(57)【要約】  本発明の方法および装置の使用によって、静置培養と気泡導入培養（ＰＭＥＵ（可搬式微生物増菌ユニット）型の培養など）の両方を用いる微生物培養法、例えば、ColilertTM 培地上での培養において、水サンプル中の衛生管理指標細菌と他の細菌、および他の微生物の、可能な限り最適な増殖開始を保証する。本発明の目的は、培養時に気泡導入または他のガス混合法を用いるか否かに関係なく、水サンプルまたは処理サンプルの微生物学的検出値を、可能な限り高いものとすることである。本発明の装置および方法は、自動または手動のサンプリング装置にも応用可能であり、サンプリング装置と連結することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養によって水サンプルから微生物を検出するための方法であって、微生物が曝された環境ストレスの量に関係なく、微生物の増殖開始を促進するガスまたはガス混合物を、水のサンプリング前またはサンプリング中に水サンプル回収用の自動または手動の装置と共に用いる容器、試験管、シリンジまたは他の入れ物に導入するか、あるいは実際の水サンプルまたは液体サンプル中に導入することによって、サンプル中に存在する微生物の可能な限り大部分を可能な限り迅速に増殖させることを特徴とする方法。
【請求項２】
サンプリングの際および培養開始の際に微生物細胞が接触するガスの状態を、目的の微生物に対する環境ストレスが最小および最適の少なくとも一方となるように調節することによって、可能な限り多量の微生物細胞の分裂を可能な限り迅速に開始させ、静置培養において最適な増殖開始点を達成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物の培養をＰＭＥＵ装置内、気流下で継続することを特徴とし、該培養が、任意の時点で行う静置培養とサンプリングに続いて行う静置培養のいずれの場合でも、サンプリングの際に使用したガスから培養時の気流への変換を、微生物細胞にとって可能な限り好ましい方法で実施する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
衛生管理指標のモニタリングを行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
微生物の培養に、大腸菌群細菌の培養および検出のための抗生物質を含有する、ColilertTM 液体培地または同様の選択培地を用いることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サンプリング時に使用するガスまたは培養中に送り込む気泡の抗生物質濃度を低下させて、微生物の培養に用いるColilertTM 液体培地または同様の選択培地における抗生物質組成を最適化し、培養条件下における、抗生物質による大腸菌群細菌の成長阻害を防止または最少化することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物培養用の微生物学的な一般培地を使用し、従属栄養性細菌の培養および検出を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
適切なガスおよびガス混合物からなる群より選ばれる少なくとも１種で事前にすすいでおいた容器、試験管、シリンジまたは他の入れ物に、水サンプルまたは他の液体サンプルを採取することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
サンプリングを自動で実行することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの方法を実施するための装置であって、１つ以上の加圧ガスボトルが、サンプリングおよび培養の少なくとも一方に使用するためのシステムに関連して連結されており、該ボトル中のガスおよびガス混合物からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いて、微生物細胞の生存および培養開始の少なくとも一方を最適な方法で実施することを特徴とする装置。
【請求項１１】
水のサンプルからサンプリング前に得られていた情報およびサンプリング後に得られた情報からなる群より選ばれる少なくとも１種、ならびにサンプリング時に入手可能であった情報に基づいて、サンプリングに使用するキャリアーガスの圧力、流速、組成、濃度、温度または他のパラメーターを調節することが可能な自動制御装置が関連して設けられていることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
上水道および取水設備における微生物学的汚染を防止・管理する技術は、ほとんどの場合、衛生状態の指標となる特定の細菌種または細菌株の検出に基づくものである。複数の異なる分野の衛生管理基準には、上記細菌種または細菌株として、大腸菌および大腸菌と類似の細菌群であるいわゆる大腸菌群細菌が糞便性腸球菌と共に列挙されている。これら細菌類のモニタリングは、多くの場合、配水網の清浄性を管理する過程において主要な業務となる。また、抗生物質耐性株が汚水処理システムを介して蔓延するといったリスクなども存在する（Hakalehto, 2006）。例えば、２００７年にフィンランドのノキアという町において、衛生基準の徹底に失敗した。ある程度は処理されたものの、相当量の病原体や種々の衛生管理指標微生物を含んだ汚水が漏洩して清潔な配水網に混入した。水の使用が禁止されるまでに、少なくとも１万人が汚染された水に曝され、これによって細菌、ウイルスおよび原虫による重篤な腸疾患がノキアに蔓延した。更に、様々な業界が、清潔な水の不足によって財政的な損失をこうむった。こういった健康被害および財務損害は、取水設備および上水道における微生物学的なモニタリングがより精巧且つ広範囲にわたるものであったならば、防止することができたであろう。
【０００２】
課題となる強力なモニタリングは、例えば、水の清浄性の標準および基準として提示されているのと同じ指標大腸菌群および指標腸球菌の迅速な解明および検出を基礎とすることができる。問題となる細菌種は、ヒトの消化管において胆汁の分泌によって多くの微生物種の増殖が抑制されている領域に特異的に由来するものである（Hakalehto et al., 2010）。腸のこの領域とは、十二指腸においてヒトの栄養吸収の最も重要な部分が行われる領域である。ファーター乳頭を通る管を介した胆嚢からの胆汁酸の分泌は、腸のこの領域で生じる。大規模な患者データベースによると、人体システムの諸機能に重要なこの領域で発生する細菌の３分の２が、大腸菌群細菌および腸球菌細菌である。ここには繊細な平衡状態が存在するとも考えられ、有機酸を生成する大腸菌および他の大腸菌群細菌と、酸の生成のバランスを保つクレブシエラ／エンテロバクター群に属する大腸菌群細菌との間に釣り合った状態が保たれることによって、健康なヒトの十二指腸のｐＨは約６に維持されている（Hakalehto et al., 2008）。この「二元」的な平衡状態は、可搬式微生物増菌ユニット（Portable Microbe Enrichment Unit、ＰＭＥＵ）で再現することが可能であり、このバランスが人体システムにおいて重要であるという事実が、このバランスを保つ役割を担う細菌がほぼ全てのヒトの腸管から見出されると期待される重要な理由である。よってこのバランスを保つことは、腸の健康状態を維持すると同時に、人体システム全体の健康を維持する上で重要な意味がある（Hakalehto, 2011）。
【０００３】
微生物叢、特に新生児腸内の大腸菌群細菌の研究においては、大量の抗生物質の使用は、腸内細菌科に属する細菌の腸管への定住を遅らせたものの、防止することはなかった（Pesola & Hakalehto, 2011）。これに加えて、種々の異なる栄養を与えられた新生児の腸内において、大腸菌群細菌は微生物叢の必須要素を形成した（Pesola et al., 2009）。種々の研究の結果によれば、腸由来汚染物の検出に衛生管理指標を用いることは妥当である。水サンプルの増菌培養の後には、微生物負荷の由来をより詳細に分析することが可能となる。例えば、カッラヴェシ湖（フィンランド国、クオピオ）の場合、ＰＭＥＵで増菌された腸球菌指標の生化学的タイプ選定法によるタイプ選定が可能であり、工業プラント近傍に存在する細菌株の種類が、都市下水処理プラントの処理済排水放出下から単離した細菌株の種類とは異なることを明確に示すことも可能であった（Heitto et al., 2009、Hakalehto, 2010）。水道水の生産および分配の各種段階における指標細菌および他の微生物の確実な検出を実行するために推奨される別の方法としては、自動微生物管理システムを構築することが挙げられる。微生物管理システムは、サンプルから衛生管理指標を検出する方法に基づくことが有利であり、このサンプルは、水質が危険に曝されていると疑われる場合に、自動または手動によるサンプリングの頻度を増加させることが可能なサンプルである。汚染管理対象のサンプリング頻度の増加は、例えば、知覚所見または物理化学的測定結果に基づいて決定する。この手順を、サンプリングまたは他のパラメーターの頻度、地域分布および特質を自動的に変化させる管理システムに連結することができる。自動化システム（あるいは手動のシステム）によって、サンプルをＰＭＥＵに採取するか、またはＰＭＥＵに対応する装置であるが、ＰＭＥＵとは反対に滅菌済みの空気またはガスの通気は行わない装置に採取することができる。いずれの場合も、微生物用の培地を水に添加する。培地は、サンプルと混合することが可能な乾燥粉末の形状で添加することが可能であり、例えば、サンプリング用のディッシュまたはシリンジに予め入れておいてもよい。可能であれば、滅菌ガス気流をサンプルの混合にも使用することができる。
【０００４】
多くの場合、細菌の増菌培養におけるＰＭＥＵの使用は、腸内細菌（Pesola & Hakalehto, 2011）および環境サンプル中の細菌（Hakalehto, 2010）が増殖過程を開始する一助となる（微生物培養において「増殖」とは、個体数または細胞数の蓄積を意味する）。増殖開始は、サルモネラ菌（Hakalehto et al., 2007）やカンピロバクター菌（Pitkanen at al., 2009）などの病原体の増殖確認との関連のみならず、指標種（Hakalehto, 2011）の増殖確認との関連も示されており、また増殖確認は、培養に使用する気相との関連も示されている。これは、微生物用の一般培地および選択培地、例えば、水生微生物学または他の衛生研究で用いられるColilertTM 液体培地（米国、Idexx Inc.）の使用に応用することができる（Hakalehto, 2010）。このColilertTM 法は、２００７年のノキアの事件の際にフィンランドでも、特にＰＭＥＵとそれに連結した自動サンプリング装置と共に効果的に使用することができたであろうと考えられる。
【０００５】
自動サンプリング装置が、培地への通気を使用しないか、通気を考慮していない培養システムに連結している場合、これらシステムには、種々の異なる培養方法を用いる研究のための拡張培養またはサンプルの分割のための装置を設けることも可能である。全ての微生物学的分析において、増殖促進のために培地をサンプルに添加することは典型的な手法である。培養中に通気することは、増殖を活性化し、促進するための有利な方法である（Hakalehto et al, 2007、Pitkanen et al., 2009、Hakalehto, 2011）。実際には、サンプル混合物に導入された水などの液体サンプルは、サンプル自体が置換するガス容積と接触することとなる。培養の正確性を保障するためには、ガスは完全に無菌でなければならず、上述したように、適切な気流はサンプル中の微生物を復活させるために有効である。過去の実験結果によると、これは実際にサンプル中に存在するのと同じ大腸菌群、腸内細菌および多様な病原体の検出を保障するものである。培養物から放出されるガスを指標細菌および病原体の検出に使用することに成功している（Hakalehto et al., 2009）。更に、未発表プロジェクトの結果によると、衛生管理指標単独では全ての汚染を明らかにすることはできないため、上水道および取水設備の従属栄養性微生物叢のモニタリングを重要視すべきである（Hakalehto, 2010）。同様に、Finnoflag Oyによる部分的に未発表の結果によると、ColilertTM 法は、増殖速度の観点からも、ガス化培養と静置培養の両方において少なくとも同等に機能する。この知見を支持する国立ポラリスプロジェクト（national Polaris-Project）の結果は、Samplion Oyのホームページ上で、Elias Hakalehtoの講義資料として初めて公表されたものである。発表は、２０１０年８月２６日にタンペレで行われたVeden Vaarat（水の危険事象）セミナーにおいて、関係当局および上水道局の代表の出席のもとに行われ、その資料は、Samplion Oyのホームページ（www.samplion.fi.）で公表された。
【０００６】
大腸菌群細菌、特に大腸菌の検出の意義は、水の微生物学的衛生管理において最も重要であり、ColilertTM 法および対応するその他の方法におけるガスの使用は上記検出に重要な意味を持つと考えられる。上述した大腸菌群細菌および大腸菌の検出のための方法と類似した微生物学的試験方法の実施の有効性は、エスポーのValtion Teknillinen Tutkimuskeskus［フィンランド技術研究センター（Technical Research Centre of Finland）、VTT Expert Services］によって２０１０年の春に確認されている（Wirtanen & Salo, 2010）。ColilertTM 法および共に使用する液体培地は、液体培地および培養物における選択因子としての抗生物質の使用に部分的には基づくものである。一方、ＰＭＥＵ培養において生じる培地のガス化は、選択的効果の効力に重要な影響を与える。ＴＨＬ（フィンランド国立健康福祉研究所（National Institute for Health and Welfare, Finland））およびFinnoflag Oyの合同プロジェクトにおいては、例えば、水サンプルからカンピロバクター菌を検出する際に、気泡によって抗生物質の選択性が増加することが認められた（Pitkanen et. al., 2009）。この現象故に、増殖速度について最適な結果を得るためには、抗生物質の濃度を、ColilertTM 培地の使用のためのガイドラインに記載されている値よりも低下させることが有効である。しかし、これら濃度レベルは製造者の所有する情報であり、現存する基準に基づく多くの検出方法に含まれるものである。にもかかわらず、抗生物質濃度の低下は、特にColilertTM 培地および他の類似した選択培地などの場合、潜在的に有利であると考えられる。これに関連して、培養容器内におけるガスの使用および／または培養容器へのガスの流通は、微生物の増殖開始を確実なものとするために、また、その増殖速度を最適にするために有効である。これら因子はいずれも、２００７年にノキアで発生した事件や、より小規模の水道事業に関連した同様の事件などの衛生災害の防止において引き続き重要である。例えば、オランダにおいては、水質を確保するための現状で最も優れた技術を使用しなければならないことを、立法者が水道局および水の製造に係る団体に求めている。よって、ガスの気流または気泡なしで培養を実施するか、実施しなければならない場合、培養法、培地またはサンプルの取扱いに際して、種々の細菌（特に大腸菌および他の大腸菌群細菌）に対するガスの影響に関する現存する知識を注意深く検討し、そして利用することを当然として要求するには十分な理由が存在する。実際のフィールドワークの現場で実施しうる１つの可能性としては、抗生物質を含有する選択液体培地、即ち、培養用培地、をＰＭＥＵ培養用の他の培地で希釈することであり、この場合、気流の利点を最大限に取り入れることができる。別の可能性としては、上述したように、例えば、Idexx社または他の培地製造業者に相談して、液体培地の濃度を変更することである。
【０００７】
培養中のガスの導入および増殖開始時の培養物におけるガスの状態の両方が、実験室における種々の細菌および他の微生物の検出において有意義であるという結果が、異なる複数の研究から共通して導かれており（Hakalehto, 2010、Hakalehto, 2011）、そのため、複数の細菌株または単細胞生物がかなりの量の「環境ストレス」に曝される水質管理の場において、上記について考慮することは有利であると考えられる。ガスの流速、圧力、組成および温度は微生物の増殖および増殖開始において意義がある。例えば、サンプルの二酸化炭素濃度またはガスの状態は、サンプリングが手動であるか自動であるかに関係なく、分析結果の正確性を最大とすることに関与する役割を担っている。よって、結果の取得に成功するためには、サンプリングの際および／または培養の開始および実行の際に、気流の導入、即ちガス化、を行うための準備をすることが重要である。
【０００８】
発明の説明
取水設備、上水道および配水網、ならびに全ての液体製品およびその製造方法における微生物管理において、自動で水サンプルを採取することが有利な場合が考えられる。こうすることによって、いわゆる「早期警戒」型の警報を可能な限り早い段階に設けておくことが可能となる。このような警報は、例えば、次の複数の工程を有してもよい。
１．物理的および化学的な基準
２．自動的に採取した微生物学的サンプルの、培養装置における静置培養
３．可能な限り信頼性の高い結果を得るために、微生物学的サンプルの増殖開始
および増殖速度を最適化するように工夫された、ＰＭＥＵ法による培養
【０００９】
「警報工程」からの陽性の表示によって、次の工程におけるサンプリングを自動的に開始することができる。これと同時に、操作に係る人たちに対して、例えば、コンピューターネットワークや電子通信ネットワークを用いた遠隔操作による警告と注意を与えることができる。従属栄養性微生物の検出が有利な最終工程は別として、必要に応じて第２工程で既に気流の補助の元で培養を実施することもできる。この場合、ColilertTM 培地または同様の抗生物質含有選択培地、および（例えば、大腸菌群細菌のための）検出用の種々のマーカーまたは標識方法を使用することが有利である。本発明の方法の主要な目的は微生物の検出であるため、乾燥状または液状の、可能であれば濃縮された培地のサンプルへの添加を含む工程であるサンプリングの際には、物質の添加および／または混合の際にガスによって生じる圧力変化や他の因子が微生物の増殖を阻害しないようにすることが特に重要である。
【００１０】
容器、試験管またはＰＭＥＵ用シリンジや他の入れ物に、自動サンプリングによってサンプルを採取する場合、サンプルが回収される容器、試験管、シリンジまたは他の入れ物を、回収前に適当なガスですすぐことができる。この場合、例えば、特定の条件化における微生物の増殖開始に対する二酸化炭素の促進効果や、低濃度の数種の微生物の増殖に対する水素ガスの使用による陽性効果を考慮することもできる（Hakalehto, 2011）。従って、自動的なサンプリングにおいては、培地とサンプルとの混合が、サンプル中の検出される細胞に対して更なるストレスを与えることがないように装置を設計することが有効である。サンプル中に存在するガス、ガスによるすすぎ、あるいはサンプリング時または種々の培養段階における培養物へのガスの導入は、サンプルの採取を補助するために用いることができる。本発明の方法および装置は、選択的ColilertTM 培地または同様の培地、あるいは従属栄養性細菌や他の微生物の増殖が可能な一般培地のいずれにサンプルを加えるかに関係なく、制御された状態で利用される、加圧したガスおよび／またはガス混合物を含む１つ以上のボトルを有利に含有していてもよい。代わりに、微生物培養装置に設置する培養用の容器、試験管、シリンジまたは他の入れ物を、適切なガスまたはガス混合物で事前にすすいでおくこともでき、この場合、容器が特定の培地のための選択因子を含有するか否か、また一般的には、容器に入っている培地の形状が固体と液体のいずれであるかには関係がない。この操作は、静置培養と、例えば、ＰＭＥＵ培養のような気泡導入培養の両方で実施可能であり、多くの場合、有利に実施することができる。サンプリングと関連したガスの状態が微生物の成長開始にとって可能な限り好ましいものとなるようにサンプリングを実施した場合、実際の培養に使用するガスが好気性、微好気性、または嫌気性であるかに関係なく、あるいは培養の一部分または全てを静置培養とするか、または全てを、例えば、ＰＭＥＵ型の培養装置で行うかに関係なく、結果は最適なものとなる。水のサンプルからサンプリング前に得られていた情報またはサンプリング後に得られた情報のみならず、サンプリング時に入手可能であった情報は、サンプリングに使用するキャリアーガスの圧力、流速、組成、濃度、温度または他のパラメーターについての指針とすることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hakalehto, E. 2006. Semmelweis' present day follow-up: Updating bacterial sampling and enrichment in clinical hygiene. Review Article. Pathophysiology 13(4), 257-67.
【非特許文献２】Hakalehto, E. 2010. Hygiene monitoring with the Portable Microbe Enrichment Unit (PMEU)（可搬式微生物増菌ユニット（ＰＭＥＵ）による衛生状態のモニタリング）．41st R3-Nordic Symposium（第４１回Ｒ３北欧シンポジウム）．Cleanroom technology, contamination control and cleaning（クリーンルーム技術、汚染管理および洗浄）．フィンランド国、エスポー、２０１０年５月．ＶＴＴ（フィンランド国、国立技術研究センター）出版物２６６．
【非特許文献３】Hakalehto, E. 2011. Simulation of enhanced growth and metabolism of intestinal Escherichia coli in the Portable Microbe Enrichment Unit (PMEU). M.C. Rogers および N.D. Peterson 編， E. coli infections: causes, treatment and prevention（大腸菌感染症：原因、処置と予防）．Nova Publishersより抜粋．
【非特許文献４】E, Humppi T, Paakkanen H. 2008. Dualistic acidic and neutral glucose fermentation balance in small intestine: Simulation in vitro. Pathophysiology 15 (4), 211-220.
【非特許文献５】Hakalehto E, Pesola J, Heitto A, Bhanj Deo B, Rissanen K, Sankilampi U, Humppi T, Paakkanen H. 2009. Fast detection of bacterial growth by using portable microbe enrichment unit (PMEU) and ChemPro100i (登録商標) gas sensor, Pathophysiology 16: 57-62.
【非特許文献６】Hakalehto E, Pesola J, Heitto L, Narvanen A, Heitto A. 2007. Aerobic and anaerobic growth modes and expression of type 1 fimbriae in Salmonella, Pathophysiology 14: 61-69.
【非特許文献７】Heitto L, Heitto A, Hakalehto E. 2009. Tracing wastewaters with faecal enterococci（糞便性腸球菌による排水のトレーシング）．ポスター発表．Second European large lakes symposium（第２回ヨーロッパ大湖シンポジウム）．スウェーデン、ノルテリエ、８月１０日〜１４日．
【非特許文献８】Pesola J, Vaarala O, Heitto A, Hakalehto E. 2009. Enrichment in Portable Enrichment Unit in rapid characterization of infant intestinal enterobacterial microbiota. Microbial Ecology in Health and Disease 21: 203-210.
【非特許文献９】Pesola, J. & Hakalehto, E. 2011. Enterobacterial Microflora in Infancy - A Case Study with Enhanced Enrichment. Indian Journal of Pediatrics. DOI: 10.1007/sl2098-010-0341-5 Online First (商標)．
【非特許文献１０】Pitkanen T, Bracker J, Miettinen I, Heitto A, Pesola J, Hakalehto E. 2009. Enhanced enrichment and detection of thermotolerant Campylobacter species from water using the Portable Microbe Enrichment Unit (PMEU) and realtime PCR, Can J Microbiol 55: 849-858.
【非特許文献１１】Wirtanen, G. & Salo, S. 2010. PMEU-laitteen validointi koliformeilla（大腸菌群細菌によるＰＭＥＵ装置の有効性の確認）．レポート VTT-S-01705-10、フィンランド国、エスポー、VTT Expert Services Oy．
【国際調査報告】
2014505479.tif 000002
2014505479.tif 000003
2014505479.tif 000004
2014505479.tif 000005