(57)【要約】【課題】乳房癌治療用組成物及び乳房癌幹細胞を治療する方法などを提供すること。【解決手段】本発明は、ＡＮＴ２  ｍＲＮＡ発現を減少させて乳房癌を治療する方法に関する。具体的に、本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌治療用組成物であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする組成物を提供する。上記本発明の組成物は、ＴＲＡＩＬの乳房癌治療効果を増加させることを特徴とする。また、本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌幹細胞治療用組成物を提供する。窮極的に、本発明は、乳房癌細胞の転移抑制効果及び抗癌剤耐性を克服することができる優れた効能を有する乳房癌治療剤を提供することができ、ひいては、乳房癌幹細胞治療剤の開発に利用されることができるものと期待される。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニンヌクレオチドトランスケータ２  低分子干渉ＲＮＡ（ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ）またはＡＮＴ２  短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を有効成分として含有する乳房癌治療用組成物であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡは、配列番号３で記載されたアンチセンス配列が配列番号１で記載されたセンス配列と結合し、ＡＮＴ２  ｍＲＮＡの分解を誘導することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体２）の発現を低下させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）の乳房癌治療効果を増加させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、乳房癌細胞表面のＤＲ４（死受容体４）及びＤＲ５（死受容体５）の発現を増加させ、ＤｃＲ１（死デコイ受容体１）及びＤｃＲ２（死デコイ受容体２）の発現を減少させることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、ｐ５３タンパク質の発現及び活性を増加させることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
アデニンヌクレオチドトランスケータ２  低分子干渉ＲＮＡ（ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ）またはＡＮＴ２  短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を有効成分として含有する乳房癌幹細胞治療用組成物。
【請求項８】
前記組成物は、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２）の発現及び活性を減少させることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、抗癌剤と併用投与時に抗癌剤に対する癌細胞の反応性を増加させ、耐性を減少させて乳房癌治療効果を増進させることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗癌剤は、ドキソルビシンであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
アデニンヌクレオチドトランスケータ２  低分子干渉ＲＮＡ（ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ）またはＡＮＴ２  短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を患者に投与し、乳房癌を治療する方法であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする方法。
【請求項１２】
アデニンヌクレオチドトランスケータ２  低分子干渉ＲＮＡ（ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ）またはＡＮＴ２  短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を患者に投与し、乳房癌幹細胞を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデニンヌクレオチドトランスケータ２（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ  ２（ＡＮＴ２））ｍＲＮＡ発現水準を減少させて乳房癌を治療する方法に関し、具体的には、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ））またはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ））を利用して乳房癌を治療する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、非正常的な細胞の過剰によって発生する非正常的で、非制御的であり、無秩序な細胞増殖の産物であって、このような腫瘍が破壊的な増殖性、浸潤性及び転移性を有するようになれば、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ）に分類される。特に、分子生物学的な観点から見れば、遺伝子の変異によって発生する遺伝的疾患（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）と言える。
【０００３】
現在まで悪性腫瘍である癌を治療する方法として、主に３つの治療法、すなわち外科的な手術、放射線治療及び化学療法があり、このうち１つまたはこれらの組合を通じて癌を治療している。具体的に、外科的手術は、疾病組職を大部分除去する方法で、このような外科的手術は、特定部位、例えば乳房、結腸及び皮膚に位置する腫瘍を除去するには非常に効果的であるが、脊椎のような一部の部位にある腫瘍を治療するか、または分散性腫瘍を治療するに適していない。
【０００４】
放射線治療は、急性炎症性疾患、陽性または悪性腫瘍、内分泌機能障害及びアレルギー性疾患などに使用され、一般的に急速に分裂する細胞で構成された悪性腫瘍に効果的に使用されている。このような放射線治療の短所としては、放射線の治療によって正常組職の機能弱化または喪失、治療後に治療部位に皮膚疾患が発生するおそれがあり、特に臓器の発育が進行される小児の場合、知能発達遅延または骨発育障害など深刻な副作用をもたらすことがある。
【０００５】
化学療法は、癌細胞の複製または代謝を撹乱させることによって、乳房、肺及び精巣の癌を治療するのに広く用いられているが、このような方法において最大の短所は、癌の治療に利用される全身性化学療法によって誘導される副作用である。化学療法による副作用は、患者の生命に重要な影響を及ぼし、治療に対する患者の不安感を増加させる。また、化学治療剤と関連した副作用としては、一般的にこのような薬物の投与時に注意すべき容量制限毒性（ｄｏｓｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＤＬＴ）である。例えば、粘膜炎は、様々な抗癌剤（抗代謝物質細胞毒消剤である５−フルオロウラシル、メトトレキサート及び抗腫瘍抗生剤であるドキソルビシン）などに対する容量制限毒性（ＤＬＴ）がある。このような化学療法の副作用のうち大部分はひどい場合、入院を要するか、痛症を治療するために、鎮痛剤を必要とする。このように、化学治療剤及び放射線治療による副作用は、癌患者の治療において重要な問題になっている。
【０００６】
一方、遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、ＤＮＡ組み換え方法を利用して治療用遺伝子を患者の細胞中に導入させて遺伝子欠陥を校正するか、細胞に新しい機能を追加し、人体細胞の遺伝的変形による各種遺伝疾患、癌、心血管疾患、感染性疾病及び自家免疫疾患などを治療するか予防する方法である。具体的には、治療遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ）を体内の所望の臓器に伝達することによって、細胞内で治療用または正常タンパク質が発現され得るように誘導し、上記疾病を治療する方法を遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）と言う。このような遺伝子治療は、一般的な薬物による治療法に比べて優れた選択性を有することができ、他の治療法で調節しにくい疾病の治療を改善することによって、長期間適用することができる。このような遺伝子治療を効果的に行うためには、治療遺伝子を所望の標的細胞に伝達し、高い効率で発現することができるようにする遺伝子伝達技術が必要である。
【０００７】
遺伝子伝達体は、所望の治療遺伝子を対象細胞に導入するために必要な媒介体であって、理想的な遺伝子伝達体は、人体に無害であり、大量生産が容易であり、効率的に遺伝子を伝達及び持続的に遺伝子を発現することができなければならない。このような遺伝子伝達体技術は、遺伝子治療技術の核心要素であって、現在遺伝子治療に多く用いられる代表的遺伝子伝達体としては、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のようなウイルス性伝達体とリポソーム及びポリエチレンイミンのような非ウイルス性伝達体がある。
【０００８】
遺伝子治療の戦略のうち腫瘍細胞を制御する戦略としては、腫瘍抑制遺伝子を利用する方法、腫瘍選択的殺傷ウイルスを利用する方法、自殺遺伝子を利用する方法及び免疫調節遺伝子を導入する方法などがある。具体的に、腫瘍抑制遺伝子を利用する方法は、相当数の癌患者で遺伝子が欠乏または変形されているｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子を原型で人体に伝達し、癌を治療する方法であり、腫瘍選択的殺傷ウイルスを利用する方法は、癌組織で変形されている腫瘍抑制遺伝子の活性を利用して腫瘍細胞だけで選択的に増殖することができるウイルス遺伝者伝達体を人体に導入して治療する方法であって、両方が共に、腫瘍細胞を直接的に死滅させる戦略である。また、自殺遺伝子を利用する方法、例えば、ＨＳＫ−ＴＫのような感受性遺伝子を導入して腫瘍細胞の自殺を誘導する方法も、このような範疇に含まれる。一方、免疫調節遺伝子を導入する方法は、抗腫瘍免疫反応を増加させるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、ガンマインターフェロン（γ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）及び腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）などの遺伝子を人体に伝達することによって、Ｔ細胞を媒介として腫瘍を認識するように誘発するか、または腫瘍誘発タンパク質を遮断することによって、細胞自殺を誘導し、間接的に疾病を治療する戦略である。
【０００９】
上記のように、癌を治療する多様な方法のうち遺伝子治療において本発明者は、代表的遺伝子としてＡＮＴ２（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ  ２）を選択し、効果的で且つ安全な抗癌治療剤の開発に重点を置いて来た。アデニンヌクレオチドトランスロケータ（ＡＤＰ／ＡＴＰ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ、ＡＮＴ）は、ミトコンドリア内膜（ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＩＭ）に存在する酵素であって、外膜（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＯＭ）のＶＤＡＣ（電位依存性陰イオンチャネル（ｖｏｌｔａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ））を通じて細胞質からミトコンドリア内部にＡＤＰを伝逹（ｉｍｐｏｒｔ）し、電子伝達系（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を経て生成されるＡＴＰを細胞質に放出（ｅｘｐｏｒｔ）する機能を行う酵素として知られている（ＨＬＡ  Ｖｉｅｉｒａ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７、１１４６−１１５４、２０００）。
【００１０】
これに加えて、細胞のエネルギー代謝に必須な役目を行うＡＮＴは、３個のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）であるＡＮＴ１、ＡＮＴ２及びＡＮＴ３が知られており、このうち、特にＡＮＴ２は、正常細胞では発現が低いが、癌細胞または増殖能が高い細胞では、非常に高く発現される特徴を有しているが、これは、嫌気性状態（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）での解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）反応と密接な関連があり、また、最近には、新しい癌治療の標的として提示されたことがある（Ｃｈｅｖｒｏｌｌｉｅｒ、Ａ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２１（２）、１５６−１６１、２００５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者は、ＡＮＴ２  ｍＲＮＡ発現水準を特異的に減少させることができるＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌細胞の転移を特異的に抑制するだけでなく、乳房癌幹細胞を治療することができることを知見し、本発明に至った。したがって、本発明の目的は、乳房癌治療用組成物及び乳房癌幹細胞を治療する方法などを提供することにある。具体的に、本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌治療用組成物、及びＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌幹細胞治療用組成物などを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌治療用組成物であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、上記ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡは、配列番号３で記載したアンチセンス（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）配列が配列番号１で記載したセンス（ｓｅｎｓｅ）配列と結合し、ＡＮＴ２  ｍＲＮＡの分解を誘導することを特徴とする。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、上記組成物は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体２（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２））の発現を低下させることを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらに他の実施形態において、上記組成物は、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ））の乳房癌治療効果を増加させることを特徴とする。
【００１６】
本発明のさらに他の実施形態において、上記組成物は、乳房癌細胞表面のＤＲ４（死受容体４（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４））及びＤＲ５（死受容体５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５））の発現を増加させ、ＤｃＲ１（死デコイ受容体１（ｄｅａｔｈ  ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １））及びＤｃＲ２（死デコイ受容体２（ｄｅａｔｈ  ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２））の発現を減少させることを特徴とする。
【００１７】
本発明のさらに他の実施形態において、上記組成物は、ｐ５３タンパク質の発現及び活性を増加させることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌幹細胞治療用組成物を提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態において、上記組成物は、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  Ｇ  ｍｅｍｂｅｒ  ２））の発現及び活性を減少させることを特徴とする。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、上記組成物は、抗癌剤と併用投与時に抗癌剤に対する癌細胞の反応性を増加させ、耐性を減少させて、乳房癌治療効果を増進させることを特徴とする。
【００２１】
上記抗癌剤は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を含む。
【００２２】
また、本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを患者に投与し、乳房癌を治療する方法であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを患者に投与し、乳房癌幹細胞を治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡは、乳房癌細胞のＡＮＴ２遺伝子発現を減少させて、効果的に細胞死滅を誘導するだけでなく、ＴＲＡＩＬ耐性を克服することができる長所を有している。特に、本発明のＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡは、乳房癌細胞の転移を抑制する効果を示す。これに加えて、乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）でも治療効果が確認され、これにより、乳房癌幹細胞治療剤としての可能性が期待される。窮極的に、本発明は、乳房癌細胞転移抑制効果及び抗癌剤耐性を克服することができる優れた効能を有する乳房癌治療剤を提供することができ、ひいては、乳房癌幹細胞治療剤の開発に利用されることができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を減少させるという結果を示すものである。
【図２】図２Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＨＳＰ９０の分解を促進させてＨＳＰ９０の発現を減少させるという結果を示すものである。  図２Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＨＥＲ２の発現を減少させるという結果を示すものである。
【図３】図３Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、Ａｋｔの活性を減少させるという結果を示すものである。  図３Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、Ａｋｔの活性を減少させ、ＡＮＴ２過発現によってＡｋｔの活性が回復するという結果を示すものである。  図３Ｃは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＨＳＰ９０とＡｋｔの結合（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が減少し、Ａｋｔの活性を減少させるという結果を示すものである。
【図４】図４Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現が減少するという結果を示すものである。  図４Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、細胞内ＶＥＧＦのタンパク質発現が減少するという結果を示すものである。  図４Ｃは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現が減少し、ＡＮＴ２の過発現によってＶＥＧＦの発現が回復するという結果を示すものである。
【図５】図５Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡ発現が減少するという結果を示すものである。  図５Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質発現が減少するという結果を示すものである。
【図６】図６Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡ発現が減少し、ＰＩ３Ｋの過発現によって回復するという結果を示すものである。  図６Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質発現が減少し、ＰＩ３Ｋ過発現によって回復するという結果を示すものである。
【図７】図７Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＭＭＰ２とＭＭＰ９のｍＲＮＡ発現が減少するという結果を示すものである。  図７Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＭＭＰ２とＭＭＰ９の活性が減少するという結果を示すものである。
【図８】図８Ａは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、癌細胞の浸湿能力が減少するという結果を示すものである。  図８Ｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過発現する乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、癌細胞の移動能力が減少するという結果を示すものである。
【図９】図９Ａは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７はＴＲＡＩＬに対して耐性を示し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は反応性（細胞死滅）が誘導されるという結果を示すものである。  図９Ｂは、ウエスタンブロットの結果を示す。ここで、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７はＴＲＡＩＬに対して耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、高い反応性（細胞死滅）を示す。  図９Ｃは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７はＴＲＡＩＬに対して耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、高い反応性（細胞死滅）を示すということを細胞写真で提示した結果である。
【図１０】図１０Ａは、乳房癌細胞株であるＴ４７ＤとＢＴ４７４はＴＲＡＩＬに対して耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、高い反応性（細胞死滅）を示すという結果である。  図１０Ｂは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７はＴＲＡＩＬに対して耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、高い反応性（細胞死滅）を示し、これにＡＮＴ２発現ベクターを導入し、ＡＮＴ２を過発現させる場合、死滅効果が消えるという結果を示すものである。  図１０Ｃは、乳房癌細胞株であるＴ４７ＤとＢＴ４７４はＴＲＡＩＬに対して耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、高い反応性（細胞死滅）を示し、この際、隋伴される現象であるカスパーゼ−８／９／７の開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）、ｂｉｄ切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、そしてミトコンドリア破壊によるシトクロムｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃの放出が増加するということを示す結果である。
【図１１】図１１Ａは、乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を有するＭＣＦ７細胞株ではＴＲＡＩＬの受容体であるＤＲ４とＤＲ５が低く発現され、ＴＲＡＩＬの信号伝逹を妨害するｄｅｃｏｙ受容体であるＤｃＲ１とＤｃＲ２が高く発現されるということを示し、これとは反対に、ＴＲＡＩＬに対して高い反応性を示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の場合、ＴＲＡＩＬの受容体であるＤＲ４とＤＲ５が高く発現され、ＴＲＡＩＬの信号伝逹を妨害するｄｅｃｏｙ受容体であるＤｃＲ１とＤｃＲ２が低く発現されるということを示す結果である。  図１１Ｂは、乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を有するＭＣＦ７細胞株ではＴＲＡＩＬの受容体であるＤＲ４とＤＲ５が低く発現されるが、ＴＲＡＩＬの信号伝逹を妨害するｄｅｃｏｙ受容体であるＤｃＲ１とＤｃＲ２は高く発現され、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＤＲ５の発現が増加し、ＤｃＲ２の発現が減少するということを示す結果である。  図１１Ｃは、乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合にも、ＴＲＡＩＬの受容体であるＤＲ４とＤＲ５が低く発現され、ＴＲＡＩＬの信号伝逹を妨害するｄｅｃｏｙ受容体であるＤｃＲ１とＤｃＲ２が高く発現されるが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＤＲ５の発現が増加し、ＤｃＲ２の発現が減少するということを示す結果である。
【図１２】図１２Ａは、乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を有するＭＣＦ７細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３タンパク質の発現とリン酸化／活性化が増加するということを示す結果である。  図１２Ｂは、乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を有するＭＣＦ７細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３タンパク質の転写調節能力（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増加するということを示す結果である。  図１２Ｃは、乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を有するＭＣＦ７細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、ＴＲＡＩＬの受容体であるＤＲ４とＤＲ５の発現が増加し、これは、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３タンパク質の活性化によるものであることを示す結果である。
【図１３】図１３は、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７はＴＲＡＩＬに対して耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、高い反応性（細胞死滅）を示し、これは、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３タンパク質の活性化によるものであることを示す結果である。
【図１４】図１４Ａは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７を免疫欠乏マウスであるＢａｌｂ／ｃ  ヌードマウスに移植した後、ＴＲＡＩＬとＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡで治療をする場合、ＴＲＡＩＬ単独治療は腫瘍抑制に大きい影響を及ぼさず、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ単独治療は部分的な腫瘍抑制効果を示し、ＴＲＡＩＬとＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを一緒に治療する場合、最も効果的な腫瘍抑制効果を示すという結果である。  図１４Ｂは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７を免疫欠乏マウスであるＢａｌｂ／ｃ  ヌードマウスに移植した後、ＴＲＡＩＬとＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを一緒に治療する場合、最も効果的な腫瘍抑制効果を示し、この際、腫瘍を摘出し、ＴＲＡＩＬ受容体であるＤＲ４とＤＲ５の発現を観察した結果ＤＲ４とＤＲ５の発現が増加していることを示す結果である。
【図１５】図１５Ａは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合と分離しない場合、いずれもＡＮＴ２が高く発現されるということを逆転写重合酵素連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）実験で示す結果である。  図１５Ｂは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合と分離しない場合、いずれもＡＮＴ２が高く発現されるということをリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）で示す結果である。
【図１６】図１６Ａは、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）  ｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、模様の変化を示す結果である。  図１６Ｂは、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリン  ｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、Ｅ−カドヘリンの発現が減少し、ＡＮＴ２の発現が増加することを示す結果である。
【図１７】図１７Ａは、乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離し、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、効果的に細胞死滅が誘導されるということを示す結果である。  図１７Ｂは、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離してＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、効果的に細胞死滅が誘導されるということを示す結果である。
【図１８】図１８Ａは、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、細胞死滅が誘導されないということを示す結果である。  図１８Ｂは、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリン  ｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、効果的に細胞死滅が誘導されるということを示す結果である。
【図１９】図１９Ａは、乳房癌細胞母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞が高い比率を占めるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合、細胞塊の形成能力が高い一方で、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞が低い比率を占めるＭＣＦ７の場合、細胞塊の形成能力が相対的に低いということを示し、これにＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、２つの細胞株がいずれも細胞塊の形成能が減少するということを示す結果である。  図１９Ｂは、乳房癌細胞母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞が高い比率を占めるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合、細胞塊の形成能力が高い一方、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞が低い比率を占めるＭＣＦ７の場合細胞塊の形成能力が相対的に低いということを示し、これにＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、２つの細胞株がいずれも細胞塊の形成能が減少するということを細胞写真で示す結果である。
【図２０】図２０は、乳房癌細胞母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞が高い比率を占めるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合、ドキソルビシンに対して高い耐性を示し、これにＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離しない場合と分離した場合、いずれもドキソルビシンに対する反応性が高くなるということを示す結果である。
【図２１】図２１は、乳房癌細胞母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞が低い比率を占めるＭＣＦ７の場合、ドキソルビシンに対して反応性を示すが（接着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ））、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合（浮遊細胞（ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ））、耐性を示すようになる。これにＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離しない場合と分離した場合、いずれもドキソルビシンに対する反応性が高くなるということを示す結果である。
【図２２】図２２は、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合には、分離しない場合と違い、薬物耐性（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関与するＡＢＣＧ２のｍＲＮＡ発現が高く（左）、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリンｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、ＡＢＣＧ２のｍＲＮＡ発現が高くなるということを示す結果である（右）。
【図２３】図２３は、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合には、分離しない場合と異なって、薬物耐性（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関与するＡＢＣＧ２のタンパク質発現が高く、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、低くなるということを示す結果である。そして、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリンｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、ＡＢＣＧ２のタンパク質発現が高くなり、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、低くなるということを示す結果である。
【図２４】図２４は、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合には、分離しない場合と異なって、薬物耐性（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関与するＡＢＣＧ２の活性が高くなり、正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリンｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、ＡＢＣＧ２の活性が高くなるということを示す結果である。
【図２５】図２５は、乳房癌細胞株であるＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１から母体になる細胞であるＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞のみを分離した場合には、分離しない場合と異なって、薬物耐性（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に関与するＡＢＣＧ２の活性が高く、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、低くなることを示し、且つ正常乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０ＡにＥ−カドヘリンｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導する場合、ＡＢＣＧ２の活性が高くなり、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、低くなるということを示す結果である。
【図２６】図２６は、乳房癌細胞の母体になる細胞表面に高く発現されているＣＤ４４を標的とする運搬物質であるナノ粒子がＣＤ４４発現が高い細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを選択的に伝達することを示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌治療用組成物であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする組成物を提供する。具体的に、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌細胞の他の組職への移動及び浸潤を抑制することを知見し、本発明を完成するに至った。
【００２７】
乳房癌細胞は、細胞表面に発現する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を通じて細胞内に特定の信号伝逹体系を活性化させて、細胞の増殖、生存、他の組職への移動と浸潤を可能にすると知られている。特に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のうちＨＥＲ２／ｎｅｕの場合、乳房癌患者の３０％程度が癌細胞の表面に過発現していると報告されており、ＨＥＲ２／ｎｅｕが過発現されている場合、治療の予後が悪く、抗癌治療に対する強い耐性（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示すと知られている。また、ＨＥＲ２／ｎｅｕを通じて活性化される代表的な信号伝達体系としては、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝達体系が知られており、この信号伝達体系の活性が乳房癌細胞の増殖、生存、他の組職への移動と浸潤に関与すると報告されている。したがって、ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を低減するか、またはＨＥＲ２／ｎｅｕを用いた信号伝達体系の活性を妨害する方法を利用して乳房癌を治療しようとする様々な試みが現在なされている。
【００２８】
本発明者は、乳房癌細胞で過発現し、乳房癌細胞のエネルギー生産（ＡＴＰ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）に決定的な役目をすると知られたＡＮＴ２遺伝子に対してＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを利用して発現を抑制させた場合、癌細胞が生きて行くのに必要なエネルギー供給が円滑ではないため、癌細胞の死滅をもたらすと共に、これに加えて癌細胞が他の組職に移動するかまたは浸潤することを防止し、転移を抑制させることができることを知見した。
【００２９】
一方、乳房癌細胞表面のＨＥＲ２／ｎｅｕの発現は、ＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質９０（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０））というタンパク質によって維持されると報告されており、ＨＳＰ９０タンパク質は、ＡＴＰが結合するとき、その機能を行うことができると知られている。したがって、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを利用して癌細胞内のＡＴＰを欠乏させるようになれば、ＨＳＰ９０に十分なＡＴＰが結合せず、すなわちＨＳＰ９０が本来の機能を行わないので、ＨＥＲ２／ｎｅｕの分解が促進されると予想し、ＨＥＲ２／ｎｅｕの分解は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを用いたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝達体系の活性弱化につながって、結局、乳房癌細胞が他の組職に移動し浸潤することができる能力が減少するという仮説を立てた。これを検証するために、人間乳房癌細胞株のうちＨＥＲ２／ｎｅｕが高く発現していると知られたＳＫ−ＢＲ３という人間乳房癌細胞株を対象としてＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入させて、ＡＮＴ２発現を低下させた。その結果、細胞内ＡＴＰ欠乏がＨＳＰ９０タンパク質の活性を低下させて、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を減少させることを観察し、これに加えて、ＨＥＲ２／ｎｅｕを用いたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝達体系の活性が弱化され、乳房癌細胞の他の組職への移動と浸潤能力が抑制されるということを実験的に確認した。
【００３０】
本発明の他の局面は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌治療用組成物であって、ＴＲＡＩＬの乳房癌治療効果を増加させることを特徴とする組成物を提供する。
【００３１】
腫瘍死滅因子であるＴＲＡＩＬ／ａｐｏ２リガンドは、正常細胞は殺さず、癌細胞のみを選択的に殺すという長所を有している。しかし、ＴＲＡＩＬを抗癌剤として使用するにあたって、癌細胞がこれに対して耐性を有するという限界を有していて、これを克服するための様々な研究が行われている。したがって、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを利用してＴＲＡＩＬに対する耐性を克服する方案を模索しようとした。
【００３２】
本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを乳房癌細胞に導入する場合、ＴＲＡＩＬによる癌細胞の死滅を増加させ、細胞培養条件（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）と動物モデルで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＴＲＡＩＬによる腫瘍成長抑制効果を増幅させるということを確認した。この際、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＴＲＡＩＬによる乳房癌細胞死滅効果を増幅させる機作でＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現を調節するということを明らかにした。ＴＲＡＩＬの受容体には、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１：ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）とＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２：ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）があり、ＤＲ４とＤＲ５にＴＲＡＩＬが結合する場合、細胞内に細胞死滅の信号が伝達され、癌細胞が死に至るようになる。しかし、ＴＲＡＩＬの受容体のうちＤｃＲ１（デコイ受容体１（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  １）：ＴＲＡＩＬＲ３）とＤｃＲ２（デコイ受容体２（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ２）：ＴＲＡＩＬＲ４）の場合、ＤＲ４とＤＲ５による癌細胞死滅から癌細胞を保護する役目をするようになる。すなわちＴＲＡＩＬがＤｃＲ１とＤｃＲ２に結合する場合、癌細胞の内部に正常な細胞死滅信号が伝達されない。すなわち、癌細胞がＴＲＡＩＬに対して耐性を示す原因には、様々な理由があるが、癌細胞表面のＤＲ４とＤＲ５の発現が減少し、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現が増加することが重要な原因として作用すると知られている。本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによる癌細胞内部の信号伝逹体系の変化が癌細胞表面のＤＲ４とＤＲ５の発現を増加させ、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現を減少させて、ＴＲＡＩＬに対する反応性を高め、耐性を克服することができるということを糾明した。
【００３３】
結論的に、本発明者は、乳房癌細胞を治療するにあたって、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＴＲＡＩＬに対する治療効果を増幅させることができ、ＴＲＡＩＬに対する耐性を克服することができるということを細胞培養実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）と動物実験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を通じて最初に糾明し、その機作は、ＴＲＡＩＬ受容体の発現調節によるものであることを最初で実験的に証明した。
【００３４】
本発明のさらに他の局面は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを有効成分として含有する乳房癌幹細胞治療用組成物を提供する。
【００３５】
現在、乳房癌細胞を対象として抗癌治療と放射線治療が行われているが、最大の問題点は、治療以後に新しい腫瘍が生成される現象（癌の再発）が現われることである。これは、癌の塊を構成する癌細胞は効果的に殺すことができるが、癌の塊を構成する細胞のうち非常に少ない数字を占める乳房癌幹細胞（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）が生き残って新しい腫瘍を生成するようになるためと考えられる。したがって、乳房癌幹細胞を効果的に除去することができる治療法を開発することが非常に重要であり、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌幹細胞治療剤として効果を有することを明らかにした。
【００３６】
本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの乳房癌幹細胞治療剤としての可能性と効果を確認するために、乳房癌幹細胞で乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）に該当するＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞集団のみを分離し、実験を進行した。具体的に、乳房上皮細胞であるＭＣＦ１０Ａに発現するＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて、人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導し、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの治療効果を確認した。これは、上皮細胞が間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）に転換されるとき（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）、乳房癌幹細胞の特性を有すると知られたことに基礎したものである。そして、乳房癌幹細胞内にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを効果的に伝達するために、アデノウイルスシステムを利用した。すなわちＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスを製作生産し、乳房癌幹細胞に感染させて使用した。その結果、乳房癌幹細胞の特徴を有する２つの細胞集団においていずれも効果的にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによって細胞死滅が誘導され、乳房癌幹細胞の抗癌剤耐性を克服し、抗癌剤に対する効果を増幅させるという結果を得ることができた。
【００３７】
また、上記本発明の組成物は、既存の抗癌剤治療法（例えば、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ））を並行する場合、抗癌剤に対する反応性を高め、耐性を減少させて、乳房癌治療効果を増進させることを特徴とする。
【００３８】
本発明のさらに他の局面は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを患者に投与し、乳房癌を治療する方法であって、乳房癌細胞の転移を抑制することを特徴とする方法を提供する。
【００３９】
本発明のさらに他の局面は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡまたはＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを患者に投与し、乳房癌幹細胞を治療する方法を提供する。
【００４０】
上記投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与回数、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様に調節されることができることは当業者に明白である。
【００４１】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより易しく理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ発現ベクターの製作
米国国立生命工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｎｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手したＡＮＴ２  ｍＲＮＡ塩基配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１５２である。この塩基配列をｓｉＲＮＡ予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ、ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｉＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｉｎｄｅｒ）に代入し、適合なＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ候補塩基配列を確保し、様々な候補塩基配列のうち、ＡＮＴ２  ｍＲＮＡの二番目エクソンに該当する塩基配列である５'ＧＣＡＧＡＵＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＧ３'に結合するｓｉＲＮＡを製作し、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡによるＡＮＴ２  ｍＲＮＡの減少（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）効果を細胞水準（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で確認した［この際、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ製作は、Ｂｉｏｎｅｅｒ（韓国）に依頼した］。
【００４３】
この結果に基づいて、ｓｈＲＮＡを製作するために、次のような塩基配列のオリゴマー二本を合成し［この際、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ製作は、Ｂｉｏｎｅｅｒ（韓国）に依頼した］、
【化１】
2014506888.tif 000003
上記二本のオリゴマーを結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させた後、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．１−Ｈ１  ｐｕｒｏプラスミドベクター（Ａｍｂｉｏｎ社）のＭＣＳ（ｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）内のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして製作した。この際、上記センス配列に引き続いて、ｓｉＲＮＡ発現誘導の効率を増加させるようにＴＴを添加した。また、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果を確認するために進行したすべての実験には、ＡＮＴ２発現を遮断せず、細胞内の特定ｍＲＮＡの発現には影響を及ぼさないスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｈＲＮＡを陰性対照群として使用し、これは、同一の条件を提供する役目をするもので、Ａｍｂｉｏｎ社で購入して使用した。
【００４４】
上記ベクターから発現されるｓｈＲＮＡの塩基配列は、配列番号１〜３で配列目録に別に記載した。
【００４５】
【化２】
2014506888.tif 000004
【００４６】
実施例１．ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
本発明者は、人間乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３の表面に高く発現するＨＥＲ２／ｎｅｕがＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入によって減少することを流動細胞分析機（ＦＡＣＳ：ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を通じて確認した。
【００４７】
この際、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３に導入するために使用された方法は、非ウイルス性伝達体であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品）という物質を使用し、細胞内にｓｈＲＮＡが入る原理は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００の正電荷を呈する親水性部分とｓｈＲＮＡの負電化が互いに相互作用することにより結合体を作って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００が細胞膜と融合し、ｓｈＲＮＡが細胞内に入るようになる。
【００４８】
具体的に、流動細胞分析機を利用した実験は、細胞表面に発現するＨＥＲ２／ｎｅｕと結合する抗体を付着し［１次抗体：ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）］、この抗体に結合する抗体である２次抗体（ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ａｎｔｉ−−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を付着した。２次抗体の場合、蛍光物質が結合されていて、流動細胞分析機がこれを認知するようになり、ＨＥＲ２／ｎｅｎが発現されている細胞と発現されていない細胞を区分するようになる。その結果、ＳＫ−ＢＲ３は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを高く発現するようになるが（ｓｃｓｈＲＮＡ）、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が減少することを確認した（図１参照）。
【００４９】
また、本発明者は、人間乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入させてＡＮＴ２発現を減少させ、細胞からタンパク質を抽出し、ＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＳＰ９０の相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の変化を確認した。具体的に、まず、ＨＥＲ２／ｎｅｕと結合する抗体［ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）］で免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）をさせ、ＨＳＰ９０に結合する抗体［ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＳＰ９０  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ］でタンパク質発現程度（ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）を確認し、その結果を図２に示した。
【００５０】
図２に示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによってＡＮＴ２発現が減少した場合、ＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＳＰ９０の相互作用が減少し、細胞内でタンパク質が分解される前に現われる現象であるユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）が増加していることを確認した。すなわちＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによってＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＳＰ９０との相互作用が減少し、そのため、ＨＥＲ２／ｎｅｕのユビキチン化が増加し、ＨＥＲ２／ｎｅｕの分解が増加するので、結果的に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現が減少することを確認した。この際、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として１７−ＡＡＧというＨＳＰ９０抑制薬物［ＨＳＰ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／１７−ＡＡＧ（１７−ａｌｌｙｌａｍｉｎｏ−１７−ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）：Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）］を使用し、実験に使用されたタンパク質の量が同一であることを示すために、細胞骨格を構成するタンパク質として細胞外部や内部の変化に影響を受けないｂｅｔａ−ａｃｔｉｎタンパク質の量が同一であることを示す［ａｎｔｉ−ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］。
【００５１】
実施例２．Ａｋｔ活性変化に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３に高く発現されているＨＥＲ２／ｎｅｕは、Ａｋｔというタンパク質を活性化させ、活性化されたＡｋｔは、乳房癌細胞の生存を維持する機作だけでなく、他の組職への移動と浸潤に関与すると知られており、Ａｋｔの活性化は、特定アミノ酸のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）程度を通じて確認することができる。
【００５２】
本発明者は、人間乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入させて活性化されたＡｋｔタンパク質の量（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ａｋｔ）を確認した［Ａｎｔｉ−Ａｋｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］。その結果、普段高い活性度を示すＡｋｔがＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入によって減少することを確認することができ、陽性対照群としてＨＳＰ９０抑制薬物である１７−ＡＡＧを使用したが、これは、ＨＳＰ９０を抑制し、ＨＥＲ２／ｎｅｕを用いたＡｋｔの活性を抑制させると知られている（図３Ａ参照）。
【００５３】
また、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＡｋｔの活性を低下させるということを再確認する実験を行った。ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによってＡＮＴ２発現が減少するとき、減少したリン酸化した−Ａｋｔ（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ）の量が、ＡＮＴ２を過発現させるベクターを導入し、ＡＮＴ２の発現を増加させるとき、さらに回復することを確認し、陽性対照群としてＡｋｔのリン酸化を誘導するタンパク質であるＰＩ３Ｋの抑制薬物［ＬＹ２９４００２：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）］を使用した（図３Ｂ参照）。
【００５４】
これに加えて、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＡｋｔの活性を低下させることと関連して、ＨＳＰ９０がＡｋｔとも相互作用をしているという報告に基づいてＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＨＳＰ９０の活性を低下させ、そのため、Ａｋｔとの相互作用が低下するかを確認する実験を行った。
【００５５】
まず、ＨＳＰ９０と結合する抗体［ＨＳＰ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／１７−ＡＡＧ（１７−ａｌｌｙｌａｍｉｎｏ−１７−ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）：Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）］で免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）をさせ、Ａｋｔと結合する抗体［Ａｎｔｉ−Ａｋｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］でタンパク質発現程度（ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）を確認した。その結果、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによってＨＳＰ９０とＡｋｔとの相互作用が減少し、活性化されたＡｋｔ（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ）の量が減少することを確認した（図３Ｃ参照）。上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによるＨＳＰ９０の活性度低下は、ＨＳＰ９０とＡｋｔとの相互作用を減少させるだけでなく、Ａｋｔの活性度を抑制させるということを意味する。
【００５６】
実施例３．ＶＥＧＦの生産に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
本発明者は、人間乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入させる場合、Ａｋｔ活性が低下し（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝逹体系の弱化）、窮極的に、癌細胞周辺の新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＶＥＧＦタンパク質の生産を低下させることを確認した。
【００５７】
具体的に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを細胞に導入した後、一定時間（２４ｈ）培養し、全体ＲＮＡｓ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡｓ）を抽出した後、ｍＲＮＡのみをｏｌｉｇｏ−ｄＴを利用して（ｍＲＮＡ３’末端にｐｏｌｙ  Ｔがあることを利用する）逆転写反応を通じてｃＤＮＡを合成した後、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ））に特異的に結合するプライマーを利用してＶＥＧＦの発現を分析した。
【００５８】
図４Ａに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３に導入させる場合、新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現が減少することを逆転写重合酵素増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて確認した。
【００５９】
また、ＶＥＧＦの細胞内タンパク質の量が減少することを流動細胞分析機（ＦＡＣＳ：ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を通じて確認した。この際、ＶＥＧＦは、細胞内で生産されてから、細胞外に分泌されるタンパク質なので、これを阻止するために、ＢＦＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）という薬物を処理し、細胞内に蓄積させた後、ＶＥＧＦタンパク質の量の差異を比較した。具体的に、ＢＦＡを処理して細胞内にＶＥＧＦを蓄積させた後、細胞膜に孔を形成し、ＶＥＧＦと結合する１次抗体［ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）］を細胞内に投入し、ＶＥＧＦと結合させ、次に、蛍光物質が結合された２次抗体［ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）］を１次抗体と結合させた後、流動細胞分析機で分析した（図４Ｂ参照）。
【００６０】
これに加えて、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を低下させることを再確認する実験を行った。ＡＮＴ２を過発現するベクター（ｐｃＤＮＡ３．０−ＡＮＴ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）を導入させてＡＮＴ２の発現を増加させる場合、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現が回復することを確認し、陽性対照群としてＡｋｔのリン酸化を誘導するタンパク質であるＰＩ３Ｋの抑制薬物（ＬＹ２９４００２）を使用した（図４Ｃ参照）。これは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝逹体系の活性によってＶＥＧＦｍＲＮＡ発現が誘導されるという事実に基づくものである。
【００６１】
実施例４．ＭＭＰｓ発現及び活性に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
本発明者は、人間乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入させる場合、Ａｋｔ活性が低下し（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝逹体系の弱化）、癌細胞周辺の組職（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）を分解し、癌細胞の移動と浸潤に関与するタンパク質であるＭＭＰｓ（マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ））の発現と活性を低下させることを確認した。
【００６２】
具体的に、ＭＭＰｓのうちＶＥＧＦによって発現が調節されると報告されているＭＴ１−ＭＭＰの発現変化を調査し、次に、ＭＴ１−ＭＭＰによって発現と活性が調節されると知られているＭＭＰ２とＭＭＰ９の発現と活性の変化を観察した。
【００６３】
まず、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３に導入させる場合、癌細胞周辺組職の分解に関与するＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡの発現が減少することを逆転写重合酵素増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて確認し（図５Ａ参照）、且つ、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質の量が減少することを確認した（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）（図５Ｂ参照）。
【００６４】
また、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡ発現を低下させることを再確認するために、ＰＩ３Ｋを過発現するベクター［ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＰＩ３Ｋ／ｐ１１０  ｖｅｃｔｏｒｓ（ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｄｒ．Ｋａｒｉｎ  Ｒｅｉｆ）］を導入させて人為的にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝達体系を活性化させる場合、ＭＴ１−ＭＭＰｍＲＮＡの発現が回復することを逆転写重合酵素増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認し（図６Ａ参照）、且つ、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質の量が回復することを確認した（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）（図６Ｂ参照）。
【００６５】
これに加えて、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３に導入させる場合、ＭＴ１−ＭＭＰによって調節されるＭＭＰ２  ｍＲＮＡ及びＭＭＰ９  ｍＲＮＡの発現が減少することを逆転写重合酵素増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて確認した（図７Ａ参照）。この際、実験に使用されたｍＲＮＡ量が同一であることを示すために細胞外部や内部の変化に影響を受けないＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの量が同一であることを示した。且つ、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを乳房癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ３に導入させる場合、ＭＴ１−ＭＭＰによって調節されるＭＭＰ２とＭＭＰ９のタンパク質の活性が減少することをゼラチンザイモグラフィ（Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を通じて確認し、この際、ＭＭＰ２とＭＭＰ９のゼラチン分解能力が大きいほど、白色バンドが強く現われ、活性化形態（ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）のＭＭＰ２とＭＭＰ９の量が増加することを観察した（図７Ｂ参照）。
【００６６】
実施例５．乳房癌細胞株の移動能力と他の組職への浸潤能力に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
上記実施例４から、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入で癌細胞の移動と浸潤に関与するタンパク質であるＭＭＰｓ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）の発現と活性が低下することを確認し、これに加えて、実際に癌細胞の移動能力と浸潤能力がどれほど低下したかを観察するために下記実験を行った。
【００６７】
ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが癌細胞の浸潤と移動能力を低下させることができることを確認するために、マトリゲル浸潤アッセイ（ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）及びトランスウェル遊走アッセイ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を実施した。マトリゲル浸潤アッセイは、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を分解して移動した癌細胞を染色することによって、癌細胞の浸潤能力を分析する方法である。具体的に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入した乳房癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ３）を１８時間培養し、これをマトリゲル浸潤チャンバー（ｍａｔｅｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｌａｂｗａｒｅ、ＵＳＡ）の上層に１００μＬの０．１％ＢＳＡ、α−ＭＥＭに細胞（２×１０４細胞）が入っているようにして培養した。２４時間後、上部の培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、耳掻きで上部の細胞を除去した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを通過してウェルの外側の底部に付いている細胞を１０％ホルマリンで１０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットで２０分間染色した。染色された細胞の数を顕微鏡下で計測した。そして、癌細胞の移動能力を比較確認するために、トランスウェル遊走アッセイ方法を利用した。まず、細孔径８μｍのｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の下面をｇｅｌａｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした後、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔの内部に細胞浮遊液をそれぞれ添加した。この際、外部容器には、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を添加した無血清培地を入れた。一定時間（１８時間）培養が終了すれば、ｉｎｓｅｒｔの内面を耳掻きで拭いて、移動しない内皮細胞を除去し、下方に移動した細胞の数はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ溶液で染色し、２００倍顕微鏡視野で計測した。
【００６８】
その結果、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入した場合、マトリゲルとトランスウェルを通過し、染色される細胞の数が減少することを確認し、これを通じて癌細胞の浸潤と移動能力が減少したことを確認することができた（図８参照）。
【００６９】
実施例６．ＴＲＡＩＬに対する反応性に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、ＴＲＡＩＬに対する反応性（癌細胞死滅）に対する効果を考察した。
【００７０】
この実験では、乳房癌細胞株としてＴＲＡＩＬに対して耐性を示すＭＣＦ７、及びＴＲＡＩＬに対して高い反応性を示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用した。ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を対象としてＴＲＡＩＬを濃度別に処理した後、細胞の死滅程度をＣＣＫ８試薬を利用して確認した。ＣＣＫ８分析法は、生きている細胞を計測する方法である。具体的に、細胞培養液１００μＬ（１ｘ１０４細胞／ウェル）を各ウェルに分株し、ＴＲＡＩＬを最終濃度が１μｇ／ｍＬで０になるように１０倍ずつ階段希釈して、処理した後、１２時間培養し、ＣＣＫ８試薬を１０μＬ添加した後、適当時間（４時間）ＣＯ２インキュベータで培養し、４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の死滅程度を測定した。
【００７１】
その結果、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合、ＴＲＡＩＬによって効果的な死滅が誘導される一方で、ＭＣＦ７細胞の場合、ＴＲＡＩＬによる細胞死滅がほとんど誘導されないことを観察した（図９Ａ参照）。この際、使用した実験方法は、培養する細胞にＣＣＫ８試薬を入れる場合、生きている細胞だけが色の変化が現われ、特定波長で吸光度を測定し、細胞の生存率を確認する方法だ。
【００７２】
乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して耐性を示すＭＣＦ７細胞は、１００ｎｇ／ｍＬで細胞死滅が誘導されない。しかし、ＭＣＦ７細胞にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ単独によっても細胞死滅が誘導されるが（〜２５％）、ＴＲＡＩＬと同時処理する場合、細胞死滅が誘導されなかったＴＲＡＩＬ単独効果とは異なって、細胞死滅が強く誘導されることを（〜６５％）ＣＣＫ８試薬を通じて確認した（図９Ｂ参照）。この際、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入によって細胞内のＡＮＴ２タンパク質発現が減少することをＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔで確認した。ＴＲＡＩＬに対する陰性対照群としては、ＰＢＳを使用し、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡに対する陰性対照群としては、特定ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼさないｓｃ  ｓｈＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｈＲＮＡ）を導入した。
【００７３】
次に、ＴＲＡＩＬに対して耐性を示すＭＣＦ７細胞に対してＴＲＡＩＬ単独処理時に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ単独導入時に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬを同時処理時に細胞死滅程度を顕微鏡で観察し、その結果を図９Ｃに示した。図９Ｃに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬを同時処理時に細胞死滅が最も強く誘導されることが分かる。また、乳房癌細胞株のうち、ＴＲＡＩＬに対して耐性を有すると報告されているＴ４７ＤとＢＴ４７４細胞株においても、同一の方法で上記実験を実施した結果、ＭＣＦ７と同一の効果を示すことを観察した（図１０Ａ参照）。この際、ＣＣＫ８試薬を通じて細胞死滅程度を定量化した。
【００７４】
これに加えて、ＴＲＡＩＬに対する反応性が増加した理由は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによるＡＮＴ２発現減少によるものであることを再確認するために、ＡＮＴ２遺伝子を発現するベクター（ｐｃＤＮＡ−ＡＮＴ２）を利用して人為的にＡＮＴ２を過発現させて、ＴＲＡＩＬによる細胞死滅が抑制されることを観察し、ＣＣＫ８試薬を通じて細胞死滅程度を定量化した（図１０Ｂ参照）。ｐｃＤＮＡ−ＡＮＴ２に対する陰性対照群としては、何らの遺伝子も発現しない空きのベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）であるｐｃＤＮＡベクターを導入し、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによってＴＲＡＩＬに対する反応性が増加し、細胞死滅が誘導されるとき、細胞死滅によって隋伴される細胞内タンパク質の変化（ＰＡＲＰタンパク質の開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）、カスパーゼ−８／９／７タンパク質の開裂、Ｂｉｄタンパク質の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ））をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔで確認した。
【００７５】
また、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬによる細胞死滅がミトコンドリアを媒介として行われるので、破壊されるとき、ミトコンドリアから細胞質に流出されるタンパク質であるシトクロムＣ量の変化を観察した。同一の量のミトコンドリアタンパク質が実験に使用されたことをミトコンドリアタンパク質であるＣＯＸ  ＩＶタンパク質の量に変化がないことから確認した。その結果、ＴＲＡＩＬ単独によっては細胞死滅によって誘導されるタンパク質の変化が観察されなかったが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬを同時に処理したとき、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ単独よりもさらに大きい変化が観察されることを確認した（図１０Ｃ参照）。すなわち、細胞内のタンパク質変化を通じてＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＴＲＡＩＬによる細胞死滅を増加させたことをもう一度確認した。
【００７６】
実施例７．ＴＲＡＩＬ受容体発現に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌細胞株のうちＴＲＡＩＬに対して互いに異なる反応性を示すＭＣＦ７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を対象としてＴＲＡＩＬと結合する受容体であるＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、およびＤｃＲ２の発現程度をＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔで確認した。
【００７７】
ＤＲ４とＤＲ５の場合、ＴＲＡＩＬが結合すれば、正常な細胞死滅信号を細胞内部に伝達するが、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の場合、ＴＲＡＩＬが結合しても、細胞死滅信号を伝達しない。すなわちＤＲ４とＤＲ５の発現は高いほど、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現は低いほど、ＴＲＡＩＬに対する反応性が高くなることができる。
【００７８】
図１１Ａに示されたように、ＴＲＡＩＬに対する反応性が低いＭＣＦ７細胞の場合、ＤＲ４とＤＲ５の発現は低く、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現は高く観察され、ＴＲＡＩＬに対する反応性が高いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の場合、ＤＲ４とＤＲ５の発現は高く、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現は低く観察された。
【００７９】
次に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入時にＴＲＡＩＬ受容体発現の変化を調査し、その結果を図１１Ｂに示した。図１１Ｂに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がＤＲ４とＤＲ５の発現を増加させ、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現を減少させることが分かる。乳房癌細胞株のうち、ＴＲＡＩＬに対して耐性を有すると報告されているＴ４７ＤとＢＴ４７４細胞株でもＭＣＦ７と同一の効果を観察した。すなわちＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がＤＲ４とＤＲ５の発現を増加させ、ＤｃＲ１とＤｃＲ２の発現を減少させることを観察した（図１１Ｃ参照）。
【００８０】
実施例８．ｐ５３の活性に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がＤＲ４とＤＲ５の発現を増加させる機作を糾明する実験を行った。腫瘍抑制因子であるｐ５３は、ＤＲ４とＤＲ５の発現を誘導すると報告されているので、これを根拠としてＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がｐ５３タンパク質の発現を増加させるか、そして、活性化されたｐ５３タンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ−ｐ５３）の量が増加するかどうかを確認するために、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入させて活性化されたｐ５３タンパク質の量（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐ５３）とｐ５３タンパク質の量を確認した［ａｎｔｉ−Ｔｈｒ８１  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３及びａｎｔｉ−ｐ５３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）］。
【００８１】
図１２Ａに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がｐ５３タンパク質の発現と活性を増加させることが分かる。
【００８２】
次に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がｐ５３タンパク質の活性を増加させ、実際にｐ５３  ＤＮＡに結合し、遺伝子発現を誘導する能力が増加したことをレポーター遺伝子分析法（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ）を通じて確認した。この分析法は、特定タンパク質がＤＮＡに結合し、遺伝子発現を誘導する場合、レポーター役目をする遺伝子発現が誘導され、誘導された遺伝子の発現程度を吸光度を測定して定量化する方法である。具体的に、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとｐ５３タンパク質が結合するプローモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有するルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現するベクター（ｐＧＬ−ｐ５３  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）を同時に導入させて、一定時間細胞を培養した後、発現されたルシフェラーゼと反応する基質を入れ、ルシフェラーゼの活性度をルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（ＦＢ１２  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。
【００８３】
図１２Ｂに示されたように、  ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、ｐ５３によってレポーター遺伝子の発現が著しく増加されることが分かる。ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡに対する陰性対照群としては、特定ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼさないｓｃ  ｓｈＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｈＲＮＡ）を導入した。上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがｐ５３タンパク質の遺伝子発現誘導能力を増加させることを意味する。
【００８４】
また、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がｐ５３タンパク質の発現と活性を誘導し、これを通じてＴＲＡＩＬ受容体であるＤＲ４とＤＲ５の発現が増加することを再確認する実験を行った。その結果、図１２Ｃに示されたように、ｐ５３タンパク質の活性を抑制するｐ５３抑制物質［ｐ５３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａｌｐｈａ）：Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）］を前処理する場合、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによるＤＲ４とＤＲ５の発現増加が抑制されることを確認した（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）。
【００８５】
これに加えて、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がｐ５３タンパク質の発現と活性を誘導し、これを通じてＴＲＡＩＬに対する反応性を増加させることを再確認するために、ｐ５３タンパク質の活性を抑制するｐ５３抑制物質（ｐ５３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａｌｐｈａ）を処理した場合、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによるＴＲＡＩＬの細胞死滅増加効果が抑制されることを確認した。この際、ＣＣＫ８試薬を通じて細胞死滅程度を定量化し、ｐ５３  抑制物質に対する陰性対照群としてＰＢＳを使用した（図１３参照）。
【００８６】
上記結果から、乳房癌細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、ｐ５３の活性を増加させ、これにより、窮極的に癌細胞表面のＤＲ４とＤＲ５の発現が増加されることが分かる。
【００８７】
実施例９．ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入時に動物モデル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でＴＲＡＩＬに対する反応性増加を用いた腫瘍成長抑制効果
ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡがＴＲＡＩＬによる細胞死滅効果を増幅させて、腫瘍成長を抑制するかどうかを確認するために動物モデルで実験を実施した。
【００８８】
ＴＲＡＩＬに対する耐性を示すＭＣＦ７乳房癌細胞株を免疫機能が欠乏されたマウスであるＢａｌｂ／ｃ  ヌードマウスに移植し、１００ｍｍ３程度サイズの腫瘍が生成されたとき、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬで治療を実施した。この際、ＴＲＡＩＬは、腹腔注射（１０ｍｇ／ｋｇ）を行い、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡは、腫瘍に注射（１００μｇ：２００μＬ  ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を追加）を行い、注射を行うとき、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの癌細胞内への伝達を助けるためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００という物質とともに注射し、３回にわたって処置をした後、４５日間腫瘍のサイズを測定した。この際、ＴＲＡＩＬに対する陰性対照群として同一ボリュームのＰＢＳを使用し、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの陰性対照群としてｓｃ  ｓｈＲＮＡを使用した。
【００８９】
図１４Ａから明らかなように、細胞培養実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）と同様に、ＴＲＡＩＬ単独によっては腫瘍成長に大きい影響を及ぼさず、ＡＮＴ２単独によっても腫瘍成長を抑制したが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬを同時に処理した場合、最も効果的に腫瘍成長を抑制することが分かる。
【００９０】
次に、動物モデルでＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡとＴＲＡＩＬを処理した後、一定期間腫瘍のサイズを測定し、４５日目にマウスを安楽死させた後、腫瘍を摘出し、腫瘍細胞でＴＲＡＩＬ受容体の発現変化を逆転写重合酵素増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて確認し、その結果を図１４Ｂに示した。
【００９１】
図１４Ｂに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がＤＲ４とＤＲ５の発現を増加させ、ＤｃＲ２の発現を減少させることが分かる。
【００９２】
上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによるＴＲＡＩＬの腫瘍成長抑制効果は、ＴＲＡＩＬ受容体の発現調節によるものであることを意味する。
【００９３】
ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡアデノウイルスの製作
腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを効果的に移入するために、アデノウイルスシステムを使用した（ＡＮＴ２をターゲットとするｓｈＲＮＡの塩基配列及びループシーケンスは、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ発現ベクター製作時に使用したものと同一である）。
【００９４】
組み換えアデノウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を製作するために、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＤＮＡでＰｃａ１４  シャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ位置でサブクローニング（ｓｕｂ−ｃｌｏｎｉｎｇ）を進行した。これは、アデノウイルスベクターにクローニングを容易にするために作られたベクターでまず行われるクローニング段階である。ＰｖｕＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ（酵素でＤＮＡを切断し、電気泳動してみたとき、正確なサイズに現われるかを判別する実験法）でリアルクローン（ｒｅａｌ−ｃｌｏｎｅ）を捜し出し、ＢＪ５１８３コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（アデノウイルスベクターとシャトルベクターＤＮＡとの間にｓｅｑｕｅｎｃｅ−同種組み換えが可能にするＥ．ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎｃ  ｅｌｌ）内でＰｃａＩ酵素で切断され線形化されたＰｃａ１４−ｍＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡ  ＤＮＡとＢｓｔＢＩ酵素で切断され線形化されたアデノウイルス−ｄｌ３２４（Ｅ１ｄｅｌｅｔｅｄ：複製欠損ベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ））ベクターＤＮＡを一緒に同種組み換え８ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を行った後、得たＤＮＡをさらにＤＨ５α細胞中で形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）過程を経てＤＮＡを多量確保した。ここで、リアルクローン（ｒｅａｌ−ｃｌｏｎｅ）を確認した後、これを２９３ａパッケージング細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＤＮＡを細胞内に流入することが容易な細胞であり、且つアデノウイルス複製遺伝子Ｅ１が含まれていて、この細胞内でのクローン化アデノウイルス（ｃｌｏｎｅｄ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を大量確保することができるようにする細胞）に細胞内ＤＮＡ流入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、細胞内でアデノウイルス増殖を誘導した。多量増殖されたアデノウイルス−ｍＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡは、ＰＥＧ−ＣｓＣｌ（密度勾配層分離）方法で純粋分離した後、実験に適用した。
【００９５】
実施例１０．乳房癌細胞株腫瘍母体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌細胞株は、腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）とそうでない細胞（ｎｏｎ−ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）で構成され、にＡＮＴ２タンパク質は、この２つの細胞集団ですべて高く発現されている。本実験では、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、２つの種類の細胞に対する細胞死滅効果を観察した。
【００９６】
腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）は、細胞表面にＣＤ４４分子陽性／ＣＤ２４分子陰性（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）に分類され、乳房癌細胞株のうち、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）が占めるパーセントが高く（８０％以上）、ＭＣＦ７細胞株の場合、低いと（１０％未満）報告されている。
【００９７】
本実験では、２つの細胞株を対象として腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分類した場合と分類しない場合にＡＮＴ２遺伝子の発現程度を逆転写重合酵素方法（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認し、これを再確認するために、リアルタイム重合酵素増幅方法（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を実施した。２つの細胞株を対象としてＣＤ４４単一抗体［ａｎｔｉ−ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＣＤ４４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、（ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）］とａｎｔｉ−ＰＥ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ［ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ。（ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ］を処理した後、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｏｒ）を使用して必要な細胞のみを分離した後、母体になる細胞のみを分離したものと分離しない細胞を対象として逆転写重合酵素方法（ＲＴ−ＰＣＲ）とリアルタイム重合酵素増幅方法（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を実施し、ＡＮＴ２  ｍＲＮＡ発現程度を確認した。
【００９８】
図１５に示されたように、２つの細胞株で腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分類した場合と分類しない場合、いずれもＡＮＴ２発現が高いことが分かる。上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを利用してＡＮＴ２発現を減少させるとき、腫瘍の母体になる細胞とそうではない細胞がすべて死滅が誘導されることができ、治療可能性を有することを意味する。
【００９９】
これに加えて、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを利用して乳房癌細胞を構成する腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を治療することができることを確認する実験を行った。本実験のための細胞システムとしては、正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて、人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）に転換されるように誘導して使用した。間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）は、乳房癌幹細胞の特性を有すると知られている。
【０１００】
図１６Ａの顕微鏡写真に示されたように、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させるために正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリンｓｈＲＮＡを導入した場合、互いに密集するように付着して成長した細胞が緩く離れて成長する模様（間葉細胞が有する特徴）を有することを観察することによって、正常上皮細胞が間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）に転換されることが分かる。この際、Ｅ−カドヘリン発現が低下し、ＡＮＴ２遺伝子発現が増加したことを逆転写重合酵素方法（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認した（図１６Ｂ参照）。
【０１０１】
また、乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ７細胞株で腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）のみを分類し、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入した場合、細胞死滅が誘導される程度をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩで染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）し、流動細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した。この方法は、細胞が死ぬようになれば、細胞膜の内側に位置するタンパク質が細胞膜の外に出るようになるが、このタンパク質にＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣが結合するようになり、細胞内側のＤＮＡが細胞の外に流出されれば、ＰＩと結合をするようになり、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩで染色された程度を通じて細胞の死滅を定量的に分析する一般的な方法である。その結果を図１７に示し、２つの細胞株でいずれも腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）のみを分類した場合にも、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによって効果的に細胞死滅が誘導されることが分かる。陰性対照群としては、ｓｃ  ｓｈＲＮＡを導入して比較した。
【０１０２】
次に、正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリンｓｈＲＮＡを導入し、乳房癌幹細胞の特徴を有する細胞を対象としてＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入したときにも、効果的に細胞死滅が誘導されるかどうかを考察し、その結果を図１８に示した。この際、使用した方法は、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩを細胞に染色し、細胞の死滅程度を確認する方法であるが、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖは、細胞が細胞自殺時には初期段階で膜構造が壊れるようになり、細胞内部だけで露出していたホスファチジルセリンのようなリン脂質が細胞外に露出するが、これと結合し、細胞が今細胞自殺の初期段階にあることを示す方法である。また、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）は、細胞が死ぬときに起きる細胞核のブレブ形成（ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｌｅｂｉｎｇ）や凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を見るために、ＤＮＡの間に立ち入るｐｒｏｐｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅを処理してから、これら自体の蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を利用して細胞の死を判別する方法であり、この実験の陰性対照群としては、正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）を使用した。その結果、ＡＮＴ２発現が低い正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）の場合、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入しても、細胞死滅がほとんど誘導されない一方（図１８Ａ）、ＭＣＦ１０ＡにＥ−ｃａｄ  ｓｈＲＮＡを導入し、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で誘導した場合、ＡＮＴ２発現が増加し、この細胞（Ｅ−ｃａｄ  ｓｈＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ−ＭＣＦ１０Ａ）にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、効果的に細胞死滅が誘導された（図１８Ｂ）。
【０１０３】
上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌幹細胞を効果的に殺すが、正常上皮細胞には影響を及ぼさないことを意味する。
【０１０４】
実施例１１．母体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の腫瘍成長能力に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の腫瘍成長能力に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果を考察するための実験を行った。
【０１０５】
具体的に、乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ７細胞株で腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）のみを分類した後（分類方法は、実施例１０と同一）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＣＦ７細胞株にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入し、細胞がよく付着しない培養ディッシュ（細胞が培養ディッシュに付着することを最小化し、細胞塊の形成を促進させるための方法である）に細胞を培養し、細胞塊が形成される程度とサイズを観察した。
【０１０６】
図１９Ａに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入しない場合には、多い個数の細胞塊が生成される一方、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが導入された場合、細胞塊がほとんど生成されないことが分かり、図１９Ｂに示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが導入された場合、細胞塊の個数だけでなく、サイズも非常に小さいことを観察した。
【０１０７】
上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ）の腫瘍成長能力を抑制させることを意味する。
【０１０８】
実施例１２．乳房癌母体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の抗癌剤耐性に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）は、抗癌剤に対して高い耐性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、抗癌剤に対する反応性に及ぶ効果を考察した。
【０１０９】
乳房癌細胞株のうち母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）が占めるパーセントが高いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を対象として乳房癌治療に広く使用される抗癌剤であるドキソルビシンを１０μＭで１０倍ずつ階段希釈し、処理した後、一定時間（２４時間）培養した後、濃度別に細胞死滅程度をＣＣＫ８試薬を通じて定量的に分析し、その結果を図２０に示した。この際、使用した実験方法は、実施例６と同一である。
【０１１０】
図２０から明らかなように、母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分離した細胞及び分離しない細胞がいずれもドキソルビシンによってほとんど反応性を示さない一方、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入した場合、濃度依存的に細胞死滅が誘導されることを確認した。
【０１１１】
また、乳房癌細胞株のうち母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）が占めるパーセントが低いＭＣＦ７細胞株を対象として乳房癌治療に広く私用される抗癌剤であるドキソルビシンを濃度別に処理し、ＣＣＫ８試薬を通じて細胞死滅程度を定量的に分析し、その結果を図２１に示した。図２１から明らかなように、母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分離した細胞の場合、分離しない細胞に比べてドキソルビシンに対してさらに低い反応性を示し、一方、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入する場合、２つの細胞集団がいずれも濃度依存的に細胞死滅が誘導されることを確認した。上記結果は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入が抗癌剤であるドキソルビシンに対する反応性を増加させ、耐性を克服することができることを意味する。
【０１１２】
実施例１３．乳房癌母体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）で抗癌剤耐性に関与する受容体ＡＢＣＧ２の発現に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの効果
乳房癌を構成する細胞のうち母体になる細胞が抗癌剤薬物に対して低い反応性、すなわち高い耐性を示す代表的な原因として細胞膜に位置しながら、細胞内に入る薬物を細胞外に排出する受容体（ＭＤＲ：ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が過発現されるからであると報告されており、このような受容体のうち乳房癌細胞に特に高く発現しているものがＡＢＣＧ２である。
【０１１３】
したがって、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによる抗癌剤に対する反応性の増加がＡＢＣＧ２の発現と反応性の調節によるものであるかを調査するために下記実験を行った。
【０１１４】
乳房癌細胞株のうち母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）が占めるパーセントが高いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株及び母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）が占めるパーセントが低いＭＣＦ７細胞株を対象として、腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分類した場合、分類しない細胞、及び正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で誘導した細胞を対象としてＡＢＣＧ遺伝子の発現程度を逆転写重合酵素方法（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認し、これに加えて、ＡＢＣＧのタンパク質発現程度をａｎｔｉ−ＡＢＣＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔで確認した。
【０１１５】
図２２に示されたように、２つの細胞株で腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分類した場合と分類しない場合、そして、正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で誘導した場合、ＡＢＣＧ２のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。
【０１１６】
また、図２３に示されたように、２つの細胞株で腫瘍の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−）を分類した場合と分類しない場合、そして、正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で誘導した場合、ＡＢＣＧ２タンパク質水準で発現が増加することを確認した。また、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入するとき、増加されたＡＢＣＧ２の発現を低下させることを観察した。上記結果は、高いＡＢＣＧ２発現を示す乳房癌母体になる細胞及び乳房癌幹細胞にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを導入すれば、ＡＢＣＧ２発現を抑制させることを意味する。
【０１１７】
これに加えて、本発明者は、乳房癌を構成する細胞のうち母体になる細胞で実際にＡＢＣＧ２の活性が増加しているかを測定してみた。具体的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株及びＭＣＦ７細胞株に対して、腫瘍の母体になる細胞を分類した場合、分類しない細胞、及び正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で誘導した細胞を対象としてＡＢＣＧ２活性程度を考察した。この際、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２という薬物を利用してこの薬物が細胞内に蓄積される程度を通じてＡＢＣＧ２の活性度を定量的に分析し、その結果を図２４に示した。
【０１１８】
図２４に示されたように、２つの細胞株で腫瘍の母体になる細胞を分類した場合及び正常乳房上皮細胞株（ＭＣＦ１０Ａ）にＥ−カドヘリン遺伝子の発現を抑制させて人為的に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）で誘導した場合、いずれもＡＢＣＧ２の活性度が増加していることが分かる。
【０１１９】
上記結果に基づいて、本発明者は、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入がＡＢＣＧ２の活性度に及ぶ効果を考察した。ＡＢＣＧ２の活性度を測定するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）という薬物を細胞に処理した後、蛍光励起細胞分離分析を実施し、ＡＢＣＧ２の活性度を定量的に分析し、その結果を図２５に示した。図２５に示されたように、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡによってＡＢＣＧ２の活性度が効果的に減少することが分かる。
【０１２０】
上記結果は、乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の場合、抗癌剤の耐性に関与する受容体であるＡＢＣＧ２が高い発現と高い活性を示すが、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの導入は、ＡＢＣＧ２の発現と活性を減少させることを示す。すなわち、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌の母体になる細胞のＡＢＣＧ２の活性度を減少させて、抗癌剤に対する耐性を克服することができることを意味する。
【０１２１】
実施例１４．乳房癌母体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）に対するＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡの選択的伝達及び細胞死滅効果
ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが乳房癌細胞の母体になる細胞を効果的に治療することができるか否かを確認する実験を行った。ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを利用して癌患者を対象として治療する場合、ＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが効果的に所望の細胞によく伝達されるかが重要な問題なので、本発明者は、乳房癌の母体になる細胞表面に高く発現されているＣＤ４４を利用して、これを標的する運搬物質としてナノ粒子［ＰＥＩ／ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＨＡ）ナノ結合体（ｎａｎｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）］を製作した。実際にＣＤ４４を高く発現する乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１と低く発現するＴ４７Ｄを対象としてＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが効果的に伝達されるか否かを確認した。蛍光物質が付着しているナノ粒子［ＰＥＩ／ヒアルロン酸（ＨＡ）ナノ結合体］にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを入れ、結合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成した後、それぞれの細胞に処理し、一定時間後、細胞内に蛍光の強さを分析し、ナノ粒子によってＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡが細胞内に流入された程度を測定した。
【０１２２】
図２６に示されたように、ＣＤ４４を高く発現する乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１に選択的によく伝達されることを確認した。
【０１２３】
上記結果は、乳房癌細胞の母体になる細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の表面に高く発現されているＣＤ４４を標的とする運搬物質であるナノ粒子［ＰＥＩ／ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＡ）ｎａｎｏ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ］を利用してＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを運搬する場合、乳房癌細胞の母体になる細胞にのみ選択的にＡＮＴ２  ｓｈＲＮＡを伝達させ、治療（細胞死滅を誘導）することができることを示す。
【０１２４】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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