(57)【要約】  本発明は、温度感受性のエラスチン型のバイオポリマー、およびそれを含んでいる細胞回収支持体、ならびに培養温度を低下させることによって容易かつ効率的に回収を実施可能にする細胞を回収する関連する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造［Ｄ−Ｂｎ−Ａｍ−Ｂｓ］を有して、ペプチドＡ、ＢおよびＤを含んでおり、
Ａは、構造（Ｆｔ１−Ｇ−Ｆｔ２）を有しており、
Ｆは、構造Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を有しており（ここで、Ｘ１およびＸ４は、アミノ酸のプロリン、リジン、セリンおよびシステインを除く、任意のアミノ酸であり得、Ｘ２はアミノ酸のプロリンであり、Ｘ３はアミノ酸のグリシンまたはアラニンであり得、Ｘ５はアミノ酸のグリシンである）、
Ｇは細胞結合配列であり、
ｔ１およびｔ２は８〜１２の値を有しており、
Ｂは、構造Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｙ５を有しており（ここで、Ｙ１およびＹ４は、アミノ酸のプロリン、リジン、セリンおよびシステインを除く、任意のアミノ酸であり得、Ｙ２はアミノ酸のプロリンであり、Ｙ３はアミノ酸のグリシンまたはアラニンであり得、Ｙ５はアミノ酸のグリシンである）、
Ｄは、リジン、システイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでいる一覧から選択される２〜１０の同じか、または異なるアミノ酸のペプチドを含んでおり、
ｎは１０〜１８の値であり、
ｍは１〜３の値であり、
ｓは１０〜１８の値である、バイオポリマー。
【請求項２】
Ｇは、ＲＧＤ、ＬＤＴ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９、またはヘパリン結合ドメイン、もしくはレシチン由来もしくはアグルチニン由来の糖に対する結合ドメインを含んでいる一覧から選択されるペプチドを含んでいるアミノ酸配列である、請求項１に記載のバイオポリマー。
【請求項３】
ＧはＲＧＤドメインを含んでいる、請求項１または２に記載のバイオポリマー。
【請求項４】
Ｇは配列番号１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項５】
Ｘ１は、アミノ酸のバリン、ロイシンまたはイソロイシンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項６】
Ｆは配列番号２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項７】
Ｙ１は、アミノ酸のバリン、ロイシンまたはイソロイシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項８】
Ｂは配列番号３である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項９】
Ｄは、アミノ酸のリジン、システイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでいる一覧から選択される３〜５の同じか、または異なるアミノ酸のペプチド含んでいる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１０】
Ｄが構成されている上記ペプチドの上記同じか、または異なるアミノ酸は、リジン、システイン、セリン、アスパラギンおよびグルタミンを含んでいる一覧から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１１】
Ｄが構成されている上記ペプチドの上記アミノ酸は、同じであり、アミノ酸のリジンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１２】
ｔ１およびｔ２は９〜１１の値である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１３】
ｎは１２〜１６の値を有している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１４】
ｍは１〜２の値を有している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１５】
ｓは１２〜１６の値を有している、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１６】
Ｄは配列番号４のペプチドであり、Ｂは配列番号３のペプチドであり、ｎおよびｓは１４の値を有しており、Ｆは配列番号２のペプチドであり、ｔ１およびｔ２は１０の値を有しており、Ｇは配列番号１のペプチドであり、ｍは２の値を有している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のバイオポリマー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマーのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、核酸。
【請求項１８】
発現ベクターである、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の核酸を用いてトランスフェクトされている、単離された細胞。
【請求項２０】
細胞を回収する足場を調製するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマー、請求項１７もしくは１８に記載の核酸、または請求項１９に記載の細胞の、使用。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマーを含んでいる、細胞を回収する足場。
【請求項２２】
上記バイオポリマーおよび足場の間における接続は、１分子のバイオポリマーにつき少なくとも２つの共有結合、好ましくは３つの共有結合を含んでいる、請求項２１に記載のの細胞を回収する足場。
【請求項２３】
ペプチドＤの上記アミノ酸のうち少なくとも２つの側鎖におけるアミノ基またはカルボキシル基は、反応して、上記共有結合を形成している、請求項２２に記載の細胞を回収する足場。
【請求項２４】
その表面が平坦であるか、または湾曲していることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞を回収する足場。
【請求項２５】
微小粒子を含んでいることを特徴とする請求項２４に記載の細胞を回収する足場。
【請求項２６】
上記微小粒子は球状または偽球状である、請求項２５に記載の細胞を回収する足場。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の足場の、細胞を回収するための使用。
【請求項２８】
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の足場を備えている、細胞培養器具および細胞回収器具。
【請求項２９】
請求項２５に記載の細胞回収器具の、細胞培養および細胞回収のための使用。
【請求項３０】
請求項２８に記載の細胞培養器具の、バイオリアクタにおける細胞培養のための使用。
【請求項３１】
以下の段階：
（ａ）細胞培養足場の機能化、
（ｂ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマーのペプチドＤからの少なくとも２つのアミノ酸に、段階（ａ）において機能化された上記足場を共有結合させること、
（ｃ）細胞懸濁物を、（ｂ）において得られた足場と接触させること、および
（ｄ）上記足場に接着した細胞を回収すること
を包含している、細胞を回収する方法。
【請求項３２】
上記足場は、アルキニル基、アルケン基、ニトリル基、カルボニル基またはイミン基を用いて機能化される、請求項３１に記載の細胞を回収する方法。
【請求項３３】
上記足場の機能化はアルキニル基を用いて実施される、請求項３１または３２に記載の細胞を回収する方法。
【請求項３４】
上記足場に接着した上記細胞は、細胞培養の温度を１０℃から３７℃に下げることによって回収される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の細胞を培養する方法。
【請求項３５】
以下の段階：
（ｃ’）細胞が増殖し、かつ単層を形成するまで、（ｃ）からの細胞を培養すること
が、段階（ｃ）および（ｄ）の間に実施されることを特徴とする請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の細胞を培養する方法。
【請求項３６】
段階（ｂ）の前に、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマーのペプチドＤからの、少なくとも２つのアミノ酸の側鎖における反応性基は、アジド基に変換される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の細胞を回収する方法。
【請求項３７】
段階（ｂ）の上記共有結合は付加環化によって形成される、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の細胞を培養する方法。
【請求項３８】
以下の段階：
（ａ）請求項１７または１８に記載の核酸の発現に適した条件のもとに、請求項１９に記載の細胞を培養すること、
（ｂ）上記核酸によってコードされている上記バイオポリマーを精製すること
を包含している、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマーを得る、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組織工学の分野に属し、バイオポリマー、および効率的かつ簡便に細胞を回収可能な、当該バイオポリマーを含んでいる細胞を回収する足場に関する。足場に結合された細胞は、単純な温度変化によって解放され、細胞表面のタンパク質を保護し、高い細胞生存度を維持する。さらに、表面は、種々の細胞に対する選択性を全体的または局所的に示し、温度感受性のバイオポリマーが足場に共有結合されているときに生成された組織に残余物を放出しない。
【０００２】
〔従来技術〕
組織工学の分野において、種々の材料の、生細胞との組合せは、再生医療を行う興味深い新規な手段をもたらす。表面は、接着もしくは非接着の特性、材料と細胞との間における相互作用を促進する特定の基、自動式の作用（刺激に対する感受性）、または微小パターンもしくはナノパターンをそれらに与えるために機能化され得る。
【０００３】
自動式の表面および薬剤放出系の両方、再生医療用の人工臓器および人工の系は、生物医学的な研究分野において特に興味深い特性を有している新たな生物機能材料を用いて一般的に開発され、当該材料は異なる刺激に感受性である。より詳細には、広範な刺激（例えば、光、温度、ｐＨ、イオン強度または電界）に感受性の材料は、そのような用途に利用可能である。特定の刺激は、種々の生体分子の状態またはコンフォメーションを変化させ得、これによって特定の表面に対するその親和性を変え、結果としてそれらの吸着を妨げる（Hyun, J. et al. 2004 Journal of the American Chemical Society. 126, 7330-7335）。つまり、そのような系は刺激に応答する。
【０００４】
一部の材料から得られた温度感受性の表面は、周囲の温度変化に応じて分子コンフォメーションの変化を受ける。いくつかのポリマーは、温度に応じて逆の挙動を示す。そのようなポリマーは、温度が上昇するにつれて溶解されにくくなり、“下限臨界溶液温度”（ＬＣＳＴ）として知られる温度において溶液から沈殿する。生体用途に使用されるこれらの特性に答えるポリマーとしては、Ｎ−アルキル置換されたポリアクリルアミド、ポリアルコールまたはポリペプチドが挙げられる。後者は、天然物であり得るか、または遺伝子工学的手法を用いて生成され得、結果として、高レベルの特異性を有しており、多数の用途にとって特別の基を含んでおり、生分解性でさえある。エラスチン様ポリマー（ＥＬＰ）は、そのようなポリペプチドの優れた例である（Cole, M. A. et al. 2009 Biomaterials. 30, 1827-50）。
【０００５】
細胞（より詳細には細胞シート）の培養および解放は、温度感受性の自動式の表面が使用される生物医学的な用途の、最も広く研究され、最も興味深い１つである。
【０００６】
そのような温度感受性の系にとっての、最も一般的に広く研究されているモデルは、おそらく、Okanoによって開発されたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）である。ＰＩＰＡＡｍは、水溶液において３２℃のＬＣＳＴを示す。上記温度以下において、ＰＩＰＡＡｍは、伸びたコンフォメーションを有して水溶液において完全に水和されており、上記ＬＣＳＴを超えると、脱水され、密集する。このようにして、ＰＩＰＡＡｍ表面は、温度に基づいて調節される分子相互作用を可能にしており、タンパク質ならびに細菌細胞および哺乳類細胞の、温度感受性の可逆的な接着／剥離研究の多数がみられる（Cole, M. A. et al. 2009 Biomaterials. 30, 1827-50）。
【０００７】
転位温度以上（３７℃）において崩壊状態をとることによって、広範な細胞の培養を可能にするＰＩＰＡＡｍの特性と、類似する温度応答特性を有している種々のポリマーが、公知である。ポリマーについての臨界温度未満への温度の低下は、当該ポリマーに、展開を起こさせ、かつ生細胞または細胞がコンフルエントである場合の完全な細胞シートを解放させ始める。温度を低下させることによって簡単に、個々の細胞または完全な細胞シートを迅速に回収することが可能である（Kikuchi, A et al. 1998. Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition. 9, 1331-1348）。
【０００８】
表面からの細胞の解放は、当該表面に結合されているポリマーの自発的な水和の結果としての細胞および表面の間における相互作用の低下、ならびに細胞の形態および代謝活性の能動的な変化の両方にともなって生じる。したがって、単純な温度変化の結果として、そのような温度感受性ポリマーは、多数の細胞種のコンフルエントな培養物を、細胞外マトリクスにおける細胞間相互作用、ならびに細胞およびタンパク質の間における相互作用を維持している組織であり得る層と類似の、細胞層として回収可能にする（Kushida, A., et al. 1999. Journal of Biomedical Materials Research. 45, 355-362）。
【０００９】
培養物からの細胞の取り出しは、回収される細胞の形態に対する有害な影響を有している酵素的または機械的な激しい方法を常に要する。最近、そのような形態の変化は、細胞膜および糖衣に対する変化の結果とみなされており、細胞の活性の低下をしばしばもたらす。また、そのような変化は、細胞の接着、増殖および分化に必須な細胞外マトリクスに影響し、これによって細胞培養における重要な意味を有していると示されている。温度の低下によって細胞を剥離する方法は、単層の細胞を得ることについて、はるかに有害ではないと証明されている。さらに、上記方法は、他のより従来の方法および技術と比べて、細胞外マトリクスに対する非常に小さい影響を有している。実施に、細胞外マトリクスに対する任意の損傷が明らかにない細胞シートが、入手され得る（Canavan, H. E., et al. 2005. J Biomed Mater Res A. 75, 1-13）。上記手法は、広範な細胞種（平滑筋細胞、肝細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞、マクロファージ、小グリア細胞および幹細胞が挙げられる）に対して首尾よく適用されている。
【００１０】
ＰＩＰＡＡｍによって機能化された表面から回収された細胞シートを用いて、Okano et al.は、広範な疾患（例えば、角膜機能障害、食道がん、気管切除および心臓の不具合）を処置するための多層の機能的な組織を作り出すための細胞シート工学として知られている技術を確立している。より近年には、臓器（例えば、心臓および肝臓）に近い系を得るための、細胞、および高度に血管が発達し、堆積した細胞外マトリクスを含んでいる三次元組織（Yang, J. et al. 2007 Biomaterials. 28, 5033-43）。
【００１１】
この分野におけるさらなる大きな進歩は、同じ表面上にある異なる細胞種の接合培養物である。例えば、表面を、異なる転位温度および細胞接着配列を有している異なる２つの温度感受性ポリマーを用いて被覆し、これによって系の制御を可能にしている（Tsuda, Y. et al. 2005 Biomaterials. 26, 1885-93）。
【００１２】
他の戦略は、細胞接着を促進するＲＧＤといったペプチド（Ozturk, N. et al. 2009. Biomaterials, 30, 5417-26）、インスリンといった成長因子、上皮成長因子、または自動式の表面における細胞結合および細胞と材料との間における連絡を促進するための（Ebara, M. et al. 2008 Advanced Materials 20, 3034-3038；Mie, M. et al. 2008 J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 86, 283-90）、接着特性を有している温度感受性のＥＬＰ（Hatakeyama, H. et al. 2006 Biomaterials. 27, 5069-78）の固定化に関する。この手法は、さらなる成長因子を必要としないので、組織工学の分野におけるそのような系の潜在性を示している。さらに、異なる細胞種は、特異的な細胞接着ドメインを用いることによって選択され、分離される（例えば、ＲＥＤＶドメインを用いた内皮細胞）（Girotti, A., et al. 2004 J. Mater. Sci.: Mater.  Med. 15, 479-484）。このようにして、天然ポリペプチド、または反復性の遺伝子の合成に利用可能な組換えＤＮＡ手法を介した遺伝子工学的手法を用いた合成ポリペプチドは、医学用途における多くの潜在性を示している。これは、細胞接着ドメイン、表面に対する共有結合のための架橋ドメインおよび／またはそのようなポリペプチドを生分解するより低い特異性のプロテアーゼによって認識され得るドメインとともに官能基を含んでおり、高レベルの特異性を有しているそのようなペプチドが、生成され得るからである。単一のポリマーは、異なるドメインを含み得、温度に対する自動式の応答を維持している。ＥＬＰは、そのようなポリマーの最たる例の一部である。例えば、Na et al.は、ＥＬＰ吸着による表面を生じさせるための外部刺激に対する自動式の材料の急速な応答によってもたらされる利点を利用することによって、細胞に基づくバイオチップを開発している。ＥＬＰの自動式の変化は、そのような化合物がガラス表面に結合されている場合に、当該表面が、温度に依存して疎水性から親水性に、かつその逆に変化し、このようにしてインキュベーション温度による可逆的な細胞接着の制御を可能にすることを意味している（Na, K. et al. 2008 Langmuir. 24, 4917-23; Rodriguez-Cabello, J.C. et al. 2010 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1-35）。
【００１３】
さらに、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用いて、小さくかつ単純な温度の低下によって個々の細胞または細胞シートを剥離し、かつ細胞に基づく多層を生成するために当該細胞およびシートを新たな表面に移すことが、可能であり、これによってそのような手法の多くの潜在性を示唆していると示されている（Zhang, H. et al. 2006 Tissue Eng. 12, 391-401）。
【００１４】
この提案を継続させて、Mie et al.は、温度の低下によって培養プレートからの細胞シートの回収を目的とする、異なる機能性（ポリヒスチジン尾部およびＲＧＤ配列）を有している２つのＥＬＰを含んでいる新たな細胞外マトリクスを開発するために、遺伝学的手法を使用している（Mie, M. et al. 2008 J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 86, 283-90）。
【００１５】
したがって、それらによって医学用途に大きな潜在性をもたらす、温度に対する自動式の特性、生体適合性、ならびにその配列に対して細胞接着ドメイン、架橋ドメインまたは生分解性ドメインを組み込む能力のために、ＥＬＰは、細胞回収にとっての優れた候補物である。さらに、そのような系は、非機械的な細胞回収およびトリプシンなしの細胞回収に好適であり、それによってそのような処置に存在する欠点（例えば、多大な経験の必要、および細胞の生存度の低下を後にともなう細胞表面にあるタンパク質に対する損傷）を回避する。
【００１６】
〔発明の説明〕
本発明は、バイオポリマー、バイオポリマーを含んでいる温度感受性の生物活性な表面、および細胞回収のためのそれらの利用に関する。
【００１７】
本発明のバイオポリマーの温度感受性の性質は、サンプルの温度変化の結果として効率的かつ迅速な細胞回収を可能にし、従来技術に説明されている他の方法を用いて実現される生存度より高い生存度を実現する。さらに、１つ以上の細胞腫に特異的な細胞結合配列を有しているバイオポリマーを設計可能であるため、組織工学用の選択的な基材を構築可能である。
【００１８】
例えば、（１）表面に堆積したポリマーの一部が、次の段階に持ち越される混入物としてシートまたは細胞に導入されて、これが結果としてリスクをともない、（２）シートにおける異なる細胞種を、規則正しくか、または構造化して、効率的に集めるか、または配置することが依然として不可能であるように、従来技術に説明されている系は、いくつかの欠点を示す。この意味において、表面に対して無差別に堆積されるにも関わらず、系が細胞回収のために温度感受性かつ有用であり続けるように、ポリマーは、共有結合によって制御されてグラフトされるので、本発明のポリマーは大きな利点を示す。
【００１９】
本発明者らは、効率的かつ単純な方法における細胞回収を可能にする表面細胞培養系について述べている。細胞が培養される表面は、異なる細胞種を選択的に結合する、温度感受性のバイオポリマーの共有結合を可能にするために、修飾される。表面に対して結合された細胞は、細胞表面タンパク質を保護し、かつ高い細胞生存度を維持する単純な温度変化によって、解放される。さらに、細胞は、培養表面の全体または局所に結合し得る。
【００２０】
使用される温度感受性のバイオポリマーが共有結合を介して表面にグラフトされているので、生じた組織の解放は、残余のバイオポリマーを持ち越すことなしに起こる。
【００２１】
本発明のバイオポリマーは、無毒な、したがって細胞との相互作用に好適な、天然エラスチンに見られるドメインの反復に基づいている。さらに、本発明のバイオポリマーは、細胞結合配列に基づく生物活性な中央のドメイン、および例えば培養表面に対する共有結合のための、反応性基（例えばリジンのアミノ基）を含んでいるドメインを示す。
【００２２】
本発明のバイオポリマーは、組換えＤＮＡ手法を用いて生成されている。
【００２３】
同様に、本発明は、本発明のバイオポリマーのアミノ酸配列をコードしている核酸、その利用および核酸を合成する方法に関する。
【００２４】
グラフトしたポリマーを用いて生物活性化された表面は、“クリック”ケミストリーを用いて、本発明において生成される。それにおける選択的な細胞接着、細胞増殖および組織成長を誘導する上記表面は、その生物活性を切り替え、制御する方式として温度に応答する。このようにして、いったん細胞が培養されるか、または組織もしくは細胞層が形成されると、細胞、組織または細胞層は、損傷または汚染を受けることなく上記表面から剥離され、したがって、細胞回収系が、高速であり、取扱い易く、効率的であることを示している。さらに、細胞が表面の異なる領域とより強い親和性を有しており、同じパターンにしたがって単層に自身を構造化さえし得るように、表面上のパターンをあらかじめ決定可能である。
【００２５】
結果として、本発明は３本の柱に基づいている。それらの第１は、バイオポリマーの温度感受性の結果として、足場の細胞接着能力を無効にする潜在性である。第２は、異なる生物活性または特異的な細胞結合配列を有しているバイオポリマーを設計する潜在性である。第３は、表面が以前の特性を保持するように、制御して持続的に表面に対してポリマーをグラフトする能力である。
【００２６】
バイオポリマーは、高度な効率、複雑さ、制御および頑健さを有して得られる。アミノ酸の疎水性が考慮される通りに、その特性は生じている。したがって、これらの材料に生じる逆転移現象の定量的かつ正確な制御、したがって生物活性から非生物活性にこれらのポリマーが変化する温度（Ｔｔ）の定量的かつ正確な制御が、可能である。
【００２７】
バイオポリマーは、本発明のバイオポリマーのアミノ酸配列をコードしている核酸配列を、当該配列を発現可能なベクターにクローニングすることによって、組換えＤＮＡ手法を用いて得られている。この手法は、バイオポリマーを生成するための生物の複製、転写および翻訳の機序を利用している。
【００２８】
本発明のバイオポリマーは、必要な温度応答性をバイオポリマーに付与する側方のエラスチン様ドメインを含んでいる。さらに、バイオポリマーは、細胞結合配列（ＲＧＤ、ＲＥＤＶなど）を含んでいる中央の生物活性ドメインを含んでいる。最後に、バイオポリマーは、それらの末端に化学反応性ドメイン（例えば、リジンのアミノ基など）を含んでいる（図１）。
【００２９】
表面に対するポリマーのグラフティングは、表面の活性化に続いて、“クリック”型の付加環化反応を介して共有結合することによるそれらの二機能化によって実施される。いったん二機能化されると、細胞を、表面に播き、組織形成が生じるまで培養する。この段階において、温度を、生物活性なポリマーにとっての転位温度より低い値まで下げ、これによって、ポリマーのコンフォメーションを変更させて、細胞層が同時に分離する非接着基材を生じさせる。
【００３０】
分子レベルにおける接着−分離現象の説明は、ナノスケールにおける分枝鎖の自己組織化に基づいており、当該組織化は、系における温度変化の結果として生じる。この過程において、鎖は、培養温度および水の存在下において、極性の細胞結合ドメインが外側に露出される傾向にある折りたたまれたコンフォメーションとして存在している。温度を低下させることによって、これらの鎖は、展開され、細胞結合ドメインを細胞と接触不可能な状態にし、細胞が剥離する非接着表面を形成する（図２）。
【００３１】
したがって、本発明の第１の局面は、構造［Ｄ−Ｂｎ−Ａｍ−Ｂｓ］を有して、ペプチドＡ、ＢおよびＤを含んでいるバイオポリマーに関する。
【００３２】
上記バイオポリマーにおいて、Ａは構造（Ｆｔ１−Ｇ−Ｆｔ２）を有しており、
Ｆは、構造Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を有しており（ここで、Ｘ１およびＸ４は、アミノ酸のプロリン、リジン、セリンおよびシステインを除く、任意のアミノ酸であり得、Ｘ２はアミノ酸のプロリンであり、Ｘ３はアミノ酸のグリシンまたはアラニンであり得、Ｘ５はアミノ酸のグリシンである）、
Ｇは細胞結合配列であり、
ｔ１およびｔ２は８〜１２の値を有しており、
Ｂは、構造Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｙ５を有しており（ここで、Ｙ１およびＹ４は、アミノ酸のプロリン、リジン、セリンおよびシステインを除く、任意のアミノ酸であり得、Ｙ２はアミノ酸のプロリンであり、Ｙ３はアミノ酸のグリシンまたはアラニンであり得、Ｙ５はアミノ酸のグリシンである）、
Ｄは、リジン、システイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでいる一覧から選択される２〜１０の同じか、または異なるアミノ酸のペプチドを含んでおり、
ｎは１０〜１８の値であり、
ｍは１〜３の値であり、
ｓは１０〜１８の値である。
【００３３】
ペプチドＡは、細胞結合ドメインを含んでいる生物活性なアミノ酸配列である。ペプチドＢおよびペプチドＦの両方はエラスチン様ドメインである。ペプチドＤは、当該ペプチドが、それらの側鎖に含まれている反応性基を介した、表面に対するバイオポリマーの共有結合性のグラフティングを可能にするような極性アミノ酸を含んでいる反応性ドメインである。
【００３４】
本発明のバイオポリマーを生じさせる上述の構造にしたがえば、アミノ酸配列（“ペプチド”という用語はアミノ酸配列を指すために区別することなく使用され得る）Ａ、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは、共有結合によってか、または本発明のバイオポリマーの特性を維持する構造を導く任意の他の型の結合によって、結合され得る。上記結合は、水素結合、イオン対化、疎水性結合、または包接複合体形成を含んでいる一覧から選択され得るが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、Ｇは、ＲＧＤ、ＬＤＴ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９、またはヘパリン結合ドメイン、もしくはレシチン由来もしくはアグルチニン由来の糖に対する結合ドメインを含んでいる一覧の中から選択されるペプチドを含んでいるアミノ酸配列である。ＧはドメインＲＧＤを含んでいることが好ましい。Ｇは配列番号１であることがより好ましい。
【００３６】
ＲＧＤドメインは、周知であり、その名称が示す通り、アミノ酸のアルギニン、グリシンおよびアスパラギン酸を含んでいる。ＲＧＤドメインは、種々の細胞種の細胞表面に由来するタンパク質によって認識され、細胞接着ドメインとして機能する。また、配列番号１６は、周知のＲＥＤＶドメインであり、当該ドメインは、その名称が示す通り、アミノ酸のアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびバリンを含んでいる。また、ＲＥＤＶドメインは、細胞接着ドメインとして機能し、内皮細胞によって認識される。ヘパリン結合ドメインは、当該ドメインが細胞表面上のグルコサミノグリカンに結合して細胞結合ドメインとして機能する。糖結合ドメインは、膜糖タンパク質によって提示されている糖を介した細胞に対する結合を可能にする。レシチンおよびアグルチニンは、周知の糖結合ドメインを有している。配列番号１８は、ラミニンに存在しており、種々の細胞種によって認識され、配列番号１９は神経突起（すなわちニューロンの細胞体からの任意の突起（樹状突起または軸索））によって認識される。本発明のバイオポリマーの一部を形成しているこれらの配列は、それぞれの細胞種によって認識され、それらの結合を促進する。配列番号１６または配列番号１９を含んでバイオポリマーは、それぞれ脈管組織または神経組織を生成するために使用される。
【００３７】
Ｇドメインは、本発明の実施例によって示されているような細胞回収系として本発明のバイオポリマーが適切に作用するために、効率的な細胞結合配列を付与する必要がある。
【００３８】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、Ｘ１はアミノ酸のバリン、ロイシンまたはイソロイシンである。Ｆは配列番号２であることが好ましい。
【００３９】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、Ｙ１はアミノ酸のバリン、ロイシンまたはイソロイシンである。Ｂは配列番号３であることが好ましい。
【００４０】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、Ｄは、リジン、システイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでいる一覧から選択される、同じか、または異なる３〜５のアミノ酸のペプチドを含んでいる。
【００４１】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、Ｄが構成されている上記ペプチドの同じか、または異なる上記アミノ酸は、リジン、システイン、セリン、アスパラギンおよびグルタミンを含んでいる一覧から選択される。Ｄが構成されている上記ペプチドは、同じであり、アミノ酸のリジンである。
【００４２】
ドメインＤは、側鎖に反応性基が存在する少なくとも２つのアミノ酸を含んでおり、当該基は、その末端の１つを介した共有結合によって、細胞表面にバイオポリマーをグラフトすることを可能にする反応に必要である。したがって、Ｄは、側鎖に反応性基を有している２〜１０の極性アミノ酸（例えば、リジン、システイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸）を含んでおり、好ましくは２〜５のそのようなアミノ酸を含んでいる。
【００４３】
アミノ酸のリジン、システイン、セリン、アスパラギンおよびグルタミンは、当該アミノ酸の側鎖におけるアミン基の、アジドへの変更によるバイオポリマーおよび表面の間の共有結合にとって好ましい。そのようなアミノ酸がＤドメインに使用されている場合、当該ドメインはバイオポリマーのＮ末端に配置される。その側鎖におけるアミン基が、本発明の実施例から明らかなように、アジド試薬を用いた求核置換反応を受けるので、リジンは、バイオポリマーのＤドメインおよび培養物表面の間に共有結合を形成するために好ましいアミノ酸である。
【００４４】
また、カルボキシル基を側鎖に有しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）は、この場合に当業者に周知の他の反応によって、バイオポリマーの末端を表面に共有結合させるために使用され得る。そのようなアミノ酸がＤドメインに使用される場合、バイオポリマー自身の末端カルボキシル基も表面との共有結合の形成に関与し得るように、当該ドメインは、バイオポリマーのＣ末端に配置される。
【００４５】
その側鎖におけるアミン基が、本発明の実施例から明らかなように、アジド試薬を用いた求核置換反応を受けるので、リジンは、バイオポリマーのＤドメインおよび培養物表面の間に共有結合を形成するために好ましいアミノ酸である。
【００４６】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、ｔ１およびｔ２は９〜１１の間の値を有している。
【００４７】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、ｎは１２〜１６の値を有している。
【００４８】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、ｍは１〜２の間の値を有している。
【００４９】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、ｓは１２〜１６の間の値を有している。
【００５０】
本発明の第１の局面のバイオポリマーの好ましい実施形態において、Ｄは配列番号４のペプチドであり、Ｂは配列番号３のペプチドであり、ｎおよびｓは１４の値を有しており、Ｆは配列番号２のペプチドであり、ｔ１およびｔ２は１０の値であり、Ｇは配列番号１のペプチドであり、ｍは２の値を有している。
【００５１】
本発明の第２の局面は、本発明の第１の局面のバイオポリマーのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸に関する。上記核酸は発現ベクターであることが好ましい。
【００５２】
“発現ベクター”（以下、発明のベクターまたは本発明のベクター）という用語は、一部の宿主において自身を複製可能なＤＮＡ断片に関し、当該用語が示す通り、発現ベクターに融合された他のＤＮＡ断片（挿入物）を増やすための輸送手段として機能し得る。挿入物は、ベクターに融合されるＤＮＡ断片に関し、本発明の場合、ベクターは、好適な宿主において自身を複製し得る当該ベクターに融合され、本発明のバイオポリマーのいずれかをコードしているヌクレオチド配列のいずれかを含み得る。ベクターとしては、ベクターの所定の定義に対応する任意の他の種類のベクターを除外することなく、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターが挙げられ得る。
【００５３】
本発明の第３の局面は、本発明の第２の局面の核酸を用いてトランスフェクトされた、単離された細胞に関する。
【００５４】
本発明に使用されるとき、細胞という用語は、原核細胞または真核細胞に関する。細胞は、形質転換された細胞外ＤＮＡを複製可能な細菌（例えば、Escherichia coli種の株のいずれか）、または植物の内部に所定のＤＮＡを移動可能な細菌（例えば、Agrobacterium tumefaciens）であり得る。細胞は、好ましくは真核の植物細胞、なかでもより好ましくは植物界に属する細胞に関する。したがって、細胞が植物細胞である場合、細胞という用語は、柔細胞、分裂細胞、または分化した細胞もしくは未分化細胞の任意の種類を少なくとも包含し得る。また同様に、プロトプラスト（細胞壁を欠く植物細胞）はこの定義に包含される。
【００５５】
“トランスフェクション”という用語は、プラスミド、ウイルスベクター（この場合には形質導入という用語も使用される）、または他の転移ツールを用いた外部のゲノム材料の、細胞への導入に関する。非ウイルス性の方法について、形質導入という用語は、真核の動物細胞への言及のために使用され、形質転換という用語は、細菌および非動物の真核細胞（例えば、真菌、藻類または植物）における遺伝物質の非ウイルス性の移入を説明するために好ましく選択される。
【００５６】
本発明の第４の局面は、本発明の第１の局面のバイオポリマー、本発明の第２の局面の核酸、または本発明の第３の局面の細胞の、細胞を回収する足場を調製するための使用に関する。
【００５７】
細胞を回収する“足場”という用語は、細胞が接着し得る任意の種類の表面である。細胞培養を可能にし、促進する１つ以上の分子（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチンなど）を用いて前処理され得る１つ以上の材料（例えば、細胞培養用に調製されたプラスティック、ガラスなど）を包含し得る、多数の細胞培養の足場（例えば、プレート、粒子、フラスコ、キュベットおよび多孔質表面の膜など）が、知られている。足場は、細胞が播かれる表面のみに関し、他の付属物（例えば、止め具、蓋など）を包含しない。
【００５８】
本発明の第５の局面は、本発明の第１の局面のバイオポリマーを含んでいる、細胞を回収する足場に関する。バイオポリマーおよび足場の間における接続は、好ましくはバイオポリマー１分子につき少なくとも２つ、より好ましくはバイオポリマー１分子につき少なくとも３つの共有結合をともなっている。ペプチドＤに由来する少なくとも２つのアミノ酸の側鎖のアミノ基またはカルボキシル基は、反応して共有結合を形成する。足場の表面は、平坦であるか、または湾曲していることが好ましい。足場は微粒子を含んでいることがより好ましい。上記微粒子は球状または偽球状であることが好ましい。
【００５９】
バイオリアクタの場合に、平坦面または広い面より、微粒子による細胞培養を実施することが所望され得る。
【００６０】
本発明の第６の局面は、本発明の第５の局面の足場の、細胞を回収するための使用に関する。
【００６１】
本発明の第７の局面は、本発明の第５の局面の足場を備えている細胞培養器具または細胞回収器具に関する。
【００６２】
細胞回収“器具”という用語は、細胞培養に必要とされる用具に関し、足場および蓋を含んでいるプレート、または本発明のバイオポリマーを含んでいる足場が置かれており、温度の条件ならびにＣＯ２およびＯ２の圧力の条件を制御可能にする培養チャンバであり得る。
【００６３】
本発明の第８の局面は、本発明の第７の局面の細胞回収器具の、細胞培養または細胞回収のための使用に関する。
【００６４】
本発明の第９の局面は、細胞を回収する方法に関する。当該方法は、以下の段階：
（ａ）細胞培養足場の機能化、
（ｂ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオポリマーのペプチドＤからの少なくとも２つのアミノ酸に、段階（ａ）において機能化された上記足場を共有結合させること、
（ｃ）細胞懸濁物を、（ｂ）において得られた足場と接触させること、および
（ｄ）上記足場に接着した細胞を回収すること
を包含している。
【００６５】
“機能化”という用語は官能基の付加に関する。
【００６６】
本発明の第９の局面の方法の好ましい実施形態において、足場は、アルキニル基、アルケン基、ニトリル基、カルボニル基またはアルキニル基を用いて機能化される。足場の機能化は、アルキニル基を用いて実施されることが好ましい。
【００６７】
本発明の第９の局面の方法の好ましい実施形態において、足場に接着された細胞は、細胞培養の温度を１０℃から３７℃に下げることによって回収される。
【００６８】
本発明の第９の局面の方法の好ましい実施形態において、以下の段階：
（ｃ’）細胞が増殖し、かつ単層を形成するまで、（ｃ）からの細胞を培養すること
が、段階（ｃ）および（ｄ）間に実施される。
【００６９】
培養における細胞は、播かれたときに当該細胞が培養表面の全体を覆っておらず、それらが分裂するにしたがって、培養表面の全体を覆う単一細胞の厚さを有している層を形成するように、分裂し得る。これは、単層を形成し、コンフルエンスになると呼ばれている。
【００７０】
本発明の第９の局面の方法の好ましい実施形態において、段階（ｂ）の前に、本発明の第１の局面のバイオポリマーのペプチドＤからの、少なくとも２つのアミノ酸の側鎖における反応性基は、アジド基に変換される。
【００７１】
本発明の第９の局面の方法の好ましい実施形態において、段階（ｂ）における上記共有結合は付加環化によって形成される。
【００７２】
本発明のバイオポリマーが細胞を回収する足場に付着される付加環化は、“クリックケミストリー”として知られている合成戦略に基づいている。当該戦略は、小規模の用途および大規模の方法における効率的かつ選択的なモジュールブロックの結合を可能にする反応に基づいている。この“クリック”戦略の一部を形成するとみなされ得る反応は、一連の明確な要求（例えば、それらが、広範な状況において適用可能なモジュール方式であり、高収率をもたらし、副生成物として無毒の物質を生成し、かつ立体特異的である（が、光学選択的である必要はない）必要がある）を満たす必要がある。さらに、そのような反応は、容易に利用可能な開始生成物を用いて、有機溶剤の非存在下または少量の有機溶剤の存在下において、穏やかな条件のもとに実施される必要があり、最終生成物は容易に単離される必要がある。
【００７３】
種々の型の変換が、“クリックケミストリー”のカテゴリに入るとみなされ得るが、１，２，３−トリアゾールに誘導する、Ｃｕ（Ｉ）によって触媒されるアルキンおよびアジドのヒュスゲン１，３−双極子付加環化は、最もよく特徴づけられており、広く使用されている例である。これは、広範な官能基および反応条件に対するその許容度とともに、アルキン誘導体およびアジド誘導体が合成され得る容易さに起因する。そのような反応は、実質的に定量的な収率において、官能基の存在下に実施され得る。
【００７４】
本発明の第１０の局面は、本発明の第１の局面のバイオポリマーを得る方法に関する。当該方法は、以下の段階：
（ａ）請求項１７または１８に記載の核酸の発現に適した条件のもとに、請求項１９に記載の細胞を培養すること、
（ｂ）上記核酸によってコードされている上記バイオポリマーを精製すること
を包含している。
【００７５】
多官能の設計にとっての必要性によって課される合成的な複雑さの度合いは、標準的な巨大分子の合成手法を用いて達成され得ない。バイオポリマーは、修正された分子生物学的手法および生物工学的手法を用いて遺伝的に改変された微生物または植物において、組換えタンパク質として得られる。
【００７６】
本発明のバイオポリマーのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列は、既知の発現ベクターに挿入される。
【００７７】
先の段落に規定されている通り、細胞のトランスフェクションは、従来技術において公知の手法（例えば、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、微粒子銃、Agrobacterium tumefaciens、または宿主細胞のＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）への、本発明の核酸のいずれかの組込みを可能にする任意の他の手法）を用いて行われる。
【００７８】
本発明の細胞における核酸の発現は、最新技術において公知の手法を用いて精製され得るバイオポリマーを導く。
【００７９】
明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用されているとき、“含んでいる”およびその変形は、他の技術的な特徴、添加物、成分またはステップを排除することを意図されていない。
【００８０】
〔図面の説明〕
図１．培養表面に固定された本発明のバイオポリマーを示す模式図。黒いドットは、基材に対する共有結合のための活性ドメインを表し、バイオポリマーの中央にある星形は、細胞認識ドメインを表している。
【００８１】
図２．バイオポリマーによる細胞培養、および細胞認識ドメインが接触不可能であるように温度が３７℃から４℃まで低下するときに、細胞がどのように剥離するかを示す模式図。
【００８２】
図３．左に分子量マーカーおよび右にバイオポリマー１を有している、バイオポリマー１のアクリルアミドゲル電気泳動。分子量は、キロダルトン（ｋＤａ）で示されている。
【００８３】
図４．３１２４６Ｄａの分子量の実験値を示すバイオポリマー１の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、“マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型”）。理論値は３１３７１Ｄａであり、２つの間の差異は測定誤差によると考えられ得る。また、分子の短分散特性は、単一のピークの狭さから明らかである。
【００８４】
図５．設計されたタンパク質に基づくポリマーに存在するアミド基に特徴的なシグナルが認められるバイオポリマー１の赤外（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ、“フーリエ変換赤外分光−全反射法”）分析。
【００８５】
図６．その逆転移温度（２４．２℃）が認められるバイオポリマー１の示差走査熱量（ＤＳＣ）分析。
【００８６】
図７．アジド基を用いたポリマーの機能化。（１）最初に、トリフリックアジドＴｆＮ３がより低い反応性の対応するアジ化ナトリウムから“インシチュ”に生成される。（２）第２ステップにおいて、トリフリックアジドは、アミノ基との置換反応における求核試薬として機能する。
【００８７】
図８．アミノ基の質量より大きい２４ユニットの質量を有しているアジド基の導入に起因する、バイオポリマー１に対する４６ユニットの分子量の増加を示す、バイオポリマー１’の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）。
【００８８】
図９．タンパク質に基づくポリマーからのアミド基の特徴的な吸収バンド（〜１７００ｃｍ−１）を、２１００ｃｍ−１に新たなアジド基にとって特徴的なシグナルとともに示す、バイオポリマー１’の赤外（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）分光分析。
【００８９】
図１０．より極性の低い基（例えばアジド）の、その構造への導入に起因する、前駆体（２４．２℃）に対するそのバイオポリマーの逆転移温度（２２．８℃）の１．３℃の低下を示す、バイオポリマー１’のＤＳＣ分析。
【００９０】
図１１．表面機能化ステップを示す模式図。第１ステップにおいて、試薬（例えばピラニア溶液）を用いて、表面を水酸基によって活性化させる。次のステップにおいて、“インシチュ”に生成されたシラノールおよび水酸基の間における共有結合によって、アミノ基によって官能性が付与された表面を生成させる。第３ステップにおいて、アミド化によってアミノ基を修飾して、使用される試薬分子の末端に存在するアルキニル基を用いて活性化された表面を生じさせる。
【００９１】
図１２．エラスチン様ポリマーを用いた表面の、“クリック”型の二機能化を示す模式図。アジド基およびアルキニルの間における１，３−双極子付加環化は、アスコルビン酸塩の存在下におけるＣｕ（ＩＩ）イオンの還元によって“インシチュ”に生成されるＣｕ（Ｉ）イオンによって触媒される水性溶媒中の反応において、対応する１，４−二置換の１，２，３−トリアゾールを生成させる。
【００９２】
図１３．ガラス、ならびにアミノ基、アルキニル基およびポリマー１’を用いて機能化された表面の、比較のＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）。ポリマーが共有結合されている表面に対するより強い被覆は、３つの他のサンプルより低い割合のシリコンから、推測され得る。さらに、窒素の割合は、もとのガラスに対して、処理した表面について増加している。これは、アミノ基およびアルキン基を用いて機能化されたサンプルならびに二機能化されたサンプルにおける、アミノ基およびアミド基の窒素含有量に起因すると予想される。
【００９３】
図１４．ポリマー１’を用いて機能化された表面の飛行時間型二次イオン質量分析（ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）。バリンを含んでいるアミノ酸被覆の存在に典型的な６８（Ｃ４Ｈ６Ｎ＋）および７２（Ｃ４Ｈ１０Ｎ＋）の質量を有しているイオン、プロリンを含んでいるアミノ酸被覆の存在に典型的な７０（Ｃ４Ｈ８Ｎ＋）の質量を有しているイオン、ならびにイソロイシンを含んでいるアミノ酸被覆の存在を示している８６（Ｃ５Ｈ１２Ｎ＋）の質量を有しているイオンが、観察される。
【００９４】
図１５．異なる８つの表面：Ａ）ガラス、Ｂ）ポリマー１’、Ｃ）ポリマー２’、Ｄ）ポリマー３’、Ｅ）ポリマー３’＋４、Ｆ）ポリマー４’、Ｇ）ポリマー５’、Ｈ）ポリマー６’についての、２４時間、２５時間、２６時間および２７時間における同一視野の位相差顕微鏡画像（倍率：×１０）。スケールバーは１００マイクロメートルに対応する。
【００９５】
図１６．種々の表面に対する４つの独立した実験において繰り返された、３つのサンプルからのランダムの９視野についての、総数に対する接着した細胞の、時間にともなう割合の評価。
【００９６】
図１７．種々の表面に対する４つの独立した実験において繰り返された、３つのサンプルからのランダムの９視野についての、接着した細胞および接着していない細胞の総数の、時間にともなう割合の評価。
【００９７】
図１８．二機能化された表面から剥離した細胞（ポリマー１’）および新たにトリプシン処理した細胞（コントロール）についての、ポリスチレン上における細胞の異なるインキュベーション時間における、“Alamar Blue”比色手法を用いた細胞生存度の評価（Ｐ＜０．０５）。
【００９８】
〔実施例〕
本発明は、本発明のバイオポリマーの合成および特性を説明している、本発明者らによって行われた試験を通して、以下に例証されている。実施例は、内容を理解可能にするために与えられており、本発明を限定すると意図されていない。
【００９９】
［実施例１．組換えエラスチン様タンパク質に基づくポリマーの生成］
使用される種々のバイオポリマー（本発明のバイオポリマーが挙げられる）のアミノ酸配列をコードする合成核酸配列を、国際公開第２０１０／０９２２２４号に記載の通りに設計し、合成した。同様にして、国際公開第２０１０／０９２２２４号に記載の通りに、バイオポリマーを、発現させ、精製し、性質決定した。
【０１００】
以下のバイオポリマーまたはポリマーを設計した。
【０１０１】
（バイオポリマー１（３７１アミノ酸））
構造：Ｄ−Ｂ１４−Ａ２−Ｂ１４
配列番号７のアミノ酸配列：
【０１０２】
【化１】
2014518636.tif 000002
【０１０３】
配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされている。
理論上のアミノ酸組成、および紫外線（ＵＶ）検出を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって得られたアミノ酸組成は、表１に見られる。
【０１０４】
【表１】
2014518636.tif 000003
【０１０５】
生成収率は７５ｍｇ／Ｌであった。
ポリマー１についての理論上の分子量は３１３７１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図３）およびQ-Star分光計を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実験的に決定された値は、３１２５０Ｄａであった（図４）。図５は、例としてのバイオポリマー１について得られた赤外（ＩＲ）スペクトルを示している。リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）におけるＤＳＣによって得られた転移温度は、２４．２℃であった（図６）。
【０１０６】
バイオポリマー１は、細胞回収系として作用可能な細胞接着配列を含んでいるエラスチン様ポリマーである。その自動式の性質を考慮すると、逆転位温度を上回った場合に、そのコンフォメーションは著しく変化し、したがって細胞の有効な培養がいったん達成されると、その細胞接着能を無効にし、かつ表面からの当該細胞の剥離を起こす。
【０１０７】
アミノ酸配列Ａは、細胞培養温度と一致する逆転移温度を超える温度において生物活性な表面に対する細胞接着を誘導する、非特異的な生物活性なＲＧＤ配列を含んでいる。
【０１０８】
アミノ酸配列Ｂは、ポリマーの自動式の特性のキャリアとして含まれており、環境の温度に依存する、ポリマーの異なるコンフォメーションを生じさせ、当該配列は、細胞接着配列Ａの作用を無効にすることによって逆転移温度以下における細胞接着を回避させる。
【０１０９】
アミノ酸配列Ｄは、共有結合を介してポリマーを表面に結合させる（すなわち二機能化された表面を得る）ために必要なアミノ基を有している３つのリジンアミノ酸を含んでいる。
【０１１０】
（バイオポリマー２（３７１アミノ酸））
構造：Ｄ−Ｂ１４−Ｃ２−Ｂ１４
配列番号９のアミノ酸配列：
【０１１１】
【化２】
2014518636.tif 000004
【０１１２】
配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされている。
理論上のアミノ酸組成、およびＵＶ検出を用いたＨＰＬＣによって得られたアミノ酸組成は、表２に見られる。
【０１１３】
【表２】
2014518636.tif 000005
【０１１４】
生成収率は７０ｍｇ／Ｌであった。
ポリマー２についての理論上の分子量は３１３７１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびQ-Star分光計を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実験的に決定された値は、３１２６５Ｄａであった。ＰＢＳにおけるＤＳＣによって得られた転移温度は、２３．５℃であった。
【０１１５】
ポリマー２は、細胞回収系として作用可能であり得る。その自動式の性質の観点から、逆転位温度を上回った場合に、そのコンフォメーションは著しく変化し、したがってその細胞接着能を無効にし、かつ細胞の有効な培養が達成されるとすぐに表面からの当該細胞の剥離を生じる。
【０１１６】
ポリマー１と同様に、ポリマー２はアミノ酸配列ＢおよびＤを有している。アミノ酸Ｃは、非生物活性な極性のＲＧＤ配列を含んでいる。
【０１１７】
（バイオポリマー３（４２７アミノ酸））
構造：Ｄ−Ｂ８４
配列番号１１のアミノ酸配列：
ＭＧＫＫＫＰ−（ＶＰＧＶＧ）８４−Ｖ
配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされている。
理論上のアミノ酸組成、およびＵＶ検出を用いたＨＰＬＣによって得られたアミノ酸組成は、表３に見られる。
【０１１８】
【表３】
2014518636.tif 000006
【０１１９】
生成収率は３５ｍｇ／Ｌであった。
【０１２０】
ポリマー３についての理論上の分子量は３５１９１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびQ-Star分光計を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実験的に決定された値は、３５１５２Ｄａであった。ＰＢＳにおけるＤＳＣによって得られた転移温度は、２９．４℃であった。
【０１２１】
ポリマー３と呼ばれるエラスチン様ポリマーは、その自動式の性質のために細胞回収系として作用し得るが、接着した細胞の数は、生物活性な細胞接着配列の欠如のためにより少ない。アミノ酸配列ＢおよびＤは、ポリマー１および２におけるアミノ酸配列ＢおよびＤと同じである。
【０１２２】
（バイオポリマー４（３７１アミノ酸））
構造：Ｂ１４−Ａ２−Ｂ１４
配列番号１３のアミノ酸配列：
【０１２３】
【化３】
2014518636.tif 000007
【０１２４】
配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１２５】
理論上のアミノ酸組成、およびＵＶ検出を用いたＨＰＬＣによって得られるアミノ酸組成は、表４に見られ得る。
【０１２６】
【表４】
2014518636.tif 000008
【０１２７】
生成収率は４２ｍｇ／Ｌであった。
ポリマー４についての理論上の分子量は３１３７１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびQ-Star分光計を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実験的に決定された値は、３１３８８Ｄａであった。ＰＢＳにおけるＤＳＣによって得られた転移温度は、２３．８℃であった。
【０１２８】
ポリマー４は２つのバイオポリマーを含んでいる系に使用される。２つのポリマーの第１であるポリマー３は、表面に対してグラフト可能であり、２つのポリマーの第２であるポリマー４は、上記系が各ポリマーの作用の間における相乗効果のために細胞回収系として有用な程度に、細胞接着を誘導可能である。
【０１２９】
実施された他の実験において、ポリマー４は、その末端アミノ基が、アミノ末端におけるリジンリッチ配列Ｄを含むことなく、アジド基にいったん変更されると、表面に対してグラフトされるために使用される。
【０１３０】
アミノ酸配列ＡおよびＢはポリマー１のアミノ酸配列ＡおよびＢと同じである。
【０１３１】
（バイオポリマー５（６９９アミノ酸））
構造：Ｈ−Ｉ６
配列番号１５のアミノ酸配列：
【０１３２】
【化４】
2014518636.tif 000009
【０１３３】
配列番号２０のヌクレオチドによってコードされている。
理論上のアミノ酸組成、およびＵＶ検出を用いたＨＰＬＣによって得られるアミノ酸組成は、表５に見られ得る。
【０１３４】
【表５】
2014518636.tif 000010
【０１３５】
生成収率は５１ｍｇ／Ｌであった。
ポリマー５についての理論上の分子量は６０６６１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびQ-Star分光計を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実験的に決定された値は、６０５５６Ｄａであった。ＰＢＳにおけるＤＳＣによって得られた転移温度は、３２．２℃であった。
【０１３６】
アミノ酸配列Ｉは、細胞接着配列ＲＧＤを保有しているアミノ酸配列Ａと類似であるが、ＲＧＤ配列の両側に位置する１０のペンタペプチドのうち、３番目の位置におけるペンタペプチドおよび８番目の位置におけるペンタペプチドからのイソロイシンが、アジド基に変換され得るアミノ基を保有するリジンによって置換されているという特性を有している。このようにして、上記配列は、バイオポリマー５の全体に広がっている複数の共有結合を介して表面に結合し、したがって、上記鎖のコンフォメーションが温度にともなって変化することを回避し、よって、より少ない有効性の細胞回収系にする。
【０１３７】
（バイオポリマー６（３４３アミノ酸））
構造：Ｄ−Ａ３
配列番号２１のアミノ酸配列：
【０１３８】
【化５】
2014518636.tif 000011
【０１３９】
配列番号２２のヌクレオチド配列によってコードされている。
理論上のアミノ酸組成、およびＵＶ検出を用いたＨＰＬＣによって得られるアミノ酸組成は、表６に見られ得る。
【０１４０】
【表６】
2014518636.tif 000012
【０１４１】
生成収率は８３ｍｇ／Ｌであった。
ポリマー５についての理論上の分子量は２９４６１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびQ-Star分光計を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって実験的に決定された値は、２９２６９Ｄａであった。ＰＢＳにおけるＤＳＣによって得られた転移温度は、２３．０℃であった。
【０１４２】
ポリマー６と呼ばれるエラスチン様ポリマーは、ポリペプチド鎖に沿って３回にわたって繰り返されているＲＧＤ細胞接着配列を保有しているアミノ酸配列Ａを含んでおり、ポリマー１〜３に見られる同じ配列Ｄを含んでおり、したがって、上記ポリマーが足場に共有結合されることを可能にする。
【０１４３】
［実施例２．ポリマー１〜６の修飾］
（バイオポリマー１’を得るためのバイオポリマー１の修飾）
バイオポリマー１’は、γ位にアミノ基を有しているリジンアミノ酸を含んでいるペプチドＤにとっての配列の変換によって得られる。上記アミノ基は、“クリック”型の環化を後に実施するために、変換される。変化されたペプチドＤをペプチドＥと呼ぶ。
【０１４４】
ペプチドＥにおけるアミノ基は、求核試薬として“インシチュ”に生成されるトリフリックアジドを用いた置換反応を介して、アジドに変換されており（図７）、８９％の反応収率を得た。これは、表面に対して化学的にグラフトされ得る生物活性な細胞接着配列を含んでいる自動式のポリマーを導く。
【０１４５】
バイオポリマー１’は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析によって性質決定され、上記分析は、それらに含まれているリジンのアミノ基の、アジド基への変換のために観察された４６ｇ／ｍｏｌの理論上の増大を有して、上記ポリマーについて３１２９６Ｄａの分子量（３１４７５Ｄａの理論上の分子量、図８）を示した。
【０１４６】
得られたバイオポリマー１’の赤外（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）スペクトルは、２１００ｃｍ−１の振動数においてアジド基の特徴的なシグナルを示し、そのようなシグナルは、前駆体ポリマー１のＩＲスペクトルにおいて観察されなかった。
【０１４７】
ポリマー１にとっての修飾反応の成功および範囲は、バイオポリマー１’について実施されたアミノ酸分析を調べることによって確認され、他のアミノ酸は不変を維持し、リジンアミノ酸の数に顕著な減少を示した。このようにして、リジンのアミノ基は、修飾され、アジド基に変換されており、変換されていると見積もられたのは４６％のリジンと推定された。
【０１４８】
【表７】
2014518636.tif 000013
【０１４９】
バイオポリマー１’の自動式の応答は、バイオポリマー１についての値（２４．２℃）より１．３℃低い、２２．８℃において生じる。この挙動は、開始のアミノ基に対する強い無極性基（すなわちアジド基）の導入による。
【０１５０】
（バイオポリマー２’〜６’を得るためのバイオポリマー２〜６の修飾）
バイオポリマー２〜６を、それぞれバイオポリマー２’〜６’を生じさせるために、バイオポリマー１について記載した通りに修飾した。
【０１５１】
修飾されたポリマーを、１’と類似の手法において性質決定した。上記ポリマーのアミノ酸分析を実施し、それらの分子量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる）および逆転位温度（ＤＳＣによる）を決定し、それらの赤外（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）スペクトルを分析し、これらのすべては、先に達した結論と類似の結論に導いた。これらのすべてのデータは以下に詳述されている。
【０１５２】
（修飾されたバイオポリマー２’）
【０１５３】
【表８】
2014518636.tif 000014
【０１５４】
反応収率：９４％
理論上の分子量：３１４７５Ｄａ
実験的な分子量の平均値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：３１２９１Ｄａ
ＰＢＳにおける転位温度（ＤＳＣ）：２１．８℃
リジン転換率：４６％。
【０１５５】
（修飾されたバイオポリマー３’）
【０１５６】
【表９】
2014518636.tif 000015
【０１５７】
反応収率：８０％
理論上の分子量：３５２９５Ｄａ
実験的な分子量の平均値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：３５１８５Ｄａ
ＰＢＳにおける転位温度（ＤＳＣ）：２７．７℃
リジン転換率：５０％。
【０１５８】
（修飾されたバイオポリマー４’）
【０１５９】
【表１０】
2014518636.tif 000016
【０１６０】
反応収率：９０％
理論上の分子量：３１３９８Ｄａ
実験的な分子量の平均値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：３１３２７Ｄａ
ＰＢＳにおける転位温度（ＤＳＣ）：２４．２℃。
【０１６１】
（修飾されたバイオポリマー５’）
【０１６２】
【表１１】
2014518636.tif 000017
【０１６３】
反応収率：８５％
理論上の分子量：６１２８５Ｄａ
実験的な分子量の平均値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：６０９００Ｄａ
ＰＢＳにおける転位温度（ＤＳＣ）：２２．２℃
リジン転換率：５４％。
【０１６４】
（修飾されたバイオポリマー６’）
【０１６５】
【表１２】
2014518636.tif 000018
【０１６６】
反応収率：５０％
理論上の分子量：２９５６５Ｄａ
実験的な分子量の平均値（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：２９３０２Ｄａ
ＰＢＳにおける転位温度（ＤＳＣ）：２１．５℃
リジン転換率：８３％。
【０１６７】
［実施例３．ポリマー二機能化表面の生成］
バイオポリマーが、アジド基を用いていったん修飾されると、二機能化された表面は、２ステップ：アルキニル基を用いたガラス表面の活性化を包含している第１のステップ、および共有結合を介して、表面にポリマーをグラフトする第２のステップにおいて得られた。
【０１６８】
（表面活性化）
まず最初に、ガラス表面のシリコン酸化物を除去し、表面に露出した遊離水酸基（−ＯＨ）を残すことが可能な、“ピラニア”溶液（硫酸（Ｈ２ＳＯ４）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の７：３容積の混合物）を用いて表面を、活性化させた。ガラス表面に実施された活性化処理は、図１１に示されている。表面上の反応を、他の技術のなかでも、各ステップの後に得られた表面に対する水の液滴の接触角を測定することによって、モニターした。疎水性の変化は、非活性化表面についての４８．１°から活性化表面についての２７．３°まで減少するそれらの接触角の変化によって認められ得、それらの疎水性は、表面にある露出した水酸基の存在によって向上される。
【０１６９】
また、表面修飾の各ステップは、約５ｎｍの分析深さまで表面に存在する元素の原子濃度を入手可能にするＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）によって特徴づけられる。また、この手法は、存在する元素の化学的状態に関する情報を提供可能である。高比率のＳｉおよびＯが、混入物としての低比率のＣおよび他の元素とともに、ガラス表面について観察される。活性化表面上のＳｉの比率はわずかに低下し、Ｏの比率は、周囲のＣのわずかな減少をともなって、上昇する（表１３）。
【０１７０】
【表１３】
2014518636.tif 000019
【０１７１】
次のステップは、新たに活性化された表面に露出した遊離の水酸基の、３−アミノプロピルシラノールとの反応によってアミノ基を用いて機能化された表面を得ることを包含しており、３−アミノプロピルシラノールは、３−アミノプロピルトリメトキシシロキサン（ＡＰＴＳ）から“インシチュ”に生成される（図１１）。表面修飾を判定する通常の手法は、表面に対する液滴の接触角を測定する（疎水性の当然の低下が観察される）ことを含んでいる（接触角は、遊離の水酸基を用いて活性化されている表面について２７．３°から、アミノプロピルシロキサン基を用いて機能化されている表面について７８．１°まで変化する）。また、表面はＸＰＳ分析によって性質決定される。アミノプロピル基の存在は、Ｎ  １ｓピークの存在、および考えられる周囲からの混入に起因する比率を超えて増加するＣの比率として、上記分析によって確認される。Ｎ  １ｓピークは、開始のガラス表面、またはピラニア溶液を用いて活性化された表面に存在せず、３９７ｅＶにおいて観察される（表１３）。
【０１７２】
最後に、アルキニル基を用いて機能化されている表面は、塩基（例えばトリエチルアミン）によって触媒される反応における、末端アルキニル基を有しているペンチン酸無水物を用いた表面上にあるアミド化によって形成される（図１１）。
【０１７３】
各ステップの後に得られる表面に対する水の液滴について、接触角の測定が実施されることは、実施される反応ステップを示している図１１から明らかであり得る。上記測定は、表面の疎水性の変化を調べることを可能にし、したがって、各反応ステップを制御またはモニターする最初の方法としての役割を果たした。このため、アルキニル基を用いて機能化された表面の疎水性は、アミノ官能性を付与した表面の疎水性に対して、前者について６４．５°までの接触角の低下から明らかなようにわずかに低下した。
【０１７４】
アルキニル官能性を付与した表面は、ＸＰＳ分析におけるＳｉ  ２ｐの比率の低下から明らかなように、アミノ官能性を付与した表面より強く被覆されている。さらに、Ｏの比率の低下、ならびにＣおよびＮのより高い相対比率が観察され、これによって、アルキニル基の付加を確認している（表１３）。
【０１７５】
グラフトの分子構造に関するさらなる情報は、所定の種々の領域の高分解能スペクトルを比較することによって得られる。調べられる元素の異なる酸化状態を確認することは、対応するスペクトルを逆重畳積分することによって可能である。アミノ基に対応する単一のピークは、アミノシラン化表面についてのＮ  １ｓ領域の高分解能スペクトルの３９９．５ｅＶに見られ得る。アルキニルシラン化表面についてのスペクトルは、アミド基の窒素に対応する４０１．７ｅＶにおける第２の窒素ピーク（より高い酸化状態にあり、したがってアミド型の共有結合の形成を裏付ける）を示している。観察された異なる酸化状態についての２つのＮピークの比率は、アルキニル基との３０％のカップリング（タンパク質に基づくポリマーを有している表面の後の機能化について、過剰ではなく十分な比率）が生じていることを、逆重畳積分によって推測可能にしている。
【０１７６】
アミノ機能化表面およびアルキニル機能化表面についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析は、両方の場合における類似のスペクトルを示しており、これらのスペクトルは、非機能化表面について観察されたスペクトルと、質量２３（Ｎａ＋）、３０（ＣＨ４Ｎ＋）および４５（ＣＨ３ＮＯ＋）を有しているイオンについて主に異なる（表１４）。Ｎａ＋イオンについてのより低い強度は、アミノ官能性を付与した表面およびアルキニル官能性を付与した表面のより強い被覆を推測可能にしている。さらに、非機能化表面について存在しない２つの新たなイオン（すなわちアミノサンプルよりアルキニルサンプルについてより高い強度を有している、質量３０（ＣＨ４Ｎ＋）を有しているイオン、および両方の表面について類似の強度を有している、質量４５（ＣＨ３ＮＯ＋）を有しているイオン）が、観察され、このようにして、被覆についての有機物の組成を推測可能にしている。
【０１７７】
【表１４】
2014518636.tif 000020
【０１７８】
（“クリック”型の付加環化による表面の二機能化）
修飾されたバイオポリマー１’〜６’は、ポリマーのアジド基および表面に露出したアルキニル基の間における“クリック”型の付加環化反応によって、アルキニル基を用いて機能化された表面に共有結合されている（図１２）。
【０１７９】
１，４−二置換の１，２，３−トリアゾールの形成は、Ｃｕ（Ｉ）イオンによって触媒される、水性溶剤におけるヒュスゲン型の１，３−双極子付加環化によって起こる。Ｃｕ（Ｉ）イオンは、アスコルビン酸塩の存在下におけるＣｕ（ＩＩ）イオンの還元によって“インシチュ”に生成される。この型の反応は、穏やかな条件のもとに起こり、水、酸素および存在し得る他の官能基に対する許容度が高く、かつ広範なプロトン性溶媒および非プロトン性溶媒において実施されて、高い収率を生じ得る（図１２）。
【０１８０】
グラフトされたバイオポリマー１’〜６’を有している表面は、ＸＰＳによって性質決定されている。アミノシラン化され、アルキニルシラン化された表面と比べてより低い比率のＳｉ  ２ｐ（４．２１％）およびより高い比率のＣ  １ｓ（５９．１５％の原子濃度）の結果として、より大きい層厚およびより高い被覆率が、アミノ官能基およびアルキニル官能基を用いて先に得られた表面についてより、バイオポリマー１’を用いて機能化された表面について観察されている。これによって、反応は効率的であり、５９：２３：１１の比率の通りに表面にグラフトされたバイオポリマー１’の顕著な存在は、バイオポリマーにおける元素の割合にしたがっていることを示している。表１４から明らかなように、同様の挙動が、分析されたポリマー２’〜６’を用いて二機能化された他の表面に認められる。一例として、図１４は、バイオポリマー１’を用いて機能化された表面が得られるまでの種々の表面機能化ステップのＸＰＳ分析を示している。
【０１８１】
【表１５】
2014518636.tif 000021
【０１８２】
修飾されたポリマー１’〜６’を用いてグラフトされた表面についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ分光分析は、アミノ官能性が付与され、アルキニル官能性が付与された表面について観察されたスペクトルと異なるスペクトルを示しており、当該スペクトルは、アミノ酸のバリン、プロリン、イソロイシンおよびグリシンによって生成された典型的なイオンの存在のために、タンパク質に基づく被覆の存在を示唆している。一例として、図１４は、バイオポリマー１’を用いて機能化された表面についてのＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析を示している。図１４は、バリンを含んでいるアミノ酸被覆の存在に典型的な６８（Ｃ４Ｈ６Ｎ＋）および７２（Ｃ４Ｈ１０Ｎ＋）の質量を有しているイオン、プロリンを含んでいるアミノ酸被覆の存在に典型的な７０（Ｃ４Ｈ８Ｎ＋）の質量を有しているイオン、ならびにイソロイシンを含んでいるアミノ酸被覆の存在に典型的な８６（Ｃ５Ｈ１２Ｎ＋）の質量を有しているイオンを示している。上述のピークは、アルキニル基を用いて機能化された表面に存在しておらず、したがって、ポリマー１’を用いてグラフトされた新たな表面に対する、タンパク質に基づく被覆を裏付けている。アミノ酸のイソロイシンの非存在が８６の分子量を有しているイオンのより低い割合を生じているポリマー３’を用いて二機能化された表面を除いて、調べたすべての表面について、同様の挙動が観察された（表１６）。系３’＋４について質量８６を有しているイオンの存在は、ポリマー３’を用いてグラフトされた表面に対するポリマー４の効率的な吸着を示すことに注目すべきである。
【０１８３】
【表１６】
2014518636.tif 000022
【０１８４】
バイオポリマー４’を用いてグラフトされた表面のＸＰＳ（表１５）およびＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析（表１６）は、上述の手法を用いて得られた結果から推測される通り、単一の末端アミノ基との反応が効率的ではなく、表面が、グラフトされたバイオポリマー４’の十分な被覆を示さないことを示唆している。上記結果は、Ｃ  １ｓのより低い比率（５０．７５％）とともに、表面に対するＳｉ  ２ｐの高比率（１６．１７％）の存在を示している。
【０１８５】
バイオポリマー５’および６’を用いてグラフトされた表面のＸＰＳ（表１５）およびＴｏＦ−ＳＩＭＳ分析（表１６）は、反応が効率的であり、表面に存在するバイオポリマーの際立った量があり、バイオポリマー５’およびバイオポリマー６’の両方が十分であることを示唆している。バイオポリマーが表面に対してグラフトされているときに、バイオポリマーの自動式の作用が維持されているか否かを、したがって、そのような系が細胞回収系として利用可能であるを確認するために、接触角の測定を熱処理したサンプルについて実施した。転位温度を超える温度（３７℃）および転位温度以下の温度（１０℃）において測定を実施し、表１７に示されている値を上記温度において得た。
【０１８６】
７６．８±１．２°および６５．２±０．８°の異なる接触角が、バイオポリマー１’を用いて機能化された表面について、バイオポリマーの構造の異なる折り畳みの結果としてそれぞれ１０℃および３７℃において得られた。表面の疎水性は、バイオポリマーの転位温度を超えるとより大きくなることが明らかである。これは、転位温度（Ｔｔ）を超えるとポリマーが水和状態から非水和状態になる（すなわちその疎水特性が温度とともに低下する）ことに起因している。結果を表１７に示す。
【０１８７】
【表１７】
2014518636.tif 000023
【０１８８】
ポリマー４’を用いた表面の乏しい被覆は、ポリマー４’を用いて機能化された表面についての接触角のわずかな低下から明らかであり、この角度は、１０℃（６０．３±０．５°）および３７℃（６４．１±１．５°）の表面について３．８°だけ変化しているのみである。ポリマー４’の構造は、ポリマー１’の構造と完全に類似であるが、観察されたわずかな変化は、表面におけるポリマーの乏しい存在を示唆しており、したがって、アルキニル基を用いて被覆されたグラフトされていない表面について見られる値（６４．５°、図１１）と類似の値が見られる。
【０１８９】
バイオポリマー５’および６’を用いて機能化された表面について実施された接触角の測定（表１７）は、表面の疎水性が温度とともに顕著に変化する（３７℃における６５．３±０．６°および１０℃における６７．５±０．５°の値）ことを示している。これらの値は、ポリマー５’が重合体鎖に沿った種々の点において表面と共有結合しているので、ポリマーが、温度にしたがってそのコンフォメーションを変化させるために求められる自由度を有しておらず、したがって、細胞回収系として使用される能力を失い得ることを示している。
【０１９０】
表面に対して実施された接触角の測定（表１７）から推測され得る通り、ポリマー６’の自動式の作用が表面に維持されており、表面の疎水性の低下が、転位温度以下に温度を低下させることによって、３７℃における４９．１±１．２°から１０℃における４３．５±２．０°まで観察されたが、観察された値は、３極のＲＧＤ細胞接着配列の存在に起因してグラフトされたポリマー４’のより高い疎水性を支持している。
【０１９１】
（ポリマー３’の“クリック”型の付加環化およびポリマー４の続く吸着による表面の二機能化）
系は、２つのバイオポリマーを含んでいる。バイオポリマーの第１（ポリマー３）は、表面にグラフトされ得、バイオポリマーの第２（ポリマー４）は、系が各ポリマーの作用の間における相乗効果に起因して細胞回収系として有用な程度に、細胞接着を誘導し得る。
【０１９２】
ポリマー４における生物活性なＲＧＤ配列は、逆転移温度を超える、細胞培養温度と一致する温度において、生物活性な表面に対する細胞接着を誘導する。
【０１９３】
ポリマーの自動式の特性のキャリアとしてポリマー４に含まれているペプチドＢは、逆転移温度以下における細胞接着を回避し、これによって、細胞接着を支持するより極性の領域の作用を無効にする。
【０１９４】
修飾されたポリマー３’は、ポリマーのアジド基および表面に存在するアルキニル基の間における化学的な“クリック”型の付加環化反応によって共有結合された。手法は、ポリマー１’および２’について記載された手法と同じであった。
【０１９５】
化学的にグラフトされたポリマー３’を用いて二機能化された表面が得られると、あらかじめ調製された表面をバイオポリマー４の水性溶液に浸漬することによって、ポリマー４をポリマー３’に吸着させた。バイオポリマー３’および４を用いて機能化された表面を、ＸＰＳによって性質決定し、アミノシラン化された表面およびアルキニルシラン化された表面と比べて、ポリマー４を用いて二機能化された表面に見られるＳｉ  ２ｐのより低い比率およびＣ  １ｓの高い比率（表１５）から推測される通り、アミノ基および／またはアルキニル基を用いて機能化された表面についてより大きい層の厚さおよびついよい被覆を示し、これによって、表面におけるバイオポリマーの存在の重要性を示している。
【０１９６】
［実施例４．細胞接着アッセイ］
（生理活性表面を用いた細胞回収方法の試験）
この種の表面を用いた細胞拐取処理の試験を、個々の細胞の回収、およびポリビニリデンフッ化物（ＰＶＤＦ）膜を用いた細胞シートの回収の２つに分けた。
【０１９７】
（個々の細胞の回収）
エラスチン様ポリマーを用いて二機能化された表面を、３０分にわたって各面を紫外光のもとに殺菌する。さらに、２４ウェルのポリスチレン多穴プレートの壁を、ＰＢＳにおける０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて処理し、一晩中４℃に維持して細胞が非特異的に結合することを防いだ。それから、ＰＢＳを用いてプレートを３回にわたって洗浄し、二機能化された殺菌プレートを対応するウェルにおいた。また、ヒトの線維芽細胞（ＨＦＦ−１細胞株）を別々に播いた。１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補ったDulbecco's Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）を含んでいる２５０ｍＬのフラスコにおいて、５％ＣＯ２濃度の雰囲気の３７℃において線維芽細胞を培養した。細胞がコンフルエンスにいったん達すると、ＰＢＳにおける０．２５％のトリプシンおよび０．０２％のエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用いた処理によって細胞を回収する。生じた細胞懸濁物の遠心分離の後に、細胞を、１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭに再懸濁させる。細胞懸濁物を、２×１０４細胞／ウェルまで希釈し、５００μＬの分取物を、ウェルにおける二機能化された各表面に加え、５％ＣＯ２濃度の雰囲気の３７℃においてインキュベートした。デジタルカメラシステムを備えている光学顕微鏡を用いた位相差顕微鏡によって、播種後の３０分、２時間、８時間および２４時間に、細胞の形態を評価し、撮影する。各実験の３回の繰返しを評価し、かつ得られた写真を用いた各表面についてランダムに選択した９視野における細胞を分析する同一条件のもとに、各実験を４回にわたって繰り返す。
【０１９８】
２４時間の培養の後に、接着した細胞を有している表面を収納している多穴プレートを、４℃に冷却した。さらなる１時間（５時間からの実験開始）、２時間（２６時間からの実験開始）および３時間（２７時間からの実験開始）にわたるインキュベーションの後に、上述の通りに、細胞の形態を観察し、撮影する。丸い細胞を、接着されていないとみなし、広がっている細胞を接着されているとみなす（図１６および１７）。
【０１９９】
接着した細胞の割合および接着した細胞の総数を、それらの平均値（ｎ＝４）および標準偏差として示す。任意の型の被覆のない生物学的に機能化されていないガラス表面を、接着および回収のコントロールとして使用する。
【０２００】
生物活性なＲＧＤペプチド配列を含んでおり、かつ図１５Ｂに示されている修飾されたバイオポリマー１’を用いて、機能化された表面は、ガラスの接着と同様に、３０分において非常に良好な接着を示す（図１６および１７）。２４時間において、この接着は、拡大画像および細胞の形態から明らかなように、ガラス表面の接着と同様に、細胞の割合および数の点において継続している（図１５Ｂ）。
【０２０１】
しかし、被覆なしのガラス表面と対照的に、ポリマーにとってのＴｔ以下に温度が低下すると、細胞間に大きな間隔が現われて細胞は剥離し始め、細胞はより丸い形態を取り始める（図１５Ｂ）。
【０２０２】
このようにして、接着した細胞の数は２４時間を過ぎると低下し、より丸い形態を有している細胞に該当する接着していない細胞の数の大きな増加が、観察される。当該細胞は、表面と相互作用していないが、細胞間の相互作用および細胞外マトリクスとの相互作用を維持している。それらの細胞は、高い接着能、および細胞を剥離させる温度変化に対する応答を示す。したがって、効率的な細胞回収系を構築する場合に、細胞が効率的に接着し得る生物活性な細胞接着配列の存在は、温度とともにコンフォメーションを変化させ、かつ非接着状態になる、表面にグラフトされたポリマーの能力と同様に重要である。
【０２０３】
図１５Ｃは、ＲＧＤペプチド配列を含んでいる修飾されたバイオポリマー２’を用いて機能化された表面を示しており、当該ＲＧＤペプチド配列は、ＲＧＤの乱雑にした変形物であり、ペプチドの接着能を失っている。この表面に接着可能な細胞の数は、ガラス表面およびポリマー１’を有している表面について、より低い（図１５Ａ、Ｂ）。さらに接着は明らかに弱い。
【０２０４】
２４時間のインキュベーション後における細胞の形態は、非常にわずかな細胞が、修飾されたバイオポリマー２’を用いてグラフトされた表面に対して、効率的に結合可能であると、示している。２５時間のインキュベーションに対応する写真（図１５Ｃ）から明らかなように、これは、温度変化の結果としての急速な剥離を生じる（図１７）。したがって、上記表面は、弱い接着能を示すが、エラスチン様ポリマーにとっての本来的な温度変化への自動式の応答を維持しているものの、効率的な回収系の構築には不十分である（図１６）。
【０２０５】
図１５Ｆにおける表面は、生物活性なペプチド配列を欠いている修飾されたバイオポリマー３’を用いて機能化された表面に対応する。この表面に接着可能な細胞の数は、ガラス表面および修飾されたバイオポリマー１’を用いてグラフトされた表面より、非常に少ない。さらに、修飾されたバイオポリマー３’を用いて機能化された表面に対する細胞接着は、不安定である。２４時間のインキュベーション後の細胞の形態は、表面に効率的に結合可能な細胞の数が少ないことを示している（図１６）。図１５Ｄおよび図１７における２５時間のインキュベーションに対応する写真から明らかなように、効率的ではない低いこの接着は、温度変化の結果として表面からの急速な剥離を生じる。よって、表面は、低い細胞接着能を示し、したがって、エラスチン様ポリマーにとっての本来的な温度変化に対する自動式の応答を維持しているにもかかわらず、効率的ではない細胞回収系を構成することを意味している。
【０２０６】
図１５Ｅは、生物活性なＲＧＤペプチド配列を含んでいるバイオポリマー４が吸着されている修飾されたバイオポリマー３’を用いて、機能化された表面を示している。この２ポリマー系は、３０分において非常に良好な細胞接着を示すが、図１６および１７から明らかなように、その接着は、ガラス表面およびポリマー１’を用いて機能化された表面より低い。バイオポリマー４が吸着されている修飾されたバイオポリマー３’を用いて機能化された表面に対する細胞接着は、２４時間において非常に低いままであるが、細胞は類似の形態を維持している（図１５Ｅおよび１７）。ガラス表面とまったく対照的に、ポリマーにとってのＴｔ以下までの温度の低下は、細胞に、剥離を開始させ、より丸い形態を取らせる。２４時間を過ぎると、接着した細胞の数は減少し、より丸い形態を有している接着していない細胞の数は著しく増加する。これらの細胞は、互いとの相互作用および細胞外マトリクスとの相互作用を維持しているが、表面との相互作用を維持していない。したがって、画像および図面を考慮すると、細胞は、高い接着能、およびそれらを剥離させる温度変化への応答を示す。これは、細胞回収にとっての効率的な系であり得るが、細胞接着、および熱処理による剥離の両方について効率的であり（図１５Ｂおよび１６）、表面に対してグラフトされる単一のポリマーのみを必要とする、バイオポリマー１’を含んでいる系ほどに効率的ではない。さらに、表面に対するバイオポリマーの共有結合のために残余物を洗い流さない、ポリマー１’を用いた例と対照的に、この表面から回収された細胞は微量のポリマー４を含んでいる。グラフトされたポリマー３’および吸着されたポリマー４を含んでいる系のさらなる欠点は、ポリマー４が吸着されているのみであり、細胞培養の間における培地への非特異的な放出を起こし得るという点である。
【０２０７】
その末端にリジン残基が存在していない生物活性なＲＧＤペプチド配列を含んでいる修飾されたバイオポリマー４’を用いて機能化された表面は、図１５Ｆに示されている。ポリマー４’は、それらの末端アミノ基がいったん修飾されると、表面に対してグラフトされ得るが、バイオポリマーの末端アミノ基の修飾のみでは、処理された表面の完全な被覆にとって不十分であると観察されている。ガラス表面の不十分な被覆は、細胞がアルキニル基を用いて機能化されたガラスの露出した領域（接着にとって効率的ではない）に接着する必要があることを意味するので、この表面は、３０分における弱い細胞接着を示す。結果として、熱処理による細胞の続く剥離は、無効であり、細胞は、表面に吸着したままである（図１６および１７）。表面に対するバイオポリマー４’の結合の乏しい効率は、細胞回収系の構築にとってのバイオポリマーの利用を実施不能にする。
【０２０８】
この知見は、バイオポリマーおよび足場の間における接続が、バイオポリマー１分子につき少なくとも２つの共有結合、好ましくはバイオポリマー１分子につき少なくとも３つの共有結合を含まなければならないことを示している。したがって、これらの結果は、接触角を測定するときにこの表面のためにあらかじめ得られた結果（図１７）を確認しており、温度とともに大きな変化がないので、バイオポリマー４’が使用された場合のより少ない被覆を示している。
【０２０９】
図１５Ｇから明らかなように、２４のリジン残基およびペプチド配列の６の繰返しをアミノ酸鎖の全体を通して含んでいる修飾されたバイオポリマー５’を用いて、機能化された表面は、ガラスおよびバイオポリマー１’について観察された細胞接着と同様に３０分における非常に良好な細胞接着を示す。画像から明らかなように（図１５Ｇ）、この接着は、表面被覆および細胞形態の両方の点に関して、２４時間におけるガラス表面について観察された接着と同等であり続ける。
【０２１０】
しかし、細胞は、バイオポリマー５’にとってのＴｔ以下の温度に低下させることによって基材の表面から剥離しないことが明らかである。これは、表面に対する接触角の不変性によって確認された通り、分子の全体に配置された残基を介したバイオポリマーの結合が、温度の低下によるコンフォメーションの変化を起こさせないことを意味している（図１７）。バイオポリマー５’は、したがって効率的な細胞回収系の構築には有効ではなく、これによって、細胞が効率的に接着可能な生物活性な細胞接着配列の存在は、温度にともなってコンフォメーションを変化させる能力を維持する、表面にグラフトされたポリマーの能力と同様に重要であることを、再び証明している。バイオポリマー５’のペプチド骨格に沿った種々の点を介した表面に対する結合は、細胞が剥離するために必要なバイオポリマーにおけるコンフォメーションの変化を不能にする。結論として、バイオポリマー５’も、細胞回収系の構築に有用ではない。
【０２１１】
図１５Ｈから明らかなように、アミノ酸鎖の全体を通して３回にわたって繰り返されている生物活性なＲＧＤペプチド配列を、アミノ末端に３つのリジン残基をともなって含んでいる修飾されたバイオポリマー６’を用いて機能化された表面は、３０分間のインキュベーション後におけるガラスについて得られる同様の接着を示す。この接着は、覆われている領域および細胞の形態の両方について、２４時間後に同程度を維持している（図１５Ｈおよび１７）。しかし、当該バイオポリマーについてのＴｔ以下に温度を低下させることによって、基材の表面から細胞は剥離しないことが明らかである（図１７）。これは、ペプチド鎖の全体を通した種々の生物活性なＲＧＤ配列の存在が、細胞の集団剥離を生じさせる分子のコンフォメーションの適切な変化を起こさせず、ＲＧＤ配列のいくつかの部分が、新たなコンフォメーションにおいておそらく露出されたままであり、当該部分が、細胞に接着を維持させるために十分であることを意味する。この知見は、温度にともなうこの表面に対する接触角のわずかな変化と一致している（表１７）。したがって、バイオポリマー６’は、細胞回収、または効率的な細胞回収系の構築に有用ではない。したがって、細胞が効率的に接着し得る生物活性な細胞接着配列の存在は、そのコンフォメーションを好適に変化させる、表面にグラフトされたポリマーの能力と同様に重要であり、生物活性な配列を細胞にさらすか、または温度に依存しないことは、再び証明されている。
【０２１２】
４℃における３時間（実験の開始から２７時間）後に、“Live-Dead cell staining kit”（Abcam）蛍光手法を用いて、表面に存在する細胞の生存度を評価した。生細胞もしくは緑色の細胞および死細胞もしくは赤色の細胞を、各表面上の異なる任意の領域に対応する９つの写真においてカウントした。生細胞の割合を対応する標準偏差とともに算出した（ｎ＝４）。
【０２１３】
この実験において、修飾したポリマー１’、２’、３’、３’＋４、５’および６’を用いて二機能化された表面に、熱処理後において存在する細胞は、すべての場合において９０％を超える生存度の割合を示し（表１８）、これによって、バイオポリマー上の培養および熱処理は細胞の生存度に悪影響を与えないことを確認した。
【０２１４】
【表１８】
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【０２１５】
また、修飾したバイオポリマー１’を用いて機能化された表面における２７時間の培養の後に、剥離された繊維芽細胞の生存度を評価した。したがって、５％ＣＯ２濃度の雰囲気の３７℃における１、３、１０および１４日にわたるＴＣポリスチレンプレート上の培養によって、接着させた繊維芽細胞を、“Alamar Blue”比色手法を用いて分析する。５％ＣＯ２濃度の３７℃における１、３、１０および１４日にわたるＴＣポリスチレンプレート上で培養された、トリプシン処理手法を用いて得られた同数の線維芽細胞を、コントロールとして使用した。同じ条件のもとに実験を４回にわたって繰り返し、各場合において３つの反復物を評価する。
【０２１６】
得られた結果は、時間にともなう代謝活性の一定の増加であり、当該増加は、コントロールと有意差なし（Ｐ＜０．０５）であり、したがって細胞が、生存可能であり、増殖可能であり（図１８）、トリプシン処理した繊維芽細胞と同じ水準に、時間とともに達することを意味している。これは、バイオポリマー１’の使用がより効率的な細胞回収方法であることを強調しており、当該方法は、細胞膜におけるタンパク質に影響せず、したがって細胞−細胞および細胞−細胞外の相互作用を完全に維持している。さらに、この試験は、熱処理が細胞の生存度に対する悪影響を有していないことを同様に示している。
【０２１７】
（ＰＶＤＦ膜を用いた細胞シートの回収）
バイオポリマー１’を用いて機能化され、グラフトしたガラス表面を、各面について３０分にわたって紫外光のもとに殺菌した。
【０２１８】
さらに、２４ウェルのポリスチレン多穴プレートの壁を、ＰＢＳにおける０．１％のＢＳＡを用いて処理し、一晩中４℃に維持して細胞が非特異的に結合することを防いだ。それから、ＰＢＳを用いてプレートを３回にわたって洗浄し、バイオポリマー１’を用いて二機能化され、グラフトした殺菌ガラス表面を対応するウェルにおいた。
【０２１９】
それから細胞の播種を行う。ＨＦＦ−１繊維芽細胞を実験の全体を通して使用する。繊維芽細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭの入っている２５０ｍＬフラスコにおいて、５％ＣＯ２濃度の雰囲気の３７℃において培養する。いったん細胞がコンフルエンスになると、ＰＢＳにおける０．２５％のトリプシンおよび０．０２％のＥＤＴＡを用いた処理によって、細胞を回収する。１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭの添加によって、この酵素消化を停止させる。細胞の懸濁物を２×１０４細胞／ウェルに調整する。各ウェルにおけるバイオポリマー１’を用いて二機能化され、グラフトしたガラス表面に対して、５００μＬの分取物を加え、細胞がコンフルエントになるまで５％ＣＯ２濃度の雰囲気の３７℃においてインキュベートする。培養物においてコンフルエントにいったん達すると、培養温度を４℃に下げる。４℃における１時間の後に、ＰＶＤＦ膜を各ウェルに入れる。ＰＶＤＦが細胞シートに付着するように、吸引によって培養液を除去する。プレートを３０分にわたって４℃において再びインキュベートする。この後に、ピンセットを用いて、細胞シートに付着したＰＶＤＦ膜を新たなポリスチレンプレートに移す。膜を、冷却した培養液の添加によって浮かせ、ピンセットを用いて膜を回収し、ウェルに細胞のみを残す。いったん新たな培養プレートに移された細胞の増殖を定量的に調べることによって、シートを構成している細胞の良好な生存度を確認した。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】培養表面に固定された本発明のバイオポリマーを示す模式図である。
【図２】バイオポリマーによる細胞培養、および細胞認識ドメインが接触不可能であるように温度が３７℃から４℃まで低下するときに、細胞がどのように剥離するかを示す模式図である。
【図３】バイオポリマー１のアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図４】バイオポリマー１の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、“マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型”）の結果を示す図である。
【図５】バイオポリマー１の赤外（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ、“フーリエ変換赤外分光−全反射法”）分析の結果を示す図である。
【図６】バイオポリマー１の示差走査熱量（ＤＳＣ）分析の結果を示す図である。
【図７】アジド基を用いたポリマーの機能化を示す図である。
【図８】バイオポリマー１’の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）の結果を示す図である。
【図９】バイオポリマー１’の赤外（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）分光分析の結果を示す図である。
【図１０】バイオポリマー１’のＤＳＣ分析の結果を示す図である。
【図１１】表面機能化ステップを示す模式図である。
【図１２】エラスチン様ポリマーを用いた表面の、“クリック”型の二機能化を示す模式図である。
【図１３】ガラス、ならびにアミノ基、アルキニル基およびポリマー１’を用いて機能化された表面の、比較のＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）の結果を示す図である。
【図１４】ポリマー１’を用いて機能化された表面の飛行時間型二次イオン質量分析（ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）の結果を示す図である。
【図１５】異なる８つの表面についての同一視野の位相差顕微鏡画像（倍率：×１０）を示す図である。
【図１６】種々の表面に対する４つの独立した実験において繰り返された、３つのサンプルからのランダムの９視野についての、総数に対する接着した細胞の、時間にともなう割合の評価の結果を示す図である。
【図１７】種々の表面に対する４つの独立した実験において繰り返された、３つのサンプルからのランダムの９視野についての、接着した細胞および接着していない細胞の総数の、時間にともなう割合の評価の結果を示す図である。
【図１８】二機能化された表面から剥離した細胞（ポリマー１’）および新たにトリプシン処理した細胞（コントロール）についての、“Alamar Blue”比色手法を用いた細胞生存度の評価の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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