(57)【要約】成体神経組織由来の安定した電気活性成体ニューロンを作製する組成物および方法が開示される。本開示の組成物を微小電極アレイとともに生体外で使用して生体内神経機能を再現させ、創薬ならびにニューロン変性疾患、ニューロン発達、およびニューロン再生の研究を行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気活性ニューロンの集団を生成する方法であって、
ａ）基質上で密集を達成する条件下で、成体神経細胞を成長因子と接触させることと、
ｂ）ステップａ）の前記成体神経細胞をｃｄｋ５阻害剤と接触させることと、
ｃ）ステップｂ）の前記神経細胞を神経伝達物質と接触させることと、
を含み、前記成体神経細胞は、電気活性ニューロンの集団に発達する、方法。
【請求項２】
前記成体神経細胞は、成体神経組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成体神経組織は、中枢神経系組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記中枢神経系組織は、脳組織である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記脳組織は、海馬組織である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記基質は、Ｎ−１［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）で処理されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記成長因子との接触が一定期間起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電気活性ニューロンを、成長因子およびｃｄｋ５因子阻害剤を含む維持培地と接触させることによって、電気活性ニューロンを維持することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記維持培地を定期的に取り換えることをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃｄｋ５阻害剤は、ロスコビチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記電気活性ニューロンは、微小電極アレイ（ＭＥＡ）上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気活性ニューロンを継代することと、電気活性を達成する条件下で、前記継代されたニューロンを培養することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
表面と、その表面上に配置される少なくとも１つの電気活性成体ニューロンと、を有する微小電極アレイを備え、前記少なくとも１つの電気活性成体ニューロンは、成体神経組織由来である、微小電極アレイ（ＭＥＡ）システム。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの電気活性成体ニューロンは、ｃｄｋ５阻害剤に暴露されたものである、請求項１４に記載のＭＥＡシステム。
【請求項１６】
前記表面は、ＰＤＬおよびラミニンで処理される、請求項１４に記載のＭＥＡシステム。
【請求項１７】
ａ）基質上で密集を達成する条件下で、成体神経細胞を成長因子と接触させることと、
ａ）ステップａ）の前記成体神経細胞をｃｄｋ５阻害剤と接触させることと、
ｂ）ステップｂ）の前記神経細胞を神経伝達物質と接触させることと、
を含み、前記成体神経細胞は１つ以上の電気活性ニューロンの集団に発達する方法によって生成される、１つ以上の電気活性ニューロンの集団。
【請求項１８】
電気活性成体ニューロンの電気活性に影響を与え得る化合物を特定する方法であって、
ａ）表面と、その表面上に配置される少なくとも１つの電気活性成体ニューロンと、を有する微小電極アレイを備えるＭＥＡシステムを、試験化合物と接触させることと、
ｂ）前記少なくとも１つの電気活性ニューロンまたはその膜部分の電気活性の変化を検出することと、を含み、前記少なくとも１つの電気活性ニューロンまたはその膜部分の電気活性の変化の前記検出が、電気活性成体ニューロンの電気活性に影響を与える化合物を特定する、方法。
【請求項１９】
前記成体ニューロンは、成体神経組織由来である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
電気活性の前記変化は、活動電位の周波数および／または振幅の変化、自発的ニューロン活性の変化、イオン流動の変化、寿命の変化、ロバスト性（健康状態）の変化、あるいは毒素または他の有害もしくは疾患誘発性物質の存在からの保護を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
電気活性成体ニューロンの電気活性に影響を与え得る化合物を特定する方法であって、
ａ）培養中の少なくとも１つの電気活性成体ニューロン、または培養中の複数の電気活性成体ニューロンを、少なくとも１つの試験化合物と接触させることと、
ｂ）少なくとも１つの電気活性ニューロンまたはその膜部分の電気活性の変化を検出することと、を含み、前記少なくとも１つの電気活性ニューロンまたはその膜部分の電気活性の変化の前記検出は、電気活性成体ニューロンの電気活性に影響を与える化合物を特定する、方法。
【請求項２２】
前記成体ニューロンは、成体神経組織由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
電気活性の前記変化は、活動電位の周波数および／または振幅の変化、自発的ニューロン活性の変化、イオン流動の変化、寿命の変化、ロバスト性（健康状態）の変化、あるいは毒素または他の有害もしくは疾患誘発性物質の存在からの保護を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの電気活性成体ニューロンは、基質上に存在する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質は、ＭＥＡデバイスに付随するものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記成体ニューロンは、疾患状態を呈する成体に由来する成体神経組織由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記成体ニューロンは、疾患状態を有する疑いのある成体に由来する成体神経組織由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記成体ニューロンは、疾患状態を有する成体神経組織由来である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＩＨにより授与された助成金番号Ｒ１  ＥＢ００５４５９のもとで政府の支援によりなされた。政府は、本発明においてある権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年５月１７日出願の米国仮特許出願第６１／４８７，２５１号の利益を主張するものである。
【０００３】
本発明は、概して、生体外細胞培養系および微小電極アレイの分野に関する。具体的には、本発明は、神経細胞／微小電極アレイハイブリッドシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
神経変性状態、ならびに外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、機能的な活性ニューロンの広範囲に及ぶ喪失を特徴とする。これらの状態の治療および療法の研究は、ヒト脳において見られる状態を模倣する正確なシステムの存在に依存する。一般に用いられるシステムには、それらの疾患の病理学的症状を模倣するラットおよびマウス疾患モデル、解離細胞培養物および脳切片を含む胚神経細胞培養系、ならびにヒト対象の後期試験が含まれる。胚脳組織ではなく成体脳組織を使用した生体外解離神経系の改善における研究が行われている。これらの現在の生体外培養系には問題が存在する。成体脳組織の解離中の損傷の制限困難、ミエリン阻害タンパク質の放出による細胞外傷の緩和、成体脳由来のニューロンの再生と長期生存の両方を促進する問題、ならびに以前に休止状態であった最終分化したニューロンの増殖は、そのような生体外系を作り出す際に直面する最も一般的な問題である。
【０００５】
成体中枢神経系ニューロンは、ニューロンが細胞周期のＧ０期に停止するため、長い間、有糸分裂後ニューロンと説明されてきた。しかしながら、ニューロンにおけるこの細胞周期停止は、永久的ではなく、むしろ、成熟した分化ニューロンは、細胞周期を通して成長しないように常に自己制御しなければならない。生体外において有糸分裂後ニューロンは、必須因子である塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の作用のため、増殖状態に戻る。
【０００６】
因子ｂＦＧＦは、グルコシルセラミド合成とＶＤＣＣの両方に影響を与えることによって、ＧＡＢＡ陰性ニューロンの生存も促進する。これは、ｃｄｋ５発現を上方制御し、細胞周期へのニューロンの再進入を誘発する。Ｃｄｋ５は、ニューロンにおいてｃｄｋ５／ｐ３５複合体中にて一般に発現されるが、通常、増殖ではなく神経突起伸長および移動に影響を与えるレベルでニューロンによって発現される。競合的ｃｄｋ５／ｐ３５阻害剤ロスコビチンを含むサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＫＩ）は、通常、細胞周期を通して進行を制御する制御決定において重要な役割を果たす。
【０００７】
神経毒性化合物の存在下ならびに神経変性条件下における学習および記憶形成に関する電気生理学的研究は、通常、パッチクランプ電気生理学に依存する。この方法は、詳細情報を提供するが、非常に労働集約的かつ複雑であり、微小電極アレイ（ＭＥＡ）等の電気活性を測定するための非侵襲的技法との関係で限られた長期能力を有している。ＭＥＡは、解離培養物由来のニューロン集団のニューロン活性と結合性の両方の研究における電気生理学的実験を行うために使用される革新的なツールである。パッチクランプ電気生理学が細胞の電気活性のみを短期間（数時間未満）測定し得る一方で、ＭＥＡシステムは、長期間（数日〜数ヵ月）に渡って同じニューロンの集団およびこれらのニューロンにおける毒性化合物、薬物等の慢性的影響を測定し得る。これらの系の使用には、学習および記憶形成の機構に関する研究、ならびに創薬、神経変性疾患、およびバイオセンサ応用の研究が含まれる。
【０００８】
ニューロンＭＥＡシステムならびに神経科学研究全般の一般的な制約は、胚組織に由来するニューロンへの依存である。これらは分化したニューロンであるが、発育が未熟であり、転写プロファイリングは、３分の２の遺伝子が出生後にのみ発現され、発現遺伝子の９５％超が生後発育中に極めて大きな変化を示すことを示している。実際には、胚または新生児ニューロンの電気生理学的特性は、有望な生体外てんかんモデルをもたらした。シナプス伝達に関与する機構を評価するとき、ＡＭＰＡチャネル発現は、出生時には限られており、生後にのみ増加する。ＮＭＤＡチャネルサブユニット、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂの遺伝子発現は、Ｅ２１−２２での出生間近まで検出されず、発現は、Ｐ２０  １４までピークに達しなかった。生体外で、ＮＲ２Ａ／Ｂチャネルは、胚由来のニューロンにおいて２週間後まで非常に低いレベルでのみ検出される。軸索ナトリウムトランスポーターサブユニット１の遺伝子発現は、Ｐ１５周辺で始まり、その後、Ｐ３０まで増加する。生体外において、すべての遺伝子、具体的には、信号伝送に関与する軸索およびシナプスチャネルの発現パターンは、生体内で見られる発現パターンに類似しており、遺伝子発現は、数週間にわたって著しい変化を示す。ニューロン電気活性およびシナプス伝達の研究におけるこれらの発育が未熟なニューロンの有用性は、成体脳におけるシナプス伝達に関与するある種のチャネルの制限された発現または発現の欠如によって制限されている。加えて、神経変性疾患または創薬の研究におけるこれらの発育が未熟なニューロンの使用は、成体脳組織における成熟したニューロンの機能または作用と相関させることが困難な結果をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
神経細胞が、特に外傷性脳損傷時のニューロンの機能、ニューロンの相互作用、老化、神経変性疾患、薬物研究、神経機能代替デバイス、ニューロコンピューティング、バイオロボティクス、および神経再生を研究するために成体ニューロンの機能特性を有する、微小電極アレイとともに使用され得る解離神経細胞培養系が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的（複数を含む）に従って、本明細書において具現化され、かつ広範に説明されるように、本発明は、成体神経細胞をｃｄｋ５阻害剤と接触させて、その成体神経細胞の細胞分裂を制御することと、およびその成体神経細胞を神経伝達物質と接触させて、それによって、電気活性ニューロンの集団を生成することを含む、電気活性ニューロンの集団を生成する方法を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、細胞分裂が制御される条件下で培養された少なくとも１つの電気活性成体ニューロンまたはその膜部分を試験化合物と接触させることと、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンまたはその膜部分への試験化合物の影響を観察することとを含む、試験目的のために成体ニューロンを利用する方法を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、表面と、その表面上に配置される少なくとも１つの電気活性成体ニューロンとを有する微小電極アレイを備える微小電極アレイシステムを備え、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンは、成体神経組織に由来する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、電気活性ニューロンの集団を含み、これらのニューロンは、成体神経細胞をｃｄｋ５阻害剤と接触させて、その成体神経細胞の細胞分裂を制御することによって、かつ電気的機能を促進する培養条件下でその成体神経細胞を神経伝達物質と接触させることによって生成された。
【００１４】
別の態様において、本発明は、微小電極アレイシステムを試験化合物候補と接触させることと（微小電極アレイシステムは、表面と、その表面上に配置される少なくとも１つの電気活性成体ニューロンを有する微小電極アレイを備え、少なくとも１つの電気活性成体神経細胞は、成体神経組織に由来する）、微小電極アレイシステム、少なくとも１つの電気活性成体神経細胞またはその膜部分への試験化合物の影響を観察することと、を含む、電気活性成体ニューロンに影響を与える可能性のある試験化合物を特定する方法を含む。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、マイクロ流体デバイスと、電気活性ニューロンの集団を含む少なくとも１つの三次元多細胞代用組織アセンブリと、を備える、マイクロスケールの流体取扱システムを備え、このデバイスは、このシステムのそれぞれの組織アセンブリを開始、培養、操作、およびアッセイするために使用される。
【００１６】
本発明のさらなる利点は、部分的には以下の記述において説明され、部分的には以下の記述から明らかになるか、または本発明の実践から理解することができる。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に指摘される要素および組み合わせを用いて実現および達成されよう。前述の概要および以下の発明を実施するための形態は両方ともに、単に例示的および説明的であり、特許請求の範囲に規定される本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の（１つの）いくつかの実施形態（複数を含む）を図解し、以下の記述とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００１８】
【図１】図１は、成体ラット海馬組織を処理および解離して、解離神経細胞培養を作成および維持するための培養方法論を示す。細胞培養の時間スケールは、成長因子の時限適用および様々なニューロンパラメータの定量化を示す。細胞を、６、１４、および２５日後に生体外で免疫細胞化学的に試験した（ニューロフィラメント−Ｍ、Ｋｉ−６７、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、シナプシン、およびＧＦＡＰ）。細胞の電気的パラメータを、６、１３、および２５日後に生体外で試験した。ロスコビチンを導入した場合としない場合とで、細胞分裂を生体外で１〜８０日間試験した。
【図２】図２は、ロスコビチン（Ｒｏｓｃ）が、成熟した成体海馬ニューロンがｂＦＧＦの存在下で細胞周期に戻り、かつ生体外で分裂することを阻止することを示す。（Ａ）：成長因子の除去または分裂因子の添加後のニューロン集団。すべての０日目の細胞密度を１００に正規化して、比較を可能にした。Ｃ：対照標準培地および因子、ＦＧＦ−Ｐ：平板培地および維持培地の両方からｂＦＧＦを除去、ＦＧＦ−Ｍ：維持培地からｂＦＧＦを除去、Ｆ−１０：２ＤＩＶにおける１０μΜのＦｕｄＲ、Ｆ−５０：２ＤＩＶにおける５０μΜのＦｕｄＲ、ａｒａ−Ｃ：２ＤＩＶにおけるａｒａ−Ｃ、Ｔ−４０：２ＤＩＶにおける４０μΜのＴｒｏｌｏｘ、Ｔ−１００：２ＤＩＶにおける１００μΜのＴｒｏｌｏｘ、Ａ−１．５：２ＤＩＶにおける１．５μΜのＡｐｈ、Ｒ−１：２ＤＩＶにおける１μΜのＲｏｓｃ、Ｒ−５：２ＤＩＶにおける５μΜのＲｏｓｃ、Ｒ−１０：２ＤＩＶにおける１０μΜのＲｏｓｃ。（Ｂ）、（Ｃ）：異なる濃度のＲｏｓｃの生体外添加による神経細胞分裂および神経突起長への影響。すべての０日目の細胞密度を１００に正規化して、比較を可能にした。対照：ニューロンを処理しなかった。第１群：２日目〜６日目に１０μΜのＲｏｓｃ、６日目以降に２μΜのＲｏｓｃで処理されたニューロン。第２群：７日目〜１１日目に１０μΜのＲｏｓｃ、１１日目以降に２μΜのＲｏｓｃで処理されたニューロン。第３群：２日目〜６日目に５μΜのＲｏｓｃ、６日目以降に２μΜのＲｏｓｃで処理されたニューロン。Ｒｏｓｃで処理されなかった成体ニューロンは、密集するまで生体外で分裂し、一方で、５μΜのＲｏｓｃでの処理後のニューロンの集団は、生体外で安定していた。ニューロンは、５μΜのＲｏｓｃの存在下で、生体外においてＭＡＰ２、ＮｅｕＮを発現するが、Ｋｉ−６７を発現しない。
【図３】図３は、ｂＦＧＦ除去によるニューロンの生存および増殖への影響を示す。培養培地中のｂＦＧＦは、ニューロンを生体外で分裂させ、一方で、ｂＦＧＦの除去は、アポトーシスおよび壊死を介してニューロンの消失を引き起こした。すべての０日目の細胞密度を１００に正規化して、比較を可能にした。培養培地からのｂＦＧＦの除去は、ニューロン分裂を阻止したが、ｂＦＧＦを有さない培地中で培養したニューロン集団において６、７、および８日目に生体外でアポトーシスを誘発した。
【図４】図４Ａは、全細胞パッチクランプ電気生理学で試験した、６、１３、または２５日後の生体外における成体ラット海馬ニューロンの電気的特性を示す。ＤＩＶ＝生体外での培養日数、Ｖｍ＝静止膜電位、Ｒｍ＝膜抵抗、Ｃｍ＝膜キャパシタンス、Ｒｓｅｒｉｅｓ＝直列抵抗、Ｖｔｈｒ＝活動電位閾値電圧、ＡＰ＝活動電位。データを平均＋／−標準誤差で示す。図４Ｂは、単一の活動電位を発射し、かつ電位依存性イオンチャネルを介して電流を細胞内に／から移動させる成体ニューロンの電圧および電流固定の代表的なトレース。これらのトレースは、１３ＤＩＶ後の成体ラット海馬ニューロンに由来した。
【図５】図５は、ＭＥＡデータ処理を示す。ＭＥＡデータ処理：胚および成体ニューロンの自発的活性を、研究期間を通して毎日３分間記録した。それぞれの３分間データセットを３段階方法で処理した。この方法は、不活性またはノイズのあるチャネルを除外した。処理後、以下のパラメータを推定した：「活性チャネル」−０〜６４の数。１分当たり７．５未満のＡＰを有するチャネルを不活性とした。「ＡＰ周波数」−記録時間で割った測定された全ＡＰの数。その数の平均およびｓｔｄｅｖは、活性チャネルから独立している。「ＡＰ活性」−続く２つのＡＰ間の時間で割った１、または周波数１／秒。「バースト」−１を超えるＡＰが１ミリ秒で現れるもの。「平均バースト周波数」−続く２つのバースト間の時差で割った１。「インバースト周波数」−そのバーストの期間で割った、バースト内のＡＰの量。「ノンバースト周波数」−活性と同様であるが、バーストに関連付けられていないＡＰを考慮する。「バースト期間」−バーストにおける最初のＡＰからバーストにおける最後のＡＰまでの期間。
【図６】図６は、ＭＥＡ上での経時的な胚および成体海馬ニューロンの基本的な発射パターンを示す。胚および成体ニューロンの自発的活性を、研究期間を通して毎日３分間記録した。毎日の活性データを処理して、不活性チャネルを除外した。（Ａ）平均バースト周波数。（Ｂ）平均バースト長。（Ｃ）バースト内での平均発射頻度。（Ｄ）バースト外での平均発射頻度。
【図７】図７は、シナプスアンタゴニストの添加による成体もしくは胚自発的活性への影響の比較を示す。活性チャネル（Ａ、Ｂ）またはＡＰ周波数（Ｃ、Ｄ）を、培養培地中のＤ−ＡＰ５（２５μΜ）またはＣＮＱＸ（２５μΜ）の存在下で、１４ＤＩＶまたは３０〜６０ＤＩＶのいずれかの成体もしくは胚海馬ニューロンＭＥＡシステムにおいて評価した。成体ニューロンは、初期の１４ＤＩＶの培養物、ならびにより後期の３０〜６０ＤＩＶの培養物の両方におけるＤ−ＡＰ５のため、著しく低下した活性チャネルおよびＡＰ周波数を示した。この活性の低下は、より少ない数の活性チャネルが喪失し、かつ残りのチャネルで活性が増加した１４ＤＩＶの胚とは著しく異なる。ＡＭＰＡチャネルアンタゴニストＣＮＱＸは、自発的活性の低下も引き起こした。しかしながら、成体培養物と胚培養物との間の活性の低下は、成体系におけるより多くの活性チャネルの損失においてのみ反映された。ＡＰ周波数の低下は、これら２つの培養系の間で一致した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、以下の発明を実施するための形態の本発明の好ましい実施形態およびそれに包含される実施例、ならびに図およびそれらの前後の詳しい記述を参照することにより、より容易に理解され得る。
【００２０】
本発明は、成体神経細胞をｃｄｋ５阻害剤に暴露して、神経細胞の細胞分裂を制御することを含む方法を含む。この方法は、神経細胞を神経伝達物質に供することによって、神経細胞の電気的機能の発達を助長することをさらに含む。成体神経細胞は、神経伝達物質への暴露の前に電気的に機能し得る。
【００２１】
本発明は、試験および／またはスクリーニング目的のために、電気活性成体神経細胞を利用する組成物および方法を含む。ある態様において、方法は、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンまたはその膜部分を試験化合物に暴露することと、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンまたはその膜部分への試験化合物の影響を観察することとを含み得る。当業者は、試験化合物への少なくとも１つの電気活性成体神経細胞またはその膜部分の暴露前および暴露後に、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンまたはその膜部分の電気生理学を観察することができる。例えば、当業者は、試験化合物が電気活性を調節することを示す、少なくとも１つの電気活性成体神経細胞またはその膜部分の細胞膜にわたってイオン流動の上方調節または下方調節を観察することができる。観察され得る影響の他の非限定的な例には、活動電位の周波数および／または振幅の変化、寿命の変化、ロバスト性（健康状態）の変化、あるいは毒素または他の有害もしくは疾患誘発性物質の存在からの保護が挙げられ得る。成体ニューロンの供給材料は、正常な神経組織、既知の疾患状態からの神経組織、または疾患状態が疑われる神経組織もしくは未知の疾患状態からの神経組織であり得る。
【００２２】
本発明は、安定した電気活性ニューロンの集団を生成するための神経組織に由来する解離神経細胞培養系を含む。再生促進成長因子、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の作用および抗分裂因子の用量依存的適用を介して、ｃｄｋ５媒介性細胞周期進行は、最終分化した成体ニューロンの分裂を促進または制御するように活性化または不活性化され得る。改善された無血清培養系への細胞周期制御組成物の適用は、制御された条件下での一次成体神経細胞の増殖、または増殖することなく形態学的および機能的の両方で再生する安定した一次ニューロン集団の発達のいずれかを可能にする。これらのニューロンは、生体外におけるニューロンの付着、再生、および長期生存の促進において優れていることが以前に示された表面である、化学基質Ｎ−１［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）でコーティングされた培養表面に適用され得る（Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｊ．Ｊ．Ｈｉｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｍ．Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｍ．Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ａ．Ｅ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。実施例は、成体ラットの海馬に由来する神経細胞培養系を含む例示の系を示す。
【００２３】
細胞または組織を説明する文脈における、本明細書で使用される「成体」という用語は、最終分化した細胞、またはそのような細胞を含有する組織に関連する。対象（ヒトまたは非ヒト動物）を説明する文脈における「成体」という用語は、典型的には、生殖能力に到達した動物を意味する。成体細胞は成体対象から得られ得る一方で、非成体対象から細胞および／または組織を得ることもでき、その場合その非成体対象が出生後であり、かつその細胞および／または組織が最終分化している限り、依然として成体細胞および／または組織と見なされ得る。
【００２４】
本明細書で使用される「対象」とは、個体であり、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、テンジクネズミ、ラット、マウス、または他の齧歯類）、魚、鳥、爬虫類、または両生類を含むが、これらに限定されない。本用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、成体および新生対象、ならびに胎児は、雄または雌にかかわらず、包含されるよう意図される。「患者」とは、疾患または障害に罹患する対象である。「患者」という用語には、ヒトおよび獣医学的対象が含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される「ニューロン」とは、「神経細胞」である。これらの用語を同義に使用することができる。
【００２６】
本発明は、成体神経細胞（ニューロン）を組織試料から得ることと、得られた成体神経細胞を好適な条件下で成長因子に暴露して、神経細胞の細胞分裂を誘導することとを含む方法を含む。他の神経細胞、例えば、グリア細胞、支持細胞、シュワン細胞、または脳もしくは脊髄において見られる他の細胞、または神経組織に由来するとして当業者に既知の細胞は、サンプリングまたは培養時に神経細胞とともに含まれ得る。細胞分裂の誘導は、典型的には、ｃｄｋ５阻害剤への暴露による細胞分裂を制御するステップの前に生じる。細胞は、成長因子およびｃｄｋ５阻害剤の両方の存在下で維持され得る。
【００２７】
成体神経細胞は、解離培地の存在下で、例えば、成体神経組織の解離および酵素消化によって得られ得る。細胞が組織試料から得られた後、これらは、組織試料の機械的解離によって相互から分離され得る。その後、個々の成体神経細胞は、平板培地の存在下で、所望の期間、例えば、３日間基質にプレーティング（付着）され得る。基質上の細胞は、例えば、培養の３日目から培養の終わりまで維持され得る。細胞を培養する例示の方法は、本明細書の実施例に提供されており、当業者であれば、細胞増殖および付着期間、ならびに特定の培地への暴露期間を決定することができる。
【００２８】
本発明は、ａ）成体神経細胞を成長因子と接触させることと、ｂ）ステップａ）の神経細胞をｃｄｋ５阻害剤と接触させることと、その後、ｃ）ステップｂ）の神経細胞を神経伝達物質と接触させることとを含む、電気活性（機能的）ニューロンの集団を生成するための方法を含み、成体神経細胞は、電気活性ニューロンの集団に発達する。神経伝達物質の非限定的な例には、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン（５−ＨＴ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、ＧＡＢＡ、プロラクチン、一酸化窒素、ヒスタミン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、バソプレシン、オキシトシン、エンドカンナビノイド、内因性オピオイド（Ｍｕ−１、Ｍｕ−２、κ、δ、ＯＲＬ、σ受容体）、グリシン、およびＧＨＢが挙げられる。
【００２９】
成体神経細胞は、成体神経組織の試料から採取される細胞である。ある態様において、成体神経組織は、対象の中枢神経系由来の成体組織である。したがって、成体神経組織は、対象の脳または脊髄由来の組織であり得る。ある態様において、成体神経組織は、対象の脳由来の海馬組織であり得る。末梢神経系は、成体神経組織の供給源であり得る。
【００３０】
ある期間好適な条件下で成体神経細胞を成長因子と接触させることで、細胞分裂を誘導し、基質上での密集を達成する。いくつかの態様において、細胞は、成長因子の不在下で密集に到達し得る。成長因子による接触期間は、１時間〜約２日間、約３日間、約５日間、約１０日間以上、およびこれらの間の任意の期間の範囲であり得る。成長因子の非限定的な例は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。ある態様において、基質、例えば、ガラスカバースリップは、Ｎ−１［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）で処理されて、細胞接着面をもたらし得る。好適な平板培地において解離成体神経細胞をＤＥＴＡで処理されたガラスカバースリップに適用することは、細胞残屑の付着を最小限にしながらニューロンを付着させることを可能にする。
【００３１】
成体電気活性神経細胞を基質に付着させた後、細胞は、成長因子およびｃｄｋ５阻害剤を含み得る維持培地と接触することによって維持され得る。ｃｄｋ５阻害剤の非限定的な例には、ブチロラクトン、インドリノンＡ、およびロスコビチンが挙げられる。
【００３２】
図１は、成体ラット海馬組織を処理および解離して、解離神経細胞培養を作成および維持するための例示の細胞培養方法論を示す。表１は、電気活性成体神経細胞の集団を生成するために必要とされる解離培地（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）、解離培地（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）、平板培地、および維持培地の組成物を列記する。
【００３３】
成体電気活性ニューロンの集団は、成体神経細胞を解離することによって作成され得る。解離培地の存在下でのラット海馬組織由来の成体電気活性ニューロンの集団が実施例に示される。解離培地の組成物について、表１を参照されたい。ある期間、例えば、４〜５時間後、成体神経細胞は、解離培地の存在下で相互から解離され得る。約１〜２時間後、解離細胞は、ＤＥＴＡで被覆された基質、例えば、ガラスカバースリップ上に５００μＬの平板培地でプレーティングされ、その後、ハイバネートＡおよびいくらかの新鮮な平板培地で洗浄され得る。約３回の細胞分裂後、平板培地は、維持培地および５μΜのロスコビチンと完全に取り換えられ得る。その後の細胞分裂が４回生じるごとに、維持培地の半分が、新鮮な維持培地および２μΜのロスコビチンと取り換えられ得る。細胞は、電気活性を達成する好適な条件下で継代および培養され得る。その後、開示の方法によって作成される１つ以上の電気活性ニューロンは、微小電極アレイ（ＭＥＡ）上に配置される。神経細胞は、再生後、電気的に活性であり得る。
【００３４】
表面と、その表面上に配置される少なくとも１つの電気活性成体ニューロンとを有する微小電極アレイを備えるＭＥＡシステムがさらに開示され、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンは、成体神経組織由来である。ある態様において、少なくとも１つの電気活性成体ニューロンは、ｃｄｋ５阻害剤、例えば、ロスコビチンに暴露されている。別の態様において、開示のＭＥＡシステムの表面は、ＰＤＬ（ポリヌクレオチド−Ｄ−リジン）およびラミニンで処理される。
【００３５】
本発明は、電気活性ニューロンの集団を含む組成物を含む。そのような組成物は、ａ）成体神経細胞を成長因子と接触させることと、ｂ）ステップａ）の神経細胞をｃｄｋ５阻害剤と接触させることと、その後、ｃ）ステップｂ）の神経細胞を神経伝達物質と接触させることとを含む方法によって生成され得、成体神経細胞は、電気活性ニューロンの集団に発達する。
【００３６】
本発明は、ａ）表面と、その表面上に配置される少なくとも１つの電気活性成体ニューロンとを有する微小電極アレイを備えるＭＥＡシステムを、試験化合物と接触させることと、ｂ）少なくとも１つの電気活性ニューロンまたはその膜部分電気活性の変化を検出することとを含む、電気活性成体ニューロンの電気活性に影響を与え得る化合物を特定する方法を含み、少なくとも１つの電気活性ニューロンまたはその膜部分の電気活性の変化の検出は、電気活性成体ニューロンの電気活性に影響を与え得る化合物を特定する。ある態様において、電気活性成体ニューロンは、成体神経組織、例えば、哺乳動物の脳由来である。別の態様において、電気活性の変化は、活動電位の周波数および／または振幅の変化、自発的ニューロン活性の変化、イオン流動の変化、寿命の変化、ロバスト性（健康状態）、あるいは毒素または他の有害もしくは疾患を引き起こす作用物質の存在からの保護を含む。細胞による活動電位の発射の停止は、神経細胞の変化を示す。
【００３７】
本発明は、表面張力に基づくバルブを用いた自動トップオフシステムを備え、これは、ある例において、いかなる可動部品も電子制御デバイスも必要としない。例のトップオフシステムは低価であり、マイクロ流体および／またはハイスループットシステムを小型化するのに便利である。別の態様において、本発明は、オペレーターの操作なしで、ウェル、例えば、培養ウェルを所望のレベルに自動的に充填する液体取扱システムを備える。例示のシステムにおいて、流体は、別個の貯蔵所に保存され、管類は、それぞれのウェルに特異的に割り当てられる。より具体的には、サイフォンシステムは、受容ウェルの表面張力に基づいて、流体貯蔵所から個々のウェルまで培地を通過させる。液体は、パルブキャップ等のシールが開放しているときに受動的に添加される。シールが閉鎖され、最初の流動が誘導された後、液体培地は、手動操作なしで、吸引ウェルにおいて一定のレベルで維持される。非限定的な例の適用には、ハイスループット細胞培養およびハイスループット生体外薬物スクリーニングが挙げられる。本発明の細胞とともに使用され得るマイクロ流体デバイスの例については、米国特許公開第２０１１００８６４２７号、同第２００９／００５３７４９号、および同第２００４０２５９１７７号を参照されたい。細胞およびそのようなマイクロ流体デバイスの実装は、薬物スクリーニングのために使用され得る。本発明は、マイクロ流体デバイスまたは三次元多細胞代用組織アセンブリのシステムまたは組み合わせにおいて使用され得、システムまたはアセンブリの少なくとも１つの構成要素は、電気活性ニューロンの集団を含み、デバイスは、システムのそれぞれの組織アセンブリを開始、培養、操作、およびアッセイするために使用される。
【００３８】
薬物スクリーニングのための別の技法は、ロボット型のシステムを利用する化合物のハイスループットスクリーニング（例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ８４／０３５６４号を参照のこと）を提供する。例えば、米国特許公開第２０１００２９７６８５号および同第２０１００１０５０７４号を参照されたい。例えば、多数の異なる小試験化合物は、プラスチックピン等の固体基質、またはその他の表面上で合成される。試験化合物は、本出願の開示の細胞またはその部分と反応させられ、洗浄される。その後、細胞は、市販の機械類および方法、例えば、液体取扱者とインタフェースをとってアッセイを最適化する直接統計分析を可能にする自動化アッセイ最適化（ＡＡＯ）ソフトウェアプラットフォーム（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳＡ）；ＣＲＳ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ）が提供するモジュラーシステム、ＰＯＬＡＲＡＴＭ（ＣＲＳ）を用いて様々な企業が提供する液体取扱システム、リーダ、およびインキュベータ、超ハイスループットスクリーニングシステム用のオープン構造実験室自動化ソフトウェア；ユーザが新たな機器にプラグ接続することによって自動化プラットフォームを再構成することを可能にするよう設計された３Ｐ（Ｐｌｕｇ  ＆  Ｐｌａｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｓ）科学技術（ＲＯＢＯＣＯＮ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）；ＨＴＳ、超ＨＴＳ、および高速プレート調製を含む幅広い発見適用を可能にするＡｌｌｅｇｒｏ（商標）システムまたはＳｔａｃｃａｔｏ（商標）ワークステーション（Ｚｙｍａｒｋ）；実験室自動化プログラミングおよび統合のためのＭＩＣＲＯＬＡＢベクターソフトウェア（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ．，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖ．，ＵＳＡ）等を用いて、当技術分野で周知の方法によって検出される。
【００３９】
これらの機械および方法のうちのいずれかについて、アッセイは、試験化合物が有効であり得る検出可能な証拠を提供する標的細胞による応答を測定する。例えば、細胞の応答には、形態の変化、ニューラルプロセス、またはシナプス形成が含まれ得るが、これらに限定されない。検出可能なシグナルは、対照細胞と比較され、検出可能なシグナルは、減算分析によって特定される。「標的化」一定分量と「非標的化」一定分量との間の差の相対存在量は、「減算」分析（示差分析）技法、例えば、示差表示、表現差異分析（ＲＤＡ）、ＧＥＭ遺伝子発現マイクロアレイ（米国特許第５，５４５，５３１号）、抑制減算ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）、および直接配列決定（ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１７９５７号）を用いて同時に比較される。減算分析は、示差表示、表現差異分析（ＲＤＡ）、抑制減算ハイブリダイゼーション（ＳＳＢ）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現マイクロアレイ（ＧＥＭ）、核酸チップ科学技術、または直接配列決定の方法を含み得る。
【００４０】
本発明が、特定の合成方法、特定の培養条件、または特定の細胞に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定するよう意図されていないことも理解されたい。したがって、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件等、またはそれらのサブクラスへの言及は、限定するよう意図されていないが、その考察が提示される特定の文脈において興味のあるものまたは価値のあるものとして当業者が認識するであろうすべてのそのような関連物質を含むよう解釈されるべきである。例えば、異なる既知の方法が、推奨される方法、物質、または組成物の使用が対象とする目標と同一の目標を達成するために使用されるように、多くの場合、ある緩衝系または培養培地を別の緩衝系または培養培地に置き換えることが可能である。
【００４１】
本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本明細書で定義されない限り、当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有するよう意図される。本明細書で用いられる技法も、別途述べられない限り、当業者に既知の技法である。
【００４２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの（ａｎ）電気活性成体ニューロン」への言及は、１つまたは複数の電気活性成体ニューロンを含み得る。「１つの（ａ）培地」への言及は、１つの培地または２つ以上の培地の混合物等を含む。
【００４３】
範囲は、本明細書において、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までの範囲として表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、その一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が、前に「約」を用いて近似値として表現されるとき、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。それぞれの範囲の終点が、他の終点と関連して、および他の終点とは独立しての両方で有意であることがさらに理解される。
【００４４】
本明細書および以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有するよう定義されるいくつかの用語について言及する。
「任意の」または「任意に」は、その後に説明される事象または状況が生じる場合と生じない場合があり、その説明は、その事象または状況が生じる例およびその事象または状況が生じない例を含むことを意味する。例えば、「〜の前に任意に接触する」という語句は、接触が規定の事象またはステップの前に生じる場合と生じない場合があることを意味する。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例は、当業者に、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法をいかにして作製および評価するかの完全な開示および説明を提供するために説明され、純粋に本発明の例示を意図するものであり、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定するようには意図されない。数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証する努力がなされているが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、温度は摂氏温度であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い。
【００４６】
［実施例１：成体ラットの海馬に由来するニューロンを培養するための条件］
成体培養系のすべてのパラメータを、生体外におけるニューロン付着、再生、および長期生存の支援のために最適化した（図１、表１）。細胞培養プロセス中の細胞外傷を、最初に解離培地の温度を４℃に低下させることによって最小限に抑えた。次に、脳断片中の細胞外マトリックスタンパク質および結合組織を、パパイン（Ｃａ２＋を除いた２ｍｇ／ｍＬのＨＡ、３７℃の振盪水浴、１分間当たり８０回転）を用いて消化し、その後、組織のすすぎ洗いを繰り返して、酵素を不活性化した。組織解離中に放出されたフリーラジカルからの酸化的損傷を、解離および平板培地中に強力な抗酸化物質Ｔｒｏｌｏｘ（Ｄ．Ｍｕｌｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）およびデキストロースでコーティングされた酸化セリウムナノ粒子（Ｍ．Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を含ませることによって制限した。アポトーシス性物質からの直接的な神経保護を、カスパーゼ阻害剤（１、３、および６）を解離培地に添加することによって達成した。細胞外傷を最小限に抑えながら細胞崩壊を最大化するために、組織を火加工（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）ガラスパスツールピペットで解離した。最後に、解離ニューロンを、平板培地中で４５分間、細胞接着面ＤＥＴＡでコーティングされたガラスカバースリップ上に適用して、細胞残屑の付着を最小限に抑えながら、付着ニューロンが付着することを可能にした。このプレーティング期間後、カバースリップを温ＨＡ（３７℃）で穏やかに洗浄して、ミエリン鞘（Ｙ．Ｚ．Ａｌａｂｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）の崩壊後に存在するミエリン阻害因子を含む細胞残屑の大半を除去させた。これらの基本的な培養パラメータの改善は、ニューロンの生存および再生を最適化し（図２〜３）、生体外制御環境下において成体ニューロンによって呈された電気的特性および発現パターンに関する研究を可能にした（図４）。
【００４７】
［実施例２：生体外での成熟したニューロンにおける細胞周期進行の阻害］
成長因子および転写因子メディエータ（図１）の時間および用量依存的適用とともに、培地組成物（表１）を適用して、ニューロンの回復および長期の機能的生存を促進した。これらの改善された培養系パラメータは、成体ニューロンをサポートしたが、これらの最終分化した一次ニューロンが細胞周期および分裂に入ることも強要した。重要な成長因子、具体的には、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および解離細胞培養条件は、成体ラット海馬組織に由来する成熟したニューロンの生存および再生をサポートしたが、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）発現の上方制御を介して、細胞周期および分裂に再び入ることも誘発した（Ｓ．Ｂ．Ｒｏｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｈ．Ｋａｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｌ．Ｍｕｎａｒｏｎ，２００２、Ｓ．Ｍ．Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｓｈａｒｍａ，２００５、Ｓ．Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｓｈａｒｍａ，２００７）。ニューロンが密集に到達した後に、これらのニューロンの有糸分裂をインビトロで停止させ（図２Ｂ、対照）、以前に分裂していたこれらのニューロンは、２５μΜのグルタメートを培養培地に少なくとも２４時間添加した後に、形態学的回復および電気的回復の両方を呈することが示された（Ｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。このシステムの有用性にもかかわらず、一次解離ニューロンのより意義ある研究のためには、ニューロンの急速な増殖を排除しなければならない。
【００４８】
一次最終分化した成体海馬ニューロンが細胞周期に戻って分裂することを阻止するために、複数の戦略を調査した。細胞培養条件下で増殖を阻止するための最終的に功を奏した戦略は、競合性ｃｄｋ阻害剤であるロスコビチンの添加であった。１、５、および１０μΜのロスコビチンを、ニューロン分裂の開始前（２ＤＩＶ）およびニューロン分裂の開始後（７ＤＩＶ）に、培養培地に導入した（図２Ａ、Ｂ）。１μΜのロスコビチンを２日目に適用したとき、細胞集団は、ロスコビチンなしの細胞集団よりも緩徐に増加した（図２Ａ）。１０μΜのロスコビチンは、２日目に適用したとき、ニューロン集団の減少を引き起こし、７日目に導入したときに、ニューロンを大幅に喪失させた（図２Ｂ）。５μΜのロスコビチンを２〜７日目に、かつ長期の「ブースター」濃度として２μΜのロスコビチンを７日目以降に生体外で適用することにより、安定したニューロン集団を得た（図２Ｂ）。加えて、この安定したニューロン集団の健康状態および成熟度は、未処理の対照ニューロンと比べて平均して４〜５倍も長いこれらのニューロンによる一次軸索の急速かつ長期にわたる伸長において明らかであった（図２Ｃ）。この細胞培養系およびロスコビチン処理を用いて、安定した成体ラットの海馬に由来するニューロン集団を得た。対照ニューロン集団が増殖して密集したが、ロスコビチンで処理されたニューロン集団は増殖して密集しなかった。これらのロスコビチンで処理された培養された非増殖性ニューロンは、培養された胚ニューロンにおいてのみ先に見られた形態学的特性を呈した。さらに、これらの非増殖性ニューロンは、成熟したニューロンマーカーＭＡＰ２およびＮｅｕＮを発現したが、増殖性細胞の核マーカーＫｉ−６７は発現しなかった。培養の数週間後、ニューロン集団は、生体外で、安定した状態を保ち（図２Ａ、Ｂ）、わずかのニューロンしかＤＥＴＡ表面から剥離しなかった。
【００４９】
生体外でのニューロン増殖の阻止において無効であると最終的に証明された有糸分裂排除の他の戦略も調査した。最初に、ｂＦＧＦを平板培地および／または維持培地から除去した。ｂＦＧＦを含まない培地に暴露されたニューロンは、分裂しなかった。しかしながら、ｂＦＧＦを欠乏したニューロン集団は、変化しないままではなく、生体外で急速に減少し、ニューロンのほぼ完全な喪失は、２週間後に明らかであった（図２Ａ：ＦＧＦ−ＰおよびＦＧＦ−Ｍ、４Ａ）。この２週間の間に、ニューロンの形態は劇的に変化し、軸索および分岐樹状突起は、細胞体に向かって退縮し、細胞体を包囲する神経突起の分岐環を最終的に形成した。因子ｂＦＧＦが、ニューロンの生存、回復、および再生を支援するための無血清培養培地の不可欠な成分であることが判明した。
【００５０】
培養されたニューロンの分裂を排除する有糸分裂阻害剤も調査した。ＦｕｄＲ（１０および５０μΜ）ならびにａｒａ−Ｃを２ＤＩＶの培養培地に添加した（図２Ａ：Ｆ−１０、Ｆ−５０、およびａｒａ−Ｃ）。すべての分裂細胞がアポトーシスを余儀なくされ、ニューロン分裂を阻止するのではなく、培養された一次ニューロンを排除したため、この戦略は失敗に終わった。両方ともに潜在的な抗有糸分裂活性を有する、さらなる新たな作用物質であるトロロックスおよびアフィディコリンを、この培養系におけるニューロンの分裂を阻害するために試験した。癌性ヒト乳癌細胞に対して抗有糸分裂特性を有する抗酸化物質、トロロックス（Ａ．ｅ．ａ．Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，１９９３）は、４０μΜおよび１００μΜの両方ともに、一次ニューロンが生体外で周期に戻ることを阻止するのに有効ではなかった（図２Ａ：Ｔ−４０、Ｔ−１００）。しかしながら、その抗酸化物質活性がニューロンの生存を改善することが認められ（図２Ａ）、それを７０ｎＭで解離培地および平板培地の両方に組み込んだ（表１）。骨髄細胞分裂に対して以前に有効であった細胞周期阻害剤、アフィディコリン（Ｄ．Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，２０００）も、有効な抗有糸分裂活性を呈さなかった。１．５μΜ（ニューロンが細胞周期に戻るのを妨げるのに十分に高い濃度）で、アフィディコリンは、大半の培養されたニューロンを壊死またはアポトーシスのいずれかにさせ（図２Ａ：Ａ−１．５）、神経突起の再生およびこれらの生存するニューロンの機能的電気的特性を制限した。
【００５１】
［実施例３：有糸分裂活性の排除後の、生体外における成体海馬ニューロンの電気活性および膜チャネル発現］
ニューロンを、全細胞パッチクランプ電気生理学を用いて、６、１３、および２５ＤＩＶ後の電気的回復について評価し、電流を細胞内に／から移動させ、かつ活動電位を発射および伝播する能力によって定義されるニューロンの電気的電位を評価した。生体外での電気活性の回復が、抑制されることなく分裂することを許容されたニューロン集団と、有糸分裂がロスコビチンの適用によって阻止されたニューロンとの間で著しく異なることが分かった。生体外で抑制されることなく有糸分裂的に分裂することを許容されたとき、ニューロンは、最大３週間、生体外において電気的に完全に回復せず、その後、ニューロンが密集に到達し、かつ２４時間を超えて２５μΜのグルタメートで刺激された後にのみ回復した（Ｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ロスコビチン（生体外で２〜７日目に５μΜ、その後、７日目後は２μΜのロスコビチン）の適用による生体外でのニューロン分裂の阻止は、生体外でのニューロンの電気的回復に必要とされる時間スケールを著しく変化させた。グルタメート（２５μΜ）を５ＤＩＶ後に適用した。ニューロンは、６ＤＩＶ後に回復し、電流を細胞内に／から移動させる能力を示し、活動電位も発射した（図４Ａ、１列目）。静止膜電位（Ｖｍ）の増加、膜抵抗（Ｒｍ）の増加、電流フローの増加（内向きナトリウムおよび外向きカリウムの両方）、ならびに活動電位振幅の増加において見られるように、これらのニューロンのさらなる回復が１３および２５ＤＩＶ後に見られた（図４、Ａ）。図４Ｂは、ニューロン内への／からの電流フローおよび活動電位を呈する例のトレースを示す。
【００５２】
［実施例４：タンパク質発現は、生体外における成体海馬ニューロンの成熟度を示す］
この系で培養されたニューロンの成熟度を調査した。有糸分裂的に増殖することを許容されたニューロンを、ニューロフィラメント−Ｍ、Ｋｉ−６７、およびＮｅｕＮの発現について調査した。ニューロン特異的構造タンパク質ニューロフィラメント−Ｍについて陽性であったが、いずれのニューロンも成熟したニューロン核マーカーＮｅｕＮについて陽性ではなかった。その代わりに、すべてのニューロンは、細胞周期において活性である分裂中ニューロンにおいてのみ発現されるＫｉ−６７について陽性であった。ロスコビチンを細胞培養培地に添加した後、ニューロンはもはや分裂せず、発現パターンが変化した。ニューロンは、依然として、成熟した構造タンパク質（ＭＡＰ２）を発現したが、増殖マーカーＫｉ−６７の代わりに、成熟した核マーカーＮｅｕＮを発現した（図２Ｅ）。これらのニューロンをＮＭＤＡチャネルサブユニット発現についても調査した。この細胞培養系におけるニューロンを、２つのサブユニットのそれぞれについて免疫細胞化学的に調査したところ、ＮＲ２ＡサブユニットがＮＲ２Ｂサブユニットの数を上回り、両方のサブユニットが存在した。
【００５３】
［実施例５：生体外における一次ニューロン集団の拡張］
ｂＦＧＦおよびロスコビチンの組み合わせは、ニューロン集団を安定した状態で保ち得るか、または拡張し得る最終分化した一次成体海馬ニューロンの培養系を可能にした。これらのニューロンが、図および表１に記載の基本的な培養条件下で、すなわち、ロスコビチンなしで拡張されたとき、３つのはっきりと異なる段階が観察された。段階１（０〜３ＤＩＶ）において、成熟したニューロンは、ニューロフィラメント−Ｍ（脳内のニューロンに固有である１５０ｋＤａの構造タンパク質）およびＮｅｕＮ（成熟したニューロンにおいてのみ発現する核マーカー（Ｒ．Ｊ．Ｍｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２））の発現によって示されるように、細胞培養の外傷から回復することができ、形態学的に再生した。平板培地の成分（表１）、具体的には、モル浸透圧濃度の調整を伴った成長因子、抗酸化物質、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａは、この回復および再生に不可欠であった。段階２（３〜２１ＤＩＶ）において、維持培地中のｂＦＧＦ（表１）は、ｃｄｋ５発現を上方制御するその活性を介してニューロンが細胞周期に再び入るように誘導した（Ｂ．−Ｓ．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｚ．Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｓ．Ｍ．Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｓｈａｒｍａ，２００５、Ｂ．Ｍｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。以前に休止状態にあって長い軸索および分岐樹状突起を有していた最終分化した位相光沢ニューロンは、最初にそれらの神経突起を細胞体に退縮させ、分裂し、最終的に、それらの軸索および樹状突起を再伸長し、観察された期間は、神経突起退縮、分裂、および神経突起伸長まで平均して９０分間であった。いちど分裂したニューロンは、この細胞分裂プロセスを繰り返し、平均して２４〜３６時間毎に数が倍になる。これらの期間中、ニューロンは、発現パターンがニューロンおよび分裂細胞の両方と一致した状態を呈し、すべての細胞が、ニューロン形態とＫｉ−６７（増殖性細胞の核マーカー（Ｔ．Ｓｃｈｏｌｚｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｇｅｒｄｅｓ，２０００））およびＮｆ−Ｍの発現との両方を呈した。しかし一方で、これらの分裂ニューロンは、ＮｅｕＮを発現しなかった。段階１におけるすべてのニューロンのパターン、具体的には、すべての細胞が成熟したニューロンマーカーを発現していること、ならびに段階２にわたる増殖マーカーの普遍的発現のパターンに基づいて、分裂しているのは成熟したニューロンであり、海馬の歯状回に存在することで知られている神経前駆細胞のサブセットではないことが決定された。より小さい前駆ニューロン集団の増幅のみが生じていたのであれば、存在するニューロンの一サブセットのみがＫｉ−６７発現の証拠を示していたはずである。
【００５４】
段階３（２１〜９０ＤＩＶ）において、ニューロンは密集に到達し、増殖を停止し、この時点でＫｉ−６７のニューロン発現が終了し、かつＮｅｕＮが再び現れた。しかしながら、密集したニューロンを、１つのＤＥＴＡカバースリップから複数のＤＥＴＡカバースリップへと、より低い細胞密度にて継代すると、１つのカバースリップ単独において見られる増殖を超える継続的なニューロン増殖が可能となり、段階２が延長された。段階２の間、ニューロン電気活性、具体的には、電流を細胞内に／から移動させ、かつ活動電位（ＡＰ）を発射する能力は、限定されたか、または存在しなかった。細胞が段階３に進むときに、ニューロンを刺激して、維持培地に２５μΜのグルタメートを導入することにより、それらの電気活性が回復した。ニューロンにおける前条件付けを阻止するために以前に使用されたタンパク質合成の阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｆ．Ｃ．Ｂａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が、グルタメートとともにニューロンをインキュベートすることによって誘導されるタンパク質合成のすべての可能性のある変化を阻止するために使用されたとき、ニューロン電気活性のすべての改善は、完全に阻止された。グルタメートの導入は、以前に分裂していたニューロンを成熟させる細胞転写活性を媒介した（Ｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００５５】
［実施例１〜５の材料および方法］
ＤＥＴＡ表面改質および解析
ガラスカバースリップ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ６６６１Ｆ５２、２２ｍｍ×２２ｍｍ、１号）を、濃縮塩酸およびメタノールの５０／５０の混合物を用いた酸洗浄によって洗浄した。カバースリップを３回洗浄し（１回につき３０分間）、それぞれの洗浄毎に蒸留脱イオン水中ですすいだ。ＤＥＴＡ（Ｎ−１［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−ジエチレントリアミン、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ，Ｔ２９１０ＫＧ）単層を、洗浄された表面と新たに蒸留されたトルエン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔ２９０４）中のオルガノシランの０．１％（ｖ／ｖ）混合物との反応によって形成した（Ｍ．Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＤＥＴＡでコーティングされたカバースリップをトルエンの沸点直下まで加熱し、トルエンですすぎ、沸点直下まで再加熱し、その後、炉乾燥させた。ＤＥＴＡは、カバースリップの表面上に反応部位限定単層を形成した（Ｍ．Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＤＥＴＡカバースリップを解析して、単層形成を確証した。最初に、光学接触角度ゴニオメーター（ＫＳＶ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＣＴ，Ｃａｍ２００）を用いて接触角度を測定した。ＤＥＴＡでコーティングされたカバースリップの接触角度は５４．２±０．２であり、これは、ニューロン海馬培養に許容されると以前に示されている（Ｍ．Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。次に、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）（ＦＩＳＯＮＳ  ＥＳＣＡＬａｂ  ２２０ｉ−ＸＬ）を用いて、ＤＥＴＡでコーティングされたカバースリップ表面の元素状態および化学状態を解析した。単色Ａｌ  Ｋα励起を用いたＸＰＳ調査スキャンならびに高解像度のＮ  １ｓおよびＣ  １ｓスキャンを得たが、以前に報告された結果に類似していた（Ｍ．Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｍ．Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００５６】
成体ラット海馬培養に使用される細胞培養方法論および培地
海馬成体ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、６〜１２月齢）を解剖し、ハイバネート−Ａ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、および抗生物質抗真菌薬からなる冷培地（約４℃）中で均質化して小組織断片にした。その後、組織を、６ｍｇのパパイン／１２ｍＬ（ＨＡ）を含有するカルシウムを含まないハイバネート−Ａ（ＨＡ）中で、３７℃で３０分間消化した。消化後、組織を冷ハイバネート−Ａ培地で３回洗浄し、すべての活性酵素を除去した。次に、ラットおよびマウス成体脳組織を個々の細胞へ解離するために調製された解離培地（表１）中に組織を懸濁し、火加工パスツールピペットでの機械的解離を介して個々の細胞に解離した。解離細胞を、組織解離後にニューロン付着および再生を促進させるために使用した平板培地（表１）中に懸濁し、その後、ＤＥＴＡでコーティングされたガラスカバースリップ上に３０〜４５分間沈着させた。そのトリアミン官能基が表面に暴露されたＤＥＴＡは、ニューロンに強力に付着し、ＥＣＭタンパク質、ミエリンデブリ、および細胞断片等のすべての非ニューロンデブリがカバースリップ表面から洗浄されることを可能にする（Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｊ．Ｊ．Ｈｉｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｍ．Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ａ．Ｅ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。この洗浄ステップ後、新鮮な平板培地を適用し、最初の３ＤＩＶのあいだ静置した。３ＤＩＶおよびその後４日おきに、培地の半分を除去し、維持培地と取り換え（図１、表１）、これらのニューロンの長期維持を支援した。細胞培養プロセスのそれぞれの段階で示される課題を特異的に満たすために、それぞれの種類の培地を調製して、著しく改善された生存、再生、および長期成長を可能にした（表１、図１）。培地のモル浸透圧濃度を調整して、成体ラット脳脊髄液のモル浸透圧濃度（２９５〜３０５ｍＯｓｍ）と一致させた（Ｓ．Ｃ．Ｂａｒａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｒ．Ａ．Ｆｉｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄ．Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，２００２）。解離培地（表１）において、組織解離中のカスパーゼ阻害剤および抗酸化物質の使用（Ｍ．Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）は、酸化的損傷および通常この段階中の細胞損傷に由来するアポトーシスへの進行の両方を最小限に抑えた。平板培地（表１）にこれらの抗酸化物質、ならびに特定の成長因子を含ませることで、生体外でのニューロンの付着および再生が促進することが見出された。長期生存のために、抗酸化物質を維持培地（表１）から除去した。
【００５７】
生体外でのニューロン分裂の制御
ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１３２５６−０２９、５ｎｇ／ｍＬ）は、密集するまで神経細胞増殖を誘発し、この期間は、急速なニューロン分裂、および機能的電気活性の制限または欠如の両方によって特徴付けられた。ニューロンの密集後、２５μΜのグルタメート（（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸、Ａｌｄｒｉｃｈ、８５５６４２）は、ニューロンの電気的回復の誘導を誘発する（Ｄ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。この培養系におけるニューロン分裂の制御を以下のように実験的に調査した：（１）平板培地および維持培地の両方からのｂＦＧＦの除去、（２）１０μΜおよび５０μΜのフルオロデオキシウリジン（ＦｕｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ−０５０３）の添加、（３）アラビノシド−Ｄ（ａｒａ−Ｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｃ−６６４５）に加えてデオキシシチジンの添加、（４）４０μΜおよび１００μΜのトロロックス（Ｓｉｇｍａ、２３８８１３）の添加、（５）１．５μΜのアフィディコリン（Ａｐｈ、Ｓｉｇｍａ、Ａ０７８１）の添加、（６）１μΜ、５μΜ、および１０μΜのロスコビチン（Ｒｏｓｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｒ７７７２）の添加。すべての因子をニューロン分裂の開始前（２ＤＩＶ）に、いくつかを分裂の開始後（３ＤＩＶ後）に添加した。
【００５８】
電気生理学
全細胞パッチクランプレコーディングを室温で行った。ｐＨをＨＥＰＥＳ酸および塩基で７．３に、イオン濃度をＮａＣｌで約１３０ｍＭに、およびモル浸透圧濃度を２９０〜３００ｍＯｓｍに調整した。維持培養培地中の細胞を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ、２ＦＳ  Ｐｌｕｓ正立顕微鏡を用いてステージ上で可視化した。パッチピペット（４〜８ΜΩ）を約２６０ｍＯｓｍのモル浸透圧濃度の細胞内液（１４０ｍＭのＫ−グルコネート、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａ２ＡＴＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で充填した。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ａ（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ）増幅器を用いて電位固定および電流固定実験を行った。Ａｘｏｎ  Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２２Ａインタフェースを用いて、シグナルを３ｋＨｚでフィルタリングし、２０ｋＨｚでデジタル化した。データレコーディングおよび分析をｐＣｌａｍｐソフトウェアを用いて行った。全細胞キャパシタンスおよび直列抵抗を電子的に補正した。２２ΜΩ未満のアクセス抵抗を有する細胞のみを分析した。高速のナトリウム電流の特性を有した内向き電流、およびカリウム電流の特性を有した外向き電流を、−７０ｍＶの保持電位から１０ｍＶの電圧ステップを用いて、電位固定モードで測定した。１秒間の脱分極電流注入で活動電位を測定し、活動電位を−７０ｍＶの保持電位から導き出した。電気生理学的解析のために、細胞を形態学的に選択した。選択された細胞は、大きい分岐先端樹状突起および小さい基底樹状突起を有する位相光沢錐体ニューロンであった。この形態を有する細胞は、抗ニューロフィラメント−Ｍ（Ｎｆ−Ｍ）および／またはＭＡＰ２について陽性染色された。ニューロンを６、１３、および２５ＤＩＶ後に電気的に解析した。
【００５９】
免疫細胞化学
細胞を調製して免疫細胞化学的に解析するために、カバースリップをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすいだ。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで、室温で１０分間固定し、その後、ＰＢＳで３回すすいだ。細胞をＰＢＳ中、５ｍＭのリジンおよび０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間透過処理し、その後、５％の正常ロバ血清を添加することにより２時間ブロックした。抗ニューロフィラメント−Ｍポリクローナル抗体（Ｎｆ−Ｍ、成熟したニューロンで見出される細胞内フィラメント、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ１９８１、１：１０００に希釈）、抗ＮｅｕＮ（成熟したニューロン中の核マーカー、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１０００に希釈）、抗Ｋｉ−６７（分裂細胞の核マーカー、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１０００に希釈）、抗ＮＲ２Ａ（シナプス後細胞膜において発現されるＮＭＤＡチャネルサブユニット、ＡＢ１５４８、１：７５に希釈）、抗ＮＲ２Ｂ（シナプス後細胞膜において発現されるＮＭＤＡチャネルサブユニット、ＭＡＢ５２１６、１：１５０に希釈）をブロッキング溶液中に４℃で１２時間添加した。ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０１１、Ａ２１４４９、およびＡ１１０２９）を２時間適用した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ培地（Ｈ１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、カバースリップをスライド上に載置した。カバースリップをＵｌｔｒａ  ＶＩＥＷＴＭ  ＬＣＩ共焦点画像化システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で観察した。
【００６０】
統計分析
数値での要約結果を平均の標本標準偏差範囲（±ＳＥＭ）として報告する。カバースリップ上にプレーティングした直後の神経細胞密度を１００に正規化して、成長因子除去または分裂因子介入の影響の比較を可能にした。２群間の比較において、統計分析は、電気生理学的データにおける２試料スチューデントｔ−検定を含んだ。
【００６１】
［実施例６：拡張可能な神経細胞株を作成するための、最終分化した成熟ニューロンにおける細胞周期の操作］
成体ラットの海馬に由来する最終分化した成熟ニューロンの集団を拡張し、その集団を４回継代し、毎回の継代後に集団の半分を増殖停止させ、その後、電気的に解析する。
【００６２】
方法：最終分化した成熟ニューロンを成体ラットの海馬から抽出し、ＤＥＴＡカバースリップ上にプレーティングした。培養培地中のｂＦＧＦは、これらのニューロンが細胞周期に再び入って増殖し、カバースリップ上に密集することを引き起こした。以下の継代プロトコルを用いた。
細胞継代技法（手短に）：
１．初期培養−２匹の成体ラットを１時間プレーティング。時間後洗浄によりミエリンデブリを除去、および平板培地の添加。
２．カバースリップ（複数を含む）上での細胞密集（生体外で約１４〜２３日間）−初期継代。
ａ．カバースリップ（複数を含む）をＨＢＳＳ中０.０５％トリプシン／ＥＤＴＡでトリプシン処理した。
ｂ．最初の細胞解離時にトリプシン阻害剤を添加した。
ｃ．細胞表面を洗浄し、１５ｍＬのフラスコ内に除去し、５００Ｘｇで５分間回転させた。
ｄ．さらに２回洗浄した後、新鮮なＤＥＴＡカバースリップ上に再度プレーティングした。
カバースリップ（複数を含む）の半分：ｃｄｋ阻害剤ロスコビチンで増殖停止し、その後、電気生理学を用いて電気的に解析した。
カバースリップ（複数を含む）の半分：増殖を続け、その後、継代した。
３．その後の継代。細胞は付着し、回復／増殖して密集した。
４．密集後、ニューロンを解離し、新鮮なＤＥＴＡカバースリップおよび／または微小電極アレイ上に再度プレーティングした。
【００６３】
［実施例７：ハイスループットＭＥＡシステムにおける成体ニューロン機能およびシナプス活性：胚または成体脳由来のニューロン間の差次的発現パターン、シナプス結合、ネットワーク通信、ならびに薬物および治療的介入への応答］
微小電極アレイ（ＭＥＡ）は、解離培養物由来の集団ニューロンにおけるシナプス活性および神経結合性の研究のための電気生理学的実験を行うために使用される革新的ツールである。そのような生体外ハイスループット試験システムの使用は、神経変性疾患、外傷性脳損傷、および発作の研究を含む。胚組織に由来するニューロンへの依存が、ニューロンＭＥＡシステムの共通の制約であり続けてきた。ＭＥＡを用いて、胚組織および成体脳組織の両方からの自発的ネットワーク活性を同時に測定した。加えて、ニューロン活性／シナプス伝達の成熟に影響を与えるアゴニストおよびアンタゴニストの導入は、創薬ならびにニューロン発達および再生を含む基礎研究におけるこのシステムの有効性を確立した。
方法：
成体ニューロン：最終分化した成熟ニューロンを成体ラットの海馬から抽出し、ＤＥＴＡカバースリップ上にプレーティングした。４日間後、ニューロンをこれらのカバースリップからＰＤＬ／ラミニンでコーティングした（細胞接着のために）ＭＥＡに継代した。
胚ニューロン：胎齢１８日のラット胎児の海馬由来のニューロンを抽出し、ＰＤＬ／ラミニンでコーティングしたＭＥＡ上に直接プレーティングした。
【００６４】
それぞれのニューロン集団において、自発的ニューロン活性の電気的記録を最大３ヵ月間行った。加えて、アンタゴニストおよびアゴニストを導入し、ベースライン電気活性に対するそれらの影響を測定した。６４チャネルアクシオンＭＥＡを用いた。
【００６５】
結果：ニューロン（胚および成体の両方）をＭＥＡ上で再生させ、電気的に回復させた。ＭＥＡ上で２週間後、両集団は、一貫して安定した電気活性を示した。
【００６６】
［実施例８：胚ラット海馬解離細胞培養方法論］
胚海馬ニューロンを培養した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た妊娠期間１８日間の妊娠ラットを二酸化炭素で安楽死させ、胎児を氷冷ハイバネートＥ（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）／Ｂ２７／Ｇｌｕｔａｍａｘｔｍ／抗生物質抗真菌薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（解離培地）中に回収した。それぞれの胎児を断頭し、全脳を新鮮な氷冷解離培地に移した。単離後、海馬を解離培地の新鮮な管内に回収した。組織を、３７℃で１０分間、パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ３１１９）、１２ｍｇ／６ｍＬのハイバネート−Ｅ（−カルシウム）（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）、および０．５ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で酵素的に消化した。海馬ニューロンを、火加工パスツールピペットを用いて組織を粉砕することによって得た。遠心分離後、細胞を培養培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｇｌｕｔａｍａｘｔｍ／抗生物質抗真菌薬）中に再懸濁し、ＭＥＡ上にプレーティングした。すべての研究は、セントラルフロリダ大学の機関内動物実験委員会によって承認され、ＮＩＨガイドラインと一致した。
【００６７】
成体ラット海馬解離細胞培養方法論
成体ニューロンを抽出、解離、培養、および維持した。簡潔に述べると、成体ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、６〜１２月齢）の海馬を解離および均質化して、ハイバネート−Ａ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、および抗生物質抗真菌薬からなる冷培地（約４℃）中の小組織断片にした。組織を、６ｍｇのパパイン／１２ｍＬを含有するカルシウムを含まないハイバネート−Ａ（ＨＡ）（カルシウムなしＨＡ）中で、３７℃で３０分間消化した。消化後、組織を冷ＨＡ培地で３回洗浄して、すべての活性酵素を除去した。次に、組織を解離培地中に懸濁し、火加工パスツールピペットを用いた機械的解離によって粉々にして個々の細胞にした。解離細胞を平板培地中に懸濁し、その後、ＤＥＴＡ（Ｎ−１［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−ジエチレントリアミン、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ，Ｔ２９１０ＫＧ）でコーティングされたガラスカバースリップ上に沈着させた。３０〜４５分後、培地を穏やかに旋回させて組織デブリを除去することによって、カバースリップを温ＨＡで洗浄した。この洗浄ステップ後、新鮮な平板培地を適用し、最初の３ＤＩＶ静置した。３ＤＩＶに培地を除去し、５μΜのロスコビチン（Ｒｏｓｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｒ７７７２）を有する維持培地と取り換えた。すべての研究は、セントラルフロリダ大学の機関内動物実験委員会によって承認され、ＮＩＨガイドラインと一致した。４ＤＩＶ後、ＤＥＴＡカバースリップ上の成体海馬ニューロンをＭＥＡに継代した。簡潔に述べると、ニューロンを、トリプシン（ＨＢＳＳ中０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ、２５２００）を用いてＤＥＴＡから取り除いた。１ｍＬ当たり０．５ｍｇの解離培地中のトリプシン阻害剤（トリプシン阻害剤、大豆、Ｇｉｂｃｏ、１７０７５−０２９）がトリプシンを不活性化した。取り除かれたニューロンを回収し、５００xｇで５分間回転させた。ＨＢＳＳ中の不活性化したトリプシンの上清を廃棄し、神経細胞ペレットを１ｍＬの平板培地中に懸濁した。
【００６８】
免疫細胞化学および共焦点レーザー走査型顕微鏡
細胞を調製して免疫細胞化学的に解析するために、カバースリップをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすいだ。細胞を、室温で１０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、その後、ＰＢＳで３回すすいだ。細胞をＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間透過処理し、その後、ＰＢＳ中の５％の正常ヤギ血清中で２時間ブロックした。抗ニューロフィラメント−Ｍ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ５７３５、１：５００）、抗シナプトフィジン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＭＡＢ３６８、１：３００）、および抗ＮＭＤＡＲ２Ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ１５５５Ｐ、１：２００）、抗ＮＭＤＡＲ２Ｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ１５５５７Ｐ、１：２００）、または抗グルタメート受容体２／３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＡＢ１５０６、１：５０）のいずれかをブロッキング溶液中に４℃で１２時間添加した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液中の蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０１１（５９４ｎｍ）、Ａ２１４４９（６４７ｎｍ）、およびＡ１１０２９（４８８ｎｍ）、１：２００）を２時間適用した。ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ培地（Ｈ１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、カバースリップをスライド上に載置した。蛍光画像を、ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）スタンドを有するＵｌｔｒａ  Ｖｉｅｗ回転ディスク共焦点システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、および２６μｍの解像度を有するＰｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ４０ｘ／１．４  Ｏｉｌ  ＤＩＣプランアポクロマート対物レンズを用いて入手した。スキャンした画像のＺ−ｓｔａｃｋ投影をＶｏｌｏｃｉｔｙ画像処理プログラム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）内で生成および修正した。
【００６９】
細胞外記録法
ＭＥＡチップ（Ａｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、２００μｍピッチで８×８のアレイ内に組織化された直径３０μｍの６４個の白金黒でコーティングされた金電極を提供した。きれいなＭＥＡを７０％のアルコールで殺菌し、その後、１ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（１００μｇ／ｍＬ）とともに３０分間インキュベートした。すべての電極を被覆する程度に大きい面積をさらに３μＬのラミニン（２μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングした。胚ラット海馬ニューロンを、５００細胞／ｍｍ２の密度でＭＥＡ上に直接プレーティングした。成体ラット海馬ニューロンを、最初にＤＥＴＡでコーティングされたカバースリップ上で培養して、回復させた。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、培養中の成体ニューロンの生存に必要であり、ｂＦＧＦは、ラットニューロンの生体外分裂を引き起こし、３ＤＩＶでのロスコビチンの投与は、ニューロン有糸分裂活性を阻止した。ＤＥＴＡカバースリップ上に４日静置した後、成体ニューロンを５００細胞／ｍｍ２の密度でＭＥＡ上に継代した。２〜３日毎に、培地の半分を２μΜのＲｏｓｃを補充した新鮮な維持培地と取り換えた。２ＤＩＶに成体ニューロンを２５μΜのグルタメート（Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸、Ａｌｄｒｉｃｈ、８５５６４２）で補充することにより、成体ニューロンの電気活性を増加させた。
【００７０】
ＭＥＡは、ガス交換を可能にするためにカバーを外してインキュベートしたが、記録をする間は汚染、培地蒸発、およびガス交換を低減するために、インキュベータからの除去時にカバーした。レコーディングシステム（Ａｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のヘッドステージを３７℃に予熱した後、成体または胚海馬培養物を有するＭＥＡを解析した。ニューロンネットワークの活性を、ソフトウェアＡｘｉｏｎ’ｓ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｔｕｄｉｏ（ＡｘＩＳ）を用いて２５ｋＨｚで記録した。ベースラインの標準偏差よりも６倍大きいシグナル振幅を活動電位スパイクとして検出した。その後、スパイクデータをＭａｔｌａｂ  ２０１０ｂ（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）にインポートして、さらに処理した。
【００７１】
実験手順
成体および胚ニューロンにおけるベースライン自発的活性を、７ＤＩＶから開始して１週間あたり連続５日間にわたり、３分間ずつ記録した。シナプスアンタゴニストＤ−（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（Ｄ−ＡＰ５、２５μΜ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０１０６）、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン二ナトリウム（ＣＮＱＸ、２５μΜ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０４５）、および（−）−ビククリンメトブロミド（Ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ、５０μΜ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０１０９）を、１４ＤＩＶおよび３０〜６０ＤＩＶの様々な時点で、成体ニューロンおよび胚ニューロンの両方に別々に投与した。３分間記録して、これらのアンタゴニストからの自発的活性への影響を定量化した。必要に応じて、アンタゴニストの投与前にさらなるベースラインを記録した。それぞれの実験後、アンタゴニストを完全に除去し新鮮な培地を入れ替えた。
【００７２】
評価および統計
データ分析を、未刊行のＭａｔｌａｂ機能を用いてオフラインで行い、それぞれのＭＥＡ記録中に作成されたスパイクファイルを評価した。手短に述べると、それぞれの３分間データセットを処理して、以下のパラメータを抽出した：「活性チャネル」（０〜６４の数）、「ＡＰ周波数」（相互のスパイク間間隔）、「バースト」（活性チャネルの少なくとも１０％が、１ミリ秒で１を超えるＡＰを示したもの）、「バースト期間」（バーストにおける最初のＡＰからバーストにおける最後のＡＰまでの期間）、「平均バースト周波数」（２つのその後のバースト間の相互の時差）、「インバースト周波数」（そのバーストの期間で割った、検出されたバースト内のＡＰの量）、「ノンバースト周波数」（バーストに関連付けられなかったＡＰ間の相互のスパイク間間隔）。成体培養物の約２５％および胚培養物の１４％において、ニューロンネットワークの一部分は、時間とともに、特に約６週間後に基質から剥離した。ＭＥＡ間で活性チャネルの数が異なることを考慮に入れるために、すべての値をＭＥＡ上の活性チャネルの量に対して補正した。３分間の記録のそれぞれについて、図６Ａ〜６Ｄに示されるように、代表的な結果チャートが生成された。シナプスアンタゴニストからの影響を、アンタゴニストの投与前に記録された胚または成体培養物のベースライン活性に対する、処理後の同一の培養物の活性チャネルまたはＡＰ周波数の割合として測定した。
【００７３】
結果
成体および胚源由来の解離ニューロン培養物は、ＭＥＡ上で回復し、ネットワークを形成した。自発的活性を、それぞれのＭＥＡにおいて、７０ＤＩＶに至るまで、週に５回、３分間記録した。細胞の状態、ならびに細胞と電極との間の物理的接触の検証のために、ＭＥＡの位相差写真をそれぞれの記録後に撮影した。
【００７４】
成体および胚ニューロンの自発的活性
自発的発射活性は、成体および胚ニューロンの両方において、７〜１０ＤＩＶに始まった。インキュベータから加熱された記録ステージまでのＭＥＡの移動、およびその後の３分間の記録期間は、一貫したベースライン活性によって表される培地のｐＨまたは温度に著しく影響を与えなかった。しかしながら、培地変化の結果として、ベースラインニューロン活性において一時的な上昇が観察された。２ヵ月を超える培養期間にわたって、胚ＭＥＡ（ｎ＝６）は、１ＭＥＡ当たり平均３７±８チャネルが活性であり、成体ＭＥＡ培養物（ｎ＝９）における１５±５チャネルに対して、一貫してより多くの活性チャネルを呈した。胚培養物における活動電位（ＡＰ）発射周波数は約２〜４Ｈｚであり、成体培養物における１〜２Ｈｚよりも高かった。自発的バーストは、胚培養物とは対照的に、成体培養物において１週間早く生じた。最初の６週間にわたるバースト進行は、２種類のニューロンネットワーク間で一貫した（図６Ａ）。しかしながら、６週間目以降、成体培養物におけるバーストの頻度は減少するように見られ、一方で、胚培養物におけるバースト周波数はさらに増加した。胚培養物および成体培養物の両方について、バーストの期間は、１０週間の期間にわたって減少した（図６Ｂ）。胚培養物のバーストは、成体培養物におけるバーストよりも平均３〜５倍長かった。胚培養物におけるバースト期間は１０週間の実験にわたって高度に変動し続けたが（約±１秒）、成体培養物におけるバースト長は減少した。この成体培養物におけるバーストの収束は、経時的にバースト内発射周波数の着実な増加と並行して起こった（図６Ｃ）。成体培養物のバースト内周波数が最初の２週間以内に回復した一方で、胚培養物は、より緩徐に回復し、約６週間後に成熟したバースト内レベルに到達した。非バースト発射周波数（バーストと関連しないＡＰ）は、成体培養物において全期間にわたって一貫したが、胚培養物においては着実に減少した（図６Ｄ）。全体として、バースト活性が、ＭＥＡ上の成体培養物においてより早く集中および成熟し、より一貫性があった一方で、胚培養物は、緩徐でより無秩序な成熟を示した。
【００７５】
成体および胚ニューロンの活性へのシナプスアンタゴニストの影響
アゴニストおよびアンタゴニストを、別個の実験において、ＭＥＡ上の胚および成体培養物に投与した：２５μΜのＤ−ＡＰ５（ＮＭＤＡチャネルアンタゴニスト）、２５μΜのＣＮＱＸ（ＡＭＰＡチャネルアンタゴニスト）、および５０μΜのビククリン（ＧＡＢＡＡアンタゴニスト）。結果を図７に要約した。
【００７６】
Ｄ−ＡＰ５（２５μΜ）は、成体ＭＥＡ培養物および胚ＭＥＡ培養物の両方において、活性チャネルの数を著しく減少させた。成体培養物は、胚培養物（１４ＤＩＶで６５±４％、３０〜６０ＤＩＶで３６±７％）に対して、より大きい割合のチャネル活性（１４ＤＩＶで９０±６％、３０〜６０ＤＩＶで８２±６％）を喪失した。活動電位周波数の変化も差があり、成体培養物においてより低い周波数となり（１４ＤＩＶで７６±８％、３０〜６０ＤＩＶで８２±１７％）、胚培養物に対する測定された影響とは著しく異なった。１４ＤＩＶにおいて胚ニューロンの発射速度は９０±６％増加した一方で、３０〜６０日齢の培養物においては発射速度は７０±７％減少した。生体外での成体および胚ニューロンにおけるＮＭＤＡチャネル発現（ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂサブユニット）の差が、２つのニューロン集団におけるＤ−ＡＰ５に対する対照的な反応を引き起こした可能性が高い。ＮＭＤＡチャネルは、１４ＤＩＶにおける胚ニューロンにおいて低いレベルで発現されていたものの、その発現のレベルは、１４ＤＩＶにおける成体ニューロンの発現のレベルには到底及ばなかった。成体ニューロンはより多くのＮＭＤＡチャネルを発現したため、競合的ＮＭＤＡアンタゴニストＤ−ＡＰ５に対するその反応がはるかに顕著であった。
【００７７】
ＣＮＱＸの添加は、Ｄ−ＡＰ５と比較して、成体ＭＥＡ培養物および胚ＭＥＡ培養物の両方において、はるかに少ないチャネルの活性の損失を引き起こした（図７）。成体培養物（１４ＤＩＶで５２±３％、３０〜６０ＤＩＶで２４±５％）は、胚培養物（１４ＤＩＶで２３±５％、３０〜６０ＤＩＶで０±７％）と比較して、より大きな割合のチャネル活性を損失した。成体培養物および胚培養物の両方における活動電位周波数の変化は、１４ＤＩＶ以降、ＣＮＱＸによって影響を及ぼされなかった。ニューロンの活性は、３０〜６０ＤＩＶに胚培養物および成体培養物の両方においてごくわずかに減少したのみであった（成体ＭＥＡにおいて３１±６％低下、胚ＭＥＡにおいて４７±５％低下）。ＡＭＰＡチャネルサブユニットＧｌｕＰｖ２／３の発現は２ＤＩＶにおける胚ニューロンにおいて観察されなかったが、発現は１４ＤＩＶまでに増加して成体レベルを反映した。
【００７８】
ＭＥＡ測定結果を記録した後、アンタゴニストをニューロンから洗浄し、全培地を交換した。２４時間後、ニューロンの活性は、ベースラインレベルに戻った。
【００７９】
結果
ラットの海馬から培養された成体ニューロンは機能的に回復し、７０ＤＩＶにわたってＭＥＡ上で自発的に発射する能力を有した。これらのニューロン成熟の研究は、ニューロン研究対象集団における遺伝子およびタンパク質発現が、生体内における成熟した成体ニューロンのものを反映していることの必要性を強調している。胚ニューロンは、成体ニューロンにおいて電気活性またはシグナル伝播に関与するものと同一の機構を発現しないため、神経毒性作用物質または薬物療法に対するそれらの応答は、成熟した成体脳における応答と相関しない場合がある。
【００８０】
成体ニューロンを培養する開示の方法は、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡチャネルサブユニットが培養物の生存期間を通して発現されるシステムをもたらした。ＮＭＤＡチャネルサブユニットＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂ、ならびにＡＭＰＡチャネルサブユニットＧｌｕＲ２／３は、２ＤＩＶにおいて、および２ＤＩＶ以降において発現された。これは、１４ＤＩＶ以降までＮＭＤＡおよびＡＭＰＡチャネル発現が遅れた胚組織に由来するニューロンとは非常に対照的であった。ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡチャネルのアンタゴニストへのニューロンの応答は、成体ニューロンと比較して、胚ニューロンでは著しく異なることが判明し、それぞれのアンタゴニストは、成体ニューロンにおいて、胚ニューロンにおける場合よりも大きく活性を減少させた。これらの結果は、培養中の胚ニューロンは３〜４週間経過後にイオンチャネルサブユニットの成熟したプロファイルを達成することを示している。したがって、特に、シナプスタンパク質プロファイルがシナプス不全のプロセスにおいて重要な役割を果たし得るアルツハイマー病等の神経変性疾患を研究する際には、胚ニューロンは培養中で完全に成熟するまでさらなる実験に用いるべきではない。
【００８１】
胚ＭＥＡシステムと比較して、本明細書に開示したように、成体海馬ニューロンを用いたＭＥＡ上でのニューロン活性の測定結果は、より成体脳に適用可能である。これらのＭＥＡの調製は胚ニューロンＭＥＡよりもわずかに複雑であったが、その最終結果は、成体脳における学習および記憶形成の動力学とよりよく相関する長期スクリーニング方法論を生み出した。さらに、バーストおよび全般的成熟のより早期の発生のため、このシステムは、より迅速で、より信頼性があり、より相関性のある、創薬、神経毒性作用物質、および神経変性の研究を促進し得る。
【００８２】
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【００８３】
本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの出版物の開示は、本発明が属する当技術分野の状況をより完全に説明するために、全体として、本明細書において参照により本出願に組み込まれる。
【００８４】
本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明に様々な修正および変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書の考察およびそこに開示される発明の実践により当業者には明らかになるであろう。本明細書および実施例は例示として考慮されるだけであることが意図されており、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲により示される。
【図１】
2014515262.tif 000002
【図２Ａ】
2014515262.tif 000003
【図２Ｂ】
2014515262.tif 000004
【図２Ｃ】
2014515262.tif 000005
【図３】
2014515262.tif 000006
【図４Ａ】
2014515262.tif 000007
【図４Ｂ】
2014515262.tif 000008
【図５】
2014515262.tif 000009
【図６Ａ】
2014515262.tif 000010
【図６Ｂ】
2014515262.tif 000011
【図６Ｃ】
2014515262.tif 000012
【図６Ｄ】
2014515262.tif 000013
【図７Ａ】
2014515262.tif 000014
【図７Ｂ】
2014515262.tif 000015
【図７Ｃ】
2014515262.tif 000016
【図７Ｄ】
2014515262.tif 000017
【国際調査報告】
2014515262.tif 000018
2014515262.tif 000019
2014515262.tif 000020