(57)【要約】  本開示は、癌のタイプに特異的な細胞外基質組成物、および腫瘍組織の長期間培養のための腫瘍微小環境プラットフォームに関し、ここで前記培養は、生理学的に関連するシグナリング系を模倣するヒトリガンドおよび腫瘍組織の微小環境を提供するものである。本開示はさらに、臨床反応予測因子の開発、ならびに予後分野（患者に対する処置の選択肢の選択）および翻訳生物学分野（抗癌剤の開発）におけるその応用に関する。本開示はさらに、腫瘍患者の１または２以上の薬物に対する臨床反応を予測する方法に関する。本開示はさらに、腫瘍細胞を、特異的マーカーの存在についてスクリーニングして、該細胞の生存率を決定し、腫瘍状態を表示するための方法に関する。
2014534809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンＣ、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を有する群から選択される少なくとも３つの成分を含む、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ＥＣＭの成分を同定すること；
ｂ．コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンＣ、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質の群から選択されるＥＣＭの成分を組み合わせて、ＥＣＭ組成物を得ること；
を含む、前記方法。
【請求項３】
腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、請求項１に記載のＥＣＭ組成物、培養培地を、任意に血清、血漿または自己ＰＢＭＣおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォーム。
【請求項４】
腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを請求項１に記載のＥＣＭ組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿または自己ＰＢＭＣおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法。
【請求項５】
腫瘍組織を器官培養する方法であって、腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して器官培養物を得る行為を含む、前記方法。
【請求項６】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと；
ｃ．アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｄ．任意に、感受性指数と、前記１または２以上の薬物に対する対象の臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理すること；
ｃ．薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価して、複数のアッセイの各々についての評価スコアを得ること；
ｄ．複数のアッセイの各々に対して重みスコアを割り当てること；
ｅ．複数のアッセイの各々の評価スコアに、複数のアッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数のアッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること；
ｅ．複数のアッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｆ．任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項９】
腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること；および
ｃ．マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
細胞外基質［ＥＣＭ］組成物が腫瘍特異的である、請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項２、４〜１１に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン１が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５０μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン３が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン４が、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約２５０μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン６が、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
フィブロネクチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約７５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５００μｇ／ｍｌであり；
ビトロネクチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約９５μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
カドヘリンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌおよび約５μｇ／ｍｌであり；
フィラミンＡが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
ビメンチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
ラミニンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；
デコリンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；
テネイシンＣが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２５μｇ／ｍｌであり；
オステオポンチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約５μｇ／ｍｌであり；
基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度である；
請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍組織が、中枢神経系、骨髄、血液、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮、間質組織および結合組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるソースから得られる、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍または腫瘍組織が、外科的にもしくは生検により、または異種移植片としてまたはそれらの任意の組合せで得られ；および前記腫瘍または腫瘍組織が、約１００μｍから約３０００μｍの切片の小さな断片に分割されている、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍組織の培養が、約３０℃から約４０℃の範囲の温度、好ましくは約３７℃で；約２〜１０日の間、好ましくは約３〜７日；および約５％のＣＯ２で実施される、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍微小環境プラットフォームが、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレートおよびペトリ皿を含む群から選択される、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９に記載の方法。
【請求項１６】
プラットフォームが、腫瘍細胞のシグナリングネットワークを維持するためのものである、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
プラットフォームが、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
培養培地が、約６０％〜約１００％の範囲の濃度、好ましくは約８０％で２ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］またはＲＰＭＩ１６４０［Roswell Park Memorial Institute Medium］；約０．１％〜約４０％の範囲の濃度、好ましくは約２％（重量／重量）の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；約１％〜約２％の範囲の濃度、好ましくは約１％（重量／重量）のペニシリン−ストレプトマイシン；約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約５ｍＭのＬ−グルタミンである非必須アミノ酸；および約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）；約０．１％〜約１０％の範囲の濃度、好ましくは約２％の血清を含む群から選択される、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９に記載の方法。
【請求項１９】
コーティングが腫瘍特異的であり、腫瘍が、胃癌、結腸癌、頭頸部癌、脳の癌、口腔癌、乳癌、胃癌、胃腸の癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮癌、骨の癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、甲状腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ならびにＡＭＬ［急性骨髄性白血病］、ＣＭＬ［慢性骨髄性白血病］、ＡＬＬ［急性リンパ性白血病］、ＴＡＬＬ［Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病］、ＮＨＬ［非ホジキンリンパ腫］、ＤＢＣＬ［びまん性Ｂ細胞性リンパ腫］、ＣＬＬ［慢性リンパ性白血病］、および多発性骨髄腫を含む血液の癌、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項４〜９に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイが、細胞生存率、細胞死、細胞増殖、腫瘍の形態、腫瘍間質含量、細胞代謝、老化またはこれらの任意の組合せについてのアッセイを含む群から選択される、請求項６〜９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞生存率および細胞代謝についてのアッセイが、ＷＳＴアッセイ、ＡＴＰ取り込みアッセイ、およびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；細胞死についてのアッセイが、ＬＤＨアッセイ、活性化カスパーゼ３アッセイ、活性化カスパーゼ８アッセイ、および酸化窒素合成酵素アッセイ、ＴＵＮＥＬを含む群から選択され；細胞増殖についてのアッセイが、Ｋｉ６７アッセイ、ＡＴＰ／ＡＤＰ比アッセイおよびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；ならびに腫瘍の形態および腫瘍間質についてのアッセイが、Ｈ＆Ｅ［ヘマトキシリン＆エオシン染色］であるか；またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、対象のための処置を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの任意の組み合わせを含む群から決定するために使用される、請求項６および７に記載の方法。
【請求項２３】
生化学的アッセイが、ＥＬＩＳＡ、ブロッティング技術、ＬＣＭＳ、ビーズベースアッセイ、免疫除去、クロマトグラフィーアッセイまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択される定量的アッセイまたは定性的アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
複数アッセイの各々に対する重みスコアの割り当てが、用いる薬物の性質に基づく、請求項７に記載の方法。
【請求項２５】
感受性指数が６０より大、２０と６０の間、および２０より小の場合に、感受性指数がそれぞれ、完全臨床反応、部分的臨床反応、および臨床反応なしと相関する、請求項６および７に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのマイクロアレイおよび核酸分析を実施して、薬物処置の前後の経路の調節を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
マイクロアレイおよび核酸分析を、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、およびホスホプロテオミクスプロファイリングを含む群から選択されるアッセイを用いて確認する、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、癌ならびに癌の予後および治療薬の開発の分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームおよびそれらの方法を提供する。
本開示は、「臨床反応予測因子」に、ならびに、抗腫瘍効果を有する化学療法、標的化された生物学的製剤および広義の剤についての、種々の癌におけるその応用に関する。本開示はさらに、腫瘍組織を長期培養するための方法であって、前記培養が、生理学的に関連するシグナリング系を模倣するヒトリガンドおよび腫瘍組織の微小環境を提供する、前記方法に関する。本開示はさらに、腫瘍状態の表示のために、細胞生存率を決定する特異的マーカーの存在について腫瘍組織をスクリーニングする方法に関する。本開示はまた、腫瘍対象の反応を予測する方法および、抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景および従来技術
当該分野で周知の様々な患者選別ツールは、以下のように大きく分類される：
バイオマーカー：
患者の腫瘍、正常組織、血清、尿、唾液、ならびに身体の他の部分および／または分泌／排泄物質の分析に基づく、種々のバイオマーカーが存在する。例えばＨｅｒ２は、タンパク質Ｈｅｒ２を過剰発現する患者を過少発現する患者から選別する、タンパク質であり遺伝子ベースのマーカーである。続いて詳細な臨床試験が実施されて、より高いレベルのＨｅｒ２タンパク質を有するものは、モノクローナル抗体ハーセプチンに顕著に良好に反応することが示されている。この文脈において、Ｈｅｒ２は、検討中の患者に対するハーセプチン処置の結果を予測する「バイオマーカー」として承認されている。その存在もしくは不在または発現プロファイルが、検討中の標的薬物の有効性を予測するために使用されるところの、ＥＧＦＲ、Ｃ−ＭＥＴなどの他のバイオマーカーも存在する。
【０００３】
バイオマーカーを用いるために、ＸＹ平面の両方の軸を定義する必要がある；すなわち、バイオマーカーの量または質を１つの軸に、および臨床反応を他の軸に定義しなければならない。バイオマーカーの使用の前に、バイオマーカーの質および／または量ならびに臨床転帰の固定された組合せについて、大量のデータを開発する必要がある。かかるデータベースが開発されれば、患者がその特定の薬物を投与される場合、新たな患者に対する同一の疾患および同一の薬剤についてのバイオマーカーの質または量の測定を用いて、臨床転帰を予測することができる。したがって、バイオマーカー主導のアプローチは、使用される薬物、それが使用される疾患、および使用されるバイオマーカーなどの多くの入力因子によって大きく制約される。
【０００４】
化学療法マーカー：
異なる癌においてシスプラチンなどの化学療法剤の有効性を予測するために用いられる試験がある。これらの試験は、サロゲートマーカーの存在または不在、またはその存在の程度を測定する。化学療法マーカーでは、バイオマーカーと同様の欠陥が問題となる。
患者の現在または以前の疾患状態：
ＨＰＶ陽性患者で頭頸部扁平上皮癌も有する者は、ＨＰＶ陰性の頭頸部扁平上皮癌患者よりも良好に化学療法に反応する。この場合、患者のＨＰＶの状態は、患者が頭頚部扁平上皮癌も発症するという事象において、頭頸部扁平上皮癌のための薬物に対する患者の反応を予測するための基準として使用される。この予後カテゴリーのもとで利用可能な情報の量は限られている。この情報は主に相関に基づくものであり、必ずしも因果関係に基づく必要はない。
【０００５】
化学的感受性試験：
試験のこのカテゴリーにおいては、患者の腫瘍試料を採取し、腫瘍細胞に均質化し、この系をin vitro系において種々の化学療法剤で処理する。あるいは、患者の腫瘍試料を、均質化することなくin vitro系において様々な化学療法剤で処理する。これらのin vitro試験は、異なる名称で実施される（例えばOncotest GMBHからの単層アッセイまたはクローン形成法、Chemofxからの化学的感受性アッセイ、Oncotechからのエクストリーム薬剤耐性（ＥＤＲ）試験）。
このモデルの基本的な欠陥は、患者の腫瘍微小環境が、これらの化学的感受性試験では捕捉されないことである。例えばいくつかの文献には、in vitroの細胞または組織ベースの系が臨床転帰の代表ではないことが記載されている。
細胞株ベースのin vitroおよびin vivo異種移植系。
近年、腫瘍増殖の阻害に基づくin vitroおよびin vivoの前臨床試験の腫瘍増殖について、および臨床的有効性を予測するために、多数の文献が公表されている。従来技術の方法すべてには、腫瘍試料の局所微小環境を模倣することができず、したがって臨床転帰との相関が悪く、臨床転帰を予測するための信頼性の高いアッセイとして使用できないという、本質的な限界がある。
【０００６】
第Ｉ相臨床試験を行う全ての癌治療薬のうち、成功して市場に参入されるのは１０％のみである。この低い成功率は、腫瘍薬のコストが非常に高いことの主な理由の１つである；低い成功率は、腫瘍学の分野における現在のin vitroおよびin vivo試験の低い予測力に起因し得る。最近まで、２Ｄ細胞単層に基づく従来の研究では、次のような顕著な制約が示されている：すなわち、細胞外基質成分の３次元（３−Ｄ）ネットワーク内、細胞間および細胞−基質相互作用における、in vivoでの細胞の分化、増殖および機能を管理する組織構造が、簡略化された２Ｄ単層条件下では実際に失われるということである。特定の構造の不在下ならびに間質成分および腫瘍に関連する他の細胞の喪失において、腫瘍の維持、開始および進行に関連する腫瘍のシグナリングおよび経路を研究するための機能的アッセイは、正確に実施することができない。しかし、従来技術のモデルは、それらが無傷の腫瘍微小環境を使用しないという点で欠陥がある；これは機能の喪失につながり、また、使用される細胞培地中のヒト由来のリガンドの欠如に起因する、シグナリング系の変化をもたらす。さらに最近では、多くのヒト上皮癌における現在の小分子阻害剤の限定的な成功は、治療に対する反応、好ましくは個々の癌およびそのユニークな遺伝的およびエピジェネティックな変化に合わせた治療に対する反応を正確に予測するための、より良い技術の開発の必要性を強調する。腫瘍−間質相互作用は、悪性疾患の発症と播種における重要な側面として長く認識されている。腫瘍の維持における腫瘍周囲組織の役割を支持する重要な証拠には、癌のいくつかのタイプの間質における遺伝的変異の存在および、治療に対する耐性の獲得における間質細胞の役割が含まれる。培養された腫瘍が実際の癌を代表するためには、腫瘍は、それがin vitroで増殖するにつれて、その組織の構成および構造、その発癌性、その分化機能、およびin vivoで存在する可能性のある任意の細胞異質性を維持することが必須である。in vitroで増殖するヒト腫瘍が上記の基準を満たすことができ、さらに、培養物中長期間にわたって高い頻度で増殖可能である場合、それらは癌生物学ならびに臨床的に関連する試験のための基本的な研究に貴重であることが証明されるはずである。
【０００７】
本開示に提供される研究は、ヒトの腫瘍が実際に上記の基準をin vitroで満たすことができるかどうかという、重要な問題に取り組む。標準の初代細胞培養系および細胞株ベースの皮下または同所異種移植片を使用したこれまでの研究は、腫瘍の挙動の理解を進めてきた；しかしこれらの方法は、発癌現象および腫瘍進行の調節における腫瘍微小環境の役割を評価することに特有の限界があり、なぜならば、細胞株ベースのモデルは均一なモデルとして広く認識されており、これが癌などの異種疾患を適切に表さないことの１つの基本的な理由だからである。対照的に、本開示は、プレート上でヒト腫瘍微小環境を模倣する、in vitroの患者選別ツールを作製する生物学的アプローチを開発することに関し、これにより、予後および探索の生物学の両方での、癌の処置のさまざまな分野における応用の可能性をもたらす。本開示はまた、予後のためだけでなく、探索生物学的用途のためのいくつかの例の仮説を確認するものである。さらに、本開示の患者選別ツールの使用は、自己免疫疾患および炎症性疾患の予後、コンパニオン診断、および探索生物学的用途の開発にも適用可能である。
【０００８】
開示の陳述
本開示は以下に関する：コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンＣ、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を有する群から選択される少なくとも３つの成分を含む、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物；上記の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為：ａ）腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ＥＣＭの成分を同定すること；ｂ）コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンＣ、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質の群から選択されるＥＣＭの成分を組み合わせて、ＥＣＭ組成物を得ること；を含む、前記方法；および、腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、上記のＥＣＭ組成物、培養培地を、任意に血清、血漿または自己ＰＢＭＣおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォーム；
【０００９】
腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを上記のＥＣＭ組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿または自己ＰＢＭＣおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法；腫瘍組織を器官培養する方法であって、腫瘍組織を上記の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して器官培養物を得る行為を含む、前記方法；腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：ａ）対象の腫瘍組織を上記の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；ｂ）培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと；ｃ）アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；およびｄ）任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応の相関をとること、を含む、前記方法；
【００１０】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：ａ）対象の腫瘍組織を上記の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；ｂ）培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理すること；ｃ）薬物に対する腫瘍の反応を複数アッセイにより評価して、複数アッセイの各々についての評価スコアを得ること；ｄ）複数アッセイの各々について重みスコアを割り当てること；ｅ）複数アッセイの各々の評価スコアに、複数アッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数アッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること；ｆ）複数アッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および、ｇ）任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応の相関をとること、を含む、前記方法；抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法であって、該方法が、以下の行為：ａ）対象の腫瘍組織を上記の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；ｂ）培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること；を含む、前記方法；腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為：ａ）対象の腫瘍組織を上記の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；ｂ）培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること；およびｃ）マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること；を含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本開示が容易に理解され実用的な効果を示すために、添付の図面の説明と共に例示の態様を参照する。本開示に従い、図は以下の詳細な説明と共に明細書に組み込まれてその一部を形成し、態様をさらに例示し、様々な原理および利点を説明する役割を果たすが、ここで、
【図１】図１は、「臨床反応予測因子」技術の開発と検証を描いた模式図である。
【図２】図２は、外植片モデルにおけるパラクリン因子の重要性を示す図である。
【図３ＡＢ】図３Ａは、外植片モデルにおける細胞外基質の重要性を示し、図３Ｂは、外植片モデルにおける微小環境の重要性を示す図である。
【図４Ａ−Ｇ】図４Ａ〜Ｇは、自己リガンドおよび細胞外基質が、培養物において患者の腫瘍の微小環境とシグナリングネットワークを保持することを示す図である。画像倍率：２０Ｘ。
【００１２】
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、ＥＣＭ組成物および生存と増殖に及ぼすその影響を示す図である。
【図６】図６は、異なるＴＰＭの、癌のシグナリングタンパク質の増殖および活性化に対する効果の比較を示す図である。
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａ〜Ｃは、ヒト腫瘍異種移植片の初期の継代が、元の患者腫瘍の分子特性を保持することを示す図である。
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、患者の腫瘍およびこれに由来する異種移植片が、腫瘍外植片培養モデルで試験した場合に、抗癌治療に対して同一の反応結果を示すことを示す図である。
【図９Ａ−Ｈ】図９Ａ〜Ｈは、ＴＰＦおよびセツキシマブの、患者の腫瘍外植片培養物に対する抗腫瘍効果が、in vivoの有効性実験により試験したヒト腫瘍異種移植片の反応に類似していることを示す図である。
【図１０】図１０は、「臨床反応予測因子」がガイドする薬物反応プラットフォームとin vivoでの有効性の相関を示す図である。
【図１１】図１１は、「臨床反応予測因子」技術の開発および検証を描いた模式図である。
【００１３】
【図１２】図１２は、頭頸部癌における「臨床反応予測因子」分析データの臨床的妥当性を示す図である。Ｍスコアは「臨床反応予測因子」を用いて計算され、予測結果と患者の臨床転帰との相関をとる。６０より大きいＭスコアが３０人の患者の腫瘍に対して得られ、これらの患者は完全な反応を有すると予測され、これらの患者の９０％以上が実際に「臨床反応予測因子」分析と一致する臨床転帰を有した。同様に、Ｍスコアが２５未満の約２９人の患者は無反応者であると予測され、これらの患者はその１００％が、処置後に無反応であった。
【図１３Ａ−Ｓ】図１３Ａ〜Ｓは、薬物または薬物の組み合わせで処置した癌患者について、「臨床反応予測因子」分析により得られた有効性データを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本開示は、コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンＣ、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を有する群から選択される、少なくとも３つの成分を含む、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物に関する。
本開示はまた、上記細胞外基質［ＥＣＭ］組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ＥＣＭの成分を同定すること；
ｂ．コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、ラミニン、デコリン、テネイシンＣ、オステオポンチン、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質の群から選択されるＥＣＭの成分を組み合わせて、ＥＣＭ組成物を得ること；
を含む、前記方法に関する。
【００１５】
本開示はまた、腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、前記のＥＣＭ組成物、培養培地を、任意に血清、血漿または自己ＰＢＭＣおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォームに関する。
本開示はまた、腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを前記のＥＣＭ組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿または自己ＰＢＭＣおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法に関する。
【００１６】
本開示はまた、腫瘍組織を器官培養する方法であって、腫瘍組織を前記の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して器官培養物を得る行為を含む、前記方法に関する。
本開示はまた、腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと；
ｃ．アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｄ．任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応の相関をとること、
を含む、前記方法に関する。
【００１７】
本開示はまた、腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理すること；
ｃ．薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価して、複数のアッセイの各々についての評価スコアを得ること；
ｄ．複数のアッセイの各々について重みスコアを割り当てること；
ｅ．複数のアッセイの各々の評価スコアに、複数のアッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数のアッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること；
ｅ．複数のアッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｆ．任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応の相関をとること、
を含む、前記方法に関する。
【００１８】
本開示はまた、抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること；
を含む、前記方法に関する。
本開示はまた、腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること；および
ｃ．マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること；
を含む、前記方法に関する。
本開示の一態様において、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物は腫瘍特異的である。
【００１９】
本開示の別の態様において、コラーゲン１は、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５０μｇ／ｍｌであり；コラーゲン３は、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌであり；コラーゲン４は、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約２５０μｇ／ｍｌであり；コラーゲン６は、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；フィブロネクチンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約７５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５００μｇ／ｍｌであり；ビトロネクチンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約９５μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；カドヘリンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌおよび約５μｇ／ｍｌであり；フィラミンＡは、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；ビメンチンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；ラミニンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；デコリンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；テネイシンＣは、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２５μｇ／ｍｌであり；オステオポンチンは、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約５μｇ／ｍｌであり；基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質は、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度である。
【００２０】
本開示のさらに別の態様において、腫瘍組織は、中枢神経系、骨髄、血液、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮、間質組織および結合組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるソースから得られる。
本開示のさらに別の態様において、腫瘍または腫瘍組織は、外科的にもしくは生検により、または異種移植片またはそれらの任意の組合せとして得られ；および腫瘍または腫瘍組織は、約１００μｍから約３０００μｍの切片の小さな断片に分割されている。
本開示のさらに別の態様において、腫瘍組織の培養は、約３０℃から約４０℃の範囲の温度、好ましくは約３７℃で；約２〜１０日の間、好ましくは約３〜７日；および約５％のＣＯ２で実施される。
【００２１】
本開示のさらに別の態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレートおよびペトリ皿を含む群から選択される。
本開示のさらに別の態様において、プラットフォームは、腫瘍細胞のシグナリングネットワークを維持するためのものである。
本開示のさらに別の態様において、プラットフォームは、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである。
【００２２】
本開示のさらに別の態様において、培養培地は、約６０％〜約１００％の範囲の濃度、好ましくは約８０％で２ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］またはＲＰＭＩ１６４０［Roswell Park Memorial Institute Medium］；約０．１％〜約４０％の範囲の濃度、好ましくは約２％（重量／重量）の熱不活性化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）；約１％〜約２％の範囲の濃度、好ましくは約１％（重量／重量）のペニシリン−ストレプトマイシン；約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約５ｍＭのＬ−グルタミンである非必須アミノ酸；および約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）；約０．１％〜約１０％の範囲の濃度、好ましくは約２％の血清を含む群から選択される。
【００２３】
本開示のさらに別の態様において、コーティングは腫瘍特異的であり、腫瘍は、胃癌、結腸癌、頭頸部癌、脳の癌、口腔癌、乳癌、胃癌、胃腸の癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮癌、骨の癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、甲状腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ならびにＡＭＬ［急性骨髄性白血病］、ＣＭＬ［慢性骨髄性白血病］、ＡＬＬ［急性リンパ性白血病］、ＴＡＬＬ［Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病］、ＮＨＬ［非ホジキンリンパ腫］、ＤＢＣＬ［びまん性Ｂ細胞性リンパ腫］、ＣＬＬ［慢性リンパ性白血病］、および多発性骨髄腫を含む血液の癌、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
本開示のさらに別の態様において、アッセイは、細胞生存率、細胞死、細胞増殖、腫瘍の形態、腫瘍間質含量、細胞代謝、老化またはこれらの任意の組合せについてのアッセイを含む群から選択される。
【００２４】
本開示のさらに別の態様において、細胞生存率および細胞代謝についてのアッセイは、ＷＳＴアッセイ、ＡＴＰ取り込みアッセイ、およびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；細胞死についてのアッセイは、ＬＤＨアッセイ、活性化カスパーゼ３アッセイ、活性化カスパーゼ８アッセイ、および酸化窒素合成酵素アッセイ、ＴＵＮＥＬを含む群から選択され；細胞増殖についてのアッセイは、Ｋｉ６７アッセイ、ＡＴＰ／ＡＤＰ比アッセイおよびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；ならびに腫瘍の形態および腫瘍間質についてのアッセイは、Ｈ＆Ｅ［ヘマトキシリン＆エオシン染色］であるか；またはそれらの任意の組み合わせである。
本開示のさらに別の態様において、方法は、対象のための処置を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの任意の組み合わせを含む群から決定するために使用される。
本開示のさらに別の態様において、生化学的アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ブロッティング技術、ＬＣＭＳ、ビーズベースアッセイ、免疫除去、クロマトグラフィーアッセイまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択される定量的アッセイまたは定性的アッセイである。
【００２５】
本開示のさらに別の態様において、複数アッセイの各々に対する重みスコアの割り当ては、用いる薬物の性質に基づく。
本開示のさらに別の態様において、感受性指数が６０より大、２０と６０の間、および２０より小の場合に、感受性指数はそれぞれ、完全臨床反応、部分的臨床反応、および臨床反応なしと相関する。
本開示のさらに別の態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのマイクロアレイおよび核酸分析を実施して、薬物処置の前後の経路の調節が検出される。
本開示のさらに別の態様において、マイクロアレイおよび核酸分析は、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、およびホスホプロテオミクスプロファイリングを含む群から選択されるアッセイを用いて確認される。
本開示の一態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、任意に培養培地、血清、血清由来のリガンドおよび薬物と共に請求項１に記載のＥＣＭ組成物でコーティングされた、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレート、およびペトリ皿を含む群から選択される。
【００２６】
本開示の一態様において、「感受性指数」と「Ｍスコア」は交換可能に使用される。
本開示の一態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、微小環境を作製および／または保持するための、物理的支持体またはベースである。したがって腫瘍微小環境プラットフォームは、腫瘍組織を培養するための物理的支持体を提供する任意のプラットフォームであることができる。本開示の態様において、腫瘍微小環境プラットフォームは、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレート、およびペトリ皿を含む群から選択される、ex vivo系である。腫瘍微小環境系は、任意に培養培地、血清、血漿、ＰＢＭＣ、血清由来のリガンドおよび薬物と共にＥＣＭ成分で被覆することにより、プラットフォーム上に作製される。
本開示の別の態様において、血清リガンドまたは血漿リガンドまたは患者由来のリガンドまたは患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、腫瘍／癌患者または対象の血液から得る。
【００２７】
本開示の一態様において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離および培養は、以下のプロトコルを用いて行われる。このプロトコルは、末梢血からの総ＰＢＭＣ（顆粒球、リンパ球、単球）の単離および培養の方法を記述する。およそ、約１０ｍｌの末梢静脈血を、ヘパリン容器に入れる。ヘパリン添加血液を、Histopaue 1.119（Sigma）密度勾配の等量の上に静かに積層し、約２５００ｒｐｍで約３０分間、約２３℃〜２５℃にて遠心分離する。最上部の血漿層を無菌の容器に取り出し、更なる使用のために保存する。細胞層を注意深く界面から取り出し、２０％ＦＢＳを補足したダルベッコ培地のイスコフ改変（ＩＭＤＭ）からなる１０ｍＬの完全培地に再懸濁し、約２０００ｒｐｍで約８分間遠心分離して、任意のHistopaue汚染を除去する。このステップを、同一の微量を除去するためにもう一度繰り返す。洗浄後、細胞を約５ｍｌの完全成長培地に再懸濁し、細胞数および生存率を血球計算機中のトリパンブルー染色により決定する（トリパンブルーは死細胞のみを染色し、生細胞は非染色細胞として可視化される）。
【００２８】
本開示の別の態様において、血清を静脈穿刺法を用いて単離する。約５ｍｌ〜約７ｍｌの全血を、真空血清分離管（ＳＳＴ）に収集する。血液を、管を垂直にして周囲温度（約１９℃〜２４℃）で約２０〜３０分間静置することにより凝固させ、次に約２０００ｇで約１０分間遠心分離して、凝固物から血清を分離する。
外植片モデルおよびヒト腫瘍異種移植片モデルを含む複数の実験モデルにおいて、制癌（ｃａ）剤（開発されたものおよび開発中のもの両方）に対する患者の臨床反応などの複数の入力パラメータを使用して、包括的な患者選別ツールを開発する。このツールを、「臨床反応予測因子」または本患者選別ツールと呼ぶ。「臨床反応予測因子」は現在、種々の固形癌に対して、化学療法および生物学的製剤両方について適用されている。追加の入力パラメータは、腫瘍のゲノム、プロテオーム、および組成物のエピジェネティックな事柄に由来する。「臨床反応予測因子」の使用は、患者の選別にある。本開示の一態様において、「臨床反応予測因子」は、実験室ベースの試験として提供される。
【００２９】
「臨床反応予測因子」は、腫瘍学において、薬物を患者に、および患者を薬物にマッチングさせるための、患者の選別ツールである。「臨床反応予測因子」外植片モデルは、検討中の患者の、彼／彼女のタイプの癌についての承認薬のセットに対する反応の予測を支援する、個別化された機能的アッセイである。これは、固形癌の患者の新鮮な腫瘍組織を使用して、特殊コーティングを施した９６／３８４ウェルプレート内で実施される。プレートを、細胞外基質の特定のセットでコーティングする。さらに、患者由来の自己リガンドを培養物に添加する。血管新生因子を添加して、腫瘍血管系を維持する。免疫調節薬の場合には、自己免疫細胞を培養物に添加する。血液学的悪性疾患の場合には、患者の血漿を９６／３８４ウェルフォーマットで培養する。試験は、癌の不均一な性質を考慮して、マルチプリケートで実施する。「臨床反応予測因子」の結果は、反応速度アッセイとエンドポイントアッセイの両方で測定する。細胞生存率、細胞死、細胞増殖、細胞代謝、老化、腫瘍の形態は、評価パラメータの一部である。これらのパラメータの各々を、２つ以上のアッセイによって測定する。例えば、細胞生存率は、ＷＳＴ、ＡＴＰ取り込みおよびグルコース取り込みアッセイによって測定する。細胞増殖および代謝は、Ｋｉ６７、ＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）、ＡＴＰ／ＡＤＰ比およびグルコースの取り込みによって測定する。細胞死は、ＬＤＨ、活性化カスパーゼ３、活性化カスパーゼ８および一酸化窒素合成酵素およびＴＵＮＥＬによって評価する。腫瘍の形態の評価は、Ｈ＆Ｅによる腫瘍細胞含量、腫瘍細胞の大きさ、生存細胞／死細胞の比率、腫瘍細胞／正常細胞の比率、および腫瘍／マクロファージ比、核の大きさおよび密度および完全性、アポトーシス体および有糸分裂像によって評価する。アッセイの各々からの結果は数値形式で表現され、独自のアルゴリズムを使用して、「Ｍスコア」と呼ばれる単一の０〜１００メトリックに変換する。収集された臨床データに基づいて、高いＭスコア（＞６０）が臨床反応と相関し、中程度のＭスコア（２５〜６０）は部分的臨床反応と、低いＭスコア（＜２５）は臨床的反応なしと相関する。
【００３０】
「臨床反応予測因子」外植片モデルを用途において有用にするその特徴は、以下である：
（ｉ）アッセイは１週間以内で行われる。したがって結果は、医師が処置を決定する時間内に利用可能である。
（ｉｉ）少量の組織（〜０．２〜０．５ｃｍ３）を必要とする；組織試料は、手術中またはパンチ生検を介して切除される。試料の要件は、針生検試料の使用を、現在多くの場合に十分ではないために防止する。
（ｉｉｉ）モデルは、可能な限り多数の患者に対して経済的に手頃な料金でできるように構築される。
（ｉｖ）予後用途の文脈においては、薬物の組み合わせが用いられる。
【００３１】
「臨床反応予測因子」の開発を、本開示の図１にさらに示す。図には、患者からの腫瘍組織を、外植片の読み取り、初代ヒト腫瘍異種移植片の読み取りを用いて分析し、次に組織学的分析と共に種々のゲノムおよびプロテオミクスプロファイリングに供し、最終的に化学療法について患者の臨床データと相関をとることが示されている。すべてのこれらの入力パラメータは、一緒になって「臨床反応予測因子」を生成する。統合された前臨床予測モデルは、機能的「臨床反応予測因子」スクリーニングプラットフォームと、それから誘導されるＭスコアに基づいて設計される。腫瘍組織は、診療所から処置の開始前に収集する。臨床転帰（PERCIST／RECIST）データは、３サイクルの化学療法の完了の前後に収集する（図１、上図）。それと共に、切除／生検の後、腫瘍を、患者が受けたものと同じ標準ケア［ＳＯＣ］または標的薬物により、「臨床反応予測因子」主導の外植片プラットフォームを用いて処理する。これは広範な機能的および分子的特徴付けをもたらす（図１、中央図）。同じ元患者からの腫瘍の第２セットは、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖させ［皮下（ｓ．ｃ．）］、in vivoで同一の薬物について試験して、「臨床反応予測因子」主導の外植片プラットフォームの確認とする（図１、下図）。このプラットフォームからの組み合わせのデータを統合してＭスコアを決定し、その後、３〜６サイクルの治療後の患者から得たPERCIST／RECISTと相関をとる。適切に検証された堅固なＭスコアは、個々の成分および既存の標準予測因子とは違って、診療所での差し迫った反応を首尾よく予測する。
【００３２】
一態様において本開示は、「臨床反応予測因子」主導の機能分析が、表３、例５に示すように、抗癌剤のパネルの迅速なスクリーニングを可能にすることを記載する。確立された治験抗癌剤（細胞傷害性および標的化の両方）のパネルは、主にそれらの既知の腫瘍増殖阻害特性に基づいて選択される。これらの薬物のex vivo効力を、患者由来の外植片のパネルに対して、約７２時間増殖（Ｋｉ−６７）および生存率アッセイで試験する。抗癌剤の阻害パーセントは、処置なしの対照に対して決定する。５０％を超える阻害は完全な反応であると考えられる。５０％未満で２０％を超える阻害は部分的な反応であると考えられる。無反応群では、阻害なし（０〜２０％）を示す薬物は無反応であり、安定した疾患と類似であると考えられる。特定の適応症に対して細胞増殖の増加を示す薬物は、進行性疾患であると考えられる。
【００３３】
一態様において、本開示は患者選別ツールを記述し、これは以下により構成される：
（ａ）患者の腫瘍微小環境をプレート上に再現。
（ｂ）腫瘍細胞の生存および細胞シグナリングネットワークを、プレート上に長時間維持する。
（ｃ）患者の無傷（非均質化）腫瘍試料を、複数の抗癌剤で単独または組み合わせのいずれかで処置。
（ｄ）患者の腫瘍試料の、チャレンジされた種々の薬物に対する反応を、複数の直交アッセイにより測定する。
（ｅ）これら複数直交アッセイからの読み取りを組み合わせて、単一の数値メトリックにする。
（ｆ）数値メトリックと、単一薬物または薬物の組み合わせに対する患者の臨床反応の相関をとる。
【００３４】
本方法の概要
本開示で使用されるプロトコルの概要を以下に提供する：
最初のステップは、患者のインフォームドコンセントを得た後の、組織試料収集および血液試料採取である。試料は、ＩＲＢ承認された手順を用いて臨床の連携により得る。それぞれの患者ソースから得られた腫瘍は、外植片および／または異種移植片処理法のいずれかに供される。
外植片処理法において、「臨床反応予測因子」は、原発の患者腫瘍における反応の評価のために行われる。
代替的に、腫瘍ソースが異種移植片である場合、マウスから腫瘍を切除し、以下に述べるようにさらに外植片分析に供する。別の態様において、腫瘍を得てマウスに移植し、その後これを増殖させ、次いで切除し、その後に本「臨床反応予測因子」分析に供する。
組織試料を得た後、これを分割して、ａ）外植片アッセイ、ｂ）ＩＨＣ（免疫組織化学）／Ｈ＆Ｅなどの組織学に基づくアッセイ、およびｃ）原発腫瘍由来の異種移植片からの有効性分析から、各種入力を得る。
【００３５】
Ａ）外植片分析用に与えられた組織試料を、Leicaビブラトーム（Vibratome）を用いて約１００〜３０００μｍ厚さの切片を生成するためにスライスする。これらの切片を、癌タイプ特異的なＥＣＭ組成物でコーティングしたプレート中、４重で、自己血清および任意に種々の薬物を含有する培地を用いて、４８〜９６時間の間培養する。薬物を有し血清／血漿／ＰＢＭＣ／血清由来リガンドを強化した培地は、２４時間毎に交換する。この期間の後、ＭＴＴ／ＷＳＴ分析を行って細胞生存率パーセントを評価する（エンドポイントアッセイ）。培地培養物からの上清を２４時間毎に取り出し、増殖（ＡＴＰおよびグルコース利用実験を用いて）および細胞死（乳酸脱水素酵素アッセイおよびカスパーゼ−３およびカスパーゼ８の測定値の評価によって）について評価して、反応速度応答の傾向を得る。結果は、薬物未処理の対照に対して定量化する。未処理の対照と比較して細胞生存率／増殖の有意な損失は、薬物／組み合わせに対する反応および細胞死の増加の指標である。処理および未処理両方の組織切片もまた、培養期間の終了時に組織学的評価に供される。
Ｂ）組織学的評価のために与えられた組織を、ＴＵＮＥＬおよび活性化カスパーゼ３アッセイによりアポトーシスを評価する。また、細胞増殖を、Ｋｉ６７などの標準的増殖マーカーについてアッセイする。Ｈ＆Ｅもまた日常的に実施して、組織の有糸分裂像、壊死および一般の全体的特徴を評価する。
【００３６】
Ｃ）選択した腫瘍を免疫不全マウスに異種移植片として移植して、連続継代を経た免疫不全マウスにおける組織の膨張および維持を目的として、腫瘍バンクを生成する。
本発明の一態様において、異種移植研究を行って、「臨床反応予測因子」の反応を検証する。異種移植試験用に与えられた試料を用いて約３〜５匹の免疫不全ＳＣＩＤマウスに移植し、薬効予測にその後供される原発腫瘍異種移植片を生成する。上記のように、異種移植法は日常的な手順ではないが、本「臨床反応予測因子」の反応の検証の一部である。「臨床反応予測因子」反応解析の一部として、外植片および異種移植系で試験した化学療法剤および標的療法剤は、腫瘍組織を得た患者に対して臨床医により規定されたレジメンと同一であることが観察される。
【００３７】
試験した固形癌のタイプとは無関係に、上記と同様の手順に従う。異なるタイプの固形癌の間での唯一の手順の違いは、試験する薬物のパネルと、コーティングされたプレートのＥＣＭ組成物である。さらに、血清由来リガンドは、外植片モデルにおいて試験するそれぞれの患者に特有である。
異種移植腫瘍組織の体積が約５００ｍｍ３に達すると、親の患者組織と同一の外植系における組織を試験し、これらのすべての前臨床の読み取り、すなわち異種移植系、外植系および親の患者組織系の読み取りからの有効性データの相関をとることにより、外植系をさらに検証する。原発腫瘍由来の異種移植片についての臨床データおよび有効性データを生成するために要する時間は３〜８ヶ月である。しかし、外植片分析と組織学的評価のための所要時間は約１週間である。
【００３８】
Ｄ）すべての前臨床結果、例えば細胞生存率、アポトーシス、細胞毒性による細胞死、および増殖状態などは、最終的に統合されて、Ｍスコアと呼ばれる単一のスコアを得る。このＭスコアは当初、訓練コホートを使用して構築された。これは、低いＭスコアは乏しい反応を示し、一方高いＭスコアは、臨床設定においてより良好な反応に対応することが見出されている。これはさらに、〜１００の頭頸部腫瘍の検証コホートを使用して検証されたが、ここで腫瘍についてのＭスコアが生成され、臨床転帰と相関された。
「臨床反応予測因子」前臨床結果は約１週間で得られ、臨床転帰は治療の約６ヶ月後に収集される。その後、前臨床結果および臨床転帰から得られた結果を相関させる。同じ「臨床反応予測因子」臨床手順を用いて、反応者と無反応者を識別する；これを、複数の固形癌における臨床転帰と比較する。
本開示の一態様において、「臨床反応予測因子」のアッセイと組み合わせて組織試料を評価し、腫瘍の生物学を理解するための、腫瘍組織の遺伝物質を決定することができる。腫瘍組織を核酸単離に供して、ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析、特異的な突然変異のための遺伝子解析、ＤＮＡのエクソーム配列決定および遺伝子プロファイリングを評価する。
【００３９】
一態様において、薬剤開発／腫瘍シグネチャー／薬物耐性とコンパニオン診断を、以下のように実施する。未処置の腫瘍試料と処置した試料の遺伝子プロファイルを比較することにより、薬物処置に影響を受けた経路が推定される。全ｍＲＮＡプロファイルを見ることで、処置の結果として調節された経路と、薬物反応へのその効果を相関させる。反応者と無反応者のＤＮＡ配列を比較して、反応または無反応のいずれかのシグネチャーを取得する。このように、いずれかの結果のシグネチャーが導出される。薬物耐性の場合は、遺伝物質が外植片内の耐性細胞から単離され、未処置試料と比較して経路調節を見ることにより、耐性の背後にある生物学を理解する。コンパニオン診断の開発のため、外植片読み取りを用いて反応者と無反応者を選別し、基礎となる遺伝情報を用いて、これをその特定の薬物処置のためのコンパニオン診断として使用するための遺伝子シグネチャーに還元する。
【００４０】
本開示の一態様において、「臨床反応予測因子」の利点の１つは、無傷の組織微小環境と細胞構造の両方を維持し、一方で腫瘍−間質相互作用の完全性を維持する能力である。細胞が真正な組織と器官特異性を示すのは、この生物物理学的および生化学的文脈においてである。ここで、細胞構造と微小環境を維持するための、組織切片を用いた外植片培養の方法が記載される。培養培地にはまた患者由来のリガンドが追加的に添加され、天然の環境に近い生理学的に関連するシグナリング経路を模倣する。さらに外植片の試験プラットフォーム系は、癌のタイプに特異的なＥＣＭ組成物を利用する。このようにして外植片系は、天然宿主環境をできるだけ近く模倣する系である。このユニークな系により、腫瘍のシグナリングおよび腫瘍環境内の特定の経路を標的とする小分子阻害剤の効果に関連する、具体的な質問に対処することが可能となる。
【００４１】
一態様において、患者の腫瘍微小環境を模倣するin vitroの局所腫瘍微小環境の作製方法が実施される。腫瘍と間質組織両方の長期の器官培養のための方法が実施され、ここで前記培養は、生理学的に関連するシグナリング系を模倣するヒトリガンドを提供する。宿主の組織微小環境の表現型模写のための、ヒトの免疫エフェクターおよび血管新生因子を含む器官培養が実施される。器官培養において、腫瘍組織は以下の腫瘍を含む固形腫瘍から得る：頭頸部（ＨＮＳＣＣ）、脳、口腔、乳房、胃、食道、結腸直腸（ＣＲＣ）、膵臓、肺、肝臓、腎臓、卵巣、子宮、骨、前立腺、精巣、および、ヒトまたはマウスいずれかに由来するその他の組織、ならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＴＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性Ｂ細胞リンパ腫（ＤＢＣＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む血液の癌。器官培養は、組織を、以下：頭頸部、口腔、乳房、卵巣、子宮、胃腸、結腸直腸、膵臓、前立腺、グリア芽腫、星状細胞腫、黒色腫、甲状腺、腎臓、膀胱、非小細胞肺、小細胞肺、肝臓、骨、およびヒトまたはマウスいずれかに由来する他の組織、からなる群から選択される組織種類から得られる癌のステージおよびタイプに特異的な、細胞外タンパク質または規定の細胞外基質のカクテルで予めコーティングされたプレート内で培養することにより、腫瘍組織の生存率およびネットワークシグナリングを維持するために行われる。
【００４２】
別の態様において、器官培養物にヒト血清から単離したリガンドを補足し、ここで該血清はヒト自己血清、非相同ヒト血清である。さらに、器官培養物に、以下を補足する：ヒト自己血清または非相同ヒト血清、またはヒト自己血漿から単離されたリガンドまたは非相同ヒト血漿から単離されたリガンド、またはヒト自己血液から単離されたリガンドまたは非相同ヒト血液から単離されたリガンド、または非ヒト血清、血漿、もしくは血液から単離されたリガンド、または自己血液から単離されたＰＢＭＣ。
さらに別の態様において、器官培養物にはまた、ヒト自己血液から、または非相同ヒト血液からのものであるかのようにして、ヒト血液から単離された免疫因子が補足される。器官培養物に、ヒト自己血漿、または非相同ヒト血漿、またはヒト自己血液、または非相同ヒト血液、または非ヒト血清、血漿、もしくは血液から単離された免疫因子を補足する。器官培養物にさらに、ヒト自己血清、非相同ヒト血清などのヒト血清から単離された血管新生因子を補足する。器官培養物に、非ヒト血清、血漿、もしくは血液から単離された血管新生因子、または市販の血管新生因子を補足する。
【００４３】
さらに別の態様において、前記器官培養物中の組織は、培養中７日より長く生存する。前記の培養条件および腫瘍組織はまた、シグナリングネットワークを研究するために使用される。さらに、器官培養物中の腫瘍組織を切除し、最大の組織の生存を維持するために処理する。前記器官培養物はまた、癌細胞のスクリーニング、ex vivoでの培養および拡大のために使用される。別の態様において、得られた器官培養物のさらなる処理および凍結保存も行われる。
別の態様において、本腫瘍微小環境の用途は、検討中の患者に対する最適な処置の選択肢の選択である。腫瘍微小環境はまた、検討中の患者に対する抗癌剤の選択、検討中の患者に対して既に選択された薬物と組み合わせる抗癌剤の選択、患者に対する処置の選択肢を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの組合せから決定すること、患者が、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの組合せに反応するかどうかを決定すること、検討中の癌患者の処置のための非癌薬の選択などにおいても、用いられる。
【００４４】
別の態様において、本腫瘍微小環境の用途は抗癌剤の開発にある。腫瘍微小環境は、次のような場合にも用いられる：抗癌剤の前臨床または臨床開発において、調査中の抗癌剤が最適な活性を有する癌のタイプを確認すること、調査中の抗癌剤と組み合わせることができて最適な活性を提供する、最適な標準のケア薬物を確認すること、最適な活性を提供する調査中の抗癌剤の最適容量を確認すること、調査中の抗癌剤と組み合わせることができて最適な活性を提供する、最適な標準のケア薬物の最適用量を確認すること、調査中の抗癌剤を投与することができて、単独でまたは標準のケア薬物と組み合わせて最適な活性を提供する、最適な患者を確認すること。
別の態様において、本腫瘍微小環境の用途は、化学療法薬、標的薬物のためのコンパニオン診断試験の開発にある。腫瘍微小環境はまた、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物のためのコンパニオン診断試験の開発において、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物のための「反応者および無反応者」を確立するために、こうして選択された「反応者および無反応者」の分子プロファイリングのために用いられ、これは、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物に反応しやすい患者を事前に選択するためのコンパニオン診断試験を開発するために用いられ、生物製剤を含む化学療法薬または標的薬物に反応しやすい患者を事前に選択する機能的コンパニオン診断試験として用いられる。
【００４５】
さらに別の態様において、本患者選別ツールの用途は、自己免疫疾患および炎症性疾患のための薬物の開発、および自己免疫疾患および炎症性疾患に使用される薬物のためのコンパニオン診断試験の開発にもある。
一態様において、腫瘍細胞を特異的マーカーの存在についてスクリーニングするための方法が提示され、この方法はＩＨＣおよび他の技術を含み、前記細胞の生存率を決定し、ここで成長および増殖は、腫瘍の状態の指標である。
別の態様において、薬剤を腫瘍に対するそれらの効果についてスクリーニングするための方法が提示され、本方法は、候補薬剤を培養物と接触させること、および該薬剤の、該培養物中の腫瘍細胞に対する効果を決定することを含む。
別の態様において、前記方法／用途は、ヒト起源または動物起源からのものである組織切片を使用する。また、組織は、中枢神経系、骨髄、血液（例えば単球）、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮または結合組織からのものである。さらに、上記の方法において、細胞は幹細胞であるか、または細胞は複数の器官からであるか、または細胞は健康な１または２以上の臓器からであるか、または細胞は罹患した１または２以上の臓器からであるか、または細胞は遺伝的に改変されたか、または細胞はトランスジェニック動物の器官からである。
【００４６】
一態様において、本開示は、腫瘍細胞を特異的マーカーについてスクリーニングするための方法であって、以下の行為：対象の腫瘍組織を請求項３に記載の本腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養すること、および培養腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理して薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価し、複数アッセイの各々に対する評価スコアを得ること、を含む、前記方法に関する。その後、ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡのマイクロアレイ解析を行い、処理前のプロファイルと比較した処理後の経路調節を検出して、推定バイオマーカーを同定する；同一標的の確認は、ＲＴＰＣＲおよびＩＨＣを用いて実施する。
以下の実施例は、本開示の側面をさらに詳述して例示する。しかし、これらの例は、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない
【００４７】
実施例
本開示は、以下の例示的な実施例により本発明の様々な側面を提示し、ここで例１は、本「臨床反応予測因子」分析で使用される、細胞プレート上の好適なＥＣＭ組成物の調製およびコーティングに関する。「臨床反応予測因子」分析システムのセットアップは、例２に詳述される。例１および２はまた、本「臨床反応予測因子」プロセスにおける、本分析用のプレートを癌特異的なＥＣＭでコーティングし、血清由来のリガンドを添加することの重要性を示す。例３は、腫瘍組織の供給源が患者からまたはその異種移植片のいずれかであり得る、外植プロトコル（すなわち「臨床反応予測因子」プロトコル）を提供し；異種移植片腫瘍組織を生成する方法論は、例４で提供される。例５は、「臨床反応予測因子」分析によって得られた結果を検証するために、ＳＣＩＤ／ヌードマウスの腫瘍異種移植片において薬物の治療効力を決定するために使用されるプロトコルを提示する。「臨床反応予測因子」システムはその後、例６および例１４の臨床的検証に示すように、前臨床検証に供される。「臨床反応予測因子」分析で用いるアッセイのプロトコルは例７に提供され、Ｍスコアの概念は例８に示される。「臨床反応予測因子」システムはさらに、例９、１３および１４において、複数の固形癌の反応を予測するために試験される。例１０は、臨床転帰を用いて得られた結果を比較する「臨床反応予測因子」のプロトコル全体を示し、本分析を検証する。例１１および１２は実験データを提供して、本「臨床反応予測因子」分析が、それぞれのバイオマーカー細胞株よりも優れた反応予測因子であることを良好に示す。
【００４８】
例１：好適なＥＣＭ組成物の調製および細胞プレート上へのコーティング：
腫瘍の供給源は、標準的なプロトコルによる患者由来の原発腫瘍組織である。代替的に、原発性ヒト腫瘍組織を免疫不全ＳＣＩＤマウスに皮下移植して、種々の固体癌についての原発性ヒト腫瘍異種移植片を生成する。およそ１０００ｍｍ３の腫瘍体積の測定の後に、腫瘍を異種移植片から切除する。ＥＣＭを、以下に提供されたプロトコルに従って、患者の腫瘍または異種移植片腫瘍組織のいずれかから単離する。
【００４９】
ヒトＥＣＭの単離およびその特徴付け：
外科的に摘出した新鮮な腫瘍組織を１〜２ｍｍの切片に切断し、ディスパーゼ溶液（Stem cell Technologies Inc.）に懸濁して、４８℃で１５分インキュベートした。この組織を、０．０５Ｍ、ｐＨ７．４のトリス、３．４Ｍの塩化ナトリウム、４ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＮ−エチルマレイミドおよびプロテアーゼ（Roche）およびホスファターゼ（phosphatise）阻害剤（Sigma）を含む高塩緩衝液中で均質化する。均質化した混合物を、７０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットを２Ｍ尿素緩衝液（０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０５Ｍ、ｐＨ７．４のトリス）中でインキュベートし、４８℃で一晩撹拌する。次いで混合物を最終的に１４，０００ｇで２０分間遠心分離し、２Ｍ尿素緩衝液に再懸濁し、アリコートで−８０℃で保存する。タンパク質の推定は、ＤＣタンパク質アッセイキット（改変Lowry、Bio-Rad）を用いて行い、定量化用に単離されたＥＣＭタンパク質の量を推定する。組織培養皿のコーティングは、タンパク質抽出物を用いて３７℃で３時間行う。
異なる適応症のための種々の腫瘍組織からのＥＣＭの分離に続いて、これらのＥＣＭの組成を質量分析により分析し、その結果を図１４に示す。異なる原発腫瘍（ＨＮＳＣＣ、胃、膵臓、および大腸の癌）から単離した細胞外基質の異なる成分の分布および存在量を、表１Ａ〜１Ｇに示す。試料を精製し、ＬＣＭＳ分析に供する。主要な基質タンパク質の存在量を、各腫瘍タイプについて示す。前述の表に示すように、ＥＣＭコーティングに必要な成分は各癌のタイプに特異的である。そのため、上記の全データは、特定の腫瘍／癌タイプに向けてウェル上にコーティングされるＥＣＭの組成を識別するのに役立つ。ＥＣＭ混合物中で必要とされる成分の濃度を、次の表１に提供する。
【００５０】
【表１】
2014534809.tif 000003
【００５１】
原発ドナー腫瘍と比較した、異なるタイプの原発性異種移植片腫瘍のＥＣＭの評価の後、コーティング実験を行って、同じタイプの固形癌（例えば結腸）であるが、異なる原発腫瘍異種移植片（別の原発ドナー）から単離されたＥＣＭも試験した。異なってコーティングされたＥＣＭプレートを、外植片で試験した組織のために支持体／足場を提供するそれらの能力に関しても分析する。上記の全データを照合して、特定の腫瘍／癌タイプに向けてプレート上にコーティングすべき最終的なＥＣＭに到達する。 
異なってコーティングされたＥＣＭ基質上の腫瘍組織の生存率を、３７℃、５％ＣＯ２で約３〜約７日の期間にわたってモニタリングし、得られた結果を表１Ａ〜１Ｇにまとめる。 
【００５２】
【表１Ａ−１】
2014534809.tif 000004
【００５３】
【表１Ａ−２】
2014534809.tif 000005
【００５４】
【表１Ｂ−１】
2014534809.tif 000006
【００５５】
【表１Ｂ−２】
2014534809.tif 000007
【００５６】
【表１Ｂ−３】
2014534809.tif 000008
【００５７】
【表１Ｂ−４】
2014534809.tif 000009
【００５８】
【表１Ｃ−１】
2014534809.tif 000010
【００５９】
【表１Ｃ−２】
2014534809.tif 000011
【００６０】
【表１Ｃ−３】
2014534809.tif 000012
【００６１】
【表１Ｃ−４】
2014534809.tif 000013
【００６２】
【表１Ｄ−１】
2014534809.tif 000014
【００６３】
【表１Ｄ−２】
2014534809.tif 000015
【００６４】
【表１Ｄ−３】
2014534809.tif 000016
【００６５】
【表１Ｄ−４】
2014534809.tif 000017
【００６６】
【表１Ｄ−５】
2014534809.tif 000018
【００６７】
【表１Ｅ−１】
2014534809.tif 000019
【００６８】
【表１Ｅ−２】
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【００６９】
【表１Ｅ−３】
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【００７０】
【表１Ｆ−１】
2014534809.tif 000022
【００７１】
【表１Ｆ−２】
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【００７２】
【表１Ｇ】
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【００７３】
上記の表１Ａ〜１Ｇにおいて、「Ｂ」の付いたタンパク質は基底膜タンパク質であり；「Ｃ」の付いたタンパク質は細胞骨格タンパク質であり；「Ｒ」の付いたタンパク質は調節タンパク質であり；「Ｍ」の付いたタンパク質は基質タンパク質であり；「Ｏ」の付いたタンパク質は「その他」である。
表１Ａ〜１Ｇから、異なるソース、すなわちＨ＆Ｎ、胃、膵臓、結腸、食道および脳からの腫瘍試料は、特定の腫瘍タイプのために特に処方されたＥＣＭ混合物でコーティングされたプレート上で、最適な生存率を有することが明らかである。ＥＣＭ混合物はこのように、外植片に使用される固形癌適応症の各々について得られる。
【００７４】
コーティングプロセス：
上記の側面により腫瘍／癌に特定のＥＣＭ混合物が決定されると、特定の癌タイプに対するＥＣＭ混合物が、個々のＥＣＭタンパク質および他の関連成分を添加し、内容物を混合してカクテル（癌特異的）を形成することにより調製される。約９６ウェルプレート上のＥＣＭコーティングが、ウェルの側面を均一に被覆するためのアプリケータスティックを使用することによって達成される。他の場合では、約２００μｌのＥＣＭ抽出物を各ウェルに添加し、約３７℃のインキュベーター中で約２時間乾燥させる。コーティングされたプレートは、滅菌１×ＰＢＳで３回洗浄し、長期保存のために約−２０℃で保存する。
【００７５】
例２：外植片のセットアップ
自己血清リガンドおよび自己血漿リガンドおよび自己ＰＢＭＣを、患者から標準的なプロトコルに従って得る。
例２．１：自己血清リガンドの添加およびＥＣＭコーティングは、天然の腫瘍細胞内シグナリングおよび生存能力を模倣するための腫瘍微小環境を培養物中に再生成する。
別の態様において、図２、３（Ａ）および３（Ｂ）は、可能な限り厳密に宿主の腫瘍微小環境を模倣するように設計された、本外植片系の性質を示す。第１の目標は腫瘍組織の構造を維持することであり、細胞プレートのＥＣＭ成分の重要性が関連する点である。腫瘍ネットワークの生物学を理解し、薬物反応や耐性を解明する場合には、構造的完全性および機能的完全性の両方が重要である。さらに本系は、シグナリングの観点および構造的な観点の両方から、組織の微小環境を無傷で維持することを目的とするように工夫されている。これは、外植片培養において培地に自己血清由来のリガンドを補足することによって行われ、これは天然のシグナリングネットワークの一部である因子を提供するために重要である。これは、小分子阻害剤または標的治療剤または化学療法を試験して、その作用を特定の経路を介して明示することに特に関連する。構造的完全性および機能的シグナリングの完全性の両方を維持した環境を提供することによって、本外植片モデルは、培養における改善された外植片の生存率と、この前臨床モデルが臨床的に意味あることを示す。
【００７６】
自己血清由来リガンドを補足した外植片培養は、無傷の天然シグナリングネットワークを維持するために必要である。自己血清由来リガンドの添加は、天然の組織微小環境（図２）を模倣するために重要なシグナリングネットワークを維持する（図２）。図３のパネルＡおよびＢは、自己血清由来リガンドなしで培養された外植片、およびパネルＤおよびＥは、自己血清由来リガンドを添加した培地で培養した外植片である。
ｃＭｅｔ［ＭＥＴまたはＭＮＮＧ  ＨＯＳ形質転換遺伝子］についてＩＨＣを実施する上で、自己血清由来リガンドの存在下で培養した外植片は、ｃＭｅｔの顕著な存在を示し、自己血清由来リガンドを補足した培地が、天然のシグナリングネットワークの模倣に重要なパラクリン因子を含むという事実を証明する。図３Ａは、癌タイプ特異的ＥＣＭ成分でコーティングされたプレートが、天然の組織微小環境を模倣するために重要である無傷の組織構造を維持することを支援する、適切な支持体／足場を提供することを示す。癌タイプ特異的ＥＣＭ成分でコーティングされたプレート上で培養された外植片は、細胞生存率を改善し、組織構造を維持するための支持体／足場を提供する。ＥＣＭコーティングあり（パネルＣおよびＥ）とＥＣＭコーティングなし（パネルＢおよびＤ）のプレート上で培養された腫瘍組織のＨ＆Ｅ染色。図３Ｂは、ＥＣＭコーティングのプレートで、自己血清由来リガンドを補足した培地で培養された外植片が、改善された細胞生存率を示すことを表す。
【００７７】
例２．２：自己リガンドおよび細胞外基質組成物は、培養における患者腫瘍の微小環境およびシグナリングネットワークを保持する。
ＨＮＳＣＣ患者由来の生検腫瘍を切片にし（〜２００ミクロン）、９６ウェルプレートにて、ＲＰＭＩ培地中、約１０％のＦＢＳ（対照）または約２％自己血清および約８％のＦＢＳ（自己血清）で、約３日間培養する。細胞生存率を、ＷＳＴアッセイにより測定する。パーセント細胞生存率を計算し、ボックスおよびウィスカープロット（図４（ａ））として提示する。ボックス中央部の水平線は平均を示す。下部と上部の境界はそれぞれ２５および７５パーセンタイルを、下限と上限のウィスカーはそれぞれ５および９５パーセンタイルである。対照と比較して＊＊Ｐ＜０。
自己血清の腫瘍の増殖に対する特異的効果を示すＩＨＣデータを、図４（ｂ）のようにプロットする。腫瘍切片をＨ＆ＥおよびＫｉ６７に対する抗体で染色して、形態学的変化および細胞増殖を評価する。画像の倍率は２０倍である。
【００７８】
図４（ｃ）は、細胞外基質組成物の腫瘍生存率に対する効果を示す。培養プレートの内部表面は、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、またはＨＮＳＣＣから単離した細胞外基質（ＥＣＭ）でコーティングし、腫瘍切片は３日間培養する。細胞生存率はＷＳＴにより測定し、生存細胞のパーセントを計算する（平均±標準誤差）。Ｔ７２対照と比較して＊Ｐ＜０．０１（分散分析）。ｎ＝８。図４（ｄ）は、ＥＣＭ組成物の存在下で培養の約３日後の、外植片腫瘍のＩＨＣプロファイルを示す。Ｈ＆Ｅ（左）およびＫｉ−６７（右）。Ｋｉ−６７スコアは、図４（ｅ）に示すように、他のタイプの基質支持体と比較して、ＥＣＭ組成物の優れた効果を示唆する。
自己血清およびＥＣＭ組成物の組み合わせは、増殖に対して、単一の相補体よりも大きい効果を示す、図４（ｆ）。腫瘍切片を約７２時間、対照、自己血清（約２％）、ＥＣＭ組成物（約１００μｇ／ｍｌ）を単独または両方の組み合わせを用いて培養する。Ｋｉ−６７スコアは、培養でのＥＣＭ組成物と自己血清を合わせた存在の利点を示す。Ｔ７２対照と比較して＊Ｐ＜０．０１、ＥＣＭ組成物単独およびＡＳ単独と比較して＊＊Ｐ＜０．０５（分散分析）。ｎ＝５。図４（ｇ）の対応するＩＨＣデータは、ＥＣＭ組成物と自己血清の添加による、Ｋｉ−６７陽性細胞の類似した増加を示す。腫瘍組織をパラフィンに包埋し、切片化して（５ミクロン）、抗Ｋｉ−６７抗体で染色する。
【００７９】
例２．３：ＥＣＭ組成物と、生存率および増殖に及ぼすその影響。
細胞外基質組成物（ＥＣＭ）を、図５（ａ）に示すＥＣＭの成分のパーセント組成に従って、腫瘍組織を培養する前にプレート上にコーティングする。外植片は、ヒト腫瘍異種源から単離されたＥＣＭの異なる用量（１、１０および１００μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレート中で約７２時間培養する。腫瘍細胞の生存率のパーセンテージ（平均±標準誤差）は、ＷＳＴにより測定する。ＡＮＯＶＡにより、Ｔ０およびＴ７２対照と比較して、それぞれ＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。図５（ｂ）に見られるように、ＥＣＭは、用量依存的に腫瘍の生存率を増加させる。全体的な腫瘍内の不均一性および完全性の維持は、Ｈ＆Ｗ（図５（ｃ）、上図）によって決定し、外植片の設定において腫瘍細胞の増殖（図５（ｃ）の下の図）は、Ｋｉ−６７抗体を用いて評価する。データは、トリプリケートで行われた５回の独立した実験の代表である。
【００８０】
例２．４：異なるＥＣＭ組成物の、増殖および癌のシグナリングタンパク質の活性化に対する効果の比較。
培養プレートの内部表面は、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、または結腸癌から単離した細胞外基質（ＥＣＭ）でコーティングし、腫瘍切片は３日間培養する。図６（ａ）に示す外植片腫瘍のＩＨＣ（免疫組織化学）プロファイルは、患者由来のＥＣＭが、標準の単一基質タンパク質よりも、増殖（Ｋｉ６７）およびＥＲＫ１／２のリン酸化に対して大きな効果を発揮することを示す。図６（ｂ）は、対応するＫｉ−６７スコアを示す。ＡＮＯＶＡにより、Ｔ７２対照と比較して＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝５）。図６（ｃ）に示すＫｉ−６７スコアの散布図は、患者に由来するＥＣＭが、同様の条件下で実行された複数の独立した実験において、外植片に対して積極的な影響を及ぼすことを示す。各点は、１つの実験を表す（ｎ＝３３）。水平線は、全試料の平均値を表す。対照と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１。上記の結果は、適切なＥＣＭの存在下で腫瘍を培養することは、腫瘍組織の生存率およびシグナリングを改善して宿主の腫瘍微小環境を模倣することを示している。
【００８１】
例３：
腫瘍組織を患者または異種移植片源から得て、これを下記のように外植片プロトコル／「臨床反応予測因子」に供する。
外植片プロトコル：
１．およそ３×３×３ｍｍの腫瘍スライスの小片（すべて均一サイズおよび壊死塊なし）を生成する。
２．腫瘍試料をLeicaビブラトームを使用して複数の小片に分割して、約１００〜３０００μｍの切片を生成し、予め適当なＥＣＭ組成物でコーティングした９６ウェル平底プレート内でトリプリケートで培養する。
３．腫瘍組織を、約２％の熱不活性化ＦＢＳと共に１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補足した約２ｍｌのＤＭＥＭの馴化培地中に維持する。培養培地に、約２％の血清由来のリガンドまたは約２％の血漿由来のリガンドを１２時間後に補足し、または、９６ウェル当たり１００，０００ＰＢＭＣを、約１０％の自己血清と共に播種し、約３７℃にて多湿条件下５％のＣＯ２で７２時間培養する。
【００８２】
４．血清／血漿／ＰＢＭＣ添加の時に培地を交換する。
５．培地は、サプリメントと共に２４時間毎に交換する。
６．５μｌの使用済み培地を用いて、腫瘍組織の細胞生存率、細胞代謝、細胞死および細胞生理学を決定する。
７．約４８時間から約１２０時間の範囲の培養期間の終わりに、組織を様々なパラメータについて評価する。この期間の後に、ＭＴＴ／ＷＳＴ分析を行ってパーセント細胞生存率を評価する。培地培養物からの上清を２４時間毎に取り出し、増殖（ＡＴＰおよびグルコース利用実験を用いて）および細胞死（乳酸脱水素酵素アッセイの評価およびカスパーゼ−３とカスパーゼ８の測定値によって）について評価して、反応速度応答の傾向を得る。結果は、薬物未処理の対照に対して定量化する。未処理の対照と比較した、細胞生存率／増殖の有意な損失は、薬物／組み合わせに対する反応および細胞死の増加の指標である。処理および未処理両方の組織切片もまた、培養期間の終了時にＩＨＣおよび組織学的評価を受ける。組織学的評価のために与えられた組織を、ＴＵＮＥＬおよび活性化カスパーゼ３アッセイによりアポトーシスについて評価する。また、細胞増殖は、Ｋｉ６７などの標準的な増殖マーカーについてアッセイする。Ｈ＆Ｅもまた日常的に行って、有糸分裂像、壊死および組織の一般的全体的特徴を評価する。
【００８３】
例４：
ＥＣＭ組成物が決定されてウェル上にコーティングされると、患者または異種移植源からの腫瘍が外植片の分析に供される。ヒト腫瘍異種移植片を外植片分析用に生成するため、腫瘍を初めにＳＣＩＤマウスに移植し、その後切除した腫瘍を、外植片プロトコルおよび「臨床反応予測因子」分析に供する。このためのプロトコルは以下の通りである：
【００８４】
動物への移植および腫瘍異種移植片の生成：
サンプル調製：
１．新鮮に取り出したヒト腫瘍試料を、ＤＰＢＳを含有する約５０ｍｌの管に入れる（約５ＭＬ）。
２．試料を取り出し、様々な実験のために試料を切断する。
３．残りの試料を、約２ｍｌのＤＰＢＳを含有する滅菌ペトリ皿に移す。
４．腫瘍を、滅菌メスの刃で消しゴム程度（約５×５×５ｍｍ）の大きさの片にカットする。できるだけ均一な片を作るよう注意すべきである。
動物の準備：
５．首の回りおよび前脚の上に人差し指と中指を置く従来の持ち方で、動物をつかむ。
６．約５〜６週齢の雌ＳＣＩＤマウスの表面を、約７０％ＥＴＯＨで洗浄する。
【００８５】
試料のマウスへの移植：
７．両脇腹の皮下空間を固体の移植のために使用する。
８．マウスの体表面をリンスした後、これを、適切なサイズのノーズコーン内または背側を上に向けてマウスケージの蓋の上に（腹側を下に）配置する。
９．約７０％ （体積／体積）エタノールを飽和させた正方形ガーゼを使用して、背骨中央から尾の付け根までの領域を拭き、トロカールを用いて腫瘍を挿入するための準備をする。
１０．移植の直前に、腫瘍片を約１００ＸＰ／Ｓに漬ける／すすぐ。
１１．トロカールの先端に腫瘍（約５ｍｍ３）の固体片を取り、腫瘍試料を乾燥させることなく、滅菌鉗子またはメスを使って内側に押し込む。
１２．トロカールの先端を、マウスの皮下空間内の尾の付け根の上に水平に挿入し、脇腹を直接覆って、皮下空間内にポケットを導入し、両方の側腹部背側の中央まで挿入し（一度に１つずつ）、この間プランジャー部と針部を固定位置に保持して、腹膜を損傷しないようにする。
１３．腫瘍の個々の片（約５０ｍｇまたは約５ｍｍ３）を、トロカールを使用して作成されたポケットに押し入れる。
１４．トロカールを、挿入された物質を乱すことなく、静かに取り出す。
１５．非毒性材料を用いて、マウスに適切な印を付ける（頭部／身体／尾／無印など）。
【００８６】
動物のフォローアップ： 
１６．マウスを清潔なケージに戻す。 
１７．最初に触診可能な腫瘍（約５０ｍｍ３）が感知され、これが増殖し始める。 
１８．マウスを毎日モニターし、下記のようにキャリパー測定を用いて、腫瘍増殖を毎週測定する。簡単に説明すると、腫瘍の増殖を、生物発光イメージングまたは外部キャリパー測定（腫瘍サイズ＝（長さ×幅×高さ）×０．５２）により、約５〜１６週の間、毎週モニターする。
１９．腫瘍が約７００ｍｍ３の最大サイズに達すると、動物を安楽死させ、腫瘍を取り出して、同じ手順に従う。 
２０．取り出した腫瘍は異なる研究のために複数片に分割する。さらに、肺およびリンパ節、腹部および選択の場合は脳などの潜在的転移部位を取り出して、ホルマリン中に移す。 
２１．動物の腫瘍増殖が遅い場合、増殖を助けるために早期に移植する。全ての動物は１６週の終わりに安楽死させる。
【００８７】
例５：
異種移植片解析による「臨床反応予測因子」を検証するためのプロトコルは以下の通りである：
Ｓｃｉｄ／ヌードマウスの腫瘍異種移植片における薬物の治療効果の決定：
動物の調製：
１．Ｐ１または後継代（Ｐ１またはＰＮ，Ｎ＞１）からのマウスを、有効性試験のために用いる。
動物のフォローアップ＆投薬：
２．マウスを毎日モニターし、下記のようにキャリパー測定を用いて、腫瘍増殖を毎週測定する。
腫瘍体積は以下の式を用いて計算する：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝Ｌ×Ｗ２／２、ここでＬ＝長さ（ｍｍ）、Ｗ＝幅（ｍｍ）。
３．腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３サイズに達すると、動物に適切な薬物（約１用量／週）を約５週間投与する。マウスを毎日モニターし、上記のようにキャリパー測定を用いて、腫瘍増殖を２週毎に測定する。
４．動物を処置の後約４週間、腫瘍の退縮／成長についてフォローする。
５．研究の最後に、標準的な安楽死の手順に従い、ＣＯ２チャンバーを用いてマウスを安楽死させ、腫瘍試料を収集する。
本開示における試験に使用される薬物の詳細なリストを、次の表２に示す。このリストは例示目的のためのみであり、非限定的かつ非網羅的である。
【００８８】
【表２−１】
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【００８９】
【表２−２】
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【００９０】
【表２−３】
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【００９１】
【表２−４】
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【００９２】
【表２−５】
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【００９３】
例６：外植片系の前臨床検証： 
腫瘍から生成された腫瘍異種移植片（ＨＴＸ）は、患者の腫瘍と類似していることが知られているので、かかる系から得られる有効性の読み取りは、その処置に対する患者の反応の指標である。本外植片系において、薬物の組み合わせで処理したＨＴＸの感受性は、同じ腫瘍についての外植片からの反応結果に非常に類似しており、「臨床反応予測因子」外植片系が、薬物または薬物の組合せに対する患者の反応について高い予測性を有することを示す。同様のことが、以下のサブ実施例により説明される。
【００９４】
例６．１：ヒト腫瘍異種移植片の初期の継代は、元の腫瘍の分子特性を保持している。
ヒト腫瘍異種移植片の初期の継代は、元の腫瘍の分子特性を保持している。図７（Ａ）は、Genespring GXソフトウェアによって生成された３ＤのＰＣＡプロットを表し、同じ起源および継代の試料の緊密なクラスタリングを示す。プロットは、結腸癌の約４対およびＨＮＳＣＣの約２対の試料を含む、約６つの明確なクラスターを示す。結腸癌およびＨＮＳＣＣの教師無し（unsupervised）の２次元階層クラスタリングを、図７のパネルＢに示す。
【００９５】
例６．２：ヒト腫瘍異種移植片および患者腫瘍の初期の継代に由来する腫瘍外植片培養物は、同一の抗腫瘍効果を発揮する。
ヒト腫瘍異種移植片の初期の継代および患者腫瘍に由来する腫瘍外植片培養物は、同一の抗腫瘍効果を示す。原発ドナー腫瘍（Ｐ０）およびそれから生成されたポスト移植片（Ｐ１およびＰ２）由来の外植片を、ＴＰＦ（シスプラチン、ドセタキセル、５ＦＵ）または対照としてＤＭＳＯ［ジメチルスルホキシド］で処理する。処理の約７２時間後に、生存率をＷＳＴにより測定し、生存率のパーセント阻害を、対応するＤＭＳＯ対照を１００％として算出する（平均±標準誤差）（図８ａ）。Ｐ０およびＰ１、Ｐ２腫瘍に起因する外植片のＴＰＦ処理後のＫｉ−６７免疫反応性パターン。像倍率は２００×（図８ｂ）である。外植片内で増殖している細胞の減少を示す代表的Ｋｉ−６７スコアは、フィールドごとのＫｉ−６７陽性細胞の計算（トリプリケートの平均±ｓ．ｅ．ｍ．）に基づいて測定する。ＡＮＯＶＡにより、対応する対照と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ｎ＝４（図８ｃ）。データは、親腫瘍とその後の異種移植片が、ＴＰＦに対して同じ反応状態を維持することを示し、もともと無反応性の原発腫瘍が、その後の異種移植片と同一のパターンを維持することが見出された。
【００９６】
ＴＰＦおよびセツキシマブの腫瘍外植片培養物に対する抗腫瘍効果は、ヒト腫瘍の異種移植モデルと類似する。ＨＮＳＣＣ患者由来の生検腫瘍を切片にし（〜２００ミクロン）、ＥＣＭをコーティングした９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ培地中約２％の自己血清および約８％のＦＢＳで、ＤＭＳＯ（対照）およびドセタキセル、シスプラチンおよび５−ＦＵ（ＴＰＦ）を用いて約３日間培養する。細胞生存率をＷＳＴにより測定し、パーセント細胞生存率を算出する。図９（ａ）のボックスプロットは、ＴＰＦで処理した腫瘍における、生存率の有意な阻害を示す。対応のあるＴ検定により、複数ドナー（ｎ＝２０）において対照と比較して＊＊ｐ＜０．００１。図９（ｂ）は、対応するＩＨＣプロファイルを示す。ＤＭＳＯ（対照）およびＴＰＦで処理した腫瘍切片をＨ＆ＥおよびＫｉ−６７で染色する。散布図は外植片試料を表し、ＴＰＦへの反応を差別的に示す（Ｔ７２対照に対する正規化された阻害倍率）。各ドットは１つの実験を表す（ｎ＝５０）。水平のラインは、全試料の平均値を表す。無反応者は、反応者と比較して、阻害の非常に低いレベルを有している。図９（ｃ）は、in vivoでの腫瘍増殖阻害を示す。同一患者の腫瘍を、免疫不全マウスで増殖させる。腫瘍を有するマウスは、毎日通常の生理食塩水（対照）および（ＴＰＦ）で２１日間処置する。腫瘍体積を、示した時点で測定する。データは、群あたり６匹のマウスの平均腫瘍体積±ｓｅｍである。対応するビヒクル対照と比較して、＊Ｐ＜０．００１。腫瘍を切断して秤量し、残存腫瘍のパーセントを計算する。処置終了時の腫瘍の代表的なＩＨＣ特性を図９（ｄ）に示す。対照およびＴＰＦ群両方の安楽死させたマウスから切除した腫瘍を包埋し、切片化し、指示に従ってＨ＆Ｅ、Ｋｉ−６７およびＴＵＮＥＬ染色する。スケールバー５０μｍ、および挿入図は１００μｍ。
【００９７】
ＨＮＳＣＣ患者由来の生検腫瘍を切片にし（〜２００ミクロン）、ＥＣＭをコーティングした９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ培地中約２％の自己血清および約８％のＦＢＳで、ＤＭＳＯ（対照）およびセツキシマブを用いて約３日間培養する。細胞生存率をＷＳＴにより測定する。図９（ｅ）のボックスプロットは、複数の実験におけるセツキシマブで処理した腫瘍における細胞生存率の阻害パーセントを、対応する対照と比較して示す（ｎ＝２０）。対応のあるＴ検定での計算により、複数回対照と比較して＊＊ｐ＜０．００１。代表的なＩＨＣ図、図９（ｆ）は、増殖および形態の変化を示す。ＤＭＳＯ（対照）およびセツキシマブで処理した腫瘍切片を、Ｈ＆ＥおよびＫｉ−６７で染色する。散布図は外植片試料を表し、セツキシマブへの反応を差別的に示す（Ｔ７２対照に対する正規化された阻害倍率）。各ドットは１つの実験を表す（ｎ＝４０）。水平のラインは、全試料の平均値を表す。対照と比較して＊＊Ｐ＜０．００１。図９（ｇ）は、セツキシマブで処置したマウスにおける腫瘍増殖阻害を示す。セツキシマブ外植片培養に用いたＨＮＳＳＣ腫瘍（ｅ）を免疫不全マウスで増殖させ、通常の生理食塩水（対照）または（セツキシマブ）で週３回、約２３日間処置する。腫瘍体積を、示した時点で測定する。データは、群あたり１０匹のマウスの平均腫瘍体積±ｓｅｍである。対応するビヒクル対照と比較して、＊Ｐ＜０．００１。図９（ｈ）は、in vivoでの腫瘍阻害に類似した分子変化を示すＩＨＣデータを表す。腫瘍は、セツキシマブの最終投与の約６時間後に、安楽死させたマウスから採取する。腫瘍切片を、Ｈ＆Ｅ、Ｋｉ−６７、ＴＵＮＥＬおよびｐ−ＥＲＫで染色する。スケールバー５０μｍ、および挿入図は１００μｍ。
【００９８】
例６．３：「臨床反応予測因子」主導による薬物反応プラットフォームとin vivo有効性の相関。
ＴＰＦ／セツキシマブで処理した外植片から得られたデータを、生存率の阻害、増殖およびアポトーシスの誘導を評価するために独立してスコア付けする。各アッセイの相対的な寄与を、実施例８に詳述されるようにして決定する。最終的な複合「臨床反応予測因子」反応スコア（阻害）の算出は、腫瘍阻害の全要素を統合し、同一の個別患者の腫瘍および薬物をＨＴＸで用いてin vivoでの有効性試験から得られた腫瘍増殖阻害データと相関させることにより行う。スピアマンの相関係数法を用いて、線形の関連を算出する。Ｒ２値は、in vivoでの反応と「臨床反応予測因子」による反応の間の正の相関関係を表す（ｎ＝１５）（図１０）。「臨床反応予測因子」に見られる腫瘍抑制のレベルは、ＨＴＸモデルで見られたものに対応する。
【００９９】
例７：外植片プロトコルで用いるアッセイ
患者または異種移植片源から得られた腫瘍試料は、その後、次のアッセイにより「臨床反応予測因子」分析に供して、Ｍスコアを得る。Ｍスコアの概念は、例７に詳述されている。
例７．１：細胞生存率を決定するためのアッセイ：
ａ）固形腫瘍外植片の組織の生存率を測定するためのＭＴＴアッセイ：
定型的ＭＴＴアッセイの修正版（Veira V et al Max Loda Lab PNAS 2010）を使用する。簡潔には、組織をビブラトームにより正確に等分に切断し（４００ミクロンのスライス）、ＲＰＭＩ１６４０［RPMI - Roswell Park Memorial Institute］中、約６０％〜約１００％の、好ましくは約８０％の濃度で、最大７２時間まで培養する。組織生存率を、ＭＴＴ  １−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３，５−ジフェニルホルマザンアッセイ（Sigma Aldrich）を用いて、Ｔ０およびＴ７２の時点に評価する。組織切片は、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴで３７℃で４時間インキュベートし、採取し、析出した塩を、０．１ＭのＨＣｌ−イソプロピルアルコールによる室温で２５分のインキュベーションにより抽出する。生存率の値は、５７０ｎｍでのホルマザンの光学密度を、外植片の乾燥重量で割り算することによって決定する。ベースライン試料（Ｔ０）はキャリブレータ（１×）として用いて吸光度測定における試料間の変動を正規化し、組織生存率を、Ｔ０試料に対する生存率のパーセンテージとして表す。異なる癌のタイプについて、外植片における組織切片は、異なる薬物を含有する培地を用いてピーク血漿濃度で最大７２時間までインキュベートする。薬物を含有する培地は２４時間毎に交換し、ＭＴＴは、通常通りＴ７２とＴ０の時点で行う。薬物の有効性を評価するために、試験の終わりにおける組織の生存率を、組織がいかなる薬物にも曝露されていない前記Ｔ０の時点での組織の生存率と比較して、等級分けする。
【０１００】
ｂ）ＷＳＴ分析
簡潔には、組織をビブラトームにより正確に等分に切断し（４００ミクロンのスライス）、ＲＰＭＩ１６４０［RPMI - Roswell Park Memorial Institute］中、約６０％〜約１００％の、好ましくは約８０％の濃度で、最大７２時間まで培養する。組織生存率をＷＳＴアッセイにより評価する。７２時間のインキュベーションの終わりに４０μｌのＣＣＫ−８（細胞計数キット−８、Dojindo Laboratories, Japan）を各ウェルに添加し、インキュベーションを３７℃／５％ＣＯ２でさらに３時間続けた。インキュベーションの間、プレートをマイクロプレートシェーカー上、培養器の中で約９０ｒｐｍで静かに攪拌した。約３時間のインキュベーションの終わりに、組織切片を注意深く取り出してそれぞれの１０％ホルマリン管に入れ、免疫組織化学試験に供する。並列して、吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad, USA）を用いて４５０ｎｍで測定する。
【０１０１】
ｃ）ＡＴＰ利用アッセイ：
アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）は、すべての生物の化学における中心的分子であり、多くの生物学的プロセスをモニターするために使用される。ＡＴＰの利用は、StayBriteTMＡＴＰアッセイキット（BioVision）を用いて検討する。微小のＡＴＰレベルを検出する正確で信頼性の高い方法は、ルシフェラーゼ／ルシフェリンである。アッセイは高スループット用に完全に自動化されており（１秒／試料）、非常に感度が高く、ＡＴＰ産生の検出に最適である。
【数１】
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標準曲線：試料中のＡＴＰ絶対含有量を算出するために、ＡＴＰ標準曲線を作成する。約１０μｌのＡＴＰ原液を約９９０μｌの溶解緩衝液に加えて、約１０−４ＭのＡＴＰ溶液を生成し、Ｓ１とラベルを付けた管に入れ、次に３〜５本のさらなる１０倍希釈液を生成する（すなわち、約１０μｌ＋約９９０μｌの溶解緩衝液で、約１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７ＭのＡＴＰを含有するＳ２、Ｓ３、Ｓ４等）。
【０１０２】
測定：約１０μｌの試料または標準を、９６ウェルプレートに加える。約９０μｌの調製した反応ミックスをウェルに加え、混合し、次にルミネッセンス（Ｌ）を読みとる。（約１０μｌの１０−４ＭのＡＴＰはウェル当たり約１ｎｍｏｌをもたらし、約１０μｌの１０−７ＭのＡＴＰはウェル当たり約１ｐｍｏｌをもたらす、など）。バックグラウンド発光（ＢＬ）を補正するため、まず約９０μｌの反応ミックスのみを加え、バックグラウンド発光（ＢＬ）を読み取り、次に約１０μｌの試料または標準をウェルに加え、混合して、総発光（Ｌ）を読み取る。
計算：ＢＬを試料および標準のそれぞれのＬから差し引くことにより、バックグラウンドを補正する。標準曲線をプロットする。試料ウェル中のＡＴＰ量を、線形回帰を用いて標準曲線から算出する。試料中のＡＴＰ濃度は、次の式を用いて算出することができる。
Ｃ＝Ｓａ／Ｓｖ（ｐｍｏｌ／μｌまたはｎｍｏｌ／ｍｌ、またはμＭ）
ここで、Ｓａは標準曲線からの試料の量（ｐｍｏｌ）である。
Ｓｖは、試料ウェルに加えた試料の体積（μｌ単位）である。
ＡＴＰ分子量：５０７．１８ｇ／ｍｏｌ。
【０１０３】
ｄ）グルコースアッセイ（GOD-POD法）
約２μｌの上清を試験プレートの各ウェルから採取し、９６ウェルプレートに添加する。標準として、同様に約２μｌのグルコース標準試薬（コンク１００ｍｇ／ｄｌ）もトリプリケートで９６ウェルプレートに添加する。これらのウェルに、約２００μｌのグルコース試薬（Medsource Ozone）添加し、室温で約１０分間インキュベートする。吸光度をBioRadプレートリーダーを用いて約４９０ｎｍで測定する。グラフをプロットし、Graph Pad Prismソフトウェアを用いて分析する。
【０１０４】
例７．２：細胞死を決定するためのアッセイ
ｅ）乳酸脱水素酵素アッセイ
乳酸脱水素酵素の評価は、ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Cayman）を用いて行う。第１のステップにおいて、ＬＤＨは、乳酸からピルビン酸への酸化による、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨとＨ＋への還元を触媒する。反応の第２ステップでは、ジアホラーゼは、新たに形成されたＮＡＤＨとＨ＋を用いて、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の、４９０〜５２０ｎｍで強く吸収する高発色のホルマザンへの還元を触媒する。生成されるホルマザンの量は、細胞毒性の結果として、培養培地中に放出されるＬＤＨの量に比例する。
プレートセットアップ：各プレートは、標準曲線、細胞を含まないウェル、および実験的処置またはビヒクルを有する細胞を含むウェルを含む。
【０１０５】
９６ウェル組織プレートを、約４００×ｇで５分間遠心分離する。新しい９６ウェルプレートを用いて、上記のように調製した約１００μｌの標準液を、適切なウェルに移す。培養細胞の各ウェルからの約１００μｌの各上清を、新しいプレート上の対応するウェル移す。約１００μｌの反応溶液を、リピートピペットを用いて各ウェルに加える。プレートを、オービタルシェーカー上で穏やかに振盪しながら室温で約３０分間インキュベートする。プレートリーダーを用いて約４９０ｎｍでの吸光度を読み取る。
計算：アッセイ緩衝培地のみを含有するウェル（ブランク）の平均吸光度値を、他のすべてのウェルの吸光度値から差し引く。標準曲線を、ＬＤＨ濃度の関数として４９０ｎｍでの吸光度についてプロットし、直線の方程式を決定する。試料中に存在するＬＤＨ活性は、以下の式を用いて決定する：
【数２】
2014534809.tif 000031
【０１０６】
ｆ）カスパーゼ３アッセイ
ＣＰＰ３２／カスパーゼ３蛍光定量プロテアーゼアッセイキット（Bio Vision）を用いて、ＤＥＶＤ依存性カスパーゼ活性を分析する。アッセイは、基質ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（ＡＦＣ：７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン）の切断の検出に基づく。ＤＥＶＤ−ＡＦＣは青色光を発する（λｍａｘ＝４００ｎｍ）；ＣＰＰ３２または関連カスパーゼによる基質の切断の際に、遊離のＡＦＣは黄緑色の蛍光を発し（λｍａｘ＝５０５ｎｍ）、これを蛍光光度計または蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化する。アポトーシス試料と非誘導対照からのＡＦＣの蛍光を比較することにより、カスパーゼ３／ＣＰＰ３２活性の増加倍数の決定が可能となる。
【０１０７】
アッセイ手順
１．所望の方法により、細胞にアポトーシスを誘導する。同時に誘導なしの対照培養物をインキュベートする。
２．細胞をカウントし、約１〜５×約１０６個の細胞をペレット化するか、または２０〜２００μｇの細胞溶解物を用いる（アポトーシスレベルに応じて）。
組織試料については、組織を溶解緩衝液中で均質化して（１×体積の組織について、約３×体積の溶解緩衝液を加える）組織溶解液を生成し、その後キットの手順に従う。
３．細胞を、約５０μｌの冷却した細胞溶解緩衝液に再懸濁する。
４．細胞を氷上で約１０分間インキュベートする。
５．各試料に、約５０μｌの２×反応緩衝液（約１０ｍＭのＤＴＴを含有）を加える。
６．約５μｌの約１ｍＭのＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質（約５０μＭの最終濃度）を加え、約３７℃で約１〜２時間インキュベートする。
７．４００ｎｍの励起フィルターと５０５ｎｍの発光フィルターを装備した蛍光光度計で、試料を読み取る。プレート読取設定のために、試料を９６ウェルプレートに移す。アッセイ全体は、９６ウェルプレート内で直接行うこともできる。
ＣＰＰ３２活性の増加倍数は、これらの結果を非誘導対照のレベルと比較することによって決定する。
【０１０８】
ｇ）カスパーゼ８アッセイ
ＦＬＩＣＥ／カスパーゼ８蛍光定量アッセイキット（Bio Vision）を用いて、配列ＩＥＴＤを認識するカスパーゼの活性を分析する。アッセイは、基質ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（ＡＦＣ：７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン）の切断の検出に基づく。ＩＥＴＤ−ＡＦＣは青色光を発する（λｍａｘ＝４００ｎｍ）；ＦＬＩＣＥまたは関連カスパーゼによる基質の切断の際に、遊離のＡＦＣは黄緑色の蛍光を発し（λｍａｘ＝５０５ｎｍ）、これを蛍光光度計または蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化する。アポトーシス試料と非誘導対照からのＡＦＣの蛍光を比較することにより、ＦＬＩＣＥ活性の増加倍数の決定が可能となる。
【０１０９】
アッセイ手順
１．所望の方法により、細胞にアポトーシスを誘導する。同時に誘導なしの対照培養物をインキュベートする。
２．細胞をカウントし、約１〜５×約１０６個の細胞をペレット化するか、または、タンパク質濃度が測定されている場合には５０〜２００μｇの細胞溶解物を用いる。
３．細胞を、約５０μｌの冷却した細胞溶解緩衝液に再懸濁する。細胞を氷上で約１０分間インキュベートする。
４．各試料に、約５０μｌの２×反応緩衝液（約１０ｍＭのＤＴＴを含有）を加える。約５μｌの約１ｍＭのＩＥＴＤ−ＡＦＣ基質（５０μＭの最終濃度）を加える。約３７℃で約１〜２時間インキュベートする。
７．４００ｎｍの励起フィルターと５０５ｎｍの発光フィルターを装備した蛍光光度計で、試料を読み取る。プレート読取設定のために、試料を９６ウェルプレートに移す。アッセイ全体は、９６ウェルプレート内で直接行うこともできる。ＦＬＩＣＥ活性の増加倍数は、これらの結果を非誘導対照のレベルと比較することによって決定することができる。
【０１１０】
例７．３：細胞老化を決定するためのアッセイ：
ｈ）老化関連β−ｇａｌ染色
組織切片の場合には、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物に埋め込まれた液体窒素（ＬＮ２）中の凍結組織を、スーパーフロストスライドに載せる。次いで、細胞を約３７℃で約２０時間、染色溶液（約４０ｍＭのクエン酸リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、約１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−イソリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド［X-gal, Fisher］、約５ｍＭのフェリシアン化カリウム、約５ｍＭのフェロシアン化カリウム、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、約２ｍＭのＭｇＣｌ２）を用いてインキュベートする。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、青色染色のための明視野顕微鏡下で観察する。
【０１１１】
例７．４：組織学的評価のためのアッセイ／ＩＨＣアッセイ：
ｉ）免疫組織化学（ＩＨＣ）分析：
腫瘍を、約１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。腫瘍切片を切断し（約５μｍ）、キシレン中で脱パラフィン化し、続いて減少グレードのエタノール中で再水和する。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。抗原検索を、VectorR抗原アンマスキング溶液（クエン酸ベース、Vector Laboratories）にて約３０分間マイクロ波加熱に曝露することにより実施する。スライドを冷却させ、続いてトリス緩衝生理食塩水で洗浄する。内因性ペルオキシダーゼの急冷は、切片を約３％のＨ２Ｏ２中で約１５分間インキュベートすることによって行う。タンパク質ブロッキングは、室温で約１０％ヤギ血清を用いて約１時間行う。その後のインキュベーションステップに続いて、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄する。切片は、上記の条件で一次抗体と共にインキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（SignalStain R Boost IHC検出試薬、Cell Signaling Technology）と共に室温で１時間インキュベートする。シグナルの発色現像は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット；Vector Laboratories）を使用して行う。組織をヘマトキシリン（パパニコロウ溶液１ａ；Merck）で対比染色する。
【０１１２】
ウサギモノクローナルホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３；D9E XPTM）とホスホ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）（クローン４０Ｈ９、Cell Signaling Technology）を、約４℃で一晩のインキュベーションのためにそれぞれ約１：５０および約１：１００希釈で用いる。ウサギモノクローナルホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（ｐＳ６ＲＰ）（Ｓｅｒ２３５／２３６；D57.2.2E XPTM）とホスホ−ＰＲＡＳ４０（Ｔｈｒ２４６、Ｃ７７Ｄ７）は、Cell Signaling Technologyから得て、約４℃で一晩のインキュベーションのために約１：２００希釈で使用する；約１：２００希釈のウサギポリクローナル抗ＧＬＵＴ１（Abcam）を、約２５℃から約３５℃の範囲の室温（ＲＴ）で約１時間のインキュベーションのために用いる；ウサギポリクローナルＫｉ６７（Vector Laboratories）を、室温で約１時間、約１：１６００希釈で使用する。アポトーシスの誘導は、ポリクローナル抗切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）抗体（ウサギポリクローナル、Cell Signaling Technology）を約１：１６００希釈で室温で約１時間用いて、切断されたカスパーゼ３を染色することにより検出する。適合するＩｇＧアイソタイプ対照を、各一次抗体について用いる。各スライドは、２人の専門家により独立して検査され、スコア付け／等級付けはＨスコアの式に従って行う。
【０１１３】
ｊ）固定組織の免疫組織化学染色−ホスホＥＲＫ／ホスホＥＧＦＲ
この技術を支える基本原理は、増幅されて可視化される抗原抗体反応である。標的抗原は、固定時に引き起こされるタンパク質の折り畳みにより、抗体に物理的にアクセスできなくなる場合がある。これは、熱を用いてタンパク質の折り畳みを変更することで抗原がよりアクセスしやすくなる、抗原回復と呼ばれる手順によって克服される。内因性ペルオキシダーゼの急冷、タンパク質ブロックおよび内因性ビオチンのブロッキングは、バックグラウンド染色および非特異的結合を回避するための重要なステップである。この標準化されたプロトコルは、標的抗原に特異的に結合する一次抗体（通常ウサギ／マウスｍＡｂ）；一次抗体に結合するビオチン化二次抗体（通常は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ）；および二次抗体に結合したビオチンを標的とするアビジンビオチン複合体（ＡＢＣ；アビジンに結合して複合体を形成する、ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ）、を含む三層検出システムを使用する。抗体は、抗原およびシグナル増幅の検出を支援する。ＡＢＣ中に存在するペルオキシダーゼ酵素は、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）が、顕微鏡下で可視化することができる褐色の沈殿物を生成し、最終的に標的抗原を検出する反応を触媒する。
【０１１４】
手順：
１．脱パラフィン化および再水和を、以下に示すようにして行う：
【表１６】
2014534809.tif 000032
２．これに抗原回復が続く
ａ．調製：１Ｌのビーカー内に、約６００ｍＬの蒸留水＋約５．６ｍＬの抗原アンマスキング溶液（Vector Labs #H-3300）。
ｂ．スライドを溶液に約１０分間浸す。
ｃ．ビーカーの内容物およびスライドを以下のように電子レンジにかける：
Ｍ−低：約５分
中：約５分
Ｍ−高：約５分
高：約５分
ｄ．ビーカーを水道水を満たした槽中に置くことによって、スライドを室温に冷却する。
ｅ．スライドを蒸留水で約５分間ずつ約４回洗浄する（コプリンジャー）。
ｆ．スライドを１×ＰＢＳで５分間洗浄する（コプリンジャー）。
【０１１５】
３．内因性ペルオキシダーゼを急冷する
ａ．新鮮な調製：約９ｍＬのＨ２Ｏ２（３０％ ）＋約７５ｍＬの蒸留水
ｂ．スライドをＨ２Ｏ２溶液中で約１５分インキュベートする（コプリンジャー）。
ｃ．スライドを水道水の流水中で約２分間洗浄する。
ｄ．スライドを１×ＰＢＳで約７分間洗浄する（コプリンジャー）。
ｅ．疎水性パップペンを使用して組織を旋回する（これは、抗体の体積をできる限り小さくするために行う）。
４．タンパク質のブロッキングを実施。これ以降のステップには、加湿チャンバー（ウェットワットマン濾紙付きのトレイ）が必要である。
ａ．約１０％ヤギ血清を調製する（２５０μＬのヤギ血清＋２．５ｍＬの１×ＰＢＳ）
ｂ．約７５μＬのヤギ血清を各組織切片に添加し、約１時間インキュベートする。
ｃ．血清を捨てる。洗浄は不要。
５．アビジン／ビオチンブロック（Vector Labs #SP2001より入手）を実施
ａ．アビジンおよびビオチンの必要量を２本のエッペンドルフ管に分注する。
ｂ．約７５μＬのアビジンを各組織切片に添加し、約１５分間インキュベートする。
ｃ．アビジンを捨て、スライドを１×ＰＢＳで短時間すすぐ（コプリンジャー）。
ｄ．約７５μＬのビオチンを各組織切片に添加し、約１５分間インキュベートする。
ｅ．スライドを１×ＰＢＳで短時間すすぐ（コプリンジャー）。
【０１１６】
６．一次抗体を添加する
ａ．約１：２００のホスホ−Ｅｒｋ／ホスホ−ＥＧＦＲ（Cell Signalling Technology #4370/#2237より入手）と１×ＰＢＳを調製する。
ｂ．約７５μＬを各組織切片に添加し、約１時間インキュベートする。
ｃ．スライドを１×ＰＢＳで３回、それぞれ約３分間洗浄する（コプリンジャー）。
７．続いて二次抗体を添加する
ａ．１：１０００のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector Labs #BA-1000）と１×ＰＢＳを調製する。
ｂ．約７５μＬを各組織切片に添加し、約３０分間インキュベートする。
ｃ．スライドを１×ＰＢＳで３回、徹底的にそれぞれ約５分間洗浄する（コプリンジャー）。
８．ＡＢＣ試薬（Vector Labsより入手；Vectastain ABC Kit Peroxidase Goat IgG #PK-4005）を添加する
ａ．試薬を調製する：溶液Ａを約１滴＋溶液Ｂを約１滴＋約２．５ｍＬの１×ＰＢＳ。室温で使用する前に試薬を約３０分間インキュベートする。余分量は、約４℃で１か月まで保存することができる。
ｂ．約７５μＬの試薬を各組織切片に添加し、約３０分間インキュベートする。
ｃ．スライドを１×ＰＢＳで３回、それぞれ約５分間洗浄する（コプリンジャー）。
【０１１７】
９．ＤＡＢ基質（Vector Labs #SK4100）
次のステップは、暗室で実施する。
ａ．新鮮な調製、ＤＡＢ基質：緩衝液を約１滴＋ＤＡＢを約２滴＋約２．５ｍＬの二重蒸留水中、約１滴のＨ２Ｏ２。
ｂ．約７５μＬの試薬を各組織切片に添加し、顕微鏡下で観察して、適切な露光時間を決定する。
ｃ．試薬を過マンガン酸カリウム溶液中に捨て、スライドを水道水で洗浄する。
１０．スライドをヘマトキシリンにより対比染色する
ａ．スライドをヘマトキシリンに２〜３回浸す。
ｂ．スライドを水道水の流水で約５分間洗浄する。
ｃ．スライドを約１％の炭酸リチウム溶液で約３０秒間洗浄する。
ｄ．７０％エタノール−１回洗浄−約３分間
ｅ．９５％エタノール−１回洗浄−約３分間
ｆ．１００％エタノール−２回洗浄−約３分間
ｇ．キシレン−２回洗浄−約３分間
１１．スライドの装着はＤＰＸ（Merck #61803502501730より入手）を用いて実施
ａ．スライドを清潔なカバーガラスと共にＤＰＸを使用して装着し、これを乾燥させる。
ｂ．適切にラベルを付ける。
【０１１８】
ｋ）固定組織のＴＵＮＥＬ染色 
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）は、核酸の末端を標識することにより、ＤＮＡの断片化を検出する方法である。ＴＵＮＥＬを用いて、アポトーシスのシグナリングカスケードに起因するＤＮＡの断片化を検出する。アッセイはＤＮＡにおけるニックの存在に依存し、これは、マーカーで二次標識されているｄＵＴＰの付加を触媒する酵素である、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはＴｄＴによって同定することができる。これはまた、重度のＤＮＡ損傷を受けた細胞も標識することができる。
【０１１９】
手順：
１．第１ステップは、脱パラフィン化および再水和が関与する：
【表１７】
2014534809.tif 000033
２．これに抗原回復が続く
ａ．約１：１０００のプロテイナーゼＫ（Qiagen # 19131）と１×ＰＢＳを調製する。
ｂ．約５０μＬを各組織切片に添加し、約５分間インキュベートする。
ｃ．スライドをｄＨ２Ｏで２回、それぞれ約２分間洗浄する（コプリンジャー）。
３．内因性ペルオキシダーゼにより急冷する
ａ．新鮮な調製：約７．５ｍＬのＨ２Ｏ２（３０％ ）＋約６７．５ｍＬの蒸留水
ｂ．スライドをＨ２Ｏ２溶液中で約５分インキュベートする（コプリンジャー）。
ｃ．スライドを水道水の流水で約２分間洗浄する。
ｄ．スライドを１×ＰＢＳで２回、約５分間洗浄する（コプリンジャー）。
ｅ．疎水性パップペンを使用して組織を旋回する（これは、抗体／試薬の体積をできる限り小さくするために行う）。
【０１２０】
４．次に平衡緩衝液による処理を行う。これ以降のステップには、加湿チャンバー（ウェットワットマン濾紙付きのトレイ）が必要である。
ａ．約１３μＬの平衡緩衝液を各組織切片に添加し、少なくとも約１０秒間（約６０分までは可能）インキュベートする。
ｂ．試薬を捨てる。洗浄は不要。
５．ＴｄＴ酵素を添加する
ａ．ＴｄＴ酵素を反応緩衝液中、約３：７の割合で希釈する（例えば：約３０μＬのＴｄＴを約７０μＬの反応緩衝液に）
ｂ．約１５μＬを各組織切片に添加し、加湿チャンバー内で約３７℃にて、約１時間インキュベートする。
ｃ．試薬を捨てる。
６．停止／洗浄緩衝液を加える
ａ．約１ｍＬの原緩衝液を約３４ｍＬのｄＨ２Ｏに加えることにより、停止／洗浄緩衝液を調製する。
ｂ．スライドを緩衝液に入れ、約１５秒間攪拌する。室温で約１０分間インキュベートする。
ｄ．スライドを１×ＰＢＳで３回、それぞれ約１分間洗浄する（コプリンジャー）。
ｅ．アリコートの抗ジゴキシゲニン結合体を取り出し、室温に置く。
【０１２１】
７．抗ジゴキシゲニン結合体を添加する
ａ．１５μＬの抗ジゴキシゲニン結合体を各組織切片に加え、加湿チャンバー内で室温で約３０分間インキュベートする。
ｂ．スライドを１×ＰＢＳで約４回、それぞれ約２分間洗浄する（コプリンジャー）。
８．スライドをペルオキシダーゼ基質で処理する：ＤＡＢ
ａ．ＤＡＢ基質を調製−ＤＡＢ希釈緩衝液で約１：５０に希釈。
ｂ．約１５μＬの試薬を各組織切片に加え、約３〜６分間インキュベートする。顕微鏡下で観察して、適正な露光時間を決定する。
ｃ．スライドをｄＨ２Ｏで３回、それぞれ約１分間洗浄する（コプリンジャー）。
ｄ．スライドをｄＨ２Ｏで室温で約５分間インキュベートする。
９．メチルグリーンを使用して対比染色する
ａ．約０．５％のメチルグリーンで室温で約１０分間、対比染色する。
ｂ．スライドをコプリンジャー内でｄＨ２Ｏを３回交換して洗浄し、スライドの浸漬を、１回目および２回目の洗浄中それぞれ約１０回、続いて３回目の洗浄中は撹拌なしで約３０秒実施する。
ｃ．スライドをコプリンジャー内で１００％のＮ−ブタノールを３回交換して洗浄し、スライドの浸漬を、１回目および２回目の洗浄中それぞれ約１０回、続いて３回目の洗浄中は撹拌なしで約３０秒実施する。
１０．取り付け
ａ．組織を、約２回交換するキシレン中に入れ、各ジャーで約２分間インキュベートすることにより、脱水する。
ｂ．カバーガラスの下に、ＤＰＸ（Merck #61803502501730）を用いて取り付ける。
【０１２２】
ｌ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）は、組織学でよく用いられる染色法である。Ｈ＆Ｅは、有糸分裂像、壊死および組織の一般的全体的特徴を評価するために日常的に実施される。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）アッセイはまた、腫瘍間質含量を決定するために使用される。
例７．４：細胞増殖のアッセイ。
ＩＨＣアッセイは、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡなどの標準的な増殖マーカーのためのアッセイにも使用され、細胞増殖を決定する。
例７．６：核酸のアッセイ。
核酸の単離はさらに、ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析、および選択された試料のみについての特定の突然変異の遺伝子解析により評価する。またエクソーム配列決定を、選択された試料のＤＮＡについてのみ実施することができる。遺伝的プロファイリングは、選択例において、「臨床反応予測因子」の一環としてではなく、腫瘍の生物学を理解するために用いられる。
【０１２３】
ｍ）組織からの全ＲＮＡの精製：
組織からの全ＲＮＡの精製は、QiagenＲＮＡ抽出キットに従って行われる。
１．RNAlaterで安定化した組織を、試薬から鉗子を使用して取り出す。
２．約３０〜５０ｍｇの腫瘍を使用する。
３．秤量した組織を約１．２ｍｌの管に入れ、約３５０μｌのＲＬＴ緩衝液を組織に加え、直ちに組織マイクロディスメンブレータ（microdismembrator）で約３０００ｒｐｍで約６０秒間、均質化する。
４．溶解物を別の管に収集し、フルスピードで約３分間遠心分離する。上清をピペットで注意深く採取し、これを新しいマイクロ遠心分離管に移す。
５．約１容量（約３５０μｌ）の約７０％エタノールを清澄化溶解物に添加し、ピペッティングにより直ちに混合する。
６．試料を、約２ｍｌの収集管にセットしたRNeasyスピンカラムに移す。蓋を静かに閉め、約１００００ｒｐｍで約１５秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
７．約３５０μｌのＲＷ１緩衝液を、RNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約１００００ｒｐｍで約１５秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
８．約１０μｌのDNase 1原液を、約７０μｌのＲＤＤ緩衝液に加える。管をゆっくりと逆転させることにより混合する。
【０１２４】
９．約８０μｌのDNase 1インキュベーションミックスをRNeasyスピンカラム膜に加え、室温で約１５分間インキュベートする。
１０．約３５０μｌの緩衝液ＲＷ１をRNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約１００００ｒｐｍで約１５秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
１１．約５００μｌのＲＰＥ緩衝液をRNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約１００００ｒｐｍで約１５秒間遠心分離する。流水を廃棄する。
１２．約５００μｌのＲＰＥ緩衝液をRNeasyスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、約１００００ｒｐｍで約２分間遠心分離する。流水を廃棄する。
１３．RNeasyスピンカラムを新しい２ｍｌの収集管に入れ、古い収集管を流水と共に廃棄する。蓋を静かに閉め、フルスピードで約１分間遠心分離する。
１４．RNeasyスピンカラムを新しい１．５ｍｌの収集管に入れる。約３５μｌのRNase非含有水をスピンカラム膜に直接加える。蓋を静かに閉め、約１００００ｒｐｍで約１分間遠心分離する。
１５．ＲＮＡを溶出し、約−８０℃で保存する。
【０１２５】
ｎ）全ＲＮＡの単離およびマイクロアレイ：
RNAlaterで安定化されたコア生検および対応するヒト腫瘍異種移植片試料は、標準的な操作手順に従って、マイクロディスメンブレータ（Sartorius）を用いて溶解する。粉砕組織から単離された全ＲＮＡは、その後、バイオアナライザおよびナノドロップによって完全性について評価する。
腫瘍ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）マイクロアレイレイを、Agilent Sure Print G3 Human GE 8x60Kマイクロアレイレイシステムプラットフォーム（Agilent Technologies）を用いて実施する。ＲＮＡマイクロアレイについては、約７以上のＲＩＮ値をカットオフとして使用する。腫瘍試料または適合する対照から抽出された約２００ｎｇのＲＮＡを最終的に逆転写して、Ｃｙ３／Ｃｙ５標識され増幅されたｃＲＮＡを生成し、Agilentキットとプラットフォーム（Agilent Technologies）を使用してプロファイリングする。アレイデータは、特徴抽出ソフトウェアおよびAgilentのGene-Springソフトウェアを使用して正規化する。さらなる統計分析は、この研究のための適切なソフトウェアを用いて行う。データは、対応する対照と比較した倍数の違いとして表す（上方制御および下方制御された遺伝子両方について）。約１．５倍以下の差は全て、さらなる検証用に有意でないと考える。ヒートマップを作成し、関係性（遺伝子の類似性）は、異なる原発腫瘍および異種移植片腫瘍の試料間で、それらの反応状態に基づいて明らかにする。教師無しアレイを用いて、薬物反応の文脈における機能的プロファイリングに基づき、ＣＲ、ＰＲまたはＰＤに由来する原発腫瘍と対応する異種移植片との間の関連性を示すツリーを作成する。正規化されたデータのＡＮＯＶＡ分析を行って、異なる腫瘍とそれに対応する異種移植片群の間で異なって発現された遺伝子（Ｐ＜０．０５）を識別する。
【０１２６】
ｏ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
マイクロアレイから有意に発現された遺伝子は、StratageneリアルタイムＰＣＲプラットフォームを使用して、特定のプローブおよびプライマーセットを用いたＲＴ−ｑＰＣＲにより確認する。
ｐ）突然変異分析用のエクソーム配列決定
ゲノムＤＮＡを、DNAeasy組織キット（Qiagen）を用いて原発ＨＮＳＣＣ腫瘍から単離する。品質チェックの後、ＤＮＡのエクソーム配列決定を、以前に記載された手順に従って変異分析用に実施する。簡単に言えば、特定の配列決定プライマーおよび標識ヌクレオチドを用いて反応を生成し、特定の遺伝子配列をイルミナエクソーム配列決定プラットフォームで分析する。臨床的反応者と無反応者の群における突然変異スペクトルの差を決定する。
【０１２７】
例８：臨床転帰を予測するアルゴリズムの作成：
腫瘍を患者から切除し、例１〜３に記載のように複数の薬物（単独で、または組み合わせて）を用いて外植分析に供する。薬物に対する腫瘍の反応は、例６に記載したように複数のアッセイによって評価する。並行して、臨床転帰を、確立されたプロトコルに従って測定する。異なる重み（weightage）を、外植片の個々のアッセイ結果に付与して、得られた総合スコアが観察された臨床転帰と線形の相関を有するようにする；すなわち、高い総合スコア（例えば＞６０）は、完全な臨床反応（ＣＲ）と相関し、低い総合スコア（例えば＜２０）は、臨床無反応（ＮＲ）と相関する。
かかるスコア付けシステムが考案されれば、これは、将来の患者の臨床反応を外植分析から予測するために使用することができる。
【０１２８】
重みを個々のパラメータに付与して、累積の重み平均データが観察された臨床転帰と良好な相関関係を有するようにする。異なるアルゴリズムは、相関に含まれるパラメータに対して異なる個別の重み（０〜１００％）を使用する。手動で割り当てる重みに加えて（５つの例示のアルゴリズムに示すように）、コンピュータを使用する「多変量解析」も可能であり、ここでは異なる重みを割り当てて、予測された臨床反応と観察された臨床反応の間の最少の偏差を有する最良適合式に到達するようにする。
様々な外植片アッセイにより得られた生のスコアを、表４に示す。これは、臨床読み取りも示す（従来のPERCIST基準に従って、完全反応、部分反応、または無反応）。
【０１２９】
【表４】
2014534809.tif 000034
【０１３０】
表５は、観察された臨床読み取りに対する数値を提供する。３、２、および１の値を、それぞれ完全反応、部分反応、または無反応に対して与える。表６は、５つの代表的アルゴリズムそれぞれの外植片アッセイに対して付与された重みを示す。これらの重みは、外植片分析に使用される薬物の性質に基づいて付与される。例えば、細胞増殖を破壊することによりその活性を示すことが知られている薬物は、細胞増殖に対して高い重みが付与される。
【０１３１】
【表５】
2014534809.tif 000035
【表６】
2014534809.tif 000036
【０１３２】
各患者の感受性指数（すなわち、Ｍスコア）を、表７に示すように、生のスコアに対応する重み係数を乗算し、得られた数値を加算することによって算出する。例えば、患者１は、生存率、組織学、増殖、およびアポトーシスに対してそれぞれ５、２０、０および１２０の生の外植片アッセイスコアを有する。アルゴリズム１（または方法１）のもとで、これらの要因の各々には２５％の重みが与えられる。したがって、患者１に対するアルゴリズム１を用いた感受性指数は、次のように計算される。
感受性指数＝（５×２５％）＋（２０×２５％）＋（０×２５％）＋（１２０×２５％）＝３６
こうして算出された感受性指数を、次のようにして予測臨床転帰に変換する（表８〜１２）。
感受性指数が＞６０の場合、予測臨床転帰＝３（＝完全反応）。
２０＜感受性指数＜６０の場合、予測臨床転帰＝２（＝部分反応）。
感受性指数が２０＜の場合、予測臨床転帰＝１（＝無反応）。
【０１３３】
【表７】
2014534809.tif 000037
予測臨床転帰を観察された臨床転帰と比較し、アルゴリズムの予測力を判定する（表８〜１２）。網掛け部分は、予測転帰と観測転帰が一致するケースを示している。 
【０１３４】
表８：アルゴリズム１の予測効率：「予測臨床転帰」と「観察臨床転帰」の比較。感受性指数が＞６０の場合、予測臨床転帰には３のスコアが与えられる（すなわち、完全反応）。感受性指数が２０＜の場合、予測臨床転帰には１のスコアが与えられる（すなわち、無反応）。２０＜感受性指数＜６０の場合、予測臨床転帰には２のスコアが与えられる（すなわち、部分反応）。
【０１３５】
【表８】
2014534809.tif 000038
【０１３６】
表９：アルゴリズム２の予測効率：「予測臨床転帰」と「観察臨床転帰」の比較。感受性指数が＞６０の場合、予測臨床転帰には３のスコアが与えられる（すなわち、完全反応）。感受性指数が２０＜の場合、予測臨床転帰には１のスコアが与えられる（すなわち、無反応）。２０＜感受性指数＜６０の場合、予測臨床転帰には２のスコアが与えられる（すなわち、部分反応）。
【０１３７】
【表９】
2014534809.tif 000039
【０１３８】
表１０：アルゴリズム３の予測効率：「予測臨床転帰」と「観察臨床転帰」の比較。感受性指数が＞６０の場合、予測臨床転帰には３のスコアが与えられる（すなわち、完全反応）。感受性指数が２０＜の場合、予測臨床転帰には１のスコアが与えられる（すなわち、無反応）。２０＜感受性指数＜６０の場合、予測臨床転帰には２のスコアが与えられる（すなわち、部分反応）。
【０１３９】
【表１０】
2014534809.tif 000040
【０１４０】
表１１：アルゴリズム４の予測効率：「予測臨床転帰」と「観察臨床転帰」の比較。感受性指数が＞６０の場合、予測臨床転帰には３のスコアが与えられる（すなわち、完全反応）。感受性指数が２０＜の場合、予測臨床転帰には１のスコアが与えられる（すなわち、無反応）。２０＜感受性指数＜６０の場合、予測臨床転帰には２のスコアが与えられる（すなわち、部分反応）。
【０１４１】
【表１１】
2014534809.tif 000041
【０１４２】
表１２：アルゴリズム５の予測効率：「予測臨床転帰」と「観察臨床転帰」の比較。感受性指数が＞６０の場合、予測臨床転帰には３のスコアが与えられる（すなわち、完全反応）。感受性指数が２０＜の場合、予測臨床転帰には１のスコアが与えられる（すなわち、無反応）。２０＜感受性指数＜６０の場合、予測臨床転帰には２のスコアが与えられる（すなわち、部分反応）。
【０１４３】
【表１２】
2014534809.tif 000042
表６〜１３において手動の重みを与える代わりに、コンピュータを任意に用いて、重回帰分析法によりこのような重みを個々の外植片アッセイに与えることができる。このような場合、コンピュータは観察された外植片データを用いて多項式近似（一次、二次または高次方程式）をもたらし、観察臨床転帰に対して最少の偏差の予測臨床結果を導く。
【０１４４】
例９：複数の固形癌において外植片系を用いて反応の予測を生成する
「臨床反応予測因子」主導の機能的アッセイは、抗癌剤のパネルの迅速なスクリーニングを可能とする。確立されたおよび治験の抗癌剤（細胞傷害性および標的化の両方）のパネルを、初めにそれらの既知の腫瘍増殖阻害特性に基づいて選択する。これらの薬物のex vivoでの有効性を、患者由来の外植片のパネルに対して、７２時間の増殖（Ｋｉ−６７）および生存率アッセイ（ＷＳＴ）で試験する。阻害パーセントは、未処理の対照を参照して決定する。結果を図１１に示す。５０％を超える阻害は、完全な反応と考えられる。５０％未満で２０％を超える阻害は、部分的な反応であると考えられる。無反応群において反応を全く示さない薬物（０〜２０％阻害）は、無反応と考えられ、安定した疾患と類似する。特定の適応症について細胞増殖の増加を示す薬物は、進行性の疾患であると考えられる。得られた結果は、「臨床反応予測因子」が腫瘍異種移植片試料を模倣することを示す。そこでこれを、臨床転帰を使用してさらに検証する。
【０１４５】
例１０：
腫瘍試料を、標準的なプロトコルに従って血清と共に患者から収集する。患者は「臨床反応予測因子」外植片分析の開始前に、ＰＥＴＣＴまたはＣＴいずれかによる評価を受けていた。収集された試料を、臨床反応予測因子外植片分析のために処理する。
腫瘍スライスの約３×３×３ｍｍの小片を生成する。腫瘍試料を、Leicaビブラトームを使用して複数の小片に分割して、約１００〜３００μｍの切片を生成し、例１に示したように、癌特異的ＥＣＭで前もってコーティングした９６ウェル平底プレート中トリプリケートで培養する。腫瘍組織を、約２％の熱不活性化ＦＢＳと、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、４ｍＭのＬグルタミン酸および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補足した、馴化培地である約２ｍｌのＤＭＥＭ中に維持する。培養培地には、約２％の血清由来のリガンドを１２時間後に補足する。薬物は、培養開始時に培地と共にまたは別々に、任意に添加する。培地は、血清添加時に交換する。培地はまた、サプリメントと共に２４時間毎に交換する。約５μｌの使用済み培地を用いて、細胞生存率、細胞増殖、組織学、および腫瘍組織の細胞死を決定する。約７２時間の範囲の培養期間の終わりに、組織をパラメータについて評価する。この期間の後にＭＴＴ／ＷＳＴ分析を実施して、パーセント細胞生存率を評価する。培地培養物からの上清を２４時間毎に取り出し、増殖（ＡＴＰおよびグルコース利用実験を用いて）および細胞死（乳酸脱水素酵素アッセイの評価およびカスパーゼ３およびカスパーゼ８の測定値によって）について評価して、速度論的反応の傾向を得る。結果を薬物未処理の対照に対して定量化する。薬物（単数または複数）による処理および未処理両方の組織切片は、培養期間の終了時にＩＨＣおよび組織学的評価のためにも用いられる。組織学的評価のために与えられた組織を、ＴＵＮＥＬおよびカスパーゼ３アッセイによりアポトーシスを評価する。また、細胞増殖は、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡなどの標準的な増殖マーカーについて分析する。
【０１４６】
細胞生存率、アポトーシスによる細胞死、組織学的評価、および増殖状態などのすべての前臨床転帰は、最終的に統合されて、以下の表３に示す感受性指数（またはＭスコア）と呼ばれる単一のスコアを与える。
本外植片分析のために登録された患者は、臨床的処置も受けており、ＰＥＴＣＴまたはＣＴのいずれかにより６〜８ヶ月の終わりに反応が評価された。次に、「臨床反応予測因子」結果（Ｍスコア）を臨床転帰と比較する。得られた結果を下記の表３に示す。
表３は、それぞれの患者（次の癌タイプの１つを有する：ＨＮＳＣＣ、神経膠芽腫、卵巣癌、乳癌、食道癌、ＣＲＣ、膵臓癌、胃癌）から得た腫瘍試料のタイプ、および「臨床反応予測因子」および臨床処置を介した両方の解析のために患者が処置される薬物または薬物の組み合わせを示す。
【０１４７】
以下の表に得られた結果から明らかなように、「臨床反応予測因子」は、無反応者に対して約１００％、および反応者に対して約８０％の有効性で、臨床転帰を成功して予測する。
頭頸部癌を有する患者１の腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」により、シスプラチン＋５ＦＵ＋ドセタキセルの組み合わせで処置する。細胞生存率、組織学的評価、細胞増殖、およびアポトーシスによる細胞死を介した組織分析により得られた前臨床転帰は統合され、感受性指数（またはＭスコア）として８を与える。患者１の前臨床処置の感受性指数は＜２０となるため、患者に同じ薬物の組み合わせが投与された場合には、処置は不良な臨床転帰を有することが予測される。これは、臨床反応について得られたＲＥＣＩＳＴデータの結果から検証され、ここで患者はスコア１が与えられて、臨床的無反応を示す。
【０１４８】
頭頸部癌を有する患者３の腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」により、カルボプラチンおよびパクリタキセルの組み合わせで処置する。細胞生存率、組織学的評価、細胞増殖、およびアポトーシスによる細胞死を介した組織分析により得られた前臨床転帰は統合され、感受性指数（またはＭスコア）として４７を与える。患者３の前臨床処置の感受性指数は＞２０かつ＜６０となるため、患者に同じ薬物の組み合わせが投与された場合には、処置は部分的臨床転帰を有することが予測される。これは、臨床反応について得られたＲＥＣＩＳＴデータの結果から検証され、ここで患者はスコア２が与えられて、部分的反応を示す。
頭頸部癌を有する患者３８の腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」により、シスプラチン、５ＦＵおよびドセタキセルの組み合わせで処置する。細胞生存率、組織学的評価、細胞増殖、およびアポトーシスによる細胞死を介した組織分析により得られた前臨床転帰は統合され、感受性指数（またはＭスコア）として９０を与える。患者３８の前臨床処置の感受性指数は＞６０となるため、患者に同じ薬物の組み合わせが投与された場合には、処置は完全臨床転帰を有することが予測される。これは、臨床反応について得られたＲＥＣＩＳＴデータの結果から検証され、ここで患者はスコア３が与えられて、完全臨床反応を示す。
【０１４９】
【表３−１】
2014534809.tif 000043
【表３−２】
2014534809.tif 000044
【０１５０】
例１１： 「臨床反応予測因子」はバイオマーカーよりも優れた反応予測因子である
上述したように、バイオマーカーは従来技術において予測ツールとして使用されているものの、これに関連する多くの制約が存在する。これらの制約は、本開示のツールおよび方法によって克服される。「臨床反応予測因子」は、最初の検証のために用いられた薬物または疾患のみに限定されるものではない。「臨床反応予測因子」は、プラットフォーム技術である。例えば、「臨床反応予測因子」が、例えば５−ＦＵなどの特定の薬物のための結腸直腸癌モデル用に開発されて、このモデルが５−ＦＵの有効性を予測するのに有用であることが示されたならば、モデルは他の薬物に対しても移植可能である。これは、「臨床反応予測因子」のための入力制約が、考慮中の患者（または患者由来の腫瘍）にリンクされており、薬物にリンクされているのではないからである。
【０１５１】
もう一つの大きな違いは、「ドライバー」と「パッセンジャー」のバイオマーカーの間の差である。多くの標的薬物については、患者は、特定のバイオマーカーを有するか否かに基づいて選別される。しかし、あるバイオマーカーの存在は、患者が薬物に反応するかどうかを確定はしない。これは、複数の要因が薬物の効力への影響に関与するという、癌の不均一な性質のためである。対照的に、「臨床反応予測因子」は偏りのないアプローチであり、患者が薬物に反応するかどうかを決定する際に腫瘍組織を全体として取り上げるため、実際の臨床転帰を決定するのにより適切である。
バイオマーカー（特定の薬物に対する反応者ｖｓ無反応者において、異なって発現される遺伝子／タンパク質）が、ハーセプチン（Ｈｅｒ２バイオマーカー）などの少数の薬物のために利用可能ではあるが、それらは他の多種多様な薬物に対しては利用できない。利用可能な場合、それらは臨床転帰に低い相関を有する。例えば、結腸直腸癌におけるエルビタックスのために承認されたバイオマーカーであるＫＲＡＳは、１０〜３０％の範囲の予測力を有する。バイオマーカーのこの側面は、表１３に示されている。
【０１５２】
【表１３−１】
2014534809.tif 000045
【表１３−２】
2014534809.tif 000046
【０１５３】
上記の表のセツキシマブへの反応を試験した試料は、ステージＩＩＩ／ＩＶの結腸癌試料である。ＮＲである試験されたほとんどの試料は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡなどの、セツキシマブに対する反応に影響を与える重要な遺伝子に変異を持っていた。この経路でさらに示されるのは、ＥＧＦＲリガンドのアンフィレグリンおよびエピレグリンである。これらのリガンドの低い発現は、ＮＲの原因であることが示されており、セツキシマブに対する反応に影響を与えると考えられている。しかし、予想された結果に反して、これらのバイオマーカーが存在しないのにＮＲである試料のサブセットがある。さらに、少数の患者、すなわち患者番号２、７、１３、２０、２３、２５、２６、２８、３１〜４２、４９および５０は、リガンドのアンフィレグリンおよびエピレグリンの両方の発現が高いことが見出されているにもかかわらず、ＮＲであることが見出された。しかし、「臨床反応予測因子」外植片分析結果は、バイオマーカーおよびＥＧＦＲリガンドの発現の影響を受けることなく、臨床転帰と一致する。
したがって、「ドライバー」と「パッセンジャー」のバイオマーカーを区別する必要があり、なぜならば、バイオマーカーの存在は多くの場合、特定の患者が薬物に反応するかどうかを決定する際の決定的な要因ではないからである。また、バイオマーカーはしばしば、特定の薬物および癌の特定のタイプにリンクされている。これとは対照的に、本「臨床反応予測因子」モデルは、特定の患者に特異的な機能的読み取りを提供する。
【０１５４】
例１２：「臨床反応予測因子」は細胞株より優れた反応予測因子である
細胞株in vitro試験および細胞株ベースの異種移植片モデルにおける基本的な欠陥は、癌は不均一な疾患であるが、細胞株は定義から均一であることである。これらのモデルは、問題を単純化し過ぎていると考えられる。
臨床反応予測因子の、血清／血漿／ＰＢＭＣ／血清由来リガンドの使用、腫瘍タイプに個別化された細胞外基質および自己腫瘍組織からの障害なしの細胞外基質の使用は、適切なパラクリン結合因子が腫瘍細胞を生存させるために存在することを確実にする；これは次に、腫瘍の開始、維持、進行および抑制に関与するシグナリング経路の研究を可能にし、従来技術で利用可能な、細胞株に基づく患者選別システムに関連する欠陥を克服する。
この側面は、次の表１４にさらに詳述されている。
【０１５５】
【表１４】
2014534809.tif 000047
【０１５６】
上記表１４に示すように、細胞株は非常に均一なモデルを表し、そのため薬物開発のための有用性が限られている。Ｋ−ＲＡＳおよびＢ−ＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡについて野生型（ＷＴ）である細胞株の８０％以上は、セツキシマブに対する反応が明らかである。しかし臨床的には、患者の１０〜３０％のみが、セツキシマブに反応する。この不一致は、細胞株モデルの臨床的関連性の欠如に起因する。「臨床反応予測因子」モデルは、実施例１１において、臨床的に関連する前臨床ツールであることが示されている（表１３）。システム生物学的アプローチを用いて、このプラットフォームは、疾患に固有の不均一性を捉えて臨床転帰のよりよい予測因子として作用し、合理的な薬物の開発を可能にする。
当該分野で周知の他の技術に関する「臨床反応予測因子」の利点：
＊従来技術で使用される遺伝子操作されたマウスモデルは良好なモデルであるが、薬物によって媒介される経路が知られている場合にのみ有用であろう。また、種々の癌において、および種々の薬物について、複数の経路が関与する。これは、遺伝子操作マウスモデルの主要な欠陥である。本発明は、患者由来の新鮮な固形組織を使用する。さらに、細胞間コミュニケーションは、組織がアッセイのために処理されている間に本発明によって破壊されない。局所微小環境もまた、外植片アッセイの場合には維持される。
【０１５７】
＊Mammaprint（Agendiaより）およびOncotype-Dx（Genomic Healthより）は、遺伝子プロファイリングに基づき患者を高リスクまたは低リスクにランク付けするために使用される試験である。Mammaprintは選択遺伝子のマイクロアレイ発現プロファイリングを使用し、一方Oncotype-Dxは、選択遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を使用する。これらの試験はいずれも、患者に個別化されず、また、どの特定の薬物の組み合わせが特定の患者に最も適しているかも、教えてくれない。対照的に、「臨床反応予測因子」は、患者自身の腫瘍および患者自身の腫瘍微小環境を使用して、その特定の患者に最適な薬物の組み合わせを決定するための、機能的試験である。
＊化学的感受性試験に関しては、本開示は、以下を介して前記試験に関連する欠点を克服することができる：第１に、本発明は、腫瘍組織内で機能的なシグナリングが維持されるためには、特定のパラクリン因子が不可欠であることを示した。第２に、本発明はさらに、異種血清よりも自己血清から誘導されるかかるパラクリン因子の臨床的相関に差があることを発見した。第３に、これに加えて、細胞プレートを、癌の同じサブタイプに由来する細胞外基質でコーティングすることが重要である。第４に、適切な量の組織拡散が生じることを保証するために、組織を特定サイズ（約１００μｍ〜３００μｍ）に維持することが重要である。まとめると、これらの要因の組み合わせにより、臨床転帰の信頼できる反射体である「臨床反応予測因子」がもたらされる。
【０１５８】
例１３：臨床反応を予測するための「臨床反応予測因子」
異なるタイプの腫瘍を有する患者で臨床研究を行って、特定の抗癌剤またはそれらの組み合わせに対する反応を検討する。同じ薬物およびそれらの組み合わせが、本発明の「臨床反応予測因子」分析で使用される。得られた結果（経路阻害に基づくＭスコア）は、特定の患者のために個別化された腫瘍環境で行われた調査に基づいて、薬物または薬物組み合わせに対する臨床反応との相関をとる。
例１３．１：
本「臨床反応予測因子」分析を、頭頸部癌の６７歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は右梨状陥凹である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３Ｎ０Ｍ０と決定され、試料タイプは原発性と分類された。
【０１５９】
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【表１８】
2014534809.tif 000048
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ａ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）シスプラチン
２）シスプラチン＋ドセタキセル＋５−フルオロウラシル
３）シスプラチン＋５−フルオロウラシル
【０１６０】
例１３．２：
本「臨床反応予測因子」分析を、頭頸部癌の５５歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は右梨状陥凹である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３／４Ｎ２ｃＭ０と決定され、試料タイプは転移性リンパ節と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【表１９】
2014534809.tif 000049
【０１６１】
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｂ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）カルボプラチン＋パクリタキセル
２）シスプラチン＋ドセタキセル＋５−フルオロウラシル
３）シスプラチン
【０１６２】
例１３．３：
本「臨床反応予測因子」分析を、結腸癌の４０歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は直腸Ｓ状結腸である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはステージＩＶと決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１６３】
【表２０】
2014534809.tif 000050
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｃ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）オキサリプラチン＋５−フルオロウラシル＋ロイコボリン
２）エピルビシン＋シスプラチン＋カペシタビン
３）イリノテカン＋５−フルオロウラシル＋ロイコボリン
【０１６４】
例１３．４：
本「臨床反応予測因子」分析を、結腸癌の５６歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は会陰塊（perineal mass）（直腸）である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３Ｎ０Ｍ０と決定され、試料タイプは再発性（Recc）と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１６５】
【表２１】
2014534809.tif 000051
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｄ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）イリノテカン＋５−フルオロウラシル＋ロイコボリン
２）オキサリプラチン＋５−フルオロウラシル＋ロイコボリン
３）イリノテカン＋５−フルオロウラシル＋ロイコボリン＋ベバシズマブ
【０１６６】
例１３．５：
本「臨床反応予測因子」分析を、胃癌の４９歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は胃の幽門部である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明であり、試料タイプは転移性リンパ節再発性（recc）と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１６７】
【表２２】
2014534809.tif 000052
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｅ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）イマチニブ
２）エピルビシン＋シスプラチン＋カペシタビン
【０１６８】
例１３．６：
本「臨床反応予測因子」分析を、胃癌の６８歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は胃である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明であり、試料タイプは再発性（recc）と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１６９】
【表２３】
2014534809.tif 000053
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｆ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）エピルビシン＋シスプラチン＋カペシタビン
【０１７０】
例１３．７：
本「臨床反応予測因子」分析を、膵臓癌の４５歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は肝臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明であり、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１７１】
【表２４】
2014534809.tif 000054
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｇ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
【０１７２】
例１３．８：
本「臨床反応予測因子」分析を、膵臓癌の５０歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は膵臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ２Ｎ０Ｍ０と決定され、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１７３】
【表２５】
2014534809.tif 000055
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｈ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
【０１７４】
例１３．９：
本「臨床反応予測因子」分析を、卵巣癌の４０歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は卵巣である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明あり、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１７５】
【表２６】
2014534809.tif 000056
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｉ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）ブレオマイシン＋エトポシド＋シスプラチン
２）カルボプラチン＋ゲムシタビン
３）トラベクチジン（trabectidin）＋ＰＬＤドキソルビシン
【０１７６】
例１３．１０：
本「臨床反応予測因子」分析を、卵巣癌の５６歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は卵巣である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは不明あり、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１７７】
【表２７】
2014534809.tif 000057
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｊ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）トラベクチジン＋ＰＬＤドキソルビシン
２）ブレオマイシン＋エトポシド＋シスプラチン
３）カルボプラチン＋ゲムシタビン
【０１７８】
例１３．１１：
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の４９歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は所属リンパ節（Ｒ）乳房である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３Ｎ１Ｍ０と決定され、試料タイプは転移性および再発性（recc）と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１７９】
【表２８】
2014534809.tif 000058
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｋ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋５−フルオロウラシル
２）ゲムシタビン＋パクリタキセル
３）ドセタキセル＋カペシタビン
【０１８０】
例１３．１２：
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の５１歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は乳房である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージは決定されず、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１８１】
【表２９】
2014534809.tif 000059
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｌ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）フィルグラスチム＋シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋５−フルオロウラシル
２）ゲムシタビン＋ドセタキセル
３）シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ドセタキセル
４）フィルグラスチム＋シクロホスファミド＋エピルビシン＋５−フルオロウラシル
【０１８２】
例１３．１３：
本「臨床反応予測因子」分析を、肝臓癌の５０歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は肝臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３ＮｘＭ１と決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察されなかった薬物を示す。
【表３０】
2014534809.tif 000060
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｍ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、本患者にとってソラフェニブは最適な治療選択肢ではないことを示唆する。他の抗癌剤を用いるさらなる試験を実施して、他のＳＯＣのいずれかがこの患者に使用できるかどうかを決定する必要がある。
【０１８３】
例１３．１４：
本「臨床反応予測因子」分析を、肝臓癌の５６歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は肝臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に手術を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ４Ｎ０Ｍ０と決定され、試料タイプは原発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。表Ａは、反応が観察された薬物を示す。
【表３１】
2014534809.tif 000061
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｎ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、本患者にとってソラフェニブが最適な治療選択肢であることを示唆する。
【０１８４】
例１３．１５：
本「臨床反応予測因子」分析を、大腸癌の５６歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は会陰塊である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３Ｎ０Ｍ０と決定され、試料タイプは再発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１８５】
【表３２】
2014534809.tif 000062
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｏ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）Ｒｘ１：オキサリプラチン＋５−ＦＵ＋ロイコボリン
２）Ｒｘ２：イリノテカン＋５−ＦＵ＋ロイコボリン
３）Ｒｘ３：オキサリプラチン＋５−ＦＵ
４）Ｒｘ４：カペシタビン＋エルビタックス
５）Ｒｘ５：アバスチン
【０１８６】
例１３．１６：
本「臨床反応予測因子」分析を、大腸癌の肺転移を有する５９歳の男性患者で試験した；腫瘍部位は直腸Ｓ状結腸である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ４Ｎ２Ｍｘと決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１８７】
【表３３】
2014534809.tif 000063
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｐ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）Ｒｘ１：オキサリプラチン＋イリノテカン
２）Ｒｘ２：エルビタックス＋カペシタビン
３）Ｒｘ３：５−ＦＵ＋ロイコボリン
４）Ｒｘ４：イリノテカン＋エルビタックス
【０１８８】
例１３．１７：
本「臨床反応予測因子」分析を、膵臓癌の肝臓転移を有する４５歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は膵臓である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３Ｎ２Ｍ１と決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１８９】
【表３４】
2014534809.tif 000064
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｑ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）Ｒｘ１：シスプラチン＋ゲムシタビン
２）Ｒｘ２：オキサリプラチン＋５−ＦＵ
３）Ｒｘ３：アブラキサン
４）Ｒｘ４：エルロチニブ＋ゲムシタビン
５）Ｒｘ５：５−ＦＵ＋ロイコボリン
【０１９０】
例１３．１８：
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の転移を有する４９歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は所属リンパ節（ＲｔＢｒ）である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴ３Ｎ１Ｍ１と決定され、試料タイプは再発性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１９１】
【表３５】
2014534809.tif 000065
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｒ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）Ｒｘ１：シクロホスファミド＋メトトレキサート＋５−ＦＵ
２）Ｒｘ２：アブラキサン
３）Ｒｘ３：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋５−ＦＵ
４）Ｒｘ４：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋パクリタキセル
５）Ｒｘ５：アバスチン
６）Ｒｘ６：カペシタビン＋ラパチニブ
７）Ｒｘ７：ドキソルビシン＋シクロホスファミド
８）Ｒｘ８：ドセタキセル＋カペシタビン
【０１９２】
例１３．１９：
本「臨床反応予測因子」分析を、乳癌の鎖骨下リンパ節転移（ＳＣＬＮ転移）を有する４０歳の女性患者で試験した；腫瘍部位は鎖骨上リンパ節である。腫瘍試料を、患者の同意と共に生検を介して得た。得られた腫瘍を分析し、腫瘍ステージはＴｘＮｘＭ２と決定され、試料タイプは転移性と分類された。
腫瘍試料を得て、上記「本方法の概要」に記載の本発明の方法に供した。その後、特定の薬物に対する腫瘍の反応に基づいてデータが得られ、これを以下の表に示す。以下の表は、試験した薬物に対する患者の反応を表し、表Ａは反応が観察された薬物を示し、表Ｂは反応が観察されなかった薬物を示す。
【０１９３】
【表３６】
2014534809.tif 000066
上記の表から得られたＭスコアおよび図１３（Ｓ）に示す有効性データに基づき、「臨床反応予測因子」分析は、患者にとって最適な治療選択肢は、次の順序による、薬物／その組み合わせの投与であることを示唆する：
１）Ｒｘ１：カペシタビン＋ラパチニブ
２）Ｒｘ２：ゲムシタビン＋エルロチニブ
３）Ｒｘ３：ハーセプチン
４）Ｒｘ４：メトトレキサート＋シクロホスファミド
５）Ｒｘ５：アバスチン
６）Ｒｘ６：５−ＦＵ＋カルボプラチン
【０１９４】
例１４：薬物の有効性を試験する「臨床反応予測因子」
シスプラチン、パクリタキセルおよび５−ＦＵを受領予定の臨床試験に登録した患者からの初代Ｈ＆Ｎ腫瘍試料を、「臨床反応予測因子」分析に供する。腫瘍試料はパンチ生検によって収集する。収集した試料の腫瘍ステージは、臨床ステージＩＩ／ＩＩＩである。例５で説明したように、「臨床反応予測因子」外植片評価を実施して、臨床転帰を予測する。Ｍスコアに到達するために行われるアッセイは、ＷＳＴ、ＫＩ、およびＴＵＮＥＬである。独立して、ＰＥＲＣＩＳＴ基準に従って臨床転帰を評価するための処置の前後にＰＥＴ−ＣＴイメージングを実施し、患者を臨床試験に供する。「臨床反応予測因子」の予測を臨床結果と比較して、「臨床反応予測因子」の予測力を評価する（図１２）。
表１５に示すように、およそ１１２人のＨ＆Ｎ腫瘍の患者がこの研究に登録され、ここで「臨床反応予測因子」を用いて感受性指標を決定し、これを臨床転帰と相関させる。
【０１９５】
【表１５−１】
2014534809.tif 000067
【０１９６】
【表１５−２】
2014534809.tif 000068
【０１９７】
【表１５−３】
2014534809.tif 000069
【０１９８】
上記の表および図１２から、以下を導くことができる：図１２の左パネル（投与前と投与後）は、化学療法の前後の腫瘍の位置を示すＣＴ画像を表す。左上のパネルは、腫瘍が縮小し、この患者が処置に反応したことを示す。oncoprintを用いて評価されたこの患者からの腫瘍はＭスコアが６２で、完全な臨床反応を示し、これは実際の臨床転帰と整合する。右上のパネルは、Ｍスコアが６０以上の３０件の腫瘍試料の臨床反応を示し、患者の９０％以上が完全な反応を有し、一方１０％は部分的反応を有した。しかしながら、それらのいずれも無反応ではなかった。
同様に、中央左のパネルは、Ｍスコアが４５と判定された部分的な反応者を表す。２５と６０未満の間のＭスコアについて予測されるように、患者は部分的な反応を示す。この分類に入るＭスコアを有する５３の患者腫瘍のうち、７９％より多くは部分的な反応者であり、８％が完全反応を有し、１３％が無反応者である。
下のパネルは無反応者を表し、ここで左側の投与後のＣＴは、患者が処置後に進行性疾患を有し、腫瘍には無反応を表すＭスコア１８を与えられたことを示す。「臨床反応予測因子」により無反応と予測された２９人の患者は、その１００％が実際に無反応であり、この技術の、臨床転帰を確実に予測する力を示す。
【０１９９】
用途：
薬物開発用途：
患者と薬物のマッチング：薬物開発の文脈においては、どの患者が開発中の薬物に反応する可能性が最も高いかを、薬物が患者に投与される前に知ることが重要である。さらに、これは癌の文脈において特に重要であり、その理由は、どの既存の薬物を、癌治療に使用される「組み合わせ」戦略の下で開発中の薬剤と組み合わせることが必要かを、決定しなければならないからである。また、どのタイプの癌を標的とするか（例えば、結腸癌対膵臓癌）を決定するのにも有用である。全体として、これは開発期間の短縮、低コストおよび成功の可能性の増加をもたらす、より良い臨床試験戦略の開発にも有用である。
【０２００】
診断用途：
処置の選択：これは、医師が、現在承認されている選択肢の中から、検討中の患者に対して最適な処置の選択肢を決めることを支援する診断モデルとして有用である。これは、現在の処置の成功率が２０％未満あり、患者間での変化が大きい、二次（再発性）および転移性癌の患者に特に有用である。また、現在の成功率が〜５０％である第一選択処置を決定する際にも役立つ。「臨床反応予測因子」の診断的適用は、頭頸部癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、食道癌、ＡＭＬおよびＣＭＬの文脈において実証されている。予測力は、無反応者の場合は〜１００％、部分的な反応者の場合は〜７５％、および反応者の場合は〜９０％である。
【０２０１】
翻訳生物学的用途：
抗癌剤の開発において、開発中の薬物についての最適な癌の同定、開発中の薬物に対する共同開発戦略としての標準ケア薬物の選択、試験中の薬物または薬物の組み合わせに最も反応する可能性のある患者プロファイルの選択、および試験中の薬物または薬物の組み合わせについての予後バイオマーカーの同定。さらに、本発明はまた、化学療法剤、標的薬物、および生物製剤を含む抗癌剤のためのコンパニオン診断ツールの開発において、患者選別ツールを利用する。
【図１】
2014534809.tif 000070
【図２】
2014534809.tif 000071
【図３ＡＢ】
2014534809.tif 000072
【図４Ａ−Ｇ】
2014534809.tif 000073
【図５Ａ−Ｃ】
2014534809.tif 000074
【図６】
2014534809.tif 000075
【図７Ａ−Ｃ】
2014534809.tif 000076
【図８Ａ−Ｃ】
2014534809.tif 000077
【図９Ａ−Ｈ】
2014534809.tif 000078
【図１０】
2014534809.tif 000079
【図１１】
2014534809.tif 000080
【図１２】
2014534809.tif 000081
【図１３Ａ−Ｄ】
2014534809.tif 000082
【図１３Ｅ−Ｉ】
2014534809.tif 000083
【図１３Ｊ−Ｍ】
2014534809.tif 000084
【図１３Ｎ−Ｑ】
2014534809.tif 000085
【図１３Ｒ−Ｓ】
2014534809.tif 000086
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月12日(2013.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分：コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、オステオポンチンを含み、任意にラミニン、デコリン、テネイシンＣ、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を共に含む、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ＥＣＭの成分を同定すること；
ｂ．ＥＣＭの成分：コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、オステオポンチン、任意にラミニン、デコリン、テネイシンＣ、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を共に組み合わせて、ＥＣＭ組成物を得ること；
を含む、前記方法。
【請求項３】
腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、請求項１に記載のＥＣＭ組成物、培養培地を、任意に血清、血漿またはＰＢＭＣおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォーム。
【請求項４】
腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを請求項１に記載のＥＣＭ組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿またはＰＢＭＣおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法。
【請求項５】
腫瘍組織を器官培養する方法であって、腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して器官培養物を得る行為を含む、前記方法。
【請求項６】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと；
ｃ．アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｄ．任意に、感受性指数と、前記１または２以上の薬物に対する対象の臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理すること；
ｃ．薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価して、複数のアッセイの各々についての評価スコアを得ること；
ｄ．複数のアッセイの各々に対して重みスコアを割り当てること；
ｅ．複数のアッセイの各々の評価スコアに、複数のアッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数のアッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること；
ｅ．複数のアッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｆ．任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項９】
腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること；および
ｃ．マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
細胞外基質［ＥＣＭ］組成物が腫瘍特異的である、請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項２、４〜１１に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン１が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５０μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン３が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン４が、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約２５０μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン６が、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
フィブロネクチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約７５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５００μｇ／ｍｌであり；
ビトロネクチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約９５μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
カドヘリンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌおよび約５μｇ／ｍｌであり；
フィラミンＡが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
ビメンチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
ラミニンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；
デコリンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；
テネイシンＣが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２５μｇ／ｍｌであり；
オステオポンチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約５μｇ／ｍｌであり；
基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度である；
請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍組織が、中枢神経系、骨髄、血液、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮、間質組織および結合組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるソースから得られる、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍または腫瘍組織が、外科的にもしくは生検により、または異種移植片としてまたはそれらの任意の組合せで得られ；および前記腫瘍または腫瘍組織が、約１００μｍから約３０００μｍの切片の小さな断片に分割されている、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍組織の培養が、約３０℃から約４０℃の範囲の温度、好ましくは約３７℃で；約２〜１０日の間、好ましくは約３〜７日；および約５％のＣＯ２で実施される、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９に記載の方法。
【請求項１５】
コーティングプラットフォームが、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレートおよびペトリ皿を含む群から選択される、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９に記載の方法。
【請求項１６】
微小環境プラットフォームが、腫瘍細胞のシグナリングネットワークを維持するためのものである、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
微小環境プラットフォームが、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、および請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
培養培地が、約６０％〜約１００％の範囲の濃度、好ましくは約８０％で２ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］またはＲＰＭＩ１６４０［Roswell Park Memorial Institute Medium］；約０．１％〜約４０％の範囲の濃度、好ましくは約２％（重量／重量）の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；約１％〜約２％の範囲の濃度、好ましくは約１％（重量／重量）のペニシリン−ストレプトマイシン；約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約５ｍＭのＬ−グルタミンである非必須アミノ酸；および約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む群から選択され；および、培養培地中の血清が、約０．１％〜約１０％の範囲の濃度、好ましくは約２％である、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍が、胃癌、結腸癌、頭頸部癌、脳の癌、口腔癌、乳癌、胃癌、胃腸の癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮癌、骨の癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、甲状腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ならびにＡＭＬ［急性骨髄性白血病］、ＣＭＬ［慢性骨髄性白血病］、ＡＬＬ［急性リンパ性白血病］、ＴＡＬＬ［Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病］、ＮＨＬ［非ホジキンリンパ腫］、ＤＢＣＬ［びまん性Ｂ細胞性リンパ腫］、ＣＬＬ［慢性リンパ性白血病］、および多発性骨髄腫を含む血液の癌、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項２、４〜９に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイが、細胞生存率、細胞死、細胞増殖、腫瘍の形態、腫瘍間質含量、細胞代謝、老化またはこれらの任意の組合せについてのアッセイを含む群から選択される、請求項６〜９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞生存率および細胞代謝についてのアッセイが、ＷＳＴアッセイ、ＡＴＰ取り込みアッセイ、およびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；細胞死についてのアッセイが、ＬＤＨアッセイ、活性化カスパーゼ３アッセイ、活性化カスパーゼ８アッセイ、および酸化窒素合成酵素アッセイ、ＴＵＮＥＬを含む群から選択され；細胞増殖についてのアッセイが、Ｋｉ６７アッセイ、ＡＴＰ／ＡＤＰ比アッセイおよびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；ならびに腫瘍の形態および腫瘍間質についてのアッセイが、Ｈ＆Ｅ［ヘマトキシリン＆エオシン染色］であるか；またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、対象のための処置を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの任意の組み合わせを含む群から決定するために使用される、請求項６および７に記載の方法。
【請求項２３】
生化学的アッセイが、ＥＬＩＳＡ、ブロッティング技術、ＬＣＭＳ、ビーズベースアッセイ、免疫除去、クロマトグラフィーアッセイまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択される定量的アッセイまたは定性的アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
複数アッセイの各々に対する重みスコアの割り当てが、用いる薬物の性質に基づく、請求項７に記載の方法。
【請求項２５】
感受性指数が６０より大、２０と６０の間、および２０より小の場合に、感受性指数がそれぞれ、完全臨床反応、部分的臨床反応、および臨床反応なしと相関する、請求項６および７に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのマイクロアレイおよび核酸分析を実施して、薬物処置の前後の経路の調節を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
マイクロアレイおよび核酸分析を、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、およびホスホプロテオミクスプロファイリングを含む群から選択されるアッセイを用いて確認する、請求項２６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ヒトＥＣＭの単離およびその特徴付け：
外科的に摘出した新鮮な腫瘍組織を１〜２ｍｍの切片に切断し、ディスパーゼ溶液（Stem cell Technologies Inc.）に懸濁して、４８℃で１５分インキュベートした。この組織を、０．０５Ｍ、ｐＨ７．４のトリス、３．４Ｍの塩化ナトリウム、４ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＮ−エチルマレイミドおよびプロテアーゼ（Roche）およびホスファターゼ（phosphatise）阻害剤（Sigma）を含む高塩緩衝液中で均質化する。均質化した混合物を、７０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットを２Ｍ尿素緩衝液（０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０５Ｍ、ｐＨ７．４のトリス）中でインキュベートし、４８℃で一晩撹拌する。次いで混合物を最終的に１４，０００ｇで２０分間遠心分離し、２Ｍ尿素緩衝液に再懸濁し、アリコートで−８０℃で保存する。タンパク質の推定は、ＤＣタンパク質アッセイキット（改変Lowry、Bio-Rad）を用いて行い、定量化用に単離されたＥＣＭタンパク質の量を推定する。組織培養皿のコーティングは、タンパク質抽出物を用いて３７℃で３時間行う。
異なる適応症のための種々の腫瘍組織からのＥＣＭの分離に続いて、これらのＥＣＭの組成を質量分析により分析し、その結果を図１４に示す。異なる原発腫瘍（ＨＮＳＣＣ、胃、膵臓、および大腸の癌）から単離した細胞外基質の異なる成分の分布および存在量を、表１Ａ〜１Ｇに示す。試料を精製し、ＬＣＭＳ分析に供する。主要な基質タンパク質の存在量を、各腫瘍タイプについて示す。前述の表に示すように、ＥＣＭコーティングに必要な成分は各癌のタイプに特異的である。そのため、上記の全データは、特定の腫瘍／癌タイプに向けてウェル上にコーティングされるＥＣＭの組成を識別するのに役立つ。ＥＣＭ混合物中で必要とされる成分の濃度を、次の表１に提供する；この表は表１Ａ〜１Ｇの要約である。
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月20日(2014.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分：コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、オステオポンチンを含み、任意にラミニン、デコリン、テネイシンＣ、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を共に含む、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物を得るための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．腫瘍組織を生化学的アッセイに供して、ＥＣＭの成分を同定すること；および
ｂ．ＥＣＭの成分：コラーゲン１、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン６、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、フィラミンＡ、ビメンチン、オステオポンチン、任意にラミニン、デコリン、テネイシンＣ、基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質を共に組み合わせて、ＥＣＭ組成物を得ること；
を含む、前記方法。
【請求項３】
腫瘍組織を培養するための腫瘍微小環境プラットフォームであって、該微小環境が、請求項１に記載のＥＣＭ組成物、培養培地を、任意に血清、血漿またはＰＢＭＣおよび薬物と共に含む、前記腫瘍微小環境プラットフォーム。
【請求項４】
腫瘍組織を培養するための、腫瘍微小環境プラットフォームを得るための方法であって、該方法が、プラットフォームを請求項１に記載のＥＣＭ組成物でコーティングすること、および培養培地を任意に血清、血漿またはＰＢＭＣおよび薬物と共にプラットフォームに加えて、腫瘍微小環境プラットフォームを得ること、の行為を含む、前記方法。
【請求項５】
腫瘍組織を器官培養する方法であって、腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して器官培養物を得る行為を含む、前記方法。
【請求項６】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、アッセイを行うこと；
ｃ．アッセイの読み取りを数値メトリックに変換して感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｄ．任意に、感受性指数と、前記１または２以上の薬物に対する対象の臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
腫瘍対象の、１または２以上の薬物に対する反応を予測する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理すること；
ｃ．薬物に対する腫瘍の反応を複数のアッセイにより評価して、複数のアッセイの各々についての評価スコアを得ること；
ｄ．複数のアッセイの各々に対して重みスコアを割り当てること；
ｅ．複数のアッセイの各々の評価スコアに、複数のアッセイの対応するアッセイの重みスコアを乗じて、複数のアッセイの各々についての独立アッセイスコアを得ること；
ｆ．複数のアッセイの各々の独立アッセイスコアを組み合わせて感受性指数を取得し、これにより、対象の１または２以上の薬物に対する反応を予測すること；および
ｇ．任意に、感受性指数と、対象の１または２以上の薬物に対する臨床反応との相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
抗癌剤をスクリーニングまたは開発する方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；および
ｂ．培養された腫瘍組織を剤で処理し、剤に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価して、前記剤の腫瘍細胞に対する効果を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項９】
腫瘍細胞を特定のマーカーについてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下の行為：
ａ．対象の腫瘍組織を請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム上で培養して、培養された腫瘍組織を得ること；
ｂ．培養された腫瘍組織を１または２以上の薬物で処理し、薬物に対する腫瘍の反応をアッセイにより評価すること；および
ｃ．マイクロアレイおよび核酸解析を行って、バイオマーカーについてスクリーニングすること；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、または請求項２、４〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、細胞外基質［ＥＣＭ］組成物が腫瘍特異的であり、コラーゲン１が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５０μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン３が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン４が、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約２５０μｇ／ｍｌであり；
コラーゲン６が、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
フィブロネクチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約７５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌまたは約５００μｇ／ｍｌであり；
ビトロネクチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約９５μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
カドヘリンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌおよび約５μｇ／ｍｌであり；
フィラミンＡが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
ビメンチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌであり；
ラミニンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；
デコリンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌであり；
テネイシンＣが、約０．０１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１０μｇ／ｍｌまたは約２５μｇ／ｍｌであり；
オステオポンチンが、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約１μｇ／ｍｌまたは約５μｇ／ｍｌであり；
基底膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および基質タンパク質が、約０．０１μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度である；
前記細胞外基質［ＥＣＭ］組成物、腫瘍微小環境プラットフォーム、または方法。
【請求項１１】
腫瘍組織が、中枢神経系、骨髄、血液、脾臓、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、胃、食道、卵巣、膀胱、精巣、子宮、間質組織および結合組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるソースから得られ、腫瘍または腫瘍組織が、外科的にもしくは生検により、または異種移植片としてまたはそれらの任意の組合せで得られ；および前記腫瘍または腫瘍組織が、約１００μｍから約３０００μｍの切片の小さな断片に分割されている、請求項３に記載の腫瘍微小環境、または請求項２、４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍組織の培養が、約３０℃から約４０℃の範囲の温度、好ましくは約３７℃で；約２〜１０日の間、好ましくは約３〜７日；および約５％のＣＯ２で実施され、コーティングプラットフォームが、プレート、ベース、フラスコ、ディッシュ、ペトリプレートおよびペトリ皿を含む群から選択される、請求項３に記載の腫瘍微小環境、または請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
微小環境プラットフォームが、腫瘍細胞のシグナリングネットワーク、無傷の組織の微小環境、細胞構造、および腫瘍−間質相互作用の完全性を維持するためのものである、請求項３に記載の腫瘍微小環境プラットフォーム、または請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
培養培地が、約６０％〜約１００％の範囲の濃度、好ましくは約８０％で２ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］またはＲＰＭＩ１６４０［Roswell Park Memorial Institute Medium］；約０．１％〜約４０％の範囲の濃度、好ましくは約２％（重量／重量）の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；約１％〜約２％の範囲の濃度、好ましくは約１％（重量／重量）のペニシリン−ストレプトマイシン；約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約５ｍＭのＬ−グルタミンである非必須アミノ酸；および約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度、好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む群から選択され；および、培養培地中の血清が、約０．１％〜約１０％の範囲の濃度、好ましくは約２％である、請求項３に記載の腫瘍微小環境、および請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍が、胃癌、結腸癌、頭頸部癌、脳の癌、口腔癌、乳癌、胃癌、胃腸の癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮癌、骨の癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、甲状腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ならびにＡＭＬ［急性骨髄性白血病］、ＣＭＬ［慢性骨髄性白血病］、ＡＬＬ［急性リンパ性白血病］、ＴＡＬＬ［Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病］、ＮＨＬ［非ホジキンリンパ腫］、ＤＢＣＬ［びまん性Ｂ細胞性リンパ腫］、ＣＬＬ［慢性リンパ性白血病］、および多発性骨髄腫を含む血液の癌、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項２、４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アッセイが、細胞生存率、細胞死、細胞増殖、腫瘍の形態、腫瘍間質含量、細胞代謝、老化またはこれらの任意の組合せについてのアッセイを含む群から選択され、細胞生存率および細胞代謝についてのアッセイが、ＷＳＴアッセイ、ＡＴＰ取り込みアッセイ、およびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；細胞死についてのアッセイが、ＬＤＨアッセイ、活性化カスパーゼ３アッセイ、活性化カスパーゼ８アッセイ、および酸化窒素合成酵素アッセイ、ＴＵＮＥＬを含む群から選択され；細胞増殖についてのアッセイが、Ｋｉ６７アッセイ、ＡＴＰ／ＡＤＰ比アッセイおよびグルコース取り込みアッセイを含む群から選択され；ならびに腫瘍の形態および腫瘍間質についてのアッセイが、Ｈ＆Ｅ［ヘマトキシリン＆エオシン染色］であるか；またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、対象のための処置を、化学療法、標的療法、外科手術、放射線またはそれらの任意の組み合わせを含む群から決定するために使用され、感受性指数が６０より大、２０と６０の間、および２０より小の場合に、感受性指数がそれぞれ、完全臨床反応、部分的臨床反応、および臨床反応なしと相関する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１８】
生化学的アッセイが、ＥＬＩＳＡ、ブロッティング技術、ＬＣＭＳ、ビーズベースアッセイ、免疫除去、クロマトグラフィーアッセイまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択される定量的アッセイまたは定性的アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
複数アッセイの各々に対する重みスコアの割り当てが、用いる薬物の性質に基づく、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのマイクロアレイおよび核酸分析を実施して、薬物処置の前後の経路の調節を検出し、マイクロアレイおよび核酸分析が、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、およびホスホプロテオミクスプロファイリングを含む群から選択されるアッセイを用いて確認される、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
2014534809.tif 000087
2014534809.tif 000088
2014534809.tif 000089