(57)【要約】  本発明は、腫瘍治療に関する。一つの態様では、本発明は、アマトキシンと標的結合部分（例えば抗体等）とが特定のリンケージにより連結されてなる、癌の治療に有用な複合体に関する。更なる態様では、本発明は、かかる複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
2014508767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2014508767.tif 000019
［式中、
Ｒ１はＨ又はＯＨであり；
Ｒ２はＨ又はＯＨであり；
Ｒ３はＮＨ2又はＯＨであり；
Ｒ４はＯＨ又はＯＣ1-6−アルキルであり；そして
Ｒ５はＬ−Ｔであり；ここで、Ｌはリンカーであり；そしてＴは標的結合部分である］
のアマトキシン複合体。
【請求項２】
前記リンカーが、尿素部分を介して標的結合部分に連結される、請求項１に記載のアマトキシン複合体。
【請求項３】
前記標的結合部分が、標的結合部分中に存在するアミノ基を介してリンカーＬに連結されるとともに、前記アミノ基は、前記尿素部分の一部を形成する、請求項１又は２に記載のアマトキシン複合体。
【請求項４】
前記リンカーが、１〜８個、具体的には１〜６個、より具体的には１〜４個、最も具体的には２〜４個の原子長を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項５】
前記リンカーＬが、任意で置換されていてもよいアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項６】
前記リンカーＬが、ジスルフィド、エーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン、及び尿素部分のうちの一つから選択される部分を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項７】
前記標的結合部分が、腫瘍細胞上に存在するエピトープと特異的に結合し、具体的には、前記標的結合部分が、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項８】
前記標的結合部分が、
（ｉ）抗体又はこの抗原結合断片；
（ｉｉ）抗体様タンパク質；及び
（ｉｉｉ）核酸アプタマー
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項９】
前記標的結合部分が、ジアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体から選択される抗体又はその抗原結合断片である、請求項８に記載のアマトキシン複合体。
【請求項１０】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖｓ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項８又は９に記載のアマトキシン複合体。
【請求項１１】
医薬として使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項１２】
患者において癌の治療に使用されるとともに、前記癌が、膵臓癌、胆管癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体を含んでなり、更に一又は複数の医薬的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
式Ｉ［式中、Ｒ１〜Ｒ４は請求項１で定義した通りであり；そしてＲ５はＬ−Ｘであり；ここでＬはリンカーであり；そしてＸは、標的結合部分の求核基により置換され得る脱離基である］のアマトキシン複合体形成用分子。
【請求項１５】
Ｘが、第一級アミンにより置換され得る脱離基である、請求項１４に記載のアマトキシン複合体形成用分子。
【請求項１６】
Ｘが、−tブチルオキシ、−スクシンイミジルオキシ、−１−Ｏ−スクシンイミジルオキシ−３−スルホネート（−スルホ−ＮＨＳ）、−Ｏ−（４−ニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（３−ニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（２，４−ジクロロ−６−ニトロフェニルオキシ）、−ペンタフルオロフェニルオキシ、−ペンタクロロフェニルオキシ、−Ｏ−（２，４，５−トリクロロフェニルオキシ）、−Ｏ−（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）、−Ｏ−（エンド−１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド−１−イル）、−１−フタルイミドイルオキシ、−１−ベンゾトリアゾリルオキシ、−１−（７−アザ−ベンゾトリアゾリル）オキシ）、及び−Ｎ−イミダゾリルから選択される、請求項１４又は１５に記載のアマトキシン複合体形成用分子。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体を合成するための方法であって、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体形成用分子を、求核基を含む標的結合部分と反応させる工程を含む方法。
【請求項１８】
前記求核基が、第一級アミンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者において癌を治療する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアマトキシン複合体、又は、請求項１３に記載の医薬組成物を、患者に投与する工程を含む方法。
【請求項２０】
前記癌が、膵臓癌、胆管癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療に関する。一つの態様では、本発明は、アマトキシンと標的結合部分（例えば抗体等）とが特定のリンケージにより連結されてなる、癌の治療に有用な複合体に関する。更なる態様では、本発明は、かかる複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アマトキシンは、８個のアミノ酸からなる環状ペプチドである。これらは、タマゴテングダケ（Amanita phalloides）というキノコから単離することができ、あるいは合成により調製することができる。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより影響を受ける細胞の転写及びタンパク質生合成をも特異的に阻害する。細胞における転写の阻害は、成長及び増殖の停止を引き起こす。共有結合をしていないもかかわらず、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体は非常に強固である（ＫD＝３ｎＭ）。この酵素からのアマニチンの解離は、非常にゆっくりとしたプロセスであり、それ故影響を受けた細胞の回復は起こりにくい。転写の阻害があまりにも長く続くと、細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を被る。
【０００３】
腫瘍治療用の細胞毒性成分としてのアマトキシンの使用は、既に１９８１年の時点で検討されている。これは、抗Ｔｈｙ１．２抗体を、α−アマニチンに対して、Ｔｒｐ（アミノ酸４；図１参照）のインドール環に付着されたリンカーを用いて、ジアゾ化を介して連結することによりなされた（Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388）。Davis及びPrestonは、付着部位を位置７’であると特定している。Morris及びVentonも同様に、位置７’を置換することにより、細胞毒性を維持する誘導体が得られることを実証した（Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419-430）。
【０００４】
欧州特許出願公開第１８５９８１１Ａ１号明細書（２００７年１１月２８日公開）は、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子が、アルブミン又はモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、又はＰＡ−１と直接的に、即ちリンカー構造を介することなく連結した複合体を記載した。さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）、及びＴ−リンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に関するこれらの複合体の阻害効果が示された。アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等の構成要素を含んでなるリンカー等の使用が提案されたが、かかる構造は実際には示されず、アマトキシン上の付着部位などの詳細も提供されなかった。
【０００５】
国際公開第２０１０／１１５６２９号及び国際公開第２０１０／１１５６３０号（双方ともに２０１０年１０月１４日公開）は、アマトキシンに対して抗ＥｐＣＡＭ抗体等（例えばヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５等）の抗体が、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子、（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ−原子、又は（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ−原子により、各々直接に、あるいは、抗体とアマトキシンとの間にリンカーを介して連結された複合体を記載する。提案されたリンカーは、構成要素、例えばアミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等を含んでなる。さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ−７細胞株）、膵臓癌（Ｃａｐａｎ−１細胞株）、結腸癌（Ｃｏｌｏ２０５細胞株）及び胆管癌（ＯＺ細胞株）の増殖に関するこれらの複合体の阻害効果が示された。
【０００６】
アマトキシンは、抗体分子等の大型生体分子担体と連結された状態では比較的毒性が少なく、生体分子担体が切断された後にのみ、その細胞毒性活性を発揮することが知られている。アマトキシンの毒性、特に肝細胞への毒性を考慮すると、標的化腫瘍療法用のアマトキシン複合体は、血漿への投与後には高い安定性を維持する一方、標的細胞への内在化後にアマトキシンを放出することが重要である。斯かる背景を鑑みると、該複合体の安定性の改善は、たとえ僅かであっても、アマトキシン複合体の治療域やその治療手段としての安全性に対して非常に大きな影響を及ぼす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、従来技術には、非標的細胞への有害な副作用を最小化するべく、血漿中において安定な標的結合部分アマトキシン複合体に対する必要性が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アマトキシンに標的部分を連結する際に、４トリプトファンに相当するアミノ酸が有する更なる付着部位、即ち１’−Ｎ位に対して、リンカーを介してアマトキシンを連結することにより、当該アマトキシンと、その標的たる哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIとの相互作用の妨害を回避できるという、予期せぬ知見に基づく。
【０００９】
従って、本発明は、リンカーＬを介してアマトキシン、又はアマトキシンアナログと連結した標的結合部分を含んでなる複合体であって、該リンカーＬは、アミノ酸４の１’−Ｎ原子によりアマトキシンと接続する複合体に関する。
【００１０】
一つの態様では、本発明は、式Ｉ
【００１１】
【化１】
2014508767.tif 000003
【００１２】
［式中、
Ｒ１＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｒ２＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｒ３＝ＮＨ2又はＯＨであり；
Ｒ４＝ＯＨ又はＯＣ1-6−アルキルであり；そして
Ｒ５＝Ｌ−Ｔであり；ここでＬはリンカーであり；そしてＴは標的結合部分である］
のアマトキシン複合体（amatoxin-conjugate）に関する。
【００１３】
更なる態様では、本発明は、本発明の複合体を含んでなる医薬組成物に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、式Ｉのアマトキシン複合体形成用分子（amatoxin-conjugation molecule）であって、Ｒ１〜Ｒ４は上記で定義した通りであり；そしてＲ５＝Ｌ−Ｘであり；ここでＬはリンカーであり；そしてＸは、標的結合部分の求核基、特に第一級アミンにより置き換えられ得る脱離基である、式Ｉのアマトキシン複合体形成用分子に関する。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は、本発明の複合体を合成するための方法であって、本発明のアマトキシン複合体形成用分子を求核基、特に第一級アミンを含んでなる標的結合部分と反応させる工程を含んでなる、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、様々なアマトキシンの構造式を示す。太字の数（１〜８）は、アマトキシンを形成する８個のアミノ酸の標準的な番号付けを示す。アミノ酸１、３及び４における原子の標準的な番号付けをまた示す（それぞれ、ギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、及び数字１’〜７’）。
【００１７】
【図２】図２は、７２時間インキュベーション後のインビトロＢｒｄＵアッセイにおけるＨＥＲ２−陽性腫瘍細胞株に対するＨｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８［２．８］の細胞毒性活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を下記で詳細に記載する前に留意すべきは、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬は、本発明を限定するものではなく、変更し得るものであるという点である。また、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも留意すべきである。他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１９】
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）に記載されるように定義される。
【００２０】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上別途解釈すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」、並びにその活用形、例えば「含む（comprises）」や「含むこと（comprising）」等は、記載された整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を包含することを含意するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを意図するものではないと解すべきである。
【００２１】
本明細書の本文全体を通じて複数の文献を引用する。本明細書で引用する文献（全ての特許、特許出願、科学論文、製造業者の仕様書、取扱説明書、GenBank登録番号配列寄託書（submissions）等を含む）は各々、上記か下記かに関わらず、対応する特許法の下で可能な程度まで、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくかかる開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００２２】
これから本発明をさらに説明する。以下の節では本発明の様々な態様をより詳細に規定する。このようにして規定した各態様は、反対の内容が明示されない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴を、好ましい又は有利であるとして示した任意の他の特徴と組み合わせることができる。
【００２３】
従って、本発明は、リンカーＬを介してアマトキシン、又はアマトキシンアナログと連結した標的結合部分を含んでなる複合体であって、ここでリンカーＬが、アミノ酸４の１’−Ｎ原子によりアマトキシンと接続する複合体に関する。
【００２４】
本発明に関連して、用語「複合体」とは、共有結合により連結された少なくとも二つの異なる分子を含んでなる分子を意味する。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、用語「標的結合部分」とは、標的分子又は標的エピトープと特異的に結合することができる任意の分子又は分子の一部を意味する。本願との関連で好ましい標的結合部分は、（ｉ）抗体又はこの抗原結合断片；（ｉｉ）抗体様タンパク質；及び（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。本発明における使用に好適な「標的結合部分」は、典型的に、４００００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上の分子量を有する。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、第一の化合物（例えば抗体）が第二の化合物（例えば抗原、例えば標的タンパク質）に対して１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは９０ｎＭ以下、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下、さらにより好ましくは６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは４０ｎＭ以下、さらにより好ましくは３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫDを有する場合、第１の化合物は上記第２の化合物と「特異的に結合する」と解釈される。
【００２７】
本願との関連では、用語「標的分子」及び「標的エピトープ」とは、それぞれ標的結合部分が特異的に結合する抗原及び抗原のエピトープをそれぞれ意味する。好ましくは、標的分子は、腫瘍関連抗原、特に非腫瘍細胞の表面と比較して高い濃度で及び／又は異なる立体配置において、一又は複数の腫瘍細胞型の表面上に存在する抗原又はエピトープである。好ましくは、前記抗原又はエピトープは、一又は複数の腫瘍細胞型の表面上に存在するが、非腫瘍細胞の表面上には存在しない。特定の実施形態では、該標的結合部分は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ又は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する。他の実施形態では、前記抗原又はエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞上で優先的に発現される。特定のかかる実施形態では、該標的結合部分は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のエピトープと特異的に結合する。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体又はこの抗原結合断片」とは、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を表す。例えば標的分子、例えば標的タンパク質であるＨｅｒ−２／ｎｅｕ又はＥｐＣＡＭと特異的に結合するファージディスプレイを含む技術により選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、又はサブクラスのものでもよい。本発明における使用に好適な「抗体及びこの抗原結合断片」としては、限定することなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ複合体抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化（特にＣＤＲ移植）抗体、脱免疫化抗体、又はキメラ抗体、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより産生される断片、ダイアボディ（diabodies）又はテトラボディ（tetrabodies）（Holliger P. et al., 1993）、ナノボディ（nanobodies）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含む。
【００２９】
実施形態によっては、抗原結合断片は、本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、限定することなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）、並びにＶＬドメイン又はＶＨドメインを含んでなる断片を含む。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変ドメインを単独で、あるいはヒンジ領域、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全体若しくは一部との組み合わせを含み得る。ヒンジ領域、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインと可変ドメインの任意の組合せをまた含んでなる抗原結合断片も、本発明に含まれる。
【００３０】
本発明において使用可能な抗体は、鳥及び哺乳動物を含む任意の動物起源由来であってもよい。好ましくは、該抗体は、ヒト、齧歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源由来である。該抗体は、ヒト起源又はマウス起源のものであることが特に好ましい。本明細書で用いられる場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された、あるいは一又は複数のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入した内在性免疫グロブリンを発現しない動物（例えばKucherlapati & Jakobovitsによる米国特許第５９３９５９８号に記載されるような）由来の抗体を含む。
【００３１】
用語「抗体様タンパク質」とは、標的分子と特異的に結合するように（例えばループの突然変異誘発により）改変されたタンパク質を意味する。典型的には、かかる抗体様タンパク質は、両端でタンパク質骨格と結合した少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的制約は、抗体様タンパク質の結合親和性を抗体の結合親和性に匹敵するレベルまで大幅に増大させる。可変ペプチドループの長さは、典型的に１０個〜２０個のアミノ酸からなる。骨格タンパク質は、優れた溶解特性を有する任意のタンパク質でもよい。好ましくは、骨格タンパク質は小さい球状タンパク質である。抗体様タンパク質は、限定することなく、アフィボディ（affibodies）、アンチカリン（anticalins）、及び設計されたアンキリン反復タンパク質（概説に関してはBinz et al. 2005を参照のこと）を含む。抗体様タンパク質は、突然変異体の大規模ライブラリ由来のものであってもよく、例えば大規模ファージディスプレイライブラリから選択して（panned）もよく、通常の抗体と同様に単離してもよい。また、抗体様結合タンパク質を、球状タンパク質の表面露出残基のコンビナトリアル突然変異誘発により得ることができる。
【００３２】
用語「核酸アプタマー」とは、インビトロ選択の繰り返し又はＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）により、標的分子と結合するように改変された核酸分子を意味する（概説に関してはBrody and Gold, 2000を参照のこと）。該核酸アプタマーは、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子でもよい。該アプタマーは、修飾、例えば修飾ヌクレオチド、例えば２’−フッ素−置換ピリミジンを含んでもよい。
【００３３】
本明細書で使用する場合、化合物の「アナログ」は、該化合物と構造的に関連するが同一ではなく、該化合物の少なくとも一つの活性を示す。該アナログが比較される化合物は、「親」化合物として知られる。上記で言及した活性は、限定することなく、別の化合物との結合活性；阻害活性、例えば酵素阻害活性；毒性効果；活性化活性、例えば酵素活性化活性を含む。該アナログが親化合物と同程度の活性を示す必要はない。本願との関連内では、化合物が親化合物の活性の少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の程度まで関連する活性を示す場合、該化合物はアナログとみなされる。従って、本明細書で用いられる場合、「アマトキシンのアナログ」とは、図１に示すようなα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸のいずれか一つと構造的に関連し、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸の少なくとも１つと比較して哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対して少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の阻害活性を示す化合物を意味する。本発明における使用に好適な「アマトキシンのアナログ」はさらに、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対してα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン又はアマヌリン酸のいずれか１つより大きな阻害活性を示してもよい。阻害活性は、５０％の阻害が生じる濃度（ＩＣ50値）を決定することにより測定することができる。哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する阻害活性は、細胞増殖に関する阻害活性を測定することにより間接的に決定することができる。細胞増殖の阻害を測定するための好適なアッセイを実施例に記載する。
【００３４】
「半合成アナログ」とは、出発物質として天然資源（例えば植物材料、細菌培養物、又は細胞培養物）由来の化合物を用いて化学合成により得られるアナログを意味する。典型的には、本発明の「半合成アナログ」とは、アマニタ（Amanita）科のキノコから単離された化合物から出発して合成される。これに対して、「合成アナログ」とは、小さい（典型的には石油化学品の）構成要素からいわゆる全合成により合成されるアナログを意味する。通常、この全合成が生物学的プロセスに頼ることなく行なわれる。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「アプタマー複合体」とは、標的結合部分が、上記の代替物（ｉｉｉ）の核酸アプタマーである、標的結合部分毒素複合体を意味する。
【００３６】
本発明との関連において、「リンカー」とは、それぞれがリンカーの一端に取り付けられた、二つの構成要素、例えば本願において標的結合部分とアマトキシンを接続する分子を意味し、これは、二つの構成要素間の距離を増大させ、これらの化合物間の立体障害を軽減させる。リンカーが存在しない場合、アマトキシンと標的結合部分との直接の結合は、アマトキシンのＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力を減少させ得る。特定の実施形態では、リンカーは、その骨格中に１〜３０個の原子（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の原子；従って、本発明との関連において、用語「〜（between）」は、言及される境界が含まれるように用いられる）の連続する鎖を有し、即ち、リンカーの長さは、アマトキシン部分及び標的結合部分間の原子又は結合の数により測定されるような最も短い接続として定義され、ここで、リンカー骨格の一方は、アマトキシンと反応し、他方は、標的結合部分と反応する。本発明との関連において、リンカーは、好ましくは、任意で置換された、Ｃ1-20−アルキレン、Ｃ1-20−ヘテロアルキレン、Ｃ2-20−アルケニレン、Ｃ2-20−ヘテロアルケニレン、Ｃ2-20−アルキニレン、Ｃ2-20−ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である。該リンカーは、一又は複数の構造要素、例えばカルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等を含んでもよい。該リンカーはまた、これらの構造要素の二又はそれ以上の組合せを含んでもよい。これらの構造要素の各々が、リンカー中に２箇所以上、例えば２箇所、３箇所、４箇所、５箇所又は６箇所存在してもよい。実施形態によっては、該リンカーは、ジスルフィド結合を含んでもよい。該リンカーを、単一工程で又は二又はそれ以上の後続の工程においてアマトキシン及び標的結合部分と結合させなければならないことは理解される。そのため、その後にリンカーとなるものは、好ましくは近位端及び遠位端に２つの基を保有し、これは、（ｉ）連結される構成要素の一つに存在する基、好ましくはアマトキシン若しくは標的結合ペプチド上の活性化された基と共有結合を形成することができ、あるいは（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化される若しくは活性化され得る。従って、化学基がリンカーの遠位端及び近位端に存在し、これが、結合反応、例えばエステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ペプチド結合等の結果であることが好ましい。
【００３７】
本発明との関連において、用語「アマトキシン」は、アマニタ（Amanita）属から単離されWieland, T.及びFaulstich H.（Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3):185-260）により記載されるような８個のアミノ酸からなる全て環状ペプチドを含み、さらにこの全ての化学的誘導体、さらにこの全ての半合成アナログ、さらに天然化合物の主要構造（環状、８個のアミノ酸）に従って基本単位から構築されるこの全ての合成アナログ、さらにヒドロキシル化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する全ての合成アナログ又は半合成アナログ、さらにスルフィド、スルホンにより、又は硫黄以外の原子、例えば炭素原子により（アマニチンのカルバアナログの場合のように）チオエーテルスルホキシド部分が置換された全ての合成アナログ又は半合成アナログを含み、いずれの場合にも任意のかかる誘導体又はアナログは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することにより、機能的に活性である。
【００３８】
機能的に、アマトキシンは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又は弟子ペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンが、上記で定義されたリンカー分子又は標的結合部分と反応することができる官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基又はチオール結合基）を含むものである。本発明の複合体に特に好適なアマトキシンは、図１に示されるようなα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン（amanin）、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸（amanullinic acid）、並びにこれらの塩、化学的誘導体、半合成アナログ及び合成アナログである。本発明における使用のために特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、及びアマニンアミドである。
【００３９】
本明細書で用いられる化合物の「化学的誘導体」（又は略して「誘導体」）とは、該化合物と同様の化学構造を有するが、該化合物中には存在しない少なくとも１つの化学基を含有し、及び／又は該化合物中に存在する少なくとも１つの化学基を欠く化学種を意味する。誘導体の比較される化合物は、「親」化合物として知られる。典型的には、「誘導体」は、一又は複数の化学反応工程で親化合物から作製することができる。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、アマトキシンは、アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、若しくはアマヌリン酸から、又はこれらの塩又はアナログから選択される。
【００４１】
一つの態様では、本発明は、式Ｉ
【００４２】
【化２】
2014508767.tif 000004
【００４３】
［式中、
Ｒ１＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｒ２＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｒ３＝ＮＨ2又はＯＨであり；
Ｒ４＝ＯＨ又はＯＣ1-6−アルキルであり；そして
Ｒ５＝Ｌ−Ｔであり；ここでＬはリンカーであり；そしてＴは標的結合部分である］
のアマトキシン複合体に関する。
【００４４】
特定の実施形態では、式Ｉのアマトキシン複合体は、α−アマニチンの誘導体（Ｒ１＝ＯＨ；Ｒ２＝ＯＨ；及びＲ３＝ＮＨ2）である。
【００４５】
特定の実施形態では、Ｒ４は、Ｏ−Ｍｅである。
【００４６】
特定の実施形態では、該リンカーは、尿素部分を介して標的結合部分と接続する。
【００４７】
本発明の明細書において、用語「尿素部分を介して標的結合部分と接続する」とは、リンカーと標的結合部分との接続を意味し、ここで標的結合部分は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を介してリンカーと直接的に取り付けられる。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、該標的結合部分は、標的結合部分中に存在するアミノ基を介したリンカーＬとの接続であり、ここで前記アミノ基は、尿素部分の一部を形成する。
【００４９】
特定の実施形態では、該リンカーは、１〜８個、具体的には１〜６個、より具体的には１〜４個、最も具体的には２〜４個の原子長を有する。従って、エチレンリンカーは２原子長を、プロピレンリンカーは３原子長を、そしてブチレンリンカーは４原子長を有する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態では、該リンカーＬは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、及びヘテロアラルキレン基から選択される一又は複数の基、特に、一、二又は三つの基であり、ここで各基は任意で独立して置換されてもよい、を含んでなる。
【００５１】
用語「アルキレン」とは、１〜１０個の炭素原子を有する基を含む、１〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基を意味する。特定の実施形態では、アルキレン基は、低級アルキレン基でもよい。用語「低級アルキレン」とは、１〜６個の炭素原子、特定の実施形態では、１〜５又は１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基を意味する。アルキレン基の例としては、限定しないが、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、及びｎ−ヘキシレンが挙げられる。
【００５２】
用語「アルケニレン」とは、２〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖基を意味し、ここで、少なくとも一つの炭素−炭素は二重結合である一方で他の結合は、一重結合又はさらに二重結合でもよい。本明細書で用語「アルキニレン」とは、２〜２０個の炭素原子を有する基を意味し、少なくとも一つの炭素−炭素は三重結合である一方で、他の結合は、一重結合又はさらに二重結合、又はさらに三重結合でもよい。アルケニレン基の例としては、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレン等が挙げられる。アルキニレン基の例としては、エチニレン、１−プロピニレン、２−プロピニレン等が挙げられる。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキレン」とは、任意の安定した一環又は多環系の一部である二価の環であって、かかる環は、３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子は有さず、そしてかかる環は完全に飽和される環を意味することを意図し、用語「シクロアルケニレン」は、任意の安定した一環又は多環系の一部である二価の環であって、かかる環は、３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子は有さず、そしてかかる環は少なくとも部分的に不飽和である環（ただし任意のアリーレン環は除く）を意味することを意図する。シクロアルキレンの例としては、限定しないが、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、及びシクロヘプチレンが挙げられる。シクロアルケニレンの例としては、限定しないが、シクロペンテニレン及びシクロヘキセニレンが挙げられる。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語「ヘテロシクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルケニレン」とは、任意の安定した一環又は多環系の一部である二価の環であって、かかる環は、３〜約１２個の炭素原子を有し、かかる環は、炭素原子、及び少なくとも一つのヘテロ原子、特にＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも一つのヘテロ原子からなる環を意味し、完全に飽和したかかる環であるヘテロシクロアルキレン、及び少なくとも部分的に不飽和である環であるヘテロシクロアルケニレン（ただし任意のアリーレン又はヘテロアリーレン環は除く）を意味することを意図する。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、場合、用語「アリーレン」とは、任意の安定した一環又は多環系の一部である二価の環又は環系であって、かかる環又は環系は、３〜２０個の炭素原子を有するがヘテロ原子を有さず、かかる環又は環系は、フェニレン等の「４ｎ＋２」π電子則により定義される芳香族部分からなる環又は環系を意味することを意図する。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、用語「ヘテロアリーレン」とは、任意の安定した一又は多環系の一部である二価の環又は環系であって、かかる環又は環系は、３〜２０個の原子を有し、環又は環系は、「４ｎ＋２」π電子則により定義される芳香族部分からなり、炭素原子、及び一又は複数の窒素、硫黄、及び／又は酸素であるヘテロ原子を含んでなる環又は環式を意味する。
【００５７】
本発明との関連において、用語「置換された」とは、示される原子の通常の原子価、又は置換される基の適切な原子の原子価が超過することなく、かつ置換が安定的な化合物をもたらすことを条件として、リンカーの骨格中に存在する一又は複数の水素が示される基から選択で置き換えられることを示すことを意図する。用語「任意で置換された」とは、本明細書で定義される一又は複数の置換基で、本明細書に定義されるように置換される又は置換されないリンカーを意味することを意図する。置換基が、ケト（又はオキソ、即ち＝Ｏ）基、チオ基又はイミノ基等である場合、リンカー骨格原子上の二つの水素は置換される。典型的な置換基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフィドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、サルフェート、スルホネート，スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、パラフルオロアルキル（例えばトリフルオロメチル）を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、（任意で、例えばアルキル、アリール又はヘテロアリールにより一又は二置換された）アミノ、イミノ、カルボキサミド、（任意で、例えばアルキル、アリール又はヘテロアリールにより一又は二置換された）カルバモイル、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、アリール（チオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アルアルコキシ、又は−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ、−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、若しくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ（ｎは１〜４であり、かつＲは、独立して、水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ−結合−ヘテロシクロアルキル）、−（Ｃ−結合−ヘテロシクロアルケニル）、−アリール、及び−ヘテロアリールから選択され、複数の置換が許容される）が挙げられる。置換基、例えばヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキル等、又は官能基、例えば−ＯＨ、−ＮＨＲ等は、場合によりこれら自体が置換されてもよいことは、当業者に理解される。置換される部分自体が、場合により置換されてもよいことはまた、当業者に理解される。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、リンカーＬが、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、及びヘテロアラルキレン基から選択される基ｍを含んでなり、各基は、任意で独立に置換されてもよく、該リンカーはさらに以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）の一つから独立して選択される部分ｎを含んでなり、ｍ＝ｎ＋１である。特定の実施形態では、ｍは２であり、かつｎは１である、あるいはｍが３であり、かつｎが２である。特定の実施形態では、該リンカーは、２又は３の置換されていないアルキレン基、及び未置換のアルキレン基と結合する、それぞれ１又は２のジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン若しくは尿素部分を含んでなる。
【００５９】
本発明の特定の実施形態では、該標的結合部分は、腫瘍細胞上に存在するエピトープと特異的に結合する。
【００６０】
本発明の特定の実施形態では、該標的結合部分は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ又は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープと特異的に結合する。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、該標的結合部分は、抗体又はこの抗原結合断片；抗体様タンパク質；及び核酸アプタマーからなる群から選択される。
【００６２】
本発明の特定の実施形態では、該抗体又はこの抗原結合断片は、ジアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体から選択される。
【００６３】
本発明の特定の実施形態では、該抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合したＦｖｓ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される。
【００６４】
特定の実施形態では、該抗体は、ハーセプチン若しくはＨＥＡ１２５、又はハーセプチン若しくはＨＥＡ１２５の抗原結合断片を含んでなる抗体断片である。
【００６５】
特定の実施形態では、二以上のアマトキシン分子が一つの標的結合部分と結合する。複合体あたりのアマトキシンの数の増加はまた、毒性を増加させる。従って、特定の実施形態では、標的結合部分とアマトキシンとの比は、１標的結合部分に対して２〜１５の間、特に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アマトキシン分子である。比の計算のために、抗体二量体、例えばＩｇＧの場合、二量体は、一つの標的結合部分として解釈される。
【００６６】
本発明の特定の実施形態では、該複合体は、医薬として用いられる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態では、該複合体が、患者における癌の治療に用いられ、該癌は、膵臓癌、胆管癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択される。
【００６８】
さらに別の態様では、本発明は、患者における癌の治療のための方法であって、該癌が、膵臓癌、胆管癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択され、本発明の複合体をこれらを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、方法に関する。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、「患者」とは、本明細書に記載される標的結合部分毒素複合体による治療から利益を受け得る任意の哺乳動物又は鳥類を意味する。好ましくは、「患者」は、実験動物（例えばマウス又はラット）、家畜動物（例えばモルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ又はイヌを含む）、又はヒトを含む霊長類からなる群から選択される。「患者」はヒトであることが特に好ましい。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、疾患又は障害を「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」又は「治療（treatment）」とは、（ａ）該障害の重症度を低減すること；（ｂ）治療される該障害に特徴的な症状の発症を制限又は予防すること；（ｃ）治療される該障害に特徴的な症状の悪化を阻止すること；（ｄ）該障害を過去に有していた患者における該障害の再発を制限又は予防すること；及び（ｅ）過去に該障害の症状を示した患者における症状の再発を制限又は予防することのうち１つ又は複数を達成することを意味する。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、該治療は、本発明の複合体又は医薬組成物を患者に投与することを含んでなり、「投与すること」とは、生体内投与、及び体外で、例えば静脈移植での組織への直接的投与を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、治療的有効量の本発明の複合体が用いられる。
【００７３】
「治療的有効量」とは、意図した目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所定の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療剤の投与対象の動物の大きさ及び種、並びに投与目的等の因子により変動し得る。各々の個別のケースにおける有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って当業者が経験的に決定することができる。
【００７４】
更なる態様では、本発明は、本発明による複合体を含んでなり、更に一又は複数の医薬的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存剤を含んでなる、医薬組成物に関する。
【００７５】
「医薬的に許容される」とは、連邦政府若しくは州政府の監督官庁により承認されていること、又は米国薬局方、若しくは動物、より具体的にはヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方にリストされていることを意味する。
【００７６】
特定の実施形態では、該医薬組成物は、全身的に投与される医薬品の形態で用いられる。これは、他の注射剤及び注入剤を含む非経口剤を含む。注射剤は、アンプルの形態で、又はいわゆる即用可能な（ready-for-use）注射剤、例えば即用可能（ready-to-use）な注射器若しくは使い捨ての注射器として、及びこれに加えて複数回の抜取りを行うための穿刺用フラスコ中に製剤化される。注射剤の投与は、皮下（s.c.）、筋肉内（i.m.）、静脈内（i.v.）又は皮内（i.c.）の適用の形態であってもよい。特に、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子又は（例えばハイドロゾルのような）コロイド分散系としてそれぞれ好適な注射製剤を製造することが可能である。
【００７７】
注射用製剤はさらに、水性等張希釈剤を用いて溶解又は分散させることができる濃縮物として製造することができる。注入剤を、等張溶液、脂肪性エマルション、リポソーム製剤及びマイクロエマルションの形態で調製することもできる。注射剤と同様に、注入製剤を、希釈用濃縮物の形態で調製することもできる。注射用製剤を、例えばミニポンプにより、入院療法及び通院療法の双方において持続性注入剤の形態で適用することもできる。
【００７８】
例えばアルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調整物質（pH-influencing substances）、錯体形成物質若しくは高分子物質を、特にタンパク質若しくは高分子に対する本発明の標的結合部分毒素複合体の吸着に影響を与えるための物質として、非経口薬剤配合物に添加することが可能であり、又は本発明の標的結合部分毒素複合体の吸着を低減させる目的で、注射機器のような材料、若しくは包装用材料、例えばプラスチック若しくはガラスにこれらを添加することもできる。
【００７９】
本発明の標的結合部分毒素複合体を、非経口剤におけるマイクロキャリア又はナノ粒子と、例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸又はポリエーテルウレタンに基づく微分散粒子等と結合させることができる。本発明の標的結合部分毒素複合体をそれぞれ微分散形態、分散形態及び懸濁形態で導入する場合、例えば「複数単位原理（multiple unit principle）」に基づき持続性製剤として、又は本発明の標的結合部分毒素複合体を製剤中に、例えば錠剤若しくは棒剤（rod）（その後埋め込まれる）中に封入する場合、医薬品中の結晶の懸濁液として若しくは「単一単位原理（single unit principle）」に基づき、非経口製剤を変更することもできる。単一単位製剤及び複数単位製剤のこれらの埋め込み剤又は持続性医薬品は多くの場合、いわゆる生分解性高分子、例えば乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレート、又は多糖等からなる。
【００８０】
非経口剤として製剤化される本発明の医薬組成物の製造時に添加される補助剤及び担体は、好ましくは滅菌水（aqua sterilisata（sterilized water））、ｐＨ値調整物質、例えば有機酸若しくは無機酸若しくは有機塩基若しくは無機塩基及びこれらの塩等、ｐＨ値調整用の緩衝物質、等張化用の物質、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース等、それぞれ界面活性剤（tensides）及び界面活性剤（surfactants）、並びに乳化剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標））、若しくは例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））等、脂肪油、例えば落花生油、大豆油若しくはヒマシ油等、脂肪酸の合成エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標））等、並びに高分子補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン等、有機溶媒の溶解度を増大させる添加剤、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコール等、又は錯体形成物質、例えばシトレート及び尿素等、保存料、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコール等、抗酸化剤、例えば亜硫酸ナトリウム等、並びに安定化剤、例えばＥＤＴＡ等である。
【００８１】
好ましい一実施形態において懸濁液として本発明の医薬組成物を製剤化する場合、本発明の標的結合部分毒素複合体の硬化を防止するための増粘剤、又は界面活性剤、及び堆積物の再懸濁能を確保するための高分子電解質、及び／又は錯体形成剤、例えばＥＤＴＡ等を添加する。様々な高分子との活性成分の複合体を得ることも可能である。かかる高分子の例としては、ポリエチレングリコール、ポリスチロール、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）又はポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルが挙げられる。本発明の標的結合部分毒素複合体を、包接化合物（例えばシクロデキストリンによる）の形態で液体製剤中に組み込むこともできる。特定の実施形態では、分散剤を、さらなる補助剤として添加することができる。凍結乾燥物の製造のために、足場剤（scaffolding agents）、例えばマンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、又は様々なゼラチンを用いることができる。
【００８２】
更なる態様では、本発明は、膵臓癌、胆管癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫を治療するための方法であって、これらを必要とする患者に、有効量の本発明の複合体又は医薬組成物を投与することを含む方法を対象とする。
【００８３】
別の態様では、本発明は、アマトキシン又はアマトキシンのアナログに接続されたリンカーＬに取り付けられた脱離基Ｘを含んでなるアマトキシン複合体形成用分子であって、リンカーＬは、アミノ酸４の１’−Ｎ原子によりアマトキシンと接続する、アマトキシン複合体形成用分子に関する。
【００８４】
かかる態様の特定の実施形態では、本発明は、式Ｉ
【００８５】
【化３】
2014508767.tif 000005
【００８６】
［式中、
Ｒ１＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｒ２＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｒ３＝ＮＨ2又はＯＨであり；
Ｒ４＝ＯＨ又はＯＣ1-6−アルキルであり；そして
Ｒ５＝Ｌ−Ｘであり；ここでＬはリンカーであり；そしてＸは標的結合部分の求核基により置き換えられ得る脱離基である］
のアマトキシン複合体形成用分子に関する。
【００８７】
特定の実施形態では、該求核基は、第一級アミンである。
【００８８】
特定の実施形態では、式Ｉのアマトキシン複合体形成用分子は、α−アマニチン（Ｒ１＝ＯＨであり；Ｒ２＝ＯＨであり；及びＲ３＝ＮＨ2である）の誘導体である。
【００８９】
特定の実施形態では、Ｒ４はＯ−Ｍｅである。
【００９０】
特定の実施形態では、該リンカーは、１〜８個、具体的には１〜６個、より具体的には１〜４個、最も具体的には２〜４個の原子長を有する。
【００９１】
特定の実施形態では、該リンカーＬは、任意で置換されたアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である。
【００９２】
特定の実施形態では、該リンカーＬは、以下の部分：ジスルフィド、エーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン、及び尿素部分の一つから選択される部分を含んでなる。
【００９３】
特定の実施形態では、官能基Ｘは、tブチルオキシ、スクシンイミジルオキシ、１−Ｏ−スクシンイミジルオキシ−３−スルホネート（スルホ−ＮＨＳ）、Ｏ−（４−ニトロフェニルオキシ）、Ｏ−（３−ニトロフェニルオキシ）、Ｏ−（２，４−ジニトロフェニルオキシ）、Ｏ−（２，４−ジクロロ−６−ニトロフェニルオキシ）、ペンタフルオロフェニルオキシ、ペンタクロロフェニルオキシ、Ｏ−（２，４，５−トリクロロフェニルオキシ）、Ｏ−（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）、Ｏ−（エンド−１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド−１−イル）、１−フタルイミドイルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−（７−アザ−ベンゾトリアゾリル）オキシ、及びＮ−イミダゾリルから選択される。
【００９４】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のアマトキシン複合体を合成するための方法であって、本発明のアマトキシン複合体形成用分子と求核基、特に第一級アミンを含んでなる標的結合部分とを反応させる工程を含む方法に関する。
【００９５】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のアマトキシン複合体形成用分子を合成するための方法であって、（ｉ）アマトキシンとリンカー分子Ｙ−Ｌ−Ｘ（Ｙは、アマトキシンのアミノ酸４の１’−Ｎ原子と反応し得る部分であり、Ｘは、標的結合部分の求核基、特に第一級アミンと置き換えることができる脱離基である）とを反応させる工程を含む方法に関する。
【００９６】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のアマトキシン複合体形成用分子を合成するための方法であって、（ｉ）アマトキシンとリンカー分子Ｙ−Ｌ−Ｚ（Ｙは、アマトキシンのアミノ酸４の１’−Ｎ原子と反応し得る部分であり、Ｚは、標的結合部分の求核基、特に第一級アミンと置き換えることができる脱離基Ｘに変換することができる部分である）とを反応させる工程を含む方法に関する。
【００９７】
特定の実施形態では、該アマトキシンは、リンカー分子Ｙ−Ｌ−Ｘ、又はＹ−Ｌ−Ｚ（Ｙは、Ｏ−Ｔｏｓ（Ｏ−Ｔｏｓ＝トシレート）；Ｉ；Ｂｒ、及びＯ−Ｔｆ（Ｏ−Ｔｆ＝トリフレート）からなる群から選択される）と反応する。特定のかかる実施形態では、該アマトキシンは、溶媒、特に極性溶媒、非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、又はＮＭＰ中で、塩基、特にＫＯtＢｕ、ＬｉＯＨ又はＮａＨの存在下で、それぞれＹ−Ｌ−Ｘ、又はＹ−Ｌ−Ｚで処理される。
【００９８】
特定の実施形態では、Ｚ基は、保護された第一級アミノ基、特にＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＯｔＢｕである。特定のかかる実施形態では、保護された第一級アミノ基は、最初に脱保護され、その後炭酸誘導体、例えばジヒドロキシスクシンイミドカルボネート（ＤＳＣ）により活性化される。
【００９９】
別の態様では、本発明は、式Ｉのアマトキシン−リンカー分子であって、ここでＲ１〜Ｒ４は上記で定義された通りであり；Ｒ５＝Ｌ−Ｚであり；Ｌがリンカーであり；そしてＺが標的結合部分の求核基、特に第一級アミンにより置き換えることができる脱離基Ｘに変換することができる部分であるアマトキシン−リンカー分子に関する。
【実施例】
【０１００】
以下において、非限定的な実施例により、本発明をより詳細に説明する。
実施例１
Ｎ１’リンカーアマニチンの合成
１．１  Ｎ１’−６−アミノヘキシル−６’−Ｏ−メチル−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０３７８）の調製
【０１０１】
【化４】
2014508767.tif 000006
【０１０２】
４．８６ｍｇ（５．２１μｍｏｌ）Ｏ−メチル−α−アマニチンを５００μｌ乾燥ＤＭＳＯに溶解した。アルゴン雰囲気下で、１１．６８ｍｇ（４１．６７μｍｏｌ）Ｂｏｃ−アミノヘキシルブロミド及び１００μｌのＤＭＳＯ中カリウムｔ−ブタノラートの５２．１ｍＭ溶液を添加した。さらに５．２１ｍＭストック溶液のカリウムｔ−ブタノラート部分を１．５時間において５０μｌ；４時間において５０μｌ；６時間において５０μｌ添加した。１９時間後、１００μｌカリウムｔ−ブタノラート及び１１．９６ｍｇ（４１．６７μｍｏｌ）Ｂｏｃ−アミノヘキシルブロミドを添加した。２１時間後、該反応混合物を１０４μｌの１００ｍＭ  ＤＭＳＯ中酢酸溶液でクエンチした。該粗生成物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：２６．０ｍｌ／分、λ＝２９５ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  １００％Ａ；５〜２０分  ０％Ａ；２０〜２５分  ０％Ａ；２５〜２７分  １００％Ａ；２７〜３５分  １００％Ａ）。１９．２〜２０．９分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を固体状態になるまで蒸発させた。
【０１０３】
４．８１ｍｇ（８１％）ＨＤＰ  ３０．０３６８；ＭＳ：１１３３（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１０４】
【化５】
2014508767.tif 000007
【０１０５】
４．７５ｍｇ（４．１９μｍｏｌ）ＨＤＰ  ３０．０３６８を２００μｌトリフルオロ酢酸に溶解し、２分間撹拌した。該反応混合物を室温で乾燥するまで蒸発させ、１０００μｌトルエン及び１００００μｌアセトニトリルで共蒸発させた。該粗生成物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：２６．０ｍｌ／分、λ＝２９５ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  １００％Ａ；５〜２０分  ０％Ａ；２０〜２５分  ０％Ａ；２５〜２７分  １００％Ａ；２７〜３５分  １００％Ａ）。保持時間１４．９〜１５．５分を含む画分を回収し、溶媒を蒸発させ、粉末状態になるまで凍結乾燥させた。
【０１０６】
１．５４ｍｇ（３２％）ＨＤＰ  ３０．０３７８；ＭＳ：１０３３（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０１０７】
１．２  Ｎ１’−８−アミノオクチル−６’−Ｏ−メチル−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０５１６）の調製
【０１０８】
【化６】
2014508767.tif 000008
【０１０９】
１２．４３ｍｇ（１３．３２μｍｏｌ）Ｏ−メチル−α−メチルアマニチンを７５０μｌ乾燥ＤＭＳＯに溶解した。４０．００ｍｇ（１２９．７６μｍｏｌ）Ｎ−Ｂｏｃ−８−アミノブロモオクタン及び１２０μｌのＤＭＳＯ／水（１：１）中０．１Ｍ  ＬｉＯＨ溶液を添加した。該反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。１８時間後、にさらに８０μｌ  ＬｉＯＨを添加し、その後３６時間後に４０μｌ、３９時間後に５０μｌ、４４時間後に８０μｌを添加した。ＤＭＳＯ及び水を高真空下において除去し、残余物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２３０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。３７．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１１０】
白色粉末として３．９６ｍｇ（２６％）ＨＤＰ  ３０．０４９６。ＭＳ：１１６０（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１１１】
【化７】
2014508767.tif 000009
【０１１２】
３．９６ｍｇ（３．４１μｍｏｌ）ＨＤＰ  ３０．０４９６を３００μｌトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で２．５分間撹拌した。該反応混合物を１０００μｌトルエンで希釈し、室温で乾燥状態まで蒸発させた。該残余物を等量のトルエンで２回共蒸発させた。該残余物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２３０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。２１．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１１３】
白色粉末として２．６６ｍｇ（７４％）ＨＤＰ  ３０．０５１６。ＭＳ：１０６０（Ｍ＋Ｈ+）；１０８３（Ｍ＋Ｎａ+）。
【０１１４】
１．３  Ｎ１’−６−アミノブチル−６’−Ｏ−メチル−α−アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０５９２の調製
【０１１５】
【化８】
2014508767.tif 000010
【０１１６】
１１．８８ｍｇ（１２．７４μｍｏｌ）Ｏ−メチル−α−アマニチンを５００μｌ乾燥ＤＭＳＯに溶解した。アルゴン雰囲気下で、２０．００ｍｇ（７９．３２μｍｏｌ）Ｂｏｃ−アミノブチルブロミド及び８３．４μｌのカリウムｔ−ブタノラートの０．２５ｍＭ溶液を添加した。追加分の２０．００ｍｇ（７９．３２μｍｏｌ）Ｂｏｃ−アミノブチルブロミド及び８３．４μｌカリウムｔ−ブタノラートを、反応期間中、１時間ごとに添加した。該反応混合物を８時間後、１００μｌの酢酸でクエンチした。該粗生成物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水）、流速：１５．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：１００％水。溶媒Ｂ：１００％メタノール。勾配：０分  ９５％Ａ；０〜５分  ５０％Ａ；５〜１０分  ３０％Ａ；１０〜２０分  ２０％Ａ；２０〜４５分  ５％Ａ）。１６．５分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を蒸発させた。
【０１１７】
５．１０ｍｇ（３６％）ＨＤＰ  ３０．０５８７；ＭＳ：１１０４．５（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１１８】
【化９】
2014508767.tif 000011
【０１１９】
５．１０ｍｇ（４．６１μｍｏｌ）ＨＤＰ  ３０．０５８７を１０００μｌトリフルオロ酢酸に溶解し、２分間撹拌した。該反応混合物を室温で乾燥状態まで蒸発させ、真空下で乾燥させた。該粗生成物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ、（メタノール／水）、流速：１５．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：５％水：９５％メタノール０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０分  １００％Ａ；０〜５分  ５０％Ａ；５〜１０分  ３０％Ａ；１０〜２０分  ２０％Ａ；２０〜４５分  ０％Ａ）。１０．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を蒸発させた。
【０１２０】
白色粉末として３．４８ｍｇ（７５％）ＨＤＰ  ３０．０５９２。ＭＳ：１００４．４（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１２１】
１．４  Ｎ１’−６−アミノペンチル−６’−Ｏ−メチル−α−アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０６４４の調製
【０１２２】
【化１０】
2014508767.tif 000012
【０１２３】
８．４０ｍｇ（９．００μｍｏｌ）Ｏ−メチル−α−メチルアマニチンを４００μｌ乾燥ＤＭＳＯに溶解した。２９．００ｍｇ（１０８．９４μｍｏｌ）Ｎ−Ｂｏｃ−５−アミノブロモペンタン及び１４．２０μｌの１Ｍ水中ＬｉＯＨ溶液を添加した。該反応混合物をアルゴン雰囲気下で、室温で撹拌した。４時間後、さらに７．１０μｌ  ＬｉＯＨを添加した。該反応混合物を６時間後に１００μｌ酢酸でクエンチし、ＤＭＳＯ及び水を高真空下において除去した。該残余物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水）、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水）、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール。溶媒Ｂ：５％水：９５％メタノール。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。３０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１２４】
ＨＤＰ  ３０．０６３６を白色粉末として得た。ＭＳ：  １１１８．５（Ｍ＋Ｈ+）。該生成物を次の工程に用いた。
【０１２５】
【化１１】
2014508767.tif 000013
【０１２６】
ＨＤＰ  ３０．０６３６を４００μｌトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で５分間撹拌した。該反応混合物を１０００μｌトルエンで希釈し、室温で乾燥状態まで蒸発させた。該固体残余物を等量のトルエン（２ｘ）で共蒸発させ、ＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。１８．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１２７】
０．５１ｍｇ白色粉末（全体としてのの収率６％）ＨＤＰ  ３０．０６４４。ＭＳ：１０１８．４（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１２８】
１．５  Ｎ１−ｔ−ブチルプロピオニル−６−Ｏ−メチル−α−アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０６７８の調製
【０１２９】
【化１２】
2014508767.tif 000014
【０１３０】
７．０４ｍｇ（７．５５μｍｏｌ）Ｏ−メチル−α−メチルアマニチンを５００μｌ乾燥ＤＭＳＯに溶解した。１４．１０μｌの水中１Ｍ  ＬｉＯＨ溶液を添加した。該反応混合物をアルゴン雰囲気下で５分間室温で撹拌し、２０μｌ  １−クロロプロピオン酸−ｔ−ブチルエステルを添加した。１時間後、さらに、２０．００μｌ  ＬｉＯＨ及び２０．００μｌ  １−クロロプロピオン酸−ｔ−ブチルエステルを添加した。該反応混合物を２時間後に１００μｌ酢酸でクエンチした。ＤＭＳＯ及び水を高真空下で除去し、該残余物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ、（メタノール／水）、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール。溶媒Ｂ：５％水：９５％メタノール。勾配：０−５分  ８０％Ａ；５−１０分  ５０％Ａ；１０−２０分  ３０％Ａ；２０−５０分  ２０％Ａ）。２６．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１３１】
白色固体としてＨＤＰ  ３０．０６７７を得た。ＭＳ：１０４７．４（Ｍ＋Ｈ+）。該残余物を次の工程に用いた。
【０１３２】
【化１３】
2014508767.tif 000015
【０１３３】
ＨＤＰ  ３０．０６７７を５００μｌトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で４分撹拌した。該反応混合物を室温で乾燥状態まで蒸発させた。該残余物を５ｍｌトルエンで２回共蒸発させた。該白色残余物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ、（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。１８．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１３４】
１．９０ｍｇ（２５％）ＨＤＰ  ３０．０６７８  白色粉末。ＭＳ：９９１．３（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１３５】
１．６  Ｎ１’−４−Ｂｏｃ−アミノメチルベンジル−６’−Ｏ−メチル−α−アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０６８３の調製
【０１３６】
【化１４】
2014508767.tif 000016
【０１３７】
８．９０ｍｇ（９．５４μｍｏｌ）Ｏ−メチル−α−メチルアマニチンを５００μｌ乾燥ＤＭＳＯに溶解した。２１．４μｌの１Ｍ水中ＬｉＯＨ溶液を添加した。該反応混合物をアルゴン雰囲気下で室温において１０分撹拌し、２０．０ｍｇ（７８．４０μｍｏｌ）４−Ｂｏｃアミノベンジルクロリドを一度添加した。１８時間後、反応該混合物を１００μｌ酢酸でクエンチした。ＤＭＳＯ及び水を高真空下で除去し、該残余物をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ（メタノール／水）、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ、（メタノール／水）、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール。溶媒Ｂ：５％水：９５％メタノール。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。３４．０分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させ、白色残余物として、ＨＤＰ  ３０．０６８０を得た。ＭＳ：１１５２．５（Ｍ＋Ｈ＋）。該生成物を次の工程に用いた。
【０１３８】
【化１５】
2014508767.tif 000017
【０１３９】
ＨＤＰ  ３０．０６８０を５００μｌトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で１０分間撹拌し、そして室温で乾燥状態まで蒸発させた。該残余物を４ｍｌトルエンで２回共蒸発させた。該白色粉末をＬａＰｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｘ２０ｍｍ、（メタノール／水（０．０５％ＴＦＡ））、流速：１０．０ｍｌ／分、λ＝２９０ｎｍにおいて検出。溶媒Ａ：９５％水：５％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。溶媒Ｂ：１０％水：９０％メタノール、０．０５％トリフルオロ酢酸。勾配：０〜５分  ８０％Ａ；５〜１０分  ５０％Ａ；１０〜２０分  ３０％Ａ；２０〜５０分  ２０％Ａ）。１８．４分の保持時間を含む画分を回収し、溶媒を真空下で蒸発させた。
【０１４０】
白色粉末として３．１５ｍｇ（３１％）ＨＤＰ  ３０．０６８３。ＭＳ：１０５２．４（Ｍ＋Ｈ+）。
【０１４１】
実施例２
アマトキシン複合体の合成
ＨＤＰ  ３０．０３７８複合体Ｈｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８［２．８］の合成
【０１４２】
【化１６】
2014508767.tif 000018
【０１４３】
１．０ｍｇＨＤＰ  ３０．０３７８を１００μｌ乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。アルゴン雰囲気下で室温において撹拌し、１０．４μｌのＤＭＦ中ジヒドロキシスクシンイミドカルボネート（ＤＳＣ）（１００μｌＤＭＦ中２．５６ｍｇ）の溶液及び２．１μｌトリエチルアミンを一度に添加した。該反応混合物を室温で撹拌した。１２時間後、３０ｍｌの冷却したジエチルエーテルを添加した。沈殿物を回収し、ジエチルエーテルで数回洗浄し、真空下で乾燥させた。残った固体を２００μｌＤＭＦ＝溶液Ａに溶解した。１２．０ｍｇハーセプチンを４．０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）＝溶液Ｂに溶解した。溶液Ａと溶液Ｂを合わせた。ハーセプチンアマニチン−リンカー溶液を４℃で１４時間振盪し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲル濾過クロマトグラフィー（ＸＫ−１６カラム；２ｍｌ／分）により分離した。Ｇ−２５カラムを５００ｍｌＰＢＳ溶液ｐＨ＝７．４で予め洗浄した。Ｈｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８複合体画分をＵＶ吸収により検出した。タンパク質濃度をＲｏｔｉＱｕａｎｔ−アッセイ（Carl Roth; Germany）により決定した。ハーセプチンのアマニチンペイロード（payload）をＡ＝２８０ｎｍ及びＡ＝３１０ｎｍにおけるＵＶ吸収の測定により決定した。各ハーセプチン分子について２．８アマニチン分子の毒性ペイロードを計算した。
【０１４４】
実施例３
インビトロにおけるＨＥＲ２−陽性腫瘍細胞株に対するＨｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８［２．８］の細胞毒性
Ｈｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８［２．８］の細胞毒性活性を、インビトロでＨＥＲ２−陽性腫瘍細胞株ＳＫ−ＯＶ−３（ovar）及び化学発光ＢｒｄＵ取り込みアッセイ（Roche Diagnostics）を用いて評価した。細胞生存率を、３７℃及び５％ＣＯ２において、様々な濃度のＨｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８［２．８］での７２時間のインキュベーション後、BMG Labtech Optimaマイクロプレートリーダーにおいて、抗−ＢｒｄＵ−ＨＲＰ抗体を用いた固定化した細胞及び透過処理した細胞の測定により決定した。用量反応曲線のＥＣ50値を、Graphpad  Prism 4.0ソフトウェアにより計算した。ＳＫ−ＯＶ−３細胞を用いたＨｅｒ−ＤＳＣ−３０．０３７８［２．８］についてのＥＣ50は、４．１ｘ１０−１１Ｍであった（図２を参照のこと）。
【図１】
2014508767.tif 000020
【図２】
2014508767.tif 000021
【国際調査報告】
2014508767.tif 000022
2014508767.tif 000023