(57)【要約】本発明は、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるＩＧＦＢＰ−３のポリペプチド誘導体を提供する。これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、種々の治療的および診断的適用において有用である。また、このようなＩＧＦＢＰ−３誘導体を含む薬学的組成物およびキット、並びに、種々の疾患の処置のためのこれらの誘導体の使用法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含むＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体であって、
Ｎ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列を含み；
中間ドメインは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーを含み；そして
Ｃ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列を含む、
前記ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項２】
ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の中間ドメインが、野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の一部が、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーによって置換されている、請求項１記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項３】
ＩＧＦＢＰ−３が、ヒトＩＧＦＢＰ−３であり、そして
野生型ＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインのアミノ酸配列が配列番号１に示された通りであり；
野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列が配列番号２に示された通りであり；そして
野生型ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのアミノ酸配列が配列番号３に示された通りである、請求項１または請求項２記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項４】
リンカーが、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のある配列番号４に示された配列またはその任意の変異体を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項５】
配列番号３におけるアミノ酸残基４３〜４７が、ＡＬＳ（酸不安定サブユニット、Acid Labile Subunit）に結合しないＡＧＧＳＧ（配列番号５）またはその任意の変異体で置換されている、請求項４または請求項５記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項６】
ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に対して融合した、免疫グロブリンＩｇＧ１Ｆｃフラグメントをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項７】
ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列をさらに含み、ＩＧＦ−ＩがＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と複合体を形成している、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項８】
ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体のＣ末端ドメインの末端に共有結合したＢｉｒＡ酵素基質をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項９】
ＢｉｒＡ酵素基質が配列番号６に示された配列を有する、請求項８記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項１０】
ＢｉｒＡ酵素基質に共有結合したビオチンをさらに含む、請求項８または請求項９記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項１１】
ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に対して融合した、ＳｅＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項１２】
癌および増殖網膜症から選択された疾患の処置において使用するための請求項１〜６および８〜９のいずれか１項記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項１３】
成長ホルモン抵抗性、ＩＧＦ−Ｉ欠乏症、重度の熱傷、ＨＩＶ消耗、嚢胞性線維症、セリアック病、神経性食欲不振症、筋肉消耗疾病、筋緊張性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、重度のインスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、脳虚血、心虚血、および移植からなる群より選択された疾患の処置において使用するための請求項７記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体。
【請求項１４】
治療有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載の少なくとも１つのＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するための方法であって、前記方法は、
生物学的試料を、請求項１１記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と接触させて、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と、生物学的試料中に存在するあらゆるｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩとの間の複合体の形成を可能とさせる工程、ここで、ｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＩの部分的にプロセシングされた形態である；および
複合体におけるＳｅＡＰのアルカリ活性を測定することによって、生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩの濃度を決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１６】
請求項１１記載のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体およびアルカリ活性を測定するための少なくとも１つの試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年２月２４日に提出された欧州特許出願第ＥＰ１１３０５１９７．３号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
ＩＧＦ（インスリン様成長因子）系は、細胞がその生理学的環境と情報交換するために使用する、十分に特徴付けられたポリペプチドのセットからなる。この系は、２つの細胞表面レセプター（ＩＧＦ１ＲおよびＩＧＦ２Ｒ）、２つのペプチド性リガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質ファミリー（ＩＧＦＢＰ−１〜６）、並びに関連したＩＧＦＢＰ分解酵素（まとめてプロテアーゼと呼ばれる）を含む。ＩＧＦシグナル伝達経路は、哺乳動物の身長の増加に主要な役割を果たしているだけでなく、細胞の増殖および生存にも関与している。成長ホルモン（ＧＨ）は多くの組織においてＩＧＦ−Ｉ産生の主要なレギュレーターであるが、ＩＧＦは、ほぼ遍在的に産生され、そして血清中においてＩＧＦＢＰとほぼ結合して高い濃度で循環している。ＩＧＦが、そのチロシンキナーゼ細胞表面レセプターであるＩＧＦ１Ｒとの会合を通してその効果を発揮するためには、それらはまず、ＩＧＦＢＰと形成された複合体から解離しなければならず、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対するＩＧＦＢＰの親和性は、時にＩＧＦ１Ｒよりも高い。従って、レセプター−リガンド相互作用は、「遊離」ＩＧＦレベルに高度に依存し、前記レベルは、血清および他の生物学的液体中に存在するＩＧＦＢＰによって堅固に調節されている。それ故、ＩＧＦとＩＧＦＢＰの相互作用は、制御されない細胞増殖または低血糖などの望ましくないＩＧＦ作用を防ぐことができる。逆に、ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ複合体の破壊は、ＩＧＦレセプターを通してＩＧＦがその分裂促進作用および代謝作用を発揮するためのほぼ確実な必要条件である。
【０００３】
調節不全のＩＧＦシグナル伝達経路は、数多くの悪性腫瘍の発病、並びに、化学療法剤へのその耐性における主要なプレーヤーとして出現した（Samani et al., Endocr. Rev., 2006, 24: 24）。この経路において増加した活性は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の活性化を介して細胞の増殖を促進し、そしてＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路の活性化を通してアポトーシス促進性のシグナルに対抗する。これらの理由のために、ＩＧＦの活性を減少させるためにＩＧＦシグナル伝達経路をターゲティングすることは、現代の医学研究の大きな挑戦となっている（YuenおよびMacaulay, Expert. Opin. Ther. Targets, 2008, 12: 589-603）。
【０００４】
さらに、特定の組織へのＩＧＦの供給を改変することは、ＩＧＦ欠乏症に因る低身長症、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、しかしまた変性疾病、例えば筋緊張性ジストロフィー（Heatwole et al., Arch. Neurol., 2011, 68: 37-44）、筋萎縮性側索硬化症神経変性（Goberdhan et al., Differentiation, 2003, 71: 375-397）および血管増殖網膜症、例えば糖尿病合併症、未熟および加齢およびさらには動脈硬化症を含む、多種多様なヒト疾病の経過を制御することを助け得る。さらに、生物学的に利用可能なＩＧＦの急性増加は、火傷、脳虚血または心虚血、消耗症候群および骨密度の減少を患う患者に有益であり得る（Clemmons, Nat. Rev. Drug Discov., 2007, 6: 821-833）。
【０００５】
血中のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの濃度は、少なくとも部分的には、ＩＧＦＢＰのレベルによって間接的に決定される。インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）は、血中において最も豊富なＩＧＦＢＰであり、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して最も高い親和性を有し、そしてそれ故、血流における主要なＩＧＦの貯蔵庫である（JonesおよびClemmons, Endocr. Rev., 1995, 16: 3-34）。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦの捕捉および輸送におけるその役割に加えて、それ自体の生物学的作用を有し得る。その５つのＩＧＦＢＰ同属種と同じように、ＩＧＦＢＰ−３は、ほぼ同じサイズの３つのドメインからなり、その中でＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインのみがＩＧＦ結合に関与している（Sitar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103: 13028-13033）。ゆるく構築された中間ドメインは、その機能のいくつかに極めて重要なタンパク質分解的開裂のターゲットである（Fowlkes et al., Endocrinology, 2004, 145: 620-626）。ＩＧＦＢＰ分解プロテアーゼは、ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体からのＩＧＦの遊離を誘導し、これによりＩＧＦが生物学的作用のために利用可能となる。さらに、特定の遊離ＩＧＦＢＰはまた、プロテアーゼによっても作用を受け得、これにより、ＩＧＦに対する親和性が低下する。
【０００６】
ＩＧＦシグナル伝達経路をターゲティングするためにいくつかのアプローチが使用されており、これには、（１）リガンド特異的抗体（Goya et al., Cancer Res., 2004, 64: 6252-6258）または成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト（Divisova et al., Breast Cancer Res. Treat., 2006, 98: 315-327）を使用したＩＧＦ−１のレベルまたは生物活性の低減、および（２）（ａ）Pfizer (CP-751871 - Lacy et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3196-3203; Haluska et al., Clin. Cancer Res., 2007, 13: 5834-5840; De Bono et al., Clin. Cancer Res., 2007, 13: 3611-3616)、Amgen (AMG479 - Tolcher et al., J. Clin. Oncol., 2007, 25: 3002; Sarantopoulos et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3583))、Sanofi-Aventis (AVE1642 - Tolcher et al., J. Clin. Oncol., 2008, 25: 3582)、Imclone (A12 - Higano et al., J. Clin. Oncol., 2007, 25: 3505)、Merck (MK0646 - Hidalgo et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3520; Atzori et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3519)およびRoche (R1507 - Rodon et al., J. Clin. Oncol., 2007, 26: 3590)によって開発された抗ＩＧＦ１Ｒ抗体などのレセプター特異的抗体、または（ｂ）小分子チロシンキナーゼ阻害剤（Haluska et al., Cancer Res., 2006, 66: 362-371; Ji et al., Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 2158-2167; Zimmermann et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18: 4075-4080; Mulvihill et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 16: 1359-1375; Hofmann et al., Drug Discov. Today, 2005, 10:1041-1047; Vasilcanu et al., Oncogene, 2008, 27: 1629-1638）を使用したＩＧＦレセプター機能の阻害が含まれる。
【０００７】
組換えＩＧＦ−Ｉ（メカセルミンと呼ばれる、商品名：Tercica, Inc.によるIncrelex（商標））の投与は、適応された場合、低血糖などの望ましくない副作用、遊離ＩＧＦ−Ｉの短い半減期および同時に内因性ＩＧＦＢＰに因る低下した効力により妨害される。組換えヒトＩＧＦ−１（ｒｈＩＧＦ−１）のこれらの副作用を減少させつつ半減期を増加させる試みにおいて、等モル量のｒｈＩＧＦ−１および組換えヒトＩＧＦＢＰ−３（ｒｈＩＧＦＢＰ−３）（メカセルミンリンファベート（rinfabate）、商品名：Insmed Corp.によるSomatoKine（商標）またはIplex（商標））からなる複合体の投与からなるアプローチが開発された。ｒｈＩＧＦ−１／ｒｈＩＧＦＢＰ−３複合体の効力は、重度のインスリン抵抗性（Regan et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., May 2010, 95: 2113-2122）、成長ホルモン非感受性症候群（Kemp et al., Endocr. & Metabol., 2006, 15: 409-415; Tonella et al., Horm. Res. Paediatr., Feb. 2010, 73: 140-147）、１型糖尿病（Clemmons et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 2000, 85: 1518-1524）、２型糖尿病（Clemmons et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 2005, 90: 6561-6568）、骨粗鬆症（Boonen et al., Endocrinol. Metab., 2002, 87: 1593-1599）、火傷（Jeschke et al., Mol. Med., 2002, 8: 238-246）、１型筋緊張性ジストロフィー（Heatwole et al., Arch. Neurol., Sept. 2010）を有する被験体、並びに低出生体重児（Iniguez et al., Clin. Endocrinol., 2006, 65: 687-392）において試験された。
【０００８】
これらの研究は、それらが治療目的のためにＩＧＦ−Ｉを送達するというこのアプローチの有用性を実証することを促す。
【０００９】
発明の要約
本発明は、種々の治療的および／または診断的適用において有用であるＩＧＦＢＰ−３の誘導体に関する。
【００１０】
特に、１つの局面において、本発明は、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であり、そして野生型ＩＧＦＢＰ−３の対応する結合親和性と同一または実質的に類似したＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳ（酸不安定サブユニット、Acid Labile Subunit）に対する結合親和性を示す、ＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。
【００１１】
より特定すると、本発明は、Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含むＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体を提供し、（ｉ）Ｎ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）中間ドメインは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーを含み；そして（ｉｉｉ）Ｃ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列を含む。
【００１２】
特定の態様において、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の中間ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなり、前記アミノ酸配列の一部は、タンパク質分解ドメインに対して抵抗性のあるリンカーで置換されている。
【００１３】
特定の態様において、ＩＧＦＢＰ−３は、ヒトＩＧＦＢＰ−３であり、そして（ｉ）野生型ＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインのアミノ酸配列は配列番号１に示された通りであり；（ｉｉ）野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列は配列番号２に示された通りであり；そして（ｉｉｉ）野生型ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのアミノ酸配列は配列番号３に示された通りである。
【００１４】
特定の態様において、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のある配列番号４に示された配列またはその任意の変異体を有する。
【００１５】
関連した局面において、本発明は、野生型ＩＧＦＢＰ−３のそれぞれの結合親和性と同一または実質的に類似したＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびヘパリンに対する結合親和性を示すが、ＡＬＳには結合しない、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。より特定すると、このようなＩＧＦＢＰ−３誘導体は、配列番号３におけるアミノ酸残基４３〜４７が、ＡＬＳに結合しないＡＧＧＳＧ（配列番号５）またはその任意の変異体で置換されている以外は、本明細書において定義した通りである。
【００１６】
別の関連した局面において、本発明は、ＩＧＦに対する増加した親和性および延長された血漿中半減期を有する、ＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。より特定すると、このようなＩＧＦＢＰ−３誘導体は、本明細書において定義した通りであり、そしてさらに、それに対して融合した、免疫グロブリンＩｇＧ１Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の関連した局面において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列をさらに含むＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。より特定すると、このようなＩＧＦＢＰ−３誘導体において、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と複合体を形成している。特定の好ましい態様において、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列は、ヒトＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列である。
【００１８】
さらに別の関連した局面において、本発明は、ＢｉｒＡ酵素によるビオチニル化を受け入れられるＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。より特定すると、このようなＩＧＦＢＰ−３誘導体は、本明細書において定義した通りであり、そしてさらに、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体のＣ末端ドメインの末端に共有結合したＢｉｒＡ酵素基質を含む。特定の態様において、ＢｉｒＡ酵素基質は、配列番号６に示された配列を有する。特定の態様において、ＩＧＦＢＰ−３誘導体はさらに、ＢｉｒＡ酵素基質に共有結合したビオチンを含む。
【００１９】
さらに別の関連した局面において、本発明は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方に対して高い親和性を付与された安定なレポータータンパク質であるＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。より特定すると、このようなＩＧＦＢＰ−３誘導体は、本明細書において定義した通りであり、そしてさらに、それに対して融合した、ＳｅＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、種々の治療処置において有用であり得る。従って、特定の態様において、本明細書に記載されたＩＧＦＢＰ−３誘導体（ＩＧＦ−１のアミノ酸配列と会合したものを除く）は、癌および血管増殖網膜症から選択された疾患の処置における使用のために提供される。他の態様において、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列と会合したＩＧＦＢＰ−３誘導体は、成長ホルモン抵抗性、ＩＧＦ−Ｉ欠乏症、重度の火傷、ＨＩＶ消耗、嚢胞性線維症、セリアック病、神経性食欲不振症、筋肉消耗疾病、筋緊張性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、重度のインスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、脳虚血、心虚血、および移植からなる群より選択された疾患の処置において使用するために提供される。
【００２１】
関連した局面において、本発明は、被験体における疾患の処置法を提供し、前記方法は、有効量の本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体を被験体に投与する工程を含む。被験体への本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体の投与は、例えば、非経口、エアゾール、経口、眼内および局所経路を含む、任意の適切な経路により得る。本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体は、単独で、または任意の追加の治療剤または手順と組み合わせて投与され得る。特定の態様において、処置しようとする疾患は、癌および増殖網膜症からなる群より選択される。他の態様において、処置しようとする疾患は、成長ホルモン抵抗性、ＩＧＦ−Ｉ欠乏症、重度の火傷、ＨＩＶ消耗、嚢胞性線維症、セリアック病、神経性食欲不振症、筋肉消耗疾病、筋緊張性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、重度のインスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、脳虚血、神経変性状態（例えばアルツハイマー病）、心虚血、未熟児網膜症、および移植からなる群より選択される。
【００２２】
本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体は、それ自体または薬学的組成物として投与され得る。従って、別の局面において、本発明は、癌および増殖網膜症からなる群より選択された疾患の処置のための、または成長ホルモン抵抗性、ＩＧＦ−Ｉ欠乏症、重度の火傷、ＨＩＶ消耗、嚢胞性線維症、セリアック病、神経性食欲不振症、筋肉消耗疾病、筋緊張性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、重度のインスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、脳虚血、心虚血および移植からなる群より選択された疾患の処置のための、医薬品、薬学的組成物または薬学的キットの製造のための本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体の使用を提供する。
【００２３】
関連した局面において、本発明は、有効量の本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体および少なくとも１つの生理学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。特定の態様において、薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤と組み合わせての投与に適応される。他の態様において、薬学的組成物はさらに、少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【００２４】
別の局面において、本発明は、生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するための方法を提供し、前記方法は、
生物学的試料を、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に対して融合したＳｅＡＰのアミノ酸配列を含むＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と接触させ、これにより、ＩＧＦＢＰ−３誘導体と、生物学的試料中に存在するあらゆるｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩとの間の複合体の形成を可能とさせる工程、ここで、ｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＩの部分的にプロセシングされた形態である；および
複合体中のＳｅＡＰのアルカリ活性を測定することによって、生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩの濃度を決定する工程
を含む。
【００２５】
関連した局面において、本発明は、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に対して融合したＳｅＡＰのアミノ酸配列を含むＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体およびアルカリ活性を測定するための少なくとも１つの試薬を含むキットを提供する。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下の好ましい態様の詳細な説明を読んだ当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、部位特異的突然変異誘発によってＨ６−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３をコードする突然変異プラスミド（ｐＤＢ３ｓ−Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３）（下のパネル）を生成するための鋳型としてその後に使用されたｐＤＢ３ｓ−Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３プラスミド（上のパネル）の制限酵素地図を示す。前者のプラスミドは、図２に輪郭を描いたミニ−ＩＧＦＢＰ−３タンパク質をコードする。
【図２Ａ】図２（Ａ）は、野生型（Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３）および突然変異組換えＩＧＦＢＰ−３（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３）の図解である。図２（Ｂ）は、Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３ムテインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。Ｎ末端ドメインは青で、中間ドメインは灰色で、そしてＣ末端ドメインはオレンジ色で提示されている。ヘキサヒスチジン精製配列は緑色で提示され、そして可能性あるＮ−グリコシル化部位は旗印によって表されている。
【図２Ｂ】図２（Ａ）は、野生型（Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３）および突然変異組換えＩＧＦＢＰ−３（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３）の図解である。図２（Ｂ）は、Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３ムテインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。Ｎ末端ドメインは青で、中間ドメインは灰色で、そしてＣ末端ドメインはオレンジ色で提示されている。ヘキサヒスチジン精製配列は緑色で提示され、そして可能性あるＮ−グリコシル化部位は旗印によって表されている。
【図３】図３は、表面プラスモン共鳴によって分析されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−ＩＩ複合体の会合および解離の動態を示したグラフである（実験の詳細については実施例２参照）。
【図４】図４は、トロンビンによるタンパク質分解に対する野生型ＩＧＦＢＰ−３（左）およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３（右）の感受性を示したゲルを示す（実験の詳細については実施例２参照）。
【図５】図５は、部位特異的突然変異誘発によって得られたｐＲＨ−３ｓ−ａｖｉｔａｇ導入ベクターの制限酵素地図を示し、そしてミニ−ＩＧＦＢＰ−３のコード配列が挿入されることにより、順にｐＲＨ−３ｓ−Ｈ６−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３ベクター、ＡｃＭＮＰＶ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３組換えウイルスおよびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ組換えタンパク質が産生される。
【図６】図６は、ターゲティングされた酵素的ビオチニル化後の組換えミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇの電気泳動分析の結果を示す。左のパネル：精製された組換えＨ６−ＩＧＦＢＰ−３（Ａ）、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３（Ｂ）、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇ（Ｃ）がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色された。右のパネル：精製されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇは、ビオチンおよびＢｉｒＡ酵素を用いてのビオチニル化にかけられ、そして反応産物のアリコートを（Ｅ）、前以て化学的にビオチニル化しておいたモノクローナル抗体（７Ｅ８）（Ｄ）と並べてＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングした。実験の詳細については実施例３を参照されたい。
【図７Ａ】図７（Ａ）は、（ａ）親ミニ−ＩＧＦＢＰ−３を産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からの種々のタンパク質抽出物、（ｂ）ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇを産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からの種々のタンパク質抽出物、および（ｃ）精製されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇの電気泳動分析を示す。図７（Ｂ）は、ターゲティングされたＢｉｒＡによるビオチニル化後のタンパク質抽出物の電気泳動分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、ＰＶＤＦ膜への転写、ストレプトアビジン−ＡＰとのインキュベーション、およびＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によるＡＰａｓｅ活性を示す。レーンｃ、ｄおよびｅはビオチニル化レーンａ、ｂおよびｃにそれぞれ対応する。図７（Ｃ）において、ＰＢＳに対する十分な透析後、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ−ビオチン（レーンｅ）を含む粗培養培地をストレプトアビジンチップに注入した。１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、６Ｅ８抗ＩＧＦＢＰ−３モノクローナル抗体を含む溶液およびＩＧＦ−ＩＩを含む溶液を順次注入した。
【図７Ｂ】図７（Ａ）は、（ａ）親ミニ−ＩＧＦＢＰ−３を産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からの種々のタンパク質抽出物、（ｂ）ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇを産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からの種々のタンパク質抽出物、および（ｃ）精製されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇの電気泳動分析を示す。図７（Ｂ）は、ターゲティングされたＢｉｒＡによるビオチニル化後のタンパク質抽出物の電気泳動分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、ＰＶＤＦ膜への転写、ストレプトアビジン−ＡＰとのインキュベーション、およびＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によるＡＰａｓｅ活性を示す。レーンｃ、ｄおよびｅはビオチニル化レーンａ、ｂおよびｃにそれぞれ対応する。図７（Ｃ）において、ＰＢＳに対する十分な透析後、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ−ビオチン（レーンｅ）を含む粗培養培地をストレプトアビジンチップに注入した。１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、６Ｅ８抗ＩＧＦＢＰ−３モノクローナル抗体を含む溶液およびＩＧＦ−ＩＩを含む溶液を順次注入した。
【図７Ｃ】図７（Ａ）は、（ａ）親ミニ−ＩＧＦＢＰ−３を産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からの種々のタンパク質抽出物、（ｂ）ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇを産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からの種々のタンパク質抽出物、および（ｃ）精製されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇの電気泳動分析を示す。図７（Ｂ）は、ターゲティングされたＢｉｒＡによるビオチニル化後のタンパク質抽出物の電気泳動分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、ＰＶＤＦ膜への転写、ストレプトアビジン−ＡＰとのインキュベーション、およびＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によるＡＰａｓｅ活性を示す。レーンｃ、ｄおよびｅはビオチニル化レーンａ、ｂおよびｃにそれぞれ対応する。図７（Ｃ）において、ＰＢＳに対する十分な透析後、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ−ビオチン（レーンｅ）を含む粗培養培地をストレプトアビジンチップに注入した。１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、６Ｅ８抗ＩＧＦＢＰ−３モノクローナル抗体を含む溶液およびＩＧＦ−ＩＩを含む溶液を順次注入した。
【図８Ａ】図８（Ａ）は、ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３リポーター融合タンパク質を産生するために構築されたｐＭＪ−ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。図８（Ｂ）は、ヒト血漿中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するために開発された固相「サンドイッチ」アッセイの図解である。図８（Ｃ）は、健康成人、非膵島細胞腫瘍性低血糖症（ＮＩＣＴＨ）患者、および腫瘍除去後のＮＩＣＴＨ患者の血漿中において「サンドイッチ」アッセイを使用して決定されたｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩレベルを示すグラフである。実験の詳細については実施例４を参照されたい。
【図８Ｂ】図８（Ａ）は、ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３リポーター融合タンパク質を産生するために構築されたｐＭＪ−ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。図８（Ｂ）は、ヒト血漿中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するために開発された固相「サンドイッチ」アッセイの図解である。図８（Ｃ）は、健康成人、非膵島細胞腫瘍性低血糖症（ＮＩＣＴＨ）患者、および腫瘍除去後のＮＩＣＴＨ患者の血漿中において「サンドイッチ」アッセイを使用して決定されたｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩレベルを示すグラフである。実験の詳細については実施例４を参照されたい。
【図８Ｃ】図８（Ａ）は、ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３リポーター融合タンパク質を産生するために構築されたｐＭＪ−ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。図８（Ｂ）は、ヒト血漿中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するために開発された固相「サンドイッチ」アッセイの図解である。図８（Ｃ）は、健康成人、非膵島細胞腫瘍性低血糖症（ＮＩＣＴＨ）患者、および腫瘍除去後のＮＩＣＴＨ患者の血漿中において「サンドイッチ」アッセイを使用して決定されたｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩレベルを示すグラフである。実験の詳細については実施例４を参照されたい。
【図９Ａ】図９（Ａ）は、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ＦｃＩｇＧ１融合タンパク質を産生するために構築されたｐＹＭ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。図９（Ｂ）は、得られたイムノアドヘシンの図解である。
【図９Ｂ】図９（Ａ）は、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ＦｃＩｇＧ１融合タンパク質を産生するために構築されたｐＹＭ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。図９（Ｂ）は、得られたイムノアドヘシンの図解である。
【図１０Ａ】図１０（Ａ）は、ＩＧＦ−ＩＩに対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの相対的な結合親和性を示したグラフである。使用した固相アッセイは、漸増濃度の遊離ＩＧＦ−ＩＩが、支持体上に固定されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃへのビオチニル化ＩＧＦ−ＩＩトレーサーの結合を置換する能力を測定した（実験の詳細については実施例５参照）。図１０（Ｂ）は、１０％ＦＣＳの存在下で培養した３つのヒト腫瘍細胞株：Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７およびＩＮＡ−６の増殖および生存に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を示したグラフである。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を、ＩＧＦ−Ｒシグナル伝達経路と干渉することが知られる化合物であるピクロポドフィリン（ｐｐｐ）の効果と比較する（実験の詳細については実施例５参照）。
【図１０Ｂ】図１０（Ａ）は、ＩＧＦ−ＩＩに対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの相対的な結合親和性を示したグラフである。使用した固相アッセイは、漸増濃度の遊離ＩＧＦ−ＩＩが、支持体上に固定されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃへのビオチニル化ＩＧＦ−ＩＩトレーサーの結合を置換する能力を測定した（実験の詳細については実施例５参照）。図１０（Ｂ）は、１０％ＦＣＳの存在下で培養した３つのヒト腫瘍細胞株：Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７およびＩＮＡ−６の増殖および生存に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を示したグラフである。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を、ＩＧＦ−Ｒシグナル伝達経路と干渉することが知られる化合物であるピクロポドフィリン（ｐｐｐ）の効果と比較する（実験の詳細については実施例５参照）。
【図１１Ａ】図１１（Ａ）は、ＩＮＡ−６骨髄腫細胞におけるＡＫＴのリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの阻害効果を示す。これらの効果をｐｐｐのそれと比較する（実験の詳細については実施例５参照）。図１１（Ｂ）は、示されているような種々のインキュベーション時間後の、ＭｉａＰａＣａ−２細胞（左上）、ＨＴ−２９細胞（右上）およびＡ５４９細胞（左下）におけるＡＫＴのリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果、およびＡ５４９細胞（右下）におけるＡＫＴのリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を示したグラフである（実験の詳細については実施例５参照）。
【図１１Ｂ】図１１（Ａ）は、ＩＮＡ−６骨髄腫細胞におけるＡＫＴのリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの阻害効果を示す。これらの効果をｐｐｐのそれと比較する（実験の詳細については実施例５参照）。図１１（Ｂ）は、示されているような種々のインキュベーション時間後の、ＭｉａＰａＣａ−２細胞（左上）、ＨＴ−２９細胞（右上）およびＡ５４９細胞（左下）におけるＡＫＴのリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果、およびＡ５４９細胞（右下）におけるＡＫＴのリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を示したグラフである（実験の詳細については実施例５参照）。
【図１２】図１２は、マウス血漿中のミニ−ＩＧＦＢＰ−３誘導体濃度の減衰を示す。２５０μgの示されたタンパク質を、時間０においてマウス群（ｎ＝３）に静脈内注射した。血液試料を示された時点で採取し、遠心分離にかけ、そして凍結して保持した。注射されたタンパク質の濃度を、抗ヒトＩＧＦＢＰ−３特異的モノクローナル抗体を使用してインハウスサンドイッチ型ＥＬＩＳＡによって決定した。
【図１３】図１３は、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片を有するマウスに投与されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３またはミニ−ＩＧＦＢＰ−Ｆｃを用いての１２時間の処理の、腫瘍の重要なシグナル伝達パラメーターに対するin vivoにおける効果を示す（実験の詳細については実施例６参照）。
【００２８】
定義
明細書全体を通して、以下の段落で定義されたいくつかの用語が使用される。
【００２９】
本明細書において使用する「被験体」という用語は、ヒトまたは別の哺乳動物（例えば霊長類、マウス、ラット、ウサギなど）を指す。本発明の多くの態様において、被験体はヒトである。このような態様において、被験体はしばしば「個体」または「患者」と呼ばれる。「個体」および「患者」という用語は特定の年齢を示さない。
【００３０】
「処置」という用語は、本明細書において、（１）疾病または状態の発症を遅延または予防すること；（２）疾病または状態の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止させること；（３）疾病または状態の症状の寛解をもたらすこと；または（４）疾病または状態を治癒することを目指した、方法または工程を特徴付けるために使用される。処置は、予防的作用（prophylactic action）または予防的作用（preventive action）のために疾病または状態の発症前に投与されてもよい。代替的にまたは追加的に、処置は、治療的作用のために疾病または状態の開始後に投与されてもよい。
【００３１】
「薬学的組成物」は、本明細書において、有効量の本発明の少なくとも１つのＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含むとして定義される。
【００３２】
本明細書において使用する「有効量」という用語は、その意図する目的、例えば細胞、組織、系または被験体における所望の生物学的または医学的応答などを満たすに十分な任意の量の化合物、薬剤、抗体または組成物を指す。
【００３３】
「薬学的に許容される担体または賦形剤」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、そしてそれが投与される濃度においては宿主に対して過度に毒性ではない、担体媒体（medium）を指す。この用語は、溶媒、分散剤、媒体（media）、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, E.W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３４】
タンパク質またはポリペプチドに言及して本明細書において使用する「単離された」という用語は、元々または操作によって、天然に会合したまたは最初に得られた時に会合していた少なくともいくつかの成分から分離されている、タンパク質またはポリペプチドを意味する。「単離された」によって、対象のタンパク質またはポリペプチドが、人間の手によって産生または合成されることを代替的にまたは追加的に意味する。
【００３５】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は本明細書において同義語として使用され、そしてその中性（非荷電）形態でまたは塩としてのいずれかの、そして修飾されていないか、またはグリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化によって修飾されているかのいずれかである、多種多様な長さのアミノ酸配列を指す。特定の態様において、アミノ酸配列は完全長のネイティブなタンパク質である。他の態様において、アミノ酸配列は、完全長タンパク質のより小さなフラグメントである。さらに他の態様において、アミノ酸配列は、グリコシル単位、脂質または無機イオン、例えばホスフェートなどのアミノ酸側鎖に付着した追加の置換基、並びに、スルフヒドリル基の酸化などの鎖の化学的変換に関連した修飾によって修飾されている。従って、「タンパク質」という用語（またはその等価な用語）は、その特異的な特性を有意に変化させない修飾を受けた、完全長のネイティブなタンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むことを意味する。特に、「タンパク質」という用語は、タンパク質アイソフォーム、すなわち、同じ遺伝子によってコードされているが、そのｐＩまたはＭＷにおいてまたはその両方において異なっている変異体を包含する。このようなアイソフォームは、そのアミノ酸配列が異なり得るか（例えば、対立遺伝子変異、選択的スプライシングまたは限定タンパク質分解の結果として）、または代替的には、異なる翻訳後修飾から生じ得る（例えばグリコシル化、アシル化、リン酸化）。
【００３６】
タンパク質またはタンパク質部分に言及して本明細書において使用する「類似体」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質部分と類似もしくは同一の機能を有するが、タンパク質もしくはタンパク質部分のアミノ酸配列と類似もしくは同一のアミノ酸配列、またはタンパク質もしくはタンパク質部分と類似もしくは同一の構造を含む必要は必ずしもない、ポリペプチドを指す。好ましくは、本発明の脈絡において、タンパク質類似体は、タンパク質またはタンパク質部分のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３７】
「タンパク質フラグメント」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５つ連続したアミノ酸残基（好ましくは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０またはそれ以上のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。タンパク質のフラグメントは、タンパク質の機能的活性を有していてもいなくてもよい。
【００３８】
タンパク質またはタンパク質部分の変異体、類似体またはフラグメントを特徴付けるために本明細書において使用する「生物学的に活性」という用語は、タンパク質またはタンパク質部分と類似または同一の特性を示すに十分なタンパク質またはタンパク質部分とのアミノ酸配列の同一性または相同性を共有する分子を指す。例えば、本発明の多くの態様において、ＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインの生物学的に活性なフラグメントは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに結合するためのＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインの能力を保持したフラグメントである。同様に、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインの生物学的に活性なフラグメントは、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに結合するためのＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインの能力を保持したフラグメントである。
【００３９】
本明細書において使用する「相同」（または「相同性」）という用語は、「同一性」という用語と同義であり、そして２つのポリペプチド分子間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。両方の比較された配列中の位置が、同じ塩基または同じアミノ酸残基によって占有されている場合、それぞれの分子は、よって、その位置で相同である。２つの配列間の相同性の比率は、２つの配列によって共有される一致または相同な位置の数を、比較される位置の数で割り、そして１００を乗じることに対応する。一般的に、最大の相同性が得られるように２つの配列をアラインさせて比較が行なわれる。相同なアミノ酸配列は、同一または類似したアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、リファレンス配列中の対応するアミノ酸残基の保存的置換または「許容される点突然変異」である。リファンレス配列中の残基の「保存的置換」は、対応するリファレンス残基と物理的にまたは機能的に類似した、例えば、類似したサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合の形成能を含む）などを有する、置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoff et al. (「Atlas of Protein Sequence and Structure」, 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352)によって記載されたような「許容される点突然変異」について定義された基準を満たすものである。
【００４０】
数値に言及して本明細書において使用する「約（approximately）」および「約（about）」という用語は、一般的に、特記しない限りまたはさもなければ内容から明らかでない限り、数値のいずれの方向（前記数値より大きいまたは前記数値より少ない）においても１０％の範囲内に該当する数値を含む（このような数値が１００％という可能な値を超える場合を除く）。
【００４１】
特定の好ましい態様の詳細な説明
前記したように、本発明は、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体を提供する。これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、種々の治療的および／または診断的適用において適用を見出し得る。
【００４２】
Ｉ−ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体
本発明によるＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、一般的に、Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含み、（ａ）Ｎ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなり；（ｂ）中間ドメインは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーを含み；そして（ｃ）Ｃ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。
【００４３】
ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３部分を特徴付けるために本明細書において使用する「野生型」という用語はその当技術分野において理解されている意味を有し、そしてＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３部分の天然に存在する（またはネイティブな）配列を指す。本発明の特定の好ましい態様において、野生型ＩＧＦＢＰ−３は野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３である。
【００４４】
ヒトＩＧＦＢＰ−３
前記したように、ＩＧＦは、ほぼ全体が、ＩＧＦ利用能および作用の重要な決定因子である６個の特異的で高親和性の結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜６）と会合して、ヒトの身体全体に存在している。血漿中のＩＧＦ−Ｉの９０％超が、同定された６個のＩＧＦＢＰの中で最も豊富であるＩＧＦＢＰ−３と結合している。ＩＧＦＢＰ−３は、主要な循環担体タンパク質としての作用に加えて、多くの組織において産生され、ここでＩＧＦ作用を調節するその能力を介しておよびまた直接的な内因性作用に因り、細胞機能に対して複数の効果を及ぼす。
【００４５】
ヒトにおいては、ＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦＢＰ３遺伝子によってコードされる。異なるアイソフォームをコードする選択的転写変異体が特徴付けられている。２つの選択的転写物が、アクセッションナンバーＮＰ＿０００５８９．２およびＮＰ＿００１０１３４１６．１の下で知られている。
【００４６】
従って、特定の態様において、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体のＮ末端ドメインは、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインのアミノ酸配列、すなわち、ヒトに天然に存在する任意のＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。他の態様において、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体のＮ末端ドメインは、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインの生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列、すなわち、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳ（酸不安定サブユニット）と結合する野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインの能力を保持した野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。さらに他の態様において、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体のＮ末端ドメインは、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインの生物学的に活性な変異体のアミノ酸配列、すなわち、欠失、置換、付加および／または改変によって野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３とは異なるが、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３に対するその全体的な配列類似性は、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインと比較して、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに対して、より高くはないにしても、少なくとも同一または類似した結合親和性を示すようなものである、ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。特定の好ましい態様において、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１に示された通りである。
【００４７】
同様に、特定の態様において、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体のＣ末端ドメインは、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのアミノ酸配列、すなわち、ヒトに天然に存在する任意のＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。他の態様において、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体のＣ末端ドメインは、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインの生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列、すなわち、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに結合する野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインの能力を保持した野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。さらに他の態様において、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体のＣ末端は、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインの生物学的に活性な変異体のアミノ酸配列、すなわち、欠失、置換、付加および／または改変によって野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３とは異なっているが、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３に対するその全体的な配列類似性は、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３と比較して、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに対して、より高くはないにしても、少なくとも同一または類似した結合親和性を示すようなものである、ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなる。特定の好ましい態様において、野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３に示された通りである。
【００４８】
タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカー
本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体は、タンパク質分解的開裂に対する抵抗性によって特徴付けられる。前記したように、野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインはゆるく構築され、そしてタンパク質分解的開裂のターゲットである。いくつかのプロテアーゼがＩＧＦＢＰ−３を開裂することが示されており、これにはプラスミン、トロンビン、カリクレイン、前立腺特異的抗原、マトリックスメタロプロテアーゼおよびカテプシンが挙げられる。ＩＧＦＢＰ−３のタンパク質分解は、ＩＧＦに対するその親和性を低下させ、従って、完全に結合したＩＧＦに対する遊離ＩＧＦの全体的な比は増加する。
【００４９】
これに対し、本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体は、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるように設計された。ＩＧＦＢＰ−３誘導体（またはリンカー）に言及して本明細書において使用する場合「タンパク質分解的開裂に対して抵抗性」という用語は、ＩＧＦＢＰ−３誘導体（またはリンカー）が、野生型ＩＧＦＢＰ−３を開裂するプロテアーゼの存在下においてin vitroおよび／またはin vivoにおいて有意な（すなわち検出可能な）酵素的分解を受けないことを意味する。当業者は、タンパク質分解的開裂に対するポリペプチドの感受性を試験および評価する方法を知っているだろう。
【００５０】
本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体によって示されるプロテアーゼの分解作用に対する抵抗性は、その中間ドメインがタンパク質分解的開裂に対して抵抗性となるように設計されているという事実から生じる。特定の態様において、中間ドメインは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるリンカーからなる。他の態様において、中間ドメインは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるリンカーを含む。例えば、本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体の中間ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなり、前記アミノ酸配列の一部は、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるリンカーで置換されている。野生型ＩＧＦＢＰ−３が野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３である態様において、野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２に示された通りであり得る。
【００５１】
一般的に、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるリンカーで置換された野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列の一部は、生じるＩＧＦＢＰ−３誘導体の中間ドメインがタンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるようなものである。従って、好ましくは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるリンカーで置換された野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列の一部は、野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列の実質的な一部である。本明細書において使用する「野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列の実質的な一部」は、野生型ＩＧＦＢＰ−３の全中間ドメインの少なくとも８５％、または野生型ＩＧＦＢＰ−３の全中間ドメインの少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、または９０％超を指す。代替的にまたは追加的に、「野生型ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインのアミノ酸配列の実質的な一部」は、ＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインの８５の連続したアミノ酸残基、またはＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインの８５超の連続したアミノ酸残基、例えばＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインの８６、８７、８８、８９、９０、９１または９２の連続したアミノ酸残基を指す。
【００５２】
本発明の脈絡において、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーは、野生型ＩＧＦＢＰ−３を開裂するプロテアーゼの存在下においてin vitroおよび／またはin vivoにおいて全く有意な酵素的分解を受けない任意のポリペプチドであり得る。特定の好ましい態様において、リンカーは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のある配列番号４に示された配列または配列番号４の任意の変異体の配列を有する。
【００５３】
特定の態様において、リンカーは、条件的タンパク質分解のエレメント、すなわち、特定の条件下でのみタンパク質分解を受ける実体を含み得る。タンパク質またはポリペプチドに条件的タンパク質分解を受けさせる戦略およびシステムは当技術分野において公知である。
【００５４】
ミニＩＧＦＢＰ−３誘導体
前記したＩＧＦＢＰ−３誘導体は、少なくとも２つの主要な特性を共有する：（１）それらはタンパク質分解的開裂に対して抵抗性である、そして（２）それらは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の対応する結合親和性と同一、実質的に類似またはさらにはより高い、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに対する結合親和性を示す。本発明者らは、これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体を「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３」と呼ぶ。
【００５５】
本発明者らの計画の構築基盤または土台としてミニ−ＩＧＦＢＰ−３を使用して、本発明者らは、異なる特性および可能性ある適用を有する他のＩＧＦＢＰ−３誘導体を設計および開発した。
【００５６】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３ＡＬＳ−誘導体
従って、１つの局面において、本発明は、（１）タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であり、（２）野生型ＩＧＦＢＰ−３の対応する結合親和性と同一、実質的に類似またはさらにはより高い、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびヘパリンに対する結合親和性を示すが、（３）ＡＬＳには結合しない（または実質的に結合しない）、ＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、本明細書において、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３ＡＬＳ−」誘導体と呼ばれる。
【００５７】
このようなミニ−ＩＧＦＢＰ−３ＡＬＳ−誘導体は、一般的に、Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含み、（ａ）Ｎ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなり；（ｂ）中間ドメインは、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性のあるリンカーを含み；そして（ｃ）Ｃ末端ドメインは、野生型ＩＧＦＢＰ−３の、その生物学的に活性な変異体の、またはその生物学的に活性なフラグメントの、Ｃ末端ドメインのアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれからなり、ＡＬＳに結合するＣ末端ドメインの一部は、ＡＬＳに結合しないＡＧＧＳＧ（配列番号５）または配列番号５の任意の変異体で置換されている。
【００５８】
野生型ＩＧＦＢＰ−３が野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３であり、そして野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインのアミノ酸配列が配列番号３に示した通りである態様において、配列番号３におけるアミノ酸残基４３〜４７は、ＡＬＳに結合しないＡＧＧＳＧ（配列番号５）またはその任意の変異体で置換されている。
【００５９】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ誘導体
本発明はまた、（１）タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であり、（２）野生型ＩＧＦＢＰ−３の対応する親和性よりも高い、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性を示し、そして（３）野生型ＩＧＦＢＰおよび／または他のミニ−ＩＧＦＢＰ−３誘導体の血漿中半減期よりも長い血漿中半減期を有する、ＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ」誘導体と呼ばれる。
【００６０】
実際に、本発明のミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ誘導体は、本明細書において定義したようなＮ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインに加えて、それに対して融合した免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む。「免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント」という用語は、本明細書において、その当技術分野において理解されている意味を有し、そしてヒト血清中で最も豊富であるグロブリンタンパク質のＩｇＧ１クラスの抗体の結晶化可能なフラグメント領域を指す。好ましくは、免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントは、ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ誘導体のＣ末端ドメインの末端に融合している。特定の態様において、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントの各「アーム」（すなわち、Ｆｃフラグメントを構成する２つの同一のポリペプチドの各々）は、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３誘導体のＣ末端ドメインの末端に融合している。結果として、本発明はまた、２つのミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ誘導体に融合した免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む融合タンパク質を提供する。本発明者らは、このような融合タンパク質（実施例の章を参照）が、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントに融合していないＩＧＦＢＰ−３誘導体よりも７倍高い、見かけの親和性ＩＣ５０を有することを発見した。
【００６１】
当業者によって理解されるであろうように、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ」融合タンパク質のミニ−ＩＧＦＢＰ−３部分は、前記したように、ＡＬＳへの結合を全く示さない（または有意ではない結合しか示さない）ように改変されていても改変されていなくてもよい。
【００６２】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体
本発明はまた、タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であるＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体を提供する。
【００６３】
このようなＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体は、一般的に、本明細書において定義したようなＮ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含み、そしてさらに、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列を含み、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と複合体を形成している。本明細書において使用する「ＩＧＦ−Ｉ」という用語はその当技術分野において理解されている意味を有し、そしてヒトにおいてはＩＧＦ１遺伝子（アクセッションナンバーＮＰ＿００１１００４７５３、ＮＰ＿００１１０４７５４、およびＮＰ＿０００６０９）によってコードされるインスリン様成長因子１と呼ばれる小さなタンパク質（約７，５００ｋＤａ）を指す。
【００６４】
ＩＧＦ−Ｉは、３つの分子内ジスルフィド橋を有する一本鎖のアミノ酸からなる。それは最初は生物学的に不活性なｐｒｏ−ＩＧＦ−Ｉペプチドとして合成され、これは続いて調節されたエンドタンパク質分解的開裂を受けて成熟形となる。本発明の脈絡において、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列は、好ましくは、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉ（すなわち、ヒトに天然に存在する任意のＩＧＦ−Ｉ）またはその生物学的に活性なフラグメントまたはその生物学的に活性な変異体のアミノ酸配列を含む（または代替的にそれからなる）。野生型ヒトＩＧＦ−Ｉの適切な生物学的に活性なフラグメントおよび変異体は、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉの生物学的特性（特にＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−１Ｒへの結合）を保持したフラグメントおよび変異体を包含する。
【００６５】
ＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体において、ＩＧＦＢＰ−３誘導体およびＩＧＦ−Ｉは、非共有結合によって会合している。非共有結合的相互作用は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力および疎水性相互作用を含む。一般的に、ＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体において、ＩＧＦＢＰ−３誘導体およびＩＧＦ−Ｉは、（生体内に）天然に存在するＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体と同一または類似した様式で会合している。
【００６６】
特定の態様において、本発明のミニ−ＩＧＦＢＰ−３：ＩＧＦ−Ｉ複合体のリンカーは、同義の条件的タンパク質分解のエレメントを含む。例えば、条件的タンパク質分解のエレメントは、ＩＧＦ−Ｉのターゲティング送達を可能とするように設計され得る。
【００６７】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇ誘導体
本発明はまた、（１）タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であり、（２）野生型ＩＧＦＢＰ−３の対応する結合親和性と同一、実質的に類似またはさらにはより高い、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに対する結合親和性を示し、そして（３）ＢｉｒＡ酵素によるビオチニル化を受け入れられる、ＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ」誘導体と呼ばれる。
【００６８】
このようなミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ誘導体は、一般的に、本明細書において定義したような、Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含み、そしてさらに、ＩＧＦＢＰ−３誘導体のＣ末端ドメインの末端に共有結合したＢｉｒＡ酵素基質を含む。本明細書において使用する「ＢｉｒＡ酵素」は、その当技術分野において理解されている意味を有し、そして、認識配列中の特定の残基においてタンパク質（すなわちＢｉｒＡ酵素基質）をビオチニル化する能力を有するE.coliビオチンリガーゼ酵素を指す（O'callaghan et al., Anal. Biochem., 1999, 266: 9-15）。本明細書において使用する「ＢｉｒＡ酵素基質」という用語は、ＢｉｒＡ酵素によって認識され、そしてＢｉｒＡ酵素がビオチンを付着させることのできる、任意のターゲットアミノ酸配列を指しそしてこれを包含する。多種多様なＢｉｒＡ酵素基質が当技術分野において知られており、これには、本発明の脈絡において使用するに適した、例えば米国特許第５，７２３，５８４号、米国特許第５，４８７，９９３号、欧州特許第０５５０６９３号およびＷＯ第９５／０４０６９号に記載されているものが挙げられる。しかしながら、特定の好ましい態様において、ＢｉｒＡ酵素基質は、配列番号６において示された配列を有する。
【００６９】
本発明はさらに、本明細書において定義したような、Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを一般的に含み、そしてさらに、ＩＧＦＢＰ−３誘導体のＣ末端ドメインの末端に共有結合したＢｉｒＡ酵素基質およびＢｉｒＡ酵素基質に共有結合的に付着したビオチン分子を含む、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ誘導体を提供する。これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、本明細書において、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ−ビオチン」誘導体と呼ばれる。
【００７０】
当業者によって理解されるであろうように、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ誘導体またはミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ−ビオチン誘導体のミニ−ＩＧＦＢＰ−３部分は、前記したようなＡＬＳへの結合を全く示さない（または有意ではない結合しか示さない）ように改変されていても改変されていなくてもよい。
【００７１】
ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３誘導体
本発明はまた、（１）タンパク質分解的開裂に対して抵抗性であり、（２）野生型ＩＧＦＢＰ−３の対応する結合親和性と同一、実質的に類似またはさらにはより高い、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ヘパリンおよびＡＬＳに対する結合親和性を示し、そして（３）リポータータンパク質で標識されることによって検出可能である、ＩＧＦＢＰ−３誘導体を提供する。例えば、リポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどであり得る。リポータータンパク質がアルカリホスファターゼである場合、これらのＩＧＦＢＰ−３誘導体は、「ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３」誘導体と呼ばれる。
【００７２】
このようなＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３誘導体は、一般的に、本明細書において定義したような、Ｎ末端ドメイン、中間ドメインおよびＣ末端ドメインを含み、そしてさらに、Ｎ末端ドメインの末端に融合した、ＳｅＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）のアミノ酸配列を含む。当業者によって理解されるであろうように、ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３誘導体のミニ−ＩＧＦＢＰ−３部分は、前記したようなＡＬＳへの結合を全く示さない（または有意ではない結合しか示さない）ように改変されていても改変されていなくてもよい。
【００７３】
「ＳｅＡＰ」および「分泌型アルカリホスファターゼ」という用語は、本明細書において同義語として使用される。それらは、ＳＥＡＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＰ＿００１６２３）によってコードされ、そしてヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）の切断短縮形である、酵素を指す。ＳＥＡＰは、極めて熱に安定であり、そしてホスファターゼ阻害剤Ｌ−ホモアルギニンに対して抵抗性であるという珍しい特性を有する（Micanovic et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1990, 87: 157-161）。
【００７４】
ＩＧＦＢＰ−３誘導体の調製
本発明によるＩＧＦＢＰ−３誘導体は、本発明者らによって使用されたような部位特異的突然変異誘発および組換え技術を含む、当技術分野において公知の多種多様な適切な方法のいずれかを使用して調製され得る（実施例の章を参照）。本発明は、本発明者らによって開発された発現ベクター並びにこのような発現ベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００７５】
ＩＩ−ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の使用
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、種々の治療的および／または診断的適用において使用され得る。それらは、ヒト起源のタンパク質から誘導されたという利点を有し、これはいくつかの治療適応症のためにＦＤＡによってすでに認可され、そしてこれは大きな二次的作用を全く伴わないことが証明された。
【００７６】
１−治療的適用
Ａ．適応症
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、ＩＧＦ（ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩ）を捕捉し、そしてこれによりそのバイオアベイラビリティ−を低下させる薬剤として有用であり得る。従って、それらは、ヒト悪性腫瘍の化学療法または放射線療法におけるアジュバントとして、既存の抗ＩＧＦ１−Ｒモノクローナル抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤の代替物を構成し得る（Klinakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 2359-2364; Pollack et al., Nat. Rev. Cancer, 2004, 4: 505-518; Ryan and Goss; Oncologist, 2008, 13: 16-24; Sachdev and Yee, Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 1-12; Samani et al., Endocr. Rev.2006）。本発明のいくつかのＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体、例えばミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃは、血流中に存在するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方を捕捉することができ、一方、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３ ＡＬＳ−などのその他は、生物学的に利用可能な組織中ＩＧＦを減少させることができる。この後者の特徴はさらに、ＩＧＦＢＰ−３誘導体にビオチン残基を付加することによって（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ＡＬＳ−ａｖｉｔａｇ−ビオチン）腫瘍組織それ自体へとターゲティングさせることができる。両方の戦略において、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の投与により、ＩＧＦシグナル伝達経路のダウンレギュレーションが起こる。このアプローチは、インタクトなＩＧＦＢＰ−３の循環が強く抑制されている転移性腫瘍患者の場合には特に関連性がありそして見込みがあると思われる（Fowlkes et al., Endocr., 2004, 145: 620-626; Miyamoto et al., Cancer Res., 2004, 64: 665-371; Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 333: 1011-1016）。プロテアーゼに抵抗性のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の投与は、腫瘍にとって有害な持続的なＩＧＦの欠乏をもたらし、これは腫瘍量を減少させるための他の化学療法剤の効果を増強するはずである。
【００７７】
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体によるＩＧＦの捕捉はまた、特定の眼疾患の管理においても有益であり得る。本発明により処置することのできるＩＧＦ−Ｉの過剰に関連した眼疾患の例としては、ＩＧＦ−Ｉが病原的なＶＥＧＦの過剰産生に関与していることが示された、増殖網膜症、例えば加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症が挙げられるがそれらに限定されない（Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104: 10595-10600; Grant et al., Expert Opin. Invest. Drugs, 2004, 13: 1275-1293）。他の例としては、網膜創傷、続発性白内障、角膜上皮創傷およびシェーグレン症候群が挙げられる。このような適用において、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、例えば、眼への注入または角膜への適用（例えば、点眼液または結膜嚢に配置された徐放性カプセルを介して）によって投与され得る。
【００７８】
本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体はまた、ＩＧＦ−１の全身投与が適応される場合に、ＩＧＦ−１を供給するためのベクターとしても使用され得る。このような適応症としては、成長ホルモン抵抗性、ＩＧＦ−１欠乏症、重度の熱傷、ＨＩＶ消耗、嚢胞性線維症、セリアック病、神経性食欲不振症、筋肉消耗疾病、筋緊張性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、骨粗鬆症、重度のインスリン抵抗性（Clemmons, Nat. Rev. Drug Discov., 2007, 6: 821-833）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、脳虚血、心虚血、および移植が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７９】
本発明の処置法は、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体またはその薬学的組成物を使用して達成され得る。これらの方法は、一般的に、有効量の少なくとも１つのＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体（同義の）またはその薬学的組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む。投与は、当業者に公知の方法のいずれかを使用して実施され得る。特に、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体またはその組成物は、エアゾール、非経口、経口または局所経路を含むがそれらに限定されない種々の経路のいずれかによって投与され得る。
【００８０】
一般的に、本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体またはその組成物は、有効量で、すなわち、その意図する目的を満たすに十分な量で投与される。投与しようとするＩＧＦＢＰ−３誘導体または薬学的組成物の正確な量は、処置しようとする被験体の年齢、性別、体重および全般的な健康状態、所望の生物学的または医学的応答などに依存して、被験体ごとに異なる。特定の態様において、有効量は、ＩＧＦシグナル伝達経路の効率的なダウンレギュレーション、血流中に存在するＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩの効率的な捕捉、および／または生物学的に利用可能な組織中ＩＧＦの効率的な減少を可能とするものである。他の態様において、有効量は、ＩＧＦ−１の効率的な供給を可能とするものである。大半の態様において、ＩＧＦＢＰ−３誘導体またはその薬学的組成物の有効量は、疾患（このために投与される）を処置、例えば疾患の症状の進行、増悪もしくは悪化を減速もしくは停止、および／または疾患の症状を寛解、および／または疾患を治癒するものである。本発明による処置の効果は、処置される疾病の診断のための当技術分野において公知のアッセイのいずれかを使用してモニタリングされ得る。
【００８１】
特定の態様において、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体またはその組成物は、本発明の処置法に従って単独で投与される。他の態様において、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体またはその組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤または治療手順と組み合わせて投与される。ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体または組成物は、治療剤の投与または治療手順の前に、治療剤または手順と同時に、および／または治療剤の投与または手順の後に投与され得る。
【００８２】
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体または組成物と組み合わせて投与され得る治療剤は、疾病（このためにＩＧＦＢＰ−３誘導体が投与される）の処置において有益な効果を有することが知られる多種多様な生物学的に活性な化合物の中から選択され得る（例えば、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗細菌剤、抗生物質、抗酸化剤、消毒剤、およびその組合せ）。本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体または組成物の投与と組み合わせて実施され得る治療手順としては、手術、放射線療法などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８３】
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体または組成物が単独でまたは他の療法と併用して有益に投与され得る病気のより具体的な例としては、非小細胞肺癌およびＥＧＦＲターゲティング療法（ゲフィチニブ、エルロチニブ）に対して抵抗性を発達させた疾病形態、肝細胞癌（ソラフェニブ）およびこのような薬剤に対して抵抗性を発達させた形態、ＨＥＲ２ターゲティング療法（トラスツズマブ）に関連したＨＥＲ２増幅乳癌およびこの薬剤に対して抵抗性を発達させた形態、ホルモン療法に関連したエストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）乳癌、および顕著にはホルモン療法に対して応答しない低レベルのＥＲを有するエストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）乳癌のサブセット（luminal B）、いくつかの三種陰性の乳癌、エストロゲンレセプターターゲティング療法（フルベストラント）に対して抵抗性を発達させた乳癌、ＰＤＧＦＲターゲティング療法（イマチニブ）に対して非感受性または抵抗性のいずれかである消化管間葉性腫瘍、前立腺癌におけるアンドロゲンレセプターターゲティング療法に対する抵抗性、メラノーマおよび大腸癌のＢＲＡＦＶ６００Ｅターゲティング療法に対する抵抗性、ＩＧＦ−Ｉ産生ユーイング肉腫および他の肉腫の療法、他の療法と併用しての多発性骨髄腫療法（顕著にはＩＧＦ−Ｉ産生骨髄腫）、肝細胞癌療法（顕著にはＩＧＦ−ＩＩ産生腫瘍）、大腸腺癌の療法（顕著にはＩＧＦ−ＩＩ産生腫瘍）、卵巣癌の療法（顕著には卵巣上皮癌およびＩＧＦ−ＩＩ産生腫瘍）、副腎皮質癌の療法、いくつかの膵臓癌の療法、および乳癌および前立腺癌のホルモン療法のアジュバントとして、頭頸部の扁平上皮細胞癌の療法、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫などの小児腫瘍の療法、しかしまた成人神経膠芽腫の療法、非膵島細胞腫瘍性低血糖症（ＮＩＣＴＨ）などのＩＧＦ−ＩＩ産生腫瘍の療法、骨肉腫の療法、中皮腫の療法が挙げられる。
【００８４】
Ｂ．投与
ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体（場合により１つ以上の適切な薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて製剤化した後）を、所望の投与量で、それを必要とする被験体に任意の適切な経路によって投与することができる。種々の送達システムが知られており、そしてこれを使用して、本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体を投与することができ、これには錠剤、カプセル剤、注射溶液、封入（リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルなどへの）が含まれる。投与法としては、経皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病巣内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺内、硬膜外、眼内および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体または組成物は、任意の簡便なまたは他の適切な経路によって、例えば点滴またはボーラス注入によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（mucocutaneous lining）（例えば経口、粘膜、直腸および腸管粘膜など）を通した吸収によって投与され得る。投与は全身的であっても局所的であってもよい。非経口投与は、カテーテル法によるなどの、患者の特定の組織に向けられ得る。当業者には理解されるであろうように、本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体が追加の治療剤と共に投与される態様において、ＩＧＦＢＰ−３誘導体および治療剤は、同じ経路（例えば経口）によって、または異なる経路（例えば経口および静脈内）によって投与され得る。
【００８５】
Ｃ．投与量
本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体（またはその組成物）の投与は、送達される量が意図する目的のために効果的であるような投与量である。投与経路、投与される製剤および投与量は、所望の治療効果、処置する疾患の重度、あらゆる感染の存在、患者の年齢、性別、体重および全般的な健康状態並びに使用されるＩＧＦＢＰ−３誘導体の効力、バイオアベイラビリティおよびin vivoにおける半減期、併用療法の使用（または不使用）および他の臨床因子に依存する。これらの因子は、療法の過程で担当の医師によって容易に決定され得る。代替的にまたは追加的に、投与しようとする投与量は、動物モデルを使用した研究から決定され得る。これらまたは他の方法に基づいて最大効力を達成するように投与量を調整することは、当技術分野において周知であり、そしてこれは訓練された医師の能力の範囲内である。研究は本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体を使用して実施されるので、適切な投与量レベルおよび処置期間に関するさらなる情報が現れるだろう。
【００８６】
本発明による処置は、１回量または複数回の投与量からなり得る。従って、本発明のＩＧＦＢＰ−３誘導体またはその組成物の投与は、特定の期間の間または周期的におよび特定の間隔で、例えば１時間間隔、１日間間隔、１週間間隔（または数日間の間隔で）；１カ月間隔、１年間間隔（例えば徐放形）で一定であり得る。あるいは、送達は、特定の期間の間に数回、例えば１週間に２回以上、１ヶ月間に２回以上などで行ない得る。送達は、しばらくの間連続的な送達であり得、例えば静脈内送達であり得る。
【００８７】
２−診断適用
本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体のいくつかは、診断適用において有用であり得る。特に、本発明は、生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するための方法を提供し、前記方法は、（１）生物学的試料を、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に対して融合した、ＳｅＡＰのアミノ酸配列を含む、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体と接触させて、ＩＧＦＢＰ−３誘導体と、生物学的試料中に存在するあらゆるｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩとの間の複合体の形成を可能とする工程、ここで、ｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＩの部分的にプロセシングされた形態である；および（２）複合体中のＳｅＡＰのアルカリ活性を測定することによって生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩの濃度を決定する工程を含む。
【００８８】
本明細書において使用する「ｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ」という用語は、その当技術分野において理解されている意味を有し、そしてＩＧＦ−ＩＩの部分的にプロセシングされた形態を指し、これは最初に合成され、その後、調節されたエンドタンパク質分解的開裂を受けて成熟形（ＩＧＦ−ＩＩ）となる。
【００８９】
「生物学的試料」という用語は、本明細書においてその最も広い意味で使用される。生物学的試料は、一般的に、被験体から得られる。試料は、ｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩを含み得る任意の生物学的組織または液体であり得る。ヒトにおいて、ＩＧＦ−ＩＩのｐｒｏ形は、血清中並びに脳脊髄液および羊水に検出される。頻繁には、生物学的試料は「臨床的試料」であり、すなわち、患者（すなわち疾病を有すると診断されたまたは疾病を有することが疑われる被験体）から得られた試料である。
【００９０】
複合体中のＳｅＡＰのアルカリ活性を測定することによって生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩの濃度を決定する工程は、実施例の章において記載したようなｐ−ニトロフェニルホスフェートの使用を通すことを含む、当技術分野において公知の任意の方法を使用して実施され得る。
【００９１】
ＩＩＩ−薬学的組成物
前記したように、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、それ自体または薬学的組成物として投与され得る。従って、本発明は、有効量の少なくとも１つのＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、前記組成物はさらに、１つ以上の追加の生物学的に活性な薬剤を含む。
【００９２】
ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体およびその薬学的組成物は、所望の予防効果および／または治療効果を達成するために効果的な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。最適な薬学的製剤は、投与経路および所望の投与量に依存して変化し得る。このような製剤は、物理的状態、安定性、in vivoにおける放出速度、および投与された活性成分のin vivoにおけるクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
【００９３】
本発明の薬学的組成物は、投与し易さおよび投与量の均一性のために、単位投与形で製剤化され得る。本明細書において使用する「単位投与形」という表現は、処置しようとする患者のためのＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の物理的に分離した単位を指す。しかしながら、前記組成物の１日全投与量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されるだろう。
【００９４】
Ａ．製剤
注射調製物、例えば無菌注射水性または油性懸濁液を、公知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用して製剤化し得る。無菌注射調製物はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液、懸濁液またはエマルション、例えば２，３−ブタンジオール溶液などであり得る。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が溶液または懸濁媒体として慣用的に使用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性の不揮発性油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射製剤の調製に使用し得る。無菌液体担体は、非経口投与のための無菌液体形組成物に有用である。
【００９５】
注射製剤は、例えば細菌保持フィルターを通してのろ過によって滅菌することができるか、または無菌固体組成物の形態で除菌剤を取り込み、これを使用前に滅菌水もしくは他の無菌注射媒体に溶解または分散させることによって滅菌することができる。無菌溶液または懸濁液である液体の薬学的組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下注射によって投与され得る。注射は、１回押すことを介して、またはゆっくりとした点滴によってであり得る。必要である場合または所望である場合、前記組成物は、注射部位における痛みを和らげるための局所麻酔薬を含んでいてもよい。
【００９６】
活性成分の効果を延長するために、しばしば、皮下または筋肉内注射からの成分の吸収を遅くすることが望ましい。非経口的に投与された活性成分の吸収遅延は、油ビヒクルに成分を溶解または懸濁することによって達成され得る。注射用デポー形は、ポリ乳酸−ポリグリコライドなどの生分解性ポリマー中でマイクロカプセル化された活性成分のマトリックスを形成することによって製造される。活性成分とポリマーの比および使用する特定のポリマーの性質に依存して、成分の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に活性成分を封入することによって調製され得る。
【００９７】
経口投与のための液体投与形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物が挙げられるがそれらに限定されない。ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に加えて、液体投与形は、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロプレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルおよびその混合物を含み得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、懸濁化剤、保存剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定化剤または浸透圧調節剤などの補助剤を含み得る。経口投与のために適切な液体担体の例としては、水（カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液などの例えばセルロース誘導体などの、前記のような添加剤を含む可能性がある）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびその誘導体、および油（例えば分別ヤシ油およびピーナッツ油（arachis oil））が挙げられる。加圧組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【００９８】
経口投与用の固体投与形としては、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が挙げられる。このような固体投与形では、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、少なくとも１つの不活性で薬学的に許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および（ａ）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸；（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア；（ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えばアガーアガー、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸、および炭酸ナトリウム；（ｅ）溶液遅延剤（solution retarding agents）、例えばパラフィン；吸収促進剤、例えば第４級アンモニウム化合物；（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート；（ｈ）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；および（ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物の１つ以上と混合され得る。固形製剤に適した他の賦形剤としては、表面改質剤、例えば非イオン性およびアニオン性表面改質剤が挙げられる。表面改質剤の代表例としては、ポロクサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、ホスフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウムおよびトリエタノールアミンが挙げられるがそれらに限定されない。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、投与形はまた、緩衝剤を含んでいてもよい。
【００９９】
類似のタイプの固形組成物はまた、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用され得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投与形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび薬学製剤技術において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは場合により、不透明化剤を含み得、そしてまた、それらが活性成分を消化管の特定の部分でのみ、または好ましくは消化管の特定の部分で、場合により遅延した様式で放出するような組成物であり得る。使用することのできる包埋組成物（embedding compositions）の例としては、ポリマー性物質およびワックスが挙げられる。
【０１００】
特定の態様において、本発明の組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望ましくあり得る。これは、例えであって、制限するものではないが、手術中の局所的注入によって、局所的適用によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または皮膚パッチもしくはステントもしくは他のインプラントによって達成され得る。
【０１０１】
局所適用のために、前記組成物は、好ましくは、ゲル、軟膏、ローションまたはクリームとして製剤化され、これは、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステルまたは鉱油などの担体を含み得る。他の局所担体としては、液化石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン水溶液（５％）、ラウリル硫酸ナトリウム水溶液（５％）が挙げられる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定化剤および類似の薬剤などの他の材料も必要であれば加えてもよい。
【０１０２】
さらに、特定の場合、本発明の組成物を、皮膚の上、中または下に配置された経皮装置内に配置し得ることが期待される。このような装置としては、パッチ、インプラントおよび注射が挙げられ、これは活性成分を受動的または能動的な放出機序のいずれかによって放出する。経皮投与は、身体の表面および身体の通路の内層（上皮および粘膜組織を含む）を横切る全ての投与を含む。このような投与は、本発明の組成物を使用して、ローション、クリーム、泡状物、パッチ、懸濁液、溶液および坐剤（直腸および膣）で実施され得る。
【０１０３】
経皮投与は、活性成分（すなわちＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体）と、皮膚に無毒性である担体とを含み、そして皮膚を介した血流中への全身的吸収のための成分の送達を可能とする、経皮パッチの使用を通して達成され得る。担体は、クリームおよび軟膏、ペースト、ゲルおよび眼内装置などの任意の数の形態をとり得る。クリームおよび軟膏は、水中油滴型または油中水滴型のいずれかの粘性液体または半固体のエマルションであり得る。活性成分を含む石油または親水性石油に分散された吸収性粉末からなるペーストが、適切であり得る。多種多様な眼内装置を使用して、血流中に活性成分を放出し得、これには、例えば、担体と共にまたは非存在下で活性成分を含むレザバーリザーバーを覆う半透過性膜、または活性成分を含むマトリックスなどがある。
【０１０４】
坐剤製剤は、坐剤の融点を変化させるためのワックスの添加されたまたは添加されていないココアバター、およびグリセリンを含む、伝統的な材料から製造され得る。水溶性坐剤基剤、例えば種々の分子量のポリエチレングリコールなども使用し得る。
【０１０５】
種々の製剤を作製するための材料および方法は当技術分野において公知であり、そして本発明を実施するために適応させ得る。抗体の送達のために適切な製剤は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, E.W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PAに見出され得る。
【０１０６】
Ｂ．追加の生物学的に活性な薬剤
特定の態様において、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体は、本発明の薬学的組成物における唯一の活性成分である。他の態様において、薬学的組成物はさらに、１つ以上の生物学的に活性な薬剤を含む。適切な生物学的に活性な薬剤の例としては、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗細菌剤、抗生物質、抗酸化剤、消毒剤およびその組合せが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０７】
このような薬学的組成物において、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および少なくとも１つの追加の治療剤は、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および治療剤（群）の同時、別々または連続的投与のために１つ以上の調製物において合わせられていてもよい。より特定すると、本発明の組成物は、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および治療剤（群）が一緒にまたは互いに独立して投与することができるように製剤化され得る。例えば、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体および治療剤は、一緒に１つの組成物に製剤化されていてもよい。あるいは、それらは別々に維持（例えば異なる組成物および／または容器に）および投与されてもよい。
【０１０８】
Ｃ．キットの医薬パック（pharmaceutical pack）
別の局面において、本発明は、本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の投与を可能とする、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を含む１つ以上の容器（例えばバイアル、アンプル、試験管、フラスコまたは瓶）を含む医薬パックまたはキットを提供する。本発明はまた、生物学的試料中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度の決定を可能とする１つ以上の成分を含む１つ以上の容器を含むキットを提供する。このようなキットは、一般的に、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体に対して融合したＳｅＡＰのアミノ酸配列を含む本発明のＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体、およびＳｅＡＰのアルカリ活性を測定するための少なくとも１つの試薬を含む。
【０１０９】
医薬パックまたはキットの種々の成分が、固体形（例えば凍結乾燥形）または液体形で供給され得る。各成分は、一般的に、そのそれぞれの容器に分注されて、または濃縮形で提供されるのが適切であり得る。本発明によるパックまたはキットは、凍結乾燥された成分の復元のための媒体を含み得る。キットの個々の容器は、好ましくは、市販のために厳重に密閉して維持される。
【０１１０】
特定の態様において、パックまたはキットは、１つ以上の追加の治療剤（群）を含む。場合により容器（群）に付随して、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定された形式の注意書きまたは添付文書があり得、この注意書きは、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による認可を反映する。添付文書の注意書きは、本明細書において開示した処置法に従って薬学的組成物を使用するための説明書を含み得る。
【０１１１】
識別因子、例えばバーコード、電波による識別（radio frequency）、ＩＤタグなどが、キット中またはキット上に存在し得る。識別因子は、例えば、品質制御、在庫管理、ワークステーション間の移動の追跡の目的のためにキットを比類なく同定するために使用され得る。
【０１１２】
実施例
以下の実施例は、本発明を製造および実施する好ましい形態のいくつかを記載する。しかしながら、実施例は説明の目的のためだけのものであり、そして本発明の範囲を制限する意味はないと理解されるべきである。さらに、もし実施例中の記載が過去時制で提示されてはいなければ、明細書の残りと同様に、本文は、実験が実際に実施されたか、またはデータが実際に得られることを示唆するものではない。
【０１１３】
実施例１：ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチド誘導体の調製
導入ベクターの構築
以下の導入ベクターを本研究に使用した：ｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６、ｐＭＪ−ＳｅＡＰおよびｐＹＭ−Ｆｃ−ＩｇＧ１。ｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６は、以前に記載されているように（Netchine et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 2009, 94: 3913-3921）本発明者らの研究室で構築された分泌タンパク質発現のためのバキュロウイルス導入ベクターである。同様に、アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）またはヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントのいずれかを有する分泌融合タンパク質を産生するために使用されたｐＭＪ−ＳｅＡＰおよびｐＹＭ−Ｆｃ−ＩｇＧ１ベクターもまた、本発明者らの研究室で構築され、そしてこれは以前に記載されている（Bara et al., Int. J. Cancer, 1998, 75: 767-773; Mahiou et al., Biochem. J., 1998, 330: 1051-1058、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１１４】
全ての組換え導入ベクターは、スペーサーおよび適切なエンドヌクレアーゼ制限酵素部位を含むプライマーを使用してＰＣＲフラグメントを作製した後に構築された。二次構造の形成を最小限にするために、これらの反応を、以前に記載されているように（Chakrabarti and Schutt, Nucleic Acids Res., 2001, 29: 2377-2381）１０％ジメチルスルホキシド中でPerkinElmer Life Sciences (Norwalk, CT)サーモサイクラ−を使用して以下の条件下で実施した：９４℃で１０分間かけての最初の変性、その後、９４℃、６０℃および７２℃で３０から４０秒間のサイクル。
【０１１５】
最初に、ｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６においてヘキサヒスチジンＮ末端伸長部の下流にヒトＩＧＦＢＰ−３の完全コード配列を有する導入ベクターを構築した（図１）。使用したＰＣＲ反応は： 
【化１】
2014508760.tif 000002
（終止コドンに下線を引いている）をそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして；および、ＩＧＦＢＰ−３ｃＤＮＡを有するプラスミドを鋳型として、使用した。上のプライマーに加えられた制限酵素部位ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩは小文字で提示されている。８１５ｂｐのＰＣＲ産物を、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして同酵素で前以て消化しておいたｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６導入ベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を使用して、エレクトロコンピテントなE.coli細胞を形質転換した。ｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３と呼ばれる組換えプラスミドを、ヌクレオチドシークエンスの後に選択し、そしてバキュロウイルスＤＮＡと一緒にＳｆ９細胞に同時トランスフェクションして、Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３組換えタンパク質をコードする対応する組換えウイルスを産生した。
【０１１６】
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、実質的には以前に記載されているように（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 488-492）変異原性オリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して、「MutaGene（登録商標）Phagemid in vitro mutagenesis kit version 2」(BioRad)を使用して実施した。簡潔に言うと、導入ベクターｐＭＪ−Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３およびｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３（各々、Ｍ１３複製起点を含む）を使用して、ＣＪ２３６（ｕｎｇ−ｄｕｔ−）突然変異株を形質転換した。ファージミドクローンを選択して、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用いての感染後にウイルス粒子を産生させた。抽出後、対応する一本鎖ＤＮＡは、Kunkelによって記載されたような５’−リン酸化変異原性オリゴヌクレオチド、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む重合反応における鋳型として作用した。
【０１１７】
二本鎖産物を使用して、エレクトロコンピテントなｕｎｇ ｄｕｔ能のあるE.coli株を形質転換した。形質転換クローンを、制限酵素マッピングおよびヌクレオチドシークエンスによって突然変異の存在についてスクリーニングした。このアプローチを使用して、一本鎖ＩＧＦＢＰ−３ＤＮＡ鋳型を以下の変異原性オリゴヌクレオチド：
【化２】
2014508760.tif 000003
にアニーリングさせることによって、ヒトＩＧＦＢＰ−３の中間ドメインを短くした。得られたムテインでは、野生型ＩＧＦＢＰ−３中間ドメインに存在する８５アミノ酸（残基９５から残基１７９）は、１５アミノ酸のスペーサー（その配列は
【化３】
2014508760.tif 000004
である）によって置換されている。得られた突然変異したプラスミド（ｐＤＢ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３）は、ネイティブな中間ドメインの大半を欠失した、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３」と呼ばれる、このＩＧＦＢＰ−３ムテインをコードする組換えバキュロウイルスを生成するように作用した。
【０１１８】
一旦この親配列が得られたら、新たな一本鎖ＤＮＡ鋳型を合成し、そしてこれを使用して、部位特異的突然変異誘発によって新たな突然変異したミニ−ＩＧＦＢＰ−３ｓを生成した。
【０１１９】
これらの突然変異体の１つは、ＡＬＳ結合に関与する配列を排除することによって作製され、これにより、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３ ＡＬＳ−が生成された。この目標を達成するために、ＩＧＦＢＰのＣ末端ドメインにおける塩基性アミノ酸ＫＧＲＫＲを、ｐＢＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３から誘導された一本鎖鋳型と変異原性オリゴヌクレオチド：
【化４】
2014508760.tif 000005
とを使用して、配列ＡＧＧＳＧに置換した。
【０１２０】
同じ鋳型を、以下の変異原性オリゴヌクレオチド：
【化５】
2014508760.tif 000006
と併せて使用して、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端に、ＢｉｒＡ酵素のための基質（Schatz, Biotechnology, 1993, 11: 1138-1143）であるＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥペプチド（Beckett et al., Protein Sci., 1999, 8: 921-929）を付加した。得られたタンパク質、すなわち−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇを酵素的にビオチニル化することができた。
【０１２１】
融合タンパク質の産生
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３リポータータンパク質を得るために、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３コード配列を、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてのその二重消化後に得られたベクターｐＤＢ−３ｓ−Ｈ６−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３からのミニ−ＩＧＦＢＰ−３の切り出し、およびその後の同酵素を用いて前以て消化しておいたｐＭＪ−ＳｅＡＰベクターへの得られたフラグメントのライゲーションによって、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）の３’末端に融合させた。得られた組換えプラスミドを使用して、「ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３」と呼ばれるリポーター融合タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを生成した。
【０１２２】
ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントにミニ−ＩＧＦＢＰ−３を結合させて、「ミニ−ＩＧＦＢＰ−３イムノアドヘシン」融合タンパク質を得るために、適切な制限酵素部位を含むミニ−ＩＧＦＢＰ−３アンプリコンをＰＣＲによって作製し、そして適切に消化されたｐＹＭ−ＦｃｇＧ１ベクターにライゲーションした。得られた組換えプラスミドを使用して、「ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ」と呼ばれるイムノアドヘシン融合タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを生成した。
【０１２３】
組換えタンパク質の精製
前記した組換えウイルスのいずれかを用いて感染させた昆虫細胞の培養培地を収集し、そして組換えタンパク質を、実質的に以前に記載されたように（Mahiou et al., 1998、上を参照）ＩＭＡＣによって精製した。組換えタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製工程を必要としたので、ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃイムノアドヘシンを、プロテインＡ−セファロースアフィニティクロマトグラフィーによってさらに精製した（Mahiou et al., 1998、上を参照）。
【０１２４】
実施例２：ミニ−ＩＧＦＢＰ−３の特性
図２は、野生型ＩＧＦＢＰ−３（Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３）および突然変異した組換えＩＧＦＢＰ−３（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３）の図解を示し、これは、後者が、部位特異的突然変異誘発によって達成された示された１５アミノ酸の可動性リンカーによるその中間ドメインの大半の置換により、野生型Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３から誘導されるという事実を示す。また、図２には、Ｈ６−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３のアミノ酸配列も提示されている。
【０１２５】
結合特性。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−ＩＩの会合および解離の動態を、表面プラスモン共鳴（BIAcore）によって研究した。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３を、カルボジイミドを介してＣＭ−５表面に共有結合させた。１Ｍエタノールアミン溶液を用いて飽和させた後、ＩＧＦ−ＩＩのＰＢＳ溶液を表面上に注入し、そしてこれを８０秒後に緩衝液によって置換した。得られた結果を図３に提示する。
【０１２６】
野生型（ｗｔ）ＩＧＦＢＰ−３および突然変異ＩＧＦＢＰ−３（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３）のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ ＩＩに対する親和性を、放射性トレーサーとして１２５Ｉ−ＩＧＦ−Ｉを使用して決定した。種々の濃度のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを競合物質として使用し、そして親和性定数をスキャッチャード分析によって決定した。得られた結果を以下の表に提示する。
【０１２７】
【表１】
2014508760.tif 000007
【０１２８】
タンパク質分解に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３の抵抗性。トロンビンによるタンパク質分解に対する野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３の感受性を、精製されたタンパク質（１００ng）を、漸増濃度のトロンビン（０．０００８；０．００４；０．０２および０．１ＮＨＩ Ｕ／mL）と共に１時間インキュベーションすることによって研究した。その後、消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして完全ＩＧＦＢＰ−３分子に対して生じたウサギポリクローナル抗体を使用してイムノブロットによって分析した。得られた結果を図４に提示する。
【０１２９】
実施例３：ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇの特性
図５は、部位特異的突然変異誘発によって得られたｐＲＨ−３ｓ−Ｈ６−ａｖｉｔａｇ導入ベクターの制限酵素地図の図解を示す。このベクターにおいて、ＳｆｉＩおよびＰｖｕＩＩ制限酵素部位によってフランキングされるあらゆるオープンリーディングフレーム配列をＰＣＲによって同酵素によって消化されたベクターに導入することができる。構築物の翻訳から生じた分泌ポリペプチドは、そのＣ末端にＡｖｉｔａｇペプチドを有し、そしてＢｉｒＡ酵素を使用したターゲティングされた酵素的ビオチニル化を受け入れられる。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３のコード配列をこのベクターに導入することにより、順にｐＲＨ−３ｓ−Ｈ６−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３ベクター、ＡｃＭＮＰＶ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３組換えウイルスおよびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ組換えタンパク質が得られた。
【０１３０】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇの酵素的ビオチニル化。酵素的ビオチニル化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇの感受性を評価するために、精製された組換えＨ６−ＩＧＦＢＰ−３、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇ（各々１μg）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇをまず、ビオチンおよびＢｉｒＡ酵素を含むビオチニル化反応混合物に加える前に精製した。反応産物のアリコートを、前以て化学的にビオチニル化しておいたモノクローナル抗体（７Ｅ８）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に並べてローティングした。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、これを飽和後、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共にインキュベーションした。ペルオキシダーゼ活性を化学発光によって決定した。得られた結果を図６に提示する。
【０１３１】
粗抽出物におけるミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇのターゲティングされた酵素的ビオチニル化。（ａ）親ミニ−ＩＧＦＢＰ−３を産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からのタンパク質抽出物、（ｂ）ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ａｖｉｔａｇを産生するウイルスによって感染されたＳｆ−９細胞の培養上清からのタンパク質抽出物、および（ｃ）精製されたミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇを、ターゲティングされたＢｉｒＡビオチニル化にかけた。その後、各試料のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてその後、ＰＶＤＦ膜に転写し、これをその後、ストレプトアビジン−ＡＰと共にインキュベーションした。その後、ＡＰａｓｅ活性は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によって実証された。得られた結果を図７に提示する。
【０１３２】
ＰＢＳに対する十分な透析の後、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ａｖｉｔａｇ−ビオチンを含む粗培養培地（図７のパネルＢのレーンｅ）をストレプトアビジンチップに注入した。１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、６Ｅ８抗ＩＧＦＢＰ−３モノクローナル抗体を含む溶液およびＩＧＦ−ＩＩを含む溶液を順次注入した。得られた結果を図７（Ｃ）に提示する。
【０１３３】
実施例４：ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３リポーター融合タンパク質およびその使用
図８（Ａ）は、ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３リポーター融合タンパク質を産生するために構築および使用されたｐＭＪ−ＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。
【０１３４】
固相サンドイッチアッセイ。ヒト血漿中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩ濃度を決定するために開発された固相「サンドイッチ」アッセイの図解を図８（Ｂ）に提示する。この「サンドイッチ」アッセイは、支持体上に固定されたポリクローナル抗ＩＧＦ−ＩＩ Ｅペプチド抗体を捕獲剤として、およびＳｅＡＰ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３を特異的リポーター試薬として、使用する。
【０１３５】
このアッセイは、健康成人（ｎ＝４０）、非膵島細胞腫瘍性低血糖症（ＮＩＣＴＨ）と診断された患者（ｎ＝２５）、および腫瘍除去後にＮＩＣＴＨを有する患者（ｎ＝４）の血漿中のｐｒｏ−ＩＧＦ−ＩＩレベルを決定することによって検証された。得られた結果を図８（Ｃ）に提示する。
【０１３６】
実施例５：ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの特性
図９（Ａ）は、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ＦｃＩｇＧ１融合タンパク質（図９（Ｂ）に図解により提示する）を産生するために使用された、構築されたｐＹＭ−ミニ−ＩＧＦＢＰ−３導入ベクターの制限酵素地図を示す。
【０１３７】
ＩＧＦ−ＩＩに対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの親和性。固相アッセイを使用して、ＩＧＦ−ＩＩに対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの結合親和性を研究した。このアッセイにおいて、２つの結合タンパク質（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ）を支持体上に固定した。それらをビオチニル化されたＩＧＦ−ＩＩトレーサーと共にインキュベーションし、そしてその後、漸増濃度のＩＧＦ−ＩＩを加えた。得られた結果は、図１０（Ａ）に提示され、これはミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ＦｃがＩＧＦ−ＩＩに、その融合していない対応物（ミニ−ＩＧＦＢＰ−３）よりも高い見かけの親和性で結合することを示す。
【０１３８】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの抗増殖活性。３つのヒト腫瘍細胞株、すなわちＨｅｐ３ＢおよびＨｕＨ７（肝細胞癌細胞株）およびＩＮＡ−６（多発性骨髄腫細胞株）の増殖および生存に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を研究した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下で培養した各細胞株について、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの効果を、ＩＧＦ１−Ｒシグナル伝達経路に干渉することが知られる化合物であるピクロポドフィリン（ｐｐｐ）の効果と比較した。細胞生存度アッセイを、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃ（１００nM）またはｐｐｐ（１μM）の存在下１０％ＦＣＳを含む培地中で培養開始から７２時間後に、ＷＳＴ−１を添加しそしてホルマザン変換をモニタリングすることによって実施した。得られた結果を図１０Ｂに提示する。それらは、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃが、試験した３つのヒト腫瘍細胞株に対する抗増殖活性を有することを示す。
【０１３９】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−ＦｃによるＡＫＴリン酸化阻害
ＩＮＡ−６骨髄腫細胞株を、１０％ＦＣＳの存在下で増殖させた。細胞を、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３（１００nm）またはｐｐｐ（１μM）と共に３、６または２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を、溶解緩衝液を使用して溶解し、そして細胞抽出物（タンパク質含量について標準化された）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、ニトロセルロース膜に転写し、これをさらにＡＫＴタンパク質のホスホ−Ｓ２７３残基に対して作られたモノクローナル抗体と共にインキュベーションした。膜をまた、等価なローディングを確認するために、ストリッピング後に抗アクチン抗体を用いて再プローブした。得られた結果を図１１Ａに提示する。
【０１４０】
ＡＫＴリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの阻害活性をまた、種々のヒト腫瘍細胞株：ＭｉａＰａＣａ−２（膵臓癌）、ＨＴ−２９（大腸癌）およびＡ５４９（肺癌）で評価した。ＡＫＴリン酸化に対するミニ−ＩＧＦＢＰ−３の阻害活性をＡ５４９細胞で評価した。得られた結果を図１１Ｂに提示し、これは、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃおよびミニ−ＩＧＦＢＰ−３が、試験した全てのヒト腫瘍細胞株のＡＫＴリン酸化を遮断することができることを示す。
【０１４１】
実施例６：in vivoにおけるミニ−ＩＧＦＢＰ−３および誘導体の特性
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３のin vivo活性の将来の評価のための根拠を築くために、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびその誘導体をマウスに注入した。ヒト特異的ＩＧＦＢＰ−３ＥＬＩＳＡ試験を使用して測定した場合、いくつかの動態を観察することができた。
【０１４２】
図１２に見られるように、投与後、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３は、血流から２つの異なる動態でもって排除された：初回投与量の８０〜９０％は最初の３〜４時間の間に血流に残ったが、残りの１０〜２０％は４８時間までに非常にゆっくりと消失した。予期されたように、ＡＬＳに対する結合を抑制する突然変異を有するミニ−ＩＧＦＢＰ−３は、はるかに速く消失し、注入から８時間後にはほぼ全くタンパク質が残っていなかった。これに対し、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃの血清中濃度は、はるかにゆっくりとした単一勾配の動態で減衰し、半減期は約１２時間であった。
【０１４３】
ミニ−ＩＧＦＢＰ−３に対してin vitroにおいて応答性であることが以前に示されていた、ＩＧＦ−ＩＩを産生するＨＴ−２９ヒト大腸腺癌細胞株を使用して、in vivoにおけるミニ−ＩＧＦＢＰ−３活性を評価した。従って、ＨＴ−２９異種移植片をヌードマウスにおいて確立した。腫瘍が臨界サイズに達した後、マウスを、３時間の間隔を置いた３回の腹腔内注射でミニ−ＩＧＦＢＰ−３またはミニ−ＩＧＦＢＰ３−Ｆｃのいずれかで処置し、そしてマウスをさらに３時間後に屠殺した。腫瘍ＭＥＫおよびＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路を、これらの腫瘍において、細胞周期レギュレーターＲｂと一緒に、ウェスタンイムノブロットを使用してそれぞれＡＫＴ、ＥＲＫ−１／２およびＲｂのリン酸化状態を評価することによって評価した。
【０１４４】
より特定すると、２．５×１０６個のＨＴ−２９細胞を、５週令のＮＭＲＩ−ｎｕマウスの各側腹部に皮下注射した。腫瘍を５００mm３の容積まで成長させ、その後、マウスを個々の処置群（ｎ＝２）に無作為に分類し、そして３時間毎にミニ−ＩＧＦＢＰ−３またはミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃのいずれかの３回の腹腔内注射（３４０μg）を受けた。対照群には、食塩水を注射した。処置開始から１２時間後、マウスを屠殺し、そして切り出した腫瘍を半分に切断した。一方の半分を液体窒素中で瞬間凍結し、そして−８０℃で保存した。もう一方の半分をＦｉｎｆｉｘで固定し、パラフィンに含め、そして免疫組織化学法のために加工した。ウェスタンブロット分析のために、腫瘍を溶解緩衝液（ｐＨ７．４の１０mMトリスＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１mM ＥＤＴＡ、２mMオルトバナジン酸ナトリウム、錠剤型プロテアーゼ阻害剤[Roche Molecular Biochemicals]）中でホモジナイズした。遠心分離後、タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Bio-Rad）によって決定した。１５μgのタンパク質を、４％〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Invitrogen）上で泳動させた。メンブランをＴＢＳ−Ｔ中５％脱脂乳で４℃で一晩かけてブロックし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ中の抗マウスまたは抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と共に１時間かけて室温でインキュベーションし、そしてＴＢＳ−Ｔで洗浄した。シグナルを、増強された化学発光溶液を使用して可視化し、そしてフィルムに感光させた。使用したブロッティング抗体は、リン酸化Ａｋｔ、Ａｋｔ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＥＲＫ１／２、リン酸化マイトジェン活性化プロテインキナーゼｐＥｒｋ１／２、Ｒｂ（BD Biosciences）、β−アクチンおよびＧ３ＰＤＨであり；抗体は、特記しない限り、Cell Signalling Technology製であった。
【０１４５】
図１３に見られるように、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３またはミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃのいずれかを用いての１２時間の処置は、各々の処置されたマウスの腫瘍におけるＡｋｔＳ４７３リン酸化を消失させ、このことはＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の強力な遮断を示す。予期された通り、ＭＥＫシグナル伝達経路も同様に妨害された。というのも、Ｅｒｋ１／２リン酸化もまた、処置された腫瘍において、その非処置の対応物と比較してかなり減少したからである。従って、細胞周期制御は、Ｒｂタンパク質のリン酸化状態を調べることによって評価された。図１３に示したように、Ｒｂタンパク質は非処置の腫瘍において完全にリン酸化されたが、Ｒｂリン酸化は全ての処置された腫瘍においては減少した。これらのデータと一致して、有糸分裂指数は、これらの腫瘍において、その非処置の対応物と比較して僅かに低かった（−１２％）。合わせて、これらのデータは、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３およびその誘導体であるミニ−ＩＧＦＢＰ−３−Ｆｃが両方共にin vivoにおいて活性であり、ＩＧＦ−１ＲまたはＩＲ−Ａレセプターチロシンキナーゼのいずれかによって活性化される２つの主要なシグナル伝達経路を妨害し、これにより細胞周期停止のイニシエーションに至ることを示す。従って、ＩＧＦ−ＩＩ産生腫瘍を有する動物におけるプロテアーゼ抵抗性ＩＧＦ結合タンパク質による遊離ＩＧＦ−Ｉおよび遊離ＩＧＦ−ＩＩの捕捉は、腫瘍にとって生物学的に利用可能なＩＧＦを枯渇させ、これにより腫瘍を飢餓させ、そして腫瘍細胞周期進行に関与するシグナル伝達経路を遮断する。これらの実験において使用した処置期間は、アポトーシスに関連したマーカーの活性化を観察するには短すぎた。
【０１４６】
実施例７：現在および将来の研究
エストロゲンに対するその依存性を回避する細胞の出現を妨げるミニ−ＩＧＦＢＰ−３の能力は、現在処理中である。Luminal A型の腫瘍に典型的なＭＣＦ−７細胞はエストロゲンレセプター陽性であり、そしてその増殖をエストロゲンに依存する。これらの実験において、これらの細胞を、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３の存在下または非存在下においてエストロゲンを枯渇させた培地中に蒔く。エストロゲン非依存性増殖を、クリスタルバイオレットを用いての染色によって対照および試験プレートにおいて評価する。いくつかの対照細胞はそうした条件下で増殖するが、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３で処理されたプレートにおいては全く細胞は増殖しないと予期される。
【０１４７】
マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９によるタンパク質分解的消化に抵抗するミニ−ＩＧＦＢＰ−３の能力もまた現在試験されている。ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９は腫瘍細胞によって発現され、そして癌患者の血流中により多くの量で存在し、そこでネイティブな内因性のＩＧＦＢＰ−３の分解に寄与する。実験において、これらの酵素をまず１mM ＡＰＭＡを用いて活性化する。ミニ−ＩＧＦＢＰ−３および完全長ＩＧＦＢＰ−３を、活性化ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９に対する基質として比較する。各基質の濃度（２０μM）を、ＭＭＰ−７またはＭＭＰ−９のいずれかと共に１：１０のモル比でインキュベーションする。インキュベーション期間の終了時に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、そのそれぞれのフラグメントへの開裂を評価する。完全長ＩＧＦＢＰ−３は、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９の両方によって消化されるが、ミニ−ＩＧＦＢＰ−３はこのタンパク質分解的攻撃に抵抗性である。
【０１４８】
他の態様
本発明の他の態様は、本明細書において開示した本発明の明細書または実施の考察から当業者には明らかであろう。明細書および実施例は、単に例示として考えられ、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１】
2014508760.tif 000008
【図２Ａ】
2014508760.tif 000009
【図２Ｂ】
2014508760.tif 000010
【図３】
2014508760.tif 000011
【図４】
2014508760.tif 000012
【図５】
2014508760.tif 000013
【図６】
2014508760.tif 000014
【図７Ａ】
2014508760.tif 000015
【図７Ｂ】
2014508760.tif 000016
【図７Ｃ】
2014508760.tif 000017
【図８Ａ】
2014508760.tif 000018
【図８Ｂ】
2014508760.tif 000019
【図８Ｃ】
2014508760.tif 000020
【図９Ａ】
2014508760.tif 000021
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2014508760.tif 000023
【図１０Ｂ】
2014508760.tif 000024
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
2014508760.tif 000027
【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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