(57)【要約】本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を含むシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）スキャフォールドを提供する。１または２以上の非規範ジスルフィド結合は、変異によりＦＲ２およびＦＲ３に導入されたシステイン間に形成され得る。ｓｄＡｂスキャフォールドがＶＨである場合、Ｃｙｓは、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション（４７〜４９）のうちいずれか１つおよびポジション（６７〜７１）のうちいずれか１つに導入することができ、一例において、Ｃｙｓは、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション（４９）および（６９）に導入することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フレームワーク領域（ＦＲ）に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を含む免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｉｎ）スキャフォールドが、ＶＨスキャフォールドまたはＶＬスキャフォールドから選択され、該ＶＨスキャフォールドが、前記ＦＲに少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合を含み、該非規範ジスルフィド結合が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入されたシステイン残基間に形成され；該ＶＬスキャフォールドが、該ＦＲに少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合を含み、該非規範ジスルフィド結合が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入されたシステイン残基間に形成される、組成物。
【請求項３】
前記スキャフォールドが、より大きな抗体タンパク質またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２からなる群から選択される断片または成熟免疫グロブリンの一部である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記成熟免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよび／またはＩｇＭからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫グロブリンスキャフォールドが、ＶＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＶＨが、ＶＨ３ファミリーのものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫グロブリンスキャフォールドが、ＶＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬが、カッパーまたはラムダファミリーのものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記１または２以上の非規範ジスルフィド結合が、変異によりＦＲ２およびＦＲ３に導入されたシステイン残基間に形成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記システイン残基が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記システイン残基が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入される、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記スキャフォールドが、多量体化され、得られた多量体が、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記スキャフォールドが、Ｆｃ断片、標的化配列、シグナル配列および精製タグまたはこれらの任意の組み合わせから選択される第二の配列と融合される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンスキャフォールドが、
【化１６】
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【化１７】
2014506454.tif 000035
【化１８】
2014506454.tif 000036
【化１９】
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からなる群から選択される配列またはそれと実質的に同一の配列またはその断片（ただし、該実質的に同一の配列またはその断片は、規範および非規範ジスルフィド結合の両方を保持し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む残基は、任意の適切な配列となることができる）のフレームワーク領域を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物スキャフォールド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞または生物。
【請求項１８】
請求項２に定義されている少なくとも１種の免疫グロブリンスキャフォールドを含む組換えライブラリーであって、該免疫グロブリンスキャフォールドが、ライブラリー当たり少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または１０９を超えるクローンの多様性を提供する多数の適切なＣＤＲ配列をさらに含む、組換えライブラリー。
【請求項１９】
フレームワーク領域に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を導入するステップを含む、免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物の安定性を改善する方法。
【請求項２０】
前記免疫グロブリン配列が、非ヒト動物に由来する、請求項１から１４のいずれか１または複数項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記非ヒト動物が、鳥類、両生類、爬虫類、哺乳類、ラクダ科の動物、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ウマまたは非ヒト霊長類から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記非ヒト動物が、ラクダ科の動物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ラクダ科の動物の種が、ラマ、アルパカおよびラクダから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンスキャフォールドが、ＶＨ領域、ＶＬまたはＶＨＨ領域のうちいずれか１または複数から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンスキャフォールドが、ヒューマニア化されている、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫グロブリン配列が、ヒトに由来する、請求項１から１４のいずれか１または複数項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２０１１年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／４３７１７４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、免疫グロブリンドメインの工学的作製（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）に関する。より具体的には、本発明は、免疫グロブリンの生物物理学的特性を改善するための免疫グロブリンドメインの工学的作製を対象にする。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
不安定なタンパク質は、可変的な治療有用性およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける予測不可能な生理学的効果をもたらすため、タンパク質安定性は、タンパク質治療法における重要な役割を果たす（Ｈｏｒｗｉｃｈ、２００２年；Ｗｅｔｚｅｌ、１９８８年；ＭｉｔｒａｋｉおよびＫｉｎｇ、１９９２年；ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００１年；Ｈｕｒｌｅら、１９９４年）。抗体治療の分野において、ヒトの従来の抗体および抗体断片は、大き過ぎる、および／または低い安定性、不可逆的アンフォールディングおよび低発現等の貧弱な生物物理学的特性を有する。したがって、これらの臨床応用は限定的である。「天然に存在する」シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えば、ラクダ科の動物のＶＨＨ、サメのＶＮＡＲは、その非ヒト性質のために免疫原性ではあるが、上記の問題がない。
【０００４】
完全にヒトのｓｄＡｂ、例えば、ＶＨまたはＶＬは、より低い免疫原性（または免疫原性を欠く）が予想されるため、ヒトの治療に理想的な分子となることになる。しかし、これは、その低い安定性および溶解性のために凝集する傾向がある（Ｗａｒｄら、１９８９年；ＤａｖｉｅｓおよびＲｅｉｃｈｍａｎｎ、１９９４年；ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９５年；Ｔａｎｈａら、２００１年；ＫａｚｌａｕｓｋａｓおよびＢｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ、２００９年；ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５年；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００５年）。この性質は、ヒトの治療法おけるその適用を限定する。治療分子としての安定な抗体の意義を考慮すると、より安定な／可溶性のシングルドメイン抗体を選択する試みがなされてきたのは当然のことである（ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９６年ａ；Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４年；Ｔｏら、２００５年；  Ｔａｎｈａら、２００６年；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ａ；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ｂ；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年）。
【０００５】
ｓｄＡｂの安定性を改善する典型的な一方法は、１種のｓｄＡｂをスキャフォールドとして用いて、それぞれ独自の特異性を有する数億種のｓｄＡｂ変種を含むディスプレイライブラリーを生成することである。次に、パニング技法により、標的抗原に対してバインダー（ｓｄＡｂ）が選択される。この方法に対するアプローチの一つにおいて、先ず、親スキャフォールドが、非凝集となるよう工学的に作製され、次に、非凝集スキャフォールドに基づきライブラリーが構築される。ライブラリーにおける後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）ｓｄＡｂは、親スキャフォールドの非凝集特性を全般的に「受け継ぐ」ことが想定されるため、親和性判定基準のみに基づく従来のパニングが行われて、非凝集ｓｄＡｂを選択する。第二のアプローチにおいて、親スキャフォールドは、非凝集であっても、そうでなくてもよく、そのライブラリーは、親和性と非凝集判定基準の両方に基づきパニングされる。アプローチに関係なく、凝集および非凝集ｓｄＡｂは、頻繁に共選択（ｃｏ−ｓｅｌｅｃｔ）される。多くの場合、凝集ｓｄＡｂは、選択過程において優位に立つ、あるいは、選択されたバインダーは、低い溶解性、安定性および発現レベルを有する。さらに、広範囲のアミノ酸置換が生じてＶＨを不安定化し凝集をもたらす場合、いくつかのＶＨ抗体が、親和性選択の間に失われる（ＫａｚｌａｕｓｋａｓおよびＢｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ、２００９年；Ｂｌｏｏｍら、２００６年）。これらの要因は、非凝集ｓｄＡｂの選択を退屈かつ大きな労働力を必要とし、時に手ごわいものとする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、本技術分野において依然として、非凝集性、可溶性で安定な抗体の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、免疫グロブリンドメインの工学的作製に関する。より具体的には、本発明は、免疫グロブリンの生物物理学的特性を改善するための免疫グロブリンドメインの工学的作製を対象にする。
【０００８】
本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）に１または２以上の非規範（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ジスルフィド結合を含む免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物ならびに該組成物を作製および使用するための方法を提供する。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。免疫グロブリンスキャフォールドは、ＶＨとなることができ、ＶＨは、ＶＨ３ファミリーのものとなることができる。あるいは、免疫グロブリンスキャフォールドは、ＶＬとなることができ、ＶＬは、カッパーまたはラムダファミリーのものとなることができる。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、ヒトである。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドはヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒ）されている。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、ラクダ科の動物である。一実施形態において、ラクダ科の動物の種は、ラマ、アルパカおよびラクダからなる群から選択される。
【０００９】
上に記す免疫グロブリンスキャフォールドにおいて、１または２以上の非規範ジスルフィド結合は、ＦＲ２およびＦＲ３において変異により導入されたシステイン間で形成され得る。免疫グロブリンスキャフォールドがＶＨである場合、本発明は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４７〜４９のうちいずれか１つおよびポジション６７〜７１のうちいずれか１つにＣｙｓが導入されていてよい、スキャフォールドを作製する方法を提供する。一実施形態において、Ｃｙｓは、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入されていてよい。免疫グロブリンスキャフォールドがＶＬである場合、本発明は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４６〜４９のうちいずれか１つおよびポジション６２〜６６のうちいずれか１つにＣｙｓ残基が導入されていてよい、スキャフォールドを作製する方法を提供する。一実施形態において、Ｃｙｓ残基は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入されていてよい。
【００１０】
本明細書に記載されている免疫グロブリンスキャフォールドは、抗体可変領域のフレームワーク領域ＦＲ２およびＦＲ３に導入された少なくとも２個の非規範Ｃｙｓ残基を含むポリペプチド配列を含むことができる。一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＨ  ｓｄＡｂドメインのＶＨ  ＦＲ２領域の残基４７〜４９から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基およびＶＨ  ＦＲ３領域の残基６９〜７１から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＬ  ｓｄＡｂドメインのＶＬ  ＦＲ２領域の残基４６〜４９から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基およびＶＬ  ＦＲ３領域の残基６２〜６６から選択されるポジションにＣｙｓ残基を含む。
【００１１】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＨドメインの少なくともポジション４９におけるＣｙｓ残基および少なくともポジション６９におけるＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、本発明に係るＶＨドメインは、ｓｄＡｂ断片を含む。一実施形態において、本発明は、多数のＣＤＲ配列を含む本発明に係るＶＨ  ｓｄＡｂ断片を含む発現ライブラリーを提供する。一実施形態において、配列番号２、４、６および８の群から選択される本発明に係るＶＨ  ｓｄＡｂ断片のＣＤＲ領域のポジションは、図１Ａに提示されているポジションにあり、配列番号７０〜８３の群から選択される断片のＣＤＲ領域のポジションは、ＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号の図２における対応する野生型配列に提示されているポジションにある。
【００１２】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＬドメインの少なくともポジション４８におけるＣｙｓ残基および少なくともポジション６４におけるＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、本発明に係るＶＬドメインは、ｓｄＡｂ断片を含む。一実施形態において、本発明は、多数のＣＤＲ配列を含む本発明に係るＶＬ  ｓｄＡｂ断片を含む発現ライブラリーを提供する。一実施形態において、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の群から選択される発明に係るＶＬ  ｓｄＡｂ断片のＣＤＲ領域のポジションは、図１Ｂに提示されているポジションにある。
【００１３】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドのＣＤＲ残基は、任意の適切な配列であり得、図１Ａおよび１Ｂに提示されている数以外の可変的な数の残基を有することができる。
【００１４】
一実施形態において、本発明に係る免疫グロブリンポリペプチドは、
【００１５】
【化１】
2014506454.tif 000003
【００１６】
【化２】
2014506454.tif 000004
【００１７】
【化３】
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【００１８】
【化４】
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からなる群から選択される配列またはそれと実質的に同一の配列またはその断片（ただし、実質的に同一の配列またはその断片は、規範および非規範ジスルフィド結合の両方を保持し、ＣＤＲの領域における配列は、任意の適切な配列となることができ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれに適切だが可変的な数の残基を有することができる）のうち１または複数のスキャフォールド領域を含む。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の場合、ＣＤＲを含む残基は、図１Ａおよび１Ｂに提示されている通りのものである。配列番号７０から８３の場合、ＣＤＲを含む残基は、ＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号の図２に提示されている対応する野生型クローンに提示されている通りのものである。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載されているとおりの本発明に係る非規範Ｃｙｓ−Ｃｙｓ残基を含むスキャフォールドのフレームワーク領域がその間を占める、多種多様な適切な配列および長さを含む多数のＣＤＲを含む可変ドメインであって、多様な可変ドメインをコードする組換えライブラリーも包含する。一実施形態において、組換えライブラリーは、哺乳類配列を含む。一実施形態において、組換えライブラリーは、ヒト配列を含む。一実施形態において、組換えライブラリーは、ラクダ科の動物の配列を含む。一実施形態において、組換えライブラリーは、選択された後に、必要に応じて成熟化および／またはヒューマニア化される多様な配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、フレームワーク領域に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を導入するステップを含む、シングルドメイン抗体の安定性を改善する方法を提供する。
【００２１】
本発明は、安定性を増強するようＶＨおよびＶＬドメインを工学的に作製するための方法を提供する。Ｃｙｓ対（複数可）を特定の位置に導入することによる、ＶＨおよびＶＬドメインにおける追加のジスルフィド連結（複数可）の形成は、ＶＨおよびＶＬを高度に非凝集性で可溶性、安定かつ発現可能なドメインに形質転換すると本明細書において示される。特に、ＶＨについてのアミノ酸ポジション４９および６９ならびにＶＬについての４８および６４（Ｋａｂａｔナンバリング）にＣｙｓ対が導入されるよう、ＦＲ２およびＦＲ３領域内の残基が置き換えられる場合、これらの有利な特性が得られる。Ｃｙｓ変異体において、導入された非規範残基間におけるジスルフィド連結の形成が質量分析により確認された。この様式で改変された、即ち、列挙されている非規範ジスルフィド架橋を含有するあらゆるＣｙｓ変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける有害発現を示さず、表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）の結合測定により有害な高次構造変化を示さず、凝集減少または凝集欠如のいずれかを示した。その上、あらゆる変異体は、その野生型対応物よりも少なくとも１１℃高い融解温度を有して、大幅により高い安定性を有していた。本データは、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドのいずれかまたはその両方へのこのようなジスルフィド連結の導入によるＶＨおよびＶＬドメインフレームワークの安定化が、そのプロテアーゼ抵抗性を改善できることを実証する。本発明の工学的に作製されたスキャフォールドに基づくＶＨおよび／またはＶＬライブラリーを調製して、特異的な標的分子に結合する安定かつ非凝集性のＶＨおよびＶＬを同定することができる。本技術分野で公知の種々のディスプレイライブラリーを用いて、本発明のＶＨおよび／またはＶＬ構築物を発現させることができる。一実施形態において、ライブラリーは、シングルドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」）ライブラリーである。
【００２２】
本発明は、（ｉ）凝集ｓｄＡｂを非凝集ｓｄＡｂに転換し、（ｉｉ）ｓｄＡｂライブラリーから非凝集ｓｄＡｂを得る効率を増大させ、（ｉｉｉ）ｓｄＡｂの安定性、例えば、融解温度、リフォールディング効率、プロテアーゼに対する抵抗性および発現レベルをさらに増大させることのできる新規アプローチを提供する。これらの特徴を有するＶＨおよびＶＬスキャフォールドの提供は、抗体ライブラリーからより広い範囲の抗体の回収を可能にすることができる。高度な非凝集性および安定性の保持は、他の仕方では抗体選択プロセスの間に失われてしまう可能性のある新規抗体の単離をもたらすことができる。その上、生物物理学的特徴の改善は、ＶＨおよびＶＬを、治療学および産業分野において広範に適用できるようにすることができる。
【００２３】
次に、添付の図面を参照しつつ、本発明の前述および他の特色を例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１は、ＶＨ、ＶＬおよび対応するＣｙｓ変異体の一次構造を示す。図１Ａは、Ｋａｂａｔナンバリング方式（Ｋａｂａｔら、１９９１年）を用いたＶＨ（配列番号１〜３８）のナンバリングおよびＣＤＲ表記を示す。システインに目下置き換えられている残基（Ｓｅｒ４９およびＩｌｅ６９）は、灰色の陰影で示される。図１Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングを用いたＶＬのナンバリングおよびＣＤＲ表記を示す。システインに目下置き換えられている残基（Ｉｌｅ／Ｖａｌ４８およびＧｌｙ／Ａｌａ６４）は、灰色の陰影で示される。「ＦＲ」は、ＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域を示し、ＣＤＲは、相補性決定領域を示す。
【図１Ｂ】図１は、ＶＨ、ＶＬおよび対応するＣｙｓ変異体の一次構造を示す。図１Ａは、Ｋａｂａｔナンバリング方式（Ｋａｂａｔら、１９９１年）を用いたＶＨ（配列番号１〜３８）のナンバリングおよびＣＤＲ表記を示す。システインに目下置き換えられている残基（Ｓｅｒ４９およびＩｌｅ６９）は、灰色の陰影で示される。図１Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングを用いたＶＬのナンバリングおよびＣＤＲ表記を示す。システインに目下置き換えられている残基（Ｉｌｅ／Ｖａｌ４８およびＧｌｙ／Ａｌａ６４）は、灰色の陰影で示される。「ＦＲ」は、ＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域を示し、ＣＤＲは、相補性決定領域を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）精製からのＶＨの溶出プロファイルを示す。野生型および変異体ＶＨは、それぞれ点線および実線（ｃｌｏｓｅｄ  ｌｉｎｅ）で示す。２０ｍＬの時点またはその後に溶出するピークは、精製ＶＨを含有する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＭＡＣにより精製された野生型および変異体ＶＨの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す（例としてＨＶＨＡｍ３０２／ＨＶＨＡｍ３０２ＳおよびＨＶＨＰＣ２３５／ＨＶＨＰＣ２３５Ｓペアを示す）。矢印は、ＨＶＨＡｍ３０２の二量体分子種を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける「Ｍ」は、タンパク質標準をロードしたレーンを示す。
【図３Ａ−１】図３Ａは、質量分析法による分析のためのＶＨのトリプシンペプチド（配列番号２５〜３６、表２も参照）の概略図である。Ｃｙｓ対を接続するジスルフィド連結（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）を線で示す。黒塗りの点（ｃｌｏｓｅｄ  ｄｏｔ）は、ポジション４９および６９に導入されたシステイン（Ｃ）を示す。規範天然（野生型および変異体に存在）または非規範工学的作製（変異体にのみ存在）ジスルフィド連結を有する主要ペプチドのみを示す。トリプシン消化部位（ＬｙｓおよびＡｒｇのＣ末端）は太字で示す。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、ＶＨがトリプシンにより首尾よく消化されて、小型のペプチドになったことを示す（「＋トリプシン」を「−トリプシン」と比較）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける「Ｍ」は、タンパク質標準をロードしたレーンを示す。
【図３Ａ−２】図３Ａは、質量分析法による分析のためのＶＨのトリプシンペプチド（配列番号２５〜３６、表２も参照）の概略図である。Ｃｙｓ対を接続するジスルフィド連結（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）を線で示す。黒塗りの点（ｃｌｏｓｅｄ  ｄｏｔ）は、ポジション４９および６９に導入されたシステイン（Ｃ）を示す。規範天然（野生型および変異体に存在）または非規範工学的作製（変異体にのみ存在）ジスルフィド連結を有する主要ペプチドのみを示す。トリプシン消化部位（ＬｙｓおよびＡｒｇのＣ末端）は太字で示す。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、ＶＨがトリプシンにより首尾よく消化されて、小型のペプチドになったことを示す（「＋トリプシン」を「−トリプシン」と比較）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける「Ｍ」は、タンパク質標準をロードしたレーンを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨＶＨＡｍ３０２Ｓのトリプシン消化からの、工学的に作製したジスルフィド連結したペプチド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＥＷＶＣＡＩＳＳＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（Ｐ１）（Ｔ４４〜Ｔ６４）−ＦＴＣＳＲ（Ｐ２）（Ｔ６７〜Ｔ７１）（Ｃｙｓ４９−Ｃｙｓ６９）（配列番号２９および３０）のｍ／ｚ９６４．０４（３＋）イオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）−ＭＳ２スペクトルである。ジスルフィド連結を有する２種のペプチド（ｂ１６＋Ｐ２およびｙ１１７＋Ｐ２）は、ＭＳ（質量分析）ピークに注釈を付け、アスタリスクで示す。関連データを表２に提示する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムの調査から観察される、ジスルフィド連結したペプチドＬＬＣＦＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲ（Ｐ１）（配列番号４３）、ＦＳＣＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳ  ＴＰＲ（Ｐ２）（配列番号４４）およびＶＴＩＴＣＲ（Ｐ３）（配列番号４２）に対応するＨＶＬＰ３２４Ｓトリプシンペプチドからの、ｍ／ｚ１０４２．６６（６＋）におけるジスルフィド連結したペプチドイオンのＣＩＤ−ＭＳ２スペクトルである。ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）による改変としてのＰ２とＰ３から、非常に情報価値のあるｙフラグメントイオンを観察した。同様に、Ｐ１のほぼ完全なｙイオンシリーズを観察した。ＥＴＤによる３種のペプチド断片のジスルフィド連結の解離後に、それぞれｍ／ｚ６９１．４７（１＋）、１６４８．８６（１＋）および１９５６．８５（２＋）におけるインタクトＰ１、Ｐ２およびＰ３イオンが全て相対的に高い存在量で観察された、ＨＶＬＰ３２４Ｓの同一のジスルフィド−連結したペプチドから、ｍ／ｚ１２５０．９９（５＋）におけるペプチドイオン［Ｍ＋５Ｈ］５＋のＥＴＤ−ＭＳ２スペクトルにより、ジスルフィド連結をさらに確認した（データは示していない）。
【図４Ａ】図４Ａは、ＶＨドメインおよびその対応するＣｙｓ変異体バージョン（ＨＶＨＡｍ３０２／ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ、ＨＶＨＡｍ４２７／ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ、ＨＶＨＡｍ４３１／ＨＶＨＡｍ４３１ＳおよびＨＶＨＰＣ２３５／ＨＶＨＰＣ２３５Ｓ）の分子ふるいクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４種の追加のＣｙｓ変異体ＶＨドメイン（ＨＶＨＰ４１４Ｓ、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４２６ＳおよびＨＶＨＰ４２９Ｓ）の分子ふるいクロマトグラムを示す。対応する野生型バージョンは、非凝集単量体であることが以前に示された（Ｔｏら、２００５年）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヒトＶＬドメインおよびそのＣｙｓ変異体バージョンの分子ふるいクロマトグラムを示す。図４Ａ、ＢおよびＣにおける各クロマトグラムについては、バックグラウンド吸光度を差し引き、１００％に設定した単量体ピーク（矢頭で示す）に対して全ピークを正規化した。単量体ピークの左にあるピークは、凝集体ピークとして考えられた。
【図５】図５は、ＶＨの熱によるアンフォールディングを示す。野生型およびＣｙｓ変異体ＶＨは、それぞれ黒塗りおよび白塗りの記号で示す（ＨＶＨＡｍ３０２およびＨＶＨＡｍ３０２Ｓ（正方形）；ＨＶＨＡｍ４３１およびＨＶＨＡｍ４３１Ｓ（丸）；ＨＶＨＰＣ２３５およびＨＶＨＰＣ２３５Ｓ（三角形））。ＶＨの計算されたアンフォールディング中点温度、Ｔｍを表４に記録する。
【図６】図６は、野生型（図６Ａ）またはＣｙｓ変異体（図６Ｂ）ＶＬの熱によるアンフォールディングを示す。計算されたＴｍを表４に記録する。図６Ｃにおいて、それぞれ最低および最高Ｔｍを有するＨＶＬＰ３８９およびＨＶＬＰ３２５の熱によるアンフォールディング曲線を、そのＣｙｓ変異体バージョン、ＨＶＬＰ３８９ＳおよびＨＶＬＰ３２５Ｓと並列で比較する。
【図７Ａ−１】図７は、固定したプロテインＡに対するＶＨのＳＰＲ結合解析を示す。次に、図７ＡにおいてμＭで示す各ＶＨの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５および３．３５（ＨＶＨＡｍ３０２）；０．２、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０および３．８８（ＨＶＨＡｍ４２７）；０．５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５および３．８１（ＨＶＨＡｍ４３１）；０．０１、０．０１、０．０２、０．０５、０．２５、０．２５、０．５、１．０および２．５（ＨＶＨＡｍＣ２３５）；０．４、０．８、１．６、３．２、５．４および８．２２（ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ）；０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．０および３．０８（ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ）；０．５、１．０、１．０、２．０、４．０、６．５、１０．０および１３．３（ＨＶＨＡｍ４３１Ｓ）；０．０２５、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．４、０．８、０．８、０．８、１．５、１．５、３．０、６．０および９．９（ＨＶＨＡｍＣ２３５Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。ＲＵ、共鳴単位。図７Ｂは、野生型および変異体ＶＨのアイソアフィニティー対角プロットによる運動速度図である。ＳＰＲ解析により決定された運動速度（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を、同じ対角線上に位置するＶＨが、同一ＫＤ値を有するように、二次元平面に対数スケールでプロットした。
【図７Ａ−２】図７は、固定したプロテインＡに対するＶＨのＳＰＲ結合解析を示す。次に、図７ＡにおいてμＭで示す各ＶＨの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５および３．３５（ＨＶＨＡｍ３０２）；０．２、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０および３．８８（ＨＶＨＡｍ４２７）；０．５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５および３．８１（ＨＶＨＡｍ４３１）；０．０１、０．０１、０．０２、０．０５、０．２５、０．２５、０．５、１．０および２．５（ＨＶＨＡｍＣ２３５）；０．４、０．８、１．６、３．２、５．４および８．２２（ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ）；０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．０および３．０８（ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ）；０．５、１．０、１．０、２．０、４．０、６．５、１０．０および１３．３（ＨＶＨＡｍ４３１Ｓ）；０．０２５、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．４、０．８、０．８、０．８、１．５、１．５、３．０、６．０および９．９（ＨＶＨＡｍＣ２３５Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。ＲＵ、共鳴単位。図７Ｂは、野生型および変異体ＶＨのアイソアフィニティー対角プロットによる運動速度図である。ＳＰＲ解析により決定された運動速度（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を、同じ対角線上に位置するＶＨが、同一ＫＤ値を有するように、二次元平面に対数スケールでプロットした。
【図７Ｂ】図７は、固定したプロテインＡに対するＶＨのＳＰＲ結合解析を示す。次に、図７ＡにおいてμＭで示す各ＶＨの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５および３．３５（ＨＶＨＡｍ３０２）；０．２、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０および３．８８（ＨＶＨＡｍ４２７）；０．５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５および３．８１（ＨＶＨＡｍ４３１）；０．０１、０．０１、０．０２、０．０５、０．２５、０．２５、０．５、１．０および２．５（ＨＶＨＡｍＣ２３５）；０．４、０．８、１．６、３．２、５．４および８．２２（ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ）；０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．０および３．０８（ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ）；０．５、１．０、１．０、２．０、４．０、６．５、１０．０および１３．３（ＨＶＨＡｍ４３１Ｓ）；０．０２５、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．４、０．８、０．８、０．８、１．５、１．５、３．０、６．０および９．９（ＨＶＨＡｍＣ２３５Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。ＲＵ、共鳴単位。図７Ｂは、野生型および変異体ＶＨのアイソアフィニティー対角プロットによる運動速度図である。ＳＰＲ解析により決定された運動速度（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を、同じ対角線上に位置するＶＨが、同一ＫＤ値を有するように、二次元平面に対数スケールでプロットした。
【図８Ａ−１】図８は、固定したプロテインＬに対するＶＬのＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。図８Ａにおける各ＶＬの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、０．７５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３８９、ＨＶＬＰ３５１およびＨＶＬＰ３６４）；１、２、３、５、７．５および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２）；０．２、０．５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３３５）；０．２、０．５、１、１．５、２および５μＭ（ＨＶＬＰ３２５）、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３および５μＭ（ＨＶＬＰ３１０３）ならびに１、２、４、６、８および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４）。プロテインＬの低親和性部位に対するＨＶＬＰ３２４およびＨＶＬＰ３４２結合のセンサーグラムは包含されていないが、計算されたＫＤを表４に記録する。図８Ｂにおいて、Ｃｙｓ変異体ＶＬの濃度は、以下のとおりであった：０．０５、０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４および７μＭ（ＨＶＬＰ３８９Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４、６および８μＭ（ＨＶＬＰ３３５Ｓ）；０．０５、０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４および６μＭ（ＨＶＬＰ３５１Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、２、４、７および１０μＭ（ＨＶＬＰ３１０３Ｓ）；４、８、８、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４Ｓ）；０．１、０．２、０．４、０．８、１．５、３、６、１２μＭ（ＨＶＬＰ３２５Ｓ）；２、４、８、１６、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。
【図８Ａ−２】図８は、固定したプロテインＬに対するＶＬのＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。図８Ａにおける各ＶＬの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、０．７５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３８９、ＨＶＬＰ３５１およびＨＶＬＰ３６４）；１、２、３、５、７．５および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２）；０．２、０．５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３３５）；０．２、０．５、１、１．５、２および５μＭ（ＨＶＬＰ３２５）、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３および５μＭ（ＨＶＬＰ３１０３）ならびに１、２、４、６、８および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４）。プロテインＬの低親和性部位に対するＨＶＬＰ３２４およびＨＶＬＰ３４２結合のセンサーグラムは包含されていないが、計算されたＫＤを表４に記録する。図８Ｂにおいて、Ｃｙｓ変異体ＶＬの濃度は、以下のとおりであった：０．０５、０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４および７μＭ（ＨＶＬＰ３８９Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４、６および８μＭ（ＨＶＬＰ３３５Ｓ）；０．０５、０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４および６μＭ（ＨＶＬＰ３５１Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、２、４、７および１０μＭ（ＨＶＬＰ３１０３Ｓ）；４、８、８、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４Ｓ）；０．１、０．２、０．４、０．８、１．５、３、６、１２μＭ（ＨＶＬＰ３２５Ｓ）；２、４、８、１６、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。
【図８Ｂ−１】図８は、固定したプロテインＬに対するＶＬのＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。図８Ａにおける各ＶＬの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、０．７５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３８９、ＨＶＬＰ３５１およびＨＶＬＰ３６４）；１、２、３、５、７．５および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２）；０．２、０．５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３３５）；０．２、０．５、１、１．５、２および５μＭ（ＨＶＬＰ３２５）、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３および５μＭ（ＨＶＬＰ３１０３）ならびに１、２、４、６、８および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４）。プロテインＬの低親和性部位に対するＨＶＬＰ３２４およびＨＶＬＰ３４２結合のセンサーグラムは包含されていないが、計算されたＫＤを表４に記録する。図８Ｂにおいて、Ｃｙｓ変異体ＶＬの濃度は、以下のとおりであった：０．０５、０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４および７μＭ（ＨＶＬＰ３８９Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４、６および８μＭ（ＨＶＬＰ３３５Ｓ）；０．０５、０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４および６μＭ（ＨＶＬＰ３５１Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、２、４、７および１０μＭ（ＨＶＬＰ３１０３Ｓ）；４、８、８、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４Ｓ）；０．１、０．２、０．４、０．８、１．５、３、６、１２μＭ（ＨＶＬＰ３２５Ｓ）；２、４、８、１６、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。
【図８Ｂ−２】図８は、固定したプロテインＬに対するＶＬのＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。図８Ａにおける各ＶＬの濃度は以下のとおりであった：０．２、０．５、０．７５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３８９、ＨＶＬＰ３５１およびＨＶＬＰ３６４）；１、２、３、５、７．５および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２）；０．２、０．５、１、２、３、５および１０μＭ（ＨＶＬＰ３３５）；０．２、０．５、１、１．５、２および５μＭ（ＨＶＬＰ３２５）、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３および５μＭ（ＨＶＬＰ３１０３）ならびに１、２、４、６、８および１０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４）。プロテインＬの低親和性部位に対するＨＶＬＰ３２４およびＨＶＬＰ３４２結合のセンサーグラムは包含されていないが、計算されたＫＤを表４に記録する。図８Ｂにおいて、Ｃｙｓ変異体ＶＬの濃度は、以下のとおりであった：０．０５、０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４および７μＭ（ＨＶＬＰ３８９Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４、６および８μＭ（ＨＶＬＰ３３５Ｓ）；０．０５、０．１、０．２、０．２、０．４、０．６、１、２、４および６μＭ（ＨＶＬＰ３５１Ｓ）；０．１、０．２、０．２、０．５、０．７５、１、２、４、７および１０μＭ（ＨＶＬＰ３１０３Ｓ）；４、８、８、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３２４Ｓ）；０．１、０．２、０．４、０．８、１．５、３、６、１２μＭ（ＨＶＬＰ３２５Ｓ）；２、４、８、１６、１６、３２、６４、１２０、２４０ｎＭ（ＨＶＬＰ３４２Ｓ）。計算されたＫＤを表４に記録する。
【図９−１】図９は、ＶＬのＧＩプロテアーゼ（ペプシン、キモトリプシンおよびトリプシン）抵抗性を示す。図９Ａは、異なる比率のプロテアーゼ対タンパク質における野生型ＶＬ（白塗の丸）のプロテアーゼ抵抗性プロファイルを、Ｃｙｓ変異体ＶＬ（黒塗の丸）のプロファイルと比較する。図９Ｂにおいて、野生型（白丸）対Ｃｙｓ変異体（黒塗の丸）のＶＬについての％プロテアーゼ抵抗性対Ｔｍのプロットを示す。
【図９−２】図９は、ＶＬのＧＩプロテアーゼ（ペプシン、キモトリプシンおよびトリプシン）抵抗性を示す。図９Ａは、異なる比率のプロテアーゼ対タンパク質における野生型ＶＬ（白塗の丸）のプロテアーゼ抵抗性プロファイルを、Ｃｙｓ変異体ＶＬ（黒塗の丸）のプロファイルと比較する。図９Ｂにおいて、野生型（白丸）対Ｃｙｓ変異体（黒塗の丸）のＶＬについての％プロテアーゼ抵抗性対Ｔｍのプロットを示す。
【図１０】図１０は、ｆｄ−ｔｅｔＶＬ２４Ｓベクターの概略図を示す。ＰＣＲを行い、ＡｐａＬＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、その後、ＡｐａＬＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で線状化したｆｄ−ｔｅｔＧＩＩＩＤ（Ｔａｎｈａら、２００１年）ファージＤＮＡへとクローニングすることにより、その３’端にリンカー配列を有するＨＶＬＰ３２４Ｓ遺伝子を調製した。この操作により、ファージ遺伝子ＩＩＩリーダー配列と遺伝子ＩＩＩオープンリーディングフレーム配列との間にリンカーを有するＨＶＬＰ３２４Ｓを配置させる。ＤＮＡリンカー配列は、ＧＳＧＳＫＡＡＡ（配列番号８６）ポリペプチドをコードし、式中、リシン残基は、トリプシン開裂部位（矢印で示す）を提供する。この構成により、抗体ファージディスプレイライブラリーのパニングにおける結合ステップに続きトリプシンを添加することにより、標的抗原から結合しているファージの溶出を可能にする。
【図１１】図１１は、合成ＨＶＬＰ３２４Ｓライブラリーの構築を示す。ライブラリー構築のために用いたヒトＶＬスキャフォールドであるＨＶＬＰ３２４Ｓのアミノ酸配列（配列番号１０）は、Ｋａｂａｔ方式（Ｋａｂａｔら、１９９１年）に従ってナンバリングした。ランダム化されることになるＣＤＲ（１、２および３）におけるアミノ酸ポジションに下線を引いた。非規範Ｃｙｓ残基を点で示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発のために選択したＣＤＲにおけるＨＶＬＰ３２４Ｓコドンを、その対応するランダム化コドンと共に示す。アミノ酸ポジション２８（ＣＤＲ１における）は、ＳｅｒまたはＧｌｙコドン（ＲＧＣとして示す）に制限され、ポジション５４（ＣＤＲ２における）は、ＡｒｇまたはＬｅｕコドン（ＣＫＮとして示す）に制限された。ＣＤＲ３変異誘発に対し、種々の長さを有する３種のオリゴヌクレオチド（ＶＬ２４−ＣＤＲ３／３ａ／３ｂ；表６、実施例８を参照）を用いて、９、１０または１１アミノ酸のＣＤＲ３長を作製した。ＩＵＰＡＣ命名法に従い次の文字を用いて、オリゴヌクレオチド内の種々のポジションにおける縮重核酸を表記した。Ｎ：Ａ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチド；Ｒ：ＡまたはＧヌクレオチド；Ｋ：ＴまたはＧヌクレオチド。
【図１２】図１２は、ヒトリゾチームと結合するＶＬのファージ選択を示す。２種の異なる選択条件（室温および６５℃−２時間）下におけるファージパニング（ラウンド３および４）から選択された抗ヒトリゾチームＶＬの頻度（％）を、それぞれ灰色または黒色の角柱で示す。
【図１３】図１３は、抗ヒトリゾチームＶＬおよび抗ヒト血清アルブミンＶＬのアミノ酸配列を示す。ＨＶＬＰ３２４Ｓのアミノ酸配列（配列番号１０）を、詳細な生物物理学的解析のために選択された８種の抗ヒトリゾチームＶＬおよび１種の抗ヒト血清アルブミンＶＬとともに整列する。ＣＤＲおよびＦＲは、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔら、１９９１年）により表記した。
【図１４】図１４は、抗ヒトリゾチームＶＬの非凝集状態および熱安定性を示す。（Ａ）抗ヒトリゾチームＶＬおよび抗ヒト血清アルブミンＶＬのＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）。クロマトグラム毎に、バックグラウンド吸光度を差し引き、全ピークは、１００％に設定された単量体ピーク（矢頭）に対して正規化された。単量体ピークの左にあるピークは、凝集ピークとみなす。記載されているクロマトグラムの面積積分により、％凝集体値および％単量体値を計算した。（Ｂ）抗ヒトリゾチームＶＬおよび抗ヒト血清アルブミンＶＬの熱によるアンフォールディング転移曲線。以前に記載された通り、フォールディングしたものの割合対温度のプロットを得た。アンフォールディング転移曲線の中点（Ｆ０．５）に対応する温度を、融解温度（Ｔｍ）とした。Ｔｍ範囲を両矢印で示す。（Ｃ）Ｔｍ対％単量体の相関曲線。データをプロットし、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ（バージョン４．０２）により解析した。
【図１５−１】図１５は、抗ヒトリゾチームＶＬのＳＰＲ解析を示す。各センサーグラムに示された以下の多様な濃度範囲における、固定した抗ヒトリゾチームＶＬとヒトリゾチームとの結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。ＨＶＬＨＬＡＱについては、１０、２５、２５、１００、２００、２００、５００、７５０および２０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＤＳは、１００、２５０、５００、１０００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００および１００００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＥＭについては、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、１５０００および２００００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＮＥについては、１０、２５、５０、１００、２５０、２５０、５００、７５０および１０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＮＮについては、５０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００および１０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＱＩについては、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１０００および２５００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＲＮについては、１０、２５、５０、１００、２００、２００、５００、７５０および１０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＹＳについては、５０、１００、２５０、５００、１０００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、１００００、１５０００および２００００ｎＭ。
【図１５−２】図１５は、抗ヒトリゾチームＶＬのＳＰＲ解析を示す。各センサーグラムに示された以下の多様な濃度範囲における、固定した抗ヒトリゾチームＶＬとヒトリゾチームとの結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。ＨＶＬＨＬＡＱについては、１０、２５、２５、１００、２００、２００、５００、７５０および２０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＤＳは、１００、２５０、５００、１０００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００および１００００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＥＭについては、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、１５０００および２００００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＮＥについては、１０、２５、５０、１００、２５０、２５０、５００、７５０および１０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＮＮについては、５０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００および１０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＱＩについては、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１０００および２５００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＲＮについては、１０、２５、５０、１００、２００、２００、５００、７５０および１０００ｎＭ；ＨＶＬＨＬＹＳについては、５０、１００、２５０、５００、１０００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、１００００、１５０００および２００００ｎＭ。
【図１６−１】図１６は、抗ヒトリゾチームＶＬのＩＭＡＣ精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。（Ａ）固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に続く、抗ヒトリゾチームＶＬの溶出プロファイル。精製ＶＬに対応する溶出ピークは、四角のボックスで示す。ｍＡＵ、ミリ吸光度単位。（Ｂ）還元（＋ＤＴＴ）条件下における、ＩＭＡＣ精製ＶＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する前に、精製ＶＬをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において透析した。星印は、Ｈｉｓタグの取れたＶＬを表示する。タンパク質標準（レーンＭ）は、それぞれの分子量をｋＤａで標示する。
【図１６−２】図１６は、抗ヒトリゾチームＶＬのＩＭＡＣ精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。（Ａ）固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に続く、抗ヒトリゾチームＶＬの溶出プロファイル。精製ＶＬに対応する溶出ピークは、四角のボックスで示す。ｍＡＵ、ミリ吸光度単位。（Ｂ）還元（＋ＤＴＴ）条件下における、ＩＭＡＣ精製ＶＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する前に、精製ＶＬをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において透析した。星印は、Ｈｉｓタグの取れたＶＬを表示する。タンパク質標準（レーンＭ）は、それぞれの分子量をｋＤａで標示する。
【図１７】図１７は、抗ヒト血清アルブミンＶＬのＳＰＲ解析を示す。センサーグラムに示された以下の多様な濃度範囲の、固定したヒト血清アルブミンに対する抗ヒト血清アルブミンＶＬの結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．５、０．７５、１、１、２および４μＭ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫グロブリンドメインの工学的作製に関する。より具体的には、本発明は、免疫グロブリンの生物物理学的特性を改善するための免疫グロブリンドメインの工学的作製を対象にする。組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）ならびにこのような組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を作製および使用する方法が、提供される。
【００２６】
本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を含むＶＨまたはＶＬスキャフォールドを含むポリペプチドを含む組成物であって、該非規範ジスルフィド結合が、該ポリペプチドの改善された安定性および非凝集性を提供する組成物を提供する。一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドである。一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＨまたはＶＬドメインのｓｄＡｂ断片を含む。ｓｄＡｂは、本明細書に記載されているＶＨ領域、ＶＨＨ領域またはＶＬ領域に由来し得る。
【００２７】
免疫グロブリンスキャフォールドは、重鎖可変領域（「ＶＨ」）を含むことができる。一実施形態において、ＶＨは、ＶＨ１、ＶＨ２またはＶＨ３ファミリーに由来する。一実施形態において、ＶＨは、ＶＨ３ファミリーのものであり得る。あるいは、免疫グロブリンスキャフォールドは、軽鎖可変領域（「ＶＬ」）のものであり得る。一実施形態において、ＶＬは、カッパーまたはラムダファミリーのものであり得る。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、非ヒト動物である。一実施形態において、非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、特に、鳥類、両生類、爬虫類、哺乳類、ラクダ科の動物、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ウマまたは非ヒト霊長類から選択される脊椎動物を包含する。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、ヒトである。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、ラクダ科の動物である。一実施形態において、ラクダ科の動物の種は、ラマ、アルパカおよびラクダからなる群から選択される。一実施形態において、ラクダ科の動物のスキャフォールドは、ＶＨ領域、ＶＬまたはＶＨＨ領域のうちいずれか１または複数に由来する。
【００２８】
一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、「ヒューマニア化」（あるいは同様に「ヒト化」と言う）されている、即ち、ヒト被験体に投与されるｓｄＡｂとの関係において免疫原性または潜在的に免疫原性のアミノ酸残基を有していたが、免疫原性がより低いまたは免疫原性がないアミノ酸に置き換えられた、ヒト以外の種から生じたｓｄＡｂである。Ｋａｌｏｂｉｏｓのヒューマニア化技術が挙げられるがそれに限定されない、ヒューマニア化抗体を作製するための本技術分野で公知のいずれかの方法が、本発明において企図される。スキャフォールドがヒューマニア化される場合、免疫原性アミノ酸残基は、保存されたアミノ酸変化を構成するか否かにかかわらず、他のいかなる免疫原性のより低いアミノ酸残基に置き換えてもよいことに留意されたい。本発明のヒューマニア化されたスキャフォールドは、本明細書に記載されている非規範Ｃｙｓ残基ならびに、任意の天然（規範）ジスルフィド結合を保持することが理解される。
【００２９】
本明細書において、「ＶＨドメインまたはＶＬドメイン」とも称される用語「ＶＨ」または「ＶＬ」は、本明細書において使用する場合、それぞれ抗体重鎖または抗体軽鎖の可変領域を指す。一実施形態において、ＶＨドメインまたはＶＬドメインは、「シングルドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）形式のものである。本明細書において使用する場合、「ｓｄＡｂ」は、免疫グロブリンフォールドを保持する単一の免疫グロブリンドメインを指す。即ち、これは、最大３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、最大４個のフレームワーク領域（ＦＲ）と共に抗原結合部位を形成している可変ドメインである。ＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメインのＣＤＲは、本明細書において使用する場合、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。ＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメインのＦＲは、本明細書において使用する場合、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される。相補性決定領域の同定のために、種々のスキームが存在し、２通りの最も一般的なスキームは、ＫａｂａｔのスキームならびにＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋのスキームである。Ｋａｂａｔら（１９９１年）は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインの抗原結合領域における配列可変性に基づき「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義する。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）は、ＶＨおよびＶＬドメインにおける構造的ループ領域の位置に基づき「高度可変ループ」（ＨまたはＬ）を定義する。これらの個々のスキームは、隣接またはオーバーラップするＣＤＲおよび高度可変ループ領域を定義するため、抗体技術分野の当業者は、多くの場合、用語「ＣＤＲ」および「高度可変ループ」を互換的に利用し、本明細書においても、この用語をそのように用いることができる。可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）における配列可変性の大部分は、ＣＤＲ／ループにおいて生じる。ＣＤＲ／ループの外側の領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。ＦＲは、可変ドメインに構造的完全性を提供し、免疫グロブリンフォールドの保持を確実にする。ＦＲおよびＣＤＲ／ループは、本明細書において使用する場合、Ｋａｂａｔナンバリング方式（Ｋａｂａｔら、１９９１年）に従って定義される。一実施形態において、本明細書に記載されているポリペプチドのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域によるポジションのナンバリングは、ＶＨドメインに関しては図１Ａに提示されている通りのものであり、ＶＬドメインに関しては図１Ｂに提示されている通りのものである。
【００３０】
ヒトＶＨドメインまたはヒトＶＬドメインは、ヒトＩｇ重鎖または軽鎖配列から得ることができる（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５年；Ｈｏｌｔら、２００３年；Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４年；Ｔｏら、２００５年）。ＶＨドメインまたはＶＬドメインを非ヒト種から得るための同様の技法は、本技術分野で公知である。さらに、本発明の本発明に係るＶＨドメインおよびＶＬドメインは、組換えにより産生されたＶＨまたはＶＬならびに、親和性成熟、安定化、可溶化（例えば、ラクダ化）または他の抗体の工学的作製方法による、このようなＶＨまたはＶＬのさらなる改変により生成されたＶＨまたはＶＬを包含する。本発明により、ＶＨまたはＶＬの安定性および非凝集特徴を保持または改善するホモログ、誘導体または変異体も包含される。
【００３１】
本発明は、非規範Ｃｙｓ残基（ｒｅｓｉｄｅ）を含むスキャフォールドを含む新規ＶＨまたはＶＬドメインを提供する。本明細書で使用する「スキャフォールド」、または、代わりに「免疫グロブリンスキャフォールド」は、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、ここで、フレームワークは、種々のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のためのポリペプチド骨格を提供する。本明細書において使用する場合、用語「スキャフォールド」は、本発明の組成物のフレームワーク部分を記載するため、ＣＤＲ領域を無視する。
【００３２】
本明細書に記載されている免疫グロブリンスキャフォールドは、抗体可変領域のフレームワーク領域ＦＲ２およびＦＲ３に導入された、少なくとも２個の非規範Ｃｙｓ残基を含むポリペプチド配列を含むことができる。一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＨ  ｓｄＡｂドメインのＶＨ  ＦＲ２領域の残基４７〜４９から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基およびＶＨ  ＦＲ３領域の残基６９〜７１から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＬ  ｓｄＡｂドメインのＶＬ  ＦＲ２領域の残基４６〜４９から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基およびＶＬ  ＦＲ３領域の残基６２〜６６から選択されるポジションにおけるＣｙｓ残基を含む。本明細書において使用する場合、「導入された」または「導入する」は、特に組換え技術等、当業者に公知のいずれかの適切な方法を用いて、ポリペプチド組成物または該ポリペプチド組成物をコードするヌクレオチド配列に変化を取り込むことを意味する。一実施形態において、Ｃｙｓ残基は、遺伝子、コード配列および／またはｍＲＮＡにおける既存のコドンを、システイン残基に特異的なコドンで置き換えることにより、ＶＨおよび／またはＶＬ構築物に導入される。
【００３３】
一実施形態において、本発明に係る組成物は、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドから選択される免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｉｎ）スキャフォールドを含み、ここで、ＶＨスキャフォールドは、ＦＲに少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合を含み、ここで、非規範ジスルフィド結合は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入されたＣｙｓ残基間に形成され、ＶＬスキャフォールドは、ＦＲに少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合を含み、ここで、非規範ジスルフィド結合は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入されたＣｙｓ残基間に形成される。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「発明に係る」ＶＨ構築物またはｓｄＡｂ断片は、少なくともポジション４９におけるＣｙｓ残基および少なくともポジション６９におけるＣｙｓ残基を含む、少なくとも１個の非規範ジスルフィド架橋を含む。
【００３５】
本明細書において使用する場合、「発明に係る」ＶＬ構築物またはｓｄＡｂ断片は、少なくともポジション４８におけるＣｙｓ残基および少なくともポジション６４におけるＣｙｓ残基を含む、少なくとも１個の非規範ジスルフィド架橋を含む。
【００３６】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＨドメインの少なくともポジション４９におけるＣｙｓ残基および少なくともポジション６９におけるＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、本発明に係るＶＨドメインは、ｓｄＡｂ断片を含む。一実施形態において、本発明は、本発明に係るＶＨ免疫グロブリンスキャフォールドを含む発現ライブラリーであって、ここで、免疫グロブリンスキャフォールドが、多数のＣＤＲ配列をさらに含む発現ライブラリーを提供する。一実施形態において、本発明は、ライブラリー当たり少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または１０９クローンを超える多様性を有するライブラリーを提供するように、本発明に係るＶＨ免疫グロブリンスキャフォールドおよび多数の適切なＣＤＲ配列を含む組換えライブラリーを提供する。一実施形態において、配列番号２、４、６および８の群から選択される、本発明に係るＶＨ  ｓｄＡｂ断片のＣＤＲ領域のポジションは、図１Ａに提示されているポジションにあり、配列番号７０〜８３の場合のポジションは、ＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号の図２における対応する野生型配列に提示されているポジションにある。
【００３７】
一実施形態において、ポリペプチドは、ＶＬドメインの少なくともポジション４８におけるＣｙｓ残基および少なくともポジション６４におけるＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、本発明に係るＶＬドメインは、ｓｄＡｂ断片を含む。一実施形態において、本発明は、本発明に係るＶＬ  ｓｄＡｂ断片を含む発現ライブラリーであって、ここで、本発明に係るｓｄＡｂ断片が、多数のＣＤＲ配列を含む発現ライブラリーを提供する。一実施形態において、本発明は、ライブラリー当たり少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または１０９クローンを超える多様性を有するライブラリーを提供するように、本発明に係るＶＬ免疫グロブリンスキャフォールドおよび多数の適切なＣＤＲ配列を含む組換えライブラリーを提供する。一実施形態において、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の群から選択される本発明に係るＶＬ  ｓｄＡｂ断片のＣＤＲ領域のポジションは、図１Ｂに提示されているポジションにある。
【００３８】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドのＣＤＲ残基は、任意の適切な配列であり得、図１Ａおよび１Ｂに提示されている数以外の可変的な数の残基を有することができる。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ、抗体技術分野の当業者にとって公知の指針に従って配列および長さが変動し得る。特定の参考文献のいずれか１報に限定されることは望まないが、本明細書に引用されているＫａｂａｔならびにＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋの刊行物において、例示的な指針が提供される。非限定的な例において、ＨＶＬＰ３２４Ｓスキャフォールドに基づくファージライブラリーの設計および構築を図１１および実施例８に提示し、ライブラリーを実施例９において特徴付ける。
【００３９】
本発明のＶＨまたはＶＬ組成物は、追加のライブラリーまたは抗体の構築におけるスキャフォールドを提供する。一実施形態において、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を用いて、種々のＣＤＲを保有することができる、即ち、ここで、ＦＲは、提示されている通りのものであり、ここで、ＣＤＲ領域の配列および残基数は、提示されている通りのものである、あるいはＣＤＲ特異的残基の１もしくは複数または全てにおいて変動する。この様式において、合成ＶＨまたはＶＬライブラリーは、ランダム化した配列を含む適切なオリゴヌクレオチドを挿入して、ランダム化したＣＤＲ／ループを提供することにより、単一スキャフォールド上に構築することができる。このようなライブラリーは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは酵母ディスプレイ等の、ディスプレイライブラリーであり得る。このアプローチは、本技術分野においてルーチンであり、多くの刊行物（例えば、Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ａおよびその参考文献が挙げられるがこれらに限定されない）に記載されている。さらなる抗体工学的作製のため、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟のため、ライブラリーを必要に応じて用いることができる（ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９６年ｂ；Ｙａｕら、２００５年）。あるいは、天然に存在するｓｄＡｂに基づく既存のライブラリーを用いて、スプライスオーバーラップ伸長（ｓｐｌｉｃｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年およびその参考文献；Ｈｏら、１９８９年）または他の方法（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７年；Ｓｉｄｈｕら、２０００年）により、ジスルフィド連結（複数可）をライブラリーの全メンバーへと工学的に作製することができる。
【００４０】
さらに別の代替において、ＶＨまたはＶＬは、特異的なＣＤＲ配列を取り込むためのスキャフォールドとして用いることができる。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、組換え技術を用いることにより、任意の非ヒト抗体からヒト化抗体が構築され、該抗体は本明細書に提供されている方法に従って非規範ジスルフィド架橋をさらに含むことができる。次に、この構築物は、適正なＣＤＲコードセグメント（所望の結合特性に関与し、本明細書に引用され、抗体技術分野の当業者に公知の指針に従い、配列および長さが変動し得る）を、本発明によるヒト化抗体スキャフォールドに挿入することにより、特異的な標的と結合するようさらに改変することができる。当業者にとって公知の通り、これらの技法は、適正なベクターおよび細胞（哺乳類その他の細胞）内発現を用いた標準クローニングおよび組換えＤＮＡ方法により達成される。このような方法および技法は、当業者にとって周知のものであり、本明細書には記載されていない。
【００４１】
本発明のＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、フレームワーク領域に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合は、システイン残基間の２個のチオール基のカップリングによりタンパク質を安定化する共有結合力である（Ｂｅｔｚ、１９９３年）。「非規範」とは、ジスルフィド結合が、天然に存在するヒトＶＨおよびＶＬに見出されるものではなく、むしろ分子の工学的作製技法を用いて導入されるものであることを意味する。可変ドメイン内の２個のβ−シートを接続する天然に存在する（または「規範」）ジスルフィド結合は、ＶＨおよびＶＬスーパーファミリーにおいて高度に保存されている（ＡｍｚｅｌおよびＰｏｌｊａｋ、１９７９年；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ、１９８８年）。保存されたジスルフィド結合は、ＶＨにおけるＣｙｓ２２とＣｙｓ９２との間ならびにＶＬにおけるＣｙｓ２３とＣｙｓ８８との間に形成され、ここで、これらの残基は、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングされる（図１を参照）。本発明において、１または２以上の追加の非規範ジスルフィド結合が、ＶＨまたはＶＬドメインへと工学的に作製される。好ましくは、工学的に作製されたジスルフィド結合は、免疫グロブリンフォールドにおける第一のベータシート由来のＣｙｓと、近傍の第二のベータシート由来のＣｙｓとの間に形成される。例えば、これは、発現して完全にフォールディングしたタンパク質においてジスルフィド結合を形成するフレームワーク領域における位置に、適正な数のＣｙｓ対（複数可）を導入することにより達成することができる。Ｃｙｓ残基は、可変ドメインの三次元構造において隣接するフレームワーク領域に導入することができる。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、Ｃｙｓ残基は、ＦＲ２ベータシート領域およびＦＲ３ベータシート領域に導入することができる。Ｃｙｓ残基は、チオール基のカップリング範囲内の位置にある隣接するフレームワーク領域に導入される。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、Ｃｙｓ残基は、それぞれのＣｙｓ対が、ジスルフィド結合を形成するよう十分な近接内に存在することを条件に、ＶＨについてのポジション４７〜４９（３ポジション）のうち１個およびポジション６７〜７１（５ポジション）のうち１個に、あるいはＶＬについてのポジション４６〜４９（４ポジション）のうち１個およびポジション６２〜６６（５ポジション）のうち１個に導入することができる（Ｋａｂａｔナンバリングに基づく）。さらに非限定的な例において、Ｃｙｓ残基は、ＶＨについてのポジション４９および６９、および／またはＶＬについての４８および６４（Ｋａｂａｔナンバリングに基づく）に導入することができる。
【００４２】
Ｃｙｓは、本技術分野で公知のいずれかの適切な方法を用いてＶＨまたはＶＬドメインのフレームワーク領域に導入することができる。限定するものとなることは望まないが、Ｃｙｓは、点変異または組換えＤＮＡ方法による挿入により導入することができる。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、Ｃｙｓは、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）−ＰＣＲを用いて導入することができる（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年およびその参考文献；Ｈｏら、１９８９年）。
【００４３】
ＶＨおよび／またはＶＬスキャフォールドにおける１または２以上の非規範ジスルフィド結合は、抗体の安定性改善および非凝集に役立つ。非凝集は、単量体状態で存在する分子を指す。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、単量体は、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）において基本的に１個のピークを生じる。凝集している分子は、二量体、三量体およびより高次の凝集体を形成する。抗体の安定性は、熱安定性、熱および化学的リフォールディング効率ならびにプロテアーゼ抵抗性等の生物物理学的特徴を包含する。本発明のＶＨまたはＶＬスキャフォールドを評価する場合に考慮すべき他の要因は、発現レベルおよび溶解性を包含する。本技術分野で公知の通り、溶解性は、沈殿前に液体に溶解され得る、体積当たりの分子数（例えば、容量モル濃度またはｍｇ／ｍＬにおける）を指す。ｓｄＡｂの場合、そして本発明との関係において、単量体分子の数は特に重要である。
【００４４】
非規範ジスルフィド結合の付加は、上記の生物物理学的特徴のうち１または２以上を改善し得る。例えば、理論による束縛は望まないが、ＶＨまたはＶＬドメインへの非規範ジスルフィド結合の導入は、安定性（例えば、フレームワークの安定化による、より高い融解温度およびプロテアーゼ抵抗性）を改善し得る、かつ／または非凝集（分子間相互作用および凝集体形成の低下による）を改善し得る。
【００４５】
非規範ジスルフィド結合が導入されたＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、いかなる適切な生殖系列起源のものであってもよい。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、ＶＬは、ラムダまたはカッパーファミリー、例えば、カッパー１またはカッパー３のものとなることができる、あるいは、その組成物は、ＶおよびＪセグメント生殖系列配列の種々の組み合わせに由来することができる。別の一例において、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、ＶＨは、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６またはＶＨ７ファミリーのものとなることができる、あるいはその組成物は、Ｖ、ＤおよびＪセグメント生殖系列配列の種々の組み合わせに由来することができる（Ｔｏら、２００５年；ＭＲＣタンパク質工学センター（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のＶ  ＢＡＳＥデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）。一実施形態において、ＶＨは、ＶＨ３ファミリーのものとなることができる。
【００４６】
一実施形態において、本発明のＶＨまたはＶＬスキャフォールドとして、
【００４７】
【化５】
2014506454.tif 000007
【００４８】
【化６】
2014506454.tif 000008
【００４９】
【化７】
2014506454.tif 000009
からなる群から選択される配列またはそれと実質的に同一の配列またはその断片（ただし、実質的に同一の配列またはその断片は、規範および非規範ジスルフィド結合の両方を保持し、ここで、ＣＤＲの領域における配列は、任意の適切な配列となることができ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれにおいて適切だが可変的な数の残基を有することができる）のフレームワーク領域を含むスキャフォールドを挙げることができるがこれらに限定されない。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の場合、ＣＤＲを含む残基は、図１Ａおよび１Ｂに提示されている通りのものである。配列番号７０から８３の場合、ＣＤＲを含む残基は、ＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号の図２に提示されている対応する野生型クローンに提示されている通りのものであり、ここで、前記図２を本明細書において参考として援用する。実質的に同一の配列も、ＶＨまたはＶＬの安定性および非凝集特徴を保持するまたは改善するはずである。本文章を通じて述べた通り、本発明に係るスキャフォールドは、本明細書に列挙するクローンのため図１Ａおよび１Ｂに範囲を定めるＣＤＲ領域に列挙する残基に限定されない。
【００５０】
実質的に同一の配列は、１または複数の保存的アミノ酸変異を含むことができる。参照配列に対する１または複数の保存的アミノ酸変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的または機能的特性に実質的変化がない変異体ペプチドを生じ得ることは、本技術分野で公知である。このような場合、参照および変異体配列は、「実質的に同一」のポリペプチドであると考慮される。保存的アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、欠失または置換を包含することができる。保存的アミノ酸置換は、本明細書において使用する場合、あるアミノ酸残基による、同様の化学的特性（例えば、サイズ、電荷または極性）を有する別のアミノ酸残基の置換として定義される。
【００５１】
非限定的な例において、保存的変異は、アミノ酸置換であり得る。このような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性または酸性アミノ酸により、同じグループの別のアミノ酸を置換することができる。用語「塩基性アミノ酸」とは、通常生理学的ｐＨで正電荷を持つ、７よりも大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸は、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびリシン（ＬｙｓまたはＫ）を包含する。用語「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」とも言う）とは、生理学的ｐＨで無電荷の側鎖を有するが、２個の原子に共通して共有される電子対が、原子の一方のより近くに保持された少なくとも１個の結合を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸は、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）を包含する。用語「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」とも言う）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４年）の正規化コンセンサス疎水性スケールに従いゼロよりも大きい疎水性を示すアミノ酸を包含することを意味する。疎水性アミノ酸は、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）およびグリシン（ＧｌｙまたはＧ）を包含する。「酸性アミノ酸」は、通常生理学的ｐＨで陰性に荷電した、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）およびアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）を包含する。
【００５２】
配列同一性は、２つの配列の類似性の評価に用いられる。これは、残基ポジション間で最大一致するよう２つの配列が整列したとき、同じである残基のパーセントを計算することにより決定される。任意の公知方法を用いて、配列同一性を計算することができる。例えば、配列同一性の計算にコンピュータソフトウェアが利用できる。限定するものとなることは望まないが、配列同一性は、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより維持される（また、ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／に見出される）ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、Ｂｌａｓｔ−ＮもしくはＦＡＳＴＡ−Ｎまたは本技術分野で公知のその他いずれかの妥当なソフトウェア等の、ソフトウェアにより計算することができる。一実施形態において、パーセント同一性の計算は、フレームワーク領域の比較に限定され、ＣＤＲ内の残基を無視する。一実施形態において、パーセント同一性の計算は、フレームワーク領域およびＣＤＲの残基両方を包含する、ポリペプチドにおける全残基を比較する。
【００５３】
本文章を通じて述べた通り、本発明に係るスキャフォールドは、本明細書において配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４として列挙されているクローンに対しては図１Ａおよび１Ｂに範囲を定める通りの、また、本明細書において配列番号７０から８３として列挙されているクローンに対応する野生型配列に対してはＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号の図２に範囲を定める通りの、ＣＤＲ領域において列挙される残基に限定されない。
【００５４】
本発明の実質的に同一な配列は、少なくとも９０％同一となり得る。別の一例において、実質的に同一な配列は、本明細書に記載されている配列に対し、アミノ酸レベルで少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％（またはこれらの間のいずれかのパーセンテージ）同一となり得る。さらに別の一実施形態において、本明細書に提供されている本発明に係る組成物とともに整列した場合、実質的に同一な配列は、フレームワーク領域に１、２、３または４アミノ酸の差異を含有し得る。重要なことに、実質的に同一な配列は、安定性および参照配列の生物物理学的特性を保持する。非限定的な実施形態において、配列同一性における差異は、保存的アミノ酸変異（複数可）によるものであり得る。一実施形態において、実質的に同一な配列は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む残基からなり、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のうちいずれか１または複数を含む残基を考慮しない。
【００５５】
ＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、非凝集性、安定性、発現レベルおよび溶解性等おｎ、これらの生物物理学的特性を増大させるために、より大きな抗体タンパク質または断片、例えばｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２のうち１もしくは複数および／または、ＩｇＧ、ＩｇＥおよび／もしくはＩｇＭが挙げられるがこれらに限定されない成熟免疫グロブリンの一部として包含され得る。本明細書において使用する場合、「成熟免疫グロブリン」は、可変および定常領域を含む軽鎖と、可変および定常領域を含む重鎖とを含む。一実施形態において、成熟免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよび／またはＩｇＭからなる群から選択される。一実施形態において、このより大きな抗体構築物の導入された配列は、ヒトであるかまたはヒューマニア化されている。上記のアプローチは、毒素等の他のポリペプチドとＶＨおよびＶＬとの融合により作製された融合構築物、同じまたは異なる特異性を有するＶＨおよび／またはＶＬ、Ｆｃドメイン等、ＶＨ誘導体およびＶＬ誘導体にも適用することができる。該アプローチは、溶解性、非凝集性、発現レベルおよび安定性等の、これらの生物物理学的特性を増大させるためのものである。
【００５６】
本発明のＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、また、組換え抗体またはその断片の発現、検出または精製を補助するための追加の配列と融合させてもよい。当業者にとって公知のこのような配列またはタグのいずれを用いてもよい。例えば、限定するものとなることは望まないが、抗体またはその断片は、標的化もしくはシグナル配列（例えば、ｏｍｐＡが挙げられるがこれに限定されない）、検出タグ（例えば、ｃ−Ｍｙｃが挙げられるがこれに限定されない）、精製タグ（例えば、Ｈｉｓ５もしくはＨｉｓ６が挙げられるがこれらに限定されない）、Ｆｃ断片またはこれらの組み合わせを含むことができる。別の一例において、追加の配列は、Ｃｒｏｎａｎらによる国際公開第９５／０４０６９号またはＶｏｇｅｓらによる国際公開第／２００４／０７６６７０号に記載されているもの等の、ビオチン認識部位となることができる。同様に当業者であれば公知の通り、リンカー配列は、追加の配列またはタグと併せて用いることができる。
【００５７】
本発明のＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、多価ディスプレイにおいて存在してもよい。多量体化は、本技術分野で公知のいずれかの適切な方法により達成することができる。例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、多量体化は、Ｚｈａｎｇら（２００４年ａ；２００４年ｂ）および国際公開第２００３／０４６５６０号に記載されている自己集合分子を用いて達成することができる。記載されている方法は、本発明のＶＨまたはＶＬスキャフォールドおよびＡＢ５毒素ファミリー（ＭｅｒｒｉｔｔおよびＨｏｌ、１９９５年）のＢ−サブユニットの五量体形成（ｐｅｎｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）ドメインを含む融合タンパク質を発現させることにより、ペンタボディ（ｐｅｎｔａｂｏｄｉｅｓ）を産生する。五量体形成ドメインは、集合して五量体を構築し、これにより抗体またはその断片の多価ディスプレイが形成される。その上、五量体形成ドメインは、リンカーを用いてＶＨまたはＶＬスキャフォールドと連結することができる。このようなリンカーは、２つの分子の可動的な付着を提供するのに十分な長さおよび適正な組成のものとなる必要があるが、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドの生物物理学的特性を妨害すべきではない。
【００５８】
他の形態の多価ディスプレイも本発明に包含される。例えば、限定するものとなることは望まないが、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または他のいずれかの適切なオリゴマーとして提示することができる。これは、本技術分野で公知の方法、例えば、直接リンキング接続（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）（Ｎｉｅｌｓｏｎら、２０００年）、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（ｄｅ  ＫｒｕｉｆおよびＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ、１９９６年）、「ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）」相互作用（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６年）または本発明に係るクローンのコード領域の反復単位および本技術分野で公知の適切な短いポリペプチドリンカーの逐次的クローニングにより達成することができる。
【００５９】
多量体化のための本技術分野で公知の別の方法は、Ｆｃドメインを用いてＶＨまたはＶＬ組成物を二量体形成することである。ｉｎ  ｖｉｖｏで適用すると、単量体ｓｄＡｂは、循環から直ちに取り除かれる（Ｂｅｌｌら、２０１０年）。この問題を解決するため、また、ＶＨまたはＶＬに、抗原結合後に免疫応答を誘導する能力を与えるため、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドを抗体定常領域断片（「Ｆｃ」）と融合させて、キメラ重鎖抗体を作製することができる（Ｂｅｌｌら、２０１０年）。このアプローチにおいて、Ｆｃ遺伝子は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子と共にベクターに挿入されて、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を生成する（Ｂｅｌｌら、２０１０年；Ｉｑｂａｌら、２０１０年）。融合タンパク質は、組換えにより発現された後に精製される。このような抗体は、工学的作製および産生が容易であり（Ｚｈａｎｇら、２００９年）、ＶＨまたはＶＬの血清半減期を大幅に延長させることができ、優れた腫瘍イメージング試薬となることができる（Ｂｅｌｌら、２０１０年）。一実施形態において、Ｆｃ部分はヒトである。
【００６０】
本発明は、本明細書に記載されている分子をコードする核酸配列も包含する。一実施形態において、核酸は、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドから選択される免疫グロブリンスキャフォールドをコードする配列を含み、ここで、ＶＨスキャフォールドは、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入されたＣｙｓ残基間に形成された、少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合をＦＲに含み、ＶＬスキャフォールドは、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入されたＣｙｓ残基間に形成された、少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合をＦＲに含む。一実施形態において、核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および７０〜８３から選択される配列のうちいずれか１または複数をコードする。一実施形態において、核酸配列は、適正なアミノ酸残基をコードする縮重コードのうちいずれかのコドンを含む。一実施形態において、核酸配列のコード領域は、コドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、発現ベクターに存在する。一実施形態において、発現ベクターは、前記核酸を発現できる宿主細胞または生物に存在する。
【００６１】
当業者にとって周知の通り、特定のアミノ酸をコードする核酸（即ち、コドン）を、宿主生物においてより良く発現される別のコドンで置き換えることにより、宿主細胞または生物における核酸配列の発現を改善することができる。この効果が生じる根拠の１つは、異なる生物が、異なるコドンに対して優先度を示すという事実による。特に、細菌生物および酵母生物は、植物や動物とは異なるコドンを好む。コドン優先度に基づきより良い発現を達成するために核酸配列を変えるプロセスは、コドン最適化と呼ばれる。種々の生物におけるコドン使用バイアスを解析するための統計的方法が生み出され、コドン最適化された遺伝子配列の設計においてこのような統計的解析を実行するための多くのコンピュータアルゴリズムが開発された（ＬｉｔｈｗｉｃｋおよびＭａｒｇａｌｉｔ、２００３年）。一実施形態において、核酸配列は、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化することができる。一実施形態において、核酸配列は、種々の微生物における発現のためにコドン最適化される。一実施形態において、核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化される。一実施形態において、核酸配列は、酵母における発現のためにコドン最適化することができる。一実施形態において、核酸配列は、酵母における発現のためおよび抗体の表面ディスプレイのために、即ち、抗体ファージディスプレイと抗体酵母ディスプレイとの間のシャトルのためにコドン最適化される。本発明は、正に記載した通りの核酸を含むベクターも包含する。さらに、本発明は、記載されている核酸および／またはベクターを含む細胞を包含する。
【００６２】
本発明は、種々の方法論を用いて表面上に固定されたＶＨまたはＶＬスキャフォールドをさらに包含する。例えば、限定するものとなることは望まないが、ＶＨまたはＶＬスキャフォールドは、Ｈｉｓタグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着などを介して表面に連結またはカップリングすることができる。固体表面は、例えば、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、メンブレン、ビーズ（磁気ベースのもしくはセファロースベースのビーズまたは他のクロマトグラフィー樹脂等）、ガラス、フィルムまたは他のいずれかの有用な表面であり得るがこれらに限定されない任意の適切な表面となることができる。
【００６３】
本発明は、カーゴ分子に連結した本発明に係るＶＨまたはＶＬをさらに提供する。抗体またはその断片は、カーゴ分子を所望の部位に送達することができる。カーゴ分子は、診断、処置またはバイオマーカー検出に用いることのできるいかなる種類の分子であってもよい。一実施形態において、カーゴマーカーは、標的化された細胞の成長を低下および／または阻害することのできる分子である。一実施形態において、標的化された細胞は、増殖性疾患に関連する細胞である。一実施形態において、増殖性疾患は、種々の型の腫瘍等の、がんであり、ここで、標的化された細胞は、本発明のＶＨまたはＶＬドメイン部分によって認識されるマーカーを発現する。よって、一実施形態において、カーゴ分子は、治療薬または診断薬である。一実施形態において、カーゴ分子は、治療薬または診断薬に連結する。
【００６４】
例えば、いかなる仕方においても限定するものとなることは望まないが、治療薬は、放射免疫療法に用いてよい放射性同位元素；免疫毒素等の毒素；免疫サイトカイン等のサイトカイン；細胞毒；アポトーシス誘導因子；酵素；または他の本技術分野で公知のいずれかの適切な治療用分子となることができる。代替において、診断薬として、検出可能タンパク質ベースの分子と融合した放射性同位元素、常磁性標識、フルオロフォア、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン等）またはイメージング方法により検出され得る他のいずれかの適切な剤を挙げることができるが、これらに決して限定されない。特定の非限定的な例において、抗体またはその断片は、ＦＩＴＣ等の蛍光剤と連結させることができる、あるいは増強緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＧＦＰ）と遺伝学的に融合させることができる。
【００６５】
抗体またはその断片は、本技術分野で公知のいずれかの方法（組換え技術、化学的コンジュゲーション等）を用いてカーゴ分子と連結させることができる。
【００６６】
本発明はまた、フレームワーク領域に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を導入するステップを含む、シングルドメイン抗体の安定性を改善する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象とする免疫グロブリンのフレームワーク領域に少なくとも２個の非規範Ｃｙｓ残基を導入するステップを含む。一実施形態において、２個のＣｙｓ残基は、抗体可変領域のＦＲ２およびＦＲ３における残基を置き換える。一実施形態において、方法は、ＶＨ  ｓｄＡｂドメインのＶＨ  ＦＲ２領域の残基４７〜４９から選択されるポジションにＣｙｓ残基を導入し、ＶＨ  ＦＲ３領域の残基６９〜７１から選択されるポジションにＣｙｓ残基を導入するステップを含む。一実施形態において、方法は、ＶＬ  ｓｄＡｂドメインのＶＬ  ＦＲ２領域の残基４６〜４９から選択されるポジションにＣｙｓ残基を導入し、ＶＬ  ＦＲ３領域の残基６２〜６６から選択されるポジションにＣｙｓ残基を導入するステップを含む。
【００６７】
一実施形態において、方法は、ＶＨドメインのポジション４９に少なくとも１個の非規範Ｃｙｓ残基を導入し、ポジション６９に少なくとも１個の非規範Ｃｙｓ残基を導入するステップを含む。一実施形態において、方法は、ＶＬドメインのポジション４８に少なくとも１個の非規範Ｃｙｓ残基を導入し、ポジション６４に少なくとも１個の非規範Ｃｙｓ残基を導入するステップを含む。
【００６８】
一実施形態において、方法は、ポジション４９および６９における非規範Ｃｙｓ残基間にジスルフィド架橋を含む本発明に係るＶＨ  ｓｄＡｂ断片であって、多数のＣＤＲ配列を含む、本発明に係るｓｄＡｂ断片を含む発現ライブラリーの作製を含む。一実施形態において、方法は、ポジション４８および６４における非規範Ｃｙｓ残基間にジスルフィド架橋を含む本発明に係るＶＬ  ｓｄＡｂ断片であって、多数のＣＤＲ配列を含む本発明に係るｓｄＡｂ断片を含む発現ライブラリーの作製を含む。抗体ライブラリー作製およびＣＤＲ配列の置き換えのための本技術分野で公知のいずれかの適切な方法を用いてよい。一実施形態において、ＣＤＲ領域のポジションは、Ｋａｂａｔによって定義されている通りのものである。一実施形態において、ＣＤＲ領域のポジションは、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋによって定義されている通りのものである。一実施形態において、発現ライブラリーは、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、発現ライブラリーは、酵母における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、発現ライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されている。
【００６９】
一実施形態において、変異は、ＳＯＥ−ＰＣＲアプローチ（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年およびその参考文献；Ｈｏら、１９８９年）または他の方法（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７年；Ｓｉｄｈｕら、２０００年、Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｃ））により導入することができる。あるいは、変異体の遺伝子は、そのままの状態で、または標的クローニングおよび発現ベクター内に入った状態のいずれかで商業的に入手することができる（Ｋｉｍら、印刷中）。
【００７０】
次の実施例において本発明をさらに説明する。しかし、これらの実施例は、例証目的のみのものであり、決して本発明の範囲の限定に用いるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
変異体ＶＨおよびＶＬのクローニング、発現および精製
凝集および非凝集ＶＨおよびＶＬドメインならびにそれらの対応物の二重システイン変異体をクローニングし、発現させ、精製した。利用したＶＨおよびＶＬならびにそれらの対応するＣｙｓ変異体を表１に列挙し、図１に示す。  
表１．構築したＶＨおよびＶＬならびに変異体
【００７２】
【表１】
2014506454.tif 000010
＊本明細書において、「野生型」と称される。配列番号が提示されていない場合、野生型配列は、ＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号に、特にこの刊行物の図２に示されるとおり、提示されている。
【００７３】
Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら（２００９年ｂ）に記載されている通り、野生型ＶＨ、ＨＶＨＡｍ３０２、ＨＶＨＡｍ４２７、ＨＶＨＡｍ４３１およびＨＶＨＰＣ２３５を調製した。Ｔａｎｈａによる国際公開第２００６／０９９７４７号に記載されている通り、１４種の追加の野生型ＶＨ、ＨＶＨＰ４４、ＨＶＨＢ８２、ＨＶＨＰ４２１、ＨＶＨＰ４１９、ＨＶＨＰ４３０、ＨＶＨＰ４２９、ＨＶＨＭ４１、ＨＶＨＭ８１、ＨＶＨＰ４２８、ＨＶＨＰ４２０、ＨＶＨＰ４１４、ＨＶＨＰ４２３、ＨＶＨＰ４１３およびＨＶＨＰ４２６ならびに野生型ＶＬを調製した。これらの野生型ドメイン（１４種の上記のＶＨは除外する；後述を参照）の遺伝子を含有するプラスミドを鋳型として用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲにより対応する変異体バージョンを構築した。
【００７４】
オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）−ＰＣＲにより、本明細書において「Ｃｙｓ変異体」とも称される、発明に係るＶＨおよびＶＬの構築物（ＨＶＨＡｍ３０２、ＨＶＨＡｍ４２７、ＨＶＨＡｍ４３１およびＨＶＨＰＣ２３５）を作製して（Ｈｏら、１９８９年；Ｋｉｍら、投稿済み、Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年）、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔら、１９９１年）に定義され、ＶＨドメインに関しては図１Ａ、ＶＬドメインに関しては図１Ｂに提示されている通り、ポジション４９および６９（ＶＨ）またはポジション４８および６４（ＶＬ）にＣｙｓ対を導入した。要約すると、ＶＨ変異体を生成するために。これらクローンのＣｙｓ変異導入された細断片（ｓｕｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ）を調製し、次にＳＯＥ−ＰＣＲにより集合させて完全長Ｃｙｓ変異体を形成した。例えば、ＨＶＨＡｍ３０２Ｓの場合、ＤＮＡ鋳型として野生型ＨＶＨＡｍ３０２遺伝子を含有するプラスミドと、以下のプライマー対を用いた標準ＰＣＲにより、細断片３０２Ｓ−１および３０２Ｓ−２を別々に作製した：
Ｍ１３ＲＰａ（５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号３７）および
ＫＴ１３１（５’−ＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ  ＣＧＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣ−３’）（配列番号３８）（３０２Ｓ−１細断片用）ならびに
Ｍ１３ＦＰ（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）（配列番号３９）および
ＫＴ１２９（５’−ＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣ−３’）（配列番号４０）（３０２Ｓ−２細断片用）。
【００７５】
第二に、鋳型として３０２Ｓ−２を用いて、以下のＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲにより断片３０２Ｓ−２−２を作製する：Ｍ１３ＦＰおよび
ＫＴ１３０（５’−ＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧ−３’）（配列番号４１）。
【００７６】
このステップは、３０２Ｓ−２にオーバーラップ領域を付加した。その後、プライマー対Ｍ１３ＲＰ  ａまたはｂ／Ｍ１３ＦＰを用いたＳＯＥ−ＰＣＲにより、細断片３０２Ｓ−１および３０２Ｓ−２−２を集合させて、Ｃｙｓ変異を有する完全長ＶＨ断片を作製した。同じ手順およびプライマーを用いて、他のＶＨ変異体をその対応する野生型ＶＨプラスミドから生成した。異なるＶＬ遺伝子特異的なＰＣＲプライマーおよび対応する野生型ＶＬプラスミド鋳型を用いた以外は、ＶＨ変異体に対する手順と同じＳＯＥ−ＰＣＲ手順を用いてＶＬ変異体を生成した。ＤＮＡ２．０（米国カリフォルニア州メンローパーク）により、１４種の非凝集ＶＨ、ＨＶＨＰ４４、ＨＶＨＢ８２、ＨＶＨＰ４２１、ＨＶＨＰ４１９、ＨＶＨＰ４３０、ＨＶＨＰ４２９、ＨＶＨＭ４１、ＨＶＨＭ８１、ＨＶＨＰ４２８、ＨＶＨＰ４２０、ＨＶＨＰ４１４、ＨＶＨＰ４２３、ＨＶＨＰ４１３およびＨＶＨＰ４２６のＣｙｓ変異体バージョンを合成した。これらは、それぞれＨＶＨＰ４４Ｓ、ＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２８Ｓ、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４１４Ｓ、ＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３ＳおよびＨＶＨＰ４２６Ｓと称される。これら１４種の構築物に関し、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、ＰＣＴ公開、国際公開第２００６／０９９７４７号に、特にこの刊行物の図２に示されるとおり、提示されている対応する野生型配列のものと別の方法で同じである。
【００７７】
次に、他の文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ｔｏら、２００５年；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ａ；２００９年ｂ；２０１０年）に記載されている通りに完全長Ｃｙｓ変異体を発現ベクターにクローニングし、発現させ、精製し、その濃度を決定した。
【００７８】
追加のジスルフィド連結は、Ｃｙｓ変異体ＶＨおよびＶＬの発現収量に対して有害な作用がなかった。野生型および変異体ｓｄＡｂは、ミリグラム量での匹敵する収量を有した。実際のところ、一部の発現試行において、ＨＶＨＡｍ３０２ＳおよびＨＶＨＡｍ４３１Ｓは、その野生型対応物よりも有意に高い発現収量を有した（図２ＡにおけるＩＭＡＣ溶出プロファイルを参照）。
【００７９】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、変異体ＶＨおよびＶＬは、その野生型対応物よりも遅く移動した（図２Ｂ、ＨＶＨＡｍ３０２／ＨＶＨＡｍ３０２ＳおよびＨＶＨＰＣ２３５／ＨＶＨＰＣ２３５Ｓ  ＶＨペアについて示される例）。移動の差は、還元条件下で消失した。ＶＨＨの場合にもこのようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度パターンが観察され、Ｃｙｓ変異体に形成されたＣｙｓ４９／Ｃｙｓ６９ジスルフィド連結の兆しとして示唆された（Ｈｕｓｓａｃｋら、２０１１年）。野生型／変異体ペアは、基本的に同じ分子量を有するため、野生型ＶＨと変異体ＶＨとの間のゲル泳動の差は、変異体における特別な（ｅｘｔｒａ）工学的に作製されたジスルフィド連結の結果生じた、その高次構造の差によるものである（ＫｉｍおよびＴａｎｈａ、２０１０年）。加えて、野生型ＶＨ  ＨＶＨＡｍ３０２は、凝集体（図２Ｂにおける二量体バンドを参照）を形成し、これは、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりさらに確認された（図２Ｂ、およびデータは示していない）。対応する変異体ＶＨ、ＨＶＨＡｍ３０２Ｓにおいて、二量体バンドは消失する（図２Ｂ）。これは、工学的に作製されたジスルフィド連結が、ＶＨ非凝集を改善することを示し、分子ふるいクロマトグラフィーの知見（後述および図４Ａを参照）と一致する。
【００８０】
（実施例２）
Ｃｙｓ変異体のジスルフィド連結マッピング
ＶＨおよびＶＬ  Ｃｙｓ変異体に導入されたジスルフィド連結は、この抗体にとって自然なものではないため、ＶＨおよびＶＬ変異体のさらなる特性評価の前に、変異導入ポジションにおけるジスルフィド連結の存在を検証した。
【００８１】
野生型ＶＨにおいて天然ジスルフィド連結を形成する２個のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ２２およびＣｙｓ９２）（ＡｍｚｅｌおよびＰｏｌｊａｋ、１９７９年；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｂａｒｃｌａｙ、１９８８年）および変異体の変異導入された残基の知識に基づき、ジスルフィド連結の位置を予測することができた。ＶＨにおける予測ジスルフィド結合間に数個のトリプシン開裂部位が存在したため、Ｃｙｓ変異体をトリプシン処理し、質量分析を利用して工学的に作製されたジスルフィド連結の存在を検証することが可能であった。
【００８２】
他に記載されている通りに（Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｂ）；ＫｉｍおよびＴａｎｈａ、印刷中；Ｗｕら、２００９年）、ＶＨおよびＶＬについてのジスルフィド連結の決定を行った。ＫｉｍおよびＴａｎｈａ（印刷中）に記載されている通り正確に、ＨＶＨＡｍ３０２およびＨＶＨＡｍ３０２Ｓについてのジスルフィド連結の決定を行った。要約すると、ｂｉｏｍａｘ−５メンブレンを有するＵｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５遠心分離フィルターデバイス（ＭＷＣＯ５０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カナダ、オンタリオ州ネピアン）を用いて、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中にＶＨ  Ｃｙｓ変異体を濃縮し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中の０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のトリプシン消化（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｎａｄａ、カナダ、ケベック州ラヴァル）に付し、トリプシン消化の成功についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、その後、ペプチドを質量分析による分析に付した（図３および表２）。
【００８３】
結果は、用いた質量分析方法により、ＶＨのトリプシン消化により生じたジスルフィド連結したペプチドを同定できたことを示した（図３Ｂおよび表２）。組換えタンパク質の全分子量は、インフュージョンＥＳＩ−ＭＳを用いて４０ｐｐｍの質量精度以内であると決定された。ｎａｎｏＲＰＬＣ−ＭＳ２とＤＤＡ（データ依存解析）を用いた、そのトリプシン消化の解析からの各タンパク質の同定適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）は、３０％を超えた。ジスルフィド連結したペプチドイオンは、ＤＤＡ実験のサーベイスキャンにおいて突出しているように見えた。ＶＨからの予想されるジスルフィド連結したペプチド配列は全て、手作業のｄｅ  ｎｏｖｏ配列決定により確認した。
【００８４】
表２．質量分析によるＶＨのジスルフィド連結の決定。ジスルフィド連結を含有する主要なトリプシンペプチドを示す。接続したシステインは、太字および下線で表し、ＶＨの残りの配列は、トリプシン処理により失われる。ペプチドダブレット内のスペースは、配列の中断を表示する。
【００８５】
【表２】
2014506454.tif 000011
ａＭＷｆｏｒとＭＷｅｘｐとの間の非常に密接なマッチは、Ｃｙｓ４９−Ｃｙｓ６９ジスルフィド連結の存在を示す。ＭＷｆｏｒ：式（から予想される）分子量；ＭＷｅｘｐ：ＭＳによる実験により決定された分子量；ΔＭＷを次のように計算する：（ＭＷｆｏｒ−ＭＷｅｘｐ）。ＭＷｆｏｒ、ＭＷｅｘｐおよびΔＭＷはダルトン（Ｄａ）で示される。
【００８６】
ＨＶＨＡｍ３０２Ｓの場合、ｍ／ｚ９６４．０４（３＋）における顕著なイオンを、ジスルフィド連結した
【００８７】
【化８】
2014506454.tif 000012
として配列決定し（図３Ｂおよび表２）、ジスルフィド連結を含有するペプチドフラグメントイオン、ｙ１１７＋Ｐ２およびｂ１６＋Ｐ２が、それぞれｍ／ｚ１１５３．８５（２＋）およびｍ／ｚ６４９．７８（２＋）において明らかに観察された（図３および表２）。これにより、ＨＶＨＡｍ３０２ＳにおけるＣｙｓ４９とＣｙｓ６９との間の工学的に作製されたジスルフィド連結の存在が確認された。ＨＶＨＰＣ２３５ＳにおけるＣｙｓ４９とＣｙｓ６９との間の工学的に作製されたジスルフィド連結の存在も決定した（表２）。しかし、ＨＶＨＡｍ４２７ＳおよびＨＶＨＡｍ４３１Ｓのジスルフィド連結は、それがプロテアーゼ（トリプシンまたはペプシン）消化に対し高度に抵抗性であったため、質量分析により確認できなかった。しかし、それらそれぞれの野生型形態と比較したＨＶＨＡｍ４２７ＳおよびＨＶＨＡｍ４３１Ｓの劇的なＴｍ増大（表４）ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度シフト（図２Ｂ）は、ＨＶＨＡｍ４２７ＳとＨＶＨＡｍ４３１Ｓの両方における工学的に作製されたジスルフィド連結の存在を示す。
【００８８】
別の代表例として、１４種の変異体ＶＨのうち１種（ＨＶＨＰ４２６Ｓ）もＣｙｓ４９／Ｃｙｓ６９ジスルフィド連結形成の決定のために選んだ。他のＶＨの事例として、ＭＳ結果は、ＨＶＨＰ４２６Ｓが、Ｃｙｓ４９とＣｙｓ６９との間にジスルフィド連結を形成したことを示した（表２）。
【００８９】
変異体ＶＬにおける同様の質量分析による分析により、全ＶＬにおけるポジションＣｙｓ４８とＣｙｓ６４との間における工学的に作製されたジスルフィド連結の存在が確認された（表３）。
【００９０】
表３．質量分析（ＭＳ）によるＶＬのジスルフィド連結の決定。ジスルフィド連結を含有する主要なトリプシンペプチドを示す。接続したシステイン同士は、同様の下線（および斜体）および太字で表す。ＨＶＬＰ３２４Ｓ、ＨＶＬＰ３４２Ｓ、ＨＶＬＰ３５１ＳおよびＨＶＬＰ３１０３Ｓの場合、接続したシステインの別の対を斜体で示す。ＶＬにおける残りの配列は、トリプシン処理により失われる。ペプチド断片間のスペースは、配列の中断を表示する。
【００９１】
【表３−１】
2014506454.tif 000013
【表３−２】
2014506454.tif 000014
ａＭＷｆｏｒおよびＭＷｅｘｐ間の非常に密接なマッチは、Ｃｙｓ４８−Ｃｙｓ６４ジスルフィド連結の存在を示す。ＭＷｆｏｒ：式（から予想される）分子量；ＭＷｅｘｐ：ＭＳによる実験により決定された分子量；ΔＭＷを次の通り計算する：（ＭＷｆｏｒ−ＭＷｅｘｐ）。ＭＷｆｏｒ、ＭＷｅｘｐおよびΔＭＷはダルトン（Ｄａ）で示される。
【００９２】
結晶構造解析は、検査した発明に係るＶＨおよびＶＬ構築物の全てにおける規範Ｃｙｓ−Ｃｙｓ残基間のジスルフィド架橋に加えて、非規範Ｃｙｓ−Ｃｙｓ残基間のジスルフィド架橋の存在を確認した。
【００９３】
（実施例３）
分析的分子ふるいクロマトグラフィー
分子ふるいクロマトグラフィー（またはゲル濾過クロマトグラフィー）は、タンパク質を分子サイズおよび流体力学的容積により分離する（ＰｏｒａｔｈおよびＦｌｏｄｉｎ、１９５９年）。したがって、この方法は、溶液におけるタンパク質凝集状態の評定において有用である。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５を利用する分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、ＶＨ（またはＶＬ）ドメインの凝集状態を評定する。非凝集ＶＨ（またはＶＬ）は、単量体ＶＨ（またはＶＬ）に予想される溶出体積で、単一の対称的ピークのクロマトグラムを生じる筈である。対照的に、凝集ＶＨのクロマトグラムプロファイルは、単量体ピークに加えて、より早く溶出する追加のピーク、例えば、大きな凝集体、二量体凝集体からなる。パーセント単量体は、ピークの面積積分により計算し、ＶＨ（またはＶＬ）凝集傾向の定量的尺度として用いることができる（ＶＨ（またはＶＬ）の％単量体が高い程、その凝集傾向は低くなり、逆に、ＶＨ（またはＶＬ）の％凝集体が高い程、その凝集傾向も高くなる）。
【００９４】
以前に記載された通りに（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；  Ｔｏら、２００５年；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ａ；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ｂ；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年；ＫｉｍおよびＴａｎｈａ、印刷中）、ＶＨおよびＶＬならびにそれらの対応するＣｙｓ変異体の分子ふるいクロマトグラフィーを行った。要約すると、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５分子ふるいカラムを、ポンプ速度０．５ｍＬ／分にて５０ｍＬの濾過・脱気済ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、その後、５０ｍＬの濾過・脱気済ＰＢＳで平衡化した。試料は、０．２２μｍ使い捨てフィルターユニットを通して濾過し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムを用いたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣにおいて製造業者の指示の通りに、流速０．５ｍＬ／分のＰＢＳバッファーによる分子ふるいクロマトグラフィーに供した。チューブ当たり０．５ｍＬの画分体積のＡＫＴＡフラクションコレクターを用いて、ピークに対応する溶出液を収集した。分子ふるいクロマトグラフィーの後、グラフ作成ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン４．０２；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてＡ２８０対溶出体積をプロットした（図４）。単量体ピークおよび凝集体ピークを積分して、％単量体または％凝集体を得た。
【００９５】
分子ふるいクロマトグラム（ＳＥＣ）における吸光度の値（Ａ２８０）を正規化し、溶出体積に対してプロットした。次式に従い、吸光度の正規化を行った。
％Ａ２８０＝（Ａ２８０Ｎ−Ａ２８０Ｂ）／（Ａ２８０Ｍ−Ａ２８０Ｂ）×１００
（式中、％Ａ２８０は、正規化された吸光度であり、Ａ２８０Ｎは、任意の溶出体積における吸光度であり、Ａ２８０Ｍは、最大吸光度であり、Ａ２８０Ｂは、ベースライン吸光度である）。
【００９６】
結果（図４Ａ）は、３種の凝集ＶＨである、ＨＶＨＡｍ３０２、ＨＶＨＡｍ４２７およびＨＶＨＡｍ４３１の全てにおいて、変異によりタンパク質非凝集性が大いに改善されたことを示す。野生型ＶＨは、単量体ピークに加えて凝集ＶＨに典型的な早い溶出ピークを示したが（ＨＶＨＡｍ３０２およびＨＶＨＡｍ４２７については約２２％、ＨＶＨＡｍ４３１については２５％）、これらの早い溶出ピークは、対応する変異体において消失し、その変異体は基本的に単量体ピークからなっていた。この結果は、ジスルフィド連結の工学的作製が、凝集ＶＨを非凝集ＶＨに転換したことを示す。その分子ふるいクロマトグラフィー（図４Ａ）に示す通り、ＨＶＨＰＣ２３５ＳへとＣｙｓ変異導入した場合、非凝集ＶＨである、ＨＶＨＰＣ２３５は、その非凝集特徴を維持した。図４Ｂは、ＶＨの１４種のＶＨ変異体である、ＨＶＨＰ４４Ｓ、ＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２８Ｓ、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４１４Ｓ、ＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３ＳおよびＨＶＨＰ４２６Ｓの代表的ＳＥＣプロファイルを示す。試験した４事例（ＨＶＨＰ４１４Ｓ、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４２６ＳおよびＨＶＨＰ４２９Ｓ）の全てにおいて分かる通り、変異体は、これらの親野生型ＶＨと同様に非凝集のままであった。この結果は、非凝集ＶＨの場合、ジスルフィドの工学的作製は、ＶＨの非凝集特性を損なわない一方で、下に示す通り、その安定性を大いに改善することを再度実証する。
【００９７】
野生型ＶＬは、基本的に凝集体がなく、対称的単一ピークを示した。僅かな凝集（１１％の二量体凝集体）を示したＨＶＬＰ３６４Ｓを例外として、ＶＬ  Ｃｙｓ変異体も単量体型であった。よって、一般に、工学的に作製されたジスルフィド連結は、ＶＬの非凝集特性を損なわなかった（図４Ｃ）。
【００９８】
（実施例４）
円二色性（ＣＤ）分光法による熱安定性の測定
変異体ＶＨおよびＶＬにおける追加の工学的に作製されたジスルフィド連結が、タンパク質安定性を改善するか評定するため、ＣＤ分光法による融解温度（Ｔｍ）の測定により熱安定性を評価した。
【００９９】
全ＶＨおよび変異体ＶＬについて、Ｐｅｌｔｉｅｒ熱電性型温度制御システムを備えるＪａｓｃｏ  Ｊ−８１５分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、米国メリーランド州イーストン）を用いて実験を行った。路長１ｍｍのＣＤキュベットを用いた。スキャンスピード５０ｎｍ／分、デジタル積分時間（ＤＩＴ）４秒、バンド幅１ｎｍ、データピッチ１ｎｍおよび積分時間１秒で、波長範囲１８０〜２６０ｎｍにわたりスペクトルを記録した。融解温度またはＴｍ（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００６年ａ；２００６年ｂ）を測定するため、温度範囲３０℃〜９６℃にわたりＣＤスペクトルを記録した。全ＣＤスペクトルは、バッファースペクトルに相当するブランクから差し引いた。１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中の５０μｇ／ｍＬ  ＶＨ濃度を用いて測定を行った。楕円率の変化により、２１０ｎｍにて全Ｃｙｓ変異体ＶＬならびにＨＶＨＡｍ４３１、ＨＶＨＡｍ４３１ＳおよびＨＶＨＰ４１９Ｓについての；２０５ｎｍにてＨＶＨＡｍ４２７、ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ、ＨＶＨＡｍ３０２、ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ、ＨＶＨＢ８２、ＨＶＨＰ４２１、ＨＶＨＰ４２６、ＨＶＨＰ４２８、ＨＶＨＰ４２９、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４２６Ｓ、ＨＶＨＰ４２８Ｓ、ＨＶＨＭ４１およびＨＶＨＰ４１４Ｓについての；２２０ｎｍにてＨＶＨＰＣ２３５についての；２００ｎｍにてＨＶＨＰＣ２３５Ｓ、ＨＶＨＰ４３０、ＨＶＨＰ４１３、ＨＶＨＰ４２３、ＨＶＨＭ８１、ＨＶＨＰ４１９、ＨＶＨＰ４２０およびＨＶＨＢ８２Ｓについての；２０２ｎｍにてＨＶＨＰ４４、ＨＶＨＰ４１４およびＨＶＨＰ４２３Ｓについての；２０８ｎｍにてＨＶＨＰ４４Ｓについての；ならびに２０９ｎｍにてＨＶＨＭ４１Ｓについての熱誘導性タンパク質変性をモニターした。記載されている式（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００６年ａ；２００６年ｂ）により、フォールディングしたものの割合（ｆｆ）を得た。
ｆｆ＝（［θ］Ｔ−［θ］Ｕ）／（［θ］Ｆ−［θ］Ｕ）          式Ｉ
（式中、［θ］Ｔは、任意の温度におけるモル楕円率であり、［θ］Ｆは、３０℃における完全にフォールディングしたタンパク質のモル楕円率であり、［θ］Ｕは、９０℃におけるアンフォールディングしたタンパク質のモル楕円率である）。グラフ作成ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン４．０２）を用いた非線形回帰曲線あてはめ（ＢｏｌｔｚｍａｎＳ字状方程式）により、アンフォールディング曲線（フォールディングしたものの割合（ｆｆ）対温度）の中点として融解温度（Ｔｍ）を得て、表４に記録した。
【０１００】
野生型ＶＬについては、ＮＥＳＬＡＢ  ＲＴＥ−１１１バスアクセサリーを備えるＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計を用いた。路長０．０２ｃｍの円形セルを用いた。スキャンスピード１００ｎｍ／分、バンド幅１ｎｍおよび積分時間１秒でスペクトルを記録した。温度範囲２５℃〜８５℃にわたりＨＶＬＰ３４２、ＨＶＬＰ３５１およびＨＶＬＰ３１０３についての、２５℃〜８０℃にわたりＨＶＬＰ３２４、ＨＶＬＰ３２５、ＨＶＬＰ３６４およびＨＶＬＰ３８９についての、２５℃〜９０℃にわたりＨＶＬＰ３３５についてのＣＤスペクトルを記録した。２０３ｎｍにてＨＶＬＰ３２５およびＨＶＬＰ３８９についての、２１８ｎｍにてＨＶＬＰ３２４、ＨＶＬＰ３３５、ＨＶＬＰ３４２、ＨＶＬＰ３５１、ＨＶＬＰ３６４およびＨＶＬＰ３１０３についてのモル楕円率の熱誘導性変化をモニターした。リン酸ナトリウムバッファーにおいて４．１×１０−５Ｍ〜５．７×１０−５Ｍの範囲の濃度で測定を行った。全ＣＤスペクトルは、バッファースペクトルに相当するブランク（ｔｈｅ  ｂｌａｎｋ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｐｅｃｔｒａ）から差し引き、以前に記載された通りにＶＨおよび変異体ＶＬについての融解温度（Ｔｍ）を得た。
【０１０１】
表４．ＶＨ、ＶＬおよび対応するＣｙｓ変異体の親和性定数、ＫＤおよび融解温度、Ｔｍ  。ＶＬについて、ＫＤはプロテインＬに対するものであり、ＶＨについてはプロテインＡに対するものである。
【０１０２】
【表４−１】
2014506454.tif 000015
【０１０３】
【表４−２】
2014506454.tif 000016
ａより小さいＫＤ値は、プロテインＬにおける高親和性部位に対するＨＶＬＰ３２４、ＨＶＬＰ３２４Ｓ、ＨＶＬＰ３４２およびＨＶＬＰ３４２Ｓの結合に対応する。
ｂＡｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら（２００９年ｂ）における表１を参照されたい。
ｃ２つの非常に近いＫＤが得られた。
ｄ括弧内の値は、より高濃度の単量体で得られた。
ｅそのように限定されない（ｎｏｔ−ｓｏ−ｄｅｆｉｎｅｄ）より低いプラトーのため、推定の最小Ｔｍを表す（図５Ａにおける融解曲線プロファイルを参照）。
ｆ２つ組で行った。
ｇＴｏら、２００５年から採用したＫＤ。
【０１０４】
変性への急激な転移に対応する観察された変性曲線に一致する、二状態系を想定する楕円率データに基づき、ＶＨ（ＨＶＨＡｍ３０２およびＨＶＨＡｍ３０２Ｓ、ＨＶＨＡｍ４２７およびＨＶＨＡｍ４２７Ｓ、ＨＶＨＡｍ４３１およびＨＶＨＡｍ４３１Ｓ、ＨＶＨＰＣ２３５およびＨＶＨＰＣ２３５Ｓ、ＨＶＨＰ４４およびＨＶＨＰ４４Ｓ、ＨＶＨＢ８２およびＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１およびＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４１９およびＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０およびＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９およびＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ４１およびＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＭ８１およびＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２８およびＨＶＨＰ４２８Ｓ、ＨＶＨＰ４２０およびＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４１４およびＨＶＨＰ４１４Ｓ、ＨＶＨＰ４２３およびＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３およびＨＶＨＰ４１３ＳならびにＨＶＨＰ４２６およびＨＶＨＰ４２６Ｓ）ならびにＶＬの融解温度（Ｔｍ）を決定した（図５および６ならびに表４）。フォールディングしたものの割合（ｆｆ）対温度のＳ字状変性曲線の中点にＴｍ値を取った。ＨＶＨＡｍ３０２およびＨＶＨＣ２３５とは異なり、ＨＶＨＡｍ４２７およびＨＶＨＡｍ４３１は両者共に、相当により高いＴｍを有しており、これは恐らく、可能性のあるＣＤＲ１−ＣＤＲ３間ジスルフィド連結の存在によるものであろう（図１Ａおよび表４）。ＨＶＨＡｍ３０２およびＨＶＨＡｍ３０２Ｓ、ＨＶＨＡｍ４２７およびＨＶＨＡｍ４２７Ｓ、ＨＶＨＡｍ４３１およびＨＶＨＡｍ４３１Ｓ、ＨＶＨＰＣ２３５およびＨＶＨＰＣ２３５Ｓ  ＶＨの場合、本発明者らは、変異体ＶＨが、その対応する野生型対応物と比較して、有意により高いＴｍを有したことを見出し（表４）（対応のあるｔ検定、両側、ｐ＝０．０００８）、この結果は、工学的に作製したジスルフィド連結の安定化効果を示した。野生型ＶＨは、５２．８℃〜７０．９℃のＴｍを有していたが、これは変異体ＶＨでは６５．４℃〜８４．６℃へと増大した。これは、１２．６℃〜１６．５℃のＴｍ増大（ΔＴｍ）に相当する。ＨＶＨＰ４４およびＨＶＨＰ４４Ｓ、ＨＶＨＢ８２およびＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１およびＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４１９およびＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０およびＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９およびＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ４１およびＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＭ８１およびＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２８およびＨＶＨＰ４２８Ｓ、ＨＶＨＰ４２０およびＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＰ４１４およびＨＶＨＰ４１４Ｓ、ＨＶＨＰ４２３およびＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３およびＨＶＨＰ４１３ＳならびにＨＶＨＰ４２６およびＨＶＨＰ４２６Ｓ  ＶＨの場合、同様のパターンが観察され、野生型ＶＨは、５４．２℃〜７２．５℃のＴｍを有し、一方、変異体対応物は、６４．７℃〜８２．７℃のＴｍを有した。これは、変異体ＶＨについての８．９℃〜１６．８℃のＴｍ増大（ΔＴｍ）に相当する（表４）。変異体対野生型ＶＨのジスルフィド連結パターンを比較することにより（表２）、Ｔｍ増大が実際に、特別なＣｙｓ４９／Ｃｙｓ６９ジスルフィド連結の存在によるものであることが明らかとなる。理論による束縛は望まないが、ＨＶ���Ａｍ４２７Ｓにおけるジスルフィド連結は、高次構造の変化をもたらして、ベータ−シート等の、高次構造モジュールを互いに近づけ（短または長距離接触のいずれかにより作用する）、疎水性相互作用または塩橋等の、特別な化学力を誘導し、そのレベルで構造をさらに安定化し得る。
【０１０５】
ＶＬのＴｍは、４９．３℃〜６４．６℃の範囲であり、他のｓｄＡｂにおいて観察される範囲であった（Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４年；Ｔａｎｈａら、２００６年）（図６および表４）。変異体ＶＨの場合と同様に、全変異体ＶＬについて、そのＴｍは、野生型ＶＬについてのＴｍと比較して、平均１７℃まで大幅に増大した（範囲：１１．２℃〜２１．１℃）。変異体ＶＬのＴｍは、野生型ＶＬの４９．３℃〜６４．６℃と比較して、６３．８℃〜８２．５℃の範囲であった。よって、熱安定性が最も低い変異体、ＨＶＬＰ３４２ＳのＴｍは、熱安定性が最も高い野生型、ＨＶＬＰ３２５に匹敵した（図６Ｃ）。ＨＶＬＰ３２５Ｓは、最高のＴｍ（８２．５℃）を有した一方、ＨＶＬＰ３４２Ｓは、最低のＴｍ（６３．８℃）を有した。ＶＬの安定性におけるジスルフィドの工学的作製の効果は、その生殖系列配列起源にかかわりなくラムダとカッパーの両方の型のＶＬを安定化するため、この効果は普遍的であるようである。
【０１０６】
（実施例５）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
それぞれＶＨおよびＶＬのプロテインＡおよびプロテインＬ結合特性をＳＰＲ結合解析において用いて、ＶＨ変異体およびＶＬ変異体における工学的に作製されたジスルフィド連結によるあらゆる可能性のある微細な構造変化を精査した。プロテインＡは多くの場合、ＶＨの高次構造完全性のモニターに用いられる（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら、１９９９年）。ＶＨおよびＶＬのＳＰＲ解析のための、標準手順を行った。
【０１０７】
ＢＩＡＣＯＲＥ解析前に、ＶＨおよびＶＬをＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％Ｐ２０サーファクタント）において流速０．５ｍＬ／分で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５  １０／３００（ＧＬ）分子ふるいクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付し、凝集した材料の証拠が全くなくても、収集した単量体ピークを精製した。ＢＩＡＣＯＲＥ３０００バイオセンサーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲにより、プロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、カナダ、オンタリオ州ネピアン）とＶＨおよびプロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）とＶＬとの相互作用についての結合動態を決定した。
【０１０８】
ＶＨである、ＨＶＨＡｍ３０２、ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ、ＨＶＨＡｍ４２７、ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ、ＨＶＨＡｍ４３１およびＨＶＨＡｍ４３１Ｓのため、それぞれ５４０ＲＵおよび１３５０ＲＵのプロテインＡおよび卵白アルブミン（参照タンパク質として）（Ｓｉｇｍａ、カナダ、オンタリオ州オークビル）を、研究用グレードのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定した。製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により供給されたアミンカップリングキットを用いて、１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５における５０μｇ／ｍＬで固定を行った。ＨＢＳ−ＥＰバッファーにおいて流速５０μＬ／分、２５℃で全測定を行った。ランニングバッファーで洗浄することにより、表面を再生させた。
【０１０９】
ＨＶＨＰＣ２３５およびＨＶＨＰＣ２３５Ｓのため、それぞれおよそ１，１００ＲＵおよび１，０００ＲＵの組換えプロテインＡおよび卵白アルブミン（参照タンパク質）を、研究用グレードのセンサーチップＣＭ５に固定した。製造業者により供給されたアミンカップリングキットを用いて、１０ｍＭ酢酸バッファー（それぞれプロテインＡまたは卵白アルブミンに対しｐＨ４．０またはｐＨ４．５）における５０μｇ／ｍＬで固定を行った。それぞれＨＶＨＰＣ２３５またはＨＶＨＰＣ２３５Ｓのために流速２０μＬ／分または４０μＬ／分で、ＨＢＳ−ＥＰバッファーにおいて２５℃で全測定を行った。
【０１１０】
変異体ＶＨ（ＨＶＨＰ４４Ｓ、ＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２８Ｓ、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３Ｓ、ＨＶＨＰ４２６ＳおよびＨＶＨＰ４１４Ｓ）のため、それぞれおよそ１，１７０ＲＵおよび１，２４０ＲＵの組換えプロテインＡおよび卵白アルブミン（参照タンパク質）を、研究用グレードのセンサーチップＣＭ５に固定した。製造業者により供給されるアミンカップリングキットを用いて、１０ｍＭ酢酸バッファー（プロテインＡと卵白アルブミンの両方に対しｐＨ４．５）における５０μｇ／ｍＬで固定を行った。それぞれＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３Ｓ、ＨＶＨＰ４２６ＳおよびＨＶＨＰ４１４Ｓ、またはＨＶＨＰ４４Ｓ、ＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２８ＳおよびＨＶＨＰ４２０Ｓのために流速２０μＬ／分または４０μＬ／分で、ＨＢＳ−ＥＰバッファーにおいて２５℃で全測定を行った。野生型対応物のプロテインＡ結合特性は、以前に決定された（Ｔｏら、２００５年）。
【０１１１】
野生型ＶＬのため、６００ＲＵのプロテインＬまたは８００ＲＵのＦａｂ参照タンパク質を、研究用グレードのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定した。ＶＬ変異体のため、およそ４００ＲＵの組換えプロテインＬまたは卵白アルブミン（参照タンパク質）を固定した。製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により供給されるアミンカップリングキットを用いて、１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５における２０または５０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度で固定を行った。流速４０または５０μＬ／分でＨＢＳ−ＥＰバッファーにおいて２５℃で全測定を行った。ランニングバッファーで洗浄することにより、表面を再生した。全データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて評価した。
【０１１２】
ＳＰＲ解析は、圧倒的多数の変異体ＶＨ（ＨＶＨＡｍ３０２Ｓ、ＨＶＨＡｍ４２７Ｓ、ＨＶＨＡｍ４３１Ｓ、ＨＶＨＰＣ２３５Ｓ、ＨＶＨＢ８２Ｓ、ＨＶＨＰ４２１Ｓ、ＨＶＨＰ４１９Ｓ、ＨＶＨＰ４３０Ｓ、ＨＶＨＰ４２９Ｓ、ＨＶＨＭ８１Ｓ、ＨＶＨＰ４２０Ｓ、ＨＶＨＭ４１Ｓ、ＨＶＨＰ４２３Ｓ、ＨＶＨＰ４１３Ｓ、ＨＶＨＰ４２６ＳおよびＨＶＨＰ４４Ｓ）が、その野生型対応物と比較してより高いＫＤ値により表わされるより低い親和性でプロテインＡと結合したことを示した（図７および表４）（２種の変異体ＶＨ［ＨＶＨＰ４２８ＳおよびＨＶＨＰ４１４Ｓ］のみが、その野生型対応物とある程度同じＫＤ値を示した）。プロテインＡ結合の低下（ＫＤ値の増大）は、ＨＶＨＭ８１／ＨＶＨＭ８１Ｓペアについての１．６倍からＨＶＨＰＣ２３５／ＨＶＨＰＣ２３５Ｓペアについての１０倍に及ぶ（図７Ａおよび表４）。この結果は、工学的に作製されたジスルフィド結合が、ＶＨの高次構造を若干変えることを実証する。理論による束縛は望まないが、ＶＨのＦＲ１およびＦＲ３内に存することが公知のプロテインＡ結合部位（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら、１９９９年；ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＤａｖｉｅｓ、１９９５年）は、ＦＲ２およびＦＲ３のベータ鎖における２個のＣｙｓの導入により損なわれた可能性がある。興味深いことに、変異体ＶＨは、その野生型対応物と比較して、解離速度定数（ｋｏｆｆ）の一貫した増大を示し、これは、平衡結合定数（ＫＤ）の上昇をもたらした（図７Ｂ）。
【０１１３】
ＶＬ  Ｃｙｓ変異体が、その野生型対応物と同様の親和性でプロテインＬと結合したことが判明し（図８および表４）、この結果は、ジスルフィド結合が、ＶＬの全体的な構造に影響を与えないことを示した。
【０１１４】
（実施例６）
プロテアーゼ安定性
主要ＧＩプロテアーゼである、トリプシン、キモトリプシンおよびペプシンを用いて、ＶＬおよびＶＨのプロテアーゼ安定性における工学的に作製されたジスルフィド連結の効果を評価した。ＧＩプロテアーゼによる消化反応後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により、酵素による開裂の出現に関してＶＬおよびＶＨを試験した。基本的に記載されている通りに（Ｈｕｓｓａｃｋら、２０１１年）消化を行った。
【０１１５】
ＶＬのため、６μｇのＶＬを有する総体積３０μＬ中、３７℃で１時間、酵素対ｓｄＡｂ比、１：２００、１：４０、１：２０および１：１０（トリプシン／キモトリプシン）または１：２００、１：２０、１：１０および１：４（ペプシン）で消化実験を行った。配列決定グレードの酵素（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．、カナダ、オンタリオ州ミシサガ）を用いて製造業者の指示に従い、トリプシンおよびキモトリプシン消化実験を行った。適正な体積の４００ｍＭ  ＨＣｌを添加することによりｐＨを調整して、約ｐＨ２．０でペプシン（Ｓｉｇｍａ）消化反応を行った。対照実験において、酵素を等体積の反応バッファーに置き換えた。等体積のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（０．２Ｍジチオスレイトールを含有）を添加し、混合物を９５℃で５分間煮沸することにより、反応を停止させた。その後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析に付し、Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ａ）に記載されているとおりスポット密度解析により、プロテアーゼ消化後のインタクトｓｄＡｂのパーセントを決定し、対照と比較して、プロテアーゼ消化後にインタクトな構造を有するＶＬのパーセンテージを計算した。
【０１１６】
ＶＨのため、６μｇのＶＨを有するおよび並列式にその変異体ＶＨ対応物を有する総体積３０μＬ中、３７℃で１時間、酵素対ｓｄＡｂ比、１：２０で、２回の独立した試行により２つ組で、トリプシン／キモトリプシン／ペプシンによる消化実験を行った。ＶＬに関して記載されている通り、消化および解析を行った。
【０１１７】
結果を図９Ａに示す。トリプシンまたはキモトリプシンに対する抵抗性に関して、野生型と変異体ＶＬとの間に有意差は観察されなかったが（Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペアｔ検定、両側Ｐ値＝０．２９６９［トリプシン］および０．０６２５［キモトリプシン］）、ペプシンに対する抵抗性における差は、有意であった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペアｔ検定、両側Ｐ値＝０．００７８）。検査した変異体ＶＬは、ペプシンに対する抵抗性の改善を示し、そのうちの１つ、ＨＶＬＰ３１０３Ｓは、０％抵抗性（野生型）から、ほとんど９０％抵抗性（変異体）へと劇的な増大を示した。ペプシン抵抗性の平均値は、ペプシン対ＶＬ比、１：２０において変異体ＶＬについての５１％に対して野生型ＶＬについての１１％であった。同じ比において、ペプシン抵抗性の中央値は、変異体ＶＬについての５４％に対して野生型ＶＬについての１．５％であった。よって、ｓｄＡｂのジスルフィド連結の工学的作製は、そのトリプシンおよびキモトリプシン抵抗性特性に影響を与えることなく、そのペプシン抵抗性を有意に増大させた。
【０１１８】
プロテアーゼ抵抗性（％）対Ｔｍをプロットすることにより、熱安定性とプロテアーゼ抵抗性との間の相関をさらに探索した（図９Ｂ）。一般に、より高いＴｍを有するＶＬは、ペプシンに対しより高い抵抗性を示した（両側、Ｐ値＝０．００１２、Ｒ２（Ｓｐｅａｒｍａｎ）＝０．７３４４）。トリプシンおよびキモトリプシンの場合、このような相関は観察されなかった（両側、Ｐ値＝０．５２４５、Ｒ２（Ｓｐｅａｒｍａｎ）＝−０．１７１９［トリプシン］；両側、Ｐ値＝０．５４０７、Ｒ２（Ｓｐｅａｒｍａｎ）＝−０．１６５３［キモトリプシン］）。
【０１１９】
表５に示すＶＨの場合、差は有意ではなかったが（Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペアｔ検定、両側Ｐ値＝０．０８９９［トリプシン］、０．７８９６［キモトリプシン］および０．７８３２［ペプシン］）、変異体ＶＨは、３種のＧＩプロテアーゼの全てに対してより高い抵抗性（％中央値）を示した（それぞれ野生型および変異体ＶＨに関し、７７％および８２％［トリプシン］、６９％および７５％［キモトリプシン］ならびに９６％および９８％［ペプシン］）。変異体ＶＨの大部分は、ペプシンに対し未変化のまたは僅かに改善した抵抗性を示したが、２種の変異体ＶＨ（ＨＶＨＭ８１ＳおよびＨＶＨＰ４２３Ｓ）は、１００％（ＨＶＨＭ８１とＨＶＨＰ４２３の両方について）から５３％（ＨＶＨＭ８１Ｓについて）および６８％（ＨＶＨＰ４２３Ｓについて）へと減少した抵抗性を示し、なお、スポット密度解析ツールは、タンパク質バンドを適正に認識できないため、ＨＶＨＭ８１Ｓのペプシン抵抗性は過小評価されたようであった。興味深いことに、２種の変異体ＶＨ（ＨＶＨＰ４４ＳおよびＨＶＨＰ４１３Ｓ）から、トリプシン抵抗性に関して大きな改善が示され、これらのトリプシン抵抗性は、５％および２９％（それぞれＨＶＨＰ４４およびＨＶＨＰ４１３）から５７％および１００％（それぞれＨＶＨＰ４４ＳおよびＨＶＨＰ４１３Ｓ）へと改善した。総合すると、変異体は、野生型対応物と同じ程度プロテアーゼ抵抗性である。
【０１２０】
表５．ＶＨのＧＩプロテアーゼ抵抗性
【０１２１】
【表５−１】
2014506454.tif 000017
【０１２２】
【表５−２】
2014506454.tif 000018
ａペプシン抵抗性は、過小評価である。
【０１２３】
（実施例７）
ＶＨ間およびＶＬ間の配列同一性
ＶＨ間ならびにＶＬ間の配列同一性を決定した。解析において、ＦＲ配列のみを含めた、即ち、ＣＤＲ配列を除外した。
【０１２４】
ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年）を用いてＶＨペアまたはＶＬペアの配列を整列させ、ＢｉｏＥｄｉｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｅｄｉｔｏｒを用いてＶＨペアまたはＶＬペア間のパーセンテージ同一性を計算した。
【０１２５】
ＶＨについてのポジション４９および６９ならびにＶＬについての４８および６４におけるＣｙｓ対置換の生物物理学的意義は、その配列、生殖系列起源ならびにＣＤＲ長および組成にかかわりなく普遍的であることが示される。ＶＨは、多様な生殖系列起源ならびにＣＤＲ長およびアミノ酸組成を有する。特に、ＣＤＲ３長および組成は、より多様である。そうであるにもかかわらず、これらの構造的変動とは無関係に、ポジション４９および６９におけるＣｙｓ対の導入は、Ｃｙｓ４９／Ｃｙｓ６９ジスルフィド連結を形成し、その発現収量を損なうことなく、ＶＨの非凝集性、熱安定性およびプロテアーゼ安定性における有意な改善をもたらす。国際公開第２００６／０９９７４７号に記載されている３２種のＶＬは、多様である。これらは、カッパーおよびラムダファミリーの両方に属し、多様なＶセグメントおよびＪセグメント生殖系列起源ならびにＣＤＲアミノ酸組成および長さを有する。特に、ＣＤＲ３の長さは、６〜１１アミノ酸の範囲に及ぶ。異なるクラスを表す８種の非凝集ＶＬ（図１Ｂ）を、上記の３２種から選び、Ｃｙｓ４８／Ｃｙｓ６４置換の生物物理学的意義を評定した。ＶＨの場合と同様に、８種のＶＬおよびそれらのＣｙｓ変異体バージョンの並列解析は、構造的変動と無関係に、ポジション４８および６４におけるＣｙｓ対の導入は、Ｃｙｓ４８／Ｃｙｓ６４ジスルフィド連結を形成し、その非凝集状態または発現収量を損なうことなくＶＬの熱安定性およびプロテアーゼ安定性における有意な改善をもたらすことを示した。
【０１２６】
（実施例８）
ジスルフィドにより安定化されたＶＬファージディスプレイライブラリーの構築
ＨＶＬＰ３２４Ｓ  ＶＬファージディスプレイライブラリーを、Ｈｕｓｓａｃｋら（印刷中（ｃ））に記載された方法により二段階で構築した。先ず、ＨＶＬＰ３２４Ｓ  ＶＬスキャフォールドに基づきランダム化されたＣＤＲ３を有するライブラリーを構築した（図１０）。次に、ＣＤＲ３がランダム化されたライブラリーをスキャフォールドとして用いて、全３種のＣＤＲがランダム化された最終ライブラリーを構築した。
（ｉ）ＣＤＲ３がランダム化されたＶＬファージディスプレイライブラリーの構築
ｓｓＤＮＡ調製に用いたファージがｆｄ−ｔｅｔＶＬ２４Ｓであったこと以外は記載されている通りに（Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｃ））、チミジンの代わりにウリジンを含有するファージｓｓＤＮＡ（ｄＵ−ｓｓＤＮＡ鋳型）を調製した。ｆｄ−ｔｅｔＶＬ２４Ｓは、そのゲノム内にファージｐ３遺伝子と融合したＨＶＬＰ３２４Ｓ  ＶＬ遺伝子を有するｆｄ−ｔｅｔＧＩＩＩＤファージ（Ｔａｎｈａら、２００１年）である（図１０）。ファージｓｓＤＮＡへのウリジンの取り込みは、記載されている通りに（Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｃ））、ＴＧ１およびＣＪ２３６  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に対するファージの力価測定により確認された。ｄｄＨ２Ｏ中の総計７５μｇのｆｄ−ｔｅｔＶＬ２４Ｓ  ｓｓＤＮＡを調製した。記載されている通りに（Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｃ））、プライマーＶＬ２４−ＣＤＲ３、ＶＬ２４−ＣＤＲ３ａおよびＶＬ２４−ＣＤＲ３ｂを用いたＣＤＲ３の同時ランダム化によるヘテロ二本鎖ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を行った。プライマーをリン酸化し（Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｃ））、アニーリング反応において用いた。８．２μＬの１２１．５ｎｇ／μＬ  ｆｄ−ｔｅｔＶＬ２４Ｓ  ｄＵ−ｓｓＤＮＡ、０．３３μＬのリン酸化プライマーＶＬ２４−ＣＤＲ３、ＶＬ２４−ＣＤＲ３ａまたはＶＬ２４−ＣＤＲ３ｂ、１μＬのミックス（２μＬの１０×ＴＭバッファー［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５］、２μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１５μＬ  ｄｄＨ２Ｏ）および１．５μＬの１０×ＴＭバッファーを有する総体積１５μＬ中で、９３℃５分間、５０℃１５分間、２０℃２０分間の、３通りの別個のアニーリング反応を行った。記載されている通りに、共有結合により閉環した環状ＤＮＡ（ＣＣＣ−ＤＮＡ）を合成した（ｄｄＨ２Ｏ中の総計１００μｇのＣＣＣ−ＤＮＡを調製し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）により、２５５μＬにおける８２．５μｇ（３２３ｎｇ／μＬ）となるまで濃縮した）。２３通りの形質転換（１１μＬのＣＣＣ−ＤＮＡプラス３５０μＬのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１）を記載されている通りに行った。ＳＯＣ培地におけるインキュベーション後に、形質転換材料を力価測定し、１Ｌの２ｘＹＴ／テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍＬ）において一晩３７℃、１８０ｒｐｍで成長させた。翌朝、細胞を収穫し、記載されている通りに凍結ライブラリーストックを作製した。Ａ６００ｎｍ測定値により、凍結ライブラリーストックの細胞密度を推定した。増幅させたライブラリーファージを上清から精製し、力価測定し（Ｈｕｓｓａｃｋら（ｃ）を参照）、最終ライブラリー（セクション（ｉｉ）を参照）を構築するための出発材料として用いた。形質転換材料（上記を参照）における力価測定実験から、ライブラリーサイズ（形質転換体の数）は、２．３×１０８であると決定された。
（ｉｉ）ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３ランダム化ＶＬファージディスプレイライブラリーの構築
ライブラリー構築の第二のステップにおいて、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２をランダム化した。上記の４×１０１２ｃｆｕ  ＣＤＲ３ランダム化ライブラリーファージ（Ｈｕｓｓａｃｋら（ｃ）を参照）から出発して、ｄＵ−ｓｓＤＮＡ鋳型を調製した。２ｍＬのファージ（２×１０９／μＬ）から２００μｇのｓｓＤＮＡを得た。ファージｓｓＤＮＡへのウリジンの取り込みを上記の通りに確認した。変異原性オリゴヌクレオチドのＶＬ２４−ＣＤＲ１およびＶＬ２４Ｓ−ＣＤＲ２を用いた変異誘発の第二ラウンドにおいて、ｄＵ−ｓｓＤＮＡ鋳型を用いた。アニーリングおよびＣＣＣ−ＤＮＡ合成ステップは、上に記すステップと基本的に同一であった。１ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中の総計３００μｇのＣＣＣ−ＤＮＡを調製した。記載されている通りに７７通りの形質転換（１３μＬのＣＣＣ−ＤＮＡプラス２００μＬのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１）を行った。ＳＯＣ培地におけるインキュベーション後に、形質転換材料を力価測定し、３Ｌの２ｘＹＴ／テトラサイクリン（５μｇ／ｍＬ）において一晩１８０ＲＰＭ、３７℃で成長させた。凍結ライブラリーストックを作製し、その細胞密度を上に記す通りに推定した。最終体積２０ｍＬのＰＢＳにおける上清からライブラリーファージを精製し、ＴＧ１に対し力価測定し、インプットファージとしての将来的な第一ラウンドのパニングのため、５００μＬアリコートにおいて−８０℃で凍結して貯蔵した。ライブラリーサイズは、１×１０８形質転換体であると決定された。ライブラリー（非増幅ライブラリー）タイタープレートからの７８種のＶＬクローンを、Ｈｕｓｓａｃｋら（ｃ）に記載されている通りに配列決定に付した。
【０１２７】
ＨＶＬＰ３２４Ｓ  ＶＬを、ジスルフィドで安定化された合成ＶＬライブラリーの構築のためのスキャフォールドとして用いた。ＨＶＬＰ３２４Ｓは、以前に記載されたＨＶＬＰ３２４の変異体バージョンであるが、これは、Ｃｙｓ４８とＣｙｓ６４との間に追加のジスルフィド連結を有する。以前に記載されたＨＶＬＰ３２４ＶＬファージディスプレイライブラリーに関して基本的に記載されている通りに、全３種のＣＤＲにおける１６（ＣＤＲ３＝９アミノ酸）、１７（ＣＤＲ３＝１０アミノ酸）および１８（ＣＤＲ３＝１１アミノ酸）位置に多様性を導入することにより、ＨＶＬＰ３２４Ｓ  ＶＬファージディスプレイライブラリーを構築した（図１１、Ｈｕｓｓａｃｋら（ｃ））。ライブラリーサイズは、１×１０８形質転換体という中程度のものであった。非増幅ライブラリーからの７８種のＶＬクローンの配列解析は、親ＶＬ（ＨＶＬＰ３２４Ｓ）アミノ酸残基を好む偏りのあるランダム化により、全ＣＤＲポジションに多様性が導入されていることを示した。７８クローンの配列決定により、２クローンは野生型ＨＶＬＰ３２４Ｓと同一で、８クローンはＣＤＲ１について野生型配列を有し、２クローンはＣＤＲ２について野生型配列を有し、１８クローンはＣＤＲ３について野生型配列を有し、９クローンはＣＤＲ１とＣＤＲ２の両方について野生型配列を有し、１クローンはＣＤＲ２とＣＤＲ３の両方について野生型配列を有し、２クローンはＣＤＲ１とＣＤＲ３の両方について野生型配列を有することが示された。ライブラリーにおけるこれらクローンの存在は、上記の配列の偏りに寄与する。
【０１２８】
７６種のライブラリークローンのＣＤＲ３長分布解析は、大部分（７１％）のライブラリークローンが、９アミノ酸のＣＤＲ３長を有することを示した。１０および１１アミノ酸のＣＤＲ３長を有するクローンは、それぞれ１８％および１１％であった。
【０１２９】
ライブラリー設計、構築および特性評価のさらなる詳細は、図１１の凡例および図面に提示する。用いた特定のオリゴヌクレオチドは、表６に提示されている通りのものであり、表中、Ｎ、ＫおよびＲで示すポジションにおける縮重ヌクレオチド残基の表記にはＩＵＰＡＣ命名法が用いられる。
【０１３０】
表６．分子クローニングのために用いたオリゴヌクレオチドのリスト
【０１３１】
【表６】
2014506454.tif 000019
Ｎ：Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ。
Ｋ：ＴまたはＧ。
Ｒ：ＡまたはＧ。
【０１３２】
（実施例９）
ジスルフィドにより安定化されたＶＬファージディスプレイライブラリーの検証
ＨＶＬＰ３２４Ｓ  ＶＬファージディスプレイライブラリーを検証するため、ライブラリーを、２種の異なる被験抗原、即ち、ヒトリゾチームおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するバインダーの選択に付した。最初の結合アッセイ（ファージＥＬＩＳＡ）により同定された陽性候補バインダー（ファージディスプレイしたＶＬ）を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のためのベクターにサブクローニングした。ＶＬバインダーを発現させ、精製し、親和性および安定性に関して解析した。
【０１３３】
（実施例９ａ）
パニング
標準パニング技法（例えば、Ｌｅｅら、２００７年；Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ａを参照）により、抗ヒトリゾチームＶＬの選択を行った。要約すると、Ｎｕｎｃマイクロタイターウェル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｌｔｄ．、カナダ、オンタリオ州ミシサガ）を、無菌ＰＢＳ（３．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ  ＫＣｌ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）における１００μＬの１ｍｇ／ｍＬヒトリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カナダ、オンタリオ州ミシサガ）で一晩４℃にてコーティングした。ウェルを無菌ＰＢＳで３×洗浄し、ペーパータオル上で水分を切り、無菌ＰＢＳにおける１５０μＬの２％（ｗ／ｖ）ミルク（２％ＭＰＢＳ）で３７℃２時間ブロッキングした。ウェルからブロッキング剤を除去し、１％ＭＰＢＳにおける１００μＬのライブラリーファージ（実施例８、セクション（ｉｉ）において調製された増幅ファージ（５×１０１１ｃｆｕ；３７℃で１．５時間プレインキュベート）をウェルに添加し、１．５時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳＴ（無菌ＰＢＳ中の０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０×洗浄した後、ウェルを１００μＬの新たに調製した１２４ｍＭトリエチルアミンで１０分間室温にてインキュベートし、８分の時点で上下にピペッティングすることによりファージを溶離させた。溶離したファージ溶液を１．５ｍＬマイクロチューブ中で、５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５と混合することにより中和し、感染期まで氷上で保持した。５０ｍＬの無菌Ｆａｌｃｏｎチューブ中に２×５ｍＬの指数増殖Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（ＯＤ６００＝約０．５）を調製し（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２００９年ａ）、そこから２ｍＬを３７℃で３０分間、１４５μＬの溶離ファージ（下に記す通り溶離ファージの力価を決定するために５μＬを取り分けた）に感染させた。感染した細胞を、Ｓｏｒｖａｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴローターおよび遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州ネピアン）を用いて４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを１ｍＬの２ｘＹＴに再懸濁し、２ｘＹＴ寒天／５μｇ／ｍＬテトラサイクリン（２ｘＹＴ／Ｔｅｔ）の入った３枚の大型ペトリ皿上に均等に広げた。ペトリ皿を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、大型ペトリ皿から増幅ファージを回収した。要約すると、１０〜１５ｍＬの無菌ＰＢＳ（容量はコロニー密度に応じて添加）を各プレートに添加し、ガラススプレッダーを用いて細胞を擦り取り、無菌５０ｍＬ無菌Ｆａｌｃｏｎチューブに収集した。前記と同様に細胞をもう一度擦り取り、前のものと一緒にプールした。懸濁液を、Ｓｏｒｖａｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴローターおよび遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた２０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃での遠心分離により、細胞ペレットおよび上清へと分画した。基本的に記載されている通りに（Ｌｅｅら、２００７年）、上清から増幅ファージを精製した。要約すると、無菌０．２２μｍフィルターにより前濾過したファージ上清に、５０ｍＬ無菌Ｆａｌ��ｏｎチューブ中１／５容の２０％ＰＥＧ−８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、混合物を氷上で１時間インキュベートした。溶液を、Ｓｏｒｖａｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴローターおよび遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。ファージペレットを３ｍＬの無菌ＰＢＳに再溶解し、１５ｍＬ無菌Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、１／５容の２０％ＰＥＧ−８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ（０．６ｍＬ）と混合し、氷上で２０分間インキュベートした。ファージ溶液を、Ｓｏｒｖａｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴローターおよび遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、ファージペレットを、ペレットサイズに応じた溶解体積である、０．５〜１ｍＬの無菌ＰＢＳに溶解した。無菌１．５ｍＬ無菌マイクロチューブにおいて、ファージ溶液を０．１ｍＬ容量に分注した。下に記す通りに増幅ファージの力価を決定した。
【０１３４】
パニングの第二ラウンドのため、上に記す従来のパニングと並行して、サーモパニング（ｔｈｅｒｍｏｐａｎｎｉｎｇ）も行い、そこでは、第一ラウンドからの無菌ＰＢＳ中の増幅ファージを、１．５ｍＬ無菌マイクロチューブ中で６５℃で２時間加熱し、その後遠心分離し、（パニングの第二ラウンドにおける）結合のためにヒトリゾチームをコーティングしたウェルにファージ上清を添加した。残りのステップは全て、両方のパニング方法で同じであった。並行パニングをさらに２ラウンド継続した。それぞれパニングの第二、第三および第四ラウンドについて、洗浄は、１２×、１５×および１５×であった。
【０１３５】
並行したサーモパニングが行われない以外はヒトリゾチームについて記載されている通りに、ヒト血清アルブミンに対するパニング（従来のパニング）を行った。パニング後に、タイタープレートからのクローンにおいて（溶離ファージから得られる）、標準ファージＥＬＩＳＡ（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９９６年；Ｔａｎｈａら、２００１年；Ｈｕｓｓａｃｋら、印刷中（ｃ））を行って、ヒトリゾチームまたは血清アルブミンとの結合が陽性のＶＬをディスプレイするファージを同定した。
【０１３６】
（実施例９ｂ）
ファージ力価の決定
標準技法を用いて、ファージ力価を決定した。溶離ファージの力価を決定するため、ＰＢＳにおいて溶離ファージの１０−１〜１０−４希釈物を作製した（１８μＬのＰＢＳに２μＬのファージを添加して、１０−１希釈物をなど作製した）。１０μＬの各希釈物を、１００μＬの指数増殖Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（ＯＤ６００＝約０．５）と混合し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞のファージ感染が起こるよう、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。感染したＴＧ１細胞を、２ｘＹＴ／Ｔｅｔ寒天ペトリ皿上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーの数を用いて、溶離ファージの力価（ｃｆｕ／ｍＬ）を決定した。ｆｄＴＧＩＩＩおよび−９６ＧＩＩＩプライマー（表６）を用いて、コロニーに対するコロニー−ＰＣＲを行って、インサートの存在を検証し（陽性ヒットは、５００ｂｐ前後のサイズを生じた）、ＤＮＡ配列決定のための鋳型を提供した。配列を解析し、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ８により操作した。
【０１３７】
要約すると、増幅ファージ（インプットファージ）の力価を決定するため、１０−３、１０−６、１０−８および１０−１０のファージ希釈物を作製した。１０μＬの各希釈ファージを１００μＬの指数増殖ＴＧ１細胞と混合し、細胞のファージ感染が起こるように混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、無菌使い捨てスプレッダーを用いて、ファージ感染細胞を２ｘＹＴ  ｒ／Ｔｅｔ寒天培地の入ったペトリ皿上に広げ、クリーンベンチ内に５分間放置した。プレートを一晩３７℃でインキュベートした。翌朝、プレートにおけるコロニー力価を用いて、増幅ファージの力価を決定した。
【０１３８】
ライブラリーの有用性を示すため、４ラウンド（ｆｏｕｒ  ｒｏｕｎｄｓ）のためヒトリゾチームおよびヒト血清アルブミンに対しライブラリーをパニングした。ヒトリゾチームに対するパニングの事例において、第一ラウンドにおいて従来のパニングを行い、続いて第２ラウンドから従来のパニングおよびサーモパニングを並行して行った。サーモパニングアプローチにおいて、インプットファージを６５℃で２時間インキュベートし、遠心分離して、あらゆる可能な凝集体を除去し、結合のためにリゾチームをコーティングしたウェルに上清を添加した。従来のパニングアプローチにおいて、インプット（増幅）ファージをリゾチームをコーティングしたウェルに熱処理せず直接添加した。サーモパニングを適用して、従来のパニングと比較して安定な（熱安定なかつ／または非凝集性の）ＶＬバインダーを優先的に富化するかどうかを観察したが、これは、安定および不安定なＶＬバインダーに関して無差別的であると予想された。
【０１３９】
表７は、アウトプットファージ力価（または溶離ファージ力価）に関するヒトリゾチームに対するパニングの結果を示す。一般に、アウトプットファージ力価は、従来のパニングと比較して、サーモパニングアプローチでは３〜４桁低い。これは、用いたさらに低いインプットファージ力価および熱処理の間の凝集（データ図示せず）に起因するさらなるファージ損失（恐らく、凝集ファージによりディスプレイされたＶＬ）による可能性がある。
【０１４０】
表７．室温（従来のパニング）対６５℃−２時間（サーモパニング）の選択条件下で行ったパニングのためのファージ力価。データは、ヒトリゾチームに対するパニングのためのものである。ｃｆｕ：コロニー形成単位。
【０１４１】
【表７】
2014506454.tif 000020
ラウンド３および４からのファージＥＬＩＳＡおよび配列解析により、固定化ヒトリゾチームに対し多様なな親和性を有する９種の抗ヒトリゾチームＶＬが同定された（図１３および表８）。解析した総計１７７種のＶＬ（それぞれラウンド３およびラウンド４に対し１０１種のＶＬおよび７６種のＶＬ）のうち４ラウンドのパニングの後、ラウンド３において同定された総計９クローンのうち５クローン、ＨＶＬＨＬＲＮ；ＨＶＬＨＬＤＳ；ＨＶＬＨＬＮＥ；ＨＶＬＨＬＮＮ；ＨＶＬＨＬＦＬが生存した（図１２）。これらは、サーモパニングアプローチ（６５℃、２時間）において、それぞれＨＶＬＨＬＲＮおよびＨＶＬＨＬＤＳについての５４．２％および２５％、続いてそれぞれＨＶＬＨＬＮＥ、ＨＶＬＨＬＮＮおよびＨＶＬＨＬＦＬについての８．３％、８．３％および４．２％で表された。対照的に、従来のパニングアプローチ（室温［ＲＴ］）を用いて、ＨＶＬＨＬＲＮおよびＨＶＬＨＬＤＳは表されず、ＨＶＬＨＬＮＥ、ＨＶＬＨＬＮＮおよびＨＶＬＨＬＦＬは、それぞれ２８．６％、４２．９％および２８．６％の相対頻度で生じた（図１２）。ＨＶＬＨＬＲＮおよびＨＶＬＨＬＤＳも、サーモパニングのラウンド３における優勢クローンであり、従来のパニングのラウンド３においては僅かに存在した。ＨＶＬＨＬＹＳ、ＨＶＬＨＬＡＱ、ＨＶＬＨＬＱＩおよびＨＶＬＨＬＥＭは、ラウンド４パニングにおける従来のパニングまたはサーモパニングのいずれによっても選択されなかった。
【０１４２】
表８．パニングのラウンド３および４から単離された抗ヒトリゾチームＶＬおよび抗ヒト血清アルブミンＶＬの特性。
【０１４３】
【表８】
2014506454.tif 000021
ＮＤ、決定されず；ＲＴ、室温；Ａｇｇ．、凝集体。％は％凝集体。
【０１４４】
ヒト血清アルブミンに対する４ラウンドのパニングの後、ファージＥＬＩＳＡによる５０クローンのスクリーニングおよび配列決定は、１種の優勢ＶＬ、即ち、ヒト血清アルブミンに対する結合がファージＥＬＩＳＡにより陽性であるＨＶＬＨＳＡ１を明らかにした（図１３；表８）。
【０１４５】
その後、１０種の抗リゾチームファージＶＬバインダーおよび抗アルブミンファージＶＬバインダーを全て、下に記すとおりさらなる特性評価のために加工した。
【０１４６】
（実施例９ｃ）
抗ヒトリゾチームＶＬおよび抗ヒト血清アルブミンＶＬの生物物理学的特性評価
ファージによりディスプレイされるＶＬクローンから開始し、他の抗体ドメインについて上に記すとおりの標準技法によりＶＬをクローニングし、発現させ、精製した。その後、凝集状態に関しては分子ふるいクロマトグラフィーにより、熱安定性に関してはＣＤにより、その結合親和性および特異性に関しては表面プラズモン共鳴により、ＶＬを解析した。
【０１４７】
他のドメインについて記載されている通りに、９種の抗ヒトリゾチームＶＬおよびＨＶＬＨＳＡ１  ＶＬ（図１３；表８）をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、標準技法により精製した。ＶＬは、そのＣ末端にＨｉｓ６タグを有するため、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。図１６Ａは、最高溶出ピークが４００ｍＡＵ（ＨＶＬＨＬＥＭ）から２４００ｍＡＵ（ＨＶＬＨＬＲＮ）のＡ２８０範囲を示す精製ＶＬのＩＭＡＣクロマトグラムプロファイルを示す。ＶＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、ＶＬが高度に純粋であることを示す（図１６Ｂ）。そのＩＭＡＣクロマトグラムプロファイルから判断すると、ＨＶＬＨＳＡ１の発現収量も高かった（データは示さず）。よって、ＶＬは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高純度、高収量で発現することができる。
【０１４８】
その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５分子ふるいクロマトグラフィーによりＶＬをその凝集挙動に関して解析した。記載されている通りに（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、２０１０年）各ＶＬについての％凝集体（または％単量体）も決定した。図１４Ａに示す通り、３種の抗ヒトリゾチームＶＬ（ＨＶＬＨＬＲＮ、ＨＶＬＨＬＥＭおよびＨＶＬＨＬＤＳ）は、純粋に単量体（非凝集）である一方、残りのＶＬバインダーは、７％〜１７％に及ぶ％凝集体を有して凝集していた（表８）。ＨＶＬＨＳＡ１  ＶＬも、他のドメインに関して記載されている通りに分子ふるいクロマトグラフィーにより解析した。クロマトグラムは、ＶＬが１００％非凝集単量体であることを実証する対称の単量体ピークを生じた（図１４Ａ；表８）。これらの結果は、非規範Ｃｙｓ４８／Ｃｙｓ６４（またはＣｙｓ４９／Ｃｙｓ６９）ジスルフィド連結の特色を有するＶＬ（またはＶＨ）ライブラリーが、非凝集バインダーをもたらすことを示す。
【０１４９】
ＶＬバインダーの熱安定性の尺度を得るため、他のドメインに関して以前に記載された通りにＣＤによりＶＬの融解温度（Ｔｍ）を決定した。図１４Ｂは、６２℃〜７４℃の範囲にある抗ヒトリゾチームＶＬの融解プロファイルを示す。計算されたＴｍを表８に記録する。抗アルブミンＨＶＬＨＳＡ１のＴｍも決定し、それが７１℃と高いことを示した（図１４Ｂ；表８）。これらのＴｍは、非規範ジスルフィド連結のないＶＬよりも有意に高く、このことから、非規範Ｃｙｓ４８／Ｃｙｓ６４（またはＣｙｓ４９／Ｃｙｓ６９）ジスルフィド連結の特色を有するＶＬ（またはＶＨ）ライブラリーにより、より安定なバインダーがもたらされることが実証される。ヒトリゾチームパニングの事例において、非凝集性であり（表８）、最高のＴｍを有するＨＶＬＨＬＲＮおよびＨＶＬＨＬＤＳはまた、サーモパニングによって、凝集し熱安定性が低いクローンよりも、非常に著しく富化されたクローンであるが、それは、従来のパニングによっては富化されなかった。これは、どちらのパニングアプローチも、非凝集性の熱安定なバインダーをもたらすが、サーモパニングは、これらを富化することにおいてより効率的であることを実証する。（非凝集性かつ熱安定な、ＨＶＬＨＬＥＭがサーモパニングによりラウンド４においてまだ選択されていなかったという事実は、パニングの結合ステージにおけるその非常に低い親和性に起因し得た［図１２；表８］）。図１４Ｃは、抗リゾチームＶＬおよび抗アルブミンＶＬのＴｍと％単量体との間に強い正の相関が存在することを示し（Ｒ２＝０．８５６８；Ｐ値（両側）＝０．００１３、Ｓｐｅａｒｍａｎ  ｒ＝０．９０６１）、ここことは、ＶＬのＴｍが高ければ高いほど、ＶＬは、非凝集となる可能性がより高くなることを意味する。これは、非規範ジスルフィド連結の特色を有するＶＬ／ＶＨライブラリーは、この特色なしのライブラリーよりも熱安定なＶＬ／ＶＨバインダーをもたらすため、これは同様により非凝集性のＶＬ／ＶＨバインダーをもたらすことも意味する。治療薬として、非凝集性かつ熱安定なＶＬ／ＶＨバインダーは、さらに有効である。
【０１５０】
その抗原である、ヒトリゾチームに対する抗ヒトリゾチームＶＬの親和性（ＫＤ）も決定した。ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、固定した抗ヒトリゾチームＶＬバインダーに対するヒトリゾチームの結合を決定した。２９８共鳴単位（ＲＵ）、３１２ＲＵ、２９５ＲＵ、３３９ＲＵ、３１５ＲＵ、４１２ＲＵ、３７０ＲＵ、３４５ＲＵおよび３４９ＲＵの各ＶＬバインダー（それぞれＨＶＬＨＬＡＱ、ＨＶＬＨＬＮＥ、ＨＶＬＨＬＥＭ、ＨＶＬＨＬＹＧ、ＨＶＬＨＬＲＮ、ＨＶＬＨＬＮＮ、ＨＶＬＨＬＱＩ、ＨＶＬＨＬＹＳおよびＨＶＬＨＬＤＳ）を、研究用グレードのＣＭ５センサーチップ上に固定した。製造業者によって供給されるアミンカップリングキットを用いて、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸中の１０μｇ／ｍＬ濃度で固定を行った。ヒトリゾチームを、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％Ｐ２０サーファクタント）において流速０．５ｍＬ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して、Ｂｉａｃｏｒｅ解析前にあらゆる可能な凝集体を排除した。結合試験のため、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％サーファクタントＰ２０を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４において２５℃で解析を行った。用いた流速は２０μＬ／分であった。再生のため、表面をランニングバッファーで１５分間洗浄した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアによりデータを解析した。結合プロファイルおよび計算されたＫＤを図１５および表８に示す。ＳＰＲプロファイル（図１５）から、抗ヒトリゾチームＶＬが、その標的抗原である、リゾチームと実際に結合することを認めることができ、ファージＥＬＩＳＡにより得られた結合結果を確認することができる。計算された結合親和性（ＫＤ）は多様であり、その多くは高親和性を有する（ＫＤ＝０．０５μＭ〜０．２μＭ）。
【０１５１】
上記の他のドメインに関して記載されている通りに表面プラズモン共鳴により、ヒト血清アルブミンに対するＶＬのＫＤを決定した。要約すると、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲにより、固定したヒト血清アルブミンとＶＬとの結合を決定した。およそ１，６００ＲＵのヒト血清アルブミン、１，９００ＲＵのウシ血清アルブミンおよび２，２００ＲＵの卵白アルブミンを研究用グレードのＣＭ５センサーチップ上に固定した。タンパク質表面と正確に同じ仕方で、エタノールアミンでブロッキングした表面を参照として調製した。製造業者によって供給されるアミンカップリングキットを用いて、１０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ４．５中の２０μｇ／ｍＬ濃度で固定を行った。ＶＬを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して、Ｂｉａｃｏｒｅ解析前にあらゆる可能な凝集体を排除した。結合実験のため、２５℃で、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％サーファクタントＰ２０を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４において解析を行った。用いた流速は４０μＬ／分であり、試料体積は６０μＬであった。再生のため、表面をランニングバッファーで１０分間洗浄した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアによりデータを解析した。図１７は、ＶＬが、その標的抗原である、ヒト血清アルブミンと結合することを明らかに示す。計算されたＫＤは、０．８μＭであると決定された（表８）。ＶＬは卵白アルブミンまたはウシ血清アルブミンと結合しなかったため、結合は特異的であった。
【０１５２】
よって、結果は、非規範ジスルフィド結合を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインが、高い親和性、安定性（非凝集性および熱安定性）ならびに発現収量を有する抗原バインダーの供給源であるＶＨ／ＶＬ合成ライブラリーを構築するためのスキャフォールドとして実施可能であることを示す。
【０１５３】
（実施例１０）
ジスルフィドにより安定化されたＶＨファージディスプレイライブラリーの構築
ポジション４９および６９における特別なジスルフィド連結により安定化されたＶＨスキャフォールドに築いた、ランダム化ＣＤＲを有するＶＨファージディスプレイライブラリーを作製するための実験を設計した。ライブラリーを構築するため、ＶＨファージディスプレイライブラリー（ＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３）を鋳型として用いて、ＶＬライブラリーに関して上に記す方法および以前に記載された方法（Ｓｉｄｈｕら、２０００年；Ｈｕｓｓａｃｋら（ｃ））を用いて、２個の選択されたアミノ酸残基（４９Ｓｅｒおよび６９Ｉｌｅ）をシステインで置き換えることにより、追加のジスルフィド連結を導入した。ＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３ファージディスプレイライブラリーは、ファージミドｐＭＥＤ−１にクローニングされ、タンパク質３遺伝子と融合したＣＤＲがランダム化されたヒトＶＨ遺伝子を有するファージミドベクターベースのライブラリーである（「Ｎｏｎ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ」ＰＣＴ公開、国際公開第２００９／０７９０９３号）。
【０１５４】
基本的に上に記す通りならびにＨｕｓｓａｃｋら（ｃ）およびＳｉｄｈｕら、２０００年に記載されている通りに、ジスルフィドにより安定化されたＶＨファージディスプレイライブラリーを構築する手順を行った。要約すると、システインで置き換えられるよう選択された２個のアミノ酸残基における部位特異的変異誘発の２回の別個のラウンドにより、構築を行った。第一に、ＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３ライブラリーから、ファージ（４×１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位））に感染させたＥ．ｃｏｌｉ  ＣＪ２３６を用いてｄＵ−ｓｓＤＮＡ（ウリジン含有一本鎖ファージＤＮＡ）を調製した。上に記す通りおよびＨｕｓｓａｃｋら（ｃ）に記載されている通りにＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１およびＣＪ２３６に対する力価を決定することにより、ｄＵ−ｓｓＤＮＡへのウリジンの取り込みを確認した後、４９Ｓｅｒを４９Ｃｙｓへと変異誘発するアニーリングのためのプライマーＫＴ１２４のリン酸化、ライゲーションおよび重合を包含する一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ合成反応を、２０μｇのｄＵ−ｓｓＤＮＡを用いてその後に行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ合成反応は、合計して２３μｇのヘテロ二本鎖ＤＮＡをもたらした。続く、形質転換毎に５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１コンピテント細胞と、５６４ｎｇのヘテロ二本鎖ＤＮＡを用いた１０種の別個の形質転換は、合計して１．１×１０１０ｃｆｕの多様性を生じた。プライマー（Ｍ１３ＲＰ  ａまたはｂおよび−９６ＧＩＩＩ）を用いたＰＣＲによるクローンの選択は、約５０％（１６クローンのうち８クローン）のクローンが、４９Ｓｅｒから４９Ｃｙｓへの変異を有したことを明らかにした。変異誘発の次のラウンドのため、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージによりレスキューすることにより、４９Ｓｅｒから４９Ｃｙｓへ変異導入したファージミドライブラリー（（ＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３Ｃ１））からファージを調製し、２．１×１０１３ｃｆｕ／ｍＬのファージ力価をもたらした。その後、（ＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３Ｃ１）からのファージ（４×１０１２ｃｆｕ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＣＪ２３６からｄＵ−ｓｓＤＮＡを調製し、続いて８μｇのｄＵ−ｓｓＤＮＡおよびプライマーＫＴ１２５を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ合成反応を行い、アニーリングして別のアミノ酸残基を変異誘発させ（６９Ｉｌｅから６９Ｃｙｓ）、合計して１２μｇのヘテロ二本鎖ＤＮＡをもたらした。続く、形質転換毎に５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１コンピテント細胞と２３０ｎｇのヘテロ二本鎖ＤＮＡを用いた２２種の別個の形質転換は、合計して５．３×１０９ｃｆｕのライブラリーサイズを生じた。二重変異（４９Ｓｅｒから４９Ｃｙｓおよび６９Ｉｌｅから６９Ｃｙｓ）を有するＶＨ遺伝子を表すライブラリーのパーセンテージを決定するため、プライマー（Ｍ１３ＲＰ  ａまたはｂおよび−９６ＧＩＩＩ）を用いたＰＣＲにより６５個のコロニーをスクリーニングし、配列決定し、解析し、２８％（６５クローンのうち１８クローン）のクローンが二重変異（４９Ｓｅｒから４９Ｃｙｓおよび６９Ｉｌｅから６９Ｃｙｓ）を有し、３５％（６５クローンのうち２３クローン）が単一の変異（４９Ｓｅｒから４９Ｃｙｓ）を有し、１５％（６５クローンのうち１０クローン）が単一の変異６９Ｉｌｅから６９Ｃｙｓを有し、２２％（６５クローンのうち１４クローン）が変異なしであったことを明らかにした。よって、両方のＣｙｓ変異を有するライブラリー（ＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３Ｃ２）のサイズを、クローンの選択の結果に従い、１．５×１０９ｃｆｕ（＝５．３×１０９×２８％）に補正した。３００ｍＬの２ｘＹＴにおいてＨＶＨＰ４３０ＬＧＨ３Ｃ２ファージディスプレイライブラリーを増幅させ、ライブラリー細胞を１５ｍＬの１０％グリセロールに再懸濁し、その後、１ｍＬアリコートとして−８０℃で維持した。
【０１５５】
ライブラリーの多様性は高く（５．３×１０９形質転換体）、その全ＶＨメンバーにおいて追加の安定化変異（４９Ｓｅｒから４９Ｃｙｓおよび６９Ｉｌｅから６９Ｃｙｓ）を有した。ライブラリーは、そのＶＨメンバーにおけるＣｙｓ４９／Ｃｙｓ６９ジスルフィド連結の存在のため、本技術分野で公知の標準選択技法およびパニング技法を用いることにより、標的抗原に対し高い安定性を有するバインダーを生じる筈である。
本発明の非限定的な実施形態
実施形態１は、フレームワーク領域（ＦＲ）に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を含む免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物を含む。実施形態１は、フレームワーク領域（ＦＲ）に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を含む変異体免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物であって、安定性の増大、融解温度の増大、溶解性の増大および凝集の減少から選択される１または複数の改善を有する組成物をさらに含む。実施形態１に記載の変異体組成物の改善は、熱リフォールディング効率の改善、プロテアーゼ消化に対する抵抗性の増大、室温以上での、４℃でのまたは０℃未満での貯蔵寿命の増大から選択され得る。実施形態１に記載の変異体組成物の改善は、ヒト被験体に投与したときに、非規範ジスルフィド結合を含まない対応する組成物と比較した場合、機能性の増大または延長としてさらに特徴付けることができる。
【０１５６】
実施形態２は、実施形態１に記載の組成物であって、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｉｎ）スキャフォールドがＶＨスキャフォールドまたはＶＬスキャフォールドから選択され、該ＶＨスキャフォールドが、ＦＲに少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合を含み、該非規範ジスルフィド結合が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入されたＣｙｓ残基間に形成され；該ＶＬスキャフォールドが、ＦＲに少なくとも１個の非規範ジスルフィド結合を含み、該非規範ジスルフィド結合が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入されたＣｙｓ残基間に形成される、組成物を含む。
【０１５７】
実施形態３は、スキャフォールドが、より大きな抗体タンパク質またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２からなる群から選択される断片または成熟免疫グロブリンの一部である、実施形態１に記載の組成物を含む。実施形態４は、成熟免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよび／またはＩｇＭからなる群から選択される、実施形態３に記載の組成物を含む。
【０１５８】
実施形態５は、免疫グロブリンスキャフォールドがＶＨである、実施形態１に記載の組成物を含む。実施形態５は、免疫グロブリンスキャフォールドが、ＶＨ１ファミリー、ＶＨ２ファミリーまたはＶＨ３ファミリーから選択される、実施形態１に記載の組成物をさらに含む。実施形態６は、ＶＨが、ＶＨ３ファミリーのものである、実施形態５に記載の組成物を含む。さらに別の一実施形態において、ＶＨ免疫グロブリンスキャフォールドは、配列番号２、４、６、８および７０〜８３からなる群のうち１または複数の配列またはそれと実質的に同一の配列から選択される。一実施形態において、実質的に同一の配列は、本開示されている配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５残基異なる。
【０１５９】
実施形態７は、免疫グロブリンスキャフォールドが、ＶＬである、実施形態１に記載の組成物を含む。実施形態８は、ＶＬが、カッパーまたはラムダファミリーのものである、実施形態７に記載の組成物を含む。さらに別の一実施形態において、ＶＬ免疫グロブリンスキャフォールドは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群のうち１または複数の配列またはそれと実質的に同一の配列から選択される。一実施形態において、実質的に同一の配列は、本開示されている配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５残基異なる。
【０１６０】
実施形態９は、１または２以上の非規範ジスルフィド結合が、変異によりＦＲ２およびＦＲ３に導入されたシステイン間に形成される、実施形態１〜８のうちいずれか一実施形態に記載の組成物を含む。実施形態１０は、Ｃｙｓ残基が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４９および６９に導入される、実施形態５または６に記載の組成物を含む。実施形態１１は、Ｃｙｓ残基が、Ｋａｂａｔナンバリングに基づくポジション４８および６４に導入される、実施形態７または８に記載の組成物を含む。
【０１６１】
実施形態１２は、スキャフォールドが、多量体化される、実施形態１〜１１のうちいずれか一実施形態に記載の組成物を含む。一実施形態において、実施形態１２から得られた多量体は、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体を含む。
【０１６２】
実施形態１３は、スキャフォールドが、Ｆｃ断片、標的化配列、シグナル配列および精製タグまたはこれらの任意の組み合わせから選択される第二の配列と融合される、実施形態１〜１２のうちいずれか一実施形態に記載の組成物を含む。一実施形態において、第二の配列の少なくとも１単位は、本発明のスキャフォールドを含む少なくとも１個の単量体と融合される。一実施形態において、第二の配列の少なくとも１単位は、実施形態１２に記載の組成物と融合される。
【０１６３】
実施形態１４は、免疫グロブリンスキャフォールドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および７０〜８３からなる群から選択される配列またはそれと実質的に同一の配列またはその断片（ただし、実質的に同一の配列は、規範および非規範ジスルフィド結合の両方を保持し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む残基は、任意の適切な配列となることができる）のフレームワーク領域を含む、実施形態１〜１３のうちいずれか一実施形態に記載の組成物スキャフォールド（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号２またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号４またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号６またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号８またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号１０またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号１２またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号１４またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号１６またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号１８またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号２０またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号２２またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号２４またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７０またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７１またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７２またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７３またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７４またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７５またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７６またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７７またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７８またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号７９またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号８０またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号８１またはその機能的断片を含む。特定の一実施形態において、組成物は、配列番号８２またはその機能的断片を含む。特異的な一実施形態において、組成物は、配列番号８３またはその機能的断片を含む。特異的な一実施形態において、組成物は、配列番号８４またはその機能的断片を含む。
【０１６４】
実施形態１５は、実施形態１〜１４のうちいずれか一実施形態に記載の組成物をコードする核酸を含む。実施形態１６は、実施形態１５に記載の核酸を含む発現ベクターを含む。実施形態１７は、実施形態１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞または生物を含む。一実施形態において、本発明の免疫グロブリンスキャフォールドをコードする核酸配列は、本発明の開示されている組成物と実質的に同一の配列をコードする。一実施形態において、実質的に同一の配列は、本開示されている配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５残基異なる。一実施形態において、核酸は、宿主細胞または生物における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、細菌における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、酵母における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、非ヒト動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、核酸は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【０１６５】
実施形態１８は、実施形態２に記載の少なくとも１種の免疫グロブリンスキャフォールドを含む組換えライブラリーであって、該免疫グロブリンスキャフォールドが、ライブラリー当たり少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または１０９を超えるクローンの多様性を提供する多数の適切なＣＤＲ配列をさらに含む、組換えライブラリーを含む。
【０１６６】
実施形態１９は、免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物の安定性を改善する方法であって、フレームワーク領域に１または２以上の非規範ジスルフィド結合を導入するステップを含む方法を含む。実施形態１９に記載の方法は、組換え技術を用いて、免疫グロブリン配列における第一のコドンおよび第二のコドンを、各ポジションにおいてシステインのコドンと置き換える方法であって、該免疫グロブリン配列が、ＶＨスキャフォールドであり、該第一のコドンが、Ｋａｂａｔナンバリングを用いてポジション４９に相当し、該第二のコドンが、Ｋａｂａｔナンバリングを用いてポジション６９に相当する方法をさらに含む。実施形態１９に記載の方法は、組換え技術を用いて、免疫グロブリン配列における第一のコドンおよび第二のコドンを、各ポジションにおいてシステインのコドンで置き換える方法であって、該免疫グロブリン配列が、ＶＬスキャフォールドであり、該第一のコドンが、Ｋａｂａｔナンバリングを用いてポジション４８に相当し、該第二のコドンが、Ｋａｂａｔナンバリングを用いてポジション６４に相当する方法をさらに含む。本発明は、発現ライブラリーを作製するための、実施形態１９に記載の方法の使用をさらに含む。一実施形態において、ライブラリーは、実施形態１８に記載のライブラリーである。
【０１６７】
実施形態２０は、安定性の増大、融解温度の増大、溶解性の増大および凝集の減少から選択される１または複数の改善を有する免疫グロブリンスキャフォールドを含む変異体組成物を作製する方法であって、実施形態１９に記載の方法を含む。実施形態２０に記載の変異体組成物の改善は、熱リフォールディング効率の改善、プロテアーゼ消化に対する抵抗性の増大、室温以上での、４℃でのまたは０℃未満での貯蔵寿命の増大から選択され得る。実施形態２０に記載の変異体組成物の改善は、ヒト被験体に投与したときに、非規範ジスルフィド結合を含まない対応する組成物と比較した場合、機能性の増大または延長としてさらに特徴付けることができる。
【０１６８】
実施形態２１は、治療薬である、実施形態１から１４のうちいずれか１または複数に記載のいずれか１または複数の組成物を含む。本発明は、実施形態２１に記載の組成物を、薬学的に許容される該組成物のためのキャリアまたは賦形剤中にさらに含む。
【０１６９】
実施形態２２は、実施形態２１に記載の組成物であって、それを必要とする被験体に投与される組成物の使用を含む。実施形態２３は、処置を必要とする被験体に投与される薬剤としての実施形態２１に記載のいずれか１または複数の組成物の使用を含む。
【０１７０】
実施形態２４は、免疫グロブリンスキャフォールドを含む組成物が、非ヒト動物に由来する、実施形態１から１４のうちいずれか１または複数に記載のいずれか１または複数の組成物を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、特に、鳥類、両生類、爬虫類、哺乳類、ラクダ科の動物、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ウマまたは非ヒト霊長類から選択される脊椎動物を包含する。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、ヒトである。一実施形態において、免疫グロブリンスキャフォールドは、ラクダ科の動物である。一実施形態において、ラクダ科の動物の種は、ラマ、アルパカおよびラクダからなる群から選択される。一実施形態において、ラクダ科の動物のスキャフォールドは、ＶＨ領域、ＶＬまたはＶＨＨ領域のうちいずれか１または複数に由来する。
【０１７１】
【化９】
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【０１７２】
【化１０】
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【０１７３】
【化１１】
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【０１７４】
【化１２】
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【０１７５】
【化１３】
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【０１７６】
【化１４】
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【０１７７】
本明細書に記載されている実施形態および実施例は、説明目的のものであり、請求されている本発明の範囲を限定するよう意味づけられていない。代替物、修正物および均等物を包含する上記の実施形態の変種は、本特許請求の範囲に包含されていることが本発明者らにより企図される。さらに、記述されている特色の組み合わせは、本発明に係る解明に必要とされないことがある。
【０１７８】
参考文献
本明細書および本願全体を通じて参照されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に援用する。
【０１７９】
【数１】
2014506454.tif 000028
【０１８０】
【数２】
2014506454.tif 000029
【０１８１】
【数３】
2014506454.tif 000030
【０１８２】
【数４】
2014506454.tif 000031
【０１８３】
【数５】
2014506454.tif 000032
【０１８４】
【数６】
2014506454.tif 000033
【図１Ａ】
2014506454.tif 000038
【図１Ｂ】
2014506454.tif 000039
【図２Ａ】
2014506454.tif 000040
【図２Ｂ】
2014506454.tif 000041
【図３Ａ−１】
2014506454.tif 000042
【図３Ａ−２】
2014506454.tif 000043
【図３Ｂ】
2014506454.tif 000044
【図３Ｃ】
2014506454.tif 000045
【図４Ａ】
2014506454.tif 000046
【図４Ｂ】
2014506454.tif 000047
【図４Ｃ】
2014506454.tif 000048
【図５】
2014506454.tif 000049
【図６】
2014506454.tif 000050
【図７Ａ−１】
2014506454.tif 000051
【図７Ａ−２】
2014506454.tif 000052
【図７Ｂ】
2014506454.tif 000053
【図８Ａ−１】
2014506454.tif 000054
【図８Ａ−２】
2014506454.tif 000055
【図８Ｂ−１】
2014506454.tif 000056
【図８Ｂ−２】
2014506454.tif 000057
【図９−１】
2014506454.tif 000058
【図９−２】
2014506454.tif 000059
【図１０】
2014506454.tif 000060
【図１１】
2014506454.tif 000061
【図１２】
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【図１３】
2014506454.tif 000063
【図１４】
2014506454.tif 000064
【図１５−１】
2014506454.tif 000065
【図１５−２】
2014506454.tif 000066
【図１６−１】
2014506454.tif 000067
【図１６−２】
2014506454.tif 000068
【図１７】
2014506454.tif 000069
【配列表】
2014506454000001.app
【国際調査報告】
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2014506454.tif 000072
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