(57)【要約】  本発明は、第一のアミノ酸配列が配列番号１の配列に少なくとも８８％相同であり、かつ、第二のアミノ酸配列が配列番号２の配列に少なくとも８８％相同である、第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列を含むStaphylococcus aureusエピトープ結合部位を形成するペプチドまたはペプチドの配置に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列を含むStaphylococcus aureusエピトープ結合部位を形成するペプチドまたはペプチドの配置であって、第一のアミノ酸配列は配列番号１に少なくとも８８％相同であり、第二のアミノ酸配列は配列番号２に少なくとも８８％相同である、前記ペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項２】
第一のアミノ酸配列が、配列番号１の配列に、少なくとも９０％相同、特に少なくとも９２．５％相同、特に少なくとも９５％相同、特に少なくとも９７．５％相同、特に１００％相同である、および／または、第二のアミノ酸配列が、配列番号２の配列に、少なくとも９０％相同、特に少なくとも９２．５％相同、特に少なくとも９５％相同、特に少なくとも９７．５％相同、特に１００％相同である、請求項１に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項３】
第一のアミノ酸配列が重鎖の一部である、および／または、第二のアミノ酸配列が抗体または抗体フラグメントの軽鎖の一部である、または、
第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列が単一鎖の可変フラグメント（scFv）、もしくは、抗体のFcフラグメントを含む単一鎖の可変フラグメント（scFvFc）を含む、
請求項１または２に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項４】
抗体が、モノクローナル抗体、特にIgG型、特にIgG1型、IgG2 型、またはIgG4型の抗体である、請求項３に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項５】
フラグメントが、Fabフラグメント、Fab/cフラグメント、Fvフラグメント、Fab'フラグメントまたはF(ab')2フラグメントである、請求項３または４に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項６】
抗体が、細胞株、特に昆虫の細胞株または哺乳動物の細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の細胞株またはハイブリドーマの細胞株の細胞において生産される組み換え抗体である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項７】
第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列によって形成されない抗体の一部が、ヒト抗体の対応する一部に、少なくとも８５％相同、特に少なくとも９０％相同、特に少なくとも９２．５％相同、特に少なくとも９５％相同、特に少なくとも９７．５％相同、特に１００％相同である、請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項８】
軽鎖が配列番号６の配列、特に配列番号７の配列を含み、重鎖が配列番号４の配列、特に配列番号５の配列、配列番号９の配列、特に配列番号１０の配列、または配列番号１１の配列、特に配列番号１２の配列を含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項９】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項１０】
医薬が、ヒトまたは動物の処置のための医薬であり、該ヒトまたは動物は、Staphylococcus aureus、とりわけメチシリン耐性またはメチシリン感受性のStaphylococcus aureusに感染しているか、またはそのような感染にかかるリスクがある、請求項９に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項１１】
ヒトまたは動物が、乳腺炎、S. aureus菌血症、血流感染、人工装具感染、移植片感染、軟部組織感染、外科関連感染、小児または新生児感染、透析関連感染、肺炎、骨感染、または感染によって引き起こされる敗血症を持つ、請求項１０に記載のペプチドまたはペプチドの配置
【請求項１２】
ペプチドまたはペプチドの配置が、Staphylococcus aureusの少なくとも１つのさらなるエピトープに対する、少なくとも１つの他のペプチドまたはペプチドの配置を有する混合物において存在する、前記ペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項１３】
ペプチドまたはペプチドの配置が、少なくとも１つの抗生物質を有する混合物において存在する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項１４】
ペプチドまたはペプチドの配置が、哺乳動物、とりわけヒトの血漿または血液において存在する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項１５】
医薬が、全身的および／または局所的な利用のための医薬である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置。
【請求項１６】
Staphylococcus aureusの検出のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置を包含するキット。
【請求項１７】
Staphylococcus aureusの検出のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置の使用。
【請求項１８】
請求項３〜８のいずれか一項に記載の抗体、抗体フラグメント、ScFv、またはScFvFcを生産する細胞株。
【請求項１９】
ヒトまたは動物の処置方法であって、該ヒトまたは動物は、Staphylococcus aureus、とりわけメチシリン耐性またはメチシリン感受性のStaphylococcus aureusに感染しているか、またはそのような感染にかかるリスクがあり、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチドの配置がヒトまたは動物に投与される、前記処置方法。
【請求項２０】
ヒトまたは動物が、乳腺炎、S. aureus菌血症、血流感染、人工装具感染、移植片感染、軟部組織感染、外科関連感染、小児または新生児感染、透析関連感染、肺炎、骨感染、または感染によって引き起こされる敗血症を持つ、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドまたはペプチドの配置が、Staphylococcus aureusの少なくとも１つのさらなるエピトープに対する、少なくとも１つの他のペプチドまたはペプチドの配置を有する混合物において存在する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドまたはペプチドの配置を、投与前に、哺乳動物、とりわけヒトの血漿または血液と混ぜる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ペプチドまたはペプチドの配置を、局所的または全身的に、特に、静脈、肺内、腹腔内、鼻、または舌下に投与する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ペプチドまたはペプチドの配置を、少なくとも１つの抗生物質とあわせて投与する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Staphylococcus aureus（＝S. aureus）エピトープ結合部位を形成するペプチドまたはペプチドの配置（arrangement）、本ペプチドまたはペプチドの配置を包含するキット、本ペプチドまたはペプチドの配置の使用、本ペプチドまたはペプチドの配置を含む抗体を生産する細胞株、および処置方法に関する。
【０００２】
WO 2010/133600 A1より、IsaAのS. aureusエピトープに対する抗体またはそのフラグメントは知られている。これらの抗体は、第一可変領域を有する重鎖および第二可変領域を有する軽鎖から形成される結合部位を持ち、ここで、第一可変領域の配列は配列番号１３であってもよく、第二可変領域の配列は配列番号１４であってもよい。哺乳動物におけるS. aureusに対する抗体の有効性は、食血球による食作用によるS. aureusの死滅（killing）に依存する。WO 2010/133600 A1より知られる抗体によって食作用過程は加速された。３０分のインキュベーション後、IsaAのエピトープに特異的な抗体の存在下におけるヒト好中球によるS. aureusの死滅によって、非特異的な対照抗体と比較して、約２５％から３０％高まった。
【０００３】
本発明の目的は、食血球によるS. aureus の死滅に関する抗体または抗体のフラグメントに極めて有効であり、したがって、Staphylococcus aureusによって引き起こされる感染症の処置によく適したS. aureusエピトープ結合部位を提供することである。さらに、結合部位はS. aureusの検出によく適しているべきである。本発明のさらなる目的は、結合部位を包含するキット、結合部位の使用、結合部位を含む、抗体、抗体フラグメント、ScFvsまたはScFvFcsを分泌する細胞株、および処置方法を提供することである。
【０００４】
本目的は、請求項１、９、１６、１７、１８および１９の主題によって解決される。本発明の態様は請求項２から８、１０から１５、および２０から２４において開示される。
【０００５】
本発明により、第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列を含むStaphylococcus aureusエピトープ結合部位を形成するペプチドまたはペプチドの配置が提供される。第一のアミノ酸配列は、配列番号１の配列に少なくとも８８％相同であり、第二のアミノ酸配列は、配列番号２に少なくとも８８％相同である。
【０００６】
態様において、第一のアミノ酸配列は、配列番号１の配列に、少なくとも９０％相同、特に少なくとも９２．５％相同、特に少なくとも９５％相同、特に少なくとも９７．５％相同、特に１００％相同である。第二のアミノ酸配列は、配列番号２の配列に、少なくとも９０％相同、特に少なくとも９２．５％相同、特に少なくとも９５％相同、特に少なくとも９７．５％相同、特に１００％相同である。
【０００７】
第一のアミノ酸配列は、重鎖の一部であってもよく、および／または第二のアミノ酸配列は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖の一部であってもよい。この場合、第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列は、抗体または抗体フラグメントの可変領域を形成する。結合部位は単一鎖の可変フラグメントによって形成されることもできる。この場合、第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列は、単一鎖の可変フラグメント（scFv）、または抗体のFcフラグメントを含む単一鎖の可変フラグメント（scFvFc）に含まれる。FcフラグメントはscFvFcが結合したS. aureusの食作用を高める。
【０００８】
本発明者らは、WO 2010/133600 A1から知られる抗体の１つの結合領域を改変し、それによって、ヘパリン化されたヒト全血における食血球による食作用によるS. aureusの死滅の支援において、知られた抗体よりも、より効果的な結合部位を開発した。以下のアラインメント配列から見られるように、配列番号１は、対応する配列番号１３の配列とは、１１８アミノ酸の１７箇所で異なり、および、配列番号２は、WO 2010/133600 A1から知られる配列番号１４とは１１３アミノ酸の８箇所で異なる：
【表１】
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相同なアミノ酸は配列間の空間において表示されている。
【０００９】
第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列を含む可変領域を包含する抗体は、メチシリン耐性およびメチシリン感受性のS. aureusにおいて、免疫優性構造のIsaAに対しては高い親和性、および本構造への結合に関しては高い特異性を示す。
【００１０】
抗体は、モノクローナル抗体、特にIgG型、特にIgG1型、IgG2型またはIgG4型の抗体であってもよい。フラグメントはFabフラグメント、Fab/cフラグメント、Fvフラグメント、Fab'フラグメントまたはF(ab')2フラグメントであってもよい。S. aureusの細胞壁は、そのFc部分を介して免疫グロブリンに非特異的に結合するタンパク質Aを包含するので、これらのフラグメントはS. aureusの検出に特に有用である。
【００１１】
本発明の態様において、抗体は、細胞株、特に昆虫の細胞株または哺乳動物の細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）の細胞株、またはハイブリドーマの細胞株の細胞において生産される組み換え抗体である。第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列で形成されない抗体の一部は、ヒト抗体の対応する一部に、少なくとも８５％相同、特に少なくとも９０％相同、特に少なくとも９２．５％相同、特に少なくとも９５％相同、特に少なくとも９７．５％相同、特に１００％相同である。抗体の軽鎖は、配列番号６の配列、特に配列番号７の配列を含むことができ、重鎖は配列番号４の配列、特に配列番号５、配列番号９の配列、特に配列番号１０の配列、または配列番号１１の配列、特に配列番号１２を含むことができる。配列番号７、配列番号５、配列番号１０および配列番号１２の配列は、KV3A9_mousのMOPC 63、Ig kappa chain V-IIIからの配列番号８のリーダー配列を含む。本リーダー配列は哺乳動物の細胞においてよい発現を可能にする。配列番号４の配列は、配列番号１の配列およびIgG1の重鎖、ヒトγ1アロタイプGm 1、17を含む。配列番号６の配列は、配列番号２の配列およびIgG軽鎖Kを含む。配列番号９の配列は配列番号１の配列およびIgG2の重鎖、アロタイプG2m(23)を含む。配列番号１１の配列は配列番号１およびIgG4の重鎖を含む。
【００１２】
ペプチドまたはペプチドの配置は、本発明により、医薬として用いられてもよい。とりわけ、それらはヒトまたは動物の処置のための医薬として用いられてもよく、該ヒトまたは動物は、S. aureus、とりわけメチシリン耐性またはメチシリン感受性のS. aureusに感染しているか、またはそのような感染にかかるリスクがある。本発明の意味での処置は予防を含む。動物は哺乳動物であってもよい。ヒトまたは動物は、乳腺炎、S. aureus菌血症、特に、原発性または二次的菌血症、血流感染、特に、原発性または二次的血流感染、人工装具感染（prosthetic infection）、移植片感染、軟部組織感染、外科関連感染、小児または新生児感染、透析関連感染、肺炎、骨感染、または感染によって引き起こされる敗血症であり得る。乳腺炎はウシ乳腺炎であってもよい。乳牛がウシ乳腺炎にかかった場合、乳牛から使用可能な牛乳が生産されることはなく、乳牛が、この場合では通例のとおり、抗生物質で処置された場合、この乳牛によって生産される牛乳は、この乳牛の牛乳に抗生物質が包含されなくなるまで捨てなければならない。この通例の処置の不利益は、本発明により、ウシ乳腺炎の処置のための医薬としてのペプチドまたはペプチドの配置の使用によって回避し得る。
【００１３】
ペプチドまたはペプチドの配置は、S. aureusの少なくとも１つのさらなるエピトープに対する、少なくとも１つの他のペプチドまたはペプチドの配置を有する混合物において存在し得る。このさらなるエピトープは、エピトープが位置する抗原、すなわちIsaA、または、さらなる抗原に位置してもよい。かかる混合物の医薬としての使用は、単に、本発明によるペプチドまたはペプチドの配置を包含する医薬の使用よりも、より効果的であり得る。これは、種々の菌株（strains）における、異なる程度の抗原の発現を引き起こし、抗体またはフラグメント単独よりも、より多くの細菌が抗体またはフラグメントの混合物によって識別される、S. aureusの高い変異性（variavility）によるものであり得る。
【００１４】
ペプチドまたはペプチドの配置は、少なくとも１つの抗生物質と混合物において存在し得る。医薬で処置されるべきヒトまたは動物において、変異したS. aureusは一般的なS. aureusに加えて存在してもよい。変異したS. aureusは、本発明により、ペプチドまたはペプチドの配置によって認識されることができない、変異したIsaAを持ち得る。この場合において、抗生物質は変異したS. aureusに対して有効であり得る。
【００１５】
本発明によるペプチドまたはペプチドの配置は、哺乳動物、特にヒトの血漿または血液を有する混合物において存在してもよい。本発明者らは、血漿で混合した本発明によるペプチドまたはペプチドの配置が、生理食塩水に包含される本発明によるペプチドまたはペプチドの配置よりもはるかに有効であり得ることを見出した。
【００１６】
医薬は全身的および／または局所的な利用のために調製される医薬であってもよい。本発明者らは、本発明によるペプチドまたはペプチドの配置による重篤なS. aureus感染の処置は、著しい死亡率の減少、および処置されたヒトまたは動物の臓器におけるS. aureusの数の減少になることを認めた。
【００１７】
本発明は、S. aureusの検出、特に非常に特異的な検出のための、本発明によるペプチドまたはペプチドの配置を包含するキットにも関する。
【００１８】
本発明は、さらに、S. aureusの検出、特に非常に特異的な検出のための、本発明によるペプチドまたはペプチドの配置の使用に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、上述のとおり、抗体、抗体フラグメント、ScFvまたはScFvFcを生産する、細胞株、特に昆虫の細胞株または哺乳動物の細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の細胞株またはハイブリドーマの細胞株に関する。
【００２０】
本発明は、さらに、ヒトまたは動物の処置方法に関するものであり、該ヒトまたは動物が、Staphylococcus aureus、とりわけメチシリン耐性またはメチシリン感受性Staphylococcus aureusに感染する、またはそのような感染にかかるリスクがあり、ここで、本発明によるペプチドまたはペプチドの配置が、ヒトまたは動物に投与される。ペプチドまたはペプチドの配置は、ヒトまたは動物におけるS. aureusの量を減少させるために、またはS. aureusを排除するために十分な投薬量において投与される。ペプチドまたはペプチドの配置は適した担体と混合してもよい。
【００２１】
ヒトまたは動物は、乳腺炎、S. aureus菌血症、特に、原発性または二次的菌血症、血流感染、特に、原発性または二次的血流感染、人工装具感染、移植片感染、軟組織感染、外科関連感染、小児または新生児感染、透析関連感染、肺炎、骨感染、または感染によって引き起こされる敗血症になり得る。
【００２２】
ペプチドまたはペプチドの配置は、S. aureusの少なくとも１つのさらなるエピトープに対する、少なくとも１つの他のペプチドまたはペプチドの配置を有する混合物において存在し得る。ペプチドまたはペプチドの配置は、投与前に、哺乳動物、とりわけヒトの血漿または血液と混ぜてもよい。ペプチドまたはペプチドの配置は、局所的または全身的に、特に、静脈、肺内、腹腔内、鼻、または舌下に投与してもよい。これらは少なくとも１つの抗生物質とあわせて投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
発明の態様
【図１】図１は、IsaA抗原への種々の抗IsaA抗体の結合を決定する競合ELISAの結果を示している。
【００２４】
【図２】図２は、種々のS. aureus株への種々の抗IsaA抗体の結合を決定する細菌細胞ELISAを示している。
【００２５】
【図３】図３は、ヘパリン化したヒト全血において、食血球による食作用によるS. aureusのNewman株の死滅の定量を示している。
【００２６】
【図４】図４は、健康な血液提供者（ｎ＝１５）からのヘパリン化したヒト全血において、食血球による食作用によるS. aureusのNewman株の死滅の定量を示している。
【００２７】
【図５】図５は、透析患者からのヘパリン化したヒト全血において、食血球による食作用によるS. aureusのNewman株の死滅の定量を示している。
【００２８】
【図６】図６は、HL-60細胞における対照アイソタイプと対比して、抗IsaA抗体UK66-2の２つの濃度の存在下において、生物発光のS. aureusのNewman (Newlux)株のオプソニン食作用障害作用を示している。
【００２９】
配列番号１および２、配列番号１および３、および他の配列を包含するScFv分子は、E. coliにおいて発現され、ELISAと競合ELISAにおいて、結合および親和性の試験を行った。結果は、配列番号１および２の配列を包含するScFv分子の親和性は、配列番号１および３の配列を包含するScFv分子の親和性と比べて約１０倍高いことを示した。
【００３０】
完全な抗体の発現のためのベクターコンストラクトは、ＣＨＯ細胞に導入された。Igkリーダー配列である配列番号８の配列を有する配列番号４の配列（配列番号１の配列を含む）（配列番号５の配列になる）によるIgG1の重鎖、ヒトγ1アロタイプGm 1、17、および、Igkリーダー配列である配列番号８の配列を有する配列番号６の配列（配列番号２の配列を含む）（配列番号７の配列になる）によるIgGの軽鎖Kを発現し、抗体UK66-2を形成した。機能的活動へのアイソタイプの影響を調べるために、IgG2およびIgG4アイソタイプを合成した。このために、IgG1の重鎖は、Igkリーダー配列である配列番号８の配列を有する配列番号９の配列（配列番号１０の配列になる）によるIgG2の重鎖、アロタイプG2m (23)、または、Igkリーダー配列である配列番号８の配列を有する配列番号１１の配列（配列番号１２の配列になる）によるIgG4の重鎖と置き換えた。
【００３１】
発現後、IgG1抗体はタンパク質AカラムによってＣＨＯ細胞の上清から精製された。精製された抗体は、結合のカイネティクス、ELISA、競合ELISA、ウェスタンブロット、および免疫蛍光における結合、およびヒト食血球を用いた食作用アッセイにおける機能のために試験された。機能アッセイにおいて、配列番号１および２の配列を含む抗体（UK66-2）は、知られた抗体UK66よりも、酸化バーストおよびS. aureusの死滅を著しく高めた。
【００３２】
IsaAの固定された抗体UK66-2への結合のカイネティクスは、BIACORE（登録商標）2000 system（GE Healthcare Europe GmbH、Munzinger Strasse 5、79111 Freiburg、Germany）を用いて、ラベルフリーな表面プラズモン共鳴によって決定された。抗体UK66-2の可逆的な固定は、抗Fab抗体によって行われた。相互作用の解析は、HBS-EP buffer（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて行われた。センサグラムは２５℃で３０μｌ／ｍｉｎの流速で記録された。
【００３３】
結合（kon）および解離（koff）の親和性および速度定数は、得られたセンサグラムを１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングするBIAevaluation software 4.0.1によって算出された。本方法において、４．８ｎＭの解離定数KDは、独立した２つの測定において決定された。UK66-2とIsaA間の相互作用の結合および解離の速度定数は、それぞれ３．７ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１（kon）および１．８ｘ１０−３ｓ−１（koff）と決定した。
【００３４】
図１は、可溶性組み換え型IsaA抗原への種々の抗IsaA抗体の結合を決定する競合ELISAの結果を示している。４５０ｎｍでの光学密度は、IsaAへの抗体の結合を示している。可溶性IsaAは種々の濃度において加えた。３本の線は、以下の抗IsaA抗体を用いて得られた結果を示している：
―  ０．０１μＭの可溶性IsaAでの上部の線：UK66（WO 2010/133600 A1から知られる参照抗体）
―  ０．０１μＭの可溶性IsaAでの中央の線：UK66-2（配列番号１および２の配列を含む結合部位を有する抗体）
―  ０．０１μＭの可溶性IsaAでの下部の線：UK66-3（配列番号１および３の配列を含む結合部位を有する抗体）
【００３５】
方法の記述：
Nunc-Maxisorp９６ウェルプレートを、５０μｌ／ウェル（１ｘＰＢＳにおいて０．５μｇ／ウェル）のIsaA でコートし、４℃でオーバーナイトでインキュベートした。翌日、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を包含するＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄した。洗浄の後、２００μｌの５％スキムミルクパウダー／ＰＢＳの添加によってブロッキングを行い、室温で１時間インキュベートした。ウェルはＰＢＳＴ（０．０５％）で２回洗浄し、プライマリーな抗IsaA抗体を０．４μＭから０．０１μＭにおよぶ一連の濃度において加えた。プライマリーな抗IsaA-IgG1抗体は、２．５％スキムミルクパウダー／ＰＢＳにおいて希釈され、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％）で３回洗浄し、２．５％のスキムミルクパウダー／ＰＢＳにおいて１：５０００希釈した５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルはＰＢＳＴ（０．０５％）で４回洗浄し、５０μｌのＴＭＢ(Thermo Scientific Pierce ELISA substrate)を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。反応は１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、基質反応の光学密度はＯＤ ４５０ｎｍでELISAプレートリーダーを用いて解析した。
【００３６】
図２は、S. aureus株、USA300、SH1000、RN4220、E, MA12およびMA12isaA-への種々の抗IsaA抗体の結合を決定する細菌ELISAを示している。MA12isaA-において、免疫優性構造のIsaAを削除した。４５０ｎｍでの光学密度は、細菌細胞への抗体の結合を示している。三つのカラムは以下の抗IsaA抗体を用いて得られた結果を示している：
―  左カラム：抗体UK66（参照抗体）
―  中央カラム：抗体UK66-2
―  右カラム：抗体UK66-3
【００３７】
方法の記述：
S. aureusの株は、B培地において３７℃でオーバーナイトで培養した。細菌は１分で１３０００ｒｐｍで遠心分離によってペレット化させ、PBS (phosphate buffered saline)で洗浄した。遠心分離の過程の後、ペレットを１ｍｌ ＰＢＳにおいて再懸濁した。５ｘ１０７細菌／５０μｌを包含する細菌懸濁液を調製した。Nunc-Maxisorp９６ウェルプレートは、５０μｌ／ウェルの細菌懸濁液でコートし、４℃でオーバーナイトでインキュベートした。翌日、プレートは０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を包含するＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄した。洗浄の後、２００μｌの５％のスキムミルクパウダー／ＰＢＳの添加によってブロッキングを行い、室温で１時間インキュベートした。ウェルはＰＢＳＴ（０．０５％）で２回洗浄し、プライマリーな抗IsaA抗体を加えた。プライマリーな抗IsaA-IgG1抗体を、２．５％スキムミルクパウダー／ＰＢＳにおいて１：２０００希釈し、５０μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％）で３回洗浄し、２．５％スキムミルクパウダー／ＰＢＳにおいて１：５０００希釈した５０μｌホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルはＰＢＳＴ（０．０５％）で４回洗浄し、５０μｌのＴＭＢ(Thermo Scientific Pierce ELISA substrate)を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。反応は１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、基質反応の光学密度はＯＤ ４５０ｎｍでELISAプレートリーダーを用いて解析された。
【００３８】
図３は、ヘパリン化したヒト全血における食血球による食作用によるS. aureusのNewman株の死滅の定量を示している。細菌はヘパリン化したヒト全血で３０分間インキュベートした。抗体溶液なしでインキュベーション後の生存細菌の数を１００％とした（左カラム）。死滅は、アイソタイプ対照抗体（中央カラム）と比べて、UK66-2（右カラム）の存在下において著しく増加した。
【００３９】
方法の記述：
S. aureusのNewman株はＢ培地において３７℃でオーバーナイトで培養した。細菌は１３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。遠心分離の過程を繰り返し行い、細菌は１ｍｌ ＰＢＳにおいて再懸濁した。５ｘ１０７細菌／２０μｌの細菌溶液を調製した。１００μｌのヘパリン化した血液を１．５ｍｌチューブに加え、氷上で保存した。２０μｌの細菌懸濁液および抗体溶液を加え、抗体を包含しないが細菌を包含する陰性対照試料を除いた。試料は、ハイブリダイゼーションオーブンにおける高架（overhead）で、一定の動きで３７℃で３０分間インキュベートした。食作用は、試料を氷上に置くことによって停止させた。血球は、調製された０．１％の新鮮なサポニンで溶解させた（氷上で２０分間）。試料の二つの段階希釈系列を調製した。２０μｌの１０−２、１０−３、および１０−４希釈をそれぞれＬＢプレートにおいて２連で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。コロニーを数え、死滅は抗体溶液のない血液における生存細菌の数を１００％として計算した。
【００４０】
図４は、健康な血液提供者（ｎ＝１５）からのヘパリン化したヒト全血における食血球による食作用によるS. aureusのNewman株の死滅の定量を示している。図５は、透析患者（ｎ＝７）からのヘパリン化したヒト全血における食血球による食作用によるS. aureusのNewman株の死滅の定量を示している。両方の場合において、細菌はヘパリン化された血液で６０分間インキュベートした。抗体溶液なしでインキュベーション後の生存細菌の数を１００％とした（左散布図“プラセボ”）。死滅は、アイソタイプ対照抗体（第二の散布図“アイソタイプ対照[９００μｇ／ｍｌ]”）と比べて、UK66-2（第三および第四の散布図“UK66-2[７５μｇ／ｍｌ]”および“UK66-2[９００μｇ／ｍｌ]”）の存在下において著しく増加した。
【００４１】
方法の記述：
S. aureusのNewman株はＬＢ培地において３７℃でオーバーナイトで培養した。細菌は１３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳで洗浄した。遠心分離の過程は繰り返し行い、細菌は１ｍｌ ＰＢＳにおいて再懸濁した。５ｘ１０７細菌／２０μｌの細菌溶液を調製した。１００μｌのヘパリン化した血液を１．５ｍｌチューブに加え、氷上で保存した。２０μｌのバクテリア懸濁液および抗体溶液を加え、抗体を包含しないが細菌を包含する陰性対照試料を除いた。試料は、ハイブリダイゼーションオーブンにおいて、一定の頭上の動きで３７℃で６０分間インキュベートした。食作用は、試料を氷上に置くことによって停止させた。血球は、調製された０．１％の新鮮なサポニンで溶解させた（氷上で２０分間）。試料の二つの段階希釈系列を調製した。２０μｌの１０−２、１０−３、および１０−４希釈をそれぞれＬＢプレートにおいて２連で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。コロニーを数え、死滅を計算した。抗体溶液のない血液における生存細菌の数を１００％とした。
【００４２】
図６は、HL-60細胞における、アイソタイプ対照（２００μｇ／ｍｌ）に対する、抗IsaA抗体UK66-2の二つの濃度存在下（２０μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌ）における、生物発光のS. aureus（S. a.）のNewman株（Newlux）の死滅を示している。生き残った細菌の相対数の決定は、生物発光の測定によって行った。生き残った細菌は光の放射（ＲＬＵ＝相対発光単位（relative light units））として与えられる。細菌の死滅はUK66-2に依存した濃度であり、アイソタイプにマッチしたヒトIgG1対照抗体では観察されない。
【００４３】
方法の記述：
luxABCEDオペロンを有するS. aureusのNewman株の単一コロニーは、５ｍｌのＬＢ培地に植菌するために用いた。luxABCEDオペロンは死んだ細菌ではなく生きている細菌において発光を生じることから、発光は生きている細菌の数に相関する。細菌はオーバーナイトで培養し、５０μｌの本培養液は、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補われた５ｍｌのＬＢ培地に植菌するために用いた。培養液は、３７℃で４〜６時間で２００ｒｐｍでロータリーシェーカー上で培養した。細菌の生物発光はLumat LB 9501 luminometer（Berthold Technologies、Bad Wildbad、Germany）を用いて決定した。培養液は、１００μｌの培養液が１６０００〜２４０００相対発光単位(ＲＬＵ)の間の範囲で生物発光シグナルを発生させたときにアッセイを行う用意ができた。培養に続いて、phosphate buffered saline（PBS）において細菌を二度洗浄し、Opti-MEM（登録商標） medium（Life Technologies、Darmstadt、Germany）において再懸濁し、終濃度を１ｘ１０９／ｍｌとした。食作用を持つHL-60細胞は０．８％ＤＭＦで５日間分化させ、Opti-MEM（登録商標）において再懸濁して１ｘ１０８細胞／ｍｌとし、１ウェルあたり５０μｌを９６ウェル組織培養プレート（Greiner Bio-One、Frickenhausen、Germany）に植菌した。抗体溶液（５０μｌ）、続いて１００μｌのS. aureus (１ｘ１０９／ｍｌ)を加えた。HL-60細胞、抗体および細菌は、３７℃でインキュベートし、生物発光を１５分の間隔で２４０分間連続的に測定し、最適なシグナル―ノイズ比を決定した。全てのアッセイは３連で行い、少なくとも３回繰り返した。生物発光はmulti-mode reader Infinite 200 Pro（TECAN、Maennedorf、Switzerland）を用いて決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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