(57)【要約】 ６８Ｇａを含有する錯体の調製方法であって、その錯体形成反応では、金属陽イオンを封鎖することが可能な化合物の存在下、緩衝剤ギ酸／ギ酸塩を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６８Ｇａ錯体の調製方法であって、キレート剤で官能基化された分子と６８Ｇａ間の錯体化反応を、場合により金属陽イオンを封鎖することが可能な化合物の存在下で、緩衝剤ギ酸／ギ酸塩水溶液中において行い、ここで、前記金属陽イオンを封鎖することが可能な化合物を使用する場合、該金属陽イオンを封鎖することが可能な化合物を錯体化反応の開始時に加える、方法。
【請求項２】
６８Ｇａ錯体の調製方法であって、キレート剤で官能基化された分子と６８Ｇａ間の錯体化反応を、金属イオン封鎖剤の存在下、緩衝水溶液中において行う、方法。
【請求項３】
前記キレート剤で官能基化された分子が、ＤＯＴＡ及びその誘導体、ＮＯＴＡ及びその誘導体、ＰＣＴＡ及びその誘導体よりなる群から選択され、前記ギ酸塩がギ酸ナトリウムである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
標識混合物中におけるギ酸／ギ酸塩の比が１〜３．５である、請求項１及び３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記金属イオン封鎖剤が、グリシン及び他のキレートアミノ酸、クラウンエーテル類及び窒素クラウンエーテル類、複素環式有機化合物、カリックスアレーン類、多座キレート剤、天然キレート剤、例えばカテキン類、タンニン、ポルフィリン、線状又は大環状キレート剤よりなる群から選択される、請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記錯体化反応がｐＨ３〜４．５の範囲で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
反応のｐＨが３．２〜４．２であることが更に好ましい、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反応のｐＨが３．４〜４．０であることが最も好ましい、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
・商業用６８Ｇａ発生剤を、酸を含有する溶離液を用いて、緩衝剤ギ酸塩及び塩基を含有するバイアル中に直接溶離させ；
・キレート剤で官能基化された分子を前記バイアル中に加え、その反応バイアルを短時間加熱し；
・生成物を集める、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
・商業用６８Ｇａ発生剤を、酸を含有する溶離液を用いて、キレート剤で官能基化された分子を含有するバイアル中に直接溶離させ；
・緩衝剤ギ酸塩及び塩基を前記バイアル中に加え、その反応バイアルを短時間加熱し；
・生成物を集める、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
酸溶離液がＨＣｌ水溶液であり、塩基がＮａＯＨ水溶液である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
・キレート剤で官能基化された分子及び金属陽イオンを封鎖することが可能な化合物を含有するバイアルと；
・適切な超高純度のギ酸／ギ酸ナトリウム混合物を含有するバイアル又はシリンジと
を備える反応キット。
【請求項１３】
キレート剤で官能基化された分子と、金属陽イオンを封鎖することが可能である選ばれた化合物と、適切な超高純度のギ酸／ギ酸ナトリウム混合物とを含有するバイアル。
【請求項１４】
前記バイアルがシリコン処理をしたバイアルである、請求項１１に記載の反応キット又は請求項１３に記載のバイアル。
【請求項１５】
請求項１〜１０及び１３のいずれか１項に記載の方法によって得られた６８Ｇａ錯体であって、１０ｍｇ／ｍｌ未満のギ酸塩／ギ酸と、使用した場合には１００ｎｍｏｌ未満の金属イオン封鎖剤とを含有することを特徴とする６８Ｇａ錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同位体を含有する錯体の調製方法、特には放射線マーカーとして有用である同位体６８Ｇａを含有する錯体の調製方法を扱うものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内ＰＥＴ画像処理に６８Ｇａで標識された放射性トレーサーを用いる最近の臨床研究での励まされる結果にもかかわらず、その同位体の長期的分布を可能にしない短い半減期（６８分）は、標識化プロセスの設備が整っている「プロダクション・ラジオファーマシー」の必要性と共に、依然として、核医学ルーチンでの広範な使用を禁止している。
【０００３】
Ｇａ−６８による標識化は、放射性金属を、適切なキレート剤と、反応媒体中で錯体化することによって行われるが、該反応媒体中には、６８Ｇａ発生剤の溶離に由来する放射線量の６８Ｇａと、標識されるべき分子（我々の出願では、キレート剤で官能基化された分子又は前駆物質と称される）の量と、錯体形成に最適なｐＨを確保するのに適した緩衝剤とが導入されている。
【０００４】
所謂６８Ｇａ発生剤は、ゲルマニウムを含有する市販の樹脂であり、該樹脂から、ゲルマニウム崩壊によって、所望の６８Ｇａが自然に形成される；それ故に、適当なｐＨ条件下で且つキレート剤で官能基化された分子の存在下で上記樹脂を溶離することにより、６８Ｇａを含有する所望の錯体の形成が可能である；選ばれたキレート剤で官能基化された分子によって、７５〜９０℃での加熱が必要な場合がある。
【０００５】
上記標識化成功の主な限界は、適切なｐＨを一定に保つ必要があることと、錯体形成過程でのＧａ−６８と金属不純物の競合とによって与えられる。
【０００６】
上述の内容を考慮すると、標準ｐＨを確保することのできる適切な緩衝剤を調査することが、６８Ｇａ標識化における当業者によって継続的に調べられている話題であることは明らかであり、未だに未解決である。
【０００７】
かかる緩衝剤は、毒性がなく、ｐＨ３．５〜５．０の範囲で緩衝液として作用することができるべきであり、ガリウムイオンと競合すべきではなく、優先的に、弱い金属錯体化能を有するべきでもない。
【０００８】
報告された異なる緩衝剤の中で、これまでに主として使用されてきたものは、ＨＥＰＥＳ（スルホン酸誘導体）又は酢酸塩緩衝剤である；しかしながら、それらは、厳しく規定されたｐＨ範囲でのみ作動することが可能であり（出版物Velikyan et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19, 569-573）、溶離液酸性度がわずかに変化すると、所要の緩衝能をもはや保つことができない。
【０００９】
例えば、上記発生剤から来る溶離液の体積が少し増加しても、錯体形成を損ない、多量の遊離Ｇａ−６８をもたらす値にｐＨが変化する原因となる。これは、最終精製を強制させるノンコンプライアンスの危険を生じさせる。更に、ＨＥＰＥＳ緩衝剤については、利用できる毒物学的データがない：最終精製は、放射性医薬品の投与前にＨＥＰＥＳを除去し又は少なくとも低減するためにも行われる必要がある。
【００１０】
最近、他の緩衝剤が、Ｇａ−６８錯体形成に効率的な解決策として報告されており（ＷＯ２０１０／０９２１１４）、例えば、乳酸塩、酒石酸塩及び炭酸塩緩衝剤である。これら緩衝剤は、少なくとも２つのＧａ−６８配位機能を備えており、緩衝剤が標識化を妨げることもあり得るという偏見を克服する。とにかく、それらの使用は、Ｇａ−６８溶液の予備標識化処理を免除することなく、上記発生剤溶離液の減少され且つ精製した画分を用いて首尾よく試験された。
【００１１】
第２の重要な限界は、金属不純物の競合であり、主として、固定相とＧａ−６８崩壊の両方に由来する三価の及び二価の陽イオンである（Ｚｎ）。これら金属は、Ｇａ−６８と同様に、キレート剤で官能基化された分子によって拘束され、標識化に実際利用できる分子の数を低減する。これは、Ｇａ−６８の不完全な錯体形成を招く場合があり、調製物の最終放射化学的純度を低減する。時に、先行技術において、標識化の間キレート剤で官能基化された分子によって錯体化されていないＧａ−６８は、放射性医薬品調製物の投与の場合に高い割合での遊離金属の存在を回避し且つそれらの除去を促進するために、同位体に対する親和性が認められている過剰のキレート剤（例えばＥＤＴＡキレート剤）を標識化後に加えることで、完全に封鎖される（ＷＯ２０１０／１４１８３３−例２）。そうではなく、より多い量のキレート剤で官能基化された分子から開始して、部分的なＧａ−６８錯体形成に直面するかもしれない。しかしながら、キレートされた前駆物質の量の増加は、比放射能（放射性の物と標識されていない物の比）の望ましくない低減を引き起こし、診断結果を悪化させる場合がある。実際、同じ受容体について、標識された分子との競合によって、標識されていない分子の存在は、標的組織における放射能濃度に悪影響を及ぼす可能性がある。それ故に、高ＳＲＡ（比放射能）は、標的組織とその周りのＰＥＴ画像において十分なコントラストを与えるために重要である可能性がある。当該技術の状況においては、（特許番号ＷＯ２０１０／０９２１１４に記載されるように）競合する金属イオンの存在が、通常、標識化前に溶離液の予備精製又は分画によって低減されるものの、これら工程は、開始活性の不利な喪失をもたらす。
【００１２】
更に、予備標識化工程も最終精製も回避できない場合、Ｇａ−６８標識化は、常に、合成モジュールを用いることで、ある程度、自動化に基づいており、そのキット戦略を実現不可能にさせる。これは、必要とされる技術的な専門知識に加えて、標識化のために好ましくない長時間を要する。放射性核種の短い半減期（ｔ１／２＝６８分）と、上記発生剤によって与えられる限られた活性の理由から、非常に迅速で、直接的で且つ高収率の錯体形成を得ることを目標としているどんな改善も非常に望ましい。
【００１３】
先に述べたすべての内容から、６８Ｇａ錯体の調製を可能にし、先に述べた問題を克服する方法の必要性は明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０９２１１４
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１４１８３３
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Velikyan et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19, 569-573
【発明の概要】
【００１６】
６８Ｇａを含有する錯体の調製方法であって、その錯体形成反応において、場合により金属陽イオンを封鎖することが可能な化合物の存在下で、緩衝剤ギ酸／ギ酸塩を用いる方法について説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、含水緩衝剤ギ酸／ギ酸塩中においてＧａ−６８がキレート剤で官能基化された分子により効果的に錯体化される方法によって、上述の課題を克服することを可能にする。
【００１８】
上述の緩衝剤ギ酸／ギ酸塩は、適切なｐＨを確立することを可能にすると共に、溶離液体積／酸性度変化に耐えることも可能にする。
【００１９】
実際、その緩衝能力は、Ｇａ−６８錯体形成に適したｐＨの値にて中心があり、金属錯体形成能がないため、標識化の障害を与えない。更に、この緩衝剤は、ギ酸が薬局方の第３類（低毒性溶媒）残留溶媒に分類されており、５ｍｇ／ｍｌ（５０００ｐｐｍ）の限界が認められているため、医薬的適用に適合するはずである。
【００２０】
通常、ギ酸塩としてはギ酸ナトリウムが好適であるが、ギ酸の他のどんな金属塩も使用できる。
【００２１】
ギ酸／ギ酸塩の比は、通常、１〜３．５である。
【００２２】
更に、金属不純物の存在の問題に立ち向かうためには、当該技術の通常の慣行であるように、キレート剤で官能基化された分子の量を増加させたり（ＳＲＡの減少をもたらしたり）又は時間及び放射能を消費する精製工程により発生剤溶離液を予め処理したりする代わりに、妨害種を中和し、Ｇａ−６８がキレート剤で官能基化された分子とより自由に反応できるようにしておくため、上記方法において、金属イオン封鎖剤を使用できることを見出した。
【００２３】
これら金属イオン封鎖剤は、存在する場合、キレート剤で官能基化された分子をサポートする役目を果たし、キレート剤で官能基化された分子との反応に競合する金属を一時的に又は恒久的に取り去る。
【００２４】
注目すべきは、本発明における金属イオン封鎖剤の機能が、上述のように、先行技術で使用される金属イオン封鎖剤の機能と反対であることである。
【００２５】
実際、既知の手順に従うと、標識化の終わりで、ガリウムに対して特定の親和性を持つ金属イオン封鎖剤を、その同位体の未反応部分をキレートするために、加えることができるが、本発明によれば、金属不純物の競合を最小限に抑えることができる金属イオン封鎖剤を反応の開始時に加える。
【００２６】
本発明に使用される金属イオン封鎖剤は、明らかに、主要な標識化反応の障害又はバイサイドで標識される種の形成を回避するため、Ｇａ−６８イオンよりむしろ競合する金属と優先的に結合するはずである。
【００２７】
更に、特定の実施態様によれば、本発明はまた、放射性同位体、特には６８Ｇａを錯体化するための方法であって、緩衝溶液を、上述し且つ以下に述べる金属イオン封鎖剤と組み合わせて使用する方法についても言及する。
【００２８】
本発明によれば、キレート剤で官能基化された分子は、Ｇａ−６８等の放射性同位体を錯体化することができるキレートで官能基化された標的能力を持つどんな分子も対象となる。
【００２９】
本発明に従うＧａ−６８の錯体形成に好適なキレートは、ＤＯＴＡ及びその誘導体、ＮＯＴＡ及びその誘導体、ＰＣＴＡ及びその誘導体の中から選択できる。
【００３０】
一般に、Ｇａ３＋の周りに十分安定したケージを形成できるどんなキレートを使用してもよく、特には、あらゆる脂肪族、大環状若しくは線状アミンであり、又は第３級アミンを備えた大環状アミンである。
【００３１】
標的能力を持つ分子としては、診断又は治療的に興味のある生物学的過程を標的にすることができる分子が対象とされ、有利には、アミノ酸、ペプチド、有利には４〜１５若しくは４〜１０のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ビタミン、単糖若しくは多糖、抗体、核酸、又はアプタマーである。
【００３２】
本発明に有用である標的能力を持つ分子の中でも、我々は以下のものについて言及することができる（例であり、制限する一覧ではない）：
・ＶＥＧＦ受容体を標的にする分子
・ボンベシン類似物又はＧＲＰ受容体を標的にする分子
・ソマトスタチン受容体を標的にする分子
・ＲＧＤペプチド又はαｖβ３及びαｖβ５標的分子
・アネキシンＶ又はアポトーシス過程を標的にする分子
・エストロゲン受容体を標的にする分子
・アテロームプラークを標的にする分子
・Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２２２，２６０−２７０，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓで想起された標的分子
【００３３】
金属イオン封鎖剤は、存在する場合、以下のものよりなる群から選択されるのが好ましい：
・グリシン及び他のキレートアミノ酸（例えばメチオニン、システイン等）
・クラウンエーテル及び窒素クラウンエーテル
・複素環式有機化合物、例えば１，１０−フェナントロリン、２，２’−ビピリジン
・カリックスアレーン類
・多座キレート剤、例えばタンパク質、多糖類及びポリ核酸
・天然キレート剤、例えばカテキン類、タンニン、ポルフィリン
・一般的な線状又は大環状キレート剤（例えばポダンド及びクリプタンド）
【００３４】
通常ではミクロモル量の、より有利にはナノモル量の金属イオン封鎖剤が使用され、好ましくは１００ナノモル未満であり、例えば２０と２５ナノモルの範囲にある。
【００３５】
先に説明した金属イオン封鎖剤は、他の緩衝剤を使用する錯体化反応においても有利に利用できることに注目することが重要である。
【００３６】
従って、本発明の他の実施態様は、放射性同位体、特に６８Ｇａの錯体化反応を含む方法であって、先に規定された金属イオン封鎖剤を反応緩衝剤に加える方法である。
【００３７】
錯体化反応は、好ましくはｐＨ３〜４．５、より好ましくは３．２〜４．２、最も好ましくは３．４〜４．０の範囲で行われる。
【００３８】
先に記載される方法に従って得られる錯体も本発明の実施態様である；それらは、１０ｍｇ／ｍｌ未満のギ酸／ギ酸塩と、１００ｎｍｏｌ未満の金属イオン封鎖剤（使用した場合）とを含有することができる。
【００３９】
前述のように、商業用発生剤（ゲルマニウムを持つ樹脂カラムからなる）を、酸（通常ＨＣＬ）を含有する溶離液を用いて、緩衝剤ギ酸塩と塩基とを含有するバイアル中に直接溶離させる。
【００４０】
そのバイアル中に、キレート剤で官能基化された分子を（通常、例えばフェナントロリンのような金属イオン封鎖剤の存在下で）加え、その反応バイアルを短時間加熱する；その生成物溶液を集めて、逆相ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣ（ＭｅＯＨ／１Ｍの酢酸アンモニウム  １／１）によって調べる。
【００４１】
また、その添加順序を逆にすることもできる。
【００４２】
例えば、上記商業用発生剤を、酸（通常ＨＣＬ）を含有する溶離液を用いて、キレート剤で官能基化された分子を（好ましくは、例えばフェナントロリンのような金属イオン封鎖剤の存在下で）含有するバイアル中に直接溶離させることができる。
【００４３】
ギ酸塩緩衝剤と塩基とをそのバイアル中に加え、反応混合物を短時間加熱する。
【００４４】
酸溶離液は、通常、例えばＨＣｌのような強酸の水溶液によって構成されるが、塩基は、例えばＮａＯＨのような強塩基の水溶液である。
【００４５】
全体的に見ると、ギ酸塩緩衝剤の使用は、たとえ溶離液酸性度の変化が起きても、適切なｐＨを保証し、このようにして、低過ぎる又は高過ぎるｐＨであって、それぞれが高含量の遊離６８Ｇａ３＋又は６８Ｇａ水酸化物を生じさせるｐＨによって錯体化していないＧａ−６８の量を低減する。更に、金属イオン封鎖剤を加えることで、完全なＧａ−６８錯体形成を得るために必要とされるキレート剤で官能基化された分子の量を減少させることが可能になる。
【００４６】
これら２つの態様は、出願人が、適切な程度の錯体形成、有利には少なくとも９２％、９５％及び９７％を実現することを可能にし、その結果として、十分な純度であり（少なくとも９２％、９５％及び９７％）、どんな種類の予備又は最終精製もない。得られた結果は、操作や精製を要しない直接的なＧａ−６８標識化の実現可能性を裏付けるため、その処方を特定のキットの製造に適用することができる。
【００４７】
それ故に、特定の実施態様によれば、本発明はまた、
・キレート剤で官能基化された分子と選択された金属イオン封鎖剤とを含有するシリコン処理されたバイアル；
・適切な超高純度のギ酸／ギ酸ナトリウム混合物を含有するシリコン処理されたバイアル又はシリンジ
を備える反応キットに関する。
【００４８】
更に、本発明はまた、キレート剤で官能基化された分子と、選択された金属イオン封鎖剤と、適切な超高純度のギ酸／ギ酸ナトリウム混合物とを含有する単一のバイアルに関する。
【実施例】
【００４９】
例１
０．６ＭのＨＣｌ溶離液３ｍｌを用いた６８ＧａＤＯＴＡペプチドの標識化
ＳｎＯ２固定相を有する３０ｍＣｉの商業用発生剤（ＩＤＢ製）を、０．６Ｍの超高純度ＨＣｌの溶離液３ｍｌを用いて、１．５Ｍの超高純度緩衝剤ギ酸塩２００μｌと４．５Ｍの超高純度ＮａＯＨ４００μｌとを含有するバイアル中に直接溶離させた。次いで、ＤＯＴＡ−ペプチド３０μｇと、１，１０−フェナントロリン４．５μｇとを加え、その反応バイアルを９５℃で７分間加熱した。生成物を逆相ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣ（ＭｅＯＨ／１Ｍの酢酸アンモニウム．１／１）によって調べたところ、両方のテストで放射化学純度９８％がもたらされた。
【００５０】
例２
０．６ＭのＨＣｌ溶離液３．２ｍｌを用いた６８ＧａＤＯＴＡペプチドの標識化
ＳｎＯ２固定相を有する３０ｍＣｉの商業用発生剤（ＩＤＢ製）を、０．６Ｍの超高純度ＨＣｌの溶離液３．２ｍｌを用いて、１．５Ｍの超高純度緩衝剤ギ酸塩２００μｌと４．５Ｍの超高純度ＮａＯＨ４００μｌとを含有するバイアル中に直接溶離させた。次いで、ＤＯＴＡ−ペプチド３０μｇと、１，１０−フェナントロリン４．５μｇとを加え、その反応バイアルを９５℃で７分間加熱した。生成物を逆相ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣ（ＭｅＯＨ／１Ｍの酢酸アンモニウム．１／１）によって調べたところ、両方のテストで放射化学純度９７％がもたらされた。
【００５１】
例３：
０．６ＭのＨＣｌ溶離液３ｍｌを用いた６８ＧａＤＯＴＡペプチドの標識化
ＳｎＯ２固定相を有する３０ｍＣｉの商業用発生剤（ＩＤＢ製）を、０．６Ｍの超高純度ＨＣｌの溶離液３ｍｌを用いて、１．５Ｍの超高純度緩衝剤ギ酸塩２００μｌと４．５Ｍの超高純度ＮａＯＨ４００μｌとを含有するバイアル中に直接溶離させた。次いで、３０μｇのＤＯＴＡ−ペプチドと、１５μｇの１２−クラウン−４とを加え、その反応バイアルを９５℃で７分間加熱した。生成物を逆相ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣ（ＭｅＯＨ／１Ｍの酢酸アンモニウム．１／１）によって調べたところ、それぞれ９８％及び９６％の放射化学純度がもたらされた。
【００５２】
例４：
０．６ＭのＨＣｌ溶離液３ｍｌを用いた６８ＧａＤＯＴＡペプチドの標識化
ＳｎＯ２固定相を有する３０ｍＣｉの商業用発生剤（ＩＤＢ製）を、０．６Ｍの超高純度ＨＣｌの溶離液３ｍｌを用いて、３０μｇのＤＯＴＡ−ペプチドと１５μｇの１２−クラウン−４とを含有するバイアル中に直接溶離させた。次いで、１．５Ｍの超高純度緩衝剤ギ酸塩２００μｌと４．５Ｍの超高純度ＮａＯＨ４００μｌとを加え、その反応バイアルを９５℃で７分間加熱した。生成物を逆相ＨＰＬＣ及びＩＴＬＣ（ＭｅＯＨ／１Ｍの酢酸アンモニウム．１／１）によって調べたところ、それぞれ９８％及び９６％の放射化学純度がもたらされた。
【国際調査報告】
2014524423.tif 000002
2014524423.tif 000003
2014524423.tif 000004
2014524423.tif 000005