(57)【要約】  本明細書で提供される教示は、一般的に、酵素の、生物変換プロセスを使用して、リグニン由来の化合物を有益な芳香族化合物に変換する方法を対象としている。本教示は、（ｉ）リグニン画分に存在する毒性の化合物に耐性のある宿主細胞；（ｉｉ）芳香族化学製品へのリグニン画分の生物変換において酵素として使用され得るポリペプチド；（ｉｉｉ）リグニン画分の生物変換において酵素としてのポリペプチドの選択を発現する宿主細胞を形質転換するために使用され得るポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）酵素を発現する形質転換体、の選択を提供する。【選択図】図２Ｂ
2014506115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、
配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列であって、配列番号１０１の残基１、２、４−８、１０−１２、１４、１７、１９−２２、２４、２５、２７−３７、３９、４１−５４、５７、５８、６０、６２−６７、６９−７３、７５、７７−８０、８２−８７、８９、１００、１０２、１０３、１０４、１０５、１０７、１１０−１１４、１１７、２１２、１２２、１２４−１３０、１３３、１３４、１３７−１３９、１４８、１４９、１５１−１５６、１５９、１６０、１６６−１６８、１７０、１７３、１７４、１７８−１８１、１８４、１８５、１８７−１８９、１９８−２０１、２０４、２０５、２０７、２１０−２１６、２１９、２２２、２２３、２２６−２３２、２３５−２３９、２４２−２４６、２４９、２５１、２５４、２５７、２６４、２６６、２６７、２７０、２７５、及び２７８を保存する前記アミノ酸配列を含み；
ここで、保存された残基を除いたアミノ酸置換は、同類置換であり；及び、
前記アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項２】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、
配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列であって、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存する前記アミノ酸配列を含み；
ここで、保存された残基を除いた前記アミノ酸置換は、同類置換であることを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、請求項２に記載の分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項４】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、
配列番号１０１、または保存された残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を除いたその同類置換を含むことを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項５】
分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であって、該分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、
配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列であって、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存するアミノ酸配列を含み；
ここで、前記アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素。
【請求項６】
分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であって、該分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含み；
ここで、前記アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素。
【請求項７】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、
約２７９から約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；
配列番号１０１からの残基１９−５４、又は配列番号１０１の保存された残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、及び５０−５４を除いたその同類置換から成る第１アミノ酸領域；及び、
配列番号１０１からの残基９８−２２１、または保存された残基１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を除いたその同類置換から成る、第２アミノ酸領域を含むことを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項８】
分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であって、該分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、
約２７９から約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；
配列番号１０１からの１９−５４に対して少なくとも９５％の同一性を有している一方で、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、及び５０−５４を保存している第１アミノ酸領域であって；約１４の残基から約５９の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられる第１アミノ酸領域；及び、
配列番号１０１からの９８−２２１に対して少なくとも９５％の同一性を有している一方で、配列番号１０１の残基１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存している第２アミノ酸領域であって；約９３の残基から約２２６の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられる第２アミノ酸領域；及び、
ここで、前記組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素。
【請求項９】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項８に記載の分離した組み換え型ポリペプチド。
【請求項１０】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有するとともに、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存しているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンの分子量を有していることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有するとともに、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存しているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンの分子量を有していることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有するとともに、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存しているアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ベータ−アリールエーテル、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンの分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドを接触させることにより、ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項２０】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え型ポリヌクレオチドであって、前記アミノ酸配列は、配列番号１０１の残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を保存していることを特徴とする、組み換え型ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号１０１；又は配列番号１０１の保存された残基１９−２２、２４、２５、２７−３０、３３−３６、３９−４５、４７、４８、５０−５４；１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１６６、１０７、１８４、１８７、１８８、１９１、１９２、および１９５を除いたその同類置換を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組み換え型ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項２５】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、プラスミド。
【請求項２６】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、プラスミド。
【請求項２７】
請求項２３に記載のベクターにより形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２４に記載のベクターにより形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項２９】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
ポリペプチドを生産するのに適切な条件下で請求項２７に記載の宿主細胞を培養する工程；
前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する工程；及び、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、ポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトンから約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
ポリペプチドを生産するのに適切な条件下で請求項２８に記載の宿主細胞を培養する工程；
前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する工程；及び、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、ポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉであることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトンから約１０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項２７に記載の形質転換された宿主細胞；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項４３】
前記形質転換された宿主細胞が、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを含むことを特徴とする、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項２３に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を含む、ポリペプチドを発現する形質転換体；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項４６】
前記形質転換体がＥ．Ｃｏｌｉを含むことを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記形質転換体がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを含むことを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４８】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４９】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５０】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有していることを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５１】
溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５２】
溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５３】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項２４に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を含むポリペプチドを発現する形質転換体；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項５４】
前記形質転換体がＥ．Ｃｏｌｉを含むことを特徴とする、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記形質転換体がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを含むことを特徴とする、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５６】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５７】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有していることを特徴とする、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５８】
溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５９】
溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６０】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項２３に記載のベクターにより形質転換されたＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ宿主細胞を含む、ポリペプチドを発現する形質転換体；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項６１】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有していることを特徴とする、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６４】
溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６５】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、残基４７−５７、６３−７６、１００、１０１、１０４、１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、および２０６を保存することを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項６６】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項６５に記載の分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項６７】
前記アミノ酸配列が、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、請求項６５に記載の分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項６８】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、配列番号５４１；又は保存された残基４７−５７、６３−７６、１００、１０１、１０４、１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、および２０６を除いたその同類置換を含むことを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項６９】
分離されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であって、該分離されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、残基４７−５７、６３−７６、１００、１０１、１０４、１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、および２０６を保存し、前記アミノ酸配列は、β−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、分離されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素。
【請求項７０】
分離されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であって、該分離されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含み；ここで、前記アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、分離されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素。
【請求項７１】
分離された組み換え型ポリペプチドであって、該分離された組み換え型ポリペプチドは、
約２５６から約２６０に及ぶアミノ酸の長さ；
配列番号５４１からの残基４７−５７、又は保存された残基４７、４８、４９、５０、５２、５４、５５、５６、５７を除いたその同類置換から成る第１アミノ酸領域；
配列番号５４１からの残基６３−７６から成る第２アミノ酸領域；及び、
配列番号５４１からの残基９９−２３０、又は保存された残基１００、１０１、１０４、１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、及び２０６を除いたその同類置換から成る第３アミノ酸領域を含むことを特徴とする、分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項７２】
分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であって、該分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、
約２７９から約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；
配列番号５４１からの残基４７−５７、又は保存された残基４７、４８、４９、５０、５２、５４、５５、５６、５７を除いたその同類置換に対して少なくとも９５％同一性を有している第１アミノ酸領域；
配列番号５４１からの残基６３−７６から成る第２アミノ酸領域；及び、
配列番号５４１からの残基９９−２３０、又は保存された残基１００、１０１、１０４、１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、及び２０６を除いたその同類置換に対して少なくとも９５％同一性を有している第３アミノ酸領域を含み；
ここで、前記組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素が、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することを特徴とする、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素。
【請求項７３】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項７２に記載の分離された組み換え型ポリペプチド。
【請求項７４】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有するとともに残基４７−５７、６３−７６、１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、および２０６を保存しているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項７５】
前記リグニン由来の化合物が、約１８０ダルトンから約１０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、配列番号５４１または保存された残基４７−５７、６３−７６、１００、１０１、１０４、１０７、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、および２０６のその同類置換を含むポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項８０】
前記リグニン由来の化合物が、約１８０ダルトンから約１０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているポリペプチドを含み、アミノ酸が残基４７−５７、６３−７６、１００、１０１、１０４、１１１、１１２、１１５、１１６、１７６、１９４、１９７、１９８、２０１、２０２、および２０６を保存している、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているポリペプチド；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンの分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項８４】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項８３に記載のシステム。
【請求項８５】
請求項６５に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組み換え型ポリヌクレオチド。
【請求項８６】
請求項６８に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組み換え型ポリヌクレオチド。
【請求項８７】
請求項６５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項８８】
請求項６８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項８９】
請求項６５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、プラスミド。
【請求項９０】
請求項６８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、プラスミド。
【請求項９１】
請求項８７に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項９２】
請求項８８に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項９３】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
ポリペプチドを生産するのに適切な条件下で請求項９１に記載の宿主細胞を培養する工程；
前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する工程；及び、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、ポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項９４】
前記宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記宿主細胞がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉであることを特徴とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトンから約１０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法であって、該方法は、
ポリペプチドを生産するのに適切な条件下で請求項９２に記載の宿主細胞を培養する工程；
前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する工程；及び、
（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、および（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、ポリペプチドとを接触させる工程を含み；
ここで、前記接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じることを特徴とする、方法。
【請求項１０１】
前記宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記宿主細胞がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉであることを特徴とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトンから約１０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項９１に記載の形質転換された宿主細胞；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドとを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項１０７】
前記形質転換された宿主細胞が、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを含むことを特徴とする、請求項１０６に記載のシステム。
【請求項１０８】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で請求項６５に記載の前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項１０６に記載のシステム。
【請求項１０９】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項８７に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を含む、ポリペプチドを発現する形質転換体；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドとを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項１１０】
前記形質転換体がＥ．Ｃｏｌｉを含むことを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１１】
前記形質転換体がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを含むことを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１２】
保存された残基を除いたアミノ酸置換が同類置換であることを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１３】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１４】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有していることを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１５】
溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１６】
溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１７】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項８８に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を含む、ポリペプチドを発現する形質転換体；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドとを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項１１８】
前記形質転換体がＥ．Ｃｏｌｉを含むことを特徴とする、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１１９】
前記形質転換体がＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを含むことを特徴とする、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１２０】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１２１】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有していることを特徴とする、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１２２】
溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１２３】
溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１２４】
リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムであって、該システムは、
請求項８７に記載のベクターにより形質転換されたＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ宿主細胞を含む、ポリペプチドを発現する形質転換体；
ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、
前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；
ここで、前記システムは、溶媒中で前記リグニン由来の化合物と前記ポリペプチドとを接触させることにより、前記ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能することを特徴とする、システム。
【請求項１２５】
前記形質転換された宿主細胞は、前記リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒中で請求項６５に記載の前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、請求項１２４に記載のシステム。
【請求項１２６】
前記リグニン由来の化合物が約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンに及ぶ分子量を有していることを特徴とする、請求項１２４に記載のシステム。
【請求項１２７】
溶媒環境が水を含むことを特徴とする、請求項１２４に記載のシステム。
【請求項１２８】
溶媒環境が極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１２４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〈関連出願への相互参照〉
本出願は、２０１０年９月１５日に出願の米国仮特許出願第６１／４０３，４４０号、２０１０年１０月２５日に出願の米国仮特許出願第６１／４５５，７０９号の利益を主張し；それら文献の各々の適用は、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〈配列表〉
本出願は、配列表のＡＳＣＩＩコンプライアントテキストファイル（ｃｏｍｐｌｉａｎｔ  ｔｅｘｔ  ｆｉｌｅ）と共に申請される。添付ファイルの名称は、ＡＬＩＧＰ００４ＵＳ０１＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＡＳ−ＦＩＬＥＤ．ｔｘｔであり、当該ファイルは、２０１１年８月２９日に作成され、８１３ＫＢのサイズであり、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコンプライアントテキストファイルは、§１．８２１（ｃ）に必要とされる紙のコピーと、§１．８２１（ｅ）に必要とされるＣＲＦの両方としての役目を果たすため、配列表の紙のコピーとＣＲＦコピーとが同じであると示す声明は、米国公報／Ｖｏｌ７４、Ｎｏ．２０６／２００９年１０月２７日火曜日、セクションＩのように、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１（ｆ）の下では必要とされない。
【背景技術】
【０００３】
本明細書で提供される教示は、一般に、酵素の生物変換プロセスを使用して、リグニン由来の化合物を有益な芳香族化学物質に変換する方法を対象としている。
【０００４】
〈関連技術の説明〉
現在、燃料と化学物質の製造用の非再生原料としての石油に対する依存性が世界全体で存在する。石油を使用する問題は非常に周知であり、その問題が世界の人々に対する決まり文句に近いものになったということが文書化されている。要するに、石油にベースのプロセスは、汚くて危険である。石油の使用に関連する環境効果は、例えば、大気汚染、地球温暖化、抽出によるダメージ、石油流出、タールボール、及び健康上有害なものによるヒト、家庭動物、及び野生生物の健康上の危険を含むことが知られている。
【０００５】
石油精製所は、例えば、主としてガソリンを生成する、石油ベースのプロセスである。しかしながら、それらはまた、医薬品、農薬、食品成分、及びプラスチックの製造において使用される、貴重であり、あまり周知でない化学製品を生成するため、広範囲に使用される。この市場領域への清潔で環境に優しい代替案は、世界的に認識されるであろう。
【０００６】
バイオプロセスは、石油ベースのプロセスに対する清潔で環境に優しい代替案、即ち、商業的プロセスを行なうために生物、細胞、細胞小器官、又は酵素を使用するものであるバイオプロセスを提示することができる。生物精製所は、例えば、化学物質、熱、及び粉末、同様に、食物、飼料、燃料、並びに産業化学製品を生成することができる。生物精製所の例は、湿って乾燥した（ｗｅｔ  ａｎｄ  ｄｒｙ）トウモロコシ製粉機、パルプ工場及び紙工場、並びにバイオ燃料産業を含み得る。革なめしにおいて、プロテアーゼを使用して、皮革が柔らかくなり、体毛が取り除かれる。醸造において、アミラーゼは大麦を発芽させるのに使用される。チーズ製造において、レンニンは、工場（ｍｉｌ）においてタンパク質を凝結させるために使用される。バイオ燃料産業においては、例えば、石油ベースの燃料を置換するための燃料生成物へと自然に注目されるといったように、最近では注目された結果、石油ベースのプロセスにも依存する他の有益な化学製品が開発されなかった。
【０００７】
そのため、生物精製所は、天然物を有用な化学物質に変換するために酵素を使用する。パルプ工場と紙工場において使用される木材などの天然産物は、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを含む。硬材用組成物の典型的な範囲は、約４０−４４％のセルロース、約１５−３５％のヘミセルロース、及び約１８−２５％のリグニンでもよい。同様に、軟材用組成物の典型的な範囲は、約４０−４４％のセルロース、約２０−３２％のヘミセルロース、及び約２５−３５％のリグニンでもよい。全てのバイオ燃料がセルロースの生物精製所から生じるため、ここでの基本原料はグルコースであり、セルロースに由来し、リグニンは十分に利用されないままである。リグニンは、本来は芳香族化合物の単一の最も豊富なソースであり、リグニンの使用は、現在、生物精製所の設備用のプロセスによる熱（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｈｅａｔ）及びエネルギーを生成する燃焼などの、価値の少ない適用に限定される。代案において、リグニンは、飼料又は肥料の天然成分として販売される。しかし、興味深いことに、リグニンは芳香族コア構造に基づいた唯一の植物バイオマス成分であり、前記コア構造は、産業用化学物質の生成において有益である。当業者は、あいにく、リグニンのそのような使用の主な問題が以下のように残ることを認識するであろう：生物精製所のリグニン画分に存在する芳香族化合物は、産業上の微生物の増殖及び生存を阻害する毒性の化合物を含む。少なくともこのような理由により、産業上の微生物を使用する、リグニン画分を産業製品に変換する工程は、成功していない。
【０００８】
上述のものを考慮して、当業者は、（ｉ）例えば、医薬品、農薬、食品成分、及びプラスチックなど主要な市場を含む、有益な化学製品の生成における石油ベースのプロセスのための、清潔で環境に優しい置換；（ｉｉ）現在、産業上の原料として十分に利用されない産業廃棄物ストリーム（ｓｔｒｅａｍ）である、リグニンにおいて入手可能な、豊富で再生可能な自然資源の有利な使用；（ｉｉｉ）原料中のリグニン画分に存在する毒性の化合物に耐性のある宿主細胞の選択；（ｉｖ）有益な化学製品へのリグニン画分の生物変換において酵素として使用することができる、ポリペプチドの選択；（ｖ）有益な化学製品へのリグニン画分の生物変換においてポリペプチドを選択したもの（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を発現するため、宿主細胞を形質転換させるために使用することができる、ポリヌクレオチドの選択；（ｖｉ）抽出された化合物をリグニン画分との直接接触に使用した後、（ａ）リグニン画分への直接接触の間に酵素を発現するため、又は（ｂ）細胞からの抽出のため酵素を発現するために、形質転換体を使用する、酵素を発現する形質転換体を含むシステム；及び（ｖｉｉ）石油ベースのプロセスより高い利益で、有益な化学製品をもたらす、清潔で環境に優しい方法を認識するであろう。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、一般に、有益な芳香族化学物質へのリグニン由来の化合物の生物変換において使用される酵素を生成する組み換え法を対象としている。幾つかの実施形態において、本教示は、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型ポリペプチドを対象としている。配列は、残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、Ｇ５４、Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を保存することができる。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本教示は、配列番号１０１；又は保存された残基を除いたその同類置換を含む、分離された組み換え型ポリペプチドを対象としている。保存された残基は、Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、Ｇ５４；Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を含むことができる。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本教示は、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素を対象としている。アミノ酸配列は、残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、Ｇ５４；Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を保存することができ；ここで、前記アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００１２】
幾つかの実施形態において、本教示は、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素に向けられ；ここで、前記アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００１３】
幾つかの実施形態において、本教示は、分離した組み換え型ポリペプチドに向けられ、該分離した組み換え型ポリペプチドは、以下のものを含む。（ｉ）約２７９から約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）配列番号１０１からの残基１９−５４、又は保存された残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、及びＧ５４を除いたその同類置換から成る、第１アミノ酸領域；ここで、第１アミノ酸領域は、約１４の残基から約５９の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；及び、（ｉｉｉ）配列番号１０１からの残基９８−２２１、又は保存された残基Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を除いたその同類置換から成る、第２アミノ酸領域；ここで、第２アミノ酸領域は、約９３の残基から約２２６の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得る。
【００１４】
幾つかの実施形態において、本教示は、分離した組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素に向けられ、該分離した組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、以下のものを含む。（ｉ）約２７９から約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、及びＧ５４を保存する間、配列番号１０１からの残基１９−５４に少なくとも９５％の同一性を有している第１アミノ酸領域；ここで、第１アミノ酸領域は、約１４の残基から約５９の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ；及び、（ｉｉｉ）残基Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を保存する間、配列番号１０１からの残基９８−２２１に少なくとも９５％の同一性を有している第２アミノ酸領域；ここで、第２のアミノ酸領域は、約９３の残基から約２２６の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；並びに、組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能することができる。
【００１５】
幾つかの実施形態において、本教示は、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素に向けられ；ここで、アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、本教示は、分離された組み換え型ポリペプチドに向けられ、該分離された組み換え型ポリペプチドは、以下のものを含む。（ｉ）約２５６から約２６０に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）配列番号５４１からの残基４７−５７、又は保存された残基Ａ４７、Ｉ４８、Ｎ４９、Ｐ５０、Ｇ５２、Ｖ５４、Ｐ５５、Ｖ５６、Ｌ５７を除いたその同類置換から成る、第１アミノ酸領域；ここで、第１アミノ酸領域は、約４５の残基から約５７の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ；（ｉｉｉ）配列番号５４１からの６３−７６から成る第２アミノ酸領域；及び、（ｉｖ）配列番号５４１からの残基９９−２３０、又は保存された残基Ｒ１００、Ｙ１０１、Ｋ１０４、Ｄ１０７、Ｍ１１１、Ｎ１１２、Ｓ１１５、Ｍ１１６、Ｋ１７６、Ｌ１９４、Ｉ１９７、Ｎ１９８、Ｓ２０１、Ｈ２０２、及びＭ２０６を除いたその同類置換から成る、第３アミノ酸領域；ここで、第２アミノ酸領域は、約９４の残基から約２３５の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられる。
【００１７】
幾つかの実施形態において、本教示は、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素に向けられ、該分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、以下のものを含む。（ｉ）約２７９から約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）配列番号５４１からの４７−５７に対して少なくとも９５％の同一性を有している第１アミノ酸領域、又は保存された残基Ａ４７、Ｉ４８、Ｎ４９、Ｐ５０、Ｇ５２、Ｖ５４、Ｐ５５、Ｖ５６、Ｌ５７を除いたその同類置換；ここで、第１アミノ酸領域は、約４５の残基から約５７の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；（ｉｉｉ）配列番号５４１からの６３−７６から成る第２アミノ酸領域；及び、（ｉｖ）配列番号５４１からの残基９９−２３０に少なくとも９５％の同一性を有している第３アミノ酸領域、又は保存された残基Ｒ１００、Ｙ１０１、Ｋ１０４、Ｄ１０７、Ｍ１１１、Ｎ１１２、Ｓ１１５、Ｍ１１６、Ｋ１７６、Ｌ１９４、Ｉ１９７、Ｎ１９８、Ｓ２０１、Ｈ２０２、及びＭ２０６を除いたその同類置換；ここで、第２アミノ酸領域は、約９４の残基から約２３５の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；ここで、組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素はベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００１８】
幾つかの実施形態において、保存された残基を除いたアミノ酸置換は、同類置換であり得る。そして、多くの実施形態において、アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能し得る。
【００１９】
本教示はまた、（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合、及び（ｉｉ）約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するリグニン由来の化合物と、本明細書で教示されるポリペプチドとを接触させる工程を含む、ベータ−アリールエーテルを開裂する方法に向けられ；ここで、該接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じる。
【００２０】
幾つかの実施形態において、リグニン由来の化合物は、約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンの分子量を有している。幾つかの実施形態において、溶媒環境は、水を含む。また、幾つかの実施形態において、溶媒環境は、極性有機溶媒を含む。
【００２１】
本教示はまた、リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするためのシステムに向けられ、該システムは、本明細書で教示されるポリペプチド、ベータ−アリールエーテル結合及び約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境を含み；ここで、該システムは、溶媒中でリグニン由来の化合物とポリペプチドを接触させることにより、ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能する。
【００２２】
本教示はまた、本明細書で教示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え型ポリヌクレオチドを対象としている。同様に、本教示はまた、ポリペプチドを発現するためにベクター又はプラスミドによって形質転換された宿主細胞と同様に、ポリヌクレオチドを含むベクター又はプラスミドを対象としている。
【００２３】
本教示はまた、ベータ−アリールエーテル結合を切断する方法に向けられ、該方法は、（ｉ）本明細書で教示されるポリペプチドを生産するのに適切な条件下で、本明細書に教示される宿主細胞を培養する工程；（ｉｉ）前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する工程；及び、（ｉｉｉ）ベータ−アリールエーテル結合及び約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物と、請求項１のポリペプチドとを接触させる工程を含み；ここで、該接触させる工程は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じる。
【００２４】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．Ｃｏｌｉ、又はＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉなどのアゾトバクター株であり得る。また、幾つかの実施形態において、リグニン由来の化合物は、約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンの分子量を有することができる。
【００２５】
本教示はまた、リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするためのシステムに向けられ、該システムは、（ｉ）本明細書で教示される形質転換された宿主細胞；（ｉｉ）ベータ−アリールエーテル結合、及び約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、（ｉｉｉ）リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；ここで、該システムは、溶媒中でリグニン由来の化合物と本明細書に教示されるポリペプチドとを接触させることによって、ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａと１Ｂは、幾つかの実施形態に従った、生物精製所の一般的な概念、及び本明細書で考察される発見プロセスを示す。
【図１Ｂ】図１Ａと１Ｂは、幾つかの実施形態に従った、生物精製所の一般的な概念、及び本明細書で考察される発見プロセスを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、幾つかの実施形態に従った、生物変換を使用してもたらされ得る、幾つかの構成単位の化学物質の構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、幾つかの実施形態に従った、生物変換を使用してもたらされ得る、幾つかの構成単位の化学物質の構造を示す。
【図３】図３は、幾つかの実施形態に従った、モデルリグニン二量体、α−（Ｏ）−（ｓ−メチルウンベリフェリル）アセトバニロン（ＭＵＡＶ）のベータ−エーテラーゼにより触媒される加水分解の例である。
【図４】図４は、幾つかの実施形態に従った、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの陽性対照ポリペプチド、及びＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓの推測ベータ−エーテラーゼポリペプチドに関する、ベータ−エーテラーゼ機能のための生化学的活性のアッセイからの、予測されない結果を示す。
【図５】図５は、幾つかの実施形態に従った、天然のリグニン構造を表わす基質として試験される、ベータ−アリールエーテル化合物を示す。
【図６】図６は、幾つかの実施形態に従った、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓによる、グアヤシルグリセロール−β−グアヤシルエーテル（ＧＧＥ）の代謝の経路を示す。
【図７】図７は、幾つかの実施形態に従った、リグニンオリゴマーからのカテコールの生成のための生化学的プロセスの例を示す。
【図８】図８は、幾つかの実施形態に従った、リグニンオリゴマーからのバニリンの生成のための生化学的プロセスの例を示す。
【図９】図９は、幾つかの実施形態に従った、リグニンオリゴマーからの２，４−ジアミノトルエンの生成のための生化学的プロセスの例を示す。
【図１０】図１０は、幾つかの実施形態に従った、リグニンオリゴマーからの有益な化学物質の生成のために、オルト酸のクレゾール、サリチル酸、及びアミノサリチル酸を含む追加の生成物標的に関するプロセススキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、一般に、リグニン由来の有益な芳香族化学物質への化合物の生物変換で使用される酵素を生成する組み換え法を対象としている。現在、当該技術分野は、リグニンを所望の芳香族化合物へと選択的に変換することができる酵素の知識に限定されるように、有用な生成物をもたらすリグニンの分解を制御する能力に限定される。一般に、当該技術分野において、２つの基礎的なことが知られている：（１）リグニンは複雑である；及び（２）細菌のリグニン分解システムは故に、少なくともリグニン自体と同じくらい複雑である。従って、少なくともこれらの理由により、本明細書で提供される教示は、産業上有用な芳香族化学物質の生成に役立つ、有益で、予測されない、驚くべき一連のシステム、方法、及び組成物を提供する。
【００２８】
図１Ａと１Ｂは、幾つかの実施形態に従った、生物精製所の一般的な概念、及び本明細書で考察される発見プロセスを示す。図１Ａは、リグニン由来の化合物からの芳香族化学物質の生成のための生体内変化における、組み換え型微生物株の使用の一般化された例を示す。生物精製所プロセス（１００）は、形質転換された宿主細胞を使用する一連の生体内変化により、可溶性の生物精製所リグニン（１０５）を変換する。生物精製所リグニン（１０５）は、例えば、リグニン由来のモノマー及びオリゴマーの組み合せになり得る、リグニン由来の化合物を含む原料である。「生体内変化１」（１０７）は、追加のリグニンモノマー（１１０）を作成するモノマー上の、又はそのモノマー間の結合を選択的に開裂するために使用することができる。「生体内変化２」（１１２）は、モノ−芳香族商品（１１５）を作成するモノマー上の、又はそのモノマー間の追加の結合を選択的に開裂するために使用することができる。図１Ｂは、毒性のリグニン由来の化合物に耐性のある宿主細胞株を選択する工程を含む、発見プロセス（１２０）を示す。株の獲得（１２５）は、株の増殖、サンプル調製、及び保管を含む。１式のバクテリア菌株は、可溶性の生物精製所のリグニンのサンプルに対して耐性のある株を試験するために得られる。
【００２９】
幾つかの実施形態において、株は、（ｉ）十分に特徴付けられた芳香族及び異物の代謝を有するため；（ｉｉ）アノテートしたゲノム配列のため；及び（ｉｉｉ）試験的な又はより大きなスケールの発酵プロセスにおける事前の使用のために選択され得る。株の例は、限定されないが、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１３０３  ＤＪ）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ（ＡＴＣＣ  ４４１２（ＥＢ  Ｆｒｅｄ）Ｘ−５０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７７  Ｐｆ−５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ２９８３７  ＮＣＴＣ  １１００）を含むことができる。株は、再生用の付随のＡＴＣＣ文献によって記載されるような、関連する豊富な培地プレート上でストリークされ得る（ｓｔｒｅａｋｅｄ）。個々のコロニー（各々５）は、採集され、飽和するまで液体培地上で培養され得る。１２．５％の最終のグリセロール濃度で調製された培養物サンプルは、瞬間冷凍され、−８０℃で保存され得る。
【００３０】
選択的活性のための生化学的スクリーニングで使用されるモデルの基質合成（１５０）は、受託試験機関（ＣＲＯ）を通じて外部委託することができる。酵素を発見する試みは、最初に、バイオインフォーマティックな方法によって識別された、潜在的なベータ−エーテラーゼ候補遺伝子の識別に注目され得る。ベータ−エーテラーゼ活性を有する候補の識別は、可溶性のリグニンストリームの中に存在するリグニンオリゴマーから、リグニンモノマーを生じさせるための第一歩である。蛍光の基質α−Ｏ−（ｓ−メチルウンベリフェリル）アセトバニロン（ＭＵＡＶ）は、例えば、ベータ−エーテラーゼ機能を識別するため、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイで使用することができる（Ａｃｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｔ．  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）。アリールエーテル結合の加水分解の際の、４  メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の形成は、例えば、λｅｘ＝３６５ｎｍ及びλｅｍ＝４５０ｎｍ（或いは４６０ｎｍ）の蛍光によって監視することができる。
【００３１】
遺伝子合成、クローニング、及び形質転換工程（１４５）は、バイオインフォーマティックな方法と、所望の選択的な酵素活性を示す酵素についての既知の情報を組み合わせる工程を含み得る。例えば、バイオインフォーマティクスは、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ｌｉｇＥ及びｌｉｇＦベータ−エーテラーゼ配列に対する有意な相同性を共有する、推測ベータ−エーテラーゼ配列をもたらすことができる。「Ｍａｓａｉ，  Ｅ．  ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （３）：１７６８−１７７５（２００３）（“Ｍａｓａｉ”）」を参照し、それは引用により全体において本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ配列は、生化学的アッセイが酵素発見戦略において相対活性を示すため、陽性対照として使用することができる。
【００３２】
遺伝子合成、クローニング、及び形質転換工程（１４５）は、当業者に既知の任意の方法を使用して行うことができる。例えば、全ての遺伝子は、標準のＰＣＲベースのアセンブリ法の使用、及びＥ．ｃｏｌｉコドンバイアスの使用により、オリゴヌクレオチドからのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として、直接合成することができる。末端配列は、制限消化、及び大腸菌発現ベクターｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのクローニングのために、アダプター（ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ）を含み得る。内部のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトは、オリゴヌクレオチドの設計中にＯＲＦ配列から排除することができる。アセンブリされた遺伝子は、専有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）クローニングベクター（ｐＧＯＶ４）へとクローン化され、Ｅ．ｃｏｌｉＣＨ３の化学的なコンピテントセル及びＤＮＡ塩基配列へと形質転換され、ＤＮＡ配列は、精製されたプラスミドＤＮＡから決定される（Ｔｏｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）。配列検証の後、制限消化は、クローニングベクターから各々のＯＲＦ断片を切除するために使用され、配列はｐＥＴ２４ａへとサブクローン化され得る。その後、ｌｉｇＥとｌｉｇＦの全体の１式を有するプラスミドは、ベータ−エーテラーゼ発現及び生化学的な試験のための宿主株としての役目を果たし得る、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換することができる。
【００３３】
酵素スクリーニング（１５５）は、新しいエーテラーゼ（１６０）を識別するために行われる。蛍光の基質ＭＵＡＶは、組み換え型Ｅ．ｃｏｌｉのクローンからベータ−エーテラーゼ活性をスクリーンするため、及び識別するために使用することができる。ベータ−エーテラーゼ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによる誘導を使用して、ＬＢ培地中の組み換え型Ｅ．ｃｏｌｉ株の５ｍｌ又は２５ｍｌのサンプル中で行うことができる。誘発、及び細胞採取の後、細胞ペレットは、ＢＰＥＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞融解システムを使用して溶解される。細胞抽出液は、蛍光の基質ＭＵＡＶの上のベータ−エーテラーゼ活性に関する、インビトロの（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生化学的アッセイにおいて試験することができる。ＭＵＡＶ内でのアリールエーテル結合の加水分解の際の、４  メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の形成は、λｅｘ＝３６５ｎｍ及びλｅｍ＝４６０ｎｍの蛍光で監視することができ、ベータ−エーテラーゼ機能の定量的測度を提供することができる。Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ｌｉｇＥ及びｌｉｇＦの遺伝子により形質転換した大腸菌の細胞抽出液は、アッセイ陽性対照であり得る。試験サンプル又は知られていないサンプルは、例えば、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓから推測ベータ−エーテラーゼ遺伝子を発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ株を含むことができる。
【００３４】
リグニンストリームの獲得（１３０）は、試験用の生物精製所からの不用のリグニンストリームを含む。そのようなリグニンの１つのソースの予備的な特徴づけは、１ｇ／ｌ未満の芳香族モノマー濃度、及び〜１０ｇ／Ｌのオリゴマー濃度を示した。オリゴマーは、糖：フェノール樹脂について１０：１の比率で、炭水化物に関連するように思われる。幾つかの情報は、安息香酸、バニリン、シリンガ酸、及びフェルラ酸を含む、液体ストリーム中の化合物に存在し、それらは、可溶性のサンプルの中で慣例的に定量化される。〜２８０の平均分子量は、モノマーのために確立され；及びオリゴマーの成分は、まだ特徴づけられていない。
【００３５】
株の耐性試験（１３５）の株の耐性は、生物精製所のリグニンへの曝露の際の細胞増殖によって測定されるであろう。生物精製所のリグニンの不用の流出物におけるフェノール化合物に対する耐性は、生物プロセスの有効性、及び微生物のシステムによる芳香族化学物質の高レベルの生成にとって決定的に重要になる。細胞増殖は、可溶性のテトラゾリウム塩の減少によって、呼吸の機能として定量化される。ＸＴＴ（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリドの内塩、Ｓｉｇｍａ）は、呼吸細胞（ｒｅｓｐｉｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ）により、可溶性の紫のフォルマザン化合物へと還元される。フォルマザン生成物は、４５０ｎｍの吸光度によって検出され、定量化される。
【００３６】
可溶性のリグニン上での株の耐性試験（１３５）は、例えば、４８ウェルプレート中の液体のフォーマットにおいて行われ得る。各々の株は、８の複製において試験することができ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは陰性対照株として使用することができる。株は、飽和するまで富栄養培地で最初に増殖し、洗浄され、培地のＯＤ６００ｎｍが測定される。細菌の等しい数は、炭素源を除いた最少培地を含む、４８ウェルの増殖プレートのウェルへとインキュベートされ得る。マイナスのリグニンの陽性対照に加えて、可溶性のリグニン画分の濃度の増加は、０．８ｍｌの最終的な容量に対して各々の種を含んでいるウェルに加えることができる。リグニン画分の安息香酸の含有量の分析は、異なる起源のリグニン廃棄物のフェノール含有量の内部標識として使用することができる。３０℃で振盪して２４−４８時間のインキュベーションを行った後、培地は、ＸＴＴアッセイキットを使用して、リグニン画分への曝露の際の増殖に関して試験され得る。培養物サンプルは、４８ウェル増殖プレートから取り除かれ、ＸＴＴ試薬が加えられ得る９６ウェルアッセイプレート中で適切に希釈され得る。もたらされた可溶性のフォルマザンは、４５０ｎｍの吸光度によって定量化される。増殖の最高水準を示す菌株、及びそれ故の耐性は、リグニン変換のための宿主株として、更なる開発のための候補となり得る。
【００３７】
最良の耐性の特徴を有すると実証された株は、最も高い生物化学活性を示すとして識別された、ベータ−エーテラーゼ遺伝子により形質転換することができる。制限消化は、クローニングベクターからＯＲＦフラグメントを切除するために使用され、配列は、シャトルベクターｐＭＭＢ２０６へとサブクローン化され得る。シャトルベクターでクローン化されるコンストラクトは、エレクトロポーション、又は化学的形質転換によって、アゾトバクター又はシュードモナスの株へと形質転換され得る。組み換え型の、リグニンに耐性のある宿主株は、使用されている特定の宿主株に適用される、本明細書に記載されるもの等の、当業者に知られる任意の方法を使用して、ベータ−エーテラーゼの発現及び活性について再試験され得る。
【００３８】
〈生物精製所プロセスからの原料〉
出発物質の例は、前処理されたリグノセルロースのバイオマスであり得る。幾つかの実施形態において、リグノセルロースのバイオマス材料は、草、トウモロコシ茎葉、もみ殻、農業残留物、軟材及び硬材を含み得る。幾つかの実施形態において、リグニン由来の化合物は、ミシガンのアッパー半島領域にあるポプラなど硬材の種、又はヴァージニアとジョージアの領域にあるポプラ、ロロビーパイン（ｌｏｌｌｏｂｙ  Ｐｉｎｅ）、及びユーカリなどの硬材に由来し、又はニューヨーク北部地方にあるモミジとカシの種を含む混合された硬材であり得る。
【００３９】
幾つかの実施形態において、前処理方法は、様々な物理的、化学的、及び生物学的なものに基づいたプロセスを包含し得る。Ａｌｉｇｎａプロセス用の原料を生じさせるために使用される前処理方法の例は、物理的前処理、溶剤分別法、化学的前処理、生物学的前処理、イオン液体前処理、超臨界流体前処理、又はそれらの組み合せを例えば含み得、それらは段階的に適用され得る。
【００４０】
リグノセルロースバイオマスの微粉化を還元するために使用される物理的な前処理方法は、乾燥した、湿った震動性の、圧縮に基づいたボールミル粉砕手順（ｄｒｙ，  ｗｅｔ  ｖｉｂｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｂａｌｌ  ｍｉｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）の機械的ストレス方法を利用し得る。溶媒画分法は、バイオマスの様々な成分を差別的に可溶化して区分する、リグノセルロースバイオマスを前処理するために、オルガノソルブプロセス（ｏｒｇａｎｏｓｏｌｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、リン酸分別プロセス、及びイオン液体を使用する方法を含む。幾つかの実施形態において、オルガノソルブ方法は、約２５乃至約１００分の滞留時間で、約９０乃至約２０℃及び約１５５乃至約２２０℃の温度範囲の酸性触媒により、エタノールを含むアルコールを使用して、行われ得る。触媒濃度は、約０．８３％から約１．６７％まで変化することができ、アルコール濃度は、約２５％から約７４％（ｖ／ｖ）まで変化することができる。幾つかの実施形態において、リグノセルロースバイオマスのリン酸分別は、およそ５０℃の温度でリン酸、アセトン、及び水を使用する、一連の異なる抽出を使用して行われ得る。幾つかの実施形態において、リグノセルロースバイオマスのイオン液体前処理は、塩化物、ギ酸塩、酢酸塩、又はアルキルホスホナートのようなアニオンを含有するイオン液体の使用を含み、バイオマス：イオン液体の比率はおよそ１：１０（ｗ／ｗ）である。前処理は、約１００℃から約１５０℃の範囲に及ぶ温度で行われ得る。使用され得る他のイオン液体化合物は、１−ブチル−３−メチル−塩化イミダゾリウム及び１−エチル−３−塩化メチルイミダゾリウムを含む。
【００４１】
リグノセルロースバイオマス材料の化学的前処理は、酸性処理、アルカリ性処理、及び酸化処理を含む技術を使用して行われ得る。幾つかの実施形態において、以下に記載のものなどのリグノセルロースバイオマスの酸性前処理方法が適用され得る。約０．０５％乃至約５％の近似範囲の濃度、及び約１６０℃乃至約２２０℃の範囲の温度で硫酸を使用する、希酸による前処理。約１６０℃乃至約２９０℃の間の温度で、蒸気爆発の前に、硫酸、硝酸、炭酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、二酸化硫黄、水酸化ナトリウム、アンモニアなどの触媒を使用する、又はそれらを使用しない、蒸気爆発。＞５ＭＰａの圧力、約１６０℃乃至約２３０℃の範囲に及ぶ温度、及び約４と約７の間の範囲のｐＨでの、液体熱湯処理（Ｌｉｑｕｉｄ  ｈｏｔ  ｗａｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。また、幾つかの実施形態において、酸化カルシウム、アンモニア、及び水酸化ナトリウムなどの触媒を使用するアルカリ性の前処理方法が、使用され得る。アンモニアファイバー拡張（ａｍｍｏｎｉａ  ｆｉｂｅｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）（ＡＦＥＸ）方法を適用して、乾燥重量バイオマスの１ｋｇ当たり約０．３ｋｇ乃至約２ｋｇで濃縮されたアンモニアを、高圧反応装置中で約６０℃乃至約１４０℃で使用し、急速な圧力放出の前に５−４５分間調理する（ｃｏｏｋｅｄ）。アンモニア再循環浸出（ＡＲＰ）方法は、高い温度と圧力で５−１５％の濃度のアンモニア性溶液をろ過することにより、フロースルーモード（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｏｄｅ）において使用され得る。アルカリ性の湿式酸化などの酸化の前処理方法は、酸化剤として加圧空気／酸素の混合物又は過酸化水素を使用する高圧反応装置において、約１７０℃乃至約２２０℃の範囲に及ぶ温度で、炭酸ナトリウムと共に使用され得る。
【００４２】
白色腐巧担子菌類（ｗｈｉｔｅ  ｒｏｔ  ｂａｓｉｄｏｍｙｃｅｔｅｓ）と特定の放線菌を使用する生物学的前処理方法が適用され得る。前記前処理方法からの１種の生成物ストリームは、可溶性のリグニンであり、及び約１ｇ／ｌ乃至約１０ｇ／ｌの範囲でリグニン由来のモノマー及びオリゴマー、及びキシランを含み得る。リグニン由来のモノマーは、没食子酸、ヒドロキシベンゾアート、フェルラ酸、ヒドロキシメチルフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールアルコール、バニリン、ホモバニリン、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、及びフルフラールアルコールなどの化合物を含み得る。
【００４３】
超臨界流体前処理方法は、バイオマスを処理するために使用され得る。バイオマスのプロセスで使用される超臨界流体の例は、エタノールと二酸化炭素の臨界点を超える温度及び圧力ではあるが、水の臨界点未満の温度及び／又は圧力の、エタノール、アセトン、水、及び二酸化炭素を含む。
【００４４】
蒸気前処理及び生物学的前処理の方法の組み合わせが適用され得る。例えば、バイオマス蒸気は、制御されたｐＨで、１０分間１９５℃で前処理され、その後、１００ｍｇのタンパク質／ｇの全固形物の用量の市販のセルラーゼ及びキシラナーゼを使用し、５００ｒｐｍの撹拌によるｐＨ５．０、５０℃でのインキュベーションにより、酵素処理を行った。
【００４５】
幾つかの実施形態において、熱水の、オルガノソルブの、及び生物学的な前処理方法の組み合わせが使用され得る。そのような組み合わせの１つの例は、３段階のプロセスである：
段階１．熱水プロセスのため、予め定められたｐＨ、温度、及び圧力で、水性媒体中で熱を使用する；
段階２．オルガノソルブ工程のため、水中で６−６ｃに記載されるものから少なくとも１つの有機溶媒を使用する；
段階３．生物学的前処理工程のため、天然又は組み換え型の形態において、酵母菌、白色腐巧担子菌類、放線菌、及びセルラーゼ並びにキシラナーゼを使用する。
【００４６】
オルガノソルブ方法を使用して派生した可溶性のリグニン画分は、様々な極性溶媒において可溶性である、１８８−１０００の分子量範囲の可溶性のリグニンをもたらし得る。任意の理論又は作用の機構に縛られることなく、オルガノソルブプロセスは一般的に、リグニンベータ−アリールエーテル結合を維持すると信じられている。
【００４７】
リグノセルロースのバイオマスを爆発させた蒸気からのリグニンストリームが、使用され得る。蒸気爆発は、例えば、約２００ｐｓｉ乃至約５００ｐｓｉの範囲の高圧蒸気を使用して、及び約１８０℃乃至約２３０℃に及ぶ温度で、バッチ又は連続的なリアクターにおいて約１分乃至約２０分間行われ得る。リグニンは、有機溶媒を使用するアルカリ洗浄又は抽出により、蒸気爆発した材料から抽出され得る。蒸気爆発したリグニンは、オルガノソルブリグニンを形成すると記載されるものに類似する特性を示し、天然の結合構造を保持し、オリゴマーユニットにつき約３乃至約１２の芳香族ユニットを含み得る。
【００４８】
超臨界流体前処理は、本明細書で提供される教示と共に使用され得る可溶性のリグニン画分をもたらすことができる。そのようなプロセスは、典型的には＜約１０００ダルトンの分子量を有するモノマー及びリグニンオリゴマーをもたらす。
【００４９】
生物学的前処理は、本明細書で提供された教示と共に使用され得る可溶性のリグニン画分をもたらすことができる。そのようなリグニンストリームは、約１ｇ／ｌ乃至約１０ｇ／ｌの範囲でリグニンモノマーとオリゴマーを含み、＜約１０００ダルトンの分子量、及びキシランを有し得る。リグニン由来のモノマーは、没食子酸、ヒドロキシベンゾアート、フェルラ酸、ヒドロキシメチルフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールアルコール、バニリン、ホモバニリン、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、及びフルフラールアルコールなどの化合物を含み得る。
【００５０】
〈木材パルプ化プロセスからの原料〉
木材パルプ化プロセスは、様々なリグニンのタイプ、即ち、使用されるプロセスのタイプに依存するリグニンのタイプをもたらす。化学パルプ化プロセスは、例えば、クラフトパルプ法及び亜硫酸塩パルプ法を含む。
【００５１】
幾つかの実施形態において、リグニン由来の化合物は、クラフトパルプ化プロセスからの使用済みのパルプ廃液又は「黒液」から由来し得る。クラフトリグニンは、例えば、約１５０℃乃至約２００℃の範囲の反応温度と、およそ２時間の反応時間を使用するバッチ又は連続プロセスから由来し得る。リグニンの分子量の任意の範囲が得られ、有用な画分は、幾つかの実施形態において、約２００ダルトン乃至約４０００ダルトンに及び得る。約１０００ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有するチオリグニンは、生物変換において使用され得る。
【００５２】
幾つかの実施形態において、亜硫酸塩パルプ化プロセスからのリグニンが使用され得る。亜硫酸塩パルプ化プロセスは、例えば、約２乃至約１２に及ぶｐＨで、水溶性の二酸化硫黄、重亜硫酸塩、及びモノ亜硫酸塩を使用する化学的なスルホン化を含み得る。スルホン化されたリグニンは、リグノスルホン酸塩として過剰な石灰による沈澱によって回収され得る。或いは、スルホン化後のリグニン芳香族化合物のホルムアルデヒドベースのメチル化が、行われ得る。リグニンの分子量の任意の範囲が得られ、有用な画分は、幾つかの実施形態において、約２００ダルトン乃至約４０００ダルトンの範囲に及び得る。約１０００ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有する亜硫酸リグニンは、生物変換において使用され得る。
【００５３】
〈生物変換で使用されるリグニン由来の化合物の特徴づけ〉
特定の原料用のシステムの最適化は、特定の原料の組成物についての理解を含むべきである。例えば、当業者は、天然のリグニンの組成物が、原料に使用される与えられたリグニン画分（ｆａｃｔｉｏｎ）中のリグニン由来の化合物の組成物とかなり異なり得ることを認識するであろう。従って、原料の組成物についての理解は、有益な芳香族化合物に対するリグニン由来の化合物の変換の最適化を支援するであろう。当業者に既知の任意の方法は、原料の組成物を特徴づけるために使用され得る。例えば、当業者は、伝統的に使用されるガスクロマトグラフィー、又はＮＭＲとＦＴＩＲなどの分光学技術と合わせた、チオ酸分解及びニトロベンゼン酸化などのウェットな化学技術を使用し得る。チオ酸分解は、例えば、リグニン中のβ−Ｏ−４結合を開裂し、その後ＳとＧの含有量を計算するために使用されるモノマー及び二量体を生じさせる。類似の情報は、ニトロベンゼン酸化を使用して得られるが、比率はそれほど正確でないと思われている。幾つかの実施形態において、Ｓ、Ｇ及びＨの含有量、同様にそれらの相対的な比率は、生物変換システム設計を決定する目的のための原料の組成物を特徴づけるために使用され得る。
【００５４】
リグニンの生合成、モノリグノールとも称される、３つのタイプのフェニルプロパンユニットの重合に由来することは、広く受け入れられる。これらのユニットは、コニフェリル、シナピル（ｓｉｎａｐｙｌ）、及びｐ−クマリル（ｃｏｕｍａｒｙｌ）アルコールである。３つの構造は、以下の通りである：
【００５５】
【化１】
2014506115.tif 000003
【００５６】
表１Ａ及び１Ｂは、バイオマスの様々なケースでの、ｐ−クマリルアルコール又はｐ−ヒドロキシルフェノール（Ｈ）、コニフェリルアルコール又はグアヤシル（Ｇ）、シナピルアルコール又はシリンギル（Ｓ）リグニンの分布を要約する。表１Ａは、バイオマス中のリグニンの割合を、Ｇ：Ｓ：Ｈと比較する。
【００５７】
【表１Ａ】
2014506115.tif 000004
【００５８】
表１Ａは、バイオマス、種、及び環境ストレスにおけるサンプルの位置と、Ｇ：Ｓ：Ｈを比較する。
【００５９】
【表１Ｂ】
2014506115.tif 000005
【００６０】
一般に、リグニン中のＧ、Ｓ、及びＨの相対量は、その全体組成の優れた指標、及び本明細書で教示される生物変換等の処理に対する反応となり得る。ポプラ種において、例えば差は、測定技術と同様に種に基づくと見られるが、一般には１．３乃至２．２に及ぶＳ／Ｇ比率に基づく。これは、硬材のユーカリに類似するが、草木のバイオマススイッチグラス及びススキよりも高い。このことは、草リグニンにおけるより高いＨ含有量を与えられると予測される。最適化されたニトロベンゼン酸化法は、２つの異なるサイト、及び１．０１乃至１．６８に及ぶ得られた値からの、１３のポプラサンプルのＳ／Ｇ比率を示した。さらに、線形相関（Ｒ２＝０．８５）は、リグニン含有量の減少と、Ｓ／Ｇ比率の増加との間のポプラにおいて見出されていた。相関性は、地理学的な位置に対する依存性を示唆する単一のサイトからのサンプルにおいて、より強力であった（Ｒ２＝０．９３）。
【００６１】
より高いハイスループット方法は、原料の急速なスクリーニングに使用され得る。そのような方法の例は、限定されないが、近赤外線（ＮＩＲ）、反射分光法、熱分解分子線質量分析法（ｐｙＭＢＭＳ）、フーリエ変換赤外分光法、改変されたチオ酸分解技術、及びイオン液体中の溶解後の全体の細胞のＮＭＲを含む。Ｓ／Ｇ比率などの、リグニンの幾つかの構造の特性についての情報は、これらの方法を使用して急速に得ることができる。１０４のポプラリグニンサンプルの平均のＳ：Ｇ：Ｈ比率は、例えば、改変されたチオ酸分解技術を使用して測定され、６８：３２：０．０２であると見出された。幾つかの実施形態において、比率におけるＳ、Ｇ、及びＨの成分は、重量パーセントとして表わされ得る。幾つかの実施形態において、比率におけるＳ、Ｇ、及びＨの成分は、任意の相対的な単位として表わされ得る、又は単位が無い。各々の成分の量が組成物中の他のそれぞれの成分に直接相互に関連する場合、任意の比較が使用され得る。比率は、Ｓ：Ｇ：Ｈとして相対的な整数又は画分で、又はＳ／Ｇ、Ｇ／Ｓなどの、成分の任意の他の順序或いは組み合せで表わされ得る。幾つかの実施形態において、Ｓ／Ｇ比率が使用される。幾つかの実施形態において、Ｓ／Ｇ比率は、約０．２０乃至約２０．０、約０．３乃至約１８．０、約０．４乃至約１５．０、約０．５乃至約１５．０、約０．６乃至約１２．０、約０．７乃至約１０．０、約０．８乃至約８．０、約０．９乃至約９．０、約１．０乃至約７．０、又はその任意の範囲に及び得る。幾つかの実施形態において、Ｓ／Ｇ比率は、約０．２、約０．４、約０．６、約０．８、約１．０、約１．２、約１．４、約１．６、約１．８、約２．０、約２．２、約２．４、約２．６、約２．８、約３．０、約３．２、約３．４、約３．６、約３．８、約４．０、約４．２、約４．４、約４．６、約４．８、約５．０、約５．２、約５．４、約５．６、約５．８、約６．０、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０、約８．２、約８．４、約８．６、約８．８、約９．０、約９．２、約９．４、約９．６、約９．８、約１０．０、及び０．１刻みで増加する任意の比率、及びその比率の任意の範囲であり得る。
【００６２】
〈生物変換で使用するためのリグニン由来の化合物の分画〉
生物精製所又はクラフト法に由来する可溶性のリグニンストリームは、追加の精製を行うこと無く微生物の変換において直接使用され、或いは、それらは、微生物の変換前に分離又は分画の技術の１つ以上によってさらに精製され得る。
【００６３】
幾つかの実施形態において、膜濾過は、１−６０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲のリグニンのモノマー及びオリゴマーの出発濃度、約１８０ダルトン乃至約２０００ダルトン、約２００ダルトン乃至約４０００ダルトン、約２５０ダルトンから約２５００ダルトン、約１８０ダルトン乃至約３５００ダルトン、約３００ダルトン乃至約３０００ダルトン、又はその任意の範囲に及ぶ分子量を達成するために適用され得る。
【００６４】
幾つかの実施形態において、可溶性のリグニンストリームは、例えば、ＨＰ−２０レジンを使用するクロマトグラフィーによって部分的に精製され得る。リグニンモノマーとオリゴマーは、レジンに結合することができる一方で、微生物に対して毒性であり得る高度に極性の不純物又は無機物は、結合されないままであり得る。例えば、メタノール水溶媒系による後の溶出は、リグニンのモノマーとオリゴマーにおいて濃縮された、高純度の画分を提供することができる。
【００６５】
〈化学製品〉
本教示の目的は、様々なリグニンのコア構造から有益な商品を作成する、新しい生化学的な変換の発見を含む。そのような商品は、構成単位の化学物質として機能し得る、モノマーの芳香族化学物質を含む。当業者は、莫大な数の芳香族化学物質が、本明細書で説明される教示によって提供される原理を使用してもたらすことができ、もたらされ得る可能な全ての化学物質の包括的な教示が、本教示の範囲及び目的を超えるものであることを認識する。
【００６６】
図２Ａと２Ｂは、幾つかの実施形態に従った、（ｉ）生物変換を使用してもたらされ得る幾つかの構成単位の化学物質の構造、及び（ｉｉ）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの遺伝子クラスターからの酵素系の例を示す。図２Ａは、リグニン由来の構成単位の化学物質としての役目を果たし得る幾つかのモノマーの芳香族構造の例が、限定されないが、グアヤコール、β−ヒドロキシプロピオバニロン、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、コニフェルアルデヒド（ｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、フェルラ酸、オイゲノール、プロピルグアヤコール（ｐｒｏｐｙｌｇｕａｉｃｏｌ）、及び４−アセチルグアヤコール（ａｃｅｔｙｌｇｕａｉａｃｏｌ）を含むことを示す。これら構造の各々は、本明細書で提供される教示を使用してもたらすことができることが認識されるべきである。図２Ｂ（ｉ）は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ株におけるＬｉｇＤＦＥＧの遺伝子クラスターの組織化を示す。図２Ｂ（ｉｉ）は、モデルリグニン構造、グアヤシルグリセロール−β−グアヤシルエーテル（ＧＧＥ）中のβ−アリールエーテル結合の開裂に関与されると信じられている、遺伝子産物の推定された機能を示す。制限酵素地図の上の垂直棒は、ＬｉｇＤ、ＬｉｇＦ、ＬｉｇＥ、及びＬｉｇＧの遺伝子挿入の位置を示す。ＬｉｇＤは、Ｃα−デヒドロゲナーゼ活性を示し、ＬｉｇＦ、及びＬｉｇＥは、β−エーテラーゼ活性を示し、ＬｉｇＧは、グルタチオンリアーゼ活性を示した。図２の説明文（略語）：制限酵素Ａｐ（ＡｐａＩ）、Ｂ（ＢｓｔＸＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｅｃ（Ｅｃｏ４７ＩＩＩ）、ｍｌ（ＭｌｕＩ）、Ｐ（ＰｓｔＩ）、ＲＶ（ＥｃｏＲＶ）、Ｓ（ＳａｌＩ）、Ｓｃ（ＳａｃＩ）、ＳｃＩＩ（ＳａｃＩＩ）、Ｓｔ（ＳｔｕＩ）、Ｓｍ（ＳｍａＩ）、Ｔｔ（ＴｔｈｌｌｌＩ）、及びＸ（ＸｈｏＩ）；化学物質ＧＧＥ（グアヤシルグリセロール−β−グアヤシルエーテル、ＧＳＨ（グルタチオン）、ＧＳＳＧ（グルタチオンジスルフィド）、及び星印は、不斉炭素である。
【００６７】
本明細書で教示されるように、リグニン由来の化合物の生物変換から得ることができる商品は、モノ−芳香族化学物質を含む。そのような化学物質の例は、限定されないが、カプロラクタム、クメン、スチレン、モノニトロ−及びジニトロトルエン並びにそれらの誘導体、２，４−ジアミノトルエン、２，４−ジニトロトルエン、テレフタル酸、カテコール、バニリン、サリチル酸、アミノサリチル酸、クレゾール及び異性体、アルキルフェノール、塩化フェノール、ニトロフェノール、多価フェノール、ニトロベンゼン、アニリン及び第二・第三アニリン塩基、ベンゾチアゾール及び誘導体、アルキルベンゼン及びアルキルベンゼンスルフォン酸塩、４，４−ジフェニルメタンジイソシアナート（ＭＤＩ）、クロロベンゼン及びジクロロベンゼン、ニトロクロロベンゼン、トルエン、プソイドクメン、メシチレン、ニトロクメン、クメンスルホン酸のスルホン酸誘導体を含む。
【００６８】
〈酵素発見〉
本明細書の教示はまた、新しい酵素の発見を対象としている。幾つかの実施形態において、酵素はベータ−エーテラーゼ酵素である。
【００６９】
リグニンは、芳香族コア構造に基づいた唯一の植物バイオマス成分であり、分枝状のフェニルプロペニル（Ｃ９）ユニットで構成される。リグニンのグアヤコールとシリンゴール（ｓｙｒｉｎｇｏｌ）構成単位は、炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）及び炭素−酸素（Ｃ−Ｏ、エーテル）の結合を通じて連結される。リグニンの天然の構造は、芳香族化学物質用の化学原料としてその重要な適用を示唆する。そのような化学構造の生成は、Ｃ−Ｃ及びＣ−Ｏの結合の解重合及び断裂を必要とする。リグニン中の豊富な化学結合は、ベータ−アリールエーテル結合であり、それは、リグニン中の結合タイプの５０％乃至７０％を含む。ベータ−アリールエーテル結合の効果的な開裂は、リグニンモノマーの構成単位を生成し、様々な産業製品への後の変換のための化学原料を提供するであろう。
【００７０】
ベータ−エーテラーゼ酵素系は、ラッカーゼ酵素系上のモノマーへのリグニンオリゴマーの変換のための複数の利点を有する。ベータ−エーテラーゼ酵素系は、副産物を形成することないリグニンオリゴマーのモノマーへの効果的及び高収率の変換、リグニンの芳香族コア構造の分解、又は酸化及び根本的な化学作用に基づいたラッカーゼ酵素系の使用と共に必要とされる電子伝達媒介物質の使用のため、高度に選択的な還元性の結合切断触媒を達成するだろう。
【００７１】
図３は、幾つかの実施形態に従った、モデルリグニン二量体、α−Ｏ−（β−メチルウンベリフェリル）アセトバニリン（ＭＵＡＶ）のベータ−エーテラーゼにより触媒された加水分解の例である。微生物Ｓｐｈｉｎｇｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓからのベータ−エーテラーゼによる、リグニンのモデル化合物中のベータ−アリールエーテル結合の切断が、記載された。しかし、入手可能な情報は限定され、産業規模プロセスのための産業上の微生物として、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの使用に関する文献において先例はない。新しいベータ−エーテラーゼ酵素の発見、及びアゾトバクター株におけるこれらの新しい酵素の異種の発現は、当該技術分野に、リグニン変換プロセスに特に良く適する有益な産業生産株を提供する。
【００７２】
当業者は、当該技術分野に対する標準として、本明細書で使用される化学的な命名法を認識するであろう。例えば、本明細書で使用されるアミノ酸は、少なくとも、表２における以下の従来の３文字の略語によって識別することができる：
【００７３】
【表２】
2014506115.tif 000006
【００７４】
一文字の識別子は、引用の容易さのために提供されるが、任意のフォーマットが使用され得る。３文字の略語は、一般にペプチド技術分野で許容され、生化学的な命名法においてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会によって推奨され、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５に従うように提供される。更に、ペプチド配列は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５に再び従うように、配列表の左側にＮ末端を置き、右側にＣ末端を置く、一般に許容される慣例に従って、教示される。
【００７５】
〈組み換え型ポリペプチド〉
本明細書の教示は、有益な芳香族化合物へのリグニン由来の化合物の変換において機能し得る、新しく、明白でないタンパク質、ＤＮＡ、及び宿主細胞系の発見に基づく。系は、天然の野生型の成分又は組み換え型成分、自然に生じるものから分離することができる組み換え型成分を含むことができる。
【００７６】
用語「分離した」は、その自然状態から「人の手によって」変更されることを意味し；すなわち、それが自然に生じる場合、変更されるか、又はその本来の環境から除去される、又はその両方が行われる。例えば、自然発生のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その自然状態において生きた動物内に自然に存在し、「分離されない」が、その自然状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、用語が本明細書で使用されるように、「分離される」。例えば、ポリヌクレオチドに関して、用語「分離された」は、自然に生じる染色体及び細胞からそれが分離されることを意味する。しかしながら、混合されたクローンライブラリ（例えば、ゲノム又はｃＤＮＡのライブラリ）のメンバーであり、クローンに含まれていた核酸分子、及びそれは、ライブラリの他のクローン（例えば、ライブラリの他のメンバー無しにクローンを含んでいる均一溶液の形態で）、又は細胞或いは細胞溶解物から分離されるか除去される染色体（例えば、核型内でのように「広げられた染色体」）から分離されないクローンに含有される、核酸分子は、本明細書の教示の目的のために「分離されない」。さらに、機械的に又は酵素学的に切断されたゲノムＤＮＡの調製において含有される孤立した核酸分子はまた、核酸分子の分離が目的でなかった場合、本明細書の教示の目的のために「分離されない」。故意の分離の一部、又はそれに伴うものとして、ポリヌクレオチドは、例えば、突然変異生成のため、融合タンパク質を形成するため、及び宿主における繁殖又は発現のために、他のポリヌクレオチドに連結され得る。分離されたポリヌクレオチドは、単独で、又はベクターなど他のポリヌクレオチドに連結して、そのようなＤＮＡがまだ分離された後、培地又は全体の生物において、宿主細胞へ導入され、このことは、それらが自然発生の形態又は環境でなかったためである。同様に、分離されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、培地製剤等の組成物、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの、例えば細胞への導入のための溶液、（例えば、自然発生の組成物でない）化学反応又は酵素反応のための組成物又は溶液において生じ得、及び、その結果、本明細書で使用されるような用語の意味の中で「分離された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドを残す。
【００７７】
発現ベクターなどの「ベクター」は、細菌、酵母菌、又はより高等な真核細胞などの、原核生物の又は真核生物の宿主細胞への、対象のＤＮＡを移動或いは伝送するために使用される。ベクターは、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むよう組み換え型に設計され得る。これらのベクターは、タグ、切断サイト、又は例えば、ポリペプチドの生成、分離、及び精製のプロセスを促進するこれらの要素の組み合せを含むことができる。対象のＤＮＡは、ベクターの発現成分として挿入され得る。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテリオファージを含む。ベクターがウイルス又はバクテリオファージである場合、用語「ベクター」は、ウイルス／バクテリオファージの被膜を含むことができる。用語「発現ベクター」は、通常、宿主細胞の機構によって発現される、対象の発現産物（通常、タンパク質）をコードする遺伝子を含有する、ＤＮＡコンストラクトを記載するために使用される。このタイプのベクターは頻繁にプラスミドであるが、バクテリオファージベクター及びウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、複製欠損のレトロウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態が、使用され得る。
【００７８】
幾つかの実施形態において、本明細書で教示されるポリペプチドは、天然又は野生型であるか、分離される、及び／又は組み換え型であり得る。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、天然又は野生型であるか、分離される、及び／又は組み換え型であり得る。幾つかの実施形態において、教示は、そのようなポリヌクレオチド、又はそのようなベクターによって形質転換された宿主細胞を含むことができるベクターを対象としている。
【００７９】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型ポリペプチドであり得る。配列は、残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、Ｇ５４、Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を保存することができる。
【００８０】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０１を含む、分離された組み換え型ポリペプチド；或いは、その保存された残基を除くその同類置換であり得る。保存された残基は、Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、Ｇ５４；Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を含むことができる。
【００８１】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であり得る。アミノ酸配列は、残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、Ｇ５４；Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を保存することができ；ここで、アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００８２】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型グルタチオンＳトランスフェラーゼ酵素であり；ここで、アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００８３】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、分離された組み換え型ポリペプチドであり、該分離された組み換え型ポリペプチドは、以下のものを含む。（ｉ）約２７９乃至約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）配列番号１０１からの残基１９−５４、又は保存された残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、及びＧ５４を除いたその同類置換から成る、第１アミノ酸領域；ここで、第１アミノ酸領域は、約１４の残基から約５９の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；及び、（ｉｉｉ）配列番号１０１からの残基９８−２２１、又は保存された残基Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を除いたその同類置換から成る、第２アミノ酸領域；ここで、第２アミノ酸領域は、約９３の残基から約２２６の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得る。
【００８４】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であり、該分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、以下のものを含む。（ｉ）約２７９乃至約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）残基Ｔ１９、Ｉ２０、Ｓ２１、Ｐ２２、Ｖ２４、Ｗ２５、Ｔ２７、Ｋ２８、Ｙ２９、Ａ３０、Ｈ３３、Ｋ３４、Ｇ３５、Ｆ３６、Ｄ３９、Ｉ４０、Ｖ４１、Ｐ４２、Ｇ４３、Ｇ４４、Ｆ４５、Ｇ４７、Ｉ４８、Ｅ５０、Ｒ５１、Ｔ５２、Ｇ５３、及びＧ５４を保存する間、配列番号１０１からの残基１９−５４に少なくとも９５％の同一性を有している第１アミノ酸領域；ここで、第１アミノ酸領域は、約１４の残基から約５９の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ；及び、（ｉｉｉ）残基Ｋ１００、Ａ１０１、Ｎ１０４、Ｖ１１１、Ｇ１１２、Ｍ１１５、Ｆ１１６、Ｐ１６６、Ｗ１０７、Ｙ１８４、Ｙ１８７、Ｒ１８８、Ｇ１９１、Ｇ１９２、及びＦ１９５を保存する間、配列番号１０１からの残基９８−２２１に少なくとも９５％の同一性を有している第２アミノ酸領域；ここで、第２アミノ酸領域は、約９３の残基から約２２６の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；並びに、組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、ベータ−アリールエーテルを開裂するために機能することができる。
【００８５】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５４１に対して少なくとも９５％の同一性を有しているアミノ酸配列を含む、分離された組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であり；ここで、アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを切断するように機能する。
【００８６】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、分離された組み換え型ポリペプチドであり、該分離された組み換え型ポリペプチドは、以下のものを含む。（ｉ）約２５６乃至約２６０に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）配列番号５４１からの残基４７−５７、又は保存された残基Ａ４７、Ｉ４８、Ｎ４９、Ｐ５０、Ｇ５２、Ｖ５４、Ｐ５５、Ｖ５６、Ｌ５７を除いたその同類置換から成る、第１アミノ酸領域；ここで、第１アミノ酸領域は、約４５の残基から約５７の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ；（ｉｉｉ）配列番号５４１からの６３−７６から成る第２アミノ酸領域；及び、（ｉｖ）配列番号５４１からの残基９９−２３０、又は保存された残基Ｒ１００、Ｙ１０１、Ｋ１０４、Ｄ１０７、Ｍ１１１、Ｎ１１２、Ｓ１１５、Ｍ１１６、Ｋ１７６、Ｌ１９４、Ｉ１９７、Ｎ１９８、Ｓ２０１、Ｈ２０２、及びＭ２０６を除いたその同類置換から成る、第３アミノ酸領域；ここで、第２アミノ酸領域は、約９４の残基から約２３５の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられる。
【００８７】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素であり、該組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素は、以下のものを含む。（ｉ）約２７９乃至約２８１に及ぶアミノ酸の長さ；（ｉｉ）配列番号５４１からの４７−５７に対して少なくとも９５％の同一性を有している第１アミノ酸領域、又は保存された残基Ａ４７、Ｉ４８、Ｎ４９、Ｐ５０、Ｇ５２、Ｖ５４、Ｐ５５、Ｖ５６、Ｌ５７を除いたその同類置換；ここで、第１アミノ酸領域は、約４５の残基から約５７の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；（ｉｉｉ）配列番号５４１からの６３−７６から成る第２アミノ酸領域；及び、（ｉｖ）配列番号５４１からの残基９９−２３０に少なくとも９５％の同一性を有している第３アミノ酸領域、又は保存された残基Ｒ１００、Ｙ１０１、Ｋ１０４、Ｄ１０７、Ｍ１１１、Ｎ１１２、Ｓ１１５、Ｍ１１６、Ｋ１７６、Ｌ１９４、Ｉ１９７、Ｎ１９８、Ｓ２０１、Ｈ２０２、及びＭ２０６を除いたその同類置換；ここで、第２アミノ酸領域は、約９４の残基から約２３５の残基までの組み換え型ポリペプチドに位置付けられ得；ここで、組み換え型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素はベータ−アリールエーテルを開裂するように機能する。
【００８８】
幾つかの実施形態において、保存された残基を除いたアミノ酸置換は、同類置換であり得る。そして、多くの実施形態において、アミノ酸配列は、ベータ−アリールエーテルを開裂するように機能し得る。
【００８９】
〈組み換え型ＳＤＦ−１ポリヌクレオチド及びポリペプチドを調製する方法〉
教示は、所望のポリペプチドをもたらすのに適切な条件下で宿主細胞を培養する工程；及び宿主細胞培地からポリペプチドを回収する工程を含む、本明細書に記載のポリペプチドを調整する方法を含み；ここで、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードする、外因的に由来するポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、例えばＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉなどのアゾトバクター株であり得る。
【００９０】
最初に、組み換え型ポリペプチドの主要なアミノ酸配列をコードする、二本鎖ＤＮＡ断片が、設計され得る。このＤＮＡ断片は、発現産物の合成、クローニング、発現、又は生化学的な操作を促進するために操作され得る。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに結紮され（ｌｉｇａｔｅｄ）得、次に、クローン化遺伝子のヌクレオチド配列が測定され、確認され得る。その後、遺伝子は、挿入遺伝子（ｉｎｓｅｒｔ  ｇｅｎｅ）の両側に導入される特異的な制限酵素配列を有する、設計されたプライマーを使用して増幅され得、遺伝子は、適切なサブクローン／発現のベクターへとサブクローン化され得る。突然変異のための合成遺伝子を有する発現ベクターは、適切な発現宿主に挿入され得る。その後、発現宿主は、遺伝子産物の生成に適している条件下で維持され得、幾つかの実施形態において、タンパク質は、（ｉ）遺伝子を発現する細胞から分離及び精製され、又は（ｉｉ）宿主細胞を含む反応環境の中で直接使用され得る。
【００９１】
核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、発現のためのクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、複製可能なベクターに挿入され得る。様々なベクターは公に入手可能である。例えば、一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼサイトに挿入され得る。ベクター成分は一般に、限定されないが、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
【００９２】
シグナル配列は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は耐熱性毒素ＩＩリーダーの群から選択される、原核生物のシグナル配列であり得る。酵母菌分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母菌転化酵素リーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミケス及びクリベロマイセスのアルファ因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載される）、又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（ＥＰ  ３６２，１７９）、或いは、例えばＷＯ  ９０／１３６４６に記載されるシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、ウイルスの分泌のリーダーと同様に、同種又は近縁種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列などのタンパク質の分泌を指示するために使用され得る。
【００９３】
発現とクローニングベクターの両方は、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞で複製することを可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母菌、及びウイルスに関して周知である。プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）からの複製起点は、例えば、大半のグラム陰性細菌に適切であり、２μのプラスミド起点は酵母菌に適切であり、様々なウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに役立つ。
【００９４】
発現とクローニングのベクターは、典型的には選択遺伝子を含み、選択可能なマーカーとも称される。典型的な選択遺伝子は、タンパク質をコードし、該タンパク質は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与え、（ｂ）栄養要求性の欠損症を補足し、又は（ｃ）複合培地から入手可能でない重大な栄養素、例えば、バチルスのための遺伝子コード化Ｄアラニンラセマーゼを供給する。
【００９５】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼなどの、コード化核酸を得るのに有能な細胞の識別を可能にするものである。野生型のＤＨＦＲが使用される場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が不足しているＣＨＯ細胞株であり、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：４２１６  （１９８０）によって記載されるように調整及び伝播される。酵母菌で使用される適切な選択遺伝子は、酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：３９  （１９７９）；  Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ７：１４１  （１９７９）；  Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １０：１５７  （１９８０））。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６、ＰＥＰ４−１において増殖する能力を欠く、酵母菌の突然変異株に選択マーカーを与える（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ８５：１２  （１９７７））。
【００９６】
発現とクローニングのベクターは、通常、ｍＲＮＡの合成を指示するためのコード化核酸配列に操作可能に連結されるプロモーターを含む。様々な潜在的な宿主細胞によって認識されたプロモーターは、周知である。原核生物の宿主と共に使用するのに適切なプロモーターは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターの系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５：６１５  （１９７８）；  Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：５４４  （１９７９））、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７  （１９８０）；  ＥＰ  ３６，７７６）、及びｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：２１  ２５  （１９８３））を含む。細菌の系で使用されるプロモーターはまた、コード化ＤＮＡに操作可能に連結されるシャイン−ダルガノ配列を含む。
【００９７】
他の酵母菌プロモーターは、増殖条件によって制御された転写の追加の利点を有する誘導可能なプロモーターであり、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース並びにガラクトースの利用の原因である酵素のための、プロモーター領域である。酵母菌発現で使用される、適切なベクター及びプロモーターは、当該技術分野で既知であり、更なる考察のため、例えばＥＰ７３，６５７を参照する。
【００９８】
哺乳動物宿主細胞のベクターからのＰＲＯ８７２９９の転写は、例えば、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから、異種の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモータ）から、及び熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御され、その場合、前記プロモーターは宿主細胞系と適合する。
【００９９】
より高い真核生物によるコード化ＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加され得る。エンハンサーは、通常１０乃至３００ｂｐの、その転写を増加させるためプロモーター上で作用する、ＤＮＡのシス作用エレメントである。多くのエンハンサー配列は現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテイン、及びインスリン）から知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例は、複製起点の後側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）にシミアンウイルス４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期のプロモーターエンハンサー、複製起点の後側にポリオーマウイルスエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、コード配列に対する位置５’又は３’でベクターへスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターからサイト５’に位置する。
【０１００】
真核生物の宿主細胞（酵母菌、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）の中で使用される発現ベクターはまた、転写の終了に、及びｍＲＮＡを安定させるために必要な配列を含む。そのような配列は、５’、及び時々３’、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの翻訳されていない領域から一般に入手可能である。これらの領域は、突然変異株をコードするｍＲＮＡの翻訳されていない部分におけるポリアデニル化された断片として転写された、ヌクレオチドセグメントを含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、発現調節配列は、ｌａｃシステム、Ｔ７発現システム、ｐＢＲ３２２起点の主要なオペレーター及びプロモーター領域、及び他の原核生物の制御領域から成る群から選択され得る。組み換え型脊椎動物細胞の培養における突然変異体の合成への適応に適した、また他の方法は、Ｇｅｔｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９３：６２０  ６２５  （１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：４０  ４６  （１９７９）；ＥＰ  １１７，０６０；及びＥＰ  １１７，０５８に記載される。
【０１０２】
突然変異体は、融合タンパク質として発現され得る。幾つかの実施形態において、方法は、タンパク質に、及び幾つかの実施形態においてタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を加える工程を含む。例えば、余分なアミノ酸は、アフィニティータグ又は開裂サイトとして機能し得る。融合タンパク質は、以下のように設計され得：（１）アフィニティー精製のための一時的なリガンドとして作用することによって精製を補助する、（２）標的遺伝子とアフィニティータグの間の開裂サイトを使用して、追加のアミノ酸を取り除くことにより、正確な組み換え型をもたらす、（３）生成物の溶解度を増加させる、及び／又は（４）生成物の発現を増加させる。タンパク質分解の開裂サイトは、生成物のさらなる精製−融合タンパク質のアフィニティー精製後の融合タンパク質からの組換え型タンパク質の分離を可能にするために、融合領域の接合部及び対象のタンパク質に含まれ得る。そのような酵素、及びそれらの同族の認識配列は、例えば、因子Ｘａ、トロンビン及びエンテロキナーゼ、臭化シアン、トリプシン、又はキモトリプシンを含むことができる。典型的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｓ．  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０  （１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓ．）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）及びｐＥＴ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ）を含み、それらは、それはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、又は６−ヒスチジン配列それぞれを、標的組換え型タンパク質に融合させることができる。
【０１０３】
ヌクレオチド、タグ及び開裂サイトの配列を含んでいる合成ＤＮＡが設計され、組み換え型ポリペプチド突然変異体のため修飾されるコードとして提供され得る。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、アフィニティータグを有する融合ポリペプチドであり、回収工程は、（１）融合ポリペプチドを捕らえて精製する工程、（２）所望のポリペプチドに少なくとも９５％相同性である、所望のポリペプチド又はアミノ酸配列の高収率生成用のアフィニティータグを取り除く工程を含む。突然変異体をコードするＤＮＡは、突然変異体のためにｍＲＮＡを持つ組織から調製される、ｃＤＮＡライブラリから得られ得る。そのため、ＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリから好都合に得ることができる。突然変異体のためのコード化遺伝子も、ゲノムライブラリから、又は既知の合成手順（例えば、自動化核酸合成）によって得られ得る。
【０１０４】
ライブラリは、対象の遺伝子又はそれによってコードされたタンパク質を識別するように設計されたプローブにより、スクリーンされ得る。選択されたプローブによる、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載されるもの等、標準のハイブリダイゼーション手順を使用して行われ、前記文献は引用により本明細書に組み込まれる。遺伝子コード化組み換え型ポリペプチド突然変異体を分離する代替手段は、ＰＣＲ方法論を用いることである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５）］。
【０１０５】
所望のタンパク質コード配列を有する核酸は、ｃＤＮＡへ逆転写され得ないｍＲＮＡの前駆体及び処理中間体（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を検出するために、推定されたアミノ酸配列を使用して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーンすることにより、及び必要であれば、以前にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるような従来のプライマー伸長手順により、得られ得る。
【０１０６】
発現ベクターの選択、配列の制御、変換法などは、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞のタイプに依存する。細胞への流入の後、挿入物ＤＮＡを含むベクターＤＮＡの全て又は一部は、宿主細胞染色体に組み込まれ、又はベクターは、染色体外に維持され得る。染色体外に維持されるベクターは頻繁に、宿主細胞中の自律複製が可能である。他のベクターは、宿主細胞のゲノムへ統合され、宿主ゲノムと共に複製される。
【０１０７】
宿主細胞は、突然変異体をもたらすため、本明細書に記載の発現又はクローニングのベクターによりトランスフェクトされる、又は形質転換される。細胞は、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なものとして修飾される従来の栄養培地において培養される。培地、温度、ｐＨなどの培養条件は、不適当な実験法を必要とせず、当業者により選択され得る。一般に、細胞培地の生産性を最大限にするための原則、プロトコル、及び実用技術は、上述の、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｍ．  Ｂｕｔｌｅｒ，  ｅｄ．  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１）  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に見出され得、その各々は引用により組み込まれる。
【０１０８】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物であり、及び本明細書のベクター中のＤＮＡのクローン化又は発現に適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又はより高等な真核細胞を含むことができる。真核細胞トランスフェクション及び原核細胞形質転換の方法は、当業者に既知である（例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介の、及びエレクトロポーション）。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切な標準技術を使用して行われる。上述の、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、又はエレクトロポーションは、一般に原核生物に対して使用される。Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２３：３１５  （１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染は、特定の植物細胞の形質転換に使用される。そのような細胞壁のない哺乳動物細胞に関して、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６  ４５７  （１９７８）のリン酸カルシウム沈澱法が、利用され得る。哺乳動物細胞の宿主システムトランスフェクションの一般的な態様は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌への形質転換は、典型的に、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔ．，  １３０：９４６  （１９７７）  ａｎｄ  Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ７６：３８２９  （１９７９）の方法に従って実行される。しかしながら、核微量注入、エレクトロポーション、完全細胞との細菌の原形質融合、又はポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン）などによる、細胞へＤＮＡを導入する他の方法も、使用され得る。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８５：５２７  ５３７  （１９９０）  ａｎｄ  Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３６：３４８  ３５２  （１９８８）を参照。
【０１０９】
本明細書のベクター中のＤＮＡのクローン化又は発現に適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又はより高等な真核細胞を含む。適切な原核生物は、限定されないが、グラム陰性又はグラム陽性の生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの腸内菌）などの真性細菌を含む。様々なＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）、及びＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）などのように、公に入手可能である。他の適切な原核生物の宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｉｎｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｎｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びＳｈｉｇｅｌｌａなどのような腸内細菌科、同様に、バシラス綱（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示される、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、シュードモナス属（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）、及び、ストレプトマイセス属を含む。これらの例は、限定的ではなく説明に役立ち、単に本明細書の教示の残りを補足する。株Ｗ３１１０は、それが組み換え型ＤＮＡ生成物の発酵のための一般的な宿主株であるため、１つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に内因性のタンパク質をコードする遺伝子において遺伝子突然変異をもたらすために修飾され得、そのような宿主の例は、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株１  Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＣ  ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシンの耐性のｄｅｇＰ欠失突然変異を有する３７Ｄ６であるＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株４０Ｂ４；及び米国特許第４，９４６，７８３号に開示されるような突然変異ペリプラズムのプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株を含む。或いは、クローニングのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の方法（例えばＰＣＲ、又は他の核酸ポリメラーゼ反応）が、適切である。
【０１１０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核生物の微生物は、突然変異に適切なクローニング又は発現の宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用される、より下等な真核生物の宿主微生物である。他のものは、分裂酵母（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０：  １４０  （１９８１）；  ＥＰ  １３９，３８３  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ２  Ｍａｙ  １９８５）；クリベロマイセス属宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；  Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９：９６８  ９７５  （１９９１））（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ，  ＣＢＳ６８３，  ＣＢＳ４５７４；  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５４（２）：７３７  ７４２  （１９８３））、Ｋ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  （ＡＴＣＣ  １２，４２４），  Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  （ＡＴＣＣ  １６，０４５），  Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ  （ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ  （ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ  （ＡＴＣＣ  ３６，９０６；  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：１３５  （１９９０））、Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ等）；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２８：２６５  ２７８  ［１９８８］）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７６：５２５９  ５２６３  （１９７９））；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのシュワニオマイセス属（ＥＰ３９４，５３８）；及び例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポカラジウム属等の糸状菌（ＷＯ９１／００３５７）、並びに、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ等のアスペルギルス属宿主（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １１２：２８４  ２８９  （１９８３）；  Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２６：２０５  ２２１  （１９８３）；  Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  １４７０  １４７４  （１９８４））、及びＡ．  ｎｉｇｅｒ  （Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ４：４７５  ４７９  （１９８５））を含む。メチロトローフの酵母菌は、本明細書で適切であり、限定されないが、ハンゼヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピキア属、サッカロマイセス属、トルロプシス属、及びロドトルラ属から成る属から選択される、メタノール上で増殖可能な酵母菌を含む。代表的な酵母菌のこのクラスである特異的な種の一覧は、Ｃ．  Ａｎｔｈｏｎｙ，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，  ２６９  （１９８２）において見出され得る。
【０１１１】
グリコシル化した突然変異体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から由来し得る。無脊髄動物の細胞は、植物細胞と同様に、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ属Ｓｆ９などの昆虫細胞を含む。有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より特異的な例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサルの腎臓ＣＶＩ株；ヒト胎生腎株（懸濁培養での増殖のためサブクローン化された２９３又は２９３の細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６：５９  （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，  Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：４２１６  （１９８０））；マウスセルトリ細胞；（ＴＭ４，  Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２３：２４３  ２５１  （１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，  ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）を含む。当業者は、不適当な実験無しに、少なくとも実施形態を採取する細胞外のタンパク質に関して、適切な宿主細胞を容易に選ぶことができる。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、適度に厳密な条件下で、所望のヌクレオチド配列を含む又はそれに相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸に、ハイブリダイズすることができる。幾つかの実施形態において、分離されたヌクレオチド配列は、厳密な条件下で、所望のヌクレオチド配列を含む又はそれに相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸に、ハイブリダイズすることができる。核酸分子の一本鎖の形態が、適切な温度条件及びイオン強度の下で、もう一方の核酸分子にアニール化され得るとき、核酸分子は、別の核酸分子に「ハイブリダイズする」ことができる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。温度条件とイオン強度は、ハイブリダイゼーションの「厳密性」を決定する。「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。しかし、混成の厳密性に依存して、ベース間のミスマッチが生じ得る。核酸をハイブリダイズするのに適切な厳密性は、核酸の長さ及び補足性の程度に依存する。そのような変数は、当該技術分野において周知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似点又は相同性の程度が大きくなるにつれ、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍ値が大きくなる。長さが１００のヌクレオチドを超えるハイブリッドに関して、Ｔｍを計算するための方程式が引き出された（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションのため、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドとポリペプチドは、所望のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの相同性を有する。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドとポリペプチドは、所望のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有する。また、幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドとポリペプチドは、所望のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの類似性を有する。上述のように、所望のポリヌクレオチドの変性型も許容可能である。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、所望のポリペプチドとしての同じ機能を共有できるほど長い、所望のポリペプチドに対して９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９の相同し、同一であり、或いは類似し得、機能の拡張は、所望のポリペプチドのものよりも少ないか、又はそれより大きくてもよい。幾つかの実施形態において、例えば、ポリペプチドは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は任意の０．１％刻みである、所望のポリペプチドの機能を有し得る。そして、幾つかの実施形態において、例えば、ポリペプチドは、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、或いは任意の１％刻みである、所望のポリペプチドの機能を有し得る。幾つかの実施形態において、「機能」は、例えば本明細書の教示に使用される方法などの、当業者に既知の任意の方法によって測定可能な酵素活性である。「所望のポリペプチド」又は「所望のポリヌクレオチド」は、「参照ポリペプチド」又は「参照ポリヌクレオチド」などとして称され、幾つかの実施形態においては、「試験ポリペプチド」又は「試験ポリヌクレオチド」などと考慮され得る対象のポリペプチドの比較のための対照として称され得る。どんな場合も、比較は、相同性、同一性、又は類似性を測定する目的のための別の１式に対する、塩基又はアミノ酸の１式である。ハイブリッド形成する能力は、もちろん、ヌクレオチド配列を比較する別の方法である。
【０１１４】
用語「相同性」、「相同性である」は、幾つかの実施形態において交換可能に使用することができる。用語は、核酸配列の一致、及びポリヌクレオチド配列間のヌクレオチド塩基における変化が遺伝子発現に影響を与える程度を指すことができる。これらの用語はまた、１つ以上のヌクレオチドの欠失又は挿入などの修飾、及び修飾されていないポリヌクレオチドに関する結果として生じるポリヌクレオチドの機能特性に対する、それらの修飾の効果を指す。同様に、用語は、ポリペプチド配列の一致、及び修飾されるポリペプチドと修飾されないポリペプチドを比較する時に見られたものなどの、ポリペプチド配列の変化が、ポリペプチドの機能に影響を与える程度を指す。本明細書で教示される突然変異体などのポリペプチドが、縮重の制限内の２つの非相同のポリヌクレオチド配列からもたらされ得ることは、当業者に認識されるべきである。
【０１１５】
用語「類似性」、「同一性」は、当該技術分野で既知である。用語「同一性」は、比較されている配列における相応して同一の位置の間の同一の一致に基づいた配列比較に言及するために使用され得る。用語「類似性」は、アミノ酸配列間の比較に言及するために使用され得、対応する位置で同一のアミノ酸だけでなく、対応する位置で機能的に類似するアミノ酸も考慮する。したがって、ポリペプチド配列間の類似性は、配列の類似性に加えて、機能的な類似性を示す。遺伝子配列間の同一性のレベル、及びアミノ酸配列間の同一性又は類似性のレベルは、既知の方法を使用して計算することができる。例えば、公的に入手可能な計算機に基づく、同一性及び類似性を測定する方法は、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９０；  ２１５：４０３−４１０）、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴＸプログラム、及びＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷｉｓからのＧａｐプログラムを含む。幾つかの実施形態において、Ｇａｐプログラムは、１２のＧａｐペナルティと４のＧａｐ長さペナルティと共に、アミノ酸配列を測定するため、及び、ポリヌクレオチド配列比較のため５０のＧａｐペナルティと３のＧａｐ長さペナルティのために使用され得る。幾つかの実施形態において、配列は、最上位の一致が得られるようにアラインされ得る。一致は、例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１を含む、公開された技術を使用して計算することができ、その各々は引用により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
そのため、用語「類似性」は、「同一性」に類似しているが、同一性とは対照的に、類似性は、同一の一致及び同類置換の一致の両方を指すために使用され得る。例えば、２つのポリペプチド配列が１０／２０の同一のアミノ酸を有しており、残部が全て非同類置換ならば、パーセント同一性及び類似性は、両方とも５０％になる。一方、同類置換がある５より多くの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％であり、パーセント類似性は７５％である。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、用語「実質的な配列同一性」は、デフォルトギャップペナルティを使用し、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を有する、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどにより、最適なアライメントを指すことができる。最重要の要因が多くの場合、システムにおける配列の機能であるため、同一性に関して「実質的な」ものにおける違いは、多くの場合、相当するパーセント類似性に従って変化することができる。用語「実質的なパーセント同一性」は、同じタンパク質のためにコードするためのヌクレオチドレベルでの参照の配列に十分に類似しているＤＮＡ配列、又は、比較がコード領域の対立形質の違いを許容できる同じ機能を実質的に有するタンパク質を指すために、使用することができる。同様に、用語は、最適に位置を調整した２つのポリペプチドの配列の比較に言及するために使用することができる。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、配列比較は、個別比較に役立つ任意の数のアミノ酸又は塩基を含む、アミノ酸又は塩基の「比較ウィンドウ」上の参照の配列に対して行われ得る。例えば、参照の配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。幾つかの実施形態において、比較ウィンドウは、少なくとも１０の残基又は塩基の位置、及び時には少なくとも１５−２０のアミノ酸又は塩基を含み得る。参照又は試験の配列は、例えば、１つ以上の欠失、置換、又は追加を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを表わし得る。
【０１１９】
用語「変異体」は、ペプチドがその結合特性を保持することを可能にする、ペプチドに対する修飾を指し、そのような変更は、限定されないが、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される同類置換；結合特性又は二次構造に対して最小の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は追加；リンカーの結合；例えば、官能基の追加などの翻訳後修飾を含む。そのような翻訳後修飾の例は、限定されないが、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、脂肪酸による修飾、ペプチド間のジスルフィド結合の形成、ビオチン化、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、及びそれらの組み合せなどのプロセスを通じて、以下に記載される修飾基の追加を含むことができる。実際、大半の実施形態において、ポリペプチドは、当業者に既知の、様々な修飾基のうちの何かにより修飾され得る。
【０１２０】
用語「保存的に修飾した変異体」、「保存的に修飾した置換」、及び「同類置換」は、幾つかの実施形態において交換可能に使用され得る。これらの用語は、保存的なアミノ酸置換を指すために使用され得、保存的なアミノ酸置換は、例えばバリンをイソロイシンに置換することなど、アミノ酸の類似の電荷密度、親水性／疎水性、大きさ、及び／又は配置によって置換されたアミノ酸である。比較すると、「非保存的に修飾した変異体」は、非保存的なアミノ酸置換を指し、非保存的なアミノ酸置換は、例えばバリンをフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）に置換すること等、アミノ酸の異なる電荷密度、親水性／疎水性、大きさ、及び／又は配置によって置換されたアミノ酸である。当業者は、同類置換を定義する複数の方法が存在し、これらの方法の何かが、本明細書で提供される教示と共に使用され得ることを認識するであろう。幾つかの実施形態において、例えば、以下の基の１つになる（ｆａｉｌｉｎｇ）アミノ酸が、同じ群になるアミノ酸によって置換される場合、置換は、保存的であると考慮され得る：親水性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、脂肪性（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ）、塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、及びスルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）（Ｃｙｓ）。本明細書に組み込まれる、Ｄａｙｈｏｆｆ，  ＭＯ．  Ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：８９−９９（１９７２）を参照する。幾つかの実施形態において、アミノ酸の置換は、保存的であると考慮され、ここで、置換の側鎖は、置換されたアミノ酸の側鎖に対して類似の生化学的な特性を有する。
【０１２１】
〈微生物システム−抗菌リグニン−由来の化合物〉
リグニン由来の化合物の抗菌活性は、本明細書で教示されるシステムによって扱われた主な問題である。例えば、典型的な産業上の発酵プロセスは、十分に特徴づけられた産業生産株である、微生物Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＫ１２又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＢ、又は酵母菌であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びこれらの微生物の組み換え型のバージョンを利用し得る。問題は、そのような産業上の微生物上の芳香族化合物の抗菌活性が、微生物に対して有毒であるということであり、リグニン由来の化合物の生体内変化に対する適用を打ち消す。
【０１２２】
前処理されたリグノセルロースのバイオマスに由来する、フェノール類のストリーム又は可溶性のリグニンストリームは、例えば、没食子酸、ヒドロキシメチルフルフラールアルコール、ヒドロキシメチルフルフラール、フルフラールアルコール、３，５−ジヒドロキシベンゾアート、フロン酸、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、ヒドロキシベンゾアート、ホモバニリン、シリンガ酸、バニリン、及びシリンガアルデヒドなどの、芳香族化合物及び非芳香族化合物を含み得る。抗菌剤である様々なリグニン由来の化合物が存在する。例えば、フルフラール、４−オキシベンズアルデヒド、シリンガアルデヒド、５−ヒドロキシメチルフルフラール、及びバニリンは、各々Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに対する抗菌活性を有すると知られており、組み合わせて存在する際に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに対する追加の抗菌活性を有し得る。更に、ベラトルムアルデヒド、珪皮酸、及びバニリン酸の各安息香酸誘導体、バニリルアセトン、並びにｏ−クマル酸、ｍ−クマル酸及びｐ−クマル酸の珪皮酸誘導体は、前処理されたリグノセルロースのバイオマスからのフェノール類のストリームの成分であり得る。ベラトルムアルデヒド、珪皮酸、及びバニリン酸の各安息香酸誘導体、バニリルアセトン、並びにｏ−クマル酸、ｍ−クマル酸及びｐ−クマル酸の珪皮酸誘導体は、各々、酵母菌であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対する著しい抗真菌活性を有しており、組み合わせて存在する際に、酵母菌であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対する追加の抗真菌活性を有し得る。
【０１２３】
以下のベンズアルデヒド誘導体の１つ以上は、前処理されたリグノセルロースのバイオマスからのフェノール類のストリームの中に存在し得る：２，４，６−トリヒドロキシベンズアルデヒド、２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２，３，４−トリヒドロキシベンズアルデヒド、２−ヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド、２，３−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシベンズアルデヒド、２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、及び２−ヒドロキシベンズアルデヒド。同様に、２，４，６−トリヒドロキシベンズアルデヒド、２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２，３，４−トリヒドロキシベンズアルデヒド、２−ヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド、２，３−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシベンズアルデヒド、２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、及び２−ヒドロキシベンズアルデヒドは、各々、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに対する抗菌活性を実証しており、組み合わせて存在する際、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに対する追加の抗菌活性を有し得る。
【０１２４】
〈微生物システム−適切な微生物〉
リグニン由来の化合物の抗菌活性は、反応環境においてそのような活性に耐性のある微生物の株の必要性を創出する。教示は、商品に対するリグニン由来の化合物の生体内変化のため芳香族化合物を自然に代謝することができる、組み換え型又は非組み換え型の微生物の種の同定を含む。
【０１２５】
前処理されたリグノセルロースのバイオマスからのフェノール類のストリームの生体内変化に特に適した微生物の種の幾つかの例は、限定されないが、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｓｐｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ａ１、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＳＹＫ−６、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｌａｓｋｅｎｅｓｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｓｐｏｒｕｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｉｖｏｒａｎｓ、及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉを含む。文献からのバイオインフォーマティックなデータ及び実験データの両方は、リグニン由来のオリゴマーを加水分解する酵素の発見、及びリグニンのコア構造の生体内変化のために、それらを関連する種にする、これらの株における芳香族化合物への広範囲な代謝活性の存在を明らかにする。任意の理論又は作用の機構に縛られることなく、これらの種は、例えば、ベンゾアート；アミノ−、フルオロ−、及びクロロ−ベンゾアート；ビフェニル；トルエン及びニトロトルエン；キシレン；アルキルベンゼン；スチレン；アトラジン；カプロラクタム；及び多環式芳香族炭化水素などの芳香族化合物の代謝を示す。
【０１２６】
微生物は、例えば、当業者に既知の方法を使用して、発酵槽で増殖することができる。バイオプロセシングにおいて使用される酵素は、微生物から得られ、それらは、細胞内、細胞外、又はその組み合せであり得る。そのため、酵素は、例えば、濾過又は遠心分離、蒸発、及び精製を含む、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞から回収することができる。幾つかの実施形態において、方法は、超音波又は機械装置を使用して宿主細胞を破壊して開ける工程を含み、例えば電気泳動を使用してタンパク質を精製した後、デブリを取り除き、タンパク質を抽出することができる。しかし、幾つかの実施形態において、教示は、リグニン由来の化合物に対する耐性を有する、組み換え型又は非組み換え型の微生物の使用を含む。リグニン由来の化合物に耐性のある微生物は、例えば、リグニン由来の化合物に直接関連する一方で、所望の酵素活性を有する、任意の組み換え型又は非組み換え型の酵素を発現するために、産業上で使用することができる。そのような活性は、例えば、ベータ−エーテラーゼ活性、Ｃ−アルファ−デヒドロゲナーゼ活性、グルタチオンリアーゼ活性、又はリグニン由来の化合物の生体内変化に役立つ他の酵素活性を含む。活性は、野生型であるか、又は例えば、トランスフェクション或いは形質転換などの当業者に既知の方法によりもたらされ得る。
【０１２７】
〈微生物システム−アゾトバクター株〉
本明細書の教示はまた、リグニンオリゴマーの加水分解のための新しいベータ−エーテラーゼ酵素を異種発現する、組み換え型アゾトバクター株の発見及び使用を対象としている。
【０１２８】
適切な微生物の発見に向けられた研究は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉが、本明細書で提供された教示に所望される、産業上関連する株の基準を持ち得ることを示した。幾つかの実施形態において、基準は、（ｉ）低コストで明確化された特定培地上での増殖、（ｉｉ）リグノセルロースの水解物における阻害剤に対する耐性、（ｉｉｉ）酸性のｐＨ及びより高温度に対する耐性、（ｉｖ）ペントースとヘキソースの糖の共同発酵、（ｖ）遺伝子発現ツールの遺伝学的な従順及び有用性、（ｖｉ）急速な世代時間、及び（ｖｉｉ）試験規模の発酵における成功した増殖パフォーマンスを含む。さらに、リグニンストリームの変換に対するＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉの潜在的な適合性に寄与する重要な生理的な特性は、芳香族化合物と生体外物質を代謝する能力を含む。さらに、産業廃棄物のストリームにおいてフェノール化合物に対する耐性を有することが示された。Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉのアノテートされたゲノム配列、及び酵素の形質転換並びに異種の発現のための遺伝子ツールの有用性は、例えば、リグニンストリームからの産業用の化学物質の高収率生成において、天然の形態における又は形質転換体としての機能に対するこの微生物の可能性に寄与する。
【０１２９】
教示はまた、ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法に向けられ、該方法は、（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合及び（ｉｉ）約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有する、リグニン由来の化合物と、本明細書で教示されるポリペプチドを接触させる工程を含み；ここで、該接触は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境において生じる。用語「接触させること」は、標的化合物と共に本明細書で教示される化合物などの薬剤を配置することを指し、この配置は、例えば、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）又はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で生じ得る。
【０１３０】
教示はまた、ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法に向けられ、該方法は、（ｉ）ベータ−アリールエーテル結合及び（ｉｉ）約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有する、リグニン由来の化合物と、本明細書で教示されるポリペプチドを接触させる工程を含み；ここで、該接触は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境において生じる。幾つかの実施形態において、リグニン由来の化合物は、約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンの分子量を有する。幾つかの実施形態において、溶媒環境は、水を含む。また、幾つかの実施形態において、溶媒環境は、極性有機溶媒を含む。
【０１３１】
教示はまた、リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするシステムに向けられ、該システムは、本明細書で教示されるポリペプチド、ベータ−アリールエーテル結合及び約１８０ダルトン乃至約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有する、リグニン由来の化合物；及び、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境を含み；ここで、該システムは、溶媒中でポリペプチドとリグニン由来の化合物を接触させることにより、ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能する。
【０１３２】
教示はまた、本明細書で教示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え型ポリヌクレオチドを対象としている。同様に、本教示はまた、ポリペプチドを発現するためにベクター又はプラスミドによって形質転換された宿主細胞と同様に、ポリヌクレオチドを含むベクター又はプラスミドを対象としている。
【０１３３】
教示はまた、ベータ−アリールエーテル結合を開裂する方法に向けられ、該方法は、（ｉ）本明細書で教示されるポリペプチドをもたらすのに適切な条件下で、本明細書で教示される宿主細胞を培養する工程；（ｉｉ）宿主細胞培地からポリペプチドを回収する工程；及び、（ｉｉｉ）ベータ−アリールエーテル結合及び約１８０ダルトンから約３０００ダルトンに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物と、請求項１のポリペプチドとを接触させる工程を含み；ここで、該接触は、リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒環境で生じる。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、又はＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ等のアゾトバクター株であり得る。また、幾つかの実施形態において、リグニン由来の化合物は、約１８０ダルトン乃至約１０００ダルトンの分子量を有することができる。
【０１３５】
教示はまた、リグニン由来の化合物をバイオプロセシングするためのシステムに向けられ、該システムは、（ｉ）本明細書で教示される形質転換された宿主細胞；（ｉｉ）ベータ−アリールエーテル結合及び約１８０ダルトンから約３０００ダルトンまでに及ぶ分子量を有しているリグニン由来の化合物；及び、（ｉｉｉ）リグニン由来の化合物が可溶性である溶媒を含み；ここで、該システムは、溶媒中でリグニン由来の化合物と本明細書に教示されるポリペプチドとを接触させることによって、ベータ−アリールエーテル結合を開裂するように機能する。
【実施例】
【０１３６】
以下の実施例は、限定しないが、本発明を示す。
【０１３７】
〈実施例１〉
可溶性リグニンサンプル上での微生物の増殖と代謝の研究を、リグニン由来の化合物に対する微生物の耐性を試験するために行った。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株の増殖を阻害することが知られている一連の芳香族化合物及び非芳香族化合物が、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株ＢＡＡ１３０３及びＡ．ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ株４４１２（ＥＢ  Ｆｒｅｄ）Ｘ−５０の増殖、耐性及び代謝能力を特徴づけるのに使用し得る。微生物株による様々な芳香族化合物及び非芳香族化合物の代謝は、活発に代謝している細胞による可溶性テトラゾリウム塩の還元に基づいた細胞の呼吸の機能として測定され得る。ＸＴＴ（２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド内塩、Ｓｉｇｍａ）を、呼吸している細胞により可溶性の紫ホルマザン化合物へと還元した。本研究において、Ｅ．ｃｏｌｉは陰性対照株として使用され得る。菌株を富栄養培地で飽和するまで増殖させることができ、洗浄し、培地のＯＤ６００ｎｍを測定した。４８ウェルのウェルの中に等しい数の細菌を接種し、０−５００ｍＭの範囲内である、増殖を低下させる（ａｓｉｎｇ）濃度の芳香族化合物及び非芳香族化合物をウェルに加え、最終的な容積を０．８ｍｌとした。２５−３７℃で振とうしながら２４−４８時間培養した後、ＸＴＴアッセイ・キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、試験化合物に曝露した時の増殖について、培地を試験した。培地サンプルを４８ウェル増殖プレートから取り除き、ＸＴＴ試薬が加えられるであろう９６ウェルアッセイプレート内で適切に希釈した。形成された可溶性ホルマザンを、４５０ｎｍの吸光度によって定量化する。４５０ｎｍでの増加した吸光度は、特定の試験化合物による株の増殖または生存、あるいはその代謝を示す。表３は、リグニン由来の化合物に対する微生物の耐性を試験するために使用することができる、いくつかの化合物の例を一覧表したものである。
【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
一連の試験されるリグニン化合物は、本明細書で提供された教示のうちのいずれにも拡大され得る。また、可溶性リグニンサンプル上での微生物の増殖及び代謝の研究は、クラフトリグニン及び生物精製所のリグニンのような実際の産業サンプルでも行われ得る。
【０１４０】
〈実施例２〉
本実施例は、本明細書中で提供される教示において使用するために、予想された酵素をどのように特定したかを示す。商業生産スケールにおける産業用微生物として一度もうまく異種発現できていないが、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓは、リグニン内のベータアリールエーテル結合の開裂において何らかの活性を持つ酵素を生産することが示されている。Ｍａｓａｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．を参照。従って、Ｍａｓａｉによって特定された、ベータエーテラーゼ活性を持つ二つの酵素、ｌｉｇＥ及びｌｉｇＦに対してＢＬＡＳＴ検索を行うことから、酵素発見の試みを始めた。同文献の要約を参照。表４は、最初のスクリーニングのためのＢＬＡＳＴ検索によって特定された遺伝子を一覧表にしたものである。
【０１４１】
【表４】
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【０１４２】
表４のヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
〈実施例３〉
本実施例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での既知及び推測のベータ−エーテラーゼをコードする遺伝子配列の異種発現のために、組み換え宿主細胞を調製する方法を記載する。Ｅ．ｃｏｌｉを、本実施例における酵素発見のために、代理で酵素を生産する宿主生物として使用する。新しい産業用宿主微生物であるＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉの構築を、下記に記載する。
【０１４４】
表３の受入番号を持つ遺伝子配列を、標準的なＰＣＲに基づくアセンブリ方法及び１０％閾値を持つＥ．ｃｏｌｉコドンバイアスを用いて、オリゴヌクレオチドからオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として直接合成した。端部配列は、制限消化のために及びＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ２４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングするために、アダプター（ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ）を含んだ。オリゴヌクレオチドを設計する間、内側のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩサイトをＯＲＦ配列から排除した。アセンブリした遺伝子をクローニングベクター（ｐＧＯＶ４）にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＨ３の化学的なコンピテントセルに形質転換し、精製したプラスミドＤＮＡからＤＮＡ配列を決定した。配列を確認した後、制限消化を使用してクローニングベクターから各ＯＲＦ断片を切り取り、ｐＥＴ２４ｂに前記配列をサブクローン化した。次に、ｌｉｇＥ及びｌｉｇＦを有するプラスミド全一式を、ベータ−エーテラーゼ発現及び生化学的活性試験のため宿主菌株としての役割を果たしたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【０１４５】
受入番号ＢＡＡ２０３２．１のＬｉｇＥは、本明細書において、タンパク質を配列番号１として、及び遺伝子を配列番号２として表に記載される。「最適化された」核酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換を容易にするために作製し、本明細書に配列番号９７７として表に記載する。
【０１４６】
受入番号ＡＢＤ２６４８１．１のＬｉｇＥ−１は、本明細書において、タンパク質を配列番号１０１として、及び遺伝子を配列番号１０２として表に記載される。「最適化された」核酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換を容易にするために作製し、本明細書に配列番号９７８として表に記載する。
【０１４７】
受入番号ＢＡＡ２０３１．１（Ｐ３０３４７．１）のＬｉｇＦは、本明細書において、タンパク質を配列番号５１３として、及び遺伝子を配列番号５１４として表に記載される。「最適化された」核酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換を容易にするために作製し、本明細書に配列番号９７９として表に記載する。
【０１４８】
受入番号ＡＢＤ２６５３０．１のＬｉｇＦ−１は、本明細書において、タンパク質を配列番号５３９として、及び遺伝子を配列番号５４０として表に記載される。「最適化された」核酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換を容易にするために作製し、本明細書に配列番号９８０として表に記載する。
【０１４９】
受入番号ＡＢＤ２７３０１．１のＬｉｇＦ−２は、本明細書において、タンパク質を配列番号５４１として、及び遺伝子を配列番号５４２として表に記載される。「最適化された」核酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換を容易にするために作製し、本明細書に配列番号９８１として表に記載する。
【０１５０】
受入番号ＡＢＤ２７３０９．１のＬｉｇＦ−３は、本明細書において、タンパク質を配列番号５４５として、及び遺伝子を配列番号５４６として表に記載される。「最適化された」核酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換を容易にするために作製し、本明細書に配列番号９８２として表に記載する。
【０１５１】
〈実施例３〉
本実施例は、ベータ−エーテラーゼ生化学的アッセイと同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ内での遺伝子発現の方法を記載する。最終濃度０．１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を用いて遺伝子発現を誘導することにより、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地中の本明細書記載の組み換えＥ．ｃｏｌｉ菌株の５ｍｌ培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）を使用して、既知及び推測のベータ−エーテラーゼ遺伝子の発現を行った。誘導及び細胞を集積した後、超音波処理またはＢＰＥＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞溶解システムを用いて前記細胞を破壊した。
【０１５２】
モデルリグニン二量体化合物α−Ｏ−（β−メチルウンベリフェリル）アセトバニロン（ＭＵＡＶ）である蛍光基質上のベータ−エーテラーゼ活性のためのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生化学アッセイにおいて、浄化した細胞抽出物を試験した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭグルタチオン、０．０５ｍＭまたは０．１ｍＭ  ＭＵＡＶ、及び反応を開始させるために使用する１０μｌの浄化した細胞抽出物を含む合計容積２００μｌ中でインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）反応を行った。室温で２．５時間インキュベーションした後、１５０μｌの３００ｍＭグリシン／ＮａＯＨバッファー  ｐＨ９を使用して、５０μｌの反応サンプルの反応を終了させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｐｅｃｔｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いたλｅｘ＝３６０ｎｍ及びλｅｍ＝４５０ｎｍの蛍光の増加によって、アリールエーテル結合の加水分解による４  メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の形成を監視した。
【０１５３】
タンパク質定量のためのＢＣＡ試薬システム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、細胞溶解物の合計タンパク質濃度を測定した。
【０１５４】
誘導は、０．０１−１ｍＭの範囲内でのＩＰＴＧ濃度を使用して行っても良い。細胞の破壊は、トルエン易透化、フレンチプレス技術、またはリゾチームとともに凍結／解凍の繰り返しを使用して行っても良い。アッセイ条件は、１０−１５０ｍＭ濃度及び６．５−８．５の範囲のｐＨであるＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０−２ｍＭのジチオトレイトール、０．０５−２ｍＭグルタチオン、０．０１−５ｍＭ  ＭＵＡＶ、２２−４２℃の反応温度を含むように変化し得る。生化学アッセイを、酵素反応速度パラメータを取り出すために５分から１２時間の反応時間を備えた固定された時点のアッセイ（ｆｉｘｅｄ  ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ  ａｓｓａｙ）で行っても良く、グリシン／ＮａＯＨバッファーでクエンチすることなく続けて行っても良い。
【０１５５】
〈実施例４〉
本実施例は、新しく発見されたベータ−エーテラーゼ酵素の試験された生化学的活性を記載する。
【０１５６】
図４は、幾つかの実施形態に従った、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓの陽性対照ポリペプチド、及びＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓの推測ベータ−エーテラーゼポリペプチドに関する、ベータ−エーテラーゼ機能のための生化学的活性のアッセイからの、予測されない結果を示す。Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのｌｉｇＥ遺伝子生成物に比べてＮ．ａｒｏｍｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ由来の推測ｌｉｇＥ１遺伝子生成物が非常に高いベータ−エーテラーゼ活性を示したことは、酵素発見計画において完全に予想外の結果だった。
【０１５７】
０．１ｍＭ  ＭＵＡＶ基質を含む反応物中で、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのｌｉｇＥ１タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物は、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのｌｉｇＥタンパク質の７ｒｆｕ／ｕｇに比べて、５２９ｒｆｕ／ｕｇの合計活性を得た。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓ由来の新しく発見されたベータ−エーテラーゼは、以前記載されたＳ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ｌｉｇＥベータ−エーテラーゼ酵素よりも約７５倍効果的である。高効率な新しいベータ−エーテラーゼは、バイオテクノロジーのプロセスにおいてリグニンアリールエーテルを単量体に変換する生体触媒として理想的に適合する。
【０１５８】
Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのＬｉｇＦ配列と同一性を持つ３つの新しいＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓのポリペプチドが、ＭＵＡＶ基質上でベータ−エーテラーゼ活性を示すと見出されたことも驚くべきことだった。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ由来の３つの推測ｌｉｇＦ遺伝子生成物全てがベータ−エーテラーゼ活性を示した一方、ＬｉｇＦ２ポリペプチドは、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのＬｉｇＦタンパク質よりも約２倍効果的である。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２タンパク質は、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのＬｉｇＦタンパク質の５５８ｒｆｕ／ｕｇに比べて、１２０６ｒｆｕ／ｕｇの合計活性を得た。
【０１５９】
このように、酵素発見計画において予想外に及び驚くべきことに、ベータ−エーテラーゼ活性を持つＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓ由来の四つの（４）新しいポリペプチドを生成した。リグニン由来の化合物の完全な単量体への分解を触媒するのに、これらの酵素一式は大きな可能性を示す。この結果は、少なくとも以下の理由で予想外及び驚くべきものであった。
【０１６０】
ベータ−エーテラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする四つの（４）新しい遺伝子配列が、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓから発見された。これらの配列はＡＢＤ２６８４１．１（配列番号１０１）、ＡＢＤ２６５３０．１（配列番号５３９）、ＡＢＤ２７３０１．１（配列番号５４１）及びＡＢＤ２７３０９．１（配列番号５４５）のＧｅｎＢａｎｋ番号を持つ。
【０１６１】
特に（ｉ）異なる種におけるＬｉｇＥとして知られているもののみを有すること、（ｉｉ）ＬｉｇＦに対する活性酵素として知られているもの、（ｉｉｉ）発見されたこのような活性の予想外の範囲、という観点から、推測酵素を特定するのを助けるのに使用されたバイオインフォマティックスによる選択は、生化学的な活性の的確な予測の判断材料ではないことを当業者は認識するであろう。よって、機能の試験を、一連のＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓ推測ベータ‐エーテラーゼ遺伝子上で実験的に行わなければならない。
【０１６２】
Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのＬｉｇＥ及びＬｉｇＦタンパク質に対して配列を有する比較的低いレベルの同一性（３７％−６２％）を考慮すると、４つのＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのポリペプチド全てがベータ−エーテラーゼ活性を持つことが完全に驚きであることを当業者は認識するであろう。
【０１６３】
Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ由来の対応するＬｉｇＥ及びＬｉｇＦを超える、改善された活性を持つＮ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓ由来の２つの新しいベータ−エーテラーゼを発見したことが、完全に予想外であることも当業者は認識し、この素晴らしい発見はさらなる産業的利用のための酵素開発の基盤を提供する。
【０１６４】
〈実施例５〉
本実施例は、発見計画において推測酵素のプールを特定するためのバイオインフォマティクスの広範な使用を記載する。上述の通り、特に（ｉ）異なる種におけるＬｉｇＥとして知られているもののみを有すること、（ｉｉ）ＬｉｇＦに対する活性酵素として知られているもの、（ｉｉｉ）発見されたこのような活性の予想外の範囲、という観点から、推測酵素を特定するのを助けるのに使用するバイオインフォマティックスによる選択は、始めは生化学的な活性の的確な予測の判断材料ではない。既知の活性酵素が追加することによって、ＬｉｇＥ型及びＬｉｇＦ型酵素の両方の推測酵素のプールを特定するためのバイオインフォマティクスの有効性を高めるために使用できる、より多くの情報が提供される。
【０１６５】
新しく発見されたベータ−エーテラーゼの機能相関に対する配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ）を分析し、特定した。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ及びＬｉｇＦポリペプチドについて、機能ドメイン、重要な触媒残基及び配列のアライメントのバイオインフォマティック調査を行った。任意の理論または作用の機構に縛られることない一方、調査の論拠及び重要な結果は少なくとも以下を含んでいる。
【０１６６】
機能ドメインの特定
【０１６７】
図４に示すように、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのＬｉｇＥ及びＬｉｇＦタンパク質と比較して、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１及びＬｉｇＦ２ポリペプチド配列についてベータ−エーテラーゼ活性の高いレベルを発見した。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１及びＬｉｇＦ２ポリペプチド配列を、ＧｅｎＢａｎｋ中の保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）を使用した機能ドメインの特定のための問い合わせ配列として使用した。
【０１６８】
Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチドを、ＧＳＴ＿Ｃファミリーと類似した、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−様タンパク質及びベータ−エーテラーゼＬｉｇＥサブファミリーとしてアノテートする。ＬｉｇＥサブファミリーは、還元グルタチオン（ＧＳＨ）を反応中の水素ドナーとして利用し、低分子量リグニンに存在するベータ−アリールエーテル連結の開裂を触媒するＧＳＴ−様タンパク質であるＳ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのベータ−エーテラーゼＬｉｇＥに類似したタンパク質で構成される。ＧＳＴフォールドは、Ｎ末端チオレドキシン−フォールドドメイン及びＣ末端アルファヘリックスドメインを含み、活性サイトは、二つのドメインの間の裂け目に位置する。
【０１６９】
表５はいくつかの実施形態に従って、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチド（ＡＢＤ２６８４１．１）内の保存ドメイン及び必須なアミノ酸残基を記載する。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチド内でアノテートされた三つの（３）保存された機能ドメインは：ｉ）二量体界面、ｉｉ）Ｎ末端ドメイン、ｉｉｉ）リグニン基質結合ポケットあるいはＨサイトである。このような実施形態の機能ドメインを定義するアミノ酸残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチドの残基９８−２２１である。
【０１７０】
表５はまた、いくつかの実施形態に従って、保存された触媒活性及び触媒活性に必須なもの（表５の欄３）としての十五の（１５）アミノ酸残基を表に記載する。これらはＫ１００；Ａ１０１；Ｎ１０４；Ｐ１６６；Ｗ１０７；Ｙ１８４；Ｙ１８７；Ｒ１８８；Ｇ１９１；Ｇ１９２；Ｆ１９５；Ｖ１１１；Ｇ１１２；Ｍ１１５；Ｆ１１６を含む。任意の理論または作用の機構に縛られることのない一方で、これらの残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチドに関して発見された、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのｌｉｇＥポリペプチドと比較して高いベータ−エーテラーゼ活性の原因であると思われる。
【０１７１】
このような実施形態において、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチドの重要なアミノ酸残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１ポリペプチドの触媒機能を保つまたは改善するような、保守的に、及び、一つずつまたは類似のアミノ酸残基と組み合わせて、変わっても良い。必須な位置に組み込まれ得るこのような代わりの残基の例を、表５の欄４にも示す。
【０１７２】
【表５】
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【０１７３】
Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチドを、広い範囲の生体異物物質とグルタチオンの結合を触媒するＧＳＴ＿Ｃファミリーと類似の、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）‐様タンパク質としてアノテートする。
【０１７４】
表６は、いくつかの実施形態に従って、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチド（ＡＢＤ２７３０１．１）の保存ドメイン及び必須なアミノ酸残基を記載する。Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチドでアノテートされた三つの（３）保存された機能ドメインは、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥポリペプチドについて記載されたものに類似しており、ｉ）二量体界面、ｉｉ）Ｎ末端ドメイン、ｉｉｉ）基質結合ポケットまたはＨサイトを含む。このような実施形態において、機能ドメインを定義するアミノ酸残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチド中の９９−２３０残基である。
【０１７５】
表６は、いくつかの実施形態に従って、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチドの保存された触媒活性及び触媒活性に必須なものとしての十六の（１６）アミノ酸残基（表６の欄３）も表に記載する。これらは、Ｒ１００；Ｙ１０１；Ｋ１０４；Ｋ１７６；Ｄ１０７；Ｌ１９４；Ｉ１９７；Ｎ１９８；Ｓ２０１；Ｍ２０６；Ｍ１１１；Ｎ１１２；Ｓ１１５；Ｍ１１６；Ｍ２０６；Ｈ２０２を含む。任意の理論または作用や機構に縛られることのない一方で、これら１６の残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチドについて発見された、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓのＬｉｇＦポリペプチドと比較して高いベータ−エーテラーゼ活性の原因であるように思われる。
【０１７６】
このような実施形態において、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチドの必須なアミノ酸残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２ポリペプチドの触媒機能を保つまたは改善するような、保守的に、及び、一つずつまたは類似のアミノ酸残基と組み合わせて、変わっても良い。重要な位置に組み込まれ得るこのような代わりの残基の例を、表６の欄４にも示す。
【０１７７】
【表６】
2014506115.tif 000010
【０１７８】
追加の機能ドメインの特定
【０１７９】
所望の活性をもたらし得るタンパク質構造をさらに理解するために、バイオインフォマティックスの方法を使用した。まず、ＬｉｇＥ１及びＬｉｇＦ２を一緒に分析した。ＧｅｎＢａｎｋ内のＢＬＡＳＴ−Ｐプログラム、ＰｒｏＤｏｍ及びＰｒａＬｉｎｅプログラムを使用し、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのｌｉｇＥ１（ＡＢＤ２６８４１．１）及びｌｉｇＦ２を用いてアミノ酸配列アライメントを行った。全長配列アライメントは、例えば＜７０％の同一性のように、比較的低い同一性のヒット（ｈｉｔ）を得た。
【０１８０】
次に、ＬｉｇＥ１及びＬｉｇＦ２の領域を、ＧＥＮＢＡＮＫ内で独立して分析した。ＬｉｇＥ１では、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのｌｉｇＥ１由来の以下の問い合わせ配列、「ｔｉｓｐｆｖｗａｔｋｙａｌｋｈｋｇｆｄｌｄｖｖｐｇｇｆｔｇｉｌｅｒｔｇｇ」（配列番号１０１の１９−５４残基）を用いて、ＧＥＮＢＡＮＫ内のデータベースに対してアライメントを行った。ＢＬＡＳＴにより、チオレドキシン（ＴＲＸ）フォールドを含むタンパク質のＴＲＸ‐様スーパーファミリーと高い同一性を持つ、少なくとも３つの対象配列を得られた。多くのメンバーが酸化還元活性なＣＸＸＣモチーフとともに標準的なＴＲＸドメインを含む。
【０１８１】
任意の理論または作用の機構に縛られることなく、それらは、その活性サイトジチオールの可逆的な酸化を通して標的タンパク質の還元状態を変えるタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＰＤＯ）として機能すると思われる。このスーパーファミリーのＰＤＯメンバーは、ＴＲＸ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ｔｌｐＡ、グルタレドキシン、ＮｒｄＨレドキシン、及び細菌性Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ，ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ，ＤｓｂＥ、ＤｓｂＤガンマ）のファミリーを含む。ＰＤＯとして機能しないがＴＲＸ‐フォールドドメインを含む前記スーパーファミリーのメンバーは、とりわけフォスズシン、ペルオキシレドキシン、グルタチオン（ＧＳＨ）ペルオキシダーゼ、ＳＣＯタンパク質、ＧＳＨトランスフェラーゼ（ＧＳＴ，Ｎ−末端ドメイン）、ヒ素レダクターゼ、ＴＲＸ‐様フェレドキシン及びカルセケシトリンを含む。
【０１８２】
表７は、ＬｉｇＥ−１（配列番号１０１）の残基１９−５４に対して高い同一性（＞８０％）を持つ３つの対象配列を記載する。幾つかの実施形態において、これらの配列は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのｌｉｇＥ１ポリペプチドについて、発見されたものに類似した触媒機能に必須であると思われる。
【０１８３】
【表７】
2014506115.tif 000011
【０１８４】
表７のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
同様に、ＬｉｇＦ２では、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのｌｉｇＦ２（ＡＢＤ２７３０１．１）由来の「ａｉｎｐｅｇｑｖｐｖｌ」（配列番号５４１の残基４７−５７）及び「ｉｉｔｈｔｔｖｉｎｅｙｌｅｄ」（配列番号５４１の残基６３−７６）の二つの問い合わせ配列を用いて、ＧＥＮＢＡＮＫ内のデータベースに対する別々のアライメントを行い、ＧＳＴ−Ｎスーパーファミリーのタンパク質と高い同一性を持つ複数の対象配列を得た。任意の理論または作用の機構に縛られることなく、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのｌｉｇＦ２ポリペプチドのＮ末端領域（配列番号５４１の残基４３−７５）をＣＤＤ中でアノテートし、以下を包含する。
【０１８６】
ｉ．ＧＳＴ−Ｎファミリーのタンパク質のタンパク質三次構造を形成するにあたり、Ｃ末端界面と接触すると思われるＮ末端残基；
【０１８７】
ｉｉ．ポリペプチドの二量体化に関わっていると思われるＮ末端残基；及び
【０１８８】
ｉｉｉ．グルタチオン基質への結合に関わっていると思われる残基。
【０１８９】
表８は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２照会配列の残基４７−５７との同一性パーセント及び類似性を提供する。
【０１９０】
【表８】
2014506115.tif 000012
【０１９１】
表８のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
表９は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのＬｉｇＦ２問い合わせ配列の残基６３−７６との同一性及び類似性のパーセントを提供する。
【０１９３】
【表９】
2014506115.tif 000013
【０１９４】
表９のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
バイオインフォマティクスは、試験候補を特定するのを助けることのできる、タンパク質構造に関する価値のある情報を提供する。例えば、ＬｉｇＥ１は、９８−２２１領域を持っており、９８−２２１領域は結合及び活性の構成要素と同じくらい潜在的に重要なデータベースにおいて、及び一般的に結合及び触媒に関わるとアノテートされる。任意の理論または作用の機構に縛られることのない一方で、活性サイトの構造の可変性は、基質の構造の可変性を反映している。同様に、バイオインフォマティクスを用いたさらなる研究の上で、メンバー間でより多くの保存を有している一方で、１９−５４領域はレダクターゼ機能の構成要素として潜在的に重要であり、ゆえに９８−２２１領域に加えた触媒に潜在的に重要な第二の領域としてのデータベースにおいてアノテートされる。
【０１９６】
菌株の各ファミリー内の高性能なタンパク質を見つけるのを助けるであろう追加の構造情報を得ることは、当業者に方法論が知られているという点で、教示の範囲内である。あらゆる研究技術が当業者に知られている。モチーフ検索等バイオインフォマティクスの方法は、追加の構造情報を得る１つの方法の例である。プロフィール分析としても知られるモチーフ検索は、問い合わせ集合（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｔ）内の配列との間の短い保存された配列モチーフをアラインすることを試みる、広範囲に及ぶ複数の配列のアライメント（ｇｌｏｂａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を構築する。これは例えば、まず本明細書で教示され、かつプロフィールマトリックス一式を構築するのに使用されるものに類似する方法で、よく保存された領域が分離した後、一般的な広範囲に及ぶ複数の配列のアライメントの構築を最初にすることによって行うことができる。プロフィールマトリックスは重みマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）と同じように配置されるが、各位置の各アミノ酸またはヌクレオチドの頻度数は、より多くの一般的な経験分布ではなく、むしろ保存された領域の特性分布に由来する。プロフィールマトリックスを、その後特徴づけたモチーフの発生に関する、他の配列を検索するために、そのプロフィールマトリックスを使用する。
【０１９７】
ＬｉｇＥ−１及びＬｉｇＦ−２を、ＬｉｇＥ型及びＬｉｇＦ型の他のポリペプチドの構造とそれぞれ比較することで、さらに試験した。表１０Ａは、ＬｉｇＥ及びＬｉｇＥ−１のポリペプチド配列の間で保存された残基を示し、表１０Ｂは、ＬｉｇＦ及びＬｉｇＦ−２のポリペプチド配列の間で保存された残基を示す。
【０１９８】
【表１０Ａ】
2014506115.tif 000014
【０１９９】
見ての通り、ＬｉｇＥ型ファミリー内のＬｉｇＥ及びＬｉｇＥ−１の間には、高度の種間類似性が存在する。ＬｉｇＥ残基は、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ（ＢＡＡ０２０３２．１）に由来し、ＬｉｇＥ−１残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｖｏｒａｎｓのＬｉｇＥ１（ＡＢＤ２６８４１．１）に由来する。番号付けは、ＰＲＡＬＩＮＥアライメントファイル内のＳ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ配列（ＢＡＡ０２０３２．１）に従って行った（ギャップは含まれていない）。
【０２００】
【表１０Ｂ】
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見ての通り、ＬｉｇＦ型ファミリー内のＬｉｇＦ及びＬｉｇＦ−２の間の種間類似性はあまりない。ＬｉｇＦ残基は、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ（ＢＡＡ０２０３２．１）に由来し、ＬｉｇＦ−２残基は、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｖｏｒａｎｓ（ＡＢＤ２７３０１．１）に由来する。番号付けは、ＰＲＡＬＩＮＥアライメントファイル内のＳ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ配列（ＢＡＡ０２０３２．１）に従って行った（ギャップは含まれていない）。
【０２０１】
〈実施例６〉
本実施例は、アッセイの２番目のラウンドに追加的な配列を提供し、その配列は、タンパク質のＧＳＴ＿Ｃファミリーについて本明細書に記載されている３つの保存された機能ドメインを含んでおり、また、ベータ−エーテラーゼ  ＬｉｇＥサブファミリーに属する。表１１は、問い合わせとして、アミノ酸レベルでＳ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＬｉｇＥ配列（Ｐ２７４５７．３）を使用してＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースで特定した、５１％−７３％の同一性を有する、九（９）つの追加的な配列を表に記載する。バイオインフォマティックな情報は、これら９つの配列が、本明細書に記載されている方法を使用する、所望の生化学的な機能についての合成、クローニング、発現及び試験の次のラウンドに対する優れた候補であることを示唆する。
【０２０２】
【表１１】
2014506115.tif 000016
【０２０３】
表１１のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
〈実施例７〉
本実施例は、Ｃ  アルファ−デヒドロゲナーゼ、ベータ−エーテラーゼ及びグルタチオン除去酵素の作用によって、どのように天然のリグニンコア構造を加水分解することができるか記載する。
【０２０５】
図５は、いくつかの実施形態に従って、天然のリグニン構造を代表する基質として試験される、ベータ−アリールエーテル化合物を示す。新規ベータ−エーテラーゼ酵素の特定におけるモデル基質として、ＭＵＡＶを使用した一方、ベータ−アリールエーテル結合及び代表的な天然のリグニン構造を含む芳香族化合物の二量体及び三量体に対する、ベータ−エーテラーゼの基質特異性を評価するために、図５に示されるような追加的なアリールエーテル化合物を使用し得る。分子量２０００未満の高次オリゴマーを、同様に合成及び試験し得る。蛍光の基質ＭＵＡＶに関しては、カスタム有機合成によって化合物を得てもよい。
【０２０６】
図６は、いくつかの実施形態に従って、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓによるグアヤシルグリセロール−β−グアヤシルエーテル（ＧＧＥ）代謝の経路を示す。天然のリグニンコア構造を加水分解するために、ＬｉｇＥ／Ｆ−様  ベータ−エーテラーゼに加えて、酵素が必要とされ得る。モデルβ−アリールエーテルを配合するグアヤシルグリセロール−β−グアヤシルエーテル（ＧＧＥ）は、ヒドロキシル、アリルエーテル及びメトキシの機能性を含む天然のリグニン中に存在する、主要な化学連結を含有すると考えられる。ＧＧＥのリグニン単量体ベータ−ヒドロキシプロピオバニロン（ベータ−ＨＰＶ）への生体内変化は、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓに関して部分的に理解され、段階的な方法で３つの別々の酵素の作用を介して生成されることを提示した。ｌｉｇＤ遺伝子生成物は、ＧＧＥをα−（２−メトキシフェノキシ）−β−ヒドロキシプロピオバニロン（ＭＰＨＰＶ）に酸化させる、Ｃ  アルファ−デヒドロゲナーゼをコード化し；ｌｉｇＥ及びｌｉｇＦ遺伝子生成物のベータ−エーテラーゼ活性により、ＭＰＨＰＶのエーテル結合が切断され、リグニン単量体グアイアコール、及びα−グルタチオニルヒドロキシプロピオバニロン（ＧＳ−ＨＰＶ）をそれぞれ得る。ｌｉｇＧ遺伝子生成物は、ＧＳ−ＨＰＶからグルタチオンの除去（ＧＳＨ）を触媒する、グルタチオン（ＧＳＨ）−除去グルタチオンＳトランスフェラーゼをコード化し、リグニンヒドロキシプロピオバニロン（ＨＰＶ）を得る。
【０２０７】
本明細書に記載されている、ＬｉｇＥとＬｉｇＦのポリペプチド、又は類似したポリペプチドは、天然のリグニン構造を加水分解するのに十分かもしれない一方、産業的応用のための新しいＣ  アルファ−デヒドロゲナーゼ（Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＬｉｇＤホモログ）及びグルタチオン（ＧＳＨ）除去グルタチオンＳトランスフェラーゼを発見するのに有用である。酵素発見計画は、本明細書に記載されているものに類似した方法によって行なわれてもよい。リグニンの基質、中間物及び生成物の生化学反応の検出を、濾過及び基質と生成物の酢酸エチルに抽出した後に測定してもよい。メタノールと水の勾配溶剤系（ａ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）により発達したＣ１８カラムを用いる、逆相ＨＰＬＣ条件を使用して、基質と生成物を分離し、２３０ｎｍ又は２５４ｎｍで検出した。
【０２０８】
表１２は、限定されないが、ＬｉｇＥ／Ｆを含むβ−エーテラーゼと併用するための、ＬｉｇＤ−型である、潜在的なＣ  アルファ−デヒドロゲナーゼポリペプチド配列を表に記載する。本明細書に記載されたような生化学的方法を使用して、配列を特定した。これらのＣ  アルファ−デヒドロゲナーゼを、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ）としてＣＤＤにおいて分類され、またそれらは、構造上保存されたロスマンフォールド（ｃｅｎｔｒａｌ  ベータ−シートを有する、アルファ／ベータフォールディングパターン）、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）−結合領域、及び構造上多様なＣ末端領域を有する単一ドメインを持つ、オキシドレダクターゼの機能的に多様なファミリーである。標準的なＳＤＲは、典型的に約２５０残基の長さである一方で、伸長したＳＤＲは、およそ３５０残基の長さである。異なるＳＤＲ酵素間の配列同一性は、典型的には１５−３０％の範囲であるが、その酵素は、ロスマンフォールドＮＡＤ結合モチーフ、特徴的なＮＡＤ結合及び触媒性の配列パターンを共有している。
【０２０９】
任意の理論又は作用の機構に縛られることなく、これらの酵素は、ステロイド、補助因子、炭水化物、脂質、芳香族化合物及びアミノ酸の代謝、及びレドックスセンシングでの作用を含む広範囲の活性を触媒すると考えられる。標準的なＳＤＲは、重要な触媒性の残基（Ｔｙｒ−１５１、ヒトプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤＨ）による番号付け）として役割を果たす活性サイトのＴｙｒ残基モチーフを備えた、ＴＧＸＸＸ［ＡＧ］ＸＧ補助因子結合モチーフ及びＹＸＸＸＫ活性サイトモチーフを有している。ＴｙｒとＬｙｓに加えて、多くの場合、活性サイトに寄与する、上流のＳｅｒ（Ｓｅｒ−１３８、ＰＧＤＨによる番号付け）及び／又はＡｓｎ（Ａｓｎ−１０７、ＰＤＧＨによる番号付け）が存在し；他方、基質結合はＣ末端領域にあり、特異性を決定する。
【０２１０】
任意の理論又は作用の機構に縛られることなく、標準的な反応メカニズムは、保存されたＴｙｒとＬｙｓ、Ａｓｎによって安定した水分子、及びニコチン酸アミドに伴う、４−ｐｒｏ−Ｓ  水素移動及びプロトンリレーであると考えられる。伸長したＳＤＲは、Ｃ末端領域に追加の要素を有しており、典型的にはＴＧＸＸＧＸＸＧ補助因子結合モチーフを有している。脂肪酸シンターゼのケトレダクターゼドメインなどの複合体（マルチドメイン）ＳＤＲｓは、ＧＧＸＧＸＸＧ  ＮＡＤ（Ｐ）−結合モチーフ及び変更された活性サイトモチーフ（ＹＸＸＸＮ）を有し得る。真菌タイプのケトアシルレダクターゼは、ＴＧＸＸＸＧＸ（１−２）Ｇ  ＮＡＤ（Ｐ）−結合モチーフを有しうる。いくつかの典型的でないＳＤＲは、失った触媒能力を有しており、及び／又は、異常なＮＡＤ（Ｐ）−結合モチーフ及び欠損した、あるいは異常な活性サイト残基を有していると考えられる。ＳＤＲファミリー内で触媒された反応は、異性化、脱炭酸、エピマー化、Ｃ＝Ｎ結合還元、脱水酵素活性、脱ハロゲン化、エノイル−ＣｏＡ還元及びカルボニル−アルコール酸化還元を含みうる。
【０２１１】
【表１２】
2014506115.tif 000017
【０２１２】
表１２のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
表１３は、限定されないが、ＬｉｇＥ／Ｆを含むベータエーテラーゼと併用するための、潜在的なＬｉｇＧ（グルタチオン−除去）−様酵素配列を表に記載する。本明細書に記載されたようなバイオインフォマティックな方法を使用して、配列を特定した。これらは、Ｃ−アルファデヒドロゲナーゼ、及び／又は、ＬｉｇＥ／Ｆ−様ベータ−エーテラーゼと併用してもよい。ＴＲＸフォールドを含むタンパク質の、ＧＳＴ＿Ｃファミリー、ＧＳＴ−Ｎファミリー、及びチオレドキシン（ＴＲＸ）−様スーパーファミリーと類似性を有する、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−様タンパク質として、ＬｉｇＧ−ｌｉｋｅ  タンパク質をＣＤＤにおいてアノテートした。
【０２１４】
【表１３】
2014506115.tif 000018
【０２１５】
表１３のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を通じて、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
〈実施例８〉
本実施例は、リグニンオリゴマーの単量体への変換のための、新規組み換え微生物システムの創出を記載する。例えば、産業的プロセスで高収率にリグニンオリゴマーを単量体に変換することができるリグニンフェノール耐性Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株を創出する目的を有する、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｏｖｏｒａｎｓのベータ−エーテラーゼをコード化する遺伝子を用いてＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株  ＢＡＡ−１３０３  ＤＪに形質転換してもよい。表１４は、ベータ−エーテラーゼ遺伝子発現のために宿主株として使用してもよい、追加のＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株を、例えば、それらの株表示及びアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号によって表に記載する。
【０２１７】
【表１４】
2014506115.tif 000019
【０２１８】
本明細書に記載されている発現プラスミドシステムを使用して、ベータ−エーテラーゼ、Ｃα−デヒドロゲナーゼ、及びＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ内でのリグニン単量体と芳香族生成物の生産のためのその他の酵素の異種生産を達成してもよい。ストレプトマイシン耐性をコード化している、広範囲の宿主域（ｂｒｏａｄ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ）のマルチコピープラスミドｐＫＴ２３０（ＡＴＣＣ）を、遺伝子クローニングに使用してもよい。遺伝子は上記記載の方法によって合成することができ、またｐＫＴ２３０のＳｍａＩサイトへクローン化することができる。Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株ＢＡＡ  １３０３  ＤＪからのｎｉｆＨプロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用することができる。
【０２１９】
エレクトロコンピテントセルのエレクトロポレーション（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ法）を使用するｐＫＴ２３０誘導体を用いて、又はＴＦ培地で化学的に調製されたコンピテントセル（１リットル当たり、１．９７１８ｇのＭｇＳＯ４、０．０１３６ｇのＣａＳＯ４、１．１ｇのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４、１０ｇのグルコース、０．２５ｇのＫＨ２ＰＯ４及び０．５５ｇのＫ２ＨＰＯ４）を用いるプラスミドＤＮＡのインキュベーションによって、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株ＢＡＡ  １３０３  ＤＪを形質転換してもよい。形質転換体は、ストレプトマイシンに対する耐性でスクリーニングによって選択されてもよい。無窒素バーク培地下（微量のＦｅＣｌ３及びＮａ２ＭｏＯ４とともに、１リットル当たり０．２ｇのＭｇＳＯ４、０．１ｇのＣａＳＯ４、０．５ｇの酵母抽出物、２０ｇのスクロース、０．８ｇのＫ２ＨＰＯ４、また０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４）での細胞増殖によって、遺伝子発現を誘導してもよい。
【０２２０】
Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ株ＢＡＡ  １３０３  ＤＪで機能的に発現された、新たに発見されたベータ−エーテラーゼ酵素の生物化学的活性は、本明細書で提供されているような、当業者にとって既知の方法を使用して試験してもよい。ベータ−エーテラーゼの機能及び総タンパク質のアッセイは、本明細書に記載されているように行われてもよい。
【０２２１】
〈実施例９〉
本実施例は、リグニンコア構造からの価値の高い芳香族化合物の生成のための組み換えアゾトバクター株の異種発現酵素の設計及び使用を記載する。表１５は、本明細書に記載されている微生物のプラットフォームによって生成されてもよい芳香族化合物の少しの例を表に記載する。
【０２２２】
【表１５】
2014506115.tif 000020
【０２２３】
市販の芳香族化合物に対する微生物プロセスの１つの例は、リグニン由来のフェノール化合物からのカテコールの生成であってもよい。ベータ−エーテラーゼとデメテラーゼを含む酵素、又はデメテラーゼ酵素のみで設計したＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ又はＡ．ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ株を使用するグアイアコールから、カテコールを生成してもよい。アゾトバクター株を、異種の酵素を発現させるために、本明細書に記載されている方法によって設計してもよい。
【０２２４】
図７は、いくつかの実施形態に従い、リグニンオリゴマーからのカテコールの生成のための生化学的プロセスの例を示す。カテコールなど芳香族生成物に至る生化学的プロセスは、以下に記載の３つの単位の操作として設計されてもよい：
【０２２５】
ｉ）  可溶性リグニンの画分  −  当業者に既知の方法を使用した、可溶性の生物精製所リグニンの分画又はフェノールストリームの濃縮又は部分精製。
【０２２６】
ｉｉ）  生体内変化  −  特異的にかつ最適に、特異的なリグニン由来のフェノール基質をカテコールなどの最終生成物に転換するように設計されたアゾトバクター株を使用した流加回分（フェドバッチ）バイオプロセス中で、フェノール基質ストリームの生体内変化を実行してもよい。コーンスティープリカーを、生体内変化において使用される基礎培地として使用してもよい。株による耐性があるであろう濃度で、流加回分（フェドバッチ）モードでフェノールストリームを導入してもよい。
【０２２７】
ｉｉｉ）  生成物分離  −  後に続く方法に適用される極性が変化する溶媒を用いて、液−液抽出（ＬＬＥ）などの標準的な化学的分離法を使用し、カテコールなど生成物を水溶性の培養ブロスから精製してもよい。
【０２２８】
芳香族生成物への設計された生化学的なルートの、追加の例は以下に記載される：
【０２２９】
ｉ）  アリルアルデヒドオキシダーゼ及びメチル基分解酵素を使用した２段階の生化学的変換を介して、リグニン由来のシリンガ酸を没食子酸に転換してもよい。
【０２３０】
ｉｉ）  アリルアルデヒドオキシダーゼ及びメチル基分解酵素を使用した２段階の生化学的変換を介して、リグニン由来のバニリンをプロトカテク酸に変換してもよい。
【０２３１】
ｉｉｉ）  アリルアルデヒドオキシダーゼ、芳香族デカルボキシラーゼ及びメチル基分解酵素を使用する、３段階の生化学的変換を介して、リグニン由来のバニリンをカテコールに変換してもよい。
【０２３２】
ｉｖ）  メチル基分解酵素、フェルラーテ−５−ヒドロキシラーゼ、２，４−ニトロフェノールオキシドレダクターゼ、及び２，４−ニトロベンゼンレダクターゼを使用する、４段階の生化学的な変換を介して、リグニン由来の２−メトキシトルエンを、ウレタン前駆体２，４−ジアミノトルエンに変換してもよい。
【０２３３】
各々の場合において、特異的な酵素を、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ又はＡ．ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ株の中に設計してもよく、例えば、カテコールの生化学的な生成のために、本明細書に記載されているものに類似した単位の操作を使用して、そのプロセスを行ってもよい。
【０２３４】
図８は、いくつかの実施形態に従い、リグニンオリゴマーからバニリンの生成のための生化学的プロセスの例を示す。メチルドパなど医薬品のための香味料として、また前駆体として、バニリンを使用することができる。例えば、合成のバニリンは、グリオキシル酸を有する反応によって、石油系のグアイアコールから生成することができる。しかしながら、図８に示されているプロセススキームに従って、リグニン由来のβ−ヒドロキシプロピオバニロン（β−ＨＰＶ）から、バニリンを生成することができる。２，４−ジヒドロキシアセトフェノンオキシドレダクターゼ、及びバニリン脱水素酵素又はカルボン酸レダクターゼを使用して、β−ＨＰＶからバニリンへの２段階の生化学的なルートを達成し、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉの中に設計することができる。
【０２３５】
図９は、いくつかの実施形態に従い、リグニンオリゴマーから２，４−ジアミノトルエンを生成するための生化学的プロセスの例を示す。ポリウレタンの製造において、トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）を使用することができる。例えば、２，４−ジアミノトルエン（２，４−ＤＡＴ）は、ＴＤＩへの重要な前駆体である。硝酸を用いるトルエンの連続するニトロ化と、その後の対応するジアミノトルエンに対するジニトロトルエンの還元により、ジアミノトルエンを産業的に生成することができる。ニトロ化と還元反応の両方により、トルエン異性体の混合物が得られ、そこから蒸留によって、２，４−ＤＡＴ異性体を精製する。図９で概説されたプロセススキームに従って、リグニン由来の２−メトキシトルエンの２，４−ＤＡＴへの転換を達成することができる。メトキシトルエンを特異的に、脱メチル化、ヒドロキシル化、ニトロ化及びアミノ化した４つの酵素を中に設計したＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉによって、２−メトキシトルエンを２，４−ＤＡＴに転換することができる。
【０２３６】
図１０は、いくつかの実施形態に従い、リグニンオリゴマーから価値のある化学物質の生成のための、オルトクレゾール、サリチル酸、及びアミノサリチル酸を含む追加的な生成標的のためのプロセススキームを示す。これらの化学薬品を、他のものと同様に、問題を含む石油化学製品プロセスから慣例的に得た。本明細書における教示を使用した、グアイアコール又は２−メトキシトルエンに基づく、これらの化学物質を生成する少しのプロセススキームを、図１０に模式的に示す。リグニン構造を産業化学物質及びファインケミカルへ転換するために、アゾトバクター株の顕著なフェノール−耐性形質（ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｒａｉｔｓ）を組み合わせて設計された生化学的なルートを提示する。
【０２３７】
〈実施例１０〉
本実施例は潜在的なＬｉｇＥ−、ＬｉｇＦ−、ＬｉｇＧ−、及びＬｉｇＤ−型ポリペプチド、並びにそれらをコード化する遺伝子について記載する。潜在的なポリペプチドを、本明細書で開示されたような、バイオインフォマティックな方法を使用して特定した。
【０２３８】
前記の通り、ＬｉｇＥ−型及びＬｉｇＦ−型のための、最初のパスにおける問い合わせ配列は、Ｍａｓａｉ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．で議論されような、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ配列であった。同様に、ＬｉｇＧ−型及びＬｉｇＤ−型のための問い合わせ配列もまた、Ｍａｓａｉで議論されたような、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ配列であった。全ての問い合わせのための最初のパスにおいて、次の配列を使用した：
【０２３９】
受入番号ＢＡＡ２０３２．１からのＬｉｇＥを、タンパク質の配列番号：１及び遺伝子の配列番号：２として、本明細書中の表に記載する。
【０２４０】
受入番号ＢＡＡ２０３１．１（Ｐ３０３４７．１）からのＬｉｇＦを、タンパク質の配列番号：５１３及び遺伝子の配列番号：５１４として、本明細書中の表に記載する。
【０２４１】
受入番号Ｑ９Ｚ３３９．２からのＬｉｇＧを、タンパク質の配列番号：７３３及び遺伝子の配列番号：７３４として、本明細書中の表に記載する。
【０２４２】
受入番号Ｑ０１１９８．１からのＬｉｇＤを、タンパク質の配列番号：７７７及び遺伝子の配列番号７７８として、本明細書中の表に記載する。
【０２４３】
ＬｉｇＥ−型及びＬｉｇＦ−型をさらに洗練させるために、以下の配列を修正した問い合わせにおいて使用し、また、図４に示す通り、意外で予期しない結果を示した問い合わせ配列は、ＬｉｇＥ−１及びＬｉｇＦ−２であった：
【０２４４】
受入番号ＡＢＤ２６８４１．１からのＬｉｇＥ−１を、タンパク質の配列番号：１０１及び遺伝子の配列番号：１０２として、本明細書中の表に記載する。
【０２４５】
受入番号ＡＢＤ２７３０１．１からのＬｉｇＦ−２を、タンパク質の配列番号：５４１及び遺伝子の配列番号：５４２として、本明細書中の表に記載する。
【０２４６】
表１６は、タンパク質をコード化するそれぞれの遺伝子配列と同様に、ＬｉｇＥ−型の潜在的なタンパク質配列である、配列番号：１−２４６を表に記載する。表１７は、タンパク質をコード化するそれぞれの遺伝子配列と同様に、ＬｉｇＦ−型の潜在的なタンパク質配列である、配列番号：２４７−５７６を表に記載する。表１８は、タンパク質をコード化するそれぞれの遺伝子配列と同様に、ＬｉｇＧ−型の潜在的なタンパク質配列である、配列番号：５７７−７７６を表に記載する。表１９は、タンパク質をコード化するそれぞれの遺伝子配列と同様に、ＬｉｇＤ−型の潜在的なタンパク質配列である、配列番号：７７７−９７６を表に記載する。
【０２４７】
本明細書に記載されているようなバイオインフォマティックな方法は、本明細書で提供された教示とともに使用するために、追加の潜在的な酵素を特定するための実験の効果的な順序を示唆することができる。さらに、本明細書で提供された教示により得ようとしていた酵素機能に関して、最も活性なタンパク質の構造をさらに理解するために、変異とアミノ酸置換を、酵素の活性への影響をテストするために使用することができる。
【０２４８】
【表１６−１】
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【０２４９】
【表１６−２】
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【０２５０】
【表１６−３】
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【０２５１】
【表１６−４】
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【０２５２】
【表１６−５】
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【０２５３】
【表１６−６】
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【０２５４】
【表１６−７】
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【０２５５】
【表１６−８】
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【０２５６】
【表１６−９】
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【０２５７】
【表１６−１０】
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【０２５８】
【表１７−１】
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【０２５９】
【表１７−２】
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【０２６０】
【表１７−３】
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【０２６１】
【表１７−４】
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【０２６２】
【表１７−５】
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【０２６３】
【表１７−６】
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【０２６４】
【表１７−７】
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【０２６５】
【表１７−８】
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【０２６６】
【表１７−９】
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【０２６７】
【表１７−１０】
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【０２６８】
【表１７−１１】
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【０２６９】
【表１７−１２】
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【０２７０】
【表１７−１３】
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【０２７１】
【表１７−１４】
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【０２７２】
【表１７−１５】
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【０２７３】
【表１７−１６】
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【０２７４】
【表１７−１７】
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【０２７５】
【表１７−１８】
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【０２７６】
【表１７−１９】
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【０２７７】
【表１７−２０】
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【０２７８】
【表１７−２１】
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【０２７９】
【表１７−２２】
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【０２８０】
【表１７−２３】
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【０２８１】
【表１７−２４】
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【０２８２】
【表１８−１】
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【０２８３】
【表１８−２】
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【０２８４】
【表１８−３】
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【０２８５】
【表１８−４】
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【０２８６】
【表１８−５】
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【０２８７】
【表１８−６】
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【０２８８】
【表１８−７】
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【０２８９】
【表１８−８】
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【０２９０】
【表１８−９】
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【０２９１】
【表１９−１】
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【０２９２】
【表１９−２】
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【０２９３】
【表１９−３】
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【０２９４】
【表１９−４】
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【０２９５】
【表１９−５】
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【０２９６】
【表１９−６】
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【０２９７】
【表１９−７】
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【０２９８】
【表１９−８】
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【０２９９】
【表１９−９】
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【０３００】
【表１９−１０】
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【０３０１】
【表１９−１１】
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【０３０２】
【表１９−１２】
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【０３０３】
【表１９−１３】
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【０３０４】
【表１９−１４】
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【０３０５】
【表１９−１５】
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【０３０６】
【表１９−１６】
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【０３０７】
【表１９−１７】
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【０３０８】
当業者は、わずか型通りの実験を使用するだけで、当業者が特異的な実施形態の範囲を十分に超えた本発明を実行することができる程度にまで記載され、及び可能となった、本明細書に記載される特異的な実施形態に対する多くの同等物があることを、認識するか又は確認することができる。そのような同等物は、以下の請求項に包含されるように意図される。加えて、本明細書で教示及び請求される、多数のリストとマーカッシュ群（Ｍａｒｋｕｓｈ  ｇｒｏｕｐｓ）が存在する。当業者は、本明細書で教示及び請求されるあらゆるリスト及び群が、本発明の実施において実現可能なあらゆる実施形態に適用可能でないかもしれないため、各々のそのようなリストが様々な種を含み、１以上の種の除去又は追加によって修飾され得ることを認識するであろう。そのため、そのようなリストにおける成分は取り除かれ、及び本明細書で教示される幾つかの実施形態を反映するために取り除かれると予想される。本出願において言及される、全ての出版物、特許、特許出願、他の参考文献、受入番号、ＡＴＣＣナンバーなどは、あたかも各々がその全体において引用により本明細書に組み込まれることを具体的に示されるかのように、同じ程度まで本明細書への引用により、本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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