(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、対象に化合物Ａを投与する工程を含む、対象においてループスを処置するための方法を提供する。  【選択図】      図２１
2014506934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてループスを処置するための方法であって、前記対象に化合物Ａを投与する工程を有する方法。
【化１】
2014506934.tif 000094
【請求項２】
対象においてループスを処置するための薬物の製造における化合物Ａの使用。
【化２】
2014506934.tif 000095
【請求項３】
対象における前記ループスの処置における化合物Ａの使用。
【化３】
2014506934.tif 000096
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａがプロドラッグとして投与されるものである方法、使用、または化合物。
化合物Ａ
【請求項５】
請求項４記載の方法、使用、または化合物において、前記プロドラッグが化合物Ａのボロン酸エステルである方法、使用、または化合物。
【請求項６】
請求項５記載の方法、使用、または化合物において、前記プロドラッグが化合物Ｂである方法、使用、または化合物。
【化４】
2014506934.tif 000097
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａが週に１回投与されるものである方法、使用、または化合物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａが週に２回投与されるものである方法、使用、または化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａが皮下投与されるものである方法、使用、または化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａが約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される方法、使用、または化合物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａが約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される方法、使用、または化合物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の方法、使用、または化合物において、前記化合物Ａが約２ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される方法、使用、または化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ループス処置
【背景技術】
【０００２】
ループス（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）は、活性化したＴ細胞およびＢ細胞、自己抗体、ならびに関節、皮膚、腎臓、ＣＮＳ、心組織、および血管を含む身体の様々な部位を攻撃する慢性炎症の存在を特徴とする慢性自己免疫疾患である。重篤な例では、抗体が腎臓の細胞（糸球体）に沈着して、炎症および場合によってループス腎炎として公知の状態である腎不全を引き起こす。
【０００３】
ループスの原因は不明のままであるが、前記疾患の発現は、遺伝子多型性、環境毒素および病原体に関連付けられてきた（Ｍｏｒｅｌ  ２０１０；Ｆａｉｒｈｕｒｓｔｍ，Ｗａｎｄｓｔｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。その上、性別、ホルモンの影響およびサイトカイン調節異常がループスの発症に関連付けられてきた（ＡｒｉｎｇｅｒおよびＳｍｏｌｅｎ  ２００４；Ｓｍｉｔｈ−Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｄｉｖｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ループスは男性の９倍多く女性に発症する。それはどんな年齢でも起こる可能性があるが、最も多くの場合１０歳と５０歳間の人に現れる。アフリカ系アメリカ人およびアジア人がほかの人種よりも多く発症する。
【０００４】
ループスには治療法がない。現在のループスの処置は、症状を制御することを目的とし、毒物および重篤な副作用を伴う免疫抑制剤、例えば高用量グルココルチコイドおよび／またはヒドロキシクロロキン(ｈｙｄｒｏｘｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ)などに限定されている。重篤な疾患（例えば、腎合併症の徴候を有する患者）は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）および／またはシクロホスファミド（ＣＴＸ）を含む、より攻撃的な薬剤を必要とする（ＢｅｒｔｓｉａｓおよびＢｏｕｍｐａｓ  ２００８）。ＣＴＸ、ＡＺＡ、およびＭＭＦは、非常に毒性が高く免疫抑制性であり、処置した患者の５０％だけが完全な緩解に入り、２年再発率は３０％までである。
【０００５】
プロテアソーム阻害剤は、ループスの処置としていくらかの可能性を示した。最近の研究では、唯一ＦＤＡに認可されたプロテアソーム阻害剤（ミレニアム・ファーマシューティカルズによってベルケード（登録商標）という商標名で多発性骨髄腫用に販売されている）であるボルテゾミブが、媒体と比較して、ループス易発性のＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの生存期間を著しく延長し、また、タンパク尿を著しく低下させ、腎臓の病態を改善した（Ｎｅｕｂｅｒｔ，Ｋｉｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．およびＫｉｍ，Ｂ．Ｓ．，２０１０）。より限定された実験では（対照動物６匹、５匹に薬剤）、ボルテゾミブはまた、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存期間を著しく改善した（ｐ＝０．０３）（Ｎｅｕｂｅｒｔ，Ｋｉｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。多発性骨髄腫とループスの両方をもつ女性の症例研究において、プレドニゾロンと併用したボルテゾミブは、前記患者のループス症状を改善した（Ｆｒоｈｌｉｃｈ、Ｋａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ループスの処置としてボルテゾミブを使用することの障害は、ボルテゾミブが深刻な副作用、例えば多発神経炎、血小板減少症および胃腸管合併症などに関連していることである（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．およびＫｉｍ，Ｂ．Ｓ．，２０１０；Ｆｒｏｈｌｉｃｈ，Ｋａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ループス腎炎を含むループスの新しい処置に対する必要性がある。  
【課題を解決するための手段】
【０００７】
対象に化合物Ａを投与する工程を含む、対象においてループスを処置するための方法が提供される。
【０００８】
【化１】
2014506934.tif 000003
【０００９】
一実施形態では、前記対象はヒトである。一実施形態では、前記化合物Ａは、プロドラッグとして投与される。一実施形態では、前記プロドラッグは、化合物Ａのボロン酸エステルである。一実施形態では、前記プロドラッグは、化合物Ｂである。
【００１０】
【化２】
2014506934.tif 000004
【００１１】
一実施形態では、前記化合物Ａは、週１回投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、約２ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【００１２】
一実施形態では、前記対象は、処置中に１若しくはそれ以上の血清サイトカインの低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中にＩＬ−１２の低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中に１若しくはそれ以上の血清抗核抗体の低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中に血清抗クロマチンＩｇＧの低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中に血清抗スミスＡｇ  ＩｇＧの低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中に血清抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧの低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中にタンパク尿の低下を経験する。一実施形態では、前記対象は、処置中に血清Ｃ３の増加を経験する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、急性ループスＭＲＬ／ｌｐｒマウスモデルにおいて化合物Ａおよびボルテゾミブを試験するための実験計画の概要を示すものである。
【図２】図２は、試験期間の処置群間のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの体重の進行を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、前記試験期間の各群の平均±ＳＥＭ体質量を示す。
【図３】図３は、試験期間の処置群間のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、前記実施例の各週の生存マウスの百分率を示す。
【図４】図４は、試験期間の処置群間のＭＲＬ／ｌｐｒマウスのリンパ肥大を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。リンパ肥大または肥大したリンパ節の存在を、毎週観察し、書きとめた。グラフは、肥大していないリンパ節をもつマウス（ＬＮｓ）の百分率を示す。
【図５】図５は、試験期間の処置群間のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾腫大を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。前記実施例の終わりまで生存したすべてのマウスの脾臓質量をグラフで示す。各記号は、２５週齢の１匹のマウスの脾臓重量を表す。
【図６】図６は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける疾患処置の経過にわたる血清ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０濃度を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスからのマウス血清ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０の濃度の平均±ＳＥＭを示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図７】図７は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける疾患処置の経過にわたる血清ＩＬ−１β濃度を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスからのマウス血清ＩＬ−１ｂの濃度の平均±ＳＥＭを示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図８】図８は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける疾患処置の経過にわたる血清ＴＮＦα濃度を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスからのマウス血清ＴＮＦαの濃度の平均±ＳＥＭを示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図９】図９は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓における抗スミス抗原および抗ｄｓＤＮＡ抗体分泌細胞の出現頻度を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウス脾臓を生体外Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾細胞に加工処理した。Ｅｌｉｓｐｏｔウェルを１０μｇ／ｍＬのスミス抗原、ｄｓＤＮＡまたはオボアルブミンタンパク質でコーティングした。新鮮な全脾細胞を、細胞培地中５００，０００細胞／ウェルで各ウェルに添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。発育したウェルは、脾細胞百万個あたりのＡＳＣの出現頻度として計数されるスポットを提供した。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１０】図１０は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓における抗クロマチン抗体分泌細胞の出現頻度を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウス脾臓を、生体外Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾細胞に加工処理した。Ｅｌｉｓｐｏｔウェルを、１０μｇ／ｍＬの煮沸したニワトリクロマチンまたはオボアルブミンタンパク質でコーティングした。新鮮な全脾細胞を、細胞培地中５００，０００細胞／ウェルで各ウェルに添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。発育したウェルは、脾細胞百万個あたりのＡＳＣの出現頻度として計数されるスポットを提供した。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１】図１１は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける経時的な抗クロマチン抗核抗体濃度を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスの血清試料を、抗クロマチンＩｇＧ循環ＡＮＡの存在についてＥＬＩＳＡアッセイによって分析した（材料および方法を参照）。グラフは、原株から２０００倍希釈した、抗クロマチンＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭをｎｇ／ｍＬで示している。
【図１２】図１２は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける経時的な抗スミス抗原抗核抗体濃度を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスの血清試料を、抗スミス抗原ＩｇＧ循環ＡＮＡの存在についてＥＬＩＳＡアッセイによって分析した（材料および方法を参照）。グラフは、原株から１００倍希釈した、抗スミス抗原ＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭをｎｇ／ｍＬで示している。
【図１３】図１３は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける経時的な抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体濃度を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスの血清試料を、抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ循環ＡＮＡの存在についてＥＬＩＳＡアッセイによって分析した（材料および方法を参照）。グラフは、原株から１００倍希釈した、抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭをｎｇ／ｍＬで示している。
【図１４】図１４は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来のＣＤ１３８ｈｉ脾臓形質細胞の割合を示すものである。ＭＲＬ／ｌｐｒ脾臓を取り出し、白血球について加工処理した（ＲＢＣ溶解）。全脾臓白血球を、形質細胞免疫表現型について抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、抗細胞内ＩｇＬκ軽鎖−ＰＥおよび抗ＣＤ１３８−ＡＰＣで染色した。形質細胞の染色を、適切なアイソタイプ対照と対にした。細胞をＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６サンプラーフローサイトメーターに流し、２００，０００イベントを収集し、ＳＳＣｍｉｄ、ＦＳＣｍｉｄ（生細胞サイズにゲート設定）、ＣＤ１３８を発現したＣＤ１９陰性細胞について分析すると、細胞内ＩｇＬκ軽鎖に対して陽性であった。形質細胞の出現頻度を、生細胞サイズのゲートを通過したリンパ球の百分率として示し、平均±ＳＥＭをグラフ中に示す。
【図１５】図１５は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける総尿中タンパク質（タンパク尿）を経時的に示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスから収集した尿を、ラット尿分析キットを用いて総タンパク質含有量について分析した。グラフは、タンパク質濃度の平均±ＳＥＭをｍｇ／ｍＬで示している。
【図１６】図１６は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける尿中白血球（白血球尿）の存在を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来の尿を、Ｕｒｉｓｔｉｘアッセイを用いて白血球または白血球尿の存在について試験した。グラフは、試験の最後の４つの時点に関して、製造業者の説明書に従って各ストリップに与えたスコアを示す。グラフに表した結果は、平均±ＳＥＭである。
【図１７】図１７は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Ｈ&Ｅ染色したパラフィンワックス包埋２５週齢マウス由来の腎組織切片）の腎病理組織診断を示すものである。画像は、病理学者により盲検的に選択された組織切片の最もひどく影響を受けた領域を示す。
【図１８】図１８は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓における２０Ｓプロテアソームの活性を示すものである。処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来の脾臓を溶解し、２０Ｓプロテアソームのための機能的生体外試験を用いて分析した。
【図１９】図１９は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎臓の薬物処置の３時間後のリン酸−ＩκＢα細胞の蓄積を示すものである。腎臓を溶解し、細胞のＩκＢαの蓄積をプロテアソーム活性の関数として測定する市販のＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。
【図２０】図２０は、前記ＮＺＭループス腎炎マウスモデルにおける進行性ループスの化合物Ａおよびボルテゾミブ処置を試験するための実験計画の概要を示すものである。
【図２１】図２１は、試験期間の処置群間のＮＺＭマウスの生存を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、実験の各週の生存マウスの百分率を示す。
【図２２】図２２は、試験期間の処置群間のＮＺＭマウスの体重の進行を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、試験期間にわたる各群の平均±ＳＥＭ体質量を示す。
【図２３】図２３は、試験期間の処置群間のＮＺＭマウスの脾腫大を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。試験の終わりまで生存したすべてのマウスについての脾臓重量をグラフに表す。値は、２５週齢の平均±ＳＥＭ脾臓重量を表す。
【図２４】図２４は、ＮＺＭマウスにおける総尿中タンパク質（タンパク尿）を示すものである。ＮＺＭマウスから収集した尿を、ラット尿分析キットを用いて総タンパク質含有量について分析した。グラフは、タンパク質濃度の平均±ＳＥＭをｍｇ／ｍＬで示している。
【図２５】図２５は、ＮＺＭマウスの血清中の抗クロマチン抗核抗体濃度を示すものである。ＮＺＭマウス血清試料を、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗クロマチンＩｇＧ循環ＡＮＡの存在について分析した。グラフは、原株から２０００倍希釈した、抗クロマチンＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭをｎｇ／ｍＬで示している。
【図２６】図２６は、ＮＺＭマウスにおける抗スミス抗原抗核抗体濃度を示すものである。ＮＺＭマウス血清試料を、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗スミス抗原ＩｇＧ循環ＡＮＡの存在について分析した。原株から１００倍希釈した、抗スミスＡｇ  ＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭ値をｎｇ／ｍＬで表す。
【図２７】図２７は、ＮＺＭマウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体濃度を示すものである。ＮＺＭマウス血清試料を、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ循環ＡＮＡの存在について分析した。原株から１００倍希釈した、抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭ値をｎｇ／ｍＬで表す。
【図２８】図２８は、ＮＺＭマウスにおける疾患処置の経過にわたる血清ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０濃度を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０の濃度の平均±ＳＥＭ値。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図２９】図２９は、ＮＺＭマウスにおける血清ＭＩＧ濃度を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清モノカイン、ＭＩＧの濃度の平均±ＳＥＭ値を示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図３０】図３０は、ＮＺＭマウスにおける血清ＩＰ−１０濃度を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清ＩＦＮ−γ誘導タンパク質、ＩＰ−１０の濃度の平均±ＳＥＭ値を示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図３１】図３１は、ＮＺＭマウスにおける血清ＩＬ−１３濃度を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清Ｔｈ２サイトカイン、ＩＬ−１３の濃度の平均±ＳＥＭ値を示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図３２】図３２は、ＮＺＭマウスにおける血清ＴＮＦα濃度を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清炎症性サイトカイン、ＴＮＦαの濃度の平均±ＳＥＭ値を示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図３３】図３３は、ＮＺＭマウスにおける血清ＩＬ−１７Ａ濃度を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清Ｔｈ１７サイトカイン、ＩＬ−１７Ａの濃度の平均±ＳＥＭ値を示す。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。
【図３４】図３４は、ＮＺＭマウスの脾臓における抗クロマチン抗体分泌細胞の出現頻度を示すものである。処置したＮＺＭマウス脾臓を、生体外Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾細胞に加工処理した。Ｅｌｉｓｐｏｔウェルを、１０μｇ／ｍＬの煮沸したニワトリクロマチンまたはオボアルブミンタンパク質でコーティングした。新鮮な全脾細胞を、細胞培地中５００，０００細胞／ウェルで各ウェルに添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。発育したウェルは、脾細胞百万個あたりのＡＳＣの出現頻度として計数されるスポットを提供した。グラフは、平均±ＳＥＭ値を示す。
【図３５】図３５は、ＮＺＭマウスの脾臓における全ＩｇＧ抗体分泌細胞の出現頻度を示すものである。処置したＮＺＭマウス脾臓を、生体外Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾細胞に加工処理した。Ｅｌｉｓｐｏｔウェルを１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ、ＩｇＨ、およびＩｇＬ鎖でコーティングした。新鮮な全脾細胞を、細胞培地中５００，０００細胞／ウェルで各ウェルに添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。発育したウェルは、脾細胞百万個あたりのＡＳＣの出現頻度として計数されるスポットを提供した。グラフは、平均±ＳＥＭ値を示す。
【図３６】図３６は、ＮＺＭマウスにおける血清補体Ｃ３濃度を示すものである。ＮＺＭ血清試料を、ＡＮＡ分析について記載される通り加工処理した。市販のキットを用いて、全補体因子３（Ｃ３）濃度について血清を試験した。グラフは、生理食塩水中１対５０，０００に希釈した血清試料を平均±ＳＥＭ値として示す。
【図３７】図３７は、ＮＺＭマウスにおけるＩ型コラーゲン架橋剤テロペプチド（ＣＴｘ）の血清濃度を示すものである。ＮＺＭ血清試料を、ＡＮＡ分析について記載される通り加工処理した。血清を、市販のキットを用いて、全身性骨吸収のバイオマーカーである全Ｉ型コラーゲン架橋剤（ＣＴｘ）濃度について試験した。グラフは、生理食塩水中１対６に希釈した血清試料を平均±ＳＥＭ値として示す。
【図３８】図３８は、ＮＺＭマウス由来の腎病理組織診断スコアを示すものである。
【図３９】図３９は、４０週齢のＮＺＭマウス（Ｈ&Ｅ染色したパラフィンワックス包埋２５週齢マウス由来の腎組織切片）の腎および肺の病理組織診断結果を示すものである。画像は、病理学者により盲検的に選択された切片の最も悪く影響を受けた領域を示す。
【図４０】図４０は、ＮＺＭマウスの脾臓における２０Ｓプロテアソームの阻害を示すものである。処置したＮＺＭマウス由来の脾臓を溶解し、２０Ｓプロテアソームのための機能的生体外試験を用いて分析した。グラフは、処置群に対する平均±ＳＥＭ制御率を表す。
【図４１】図４１は、ＮＺＭマウスの投薬後３時間の腎臓ＩκＢαの蓄積を示すものである。腎臓を溶解し、細胞のＩκＢαの蓄積をプロテアソーム活性の関数として測定する市販のＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。グラフは、処置群に対する平均±ＳＥＭ制御率を表す。
【図４２】図４２は、前記ＮＺＭループス腎炎マウスモデルにおいて化合物Ａおよびボルテゾミブの皮下投与を試験するための実験計画の概要を示すものである。
【図４３】図４３は、試験期間の処置群間のＮＺＭマウスの体重の進行を示すものである。グラフは、試験の終わりの各群の平均±ＳＥＭ体質量を示す。
【図４４】図４４は、試験期間の処置群間のＮＺＭマウスの生存を示すものである。ＮＺＭマウスは、説明文に概説される通り処置した。グラフは、試験の各週の生存マウスの百分率を示す。９１日目のエンドポイントに生存しているマウスの全体的な百分率を説明文の中の括弧内に記載している。＊は、ｐ≦０．０５を示す。
【図４５】図４５は、ＮＺＭマウスにおける総尿中タンパク質（タンパク尿）を示すものである。ＮＺＭマウスから収集した尿を、ラット尿分析キットを用いて総タンパク質含有量について分析した。グラフは、タンパク質濃度の平均±ＳＥＭをｍｇ／ｍＬで示している。＊は、ｐ≦０．０５を示す。
【図４６】図４６は、ＮＺＭマウスにおける抗スミス抗原抗核抗体濃度を示すものである。ＮＺＭマウス血清試料を、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗スミス抗原ＩｇＧ循環ＡＮＡの存在について分析した。抗スミスＡｇ  ＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭ値（ｎｇ／ｍｌ）は、原株からの１００倍希釈として記載されている。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図４７】図４７は、ＮＺＭマウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体濃度を示すものである。ＮＺＭマウス血清試料を、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ循環ＡＮＡの存在について分析した．抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡ濃度の平均±ＳＥＭ値（ｎｇ／ｍｌ）は、原株からの１００倍希釈として記載されている。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図４８】図４８は、ＮＺＭマウスにおける血清ＩＬ−１２濃度を示すものである。試験の終わりの処置したＮＺＭマウス由来のマウス血清ＩＬ−１２の濃度の平均±ＳＥＭ値。サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズキットを用いて分析した。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図４９】図４９は、ＮＺＭマウスの脾臓における抗スミス抗体分泌細胞の出現頻度を示すものである。処置したＮＺＭマウス脾臓を、生体外Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾細胞に加工処理した。Ｅｌｉｓｐｏｔウェルを、第三者バックグラウンド対照抗原として１０μｇ／ｍＬの精製スミス抗原またはオボアルブミンタンパク質でコーティングした。新鮮な全脾細胞を５００，０００細胞／ウェルで細胞培地の各ウェルに添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。発育したウェルは、脾細胞百万個あたりのＡＳＣの出現頻度として計数されるスポットを提供した。グラフは、平均±ＳＥＭ値を示す。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図５０】図５０は、ＮＺＭマウスの脾臓における抗ｄｓＤＮＡ抗体分泌細胞の出現頻度を示すものである。処置したＮＺＭマウス脾臓を、生体外Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ用の脾細胞に加工処理した。Ｅｌｉｓｐｏｔウェルを、第三者バックグラウンド対照抗原として１０μｇ／ｍＬのウシｄｓＤＮＡまたはオボアルブミンタンパク質でコーティングした。新鮮な全脾細胞を５００，０００細胞／ウェルで細胞培地の各ウェルに添加した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。発育したウェルは、脾細胞百万個あたりのＡＳＣの出現頻度として計数されるスポットを提供した。グラフは、平均±ＳＥＭ値を示す。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図５１】図５１は、ＮＺＭマウスにおける脾臓ＣＤ３８／ＣＤ１３８＋形質細胞の出現頻度を示すものである。抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３８−ＰＥおよび抗ＣＤ１３８−ＡＰＣで染色した脾細胞のチューブあたり合計１００，０００〜２００，０００イベントを収集し、獲得し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターで分析した。生細胞サイズによるゲーティングを、リンパ球のＦｓｃおよびＳｓｃ散乱に基づいて実施した。ＣＤ１９陰性ヒストグラムでゲートしたイベントを、示されるようにＣＤ１３８およびＣＤ３８でプロットした。合計３匹のマウスから得た代表的なデータを無作為に分析した。ＴおよびＢ細胞部分集合分析は示されていない。プロットは、処置したＮＺＭマウスにおける脾臓形質細胞の割合を示す。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図５２】図５２は、ＮＺＭマウス（Ｈ&Ｅ染色したパラフィンワックス包埋２５週齢マウス由来の腎組織切片）の腎病理組織診断スコアを示すものである。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。＊は、媒体対照Ｇ１０と比較して、ｐ≦０．０５を示す。
【図５３】図５３は、ＮＺＭマウスの投薬後３時間の脾臓および腎臓のＩκＢαの蓄積を示すものである。脾臓および腎臓を溶解し、細胞のＩκＢαの蓄積をプロテアソーム活性の関数として測定する市販のＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。グラフは、処置群に対する平均±ＳＥＭ制御率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
例示的実施形態の詳細な説明
用語「約」は、本明細書において測定可能な値、例えば量、時間的持続期間、および同類のものなどをさす場合に、前記値の合理的な変動、例えば、規定値から±１０％などを含むことを意味する。例えば、「約５０％」という語句は、５０％の合理的な変動、例えば前記数値５０の±１０％、または４５％〜５５％を包含する。
【００１５】
本明細書において、「対象」という用語には、温血動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物が含まれる。好ましい実施形態では、前記対象は霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、前記対象はヒトである。
【００１６】
前記対象に化合物Ａを投与することによる、対象においてループスを処置するための方法が提供される。化合物Ａは、化学名［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル］アミノ］−１−オキソブチル］アミノ］−３−メチルブチルボロン酸をもつプロテアソーム阻害剤である（Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉら、米国特許第７，５７６，２０６号参照）。化合物Ａは、次の構造を有する。
【００１７】
【化３】
2014506934.tif 000005
【００１８】
本発明者らは、化合物Ａがループスの処置においてボルテゾミブよりも優れていることを見出した。これは驚くべきことであり、なぜなら化合物Ａおよびボルテゾミブは、両方とも外因性および内因性アポトーシスシグナル伝達経路の活性化によって細胞死を誘導する可逆性ボロン酸プロテアソーム阻害剤であるためである（Ｃｈａｕｈａｎ  Ｄ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ．Ｃ．２００３；Ｐｉｖａ  Ｒ、Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．２００８）。さらに、両薬剤は主としてプロテアソームのキモトリプシン様触媒活性を標的とし、カスパーゼ様活性をわずかに阻害し、トリプシン様活性はほとんど阻害しない （Ｐｉｖａ  Ｒ、Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｄｅｍｏ  ＳＤ，Ｋｉｒｋ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。したがって、化合物Ａおよびボルテゾミブは、同様の作用機構を有すると思われる。その上、前記化合物は非常に類似した化学構造を有する。したがって、化合物Ａがボルテゾミブと比較してループスに対して増強された効力を提供する機構は、不明である。
【００１９】
本発明で使用される化合物Ａは、プロドラッグを含む任意の適した化学形態で投与することができる。適したプロドラッグには、親化合物の製薬上許容されるエステル形態が含まれる。好ましくは、プロドラッグは、投与後に親化合物（すなわち化合物Ａ）に変換される。本明細書において、「製薬上許容されるエステル」とは、ボロン酸残基がそのエステルを生成することによって修飾されている親化合物の誘導体をさす。好ましくは，前記プロドラッグは、ボロン酸エステルである。より好ましくは、前記プロドラッグは環状ボロン酸エステルである。環状ボロン酸エステルの例としては、限定されるものではないが、ジエタノールアミンボロン酸エステル、ジイソプロパノールアミンボロン酸エステル、アミノ二酢酸ボロン酸エステル、ピナンジオールボロン酸エステル、ピナコールボロン酸エステル、１，２−エタンジオールボロン酸エステル、１，３−プロパンジオールボロン酸エステル、１，２−プロパンジオールボロン酸エステル、２，３−ブタンジオールボロン酸エステル、１，１，２，２−テトラメチルエタンジオールボロン酸エステル、１，２−ジイソプロピルエタンジオールボロン酸エステル、５，６−デカンジオールボロン酸エステル、１，２−ジシクロヘキシルエタンジオールボロン酸エステル、ビシクロヘキシル−１，１’−ジオール、および１，２−ジフェニル−１，２−エタンジオールボロン酸エステルが挙げられる。好ましくは、前記プロドラッグは、ジエタノールアミンボロン酸エステル、ジイソプロパノールアミンボロン酸エステル、またはアミノ二酢酸ボロン酸エステルである。より好ましくは、前記プロドラッグは、ジエタノールアミンボロン酸エステルまたはジイソプロパノールアミンボロン酸エステルである。より好ましくは、前記プロドラッグは、ジエタノールアミンボロン酸エステル−すなわち、化合物Ｂである。
【００２０】
【化４】
2014506934.tif 000006
【００２１】
そのため、ある種の実施形態では前記化合物Ａは、プロドラッグとして投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、化合物Ａのボロン酸エステル誘導体として投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、化合物Ａの環状ボロン酸エステル誘導体として投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、環状ボロン酸エステル化合物Ｂとして投与される。
【００２２】
【化５】
2014506934.tif 000007
【００２３】
任意の適した投与方法を使用することができる。例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、くも膜下腔内など）、経口、直腸、経粘膜、吸入、および経皮が挙げられる。注射によって投与する場合、注射はボーラスまたは持続注入であってよい。化合物Ａは、好ましくは静脈（ＩＶ）注射、皮下（ＳＱ）注射によって、または経口的に、例えば、錠剤またはカプセル剤中などで投与される。より好ましくは、化合物Ａは、静脈（ＩＶ）注射または皮下（ＳＱ）注射によって投与される。例えば、前記化合物Ａは、注射の前に、例えば、注射用滅菌水、生理食塩水（ＮａＣｌ）、または水性マンニトールで再構成することのできる無菌の凍結乾燥粉末として提供されてよい。そのため、一実施形態では、前記化合物Ａは、注射によって投与される。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、ＩＶ注射によって投与される。もう一つの実施形態では，前記化合物Ａは、ＳＱ注射によって投与される。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、経口投与される。一実施形態では、前記化合物Ａは、錠剤で経口投与される。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、カプセル剤で経口投与される。
【００２４】
本発明で使用される化合物Ａは、一般に前記対象に医薬組成物として投与される。化合物Ａの医薬組成物は、一般に化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグに加えて少なくとも１つの製薬上許容される賦形剤を含有する。そのような賦形剤は、溶液、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液、乳濁液、および同類のものの調製を可能にする。
【００２５】
経口使用のための医薬品は、化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグを固体賦形剤と組み合わせ、得られる混合物を任意選択で粉砕し、そして必要に応じて適した補助剤を添加した後に、前記顆粒混合物を加工処理することによって、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。適した賦形剤としては、増量剤または希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、粘着防止剤（ａｎｄｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、磨砕剤、湿潤剤および界面活性剤、着色料および色素、香味剤、甘味剤、吸着剤、および味覚マスキング剤（ｔａｓｔｅ−ｍａｓｋｅｒｓ）が挙げられる。
【００２６】
希釈剤は、一般に錠剤の大きさを増やすために少量の活性薬物に添加される。最も一般的な希釈剤はラクトースであり、これは２つの異性体、α−ラクトースまたはβ−ラクトースで存在し、結晶質かまたは非晶質のいずれかであり得る。様々な種類のラクトースとしては、噴霧乾燥ラクトース一水和物（例えば、Ｓｕｐｅｒ−Ｔａｂ（商標）など）、α−ラクトース一水和物（例えば、Ｆａｓｔ  Ｆｌｏ（登録商標）など）、無水α−ラクトース、無水β−ラクトース、および凝集ラクトースが挙げられる。その他の希釈剤としては、糖、例えば、圧縮糖ＮＦなど、デキストロース賦形剤ＮＦ、およびデキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）ＮＦが挙げられる。好ましい希釈剤は、ラクトース一水和物（例えば、Ｆａｓｔ  Ｆｌｏ（登録商標）など）である。その他の好ましい希釈剤としては、微晶質セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ、およびＣｅｏｌｕｓ（商標）など）、およびミクロファインセルロース（例えば、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）など）が挙げられる。希釈剤には、デンプンおよびデンプン誘導体が含まれてよい。デンプンとしては、小麦、トウモロコシ、コメ、およびジャガイモから得た天然デンプンが挙げられる。その他のデンプンとしては、アルファ化デンプンＮＦ、およびグリコール酸ナトリウムデンプンＮＦが挙げられる。デンプンおよびデンプン誘導体は、崩壊剤としても機能する。その他の希釈剤としては、無機塩、例えば、第二リン酸カルシウムＵＳＰ（例えば、Ｄｉ−Ｔａｂ（登録商標）およびＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（登録商標）など）、第三リン酸カルシウムＮＦ（例えば、Ｔｒｉ−Ｔａｂ（登録商標）およびＴｒｉ−Ｃａｆｏｓ（登録商標）など）、および硫酸カルシウムＮＦ（例えば、Ｃｏｍｐａｃｔｒｏｌ（登録商標）など）などが挙げられる。マンニトールＵＳＰ、ソルビトールＮＦ、およびキシリトールＮＦなどのようなポリオールも希釈剤として役立つ。多くの希釈剤は、崩壊剤および結合剤としても機能し、製剤を開発する場合にこれらのさらなる特性を考慮に入れる必要がある。
【００２７】
崩壊剤は、錠剤を医薬有効成分の粒子と、前記有効成分の溶解を促進し前記有効成分のバイオアベイラビリティを強化する賦形剤の粒子に分けるために錠剤製剤に含められる。デンプンのカルボキシメチルエーテルの架橋ナトリウム塩（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプンＮＦ、Ｅｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、およびＰｒｉｍｏｇｅｌ（登録商標）など）を含む、デンプンおよびデンプン誘導体は、有用な崩壊剤である。好ましい崩壊剤は、アルファ化デンプン、例えば、Ｓｔａｒｃｈ１５００（登録商標）などである。別の好ましい崩壊剤は、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、クロスカルメロースナトリウムＮＦ、Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標）など）である。その他の崩壊剤としては、架橋ポリビニルピロリドン（例えば、クロスポビドンＮＦなど）、微晶質セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨなど）が挙げられる。
【００２８】
結合剤は、活性医薬成分とその他の賦形剤を凝集させるための湿式造粒賦形剤として使用される。結合剤は、粉末の流れを改善し、圧縮成形性を改善するように選択される。結合剤としては、セルロース誘導体、例えば、微晶質セルロースＮＦ、メチルセルロースＵＳＰ、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）ナトリウムＵＳＰ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＵＳＰ、ヒドロキシエチルセルロースＮＦ、およびヒドロキシプロピルセルロースＮＦなどが挙げられる。その他の結合剤としては、ポリビドン、ポリビニルピロリドン、ゼラチンＮＦ、天然ガム（例えば、アラビアガム、トラガント、グアー、およびペクチンなど）、デンプンペースト、アルファ化デンプンＮＦ、スクロースＮＦ、コーンシロップ、ポリエチレングリコール、およびアルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウムカルシウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、ポリエチレングリコールが挙げられる。好ましい結合剤は、ポリビニルピロリドン、特に、ポビドンＵＳＰ、好ましくは、ポビドンＫ−２９／３２である。
【００２９】
滑沢剤は、錠剤が打抜き面に固着することを防ぎ、圧縮段階中の摩擦を減らすために錠剤製剤に使用される。滑沢剤としては、一般に、植物油（例えば、トウモロコシ油など）、鉱油、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００およびＰＥＧ−６０００など）、ステアリン酸の塩（例えば、ステアリン酸カルシウムおよびステアリルフマル酸ナトリウムなど）、鉱物塩（例えば、タルクなど）、無機塩（例えば、塩化ナトリウムなど）、有機塩（例えば、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびオレイン酸ナトリウムなど）ならびにポリビニルアルコールが挙げられる。好ましい滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウムである。
【００３０】
糖衣錠コアには、適したコーティングが提供されてよい。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができ、それは任意選択でアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。識別のために、あるいは様々な組合せの活性化合物用量を特徴付けるために、染料または色素を前記錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【００３１】
経口的に使用することのできる医薬品には、ゼラチン製の押し嵌め式カプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールなどで作製された密封された軟カプセル剤が含まれる。前記押し嵌め式カプセル剤は、前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグを、増量剤、例えばラクトースなど、結合剤、例えばデンプンなど、および／または滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムなど、および任意選択で安定剤と混合して含有することができる。軟カプセル剤では、前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグは、適した液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁されていてよい。その上に、安定剤を添加することができる。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した薬用量であるべきである。
【００３２】
前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグは、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、任意選択で防腐剤を加えて、単位剤形で、例えばアンプルまたは複数用量容器で提示することができる。前記組成物は、油性若しくは水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとってよく、賦形剤、例えば懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などを含有してよい。
【００３３】
非経口投与用の医薬製剤には、前記化合物Ａの水溶液および／またはそのプロドラッグの水溶性形態が含まれる。さらに、前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグの懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製することができる。適した親油性溶媒若しくは媒体としては、脂肪油、例えばゴマ油など、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなど、またはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、前記懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含むことができる。任意選択で、前記懸濁液は、適した安定剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能するための前記化合物Ａの溶解度を増大させる薬剤も含有することができる。
【００３４】
前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグは、使用前に適した媒体、例えば注射用滅菌水で再構成するための粉末形態であってよい。例えば、前記医薬組成物は、凍結乾燥粉末であってよい。好ましくは、前記凍結乾燥粉末は、例えば０．９％ＮａＣｌを用いて再構成され、注射によって投与される。本発明での使用に適した凍結乾燥粉末は、国際公開第２０１０／１１４９８２号に開示されている。
【００３５】
凍結乾燥粉末の賦形剤には、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）からの「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）ステータスを有する充填剤が含まれる。そのような充填剤は、医薬品凍結乾燥の分野で周知であり、得られる凍結乾燥ケークの構造を強化する傾向があり、本発明で使用することができる。好ましい充填剤としては、糖類、好ましくは単糖またはオリゴ糖、アミノ酸、糖アルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。より好ましい充填剤としては、糖類、好ましくは単糖またはオリゴ糖、糖アルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。より好ましくは、本発明で使用される充填剤としては、スクロース、デキストロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、グリシン、およびデキストランが挙げられる。最も好ましい充填剤は、マンニトールである。
【００３６】
シクロデキストリンも凍結乾燥粉末医薬組成物に使用することができる。好ましいシクロデキストリンとしては、天然に存在するシクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルホナート、またはβ−シクロデキストリンスルホブチルエーテルが挙げられる。これらの大部分は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニーおよびコネチカット州ニュー・カナーンのワッカー・ケミカルズなどの供給業者から市販されている。好ましいシクロデキストリンとしては、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびβ−シクロデキストリンスルホブチルエーテルが挙げられる。好ましくは、前記シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル  β  シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、またはその混合物である。好ましいシクロデキストリンとしては、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびβ−シクロデキストリンスルホブチルエーテルが挙げられる。一実施形態では、前記シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルである。もう一つの実施形態では、前記シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。特に好ましいシクロデキストリンは、フランスのロケット・フレールより入手可能なＫＬＥＰＴＯＳＥ（登録商標）ＨＰＢである。
【００３７】
前記医薬組成物は、好ましくは１％〜９５％（ｗ／ｗ）の前記活性化合物（すなわち本発明の化合物）を含有する。より好ましくは、前記医薬組成物は、５％〜７０％（ｗ／ｗ）の前記活性化合物を含有する。
【００３８】
好ましくは、前記医薬組成物は、前記活性化合物の少なくとも１つの単位用量を含有する。通常、前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグの単位用量は、典型的な対象に対して約０．１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記化合物Ａおよび／またはそのプロドラッグの単位用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記単位用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記単位用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記単位用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記単位用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記単位用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記単位用量は、約２ｍｇ／ｍ２である。
【００３９】
前記化合物Ａは、ループスを処置するための有効量で、すなわち、前記疾患の症状を予防、軽減または寛解させ、前記処置対象の生存期間を延長し、かつ／または前記対象におけるループス関連バイオマーカーに好ましい影響を及ぼすために効果的な量で投与される。化合物Ａの有効量の決定は、本明細書において提供される詳細な開示および実施例を考慮すれば十分に当業者の能力の範囲内である。前記有効量は、前記対象の大きさ、前記ループス疾患の重症度、投与頻度、前記化合物のバイオアベイラビリティ、前記対象の健康状態および併存疾病状態、ならびに任意の同時処置（例えば、グルココルチコイド）の量および性質などの要因によって変動し得る。例えば、単剤療法用の化合物Ａの有効量は、化合物Ａをその他のループス治療と一緒に組み合わせて使用した場合に効果的な化合物Ａの量よりも多い用量である。有効量は、試験管内または動物モデル試験系から誘導した用量反応曲線から推定することができ、および前記対象の表面積または重量に基づく。
【００４０】
処置は、前記化合物の最適な用量よりも少ない、より少量の薬用量で開始することができる。その後、前記状況下で最適な効果に達するまで、前記薬用量を少ない増分ずつ増加させることができる。必要に応じて、総１日投与量を分割して、その日の間に一部分ずつ投与することができる。投薬計画を最適化するために、処置を受けている対象における様々なバイオマーカーへの処置の効果をモニターすることによって、化合物Ａの有効性をモニターすることができる。有用なバイオマーカーとしては、本明細書中の実施例の項に列挙されるもの（例えば、抗核抗体、サイトカイン、例えばＩＬ−１２など、タンパク尿、血清補体など）が挙げられる。ループス処置の有効性をモニターするための特に便利な２つのバイオマーカーが、タンパク尿および抗核抗体である。化合物Ａの有効量は、処置前の前記バイオマーカーレベルと比較して望ましい方向に前記バイオマーカー（類）を変更すること（例えば、タンパク尿を減少させる、抗核抗体を減少させる、血清Ｃ３を増加させるなど）が好ましい。従って、化合物Ａの有効量は、低用量で開始し、その後これらのバイオマーカー類の１若しくはそれ以上をモニターする間に漸増することによって最適化することができる。通常、治療を開始する前に、患者から前記バイオマーカー（類）（例えば、タンパク尿または抗核抗体）の初期評価と、処置中の異なる時点で１若しくはそれ以上のさらなる評価を得ることが望ましい。そのような使用の場合、治療前のベースライン測定値が測定され、その後にバイオマーカー（類）（例えば、タンパク尿または抗核抗体）の変化が治療の経過中に測定されて、必要に応じて用量が調節される。あるいは、処置前のベースライン測定を必要とせずに処置中に２またはそれ以上の連続する測定を行うことができる。そのような使用の場合、バイオマーカー（類）（例えば、タンパク尿または抗核抗体）の最初の評価は、レベルが増加しているかまたは低下しているかどうか、およびそれにしたがって調節または維持される用量を決定するためのベースラインレベルとして、前記対象から作製されるべきである。
【００４１】
好ましい実施形態では、化合物Ａによる処置を受けている対象は、ループス疾患に関連する１若しくはそれ以上のバイオマーカー類において望ましい変化を経験する。ループスに関連する適したバイオマーカー類としては、リンパ肥大、脾腫大、血清ＩＬ−１２、血清Ｃ３、血清抗核抗体、抗クロマチンＩｇＧ、抗スミスＡｇ  ＩｇＧ、血清抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体、血清ＩＦＮα、タンパク尿、血清ＩＬ−１７Ａ、血清ＩＬ−６、血清ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、血清ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、血清ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、血清ＩＬ−４、血清ＩＬ−１３、血清ＩＬ−１β、血清ＴＮＦα、血清ＫＣ／ＩＬ−８、および血清ＣＴｘが挙げられる。そのため、一実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中にリンパ肥大の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に脾腫大の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＬ−１２の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清Ｃ３の増加を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清抗核抗体の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に抗クロマチンＩｇＧの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に抗スミスＡｇ  ＩｇＧの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＦＮαの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中にタンパク尿の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＬ−１７Ａの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＬ−６の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＣＸＣＬ９／ＭＩＧの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＬ−４の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＬ−１３の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＩＬ−１βの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＴＮＦαの低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＫＣ／ＩＬ−８の低下を経験する。もう一つの実施形態では、前記対象は、化合物Ａによる処置中に血清ＣＴｘの低下を経験する。
【００４２】
前記化合物Ａは、前記対象に任意の適した用量で投与することができる。一実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の範囲内である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約１．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａの用量は、約２ｍｇ／ｍ２である。好ましい化合物Ａの用量としては、限定されるものではないが、１．１ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、１．８ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、２．４ｍｇ／ｍ２、２．７ｍｇ／ｍ２、および３．０ｍｇ／ｍ２が挙げられる。より好ましくは、前記化合物Ａの用量は、１．８ｍｇ／ｍ２、２．１ｍｇ／ｍ２、２．４ｍｇ／ｍ２、または２．７ｍｇ／ｍ２である。より好ましくは、前記化合物Ａの用量は、２．１ｍｇ／ｍ２または２．４ｍｇ／ｍ２である。前述の用量は、化合物Ａのどんな投与方法にも適し、皮下または静脈への投薬に特に適している。化合物Ａの経口用量は、一般に前述の範囲、例えば約１ｍｇ／ｍ２〜約７ｍｇ／ｍ２などの最高位となる。一実施形態では、化合物Ａの前記経口用量は、約２ｍｇ／ｍ２〜約６ｍｇ／ｍ２、例えば約３ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２などである。例となる化合物Ａの経口用量としては、限定されるものではないが、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２および６ｍｇ／ｍ２が挙げられる。
【００４３】
各々の化合物Ａ用量の投与計画は、剤形の薬物動態、処置または阻害されるループス症状の種類、前記対象の大きさ、およびループス疾患の重症度などの要因によって変動することがあり得る。前記化合物Ａの投与のタイミングは、上記の考慮点および本発明の詳細な開示内容を考慮して、効力を最適化し、副作用を最小限に抑えるために治療する医師によって簡単に変えることができる。本発明による化合物Ａの投薬スケジュールには広い柔軟性がある。
【００４４】
前記化合物Ａは、上記の用量で任意の適したスケジュールに従って投与することができる。前記化合物Ａの用量は、前記投薬スケジュール内で一定であってもよいし変動してもよい。好ましくは、前記化合物Ａの用量は、著しい薬物関連毒性が観察されない限り、前記スケジュールの間に一定レベルで維持され、薬物毒性が観察された場合にはその後の用量を例えば約２０〜３０％減らすことができる。適した化合物Ａのスケジュールは、一般に１日１回の投薬から週１回の投薬またはさらに月に１回の投薬にわたる。好ましくは、前記化合物Ａは、１日１回よりも少ない頻度で、例えば２〜１４日ごとに１用量などで投与される。好ましくは、前記化合物Ａは、３〜２８日ごとに、例えば３〜１４日などごとに投与される。例えば、前記化合物Ａは、週２回投与することができる。別の例では、化合物Ａは、週１回投与することができる。別の例では、化合物Ａは、２週に１回投与することができる。スケジュールには、化合物Ａで１週間以上、例えば２、３、または４週間処置した後に、化合物Ａがその間に投与されない少なくとも５日の期間、例えば約７〜２１日の期間が含まれてよい。一実施形態では、前記休止期間は、約１０〜１７日、例えば約１０日または約１７日などである。例えば、前記化合物Ａは、２１日周期の１日、４日、８日、および１１日に投与することができ、この際１２〜２１日が休止期間である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、２８日周期の１日、４日、８日、および１１日に投与することができ、この際１２〜２８日が休止期間である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、２８日周期の１日、８日、および１５日に投与することができ、この際１６〜２８日が休止期間である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、２１日周期の１日、および８日に投与することができ、この際１２〜２１日が休止期間である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、２８日周期の１日、および８日に投与することができ、この際１２〜２８日が休止期間である。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、２１日周期の１日、および１５日に投与することができる。もう一つの実施形態では、前記化合物Ａは、２８日周期の１日、および１５日に投与することができる。スケジュールされた投薬周期は、１回若しくはそれ以上反復することができる。例えば、前記スケジュールされた周期は、最大応答が観察されるまで、１回または２回のさらなる周期を加えて反復してよい。別の例として、前記スケジュールされた周期は、６〜１２周期反復することができる。任意選択で、最初の周期が終了した後に、「維持スケジュール」を用いることができ、そのスケジュールでは前記化合物Ａは、最初のスケジュールよりも少ない頻度で、および／または最初のスケジュールよりも少ない用量で、例えば、週１回、２週に１回、３週に１回、または４週に１回などで投与される。前記維持スケジュールは、固定された期間、通常１〜２年、または前記患者が進行性疾患の徴候を継続して示さず、著しい毒性なしに前記処置を許容している限り無限に継続することができる。特定の実施形態では、前記投薬スケジュールは、その他の疾患、例えば多発性骨髄腫などの処置に適した化合物Ａ投薬スケジュールから改変することができる。例えば、化合物Ａは、反復する２８日の周期の１日、８日、および１５日に化合物Ａ（約２ｍｇ／ｍ２）を投与することによる、多発性骨髄腫の処置について現在研究されている。
【００４５】
１若しくはそれ以上のさらなるループス処置を、前記化合物Ａの投与と併用することができる。そのような処置としては、限定されるものではないが、グルココルチコイド、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、およびシクロホスファミド（ＣＴＸ）が挙げられる。これらの薬剤の適当な用量は、当分野で周知である。
【００４６】
材料および方法
化合物
化合物Ａは、本明細書において報告される手順に類似する手順によって固体の灰白色粉末として得ることができる。ボルテゾミブは、本明細書において報告される手順に類似する手順によって得ることができる。デキサメタゾン（ＤＥＸ、１０ ｍｇ／ｍＬ、液体、ロット番号０８９０１６）は、Ｈａｎｎａ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（デラウェア州ウィルミントン）から購入することができる。シクロホスファミド（ＣＴＸ；Ｈａｎｎａ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、デラウェア州ウィルミントン）は、週１回腹腔内注射で５０ｍｇ／ｋｇで使用される。 化合物Ａおよびボルテゾミブの懸濁液に使用される媒体は、８７％ＰＢＳ、３％ＤＭＳＯ、１０％Ｓｏｌｕｔｏｌ（Ｍｕｔｃｈｌｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５）である。
【００４７】
化合物Ａおよびボルテゾミブを、単回使用分割量で−８０℃の７５μＬのＤＭＳＯ中に貯蔵する。８７％ＰＢＳ＋１０％Ｓｏｌｕｔｏｌを添加することによってこれらの分割量を希釈して、製剤あたり３％ＤＭＳＯの終濃度に等しい終濃度とする。
【００４８】
合成
調製１  （１Ｒ）−１−［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチルアミン塩酸塩。
【００４９】
オーバーヘッド撹拌、窒素掃引、温度表示器をもつ熱電対、１リットル添加漏斗、表面下ガス分散管、および補助加熱装置／冷却装置器を装備した、２リットルＣｈｅｍｇｌａｓｓ（登録商標）ジャケット付き反応器に、８．０リットルの無水メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを装入する。前記冷却装置を−４０℃に設定する。溶媒をかき混ぜながら−３１．３℃に冷却する。次に、７１４．４ｇ（１９．７１ｍｏｌ、５．０当量）のＨＣｌ（ｇ）を、−２５．７℃と−１０．０℃間の温度を維持しながら１．７５時間にわたり表面下に添加する。次に、１．６２３５ｋｇ（３．９６４ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）−（１Ｒ）−１−［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチルアミン（米国特許公開第２００５／０２４００４７号（Ｐｉｃｋｅｒｓｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されるものと類似の方法によって得られる）を、２．１リットルのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルに溶解する。次に、−２５℃と−１０℃との間の反応温度を維持しながら、前記溶液を前記ＨＣｌ溶液に４０分にわたり添加する。添加が完了した後、反応物を周囲温度まで暖め、前記冷却装置をオフにする。反応物を周囲温度まで温まらせ、一晩撹拌する。次に、前記反応物をロータリーエバポレーターで１〜２リットルの容積に濃縮する。３リットルのヘプタンを前記混合物に添加し、蒸留を継続してさらに３リットルの留出物を除去する。次に、さらに１リットルの留出物を除去する間に、さらに６リットルのヘプタンを少量ずつ添加する。生成物混合物を、前述の通り装備した前記２０リットルＣｈｅｍｇｌａｓｓ（登録商標）ジャケット付き反応器に移し、周囲温度で一晩ゆっくり撹拌させる。翌朝、前記混合物を約−１５℃〜−１０℃に冷却し、１時間撹拌させる。＃１  Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）濾紙を装備した中型焼結ガラス濾過用漏斗に生成物を通して濾過する。生成物ケークを、２リットルの冷（０℃）ヘプタンで洗浄し、真空下（２９ｍｍＨｇ）３５℃で窒素をパージしたオーブンで乾燥させた。収量は９９６．０ｇ（８４％）で純度は９３．９Ａ％、ジアステレオマー比は９８．７５：１．２５（ｄ．ｅ．＝９７．５％）である。
【００５０】
調製２  ６−（２Ｓ，３Ｒ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル｝−３−ヒドロキシ−２−｛（６−フェニルピリジン−２−イル）ホルムアミド］ブタンアミド（すなわち、化合物Ｂ）
工程Ａ  ６−フェニル−ピリジン−２−カルボニルクロリドの調製。オーバーヘッド撹拌機、熱電対、デジタル式温度調節器を含む加熱マントル、凝縮器、および窒素入口／出口を装備した２Ｌ三つ口丸底フラスコに、１００．０ｇ（０．５０２ｍｏｌ）の６−フェニル−２−ピリジンカルボン酸および１５００ｍＬのトルエン（Ｋｆ<０．０２重量％）を装入し、その後４０℃に温める。次に、塩化チオニル（１１０ｍＬ；１．５１ｍｏｌ、３当量）を、希薄なスラリーに、添加漏斗を介して２０分にわたり添加する。前記希薄なスラリーを７５℃に加熱し、それが透明な溶液になるまで一晩撹拌する（約１０〜１６時間）。前記反応混合物を室温まで冷却した後、前記溶媒および過剰な塩化チオニルを、次の通り真空除去する：反応混合物を、４０℃（浴温度）の高真空下でその元の容積（約５００ｍＬ）の約１／３までストリッピングし、その後（１０００ｍＬ）の新鮮なトルエンを添加する。濃縮を継続し、再び元の容積（約５００ｍＬ）の約１／３までストリッピングし、それに続いて１０００ｍＬの新鮮なトルエンで再希釈する。除去したトルエンの総量は、約２０００ｍＬである。
【００５１】
工程Ｂ  （２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［オキソ−２−（６−フェニル−ピリジン−２−イル）−エチル｝−酪酸の調製。３Ｌ三つ口丸底フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、熱電対、均圧滴下漏斗、窒素入口／出口、および氷水冷却浴を装備する。Ｌ−トレオニン、６２．８ｇ（０．５３ｍｏｌ）を添加し、それに続いて１１７ｇ（１．１ｍｏｌ）の炭酸ナトリウムおよび１５００ｍＬの脱イオン水を添加する。前記水溶液を、１０．０℃に冷却する。この間に、前記添加漏斗に、工程Ａで調製した酸塩化物／トルエン溶液を装入する。このトルエン溶液を、前記水性反応物に約１０分にわたり約１０℃で滴下する。添加が完了すると、前記反応物を室温（約２２〜２５℃）まで温め、ＨＰＬＣ解析によって完了していることが示されるまで（一般に約３時間）激しく撹拌する。次に、反応混合物を分液漏斗に移し、２つの層を分離する。次に、下側の水相を前記反応フラスコに再装入する。次に、メタノール（８００ｍＬ）を前記混合物に添加し、それに続いて、温度を１５〜２０℃に保ちながら、２．５Ｍ  ＨＣｌ（約８５０ｍＬ）でｐＨを調節する（目標ｐＨ＝１〜２）。一般にいくらかの排ガスが約ｐＨ＝５で生じ、それに続いてｐＨ＝３で生成物の沈殿が生じる。スラリーをｐＨ調節後に室温で３０分間撹拌させる。白色の固体を、真空濾過によって回収し（母液損失<２ｍｇ／ｍＬ）、脱イオン水で洗浄し（２×５００ｍｌ）、その後４０℃の真空オーブン中で窒素掃引して一定重量まで乾燥させて、１４１ｇ（０．４７１ｍｏｌ、９４％）の標題化合物を９９Ａ％（９５重量％）のＨＰＬＣ純度で得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）  δ  １２．９（ｓ，１Ｈ，ｂ）、８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１６Ｈｚ）、８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２４Ｈｚ）、８．１（ｍ，３Ｈ）、８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、７．５５（ｍ，３Ｈ）、５．３４（ｓ，１Ｈ，ｂ）、４．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５２，９．１６Ｈｚ）、４．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９２，６．２４Ｈｚ）、１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。
【００５２】
工程Ｃ  Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−１［［［（１Ｒ）−１−１［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］２−ヒドロキシプロピル］−６−フェニル−２−ピリジンカルボキサミドの調製。。熱電対、羽根車をもつ撹拌軸、添加漏斗、および低温再循環浴を装備した、１０リットルのジャケット付き反応容器に、１５６．１ｇ（０．５２ｍｏｌ、１．０当量）の（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［オキソ−２−（６−フェニル−ピリジン−２−イル）−エチル］−酪酸、２１８．８ｇ（０．５７５ｍｏｌ、１．１当量）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、１５７．７ｇ（０．５２２ｍｏｌ、１．０当量）の（１Ｒ）−１−［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチルアミン塩酸塩（イソブチルジアステレオマー（Ｒ：Ｓ）の９８．８：１．２混合物）、および２３５５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を装入する。前記反応混合物を<−２５．０℃まで冷却する前に、撹拌を開始して固体を溶解する。ジイソプロピルエチルアミン（２１８．６ｍＬ、１６２．２ｇ、１．２５ｍｏｌ、２．４当量）を前記添加漏斗に装入し、その後前記反応混合物に約３０分にわたって−２５℃〜−３０℃で滴下する。ひとたび添加が完了すると、前記反応物を−３０℃で６時間撹拌する。オーバーヘッド撹拌機および熱電対を装備した、別の２２リットル四つ口反応フラスコに、３９２５ｍＬのＤＩ水および３９２５ｍＬの酢酸エチルを装入する。前記反応混合物を室温で５分にわたってこのフラスコに移す。下側の水層を分離し、廃棄する。３９２５ｍＬのＤＩ水中、３９３ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物の溶液を調製し、有機相をこの溶液で洗浄する。下側の水相を再び除去し、廃棄する。４７１０ｍＬのＤＩ水中、３７６．９ｇの重炭酸ナトリウムの溶液を調製し、有機相を、２つの部分に分けた後にこの溶液で洗浄する。再度、下側の水相を分離し、廃棄する。飽和塩化ナトリウム溶液を、３１４０ｍＬのＤＩ水中の４８１．４ｇの塩化ナトリウムを用いて調製し、有機相をこの溶液で洗浄し、層を分離し、下側の水相を廃棄する。Ｎｏｒｉｔ  ＧＡＣ  １２４０＋炭素（１５７ｇ）を前記有機相に添加し、懸濁液を室温で一晩撹拌する（１３．８時間）。前記炭素を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃガラス繊維濾紙による真空濾過によって除去し、その後３５０ｍＬの酢酸エチルで洗浄する。濾液を真空下、３３〜４４℃の浴温度でロータリーエバポレーターで泡沫に濃縮して、２３１．５ｇ（０．４２２ｍｏｌ、８０．９％）の標題化合物Ａを９６．４％の化学純度をもつ泡沫として得る。トレオニン異性体の濃度は１．１６Ａ％である。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）  δ  ８．９８（ｄ，ｂ，１Ｈ，Ｊ＝２．９９Ｈｚ）、８．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５５Ｈｚ）、８．２（ｍ，３Ｈ）、８．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７���７１Ｈｚ）、８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５４Ｈｚ）、７．５４（ｍ，３Ｈ）、５．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９５Ｈｚ）、４．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２２，８．５２Ｈｚ）、４．１３（ｍ，２Ｈ）、２．６（ｍ，ｂ，１Ｈ）、２．１９（ｍ，ｂ，１Ｈ）、２．０２（ｍ，ｂ，１Ｈ）、１．８３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ）、１．７５（ｓ，ｂ，１Ｈ）、１．６８（ｍ，ｂ，１Ｈ）、１．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ）、１．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０５Ｈｚ）、１．３（ｍ，ｂ，３Ｈ）、１．２２（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝１１．６５Ｈｚ）、１．１２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．２６Ｈｚ）、０．８４（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５７Ｈｚ）、０．７９（ｓ，３Ｈ）。
【００５３】
工程Ｄ  ６−（２Ｓ，３Ｒ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル｝−３−ヒドロキシ−２−｛（６−フェニルピリジン−２−イル）ホルムアミド］ブタンアミド（すなわち、化合物Ｂ）の調製。
【００５４】
オプション１−二段階法：１２リットル四つ口丸底フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、熱電対、および窒素出口を装備した後、２２９．８ｇ（０．４２ｍｏｌ、１当量）のＮ−［（１Ｓ，２Ｒ）−１［［［（１Ｒ）−１−１［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］２−ヒドロキシプロピル］−６−フェニル−２−ピリジンカルボキサミドの２３１０ｍＬメタノール中溶液を装入する。これに、３４６５ｍＬのｎ−ヘプタン、１０８ｇ（１．０６ｍｏｌ、２．５当量）の（２−メチルプロピル）ボロン酸および３５３ｍＬのＤＩ水中７０ｍＬ（８４ｇ、０．８５ｍｏｌ、２．０当量）の３７％塩酸溶液を添加する。撹拌を開始し、二相混合物を室温で１６時間撹拌する。反応混合物を４リットル分液漏斗に少量ずつ移し、下側のメタノール性の相を分離し、前記反応フラスコに戻す。上側のヘプタン層を廃棄する。新鮮な装入量の３４６５ｍＬのｎ−ヘプタンを反応物に添加し、前記反応を室温でさらに２時間撹拌する。撹拌を停止し、相を分離し、下側のメタノール性の層を、ｎ−ヘプタンで抽出する（２×４６００ｍＬ）。ヘプタン相を廃棄し、前記メタノール性の相を、４０℃浴温度で真空濃縮する。酢酸エチル（４６２０ｍＬ）を蒸発フラスコに装入し、粘着性の黄色の残渣を溶解した後に、トランス１２リットル反応フラスコに移す。７６５０ｍＬのＤＩ水中、６６５．４ｇの重炭酸ナトリウムの溶液を調製し、酢酸エチル層を２つの部分で（１×４０００ｍＬおよび１×３８５０ｍＬ）洗浄するために使用する。２７００ｍＬのＤＩ水中、０５９．７ｇの塩化ナトリウムの溶液を調製し、その後酢酸エチル相を洗浄するために使用する。
【００５５】
層の分離後、前記酢酸エチル層を、４７．３ｇ（０．４５ｍｏｌ、１．１当量）のジエタノールアミンで処理する。混合物を室温で一晩撹拌させる。沈殿した固体を、閉鎖した濾過フラスコを用いて真空濾過により回収し、湿ケーキを５００ｍＬの酢酸エチルで洗浄する。密封した濾過用漏斗を、開いた状態のグローブボックスに移し、４８１．８ｇの湿ケーキを２つのパイレックス乾燥トレイに移し、次にそれを真空オーブンの中に入れる。生成物を、２３．５インチのＨｇおよび５０℃で２７時間にわたって一定重量まで乾燥させて、１７９．７ｇ（０．３７２ｍｏｌ、８８．８％）の標題化合物を、化学純度９８．６％およびキラル純度９８．８％ｄｅで得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００  ＭＨｚ）  δ  ８．８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５２Ｈｚ）、８．２（ｍ，３Ｈ）、８．１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６８Ｈｚ）、８．０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７，０．９Ｈｚ）、７．５（ｍ，３Ｈ）、７．２（ｄ，１Ｈ）、６．５（ｔ，ｂ，１Ｈ）、５．１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９２Ｈｚ）、４．５（ｄｄ，１Ｈ）、４．２（ｍ，１Ｈ）、３．６（ｍ，２Ｈ）、３．５（ｍ，２Ｈ）、３．１（ｍ，１Ｈ）、３．０（ｍ，２Ｈ）、２．７（ｍ，２Ｈ）、１．６（ｍ，１Ｈ）、１．３（ｍ，１Ｈ）、１．２（ｍ，１Ｈ）、１．１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ）、０．８（２ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６８，６．５２Ｈｚ）。
【００５６】
オプション２−一段階法：５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに、熱電対、撹拌子、窒素入口／出口、加熱マントル、および温度調節器を装備する。前記フラスコに、２．０ｇ（３．６５ｍｍｏｌ、１．０当量）のＮ−［（１Ｓ，２Ｒ）−１［［［（１Ｒ）−１−１［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］２−ヒドロキシプロピル］−６−フェニル−２−ピリジンカルボキサミドおよび２０ｍＬのＭＴＢＥを装入する。反応混合物を、すべての固体が溶解するまで約１０分間撹拌する。ジエタノールアミン（０．４４ｍＬ、０．４８ｇ、４．５７ｍｍｏｌ、１．２５当量）を、シリンジを介して２滴のメタンスルホン酸とともに淡黄色の溶液に装入し、混合物を５０℃に加熱する。約３０分後、白色の沈殿が生じ始める。撹拌を一晩継続した後、室温まで冷却する。固体を真空濾過によって回収し、ＭＴＢＥ（１×２０ｍＬ）で洗浄した後、６０℃で一晩真空乾燥させて、０．９２ｇ（１．９ｍｍｏｌ、５２％）の標題化合物を、化学純度９１．９％およびキラル純度>９９．５％ｄｅの白色固体として得る。
【００５７】
工程Ｅ（任意選択）。６−（２Ｓ，３Ｒ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル｝−３−ヒドロキシ−２−｛（６−フェニルピリジン−２−イル）ホルムアミド］ブタンアミド（化合物Ｂ）の調製。２リットル四つ口丸底フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、熱電対、凝縮器、加熱マントル、温度調節器、および窒素出口を装備した後、１７５ｇ（０．３６３ｍｏｌ）の６−（２Ｓ，３Ｒ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル｝−３−ヒドロキシ−２−｛（６−フェニルピリジン−２−イル）ホルムアミド］ブタンアミドおよび１４００ｍＬ（８容積）の９５％エタノールを装入する。撹拌を開始し、得られる懸濁液を２１分にわたり７５．７℃に加熱する。その温度になると、溶液を７４．９〜７５．８℃で８０分間撹拌した後、８０分にわたり２．７℃に冷却する。次に、反応スラリーを２．２〜６．０℃で一晩（１７時間）撹拌して、生成物を完全に結晶化させる。沈殿した固体を、閉鎖した濾過フラスコを用いて真空濾過によって回収し、湿ケーキを、３５０ｍＬの９５％エタノールで洗浄する。密封した濾過用漏斗を、開いた状態のグローブボックスに移し、前記２０３．８ｇの湿ケーキをパイレックス乾燥トレイに移し、次にそれを真空オーブンの中に入れる。生成物を２３．５インチのＨｇおよび５０℃で１９時間にわたって一定重量まで乾燥させて、１４７．３ｇ（０．３０６ｍｏｌ、８４．２％）の標題化合物を化学純度９９．７６％および光学純度>９９．８％ｄｅで得る。
【００５８】
調製３  ［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［［（６−フェニルピリジン−２−イル）カルボニル］アミノ］−１−オキソブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸（すなわち、化合物Ａ）。熱電対、撹拌子、および窒素出口を装備した５０ｍＬ三つ口丸底フラスコに、１．６５ｇ（３．４ｍｍｏｌ）の６−（２Ｓ，３Ｒ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル｝−３−ヒドロキシ−２−｛（６−フェニルピリジン−２−イル）ホルムアミド］ブタンアミド（化学純度＝９９．５％、キラル純度>９９．５％ｄｅ）、１７ｍＬのメチルイソブチルケトン、および１．７ｍＬの２Ｎ塩酸を装入する。混合物を一晩撹拌する。反応物の層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で蒸発乾固させる。残渣をペンタンでトリチュレートし、結果として生じる白色の固体を真空濾過によって回収した後、６０℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、１．２６ｇ（３．１ｍｍｏｌ、９０％）の標題化合を得る。ＨＰＬＣは、純度９９．６Ａ％を示す。キラル純度>９９．５％ｄｅ。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ４−ＭｅＯＤ、４００  ＭＨｚ）  δ  ８．１７（ｍ，２Ｈ）、８．１３（ｍ，１Ｈ）、８．０５（ｍ，２Ｈ）、７．５（ｍ，３Ｈ）、４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０４Ｈｚ）、４．４２（ｄｑ，１Ｈ，Ｊ＝２．９２，６．４）、２．７（ｔ，ｂ，１Ｈ）、１．６１（ｍ，１Ｈ）、１．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４８Ｈｚ）、１．２９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３６Ｈｚ）、０．８９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５２Ｈｚ）。
【００５９】
調製４  （２Ｓ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル］−３−フェニル−２−（ピラジン−２−イルホルムアミド）プロパンアミド（すなわち、ボルテゾミブのジエタノールアミンエステル）：
工程Ａ  ピラジン−２−カルボニルクロリドの調製。撹拌子、熱電対、デジタル式温度調節器を含む加熱マントル、凝縮器、および窒素入口／出口を装備した５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、１５ｇ（０．１２ｍｏｌ）のピラジンカルボン酸、２２５ｍＬのトルエン（Ｋｆ<０．０２重量％）、および２６．４ｍｌ（４３ｇ、０．３６ｍｏｌ）の塩化チオニルを装入する。希薄なスラリーを７５℃に加熱し、一晩撹拌する（１０〜１６時間）。反応混合物を室温まで冷却した後、溶媒および過剰な塩化チオニルを、次の通り真空除去する：反応混合物を高真空下６０℃（浴温度）でその元の容積の約１／３までストリッピングし、次に（１７５ｍｌ）の新鮮なトルエンを添加する。濃縮を継続し、再び元の容積の約１／３までストリッピングし、それに続いて２２５ｍｌの新鮮なトルエンで再希釈してトルエン溶液のピラジン酸塩化物を得る。
【００６０】
工程Ｂ  （Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−カルボニル）−アミノ］−プロピオン酸の調製。第２の５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、撹拌子、熱電対、均圧滴下漏斗、窒素入口／出口、および氷水冷却浴を装備する。Ｌ−フェニルアラニン、２０．２ｇ（０．１２２ｍｏｌ）を添加し、それに続いて２８．２ｇ（０．２６６ｍｏｌ）の炭酸ナトリウムおよび２２５ｍＬの脱イオン水を添加する。水溶液を１０．０℃に冷却する。この間に、前記添加漏斗に、工程Ａで調製した酸塩化物／トルエン溶液（約１２５ｍＬ）を装入する。このトルエン溶液を水性反応物に約１０℃でおよそ１０分にわたり滴下する。添加が完了すると、反応物を室温（約２２〜２５℃）まで温め、３時間激しく撹拌する。次に、反応混合物を分液漏斗に移し、２つの層を分離する。次に、下側の水相を前記反応フラスコに再び装入する。次に、メタノール（１２５ｍＬ）を赤色の溶液に添加し、それに続いて温度を１５〜２０℃に保ちながら３．０Ｍ  ＨＣｌ（約１７５ｍＬ）でｐＨを調節する（目標ｐＨ＝１〜２）。ｐＨ＝約５でいくらかの排ガスが生じ、それに続いてｐＨ＝３で生成物が沈殿する。スラリーをｐＨ調節後に周囲温度で３０分間室温で撹拌する。得られる桃色の固体沈殿物を、真空濾過によって回収し、（母液損失<２ｍｇ／ｍＬ）、脱イオン水で洗浄し（１×５０ｍｌ）、その後４０℃の真空オーブン中で窒素掃引して一定重量まで乾燥させて、１１．９２ｇ（０．４３．９ｍｍｏｌ、３６％）の標題化合物をＨＰＬＣ純度９９Ａ％で得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）  δ  １３．０４（ｓ，１Ｈ）、９．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４４Ｈｚ）、８．８８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．４８，６．１６Ｈｚ）、８．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５２，２．４Ｈｚ）、７．２５（ｍ，４Ｈ）、７．１８（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４８，８．０８Ｈｚ）、３．２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．７９，５．３２Ｈｚ）。
【００６１】
工程Ｃ  Ｎ−［（１Ｓ）−１［［［（１Ｒ）−１−［３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］−２−ベンジル］２−ピラジンカルボキサミドの調製。撹拌子、添加漏斗、熱電対、窒素入口／出口、および冷却浴を装備した５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、１１ｇ（９９．９ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン−２−カルボニル）−アミノ］−プロピオン酸、１５．５．０ｇ（４０．６ｍｍｏｌ）のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、１２．２ｇ（４０．６ｍｍｏｌ）の（１Ｒ）−１−［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチルアミン塩酸塩（イソブチルジアステレオマー（Ｒ：Ｓ）の８７：１３混合物）、および１６５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を装入する。淡黄色の反応溶液を−３５℃に冷却し、そこに１２．６ｇ（１７ｍＬ、９７．３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジ−イソプロピルエチルアミンを６分にわたり−３４℃〜−３５℃で滴下する。次に、得られる溶液を−４０〜−１１℃で一晩撹拌する。反応混合物を６００ｍｌの１：１冷水／酢酸エチル混合物でクエンチする。分液漏斗に移した後、層を分離する。次に、有機相を１０％リン酸水素ナトリウム水溶液（１×２００ｍＬ）、８％重炭酸ナトリウム水溶液（２×２００ｍＬ）、および飽和塩化ナトリウム（１×２００ｍＬ）で連続的に洗浄する。生成物溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過する。濾液を真空で蒸発乾固させて、１９．５７ｇ（３７．７ｍｍｏｌ、９３％）の標題化合物Ａを、ＨＰＬＣ純度９２Ａ％の淡褐色の泡沫として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００  ＭＨｚ）  δ  ９．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４４Ｈｚ）、８．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４８Ｈｚ）、８．７（ｍ，３Ｈ）、７．２５（ｍ，４Ｈ）、７．１８（ｍ，１Ｈ）、４．８９（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．８８，１５．４Ｈｚ）、４．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，８．５６Ｈｚ）、３．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ）、２．７（ｍ，ｂ，１Ｈ）、２．２２（ｍ，ｂ，１Ｈ）、２．０５（ｍ，ｂ，１Ｈ）、１．８７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ）、１．８１（ｓ，ｂ，１Ｈ）、１．６７（ｄ，ｂ，１Ｈ）、１．５２（ｍ，ｂ，１Ｈ）、１．１３−１．３３（ｍ，９Ｈ）、０．８３（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝２．４８，６．５６Ｈｚ）、０．８０（ｓ，３Ｈ）。
【００６２】
工程Ｄ  （２Ｓ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル］−３−フェニル−２−（ピラジン−２−イルホルムアミド）プロパンアミド（すなわち、ボルテゾミブのジエタノールアミンエステル）の調製。１リットル四つ口丸底フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、熱電対、および窒素入口／出口を装備した後、１９．０ｇ（３６．６ｍｍｏｌ）のＮ−［（１Ｓ）−１［［［（１Ｒ）−１−［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］−２−ベンジル］２−ピラジンカルボキサミド、９．３２ｇ（９１．５ｍｍｏｌ）のイソブチルボロン酸、１９０ｍＬのメタノール、３４．７ｍＬ（６９．４ｍｍｏｌ）の２Ｍ塩酸水溶液、および２８５ｍＬのヘプタンを装入する。二相の反応物を、残っている出発物質が面積で<２％とＩＰＣによって示されるまで室温にて一晩撹拌する。反応混合物を分液漏斗に移し、層を分離する。下側のメタノール層を、ヘプタン（２×２５０ｍＬ）で洗浄した後、１リットル丸底フラスコに移動させ、真空で蒸発乾固する。得られる残渣を、３００ｍＬの酢酸エチルに溶解し、それを、８％重炭酸ナトリウム水溶液（２×２００ｍＬ）およびブライン（１×３００ｍＬ）で洗浄した後、上記の通り装備した清潔な１リットル三つ口丸底フラスコに移す。
【００６３】
前記酢酸エチル溶液に、４．１ｇ（３８．４ｍｍｏｌ）のジエタノールアミンを添加し、混合物を室温で約１０〜１００時間撹拌する。得られる固体を真空濾過によって回収し、酢酸エチル（１×３０ｍＬ）で洗浄した後、５０℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、標題化合物を白色固体として得（１５．８ｇ、３４．９ｍｍｏｌ、９５．２％）、それはＨＰＬＣによってジアステレオマーの９１：９混合物（すなわち、８２％ｄｅ）であることが示される。
【００６４】
工程Ｅ（任意選択）  （２Ｓ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル］−３−フェニル−２−（ピラジン−２−イルホルムアミド）プロパンアミド（すなわち、ボルテゾミブのジエタノールアミンエステル）の精製。（２Ｓ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル］−３−フェニル−２−（ピラジン−２−イルホルムアミド）プロパンアミドを、撹拌子、熱電対、加熱マントル、制御器、凝縮器、および窒素入口／出口を装備した２５０ｍｌ三つ口（ｔｈｒｅｅ）丸底フラスコに装入する。次に、エタノール（無水、１２８ｍＬ）を前記フラスコに装入し、加熱還流する。溶解しなかった固体（これは約（２：８）で望ましくない異性体中に豊富である）を真空濾過によって除去する。濾液を前記丸底フラスコに戻し、室温まで冷却して生成物を結晶化し、それを真空濾過によって単離し、冷無水エタノール（１×５０ｍｌ）で洗浄し、５０℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、１１．６ｇ（２５．６ｍｍｏｌ、７０％）の標題化合物をジアステレオマーの９４：６混合物（すなわち、８８％ｄｅ）として得る。化学純度は、>９９．９Ａ％である。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ、４００  ＭＨｚ）  δ  ９．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ）、８．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４８Ｈｚ）、８．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８４Ｈｚ）、８．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５２，２．３２Ｈｚ）、７．３（ｍ，５Ｈ）、６．５５（ｓ，ｂ，１Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、３．６５（ｍ，２Ｈ）、３．５５（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、２．９−３．２（ｍ，４Ｈ）、２．８（ｍ，１Ｈ）、２．７（ｍ，２Ｈ）、１．５６（ｍ，１Ｈ）、１．３３（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．０４，１３．８０Ｈｚ）、１．１８（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．４８，９．８８Ｈｚ）、０．８（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６４，１２．５６Ｈｚ）。
【００６５】
調製５  ボルテゾミブ。１００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、撹拌子、熱電対、および窒素入口／出口を装備した後、５．０ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）の（２Ｓ）−Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，３，６，２−ジオキサザボロカン−２−イル）−３−メチルブチル］−３−フェニル−２−（ピラジン−２−イルホルムアミド）プロパンアミド（すなわち、ボルテゾミブのジエタノールアミンエステル）、５０ｍｌのメタノール、および１０．４ｍｌの２Ｎ塩酸水溶液を装入する。反応物を室温で一晩撹拌した後、溶媒を４０℃の真空で除去する。得られる残渣を、５０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（１×５０ｍＬ）で洗浄した後、再度有機層を真空で濃縮乾固する。次に、窒素下、５０ｍＬのペンタンで室温で一晩残渣をトリチュレートする。得られる自由流動固体を真空濾過によって回収し、ペンタン（１×２０ｍｌ）で洗浄した後、３０℃の真空オーブンで一晩乾燥させて、３．２９ｇ（８．５６ｍｍｏｌ、８２．３％）の標題化合物を、化学純度>９９．８Ａ％およびジアステレオマー比９３．５：６．５（すなわち、８７％ｄｅ）の白色固体として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ４−ＭｅＯＨ、４００  ＭＨｚ）  δ  ９．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３６Ｈｚ）、８．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４８Ｈｚ）、８．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５２，２．４４Ｈｚ）、７．２７（ｍ，４Ｈ）、７．２１（ｍ，１Ｈ）、５．０５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６８Ｈｚ）、３．２（ｍ，２Ｈ）、２．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ）、１．３９（ｍ，１Ｈ）、１．１７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１２Ｈｚ）、０．８３（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝５．３２、６．４０Ｈｚ）。
【００６６】
調製６  ６−フェニル−ピリジン−２−カルボン酸｛（１Ｓ，２Ｒ）−１−［（Ｒ）−１−（４，８−ジメチル−［１，３，６，２−ジオキサボロカン（ｄｉｏｘａｂｏｒｏｃａｎ）−２−イル）−３−メチルブチルカルバモイル｝−２−２−ヒドロキシプロピル｝アミド（すなわち、化合物Ａのジイソプロパノールアミンエステル）。
【００６７】
５０ｍＬ四つ口丸底フラスコに、撹拌子、熱電対、温度調節器をもつ加熱マントル、凝縮器、および窒素入口を装備した後、２．０ｇ（３．６５ｍｍｏｌ）のＮ−［（１Ｓ，２Ｒ）−１［［［（１Ｒ）−１−１［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］２−ヒドロキシプロピル］−６−フェニル−２−ピリジンカルボキサミド（化学純度＝９５．７％、キラル純度約９７．５％ｄｅ（前記Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−１［［［（１Ｒ）−１−１［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチル］アミノ］カルボニル］２−ヒドロキシプロピル］−６−フェニル−２−ピリジンカルボキサミドを作成するために用いた（１Ｒ）−１−［（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，７ａＲ）−ヘキサヒドロ−３ａ，５，５−トリメチル−４，６−メタノ−１，３，２−ベンゾジオキサボロール−２−イル］−３−メチルブチルアミンが９７．５％ｄｅを有するという事実に基づく））、３０ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）、および０．６１ｇ（９４．５６ｍｍｏｌ、１．２５当量）のジイソプロパノールアミンを装入する。結果として生じる黄色の溶液を、２０〜２５℃で１６時間撹拌する。さらなる１．２ｇ（９ｍｍｏｌ、２．５当量）のジイソプロパノールアミンを装入し、混合物を１６時間４０℃に加熱した後、室温まで冷却する。白色の固体を、真空濾過によって回収し、１５ｍＬのＭＴＢＥで洗浄し、その後３３℃で一晩真空乾燥させて、１Ｈ  ＮＭＲに基づいて１．３１ｇ（２．５５ｍｍｏｌ、７０％）の目的生成物を得る。化学純度は９６．８Ａ％であり、ＨＰＬＣによってジアステレオマーは検出されない（>９９．８％ｄｅ）。
【００６８】
急性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデル
動物
６週齢ループス易発性の雌ＭＲＬ／ｌｐｒ（ジャクソン研究所、＃０００４８５）および非ループス易発性の対照ＭＲＬ／ＭｐＪ（ジャクソン研究所、＃０００４８６）マウスを、ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から６週齢で入手する。すべてのマウスは、食料および水を自由に利用できる状態で２４時間の明／暗周期で維持される。すべての実験動物の手順は、セファロン社の施設実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ）の規制によって認可され、それに従う；認可されたＩＡＣＵＣプロトコールは＃０３−０４０および＃０３−０３−０４１である。
【００６９】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、一次および二次リンパ組織における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の適切なアポトーシスを妨げる不活性Ｆａｓ分子（中枢および末梢の両方の耐性機構の欠乏）に起因して、急速なリンパ増殖性疾患を発症する。この耐性機構の機能低下に起因して、末梢に入るすべてのＴ細胞およびＢ細胞の一定割合が自己タンパク質／組織に応答する見込みが高く、従って生涯の早期に自己免疫を惹起する。ＭＲＬ／ｌｐｒモデルマウスは、抗核抗体の生成、関節炎、皮膚科学的徴候、タンパク尿をもたらす免疫複合体媒介性糸球体腎炎および最終的な死を含む、初期および後期ループスに特有のいくつかの慢性炎症性疾患様症状を発症する。それよりも例の少ない特徴付けられた現象はＣＮＳおよび心臓徴候であり、それは両方ともにヒトでのほうが一般的である。以前の最適化および妥当性試験は、罹患したＭＲＬ／ｌｐｒ動物だけに疾患が現れて、対照マウスＭＲＬ／Ｍｐに現れないこと、および抗核抗体（ＡＮＡ）が４週〜１２週間に急速に生じ、１８週〜２５週ごろにタンパク尿の存在を伴ってループス腎炎の発症をもたらすことを明らかに示した。死亡率は雌のほうが高く、２５週齢ごろに起こり、腎疾患には、糸球体腎炎、糸球体浸潤、硬化症および脈管炎がある。皮膚炎に関連する脾腫大およびリンパ肥大の両方も観察することができる。
【００７０】
抗核抗体（ＡＮＡ）ＥＬＩＳＡアッセイ
血清抗ｄｓＤＮＡおよび抗スミス抗原抗体の測定は、社内で作成したカスタムＥＬＩＳＡアッセイによって行う。クロマチンをコーティングしたプレートを、Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃより購入する。精製ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）または精製ウシスミス抗原（ＧｅｎＷａｙ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、それぞれ、抗ｄｓＤＮＡおよび抗スミスＡｇ抗体の検出のための被覆抗原として使用する。コーティングしたプレートを 、ホウ酸硫酸生理食塩水（ＢＳＳ）で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤を含有するＢＳＳでブロッキングする。マウス抗クロマチン抗体（シグマ、２Ｂ１）または２５週齢ＭＲＬ／ｌｐｒ血清を用いて検量線を作成する。マウス抗ｄｓＤＮＡ抗体（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、またはマウス抗スミス抗原抗体（Ａｂｃａｍ）を、各々のアッセイの基準として使用する。二次抗体はＡｂｃａｍより購入し（ヤギ抗マウスｐＡｂ−ＨＲＰ）、基質はＲｏｃｋｌａｎｄ（ペンシルベニア州ギルバーツビル）より購入し（ＴＭＢ）、停止反応緩衝液は、１ｍＬの濃硫酸を２０ｍＬのｄＨ２Ｏ中に用いて作製する。展開したプレートは、４５０ｎｍで読み取るＶｉｃｔｏｒ−Ｘ４分光光度計を用いて基準波長５７０ｎｍで読み取る。すべてのＡＮＡ  ＥＬＩＳＡアッセイに関して、検量線に沿って最低点で設定されたかまたは製造業者によって設定された検出限界よりも低い値は、範囲外とみなされて評価されないが、その特定のアッセイの検量線に沿った最低点と推定される。
【００７１】
抗体分泌Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔの構成部品を、ＭａｂＴｅｃｈ（ナッカストランド、スウェーデン）から取り寄せ、ニトロセルロースＩＰフィルタープレートを、ミリポア（マサチューセッツ州カベリリカ）から取り寄せる。精製ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（シグマ）、精製ウシスミス抗原（ＧｅｎＷａｙ）、または溶解ニワトリ赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ペンシルベニア州ギルバーツビル）由来の煮沸し濾過精製したニワトリクロマチンのいずれか１０μｇ／ｍＬでＥｌｉｓｐｏｔウェルをコーティングする。脾臓をガラス均質化を用いて加工処理し、６０μｍ滅菌細胞ストレーナーに通して濾過し、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）溶解緩衝液を用いて赤血球（ＲＢＣｓ）を溶解する。加工処理した脾細胞を、培地の各ウェルに添加する。抗体分泌細胞型（ＡＳＣｓ）の真の生体外の出現頻度を歪めることを避けるために、細胞をＬＰＳのようなポリクローナルマイトジェンで刺激せず、むしろ単独で媒体中でインキュベートして、本当の生体外の抗体放出のモニタリングができるようにする。抗マウスｐａｎ−ＩｇＧを、全ＩｇＧ産生ＡＳＣｓの陽性対照として使用し、結果を正規化するために使用する。各々の抗原の出現頻度は、各々のモデルの最初の試験段階で確認する。クロマチンおよび全ＩｇＧのみに対して、３０，０００個の脾細胞を各ウェルに添加する；スミス抗原およびｄｓＤＮＡに対して、５００，０００個の細胞を各ウェルに添加する。ウェルあたりのスポット出現頻度の飽和限度によって、異なる数の脾細胞が異なる抗原に添加される。これらの限度は以前に確立されている。Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔを３７℃で一晩インキュベートする。各々のアッセイを展開するために、二次抗体を各ウェルに加え、インキュベートし、洗浄し、アルカリホスファターゼストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）を複合体として使用する；使用する基質はＢＣＩＰ−ＮＢＴである。スポットが見えるまでプレートを展開する。すべてのＥｌｉｓｐｏｔ解析は、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｃ．Ｔ．Ｌ．スキャナおよびＢｉｏｓｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、オハイオ州シェイカーハイツ）を用いて実施する。結果は、培地および細胞だけのウェルを引いた値として示される。一部の値は、高いバックグラウンドのためにマイナスである。
【００７２】
フローサイトメトリー
洗浄し、ＲＢＣを溶解した脾細胞を、発表されたレポートで以前に用いられたように形質細胞マーカーに対して染色する（Ｎｅｕｂｅｒｔ、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。本明細書において用語「形質細胞」は、次の免疫表現型の定義をさす：つまり、形質細胞は、生きているＣＤ１９陰性、ＣＤ１３８陽性、細胞内κ軽鎖陽性のイベントと定義される。チューブ／試料あたり合計２００，０００〜５００，０００イベントを収集する。フロー染色プロトコールは、次の通りである、手短に言えば、細胞を完全培地（下に定義）および２．５μｇの抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃＢｌｏｃｋ）と抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１３８−ＡＰＣ抗体中に懸濁する。氷上での染色の２０分後、試料を洗浄した後、固定し、ＢＤ細胞内染色キットを用いて透過処理する。透過処理緩衝液中、抗κＩｇ軽鎖−ＰＥで試料を少なくとも１時間染色し、透過処理緩衝液で２回洗浄した後、最後に培地で洗浄し、氷上でのフロー分析のために調製する。下に記載されるように、すべての試料は適切な適合したアイソタイプを用いて複製される。
【００７３】
ＢＤ  Ｔｒｕｃｏｕｎｔ  Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番号３４０３３４、ロット番号６３０５０、ビーズカウント＝５０，９７９）を、すべてのフローサイトメトリーに基づく計数に使用する。フローサイトメトリーに使用する抗体は、抗マウスＣＤ１３８−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、抗マウスＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、抗マウスκ軽鎖−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ラットＩｇＧ１−ＡＰＣアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ラットＩｇＧ２ａ−ＰＥアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）から成る。すべての試料は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ、ミシガン州アナーバー）を用いて分析した。完全培地（Ｒ１０）を、すべてのＥｌｉｓｐｏｔ実施例用の脾細胞の生体外培養を含む、すべての実施例に使用する。完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、＋１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、１％Ｌ−Ｇｌｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、１％ＮＥＡＡ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、β−ＭＥ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）から成る。
【００７４】
血清サイトカイン試料のＬｕｍｉｎｅｘ分析
サイトカイン分析用の血清試料を加工処理するために、−８０℃の凍結血漿を氷上で解凍し、ボルテックスし、１０分間遠心分離して壊死組織片および凝集物を除去する。製造業者の説明書に従って、合計２５〜５０μＬの血清をＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイに使用する。１０種類の異なるマウスサイトカインを、Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０−ｐｌｅｘビーズキット（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、品番ＬＭＣ０００１）を用いて測定する。手短に言えば、フィルタープレート（ミリポア、マサチューセッツ州ビレリカ、品番ＭＡＩＰＳＷＵ１０）を、事前に２００μＬの洗浄液（キット構成品）で湿らせ、ウェルあたり２５μＬのビーズを添加する。血清試料を希釈し、ウェルあたり総容積５０μＬを添加する（すなわち、２５μＬの試料血清＋２５μＬの製造業者によって提供されるアッセイ希釈剤）。ビーズを含むプレートを暗所でオービタルシェーカーで室温（ＲＴ）にて２時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、プレート（類）をキット緩衝液で２回洗浄し、二次ビオチン化抗体を、前記キットに提供されるビオチン希釈剤中１：１０希釈（１００μＬ）で添加する。プレートを暗所で室温で１時間インキュベートした後、キット緩衝液で２回洗浄する。アッセイ希釈剤中のストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）を、ウェルあたり１００μＬで添加した後、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。プレートを３回洗浄した後、１００μＬのキット洗浄液を添加し、暗所で室温にて２〜３分かき混ぜる。このインキュベーション期間のすぐ後に、プレートを、データ獲得および分析ソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  ２００ユニット（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ、品番ＭＡＰ０２００）に流す。すべてのビーズ洗浄は真空マニホールドユニットを用いて実施される（Ｐａｌｌ、ミシガン州アナーバー、品番５０１７）。すべてのサイトカインＬｕｍｉｎｅｘアッセイに関して、基準に沿って最低点で設定された、または製造業者によって設定された検出限界よりも低い値は、範囲外とみなされて評価されないが、その特定のアッセイの検量線に沿った最低点と推定される。
【００７５】
尿分析
尿試料は、全タンパク質回収および分析のために酸沈殿させる。十分な尿が残っている試料を、Ｕｒｉｓｔｉｘ（登録商標）白血球尿分析に使用する。手短に言えば、標準タンパク質溶液を、正常なマウス血清から調製し、濁度によるマウス尿タンパク質アッセイの基準として使用する。標準試料は次の通り：０、５、１０、１５、２０、３０、４０、および５０μＬの、前記キットに提供される４ｍｇ／ｍＬマウス血清標準タンパク質溶液であり、２本のカラムに二重反復で添加される。ＰＢＳを個々のウェルに添加して、最終容積を５０μＬに調節する。尿試料調製のために、卓上型微量遠心機を用いて９８８０×ｇで３分間、尿試料を遠心分離する。尿上清（１〜５０μＬ）を二重反復で添加する。ＰＢＳを添加して、最終容積を５０μＬに調節する。濁度アッセイのために：２５μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを、空のカラムの中に添加し、２５０μＬの３％スルホサリチル酸（ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）を試験カラムに添加する。マイクロプレートを室温で１０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡリーダーを用いてプレートを４５０ｎｍの単一ビームで読み出す。Ｕｒｉｓｔｉｘ（登録商標）ストリップアッセイのために、ストリップを広げて標識する。２０マイクロリットルの尿を、各々の試験ストリップの正方形に置き、少なくとも３０秒間インキュベートした後、結果を記録する。すべての全尿分析プレートに基づくアッセイに関して、基準に沿って最低点で設定された、または製造業者によって設定された検出限界よりも低い値は、範囲外とみなされて評価されないが、その特定のアッセイの検量線に沿った最低点と推定される。
【００７６】
組織学
組織学的解析のために、各動物から左腎臓を取り出し、２５℃のオービタルロッカーの上で１０％緩衝中性１０％ホルマリン（ＥＭＤ）中で４８時間固定し、その後ｄＨ２Ｏを流して一晩洗浄し、加工処理する準備ができるまで４℃の７０％エタノール中で貯蔵する。組織学的解析に使用した腎臓染色には、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ&Ｅ）、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、およびトリクローム染色（ウィスター研究所、ペンシルベニア州フィラデルフィア）が含まれた。すべての３つの染色片は、病理学者によってスコアリングの目的のために使用される。すべての組織学的スコアリングは盲検で、独立した委員会認定獣医学病理学者（Ｊｕｌｉｅ  Ｅｎｇｉｌｅｓ、ＶＭＤ、ＤＡＣＶＰ）によって実施される。複数の染色を用いてスコア値を決定する。図１７の画像は、前記病理学者により盲検的に選択された、切片の最も悪く影響を受けた領域を示す。
【００７７】
腎臓ＩＣ−ＧＮスコアリング法（Ｓｍｉｔｈ，Ｄｏｎｇら、２００７）：
１．糸球体細胞充実度−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
２．糸球体壊死−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
３．糸球体硬化−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
４．間質浸潤−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
５．尿細管萎縮−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
６．間質線維化−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
７．脈管炎−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
具体的な病理学者定義：
・壊死は、「壊死」を示す糸球体係蹄内の核の壊死組織片／核濃縮の存在によって定義される。多くの試料において、これは糸球体係蹄のごく少数のセグメント内だけの非常に軽度の、珍しい知見である。ＰＡＳ陽性のトリクローム陰性物質の壊死による糸球体係蹄の消滅も考慮する。
・糸球体硬化は、糸球体係蹄または糸球体嚢の中の線維増殖または線維症の増加によって定義される。時折、糸球体硬化は「末期」の糸球体変化とみなされるが、ここでは糸球体「硬化」として「活発な」進行性線維症を示すものと分類する。
・尿細管萎縮は、管腔径の増大および／または腎尿細管上皮の平坦化、または尿細管の脱落によって分類される。
・間質浸潤は、炎症性浸潤とみなされる。
・脈管炎−非炎症性（退行性／増殖性）脈管病理を考慮する脈管炎のより緩い定義。大部分の脈間の変化は軽度であり、平滑筋細胞の増殖、および細胞外基質のヒアリン化を特徴とする「動脈硬化症」とみなすことができ得る。この変化は、糸球体病理に対して二次的な高血圧症を反映することがある。ごく少数の動物において明白な「脈管炎」がある。最も炎症性の変化は、血管壁内部であり、内皮への損傷はほとんど〜全くなく、明白な出血／フィブリン漏出はない。また、多くが線維芽細胞の血管周囲縁を有する。
【００７８】
薬力学（ＰＤ）解析
脾臓および腎臓を、１１８日目の最終用量の投与の３時間後に採取し、冷却したイソペンテンとともにドライアイスで瞬間冷凍し、−８０℃で貯蔵する。溶解した脾臓および腎臓を、以下のプロトコールを用いて加工処理する。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、品番５３９１３６）およびＨａｌｔホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番７８４２０）またはＲｏｃｈｅホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、品番０４９０６８３７００１）を組織抽出試薬Ｉ（インビトロジェン、品番ＦＮＮ００７１）中で合することにより作成した７００マイクロリットルの「組織抽出緩衝液」を、各々の試料に添加する。試料は、ＰＴ１０−３５ポリトロンホモジナイザー（ＶＷＲ、品番９７０３６−０８２）を用いて凍結した状態で均質化する。均質化の後、４℃で２０００×ｇで１０分間、前記試料を遠心分離し、４℃で最大速度１４，０００×ｇで１５分間、上清を再び遠心分離する。脂質／脂肪壊死組織片の上層を拾い上げないように、上清を注意深く取り除く。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス、品番８３２２８）を用いてタンパク質濃度を３ｍｇ／ｍｌに調節する。脾臓プロテアソーム活性を、２０Ｓ蛍光発生アッセイ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カタログ番号１０００８０４１、ロット番号０４１４６９８−１）を用いて分析し、腎臓におけるプロテアソーム活性の調節を、ＩκＢαの蓄積のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７３５５、ロット番号１７）を用いて分析する。両方のアッセイは、製造業者の説明書に従って実施する。
【００７９】
自発性進行性ループス腎炎モデル
動物
自発性ＳＬＥ易発性ＮＺＢＷＦ１／J（ＮＺＭ）（カタログ番号１００００８）雌マウスおよび（実施例の時間内で）非ループス易発性のＮＺＷ／ＬａｃＪ（カタログ番号００１０５８）雌マウスを、ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から６週齢で入手する。すべてのマウスは、食料および水を自由に利用できる状態で２４時間の明／暗周期で維持される。すべての実験動物の手順は、セファロン社の施設実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ）の規制によって認可され、それに従う；認可されたＩＡＣＵＣプロトコールは＃０３−０４０および＃０３−０３−０４１である。
【００８０】
ＮＺＭ系統は、遺伝的な進行性の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルとして働く。ＮＺＭマウスにおける疾患の進化は、ＤＮＡおよびその他の核内抗原に対する抗体、および細胞骨格タンパク質に対する抗体をはじめとする様々な自己抗体の多量産生を含む、ポリクローナルＢ細胞の活性化の異常を特徴とする。循環免疫複合体の上昇は、老齢マウスにおいて致死的な糸球体腎炎を引き起こし得る。実施例に関して、動物は同齢であり、試験は２８週齢で開始され、マウスは４０週齢まで処置される。
【００８１】
フローサイトメトリーおよび抗体
フローサイトメトリーに使用される抗体は、抗マウスＣＤ１３８−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、抗マウスＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、抗マウスＣＤ３８−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、および抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０−Ｃｙｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ラットＩｇＧ１−ＡＰＣアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ラットＩｇＧ２ａ−ＰＥアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）から成る。すべての試料は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ、ミシガン州アナーバー）を用いて分析した。完全培地を、すべてのＥｌｉｓｐｏｔ実施例用の脾細胞の生体外培養を含む、すべての実施例に使用する。完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、＋１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、１％Ｌ−Ｇｌｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、１％ＮＥＡＡ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、１％ＮＥＡＡ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、β−ＭＥ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）、＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）から成る。
【００８２】
抗核抗体（ＡＮＡ）ＥＬＩＳＡアッセイ
血清抗ｄｓＤＮＡおよび抗スミス抗原抗体の測定は、社内で作成したカスタムＥＬＩＳＡアッセイによって行う。クロマチンをコートしたプレートを、Ｉｎｏｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃより購入する。精製ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）または精製ウシスミス抗原（ＧｅｎＷａｙ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、それぞれ、抗ｄｓＤＮＡおよび抗スミスＡｇ抗体の検出のための被覆抗原として使用する。コーティングしたプレートを、ホウ酸硫酸生理食塩水（ＢＳＳ）で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤を含有するＢＳＳでブロッキングする。マウス抗クロマチン抗体（シグマ、２Ｂ１）または２５週齢ＭＲＬ／ｌｐｒ血清を用いて検量線を作成する。マウス抗ｄｓＤＮＡ抗体（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）またはマウス抗スミス抗原抗体（Ａｂｃａｍ）を、各々のアッセイの基準として使用する。二次抗体はＡｂｃａｍより購入し（ヤギ抗マウスｐＡｂ−ＨＲＰ）、基質はＲｏｃｋｌａｎｄ（ペンシルベニア州ギルバーツビル）より購入し（ＴＭＢ）、停止反応緩衝液は、１ｍＬの濃硫酸を２０ｍＬのｄＨ２Ｏ中に用いて作成する。展開したプレートは、４５０ｎｍで読み取るＶｉｃｔｏｒ−Ｘ４分光光度計を用いて基準波長５７０ｎｍで読み取る。
【００８３】
抗体分泌Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔの構成部品を、ＭａｂＴｅｃｈ（ナッカストランド、スウェーデン）から取り寄せ、ニトロセルロースＩＰフィルタープレートを、ミリポア（マサチューセッツ州カベリリカ）から取り寄せる。精製ウシ胸腺ｄｓＤＮＡ（シグマ）、精製ウシスミス抗原（ＧｅｎＷａｙ）、または溶解ニワトリ赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ペンシルベニア州ギルバーツビル）由来の煮沸し濾過精製したニワトリクロマチンのいずれか１０μｇ／ｍＬでＥｌｉｓｐｏｔウェルをコーティングする。脾臓をガラス均質化（フロストスライド）を用いて加工処理する。分散した細胞内容物を滅菌ＨＢＳＳで洗浄し、１×ＲＢＣ溶解緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０３０１）を用いてＲＢＣを溶解する。加工処理した脾細胞を各ウェルに添加し、抗体分泌細胞型（ＡＳＣｓ）の真の生体外の出現頻度を歪めることを避けるために、リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激しない。抗マウスｐａｎ−ＩｇＧを、全ＩｇＧ産生ＡＳＣｓの陽性対照として使用し、結果を正規化するために使用する。各々の抗原の出現頻度は、各々のモデルの最初の試験段階で確認する。クロマチンおよび全ＩｇＧのみに対して、３０，０００個の脾細胞を各ウェルに添加する；スミス抗原およびｄｓＤＮＡに対して、５００，０００個の細胞を各ウェルに添加する。ウェルあたりのスポット出現頻度の飽和限度のために、異なる数の脾細胞が異なる抗原に添加される。Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔを３７℃で一晩インキュベートする。各々のアッセイを展開するために、二次抗体を各ウェルに加え、インキュベートし、洗浄し、アルカリホスファターゼストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）（ジャクソン・イムノリサーチ、ペンシルベニア州ウェストグローブ）を複合体として使用する；使用する基質はＢＣＩＰ−ＮＢＴ（ＭａｂＴｅｃｈ、オハイオ州シンシナティ）である。スポットが見えるまでプレートを展開する。すべてのＥｌｉｓｐｏｔ解析は、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｃ．Ｔ．Ｌ．スキャナおよびＢｉｏｓｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、オハイオ州シェイカーハイツ）を用いて実施する。結果は、培地および細胞だけのウェルを引いた値として示される。一部の値は、高いバックグラウンドのためにマイナスである。
【００８４】
血清サイトカイン試料のＬｕｍｉｎｅｘ分析
サイトカイン分析用の血清試料を加工処理するために、−８０℃の凍結血漿を氷上で解凍し、ボルテックスし、１０分間遠心分離して（１０，０００×ｇ）壊死組織片および凝集体を除去する。合計２５〜５０μＬの血清を、製造業者の説明書に従ってＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイに使用する。１０種類の異なるマウスサイトカインを、Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０−ｐｌｅｘビーズキット（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド、品番ＬＭＣ０００６）を用いて測定する。手短に言えば、フィルタープレート（ミリポア、マサチューセッツ州ビレリカ、品番ＭＡＩＰＳＷＵ１０）を、事前に２００μＬの洗浄液（キット構成品）で湿らせ、ウェルあたり２５μＬのビーズを添加する。血清試料を希釈し、ウェルあたり総容積５０μＬを添加する（すなわち、２５μＬの試料血清＋２５μＬの製造業者によって提供されるアッセイ希釈剤）。ビーズを含むプレートを暗所でオービタルシェーカーで室温（ＲＴ）にて２時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、プレート（類）をキット緩衝液で２回洗浄し、二次ビオチン化抗体を、前記キットに提供されるビオチン希釈剤中１：１０希釈（１００μＬ）で添加する。プレートを暗所で室温で１時間インキュベートした後、キット緩衝液で２回洗浄する。アッセイ希釈剤中のストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）を、ウェルあたり１００μＬで添加した後、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。プレートを３回洗浄した後、１００μＬのキット洗浄液を添加し、暗所で室温にて２〜３分かき混ぜる。このインキュベーション期間のすぐ後に、プレートを、データ獲得および分析ソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  ２００ユニット（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ、品番ＭＡＰ０２００）に流す。すべてのビーズ洗浄は真空マニホールドユニットを用いて実施される（Ｐａｌｌ、ミシガン州アナーバー、品番５０１７）。すべてのサイトカインＬｕｍｉｎｅｘアッセイに関して、基準に沿って最低点で設定された、または製造業者によって設定された検出限界よりも低い値は、範囲外とみなされて評価されないが、その特定のアッセイの検量線に沿った最低点と推定される。
【００８５】
尿分析
尿試料は、全タンパク質分析のために酸沈殿させる。尿試料調製のために、卓上型微量遠心機を用いて１０，０００ｒｐｍで３分間、尿試料を遠心分離する。１〜５０μＬの尿上清を二重反復で添加する。ＰＢＳを添加して、最終容積を５０μＬに調節する。濁度アッセイのために：２５μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを、空のカラムの中に添加し、２５０μＬの３％スルホサリチル酸（ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）を試験カラムに添加する。マイクロプレートを、室温で１０分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡリーダーを用いてプレートを４５０ｎｍの単一ビームで読み出す。標準タンパク質溶液を、正常なマウス血清から調製し、濁度によるマウス尿タンパク質アッセイの基準として使用する。標準試料は次の通り：０、５、１０、１５、２０、３０、４０、および５０μＬの、前記キットに提供される４ｍｇ／ｍＬマウス血清標準タンパク質溶液であり、２本のカラムに二重反復で添加される。ＰＢＳを個々のウェルに添加して、最終容積を最終容積を５０μＬに調節する。十分な尿が残っている試料を、Ｕｒｉｓｔｉｘ（登録商標）白血球尿分析に使用する。Ｕｒｉｓｔｉｘ（登録商標）ストリップアッセイのために、ストリップを広げて標識する。２０マイクロリットルの尿を、各々の試験ストリップの正方形に置き、少なくとも３０秒間インキュベートした後、結果を記録する。すべての全尿分析プレートに基づくアッセイに関して、基準に沿って最低点で設定された、または製造業者によって設定された検出限界よりも低い値は、範囲外とみなされて評価されないが、その特定のアッセイの検量線に沿った最低点と推定される。
【００８６】
組織学
組織学的解析のために、各動物から左腎臓を取り出し、２５℃のオービタルロッカーの上で１０％緩衝中性ホルマリン（ＥＭＤ）中で４８時間固定し、その後ｄＨ２Ｏを流して一晩洗浄し、加工処理する準備ができるまで４℃の７０％エタノール中で貯蔵する。組織学的解析に使用した腎臓染色には、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ&Ｅ）、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）およびトリクローム染色（ウィスター研究所、ペンシルベニア州フィラデルフィア）が含まれた。すべての３つの染色片は、病理学者によってスコアリングの目的のために使用される。すべての組織学的スコアリングは盲検で、独立した委員会認定獣医学病理学者（Ｊｕｌｉｅ  Ｅｎｇｉｌｅｓ、ＶＭＤ、ＤＡＣＶＰ）によって実施される。複数の染色を用いてスコア値を決定する。図３９の画像は、前記病理学者により盲検的に選択された、切片の最も悪く影響を受けた領域を示す。
【００８７】
腎臓ＩＣ−ＧＮスコアリング法（Ｓｍｉｔｈ，Ｄｏｎｇら、２００７）：
１．糸球体細胞充実度−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
２．糸球体壊死−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
３．糸球体硬化−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
４．間質浸潤−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
５．尿細管萎縮−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
６．間質線維化−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
７．脈管炎−スコア１〜５：無、低度、中等度、高度、重度
具体的な病理学者定義：
・壊死は、「壊死」を示す糸球体係蹄内の核の壊死組織片／核濃縮の存在によって定義される。多くの試料において、これは糸球体係蹄のごく少数のセグメント内だけの非常に軽い、珍しい知見である。ＰＡＳ陽性のトリクローム陰性物質の壊死による糸球体係蹄の消滅（ｅｆｆａｃｅｍｅｎｔ）も考慮する。
・糸球体硬化は、糸球体係蹄または糸球体嚢の中の線維増殖または線維症の増加によって定義される。時折、糸球体硬化は「末期」の糸球体変化とみなされるが、ここでは糸球体「硬化」として「活発な」進行性線維症を示すものと分類する。
・尿細管萎縮は、管腔径の増大および／または腎尿細管上皮の平坦化、または尿細管の脱落によって分類される。
・間質浸潤は、炎症性浸潤とみなされる。
・脈管炎−非炎症性（退行性／増殖性）脈管病理を考慮する脈管炎のより緩い定義。大部分の脈間の変化は軽度であり、平滑筋細胞の増殖および細胞外基質のヒアリン化を特徴とする「動脈硬化症」とみなすことができ得る。この変化は、糸球体病理に対して二次的な高血圧症を反映することがある。ごく少数の動物において明白な「脈管炎」がある。最も炎症性の変化は、血管壁内部であり、内皮への損傷はほとんど〜全くなく、明白な出血／フィブリン漏出はない。また、多くが線維芽細胞の血管周囲縁を有する。
【００８８】
Ｉ型コラーゲン架橋剤（ＣＴｘ）骨吸収バイオマーカーＥＬＩＳＡ
血清試料は、市販のキット（ＲａｔＬａｐｓ  ＥＩＡ、カタログ番号ＡＣ−０６Ｆ１、ロット番号４５３８  ＩＤＳ、アリゾナ州スコッツデール）を用いて分析する。アッセイは製造業者の指示する通り実施する。手短に言えば、ビオチン化ｒａｔｌａｐｓ抗原を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに最初に添加する。このプレートを覆い、室温で３０分間インキュベートする。プレートを洗浄液で５回洗浄し、適切なウェルにおいて標準品または未知の試料とともにインキュベートし、それに続いて一次抗体とともにインキュベートする。４℃で１８時間の一晩のインキュベートの後、緩衝液で洗浄する。２回目のインキュベーションは、各ウェルにペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを添加し、室温で１時間インキュベートする。暗所で室温で１５分間、発色基質溶液とともにインキュベートし、分析のために前記プレートを展開する。停止溶液により反応を停止させ、２時間以内に４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００８９】
血清Ｃ３補体ＥＬＩＳＡ
血清試料は、市販のキット（ＧｅｎＷａｙ、カタログ番号４０−３７４−１３００４７、ロット番号１０Ｅ）を用いて分析する。アッセイは製造業者の指示する通り実施する。血清試料を、希釈緩衝液中１対５０，０００倍に希釈する。標準品または未知の血清試料を各ウェルに添加し、プレートを室温で２０分間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄する。希釈した酵素−抗体複合体を各ウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートする。プレートを洗浄液で４回洗浄する。ＴＭＢ基質溶液を各ウェルに添加し、暗所で室温で１０分間インキュベートする。停止溶液により反応を停止させる。吸光度４５０ｎｍでプレートを読み取る。
【００９０】
血清ＩＦＮαＥＬＩＳＡ
血清試料は、市販のキット（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ、カタログ番号４２１００−１、ロット番号ＬＦ１３１８０５１ＰＢＬ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて分析する。アッセイは製造業者の指示する通り実施する。標準品または未知の試料を、各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを１回洗浄し、抗体溶液を各ウェルに添加し、室温で２４時間インキュベートする。ウェルを３回洗浄し、ブロットして半乾燥させる。ＨＲＰ複合体溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。次に、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質溶液とともに暗所で室温で１５分間インキュベートする。光学濃度を、停止溶液の添加の５分後に４５０ｎｍで測定する。
【００９１】
データ分析
データは、マイクロソフトＥｘｃｅｌ、またはグラフ作成にも使用されるＰｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ５．０を用いて計算する。統計分析は、一元配置、二元配置ＡＮＯＶＡ試験またはマン−ホイットニーの両側対応スチューデントｔ検定を用いて実施する。
【００９２】
薬力学（ＰＤ）解析
脾臓および腎臓を収集し、冷却したイソペンテンとともにドライアイスで瞬間冷凍し、−８０℃で貯蔵する。脾臓および腎臓の溶解は、以下のプロトコールを用いて実施する：プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、品番５３９１３６）およびＨａｌｔホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番７８４２０）またはＲｏｃｈｅホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、品番０４９０６８３７００１）を組織抽出試薬Ｉ（インビトロジェン、品番ＦＮＮ００７１）中で合することにより作製した７００マイクロリットル「組織抽出緩衝液」を、各試料に添加する。試料は、ＰＴ１０−３５ポリトロンホモジナイザー（ＶＷＲ、品番９７０３６−０８２）を用いて凍結した状態で均質化する。均質化の後、４℃で２０００×ｇで１０分間、前記試料を遠心分離し、４℃で最大速度１４，０００×ｇで１５分間、上清を再び遠心分離する。脂質／脂肪壊死組織片の上層を拾い上げないように、上清を注意深く取り除く。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス、品番８３２２８）を用いてタンパク質濃度を３ｍｇ／ｍｌに調節する。脾臓プロテアソーム活性を、２０Ｓ蛍光発生アッセイ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カタログ番号１０００８０４１、ロット番号０４１４６９８−１）を用いて分析し、腎臓におけるプロテアソーム活性の調節を、ＩκＢαの蓄積ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７３５５、ロット番号１７）を用いて分析する。両方のアッセイは、製造業者の説明書に従って実施する。
（実施例）
【実施例１】
【００９３】
化合物ＡのＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるループスの効果的な処置
プロトコール
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを最初に無作為化し、初回出血を採取し、ベースライン測定のために体重を記録する（図１）。すべてのマウスは個別に耳標を付けられ、実験全体を通してモニターされる（例えば、「群番号−ケージ文字−マウス番号」であるので、「３Ｂ５」は、群３（Ｇ３）、ケージＢ、マウス５番である）。マウスは同齢であり、６〜８週齢で処置が開始される。頬出血および尿の採取は実施例を通して毎週採取される。マウスは、サイトカインおよびＡＮＡ濃度、タンパク尿、体質量、リンパ肥大、全体的な健康、および死亡数を含むいくつかのパラメータについて個別に追跡される。すべてのパラメータは、毎日モニターされる死亡数を除いて、隔月に評価される。すべての群は、１つの群につき最低少なくとも１０〜１２匹のマウスから成る。生体外実施例には、形質細胞、血清補体Ｃ３およびＡＮＡ濃度についてのフローサイトメトリー分析；尿タンパク質および白血球、血清サイトカインプロファイリング、腎病理組織診断、ならびに脾臓、腎臓および血漿中の化合物濃度の決定（薬物動態学（ＰＫ））が含まれる。マウスは個体ベースで追跡される。すべてのデータに関して、マウスを集団にグループ化し、データを平均±ＳＥＭとしてグラフ化する。最終段階の読み出し情報を、材料および方法の項および図１に記載されるように分析する。
【００９４】
図１に示されるように、マウスは、静脈内または腹腔内のいずれかで化合物Ａまたはボルテゾミブを用いて、あるいは経口的に化合物Ａを用いて処置される。使用するケア剤の標準物質は、生理食塩水中のデキサメタゾンである。媒体単独は、週２回経口的に提供される（経口投与）。両方のプロテアソーム阻害剤は、前記媒体溶液に懸濁される。隔月に出血および尿を採取し、アッセイされるまで８０℃で凍結させる。最終分析には、腎組織学、脾細胞Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＢおよびＴ細胞集団のフローサイトメトリー、ＰＤマーカー、血清サイトカイン、抗体および補体濃度が含まれる。その上、尿中タンパク尿をすべての動物について測定する。
【００９５】
最初に、群１（Ｇ１）の化合物Ａの投与量は、４ｍｇ／ｋｇ、週１回静脈内である。この群の動物死亡数（７１日目に前５匹のマウスのうち４匹）によって、前記投与を３ｍｇ／ｋｇ、週１回静脈内に変更した。化合物Ａ４ｍｇ／ｋｇの投与量で死亡した動物は、分析に含めなかった。群２（Ｇ２）では、化合物Ａは、３ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回静脈内投与した。群３（Ｇ３）では、化合物Ａは、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回経口投与した。群４（Ｇ４）では、ボルテゾミブを最初に０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回静脈内投与した。しかし、この群の動物死亡数に起因して、該群を２つの群、Ｇ４およびＧ５に分割し、新しいＧ４群においてボルテゾミブを０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で週１回静脈内投与した。新しい群５（Ｇ５）では、ボルテゾミブを０．３ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回静脈内投与した。デキサメタゾンは１．５ｍｇ／ｋｇ／２ｄ（Ｍ，Ｗ，Ｆ）の投与量で腹腔内投与した。媒体は、３％ＤＭＳＯ／１０％Ｓｏｌｕｔｏｌ／８７％ＰＢＳであった。静脈内経路によってマウスに注射することができなかった場合には、薬剤は表１に記述されるように腹腔内投与された。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
体重および生存
前記処置群のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの体重は、媒体と比較して低下した（図２ならびに表２および２０参照）。媒体群と比較して体質量が減少したボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ、週１回静脈内）および化合物Ａ（３ｍｇ／ｋｇ、週１回静脈内）群（それぞれ１７％および１５％低下；ｐ<０．０５）を除いて、すべての処置動物において体重減少は等しかった。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
化合物Ａ処置の結果、０．３ｍｇ／ｋｇ週１回の投与計画について媒体よりも生存が５％増加し、０．３ｍｇ／ｋｇ静脈内および１０ｍｇ／ｋｇ経口週２回の投与計画に対して生存が８．４％増加した（図３ならびに表３および２０参照）。ボルテゾミブ処置は、初期量範囲測定試験に基づく予想外の毒性に関係し、ＥＯＳの媒体に対して生存の２％低下（０．５ｍｇ／ｋｇ、週１回静脈内）および１９％低下（０．３ｍｇ／ｋｇ、週２回静脈内）となった。生存の増加は、前記ボルテゾミブ処置群の両方と比較して化合物Ａ処置群に観察された（ｐ<０．０５）（図３ならびに表３および２０参照）。化合物Ａの処置により提供される長期の生存と組み合わせて、低投与量のボルテゾミブの死亡率が高いことは、ボルテゾミブが疾患に関連する死亡率を防ぐことにあまり効果がなく、化合物Ａほど耐容性がよくないことを示唆する。
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
リンパ肥大および脾腫大
化合物Ａで静脈内処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、リンパ肥大（すなわち腫大した頸部リンパ節の存在）の低下を示した（７１％および３４％低下；ｐ<０．０５）（図４ならびに表４および２０参照）。ボルテゾミブ処置はリンパ肥大をあまり低下させなかった。脾腫大（脾臓腫脹）の縮小は、媒体処置群と比較してすべての処置群に観察された（ＥＯＳまでに５６８ｍｇが１５０〜３００ｍｇに低下）（ｐ<０．０１）（図５および表５参照）。最大の縮小は、試験の終わりの媒体処置群と比較して化合物Ａ３ｍｇ／ｋｇ週２回静脈内処置群に観察された（７４％低下、ｐ<０．００１）（表２０参照）。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
脾腫大およびリンパ肥大はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるループス疾患を示すので、これらの結果は重要である。そのため、脾臓およびリンパ節サイズの低下は、化合物Ａが処置中に全身性自己免疫応答を部分的に制御したことを示す。意義深いことには、化合物Ａは、リンパ肥大を低下させるという点でボルテゾミブよりも優れており、脾腫大を低下させるという点で週２回の投与量のボルテゾミブよりも優れていた。
【０１０５】
血清サイトカイン
化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体処置マウスと比較して、いくつかの血清サイトカイン（ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０、ＴＮＦαおよびＩＬ−１β）の濃度の低下を示した（表２０参照）。すべての３つの化合物Ａ処置投与計画は、血清ＩＬ−１２濃度に有意に影響を及ぼしたが、最も高い投与量のボルテゾミブ０．５ｍｇ／ｋｇの週１回静脈内投与だけが、媒体処置動物よりも下にＩＬ−１２濃度を有意に低下させた（ｐ<０．０５、図６および表６参照）。すべての処置群が、媒体と比較して血清ＩＬ−１βを低下させたが、化合物Ａの３ｍｇ／ｋｇ、週２回の投与量だけが有意な低下を提供した（ＥＯＳまでに１６．８ｐｇ／ｍＬが５．７ｐｇ／ｍＬに低下）（ｐ<０．０５）（図７および表７参照）。媒体と比較して、すべての処置群が、血清ＴＮＦαの低下を経験した（図８ならびに表８および２０参照）。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
ＩＬ−１２およびＩＬ−１０は、ループス患者において上昇し、疾患進行の予後マーカーとして使用することができるため、このデータは重要である（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００７、Ｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）。いくつかの一般的な炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−１βおよびＴＮＦαなども、ループス疾患の経過中に上昇する（Ａｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００４）。化合物Ａによる処置はＩＬ−１２を大幅に低下させたが、ボルテゾミブ週２回による処置は効果がなかったという点で、化合物Ａはボルテゾミブよりも優れていた。その上、週２回の化合物Ａの投与は、ＩＬ−１βを大幅に低下させた唯一の処置であった。
【０１１０】
Ｃ３
化合物Ａで経口的に処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して血清Ｃ３濃度を大幅に増加させたことを示した（９９日目に媒体の１２８％増加；ｐ<０．００１）。ボルテゾミブ処置群は媒体と比較して血清Ｃ３の有意な増加を示さなかったので、化合物Ａは、この点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１１１】
血清中のＣ３の濃度は、炎症の規模または範囲と間接的に相関しているので、このデータは重要である。ＳＬＥ患者は、時間とともにＣ３およびＣ４の濃度の低下を示し、それは全身性炎症の増加を示し、それは組織器官の損傷という結果になる。しかし処置によってこれらの要素は元に戻り、前記処置が全身性炎症を低下させ、従って前記疾患を効果的に処置することを示す。そのため、血清Ｃ３の増加は、ループス疾患の消散および処置を示す（Ｂｏｕｍｐａｓ，Ｆｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【０１１２】
抗体分泌細胞
化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、抗スミスＡｇおよび抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧを産生する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の出現頻度の低下を示した（群１〜３について、それぞれ、スミスＡｇ  ＡＳＣに関して９７％、１００％および８６％低下；ｄｓＤＮＡ  ＡＳＣに関して８０％、８４％、８２％低下）（図９ならびに表９および２０参照；ｐ<０．０１〜ｐ<０．０５）。化合物Ａで静脈内処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ボルテゾミブと比較して、抗スミスＡｇ  ＡＳＣの出現頻度の低下を示した（図９および表９参照；ｐ<０．０１〜ｐ<０．０５）。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ボルテゾミブ０．３ｍｇ／ｋｇ週２回静脈内およびデキサメタゾンの両方と比較して、抗スミスＡｇおよび抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ産生ＡＳＣの出現頻度の低下を示した（図９および表９参照；ｐ<０．０１〜ｐ<０．０５）。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ボルテゾミブ０．３ｍｇ／ｋｇ週２回静脈内、デキサメタゾン、および媒体で処置したマウスよりも低い、抗クロマチンＩｇＧ産生脾臓ＡＳＣの出現頻度の低下を示した（図１０および表１０参照；ｐ<０．０１〜ｐ<０．０５）。
【０１１３】
【表９】
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【０１１４】
【表１０】
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【０１１５】
循環する自己抗体分泌細胞型は、ＳＬＥの予後不良に直接相関するので、このデータは重要である（Ｎｅｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００８、Ｓａｎｚ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）。意義深いことには、化合物Ａは、抗スミスＡｇＡＳＣを低下させることにおいてボルテゾミブよりも優れていた。そして、週１回および週２回の静脈内投与量の化合物Ａの投与量は、抗ｄｓＤＮＡＩｇＧ産生ＡＳＣおよび抗クロマチンＩｇＧ産生脾臓ＡＳＣの両方を低下させることにおいて、両方とも週２回投与量のボルテゾミブよりも優れていた。
【０１１６】
抗核抗体（ＡＮＡ）
化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、抗クロマチンＩｇＧの濃度の低下を示した（群１〜３について、それぞれ、８９％、９８％、および７９％）（図１１ならびに表１１および２０参照；ｐ<０．００１）。週１回のボルテゾミブ投与量だけが、媒体と比較して、抗クロマチンＩｇＧ濃度を低下させた（６４％低下）（図１１および表１１参照；ｐ<０．００１および表２０）。同様の応答が、抗スミスＡｇ  ＩｇＧ  ＡＮＡ濃度に対して観察された（ＥＯＳの媒体処置動物と比較して、群１〜４について９７％、１００％、８６％、および７４％低下）（図１２ならびに表１２および２０参照）。化合物Ａおよびボルテゾミブの両方の静脈内投与量が、媒体と比較して抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ  ＡＮＡを低下させた（それぞれ、群１、２、４および５について、８０％、８４％、８２％、および５８％低下）（図１３ならびに表１３および２０参照）。
【０１１７】
【表１１】
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【０１１８】
【表１２】
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【０１１９】
【表１３】
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【０１２０】
抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在は、ループスの予後不良に関連し、致死的となり得る腎炎の発症にも強く関連しているので、このデータは重要である（Ｅｇｎｅｒ  ２０００；Ｋｉｓｓ、Ｌａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。化合物Ａによる処置は抗クロマチンＩｇＧと抗スミスＡｇ  ＩｇＧ  ＡＮＡの濃度を大幅に低下させたが、ボルテゾミブによる週２回の処置はいずれのＡＮＡの血清濃度もあまり低下させることができなかったという点で、化合物Ａはボルテゾミブよりも優れていた。
【０１２１】
形質細胞
化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、脾臓形質細胞（ＣＤ１９−ＣＤ１３８＋細胞内ＩｇＬκ軽鎖＋細胞により定義される）の低下を示した（群１〜３について６７％低下；ｐ<０．０５）（図１４ならびに表１４および２０参照）。同様の結果がボルテゾミブについて得られた（群４について６６％低下、群５について３３％低下）。化合物Ａによる処置は、ボルテゾミブによる週１回の処置に類似して、デキサメタゾンと比較して、全脾臓形質細胞の有意な改善を提供した（ｐ<０．０５）。
【０１２２】
【表１４】
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【０１２３】
形質細胞は自己抗体の産生を担っており、長期生存形質細胞はヒトにおける継続的なループスの病因の根本の繁殖体の１つであると思われているので、このデータは重要である（Ｅｓｐｅｌｉ，Ｂｏｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｎｅｕｂｅｒｔ，Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。長期生存形質細胞（ＬＬ−ＰＣｓ）は、主として骨髄（ＢＭ）に集まるが、炎症部位の脾臓にも見出すことができ、ループス腎炎の数少ない承認された治療法の１つであるシクロホスファミドに抵抗性であることが知られている（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ、Ｇｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。化合物Ａによる処置は、デキサメタゾンと比較して脾臓形質細胞を大幅に減少させるが、週２回のボルテゾミブによる処置はそうでないという点で、化合物Ａはボルテゾミブよりも優れていた。
【０１２４】
タンパク尿および白血球尿
化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、３つのすべての処置群について試験の過程にわたって総尿中タンパク質の大幅な低下を示した（群１〜３について、それぞれ、６０％、７０％、および７１％；ｐ<０．０１）（図１５ならびに表１５および２０）。しかし、週１回ボルテゾミブで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスだけがタンパク尿の大幅な低下を示した（５５％低下；ｐ<０．０５）（図１５および表１５および２０）。化合物Ａおよびボルテゾミブの両方による処置は、白血球尿濃度を媒体のものよりも低下させた（群１〜５について６９〜９６％低下；ｐ<０．００１）（図１６ならびに表１６および２０）。
【０１２５】
【表１５】
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【０１２６】
【表１６】
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【０１２７】
尿中タンパク質（タンパク尿）および尿中白血球（白血球尿）の増加は、ループス腎炎に関連する腎障害の直接的結果であるので、これらの結果は重要である。化合物Ａによる処置はタンパク尿を大幅に低下させたが、週２回のボルテゾミブによる処置は、媒体と比較して尿タンパク質の大幅な低下を提供することができなかったという点で、化合物Ａはボルテゾミブよりも優れていた。
【０１２８】
病理組織学的解析
末期のループス腎炎を病理組織診断によって評価し、委員会認定病理学者によって罹患動物における全体としての腎障害の評価についてスコア化した。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、様々な腎症状の重症度の大幅な低下を示した（平均スコアで１．５５〜１．８６倍低下）（図１７ならびに表１７および２０参照）。しかし、週１回ボルテゾミブで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスだけが、腎症状の重症度の大幅な低下を示した（媒体と比較して平均スコアで１．６８倍低下）（図１７ならびに表１７および２０）。重要なことに、３つすべての化合物Ａ処置群が、媒体と比較して腎間質浸潤の低下を示したが（最大６１％低下）、ボルテゾミブの実現した最大低下は４７％であった（表２０参照）。
【０１２９】
これらの結果は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの化合物Ａによる処置が、ループス易発性マウスにおいてループス腎炎の発症を遅らせる、かつ／または防ぐことができることを示すために重要である。化合物Ａは、化合物Ａによる処置はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて腎障害を大幅に低下させたが、ボルテゾミブによる週２回の処置は、大幅な低下を提供することができなかったという点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１３０】
【表１７】
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【０１３１】
薬力学
２０ＳプロテアソームアッセイとＩκＢαの蓄積のＥＬＩＳＡを用いて、処置マウスの脾臓および腎臓における化合物Ａの薬力学活性を測定した。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較して、脾臓において２０Ｓプロテアソームの機能の低下を示した（群１〜３について、それぞれ、４０％、４５％および４１％低下；ｐ<０．０１）（図１８ならびに表１８および２０参照）。同様の知見が、ボルテゾミブ処置群について観察された（媒体処置と比較して、それぞれ、群４および５について４０％および４１％低下）。活発で多くの場合致死的な疾患が突然引き起こされる腎臓に関して、ＩκＢα蓄積アッセイにより測定されるプロテアソーム阻害の規模は大きかった：化合物Ａおよびボルテゾミブの両方による処置は、媒体処置群の３〜６倍の細胞質ＩκＢαの蓄積をもたらした（媒体の２６６〜５３７％増加；ｐ<０．００１）（図１９ならびに表１９および２０参照）。
【０１３２】
【表１８】
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【０１３３】
【表１９】
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【０１３４】
【表２０】
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【０１３５】
まとめ
ループス易発性ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの化合物Ａによる処置の結果、デキサメタゾンおよびボルテゾミブと比較して、いくつかのループスに関連する免疫パラメータが低下した。化合物Ａは、多くの点でボルテゾミブよりも優れていることが証明された。例えば、３つすべての化合物Ａの投与計画の結果、ボルテゾミブ０．３ｍｇ／ｋｇ週２回群と比較して、腎症状の発生率および重症度が大幅に低下し、これらの低下はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるタンパク尿およびＳＬＥ関連死亡率の減少に直接相関した。
【実施例２】
【０１３６】
化合物ＡのＮＺＭマウスにおけるループスの効果的な処置
プロトコール
同齢の雌ＮＺＭまたはＮＺＷ／ＬａｃＪマウスを、ループス腎炎の試験のために合計７ヶ月または２１０日の間十分に成長させ、その時にタンパク尿検出のために尿を採取した。光学濃度に基づく総タンパク質沈殿アッセイによって測定して０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの尿タンパク質またはスティックアッセイによって測定して３０〜３００ｍｇ／ｄｌのタンパク質を有するマウスを、タンパク尿陽性とみなし、試験の登録に選択した。タンパク尿陽性動物のガウス分布を含有するように群を正規化し（すなわち、１／３が低タンパク尿、１／３が中間、１／３が高）、その後群間で無作為化した後、耳標を付け、体重測定、尿採取および血清採取を含むベースライン測定を行った。全集団から合計５匹のマウスを、ベースライン腎臓組織学評価のために無作為に選択した。
【０１３７】
各群の処置および試験は、図２０に記載される通りである。手短に言えば、群１（Ｇ１）では、化合物Ａを３ｍｇ／ｋｇの投与量で週１回腹腔内投与した。群２（Ｇ２）では、化合物Ａを３ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回腹腔内投与した。群３（Ｇ３）では、ボルテゾミブを０．３ｍｇ／ｋｇの投与量で週１回腹腔内投与した。群４（Ｇ４）では、ボルテゾミブを０．３ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回腹腔内投与した。群５および６（Ｇ５およびＧ６）は、ケア剤の標準物質シクロホスファミド（ＣＴＸ）およびデキサメタゾンであった。Ｇ５では、ＣＴＸを生理食塩水中で５０ｍｇ／ｋｇで、週１回腹腔内投与した。ＭＭＦおよびアザチオプリンとともに、シクロホスファミドは、強力な免疫抑制剤として作用するので、ループス腎炎に罹患している患者に受け入れられている処置選択肢である、しかし、その重篤な副作用のために、シクロホスファミドは最も重篤な症例においてしか使用されない。Ｇ６では、デキサメタゾンを生理食塩水で１．５ｍｇ／ｋｇで、週３回腹腔内投与した。群７（Ｇ７）では、媒体を、生理食塩水および１％ＤＭＳＯに懸濁した防腐剤としてＳｏｌｕｔｏｌとともに腹腔内に提供した。化合物Ａおよびボルテゾミブを媒体溶液に懸濁させた。２１２日齢で処置を開始し、一部のマウスは処置後まもなく死亡したが、健康状態にかかわらずすべての動物を、投薬時から群全体の大きさに対して計数した。隔月に出血および尿を採取し、血清および尿をアッセイされるまで−８０℃で凍結させた。最終分析には、腎臓組織学、脾細胞Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｂ細胞およびＴ細胞集団のフローサイトメトリー、薬力学マーカー、血清サイトカイン、抗体および補体濃度が含まれた。関連のある図面に示されるすべてのグラフは、「処置の開始」であり、従って２１２日齢を表す０日目を示す。９８日目または「処置／試験の終わり」は、前記ＮＺＭ動物の３１０日齢を表す。すべてのグラフは、２１２日齢で開始し３１０日齢で終わる試験の日によって、「試験日」として時間を示す。
【０１３８】
体重および生存
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、ボルテゾミブおよびケア剤標準品に類似して、媒体と比較して、体重の大幅な増加を示した（それぞれ９％および１０％；ｐ<０．００１）（図２２ならびに表２２および４１参照）。
【０１３９】
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して、生存期間の大幅な増加を示し（５５％および４６％、それぞれ；ｐ<０．００１）、両方のケア剤標準物質（ＣＴＸおよびデキサメタゾン）および両方のボルテゾミブ群よりも生存期間を大幅に延長した（ｐ<０．０１）（図２１ならびに表２１および４１参照）。５６日目に、両方の化合物Ａ処置群に関して１００％のマウスがなお生存し、両方の前記ボルテゾミブ処置群に関しては７５％のマウスだけがなお生存していた。試験の終わりに（３１０日目）、前記媒体処置群では４５％のマウスしか生存せず、一方化合物Ａ処置群では１００％の動物が生き残った。
【０１４０】
【表２１】
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【０１４１】
【表２２】
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【０１４２】
このデータは、化合物Ａがこのループス腎炎のマウスモデルにおいてボルテゾミブよりも著しい延命効果を提供することを示すので重要である。
【０１４３】
脾腫大
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体対照と比較して、脾腫大の低下を示した（ＥＯＳで３７％および３４％低下）（図２３ならびに表２３および４１参照）。化合物ＡまたはＣＴＸによる処置も、週１回ボルテゾミブと比較して脾臓質量を大幅に減少させた（ｐ<０．０５）（図２３ならびに表２３および４１参照）。すべての群の体質量は、ＥＯＳの９８日目に二元配置ＡＮＯＶＡ試験を用いて分析してあまり異ならなかったので（ｐ>０．０５）、脾臓質量の変化は、媒体処置群脾臓質量と比較し、ＥＯＳの９８日目の体質量について正規化しなかった。
【０１４４】
【表２３】
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【０１４５】
脾腫大（脾臓腫脹）は、ＮＺＭマウスにおけるループス疾患を示すので、このデータは重要である。化合物Ａは、週１回ボルテゾミブと比較して、化合物Ａで処置した動物で脾腫大が大幅に低下したという点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１４６】
タンパク尿
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、週１回ボルテゾミブ、ＤＥＸ、または媒体と比較して、タンパク尿の低下を示した（媒体と比較して、群１および２について６１％および７２％）（ｐ<０．０１）（図２４ならびに表２４および４１参照）。
【０１４７】
【表２４】
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【０１４８】
尿中タンパク質（タンパク尿）の増加は、ループス腎炎に関連する腎障害の直接的な結果であるので、これらの結果は重要である。化合物Ａは、タンパク尿が、週１回ボルテゾミブと比較して、化合物Ａで処置した動物において大幅に低下したという点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１４９】
抗核抗体（ＡＮＡ）
化合物Ａで週１回または週２回処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して、血清抗クロマチンＡｂの大幅な低下を示した（それぞれ６３％および７９％低下；ｐ<０．０５）（表２５および４１ならびに図２５参照）。化合物Ａによるこれらの抗クロマチンＡｂの低下は、ボルテゾミブ、ＤｅｘまたはＣＴＸ処置群について観察された低下（それらのどれもが媒体処置群と比較して著しくなかった）よりも大きかった。化合物Ａで週２回処置したＮＺＭマウスは、週２回ボルテゾミブ（媒体と比較して２２％低下）と比較して、血清抗クロマチンＡｂの低下を示した（媒体と比較して７９％低下）（図２５ならびに表２５および４１参照）。化合物Ａで週１回または週２回で処置したＮＺＭマウスは、週１回ボルテゾミブと比較して、血清抗クロマチンＡｂの低下を示した（ｐ<０．００１）（図２５ならびに表２５および４１参照）。化合物Ａの週１回投与は、血清抗スミスＡｇ  Ａｂを週１回ボルテゾミブと比較して低下させた（媒体と比較して８８％対２２％低下）（図２６ならびに表２６および４１参照）。化合物Ａの週１回および週２回投与は両方とも、血清抗ｄｓＤＮＡＡｂ濃度を週１回および週２回ボルテゾミブよりも下に低下させた（媒体対照と比較して、２１％および６８％低下に対して９５％増加および２％低下）（図２７ならびに表２７および４１参照）。
【０１５０】
【表２５】
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【０１５１】
【表２６】
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【０１５２】
【表２７】
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【０１５３】
抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在は、ループスの予後不良に関連し、しばしば致死性のループス腎炎の発症に強く関連しているので、このデータは重要である（Ｅｇｎｅｒ  ２０００；Ｋｉｓｓ、Ｌａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。化合物Ａは、媒体と比較して、化合物Ａだけが血清抗クロマチンＡｂの大幅な低下を提供し、媒体と比較して、週１回化合物Ａだけが血清抗スミスＡｇ  Ａｂの大幅な低下を提供したという点でボルテゾミブよりも優れていた。その上、化合物Ａの週１回および週２回投与の両方が、血清抗ｄｓＤＮＡ  Ａｂ濃度を週１回および週２回ボルテゾミブよりも下に低下させた。
【０１５４】
血清サイトカイン
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して、血清ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０の大幅な低下を示した（それぞれ８３％および６７％低下；ｐ<０．０１）（図２８ならびに表２８および４１参照）。化合物Ａは、前記媒体と比較して、ボルテゾミブよりも大きい血清ＩＬ−１２濃度の低下を提供した（化合物Ａの６７〜８３％低下に対してボルテゾミブの３２〜５５％低下）（図２８ならびに表２８および４１参照）。血清単球ケモカイン（すなわち、モノカイン）、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧは、ＣＴＸと比較して、化合物Ａまたはボルテゾミブによる処置によって低下したが（ｐ<０．００１）、ＤＥＸと比較して低下しなかった（図２９ならびに表２９および４１参照）。血清ＩＦＮ−γ−誘導性ケモカイン、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０は、媒体と比較して、週２回投与量の化合物Ａによる処置の後に減少（３０％低下）したが、著しい変化はＣＴＸと比較した場合だけ見られた（図３０ならびに表３０および４１参照）。ＩＬ−１３血清濃度の著しい変化は、媒体と比較して、前記化合物Ａまたはボルテゾミブ処置群について観察されなかった（図３１ならびに表３１および４１参照）。化合物Ａの週１回および週２回投与量は両方とも、血清ＴＮＦαをＤｅｘよりも低下させた（ｐ<０．００１）（図３２ならびに表３２および４１参照）。ＩＬ−１７Ａ血清濃度の著しい変化は、媒体と比較して、前記化合物Ａまたはボルテゾミブ処置群について観察されなかった（図３３ならびに表３３および４１参照）。
【０１５５】
【表２８】
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【０１５６】
【表２９】
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【０１５７】
【表３０】
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【０１５８】
【表３１】
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【０１５９】
【表３２】
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【０１６０】
【表３３】
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【０１６１】
これらのサイトカインは、ループス患者において上昇し、ループス発赤増大および前記疾患を永続させる自己抗原に対する進行中の免疫応答に関与しているので、これらの結果は重要である（Ｃｈｕｎ，Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｔｕｃｃｉ，Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。これらのサイトカインプロフィールの低下または調節により、患者に好ましい利益を提供し、疾患消散の間接的な指標を提供することができる。（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１；ＡｒｉｎｇｅｒおよびＳｍｏｌｅｎ  ２００４；Ｃｈｕｎ，Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｎｉｅｗｏｌｄ，Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｆｕ，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｔｕｃｃｉ，Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。化合物Ａは、媒体と比較して、ボルテゾミブよりも大きい血清ＩＬ−１２濃度の低下を化合物Ａが提供したという点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１６２】
抗体分泌細胞
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、ボルテゾミブ、ＤＥＸ、および媒体のものよりも下の抗クロマチンＡＳＣ出現頻度の低下を示した（媒体と比較して、化合物Ａについて抗クロマチンＡＳＣが９６〜１００％低下；ｐ<０．０１）（図３４ならびに表３４および４１参照）。同様の結果は、処置マウスの脾臓の全ＩｇＧ産生ＡＳＣについて観察された。化合物Ａは、全ＩｇＧ産生ＡＳＣを週１回ボルテゾミブ、ＤＥＸ、ＣＴＸ、および媒体のものよりも下に低下させた（媒体と比較して、ＣＥＰ−１８７０について６２〜６７％低下）（図３５ならびに表３５および４１参照）。
【０１６３】
【表３４】
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【０１６４】
【表３５】
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【０１６５】
循環する自己抗体分泌細胞型は、ＳＬＥの予後不良に直接相関するので、このデータは重要である（Ｎｅｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００８、Ｓａｎｚ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）。化合物Ａは、化合物Ａが抗クロマチンＡＳＣをボルテゾミブよりも大幅に低下させたという点、および（ボルテゾミブではなく）化合物Ａだけが、媒体と比較して、全ＩｇＧ産生ＡＳＣを大幅に低下させたという点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１６６】
血清補体
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、ＣＴＸのものを上回る補体Ｃ３血清濃度の増加を示した（ｐ<０．００１；週２回化合物Ａについて、ｐ<０．０５）（図３６ならびに表３６および４１参照）。週１回化合物ＡだけがＣ３を媒体よりも増加させた（４５％増加；ｐ<０．０５）（図３６ならびに表３６および４１参照）。週１回化合物Ａ群（Ｇ１）も、週２回ボルテゾミブよりもＣ３濃度を大幅に増加させた（ｐ<０．０１）（図３６ならびに表３６および４１参照）。
【０１６７】
【表３６】
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【０１６８】
血清中のＣ３の濃度は、炎症の規模または範囲と間接的に相関しているので、このデータは重要である。ＳＬＥ患者は、時間とともにＣ３およびＣ４の濃度の低下を示し、それは全身性炎症の増加を示し、それは組織器官の損傷という結果になる。しかし処置によってこれらの要素は元に戻り、前記処置が全身性炎症を低下させ、従って前記疾患を効果的に処置することを示す。そのため、血清Ｃ３の増加は、ループス疾患の回復および処置を示す（Ｂｏｕｍｐａｓ，Ｆｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。化合物Ａは、（ボルテゾミブではなく）化合物Ａだけが媒体と比較してＣ３を増加させたという点でボルテゾミブよりも優れていた。
【０１６９】
血清Ｉ型コラーゲン架橋剤（ＣＴｘ）骨吸収バイオマーカー
化合物Ａかまたはボルテゾミブのいずれかで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して、ＣＴｘ濃度に変化を示さなかった（図３７ならびに表３７および４１参照）。
【０１７０】
【表３７】
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【０１７１】
病理組織学的解析
末期のループス腎炎を病理組織学によって評価し、委員会認定病理学者によって罹患動物における全体としての腎障害の評価についてスコア化した。化合物Ａで処置したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、媒体と比較していくつかの腎症状の発生率および重症度の大幅な低下を示し、それには、糸球体細胞充実度（約５０％低下）、糸球体硬化（約５３％低下）、間質浸潤（４３〜４６％低下）、尿細管萎縮（５５〜５９％低下）、間質線維化（約５５％低下）および脈管炎（約５１〜５５％低下）が含まれた（図３８ならびに表３８および４１参照）。様々な腎症状の低下の同様の規模は、週１回および週２回の両方の化合物Ａ処置の結果生じた。これらの腎症状における著しい低下は、ボルテゾミブ処置群のこのモデルにおいて、間質浸潤の低下（４４％）を除いて生じなかった（図３８ならびに表３８および４１参照）。化合物Ａの週１回および週２回の投与は両方ともに、いくつかの腎症状を、ボルテゾミブ、ＤＥＸ−および媒体処置した群のものよりも下に低下させた（糸球体細胞充実度、糸球体壊死、糸球体硬化、間質浸潤、尿細管萎縮、間質線維化、脈管炎（ｖａｃｕｌｉｔｉｓ））。通常、化合物Ａの処置は、腎組織障害および炎症にボルテゾミブよりも大きい影響を明確に及ぼす（例えば、いくつかのパラメータについて、媒体と比較して、化合物Ａのスコアが約４５〜５５％低下であるのに対し、ボルテゾミブのスコアは約６〜１４％低下）（図３８ならびに表３８および４１参照）。腎浸潤および肺浸潤の両方が媒体処置マウスにおいて観察された（図３９参照）。
【０１７２】
これらの結果は、ＮＺＭマウスの化合物Ａによる処置もまた、ループス易発性マウスにおいてループス腎炎の発症を遅らせる、かつ／または防ぐことができることを示すために重要である。化合物Ａは、化合物Ａによる処置は、媒体と比較してＮＺＭマウスにおいて腎障害を大幅に低下させた（７つの病理組織診断のうち６つが大幅に低下した）が、ボルテゾミブによる処置は、大幅な低下を提供することができなかったという点でボルテゾミブよりも優れていた（前記７つの病理組織診断のうち間質浸潤だけが、しかも週２回の投与量だけ大幅に低下した）（図３８ならびに表３８および４１参照）。化合物Ａは、週１回ボルテゾミブと比較して、ループス腎炎に関連する前記７つの腎症状のうち５つで著しい低下を提供した（図３８ならびに表３８および４１参照）。
【０１７３】
【表３８】
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【０１７４】
薬力学
２０Ｓプロテアソーム活性とＩκＢαの蓄積の両方を、処置マウスの脾臓および腎臓における化合物Ａに媒介されるプロテアソーム阻害の薬力学的指標として用いた。化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して前記脾臓２０Ｓプロテアソームの機能低下を示した（ｐ<０．０５）（媒体と比較して、約４０％阻害）（図４０ならびに表３９および４１参照）。化合物Ａの週２回投与は、腎臓ＩκＢα濃度の蓄積を、媒体処置のものよりも増加させた（約４０％増加、ｐ<０．０５）（図４１ならびに表４０および４１参照）。
【０１７５】
【表３９】
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【０１７６】
【表４０】
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【０１７７】
【表４１】
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【０１７８】
まとめ
ループス易発性ＮＺＭマウスの化合物Ａによる処置は、ループス腎炎の疾患症状を低下させ、生存を促進した。化合物Ａは、デキサメタゾン、シクロホスファミドおよびボルテゾミブと比較して、より大きな生存期間、耐容性およびいくつかのループス関連免疫パラメータの低下という結果をもたらした。例えば、化合物Ａは、抗クロマチン自己抗体分泌細胞（ＡＳＣ）をボルテゾミブよりも大幅に低下させ、（ボルテゾミブではなく）化合物Ａだけが、媒体と比較して血清補体Ｃ３を増加させ、（ボルテゾミブではなく）化合物Ａは、媒体と比較して、複数の腎症状の発生率および重症度の大幅な低下という結果をもたらした。
【実施例３】
【０１７９】
皮下投与された化合物ＡのＮＺＭマウスにおけるループスの効果的な処置
プロトコール
処置を図４２および表４２に要約する。試験期間は９１日であり、２１２日齢に始まり、３０３日齢に終わりとなった。
【０１８０】
【表４２】
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【０１８１】
体重および生存期間
体重は、９１日目の試験終了時にすべての処置群で比較的同程度であった（図４３参照）。群１、２、および４の化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して、生存期間を大幅に増加させた（図４４参照）。
【０１８２】
タンパク尿
群１、２、４、および５の化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体（群１０）および腹腔内投与されたボルテゾミブ（群７）と比較してタンパク尿の低下を示した（図４５参照）。
【０１８３】
抗核抗体（ＡＮＡ）
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して血清抗スミスＡＮＡの大幅な低下を示した（群１、２、４、および５について、それぞれ、９３．８％、８５．０％、９４．５％、および９２．４％）（図４６参照）。化合物Ａによるこれらの抗スミスＡＮＡの低下は、前記ボルテゾミブ腹腔内処置群（群７）について観察された低下（たった６６．７％の軽微な低下を示した）よりも大きかった。ボルテゾミブｓｃ群（群８）は、媒体処置群に対して８５．７％低下を示した。化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して血清抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡの低下を示した（群１、２、４、および５について、それぞれ、７９．６％、６９．２％、８４．１％、および８１．０％）（図４７参照）。化合物Ａによるこれらの抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡの低下は、前記ボルテゾミブ腹腔内処置群（群７）について観察された低下（たった２５．８％の軽微な低下を示した）よりも大きかった。ボルテゾミブｓｃ群（群８）は、媒体処置群に対して５５．４％低下を示した。
【０１８４】
血清サイトカイン
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して血清ＩＬ−１２サイトカイン濃度の低下を示した（群１、２、４、および５について、それぞれ、９２．８％、７６．６％、７５．７％、および７０．８％）（図４８参照）。化合物Ａによるこれらの血清ＩＬ−１２ サイトカイン濃度の低下は、前記ボルテゾミブ腹腔内処置群（群７）について観察された低下（たった６５．８％の軽微な低下を示した）よりも大きかった。ボルテゾミブｓｃ群（群８）は、媒体処置群に対して７５．６％低下を示した。
【０１８５】
抗体分泌細胞
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して抗スミスＡＳＣの低下を示した（群１、２、４、および５について、それぞれ、９８．７％、９６．６％、９８．６％、および９７．６％）（図４９参照）。化合物Ａによるこれらの抗スミスＡＳＣの低下は、前記ボルテゾミブ処置群（群７）について観察された低下（群７および８について、それぞれ、４６．３％および８２．４％の低下を示した）よりも大きかった。化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して抗ｄｓ（ｓｄ）ＤＮＡ  ＡＳＣの低下を示した（群１、２、４、および５について、それぞれ、９７．９％、９６．４％、１００．７％、および９５．９％）（図５０参照）。化合物Ａによるこれらの抗ｄｓＤＮＡ  ＡＳＣｓの低下は、前記ボルテゾミブ処置群（群７）について観察された低下（群７および８について、それぞれ、６４．７％および８８．９％の低下を示した）よりも大きかった。
【０１８６】
脾臓ＣＤ３８／ＣＤ１３８＋形質細胞
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して脾臓ＣＤ１９／ＣＤ４５Ｒ二重陰性ＣＤ１３８／ＣＤ３８二重陽性血漿Ｂ細胞の比率の低下を示した（群１、２、４、５、および６について、それぞれ、５６．６％、３８．１％、４９．８％、２４．３％、および４７．８％）（図５１参照）。前記ボルテゾミブ処置群は、群７および８について、それぞれ、３５．４％および５７．８％の低下を示した。
【０１８７】
病理組織学的解析
化合物Ａで処置したＮＺＭマウスは、媒体と比較して、複合平均腎病理組織診断盲検スコアの低下を示した（群１〜５について、それぞれ、５３％、４３．６％、１８．９％、４８．７％、および４０．５％）（図５２参照）。化合物Ａによるこれらの複合平均腎病理組織診断盲検スコアの低下は、前記ボルテゾミブ腹腔内処置群（群７）について観察された低下（たった１９．４％の軽微な低下を示した）よりも大きかった。ボルテゾミブｓｃ群（群８）は、媒体処置群に対して４３．６％の低下を示した。
【０１８８】
薬力学
ＩκＢα蓄積ＥＬＩＳＡを、処置マウスの脾臓および腎臓におけるプロテアソーム阻害活性を測定するための、標準的な薬力学的（ＰＤ）アッセイとして使用した（図５３参照）。
【０１８９】
まとめ
ループス易発性ＮＺＭマウスの化合物Ａによる腹腔内若しくは皮下処置は、ループス腎炎の疾患症状を低下させ、生存を促進した。観察した結果は、一般に、特に腹腔内処置群と比較してボルテゾミブよりも優れていた。
【０１９０】
好ましい実施形態
本発明の好ましい実施形態は以下の通りである：
実施形態１：該対象に化合物Ａを投与する工程を含む、対象においてループスを処置するための方法。
【０１９１】
【化６】
2014506934.tif 000089
【０１９２】
実施形態２：該対象に有効量の化合物Ａを投与する工程を含む、対象においてループスを処置するための方法。
【０１９３】
実施形態３：対象においてループスを処置するための薬物の製造における、化合物Ａの使用。
【０１９４】
実施形態４：対象におけるループスの処置で使用するための化合物Ａ。
【０１９５】
実施形態５：前記化合物Ａが静脈内投与される、実施形態１〜４のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０１９６】
実施形態６：前記化合物Ａが皮下投与される、実施形態１〜４のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０１９７】
実施形態７：前記化合物Ａが経口投与される、実施形態１〜４のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０１９８】
実施形態８：前記化合物Ａが約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０１９９】
実施形態９：前記化合物Ａが約１ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２００】
実施形態１０：前記化合物Ａが約０．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０１】
実施形態１１：前記化合物Ａが約１ｍｇ／ｍ２〜約４ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０２】
実施形態１２：前記化合物Ａが約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０３】
実施形態１３：前記化合物Ａが約１．５ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０４】
実施形態１４：前記化合物Ａが約２ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０５】
実施形態１５：前記化合物Ａが約２ｍｇ／ｍ２〜約２．５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０６】
実施形態１６：前記化合物Ａが約１．５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０７】
実施形態１７：前記化合物Ａが約２．５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０８】
実施形態１８：前記化合物Ａが約０．１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２０９】
実施形態１９：前記化合物Ａが約１ｍｇ／ｍ２〜約７ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１０】
実施形態２０：前記化合物Ａが約２ｍｇ／ｍ２〜約６ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１１】
実施形態２１：前記化合物Ａが約３ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１２】
実施形態２２：前記化合物Ａが約３ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１３】
実施形態２３：前記化合物Ａが約４ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１４】
実施形態２４：前記化合物Ａが約５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１５】
実施形態２５：前記化合物Ａが約６ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１６】
実施形態２６：前記化合物が週２回投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１７】
実施形態２７：前記化合物が週１回投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１８】
実施形態２８：前記化合物が２週に１回投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２１９】
実施形態２９：前記化合物が２１日周期の１日、４日、８日、および１１日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２０】
実施形態３０：前記化合物が２８日周期の１日、４日、８日、および１１日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２１】
実施形態３１：前記化合物が２８日周期の１日、８日、および１５日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２２】
実施形態３２：前記化合物が２１日周期の１日および８日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２３】
実施形態３３：前記化合物が２８日周期の１日および８日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２４】
実施形態３４：前記化合物が２１日周期の１日および１５日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２５】
実施形態３５：前記化合物が２８日周期の１日および１５日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２６】
実施形態３６：前記化合物が２８日周期の１日、６日、１１日、および１７日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２７】
実施形態３７：前記化合物が２１日周期の１日、６日および１１日に投与される、実施形態１〜２５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２８】
実施形態３８：前記周期が少なくとも１回反復される、実施形態２９〜３７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２２９】
実施形態３９：前記対象が、処置中に処置中にリンパ肥大の低下を経験する、実施形態１〜３８のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３０】
実施形態４０：前記対象が、処置中に脾腫大の低下を経験する、実施形態１〜３９のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３１】
実施形態４１：前記対象が、処置中に１若しくはそれ以上の血清抗核抗体の低下を経験する、実施形態１〜４０のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３２】
実施形態４２：前記対象が、処置中に１若しくはそれ以上の血清サイトカインの低下を経験する、実施形態１〜４１のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３３】
実施形態４３：前記対象が、処置中に血清ＩＦＮαの低下を経験する、実施形態１〜４２のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３４】
実施形態４４：前記対象が、処置中にタンパク尿の低下を経験する、実施形態１〜４３のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３５】
実施形態４５：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−１２の低下を経験する、実施形態１〜４４のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３６】
実施形態４６：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−１７Ａの低下を経験する、実施形態１〜４５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３７】
実施形態４７：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−６の低下を経験する、実施形態１〜４６のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３８】
実施形態４８：前記対象が、処置中に血清ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの低下を経験する、実施形態１〜４７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２３９】
実施形態４９：前記対象が、処置中に血清ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の低下を経験する、実施形態１〜４８のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４０】
実施形態５０：前記対象が、処置中に血清ＣＸＣＬ９／ＭＩＧの低下を経験する、実施形態１〜４９のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４１】
実施形態５１：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−４の低下を経験する、実施形態１〜５０のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４２】
実施形態５２：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−１３の低下を経験する、実施形態１〜５１のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４３】
実施形態５３：前記対象が、処置中に血清ＴＮＦαの低下を経験する、実施形態１〜５２のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４４】
実施形態５４：前記対象が、処置中に血清ＫＣ／ＩＬ−８の低下を経験する、実施形態１〜５３のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４５】
実施形態５５：前記対象が、処置中に血清ＣＴｘの低下を経験する、実施形態１〜５４のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４６】
実施形態５６：前記対象が、処置中に血清Ｃ３の増加を経験する、実施形態１〜５５のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４７】
実施形態５７：前記対が、処置中に血清抗クロマチンＩｇＧの低下を経験する、実施形態１〜５６のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４８】
実施形態５８：前記対象が、処置中に血清抗スミスＡｇ  ＩｇＧの低下を経験する、実施形態１〜５７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２４９】
実施形態５９：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−１βの低下を経験する、実施形態１〜５８のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２５０】
実施形態６０：前記対象が、処置中に血清抗ｄｓＤＮＡ抗核抗体の低下を経験する、実施形態１〜５９のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２５１】
実施形態６１：前記化合物Ａが、プロドラッグとして投与される、実施形態１〜６０のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２５２】
実施形態６２：前記プロドラッグが、化合物Ａのボロン酸エステル誘導体である、実施形態６１に記載される方法、使用、または化合物。
【０２５３】
実施形態６３：前記プロドラッグが、化合物Ａの環状ボロン酸エステル誘導体である、実施形態６２に記載される方法、使用、または化合物。
【０２５４】
実施形態６４：前記プロドラッグが、化合物Ｂである、実施形態６３に記載される方法、使用、または化合物。
【０２５５】
【化７】
2014506934.tif 000090
【０２５６】
実施形態６５：前記対象がヒトである、実施形態１〜６４のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２５７】
実施形態６６：前記対象が、処置中に血清抗クロマチンＡＮＡの低下を経験する、実施形態１〜５６のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２５８】
実施形態６７：前記対象が、処置中に血清抗スミスＡｇ  ＡＮＡの低下を経験する、実施形態１〜５６または６６のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２５９】
実施形態６８：前記対象が、処置中に血清ＩＬ−１βの低下を経験する、実施形態１〜５６、６６、または６７のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２６０】
実施形態６９：前記対象が、処置中に血清抗ｄｓＤＮＡ  ＡＮＡの低下を経験する、実施形態１〜５６、または６６〜６８のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２６１】
実施形態７０：前記化合物Ａが、プロドラッグとして投与される、実施形態１〜５６、または６６〜６９のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２６２】
実施形態７１：前記プロドラッグが、化合物Ａのボロン酸エステル誘導体である、実施形態７０に記載される方法、使用、または化合物。
【０２６３】
実施形態７２：前記プロドラッグが、化合物Ａの環状ボロン酸エステル誘導体である、実施形態７１に記載される方法、使用、または化合物。
【０２６４】
実施形態７３：前記プロドラッグが化合物Ｂである、実施形態７２に記載される方法、使用、または化合物。
【０２６５】
【化８】
2014506934.tif 000091
【０２６６】
実施形態７４：前記対象がヒトである、実施形態１〜５６、または６６〜７３のいずれかに記載される方法、使用、または化合物。
【０２６７】
さらなる好ましい実施形態は以下の通りである：
１．対象に化合物Ａを投与する工程を含む、対象においてループスを処置するための方法。
【０２６８】
【化９】
2014506934.tif 000092
【０２６９】
２．前記対象がヒトである、好ましい実施形態１に記載される方法。
３．前記化合物Ａが、プロドラッグとして投与される、好ましい実施形態２に記載される方法。
４．前記プロドラッグが化合物Ａのボロン酸エステルである、好ましい実施形態３に記載される方法。
５．前記プロドラッグが化合物Ｂである、好ましい実施形態４に記載される方法。
【０２７０】
【化１０】
2014506934.tif 000093
【０２７１】
６．前記化合物Ａが、週１回投与される、好ましい実施形態２に記載される方法。
７．前記化合物Ａが、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される、好ましい実施形態２に記載される方法。
８．前記化合物Ａが、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される、好ましい実施形態２に記載される方法。
９．前記化合物Ａが、約２ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される、好ましい実施形態２に記載される方法。
１０．前記化合物Ａが、約０．５ｍｇ／ｍ２〜約５ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される、好ましい実施形態５に記載される方法。
１１．前記化合物Ａが、約１ｍｇ／ｍ２〜約３ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される、好ましい実施形態５に記載される方法。
１２．前記化合物Ａが、約２ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される、好ましい実施形態５に記載される方法。
１３．前記対象が、処置中に１若しくはそれ以上の血清サイトカインの低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
１４．前記対象が、処置中にＩＬ−１２の低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
１５．前記対象が、処置中に１若しくはそれ以上の血清抗核抗体の低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
１６．前記対象が、処置中に血清抗クロマチンＩｇＧの低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
１７．前記対象が、処置中に血清抗スミスＡｇ  ＩｇＧの低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
１８．前記対象が、処置中に血清抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧの低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
１９．前記対象が、処置中にタンパク尿の低下を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
２０．前記対象が、処置中に血清Ｃ３の増加を経験する、好ましい実施形態１〜１２のいずれかに記載される方法。
【０２７２】
当業者の理解するように、上記の教示を考慮すれば本発明の多数の変更形態および変形形態が可能である。そのため、添付の特許請求の範囲内で、本明細書に具体的に記載される形態以外で本発明を実践することができ、本発明の範囲はすべてのそのような変形形態を包含することを意図することが理解される。
【０２７３】
本明細書において参照されるすべての刊行物は、すべての目的に関してその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７４】
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【図１】
2014506934.tif 000098
【図２】
2014506934.tif 000099
【図３】
2014506934.tif 000100
【図４】
2014506934.tif 000101
【図５】
2014506934.tif 000102
【図６】
2014506934.tif 000103
【図７】
2014506934.tif 000104
【図８】
2014506934.tif 000105
【図９】
2014506934.tif 000106
【図１０】
2014506934.tif 000107
【図１１】
2014506934.tif 000108
【図１２】
2014506934.tif 000109
【図１３】
2014506934.tif 000110
【図１４】
2014506934.tif 000111
【図１５】
2014506934.tif 000112
【図１６】
2014506934.tif 000113
【図１７】
2014506934.tif 000114
【図１８】
2014506934.tif 000115
【図１９】
2014506934.tif 000116
【図２０】
2014506934.tif 000117
【図２１】
2014506934.tif 000118
【図２２】
2014506934.tif 000119
【図２３】
2014506934.tif 000120
【図２４】
2014506934.tif 000121
【図２５】
2014506934.tif 000122
【図２６】
2014506934.tif 000123
【図２７】
2014506934.tif 000124
【図２８】
2014506934.tif 000125
【図２９】
2014506934.tif 000126
【図３０】
2014506934.tif 000127
【図３１】
2014506934.tif 000128
【図３２】
2014506934.tif 000129
【図３３】
2014506934.tif 000130
【図３４】
2014506934.tif 000131
【図３５】
2014506934.tif 000132
【図３６】
2014506934.tif 000133
【図３７】
2014506934.tif 000134
【図３８】
2014506934.tif 000135
【図３９】
2014506934.tif 000136
【図４０】
2014506934.tif 000137
【図４１】
2014506934.tif 000138
【図４２】
2014506934.tif 000139
【図４３】
2014506934.tif 000140
【図４４】
2014506934.tif 000141
【図４５】
2014506934.tif 000142
【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【国際調査報告】
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