(57)【要約】本発明は、B7-H3を発現する間葉系間質細胞の組成物、組織修復におけるそれらのその後の使用、組織修復細胞を作製する改善された方法、およびCD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法を提供する。2014515263.tif 000011
2014515263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された間葉系間質細胞組成物であって、該間葉系間質細胞がB7-H3（B7 homolog 3）を発現する、組成物。
【請求項２】
B7-H3（B7 homolog 3）を発現する間葉系間質細胞を含む、単離された細胞組成物。
【請求項３】
間葉系間質細胞が、5回未満の継代培養の後、非増殖性となる、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
間葉系間質細胞が不死化されている、請求項1または2記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも90％の細胞がCD90を発現する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも80％の細胞がCD90を発現する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも70％の細胞がCD90を発現する、請求項1または2記載の組成物。
【請求項８】
25％未満の生存CD45+細胞を含む、請求項2記載の細胞組成物。
【請求項９】
間葉系間質細胞が造血細胞に由来する、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
間葉系間質細胞が、培養中、接着性である、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
間葉系間質細胞が、培養中、分化しない、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
T細胞活性化を阻害する、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
Th2/CD8リンパ球の増殖を促進する、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
間葉系間質細胞がCD90+かつCD105+である、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
間葉系間質細胞がCD146+かつCD73+である、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
間葉系間質細胞が単核細胞に由来する、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
単核細胞が、動員された末梢血、骨髄、臍帯血、または胎児肝臓に由来する、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
細胞の表面上にB7-H3（B7 homolog 3）を安定的に発現するよう遺伝子操作された間葉系間質細胞。
【請求項１９】
（a）2μg/ml未満のウシ血清アルブミンと、
（b）1μg/ml未満の酵素的に活性な採集用試薬と、を含有しており、かつ
（c）マイコプラズマ、内毒素、および微生物の汚染が実質的にない、
前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
前記請求項のいずれか一項記載の組成物をそれを必要とする患者へ投与する工程を含む、組織の再生または修復の方法。
【請求項２１】
組織が、心組織、骨組織、ニューロン組織、皮膚組織、肺組織、唾液腺組織、肝組織、および膵組織からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
B7-H3ポリペプチドおよび／またはVSIG4（V-set and Ig domain-containing 4）ポリペプチドの存在下で単核細胞を培養する工程を含む、造血系、間葉系、および内皮系の細胞の混合集団を含む細胞組成物を作製する方法であって、該組成物が5〜75％の生存CD90+細胞を含有しており、該組成物中の残りの細胞が、CD45+、CD31+、CD14+、かつauto+であることを特徴とする、方法。
【請求項２３】
B7-H3ポリペプチドおよび／またはVSIG4ポリペプチドの存在下で単核細胞を培養する工程、ならびに培養物からCD14+である自家蛍光性マクロファージを単離する工程を含む、CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法。
【請求項２４】
請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物の存在下で単核細胞を培養する工程、および培養物からCD14+である自家蛍光性マクロファージを単離する工程を含む、CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法。
【請求項２５】
マクロファージが、マーカー：CD45、CD163、またはCD206のうちの少なくとも1種を発現する、請求項23または24記載の方法。
【請求項２６】
培養する工程が、
細胞を培養するためのバイオチャンバーを準備する工程；
該バイオチャンバー内で細胞を培養するための培養培地を準備する工程；
該バイオチャンバーへ細胞を接種する工程；および
該細胞を培養する工程
によって実施される、請求項22〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
所定の培養期間の後、生体適合性の第一の濯ぎ溶液によりバイオチャンバーから培養培地を排除する工程；
第一の濯ぎ溶液を細胞採集用酵素溶液に置換する工程；
インキュベーションの間に、酵素が、少なくとも細胞を相互にかつ／またはバイオチャンバー表面から解離させるよう、所定の期間、バイオチャンバーの内容物をインキュベートする工程；
酵素が排除された後、チャンバーが第二の濯ぎ溶液で実質的に満たされるよう、第二の濯ぎ溶液によって酵素溶液を排除する工程；
チャンバーにおいて所定の減少した液量とするため、気体により第二の濯ぎ溶液の一部分を排除する工程；
固着した細胞を懸濁させるため、チャンバーを撹拌する工程；および
懸濁細胞を含む溶液を細胞収集容器へ排出させる工程
をさらに含む、請求項26記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、2011年5月18日出願の米国仮出願第61/487,558号に基づく優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、間葉系間質細胞の組成物、組織修復におけるそれらのその後の使用、組織修復細胞を作製する改善された方法、およびCD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
再生医療は、再生細胞、例えば、幹細胞および／または前駆細胞（即ち、身体の未分化万能細胞）の、無限に自己再生し、成熟分化細胞へと発達する能力を、臨床的な目標に向けて利用する。幹細胞は、発生初期の胚、胎児組織、ならびにいくつかの成体の器官および組織に見出される。胚性幹細胞（以後「ESC」と呼ぶ）は、身体の細胞型および組織型の全てではないにしても多くになることが公知である。ESCは、個体の遺伝情報を全て含有しているのみならず、身体の200種を越える細胞および組織のいずれかになる新生能力も含有している。従って、これらの細胞は、再生医療のための極めて大きな可能性を有する。例えば、ESCを、心臓、肺、または腎臓のような特定の組織へ成長させることができ、次いで、それらを、傷害および疾患を有する器官を修復するために使用することができる。しかしながら、ESCに由来する組織は、臨床的な限界を有する。ESCは、必然的に、他の個体、即ち、胚に由来するため、レシピエントの免疫系が、新たな生物学的材料を拒絶するというリスクが存在する。そのような拒絶を防止するために免疫抑制薬が利用可能ではあるが、そのような薬物は、細菌感染およびウイルスに対するもののような望ましい免疫応答も阻止することが公知である。
【０００４】
さらに、ESCの起源、即ち、胚についての倫理的な討論がよく記録に留められており、付加的な、おそらく、当分の間は克服し得ない障壁となっている。
【０００５】
成体幹細胞（以後、交換可能に「ASC」と呼ぶ）は、ESCの使用の代替法である。ASCは、多くの非胎児組織にひそかに存在し、外傷またはその他の破壊的な疾患過程に応答して、損傷を受けた組織を治癒させることができるよう、待機していると推測されている。特に、最近の科学的証拠は、細胞および組織の全てではないにしても多くの型になる能力をESCと共有している可能性のあるASCのプールを、各個体が保持していることを示している。従って、ASCはESCと同様に、再生医療の臨床的適用のための極めて大きな可能性を有する。
【０００６】
ASC集団は、骨髄、皮膚、筋肉、肝臓、および脳のうちの一つまたは複数に存在することが示されている。しかしながら、これらの組織におけるASCの頻度は低い。例えば、骨髄における間葉幹細胞の頻度は、有核細胞100,000個中、1個〜1,000,000個中1個と推定されている。従って、そのような組織に由来するASCの提唱された臨床的適用には、細胞精製および細胞培養の過程によって、細胞の数、純度、および成熟度を増加させることが必要である。
【０００７】
細胞培養工程は、細胞の数、純度、および成熟度の増加を提供し得るが、それはある犠牲を伴う。この犠牲には、以下の技術的問題のうちの一つまたは複数が含まれ得る：細胞老化による細胞機能の損失、可能性のある有用な細胞集団の損失、細胞の患者への可能性のある適用の遅延、金銭的コストの増加、培養中の細胞への環境微生物汚染のリスクの増加、および採集された細胞と共に含有されている培養材料を激減させるための、さらなる培養後処理の必要性。
【０００８】
より具体的には、全ての最終細胞生成物が、Federal Drug Administration（FDA）により課された厳格な要件を満たさなければならない。FDAは、全ての最終細胞生成物が、ヒト対象においてアレルゲン作用を生じ得ることが公知の「外来性」タンパク質を最小限であり、かつ汚染リスクが最小限であることを要求する。さらに、FDAは、70％という最低細胞生存率を期待しており、いかなる過程も一貫してこの最低要件を越えていなければならない。
【０００９】
不要な溶解培養成分から細胞を分離するための方法および装置が既に存在し、多様な装置が、現在、臨床的に使用されているが、そのような方法および装置には、重大な問題がある：例えば、細胞の生存率および生物学的機能の低下、ならびに遊離の細胞DNAおよび砕片の増加によって示される、分離過程において適用される機械的な力により引き起こされる細胞傷害。さらに、全ての細胞を分離装置へ移すことも、全ての細胞を装置から抽出することも不可能であるため、細胞の相当の損失が起こり得る。さらに、混合細胞集団について、これらの方法および装置は、より大きくより脆弱な亜集団が優先的に損失することによって細胞プロファイルのシフトを引き起こす場合がある。
【００１０】
従って、実質的に高い生存率および機能性を有し、細胞の培養および採集のために必要とされた材料が実質的に激減している、患者へ直接投与可能な細胞組成物が、組織修復、組織再生、および組織工学のような細胞治療の領域において必要とされている。さらに、細胞治療生成物としてのこれらの組成物の臨床的実行および大規模商業化のために適当なこれらの組成物の作製を可能にする、信頼性のある過程および装置が、必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、間葉系間質細胞がB7-H3（B7 homolog 3）を発現する、単離された間葉系間質細胞組成物を提供する。B7-H3を発現する間葉系間質細胞を含む、単離された細胞組成物も、本明細書において提供される。本発明は、細胞の表面上にB7-H3を安定的に発現するよう遺伝子操作された間葉系間質細胞をさらに提供する。
【００１２】
本発明の細胞組成物は、5回未満の継代培養の後、非増殖性となる間葉系間質細胞を含み得る。あるいは、本発明の細胞組成物は、培養中、分化しない間葉系間質細胞を含み得る。任意で、間葉系間質細胞は不死化されていてもよい。好ましくは、本発明の細胞組成物は、CD90を発現する細胞を、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％含む。好ましい態様において、本発明の細胞組成物は、25％未満の生存CD45+細胞を含む。本発明の間葉系間質細胞は、培養中、接着性であり得る。
【００１３】
細胞組成物の間葉系間質細胞は、造血細胞または単核細胞に由来し得る。単核細胞は、動員された末梢血、骨髄、臍帯血、または胎児肝臓に由来する。
【００１４】
本発明の細胞組成物は、T細胞活性化を阻害するか、またはTh2型CD8（Th2/CD8）リンパ球の増殖を促進する。
【００１５】
本発明の細胞組成物は、CD90+かつCD105+である間葉系間質細胞を含み得る。好ましくは、本発明の細胞組成物は、CD90+、CD105+、CD146+、かつCD73+である間葉系間質細胞を含み得る。別の好ましい態様において、本発明の細胞組成物は、2μg/ml未満のウシ血清アルブミン；1μg/ml未満の酵素的に活性な採集用試薬を含有しており；マイコプラズマ、内毒素、および微生物の汚染が実質的にない。
【００１６】
本発明は、本発明の細胞組成物をそれを必要とする患者へ投与することによる、組織の再生または修復の方法も提供する。組織は、心組織、骨組織、ニューロン組織、皮膚組織、肺組織、唾液腺組織、肝組織、および膵組織からなる群より選択される。
【００１７】
本発明の別の局面は、B7-H3ポリペプチドおよび／またはVSIG4（V-set and Ig domain-containing 4）ポリペプチドの存在下で単核細胞を培養することによって、5〜75％の生存CD90+細胞を含有し、組成物中の残りの細胞が、CD45+、CD31+、CD14+、かつauto+であることを特徴とする、造血系、間葉系、および内皮系の細胞の混合集団を含む細胞組成物を作製する方法である。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、B7-H3ポリペプチドおよび／またはVSIG4（V-set and Ig domain-containing 4）ポリペプチドの存在下で単核細胞を培養し、培養物からCD14+である自家蛍光性マクロファージを単離することにより、CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法を提供する。
【００１９】
本発明の細胞組成物の存在下で単核細胞を培養し、培養物からCD14+である自家蛍光性マクロファージを単離することにより、CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法も、本発明に含まれる。
【００２０】
いずれの方法においても、マクロファージは、マーカーCD45、CD163、またはCD206のうちの少なくとも1種を発現する。培養は、細胞を培養するためのバイオチャンバーを準備し；バイオチャンバー内で細胞を培養するための培養培地を準備し；バイオチャンバーへ細胞を接種し；細胞を培養することによって実施される。培養は、所定の培養期間の後、生体適合性の第一の濯ぎ溶液によりバイオチャンバーから培養培地を排除する工程；第一の濯ぎ溶液を細胞採集用酵素溶液に置換する工程；インキュベーションの間に、酵素が、少なくとも細胞を相互にかつ／またはバイオチャンバー表面から解離させるよう、所定の期間、バイオチャンバーの内容物をインキュベートする工程；酵素が排除された後、チャンバーが第二の濯ぎ溶液で実質的に満たされるよう、第二の濯ぎ溶液によって酵素溶液を排除する工程；チャンバーにおいて所定の減少した液量とするため、気体によって第二の濯ぎ溶液の一部分を排除する工程；固着した細胞を懸濁させるため、チャンバーを撹拌する工程；および懸濁細胞を含む溶液を細胞収集容器へ排出させる工程をさらに含み得る。
【００２１】
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である方法および材料を、本発明の実施または試行において使用することができるが、適当な方法および材料を、以下に記載する。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によりその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
【００２２】
本発明のその他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲より明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】TRC（IXMYELOCEL-T）のマイクロアレイ遺伝子発現分析を示す。
【図１Ｂ】TRC（IXMYELOCEL-T）のマイクロアレイ遺伝子発現分析を示す。
【図２Ａ】CD90+MSCのB7H3発現およびCD14+マクロファージにおけるVSIG4発現を証明するTRC（IXMYELOCEL-T）のFACS分析を示す。
【図２Ｂ】CD90+MSCのB7H3発現およびCD14+マクロファージにおけるVSIG4発現を証明するTRC（IXMYELOCEL-T）のFACS分析を示す。
【図２Ｃ】CD90+MSCのB7H3発現およびCD14+マクロファージにおけるVSIG4発現を証明するTRC（IXMYELOCEL-T）のFACS分析を示す。
【図３】B7H3中和抗体がTH1/TH2リンパ球分化を改変することを示す。
【図４】同種異系T細胞増殖に対する応答の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、幹細胞および前駆細胞が増加した混合細胞集団（本明細書中、「組織修復細胞」または「TRC」と呼ぶ）が、B7-H3（B7 homolog 3）を発現する間葉系間質細胞を含有しているという驚くべき発見に基づく。細胞はインビトロで免疫応答をモジュレートする。これは、自己間葉系間質細胞におけるB7H3の構成的発現の最初の報告である。間葉系間質細胞は、CD90+を発現し、造血系の細胞に由来する。驚くべきことに、本発明の間葉系間質細胞は、間葉幹細胞とは対照的に、培養中、実質的に増殖せずかつ分化しない。
【００２５】
組織修復細胞（TRC）は、虚血組織修復における臨床的有効性を示した、自己の、骨髄由来の、造血細胞型および間葉系間質細胞から構成される混合細胞生成物である。4人の異なるドナーに由来する骨髄単核細胞（BMMNC）の全般的遺伝子発現プロファイルを、培養後の対応する自己TRC生成物と比較する、マイクロアレイを使用した遺伝子発現研究を実施した。データは、IL-2受容体（2.33倍、p＜0.00025）、ICOS/CTLA-4（2.79倍；p＜0.00094）、およびCD69（4.08倍；p＜0.000018）を含む、T細胞活性化に関与する多数の転写物が、有意に下方制御されることを証明した。同時に、これらの研究は、TRC製造過程における自己間葉系間質細胞の増殖中に有意に上方制御されるB7スーパーファミリーの2種のメンバー、B7H3（2.65倍；p＜0.000091）およびVSIG4（4.23倍；p＜0.00042）を同定した。これらの結果は、VSIG4およびB7H3の両方について、FACSおよび抗体を使用した表現型分析により確認される。T細胞活性化の負の調節因子であるVSIG4は、CD14+マクロファージにより同時発現された。しかしながら、B7H3は、CD90+/CD105+間葉系間質細胞により排他的に同時発現され、CD45+造血細胞においては同時発現されなかった。さらに、本発明者らは、同種異系混合リンパ球反応において、B7H3を発現する自己間葉系間質細胞の機能的意義を評価し、γインターフェロンまたは抗CD3抗体による刺激の後ですら、TRCが同種異系混合リンパ球応答においてT細胞活性化を阻害することを見出した。これらの結果は、TRCがインビトロでT細胞活性化を阻害することを証明している。
【００２６】
従って、本発明は、間葉系間質細胞がB7-H3またはB7H3（B7 homolog 3）を発現する、単離された間葉系間質細胞組成物を提供する。B7-H3（B7 homolog 3）を発現する間葉系間質細胞を含有している細胞組成物も、本発明に含まれる。いくつかの局面において、これらの組成物は、CD90を発現する細胞を、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％含有している。いくつかの局面において、これらの組成物は、25％未満、20％未満、10％未満、または5％未満のCD45+細胞を含有している。間葉系間質細胞組成物は、培養中、実質的に増殖しない。例えば、間葉系間質細胞組成物は、5回未満の継代培養の後、非増殖性となる（即ち、細胞分裂を行わない）。いくつかの局面において、間葉系間質細胞組成物は、4回、3回、2回、または1回の継代培養の後、非増殖性となる。間葉系間質細胞はCD90+かつCD105+である。任意で、間葉系間質細胞はCD146+かつCD73+である。あるいは、間葉系間質細胞はCD90+、CD105+、CD146+、かつCD73+である。細胞は造血系の細胞に由来する。好ましくは、細胞は単核細胞に由来する。単核細胞は、動員された末梢血、骨髄、臍帯血、または胎児肝臓に由来する。組成物は、T細胞活性化を阻害し、リンパ球分化を改変し、Th2型CD8（Th2/CD8）細胞を増強する（即ち、その増殖を促進する）。
【００２７】
細胞組成物は、本発明の間葉系間質細胞組成物をそれを必要とする患者へ投与することによる、組織の再生または修復のために有用である。組織は、例えば、心組織、骨組織、ニューロン組織、皮膚組織、肺組織、唾液腺組織、肝組織、または膵組織より選択される。
【００２８】
本発明の間葉系間質細胞は、B7-H3を使用し、任意で、CD90およびCD105を使用したポジティブ選択により、TRC組成物から単離され得る。ポジティブ選択の方法は、当技術分野において公知である。
【００２９】
本発明の間葉系間質細胞は、インビボで増殖し得るよう不死化されてもよい。細胞を不死化する方法は、当技術分野において公知である。
【００３０】
細胞の表面上にB7-H3ポリペプチドを安定的に発現するよう遺伝子操作された間葉系間質細胞、即ち、CD90+細胞も、本発明に含まれる。任意で、細胞は、培養中、増殖し得るよう、さらに不死化される。
【００３１】
B7-H3ポリペプチド、VSIG4、または両方の存在下で、単核細胞を培養する工程を含む、TRCを培養する改善された過程も、本発明に含まれる。CD14+である自家蛍光性（auto+）マクロファージの実質的に精製された集団が、さらに含まれる。CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に精製された集団は、TRCを培養し、CD14+である自家蛍光性マクロファージを単離する改善された過程を使用して、作製される。
【００３２】
TRCの単離、精製、特徴決定、および培養はWO/2008/054825に記載されており、その内容は参照によりその全体が組み入れられる。
【００３３】
本発明は、B7-H3ポリペプチドおよび／またはVSIG4（V-set and Ig domain-containing 4）ポリペプチドの存在下で単核細胞を培養することにより、5〜75％の生存CD90+細胞を含有し、組成物中の残りの細胞がCD45+、CD31+、CD14+、かつauto+であることを特徴とする、造血系、間葉系、および内皮系の細胞の混合集団を含む細胞組成物を作製する方法も提供する。
【００３４】
B7-H3ポリペプチドおよび／またはVSIG4（V-set and Ig domain-containing 4）ポリペプチドの存在下で単核細胞を培養し、培養物からCD14+である自家蛍光性マクロファージを単離することにより、CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法が、さらに提供される。
【００３５】
本発明の細胞組成物の存在下で単核細胞を培養し、培養物からCD14+である自家蛍光性マクロファージを単離することにより、CD14+である自家蛍光性マクロファージの実質的に純粋な集団を作製する方法も、本発明に含まれる。
【００３６】
いずれの方法においても、マクロファージは、マーカーCD45、CD163、またはCD206のうちの少なくとも1種を発現する。培養は、細胞を培養するためのバイオチャンバーを準備し；バイオチャンバー内で細胞を培養するための培養培地を準備し；バイオチャンバーへ細胞を接種し；細胞を培養することによって実施される。培養は、所定の培養期間の後、生体適合性の第一の濯ぎ溶液によりバイオチャンバーから培養培地を排除する工程；第一の濯ぎ溶液を細胞採集用酵素溶液に置換する工程；インキュベーションの間に、酵素が、少なくとも細胞を相互にかつ／またはバイオチャンバー表面から解離させるよう、所定の期間、バイオチャンバーの内容物をインキュベートする工程；酵素が排除された後、チャンバーが第二の濯ぎ溶液で実質的に満たされるよう、第二の濯ぎ溶液により酵素溶液を排除する工程；チャンバーにおいて所定の減少した液量とするため、気体により第二の濯ぎ溶液の一部分を排除する工程；固着した細胞を懸濁させるため、チャンバーを撹拌する工程；および懸濁細胞を含む溶液を細胞収集容器へ排出させる工程をさらに含み得る。
【００３７】
B7-H3を発現しているMSCは、組織修復、組織再生、および組織工学を含む多様な治療法のために有用である。例えば、TRCは、骨再生、心再生、血管再生、神経再生、および虚血障害の処置において有用である。虚血状態には、四肢虚血、うっ血性心不全、心虚血、腎虚血およびESRD、発作、ならびに眼の虚血が含まれるが、これらに限定されない。さらに、MSCにより産生される免疫調節性サイトカインのため、MSCは、多様な免疫疾患および炎症性疾患の処置においても有用である。免疫疾患および炎症性疾患には、例えば、糖尿病（I型およびII型）、炎症性腸疾患（IBD）、移植片対宿主病（GVHD）、乾癬、同種異系の細胞、組織、または器官の拒絶（寛容誘導）、心疾患、脊髄損傷、慢性関節リウマチ、骨関節炎、人工股関節置換術による炎症、クローン病、全身性エリテマトーデス（SLE）、慢性関節リウマチ（RA）、および多発性硬化症（MS）のような自己免疫疾患が含まれる。本発明の別の局面において、間葉系間質細胞は、血管形成を誘導するためにも有用である。
【００３８】
間葉系間質細胞は、組織の修復または再生を達成するため、哺乳動物対象、例えば、ヒトへ投与される。間葉系間質細胞は、同種異系または自己に投与される。
【００３９】
記載された間葉系間質細胞は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含有している薬学的または生理学的に許容される調製物または組成物として投与され得、ヒトおよび非ヒト動物を含む関心対象のレシピエント生物の組織へ投与され得る。間葉系間質細胞含有組成物は、無菌生理食塩水またはその他の生理学的に許容される注射可能水性液体のような適当な液体または溶液に、細胞を再懸濁させることにより調製され得る。そのような組成物において使用される成分の量は、当業者によって定型的に決定され得る。
【００４０】
間葉系間質細胞またはその組成物は、TMSC懸濁物を吸収性または粘着性の材料、即ち、コラーゲンスポンジマトリックスに置き、関心対象の部位へTRC含有材料を挿入することによって投与されてもよい。あるいは、間葉系間質細胞は、皮下、静脈内、筋肉内、および胸骨内を含む、非経口注射経路によって投与されてもよい。その他の投与方式には、心外膜、心臓内、鼻腔内、くも膜下腔内、皮内、経皮、経腸、および舌下が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一つの態様において、間葉系間質細胞の投与は、胸腔鏡検査のような内視鏡手術により媒介されてもよい。
【００４１】
注射可能投与のため、組成物は、無菌の溶液もしくは懸濁物であってもよいし、または、薬学的かつ生理学的に許容される水性もしくは油性の媒体に再懸濁させられてもよく、それらは、保存剤、安定剤、および溶液または懸濁物をレシピエントの体液（即ち、血液）と等張にするための材料を含有していてもよい。使用するために適当な賦形剤の非限定的な例には、水、リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）、0.15M水性塩化ナトリウム溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノール等、およびそれらの混合物が含まれる。例示的な安定剤は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、それらは、単独で使用されてもよいしまたは混和物として使用されてもよい。使用される量（amounts）または量（quantities）および投与経路は、個別に決定され、当業者に公知の類似の型の適用または適応症において使用される量に相当する。
【００４２】
本発明と一致して、間葉系間質細胞は、肝臓、膵臓、肺、唾液腺、血管、骨、皮膚、軟骨、腱、靭帯、脳、毛髪、腎臓、筋肉、心筋、神経、骨格筋、関節、および四肢を含む身体組織へ投与され得る。
【００４３】
間葉系間質細胞懸濁物の中の細胞数および投与方式は、処置される部位および状態に依って変動し得る。
【００４４】
組織修復細胞（TRC）
TRCは、単核細胞から作製された造血細胞系、間葉細胞系、および内皮細胞系の細胞の混合物を含有している。単核細胞は、成体、少年、胎児、または胚の組織から単離される。例えば、単核細胞は、動員された末梢血、骨髄、末梢血、臍帯血、または胎児肝組織に由来する。TRCは、例えば、出発材料として使用される単核細胞集団と比較して、表現型および機能の両方の違いを有する独特の細胞組成物をもたらすインビトロ培養過程によって、単核細胞から作製される。さらに、TRCは、高い生存率と、作製中に使用される成分の低い残存レベルとの両方を有する。
【００４５】
TRCの生存率は、少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い。生存細胞は、測定可能な細胞生存率を有する細胞である。生存率は、トリパンブルー排除のような当技術分野において公知の方法によって測定され得る。細胞生存率は、代謝活性の測定（例えば：MTT［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイ、ATP［アデノシン三リン酸］アッセイ）、組織培養における生存および成長（例えば、増殖アッセイ）、機能アッセイ、代謝物取り込み（例えば、蛍光に基づくアッセイ）、構造改変、ならびに膜完全性（例えば、LDH（乳酸脱水素酵素）アッセイ）を含むが、これらに限定されない、多様な細胞生存率アッセイを使用して測定されてもよい。各生存率アッセイ法は、細胞生存率の異なる定義に基づく。この増強された生存率は、TRC集団を組織修復においてより有効にし、さらに、最終細胞生成物の貯蔵寿命および凍結保存可能性を増加させる。
【００４６】
作製中に使用される成分とは、ウマ血清、ウシ胎児血清のような培地培地成分、および細胞採集のための酵素溶液を意味するが、これらに限定されない。酵素溶液には、トリプシン（動物由来、微生物由来、もしくは組換え）、様々なコラゲナーゼ、代替的な微生物由来の酵素、解離剤、一般的なプロテアーゼ、またはこれらの混合物が含まれる。これらの成分の除去は、それを必要とする対象へのTRCの安全な投与を提供する。
【００４７】
好ましくは、本発明のTRC組成物は、10μg/ml未満、5μg/ml未満、4μg/ml未満、3μg/ml未満、2μg/ml未満、1μg/ml未満のウシ血清アルブミン；（酵素活性により決定される）5μg/ml未満、4μg/ml未満、3μg/ml未満、2μg/ml未満、1μg/ml未満、0.9μg/ml未満、0.8μg/ml未満、0.7μg/ml未満、0.6μg/ml未満、0.5μg/ml未満の採集用酵素を含有しており、マイコプラズマ、内毒素、ならびに微生物（例えば、好気性、嫌気性、および真菌）の汚染が実質的にない。
【００４８】
内毒素が実質的にない、とは、1日当たり体重1kg当たり5EUの全内毒素、平均的な70kgのヒトの場合、TRCの全用量当たり350EUである、生物製剤についてFDAにより認可されているものより少ない、TRCの1用量当たりの内毒素が存在することを意味する。
【００４９】
マイコプラズマおよび微生物の汚染が実質的にない、とは、当業者に公知の一般に認められている試験について、読み取り陰性であることを意味する。例えば、マイコプラズマ汚染は、ブロス培地においてTRC生成物試料を継代培養し、適切な陽性対照および陰性対照と共に、37℃で、1日目、3日目、7日目、および14日目に、寒天プレート上に播くことによって決定される。生成した試料の外観を、陽性対照および陰性対照のものと、100倍の顕微鏡下で比較する。さらに、指標細胞培養物の接種物を、3日間および5日間インキュベートし、DNA結合蛍光色素を使用して、落射蛍光顕微鏡検により、マイコプラズマの存在について600倍で調査する。寒天法および／またはブロス培地法ならびに指標細胞培養法がマイコプラズマ汚染の証拠を示さない場合、その生成物は良好であると見なされる。
【００５０】
生成物に微生物汚染がないことを証明するための無菌性試験は、U.S.Pharmacopedia Direct Transfer Methodに基づく。この手法は、採集前の培地流出物および予め濃縮された試料を、トリプティックソイブロス培地および液体チオグリコール酸培地を含有しているチューブへ接種することを必要とする。これらのチューブを、14日間のインキュベーションの間、混濁した外観（濁度）について定期的に観察する。いずれかの培地におけるいずれかの日における混濁した外観は汚染を示し、透明な外観（成長なし）の試験は、汚染が実質的にないことを示す。
【００５１】
クローン原性コロニーを形成するTRC内の細胞の能力を、BMMNCと比較して、決定した。造血コロニー（CFU-GM）および間葉コロニー（CFU-F）の両方をモニタリングした（表1）。表1に示されるように、培養により、CFU-Fは280倍に増加し、CFU-GMはわずかに減少した。
【００５２】
（表１）
2014515263.tif 000003
結果は、8回の臨床規模実験からの平均値±SEMである。
【００５３】
TRC組成物の細胞を、細胞表面マーカー発現により特徴決定した。表2は、出発BMMNCおよびTRCについてのフローサイトメトリーにより測定された典型的な表現型を示す（表2を参照のこと）。これらの表現型および機能の違いは、単核細胞出発組成物からTRCを高度に区別する。
【００５４】
（表２）
2014515263.tif 000004
M＝間葉系、H＝造血系、E＝内皮系。結果は、4回の臨床規模実験の平均値である。
【００５５】
造血系、間葉系、および内皮系のマーカーを調査した。出発BMMNCとTRC生成物とを比較する4回の実験からの平均結果が、図に示される。CD11b骨髄系、CD14auto-単球、CD34前駆細胞、およびCD3リンパ様を含む、大部分の造血系細胞がわずかに減少し、CD14auto+マクロファージが81倍に増加する。CD90+およびCD105+/CD166+/CD45-/CD14-により定義される間葉系細胞は、最大373倍に増加する。成熟血管内皮細胞（CD144/CD146）およびCXCR4/VEGFR1+支持細胞を含む、血管新生に関与し得る細胞は、6〜21倍に増加する。
【００５６】
大部分の造血系細胞は、これらの培養において増加しないが、最終生成物は、まだ80％近くのCD45+造血細胞、およびおよそ20％のCD90+間葉細胞を含有している。
【００５７】
TRCは、それが由来した単核細胞集団と比較して、CD90+細胞について高度に濃縮されている。TRC組成物中の細胞は、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、またはそれより多くが、CD90+である。TRC組成物中の残りの細胞はCD45+である。あるいは、TRC組成物中の残りの細胞は、CD45+、CD31+、CD14+、かつ／またはauto+である。好ましくは、TRC組成物中の細胞は、約5〜75％が生存CD90+である。様々な局面において、CD90+の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、またはそれより多くが、CD15+でもある（表3を参照のこと）。さらに、CD90+はCD105+でもある。
【００５８】
（表３）
2014515263.tif 000005
【００５９】
対照的に、骨髄単核細胞（BMMNC）の中のCD90+集団は、典型的には1％未満であり、その結果、CD45+細胞が、BMMNCの中の有核細胞の99％超を構成している。従って、出発単核細胞集団と比較して、TRC組成物においては、成熟造血細胞の多くの有意な減少が存在する（表2を参照のこと）。
【００６０】
造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞のこの独特の組み合わせは、単核細胞と明確に異なるのみならず、細胞治療において現在使用されている他の細胞組成物とも明確に異なる。表4は、間葉幹細胞および脂肪由来幹細胞と比較した、TRCの細胞表面マーカープロファイルを示す（Deans RJ,Moseley AB.2000.Exp.Hematol.28:875-884；Devine SM.2002.J Cell Biochem Supp 38:73-79；Katz AJ,et al.2005.Stem Cells.23:412-423；Gronthos S,et al.2001.J Cell Physiol 189:54-63；Zuk PA,et al.2002.Mol Biol Cell.13:4279-95.）。
【００６１】
例えば、間葉幹細胞（MSC）は、CD90+について高度に精製されており（95％超がCD90+）、（もし存在するとしても）極めて低い割合がCD45+である。脂肪由来幹細胞は、より可変性であるが、やはり、典型的には、95％超のCD90+を有し、CD45+血球はほとんど組成物中に含まれない。BMMNCから培養され、CD49cを同時発現するMSCとは異なる純粋なCD90集団をもたらす、多能性成体前駆細胞（MAPC）も存在する。使用されているその他の幹細胞は、CD34+細胞、AC133+細胞、およびCD34+lin-細胞を含む、高度に精製された細胞型であり、それらは本来、組成物中にCD90+細胞をほとんど乃至全く含まず、従って、TRCとは実質的に異なる。
【００６２】
細胞マーカー分析は、本発明の方法に従い単離されたTRCが、CD14+細胞、auto+細胞、CD34+細胞、およびVEGFR+細胞のより高い割合を有することも証明した。
【００６３】
（表４）
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【００６４】
TRC集団の中に存在する細胞型の各々は、様々な免疫調整特性を有する。単球／マクロファージ（CD45+、CD14+）は、T細胞活性化を阻害し、マクロファージによるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）発現を示す（Munn D.H.and Mellor A.L.,Curr Pharm Des.,9:257-264(2003)；Munn D.H.,et al.J Exp Med.,189:1363-1372(1999)；Mellor A.L.and Munn D.H.,J.Immunol,170:5809-5813(2003)；Munn D H.,et al.,J.Immunol.,156:523-532(1996)）。単球およびマクロファージは、炎症および組織修復を調節する（Duffield J.S.,Clin Sci(Lond),104:27-38(2003)；Gordon,S.;Nat.Rev.Immunol,3:23-35(2003)；Mosser,D.M.,J.Leukoc.Biol.,73:209-212(2003)；Philippidis P.,et al.,Circ.Res.,94:119-126(2004)）。これらの細胞は、寛容および移植免疫抑制も誘導する（Fandrich F et al.Hum.Immunol.,63:805-812(2002)）。調節性T細胞（CD45+CD4+CD25+）は、損傷後の自然炎症応答を調節する（Murphy T.J.,et al.,J.Immunol.,174:2957-2963(2005)）。T細胞は、自己寛容の維持ならびに自己免疫疾患の防止および抑制も担う（Sakaguchi S.et al.,Immunol.Rev.,182:18-32(2001)；Tang Q.,et al.,J.Exp.Med.,199:1455-1465(2004)）。T細胞は移植寛容も誘導し維持し（Kingsley C.I.,et al.J.Immunol.,168:1080-1086(2002)；Graca L.,et al.,J.Immunol.,168:5558-5565(2002)）、移植片対宿主病も阻害する（Ermann J.,et al.,Blood,105:2220-2226(2005)；Hoffmann P.,et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,293:265-285(2005)；Taylor P.A.,et al,Blood,104:3804-3812(2004)）。間葉幹細胞（CD45+CD90+CD105+）は、IDOを発現し、T細胞活性化を阻害し（Meisel R.,et al.,Blood,103:4619-4621(2004)；Krampera M.,et al.,Stem Cells,(2005)）、さらに、抗炎症活性を誘導する（Aggarwal S.and Pittenger M.F.,Blood,105:1815-1822(2005)）。
【００６５】
TRCは、PDL1（programmed death ligand 1）の発現の増加も示す。PDL1の発現の増加は、抗炎症性サイトカインIL-10の産生に関連している。PDL1発現は非炎症状態に関連している。TRCは、炎症誘導に応答してPDL1発現の増加を有し、これは、TRCの抗炎症特性の別の局面を示している。
【００６６】
TRCは、BMMNCとは対照的に、創傷修復と炎症の制御された下方制御との両方のための強力な活性を有する、少なくとも5種の別個のサイトカインおよび1種の調節酵素も産生する。具体的には、TRCは、（1）インターロイキン-6（IL-6）、（2）インターロイキン-10（IL-10）、（3）血管内皮増殖因子（VEGF）、（4）単球走化性タンパク質1（MCP-1）、および（5）インターロイキン1受容体アンタゴニスト（IL-1ra）を産生する。これらの5種のサイトカインの特徴は、下記表5に要約される。
【００６７】
（表５）TRCにより発現されるサイトカインの特徴
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【００６８】
TRCの付加的な特徴には、インターロイキンα（IL-1α）、インターロイキンβ（IL-1β）、インターフェロンγ（IFNγ）、最も顕著には、インターロイキン12（IL-12）を含む、Th1炎症経路を活性化することが公知のある種の中心的メディエーターを、自発的には産生し得ないか、または極めて低レベルに産生する点が含まれる。重要なことに、TRCは、培地置換培養または灌流培養においても、細菌リポ多糖（LPS）のような公知の炎症性刺激による意図的な誘導の後にも、これらの後者のTh1型サイトカインを自発的には産生しない。TRCは、抗CD3 mAbによるT細胞誘発の後にのみ、低レベルのIFNγを産生した。最後に、本発明の方法により作製されたTRCは、抗炎症性サイトカインIL-6およびIL-10をより多く産生し、炎症性サイトカインIL-12をより少なく産生する。
【００６９】
さらに、TRCは、インドールアミン-2,-3ジオキシゲナーゼ（IDO）と名付けられた重要な免疫調節酵素の発現について誘導可能である。本発明に係るTRCは、インターフェロンγによる誘導により、より高レベルのIDOを発現する。IDOは、動物モデルおよびヒトにおいて、新生の炎症性応答および進行中の炎症性応答の両方を下方制御することが証明されている（Meisel R.,et al.,Blood,103:4619-4621(2004)；Munn D.H.,et al.,J.Immunol.,156:523-532(1996)；Munn D.H.,et al.J.Exp.Med.189:1363-1372(1999)；Munn D.H.and Mellor A.L.,Curr.Pharm.Des.,9:257-264(2003)；Mellor A.L.and Munn D.H.,J.Immunol.,170:5809-5813(2003)）。
【００７０】
上述のように、TRCは、CD90およびCD15を同時発現する細胞の集団について高度に濃縮されている。
【００７１】
CD90は、複数の系統へ分化することができる幹細胞および前駆細胞に存在する。これらの細胞は、異なる分化状態にある細胞の不均一な集団である。細胞の分化状態を定義する細胞マーカーが、胚起源または胎児起源の幹細胞において同定されている。これらのマーカーのうちの1種、CD15とも呼ばれるSSEA-1は、マウス胚性幹細胞に見出されるが、ヒト胚性幹細胞には発現されない。しかしながら、それは、マウスおよびヒトの両方において神経幹細胞に検出されている。CD15は、ヒトの骨髄または脂肪組織に由来する精製された間葉幹細胞にも発現されない（表6を参照のこと）。従って、CD90およびCD15の両方を同時発現するTRC内の細胞集団は、独特の細胞集団であり、CD90成体由来細胞の幹様状態を定義し得る。
【００７２】
従って、本発明の別の局面において、CD90およびCD15の両方を発現する細胞集団を、さらに濃縮することができる。さらに濃縮する、とは、細胞組成物が、CD90+CD15+細胞を、5％、10％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％含有していることを意味する。細胞表面マーカーに対する抗体を使用したポジティブ選択またはネガティブ選択のような、当技術分野において公知の方法により、CD90+CD15+細胞についてTRCをさらに濃縮することができる。CD90+CD15+細胞についてさらに濃縮されたTRCは、心臓の修復および再生において特に有用である。
【００７３】
（表６）
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【００７４】
CD90+CD15+のCFU-Fおよび骨形成能を査定した。CD90+細胞を除去すると、全てのCFU-Fおよびインビトロ骨形成能がほとんどなくなる。驚くべきことに、（CD90がCD15を発現しない）MSC培養物においては、CD90の全体的な出現度合いおよびCFU-Fがより高いが、TRCにおいては、CD90細胞1個当たりのCFU-Fの相対数が劇的により高い。これは、CD90細胞が、精製された細胞集団として成長するTRCにおいて、はるかに強力であることを証明する。
【００７５】
TRCの作製法
TRCは、骨髄単核細胞（BMMNC）を含有している任意の哺乳動物組織から単離される。BMMNCのための適当な起源は、末梢血、骨髄、臍帯血、または胎児肝臓である。血液が、しばしば使用されるが、それは、この組織が容易に入手されるためである。哺乳動物には、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、またはブタが含まれる。
【００７６】
TRCを生成するための培養法は、従来の細胞分画法を使用して、赤血球および多核細胞のいくらかを除去することによる、出発材料（例えば、組織）からのBMMNCの濃縮によって開始する。例えば、細胞を、FICOLL（登録商標）密度勾配分離を使用することにより分画する。培養のために必要とされる出発材料の体積は、典型的には、小さく、例えば、培養を開始するために十分な量の細胞を提供するため、40〜50mLである。しかしながら、出発材料の任意の体積を使用し得る。
【００７７】
次いで、自動細胞カウンタを使用して、有核細胞濃度を査定し、出発材料の濃縮された画分を、バイオチャンバー（細胞培養容器）へ接種する。バイオチャンバーへ接種される細胞の数は、チャンバーの容量に依る。本発明に従って使用され得るTRC培養は、培養物1ml当たり104〜109細胞の細胞密度で実施される。Aastrom Replicell Biochamberが使用される時、2〜3×108個の全細胞が、およそ280mLの体積へ接種される。
【００７８】
接種前に、バイオチャンバーに培養培地を注入する。例示的に、本発明に従って使用される培地は、3種の基本成分を含む。第一の成分は、IMDM、MEM、DMEM、RPMI1640、α培地、もしくはマッコイ培地から構成された培地成分、または等価な公知の培養培地成分である。第二は、ウマ血清またはヒト血清を少なくとも含み、任意で、ウシ胎仔血清、ウシ新生仔血清、および／またはウシ血清をさらに含む血清成分である。任意で、当技術分野において公知の無血清培養培地が使用されてもよい。第三の成分は、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ソルメドロール、またはこれらの組み合わせのような副腎皮質ステロイド、好ましくは、ヒドロコルチゾンである。培養培地は、B7H3ポリペプチド、VSIG4ポリペプチド、または両方の組み合わせをさらに含む。Aastrom Replicell Biochamberが使用される時、培養培地は、IMDM、約10％ウシ胎児血清、約10％ウマ血清、約5μMヒドロコルチゾン、および4mM L-グルタミンからなる。次いで、細胞および培地を、培養過程の間、制御された勾配灌流スケジュールで、バイオチャンバーに通す。細胞を、2日間、4日間、6日間、8日間、10日間、12日間、14日間、16日間、またはそれより多く培養する。好ましくは、細胞を、12日未満、培養する。理論によって拘束されないが、B7H3ポリペプチド、VSIG4ポリペプチド、または両方の添加は、TRC、特に、CD45+、CD31+、CD14+、かつauto+細胞集団の急速な増殖を可能にするであろうと考えられる。この急速な増殖は、培養時間を大きく短縮するであろう。それは、ヒトへの移植のために適当な細胞を製造する時、特に有利である。
【００７９】
例えば、Aastrom Replicell System Cell Cassetteと共に使用される時、培養物は、5％CO2および20％O2で、37℃で維持される。
【００８０】
これらの培養は、典型的には、ほぼ生理学的なpH、即ち、6.9〜7.6で実施される。培地は、1〜20体積％酸素、好ましくは、3〜12体積％酸素を含有している、酸素含有雰囲気に相当する酸素濃度で維持される。O2濃度の好ましい範囲とは、細胞付近のO2の濃度をさし、培地表面にあるかまたは膜を通るO2導入の点における濃度とは限らない。
【００８１】
標準的な培養スケジュールとしては、毎週実施される一回の交換、または週2回実施される培地および血清の半分の交換として、培地および血清が毎週交換されることが必要である。1ml当たり2×106〜1×107細胞の密度で培養された細胞の場合、好ましくは、培養物の栄養培地は、約24〜約48時間当たり培養物1ml当たり約1mlの率で、連続的にまたは定期的に、置換され、好ましくは、灌流される。1ml当たり1×104〜2×106細胞の細胞密度の場合、同一の培地交換率が使用され得る。従って、1ml当たり約107細胞の細胞密度の場合、当培地置換率は、約24〜約48時間当たり107細胞当たり1mlの培地として表され得る。1ml当たり107細胞より高い細胞密度の場合、培地交換率は、単位時間当たりの1細胞当たりの一定の培地および血清の流入を達成するため、比例的に増加し得る。
【００８２】
骨髄細胞を培養する方法は、（参照により本明細書に組み入れられる）Lundell,et al.,"Clinical Scale Expansion of Cryopreserved Small Volume Whole Bone Marrow Aspirates Produces Sufficient Cells for Clinical Use," J.Hematotherapy(1999)8:115-127に記載されている。骨髄（BM）吸引液を、等張緩衝生理食塩水（Diluent 2、Stephens Scientific,Riverdale,NJ）で希釈し、Coulter ZM細胞カウンタ（Coulter Electronics,Hialeah,FL）を使用して有核細胞を計数する。赤血球（無核）を、Manual Lyse（Stephens Scientific）を使用して溶解し、25℃での20分間の300gにおける密度勾配遠心分離（Ficoll-Paque（登録商標）Plus、Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）（比重1.077）により、単核細胞（MNC）を分離する。4mM L-グルタミン（GIBCO BRL,Grand Island,NY）、10％ウシ胎仔血清（FBS）（Bio-Whittaker,Walkersville,MD）、10％ウマ血清（GIBCO BRL）、20μg/mlバンコマイシン（Vancocin（登録商標）HCl、Lilly,Indianapolis,IN）、5μg/mlゲンタマイシン（Fujisawa USA,Inc.,Deerfield,IL）、および5μMヒドロコルチゾン（Solu-Cortef（登録商標）、Upjohn,Kalamazoo,MI）が補足されたイスコブ変法ダルベッコ培地（IMDM）である長期BM培養培地（LTBMC）により、BMMNCを2回洗浄した後、培養する。
【００８３】
細胞保管
培養後、細胞を、例えば、トリプシンを使用して採集し、成長培地を除去するために洗浄する。血清アルブミンが補足された薬学用電解質溶液、例えば、Isolyte（B.Braun Medical Inc.,Bethlehem,PA）に、細胞を再懸濁させる。
【００８４】
あるいは、下記の洗浄採集法を使用して、採集前にバイオチャンバー内で細胞を洗浄する。任意で、採集後、細胞を濃縮し、解凍中の細胞凝集を阻害するために10％DMSO（Cryoserv、Research Industries,Salt Lake City,UT）、10％HSA（Michigan Department of Public Health,Lansing,MI）、および200μg/ml組換えヒトDNAse（Pulmozyme（登録商標）、Genentech,Inc.,South San Francisco,CA）を含有している凍結保護ストック溶液を使用して、250ml cryocyte凍結容器（Baxter Healthcare Corporation,Irvine,CA）のような生体適合性の容器において凍結保管する。cryocyte凍結容器を、予め冷却されたカセットに移し、速度制御凍結（Model 1010、Forma Scientific,Marietta,OH）により凍結保管する。凍結細胞を、液体窒素フリーザー（CMS-86、Forma Scientific）に直ちに移し、液相で保管する。濃縮培養物の好ましい体積は、約5mL〜約15mlの範囲である。より好ましくは、細胞は体積7.5mLに濃縮される。
【００８５】
培養後
バイオチャンバーから採集された時、細胞は、細胞の培養を支持するために必要とされた様々な溶解成分と、培養中に細胞により産生された溶解成分とからなる溶液の中に存在する。これらの成分の多くは、安全でないか、またはその他の点で患者への投与のために不適当である。従って、ヒトにおいて治療的に使用可能な細胞を産出するためには、細胞治療適用における細胞の保管およびヒトへの投与のために適当な薬学用の注射可能電解質溶液のような、所望の組成を有する新たな溶液に、培養溶液を置換することにより、細胞から溶解成分を分離することが必要とされる。
【００８６】
多くの分離過程に関連した重大な問題は、例えば、細胞の生存率および生物学的機能の低下、ならびに遊離の細胞DNAおよび砕片の増加により示される、これらの過程の間に適用される機械的な力により引き起こされる細胞傷害である。さらに、全ての細胞を分離装置へ移すことも、全ての細胞を装置から抽出することも不可能であるため、細胞の相当の損失が起こり得る。
【００８７】
分離戦略は、一般的に、遠心分離または濾過のいずれかの使用に基づく。遠心分離の一例は、COBE 2991 Cell Processor（COBE BCT）であり、濾過分離の一例は、CYTOMATE（登録商標）Cell Washer（Baxter Corp）である（表7）。いずれも、採集された細胞から溶解培養成分を分離（洗浄）するために使用され得る、市販されている最先端の自動分離装置である。表7に見られるように、これらの装置は、細胞生存率の有意な下落、細胞の総量の減少、およびTRCの大きく脆弱なCD14+auto+亜集団が優先的に損失することによる細胞プロファイルのシフトをもたらす。
【００８８】
（表７）2種の異なる細胞分離装置の性能に関する3種の異なる研究
2014515263.tif 000009
【００８９】
当技術分野におけるこれらの限界は、ヒトにおいて使用するために適当な細胞集団を産出するための製造および作製の過程の実行において問題を起こす。分離過程は、細胞への傷害を最小限にし、それによって、細胞の最小限の損失と共に、高い生存率および生物学的機能を保持しつつ、不要な溶解成分が激減した細胞溶液をもたらすことが望ましい。さらに、安全でない最終生成物をもたらすであろう微生物的汚染物の導入のリスクを最小化することが重要である。細胞のより少ない操作および移動は、このリスクを本質的に減少させるであろう。
【００９０】
本開示に記載された本発明は、機械的な力への細胞の曝露を最小化し、回復し得ない細胞の欠陥を最小限にする、細胞を洗浄するための分離過程を実行することによって、現在の当技術分野におけるこれらの限界の全てを克服する。その結果として、細胞への傷害（例えば、生存率または機能の低下）、細胞の損失、および細胞プロファイルのシフトが、全て、最小化される一方で、不要な溶解培養成分が効率的に分離される。好ましい実行において、分離は、細胞が培養されるのと同一の装置内で実施されるため、別の装置を使用する場合に追加される、移動および分離による汚染のリスクが取り除かれる。本発明に係る洗浄過程を、以下に説明する。
【００９１】
洗浄採集
細胞をバイオチャンバーから除去（採集）した後、培養材料から細胞を分離（洗浄）するため別の装置に移す従来の培養過程とは対照的に、洗浄採集技術は、順序を逆にし、バイオチャンバーから細胞を採集する前に全ての分離（洗浄）工程を完了する独特の手段を提供する。
【００９２】
細胞から培養材料を分離するため、所望の組成の新たな液体（または気体）を、好ましくは、バイオチャンバーの中心に、好ましくは、所定の制御された流速で、導入することができる。これにより、液体が、例えば、開口部48を通して、バイオチャンバーの周囲に沿って排除され放出される。それを、廃物バッグ76に収集することができる。
【００９３】
本発明のいくつかの態様において、バイオチャンバー内の液体スペースの直径は、約33cmであり、液体スペースの高さは、約0.33cmであり、濯ぎ液および／または採集用の液をバイオチャンバーへ添加する流速は、毎分約0.03〜1.0体積の交換（VE）、好ましくは、毎分0.50〜約0.75VEである。これは、約8.4〜約280mL/分、好ましくは、140〜約210ml/分に実質的に相当する。いくつかの態様によると、培養細胞の過半数がバイオチャンバーに保持され、廃物バッグへ失われないこと、および過程を完了するために過度に長い期間を必要としないことを確実にするのを流速および速度は補助する。一般に、チャンバー内の細胞の量は、104〜108細胞/mLの範囲であり得る。TRCについて、量は、上記のバイオチャンバー寸法の場合、30〜3億個の全細胞に相当する、105〜106細胞/mLの範囲であり得る。当然、当業者は、細胞量がバイオチャンバー寸法の変化により変化することを理解するであろう。
【００９４】
いくつかの態様によると、バイオチャンバーからの培養細胞の採集において、以下の過程に従うことができ、それは下記表3に広く概説される。バイオチャンバーへ導入される溶液は、バイオチャンバーの中心へ添加される。廃物培地バッグ76は、液体または気体がバイオチャンバーへ導入される各工程の後に排除された対応する液体を収集することができる。従って、細胞が培養された後、バイオチャンバーは、条件培養培地（例えば、IMDM、10％FBS、10％ウマ血清、培養中に細胞により分泌された代謝物）で満たされており、約30〜約3億個の細胞を含む。次いで、約1.5〜約2.0リットルの全体積がバイオチャンバーから放出されるまで、0.9％NaCl溶液（「濯ぎ溶液」）を、毎分約140〜210mLで、バイオチャンバーへ導入することができる（工程1）。
【００９５】
バイオチャンバーへの新たなまたは異なる液体の導入のための1体積の交換は、バイオチャンバー内の以前の液体を有意に減少させるが、以前の液体は、ある程度の量、残存するであろう。従って、新たな／異なる液体の付加的な体積の交換によって、以前の液体は有意に激減するであろう。
【００９６】
任意で、関心対象の細胞が、TRCのような接着細胞である時、濯ぎ溶液は採集用溶液に置換される。採集用溶液は、典型的には、培養表面に接着した細胞の剥離を可能にする酵素溶液である。採集用溶液は、例えば、0.9％NaCl中の0.4％トリプシン／EDTAを含み、それを、約400〜約550mlの全体積が送達されるまで、毎分約140〜210mLでバイオチャンバーへ導入することができる（工程2）。その後、バイオチャンバーの培養表面に接着した細胞の酵素的な剥離を可能にするため、所定の期間を経過させる（例えば、13〜17分）（工程3）。
【００９７】
酵素溶液を排除するため、約2〜約3リットルの全体積が送達されるまで、毎分約140〜210mLで、0.5％HSAが補足されたIsolyte（B Braun）を導入することができる（工程4）。
【００９８】
この点で、細胞からの不要な溶液（培養培地、酵素溶液）の分離は、実質的に完了している。
【００９９】
収集体積を減少させるため、開示された流速でバイオチャンバーへ導入される気体（例えば、空気）を使用して、Isolyte溶液のうちのいくらかを、好ましくは、排除する（工程5）。これは、バイオチャンバーの現在の体積のうちのおよそ200〜250ccを排除するために使用され得る。
【０１００】
次いで、固着した細胞を溶解させるため、バイオチャンバーを撹拌することができる（工程6）。次いで、この細胞懸濁物を、細胞採集バッグ70（またはその他の容器）へ排出させることができる（工程7）。他の残存細胞を濯ぐため、付加的な量の第二の溶液をバイオチャンバーに添加することができ、2回目の撹拌を行うことができる（工程8＆9）。次いで、この最終濯ぎ液を採集バッグ70に添加することができる（工程10）。
【０１０１】
（表８）洗浄採集プロトコル
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【０１０２】
他の態様
本発明を、その詳細な説明と共に記載したが、上記の説明は、本発明を例示するためのものであって、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するためのものではない。その他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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