(57)【要約】本発明は、シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流中のモノマー含有量を富化するための方法に関する。とくに、該方法は、シクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流と生体触媒とを組み合わせる工程、ならびに該廃棄流のダイマー成分および／またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換する工程を伴う。該方法は、混合有機性廃棄流中の二酸、アジピン酸、および／または他のα,ω-二官能性C6アルカンの含有量を富化し得る。加えて、処理された混合有機性廃棄流は、改善された燃焼効率を有し得る。2014518070.tif 000012
2014518070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）シクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流と生体触媒とを組み合わせる工程；ならびに
（b）該廃棄流のダイマー成分および／またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換する工程
を含む、シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流中のモノマー含有量を富化するための方法。
【請求項２】
前記生体触媒を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該生体触媒が、少なくとも1種のヒドロラーゼ酵素、天然宿主細胞、または非天然宿主細胞を含む、工程；
該廃棄流中のオリゴマーエステルをモノマーに加水分解する工程；および
該混合有機性廃棄流中のモノマー成分の量を増大させる工程
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
天然のまたは非天然の宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、酵素的に：
a．該混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解するか；
b．該混合有機性廃棄流中のラクトンの少なくとも一部をヒドロキシ酸に加水分解するか；または
c．該混合有機酸廃棄流中に存在している直鎖状C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部を対応する二酸に酸化する
、工程；ならびに
該流中の二酸の相対量を増大させる工程
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
非天然宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、酵素的に：
a．該混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する；
b．該混合有機性廃棄流中のε-カプロラクトンの少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸に加水分解する；
c．該混合有機性廃棄流中のカプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、および6-オキソカプロン酸の少なくとも一部をアジピン酸に酸化する；
d．該混合有機性廃棄流中の環状C6成分の少なくとも一部をアジピン酸に変換する；
e．該混合有機性廃棄流中に存在しているC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する；または
f．該混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化する
、工程；ならびに
該廃棄流中のアジピン酸の相対濃度を増大させ、かつ該流中の一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させる工程
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
非天然宿主細胞を用いて前記混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、酵素的に：
i．該混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する；
ii．該混合有機性廃棄流中のカプロン酸の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸に酸化する；
iii．該混合有機性廃棄流中の環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸もしくは6-オキソカプロン酸に変換する；
iv．該混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する；または
v．該混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化し；かつ、アジピン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、もしくは6-オキソヘキサン酸を1,6-ヘキサンジオール、6-アミノカプロン酸、ε-カプロラクタム、もしくはヘキサメチレンジアミンに変換する少なくとも1種の生合成経路酵素を発現する
、工程；ならびに
該流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性C6アルカンに変換する工程
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記混合有機性廃棄流が、NVR、洗浄水、COP酸、苛性洗浄液流、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
単離されたもしくは固定化されたヒドロラーゼ、または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌される内在性もしくは異種性ヒドロラーゼによる、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解をさらに含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ヒドロラーゼ（EC 3.1.1.-）が、リパーゼ（EC 3.1.1.3）、エステラーゼ（EC 3.1.1.1）、クチナーゼ（EC 3.1.1.74）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）、ラクトンヒドロラーゼ；グルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）、ラッカーゼ（EC 1.10.3.2）、またはそれらの組み合わせである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記ラクトンヒドロラーゼが1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
酸性pH、生理的pH、またはアルカリ性pHで活性を有するヒドロラーゼによる、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を触媒する工程をさらに含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒドロラーゼを用いた処理によって前記混合有機性廃棄流の粘性を低下させて、該流を燃焼させる効率を改善し、かつ／またはさらなる化学的もしくは生物学的処理のために該流を調製する、請求項2記載の方法。
【請求項１２】
前記処理された混合有機性廃棄流を燃料価値のためにまたは合成ガスを産生するために燃焼させる工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
混合エステルもしくはポリオールを産生するためのエステル化、ジオールへの水素化、二酸への酸化、還元的アミノ化、スルホン化、またはNH4OHもしくはポリアミンを用いた処理のために、前記処理された混合有機性廃棄流の1種もしくは複数種の成分を使用する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
さらなる分離、化学的変換、または生体触媒による酵素的変換と同時に、オリゴマーエステルをモノマーに加水分解する工程を含む、請求項2記載の方法。
【請求項１５】
オキソ酸を介してC4-C6またはC6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸を二酸に変換する天然のまたは非天然の宿主細胞が、以下の変換のうちの1つまたは複数を触媒する内在性または異種性のω酸化経路を有する、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法：
a．酪酸、吉草酸、および／もしくはアジピン酸のコハク酸、グルタル酸、および／もしくはアジピン酸への変換；
b．酪酸、吉草酸、および／もしくはアジピン酸の4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および／もしくは6-ヒドロキシカプロン酸への変換；
c．4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および／もしくは6-ヒドロキシカプロン酸の4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および／もしくは6-オキソヘキサン酸への変換；または
d．4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および／もしくは6-オキソヘキサン酸のコハク酸、グルタル酸、および／もしくはアジピン酸への変換。
【請求項１６】
内在性または異種性のω酸化経路を有する天然のまたは非天然の宿主細胞が、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し、かつ該天然のまたは非天然の宿主細胞が、n-アルカンを利用する酵母または細菌である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記n-アルカンを利用する酵母が、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、C.アルビカンス（C. albicans）、C.クロアカエ（C. cloacae）、C.ギリエルモンジイ（C. guillermondii）、C.インターメディア（C. intermedia）、C.マルトサ（C. maltosa）、C.パラプシローシス（C. parapsilosis）、C.ゼイラノイデス（C. zeylenoides）、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ（Rhodotorula）属、リゾプス（Rhizopus）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、デバリオマイセス（Debaryomyces）属、およびリポマイセス（Lipomyces）属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり；かつ前記n-アルカンを利用する細菌が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、P.プチダ（P. putida）、P.エルギノーサ（P. aeroginosa）、P.オレオボランス（P. oleoverans）、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）、オレイフィラス・メシネンシス（Oleiphilus messinensis）、アルスロバクター・ビスコサス（Arthrobacter viscosus）、カプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomona spaucimobilis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）、アルカニボラクス・ディエソレイ（Alcanivorax diesolei）、またはそれらの組み合わせである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記廃棄流の環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する、前記天然のまたは非天然の宿主細胞が、以下の変換のうちの1つまたは複数を触媒する内在性または異種性の経路を有する、請求項4または5記載の方法：
I．シクロヘキサノールの6-オキソヘキサン酸への変換であって、以下の変換：
a．シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換；
b．シクロヘキサノンのε-カプロラクトンへの変換；
c．ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への変換；もしくは
d．6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換
のうちの1つもしくは複数が触媒される、変換；
II．1,2-シクロヘキサンジオールの6-オキソヘキサン酸への変換であって、以下の変換：
a．シクロヘキサン-1,2-ジオールのシクロヘキサン-1,2-ジオンへの変換；もしくは
b．シクロヘキサン-1,2-ジオンの6-オキソヘキサン酸への変換
のうちの1つもしくは複数が触媒される、変換；および
III．6-オキソヘキサン酸のアジピン酸への変換。
【請求項１９】
前記天然のまたは非天然の宿主細胞がNVRに対して耐性を有する、請求項2〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が混合有機性廃棄流の少なくとも1容量％に対して耐性を有する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記混合有機性廃棄流に対する前記宿主細胞の前記耐性を、該流中の阻害性化合物の量を低下させることによって改善する工程を含む、請求項19または20記載の方法。
【請求項２２】
前記阻害性化合物がラクトンを含み、前記方法が、前記天然のまたは非天然の宿主細胞を用いた前記混合有機性廃棄流の処理の前または最中の、ラクトンを対応するヒドロキシル酸に加水分解する1種または複数種の生体触媒を用いた該流の処理によって、該混合有機性廃棄流中のラクトンの量を低下させる工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記生体触媒が、前記宿主細胞によって発現されかつ発酵の間に分泌される酵素である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記廃棄流からより高収率のC6成分を提供するために、前記宿主細胞によるC6化合物の異化の割合を減少させる工程を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞によるβ酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸のアセチル-CoAへの分解を低下させる工程を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸を用いてCoAエステルを生成する酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
CoAエステルを酸化する酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる工程を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
CoAエステルが、CoAリガーゼ、トランスフェラーゼ、アシル-CoAオキシダーゼ、またはアシル-CoAデヒドロゲナーゼを含む、請求項26または27記載の方法。
【請求項２９】
C4、C5、またはC6二酸への分離の前に二酸混合物をエステル化する工程を含む、請求項3記載の方法。
【請求項３０】
混合物からアジピン酸を結晶化させる工程を含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、およびアジピン酸に変換する前記非天然宿主細胞が、1,6-ヘキサンジオールも産生する、請求項5記載の方法。
【請求項３２】
1,6-ヘキサンジオールを産生する前記宿主細胞が、6-オキソヘキサン酸の6-ヒドロキシカプロン酸への変換を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼを発現する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸も産生する、請求項5記載の方法。
【請求項３４】
6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-オキソヘキサン酸を6-アミノカプロン酸に変換するアミノトランスフェラーゼを発現する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸をε-カプロラクタムに変換するアミドヒドロラーゼも発現する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
6-アミノカプロン酸を産生する前記非天然宿主細胞が、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換する1-アミノトランスフェラーゼによって、ヘキサメチレンジアミンを産生する、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
前記生体触媒が、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素を含み、かつ該酵素が、P450シトクロムオキシダーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、ω-オキシゲナーゼ酵素、もしくはクラスEC 1.14.15.3由来のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ；脂肪アルコールオキシダーゼ；クラスEC 1.1.1由来のアルコールデヒドロゲナーゼ；バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ；カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ；脂肪アルコールオキシダーゼ；アルコールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ；またはα,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ（EC 3.1.1.-）である、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
生体触媒が、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素であり、かつ該酵素が、クラスEC 1.1.1.245由来のシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ／ChnA；クラスEC 1.14.13.22由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ／ChnB；クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ／ChnC；クラスEC 1.1.1.2由来のChnD；EC 1.1.1.174由来のシクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ；EC 3.7.1.10もしくはEC 3.7.1.11由来のシクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ；リパーゼ（EC 3.1.1.3）；エステラーゼ（EC 3.1.1.1）；クチナーゼ（EC 3.1.1.74）；ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）；1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）；グルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）；ラッカーゼ（EC 1.10.3.2）；またはそれらの組み合わせである、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記混合有機性廃棄流中の炭素供給源を利用する宿主細胞生体触媒を用いて、該廃棄流をpH5.0〜8.0で処理する工程を含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流と生体触媒とを含む、組成物。
【請求項４１】
前記混合有機性廃棄流が、NVR、洗浄水、COP酸、苛性洗浄液流、またはそれらの組み合わせである、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
前記生体触媒が、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素である、請求項39または40記載の組成物。
【請求項４３】
前記宿主細胞がNVRに対して耐性を有する、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
前記宿主細胞が前記混合有機性廃棄流の少なくとも1容量％に対して耐性を有する、請求項43記載の組成物。
【請求項４５】
前記天然のまたは非天然の宿主細胞が、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換する内在性または異種性のω酸化経路を含み、かつ該天然のまたは非天然の宿主細胞が、n-アルカンを利用する酵母または細菌である、請求項42〜44のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
前記n-アルカンを利用する酵母が、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、デバリオマイセス属、およびリポマイセス属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり；かつ前記n-アルカンを利用する細菌が、シュードモナス・フルオレッセンス、P.プチダ、P.エルギノーサ、P.オレオボランス、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス、アシネトバクター・ベネチアヌス、オレイフィラス・メシネンシス、アルスロバクター・ビスコサス、カプリアビダス・メタリデュランス、ロドコッカス・エリスロポリス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、バークホルデリア・セパシア、デルフチア・アシドボランス、アルカニボラクス・ディエソレイ、またはそれらの組み合わせである、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
前記酵素がヒドロラーゼである、請求項42記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヒドロラーゼが、リパーゼ（EC 3.1.1.3）、エステラーゼ（EC 3.1.1.1）、クチナーゼ（EC 3.1.1.74）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）、ラクトンヒドロラーゼ；グルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）、ラッカーゼ（EC 1.10.3.2）、またはそれらの組み合わせである、請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
前記ラクトンヒドロラーゼが1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）である、請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
前記酵素が、P450シトクロムオキシダーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、ω-オキシゲナーゼ酵素、もしくはクラスEC 1.14.15.3由来のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ；脂肪アルコールオキシダーゼ；クラスEC 1.1.1由来のアルコールデヒドロゲナーゼ；バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ；カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ；脂肪アルコールオキシダーゼ；アルコールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ；α,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ（EC 3.1.1.-）；またはそれらの組み合わせである、請求項42記載の組成物。
【請求項５１】
前記酵素が、クラスEC 1.1.1.245由来のシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ／ChnA；クラスEC 1.14.13.22由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ／ChnB；クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ／ChnC；クラスEC 1.1.1.2由来のChnD；EC 1.1.1.174由来のシクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ；EC 3.7.1.10もしくはEC 3.7.1.11由来のシクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ；またはそれらの組み合わせである、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
前記廃棄流から前記モノマー成分、二酸、アジピン酸、または他のα,ω-二官能性C6アルカンを回収するまたは分離する工程をさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
NVR、COP酸、または洗浄水の存在下で微生物を培養する工程であって、該NVR、COP酸、または洗浄水が、該微生物の増殖に必要とされる炭素の少なくとも一部を補給する工程、ならびに
該NVR、COP酸、または洗浄水中のモノマー含有量を富化する工程であって、該微生物が、該廃棄流のダイマー成分および／またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換する工程
を含む、微生物の流加培養または連続培養のための方法。
【請求項５４】
培養物のpHを6.0〜7.5の間で制御する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
栄養供給物または前記廃棄流とともに、グリセロールまたはグルコース等の追加の発酵性炭素供給源を補給する工程をさらに含む、請求項53または54記載の方法。
【請求項５６】
流加培養発酵の場合には部分的滴下による細胞保持またはケモスタット培養の最中の細胞保持をさらに含む、請求項53〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記微生物がY.リポリティカである、請求項53〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
前記モノマー成分が、二酸、アジピン酸、α,ω-二官能性アルカン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項53〜57のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年6月17日に提出された仮出願第61/498404号および2011年11月11日に提出された仮出願第61/558718号の優先権を主張するものであって、その内容は参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、産業用シクロアルカン酸化の廃棄流のモノマー成分を富化するための、それらの二酸およびアジピン酸濃度を富化するための、ならびに／またはそれらからα,ω-二官能性アルカンを産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ナイロンは、ジアミンとジカルボン酸、ωアミノ酸、またはラクタムとの縮重合によって一般的に合成されるポリアミドである。よく見られるナイロンの変種は、ヘキサメチレンジアミンとヘキサン-1,6-二酸（アジピン酸）の反応によって形成されるナイロン6,6である。代替的には、ナイロン6が、カプロラクタムの開環重合によって合成され得る。ゆえに、ヘキサン-1,6-二酸（アジピン酸）、アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン（hexamethyldiamine）、およびカプロラクタムはすべて、ナイロンの産生における重要な中間体である（Anton, A. and Baird, B. R. 2005. Polyamides, Fibers. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology（非特許文献1））。
【０００４】
産業上、これらの中間体は、石油化学ベースの原料を用いて合成されている。現在用いられている商業的プロセスにおいて、アジピン酸およびカプロラクタムを産生するための開始材料はシクロヘキサンであり、次いでそれは一連の工程において空気によって酸化されて、シクロヘキサノン（K）およびシクロヘキサノール（A）の混合物を形成し、この混合物はKAオイルとして公知である。アジピン酸については、後続の工程において硝酸酸化によりKAオイルをアジピン酸に酸化する。カプロラクタムについては、いくつかの周知の工程により、シクロヘキサノンをカプロラクタムに変換する（Oppenheim, J. P. and Dickerson, G. L. 2003. Adipic Acid. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology（非特許文献2））。該プロセスおよび種々の改善は、米国特許第2,439,513号（特許文献1）；同第2,557,282号（特許文献2）；同第2,791,566号（特許文献3）；同第2,840,607号（特許文献4）；同第2,971,010号（特許文献5）；および同第3,338,959号（特許文献6）において開示されている。
【０００５】
シクロヘキサンのKAオイルへの空気酸化において、ジカルボン酸、一酸、ヒドロキシ酸、シクロヘキサノン、シクロヘキサノールなどのエステル／オリゴマーの混合物を含む、かなりの量の廃棄流が産生される。これらの廃棄流は、非揮発性残留物（NVR）、洗浄水（water wash）、またはCOP酸の流（stream）と呼ばれる。米国特許第4,058,555号（特許文献7）等、これらの混合物から材料を回収するための化学的方法および化学的プロセスに関する多数の刊行物が存在している。しかしながら、これらの流からの炭素の回収は低収率に悩まされており、炭素の大部分は利用されていない。
【０００６】
経済的かつ環境的な配慮により、石油化学原料シクロヘキサンのより効率的な炭素利用が必要とされる。発酵基質としての苛性シクロヘキシルヒドロペルオキシド（CHHP）分解プロセスからのNVR中の成分の利用が、数十年前に手短に調査されたが（Ramsay et al., Applied & Environmental Microbiology, 1986, 52(1): 152-156（非特許文献3））、これらの廃棄流の処理のためのまたはこれらの廃棄流中の炭素の利用のための生物学的プロセスは、微生物に対するこれらの流の高い毒性のために今日まで開発されたことがなかった。したがって、これらの廃棄流は燃焼させることによって処分する必要があり、かつこれは、該流の性質に応じて特別に設計された焼却炉での燃焼を要し得る。
【０００７】
したがって、燃料価値のために燃焼させたり処分するのではなくむしろ、これらの廃棄流中で失われる炭素をより効率的に利用するためおよび／または炭素をより有用な生成物に変換するための代替的方法の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第2,439,513号
【特許文献２】米国特許第2,557,282号
【特許文献３】米国特許第2,791,566号
【特許文献４】米国特許第2,840,607号
【特許文献５】米国特許第2,971,010号
【特許文献６】米国特許第3,338,959号
【特許文献７】米国特許第4,058,555号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Anton, A. and Baird, B. R. 2005. Polyamides, Fibers. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology
【非特許文献２】Oppenheim, J. P. and Dickerson, G. L. 2003. Adipic Acid. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology
【非特許文献３】Ramsay et al., Applied & Environmental Microbiology, 1986, 52(1): 152-156
【発明の概要】
【００１０】
発明の種々の態様についての概要
本発明は、酵素、天然微生物、および非天然微生物の使用を通して、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善する必要性に対処する。とくに本発明者らは、驚くべきことに、酵素および微生物を用いて、商業用シクロアルカン酸化（例えば、シクロヘキサン酸化）からのこれらの混合有機性廃棄流（例えば、NVR、COP酸、および洗浄水廃棄流）中に存在している化学物質の複雑な毒性混合物の成分を変換してモノマーに富む流を産生でき、次にこれを、混合物中の成分の生物毒性（biotoxicity）にもかかわらず、ポリオール、二酸、ナイロン中間体もしくはナイロン中間体に変換され得る前駆体、またはポリウレタン中間体等の有用な化合物に変換できることを、見出した。これによって、商業用シクロアルカン酸化プロセスからの副生成物の回収および／または再利用が可能となり、ゆえにより経済的かつ持続可能なプロセスを提供する。
【００１１】
とくに、本発明者らは、ある特定の酵素を用いて、NVRおよびCOP酸中にオリゴマーエステルとして存在している相当量の利用不能なC6成分をモノマーに変換することができる方法を同定した。モノマーとして利用可能になれば、加水分解された混合物中の該成分を、非常に高収率でポリオール等の有用な生成物に化学的に変換することができる。
【００１２】
あるいは、代謝的に操作された微生物を利用して、これらのモノマーを、二酸、1,6-ヘキサン二酸（アジピン酸）、またはポリマーの産生に有用な他のC6化合物、例えば1,6-ヘキサンジオール、カプロラクトン、6-アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジアミン、およびカプロラクタムの混合物等の有用な生成物に変換することができる。
【００１３】
本発明者らは、NVR中の阻害性成分としてのバレロラクトンも同定した。混合物中に存在しているバレロラクトンを除去するまたはその量を減少させるために、混合有機性廃棄流を処理することによって、NVR中で天然に増殖し得ない宿主細胞が、該処理された混合物の存在下で増殖することができ、かつ他の混合有機性廃棄流成分の望ましい化合物への変換を触媒することができる。
【００１４】
したがって、本発明は、シクロアルカン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流と生体触媒とを組み合わせて、該廃棄流のダイマー成分および／またはオリゴマー成分をモノマー成分に酵素的に変換することによって、シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流、例えばNVR、COP酸、または洗浄水廃棄流中のモノマー含有量を富化するための方法を提供する。
【００１５】
いくつかの態様において、混合有機性廃棄流中のオリゴマーエステル成分を加水分解して、該流中のモノマー成分の量を増大させる。一局面において、方法は、少なくとも1種のヒドロラーゼ酵素、天然宿主細胞、または非天然宿主細胞を含む生体触媒を用いて混合有機性廃棄流を処理する工程、該廃棄流中のオリゴマーエステルを加水分解する工程、および混合有機性廃棄流中のモノマー成分の量を増大させる工程を含む。
【００１６】
別の局面において、方法は、天然のまたは非天然の宿主細胞を用いて混合有機性廃棄流を処理する工程であって、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、廃棄流中のオリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する、混合有機性廃棄流中のラクトンの少なくとも一部をヒドロキシ酸に加水分解する、または混合有機性廃棄流中に存在している直鎖状C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部を対応する二酸に酸化する、工程、混合有機性廃棄流中のモノマー成分の量を増大させる工程を含む。
【００１７】
一局面において、生体触媒は、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素である。別の局面において、生体触媒は、オリゴマーエステルもしくはラクトンに作用する内在性もしくは異種性ヒドロラーゼを分泌する非天然宿主細胞であり、かつ／または一酸を二酸に変換するω水酸化経路ならびに／もしくはシクロヘキサノールおよびシクロヘキサノンをアジピン酸に変換するシクロヘキサノール分解経路を有する。生体触媒は、β酸化を介してアジピン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、および／またはカプロン酸を分解し得る弱められた能力をさらに有し得る。ホールセル（whole cell）生体触媒は、さらに、ヒドロキシカプロン酸、6-オキソカプロン酸、およびアジピン酸を、官能基が-OH、-COOH、および-NH2より選択されるα,ω-二官能性アルカンに変換する酵素を発現し得る。
【００１８】
一局面において、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を、単離されたもしくは固定化されたヒドロラーゼ、または、天然のもしくは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌される内在性もしくは異種性ヒドロラーゼによって触媒する。
【００１９】
別の局面において、ヒドロラーゼ（EC 3.1.1.-）は、リパーゼ（EC 3.1.1.3）、エステラーゼ（EC 3.1.1.1）、クチナーゼ（EC 3.1.1.74）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）、1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）もしくはグルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）等のラクトンヒドロラーゼ、またはそれらの組み合わせである。
【００２０】
一局面において、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を、酸性pH、生理的pH、またはアルカリ性pHで活性を有するヒドロラーゼによって触媒する。別の局面において、廃棄流中の炭素供給源を利用および変換することができる非天然宿主細胞を用いて、混合有機性廃棄流をpH5.0〜8.0で処理する。
【００２１】
一局面において、ヒドロラーゼを用いた処理によって、混合有機性廃棄流の粘性を低下させて、該流を燃焼させる効率を改善し、かつ／またはさらなる化学的もしくは生物学的処理のために該流を調製する。とくに、処理された混合有機性廃棄流を燃料価値のためにもしくは合成ガスを産生するために燃焼させることができ、あるいは処理された混合有機性廃棄流の1種もしくは複数種の成分を、混合エステルもしくはポリオールを産生するためのエステル化、ジオールへの水素化、二酸への酸化、還元的アミノ化、スルホン化、またはNH4OHもしくはポリアミンを用いた処理に用いる。
【００２２】
一局面において、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を、さらなる分離、化学的変換、または生体触媒による酵素的変換と同時に実施する。あるいは、オリゴマーエステルのモノマーへの加水分解を、さらなる分離、化学的変換、または生体触媒による酵素的変換より前に実施する。
【００２３】
いくつかの態様において、オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解し得る；ラクトンの少なくとも一部をヒドロキシ酸に加水分解し得る；かつ／または混合有機酸流中に存在している直鎖状C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部を対応する二酸に酸化し得る、天然のまたは非天然の宿主細胞を用いて、混合有機性廃棄流を処理することによって、非揮発性残留物、COP酸、または洗浄水中のC4-C6一酸およびヒドロキシ酸を二酸に変換する。一局面において、C4、C5、またはC6二酸への分離の前に二酸混合物をエステル化する。
【００２４】
別の局面において、非天然宿主細胞を用いて混合有機性廃棄流を処理し、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する；バレロラクトンの少なくとも一部を5-ヒドロキシ-吉草酸に加水分解する；カプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、および6-オキソカプロン酸の少なくとも一部をアジピン酸に酸化する；廃棄流の環状C6成分の少なくとも一部をアジピン酸に変換する；混合有機性廃棄流中に存在しているC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する；かつ／または混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化する。そのような処理によって、該流中のアジピン酸の相対的濃度が増大し、該流中の一酸およびヒドロキシ酸の量が低下する。一局面において、C4、C5、またはC6二酸への分離の前に二酸混合物をエステル化する。あるいは、混合物からアジピン酸を結晶化する。
【００２５】
さらに別の局面において、非天然宿主細胞を用いて混合有機性廃棄流を処理し、該細胞が、単独でまたは組み合わせで、オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解する；カプロン酸の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸に酸化する；環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸または6-オキソカプロン酸に変換する；混合有機性廃棄流中に存在しているC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する；混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化する；アジピン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、または6-オキソヘキサン酸を1,6-ヘキサンジオール、6-アミノカプロン酸、ε-カプロラクタム、またはヘキサメチレンジアミンに変換する少なくとも1種の生合成経路酵素を発現する。そのような処理によって、該流中に存在しているC6成分および前駆体はα,ω-二官能性C6アルカンに変換される。
【００２６】
一局面において、オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、およびアジピン酸に変換する非天然宿主細胞は、1,6-ヘキサンジオールも産生する。特定の局面において、1,6-ヘキサンジオールを産生する宿主細胞は、6-オキソヘキサン酸の6-ヒドロキシカプロン酸への変換を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
【００２７】
別の局面において、オリゴマーエステル、カプロン酸、および環状C6化合物を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する非天然宿主細胞は、6-アミノカプロン酸も産生する。特定の局面において、6-アミノカプロン酸を産生する非天然宿主細胞は、6-オキソヘキサン酸を6-アミノカプロン酸に変換するアミノトランスフェラーゼを発現する。一局面において、6-アミノカプロン酸を産生する非天然宿主細胞は、6-アミノカプロン酸をε-カプロラクタムに変換するアミドヒドロラーゼも発現する。あるいは、6-アミノカプロン酸を産生する非天然宿主細胞は、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換する1-アミノトランスフェラーゼによって、ヘキサメチレンジアミンも産生する。
【００２８】
一局面において、オキソ酸を介してC4-C6またはC6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸を二酸に変換する天然のまたは非天然の宿主細胞は、酪酸、吉草酸、および／もしくはカプロン酸のコハク酸、グルタル酸、および／もしくはアジピン酸への変換；酪酸、吉草酸、および／もしくはカプロン酸の4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および／もしくは6-ヒドロキシカプロン酸への変換；4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および／もしくは6-ヒドロキシカプロン酸の4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および／もしくは6-オキソヘキサン酸への変換；ならびに／または4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および／もしくは6-オキソヘキサン酸のコハク酸、グルタル酸、および／もしくはアジピン酸への変換を触媒する内在性または異種性のω酸化経路を有する。とくに、内在性または異種性のω酸化経路を有する天然のまたは非天然の宿主細胞は、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し得、該宿主細胞は、n-アルカンを利用する酵母または細菌である。特定の局面において、n-アルカンを利用する酵母は、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、C.アルビカンス（C. albicans）、C.クロアカエ（C. cloacae）、C.ギリエルモンジイ（C. guillermondii）、C.インターメディア（C. intermedia）、C.マルトサ（C. maltosa）、C.パラプシローシス（C. parapsilosis）、C.ゼイラノイデス（C. zeylenoides）、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ（Rhodotorula）属、リゾプス（Rhizopus）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、デバリオマイセス（Debaryomyces）属、およびリポマイセス（Lipomyces）属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり；n-アルカンを利用する細菌は、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、P.プチダ（P. putida）、P.エルギノーサ（P. aeroginosa）、P.オレオボランス（P. oleoverans）、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）、A.ベネチアヌス（A. venetianus）等のアシネトバクター種（Acinetobacter sp.）、オレイフィラス・メシネンシス（Oleiphilus messinensis）、アルスロバクター・ビスコサス（Arthrobacter viscosus）、カプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）およびR.エリスロポリス（R. erythropolis）等のロドコッカス種、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomona spaucimobilis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）、アルカニボラクス・ディエソレイ（Alcanivorax diesolei）、またはそれらの組み合わせである。
【００２９】
一局面において、廃棄流の環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に変換する天然のまたは非天然の宿主細胞は、シクロヘキサノールの6-オキソヘキサン酸への変換；1,2-シクロヘキサンジオールの6-オキソヘキサン酸への変換；および／または6-オキソヘキサン酸のアジピン酸への変換を触媒する内在性または異種性の経路を有する。
【００３０】
一局面において、β酸化を介したアジピン酸および／または6-ヒドロキシカプロン酸および／またはカプロン酸の分解は、C6酸が活性化されてCoAエステルとなるのを阻止することによって、またはアシル-CoAオキシダーゼをコードする1種もしくは複数種のPOX遺伝子の欠失によって、弱まる。
【００３１】
特定の局面において、1,2-シクロヘキサンジオールの6-オキソヘキサン酸への変換には、シクロヘキサン-1,2-ジオールのシクロヘキサン-1,2-ジオンへの変換および／またはシクロヘキサン-1,2-ジオンの6-オキソヘキサン酸への変換が含まれる。
【００３２】
別の特定の局面において、シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換には、シクロヘキサノンのε-カプロラクトンへの変換；ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への変換；および／または6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換が含まれる。
【００３３】
種々の態様において、非揮発性残留物または洗浄水中の6-ヒドロキシヘキサン酸および／またはカプロン酸を含む6炭素成分の一部を、アジピン酸に変換する。
【００３４】
種々の態様において、非揮発性残留物または洗浄水中の残存するシクロヘキサノンおよび／またはシクロヘキサノールの一部を、6-ヒドロキシヘキサン酸または6-オキソヘキサン酸に変換する。
【００３５】
一局面において、天然のまたは非天然の宿主細胞は、NVRに対して耐性を有する。特定の局面において、宿主細胞は、混合有機性廃棄流の少なくとも1容量％に対して耐性を有する。別の局面において、混合有機性廃棄流に対する宿主細胞の耐性を、該流中の阻害性化合物の量を低下させることによって向上させる。特定の局面において、阻害性化合物はラクトンであり、天然のまたは非天然の宿主細胞を用いた混合有機性廃棄流の処理の前または最中の、ラクトンを対応するヒドロキシ酸に加水分解し得る1種または複数種の生体触媒を用いた該流の処理によって、混合有機性廃棄流中のラクトンの量を低下させる。別の局面において、生体触媒は、宿主細胞によって発現されかつ発酵の間に分泌される酵素である。
【００３６】
一局面において、廃棄流からより高収率のC6成分を提供するために、宿主細胞によるC6化合物の異化の割合を減少させる。特定の局面において、宿主細胞によるβ酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸のアセチル-CoAへの分解を低下させる。より特定の局面において、カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸を用いてCoAエステルを形成する酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる。一局面において、CoAエステルを酸化する酵素を欠失させるまたは阻害することによって、β酸化を通じたカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の分解を低下させる。CoAエステルを形成する例示的な酵素は、CoAリガーゼおよびCoAトランスフェラーゼである。CoAエステルを酸化する例示的な酵素は、アシル-CoAオキシダーゼおよびアシル-CoAデヒドロゲナーゼである。
【００３７】
有利なことには、本明細書において記載される方法は、石油化学ベースの材料の使用を減少させ、かつ商業的産業プロセスからの廃棄物を利用する持続可能なプロセスを提供する。所望の場合には、これらのプロセスを新しい設備で実施することができるが、これらのプロセスを既存の商業プラントで実施することができ、ゆえに新しい費用のかかるプラントの建設を必要としない。さらには、原料はインサイチューで生成されるため、産生されるアジピン酸を既存の精製および／または結晶化設備に直接供給し得るので、輸送費用は最小限に抑えられる。
【００３８】
種々の態様において、NVRまたは洗浄水流の4炭素および5炭素成分の一部を、対応する二酸に異化または変換する。
【００３９】
本発明は、シクロアルカン酸化プロセスの混合有機性廃棄流と生体触媒とを含む組成物も提供する。一局面において、混合有機性廃棄流は、NVR、洗浄水／COP酸、または苛性洗浄液流を含む。別の局面において、生体触媒は、単離された酵素、または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素、またはホールセルである。
【００４０】
別の局面において、宿主細胞がNVRに対して耐性を有する。特定の局面において、宿主細胞は、混合有機性廃棄流の少なくとも1容量％に対して耐性を有する。
【００４１】
一局面において、天然のまたは非天然の宿主細胞は、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し得る内在性または異種性のω酸化経路を含み、該宿主細胞は、n-アルカンを利用する酵母または細菌である。特定の局面において、n-アルカンを利用する酵母は、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、デバリオマイセス属、およびリポマイセス属の酵母、もしくはそれらの組み合わせであり；n-アルカンを利用する細菌は、シュードモナス・フルオレッセンス、P.プチダ、P.エルギノーサ、P.オレオボランス、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス、A.ベネチアヌス等のアシネトバクター種、オレイフィラス・メシネンシス、アルスロバクター・ビスコサス、カプリアビダス・メタリデュランス、ロドコッカス・ロドクラウスおよびR.エリスロポリス等のロドコッカス種、スフィンゴモナス・パウシモビリス、バークホルデリア・セパシア、デルフチア・アシドボランス、もしくはアルカニボラクス・ディエソレイ、またはそれらの組み合わせである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の種々の態様についての詳細な説明
本発明の方法は、有機性廃棄流からの成分のより高収率でありかつ改善された回収を可能にする少なくとも1種の生体触媒を用いる。本明細書において用いられる「生体触媒」という用語は、単離されたもしくは精製された酵素、または1つの有機分子の単一化学転換を行う宿主細胞によってインサイチューで産生された酵素、または1つもしくは複数の有機分子の一連の連続的転換を触媒するホールセルを表す。単離されたもしくは精製された酵素を、商業的供給源から購入してよく、または該酵素を天然にもしくは非天然に発現させた宿主細胞から精製してよい。宿主細胞は、天然でも非天然でも、例えば遺伝子操作されたものであってよい。宿主細胞は、細菌もしくは古細菌等の原核生物、または酵母もしくは動物細胞等の真核生物であってよい。宿主細胞は、特定の反応、例えば加水分解を触媒し得る酵素を発現かつ分泌し得る。加えて、宿主細胞は、異なる反応を触媒するさらなる酵素経路を含有し得る。例として、宿主細胞は、混合有機性廃棄流中の一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸成分の酸化を触媒するω水酸化経路、または廃棄流の成分から形成される6-オキソヘキサン酸等の化合物を転換して、6-アミノカプロン酸等の商業的により価値のある生成物を生成する酵素を含有し得る。
【００４３】
とくに、生体触媒は、オリゴマーエステルをモノマーに加水分解する。これは、二酸、アジピン酸、および二官能性アルカンを富化する等の後続の化学的または酵素的処理に利用可能なモノマーを産生することによって、廃棄流の焼却価値を改善し、かつ／または廃棄流の組成を改善する。本明細書において記載される方法の開発における重要な工程は、産業用シクロヘキサン酸化のNVR、COP酸、および洗浄水廃棄物中に存在している化合物のより望ましい化合物への変換に必要な種々の酵素および経路を天然に発現する、かつ／または発現するように遺伝子改変されている宿主細胞の同定である。いくつかの場合において、天然および非天然の宿主細胞は、NVRおよび洗浄水廃棄物中に存在しているそれらの化合物（容易には6-オキソヘキサン酸に変換され得ない）を増殖のための栄養源として使用し得る。
【００４４】
本発明者らは驚くべきことに、混合有機性廃棄流の存在下で、宿主細胞が生存したままであり、かつ酵素が活性を有し、廃棄流のより望ましくない成分を産業的かつ商業的に有用な化合物または中間体へ変換し得ることを発見した。さらに、産業用シクロヘキサン酸化プロセスの副生成物としてNVRおよび洗浄水廃棄物中に存在している数々の阻害性化学物質にもかかわらず、宿主細胞が、該酸化におけるNVRおよび洗浄水廃棄流に耐性があり得る（かつ、ある場合には、その成分を異化し得る）という本発明者らの発見も予想外であった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】産業用シクロヘキサン酸化のNVRおよび洗浄水廃棄物の、脂肪族および環状のC6成分のアジピン酸への変換に伴う酵素変換についての模式図である。図は、NVRおよび洗浄水廃棄物のC3-C5成分を、細胞の中心代謝に供給され得る化合物に変換し、それによって該細胞が増殖のために該化合物を使用し得るようにするために必要な変換も説明している。さらに、図は、所望の生成物の全体的収率を増大させるために本発明の操作された細胞において阻害され得る酵素変換を説明している。これらの阻害された経路は、変換の方向を示す矢印の上の×印の存在によって表示されている。
【図２】6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換のための、および、6-オキソヘキサン酸の6-アミノヘキサン酸への変換（これが次いでカプロラクトンにまたは6-アミノヘキサナールを介してヘキサン-1,6-ジアミン（ヘキサメチレンジアミン）に変換される）のための例示的な酵素変換を示す模式図である。1：1-アミノトランスフェラーゼEC 2.6.1.191、また、バシラス・ワイヘンステファンエンシス（Bacillus weihenstephanensis）KBAB4、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）gi99510722由来のアミノトランスフェラーゼ；2：カルボキシレートレダクターゼEC 1.2.99.6またはアルデヒドデヒドロゲナーゼEC 1.2.1.3／EC 1.2.1.31；3：6-ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼEC 1.1.1.258；4：アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼEC 1.2.1.10；5：EC 3.5.2.11等のアミドヒドロラーゼ（EC 3.5.2.-）。
【図３】宿主株ヤロウイア・リポリティカにおける細胞外分泌の標的とされる酵素の発現に用いた発現ベクター構築物の概略図である。
【図４】NVRおよびCOP酸オリゴマーを加水分解し得る商業用エステラーゼおよびリパーゼの能力を試験するそれぞれの間隙（clearance）プレートアッセイの写真を示している。図4、パネルAは、エステラーゼによるCOP酸（4％ v/v）の加水分解を示している：ウェル1は対照（酵素なし、リン酸塩バッファーのみ）であり；ウェル2はムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）エステラーゼであり；ウェル3はシュードモナス・フルオレッセンスエステラーゼであり；ウェル4はシュードモナス種コレステロールエステラーゼであり；ウェル5はバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilu）エステラーゼであり；ウェル6はウマ肝臓エステラーゼであり；ウェル7はカンジダ・リポリティカ（Candida lipolytica）エステラーゼであり；ウェル8はリゾプス・オリゼ（Rhizopusoryza）エステラーゼであり；およびウェル9はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エステラーゼである。図4、パネルBおよびCは、リパーゼによるCOP酸（4％ v/v）の加水分解を示している：c−酵素なし対照（リン酸塩バッファー）、ウェル1：サーモマイセス・ラヌギノサス（Thermomyceslanuginosus）、ウェル2：バークホルデリア・セパシア（Burholderia capacia）リパーゼ、ウェル3：ムコール・ミエヘイリパーゼ、ウェル4：リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、ウェル5：シュードモナス・フルオレッセンスリパーゼ、ウェル6：ペニシリウム・カメンベルティ（Penicillium camemberti）リパーゼ、ウェル7：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）リパーゼ、ウェル8：アスペルギルス・ニガーアマノリパーゼA、ウェル9：カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼA、ウェル10：カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）III型リパーゼ、およびウェル11：リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）リパーゼ。
【図５】選択されたエステラーゼによる、異なるpHにおけるポリカプロラクトンジオールポリマー（2％、w/v、MW＝530g/モル）の加水分解を示している。ムコール・ミエヘイ（E1）およびリゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）（E12）由来のエステラーゼは、pH3.5で活性があった。ストレプトマイセス・ディアスタトクロモゲネス（Streptomyces diostotochromogenes）（E8）はアルカリ性エステラーゼであり、pH＞8でのみ活性を呈した。
【図６】生体内転換アッセイの間の、選択されたエステラーゼで16時間処理された、リン酸塩バッファー（100mM、pH7.0）中のNVR反応混合物（2％ v/v）におけるカプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、アジピン酸、および総酸の濃度の増大を示している。
【図７】生体内転換アッセイの間の、選択されたリパーゼで16時間処理された、リン酸塩バッファー（100mM、pH7.0）中のNVR反応混合物（2％ v/v）における6-ヒドロキシカプロン酸の濃度の増大を示している。
【図８】生体内転換アッセイの間の、選択されたエステラーゼで16時間処理された、リン酸塩バッファー（100mM、pH7.0）中のCOP酸（4％ v/v）におけるカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、アジピン酸、および総酸の濃度の増大を示している。
【図９】生体内転換アッセイの間の、選択されたリパーゼで16時間処理された、リン酸塩バッファー（100mM、pH7.0）中のCOP酸（4％ v/v）におけるカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、アジピン酸、および総酸の濃度の増大を示している。
【図１０】生体内転換アッセイの間の、固定化したリパーゼで16時間処理された、リン酸塩バッファー（100mM、pH7.0）中のNVR（4％ v/v）における6-ヒドロキシカプロン酸の濃度の増大を示している。
【図１１】指向進化によって創出された内在性Lip2リパーゼの変種を発現する組換えY.リポリティカ酵母株の、オリゴマーエステルを加水分解し得る能力を試験するそれぞれの間隙プレートアッセイの写真を示している。Y.リポリティカ非形質転換宿主およびムコール・ミエヘイエステラーゼを、分泌されたリパーゼ変種の相対活性を判断するための対照として用いた。変種15および36は、コロニー周辺の光輪の大きさによって判断されるように高い活性を呈した。
【図１２】NVR中に存在している酪酸および吉草酸を異化し得る株を選択するために用いられたケモスタット発酵機構の模式図である。
【図１３】約0.1［毎時］の希釈率において、ケモスタットの定常状態に到達したことを示すグラフ表現である。
【図１４】約0.1［毎時］の希釈率における定常状態に接近する間のpHかく乱を示すグラフ表現である。
【図１５】約0.1［毎時］の希釈率における定常状態付近でのpH逸脱ドリフト実験からの結果を示すグラフ表現である。
【図１６】炭素およびエネルギー供給源としてのNVR中で増殖させたY.リポリティカの細胞保持を調査するために用いられた、細胞保持実験機構を有するケモスタットを示している。
【図１７】約215［mL/時間］の流速における2［％］（v/v）NVRおよび約0.025［毎時］の有効バイオマス希釈率を用いた、細胞保持を伴う定常状態ケモスタット培養を示している。
【図１８】0.1〜1g/Lラクトンの存在下での選択された酵母の増殖を示している。Iss#125は、S. セレビシエ（対照）である。Iss#134は、3％（v/v）NVR＋YPD培地上での緩慢増殖後にプレートから単離されたものである。Iss#137は、合成NVR成分の供給を用いたケモスタットから単離されたものである。
【図１９】唯一の炭素供給源として1〜2％NVRを用いた細胞保持ケモスタットにおける、バレロラクトンの蓄積を示している。
【図２０】カプロラクトンの6-ヒドロキシカプロン酸への変換を触媒するChnCを含む、シクロヘキサノンのアジピン酸への酸化に伴う遺伝子を示している。ChnCとして分類されるいくつかの酵素は、バレロラクトンの5-ヒドロキシ吉草酸への変換も触媒する。
【図２１】NVR（4％）とインキュベートした場合に、6-ヒドロキシカプロン酸およびアジピン酸が、弱められたβ酸化を有するY.リポリティカ株（種々のPOX変異体）の反応上清中に蓄積し、一方で親株および野生型株において蓄積が観察されないことを説明している。ゆえに、アシル-CoAオキシダーゼをコードするPOX遺伝子の欠失は、β酸化を通じたNVR中のアジピン酸および6-ヒドロキシカプロン酸の両方の分解を阻止する。
【図２２】NVR中の6-ヒドロキシカプロン酸およびアジピン酸が親株および野生型株によって分解され、一方でPOX変異体は両方の酸を蓄積することを説明している。POX3は、C6成分の分解に対して最大の効果を有する。
【００４６】
混合廃棄流：非揮発性残留物、洗浄水廃棄物、およびCOP酸
商業的シクロアルカンの二酸への酸化プロセスは、概して2つの工程を伴う。これらの工程の最初に、空気を用いてシクロアルカンを酸化して、シクロアルカノールおよびシクロアルカノンの混合物を産生する。次いで、硝酸を用いてこの混合物を二酸に酸化する。KA混合物の産生の間に、いくつかの副生成物流が生成される。より具体的には、シクロヘキサンが酸素または酸素を含有する気体で酸化された場合、シクロヘキサン中にシクロヘキサノール（A）、シクロヘキサノン（K）、およびシクロヘキシルヒドロペルオキシド（CHHP）を含有する中間体流が産生される。この中間体流は、CHHPをKAに変換することを意図した後続の処理工程を妨げる、副生成物も含む。したがって、商業的プロセスは、K、A、およびCHHPを含有する中間体流を水または腐食剤（米国特許第3,365,490号に記載されているもの等）と接触させて、不要な副生成物を除去する工程を含んでよい。この抽出工程は、（i）K、A、およびCHHPを含有する精製されたシクロヘキサン流；ならびに（ii）水廃棄流を産出する。
【００４７】
本明細書において用いられる「洗浄水」、「洗浄水廃棄流」、または「水廃棄流」という用語は、シクロヘキサンオキシデートの水抽出によって産生される水性流を表す（Oppenheim, J. P. and Dickerson, G. L. 2003. Adipic Acid. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology）。洗浄水は、種々の一酸および二酸、ヒドロキシ酸、ならびにシクロヘキサンの初期酸化の間に形成される他の酸化副生成物を含有する。
【００４８】
CHHPのKおよびAへの変換が完了したら、（i）再利用のために、未反応のシクロヘキサンを回収するため、ならびに（ii）引き続くアジピン酸への酸化またはカプロラクタムへの変換のために、精製したKおよびAを獲得するため、得られた混合物を純化する。本明細書において用いられる「非揮発性残留物の流」または「NVR」という用語は、燃焼により適した低クロム含有量を有する、シクロヘキサン酸化生成物のシクロヘキサノールおよびシクロヘキサノンの蒸留による回収からの高沸点の蒸留底部を表す（Oppenheim, J. P. and Dickerson, G. L. 2003. Adipic Acid. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology）。NVRは、酪酸、吉草酸、カプロン酸、5-ヒドロキシ吉草酸、6-ヒドロキシカプロン酸、バレロラクトン、コハク酸、グルタル酸、およびアジピン酸、ならびにシクロヘキサノール（cylohexanol）、シクロヘキサンジオール、およびシクロヘキサノンを含むがそれらに限定されない、いくつかの成分を含む。
【００４９】
概説のために、シクロヘキサン酸化プロセスから入手可能な、「副生成物」流として本明細書において時々表される副生成物流には、「洗浄水」（シクロヘキサンオキシデートの水抽出によって産生される水性流）および「NVR」（KA純化からの高沸点の蒸留底部、CAS登録番号68411-76-7）を含める。水の少なくとも一部の除去による洗浄水の濃縮によって、「COP酸」として公知の濃縮された水抽出物流が産生される。本明細書において用いられる「COP酸」という用語は、熱処理されて過酸化物が除去され、かつ濃縮されて水の少なくとも一部が除去された洗浄水流を表す（CAS登録番号68915-38-8）。NVRの産生を記載している、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2004/0054235号、ならびに遊離酸性官能基のモノマーエステルおよびオリゴマーエステルへの変換による、NVR、洗浄水、またはCOP酸の処理、ならびにオリゴマーエステルのモノマーエステルへの変換を記載している、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2012/0064252号および第2012/0101009号を参照されたい。
【００５０】
一態様において、抽出工程においてシクロヘキサンの空気酸化産物を水と接触させ、かつ以下で「洗浄水」と称される抽出物である水相を分離することによって、「COP酸」が提供され得る。一態様において、「洗浄水」を熱処理して、貯蔵および出荷の間に困難をもたらし得る過酸化物を破壊する。貯蔵量および輸送費用を低下させるために、水の部分的除去によって洗浄水を濃縮することができる。
【００５１】
一態様において、COP酸は、概して約10重量％〜70重量％の水を含有し得る。一態様において、COP酸は、約10重量％〜50重量％の水を含有し得る。一態様において、NVRは、約10重量％〜50重量％の水を含有し得る。一態様において、洗浄水は、約70重量％〜90重量％の水を含有し得る。一態様において、洗浄水は、約85重量％の水を含有し得る。
【００５２】
方法のための開始材料として、以下で「洗浄水」と称される、シクロヘキサン酸化プロセスからの（またはシステムからの）水性抽出物からの生成物の一部、以下で「COP酸」と称される、シクロヘキサン酸化プロセスからの濃縮水性抽出物、本明細書において非揮発性残留物もしくは「NVR」として表される、KA純化からの蒸留底部、またはそれらの組み合わせを用いることができる。「それらの組み合わせ」に関して、任意の1つ、または2つの組み合わせ（例えば、洗浄水とCOP酸；洗浄水とNVR；またはCOPとNVR）、または3つすべての組み合わせ（すなわち、洗浄水、COP酸、およびNVR）をそれらの組み合わせと見なすことができる。
【００５３】
混合有機性廃棄流の成分
シクロヘキサン酸化の非揮発性残留物および洗浄水廃棄流は、化合物の混合物を含み、その一部は直鎖状C6分子であり、一部は環状C6分子であり、かつ一部は直鎖状C6分子を含むポリマーエステルである。他のより短い鎖長の化合物も、NVRおよび洗浄水廃棄流中に存在している。
【００５４】
とくに、非揮発性残留物および洗浄水廃棄流は、一官能性および多官能性生成物の両方を含有する。これらの生成物上に存在し得る官能基には、酸、過酸化物、ケトン、アルコール、エステル、およびオリゴマーが含まれる。アルデヒド、ラクトン、およびアルケン等の他の官能基も存在し得る。1つの分子は、1個または複数個の官能基を含んでよい（Ramsay et al., Applied & Environmental Microbiology, 1986, 52(1):152-156）。
【００５５】
ヒドロキシル酸基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、ヒドロキシヘキサン酸、ヒドロキシペンタン酸、ヒドロキシブタン酸、ヒドロキシプロパン酸、およびヒドロキシ酢酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一態様において、酸性基は、直鎖状ヒドロカルビル鎖の一方の末端に位置してよく、一方でヒドロキシル基は、該鎖上の種々の位置に存在してよい。
【００５６】
一態様において、ヒドロキシヘキサン酸は、2-ヒドロキシヘキサン酸、3-ヒドロキシヘキサン酸、4-ヒドロキシヘキサン酸、5-ヒドロキシヘキサン酸、または6-ヒドロキシヘキサン酸である。
【００５７】
一態様において、ヒドロキシペンタン酸は、2-ヒドロキシペンタン酸、3-ヒドロキシペンタン酸、4-ヒドロキシペンタン酸、または5-ヒドロキシペンタン酸である。
【００５８】
一態様において、ヒドロキシブタン酸は、2-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシブタン酸、または4-ヒドロキシブタン酸である。
【００５９】
一態様において、ヒドロキシプロパン酸は、2-ヒドロキシプロパン酸または3-ヒドロキシプロパン酸である。
【００６０】
一酸基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、ギ酸、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、およびヘキサン酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６１】
二酸基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、およびhex-2-エン二酸（hex-2-enedioic acid）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６２】
ケト酸基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、αケト酸、例えばピルビン酸等の2-オキソ酸、βケト酸、例えばアセト酢酸等の3-オキソ酸、γケト酸、例えば4-オキソペンタン酸（レブリン酸としても知られる）等の4-オキソ酸、および5-オキソヘキサン酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６３】
アルコール基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、シクロヘキサノール、プロパノール（例えば、1-プロパノール、2-プロパノール）、ブタノール（例えば、1-ブタノール、2-ブタノールなど）、ペンタノール（例えば、1-ペンタノール、2-ペンタノールなど）、ヘキサノール（例えば、1-ヘキサノール、2-ヘキサノールなど）、ならびに1,2-、1,3-、および1,4-シクロヘキサンジオール、種々のブタンジオール異性体、および種々のペンタンジオール異性体等のジオールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６４】
過酸化基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、シクロヘキシルヒドロペルオキシドおよびヒドロキシヘキサン酸ヒドロペルオキシド（hydroxyhexanoic hydroperoxide）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６５】
エステル基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、シクロヘキシルホルメートおよびシクロヘキシルペンタノエートが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６６】
ケトン基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、シクロヘキサノンおよびシクロペンタノンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６７】
アルデヒド酸基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、5-ホルミルペンタン酸および4-ホルミルブタン酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６８】
ラクトン基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、γ-ブチロラクトン、δ-バレロラクトン、γ-バレロラクトン、およびε-カプロラクトンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６９】
アルケン基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水廃棄流中に存在し得る生成物の例には、シクロヘキセン-1-オン、ペンテン酸、およびシクロヘキセン-オールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７０】
エステル基を含み、かつ非揮発性残留物および／または洗浄水流中に存在し得る生成物の例には、6-ヒドロキシヘキサン酸のエステルまたはオリゴマー、および6-ヒドロキシヘキサン酸と1,6-ヘキサン二酸（1,6-hexandoic acid）等のジカルボン酸とを含有する架橋エステル（cross ester）またはオリゴマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７１】
生体触媒によるオリゴマー混合有機性廃棄流成分の加水分解
NVR中の利用可能なC6炭素分子の最大60％が、ヒドロキシカプロン酸、アジピン酸、およびヘキサン酸のエステルオリゴマーとして、ならびにC4-C5ヒドロキシ酸、一酸、および環式アルコールを組み入れた混合ポリマーエステルとして存在している。より低い不均一性ではあるが、主にヒドロキシカプロン酸からなる類似のオリゴマーエステルがCOP酸中に存在している。ヒドロキシカプロン酸はこれらのオリゴマーの主要な成分であり、一方で一酸および二酸は鎖終結剤（chain terminator）として作用し、異なる鎖長のオリゴマーをもたらす。NVRおよびCOP酸の商業的に実現可能な利用のためには、これらの廃棄流に由来し得る、ポリマー用途に有用なポリオール、C4-C6二塩基酸もしくは二塩基エステル混合物、またはα,ω-二官能性C6アルカン等の生成物の収率を改善するための、オリゴマーエステルからのモノマーの放出が必要とされる。NVR中の高レベルのオリゴマーはまた、NVRがボイラー燃料として処分される場合の、高粘性で低効率な焼却にもつながる。
【００７２】
カルボキシルエステルヒドロラーゼ（EC3.1.1.-）は、エステルをアルコールおよび酸に加水分解する加水分解酵素である。リパーゼ（EC 3.1.1.3）は、脂質を加水分解する、これらのヒドロラーゼのサブクラスであり、水相と有機相との界面で作用し得る。エステラーゼ（EC 3.1.1.1）、クチナーゼ（EC 3.1.1.74）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）、1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）もしくはグルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）等のラクトンヒドロラーゼもエステル結合を加水分解する。
【００７３】
リパーゼを、それらの結合部位の形状、遺伝子配列、機能、または他の特性に基づいて分類することができる。リパーゼエンジニアリングデータベース（LED）は、リパーゼ、エステラーゼ、およびα／βヒドロラーゼ折り畳み構造を有する関連タンパク質の配列、構造、および機能に関する情報を統合して、すべてのリパーゼに対する分類体系を作成している（Widmann et al., BMC Genomics 2010, 11:123）。触媒用三連構造（Ser-Asp(Glu)-His）に加えて、活性部位を形成するオキシアニオンホールを形成するのに関与するアミノ酸に応じて、任意の生物由来のリパーゼを3つのグループ：GGGX-、GX-、およびY-クラスに類別することができる。所定の基質に対して所望の活性を有するリパーゼが一旦同定されていれば、このデータベースは、所望の特異性および特性を有するさらなる酵素を同定するための結果を推定するのに有用な資源となる。
【００７４】
一態様において、本発明は、リパーゼとエステラーゼとの組み合わせ等の1種または複数種の酵素の使用を提供する。例えば、一局面において、リパーゼはオリゴマーエステルをより小さなオリゴマーに加水分解し、エステラーゼは該より小さなオリゴマーをモノマーに加水分解する。
【００７５】
本発明の方法は、廃棄流に少なくとも1種の生体触媒を適用することによって、シクロヘキサン酸化プロセスからの混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するための手段を提供する。有機性廃棄流は、限られた数の供給源によって生成され、燃料価値のためにまたは合成ガスを産生するために、燃焼させることが最も多い。廃棄流を燃焼させた結果、または例えば流の改質によってそれらを合成ガスに変換した結果として、該流の商業的に価値のあるC6成分が失われる。加えて、廃棄流のC6成分の40〜60％程度がオリゴマーとして「捕捉」され、このことは、廃棄流を投入材料として用いるさらなる化学的もしくは酵素的処理からの有用な化合物の不十分な回収につながり、かつオリゴマーはモノマーほど効率的に燃焼しないため、燃料用に廃棄流を燃焼させる効率を低下させる。理論に拘束されることを望むわけではないが、NVR中のオリゴマーは、流の粘性を増大させ、これは焼却器先端での効率的な噴霧化を妨げると考えられる。さらに、オリゴマーは組成および量に違いがあるため、焼却プロセスを最適化するのが非常に難しいと考えられる。ゆえに、NVRおよびCOP酸からのオリゴマーの排除によって、より低い粘性の流がもたらされ得、これが、焼却によってより処分しやすいより均一な流をもたらす。
【００７６】
混合有機性廃棄流、例えばNVRおよびCOP酸に関連したこれらの制限によって、商業的に価値のある操作、例えば二酸またはナイロン中間体の産生における廃棄流およびそのC6成分の使用が減少する。本発明は、廃棄流に少なくとも1種の生体触媒を適用し、該生体触媒がオリゴマーを加水分解してモノマーを形成することによって、C6成分をモノマーとして放出するための方法を提供する。モノマーは、燃料用により効率的に燃焼させられ得、かつ／または改善された収率を提供する後続の化学的および酵素的処理に用いられ得る。
【００７７】
一局面において、生体触媒は、単離された酵素、もしくは固定化された酵素、酵素を天然に発現する宿主細胞、またはα,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ（EC 3.1.1.-）を分泌するように改変されている宿主細胞である。
【００７８】
オリゴマーエステルをモノマーに加水分解し得るヒドロラーゼは、単離されたまたは固定化された酵素であってよい。あるいは、ヒドロラーゼは、天然のまたは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌された内在性または異種性ヒドロラーゼであってよい。
【００７９】
一局面において、オリゴマーエステルをモノマーに加水分解し得るヒドロラーゼは、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（EC 3.1.1.-）である。別の局面において、ヒドロラーゼは、リパーゼ（EC 3.1.1.3）、エステラーゼ（EC 3.1.1.1）、クチナーゼ（EC 3.1.1.74）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）、ラクトンヒドロラーゼ、またはそれらの組み合わせより選択される。特定の局面において、ラクトンヒドロラーゼは、1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）またはグルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）である。
【００８０】
NVR、COP酸、洗浄水、または苛性廃棄流が生成される特異的シクロヘキサン酸化プロセス、および意図される用途に応じて、異なるpH条件下でオリゴマーエステルの加水分解を実施してよい。例えば、シアン（cyane）酸化からのNVR、COP酸、および洗浄水は酸性であり、一方で苛性CHHPプロセスはアルカリ性NVR流、ならびに苛性洗浄水およびCOP廃棄流をもたらす。ゆえに、異なるNVRおよび濃縮した洗浄水流中に存在しているオリゴマーを、酸性、中性、または塩基性の条件下で用いられ得る異なる酵素で加水分解できることは有利である。
【００８１】
混合物のpHおよび水含有量の調整の有無にかかわらず、混合有機性廃棄流をヒドロラーゼで処理することができる。ヒドロラーゼは、中性付近のpH、酸性pH、またはアルカリ性pHで、それが廃棄流中に存在しているオリゴマーエステルをモノマーに加水分解できるような適切なpHでその酵素活性を保持し得るその能力に従って選択される。一局面において、酸性pH、すなわち6未満のpHで活性を有するヒドロラーゼを用いて混合有機性廃棄流を処理する。別の局面において、アルカリ性pH、すなわち8を上回るpHで活性を有するヒドロラーゼを用いて混合有機性廃棄流を処理する。さらに別の局面において、生理的pH、すなわちpH6〜8で活性を有するヒドロラーゼを用いて混合有機性廃棄流を処理する。
【００８２】
ヒドロラーゼを用いた混合有機性廃棄流の処理によって、該流の粘性を低下させ、該流を燃焼させる効率を改善することができる。加えて、混合有機性廃棄流のヒドロラーゼ処理によって、さらなる化学的および／または生物学的処理のために該流を調製することもできる。
【００８３】
一局面において、ヒドロラーゼ処理されたNVR等の混合有機性廃棄流を、燃料価値のためにまたは合成ガスを産生するために燃焼させる。理論に拘束されることを望むわけではないが、加水分解によってオリゴマーエステルからモノマーが放出された場合、結果として得られた混合物はボイラー燃料として処分される際により効率的に燃焼すると考えられる。別の局面において、ヒドロラーゼ処理されたNVR等の混合有機性廃棄流からの少なくとも1種の成分を、さらなる化学的処理に用いる。例示的なモノマーのさらなる化学的処理には、混合エステルもしくはポリオールを産生するためのエステル化、ジオールへの水素化、二酸への酸化、還元的アミノ化、スルホン化、またはNH4OHもしくはポリアミンを用いた処理が含まれる。
【００８４】
ヒドロラーゼで処理された廃棄流をボイラー燃料として用いることを意図する場合、または廃棄流をヒドロラーゼで処理して、それをさらなる化学的処理のために調製する場合、水による廃棄流の希釈を最小限に抑えること、およびヒドロラーゼを用いた処理の前または最中の混合物のpHの調整を最小限に抑えることが有利である。低いpHで活性を保持するヒドロラーゼは、シアン酸化プロセスから生じる廃棄流の処理に最も有利であり、一方でアルカリ性pHで活性を保持するヒドロラーゼは、CHHPプロセスから生じる廃棄流の場合において最も有利である。廃棄流を宿主細胞による生物学的処理に供して、廃棄流の成分を異化し、かつ／または廃棄流中の成分を二酸もしくはα,ω-二官能性アルカンに変換することを意図する場合、生理的pH付近（pH5〜8）で活性を有するヒドロラーゼを採用することが最も有利である。
【００８５】
例えば、本発明者らは、Y.リポリティカの広範な増殖pH範囲（pH3.0〜9.0）にもかかわらず、混合有機性廃棄流中に存在している炭素供給源での該宿主細胞の増殖率が、酸性pHおよび／またはアルカリ性pHで有意に阻害され得ることを実証した（pH＞8.0およびpH＜5.0でのNVRにおける増殖阻害）。実施例2を参照されたい。一局面において、廃棄流中の炭素供給源を利用し得る宿主細胞生体触媒を用いて、混合有機性廃棄流をpH5.0〜8.0で処理する。
【００８６】
混合有機性廃棄流のオリゴマーエステル成分の加水分解を、さらなる分離、化学的変換、または宿主細胞によって発酵の間に分泌される酵素による酵素的変換と同時に実施することができる。遊離したもしくは固定化したヒドロラーゼで流を処理することによって発酵前に、または、バッチで、段階的に、もしくは栄養供給物とともに発酵ブロスに生体触媒を添加することによって発酵中に、混合有機性廃棄流をヒドロラーゼで処理することができる。あるいは、宿主細胞は、NVR中に存在しているオリゴマーエステルを加水分解する酵素を、発酵中に発酵ブロス内に分泌し得る。
【００８７】
カルボキシルエステラーゼは、生理的pH付近（pH5〜8）で活性を有することが知られている。当業者であれば、合理的設計を採用する酵素工学または指向進化技術によって、そのようなヒドロラーゼのpH最適条件、基質特異性、および活性を変更することができると分かるであろう。（Dalby, P.A. (2003). Optimizing enzyme function by directed evolution. Current Opinion in Structural Biology, 13, 500-505）。実施例1において、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルをpH5〜8で加水分解し得るいくつかのリパーゼおよびエステラーゼを提供する。さらに、ムコール・ミエヘイ（E1）およびリゾプス・オリゼ（E12）由来のエステラーゼ等、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルに対してpH3.5で加水分解活性を呈したエステラーゼ、ならびにストレプトマイセス・ディアスタトクロモゲネス（E8）由来のpH＞8でのみ活性を呈したアルカリ性エステラーゼの例を実施例1において提供する。
【００８８】
非常に低いpH（pH＜3.5）で活性を有するカルボキシルエステラーゼは、文書で十分に立証されていない。しかしながら、本発明者らは、アスペルギルス・ニガーNCIM 1207（GenBank An16g01880；SEQ ID NO:6）、クルツマノマイセス種（Kurtzmanomyces sp.）I-11（GenBank BAB91331.1；SEQ ID NO:5)、超好熱古細菌ピロバキュラム・カリディフォンティス（Pyrobaculum calidifontis）Va1（GenBank BAC06606；SEQ ID NO:8）、およびピクロフィルス・トリダス（Picrophilus torridus）エステラーゼ（GenBank AAT43726；SEQ ID NO:7）等、NVRおよびCOP酸の流を処理して、pH＜5でオリゴマーエステルを加水分解するのに利用され得るいくつかのヒドロラーゼを同定した。アスペルギルス・ニガーNCIM 1207は、pH2.5で活性を有する高レベルの細胞外リパーゼを産生することが示されている（Mahadik et al., 2002. Process Biochemistry, 38: 715-721）。アスペルギルス・ニガー由来のこの特有のリパーゼは、精製され、液中発酵下で特徴決定された（Mhetras et al., 2009. Bioresource Technology, 100: 1486-1490）。これは、pI8.5、最適温度50℃、および最適pH2.5を有する32.2kDaのタンパク質である。より低いpH（pH1.5等）で、活性は減少する。
【００８９】
クルツマノマイセス種I-11株は、唯一の炭素供給源として大豆油を含有する培地中で細胞を増殖させた場合に産生されるマンノシルエリスリトールリピッドの高レベルな生産体である。培養の初期段階の間、培養ブロスのpHは3.2まで低下し、そのpHで大豆油は急速に脂肪酸とグリセロールとに加水分解され、これは、培養ブロス中に好酸性リパーゼが産生されたことを示唆する。クルツマノマイセス種I-11株リパーゼは、高い活性でNVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルを加水分解することが本発明者らによって示されたカンジダ・アンタークティカAリパーゼ（実施例1におけるL5）との高い配列同一性を示す。酵母クルツマノマイセス種I-11によって産生される細胞外リパーゼは、精製され、特徴決定された（Kakugawa et al., 2002. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 66(5): 978-985）。それは、最適温度75℃を有する49kdaのタンパク質であるが、活性は70℃より下の温度で安定である。この酸性リパーゼは、酸性領域（pH1.9〜7.2）において活性pH範囲を有し、活性は40％の濃度における種々の有機溶媒の存在下で安定である。
【００９０】
超好熱古細菌ピロバキュラム・カリディフォンティスVa1は、高活性の熱安定性カルボキシエステラーゼを産生することが報告されている。このエステラーゼは、報告されるべき最も熱安定性かつ好熱性の酵素の1つであることが見出された。それは、最適温度90℃および最適pH7を示す、34.3kDaのタンパク質である。このエステラーゼは、80％の濃度における種々の水混和性有機溶媒とのインキュベーション後に安定であり、有機溶媒の存在下で活性を示す（Hotta et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology, 68(8):3925-3931）。ピクロフィルス・トリダスは、極めて厳しい条件下で成長し得る能力（pH0.7および60℃で最適増殖）に関与する遺伝的および分子的メカニズムを調査するための特有のモデル生物、ならびに極めて安定なエステラーゼおよびリパーゼの有望な供給源である。P.トリダスのエステラーゼをコードする2つの遺伝子は、同定され、特徴決定された。これらのエステラーゼの1つ（Est B）は、種々の有機溶媒の存在下で脂肪酸エステルを加水分解し得る高い能力を示す。EstBは、70℃で測定された最も高い活性を有する約27kDaのエステラーゼである（Hess et al., (2008). Extremophiles, 12:351-364）。
【００９１】
クチナーゼは、それらの触媒部位がふたで覆われておらず、したがって溶液中で基質に接近可能なままであるため、界面活性化を必要としないという点でリパーゼと異なる（Martinez et al., 1992）。クチナーゼは、ゆえに界面の存在にかかわらず活性を有し、ゆえに可溶性および不溶性基質の両方を加水分解することができる。アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzye）は、C6カルボン酸を含有するオリゴマーを加水分解し得、かつpH＞11で安定でありかつ活性を有するクチナーゼ（AoC）を分泌する（Maeda, H. et al., (2005). Purification and characterisation of a biodegradable plastic-degrading enzyme from Aspergillus oryzae. Applied and Environmental Biotechnology, 67: 778-788）。
【００９２】
それらの広範な基質特異性、広いpH範囲にわたる活性および安定性により、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルを加水分解するのに有用である他のクチナーゼには、アルテルナリア・ブラッシコーラ（Alternaria brassicicola）、（AbC）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、（AfC）、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、（HiC）、およびフザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、（FsC）由来のクチナーゼが含まれる。植物病原体フザリウム・ソラニ種ピシ（pisi）由来のクチナーゼ（Egmond et al. 2000）は、短鎖および長鎖脂肪酸の両方を有する、クチン、カルボン酸エステル、トリアシルグリセロール（TAG）、およびリン脂質（15）を含む広範囲の基質を分解することが見出されている。この酵素は、短鎖p-ニトロフェニルエステル等の可溶性基質に対しても活性を有する。F.ソラニのクチナーゼは、広範なpH範囲内（2〜12）で作動し、pH8.5で最適活性を有し、かつ40〜60℃の範囲内で適度に好熱性であることが示された（Peterson et al., 2001）。さらには、野生型F.ソラニ種ピシは、ポリカプロラクトンを分解し得、かつ炭素およびエネルギーの供給源としてそれを用い得ることが示された。クチナーゼ活性は、培地中のグルコースの存在（0.5％ w/w）によって抑制され、ポリカプロラクトン分解の酵素生成物によって誘導された（Murphy et al., 1996）。F.ソラニのクチナーゼ1に類似したタンパク質に対するBLAST検索により、クチナーゼを分泌している生物の2つの主要なグループが存在することが示された。それらは、真菌植物病原体またはマイコバクテリウムである。真菌性クチナーゼの中で、HiCは、その高い熱安定性により、高い温度でかつすべてのpH値の下でポリカプロラクトン分解に対して最も高い活性を呈する。AoC、AfC、およびHiCは、より極端な温度およびpHの条件下で相当量の加水分解活性を保持する。対照的に、AbCおよびFsCは、最も熱安定性が低く、高い温度および低いpH値ではほとんど活性を保持しない。
【００９３】
本節において記載される酵素は、本明細書において記載される方法のいずれかで用いられてよく、または本明細書において記載される組成物のいずれかに含まれてよい。
【００９４】
混合有機性廃棄流中の二酸の相対量を増大させる方法
本発明は、一酸およびヒドロキシ酸成分を二酸に変換することによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するためのさらなる手段を提供する。これらの廃棄流の主要な成分は、C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、および二酸の混合物からなる。しかしながら、多くの用途を有する二酸を、廃棄流中の一酸およびヒドロキシ酸成分から容易に分離することはできず、それによって、他の潜在的用途に加えて、さらなる化学的または生物学的処理に対する廃棄流の有用性および収率を制限している。
【００９５】
本発明の方法は、NVR中の直鎖状C4、C5、およびC6一酸およびヒドロキシ酸成分、ならびに環状C6成分を、C4、C5、およびC6二酸の混合物に酵素的に変換する生体触媒を採用する。得られる二酸混合物を、そのままで、すなわちさらなる修飾または処理なしで用いることができる。あるいは、二酸混合物を、C4、C5、およびC6二酸に分離することができ、またはエステル化し、次いでC4、C5、およびC6二酸に分離することができ、または二酸混合物からアジピン酸を結晶化することができる。生体触媒を用いて、他の用途、例えば燃焼価値および／またはアジピン酸もしくは二官能性アルカンへの変換における使用からモノマーを効果的に捕捉する相当量のオリゴマーエステルを含有するNVRおよびCOP酸のモノマー成分を増大させ得る。
【００９６】
一酸およびヒドロキシ酸の二酸への酵素的変換によって、廃棄流中の二酸の相対量は増大し、これは他の廃棄流成分からの分離からの二酸の回収を増大させる。とくに、これらの方法は、オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解することによって、ラクトンの少なくとも一部をヒドロキシ酸に加水分解することによって、混合有機性廃棄流中に存在している直鎖状C4、C5、およびC6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部を対応する二酸に酸化することによって、混合有機性廃棄流中の二酸の相対量を増大させることができる。好ましくは、ヒドロラーゼを用いて、NVRおよびCOP酸の廃棄流中に存在しているオリゴマーエステルをモノマーに加水分解する。多様な他の生体触媒を、NVRおよびCOP酸、ならびに洗浄水廃棄流に用いて、ラクトンをヒドロキシ酸に加水分解し得、かつ／または直鎖状C4、C5、およびC6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸を二酸に酸化し得る。
【００９７】
オリゴマーエステルをモノマーに加水分解し得るヒドロラーゼは、単離されたまたは固定化された酵素であってよい。あるいは、ヒドロラーゼは、天然のまたは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌された内在性または異種性ヒドロラーゼであってよい。
【００９８】
好ましくは、一酸およびヒドロキシ酸を二酸に酵素的に変換する生体触媒は、天然のまたは非天然の宿主細胞である。例えば、Y.リポリティカは、NVR中の炭素供給源を増殖のために利用し得る天然宿主細胞である。加えて、変換は、細胞膜内膜貫通タンパク質であるシトクロムp450酵素を伴い、ゆえにp450酵素経路を含む宿主細胞を必要とするため、天然のまたは非天然の宿主細胞生体触媒を廃棄流成分の二酸への酵素的変換に用いることができる。
【００９９】
1．6-オキソヘキサン酸由来のアジピン酸の相対濃度を増大させる
6-オキソヘキサン酸を、ナイロンの合成における用途を有する種々の化合物にさらに変換することができる。例えば、6-オキソヘキサン酸をヘキサン-1,6-二酸（アジピン酸）に変換することができる。さらに、アジピン酸または6-オキソヘキサン酸を、6-アミノヘキサン酸、カプロラクタム、6-アミノヘキサナール、またはヘキサン-1,6-ジアミン（ヘキサメチレンジアミン）に変換することができる。本発明は、これらの化合物を生成するための方法も提供する。
【０１００】
i）オリゴマーエステルおよびラクトンを加水分解して、直鎖状C6成分を放出する
一局面において、混合有機性廃棄流からの6-オキソヘキサン酸の産生は、NVRおよび／または洗浄水等の廃棄流中に存在しているポリマーエステルおよびオリゴマーエステルを加水分解することを伴う。これらのダイマー、トリマー、テトラマー、またはオリゴマーのエステルは、該ポリマーおよびオリゴマーからの放出後に6-ヒドロキシヘキサン酸、カプロン酸、および潜在的には1,6-ヘキサン二酸に変換され得る直鎖状C6分子から構成される。ゆえに、本発明は、エステラーゼ／リパーゼおよびポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼを含むカルボキシルエステラーゼ等のα,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来の生体触媒の使用を含む、シクロヘキサン酸化の混合有機性廃棄流から6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する。
【０１０１】
直鎖状C6分子から構成されるポリマーエステルからの6-オキソヘキサン酸の産生における一工程は、6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換である。本発明の一局面において、脂肪アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ等の生体触媒を用いて、6-ヒドロキシヘキサン酸を6-オキソヘキサン酸に酵素的に変換する。
【０１０２】
直鎖状C6分子から構成されるポリマーエステルからの6-オキソヘキサン酸の産生における別の工程は、カプロン酸の6-ヒドロキシヘキサン酸への変換である。本発明の一局面において、ω-ヒドロキシラーゼ等の生体触媒を用いて、カプロン酸を6-ヒドロキシヘキサン酸に酵素的に変換する。
【０１０３】
これらの酵素的変換は、2つの分離した工程の代わりに、単一の方法に組み合わせることができる。この局面では、カルボキシルエステラーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、および脂肪アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素の組み合わせを用いて、混合有機性廃棄流から6-オキソヘキサン酸を産生する。
【０１０４】
ii）直鎖状C6成分を6-オキソヘキサン酸に変換する
ヘキサン酸からの6-オキソヘキサン酸の産生における一工程は、ヘキサン酸（カプロン酸）の6-ヒドロキシヘキサン酸（ヒドロキシカプロン酸）への変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、シトクロムP450、またはクラスEC 1.14.15.3由来のω-ヒドロキシラーゼもしくはω-オキシゲナーゼ酵素等の酵素を用いて、混合有機性廃棄流中に存在している成分から6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する。特定の変換に対する特異的酵素の使用が公知であるが（例えば、Coon, Biochemical & Biophysical Research Communications, 2005,338:378-385）、本発明者らは驚くべきことに、これらの酵素を用いて、混合有機性廃棄流の成分を酵素的に変換し得ることを発見した。
【０１０５】
加えて、6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換を介して、ヘキサン酸から間接的に、または6-ヒドロキシヘキサン酸から直接的に、6-オキソヘキサン酸を産生することができる。一局面において、本発明は、クラスEC 1.1.1-由来の脂肪アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いて、混合有機性廃棄流中に存在している成分、すなわちヘキサン酸または6-ヒドロキシヘキサン酸から6-オキソヘキサン酸を産生する方法を提供する（Eurich et al., Applied & Environmental Microbiology, 2004, 70(8): 4872-4879）。
【０１０６】
これらの酵素工程を、単一の方法に組み合わせることができる。ゆえに、一局面において、本発明は、（i）シトクロムP450またはω-ヒドロキシラーゼ酵素、および（ii）脂肪アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素の組み合わせの使用を含む、NVRおよび／または洗浄水等のシクロヘキサン酸化の混合有機性廃棄流から6-オキソヘキサン酸を産生する方法を提供する。
【０１０７】
iii）環状C6成分を6-オキソヘキサン酸に変換する
シクロヘキサノールからの6-オキソヘキサン酸の産生における一工程は、シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、クラスEC 1.1.1-由来のアルコールデヒドロゲナーゼまたはシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ／ChnA等の酵素、例えばEC 1.1.1.90、1.1.1.245などの使用を含む、シクロヘキサン酸化の混合有機性廃棄流の成分からシクロヘキサノンを産生する方法を提供する（Donoghue & Trudgill, Eur J Bochem., 1975,60:1-7）。
【０１０８】
シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換後、6-オキソヘキサン酸の産生における後続の工程は、シクロヘキサノンのε-カプロラクトンへの変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、バイヤー・ビリガー（Baeyer-Villiger）モノオキシゲナーゼ、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ／ChnB等の酵素、例えば1.14.13.22などの使用を含む、混合有機性廃棄流の成分からε-カプロラクトンを産生する方法を提供する（Kim et al., Biotechnol. Bioprocess Eng., 2008, 13:40-47）。
【０１０９】
シクロヘキサノールからの6-オキソヘキサン酸の産生におけるさらにもう一つの工程は、ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への引き続く変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ、クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ／ChnC等の酵素の使用を含む、混合有機性廃棄流の成分から6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する（Cheng et al., Journal of Bacteriology, 2000, 182(17):4744-4751）。
【０１１０】
ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への変換後、シクロヘキサノールからの6-オキソヘキサン酸の産生における別の工程は、6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換である。ゆえに、一局面において、本発明は、脂肪アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼまたはChnD等の酵素の使用を含む、混合有機性廃棄流の成分から6-オキソヘキサン酸を産生する方法を提供する。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼは、1.1.1.258など、クラスEC 1.1.1.2より選択されてよい（Cheng et al., Journal of Bacteriology, 2000, 182(17):4744-4751）。
【０１１１】
これらの酵素工程を、単一の方法に組み合わせることができる。ゆえに、一局面において、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼおよびバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼの使用を含む、混合有機性廃棄流中に存在しているシクロヘキサノールおよびシクロヘキサノン分子からε-カプロラクトンを産生する方法を提供する。別の局面において、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼ、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、およびカプロラクトンラクトノヒドロラーゼ等の酵素の組み合わせの使用を含む、混合有機性廃棄流から6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する。さらに別の局面において、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼ、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ、および脂肪アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼの使用を含む、混合有機性廃棄流から6-オキソヘキサン酸を産生する方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼおよびシクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼの使用を含む、シクロヘキサン酸化の非揮発性残留物および／または洗浄水中に存在している1,2-シクロヘキサンジオールおよびシクロヘキサン-1,2-ジオンから6-ヒドロキシヘキサン酸を産生する方法を提供する。
【０１１２】
iv）6-オキソヘキサン酸のナイロン中間体への変換
本明細書において記述されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼの作用によって、6-オキソヘキサン酸をヘキサン-1,6-二酸（アジピン酸）に酵素的に変換することができる。ゆえに、一局面において、本発明は、上記に提示した生体触媒を用いて6-オキソヘキサン酸を産生する工程、ならびに例えばEC 1.2.1.4およびEC 1.2.1.63などに由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ等の生体触媒を用いた6-オキソヘキサン酸のヘキサン-1,6-二酸への酵素的変換をさらに含む、ヘキサン-1,6-二酸（アジピン酸）を産生する方法を提供する。生体触媒は、単離された酵素、または該酵素を発現および分泌する天然のもしくは非天然の宿主細胞であってよい。
【０１１３】
本明細書において記述されるように、アミノトランスフェラーゼの作用によって、6-オキソヘキサン酸を6-アミノヘキサン酸に変換することができる。ゆえに、一局面において、本発明は、上記に提示した生体触媒を用いて6-オキソヘキサン酸を産生する工程、ならびにトランスアミナーゼ（EC 2.6.1.-）またはEC 1.4.1.-などのデヒドロゲナーゼ等の生体触媒を用いて6-ヒドロキシヘキサン酸を6-アミノヘキサン酸に酵素的に変換する工程をさらに含む、6-アミノヘキサン酸を産生する方法を提供する。生体触媒は、単離された酵素、または該酵素を発現かつ分泌する天然のもしくは非天然の宿主細胞であってよい。
【０１１４】
本明細書において記述されるように、アミノヒドロラーゼの作用によって、6-アミノヘキサン酸をカプロラクタムに変換することができる。ゆえに、一局面において、本発明は、上記に記載されるように、生体触媒を用いて6-アミノヘキサン酸を産生し、かつ例えばEC 3.5.2.-などのアミノヒドロラーゼ等の生体触媒を用いた6-アミノヘキサン酸のカプロラクタムへの酵素的変換をさらに含む、カプロラクタムを産生する方法を提供する。生体触媒は、単離された酵素、または該酵素を発現かつ分泌する天然のもしくは非天然の宿主細胞であってよい。
【０１１５】
本明細書において記述されるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼの作用によって、6-アミノヘキサン酸を6-アミノヘキサナールに変換することができる。ゆえに、一局面において、本発明は、上記に提示されるように、生体触媒を用いて6-アミノヘキサン酸を産生する工程、ならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼ等の生体触媒を用いた6-アミノヘキサン酸の6-アミノヘキサナールへの酵素的変換をさらに含む、6-アミノヘキサナールを産生する方法を提供する。別の局面において、複数の酵素的工程を介して、例えば中間体として6-アセトアミドヘキサノエート、対応するアセチル-CoA、またはリン酸エステルを形成することによって、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換する。生体触媒は、単離された酵素、または該酵素を発現かつ分泌する天然のもしくは非天然の宿主細胞であってよい。
【０１１６】
本明細書において記述されるように、アミノトランスフェラーゼまたはアミンオキシダーゼの作用によって、6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換することができる。ゆえに、一局面において、本発明は、上記に提示されるように、混合有機性廃棄流に生体触媒を適用して6-アミノヘキサナールを産生する工程、ならびにアミノトランスフェラーゼまたはアミンオキシダーゼ等の生体触媒を用いた6-アミノヘキサナールのヘキサメチレンジアミンへの酵素的変換をさらに含む、ヘキサメチレンジアミンを産生する方法を提供する。生体触媒は、単離された酵素、または該酵素を発現かつ分泌する天然のもしくは非天然の宿主細胞であってよい。
【０１１７】
混合有機性廃棄流中のアジピン酸の相対量を増大させる方法
本発明は、生体触媒を用いて、NVR等の混合有機性廃棄流の複雑性を低下させ、かつ該流中のアジピン酸の相対濃度を増大させることによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するためのさらなる手段を提供するものであって、これは廃棄流からのアジピン酸の回収を促進する。とくに、方法は、混合有機性廃棄流中のアジピン酸の相対濃度を増大させ、かつ該流中の一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させる。およそ10％のアジピン酸が、オリゴマー化の結果としてならびに／または一酸およびヒドロキシ酸と分離不可能に混合された二酸として、混合有機性廃棄流中で喪失する。しかしながら、本発明者らは、少なくとも1種の生体触媒を有機性廃棄流に適用することによって、アジピン酸の回収が改善され得ることを発見した。
【０１１８】
とくに、生体触媒は、オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解し得、e-カプロラクトンの少なくとも一部をε-ヒドロキシカプロン酸に加水分解し得、カプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、および6-オキソカプロン酸の少なくとも一部をアジピン酸に酸化し得、かつ／または廃棄流の環状C6成分の少なくとも一部をアジピン酸に変換し得る。
【０１１９】
オリゴマーエステルをモノマーに加水分解し得るヒドロラーゼは、単離されたまたは固定化された酵素であってよい。あるいは、ヒドロラーゼは、天然のまたは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌された内在性または異種性ヒドロラーゼであってよい。
【０１２０】
これらの方法は、NVRの複雑性を低下させ得、かつNVR廃棄流内のアジピン酸の相対濃度を増大させ得、これは、カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、および環状C6化合物（例えば、KおよびA）をアジピン酸に変換することによって、NVRからのアジピン酸の回収を促進する。NVRのあまり望ましくない成分、例えばC3-C5を増殖のために利用する生体触媒は、廃棄流の複雑性をさらに低下させ得る。例えば、好ましい方法は、廃棄流中に存在しているオリゴマーエステルをモノマーに加水分解する工程；一酸およびヒドロキシ酸を二酸に変換する工程；混合物からC4およびC5成分を除去する工程；該混合有機性廃棄流中に存在しているC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化する工程；ならびに／または混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化する工程を含む。NVRに加えて、生体触媒をCOP酸および洗浄水廃棄流にも適用して、多様な酵素的変換、例えばラクトンのヒドロキシ酸への加水分解ならびに／または直鎖状C4-C6一酸およびヒドロキシ酸の二酸への酸化を実施し得る。
【０１２１】
一局面において、これらの方法を用いて、発酵の間に混合有機性廃棄流中のアジピン酸の相対濃度を富化することができる。次いで、処理された混合物を発酵槽から取り出して結晶化過程に戻すことができ、ここで、アジピン酸は、発酵の間の十分な富化の結果としての混合物から、結晶化される。そのような方法を用いることで、シクロアルカン酸化のための既存の設備を改変して、アジピン酸を富化する生体触媒を用いた廃棄流の処理が可能となり得る。そのような富化のための全く新しい設備を建設する必要性はなく、これにより相当量の時間と費用が節約される。
【０１２２】
好ましくは、アジピン酸の相対濃度を増大させかつ一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させるための方法は、これらの方法が宿主細胞内で天然には共存しないと考えられる2つの酵素経路を必要とするため、生体触媒として非天然宿主細胞を用いて実施される。一局面において、アジピン酸が分解されないように、生体触媒中に存在しているβ酸化経路を弱めてよい。例えば、宿主細胞は、宿主細胞のβ酸化経路が損なわれるようにPOX遺伝子がノックアウトされている、すなわち不活性化され、それによってアジピン酸の蓄積がもたらされる、Y.リポリティカであってよい。
【０１２３】
混合有機性廃棄流のC6成分および前駆体をα,ω-二官能性C6アルカンに変換する方法
本発明は、生体触媒を用いて、廃棄流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性C6アルカンに変換することによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善するためのさらなる手段を提供する。
【０１２４】
6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの、アジピン酸の6-オキソヘキサン酸への、および6-オキソヘキサン酸の6-アミノカプロン酸への酵素的変換を、一連の異なる酵素によって仲介する（図2を参照されたい）。とくに、アミノトランスフェラーゼEC 2.6.1.19（β-アラニンの代謝に関する酵素的調査はHayaishi et al. 1961 J. Biol. Chem. 236, p.781-790に開示されている）、ならびに参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられるWO2009/113855およびWO2011/031147に開示されているアミノトランスフェラーゼによって、6-オキソヘキサン酸を6-アミノカプロン酸に変換し、これは、そのような酵素を用いることによる、5-ホルミル吉草酸からの6-アミノカプロン酸（6-aminoacproic acid）の調製、およびαケト酸からのアミン基を含む化合物の調製をそれぞれ示す。同様に、これらのアミノトランスフェラーゼを用いて、6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換し得る。カルボキシレートレダクターゼEC 1.2.99.6またはアルデヒドデヒドロゲナーゼEC 1.2.1.3もしくはEC 1.2.1.31によって、6-オキソヘキサン酸をアジピン酸に変換し得る。今度は、6-アミノカプロン酸をヘキサメチレンジアミンまたはカプロラクタムに変換することができる。一局面において、これらのカルボキシレートレダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換し得る。別の局面において、6-ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼEC 1.1.1.258による6-ヒドロキシカプロン酸（これが後にアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼEC 1.2.1.10によって1,6-ヘキサンジオールに変換され得る）への変換を介して、6-オキソヘキサン酸を1,6-ヘキサンジオールに変換し得る。加えて、EC 3.5.2.11等のアミドヒドロラーゼ（EC 3.5.2.-）によって、6-アミノカプロン酸をカプロラクタムに変換し得る。
【０１２５】
一局面において、オリゴマーエステルの少なくとも一部をモノマーに加水分解し得る；カプロン酸の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸に酸化し得る；環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸もしくは6-オキソカプロン酸に変換し得る；混合有機性廃棄流中に存在しているC3、C4、およびC5成分の少なくとも一部を異化し得る；かつ／または混合有機性廃棄流中のC3、C4、およびC5成分よりも低い割合でC6成分を異化し得る非天然宿主細胞を用いて、混合有機性廃棄流を処理する。
【０１２６】
オリゴマーエステルをモノマーに加水分解し得るヒドロラーゼは、単離されたまたは固定化された酵素であってよい。あるいは、ヒドロラーゼは、天然のまたは非天然の宿主細胞によって発酵および生物変換の間に分泌された内在性または異種性ヒドロラーゼであってよい。
【０１２７】
加えて、宿主細胞は、アジピン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、または6-オキソヘキサン酸を、1,6-ヘキサンジオール、6-アミノカプロン酸、ε-カプロラクタム、またはヘキサメチレンジアミンに変換する少なくとも1種の生合成経路酵素を発現し得る。
【０１２８】
別の局面において、本発明は、微生物を宿主細胞生体触媒として用いて、NVR成分の二官能性アルカンへの酵素的変換を生物学的に合成するための方法を提供する。混合有機性廃棄流以外の供給源からのアジピン酸および二官能性アルカンの生物学的産生のための微生物の使用は、以前に実証されている。参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられるWO2009/151728およびWO2010/068944を参照されたい。本発明は、例えば、NVRの環状C6成分の6-ヒドロキシカプロン酸または6-オキソカプロン酸への変換に必要とされる異種性酵素を含有するように改変された、非天然宿主細胞を適用することを提供する。
【０１２９】
別の局面において、非天然宿主細胞を、1,6-ヘキサンジオールを産生するようにさらに改変する。任意で、そのような1,6-ヘキサンジオール産生宿主細胞は、1,6-ヘキサンジオールの産生に関与する特定の酵素も発現し得る。好ましくは、宿主細胞は、6-オキソヘキサン酸の6-ヒドロキシカプロン酸への変換を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、および6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
【０１３０】
さらに別の局面において、非天然宿主細胞を、6-アミノカプロン酸を産生するようにさらに遺伝子改変する。任意で、そのような6-アミノカプロン酸産生宿主細胞は、6-アミノカプロン酸の産生に関与する特定の酵素も発現し得る。好ましくは、宿主細胞は、6-オキソヘキサン酸を6-アミノカプロン酸に変換し得るアミノトランスフェラーゼを発現する。一局面において、アミノトランスフェラーゼを発現する宿主細胞を、6-アミノカプロン酸をε-カプロラクタムに変換し得るアミドヒドロラーゼを発現するようにさらに遺伝子改変する。別の局面において、アミノトランスフェラーゼを発現する宿主細胞を、6-アミノカプロン酸を6-アミノヘキサナールに変換し得るアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび6-アミノヘキサナールをヘキサメチレンジアミンに変換し得る1-アミノトランスフェラーゼによりヘキサメチレンジアミンを産生するように、さらに遺伝子改変する。
【０１３１】
C3、C-4、およびC-5種の変換および／または分解
シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中に存在しているC-4およびC-5一酸（酪酸およびペンタン酸）ならびに／またはヒドロキシ酸（4-ヒドロキシ酪酸および5-ヒドロキシペンタン酸）を、カプロン酸およびヒドロキシカプロン酸に関して記載される、ω-ヒドロキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる同じ経路を介して任意で変換する。酪酸およびペンタン酸を対応する二酸、つまりコハク酸およびグルタル酸に変換する。この変換によって、シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中の化学種の混合物の複雑性は、主にC6、C5、およびC4二酸からなる混合物まで低下する。混合物中の化学種の数を低下させることによって、得られる二酸混合物は、二酸としての商業的用途のための発酵液からより容易に回収され、または二塩基エステル混合物としての商業的用途を有する対応する二塩基エステルに公知の方法によって任意でエステル化され、または公知の方法によってC6、C5、およびC4二塩基エステルに任意で分離される。酪酸、ペンタン酸、コハク酸、グルタル酸、4-ヒドロキシ酪酸、および5-ヒドロキシペンタン酸等の、シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中に存在しているC4およびC5種の一部またはすべては、TCA回路を介したアセチル-CoAにβ酸化を介して異化され、それによって化学種の複雑性が低下し、かつアジピン酸、アミノカプロン酸、カプロラクタム、またはヘキサメチレンジアミンのより容易な回収を促進し、一方でバイオマス産生のための炭素供給源として機能し、ゆえにバイオマス産生に必要とされる発酵性炭素供給源の量を低下させる。ゆえに、本発明は、シクロヘキサン酸化からのNVRまたは洗浄水中のC-4およびC-5炭素種C3種の少なくとも一部を異化することによって、C-4およびC-5種の濃度を低下させる方法を提供する。カプロン酸および／またはアジピン酸（β酸化を介してまたはTCA回路を介して異化される）の喪失を最小限に抑えるために、宿主の遺伝子操作を実施することができる。
【０１３２】
宿主生物のβ酸化経路を介したカプロン酸またはアジピン酸の分解を低下させ、かつ従って発酵液から回収され得る有用な生成物の量を向上させるために、これらの基質またはそれらのCoAエステルに作用する酵素をコードする遺伝子をノックアウトするか、もしくはその活性を低下させるために変異させるか、またはこれらの遺伝子によってコードされる酵素の基質特異性を変化させることができる。カプロン酸またはアジピン酸の対応するCoAエステルへの活性化を阻止するまたは低下させるために、5〜16個の炭素の鎖長を有するジカルボン酸に作用する、EC 6.2.1.23等のクラスEC 6.2.1.-などに属するアジピン酸またはカプロン酸に作用するCoAリガーゼまたはCoAトランスフェラーゼをコードする宿主株の遺伝子を、これらが宿主株に存在している場合には、破壊するまたは変異させることが有用である。あるいは、カプロイル-CoAまたはアジポイル-CoAに作用するEC 1.3.3.6またはEC 1.3.99.-などのアシル-CoAオキシダーゼまたはアシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、宿主生物に存在している遺伝子を破壊するまたは変異させることによって、活性化したCoAエステルがβ酸化経路に入るのを阻止することも有利である。
【０１３３】
非天然酵素
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法における変換を実施するために用いられる酵素は非天然である、すなわち、該酵素をコードするDNAは、該酵素の特性の1つまたは複数を改善するために野生型配列から変異されている。遺伝子の突然変異誘発およびタンパク質工学のための方法は、当技術分野において周知である。変異のライブラリーの創出のために、DNAシャッフリング、STEPおよびエラープローンPCR、分子進化、ならびに突然変異誘発株等の手法を含む、ランダムおよび／または組み合わせ突然変異誘発の手法を代替的または付加的に用いてよい。突然変異誘発による変化の非限定的なリストには、欠失、挿入、置換、転位、点変異、およびサプレッサー突然変異が含まれる。
【０１３４】
突然変異誘発法の生成物を、次いで所望の活性についてスクリーニングする必要がある。ゆえに、いくつかの態様において、混合有機性廃棄流のオリゴマーエステルの加水分解または他の酵素的変換、例えば酸化に用いられる酵素は、上記の例えば1（i）〜（iv）の節において記載される酵素に由来する。本明細書において使用するとき、「由来する」という用語は、酵素が、野生型のアミノ酸配列と比較して1個または複数個のアミノ酸変化を含有することを意味し、該1個または複数個の変化は欠失、挿入、置換、転位、点変異を含む。当業者であれば、上記に記載される酵素に関して記述されるEC分類体系が非常に特異的であり、酵素によって触媒される特異的基質によって決まることを理解するであろう。したがって、記載される酵素の1つに由来する酵素は、野生型酵素とは異なるECカテゴリーに分類されうる。
【０１３５】
一局面において、非天然酵素は、P450シトクロムオキシダーゼ、ω-ヒドロキシラーゼ、ω-オキシゲナーゼ酵素、もしくはクラスEC 1.14.15.3由来のアルカン-1-モノオキシゲナーゼ；脂肪アルコールオキシダーゼ；クラスEC 1.1.1由来のアルコールデヒドロゲナーゼ；バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ；カプロラクトンラクトノヒドロラーゼ；脂肪アルコールオキシダーゼ；アルコールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ；α,β-ヒドロラーゼ折り畳みファミリー由来のカルボキシルエステラーゼ（EC 3.1.1.-）；またはそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数に由来する。
【０１３６】
別の局面において、非天然酵素は、クラスEC 1.1.1.245由来のシクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ／ChnA；クラスEC 1.14.13.22由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ／ChnB；クラスEC 3.1.1.17由来のグルコノラクトナーゼ／ChnC；クラスEC 1.1.1.2由来のChnD；EC 1.1.1.174由来のシクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ；シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼEC 3.7.1.10もしくはEC 3.7.1.11；リパーゼ（EC 3.1.1.3）；エステラーゼ（EC 3.1.1.1）；クチナーゼ（EC 3.1.1.74）；ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）デポリメラーゼ（EC 3.1.1.75およびEC 3.1.1.76）；1,4-ラクトナーゼ（EC 3.1.1.25）；グルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）；ラッカーゼ（EC 1.10.3.2）；またはそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数に由来する。
【０１３７】
本方法に用いられる酵素を、いくつかのパラメーターについて改善することができる。（Dalby, P.A. (2003). Optimizing enzyme function by directed evolution. Current Opinion in Structural Biology, 13, 500-505）。規定の期間内により多くの基質を生成物に変換できるような、野生型酵素よりも反応の速度が向上した酵素を作製できる。このことは、それによって本発明の方法を実施するためにかかる時間が減少するため有利である。代替的に、酵素を、有機溶媒の存在下における酵素の溶媒安定性に関して野生型酵素よりも改善することができる。このことは、いくつかの態様において、二相系または混合溶媒系（例えば、混合した水／シクロヘキサノールおよびシクロヘキサノン系）で本発明の方法を全体的にまたは部分的に実施し得るため有利である。さらに代替的に、酵素を、高い温度におけるその活性に関して野生型酵素よりも改善することができる。このことは、それが、反応の速度を増大させる（しかし、野生型酵素を不活性化するであろう）温度で方法を全体的にまたは部分的に実施し得ることを意味するため有利である。
【０１３８】
さらに代替的に、酵素を操作して、生成物阻害および／または基質阻害を低下させる。これは有利なことに、より高い濃度の生成物および／または基質が反応中に存在するのを可能にする。さらに代替的に、酵素の基質反応性を変更してよい。このことは、操作された酵素が、野生型酵素が反応し得ない基質と反応し得ることを意味する。そのような酵素は、典型的には、所望の反応を実施し得る野生型酵素が知られていないまたは適さない場合に採用される。酵素を操作することによって、基質特異性も変化させることができ、それによって野生型酵素が受容し得ない基質を受容しかつそれと反応することができる。なおさらに代替的に、酵素を操作して、そのpH最適条件をより酸性またはよりアルカリ性のpHに移行する。このことは、プロセス要件に適したpHで酵素を採用し得ることを意味する。
【０１３９】
さらに代替的に、添付の特許請求の範囲の方法に用いられる酵素をコードする遺伝子をコドン最適化する。ゆえに、各アミノ酸に対するコドンが、酵素が発現されることになる宿主細胞におけるそのアミノ酸に対して最も普及しているtRNAを使用するように、該酵素をコードするDNA配列を変更する。
【０１４０】
別の選択肢において、容易な精製のためのタグ（例えば、Hisタグ、GSTタグ、Flagタグ）を含むように、ポリペプチドを操作してよい。別の選択肢において、特異的細胞部位、例えば細胞小器官、細胞外、細胞膜、またはペリプラズムにポリペプチドを標的化するための局在配列を含むように、ポリペプチドを操作してよい。
【０１４１】
操作される単一の酵素において、これらの種々の選択肢、例えばコドン最適化、局在配列および／または精製タグを含むための改変、ならびに温度での活性、基質阻害などを変更するための改変を組み合わせてよい。
【０１４２】
酵素の組み合わせ
本明細書において記載される方法または組成物のいずれかにおいて、多種類の酵素が存在してよい。例えば、本明細書において記述される酵素の種類の、例えば2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、または12種の任意の組み合わせを用いてよい。適切な酵素には、シトクロムP450またはω-ヒドロキシラーゼ（オメガ-ヒドロキシラーゼ）、脂肪酸オキシダーゼまたは第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはChnE、アルコールデヒドロゲナーゼまたはChnA、グルコノラクトナーゼまたはバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、シクロヘキサン-1,2-ジオンアシルヒドロラーゼ、シクロヘキサン-1,2-ジオールデヒドロゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼまたはエステラーゼまたはリパーゼまたはポリヒドロキシアルカノエートデポリメラーゼ、トランスアミナーゼまたは6-ヒドロキシカプロエートデヒドロゲナーゼ、アミドヒドロラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびジアミンオキシダーゼまたはジアミントランスアミナーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４３】
宿主細胞生体触媒
本発明は、混合有機性廃棄流、例えばシクロヘキサン酸化等のシクロアルカン酸化の非揮発性残留物または洗浄水廃棄流中に見出される化合物を、ナイロンの合成に有用である化合物に酵素的に変換するための生体触媒の使用に関する。
【０１４４】
本発明の方法に用いられる生体触媒を、多様な形態の反応に導入してよい。一局面において、各酵素は同じ形態である。別の局面において、酵素は異なる形態で提供される。
【０１４５】
主張される方法において有用な1種または複数種の酵素を発現する宿主細胞生体触媒を、生体触媒として用いてよい。用いられる宿主細胞は、典型的にはいくつかの特性を持つ：それらは、容易に遺伝子改変され得、本発明の方法に用いられる条件に耐性があり、かつ産業的に有用である細胞密度まで増殖する。任意で、ホールセルは、単一細胞の微生物であってよく、または細胞株の細胞であってよい。ホールセルは、野生型の遺伝子型のものであってよい。この場合、主張される方法における1つまたは複数の工程を触媒するために用いられる酵素は、ホールセル内に存在しており、かつ本発明の方法における産業的用途を有するレベルで発現される。代替的に、本発明の方法における産業的用途を有するレベルで該酵素を発現するように、宿主生物が遺伝子改変されている。酵素は、それが発現される細胞から供給されてよい。代替的に、酵素は、異なる株または細胞の種から供給される。
【０１４６】
一局面において、ホールセルは原核生物である。別の選択肢において、それは真核生物である。典型的には、単一細胞の微生物が用いられる。
【０１４７】
原核細胞という用語には、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌が含まれる。本発明の方法とともに用いられ得るグラム陰性細菌の例は、大腸菌（Escherichia coli）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、スフィンゴモナス（sphingomonads）、シュードモナス（pseudomonads）、ならびにサルモネラ（Salmonella）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、モラクセラ（Moraxella）属、アルカリゲネス（Acaligenes）属、サイクロバクター（Psychrobacter）属、テルモトガ（Thermotoga）属、アシネトバクター（Acinetobacteria）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、アゾアルカス（Azoarcus）属、およびロドスピリルム（Rhodospirillum）属に属する他の細菌である。本発明の方法とともに用いられ得るグラム陽性細菌の例は、レンサ球菌（streptococci）、乳酸菌（lactobacilli）、ならびにノカルディア（Nocardia）属、バシラス属、ロドコッカス属、クロストリジウム（Chlostridium）属、ストレプトマイセス属、およびアルスロバクター（Arthobacter）属に属する他の細菌である。
【０１４８】
真核宿主細胞には、酵母および他の真菌由来のものが含まれる。本発明の方法とともに用いられ得る真核宿主細胞の例は、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス等のカンジダ属、ロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、およびリポマイセス属に属する酵母、ならびにアスペルギルス属、エクソフィアラ（Exophiala）属、ムコール属、トリコデルマ（Trichoderma）属、クラドスポリウム（Cladosporium）属、ファネロケーテ（Phanerochaete）属、クラドフィアロフォラ（Cladophialophora）属、ペシロマイセス（Paecilomyces）属、スケドスポリウム（Scedosporium）属、およびオフィオストマ（Ophiostoma）属に属する他の真菌由来のものである。
【０１４９】
宿主細胞生体触媒は天然にまたは遺伝子改変によって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善する他の主張される酵素的変換と併用してとりわけ有用である酵素的変換を実施する、さらなる酵素経路を含有する。例えば、天然の宿主細胞生体触媒は、該流中に存在している直鎖状C4-C6一酸、ヒドロキシ酸、およびオキソ酸の少なくとも一部をそれらの対応する二酸に酸化することによって、混合有機性廃棄流中のアジピン酸の相対量を増大するために必要とされる2つの酵素経路を含有し得る。そのようなプロセスは、宿主細胞のシトクロムp450経路、ならびにさらなる任意の酵素を必要とする。宿主細胞におけるさらなる内在性または異種性の酵素経路の存在は、混合有機性廃棄流中の二酸の相対量を増大させるのに、アジピン酸の相対濃度を増大させかつ廃棄流中の一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させるのに、かつ／または廃棄流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性アルカンに変換するのにとりわけ有用である。
【０１５０】
一局面において、オキソ酸を介したC4-C6もしくは環状C6一酸、ヒドロキシ酸、またはオキソ酸の二酸への酵素的変換を実施する天然のまたは非天然の宿主細胞は、以下の変換のうちの1つまたは複数をし得る内在性または異種性のω酸化経路を有する：
酪酸、吉草酸、および／もしくはアジピン酸の対応する二酸（すなわち、それぞれコハク酸、グルタル酸、および／もしくはアジピン酸）への変換；
酪酸、吉草酸、および／もしくはアジピン酸の対応するヒドロキシ酸（すなわち、それぞれ4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および／もしくは6-ヒドロキシカプロン酸）への変換；
4-ヒドロキシ酪酸、5-ヒドロキシ吉草酸、および／もしくは6-ヒドロキシカプロン酸の対応するオキソ酸（すなわち、それぞれ4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および／もしくは6-オキソヘキサン酸）への変換；または
4-オキソブタン酸、5-オキソペンタン酸、および／もしくは6-オキソヘキサン酸の対応する二酸（すなわち、それぞれコハク酸、グルタル酸、および／もしくはアジピン酸）への変換。
【０１５１】
ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し得る内在性または異種性のω酸化経路を有する宿主細胞は、n-アルカンを利用する酵母または細菌であってよい。例示的なn-アルカンを利用する酵母には、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス、もしくはそれらの組み合わせ、またはロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、デバリオマイセス属、およびリポマイセス属の酵母、もしくはそれらの組み合わせが含まれる。例示的なn-アルカンを利用する細菌には、シュードモナス・フルオレッセンス、P.プチダ、P.エルギノーサ、P.オレオボランス、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス、A.ベネチアヌス等のアシネトバクター種、オレイフィラス・メシネンシス、アルスロバクター・ビスコサス、カプリアビダス・メタリデュランス、R.ロドクラウスおよびR.エリスロポリス等のロドコッカス種、スフィンゴモナス・パウシモビリス、バークホルデリア・セパシア、デルフチア・アシドボランス、アルカニボラクス・ディエソレイ、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１５２】
別の局面において、混合有機性廃棄流中に存在している環状C6成分の少なくとも一部を6-ヒドロキシカプロン酸、6-オキソヘキサン酸、またはアジピン酸に酵素的に変換する天然のまたは非天然の宿主細胞は、（i）シクロヘキサノールを6-オキソヘキサン酸に変換し得る、（ii）1,2-シクロヘキサンジオールを6-オキソヘキサン酸に変換し得る、かつ／または（iii）6-オキソヘキサン酸をアジピン酸に変換し得る内在性または異種性の経路を有する。
【０１５３】
シクロヘキサノールを6-オキソヘキサン酸に変換する際、宿主細胞は、シクロヘキサノールのシクロヘキサノンへの変換；シクロヘキサノンのε-カプロラクトンへの変換；ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサン酸への変換；および／または6-ヒドロキシヘキサン酸の6-オキソヘキサン酸への変換を触媒する。
【０１５４】
1,2-シクロヘキサンジオールを6-オキソヘキサン酸に変換する際、宿主細胞は、シクロヘキサン-1,2-ジオールのシクロヘキサン-1,2-ジオンへの変換またはシクロヘキサン-1,2-ジオンの6-オキソヘキサン酸への変換を触媒する。
【０１５５】
宿主細胞生体触媒の改変
本発明の方法に用いられる生体触媒は、酵素が天然で存在している種である、非改変宿主細胞であってよい。しかしながら、該宿主細胞を遺伝子改変して、操作された細胞を産生することが必要である可能性がある。本明細書において使用するとき、操作された細胞とは、そのゲノムが野生型細胞のゲノムから変更されるように操作された細胞を意味する。ゲノムの変更には、プラスミドの導入および欠失が含まれる。一局面において、遺伝子改変とは、細胞のゲノム内への核酸の導入である。図3を参照されたい。細胞内に導入される核酸は、別の種または生物由来の核酸配列、例えばホールセルの野生型ゲノム内に存在していないDNA配列を含んでよい。他の例では、導入されるDNA配列は、ホールセルのゲノム内のDNA配列のさらなるコピーであってよい。いくつかの選択肢において、遺伝子改変は、ホールセルのゲノムからのDNA配列の欠失である。別の局面において、遺伝子改変は、細胞のゲノムの改変である。
【０１５６】
ある選択肢において、操作される細胞は原核生物である。別の選択肢において、それは真核生物である。典型的には、単一細胞の微生物が用いられる。
【０１５７】
原核細胞という用語には、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌が含まれる。本発明の操作される細胞としての使用に適しているグラム陰性細菌の例には、大腸菌、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス、シュードモナス、ならびにサルモネラ属、バークホルデリア属、モラクセラ属、アルカリゲネス属、サイクロバクター属、テルモトガ属、アシネトバクター属、ロドバクター属、アゾアルカス属、およびロドスピリルム属に属する他の細菌が含まれる。本発明の操作される細胞としての使用に適しているグラム陽性細菌の例には、レンサ球菌、乳酸菌、ならびにノカルディア属、バシラス属、ロドコッカス属、クロストリジウム属、ストレプトマイセス属、およびアルスロバクター属に属する他の細菌が含まれる。
【０１５８】
典型的には、操作される真核細胞は酵母および他の真菌である。操作される真核細胞の非限定的な例には、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス等のカンジダ属、ロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、およびリポマイセス属に属する酵母、ならびにアスペルギルス属、エクソフィアラ属、ムコール属、トリコデルマ属、クラドスポリウム属、ファネロケーテ属、クラドフィアロフォラ属、ペシロマイセス属、スケドスポリウム属、およびオフィオストマ属に属する他の真菌が含まれる。ある選択肢において、宿主細胞はヤロウイア・リポリティカである。
【０１５９】
i）導入される核酸配列
細胞内に導入される核酸は、いくつかのエレメントのうちの1つまたは複数を含んでよい。典型的には、エレメントの1つは、本発明の方法に用いられる酵素、例えばシトクロムP450、ω-ヒドロキシラーゼ（オメガ-ヒドロキシラーゼ）、脂肪酸オキシダーゼ、第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、ケトレダクターゼ、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、カプロラクトンヒドロキシラーゼ、ジオンヒドロラーゼ、エステラーゼ／リパーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アミドヒドロラーゼ、またはこれらの種類の酵素のいずれかの操作された型をコードする遺伝子である。いくつかの選択肢において、核酸は、シャペロンまたは遺伝子のアクチベーターもしくはリプレッサーとして作用するタンパク質等、本発明の方法において機能する酵素ではないタンパク質をコードする。
【０１６０】
典型的には、ポリペプチドがプロモーターに機能的に連結されるように核酸を設計する。本明細書において使用するとき、本明細書において用いられる「機能的に連結される」という用語は、エレメントがポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を指示し得るような位置に該エレメントを配することを意味する。導入される核酸配列上で発現されようとしている1つまたは複数のポリペプチドにプロモーターを機能的に連結し、それにより細胞内への核酸の導入前に機能的連結を確立することによって、これを配置してよい。1つまたは複数の酵素へのプロモーターの機能的連結を確実にするために、プロモーターを酵素の5'に配するべきであり、かつインフレームの終止コドンはプロモーターと酵素との間の配列に存在すべきではない。あるいは、核酸が導入された場合に、該核酸内の遺伝子配列が、宿主細胞のゲノム内にすでに存在しているプロモーターに機能的に連結されかつしたがって酵素がそのプロモーターから発現され得るような様式で宿主細胞のゲノム内に配されるように、該核酸を設計してよい。
【０１６１】
ii）ホールセルにおける複数の酵素の発現
いくつかの態様において、単一株のホールセルを用いて、本発明の方法に用いられる1種を上回る酵素を発現させる。この場合、複数の酵素は、導入される同じ核酸によってコードされてもよい。代替的に、酵素は、導入される別個の核酸フラグメント上でコードされてもよい。酵素を、単一のプロモーターからすべて発現させてよい（例えば、酵素をオペロンの形態に配置することによって）。代替的に、酵素を、複数の分離したプロモーターから発現させてよい。いくつかの例において、複数の分離したプロモーターを、同じ化学物質によって誘導してよい（例えば、複数の酵素のそれぞれを酵母GALプロモーターから発現させてよく、ゆえに各遺伝子がガラクトースで誘導可能であることを意味する）。他の適切なプロモーターは、当技術分野において公知である。代替的に、本発明の方法に用いられる酵素をコードする遺伝子のそれぞれは、異なるプロモーターの制御下にある。ゆえに、異なる誘導化合物の使用によって、異なる酵素を個々に導入することができる。別の選択肢において、いくつかの酵素が同じプロモーターの制御下にあり、かついくつかの酵素が異なるプロモーターの制御下にある、中間型の手法を用いる。この代替策は、ホールセル内に多数の酵素経路が作製されておりかつ経路の各メンバーを他の経路メンバーと協調させて制御したいが各経路を別々に制御したいと望まれる場合に、とりわけ有利であり得る。
【０１６２】
iii）シャペロンシステム
天然ではない条件下でタンパク質を発現するように細胞が操作されている場合（例えば、種にとって天然型であるタンパク質を天然のレベルを上回るレベルで発現させた場合、または代替的に、異なる種由来のタンパク質を宿主細胞において発現させた場合）、場合によっては、そのタンパク質は活性型で発現されない。その代わり、それは不正確に折り畳まれ、機能的でない「封入体」凝集物として蓄積し得る。この場合、該タンパク質を発現させるために用いられた細胞を遺伝子改変に供して、該タンパク質の誤った折り畳みを阻止し得るまたは凝集した状態からそれを再折り畳みし得るシャペロンタンパク質を、さらに発現させてよい。
【０１６３】
そのようなシャペロンタンパク質の包含は、それによって、細胞あたりの活性タンパク質の量が増大し、したがって本発明の方法の全体的効率が増大するため有利である。発現されるシャペロンは、宿主細胞のシャペロンタンパク質であってよい。代替的に、シャペロンは、タンパク質と同じ種／株由来のものであってよい。発現のための典型的なシャペロンタンパク質には、GroEL/GroESファミリーのメンバー、およびDnaJ/DnaK/GrpEファミリーのメンバーが含まれる。原型的な大腸菌（E. coli）のGroEL/GroESおよびDnaJ/DnaK/GrpEタンパク質のホモログは、他の原核生物種で同定されており、真核生物のホモログも公知である（GroELおよびGroESは、真核生物タンパク質Hsp60およびHsp10に対応し、DnaJ、DnaK、およびGrpEは、真核生物タンパク質Hsp70、Hsp40、およびHsp24にそれぞれ対応する）。これらのタンパク質は、酵母のいくつかの種で同定されている（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）。本発明の方法に用いられる酵素との共発現のための適切なシャペロンタンパク質の選択は、本明細書における教示に従う当業者にとって明白であろう。
【０１６４】
ホールセルの代謝工学
代謝工学とは、化合物を産生し得る細胞の能力を増大させるために、ホールセルにおけるパラメーターを最適化するプロセスである。本発明の方法に用いられるホールセルは、二酸、あるいはアジピン酸または6-オキソヘキサン酸、1,6-ヘキサンジオール（1,6-hexanedoil）、6-アミノヘキサン酸、カプロラクタム、およびヘキサメチレンジアミンの産出を最適化するように任意で操作されている。
【０１６５】
化合物を産生し得る細胞の能力を増大させる代謝工学は、主に2つの道を通して実施される。1つ目は、開始材料から所望の生成物を産生する経路において酵素を最適化することである。当業者に公知の技術（例えば、二次元電気泳動、同位体標識した前駆体の使用、および核磁気共鳴（NMR）分光法）を用いることによって、経路における各中間体の濃度を決定し、したがってどの酵素変換が律速工程であるか、換言すると反応スキームにおけるどの工程が最も低速であるかを決定することが可能である。これは、この中間体に作用する酵素が変換の全体的速度を制限していることを示す、中間体の集積を観察することによって決定され得る。したがって、この場合、この中間体が反応する速度を増大すべきである。
【０１６６】
例として、本発明の方法において、変換は、ヘキサン酸からのヘキサン-1,6-二酸の産生であってよい。この変換は、（図2に示されるように）3種の酵素：ヘキサン酸を6-ヒドロキシヘキサン酸に変換するシトクロムP450、6-ヒドロキシヘキサン酸を6-オキソヘキサン酸に変換するアルコールデヒドロゲナーゼ、および6-オキソヘキサン酸をヘキサン-1,6-二酸に変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼの使用を必要とする。
【０１６７】
シトクロムP450によるヘキサン酸からの6-ヒドロキシヘキサン酸の産生の速度が、経路における後続の変換（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼによる）が実施される速度を下回る場合、6-ヒドロキシヘキサン酸の産生の速度を増大すべきである。これは、いくつかの手段によって実施され得る。第一に、シトクロムP450の発現レベルを増大させてよい。任意で、これは、酵素をコードする遺伝子を強力なプロモーター、例えば該酵素が大腸菌で発現される場合にはT7プロモーター、または該酵素が酵母で発現される場合にはTEFプロモーターの制御下に配することによって達成され得る。
【０１６８】
第二の選択肢は、例えば多コピープラスミド上に遺伝子を配することによって、または宿主細胞の染色体内に遺伝子の複数のコピーを組み入れることによって（これらのコピーは、染色体内の同じ位置に、または染色体内の異なる位置に組み入れられ得る）、細胞内に存在している酵素をコードする遺伝子のコピー数を増大させることである。
【０１６９】
第三には、シトクロムP450酵素を、該酵素をより速い速度で反応するように進化させる突然変異誘発に、または該酵素をその発現を増大させるようにコドン最適化することに供してよい。この記載は単に例示的なものであり、同じプロセスを実施して、本発明の方法に用いられる他の酵素（すなわち、ω-ヒドロキシラーゼ（オメガ-ヒドロキシラーゼ）、脂肪酸オキシダーゼ、第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、ケトレダクターゼ、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ、カプロラクトンヒドロキシラーゼ、ジオンヒドロラーゼ、エステラーゼ／リパーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アミドヒドロラーゼ、またはこれらの種類の酵素のいずれかの操作された型）の発現を最適化してよい。
【０１７０】
基質、中間体のいずれか、または生成物を本発明の目的であるもの以外の代謝経路に流用し得る任意の酵素の活性を不活性化するまたは低下させることによっても、ヘキサン-1,6-二酸の産生を増大させることができる。上述される例示した経路において、ヘキサン酸およびヘキサン-1,6-二酸の両方ともに、アシル-CoAリガーゼおよび／またはCoAトランスフェラーゼ酵素の作用を受け得る。CoAにライゲーションされたら、次いで化合物は細胞のβ酸化（ベータ酸化）経路に供給され得、これにより、該化合物の崩壊がもたらされる。ゆえに、いくつかの態様において、本発明の方法に用いられるホールセルは、CoAをヘキサン酸、6-ヒドロキシヘキサン酸、6-オキソヘキサン酸、またはヘキサン-1,6-二酸にライゲーションされ得る1種または複数種のアシル-CoAリガーゼおよび／またはCoAトランスフェラーゼ酵素を欠失するように操作されている。
【０１７１】
代替的に、アシル-CoAリガーゼおよび／またはCoAトランスフェラーゼ酵素を欠失させないが、代わりに、基質、中間体、または生成物にもはや作用できないが（すなわち、それは直鎖状C6分子を基質としてもはや受容し得ないが）、CoAを他の分子、典型的にはC3-C5鎖にライゲーションさせ得る全ての能力を保持するように、操作する。
【０１７２】
一局面において、C6成分の高収率は、宿主細胞内のC6成分の異化の速度を減少させることによって達成される。そのような手法は、（i）混合有機性廃棄流中のアジピン酸の相対濃度を増大させ、かつ一酸およびヒドロキシ酸の量を減少させる工程、ならびに／または（ii）混合有機性廃棄流中に存在しているC6成分および前駆体をα,ω-二官能性アルカンに変換する工程を伴う方法にとりわけ有用であり得る。とくに、混合物中に存在している宿主細胞生体触媒によるカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸の異化は、β酸化を介したアシル-CoAへの分解を低下させることによって低下し得る。
【０１７３】
混合有機性廃棄流中に存在しているC6化合物の宿主細胞による異化の速度の減少は、カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸をそれらの対応するCoAエステルに活性化する宿主細胞生体触媒内の酵素を欠失させるまたは阻害することによって、達成され得る。例えば、CoAリガーゼおよびトランスフェラーゼ等の宿主細胞酵素の欠失または阻害によって、これらの化合物が異化される速度を減少させることができる。さらなる例として、アシル-CoAオキシダーゼおよびアシル-CoAデヒドロゲナーゼ等の宿主細胞酵素の欠失または阻害もまた、宿主細胞のβ酸化経路を介してカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸がそれらの対応するCoAエステルとなる速度を減少させることができる。
【０１７４】
一局面において、基質の取り込みおよび生成物の分泌を改善するために、NVRまたはCOP酸中の種の細胞内へのおよび細胞からの輸送を代謝工学によって最適化する。これは、一酸のさらなる輸送体を発現させることによって、または一酸の取り込み速度を改善するように輸送体を操作することによって達成される。あるいは、一酸に作用するCytP450等の第一の酵素を細胞表面に提示させて、一酸を、一酸よりも速い速度で細胞内に取り込まれるヒドロキシ酸に転換してよい。
【０１７５】
ホールセル生体触媒を増殖させることによる、炭素供給源としてのC3-C5分子の使用
本発明の方法において開始材料として用いられるシクロヘキサン酸化プロセスの混合有機性廃棄流は、酸化した炭化水素分子を含む。主張される方法は、廃棄流中に存在している望ましくない成分をより望ましい生成物に酵素的に変換する少なくとも1種の生体触媒を該流に適用することによって、混合有機性廃棄流の特性および組成を改善し、それによって処理された廃棄流を後続の化学的および／または酵素的処理に用いて、可能な限り高い純度で高収率の所望の生成物を提供することができる。上記に記載されるように、シクロヘキサン酸化の結果として生じる生成物には、NVRおよび／または洗浄水中に見出される、ペンタン酸、5-ヒドロキシペンタン酸、ブタン酸、4-ヒドロキシブタン酸、およびプロパン酸を含む、当初のC6分子の崩壊生成物が含まれる。NVRおよび／または洗浄水の特性を改善するために、ホールセル生体触媒を廃棄流に適用して、開始材料中に存在している不要な化合物を利用する。
【０１７６】
一局面において、廃棄流中のC3-C6成分の存在を減少させることによって、混合有機性廃棄流、例えばNVRの複雑性を低下させることができる。複雑性の低下を達成するための一方法は、混合有機性廃棄流のC3-C5成分を増殖のための炭素供給源として利用し得る宿主細胞生体触媒を選択することである。混合有機性廃棄流のそのような複雑性の低下は、アジピン酸の相対濃度を直接的に増大させるのに、かつカプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、および環状C6化合物、例えばKおよびAからのアジピン酸の回収を促進することによって、アジピン酸の相対濃度を間接的に増大させるのに有用であり得る。
【０１７７】
分子へのCoA（補酵素A）のライゲーションによって、および細胞のβ酸化経路内への該CoA結合分子の代謝によって、ペンタン酸、ブタン酸、およびプロパン酸を細胞による炭素供給源として用いることができる。ゆえに、いくつかの態様において、本発明の方法に用いられるホールセル生体触媒は、CoAをペンタン酸、ブタン酸、および／またはプロパン酸にライゲーションさせ得るアシル-CoAリガーゼおよび／またはCoAトランスフェラーゼを含む。加えて、本発明の方法において開始材料として用いられる、シクロヘキサン酸化の非揮発性残留物および／または洗浄水中にもしばしば存在している5-ヒドロキシペンタン酸および4-ヒドロキシブタン酸をホールセルによって代謝して、本発明の方法の生成物の純度をさらに改善することもできる。アルコールデヒドロゲナーゼによって5-ヒドロキシペンタン酸を5-オキソペンタン酸に酸化することができ、今度はアルデヒドデヒドロゲナーゼによって4-オキソペンタン酸をペンタン-1,5-二酸（グルタル酸）に酸化することができる。適切なアシル-CoAリガーゼおよび／またはCoAトランスフェラーゼによるペンタン-1,5-二酸へのCoAのライゲーションは、細胞のβ酸化経路を介して代謝される化合物をもたらす。アルコールデヒドロゲナーゼによって4-ヒドロキシブタン酸を4-オキソブタン酸に酸化することができ、今度はアルデヒドデヒドロゲナーゼによってそれをブタン-1,4-二酸（コハク酸）に酸化することができる。コハク酸は、トリカルボン酸回路（クエン酸回路またはクレブス回路としても知られる）における中心的成分である。プロピオン酸もピルベートおよびβ-アラニンに異化することができる。
【０１７８】
阻害性化合物を除去するための混合有機性廃棄流の前処理
本発明者らは、混合有機性廃棄流中に存在している主要な阻害性化合物としてバレロラクトンを同定しており、バレロラクトンがNVR耐性宿主細胞の増殖を阻止することに関与していることを確認した。NVRの存在下において適当な宿主細胞の増殖を可能にするために、NVRの重要な阻害性成分としてのバレロラクトンの同定に基づき、廃棄流を適切に処理して、廃棄流からバレロラクトンを除去する、または廃棄流中に存在しているバレロラクトンの量を軽減することができる。
【０１７９】
一局面において、阻害性化合物を加水分解する遊離したもしくは固定化した酵素を用いて、混合有機性廃棄流を前処理し、またはそれ以外の方法で該流から阻害性化合物を効果的に除去する。阻害性化合物のそのような除去によって、混合有機性廃棄流中での宿主細胞増殖の阻害は緩和される。
【０１８０】
非揮発性残留物、COP酸、または洗浄水流を前処理に供し、事前に阻害性化合物を除去してよく、かつ／または基質としてのその使用前にポリマーエステルを加水分解してよい。例えば、AhpDまたはAhpF等の電子供与体の有無にかかわらず、ペルオキシダーゼ／カタラーゼ等の適切な生体触媒、例えばKatA、KatG、およびアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ（例えば、酵母におけるAhp1または細菌におけるAhpC）を含むクラスEC 1.11.1-中の他の酵素、EC 1.11.1.15、および他のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ（例えば、EC 1.8.1.-およびEC 1.6.99.3）を用いた処理によって、洗浄水中に存在しているアルキルヒドロペルオキシドを除去してよい。（混合物中のポリマーエステルを加水分解するための）カルボキシルエステラーゼとアルキルヒドロペルオキシドに作用する酵素との組み合わせを、バイオリアクター内への供給前に流へ添加される酵素調製物として用いてよく、またはこれを、リパーゼ／エステラーゼの分泌によってポリマーエステルを加水分解できかつ同時に、価値のある化合物の産生のための第二のバイオリアクター内に上清を供給する前に有機ヒドロペルオキシドを減少できる微生物培養物を含有する「事前発酵槽」内に未処理の流を供給することによって用いてよい。
【０１８１】
加えて、混合有機性廃棄流を、ラクトンヒドロラーゼまたは該流から阻害性ラクトン成分を除去し得る他の酵素（宿主細胞生体触媒または宿主細胞から単離された酵素）で処理してよく、それによって該流を炭素供給源として用いる宿主細胞の増殖が改善される。混合有機性廃棄流中の微生物の増殖は、そのような阻害性化合物の存在によって悪化し得る。とくに、NVRを含有する培養物中で増殖したY.リポリティカの種々の株は、バレロラクトン蓄積の結果として定常状態の増殖に達することができなかった。実施例4を参照されたい。しかしながら、バレロラクトンをヒドロキシ吉草酸に変換するラクトンヒドロラーゼを発現かつ分泌する宿主細胞は、阻害性化合物が培地から除去されているため、NVR中で上手く増殖し得る。実施例5を参照されたい。
【０１８２】
混合有機性廃棄流に対して耐性を有する宿主細胞の選択
あるいは、混合有機性廃棄流を含有する培養物中での生体触媒の増殖を改善するために、それが混合有機性廃棄流に対して耐性を有する、例えばNVR、COP酸、または洗浄水流を含有する培養物中で増殖し得る宿主細胞を選択してよい。
【０１８３】
さらには、耐性宿主細胞を、ある特定の容量パーセンテージの処理された混合有機性廃棄流を含む培養物中で増殖させてよい。前処理された混合有機性廃棄流と組み合わせた耐性宿主細胞の使用、例えばバレロラクトンのようなラクトン化合物を除去するためのヒドロラーゼの用途は、廃棄流材料を含有する培地中での宿主細胞の増殖を有意に改善し得る。
【０１８４】
一局面において、生体触媒は、NVR等の混合有機性廃棄流に対して耐性を有する天然のまたは非天然の宿主細胞である。好ましくは、宿主細胞は、少なくとも1容量％の混合有機性廃棄流に対して耐性を有する。例えば、宿主細胞生体触媒は、少なくとも1％のNVRを含有する培養物中で定常状態の増殖に達することができる。
【０１８５】
別の局面において、混合有機性廃棄流に対する宿主細胞の耐性を、混合有機性廃棄流中に存在している阻害性化合物の量の低下によって改善する。上記に記述されるように、培地中のバレロラクトンをヒドロキシ吉草酸（hydroxycaleric acid）に変換するための1,4-ラクトナーゼクラスの酵素（EC 3.1.1.25）を用いた廃棄流の前処理によって、残存廃棄流成分の存在下での細胞増殖が増進され得る。加えて、グルコノラクトナーゼクラスの酵素（EC 3.1.1.17）を用いて、ラクトンをそれらの対応する酸形態、ヒドロキシカルボン酸に変換してもよい。実施例5を参照されたい。
【０１８６】
一局面において、混合有機性廃棄流中に存在している阻害性化合物はラクトンであり、二酸の相対量を増大させるため、アジピン酸の相対濃度を増大させて一酸およびヒドロキシ酸の量を低下させるため、ならびに／またはC6成分および前駆体をα,ω二官能性アルカンに変換するために必要な変換を仲介し得る天然のまたは非天然の宿主細胞を用いた、混合有機性廃棄流の処理の前または最中の、ラクトンを対応するヒドロキシル酸に加水分解し得る1種または複数種の酵素を用いた混合有機性廃棄流の処理によって、該流中のラクトンの量を低下させる。
【０１８７】
生成物の分離および回収
本発明は、本明細書において記載されるモノマー成分（例えば、二酸、アジピン酸）の分離および回収も提供する。例えば、本発明は、混合有機性廃棄流の6炭素成分、例えば6-オキソヘキサン酸のアジピン酸への変換後に、反応混合物からアジピン酸またはアジピン酸誘導体を分離する方法を提供する。これらの分離した生成物を、初期工程において分離され得るC4およびC5二酸、ならびに／または誘導体の除去によってさらに精製することができる。
【０１８８】
一局面において、濃縮した反応混合物からのアジピン酸の結晶化によって、または反応混合物からのアジピン酸ジエステルのエステル化および蒸留によって、アジピン酸を他の成分から分離する。
【０１８９】
上記に記述されるように、生体触媒を用いて、直鎖状C4-C6一酸およびヒドロキシ酸成分、ならびに環状C6成分を、後にC4、C5、およびC6二酸に分離され得るC4-C6二酸の混合物に変換することができる。一局面において、C4、C5、およびC6二酸への分離前に二酸混合物をエステル化する。
【０１９０】
混合有機性廃棄流および生体触媒の組成物
本発明は、シクロヘキサン酸化プロセスの混合有機性廃棄流と生体触媒とを含む組成物も提供する。一局面において、混合有機性廃棄流は、NVR、洗浄水／COP酸、または苛性洗浄液流である。
【０１９１】
一局面において、生体触媒は、単離された酵素または天然のもしくは非天然の宿主細胞によって分泌された酵素である。組成物は、前節において詳述されている酵素より選択される1種もしくは複数種の酵素、または非天然のそれらの変種を含んでよい。
【０１９２】
一局面において、組成物は、混合有機性廃棄流に対して耐性を有する宿主細胞生体触媒を含む。言い換えれば、生体触媒は、混合有機性廃棄流を含有する培養物中で、産業的に有用である密度まで増殖することができる。好ましくは、宿主細胞はNVRに対して耐性を有する。別の局面において、宿主細胞は、少なくとも1容量％の混合有機性廃棄流に対して耐性を有する。したがって、宿主細胞は、1容量％の混合有機性廃棄流を含有する培養物中で増殖し、産業的に有用である密度に達することができる。
【０１９３】
オメガ酸化（ω酸化）は、脂肪酸代謝に対するベータ酸化（β酸化）の代替的経路である。ω酸化経路は、β炭素を伴うβ酸化経路とは異なり、ω炭素、すなわち脂肪酸のカルボキシル基から最も遠い炭素の酸化を伴う。ω酸化プロセスは、通常、中鎖脂肪酸、すなわちC10-12に対する小規模な異化経路であるが、該経路は、β酸化に欠陥がある場合により重要になる。ω酸化プロセスは、ω炭素の水酸化（hydrozylation）および継続的酸化を伴い、アジピン酸および他の生成物、例えばコハク酸を産出した。
【０１９４】
一局面において、天然のまたは非天然の宿主細胞生体触媒は、ヒドロキシル酸およびオキソ酸を介して脂肪族脂肪酸を二酸に変換し得る内在性または異種性のω酸化経路を含む。好ましくは、ω酸化経路を有する宿主細胞生体触媒は、n-アルカンを利用する酵母または細菌である。
【０１９５】
当業者であれば、主張される方法において用いるのに適している多数のn-アルカンを利用する酵母または細菌を知っている。一局面において、例示的なn-アルカンを利用する酵母には、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、C.アルビカンス、C.クロアカエ、C.ギリエルモンジイ、C.インターメディア、C.マルトサ、C.パラプシローシス、C.ゼイラノイデス、またはそれらの組み合わせ、ロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、デバリオマイセス属、およびリポマイセス属の酵母、またはそれらの組み合わせが含まれる。別の局面において、例示的なn-アルカンを利用する細菌には、シュードモナス・フルオレッセンス、P.プチダ、P.エルギノーサ、P.オレオボランス、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス、A.ベネチアヌス等のアシネトバクター種、オレイフィラス・メシネンシス、アルスロバクター・ビスコサス、カプリアビダス・メタリデュランス、R.ロドクラウスおよびR.エリスロポリス等のロドコッカス種、スフィンゴモナス・パウシモビリス、バークホルデリア・セパシア、デルフチア・アシドボランス、アルカニボラクス・ディエソレイ、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１９６】
発酵プロセス
本発明の発酵プロセスを、バッチ様式、流加培養様式、または連続様式で実施してよい。流加培養様式において、該プロセスを部分的滴下で実施してよい。あるいは、細胞保持の有無にかかわらず、ケモスタット発酵を採用してよい。実施例3を参照されたい。さらには、廃棄流中の成分を唯一の炭素およびエネルギー供給源として供給してよく、あるいはグリセロールもしくは糖類、または他の適切な発酵性炭素もしくはエネルギー供給源の同時供給をエネルギーおよび炭素のさらなる供給源として用いて、より高等なバイオマスを獲得してよい。炭素供給源限定的培養を採用して、NVRおよびCOP酸中の種の毒性を低下させてよい。好ましい態様において、5〜8のpH範囲内で、より好ましくはpH6〜pH7.5の間で培養を実施して、解離していない有機酸による増殖阻害を克服する。
【０１９７】
以下の実施例は、本発明を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【０１９８】
実施例1−NVR、COP酸、および洗浄水中のオリゴマーエステルの加水分解
それらの結合部位の形状に基づいて異なるクラス由来の商業用リパーゼ（遊離および固定）およびエステラーゼを選択して、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルの加水分解についてスクリーニングした（表1および2）。このスクリーニングの結果に基づき、リパーゼエンジニアリングデータベース（LED）（Widmann et al., BMC Genomics 2010, 11:123）および他のバイオインフォマティクス資源を用いて、オリゴマーエステルの加水分解についてスクリーニングするためのさらなる酵素候補、およびとくに、熱安定性または低いpHで活性を有する酵素を同定した。当業者であれば、合理的設計を用いた酵素工学または指向進化技術によって、所望の活性を有する酵素のpH最適条件および安定性を変化させること、または所望のpHおよび安定性特性を有する酵素の基質特異性を変更すること、またはその両方が可能であることも理解するであろう。
【０１９９】
市販のリパーゼおよびエステラーゼを用いた、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルの加水分解についてのスクリーニング方法を、幅広い分子量を有する市販のカプロラクトンジオール（CPL）ポリマーを用いて検証した。寒天中のオリゴマーが加水分解された場合に放射状の酵素拡散によって間隙域が産生される寒天プレートアッセイと、モノマーの濃度を定量するためのUV検出を有するHPLCまたはLC-MSによってアッセイされる生体内転換反応との両方を用いて、酵素候補を同定した。2つのスクリーニング方法は相補的情報を提供する：プレートアッセイで観察される間隙域の大きさは、オリゴマーを可溶性であるより小さなエステルに加水分解する全加水分解活性（エンドおよびエキソ切断）の指標であり、一方で液体クロマトグラフィーは、モノマー濃度の増大についてのデータを提供し、ゆえにオリゴマーの末端モノマーを加水分解する酵素を同定する。
【０２００】
プレートアッセイのために、1〜4％ポリカプロラクトン（PCL）、NVRまたはCOP酸（v/v）を含有する寒天プレート（1.5％アガロース）を、50mMクエン酸塩、Tris/HCl、またはリン酸塩のバッファーを用いて調製して、pH3,5、5、7、および8における加水分解活性について酵素をアッセイした。PCLの分子量は530g/モルである。およそ3mmの径を有するウェルをプレート内に作製し、酵素を添加した（1U/ウェル）。間隙域を24時間後に測定した。NVR、COP酸、およびカプロラクトンポリマー中のオリゴマーの加水分解について、商業用リパーゼおよびエステラーゼの活性をそれぞれ比較する結果を示している表1および2を参照されたい。
【０２０１】
非結合の商業用エステラーゼおよびリパーゼを用いた生体内転換反応を、プレートアッセイに対するものと同じバッファーおよび基質の濃度を用いて実施した。商業用酵素調製物の添加（1U/ml）によって反応を開始した。固定化したリパーゼの場合には、NVR中のオリゴマーエステルの加水分解に対して、ChiralVision Immozyme（商標）リパーゼキット（ポリアクリル酸ビーズに共有結合している酵素）を用いた。固定化した酵素（100mg）を、1mlリン酸塩バッファーpH7.0中2％NVR（v/v）とインキュベートした。16時間後に100℃で10分間の酵素の不活性化によって生体内転換反応を停止させ、遠心分離し、濾過し、HPLCまたはLC-LC-MSによって分析した。寒天プレート上の典型的な間隙域を示している図4、および異なるpHにおけるエステラーゼの間隙域の径によって測定される相対活性を比較している図5を参照されたい。
【０２０２】
210nmでモニターするDAD検出器を有するShimadzu HPLC 2100システムでHPLC分析を実施した。Synergi Fusion RPカラム（250mm×4.6mm）で0.9ml/分の流速にて分離を実施し、リン酸およびアセトニトリルを用いてサンプルを溶出した。
【０２０３】
Agilent 6530 Accurate−Mass Q-TOF LC/MSと連動したAgilent 1290 Infinity UHPLCシステムでLC-MS分析を実施した。
【０２０４】
酸およびラクトンに対するLC条件：
カラム：100×2mm Synergi Fusion RPカラム（Phenomenex）
カラムオーブン温度：40℃
注入容量：2μL
溶離液：
A：0.1％酢酸を含有する5mM酢酸アンモニウム
B：5％水を含有するアセトニトリル
勾配：
2014518070.tif 000003
【０２０５】
MS Q-TOF条件：イオン供給源：ESI（エレクトロスプレーイオン化）。極性様式：陰性（酸）および陽性（ラクトン）。
【０２０６】
図6、7、8、および9は、LCおよびLC/MSによってアッセイされる、商業用リパーゼおよびエステラーゼの作用によるNVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルの加水分解に起因する、モノマー（カプロン酸、ヒドロキシカプロン酸、アジピン酸、および総酸）の濃度の増大を示す。LC/MSによって測定される、固定化したリパーゼによるNVR中のオリゴマーエステルからのモノマーの放出を図10に描写する。
【０２０７】
（表１）NVRおよびCOP酸中のオリゴマーの加水分解について評価された商業用エステラーゼおよびリパーゼ
2014518070.tif 000004
【０２０８】
（表２）NVRおよびCOP酸中のオリゴマーの加水分解について評価された固定化したリパーゼ
2014518070.tif 000005
【０２０９】
（表３）ポリカプロラクトン（PCL）ポリマー（MW 530g/モル）、NVR、またはCOP酸を含有する寒天プレート上の間隙域の径を測定することによってアッセイされる、商業用エステラーゼの加水分解活性の比較
2014518070.tif 000006
【０２１０】
（表４）ポリカプロラクトン（PCL）ポリマー（MW 530g/モル）、NVR、またはCOP酸を含有する寒天プレート上の間隙域の径を測定することによってアッセイされる、商業用リパーゼの加水分解活性の比較
2014518070.tif 000007
【０２１１】
プレートアッセイの結果は、いくつかの選択されたエステラーゼおよびリパーゼによる、pH5〜8のpH範囲におけるNVRおよびCOP酸の両方の中に存在しているオリゴマーエステルの加水分解を示している。ムコール・ミエヘイ由来のエステラーゼは、NVRおよびCOP酸オリゴマーの両方に対して、広いpH範囲にわたってプレート上で高い加水分解活性を呈した。シュードモナス・フルオレッセンス、バシラス・ステアロサーモフィラス、カンジダ・リポリティカ、およびリゾプス・オリゼ由来のエステラーゼは、pH5〜8の間で、合成ポリカプロラクトンジオール基質に対して、ならびにNVRおよびCOP中のオリゴマーに対して優れた加水分解活性を呈した。加えて、ウマ肝臓由来のエステラーゼは、COP酸オリゴマーの優れた加水分解を呈した。同様に、サーモマイセス・ラヌギノサスおよびクロモバクテリウム・ヴィスコスム由来のリパーゼは、広いpH範囲にわたって、合成、NVR、およびCOP酸オリゴマーの両方に対して高い加水分解活性を呈した。加えて、リゾムコール・ミエヘイ、ムコール・ミエヘイ、シュードモナス・フルオレッセンス、バークホルデリア・セパシア、およびアスペルギルス・ニガー由来のリパーゼは、NVRおよびCOP酸の両方の中のオリゴマーを加水分解し、大きな間隙域を産生した。表3、4、および図4を参照されたい。
【０２１２】
生体内転換アッセイは、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーエステルを異なるリパーゼおよびエステラーゼで処理した場合にモノマー濃度の著しい増大を示している。しかしながら、LC/MSによって測定されたモノマーの最も高い放出は、COP酸およびNVRオリゴマーからのモノマーの最大限の放出のためにヒドロラーゼの組み合わせを選択することの重要性を示唆している。図6、7、8、および9を参照されたい。ウマ肝臓由来のエステラーゼ（E9）は、NVRおよびCOP酸の両方からのモノマーの良好な放出を呈したが、プレートアッセイでは、間隙域の相対的大きさによって中程度の加水分解活性のみが示された。ゆえにこれは、NVRまたはCOP酸を処理するための、ムコール・ミエヘイ（E1）またはリゾプス・オリゼ（E12）と組み合わせて使用するための酵素の優れた選択であると考えられる。バークホルデリア・セパシア（L2）およびカンジダ・アンタークティカA（L5）由来のリパーゼは、COP酸中のオリゴマー酸からのモノマー酸の良好な放出を呈した。
【０２１３】
全体的には、NVRおよびCOP酸オリゴマーは、選択された遊離リパーゼおよびエステラーゼのいくつかによって良好な活性で加水分解されており、かつ酵素の大部分は広いpH範囲（pH5〜8）にわたって良好な活性を保持する。図4A〜Cおよび図5を参照されたい。
【０２１４】
カンジダ・アンタークティカA（IL4）、シュードモナス・フルオレッセンス（Il13）、およびリゾプス・オリゼ（IL 17）由来の固定化したリパーゼ（表2、図10）は、NVR中のオリゴマーエステルに対して、遊離リパーゼ（L5、L10）と同様の高いエキソ加水分解活性を呈した。
【０２１５】
指向進化によって獲得されかつY.リポリティカのリパーゼ欠損株において発現されたリパーゼ変種による、NVRおよびCOP酸中のオリゴマーの加水分解は、より高い活性を有する改善されたリパーゼ変種が指向進化によって獲得され得ること、および培地中にリパーゼを分泌する細胞がオリゴマーエステルを効率的に加水分解し得ることを示した。
【０２１６】
上記に記載されるように、滴下（drop）プレートを用いてオリゴマーエステルの加水分解を評価し、Lip2の変種を発現する酵母株（Bordes et al., 2011. Isolation of a thermostable variant of Lip2 lipase from Yarrowia lipolytica by directed evolution and deeper insight into the denaturation mechanisms. Journal of Biotechnology, 156: 117-124）をYNB培地中で一晩培養し、OD600 1.0に希釈し、5μlをアガロースプレート上に滴下した。YNBアガロースプレートは、グルコース（0.5％）の有無にかかわらず、オレイン酸（2％）、ポリカプロラクトントリオール（2％）（Sigma 200387）、50mMリン酸塩pH7.0を含有していた。プレートを28℃で72時間インキュベートし、細胞周囲の間隙域について分析した。欠失した主要な細胞外リパーゼおよび0.1Uのムコール・ミエヘイエステラーゼを有する宿主株を対照として用いた。LIP2変異体リパーゼのライブラリーのうちのいくつかの変種を発現している株は、細胞周囲の空白域によって評価されたように、オリゴマーエステルの有意な加水分解を呈した。図11を参照されたい。
【０２１７】
実施例2−NVR中の主要なC4およびC5成分を異化し得る宿主細胞の選択
C4およびC5一酸（酪酸および吉草酸）ならびにヒドロキシ酸を対応する二酸に変換することによって、またはβ酸化を介して増殖のために利用することによって、NVRからこれらを除去することは、NVRからC4-C6二酸混合物またはアジピン酸を産生するために重要である。NVRから二酸混合物を産生するために、ω酸化を介した一酸からの二酸の蓄積、および一酸よりも低い二酸の消費速度が望ましい。本実施例は、混合有機性廃棄流の主要なC4およびC5成分を異化し得る宿主細胞微生物の選択を実証する。
【０２１８】
ヤロウイア・リポリティカ株（全72種の株）の混合培養物をケモスタット培養のための開始培養物として用いて、酪酸および吉草酸を効率的に利用し得るそれらの能力について株を選択した。ケモスタット培養の間、炭素の唯一の供給源として一酸を供給することによってこれを行った。対応する二酸（コハク酸およびグルタル酸）のものと比較した一酸の消費速度を決定した。
【０２１９】
図12に示されるように、1Lの被覆されたガラス発酵槽を用いるケモスタット発酵を設定した。実験機構には、NVR中に普及しているC4およびC5炭素供給源を含有する栄養供給物、ならびに塩基供給物（12％（v/v）NH3（水溶液））を提供し、両方とも蠕動ポンプを介して濾過滅菌して発酵槽内に入れた。さらに、蠕動ポンプによって、発酵槽からのバイオマス収集を可能にした。
【０２２０】
ケモスタットの制御原理は、ポンプの可変速駆動による栄養供給物の手動の供給制御、塩基供給物によるpH制御、それぞれのフィードバックループを介した発酵槽の被覆への冷却水補給、一定のエアレーション、および撹拌速度による温度制御、ならびに収集ポンプを用いた収集パイプ深度によるレベル制御を必要とした。
【０２２１】
最小の初期充填培地を調製し（アミノ酸を含まない6.7g/L酵母窒素塩基、16.5g/LグルコースH2O、1mL/L消泡剤）、C4およびC5酸を含有する栄養供給物を調製した（A1：アミノ酸を含まない6.7g/L酵母塩基；10g/L吉草酸；0.4g/Lコハク酸；2.3g/L酪酸；0.8g/Lグルタル酸；および1mL/L消泡剤；A2：アミノ酸を含まない6.7g/L酵母塩基；30g/L吉草酸；1.2g/Lコハク酸；6.9g/L酪酸；2.3g/Lグルタル酸；および1mL/L消泡剤）。発酵槽に対する対照パラメーターを設定した（A1およびA2：1vvmエアレーション、pH7.0、pH7.0でかつ100％飽和状態まで1vvmでのDO校正、28℃、グルコース枯渇までの750rpmでの初期撹拌、グルコース枯渇後の最大rpmでの最終撹拌、手動消泡）。
【０２２２】
凍結保存ストックから一晩増殖させた各振とうフラスコから750μLを用いて、72種の野生型ヤロウイア・リポリティカ株の混合物由来の10［％］（v/v）接種材料を発酵槽に植菌した。定常状態に達するまで、グルコースに関してバッチ相で培養物を増殖させた。栄養供給を開始し、約20［％］の飽和溶存酸素（DO）濃度で約0.1［毎時］の希釈率にて定常状態に到達した（図13）。図14に示されるように、0.1［毎時］におけるこの定常状態に到達する前にpHのかく乱が発生し、図15に示されるように、pH逸脱ドリフト変化実験に取り組んだ。希釈率の各増大前にサンプルを採取して、有機酸を効率的に利用し得る株を選択した。
【０２２３】
結果：
ブチレートおよびバレレートを唯一の炭素供給源として効率的に利用し得る約13種のヤロウイア・リポリティカ株の混合培養物（コロニー形態の視覚的査定に基づく）が、元の72種の株から単離された。
【０２２４】
非競合的増殖率のために、ブチレートおよびバレレートを効率的に異化できない株を、ケモスタット発酵槽から洗い出した。表5は、酪酸、吉草酸、コハク酸、およびグルタル酸の瞬間消費速度を示している。
【０２２５】
（表５）
2014518070.tif 000008
【０２２６】
図14に示されるように、一定の酸素移動速度での酸素取り込み速度の指標としての溶存酸素（DO）濃度は、pHが7.0から8.0に増大するにつれて、約35％飽和状態から約70％飽和状態に急激に増大する。酸素消費が増殖率の指標であること、およびそれゆえのヤロウイア・リポリティカ等の偏性好気性菌における炭素供給源消費を考慮すると、唯一の炭素およびエネルギー供給源としてNVR炭素種を用いたpH＞8.0での培養は適していない。
【０２２７】
図15に示されるように、一定の酸素移動速度での酸素取り込み速度の指標としての溶存酸素（DO）濃度は、pHが7.0から5.0に減少するにつれて、約20％飽和状態から90％飽和状態に急激に増大する。酸素消費が増殖率の指標であること、およびそれゆえのヤロウイア・リポリティカ等の偏性好気性菌における炭素供給源消費を考慮すると、唯一の炭素およびエネルギー供給源としてNVR炭素種を用いたpH＜5.0での培養は適していない。
【０２２８】
2.0＜pH＜9.0というヤロウイア・リポリティカの広範な増殖pH範囲にもかかわらず（Gonzalez-Lopez, C.I. (2002), Genetic control of extracellular protease synthesis in the yeast Yarrowia lipolytica. Genetics, 160: 417-427）、NVR中の普及している炭素供給源に対する増殖率は、pH＞8.0およびpH＜5.0で有意に阻害される。
【０２２９】
C4およびC5一酸の消費は良好であり、一方で二酸はそれほど効率的に利用されず、ブロス中に蓄積した。ブロス成分のHPLC定量化によって、酪酸および吉草酸の一部は増殖に利用され、一方で残りは内在性のω酸化経路を介して二酸、コハク酸および酪酸に転換されたことが明確に示された。表5を参照されたい。したがって、ヤロウイア・リポリティカ等の宿主細胞微生物を用いて、混合有機性廃棄流のより好ましくない成分、例えばC4およびC5一酸を消費することができる。
【０２３０】
実施例3−ヤロウイア・リポリティカの炭素およびエネルギー供給源としてNVRを用いた、細胞保持を伴うケモスタット発酵
図16に示されるように、1Lの被覆されたガラス発酵槽および225［cm2］ポリエーテルスルホン0.2［μm］中空繊維膜を用いた、細胞保持を伴うケモスタット発酵を設定した。実験機構には、蠕動ポンプを介して発酵槽内に濾過滅菌されたNVR供給物、栄養供給物、および塩基供給物（12［％］（v/v）NH3（水溶液））を提供した。さらには、蠕動ポンプによって、中空繊維膜に必須のクロスフロー保持物流速が提供され、蠕動ポンプによって、透過物の離脱が可能となり、かつ蠕動ポンプによって、発酵槽からのバイオマス流出が可能となった。
【０２３１】
ケモスタットの制御原理には、NVR供給物 対 栄養供給物の速度の手動の供給率制御、塩基供給物によるpH制御、それぞれのフィードバックループを介した発酵槽の被覆への冷却水補給、一定のエアレーション、および撹拌速度による温度制御、保持物ポンプの可変速駆動による一定のクロスフロー速度、透過物ポンプによる手動のレベル制御、ならびに流出ポンプによる手動の希釈率制御が必要であった。
【０２３２】
最小の初期充填培地を調製し（アミノ酸＋(NH4)2SO4を含まない6.7g/L酵母塩基、15g/Lグルコース、75mg/Lクエン酸（Mr＝210g/モル）、5.8g/Lクエン酸ナトリウム（Mr＝294.1g/モル）、10.7g/L K2HPO4（Mr＝174g/モル）、5.2g/L KH2PO4（M＝136.1g/モル）、および2mL/L消泡剤）、栄養供給物を調製した（アミノ酸＋(NH4)2SO4を含まない6.7g/L酵母塩基、75mg/Lクエン酸（Mr＝210g/モル）、5.8g/Lクエン酸ナトリウム（Mr＝294.1g/モル）、10.7g/L K2HPO4（Mr＝174g/モル）、5.2g/L KH2PO4（M＝136.1g/モル）、および2mL/L消泡剤）。発酵槽に対する対照パラメーターを設定した（A1およびA2：1vvmエアレーション、pH7.0、pH7.0でかつ100％飽和状態まで1vvmでのDO校正、28℃、グルコース枯渇までの750rpmでの初期撹拌、グルコース枯渇後の1250rpmでの最終撹拌、手動消泡）。
【０２３３】
凍結保存ストックから一晩増殖させた野生型ヤロウイア・リポリティカの振とうフラスコからの10％（v/v）接種材料を発酵槽に植菌した。バッチの指数関数的増殖期が開始し、およそ8時間後にグルコース枯渇に至った。
【０２３４】
図17に示されるように、グルコース枯渇後、約215［mL/時間］の栄養供給物流速における有効2％（v/v）のNVR供給および約0.025［毎時］の有効バイオマス希釈率で、定常状態に到達した。
【０２３５】
HPLC保持時間によりNVR供給物および透過物サンプル中で同定されたNVR炭素種は、γ-ブチロラクトン、酪酸、コハク酸、δ-バレロラクトン、吉草酸、5-ヒドロキシ吉草酸、グルタル酸、カプロン酸、6-ヒドロキシカプロン酸、およびアジピン酸であった。
【０２３６】
表6は、野生型ヤロウイア・リポリティカによる正味の異化または生合成を有するNVR種を要約している。とくに、約215［mL/時間］の流速における2％（v/v）NVRおよび約0.025［毎時］の有効バイオマス希釈率を用いた、細胞保持を伴う定常状態ケモスタット培養の間、ヤロウイア・リポリティカによってC4、C5、およびC6一酸の異化が観察された。
【０２３７】
（表６）
2014518070.tif 000009
【０２３８】
表6から、コハク酸およびグルタル酸の正味の合成は定常状態に達したと見ることができ、野生型ヤロウイア・リポリティカ培養物によって、直鎖状C4-C6種の一部が対応するジカルボン酸に酸化されたことを示している。
【０２３９】
表6から、5-ヒドロキシ吉草酸および6-ヒドロキシカプロン酸の正味の合成は、β酸化経路飽和の指標である、ω酸化への炭素のオーバーフローを実証していると見ることもできる。したがって、C4-C6 NVR種の異化は、野生型ヤロウイア・リポリティカ培養物中で減衰する。
【０２４０】
さらに、表6は、直鎖状C4-C6モノカルボン酸；とりわけ酪酸、吉草酸、およびカプロン酸の一部が異化されたことを示している。したがって、野生型ヤロウイア・リポリティカ培養物によって、C4-C6 NVR種の一部が異化された。
【０２４１】
また表6において、C6成分であるカプロン酸およびアジピン酸の異化は、C5成分である吉草酸の異化のそれぞれ42％および18％で定常状態流束を有すると見ることもできる。吉草酸の異化の7％という、酪酸のより低い定常状態流束は、NVR供給物における低濃度を考慮すると、酪酸の炭素供給源を限定する条件の影響である。したがって、野生型ヤロウイア・リポリティカ培養物によって、カプロン酸およびアジピン酸は吉草酸よりも低い割合で異化された。
【０２４２】
最後に、表6は、カプロン酸の正味の異化、およびω酸化活性の指標である6-ヒドロキシカプロン酸の正味の合成が存在したことを示している。したがって、野生型ヤロウイア・リポリティカ培養物によって、カプロン酸の一部が6-ヒドロキシカプロン酸に酸化された。
【０２４３】
表7は、約215［mL/時間］の流速における2％（v/v）NVRおよび約0.025［毎時］の有効バイオマス希釈率を用いた、細胞保持を伴う定常状態ケモスタット培養の間の質量ベースでのアジペートおよびジカルボン酸の富化を示している。
【０２４４】
（表７）
2014518070.tif 000010
【０２４５】
表7から、同定されたNVR種ベースでのジカルボン酸の定常状態ブロス純度は、NVRにおけるジカルボン酸純度と比較して増大したと見ることができる。
【０２４６】
2％（v/v）の有効NVR供給濃度での定常状態における飽和溶存酸素（DO）濃度＜100［％］は、有効NVR供給濃度＞1％（v/v）に対する培養物の生存能力の維持を実証している。図17を参照されたい。約0.025［毎時］の有効バイオマス希釈率での定常状態の溶存酸素（DO）濃度＜100％は、有効NVR供給濃度＞1％（v/v）における測定可能な増殖率を実証している。
【０２４７】
本実施例は、NVR中で培養された野生型ヤロウイア・リポリティカが、直鎖状C4-C6種を対応するジカルボン酸に酸化し得、かつC4-C6 NVR種の異化を減衰させ得ることを実証している。さらに、カプロン酸およびアジピン酸が吉草酸よりも低い割合で異化されたように、野生型ヤロウイア・リポリティカ培養物は、NVR成分を選択的に異化することができる。加えて、カプロン酸の異化は、有用な中間体、例えば6-ヒドロキシカプロン酸の産生をもたらした。
【０２４８】
実施例4−NVR中の阻害性化合物としてのバレロラクトンの同定
13種のY.リポリティカ株を、酪酸および吉草酸を消費する能力について選択した。C供給源限定およびpHスタットを含む異なる条件において唯一のエネルギーおよび炭素供給源としての2.5％（v/v）NVRについて、ケモスタットで株を培養した。いずれの場合にも、培養物は定常状態に達せず、洗い出された。重金属を含む、NVR中に存在していることが知られるすべての成分を毒性について評価および試験したが、唯一の炭素供給源としてのNVRの供給の間に観察される重度の阻害効果を説明するものはない。ブロス中の成分のHPLC分析によって、未知の化合物がブロス中に蓄積し、全く消費されなかったことが示された。
【０２４９】
3％NVRを含有する寒天プレートでNVRにあらかじめ適合させたY.リポリティカ株を、0.1〜1g/Lの濃度でのブチロラクトン、バレロラクトン、およびカプロラクトンに曝露した場合、とくにC4およびC5酸での増殖についてケモスタット培養によって選択された株に対して、バレロラクトンが阻害的であることが見出された（図18）。細胞の流出を回避するために、細胞保持ケモスタットが必要とされた。1つのそのような細胞保持ケモスタットにおいて、2％（v/v）有効NVR供給で、バレロラクトンは、およそ1.7g/Lまでブロス中に蓄積し、該阻害調査から、これが増殖を完全に阻害していると考えられる（図19）。HPLC分析によって、NVRは高濃度（およそ92g/L）のバレロラクトンを含有することが確認された。
【０２５０】
本実施例は、NVR中に存在している重要な阻害性化合物としてバレロラクトンを同定した。バレロラクトンの存在は、NVR耐性宿主細胞の増殖を阻害することが確認された。
【０２５１】
実施例5−ラクトンヒドロラーゼはバレロラクトンを5-ヒドロキシ吉草酸に変換することによってNVRから除去する、および、NVR中のシクロヘキサノール／シクロヘキサノンのアジピン酸への変換
ラクトンの加水分解は、ヒドロキシカルボン酸のラクトンおよび酸の形態間の相互変換を仲介する1,4-ラクトナーゼクラスの酵素（EC 3.1.1.25）およびグルコノラクトナーゼ（EC 3.1.1.17）によって触媒される。唯一の炭素供給源としてのシクロヘキサノールまたはシクロヘキサノンで増殖し得る微生物細胞は、ε-カプロラクトンを介してシクロヘキサノンをアジピン酸に変換する。ε-カプロラクトンの6-ヒドロキシヘキサノエートへの加水分解は、ChnCによって触媒される（図20）。
【０２５２】
シクロヘキサノール分解経路を有するラクトナーゼ（ChnC）形成生物は、δ-バレロラクトンを5-ヒドロキシ吉草酸に変換し得ることが公知であり、これは、クローニングされかつω-酸化経路を有する宿主において分泌酵素として発現されることが可能である。これによって、Y.リポリティカ等の宿主は、δ-バレロラクトンを5-ヒドロキシ吉草酸に変換し、かつ形成された5-ヒドロキシ吉草酸をグルタル酸にその後変換することによってNVRを解毒することが可能となり得る。細胞外分泌の標的とされる異種性ヒドロラーゼをY.リポリティカにおいて発現させる一般的方法に関しては、実施例7を参照されたい。
【０２５３】
同様に、ChnB、ChnC、ChnD、およびChnEから構成される遺伝子クラスターをY.リポリティカまたは他の適切な宿主細胞において発現させて、NVR中に存在しているシクロヘキサノール／シクロヘキサノンをアジピン酸に変換することができる。シクロヘキサノンのアジピン酸への変換のための遺伝子クラスターの適切な供給源、またはδ-バレロラクトンを5-ヒドロキシ吉草酸に変換するChnCには、以下が含まれる。
【０２５４】
アシネトバクター・アセチルヒドロラーゼ（ChnC）（GenBankアクセッションAAG10029.1、SEQ ID NO：1）。唯一の炭素供給源としてシクロヘキサノールを利用するアシネトバクターSE19における遺伝子クラスターは、加水分解工程に関与するChnCを含む、13個のオープンリーディングフレームを含有する（図1、Cheng Q, Thomas SM, Kostichka K, Valentine JR, Nagarajan V (2000). Genetic analysis of a gene cluster for cyclohexanol oxidation in Acinetobacter sp. Strain SE19 by in vitro transposition. Journal of Bacteriology. 182: 4744-4751）。アシネトバクターにおける変異に際して、カプロラクトンの蓄積によって、chnCはカプロラクトンヒドロラーゼをコードすることが実証された。Onakunleら（1997）は、このラクトナーゼが、δ-ラクトンに対するいくらかの活性とともに、ε-カプロラクトンに対する強力な特異性を有するとして報告した。（Onakunle OA, Knowles CJ, Bunch AW. (1997). The formation and substrate specificity of bacterial lactonases capable of enantioselective resolution of racemic lactones. Enzyme and Microbial Technology. 21: 245-251）。
【０２５５】
ブレビバクテリウム・エピデルミディス（Brevibacterium epidermidis）HCUラクトノヒドロラーゼ（ChnC2）（GenBankアクセッションAAK73167.2、SEQ ID NO：2）。ブレビバクテリウム・エピデルミディスHCUは、シクロヘキサノールで増殖することができ、2種の異なるε-カプロラクトンヒドロラーゼを含有すると提唱されている（Brzostowicz PC, Blasko MS, Rouviere PE (2002). Identification of two gene clusters involved in cyclohexanone oxidation in Brevibacteriumepidermidis strain HCU. Applied and Microbiological Biotechnology. 58:781-789）。これらは互いに対する同一性を21％しか有さず、クラスター1遺伝子は、ロドコッカスのカプロラクトナーゼ（下記）に最も密接に関係している。クラスター2由来の遺伝子は、コマモナス（Comomonas）種NCIMB 9872由来のものを含む、δ-バレロラクトナーゼと最も近い相同性を有し、このラクトンヒドロラーゼは、その唯一の炭素供給源として0.1％シクロペンタノールで増殖し得る細菌から単離されており（Ishikawa T, Nishikawa H, Gao Y, Sawa Y, Shibata H, Yabuta Y, Maruta T, Shigeoka S (2008). The pathway via D-galacturonate/L-galactonate is significant for ascorbate biosynthesis in Euglena gracilis: identification and functional characterization of aldonolactonase. Journal of Biologiocal Chemistry. 283:31133-31141）、かつOnakunleらによって報告されているように（Onakunle OA, Knowles CJ, Bunch AW (1997) The formation and substrate specificity of bacterial lactonases capable of enantioselective resolution of racemic lactones. Enzyme and Microbial Technology. 21: 245-251）、δ-バレロラクトンに対する強力な選好性を有する（ε-カプロラクトンに対するよりも10倍を上回る）。クラスター1由来の遺伝子は、カプロラクトンヒドロラーゼにより近い。
【０２５６】
ロドコッカス種Phi2カプロラクトンヒドロラーゼ（ChnC）（GenBankアクセッションAAN37290.1、SEQ ID NO：3）。Brzostowiczら（2003）は、廃水バイオリアクター内のシクロヘキサノンに関して、増殖のために富化された微生物群落からロドコッカス種Phi2における部分的遺伝子クラスターを同定した（Brzostowicz PC, Walters DM, Thomas SM, Nagarajan V, Rouviere PE (2003) mRNA differential display in a microbial enrichment culture: simultaneous identification of three cyclohexanonemonooxygenases from three species. Applied and Environmental Microbiology. 69: 334-342）。該クラスターは、シクロヘキサノンのアジピン酸への酸化に必要とされる4つの遺伝子を含有し、カプロラクトンヒドロラーゼは、これも同じ調査で同定されたアルスロバクター種BO2における同等のタンパク質に密接に関係している。Bennettらは、シクロヘキサノールの存在下で誘導されたノカルディア・グロベルラ（Nocardia globerula）CL1からカプロラクトンヒドロラーゼを精製した。（Bennett AP, Strang EJ, Trudgill PW, Wong VK (1988). Purification and properties of ε-caprolactone hydrolases from Acinetobacter NCIB 9871 and Nocardiaglobevula CL1. Journal of General Microbiology. 134: 161-168）。このタンパク質は、ε-カプロラクトンおよびδ-バレロラクトンに対して最大の活性（ε-カプロラクトンに関するものと比較して40％の活性）を呈した。ノカルディア・グロベルラおよびロドコッカスは、両方ともノカルディア科（Nocardiaceae）ファミリーにある。
【０２５７】
ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）ラクトナーゼ（GNL）（GenBankアクセッションBAF94304.1、SEQ ID NO：4）。Ishikawaら（2008）は、グルコノ-δ-ラクトン、ガラクトノ-γ-ラクトン、およびグルコノ-γ-ラクトンを加水分解する、光合成藻類ユーグレナ・グラシリスから精製されたアルドノラクトナーゼの活性を報告している。
【０２５８】
LIP2遺伝子は、Y.リポリティカの主要な細胞外リパーゼ活性をコードし（Pignede G, Wang H, Fudalej F, Gaillardin C, Seman M, Nicaud JM (2000). Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica. Journal of Bacteriology. 182: 2802-2810）、そのcDNA配列は、13アミノ酸のシグナル配列、ジアミノペプチダーゼの基質である、一続きの4個のジペプチド（X-AlaまたはX-Pro）、およびXprエンドプロテアーゼに対する基質であるKR（Lys-Arg）部位を含有する12アミノ酸のプロ領域を含有するプレプロ酵素をコードする（Fickers P, Marty A, Nicaud JM (2011). The lipases from Yarrowia lipolytica: Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological applications. Biotechnology Advances 29: 632-644）。増殖の早期段階において、細胞外リパーゼは、増殖期の最後に培養ブロス中に放出される前に主に細胞壁に結合している（Fickers P, Nicaud JM, Gaillardin C, Destain J, Thonart P (2004). Carbon and nitrogen sources modulate lipase production in the yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Applied Microbiology 96:742-9）。その結果として、LIP2のシグナル配列は、分泌を可能にする他のタンパク質との融合に適している。
【０２５９】
ラクトナーゼはδ-バレロラクトンを5-ヒドロキシ吉草酸に変換するという当技術分野における報告に基づき、ラクトナーゼをクローニングして、5-ヒドロキシ吉草酸への変換によるNVRからのバレロラクトンの除去を仲介するω酸化経路も含有する宿主細胞において分泌酵素として発現させることができる。加えて、微生物遺伝子、例えばChnB、ChnC、ChnD、およびChnEは、唯一の炭素供給源としてのシクロヘキサノールまたはシクロヘキサノンの利用に関与しているという文献における報告に基づき、これらの遺伝子をクローニングして、別の宿主細胞、例えばY.リポリティカにおいて発現させ、ε-カプロラクトンを介してシクロヘキサノンをアジピン酸に変換することができる。
【０２６０】
したがって、ラクトナーゼ、例えばChnCをY.リポリティカ等の宿主細胞において発現させて、δ-バレロラクトンを、後にω酸化経路を介してグルタル酸に変換され得る5-ヒドロキシ吉草酸に変換することによって、NVRから増殖阻害成分を除去できる。そのような様式で、宿主細胞は、廃棄流が微生物の増殖に適するように、混合有機性廃棄流の特性を改変し得る。
【０２６１】
実施例6−Y.リポリティカによるカプロン酸およびヒドロキシカプロン酸のアジピン酸への変換、およびアシル-CoAオキシダーゼをコードする破壊されたPOX遺伝子を有する株におけるアジピン酸の蓄積
ヤロウイア・リポリティカの野生型（W29またはPo1d（Mata ura3-302-270、xpr2-322、Ura−、Leu−））および種々のPOX遺伝子欠失を有する変異体株（下記の表）をYPD（3ml）中で16時間前培養し、0.05の最終OD600まで、10％産生培地（Y1T2D1O2、pH6.8−一般的方法を参照されたい）を含有する振とうフラスコに植菌するために用いた。
【０２６２】
（表８）本調査に用いた酵母株
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【０２６３】
株を48時間培養し、遠心分離によって収集し、リン酸塩バッファー（50mM、グルコース（10mM）、グルコース-6-ホスフェート（6.7mM）、0.4U Glc6Pデヒドロゲナーゼ、およびNADPH（5mM）を含有、pH7.0）中で再懸濁して200mg/mlとした。反応をNVR（4％）の添加によって開始させ、24時間後に100μl 6M H2SO4の添加によって停止させ、上清をLC-MSによって分析した。
【０２６４】
結果によって、6-ヒドロキシカプロン酸およびアジピン酸は、β酸化が損なわれた株（POX変異体）の反応上清中に蓄積し、一方で親株および野生型株において蓄積は観察されないことが明確に示されている。図1に描写されかつ図21および22に説明されるように、POX遺伝子のこのような欠失は、β酸化を通じたNVR中のアジピン酸および6-ヒドロキシカプロン酸の両方の分解を阻止する。このように、β酸化を通じたNVR中のC6成分の異化に必要なPOX遺伝子を同定すること、および宿主株における該POX遺伝子を欠失させることによって、親株および野生型株による6-ヒドロキシカプロン酸およびアジピン酸の異化を阻止することができる。ヤロウイア・リポリティカにおいて、POX3は、C6成分に対して最大の効果を有する。
【０２６５】
実施例7−Y.リポリティカにおける細胞外分泌の標的とされる遺伝子のクローニングおよび酵素の発現のための一般的方法
LIP2遺伝子は、Y.リポリティカの主要な細胞外リパーゼ活性をコードし（Pignede G, Wang H, Fudalej F, Gaillardin C, Seman M, Nicaud JM (2000). Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica. Journal of Bacteriology. 182: 2802-2810）、そのcDNA配列は、13アミノ酸のシグナル配列、ジアミノペプチダーゼの基質である一続きの4個のジペプチド（X-AlaまたはX-Pro）、およびXprエンドプロテアーゼに対する基質であるKR（Lys-Arg）部位を含有する12アミノ酸のプロ領域を含有する、プレプロ酵素をコードする（Fickers P, Marty A, Nicaud JM (2011). The lipases from Yarrowia lipolytica: Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological applications. Biotechnology Advances 29: 632-644）。増殖の早期段階において、細胞外リパーゼは、増殖期の最後に培養ブロス中に放出される前に主に細胞壁に結合している（Fickers P, Nicaud JM, Gaillardin C, Destain J, Thonart P (2004). Carbon and nitrogen sources modulate lipase production in the yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Applied Microbiology 96:742-9）。その結果として、LIP2のシグナル配列は、分泌を可能にする他のタンパク質との融合に適している。
【０２６６】
Sambrookら（Molecular Cloning - a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に従って、標準的分子技術を適用した。まず、発現宿主ヤロウイア・リポリティカにおけるコドン使用の頻度に従って、それぞれのヒドロラーゼ（エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ラクトナーゼ）をコードする標的DNA配列をコドン最適化した。その後、効率的なタンパク質の発現、分泌、およびプロセシングのために、コドン最適化されたヒドロラーゼ遺伝子配列を、5'アーム側においてそれらの元のシグナルペプチド配列をヤロウイア・リポリティカ・リパーゼ2（Lip2）のプレプロDNA配列と融合させる／置換するように設計した。翻訳開始部位におけるコンセンサス配列（CACA）とBamHI部位、ならびにAvrII部位および2個の終止コドンも、それぞれ5'アーム側および3'アーム側の両方において設計して、酵母発現ベクター内への標的遺伝子のクローニングを容易にした（Gasmi et al, (2011) Appl Microbiol Biotechnol 89:109-119）。すべてのヒドロラーゼ遺伝子を合成し、Eurofins MWG operon（Germany）によるpEX-Aベクター内に最終的にクローニングした（pEX-A_ヒドロラーゼ）。
【０２６７】
BamHI/AvrII制限酵素を用いて、プレプロLip2_ヒドロラーゼ（エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、またはラクトナーゼ）を保持するフラグメントをpEX-A_ヒドロラーゼプラスミドから取り出し、精製し、かつ強力な誘導性Poxプロモーター、Lip2遺伝子ターミネーター、Ura3選択可能マーカー、ならびにランダムな染色体への組み込みのためのZetaドッキング配列を含有するヤロウイア・リポリティカ発現ベクターJMP62 URAex（JME 803）内にサブクローニングした（JMP62-ヒドロラーゼ発現ベクターおよびヒドロラーゼ発現カセットの図式的プラスミドマップについては図3を参照されたい）。
【０２６８】
標的ヒドロラーゼを有する発現ベクターを制限酵素NotIで消化し、電気泳動に供した。発現カセットをゲルから抽出し、ヤロウイア・リポリティカの形質転換に用いた。
【０２６９】
Le Dallら、1994（Multiple-copy integration in the yeast Yarrowia lipolytica. Current Genetics 26:38-44）によって記載されている酢酸リチウム法を用いて、ヤロウイア・リポリティカのリパーゼ欠損株JMY1212（MATA ura3-302 leu2-270-LEU2-zeta xpr2-322 Δlip2Δlip7Δlip8、Leu＋、Ura−）を形質転換した。YNB培地プレート上でUra＋に関して選択すると、ヤロウイア・リポリティカ形質転換体が得られた。それぞれのヒドロラーゼを有する各形質転換株から、独立したコロニーを選択した。
【０２７０】
誘導性発現のために、富栄養培地YPD（10g/l酵母エキス、10g/l bactopeptone、10g/lグルコース）中、またはY1T2D1O2培地（1％酵母エキス、2％トリプトン、1％グルコース、2％オレイン酸、および50mMリン酸ナトリウムバッファー、pH6.8）中で酵母株を増殖させた。（Pignede et al., 2000 Appl. Environ. Microbiol 66:3283-3289）によって記載されている改変法を用いて、タンパク質発現およびオリゴマーエステルに対する酵素的加水分解活性を決定した。
【０２７１】
したがって、これらの標準的クローニング技術を用いることによって、ヤロウイア・リポリティカを改変して、混合有機性廃棄流のオリゴマーエステル成分をモノマーに異化し、かつモノマー成分を望ましい化合物にさらに酵素的に加工する酵素を発現および分泌させることができる。
【０２７２】
実施例8−NVR中の成分のα,ω-二官能性C6アルカンへの変換
図2は、6-ヒドロキシカプロン酸の1,6-ヘキサンジオールへの、アジピン酸の6-オキソヘキサン酸への、および6-オキソヘキサン酸の6-アミノカプロン酸への酵素的変換を示している。6-アミノカプロン酸は次に、ヘキサメチレンジアミンまたはカプロラクタムに変換することができる。
【０２７３】
β-アラニン-アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.19）によって触媒される6-オキソヘキサン酸の6-アミノカプロン酸への変換（図2中の反応1）は、Enzymatic studies on the metabolism of beta-alanine（Hayaishi et al., 1961 J. Biol. Chem. 236, p.781-790)で立証されており、1-アミノトランスフェラーゼのさらなる例は、WO2009/113855（The preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formyl valeric acid）およびWO2011-031147（Preparation of a compound comprising an amine group from an alpha-keto acid）に開示されている。アジピン酸の6-オキソヘキサン酸への変換（図2中の反応2）を触媒するのに適している酵素には、カルボキシレートレダクターゼ（EC 1.2.99.6）またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.3およびEC 1.2.1.31）が含まれる。6-オキソヘキサン酸の6-ヒドロキシヘキサン酸への変換を触媒するのに適している酵素には、6-ヒドロキシヘキサノエートデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.258）が含まれる。6-ヒドロキシヘキサン酸の1,6-ヘキサンジオールへの変換（図2中の反応4）を触媒するのに適している酵素には、二機能性アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.10）が含まれ、一方で6-アミノヘキサン酸のカプロラクタムへの変換（図2中の反応5）を触媒するのに適している酵素には、EC 3.5.2.11等のアミドヒドロラーゼ（EC 3.5.2.-）が含まれる。図2中の変換2、3、4、および5を触媒するのに適した予測される酵素は、（WO2009/151728：Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds、WO2010/068944：Biological synthesis of difunctional alkanes from carbohydrate feedstocks）に開示されている。
【０２７４】
特許、公開された特許出願、および特許以外の文献を含むがそれらに限定されない、本明細書において引用されるすべての資料は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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