(57)【要約】  本発明は、インフルエンザ血球凝集素と特異的に結合して、血球凝集素がシアル酸と結合することを減少又は阻害する新規なインフルエンザ抗体を特徴としている。本発明は、新規抗体及びそのインフルエンザ感染の予防又は治療における使用を特徴としている方法、組成物、及びキットも提供する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のエピトープに特異的に結合し、それによってインフルエンザ血球凝集素がシアル酸と結合することを減少又は阻害する、単離された抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項２】
インフルエンザＨＡ上のエピトープがシアル酸結合ドメインを含む、請求項１に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項３】
ＨＡが、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ２ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ又はＨ５ ＨＡである、請求項１又は２に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項４】
エピトープが：
ｉ．ＣＤＲ Ｈ１残基１５８；ＣＤＲ Ｈ２残基１５８〜１６０；ＣＤＲ Ｈ３残基１３５〜１３６、１９０〜１９５、及び２２６；ＣＤＲ Ｌ１残基２２２、２２５、及び２２７；並びにＣＤＲ Ｌ３残基１８７及び１８９に対応している、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌｎｄｓ／３／２００６由来のアミノ酸；
ｉｉ．配列番号１７〜４４の何れか１つに示されているアミノ酸；又は
ｉｉｉ．配列番号１７〜４４の何れか１つにあるＣＨ６５〜ＣＨ６７結合残基：
を含む、請求項３に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項５】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、可変重鎖（ＶＨ鎖）を含み、ここでＶＨ鎖は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項６】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、可変軽鎖（ＶＬ鎖）を含み、そしてここでＶＬ鎖は配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項７】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２の可変重鎖（ＶＨ鎖）アミノ酸配列内に存在している１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ領域を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項８】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ鎖）アミノ酸配列内に存在している１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲ領域を含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項９】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、ｉ）配列番号１０に示されているアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖（ＶＨ鎖）、及びｉｉ）配列番号１４に示されている可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項１〜８の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ領域が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２の可変重鎖（ＶＨ鎖）アミノ酸配列内に存在しているＣＤＲ３領域を含む、請求項７に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ領域が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ鎖）アミノ酸配列内に存在しているＣＤＲ３領域を含む、請求項１０に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１２】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が可変重鎖（ＶＨ鎖）を含み、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域がＡｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｖａｌ１０６、Ａｓｐ１０７、Ｔｙｒ１０９、Ｔｙｒ１１０、Ｔｙｒ１１２、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１３】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はその抗体断片である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１４】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、ヒト化抗体又は抗体断片である、請求項１〜１３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１５】
抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、一本鎖断片、二重特異性抗体、又は線状抗体である、請求項１〜１４の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１６】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片に結合している薬剤を更に含んでいる、請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１７】
抗インフルエンザ抗体又は抗体断片に結合している薬剤が、治療薬又は検出可能な標識である、請求項１６に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１８】
治療薬が、小分子、ナノ粒子、ポリペプチド、放射性同位元素、又は抑制性核酸である、請求項１７に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項１９】
治療薬が抗ウイルス剤又は毒素である、請求項１８に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項２０】
治療薬が、インフルエンザウイルス産生を減少するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンス核酸分子である、請求項１８に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項２１】
検出可能な標識が、分光学、光化学、生物化学、免疫化学、物理学、又は化学手段で検出される、請求項１７に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項２２】
検出可能な標識が、酵素、蛍光分子、粒子標識、電子密度の高い物質、放射性標識、微小気泡、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は検出可能に作られたハプテン又はタンパク質である、請求項１７又は２１に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項２３】
インフルエンザが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、又はヒト適合Ｈ５株である、請求項１〜２２の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を含んでいる、医薬組成物。
【請求項２５】
医薬組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】
クレーム２６に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでいる、発現ベクター。
【請求項２８】
クレーム２７に記載の発現ベクターを含んでいる、宿主細胞。
【請求項２９】
方法が、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルス感染を治療又は予防することを含む、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する方法。
【請求項３０】
方法が、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルスを中和することを含む、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルスを中和する方法。
【請求項３１】
方法が、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルス感染の確立を阻害することを含む、それを必要としている対象におけるインフルエンザ感染の確立を阻害する方法。
【請求項３２】
方法が、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害することを含む、対象におけるインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害する方法。
【請求項３３】
方法が、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによってインフルエンスウイルスが対象の細胞への侵入を阻害することを含む、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害する方法。
【請求項３４】
インフルエンザが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、又はヒト適合Ｈ５株である、請求項２９〜３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
対象が、インフルエンザに感染しているか又はインフルエンザに感染する危険性がある、請求項２９〜３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
対象が哺乳動物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象がウイルスに感染しやすい、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３９】
対象が妊婦である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象が若年者又は乳幼児である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
対象が高齢者である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ｉ）抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）医薬組成物を、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、又は吸入によって投与する、請求項２９〜４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
方法が、インフルエンザに感染しているか又はインフルエンザに感染する危険性がある細胞を、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物と接触させること、それによってインフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害することを含む、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害する方法。
【請求項４４】
インフルエンザが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、又はヒト適合Ｈ５株である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
キットが、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するためのキット。
【請求項４６】
キットが、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルスを中和するためのキット。
【請求項４７】
キットが、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルス感染の確立を阻害するためのキット。
【請求項４８】
キットが、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルス感染の伝播を阻害するためのキット。
【請求項４９】
キットが、ｉ）請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はｉｉ）請求項２４又は２５に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害するためのキット。
【請求項５０】
キットが治療薬を更に含む、請求項４５〜４９の何れか一項に記載のキット。
【請求項５１】
治療薬がインフルエンザ感染を阻害する、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
請求項２９〜５２の何れか一項に記載の方法でのキットの使用説明書を更に含んでいる、請求項４５〜５１の何れか一項に記載のキット。
【請求項５３】
インフルエンザが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、又はヒト適合Ｈ５株である、請求項４５〜５２の何れか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０１１年８月３日に出願した、米国仮特許出願第６１／５１４，６６２号の優先権を主張する。この内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（連邦政府支援研究のもとでなされた発明に対する権利の主張）
本研究は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）の認可番号Ｕ１９ ＡＩ０６７８５４及びＰ０１ ＧＭ６２５８０によって支援された。政府は本発明にある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスの季節性の抗原ドリフトはよく知られており、既に感染した個人に長期免疫防御がないことを説明している。ウイルス受容体に結合して融合及び低ｐＨエンドソームからの浸透を促進する三量体表面タンパク質である、血球凝集素（ＨＡ）はインフルエンザウイルス粒子上の主要な表面抗原である。ＨＡは可変エピトープと同様に保存されたエピトープも提示するが、可変エピトープに対する中和抗体が免疫付与及び感染への応答を支配する。
【０００４】
従って、インフルエンザの抗原ドリフトした株を効率的に治療又は予防できる広く中和する治療薬の開発が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
以下に記載するように、本発明はインフルエンザ抗原変異体を広く中和する新規な抗体の発見に基づいている。本発明は新規な抗体を含有している組成物及びキットを、更にインフルエンザウイルス感染を治療又は予防するためのこれら新規な治療薬の使用方法も特徴としている。
【０００６】
態様では、本発明は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のエピトープと特異的に結合する単離された抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を提供する。抗体又は抗体断片のインフルエンザエピトープとの結合はシアル酸へのインフルエンザＨＡ結合を減少又は阻害する。
【０００７】
実施態様では、インフルエンザＨＡのエピトープはシアル酸結合ドメインを含む。
【０００８】
実施態様では、ＨＡは、Ｈ１ＨＡ、Ｈ２ＨＡ、Ｈ３ＨＡ、又はＨ５ＨＡ（ヒト適合Ｈ５株由来のＨＡ）である。
【０００９】
関連する実施態様では、インフルエンザＨＡエピトープは、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６に由来し、ＣＤＲ Ｈ１残基１５８；ＣＤＲ Ｈ２残基１５８〜１６０；ＣＤＲ Ｈ３残基１３５〜１３６、１９０〜１９５、及び２２６；ＣＤＲ Ｌ１残基２２２、２２５、及び２２７；並びにＣＤＲ Ｌ３残基１８７及び１８９に対応するアミノ酸残基を含む。
【００１０】
関連する実施態様では、インフルエンザＨＡエピトープは、配列番号１７〜４４の何れかに記載されているアミノ酸を含む。
【００１１】
関連する実施態様では、インフルエンザＨＡエピトープは、配列番号１７〜４４の何れかにあるＣＨ６５−ＣＨ６７結合残基（例えば、図１５で識別されるＣＨ６５−ＣＨ６７結合残基）を含む。
【００１２】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖（ＶＨ鎖）を含んでいて、ＶＨ鎖は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含む。
【００１３】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２の可変重鎖（ＶＨ鎖）アミノ酸は配列中に存在している１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む。関連する実施態様では、１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ領域は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２の可変重鎖（ＶＨ鎖）アミノ酸配列中に存在しているＣＤＲ３領域を含む。
【００１４】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変軽鎖（ＶＬ鎖）を含んでいて、ＶＬ鎖は配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む。
【００１５】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ鎖）アミノ酸配列中に存在している１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。関連する実施態様では、１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ鎖）アミノ酸配列中に存在しているＣＤＲ３領域を含む。
【００１６】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、ｉ）配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖（ＶＨ鎖）、及びｉｉ）配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変軽鎖（ＶＬ鎖）を含む。
【００１７】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖（ＶＨ鎖）を含んでいて、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域はＡｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｖａｌ１０６、Ａｓｐ１０７、Ｔｒｙ１０９、Ｔｒｙ１１０、Ｔｒｙ１１２、又はこれらの組み合わせを含む。
【００１８】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体はモノクローナル抗体又はその抗体断片である。
【００１９】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体はヒト化抗体である。
【００２０】
実施態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ'断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、単鎖断片、二重特異性抗体、又は直鎖抗体である。
【００２１】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、抗インフルエンザ抗体又はその抗体断片に接合している薬剤を更に含む。関連する実施態様では、抗体又はその抗体断片に接合している薬剤は治療薬又は検出可能な標識である。
【００２２】
治療薬は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の治療薬であってよい。このような薬剤は当該技術分野で周知であって、小分子、ナノ粒子、ポリペプチド、放射性同位元素、抑制性核酸などを包含する。実施態様では、治療薬は抗ウイルス剤又は毒素である。実施態様では、治療薬はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はインフルエンザウイルス産生を減少するアンチセンス核酸分子である。
【００２３】
検出可能な標識は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の検出可能な標識であってよい。このような標識は当該技術分野で周知であって、分光学、光化学、生物化学、免疫化学、物理学、又は化学手段で検出される標識を包含する。実施態様では、検出可能な標識は、酵素、蛍光分子、粒子標識、電子密度の高い試薬、放射標識、微小気泡、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン或いは検出できるように作製されたタンパク質である。
【００２４】
態様では、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも１つの抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物を提供する。実施態様では、医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
【００２５】
態様では、本発明は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。関連する態様では、本発明は、そのような単離されたポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターを提供する。更なる関連する態様では、本発明は、このような発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。
【００２６】
態様では、本発明は、それを必要としている対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は、感染に関連する症状を減少又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。
【００２７】
態様では、方法は、それを必要としている対象のインフルエンザウイルスを中和する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルスを調和し、それによって感染に関連する症状を減少又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。
【００２８】
態様では、本発明は、それを必要としている対象においてインフルエンザウイルス感染を確立する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象におけるインフルエンザウイルス感染の確率を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防する。
【００２９】
態様では、本発明は、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルス感染の広がりを抑制する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は、対象におけるインフルエンザウイルス感染の広がりを抑制しそれによって感染に関連する症状を減少又は緩和する。
【００３０】
態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法はインフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防するか、或いは感染に関連する症状を減少又は緩和する。
【００３１】
態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法は、ウイルス感染を発症しているか又はその危険性がある細胞を、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物と接触させることを含んでいる。方法は、インフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する。
【００３２】
上記態様の何れかにおいて、対象はウイルス感染を発症しているか又はその危険性がある。関連する実施態様では、対象は哺乳動物（例えば、ヒト）である。関連する実施態様では、対象はウイルス感染に罹りやすい（例えば、妊婦、若者又は乳児、高齢者）。
【００３３】
上記態様及び実施態様の何れかにおいて、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは医薬組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、又は吸入によって投与される。
【００３４】
態様では、本発明は、インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するキット；インフルエンザウイルスを中和するキット；インフルエンザウイルス感染の確立を阻害するキット；インフルエンザウイルス感染の広がりを阻害するキット；及びインフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害するキットを提供する。
【００３５】
実施態様では、キットは、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を含む。
【００３６】
実施態様では、キットは、治療薬も含む。関連する実施態様では、治療薬はインフルエンザ感染を阻害する。
【００３７】
実施態様では、キットは、本明細書に記載されている何れかの方法にいてキットを用いるための説明書も含む。
【００３８】
上記実施態様の何れかにおいて、インフルエンザは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、又はヒト適合Ｈ５インフルエンザ株（すなわち、ヒト受容体特異性を獲得したＨ５インフルエンザ；例示株として図１４Ｄを参照されたい）であってよい。
【００３９】
本発明の更なる目的及び利点は以下の詳細な説明にある程度述べられていて、部分的に記載から明瞭であるか、或いは発明の実施によって獲得できるだろう。本発明の目的及び利点は、添付されている特許請求の範囲で指摘されているものを含んでいる、本明細書に記載されている要素及びその組み合わせの手段によって理解並びに獲得できるだろう。前記の一般的な記載及び以下の詳細な説明は、例示及び説明のみであって、特許請求されている発明の限定ではないことを理解すべきである。本明細書に取り込まれて明細書の１部を構成している、添付した図面は本発明の幾つかの実施態様を説明して、記載と共に本発明の本質を説明する働きをしている。
【００４０】
（定義）
本発明の理解を容易にするために、多くの用語及び語句を以下に定義する。
【００４１】
本明細書で用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示していない限り、複数形を含む。従って、例えば、「ａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｔｉｂｏｄｙ」への参照は、１つ又はそれ以上のインフルエンザ抗体への参照を包含する。
【００４２】
具体的に述べていないか又は文脈から明瞭でないならば、「又は」は包括的であると理解される。
【００４３】
本明細書用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法がそれらに帰している意味を有することができて、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、及び「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味することができる；「本質的に〜から成っている（ｃｏｎｓｉｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」などは、米国特許法がそれらに帰している意味を有することができて、この用語は、列挙されている基本的或いは新規な特性が列挙されているものより多くのものの存在によって変更されない限り、列挙されているものより多くのものの存在を可能にするように、制限がないが、先行技術の実施態様を除外する。
【００４４】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域にある少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は前述のものの組み合わせのような、標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、完全なポリクローナル抗体、完全なモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖ断片など）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つの完全抗体から作製された二重特異性抗体のような多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原認識部位を含んでいる融合タンパク質、及び抗体が望ましい生物活性を示す限り、抗原認識部位を含んでいるその他の改変免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の何れかにある。異なったクラスの免疫グロブリンは異なった周知のサブユニット構造及び三次元配置を有している。抗体はそのままか或いはトキシン、放射性同位元素のような他の分子と結合していてもよい。
【００４５】
基本的な４本鎖抗体ユニットは２本の同一軽（Ｌ）鎖及び２本の同一重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる更なるポリペプチドと共に５つの基本四量体ユニットから成っているので、１０個の抗原結合部位を含んでいるのに対して、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２〜５つの基本４本鎖ユニットから成る多価集団を形成する。ＩｇＧの場合は、４本鎖ユニットは一般に約１５０，０００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合しているのに対して、２本のＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて１つ又はそれ以上のジスルフィド結合で互いに結合している。それぞれのＨ鎖及びＬ鎖も規則的に間隔を空けた鎖内のジスルフィド架橋を有している。それぞれのＨ鎖はＮ−末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、それに続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ）をそれぞれのアルファ及びガンマ鎖のために、そして４つのＣＨドメインをミュー及びイプシロンアイソタイプのために有している。それぞれのＬ鎖はＮ−末端に、可変ドメイン（ＶＬ）を、それに続いて定常ドメイン（ＣＬ）をその末端に有している。ＶＬはＶＨと直線になり、ＣＬは重鎖（ＣＨ１）の第１定常ドメインと直線になる。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインの間に接合部分を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬの対合は共に単一の抗原結合部位を形成する。異なったクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6 を参照されたい。
【００４６】
「単離された抗体」は、その自然環境の成分から分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の混入成分は、抗体の診断上及び治療上の使用を妨げて、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク性又は非タンパク性溶質を包含する。実施態様では、抗体は（１）ローリー法で測定して抗体の８０％、８５％、９０％、９５％或いははそれ以上まで；（２）スピンニング−カップ配列決定基を用いてＮ−末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基得るのに十分な程度まで；又は（３）クムシーブルー、銀染色、等を用いる還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで精製されている。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在していないかもしれないので、単離された抗体は組み換え細胞内に抗体自体を含んでいる。実施態様では、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程で調製される。
【００４７】
用語「抗体断片」は、完全抗体の部分を示して、完全抗体の抗原決定可変領域を示す。抗体断片の例は、これに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖ断片、線形抗体、単鎖抗体、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を包含する。
【００４８】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、２つの同じ抗原結合断片、及び命名が容易に結晶化可能なことを反映している、残余の「Ｆｃ」を生成する。Ｆａｂ断片はＨ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメインと共に全長Ｌ鎖、及び１本の重鎖（ＣＨ１）の第１定常領域から成っている。それぞれのＦａｂ断片は抗原結合に対して１価である。すなわち、これは１つの抗原結合部位を有している。抗体のペプシン処理は、２価の抗原結合活性を有していて未だ抗原を架橋できる２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片とほぼ対応する１つの大きいＦ（ａｂ'）２断片を生じる。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又はそれ以上のシステインを含んでいるＣＨ１のカルボキシ末端に僅かの追加残基を有している点でＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ'−ＳＨは本明細書ではＦａｂ'の名称であって、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有している。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片はもともと、２つの間にヒンジシステインを有している１つのＦａｂ'断片として生成された。抗体断片のその他の化学結合も知られている。
【００４９】
「Ｆｃ」断片はジスルフィドで結合している２つのＨ鎖カルボキシ末端を含んでいる。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決定され、この領域は細胞のある特定の型で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００５０】
「Ｆｖ抗体」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含んでいる最小の抗原断片を示す。この部位は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域が非共有結合二量体を形成している２本鎖として、又は１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域が、２本の鎖が同一の二量体構造に関わるように柔軟なペプチドリンカーによって共有結合している１本鎖（ｓｖＦｖ又はｓＦｖ）としての部位である。この配置では、それぞれの可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、Ｆｖ二量体の抗原結合特異性を限定するのに影響する。また、１本鎖可変ドメイン（又はＦｖの半分）は抗原を認識及び結合するために用いることができるが、一般に親和性が低い。
【００５１】
用語「二重特異性抗体」は、２価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらす、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間結合が得られるように、ＶＨ及びＶＬドメインの間の短いリンカー（約５〜１０残基）を用いてｓＦｖ断片（前の項を参照されたい）を構築して製造される、小抗体を示す。二重特異性抗体は、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なったポリペプチド鎖上に存在している、「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。二重特異性抗体は、例えば、ヨーロッパ特許第ＥＰ４０４，０９７号；国際特許出願公開第ＷＯ９３／１１１６１号；及び Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) により完全に記載されている。
【００５２】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基、又はエピトープの特異性の高い認識及び結合に関与する均質抗体群を示す。これは、通常、異なった抗原決定基に対する異なった抗体を含んでいるポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は完全及び全長モノクローナル抗体、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなど）、１本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体タンパク質を含んでいる融合タンパク質、及び抗原認識部位を含んでいるその他の改変免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、これに限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、及び形質転換動物によって作製されたような抗体を示す。
【００５３】
用語「ヒト化抗体」は、最小の非ヒト（例えば、ネズミ）配列を含んでいる特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はこれらの断片である非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の形態を示す。一般に、ヒト化抗体は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が望ましい特異性、親和性、及び機能を有している非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられている（Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536）。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域が、望ましい特異性、親和性、及び機能を有している非ヒト種由来抗体の対応する残基で置き換わっている。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性、及び／又は機能を改善及び最適化するために、Ｆｖネットワーク領域内の及び／又は置き換えた非ヒト残基内の何れかの更なる残基の置換によって改変することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応している全ての又は実質的に全てのＣＤＲ領域を含んでいる、実質的に全ての、又は少なくとも１つの、そして通常は２つ又は３つの可変ドメインから成るのに対して、全ての又は実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のようなものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも１部分も含むことができる。ヒト化抗体を作製するために用いる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９語に記載されている。
【００５４】
用語「ヒト抗体」はヒトによって生成された抗体、又は当該技術分野で公知の任意の技術を用いて人為的に生成された抗体に対応しているアミノ酸配列を有している抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、完全又は全長抗体、それらの断片、及び／又は、例えば、ネズミ軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドから成る抗体のような、少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドからなる抗体を包含する。
【００５５】
ハイブリッド抗体は、異なった抗原決定領域を有する抗体由来の重鎖と軽鎖の対が、２つの異なったエピトープ又は２つの異なった抗原が得られる四量体によって認識及び結合できるように一緒に構築されている免疫グロブリン分子である。
【００５６】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ又はそれ以上の種に由来している抗体を示す。一般的に、軽鎖及び重鎖両方の可変領域は望ましい特異性、親和性、及び機能を有している哺乳動物の１種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）由来抗体の可変領域に対応しているが、定常領域は、その種において免疫応答を誘発するのを避けるために、別の種（通常はヒト）に由来する抗体内の配列と一致している。
【００５７】
抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域の単独又は組み合わせを示す。重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変基としても知られている、３つの相補性決定基（ＣＤＲｓ）で結ばれた４つのフレームワーク領域（ＦＲ）で構成されている。それぞれの鎖のＣＤＲｓはごく近接してＦＲによって結合して、別の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に役立っている。ＣＤＲを決定するために少なくとも２つの技術がある：（１）種間配列変化に基づく方法（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (5thed., 1991, National Institute of Health, Bethesda Md を参照されたい)；及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Al-lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:957-948 (1977) を参照されたい）。更に、これら２つの方法の組み合わせがＣＤＲ決定の技術において時々用いられている。
【００５８】
「投与すること」は、薬物又は薬物を含んでいる組成物を、薬物が対象の体内にあるようにする方法で、対象に与える手段であると本明細書で定義する。このような投与は、限定されないが、経口、経皮（例えば、膣、直腸、口腔粘膜）、注射（例えば、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内）、又は吸入（例えば、経口又は経鼻）を含む何れかの経路で行うことができる。医薬製剤は、もちろん、それぞれの投与経路に適している形態で与えられる。
【００５９】
「薬剤」とは、任意の小分子、化学化合物、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、或いはこれらの組み合わせを意味する。
【００６０】
「類縁体」とは、同一ではないが、類似の機能又は構造特性を有している分子を意味する。例えば、インフルエンザ抗体のアミド、エステル、カルバミン酸、炭酸、ウレイド、又はリン酸類縁体は、１）インフルエンザ抗体の生物活性を損なわずに、インビボにおけるインフルエンザの有利な特性、例えば、吸収、作用の持続、又は作用の発現などを与えるか；又は２）自体は生物不活性であるがインビボで生物活性化合物に変換するか何れかの分子である。類縁体はインフルエンザ抗体のプロドラッグ形態を包含する。このようなプロドラッグは生体系に投与すると、自然化学反応（複数を含む）、酵素触媒化学反応（複数を含む）、及び／又は代謝化学反応（複数を含む）の結果としてインフルエンザ抗体を生成する。
【００６１】
「対照」とは、標準又は標準状態を意味する。
【００６２】
用語「誘導体」は、所定の薬物（例えば、インフルエンザ抗体）と同等の又はほぼ同等の生理学的機能性を有する医薬活性化合物を意味する。本明細書で用いられる用語「誘導体は、薬学的に許容される塩、エーテル、エステル、プロドラッグ、溶媒和物、エナンチオマー、ジアステレオマー、又は立体異性的に強化した、或いはラセミ体の混合物、及び被投与者に投与するとこのような化合物又はそれらの抗ウイルス活性代謝物或いは残基をもたらす（直接又は間接的に）任意のその他の化合物を包含する。
【００６３】
「病気」とは、細胞、組織、又は臓器の正常機能に損傷を与える化合物又はこれを妨げる疾患又は障害を意味する。
【００６４】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は本明細書では区別無しで用いられて、特定の抗体によって認識されて特異的に結合されることが可能な抗原の部分を示す。抗原がポリペプチドの場合は、エピトープは連続アミノ酸及びタンパク質の３回畳み込みによって並べられた及び非連続アミノ酸の両方から形成できる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは通常タンパク変成によって保持されるが、３回畳み込みによって形成されたエピトープはタンパク変成すると失われる。エピトープは一般的に少なくとも８個の、そしてより一般的に少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸を独特の空間配置内に包含している。
【００６５】
抗体間の競合は、参照抗体の一般的な抗原との特異的結合を被検免疫グロブリンが阻害するアッセイによって判断する。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相の直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接又は間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983) を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986) を参照されたい）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press (1988) を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immnol. 25(1):7-15 (1988) を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)）；及び直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)）が知られている。一般に、このようなアッセイは固体表面に結合した精製抗原又はこれらの何れかを有している細胞、標識化していない試験免疫グロブリン、及び標識化した参照の免疫グロブリンの使用を含んでいる。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定して比較する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在している。競合アッセイで確認された抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び生じる立体障害のために参照抗体による結合に対して十分近位にある隣接エピトープに結合する抗体を包含する。競合抗体が過剰に存在している場合は、参照抗体の一般的な抗原との特異的結合を少なくとも２５％、５０％、７５％又はそれ以上阻害する。
【００６６】
「増強する」又は「増大する」とは、参照と比べて、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の正の変化を意味する。
【００６７】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の部分を意味する。この部分は参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含んでいる。断片は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいる。
【００６８】
「ハイブリダイゼーション」は、水素結合を意味して、それは相補的核酸塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。
【００６９】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が誘導される有機体の天然由来ゲノム中で遺伝子の側面を守る遺伝子を含んでいない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。従って、この用語は、例えば、ベクターに；自己複製プラスミド又はウイルスに；
又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれているか、或いは他の配列から独立している別の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって作られるｃＤＮＡ又はゲノム又はｃＤＮＡ断片）として存在する組み換えＤＮＡを包含する。更に、この用語はＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、並びに追加のポリペプチド配列をコードするハブリッド遺伝子の部分である組み換えＤＮＡを包含する。
【００７０】
「単離されたポリペプチド」とは、天然にそれに付随している成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。一般に、ポリペプチドは、タンパク質及びそれが天然に会合している天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％含まないときに単離されている。実施態様では、調製品は少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、又は９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然物から抽出して、このようなポリペプチドをコードする組み換えた核酸の発現によって；又はタンパク質を化学合成してえることができる。純度は任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析などによって測定できる。
【００７１】
２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチドに関連している用語「同一」又は「同一性パーセント」は、配列相同性の一部として同類置換を何れも考慮せずに、最大対応のために対比して位置合わせしたときの、同一であるか或いは同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定パーセントを有している２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を示す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いてあるいは目視検査で測定できる。アミノ酸又はヌクレオチド配列の位置合わせに用いることができる多くのアルゴリズム及びソフトウェアは当該技術分野において公知である。このような配列位置合わせアルゴリズムの限定されない例は、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877(1993) で修正され、そして NBLAST and XBLAST program (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991) に組み込まれた、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990) に記載されているアルゴリズムである。ある特定の実施態様では、Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) に記載されているようにＧａｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用できる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Genentech, South San Francisco California）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）は、配列を位置合わせするために用いることができる更なる公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。ある特定の実施態様では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウェア内のＧＡＰプログラムを用いて（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及びギャップ重量４０、５０、６０、７０、又は９０並びに長さ重量１、２、３、４、５、又は６を用いる）決定できる。ある特定の実施態様では、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453(1970))のアルゴリズムに取り込まれている、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために用いることができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリックスの何れか、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、又は４並びに長さ重量１、２、３、４、５を用いる）。ある特定の実施態様では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) のアルゴリズムを用いて決定できる。例えば、同一性パーセントはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用いて、そして残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティー４を有するＰＡＭ１２０を用いて決定できる。特定の位置合わせソフトウェアによる最大位置合わせのための適切なパラメータは当業者が決定できる。ある特定の実施態様では、位置合わせソフトウェアの初期設定パラメータが用いられる。ある特定の実施態様では、第２アミノ酸配列に対する第１アミノ酸配列の同一性パーセント「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として算出する。ここで、Ｙは第１及び第２配列の位置合わせ（目視測定又は特定の位置合わせプログラムによる位置合わせ）における完全な一致として記録したアミノ酸残基の数であり、そしてＺは第２配列の残基の総数である。第１配列の長さが第２配列より長い場合は、第２配列に対する第１配列の同一性パーセ���トは第１配列に対する第２配列の同一性パーセントより長い。
【００７２】
限定されない例として、特定のポリヌクレオチドが参照配列に対してある特定の配列同一性パーセント（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、そしてある実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一）を有しているか否かは、ある特定の実施態様では、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）を用いて決定できる。Ｂｅｔｆｉｔは、Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics 2:482 489 (1981) の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列の間の相同性のベストセグメントを見出す。本発明に従って特定の配列が、例えば、参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔ又はその他の位置合わせプログラムを用いるときは、同一性のパーセントを参照ヌクレオチド配列の全長に渡って算出できるように、そして参照配列の核酸の総数の最大５％の相同性ギャップが許容されるようにパラメータを設定する。
【００７３】
ある実施態様では、本発明の２つの核酸又はポリペプチドが実質的に同一であるということは、最大対応のために比較及び位置合わせしたときに、配列比較アルゴリズムを用いて測定して或いは目視測定して、これらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、そしてある実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド又はアミノ酸同一性を有していることを意味している。同一性は、長さが少なくとも５、少なくとも１０、約２０、約４０〜６０残基又はそれらの間の任意の整数値である配列の領域に渡って、又は６０〜８０残基、少なくとも９０〜１００残基より長い残基に渡って存在するか、或いは配列は比較している配列の全長に渡って同一である。
【００７４】
「同類アミノ酸置換」は、１個のアミノ酸残基を類似の側鎖を有している別のアミノ酸残基で置き換えることである。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有しているアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換することは同類置換である。好ましくは、本発明のポリペプチド及び抗体の配列における同類置換はポリペプチド又は、アミノ酸配列を含んでいる抗体の抗原（複数を含む）との結合を抑制しない。抗原結合を消去しないヌクレオチド及びアミノ酸同類置換を識別する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Brummel et al., BIochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999) 及び Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997) を参照されたい）。
【００７５】
「薬学的に許容される」は、ヒトを含む動物における使用について、連邦政府又は州政府の規制官庁によって承認された又は承認されうること、或いは米国薬局方又はその他の一般に認められている薬局方に収載されていることを示す。
【００７６】
「薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤」は、薬剤と共に対象に投与できて、薬剤の治療量を送達するのに十分な用量を投与したときに、その薬理活性を損なわず、そして無害である賦形剤、担体又は希釈剤を示す。
【００７７】
本明細書で列挙されているインフルエンザ抗体の「薬学的に許容される塩」は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の障害或いは合併症なしにヒト又は動物の組織に接触させて用いるのに適していると当該技術分野で一般に考えられている酸又は塩基の塩である。このような塩はアミンのような塩基性残基の鉱酸又は有機酸の塩、並びにカルボン酸のような酸性残基のアルカリ又は有機塩を包含する。具体的な医薬塩は、これに限定されないが、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸のようなアルカン酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０〜４である）などのような酸の塩を包含する。同様に、薬学的に許容されるカチオンは、これに限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウムを包含する。当業者は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985) によってリストアップされているものを包含している、本明細書で提供されている抗体の更なる薬学的に許容される塩を認識するだろう。一般に、薬学的に許容される酸又は塩基の塩は塩基性又は酸性部分を含んでいる親化合物から従来の化学的方法の何れかによって合成できる。つまり、このような塩はこれらの化合物の遊離酸又は遊離塩基形態を適切な溶媒中で、適切な塩基又は酸の化学量論的な量と反応させて製造できる。
【００７８】
用語「患者」又は「対象」は、治療、観察、又は実験の対象である動物を示す。ほんの一例として、対象は、これに限定されないが、ヒト又は、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、若しくはネコのような非ヒト哺乳動物を包含するが、これに限定されない、哺乳動物を包含する。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」などは、病気又は疾患はないが病気又は疾患を発症する危険性があるか又は発症しやすい対象において病気又は疾患を発症する可能性を減少することを示す。
【００８０】
「減少する」とは、参照と比べて少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変化を意味する。
【００８１】
「参照」とは、標準又は対照の条件を意味する。
【００８２】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、サンプル、例えば、本発明のポリペプチドを天然に含んでいる、生体サンプル中の他の分子を実質的に認識して結合しない、化合物又は抗体を意味する。
【００８３】
抗体がエピトープ又はタンパク質に「特異的に結合する」ということは、抗体が、関係のないタンパク質を含む、別の物質に比べて、より高い頻度で、より速く、より長時間持続して、より高い親和性で、又はこれらを幾つか組み合わせでエピトープ又はタンパク質と反応又は結合することを意味する。ある特定の実施態様では、「特異的に結合する」は、例えば、薬学的に許容される０．１ｍＭ以下だが、より一般的には約１μＭ未満のＫＤで、抗体がタンパク質に結合することを意味する。異なった種における相同タンパク質間の配列同一性のために、特異的結合は、１つ以上の種の特定タンパク質を認識する抗体を包含する。第１の標的に結合する抗体又は結合部位は第２の標的と特異的に結合するかどうかは分からないということは理解されている。このように、「特異的な結合」は排他的な結合、すなわち、単一標的との結合を必ずしも必要としない（これは含むことができるが）。一般に、しかし必要ないが、結合への参照は特異的結合を意味する。
【００８４】
本明細書で用いられる「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは９５％純粋、より好ましくは９８％純粋、より好ましくは９９％純粋である物質を示す。
【００８５】
本明細書で用いられる用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患及び／又はそれに伴う症状を減少すること又は緩和することを示す。「緩和する」とは病気の発症又は進行を減少し、抑制し、軽減し、停止し、又は安定化することを意味する。当然のことながら、妨げはしないが、病気又は疾患を治療することは病気、疾患又はそれらに伴う症状を完全が取り除かれることを必要としていない。
【００８６】
用語「治療効果」は疾患の症状又はその関連する病状の１つ又はそれ以上の軽減の程度を示す。この用語は、治療療法及び予防（prophylactic 又は preventive）対策の両方を示し、この目的は、標的とする病状又は障害を抑えるか又は遅らせる（減少する）ことである。治療を必要としているものは、既に病気に罹っているもの、並びに病気に罹りやすいもの又は病気を予防しなければならないものを包含する。本発明の方法に従って抗体の治療量を投与された後に、患者が以下のものの１つ又はそれ以上に観察可能な及び／又は測定可能な減少又は欠如を示したら、対象又は哺乳動物は感染を成功裏に「治療される」：感染された細胞数の減少又は非存在；感染している総細胞のパーセントの減少；特定の感染に関連している１つ又はそれ以上の症状（例えば、インフルエンザ感染に関連している症状）のある程度の軽減；減少した罹患率及び死亡率、及び生活の質の改善。成功的治療及び疾患の改善を評価するための上記パラメータは医師によく知られている日常の手段によって容易に測定できる。
【００８７】
「治療的有効量」は、治療効果を達成するのに必要な量を制限することを意図している。当該技術分野における通常の技術を有している医師又は獣医は必要とされる医薬組成物の「治療的有効量」（例えば、ＥＤ５０）を容易に決定して処方できる。例えば、医師又は獣医は医薬組成物中で用いられる本発明の化合物の用量を所望の治療効果を達成するために必要なものより低い濃度で始めて、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増大することができる。
【００８８】
語句「併用療法」は、２つの治療薬の相互作用による有益な効果をもたらすことを意図している特定治療計画の一端としてインフルエンザ抗体と第２治療薬投与を含んでいる。併用の有益な効果は、これに限定されないが、治療薬の併用からもたらされる薬物動態的又は薬力学的相互作用を包含する。これらの治療薬の併用での投与は一般に、決められた時間周期（通常、選択された組み合わせに従って、分、時間、日、又は週）に渡って実施される。「併用療法」は一般に、偶然にそして任意に本発明の併用をもたらす別個の単剤両方の一端としての２つ又はそれ以上のこれら治療薬の投与を包含するように意図されていない。「併用療法」は、これらの治療薬の逐次的方法での投与、すなわち、それぞれの治療薬を異なった時間に投与すること、並びにこれらの治療薬、又はこれらの薬剤の少なくとも２つの実質上同時投与を含むように意図されている。実質上同時投与は、例えば、一定比率の各治療薬を有している単一カプセル、又はそれぞれの治療薬を含有している単一カプセルを複数対象に投与することによって達成できる。例えば、本発明の１つの併用はインフルエンザ抗体及び少なくとも１つの追加治療薬（例えば、抗インフルエンザ薬を包含している、抗ウイルス薬）を同時に又は異なった時間に含んでいるか、又はこれらを２つの化合物を含んでいる単一の、同時製剤化した医薬組成物としてこれらを製剤化できる。別の例として、本発明の併用（例えば、インフルエンザ抗体と、抗ウイルス剤のような少なくとも１つの追加の治療薬）は同時に又は異なる時間に投与できる個別の医薬組成物として製剤化される。各治療薬の連続投与又は実質上同時投与は、これに限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織（例えば、鼻、口、膣、及び直腸）を介する直接吸収を含む、適切な経路の何れかによって達成される。治療薬は同じ経路で又は異なった経路で投与できる。例えば、特定の併用の１つの成分を静脈内注射によって投与できるのに対して、併用の他の成分を経口で投与できる。成分は治療上有効な順番で投与できる。
【００８９】
語句「併用」は、化合物の群又は併用療法の一部として有用な非薬物療法を包含する。
【００９０】
用語「ベクター」は、１つ又はそれ以上の目的の遺伝子（複数を含む）又は配列（複数を含む）を宿主細胞内へ送達して発現することができる構築物を意味する。ベクターの例は、これに限定されないが、ウイルスベクター、無傷のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、陽イオン性縮合剤と結合しているＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されているＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び産生細胞のような、ある特定の真核細胞を包含する。
【００９１】
具体的に記述されてなく、或いは文脈から明瞭でない限り、本明細書で用いられる用語「約」は、当該技術分野における通常の許容範囲、例えば、平均値の２標準偏差以内であると理解される。約は、表示した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解できる。文脈から明確でない限り、本明細書に示されている数値は用語約によって修飾されている。
【００９２】
本明細書に示されている範囲は、範囲内の全ての値の省略であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含んでいると理解される。
【００９３】
本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基の列挙の記載は列挙された基の任意の単一基又は組み合わせとしての可変基の定義を包含している。可変基に関する実施態様又は本明細書の態様の記載は、任意の単一実施態様又は他の任意の実施態様又はその１部との組み合わせとしての実施態様を包含している。
【００９４】
本明細書に提供されている組成物又は方法は、本明細書に提供されている他の組成物及び方法の１つ又はそれ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】（Ａ）はクローン８６０の推定系統である。左は３つの抗体（それらの番号で示した、右）の未変異共通祖先（ＵＣＡ）である。（Ｂ）は系統内の重鎖（上）及び軽鎖（下）配列の配列比較である。（Ｃ）はＣＨ６５由来ＦａｂのＨＡ１との接触である。重鎖は濃青色で；軽鎖を淡青色で；ＣＤＲはＢで標識した色で；ＨＡは赤で；分子表面は部分的に透けて見える透明に示した。ＵＣＡから変異した残基は緑の細い枝で表されている。
【図２】（Ａ）はＣＨ６５Ｆａｂを有しているＨＡ三量体である。１本のＨＡ鎖は赤色に（ＨＡ１）と緑色に（ＨＡ２）；他の２本の鎖を灰色に；グリカンを黄色に表した。着色したＨＡ鎖に結合したＦａｂを濃青色（重鎖）と淡青色（軽鎖）に表して、接触しているＣＤＲを図１Ｂで示したように着色した。（Ｂ）はＦｖ領域とそのＨＡ１との接触の引き伸ばし図である。図１のような色にした。重鎖ＣＤＲ３（赤紫色）はＨＡ１上の受容体結合ポケットに突き出ているのに対して、残りのＣＤＲはより限定された表面接触を有していることに注目されたい。（Ｃ）及び（Ｄ）は、矢印で示したように開いた、Ｆａｂ ＣＨ６５とＨＡ１の間の接触の表面を説明した図である。１つのＨＡサブユニット上のシアル酸ポケットを濃紅色に；他のサブユニットを暗赤色に；残りの２つのサブユニットを灰色に；グリカンを黄色に表した。
【図３】図３は、ＣＨ６５（Ａ）とα−２，６−シアリルラクトンからの相互作用の比較である。
【図４】図４は、Ｈ１及びＨ３インフルエンザ株に対するＣＨ６５−ＣＨ６７系統株の活性の酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）である。２９３Ｔ細胞をＸ３１株由来の全長ＨＡで（上のパネル、Ａ〜Ｃ）、又はＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６［Ｈ１］由来の細胞表面発現球状頭部で（下のパネル、Ｅ〜Ｇ）でトランスフェクトした。細胞をホルムアルデヒドで固定してＣＨ６５ Ｆａｂ（ｂ及びｆ）又はＣＨ６６全長抗体（Ｃ及びＧ）で、続いてヒトＦａｂに特異的なＦＩＴＣ−結合二次抗体でプローブした。細胞をＦＩＴＣ発光（５３２ｎｍ）によって撮像した。対照として、トランスフェクトした細胞を第二次抗体のみでプローブした（Ａ及びＥ）。
【図５】図５は、ＣＨ６５のＶＤＪ組み換え部位の配列である。ｋｅｙは断片をコードする重鎖（Ｖ、Ｄ、Ｊ及びｎ−ヌクレオチド）の起源を示す。
【図６】図６は、ＣＨ６５−ＣＨ６７ ＨＡ抗体の重鎖ＤＮＡ配列である。
【図７】図７は、ＣＨ６５−ＣＨ６７ ＨＡ抗体の軽鎖ＤＮＡ配列である。
【図８】図８は、ＣＨ６５−ＣＨ６７ ＨＡ抗体の重鎖アミノ酸配列である。
【図９】図９は、ＣＨ６５−ＣＨ６７ ＨＡ抗体の軽鎖アミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、ＣＬ８６０ＵＣＡ、ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７のＶＨ ＤＮＡ配列の配列比較である。
【図１１】図１１は、ＣＬ８６０ＵＣＡ、ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７のＶＬ ＤＮＡ配列の配列比較である。
【図１２】図１２は、ＣＬ８６０ＵＣＡ、ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７のＶＨ アミノ酸配列の配列比較である。
【図１３】図１３は、ＣＬ８６０ＵＣＡ、ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７のＶＬＨ アミノ酸配列の配列比較である。
【図１４】図１４は、Ｈ１（Ａ）、Ｈ２（Ｂ）、Ｈ３（Ｃ）、及びＨ５（Ｄ）血球凝集素由来の代表的な受容体結合ドメインである。
【図１５】図１５は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、及びＨ５血球凝集素由来の代表的な受容体結合ドメインの配列比較である。ＣＨ６５−ＣＨ６７抗体と相互作用するアミノ酸残基に下線を付した。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本発明は、インフルエンザ抗原変異体を広く中和する新規な抗体を特徴としている。本発明は、新規な抗体を含んでいる組成物及びキット、並びにインフルエンザ感染を治療又は予防（例えば、ワクチン接種）するためのこれら新規な治療分子を用いる方法も提供する。
【００９７】
インフルエンザウイルス受容体は、末端α−２，３又はα−２，６連鎖によって糖タンパク質又は糖脂質上のグリカンに結合している、シアル酸である（Wiley, D.C. and Skehel, J.J. Annu. Rev. Biochem. 56:365-394 (1987） に概説されている)。殆どの中和抗体は、それらのフットプリントが受容体結合部位と重なり合うことにより、或いはそれらがＨＡ表面のどこかに結合すると立体障害を与えることにより、細胞接着を阻害する（Knossow, M. and Skehel, J.J. Immunology 119:1-7 (2006)）。Ｆａｂ：ＨＡ複合体の構造が確認されている、２つのマウスモノクローナル中和抗体は、ＨＡ上のシアル酸結合ポケットに突き出て、ほぼシアル酸カルボキシレートと思われるところにアスパラギン酸側鎖を提示する（Fleury D. et al., Nat. Struct. Biol. 5:119-123 (1998); 及び Barbey-Martin, C. et al., Virology 194:70-74 (2002)）。しかし、これら２つの抗体は、受容体部位に比べてより容易にエスケープ変異が起こる、他の表面領域との広い接触も有している。
【００９８】
本発明は少なくともその一部が受容体ポケット内に主要な接触を有している新規な抗体の発見に基づいている。ＣＨ６５と命名された、そのような抗体の１つは、２００７三価ワクチンを投与された対象から得られた、選別された形質細胞から再配列された重鎖及び軽鎖遺伝子を単離して見出された。ＣＨ６５は、３０年以上にわたるシーズン分離株Ｈ１の極めて広い範囲を中和する。その１９残基の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）は受容体ポケットに挿入して、シアル酸が行う多くの相互作用を模倣する。重鎖と軽鎖の両方のＣＤＲはＨＡ１の外部接面とより制限された、更なる接触に関与する。ＣＨ６５の予測される非変異祖先は、重鎖変異可変ドメインの１２位、及び軽鎖可変ドメインの６位にある親和性成熟抗体とは異なっている。従って、ヒトＢ細胞レパートリーは、主に結合部位に対する抗体を作製する能力を含んでいる。抗体ＣＨ６５によって中和される多数の季節性Ｈ１ウイルスは、このような応答は通常耐性を選択するにはあまりにもまれであること、又は潜在的なエスケープ変異が受容体結合を危うくするような場合のように、耐性は適応コストを非常に大きくすることを示唆している。従って、インフルエンザウイルスの広範囲中和が受容体のそれを模倣した接触を有する抗体によって達成できるということを本発明者が発見したことは驚くべきことである。従って、本発明はインフルエンザＨＡとシアル酸受容体の間の接触を模倣した新規な抗体を提供する。これらの新規な抗体はインフルエンザの抗原ドリフトした株による感染を効果的に治療及び／又は予防できる。このように、本発明は新規な抗体を含んでいる組成物及びキット、並びにインフルエンザ感染を治療及び／又は予防するためにこれらの治療分子を用いる方法を提供する。本発明は新規な抗体を含んでいる併用治療にも関している。
【００９９】
（ＣＨ６５−ＣＨ６７血球凝集素抗体）
本発明は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のエピトープに特異的に結合する新規な抗インフルエンザ抗体を提供する。抗体のＨＡとの結合はシアル酸へのインフルエンザ血球凝集素結合を減少又は阻害する。
【０１００】
実施態様では、インフルエンザＨＡのエピトープはシアル酸結合ドメインを含む。
【０１０１】
実施態様では、ＨＡは、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ２ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、又はＨ５ ＨＡ（ヒト適合化Ｈ５株由来のＨＡ）である。
【０１０２】
関連する実施態様では、インフルエンザＨＡエピトープは、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６に由来する、ＣＤＲ Ｈ１残基１５８、ＣＤＲ Ｈ２残基１５８〜１６０、ＣＤＲ Ｈ３残基１３５〜１３６、１９０〜１９５、及び２２６、ＣＤＲ Ｌ１残基２２２、２２５、及び２２７、並びにＣＤＲ Ｌ３残基１８７及び１８９に対応するアミノ酸を含む。
【０１０３】
関連する実施態様では、インフルエンザＨＡエピトープは、配列番号１７〜４４の何れか１つに記載されているアミノ酸を含む。
【０１０４】
関連する実施態様では、インフルエンザＨＡエピトープは、配列番号１７〜４４の何れかにあるＣＨ６５−ＣＨ６７結合残基（例えば、図１５で識別されるＣＨ６５−ＣＨ６７結合残基）を含む。
【０１０５】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖（ＶＨ鎖）を含んでいて、ＶＨ鎖は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２の可変重鎖（ＶＨ鎖）アミノ酸は配列中に存在している１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む。関連する実施態様では、１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ領域は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２の可変重鎖（ＶＨ鎖）アミノ酸配列中に存在しているＣＤＲ３領域を含む。
【０１０７】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変軽鎖（ＶＬ鎖）を含んでいて、ＶＬ鎖は配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ鎖）アミノ酸配列中に存在している１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。関連する実施態様では、１つ又はそれ以上の軽鎖ＣＤＲ領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ鎖）アミノ酸配列中に存在しているＣＤＲ３領域を含む。
【０１０９】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、ｉ）配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖（ＶＨ鎖）、及びｉｉ）配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変軽鎖（ＶＬ鎖）を含む。
【０１１０】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖（ＶＨ鎖）を含んでいて、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域はＡｒｇ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｖａｌ１０６、Ａｓｐ１０７、Ｔｒｙ１０９、Ｔｒｙ１１０、Ｔｒｙ１１２、又はこれらの組み合わせを含む。
【０１１１】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体はモノクローナル抗体又はその抗体断片である。
【０１１２】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体はヒト化抗体である。
【０１１３】
実施態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ'断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、単鎖断片、二重特異性抗体、又は直鎖抗体である。
【０１１４】
実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、抗インフルエンザ抗体又はその抗体断片に接合している薬剤を更に含む。関連する実施態様では、抗体又はその抗体断片に接合している薬剤は治療薬又は検出可能な標識である。
【０１１５】
治療薬は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の治療薬であってよい。このような薬剤は当該技術分野で周知であって、小分子、ナノ粒子、ポリペプチド、放射性同位元素、抑制性核酸などを包含する。実施態様では、治療薬は抗ウイルス剤又は毒素である。実施態様では、治療薬はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はインフルエンザウイルス産生を減少するアンチセンス核酸分子である。
【０１１６】
検出可能な標識は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の検出可能な標識であってよい。このような標識は当該技術分野で周知であって、分光学、光化学、生物化学、免疫化学、物理学、又は化学手段で検出される標識を包含する。実施態様では、検出可能な標識は、酵素、蛍光分子、粒子標識、電子密度の高い試薬、放射標識、微小気泡、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン或いは検出できるように作製されたタンパク質である。
【０１１７】
上記実施態様の何れかでは、インフルエンザはＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、又はヒト適合化Ｈ５株であってよい。
【０１１８】
本発明の抗体は当該技術分野で公知の従来方法の何れかによって作製できる。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ヒツジ、有蹄動物、ウシ、ラクダ、家禽、ニワトリなど）を適切なハプテン（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミンなど）と任意に結合している関連抗原（例えば、精製したペプチド断片、全長組み換えタンパク質、融合タンパク質等）の複数回の皮下又は腹腔内注射によって免疫することによって作製できる。抗原を適切な溶媒（例えば滅菌した食塩水）で希釈してアジュバント（例えば、コンプリート又はインコンプリートフロインドアジュバント）と混合して安定な乳濁液を形成することができる。次いで、ポリクローナル抗体をこのように免疫した動物の血液、腹水などから回収する。採取した血液を凝固して、血清をデカンテーションし、遠心分離で清澄にして抗体価を測定する。ポリクローナル抗体は血清又は腹水から、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む当該技術分野における標準的な方法に従って精製することができる。
【０１１９】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256:495(1975) によって記載されているような、ハイブリドーマ方法を用いて作製できる。ハイブリドーマ法を用い、免疫抗原に特異的に結合できる抗体のリンパ球による産生を引き起こすために上記のように適切な宿主動物を免疫する。リンパ球もインビボで免疫できる。免疫に続いて、リンパ球を単離して、例えばポリエチレングリコールを用い適切な骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成し、融合しなかったリンパ球と骨髄腫細胞を除いてハイブリドーマを選択する。次いで、免疫沈降法、免疫ブロッティング法により、又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）など）によって確認されるように選択された抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを標準的方法を用いるインビトロの培養（Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, Academic Press 1986 を参照されたい）で、或いは動物における腹水腫瘍としてインビボの何れかで増殖する。次いで、モノクローナル抗体を、ポリクローナル抗体について上に記載したように、培養培地又は腹水から精製できる。
【０１２０】
また、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組み換えＤＮＡ法を用いても作製できる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いる例えばＲＴ−ＰＣＲなどによって、成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離して、通常の方法を用いてそれらの配列を決定する。次いで、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド（本明細書に記載されている単離されたポリヌクレオチドを包含する）を適切な発現ベクター内にクローン化し、これはＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又は他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞によって産生される。また、所望種の組み換えモノクローナル抗体又はその断片は記載されているような所望種のＣＤＲを発現するファージ提示ライブラリーから単離できる（MacCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 356:624-628; 及び Marks et al., 1991, J. Mo;. Biol., 222:581-597 を参照されたい）。
【０１２１】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（複数を含む）は、代替抗体を作製するために組み換えＤＮＡ技術を用いる多くの異なった手段で更に修正できる。いくつかの実施態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、１）例えば、キメラ抗体を作製するヒト抗体の領域で、又は２）融合抗体を作製する非免疫グロブリンポリペプチドで置換することができる。いくつかの実施態様では、定常領域をトランケート又は除去してモノクローナル抗体の所望抗体断片を作製する。可変領域の部位特異的又は高密度な突然変異生成をモノクローナル抗体の特異性親和性等を最適化するために用いることができる。
【０１２２】
本発明のいくつかの実施態様では、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、それぞれの抗体鎖内に３つの相補性決定基（ＣＤＲ）を含んでいる抗原決定又は超可変領域内の非ヒト（例えば、ネズミ）抗体由来最小配列を含んでいる抗体である。このような抗体は、ヒト対象に投与したときに抗原性及びＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答を減少するために治療に用いられる。実際には、ヒト化抗体は、非ヒト配列が最小から殆ど無い典型的にヒトの抗体である。ヒト抗体はヒトによって産生された抗体又はヒトによって産生された抗体に対応しているアミノ酸配列を有している抗体である。
【０１２３】
ヒト化抗体は当該技術分野で公知の多くの技術を用いて産生できる。抗体は、ヒト抗体のＣＤＲを所望の特異性、親和性、及び機能を有している非ヒト抗体（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）と置き換えることによってヒト化できる（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); 及び Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) の記載を参照されたい）。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性及び／又は機能を改善又は最適化するために、可変ヒトフレームワークの領域内の及び／又は置き換えられた非ヒト残基内の更なる残基の置換によって更に修正することができる。
【０１２４】
ヒト化抗体の作製に利用するためのヒト重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインの選択は抗原性を減少するために重要であろう。「ｂｅｓｔ−ｆｉｔ」法に従って、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を公知ヒト可変ドメインアミノ酸配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。従って、ある特定の実施態様では、そこからＣＤＲを採取する非ヒト抗体のそれと最も相同性があるヒトアミノ酸配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として用いる（Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993): Chothia at al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987) を参照されたい）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定サブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定ＦＲを用いていくつかの異なったヒト化抗体に用いることができる（Carter et al., PNAS 89; 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993) を参照されたい）。実施態様では、方法の組み合わせが、ヒト化抗体の作製に用いるヒト可変ＦＲを採取するために用いられる。
【０１２５】
ヒト化する抗体は抗原に対する高い親和性、並びにその他の好ましい生物特性を保持していなければならないということも当然のことである。目的を達成するために、ヒト化する非ヒト抗体及び多種の候補ヒト化配列由来の親配列の解析プロセスによってヒト化抗体を作製できる。三次元の免疫グロブリンモデルは当業者に入手可能であってよく知られている。選択された候補抗体配列の推定三次元立体配座構造を説明して表示するためにコンピュータプログラムを用いることができる。このようなモデルの使用は、ヒト化する抗体の機能における残基の可能性のある役割の解析、すなわち、その抗原に結合させる候補抗体の能力に影響を与える残基の解析を可能にする。この方法で、所望の抗体特性が得られるように、親抗体からＦＲ残基を選択してレシピエントヒト化抗体と結合させることができる。一般に、抗原決定領域（又は超可変領域）のＣＤＲにある残基は抗原結合について親抗体（例えば、望ましい抗原結合特性を有する非ヒト抗体）からヒト化抗体に保持している。ある特定の実施態様では、可変ＦＲ内の少なくとも１つの追加残基は親抗体からヒト化抗体内に保持されている。ある特定の実施態様では、可変ＦＲ内の最大６個までの追加残基が親抗体からヒト化抗体内に保持されている。
【０１２６】
免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変領域由来のアミノ酸を、それぞれＨＸ及びＬＸと指定し、ここで、ｘはＫａｂａｔ（Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1987, 1991）のスキームに従うアミノ酸の位置を指定している数である。Ｋａｂａｔは抗体に関してそれぞれのサブグループについて多くのアミノ酸配列を記載して、そのサブグループ内のそれぞれの残基について最も普通に存在するアミノ酸を記載してコンセンサス配列を作り出す。Ｋａｂａｔは、記載されている配列内の各アミノ酸に残基ナンバーを割り当てる方法を用いていて、残基ナンバーを割り当てるこの方法はこの分野で標準となった。Ｋａｂａｔのスキームは、問題の抗体をＫａｂａｔ内の１つのコンセンサス配列と、同類アミノ酸を参照して、配列比較することによってこの一覧表に含まれていない別の抗体まで拡張可能である。Ｋａｂａｔの番号付与システムの使用は、異なった抗体における同等の位置にあるアミノ酸を容易に確認する。例えば、ヒト抗体のＬ５０位にあるアミノ酸は、マウス抗体のアミノ酸位Ｌ５０に相当する位置を占めている。更に、例えば、１つの抗体配列内の各アミノ酸を同じＫａｂａｔナンバーを有している他の配列内のアミノ酸と配列比較できるように、Ｋａｂａｔ番号付与システムを用いて同一性パーセントを確認するために、任意の２つの抗体配列を一意的に配列比較できる。配列比較の後に、対象抗体領域（例えば、重鎖又は軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較したら、対象抗体領域と参照抗体領域の間の配列同一性パーセントは、ギャップを考慮せずに、２つの領域の比較した位置の総数で割った、対象抗体領域と参照抗体領域の両方の同じアミノ酸で占められた位置の数を１００倍してパーセントに変換した数である。
【０１２７】
ヒト化抗体に加えて、完全ヒト抗体を当該技術分野で公知の多くの技術を用いて直接作製できる。インビトロで免疫したか、又は標的抗原に対して抗体を産生する免疫した個人から単離した不死化ヒトＢリンパ球を作製できる（例えば、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991); 及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい）。また、ヒト抗体をファージライブラリーから選択でき、ここでファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996); Sheets et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); 及び Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991) を参照されたい）。ヒト抗体は、免疫すると内因性免疫グロブリン産生なしでヒト抗体の全範囲を産生できるヒト免疫グロブリン遺伝子座を包含している組み換えマウスにおいても作製できる。このデュ法は米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１２８】
本発明は二重特異性抗体も包含している。二重特異性抗体は少なくとも２つの異なったエピトープを特異的に認識して結合できる抗体である。異なったエピトープは同じ分子（例えば、インフルエンザＨＡ）内にあるか、或いは二重特異性抗体が目的の抗体（例えば、インフルエンザＨＡ）並びに、例えば、別のウイルスタンパク質（例えば、Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、Ｍ２など）内にあるエピトープを特異的に認識して結合するように異なった分子上にあり得る。二重特異性抗体を作製する技術は当該技術分野でよく見られる（Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983); Brrnnan et al., Science 229:81 (1985); Suresh et al., Methods in Enzymol. 121:120 (1986); Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992); Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994); 及び米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）。二価以上を有する抗体も目論まれている。例えば、三重特異性抗体を作製できる（Tutt et al., J. immunol. 147:60(1991) を参照されたい）。
【０１２９】
実施態様では、本発明の抗体は抗体断片である。抗体断片の作製に関して多くの技術が知られている。従来から、これらの断片は無傷抗体のタンパク分解消化を用いて生成された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1993); 及び Brennan et al., Science 229:81 (1985) を参照されたい）。抗体断片は組み換え技術によっても産生できる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ又はその他の宿主細胞内で発現されそこから分泌されるので、これらの断片の大量生産が可能となる。このような抗体断片は上記のように抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように線形の抗体であってよく、そして単一特異性又は二重特異性であってもよい。抗体断片の産生のためのその他の技術は当業者が容易に見出せるだろう。
【０１３０】
本発明によると、本発明のポリペプチドに特異的な単鎖抗体の産生に技術を適用することができる（米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。更に、インフルエンザＨＡに対する望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ効果的な同定が可能なＦａｂ発現ライブラリー（Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) を参照されたい）の構築のために方法を適用できる。本発明のポリペプチドに対するイディオタイプを含む抗体断片を、これに限定されないが、（ａ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ'）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ'）２断片のジスルフィド架橋を還元して作製されたＦａｂ断片、（ｃ）抗体分子をパパイン及び還元剤で処理して作製されたＦａｂ断片、及び（ｄ）Ｆｖ断片を包含する当該技術分野の技術によって産生できる。
【０１３１】
特に抗体断片の場合において、血清半減期を増大するために抗体を修飾することが更に望ましい。例えば、抗体断片内の適切な領域を突然変異することによって、再利用（サルベージ）受容体結合エピトープを抗体断片内に取り込むことで、或いはエピトープをペプチドのタグに取り込み、次いで末端に又は中央にある抗体と融合して（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成で）これを達成できる。
【０１３２】
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は２つの共有結合した抗体から成っている。このような抗体は、例えば、標的の免疫細胞を不要な細胞にするように企図されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。架橋剤に関連しているものを包含している、合成タンパク質化学において公知の方法を用いて抗体をインビトロで作製することが目論まれている。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるか或いはチオエーテル結合を形成して免疫毒素を構築できる。この目的に適している試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートを包含する。
【０１３３】
本発明で目論まれている別の修正は、重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインを１つ又はそれ以上のＣＤＲの少なくとも部分置換によって、所望により、部分ネットワーク領域置換及び配列変更によって修正することである。ＣＤＲはフレームワークが由来している抗体として同じクラスの或いは同等のサブクラスの抗体に由来していても、ＣＤＲは異なったクラスの抗体に、好ましくは異なった種由来の抗体に、由来していると推測される。ＣＤＲの全てをドナー可変領域由来の完全ＣＤＲで置き換えて１つの可変ドメインの抗原結合能力を他方へ移す必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性を保持するのに必要なこれらの残基を移すことだけが必要である。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，６９３，７６２号に述べられている説明を考えると、通常の実験を行って、或いは試行錯誤の試験によって、減少した免疫原性を有する機能的な抗体を得ることは、十分当業者の能力の範囲内である。
【０１３４】
可変領域の変更にもかかわらず、当業者は、本発明の改変された抗体は、少なくとも１つ又はそれ以上の定常領域ドメインが欠失しているか、或いはその反対に天然の又は未処理の定常領域から成るほぼ同じ免疫原性の抗体と比較したときに増大した腫瘍局在化又は減少した血清半減期のような望ましい生物化学特性をもたらすように変更した、抗体、又はその免疫反応性断片を包含できることを理解できるだろう。ある実施態様では、改変した抗体の定常領域はヒト定常領域を包含している。本発明に適合する定常領域の修正は、１つ又はそれ以上のドメインにある１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換から成っている。すなわち、本明細書に開示されている改変された抗体は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の修正又は改変を含んでいる。本発明のある実施態様では、１つ又はそれ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している改変された定常領域が目論まれている。ある実施態様では、全てのＣＨ２ドメインが除去されたドメイン欠失構築物又は変異体（ΔＣＨ２構築物）を包含する。ある実施態様では、除かれた定常領域ドメインは、通常は欠失した定常領域によって与えられる分子柔軟性の一部をもたらす、短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）で置き換えられる。
【０１３５】
本発明は更に、本明細書に説明されたキメラ、ヒト化及びヒト抗体、或いはそれらの断片と実質的に類似している変異体及び等価物を包含する。これらは、例えば、同類置換突然変異、すなわち、１つ又はそれ以上のアミノ酸を類似のアミノ酸による置換を含んでいる。例えば、同類置換は、例えば、１つの酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、１つの塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、又は１つの中性アミノ酸を別のアミノ酸でのように、１つのアミノ酸の同一の一般的分類内の別のものによる置換を示す。同類アミノ酸置換によって意図されていることは当該技術分野において周知である。
【０１３６】
本発明の抗体は当該技術分野で公知の方法で、免疫特異的結合についてアッセイできる。用いることができる免疫アッセイは、これに限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光測定、細胞免疫化学、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫測定、プロテインＡ免疫アッセイなどのような技術を用いる、競合及び非競合アッセイ系を包含する。このようなアッセイは日常的なもので当該技術分野でよく知られている（例えば、その全てが参照により本明細書に取り込まれている、Ausbel et al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York を参照されたい）。
【０１３７】
実施態様では、抗体のインフルエンザＨＡに対する免疫特異性はＥＬＩＳＡによって確認される。ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原を作製すること、マイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングすること、酵素物質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合している抗体をウェルに添加すること、一定時間培養すること及び抗原の存在を検出することから成っている。ある実施態様では、抗体を検出可能な化合物と結合してはいないが、その代わりに、インフルエンザＨＡ抗原に対する抗体を認識する第２結合抗体をウェルに添加する。ある実施態様では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされて検出可能な化合物に結合している第２抗体を抗原の添加に続いて、コーティングされたウェウルに添加できる。当業者は検出された信号を増幅するために修正できるパラメータ、並びに当該技術分野で公知のＥＬＩＳＡのその他のバリーションに関して精通しているだろう（例えば、Ausbel et al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York の 11.2.1 を参照されたい）。
【０１３８】
インフルエンザＨＡに対する抗体の結合親和性及び抗体−抗原相互作用のオフ速度は競合的結合アッセイによって確認できる。競合的結合アッセイの１つの例は標識化抗原（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ）、或いはその断片又は変異体を、所定の抗体と、量を増大させている非標識化抗原の存在下で培養すること、それに続く標識化抗原への抗体結合の検出を含んでいる。抗原に対する抗体の親和性及び結合オフ速度はスキャッチャードプロット分析によるデータから確認できる。ある実施態様では、ＢＩＡｃｏｒｅ動力学的分析は、癌幹細胞マーカーに対する抗体の結合オン及びオフ速度を確認するために用いられる。ＢＩＡｃｏｒｅ動力学的分析は、その表面に癌幹細胞マーカー抗原を固定したチップから抗体の結合及び解離を分析することから成っている。
【０１３９】
（インフルエンザ血球凝集素抗体ポリペプチド及びポリヌクレオチド）
本発明は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗体又はその断片を含んでいるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも包含する。
【０１４０】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドをコードする配列のみを含んでいるポリヌクレオチド、並びに更なるコード配列及び／又は非コード配列を含んでいるポリヌクレオチドを包含している。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形状又はＤＮＡの形状であってよい。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み；そして二本鎖又は一本鎖であってよく、そして一本鎖はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってよい。
【０１４１】
本発明は更に、ポリヌクレオチドの変異体、例えば、断片、類縁体、及び誘導体に関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体、又はポリヌクレオチドの非天然変異体であってよい。ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、開示したポリペプチドのコード配列の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。当該技術分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、例えば、ポリペプチドをコードする機能を実質的に変えない、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を有しているポリヌクレオチド配列の代替形態である。
【０１４２】
実施態様では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、宿主細胞からの発現及び分泌に役立つポリペプチド（例えば、細胞からポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）と融合した成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでいてよい。リーダー配列を有しているポリペプチドはタンパク質前駆体であって、宿主細胞によって切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に追加の５'アミノ酸残基を加えたタンパク質前駆体をコードすることもできる。プロ配列を有している成熟タンパク質はタンパク質前駆体であって、タンパク質の不活性形態である。タンパク質前駆体が切断されると、活性な成熟タンパク質が残存する。
【０１４３】
実施態様では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、コードされたポリペプチドを純化する効果があるマーカー配列と融合した成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでいてよい。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合に、マーカーに融合している成熟ポリペプチドの純化をもたらすｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン標識であってよく、或いはマーカー配列は、哺乳動物の宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を用いるときにインフルエンザ血球凝集素から誘導される血球凝集素（ＨＡ）標識であってもよい。更なる標識は、これに限定されないが、カルモジュリン（Calmodulin）標識、ＦＬＡＧ標識、Ｍｙｃ標識、Ｓ標識、ＳＢＰ標識、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｖ５標識、Ｘｐｒｅｓｓ標識、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、Ｓｐｙ標識、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（Biotin Carboxyl Carrier Protein; ＢＣＰ）標識、ＧＳＴ標識、蛍光タンパク質標識（例えば、緑色蛍光タンパク質標識）、マルトース結合タンパク質標識、Ｎｕｓ標識、Ｓｔｒｅｐ−標識、チオレドキシン（thioredoxin）標識、Ｔｃ標識、Ｔｙ標識などを包含する。
【０１４４】
実施態様では、本発明は、本発明のインフルエンザＨＡ抗体又は抗体断片を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、或いは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有している単離された核酸分子を提供する。
【０１４５】
ポリヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチド当り５つの点突然変異を包含できるということを除いて、少なくとも、例えば、参照ヌクレオチド配列と９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを表す。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドを得るために、参照配列内の最大５％のヌクレオチドを欠失又は他のヌクレオチドで置換でき、或いは参照配列内の総ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドを参照配列に挿入できる。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列のアミノ−又はカルボキシ−末端部分に、又はこれら末端の間のどこかに、参照配列内のヌクレオチド間に個々に、又は参照配列内の１つ又はそれ以上の連続基内に組み入れて起こり得る。
【０１４６】
実際に、ある特定の核酸分子が参照配列と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、そしてある実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）のような公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り確認できる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の最大の相同断片を見出すために、Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics 2: 482 489 )1981) のローカルホモロジーアルゴリズムを用いる。特定の配列が本発明による参照配列と、例えば、９５％同一であるか否かを確認するためにＢｅｓｔｆｉｔ又はその他の配列比較プログラムを用いるときは、同一性パーセントを参照ヌクレオチド配列の全長に渡って計算できるように、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の最大５％の相同性におけるギャップが許容されるようにパラメータを設定する。
【０１４７】
ポリヌクレオチド変異体はコード領域、非コード領域、又は両方に改変を含んでいる。ある実施態様では、ポリヌクレオチド変異体はサイレント置換、付加、又は欠失を生じる改変を含んでいるが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変えない。ある実施態様では、ヌクレオチド変異体は、遺伝コードの重縮に起因するサイレント置換によって産生する。ポリヌクレオチド変異体多種の理由、例えば、特定宿主のためにコドン発現を最適化するため（ヒトｍＲＮＡ内のコドンをＥ．ｃｏｌｉのような細菌性宿主が好むものに変える）によって産生する。
【０１４８】
本発明のポリペプチドは、インフルエンザＨＡに対する抗体又はその断片を含んでいる組み換えポリペプチド、天然のポリペプチド、又は合成ポリペプチドであってよい。本発明のいくつかのアミノ酸配列はタンパク質の構造又は機能に大きな影響を与えずに変異できることは当該技術分野で認識されている。従って、本発明は更に、十分な活性を示し、或いはインフルエンザＨＡに対するヒト化抗体、又はその断片の領域を包含しているポリペプチドの変異を包含している。このような突然変異体は欠失、挿入、逆位、反復、及び類型置換（type substitution）を包含する。
【０１４９】
ポリペプチド及び類縁体はタンパク質の通常部位ではない追加の化学部分を含むように更に修正できる。これらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期又は吸収を改善できる。この部分はタンパク質の望ましい副作用などを減少又は取り除くこともできる。これらの部分の概説は Remington’s Pharmaceutical Science, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000) に見出すことができる。
【０１５０】
本明細書に記載されている単離されたポリペプチドは当該技術分野で公知の適切な方法の何れかによって作製できる。このような方法は直接タンパク質合成方法から、単離されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築すること及び適切な形質変換宿主内でこれらの配列を発現することまで及ぶ。ある実施態様では、ＤＮＡ配列は、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離又は合成する組み換え技術を用いて構築する。任意で、配列に部位特異的突然変異によって突然変異を起こしてそれらの機能的類縁体をもたらしてもよい。例えば、Zoeller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) を参照されたい。
【０１５１】
実施態様では、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いる化学合成によって構築することができる。このようなオリゴヌクレオチドは所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計して、そこで目的の組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞が好むコドンを選択できる。単離された目的のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために標準的な方法を適用できる。例えば、全アミノ酸配列を逆翻訳された遺伝子を構築するために用いることができる。更に、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有しているＤＮＡオリゴマーを合成できる。例えば、所望ポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成した後ライゲートできる。個々のオリゴヌクレオチドは一般に、相補的構築のために５'又は３'突出部を含んでいる。
【０１５２】
構築されると（例えば、合成、部位特異的突然変異誘発、又は他の方法で）、特定の単離された目的のポリペプチドは発現ベクター内に挿入されて、任意で所望の宿主の発現に適している発現制御配列と操作可能に結合される。適切な構築は、ヌクレオチド配列、制限酵素地図、及び適切な宿主における生物活性ポリペプチドの発現によって確認できる。当該技術分野で周知のように、宿主内の形質転換遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子を、選択された発現宿主において機能する転写及び翻訳発現制御配列と操作可能に結合できる。
【０１５３】
インフルエンザＨＡ抗体をコードするＤＮＡを増幅して発現するために組み換え発現ベクターが用いられる。組み換え発現ベクターは、インフルエンザＨＡ抗体をコードする合成の又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有している複製可能なＤＮＡ構築物、又は哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子由来の適切な転写又は翻訳調節エレメントに操作可能に結合している生物学的に等価の類縁体である。転写ユニットは一般に、（１）遺伝エレメント又は遺伝子発現に調節の役割を有しているエレメント（例えば、転写プロモーター又はエンハンサー）、（２）ｍＲＮＡ内に転写されてタンパク質に翻訳される構造又はコード配列、及び（３）以下に詳述するような、適切な転写及び翻訳開始又は終止配列の構築物から成っている。このような調節エレメントは転写を制御するオペレーター配列を包含できる。宿主における複製する能力は、一般に複製の起点によってもたらされ、そして形質転換細胞の認識を促進するための選択遺伝子を更に組み込むことができる。ＤＮＡ領域を、これらが互いに機能的に関連したときに操作可能に結合される。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に関するＤＮＡは、それがポリペプチドの発現に関与する前駆体として発現されるならポリペプチドに関するＤＮＡに操作可能に結合し；プロモーターは、それが配列の転写を制御するならコード配列に操作可能に結合し；或いはリボソーム結合部位は、それが複写を可能にするように位置付けられているならコード配列に操作可能に結合している。一般に、操作可能な結合は、隣接していることを意味して、分泌リーダーの場合は、隣接して解読フレーム内にあることを意味する。酵母発現系で用いるように意図されている構造エレメントは、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を許容するリーダー配列を含んでいる。また、リーダー又は輸送配列なしで組み換えタンパク質が発現される場合には、Ｎ−末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は任意に、発現された組み換えタンパク質から次に切断されて最終産物をもたらす。
【０１５４】
発現制御配列及び発現ベクターの選択は宿主の選択次第である。多種多様の発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主のために有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列から成るベクターを包含する。細菌性宿主のために有用な発現ベクターは、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体を含んでいる、大腸菌由来のプラスミド、Ｍ１３及びフィラメント状一本鎖ＤＮＡファージのような、広い宿主域プラスミドのような、公知の細菌性プラスミドを包含する。
【０１５５】
ポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞は、プロモーターの制御下における原核生物、酵母、昆虫、又は適切な高等真核生物を包含する。原核生物は、グラム陰性又はグラム陽性細菌、例えば、大腸菌又はバチルスを包含する。高等真核生物細胞は、哺乳動物起源の確立した細胞株を包含する。無細胞翻訳システムも利用できる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主と用いるための適切なクローニング及び発現ベクターは当該技術分野で周知である（Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Mannual Elsvier, N.Y., 1985 を参照されたい）。
【０１５６】
多種の哺乳動物又は昆虫細胞培養系も組み換えタンパク質を発現するために有利に利用される。哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質は一般に正確に折り畳まれており、適切に改変されおり、そして完全に機能的であるので実施し得る。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、Gluzman (Cell 23:175, 1981)によって記載された、サル肝臓細胞のＣＯＳ−７株、及び、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株を包含する、適切なベクターを発現できるその他の細胞株を包含する。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に結合した適切なプロモーターとエンハンサー、及び必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終止配列のような、その他の５'又は３'隣接非転写領域、及び５'又は３'隣接非翻訳領域のような非転写エレメントから成っていてもよい。昆虫細胞内で異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) によって総括されている。
【０１５７】
形質転換した宿主によって産生されたタンパク質は適切な方法で精製できる。このような標準的な方法は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性及び粒度カラムクロマトグラフィーなど）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質精製のためのその他の標準技術の何れかを包含する。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのような親和性標識をタンパク質に付加して、適切な親和性カラムを通過させることによって精製が容易に行われる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学のような技術を用いて物理学的に特性化もできる。
【０１５８】
例えば、組み換えタンパク質を培養培地内に分泌するシステム由来の上澄液を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン又はミリポア ペリコン限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮できる。濃縮工程に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用できる。また、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有しているマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はタンパク質の精製に通常用いられている別の種類であってよい。また、陽イオン交換工程を利用できる。適切な陽イオン交換体はスルホプロピル又はカルボキシメチル基を含有している多種の不溶性マトリックスを包含する。最終的に、疎水性ＨＰ―ＬＰＣ媒体、例えば、ペンダントメチル又は別の炭化水素基を有しているシリカゲルを用いる、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＬＰＣ）を癌幹細胞タンパク質−Ｆｃ組成物を更に精製するために用いることができる。前記精製工程の幾つか又は全てを、様々な組み合わせで、均質な組み換えタンパク質を提供するために用いることもできる。
【０１５９】
細菌培養物中に産生される組み換えタンパク質は、例えば、細胞ペレットから最初の抽出、それに続く１回又はそれ以上の濃縮、脱塩、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離できる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。組み換えタンパク質の発現に用いた微生物細胞を、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来法によって破砕できる。
【０１６０】
（治療方法）
本発明はインフルエンザ感染を治療又は予防する方法を提供する。
【０１６１】
態様では、本発明は、それを必要としている対象のインフルエンザ感染を治療又は予防する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は、感染と関連する症状を減少すること又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。
【０１６２】
態様では、本発明は、それを必要としている対象のインフルエンザウイルスを中和する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルスを調和し、それによって感染と関連する症状を減少すること又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。
【０１６３】
態様では、本発明はそれを必要としている対象のインフルエンザウイルス感染の確立方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルス感染の確立を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防する。
【０１６４】
態様では、本発明はそれを必要としている対象のインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害し、それによって感染に関連する症状を減少又は緩和する。
【０１６５】
態様では、本発明はインフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法はインフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防するか、或いは感染に関連する症状を減少又は緩和する。
【０１６６】
態様では、本発明はインフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法はインフルエンザ感染を有しているか、又は進展の危険性がある細胞を、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物と接触させることを含んでいる。方法はインフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する。
【０１６７】
上記態様の何れかにおいて、インフルエンザはＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、又はヒト適合Ｈ５株であってよい。
【０１６８】
上記態様の何れかにおいて、対象はインフルエンザ感染症に罹っているか又は発症する危険性がある。関連する実施態様では、対象は哺乳動物（例えば、ヒト）である。関連する実施態様では、対象はウイルス感染症に罹りやすい（例えば、妊婦、若年者、乳幼児、高齢者）。
【０１６９】
上記態様又は実施態様の何れかにおいて、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは医薬組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、又は吸引によって投与される。
【０１７０】
（医薬組成物）
本発明は、本明細書に記載されている新規なインフルエンザＨＡ抗体を含んでいる医薬組成物を提供する。実施態様では、医薬組成物は薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含んでいて、これは組成物を投与されている対象に有害な免疫応答の産生をそれ自体が誘発しない任意の医薬を含有し、そしてこれは過度の毒性なしで投与できる。本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される」は、哺乳動物、そして特にヒトにおける使用について、連邦政府又は州政府の規制官庁によって承認された、或いは米国薬局方、欧州薬局方又はその他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物はインフルエンザ感染を治療及び／又は予防するために有用である。
【０１７１】
薬学的に許容される担体、希釈剤及びその他の賦形剤の詳細な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (17th ed., Mack Publishing Company) 及び Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Lippincott Williams & Wilkins) にあり、これらは参照により本明細書に取り込まれている。医薬組成物の製剤は投与方法に適合していなければならい。実施態様では、医薬組成物はヒトへの投与に適していて、無菌、非粒子性そして／又は非発熱性にできる。
【０１７２】
薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤は、これに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、無菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせを包含する。
【０１７３】
湿潤剤、乳化剤、及びラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような、滑沢剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味及び芳香剤、保存剤、及び抗酸化剤も組成物に含ませることができる。
【０１７４】
薬学的に許容される抗酸化剤の例は、これに限定されないが：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような、水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没色子酸プロピル、α−コフェロールなどのような、脂溶性抗酸化剤；及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような、金属キレート剤：を包含する。
【０１７５】
実施態様では、医薬組成物は、再構築に適している凍結乾燥粉末のような、固体形態、液体溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放製剤、又は粉末として提供される。
【０１７６】
実施態様では、医薬組成物は、液体剤形、例えば、医薬組成物中の活性成分の量及び濃度を示している封入容器中で供給される。関連する実施態様では、医薬組成物の液体剤形は密封されている容器中で供給される。
【０１７７】
本発明の医薬組成物を製剤化する方法は従来の方法で当該技術分野において周知である（Remington and Remington’s を参照されたい）。当業者は所望の特性（例えば、投与経路、バイオセーフティー、及び放出プロフィール）を有している医薬組成物を容易に製剤化できる。
【０１７８】
医薬組成物を製造する方法は、活性成分を薬学的に許容される担体及び、任意に、１つ又はそれ以上の補助成分と一体化させる段階を含んでいる。医薬組成物は活性成分を液体担体、又は微粉化した固体担体、又は両方と均一にそして密に一体化させ、必要に応じて、その生成物を成形することによって製造できる。多層剤形の製造を含む、医薬組成物を製造する更なる手法は、Ansel’s Pharmaceutical Dosage forms and Drug Delivery Systems (9th ed., Lippincott Williams and Wilkins) に記載されていて、これは参照により本明細書に取り込まれている。
【０１７９】
（送達方法）
本発明の医薬組成物は、経口及び非経口（例えば、局所、経皮、又は注射で）によって対象に投与できる。このような投与方法及びそこで用いるための適切な医薬組成物を製造する方法は、Gibaldi’s Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care (1st ed., American Society of Health-System Pharmacists) に記載されていて、これは参照により本明細書に取り込まれている。
【０１８０】
実施態様では、医薬組成物は固体製剤で経口投与される。
【０１８１】
経口投与に適している医薬組成物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、ロセンジ（通常は蔗糖及びアカシアガム又はトラガカントガムである風味付け基剤を用いる）、粉剤、顆粒剤の形態で、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、又は水中油型又は油中水型液体乳剤として、又はエリキシル剤又はシロップ剤として、又はトローチ（ゼラチンとグリセリン、又は蔗糖とアカシアガムのような内部基剤を用いる）として、そして／又は洗口液などとして投与でき、それぞれは、活性成分として、所定量の本明細書に記載された化合物、その誘導体、又はその薬学的に許容される塩又はプロドラッグを含んでいる。活性成分はボーラス、舐剤、又はペーストとしても投与できる。
【０１８２】
経口投与のための固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉剤、顆粒剤など）においては、活性成分を、クエン酸ナトリウム又はリン酸水素カルシウムのような、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤、及び／又は以下の何れか：（１）澱粉、乳糖、蔗糖、ブドウ糖、マンニトール、及び／又はケイ酸のような、充填剤又は増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、蔗糖及び／又はアカシアガムのような、結合剤；（３）グリセロールのような、保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムのような、崩壊剤；（５）パラフィンのような、溶液抑制剤；（６）四級アンモニウム化合物のような、吸収促進剤；（７）例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；（８）カオリン及びベントナイト粘度のような、吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物のような滑沢剤；及び（１０）着色剤：と混合する。カプセル、錠剤、及びピルの場合は、医薬組成物は緩衝剤も含むことができる。ソフト及びハード充填ゼラチンカプセル内に増量剤を、そしてラクトース又は乳糖、並びに高分子量のポリエチレングリコールなどを用いて同じタイプの固体組成物も製造できる。
【０１８３】
錠剤は、任意に１つ又はそれ以上の補助成分とともに、圧縮又は成形によって作られる。圧縮錠は結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、及び／又は分散剤を用いて製造できる。成形錠は不活性液体希釈剤で湿潤した粉末状の活性成分を適切な機械の中で成形することによって作製できる。
【０１８４】
錠剤及び、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒剤のような、その他の固体剤形は任意に、割線を入れるか或いは、腸溶コーティング及び当該技術分野で周知のその他のコーティングのような、コーティング又は外皮を用いて調製できる。
【０１８５】
医薬組成物は、例えば、所望の放出プロフィールをもたらす広い割合のヒドロキシメチルセルロース、その他の高分子物質、リポソーム及び／又はミクロスフェアを用いて、その活性成分の遅れた、延長された、又は制御された放出をもたらすようにも製剤化できる。医薬組成物は任意に乳白剤も含むことができて、活性成分を、任意に遅延的に、胃腸管のある特定の部分のみに、又は優先的に放出する組成物にできる。包埋組成物の例は、重合物質及びワックスを包含している。活性成分を、適切な場合は当該技術分野で周知の１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤（例えば、Remington and Remington’s を参照されたい）と共に、マイクロカプセル化した剤形にもできる。
【０１８６】
医薬組成物は、例えば、細菌保持フィルターで濾過することによって、或いは滅菌水、又は使用直前に滅菌注射用媒体に溶解できる固体組成物の形態の殺菌剤を取り込むことによって殺菌できる。
【０１８７】
実施態様では、医薬組成物は液体剤形で経口投与される。
【０１８８】
活性成分の経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤のような、当該技術分野で通常用いられている不活性希釈剤及び、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物のような、乳化剤を含有できる。不活性希釈剤に加えて、液体の医薬組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、香味、着色、芳香及び保存剤などのような、補助剤を含有できる。
【０１８９】
懸濁液は、活性成分に加えて、これに限定されないが、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天及びトラガカントガム、並びにこれらの混合物のような、懸濁化剤を含有できる。
【０１９０】
実施態様では、医薬組成物は、局所投与、経皮投与、注射によるような、非経口方法で投与される。関連する実施態様では、医薬組成物は、注射、点滴又は移植（例えば、静脈内、筋肉内、関節内、皮下など）によって経口投与される。
【０１９１】
非経口用の組成物は単位剤形、例えば、アンプル又は数用量を含有していて、適切な保存剤を添加できる、バイアルで存在できる。このような組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、輸液用器具、移植用の送達用器具の形態であってよく、或いは使用前に水又はその他の適切な媒体と再構築する乾燥粉末として存在できる。エタノールのような、１つ又はそれ以上の補助賦形剤も使用できる。活性成分の他に、組成物は適切な非経口投与で許容される担体及び／又は賦形剤を含有できるか、或いは活性成分を制御放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに取り込むことができる。更に、組成物は懸濁化、可溶化、安定化、ｐＨ調節剤、及び／又は分散剤も含有することができる。
【０１９２】
医薬組成物は滅菌注射の形態にすることができる。このような組成物を製造するために、活性成分を非経口投与で許容される液体賦形剤に溶解又は懸濁する。例示的な賦形剤及び溶媒は、これに限定されないが、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム、又は適切な緩衝剤を加えて適切なｐＨに調節した水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液及び等張の塩化ナトリウム溶液を包含する。医薬組成物は１つ又はそれ以上の保存剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル、ｎ−プロピルも含有できる。溶解性を改善するために、溶解増強剤又は可溶化剤を加えることができ、或いは溶媒は１０〜６０ｗ／ｗ％のプロピレングリコールなどを含有することができる。
【０１９３】
医薬組成物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される滅菌等張水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳剤、或いは使用直前に滅菌注射用の溶液又は分散液に再構築できる滅菌粉末を含有できる。このような医薬組成物は抗酸化剤；緩衝剤；静菌剤；製剤を対象とする被投与者の血液と等張にする、溶質；懸濁化剤；増粘剤；保存剤などを含有することができる。
【０１９４】
本発明の医薬組成物で使用できる、適切な水性又は非水性単体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような）、及びこれらの適切な組み合わせ、オリーブ油のような、植物油、及びオレイン酸エチルのような、注射可能な有機エステルを包含する。例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いて、分散液の場合は必須の粒子径を保持して、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保持できる。
【０１９５】
ある実施態様では、活性成分の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射から化合物の吸収を遅らせることが好ましい。これは、難水溶性の結晶又はアモルファスの液体懸濁液を用いることによって達成できる。活性成分の吸収は、結晶の大きさ及び結晶形によって決めることができる、その溶解速度によって決まる。あるいは、非経口投与される活性成分の遅延吸収は化合物を油性媒体に溶解又は懸濁することによって達成される。更に、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる物質の封入によってもたらすことができる。
【０１９６】
放出制御非経口化合物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁気ミクロスフェア、油性懸濁液、乳剤の形態にでき、或いは活性成分を生体適合性担体（複数を含む）、リポソーム、ナノ粒子、移植片又は輸液用容器に取り込むことができる。
【０１９７】
ミクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの製造に用いる物質は、ポリグラクチン、ポリ−（シアノアクリル酸イソブチル）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）及びポリ（乳酸）のような、生物分解性／生体内分解性ポリマーを包含する。
【０１９８】
放出制御非経口製剤を製剤化するときに用いることができる生体適合性担体は、デキストランのような炭水化物、アルブミンのようなタンパク質、リポタンパク質又は抗体を包含する。
【０１９９】
移植片に用いるための物質は、非生物分解性、例えば、ポリジメチルシロキサン、又は例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グルコール酸）又はポリ（オルエステル）のような生物分解性であってよい。
【０２００】
実施態様では、活性成分（複数を含む）はエアゾールで投与される。これは、化合物を含有している水性エアゾール、リポソーム製剤、又は固体粒子を製造することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液を用いることができる。医薬化合物は、音波ネブライザーを用いて投与でき、これは化合物の分解をもたらす、せん断への暴露を最小にできる。
【０２０１】
通常、水性エアゾールは、通常の薬学的に許容される担体及び安定化剤と共に活性成分（複数を含む）の水性溶液又は懸濁液を処方することによって作られる。担体及び安定化剤は特定の化合物によって異なるが、一般に、非イオン性界面活性剤（ツイーン類、プルロニック類、ポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル類、オレイン酸、レクチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝剤、糖又は糖アルコールを包含する。エアゾールは通常、等張溶液から製造される。
【０２０２】
活性成分（複数を含む）の局所又は経皮投与用の剤形は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、貼付剤及び吸入剤を包含する。活性成分（複数を含む）を薬学的に許容される担体と、そして必要に応じて保存剤、緩衝剤、又は高圧ガスの何れかと滅菌条件下で混合することができる。
【０２０３】
本発明で用いるのに適している経皮貼付剤は、Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives (Marcel Dekker Inc., 1989) 及び米国特許第４，７４３，２４９号、同第４，９０６，１６９号、同第５，１９８，２２３号、同第４，８１６，５４０号、同第５，４２２，１１９号、同第５，０２３，０８４号に開示されており、これらは参照により本明細書に取り込まれている。経皮貼付剤は、経陰嚢貼付剤を含む、当該技術分野で周知の経皮貼付剤の何れかであってもよい。このような経皮貼付剤の医薬化合物は、１つ又はそれ以上の当該技術分野で周知の吸収促進剤又は皮膚浸透促進剤を含むことができる（例えば、米国特許第４，３７９，４５４号及び同第４，９７３，４６８号を参照されたい。これらは参照により本明細書に取り込まれている）。本発明で用いるための経皮治療システムはイオントフォレシス、拡散、又はこれら２つの効果の組み合わせに基づくことができる。
【０２０４】
経皮貼付剤は活性成分（複数を含む）を身体への制御送達をもたらすという更なる利点を有している。このような剤形は、活性成分（複数を含む）を適切な媒体に溶解又は分散することによって作られる。皮膚を通過する活性成分の流れを増大するために吸収促進剤を使用することもできる。このような流れの速度は、速度制御膜を供給するか、或いは活性成分（複数を含む）をポリマーマトリックス又はゲルに分散するかの何れかによって制御できる。
【０２０５】
このような医薬組成物はクリーム、軟膏、ローション、リニメント、ゲル、溶液、懸濁液、スティック、スプレー、ペースト、硬膏及び経皮薬剤送達システムのその他の種類の形態にすることができる。組成物は、乳化剤、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、及び皮膚保護材のような薬学的に許容される担体又は賦形剤も含有することができる。
【０２０６】
乳化剤の例は、これに限定されないが、天然のガム、例えば、アカシアガム、トラガカントガム；天然のリン脂質、例えば、大豆レシチン；及びモノオレイン酸ソルビタン誘導体を包含する。
【０２０７】
抗酸化剤の例は、これに限定されないが、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、及びシステインを包含する。
【０２０８】
保存剤の例は、これに限定されないが、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピルのようなパラベン、及び塩化ベンザルコニウムを包含する。
【０２０９】
保湿剤の例は、これに限定されないが、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及び尿素を包含する。
【０２１０】
浸透促進剤の例は、これに限定されないが、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−ピロリドン及びその誘導体、テトラヒドロフルフリルアルコール、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノラウレート又はメチルラウレートとのプロピレングリコール、ジエチレングリコールモノエチル又はモノメチルエーテル、オイカリプトール、レシチン、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標）、及びＡｚｏｎｅ（登録商標）を包含する。
【０２１１】
キレート剤の例は、これに限定されないが、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸及びリン酸を包含する。
【０２１２】
ゲル形成剤の例は、これに限定されないが、カーボポール、セルロース誘導体、ベントナイト、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンを包含する。
【０２１３】
活性成分（複数を含む）に加えて、本発明の軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、動物性又は植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物のような、賦形剤を含有できる。
【０２１４】
粉末及びスプレーは、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素類、及びブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素類のような、通常の噴霧剤を更に含有できる。
【０２１５】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生物分解性ポリマー中で本発明化合物のマイクロカプセル被包物質を結成して作製できる。化合物のポリマーに対する比率によって、そして用いる特定のポリマーの特質によって、化合物放出の速度を制御できる。その他の生物分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を包含する。デポー注射製剤は、薬剤を体組織に適合するリポソーム又はマイクロエマルジョンに封入することによっても製造できる。
【０２１６】
皮下移植片は当該技術分野において周知であって本発明での使用に適している。皮下移植法は非刺激性であって機械的に弾力性があることが好ましい。移植片はマトリックス型、貯留槽型、又はこれらの混合型であってよい。マトリックス型のデバイスでは、担体物質は多孔性又は無孔性、固体又は半固体、そして活性化合物（複数を含む）に対して透過性又は非透過性であってよい。担体物質は生物分解性であっても、或いは投与後に徐々に失われてもよい。ある例では、マトリックスは非分解性ではなく、担体物質のためのマトリックスを介する活性化合物の拡散に依存して分解する。それに代わる皮下移植法は貯留デバイスを利用し、そこでは活性化合物（複数を含む）は速度制御膜、例えば、成分濃度に無関係な（ゼロ次速度過程を有している）膜に取り囲まれている。速度制御膜に取り囲まれているマトリックスから成るデバイスも使用に適している。
【０２１７】
貯蔵槽型及びマトリックス型デバイスの両方は、Ｓｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）のような、ポリジメチルシロキサン、又はその他のシリコンゴムのような物質を含有できる。マトリックス物質は不溶性のポリプロピレン、ポリエチレン、塩化ポリビニル、酢酸エチルビニル、ポリスチレン及びポリメタアクリレート、並びにパルミトステアリン酸グリセロールのグリセロールエステル、ステアリン酸グリセロール、及びベヘン酸グリセロール型であってよい。物質は疎水性又は親水性ポリマーであってよくそして任意に可溶化剤を含有している。
【０２１８】
皮下移植デバイスは適切なポリマー、例えば、米国特許第５，０３５，８９１号及び同第４，２１０，６４４号（これらは参照により本明細書に取り込まれている）に記載されているようなものの何れかと作られた徐放性カプセルであってよい。
【０２１９】
一般に、薬剤化合物の放出及び経皮浸透の速度制御をもたらすために少なくとも４つの異なる方法を適用できる。これらの方法は：膜調整システム、粘着性拡散制御システム、マトリックス分散型システム、及びマイクロ貯蔵槽システムである。当然のことながら、経皮及び／又は局所用組成物はこれらの方法の適切な組み合わせを用いて得ることができる。
【０２２０】
膜調整システムでは、活性成分は、金属プラスチックラミネートのような薬剤不浸透性ラミネート、及び微孔性又は無孔性ポリマー膜、例えば、エチレン−ビニル酢酸共重合体のような速度制御ポリマー膜から成形された底の浅い区画に完全に封入されている貯蔵槽内に存在している。活性成分は速度制御ポリマー膜を介して放出される。薬剤貯蔵槽内で、活性成分は固体ポリマーマトリックス内に分散されるか、或いはシリコン溶液のような濾過不可能な、粘性のある液体媒体中に懸濁する。ポリマー膜の外部表面上に、粘着性ポリマーの薄い層を付けて経皮システムと皮膚表面の密接な接触をもたらす。粘着性ポリマーは、低刺激性で活性医薬物質と適合性があるポリマーが好ましい。
【０２２１】
粘着性拡散制御システムでは、活性成分の貯蔵槽は活性成分を直接粘着性ポリマーに分散し、次いで、例えば、溶媒を投入して、活性成分を含有している粘着剤を、実質的に薬剤不浸透性金属プラスチック裏打ちに塗布して薄い薬剤貯蔵槽の層を形成する。
【０２２２】
マトリックス分散型システムは、活性成分の貯蔵層を、活性成分を親水性の又は親水性ポリマーのマトリックス内に実質的に均一に分散することによって形成したということが特徴である。次いで、薬剤を含有しているポリマーを実質的に明確に定義された表面積及び制御された厚さを有する円盤型に形成する。粘着性ポリマーを円周に沿って塗り、円盤の周りに接着剤のストリップを形成する。
【０２２３】
マイクロ貯蔵槽システムは、貯蔵槽とマトリックス分散型システムの組み合わせと考えられる。この場合、活性成分の貯蔵槽は固体薬剤を初めに水溶性ポリマーの水性溶液に懸濁して、次いで、薬剤懸濁液を脂溶性のポリマーに分散して薬剤貯蔵槽の多数の顕微鏡的球体を形成する。
【０２２４】
上記の制御放出、延長放出、及び持続放出組成物は何れも、活性成分を約３０分〜約１週間、約３０分〜約７２時間、約３０分〜約２４時間、約３０分〜約１２時間、約３０分〜６時間、約３０分〜約４時間、及び約３時間〜約１０時間活性成分を放出するように製剤化できる。実施態様では、医薬組成物を対象に投与した後、活性成分（複数を含む）の有効濃度を対象内に４時間、６時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間又はそれ以上持続した。
【０２２５】
（用量）
本明細書に記載されている薬剤を医薬としてヒト及び動物に投与するときは、これらそれ自体又は活性成分を薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と組み合わせて含有している医薬組成物として投与することができる。
【０２２６】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベル及び経時変化は、患者に対する毒性なしで、特定の患者、組成物及び投与方法に対して望ましい治療応答を達成するのに有効である活性成分の量が得られるように変えることができる。一般に、本発明の薬剤又は医薬組成物は、インフルエンザ感染に関連している症状を減少又は緩和するのに十分な量が投与される。
【０２２７】
例示的な用量範囲は、１日当り０．０１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１日当り０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、１日当り１ｍｇ〜１００ｍｇ、１日当り１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１日当り１ｍｇ〜１０ｍｇ、及び１日当り０．０１ｍｇ〜１０ｍｇを包含する。薬剤の好ましい用量は、患者が許容できて重大な又は受け入れがたい副作用の発症がない最大値である。実施態様では、薬剤は１日に体重１キログラム当り約１０マイクログラム〜約１００ｍｇ、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、又は約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で投与される。
【０２２８】
実施態様では、医薬組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇのように１〜１０ｍｇの範囲の量で薬剤を含んでいる。
【０２２９】
実施態様では、治療有効量は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５０−１００μｇ／ｍｌの薬剤の血清濃度を生じる。医薬組成物は一般に、１日に体重１キログラム当り約０．００１ｍｇ〜約２０００ｍｇの化合物の用量を提供しなければならない。例えば、ヒト患者への全身投与の用量は、１〜１０μｇ／ｋｇ、２０〜８０μｇ／ｋｇ、５〜５０μｇ／ｋｇ、７５〜１５０μｇ／ｋｇ、１００〜５００μｇ／ｋｇ、２５０〜７５０μｇ／ｋｇ、５００〜１０００μｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ、７５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、又は２０００ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。薬剤の単位用量剤形は化合物又は単位用量剤形当りの必須成分の組み合わせの約１ｍｇ〜約５０００ｍｇ、例えば、約１００〜約２５００ｍｇを提供するように製造される。
【０２３０】
実施態様では、薬剤の約５０ｎＭ〜１μＭを対象に投与する。関連する実施態様では、約５０〜１００ｎＭ、５０〜２５０ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、２５０〜５００ｎＭ、２５０〜７５０ｎＭ、５００〜７５０ｎＭ、５００ｎＭ〜１μＭ又は７５０ｎＭ〜１μＭの薬剤を対象に投与する。
【０２３１】
有効量の決定は、特に本明細書に提供されている詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、薬剤の効果的な或いは有効な量は、最初に薬剤の低用量を投与すること、次いで投薬量又は１回用量を、最小の又は受容可能な毒性副作用を伴う、望ましい効果（例えば、減少したインフルエンザ感染に関連している症状）が治療した対象において観察されるまで、徐々に増大して決定される。本発明の医薬化合物の投与のための適切な用量及び服薬計画を決定するために適用可能な方法は、例えば、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition,  McGraw-Hill 2005, 及び Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005) に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に取り込まれている。
【０２３２】
（併用療法）
本明細書に記載されている薬剤及び医薬組成物はその他の治療用分子と併用しても投与できる。治療用分子はインフルエンザ感染を治療するために用いられる任意の化合物であってよい。このような化合物の例は、これに限定されないが、インフルエンザウイルス産生を減少する抑制性核酸、抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、オセルタミビルなど）、毒素、及びインフルエンザ感染に関連する症状を減少する薬剤（例えば、抗炎症剤）を包含する。
【０２３３】
インフルエンザＨＡ抗体は、追加の治療薬剤の投与前、投与中、又は投与後に投与できる。実施態様では、抗体は、追加治療薬剤の最初の投与の前に投与する。実施態様では、抗体は、追加治療薬剤の最初の投与の後（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日又はそれ以上）に投与する。実施態様では、抗体は、追加治療薬剤の最初の投与と同時に投与する。
【０２３４】
対象に投与される治療薬剤の量は担当医又は獣医によって容易に決定できる。一般に、抗体及び追加治療薬の有効又は効果量は、一方又は両方の活性薬剤の低用量を最初に投与し、次いで、最小の中毒性の副作用で又は副作用なしで、所望の効果が観察される（例えば、減少したインフルエンザ感染症状）まで投薬量又は１回用量を徐々に増大することによって、決定される。本発明の併用投与のための適切な用量及び投与計画を決定するために適用可能な方法は、例えば、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition., 上記、及び Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, 上記、に記載されている。
【０２３５】
（キット）
本発明は、インフルエンザ感染を治療又は予防する；インフルエンザウイルスを中和する；インフルエンザウイルス感染の構築を阻害する；インフルエンザ感染の伝播を阻害する；並びにインフルエンザウイルスの細胞内侵入を阻害するためのキットを提供する。実施態様では、キットは本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の薬剤又は医薬組成物を含んでいる。実施態様では、キットは使用説明書を提供する。使用説明書は本明細書に記載されている方法の何れかと関連している。関連する実施態様では、説明書はインフルエンザウイルスを治療又は予防するために薬剤（複数を含む）及び医薬組成物（複数を含む）を用いることに関連している。本発明のこの態様によるキットは、１つ又はそれ以上の収容手段（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなど）をその中に厳重に閉じ込めて有している運搬手段（例えば、箱、ボール箱、チューブなど）を含んでいてもよい。実施態様では、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する行政機関が規定する書式の通知書を提供し、この通知書はキット及びその中の成分のヒトに対する製造、使用及び販売の行政機関による承認を反映している。
【実施例】
【０２３６】
当然のことながら、本発明はここに記載されている実施例に限定して解釈してはならず；むしろ、本発明は本明細書で提供された全ての適用及び当業者の技術範囲にある均等な改変の全てを包含していると解釈すべきである。
【０２３７】
実施例１：広域中和抗体のクローン系統
２００７三価不活性化ワクチン（ＴＩＶ）（Liao, H.X. et al. J. Virol. Methods 158:171-179 (2009)）でワクチン接種１週間後の対象から採取した、末梢血単核細胞からＲＴ／ＰＣＲによって、再配列されたＩＧ ＶＨ及びＶＬ遺伝子を単離した。再配列された遺伝子をシークエンシングして検出したクローン系統の中から、３組のクローン（ｍＡＢｓＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７）を図１Ａに示した。抗体ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７のクローン系統の未変異共通祖先（ＵＣＡ）の推測配列は、グリシン又はアラニンの何れかであるだろう、重鎖の９９位を除いて、はっきりしている。図１Ｂは各抗体のＵＣＡに対するアミノ酸配列のアライメントを示す。３つの抗体全てはワクチン（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６）に存在しているＨ１血球凝集素（ＨＡ）にほぼ同一の親和性で結合する；ＵＣＡはより弱く結合する。
【０２３８】
実施例２：中和活性の幅
ＣＨ６５の重鎖はＵＣＡとはその可変領域の１２個の位置で；及びその軽鎖の６個の位置で異なっている。ＣＨ６５ ＩｇＧ１及びそのＦａｂは一過性トランスフェクションによって２９３Ｔ細胞内で発現されて以下に記載するようにして精製される。１９７７年、１９９１年及び１９９５年を含む、過去３０年に単離されたＨ１の大パネルに対して中和を試験して、ひときわ広い効果を観察した（表１）。ＣＨ６７もこのパネルの一部に対して試験した。
【０２３９】
【表１】
2014524750.tif 000003
【０２４０】
抗体は、２１年間の抗原ドリフトを越えて、１９８６年に早くも単離されたＨ１Ｎ１を中和した。予想通り、これは、２００７ワクチンのＨ１成分である、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６を中和した。試験した３６株のうち、２００９パンデミック株、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１及びＡ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７を含む、６株のみを中和できなかった。ＣＨ６７抗体は同様な幅を有している；これは２００９パンデミック株も中和した（弱く）。ＣＨ６６（多分ＣＨ６５も）はＨ３ウイルス（Ｘ３１、１９７８パンデミック由来の実験室株）由来のＨＡに結合するという証拠もある。ＨＡに対するヒトモノクローナル抗体は体系的に比較するにはあまりに少ないが、血清サンプルによる中和がこの程度の広範さで示されることは通常ない。
【０２４１】
実施例３：ＣＨ６５：ＨＡの構造
ｍＡｂ ＣＨ６５ ＦａｂとＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（ＨＡＳＩ）由来のＨＡ細胞外ドメインとの複合体を結晶化し、３．２−Åの最小Ｂｒａｇｇ間隔に対する回析を記録して（表２）、以下に概説したように分子置換によって構造を決定した。
【０２４２】
【表２】
2014524750.tif 000004
【０２４３】
結晶の非対称ユニットは、３つの結合したＦａｂｓと共にＨＡ三量体の単一コピーを含んでいる（図２Ａ〜２Ｄ）。最終モデルは、ＨＡ１のＣ−末端にある４つの不規則な残基を除いて、発現されたタンパク質中の全てのＨＡ１及びＨＡ２残基を包含している。電子密度図は、それぞれの単量体上の８つの可能性のある部位全てにおけるＮ−結合グリコシル化の証拠を示して、これらの位置のうちの５つで１つ又はそれ以上の糖残基を一致させることができた。軽鎖の残基１及び重鎖の残基１４１―１４７（これらは全て結合部位から離れている）を除いて、Ｆａｂは秩序だっている。
【０２４４】
Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（本研究）及びＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Gamblin, S.J. et al., Science 303:1838-1842 (2004)）だけが、発明者の知識によると、ＨＡの構造が確認されている季節性Ｈ１Ｎ１株であり；その他はパンデミック株又は動物のインフルエンザ株の何れかである。プログラムＤＡＬＩを用いて比較すると、２００９年に単離されたパンデミック（アライメントされた４９５残基にわたりＣα ＲＭＳＤが０．９Å、７９％の配列同一性；ＰＤＢ ＩＤｓ ３ＬＺＧ（Xu, R. et al., Science 328:357-360 (2010)）及び３ＬＹＪ（Zhang, W. et al., Protein Cell 1:459-467 (2010)））及び１９１８（アライメントされた４９５残基にわたりＣα ＲＭＳＤが１．５Å、８５％の配列同一性；ＰＤＢ ＩＤｓ ３ＬＺＦ（Xu, R. et al., Science 328:357-360 (2010)）及び１ＲＵＺ（Gamblin, S.J. et al., Science 303:1838-1842 (2004)））及び１９３４に由来する季節性単離株（アライメントされた４８２残基にわたりＣα ＲＭＳＤが１．５Å、８６％の配列同一性；ＰＤＢ ＩＤ １ＲＶＺ（Gamblin, S.J. et al., Science 303:1838-1842 (2004)））のそれのように、ＨＡＳＩは他のＨ１Ｎ１ ＨＡと同じであった。ＨＡＳＩの退化したエステラーゼドメインは、１９１８及び１９３４ＨＡのそれよりさらに密接に２００９ＨＡのそれと似ている。
【０２４５】
ＭＡｂ ＣＨ６５はＨＡ三量体の球状頭部に結合する（図１Ｃ及び２Ａ）。エピトープは、初期の分析において、受容体部位とＳｂと呼ばれる抗原部位の両方を含んでいる（Caton, A.J. et al., Cell 31:417-427 (1982)）。接触は抗体上の８５８Å２及びＨＡ１上の７４８Å２を覆う。重鎖の３つのＣＤＲすべて、並びに軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１及びＬ３は接触に関わっている（図１Ｃ及び２Ｂ〜Ｄ）。ＣＤＲ−Ｈ３は受容体部位に挿入している。１９残基のうちの７つは埋没表面積の４０２Å２又は完全接合部分の４７％を占めている。その他のＣＤＲは隣接相互作用を形成する。ＣＤＲ−Ｌ３は、短いアルファ螺旋のＮ−末端、受容体ポケットの端にあるＳｂ部位に接触し、そしてＣＤＲ−Ｈ１及び−Ｈ２は短いアルファ螺旋のＣ−末端に隣接しているＨＡ１から突き出ているループに接触する。
表３及び４は抗体とＨＡの間の重要な相互作用の幾つかを要約している。
【０２４６】
【表３】
2014524750.tif 000005
【０２４７】
【表４】
2014524750.tif 000006
【０２４８】
実施例４：受容体と比較したｍＡｂ ＣＨ６５のＣＤＲ−Ｈ３
ＣＤＲ−Ｈ３は受容体部位に挿入しているので、この構造を１９３４ ＨＡ（ＰＤＢ ＩＤ １ＲＶＺ：参照（Gamblin, S.J. et al., Science 303:1838-1842 (2004)））（図３Ａ及び３Ｂ）と結合しているヒト受容体類縁体ＬＳＴｃ（シアル酸−α−２，６−ガラクトース−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン）のそれと比較した。ＣＨ６５において、ＣＤＲ−Ｈ３の先端にあるＡｓｐ１０７はＨＡ１ Ａｌａ１３７の骨格アミド、Ｓｅｒ１３６の側鎖ヒドロキシル、及びＡｒｇ２２６の側鎖Ｎεからの水素結合を受け入れる。（アルギニンは２２６位で極めてまれに見られる；グルタミンがより多く見られる。Ａｒｇ２２６は結晶構造中のねじれ配置に適応する；グルタミンは、アルギニン側鎖の対応する原子のように、同じ位置のＮεで容易にかみ合う。）抗体内のＶａｌ１０６の骨格アミドは、Ｈ１上のＨＡ１ Ｖａｌ１３５のカルボキシ酸素との水素結合に寄与して、Ｖａｌ１０６の非極性側鎖はＨＡ１ Ｔｒｐ１５３及びＬｅｕ１９４とファンデルワールス接触している。受容体類縁体ＬＳＴｃにおいて、シアル酸のカルボキシル基が、Ａｓｐ１０７の側鎖が行うように（化学的に類似）ＨＡ１と同様の接触を有していて、Ｎアセチル基は、Ｖａｌ１０６のアミド及び側鎖について今述べたのと同じ方法でＨＡと相互作用する。要するに、ｍＡｂ ＣＨ６５は、ＨＡと相互作用するヒト受容体上の殆どの化学基を模倣している。
【０２４９】
実施例５：グリコシル化
抗原部位のグリコシル化はインフルエンザウイルスによる免疫回避の重要なメカニズムである（Knossow, M. and Skehel, J.J. Immunology 119:1-7 (2006); Wiley, D.C. and Skehel, J.J.  Annu. Rev. Biochem. 56:365-394 (1987); 及び Wei, C.J. et al., Sci. Transl. Med. 2:24ra21 (2010)）。ＨＡＳＩにおいては、グリコシル化レベルが露出したＳｂ及びＣｂを位置決めし、特にＣａ部位を目立たなくして、抗原部位Ｓａを完全に隠す。部位Ｓａは、１９１８流行の生存者中の２００９Ｈ１Ｎ１に対するＩｇ介在免疫のプロタイプである、抗体２Ｄ１によって認識されるエピトープである（Xu, R. et al., Science 328:357-360 (2010)）。２Ｄ１と接触する側鎖のうち、ＨＡＳＩと１９１８ＨＡの間で７／１６異なり、これと比べると、２００９パンデミックと１９１８ＨＡの間では３／１６異なる。Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６のＨＡはＳａ部位がグリコシル化されるので、ＴＩＶ２００７によるワクチン化も、或いはＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６類似株による以前の感染も２Ｄ１のような免疫応答を誘発しない。
【０２５０】
実施例６：親和性成熟化
ＣＨ６５のアミノ酸配列はＵＣＡからの親和性成熟化の結果である。そのクローン系統（図１Ｂ）を考慮した構造の分析は、抗体のＨＡとの主要な相互作用は親和性成熟化によって不変部を残していることを示す。ＣＤＲ−Ｈ３は突然変異を有していなく、軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３の短いα螺旋のＮ−末端、部位Ｓｂとの接触も有していない。（ＣＤＲ−Ｌ３のＳｅｒ９３は系統メンバーＣＨ６７のＡｓｐである；Ａｓｐへの置換はＣＨ６７がＨＡ Ａｓｎ１８７から水素結合を受け入れることを許容するだろう。）抗体の相互作用面の他の場所での、２つの残基への変化は抗体とＨＡＳＩの間に追加の水素結合を作る。ＣＤＲ−Ｌ１内の軽鎖残基Ａｓｐ２６及びＡｒｇ２９は、それぞれの生殖細胞系列の対応アミノ酸、Ａｓｎ及びＳｅｒから突然変異している。Ａｓｐ２６はＨＡ Ｌｙｓ２２２から水素結合を受け入れている。Ａｒｇ２９は２つの水素結合をＨＡ Ａｓｐ２７へ提供するように位置している。３１位（ＧｌｙからＡｓｐへ）及び３３〜３５位（Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−ＨｉｓからＨｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎへ）の変化を含むその他の変化はＣＤＲ−Ｈ３の構造に微妙な影響を及ぼすだろう。
【０２５１】
実施例７：異なったインフルエンザ株に対するＣＨ６５−ＣＨ６７系統の反応性
ＣＨ６５−ＣＨ６７Ｃの他のインフルエンザ株と反応する能力を評価した。Ｘ３１株（Ｈ３インフルエンザ株）由来の全長ＨＡ（図４Ａ〜４Ｃ、上図）又はＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１インフルエンザ株）由来の細胞表面で発現された球状頭部（図４Ｅ〜４Ｇ、下図）を用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。細胞をホルムアルデヒドで固定して、ＣＨ６５Ｆａｂ（図４Ｂ及び４Ｆ）又はＣＨ６６全長抗体（図４Ｃ及び４Ｄ）、続いてヒトＦａｂに特異的なＦＩＴＣ結合二次抗体でプローブした。ＦＩＴＣ発光（５３２ｎｍ）によって細胞を画像化した。対照として、トランスフェクト細胞を二次抗体のみでプローブした（図４Ａ及び４Ｅ）これらの結果は、ＣＨ６５−ＣＨ６７抗体（例えば、ＣＨ６６）他のインフルエンザ血清型（例えば、Ｈ３）とも結合することを示している。
【０２５２】
上記実施例で詳細に説明したように、ＣＨ６５は米国の成人対象に由来しており、対象は血清試料を提供する１週間前に２００７ＴＩＶを投与された。対象は過去にＨ１Ｎ１インフルエンザ株に暴露されたことがあるので、組み換え血球凝集素（ｒＨＡ）のパネルを用いるスクリーニングで得られた抗体は二次応答によるものであると考えられる。実際に、突然変異の数（全体の頻度は約５％）は一次暴露からまさに１週間以内に生じたにしては多すぎる。ＴＩＶを接種すると、ワクチン接種１週間後に血清細胞が分泌している循環抗体の大部分はインフルエンザ特異性である（Wrammert, J. et al., Nature 453:667-671 (2008)）。ヒトＢ細胞応答のハイスループット分析についての他の方法（例えば、ファージ提示）とは異なって、本明細書に記載されているＣＨ６５を単離する方法は、対になって再配列されたＶＨ及びＶＬ領域を検出し、それによって天然抗体の完全な抗原結合部位を再構築する（Liao, H.X. et al. J. Virol. Methods 158:171-179 (2009)）。
【０２５３】
ＣＨ６５抗体は検出された配列の比較的小さいクローン系統に属するが、発現された抗体の中に他のメンバーは存在しないと思われる。抗体が由来する血清細胞は恐らくワクチンに刺激された記憶細胞に由来しているので、それをＵＡから分離する突然変異の大部分は初期の一次応答の間に生じている。ＣＨ６５による感染性の中和の範囲が、これが２００７年以前の２０年間の季節性流行の何れか近くで生じたことを暗示しており、二次応答の間のごく少数の突然変異のみが幾分低い親和性の１つから非常に強固結合した抗体を生じたことを暗示している。
【０２５４】
ＣＨ６５の抗原結合部位は著しく不規則な構造特性は有していない。この部位にはＶＨ１〜２、ＤＨ１〜１、及びＪＨ６からの、そしてＶκ３〜２１及びＪκ２からの寄与がある（表５）。
【０２５５】
【表５】
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【０２５６】
１９残基の重鎖ＣＤＲ３はほぼ平均の長さである（Volpe, J.M. and Kepler, T.B., Immunome Res. 4:3 (2008)）。成熟抗体における配列はＵＣＡにおけるものと同じである。ＵＣＡのコード配列を生じるＶＤＪ再結合は１７ｎのヌクレオチドを包含しているので、１４のＣＤＲ３残基のうちの６つを不明確な接合によって生じたランダム挿入によってコードする。これらの６つの残基は、シアル酸ポケット内で最も重要な接触を一緒に作る、Ｖａｌ１０６、Ａｓｐ１０７を包含している。予測されるｎ−ヌクレオチド付加はＶ−Ｄ接合点における平均よりやや少なく、そしてＤ−Ｊ接合点における平均よりやや多い（Volpe, J.M. and Kepler, T.B., Immunome Res. 4:3 (2008)）。
【０２５７】
ＣＨ６５重鎖ＣＤＲ３の先端は、ＨＡに接触するシアル酸表面の著しく忠実な模倣体である。インフルエンザの抗原変異に関する初期の研究は、中和からの脱出と露出した結合部位の保護との間の明らかな矛盾の議論を導いた。シアル酸結合部位は典型的な抗体のフットプリントより小さいので、受容体ポケットの表面における突然変異は受容体の付着を阻害せずに中和を妨げることができるということを示すことによって、ＨＡ構造がこの議論を解決した（Wiley, D.C. et al., Nature 289:373-378 (1981); 及び Wilson, I.A. et al., Nature 289:366-373 (1981)）。実際に、Ａｂ ＣＨ６５による中和に対する感受性に影響を及ぼしている突然変異は受容体ポケットの側面であるが直接受容体接触を避ける位置にある。
【０２５８】
Ｈ３ ＨＡと結合しているネズミｍＡｂの２つの公表された構造は、どちらの場合も、重鎖ＣＤＲ３による受容体部位へのある程度の侵入を示す。どのｍＡｂもＣＨ６５が行うように大々的にシアル酸相互作用を模倣しない。一方では（ＰＤＢ ＩＤ １ＫＥＮ（Barbey-Martin, C. et al., Virology 294:70-74 (2002)））、アスパラギン酸側鎖はシアル酸カルボン酸の位置であるが、水素結合をＳｅｒ１３６のヒドロキシルのみから受け取ることができるが、Ａｓｎ１３７の主鎖ＮＨから受け取ることができない方向に接近する。他方では（２ＶＩＲ（Fleury, D. et al., Nat. Struct. Biol. 5:119-123 (1998)））、ＣＤＲ３の先端にあるＴｙｒ−Ａｓｐ対は、我々のＣＨ６５：ＨＡ複合体中のＶａｌ−Ａｓｐ対のそれと関連している方向を有し、そしてアスパラギン酸側鎖は同じ水素結合パターンを有しているが、模倣は受容体Ｎ−アセチル基の相互作用の何れにも広がらない。Ｈ３ ＨＡは２２６位にグルタミン又はアルギニンではなく、ロイシンを有しているので、更なる極性接触は利用できない。
【０２５９】
ＨＡの自然発生、季節性抗原変異体における突然変異の部位は、大部分がＨＡ１の外部接面上にある。ＨＡの「幹」に沿っている保存部位に結合している比較的まれないくつかの抗体は、無関係に再配列されたヒトＶＨ遺伝子（全てＶＨ１〜６９由来）のファージ表示ライブラリーに由来している。ＣＨ６５の構造及び特性は、広域中和、受容体結合部位抗体を生じることも可能であることを示している。類似点が広域中和、ＨＩＶ−１に対する受容体部位抗体（例えば、抗体ＶＣＲ０１）を引き出すことができ、これは機能的受容体、ＣＤ４のかなり近い模倣体である（Zhou T. et al., Science 329:811-817 (2010)）。
【０２６０】
ＣＨ６５様の応答を誘発する確率が高い免疫原は、一連の季節性株を予防するだろう。構造及び系統両方の分析に基づいて、このような免疫原を設計する戦略は、（天然のＨＡに加えて）ＵＣＡ様の一次応答を誘発する成分を包含できる。ＣＨ６５とそのＵＣＡの間の相違点の検証が親和性に影響を及ぼす主な変異は軽鎖ＣＤＲ内にあって、そこでは２６及び２９位の突然変異がＨＡとの塩橋を導入した（表６）。
【０２６１】
【表６】
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【０２６２】
抗原の突然変異から安定性を得る代わりに、同じ抗体と接触する改変されたＨＡが望ましい特性を有しているかもしれない。
【０２６３】
試験した多くの株の間で共通の耐性突然変異の欠如は、Ａｂ ＣＨ６５は治療用抗体に対する有用な鋳型であることを示唆している。２００７−８の初めに急速に出現した、オセルタミビル−耐性Ｈ１Ｎ１が季節性インフルエンザの主要な株になってきており、重症感染症の管理は、広い反応性を有する免疫に基づく治療から利益を得ることができるだろう（Dharan, N.J. et al. JAMA 301:1034-1041 (2009)）。Ｈ５Ｎ１の球状頭部を標的としているヒトｍＡｂを用いる以前の研究によれば、ＣＨ６５に対する効果的な中和濃度はインビボにおいて防御的であることが示唆される（Simmons, C.P. et al. PLoS Med. 4:e178 (2007)）。
【０２６４】
従って、インフルエンザ感染の治療及び予防において極めて有効である新規なインフルエンザＨＡ抗体が本明細書に記載されている。暴露又はワクチン接種は抗原ドリフトした株に対して限定された交差中和を有するヒト抗体生じるため、循環しているインフルエンザウイルスの季節性の抗原ドリフトはワクチン成分の頻繁な変更の必要性を引き起こすので、インフルエンザの抗原ドリフトした株を広範囲に中和できる効果的な治療に対して重要で未だ満たされていない要求がある。上記の結果は新規な抗体の使用が未だ満たされていない要求の解決法を提供するということを明確に立証している。従って、本明細書に記載されている新規な抗体を用いる治療はインフルエンザ感染症に罹っている患者の治療において有意な前進である。
【０２６５】
本明細書に報告された結果は以下の方法及び材料を用いて得られた。
【０２６６】
（臨床サンプル）
ＭＡｂｓ ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７は、Duke Institutional Board が承認したヒト対象プロトコールのもとで、２００７ＴＩＶでワクチン接種された対象から得た。対象は２００７−２００８Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標、Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA）を投与され、これはＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４を含んでいた。ワクチン接種の７日後に採血し、ＰＢＭＣを単離して同日に冷凍保存した。記載されているように抗体のパネルを用いて、単一の形質芽球を９６ウェルのプレートに選別した（Moody MA, et al., PLoS One 6:e25797 (2011)）。配列決定のためのＤＮＡを得るために、シングルセルＲＴ／ＰＣＲを実施したが（(Liao, H.X. et al. J. Virol. Methods 158:171-179 (2009))、これはＡＢＩ３７００上のＢｉｇＤｙｅ（登録商標）シークエンスキット（Ewing, B. et al., Genome Res. 8:175-185 (1998)）を用いて順方向と逆方向の両方で行って、各位置における品質スコアに基づく方法で組み立てた（Kepler, T.B. et al. BMC Genomics 11:444 (2010)）。Ｉｇアイソタイプを、公知の配列；Ｖ、Ｄ、及びＪ領域遺伝子、ＣＤＲ３ループ長による局所配列によって決定して、突然変異頻度を推測される非変異先祖と比較して確認した。
【０２６７】
（系統分析）
ＤＮＡＭＬを用いる最大尤度（Felsenstein, J. J. Mol. Evol. 17:368-376 (1981)）によって最小にクローンツリーを確認してＢａｙｅｓｉａｎ法を用いてＵＣＡを推定し、次いで、推定ＭＬツリーを条件として、遺伝子断片及び組み換え部位上の後部接合分布を計算した。次いで、各部位のヌクレオチド上の後部確率質量関数を直接得た。
【０２６８】
（ＩｇＧ及びＦａｂの発現及び精製）
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域を、上記のようにして単一の血清細胞からＲＴ／ＰＣＲによって単離した（Liao, H.X. et al. J. Virol. Methods 158:171-179 (2009)）。精製全長ＩｇＧ抗体の産生のために、ＣＨ６５、ＣＨ６６及びＣＨ６７のＶＨ及びＶκ遺伝子を、ヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子又はκ鎖定常領域遺伝子の何れかを含有しているｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター内にクローンした（Liao, H.X. et al. J. Virol. Methods 158:171-179 (2009)）。ＣＨ６５Ｆａｂを産生するために、制限部位（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）及びＩｇシグナルペプチドの５’配列にアニールする配列を含むように、５’プライマー、ＨＶ１３２７４−Ｆ１（５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧＣＴＣＣ−３’）を設計し、制限部位（ＸｂａＩ）を含んで、ヒトＩｇＧ１定常領域のヒンジの直前でアミノ酸残基ＳＣＤＫをコードする配列（５’ＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡ３’）の後ろに停止コドンを導入するために、３’−プライマー、ＨＶ１３２２１Ｈ−Ｒ４７４（５’−ＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＣＴＡＧＡ−３’）を設計した。これらのプライマー及び鋳型としての全長ＩｇＧ１重鎖遺伝子を用いる、ＰＣＲ増幅によって、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ内にクローンされたＦａｂ遺伝子を得た（Nicely, N.I. et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 17:1492-1494 (2010)）。組み換え、無傷のＣＨ６５ＩｇＧ１及びそのＦａｂを２９３Ｔ細胞内で重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子による同時トランスフェクションによって産生した。無傷の抗体を、抗ヒトＩｇＧビーズ（Sigma, St. Louis, MO）を用い、Ｆａｂを、抗Ｌ−鎖ビーズ（Sigma, St. Louis, MO）を用いて、続いてＦＰＬＣゲル濾過（Liao, H.X. et al. J. Virol. Methods 158:171-179 (2009); 及び Nicely, N.I. et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 17:1492-1494 (2010)）によって精製した。
【０２６９】
（感染性中和）
Centers for Disease Control and Prevention （ＣＤＣ）におけるインフルエンザリファレンス研究所の方法に基づいて感染性中和をマイクロ中和アッセイで分析した（Hancock, K. et al., N. Engl. J. Med. 361:1945-1952 (2009)）。Ｈ１Ｎ１の歴史的なウイルス資源は Vladimir Lugovtsev (Div. of Viral Products, CBER, FDA) から提供された。全てのウイルスをＭＤＣＫ細胞上で滴定して、１ウェル当り１００ＴＣＩＤ５０で用いた（３回）。１００μｇ／ｍｌから始めて、ｍＡｂＣＨ６５の２倍連続希釈を、ＭＤＣＫ細胞単層に添加する前に、ウイルス株と混和した。ウイルスの複製を完全に阻止する最小濃度（ＥＣ９９）を表１に報告した。
【０２７０】
（ＨＡの発現及び精製）
ＨＡ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６の細胞外ドメインのコドン最適化ｃＤＮＡをＧｅｎＡｒｔによって合成して、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）のために改変したｐＥＴベクター内にサブクローンした。合成遺伝子は、Ｎ末端に分泌シグナルをコードし、膜貫通ドメインの代わりに、トロンビン開裂部位、正確な三量体を促進するためのＴ４−フィブリチン「フォルドン」をコードし、Ｃ末端にＨｉｓ６タグをコードする。イラクサギンウワバ（trichoplusia ni）（Ｈｉ−５）細胞を組み換えバキュロウイルスで感染した。感染４８時間後に上澄液を遠心分離で採取し、濃縮し、４０ｍＭのイミダゾールを有するリン酸緩衝食塩水に対して透析濾過して、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に取り込んだ。タンパク質を溶出し、透析して、１：５００質量比のＴＰＣＫで処理したトリプシンと１晩培養して三量体及びＨｉｓ６標識を除いてＨＡ０前駆体ペプチドを開裂した。タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（GE Healthcare）上のゲル濾過クロマトグラフィーで更に精製した。
【０２７１】
（結晶化）
ＣＨ６５ＦａｂとＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６ＨＡを４．５：１のモル比で培養して、得られた３：１の複合体を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００上のゲル濾過クロマトグラフィーで過剰のＦａｂから分離した。複合体を、２８０ｎｍで吸光度１０（約６ｍｇ／ｍＬ）まで濃縮した。２．２Ｍの硫酸アンモニウム、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、及び５％のＰＥＧ−４００を含有している容器上に１８℃で懸滴して結晶を成長させた。結晶化はマイクロシーディングによって改善された。３〜１４日後に、容器に１５％のグルセロールを補完した溶液を滴下して結晶を凍結保護し、次いで回収して液体窒素中で瞬間冷却した。
【０２７２】
（構造決定及び精密化）
Advance Photon Source でビームライン２４−ＩＤ−Ｅにおいて回析実験を行った。３．２−Å解像度でデータセットを単一から５０ｘ５０ｘ３００μｍロッドまで採取してＨＫＬ２０００を用いて処理した（表２）。１９３４Ｈ１ ＨＡ（ＰＤＢ ＩＤ １ＲＶＺ（Gamblin, S.J. et al., Science 303:1838-1842 (2004)））を出発モデルとして用い、ＰＨＡＳＥ（McCoy, A.J. et al., J. Appl. Crystallogr. 40:658-674 (2007))によって分子置換（ＭＲ）計算を実施した。ＭＲの初期段階は、Ｆａｂ構造のライブラリーを用いて、ＭＯＬＲＥＰにおいて段階的分子置換によってＦａｂ分子の検索が可能であった。モデルをＣＮＳ（Brunger, A.T., Nat. Protoc. 2:2728-2733 (2007)）中で、ＧＯＯＴ（Emsley, P. and Cowtan, K., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:2126-2132 (2004)）中の可変弾性ネットワーク拘束及び再構築を用いる疑似アニーリングによって精密化した。高分解能構造由来のＮ−結合グリカンを、必要に応じて、実験的電気密度マップに当てはめた。強力で３倍の非結晶学的対称性抑制をＨＡ及びＦａｂのそれぞれのドメインに精密化の間中適用して、Ｆａｂの保存ドメインと可変ドメイン間の角内の変動を許容した。最後に、ＰＨＥＮＩＸ（Adams, P.D. et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58:1948-1954 (2002)）において、個々の位置及びＢ−ｆａｃｔｏｒの精密化の３周期が、観察された強度（Ｒ／Ｒｆｒｅｅ＝２１．１／２４．８％）とよく一致したモデルをもたらした。座標及び回析データが、受け入れ番号３ＳＭ５でＰＤＢに提出された。
【０２７３】
（その他の実施態様）
上記より、本明細書に記載されている発明に変更及び修正を行ってそれを多種の用途及び条件に適用できることは明らかであろう。このような実施態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２７４】
本明細書の可変基の定義の何れかにおける要素のリストの記載は単一成分又はリストされた成分の組み合わせ（又は下位の組み合わせ）としての可変基の定義を含んでいる。本明細書の実施態様の記載は単一の実施態様の何れか又は他の何れかの実施態様又はその一部分との組み合わせとしての実施態様を含んでいる。
【０２７５】
（参照による取り込み）
本明細書で述べられている特許及び刊行物は、独立した特許及び刊行物が参照により取り込まれていることが具体的にそして個々に示されているのと同じような範囲まで参照により取り込まれている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2014524750.tif 000010
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2014524750.tif 000015
【図３】
2014524750.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014524750.tif 000020
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014524750.tif 000023
【図１１】
2014524750.tif 000024
【図１２】
2014524750.tif 000025
【図１３】
2014524750.tif 000026
【図１４Ａ】
2014524750.tif 000027
【図１４Ａ−１】
2014524750.tif 000028
【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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