(57)【要約】  本発明は、レプチン誘導体、それらの組成物および治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって、式中、Zは12〜22個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基であり;
Yは、結合、
【化１】
2014505060.tif 000083
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
からなる群から選択されるスペーサーであり;
Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーである、
【化２】
2014505060.tif 000084
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)
化合物、またはその医薬的塩、アミドもしくはエステル。
【請求項２】
Z-Y-X-部分が、レプチン化合物中のN末端アルファ-アミノ基中に存在するアミノ基に連結している、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって、式中、
Zは12〜22個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基であり;
Yは、結合、
【化３】
2014505060.tif 000085
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
からなる群から選択されるスペーサーである化合物。
【請求項４】
Zが16〜18個の炭素原子を含み、Yが、結合、
【化４】
2014505060.tif 000086
(式中、mは0、1、2;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3または4;rは1、2または3である)
【化５】
2014505060.tif 000087
(式中、mは0、1、2または3であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3または4であり;rは1、2または3である)
からなる群から選択されるスペーサーであり;
Xが、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【化６】
2014505060.tif 000088
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である、
請求項1、2または3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記Z-Y-X-部分がアルキル化化学作用によりレプチンに結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記レプチン化合物がレプチンの類似体、例えば、ラットまたはヒトレプチンの類似体などである、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Zが脂肪酸または脂肪族二酸を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Zがアルファおよびオメガカルボキシ基を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Zが12〜22個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Zが16〜20個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
化合物B
【化７】
2014505060.tif 000089
である請求項1から10のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
化合物D
【化８】
2014505060.tif 000090
である請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
医学において使用するための請求項1から12のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
肥満、糖尿病、脂肪異栄養症、思春期遅発症、無月経症または多嚢胞性卵巣症候群の治療のための請求項1から13のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物と、1種または複数の医薬賦形剤と、場合により1種または複数のさらなる抗肥満剤および/または抗糖尿病剤、例えば、プラムリンチドなどとを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のレプチン誘導体およびそれらに関連する態様、例えば、それらの組成物およびそれらの治療的使用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
レプチンは、食欲および代謝を含めたエネルギー摂取量およびエネルギー消費量の調節において重要な役割を果たす16kDaのタンパク質ホルモンである。レプチンは、主に白色脂肪組織により分泌される。マウスにおける研究により、ob/obマウスにおいてレプチン遺伝子のホモ接合変異が重度の肥満を引き起こし、高血糖状態につながることが証明された。ob/obマウスモデルにおいてレプチン投与により食物摂取量および体重が低下し、肥満関連代謝および内分泌欠損が是正される。レプチンは、したがって、肥満の治療の候補である。しかし、肥満のヒトは、レプチン抵抗性であることを特徴としていることが多く、このため、今までのところ、レプチンの抗肥満剤としての使用が制限されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】US6025324
【特許文献２】US6025325
【特許文献３】WO11015649
【特許文献４】WO2007/009894
【特許文献５】WO2009083549
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、それ自体が改善されたin vivo効力を有するレプチン誘導体および/またはさらなる抗肥満剤との併用療法においてヒトレプチンより投与の頻度を下げることができるレプチン誘導体が肥満を治療するために望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって、式中、
Zは12〜22個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基であり;
Yは、結合、
【０００６】
【化１】
2014505060.tif 000002
【０００７】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)からなる群から選択されるスペーサーであり;Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【０００８】
【化２】
2014505060.tif 000003
【０００９】
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である
化合物;
またはその医薬的塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００１０】
一態様においてYは、結合、
【００１１】
【化３】
2014505060.tif 000004
【００１２】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
および
【００１３】
【化４】
2014505060.tif 000005
【００１４】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2または3である)からなる群から選択されるスペーサーである。
【００１５】
Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【００１６】
【化５】
2014505060.tif 000006
【００１７】
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である。
【００１８】
一態様において、本発明は、本明細書において定義する化合物と、1種または複数の医薬賦形剤と、場合により1種または複数のさらなる抗肥満剤および/または抗糖尿病剤、例えば、プラムリンチドなどとを含む組成物に関する。
【００１９】
一態様において、本発明は、医学において使用するための本明細書において定義する化合物に関する。一態様において、本発明は、肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２０】
一態様において、本発明は、2型糖尿病の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２１】
一態様において、本発明は、2型糖尿病に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２２】
一態様において、本発明は、2型糖尿病に関連した合併症および症状、例えば、インスリン抵抗性、高血糖、高トリグリセリド血症および/または肝脂肪症などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２３】
一態様において、本発明は1型糖尿病の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２４】
一態様において、本発明は1型糖尿病に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２５】
一態様において、本発明は1型糖尿病に関連した合併症および症状、例えば、高血糖などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２６】
一態様において、本発明は、先天性レプチン欠乏の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２７】
一態様において、本発明は、先天性レプチン欠乏に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２８】
一態様において、本発明は、全身のレプチンのレベルを不十分にする遺伝子変異が原因の先天性レプチン欠乏に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００２９】
一態様において、本発明は、先天性脂肪組織萎縮症および/または脂肪異栄養症の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３０】
一態様において、本発明は、先天性脂肪組織萎縮症および/または脂肪異栄養症に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３１】
一態様において、本発明は、脂肪組織低減または全身のレプチンのレベルの低さから生じる先天性脂肪組織萎縮症および/または脂肪異栄養症に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３２】
一態様において、本発明は、先天性脂肪組織萎縮症および/または脂肪異栄養症に関連した合併症および症状、例えば、インスリン抵抗性、高血糖、高トリグリセリド血症および/または肝脂肪症などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３３】
一態様において、本発明は、HIV関連脂肪異栄養症の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３４】
一態様において、本発明は、HIV関連脂肪異栄養症に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３５】
一態様において、本発明は、レプチン欠乏(diffficiencie)が原因のHIV関連脂肪異栄養症に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３６】
一態様において、本発明は、HIV関連脂肪異栄養症に関連した合併症および症状、例えば、インスリン抵抗性、代謝症候群、高脂血症(hyperlipedemia)および/または腹部肥満などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３７】
一態様において、本発明は、一般的肥満および/または減量維持(食事療法に関連するヨーヨー効果の予防)の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３８】
一態様において、本発明は、レプチン抵抗性が合併症または症状である一般的肥満の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００３９】
一態様において、本発明は、一般的肥満に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４０】
一態様において、本発明は、月経周期の停止および/または不規則性ならびにそれらの副作用、例えば、無月経症(原発性および続発性)などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４１】
一態様において、本発明は、無月経症(原発性および続発性)に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４２】
一態様において、本発明は、無月経症(原発性および続発性)に関連した合併症および症状、例えば、月経周期の停止および/または不規則性などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４３】
一態様において、本発明は、不規則な月経サイクル、例えば、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)における不規則な月経サイクルなどの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４４】
一態様において、本発明は、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４５】
一態様において、本発明は、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４６】
一態様において、本発明は、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)に関連した合併症および症状、例えば、不規則な月経サイクルなどの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４７】
一態様において、本発明は、骨質量の損失、例えば、骨粗鬆症などにおける骨質量の損失の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４８】
一態様において、本発明は、骨粗鬆症の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００４９】
一態様において、本発明は、骨粗鬆症に関連した合併症および症状の治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００５０】
一態様において、本発明は、骨粗鬆症に関連した合併症および症状、例えば、骨質量の損失および/または骨の脆弱性などの治療のための本明細書に記載の化合物に関する。
【００５１】
一態様において、本発明は、肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療用の薬剤の調製のための本明細書において定義する化合物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】レプチン感受性が高いob/obマウスにおける、実施例2および3に記載のレプチン誘導体(化合物AおよびB)の単回注射後の、未修飾ヒト/ラットレプチンと比較した体重低減に対する6日後の効果、平均±SEM、n=6〜7を示す図である。
【図２】レプチン感受性が高いob/obマウスにおける、実施例5および6に記載のレプチン誘導体(化合物CおよびD)の単回注射後の、未修飾ヒト/ラットレプチンと比較した体重低減に対する6日後の効果、平均±SEM、n=6〜7を示す図である。
【図３】レプチン感受性が高いob/obマウスにおける、実施例2および3に記載のレプチン誘導体(化合物AおよびB)の単回注射後の、未修飾ヒト/ラットレプチンと比較した血糖に対する効果を示す図である。
【図４】レプチン感受性が高いob/obマウスにおける、実施例5および6に記載のレプチン誘導体(化合物CおよびD)の単回注射後の、未修飾ヒト/ラットレプチンと比較した血糖に対する効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
一態様において、本発明は、一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって;Zは、アシル基であり;Yは、本明細書において定義するスペーサーであり;Xは、本明細書において定義する結合基である化合物に関する。
【００５４】
一態様において、本発明は、一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって、式中、
Zは12〜22個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基であり;
Yは、結合、
【００５５】
【化６】
2014505060.tif 000007
【００５６】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)からなる群から選択されるスペーサーであり;
Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【００５７】
【化７】
2014505060.tif 000008
【００５８】
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である
化合物;
またはその医薬的塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００５９】
一態様においてYは、結合、
【００６０】
【化８】
2014505060.tif 000009
【００６１】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
および
【００６２】
【化９】
2014505060.tif 000010
【００６３】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2または3である)からなる群から選択されるスペーサーであり;
Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【００６４】
【化１０】
2014505060.tif 000011
【００６５】
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である
化合物;
またはその医薬的塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００６６】
一態様において、本発明は、一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって、式中、
Zは16〜18個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基であり;
Yは、結合、
【００６７】
【化１１】
2014505060.tif 000012
【００６８】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)からなる群から選択されるスペーサーであり;
Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【００６９】
【化１２】
2014505060.tif 000013
【００７０】
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である
化合物;
またはその医薬的塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００７１】
一態様においてYは、結合、
【００７２】
【化１３】
2014505060.tif 000014
【００７３】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
および
【００７４】
【化１４】
2014505060.tif 000015
【００７５】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2または3である)からなる群から選択されるスペーサーであり;Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【００７６】
【化１５】
2014505060.tif 000016
【００７７】
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である
化合物;
またはその医薬的塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００７８】
一態様において、前記Z-Y-X-部分は、レプチン化合物中に存在するアミノ酸残基内に存在するアミノ基に、またはレプチン化合物中のN末端アルファ-アミノ基に連結している。一態様において、水素は、前記アミノ基から除去されている。
【００７９】
一態様において、前記Z-Y-X部分のX部分は、アルキル化化学作用によりレプチン化合物に結合している。
【００８０】
一実施形態において、前記Z-Y-X-レプチン化合物の前記Z-Y-X部分は、アルキル化化学作用によりレプチン化合物に結合している。
【００８１】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、wtレプチンのレプチンを提供する。
【００８２】
一態様において、本発明は、wtレプチン類似体のレプチンを提供する。一態様において、本明細書において定義する化合物は、wtレプチンのN末端に選択的に結合しているZ-Y-X部分を含むレプチン誘導体を提供する。
【００８３】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、wtラットレプチンのN末端に選択的に結合しているZ-Y-X部分を含むラットレプチン誘導体を提供する。
【００８４】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、wtヒトレプチンのN末端に選択的に結合しているZ-Y-X部分を含むヒトレプチン誘導体を提供する。
【００８５】
一態様において、前記Z-Y-X部分のX部分は、アルキル化化学作用によりMet-ヒトレプチンに結合している。
【００８６】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、レプチンのレプチン誘導体を提供する。
【００８７】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、レプチンのレプチン誘導体を提供し、N末端において選択的にアルキル化されている。
【００８８】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、ヒトレプチン(配列番号1)のレプチン誘導体を提供する。
【００８９】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、ヒトレプチン(配列番号1)のレプチン誘導体を提供し、N末端において選択的にアルキル化されている。
【００９０】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、ラットレプチン(配列番号2)のレプチン誘導体を提供する。
【００９１】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、ラットレプチン(配列番号2)のレプチン誘導体を提供し、N末端において選択的にアルキル化されている。
【００９２】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、Met-ヒトレプチン(配列番号3)のレプチン誘導体を提供する。
【００９３】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、Met-ヒトレプチン(配列番号3)のレプチン誘導体を提供し、N末端において選択的にアルキル化されている。
【００９４】
一態様において、本明細書において定義する化合物は、生物活性であるレプチン誘導体を提供する。
【００９５】
一態様において、前記レプチン化合物は、レプチンの類似体、例えば、ラットまたはヒトレプチンの類似体などである。一態様において、前記レプチン化合物は、ヒトレプチンに対して90%、例えば、95%または98%などの配列同一性を有する。
【００９６】
一態様において、該レプチン化合物は、哺乳動物、例えば、ヒト、ブタ、ラットもしくはマウスなど、またはヒトもしくはラットなどに由来する。一態様において、該レプチン化合物は、VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILT-LSKMD-QTLAVYQQILT SMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP-WASGLETLDSLGGVLEAS-GYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(配列番号1)により定義されるヒトレプチンである。「ヒトレプチン」および「hレプチン」という用語は、配列番号1を記述するために本明細書において互換的に使用する。一態様において、該レプチン化合物は、AVPIHKVQDDTKTLIK TIVTRINDISHTQSVSARQRVT-GLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQILTSLP-SQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQ-TRGLQKPESLD GVLEASLYS-TEVVALSRLQGSLQDILQQLDL SPEC(配列番号2)により定義されるラットレプチンである。「ラットレプチン」および「rレプチン」という用語は、配列番号2を記述するために本明細書において互換的に使用する。
【００９７】
「Met-ヒトレプチン」および「Met-hレプチン」という用語は、配列番号3を記述するために本明細書において互換的に使用する。一態様において、該レプチン化合物は、MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD-QTLAVYQQILT SMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEAS-GYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(配列番号3)により定義されるMet-ヒトレプチンである。
【００９８】
「レプチン」という用語は、本明細書において使用する場合、異なる指示がなければ、哺乳類レプチンの野生のタイプ(wt)の変種を指す。「wt」もしくは「天然の」レプチンまたは「wtのレプチン」という用語は、本明細書において使用する場合、哺乳類レプチンの変種であるwt(野生のタイプ)ペプチド、または化合物を指す。配列リストに含まれている配列番号1は、ラット「wtレプチン」の一例であり、「ラットレプチン」と示すことができ、配列リストに含まれている配列番号2は、ヒト「wtレプチン」の一例であり、「ヒトレプチン」と示すことができる。配列番号1の配列を有するペプチドは、「天然の」ラットレプチンまたは「天然の」rレプチンと示すこともできる。配列番号2の配列を有するペプチドは、「天然の」もしくは「wt」ヒトレプチンまたは「天然の」もしくは「wt」hレプチンと示すこともできる。
【００９９】
「レプチン化合物」という用語は、本明細書において使用する場合、哺乳類レプチンまたはMet-ヒトレプチンを指し、したがって、本明細書において定義するレプチンおよびレプチン類似体のwt変種を含む。「本明細書において定義する化合物」または「本明細書に記載の化合物」という用語は、本明細書において使用する場合、発明を実施するための形態および/または特許請求の範囲において定義する「レプチン誘導体」および/または修飾された「レプチン化合物」を示す。
【０１００】
一態様において、該レプチン化合物は、レプチンの類似体、例えば、ラットまたはヒトレプチンの類似体などである。一態様において、ペプチドの「類似体」という用語は1つまたは複数のアミノ酸残基が置換、削除または挿入されている前記ペプチドを意味することを意図したものである。一態様において「アミノ酸残基」という用語は、形式上、そのカルボキシ基からヒドロキシ基が除去されている、および/または形式上、そのアミノ基から水素原子が除去されている前記アミノ酸を意味することを意図したものである。
【０１０１】
「レプチン類似体」という用語は、本明細書において使用する場合、wtレプチンの1つまたは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、ならびに/あるいは1つまたは複数のアミノ酸残基がレプチンから削除されている、ならびに/あるいは1つまたは複数のアミノ酸残基がレプチンに付加および/または挿入されている修飾されたヒトレプチンを意味する。
【０１０２】
本明細書において、「アルファ-ala-rレプチン」および「アルファ-rレプチン」という用語は、置換がN末端アミノ基で発生していることを記述するために本明細書において互換的に使用する。
【０１０３】
本明細書において、「アルファ-ala-rレプチン」および「アルファ-rレプチン」という用語は、置換がアラニンのN末端アルファ-アミノ基で発生していることを記述するために本明細書において互換的に使用する。
【０１０４】
一態様において、該レプチン化合物は、ヒトレプチンに対して90%、例えば、95%または98%などの配列同一性を有する。一態様において「配列同一性」は、ペプチド全体にわたって決定し、2つのペプチド類似体を整列させ、整列した同一の残基の数から異なる残基の数を引いた数を第1の類似体中の残基の総数で除算することにより第1の類似体の第2の類似体に対する配列同一性を得る。したがって、ペプチドAAEAAのペプチドAAAAAに対する配列同一性は、(5-1)/5である。
【０１０５】
一態様において、レプチン類似体は、ヒトレプチンに対して10未満のアミノ酸修飾(置換、欠失、(挿入を含めた)付加および任意のそれらの組合せ)、あるいはヒトレプチンに対して9、8、7、6、5、4、3、2または1未満の修飾を含む。
【０１０６】
「レプチン誘導体」または「延長型レプチン」という用語は、本明細書において使用する場合、化学的に修飾されたレプチン化合物またはレプチン類似体を意味し、その修飾は、側鎖の結合の形態である。本発明の側鎖としては、発明を実施するための形態において定義するZ-Y-X部分が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０７】
「Z-Y-Xレプチン化合物」という用語は、本明細書において使用する場合、「レプチン誘導体」という用語により示すこともでき、したがって、「レプチン誘導体」という用語の定義を含む。
【０１０８】
「Met-ヒトレプチン」または「Met-hレプチン」という用語は、本明細書において使用する場合、N末端においてメチオニンアミノ酸を含むヒトレプチン類似体を指す。これは、E.Coliにおける発現により得られるMet-ヒトレプチンを含む。配列番号3の配列を有するペプチドは、そのようなMet-ヒトレプチンの一例であり、「Met-ヒトレプチン」または「Met-hレプチン」と示すこともできる。
【０１０９】
一態様において、Z-Y-X-部分は、アミノ基に連結しており、これは、N末端アミノ基であるか、またはレプチン化合物中に存在するアミノ酸残基内に存在する。
【０１１０】
一態様において、Zは12〜22個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基である。一態様において、Zは、アシル基を含む。一態様において、Zは、アシル基である。一態様において、Zは12〜22個の炭素原子を含む。一態様において、Zは、末端カルボン酸基を含む。一態様において、Zは、末端テトラゾール基を含む。一態様において、Zは、脂肪酸または脂肪族二酸を含む。一態様において、Zは、脂肪酸または脂肪族二酸である。一態様において、Zは、アルファおよびオメガカルボキシ基を含む。一態様において、Zは12〜22個の炭素原子、例えば、16、18または20個の炭素原子などを有する脂肪酸または脂肪族二酸である。一態様において、Zは、
【０１１１】
【化１６】
2014505060.tif 000017
【０１１２】
である。
【０１１３】
一態様においてYは、結合、
【０１１４】
【化１７】
2014505060.tif 000018
【０１１５】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)からなる群から選択されるスペーサーである。
【０１１６】
一態様においてYは、結合、
【０１１７】
【化１８】
2014505060.tif 000019
【０１１８】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
および
【０１１９】
【化１９】
2014505060.tif 000020
【０１２０】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2または3である)からなる群から選択されるスペーサーである。
【０１２１】
一態様においてYは、結合である。
【０１２２】
一態様においてYは、
【０１２３】
【化２０】
2014505060.tif 000021
【０１２４】
である。
【０１２５】
一態様においてYは、
【０１２６】
【化２１】
2014505060.tif 000022
【０１２７】
である。
【０１２８】
一態様においてYは、
【０１２９】
【化２２】
2014505060.tif 000023
【０１３０】
である。
【０１３１】
一態様においてYは、
【０１３２】
【化２３】
2014505060.tif 000024
【０１３３】
である。
【０１３４】
一態様においてYは、
【０１３５】
【化２４】
2014505060.tif 000025
【０１３６】
である。
【０１３７】
一態様においてYは、
【０１３８】
【化２５】
2014505060.tif 000026
【０１３９】
である。
【０１４０】
一態様においてYは、
【０１４１】
【化２６】
2014505060.tif 000027
【０１４２】
である。
【０１４３】
一態様において、mは0、1、2、3、4、5または6である。一態様において、nは1、2または3である。一態様において、sは0、1、2または3である。一態様において、pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり; rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である。
【０１４４】
一態様において、mは0、1、2、3、4、5または6である。一態様において、nは1、2または3である。一態様において、sは0、1、2または3である。一態様において、pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり; rは1、2または3である。一態様において、mは0、1または2であり、rは1または2であり、pは1であり、nは1である。
【０１４５】
一態様において、mは0または1であり;rは1または2であり; pは、1であり;nは0または1である。
【０１４６】
一態様において、mは0または2であり;rは1または2であり; pは、1であり;nは0または1である。
【０１４７】
一態様において、mは0または1であり;rは、1であり; pは、1であり;nは0または1である。
【０１４８】
一態様において、mは0または2であり;rは、2であり; pは、1であり;nは、1である。
【０１４９】
一態様において、mは、1であり;nは、1であり; sは1または2である。
【０１５０】
一態様において、mは0または1であり;nは0または1であり; sは、1である。
【０１５１】
一態様において、mは0または1であり;nは0または1であり;sは、2である。
【０１５２】
Yは、結合、
【０１５３】
【化２７】
2014505060.tif 000028
【０１５４】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
および
【０１５５】
【化２８】
2014505060.tif 000029
【０１５６】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2または3である)からなる群から選択されるスペーサーである。
【０１５７】
一態様においてXは、
【０１５８】
【化２９】
2014505060.tif 000030
【０１５９】
である。
【０１６０】
一態様において、これらの式において、「→」は、第1の部分から第2の部分、例えば、YからXなどへの結合を示し、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示し、すなわち、Xを表す式については、「*」は、Xのレプチン化合物への結合点を示し、「*"」は、XのYへの結合点を示す。
【０１６１】
一態様において、Xは、遊離している、またはアセタールの脱保護により形成されるアルデヒドから生成されるレプチン化合物に対する結合アンカー、例えば、
【０１６２】
【化３０】
2014505060.tif 000031
【０１６３】
などである。
【０１６４】
一態様において、Zのα-カルボニル端は、アミド結合を介してYのアミノ端に連結し、Yのカルボニル端は、アミド結合を介してXのアミノ端に連結している。一態様において、Zのα-カルボニル端は、アミド結合を介してXのアミノ端に連結している。
【０１６５】
一態様において、Z-Y-X-部分は、
【０１６６】
【化３１】
2014505060.tif 000032
【０１６７】
である。
【０１６８】
一態様において、Z-Y-X-部分の化合物は、
【０１６９】
【化３２】
2014505060.tif 000033
【０１７０】
である。
【０１７１】
一態様において、本発明の化合物は、Z-Y-X-部分の全ての立体異性体を含む。
【０１７２】
本発明の化合物は、
【０１７３】
【化３３】
2014505060.tif 000034
【０１７４】
(化合物A)である。
【０１７５】
本発明の化合物は、
【０１７６】
【化３４】
2014505060.tif 000035
【０１７７】
(化合物B)である。
【０１７８】
本発明の化合物は、
【０１７９】
【化３５】
2014505060.tif 000036
【０１８０】
(化合物C)である。
【０１８１】
本発明の化合物は、
【０１８２】
【化３６】
2014505060.tif 000037
【０１８３】
(化合物D)である。
【０１８４】
調製法
本発明のレプチン化合物(すなわち、wtまたは天然のレプチン)は、それ自体が知られている様式で調製することができる。ラットおよびヒトレプチンは市販されている(RayBiotech、Inc.、Norcross、GA、USA)。Met-ヒトレプチンは、以下に記載の通り作成した。別の戦略は、レプチン化合物を最初に調製するものとすることができる。該レプチン化合物は、当業者に知られている方法を使用して発現させることができる(例えばUS6025324およびUS6025325を参照されたい)。Z-Y-X-部分は、当業者に知られている方法、例えば、欧州特許WO11015649に記載されているものなどを使用して作製することができる。そのような方法の非限定的な例は、WO2011/015649の76頁に記載されている。
【０１８５】
薬理学的効果
一態様において、本発明は、医学において使用するための本明細書において定義する化合物の使用に関する。一態様において、本発明は、肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療のための本明細書において定義する化合物の使用に関する。一態様において、本発明は、肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療用の薬剤の調製のための本明細書において定義する化合物の使用に関する。一態様において、本発明は、本明細書において定義する化合物をそれを必要としている患者に投与する肥満または糖尿病の治療の方法に関する。
【０１８６】
レプチンは、重要な生殖のホルモンによる制御である。一態様において、本発明は、思春期遅発症、無月経症または多嚢胞性卵巣症候群の治療のための本明細書において定義する化合物の使用に関する。
【０１８７】
本発明の化合物の薬理学的効果は、特にそれらが長期の作用を有するので、肥満の治療に有益である。一態様において、本発明は、本明細書において定義する化合物の使用に関し、前記化合物を1日1回以下、例えば、週に1回の頻度などでそれを必要としている対象に投与する。
【０１８８】
一態様において、本発明の化合物は、食物摂取量に対する十分な効果を有するはずである。食物摂取量に対する効果は、本明細書においてアッセイ(I)に記載する方法により求めることができる。
【０１８９】
一態様において、本発明の化合物は、体重に対する十分な効果を有するはずである。体重に対する効果は、本明細書においてアッセイ(I)に記載する方法により求めることができる。
【０１９０】
本発明の化合物を含有する医薬製剤は、例えば、食物摂取量の低減および体重の低減に使用することができる。それ故、本発明の化合物を用いた薬理学的治療は、肥満の治療または予防に適し得る。
【０１９１】
医薬組成物
一態様において、本発明は、本明細書において定義する化合物と1種または複数の医薬賦形剤とを含む組成物に関する。一態様において、前記組成物は1種または複数のさらなる抗肥満剤および/または抗糖尿病剤と、場合により1種または複数の医薬賦形剤とをさらに含む。一態様において、前記抗肥満剤および/または抗糖尿病剤のうちの1つは、プラムリンチドである。
【０１９２】
一態様において、本発明は、本明細書において定義する化合物と1種または複数の医薬賦形剤とを含む組成物に関する。
【０１９３】
本発明の一態様において、治療有効量の本発明の化合物を、そのような治療の利益を享受するであろう対象(例えば、患者または動物)に投与する。治療は、例えば、肥満とすることができる。本発明の化合物の投与のための投薬量の範囲は、所望の効果を得るのに十分広いものである。
【０１９４】
一態様において、本発明は、本発明の化合物を患者への投与用の単位剤形中に提供する。本明細書において使用する場合、「単位剤形」は、疾患または医学的状態に苦しむ対象を治療するための単回投与を意図した組成物を指す。各単位剤形は、一般に、本発明の化合物と薬学的に許容される賦形剤の各々を含む。単位剤形の例は、個々の錠剤、個々のカプセル剤、混合散剤、溶液剤、坐剤、乳剤または懸濁剤である。疾患または状態の治療は、単位剤形の周期的投与、例えば:1つの単位剤形を1日に2回以上、食事毎に1つ、4時間毎に1つもしくは他の間隔、または1日1つだけを必要とし得る。注射用の製剤は、単位剤形中に、例えば、アンプル中にまたは多回用量容器中に含めることができる。
【０１９５】
本発明の単位剤形は、治療上有効用量の本発明の化合物を含有する。一態様において、単位剤形の投与により、哺乳動物における本発明の化合物のレベルが適当となる。
【０１９６】
具体的な用量は、具体的な本発明の化合物の分子構造および化学的性質次第であるが、薬理学の当業者は、慣用的な技術を使用して適切な用量を求めることができることを本開示から理解しよう。例えば、哺乳動物において好ましくない副作用を有さないかまたは最低限誘発するだけの本発明の化合物の用量または製剤は、様々な方法で求めることができる。この文脈において使用する場合、「増大したレベル」は、所定のレベル(例えば、副作用の指定の閾値レベル)への増大を指すことができる。そのような決定を行う方法の1つは、(a)本発明の化合物の複数の異なる用量(または製剤)を試験哺乳動物に投与することと;(b)各用量または製剤の効果を測定し、副作用に対する各用量の効果を測定し、それにより所望の効果および副作用に関する用量反応データを作製することと;(ii)用量反応データから、所望の効果をもたらすが副作用を誘発しない本発明の化合物製剤の用量を求めることにより用量反応アッセイを実行することとを伴う。
【０１９７】
本発明の化合物の所望のレベルまたは濃度を達成するために動物に投与する本発明の化合物の量は、実務家によく知られている多数の因子、例えば、化合物半減期(例えば、血清半減期)、ならびに投与頻度およびモードなど次第である。その他の範囲の本発明の化合物は、最初の用量反応曲線からのデータおよび慣用的な方法により得ることができるその他のデータから当業者に明らかとなろう。
【０１９８】
本発明は1種または複数の薬学的に許容される賦形剤と合わせて本発明の化合物を含有する組成物も提供する。
【０１９９】
一態様において、該組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝液またはNa2HPO4などを含む。
【０２００】
一態様において、該組成物は、グリセロールを含む。
【０２０１】
一態様において、該組成物は、等張剤、例えば、NaClなどを含む。
【０２０２】
一態様において、該組成物のpHは、pH3〜10の範囲、例えば、pH7.5などである。
【０２０３】
一態様において、該組成物は、Na2HPO4、グリセロールおよびNaClを含む。一態様において、該組成物は15mMのNa2HPO4、7.5%(v/v)のグリセロール、125mMのNaCl、pH7.5を含む。
【０２０４】
本発明の化合物は、治療される対象に直接投与することができる。投与は、場合により無菌条件下で行う。しかし、本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、医薬製剤として提示することが好ましいことが多い。製剤は、一般に、少なくとも1種の活性成分とそれらの1種または複数の許容される担体とを共に含む。各担体は、他の成分と相溶性であり対象に有害ではないという意味で医薬としても生理学的にも許容されるべきである。治療用製剤は、薬学の分野においてよく知られている任意の方法により調製することができる。
【０２０５】
本発明の化合物は、非経口(例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ICV、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、または移植)により、吸入スプレー、経鼻、腟内、直腸、舌下、または局所投与の経路により投与することができ、単独で、または、各投与の経路に適切な従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する適切な投薬単位製剤中に一緒に製剤化してもよい。投与は、非経口(例えば、静脈内)であることが多い。
【０２０６】
所望であれば(例えば、特定の血漿中濃度を維持するために)、本発明の化合物は、制御送達製剤の形態で患者に投与することができる。様々な適切な制御送達系が知られており、これには、非経口、および他の投与の経路に適した形態が含まれる。薬物送達系の製造において採用される賦形剤は、当業者に知られている様々な刊行物に記載されている。この刊行物は、延長放出および遅延放出錠剤およびカプセル剤の薬物放出能力を決定するための総論および具体的な試験も提示する。本発明の一態様において、本発明の化合物は、対象における運動が媒介するトリグリセリドの分解を強化するための運動のプログラムと併せて投与する。
【０２０７】
医薬組成物は、滅菌注射用の水性または油性(oleagenous)の懸濁液の形態とすることができる。この懸濁液は、知られている技術に従ってそれらの適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液とすることもできる。許容されるビヒクルおよび溶媒の中で採用することができるのは、水、リンゲル液および等張食塩液である。しかし、任意の特定の患者の具体的な用量レベルおよび投薬の頻度は多様であってもよく、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与のモードおよび時間、排出の速度、薬物の組合せ、ならびに特定の状態の重症度を含めた様々な因子次第であることが理解されよう。一部の実施形態において、本発明の化合物の毎日または週単位の投与を意図している。
【０２０８】
本明細書において、本発明のアシル化誘導体が「長期の作用」を有するという表現は、それらのT1/2が、対応する非誘導体化レプチンのT1/2より少なくとも50%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも500%長いことを意味する。
【０２０９】
本明細書において、本発明のアルキル化誘導体が「長期の作用」を有するという表現は、それらのT1/2が、対応する非誘導体化レプチンのT1/2より少なくとも50%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも500%長いことを意味する。
【０２１０】
本明細書において、本発明のアルキル化誘導体が「長期の効果」を有するという表現は、それらの薬力学的効果が対応する非誘導体化レプチンに対して増大したことを意味する。一態様において、増大とは、対応する非誘導体化レプチンの薬力学効果より少なくとも50%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも500%長いことである。
【０２１１】
本明細書において、「薬力学的効果」という表現は、身体に対する生化学的および生理学的効果である。一実施形態において、「薬力学的効果」は、体重、食物摂取量または血糖に対するレプチンの阻害効果を指す。
【０２１２】
本明細書において、「治療有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医により探求される、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発するように算出された試剤の所定の量、例えば、所望の治療効果を達成するために疾患または任意の他の望ましくない症状の進行を刺激、予防、妨害、遅延または反転するのに十分な量を指す。
【０２１３】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、投与時に有害な物理的反応を引き起こさない担体、および治療有効量を送達するのに治療剤が十分に溶解することができるものを指す。賦形剤の例としては、緩衝用水、生理学的食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、デキストロース溶液、ハンクス溶液および不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【０２１４】
本明細書において、「哺乳動物」は、その通常の意味を有し、霊長類(例えば、ヒトおよびヒト以外の霊長類)、実験動物(例えば、齧歯類、例えば、マウスおよびラットなど)、家畜(例えば、カウ、ブタ、ヒツジおよびウマなど)、および家畜(例えば、イヌおよびネコなど)を含む。
【０２１５】
本明細書において、哺乳動物における状態および/または疾患の「治療(treatment)」または「治療すること(treating)」という用語は、(i)状態または疾患を予防すること、すなわち、疾患の任意の臨床症状を回避すること;(ii)状態または疾患を阻害すること、すなわち、臨床症状の発現または進行を阻止すること;および/または(iii)状態または疾患を軽減すること、すなわち、臨床症状の退行を引き起こすことを意味する。
【０２１６】
本発明の実施形態
1.一般式Z-Y-X-レプチン化合物の化合物であって、式中、
Zは12〜22個の炭素原子を含有しC末端カルボン酸またはC末端テトラゾール基を含むアシル基であり;
Yは、結合、
【０２１７】
【化３７】
2014505060.tif 000038
【０２１８】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)
からなる群から選択されるスペーサーであり;
Xは、レプチン化合物に対する結合アンカーであり、
【０２１９】
【化３８】
2014505060.tif 000039
【０２２０】
または
(式中、「*」は、レプチン化合物の方向を向いている部分の箇所を示し、「*"」は、Zの方向を向いている部分の箇所を示す)である化合物;またはその医薬的塩、アミドもしくはエステル。
【０２２１】
2.Yが、結合、
【０２２２】
【化３９】
2014505060.tif 000040
【０２２３】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である)および
【０２２４】
【化４０】
2014505060.tif 000041
【０２２５】
(式中、mは0、1、2、3、4、5または6であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23であり;rは1、2または3である)
からなる群から選択されるスペーサーである、実施形態1に記載の化合物。
【０２２６】
3.Yが、結合、
【０２２７】
【化４１】
2014505060.tif 000042
【０２２８】
【化４２】
2014505060.tif 000043
【０２２９】
(式中、mは0、1または2であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3または4であり;rは1、2または3である)および
【０２３０】
【化４３】
2014505060.tif 000044
【０２３１】
(式中、mは0、1、2または3であり;nは1、2または3であり;sは0、1、2または3であり;pは1、2、3または4であり;rは1、2または3である)
からなる群から選択されるスペーサーである、実施形態1に記載の化合物。
【０２３２】
4.Z-Y-X-部分が、レプチン化合物中に存在するアミノ酸残基内に存在するアミノ基に、またはレプチン化合物中のN末端アルファ-アミノ基に連結している、実施形態1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【０２３３】
5.水素が前記アミノ基から除去されている、実施形態1に記載の化合物。
【０２３４】
6.前記レプチン化合物が、レプチンの類似体、例えば、ラットまたはヒトレプチンの類似体などである、実施形態1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【０２３５】
7.前記レプチン化合物が、ヒトレプチンに対して90%、例えば、95%または98%などの配列同一性を有する、実施形態1から6のいずれか一項に記載の化合物。
【０２３６】
8.Zがアシル基を含む、実施形態1から7のいずれか一項に記載の化合物。
【０２３７】
9.Zが脂肪酸または脂肪族二酸を含む、実施形態1から8のいずれか一項に記載の化合物。
【０２３８】
10.Zがアルファおよびオメガカルボキシ基を含む、実施形態1から9のいずれか一項に記載の化合物。
【０２３９】
11.Zが末端カルボン酸基を含む、実施形態1から10のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４０】
12.Zが末端テトラゾール基を含む、実施形態1から11のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４１】
13.Zが12〜22個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、実施形態1から12のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４２】
14.Zが16〜18個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、実施形態1から13のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４３】
15.Zが16個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、実施形態1から14のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４４】
16.Zが18個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、実施形態1から15のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４５】
17.Zが20個の炭素原子を有する脂肪酸または脂肪族二酸を含む、実施形態1から16のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４６】
18.Zが、
【０２４７】
【化４４】
2014505060.tif 000045
【０２４８】
である、実施形態1から17のいずれか一項に記載の化合物。
【０２４９】
19.Yが結合である、実施形態1から18のいずれか一項に記載の化合物。
【０２５０】
20.Yが、
【０２５１】
【化４５】
2014505060.tif 000046
【０２５２】
である、実施形態1から19のいずれか一項に記載の化合物。
【０２５３】
21.Yが、
【０２５４】
【化４６】
2014505060.tif 000047
【０２５５】
である、実施形態1から20のいずれか一項に記載の化合物。
【０２５６】
22.Yが、
【０２５７】
【化４７】
2014505060.tif 000048
【０２５８】
である、実施形態1から21のいずれか一項に記載の化合物。
【０２５９】
23.Yが、
【０２６０】
【化４８】
2014505060.tif 000049
【０２６１】
である、実施形態1から22のいずれか一項に記載の化合物。
【０２６２】
24.Yが、
【０２６３】
【化４９】
2014505060.tif 000050
【０２６４】
である、実施形態1から23のいずれか一項に記載の化合物。
【０２６５】
25.Yが、
【０２６６】
【化５０】
2014505060.tif 000051
【０２６７】
である、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
【０２６８】
26.Yが、
【０２６９】
【化５１】
2014505060.tif 000052
【０２７０】
である、実施形態1から25のいずれか一項に記載の化合物。
【０２７１】
27.Yが、
【０２７２】
【化５２】
2014505060.tif 000053
【０２７３】
である、実施形態1から26のいずれか一項に記載の化合物。
【０２７４】
一態様において、mは1または2であり、rは1または2であり、pは1であり、nは1である。
【０２７５】
28.Yが、
【０２７６】
【化５３】
2014505060.tif 000054
【０２７７】
である、実施形態1から27のいずれか一項に記載の化合物。
【０２７８】
29.Yが、
【０２７９】
【化５４】
2014505060.tif 000055
【０２８０】
(式中、rは1であり、sは1であり、nは1である)である、実施形態1から28のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８１】
30.mが0、1、2、3、4、5または6である、実施形態1から29のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８２】
31.nが1、2または3である、実施形態1から30のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８３】
32.sが0、1、2または3である、実施形態1から31のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８４】
33.rが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である、実施形態1から32のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８５】
34.rが0、1、2または3である、実施形態1から33のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８６】
35.pが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23である、実施形態1から34のいずれか一項に記載の化合物。
【０２８７】
36.Xが、
【０２８８】
【化５５】
2014505060.tif 000056
【０２８９】
である、実施形態1から35のいずれか一項に記載の化合物。
【０２９０】
37.Xが、
【０２９１】
【化５６】
2014505060.tif 000057
【０２９２】
である、実施形態1から36のいずれか一項に記載の化合物。
【０２９３】
38.Xが、
【０２９４】
【化５７】
2014505060.tif 000058
【０２９５】
である、実施形態1から37のいずれか一項に記載の化合物。
【０２９６】
39.化合物A:
【０２９７】
【化５８】
2014505060.tif 000059
【０２９８】
である実施形態1から38のいずれか一項に記載の化合物。
【０２９９】
40.化合物B:
【０３００】
【化５９】
2014505060.tif 000060
【０３０１】
である実施形態1から39のいずれか一項に記載の化合物。
【０３０２】
41.化合物C:
【０３０３】
【化６０】
2014505060.tif 000061
【０３０４】
である実施形態1か40のいずれか一項に記載の化合物。
【０３０５】
42.化合物D:
【０３０６】
【化６１】
2014505060.tif 000062
【０３０７】
である実施形態1から41のいずれか一項に記載の化合物。
【０３０８】
43.医学において使用するための実施形態1から42のいずれか一項に記載の化合物。
【０３０９】
44.肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療のための実施形態1から43のいずれか一項に記載の化合物。
【０３１０】
45.前記抗肥満剤および/または抗糖尿病剤のうちの1つがプラムリンチドである、実施形態36に記載の組成物。
【０３１１】
46.思春期遅発症、無月経症または多嚢胞性卵巣症候群の治療のための実施形態1から45のいずれか一項に記載の化合物。
【０３１２】
47.1日1回以下、例えば、週に1回の頻度などでそれを必要としている対象に投与される実施形態41〜46のいずれか一項に記載の化合物。
【０３１３】
48.実施形態1から47のいずれか一項に記載の化合物と1種または複数の医薬賦形剤とを含む組成物。
【０３１４】
49.肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療用の薬剤の調製のための実施形態1から48のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【０３１５】
50.思春期遅発症、無月経症または多嚢胞性卵巣症候群の治療用の薬剤の調製のための実施形態1から49のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【０３１６】
51.肥満、糖尿病または脂肪異栄養症の治療の方法であって、実施形態1から50のいずれか一項に記載の化合物を、それを必要としている患者に投与する方法。
【０３１７】
52.思春期遅発症、無月経症または多嚢胞性卵巣症候群の治療の方法であって、実施形態1から51のいずれか一項に記載の化合物を、それを必要としている患者に投与する方法。
【０３１８】
(実施例)
略語
Boc=tertブチルオキシカルボニル
CHCl3=クロロホルム
CaCl2=塩化カルシウム
CH3CN=アセトニトリル
DCM=ジクロロメタン、CH2Cl2、塩化メチレン(methylenechloride)
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド(diiopropylcarbdiimide)
DIPEA=N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
E.Coli=エシェリキア・コリ(Escherichia coli)
EDAC=1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
Et2O=ジエチルエーテル
EtOAc=酢酸エチル
Fmoc=9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Fmoc-Glu-O-t-Bu=N-Fmoc-グルタミン酸-1-t-ブチルエステル
Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
H2O=水
HCl=塩化水素(Hydrogenchloride)
HEK293=ヒト胎児由来腎臓293
HPCD=(2-ヒドロキシプロピル)-β-シクロデキストリン
HOAt=1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
MeOH=メタノール
MgCl2=塩化マグネシウム
NaCl=塩化ナトリウム
NMP=N-メチルピロリジン-2-オン
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
OtBu=tertブチルエステル
tBu=tertブチル
NaCl=塩化ナトリウム
NMP=N-メチルピロリジン-2-オン
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
OtBu=tertブチルエステル
tBu=tertブチル
PBS緩衝液=リン酸緩衝食塩水
p-STAT-3=リン酸化シグナル伝達性転写因子3
TFA=トリフルオロ酢酸(trifuloroacetic acid)
TIPS=トリイソプロピルシラン
THF=テトラヒドロフラン
【０３１９】
Met-hレプチン
Met-hレプチン(配列番号3)は、市販されているが、しかし、当業者により知られている方法によりE.Coliにおいて発現させることができる。
【０３２０】
タンパク質分析方法
UPLC: UPLC-分析は、Water Acquity ACQUITY UPLC BEH C18、1.7um、2.1mm×50mmカラムが取り付けられたWater Acquity UPLC系を使用して実施した。UV検出を214nmで回収した。オーブン温度は40℃であった。以下の溶離液を使用した;
溶媒A:99.95%の水、0.05%のトリフルオロ酢酸
溶媒B:99.95%のアセトニトリル、0.05%のトリフルオロ酢酸。ステップ勾配:0.5分で5〜35%のB、次いで、3.5分で35〜55%のB
勾配実行時間:4.0分
合計実行時間:6.0分
流量:以下の2つの方法のうちの1つにより0.40ml/分で固定。
【０３２１】
【表１】
2014505060.tif 000063
【０３２２】
【表２】
2014505060.tif 000064
【０３２３】
(実施例1)
延長基4-(1-カルボキシ-3-{2-[2-({[(2,2-ジメトキシ-エチルカルバモイル)-メチル]-カルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-2-[4-(16-2H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-ブチリルアミノ]-酪酸(化合物1)の合成
【０３２４】
【化６２】
2014505060.tif 000065
【０３２５】
延長基化合物1の合成は、スキーム1に例示し以下に記載する通り実施した。
スキーム1.
【０３２６】
【化６３】
2014505060.tif 000066
【０３２７】
t-BOC-Gly Pam樹脂(3g、充填量1mmol/g)をNMPで1時間洗浄し、濾過した。20mLのTFAを添加し、懸濁液を10分間振盪し、濾過し、NMPで2回洗浄し、その後、NMP(25mL)中の5%DIPEAで浄し、さらに3回NMPで洗浄した。
【０３２８】
Fmoc-OEG-OH(3.1g、8mmol)をHOAtのNMP(0.25M、32mL)溶液に溶解し、DIC(1250μL、8mmol)を添加し、混合物を15分間予め活性化させ、その後、樹脂に添加した。懸濁液を一晩振盪し、濾過し、NMPで3回洗浄した。樹脂にピペリジンのNMP(25%、20mL)溶液を添加し、10分間振とうし、濾過し、NMPで6回洗浄した。
【０３２９】
Fmoc-Glu-(OtBu)-OH(1.7g、4mmol)をHOAtのNMP(0.25M、16mL)溶液に溶解し、DIC(626μL、4mmol)を添加し、混合物を15分間予め活性化させ、その後、樹脂に添加した。懸濁液を2時間振盪し、濾過し、NMPで3回洗浄した(3回)。樹脂にピペリジンのNMP(25%、20mL)溶液を添加し、10分間振とうし、濾過し、NMPで6回洗浄した。
【０３３０】
Fmoc-Glu-(OtBu)-OH(1.7g、4mmol)をHOAtのNMP(0.25M、16mL)溶液に溶解し、DIC(626μL、4mmol)を添加し、混合物を15分間予め活性化させ、その後、樹脂に添加した。懸濁液を2時間振盪した、濾過し、NMPで3回洗浄した(3回)。樹脂にピペリジンのNMP(25%、20mL)溶液を添加し、10分間振とうし、濾過し、NMPで6回洗浄した。
【０３３１】
4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-酪酸(WO2007/009894、79〜82頁に記載されている合成)(1.9g、4mmol)をHOAtのNMP(0.25M、16mL)溶液に溶解し、DIC(626μL、4mmol)を添加し、混合物を15分間予め活性化させ、その後、樹脂に添加した。懸濁液を5時間振盪し、濾過し、NMPで3回洗浄した。樹脂をTFA(20mL)、TIPS(500μL)および水(500μL)で1時間処理した。樹脂に結合した無保護のペプチドを、45℃で20時間、マグネチックスターラーを用いてCHCl3/アミノアセトアルデヒドジメチルアセタール(3:2)(25mL)の混合物で処理した。樹脂を濾過し、溶液を蒸発乾固させて、化合物1を得た。
【０３３２】
(実施例2)
延長型ラットレプチン(化合物A)の合成
【０３３３】
【化６４】
2014505060.tif 000067
【０３３４】
化合物1(22mg、0.0094mmol)を、20%(2-ヒドロキシプロピル)-β-シクロデキストリン(HPCD)を含有する水(4mL)に溶解した。HCl水溶液(2μL、1N)を添加することによりアルデヒドを遊離し、その後、1時間振とうした。ラットレプチン(100mg、0.0031mmol)を5mLのHEPES緩衝液(milliQ水中の25mMのHEPES、pH7)に溶解した。この溶液に遊離アルデヒドを添加し、混合物を室温で1時間振盪した。NaCNBH3(50mg)を添加し、混合物を一晩振盪した。混合物を、10mMのNa2HPO4、15%(v/v)グリセロール、pH7.6からなる緩衝液を使用して8mLのPoros50HQ陰イオン交換カラムで精製し、そこに溶出条件とするために0.5MのNaClを添加し、それにより、精製化合物A、すなわち、N末端アミノ基で化合物1によりアルキル化されたラットレプチン(配列番号2)が生じた。Mw=17190g/mol。
【０３３５】
UPLCおよびLC-MS分析を上記の通り実施し、その結果は、UPLC:RT=3.66分;LC-MS:平均質量=17190.2Da(算出値=17、189.8Da;MS分離度=100000)である。
【０３３６】
(実施例3)
延長型ヒトレプチン(化合物B)の合成
【０３３７】
【化６５】
2014505060.tif 000068
【０３３８】
化合物1(10mg)を、20%(2-ヒドロキシプロピル)-β-シクロデキストリン(HPCD)を含有する水(2mL)に溶解した。水溶液HCl(1μL、1N)を添加することによりアルデヒドを遊離し、その後、1時間振とうした。Met-hレプチン(50mg)を、2.5mLのHEPES緩衝液(milliQ水中の25mMのHEPES、pH7)+5%HPCDを含有する1.5mLのHEPES緩衝液(25mM、pH7.0)の混合物に溶解した。この溶液に遊離アルデヒドを添加し、混合物を室温で24時間振盪した。NaCNBH3(24mg)を添加し、混合物を一晩振盪した。混合物を、10mMのNa2HPO4、15%(v/v)グリセロール、pH7.6からなる緩衝液を使用して8mLのPoros50HQ陰イオン交換カラムで精製し、そこに、溶出条件とするために0.5MのNaClを添加し、それにより、精製化合物B、すなわち、N末端アミノ基で化合物1によりアルキル化されたヒトレプチン(配列番号3)が生じた。Mw=17115g/mol。
【０３３９】
UPLCおよびLC-MS分析を上記の通り実施し、その結果は、UPLC:RT=3.72分;LC-MS:平均質量=17115Daである。
【０３４０】
(実施例4)
延長基17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミル-ベンジルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}エチルカルバモイル)-プロピルカルバモイル]-ヘプタデカン酸(化合物2)の合成
【０３４１】
【化６６】
2014505060.tif 000069
【０３４２】
延長基化合物2の合成は、スキーム2に例示し以下に記載する通り実施した。
スキーム2。
【０３４３】
【化６７】
2014505060.tif 000070
【０３４４】
t-Bu-N-(4-ホルミル-ベンジル)カルバメート(100mg)をTFA/DCM(1:1)で1時間処理した。混合物を真空中で濃縮し、トルエンと共濃縮した(2回)。
【０３４５】
残基をTHF(2.5ml)に溶解し、17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカン酸(320mg)のTHF(5ml)溶液を添加した。DIPEA(0.5ml)をゆっくりと添加した。130分後、混合物を真空中で濃縮した。
【０３４６】
残基をEtOAcおよび1NのHClに溶解した。有機層を1NのHClおよびブラインで抽出した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、真空中で濃縮して白色の固体を得た。
【０３４７】
17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカンの合成を、WO2009083549の実施例7、79頁に記載の方法に従って実施した。
【０３４８】
(実施例5)
延長型ラットレプチン(化合物C)の合成
【０３４９】
【化６８】
2014505060.tif 000071
【０３５０】
一般的手順:
該レプチンをリン酸緩衝液、pH約7.4、濃度5〜10mg/mLに移した。
【０３５１】
延長型化合物(すなわち、化合物2)を10mg/mLの濃度で40%のHPβCD溶液に溶解した。4当量の延長型化合物をタンパク質に添加した。全量約5mL。
【０３５２】
新たなNaCNBH3のメタノール溶液を調製した(5〜10%)。50μLのメタノール中の還元剤の複数のアリコートをそれから2日間タンパク質溶液に添加した(24時間当たり約200μL)。LC-MSを使用して反応をモニターした。3日目に、HICカラムおよび10倍PBS対MilliQ水の勾配を使用して生成物を精製した。
【０３５３】
精製された生成物は、化合物C、すなわち、N末端アミノ基で化合物2によりアルキル化されたラットレプチン(配列番号2)であった。
延長型rレプチン
LC-MS:算出質量17065.72、実測17068.33
【０３５４】
(実施例6)
延長型ヒトレプチン(化合物D)の合成
【０３５５】
【化６９】
2014505060.tif 000072
【０３５６】
Met-hレプチン(配列番号3)をリン酸緩衝液、pH約7.4、濃度5〜10mg/mLに移した。
【０３５７】
延長型化合物(protracto)(すなわち、化合物2)を10mg/mLの濃度で40%のHPβCD溶液に溶解した。4当量の延長型化合物をタンパク質に添加した。全量約5mL。
【０３５８】
新たなNaCNBH3のメタノール溶液を調製した(5〜10%)。メタノール中の50μLの還元剤の複数のアリコートをそれから2日間タンパク質溶液に添加した(24時間当たり約200μL)。LC-MSを使用して反応をモニターした。3日目に、HICカラムおよび10倍PBS対MilliQ水の勾配を使用して生成物を精製した。
【０３５９】
精製された生成物は、化合物D、すなわち、N末端アミノ基で化合物2によりアルキル化されたMet-hレプチン(配列番号3)であった。
延長型Met-hレプチン
LC-MS:算出質量16990.60、実測16992.44
【０３６０】
(実施例7)
実施例5および6に記載の化合物(化合物CおよびD)の全細胞結合
ヒトレプチン受容体を安定的に発現するHEK293細胞をポリ-D-リジンでコーティングした24ウェルプレートにウェル当たり200.000細胞で播種し、+37℃、5%のCO2を有する加湿雰囲気で、アルファ-最小必須培地(MEM)、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)、1mg/mlのゼオシンおよび1mg/mlのG418抗生物質を含有する細胞培養培地において2日間培養した。実験の前に、細胞を純粋なMEM培地中ですすぎ、その後、0.005%のポリソルベート20および0.1%のオボアルブミンおよび[125I]-hレプチン100000cpmを含有するMEMにおいて、10、3、1、0.3、0.1、0.03および0.01nMの濃度のレプチン類似体中で45分間インキュベーションした。細胞を氷冷のMEM中で3回洗浄し、1.0%のノニデットP-40、0.5%のトリトンX-100(C14H22O(C2H4O)n)および1Mの水酸化ナトリウムを含有する溶解緩衝液に溶解した。試料をプラスチックに移す
【０３６１】
【表３】
2014505060.tif 000073
【０３６２】
(実施例8)
実施例2、3、5および6に記載の化合物(化合物A、B、CおよびD)のシンチレーション近接アッセイ(SPA)
ヒトレプチン受容体を安定的に発現するHEK 293細胞を、+37℃、5%のCO2を有する加湿雰囲気で、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)、1mg/mlのゼオシンおよび1mg/mlのG418抗生物質を含有するRPMI 1640細胞培養培地中の500cm2の細胞収穫皿において培養し、擦過により機械的に分離した。プレートを氷冷のPBS(pHを7.4に調整した137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3mMのNa2HPO4,1.47mMのKH2PO4)中で洗浄し、細胞を管に移し、+4℃、1000gで5分遠心分離した。ペレットを氷冷の均質化緩衝液(20mMのHEPES、5mMのMgCl2、1mg/mlのバシトラシン、pH7.1)中で再懸濁し、次いで、組織ホモジナイザーを中程度の速度で使用して30秒間均質化した。+4℃で10分間超遠心機を使用して35000gでホモジネートを遠心分離し、上澄みを廃棄し、新たな均質化緩衝液を添加した。ペレットの均質化を合計で3回繰り返した。最終ペレットを数ミリリットルの均質化緩衝液中で再懸濁し、Bradford法を使用しミクロプレートリーダーで595nmで測定して、タンパク質濃度を求めた。タンパク質濃度を1mg/mlに調整し、クライオチューブに移し、-80℃で貯蔵した。
【０３６３】
ヒトレプチン受容体SPA結合アッセイを、ウェル当たり200μlの全量で白色の96ウェルプレートにおいて実施した。シンチレーション液体を含有するコムギ胚芽凝集素でコーティングしたビーズを結合緩衝液(50mMのHEPES、1mMのCaCl2、5mMのMgCl2、0.02%のTween 20、0.25%のオボアルブミン、pH7.4)で戻し、膜調製物と混合して、ウェル当たり1mgのビーズおよび10μgの総タンパク質という最終濃度を得た。おおよそ100pMの濃度に対応するウェル当たり50.000cpmの放射性リガンドヒト[125I]-レプチンを添加した。アルブミンの存在下での結合を調査したときは、最終濃度が2%になるまでヒト血清アルブミンを添加した。凍結乾燥レプチン類似体をPBSに溶解して100μMとし、結合緩衝液中で段階希釈して、100nM〜0.01pMの範囲の最終アッセイ濃度を得た。プレートを封止し、400rpmに設定したプレートシェーカーにおいて+25℃で2時間インキュベートし、その後、1500rpmで10分間遠心分離した後、ミクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンターでルミネッセンスを測定した。放射性リガンドの置換をルミネッセンスの低減として測定し、S字状用量反応曲線の非線形回帰分析によりIC50値を算出した。
【０３６４】
【表４】
2014505060.tif 000074
【０３６５】
(実施例9)
実施例2、3、5および6に記載の化合物(化合物A、B、CおよびD)のルシフェラーゼ機能アッセイ
hレプチン受容体を安定的に発現するHEK293細胞と、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するp-STAT-3応答エレメントとを、+37℃、5%のCO2を有する加湿雰囲気で、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)、1mg/mlのゼオシンおよび1mg/mlのG418抗生物質を含有する細胞培養培地RPMI 1640において培養した。細胞を96ウェルプレートに播種し(ウェル当たり20.000細胞)、24時間接着させ、その後、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)を有するRPMI培地において24時間だけ飢餓培養した。細胞を、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)を有するRPMI培地において4.5時間、0.7%のヒト血清アルブミンなしで、または100nM〜0.01pMの範囲の最終濃度の0,7%のヒト血清アルブミンと共にでレプチン類似体中でインキュベートし、その後、全ての培地を除去した。ルシフェラーゼは、ホタル特異性基質、D-ルシフェリンの酸化を触媒して光を生じ、D-ルシフェリンを含有する溶解緩衝液は、PBSで1:1希釈され、200μlを各ウェルに添加し、その後、室温で30分インキュベーションした。ルミネッセンスをミクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンターで測定し、S字状用量反応曲線の非線形回帰分析によりEC50値を算出した。
【０３６６】
【表５】
2014505060.tif 000075
【０３６７】
(実施例10)
HSA濃度0.7%および2.0%での実施例2、3、5および6に記載の化合物(化合物A、B、CおよびD)のヒト(Humas)血清アルブミン(HSA)結合
【０３６８】
【表６】
2014505060.tif 000076
【０３６９】
薬理学的方法
アッセイ(I):ob/obマウスにおける食物摂取量および体重をモニタリングするための実験手順
レプチンの単回投与後に個々に収容されたob/obマウスにおける食物摂取量をモニターした。オンライン食物摂取量モニタリングシステム(BioDAQ)を介して連続食物摂取量を自動的にモニターした。該システムは、32箇所に、高感度のスケールの上に置かれた個々のフードホッパーを有していた。フードがフードホッパーから取り出される度に、これがコンピューターにより記録され、コンピューターは、32の個々のスケールの各々からデータを連続的に回収した。
【０３７０】
マウスは、レプチンを皮下(sub cutaniuosly)(s.c)投与されたとき8〜9カ月齢のob/obマウス(Taconic)であった。それらを実験の開始前に2週間以上該システムに順応させておいた。それらは、逆にした昼夜間の光サイクル(10am〜10pmは暗い)で平穏に収容した。ケージ当たり2匹のマウスを収容し、これらは、2匹のマウス間での多少の相互作用を可能にすると同時に個々の食物摂取量の記録を可能にする隔壁で分離した。
【０３７１】
マウスに固形飼料(Research DietからのD12450B)を供給した。該スケール用に作製され、マウスが該スケールの外側に過剰なフードを落とすことなく自由に食べることを可能にするフードホッパーにペレットを入れた。マウスは、水に自由にアクセスすることができた。
【０３７２】
マウスを4時間絶食させ、暗いサイクルの開始の30分前にレプチンを含む組成物をs.c.で1回投与した。
【０３７３】
投薬後のある期間、食物摂取量をモニターした。体重は、投薬の前と、その後の時点、例えば、6日目などに測定した。食物摂取量および体重における差は、一元配置ANOVA分析、続いてビヒクル治療と比較するためのDunnettの事後検定により統計的に評価した。
【０３７４】
アッセイ(II):
アッセイ(I)に従って、ビヒクル、wtラット/ヒトレプチンまたは化合物A/B/C/Dの投与後のob/obマウスの食物摂取量および体重を6日間にわたって測定した。用量体積は、マウス当たり0.2または0.6mlであった。結果をTable 2(表2)(食物摂取量)およびTable 3(表3)(体重)に示す。本発明のレプチン誘導体が、ob/obマウスにおける食物摂取量に対して有意で長く持続する効果を有していたことが観察された。本発明のレプチン誘導体が、ob/obマウスにおける体重の低減に対する有意で用量依存的な効果を有していたことが観察された。さらに、自然な日周リズムが損なわれなかったことが観察された。
【０３７５】
アッセイ(III):
血液試料(10μl)を様々な時点(表を参照されたい)で尾静脈から毛細管に採取した。500μlのEBIO(EBIO Eppendorf、Germany)緩衝液を含有する管に毛細管を入れ、BioSen(EKF Diagnostics)において血糖濃度を分析した。血糖濃度は、グルコース分析器(Biosen 5030、EKF Diagnostics、Germany)により求めた。
【０３７６】
(実施例11)
60または180μg/マウスの実施例2に記載の化合物(化合物A)の投与後のob/obマウスにおける食物摂取量
【０３７７】
【表７】
2014505060.tif 000077
【０３７８】
(実施例12)
60または180μg/マウス実施例2に記載の化合物(化合物A)の投与後のob/obマウスにおける体重変化
【０３７９】
【表８】
2014505060.tif 000078
【０３８０】
(実施例13)
150μg/マウスの実施例2および3に記載の化合物(化合物AおよびB)の投与後のob/obマウスにおける食物摂取量
【０３８１】
【表９】
2014505060.tif 000079
【０３８２】
(実施例14)
150μg/マウスの実施例2および3に記載の化合物(化合物AおよびB)の投与後のob/obマウスにおける体重変化
【０３８３】
【表１０】
2014505060.tif 000080
【０３８４】
(実施例15)
150μg/マウスの実施例4および5に記載の化合物(化合物CおよびD)の投与後のob/obマウスにおける食物摂取量
【０３８５】
【表１１】
2014505060.tif 000081
【０３８６】
(実施例16)
150μg/マウスの実施例4および5に記載の化合物(化合物CおよびD)の投与後のob/obマウスにおける体重変化
【０３８７】
【表１２】
2014505060.tif 000082
【０３８８】
本明細書において列挙した刊行物、特許出願、および特許を含めた全ての参考文献は、本明細書において参照によりその全体を本明細書に組み込むものであり、各参考文献を参照により組み込むことを個々におよび具体的に示し、その全体を本明細書に記述していた場合と同程度に(法律により認められる最大限の範囲で)組み込むものである。
【０３８９】
全ての見出しおよび小見出しは、本明細書において単に便宜上使用するものであり、決して本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【０３９０】
本明細書において示す任意のおよび全ての実施例、または例示的な用語(例えば、「など(such as)」)の使用は、単に、本発明をより適切に明らかにすることを意図したものであり、別途特許請求しない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の用語は、全て、任意の特許請求していない要素が本発明の実施に必須であることを示すものと解釈すべきではない。
【０３９１】
本明細書における特許文書の引用および組込みは、単に便宜上行うものであり、そのような特許文書の任意の妥当性、特許性、および/または執行可能性に対する見解を反映するものではない。
【０３９２】
本発明は、適用法により認められる通り、添付の特許請求の範囲において列挙した主題の全ての変法および均等物を含む。
【図１】
2014505060.tif 000091
【図２】
2014505060.tif 000092
【図３】
2014505060.tif 000093
【図４】
2014505060.tif 000094
【配列表】
2014505060000001.app
【国際調査報告】
2014505060.tif 000095
2014505060.tif 000096