(57)【要約】本明細書には、細胞培養培地、細胞培養培地を調製するためのキットおよび方法、ならびに女性生殖器官の細胞および腫瘍細胞などの細胞を培養するための方法が記載されている。本発明の細胞培養培地と、細胞であって、該細胞が、不死化卵巣細胞および／または前記卵管細胞である、細胞とを含む組成物もまた提供される。候補治療剤を同定する方法であって、本発明の方法に従って細胞を培養するステップと、該細胞を作用物質と接触させるステップと、該細胞の１つまたは複数の生理的特徴を測定するステップとを含み、該細胞の該１つまたは複数の生理的特徴を調節する作用物質が候補治療剤である方法もまた提供される。
2014508540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アデノシン三リン酸；
（ｂ）担体タンパク質；
（ｃ）コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；
（ｄ）グルタチオン；
（ｅ）ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；
（ｆ）ホスホエタノールアミン；
（ｇ）セレン；
（ｈ）トランスフェリン；
（ｉ）トリヨードサイロニン；
（ｊ）ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；
（ｋ）Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ；
（ｌ）細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；
（ｍ）上皮成長因子（ＥＧＦ）；
（ｎ）ヒドロコルチゾン；
（ｏ）インスリン；および
（ｐ）血清
を含む、細胞培養培地、または細胞培養培地を調製するためのキット。
【請求項２】
アデノシン一リン酸をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
ビタミンＥをさらに含む、請求項１から２のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項４】
前記担体タンパク質がアルブミンである、請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項５】
前記ヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基がキサンチンまたはヒポキサンチンである、請求項１から４のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項６】
キサンチンおよびヒポキサンチンを含む、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項７】
ビタミンＫ３、ナイアシン、またはナイアシンアミドのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項８】
前記細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質がコレラ毒素である、請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項９】
１０ｎｇ／ｍＬから７０ｎｇ／ｍＬの間のコレラ毒素を含む、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
２０ｎｇ／ｍＬから２５ｎｇ／ｍＬの間のコレラ毒素を含む、請求項９に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
約２０ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素を含む、請求項１０に記載の細胞培養培地。
【請求項１２】
約２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素を含む、請求項１０に記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
３ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの間のＥＧＦを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項１４】
約１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む、請求項１３に記載の細胞培養培地。
【請求項１５】
０．００５μｇ／ｍＬから１．５μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾンを含む、請求項１から１４のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項１６】
１．０μｇ／ｍＬから７５．０μｇ／ｍＬの間のインスリンを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項１７】
０．２％ｖ／ｖから１０．０％ｖ／ｖの間の血清を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項１８】
１．０％ｖ／ｖから５．０％ｖ／ｖの間の血清を含む、請求項１７に記載の細胞培養培地。
【請求項１９】
１．８％ｖ／ｖから２％ｖ／ｖの間の血清を含む、請求項１８に記載の細胞培養培地。
【請求項２０】
約１．８％ｖ／ｖの血清を含む、請求項１９に記載の細胞培養培地。
【請求項２１】
０．１５μｇ／ｍＬから０．３μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾンを含む、請求項１８から２０のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項２２】
約０．１５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む、請求項２１に記載の細胞培養培地。
【請求項２３】
５．０μｇ／ｍＬから５０．０μｇ／ｍＬの間のインスリンを含む、請求項１８から２２のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項２４】
約１５．０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項２５】
エストロゲンをさらに含む、請求項１から２４のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項２６】
エストロゲンを、３０ｎＭから３００ｎＭの間の１７−ベータ−エストラジオールと等しい効力の濃度で含む、請求項２５に記載の細胞培養培地。
【請求項２７】
エストロゲンを、約１００ｎＭの１７−ベータ−エストラジオールと等しい効力の濃度で含む、請求項２６に記載の細胞培養培地。
【請求項２８】
前記エストロゲンが１７−ベータ−エストラジオールである、請求項２４から２７のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項２９】
エストロゲンを実質的に含まない、請求項１から２３のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項３０】
０．２％ｖ／ｖから５．０％ｖ／ｖの間の血清を含む、請求項１７に記載の細胞培養培地。
【請求項３１】
０．２５％ｖ／ｖから０．７５％ｖ／ｖの間の血清を含む、請求項３０に記載の細胞培養培地。
【請求項３２】
約０．５％ｖ／ｖの血清を含む、請求項３１に記載の細胞培養培地。
【請求項３３】
０．２５μｇ／ｍＬから０．５０μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾンを含む、請求項３０から３２のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項３４】
約０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む、請求項３３に記載の細胞培養培地。
【請求項３５】
５．０μｇ／ｍＬから５０．０μｇ／ｍＬの間のインスリンを含む、請求項３０から３４のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項３６】
約２０．００μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項３５に記載の細胞培養培地。
【請求項３７】
卵巣腫瘍細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約１５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持する、請求項１から２９のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項３８】
卵巣細胞および／または卵管細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約１５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持する、請求項１から１７および３０から３６のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれかに記載の細胞培養培地を調製するためのキットであって、構成成分（ａ）〜（ｋ）を含む第１の１つまたは複数の容器と、構成成分（ｌ）〜（ｐ）および場合によってエストロゲンを含む第２の１つまたは複数の容器を含み、それにより、該第１の容器の内容物と該第２の容器の内容物とを適切な割合で組み合わせることにより該細胞培養培地がもたらされるキット。
【請求項４０】
（ａ）細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；
（ｂ）上皮成長因子（ＥＧＦ）；
（ｃ）ヒドロコルチゾン；
（ｄ）インスリン；
（ｅ）血清；および場合によって、
（ｆ）エストロゲン
を含む細胞培養培地補助剤であって、
該補助剤を基本細胞培養培地に添加することによって請求項１から３８のいずれかに記載の細胞培養培地がもたらされる補助剤。
【請求項４１】
構成成分（ａ）〜（ｐ）および場合によってエストロゲンを組み合わせることを含む、請求項１から３８のいずれかに記載の細胞培養培地を調製する方法。
【請求項４２】
構成成分（ａ）〜（ｋ）が第１の１つまたは複数の容器から添加され、構成成分（ｌ）〜（ｐ）、および場合によってエストロゲンが第２の１つまたは複数の容器から添加される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
卵巣細胞および卵管細胞を培養するための方法であって、
（ａ）卵巣または卵管から卵巣細胞および／または卵管細胞を得るステップと、
（ｂ）該細胞を請求項１から１７、３０から３６、および３８のいずれかに記載の細胞培養培地中で培養するステップと
を含み、該細胞培養培地により、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞の少なくとも１５回の集団倍加が支持される方法。
【請求項４４】
腫瘍細胞を培養するための方法であって、
（ａ）腫瘍細胞を得るステップと、
（ｂ）該腫瘍細胞を請求項１から１７、１８から２９、および３７のいずれかに記載の細胞培養培地中で培養するステップと、
を含み、該細胞培養培地により、該腫瘍細胞の少なくとも１５回の集団倍加が支持される方法。
【請求項４５】
培養プレートを、最初の１〜５回の細胞継代にわたってトリプシンで処理し、それにより、癌細胞を富化するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍細胞が、卵巣癌細胞、ヒト乳癌細胞、膵癌細胞、腺様嚢胞癌細胞、および／または肺または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍（カルチノイド）細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍細胞が卵巣癌細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記卵巣癌細胞が、患者の一次固形卵巣組織または腹水から、または動物モデルにおいて成長させた腫瘍異種移植片から得られる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記腫瘍細胞が乳頭状漿液性腫瘍細胞、明細胞腫瘍細胞、癌肉腫細胞、または未分化胚細胞腫細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞培養培地が、約１００ｎＭの１７−ベータ−エストラジオールと等しい効力の量のエストロゲンをさらに含み、前記腫瘍細胞が類内膜腫瘍細胞または粘液性腫瘍細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞培養培地により、細胞の増殖が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも１５、２５、または３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持される、請求項３９に記載のキット。
【請求項５２】
請求項１から１７、３０から３６、および３８のいずれかに記載の細胞培養培地と、
細胞であって、該細胞が、不死化卵巣細胞および／または前記卵管細胞である、細胞と
を含む組成物。
【請求項５３】
前記不死化細胞がテロメラーゼの触媒サブユニットを過剰発現している、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記テロメラーゼ触媒サブユニットが、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）である、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記卵巣細胞が卵巣上皮細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
前記卵巣上皮細胞の起源が卵巣表面である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記卵管細胞が卵管上皮細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
前記卵管上皮細胞の起源が卵管の采状表面である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
候補治療剤を同定する方法であって、
（ａ）請求項４３から５０に記載の方法に従って細胞を培養するステップと、
（ｂ）該細胞を作用物質と接触させるステップと、
（ｃ）該細胞の１つまたは複数の生理的特徴を測定するステップと
を含み、
該細胞の該１つまたは複数の生理的特徴を調節する作用物質が候補治療剤である方法。
【請求項６０】
ステップ（ａ）の細胞を、ステップ（ｂ）の前に試験動物内で成長させることをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、発癌性形質転換した卵巣細胞および／または卵管細胞である、請求項５９および６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が原発腫瘍に由来する、請求項５９および６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記原発腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記卵巣腫瘍が、乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、未分化胚細胞腫、類内膜腫瘍、または粘液性腫瘍のうちの少なくとも１つである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
測定される前記生理的特徴が細胞増殖を含み、細胞増殖を阻害する作用物質が候補治療剤である、請求項５９から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
卵巣細胞の実質的に精製された培養物であって、該卵巣細胞がプローブセットＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＬＰ３を過剰発現しており、該培養物が少なくとも１０３個の細胞を含み、該細胞が少なくとも１４回の集団倍加を行う能力を有する培養物。
【請求項６７】
卵管細胞の実質的に精製された培養物であって、該卵管細胞がプローブセットＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４を過剰発現しており、該培養物が少なくとも１０３個の細胞を含み、該細胞が少なくとも１４回の集団倍加を行う能力を有する培養物。
【請求項６８】
ｈＴＥＲＴが過剰発現している細胞を含む培養物であって、ｈＴＥＲＴの過剰発現が該細胞に少なくとも１４回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である培養物。
【請求項６９】
ｈＴＥＲＴの過剰発現が、前記細胞に少なくとも２５回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である、請求項６６、６７または６８に記載の培養物。
【請求項７０】
ｈＴＥＲＴの過剰発現が、前記細胞に少なくとも３５回の集団倍加を受ける能力を持たせるために十分である、請求項６６、６７または６８に記載の培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１１年３月２４日に出願された米国仮出願第６１／４６７，３６３号および２０１１年３月２５日に出願された米国仮出願第６１／４６７，９４９号の利益を主張する。これらの出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞株をｅｘ  ｖｉｖｏで培養することは、ヒト疾患の研究および治療の著しい助けとなっている。今日、多くの障害の機構的起源が、培養細胞株において特徴付けられており、細胞株は、スクリーニングするため、および治療薬を製造するために使用されている。癌および女性の性と生殖に関する健康の分野では、女性生殖器官由来の正常細胞および腫瘍細胞を培養することによって研究が強化されている。しかし、多くの細胞型は、利用可能な培地および現行の技法を用いて培養することが難しいことが証明されている。例えば、正常な卵巣細胞を培養するための現行の方法では、卵巣細胞のサブタイプを区別すること、例えば、線毛細胞と無線毛細胞、または卵巣表面上皮と封入体嚢胞上皮を区別することができない。さらに、悪性度が高い乳頭状漿液性腺癌に推定起源細胞として関係づけられている卵管上皮細胞はｅｘ  ｖｉｖｏでは培養されていない。卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞も、培養物中で成長させることが難しいことが証明されている。少数の卵巣癌細胞株が存在するが（非特許文献１（Verschraegen  CFら、Clin  Cancer  Res.  ２００３年２月；９巻（２号）：８４５〜５２頁）および特許文献１（米国特許第５，７１０，０３８号））、これらの細胞株は、集団倍加情報、起源腫瘍組織の臨床的−病理学的サブタイプ、悪性起源の検証、または表現型に関しては十分に特徴付けられていない。したがって、当技術分野では、卵巣組織、卵管細胞、および腫瘍細胞由来の細胞株を樹立するための培養細胞培地、キット、および方法が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，７１０，０３８号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Verschraegen  CFら、Clin  Cancer  Res.  ２００３年２月；９巻（２号）：８４５〜５２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、アデノシン三リン酸；担体タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン）；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基（キサンチンおよび／またはヒポキサンチンが好ましい）；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ；細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質（コレラ毒素が好ましい）；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；および血清を含む細胞培養培地、または細胞培養培地を調製するためのキットに関する。細胞培養培地は、アデノシン一リン酸、ビタミンＥ、ビタミンＫ３、ナイアシン、およびナイアシンアミドのうちの１つまたは複数も含んでよい。
【０００６】
細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質がコレラ毒素である特定の実施形態では、細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬから７０ｎｇ／ｍＬまでの間、好ましくは１５ｎｇ／ｍＬから３０ｎｇ／ｍＬの間、例えば、２０ｎｇ／ｍＬから２５ｎｇ／ｍＬの間などのコレラ毒素を含んでよい。ある特定の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約２０ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素を含む。他の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素を含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、３ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの間のＥＧＦ、好ましくは約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬなどのＥＧＦを含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、０．００５μｇ／ｍＬから１．５μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾンおよび／または１．０μｇ／ｍＬから７５．０μｇ／ｍＬの間のインスリンを含む。
【０００９】
ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、０．２％ｖ／ｖから４．０％ｖ／ｖの間の血清を含む。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、０．２％ｖ／ｖから１０．０％ｖ／ｖの間または０．２％ｖ／ｖから５．０％ｖ／ｖの間の血清を含む。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞（例えば、卵巣腫瘍細胞など）を培養するために適し、１．０％ｖ／ｖから１０．０％ｖ／ｖの間の血清、１．０％ｖ／ｖから４．０％ｖ／ｖの間の血清、好ましくは１．８％ｖ／ｖおよび２％ｖ／ｖの血清、最も好ましくは約１．８％ｖ／ｖの血清を含む細胞培養培地に関する。いくつかのそのような実施形態では、細胞培養培地は、０．１５μｇ／ｍＬから０．３μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾン、好ましくは約０．１５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンおよび／または５．０μｇ／ｍＬから５０．０μｇ／ｍＬの間のインスリン、好ましくは約１５．０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。腫瘍細胞を培養するために適した例示的な培地はＷＩＴ−ｏｃである。
【００１１】
類内膜腫瘍および粘液性腫瘍由来のものなどの特定の卵巣腫瘍細胞を培養するために適したそのような実施形態では、細胞培養培地は、エストロゲンをさらに含み、例えば、エストロゲン（例えば、１７−ベータ−エストラジオール）を、３０ｎＭから３００ｎＭの間の１７−ベータ−エストラジオール、好ましくは約１００ｎＭの１７−ベータ−エストラジオールと等しい効力の濃度で含む。特定の卵巣腫瘍細胞、例えば、乳頭状漿液腫、明細胞腫瘍、癌肉腫、および未分化胚細胞腫由来の腫瘍細胞などを培養するために適した実施形態などの他の実施形態では、細胞培養培地はエストロゲンを実質的に含まない。例示的な培地ＷＩＴ−ｏｃは、その中で培養する細胞型に応じて、エストロゲンを含んでもよく、エストロゲンを実質的に含まなくてもよい。
【００１２】
ＷＩＴ−ｏｃおよび卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞を培養するために適した細胞培養培地により、卵巣腫瘍細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約１４、２５、またはさらには３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持することができる。
【００１３】
正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために適したさらに他の実施形態では、細胞培養培地は、０．２５％ｖ／ｖから０．７５％ｖ／ｖの間の血清、好ましくは約０．５％ｖ／ｖの血清を含む。この細胞培養培地では、ヒドロコルチゾンの濃度は、好ましくは０．２５μｇ／ｍＬから０．５０μｇ／ｍＬの間、例えば、約０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンであり、および／または５．０μｇ／ｍＬから５０．０μｇ／ｍＬの間、好ましくは約２０．００μｇ／ｍＬのインスリンである。上皮細胞などの正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために適した例示的な培地はＷＩＴ−ｆｏである。
【００１４】
ＷＩＴ−ｆｏおよび正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために適した細胞培養培地により、卵巣細胞および／または卵管細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約１４、２５、またはさらには３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持することができる。いくつかの実施形態では、卵巣細胞および／または卵管細胞は不死化細胞である。不死化細胞はテロメラーゼの触媒サブユニット、例えばヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を過剰発現していてよい。本発明の１つの態様は、ｈＴＥＲＴが過剰発現している細胞を含む培養物であって、ｈＴＥＲＴの過剰発現が、細胞に、少なくとも１４、２５、または３５回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である培養物である。ある特定の実施形態では、培養物は、細胞の実質的に精製された培養物である。
【００１５】
本発明の１つの態様は、卵巣細胞の実質的に精製された培養物であって、卵巣細胞がプローブセットＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＬＰ３を過剰発現しており、培養物が、細胞を少なくとも１０３個含み、細胞が、少なくとも１４、２５、または３５回の集団倍加を行う能力を有する培養物に関する。同様に、一態様は、卵管細胞の実質的に精製された培養物であって、卵管細胞がプローブセットＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４を過剰発現しており、培養物が細胞を少なくとも１０３個含み、細胞が、少なくとも１４、２５、または３５回の集団倍加を行う能力を有する培養物に関する。本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕを含む第１の１つまたは複数の容器と、細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；および血清；ならびに場合によってエストロゲンを含む第２の１つまたは複数の容器とを含んでよく、したがって、第１の容器の内容物と第２の容器の内容物（または第１の容器のセットと第２の容器のセット）を適切な割合で組み合わせることにより、例えば、本明細書において多様に定義されている細胞培養培地がもたらされる。いくつかの実施形態では、このキットにより、細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも１４、２５、またはさらには少なくとも３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は細胞培養培地補助剤であり、この補助剤は、細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；血清；および場合によってエストロゲンを相対的な濃度で含み、したがって、適切な割合の補助剤を基本細胞培養培地に添加することにより、本明細書に記載の細胞培養培地がもたらされる。例えば、補助剤を細胞培養培地に添加することにより、例えば、本明細書において多様に記載されている通り０〜７０ｎｇ／ｍＬの細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．０１５〜０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン；少なくとも１０．００μｇ／ｍＬのインスリン、０．２％ｖ／ｖ〜４．０％ｖ／ｖの血清補助剤、および場合によって、３０〜３００ｎＭのエストロゲンがもたらされる。
【００１７】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ；細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；および血清；ならびに場合によってエストロゲンを組み合わせることを含み、それにより、内容物を適切な割合で組み合わせることにより、本明細書に多様に記載されている細胞培養培地がもたらされる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の成分（例えば、第１の１１種の成分である、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ）が第１の１つまたは複数の容器から添加され、１つまたは複数の追加成分、例えば、後者の５種の成分および場合によってエストロゲンが第２の１つまたは複数の容器から添加される。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を培養するための方法である。この方法は、卵巣または卵管から卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を得るステップと、細胞を本明細書に記載の細胞培養培地中で培養するステップとを含み、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は、細胞培養培地中で少なくとも１４、２５、またはさらには３５回の集団倍加を行うことができる。細胞は、卵巣表面に由来するものなどの卵巣上皮細胞であってよい。細胞は、卵管の采状表面に由来するものなどの卵管上皮細胞であってよい。
【００１９】
同様に、本発明の態様は、腫瘍細胞を培養するための方法に関する。この方法は、腫瘍細胞を得るステップと、腫瘍腫細胞を、本明細書に記載されており、ＷＩＴ−ｏｃによって例示される腫瘍細胞を培養するために適した細胞培養培地中で培養するステップとを含み、細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質はコレラ毒素であり、細胞培養培地は２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）、０．１５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン；１５．００μｇ／ｍＬのインスリン；および１．８％の血清補助剤（好ましくはエストロゲンを実質的に含まない）を含み、腫瘍細胞は、細胞培養培地中で少なくとも１４、２５、またはさらには３５回の集団倍加を行うことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、培養プレートを、最初の１〜５回の細胞継代にわたってトリプシンで処理し、それにより、癌細胞を富化するステップをさらに含む。他の実施形態では、腫瘍細胞は卵巣癌細胞、ヒト乳癌細胞、膵癌細胞、腺様嚢胞癌細胞、および／または肺または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍（カルチノイド）細胞である。例えば、腫瘍細胞は卵巣癌細胞であってよい。卵巣癌細胞は、患者の一次固形卵巣組織または腹水から、または動物モデルにおいて成長させた腫瘍異種移植片から得ることができる。さらなる実施形態では、腫瘍細胞は乳頭状漿液性腫瘍細胞、明細胞腫瘍細胞、癌肉腫細胞、または未分化胚細胞腫細胞である。他の実施形態では、例えば、類内膜腫瘍細胞または粘液性腫瘍細胞を培養するために、細胞培養培地は、１００ｎＭの１７−ベータ−エストラジオールまたは等しい効力の量の別のエストロゲンをさらに含んでよい。
【００２０】
本発明の追加的な態様は、候補治療剤を同定する方法であって、細胞（すなわち、乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、未分化胚細胞腫、類内膜腫瘍、または粘液性腫瘍のうちの少なくとも１つである卵巣腫瘍などの原発腫瘍に由来する細胞）を培養するステップと、細胞を作用物質と接触させるステップと、細胞の生理機能を測定するステップとを含み、細胞の生理機能を調節する作用物質が候補治療剤である方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を作用物質と接触させる前に細胞を試験動物内で成長させることをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１は、卵巣および卵管の解剖学的構造を示す。図１Ａおよび１Ｂは、卵母細胞（卵細胞）が産生される女性生殖器である卵巣を示す。卵巣は靭帯で子宮に付着しており、卵管の采状末端と並んでいる。図１Ｃは、薄い上皮で覆われた卵巣表面を示す。排卵の間、卵母細胞は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端に放出される。次の７日間で卵母細胞は卵管から子宮の子宮内膜腔に移動する。図１Ｄは、排卵の部位が通常は修復されるが、時には上皮に裏打ちされた小さな封入体嚢胞が卵巣の表面下に取り残されることを示す。図の出典、Baba  AI、Catoi  C.、Comparative  Oncology.  Bucharest：The  Publishing  House  of  the  Romanian  Academy；２００７年およびワールドワイドウェブwww.cancer.gov/cancertopics/ovarianepithelialにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの卵巣上皮癌治療に関するウェブサイト。
【図１Ｂ】図１は、卵巣および卵管の解剖学的構造を示す。図１Ａおよび１Ｂは、卵母細胞（卵細胞）が産生される女性生殖器である卵巣を示す。卵巣は靭帯で子宮に付着しており、卵管の采状末端と並んでいる。図１Ｃは、薄い上皮で覆われた卵巣表面を示す。排卵の間、卵母細胞は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端に放出される。次の７日間で卵母細胞は卵管から子宮の子宮内膜腔に移動する。図１Ｄは、排卵の部位が通常は修復されるが、時には上皮に裏打ちされた小さな封入体嚢胞が卵巣の表面下に取り残されることを示す。図の出典、Baba  AI、Catoi  C.、Comparative  Oncology.  Bucharest：The  Publishing  House  of  the  Romanian  Academy；２００７年およびワールドワイドウェブwww.cancer.gov/cancertopics/ovarianepithelialにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの卵巣上皮癌治療に関するウェブサイト。
【図１Ｃ】図１は、卵巣および卵管の解剖学的構造を示す。図１Ａおよび１Ｂは、卵母細胞（卵細胞）が産生される女性生殖器である卵巣を示す。卵巣は靭帯で子宮に付着しており、卵管の采状末端と並んでいる。図１Ｃは、薄い上皮で覆われた卵巣表面を示す。排卵の間、卵母細胞は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端に放出される。次の７日間で卵母細胞は卵管から子宮の子宮内膜腔に移動する。図１Ｄは、排卵の部位が通常は修復されるが、時には上皮に裏打ちされた小さな封入体嚢胞が卵巣の表面下に取り残されることを示す。図の出典、Baba  AI、Catoi  C.、Comparative  Oncology.  Bucharest：The  Publishing  House  of  the  Romanian  Academy；２００７年およびワールドワイドウェブwww.cancer.gov/cancertopics/ovarianepithelialにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの卵巣上皮癌治療に関するウェブサイト。
【図１Ｄ】図１は、卵巣および卵管の解剖学的構造を示す。図１Ａおよび１Ｂは、卵母細胞（卵細胞）が産生される女性生殖器である卵巣を示す。卵巣は靭帯で子宮に付着しており、卵管の采状末端と並んでいる。図１Ｃは、薄い上皮で覆われた卵巣表面を示す。排卵の間、卵母細胞は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端に放出される。次の７日間で卵母細胞は卵管から子宮の子宮内膜腔に移動する。図１Ｄは、排卵の部位が通常は修復されるが、時には上皮に裏打ちされた小さな封入体嚢胞が卵巣の表面下に取り残されることを示す。図の出典、Baba  AI、Catoi  C.、Comparative  Oncology.  Bucharest：The  Publishing  House  of  the  Romanian  Academy；２００７年およびワールドワイドウェブwww.cancer.gov/cancertopics/ovarianepithelialにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの卵巣上皮癌治療に関するウェブサイト。
【図２】図２は、ＷＩＴ−ｆｏ培地で正常な卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を長期培養した結果を例示しているグラフである。図２Ａは、ＷＩＴ−ｆｏ培地での卵管上皮（ＦＴＥ）細胞の成長（●青色の曲線）または対照培地での卵管上皮（ＦＴＥ）細胞の成長（■赤色の曲線）を示す。対照培地として、５％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２の１：１混合物を使用した。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＦＴＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく、連続的に少なくとも１２０日間分裂し、２４回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は１４日で停止した（■赤色の曲線）。図２Ｂは、ＷＩＴ−ｆｏ培地（●青色の曲線）での卵巣上皮（ＯＳＥ）細胞の成長または対照培地での卵巣上皮（ＯＳＥ）細胞の成長（■赤色の曲線）を示す。対照培地として１０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９の１：１混合物を使用した。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＯＳＥ細胞は、それらの増殖速度が低下することなく連続的に少なくとも４０日間分裂し、１５回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数週間で停止し、３回の集団倍加に到達しなかった（■赤色の曲線）。
【図３】図３は、ＰＡＸ８、ＣＫ７およびＦＯＸＪ１により、正常なヒト卵巣および卵管上皮における特定の細胞サブタイプが同定されることを示す。図３Ａ〜３Ｄは、正常なヒト卵巣組織；ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片のＰＡＸ８を用いた免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。異なる患者由来の多数の試料についてのレビューにより、卵巣封入体嚢胞の大部分がＰＡＸ８＋上皮に裏打ちされていることが実証されている（ＡおよびＢの褐色の核染色）。対照的に、卵巣表面上皮はほとんど常にＰＡＸ８陰性であり（Ａ、Ｃ）、封入体嚢胞上皮も時々ＰＡＸ８陰性になる場合がある（Ｄ）。図３Ｅは、正常なヒト卵管組織；ＦＦＰＥ切片の２重免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。線毛細胞はＦＯＸＪ１＋（褐色の核）であり、無線毛細胞はＰＡＸ８＋（赤色の核）である。図３Ｆは、正常なヒト卵管組織；ＦＦＰＥ切片の２重免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。線毛細胞はＦＯＸＪ１＋（褐色の核）であり、無線毛細胞はケラチン７＋（赤色の細胞質）である。２重免疫染色（Ｅ、Ｆ）は、ＦＯＸＪ１−ＨＲＰ（褐色）、その後ＰＡＸ８／ＣＫ７アルカリホスファターゼ（赤色）で逐次的に染色することによって実施した（スケールバー＝２０μＭ）。図３Ｇは、培養細胞株が、卵巣嚢胞上皮（ＯＳＥ）および無線毛卵管上皮（ＦＮＥ）と一致する免疫プロファイルを示すことを示す。
【図４Ａ】図４は、ＷＩＴ−ｆｏ培地において、正常な卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）および卵管無線毛上皮（ＦＮ）細胞がｈＴＥＲＴ単独で不死化されることを例示している。図４Ａは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＯＣ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＦＮ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｃは、蛍光補助細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を示し、親の卵巣上皮細胞（黒色の曲線）と比較して培養物中の細胞のほとんど全てがｇｆｐ陽性である（赤色の曲線および青色の曲線）。図４Ｄは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）を示す（●青色の曲線）または対照培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物））で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−Ｏ培地では、ＯＣＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく、連続的に少なくとも１５０日間分裂し、７０回の集団倍加に到達した（青色の線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。図４Ｅは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）または対照培地（０．１％ＢＳＡ、５％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２の１：１混合物）で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＦＮＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく連続的に少なくとも１５０日間分裂し、４０回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。
【図４Ｂ】図４は、ＷＩＴ−ｆｏ培地において、正常な卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）および卵管無線毛上皮（ＦＮ）細胞がｈＴＥＲＴ単独で不死化されることを例示している。図４Ａは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＯＣ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＦＮ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｃは、蛍光補助細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を示し、親の卵巣上皮細胞（黒色の曲線）と比較して培養物中の細胞のほとんど全てがｇｆｐ陽性である（赤色の曲線および青色の曲線）。図４Ｄは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）を示す（●青色の曲線）または対照培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物））で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−Ｏ培地では、ＯＣＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく、連続的に少なくとも１５０日間分裂し、７０回の集団倍加に到達した（青色の線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。図４Ｅは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）または対照培地（０．１％ＢＳＡ、５％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２の１：１混合物）で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＦＮＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく連続的に少なくとも１５０日間分裂し、４０回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。
【図４Ｃ】図４は、ＷＩＴ−ｆｏ培地において、正常な卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）および卵管無線毛上皮（ＦＮ）細胞がｈＴＥＲＴ単独で不死化されることを例示している。図４Ａは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＯＣ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＦＮ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｃは、蛍光補助細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を示し、親の卵巣上皮細胞（黒色の曲線）と比較して培養物中の細胞のほとんど全てがｇｆｐ陽性である（赤色の曲線および青色の曲線）。図４Ｄは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）を示す（●青色の曲線）または対照培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物））で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−Ｏ培地では、ＯＣＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく、連続的に少なくとも１５０日間分裂し、７０回の集団倍加に到達した（青色の線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。図４Ｅは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）または対照培地（０．１％ＢＳＡ、５％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２の１：１混合物）で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＦＮＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく連続的に少なくとも１５０日間分裂し、４０回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。
【図４Ｄ】図４は、ＷＩＴ−ｆｏ培地において、正常な卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）および卵管無線毛上皮（ＦＮ）細胞がｈＴＥＲＴ単独で不死化されることを例示している。図４Ａは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＯＣ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＦＮ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｃは、蛍光補助細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を示し、親の卵巣上皮細胞（黒色の曲線）と比較して培養物中の細胞のほとんど全てがｇｆｐ陽性である（赤色の曲線および青色の曲線）。図４Ｄは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）を示す（●青色の曲線）または対照培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物））で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−Ｏ培地では、ＯＣＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく、連続的に少なくとも１５０日間分裂し、７０回の集団倍加に到達した（青色の線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。図４Ｅは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）または対照培地（０．１％ＢＳＡ、５％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２の１：１混合物）で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＦＮＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく連続的に少なくとも１５０日間分裂し、４０回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。
【図４Ｅ】図４は、ＷＩＴ−ｆｏ培地において、正常な卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）および卵管無線毛上皮（ＦＮ）細胞がｈＴＥＲＴ単独で不死化されることを例示している。図４Ａは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＯＣ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ｇｆｐを発現しているＦＮ細胞の生細胞画像を示す（バー＝５０μＭ）。図４Ｃは、蛍光補助細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を示し、親の卵巣上皮細胞（黒色の曲線）と比較して培養物中の細胞のほとんど全てがｇｆｐ陽性である（赤色の曲線および青色の曲線）。図４Ｄは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）を示す（●青色の曲線）または対照培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物））で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵巣封入体嚢胞上皮細胞（ＯＣＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−Ｏ培地では、ＯＣＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく、連続的に少なくとも１５０日間分裂し、７０回の集団倍加に到達した（青色の線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。図４Ｅは、ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）または対照培地（０．１％ＢＳＡ、５％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２の１：１混合物）で成長させたｈＴＥＲＴを発現する卵管無線毛上皮細胞（ＦＮＥ）（■赤色の曲線）を示す。ＷＩＴ−ｆｏ培地では、ＦＮＥ細胞はそれらの増殖速度が低下することなく連続的に少なくとも１５０日間分裂し、４０回の集団倍加に到達した（●青色の曲線）。対照的に、対照培地における同じドナー由来の対応する細胞の成長は数日で停止した（■赤色の曲線）。
【図５】図５は、正常なヒト卵巣細胞（ＯＣＥ）および卵管（ＦＮＥ）細胞の腫瘍形成性形質転換を示す。図５Ａは、ＯＣ細胞およびＦＮ細胞を示し、これらはステップ１において同じドナーから単離し、ｈＴＥＲＴを単独で用いて不死化し、それぞれＯＣＥ１細胞およびＦＮＥ１細胞を生じさせた。これらの細胞をステップ２においてＳＶ４０Ｔ／ｔ（ＳＶ４０ＥＲ）を用いて、およびステップ３において突然変異体Ｈ−Ｒａｓ  Ｖ１２を用いて腫瘍形成性細胞に形質転換し、腫瘍形成性卵巣上皮細胞（ＯＣＬＥＲ１）および腫瘍形成性卵管上皮細胞（ＦＮＬＥＲ１）を生じさせた。第２のドナー由来の細胞を用いてこれらの実験を繰り返して、ＯＣＬＥＲ２細胞およびＦＮＬＥＲ２細胞を生じさせた。図５Ｂは、ｈＴＥＲＴのみを発現しているＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞における陰性染色と比較して、ＯＣＬＥＲ１／ＦＮＬＥＲ１対（ドナー１）およびＯＣＬＥＲ２／ＦＮＬＥＲ２対（ドナー２）ではＳＶ４０ＬＴおよびＨ−Ｒａｓタンパク質が発現していることを示すウェスタン免疫ブロットである。図５Ｃは、免疫蛍光による画像を示し、ＯＣＬＥＲ細胞およびＦＮＬＥＲ細胞におけるＳＶ４０−ラージＴ  Ａｇの同様の発現（ＬＴ、緑色の核）およびＨ−Ｒａｓタンパク質の発現（Ｒａｓ、緑色の細胞質）を実証している。ＤＡＰＩ核染色；４０×拡大率、スケールバー＝５０μＭ。ＯＣＬＥＲ細胞およびＦＮＬＥＲ細胞におけるラージＴ  Ａｇ（ＬＴ、緑色の核）およびＨ−Ｒａｓ（Ｒａｓ、緑色の細胞質）タンパク質の発現。ＤＡＰＩ核染色；４０×拡大率、スケールバー＝５０μＭ。
【図６】図６は、免疫無防備状態のヌードマウスにおけるＯＣＬＥＲおよびＦＮＬＥＲの腫瘍の組織病理を示す。図６Ａおよび６Ｂは、卵巣ＯＣＬＥＲ腫瘍異種移植片由来の代表的な腫瘍切片（ａ）および卵管ＦＮＬＥＲ腫瘍異種移植片由来の代表的な腫瘍切片（ｂ）のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。どちらの腫瘍も主に高悪性度低分化型であったが、限局的に、珍しい乳頭状漿液性腺癌によく似た微小乳頭（ｍｉｃｒｏｐａｐｉｌｌａｒｙ）構造が存在していた。図６Ｃおよび６Ｄは、ＯＣＬＥＲ異種移植片由来の代表的なＦＦＰＥ腫瘍切片（Ａ）およびＦＮＬＥＲ異種移植片由来の代表的なＦＦＰＥ腫瘍切片（Ｂ）のＰＡＸ８免疫ペルオキシダーゼ染色を示し、これにより、これらの腫瘍がＯＣ起源およびＦＮ起源であることが確認される。組織切片は、細胞を腹腔内注射および皮下注射した５〜９週間後に外植した、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織から調製した（スケールバー＝２０μＭ）。
【図７】図７は、ＦＮＬＥＲ腫瘍がＯＣＬＥＲ腫瘍よりも転移性であることを示す。図７Ａおよび７Ｂは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）異種移植片腫瘍のヘマトキシリン・エオシン染色を示し、ＦＮＬＥＲ（ａ）およびＯＣＬＥＲ（ｂ）がマウス膵臓に侵入していることを示す（スケールバー＝２５０μＭ）。図７Ｃは、ＦＮＬＥＲ腫瘍が、蛍光解剖顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（スケールバー＝２５０μＭ）でＧＦＰ陽性の腫瘍小結節であることが最初に観察された腹腔内注射部位または皮下注射部位からマウス肺に転移したことを示す。図７Ｄおよび７Ｅは、Ｈ＆Ｅ染色細胞（ｄ）ならびにＳＶ４０ＬＴ陽性染色細胞（ｅ）およびＰ５３陽性染色細胞（ｆ）によってＦＦＰＥマウス肺において同定された転移性ＦＮＬＥＲ細胞を示す（スケールバー＝５０μＭ）。図７Ｇは肺転移の頻度を示し、これはＯＣＬＥＲ腫瘍と比較してＦＮＬＥＲ腫瘍について有意に高かった（Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）。総腫瘍量＞０．５ｇのマウスの間で、腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで５〜９週間インキュベーションした後に、腹腔内注射部位および皮下注射部位から肺への転移の頻度をＯＣＬＥＲとＦＮＬＥＲの間で比較した。ＦＮＬＥＲとＯＣＬＥＲの間で腫瘍量またはインキュベーションの時間に有意差はなかった。
【図８Ａ】図８は、ＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞の遺伝子発現サインにより、ヒト卵巣腺癌組織における卵巣様遺伝子発現パターンおよび卵管様遺伝子発現パターンが同定されることを示す。１０種の最も重要な卵巣／卵管起源細胞遺伝子を２つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。図８Ａは、Ｗｕデータセットにおける各遺伝子と臨床的変数との関連性を示す（アレイプラットフォームの差異により、８種の遺伝子がＷｕデータセットに存在していた）。係数が＞０または＜０であることは、それぞれ、より高い悪性度、病期または漿液サブタイプを有する各遺伝子が上方制御または下方制御されていることを示す。線形ロジスティック回帰（悪性度および病期を順序変数とする）からのＰ値を偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）について補正した。図８Ｂの密度プロットは、Ｗｕ腫瘍試料におけるＯＶ／ＦＴ様スコアのいくらか二峰性の分布を示し、これにより、我々によるＯＶ様腫瘍クラスターおよびＦＴ様腫瘍クラスターへの分離が支持される。図８Ｃは、ＷｕデータにおけるＯＶ様サブグループおよびＦＴ様サブグループと臨床的特性（ロジスティック回帰（悪性度、病期を順序変数とする）およびフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）からのＰ値）との関連性を示す。図８Ｄの密度プロットにより、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ／ＦＴ様スコアのわずかな左寄りの非対称が実証されており、これによりＯＶ様腫瘍の小さな亜集団（矢印）が示唆される。図８Ｅは、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループと臨床的特徴（（ｃ）の場合と同様に算出したＰ値）との関連性を示す。図８Ｆは、カプラン・マイヤープロットを示し、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループとの間の生存における有意差が実証されている（コックス比例ハザードＰ値を腫瘍悪性度、病期および組織学的サブタイプに対して調整した）。
【図８Ｂ】図８は、ＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞の遺伝子発現サインにより、ヒト卵巣腺癌組織における卵巣様遺伝子発現パターンおよび卵管様遺伝子発現パターンが同定されることを示す。１０種の最も重要な卵巣／卵管起源細胞遺伝子を２つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。図８Ａは、Ｗｕデータセットにおける各遺伝子と臨床的変数との関連性を示す（アレイプラットフォームの差異により、８種の遺伝子がＷｕデータセットに存在していた）。係数が＞０または＜０であることは、それぞれ、より高い悪性度、病期または漿液サブタイプを有する各遺伝子が上方制御または下方制御されていることを示す。線形ロジスティック回帰（悪性度および病期を順序変数とする）からのＰ値を偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）について補正した。図８Ｂの密度プロットは、Ｗｕ腫瘍試料におけるＯＶ／ＦＴ様スコアのいくらか二峰性の分布を示し、これにより、我々によるＯＶ様腫瘍クラスターおよびＦＴ様腫瘍クラスターへの分離が支持される。図８Ｃは、ＷｕデータにおけるＯＶ様サブグループおよびＦＴ様サブグループと臨床的特性（ロジスティック回帰（悪性度、病期を順序変数とする）およびフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）からのＰ値）との関連性を示す。図８Ｄの密度プロットにより、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ／ＦＴ様スコアのわずかな左寄りの非対称が実証されており、これによりＯＶ様腫瘍の小さな亜集団（矢印）が示唆される。図８Ｅは、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループと臨床的特徴（（ｃ）の場合と同様に算出したＰ値）との関連性を示す。図８Ｆは、カプラン・マイヤープロットを示し、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループとの間の生存における有意差が実証されている（コックス比例ハザードＰ値を腫瘍悪性度、病期および組織学的サブタイプに対して調整した）。
【図８Ｃ】図８は、ＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞の遺伝子発現サインにより、ヒト卵巣腺癌組織における卵巣様遺伝子発現パターンおよび卵管様遺伝子発現パターンが同定されることを示す。１０種の最も重要な卵巣／卵管起源細胞遺伝子を２つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。図８Ａは、Ｗｕデータセットにおける各遺伝子と臨床的変数との関連性を示す（アレイプラットフォームの差異により、８種の遺伝子がＷｕデータセットに存在していた）。係数が＞０または＜０であることは、それぞれ、より高い悪性度、病期または漿液サブタイプを有する各遺伝子が上方制御または下方制御されていることを示す。線形ロジスティック回帰（悪性度および病期を順序変数とする）からのＰ値を偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）について補正した。図８Ｂの密度プロットは、Ｗｕ腫瘍試料におけるＯＶ／ＦＴ様スコアのいくらか二峰性の分布を示し、これにより、我々によるＯＶ様腫瘍クラスターおよびＦＴ様腫瘍クラスターへの分離が支持される。図８Ｃは、ＷｕデータにおけるＯＶ様サブグループおよびＦＴ様サブグループと臨床的特性（ロジスティック回帰（悪性度、病期を順序変数とする）およびフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）からのＰ値）との関連性を示す。図８Ｄの密度プロットにより、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ／ＦＴ様スコアのわずかな左寄りの非対称が実証されており、これによりＯＶ様腫瘍の小さな亜集団（矢印）が示唆される。図８Ｅは、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループと臨床的特徴（（ｃ）の場合と同様に算出したＰ値）との関連性を示す。図８Ｆは、カプラン・マイヤープロットを示し、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループとの間の生存における有意差が実証されている（コックス比例ハザードＰ値を腫瘍悪性度、病期および組織学的サブタイプに対して調整した）。
【図８Ｄ】図８は、ＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞の遺伝子発現サインにより、ヒト卵巣腺癌組織における卵巣様遺伝子発現パターンおよび卵管様遺伝子発現パターンが同定されることを示す。１０種の最も重要な卵巣／卵管起源細胞遺伝子を２つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。図８Ａは、Ｗｕデータセットにおける各遺伝子と臨床的変数との関連性を示す（アレイプラットフォームの差異により、８種の遺伝子がＷｕデータセットに存在していた）。係数が＞０または＜０であることは、それぞれ、より高い悪性度、病期または漿液サブタイプを有する各遺伝子が上方制御または下方制御されていることを示す。線形ロジスティック回帰（悪性度および病期を順序変数とする）からのＰ値を偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）について補正した。図８Ｂの密度プロットは、Ｗｕ腫瘍試料におけるＯＶ／ＦＴ様スコアのいくらか二峰性の分布を示し、これにより、我々によるＯＶ様腫瘍クラスターおよびＦＴ様腫瘍クラスターへの分離が支持される。図８Ｃは、ＷｕデータにおけるＯＶ様サブグループおよびＦＴ様サブグループと臨床的特性（ロジスティック回帰（悪性度、病期を順序変数とする）およびフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）からのＰ値）との関連性を示す。図８Ｄの密度プロットにより、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ／ＦＴ様スコアのわずかな左寄りの非対称が実証されており、これによりＯＶ様腫瘍の小さな亜集団（矢印）が示唆される。図８Ｅは、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループと臨床的特徴（（ｃ）の場合と同様に算出したＰ値）との関連性を示す。図８Ｆは、カプラン・マイヤープロットを示し、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループとの間の生存における有意差が実証されている（コックス比例ハザードＰ値を腫瘍悪性度、病期および組織学的サブタイプに対して調整した）。
【図８Ｅ】図８は、ＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞の遺伝子発現サインにより、ヒト卵巣腺癌組織における卵巣様遺伝子発現パターンおよび卵管様遺伝子発現パターンが同定されることを示す。１０種の最も重要な卵巣／卵管起源細胞遺伝子を２つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。図８Ａは、Ｗｕデータセットにおける各遺伝子と臨床的変数との関連性を示す（アレイプラットフォームの差異により、８種の遺伝子がＷｕデータセットに存在していた）。係数が＞０または＜０であることは、それぞれ、より高い悪性度、病期または漿液サブタイプを有する各遺伝子が上方制御または下方制御されていることを示す。線形ロジスティック回帰（悪性度および病期を順序変数とする）からのＰ値を偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）について補正した。図８Ｂの密度プロットは、Ｗｕ腫瘍試料におけるＯＶ／ＦＴ様スコアのいくらか二峰性の分布を示し、これにより、我々によるＯＶ様腫瘍クラスターおよびＦＴ様腫瘍クラスターへの分離が支持される。図８Ｃは、ＷｕデータにおけるＯＶ様サブグループおよびＦＴ様サブグループと臨床的特性（ロジスティック回帰（悪性度、病期を順序変数とする）およびフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）からのＰ値）との関連性を示す。図８Ｄの密度プロットにより、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ／ＦＴ様スコアのわずかな左寄りの非対称が実証されており、これによりＯＶ様腫瘍の小さな亜集団（矢印）が示唆される。図８Ｅは、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループと臨床的特徴（（ｃ）の場合と同様に算出したＰ値）との関連性を示す。図８Ｆは、カプラン・マイヤープロットを示し、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループとの間の生存における有意差が実証されている（コックス比例ハザードＰ値を腫瘍悪性度、病期および組織学的サブタイプに対して調整した）。
【図８Ｆ】図８は、ＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞の遺伝子発現サインにより、ヒト卵巣腺癌組織における卵巣様遺伝子発現パターンおよび卵管様遺伝子発現パターンが同定されることを示す。１０種の最も重要な卵巣／卵管起源細胞遺伝子を２つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。図８Ａは、Ｗｕデータセットにおける各遺伝子と臨床的変数との関連性を示す（アレイプラットフォームの差異により、８種の遺伝子がＷｕデータセットに存在していた）。係数が＞０または＜０であることは、それぞれ、より高い悪性度、病期または漿液サブタイプを有する各遺伝子が上方制御または下方制御されていることを示す。線形ロジスティック回帰（悪性度および病期を順序変数とする）からのＰ値を偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）について補正した。図８Ｂの密度プロットは、Ｗｕ腫瘍試料におけるＯＶ／ＦＴ様スコアのいくらか二峰性の分布を示し、これにより、我々によるＯＶ様腫瘍クラスターおよびＦＴ様腫瘍クラスターへの分離が支持される。図８Ｃは、ＷｕデータにおけるＯＶ様サブグループおよびＦＴ様サブグループと臨床的特性（ロジスティック回帰（悪性度、病期を順序変数とする）およびフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）からのＰ値）との関連性を示す。図８Ｄの密度プロットにより、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ／ＦＴ様スコアのわずかな左寄りの非対称が実証されており、これによりＯＶ様腫瘍の小さな亜集団（矢印）が示唆される。図８Ｅは、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループと臨床的特徴（（ｃ）の場合と同様に算出したＰ値）との関連性を示す。図８Ｆは、カプラン・マイヤープロットを示し、ＴｏｔｈｉｌｌデータにおけるＯＶ様サブグループとＦＴ様サブグループとの間の生存における有意差が実証されている（コックス比例ハザードＰ値を腫瘍悪性度、病期および組織学的サブタイプに対して調整した）。
【図９】図９は、形質転換細胞様サイン（ＴＣＳ）および不死化細胞様サイン（ＩＣＳ）により、転帰の異なるヒト卵巣腺癌が同定されることを示す。図９Ａは、ＴＳＣ＋発現サイン（赤色の線）を有するヒト卵巣癌がＩＣＳ＋サイン（青色の線）を有する腫瘍よりも有意に良好な全生存を有する（Ｐ＝０．０４６）ことを示すカプラン・マイヤー生存曲線を示す。予測通り、Ｌｉｍｍａモデル（ＦＤＲ多重検定補正を含む）により、Ｐ＜０．０５レベルの有意性で示差的に発現された多数のプローブ（ｎ＝１７，６４１）が同定された。我々は、細胞株における腫瘍と正常との比較から１，０００種の最も高度に有意なプローブを選択し、「腫瘍様」試料および「正常様」試料のクラスターを同定するために、この遺伝子サインを直接適用して、コンセンサスｋ平均クラスタリングを用いて同じ２つの独立したデータセット（Ｔｏｔｈｉｌｌ）において卵巣腫瘍を分類した（ｋ＝２）。Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットにおける１３６例の漿液性高悪性度（Ｇ３）進行病期（ＦＩＧＯ  ＳＩＩＩ／ＩＶ）腫瘍の間で、クラスター安定性が高い２つのクラスター（クラスターコンセンサス＝０．８９および０．９４）が同定され、これらはそれぞれ５１試料および８５試料を含んだ。図９Ｂは、Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットにおける５１試料が、ｋ平均クラスタリングによって「形質転換細胞サイン」（ＴＳＣ）を発現していると同定され、８５試料が不死化細胞サイン（ＩＣＳ）を有することが同定されたことを示す。ＴＣＳに分類した５１例のうち、３例のみがＴｏｔｈｉｌｌで予後不良（Ｃ１）であるとして分類され、ＩＳＣ腫瘍は４６／８５がＴｏｔｈｉｌｌによって予後不良（Ｃ１）として分類された。
【図１０Ａ】図１０は、従来の細胞培養培地での卵巣腫瘍の培養に対する新しく開発されたＷＩＴ−ＯＣ培地での卵巣腫瘍の培養を示す。図１０Ａでは、原発性卵巣乳頭状漿液性細胞腫組織（ＯＣＩ−Ｕ１ａ）をＷＩＴ−ｏｃ（●青色の曲線）、または１０％血清を伴うＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９（▲緑色の曲線）、または１０％血清を伴うＲＰＭＩ１６４０（■赤色の曲線）にプレーティングした。細胞を週に１回計数し、新しいフラスコに継代した。７週間後、ＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地のほぼ全ての細胞が死滅した（緑色の線および赤色の線）。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃ中の細胞はほぼ一定の速度で成長し、少なくとも３０回の集団倍加に到達し、そこで実験を停止した。ＲＰＭＩ−１６４０では９０日付近で１つのクローンが生じ（赤色の線）、永久細胞株として樹立された。図１０Ｂでは、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長したＯＣＩ−Ｕ１ａ腫瘍細胞のゲノムＤＮＡおよびＲＰＭＩにおいて成長したＯＣＩ−Ｕ１ａ腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ解析を用いて起源腫瘍と比較した。全ゲノムＣＧＨトレースは、いくつかの、培養していない腫瘍試料（中央のトレース）と比較してＲＰＭＩにおいて成長した腫瘍細胞（上のトレース）で獲得されるピーク（増幅、赤色の矢印）および失われるピーク（欠失、緑色の矢印）を示す。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長した腫瘍細胞のＣＧＨパターンは、それよりも有意に、培養していない腫瘍と類似していた（それぞれ下のＣＧＨトレースおよび中央のＣＧＨトレース）。図１０Ｃでは、卵巣明細胞癌細胞（ＯＣＩ−５Ｃｘ）はＷＩＴ−ｏｃ培地で少なくとも６０回の集団倍加まで成長した（●青色の曲線）。対照培地（１０％血清を伴うＤＭＥ：Ｆ１２では、細胞の成長は停止し、３０〜４０日で死滅した（■赤色の曲線）。
【図１０Ｂ】図１０は、従来の細胞培養培地での卵巣腫瘍の培養に対する新しく開発されたＷＩＴ−ＯＣ培地での卵巣腫瘍の培養を示す。図１０Ａでは、原発性卵巣乳頭状漿液性細胞腫組織（ＯＣＩ−Ｕ１ａ）をＷＩＴ−ｏｃ（●青色の曲線）、または１０％血清を伴うＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９（▲緑色の曲線）、または１０％血清を伴うＲＰＭＩ１６４０（■赤色の曲線）にプレーティングした。細胞を週に１回計数し、新しいフラスコに継代した。７週間後、ＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地のほぼ全ての細胞が死滅した（緑色の線および赤色の線）。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃ中の細胞はほぼ一定の速度で成長し、少なくとも３０回の集団倍加に到達し、そこで実験を停止した。ＲＰＭＩ−１６４０では９０日付近で１つのクローンが生じ（赤色の線）、永久細胞株として樹立された。図１０Ｂでは、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長したＯＣＩ−Ｕ１ａ腫瘍細胞のゲノムＤＮＡおよびＲＰＭＩにおいて成長したＯＣＩ−Ｕ１ａ腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ解析を用いて起源腫瘍と比較した。全ゲノムＣＧＨトレースは、いくつかの、培養していない腫瘍試料（中央のトレース）と比較してＲＰＭＩにおいて成長した腫瘍細胞（上のトレース）で獲得されるピーク（増幅、赤色の矢印）および失われるピーク（欠失、緑色の矢印）を示す。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長した腫瘍細胞のＣＧＨパターンは、それよりも有意に、培養していない腫瘍と類似していた（それぞれ下のＣＧＨトレースおよび中央のＣＧＨトレース）。図１０Ｃでは、卵巣明細胞癌細胞（ＯＣＩ−５Ｃｘ）はＷＩＴ−ｏｃ培地で少なくとも６０回の集団倍加まで成長した（●青色の曲線）。対照培地（１０％血清を伴うＤＭＥ：Ｆ１２では、細胞の成長は停止し、３０〜４０日で死滅した（■赤色の曲線）。
【図１０Ｃ】図１０は、従来の細胞培養培地での卵巣腫瘍の培養に対する新しく開発されたＷＩＴ−ＯＣ培地での卵巣腫瘍の培養を示す。図１０Ａでは、原発性卵巣乳頭状漿液性細胞腫組織（ＯＣＩ−Ｕ１ａ）をＷＩＴ−ｏｃ（●青色の曲線）、または１０％血清を伴うＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９（▲緑色の曲線）、または１０％血清を伴うＲＰＭＩ１６４０（■赤色の曲線）にプレーティングした。細胞を週に１回計数し、新しいフラスコに継代した。７週間後、ＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地のほぼ全ての細胞が死滅した（緑色の線および赤色の線）。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃ中の細胞はほぼ一定の速度で成長し、少なくとも３０回の集団倍加に到達し、そこで実験を停止した。ＲＰＭＩ−１６４０では９０日付近で１つのクローンが生じ（赤色の線）、永久細胞株として樹立された。図１０Ｂでは、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長したＯＣＩ−Ｕ１ａ腫瘍細胞のゲノムＤＮＡおよびＲＰＭＩにおいて成長したＯＣＩ−Ｕ１ａ腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ解析を用いて起源腫瘍と比較した。全ゲノムＣＧＨトレースは、いくつかの、培養していない腫瘍試料（中央のトレース）と比較してＲＰＭＩにおいて成長した腫瘍細胞（上のトレース）で獲得されるピーク（増幅、赤色の矢印）および失われるピーク（欠失、緑色の矢印）を示す。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長した腫瘍細胞のＣＧＨパターンは、それよりも有意に、培養していない腫瘍と類似していた（それぞれ下のＣＧＨトレースおよび中央のＣＧＨトレース）。図１０Ｃでは、卵巣明細胞癌細胞（ＯＣＩ−５Ｃｘ）はＷＩＴ−ｏｃ培地で少なくとも６０回の集団倍加まで成長した（●青色の曲線）。対照培地（１０％血清を伴うＤＭＥ：Ｆ１２では、細胞の成長は停止し、３０〜４０日で死滅した（■赤色の曲線）。
【図１１Ａ】図１１は、卵管卵巣腫瘍細胞株（ＯＣＩ）をＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣに推奨される標準の卵巣腫瘍細胞培地中で培養することができないことを示す。図１１Ａは、ＷＩＴ−ｏｃ培地と、それに対して１５％血清を補充したマッコイ５Ａ、ＭＣＤＢ１０５／Ｍ１９９、またはＲＰＭＩ−１６４０培地にプレーティングした同等数のＯＣＩ株（７０６、２９、および４）を示す。細胞を５日培養した後に計数した。ＯＣＩ細胞株はこれらの標準培地では急速に死滅し、培養することが不可能であった。図１１Ｂは、ＷＩＴ−ｏｃ培地と、それに対して１５％血清を補充したマッコイ５Ａ、ＭＣＤＢ１０５／Ｍ１９９、またはＲＰＭＩ−１６４０培地にプレーティングした同等数のＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ−３、ＯＶ−９０、およびＡ２７８０）を示す。細胞を５日培養した後に計数した。ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株の全てが、ＷＩＴ−ｏｃ培地ならびにＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣにより推奨される培地において増殖した。Ａ２７８０細胞は、推奨される標準培地よりもＷＩＴ−ｏｃにおいてよく増殖した。
【図１１Ｂ】図１１は、卵管卵巣腫瘍細胞株（ＯＣＩ）をＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣに推奨される標準の卵巣腫瘍細胞培地中で培養することができないことを示す。図１１Ａは、ＷＩＴ−ｏｃ培地と、それに対して１５％血清を補充したマッコイ５Ａ、ＭＣＤＢ１０５／Ｍ１９９、またはＲＰＭＩ−１６４０培地にプレーティングした同等数のＯＣＩ株（７０６、２９、および４）を示す。細胞を５日培養した後に計数した。ＯＣＩ細胞株はこれらの標準培地では急速に死滅し、培養することが不可能であった。図１１Ｂは、ＷＩＴ−ｏｃ培地と、それに対して１５％血清を補充したマッコイ５Ａ、ＭＣＤＢ１０５／Ｍ１９９、またはＲＰＭＩ−１６４０培地にプレーティングした同等数のＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ−３、ＯＶ−９０、およびＡ２７８０）を示す。細胞を５日培養した後に計数した。ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株の全てが、ＷＩＴ−ｏｃ培地ならびにＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣにより推奨される培地において増殖した。Ａ２７８０細胞は、推奨される標準培地よりもＷＩＴ−ｏｃにおいてよく増殖した。
【図１２】図１２は、ＯＣＩ異種移植片の組織病理を例示しており、これにより起源腫瘍が再現される。ホルマリン固定パラフィン包埋原発腫瘍および異種移植片腫瘍の組織切片をヘマトキシリン・エオシンで染色した。図１２Ａは、ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３の腫瘍異種移植切片を示す。図１２Ｂは、ＡＴＣＣ卵巣癌細胞株ＯＶ９０の腫瘍異種移植切片を示す。ＡＴＣＣ株に由来する異種移植片腫瘍（Ａ〜Ｂ）に特異的な構成はない。ヒト腺癌の典型的な特徴、例えば、腺、乳頭状、間質核、ムチンまたはホルモン受容体の発現、線維形成性間質などは存在しない。これらの腫瘍はほぼ完全に腫瘍細胞のシートで構成され、組織培養物中の細胞と同様であると思われる。図１２Ｃは、ヒト乳頭状漿液性腺癌（ＰＳＣ）に由来するＯＣＩ−Ｐ９ａ株の腫瘍異種移植切片を示す。間質核および乳頭状構成が明白に存在することに留意されたい。図１２Ｄは、ヒト類内膜腺癌に由来するＯＣＩ−Ｅ１ｐ株の腫瘍異種移植切片を示す。腺が明白に存在することに留意されたい。挿入図：免疫組織学的検査により、類内膜表現型と一致して、これらの異種移植片腫瘍においてエストロゲン受容体およびムチンが発現していることが確認される。図１２Ｅは、ＯＣＩ−Ｐ９ａが由来するヒトＰＳＣ腫瘍組織の起源腫瘍切片を示す。間質核および乳頭状構成に留意されたい。図１２Ｆは、ＯＣＩ−Ｅ１ｐ株が由来するヒト類内膜腺癌組織の起源腫瘍切片を示す。
【図１３】図１３は、ＳＮＰアレイ解析を用いたＯＣＩ株と起源腫瘍組織の比較を示す。１２種の培養していない原発性腫瘍（Ｔ、黒色）およびＷＩＴ−ｏｃ培地においてそれらから生じた１２種の連続的な卵管卵巣細胞株（ＯＣＩ、赤色）、および９種のＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株（青色）由来のゲノムＤＮＡを２５０Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰアレイにハイブリダイズさせ、結果をＧｅｎｅｃｈｉｐで解析した。青色＝コピー数の変更または異型接合性の損失、黄色＝検出可能なＤＮＡの変更なし。この教師なし階層クラスタリング解析では、あらゆるＯＣＩ細胞株はその親である培養していない原発腫瘍試料の隣にクラスター化されることに留意されたい。したがって、各細胞株は、その親の起源腫瘍組織に最も類似していると正確に同定される。ＯＣＩ株における変更の大部分は、ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株と比較して染色体のセグメントが有意に短いことに関係する。ＯＣＩ−Ｕ１ｐおよびＯＣＩ−Ｐ３ａではセグメントが大規模に変更されているが、これは、それらが由来する起源腫瘍の特徴であり、細胞培養のアーチファクトの結果ではないと思われる（それぞれＴＵ１およびＴＰ３）。
【図１４】図１４は、ＯＣＩ株の遺伝子発現プロファイルにより、培養物中のヒト卵巣腺癌の臨床的サブグループが再現されることを例示している。ＯＣＩ株、正常な卵巣−卵管細胞およびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌株のｍＲＮＡ発現レベルの教師なし階層クラスタリングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ｐｌｕｓチップを用いて測定した（赤色＝高発現、青色＝低発現）。正常な卵巣細胞および卵管細胞（青色のバー）、乳頭状漿液性腫瘍（赤色のバー）由来のＯＣＩ株および明細胞／類内膜腫瘍に由来するＯＣＩ株（緑色）は別個のクラスターを形成したことに留意されたい。ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株は、いくつかの明細胞ＯＣＩ株（淡紅色）を例外として、他のＯＣＩ株とは離れて別個のクラスターを形成した（黒色）。
【図１５】図１５は、ＯＣＩ株のプロテオミクスプロファイルにより、培養物中のヒト卵巣腺癌の臨床的サブグループが再現されることを示す。ＯＣＩ株の逆相タンパク質アッセイ（ＲＰＰＡ）分析を行い、＞２００タンパク質の発現を検査した。ＲＰＰＡは、ハイスループットかつ定量的なプロテオミクス技術であり、これにより、数百のタンパク質の示差的な発現を同時に定量的に分析することが可能になる。これらのアッセイは、細胞由来のタンパク質抽出物の段階希釈物をスライドまたは膜上のアレイにプリントし、アレイを単一の抗体でプローブすることによって行う。アレイ上の各スポットに対する抗体の特異的な結合を定量化し、プロットする。ＯＣＩ株をＲＰＰＡ解析することにより、異なる腫瘍型から樹立された細胞株が、ｍＲＮＡの発現プロファイルと同様に別々のクラスターを形成することが明らかになった。これらの結果は、培養細胞は、培養物において、それらの分子の特徴を、正常な卵巣細胞および卵管細胞（青色のバー）、明細胞腫瘍（緑色のバー）、類内膜腫瘍（淡紅色のバー）および乳頭状漿液腫（赤色のバー）であると認識することが可能になる細胞生物学的情報を有意なレベルで必ず保持するはずであることを示唆している。いくつかのＯＣＩ株はそれら自体の組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）でクラスター化されず、これは、以前は認識されていなかったこれらの主要な組織型の分子サブタイプまたは変異体を反映している可能性がある。このデータセットにおける粘液癌、癌肉腫およびミュラー細胞腫（ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（黄色）の例はただ１つであったので、これらの細胞型を腫瘍起源に従ってクラスター化することができるかについては評価することができなかった。これらの実験を３連で繰り返し、結果は同様であった。
【図１６】図１６は、ＯＣＩ株ではＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株と比較して薬物応答が有意に異なることを示す。図１６Ａは、９６ウェルプレート中のＷＩＴ−ｏｃ培地に３連でプレーティングした（ウェル当たり細胞５０００個）ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株（ＳＫＯＶ３、ＯＶ９０、ＴＯＶ−１１２０およびＡ２７８０）およびＯＣＩ卵巣腫瘍株（Ｃ５ｘ、Ｐ９ａ１、Ｐ７ａおよびＦＣＩ−Ｐ１ｐ）を示す。次の日に、ＭＡＰＫ阻害薬であるＵＯ１２６の段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に１４４時間インキュベートした後、生存細胞の数を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて５９０／５３０蛍光として測定した。ＯＣＩ細胞株に対するＭＡＰＫ阻害薬の効果とＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ細胞株に対するＭＡＰＫ阻害薬の効果に有意差があった。ＯＣＩにおいて細胞数が５０％減少したＵＯ１２６の濃度（ＬＤ５０）は、予測通り、大多数のＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ細胞についておよそ５μＭであった。しかし、驚いたことに、ＯＣＩ株の大部分が、ＭＡＰＫ阻害に対する抵抗性が少なくとも５〜６倍高かった（ＬＤ５０＞３０μＭ）。図１６Ｂは、プレート中のＷＩＴ−ｏｃ培地に３連でプレーティングした（ウェル当たり細胞５０００個）ＯＣＩ卵巣腫瘍株（Ｐ７ａ、Ｐ２ａ、Ｃ２ｐ）およびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株（ＥＳ２およびＯＶ９０）を示す。次の日に、パクリタキセルの段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に７２時間インキュベートした後、生存細胞を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて５９０／５３０蛍光として測定した。図１６Ｃは、プレート中のＷＩＴ−ｏｃ培地（ウェル当たり細胞５０００個）に３連でプレーティングしたＯＣＩ卵巣腫瘍株（Ｐ７ａ、Ｐ２ａ、Ｃ２ｐ）およびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株（ＥＳ２およびＯＶ９０）を示す。次の日に、シスプラチンの段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に７２時間インキュベートした後、生存細胞を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて５９０／５３０蛍光として測定した。ＯＣＩ細胞株に対するパクリタキセルまたはシスプラチンの効果とＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ細胞株に対するパクリタキセルまたはシスプラチンの効果に劇的な差異があった。腫瘍細胞数を５０％減少させるこれらの薬物の濃度（ＬＤ９０）は、ＯＣＩ株ではＡＴＣＣＣ／ＥＣＡＣＣ株と比較して６倍高かった。
【図１７Ａ】図１７は、ＯＣＩおよびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍細胞株の遺伝子発現とヒト卵巣腫瘍との比較を示す。図１７Ａは、３７の細胞および２８５のヒト組織の遺伝子発現データの階層クラスタリングを示す。少なくとも４つの細胞における組織にわたる中央値と比較した差異が少なくとも２倍である発現レベルを有する遺伝子を階層クラスタリング解析のために選択した（３，８３１の遺伝子特徴）。データは行列形式で示されており、行が個々の遺伝子を示し、列が各組織を示す。行列内の各細胞は、個々の組織における遺伝子特徴の発現レベルを示す。細胞における赤色および緑色は、それぞれスケールバー（ｌｏｇ２変換尺度）に示されている通り、相対的な高発現レベルおよび低発現レベルを反映する。紫色のバー＝ヒト腫瘍試料であり、赤色のバーはＯＣＩ腫瘍株であり、青色のバーはＡＴＣＣ株と共にクラスター化されるＡＴＣＣ卵巣腫瘍株＋ＯＣＩ株である。図１７Ｂは、パネルａにおけるヒト卵巣腫瘍の臨床的な全生存分析データを示す。ＯＣＩ株と同様の遺伝子発現プロファイルを有するヒト腫瘍は、ＡＴＣＣ株と同様の遺伝子発現プロファイルを有するヒト腫瘍よりも悪い転帰を有する。
【図１７Ｂ】図１７は、ＯＣＩおよびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍細胞株の遺伝子発現とヒト卵巣腫瘍との比較を示す。図１７Ａは、３７の細胞および２８５のヒト組織の遺伝子発現データの階層クラスタリングを示す。少なくとも４つの細胞における組織にわたる中央値と比較した差異が少なくとも２倍である発現レベルを有する遺伝子を階層クラスタリング解析のために選択した（３，８３１の遺伝子特徴）。データは行列形式で示されており、行が個々の遺伝子を示し、列が各組織を示す。行列内の各細胞は、個々の組織における遺伝子特徴の発現レベルを示す。細胞における赤色および緑色は、それぞれスケールバー（ｌｏｇ２変換尺度）に示されている通り、相対的な高発現レベルおよび低発現レベルを反映する。紫色のバー＝ヒト腫瘍試料であり、赤色のバーはＯＣＩ腫瘍株であり、青色のバーはＡＴＣＣ株と共にクラスター化されるＡＴＣＣ卵巣腫瘍株＋ＯＣＩ株である。図１７Ｂは、パネルａにおけるヒト卵巣腫瘍の臨床的な全生存分析データを示す。ＯＣＩ株と同様の遺伝子発現プロファイルを有するヒト腫瘍は、ＡＴＣＣ株と同様の遺伝子発現プロファイルを有するヒト腫瘍よりも悪い転帰を有する。
【図１８】図１８は、ＷＩＴ−ｏｃ培地において首尾よく成長した他の腫瘍型のいくつかの例を示す画像である。図１８Ａ〜１８Ｂは、ヒト侵襲性乳管癌の２つの異なる試料から樹立された腫瘍細胞株の顕微鏡画像である。１８Ｃ〜１８Ｄは、頭頸部腫瘍の腺様嚢胞癌の２つの異なる試料から樹立された腫瘍細胞株の顕微鏡画像である。図１８Ｅ〜１８Ｆは、ヒト肺神経内分泌腫瘍（カルチノイド）の２つの異なる試料から樹立された腫瘍細胞株の顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
Ｉ．細胞培養培地
Ａ．培養培地の組成
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける初代細胞（卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を含む）および腫瘍細胞（卵巣腫瘍細胞を含む）の成長および増殖を長期にわたって支持する細胞培養培地に関する。「細胞培養培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」、「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」（それぞれの場合の複数形の「培地（ｍｅｄｉａ）」）および「培地処方」という句は、細胞を培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）するための栄養溶液を指し、これらは互換的に使用することができる。
【００２３】
本明細書に記載の培地中で培養される細胞は、少なくとも４週間（または１５回の集団倍加）、数ヶ月に至るまで、そのような培養培地において分化能を失うことなく成長することができる。一実施形態では、対象培地により、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞、ならびに／またはテロメラーゼをトランスフェクトした卵巣細胞および卵管細胞の長期の成長および増殖が、いかなる追加的な検出可能な遺伝学的変更も伴わずに、または分化能を失うことなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約１５週間または少なくとも約３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持される。別の実施形態では、対象培地により、これらの細胞の成長および増殖が、培養物中で少なくとも５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間またはそれ以上支持される。同様に、対象培地により、ヒトの腫瘍組織、悪性体液中の腫瘍細胞、および／または動物モデルにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片に由来する初代細胞株の成長を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも約１５週間または少なくとも約１４、２５またはさらには３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって、いかなる追加的な検出可能な遺伝学的変更も伴わずに、またはその表現型（形態学的、構造的、および／または分子など）および／または組織病理を失うことなく支持することができる。別の実施形態では、対象培地により、これらの細胞の成長および増殖が、培養物中で少なくとも５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間またはそれ以上支持される。
【００２４】
本発明の細胞培養培地は水ベースであり（しかし、乾燥粉末および／または凍結させた構成成分から再構成することができる）、水、液体、および／または水溶液中にいくつもの成分を含む。
【００２５】
「成分」という用語は、化学的起源か生物学的起源かに関わらず、細胞の成長または増殖を維持または促進するために細胞培養培地に使用することができる任意の化合物を指す。「構成成分」、「栄養分」および「成分」という用語は互換的に使用することができ、これらは全て、そのような化合物を指すものとする。細胞培養培地に使用される典型的な成分としては、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）を促進または維持する他の成分は、当業者が特定の必要性に応じて選択することができる。
【００２６】
「細胞培養」または「培養」とは、人工的なｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境において細胞を維持することを意味する。しかし、「細胞培養」という用語は総称であり、個々の細胞だけでなく、組織、器官、器官系、または生物体全体の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）も包含するために使用することができ、「組織培養」、「器官培養」、「器官系培養」または「器官型培養」という用語を場合によって「細胞培養」という用語と互換的に使用することができることが理解されるべきである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、培地は、１種または複数種の特定の構成成分を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、「実質的に含まない」とは、構成成分が細胞の成長および／または分化の状態に対して統計的に有意な効果を持たない少量であることを指す。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、液体の１％ｖ／ｖ未満、０．１％ｖ／ｖ未満、０．０１％ｖ／ｖ未満、０．００１％ｖ／ｖ未満、または０．０００１％ｖ／ｖ未満であることまたは溶質の１％ｗ／ｖ未満、０．１％ｗ／ｖ未満、０．０１％ｗ／ｖ未満、０．００１％ｗ／ｖ未満、または０．０００１％ｗ／ｖ未満であることを指す。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、０．００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００１ｍｇ／Ｌ未満、０．００００１ｍｇ／Ｌ未満、０．０００００１ｍｇ／Ｌ未満、または０．００００００１ｍｇ／Ｌ未満の濃度であることを指す。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、または１ｐＭ未満の濃度であることを指す。
【００２８】
本発明の一態様では、対象細胞培養培地は、（１）１種または複数種の抗酸化剤；（２）１種または複数種のヌクレオチドサルベージ経路合成前駆体；（３）１種または複数種の脂質合成前駆体；（４）１種または複数種のタンパク質合成前駆体；（５）１種または複数種の炭水化物合成およびエネルギー代謝の前駆体；（６）１種または複数種の緩衝液（必須ではない）；（７）１種または複数種の陽イオン（一価および／または二価）、イオン、微量金属および酵素補因子；（８）１種または複数種の担体タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンなど）；（９）１種または複数種の界面活性剤（例えば、ｔｗｅｅｎ８０など）；（１０）１種または複数種の、細胞内の３’−５’環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルの上昇を誘導する作用物質；（１１）１種または複数種のホルモンおよび成長因子、ならびに／または（１２）血清を含む。他の実施形態では、生じた培地により、正常な卵巣細胞および卵管細胞などの細胞ならびに／または卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞などの成長および／または増殖がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約４週間または少なくとも約１５、２５、またはさらには３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持されるのであれば、上で列挙されている構成成分カテゴリーのうちの１つまたは複数を省くことができる。
【００２９】
したがって、本発明の培地は、１種または複数種の抗酸化剤；ヌクレオチド合成およびサルベージ経路の前駆体；脂質合成前駆体；細胞内ｃＡＭＰレベルのアゴニスト；ホルモンおよび成長因子；ならびに血清を含む。培地は、他の構成成分、例えば、アミノ酸補助剤、細胞の成長／増殖に必要なビタミン、微量鉱質、無機塩、エネルギーの供給源（例えば解糖のため）など、および他の構成成分、例えば、ｐＨ指示薬などをさらに含んでよい。言い換えれば、本発明の成分は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、アデニン、Ｄ−グルコース、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チミジンおよびトランスフェリンを含んでよい。これらの成分はそれぞれ、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。
【００３０】
任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、抗酸化剤は、一般に、一般に細胞の成長に有害であると考えられているフリーラジカルのクエンチを補助する。本発明の抗酸化剤としては、これらだけに限定することなく、以下の１つまたは複数を挙げることができる：ベータカロテン、ビタミンＥ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＫ３、グルタチオン（還元型）、ナイアシン（またはナイアシンアミド）、またはＤＴＴ（ジチオスレイトール）。抗酸化剤には、場合によって、Ｚｎ、Ｓｅ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｍｇ、またはＭｎを含めた微量金属を補充することができる。
【００３１】
さらに、理論に縛られることを望むものではないが、特定の酵素を構成するために微量鉱物が必要な場合がある。例えば、グルタチオンペルオキシダーゼは補因子としてセレンを使用し、グルタチオン超酸化物は補因子として銅を使用する。フリーラジカル負荷量が大きい疾患では、特定の微小環境においてこれらの微量要素が欠損する可能性があることが仮定された。微量鉱物が存在することは、酵素的抗酸化剤（補因子を欠く可能性がある）に役立つ可能性がある。したがって、微量鉱物が存在することにより、宿主が酵素的抗酸化剤を有効に使用することが可能になり得る。亜鉛により超酸化物ジスムターゼを上方制御することができ、セレンによりグルタチオンペルオキシダーゼを上方制御することができることが公知であるので、所与の微小環境において微量鉱物を増加させることにより、微小環境における酵素的抗酸化剤の正味の増加がもたらされる。酵素的抗酸化剤の正味の増加および両親媒性抗酸化剤の増加により、組織または細胞の酸化による損傷、ならびにフリーラジカルに起因する他の有害作用がさらに減少する。
【００３２】
したがって、本発明の培地において有益であり得る多くの無機塩成分、陽イオン、イオン、微量金属、およびビタミンとしては、カルシウム塩（例えばＣａＣｌ２）、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＫＣｌ、マグネシウム塩（例えばＭｇＣｌ２）、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４ならびに微量元素であるセレンおよび亜鉛のイオンが挙げられる。場合によっては、追加的な無機塩成分として、マンガン塩（例えばＭｎＣｌ２）、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、およびスズを挙げることができる。
【００３３】
これらの微量元素は、種々の形態で提供することができ、Ｎａ２ＳｅＯ３、およびＺｎＳＯ（または任意選択の塩としてＮａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮＨ４ＶＯ３、ＮｉＳＯ４、ＳｎＣｌ２）などの塩の形態が好ましい。これらの無機塩および微量元素は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。
【００３４】
本発明の培地に含めることができるビタミン成分としては、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋＋−パントテン酸、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡおよびビタミンＢ１２が挙げられる。これらのビタミンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。
【００３５】
タンパク質合成前駆体としては、アミノ酸成分が挙げられる。一実施形態では、本発明の培地に含めることができるアミノ酸成分としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンが挙げられる。これらのアミノ酸は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。
【００３６】
あるいは、いくつかの他の実施形態では、必須アミノ酸のみが本発明の培地に含まれる。ヒト細胞などの特定の細胞は、生存するために適量の９種のアミノ酸を有さなければならない。これらのいわゆる「必須」アミノ酸は他の前駆体から合成することができない。しかし、システインがメチオニンの必要性を部分的に満たす場合があり（どちらも硫黄を含有する）、また、チロシンをフェニルアラニンと部分的に置換することができる。そのような必須アミノ酸としては、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン（および／またはシステイン）、フェニルアラニン（および／またはチロシン）、トレオニン、トリプトファン、およびバリンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンのみが含まれる。
【００３７】
上記の成分の一部または全部を溶液中で混和すると、「基本培地」を形成することができる。この基本培地に、他の構成成分、例えば、少なくとも１種のヌクレオチド合成前駆体および／またはサルベージ経路前駆体（例えばヒポキサンチン）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、少なくとも１種の、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させる作用物質、および少なくとも１種のホルモン、および少なくとも１種のタンパク質などを加えて、本発明の完全な培養培地を処方する。これらの後者の添加される構成成分、例えば、ＥＧＦおよびｃＡＭＰを上昇させる作用物質（複数可）などは、新たに処方した基本培地に加えることができる、または、本発明の完全培地を処方するために基本培地に加えるまで好ましくは約−２０℃〜約−７０℃で凍結貯蔵した貯蔵用液として混和することができる。この完全培地は、所望の細胞の成長および増殖を実現するために動物細胞培養培地中にＢＰＥまたは他の器官／腺抽出物を含んでもよく、動物細胞培養培地中にＢＰＥまたは他の器官／腺抽出物を実質的に含まなくてもよい。混和物は、１〜１０００×処方として、最も好ましくは１×、１００×、５００×または１０００×処方として調製することもでき、次いで、これを培養培地中に適切に希釈して、本発明の完全培地中１×最終処方をもたらす。
【００３８】
本発明の培地は、プロゲステロン、テストステロン、ヒドロコルチゾン、もしくはエストロゲンなどの１種または複数種のホルモン、および／またはインスリンおよびＥＧＦ（上皮成長因子）などの１種または複数種の成長因子も含んでよい。
【００３９】
例えば、本発明の培地は、ＥＧＦを含んでよく、これは天然型であっても組換え型であってもよく、ヒトのものであってもげっ歯類のものであってもよい。ＥＧＦは、市販されており（例えば、ＧＩＢＣＯ／ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから）、天然の供給源から単離されるか、当技術分野において常套的である方法体系に従って組換えＤＮＡ技法によって作製される（米国特許第４，７４３，６７９号）。本発明の培地を処方するために、好ましい実施形態では、ＥＧＦを培地（例えば、表３に示されている培地など）に、最終濃度が約０．００００１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０００５〜１ｍｇ／Ｌになるように加える。
【００４０】
本発明の培地は、ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニン、およびチミジンなどの、ヌクレオチドのサルベージ経路による合成において使用することができるヌクレオチド類似体または前駆体も含んでよい。
【００４１】
本発明の培地は、コレステロール、リノール酸、リポ酸、またはＯ−ホスホリルエタノールアミンなどの脂質合成前駆体も含んでよい。
【００４２】
本発明の培地は、１種または複数種のｃＡＭＰアゴニストまたは細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる作用物質も含む。種々のそのような作用物質を、本発明の培地の処方において使用することができる。細胞内ｃＡＭＰ（例えば、ジブチリルｃＡＭＰ）レベルの直接的な上昇を誘導する作用物質、細胞のＧタンパク質（例えば、コレラ毒素およびフォルスコリン）と相互作用することによって細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こす作用物質、β−アドレナリン作動性受容体（例えば、イソプロテレノール）のアゴニストとして作用することによって細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こす作用物質、およびｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（例えば、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）およびテオフィリン）の活性を阻害することによって細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こす作用物質が含まれる。本発明の培地の処方において使用するために最も好ましいのはコレラ毒素である。これらのｃＡＭＰを上昇させる作用物質は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から購入することができ、Green（Proc．Natl．Acad．Sci．USA  １５巻：８０１〜８１１頁（１９７８年））に記載の濃度に近い濃度で使用することができる。例えば、上記の基本培地に、コレラ毒素を約０〜０．０１ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０〜０．００１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは約０〜０．０００１ｍｇ／Ｌの濃度で加える。ジブチリルｃＡＭＰ、ＩＢＭＸ、イソプロテレノールなどを加えて、コレラ毒素と同じレベルのｃＡＭＰを実現することができる。
【００４３】
コレラ毒素、フォルスコリン、Ｇタンパク質−共役受容体アゴニスト、ＰＫＣアゴニストなどの作用物質を使用することによって細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させることも望ましい。さらに、ベータ−アドレナリン作動性のアゴニストであるイソプロテレノール（Ｉｓｏ）、プロスタグランジンＥ（２）（ＰＧＥ（２））、特定のプロスタノイド受容体選択的アゴニスト（ベラプロスト、ブタプロスト）、およびアデノシン受容体アゴニストに応答して細胞のｃＡＭＰが上昇する可能性がある。さらに、６型ＡＣまたは環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害する作用物質が過剰発現することにより、細胞のｃＡＭＰレベルが上昇した。
【００４４】
対象培地は、Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウムなどの１種または複数種の炭水化物合成およびエネルギー代謝の前駆体も含んでよい。
【００４５】
対象培地は、ウシ血清アルブミンなど（ＢＳＡ）の１種または複数種の担体タンパク質も含んでよい。担体タンパク質は、それが包埋している細胞膜を通り、細胞内に特定の物質を輸送するタンパク質であってよい。担体タンパク質は、それぞれがただ１つの物質または同様の物質の群を認識するように設計されているので、異なる物質を輸送するためには異なる担体タンパク質が必要になる場合がある。特定の担体タンパク質は１種または複数種の培地構成成分（例えば、成長因子など）に結合し、それらに培地における追加的な安定性を付与すること、または特定の生物学的プロセスを容易にすることができる（例えば、アシル−担体タンパク質、ステロール担体タンパク質、ホルモン担体タンパク質など）。
【００４６】
対象培地は、非イオン性界面活性物質であるＴｗｅｅｎ６０またはＴｗｅｅｎ８０などの１種または複数種の界面活性物質も含んでよい。さらに、いかなる特定の理論に縛られることなく、そのような界面活性剤構成成分は、特定の培地構成成分を湿らすため、可溶化するため、乳化するため、または分散させるために役立ち得る。例えば、界面活性剤構成成分により、ＢＳＡなどのタンパク質の凝集を妨げること、特定の構成成分の溶解性を増大させること、および、さらには特定の酵素の機能を増強することができる。
【００４７】
必須であるとはみなされないが、対象培地は、長期培養において平衡ｐＨが維持されるように、ＨＥＰＥＳおよび炭酸水素ナトリウム緩衝系などの１種または複数種の緩衝系をさらに含んでよい。培養培地を頻繁に、一定に、または連続的に交換することによっても、急速に成長している細胞の培地ｐＨを回復させることができる。
【００４８】
例示するために、以下の表３には、（１）乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、または未分化胚細胞腫に由来する卵巣腫瘍細胞株、（２）類内膜腫瘍または粘液性腫瘍に由来する卵巣腫瘍細胞株、および（３）正常な卵巣細胞または卵管細胞の長期にわたる成長および増殖を支持する３つの本発明の培地処方の例示的な組成物が示されている。これらの培地により、これらの細胞型の成長および増殖がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約４週間または少なくとも約１５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持され、それらの表現型（形態学的、構造的、および／または分子など）および／または組織病理はその細胞が由来する起源腫瘍と区別できない。
【００４９】
線維芽細胞および他の間質細胞の百分率は、数回の継代および集団倍加の後に、評価できる量の線維芽細胞および間質細胞の分化マーカー（例えばビメンチン）を検出することができない程度まで急激に低下する。例えば、上皮の分化マーカーとしては、ケラチン８、ケラチン１０、ケラチン１４、ケラチン１８、ケラチン１９、Ｅ−カドヘリン、ｐ６３、ＳＭＡ（平滑筋アクチン）、およびβ−カテニンを挙げることができる。
【００５０】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて組織培養することにより、細胞が酸化による損傷、代謝ストレスおよびＤＮＡ損傷に曝露され、それによりｐ５３遺伝子およびｐ１６遺伝子が誘導され、それにより今度は細胞周期の停止、老化および／またはアポトーシスが誘導され、培養細胞の寿命が限定される。別の実施形態では、本発明の培地により、初代細胞の長期にわたるストレスのない成長および増殖が支持される。対象培地におけるそのようなストレスのない成長の１つの指標は、ＣＤＫ阻害物質であるｐ１６および腫瘍抑制因子であるｐ５３の発現レベルが低いこと／検出不可能であることによって示される。これらの２つのタンパク質は、一般には、組織培養培地中のストレスを受けた細胞において高レベルで発現されるように誘導されるが、健康的に成長している細胞ではそのように誘導されない。この実施形態では、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および変動するＯ２濃度、例えば、１％、２％、３％、または周囲空気で成長させることができる。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の培地は、ヘパリン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを実質的に含まない。ある特定の実施形態では、上で列挙されている構成成分のいずれも対象培地中に存在しない。
【００５２】
しかし、そのような構成成分が、初代細胞の成長および増殖を支持することに関して培地の性能に実質的に影響を及ぼさない限りでは、ある特定の実施形態では、対象培地はそのような構成成分のうちの１つまたは複数を含んでよく、その存在を許容してよい。
【００５３】
本発明は、濃度範囲の下限が０である構成成分の任意の１つまたは複数が存在しない表３の培地の実施形態、およびそのような構成成分が存在する実施形態を提供する。表３に列挙されている本発明の培地は、ただ単に例示するためのものであることが理解されるべきである。培地自体は特定の意図された目的のため、特に本明細書で関連づけられる細胞型を各処方で培養するために十分であるが、これらの表に列挙されている構成成分の全てがそれらの意図された目的のために必要またはさらには最適である可能性があるわけではない。当業者は、当該特定の初代細胞の必要性に部分的に応じて、列挙されている任意の構成成分が必要であるかおよび／または最適であるかを、例えば、一回に１つの構成成分を排除し、または１つの構成成分の濃度を変化させ、そのような改変培地における特定の種類の培養細胞の成長／増殖を起源の培地と比較することによって容易に決定することができる。必要な場合、１つまたは複数の構成成分を同様の性質の他の化学物質で置換することもできる。１つまたは複数の非必須の／不必要な構成成分を伴わないそのような改変培地は本発明の範囲内である。同様に、当業者は、特定の細胞型に対する任意の所与の構成成分の最適レベルも、例えば、さまざまな濃度（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍高い、または１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍低い）を、列挙されている各構成成分に対して、その特定の構成成分の列挙されている濃度に基づいて、またそこから開始して試験することによって決定することができる。一部の構成成分は列挙されている範囲の濃度を有する。任意の特定の細胞型に対して適切または最適な濃度は、列挙されている濃度から開始して同様に決定することもできる。そのような試験の実施では、最初の広範囲の濃度試験は、その後で最初の実験の結果に基づいて範囲を絞り込むことができる。例えば、最初の試験について、１つの対象の構成成分の濃度を表３に列挙されている濃度の１０−３、１０−２、１０−１、１０倍、１００倍、および１０００倍に変化させることができる。１０−２試験では依然として所望の成長が支持されるが１０−３では所望の成長が支持されない場合、試験の第２ラウンドでは１０−２と１０−３の間の１０倍の濃度差についてさらに探究して、最良の範囲を正確に示すことができる。したがって、特定の細胞型に対してそのように最適化された培地も本発明の範囲内に入る。
【００５４】
当業者には容易に明らかになる通り、所与の成分の濃度は、開示されている範囲を超えて上昇または低下させることができ、濃度の上昇または低下の効果は常套的な実験のみを用いて決定することができる。任意の特定の細胞型に対する本培地処方の最適化は、Ham（Ham、Methods  for  Preparation  of  Media,Supplements  and  Substrata  for  Serum-Free  Animal  Culture、Alan  R.Liss.Inc.、New  York、３〜２１頁、１９８４年）およびWaymouth（Waymouth、C.、Methods  for  Preparation  of  Media,Supplements  and  Substrata  for  Serum-Free  Animal  Culture、Alan  R.  Liss.Inc.、New  York、２３〜６８頁、１９８４年）に記載されている手法を用いて行うことができる。培地成分についての最適な最終濃度は、一般には、単一の構成成分の滴定試験における経験的試験によって、または歴史的科学文献および現行の科学文献を解釈することによって同定される。動物細胞を使用する単一の構成成分の滴定試験では、単一の培地構成成分の濃度を変動させ、他の全ての構成物および変数は一定に保ち、動物細胞の生存能力、成長または健康の持続に対する単一の構成成分の効果を測定する。
【００５５】
本明細書において列挙されている特定のビタミンおよびホルモンは、当技術分野で公知の異なる形態（例えば、種々の天然に存在する形態または天然に存在しない形態）で存在してよく、互いに代替品として使用することができることが理解されよう。本出願にビタミンまたはホルモンが開示されている場合、本発明は、同様の生物活性を有するそのようなビタミンまたはホルモンの任意の形態（または、細胞培養培地または細胞内で修飾または代謝されて、生物学的に活性な形態をもたらす可能性がある化合物（複数可））が本発明の培地および／または方法（複数可）において使用される実施形態を包含するものと理解されるべきであることも理解されよう。
【００５６】
エストロゲン、プロゲステロン、甲状腺ホルモン、ヒドロコルチゾン、インスリンなどの化合物を、それぞれエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、甲状腺ホルモン受容体、グルココルチコイド受容体、インスリン受容体のアゴニストである他の化合物（天然に存在するまたは天然に存在しない、天然の供給源から単離された、または少なくとも部分的に化学合成された化合物）で全体的にまたは部分的に置換することができることが理解されよう。いくつものそのような化合物が当技術分野で公知である。
【００５７】
培地成分は、液体担体に溶解させること、または乾燥した形態で維持することができる。上記の好ましい濃度（すなわち、「１×処方」）で液体担体に溶解させる場合、培地のｐＨは、約７．０〜７．６、好ましくは約７．１〜７．５、最も好ましくは約７．２〜７．４に調整するべきである。培地の容量オスモル濃度も、約２７５〜３５０ｍＯｓｍ、好ましくは約２８５〜３２５ｍＯｓｍ、最も好ましくは約２８０〜３１０ｍＯｓｍに調整するべきである。成分を溶液に溶解させるために用いる液体担体の種類および方法は変動し、当業者が常套的な実験だけを用いて決定することができる。一般には、培地成分は任意の順序で添加することができる。
【００５８】
細胞培養培地は、いくつもの成分で構成され、これらの成分は、培養培地ごとに変動する。「１×処方」とは、細胞培養培地において見いだされる一部または全ての成分を作用濃度で含有する任意の水溶液を指すものとする。「１×処方」とは、例えば、細胞培養培地またはその培地の成分の任意のサブグループを指す場合がある。１×溶液中の成分の濃度は、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持または培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）するために使用する細胞培養処方物において見いだされるその成分の濃度とほぼ同じである。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）するために使用する細胞培養培地は、定義によると１×処方である。いくつもの成分が存在する場合、１×処方の各成分は、細胞培養培地中のそれらの成分の濃度とほぼ等しい濃度を有する。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地は、他の成分の中でも、０．２ｇ／ＬのＬ−アルギニン、０．０５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、および０．０２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸を含有する。これらのアミノ酸の「１×処方」は、溶液中にこれらの成分をほぼ同じ濃度で含有する。したがって、「１×処方」について言及する場合、溶液中の各成分は、記載されている細胞培養培地において見いだされる濃度と同じまたはほぼ同じ濃度であるものとする。細胞培養培地の１×処方中の成分の濃度は、当業者に周知である。その全体が参照により本明細書に組み込まれるMethods  For  Preparation  of  Media,  Supplements  and  Substrate  For  Serum-Free  Animal  Cell  Culture  Allen  R.  Liss、N.Y.（１９８４年）を参照されたい。しかし、１×処方における容量オスモル濃度および／またはｐＨは、特に、１×処方に含有される成分が少ない場合には、培養培地と比較して異なる。
【００５９】
「１０×処方」は、溶液中の各成分が、細胞培養培地中の同じ成分よりも約１０倍高度に濃縮されている溶液を指すものとする。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地の１０×処方は、他の成分の中でも、２．０ｇ／ＬのＬ−アルギニン、０．５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、および０．２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸（上記の１×処方と比較されたい）を含有してよい。「１０×処方」は、いくつもの追加成分を１×培養培地において見いだされる濃度の約１０倍の濃度で含有してよい。容易に明らかになる通り、「２５×処方」、「５０×処方」、「１００×処方」、「５００×処方」および「１０００×処方」は、成分を１×細胞培養培地と比較してそれぞれ約２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍の濃度で含有する溶液を示す。さらに、培地処方および濃縮溶液の容量オスモル濃度およびｐＨは変動してよい。
【００６０】
成分を含む溶液は１×培地処方中の同じ成分の濃度よりも高度に濃縮されていることが好ましい。成分は、１０倍高度に濃縮されていてよい（１０×処方）、２５倍高度に濃縮されていてよい（２５×処方）、５０倍高度に濃縮されていてよい（５０×濃度）、または１００倍高度に濃縮されていてよい（１００×処方）。成分が可溶性かつ安定なままであるのであれば、より高度に濃縮された処方を作出することができる。高濃度の培養培地構成成分を可溶化する方法を対象とする米国特許第５，４７４，９３１号（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６１】
培地成分を別々の濃縮溶液として調製する場合、適切な（十分な）量の各濃縮物を希釈剤と組み合わせて１×培地処方を作製する。一般には、使用される希釈剤は水であるが、緩衝水溶液、生理食塩水溶液、または他の水溶液を含めた他の溶液を本発明に従って用いることができる。
【００６２】
本発明の培養培地は、一般には、望ましくないコンタミネーションを予防するために滅菌する。滅菌は、例えば、濃縮された成分を混合した後に孔サイズ約０．１〜１．０μＭの低タンパク質結合性膜フィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．から市販されている）を通して濾過して滅菌培養培地を作製することによって実現することができる。あるいは、濃縮された成分のサブグループを濾過滅菌し、滅菌溶液として貯蔵することができる。次いで、これらの滅菌濃縮物を無菌条件下で滅菌希釈剤と混合して、濃縮された１×滅菌培地処方を作製することができる。本培養培地の構成成分の多くが熱に不安定であり、例えば大多数の熱による滅菌方法の間に達する温度によって不可逆的に分解されるので、オートクレーブまたは他の温度の上昇に基づく滅菌方法は好ましくない。
【００６３】
当業者には容易に明らかになる通り、培養培地の構成成分はそれぞれ、溶液中の１種または複数種の他の構成成分と反応する可能性がある。したがって、本発明は、上記の通り補充した、表３に開示されている処方、ならびにこれらの成分を組み合わせた後に形成される任意の反応混合物を包含する。
【００６４】
多くの組織培養培地は、一般には、１種または複数種の抗生物質を含有し、これは、細胞の成長／増殖自体には必要ないが、細菌および／または真菌などの望ましくない微生物の成長を阻害するために存在する。
【００６５】
抗生物質は、細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ種を含む）、放線菌類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む）および真菌などの微生物の種々の種によって産生される、他の微生物の成長を阻害する、またはそれを破壊する比較的分子量が低い天然の化学物質である。構造および作用様式が同様の物質を化学的に合成することができる、または天然化合物を修飾して半合成抗生物質を作製することができる。これらの生合成誘導体および半合成誘導体も同様に抗生物質として有効である。抗生物質の主要なクラスは、（１）ペニシリン、セファロスポリンおよびモノバクタムを含めたβ−ラクタム系；（２）アミノグリコシド系、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、およびアミカシン；（３）テトラサイクリン系；（４）スルホンアミド系およびトリメトプリム；（５）フルオロキノロン系、例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、およびオフロキサシン；（６）バンコマイシン；（７）例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンを含むマクロライド系、；ならびに（８）他の抗生物質、例えば、ポリミキシン、クロラムフェニコールおよびリンコサミドである。
【００６６】
抗生物質はいくつかの作用機構を通じてそれらの抗細菌効果を実現し、一般に以下の通り群分けすることができる：（１）細菌の細胞壁に作用する作用物質、例えば、バシトラシン、セファロスポリン、サイクロセリン、ホスホマイシン、ペニシリン、リストセチン、およびバンコマイシンなど；（２）細胞膜に影響を及ぼす、または界面活性剤効果を発揮する作用物質、例えば、コリスチン、ノボビオシンおよびポリミキシンなど；（３）リボソームに対する効果によって複製、情報伝達、およびタンパク質合成の細胞機構に影響を及ぼす作用物質、例えば、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、フシジン（ｆｕｃｉｄｉｎ）、リンコマイシン、ピューロマイシン、リファンピシン、他のストレプトマイシン、およびマクロライド系抗生物質、例えば、エリスロマイシンおよびオレアンドマイシンなど；（４）核酸代謝に影響を及ぼす作用物質、例えば、フルオロキノロン、アクチノマイシン、エタンブトール、５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、リファマイシン；および（５）中間代謝に影響を及ぼす薬物、例えば、スルホンアミド、トリメトプリム、および抗結核薬であるイソニアジドおよびパラ−アミノサリチル酸など。一部の作用物質は、特に高濃度では、２種以上の主要な作用機構を有する可能性がある。さらに、多くの場合、抗菌薬の一次効果の後に細菌の細胞の構造または代謝の二次的変化が起こる。
【００６７】
したがって、便宜上および他の実用的な理由で、対象培地に、望ましくない細菌／真菌／ウイルスの成長／増殖を阻害する１種または複数種の抗生物質または他の物質をさらに補充することができる。しかし、他の実施形態では、対象培地は、初代細胞の最適な成長を確実にするために、いかなる抗生物質も含まない場合がある。抗生物質を含まない培地で成長している細胞を取扱う際には、可能性のあるコンタミネーションを回避するために特別の注意を払うべきである。
【００６８】
表３に列挙されている濃度は絶対的ではなく、また、不変ではない。異なる細胞型は異なる成長要求を有する可能性があるので、一般に、各値について２〜１０倍の変動（増加または減少）が許容できる濃度範囲であることが意図されている。一部の構成成分については、さらに大きな最終濃度の変動が許容される可能性がある。これらの出発濃度を用いてさらなる最適化を実現することができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の１つまたは複数の最終濃度は、表３に列挙されている濃度とは最大１０倍異なり、これは、関連する濃度が表３に列挙されている濃度の０．１〜１０倍にわたってよいことを意味する。いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の１つまたは複数の最終濃度は、表３に列挙されている濃度とは最大３倍異なり、これは、関連する濃度が表３に列挙されている濃度の０．３〜３倍にわたってよいことを意味する。いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の１つまたは複数の最終濃度は、表３に列挙されている濃度とは最大２倍異なり、これは、関連する濃度が表３に列挙されている濃度の０．５〜２倍にわたってよいことを意味する。いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の１つまたは複数の添加濃度は、表３に列挙されている濃度とは異なり、それぞれ表３に列挙されている値から最大で１０％、２０％、または５０％異なる。
【００７０】
本発明は、１種、２種、３種、４種、または５種の構成成分のいずれも培地に添加しない実施形態を包含する。いくつかの実施形態では、培地にインスリン、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素、および血清を補充する。場合によって、培地にエストロゲンをさらに補充する。
【００７１】
Ｂ．正常な卵巣細胞および卵管細胞の培養
卵巣は、卵母細胞（卵細胞）、卵母細胞を支持する間質細胞および卵巣表面を覆う上皮で構成される女性生殖器である。排卵の間、卵母細胞（卵細胞）は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端によって捕捉される。これらの卵母細胞は卵管を移動して子宮内膜腔に入り、そこで着床する（図１Ａ〜Ｃ）。
【００７２】
内臓の上皮は乳管、腸内腔、気管支内腔などの中心内腔を限定する。上皮細胞の機能的な違いは、内腔内に物質を分泌するか、または内腔から物質を吸収するかである；例えば、唾液、母乳、肺粘液、胃酸、膵臓酵素の分泌、または胃腸管および腎臓上皮による水および栄養分の吸収など。内腔を取り囲む組織構造全体は、時には「管」または「腺」と称される。これらの細胞に共有される一般的な機能により、これらの細胞に独特の性質が与えられ、それによりこれらの細胞は体内の他の全ての細胞とは異なる別個の群になる。
【００７３】
卵巣の表面は単層上皮で覆われており、その下に、時には「卵巣皮質」と称される帯域に卵母細胞が存在する。卵母細胞は、卵巣の大部分を構成するホルモン的に活性な卵巣間質細胞によって支持されている。各サイクルの間、卵管および卵巣の表面に形成され、通常は卵巣表面上皮によって修復される間隙内にいくつかの卵母細胞が放出される。しかし、いくつかの場合には、小嚢胞は、排卵部位で形成され、表面上皮とは別個の上皮によって裏打ちされている。卵巣皮質内のこれらの嚢胞は「封入体嚢胞」と称される（図１Ｄ）。卵管の内腔は、頂端表面に繊毛が存在するかしないかによって形態学的に区別される２つの細胞型で構成される単層上皮で裏打ちされている。
【００７４】
腫瘍は卵巣および卵管の細胞から生じる。特に、内臓の腺上皮および導管上皮から生じ、かつ／またはそれを模倣する腫瘍は集合的に腺癌と称される。癌（ｃａｎｃｅｒ）または癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）という用語は、病理医により使用され、上皮の表現型を有する腫瘍を指す。したがって、「卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）」、「卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」および「卵巣腺癌」という用語は、互換的に使用することができる。
【００７５】
特に、卵管卵巣腫瘍、ならびに肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、および婦人科の腫瘍を含めたヒト腫瘍の大部分は上皮腺癌である。これらの腫瘍は、集合的に、ヒトの癌による死亡の９０パーセント超を占める。血液細胞、免疫細胞、筋肉細胞、骨細胞、神経細胞、内皮細胞、および線維芽細胞などの他の全ての細胞から生じる腫瘍は、上皮癌と比較して非常にまれである。
【００７６】
卵巣および卵管の上皮から生じる卵管卵巣腺癌は、大多数の卵巣癌に関連する死亡を引き起こす悪性卵巣腫瘍のほぼ９０パーセントを占める。卵巣内の間質細胞および生殖細胞から生じる腫瘍はまれであり、卵巣腫瘍による死亡の５パーセント未満を占める。
【００７７】
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも６種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の９０パーセント超を占める。
【００７８】
どの細胞が卵管卵巣腫瘍の推定前駆病変であるか？乳管癌（ＤＣＩＳ）、結腸の腺腫性ポリープ、子宮頸部の扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、または子宮内膜上皮内新形成（ＥＩＮ）などの初期の非浸潤性の前駆病変を同定および検出することは、これらの器官において生じる癌の発病の理解に著しく役立っている。推定起源細胞および初期の前駆病変を同定することにより、早期検出ツールを開発すること、およびこれらの器官における腫瘍の自然の進行をより良く理解することが可能になった。大多数の卵巣癌はそれらの進行の非常に後期に症候性になるので、それらの前駆病変を適切に試験することは可能ではなかった。残念ながら、現時点ではこの癌を早期検出するための常套的なスクリーニングツールは存在しない。
【００７９】
ヒト卵巣腺癌の起源について、３種類の起源正常細胞が提唱されている；歴史的に、卵巣癌は、卵巣表面上皮（ＯＳＥ）または卵巣皮質内の上皮に裏打ちされた封入体嚢胞（ＯＣ）から生じると考えられてきた。しかし、卵巣の推定前癌性病変はほとんど同定されておらず、正常な卵巣において観察される卵巣上皮内新形成などの変化が前癌状態の新生物病変を真に示すかどうかを決定することは難しい。ごく最近の研究では、卵管上皮（ＦＴＥ）、詳細には采状末端が、高悪性度乳頭状漿液性腺癌の半分に対する推定起源細胞として関係づけられた。これは、同じ女性由来の卵管前駆病変および腫瘍組織が一般的なｐ５３突然変異を共有するというデータによって裏付けられる。
【００８０】
したがって、本発明の１つの態様は、正常な卵巣細胞および卵管細胞、例えば、卵巣表面上皮（ＯＳＥ）、上皮に裏打ちされた封入体嚢胞（ＯＣ）、および卵管上皮（ＦＴＥ）の成長および／または増殖を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約４週間または少なくとも約１５、２５、またはさらには３５回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持する細胞培養培地を含む。
【００８１】
正常な卵巣細胞および／または卵管細胞（ＯＳＥ、ＯＣ、および／またはＦＴＥ）などの上皮細胞は、細胞の寿命を延長するために不死化することができる。細胞は、例えば、正常細胞を化学的突然変異原、放射線照射、または他の発癌性作用物質に曝露させることによって、および／またはウイルス癌遺伝子（例えば、Ｈ−Ｒａｓ、ヒトパピローマウイルスＥ６／７（ＨＰＶ  Ｅ６／７）、サルウイルス４０ラージＴ／スモールｔ（ＳＶ４０Ｔ／ｔ）抗原、および／またはアデノウイルスタンパク質（Ｅ１Ａ））を発現させることによって正常細胞を形質転換することによって、発癌性形質転換によって不死化することができる。細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）などのテロメラーゼの触媒サブユニットを過剰発現させることによっても不死化することができる。いくつかの実施形態では、ｈＴＥＲＴを過剰発現している卵巣細胞および／または卵管細胞を正常な卵巣細胞および卵管細胞の成長および／または増殖に適した細胞培養培地中で培養する。ｈＴＥＲＴの過剰発現と本明細書に記載の細胞培養培地を組み合わせることが、卵巣細胞および／または卵管細胞を不死化するために十分であり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、培養物は、ｈＴＥＲＴが過剰発現している細胞を含み、ｈＴＥＲＴの過剰発現は、細胞に、少なくとも１４、２５、または３５回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である。培養物は、実質的に精製された培養物であってよい。培養物は、細胞を少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、または少なくとも１０６個含んでよい。ｈＴＥＲＴの過剰発現は、例えば、ウイルスを用いたトランスフェクションまたは形質転換によるものであってよい。
【００８３】
不死化細胞などの卵巣細胞および卵管細胞を腫瘍形成性細胞に形質転換することができる。形質転換された腫瘍形成性卵巣細胞および／または卵管細胞は、本節に記載のものおよび本開示のＷＩＴ−ｆｏ（表３）によって例示されるなどの、正常な卵巣細胞および卵管細胞の成長および／または増殖に適した培地中で培養することができる。
【００８４】
無線毛卵管細胞または卵巣封入体嚢胞細胞を発癌性形質転換した後、これらの細胞型を、プローブの発現と関連づける。ある特定の実施形態では、形質転換された無線毛卵管細胞は、プローブセットＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＬＰ３を過剰発現し、形質転換された卵巣封入体嚢胞細胞は、プローブセットＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４を過剰発現する。
【００８５】
本発明の１つの態様は、卵巣細胞および／または卵管細胞の培養物に関し、卵巣細胞は、プローブセットＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＬＰ３を過剰発現し、卵管細胞は、プローブセットＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４を過剰発現し、培養物は、細胞を少なくとも１０３個含み、細胞は、少なくとも１４、２５、または３５回の集団倍加を行う能力を有する。いくつかの実施形態では、培養物は、細胞を少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、および／または１０１０個含む。
【００８６】
前述のいずれかの特定の実施形態では、細胞の実質的に精製された培養物は、培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または９８％超が対象の特定の細胞型である培養物である。
【００８７】
したがって、本発明は、上記の通り、正常な卵巣上皮細胞および正常な卵管細胞を培養するために有用な培養培地を提供する。いくつかの実施形態では、正常な卵巣上皮細胞および正常な卵管細胞を培養するために有用な細胞培養培地は、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ；細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；および血清を含む。培養培地は、少なくとも１つの  アデノシン一リン酸およびビタミンＥをさらに含んでよい。培養培地は、ビタミンＫ３、ナイアシン、またはナイアシンアミドのうちの少なくとも１つを含んでよい。培養培地中の担体タンパク質はアルブミンであってよい。培養培地中のヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基はキサンチンおよび／またはヒポキサンチンであってよい。
【００８８】
細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質はコレラ毒素であってよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、コレラ毒素を１〜１００ｎｇ／ｍＬ；１〜７５ｎｇ／ｍＬ；１〜５０ｎｇ／ｍＬ；１〜２５ｎｇ／ｍＬ；１〜１５ｎｇ／ｍＬ；１〜１０ｎｇ／ｍＬ；１０〜１００ｎｇ／ｍＬ；１０〜７５ｎｇ／ｍＬ；１０〜５０ｎｇ／ｍＬ；１０〜２５ｎｇ／ｍＬ；１０〜１５ｎｇ／ｍＬ；１５〜１００ｎｇ／ｍＬ；１５〜７５ｎｇ／ｍＬ；１５〜５０ｎｇ／ｍＬ；１５〜２５ｎｇ／ｍＬ；１５〜２０ｎｇ／ｍＬ；２０〜１００ｎｇ／ｍＬ；２０〜７５ｎｇ／ｍＬ；２０〜２５ｎｇ／ｍＬ；２５〜１００ｎｇ／ｍＬ；２５〜７５ｎｇ／ｍＬ；または２５〜５０ｎｇ／ｍＬにわたる濃度で含む。好ましくは、細胞培養培地は、約２０ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、あるいは、約２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素を含んでよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＥＧＦを含む。ＥＧＦの濃度は、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ；０．５〜２５ｎｇ／ｍＬ；０．５〜１５ｎｇ／ｍＬ；０．５〜１０ｎｇ／ｍＬ；０．５〜５．０ｎｇ／ｍＬ；０．５〜１．０ｎｇ／ｍＬ；１．０〜５０ｎｇ／ｍＬ；１．０〜２５ｎｇ／ｍＬ；１．０〜１５ｎｇ／ｍＬ；１．０〜１０ｎｇ／ｍＬ；１．０〜５ｎｇ／ｍＬ；５．０〜５０ｎｇ／ｍＬ；５．０〜２５ｎｇ／ｍＬ；５．０〜１５ｎｇ／ｍＬ；５．０〜１０ｎｇ／ｍＬ；１０〜５０ｎｇ／ｍＬ；１０〜２５ｎｇ／ｍＬ；または１０〜１５ｎｇ／ｍＬにわたってよい。好ましくは、細胞培養培地は、３ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの間のＥＧＦを含んでよい、または、最も好ましくは、約１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含んでよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含む。ヒドロコルチゾンの濃度は、０．０１〜５．０μｇ／ｍＬ；０．０１〜２．５μｇ／ｍＬ；０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．５μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．３０μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．２５μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．１０μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．０５μｇ／ｍＬ；０．０５〜５．０μｇ／ｍＬ；０．０５〜２．５μｇ／ｍＬ；０．０５〜１．０μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．５μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．３０μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．２５μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．１０μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．０５μｇ／ｍＬ；０．１５〜５．０μｇ／ｍＬ；０．１５〜２．５μｇ／ｍＬ；０．１５〜１．０μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．５μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．３０μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．２５μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．１０μｇ／ｍＬ；および０．１５〜０．０５μｇ／ｍＬにわたってよい。細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は０．０１５μｇ／ｍＬから５．０μｇ／ｍＬの間であることが好ましい。正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために、細胞培養培地は、０．２５μｇ／ｍＬから０．５０μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾンを含むことが好ましく、約０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含むことが最も好ましい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、インスリンを含む。インスリンの濃度は、１．０〜７５．０μｇ／ｍＬ；１．０〜５０．０μｇ／ｍＬ；１．０〜２５．０μｇ／ｍＬ；１．０〜１０．０μｇ／ｍＬ；１０．０〜７５．０μｇ／ｍＬ；１０．０〜５０．０μｇ／ｍＬ；１０．０〜２５．０μｇ／ｍＬ；および１０．０〜１５．０μｇ／ｍＬ；１５．０〜７５．０μｇ／ｍＬ；１５．０〜５０．０μｇ／ｍＬ；１５．０〜２５．０μｇ／ｍＬ；および１５．０〜２０．０μｇ／ｍＬにわたってよい。いくつかの好ましい実施形態では、インスリンの範囲は１５．０〜２０．０μｇ／ｍＬである。正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために、細胞培養培地は、５．０μｇ／ｍＬから５０．０μｇ／ｍＬの間のインスリンを含むことが好ましい。細胞培養培地は、約２０．００μｇ／ｍＬのインスリンを含むことが最も好ましい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、血清を、０．２％〜４．０％ｖ／ｖ；０．５〜３．０％；１．０％〜２．０％ｖ／ｖ；１．５％〜２．０％ｖ／ｖにわたる濃度で含む。いくつかの好ましい実施形態では、正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために、細胞培養物は、０．２５％ｖ／ｖから０．７５％ｖ／ｖの間の血清を含む。最も好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約０．５％ｖ／ｖの血清を含む。いくつかの実施形態では、キットまたは培地は血清を含まず、血清（存在する場合）は、別々に、または使用者が供給することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地により、卵巣細胞および／または卵管細胞の増殖が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約１０回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持される。細胞培養培地により、卵巣細胞および／または卵管細胞の増殖を、少なくとも約６ＰＤ、８ＰＤ、１０ＰＤ、１２ＰＤ、１４ＰＤ、１６ＰＤ、１８ＰＤ、２０ＰＤ、２５ＰＤ、３０ＰＤ、３５ＰＤ、４０ＰＤ、４５ＰＤ、または５０ＰＤにわたって支持することもできる。集団倍加には、細胞培養の成功の尺度として使用される「二次培養」または「継代」の数とは別個の情報が反映される可能性がある。細胞の二次培養または継代とは、単に細胞をある培養プレートから取り出し、それらを新しい培養プレートに播種することを指す。これは、細胞がプレートから別のプレートへの移動に対する耐容性を示したこと、および、細胞が移動の間生存したままであったことを示す。しかし、細胞継代の数は、必ずしも細胞増殖を示すものではない。
【００９４】
図２では、細胞増殖と継代数の間に相関がないことが例示されている。標準の対照培養条件では、「継代」卵管上皮は、４回の継代の間、ほぼ６０日にわたって継代された（図２Ｂ、赤色の曲線）。しかし、細胞の成長曲線は、１４日後に平らなままであり、細胞の数に正味の増加はなかった。したがって、継代数は、細胞数の正味の増加に関しては情報価値がない。
【００９５】
細胞数の正味の増加は、「集団倍加」（ＰＤ）で最も正確に測定される。単一細胞から、１０回の集団倍加で細胞１０２４個が生じる（２１０＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４）。したがって、１０回の集団倍加のそれぞれは３桁（１，０００倍）の細胞数の正味の増加とほぼ等しく、２０回の集団倍加とは、ほぼ百万倍の増加ということになり、３０回の集団倍加とは、ほぼ１０億倍の正味の細胞数の増加ということになる。したがって、ＰＤ対時間のチャートは、ｓｅｍｉ−ｌｏｇ２指数関数プロットである。対照的に、細胞継代は、細胞数の正味の増加がほぼないことと等しい可能性がある。
【００９６】
１つの例示的な細胞培養培地が表３のＷＩＴ−ｆｏと表示された列に記載されている。ある特定の実施形態では、任意の特定の成分を、同じ機能を果たすことができる代替成分と少なくとも部分的に交換する。本発明のある特定の実施形態では、表３に列挙されている任意の特定の成分を、同じ機能を果たすことができる代替成分と少なくとも部分的に交換する。そのような置換は、１種または複数種の列挙されている成分のいずれに関しても行うことができる（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれ以上成分を、同じ機能を果たすことができる代替成分で置換することができる）。一実施形態では、緩衝液構成成分を置換する。別の実施形態では、界面活性剤または界面活性物質の構成成分を置換する。別の実施形態では、担体タンパク質構成成分を置換する。本明細書は、適切な置換の非限定的な例を提供する。
【００９７】
本発明の別の態様は、正常な卵巣上皮細胞および卵管細胞を培養するための方法に関する。一実施形態では、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を培養するための方法は、卵巣表面および／または卵管の采状表面から卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を得るステップと、細胞を上記および表３（ＷＩＴ−ｆｏと表示された列）の細胞培養培地中で培養するステップとを含み、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は細胞培養培地において少なくとも１４回の集団倍加を行う。
【００９８】
Ｃ．腫瘍細胞の培養
本発明の一態様は、（１）ヒト固形腫瘍組織、（２）悪性体液中の腫瘍細胞および（３）マウスにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片由来の腫瘍細胞に由来する初代細胞株を支持する細胞培養培地に関する。培養細胞は実質的に組織内の起源腫瘍細胞の表現型模写として成長し、これによりヒト腫瘍を早期に検出し、診断し、予後判定し、治療するための試薬を発見し、開発するための臨床的に関連性のあるモデルをもたらす。
【００９９】
卵管卵巣腫瘍、ならびに肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、および婦人科の腫瘍を含めたヒト腫瘍の大部分は上皮腺癌である。これらの腫瘍は、集合的に、ヒトの癌による死亡の９０パーセント超を占める。血液細胞、免疫細胞、筋肉細胞、骨細胞、神経細胞、内皮細胞、および線維芽細胞などの他の全ての細胞から生じる腫瘍は、上皮癌と比較して非常にまれである。
【０１００】
卵巣および卵管の上皮から生じる卵管卵巣腺癌は、大多数の卵巣癌に関連する死亡を引き起こす悪性卵巣腫瘍のほぼ９０パーセントを占める。卵巣内の間質細胞および生殖細胞から生じる腫瘍はまれであり、卵巣腫瘍による死亡の５パーセント未満を占める。
【０１０１】
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも６種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の９０パーセント超を占める。
【０１０２】
ヒト腫瘍は、悪性腫瘍細胞、ならびに上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞などの多数の異なる正常細胞型で構成される複雑な組織である。さらに、多くの腫瘍は、非浸潤性（ｉｎ  ｓｉｔｕ）悪性構成成分および浸潤性悪性構成成分の両方、ならびに浸潤性腫瘍細胞と並んで存在する前悪性過形成性組織で構成される。したがって、培養を腫瘍組織から開始する場合、腫瘍の異なる構成成分由来の多くの細胞型が培養プレート中で増殖する機会を有する。従来の培養条件において正常な間質細胞または正常な上皮細胞、ならびに腫瘍の非浸潤性（ｉｎ  ｓｉｔｕ）構成成分由来の細胞または前悪性過形成性細胞が浸潤性腫瘍細胞よりも速く成長することは逆説的に見えるが、珍しいことではない。したがって、上首尾の腫瘍細胞の培養を確認するためには、プレート中で増殖している細胞の悪性を検証する追加的な実験が必要である。
【０１０３】
軟寒天コロニーアッセイを使用して、培養細胞が実際に悪性腫瘍細胞であることを検証することができる。正常細胞および前悪性細胞は、軟寒天において足場非依存性コロニー形成することができない。したがって、このアッセイでは、コロニーを形成する能力が培養細胞の悪性の指標である。培養細胞の悪性を検証するために用いられる別の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍形成能力である。
【０１０４】
腫瘍細胞培養の成功は、「継代数」によって表されるが、これは、良く見たところで情報価値に乏しい細胞増殖の計量である。培養細胞の継代とは、細胞が込み合った時点または増殖が遅くなった時点で細胞を培養皿またはフラスコの表面から機械的または酵素的に解離させ、細胞を新しい空のフラスコに移すことを指す。一般には、腫瘍細胞培養の成功は、「継代数」によって表されるが、これは、不完全な細胞増殖の計量であり得る。図１０には、継代数は常に細胞数の増加と相関するのではないことが示されている。腫瘍細胞の増殖は、多くの場合、２〜３回の継代後に遅くなり、停止する。細胞は生存したままであり、さらなる回数継代することができるが、それらの数は同じままである可能性がある、または減少さえする可能性がある。したがって、実際の細胞数を伴わずに継代数単独では、細胞数の正味の増加は確認されない。
【０１０５】
細胞増殖のより正確かつ客観的な尺度は、細胞の連続的な培養の間に実現される「集団倍加」（ＰＤ）の総数である。単一細胞は１０回の集団倍加（２１０＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４）で細胞１０２４個を生じることができる。したがって、１０回の集団倍加のそれぞれは３桁（１，０００倍）の細胞数の正味の増加とほぼ等しく、２０回の集団倍加とは、ほぼ百万倍の増加ということになり、３０回の集団倍加とは、ほぼ１０億倍の正味の細胞数の増加ということになる。したがって、ＰＤ対時間チャートは、ｓｅｍｉ−ｌｏｇ２指数関数プロットである。
【０１０６】
したがって、本発明の１つの態様は、癌細胞、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）またはＥＣＡＣＣ（ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託されている卵巣腺癌細胞株、または、一次ヒト固形卵巣組織に由来する細胞、腹水に由来する細胞、および／またはマウスにおいて成長させたヒト腫瘍異種移植片に由来する細胞の成長および／または増殖を支持する細胞培養培地を含む。細胞培養培地により、成長が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約４週間および／または少なくとも約３０回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持される。
【０１０７】
卵管卵巣腫瘍、ならびに肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、および婦人科の腫瘍を含めたヒト腫瘍の大部分は上皮腺癌であるので、本明細書に記載の培養培地は、ヒト乳癌、膵癌、腺様嚢胞癌、肺由来または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍（カルチノイド）、および上皮細胞に関連する他の腫瘍に由来する腫瘍細胞を培養するためにも用いることができる。
【０１０８】
一実施形態では、卵管卵巣腫瘍およびそれに由来する細胞を培養するための細胞培養培地は、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ；細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；血清；および場合によってエストロゲンを含む。培養培地は、少なくとも１つの  アデノシン一リン酸およびビタミンＥをさらに含んでよい。培養培地は、ビタミンＫ３、ナイアシン、またはナイアシンアミドのうちの少なくとも１つを含んでよい。培養培地中の担体タンパク質はアルブミンであってよい。培養培地中のヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基はキサンチンおよび／またはヒポキサンチンであってよい。
【０１０９】
細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質はコレラ毒素であってよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、コレラ毒素を１〜１００ｎｇ／ｍＬ；１〜７５ｎｇ／ｍＬ；１〜５０ｎｇ／ｍＬ；１〜２５ｎｇ／ｍＬ；１〜１５ｎｇ／ｍＬ；１〜１０ｎｇ／ｍＬ；１０〜１００ｎｇ／ｍＬ；１０〜７５ｎｇ／ｍＬ；１０〜５０ｎｇ／ｍＬ；１０〜２５ｎｇ／ｍＬ；１０〜１５ｎｇ／ｍＬ；１５〜１００ｎｇ／ｍＬ；１５〜７５ｎｇ／ｍＬ；１５〜５０ｎｇ／ｍＬ；１５〜２５ｎｇ／ｍＬ；１５〜２０ｎｇ／ｍＬ；２０〜１００ｎｇ／ｍＬ；２０〜７５ｎｇ／ｍＬ；２０〜２５ｎｇ／ｍＬ；２５〜１００ｎｇ／ｍＬ；２５〜７５ｎｇ／ｍＬ；または２５〜５０ｎｇ／ｍＬにわたる濃度で含む。好ましくは、細胞培養培地は、約２０ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、あるいは、約２５ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素を含んでよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＥＧＦを含む。ＥＧＦの濃度は、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ；０．５〜２５ｎｇ／ｍＬ；０．５〜１５ｎｇ／ｍＬ；０．５〜１０ｎｇ／ｍＬ；０．５〜５．０ｎｇ／ｍＬ；０．５〜１．０ｎｇ／ｍＬ；１．０〜５０ｎｇ／ｍＬ；１．０〜２５ｎｇ／ｍＬ；１．０〜１５ｎｇ／ｍＬ；１．０〜１０ｎｇ／ｍＬ；１．０〜５ｎｇ／ｍＬ；５．０〜５０ｎｇ／ｍＬ；５．０〜２５ｎｇ／ｍＬ；５．０〜１５ｎｇ／ｍＬ；５．０〜１０ｎｇ／ｍＬ；１０〜５０ｎｇ／ｍＬ；１０〜２５ｎｇ／ｍＬ；または１０〜１５ｎｇ／ｍＬにわたってよい。好ましくは、細胞培養培地は、３ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの間のＥＧＦを含んでよい、または、最も好ましくは、約１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含んでよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含む。ヒドロコルチゾンの濃度は、０．０１〜５．０μｇ／ｍＬ；０．０１〜２．５μｇ／ｍＬ；０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．５μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．３０μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．２５μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．１０μｇ／ｍＬ；０．０１〜０．０５μｇ／ｍＬ；０．０５〜５．０μｇ／ｍＬ；０．０５〜２．５μｇ／ｍＬ；０．０５〜１．０μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．５μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．３０μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．２５μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．１０μｇ／ｍＬ；０．０５〜０．０５μｇ／ｍＬ；０．１５〜５．０μｇ／ｍＬ；０．１５〜２．５μｇ／ｍＬ；０．１５〜１．０μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．５μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．３０μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．２５μｇ／ｍＬ；０．１５〜０．１０μｇ／ｍＬ；および０．１５〜０．０５μｇ／ｍＬにわたってよい。細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は０．０１５μｇ／ｍＬから５．０μｇ／ｍＬの間であることが好ましい。卵管卵巣腫瘍細胞を培養するために、細胞培養培地は、０．１５μｇ／ｍＬから０．３０μｇ／ｍＬの間のヒドロコルチゾンを含むことが好ましく、約０．１５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含むことが最も好ましい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、インスリンを含む。インスリンの濃度は、１．０〜７５．０μｇ／ｍＬ；１．０〜５０．０μｇ／ｍＬ；１．０〜２５．０μｇ／ｍＬ；１．０〜１０．０μｇ／ｍＬ；１０．０〜７５．０μｇ／ｍＬ；１０．０〜５０．０μｇ／ｍＬ；１０．０〜２５．０μｇ／ｍＬ；および１０．０〜１５．０μｇ／ｍＬ；１５．０〜７５．０μｇ／ｍＬ；１５．０〜５０．０μｇ／ｍＬ；１５．０〜２５．０μｇ／ｍＬ；および１５．０〜２０．０μｇ／ｍＬにわたってよい。いくつかの好ましい実施形態では、インスリンの範囲は１５．０〜２０．０μｇ／ｍＬである。卵管卵巣腫瘍細胞を培養するために、細胞培養培地は、５．０μｇ／ｍＬから５０．０μｇ／ｍＬの間のインスリンを含むことが好ましい。細胞培養培地は、約１５．００μｇ／ｍＬのインスリンを含むことが最も好ましい。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、血清を、０．２％〜４．０％ｖ／ｖ；０．５〜３．０％；１．０％〜２．０％ｖ／ｖ；または１．５％〜２．０％ｖ／ｖにわたる濃度で含む。ある特定の実施形態では、血清濃度は、０．２％〜１０％ｖ／ｖ；０．２％〜５．０％ｖ／ｖ；または１．０％〜５．０％ｖ／ｖにわたる。いくつかの実施形態では、血清濃度は、４．０％〜１０．０％ｖ／ｖ；４．０〜６．０％ｖ／ｖ；５．０〜７．０％ｖ／ｖ；６．０〜８．０％ｖ／ｖ；７．０〜９．０％ｖ／ｖ；または８．０〜１０．０％ｖ／ｖにわたる。卵管卵巣腫瘍細胞を培養するためのいくつかの好ましい実施形態では、細胞培養物は、１．０％から１．５％ｖ／ｖの間の血清を含む。最も好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約１．２％ｖ／ｖの血清を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、成長するためにエストロゲンを必要としない。エストロゲンを含有しない本明細書に記載の細胞培養培地により、乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、および未分化胚細胞腫の成長を支持することができる。
【０１１５】
他の実施形態では、特定の種類の腫瘍細胞は、成長するためにエストロゲンを必要とする場合がある。例えば、細胞培養培地は、エストロゲンを、３０〜３００ｎＭ；３０〜２００ｎＭ；３０〜１００ｎＭ；６５〜３００ｎＭ；６５〜２００ｎＭ；６５〜１００ｎＭ；１００〜３００ｎＭ；１００〜１５０ｎＭ；および１００〜２００ｎＭにわたる濃度で含んでよい。類内膜腫瘍および／または粘液性腫瘍を培養するために、細胞培養培地は、エストロゲンを約６５〜１５０ｎＭの濃度範囲でさらに含むことが好ましく、エストロゲンを約１００ｎＭの濃度で含むことが最も好ましい。エストロゲンは、１７−ベータ−エストラジオールまたはその生物学的同等物であってよい。１７−ベータ−エストラジオールの生物学的同等物は、上に列挙されている濃度範囲の１７−ベータ−エストラジオールと同じ活性を有する量で存在し、例えば、生物学的同等物の濃度は、１００ｎＭの１７−ベータ−エストラジオールと同じ活性を有するように選択することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地により、卵巣細胞および／または卵管細胞の増殖が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも約３０回の集団倍加（ＰＤ）にわたって支持される。細胞培養培地により、卵巣細胞および／または卵管細胞の増殖を、少なくとも約６ＰＤ、８ＰＤ、１０ＰＤ、１２ＰＤ、１４ＰＤ、１６ＰＤ、１８ＰＤ、２０ＰＤ、２５ＰＤ、３０ＰＤ、３５ＰＤ、４０ＰＤ、４５ＰＤ、または５０ＰＤにわたって支持することもできる。
【０１１７】
本発明の別の態様は、卵管卵巣腫瘍細胞を培養するための方法に関する。一実施形態では、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を培養するための方法は、固形腫瘍から、腹水から、またはマウスにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片由来の腫瘍細胞から卵管卵巣腫瘍細胞を得るステップと、細胞を上記および表３（ＷＩＴ−ｏｃと表示された列）の細胞培養培地中で培養するステップとを含み、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は細胞培養培地において少なくとも３０回の集団倍加を行う。一部の細胞株は、８回以上継代することができた固形腫瘍由来の非連続的細胞株である悪性腹水から樹立することができる。腹膜腹水および肺滲出液などの悪性体液試料は、線維芽細胞および他の間質細胞を含まない。腹水は、一般には、疾患が非常に後期にある患者の小さなサブセットにおいて存在し、すでに化学療法で処置された、再発疾患を有する患者においてより一般的である。したがって、腹水から単離された腫瘍細胞は、無処置の患者由来ではない。これらの処置後の腫瘍細胞は、遺伝毒性薬に曝露されていた可能性があり、したがって、起源腫瘍細胞とは異なる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＣＯ２レベルおよびＯ２レベルを改変して、特定の細胞型の培養を支持することができる。大多数の細胞培養は、二酸化炭素（ＣＯ２）を補充して５％にした周囲空気（１８％Ｏ２）において行う。他の実施形態では、類内膜腫瘍および粘液性腫瘍は、エストロゲンを補充したＷＩＴ−ｏｃ培地において、５％に調整した低酸素（Ｏ２）および（５％）ＣＯ２を含む成長条件下で培養することができる。
【０１１９】
ＩＩ．細胞培養培地を調製するための方法およびキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製するための方法およびキットに関する。キットを使用して、細胞培養培地を調製することができる。例えば、構成成分は、１つまたは複数の構成成分の貯蔵液として調製し、複数の容器に分割することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養培地を調製するためのキットは、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕを含む第１の容器と、細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；血清、および場合によってエストロゲンを含む第２の容器とを含む。そのようなキット内の細胞培養培地により、細胞の増殖を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて少なくとも２０回の集団倍加（ＰＤ）にわって支持することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養培地を作製するために、細胞培養培地補助剤を細胞培養基本培地に加えることができる。補助剤は、細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；血清；および場合によってエストロゲンを含んでよい。好ましい実施形態では、補助剤を細胞培養培地に添加することにより、０〜７０ｎｇ／ｍＬの細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．０１５〜０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン；少なくとも１０．００μｇ／ｍＬのインスリン、０．２％〜４．０％ｖ／ｖの血清補助剤、および場合によって、３０〜３００ｎＭのエストロゲンがもたらされる。
【０１２１】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製する方法であって、アデノシン三リン酸；担体タンパク質；コレステロール、リノール酸、およびリポ酸；グルタチオン；ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基；ホスホエタノールアミン；セレン；トランスフェリン；トリヨードサイロニン；ビタミンＡ、ビタミンＣ、およびビタミンＤ；Ｚｎ、Ｍｇ、およびＣｕ；細胞内ｃＡＭＰを増加させる作用物質；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ヒドロコルチゾン；インスリン；血清、および場合によってエストロゲンを組み合わせることを含む方法に関する。上記の通り、第１の容器および第２の容器から、ならびに／または１つまたは複数の構成成分の濃縮された貯蔵液から構成成分を加えることができる。いくつかの実施形態では、構成成分を任意の数の容器に任意の組み合わせで包装することができる。いくつかの実施形態では、２個、３個、４個または５個の容器、または５個から１０個の間の容器を使用する。
【０１２２】
ＩＩＩ．培養細胞の選択的成長、同定および使用
Ａ．培養細胞の選択的成長
本発明の１つの態様は、不均一な集団由来の選択的な細胞型を成長させるための、細胞培養培地の使用に関する。卵巣組織および／または卵管組織の、例えばこれらの組織の表面をブラシでこすることによる、または生検による最初の採取では、所望よりも多くの細胞型がもたらされる可能性がある。同様に、患者由来の卵巣腫瘍試料は、間質細胞または線維芽細胞などの非癌性細胞を含めた種々の細胞型を含有する可能性がある。本明細書に記載されている細胞培養培地は正常な卵巣細胞、正常な卵管細胞、および／または腫瘍細胞の成長に適しているので、この培地は他の細胞型に対しては選択されない。したがって、正常な卵巣細胞の成長に適した細胞培養培地を使用して、卵巣上皮細胞（表面上皮および／または封入体嚢胞上皮）などの正常な卵巣細胞を含む組織由来の細胞型を培養により選択することができる。正常な卵管細胞に適した細胞培養培地成長を使用して、卵管上皮細胞（線毛卵管細胞および／または無線毛卵管細胞）などの正常な卵管細胞を含む組織由来の細胞型を培養により選択することができる。卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞の成長に適した細胞培養培地を使用して、腫瘍細胞型を培養により選択することができる。したがって、６種の主要な組織病理学的サブタイプ（乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型、および移行性型）のうちの少なくとも１つなどの腺癌を含む卵巣腫瘍組織は、特定の細胞型を富化するために卵巣腫瘍細胞の成長に適した細胞培養培地において培養することができる。上で詳述されている通り、富化された細胞は、細胞の実質的に精製された培養物として提供することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書で詳述されている細胞の特性のうちの任意の１つまたは複数（例えば、増殖能力、遺伝子発現、成長特性、など）を有する。
【０１２３】
Ｂ．培養された細胞型の同定
細胞型に関して選択的に培養した後、１種または複数種の分子マーカーを使用して細胞型を同定することができる。正常な卵巣細胞の中で、３種のタンパク質（ＰＡＸ８、ＦＯＸＪ１、およびケラチン７（ＣＫ７）の発現パターンは細胞型の間で変動する。卵巣表面上皮はＣＫ７（＋）、ＰＡＸ８（−）、およびＦＯＸＪ１（−）であるが、卵巣封入体嚢胞上皮はＣＫ７（＋）、ＰＡＸ８（＋）、およびＦＯＸＪ１（−）である。同様に、卵管線毛細胞（ＣＫ７（−）、ＰＡＸ８（−）、およびＦＯＸＪ１（＋））と卵管無線毛細胞（ＣＫ７（＋）、ＰＡＸ８（＋）、およびＦＯＸＪ１（−））を区別することができる。
【０１２４】
無線毛卵管細胞または卵巣封入体嚢胞細胞を発癌性形質転換した後、これらの細胞型を、プローブの発現と関連づける。形質転換された無線毛卵管細胞は、プローブセットＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＬＰ３を過剰発現し、形質転換された卵巣封入体嚢胞細胞は、プローブセットＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４を過剰発現する。したがって、腫瘍をより卵管様または卵巣様として同定することができる。いくつかの実施形態では、キットは、卵管細胞に関連づけられるプローブセット、および／または卵巣細胞に関連づけられるプローブセットを含んでよい。
【０１２５】
本発明の１つの態様は、卵巣細胞および／または卵管細胞の実質的に精製された培養物に関し、卵巣細胞は、プローブセットＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＬＰ３を過剰発現し、卵管細胞は、プローブセットＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４を過剰発現し、培養物は、細胞を少なくとも１０３個含み、細胞は、少なくとも１４、２５、または３５回の集団倍加を行う能力を有する。いくつかの実施形態では、培養物は、細胞を少なくとも１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、および／または１０１０個含む。
【０１２６】
培養腫瘍細胞の株について、細胞由来のゲノムＤＮＡの発現プロファイルを生成することによってＤＮＡ指紋を生成することができる。各腫瘍細胞株についてｍＲＮＡの発現プロファイルおよびタンパク質の発現プロファイルも作成することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、図１３、１４、および／または１５のプロファイルを有する卵巣癌細胞を提供する。
【０１２７】
各細胞株を薬物応答性について試験したら、発現プロファイルを薬物応答と相関させることができる。いくつかの実施形態では、発現プロファイルを患者由来の腫瘍と比較することができ、患者の予後判定に関する知見が既知である場合、培養細胞株からの発現プロファイルにより予後判定を示すことができる。いくつかの実施形態では、患者の腫瘍に対する薬物の効果の可能性の予測を患者の腫瘍の発現プロファイルに基づいて確立し、薬物応答性が既知である参照細胞株と比較することができる。例えば、患者の腫瘍の発現プロファイルが参照細胞の発現プロファイルと実質的に類似しており、参照細胞が薬物治療に応答する場合、患者の腫瘍もその薬物治療に応答すると予測することができる。いくつかの実施形態では、生検または外科手術から得た腫瘍細胞を培養物中で培養し、１種または複数種の治療剤に曝露させる。細胞の増殖または生存に対する作用物質（複数可）の効果を評価して、対象の腫瘍に対する１種または複数種の作用物質の効果の可能性に関する予測を得る。いくつかの実施形態では、少なくとも部分的に、薬物が有益もしくは有効である、または１種または複数種の代替物よりも有効であることを示唆する予測または結果に基づいて、対象に対して治療を選択し、かつ／または施行する。
【０１２８】
Ｃ．培養細胞の例示的な使用
培養細胞は、例えば、種々のスクリーニング方法において、癌治療薬の候補作用物質、他の治療目的のために有用な候補作用物質（例えば、卵巣、卵管などに影響を及ぼす他の疾患において使用するための候補作用物質）を同定するために、または他の目的のために用いることができる。いくつかの実施形態では、正常細胞を使用する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞を使用する。いくつかの実施形態では、対象の疾患（例えば、生殖系に影響を及ぼす疾患）に罹患している対象から得た細胞を使用する。候補治療剤を同定する方法は、発癌性形質転換した正常な卵巣細胞または卵管細胞、または初代培養物に由来する卵巣腫瘍細胞のいずれかの細胞を適切な培地中で培養することを含む。次いで、細胞を作用物質と接触させ、細胞の生理機能に対する作用物質の効果を測定することができる。細胞の生理機能を調節する作用物質が候補治療剤である。細胞の生理機能は、細胞の成長性、１種または複数種の分子マーカーの発現、形態、および／または測定し数量化することができる他の細胞の性質を含んでよい。候補治療剤は、核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ、アプタマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）および／またはタンパク質などの生体分子であってよい、または小有機分子であってよい。ある特定の実施形態では、例えば、細胞の増殖を阻害し、かつ／または生存を阻害する作用物質の能力に基づいて作用物質を同定する。ある特定の実施形態では、例えば、軟寒天において成長する細胞の能力を阻害する作用物質の能力に基づいて作用物質を同定する。
【０１２９】
追加的なステップにおいて、試験動物において異種移植片腫瘍が成長するように、培養細胞を試験動物に投与または移植することができる。候補治療剤を試験動物に投与することができ、異種移植片腫瘍の性質を測定することができる。候補治療剤により、腫瘍の成長、生理機能、および／または他の性質が調節される。特に、候補治療剤により、腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の成長の速度が低下し、腫瘍サイズが縮小し、腫瘍体積が減少し、かつ／または転移が減少する。したがって、ある特定の実施形態では、作用物質を、動物モデルの状況下で腫瘍の成長または進行を阻害するそれらの能力について、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングする。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、培養細胞を再生医療に使用することができる。例えば、本明細書に記載の通り得た、または培養したヒト細胞（一般には正常細胞）を、後で対象（例えば、ヒト対象または非ヒト対象）に移植するために組織または器官をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて構築することに使用することができる、または疾患にかかっている、傷害を受けた、または変性した組織または器官を増強または修復するために移植することができる。いくつかの実施形態では、細胞を対象から得、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、その後、同じ対象（自己）に移植する。いくつかの実施形態では、関連するドナーまたは無関係のドナーを用いる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の通り得た、または培養した細胞を遺伝子改変に供することができる。一般に、細胞を、対象の遺伝子の任意の１つまたは複数が発現される、またはその発現が増加されるように、および／または対象の遺伝子の任意の１つまたは複数の発現が減少する、またはそれが無くなるように、または、対象の特定の突然変異または変更を有するように工学的に操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞、例えば、正常細胞を、１種または複数種の癌遺伝子が発現される、またはその発現が増加するように、または１種または複数種の腫瘍抑制因子遺伝子の発現が減少する、またはそれが無くなるように遺伝子改変することができる。対象の遺伝子は、例えば、タンパク質、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡなどをコードするものであってよい。１つまたは複数のベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど）を細胞に導入することができる。トランスフェクション、ウイルス感染などのこれを行う種々の方法が当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子改変を用いて、疾患モデルを生成することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、培養細胞を組換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質の作製に使用する。
【０１３３】
当技術分野で理解されている通り、スクリーニングは、一般には、１種または複数種の作用物質を試験し、１種または複数種の作用物質の効果を一部の適切な対照と比較することを伴う。対照を使用することにより、研究者が、変化が有意であるかどうかを評価することが可能になる。ある特定の実施形態では、細胞を使用して、化合物のライブラリーを、例えば、ハイスループットな様式などでスクリーニングする。
【実施例】
【０１３４】
本発明を一般的に説明したので、出願人らは、一般的に説明された発明の理解を助けるために以下の例示的な実施例を参照する。これらの特定の例は、ただ単に本発明のある特定の態様および実施形態を例示するために含まれており、本発明をいかなる点でも限定するものではない。しかし、実施例に記載の特定の一般原則を、本発明の他の態様または実施形態に一般に適用することができる。本発明は、上記および下記の態様、実施形態および他の特徴の任意の１つまたは複数を組み合わせることができることを意図している。
【０１３５】
（実施例１）
正常な卵巣培養物および卵管培養物の樹立。
【０１３６】
ａ．ＷＩＴ−ｆｏ培地：正常な卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は、ＷＩＴ−ｆｏ栄養培地では少なくとも１５回集団倍加培養されたが（図２Ａ〜Ｂ、青色の線）、標準培地条件下の同じ細胞の反復実験プレートは数回の継代後に成長が停止した（図２Ａ〜Ｂ、赤色の線）。
【０１３７】
ｂ．標準の卵巣上皮の培養培地：卵巣上皮細胞に対して、５〜１０％の範囲のウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を補充した、ＭＣＤＢ１０５／培地１９９の１：１混合物で構成される対照培地を使用した。対照培地としての１０〜１５％ウシ胎児血清を伴うダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２（１：１混合物）では同様の結果がもたらされた。これらの２つの培地は、過去２０年にわたり、卵巣細胞を短期培養するために多くの他の研究者によって使用されてきた。卵巣細胞は、これらの対照培地では数回の集団倍加を超えては繁殖しなかった（図２Ａ、赤色の線）。
【０１３８】
ｃ．標準の卵管培養培地：卵管上皮細胞に対して、Ｃｒｏｍｅｒらに記載されている、０．１％ＢＳＡ、５％血清（２．５％ウシ胎児血清プラス２．５％Ｎｕ血清の１：１ミックス）および１７βエストラジオールを補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）とハムＦ１２の１：１混合物で構成される対照培地を使用した。この培地の、Ｌｅｖａｎｏｎらによってわずかに改変されたバージョンである、２％血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）とハムＦ１２の１：１混合物で構成される培地も試験した（図２Ｂ、赤色の線）。
【０１３９】
ＷＩＴ−ｆｏ培地で成長させた卵巣細胞は７継代（４２日間）で１４回の集団倍加に到達し、これは、正味の細胞数の８，１９２倍の増加である（図２Ｂ）。標準の対照培地（ＤＭＥ：Ｆ１２）では、同じ細胞は同様に７回継代されたが（４２日間）、７継代（４２日間）でたった２．４回の集団倍加であり、これは、５．３倍の細胞数の正味の増加と等しい。したがって、細胞の数の正味の増加がＷＩＴ−ｆｏでは標準のＤＭＥ：Ｆ１２培地よりも１，５２６倍多かった（８，１９２÷５．３＝１，５２６）（図２Ｂ）。
【０１４０】
卵巣細胞を培養するために利用可能な細胞培養培地のいくつかの変形を試験した。以下に列挙されている培地では、卵巣細胞および卵管細胞は３〜５週間以内に分裂を停止し、細胞数の正味の増加は観察されなかった。
【０１４１】
−  １０％ウシ胎児血清、および１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物）
（Karlanら、American  J.  of  Obs.  Gyn.  １７３巻（１号）、９７〜１０４頁、１９９５年）。
【０１４２】
−  ５％ウシ胎児血清を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物）
（Auerspergら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９６巻、６２４９〜６２５４頁、１９９９年）。
【０１４３】
−  １５％ウシ胎児血清を伴うダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２（１：１混合物）
（Nittaら、Gynecologic  Oncology、８１巻、１号、１０〜１７頁、２００１年）。
【０１４４】
−  １０％ウシ胎児血清、２ｍｍ  ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を伴うＭＣＤＢ１０５／培地１９９（１：１混合物）。
（Liuら、Cancer  Res.  １；６４巻（５号）：１６５５〜６３頁、２００４年）。
【０１４５】
（実施例２）
ＷＩＴ−ｆｏで培養した正常な卵巣細胞および卵管細胞の特徴付け。
【０１４６】
培養細胞の系列および起源を同定するために、正常なヒト卵巣組織および卵管組織の免疫組織化学的な特徴付けを実施し、正常な卵管組織および卵巣組織の上皮細胞の異なるサブセットをｉｎ  ｖｉｖｏで区別するマーカーパネルを開発した。
【０１４７】
正常なヒト卵巣組織および卵管組織のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片の、異なる細胞を認識する抗体を用いた免疫組織化学的検査により、正常細胞サブセットを定義した。いくつもの抗体をスクリーニングした後、３種の抗体−ＰＡＸ８、ＦＯＸＪ１およびケラチン７（ＣＫ７）−のパネルを、卵巣の表面上皮と封入体嚢胞上皮とを区別すること、および卵管の線毛細胞と無線毛細胞とを区別することを可能にするものと決定した。卵巣上皮の全ておよび卵管上皮のサブセットがケラチン７陽性（＋）であると決定された。卵巣表面上皮はＰＡＸ８陰性（−）であるが、卵巣封入体嚢胞上皮はＰＡＸ８陽性（＋）であった。さらに、卵管上皮の無線毛サブセットはＰＡＸ８陽性（＋）およびＦＯＸＪ１陰性（−）であり、これにより、ＦＯＸＪ１陽性（＋）であるがＰＡＸ８陰性（−）であった線毛細胞と区別された（図３Ａ〜Ｅ）。
【０１４８】
【表１Ａ】
2014508540.tif 000003
卵巣および卵管由来の培養細胞を検査した。卵巣由来の培養細胞は、ＣＫ７（＋）、ＰＡＸ８（＋）タンパク質を発現したが、ＦＯＸＪ１（−）については陰性であった。このプロファイルは、卵巣封入体嚢胞の裏打ちと一致する。以後、培養卵巣細胞を卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）細胞と称する（図３Ｇ）。
【０１４９】
正常な卵管采由来の培養細胞は、ＣＫ７（＋）、ＰＡＸ８（＋）タンパク質を発現したが、ＦＯＸＪ１（−）については陰性であった。このプロファイルは、卵管上皮の無線毛細胞と一致する。これらの培養細胞を以後ＦＮ細胞（卵管無線毛細胞）と称する（図３Ｇ）。
【０１５０】
（実施例３）
ｈＴＥＲＴにより不死化した正常な卵巣培養物および卵管培養物の樹立。
【０１５１】
ａ．正常な卵巣培養物および卵管培養物の不死化。正常なヒト上皮細胞は、従来の培養培地では、細胞培養物中でよく成長せず、寿命に限りがある。対照的に、全てのげっ歯類細胞型および非上皮ヒト細胞型を培養することはより簡単である。
【０１５２】
連続的な正常なヒト上皮細胞培養物を樹立するために、発癌性形質転換を用いて、連続的に培養することができる細胞株を創出する。この手法では、正常上皮細胞の発癌性形質転換を、正常なヒト細胞を化学的突然変異原、放射線照射または他の発癌性作用物質に曝露させることによって実現する。これらの作用物質により、広範にわたる突然変異、ＤＮＡ破壊および染色体の再配置が引き起こされ、細胞は、もはや完全な正常細胞とみなすことができない。正常細胞を形質転換するための代替方法では、ウイルス癌遺伝子を使用して正常細胞を形質転換する。これらとしては、ヒトパピローマウイルスＥ６／７（ＨＰＶ  Ｅ６／７）遺伝子、サルウイルス４０ラージＴ／スモールｔ（ＳＶ４０Ｔ／ｔ）抗原、およびアデノウイルスタンパク質（Ｅ１Ａ）があるが、これらの方法には問題がある場合がある。
【０１５３】
正常なヒト細胞の寿命を延長するための、遺伝学的不安定性またはＤＮＡ突然変異を引き起こさない、侵入性が低い方法は、テロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）を過剰発現させることである。ｈＴＥＲＴを発現させることにより、ゲノムが実際に安定化し、細胞は、ほぼ、正常細胞と同様の二倍体のままである。
【０１５４】
ＷＩＴ−ｆｏ培地（表３参照、「ＷＩＴ−ｆｏ」と表示された列）では、正常な卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）と卵管無線毛（ＦＮ）上皮細胞はどちらもｈＴＥＲＴ単独で不死化した。これらの不死化したＯＣ細胞およびＦＮ細胞は、以後、それぞれＯＣＥ細胞およびＦＣＥ細胞と称される（図３Ａ〜Ｅ）。これらの細胞は、４０回の集団倍加を超えて連続的に培養され、細胞数の正味の増加がほぼ１０１２倍であり、これにより、それらの不死化が実証されている。対照的に、標準培地条件下の、ｈＴＥＲＴを発現している同じ細胞の反復実験プレートは、ｈＴＥＲＴが過剰発現していても数回の継代後に成長が停止した（図４Ａ〜Ｅ）。
【０１５５】
（実施例４）
卵巣封入体嚢胞（ＯＣ）および無線毛卵管（ＦＮ）正常上皮の腫瘍形成性形質転換：
ｈＴＥＲＴにより不死化したＯＣＥ細胞およびＦＮＥ細胞を、以前に記載されている通りＳＶ４０Ｔ／ｔおよびＨ−Ｒａｓを用いて形質転換した（図５Ａ）。ＳＶ４０Ｔ／ｔを発現させることにより、正常なヒト細胞は形質転換されたが、これらの細胞はマウスでは腫瘍形成性にはならない。マウスではＨ−Ｒａｓなどの癌遺伝子をさらに発現させることにより、これらの形質転換細胞が腫瘍形成性になる。形質転換された腫瘍形成性形質転換ＯＣ細胞（ＯＣＬＥＲ）およびＦＮ細胞（ＦＮＬＥＲ）はＰＡＸ８タンパク質およびケラチン７タンパク質を発現し、ＦＯＸＪ１については陰性であり、これにより、これらの細胞が、それらの起源である、それぞれ卵巣封入体嚢胞および卵管無線毛の表現型を保持したことが確認される。同等数のＯＶＬＥＲ細胞およびＦＮＬＥＲ細胞を免疫無防備状態のヌードマウスの腹膜腔に注射した。５〜９週間後にマウスを剖検分析することにより、両群で同様のサイズの腹腔内原発腫瘍が明らかになった。ＯＣＬＥＲ腫瘍およびＯＶＬＥＲ腫瘍はどちらも低分化型の形態を有したが、限局的に小さな微乳頭様構造を同定することができた（図６Ａ〜Ｂ）。腫瘍細胞は同様にＰＡＸ８＋であり（図６、Ｃ〜Ｄ）、膵臓などの周囲の腹腔内組織に対して局所的に浸潤性であった（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１５６】
腫瘍を担持するマウス由来の肺を検査することにより、ＯＣ由来の腫瘍形成性細胞とＦＮ由来の腫瘍形成性細胞との間の著しい差異が明らかになった。各マウスの肺を、まず、解剖顕微鏡の下でｇｆｐ＋腫瘍細胞について検査し（図７Ｃ）、同じ肺のＦＦＰＥ切片を、Ｈ＆Ｅ切片を用いて非定型的な腫瘍細胞について顕微鏡で（図７Ｄ）、ならびにｐ５３およびＳＶ４０Ｔ／ｔの免疫組織化学的染色を用いて（図７Ｅ〜Ｆ）検査した。
【０１５７】
形質転換された無線毛卵管細胞（ＦＮＬＥＲ）では、マウスの６７％（４／６）の肺で転移が形成されたが、同じ癌遺伝子を用いて形質転換した同質遺伝子型の正常な卵巣細胞（ＯＣＬＥＲ）では、マウスの１３％（１／８）で転移が形成された（図６Ｇ）。これらの細胞は、同じ患者から単離し、同一の癌遺伝子を用いて形質転換したので、これは、ＯＣにおいて生じた腫瘍と、ＦＮにおいてにおいて生じた腫瘍における転移の潜在力の差異を示す。
【０１５８】
（実施例５）
予測起源細胞遺伝子発現サインの発見：
ａ．起源細胞であるＦＮＥ（卵管）とＯＣＥ（卵巣）の発現サイン。これらの実験的試験から得られた遺伝子サインを使用して、患者由来の原発性卵巣腫瘍組織を、卵管（ＦＴ）様および卵巣（ＯＶ）様として分類した。１，０１７種のプローブの発現レベルは、正常な不死化細胞の間（ＦＮＥ対ＯＣＥ）で有意に変動した（ＦＤＲ調整Ｐ＜０．０５）。卵巣癌データセット内でＦＴ様およびＯＶ様の細区分を作製するために、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて患者をクラスタリングするための以前の広く使用されている戦略とは異なる手法を適用した。そうではなく、この手法は、ＦＮＥ（ＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＰＬ３）またはＯＣＥ（ＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４）のいずれかで過剰発現された独特の遺伝子記号を有する５種の最も高度に有意なプローブセットを選択し、２つの卵巣癌データセットにおけるこれらの遺伝子の正規化された発現値の合計を、ＦＮＥ遺伝子を（＋１）で、ＯＣＥ遺伝子を（−１）で重み付けすることによって算出すること、詳細には、ＯＣＥ遺伝子の正規化された発現値の合計をＦＮＥ遺伝子の発現値の合計から引き算して、各腫瘍についてのスコアを算出することを伴った。したがって、スコアが高いことは、よりＦＴ様であることを意味する。このスコアに混合モデリングを使用してガウス曲線の二峰性分布を当てはめて、データセット内の２つの亜集団；よりＯＶ様の亜集団およびよりＦＴ様の亜集団を同定した。
【０１５９】
このクラスタリングは、Ｗｕらのデータセット（ＧＥＯ  ＧＳＥ６００８）において実施した。この試験により、９９の新鮮な凍結した、顕微解剖した上皮性卵巣癌（多くの非漿液性組織学的サブタイプを含む）が同様のアレイプラットフォーム上でプロファイリングされた。プラットフォームの差異に起因して、１０種の遺伝子のうち８種が分析のために利用可能であった。グローバルテストでは、これらの８種の遺伝子は、組織学的サブタイプ（Ｐ＝９．９３×１０−１１）、悪性度（Ｐ＝２．０３×１０−７）および病期（Ｐ＝９．５５×１０−１２）に強力に関連した。これらの臨床的因子に最も強力に関連づけられた特定の遺伝子を同定するために、ロジスティック回帰を適用し、これにより、ＤＯＫ５、ＣＤ４７、およびＳＦＲＰ１が、この関連性を駆動すると思われることが明らかになった（図８ａ）。８種の遺伝子サインを用いて、Ｗｕデータ内のＦＴ様亜集団およびＯＶ様亜集団を定義し、いくらか二峰性の分布を例示している密度プロット内のスコアを可視化し（図８ｂ）、２つの群（ＯＶ様およびＦＴ様）への分離を裏付けた。特に、このスコアリングシステムを使用して、Ｗｕデータセット内にアレイした４つの正常な卵巣表面上皮試料は、全てＯＶ様に分類された。起源細胞分類は患者の腫瘍の臨床的差異と関連した；ＦＴ様亜集団は、病期（Ｐ＝３．２７×−６）、悪性度（Ｐ＝４．４６×１０−４）が有意に高い腫瘍を含み、主に漿液腫で構成された（Ｐ＝１．８３×１０−８）（図８ｃ）。対照的に、ＯＶ様腫瘍は、類内膜腫瘍、明細胞腫瘍および粘液性腫瘍などの種々の漿液性組織学的サブタイプを含み、悪性度がより低い腫瘍を含んだ。
【０１６０】
１０種の遺伝子サインを、同じプラットフォームに２４６の漿液性悪性腫瘍および２０の類内膜悪性腫瘍由来の新鮮な凍結腫瘍片（顕微解剖していない）がアレイされたＴｏｔｈｉｌｌデータセット（ＧＥＯ  ＧＳＥ９８９１）においてさらに検証した；重要なことに、これらの組織を患者の生存データと関連づけることができた。同じガウス混合モデリングを適用することにより、ＯＶ様スコアおよびＦＴ様スコアが同定され、これらは、はっきり二峰性ではなかったが、わずかな左寄りが観察され、これは、ＯＶ様腫瘍の小さな亜集団を示している（図８ｄ）。ＦＴ様亜集団は、漿液腫について有意に富化されており（Ｐ＝０．０１０９）、病期がより高度な腫瘍を含有し（これは有意ではなかった、Ｐ＝０．０６９１）、悪性度との関連性は示されなかった（Ｐ＝０．８７６）（図８ｅ）。ＦＴ様腫瘍は、有意に悪い無病生存（Ｐ＝０．０００２９７）および全生存（Ｐ＝０．０４９５）を有した（図８ｆ）。Ｔｏｔｈｉｌｌデータセットでは明白な二峰性が欠如しているので、腫瘍がＯＶ様またはＦＴ様と誤分類されている可能性がある。しかし、ＷｕデータセットとＴｏｔｈｉｌｌデータセットの結果の組み合わせに基づいて、起源細胞サインが卵管卵巣腫瘍に存在し、この分類により、以前は認識されていなかった卵管卵巣細胞腫の臨床的に別個のサブグループが解明されると思われると結論づけた。
【０１６１】
ｂ．形質転換遺伝子サイン対不死化遺伝子サイン。異なる細胞株により、起源細胞に関係なく、正常な不死化細胞サイン（ＩＣＳ）と、それらの対応する形質転換細胞サイン（ＴＣＳ）とを比較して遺伝子発現の差異を評価することが可能になった（図９）。これを行うために、ｈＴＥＲＴのみを発現している不死化したＦＮＥ／ＯＣＥのｍＲＮＡの発現プロファイル、およびｈＴＥＲＴ＋ＬＴ／ｓｔおよびＨ−Ｒａｓ癌遺伝子を発現している形質転換されたＦＮＬＥＲ／ＯＣＬＥＲのｍＲＮＡの発現プロファイルを測定した。
【０１６２】
結果により、ＩＣＳ＋遺伝子発現サインにより、卵巣癌患者において、ＴＣＳ＋卵巣癌と比較して統計的に有意な悪い臨床転帰予測されることが示された（図９）。
【０１６３】
正常な不死化細胞サイン（ＩＣＳ）は、形質転換細胞サイン（ＴＣＳ）と比較して、悪い転帰と相関した（図９Ａ）。この結果は、「形質転換細胞サイン」が、化学療法に対する良好な応答と相関する可能性があり、これにより良好な転帰が予測されることを示唆している。腫瘍に近接する正常上皮の顕微鏡検査では、化学療法を用いた処置後の壊死またはアポトーシスの徴候はほぼ示されない。対照的に、腫瘍の化学療法応答には、有意な壊死、アポトーシス、炎症および／または線維症が伴う。腫瘍細胞は、ＤＮＡ損傷応答、細胞周期制御、ヌクレオチドおよびエネルギー代謝に関与する多数の経路が不完全であるので、化学療法に対する感度がより高い。
【０１６４】
さらに、Ｔｏｔｈｉｌｌによってそれらのデータセットにおいて同定された、経験的に定義された不良転帰群と、それらのデータセットを検査することによって同定されたＩＣＳサインとの間に著しい重複が観察された。ＩＣＳに分類された５１例のうち３例のみが、Ｔｏｔｈｉｌｌで予後不良（Ｃ１）として分類された。対照的に、ＩＳＣ腫瘍８５例のうち４６例が、Ｔｏｔｈｉｌｌによって予後不良（Ｃ１）として分類された（図９Ｂ）。
【０１６５】
（実施例６）
標準の培養培地における腫瘍細胞の成長カイネティクス
腫瘍は、多くの細胞型で構成される複雑な組織であり、細胞型としては、腫瘍細胞と混じった線維芽細胞、内皮細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、正常上皮細胞などなどの多くの間質細胞が挙げられる。これらの中で、線維芽細胞は、歴史的に、標準の培養培地で成長させることが最も容易である。腫瘍組織を培養プレートに入れたとき、一般には、線維芽細胞が爆発的に成長し、その結果、数週間のうちに線維芽細胞は培養物を完全に追い越し、間もなく腫瘍細胞を含めた他の全ての細胞型が培養物から排除される。血清を補充したＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２ＭＣＤＢ１０５／Ｍ１９９培地を使用したほとんど全ての場合で同様の結果が得られ、線維芽細胞は増殖した主要な細胞型であった。したがって、これらの培地では、間質細胞は、完全に腫瘍細胞よりも速く成長し、純粋な癌細胞株を樹立することは不可能であった。
【０１６６】
非腫瘍細胞の過成長が起こらない希少な試料では、標準培地において短期の腫瘍細胞の成長を実現することが可能である。しかし、これらの最初の成功の希少な場合でさえも、腫瘍細胞の成長は、卵巣細胞株を培養するために最も頻繁に使用されている標準の培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩおよびＭＣＤＢ１０５／Ｍ１９９など）では一般に数週間後に停止した。この後、一般には、細胞死が広範に及ぶ。ほとんどの場合、連続細胞株は樹立されず、培養物はこの時点で廃棄される。非常に希少な場合には、サブクローンが出現し、連続細胞株が生じる可能性がある。
【０１６７】
標準培地において連続腫瘍細胞株を樹立することができるこれらの希少な場合には、一般に、４つの病期が観察される；数週間にわたる短時間の急速な成長（ａ）、その後の成長プラトー（ｂ）、その後の広範に及ぶ細胞死（ｃ）および希少な細胞クローンの出現。
【０１６８】
この事象の連続は図１０に最もよく例示されている。ヒト卵巣腫瘍試料をＲＰＭＩ培地にプレーティングすると、腫瘍細胞の成長はおよそ５回の集団倍加で停止した（図１０Ａおよび１０Ｃ、２０〜４０日目の前の赤色の線および緑色の線の平らな部分）。この後に、細胞死が広範に及び、これは、細胞数の減少に反映される（図１０Ａおよび１０Ｃ、４０〜５０日目の赤色の線および緑色の線の下向きの部分）。この種類の成長カイネティクスは、従来の培地で行われるヒト腫瘍培養の大部分に典型的である。
【０１６９】
従来の細胞培養培地を使用したほぼ３ダースの試みでただ１つの腫瘍細胞株が樹立された。この１つの場合では、腫瘍細胞のクローンはＲＰＭＩ培地において、上記の通りほとんど全ての他の細胞が死滅した後に増殖を開始した（図１０Ａ、赤色の線、９０日目）。
【０１７０】
培養していない腫瘍ＤＮＡと比較して有意な変化が起こり、ＲＰＭＩ培地において９０日後に生じた腫瘍細胞クローンのゲノムを検査した（図１０Ｂ）。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃにおいて成長した腫瘍細胞は起源腫瘍と非常に類似した（図１０Ｂ）。
【０１７１】
要約すると、例外が１つあったが、標準の細胞培養培地では、腫瘍細胞は最終的に死んだ、または培養物は線維芽細胞に追い越され、したがって、連続細胞株を樹立することはできなかった。同様に、Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎらは、６７の患者由来の９０の異なる卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）検体をＲＰＭＩ培地にプレーティングし、９０のうち１１のみを（１２％、１１／９０）たった１５継代にわたって培養することができたことが観察された。
【０１７２】
継代数対集団倍加：
継代の数は集団倍加とは等しくない。この例は図１０Ａにおいて提供される。腫瘍細胞をＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９においてほぼ２０週間にわたって継代した。典型的な継代頻度は週に１回であり、これは全部で２０継代と同等である。しかし、これらの細胞の集団倍加曲線は７継代後には平らであった。したがって、７回目の継代と２０回目の継代との間に正味の増加はなかった。したがって、これらの細胞により、任意の意味のある実験を行う実用的なプラットフォームを提供することはできなかった。これらの細胞は、毎週プレート間で標準培地に継代され、それらの細胞数の増加はわずかであった。
【０１７３】
培養物樹立の遅延時間：
我々のＲＰＭＩにおいて細胞株が出現する前に９０日の遅延時間が観察された（図１０Ａ）。この遅延時間は、一般には、２つのプロセスに起因して観察される；この遅延期の間に、細胞の大部分が死に、その代わりに、新しい突然変異を獲得した希少なサブクローンが出現し、成長が速い連続細胞株を起こすことが可能になる。しかし、図１０において例示されているように、これは、細胞培養物において獲得される遺伝学的変更を犠牲にして起こる。したがって、そのような細胞株は、起源腫瘍細胞集団から著しく逸脱したクローンの集団になる。
【０１７４】
（実施例７）
ＷＩＴ−ｏｃ培地における腫瘍細胞の成長カイネティクス
ＷＩＴ−ｏｃ培地における腫瘍細胞の成長は即時であり、遅延時間はなかった。成長速度は一定であり、成長プラトーまたは広範に及ぶ細胞死は観察されなかった（図１０ＡおよびＣ、青色の線）。これらの結果は、ＷＩＴ−ｏｃ培地では、プレーティングした腫瘍細胞の大部分が、有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるクローン選択を伴わずに増殖することができることを示唆している（図１０ＡおよびＣ、青色の線）。これは、一般には、我々が樹立した全ての細胞株の成長カイネティクスであった。
【０１７５】
以後、ＷＩＴ−ｏｃ培地において樹立された卵巣癌細胞株はＯＣＩ細胞株と称する。
【０１７６】
２５種の連続ＯＣＩ細胞株を樹立した；これらのうちの１４種は一次ヒト固形卵巣組織由来であり、７種は腹水由来の連続ＯＣＩ細胞株であり、５種はマウスにおいて最初に生長させたヒト腫瘍異種移植片由来のＯＣＩ細胞株であった（表１）。
【０１７７】
（実施例８）
卵巣腫瘍および卵管腫瘍の異なるサブタイプの培養：
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも６種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の９０パーセント超を占める。上皮表現型と間葉系表現型の混合物である多数の他の希少な卵巣腫瘍サブタイプ、例えば、癌肉腫、および未分化胚細胞腫などの生殖起源細胞の腫瘍などが存在する。
【０１７８】
成長させることが特に難しい腫瘍型、例えば、類内膜癌および明細胞癌などを含めた、ヒト卵巣癌の６種の異なるサブタイプ由来の連続腫瘍細胞株が樹立されている（表１および２）。完全に最適化された方法および培養条件を用いた２６の試みにおいて２５種のＯＣＩ株が樹立され、これらのＯＣＩ株の全てが、９０％超の成功率で長期（＞３０回の集団倍加）にわたって培養された。２５種の腫瘍株の全てが軟寒天コロニーを形成することができた（表２）。
【０１７９】
標準の培養培地では、異なるサブタイプの卵巣癌を効率的に成長させることは不可能であった。連続腫瘍株の大部分は高度に侵攻性の乳頭状漿液性卵巣癌から樹立され、他のサブタイプはめったに培養されない。
【０１８０】
さらに、我々が樹立した細胞系のうち４種の腫瘍細胞株は、原発性卵管細胞腫に由来した。最近まで、大多数の原発性ミュラー管骨盤内腫瘍が、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と称されていた。我々が開発した培養系を用いて、卵管原発性および卵巣原発性の両方の細胞株が樹立された。
【０１８１】
（実施例９）
標準培地におけるＯＣＩ細胞株の培養
ＯＣＩ株の成長を種々の標準培地において検査した。卵巣癌細胞に対してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＴＣ）およびＥＣＡＣＣによって推奨される培地を使用した。ＡＴＣＣから入手可能な７種のヒト卵巣腺癌の中で、３種のみが利用可能なサブタイプ情報を有した；明細胞癌１種、乳頭状漿液性細胞腫１種および類内膜細胞腫細胞株１種。
【０１８２】
これらの細胞株に対してＡＴＣＣによって推奨される培地は１０〜１５％血清を補充したＭＣＤＢ−１０５／Ｍ１９９、またはダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地またはＲＰＭＩ培地である。ＯＣＩ株はこれらの培地では成長することができなかった。ＯＣＩ株を用いたこれらの実験の例が図１１（上の３つのパネル）に示されている。対照的に、我々が試験したＡＴＣＣ細胞株の全てがＷＩＴ−ｏｃ培地において成長することができた（図１１、下の３つのパネル）。これらの結果は、標準培地は、ＷＩＴ−ＯＣと置き換えるために使用することができないことを例示している。
【０１８３】
（実施例１０）
起源腫瘍の組織病理とＯＣＩ腫瘍株の組織病理の比較：
生物学において、形状と機能との間には強力な関係がある。腫瘍サブタイプの特定の組織病理（形状）は、腫瘍細胞の遺伝的プログラムとそれらの微小環境および全身性因子との間の複雑な相互作用から生じる。
【０１８４】
ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株からは、ヒト卵巣腫瘍サブタイプのいずれとも似ていない低分化型腫瘍が生じる（図１２Ａ〜１２Ｂ）。対照的に、ＷＩＴ−ｏｃ培地で成長したＯＣＩ株（ＯＣＩ）からは、起源のヒト腫瘍と組織病理が区別できない腫瘍異種移植片が生じる（図１２Ｃ〜１２Ｆ）。
【０１８５】
典型的なヒト卵巣乳頭状漿液性細胞腫（ＰＳＣ）では、血管を含有する中心の間質核によって乳頭状構造が形成される。これらのコアにより、最終的に間質核をほとんど有さない腫瘍細胞のクラスターによって形成される最小の枝を形成する悪性上皮によって裏打ちされた徐々に小さくなる乳頭が生じる（図１２Ｅ）。これは、子宮および卵巣ＰＳＣにおいてのみ見られる非常に特異的な構成的特徴であり、この腫瘍に特徴的である。ＯＣＩ−Ｐ９ａ株はヒトＰＳＣから樹立され、これを免疫無防備状態のマウスに注射すると、ヒトＰＳＣの特異的構成が再現される（図１２Ｃ）。大多数の異種移植片腫瘍では起源腫瘍の組織病理学的特徴は再現されないので、これは注目すべき結果である。
【０１８６】
卵巣の別の別個の腫瘍サブタイプは、一般には、中心内腔の周囲に組織化された連続した腺を形成する類内膜腺癌である。これらの腫瘍は、一般には乳頭状構造を欠く。これらの腫瘍はまた、一般には、エストロゲン受容体およびムチンを発現する。類内膜腺癌から樹立されたＯＣＩ−Ｅ１ｐ株は腺状構成を有する腫瘍を形成し、エストロゲン受容体およびムチンを発現し、これは腫瘍の起源の表現型を再現している。
【０１８７】
要約すると、ＯＣＩ株は、ヒト卵巣癌と似た腫瘍を生じないＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ標準の卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）株とは異なり、ヒト卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の形態的な表現型模写である腫瘍を組織病理学的レベルで創出する。
【０１８８】
（実施例１１）
起源腫瘍のＤＮＡとＯＣＩ腫瘍株のＤＮＡの比較：
一塩基多型（ＳＮＰ）チップにより、培養した卵巣腫瘍細胞のＤＮＡと、それらの起源である培養していない原発性腫瘍組織のＤＮＡを比較するための高分解能の方法が可能になる。この分析により、染色体のコピー数の変化、再配置および異型接合性の損失（ＬＯＨ）をゲノムワイドに検出することが可能になる。
【０１８９】
１２種のＯＣＩ株および対応する起源腫瘍組織、ならびに９種のＡＴＣＣ卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）株のゲノムＤＮＡを検査した。細胞株およびそれらの親の腫瘍由来のゲノムＤＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２５０Ｋ  ＳＮＰアレイにハイブリダイズさせ、正常な参照ＤＮＡと対照して解析した。これらのデータをヒートマップにプロットし、そこでは異常な変化があるＤＮＡ領域が青色で強調表示されており、検出可能な変化のない領域は黄色で強調表示されている。これらの交互の黄色および青色のＳＮＰバンドのゲノム全域にわたるパターンにより、各腫瘍についての独特のＤＮＡ指紋がもたらされ、起源腫瘍と比較した培養腫瘍細胞を検証することが可能になる。
【０１９０】
培養していない原発腫瘍組織由来のゲノムＤＮＡのＣＧＨプロファイルとＷＩＴ−ｏｃで成長した細胞由来のゲノムＤＮＡのＣＧＨプロファイルには注目すべき類似性があった。データの教師なし階層クラスタリングにより、各ＯＣＩ株クラスターがその親の腫瘍組織の隣にくることが示されている。ＯＣＩ株は、起源腫瘍のゲノムサインの大半を保持し、したがって、起源腫瘍ＤＮＡ参照の隣に正確に同定することができる。ヒト腫瘍は、各サブクローンとは別個のＤＮＡの変更のスペクトルを有する多数のサブクローンを含有する。したがって、腫瘍のゲノム全域にわたってＳＮＰをトレースすることは、起源腫瘍の完全なゲノム不均一性を解析するための優れた方法である。これらの結果により、細胞培養の際にこの不均一性の大半を保持することができたことが示されている。
【０１９１】
ゲノムの変更の規模は、ＯＣＩ株の間で２つの別個の群に分離された。ＯＣＩ株のうちの２種（ＯＣＩ−Ｕ１ｐおよびＰ３ａ）およびそれらの対応する腫瘍は、最大で全染色体腕が関与する大規模な変更を有した（図１３、赤色のバー、左の４レーン）。対照的に、他の１０種のＯＣＩ株およびそれらの対応する腫瘍のゲノムの変更には狭い領域の染色体が関与した（図１３、中央の２０レーン、赤色のバー）。これらの変更はゲノム全体にわたって分布し、明白なホットスポットはなかった。
【０１９２】
ＡＴＣＣ卵巣腫瘍株については、対応する患者由来の対応する腫瘍ＤＮＡを公的に入手することができない。これらの株の多くは数十年前に樹立され、起源腫瘍と比較するために腫瘍組織の培養していない部分の位置を確認することができるかどうかは確実ではない。結果として、ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株を起源腫瘍組織と比較することはできなかった。しかし、それでも、ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株におけるＤＮＡの変更の分布は、例外を除いた全てのＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株が、大規模な１型のゲノムの変更を有し（図１３、青色のバー、右の９レーン）、それとは対照的に、ＯＣＩ株のパターンの大部分は細かい小規模な変更パターンを有したので、情報価値がある。
【０１９３】
ＳＮＰプロファイルにより、各腫瘍について異なり、独特である指紋がもたらされ、これにより、各細胞株を起源腫瘍と対照して試験し、同定することが可能になる（図１３）。
【０１９４】
（実施例１２）
ＯＣＩ腫瘍株のｍＲＮＡの発現プロファイル：
異なる卵巣腫瘍サブタイプから樹立されたＯＣＩ株のｍＲＮＡの発現プロファイルは、別個のｍＲＮＡの発現サインを有した。１２種のＯＣＩ株、５種の正常な卵巣および卵管株ならびに５種のＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株由来のｍＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ｐｌｕｓチップにハイブリダイズさせた。データの教師なし階層クラスタリングにより、乳頭状漿液性癌、類内膜癌および明細胞癌から樹立された腫瘍細胞株がそれらの腫瘍起源に基づいて別々の別個の群を形成することが明らかになった（図１４）。さらに、ｍＲＮＡの発現サインは正常な卵巣上皮（ＯＣＥ）および卵管上皮（ＦＮＥ）、ならびにＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣癌細胞株とは別個であった。
【０１９５】
これらの結果により、ＯＣＩ株が、培養物においてこれらの腫瘍型を互いに区別するために十分な、有意なレベルの起源腫瘍の遺伝子発現プロファイルを保持することが確認される。さらに、ＡＴＣＣ株とＯＣＩ株との間で、数百の遺伝子の発現の有意差があることが示されている。
【０１９６】
（実施例１３）
ＯＣＩ腫瘍株のタンパク質の発現プロファイル：
異なる卵巣腫瘍サブタイプから樹立されたＯＣＩ株のタンパク質の発現プロファイルは別個のタンパク質の発現サインを有した。ＯＣＩ株のタンパク質抽出物を、逆相タンパク質アッセイ（ＲＰＰＡ）を用いて検査し、これにより、ＯＣＩ株が再度それらの腫瘍起源に応じてクラスター化されることが明らかになった。乳頭状漿液性癌、類内膜癌および明細胞癌から樹立されたＯＣＩ株は別々のクラスターを形成した（図１５）。さらに、タンパク質の発現サインは正常な卵巣上皮（ＯＣＥ）および卵管上皮（ＦＮＥ）、ならびにＡＴＣＣ卵巣癌細胞株とは別個であった。
【０１９７】
これらの結果により、ＯＣＩ株が、培養物においてこれらの腫瘍型を互いに、および正常細胞と正確に区別するために十分な、有意なレベルの起源腫瘍のタンパク質の発現プロファイルを保持することが確認される。また、これらの結果により、ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株とＯＣＩ株との間で多数のタンパク質の発現に有意差があることが示されている。
【０１９８】
（実施例１４）
ＯＣＩ株の薬物応答：
上記の通り、ＯＣＩ株のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のプロファイルはＡＴＣＣおよびＥＣＡＣＣ腫瘍細胞株貯蔵所から入手可能な従来の卵巣癌株とは劇的に異なる。これにより、結果として、ＯＣＩ腫瘍株の薬物応答もＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株とは異なり得るという可能性が生じた。
【０１９９】
ＵＯ１２６は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を阻害する薬物の例である。ＭＡＰＫは、「細胞外シグナル調節キナーゼ」（ＥＲＫ）とも称されるマイトジェン活性化キナーゼのメンバーである。ＥＧＦおよび他の受容体チロシンキナーゼなどの多くの成長因子は、しばしば、癌において増幅され、過剰発現され、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を活性化する。さらに、Ｒａｓなどの多くの突然変異癌遺伝子によりＭＡＰＫ／ＥＲＫが活性化され、これにより、この中心的な経路が多くの種類の癌において発生する。したがって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の多くの構成成分が抗癌薬開発の活性な領域である。
【０２００】
ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ株（ＳＫＯＶ３、ＯＶ９０、ＴＯＶ−１１２０およびＡ２７８０）およびＯＣＩ卵巣腫瘍株（Ｃ５ｘ、Ｐ９ａ１、Ｐ７ａおよびＦＣＩ−Ｐ１ｐ）の、ＭＡＰＫ阻害薬であるＵＯ１２６に対する応答を検査した。ＯＣＩ細胞株およびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ細胞株をどちらも、９６ウェルプレート中、ＷＩＴ−ｏｃ培地に３連でプレーティングした（ウェル当たり細胞５０００個）。次の日に、ＭＡＰＫ阻害薬であるＵＯ１２６の段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に１４４時間インキュベートした後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて、５９０／５３０蛍光を尺度として生存細胞を測定した。
【０２０１】
ＯＣＩ細胞に対するＭＡＰＫ阻害薬の効果とＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣに対するＭＡＰＫ阻害薬の効果には有意差があった。予測通り、５μＭのＵＯ１２６により、ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣＣ細胞株の増殖が５０％阻害された（ＬＤ５０）。対照的に、ＯＣＩ株において５０％阻害を実現するためにはおよそ５倍のＵＯ１２６が必要であった（ＬＤ５０＞３０ｕＭ）（図１６Ａ）。
【０２０２】
パクリタキセルは、微小管の集合を阻害する薬物の例である。微小管は、細胞分裂および小胞輸送に関与する細胞骨格の一部であるフィラメントである。有糸分裂の間に染色体を娘細胞に分離する紡錘繊維を築くためには微小管の集合が必要である。したがって、微小管を阻害する薬物により、腫瘍細胞の増殖も阻害される。
【０２０３】
ＯＣＩ卵巣腫瘍株（Ｐ７ａ、Ｐ２ａ、Ｃ２ｐ）およびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株（ＥＳ２およびＯＶ９０）を、９６ウェルプレート中のＷＩＴ−ｏｃ培地に３連でプレーティングした（ウェル当たり細胞５０００個）。次の日に、パクリタキセルの段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に７２時間インキュベートした後、生存細胞を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて５９０／５３０蛍光として測定した。
【０２０４】
ＯＣＩ細胞に対するパクリタキセルの効果とＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣに対するパクリタキセルの効果には劇的な差異があった。腫瘍細胞数の５０％の減少（ＬＤ９０）を生じたパクリタキセルの濃度は、ＯＣＩ株ではＡＴＣＣＣ／ＥＣＡＣＣ株と比較して５倍高かった（図１６Ｂ）。
【０２０５】
シスプラチンは、ＤＮＡの架橋結合を引き起こす化学療法薬の例である。シスプラチンはＤＮＡに結合し、２つの鎖と化学的に架橋結合し、これにより、細胞分裂の間にＤＮＡ損傷が引き起こされる。これにより、修復機構が引き出され、今度は、修復が不可能であることが分かるとアポトーシスが活性化される。ＯＣＩ卵巣腫瘍株（Ｐ７ａ、Ｐ２ａ、Ｃ２ｐ）およびＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍株（ＥＳ２およびＯＶ９０）をプレート中のＷＩＴ−ｏｃ培地に３連でプレーティングした（ウェル当たり細胞５０００個）。次の日に、シスプラチンの段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に７２時間インキュベートした後、生存細胞を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて５９０／５３０蛍光として測定した。
【０２０６】
ＯＣＩ細胞株に対するシスプラチンの効果とＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ細胞株に対するシスプラチンの効果には劇的な差異があった。腫瘍細胞数の５０％の低下を生じたこれらの薬物の濃度（ＬＤ９０）は、ＯＣＩ株ではＡＴＣＣＣ／ＥＣＡＣＣ株と比較して６倍高かった（図７Ｃ）。
【０２０７】
したがって、ＯＣＩ株は多様な作用機構を有する３つの全く異なるクラスの制癌剤に対する抵抗性が、従来の卵巣癌細胞株（ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ）と比較して高い。
【０２０８】
パクリタキセルおよびシスプラチンは、卵巣癌の治療において一般に使用される第一選択薬物であり、したがって、上記の結果はよりよい治療の開発に非常に関連性がある。現存の腫瘍細胞株の１つの欠点は、それらの抗癌薬に対する感度が高レベルであることである。この感度により、薬物の開発の間に多くの「偽陽性」結果が導かれる、すなわち；培養物中の細胞株を死滅させることができる薬物が前臨床的開発および臨床開発のためにさらに選定される。しかし、現存の腫瘍細胞株に対して有効なこれらの薬物の多くは、診療所で患者において試験した時に有効であることが証明されない。腫瘍細胞株の薬物感受性と患者の薬物感受性との間に相関がないことが、有効な癌治療の急速な開発の主要な障害である。ＯＣＩ様遺伝子発現サインを有する卵巣腫瘍の患者の生存：ＯＣＩ様遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍を有する卵巣腫瘍患者は、ＡＴＣＣ様発現プロファイルを有する腫瘍よりも統計的に有意に悪い生存を有する（図１７）。これは、ＯＣＩ株が、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者を治療するために最も一般的に使用される薬物、例えばパクリタキセルおよびシスプラチンなどに対してより抵抗性であるという上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物応答の結果と一致する。これらの結果により、患者の治療応答に関して、ＯＣＩ株により、現存の腫瘍細胞株と比較してより関連性のある情報がもたらされることが示唆されている。
【０２０９】
（実施例１５）
卵管卵巣起源以外の腫瘍型はＷＩＴ−ｏｃ培地において首尾よく成長した。
【０２１０】
いくつかの腫瘍試料を、ヒト乳癌、膵癌、腺様嚢胞癌、肺由来または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍（カルチノイド）から取り出し、ＷＩＴ−ｏｃ培地において試験した。本明細書に記載の方法および培養培地により、これらの腫瘍を培養することが可能になる（図１８）。
【０２１１】
表
表1.  異なる腫瘍サブタイプから樹立された連続卵巣腫瘍細胞株の数の要約。この表には、原発性固形腫瘍、悪性腹水または異種移植片腫瘍、ならびに異なる卵管卵巣サブタイプから樹立された主要な卵管卵巣細胞腫細胞株の数が示されている。
【０２１２】
【表１】
2014508540.tif 000004
表2.  異なる腫瘍サブタイプから樹立された連続卵巣腫瘍細胞株の一覧。この表には、原発性固形腫瘍、悪性腹水または異種移植片腫瘍、ならびに異なる卵管卵巣サブタイプから樹立された25種の卵管卵巣細胞腫細胞株の一覧が示されている。
【０２１３】
【表２】
2014508540.tif 000005
【０２１４】
【表３−１】
2014508540.tif 000006
【０２１５】
【表３−２】
2014508540.tif 000007
【０２１６】
材料および方法
１）組織の採取
良性の婦人科状態に対する外科手術を受けている患者から、外科的キットを使用して正常な卵巣表面および卵管の采状末端からブラシでこすり取ったものを採取した。２人のドナー患者は５６歳および６５歳であり、いかなる種類の婦人科の癌も有していなかった。
【０２１７】
２）卵巣表面および卵管上皮の単離および培養
細胞を細胞培養培地に懸濁し、改変表面処理した組織培養フラスコ（Ｐｒｉｍａｒｉａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。培地を２〜３日ごとに交換しながら１０〜１５日後、０．０５％トリプシンを用いて細胞をはがし、細胞を最低でも１×１０４／ｃｍ２の密度で播種することによって二次培養物を樹立した。１０％血清を含有する培地を用いてトリプシンを不活化し、その後、細胞をポリプロピレンチューブに入れて遠心分離して（５００×ｇ、４分）、過剰なトリプシンおよび血清を除去した。細胞を再プレーティングした２４時間後、およびその後４８〜７２時間ごとに栄養培地を交換した。正常な卵巣表面および卵管上皮を、これらの細胞に最適な栄養培地（ＷＩＴ−ｆｏ）で培養した。
【０２１８】
３）レトロウイルスの感染
広宿主性レトロウイルスを、２９３Ｔ産生細胞株を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してレトロウイルスベクター１μｇならびに８：１の比率のパッケージングプラスミド（ｐＵＭＶＣ３）およびエンベローププラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ）合計１μｇでトランスフェクションすることによって作製した。２４時間および４８時間の時点でウイルスの上清を回収し、８μｇ／ｍＬのポリブレンと一緒に使用して一次卵巣表面細胞および卵管上皮細胞に感染させた。レトロウイルスをレシピエント細胞に以下の順序で、個々のステップで導入した：ｐｍｉｇ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴ、ｐＢＡＢＥ−ｚｅｏ−ＳＶ４０−ＥＲおよびｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−Ｈ−ｒａｓ  Ｖ１２。各感染後に、感染細胞の選択を段階的に実施し、薬物選択（５００μｇ／ｍＬのゼオシン（ｚｅｏ）および１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ｐｕｒｏ））を用いてポリクローナル感染集団を精製した。一次卵巣表面上皮細胞を、２回目の継代から６回目の継代の間にｈＴＥＲＴで不死化し、２６回目の継代から３０回目の継代の間に形質転換した。一次卵管上皮細胞には１回目の継代から４回目の継代の間にｈＴＥＲＴを形質導入し、１６回目の継代時に形質転換した。ｈＴＥＲＴを用いて不死化した細胞およびＳＶ４０および／またはＨ−ｒａｓを用いて形質導入した細胞を、Ｐｒｉｍａｒｉａ組織培養物製品上、定義済みの培地で培養した。レトロウイルスの使用を伴う全てのプロトコールはＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙにより承認されたものであった。
【０２１９】
不死化した卵巣表面および卵管上皮細胞株（ｐｍｉｇ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴベクターのみを含有する）は以後ＯＣＥおよびＦＮＥと称し、ｈＴＥＲＴ（Ｅ）、ＳＶ４０初期領域（Ｌ）およびＨＲａｓ（Ｒ）をコードするベクターを導入した後の完全に形質転換された誘導体はＯＣＬＥＲおよびＦＮＬＥＲと称する。
【０２２０】
４）ウェスタンブロット法
タンパク質の発現を、総細胞タンパク質３０マイクログラムを４〜１２％のＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で分離し、その後、ＰＶＤＦ膜に転写することにより、免疫ブロッティングによって決定した。膜をＳＶ４０ＬＴに特異的な一次抗体（Ｐａｂ１０１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｒａｓに特異的な一次抗体（ｃｌｏｎｅ  ＲＡＳ１０）およびＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７に特異的な一次抗体（ＭＡＢ３５５４）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ＰＡＸ８に特異的な一次抗体（１０３３６−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）、ＦＯＸＪ１に特異的な一次抗体（ＨＰＡ００５７１４）およびβ−Ａｃｔｉｎに特異的な一次抗体（ｃｌｏｎｅ  ＡＣ−１５）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でプローブした。
【０２２１】
５）免疫蛍光法
無処理の１２ｍｍカバーガラス（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）上で２日間成長させた細胞のタンパク質の発現を、ＳＶ４０およびＲａｓに対してそれぞれ２％パラホルムアルデヒド／０．１％トリトンＸ１００および２％パラホルムアルデヒド／アセトンを用いて固定し、ＳＶ４０ＬＴに特異的な一次抗体（ｓｃ−１４７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＲａｓ（ｃｌｏｎｅ  Ｒａｓ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に特異的な一次抗体と一緒にインキュベートした後に、免疫蛍光法によって測定した。画像を、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｕ倒立顕微鏡およびＳＰＯＴ−ＲＴソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）を使用して、油浸、４０×拡大率で取得した。
【０２２２】
６）生細胞画像および蛍光活性化細胞選別
細胞を、無処理のｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）上で２日間成長させ、生細胞の画像を、油浸、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｕ倒立顕微鏡および画像取得用のＥＺ−Ｃ１  ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、４０×拡大率で取得した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ  ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用した蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を適用して、ｐｍｉｇ−ＧＦＰ−ｈＴＥＲＴを感染させた後にＧＦＰ陽性の卵巣細胞および卵管細胞の割合を決定した。
【０２２３】
７）腫瘍形成性および転移の分析
免疫無防備状態のマウスにおける腫瘍形成実験のプロトコールはＨａｒｖａｒｄ  Ｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓによって承認されたものであった。全ての実験を、関連施設および国家のガイドラインおよび規制に従って実施した。単一細胞懸濁液をマトリゲル：ＷＩＴ−ｆｏ混合物（１：１）中に調製し、体積１００μｌ当たり細胞百万個を、マウス当たり腹腔内部位１箇所および皮下部位２箇所に注射した。腫瘍細胞の注射を、６〜８週齢の雌の免疫不全ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）に実施した。腫瘍形成性細胞を組織培養物からヌードマウスの腹腔内部位および皮下部位に移植した５〜９週間後に腫瘍を回収した。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織由来のヘマトキシリン・エオシン染色切片から腫瘍の組織病理を評価した。ＦＦＰＥ組織に対して、細胞型特異的マーカー（ＣＫ７、ＦＯＸＪ１、ＰＡＸ８）を使用して免疫組織学的検査を行って、マウスのＯＣＬＥＲ異種移植片およびＦＴＬＥＲ異種移植片ならびに正常なヒト卵巣および卵管において免疫染色パターンを決定した（免疫染色手順の完全な詳細についてはオンライン）。従来のＡＢＣ技法を用いて免疫染色を行った。ＧＦＰ発現腫瘍細胞の肺への転移を、最初にＯｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ１６  Ｓｔｅｒｅｏ蛍光顕微鏡を使用して新鮮な組織で解析し、その後、ホルマリン固定パラフィン包埋組織のヘマトキシリン・エオシン染色切片を顕微鏡検査した。マウス肺に腫瘍細胞が存在することを、ＳＶ４０ＬＴ免疫染色（Ｐａｂ  １０１）およびｐ５３免疫染色（ＦＬ−３９３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）によって確認した。
【０２２４】
８）ＲＮＡ抽出および発現プロファイリング
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用して、各細胞株から全ＲＮＡを３連で（同じ細胞株由来の異なる継代）抽出した。キャピラリー電気泳動計器（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用したサイズ分画手順でＲＮＡを確認して高品質を確実にし、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用してＲＮＡ濃度を推定した。５〜１５μｇのＲＮＡを用いて、ビオチン化ｃＤＮＡ標的を生成し、それをその後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に標準のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。全ての試料を同じマイクロアレイコア設備で同時にプロファイリングして、バッチの影響を最小限にした。
【０２２５】
９）マイクロアレイデータの正規化および解析
細胞株（ＯＣＥ、ＦＮＥ、ＯＣＬＥＲ、ＦＮＬＥＲ）のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイおよび公的に入手可能なＷｕらによる卵巣癌データセット（ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓ受託番号ＧＳＥ６００８）およびＴｏｔｈｉｌｌらによる卵巣癌データセット（ＧＥＯ  Ｓｅｒｉｅｓ受託番号ＧＳＥ９８９１）を、Ｒ（バージョン２．１０．１）において分散安定化方法（ｖｓｎｒｍａ）を用いてそれぞれ独立に正規化した。細胞株間の遺伝子発現の比較を、２４Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２マイクロアレイ（ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して実施し、５４，６７５種のプローブを測定した。アレイした試料は各細胞型について４つの生物学的反復（２人の患者由来の不死化細胞および形質転換細胞）および３つの実験的反復（異なる継代）を含んだ。
【０２２６】
最初に、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて教師なし階層クラスタリング解析を行い、不死化細胞と形質転換細胞が強力に分離されることを観察した。不死化クラスターおよび形質転換クラスターのそれぞれの中で、試料を次に患者（１または２）によって細区分し、次いで細胞型（卵巣または卵管起源）によって細区分した。
【０２２７】
マイクロアレイデータ（Ｌｉｍｍａ）に対して線形モデルを使用した改変ｔ検定（Ｐ＜０．０５）を適用し、偽発見率（ＦＤＲ）について補正して、卵管起源の細胞と卵巣起源の細胞の間で示差的に発現された遺伝子を同定した。これらの比較を、不死化細胞群内および形質転換細胞群内で別々の対比として行った（例えばＦＮＥ対ＯＣＥ；ＦＮＬＥＲ対ＯＣＬＥＲ）。ＦＤＲ調整Ｐ値を０．０５に設定したころ、正常な不死化細胞間（ＦＮＥ対ＯＣＥ）または形質転換細胞間（ＦＮＬＥＲ対ＯＣＬＥＲ）で、それぞれ１，０１７種または３００種のプローブが有意に変動していた。患者間の差異を説明するために、Ｌｉｍｍａを用いて第２の解析を行い、今回は患者間の差異を説明するためにｄｕｐｌｉｃａｔｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ機能を使用した。これにより、第１の比較および第２の比較（ｄｕｐｌｉｃａｔｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）によって同定された示差的に発現された遺伝子の間に強力な重複が確認された；したがって、第１の遺伝子サインのセットをその後の解析に使用した。
【０２２８】
ヒト卵巣腫瘍を卵管（ＦＴ）様および卵巣（ＯＶ）様に分類するために、発癌性形質転換の手順は卵管上皮細胞と卵巣上皮細胞の間の固有の差異を不明確にする可能性があるという仮説を立てたので、１，０１７種のプローブ（ＦＮＥ対ＯＣＥ）サイン（以後、「起源細胞」サインと称する）から遺伝子を選択した。２つの卵巣癌データセット内でＦＴ様およびＯＶ様の細区分を同定するために、以前の広く使用されている全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて患者をクラスタリングする戦略とは異なる手法を適用した。その代わりに、ＦＮＥ細胞（ＤＯＫ５、ＣＤ４７、ＨＳ６ＳＴ３、ＤＰＰ６、ＯＳＢＰＬ３）またはＯＣＥ細胞（ＳＴＣ２、ＳＦＲＰ１、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＨＭＴ２、ＴＭＥＭ１６４）のいずれかにおいて過剰発現された独特の遺伝子記号を有する５つの最も高度に有意なプローブセットを選択し、２つの卵巣癌データセット内のこれらの１０種の遺伝子の正規化された発現値の合計を、ＦＮＥ遺伝子を（＋１）で重み付けし、ＯＣＥ遺伝子を（−１）で重み付けすることによって算出した；詳細には、ＯＣＥ遺伝子の正規化された発現値の合計をＦＮＥ遺伝子の発現値の合計から引き算して、各腫瘍についてのスコアを算出した（例えば、スコアが高い腫瘍はよりＦＴ様である）。次いで、混合モデリングを使用してこのスコアにガウス曲線の二峰性分布を当てはめて、各データセット内のよりＯＶ様の腫瘍とＦＴ様の腫瘍の２つの腫瘍を同定した。
【０２２９】
最初に、同様のプラットフォーム（ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）にアレイされた９９の新鮮な凍結し顕微解剖した上皮性卵巣癌（多くの非漿液性組織学的サブタイプを含む）の発現プロファイルを含有するＷｕら、データセット（ＧＥＯ  ＧＳＥ６００８）においてこのクラスタリングを実施した。アレイプラットフォームの差異に起因して、選択した遺伝子の１０種のうち８種が解析のために利用可能であった。グローバルテストを適用して、これらの８種の遺伝子とＷｕデータセット内の臨床的因子（組織学的サブタイプ、悪性度および病期）との間の関連性を決定した。次いで、線形ロジスティック回帰を適用して、これらの臨床的変数に最も強力に関連づけられる特定の遺伝子を同定した。
【０２３０】
この８種の遺伝子の起源細胞サインを使用して、Ｗｕデータ（上記の通り）においてＦＴ様亜集団およびＯＶ様亜集団を定義し、密度プロットを用いてこれらのスコアの分布を可視化して、この分類の有効性を決定した。ＦＴ様／ＯＶ様分類の臨床的特性を評価し、順序ロジスティック回帰（悪性度、病期）またはフィッシャーの直接検定（組織学的サブタイプ）を用いてそれらの関連するＰ値を算出した。
【０２３１】
１０種の遺伝子の起源細胞サインを、Ｔｏｔｈｉｌｌデータセット（ＧＥＯ  ＧＳＥ９８９１）においてさらに検証した；これは、同じＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２プラットフォームにアレイされた２４６の漿液性および２０の類内膜性の新鮮な凍結悪性腫瘍片（顕微解剖していない）を含み、患者の生存と関連づけることができた。Ｗｕに関して記載されているガウス混合モデリングおよび腫瘍分類の方法をＴｏｔｈｉｌｌデータセットに適用した。さらに、ＦＴ様／ＯＶ様分類が、患者の無病生存率と全生存の差異と関連するかどうかを評価するために、カプラン・マイヤープロットを構築し、コックス比例ハザード試験を適用し、悪性度、病期および組織学的サブタイプについて調整して統計的有意性を決定した。マイクロアレイおよび生存解析は全て、Ｒ  バージョン２．１１．１を使用して行った。
【０２３２】
１０）腫瘍細胞培養
新鮮な腫瘍組織断片を細かく切り、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを用いて消化する前、および消化した後にＰｒｉｍａｒｉａプレートにプレーティングした。腫瘍細胞を最適な栄養培地（ＷＩＴ−ｏｃ）で培養した。腫瘍細胞を約１：３の比率で週に１回継代し、新しいフラスコに１ｃｍ２当たり細胞およそ１×１０４個でプレーティングした。培養の最初の数週間は、プレートは腫瘍細胞ならびに種々の正常な上皮細胞および間質細胞を含有する。これらの非腫瘍細胞は、トリプシンに対してより感受性が高く、０．０５％トリプシン処理でプレートからはがれる。したがって、初期の継代（約１〜５）の間は最初にプレートを０．０５％トリプシンで処理する。培地で何回か洗浄して、プレートからはがれた間質細胞および正常細胞を除去した。それでも培養プレートに付着している残りの細胞を、０．２５％トリプシンで処理した。一般に、腫瘍培養物は、４〜６継代では他の細胞型を含まなかった。乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、未分化胚細胞腫腫瘍、癌肉腫腫瘍由来の細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で、培養プレートに付着した単層として培養した。類内膜腫瘍および粘液性腫瘍由来の腫瘍細胞を５％ＣＯ２および５％Ｏ２、３７℃で、培養プレートに付着した単層として培養した。類内膜腫瘍および粘液性腫瘍に対しては１７β−エストロゲンを補充したＷＩＴ−ｏｃ栄養培地。ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ細胞株をベンダーの説明書の通り成長させた。
【０２３３】
１１）軟寒天コロニーアッセイ
樹立培養物（６〜８回の継代）由来の細胞を回収し、０．４％寒天にプレーティングした。１２ウェルプレートのウェルの底部を、ＷＩＴ−ｏｃ培地中に調製した０．６％寒天で密閉して単層形成を妨げた。ＷＩＴ−ｏｃ培地中０．４％寒天中の単一細胞懸濁液を加え、室温に置き、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れた。２週間の時点で細胞にＷＩＴ−ｏｃ中０．４％寒天を流加し、プレーティングの２〜４週間後にコロニー形成を観察した。
【０２３４】
あるいは、腫瘍細胞を、懸濁培養物において成長させた。腫瘍スフェアを、２％Ｂ２７、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４μｇ／ｍｌのヘパリン、および０．５％メチルセルロースを伴うＷＩＴ−ｏｃ培地で成長させた。スフェア形成実験のために、ウェル当たり細胞１５，０００〜２０，０００個を６ウェルの超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングし、１日目、３日目、および５日目に流加し、７日目にスフェアを計数した。
【０２３５】
１２）タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡの分析
腫瘍組織のゲノムＤＮＡをパラフィン切片、または入手可能な場合は新鮮な組織から抽出した。新鮮な腫瘍組織を直接ＲＴＬ＋細胞溶解緩衝液（Ｑｕｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。細胞株溶解物を直接プレート中で同じ溶解緩衝液を使用して調製した。Ｑｉａｇｅｎ  Ａｌｌ−Ｐｒｅｐ  ｍｉｎｉキットを使用してＤＮＡを溶解物から抽出した。逆相タンパク質分析（ＲＰＰＡ）のために、半集密的な（semi-confluent）細胞単層細胞を、氷上でＲＰＰＡ溶解緩衝液１２５μｌに３連で（同じ細胞株由来の異なる継代）溶解させた。ＲＰＰＡ抽出物を＞２００種の抗体を用いてプローブした。全ＲＮＡを各細胞株から３連で（同じ細胞株由来の異なる継代）からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って用いて抽出した。キャピラリー電気泳動計器（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、サイズ分画手順を用いてＲＮＡを確認して、高品質を確実にし、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用してＲＮＡ濃度を推定した。５〜１５μｇのＲＮＡを用いて、ビオチン化ｃＤＮＡ標的を生成し、その後それをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に、標準のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。腫瘍および細胞株由来のゲノムＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙチップを使用して解析した。簡単に述べると、Ｓｔｙ１を用いてＤＮＡを切断し、断片をＰＣＲ増幅する。精製した産物を、ＤＮａｓｅＩを用いてさらに断片化し、ビオチン化し、チップにハイブリダイズさせ、フィコエリトリン−コンジュゲートしたストレプトアビジンで蛍光標識しシグナル増幅を伴った。ＳＮＰ推定ＬＯＨ解析を、ｄＣＨＩＰを使用し、隠れマルコフモードを用いて行った。
【０２３６】
１３）腫瘍形成能および転移の分析
単一細胞懸濁液をマトリゲル：ＷＩＴ混合物（１：１）中で調製し、体積１００μｌ当たり細胞百万個をマウス当たり腹腔内部位１箇所および皮下部位２箇所に注射した。腫瘍細胞の注射を６〜８週齢の雌の免疫不全ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）に対して実施した。腫瘍形成性細胞を組織培養物からヌードマウスの皮下部位および腹腔内部位に移植した５〜９週間後に腫瘍を回収した。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織由来のヘマトキシリン・エオシン染色切片から腫瘍の組織病理を評価した。
【０２３７】
１４）薬物感受性実験
ＡＴＣＣ／ＥＣＡＣＣ卵巣腫瘍およびＯＣＩ卵巣腫瘍株をどちらも９６ウェルプレート中のＷＩＴ−ｏｃ培地に３連でプレーティングした。次の日に、ＭＡＰＫ阻害薬であるＵＯ１２６の段階希釈物または微小管阻害薬であるパクリタキセルをプレートに加えた。生存細胞の数を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用いて５９０／５３０蛍光として測定した。
【０２３８】
【表４−１】
2014508540.tif 000008
【０２３９】
【表４−２】
2014508540.tif 000009
【０２４０】
【表４−３】
2014508540.tif 000010
【０２４１】
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、具体的にかつ個別に、参照により組み込まれることが示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
本発明の特定の実施形態が考察されているが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば本発明の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を均等物の全範囲と一緒に、および、明細書をそのような変形と一緒に参照することによって決定されるべきである。
【図１Ａ】
2014508540.tif 000011
【図１Ｂ】
2014508540.tif 000012
【図１Ｃ】
2014508540.tif 000013
【図１Ｄ】
2014508540.tif 000014
【図２】
2014508540.tif 000015
【図４Ａ】
2014508540.tif 000016
【図４Ｂ】
2014508540.tif 000017
【図４Ｃ】
2014508540.tif 000018
【図４Ｄ】
2014508540.tif 000019
【図４Ｅ】
2014508540.tif 000020
【図６Ａ−６Ｄ】
2014508540.tif 000021
【図８Ａ】
2014508540.tif 000022
【図８Ｂ】
2014508540.tif 000023
【図８Ｃ】
2014508540.tif 000024
【図８Ｄ】
2014508540.tif 000025
【図８Ｅ】
2014508540.tif 000026
【図８Ｆ】
2014508540.tif 000027
【図９】
2014508540.tif 000028
【図１０Ａ】
2014508540.tif 000029
【図１０Ｃ】
2014508540.tif 000030
【図１１Ａ】
2014508540.tif 000031
【図１１Ｂ】
2014508540.tif 000032
【図１７Ｂ】
2014508540.tif 000033
【図３】
2014508540.tif 000034
【図５】
2014508540.tif 000035
【図７】
2014508540.tif 000036
【図１０Ｂ】
2014508540.tif 000037
【図１２】
2014508540.tif 000038
【図１３】
2014508540.tif 000039
【図１４】
2014508540.tif 000040
【図１５】
2014508540.tif 000041
【図１６】
2014508540.tif 000042
【図１７Ａ】
2014508540.tif 000043
【図１８】
2014508540.tif 000044
【国際調査報告】
2014508540.tif 000045