートして、PMAで刺激した。PBS及び内在性のTACE阻害物質TIMP-3のアミノ末端ドメインであるN-TIMP-3(NT3)を、陽性及び陰性として別々に用いた。HB-EGFのTACE媒介性シェディングを、馴化培地からAP活性をアッセイすることによって測定した(A405として示す)。(C)でいくつかの組換えTACE外部ドメイン阻害剤を同定したにもかかわらず、scFv D1(**)だけがこの阻害効力を細胞表面で保持するように思われた。全ての±はSDを表す。
【図８】D1 scFvがTACEに対して選択的であることを示すグラフである。(A)50nMの固定化されたヒトTACE外部ドメイン、ヒトTACE触媒ドメイン、マウスTACE外部ドメイン、ヒトADAM10外部ドメイン、ヒトADAM12外部ドメイン及びBSAを、100nMのD1 scFv、抗TACE触媒ドメインポリクローナル(pAb28233)及び抗ADAM10ポリクローナル(pAb10956)を用いて個々にELISAでプローブした。ADAM抗原間の配列相同性が高いにもかかわらず、D1 scFvはヒトTACE外部ドメインに対して完全に選択的なようであった。(B)組換えヒトADAM10外部ドメインを、用量設定した濃度のヒトD1 scFv又は小分子メタロプロテアーゼ阻害剤であるCT1746のいずれかとプレインキュベートした。その後のADAM10のタンパク質分解活性を、クエンチ化蛍光ペプチド切断アッセイで測定した。結果を未処理のコントロールのパーセンテージとして表す。CT1746はADAM10のタンパク質分解を急速に阻害するが、scFv D1は効果がない。全ての±はSDを表す。
【図９】D1(A12)がN-TIMP-3と共通のエピトープを有することを示すグラフである。(A)100nMのTACE外部ドメインをELISAプレート上に固定化して、様々な濃度のD1(A12)一価FAbとプレインキュベートした。その後のTACEの活性部位の接触性を、N-TIMP-3の結合をアッセイすることによってモニターした。D1(A12)は、TACE外部ドメインの活性部位への接触を1:1のモル比でブロックする。(B)プローブの配置を逆にする(すなわちTACEを様々な濃度のN-TIMP-3とプレインキュベートして、D1(A12)FAbでプローブした)は、類似の結果をもたらした。全ての±はSDを表す。
【図１０】細胞表面TACEのD1(A12)IgG1及びFAbの阻害を示すグラフである。D1(A12)IgG1の二価の特質がそのTACE阻害効力に影響するかどうかを検討するために、PMA刺激性HeLaのアルカリホスファターゼ(AP)標識性HB-EGFアッセイで、IgG1及び一価のFAbの力価を比較した。D1(A12)FAbは、IgG1に類似する阻害性プロファイルを示した。これは、各IgG1の一つの可変ドメインのみが細胞表面のTACEの阻害に関与することを示唆した。全ての±はSDを表す。
【図１１Ａ−Ｄ】D1(A12)が選択的なTACE阻害剤であることを示す図である。(A)50nMの固定化されたヒトTACE外部ドメイン、ヒトTACE触媒ドメイン、マウスTACE外部ドメイン、ヒトADAM10外部ドメイン、ヒトADAM12外部ドメイン及びBSAを、100nMのD1(A12)FAb、抗TACE触媒ドメインポリクローナル(pAb28233)及び抗ADAM10ポリクローナル(pAb10956)を用いて個々にELISAでプローブした。ADAM抗原間の配列相同性が高いにもかかわらず、D1(A12)FAbは、ヒトTACEに対して完全に選択的なようであった。(B)組換えヒトADAM10外部ドメインを、用量設定した濃度のヒトD1(A12)FAb又は小分子メタロプロテアーゼ阻害剤であるCT1746のいずれかとプレインキュベートした。その後のADAM10のタンパク質分解活性をクエンチ化蛍光ペプチド切断アッセイで測定した。部分的にTACE触媒ドメインに結合したにもかかわらず、D1(A12)FAbはADAM10の活性に影響がない。(C)アルカリホスファターゼ標識したHB-EGFで安定的にトランスフェクトされたMCF7細胞は、ADAM10の細胞表面シェディング活性とTACEの細胞表面シェディング活性を区別するための有用なモデルを提供する。非標的化、ADAM10又はTACE siRNAで処理した後の、MCF7乳癌細胞可溶化物のウエスタンブロット解析。(D)MCF7細胞のPMA刺激は、HB-EGF-APのTACE依存性シェディングをもたらす。
【図１１Ｅ−Ｆ】D1(A12)が選択的なTACE阻害剤であることを示す図である。(E)MCF7細胞のイオノマイシン刺激は、HB-EGF-APのADAM10依存性シェディングをもたらす。(F)MCF7乳癌細胞において、D1(A12)IgG1は、HB-EGF-APシェディングのTACE媒介性PMA刺激のみを阻害する。細胞アッセイに関しては、一方向ANOVA試験を、コントロール細胞(例えば非標的化siRNA)を変数(例えばPMA刺激)と比較して実施した。P値:*=<0.05、**=<0.01、***=<0.001。全ての±はSDを表す。
【図１２】PC3細胞を約10%のコンフルエンスで播種して、血清を含まない培地で24時間増殖させた。200nMのD1(A12)IgG1又は等容量のPBSのいずれかを8時間毎に培地に加えた。コンフルエンスは、IncuCyteを用いて測定した。D1(A12)IgG1によるTACE阻害は、PC3細胞の血清を含まない増殖を激しく乱した。エラーバーはS.D.を表す。
【図１３】内皮細胞、線維芽細胞及びMDA-MB-231乳癌細胞株を含む多細胞3次元スフェロイドを、330nMのD1(A12)IgG1又は等容量のPBSのいずれかとともにI型コラーゲン中でインキュベートした。36時間のインキュベーション後、緑色CMFDA CellTracker色素で前染色した内皮細胞を画像化して、内皮発芽形成を定量化して芽の総増殖及び数を求めた。両パラメーターは、TACEをD1(A12)で阻害した場合、内皮細胞発芽形成が減少することを示す。白色のバーは100μmに相当する。
【図１４】組換えTACE外部ドメインを単独又は100nMのpAb28233(抗触媒ドメインポリクローナル抗体)と一緒のいずれかで1時間プレインキュベートした。その後のタンパク質分解活性をクエンチ化蛍光ペプチドアッセイを用いて検出した。TACE触媒ドメインに結合するにもかかわらず、pAb28233はTACE活性を阻害しない。
【図１５】組換えTACE外部ドメインを単独又は100nMのmAb4.1(抗触媒ドメインモノクローナル抗体)と一緒のいずれかで1時間プレインキュベートした。その後のタンパク質分解活性を、クエンチ化蛍光ペプチドアッセイを用いて検出した。TACE触媒ドメインへ結合するにもかかわらず、mAb4.1はTACE活性を阻害しない。
【図１６】抗TACE抗体D1(A12)がKrasWT及びKrasMTの結腸直腸癌細胞を化学療法治療に対して感受性にすることを示すグラフである。
【図１７】抗TACE抗体が結腸直腸の異種移植片(H630)の増殖をインビボで抑制することを示すグラフである。
【図１８】結腸直腸癌異種移植片での潜在的なTACEの基質の血漿レベルのモニタリングを示すグラフである。
【図１９】IGROV1卵巣癌異種移植片モデルでの抗TACE抗体の試験を示すグラフである。
【図２０】IGROV1卵巣癌異種移植片モデルでの潜在的なTACEの基質の血漿/腹水レベルモニタリングを示すグラフである。
【図２１】タイムポイントあたりN=2以上のマウスを単回用量の10mg/kgで腹腔内投与した後の、ヌードマウスの抗TACE抗体D1(A12)の薬物動態を示すグラフである。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
抗TACE抗体分子
別段の記載がない限り、本明細書では、Kabatのナンバリング方式に従って抗体残基の番号が付けられる。TACEの構造及びドメインを図6に示し、TACEのアミノ酸配列を配列番号19として示す。好ましくは、本発明の抗体分子は、配列番号19に示すアミノ酸215〜651に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドを含むTACEポリペプチド又はその断片に結合することができ、この断片は生物学的に活性である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体分子は一つ以上の以下のCDR配列を含む:
(a)配列番号1のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR-H1、及び/又は
(b)配列番号2のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び/又は
(c)配列番号3のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR-H3、及び/又は
(d)配列番号4のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号4の配列を有するCDR-L1、及び/又は
(e)配列番号5のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号5の配列を有するCDR-L2、及び/又は
(f)配列番号6のアミノ酸配列又は一つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を伴う配列番号6の配列を有するCDR-L3。
【００２４】
特に、実施例のデータは、本発明による抗体分子が、VHドメインの外れの残基を介してTACEのDis-Cysドメインと及びVLドメイン中の選択された残基を介して触媒ドメインと相互作用することを示す。さらにこのことは、抗体分子はCDR-H1、CDR-H3、CDR-L1及びCDR-L3を好ましくは含むことを意味する。
【００２５】
実施例で示すように、本発明の抗体分子は、元の抗体の性質を保持しながら、CDR配列に対するいくつかのアミノ酸の変更を許容できる。例えば、抗体分子のCDRのアミノ酸配列は、配列番号1〜6のうちのいずれか一つと比較した場合に、それぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むことができる。実施例の実験によって支持されるように、好ましくはCDR中の以下のアミノ酸残基は保持される(すなわち、これらはもたらされるいかなるアミノ酸置換、欠失又は挿入の対象でもない)：
CDR-H1:SH31及びYH32、並びに/又は
CDR-H2:SH52、SH56及びYH58
CDR-H3:PH98、YH100、TH100B及びWH100D
CDR-L1:QL27、SL28、IL29及びYL32
CDR-L2:HL49及びDL50
CDR-L3:SL91、FL92及びIL94
(Kabatのナンバリングに従って残基の番号が付けられる)。当技術分野で周知のように、CDRは、様々な異なる抗体型又はフレームワーク領域に存在してもよく、場合によっては、本明細書で開示する抗体の有用な性質の保持を確実にするために一つ以上のさらなる配列変更を含む。
【００２６】
VHドメイン及びVLドメインのそれぞれは、フレームワーク領域によって分散させられた、抗原結合に関与する三つの相補性決定領域(CDR)を典型的には含む。例示した実施形態では、本発明は、配列番号1、2及び3の配列をそれぞれ有するCDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3を含むVHドメイン並びに/又は配列番号4、5及び6の配列をそれぞれ有するCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3を含むVLドメインを含む抗体分子を提供する。
【００２７】
好ましくは、抗体分子は、配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するVHドメイン及び/又は配列番号9のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するVLドメインを含む。
【００２８】
本発明はまた、配列番号15のアミノ酸20以降に示された重鎖及び配列番号16のアミノ酸21以降に示された軽鎖に対するアミノ酸配列を含む、IgG形式の抗体分子を提供する。
【００２９】
本発明はまた、配列番号11に示された重鎖及び配列番号12に示された軽鎖に対するアミノ酸配列を含む、Fab形式の抗体分子を提供する。
【００３０】
概して、本発明は、TACEの生物活性を阻害することができる抗体分子、すなわち当業者に理解されているような拮抗抗体分子に関する。例として、これには、天然起源の基質、例えば細胞表面に存在する基質、又はインビトロ切断アッセイにおける合成基質、例えば蛍光発生基質であるメトキシクマリニルアセチル-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-ジニトロフェニルジアミノプロピオニル-Ala-Arg-NH2などのいずれかの基質の切断において、TACEの活性を阻害することができる抗体分子が含まれる。典型的な実験では、TACE又は生物学的に活性なその断片は、基質切断が起こり得る条件下で基質と接触する。次に、抗体分子を加えて、抗体分子がTACEによる基質の切断を阻害することができるかどうかを決定することができる。インビトロアッセイを行うための例示的な条件を、以下の実施例に提供する。細胞ベースのシェディングアッセイを以下の実験例に記載する。このアッセイは、Willemsら(2010)に記載のアッセイを用いる。
【００３１】
TACEの阻害レベルに関しては、上記のアッセイを用いてこれを定量化することも可能である。例えば、本発明の抗体分子によるTACEの阻害を、タンパク質N-TIMP-3(アクセッション番号AAB34532)(例えば完全長又は成熟N-TIMP-3)などの既知のTACE阻害物質と比較してもよい。好ましくは、本発明の抗体分子は、同一アッセイ条件下でN-TIMP-3よりも少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも5倍強力なTACEの阻害剤である。
【００３２】
追加的に又は代替的に、本発明の抗体分子は、例えばTACEとのその相互作用の親和性又は特異性を向上させるなどの1種以上のさらなる性質を有してもよい。例えば、成熟ADAM外部ドメインは、球状メタロプロテアーゼ触媒ドメイン、ジスルフィド依存性ジスインテグリン-システインリッチ(Dis-Cys)ドメイン、及び場合により上皮増殖因子(EGF)様ドメインを含む(図6(A))。大抵のADAM触媒ドメインは相同な構造的トポロジーを有していると思われるが、顕著な配列変異が非触媒性Dis-Cysドメイン全体にわたって(特に「超可変」領域(HVR)中に(13))よく見られる。したがって、本発明の抗体分子は、完全なTACE外部ドメイン(すなわち、触媒ドメイン及びDis-Cysドメイン)に対して、単離された触媒ドメインを超える親和優先性を有することが好ましく、その結果、同様の触媒ドメインを有する関連ADAMファミリータンパク質との交差反応を回避するのに役立つ。好ましくは、親和優先性は、完全な外部ドメインに対して、単離された触媒ドメインと比べて少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも5倍、及び最も好ましくは少なくとも10倍の親和優先性である。抗体分子の親和優先性は、当業者に周知の競合実験で決定することができる。
【００３３】
抗TACE抗体分子の結合動態及び結合親和性(平衡解離定数Kdとして表される)は、例えばBIAcore解析を用いる表面プラズモン共鳴などの標準的な技術を使用して決定することができる。
【００３４】
抗TACE抗体分子は、50nM未満、40nM未満、30nM未満、20nM未満、10nM未満又は1nM未満の、TACEに対する解離定数を有してもよい。例えば、抗体分子は、1〜20nMの、例えば9〜15nMの、TACEに対する親和性を有してもよい。好ましくは、本発明の抗体分子は、10nM未満、より好ましくは5nM未満及び最も好ましくは2nM未満の親和定数(KD)を有する。TACE又はTACE外部ドメイン及び/若しくはTACE触媒ドメインへの結合に対する親和定数は、以下の実験例で例示したようなBiacore SPR解析などの当技術分野で周知の技術を用いて決定することができる。
【００３５】
抗TACE抗体分子は、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質を含んでもよく、それらには、Fab、Fab2、Fab3、scFv、ダイアボディ(diabodies)、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)、ミニボディ(minibodies)及びシングルドメイン抗体、並びに任意のアイソタイプ又はサブクラスの全抗体が含まれる。抗体分子並びにその構築方法及び使用方法は、例えば、Holliger & Hudson、Nature Biotechnology 23(9): 1126〜1136(2005)に記載されている。
【００３６】
いくつかの好ましい実施形態では、抗TACE抗体分子は全抗体でもよい。例えば、IgG、IgA、IgE若しくはIgM又はアイソタイプサブクラスのうちのいずれか、特にIgG1及びIgG4である。抗TACE抗体分子はモノクローナル抗体でもよい。抗TACE抗体分子は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体でもよい。
【００３７】
本明細書に記載の抗TACE抗体分子は、他のポリペプチド及び/又は血清成分に結合することができる抗体などの混入物が存在しないという意味で、単離することができる。大抵の目的についてはモノクローナル抗体が好ましいが、ポリクローナル抗体も使用することができる。
【００３８】
抗TACE抗体分子の産生方法には、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル)をタンパク質又はその断片で免疫することが含まれる。抗体は、当技術分野で既知の種々の技術のうちのいずれかを用いて免疫された動物から得ることができ、好ましくは目的の抗原への抗体の結合を用いて選抜することができる。例えば、ウエスタンブロット法又は免疫沈降法を用いることができる(Armitageら、1992、Nature 357: 80〜82)。動物からの抗体及び/又は抗体産生細胞の単離は、動物の屠殺ステップを伴い得る。
【００３９】
ペプチドで哺乳動物を免疫することの代替又はそれへの補足として、タンパク質に対して特異的な抗体を、例えば機能的な免疫グロブリン結合ドメインをその表面に提示するλバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを用いて、組換えによって作製された発現免疫グロブリン可変ドメインライブラリーから得ることができる。このライブラリーはナイーブ、すなわちいずれのタンパク質(又は断片)によっても免疫されていない生物から得られた配列から構築されてもよく、又は目的の抗原に曝露された生物から得られた配列を用いて構築されたライブラリーでもよい。
【００４０】
本発明では、実施例に記載されている方法を用いて、拮抗的な性質を有する抗TACE抗体のさらなる例を選抜することができる。産生及び/又は単離後に、抗TACE抗体分子の生物活性を試験することができる。例えば、抗体分子がTACEの基質の切断を阻害する能力を測定することができる。
【００４１】
抗体分子は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)を含む抗原結合ドメインを通常は含むが、重鎖可変ドメイン(VH)のみを含む抗原結合ドメインもあり得る(例えばラクダ科動物又はサメの抗体)。そうした抗体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４２】
抗体分子間の競合は、例えばELISAを用いて及び/又は1種以上の他の未標識の抗体分子の存在下で検出することができる特異的なレポーター分子を1種の抗体分子に標識することによって、インビトロで容易にアッセイすることができ、同じエピトープ又は重複するエピトープに結合する抗体分子の同定が可能になる。そうした方法は、当業者に公知である。
【００４３】
抗体分子の誘導体化
本発明の抗体分子は、誘導体化してその性質及び特にその薬理学的性質を改変することもできる。その一例としては、ポリペプチド治療剤の半減期又は他の薬理学的性質を増強するのに使用可能なポリ(アルキレングリコール)分子、特にポリエチレングリコール(PEG)分子への抗体分子のコンジュゲーションがある。ペグ化は、ペプチド、タンパク質及び抗体などの治療用ポリペプチドの性質を改変するための既知の戦略である。一般に、ポリペプチドへのPEG分子の付着は、そのコンフォメーション、静電気的又は疎水的性質を変化させるのに用いられ、薬物溶解度の増大、投与頻度の低下、循環半減期の調節(特に増大)、薬物安定性の増大及びタンパク質分解抵抗性の増大などの、その生物学的及び薬理学的性質を向上させる。ペグ化は、ポリペプチドを一つ以上のPEGポリマー分子へコンジュゲートさせることで治療用ポリペプチドの分子量を増大することによって作用する。これは、Fab断片などの完全な抗体の断片の型の抗体分子に特に適用可能である。
【００４４】
これは、抗体分子に存在する適切な官能基を反応性のポリ(アルキレングリコール)分子と反応させることによって、本発明の抗体分子に対して行うことができる。本発明の抗体分子の利用可能な官能基によっては、選択的な手段で、例えば抗体分子中の適切な反応性システイン残基を同定することによって、抗体分子をペグ化することが可能である。ポリ(アルキレングリコール)分子は、当技術分野でポリ(アルキレンオキシド)分子と互換的に称され、ポリエーテルである。ポリ(アルキレングリコール)分子は、直鎖状、分枝状、くし状又は星状構造を有すことができ、一般に非常に水溶性である。加えて、ポリ(アルキレングリコール)分子をポリペプチドなどの他の化学種と反応しやすくするために、塩基性ポリ(アルキレングリコール)構造は、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、アルキルハライド又はチオール基などの一つ以上の反応性官能基を備えることができる。好ましいポリ(アルキレングリコール)分子には、一つ以上のヒドロキシル位で、一つから四つの炭素原子を有するアルキル基などの化学基で置換されたものが含まれる。本発明に従って使用するための好ましいポリ(アルキレングリコール)分子は、ポリエチレングリコール(「PEG」)分子であるが、当業者なら、ポリプロピレングリコール又はポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリ(アルキレングリコール)分子を用いて本発明の抗体分子を誘導体化することができるであろう。PEGを含めたポリ(アルキレングリコール)分子は、典型的には、約400Da〜約80kDa、より好ましくは約1kDa〜約60kDa及びより好ましくは約5kDa〜約50kDaの間の分子量、例えば10kDa、20kDa、30kDa又は40kDの分子量を有する。本発明に従って使用することができるポリ(アルキレングリコール)分子は、当技術分野で周知であり、例えばSigmaAldrichなどの市販源から公衆に入手可能である。
【００４５】
イメージング適用
本発明の抗体分子は、その治療的使用と併せて又は治療的使用と関係なく、それをイメージングに用いることができるようにさらに標識することができる。イメージング及び分光学的用途の範囲で抗体の使用を可能にする抗体標識技術は、当技術分野で周知である。これは、いくつかの異なる医療又は研究の用途、例えば腫瘍学、心血管医学又は移植片拒絶の分野において有用であり得る。
【００４６】
イメージングに関する抗体分子使用の一特定例は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、すなわち放射性核種から放射されるガンマ線を検出して試料又は対象における放射性核種の分布の2次元画像を作成するためのイメージング技術、及び陽電子放出断層撮影法(PET)、すなわち試料又は対象中に導入された陽電子放出放射性核種によって間接的に放射されるガンマ線ペアを検出することによって3次元画像を作成するイメージング技術などの、核医学イメージング技術における放射性核種標識の使用を含む。放射性核種標識を有する抗体分子は、2種以上のイメージング技術で活性がある放射性核種を選択すること又は2種以上の標識で抗体分子を標識することのいずれかによってイメージング技術を併用する、マルチモーダル研究用にも用いることができる。
【００４７】
本発明の抗体分子は、放射性核種、例えば複合体として提供される放射性核種又は標識と結合することができるリンカーなどの第二の分子にコンジュゲートされた放射性核種で標識することができる。イメージング技術又は治療で用いる放射性核種の例には、Tc-99m、Re-186、Re-188、Co-57、Ga-67、In-111(SPECT)、Cu-64、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、Tc-94m、Ga-68、Co-55(PET)などの、テクネチウム、レニウム、銅、コバルト、ガリウム及びインジウムの同位体が含まれる。一般に、テクネチウム同位体はイメージング目的で、レニウム同位体は治療目的で、及び銅同位体はイメージング及び治療の両方に用いられる。
【００４８】
医学的使用
TACEは、癌と関連付けられた多くの基質を含めた幅広い基質を有することが報告されている(Murphy、2008、表1を参照されたい)。したがって、本発明の抗体を用いるTACEの治療的阻害は、癌、免疫関連障害又は乾せんなどの様々なTACE媒介性の状態及び疾患を標的化するための有用なアプローチであり得る。特に、本発明の抗体分子は、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌若しくは結腸直腸癌又は関節リウマチなどの免疫関連障害の治療に使用することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体分子は、化学療法剤と併せて又は放射線療法と併せて投与することができる。さらなる化学療法剤の例にはEGFR経路の阻害剤が含まれ、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、イレッサ(Iressa)(ゲフィチニブ若しくは(N-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリン-4-イルプロポキシ)キナゾリン-4-アミン)、若しくはタルセバ(Tarceva)(エルロチニブ(erlitonib)若しくはN-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン)などの抗EGFR抗体若しくはEGFRキナーゼ阻害剤、又はハーセプチン(Herceptin)(商標)(トラスツズマブ)などの他の薬剤がある。化学療法剤のさらなる例には、アルキル化剤(シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなど)、アントラサイクリン、植物アルカロイド(タキサン及びビンカアルカロイドなど)及びトポイソメラーゼ阻害剤(イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート及びテニポシドなど)又はフルオロウラシル(5FU)が含まれる。
【００５０】
さらなる可能性においては、本発明の抗体分子は、抗体分子が薬物若しくは毒物に連結している抗体薬物コンジュゲートでもよい。これを行うことで、薬物又は毒物をTACEが存在する生物システムの標的部位に導くことができる。このアプローチは、薬物又は毒物と反応することができる官能基を備えるための抗体分子のエンジニアリング、又は代わりに薬物若しくは毒物と反応することができるリンカー基を有する抗体分子の提供を必要とし得る。本発明のこの態様では、薬物は、患者の標的部位で活性薬物に変換するプロドラッグでもよい。
【００５１】
TACEと基質/疾患の関連に対する創薬努力の概要については、Moss 2008の総説(PM18414459)を参照されたい。
【００５２】
大多数の腫瘍と正常な組織との比較研究(オンコマイン(oncomine))で、TACEが過剰発現していることが知られている。TACEは、脳、乳房、結腸、胃、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺の癌及び結腸直腸癌を含めた幅広い癌で過剰発現していることが報告されている(Murphy、2008、表2)。これは、これらの状態は、本発明の抗体分子を用いて潜在的に治療可能であり得ることを意味する。加えて、TACEの基質は癌と関連付けられており、これらには、HB-EGF、アンフィレグリン、ヘレグリン、TNFα、TGFα、ノッチ、MICA及びMICBが含まれる。しかし、本発明の抗体分子は、その状態の発生の際にTACEが果たす役割によっては、TACEが「正常な」生理的レベルで単に発現している場所でも有用であり得ることに留意されたい。さらに、本発明の抗体分子はまた、TACE活性が、次に癌細胞に作用するリガンドを放出させる疾患組織又は細胞以外の体内の細胞及び組織でTACEの機能を阻害することによって、治療的使用を見出し得る。そうした一例は、腫瘍内に見出されるが、それ自体は「癌」細胞ではない間質細胞であり得る。
【００５３】
HB-EGF-(Yotsumoto 2010 PM20499311)。TACEのリガンドHB-EGFは、乳癌治療の標的であり、潜在的にハーセプチンへの抵抗性に打ち勝っている。
【００５４】
アンフィレグリン-Kenny 2007は、癌細胞株でTGFα及びAREGの下方制御を示し、これが悪性表現型に打ち勝つことを示す。Willmarth 2008、PM18437539では、乳癌の標的としてのAREGが概説されている。
【００５５】
また、アンドロゲン非依存性前立腺癌におけるAREG、HB-EGF、TGFαの過剰発現に関連する(Torring 2000、PM10769639)。
【００５６】
TGFα-Kenny 2007。さらに、Borrell-Pages 2003(PM12606576)。TACEは、TGFαの放出のために必要であり、TGFαの放出はEGFRの活性化に必要とされる。
【００５７】
ヘレグリン-これは、NSCLC中のHer3受容体を介する自己分泌ループに関与する。RNAi実験によって、ヘレグリンの放出はTACEによって引き起こされることが示されている(Zhou 2006、PM16843264)。
【００５８】
MICA及びMICB-これらは、NKG2Dなどのナチュラルキラー細胞受容体のリガンドであり、TACEの基質であり得る。TACEの活性の結果として腫瘍細胞の表面からこれらの免疫賦活性分子が失われることは、これらがナチュラルキラー細胞媒介性抗腫瘍活性を逃れるのを助ける可能性がある(Waldhauer 2008 PM 18676862)。
【００５９】
TACEがEGFファミリーのリガンドの放出を制御することができるため、TACE阻害の戦略はEGFR抗体(例えばセツキシマブ、パニツムマブ)及びEGFRキナーゼ阻害剤(例えばイレッサ、タルセバ)などのEGFR経路の阻害剤との併用で有用であり得ることが提唱されている。
【００６０】
Merchant 2008(PM18281553)は、結腸癌細胞株(HCA-7)でのTACE阻害とEGFR経路の阻害剤との間の相乗作用を実証した。
【００６１】
RankL(TRANCEとしても知られる)は、TACEに調節されるさらなるリガンドである。TACEによって調節されるRANKLのシェディングの証拠を開示しているPM 10224132、RANKLの標的化が多発性骨髄腫で有用であり得ることの全体的な総説を提供するPM 20166980及び多発性骨髄腫において試験されたRANKLに対する療法(デノスマブ)の特定例を記載しているPM 19714603を参照されたい。
【００６２】
マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)受容体はTACEに調節されるさらなるリガンドである(PM 19762488)。
【００６３】
TACEの阻害はまた、他のErbBによって引き起こされる腫瘍の阻害剤との併用において有用であり得る。例えば、TGFαはハーセプチン(トラスツズマブ)がHer2を下方制御する能力を妨害することができ、TACEの阻害はTGFαを減少させてハーセプチン治療に相乗作用を与えることが報告されている(Valabrega 2005、PM15735715)。
【００６４】
加えて、TACEの誘導は化学療法抵抗性/放射線抵抗性と関係があり、TACE阻害は化学療法及び放射線療法との併用で有益であり得るというTACEの役割がごく最近述べられている(Kyula 2010 PM20570921)。
【００６５】
TACE活性の調節は、関節炎などの炎症性疾患において重要であり得、TNFα、L-セレクチン及び可溶性IL6受容体などのTACE標的タンパク質が該疾患に密接に関連し、TACE活性の阻害が治療的に有用であり得(Moss 2008総説、PM18414459)、TACEはRAにおける標的である。
【００６６】
TACEの阻害はまた、脳卒中の治療(Lovering 2005、PM 15857301)及び糖尿病(Serino 2007、PM17646208)の治療戦略として提唱されている。
【００６７】
気道炎症モデルにおけるTACEの阻害は、炎症又はアレルギーを基にする喘息などの疾患を治療するための戦略としても知られる(Trifiliefら2002、PM11934805)。
【００６８】
医薬組成物
本発明の抗TACE抗体分子は、製薬上許容可能な添加剤ともに医薬組成物中に含むことができる。
【００６９】
製薬上許容可能な添加剤は、2次反応を誘発せず且つ例えば抗TACE抗体分子の投与の促進、体内でのその寿命及び/若しくはその有効性の増大又は溶液中のその溶解度の増大を可能にする、医薬組成物に入れる化合物又は化合物の組み合わせでもよい。これらの製薬上許容されるビヒクルは周知であり、抗TACE抗体分子の投与様式に応じて当業者が適合させる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、抗TACE抗体分子は、投与前に再構成するために、凍結乾燥形態で提供することができる。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、滅菌水中で再構成して、個体に投与前に生理食塩水と混合することができる。
【００７１】
抗TACE抗体分子は医薬組成物の形で通常投与され、医薬組成物は抗体分子に加えて少なくとも1種の成分を含み得る。したがって医薬組成物は、抗TACE抗体分子に加えて、製薬上許容可能な添加剤、担体、緩衝液、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含むことができる。そうした材料は無毒でなければならず、且つ抗TACE抗体分子の有効性を妨げてはならない。担体又は他の材料の正確な特質は投与経路に依存し、投与経路はボーラス、注入、注射又は以下に記載するような任意の他の適切な経路でもよい。
【００７２】
例えば注射による静脈内投与に関しては、抗TACE抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含有せず、且つ適切なpH、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形でもよい。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射などの等張性のビヒクルを用いて適切な溶液を十分に調製することができる。防腐剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤及び/又は他の添加物を必要に応じて用いることができ、これらには、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール;メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3'-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類及び他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えばZn-タンパク質錯体);並びに/又はTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００７３】
抗TACE抗体分子を含む医薬組成物は、単独又は他の治療と組み合わせて、治療すべき状態に応じて同時又は順次のいずれかで投与することができる。
【００７４】
本明細書に記載の抗TACE抗体分子は、ヒト又は動物体の治療方法で用いることができ、その治療方法には予防的治療(例えば、個体に生じる状態の危険性を軽減する、その発生を遅らせる又は発生後のその重症度を軽減するための、個体において状態が発生する前の治療)が含まれる。治療方法は、それを必要とする個体への抗TACE抗体分子の投与を含むことができる。
【００７５】
投与は通常「治療有効量」であり、これは患者に利益を示すのに十分なものである。こうした利益は、少なくとも一つの症状の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量並びに投与の頻度及びタイムコースは、治療を受けるものの特質及び重症度、治療を受ける具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール並びに医師に知られている他の要因によって決まる。治療の処方、例えば投薬量などの決定は、一般医及び他の医師の責任に含まれ、症状の重症度及び/又は治療される疾患の進行によって決まり得る。抗体分子の適切な用量は当技術分野で周知である(Ledermann J.A.ら(1991)Int. J. Cancer 47: 659〜664;Bagshawe K.D.ら(1991)Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915〜922)。本明細書又はPhysician's Desk Reference(2003)に示され得る特定の投薬量を投与される医薬の型にふさわしいように使用することができる。抗体分子の治療有効量又は適切な用量は、そのインビトロでの活性及び動物モデルにおけるインビボでの活性を比較することで決定することができる。マウス及び他の試験動物の有効投薬量をヒトに外挿する方法は既知である。正確な用量は、いくつかの要因よって決まり、この要因には、抗体が予防用又は治療用のどちらであるか、治療される領域の大きさ及び場所、抗体の正確な特質(例えば全抗体、断片)並びに抗体に付着された任意の検出可能な標識又は他の分子の特質が含まれる。
【００７６】
典型的な抗体用量は、全身適用では100μg〜1g、及び局所適用では1μg〜1mgの範囲である。最初に高用量、続いて1種以上の低用量を投与することができる。典型的には、抗体は全抗体、例えばIgG1又はIgG4アイソタイプである。これは、成人患者の単回治療用の用量であり、小児及び乳児用に比例的に調整することができ、また他の抗体形式用にも分子量に比例して調整することができる。治療は、医師の裁量で毎日、週2回、週1回又は月1回の間隔で繰り返すことができる。治療は、皮下投与に関しては2〜4週毎及び静脈内投与に関しては4〜8週毎でもよい。治療は定期的でもよく、投与間の期間は約2週以上、例えば約3週以上、約4週以上又は約月1回である。治療は外科手術の前及び/若しくは後に行ってもよく、並びに/又は外科的治療若しくは侵襲的手技の解剖学的部位に直接的に投与若しくは塗布してもよい。適切な製剤及び投与経路を上に記載する。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態では、抗TACE抗体分子の治療効果は、用量に応じて、数回の半減期の間持続し得る。例えば、抗TACE抗体分子の単回用量の治療効果は、個体において1カ月以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上、5カ月以上又は6カ月以上持続し得る。
【実施例】
【００７８】
材料及び方法
組換えヒトTACE
成熟組換えTACE外部ドメイン(Arg215〜Arg651)を、Millaら(28)に記載されているようにバキュロウイルス(baculovirus)を感染させたsf9細胞で発現させ、精製した。TACEの成熟触媒ドメイン(Arg215〜Val477-GlySer-His6)を同一のバキュロウイルス系を用いて調製し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で精製した。
【００７９】
阻害性の抗TACE外部ドメインヒトScFv抗体の選別
組換えヒトTACE外部ドメイン(Arg215〜Arg651)をN-スクシンイミジルビオチン(Invitrogen AL-01)を用いて1:1の比率でビオチン標識し、クエンチ化蛍光ペプチド切断アッセイ(以下を参照されたい)で野生型活性を調べ、McCafferty(23)のヒトscFvファージディスプレイライブラリーに50μMのCT1746(24)の存在下でさらした。2ラウンドの液相選別に続いて、溶出されたポリクローナルのscFv集団をpSANG10-3F(29)にクローニングし、BL21(DE3)RIPL大腸菌(Stratagene 230280)に形質転換した。個々のscFvクローンを大腸菌の周辺質から単離し、固定化された組換えTACE外部ドメインに対してCT1746なしでELISA選抜した。包括的な選抜の詳細は、以前に概要が述べられている(19、23)。初期選抜に続いて、14個の個々の抗TACE scFvクローンを500mLの自己誘導(30)振とうフラスコ培養で発現させ、周辺質画分をIMACによって精製した。精製したscFvを、組換えTACE阻害についてクエンチ化蛍光ペプチドアッセイ(以下を参照されたい)で、及び細胞表面TACE阻害についてPMA刺激性HB-EGF-アルカリホスファターゼアッセイ(以下を参照されたい)で選抜した。
【００８０】
クエンチ化蛍光ペプチド切断アッセイ
組換えヒトTACE触媒ドメイン及びTACE外部ドメインを50mM Tris-HCl、10mM CaCl2、0.05%Brij35、1%DMSO、pH7.4で1nMに希釈し、用量設定した濃度の阻害剤と4時間室温でプレインキュベートした。インキュベーションに続いて、各反応物を96ウェルの黒色のマイクロウェルプレート(Nunc 237105)中に200μLの技術的4系列に分け、蛍光発生基質メトキシクマリニルアセチル-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-ジニトロフェニルジアミノプロピオニル-Ala-Arg-NH2(Peptides International SMO-3670-PI)を各ウェルに加えた(終濃度=1μM)。Tecan Infinite-200で、蛍光を30秒毎に320nmで励起し、発光を405nmで記録した(37℃で2000秒間)。個々の測定値を基質のみのコントロールに対して標準化し、集計して各変数の平均傾向を作成した。各反応に関する線形回帰スロープをGraphPad Prismで計算し(ΔFU sec-1)、タンパク質分解活性を未処理のコントロールの傾斜率として表した(%ΔFU sec-1)。最終的な結果は、3回の別々の実験の平均値を表す。
【００８１】
ScFv D1 VL-交換
TACE阻害性scFv D1のVHドメインをMcCaffertyによって開発されたナイーブなヒト軽鎖(λ及びκ)ファージディスプレイライブラリーにクローニングし、得られたライブラリー(これ以降D1-VH-ネオ-VLライブラリーとする)から無作為に選んだコロニーをPCR選抜してVHの挿入率を評価した(86%の完全なscFv)。1:1にビオチン標識した用量設定した濃度(0.01nM、0.1nM、1nM及び10nM)のTACE外部ドメイン(CT1746なし)をD1-VH-ネオ-VLライブラリーにさらして、2ラウンドの液相選別を行った。加えて、同様に用量設定した選別を、ストレプトアビジンでコーティングされたImmuno-Tube(Nunc 444202)に固定化されたビオチン標識したTACE外部ドメインに対して実施した(固相選別)。2ラウンドの両選別に続いて、溶出されたポリクローナルscFv集団を個々にpSANG10-3Fにクローニングし、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。1,000を超える個々のscFvクローンを大腸菌の周辺質から単離し、固定化された組換えTACEに対してELISA選抜した。10選別全てから、上位の24クローンを50mLの自己誘導振とうフラスコ培養で個々に発現させ、周辺質画分をIMAC(Satorius VS-MCMINI24)で精製した。用量設定した濃度の全ての成熟scFv(元のD1 scFvを含める)を100nMのTACE外部ドメイン及び触媒ドメインに対してELISA選抜して、二重結合体(dual binders)を同定した。
【００８２】
パラトープのアラニンスキャニング変異誘発
D1(A12)パラトープ残基をホモロジーモデリング(26)によって同定し、個々のアラニンの変異体を部位特異的変異誘発(Stratagene 200521)を用いて作出した。精製した組換えscFvを8ポイントの蛍光力価測定([TACE]=1nM)(上記)及び16ポイントの力価測定ELISA([TACE]=500nM)にかけた。D1(A12)(WT)と各アラニン変異体(Ala)の両方について、GraphPad Prismを用いてIC50値及びEC50値を計算した。方程式:ΔΔG=+RTln(Ala/WT)を用いて、ギブス自由エネルギーの変化(ΔΔG)を計算した。
【００８３】
組換えD1(A12)ヒトFAbの発現
D1(A12)のVH及びVLドメインをpET22b(+)を基にした新規なヒトFAb発現ベクターに(それぞれヒトCH1及びCL-κの上流に)クローニングした。形質転換したBL21(DE3)RIPL大腸菌を5Lの卓上培養槽でOD600>40まで培養し、10mMのIPTGで誘導して、さらに4時間たってから回収した。周辺質画分を浸透圧ショックで単離して、プロテイン-Gアフィニティークロマトグラフィー(GE 17-0404-01)によってヒトFAbを精製した。
【００８４】
表面プラズモン共鳴(SPR)
アミン、アルデヒド又はビオチン結合を用いたBiacoreのSPRチップ上へのTACEの固定化は、急速にタンパク質を変性させる(直鎖状のエピトープのみが接触可能)。このことは、報告された、TACEを用いたSPR実験がなぜないかを説明し得る。この問題点を回避するために、一価のD1(A12)FAb又はN-TIMP-3のいずれかをCM5チップ(GE Healthcare)にアミン結合し(約200反応単位(RU))、用量設定した濃度のTACEを注入した。結果は、ブランクを差し引いた技術的3系列の濃度変数毎の平均値を表す。全ての実験は、40μL/秒の流速を用いて、Biacore T100(GE Healthcare)で37℃で実施した。Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて結合定数を計算した(1:1結合モデル;Rmax<200RU;tc>1x108;Chi2<0.5RU2)。
【００８５】
組換えD1(A12)ヒトIgG1の発現
D1(A12)のVH及びVLドメインを新規なpBudCE4.1(Invitrogen V532-20)ヒトIgG1発現ベクター(κ-バリアント)にクローニングし、Fugene 6(Roche 11988387001)を用いてHEK-293細胞にトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされたHEK-293集団を10層のHYPERFlask(Corning 10030)中で最大コンフルエンスまで増殖させて、プロテイン-Lアフィニティークロマトグラフィー(Pierce 89929)によって、ヒトIgG1を馴化培地から精製した。Melon Gel technology(Pierce 45206)を用いてわずかに残ったウシ血清タンパク質を除去して、最終的なD1(A12)ヒトIgG1を滅菌PBS中でバッファー交換した。
【００８６】
TNF-α切断アッセイ
組換えヒトTACEを(50mM Tris-HCl、10mM CaCl2、0.05%Brij35、1%DMSO、pH7.4で希釈した)用量設定した濃度のD1(A12)FAbと混合し、直ぐに5μMのGST-TNF-α(31)に加えた。各反応を37℃でインキュベートし、12%SDS-PAGEで分離し、クマシー染色して、個々のバンドをデンシトメトリーで定量化した(ImageQuant TL(GE Healthcare))。
【００８７】
TACEの細胞表面シェディングアッセイ
全てのシェディングアッセイ用に、(300μLの培地中の)4x104細胞/ウェルを48ウェルプレートに36時間プレーティングし、血清を含まない培地で3回洗浄して、D1(A12)ヒトIgG1、N-TIMP-3又はコントロールのヒト血漿IgG(R&D Systems 1-001-A)(血清を含まない培地で希釈されたもの)のいずれかと1時間プレインキュベートした。100μg/mLのホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)で各ウェルを刺激して、1時間後に上清を回収した。可溶性のTNF-α、TGF-α及びアンフィレグリンをサンドイッチELISA(R&D System Duoset)によって定量化し、HB-EGFアルカリホスファターゼをWillemsら(2010)に記載されているように測定した。
【００８８】
結果
抗TACE外部ドメイン阻害性ヒト抗体の単離
大抵のTACE創薬プロジェクトは、単離された触媒ドメインのタンパク質分解能力を阻害することに焦点を合わせているが、本発明者らは、完全な外部ドメイン(すなわち触媒ドメイン及びDis-Cysドメイン)を拮抗することを意図的に選択した。最近の構造学的な進歩及び従前の生化学的な知見の両方に照らして、発明者らは、完全なTACE外部ドメインの非触媒性領域を選択的に標的化することによって、より特異的な細胞表面阻害剤が生み出されるであろうという仮説を立てた。この目的のために、組換えヒトTACE外部ドメインをビオチン標識し、野生型活性を調べ、ナイーブなヒトscFv抗体ファージディスプレイライブラリー(23)にさらして、2ラウンドの液相選別を行った。メタロプロテアーゼの触媒部位を直接的に標的にするための以前の試みは、望まない交差反応性(例えばTIMP、プロドメイン及びSMI)を示す結果になったため、本発明者らは、広域スペクトルのメタロプロテアーゼ阻害剤CT1746(24)でTACEの触媒クレフトを初期選別の間ブロックした(図1(B))。したがって、得られたTACE外部ドメイン抗原は、触媒部位内深くにある残基に依存したエピトープを有する抗体を選別することができなかった。ELISA選抜(図7(A))に続いて、その後の陽性scFvクローンを配列決定して重複物を除去し、大腸菌で発現させて、アフィニティー精製(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC))を行い、機能的特性評価を行った。TACEクエンチ化蛍光(QF)ペプチドタンパク質分解を妨げるその能力によっていくつかの阻害性抗体が同定されたが(図7(C))、HB-EGFの細胞表面シェディングに対して試験した際に、scFv D1のみがこの阻害性プロファイルを保持していた(図7(D))。包括的なQF-ペプチド解析によって、scFv D1は、天然のTACE阻害物質であるTIMP-3のアミノ末端ドメイン、N-TIMP-3(IC50=3.2(±0.2)nM)と同様の効力(IC50=5.4(±0.4)nM)を持ってTACE外部ドメインを阻害することが明らかになった(図2(A))。しかしN-TIMP-3と異なり、scFv D1はTACEの単離された触媒ドメインに結合しなかった(図2(B))。本発明者らは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)はTACEのDis-Cysドメインの3次元トポロジーを変化させ得ることを以前に示した(19)。Dis-Cys結合scFv D3に対して同様の様式で、TACE外部ドメインのPDI調節がscFv D1の免疫反応性を著しく乱した(図2(C))。単離された触媒ドメインへの結合の欠如と併せると、この知見は、scFv D1は主として非触媒性のTACEのDis-Cysドメインに結合したことを示唆する。個々のscFv D1相補性決定領域(CDR)ループのアラニンスキャニング変異誘発によって、scFv D1の可変重鎖(VH)の残基は主としてTACE外部ドメインの結合に関与することが明らかになった。これに対して、可変軽鎖(VL)のCDRループは活性なD1パラトープに対して大いに寄与するようには思われなかった(図2(D))。この保存されたパラトープにもかかわらず、scFv D1は、ヒトTACEに対して完全に選択的であるように思われた(図8)。まとめると、本発明者らは、scFv D1は非触媒性のTACEのDis-Cysドメインに主として結合する、選択的なVH-依存性の阻害性抗体であると結論する。
【００８９】
VL-交換による触媒ドメイン結合の導入
scFv D1は、そのVHドメインを介して非触媒性領域に結合し、さらに低分子ペプチドの加水分解をブロックするほど触媒部位に十分近いため、本発明者らは、一般に静止状態のVLドメインはTACE触媒ドメインに近接していると結論した。さらに本発明者らは、非機能性のD1 VL-CDRをエンジニアリングすることで、TACE触媒ドメイン結合を導入することができるという仮説をさらに立てた。この考えを探究するために、D1-VHドメインをナイーブなヒトVLファージディスプレイライブラリーにクローニングして、得られた「D1-VH-ネオ-VLライブラリー」を、用量設定した濃度のビオチン標識したTACE外部ドメインに対して厳密に再選別した。D1-VHはDis-Cys結合を介して既に完全にTACE選択的であったので(図8)、本発明者らは、妨げられることなくTACE触媒部位に接触するネオ-VLドメインをもたらすために、全てのD1-VH-ネオ-VL選別からCT1746を除いた。得られた選別のシナリオは、(D1-VHを介して外部ドメインのDis-Cys領域に結合することによって)、全てのD1-VH-ネオ-VL scFvがTACE選択性を維持するのを促す一方、(小分子拮抗剤がないため)以前は接触できなかった触媒クレフトエピトープへネオ-VLドメインを同時にさらした(図1(B))。
【００９０】
溶液選別と固相選別の両方について2ラウンドした後に、1000個を超えるD1-VH-ネオ-VL scFvを、TACE外部ドメイン結合に関して再選抜した。上位30クローンを単離し、配列決定して重複物を除去し、大腸菌で個々に発現させて、アフィニティー精製した。次に、D1-VH-ネオ-VLリードscFvを、完全なTACE外部ドメインと、単離された触媒ドメインとの両方に結合するその能力に関してELISA選抜した(図3(A))。予測通り、CT1746なしでTACEに対してネオ-VL鎖を厳密に選別すると、今や単離されたTACE触媒ドメイン及び完全な外部ドメインに独立に結合することができる種々のD1-VH-ネオ-VL scFvバリアントがもたらされた。リードscFv「A12」(これ以降D1(A12))は、両方の抗原に対して最高の親和性を持っており、さらなる解析へ進めた。
【００９１】
D1(A12)-TACE相互作用の動力学的特性評価
ELISA選抜は、D1-VH-ネオ-VLクローンD1(A12)が完全なTACE外部ドメインと、単離された触媒ドメインとの両方に独立に結合できることを以前に暗示した。加えて、D1(A12)は、元のscFv D1と比較した場合、TACEのDis-CysドメインのPDI調節にかなり抵抗性である(図3(B))。まとめると、これらの結果は、D1(A12)エピトープがTACEの触媒ドメイン及びDis-Cysドメインの両方の残基を含むことを示唆する。両相互作用の動態を特性評価するために、D1(A12)をCM5 Biacoreチップにアミン結合した一価のヒトFAbに対して再フォーマットし、用量設定した濃度のTACE外部ドメイン又は単離された触媒ドメインのいずれかを注入した。表面プラズモン共鳴(SPR)によって、D1(A12)は完全なTACE外部ドメインに対して461(±65)pMの親和定数(KD)を持つが、単離された触媒ドメインに対してはわずか5,210(±102)pMであることが明らかになった(ΔKD=KDCat/KDEcto=11.3)(図3(C))。N-TIMP-3の深い触媒クレフト中心は単離されたTACE触媒ドメインへの良好な結合を支持するが(KDCat=211(±32)pM)、完全な外部ドメインへの結合は非触媒性のTACEのDis-Cysドメインがさらに存在することによって著しく乱される(KDEcto=7,221(±84)pM)(DKD=KDCat/KDEcto=0.03)。類似する>10倍のEC50の相違が力価測定逆ELISAによっても観察された(図3(D))(ΔEC50=EC50Cat/EC50Ecto=12.1)。したがって、D1(A12)は、単離された触媒ドメインと比べて完全な外部ドメインに対する親和優先性を示す最初のADAM阻害剤である。親和性のこの違いは、「二段階」ファージディスプレイ選別によって生成されたD1(A12)エピトープのマルチドメイン特質と相関する。
【００９２】
D1(A12)パラトープのスキャニング変異誘発
D1(A12)は、単離された触媒ドメインと比べて完全な外部ドメインに対して>10倍の親和優先性を有する阻害性のTACEヒト抗体である。最初のD1 scFvがTACE触媒ドメインと反応せず、さらに触媒ドメインの結合がVL-交換を介して効果的に導入されたため、本発明者らは、元のD1-VH内の残基がTACE Dis-Cysと相互作用し、ネオ-A12-VL内の残基が触媒ドメインと相互作用するという仮説を立てた。包括的にD1(A12)パラトープを特性評価するために、β炭素を越えて伸長する全ての残基を個々にアラニンに変異させ(n=30)、大腸菌で発現させて、アフィニティー精製した。各変異体の液相QF-ペプチドのIC50(IC50Ala)を、完全なTACE外部ドメイン(IC50Ecto)と単離された触媒ドメイン(IC50Cat)の両方について計算した(n=60)。加えて、「野生型」のD1(A12)scFv IC50(IC50WT)を、TACE外部ドメイン(IC50Ecto:WT=0.89(±0.04)nM)と触媒ドメイン(IC50Cat:WT=2.3(±0.09)nM)の両方について同一の方法を用いて同時に計算した。その後のギブス自由エネルギー変化(ΔΔG)を、各変異体及び抗原に関して計算した(ΔΔG=+RTln(IC50Ala/IC50WT))(図4(A))。scFv D1のCDRの変異誘発(図2(D))と一致して、多くのD1(A12)VH残基はIC50Ecto:WTに寄与する。興味深いことに、CDR-H1の残基SH31及びYH32並びにCDR-H2の残基SH52(Kabatのナンバリング)はIC50Ecto:WTにのみ寄与すると思われ、IC50Cat:WTの達成にはほぼ完全に不要である。逆に、CDR-L1の残基QL27、SL28及びIL29並びにCDR-L3の残基SL91及びFL92はIC50Cat:WTに寄与するだけであると思われ、IC50Ecto:WTの達成にはほぼ完全に不要である。この液相解析を補完するために、全てのパラトープ変異体に関して、固相ELISAのEC50ΔΔG値も計算した(図4(B))。その異なる方法体系にもかかわらず、溶液及び固相のD1(A12)パラトープΔΔGプロファイルは著しく類似している(外部ドメインの相関性=0.86±0.05;R2=0.91)(触媒ドメインの相関性=0.82±0.06;R2=0.86)。この一致は、D1(A12)の結合がTACE阻害に対する直接のプロキシであることを示唆する。重要なことに、VHの残基SH31、YH32及びSH52はその外部ドメインにバイアスがかかった挙動を繰り返し、VLの残基QL27、SL28、IL29、SL91及びFL92は、単離された触媒ドメインの結合に引き続き寄与する。
【００９３】
D1(A12)FvのRosetta Antibodyモデル(26)にマップした場合、残基は、パラトープの極性末端でいずれかの抗原バイアスクラスターを示す。加えて、CDR-H3は、パラトープのコア内に二重に重要な中間領域を表す。まとめると、これらのデータは、D1(A12)はVHドメインの外れにある残基を介してTACEのDis-Cysドメインのみと相互作用し、VLドメイン中の選択された残基を介して触媒ドメインのみと相互作用することを強く示唆する。
【００９４】
D1(A12)はTIMP-3とエピトープを共有する
内在性のメタロプロテアーゼ阻害物質TIMP-3は、単離されたTACE触媒ドメインの触媒クレフト中に緊密にドッキングすることが知られている。残念ながら、TIMP-3は多くのメタロプロテアーゼの触媒部位にも結合するため、標的治療剤としての使用が制限される。D1(A12)はTACE触媒ドメインに部分的に結合するため、本発明者らは、D1(A12)はエピトープがTIMP-3と重複している可能性があるという仮説を立てた。この考えを検討するために、TACE外部ドメインを免疫吸着(immunosorp)プレート上に固定化し、表面をブロックして、用量設定した濃度の一価のD1(A12)ヒトFAb又はコントロールのヒト血漿IgGのいずれかで各ウェルをインキュベートした。その後N-TIMP-3でプローブすることによって、D1(A12)FAbがTACE外部ドメインへのN-TIMP-3の結合を用量依存的に乱すことが明らかになった(図9(A))。D1(A12)とN-TIMP-3の配置を逆にしても同様の挙動が観察された(図9(B))。両アプローチは、D1(A12)及びN-TIMP-3が、1次プローブ:TACE外部ドメインのモル比が1:1で結合を乱すことを示した。実質的に異なるその結合動態にもかかわらず、本発明者らは、D1(A12)は少なくともエピトープの一部を内在性のTACE阻害物質TIMP-3と共有すると結論する。
【００９５】
D1(A12)は完全なTACE外部ドメインを強力に阻害する
二段階抗体ファージディスプレイを用いてADAMマルチドメイントポロジーを活用することによって、本発明者らは、単離された触媒ドメインと比較して、完全な外部ドメインに対して顕著に高い親和性を示す最初のADAM拮抗剤をエンジニアリングした。本アプローチの最終的な目標は優れたTACE阻害剤を開発することであったので、本発明者らは、この増強された外部ドメイン親和性が阻害能力へつながることについて特性評価した。TACEのクローニングがWO 96/041624で開示されているにもかかわらず、これは、当技術分野で述べられたTACEに対する拮抗抗体に関する最初の報告である。
【００９６】
一価のD1(A12)FAbは、TACE外部ドメインと単離された触媒ドメインの両方による高分子のGST-TNF-α基質のタンパク質分解を阻害できることが判明した(図5(A))。以前の親和性データと相関して、D1(A12)FAbは、単離された触媒ドメイン活性よりも強力にTACE外部ドメイン活性を阻害した(IC50Ecto=73.9(±3.2)nM;IC50Cat=124.7(±6.2)nM)。さらに、D1(A12)FAbは、包括的なQF-ペプチド解析(図5(B))においてこの強力な阻害能力を保持した。D1(A12)FAbは、天然の主要なTACE阻害物質であるN-TIMP-3と同様の効力を持って、単離されたTACE触媒ドメインを阻害した(ΔIC50=IC50Cat:N-TIMP-3/IC50Cat:D1(A12)=1.35)。しかし、完全なTACE外部ドメインを用いて同一のアッセイを実施した場合、D1(A12)は、N-TIMP-3よりも>5倍良いことが判明した(ΔIC50=IC50Ecto:N-TIMP-3/IC50Ecto:D1(A12)=5.75)。
【００９７】
完全なTACE外部ドメインを阻害する理論的根拠が優れた細胞表面TACE阻害剤を産生することであったので、D1(A12)をヒトIgG1に対して再フォーマットして、種々の癌細胞ベースのシェディングアッセイでN-TIMP-3と比較した(図5(C))。4種のヒト癌細胞株にわたって、4種の別々のTACEリガンドのシェディングへのD1(A12)IgG1の効果を検討した。興味深いことに、D1(A12)及びN-TIMP-3のQF-ペプチドTACE外部ドメイン阻害性プロファイルは、4種の細胞表面シェディングアッセイ全てでほぼ同様に再現された。基質、細胞株又はTACEの発現レベルに関係なく、D1(A12)ヒトIgG1は、決まり切ったように、N-TIMP-3よりも5倍良く細胞表面TACE活性を阻害した。一価のD1(A12)FAbを用いて同様の阻害性プロファイルが得られた(図9)。これは、IgGあたりわずか一つの可変ドメインが細胞表面のTACEに結合していたことを示唆する。ELISA、QF-ペプチド及び細胞表面シェディングアッセイによっても、D1(A12)が、TACEを特異的に標的にし、密接な関係があるプロテアーゼは標的にしないことが確認される(図10)。TACE外部ドメインのみが細胞表面に存在するため、この収集したデータは、完全なTACE外部ドメインの特異的標的化における拮抗的な値を包括的に実証する。
【表１】
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【００９８】
抗TACE抗体D1(A12)はKrasWT及びKrasMTのCRC細胞を化学療法治療に対して感受性にする
抗TACE抗体D1(12)を試験して、抗TACE抗体を5-フルオロウラシルと併用で使用した場合の、5種の結腸直腸癌(CRC)細胞株を化学療法に対して感受性にする効果を測定した。LoVo、H630、Dks-8、HKH-2及びHCT-116のヒトCRC細胞株をDMEM中で維持して、指示された濃度の5-フルオロウラシル及び抗TACE Ab D1(12)で処理した。全ての培地に10%FCS、50μg/mLペニシリン-ストレプトマイシン、2mmol/L l-グルタミン及び1mmol/Lピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)を補充した。全ての細胞を、5%CO2の加湿環境で37℃で増殖させた。細胞生存率を、テトラゾリウム色素[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、Sigma]アッセイによって評価した。細胞を、ウェルあたり2,000〜4,000個で96-ウェルプレートに播種した。細胞を、指示された用量のD1(A12)抗体とともに、増加させた用量の5-フルオロウラシルで72時間処理した。処理後、細胞を1×PBSで1回洗浄して、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(0.5mg/mL)を含む培地で37℃で3時間インキュベートした。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを含む培養培地を除去して、ホルマザンの結晶を200μL DMSO(Sigma)に再吸収させた。細胞生存率を、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて、570nmの吸光度を測定することによって決定した。IC50を、Prismソフトウェアパッケージを用いて計算した。各値は、少なくとも3回の独立した実験の代表である。
【００９９】
図16は、本発明の抗TACE抗体によるTACEの阻害が、5-FUなどの化学療法剤で処理した試験した各結腸直腸癌細胞株を相乗的に死滅させる結果になったことを示す。これは、本発明の抗TACE抗体と他の化学療法剤の併用に基づくアプローチを確証するものである。
【０１００】
抗TACE抗体は結腸直腸の異種移植片(H630)の増殖をインビボで抑制する
14日間にわたってH630異種移植片を確立してから、コントロール(PBS単独)又は指示された用量のD1(A12)抗TACE抗体の腹腔内投与による週1回の治療を行って、腫瘍の増殖を6週間かけてモニターした。各群は8匹の動物から構成されていた。雌のBALB/c重症複合免疫不全マウスを、無菌下及び制御された環境条件で(22℃、50±10%の相対湿度、12時間/12時間の明/暗周期、オートクレーブした床敷)で維持し、食糧及び水は自由に与えた。14日間の隔離期間後、マウスを本発明者らのプロトコールに組み込んだ。実験は、Animals(Scientific Procedures)Act、1986に従って行った。腫瘍体積を決定するために、デジタル式の副尺付きカリパスを用いて腫瘍の二軸を測定した。腫瘍体積を次の式:(腫瘍の最長径)×(腫瘍の最短径)2を用いて計算した。Matrigel(BD Biosciences)を用いて2×106個の細胞を側腹部に皮下注射接種することで、H630異種移植片マウスモデルを確立した。腫瘍が約200mm3(14日目)に達するまで腫瘍を増殖させ、その時点で、第一群にプラセボ(PBS)を与え、別の群には指示された用量のD1(A12)の抗体を腹腔内投与によって週1回注射した。各治療群は8匹の動物を含んでいた。腫瘍を、カリパスを用いて2次元で週3回測定した。統計的有意性を、対応のない(unpaired)両側スチューデントのt検定を用いて解析した。
【０１０１】
図17で示すように、D1(12)などの本発明の抗TACE抗体によるTACEの阻害は、H630結腸直腸癌腫瘍異種移植片の増殖を阻害する結果になった。これは、本発明の抗体が治療剤としてインビボで有効であることを実証するものである。
【０１０２】
結腸直腸癌異種移植片における潜在的なTACEの基質の血漿レベル
H630異種移植片を14日間にわたって確立してからコントロール(PBS単独)又は指示された用量のD1(A12)抗TACE抗体の腹腔内投与による週1回の治療を行って、腫瘍の増殖を6週間かけてモニターした。各群は8匹の動物から構成されていた。血漿を死後に回収して、TACEの基質レベルを解析した。可溶性のTNF-α、TGF-α、アンフィレグリン及びsIL6-RをサンドイッチELISA(R&D System Duoset)によって定量化し、HB-EGFアルカリホスファターゼをWillemsら(2010)に記載されているように測定した。
【０１０３】
図18で示すように、D1(12)などの本発明の抗TACE抗体によるTACEの阻害は、結腸直腸H630癌腫瘍異種移植片におけるいくつかのTACEの基質のレベルを低下させる結果になった。これは、抗体がインビボで活性があることを実証し、それ故、治療剤としてのその適用を支持するものである。
【０１０４】
IGROV1卵巣癌異種移植片モデルにおける抗TACE抗体の効果
本発明者らは、10mg/kgのD1(A12)を用いて10mg/kgのインフリキシマブ及びPBSビヒクルと比較して、IGROV1-Luc異種移植片における週1回の腹腔内投薬の効果を試験した。最初の用量を4日目に与え、その後、さらなる用量を腫瘍量が最大許容に近づくポイントであるエンドポイントまで7日毎に与えた。腫瘍の増殖を生物発光によって測定した。雌のBalb/cヌードマウスに5×106のIGROV1-Luc細胞を腹腔内注入して、腫瘍の増殖及び臨床徴候を毎日観察した。エンドポイントは、腫瘍量が活動の低下などの臨床徴候を引き起こし始めるポイントと定義した。
【０１０５】
腫瘍量を、生物発光イメージングによって週1回定量化した。各群の腫瘍の比増殖速度(SGR)を、公表されている次の式を用いて計算した:SGR=ln(V2/V1)/T2-t1(式中、V1は4日目(t1)の処理前の最初の平均体積であり、V2はエンドポイント(t2)の最終的な平均腫瘍体積である)。日数の単位での腫瘍倍加時間(DT)=ln(2)/SGR。これらのデータのさらなる解析では、それぞれの個々のマウスの腫瘍増殖速度をGraphPad PRISMの指数曲線適合関数を用いて計算して、次いで各群の平均k(速度定数)を比較した。処理群とビヒクル群の間の有意性をt検定を用いて計算した。血漿を死後に回収して、TACEの基質レベルを解析した。TACEの基質に対するELISAを、R&D Systems Duosetキット:ヒトTNF-α(TNFSF1A、カタログ番号DY210)、ヒト可溶性TNFR1-α(TNFRSF1A、カタログ番号DY225)、ヒトTGF-α(カタログ番号DY239)、及びヒトのアンフィレグリン(AREG)(カタログ番号DY262)を用いて実施した。DY210キットは、このキットを用いて組換えマウスTNF-αを試験して交差反応性を示さなかったことから、ヒトTNF-αに対して特異的であることが確認された。
【０１０６】
図20は、(本発明者らのD1(12)抗体を用いることによる)TACEの阻害はまた、IGROV1卵巣癌異種移植片モデルにおいていくつかのTACEの基質のレベルを低下させる結果になったことを示す。これは、抗体がインビボで活性があることを実証し、それ故、治療剤としてのその適用を支持するものである。データはまた、本発明者らのD1(A12)抗体で処理した群における腫瘍増殖の低下を示す(図19を参照されたい)。
【０１０７】
ヌードマウスでの抗TACE抗体の薬物動態
抗TACE抗体D1(A12)の薬物動態(PK)を、単回用量の10mg/kgの腹腔内投与を用いて、腫瘍を有さないマウスで検討した。図21は、タイムポイントあたりN=2以上のマウスに単回用量の10mg/kgを腹腔内投与した後の結果を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。WinNonLin非コンパートメント解析プログラムを用いてPKパラメーターを計算した:血漿Cmax=523+/-58nM、Tmax2日、半減期8.6日。これは、マウス血漿でのヒトIgG抗体の半減期について公表されている値と矛盾しない。
【０１０８】
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【０１０９】
参考文献:
本明細書で言及される全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１１０】
Murphy、Nature Reviews: Cancer、8(12): 929-941、2008.
Mossら、Nature Clinical Practice、4(6): 300-309、2008.
WO 96/041624.
Edwardsら、Mol. Aspects Med.、29(5):258-289、2008.
Willemsら、Biochem. J.、428: 439-450、2010.
Millaら、J. Biol. Chem.、274(43):30563-30570、1999.
Martinら、BMC Biotechnology 6: 46、2006.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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