(57)【要約】本発明は、ＰＲＲＳウイルス調製物の効率的な工業規模の製造方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の工業規模の製造方法であって、
ａ）同時に、ＰＲＲＳＶ感染に許容性の哺乳類細胞系を含む大規模な培養培地をバイオリアクターに播種し、ＰＲＲＳＶを前記哺乳類細胞に感染させること
ｂ）感染後にウイルスを５〜７日間増殖させること；
ｃ）前記バイオリアクターから培地を除去することによって１回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；
ｄ）培地を前記バイオリアクターに再補充し、ウイルスを１〜４日間増殖させること；
ｅ）前記バイオリアクターから培地を除去することによって２回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；
ｆ）培地を前記バイオリアクターに再補充し、ウイルスを１〜４日間増殖させること、及び
ｇ）前記バイオリアクターから培地を除去することによって３回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること
を含む、製造方法。
【請求項２】
３回目の回収工程に続いて、培地を前記バイオリアクターに再補充し、ウイルスを１〜４日間増殖させること、及び前記バイオリアクターから培地を除去することによって４回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離することを含む少なくとも１つの再供給及び回収工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ターゲット感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１〜０．３０及び細胞播種密度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類細胞が、３００Ｌバイオリアクターあたり約７ｘ１０８〜１．０ｘ１０９個の密度で播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞播種密度が３００Ｌバイオリアクターあたり約１．０ｘ１０９個である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＯＩが約７ｘ１０８個のウイルス粒子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培地のデキストロース濃度をモニタリングすることを含み、培地のデキストロース濃度が０．１g/L未満に減少する最初の日に、前記１回目の回収工程が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
培地を再補充した後１又は２日間に、前記２回目の回収が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２回目に培地を再補充した後１〜４日間に、前記３回目の回収が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類細胞系及び前記ＰＲＲＳを添加する前の日又はそれと同日に、培養培地が先にバイオリアクターに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類細胞系及び前記ＰＲＲＳを添加する１日前に、培養培地がバイオリアクターに添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオリアクターの温度が３４℃〜３８℃に設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が５％v/vの放射線照射ウシ胎仔血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＲＲＳＶが、ＰＲＲＳＶ株９４８８１、ＶＲ２３３２、レリスタッドウイルス株（レリスタッド物質（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）、又はその他の株、例えばアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０４、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１１４０、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８７、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８８、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３３２、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４７４、及びＶＲ２４０２；ＣＮＣＭ  Ｉ−１１０２、ＣＮＣＭ  Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８８、又はＥＣＡＣＣ  Ｖ９３０７０１０８；ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３６８；ＡＴＣＣ  ＶＲ−２４９５；ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８５、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８６、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４７４、及びＡＴＣＣ  ＶＲ２４０２で寄託された株からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＲＲＳＶ調製物の工業規模の製造方法であって、
ａ．前記ＰＲＲＳＶによる感染に許容性の哺乳類細胞及び前記ＰＲＲＳＶの両方を、前記細胞の成長に適切な培地を含むバイオリアクターに同時に播種すること；及び
ｂ．ＰＲＲＳＶが回収される３つの連続する回収工程を実施すること、ここで、１回目及び２回目の各回収後に培地が再補充される、ここで
ｉ．培地のデキストロース濃度が０．１g/L未満に減少した最初の日に、１回目の回収が実施され；
ｉｉ．１回目の回収後に培地を添加した後１又は２日に、２回目の回収が実施され；及び
ｉｉｉ．２回目の回収後に培地を添加した後１〜４日に、３回目の回収が実施される；
を含む、製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法に従って製造されたＰＲＲＳＶを含み、ブタへの送達のための許容しうるアジュバント又は担体と一緒に製剤化された、ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶ。
【請求項１７】
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の工業規模の製造方法であって、
ａ）同時に、ＰＲＲＳＶ感染に許容性の哺乳類細胞系を含む大規模な培養培地をローラーボトルに播種し、ＰＲＲＳＶを前記哺乳類細胞に感染させること
ｂ）感染後にウイルスを５〜７日間増殖させること；
ｃ）前記ローラーボトルから培地を除去することによって１回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；
ｄ）培地を前記ローラーボトルに再補充し、ウイルスを約２日間増殖させること；
ｅ）前記ローラーボトルから培地を除去することによって２回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；
ｆ）培地を前記ローラーボトルに再補充し、ウイルスを約２日間増殖させること、及び
ｇ）前記バイオリアクターから培地を除去することによって３回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、それに基づくワクチンの製造に使用され得る生弱毒化ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の工業規模の製造方法、及びブタの処置におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、多くの人によって、現在世界中の養豚産業に影響を及ぼしている最も重要な疾患と見られている。この症候群は、１９８７年に米国で「ブタミステリー病」として初めて記載され、急速に世界中に広まった。この症候群は、重症の繁殖不全（reproduction loss）を引き起こし、二次感染による死亡率増加に関連し、飼料効率および平均１日増体重の低下につながる。不幸なことに、ＰＲＲＳを引き起こすウイルスのコントロールは困難であることが証明された。
【０００３】
ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、科アルテリウイルス（Arteriviridae）（Cavanaugh, 1997）に分類されるエンベロープ型１本鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、１９８７年に米国で「ブタミステリー病」として初めて記載された、蔓延しているブタ疾患である（Hill, 1990）。この疾患は全ての齢群のブタに呼吸器疾患として現れ、一部の若齢ブタでの死亡および繁殖適齢のメスでの重大な繁殖の問題につながる。
【０００４】
ＰＲＲＳＶの伝染は、感染ブタと感受性ブタの間の直接接触により起こるおそれがあり、起こることが多い。非常に短い距離の空気伝染または精液を介した伝染も起こるおそれがある。ウイルスは、いったん感染したならば、成体の血中に約２〜４週間、感染したブタでは１〜２ヶ月以上残留することがある。感染した種雄ブタ（boar）は、ウイルスを精液中に１００日よりも長く排出するおそれがある。この長期間のウイルス血症は、伝染の確率を顕著に増加させる。加えて、ＰＲＲＳウイルスは、妊娠の最後の第３期間に胎盤を通過して子宮内で子ブタに感染し、死産または虚弱子ブタの原因となりうる。
【０００５】
高い健康状態もしくは普通の健康状態の群れまたは屋内もしくは屋外ユニットの両方からの群れなどの、全ての種類および大きさの群れが、ＰＲＲＳウイルスに感染する可能性がある。感染した群れは、重症の繁殖不全および成長不良を伴う離乳後肺炎のレベル増加を経験しうる。繁殖相（reproductive phase）は、典型的には２〜３ヶ月間持続するが、離乳後の問題は地方病的流行になることが多い。繁殖疾患は、妊娠後期に母ブタ（sow）および未経産雌ブタ（gilt）の両方を冒す流産の激増によって特徴づけられる。妊娠１０９〜１１２日付近で未熟分娩が起こる。死産および虚弱子ブタの数が増加し、離乳前死亡率のかなりの増加を招く。
【０００６】
呼吸相（respiratory phase）は、従来、育成豚舎内で、特にコンティニュアスフロー（continuous flow）の育成豚舎内で見られてきた。しかし、ＰＲＲＳウイルスによって起こる呼吸器の問題は、また、肥育豚舎内でブタ呼吸器複合感染症（ＰＲＤＣ）の一部として見られることがある。成長速度の減少、販売不可能なブタのパーセンテージの増加、および離乳後死亡率の増大が起こるおそれがある。診断所見は高レベルの肺炎を示し、その肺炎は、二次感染病原体として通例見なされる多種多様な他の微生物と共にＰＲＲＳウイルスに関連している。細菌単離株には、とりわけ、Streptococcus suis、Haemophilus suis、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus suis、Mycoplasma hyopneumoniae、およびPasteurella multocidaが含まれうる。一般に関係するウイルス感染病原体には、ブタインフルエンザウイルスおよびブタ呼吸器コロナウイルスが含まれる。罹患したブタは、高レベルの薬物療法に応答することがまれであり、オールイン／オールアウトシステムは、この疾患のコントロールに失敗した。
【０００７】
ＰＲＲＳＶウイルスは、約５０％の配列相同性を共有する「ＵＳ」および「ＥＵ」型と呼ばれる２種類の遺伝子型として存在する（Dea S et al. (2000). Arch Virol 145:659-88）。これら２種類の遺伝子型は、また、それらの免疫学的性質によって区別することができる。様々な単離株に関する配列情報の大部分は、構造タンパク質、すなわちウイルスゲノムの約４％だけを占めるエンベロープタンパク質ＧＰ５に基づき、一方で非構造タンパク質（ｎｓｐ）に関してはほとんど知られていない。ＰＲＲＳＶの単離およびワクチンの製造は、いくつかの公報（WO92/21375、WO93/06211、WO93/03760、WO93/07898、WO96/36356、EP0676467、EP0732340、EP0835930）に記載されている。
【０００８】
ＰＲＲＳ感染から回復するブタは、通常の環境下でブタが同じウイルス株に再度感染するのを防ぐ免疫反応を発達させているので、ワクチン接種は、ＰＲＲＳの負担を緩和するための重要な方法である。しかしながら、ＰＲＲＳウイルスは、プラス一本鎖ＲＮＡウイルスで頻繁に起こる突然変異によって高速に変化する能力を有する；従って、新たなウイルス株が生じる。このような場合、株間の防御作用は存在しない可能性があり、新たなアウトブレイクが過去に感染した農場で観察される可能性がある。従って、さらなるワクチンについて継続的な必要性がある。
【０００９】
弱毒化生ウイルスワクチンを製造するための最もよく使用されている方法は、天然のホスト以外の基質（通常は、ウイルスに許容性の細胞株を含む細胞培養液）で、ウイルスが十分に弱毒化（すなわち、毒性又は疾患を引き起こす能力の低下）されて、ワクチンとして使用されるまで、ウイルスを連続継代することである。第１継代のために、選択した接種材料を細胞培養液に感染させる。ウイルス複製の明らかな証拠（例えば、感染細胞におけるウイルス誘発性細胞変性効果［ＣＰＥ］）が得られた後に、第１継代の細胞培養培地若しくは感染細胞又はその両方の一定分量を使用して、第２の細胞培養液に感染させる。ウイルスをワクチンとして安全に使用できるように、ウイルスゲノムにおける１つ以上の重大な突然変異が十分な弱毒化を引き起こすまで、この工程を繰り返す。弱毒化の程度は、通常、天然のホストを、漸増継代レベルのウイルスに曝露することによって経験的に決定される。
【００１０】
上記手法は基本的には堅実なものであり、多数のヒト用ワクチンの開発及び獣医用途に使用されて成功している。しかしながら、工業規模の製造のことになると、効率的かつ費用効果的なＰＲＲＳＶ製造方法を提供することの必要性が依然としてある。
【００１１】
発明の概要
本発明は、このようなワクチンの製造に使用するための生ＰＲＲＳウイルスの新たな製造方法に関する。本明細書において記載される方法は、任意のＰＲＲＳウイルス、以下に限定されないが、ブダペスト条約の規定に従ってアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  １１０１２５０１及びＥＣＡＣＣ  １１０１２５０２（それぞれ２０１１年１月２５日に寄託）でEuropean Collection of Cell Cultures (ECACC)に寄託されたＰＲＲＳＶ９４８８１  ＰＲＲＳＶ株９４８８１、又は前記株のうちの１つの任意の子孫若しくは後代などを大規模に製造するのに使用され得る。
【００１２】
より具体的には、本発明は、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の工業規模の製造方法であって、
ａ）同時に、ＰＲＲＳＶ感染に許容性の哺乳類細胞系を含む大規模な培養培地をバイオリアクターに播種し、ＰＲＲＳＶを哺乳類細胞に感染させること
ｂ）感染後にウイルスを５〜７日間増殖させること；
ｃ）バイオリアクターから培地を除去することによって１回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；
ｄ）培地をバイオリアクターに再補充し、ウイルスを１〜４日間増殖させること；
ｅ）バイオリアクターから培地を除去することによって２回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；
ｆ）培地をバイオリアクターに再補充し、ウイルスを１〜４日間増殖させること、及び
ｇ）バイオリアクターから培地を除去することによって３回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること
を含む製造方法に関する。
【００１３】
特定の実施態様では、この方法は、３回目の回収工程に続いて、培地をバイオリアクターに再補充し、ウイルスを１〜４日間増殖させること、及びバイオリアクターから培地を除去することによって４回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離することを含む少なくとも１つの再供給及び回収工程をさらに含み得る。
【００１４】
好ましくは、この製造方法において、ターゲット感染多重度（ＭＯＩ）は０．０１〜０．３０であり、哺乳類細胞は、３００Ｌバイオリアクターあたり約７ｘ１０８〜１．０ｘ１０９個の密度で播種される。より具体的には、細胞播種密度は、３００Ｌバイオリアクターあたり約１．０ｘ１０９個である。具体的な実施態様では、ＭＯＩは、約７ｘ１０８個のウイルス粒子である。
【００１５】
この方法は、培地のデキストロース濃度をモニタリングすることを含んでもよく、培地のデキストロース濃度が０．１g/L未満に減少した最初の日に、１回目の回収工程が実施される。
【００１６】
工業的な製造方法において、好ましくは、培地を再補充した後１又は２日目に、２回目の回収が実施され、２回目に培地を再補充した後１〜４日目に、３回目の回収が実施される。
【００１７】
具体的な実施態様では、哺乳類細胞系及びＰＲＲＳを添加する前の日又は同日に、培養培地がバイオリアクターに添加される。好ましくは、哺乳類細胞系及びＰＲＲＳを添加する１日前に、培養培地がバイオリアクターに添加される。バイオリアクターの温度は、３４℃〜３８℃に設定される。
【００１８】
具体的な実施態様では、培地は、５％v/vの放射線照射ウシ胎仔血清を含む。
【００１９】
この方法は、任意のＰＲＲＳＶ、以下に限定されないが、ブダペスト条約の規定に従ってアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  １１０１２５０１及びＥＣＡＣＣ  １１０１２５０２（それぞれ２０１１年１月２５日に寄託）でEuropean Collection of Cell Cultures (ECACC)に寄託されたＰＲＲＳＶ９４８８１  ＰＲＲＳＶ株９４８８１、ＶＲ２３３２、レリスタッド（Lelystad）ウイルス株（Lelystad Agent（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）、又はその他の株、例えばアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０４、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１１４０、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８７、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８８、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３３２、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４７４、及びＶＲ２４０２；ＣＮＣＭ  Ｉ−１１０２、ＣＮＣＭ  Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８８、又はＥＣＡＣＣ  Ｖ９３０７０１０８；ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３６８；ＡＴＣＣ  ＶＲ−２４９５；ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８５、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８６、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４７４、及びＡＴＣＣ  ＶＲ２４０２で寄託された株からなる群より選択されるＰＲＲＳＶ、又は前記株のうちの１つの任意の子孫若しくは後代などを工業規模で製造するのに使用され得る。
【００２０】
また、ＰＲＲＳＶ調製物の工業規模の製造方法であって、
ａ．ＰＲＲＳＶによる感染に許容性の哺乳類細胞及びＰＲＲＳＶの両方を、細胞の成長に適切な培地を含むバイオリアクターに同時に播種すること；及び
ｂ．ＰＲＲＳＶが回収される３つの連続する回収工程を実施すること、ここで１回目及び２回目の各回収後に培地が再補充される、ここで
ｉ．培地のデキストロース濃度が０．１g/L未満に減少した最初の日に、１回目の回収が実施され；
ｉｉ．１回目の回収後に培地を添加した後１又は２日間に、２回目の回収が実施され；及び
ｉｉｉ．２回目の回収後に培地を添加した後１〜４日間に、３回目の回収が実施される、
を含む製造方法が企図される。上記バイオリアクター工程と同等の同時ローラーボトル工程を使用する別の方法もまた企図される。より具体的には、本発明は、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の工業規模の製造方法であって、ａ）同時に、ＰＲＲＳＶ感染に許容性の哺乳類細胞系を含む大規模な培養培地をローラーボトルに播種し、ＰＲＲＳＶを前記哺乳類細胞に感染させること；ｂ）感染後にウイルスを５〜７日間増殖させること；ｃ）前記ローラーボトルから培地を除去することによって１回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；ｄ）培地を前記ローラーボトルに再補充し、ウイルスを約２日間増殖させること；ｅ）前記ローラーボトルから培地を除去することによって２回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離すること；ｆ）培地を前記ローラーボトルに再補充し、ウイルスを約２日間増殖させること、及びｇ）前記バイオリアクターから培地を除去することによって３回目の回収工程を実施し、増殖させたウイルスをそこから単離することを含む製造方法に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、本明細書において記載される方法に従って製造されたＰＲＲＳＶを含み、ブタへの送達のための許容しうるアジュバント又は担体と一緒に製剤化されたＰＲＲＳＶ  ＭＬＶに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＲＲＳＶ９４８８１の大規模な製造のための同時工程。
【図２】３００Ｌバイオリアクター用の同時工程の定義及びタイムライン。
【図３】３００Ｌバイオリアクターにおける３つの同時ランに関するウイルス力価及びデキストロースのプロファイル。
【図４】３００Ｌバイオリアクターにおける３つの同時ランに関するウイルス力価及びグルタミンのプロファイル。
【図５】３００Ｌバイオリアクターにおける３つの同時ランに関するウイルス力価及びＤＯのプロファイル。
【図６】図６は、ＰＲＲＳＶ９４８８１でワクチン接種した動物におけるウイルス血症の％を示すＲＴ−ＰＣＴタイムＰＣＲの結果を示す。
【図７】ＰＲＲＳＶ９４８８１をローラーボトルで製造するための同時工程。
【図８】ローラーボトル工程用の同時工程の定義及びタイムライン。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、ワクチン及びその他の組成物の製造に使用するための生ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の大規模な製造方法を提供する。典型的な製造方法では、ウイルスは、ＰＲＲＳＶ感染に許容性の細胞株で生育される。しかしながら、このような一般的な方法では、細胞株は、ＰＲＲＳＶによる感染前にコンフルエンス又はほぼコンフルエンスに生育される。本発明において、本発明者らは、予想外なことに、ＰＲＲＳＶによる感染前に細胞株を播種又は生育する必要はなく、むしろ、ＰＲＲＳＶ及び細胞株を細胞培養工程に同時に添加し得ることを実証した。従って、本発明は、ウイルスを工業規模で大量に製造する場合に、時間、コスト及び材料を節約するという重要な利点を提供する。工業規模という用語は、細胞培養液の容量が１０Ｌを上回ることを指す。例えば、工業規模は、１０Ｌ〜３０００Ｌの範囲の生ＰＲＲＳＶの製造規模を指す。より具体的な実施態様では、容量は、３０Ｌ〜約３００Ｌである。
【００２４】
本発明の方法は、任意のＰＲＲＳＶ株、以下に限定されないが、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３３２、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４７４、及びＶＲ２４０２；ＣＮＣＭ  Ｉ−１１０２、ＣＮＣＭ  Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８８、又はＥＣＡＣＣ  Ｖ９３０７０１０８として寄託されたＰＲＲＳＶ株などを製造するのに使用され得る。特に好ましい実施態様では、本発明の方法は、ブダペスト条約の規定に従ってアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  １１０１２５０１（親株）及びＥＣＡＣＣ  １１０１２５０２（高継代弱毒化ＭＳＶ）（それぞれ２０１１年１月２５日に寄託）でEuropean Collection of Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, 30 Wiltshire, SP4 0JG, Great BritainにBioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Germanyによって寄託されたＰＲＲＳＶ株９４８８１、又は前記株のうちの１つの任意の子孫若しくは後代を製造するのに使用される。生育されるウイルスは、前記ウイルスのいずれかを弱毒化した形態のものであり得る。あるいは、ウイルスは遺伝的に改変されて、１つ以上のブタ疾患の抗原決定基をさらにコードする１つ以上の異種核酸を含み得る。
【００２５】
当業者であれば、ＰＲＲＳＶによる感染に許容性の多数の細胞系があることを理解するであろう。例示的な細胞は、細胞ブタ肺胞マクロファージ細胞、例えばＭＡＲＣ−１４５細胞に由来する細胞である。ＰＲＲＳＶで感染され得るその他の細胞としては、ＭＡ−１０４細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＭＡ−１０４細胞又はＭＡＲＣ−１４５細胞以外のアフリカミドリザル腎臓細胞、例えばＶＥＲＯ細胞；が挙げられ、これらがトランスフェクションされる。加えて、細胞は、ブタ動物に由来する初代細胞であって、培養液中での長期間の成長に適合されているものであり得る。特に適切なホスト細胞は、サル細胞株ＭＡ−１０４、Ｖｅｒｏ細胞又はブタ肺胞マクロファージである。ＰＲＲＳＶは、肺胞マクロファージ中で優先的に生育する（Wensvoort et al., 1991）。ＣＬ２６２１、及びサル腎臓細胞株ＭＡ−１０４からクローニングされたその他の細胞株（Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993）などの少数の細胞系もまた、ウイルスに感染しやすく、本明細書において記載される大規模な製造方法に使用され得る。
【００２６】
以下の実施例１に示される本発明の例示的な方法において、ＰＲＲＳＶ９４８８１  ＭＬＶを製造するための同時工程が提供される。この手法はＰＲＲＳＶ９４８８１  ＭＬＶについて示されているが、当業者であれば、この手法は、大規模な製造が必要とされる任意のＰＲＲＳＶに容易に使用され得ることを理解するであろう。
【００２７】
本発明の製造方法によって製造されたウイルスは、ＰＲＲＳＶが現在使用されている任意の用途に使用され得る。具体的な実施態様では、本明細書において記載される方法に従って製造されたウイルスは、ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶを調製するのに使用される。
【００２８】
本発明の方法に従って生育されたウイルス株は、悪性ＰＲＲＳウイルス、弱毒化ＰＲＲＳウイルス、又は改変されてさらなる所望の特性が付与された実際のＰＲＲＳウイルスであり得る。これは、適切なホスト細胞で増殖し続けて弱毒化の表現型を拡大するというように、古典的な増殖及び選択技術によって達成され得る。あるいは、株は、適切な遺伝子工学技術によりこれらの株のゲノムの核酸配列を定方向突然変異することによって遺伝的に改変され得る。ＰＲＲＳＶのゲノムは、完全に又は部分的に配列決定されており（Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a, Murthaugh et al, 1995）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＯＲＦ１ａ及び１ｂ）に加えて、ＧＰ２（ＯＲＦ２）、ＧＰ３（ＯＲＦ３）、ＧＰ４（ＯＲＦ４）及びＧＰ５（ＯＲＦ５）という名称の４個のエンベロープ糖タンパク質、非グリコシル化膜タンパク質Ｍ（ＯＲＦ６）並びにヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（ＯＲＦ７）という６個の構造タンパク質をコードしている（Meulenberg et al. 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996）。ＰＲＲＳＶの欧州及び米国株の免疫学的特性決定及びヌクレオチド配列決定により、ＰＲＲＳＶ株内のわずかな抗原性差異が構造ウイルスタンパク質にあることが同定されている（Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995）。
【００２９】
実際には、本発明において生育した例示的なウイルスは、ＰＲＲＳＶ９４８８１である。弱毒化株は、本明細書において記載される方法を使用して生育されるが、このウイルスは、簡単には、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー１１０１２５０２のＰＲＲＳＶ９４８８１ウイルス、又はＥＣＡＣＣアクセッションナンバー１１０１２５０１で寄託された親株の骨格が改変されて、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６又はＯＲＦ７の１つ以上の内在性配列が異なるＰＲＲＳウイルス株に由来する対応するＯＲＦに置換されているキメラウイルスにされたＰＲＲＳＶ９４８８１であり得る。例えば、異なるＰＲＲＳウイルス株は、異なる欧州株、例えばLelystadウイルス株（Lelystad Agent（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）、又はその他の株、例えばアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０４、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１１４０、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８７、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８８、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３３２、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４７４、及びＶＲ２４０２；ＣＮＣＭ  Ｉ−１１０２、ＣＮＣＭ  Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８８、又はＥＣＡＣＣ  Ｖ９３０７０１０８で寄託された株でもよいし、米国株、例えば北米ＰＲＲＳウイルス、ｐＴ７Ｐ１２９Ａ；ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３６８；ＡＴＣＣ  ＶＲ−２４９５；ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８５、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８６、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４７４、及びＡＴＣＣ  ＶＲ２４０２でもよい。
【００３０】
改変配列を調製するためのリコンビナント技術は当業者に周知であり、通常は、ウイルスゲノムの全長相補的ＤＮＡ複製物（感染性クローン）の構成を利用し、次いでこれをＤＮＡ組換え及び操作方法（部位特異的変異誘発などのような）によって改変し得る。このように、例えば、ウイルスタンパク質の抗原性部位又は酵素特性は、改変され得る。欧州及び北米遺伝子型のＰＲＲＳウイルス株の感染性クローンは文献で報告されており、本発明の方法を使用して生育され得る。
【００３１】
好ましくは、本発明のワクチンは、適切な担体で生存するこれらの株の１つ以上を含む改変された生ワクチンであるが、不活性化ウイルスもまた、死ワクチン（ＫＶ）を調製するのに使用され得る。ＭＬＶは、典型的には、１回用量あたり１０１〜１０７個のウイルス粒子、好ましくは１回用量あたり１０３〜１０５個の粒子、より好ましくは１回用量あたり１０４〜１０５個の粒子（４．０〜５．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０）の投与を可能にするように製剤化される。ＫＶは、１回用量あたり１０３〜１０１０個のウイルス粒子の不活性化前力価に基づいて製剤化され得る。ワクチンは、薬学的に許容しうる担体、例えば生理的食塩水を含み得る。ワクチンは、アジュバントを含んでもよいし含まなくてもよい。適切なアジュバントの一例は、商品名Diluvac Forte（登録商標）で入手可能な酢酸ａ−トコフェロールである。あるいは、例えば、ミョウバン系アジュバントが使用され得る。
【００３２】
ブタは、口鼻経路によりＰＲＲＳＶに感染し得る。肺中のウイルスは肺胞マクロファージによって取り込まれ、これらの細胞において、ＰＲＲＳＶの複製は９時間以内に完了する。ＰＲＲＳＶは、１２時間以内に肺から肺リンパ節に移動し、３日以内に末梢リンパ節、骨髄そして脾臓に移動する。これらの部位において、ウイルス抗原に陽性の細胞株は、ごく少数である。ウイルスは、少なくとも２１日間の間、多くの場合はそれよりも長く血中に存在する。７日後、ＰＲＲＳＶに対する抗体が血中に見られる。ＰＲＲＳに感染したブタにおいてウイルス及び抗体が一緒に存在することは、抗体の存在にもかかわらず、ウイルス感染が低レベルではあるが長時間持続し得ることを示している。少なくとも７週間の間、肺中の肺胞細胞集団は、正常なＳＰＦ肺とは異なる。
【００３３】
ワクチンは、溶媒で再構成されて注射液になる生ウイルスの凍結乾燥調製物の形態で提示され得る。従って、本発明の回収工程の後に、ウイルスは、混合及び凍結乾燥され得る。溶媒は、例えば、水、生理食塩水又は緩衝液、又は補助溶媒であり得る。溶媒は、アジュバント、例えば酢酸ａ−トコフェロールを含み得る。次いで、再構成されたワクチンは、ブタに、例えば筋肉内注射又は皮内注射として首に注射され得る。筋肉内注射の場合、２mlの容量が適用され得、皮内注射の場合、それは典型的には０．２mlである。従って、さらなる態様では、本発明は、ウイルスの凍結乾燥組成物及び再構成のための溶媒を別々の容器に含み、場合により使用説明書を含むリーフレット又はラベルをさらに含むワクチン製品である。
【００３４】
本発明の方法によって製造されたウイルスから調製されたワクチンは、前記菌株の１つ以上だけではなく、ＰＲＲＳ又はその他のブタウイルス疾患若しくは細菌性疾患（ブタサーコウイルス又は古典的なブタ熱ウイルスのような）に対して活性なさらなる成分を含み得る。従って、記載されるように、本発明はさらに、ＰＲＲＳではないブタ疾患に対して活性な少なくとも１つのさらなる抗原を含むことを特徴とするワクチンに関する。加えて、ワクチンは、特定の薬学的又は獣医学的に許容しうるアジュバントを含み得る。このようなアジュバントの１つは、α−トコフェロールである。従って、新たなワクチン組成物、特に、ＰＲＲＳＶ９４８８１を含むＰＲＲＳウイルスワクチンは、アジュバントの添加によってさらに改善され得る。このような改善は、アジュバント及びワクチンの組み合わせの投与により、ワクチン単独の投与と比較してより良い臨床反応／臨床転帰が見られるように、ワクチンの有効性を増強するアジュバントと組み合わせてワクチンを調製することを含む。例えば、本発明のワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶ９４８８１ウイルスワクチンと、ＭＣＰ−１、ヘモフィルスソムナス（Haemophilus sonmus）の一部、カルバポール（Carbapol）（商標）及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるアジュバントとを含み得る。いくつかの実施態様では、ＰＲＲＳＶ９４８８１ウイルスワクチンを含むウイルスワクチンは、リコンビナントサブユニットワクチンでもよいし、生弱毒化ウイルスワクチンでもよい。例示的な既存の生ワクチンはIngelvac（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶであり、ＰＲＲＳＶ９４８８１は、Ingelvac（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶと同様の方法で製剤化され得る。
【００３５】
上記に加えて、その他の成分が、ＭＣＰ−１、Haemophilus sonmusの一部、Carbapol（商標）若しくはその他のカルボマーのアジュバント特性、又は元となるウイルスワクチンを妨げない限り、ワクチン組成物は、その他の成分を含み得る。このようなその他の成分としては、例えば、結合剤、着色剤、乾燥剤、防腐剤、湿潤剤、安定化剤、賦形剤、接着剤、可塑剤、粘着付与剤、パッチ材料、軟膏基剤、ケラチン除去剤、塩基性物質、吸収促進剤、脂肪酸、脂肪酸エステル、高級アルコール、界面活性剤、水及び緩衝剤が挙げられる。好ましいその他の成分としては、緩衝剤、軟膏基剤、脂肪酸、防腐剤、塩基性物質又は界面活性剤が挙げられる。
【００３６】
本発明において使用されるアジュバントの含有量又は量は変化してもよく、例えば、使用されているＰＲＲＳウイルスワクチンの特性、及び剤形を考慮することによって決定され得る。アジュバントは、例えば、１〜１００重量％を含み得る。本発明のＰＲＲＳＶ９４８８１系組成物は、アジュバント成分及びウイルスワクチン成分のみ、又はそれらと様々なその他の成分を一緒に混合することによって製造される。組成物は、ウイルスワクチン及びアジュバントが１個の製剤として提示されるか、又はアジュバント及びワクチンが、同時投与又は連続投与され得る別の製剤で提示されるようなものであり得る。
【００３７】
生物への投与において、アジュバント成分は、ウイルスワクチンとは別々に投与され得る。あるいは、本発明のアジュバントは、ウイルスワクチンと一緒に、単一のワクチン組成物として投与され得る。ウイルスワクチンは、任意のウイルスワクチンであり得る。より具体的な実施態様は、ＰＲＲＳＶ９４８８１を含むＰＲＲＳウイルスワクチンの使用を企図する。加えて、このようなワクチンは、Ingelvac（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ及び／又はPorcilis（登録商標）ＰＲＲＳなどのその他のワクチンと組み合わせられ得る。これは単なる１個の例示的なＰＲＲＳウイルスワクチンであり、その他のこのようなワクチンは、本明細書において記載されるアジュバントが補充され得る。
【００３８】
本明細書において記載される免疫原性組成物は、ＰＲＲＳウイルスに反応する抗体の産生を誘導する点で特に有利である。特に、これらの特定のアジュバント、特にＭＣＰ−１を使用することにより、アジュバント及びＰＲＲＳウイルスワクチンを組み合わせて投与する場合に、ワクチンを単独で投与するのと比較して、ＰＲＲＳウイルスに対する免疫反応が増強されることが、本明細書において示されている。このような投与は、ＰＲＲＳＶ感染に伴う肺病変、拒食症、皮膚変色、けん怠感、呼吸兆候、ミイラ化した子ブタ、咳、下痢及びそれらの組み合わせなどの臨床症状の重症度の減少をもたらすことが示されている。実際、前記アジュバントの非存在下でワクチンを単独で投与することによってもたらされるこのような症状の重症度の減少と比較して、ワクチン及びアジュバントの組み合わせを用いて観察されたＰＲＲＳウイルス感染に伴う臨床症状の重症度の減少は、より大きなものである。
【００３９】
従って、組成物は、ＰＲＲＳウイルスワクチンを単独で投与することによる転帰と比較して、罹患動物における臨床転帰を特に向上させる。具体的な実施態様では、臨床転帰の向上は、前記アジュバントと組み合わせて免疫原性組成物を投与されていない動物と比較した場合に、肺病変のパーセンテージが減少することである。その他の実施態様では、臨床転帰の向上は、前記アジュバントと組み合わせて免疫原性組成物を投与されていない動物と比較した場合に、動物におけるウイルス血症が減少することである。
【００４０】
従って、一態様では、本発明は、改善されたワクチン、より具体的には改善されたＰＲＲＳウイルスワクチンに関し、改善は、ウイルスワクチンと、ＭＣＰ−１、Haemophilus sonmusの一部、carbapol及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるアジュバントとを混合することを含む。本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容しうる担体をさらに含み得る。加えて、ワクチンは、ＰＲＲＳワクチンの機能をさらに増強するために、ＨＳ、ＯＲＦ５、ＩＮＦα、ポリＩＣＬＣ、ＩＬ−１２などのその他の有効成分を含み得る。このようなアジュバントは、単独で又はＭＣＰ−１と組み合わせて添加され得る。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、製剤化の分野において公知の任意の方法によって、例えば、液体調製物、懸濁液、軟膏、粉末、ローション、Ｗ／Ｏエマルジョン、Ｏ／Ｗエマルジョン、エマルジョン、クリーム、パップ、パッチ及びゲルに製剤化され得、好ましくは薬剤として使用される。従って、本発明の別の態様によれば、上記ワクチン組成物を含む医薬組成物が提供される。本発明のワクチン組成物は、経皮投与されると、抗体産生を有意に誘導し得る。従って、本発明の別の好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、経皮調製物として提供され得る。
【００４２】
さらに、上記のように、本発明におけるウイルス及びアジュバントは、単一のワクチン組成物として一緒に、又はワクチンの抗原性ＰＲＲＳウイルス成分とは別々に分けてアジュバント調製物として生物に投与され得、それによりアジュバントは、ＰＲＲＳウイルスワクチンに反応して生物内で産生される抗体の量が、ＰＲＲＳウイルスワクチンを単独で投与するのと比較して有意に増加し得るように作用する。従って、本発明のさらに別の態様によれば、ＰＲＲＳウイルスに対して産生される抗体の量を増加させるための方法であって、免疫有効量のＰＲＲＳウイルスワクチンと、ＭＣＰ−１、Haemophilus sonmusの一部、carbapol及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるアジュバントとを、単独で又はＨＳ、ＯＲＦ５、ＩＮＦα、ポリＩＣＬＣ、ＩＬ−１２及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分と組み合わせて、免疫アジュバントとして有効な量で生物に同時投与又は連続投与することを含む方法が提供される。
【００４３】
アジュバント及びＰＲＲＳウイルスワクチンが生物に投与されると、動物の臨床転帰が向上する。アジュバントの有効量及びＰＲＲＳウイルスワクチンの免疫有効量は、例えば、抗原性物質の種類及び特性、生物種、年齢、体重、疾患の重症度、疾患の種類、投与時間並びに投与方法を考慮することによって、そしてさらに生物内で抗原性物質に対して産生される抗体の量を指標として使用して、当業者によって適切に決定され得る。
【００４４】
ＰＲＲＳウイルスワクチン、アジュバント又はそれらの組み合わせは、例えば、患者の状態及び疾患の特性に応じて選択される任意の適切な方法によって、生物に投与され得る。このような方法の例としては、腹腔内投与、経皮投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射及びパッチ）、経鼻投与、経口投与、粘膜投与（例えば、直腸投与、膣内投与及び角膜投与）が挙げられる。それらの中でも、筋肉内投与が好ましい。
【００４５】
ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶの例示的な治療用量は、約２ミリリットル（２mL）である。当業者であれば、投与量が、個々の被験体の品種、サイズ及びその他の物理的要因、並びに具体的なＰＲＲＳＶ  ＭＬＶ製剤及び投与経路に基づいて変化し得ることを認識するであろう。好ましくは、ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶは、単回用量で投与される；しかしながら、添加用量は有用であり得る。先と同様に、当業者であれば、本発明全体を通して、投与量及び投与回数は、ブタ被験体の年齢及び健康状態、並びに産業に共通のその他の検討事項、及びＰＲＲＳＶ  ＭＬＶが投与される特定条件によって影響されることを認識するであろう。
【００４６】
特定のその他の実施態様ではワクチンは、２つ以上のＰＲＲＳウイルスを含む多価ワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスの少なくとも１つがＥＣＡＣＣアクセッションナンバー１１０１２５０２で寄託された弱毒化９４８８１ウイルスである。その他のＰＲＲＳウイルスは、アクセッションナンバーで寄託されたＰＲＲＳＶ株Lelystadウイルス株（Lelystad Agent（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１）、又はその他の株、例えばアクセッションナンバーＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ  ０４１０２７０４、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１１４０、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８７、ＣＮＣＭアクセッションナンバーＩ−１３８８、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３３２、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４７４、及びＶＲ２４０２；ＣＮＣＭ  Ｉ−１１０２、ＣＮＣＭ  Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ  Ｉ−１３８８、又はＥＣＡＣＣ  Ｖ９３０７０１０８で寄託された株からなる群より選択される１つ以上でもよいし、米国株、例えば北米ＰＲＲＳウイルス、ｐＴ７Ｐ１２９Ａ；ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ寄託ＶＲ−２３６８；ＡＴＣＣ  ＶＲ−２４９５；ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８５、ＡＴＣＣ  ＶＲ２３８６、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ  ＶＲ２４７４、及びＡＴＣＣ  ＶＲ２４０２でもよい。
【００４７】
ＰＲＲＳウイルス系ワクチンは、子ブタ及び雌ブタの両方をワクチン接種するのに使用され得る。本発明の一態様では、特定の用量レジメンは、ブタの年齢及び投与のために選択された抗原に基づいて選択される。これにより、（野生型曝露及びワクチン接種の両方からの）ＰＲＲＳＶ感染は、高齢動物で非常に速やかに除去されるという本発明者らの発見に基づいて、任意の年齢のブタが最も有効な用量の投与を受けることが可能になるであろう。従って、いくつかの点において、高齢動物のワクチン接種が好ましいが、３週齢及びそれよりも若齢のブタを含む若齢のブタのワクチン接種は、能動免疫を誘導するのに役立つものであり、依然として非常に有益である。動物の年齢は、ＰＲＲＳコントロールの重要な要因であり得、ワクチン接種及び有効な免疫反応の進行に影響を与える要因であり得る。従って、年齢、疾患管理、畜産、先天性免疫及び能動免疫は重要であり、コントロール戦略で検討される必要がある。
【００４８】
ＰＲＲＳＶ９４８８１ワクチンは任意の通常の方法で投与され得、いくつかの好ましい方法では、投与は経鼻的である。投与されたＰＲＲＳＶワクチンは、Ingelvac（登録商標）のように、単回投与後にＰＲＲＳＶ感染の重症度若しくは発生率を処置又は軽減するという効果を提供することが好ましいが、しかしながら、その他の抗原又は組み合わせ又は多価ワクチンが選択される場合は、それらは通常の方法（これは、初回投与後の１つ以上の添加抗原投与量を含み得る）で投与され得ることが理解されるべきである。当業者であれば、選択されたＰＲＲＳＶワクチン、及び抗原が投与される動物の年齢幅に基づいて、適切な用量レベルを決定できるであろう。
【００４９】
実施例１：
ＰＲＲＳＶ９４８８１  ＭＬＶの生産のための典型的なスケールアップ
ＰＲＲＳＶ９４８８１のスケールアップのための３００Ｌバイオリアクター工程には、６４〜８４継代のＭＡ１０４細胞を使用した。これらの細胞を、８５０cm2のローラーボトル（Corning）で増殖させた。細胞を、３００Ｌエアリフトバイオリアクターでウイルス感染物と同時に培養した。培養工程全体を通して、培地のデキストロース／ラクテート濃度をg/L単位でモニタリングした。回収時に液体を廃棄し、ウイルスサンプルを保持した。
【００５０】
培地組成は、以下の表に示すものとした：
【００５１】
【表１】
2014506795.tif 000002
【００５２】
フェノールレッド不含ＭＥＭ培地、ネオマイシン及び１．４g/L重炭酸ナトリウムを調製し、ろ過した。ＦＢＳを培地に添加し、それと同時に培地をバイオリアクター内に置いた。添加するネオマイシンの量は、容量（ｖｏｌ）（Ｌ）ｘ３０mg/L÷効力（mg/gベース）によって計算される。
【００５３】
ＰＲＲＳＶ９４８８１の成長のための同時工程は、ＡＫ  ＭＡ１０４細胞をバイオリアクターに播種すること、及びそれと同時にＰＲＲＳＶ９４８８１ウイルスシードを細胞に感染させることを含む。図１は、同時工程を概説する。図２では、図１に概説した同時工程のタイムラインを提供する。
【００５４】
同時工程において、２７０Ｌ容量の培地を無菌ろ過してバイオリアクターに入れた。培地は、細胞及び血清を添加するのと同日又はそれよりも前の日に容器に添加した。細胞及び血清を添加するよりも前の日に培地をバイオリアクターに添加する場合、培地が３５℃に維持されるように温度コントロールを作動させること、ｐＨはコントロールモードにしてｐＨを７．２５±０．１に維持すること、及びＤＯモニターモード、及び攪拌を３５rpmに設定することを推奨する。細胞及び放射線照射ウシ胎児血清（ＩＦＢＳ）を添加する日に、温度コントロールを３６℃に設定する。培地の添加後かつ細胞の播種前に、ＩＦＢＳをバイオリアクターに添加する。ＩＦＢＳのターゲット濃度は５％v/vであり、２７０Ｌ容量では、これはバイオリアクターあたり１４．０Ｌ容量のＩＦＢＳとなる。
【００５５】
３００Ｌバイオリアクターラウンドを３回実施した。バイオリアクターのパラメーターは次のようにした：温度設定点３６℃、ｐＨ設定点７．２５（コントロールモード）、ＤＯモニター及び攪拌機３５rpm。表３、４及び５は、ＤＯ％（ＯＩＴによる）、デキストロース及びラクテート（ＹＳＩによる）並びにｐＨ及びＬ−グルタミン（ＮＯＶＡによる）について記録されたデータを示す。ＰＤ力価は、単に参照のためのものである。ＱＣ力価は、正式な力価である。
【００５６】
【表２】
2014506795.tif 000003
【００５７】
表３は、７日間の感染期間におけるロット００１ＰＤ−Ｘの結果を示す。サンプルを毎日採取し、感染後７日目（７ＰＩ）にランを終了した。ｐＨを７．２５に設定し、それが７．０以下に低下した感染後４日目（４ＰＩ）を除いてそれはランの間一定であった。感染後４日目（４ＰＩ）において、グルコースが前日の０．７４から０．４に低下し、グルタミンが消費され始め、力価が約１ｌｏｇ上がり始めた。ピーク力価は、グルコースが完全に消費された（０．１g/L以下）感染後５日目（５ＰＩ）に観察された。また、感染後５日目（５ＰＩ）において、ＤＯが３０％に低下し、コントロールが起動して夜間にＤＯが０に低下するのを防止した。力価は感染後６日目（６ＰＩ）に低下し、次いで感染後７日目（７ＰＩ）に７．４に増加した。感染後７日目（７ＰＩ）において、サンプルは混濁していた。
【００５８】
【表３】
2014506795.tif 000004
【００５９】
表４は、ロット００２ＰＤ−Ｘの結果を示す（Ｒ０Ｐ１は、培養液を再供給する時点である）。ロット００１ＰＤ−Ｘの力価の結果に基づいて、回収日を感染後５日目（５ＰＩ）に設定した。感染後１日目（１ＰＩ）から感染後５日目（５ＰＩ）までのロット００２ＰＤ−Ｘは、ロット００１ＰＤ−Ｘと一致していた。バイオリアクターを回収し、次いで感染後５日目（５ＰＩ）に再供給した。回収−ＩＩの成長曲線を作成した。サンプルを５日間毎日採取した。デキストロースは、再供給感染後２日目（Ｒ２ＰＩ）までに完全に消費された。力価は５日間ピークにあった（０．５の対数変化率は、アッセイの誤差範囲内である）。グルタミンは、再供給感染後５日目（Ｒ５ＰＩ）までに完全に消費された。ＤＯプローブは、再供給後に停止した。ＤＯレベルは、計測できなかった（ゼロに近い可能性が高い）。再供給感染後４日目（Ｒ４ＰＩ）において、ボトル中のサンプルは澄明だったことから、細胞は依然として付着していた。反復感染後５日目（Ｒ５ＰＩ）において、サンプルボトル上にいくらかの混濁が観察されたが、これは、細胞がスプリングからはがれ始めた可能性を示している。
【００６０】
【表４】
2014506795.tif 000005
【００６１】
表５は、ロット００３ＰＤ−Ｘの結果を示す。ロット００２ＰＤ−Ｘの力価の結果に基づいて、回収−ＩＩの日を感染後１日目（１ＰＩ）又は感染後２日目（２ＰＩ）に設定した。製造に柔軟性を持たせるために、感染後２日目（２ＰＩ）に液体を回収することを決定した。７日間について、回収−ＩＩＩの成長曲線を作成した。サンプルを毎日採取した。デキストロースは、再供給２回目感染後２日目（２Ｒ２ＰＩ）までに完全に消費された。力価は４日間ピークにあり、次いで２日間７．０に低下し（０．５の対数変化率は、アッセイの誤差範囲内である）、次いで感染後７日目（７ＰＩ）には６．２に低下した。グルタミンは、再供給２回目感染後５日目（２Ｒ５ＰＩ）までに完全に消費された。再供給２回目感染後２日目（２Ｒ２ＰＩ）において、ＤＯのコントロールを止めて細胞死をモニタリングした。
【００６２】
３００Ｌスケールでのウイルス増殖のための回収−Ｉ段階：回収−Ｉ（ロット００１ＰＤ−Ｘ）の成長曲線により、デキストロースは感染後５日目（５ＰＩ）までに完全に消費された（０．１g/l以下）にもかかわらず、ウイルス粒子は感染後７日目（７ＰＩ）まで成長し続けたことが示された。デキストロースが初期濃度１g/Lの約半分になった際に（感染後４日目（４ＰＩ））グルタミンの消費が始まり、次いで、デキストロースが消費された後は、グルタミンが主要なエネルギー源になったと思われる。培地は２mmol/Lを含むのみであるため、最初の２〜３日間のグルタミン測定値の不一致は、ＮＯＶＡ機器の変動に起因する可能性がある。デキストロース／グルタミン代謝及びウイルス増殖の間、ＤＯレベルは一貫して減少した。
【００６３】
ウイルス増殖動態により、感染後（ＰＩ）５〜７日間にウイルスを回収することが示唆された。感染後４日目（４ＰＩ）から感染後７日目（７ＰＩ）までの間のＱＣ力価の変動は、アッセイ変動の範囲内であった（±０．７１log/ml）。回収−Ｉの基準はデキストロースが完全に消費された時（０．１g/l以下）であり、これは３０Ｌのデータと一致していた（研究＃６１２７−１３１０−０９Ｋ−１９８）。従って、感染後４日目（４ＰＩ）から開始するオフラインのデキストロース測定は、デキストロースレベルを追跡するのに必要なものである。表３により、デキストロースが枯渇した後、３００ＬバイオリアクターにおいてＰＲＲＳＶ９４８８１ウイルスは３日間（感染後５〜７日目（５−７ｄａｙｓ  ＰＩ））安定していたことが示された。しかしながら、表４及び表５の結果に基づいて２回目の回収を実施する場合、細胞がバイオリアクターのスプリング（担体）に付着するのを確実にするために、デキストロース濃度が０．１g/L未満（ＹＳＩ測定を使用）になる最初の日に、回収−Ｉを実施することを推奨する。
【００６４】
３００Ｌスケールでのウイルス増殖のための回収−ＩＩ段階：ロット００２ＰＤ−Ｘ及び００３ＰＤ−Ｘについて、感染後５日目（５ＰＩ）に回収−Ｉを実施した後に、新たな培地及び５％血清を添加して、２回目の回収のウイルス液を作成した（表４及び表５）。１回目の回収の材料の準備について上述したのと同じ手順に従って、ＩＦＢＳ（５％v/v）含有ＭＥＭ培地（２７０〜２８０Ｌ）をバイオリアクターに添加した。ロット００２ＰＤ−Ｘにおいて、回収−ＩＩの成長曲線を５日間行ったところ、ピーク力価は、再供給後１日目に達成された（表４を参照のこと）。力価は４日間安定していた。再供給後１日目のウイルス力価は、１回目の回収の力価と同程度であった（表２）。デキストロースレベルは、感染後２日目（２ＰＩ）に完全に消費された。再供給後４日間の範囲を、２回目の回収基準に使用し得た。しかしながら、感染後４日目（４ＰＩ）に採取した液体サンプルにおいて、細胞死又はスプリングからの剥離を示唆する混濁がいくらか観察されたので、感染後４日目（４ＰＩ）に２回目の回収を実施するのは、３回目の回収に影響を与える可能性があった。このため、ロット００３ＰＤ−Ｘついては、感染後２日目（２ＰＩ）に回収−ＩＩを実施した。ロット００３ＰＤ−Ｘのデータに基づいて、２回目の再供給及び３回目の回収を実施する場合は、回収−ＩＩのターゲット日を感染後１〜２日目（１−２ＰＩ）にすることを推奨する。
【００６５】
３００Ｌスケールでのウイルス増殖のための回収−ＩＩＩ段階：ロット００３ＰＤ−Ｘ（表５）について、感染後２日目（２ＰＩ）に実施した回収−ＩＩの後に、３回目の回収のウイルス液を作成するために、添加の培地及び血清を容器に添加した（表５）。１回目の回収の材料の準備について上述したのと同じ手順に従って、ＩＦＢＳ（５％v/v）含有ＭＥＭ培地（２７０〜２８０Ｌ）をバイオリアクターに添加した。回収−ＩＩＩの成長曲線を７日間行ったところ、ピーク力価は、再供給後１日目に達成された（表５を参照のこと）。力価は４日間安定していた。再供給後１日目のウイルス力価は、２回目の回収の力価と同程度であった（表４及び表５）。デキストロースは、感染後１日目（１ＰＩ）に完全に消費された。再供給後４日間の範囲を、３回目の回収基準に使用し得た。
【００６６】
以下の３つのグラフは、３００Ｌバイオリアクターで実施した３回のランについてのデキストロース、グルタミン及びＤＯのプロファイル、並びに力価を示す。これらのグラフの目的は、３回のランの一貫性を示すことである。
【００６７】
図３は、デキストロース消費及びウイルス力価について、３００Ｌスケールで実施した３回のランすべての概要を示す。３回のランの回収−Ｉプロファイルは非常に一貫しており、デキストロースは感染後５日目（５ＰＩ）までに完全に消費され（０．１g/l以下）、それは、実施した３回のランのピーク力価と一致していた。１回目の再供給の後、感染後１日目（１ＰＩ）において、ロット００２ＰＤ及び００３ＰＤではデキストロースは０．３g/l未満になり、力価はすでにピークであった。感染後２日目（２ＰＩ）において、デキストロースは完全に消費され、ウイルス力価はピークのままであった。ロット００３ＰＤの回収ＩＩＩについて、再供給感染後２日目（Ｒ２ＰＩ）に２回目の再供給を実施すると、デキストロースは再供給２回目感染後１日目（２Ｒ１ＰＩ）までに０．１g/L未満に低下し、力価はピークであった。
【００６８】
図４は、グルタミン消費及びウイルス力価について、３００Ｌスケールで実施した３回のランすべての概要を示す。見て分かるように、３回のランの回収−Ｉプロファイルは、非常に一貫していた。グルタミンは、感染後５日目（５ＰＩ）までにその初期濃度２mmol/Lの半分に低下し、それは、実施した３回のランのピーク力価と一致していた。ロット００２ＰＤ及びロット００３ＰＤについて、１回目の再供給の後、グルタミンは感染後２日目（２ＰＩ）までにその初期濃度の半分に低下し、力価は感染後１日目（１ＰＩ）からすでにピークであった。ロット００３ＰＤの回収ＩＩＩについて、再供給感染後２日目（Ｒ２ＰＩ）に２回目の再供給を実施した。グルタミンは感染後５日目（５ＰＩ）までにゆっくりと消費されて０になり、ウイルス力価は一貫しており、そして細胞死が始まり、力価は感染後７日目（７ＰＩ）まで低下した。
【００６９】
回収−Ｉプロファイルから分かるように、３回のランは非常に一貫しており、ＤＯは感染後５日目（５ＰＩ）までに３０％に低下し、それは、実施した３回のランのピーク力価と一致していた。１回目の再供給の後、ロット００２ＰＤ−ＸについてはＤＯプローブを停止したのでデータは存在せず、ロット００３ＰＤ−ＸではＤＯは感染後１日目（１ＰＩ）に低下したが、これはピーク力価と一致していた。ロット００３ＰＤの回収−ＩＩＩについて、再供給感染後２日目（Ｒ２ＰＩ）に２回目の再供給を実施すると、細胞死が始まった感染後３日目（３ＰＩ）までＤＯは急速に減少し、ＤＯは感染後５日目（５ＰＩ）までに消費されて０になり、ウイルス力価は一貫しており、そして細胞死が始まり、力価は感染後７日目（７ＰＩ）まで低下した。
【００７０】
【表５】
2014506795.tif 000006
【００７１】
ロット００１ＰＤ−Ｘのウイルス液を漂白して廃棄した。ロット００２ＰＤ−Ｘの回収−Ｉから１リットルを保持し、研究目的のためにＳＧＳを添加し（２５％v/v）、残りの液体を漂白して廃棄した。ロット００３ＰＤ−Ｘの回収ＩＩから２リットルを濃縮目的のために冷凍保存し、残りの液体を漂白して廃棄した。
【００７２】
３００Ｌスケールの細胞播種密度（ＰＣＤ）範囲：ターゲット細胞播種密度（ＰＣＤ）は、３００Ｌバイオリアクター（運転容量２７０〜２８０Ｌ）あたり総細胞７．０ｘ１０９個である。３０ＬのFinal Process Transfer Report(6127-1310-09K-198)のデータによれば、総細胞播種範囲は、３０Ｌバイオリアクターあたり７．０ｘ１０８〜１．０ｘ１０９個である。時間的制約のため、ターゲット細胞播種密度のみを評価した。
【００７３】
３００Ｌスケールの感染多重度（ＭＯＩ）範囲：この成長系内におけるＰＲＲＳＶ９４８８１の増殖には、０．１のターゲットＭＯＩが理想的である。３０Ｌバイオリアクターにおいて、それぞれ０．０１及び０．３の低ＭＯＩレベル及び高ＭＯＩレベルを調査した。
【００７４】
リスク分析：３００Ｌバイオリアクター同時工程の推奨パラメーターを、表１１に概説する。ターゲットパラメーターのみを試験し、それらがこの工程に重要か重要ではないかについて検討した。３０Ｌスケールで範囲を評価した。定義は、以下の通りである。
・  重要なパラメーターは、最終製品の品質特性に重要なパラメーターである。
・  重要ではないパラメーターは、規定範囲内で直接的にコントロールできるか、又は広範な運転範囲を有し得るので設定点からの偏差が重要ではないパラメーターである。重要ではないパラメーターは、重要なパラメーターを規定範囲内にコントロールするのに役立つ。
・  「情報専用の」パラメーターは、工程についての添加情報を得るためにモニタリングされるが、最終製品の特質とは直接的な相関関係がないパラメーターである。
【００７５】
【表６】
2014506795.tif 000007
【００７６】
結論及び推奨工程：３０Ｌから３００Ｌのバイオリアクターにスケールアップする同時工程を達成するのに成功した。回収日及び力価について、回収−Ｉは、３０Ｌバイオリアクターの範囲内であった。回収−ＩＩも成功し、力価は回収−Ｉと同程度であった。２回目の回収の力価は、４日間安定していた。追加（３回目）の回収は、回収−Ｉ及び回収−ＩＩと同程度の力価で達成した。３回目の回収の力価は、少なくとも４日間安定していた。
【００７７】
ＰＲＲＳＶ９４８８１  ＭＬＶのための好ましい３００Ｌバイオリアクター同時工程について、以下の通り推奨する：
【００７８】
ウイルス増殖、回収−Ｉ：培地組成は、フェノールレッド不含ＭＥＭ、３０mg/Lのネオマイシン及び１．４g/L重炭酸ナトリウムとした。１４．０Ｌのウシ胎児血清５％v/vを補充した２７０〜２８０Ｌの培地に、７ｘ１０９個／３００Ｌスプリングバイオリアクターの密度で、ＭＡ１０４細胞を播種した（範囲：７ｘ１０９〜１ｘ１０１０個／３００Ｌスプリングバイオリアクター）。バイオリアクターの温度は、３６±１℃にコントロールした。ＤＯは、「モニターモード」に設定する。ＤＯレベルが１０〜３０％に低下すると、設定点１０％のＤＯコントロールを作動させる。コントロールモードでｐＨ７．２に設定する。pH高（ＣＯ２添加）に使用したＰＩＤパラメーターは、以下の通りとした。
ゲイン                        ３００．００
リセット分／反復              ２．２０
速度、分                      ０．５０
ファインバルブスパムｐＨ単位  ０．０３
ファインバルブＣＶ限界        ５％
【００７９】
気流流量は、２．０SLPMに設定する；ＣＯ２流量２．０SLPM；Ｏ２流量２．０SLPM；Ｎ２流量２．０SLPM、そして総気体散布量は２．０SLPMとするべきである。
【００８０】
ターゲットＭＯＩは０．１である（範囲、７ｘ１０８〜１ｘ１０９個のウイルス粒子／３００Ｌスプリングバイオリアクター）。
【００８１】
回収−Ｉの基準について、感染後４日目（４ＰＩ）から、デキストロース測定のオフラインサンプリングを行った。ＤＯ傾向は、指標として使用できた。回収−Ｉは、デキストロースが０．１g/L以下になる際（これは通常、感染後５〜７日目（５−７ｄａｙｓ  ＰＩ）に起こる）（＋／−２日の範囲）に実施するべきである。しかしながら、２回目の回収を実施する場合、デキストロース濃度が０．１g/L以下となる最初の日に、回収−Ｉをすることを推奨する。
【００８２】
１回目の再供給〜回収−ＩＩ：１回目の回収の後、フェノールレッド不含ＭＥＭ、ネオマイシン及び１．４g/L重炭酸ナトリウムの培地組成物２７０〜２８０Ｌに１４．０Ｌのウシ胎児血清（５％v/v）を補充したものをバイオリアクターに再供給する。再供給は、１回目の回収の培地を準備するのと同じ条件下で実施する（上記１回目の回収のパラメーターを参照のこと）。ｐＨコントロールは、設定点７．２のままにする。pH高（ＣＯ２添加）に使用したＰＩＤパラメーターは、以下の通りとした。
ゲイン                        ３００．００
リセット分／反復              ２．２０
速度、分                      ０．５０
ファインバルブスパムｐＨ単位  ０．０３
ファインバルブＣＶ限界        ５％
【００８３】
温度コントロールは、設定点３６±１℃のままにする。ＤＯコントロールは、モニターモードに設定する。
【００８４】
２回目の再供給〜回収−ＩＩＩ：２回目の回収の直後、フェノールレッド不含ＭＥＭ、ネオマイシン及び１．４g/L重炭酸ナトリウムの培地組成物２７０〜２８０Ｌに１４．０Ｌの放射線照射ウシ胎児血清（５％v/v）を補充したものをバイオリアクターに再供給する。再供給は、１回目の回収の培地を準備するのと同じ条件下で実施する（上記２回目の回収のパラメーターを参照のこと）。ｐＨコントロールは、設定点７．２のままにする。pH高（ＣＯ２添加）に使用したＰＩＤパラメーターは、以下の通りとした。
ゲイン                        ３００．００
リセット分／反復              ２．２０
速度、分                      ０．５０
ファインバルブスパムｐＨ単位  ０．０３
ファインバルブＣＶ限界        ５％
【００８５】
温度コントロールは、設定点３６±１℃のままにする。ＤＯは、モニターモードに設定する。この試験の結果は、３回目の回収のウイルス液について、最適時期は、再供給後１〜４日目であることを示している。
【００８６】
上記工程は例示的なものであり、上記工程をさらに改変して収量を増加させ、及び／又はバイオプロセッサーのランニングコストを削減し得ることが理解されるべきである。例えば、パラメーターの変更としては、以下のものが挙げられ得るが、これらに限定されない：２回目及び３回目の回収について血清濃度を減少させること、細胞播種密度を減少させること、細胞及びシードを同じボトルに添加し、それを撹拌して、回収−Ｉのためのウイルス増殖を短縮すること。また、回収ＩＶが可能な場合はもう１回再供給することによって、ウイルスの収量をさらに改善し得る。消費された培地成分、例えば以下に限定されないが、グルコース及びグルタミンを供給する。
【００８７】
実施例２
特定の実施例において、上記方法に従って製造したＰＲＲＳＶ９４８８１を使用して、ブタのワクチン接種におけるＰＲＲＳＶ９４８８１の有効性を測定した。本試験では、４〜１３日齢の子ブタに、１０７．６ＴＣＩＤ５０（２ml中）を含む組成物を筋肉内ワクチン接種した（試験０日目）。１３日目に子ブタを離乳させ、様々な疾患のパラメーターについて９０日目までモニタリングした。試験パラメーターには、ウイルス血症、組織及び分泌物中のウイルスの存在、臨床観察、肺病変及び体重増加のモニタリングが含まれていた。
【００８８】
試験０日目、１４日目、２８日目、５６日目及び９０日目において、各試験群（ワクチン接種、センチネル及びコントロール）の体重を量った。ワクチン接種及びセンチネルの両群については０〜１４日目は隔日及び９０日目まで週１回、並びにコントロールについては試験期間を通して９０日目まで週１回、血液をサンプリングした。
【００８９】
ワクチン接種及びセンチネルの両群については０〜１４日目は隔日及び５６日目まで週１回、並びにコントロールについては試験期間を通して５６日目まで週１回、鼻腔、口腔及び糞便のスワブを行った。
【００９０】
ワクチン接種群では、０〜１４日目までは隔日及び１４〜９０日目までは週１回、２匹のブタで解剖評価を行い、残りのブタは９０日目に行った。センチネル群では、５６日目に５匹のブタで行い、残りは９０日目に行った。コントロール群では、０〜１４日目は隔日及び１４〜５６日目は週１回、２匹のブタで行い、残りのブタは９０日目に行った。
【００９１】
臨床観察は毎日行った。
【００９２】
血液、口腔、糞便及び鼻腔のスワブ並びに肺洗浄からのサンプルについて、欧州ＰＲＲＳＶ特異的プライマーを使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００９３】
これらの試験データから、跛行のブタ数匹を除いて、子ブタは健康を示したことが示された。死体解剖において、１〜２匹の動物が鼠径リンパ節のわずかな腫大の徴候を示した以外は、解剖時に異常はなかった。重要なことに、ワクチン接種群では肺病変が観察されなかった。
【００９４】
図６は、センチネル群におけるウイルス血症動物を、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー１１０１２５０２で寄託された弱毒化ＰＲＲＳウイルス株を含む組成物でワクチン接種した群と比較したパーセンテージを示し、ブタに対する防御免疫の付与について、本発明の方法に従って製造したＰＲＲＳウイルスの有効性を示している。
【００９５】
実施例３
ＥＵ  ＰＲＲＳ９４８８１のための同時ローラーボトル工程の開発には、以下の機器及び試薬を使用した（表８）。
【００９６】
【表７】
2014506795.tif 000008
【００９７】
フェノールレッド含有ＭＥＭ培地及び１．４g/L重炭酸ナトリウムをＳＡＦＣから入手した。表９には、培地組成と血清濃度が記載されている。すべてのローラーボトルの再供給も含めて、ウイルスの増殖にはこの培地を使用した。
【００９８】
【表８】
2014506795.tif 000009
【００９９】
３回回収する同時工程：
同時工程では、血清、ＡＫ−ＭＡ１０４細胞及びＥＵ  ＰＲＲＳ９４８８１ウイルスシードを含む培地を容器に添加した。次いで、容器の内容物を混合し、ローラーボトルに分注した（ＴＯＩは、０日ＰＰに等しい）。図７は、同時工程の方法を図示し、図８は、工程の定義及びタイムラインを図示する。
【０１００】
ローラーボトル及び培地の調製：
ここで示す実験は、５個のローラーボトルのバッチとした。実際のバッチサイズは、変化し得る。
【０１０１】
無菌条件下で、２０００mLのＭＥＭ培地及び１００mLの放射線照射ウシ胎児血清を容器に添加した。次いで、５ｘ１０７個のＡＫ−ＭＡ１０４細胞及びＭＯＩ０．１のＥＵ  ＰＲＲＳウイルスシードを添加した。無菌条件下で、これらの材料を混合した。８５０cm２のコーニングローラーボトルあたり約４００mLを分注した。次いで、ローラーラック中、速度０．５rpm、３７℃で、ローラーボトルをインキュベーションした。培地を２回再供給して、最大３回の回収を実施した。
【０１０２】
回収基準及び許容可能な効力：
以下の表１０に示されるように、ローラーボトルの回収基準は、設定点／重要なパラメーターのターゲット（実施例１及び２の有効な３００Ｌバイオリアクター工程より）に基づくものとした。
【０１０３】
デキストロースレベルが０．１g/L以下の感染後５〜７日目（５−７ＰＩ）に、回収−Ｉを実施した。再供給後の感染後２日目（２ＰＩ）に回収ＩＩを実施し、２回目の再供給後の感染後２日目（２ＰＩ）に回収ＩＩＩを実施した。
【０１０４】
全３回のローラーボトルの回収の効力は、１０５．５ＴＣＩＤ５０以上／mLとするべきである。
【０１０５】
【表９】
2014506795.tif 000010
【０１０６】
＊重要なパラメーターは、最終製品の品質特性に重要なパラメーターである。
【０１０７】
ローラーボトルのラン
【０１０８】
【表１０】
2014506795.tif 000011
【０１０９】
表１１は、表１２ａに示される以下のパラメーター（実施例１及び２に記載される工程のもの）及び作業シードウイルス報告に基づいて同時ローラーボトル工程を規定するために設計した初期実験を示す。
【０１１０】
【表１１】
2014506795.tif 000012
【０１１１】
ＭＡ−１０４細胞を、３．５ｘ１０６〜１ｘ１０７個の範囲の細胞播種密度で１５個のローラーボトルに播種した（表１１のカラム２を参照のこと）。ローラーボトルをアルファベット順にラベリングした。３個のローラーボトルのセットは、同じ細胞播種密度及び０．００５〜０．１の範囲の同じＭＯＩであった（表１１、カラム３）。
【０１１２】
３つの細胞播種密度及び２つのＭＯＩを評価した（表１２）。３個のローラーボトルのセットは、同じ細胞播種密度及び同じＭＯＩであった（表４、カラム１）。上記ローラーボトル及び培地の調製に従ってローラーボトルを準備し、３７℃のウォークインインキュベーター中、速度０．５RPMのローラーラックにおいてインキュベーションした。
【０１１３】
感染後５日目（５ＰＩ）にローラーボトルＡ、Ｄ、Ｇ、Ｊ及びＭの回収Ｉを行い、次いでそれらに再供給して２日間インキュベーションした。次いで回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）を実施し、ローラーボトルに再供給してインキュベーションし、２日後に３回目の最後の回収を実施した。
【０１１４】
感染後６日目（６ＰＩ）にローラーボトルＢ、Ｅ、Ｈ、Ｋ及びＮの回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）を行い、次いでそれらに再供給して２日間インキュベーションした。次いで、回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）を実施した；ローラーボトルにもう１回再供給し、再度インキュベーションした。２日後に３回目の最後の回収を実施した。
【０１１５】
最後に、感染後７日目（７ＰＩ）にローラーボトルＣ、Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＯの回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）を行い、次いでそれらに再供給して２日間インキュベーションした。次いで、回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）を実施し、ローラーボトルに再供給して再度インキュベーションし、２日後に３回目の最終の回収を実施した。
【０１１６】
この実験のコントロールとして、ローラーボトルの通常工程（ローラーボトルＰ、Ｑ、Ｒ及びＳ）を用いた。この工程は、２回の回収で進行させた。回収−Ｉの範囲を感染後５日目（５ｄａｙｓ  ＰＩ）までにするとともに、３回目の回収をこれらの実験の工程に添加した。
【０１１７】
ＭＡ１０４細胞を８５０cm2ローラーボトルに２ｘ１０７個で播種し、３日間インキュベーションした（ローラーボトルＰ、Ｑ、Ｒ及びＳ）。３日後、ローラーボトルＳをトリプシン処理し、細胞をVi-cellによって数えた。細胞数は、ローラーボトル（ＲＢ）Ｐ、Ｑ及びＲのウイルスＭＯＩ計算に使用した。算出量のウイルスをローラーボトルに添加し、これをローラーラック中、３７℃でインキュベーションした。３日後、ローラーボトルＰで回収−Ｉを実施し、次いでこれに再供給して３７℃でインキュベーションした。３日後、２回目の回収を行い、２回目の再供給を行い、３回目の最後の回収のためにさらに３日間インキュベーションした。
【０１１８】
ローラーボトルＱ及びＲは、回収−Ｉ（ローラーボトルＱ（ＲＢ  Ｑ）では感染後４日目（４ＰＩ）、ローラーボトルＲ（ＲＢ  Ｒ）では感染後５日目（５ＰＩ））の後は同じ手順に従った
【０１１９】
通常のローラーボトル工程では、ウイルスを細胞に感染させる前に細胞を３日間生育する必要があるので、実施例１及び２に記載される同時工程よりも長くなり、より多くの労力を必要とする。また、同時工程と比較して２倍の細胞播種密度を必要とするが、ＭＯＩは低い。この工程は、３回の回収により高力価を一貫してもたらした。
【０１２０】
同時工程の回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）の回収時期（ＴＯＨ）は、デキストロース消費にかかわらずターゲット日数のみに基づくものとすることを決定した。回収日に、デキストロース測定及び力価のために、サンプルを採取した。
【０１２１】
許容可能な効力の力価の基準（表１０）によれば、ローラーボトルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦは、回収Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩで一貫性のない力価を示した。
【０１２２】
ローラーボトルＧ、Ｈ及びＩ（細胞播種密度７ｘ１０＾６個及びターゲットＭＯＩ０．１）では、１回目の回収のデキストロースレベルは０．１g/L以下のターゲット内であった。ローラーボトルＧ及びＨの力価の結果は、許容可能なものであった。回収−ＩＩについては、ローラーボトルＧ、Ｈ及びＩすべてにおいて、力価は上限６ｌｏｇ〜下限７ｌｏｇの範囲内であった。回収−ＩＩＩについては、ローラーボトルＧ及びＨにおいて、力価はそれぞれ６．６と６．５であり、許容可能なものであった。ほとんどの回収について、Ｇ、Ｈ及びＩのセットは許容可能なものであった。
【０１２３】
次のセットの実験Ｊ、Ｋ及びＬは、力価の点から最も有望なものであった。すべてのローラーボトル（ＲＢ）について、デキストロースは回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）の時点で消費され、力価は、表１０に基づく許容可能な基準内であった。２回目及び３回目の回収においても、２個のローラーボトルを除いて、力価は表３の基準を満たしていた。ローラーボトル（ＲＢ）Ｊ、Ｋ及びＬの回収−ＩＩＩ（Ｈ−ＩＩＩ）をもう１日延長したところ、力価は依然として許容可能なものであることが示された（表１１）。
【０１２４】
最後のローラーボトルＭ、Ｎ及びＯは、高い細胞播種密度及び低いＭＯＩを有しており、ローラーボトルＮ及びＯについては一貫した力価の結果が示された。
【０１２５】
【表１２】
2014506795.tif 000013
【０１２６】
表１０によれば、表１１に示されるローラーボトルＪ、Ｋ及びＬのＴＣＩＤ５０／mLの結果は、回収Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩについてすべての基準を満たしていた。ローラーボトルＪ、Ｋ及びＬにおける１mLあたりの細胞播種密度の割合は、３００Ｌに関するバイオリアクターの１mLあたりの細胞播種密度（表６）と等しい。これらのデータに基づいて、ローラーボトルＪ、Ｋ及びＬのパラメーターは、確認ランのために選択されたものである（表１３）。
【０１２７】
【表１３】
2014506795.tif 000014
【０１２８】
表１３は、選択した同時工程の確認ラン（表１０で評価したもの）を示す。
【０１２９】
合計１５個のローラーボトルは、血清含有培地４００mLそれぞれの細胞播種密度を１ｘ１０７個とし、ＥＵ  ＰＲＲＳ９４８８１  ＭＳＶ＋４個のシードのＭＯＩを０．１として準備した。ローラーボトルを５個ずつの３群に分けた。回収−Ｉは、Ｊ１〜Ｊ５のローラーボトル（ＲＢ）については感染後５日目（５ＰＩ）に実施し、Ｋ１〜Ｋ５については感染後６日目（６ＰＩ）に実施し、Ｌ１〜Ｌ５については感染後７日目（７ＰＩ）に実施した。各ローラーボトルについて、デキストロースを測定した。次いで、回収物をプールし、力価のためにサンプルを採取した。続いて、再供給、回収ＩＩ及びＩＩＩ（最終）を実施した。
【０１３０】
回収−Ｉでは、平均して、１５個のローラーボトルすべてのデキストロースは、バイオリアクター工程（表３）について設定した回収基準０．１g/L以下の範囲内であり、これは、この工程がローラーボトルに合っていることを裏付けている。
【０１３１】
【表１４】
2014506795.tif 000015
【０１３２】
表１４は、本発明の同時ローラーボトル工程の回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）、回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）及び回収−ＩＩＩ（Ｈ−ＩＩＩ）について、ローラーボトルＪ、Ｋ及びＬのプールの条件及びウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／mL）の概要を示す。
【０１３３】
ローラーボトル工程を模倣するために、セットＪの個々の各ローラーボトル（表１３）からのサンプルをプールし、プールしたサンプルを力価用とした。回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）、回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）及び回収−ＩＩＩ（Ｈ−ＩＩＩ）について、同じ手順をローラーボトルＫ及びＬに適用した。
【０１３４】
Ｊ、Ｋ及びＬについて、回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）のプールサンプルのデキストロースは、０．０g/Lであった。回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）、回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）及び回収−ＩＩＩ（Ｈ−ＩＩＩ）の力価は６．５〜７．７の範囲であり、これは３００Ｌバイオリアクター工程と同程度である（表１５）。
【０１３５】
【表１５】
2014506795.tif 000016
【０１３６】
表１５は、ｃＧＭＰ条件下で実施した３回の検証ランについて、パラメーター及び力価（ＴＣＩＤ５０／mL）を示す。３つのロットはすべて、同じ細胞播種密度、同じＭＯＩであった。３つのロットすべてについて、デキストロースは回収Ｉの時点で０．０g/Lであった。すべての回収は、許容可能な基準内の結果であった。
【０１３７】
ローラーボトルの細胞播種密度（ＰＣＤ）範囲：
ターゲット細胞播種密度（ＰＣＤ）は、ローラーボトル（運転容量４００mL）あたり総細胞１．０ｘ１０７個である。低範囲については、７ｘ１０６個を評価し（表４）、許容可能な力価も同様とした。高範囲は、通常工程で評価した（表１１）。
【０１３８】
ローラーボトルの感染多重度（ＭＯＩ）範囲：
この成長系内におけるＥＵ  ＰＲＲＳ９４８８１の増殖には、０．１のターゲットＭＯＩが理想的である。それぞれ０．０１及び０．３の低ＭＯＩレベル及び高ＭＯＩレベルを３０Ｌバイオリアクターで調査した。ローラーボトルでは、時間的制約のため、０．１のターゲットＭＯＩ及び０．００５のターゲットＭＯＩのみを評価した（表１０）。
【０１３９】
分析
ローラーボトル同時工程の推奨パラメーターを表１６に概説する。ターゲットパラメーターのみを試験し、それらがこの工程に重要か重要ではないかについて検討した。定義は、以下の通りである：重要なパラメーターは、最終製品の品質特性に重要なパラメーターであり、重要ではないパラメーターは、規定範囲内で直接的にコントロールできるか、又は広範な運転範囲を有し得るので設定点からの偏差が重要ではないパラメーターである。重要ではないパラメーターは、重要なパラメーターを規定範囲内にコントロールするのに役立つ。
【０１４０】
【表１６】
2014506795.tif 000017
【０１４１】
結論
同時ローラーボトル工程の開発を達成するのに成功したところ、ＴＣＩＤ５０／mLで測定した場合の効力の点において、上記バイオリアクター工程と同等であった。同時ローラーボトル工程において、ターゲットにおける回収−Ｉ（Ｈ−Ｉ）、回収−ＩＩ（Ｈ−ＩＩ）及び回収−ＩＩＩ（Ｈ−ＩＩＩ）の重要なパラメーターを再現するのに成功した。
【０１４２】
ウイルス増殖、回収−Ｉについて、ＥＵ  ＰＲＲＳ９４８８１  ＭＬＶのためのローラーボトル同時工程の好ましい実施態様は、以下の通りである：培地組成、１．４g/L重炭酸ナトリウム含有ＭＥＭ；ウシ胎児血清５％v/vを補充した培地４００mLを含む８５０cm2のコーニングローラーボトルあたり１ｘ１０７個で細胞を播種すること（範囲：７ｘ１０６〜２ｘ１０７個／ローラーボトル）；温度を３６±１℃にコントロールすること；ローラーボトルラックの速度は０．５RPMである；及びターゲットＭＯＩは０．１である。
【０１４３】
回収−Ｉの基準について、オフラインのデキストロース測定用のサンプリングを感染後５日目（５ＰＩ）に開始する。回収−Ｉは、デキストロースが０．１ｇ／以下になる際（これは通常、感染後５〜７日目（５−７ｄａｙｓ  ＰＩ）に起こる）に実施するべきである。しかしながら、２回目の回収を実施する場合、１回目の再供給、回収ＩＩ。
【０１４４】
ＩＩ．  １回目の再供給〜回収−ＩＩ
ＭＥＭ及び１．４g/L重炭酸ナトリウムの培地組成物４００mLに２０mLのウシ胎児血清（５％v/v）を補充したものを再供給する。１回目の回収の培地設定と同じ条件下で、再供給を実施する（上記１回目の回収のパラメーターを参照のこと）。温度コントロールは、設定点３６±１℃のままである。ローラーボトルラックの速度は、０．５RPMである。ウイルス液の２回目の回収は、再供給後２日目に行う。
【０１４５】
ＩＩＩ．  ２回目の再供給〜回収−ＩＩＩ
ＭＥＭ、ネオマイシン及び１．４g/L重炭酸ナトリウムの培地組成物４００mLに２０mLの放射線照射ウシ胎児血清（５％v/v）を補充したものを再供給する。１回目の回収の培地設定と同じ条件下で、再供給を実施する（上記２回目の回収のパラメーターを参照のこと）。温度コントロールは、設定点３６±１℃のままである。ローラーボトルラックの速度は、０．５RPMである。ウイルス液の３回目の回収は、再供給後２日目に行う。
【図１】
2014506795.tif 000018
【図２】
2014506795.tif 000019
【図３】
2014506795.tif 000020
【図４】
2014506795.tif 000021
【図５】
2014506795.tif 000022
【図６】
2014506795.tif 000023
【図７】
2014506795.tif 000024
【図８】
2014506795.tif 000025
【国際調査報告】
2014506795.tif 000026
2014506795.tif 000027
2014506795.tif 000028