(57)【要約】ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼを、単独で、またはUDP−グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）をコードする組換え遺伝子と共に発現するように操作された、組換え微生物、植物および植物細胞が開示される。かかる微生物、植物または植物細胞は、サフランからの、クロセチン、クロセチンジアルデヒド、クロシンまたはピクロクロシンなどの化合物を生成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（ZCD）をコードする外来性核酸を含む、組換え体であるカロテノイド生成宿主であって、前記ZCDが、任意にCrocus sativusのZCDである、前記宿主。
【請求項２】
クロセチン、クロセチンジアルデヒドまたはヒドロキシル−β−シクロシトラール（HBC）の１または２以上の検出可能量を生成する、請求項１に記載の宿主。
【請求項３】
ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ（GGPPS）、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、およびβ−カロテンシンターゼをコードする内在遺伝子を含み、および／または、GGPPS、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、およびβ−カロテンシンターゼをコードする少なくとも１の外来性核酸を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の宿主。
【請求項４】
β−カロテンヒドロキシラーゼもしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする内在遺伝子、または、β−カロテンヒドロキシラーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする外来性核酸をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の宿主。
【請求項５】
GGPPS、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、β−カロテンシンターゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、およびゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（ZCD）をコードする少なくとも１の外来性核酸を含む組換え宿主であって、ここで、前記β−カロテンヒドロキシラーゼは、任意に、Xanthophyllomyces dendrorhousのβ−カロテンヒドロキシラーゼであり、ここで前記ZCDは、任意に、Crocus sativusのZCDであり、およびここで、前記少なくとも１の外来性核酸の発現は、クロセチンおよび／またはクロセチンジアルデヒドの検出可能量を生成する、前記宿主。
【請求項６】
無糖体Ｏ−グリコシルウリジン５’−ジホスホ（UDP）グリコシルトランスフェラーゼ（Ｏ−グリコシルUGT）をコードする外来性核酸をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の宿主。
【請求項７】
ピクロクロシンまたはクロシンの検出可能量を生成する、請求項６に記載の宿主。
【請求項８】
前記無糖体Ｏ−グリコシルUGTが、UGT85C2、UGT73-EV12、またはUGT71ハイブリッド酵素である、請求項６または７に記載の宿主。
【請求項９】
ウリジン−５’−ジホスホグルコース（UDP-グルコース）−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼをコードする外来性核酸をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の宿主であって、ここで、前記UDP−グルコース−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼは、任意に、CrocusのUDP−グルコース−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼであり、ここで、前記の任意のCrocusのUDP−グルコース−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼは、CsVrUGT2であってもよい、前記宿主。
【請求項１０】
クロセチンモノグルコシドまたはクロセチンジグルコシドの検出可能量を生成する、請求項９に記載の宿主。
【請求項１１】
２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋を触媒するUGTをコードする外来性核酸をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の宿主であって、ここで、前記２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋を触媒するUGTは、任意に、UGT76G1である、前記宿主。
【請求項１２】
HBCを、無糖体Ｏ−グリコシルUGTおよびUDP-グルコースと接触させてピクロクロシンを生成することを含む、ピクロクロシンを製造する方法であって、ここで、前記無糖体Ｏ−グリコシルUGTは、UGT85C2、UGT73-EV12またはUGT71ハイブリッド酵素からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１３】
図３において記載されるUGT73アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、UGT73ポリペプチドをコードする単離された核酸、または前記核酸に作動的に連結した調節領域を含む、核酸コンストラクト。
【請求項１４】
図３において記載されるUGT73アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、または図９において記載されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号５７に記載されるアミノ酸配列をコードする、配列番号５８に記載される合成DNA配列。
【請求項１６】
配列番号６６に記載されるアミノ酸配列をコードする、配列番号６５に記載される合成DNA配列。
【請求項１７】
請求項１３に記載されるような単離された核酸、または請求項１５もしくは１６に記載されるような合成DNA配列を含む、DNA発現カセットであって、ここで、単離された核酸または合成DNA配列は、プロモーターに作動的に連結している、前記DNA発現カセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のDNA発現カセットを含む、組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のDNA発現カセットまたは請求項１８に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
【請求項２０】
細胞が、酵母、E. coli、植物細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項１９に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
酵母が、Saccharomyces cerebisivaeである、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
クロセチンジアルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナーゼと接触させて、クロセチンを生成することを含む、クロセチンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2011年8月8日に出願された米国仮出願第61/ 521171号、2011年12月16日に出願された米国仮出願第61/576460号、および2012年2月6日に出願された米国仮出願第61/595450号の優先権を主張する。
技術分野
本発明は、サフラン植物であるCrocus sativusから化合物を組換え的に生成するための方法および材料に関し、ことさらには、組換え宿主において、サフラン植物からの香味剤、芳香剤および着色剤化合物を組換え的に生成するための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
サフランは、Crocus sativus L.の花の柱頭からの抽出により調製される乾燥香辛料であり、3500年より長きにわたり用いられてきたと考えられている。この香辛料は、歴史的に、多くの医学的目的のために用いられてきたが、近年においては、主にその着色剤特性のために利用されている。サフランの主要成分の一つであるクロセチンは、関連するカロテノイド型分子に類似する抗酸化特性を有するのみならず、着色剤でもある。サフランの主要な色素はクロシンであり、これは、黄色がかった赤色を与える配糖体の混合物である。クロシンの主要な構成要素はα−クロシンであり、これは黄色である。サフラナールは、乾燥プロセスの産物であると考えられており、食品の調製において利用することができるオドラント特性をも有する。サフラナールは、サフラン抽出物であるピクロクロシンの苦い部分の無糖体形態であり、これは無色である。このように、サフラン抽出物は、着色剤または香味剤として、またはそのオドラント特性のために、多くの目的のために使用される。
【０００３】
サフラン植物は、イタリア、フランス、インド、スペイン、ギリシャ、モロッコ、トルコ、スイス、イスラエル、パキスタン、アゼルバイジャン、中国、エジプト、アラブ首長国連合、日本、オーストラリアおよびイランを含む多くの国において商業的に栽培されている。イランは、世界の年間総サフラン生産量（２００トンあまりと概算される）のうちの約８０％を生産する。１ｋｇの製品のために１５０，０００個を超える花が必要とされると報告されている。収穫量を増大するための植物育種の努力は、不稔植物を生じる植物のゲノムのトリプロイディーにより複雑化される。さらに、植物は、１０月中旬または下旬に始まる約１５日間のみ開花する。典型的には、生産は、花の柱頭の手作業による取り除きを含み、これもまた非効率なプロセスである。１ｋｇのサフランにつき＄１０００の販売価格が典型的である。魅力的な代替物は、サフランの成分の生物変換またはde novo生合成である。
【発明の概要】
【０００４】
要旨
本開示は、組換え宿主におけるサフラン植物からの化合物の生成を改善するための方法および材料、ならびに、ピクロクロシン、サフラナール、クロシン、クロセチンまたはクロセチンエステルなどの化合物の生成のための組換え経路を確立する上で有用なヌクレオチドおよびポリペプチドの発見に基づく。本開示はまた、クロセチンおよびクロセチンエステルを含む組成物に関する。生成物は、単独で生成されてもよく、食品システムにおいて最適な特徴について、または薬用サプリメントのために、組換えられてもよい。他の態様において、化合物は、混合物として生成されてもよい。一部の態様において、宿主株は組換え酵母である。他の態様において、本明細書において記載されるヌクレオチドは、植物遺伝学において、および植物育種戦略におけるマーカーとして補助するために用いることができる。
【０００５】
一側面において、この文書は、ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（zeaxanthin cleavage dioxygenase：ZCD）をコードする外来性核酸を含む、組換え体カロテノイド生成宿主（例えば微生物）に注目する。宿主は、検出可能な量のクロセチンおよび／またはクロセチンジアルデヒドおよび/またはヒドロキシル−β−シクロシトラール（HBC）を生成することができる。ZCDは、Crocus sativusのZCDであってもよい。
宿主は、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ（GGPPS）、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼおよびβ−カロテンシンターゼをコードする内在遺伝子を含んでもよい。
宿主はさらに、GGPPS、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼおよびβ−カロテンシンターゼをコードする少なくとも１の外来性核酸を含んでもよい。
【０００６】
この文書はまた、GGPPS、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、β−カロテンシンターゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼおよびゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（ZCD）（例えば、Crocus sativusのZCD）をコードする少なくとも１の外来性核酸を含む、組換え宿主に注目する。少なくとも１の外来性核酸の発現により、宿主において検出可能な量のクロセチンおよび／またはクロセチンジアルデヒドを生成することができる。
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする内在遺伝子、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD）をコードする外来性核酸を含んでもよい。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、Saccharomyces cerevisiaeのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ALD2-ALD6またはHFD1）であってもよい。
【０００７】
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、β−カロテンヒドロキシラーゼをコードする内在遺伝子、またはβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードする外来性核酸を含んでもよい。β−カロテンヒドロキシラーゼは、Xanthophyllomyces dendrorhousのβ−カロテンヒドロキシラーゼであってもよい。
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、無糖体Ｏ−グリコシルウリジン５’−ジホスホ（UDP）グリコシルトランスフェラーゼ（Ｏ−グリコシルUGT）をコードする外来性核酸を含んでもよい。かかる宿主は、検出可能な量のピクロクロシンまたはクロシンを生成することができる。無糖体Ｏ−グリコシルUGTは、UGT85C2、UGT73-EV12またはUGT71ハイブリッド酵素であってもよい。無糖体Ｏ−グリコシルUGTはまた、Crocus sativusからのCs VrUGT2であってもよい。
【０００８】
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、Ｏ−グリコシルUGTをコードする外来性核酸を含んでもよい。かかる宿主は、検出可能な量のクロセチンモノおよびジグルコシルエステルを生成することができる。無糖体Ｏ−グリコシルUGTは、UGT76G1、またはUGT71ハイブリッド酵素（例えば、71C125571C2および／または71C125571E1）であってもよい。
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋（例えば、β１，６架橋）を触媒するUGTをコードする外来性核酸を含んでもよい。かかる宿主は、検出可能量のクロセチンゲンチオビオシルエステルを生成することができる。２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋を触媒するUGTは、71C125571C2または71C125571E1などのUGT71ハイブリッド酵素であってもよい。
【０００９】
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、ウリジン−５’−ジホスホグルコース（UDP−グルコース）−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼをコードする外来性核酸を含んでもよい。かかる宿主は、検出可能量のクロセチンモノグルコシドを生成することができる。UDP−グルコース−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼは、CrocusのUDP−グルコース−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼであってもよい。
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋（例えば、β１，６架橋）を触媒するUGTをコードする外来性核酸を含んでもよい。かかる宿主は、検出可能量のクロシンを生成することができる。２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋を触媒するUGTは、UGT76G1、UN4522またはUN1671であってよい。
【００１０】
本明細書において記載される宿主のいずれかは、微生物、植物、または植物細胞であってよい。微生物は、含油性酵母（oleaginous yeast）、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母（Saccharomycete）、またはEscherichia coliであってもよい。植物または植物細胞は、Crocus sativusであってもよい。
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、デオキシキシルロース５−ホスフェートシンターゼ（DXS）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（DXR）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（CMS）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（CMK）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ（MCS）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェートシンターゼ（HDS）、および１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェートレダクターゼ（HDR）の１または２以上をコードする外来性核酸を含んでもよい。
本明細書において記載される宿主のいずれかは、さらに、切断型３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡレダクターゼ（tHMG）、メバロン酸キナーゼ（MK）、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（MPPD）の１または２以上をコードする外来性核酸を含んでもよい。
【００１１】
別の側面において、本文書は、ピクロクロシンを製造する方法に注目する。方法は、HBCを、無糖体Ｏ−グリコシルUGTおよびUDP−グルコースと接触させてピクロクロシンを生成することを含み、ここで、無糖体Ｏ−グリコシルUGTは、UGT85C2、UGT73-EV12またはUGT71ハイブリッド酵素からなる群より選択される。UGTはまた、Cs VrUGT2であってもよい。
さらに別の側面において、本文書は、UGT73ポリペプチドをコードする単離された核酸に注目する。UGT73ポリペプチドは、図３において記載されるUGT73アミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有していてもよい。本文書はまた、かかる核酸に作動的に連結した調節領域を含む核酸コンストラクト、ならびにかかる核酸または核酸コンストラクトを含む組換え宿主に注目する。
【００１２】
別の側面において、本文書は、図３において記載されるUGT73アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに注目する。ポリペプチドは、図３において記載されるUGT73アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有していてもよい。ポリペプチドは、図３において記載されるUGT73アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有していてもよい。ポリペプチドは、図３において記載されるUGT73アミノ酸配列を有していてもよい。
別の側面において、本文書は、図９において記載されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードする核酸に注目する。
【００１３】
本文書はまた、クロセチンを製造する方法に注目する。方法は、クロセチンジアルデヒドをアルデヒドデヒドロゲナーゼと接触させて、クロセチンを生成することを含む。
本発明の別の側面は、配列番号５７に記載されるアミノ酸配列をコードする、配列番号５８に記載の合成DNA配列を提供することである。
さらに別の側面において、本発明は、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列をコードする、配列番号６５に記載される合成DNA配列に注目する。
【００１４】
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および化学用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または等価の方法および材料を、本発明を実施するために用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書において記載される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、その全体において参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が規制する。さらに、材料、方法および例は、単に説明的なものであって、限定することを意図されない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかであろう。出願人は、特許法における標準的な実務に従って、移行句「〜を含む」、「〜から本質的になる」または「〜からなる」を用いることにより、開示されるいかなる発明を代替的に主張する権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図面の説明。図１は、IPPからβ−カロテンへの生合成経路の模式図である。
【図２】図２は、サフラン中での生合成経路の模式図である。
【図３】図３は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む：Stevia rebaudianaのUGT88B1（配列番号１および２）、UGT76G1（配列番号３および４）、UGT74G1（配列番号５および６）、UGT91D2e（配列番号７および８）、UGT85C2（配列番号９および１０）、ならびにUGT73（配列番号１１および１２）、Catharanthus roseusのUGT2（配列番号１３および１４）、Arabidopsis thalianaのUGT75B1（配列番号１５および１６）、ならびに２つのA. thalianaハイブリッドUGT（UGT71ハイブリッド酵素１：71C125571C2、配列番号１７および１８）ならびにUGT71ハイブリッド酵素２：71C125571E1、配列番号１９および２０）。
【００１６】
【図４】図４は、UN1671、UN3356、UN4522、UN4666、UN6460およびUN2281のUGTのアミノ酸配列が、既知のUGT91配列とクラスター形成することを表わす模式図である。
【図５】図５は、例４において同定されるUGTの配列を含む（UN6338、配列番号２１；UN4666、配列番号２２（DNA）および２３（アミノ酸）；UN3356、配列番号２４（DNA）および２５（アミノ酸）；UN6428、配列番号２６；UN3131、配列番号２７；UN1671、配列番号２８（DNA）および２９（アミノ酸）；UN4522、配列番号３０（DNA）および３１（アミノ酸）；UN6460、配列番号３２（DNA）および３３（アミノ酸）；UN2281、配列番号３４（DNA）および３５（アミノ酸）；ならびにUN2644、配列番号３６）。
【図６】図６は、Saccharomyces cerevisiaeにおけるEUGT1-EUGT19の発現のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列の配列（ソース：DNA 2.0>）、配列番号３７〜５５を含む。
【００１７】
【図７】図７は、Crocus sativusグルコシルトランスフェラーゼ２（UGT2）のヌクレオチド（配列番号５６）およびアミノ酸配列（配列番号５７）（GenBankアクセッション番号AY262037.1）、ならびにコドン最適化された核酸配列（配列番号５８）を含む。
【図８】図８は、例６において用いられるコドン最適化された遺伝子配列（配列番号５９〜６４）を含む。小文字の配列は、コード領域に対して外来性のものであり、クローニングの目的のために用いられる。
【図９】図９は、例８において用いられるバリアントのCrocusのUGT（Cs VrUGT2）のコドン最適化されたヌクレオチド配列（ソース：GenScript）（配列番号６５）およびアミノ酸配列（配列番号６６）を含む。
【００１８】
【図１０】図１０は、Crocus sativusからのCsUGT2（GenBankアクセッション番号AY262037.1）およびバリアントCs VrUGT2のアラインメント、ならびに各々のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５７および６６）を含む。
【図１１】図１１は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD）2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6およびHFD1（これもまたアルデヒドデヒドロゲナーゼであると予想されている）をコードするヌクレオチド配列を含む（配列番号６７〜７２）。多様な図面における類似の参照シンボルは、類似の要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
多様なクロセチンエステルは、サフラン抽出物の着色特性の原因である。クロセチンは、両端に２個のカルボン酸基を有するＣ１８骨格から形成されるジテルペンである。クロセチンは、β−カロテンおよびゼアキサンチンを含むカロテノイド経路から誘導される（図２を参照）。サフランの主要な色素は、２個のゲンチオビオース部分を有するクロセチンジエステル（ジゲンチオビオシド）であるクロシンである。クロシンは、クロセチンのエステルの優性形態である。クロセチン（α−クロセチンまたはクロセチン−ｌとも称される）の他の配糖体形態として、ゲンチオビオシド、グルコシド、ゲンチオグルコシドおよびジグルコシドが挙げられる。モノ−またはジ−メチルエステル形態におけるγ−クロセチンもまた、１３−シス−クロセチンおよびトランスクロセチン異性体と共に、サフランにおいて存在する。
【００２０】
ピクロクロシンは、無色であり、サフランの苦味の原因である。それは、ゼアキサンチンからHBCを介して生成されるモノテルペンアルデヒドである。ピクロクロシンの脱グルコシル化は、サフラン香辛料の主要な芳香成分である、サフラナール（４−ヒドロキシ−２，４，４−トリメチル１−シクロヘキセン−１−カルボキサルデヒド、またはデヒドロ−β−シクロシトラール）を生じる。
サフラン抽出物はまた、ロウおよび脂肪、タンパク質、精油、アントシアニン、フラボノイド、ビタミン（リボフラビンおよびチアミン）、アミノ酸、デンプン、ミネラル、ガムを含む。モノテルペンアルデヒドおよびイソホロン関連化合物は、サフラナールと共に、サフランの揮発性成分である。
【００２１】
本文書は、サフランからのクロセチン、クロセチンジアルデヒド、ピクロクロシン、クロシンまたはサフラナールなどの化合物の生合成のために有用なポリペプチドを発現する植物細胞、植物または微生物などの組換え宿主を開発することができるという発見に基づく。かかる宿主は、ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（ZCD）（ゼアキサンチン開裂オキシゲナーゼ（ZCO）（例えば、Crocus sativusからのもの）とも称される）、および一部の態様においては、１または２以上のウリジン５’−ジホスホ（UDP）グリコシルトランスフェラーゼを、発現することができる。多様な微生物クラスにおけるこれらの生合成ポリペプチドの発現により、サフランからのクロセチン、クロセチンジアルデヒド、ピクロクロシン、クロシンまたはサフラナールなどの化合物を、一貫した、再生可能な様式において、糖、グリセロール、ＣＯ２、Ｈ２および太陽光などのエネルギーおよび炭素源から生成することが可能となる。組換え宿主により生成される各々の化合物の割合は、予め選択された生合成酵素を宿主中に組み込むこと、およびそれらの適切なレベルにおいて発現させることにより、調整することができる。
【００２２】
遺伝子のうちの少なくとも１つは、組換え遺伝子であり、特定の組換え遺伝子は、使用のために選択される種および株に依存する。さらなる遺伝子または生合成モジュールを、化合物の収量を増大させるため、エネルギーおよび炭素源がサフラン化合物に変換される効率を改善するため、および／または細胞培養もしくは植物からの生産性を増大させるために、含めることができる。かかるさらなる生合成モジュールとして、テルペノイド前駆体、イソペンテニルジホスフェートおよびジメチルアリルジホスフェートの合成に関与する遺伝子が挙げられる。さらなる生合成モジュールとして、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子などのテルペンシンターゼおよびテルペンシクラーゼの遺伝子、ならびにカロテノイド合成に関与する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、内在遺伝子であっても組換え遺伝子（例えば外来性核酸）であってもよい。
【００２３】
グルコースからIPPへ
一部の態様において、本明細書において記載される組換え宿主は、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の生成に関与する組換え遺伝子、例えば、メチルエリスリトール４−リン酸（MEP）またはメバロン酸（MEV）経路に関与する遺伝子を発現する。例えば、組換え宿主は、イソプレノイド生合成のためのMEP経路に関与する酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含んでもよい。MEP経路における酵素として、デオキシキシルロース５−ホスフェートシンターゼ（DXS）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（DXR）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（CMS）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（CMK）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ（MCS）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェートシンターゼ（HDS）および１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェートレダクターゼ（HDR）が挙げられる。１または２以上のDXS遺伝子、DXR遺伝子、CMS遺伝子、CMK遺伝子、MCS遺伝子、HDS遺伝子および／またはHDR遺伝子を、組換え微生物中に組み込んでもよい。Rodriguez-Concepcion and Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002)を参照。
DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDSおよび／またはHDRポリペプチドをコードする好適な遺伝子として、E. coli、Arabidopsis thalianaおよびSynechococcus leopoliensisにより作られるものが挙げられる。DXRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば米国特許第7,335,815号において記載される。
【００２４】
一部の態様において、組換え宿主は、イソプレノイド生合成のためのメバロン酸経路に関与する酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含む。宿主中への形質転換のために好適な遺伝子は、切断型３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル（HMG）−ＣｏＡレダクターゼ（tHMG）などの、メバロン酸経路における酵素をコードするか、および／または、メバロン酸キナーゼ（MK）をコードする遺伝子、および／またはホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）をコードする遺伝子、および／またはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（MPPD）をコードする遺伝子である。したがって、１または２以上のHMG-CoAレダクターゼ遺伝子、MK遺伝子、PMK遺伝子および／またはMPPD遺伝子を、微生物などの組換え宿主中に組み込んでもよい。
【００２５】
メバロン酸経路のポリペプチドをコードする好適な遺伝子は、公知である。例えば、好適なポリペプチドとして、E. coli、Paracoccus denitrificans、Saccharomyces cerevisiae、Arabidopsis thaliana、Kitasatospora griseola、Homo sapiens、Drosophila melanogaster、Gallus gallus、Streptomyces sp. KO-3988、Nicotiana attenuata、Kitasatospora griseola、Hevea brasiliensis、Enterococcus faecium、およびHaematococcus pluvialisにより作られるものが挙げられる。例えば、米国特許第7,183,089号、同第5,460,949号、および同第5,306,862号を参照。
【００２６】
IPPからβ−カロテンへ
一部の態様において、本明細書において記載される組換え宿主は、IPPからβ−カロテンへの生合成経路に関与する遺伝子を発現する（図１）。遺伝子は、宿主に対して内在性（すなわち、宿主が天然でカロテノイドを生成する）であっても、外来性のもの、例えば組換え遺伝子（すなわち、宿主は天然ではカロテノイドを生成しない）であってもよい。IPPからβ−カロテンへの生合成経路の第１のステップは、EC 2.5.1.29として分類される、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ（GGPPS、またはGGDPS、GGDPシンターゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼもしくはCrtEとしても知られる）により触媒される。EC 2.5.1.29により触媒される反応において、トランス，トランス−ファルネシルジホスフェートおよびイソペンテニルジホスフェートは、ジホスフェートおよびゲラニルゲラニルジホスフェートに変換される。したがって、一部の態様において、組換え宿主は、GGPPSをコードする核酸を含む。好適なGGPPSポリペプチドは公知である。例えば、非限定的な好適なGGPPS酵素として、Stevia rebaudiana、Gibberella fujikuroi、Mus musculus、Thalassiosira pseudonana、Xanthophyllomyces dendrorhous、Streptomyces clavuligerus、Sulfulobus acidicaldarius、Synechococcus sp.およびArabidopsis thalianaにより生成されるものが挙げられる。GenBankアクセッション番号ABD92926；CAA75568；AAH69913；XP_002288339；ZP_05004570；BAA43200；ABC98596；およびNP_195399を参照。
【００２７】
図１の経路における次のステップは、EC 2.5.1.32として分類される、フィトエンシンターゼまたはCrtBにより触媒される。EC 2.5.1.32により触媒されるこの反応において、２個のゲラニルゲラニルジホスフェート分子が反応して、２個のピロリン酸分子およびフィトエンを形成する。このステップはまた、フィトエン−β−カロテンシンターゼまたはCrtYBとして知られる酵素により触媒されてもよい。したがって、一部の態様において、組換え宿主は、フィトエンシンターゼをコードする核酸を含む。好適なフィトエンシンターゼの非限定的な例として、X. dendrorhousのフィトエン−β−カロテンシンターゼが挙げられる。
【００２８】
β−カロテンの生合成における次のステップは、フィトエンデサチュラーゼまたはCrtIとしても知られるフィトエンデヒドロゲナーゼにより触媒される。この酵素は、フィトエンをリコピンに変換する。したがって、一部の態様において、組換え宿主は、フィトエンデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む。好適なフィトエンデヒドロゲナーゼの非限定的な例として、Neurospora crassaのフィトエンデサチュラーゼ（GenBankアクセッション番号XP_964713）が挙げられる。これらの酵素はまた、植物およびラン藻類において豊富に見出される。
【００２９】
β−カロテンは、CrtYまたはCrtL-bとも称される酵素β−カロテンシンターゼにより、リコピンから形成される。このステップはまた、多機能性CrtYBにより触媒されてもよい。したがって、一部の態様において、組換え宿主は、β−カロテンシンターゼをコードする核酸を含む。
【００３０】
β−カロテンから、ゼアキサンチンおよびサフラン化合物へ
図２は、β−カロテンから多様なサフラン化合物への経路を説明する。
初めのステップにおいて、β−カロテンは、ゼアキサンチンへと変換される。この変換は、β−カロテンヒドロキシラーゼ（BCH）により触媒され、これは、β−カロテンをβ−クリプトキサンチンへと変換し、これは次いで、さらに反応してゼアキサンチンを形成する。この酵素はまた、CrtZとしても知られる。好適なβ−カロテンヒドロキシラーゼは、Xanthophyllomyces dendrorhous、Arabidopsis thaliana、Adonis aestivalis、ならびに多数の他のカロテノイド生成微生物から利用可能である。
【００３１】
ゼアキサンチンは、酵素ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（ZCD）（ゼアキサンチン開裂オキシゲナーゼ（ZCO）としても知られる）を介して、ヒドロキシル−β−シクロシトラール（HBC）およびクロセチンジアルデヒドへと変換される。好適なZCDは、Crocus sativa植物から利用可能である。図８は、好適なZCDをコードするコドン最適化された遺伝子配列を含む。
【００３２】
HBCは、グルコース供与体としてUDP−グルコースを利用する無糖体Ｏ−グリコシルUGT酵素により、ピクロクロシンに変換される。好適なUGTとして、Stevia rebaudianaからのUGT85C2、Stevia 73−ホモログ、および２つのUGTファミリー71ハイブリッドUGTが挙げられる。これらのUGTのヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、図３を参照（配列番号１〜２０）。バリアントCs UGT2もまた、使用することができる（図９および１０を参照）。これらの酵素は、図２においてUGTbとして言及される。逆の反応は、未知のグルコシダーゼにより触媒される。ピクロクロシンの生成についての収量および力価を改善するために、選択された宿主中で、β−グルコシダーゼの機能性をノックアウトすることが望ましい場合がある。
【００３３】
サフラナールは、サフランのプロセッシングの間に自然発生的に形成し、それが物理的変換に起因するのか、酵素による触媒を必要とするのかは知られていない。HBCが、脱水を介して直接的にサフラナールに変換され得るのか、ピクロクロシンが中間体であるのかは知られていない。
クロセチンジアルデヒドは、サフラン植物において、アルデヒドオキシドレダクターゼとしても知られるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ADH）により、クロセチンへと変換される可能性がある。例９において記載されるとおり、S. cerevisiaeは、異種遺伝子を導入することなくジアルデヒドをカルボン酸形態へと変換するために用いることができる、複数の内在性アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。例９を参照。
【００３４】
クロシン形成における第２のステップは、クロセチン分子のカルボン酸末端へのグルコース部分の添加である。Crocus sativusのUGT2（CsUGT2）は、クロセチンを、クロセチンのモノグルコシド（クロセチンモノグルコシルエステルまたはクロセチンジグルコシルエステル）へ変換することが示されている。この酵素は、EC 2.4.1として分類される、ウリジン−５’−ジホスホグルコース（UDP−グルコース）−クロセチン８，８’−グルコシルトランスフェラーゼである。したがって、組換え宿主は、UGT2をコードする核酸を含んでもよい。Crocus sativusのUGT2、およびコドン最適化された核酸配列については、図７を参照。CsUGT2についてのGenBankアクセッション番号は、AY262037.1である。
【００３５】
組換え宿主はまた、クロセチンからのグルコースエステル（クロセチンモノグルコシルエステルまたはクロセチンジグルコシルエステル）の形成を触媒するCrocus sativusのUGT（Cs VrUGT2）を含んでもよい。例８を参照。Cs VrUGT2についてのアミノ酸配列は、図９において提供される。また、Cs VrUGT2とCs UGT2とのアラインメントについて、図１０を参照。
【００３６】
組換え宿主はまた、クロセチンジアルデヒドからクロシンを形成することができるような、２個のグルコース部分の間のβグルコシル架橋（例えば、β−１，６グルコシル架橋）を触媒するUGTを含んでもよい。このUGTは、図２においてUGTaとして言及される。したがって、組換え宿主は、UGT2をコードする核酸を含んでもよい。Stevia rebaudianaのUGTであるUGT76G1は、４個のグルコース部分を有するクロセチンエステルを形成することができることが示されている。例４を参照。異性体の特徴づけは、生成物がクロシンであるかクロシンのアナログであるかを決定するであろう。
【００３７】
３つのUGT、Stevia rebaudianaからのUGT76G1、ならびにCrocusからの２つのUN1761およびUN4522は、４個のグルコース部分を有するクロセチンエステルを形成することができることが示されている。例４を参照。SteviaのUGT76G1について、異性体の特徴づけは、生成物がクロシンであるかクロシンのアナログであるかを決定するであろう。UN1761およびUN4522の各々のアミノ酸配列は、図５において記載される。
【００３８】
組換え宿主はまた、一方の末端または両方のカルボキシル末端において、無糖体クロセチンを触媒するUGTを含んでもよい。３つのUGT、UGT76G1またはUGT71ハイブリッド酵素（71C125571C2および71C125571E1）は、モノおよびジグルコシルエステル形態のクロセチンの形成を示した。例７を参照。
組換え宿主はまた、クロセチンからの直接的なゲンチオビオシルエステルの形成を触媒するUGTを含んでもよい。２つのUGT、UGT71ハイブリッド酵素（71C125571C2および71C125571E1）は、クロセチンからのゲンチオビオシルエステルの形成を示した。例７を参照。
【００３９】
機能的ホモログ
上記のポリペプチドの機能的ホモログはまた、組換え宿主におけるサフラン化合物の生成における使用のために好適である。機能的ホモログとは、参照ポリペプチドに対する配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能の１または２以上を行うポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであって、配列類似性は、収束性または分岐性の進化イベントに起因し得る。したがって、機能的ホモログは、ときに、ホモログ、またはオルトログ、またはパラログとして文献において指定される。天然に存在する機能的ホモログのバリアント（野生型コード配列の変異体によりコードされるポリペプチドなど）は、それ自体が機能的ホモログである場合がある。機能的ホモログはまた、ポリペプチドについてのコード配列の部位特異的変異誘発を介して、または、異なる天然に存在するポリペプチドについてのコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）により、作製することができる。本明細書において記載される機能的なUGTポリペプチドをコードする遺伝子を修飾するための技術は公知であり、とりわけ、定向進化技術、部位特異的変異誘発技術、およびランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特定の活性を増大させるため、基質特異性を改変するため、発現レベルを改変するため、細胞内局在を改変するため、またはポリペプチド：ポリペプチド相互作用を所望の様式において修飾するために有用であり得る。かかる修飾ポリペプチドは、機能的ホモログとみなされる。用語「機能的ホモログ」は、ときに、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に対して適用される。
【００４０】
機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析により同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対してクエリーを行うことにより、本明細書において記載されるポリペプチドのホモログを同定することができる。配列の分析は、目的のアミノ酸配列を参照配列として用いる、非重複のデータベースのBLAST、Reciprocal BLAST、またはPSI-BLAST分析を含んでもよい。アミノ酸配列は、幾つかの場合において、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有するデータベース中のポリペプチドは、サフランからの化合物の合成において有用なポリペプチドとしての好適性についてのさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば、１つの疎水性残基の別のものへの置換、または１つの極性残基の別のものへの置換を可能にする。所望される場合、さらに評価するための候補の数を狭めるために、かかる候補の手作業による点検を行ってもよい。手作業による点検は、機能的ドメインを保存していると考えられる候補を選択することにより行ってもよい。
【００４１】
保存領域は、本明細書において記載されるポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域の位置であって、繰り返し配列であるか、幾つかの二次構造（例えばヘリックスおよびベータシート）を形成するか、正または負に荷電したドメインを確立するか、あるいは、タンパク質のモチーフまたはドメインを表わすものを決定することにより、同定することができる。例えば、World Wide Web上のsanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/における、多様なタンパク質のモチーフおよびドメインについてのコンセンサス配列を記載するPfamウェブサイトを参照。Pfamデータベースにおいて含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)において記載される。保存領域はまた、緊密に関連する種からの同じまたは関連するポリペプチドの配列をアラインメントすることによっても、決定することができる。緊密に関連する種は、好ましくは同じ科からのものである。一部の態様において、２つの異なる種からの配列のアラインメントが妥当である。
【００４２】
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存領域を同定するために有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。一部の態様において、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【００４３】
いかなる候補の核酸またはポリペプチドについての、参照核酸またはポリペプチドに対する％同一性は、以下のとおり決定することができる。核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをそれらの全長にわたって行うこと（グローバルアラインメント）を可能にするコンピュータープログラムClustalW（バージョン1.83、デフォルトパラメーター）を用いて、参照配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を、１または２以上の候補配列とアラインメントする。Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003)。
【００４４】
ClustalWは、参照配列と１または２以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントし、それにより、同一性、類似性および差異を決定することができる。配列アラインメントを最大にするために、参照配列、候補配列、または両方に、１または２以上の残基のギャップを挿入することができる。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメーターを用いる：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング法：パーセンテージ；トップ（ｔｏｐ）の対角線の数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の多重アラインメントのために、以下のパラメーターを用いる：ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；および、ウェイトトランジション：あり。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のパラメーターを用いる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング法：パーセンテージ；トップの対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の多重アラインメントのために、以下のパラメーターを用いる：ウェイトマトリックス：blosum；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：あり；親水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、およびLys；残基特異的ギャップペナルティ：あり。ClustalWの出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ClustalWは、例えば、World Wide Web上のBaylor College of Medicine Search Launcherのサイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）、およびWorld Wide Web上のEuropean Bioinformatics Instituteのサイト（ebi.ac.uk/clustalw）において、実行することができる。
【００４５】
候補の核酸またはアミノ酸配列の参照配列に対する％同一性を決定するために、ClustalWを用いて配列をアラインメントし、アラインメント中の同一なマッチの数を参照配列の長さで除算し、結果に１００を乗じる。％同一性値は、最も近い１０分の１値まで概数化できることに注意する。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３および７８．１４は、７８．１まで概数化され、一方、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は、７８．２に概数化される。
【００４６】
本明細書において記載されるポリペプチドは、グルコシル化または酵素により行われる他の酵素活性に関与しないさらなるアミノ酸を含んでもよく、したがって、かかるポリペプチドは、他の場合よりも長くてもよいことが理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、アミノまたはカルボキシ末端に添加された精製タグ（例えば、HISタグまたはGSTタグ）、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、分泌タグを含んでもよい。一部の態様において、ポリペプチドは、レポーターとして機能するアミノ酸配列、例えば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質を含む。
【００４７】
核酸
本明細書において記載されるポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、センス方向においてポリペプチドを発現させるために好適な１または２以上の調節領域に作動的に連結した、ポリペプチドについてのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロニックなmRNAから複数の遺伝子産物を発現することができるので、所望の場合、これらの微生物について、複数のポリペプチドを単一の調節領域の制御下において発現させることができる。コード配列および調節領域は、調節領域およびコード配列が、調節領域が配列の転写または翻訳を制御するために有効であるように位置する場合に、作動的に連結するとみなされる。典型的には、モノシストロニックな遺伝子について、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、調節領域の約１〜５０ヌクレオチド下流に位置する。
【００４８】
多くの場合において、本明細書において記載されるポリペプチドについてのコード配列は、組換え宿主以外の種において同定される、すなわち、異種核酸である。したがって、組換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核または真核微生物から、植物から、または動物からのものであってよい。一部の場合においては、しかし、コード配列は、宿主にとってネイティブな配列であり、その生物に再導入されている。ネイティブな配列は、しばしば、外来性核酸に連結した非天然の配列、例えば、組換え核酸コンストラクト中でネイティブな配列を挟む非ネイティブな調節配列の存在により、天然に存在する配列と区別することができる。さらに、安定に形質転換された外来性核酸は、典型的には、ネイティブな配列が見出される位置とは異なる位置において組み込まれる。
【００４９】
「調節領域」とは、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写または翻訳の産物の安定性および／または移動性に影響を及ぼすヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節配列として、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（UTR）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。調節領域は、典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。調節領域はまた、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（UAR）などの、少なくとも１つの制御エレメントを含んでもよい。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するために有効であるように、調節領域およびコード配列を配置することにより、コード配列に作動的に連結される。例えば、コード配列をプロモーター配列に作動的に連結するために、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置される。調節領域は、しかし、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流に位置しても、転写開始部位の約２，０００ヌクレオチドもの上流に位置してもよい。
【００５０】
含められるべき調節領域の選択は、限定されないが、効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベル、および特定の培養段階の間の優先的発現を含む幾つかの要因に依存する。当業者にとって、コード配列に対して調節領域を適切に選択して配置することによりコード配列の発現を調節することは、慣用的な事柄である。１つより多くの調節領域（例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写終結因子、および誘導性エレメント）が存在してもよいことが理解されるであろう。
【００５１】
１または２以上の遺伝子を、組換え核酸コンストラクトにおいて、サフランからの化合物の生成の別々の側面のために有用な「モジュール」において、組み合わせてもよい。複数の遺伝子をモジュール、特にポリシストロニックなモジュールにおいて組み合わせることは、多様な種における当該モジュールの使用を容易にする。例えば、ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ、またはUGT遺伝子クラスターを、好適な調節領域の挿入の後で、モジュールを広範な種へ導入することができるように、ポリシストロニックなモジュールにおいて組み合わせてもよい。別の例として、各々のUGTコード配列が別々の調節領域に作動的に連結してUGTモジュールを形成するように、UGT遺伝子クラスターを組み合わせてもよい。かかるモジュールは、モノシストロニックな発現が必要または望ましい種において用いることができる。サフランからの化合物の生成のために有用な遺伝子に加えて、組換えコンストラクトは、典型的にはまた、複製起点、および、適切な種における当該コンストラクトの維持のための１または２以上の選択可能マーカーを含む。
【００５２】
本発明の一態様は、配列番号５７において記載されるようなアミノ酸配列をコードする、配列番号５８に記載されるような合成DNA配列を提供する。
本発明の別の態様は、配列番号６６において記載されるようなアミノ酸配列をコードする、配列番号６５に記載されるような合成DNA配列を提供する。
本発明の別の態様は、図３において記載されるUGT73のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するUGT73ポリペプチドをコードする単離された核酸、または、前記核酸に作動的に連結した調節領域を含む核酸コンストラクトを含む、DNA発現カセットを提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、配列番号５７において記載されるようなアミノ酸配列をコードする、配列番号５８に記載されるような合成DNA配列を含むDNA発現カセットを提供し、ここで、単離された核酸または合成DNA配列は、プロモーターに作動的に連結している。
本発明の別の態様は、配列番号６６において記載されるようなアミノ酸配列をコードする、配列番号６５に記載されるような合成DNA配列を含むDNA発現カセットを提供し、ここで、単離された核酸または合成DNA配列は、プロモーターに作動的に連結している。
本発明の別の態様は、図３において記載されるUGT73のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するUGT73ポリペプチドをコードする単離された核酸、または、前記核酸に作動的に連結した調節領域を含む核酸コンストラクトを含むDNA発現カセットを含む、組換えベクターを提供する。
【００５４】
本発明の別の態様は、配列番号５７において記載されるようなアミノ酸配列をコードする、配列番号５８に記載されるような合成DNA配列を含むDNA発現カセットを含む、組換えベクターを提供し、ここで、単離された核酸または合成DNA配列は、プロモーターに作動的に連結している。
本発明の別の態様は、配列番号６６において記載されるようなアミノ酸配列をコードする、配列番号６５に記載されるような合成DNA配列を含むDNA発現カセットを含む、組換えベクターを提供し、ここで、単離された核酸または合成DNA配列は、プロモーターに作動的に連結している。
【００５５】
本発明のさらに別の態様は、本発明において開示されるようなDNA発現カセットまたは組換えベクターを含む、組換え細胞を提供する。
本発明のさらに別の態様は、酵母、E. coli、植物細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞からなる群より選択される組換え細胞に関する。
本発明のさらに別の態様は、組換え細胞に関し、ここで、該組換え細胞は、Saccharomyces cerevisivaeである。
【００５６】
遺伝子コードの縮重のために、多数の核酸が、特定のポリペプチドをコードすることができることが理解されるべきである。すなわち、多くのアミノ酸について、当該アミノ酸についてのコドンとして役立つ１つより多くのヌクレオチドトリプレットが存在する。したがって、所与のポリペプチドについてのコード配列におけるコドンは、その宿主（例えば微生物）について適当なコドンバイアス表を用いて、特定の宿主における最適な発現が得られるように修飾することができる。単離された核酸として、これらの修飾された配列は、精製された分子として存在することができ、組換え核酸コンストラクトのためのモジュールを構築することにおける使用のために、ベクターまたはウイルス中に組み込むことができる。
【００５７】
組換え宿主
多数の原核生物および真核生物が、本明細書において記載される組換え微生物を構築することにおける使用のために好適である（例えばグラム陰性細菌、酵母および真菌）。サフラン化合物の生成のための株としての使用のために選択される種および株は、第１に、どの生成遺伝子が当該株に対して内在性であり、どの遺伝子が存在しないか（例えばカロテノイド遺伝子）を決定するために分析される。当該株において内在性のカウンターパートが存在しない遺伝子は、１または２以上の組換えコンストラクトにおいて組み立てられ、これらは、次いで、欠損した機能を供給するために当該株中に形質転換される。
【００５８】
例示的な原核生物および真核生物種を、以下により詳細に記載する。しかし、他の種が好適である場合があることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、以下からなる群より選択される属におけるものであってもよい：Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium/Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowia。かかる属からの例示的な種として、以下が挙げられる：Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Physcomitrella patens、Rhodoturula glutinis 32、Rhodoturula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi、Candida utilisおよびYarrowia lipolytica。一部の態様において、微生物は、Gibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus nigerまたはSaccharomyces cerevisiaeなどの子嚢菌（Ascomycete）であってもよい。一部の態様において、微生物は、Escherichia coli、Rhodobacter sphaeroidesまたはRhodobacter capsulatusなどの原核生物であってもよい。特定の微生物は、ハイスループットな様式において目的の遺伝子をスクリーニングおよび試験するために用いることができ、一方、所望の生産性および増殖の特徴を有する他の微生物は、サフランからの化合物のラージスケール生成のために用いることができることが、理解されるであろう。
【００５９】
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiaeは、合成生物学において広く用いられている筐体（chassis）生物であり、組換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。変異体のライブラリー、プラスミド、代謝についての詳細なコンピューターモデル、およびS. cerevisiaeについて利用可能な他の情報が存在し、このことにより、生成物の収量を増強するための多様なモジュールの合理的な設計が可能になる。組換え微生物を作製するための方法は公知である。
本明細書において記載される遺伝子は、多数の既知のプロモーターのいずれかを用いて、酵母において発現させてもよい。テルペンを過剰産生する株は公知であり、サフラン化合物の生成のために利用可能なゲラニルゲラニルジホスフェートの量を増大させるために用いることができる。
【００６０】
S. cerevisiaeの好適な株をまた、貯蔵脂質の蓄積の増大および／またはアセチル−ＣｏＡなどの利用可能な前駆体分子の量の増大を可能にするように修飾してもよい。例えば、転写因子SNF2の破壊、植物由来ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（DGA1）の過剰発現、および酵母LEU2の過剰発現による、S. cerevisiaeにおける３０％までのトリアシルグリセロール（TAG）の蓄積が、Kamisakaら（Biochem. J. (2007) 408, 61-68）により示された。さらに、Froissardら（FEMS Yeast Res 9 (2009) 428-438）は、酵母におけるAtClo1（植物油体形成タンパク質）の発現は、油体形成を促進し、貯蔵脂質の過剰蓄積をもたらすであろうことを示した。このように蓄積されたTAGまたは脂肪酸は、例えば、TAGからアセチル−ＣｏＡを形成することができることが知られている酵素（POX遺伝子）（例えば、Yarrowia lipotica POX遺伝子）をさらに発現させることにより、アセチル−ＣｏＡ生合成に向けて転用することができる。
【００６１】
Aspergillus spp.
Aspergillus species（A. oryzae、A. nigerおよびA. sojaeなど）は、食品の生産において広く用いられている微生物であり、また、組換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。A. nidulans、A. fumigatus、A. oryzae、A. clavatus、A. flavus、A. nigerおよびA. terreusのゲノムについてヌクレオチド配列が利用可能であり、これにより、フラックスを増強し、生成物の収量を増大させるための内在経路の合理的な設計および修飾が可能になる。コウジカビ（Aspergillus）については、代謝モデルが開発され、ならびにトランスクリプトミクス研究およびプロテオミクス研究が行われてきた。A. nigerは、クエン酸およびグルコン酸などの多数の食品原料の工業的生産のために培養されており、したがって、A. nigerなどの種は、一般に、サフランからの化合物の生成のために好適である。
【００６２】
Escherichia coli
合成生物学において別の広く用いられているプラットフォーム生物であるEscherichia coliもまた、組換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。Saccharomycesと同様に、変異体のライブラリー、プラスミド、代謝についての詳細なコンピューターモデル、およびE. coliについて利用可能な他の情報が存在し、このことにより、生成物の収量を増強するための多様なモジュールの合理的な設計が可能になる。Saccharomycesについて上で記載されるものと同様の方法を用いて、組換えE. coli微生物を作製することができる。
【００６３】
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete spp.
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete spp.は、培養において大量のジベレリンを生成することが知られているので、有用であり得る。したがって、サフランからの大量の化合物を生成するためのテルペン前駆体は、内在遺伝子により既に生成されている。したがって、メバロン酸またはMEP経路の遺伝子を導入することを必要とすることなく、サフランからの化合物の生合成のための組換え遺伝子を含むモジュールを、かかる属からの種に導入することができる。
【００６４】
Rhodobacter spp.
紅色細菌（Rhodobacter）は、組換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。E. coliと同様に、利用可能な変異体のライブラリー、ならびに好適なプラスミドベクターが存在し、これにより、生成物の収量を増強するための多様なモジュールの合理的な設計が可能になる。カロテノイドおよびCoQ10の生成の増大のために、紅色細菌のうちの膜性細菌種においてイソプレノイド経路が操作されてきた。米国特許公開第20050003474号および同第20040078846号を参照。E. coliについて上で記載したものと同様の方法を用いて、組換えRhodobacter微生物を作製することができる。
【００６５】
Physcomitrella spp.
ニセツリガネゴケ（Physcomitrella mosses）は、懸濁培養中で増殖させた場合、酵母および他の真菌の培養物と類似の特徴を有する。この属は、他の型の細胞において生成することが困難であり得る植物の二次代謝物の生成のために重要な型の細胞となりつつある。
【００６６】
植物および植物細胞
一部の態様において、本明細書において記載される核酸およびポリペプチドを、サフランからの化合物を生成するために、植物または植物細胞中に導入する。したがって、宿主は、本明細書において記載される少なくとも１の組換え遺伝子を含む植物または植物細胞であってよい。植物または植物細胞を、そのゲノム中に組換え遺伝子を組み込ませることにより、形質転換することができる、すなわち、安定に形質転換することができる。安定に形質転換された細胞は、典型的には、各細胞分裂により、導入された核酸を保持する。植物または植物細胞はまた、組換え遺伝子がそのゲノム中に組み込まれないように、一過性に形質転換することができる。一過性に形質転換された細胞は、典型的には、各細胞分裂により、導入された核酸の全てまたは一部を失い、その結果として、導入された核酸は、十分な回数の細胞分裂の後で、娘細胞において検出することができない。一過性に形質転換された、および安定に形質転換されたトランスジェニック植物および植物細胞のいずれも、本明細書において記載される方法において有用であり得る。
【００６７】
本明細書において記載される方法において用いられるトランスジェニック植物細胞は、植物全体の一部または全てを構成することができる。かかる植物は、考慮されている種のために好適な様式において、グロースチャンバー、温室または野外のいずれかにおいて、生育することができる。トランスジェニック植物は、特定の目的のために、例えば、組換え核酸を他の系統中に導入するため、組換え核酸を他の種にトランスファーするため、また他の望ましい形質のさらなる選択のために所望される場合、育種してもよい。あるいは、トランスジェニック植物は、かかる技術を受け入れることができる種については、無性で繁殖させてもよい。本明細書において用いられる場合、トランスジェニック植物はまた、子孫が導入遺伝子を受け継ぐことを前提として、最初のトランスジェニック植物の子孫を指す。トランスジェニック植物により産生される種子を生育して、次いで、自家交配させ（または他家交配して自家交配させ）、核酸コンストラクトについてホモ接合型の種子を得ることができる。
【００６８】
トランスジェニック植物は、懸濁培養、または組織もしくは器官培養中で増殖させることができる。本発明の目的のために、固体および／または液体の組織培養技術を用いることができる。固体培地を用いる場合、トランスジェニック植物細胞を、培地上に直接配置しても、フィルター上に配置して、これを次いで培地と接触させてもよい。液体培地を用いる場合、トランスジェニック植物細胞を、液体培地と接触する浮遊デバイス、例えば多孔性膜上に配置してもよい。
【００６９】
一過性に形質転換された植物細胞を用いる場合、レポーター活性を有するレポーターポリペプチドをコードするレポーター配列を、形質転換の手順に含めてもよく、レポーターの活性または発現についてのアッセイを、形質転換後の好適な時間において行ってもよい。アッセイを行うための好適な時間は、典型的には、形質転換の約１〜２１日、例えば約１〜１４日、約１〜７日、または約１〜３日後である。一過性アッセイの使用は、異なる種における迅速な分析のために、または、その発現が特定のレシピエント細胞において先に確認されていない異種性ポリペプチドの発現を確認するために、特に便利である。
【００７０】
核酸を単子葉および双子葉植物中に導入するための技術は、当該分野において公知であり、限定することなく、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換、ウイルスベクターにより媒介される形質転換、エレクトロポレーションおよびパーティクルガン形質転換、米国特許第5,538,880号；同第5,204,253号；同第6,329,571号；および同第6,013,863号を含む。細胞または培養された組織を形質転換のためのレシピエント組織として用いる場合、所望される場合は、当業者に公知の技術により、形質転換された培養物から植物を再生してもよい。
【００７１】
トランスジェニック植物の集団を、導入遺伝子の発現により付与される形質または表現型を有する当該集団のメンバーについて、スクリーニングおよび／または選択することができる。例えば、１回の形質転換イベントの子孫の集団を、所望されるレベルのZCDまたはUGTのポリペプチドまたは核酸を有する植物について、スクリーニングすることができる。物理的および生化学的方法を用いて、発現レベルを同定することができる。それらは、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはPCR増幅；RNAトランスクリプトを検出するためのノーザンブロット、S1 RNase保護、プライマー伸長、またはRT-PCR増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ；ならびに、ポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降および酵素結合イムノアッセイを含む。in situハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／または核酸の存在または発現を検出するために用いることができる。言及された技術の全てを行うための方法は、公知である。代替として、独立した形質転換イベントを含む植物の集団を、サフランからの化合物の生成などの所望される形質を有する植物についてスクリーニングすることができる。選択および／またはスクリーニングは、１または２以上の世代にわたり、１つより多くの地理的位置において、行うことができる。一部の場合において、トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物において所望される形質を誘導するか、または、所望される形質をもたらすために他に必要である条件下において、生育および選択することができる。さらに、選択および／またはスクリーニングは、当該表現型が植物により示されると予測される特定の発達段階の間に適用してもよい。選択および／またはスクリーニングは、サフラン化合物のレベルにおいて、導入遺伝子を欠失する対照植物と比較して、統計学的に有意な差異を有するトランスジェニック植物を選択するために行ってもよい。
【００７２】
本明細書において記載される核酸、組換え遺伝子およびコンストラクトは、多数の単子葉および双子葉植物ならびに植物細胞系を形質転換するために用いることができる。好適な単子葉植物の非限定的な例として、例えば、イネ、ライムギ、ソルガム、アワ、コムギ、トウモロコシおよびオオムギなどの穀類が挙げられる。植物はまた、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、マメ、ゼラニウム、ホウレンソウまたはタバコなどの双子葉植物であってもよい。一部の場合において、植物は、メバロン酸経路などのフェニルリン酸の生成のための前駆体経路を含んでもよく、これは典型的には、細胞質およびミトコンドリアにおいて見出される。非メバロン酸経路は、植物色素体においてよりしばしば見出される（Dubey, et al., 2003 J. Biosci. 28 637-646）。当業者は、生合成が植物細胞の所望される場所において起こるように、リーダー配列の使用を通して生合成ポリペプチドの発現を適切な小器官に標的化してもよい。当業者は、例えばそのように所望される場合は植物の葉に対して、合成を方向づけるために、適切なプロモーターを使用するであろう。発現はまた、そのように所望される場合は、カルス培養または毛状根培養などの組織培養中で起こってもよい。
本発明を、以下の例においてさらに記載し、これは、請求の範囲に置いて記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００７３】
例
例１：酵母におけるβ−カロテンの生成
サフラン生合成遺伝子の最適な組み合わせを見つけるために設計されたeYAC実験のために、β−カロテン生成酵母レポーター株を構築した。Neurospora crassaのフィトエンデサチュラーゼ（フィトエンデヒドロゲナーゼとしても知られる）（アクセッション番号XP_964713）、およびXanthophyllomyces dendrorhousのGGDPシンターゼ（ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼまたはCrtEとしても知られる）（アクセッション番号DQ012943）、およびX. dendrorhousのフィトエン−β−カロテンシンターゼCrtYB（アクセッション番号AY177204）の遺伝子を、全て発現カセット中に挿入し、これらの発現カセットを、研究用酵母株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-11のゲノム中に組み込んだ。フィトエンデサチュラーゼおよびCrtYBを、強力な構成的GPD1プロモーターの制御下において過剰発現させ、一方、CrtEの過剰発現を、強力な構成的TPI1プロモーターを用いて可能にした。X. dendrorhousのCrtEおよびNeurospora crassaのフィトエンデサチュラーゼ発現カセットの染色体組み込みを、S. cerevisiae ECM3-YOR093Cの遺伝子間領域において行い、一方、CrtYB発現カセットの組み込みは、S. cerevisiae KIN1-INO2の遺伝子間領域において行った。
SCドロップアウトプレート上で増殖させたコロニーは、β−カロテンが生成される場合、橙色の形成を示す。β−カロテンの存在を、メタノール中への抽出およびLC/MS分析により定量化する。
【００７４】
例２：最適化された酵母のHBCおよびクロセチンジアルデヒドの生成
クロセチンはクロセチンジアルデヒドから形成され、クロセチンジアルデヒドおよびヒドロキシル−ベータ−シクロシトラール（HBC）は、酵素であるゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼ（ZCD）によるゼアキサンチン開裂により生成されることが知られている。クロセチンジアルデヒドおよびHBCの生合成のための最適な経路を確立するために、eYACおよび例１において記載されるβ−カロテン生成酵母株を用いて、eYACにおいて遺伝子のコレクションを組み立てた。
【００７５】
β−カロテンをクロセチンジアルデヒドに変換する酵素についての遺伝子アナログのコレクションを、酵母のコドン最適化合成（DNA 2.0）により供給し、多様なメチオニン抑制性遺伝子プロモーター下において、eYAC Entry Vector中に挿入した。eYAC技術の使用は、Naesby et al., Microb Cell Fact. 8:45 (2009)により記載されている。表１において示す３７のサフラン生合成遺伝子についての発現カセットを、連鎖させ（UGT遺伝子を用いて、またはこれを用いずに）、eYAC中にライゲーションした。両方の型のeYACを、β−カロテノイド生成酵母株EFSC301中に形質転換した。この株は、酵母ECM3およびKIN1の３’ＵＴＲ領域におけるGPD／TPIプロモーターに基づくCrtYB／CrtE／Nc-AI-1遺伝子発現カセットの組み込みにより作製された、安定なカロテノイド産生体である。
【００７６】
単一栄養要求選択プレートを用いて、約８００コロニー／プレートの酵母の形質転換効率が得られた。形質転換体を、次いで、二重栄養要求選択プレート（ロイシン−、トリプトファン−）上に再画線した。陽性の形質転換体を、SCドロップアウト培地（−ロイシン、−トリプトファン、および−メチオニン）中で増殖させる。細胞を、２４〜７２時間、３０℃で、振盪フラスコ中で増殖させ、細胞フリーのブロス、ならびに細胞抽出物を、有機溶媒中に抽出し、HBC、クロセチンジアルデヒドおよびクロセチンの存在について分析する。
【００７７】
形質転換された酵母において生合成されたクロセチンジアルデヒド、クロセチンおよびHBCの含有量に基づいて、高い、中程度の、および低い産生体を同定する。これらの形質転換体を、高い、中程度の、および低い産生体の遺伝子組成を決定するために、PCRによりスクリーニングする。PCRの結果に基づき、クロセチンジアルデヒド、クロセチンおよびHBCの生成のために必須の遺伝子および非必須の遺伝子を同定し、新たな組み合わせにおいて、および新たなeYACコンストラクトにおいて、遺伝子を付加または削除することにより、コンストラクトをさらに改善することができる。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
例３：ピクロクロシン形成UGTの発見
グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヒドロキシル−ベータ−シクロシトラール（HBC）からピクロクロシンを形成するために必要とされる。この反応は、グルコース−グルコース結合形成反応と対抗する、無糖体のグルコシル化であり、この型の反応をスクリーニングするための、UDP−グルコースを利用するグリコシルトランスフェラーゼの多くのファミリーが存在する。
HBC基質の供給
HBCを合成し、所望される化合物を、キラルカラムクロマトグラフィー（GVK, Hyderabad）により精製した。
【００８０】
UGT酵素のスクリーニング
以下のUGTを、ピクロクロシン形成についてアッセイした：Stevia rebaudiana 88B1、76G1、74G1、91D2e、85C2、73EV12；Catharanthus roseus UGT2；およびArabidopsis thaliana UGT 75B1、ならびにArabidopsisハイブリッド酵素UGT 353およびUGT354（図３において配列を提供する）。
これらのUGTをコードする遺伝子を、T7プロモーターを利用するプラスミド中へクローニングし、発現の研究のためにE. coli BL21細胞中に形質転換した。これらのUGTを保有する株を、０．１ｍＭのIPTGで誘導し、誘導された培養物を、２０℃で一晩増殖させた。誘導された細胞を、次いでBugBuster試薬（Novagen）で溶解し、清澄化したライセートをUGTアッセイのために用いた。
【００８１】
９８μＬの誘導して清澄化したライセートを、グルコース受容体基質としてのHBC（１０μＭの最終濃度）および供与体としてのUDP−グルコース（１ｍＭの最終濃度）に添加したものを含む、１００μＬの反応において、UGTアッセイを行った。反応は、３０℃で３時間行い、水飽和した３００μＬの１−ブタノールの添加により停止させた。試料を、３００μＬの水飽和１−ブタノールで３回抽出した。プールしたブタノール画分を、Speed-vacにおいて完全に乾燥させ、LC/MSにより、以下の方法を用いて分析した。Luna-SL C18カラム（５μｍ、１００オングストローム）モデルG1316B（4.6mm ID）を、LC分離のために用い、４４０ｎｍにおいてモニタリングする。２０分間の分離を、０．８ｍｌ／分において、他の溶媒として０．２５％のギ酸（ＦＡ）を含む２０〜８０％のアセトニトリルからの勾配を用いて行う。LCを、MS分析のためにQ-TOFと組み合わせる。
【００８２】
これらのUGTのうち、SteviaからのUGT85C2およびUGT73EV12、ならびに２つのハイブリッドArabidopsis酵素は、アッセイされた条件下において、HBCからのピクロクロシンの形成を示した。予備分析は、SteviaのUGT85C2との反応は、HBCを、ピクロクロシン標準物と類似の保持時間および質量を有する化合物へと部分的に変換したことを示した。HBCのピーク面積は、標準物の保持時間においてモニタリングした。
【００８３】
SteviaのUGT85C2を、HBCを生成することが示されている酵母株において共発現させた（例えば例２＆６を参照）。この酵素は、酵母株がグルコースからピクロクロシンを生成することができるように、in vitroにおいて示されたものと同じ反応をin vivoにおいて触媒するであろうことが予測される。
【００８４】
UGTのコレクションのスクリーニング
広範な特異性を有する１７０を超えるUGT酵素のコレクションを、E. coliにおいて発現させ、上記のものと同様の方法においてアッセイした。HBCとのグリコシル化反応を行ってピクロクロシンを形成することができる、３つのさらなるUGT：SteviaのUGT73、および２つのArabidopsisのUGT71ハイブリッド酵素（ハイブリッド酵素に関しては、Hansen, et al., Phytochemistry 70 (2009) 473-482を参照）を同定した。図３は、UGT73およびUGT71ハイブリッド酵素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【００８５】
例４：クロシン形成グリコシルトランスフェラーゼ酵素の発見
クロシンは、連続的な反応においてそれに付加される４個のグルコース部分を有するクロセチンの誘導体である。最後の２個のグルコース分子は、２個の初めのグルコース分子に、β−１，６−結合により付着され、これは１つのグリコシルトランスフェラーゼの作用によるものである可能性が非常に高い。第２のグルコースの付加を触媒するUGT酵素は、無糖体グリコシラーゼトランスフェラーゼよりもより一般的でなく、UGTのサブファミリー９１または７９である可能性がある。これらの２つのサブファミリーは、１，２または１，６グルコース−グルコース結合の形成を触媒することが現在知られている、唯一２のものである。
Crocusからの遺伝子を同定するための努力において、Crocusの柱頭からのサブファミリー７９および９１のUGT、ならびに他のサブファミリー９１のUGTが同定され、単離された。
【００８６】
Crocusピロシークエンシング
Crocusの柱頭のcDNAについてのピロシークエンシングのデータは、MOgene LC（St. Louis, MO, USA）から受け取った。２つのFLX Titaniumプレートを用いて全トランスクリプトームのシークエンシングを実行し、合計約1100MBの生のシークエンシングのデータを作製し、de novoでのアセンブリを行った。
ピロシークエンシングされたデータの66,000のユニークなコンティグを分析した後、約１０のUGT様の配列（サブファミリー９１）を、既知のUGTに対するblast分析により同定した。このことに基づき、CrocusのcDNAライブラリーから完全長遺伝子を単離するために、遺伝子／対立遺伝子特異的なインバースPCRプライマーを設計した。
【００８７】
遺伝子およびベクターに特異的なプライマーを、ピロシークエンシングされたデータに基づいて設計し、UGT遺伝子の５’および３’末端を得るために用いた。プルーフリーディングポリメラーゼ（例えばAdvantage 2およびKODポリメラーゼ）を用いて、遺伝子およびベクターに特異的なプライマーの組み合わせにより、首尾よくUGT配列の５’および３’末端を増幅した後、増幅されたPCRフラグメントを、下流のプロセッシングのためにゲル抽出した。PCRにより増幅されたフラグメントを、PCR精製キットを用いて精製し、次いでその後、TAクローニングベクター中にクローニングし（InstaTAクローニングキット、Fermentas）、E. coli株（NEB 10-βコンピテント細胞、New England Biolabs, UK）中に形質転換した。遺伝子特異的コロニーPCRによるPCRフラグメントの定性的分析の後で、プラスミドDNA試料をシークエンシングした。
【００８８】
サブファミリー９１からの、６つの完全長UGT Crocus cDNA配列を、この様式において同定した。全６つのUGT（UN1671、UN3356、UN4522、UN4666、UN6460およびUN2281）のアミノ酸配列は、既知のUGT91配列とクラスター形成した（図４を参照；図５は、UN1671、3356、4522、4666、6460および2281の配列を含む）。これら６つの中で、UN1671トランスクリプトおよびUN4522トランスクリプトが、トランスクリプトームにおけるその豊富さに基づいて、見出された９１のホモログのうちで最も高く発現された。
UN1671、UN4522、UN4666、UN6460、UN3356およびUN2281の６つの完全長配列を、遺伝子特異的プライマーによりさらに増幅し、E. coli発現およびin vitro発現のために、プラスミドベクター中に挿入した。
【００８９】
さらなる７つのUGTの完全配列の増幅のために、SMART PCR cDNA合成アプローチを利用した。このアプローチは、ナノグラム量の全RNAから高質なcDNAを生成する能力を有する。mRNAのポリアデニル化領域を捕捉するアフィニティー法に基づいて精製されたCrocusのmRNAからRACE cDNAを調製した。遺伝子特異的および対立遺伝子特異的プライマーを利用して、完全長UGTコード領域を得た。コード領域を、それぞれのUGTを保有するE. coli T7 Express lysY/Iq Competent E. coli（New England Biolabs, UK）株において形質転換し、抗生物質を含むLuria Broth培地中で増殖させ、３７℃で１６時間（２５０ｒｐｍで振盪しながら）インキュベートした。細胞を、フレッシュなLBにおいて、０．０１のＯＤ６００まで播種し、３０℃で、０．４〜０．５のＯＤ６００が達成されるまで増殖させた。温度を２０℃まで下げ、細胞を０．１ｍＭのIPTGで誘導し、２４時間インキュベートした。１２，０００ｒｐｍで１分間、室温において、細胞をペレット化し、Bug buster試薬（Novagen）中で、製造者のプロトコルのとおり溶解した。清澄化した上清をUGTアッセイのために用い、ここで、１０ｍＭのUDP−グルコース（最終濃度）および１ｍＭのジ−グルコシルエステル（最終濃度）を用い、反応物を３０℃で３時間インキュベートした。
【００９０】
in vitroで翻訳された酵素のスクリーニング
合計１９のUGT遺伝子（表２を参照）を、他のサブファミリー７９または９１のUGT配列とのそれらの相同性により、部分的にモノ−グリコシル化されたクロセチンエステルのクロシンへの変換のための候補として選択した。全ての遺伝子を、酵母のコドンの利用のために最適化して合成した（図６におけるヌクレオチド配列）。
【表２】
2014524246.tif 000003
【００９１】
in vitroでの翻訳は、１６のUGTについて成功した：他の３つのUGTは、E. coliベースの発現系中にクローニングした。１６のin vitroで翻訳されたUGTを、クロセチンゲンチオビオシルグルコシルエステル（クロセチン−3G, GVK, India）をグルコース受容体基質として、UDP−グルコースをグルコース供与体として用いて、クロシンの形成についてスクリーニングした。４０μＬのin vitroで翻訳されたタンパク質を、３ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍＬのBSA、５０μＭの基質、および１ｍＭのUDP−グルコースを含む、１００μＬの反応中で用いた。反応は、３０℃で３時間、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で行い、３００μＬの水飽和１−ブタノールを添加することにより停止させた。試料を、３００μＬの水飽和１−ブタノールで３回抽出した。プールしたブタノール画分を、Speed-Vacにおいて完全に乾燥させ、メタノール中で再懸濁し、Agilent 1200 HPLC & Q-TOF LC/MS 6520により分析した。試験された試料のいずれも、アッセイした反応条件下においてクロシンを生成しなかった。
【００９２】
植物UGT酵素のスクリーニング
Steviaからの５つのUGT（88B1、76G1、74G1、912D2eおよび85C2）、ならびにCatharanthus roseusのUGT2およびArabidopsis thalianaのUGT 75B1（例３を参照）もまた、クロシン生成についてアッセイした。
これらのUGTの中で、CrocusのUGTであるUN1671およびUN4522、ならびにSteviaのUGT76G1は、クロセチン−3Gをグリコシル化する能力を示した。LC-MSによる予備分析は、クロシンと同じ分子量の生成物分子の出現を示した。サブファミリー７６のUGTは、典型的には２個のグルコース部分の間で１，３結合を作るため、グルコース−グルコース架橋の型をNMRにより検証し、クロシンが生成されたのか、クロシンのアナログが形成されたのかを決定した。
【００９３】
例５：クロセチングルコシルエステル形成のためのCrocusのUGT2のクローニング
CrocusのUGT2（CsUGT2, GenBankアクセッション番号AY262037.1）は、カルボン酸部位において、クロセチンの２つの一次グリコシル化を触媒し、クロセチンモノ−およびジ−グルコシルエステルをもたらすと考えられる。CsUGT2を、ポリヒスチジンタグの融合と共にまたはこれを行わずに、Ｔ７プロモーターを用いて細菌の発現ベクター中にクローニングした。遺伝子をまた、強力な構成的GPD1プロモーターを用いて、酵母発現コンストラクト中にもクローニングした。最適化された酵母発現のための遺伝子を、クローニングのために利用した。図７は、CsUGT2のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにコドン最適化されたヌクレオチド配列を提供する。
【００９４】
形質転換されたXJa（DE3）自己溶菌型E. coli K株を、IPTGにより、製造者のプロトコルに従って、誘導する（Zymo research, CA 92614, U.S.A）。形質転換されたSaccharomyces cerevisiae細胞（株DSY5、Dualsystems Biotech, Switzerland）を、２％グルコースを含むｐＨ５．８のSCドロップアウト培地中で増殖させる。CsUGT2遺伝子を保有するDSY5株の単一のコロニーを、SCグルコース培地中に播種し、３０℃で２５０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートする。酵母細胞を、フレッシュな培地において、ＯＤ６００が１．０と同等になるまで、フレッシュなSCブロス中で再播種し、さらに７２時間インキュベートする。細胞を、次いでペレット化し、YeastBuster（商標）タンパク質抽出試薬（Merck, India）を用いて溶解させる。細胞フリーの抽出物を、１０ｍＭのUDP−グルコース（最終濃度）、１ｍＭのクロセチン（最終濃度）（Chromadex（US）から購入）を用いて、クロセチングリコシル化活性についてアッセイし、３０℃で３時間インキュベートする。粗反応混合物において分析を行い、モノ−およびジ−グルコシルエステルの存在を、参照文献J. Mass. Spectrom. 2009, 44, 1661-1667のとおりに質量分析を用いて、それらの質量に基づいて観察する。
【００９５】
例６：クロセチンを生成する酵母
クロセチンの生成のための機能的生合成経路を、以下のとおり開発した。例１において記載されるβ−カロテンを生成する操作された酵母株（EYS886）を、サフラン生合成経路を操作するために用いた。C. sativusのゼアキサンチン開裂オキシゲナーゼ（ZCO、ゼアキサンチン開裂ジオキシゲナーゼまたはZCDとしても知られる）と、Xanthophyllomyces dendrorhousのカロテンヒドロキシラーゼ（CH）CH-2遺伝子との共発現は、クロセチンの生成をもたらし、これはLCおよびMS分析により証明された。異種性遺伝子は、クロセチンジアルデヒドのクロセチンへの変換のためには提供されなかった；この活性は、S. cerevisiae細胞内においてネイティブに起こらなければならない。
【００９６】
表３において記載されるように供給されるカロテンヒドロキシラーゼ（「CH」）の遺伝子アナログとゼアキサンチン開裂オキシゲナーゼ（「ZCO」）との幾つかの組合せの発現のために、高コピー数のpRS416 E.coli／酵母シャトルベクターを利用した（図８は、最適化されたDNA配列を含む）。ZCO遺伝子は、TEFプロモーターの制御下において発現させ、CH遺伝子は、GPDプロモーターを用いて発現させた。以下の組み合わせを試験した：CH2／ZCO1、CH3／ZCO2およびCH6／ZCO4。
【表３】
2014524246.tif 000004
【００９７】
ZCO／CH6の組み合わせを含むプラスミドを、製造者のプロトコルのとおりに、β−カロテン生成株中に形質転換した（Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（商標）、Zymo research, Switzerland）。形質転換体を、２％グルコースを含むSC Ura−プレート（ｐＨ５．８）上に播種し、３０℃で３日間インキュベートした。
陽性の酵母クローンを、グルコースを含む液体SC Ura−培地中で、３０℃において、２００ｒｐｍで通気しながら、振盪インキュベーターにおいて一晩増殖させた。
【００９８】
培養物を遠心分離により濃縮し、フレッシュなSC Ura−培地中で、ＯＤが１．２と等しくなるまで再懸濁した。細胞をさらに、３０℃で、２００ｒｐｍにおいて、さらに７２時間インキュベートした。細胞を、次いでペレット化し、抽出物を分析のために調製した。ペレットを、冷たいPBS緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ７．２）で２回洗浄し、２ｍｌのメタノール：PBS緩衝液（３：１）中に再懸濁し、−１８℃で一晩保存した。この混合物を融解し、１０，０００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離して、ボルテックスミキサーを用いて、３ｍｌのクロロホルム：メタノール（１：２）によりペレットを再抽出した。この混合物を、１０，０００ｒｐｍにおいて２分間遠心分離し、上清をHPLCによる分析のために注入した。同様の様式において、上清を、クロロホルム、メタノールおよび水により、記載順において抽出し、HPLCにより分析した。
【００９９】
分析
細胞抽出物を、C18 Discovery HS HPLCカラムを用いて、１％酢酸および水中での６０％〜１００％の線形メタノール勾配により、４０分間の期間にわたり、１ｍｌ／分において分析した。Shimadzuの調製LC 8Aシステムを、Shimadzu SPD M20A Photo Diode Array検出器と共に、４４０ｎｍの吸光度における一次分析により利用した。
C. sativusのZCO1（GenBankアクセッション番号AJ489276、GenBankタンパク質ID CAD33262.1）およびX. dendrorhousのCH-2を含む組換え株の一つの分析により、クロセチンおよびクロセチンジアルデヒドの標準物に匹敵する時間において溶離している新たな化合物の生成が明らかとなった。この酵母株により生成される細胞内代謝物を、さらに、GC-MS分析に供し、クロセチンおよびクロセチンジアルデヒドの質量を確認した。
他のZCOとCHとの組み合わせもまた、可溶性タンパク質発現のために適切な条件下において機能的であるであろうことが予測される。
【０１００】
これらのデータは、酵母が、グルコースからクロセチンジアルデヒドを作ることができること、および、酵母が、少なくとも一部のクロセチンジアルデヒドをクロセチンへと酸化することができる酵素活性を有することを示す。さらに、HBCはZCO反応の副産物であるので、酵母はまた、HBCを生成することができる。上記のUGTおよびCsUGT2の添加により、酵母はまた、ピクロクロシンおよびクロシンを生成するであろうことが予測される。
【０１０１】
例７：クロセチンエステルを形成するグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発見
クロセチンは、２つの区別し得るUGTを含む複数のステップの経路により、酵素によりグルコシル化されることが提案されている。一方のUGTは、モノグルコシル−およびジグルコシル−エステルの形成によりクロセチンの末端のカルボキシル末端へのグルコース部分の付加を触媒する。他方のUGTは、グルコース部分をグルコシル基にトランスファーし、クロセチンモノゲンチオビオシル−およびジゲンチオビオシルエステルを形成する。
以下のUGTを、クロセチンからのモノ、ジ、またはゲンチオビオシル分子のようなクロセチンエステルの形成についてスクリーニングした：Stevia rebaudiana（88B1、76G1、74G1、912D2eおよび85C2、UGT73）ならびに２つのArabidopsisのUGT71ハイブリッド酵素（71C125571C2および71C125571E1）。
【０１０２】
これらのUGTをコードする遺伝子を、T7プロモーターの制御下においてプラスミド中にクローニングし、発現研究のためにE. coli BL21（自己溶菌型：XJb(DE3), Zymoresearch）細胞中に形質転換した。これらのUGTを保有する株を、０．１ｍＭのIPTGで誘導し、誘導された培養物を、２０℃で一晩増殖させた。誘導された細胞を、次いで、凍結融解法により溶解した。
【０１０３】
UGTアッセイは、１００μＬの反応物中で行い、これは、グルコース受容体基質としてクロセチン（１０μＭの最終濃度）および供与体としてUDP−グルコース（１ｍＭの最終濃度）と共にインキュベートした、９８μＬの誘導され清澄化されたライセートを含んだ。反応は、３０℃で３時間行い、３００μＬの水飽和１−ブタノールの添加により停止させた。試料を、３００μＬの水飽和１−ブタノールで３回抽出した。プールしたブタノール画分を、Speed-vacにおいて完全に乾燥させ、以下の方法を用いるLC/MSにより分析した。装置：Agilent 1200 HPLC & Q-TOF LC/MS 6520、カラム：c18 reverse Luna、４μｍ、４．６×１５０ｍｍ、注入容積：２０μｌ、移動相：２成分において、アセトニトリル（Ｂ）：水（Ａ）（０．１％ＨＣＯＯＨ）、流速：０．８ｍｌ／分、実行時間：２０分、検出：４４０ｎｍ、勾配：２０％のＢで５分間、８０％のＢで１５分間、８０％のＢで２０分間、イオンソース−Dual ESI、取得モード−MS、質量範囲−１００〜１５００、モード−ネガティブモード。
【０１０４】
これらのうち、３つのUGT（Steviaからの76G1、ならびに２つのArabidopsisのUGT71ハイブリッド酵素）は、クロセチンのグルコシル化を触媒して、モノおよびジグルコシルエステルを形成した。２つのArabidopsisのUGT71ハイブリッド酵素（71C125571C2および71C125571E1）はまた、クロセチンゲンチオビオシルエステルを形成する能力を示した。LC-MSによる予備分析は、モノ、ジ、およびゲンチオビオシルエステルと同じ分子量を有する生成物分子の出現を示した。
【０１０５】
例８：Crocus sativusからのクロセチンモノおよびジグルコシルエステルを形成するグリコシルトランスフェラーゼの発見
例４のピロシークエンシングのデータはまた、バリアントのCrocusのUGT、Cs VrUGT2を明らかにした。図９は、Cs VrUGT2のアミノ酸配列を含む。バリアントＵＧＴの配列を、BLASTを用いてCrocusのUGT2（CsUGT2、GenBankアクセッション番号：AY262037.1）と比較した。図１０は、Crocus sativusからのCsUGT2とバリアントCs VrUGT2とのアラインメント、ならびに各々のポリペプチドのアミノ酸配列を含む。BLAST分析に基づいて、遺伝子／対立遺伝子特異的インバースPCRプライマーを設計し、CrocusのcDNAライブラリーから完全長遺伝子を単離した。
【０１０６】
Cs VrUGT2をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を、T7プロモーターの制御下においてプラスミド中にクローニングし、発現研究のためにE. coli BL21（自己溶菌型：XJb(DE3), Zymoresearch）細胞中に形質転換した。Cs VrUGT2を保有する株を、０．１ｍＭのIPTGで誘導し、誘導された細胞を、２０℃で一晩増殖させた。誘導された細胞を、次いで、凍結融解により溶解した。
【０１０７】
UGTアッセイは、１００μＬの反応物中で行い、これは、グルコース受容体基質としてクロセチン（１０μＭの最終濃度）および供与体としてUDP−グルコース（１ｍＭの最終濃度）と共にインキュベートした、９８μＬの誘導され清澄化されたライセートを含んだ。反応は、３０℃で３時間行い、３００μＬの水飽和１−ブタノールの添加により停止させた。試料を、３００μＬの水飽和１−ブタノールで３回抽出し、画分をプールした。プールしたブタノール画分を、Speed-vacにおいて完全に乾燥させ、以下の方法を用いるLC/MSにより分析した。装置：Agilent 1200 HPLC & Q-TOF LC/MS 6520、カラム：c18 reverse Luna、４μｍ、４．６×１５０ｍｍ、注入容積：２０μｌ、移動相：２成分において、アセトニトリル（Ｂ）：水（Ａ）（０．１％ＨＣＯＯＨ）、流速：０．８ｍｌ／分、実行時間：２０分、検出：４４０ｎｍ、勾配：２０％のＢで５分間、８０％のＢで１５分間、８０％のＢで２０分間、イオンソース−Dual ESI、取得モード−MS、質量範囲−１００〜１５００、モード−ネガティブモード。
LC-MSによる予備分析は、モノおよびジグルコシルエステルと同じ分子量を有する生成分子の出現を示した。
【０１０８】
例９：クロセチンジアルデヒドをクロセチンへ変換する内在性酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼの発見
サフランの色は、主に、クロセチンの連続的なグリコシル化から誘導されるカロテノイド配糖体に起因する。サフランの生合成経路における重要なステップの一つは、クロセチンジアルデヒドのクロセチンへの酸化である。Saccharomyces cerevisiaeにおける内在性アルデヒドデヒドロゲナーゼが、この変換を行う能力を試験した。酵母ゲノムは、５つの既知のアルデヒドデヒドロゲナーゼコード遺伝子（ALD2〜ALD6）、ならびに、アルデヒドデヒドロゲナーゼであると予測されるさらなる遺伝子であるHFD1を有する。参照株S288CからのALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6およびHFD1をコードするヌクレオチド配列については、図１１を参照（配列番号６７〜７２）。配列は、参照株S288Cについてのものである。用いられてきた株における遺伝子配列には僅かな差異が存在し得る。細胞フリー抽出物を、一晩増殖させた酵母培養物から調製し、次いで、機械的溶解により破壊した。ライセートを清澄化し、表４において記載されるように行われたin vitro反応において、それらがクロセチンジアルデヒドをクロセチンへと変換する能力について試験した。ホールセル抽出物を含まない陰性対照もまた含めた。反応は、２５℃で６０分間行い、３容積（１５００ｍｌ）の水飽和ブタノールの添加により停止させた。
【表４】
2014524246.tif 000005
【０１０９】
有機相を遠心分離により分離し、真空乾燥に供し、その後、それらを、質量分析と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（LC-MS）により分析した。Agilent 1200 HPLC & Q-TOF LC/MS 6520を、５マイクロンのガードカラムを備えたLuna C18の５μｍのカラム（４．６×１５０ｍ）と共に用いた。移動相は、アセトニトリル（Ｂ）（０．１％のギ酸（ＨＣＯＯＨ））：Ｈ２Ｏ（Ａ）（０．１％のＨＣＯＯＨ）であり、流速は０．８ｍｌ／分であった。実行時間は、典型的には１５分間であり、１分間の実行後時間（post run）を有した。
【表５】
2014524246.tif 000006
MSのパラメーターは、以下を含んだ：イオンソースとしてESI、デュアルESI取得モード：１００〜４５０Ｄａの質量範囲；＋／−ve（迅速極性切り替え）モード。
酵母の内在性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、クロセチンジアルデヒドをクロセチンに変換することができ、これはLC-MSの結果により示された。
【０１１０】
他の態様
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、前述の記載は、説明することを意図されるものであり、本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の請求の範囲により定義される。他の側面、利点および改変は、以下の請求の範囲の内である。
【図１】
2014524246.tif 000007
【図２−１】
2014524246.tif 000008
【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
2014524246.tif 000019
【図４】
2014524246.tif 000020
【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図６−１】
2014524246.tif 000029
【図６−２】
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【図６−３】
2014524246.tif 000031
【図６−４】
2014524246.tif 000032
【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
2014524246.tif 000038
【図６−１１】
2014524246.tif 000039
【図６−１２】
2014524246.tif 000040
【図７−１】
2014524246.tif 000041
【図７−２】
2014524246.tif 000042
【図８−１】
2014524246.tif 000043
【図８−２】
2014524246.tif 000044
【図８−３】
2014524246.tif 000045
【図８−４】
2014524246.tif 000046
【図９】
2014524246.tif 000047
【図１０−１】
2014524246.tif 000048
【図１０−２】
2014524246.tif 000049
【図１１−１】
2014524246.tif 000050
【図１１−２】
2014524246.tif 000051
【図１１−３】
2014524246.tif 000052
【図１１−４】
2014524246.tif 000053
【図１１−５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月17日(2014.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014524246000001.app
【国際調査報告】
2014524246.tif 000055
2014524246.tif 000056
2014524246.tif 000057
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