(57)【要約】本発明は、組換えウイルスベクター、および該組換えウイルスベクターを使用してインフルエンザＡウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明は、例えば、非複製修飾ワクシニアウイルスアンカラに基づく組換えウイルスベクターを提供する。本発明の方法に従って投与されるときに、組換えウイルスベクターは、交差防御的であり、かつインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫を誘導するように設計される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡヘッドレスヘマグルチニン（ｈｌＨＡ）ポリペプチドに挿入された少なくとも１つのインフルエンザＡ  Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする遺伝子カセットを含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、配列番号２に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、配列番号３に示されるＶＮ／１２０３ＨＡアミノ酸配列のアミノ酸を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、配列番号３のＨＡ１アミノ酸１７〜５８と、ペプチドリンカーと、少なくとも１つのＭ２ｅポリペプチドと、ペプチドリンカーと、配列番号３のＨＡ１アミノ酸２９０〜３４３と、配列番号３のＨＡ２アミノ酸３４４〜５６８と、を含む、請求項３に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５】
ＨＡアミノ酸とＭ２ｅアミノ酸を連結するペプチドリンカーが、配列番号４に示されるアミノ酸ＧＧＧを含む、請求項４に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項６】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号５に示されるＨ５Ｎ１  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号６に示されるＨ１Ｎ１  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号７に示されるＨ９Ｎ２  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項９】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号８に示されるＨ７Ｎ２  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、２つ以上のＭ２ｅポリペプチドを含み、前記Ｍ２ｅポリペプチドは、ペプチドリンカーによって連結される、請求項１、３、４、５、６、７、８、または９に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１１】
前記Ｍ２ｅポリペプチドを連結する前記ペプチドリンカーが、配列番号９に示されるアミノ酸ＧＳＡＧＳＡを含む、請求項１０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１２】
前記遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１３】
前記遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現が、ｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１４】
配列番号１に示される遺伝子カセットを含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項１５】
インフルエンザＡマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコードする遺伝子カセットと、インフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードする遺伝子カセットと、を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１６】
前記Ｍ１タンパク質が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１７】
前記Ｍ１タンパク質が、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１８】
前記ＮＰが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１９】
前記ＮＰが、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１８に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２０】
前記ワクシニアウイルスが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、欠損ワクシニアリスター（ｄＶＶ）、ＭＶＡ−５７５、ＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−Ｆ６、またはＭＶＡ−Ｍ４である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２１】
前記ワクシニアウイルスがＭＶＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項２２】
前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットが、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項２１に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項２３】
前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットが、Ｄ４／５遺伝子間領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項２１または２２に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
配列番号２に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質アミノ酸配列をコードする遺伝子カセットを含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
配列番号１に示される遺伝子カセットを含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
個人におけるンフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む薬学的組成物を前記個人に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
個人におけるインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導する際に用いる薬学的組成物であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む薬学的組成物を前記個人に投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
配列番号１に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを発現する組換えＭＶＡを生成する方法であって、
ａ）  初代ニワトリ胚細胞または永久細胞株をＭＶＡに感染させるステップと、
ｂ）  前記感染させた細胞を、配列番号１に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを含み、かつＭＶＡゲノムの非必須領域と相同である遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトするステップと、
ｃ）  前記細胞を増殖させ、前記感染させた細胞内でのＭＶＡの複製中に、前記プラスミドの前記ＭＶＡゲノムとの組換えを可能にし、それによって、前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを前記非必須領域内の前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｄ）  生成された前記組換えＭＶＡを得るステップと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記非必須ＭＶＡ領域が、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域、前記欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子座である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非必須ＭＶＡ領域が、前記Ｄ４／５遺伝子間領域である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
インフルエンザＡヘッドレスヘマグルチニン（ｈｌＨＡ）ポリペプチドに挿入された少なくとも１つのインフルエンザＡ  Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第１の遺伝子カセットと、インフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードする第２の遺伝子カセットと、を含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項３３】
前記融合タンパク質が、配列番号２に示される前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質アミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が、配列番号３に示される前記ＶＮ／１２０３ＨＡアミノ酸配列のアミノ酸を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が、配列番号３のＨＡ１アミノ酸１７〜５８と、ペプチドリンカーと、少なくとも１つのＭ２ｅポリペプチドと、ペプチドリンカーと、配列番号３のＨＡ１アミノ酸２９０〜３４３と、配列番号３のＨＡ２アミノ酸３４４〜５６８と、を含む、請求項３４に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３６】
前記ＨＡアミノ酸とＭ２ｅアミノ酸を連結するペプチドリンカーが、配列番号４に示される前記アミノ酸ＧＧＧを含む、請求項３５に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３７】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号５に示される前記Ｈ５Ｎ１  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３８】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号６に示される前記Ｈ１Ｎ１  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３９】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号７に示される前記Ｈ９Ｎ２  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４０】
前記Ｍ２ｅポリペプチドが、配列番号８に示される前記Ｈ７Ｎ２  Ｍ２ｅアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４１】
前記融合タンパク質が、２つ以上のＭ２ｅポリペプチドを含み、前記Ｍ２ｅポリペプチドが、ペプチドリンカーによって連結される、請求項３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４２】
前記Ｍ２ｅポリペプチドを連結する前期ペプチドリンカーが、配列番号９に示される前記アミノ酸配列ＧＳＡＧＳＡを含む、請求項４１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４３】
前記ＮＰが、配列番号１３に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４４】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現が、ｍＨ５プロモーターまたはｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４５】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項４４に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４６】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現が、ｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項４４に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４７】
前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｍＨ５プロモーターまたはｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４８】
前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項４７に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４９】
前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項４７に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５０】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現および前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５１】
配列番号１に示される第１の遺伝子カセットと、配列番号１２に示される第２の遺伝子カセットと、を含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項５２】
前記ワクシニアウイルスが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、欠損ワクシニアリスター（ｄＶＶ）、ＭＶＡ−５７５、ＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−Ｆ６、またはＭＶＡ−Ｍ４である、請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５３】
前記ワクシニアウイルスがＭＶＡである、請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５４】
前記第１の遺伝子カセットが、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域、前記欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子座中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項５３に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項５５】
前記第２の遺伝子カセットが、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域、前記欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子座中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項５３に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項５６】
前記第１の遺伝子カセットが、前記Ｄ４／５遺伝子間領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項３２〜５３のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項５７】
前記第２の遺伝子カセットが、前記欠失ＩＩＩ領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項３２〜５３のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項５９】
前記第１の遺伝子カセットが、前記Ｄ４／５遺伝子間領域中の前記ＭＶＡに挿入され、前記第２の遺伝子カセットが、前記欠失ＩＩＩ領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項３２〜５３のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項６０】
請求項３２〜５９のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項６１】
配列番号２に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質アミノ酸配列をコードする第１の遺伝子カセットと、配列番号１３に示されるインフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードする第２の遺伝子カセットと、を含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項６２】
配列番号１に示される第１のｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットと、配列番号１２に示される第２のＮＰ遺伝子カセットと、を含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項６３】
個人におけるインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導する方法であって、前記個人に、請求項３２〜５９のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６４】
個人におけるインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答の誘導における使用のための薬学的組成物であって、前記方法は、前記個人に、請求項３２〜５９のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む薬学的組成物を投与するステップを含む、薬学的組成物。
【請求項６５】
配列番号１に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質第１遺伝子カセットおよび配列番号１２に示されるＮＰ第２遺伝子カセットを発現する組換えＭＶＡを生成する方法であって、
ａ）  初代ニワトリ胚細胞または永久細胞株をＭＶＡに感染させるステップと、
ｂ）  前記感染させた細胞を、配列番号１に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを含み、かつＭＶＡゲノムの第１の非必須領域と相同である遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトするステップと、
ｃ）  前記細胞を増殖させ、前記感染させた細胞内でのＭＶＡの複製中に、前記プラスミドの前記ＭＶＡゲノムとの組み換えを可能にし、それによって、前記ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを前記第１の非必須領域内の前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｄ）  生成された前記組換えＭＶＡを得るステップと、
ｅ）  初代ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、ステップｄ）のＭＶＡに感染させるステップと、
ｆ）  ステップｅ）の感染させた細胞を、配列番号１２に示されるＮＰ遺伝子カセットを含み、かつＭＶＡゲノムの第２の非必須領域と相同である遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトするステップと、
ｇ）  前記細胞を増殖させ、前記感染させた細胞内でのＭＶＡの複製中に、前記プラスミドの前記ＭＶＡゲノムとの組み換えを可能にし、それによって、前記ＮＰ遺伝子カセットを前記第２の非必須領域内の前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｈ）  生成された前記組換えＭＶＡを得るステップと、
を含む、方法。
【請求項６６】
前記非必須ＭＶＡ領域が、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域前記、欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子座である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の非必須ＭＶＡ領域が、前記Ｄ４／５遺伝子間領域である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２の非必須ＭＶＡ領域が、前記欠失ＩＩＩ領域である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の非必須ＭＶＡ領域が、前記Ｄ４／５遺伝子間領域であり、前記第２の非必須ＭＶＡ領域が、前記欠失ＩＩＩ領域である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
インフルエンザＡヘッドレスヘマグルチニン（ｈｌＨＡ）ポリペプチドをコードする第１の遺伝子カセットと、インフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードする第２の遺伝子カセットと、を含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項７１】
前記ｈｌＨＡポリペプチドが、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７２】
前記ＮＰが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７３】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡポリペプチドの発現が、ｍＨ５プロモーターまたはｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７４】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡポリペプチドの発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項７３に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７５】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡポリペプチドの発現が、ｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項７３に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７６】
前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｍＨ５プロモーターまたはｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７７】
前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項７６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７８】
前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｓｅｌＰプロモーターの制御下にある、請求項７６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７９】
前記第１の遺伝子カセットからの前記ｈｌＨＡポリペプチドの発現および前記第２の遺伝子カセットからのＮＰの発現が、ｍＨ５プロモーターの制御下にある、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８０】
配列番号１４に示されるｈｌＨＡ遺伝子第１カセットと、配列番号１２に示されるＮＰ第２遺伝子カセットと、を含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項８１】
インフルエンザＡ  Ｍ１をコードする第３の遺伝子カセットを更に含む、請求項７０〜８０のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８２】
前記Ｍ１タンパク質が、配列番号１１に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８３】
前記Ｍ１タンパク質が、配列番号１０に示される前記ヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８２に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８４】
前記ワクシニアウイルスが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、欠損ワクシニアリスター（ｄＶＶ）、ＭＶＡ−５７５、ＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−Ｆ６、またはＭＶＡ−Ｍ４である、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８５】
前記ワクシニアウイルスがＭＶＡである、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８６】
前記第１の遺伝子カセットが、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域、前記欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項８５に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項８７】
前記第２の遺伝子カセットが、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域、前記欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子座中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項８５または８６に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項８８】
前記第１の遺伝子カセットが、前記Ｄ４／５遺伝子間領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項８５に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項８９】
前記第２の遺伝子カセットが、前記欠失ＩＩＩ領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項８５に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項９０】
前記第１および第３の遺伝子カセットが、前記Ｄ４／５遺伝子間領域中の前記ＭＶＡに挿入され、前記第２の遺伝子カセットが、前記欠失ＩＩＩ領域中の前記ＭＶＡに挿入される、請求項８５に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項９１】
請求項７０〜９０のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項９２】
配列番号１５に示されるヘッドレスＨＡ（ｈｌＨＡ）アミノ酸配列をコードする第１の遺伝子カセットと、配列番号１３に示されるインフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードする第２の遺伝子カセットとを含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項９３】
配列番号１４に示されるｈｌＨＡ第１遺伝子カセットと、配列番号１２に示されるＮＰ第２遺伝子カセットとを含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項９４】
配列番号１４に示されるｈｌＨＡ第１遺伝子カセットと、配列番号１０に示されるＭ１第２遺伝子カセットと、配列番号１２に示されるＮＰ第３遺伝子カセットとを含む組換えＭＶＡを含む、薬学的組成物。
【請求項９５】
個人におけるインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導する方法であって、前記個人に、請求項７０〜９０のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９６】
個人におけるインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答の誘導における使用のための薬学的組成物であって、前記方法は、前記個人に、請求項７０〜９０のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡを含む薬学的組成物を投与するステップを含む、薬学的組成物。
【請求項９７】
配列番号１４に示されるｈｌＨＡ第１遺伝子カセットおよび配列番号１２に示されるＮＰ第２遺伝子カセットを発現する組換えＭＶＡを生成する方法であって、
ａ）  初代ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株をＭＶＡに感染させるステップと、
ｂ）  前記感染させた細胞を、配列番号１４に示されるヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを含み、かつＭＶＡゲノムの第１の非必須領域と相同である遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトするステップと、
ｃ）  前記細胞を増殖させ、前記感染させた細胞内でのＭＶＡの複製中に、前記プラスミドの前記ＭＶＡゲノムとの組み換えを可能にし、それによって、前記ヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質遺伝子カセットを前記第１の非必須領域内の前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｄ）  生成された前記組換えＭＶＡを得るステップと、
ｅ）  初代ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、ステップｄ）のＭＶＡに感染させるステップと、
ｆ）  ステップｅ）の感染させた細胞を、配列番号１２に示されるＮＰ遺伝子カセットを含み、かつＭＶＡゲノムの第２の非必須領域と相同である遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを含むプラスミドで、トランスフェクトするステップと、
ｇ）  前記細胞を増殖させ、前記感染させた細胞内でのＭＶＡの複製中に、前記プラスミドの前記ＭＶＡゲノムとの組み換えを可能にし、それによって、前記ＮＰ遺伝子カセットを前記第２の非必須領域内の前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｈ）  生成された前記組換えＭＶＡを得るステップと
を含む、方法。
【請求項９８】
前記非必須ＭＶＡ領域が、前記欠失Ｉ領域、前記欠失ＩＩ領域、前記欠失ＩＩＩ領域前記、欠失ＩＶ領域、前記チミジンキナーゼ遺伝子座、前記Ｄ４／５遺伝子間領域、または前記ＨＡ遺伝子座である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１の非必須ＭＶＡ領域が、前記Ｄ４／５遺伝子間領域である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記第２の非必須ＭＶＡ領域が、前記欠失ＩＩＩ領域である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１の非必須ＭＶＡ領域が、前記Ｄ４／５遺伝子間領域であり、前記第２の必須ＭＶＡ領域は、前記欠失ＩＩＩ領域である、請求項９７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えウイルスベクター、および該組換えウイルスベクターを使用してインフルエンザＡウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明は、例えば、非複製修飾ワクシニアウイルスアンカラに基づく組換えウイルスベクターを提供する。本発明の方法に従って投与されるときに、組換えウイルスベクターは、交差防御的であり、かつインフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫を誘導するように設計される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）または「インフルエンザ（ｔｈｅ  ｆｌｕ）」は、インフルエンザＡおよびＢウイルスによって引き起こされる呼吸疾患である。インフルエンザの流行は、毎年世界中で重大な病気および死亡を引き起こし、ワクチン接種は、感染および疾患を予防する最も端的な戦略である。従来のインフルエンザワクチンは、レシピエントをインフルエンザウイルスタンパク質に曝露して、そのタンパク質に対する免疫応答をレシピエントに組み込む。ワクチンに使用されるタンパク質（またはポリペプチド）は、一般的に「抗原」と呼ばれる。一般的に使用される季節性インフルエンザワクチンは、ウイルスの主要な抗原であるヘマグルチニン（ＨＡ）に基づいている。異なるＨＡ抗原を有する多数のインフルエンザＡサブタイプが存在する。インフルエンザＡサブタイプは、ウイルスによって発現されるＨＡおよびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に基づいて分けられ、分類される。インフルエンザＡサブタイプの命名法は、ＨＡサブタイプ（当該技術分野において既知の１６個の異なるＨＡ遺伝子のもの）およびＮＡサブタイプ（当該技術分野において既知の９個の異なるＮＡ遺伝子のもの）に基づいている。例示的なサブタイプには、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、およびＨ３Ｎ２が含まれるが、これらに限定されない。「株」と呼ばれるインフルエンザＡサブタイプの変種も存在する。例えば、ウイルスＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４は、インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５Ｎ１であり、株の名称はＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４である。
【０００３】
ＨＡに基づく季節性ワクチンによる保護は、株特異的であり、新たな株が常に出現するため、伝統的なインフルエンザワクチンは、現在出回っている株と適合させるために、毎年再製剤化が必要とされている。Ｌａｍｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｆａｕｃｉ  ２０１０を参照されたい。したがって、次世代のワクチンが交差防御的であり、ヘテロサブタイプ免疫性を誘導すること、すなわち、異なるサブタイプのインフルエンザＡの攻撃感染に対して保護するまたは部分的に保護する、１つのサブタイプに対するワクチンが極めて望ましい。
【０００４】
開発中の現在の「ユニバーサルワクチン」（すなわち、ヘテロサブタイプ免疫性を誘発するように設計されたワクチン）は、主に、インフルエンザマトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）（Ｓｃｈｏｔｓａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、核タンパク質（ＮＰ）、ならびにＨＡの保存部分（Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）を含む、より保存された内部インフルエンザウイルス遺伝子に基づいている。ポリメラーゼタンパク質のＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２も、実質的なＴ細胞応答を誘導し、関連する標的でもあり得る（Ａｓｓａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０００５】
現在開発中の次世代インフルエンザワクチンには、組換えタンパク質、合成ペプチド、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＮＤＡに基づくワクチン、およびウイルスベクターワクチンが含まれる（ＬａｍｂｅｒｔおよびＦａｕｃｉ、上記）。生ウイルスベクターを使用する利点は、高レベルの細胞免疫性、特にＣＤ８  Ｔ細胞を誘導するこれらの既知の特性である。これらのうち最も有望なウイルスベクターは、ワクシニアウイルスに基づく生ワクチン（ＲｉｍｍｅｌｚｗａａｎおよびＳｕｔｔｅｒ  ２００９）、ならびにアデノウイルスに基づくベクター（Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）である。ＮＰおよびＭ２を発現するアデノウイルス構築物を使用する単回用量粘膜免疫化は、例えば、毒性Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＨ１Ｎ１ウイルスからの保護を提供した（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ、上記）。更なる研究において（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、核タンパク質（ＮＰ）およびマトリックス２（Ｍ２）プラスミドによるＤＮＡワクチン接種、続く抗原適合組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）による追加免疫は、マウスおよびフェレットにおける毒性Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１の攻撃に対して強力な保護を提供した。
【０００６】
修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に基づく組換えワクチンが、多くの非臨床および臨床研究において使用されている。ＭＶＡは、極めて安全であることが証明されている。天然痘根絶に関して１２０，０００人を超えるヒト患者にＭＶＡが投与されたとき、有意な副作用は得られなかった。ビリオン形態形成における阻止に起因して、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株は、ヒトおよび大部分の哺乳類の細胞において増殖的に複製されない。それにもかかわらず、初期および後期におけるウイルスおよび外来遺伝子を発現する能力は保持される。これらの特徴により、ＭＶＡは、液性および細胞性免疫応答を誘導し、かつ高い安全特性を示す有望な生ワクチンベクターとなる。
【０００７】
特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４は、ワクシニア等の組換えポックスウイルスに関する。
【０００８】
ＭＶＡに基づくワクチンは、臨床研究において、例えばＨＩＶ、結核、マラリア、および癌に対して使用されている。これらの研究の全てにおいて、少なくとも２つの用量が使用された。ＭＶＡ系ワクチンのヒト用量は、臨床試験において適用されるように、５×１０７〜５×１０８ＰＦＵであった（Ｂｒｏｏｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｃｅｂｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｔｙｋｏｄｉ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ２００８）。
【０００９】
ＭＶＡは、汎発性Ｈ５Ｎ１（Ｋｒｅｉｊｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｋｒｅｉｊｔｚ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２００９、Ｋｒｅｉｊｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００９、Ｋｒｅｉｊｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００９、Ｋｒｅｉｊｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｍａｙｒｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）およびＨ１Ｎ１（Ｈｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｋｒｅｉｊｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００９）インフルエンザ研究においてベクターとして近年使用されている。ＮＰおよびＭ１を発現するＭＶＡに基づくワクチンは、現在、進行中の臨床試験において試験されている（Ｂｅｒｔｈｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００１０】
したがって、当該技術分野においてより広範に保護的なインフルエンザワクチンの必要性が未だ存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，９９８，２５２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０１５，０２４号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０４５，１３６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，０４５，３１３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、インフルエンザＡウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答を生成するのに有用な組換えウイルス（本明細書において、組換えウイルスベクターとも呼ばれる）を提供する。組換えウイルスは、組換えＭＶＡ等の組換えワクシニアウイルス、または当該技術分野において既知の非複製もしくは複製ワクシニアウイルスである。非複製ワクシニアウイルスには、欠損ワクシニアリスター（ｄＶＶ）、ＭＶＡ−５７５（ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７）、ＭＶＡ−ＢＮ（ＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８）、ＭＶＡ−Ｆ６、およびＭＶＡ−Ｍ４（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、組換えウイルスは、少なくとも１つのインフルエンザＡ  Ｍ２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）挿入を有するインフルエンザＡヘマグルチニン欠失突然変異体「ヘッドレスＨＡ」（ｈｌＨＡ）を含む融合タンパク質（ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ）、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質およびインフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）、またはｈｌＨＡおよびＮＰをコードする。本発明の組換えウイルスは、インフルエンザＡマトリックスタンパク質１（Ｍ１）および／またはインフルエンザＡポリメラーゼＰＢ１を更にコードすることができる。本発明の方法に従って投与されると、組換えウイルスは、交差防御的であり、ヘテロサブタイプ液性および細胞性免疫応答（ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞応答を含む）を誘導する。したがって組換えウイルスは、ヒトにおいてユニバーサルインフルエンザＡワクチンとして有用であることが企図される。
【００１３】
幾つかの実施形態において、本発明の組換えウイルス内のオープンリーディングフレームによってコードされるｈｌＨＡアミノ酸配列は、例えば、配列番号１５に示されるｈｌＨＡアミノ酸配列であり得る（配列番号３であるＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１  ＨＡ  ＮＣＢＩ  ジェンバンクＡＡＷ８０７１７に基づく）。配列番号１５のｈｌＨＡは、シグナル配列、配列番号３のＨＡ１残基１７〜５８、４つのグリシンのリンカーペプチド、配列番号３のＨＡ１残基２９０〜３４３、および配列番号３のＨＡ２ストーク領域残基３４４〜５６８を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、本発明の組換えウイルス内のオープンリーディングフレームによってコードされるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質アミノ酸配列は、例えば、配列番号２に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質アミノ酸配列であり得る。配列番号２の融合タンパク質は、シグナル配列、配列番号３のＨＡ１残基１７〜５８、３つのグリシンのリンカーペプチド（配列番号４）、Ｈ５Ｎ１のＭ２ｅ（配列番号５であり、Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１  ＮＣＢＩ  ジェンバンクＡＢＰ３５６３４に基づく）、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ（配列番号９）、Ｈ１Ｎ１のＭ２ｅ（Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２の等価物）（配列番号６であり、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３３１５／２００９  Ｈ１Ｎ１  ＮＣＢＩ  ジェンバンクＡＣＺ０５５９２に基づく）、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ（配列番号９）、Ｈ９Ｎ２のＭ２ｅ（配列番号７であり、Ａ／ニワトリ／Ｋｏｒｅａ／ＳＨ０９１３／２００９  Ｈ９Ｎ２  ＮＣＢＩ  ジェンバンクＡＤＱ４３６４１に基づく）、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ（配列番号９）、Ｈ７Ｎ２のＭ２ｅ（配列番号８であり、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１０７／２００３  Ｈ７Ｎ２  ＮＣＢＩ  ジェンバンクＡＣＣ５５２７６に基づく）、３つのグリシンのリンカーペプチド（配列番号４）、配列番号３のＨＡ１残基２９０〜３４３、および配列番号３のＨＡ２領域残基３４４〜５６８を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質は、配列番号５、６、７、および８のＭ２ｅポリペプチドのうちの１、２、３、または４つを含んでもよい。ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質は、配列番号５、６、７、および８のＭ２ｅポリペプチド以外のインフルエンザＡ  Ｍ２ｅポリペプチドを含んでもよい。
【００１６】
幾つかの実施形態において、本発明の組換えウイルス内のオープンリーディングフレームによってコードされるＮＰアミノ酸配列は、例えば、配列番号１３に示されるＮＰアミノ酸配列であり得る（Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１  ＮＰ  ＮＣＢＩ  ジェンバンクＡＡＷ８０７２０に基づく）。幾つかの実施形態において、本発明の組換えウイルス内のオープンリーディングフレームによってコードされるＭ１アミノ酸配列は、例えば、配列番号１１に示されるＭ１アミノ酸配列であり得る（Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１  Ｍ１  ジェンバンクＡＡＷ８０７２６に基づく）。幾つかの実施形態において、本発明の組換えウイルス内のオープンリーディングフレームによってコードされるＰＢ１アミノ酸配列は、例えば、配列番号１７に示されるＰＢ１アミノ酸配列であり得る（Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１  ＰＢ１  ジェンバンクＡＡＷ８０７１１に基づく）。
【００１７】
本発明は、組換えウイルスが個人に投与されるとき、ポリペプチドが保護免疫応答を誘導する能力を保持する場合、組換えウイルス内のオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドは、配列番号２、５、６、７、８、１１、１３、１５、および／または１７の配列の点で異なり得ることを企図する。これらの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２、５、６、７、８、１１、１３、１５、および／または１７と約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であり得る。
【００１８】
他の実施形態において、本発明の組換えウイルスによってコードされるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質、ｈｌＨＡポリペプチド、及びＮＰペプチドは、Ｈ１〜Ｈ１６およびＮ１〜Ｎ９（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ４Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ６Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ８Ｎ１、Ｈ９Ｎ１、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１１Ｎ１、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１３Ｎ１、Ｈ１４Ｎ１、Ｈ１５Ｎ１、Ｈ１６Ｎ１；Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ８Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ２、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１２Ｎ２、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１４Ｎ２、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１６Ｎ２；Ｈ１Ｎ３、Ｈ２Ｎ３、Ｈ３Ｎ３、Ｈ４Ｎ３、Ｈ５Ｎ３、Ｈ６Ｎ３、Ｈ７Ｎ３、Ｈ８Ｎ３、Ｈ９Ｎ３、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１２Ｎ３、Ｈ１３Ｎ３、Ｈ１４Ｎ３、Ｈ１５Ｎ３、Ｈ１６Ｎ３；Ｈ１Ｎ４、Ｈ２Ｎ４、Ｈ３Ｎ４、Ｈ４Ｎ４、Ｈ５Ｎ４、Ｈ６Ｎ４、Ｈ７Ｎ４、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ４、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１１Ｎ４、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１３Ｎ４、Ｈ１４Ｎ４、Ｈ１５Ｎ４、Ｈ１６Ｎ４；Ｈ１Ｎ５、Ｈ２Ｎ５、Ｈ３Ｎ５、Ｈ４Ｎ５、Ｈ５Ｎ５、Ｈ６Ｎ５、Ｈ７Ｎ５、Ｈ８Ｎ５、Ｈ９Ｎ５、Ｈ１０Ｎ５、Ｈ１１Ｎ５、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ５、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ５、Ｈ１６Ｎ５；Ｈ１Ｎ６、Ｈ２Ｎ６、Ｈ３Ｎ６、Ｈ４Ｎ６、Ｈ５Ｎ６、Ｈ６Ｎ６、Ｈ７Ｎ６、Ｈ８Ｎ６、Ｈ９Ｎ６、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１２Ｎ６、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１４Ｎ６、Ｈ１５Ｎ６、Ｈ１６Ｎ６；Ｈ１Ｎ７、Ｈ２Ｎ７、Ｈ３Ｎ７、Ｈ４Ｎ７、Ｈ５Ｎ７、Ｈ６Ｎ７、Ｈ７Ｎ７、Ｈ８Ｎ７、Ｈ９Ｎ７、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１１Ｎ７、Ｈ１２Ｎ７、Ｈ１３Ｎ７、Ｈ１４Ｎ７、Ｈ１５Ｎ７、Ｈ１６Ｎ７；Ｈ１Ｎ８、Ｈ２Ｎ８、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ８、Ｈ６Ｎ８、Ｈ７Ｎ８、Ｈ８Ｎ８、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１１Ｎ８、Ｈ１２Ｎ８、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１４Ｎ８、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１６Ｎ８；Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ９、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ９、Ｈ８Ｎ９、Ｈ９Ｎ９、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ９、Ｈ１５Ｎ９、およびＨ１６Ｎ９を含む）の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない同一または異なるインフルエンザＡサブタイプに基づき得る。幾つかの実施形態において、インフルエンザＡサブタイプは、流行性インフルエンザＡである。例示的な流行性インフルエンザサブタイプには、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ５Ｎ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１株を含む同定されたインフルエンザＡ株のリストは、世界保健機構（ＷＨＯ）および米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のインフルエンザＡサブタイプデータベースから入手可能である。米国国立医学図書館により維持されている国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースも、インフルエンザＡ種のウイルスのＨＡ、Ｍ２、ＮＰ、Ｍ１、およびＰＢ１遺伝子の長さおよび配列を記載する最新のデータベースを維持している。これらの機関により提示される株、ならびに他の商業的および学術的なデータベースにおいて、または文献において記載されている、かつ当該技術分野において既知の株は、本発明における使用が企図される。本明細書以降に同定され、単離される追加のインフルエンザＡ株も、インフルエンザＡタンパク質配列の供給源として本発明において有用であることも企図される。したがって、明細書において特定的に例示される任意の株、および当該技術分野において既知である、または後に発見されるものは、本発明の組換えワクシニアウイルス、薬学的組成物、および方法に適している。例示的な株には、下記の表１の株が含まれるが、これらに限定されない。表は、これらの株の例示的な遺伝子および関連するデータベース受入番号も提示する。
【表１】
2014506785.tif 000002
【００２０】
本発明の組換えウイルスにおいて、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、ｈｌＨＡ、ＮＰ、Ｍ１、および／またはＰＢ１をコードするオープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。これらの実施形態において、オープンリーディングフレーム内の１つ以上（または全て）の天然に生じるコドンは、コドン最適化オープンリーディングフレームにおいて、ヒト細胞内の遺伝子により頻繁に使用されるコドン（時々、好ましいコドンと呼ばれる）に置き換えられている。コドンを最適化して、反復配列を回避し、ｒＭＶＡ内のオープンリーディングフレームを安定化すること、および／または不要な転写終止シグナルを回避することができる。コドン最適化は、概して、細胞内のポリペプチドの発現を高めるために、組換え遺伝子発現の分野において使用されている。
【００２１】
本発明の組換えウイルス内のｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、ｈｌＨＡ、ＮＰ、Ｍ１、およびＰＢ１をコードする遺伝子カセットは、組換えワクシニアウイルス内で機能する（すなわち、オープンリーディングフレームの転写を方向付ける）プロモーターの制御下にある（すなわち、プロモーターに機能的に結合している）オープンリーディングフレームを含む。例示的な実施形態において、遺伝子カセットからの発現は、強力な初期／後期ワクシニアウイルスｍＨ５プロモーター（配列番号１８）または合成初期／後期ｓｅｌＰプロモーター（配列番号１９）の制御下にある（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。本発明の遺伝子カセットにおいて、オープンリーディングフレームは、また、ワクシニアウイルス初期転写終止シグナル等の転写終止シグナルに機能的に結合している。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、インフルエンザＡ  ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質をコードする遺伝子カセットを含む組換えワクシニアウイルスを提供する。幾つかの実施形態において、組換えワクシニアウイルスは、配列番号２に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質を発現する遺伝子カセットを含む組換えＭＶＡである。幾つかの実施形態において、組換えワクシニアウイルスは、Ｍ１タンパク質（例えば、配列番号１１に示されるＭ１）を発現する遺伝子カセット、および／またはＰＢ１タンパク質（例えば、配列番号１７に示されるＰＢ１タンパク質）を発現する遺伝子カセットを更に含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、インフルエンザＡ  ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質をコードする第１の遺伝子カセットおよびインフルエンザＮＰをコードする第２の遺伝子カセットを含む組換えワクシニアウイルスを提供する。幾つかの実施形態において、組換えワクシニアウイルスは、配列番号２に示されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質を発現する第１の遺伝子カセットおよび配列番号１３に示されるＮＰを発現する第２の遺伝子カセットとを含む組換えＭＶＡである。幾つかの実施形態において、組換えワクシニアウイルスは、Ｍ１タンパク質（例えば、配列番号１１に示されるＭ１）を発現する遺伝子カセット、および／またはＰＢ１タンパク質（例えば、配列番号１７に示されるＰＢ１タンパク質）を発現する遺伝子カセットを更に含む。
【００２４】
更に別の態様において、本発明は、インフルエンザＡ  ｈｌＨＡをコードする第１の遺伝子カセットおよびインフルエンザＮＰをコードする第２の遺伝子カセットとを含む組換えワクシニアウイルスを提供する。幾つかの実施形態において、組換えワクシニアウイルスは、配列番号１５に示されるｈｌＨＡを発現する第１の遺伝子カセットおよび配列番号１３に示されるＮＰを発現する第２の遺伝子カセットとを含む組換えＭＶＡである。幾つかの実施形態において、組換えワクシニアウイルスは、Ｍ１タンパク質（例えば、配列番号１１に示されるＭ１）を発現する遺伝子カセット、および／またはＰＢ１タンパク質（例えば、配列番号１７に示されるＰＢ１タンパク質）を発現する遺伝子カセットを更に含む。
【００２５】
本発明の組換えワクシニアウイルスにおいて、遺伝子カセットを、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４Ｒ／５Ｒ遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座等のワクシニアウイルスゲノムの非必須領域に挿入することができる。組換えＭＶＡの例示的な実施形態において、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅおよびｈｌＨＡ遺伝子カセットの挿入は、Ｄ４Ｒ／５Ｒ遺伝子間領域の中であり、ＮＰ遺伝子カセットの挿入は、欠失ＩＩＩ領域の中である。組換えＭＶＡは、国立衛生研究所から得られるＭＶＡ７４  ＬＶＤ６等の牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まないＭＶＡから誘導される。
【００２６】
本発明の組換えウイルスを、当該技術分野において既知の方法に従って薬学的組成物として処方することができる。幾つかの実施形態において、組換えウイルスは、国際公開第２０１０／０５６９９１号に記載されているように処方される。
【００２７】
本発明は、個人におけるヘテロサブタイプインフルエンザＡ免疫応答を誘導する方法であって、本発明の組換えワクシニアウイルスの組成物を個人に投与することを含む方法を提供する。本方法において、組成物を、単回用量、２回用量または多回用量として投与することができる。ヒトにおける投与経路は、吸入、経鼻、経口、および非経口であり得る。非経口投与経路の例には、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下投与が含まれる。ヒト免疫化用量の範囲は、約１０６〜約１０９ＰＦＵであり得る。本発明の方法は、個人における液性および細胞性免疫応答を誘導する。更に、本発明の実施形態において、方法は、個人における防御免疫応答を誘導する。防御免疫応答は、個人が感染の症状なし、症状の低減、組織もしくは鼻汁におけるウイルス力価の低減、および／またはインフルエンザウイルスによる感染に対する完全な保護を示す場合であり得る。
【００２８】
本発明は、本発明の組換えワクシニアウイルスを投与するキットも提供し、本キットは、その使用が本発明の方法の実践を促進するようにパッケージングされている。１つの実施形態において、そのようなキットは、密閉ボトルまたは容器等の容器内にパッケージングされた本明細書に記載の組換えウイルスまたは組成物を含み、方法を実践する際の化合物または組成物の使用を説明するラベルが、容器に貼られるか、またはパッケージ内に含まれる。好ましくは、組換えウイルスまたは組成物は、単位投与形態でパッケージングされる。キットは、特定の投与経路による投与またはスクリーニングアッセイの実践に好適な装置を更に含んでもよい。好ましくは、キットは、組換えワクシニアウイルスの使用を説明するラベルを含有する。幾つかの実施形態において、キットは、ヒト被験者に投与するための使用説明書を含む。
【００２９】
また、提供されるものは、本発明の遺伝子カセットを発現する組換えワクシニアウイルスを生成する方法である。ＭＶＡにより例示されているように、方法は、ａ）初代ニワトリ胚細胞または適切な永久細胞株（例えば、鳥類）をＭＶＡに感染させるステップと、ｂ）感染させた細胞を、遺伝子カセットを含み、かつＭＶＡゲノムの非必須領域と相同である遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトするステップと、ｃ）細胞を増殖させ、ニワトリ細胞内でのＭＶＡの複製中に、プラスミドのＭＶＡゲノムとの組換えを可能にし、それによって、遺伝子カセットを非必須領域内のＭＶＡゲノムに挿入するステップと、ｄ）生成された組換えＭＶＡを得るステップを含む。例示的なニワトリ胚細胞は、米国特許第５，３９１，４９１号（Ｓｌａｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）に記載されている。他の鳥類細胞（例えば、ＤＦ−１）も企図される。本方法において、非必須ＭＶＡ領域は、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）、欠失ＩＩＩ領域（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、欠失ＩＶ領域（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、チミジンキナーゼ遺伝子座（Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８２）、Ｄ４Ｒ／５Ｒ遺伝子間領域（Ｈｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、またはＨＡ遺伝子座（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、上記）である。１つの例示的な実施形態において、挿入は、欠失ＩＩＩ領域の中である。別の例示的な実施形態において、挿入は、Ｄ４Ｒ／５Ｒ遺伝子間領域の中である。２つの遺伝子カセットが挿入される場合、２つは、異なる非必須領域に挿入される。遺伝子カセットを、追加的に、任意の他の適切なゲノム領域または遺伝子間領域に挿入することができる。
【００３０】
他の脊椎動物の細胞系が、本発明のワクシニアウイルスの培養および増殖に有用である。本発明のワクシニアウイルスの培養に有用な例示的な脊椎動物細胞には、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、ＣＶ−１（アフリカミドリザル）、ＨＥＫ（ヒト胎児腎）、ＰｅｒＣ６（ヒト網膜芽細胞）、ＢＨＫ−２１細胞（ベビーハムスター腎）、ＢＳＣ（サル腎細胞）、ＬＬＣ−ＭＫ２（サル腎）、およびＤＦ−１等の永久鳥類細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
ベロ細胞は、世界保健機構に従ったウイルスワクチンの生成に許容された細胞系である。幾つかの実施形態において、本発明の組換え複製ワクシニアウイルスは、ベロ細胞において生成される。
【００３２】
本発明の追加的な態様および詳細は、以下の実施例により明らかとなり、これらは制限的ではなく、むしろ例示的であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）によってコードされるヘッドレスＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。タンパク質は、シグナル配列（灰色）、ＨＡ１残基（赤色）、４つのグリシンのリンカーペプチド（黒色）、ＨＡ１残基（赤色）、およびＨＡ２ストーク領域（黒色）を含有する。システイン５８および６３、ならびに多塩基切断部位（アミノ酸１１２〜１１９）に下線が引かれている。
【図２】図２は、本発明のｒＭＶＡによってコードされるヘッドレスＨＡタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図３】図３は、ヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。設計されたタンパク質は、シグナル配列（灰色）、ＨＡ１残基（赤色）、３つのグリシンのリンカーペプチド（黒色）、Ｈ５Ｎ１のＭ２ｅ（青色）、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ（黒色）、Ｈ１Ｎ１のＭ２ｅ（Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２の等価物；緑色）、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ、Ｈ９Ｎ２のＭ２ｅ（橙色）、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ、Ｈ７Ｎ２のＭ２ｅ（ピンク色）、３つのグリシンのリンカーペプチド（黒色）、ＨＡ１残基（赤色）、およびＨＡ２ストーク領域（黒色）を含有する。多塩基切断部位（アミノ酸２２４〜２３１）に下線が引かれている。
【図４】図４は、本発明のｒＭＶＡによってコードされるヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図５】図５は、インフルエンザ遺伝子を含有する単一挿入ｒＭＶＡを示す。図５Ａは、野生型ＭＶＡのヌクレオチド８７，２８１に対応する位置で組換えＭＶＡ  Ｄ４Ｒ／Ｄ５Ｒ遺伝子間遺伝子座に配置されている、ｈｌＨＡ、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、Ｍ２、ＰＢ１、またはＭ１遺伝子カセットを示す（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ、上記）。図５Ｂは、ＮＰ遺伝子カセットが、野生型ＭＶＡのヌクレオチド１４２，９９２に対応する位置で欠失ＩＩＩ領域遺伝子座に配置されていることを示す。
【図６】図６は、インフルエンザウイルス抗原について試験されたニワトリ細胞溶解産物のウエスタンブロットを示す。Ａ）ＨＡに対して向けられた検出抗体を使用する、ヘッドレスＨＡおよびヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現。レーン１は、タンパク質ラダー（大きさはｋＤａ）；レーン２は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ；レーン３は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ；レーン４は、野生型ＭＶＡ（陰性対照）；およびレーン５は、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ（陽性対照）。Ｂ）Ｍ２に対して向けられた検出抗体を使用するヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現。レーン１は、タンパク質ラダー（大きさはｋＤａ）；レーン２は、ＭＶＡ−Ｍ２−ＶＮ；レーン３は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ；およびレーン４は、野生型ＭＶＡ（陰性対照）。組換えＭＶＡ−Ｍ２−ＶＮは、Ｍ２タンパク質を発現する（１５ｋＤａ未満の弱いバンド）。抗Ｍ２抗体は、Ｍ２タンパク質のＮ末端でペプチドに結合し、したがって、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現も、７０ｋＤａ前後で検出可能である（レーン３）。
【図７】図７は、インフルエンザ遺伝子を含有する二重挿入ｒＭＶＡを示す。ｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ遺伝子カセットは、野生型ＭＶＡのヌクレオチド８７，２８１に対応する位置でＤ４Ｒ／Ｄ５Ｒ遺伝子間遺伝子座に配置されている。ＮＰ遺伝子カセットは、野生型ＭＶＡのヌクレオチド１４２，９９２に対応する位置で欠失ＩＩＩ領域遺伝子座に配置されている。
【図８】図８は、インフルエンザウイルス抗原について試験されたニワトリ細胞溶解産物のウエスタンブロットを示す。Ａ）ＨＡに対して向けられた検出抗体を使用する、ヘッドレスＨＡおよびヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質の発現。レーン１および７は、タンパク質ラダー（大きさはｋＤａ）；レーン２は、ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ（陽性対照）；レーン３は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ；レーン４は、野生型ＭＶＡ（陰性対照）；レーン５は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰ；ならびにレーン６は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰ。ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅによって発現されるｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパクは、７０ｋＤａ前後で見ることができる（レーン５）。４０ｋＤａ前後での低いバンドは、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡによって発現されるｈｌＨＡを表す。全長ＨＡタンパク質を発現する対照構築物（ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ）は、ＨＡ０（８０ｋＤａ前後のバンド）、ＨＡ１（５５ｋＤａ前後のバンド）、およびＨＡ２（２５ｋＤａ前後のバンド）を発現する。またＨＡ２タンパク質の発現は、ｈｌＨＡおよびｈｌＨＡ／Ｍ２ｅタンパク質も多塩基切断部位を含有するので、レーン３、５、および６において見ることができる。特定的なＨＡバンドは、陰性対照（レーン４）において不在である。Ｂ）ＮＰ特異的抗体によって検出されたＮＰ発現。レーン１は、タンパク質ラダー（大きさはｋＤａ）；レーン２は、ＭＶＡ−Ｄ３−ＮＰ−ＶＮ；レーン３は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰ；レーン４は、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰ；およびレーン５は、野生型ＭＶＡ（陰性対照）。
【図９】図９は、組換えＭＶＡによるワクチン接種およびＨ５Ｎ１による攻撃の後の、体重（Ａ、Ｂ）、臨床症状（Ｃ、Ｄ）、および生存（Ｅ、Ｆ）のモニタリングを示す。対照として、マウスを、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４の全長ＨＡを発現するＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ、野生型ＭＶＡでワクチン接種した、またはＰＢＳで処理した（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）。マウスを、単一組換えＭＶＡ−ｈｌＨＡ、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、ＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮ、または二重組換えＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰでワクチン接種した（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）。野生型Ｈ５Ｎ１による攻撃の後、マウスを１４日間モニターした。
【図１０】図１０は、組換えＭＶＡによるワクチン接種およびＨ９Ｎ２ウイルスによる攻撃の後の、体重（Ａ、Ｂ）、臨床症状（Ｃ、Ｄ）、および生存（Ｅ、Ｆ）のモニタリングを示す。対照として、マウスを、Ｈ９Ｎ２の全ウイルス調製物、野生型ＭＶＡでワクチン接種した、またはＰＢＳで処理した（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）。マウスを、単一組換えＭＶＡ−ｈｌＨＡ、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、ＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮ、または二重組換えＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰでワクチン接種した（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）。毒性マウス適合Ｈ９Ｎ２インフルエンザウイルスによる攻撃の後、マウスを１４日間モニターした。
【図１１】図１１は、インフルエンザ遺伝子を含有する三重挿入ｒＭＶＡを示す。ｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅおよびＭ１遺伝子カセットは、野生型ＭＶＡ配列の８７，２８１ｎｔの位置でＤ４Ｒ／Ｄ５Ｒ遺伝子間遺伝子座に配置される。ＮＰ遺伝子カセットは、野生型ＭＶＡ配列の１４２，９９２ｎｔの位置で欠失ｌｌｌ遺伝子座に配置される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
実施例
【００３５】
本発明は、以下の実施例によって例示され、ここで、実施例１は、本発明の例示的な組換えＭＶＡにおけるインフルエンザＡ抗原の選択および設計を記載し、実施例２は、単一挿入組換えＭＶＡの生成を詳述し、実施例３は、単一挿入ＭＶＡによる動物実験を記載し、実施例４は、二重挿入組換えＭＶＡの生成を詳述し、実施例５は、二重挿入ＭＶＡによる動物実験を記載し、実施例６は、三重挿入組換えＭＶＡの生成を詳述し、実施例７は、三重挿入ＭＶＡによる動物実験を記載する。
実施例１
インフルエンザＡ抗原の選択および設計
【００３６】
インフルエンザヘッドレスＨＡ、ヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、およびＰＢ１は、本発明の例示的な組換えＭＶＡによってコードされるように選択されたインフルエンザＡ抗原であった。
【００３７】
ＨＡストークドメイン、ＨＡ２領域に対するモノクローナル抗体は、広く交差反応的であり、ウイルスの幾つかのサブタイプを中和する（Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｋａｓｈｙａｐ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆａｕｑｕｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８７、Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。抗体は、分子のＨＡ２領域を標的にし、おそらく、低ｐＨでＨＡのコンフォメーション変化を防止し、したがって、おそらく、インフルエンザ感染の際にウイルスと宿主膜の融合を阻止するように作用する。しかし、可溶性で未変性（中性ｐＨ様）のＨＡ２免疫原の生成は、ＨＡの準安定性のために困難であることが証明されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。中性ｐＨコンフォメーションに対して免疫応答を誘導するため、ヘッドレスＨＡを抗原として選択した。ヘッドレスＨＡは、ＨＡ２サブユニットと相互作用して、中性ｐＨコンフォメーションを安定化する２つのＨＡ１領域からなる（Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。
【００３８】
Ｍ２タンパク質の細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ，２３ＡＳ）は、インフルエンザＡウイルスサブタイプにわたって高度に保存されている。動物では、Ｍ２ｅ特異的抗体は、広範囲のインフルエンザＡ株による感染の重篤度を低減する（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｎｅｉｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。多くのグループが、異なる形態のＭ２ｅに基づくワクチン候補を報告している（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｅｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．上記、Ｎｅｉｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．上記）。近年、Ｚｈａｏらは、Ｈ５Ｎ１  Ｍ２ｅに基づく四分岐多抗原性ペプチドワクチンが、強力な免疫応答および異なるＨ５Ｎ１クレードに対する交差保護、更には２００９Ｈ１Ｎ１からのヘテロサブタイプ保護を誘導したことを報告した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ｂ、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａ）。
【００３９】
保存インフルエンザＮＰ、またはＮＰとマトリックスタンパク質の組み合わせを発現するベクターを使用するワクチン接種が、動物モデルにおいて研究されており、同種または異種ウイルスの両方に対して様々な程度の保護が実証されている（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。ＮＰは、マウスおよびヒトにおいて強力なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発し（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｙｅｗｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５））、このことは、疫学的研究が示唆するように、インフルエンザＡウイルス感染に続く重篤な疾患に対する抵抗性に寄与し得る（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ２００６）。
【００４０】
本発明のｒＭＶＡに含まれるヘッドレスＨＡは、ＶＮ／１２０３インフルエンザ株に基づく新しいヘッドレスＨＡ（ｈｌＨＡ）である。ｈｌＨＡは、ｒＭＶＡからの発現の際に切断され、融合タンパク質を免疫系に曝露する多塩基切断部位である。ｈｌＨＡのアミノ酸配列は、図１および配列番号１５に示されている。ＭＶＡ挿入のヌクレオチド配列は、図２および配列番号１４に示されている。
【００４１】
本発明のｒＭＶＡに含まれるヘッドレスＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列は、下記の図３および配列番号２に示されている。融合タンパク質のヌクレオチド配列は、下記の図４および配列番号１に示されている。融合タンパク質において、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、およびＨ１Ｎ１（Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２の等価物）のＭ２ｅドメインは、Ｍ２ｅ「ヘッド」をｈｌＨＡに形成する。４つの特定のＭ２ｅドメインを、季節性および流行性株からのＭ２ｅを表すために選択した。
実施例２
単一挿入ＭＶＡベクターの構築および特徴決定
【００４２】
以下の単一挿入組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）を、本明細書に記載される実験に利用する。
【表２】
2014506785.tif 000003
【００４３】
ｈｌＨＡ、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質、またはＰＢ１を発現する単一挿入ｒＭＶＡベクターの構築では、ｈｌＨＡ、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、およびＰＢ１の遺伝子を化学的に合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。合成遺伝子は、強力なワクシニア初期／後期プロモーターｍＨ５（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）によって誘導され、内部に不在であるコード領域の下流にあるワクシニアウイルス特異的終止シグナルで終結される。遺伝子カセットをプラスミドｐＤＭ−Ｄ４Ｒ内でクローンし（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、それぞれ、プラスミドｐＤＭ−ｈｌＨＡ、ｐＤＭ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、およびｐＤＭ−ＰＢ１−ＶＮをもたらした。ＭＶＡのＤ４Ｒ／Ｄ５Ｒ遺伝子間領域への外来遺伝子の導入を、他で記載されているように実施し（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、ウイルスＭＶＡ−ｈｌＨＡ、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、ＭＶＡ−ＰＢ１−ＶＮをもたらした。
【００４４】
Ｍ１を発現するｒＭＶＡの構築では、Ｍ１配列（受入番号ＡＹ８１８１４４）を、強力なワクシニア初期／後期プロモーターｓｅｌＰの下流に配置し（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、ｐＤＭ−Ｄ４Ｒ内でクローンして、ｐＤＭ−Ｍ１−ＶＮをもたらした。ｐＤＤ４−Ｍ２−ＶＮの発現カセット（ｍＨ５プロモーターの制御下でＭ２配列（受入番号ＥＦ５４１４５３）を含む）をｐＤＭ−Ｄ４Ｒ内でクローンして、ｐＤＭ−Ｍ２−ＶＮをもたらした。次にプラスミドを、Ｈｏｌｚｅｒら、上記、に従ってＭＶＡとの組換えに使用して、それぞれ図５Ａに示されている、ウイルスＭＶＡ−Ｍ１−ＶＮおよびＭＶＡ−Ｍ２−ＶＮをもたらした。
【００４５】
ＮＰタンパク質を発現する単一挿入ＭＶＡの構築では、ｐＤＤ４−ｍＨ５−ｍＮＰ−ＶＮ（Ｍａｙｒｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記）のＮＰ発現カセットを、プラスミドｐｄ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔ内でクローンして、ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＮＰ−ＶＮをもたらした。プラスミドｐｄ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔは、ｌａｃＺ／ｇｐｔ選択マーカーカセット、および目的の遺伝子の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。配列は、欠失ＩＩＩ領域のゲノムＭＶＡ配列によってフレームされる。マーカーカセットは、ＭＶＡ欠失ＩＩＩフランクのタンデム反復によって不安定化され、それによって最終組換え型は補助配列を含まない。挿入プラスミドは、遺伝子カセットをＭＶＡ欠失ＩＩＩ（ｄｅｌ  ＩＩＩ）領域の中に向ける。初代ニワトリ胚細胞をＭＯＩ１に感染させた後、細胞を、リン酸カルシウム技術（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ  １９７３）に従ってｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＮＰ−ＶＮでトランスフェクトして、図５Ｂに示されているＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮをもたらした。ＭＶＡ株（ＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１）は、Ｂ．Ｍｏｓｓ（国立衛生研究所）により快く提供された。組換えウイルスは、一過性マーカー安定化法（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）を使用して選択される。
【００４６】
ＮＰ、ＰＢ１、Ｍ１、Ｍ２、ｈｌＨＡ、およびｈｌＨＡ／Ｍ２ｅを発現する単一挿入ＭＶＡベクターを、Ｈｅｓｓｅｌら、上記に記載されたようにＰＣＲおよびウエスタンブロットで特徴決定した。組換えウイルスを、ＣＥＣまたはＤＦ−１細胞において増殖させ、スクロースクッションを介した遠心分離によって精製した。初代ＣＥＣを社内で生成し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＭｅｄ１９９（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で培養した。ＤＦ−１（ＣＲＬ−１２２０３）細胞系を、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から得て、５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｉｎｃ）で培養した。
【００４７】
ｒＭＶＡによるインフルエンザタンパク質の正確な発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。この目的のため、ＣＥＣまたは永久ニワトリ細胞系のＤＦ−１を、０．１のＭＯＩに感染させ、細胞溶解産物を感染の４８〜７２時間後に調製した。ｈｌＨＡを発現する組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈｌＨＡおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ）は、検出のために抗インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１）ポリクローナル血清（ＮＩＢＳＣ  ０４／２１４）を使用するウエスタンブロットにより分析した。ロバ抗ヒツジアルカリホスファターゼ複合体ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用した。Ｍ２およびＭ２ｅを発現する組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−Ｍ２−ＶＮおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ）は、Ｈ５Ｎ１  Ｍ２（ＰｒｏＳｃｉ、カタログ番号４３３３）のアミノ末端に存在するペプチドに結合する抗鳥類インフルエンザＭ２抗体を使用するウエスタンブロットにより分析した。ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ複合体ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）抗体を二次抗体として使用した。図６Ａに示されているように、ｈｌＨＡを発現する組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈｌＨＡおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ）の遺伝子挿入は、鳥類ＤＦ−１細胞においてＨＡ含有抗原の発現を誘導する。レーン２における４０ｋＤａ前後のバンドは、ｈｌＨＡを表す。レーン３における７０ｋＤａ前後のより大きなバンドは、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅを表す。レーン５における８０ｋＤａ前後の大きなバンドは、ＨＡ０ヘマグルチニン前駆体を表し、これは切断されて、約５５および２５ｋＤａのバンドで表されるＨＡ１およびＨＡ２サブユニットとなる。特定的なｈｌＨＡ、ｈｌＨａ／Ｍ２ｅ、またはＨＡのバンドは、野生型ＭＶＡ対照では不在である（レーン４）。
【００４８】
図６Ｂは、ＭＶＡ−Ｍ２−ＶＮ（レーン２）またはＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ（レーン３）によるＭ２発現を示す。レーン２における１０ｋＤａ前後の弱いが特定的なバンドは、野生型Ｍ２タンパク質を表し、一方、７０ｋＤａ前後のより大きなバンドは、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅタンパク質を表す。両方のバンドは、野生型ＭＶＡ対照では不在である（レーン４）。
【００４９】
Ｍ１、ＮＰ、およびＰＢ１タンパク質の発現は、社内で生成されたポリクローナルモルモット抗インフルエンザＨ５Ｎ１血清、インフルエンザＡウイルスのＰＢ１を検出するポリクローナルヤギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｖＣ−１９）、およびモノクローナルマウス抗ＮＰ抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０１５９）によってそれぞれ検出される。ＭＶＡ−Ｍ１−ＶＮおよびＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮは、Ｍ１タンパク質（２７ｋＤａ前後）およびＮＰタンパク質（６０ｋＤａ前後）の発現を誘導する（示されず）。
実施例３
単一挿入ワクチンによる動物実験
保護実験
【００５０】
標準的な保護実験は、それぞれ９群のマウス（表２に示されている９つのワクチンおよび対照の１×１０６ｐｆｕをそれぞれ筋肉内にワクチン接種した）の２つの集団（約１×１０３〜１×１０５のＴＣＩＤ５０  Ｈ１Ｎ１ｖ  ＣＡ／０７で初回刺激した、および初回刺激しなかった）からなり、群は６匹の動物から構成され、その結果１０８匹の動物になり、これらを１セットと定義する。１セットの動物を、下記の表３に示される６つの攻撃ウイルスのうちの１つで攻撃する。
【表３】
2014506785.tif 000004
【００５１】
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスは、前処理の時点では８〜１０週齢であり、表２に示されているワクチンおよび対照で免疫化した時点では１４〜１６週齢である。マウスを、１０６ｐｆｕのワクチンもしくは野生型ＭＶＡ、３．７５μｇの全ウイルス調製物Ｈ９Ｎ２  Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｇ９／１９９７、または緩衝液（ＰＢＳ）により２回（４２および６３日目）筋肉内で免疫化した。８４日目には、マウスを、１０３  ＴＣＩＤ５０  Ｈ５Ｎ１  Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１、ＣＤＣ番号２００４７０６２８０）、２．５×１０４  ＴＣＩＤ５０  マウス適合Ｈ９Ｎ２  Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｇ９／１９９７、または１．６６×１０４  ＴＣＩＤ５０  Ｈ７Ｎ１  Ａ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４により経鼻的に攻撃した。攻撃用量は、動物１匹あたり、Ｈ５Ｎ１攻撃では約３０  ＬＤ５０およびＨ９Ｎ２攻撃では３２  ＬＤ５０に相当する。血清を、４１、６２、および８５日目に収集し、ＨＩ力価またはマイクロ中和試験アッセイによりＨＡ特異的ＩｇＧ濃度について分析する。
【００５２】
動物実験の主要な成績は、致死終点、体重減少、または肺力価によって測定される保護である。更に、不活性化全ウイルスＨ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４に対して測定した攻撃前プール血清のＥＬＩＳＡ力価を決定した。
Ｔ細胞実験
【００５３】
インフルエンザ特異的ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、フローサイトメトリーにより免疫化マウスにおいて決定する。標準的な実験において、５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、表２に提示されたワクチンまたは対照で２回免疫化する。脾細胞を、ＣＤ４  Ｔ細胞に対する異なるインフルエンザ株の不活性化全ウイルス抗原、入手可能であれば、ワクチン挿入構築物のＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを表すペプチドを使用してインビトロで再刺激して、ＩＦＮγ生成を測定する。全ての実験を、合計１４０匹の動物を使用して２回実施する。
他の実験
【００５４】
単回免疫化の後の細胞仲介免疫性の評価、ＶＩＴＡＬアッセイにおける細胞毒性Ｔ細胞の機能的活性の実証、および攻撃された動物の肺へのインフルエンザ特異的Ｔ細胞の動員の評価も実施する。ワクチン特異的Ｔ細胞の誘導／拡大も、これらのワクチンによりインフルエンザウイルス感染を一度解決してマウスを免疫化することにより、初回刺激マウスモデルでモニターする。
実施例４
二重挿入ｒＭＶＡベクターの構築および特徴決定
【００５５】
以下の二重挿入ｒＭＶＡおよび対照を、本明細書に記載される実験に利用する。
【表４】
2014506785.tif 000005
【００５６】
ｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅのいずれかの遺伝子カセットを、ＮＰタンパク質遺伝子カセットと組み合わせて同時発現する二重挿入ｒＭＶＡベクターの構築では、ｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ遺伝子カセットを含有する実施例２の単一挿入ＭＶＡ組換え型を使用する。ＣＥＣ細胞をＭＶＡ−ｈｌＨＡまたはＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍｅ２に感染させ、その後ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＮＰ−ＶＮでトランスフェクトした（実施例２を参照されたい）。組換えＭＶＡベクターの相同組換え、および繁殖を、実施例２に記載されたとおりに実施する。ＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰまたはＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰと呼ばれる、得られた二重挿入ＭＶＡベクターは、Ｄ４Ｒ／Ｄ５Ｒ遺伝子座にｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ発現カセット、およびｄｅｌ  ＩＩＩ遺伝子座にＮＰ発現カセットを含有する。図７を参照されたい。
【００５７】
組換えＭＶＡを、実施例２に記載されたウエスタンブロットにより特徴決定した。図８Ａは、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰ（レーン６）またはＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰ（レーン５）によるＣＥＣの感染後の、ｈｌＨＡおよびｈｌＨＡ／Ｍ２ｅの発現を示す。レーン３および６における４０ｋＤａ前後のバンドは、ＭＶＡ−ｈｌＨＡおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰ構築物のｈｌＨＡを表す。レーン５における７０ｋＤａ前後のバンドは、ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ融合タンパク質を表す。ＨＡのバンドは、レーン４の野生型対照では不在である。同じ試料を、ウエスタンブロットによるＮＰタンパク質発現の検出に使用した（実施例２に記載されている）。図８Ｂに示されているように、組換えＭＶＡのＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰも、鳥類ＣＥＣ細胞にＮＰタンパク質の発現を誘導した。レーン２〜４における６０ｋＤａ前後のバンドは、ＮＰを表す。
実施例５
二重挿入ワクチンまたはベクターの組み合わせによる動物実験
保護実験
【００５８】
標準的な実験は、各群が６匹の動物から構成される８群のマウス（表５に示されている６つのワクチンおよび対照でワクチン接種された）を含んだ。保護試験を、実施例３に記載されたとおりに実施した。攻撃の後、マウスを１４日間にわたってモニターし、体重減少、または逆毛（スコア１）、湾曲姿勢（スコア２）、感情鈍麻（スコア３）、および死亡（スコア４）を含む症状を記録した。倫理的な理由により、マウスを２５％以上の体重減少後に安楽死させた。保護の結果を表５にまとめ、図９および１０に示す。
【表５】
2014506785.tif 000006
【００５９】
陽性対照マウスを同種対照構築物でワクチン接種した。Ｈ５Ｎ１攻撃の場合では、マウスをＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ（Ｈｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）でワクチン接種し、Ｈ９Ｎ２攻撃の場合では、マウスを、Ｈ９Ｎ２  Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｇ９／１９９７インフルエンザウイルスの不活性化全ウイルス調製物でワクチン接種した。両方の対照は、完全な保護を誘導した（表５；図９および１０のパネルＥ）。野生型ＭＶＡおよび緩衝液群では、全てのマウスが、陽性対照群と比較して著しい体重減少を示し、大半のマウスが攻撃の後に死亡した。単一組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈｌＨＡ、ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ、ＭＶＡ−Ｄ３−ＮＰ−ＶＮ）でワクチン接種されたマウスは、陰性対照群と比較して、強力なＨ５Ｎ１攻撃の後で有意に良好な保護を示さなかった（図９Ａ〜Ｆ）。また、ヘテロサブタイプ（Ｈ９Ｎ２）攻撃に対して、有意な保護がＭＶＡ−ｈｌＨＡおよびＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅワクチン接種群において見られなかった（図１０）。
【００６０】
しかし、驚くべきことに、融合タンパク質ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅおよびＮＰタンパク質を発現する二重構築物によるワクチン接種は、動物１匹あたり約３０  ＬＤ５０のＨ５Ｎ１攻撃の後、ほぼ完全な保護をもたらした（図９Ｂ、Ｄ、Ｆ）。また、ヘテロサブタイプ攻撃（約３２  ＬＤ５０のＨ９Ｎ２ウイルスによる）の後、マウスは、二重組換えＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰによるワクチン接種の後で完全に保護された。更に、二重組換えＭＶＡ−ｈｌＨＡ−ＮＰおよび単一組換えＭＶＡ−ＮＰ−ＶＮは、Ｈ９Ｎ２によるヘテロサブタイプ攻撃に対して完全な保護を誘導した（図１０Ｂ、Ｄ、Ｆ）。体重モニタリング（図９および１０のパネルＢ）、ならびに臨床スコア（図９および１０のパネルＤ）において分かるように、二重構築物ＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−ＮＰは、恐らく異なるインフルエンザ抗原により寄与される有益効果の組合せによって、最良の結果を示した。
Ｔ細胞実験
【００６１】
インフルエンザ特異的ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、フローサイトメトリーにより免疫化マウスにおいて決定する。標準的なプロトコールの実験において、５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、表４に提示されたワクチンまたは対照で２回免疫化する。脾細胞を、ＣＤ４  Ｔ細胞に対する異なるインフルエンザ株の不活性化全ウイルス抗原、入手可能であれば、ワクチン挿入構築物のＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを表すペプチドを使用してインビトロで再刺激して、ＩＦＮγ生成を測定する。全ての実験を２回実施する。
他の実験
【００６２】
単回免疫化の後の細胞仲介免疫性の評価、ＶＩＴＡＬアッセイにおける細胞毒性Ｔ細胞の機能的活性の実証、および攻撃された動物の肺へのインフルエンザ特異的Ｔ細胞の動員の評価も実施する。ワクチン特異的Ｔ細胞の誘導／拡大も、これらのワクチンによりインフルエンザウイルス感染を一度解決してマウスを免疫化することにより、初回刺激マウスモデルでモニターする。
実施例６
三重挿入ｒＭＶＡベクターおよびウイルス様粒子の構築および特徴決定
【００６３】
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、液性および細胞性応答を誘導し、致死的な攻撃に対して保護することができる（Ｂｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｐｕｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。本明細書の実験に選択されたＶＬＰは、ｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅのいずれかをＮＰおよびＭ１と組み合わせて含む。ＶＬＰは、三重挿入ＭＶＡベクターから生成される。
【００６４】
ｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅのいずれかをＭ１（配列番号１１）およびＮＰタンパク質（配列番号１３）と組み合わせて同時発現する三重挿入ＭＶＡベクターの構築では、ｐＤＤ４−Ｍ１−ＶＮのＭ１遺伝子（配列番号１０）を、合成初期／後期プロモーターｓｅｌＰの下流でクローンする（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。得られた遺伝子カセットを、ｐＤＭ−ｈｌＨＡまたはｐＤＭ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅにおけるｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ遺伝子カセットの下流でクローンする。二重遺伝子カセット（ｐＤＭ−ｈｌＨＡ−Ｍ１およびｐＤＭ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−Ｍ１）を持つ、得られたプラスミドを、上記に記載された欠損ＭＶＡへの組換えに使用する。その後、ＮＰ遺伝子カセット（配列番号１２）含有プラスミド（ｐＤ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔ−ＮＰ−ＶＮ）による組換えを実施して、三重挿入ＭＶＡウイルスをもたらす。この三重挿入ＭＶＡは、一過性マーカー選択下で精製されるプラークである。
【００６５】
ＭＶＡ−ｈｌＨＡ−Ｍ１−ＮＰまたはＭＶＡ−ｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ−Ｍ１−ＮＰと呼ばれる、三重挿入ＭＶＡベクターは、Ｄ４Ｒ／Ｄ５Ｒ遺伝子座にｈｌＨＡまたはｈｌＨＡ／Ｍ２ｅ発現カセット、およびＭ１発現カセットをタンデムオーダーで、ならびにｄｅｌ  ＩＩＩ遺伝子座にＮＰ発現カセットを含有する（図７）。
【００６６】
ＶＬＰの検出は以下のとおりである。ＨｅＬａまたは２９３細胞を、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコの中に接種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで増殖させる。ＶＬＰを生成するために、細胞を１ＭＯＩの単一挿入ＭＶＡまたは三重挿入ＭＶＡ組換え型にそれぞれ感染させる。空ＭＶＡベクターまたはＭ１を有さない単一挿入ＭＶＡ組換え型を対照として使用する。感染後（ｐ．ｉ．）の１時間時点で、培地をＤＭＥＭ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐに代え、培養培地を感染から４８時間後に採取し、細胞片を、２，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化する。スクロース勾配密度浮選およびスクロースクッションによってＶＬＰを分析する手順は、以前に記載されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。次に、試料をイムノブロッティングによって分析する。加えて、感染させた細胞の培地を用いる、電子顕微鏡法（ＥＭ）分析を実施する。
実施例７
三重挿入ワクチンまたはベクターの組み合わせによる動物実験
【００６７】
標準的な実験は、各群が６匹の動物から構成され、結果的に３６匹の動物になる（１セット）６群の初回刺激した、および初回刺激なしのマウス（表５に示されている６つのワクチンおよび対照でワクチン接種した）を含む。動物を、表３に示された６つの攻撃ウイルスのうちの１で攻撃する。要約すると、それぞれ７２匹の動物の６セットが存在し、初回刺激および未変性モデルにおける交差保護を評価するために４３２匹のマウスを必要とする。
【表６】
2014506785.tif 000007
【００６８】
本発明は前述の実施例によって例示されており、その変形は当業者に明らかである。したがって、以下の特許請求の範囲に記載のもの以外の限定は、本発明に付与されるべきではない。
【００６９】
本出願に引用される全ての文献は、記載された開示の全体が参照として本明細書に組み込まれる。
引用文献
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【図１】
2014506785.tif 000008
【図２】
2014506785.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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