(57)【要約】  対象における創傷治癒を促進する方法を開示している。この方法は、グランザイムＢ（グランザイムＢ）阻害剤を創傷に適用することを含む。創傷は、皮膚創傷であることができる。グランザイムＢ阻害剤は、核酸、または抗体を含むがこれらに限定されないペプチド、または小分子から構成され得る。【選択図】図１
2014500271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ（Granzyme B）阻害剤を対象に投与し、それにより前記対象における創傷治癒を促進することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法。
【請求項２】
創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ（Granzyme B）阻害剤を創傷に適用し、それにより対象における創傷治癒を促進することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法。
【請求項３】
前記創傷が慢性創傷である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記慢性創傷が慢性皮膚創傷である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記慢性皮膚創傷が褥創である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚裂傷を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより前記対象における皮膚裂傷を予防することを含む、対象の皮膚裂傷を予防する方法。
【請求項１２】
前記皮膚裂傷が慢性創傷に付随する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記皮膚裂傷が老化に付随する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
創傷の皮膚肥厚性瘢痕化を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより創傷の肥厚性瘢痕化を阻害することを含む、創傷の肥厚性瘢痕化を阻害するための方法。
【請求項２０】
細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象におけるコラーゲン組織を増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を前記対象の皮膚に適用し、それにより前記対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させることを含む、対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させるための方法。
【請求項２６】
細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を前記対象の皮膚に適用し、それにより対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させることを含む、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるための方法。
【請求項３２】
細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞外プロテオグリカンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させ、それにより細胞外タンパク質に結合したＴＧＦβの放出を阻害することを含む、細胞外タンパク質に結合したＴＧＦβの放出を阻害するための方法。
【請求項３８】
前記タンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質がデコリンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
デコリンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させ、それにより細胞外デコリン切断を阻害することを含む、細胞外デコリン切断の阻害方法。
【請求項４１】
前記グランザイムＢ阻害剤が、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記グランザイムＢ阻害剤が、以下のもの：
２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
ＺＩＮＣ０５７２３７６４；
ＺＩＮＣ０５７２３７８７；
ＺＩＮＣ０５３１６１５４；
ＺＩＮＣ０５７２３４９９；
ＺＩＮＣ０５７２３６４６；
ＺＩＮＣ０５３９８４２８；
ＺＩＮＣ０５７２３５０３；
ＺＩＮＣ０５７２３４４６；
ＺＩＮＣ０５３１７２１６；
ＺＩＮＣ０５３１５４６０；
ＺＩＮＣ０５３１６８５９；
ＺＩＮＣ０５６０５９４７；
イソクマリン；
ペプチドクロロメチルケトン；
ホスホン酸ペプチド；
グランザイムＢ阻害性核酸分子；
抗グランザイムＢ抗体；
阻害性グランザイムＢペプチド；
ＳｅｒｐＢ９ポリペプチド、またはその断片；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、
Ｓｅｒｐ２ポリペプチド、またはその断片；
ＣｒｍＡポリペプチドまたはその断片；および
ＳｅｒｐｉｎＡ３ポリペプチドまたはその断片
の１種以上から選択される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記グランザイムＢ阻害剤が局所投与用に製剤化される、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記グランザイムＢ阻害剤が他の創傷治療と共に投与するために製剤化される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
他の創傷治療が、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記他の創傷治療が、創傷被覆剤、創傷フィラー、およびインプラントの１種以上から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
他の創傷治療が、吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；皮膚マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象がヒトである、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
対象における創傷治癒を促進するためのグランザイムＢ阻害剤の使用。
【請求項５２】
対象における創傷治癒を促進するための薬剤の調製におけるグランザイムＢ阻害剤の使用。
【請求項５３】
前記創傷が皮膚創傷である、請求項５１または５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記皮膚創傷が慢性皮膚創傷である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記グランザイムＢ阻害剤が、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５６】
前記グランザイムＢ阻害剤が、以下のもの、
２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
ＺＩＮＣ０５７２３７６４；
ＺＩＮＣ０５７２３７８７；
ＺＩＮＣ０５３１６１５４；
ＺＩＮＣ０５７２３４９９；
ＺＩＮＣ０５７２３６４６；
ＺＩＮＣ０５３９８４２８；
ＺＩＮＣ０５７２３５０３；
ＺＩＮＣ０５７２３４４６；
ＺＩＮＣ０５３１７２１６；
ＺＩＮＣ０５３１５４６０；
ＺＩＮＣ０５３１６８５９；
ＺＩＮＣ０５６０５９４７；
イソクマリン；
ペプチドクロロメチルケトン；
ホスホン酸ペプチド；
グランザイムＢ阻害性核酸分子；
抗グランザイムＢ抗体；
阻害性グランザイムＢペプチド；
ＳｅｒｐＢ９ポリペプチド、またはその断片；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、
Ｓｅｒｐ２ポリペプチド、またはその断片；
ＣｒｍＡポリペプチドまたはその断片；
ＳｅｒｐｉｎＡ３ポリペプチドまたはその断片
の１種以上から選択される、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５７】
前記グランザイムＢ阻害剤が局所投与用に製剤化される、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５８】
前記グランザイムＢ阻害剤が他の創傷治療と共に投与するために製剤化される、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５９】
前記他の創傷治療が、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択される、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
前記対象が哺乳動物である、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６１】
前記対象がヒトである、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６２】
対象における創傷治癒の促進において使用するためのグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６３】
前記創傷が皮膚創傷である、請求項６２に記載のグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６４】
前記グランザイムＢ阻害剤が、核酸分子、ペプチド、および抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項６２または６３に記載のグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６５】
局所投与用に製剤化される、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６６】
他の創傷治療と共に投与するために製剤化される、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載のグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６７】
以下のもの：
２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
ＺＩＮＣ０５７２３７６４；
ＺＩＮＣ０５７２３７８７；
ＺＩＮＣ０５３１６１５４；
ＺＩＮＣ０５７２３４９９；
ＺＩＮＣ０５７２３６４６；
ＺＩＮＣ０５３９８４２８；
ＺＩＮＣ０５７２３５０３；
ＺＩＮＣ０５７２３４４６；
ＺＩＮＣ０５３１７２１６；
ＺＩＮＣ０５３１５４６０；
ＺＩＮＣ０５３１６８５９；
ＺＩＮＣ０５６０５９４７；
イソクマリン；
ペプチドクロロメチルケトン；
ホスホン酸ペプチド；
グランザイムＢ阻害性核酸分子；
抗グランザイムＢ抗体；
阻害性グランザイムＢペプチド；
ＳｅｒｐＢ９ポリペプチド、またはその断片；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、
Ｓｅｒｐ２ポリペプチド、またはその断片；
ＣｒｍＡポリペプチドまたはその断片；および
ＳｅｒｐｉｎＡ３ポリペプチドまたはその断片
の１種以上から選択される請求項６２〜６６のいずれか一項に記載のグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６８】
前記他の創傷治療が、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択される、請求項６６に記載のグランザイムＢ阻害剤。
【請求項６９】
デコリンおよびグランザイムＢを含むインジケーター組成物を用意することと、
前記インジケーター組成物と複数の試験化合物の各々とを接触させることと、
デコリンの切断に対する前記複数の試験化合物の各々の効果を判定し、前記インジケーター組成物中のデコリンの切断を阻害する化合物を選択し、それにより慢性創傷治癒の促進に有用な化合物を同定することと
を含む、慢性創傷治癒の促進に有用な化合物を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年１２月６日出願の米国仮出願第６１／４２０，２３０号、および２０１１年６月３日出願の米国仮出願第６１／４９３，２６５号の優先権を主張するものであり、それらの全内容は、この参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、創傷治癒のための組成物、方法、および使用に関する。
【発明の背景】
【０００３】
創傷治癒は、器官、例えば、皮膚などが損傷後に修復される複雑なプロセスである。正常な皮膚において、表皮および真皮は、外部の環境に対する保護バリアを形成する。この保護バリアが破損すると、創傷治癒が開始して、保護バリアが再度修復される。
【０００４】
保護バリアは、環境因子、例えば、ＵＶ光、化学物質、熱への曝露または皮膚への機械的損傷などにより弱体化するおよび／または最終的に破損する恐れがある。さらに、生物学的および遺伝的因子が保護バリアの弱体化または破損に関与する恐れがある。例えば、糖尿病および乾癬などの疾患により保護バリア（protective barrie）が破壊される恐れがある。さらに、天然の条件、例えば、生物学的および／または環境的に誘発された老化などにより、皮膚の保護バリアの破壊または菲薄化が生じる恐れがある。運動抑制または肥満（obsesity）も皮膚の保護バリアの破壊または菲薄化につながる恐れがある。全てのこれらの条件は、圧力、虚血、摩擦、化学物質、熱、または皮膚への他の外傷により引き起こされる皮膚裂傷または潰瘍形成につながる恐れがある（例えば、Ｓｅｎら、２００９年を参照されたい）。多くの場合、これらの創傷は、これらの根底にある条件が原因で、完全にまたは適切に治癒することができない可能性がある。
【０００５】
慢性創傷、または適切に閉鎖することができないまたは再発する創傷を有する対象の健康ケアの費用が高く、おおよそ毎年２５０億ドルであることを考慮すると、当技術分野において、創傷治癒を促進するおよび／またはそのような創傷の発生もしくは再発を予防するための化合物、組成物、および方法の同定が必要である。
【概要】
【０００６】
一部の態様において、本発明は、少なくともある程度、グランザイムＢが細胞外マトリックスタンパク質、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２をインビトロで切断し、グランザイムＢによるデコリン、ビグリカン、ベータグリカンの切断が濃度依存的であるという発見に基づいている。グランザイムＢによるデコリン、ビグリカン、およびベータグリカンの切断により、活性ＴＧＦ−βが放出される。グランザイムＢの非存在下またはグランザイムＢがＤＣＩにより阻害された場合はＴＧＦ−βが放出されなかったので、ＴＧＦ−βの放出は、グランザイムＢによるデコリン、ビグリカン、およびベータグリカンの切断に特異的であった。さらに、グランザイムＢがプロテオグリカン基質、ビグリカンおよびベータグリカンをＡｓｐのＰ１残基（ビグリカン：Ｄ91、ベータグリカン：Ｄ558）で切断することが示されてきた。
【０００７】
一部の態様において、本発明は、さらに、少なくともある程度、インビボで、グランザイムＢの欠失により、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおける皮膚脆弱化、脱毛、白毛化および炎症性皮下病変または黄色腫の形成の開始が遅延するという発見に基づいている。グランザイムＢが、ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚のコラーゲンおよびデコリンの分解および再構築の領域において発現すること、ならびにグランザイムＢの欠損により、少なくとも（at lest）ある程度はデコリン切断および／または皮膚厚さの増大の阻害が原因で、皮膚菲薄化が防がれることも示されてきた。
【０００８】
さらに、本発明は、グランザイムＢの阻害剤が、インビトロおよびインビボでデコリン切断を下方制御し、例えば、コラーゲン組織を刺激すること、瘢痕化を減少させることおよび皮膚の引張強さを増大させることにより創傷治癒を促進することを示す。
【０００９】
したがって、一側面において、対象における創傷治癒を促進する方法を提供する。該方法は、グランザイムＢ（グランザイムＢ）阻害剤を創傷に適用することを伴う。創傷は、限定なく、皮膚創傷であってもよい。
【００１０】
グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：核酸、ペプチド、および小分子の１種以上から選択することができる。任意に、ペプチドは、抗体からなることができる。任意に、抗体は、モノクローナル抗体からなることができる。
【００１１】
グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：本明細書においてＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０と呼び、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０の異なるバッチは、本明細書においてＪＴ２５１０２ＢおよびＪＴ０００２５１３５と呼ぶ、アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド、５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−［（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルアセチル）アミノ］−３−メチル−１−オキソペンチル］アミノ］−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イルメチル）−、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２１９７〜２２００からの化合物２０）；Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、プロテアーゼ阻害剤−９またはその誘導体、ＣｒｍＡ、ｓｅｒｐ−２、ＺＩＮＣ０５７２３７６４、ＺＩＮＣ０５７２３７８７、ＺＩＮＣ０５３１６１５４、ＺＩＮＣ０５７２３４９９、ＺＩＮＣ０５７２３６４６、ＺＩＮＣ０５３９８４２８、ＺＩＮＣ０５７２３５０３、ＺＩＮＣ０５７２３４４６、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＺＩＮＣ０５３１５４６０、ＺＩＮＣ０５３１６８５９、および���ＩＮＣ０５６０５９４７の１種以上から選択することができる。あるいは、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０、ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、およびＮＣＩ６３０２９５の１種以上から選択することができる。
【００１２】
任意に、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化することができる。グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療（wound treatment）との共投与用に製剤化することができる。他の創傷治療は、以下のもの：局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、以下のもの：創傷被覆剤、創傷フィラー、およびインプラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、以下のもの：吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；皮膚マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラー、またはインプラントに局所適用のために製剤化することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラーまたはインプラントに含浸するために製剤化することができる。対象は、哺乳動物とすることができ；任意に、対象は、ヒトであってもよい。
【００１３】
別の側面において、対象における創傷治癒を促進するためのグランザイムＢ阻害剤の使用を開示している。別の側面において、対象における創傷治癒を促進するための薬剤の調製におけるグランザイムＢ阻害剤の使用を開示している。任意に、創傷は、皮膚創傷であってもよい。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：核酸、ペプチドおよび小分子の１種以上から選択することができる。任意に、ペプチドは、抗体であってもよい。任意に、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。
【００１４】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：本明細書においてＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０と呼ぶアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド、５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−［（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルアセチル）アミノ］−３−メチル−１−オキソペンチル］アミノ］−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イルメチル）−、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２１９７〜２２００からの化合物２０）；Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、プロテアーゼ阻害剤−９またはその誘導体、ＣｒｍＡ、ｓｅｒｐ−２、ＺＩＮＣ０５７２３７６４、ＺＩＮＣ０５７２３７８７、ＺＩＮＣ０５３１６１５４、ＺＩＮＣ０５７２３４９９、ＺＩＮＣ０５７２３６４６、ＺＩＮＣ０５３９８４２８、ＺＩＮＣ０５７２３５０３、ＺＩＮＣ０５７２３４４６、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＺＩＮＣ０５３１５４６０、ＺＩＮＣ０５３１６８５９、およびＺＩＮＣ０５６０５９４７の１種以上から選択することができる。あるいは、グランザ���ムＢ阻害剤は、以下のもの：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０、ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、およびＮＣＩ６３０２９５の１種以上から選択することができる。
【００１５】
任意に、使用されるグランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化される。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療と共に投与するために製剤化される。任意に、創傷処置材は、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択される。任意に、他の創傷治療は、創傷被覆剤、創傷フィラーおよびインプラントの１種以上から選択される。任意に、他の創傷治療は、吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；皮膚マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択される。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラー、またはインプラントに局所適用のために製剤化される。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラーまたはインプラントに含浸のために製剤化される。任意に、該使用は、哺乳動物であってもよい対象を含み；任意に、該使用は、ヒトであってもよい対象を含む。
【００１６】
別の側面において、対象における創傷治癒の促進において使用するためのグランザイムＢ阻害剤を本明細書において開示している。任意に、創傷は、皮膚創傷であってもよい。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：核酸、ペプチド、および小分子の１種以上から選択することができる。任意に、ペプチドは、抗体であってもよい。任意に、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：本明細書においてＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０と呼ぶアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド、５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−［（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルアセチル）アミノ］−３−メチル−１−オキソペンチル］アミノ］−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イルメチル）−、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２１９７〜２２００からの化合物２８）；Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、プロテアーゼ阻害剤−９またはその誘導体、ＣｒｍＡ、ｓｅｒｐ−２、ＺＩＮＣ０５７２３７６４、ＺＩＮＣ０５���２３７８７、ＺＩＮＣ０５３１６１５４、ＺＩＮＣ０５７２３４９９、ＺＩＮＣ０５７２３６４６、ＺＩＮＣ０５３９８４２８、ＺＩＮＣ０５７２３５０３、ＺＩＮＣ０５７２３４４６、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＺＩＮＣ０５３１５４６０、ＺＩＮＣ０５３１６８５９、およびＺＩＮＣ０５６０５９４７の１種以上から選択することができる。あるいは、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０、ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、およびＮＣＩ６３０２９５の１種以上から選択することができる。
【００１７】
任意に、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療と共に投与するために製剤化することができる。任意に、他の創傷治療は、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、創傷被覆剤、創傷フィラーおよびインプラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；皮膚マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラー、またはインプラントに局所適用のために製剤化することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラーまたはインプラントに含浸のために製剤化することができる。任意に、対象は、哺乳動物とすることができ；任意に対象は、ヒトであってもよい。
【００１８】
別の側面において、サイトカイン、例えば、活性トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）などの放出を阻害する方法であって、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ−が細胞外（extracelular）マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンに結合している方法を開示している。該方法は、プロテオグリカン中の切断部位の阻害を伴うことができる。プロテオグリカンは、以下のもの：ビグリカン、デコリン、フィブロモジュリン（finromodulin）、またはベータグリカンのいずれか１種から選択することができる。しかし、前述の例は、例として示しているだけのものであり、限定として存在しているものではない。開示している方法は、プロテオグリカンに結合したＴＧＦ−βを詳述しているが、他のプロテオグリカンに結合した他のサイトカインおよび成長因子も適切な標的と見なすことができる。任意に、該方法は、インビトロで実施する。任意に、該方法は、インビボで対象において実施する。任意に、対象は、哺乳動物であってもよい。任意に、対象は、ヒトであってもよい。任意に、切断部位は、以下のペプチド配列：Ａｓｐ91Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ；またはＡｓｐ558Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ；またはＡｓｐ31Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ；またはＡｓｐ69Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；またはＡｓｐ82Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ；またはＡｓｐ261Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａのいずれか１種において発生する。
【００１９】
別の側面において、老化に関連した創傷治癒を研究するためのモデルを開示している。該モデルは、高脂肪食餌で飼育したアポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを含み、高脂肪食餌は、該マウスの皮膚に黄色腫症の皮膚病変を生じるのに十分である。あるいはまたはさらに、高脂肪食餌は、非黄色腫性（non-xanthamatous）皮膚において早老をもたらすのに十分であってもよい。本明細書において詳述する通り、グランザイムＢ阻害剤を介したまたはノックアウト技術を通したグランザイムＢの阻害により皮膚厚さ、コラーゲン密度、コラーゲン組織崩壊の老化に関連した損失、および引張強さの損失が低減する。本明細書における結果に基づいて、グランザイムＢ阻害剤をＩ期の皮膚潰瘍に添加して、皮膚の厚さ、皮膚の完全性、皮膚のコラーゲニシティ（collagenicity）を回復させ、皮膚潰瘍の進行を阻害するかまたはその他の方法で減らすことができると見なされる。
【００２０】
別の側面において、インビボでのグランザイムＢタンパク質発現を研究するためのモデルを開示している。該モデルは、高脂肪食餌で飼育したアポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを含み、高脂肪食餌は、該マウスの皮膚に黄色腫症の皮膚病変を生じるのに十分であり、該皮膚病変がグランザイムＢを発現する。
【００２１】
別の側面において、創傷修復に関与している化合物をスクリーニングするためのモデルを開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分である）と；該マウスの皮膚病変に化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴う。
【００２２】
別の側面において、皮膚における老化に関連した創傷治癒を研究するためのモデルを開示している。該モデルは、高脂肪食餌で飼育したアポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを含み、高脂肪食餌は、皮膚の早老をもたらすのに十分である。
【００２３】
別の側面において、創傷修復に関与している化合物をスクリーニングする方法を開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分であり、該皮膚病変がグランザイムＢを発現する）と；該マウスの皮膚病変に化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴うことができる。
【００２４】
別の側面において、皮膚病変の阻害または低減に関与している化合物をスクリーニングする方法を開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、化合物を該マウスに投与しない場合、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分である）と；該マウスに該化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴うことができる。
【００２５】
別の側面において、皮膚病変の阻害または低減に関与している化合物をスクリーニングする方法を開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、化合物を該マウスに投与しない場合、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分であり、該皮膚病変がグランザイムＢを発現する）と；該マウスの皮膚病変に該化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴うことができる。
【００２６】
別の側面において、皮膚裂傷を阻害または低減する方法を開示している。該方法は、グランザイムＢ阻害剤を皮膚に適用することを伴うことができる。選択されるグランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：核酸、ペプチド、および小分子の１種以上であってもよい。ペプチドは、抗体であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：本明細書においてＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０と呼ぶアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド、５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−［（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルアセチル）アミノ］−３−メチル−１−オキソペンチル］アミノ］−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イルメチル）−、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２１９７〜２２００からの化合物２０）；Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、プロテアーゼ阻害剤−９またはその誘導体、ＣｒｍＡ、ｓｅｒｐ−２、ＺＩＮＣ０５７２３７６４、ＺＩＮＣ０５７２３７８７、ＺＩＮＣ０５３１６１５４、ＺＩＮＣ０５７���３４９９、ＺＩＮＣ０５７２３６４６、ＺＩＮＣ０５３９８４２８、ＺＩＮＣ０５７２３５０３、ＺＩＮＣ０５７２３４４６、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＺＩＮＣ０５３１５４６０、ＺＩＮＣ０５３１６８５９、およびＺＩＮＣ０５６０５９４７の１種以上から選択することができる。あるいは、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０、ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、およびＮＣＩ６３０２９５の１種以上から選択することができる。さらに、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化することができる。
【００２７】
別の側面において、本発明は、対象における創傷治癒を促進する方法を提供し、該方法は、創傷治癒（would healing）を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ（ＧｒＢ）阻害剤を対象に投与し、それにより対象における創傷治癒を促進することを含む。
【００２８】
別の側面において、本発明は、対象における創傷治癒を促進する方法を提供し、該方法は、創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ（グランザイムＢ）阻害剤を創傷に適用し、それにより対象における創傷治癒を促進することを含む。
【００２９】
創傷は、慢性皮膚創傷などの慢性創傷、例えば、褥創であってもよい。
【００３０】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００３１】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００３２】
別の側面において、本発明は、対象の皮膚裂傷を予防する方法を提供し、皮膚裂傷を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより対象における皮膚裂傷を予防することを含む。
【００３３】
一態様において、皮膚裂傷は、慢性創傷に付随する。別の態様において、皮膚裂傷は、老化に付随する。
【００３４】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００３５】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００３６】
さらに別の側面において、本発明は、創傷の肥厚性瘢痕化を阻害するための方法を提供し、これは、創傷の皮膚肥厚性瘢痕化を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより創傷の肥厚性瘢痕化を阻害することを含む。
【００３７】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００３８】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００３９】
別の側面において、本発明は、対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させるための方法を提供し、これは、対象におけるコラーゲン組織を増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させることを含む。
【００４０】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００４１】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００４２】
別の側面において、本発明は、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるための方法を提供し、これは、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させることを含む。
【００４３】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００４４】
一態様において、細胞外マトリックスタンパク質に結合したＴＧＦβの放出が阻害される。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、デコリンである。
【００４５】
一側面において、本発明は、細胞外タンパク質に結合したＴＧＦβの放出を阻害するための方法を提供し、これは、細胞外プロテオグリカンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させ、それにより細胞外タンパク質に結合したＴＧＦβの放出を阻害することを含む。
【００４６】
一態様において、該タンパク質は、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される。一態様において、該タンパク質は、デコリンである。
【００４７】
別の側面において、本発明は、細胞外デコリン切断を阻害するための方法を提供し、これは、デコリンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させ、それにより細胞外デコリン切断を阻害することを含む。
【００４８】
一態様において、前述の方法のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される。一態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００４９】
別の態様において、前述の方法のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：
２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
ＺＩＮＣ０５７２３７６４；
ＺＩＮＣ０５７２３７８７；
ＺＩＮＣ０５３１６１５４；
ＺＩＮＣ０５７２３４９９；
ＺＩＮＣ０５７２３６４６；
ＺＩＮＣ０５３９８４２８；
ＺＩＮＣ０５７２３５０３；
ＺＩＮＣ０５７２３４４６；
ＺＩＮＣ０５３１７２１６；
ＺＩＮＣ０５３１５４６０；
ＺＩＮＣ０５３１６８５９；
ＺＩＮＣ０５６０５９４７；
イソクマリン；
ペプチドクロロメチルケトン；
ホスホン酸ペプチド；
グランザイムＢ阻害性核酸分子；
抗グランザイムＢ抗体；
阻害性グランザイムＢペプチド；
ＳｅｒｐＢ９ポリペプチド、またはその断片；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、
Ｓｅｒｐ２ポリペプチド、またはその断片；
ＣｒｍＡポリペプチドまたはその断片；および
ＳｅｒｐｉｎＡ３ポリペプチドまたはその断片
の１種以上から選択される。
【００５０】
一態様において、前述の方法のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化される。一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療と共に投与するために製剤化される。
【００５１】
一態様において、他の創傷治療は、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択される。別の態様において、他の創傷治療は、創傷被覆剤、創傷フィラー、およびインプラントの１種以上から選択される。別の態様において、他の創傷治療は、吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；皮膚マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択される。
【００５２】
一態様において、対象は、哺乳動物である。一態様において、対象は、ヒトである。
【００５３】
別の側面において、本発明は、対象における創傷治癒を促進するための本明細書に記載のグランザイムＢ阻害剤の使用を提供する。
【００５４】
さらに別の側面において、本発明は、対象における創傷治癒を促進するための薬剤の調製における本明細書に記載のグランザイムＢ阻害剤の使用を提供する。
【００５５】
一態様において、創傷は、皮膚創傷である。一態様において、皮膚創傷は、慢性皮膚創傷である。
【００５６】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される。一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、
２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
ＺＩＮＣ０５７２３７６４；
ＺＩＮＣ０５７２３７８７；
ＺＩＮＣ０５３１６１５４；
ＺＩＮＣ０５７２３４９９；
ＺＩＮＣ０５７２３６４６；
ＺＩＮＣ０５３９８４２８；
ＺＩＮＣ０５７２３５０３；
ＺＩＮＣ０５７２３４４６；
ＺＩＮＣ０５３１７２１６；
ＺＩＮＣ０５３１５４６０；
ＺＩＮＣ０５３１６８５９；
ＺＩＮＣ０５６０５９４７；
イソクマリン；
ペプチドクロロメチルケトン；
ホスホン酸ペプチド；
グランザイムＢ阻害性核酸分子；
抗グランザイムＢ抗体；
阻害性グランザイムＢペプチド；
ＳｅｒｐＢ９ポリペプチド、またはその断片；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、
Ｓｅｒｐ２ポリペプチド、またはその断片；
ＣｒｍＡポリペプチドまたはその断片；および
ＳｅｒｐｉｎＡ３ポリペプチドまたはその断片
からなる群から選択される。
【００５７】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化される。一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療と共に投与するために製剤化される。一態様において、他の創傷治療は、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択される。
【００５８】
一態様において、対象は、哺乳動物である。一態様において、対象は、ヒトである。
【００５９】
本発明は、対象における創傷治癒の促進において使用するためのグランザイムＢ阻害剤をさらに提供する。一態様において、創傷は、皮膚創傷である。一態様において、創傷は、慢性（chrionic）皮膚創傷である。
【００６０】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、核酸分子（moelcue）、ペプチド、および抗体、および小分子からなる群から選択される。
【００６１】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化される。一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、本明細書に記載の他の創傷治療と共に投与するために製剤化される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】細胞外（extracelllular）グランザイムＢ基質の同定を示す図。星印は全長を示し、矢印は切断断片を示す。
【図２】グランザイムＢが天然の平滑筋細胞由来のデコリンおよびビグリカンの切断を媒介することを示す図。
【図３】Ａ〜Ｃ：デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンの用量依存的なグランザイムＢ媒介切断を示す図。
【図４】ＰＧのグランザイムＢ媒介切断が４ｈおよび２４ｈでＤＣＩにより阻害され、グランザイムＢ切断部位がアスパラギン酸をＰ１残基で含有することを示す図。
【図５】デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムＢ切断により活性ＴＧＦ−βが放出されることを示す図。
【図６】グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βが活性であり、ＨＣＡＳＭＣにおいてＳＭＡＤ−３およびＥｒｋ−２リン酸化を誘発することを示す図。
【図７】ＨＣＡＳＭＣにおけるグランザイムＢ切断により放出されたＴＧＦ−βによるＳＭＡＤ−３のグランザイムＢ依存的リン酸化を示す図。
【図８】著しい皮膚病態、罹患率および脆弱化の分析を示す図。
【図９】皮膚形態および黄色腫発生を示す図。
【図１０】皮膚厚さの分析を示す図。
【図１１】病的な皮膚におけるコラーゲンおよびエラスチン再構築の分析を示す図。
【図１２】デコリンおよびコラーゲン再構築領域近くでのグランザイムＢ発現の分析を示す図。
【図１３】グランザイムＢのノックアウトにより救助されたａｐｏＥ−ＫＯマウスにおける皮膚コラーゲン密度の損失を示す図。
【図１４】グランザイムＢがデコリンを切断し、デコリン分解の領域に存在していることを示す図。
【図１５】特定の小分子阻害剤を使用したグランザイムＢの阻害によりベータグリカン切断が阻害されることを示す図。
【図１６】特定の小分子阻害剤を使用したグランザイムＢの阻害によりプロテオグリカン封鎖ＴＧＦ−βの放出が阻害されることを示す図。
【図１７】特定の小分子阻害剤を使用したグランザイムＢの阻害によりデコリン切断が阻害されることを示す図。
【図１８】小分子阻害剤を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりＥＣＭ切断が阻害されることを示す図。
【図１９】小分子阻害剤を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりＥＣＭ切断が阻害されることを示す図。
【図２０】ＮＣＩ６４４７７７を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりベータグリカン切断が阻害されることを示す図。
【図２１】Ａ：フィブロネクチン（ＦＮ）のグランザイムＢ（グランザイムＢ）切断によりＦＮへのＥＣ癒着が用量依存的に低減することを示し、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０を使用したグランザイムＢの阻害も示す図。Ｂ：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりフィブロネクチン切断が阻害されることを示す図。
【図２２】ＧｚｍＢが血漿フィブロネクチン（ＦＮ）をその可溶（soluable）形態およびマトリックス形態で切断することを示す図。
【図２３】グランザイムＢの阻害によりインビボで慢性創傷におけるデコリン分解が予防されることを示す図。
【詳細な説明】
【００６３】
最近まで、グランザイムＢ（グランザイムＢ）は、細胞内で細胞破壊を媒介するように作用すると考えられていた。この細胞傷害性酵素は、ウイルス感染および悪性細胞を効果的に死滅させる。しかし、本明細書に記載の通り、グランザイムＢが細胞の外部に存在する場合、慢性炎症および創傷の領域の細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）に大損害をもたらすことが示されてきた。本明細書にも記載の通り、グランザイムＢが阻害されると、外部環境で始まった破壊カスケードが中断され、結果として生じる細胞の損傷が終わる。外傷は北米における主な死亡原因の５番目であるので、創傷ケアの効果的な代替の解決策を発見することが必須である。現在、大部分の創傷ケアは、症状を処置することに重点を置いているが、グランザイムＢが皮膚の完全性を維持するのに必要なＥＣＭタンパク質を破壊し続ける場合、創傷修復および閉鎖は難しい。
【００６４】
グランザイムＢ（グランザイムＢ、本明細書においてＧＺＭＢとも呼ぶ）は、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の顆粒中に存在するアポトーシス誘導性のセリンプロテアーゼである。グランザイムＢは、ポア形成タンパク質、パーフォリンと共に標的細胞に対して放出され、その結果、細胞質へのそのパーフォリン依存的内部移行およびその後のアポトーシスの誘導が生じる（例えば、Ｍｅｄｅｍａら、１９９７を参照されたい）。しかし、老化、炎症および慢性疾患の間に、グランザイムＢは、他のタイプの免疫（例えば、肥満細胞、マクロファージ、好中球、樹状）または非免疫（角化細胞、軟骨細胞）細胞によっても発現および分泌される恐れがあり、細胞外マトリックス再構築活性を有するものである（Ｃｈｏｙら、２００４およびＢｕｚｚａら、２００５）。
【００６５】
Ｉ．本発明の方法
一部の態様において、本発明は、少なくともある程度、グランザイムＢが、細胞外マトリックスタンパク質、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２をインビトロで切断し、グランザイムＢによるデコリン、ビグリカン、ベータグリカンの切断が濃度依存的であるという発見に基づいている。グランザイムＢによるデコリン、ビグリカン、およびベータグリカンの切断により、活性ＴＧＦ−βが放出される。ＴＧＦ−βは、グランザイムＢの非存在下またはグランザイムＢがＤＣＩにより阻害される場合は放出されないので、ＴＧＦ−βの放出は、グランザイムＢによるデコリン、ビグリカン、およびベータグリカンの切断に特異的である。
【００６６】
さらに、グランザイムＢが、プロテオグリカン基質、ビグリカンおよびベータグリカンをＡｓｐのＰ１残基（ビグリカン：Ｄ91、ベータグリカン：Ｄ558）で切断することが示されてきた。
【００６７】
一部の態様において、本発明は、さらに、少なくともある程度、インビボで、グランザイムＢの欠失により、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおける皮膚脆弱化、脱毛、白毛化および炎症性皮下病変または黄色腫の形成の開始が遅延するという発見に基づいている。グランザイムＢが、ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚のコラーゲンおよびデコリンの分解および再構築の領域において発現すること、ならびにグランザイムＢの欠損により、少なくともある程度は皮膚厚さの増大、コラーゲン密度の増大、および／またはコラーゲン組織の増大が原因で、皮膚菲薄化が防がれることも示されてきた。さらに、本発明は、グランザイムＢの阻害剤が、インビトロおよびインビボでデコリンおよびビグリカン切断を下方制御し、例えば、コラーゲン組織を刺激すること、瘢痕化を減少させることおよび皮膚の引張強さを増大させることにより創傷治癒を促進することを示す。
【００６８】
したがって、本発明は、とりわけ、創傷治癒を促進するための方法、細胞外マトリックス（matric）タンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンに結合したＴＧＦβの放出を阻害するための方法、創傷の肥厚性瘢痕化を予防する方法、および皮膚裂傷を予防する方法を提供する。
【００６９】
一側面において、本発明は、創傷を有する対象における創傷治癒を促進するための方法を提供する。本発明は、対象における創傷治癒を促進するためのグランザイムＢ阻害剤の使用をさらに提供する。別の側面において、対象における創傷治癒を促進するための薬剤の調製におけるグランザイムＢ阻害剤の使用を開示している。
【００７０】
本明細書において使用する場合、「瘢痕化」としても知られている「創傷治癒」という用語は、皮膚（または別の器官組織）が損傷後に自身を修復するプロセスである。正常な皮膚において、表皮（最外層）および真皮（内または深層）は、定常状態平衡で存在し、外部環境に対する保護バリアを形成する。保護バリアが破損すると、創傷治癒の通常の（生理的）プロセスが直ちに開始する。創傷治癒の古典的モデルは、４つの連続しさらに重なった期：（１）止血、（２）炎症、（３）増殖および（４）再構築に分割される。皮膚が損傷すると、一連の複雑な生化学的事象が、密接に組織化されたカスケードで発生して、損傷を修復する。損傷後数分以内で、血小板（栓球）が損傷部位で凝集して、フィブリンクロットを形成する。このクロットは、活動性出血を制御するように作用する（止血）。
【００７１】
炎症期において、細菌および壊死組織片が貪食および除去され、増殖期に関与している細胞の遊走および分裂を引き起こす因子が放出される。
【００７２】
増殖期は、血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮形成、および創傷収縮を特徴とする。血管新生において、新しい血管が血管内皮細胞により形成される。［５］線維増殖および肉芽組織形成において、線維芽細胞が成長し、コラーゲンおよびフィブロネクチンを分泌することにより新しい仮細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を形成する。同時に、表皮の再上皮形成が発生し、そこでは、上皮細胞が増殖し、創傷床の頂上まで「ゆっくり動き（crawl）」、新しい組織用の被覆を提供する。
【００７３】
収縮において、創傷は、創傷の縁にグリップを設け、平滑筋細胞におけるものと同様の機序を使用してそれら自体が収縮する筋線維芽細胞の作用により小さくなる。細胞の役割が完了に近づくと、不必要な細胞は、アポトーシスを受ける。
【００７４】
成熟および再構築期において、コラーゲンが再構築され、割線（tension line）に沿って再編成され、もはや必要でない細胞は、アポトーシスにより除去される。
【００７５】
一態様において、該方法は、創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象に投与し、それにより創傷を有する対象における創傷治癒を促進することを含む。一態様において、該方法は、創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を創傷に適用し、それにより創傷を有する対象における創傷治癒を促進することを含む。
【００７６】
一態様において、創傷は、急性創傷である。
【００７７】
一態様において、創傷は、「慢性創傷」または「再発性創傷」である。本明細書において使用する場合、「慢性創傷」および「再発性創傷」という用語は、損傷部位の解剖学的および機能的完全性をもたらすための、秩序立った適時の修復プロセスを経ることに失敗した創傷を指す。慢性創傷は、創傷治癒の期の１つ以上に拘束された創傷である。例えば、急性創傷においては、分子、例えば、コラーゲンなどの生産と分解の間に正確なバランスが存在し；慢性創傷においては、このバランスが失われ、分解の果たす役割が大きすぎる。一態様において、「慢性創傷」または「再発性創傷」とは、約４週間（または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは約３５日間）著しい治癒を示していないか、または約８週間（または約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、もしくは約６５日間）完全には治癒していない創傷である。慢性創傷は、本明細書において使用する場合、炎症が消散していない創傷、損傷した組織の元の引張強さの８０％超まで回復していない創傷、デコリンが低減したおよび／またはコラーゲンが組織崩壊したままの創傷ならびに／あるいはコラーゲンの厚い束の形成が存在していない創傷も指す。
【００７８】
慢性創傷は、外傷、糖尿病、末梢血管疾患、静脈異常、外科手術後の合併症、リンパ水腫および循環を損なう多くの他の状態から生じる恐れがある。一態様において、慢性創傷は、皮膚創傷であるが、しかし、当業者は、創傷が他の上皮組織において発生していてもよいことを理解しよう。非限定的な例として、「創傷」という用語は、限定なく、皮膚潰瘍を包含し、皮膚潰瘍としては、静脈皮膚潰瘍、動脈皮膚潰瘍、褥創、および糖尿病皮膚潰瘍が挙げられる。創傷としては、上皮組織の裂傷、および熱傷（例えば、熱、化学物質、放射活性、ＵＶ熱傷）も挙げることができるが、これらに限定されない。一態様において、慢性皮膚創傷は、褥創または褥瘡である。
【００７９】
「有効量」の本発明のグランザイムＢ阻害剤（およびそのような作用剤を含む治療組成物）の使用は、所望の結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量である。
【００８０】
例えば、グランザイムＢ阻害剤の有効量は、疾患状態、年齢、性別、生殖状態、および体重などの因子、ならびに対象において所望の応答を誘発する該阻害剤（inhibotor）の能力に応じて変動していてもよい。投薬計画は、最適な応答を得るように調整することができる。例えば、複数の分割用量を毎日提供するか、または状況の要求により指示されるように用量を比例的に低減することができる。
【００８１】
例えば、細胞外プロテオグリカン切断、例えば、デコリン切断を阻害するグランザイムＢ阻害剤の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果、例えば、グランザイムＢ阻害剤の非存在下で検出される通常のレベルの細胞外プロテオグリカン切断、例えば、デコリン切断と比較した、細胞外プロテオグリカン切断、例えば、デコリン切断の阻害を得るのに十分な量である。細胞外プロテオグリカン切断、例えば、デコリン切断の阻害は、グランザイムＢ阻害剤を用いて得られる値が対照に対して約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％である場合に達成される。細胞外プロテオグリカン切断、例えば、デコリン切断を測定および決定するのに適切なアッセイは、当技術分野において知られており、本明細書に記載しており、例えば、当業者に知られている技術、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能などを使用したタンパク質またはＲＮＡレベルの検査、ならびに本明細書に記載しており当業者に知られている表現型アッセイが含まれる。
【００８２】
本発明の特定の態様において、慢性創傷を有する対象における創傷治癒を促進するための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンの切断が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を投与または適用することを含む。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリンである。
【００８３】
他の態様において、慢性創傷を有する対象における創傷治癒を促進するための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される細胞外プロテオグリカンに結合したＴＧＦβまたは他の成長因子またはサイトカインの放出が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を投与または適用することを含む。一態様において、デコリンに結合したＴＧＦβの放出が阻害される。
【００８４】
別の側面において、本発明は、対象の皮膚裂傷を予防する方法を提供する。皮膚裂傷は、創傷、例えば、慢性皮膚創傷などの慢性創傷、または老化に付随していてもよい。該方法は、皮膚裂傷を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより対象における皮膚裂傷を予防することを含む。
【００８５】
本発明の特定の態様において、対象における皮膚裂傷を予防するための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンの切断が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を適用することを含む。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリンである。
【００８６】
他の態様において、対象における皮膚裂傷を予防するための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される細胞外プロテオグリカンに結合したＴＧＦβの放出が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を適用することを含む。一態様において、デコリンに結合したＴＧＦβの放出が阻害される。
【００８７】
本明細書において使用する場合、「皮膚裂傷」とは、表皮を真皮から分離する、あるいは表皮と真皮の両方を根底にある構造から分離する摩擦および／または剪断力の結果として発生する外傷性創傷である。一態様において、皮膚裂傷は、四肢の創傷である。一態様において、皮膚裂傷は、再発性または慢性皮膚裂傷、例えば、同じ領域において約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、または約１１０日以内に既に発生していた皮膚裂傷である。
【００８８】
別の側面において、本発明は、創傷の肥厚性瘢痕化を阻害する方法を提供する。該方法は、創傷の皮膚肥厚性瘢痕化を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより創傷の肥厚性瘢痕化を阻害することを含む。
【００８９】
本発明の特定の態様において、創傷の肥厚性瘢痕化を阻害するための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンの切断が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を創傷に適用することを含む。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリンである。
【００９０】
他の態様において、対象における創傷の肥厚性瘢痕化を阻害するための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される細胞外プロテオグリカンに結合したＴＧＦβの放出が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を適用することを含む。一態様において、デコリンに結合したＴＧＦβの放出が阻害される。
【００９１】
本明細書において使用する場合、「肥厚性瘢痕化」という用語は、過剰な量のコラーゲンの沈着を特徴とする皮膚の状態を指し、これは、隆起した瘢痕を生じるが、ケロイドで観察されるほどではない。しかし、ケロイドのように、それらは、ほとんどの場合、面皰、ボディーピアス、切創および熱傷の部位に形成する。それらは、神経および血管を含有することが多い。それらは、一般に、真皮の深層を含む熱傷または外傷後に発生する。さらに、肥厚性瘢痕は、デコリンを欠いており、高いレベルのＴＧＦβを有する。
【００９２】
他の側面において、本発明は、それを必要としている対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させるための方法を提供する。該方法は、対象におけるコラーゲン組織を増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させることを含む。
【００９３】
皮膚中のコラーゲン組織の増大を必要としている対象は、例えば、年齢、疾患、例えば、糖尿病、運動抑制、薬物（例えば、長期のコルチコステロイド使用）、脱水が原因で脆弱な皮膚を有する対象、ならびに以前の皮膚裂傷を約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、または約１１０日以内に有していた対象である。
【００９４】
特定の態様において、コラーゲン組織を増大させるための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンの切断が阻害されるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスプロテオグリカンは、デコリンである。
【００９５】
他の態様において、コラーゲン組織を増大させるための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される細胞外プロテオグリカンに結合したＴＧＦβの放出が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を適用することを含む。一態様において、デコリンに結合したＴＧＦβの放出が阻害される。
【００９６】
他の側面において、本発明は、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷、例えば、慢性皮膚創傷の引張強さを増大させるための方法を提供する。該方法は、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む。
【００９７】
特定の態様において、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンの切断が阻害されるのに十分な量および十分な時間でグランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリンである。
【００９８】
他の態様において、治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷、例えば、慢性皮膚創傷の引張強さを増大させるための方法および使用は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択される細胞外プロテオグリカンに結合したＴＧＦβの放出が阻害されるのに十分な時間および十分な量でグランザイムＢ阻害剤を適用することを含む。一態様において、デコリンに結合したＴＧＦβの放出が阻害される。
【００９９】
「治癒しつつある創傷」とは、凝固が発生している創傷、細胞および細胞外マトリックスの一時的な置換が発生している創傷、炎症の消散が発生している創傷、ならびに／あるいは組織の機能性および構造を回復させる様式で細胞および細胞外マトリックスの合成および組織化が発生している創傷である。
【０１００】
別の側面において、本発明は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンに結合したサイトカイン、例えば、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）の放出、例えば、活性ＴＧＦ−βの放出を阻害するための方法を提供する。該方法は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させ、それにより細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンに結合したサイトカイン、例えば、ＴＧＦβの放出を阻害することを含む。該方法は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカン中の切断部位を阻害することも伴うことができる。任意に、切断は、以下のペプチド配列：Ａｓｐ91Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号１）；またはＡｓｐ558Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（配列番号２）；またはＡｓｐ31Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号３）；またはＡｓｐ69Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号４）；またはＡｓｐ82Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号５）；またはＡｓｐ261Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号６）のいずれか１種において発生する。
【０１０１】
細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンに結合したサイトカイン、例えば、ＴＧＦβの放出を阻害する方法および使用は、インビトロまたはインビボで実施することができる。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリンである。
【０１０２】
別の側面において、本発明は、細胞外マトリックスタンパク質分解を阻害するための方法を提供する。該方法は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させることを含み、それにより、封鎖されたサイトカイン、例えば、ＴＧＦβの放出が阻害され、それにより細胞外マトリックスタンパク質分解が阻害される。
【０１０３】
細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンの分解を阻害する方法および使用は、インビトロまたはインビボで実施することができる。細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、およびフィビュリン−２からなる群から選択することができる。一態様において、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカンは、デコリンである。
【０１０４】
さらに別の側面において、本発明は、細胞外デコリン切断を阻害する方法を提供する。該方法は、細胞外デコリンとグランザイムＢ阻害剤とを接触させ、それにより細胞外デコリン切断を阻害することを含む。
【０１０５】
デコリン切断を阻害する方法および使用は、インビトロまたはインビボで実施することができる。特定の態様において、該方法は、皮膚の表皮真皮接合部におけるデコリンの発現および／または活性が増大するように、細胞、例えば、皮膚細胞などとグランザイムＢ阻害剤とを接触させることを含む。
【０１０６】
本明細書に記載の方法、使用および組成物において使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、核酸、ペプチド、抗体、例えば、ヒト化抗体など、または小分子であってもよい。本発明の方法、使用、および組成物のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、以下に詳細に記載している。
【０１０７】
「対象」または「患者」という用語は、哺乳類生物を含むことを意図したものである。対象または患者の例としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および非ヒトトランスジェニック動物が挙げられる。本発明の特定の態様において、対象は、ヒトである。
【０１０８】
「投与する（administering）」という用語は、対象の系または対象の中もしくは上の特定の領域へのグランザイムＢ阻害剤またはグランザイムＢ阻害剤を含む医薬組成物の送達の任意の方法を含む。特定の態様において、成分は、局所、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、経口、経皮、髄腔内、硝子体内、脳内、または経粘膜投与される。
【０１０９】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤の投与は、局在的投与、例えば、創傷、例えば、慢性皮膚創傷の部位への投与である。一態様において、グランザイムＢ阻害剤の投与は、創傷、例えば、慢性皮膚創傷の部位への局所投与である。
【０１１０】
本明細書において使用する場合、「適用する（applying）」という用語は、グランザイムＢ阻害剤の投与を指し、該阻害剤の展着、（少なくとも一部分の）被覆、または塗布を含む。例えば、グランザイムＢ阻害剤は、皮膚を阻害剤で展着または被覆することにより、対象の皮膚に適用するか、または創傷に適用することができる。さらに、グランザイムＢ阻害剤は、例えば、該阻害剤を含む創傷被覆剤を使用して皮膚または創傷に適用することができる。
【０１１１】
本明細書において使用する場合、「接触させる（contacting）」（すなわち、タンパク質、細胞、例えば、宿主細胞、または対象とグランザイムＢ阻害剤とを接触させる）という用語は、グランザイムＢ阻害剤と、例えば、細胞を一緒にインビトロでインキュベートする（例えば、該成分を培養液中の細胞に添加する）こと、ならび該成分と対象の細胞または組織とがインビボで接触するように該成分を対象に投与することを含む。
【０１１２】
本明細書において使用する場合、「処置する（treating）」または「処置（treatment）」という用語は、検出可能であるかどうかにかかわらず、１種以上の症状の軽減または回復、障害の程度の縮小、障害の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、障害の回復または緩和が挙げられるがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を指す。「処置」とは、処置の非存在下で予想される生存率と比較した生存率の延長を意味することもできる。
【０１１３】
ＩＩ．グランザイムＢ阻害剤
本発明の組成物、方法および使用のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、核酸分子、ペプチド、抗体、例えば、ヒト化抗体もしくはラクダ抗体など、または小分子であってもよい。
【０１１４】
多くのグランザイムＢ阻害剤が当業者に知られており、例えば、ＷＯ０３／０６５９８７として公開された国際特許出願およびＵＳ２００３／０１４８５１１として公開された米国特許出願；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら、２００２；Ｈｉｌｌら、１９９５；Ｓｕｎ  Ｊ．ら、１９９６；Ｓｕｎ  Ｊ．ら、１９９７；Ｂｉｒｄら、１９９８；Ｋａｍら、２０００；ならびにＭａｈｒｕｓおよびＣｒａｉｋ、２００５に記載されている。
【０１１５】
本発明の組成物、方法および使用のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、核酸分子、ペプチド、抗体、例えば、ヒト化抗体もしくはラクダ抗体など、または小分子であってもよい。
【０１１６】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、
２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソオキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセトアミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセトアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；アゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
ＺＩＮＣ０５７２３７６４；
ＺＩＮＣ０５７２３７８７；
ＺＩＮＣ０５３１６１５４；
ＺＩＮＣ０５７２３４９９；
ＺＩＮＣ０５７２３６４６；
ＺＩＮＣ０５３９８４２８；
ＺＩＮＣ０５７２３５０３；
ＺＩＮＣ０５７２３４４６；
ＺＩＮＣ０５３１７２１６；
ＺＩＮＣ０５３１５４６０；
ＺＩＮＣ０５３１６８５９；
ＺＩＮＣ０５６０５９４７；
イソクマリン；
ペプチドクロロメチルケトン；
ホスホン酸ペプチド；
グランザイムＢ阻害性核酸分子；
抗グランザイムＢ抗体；
阻害性グランザイムＢペプチド；
ＳｅｒｐＢ９ポリペプチド、またはその断片；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸；
（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；
（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、
Ｓｅｒｐ２ポリペプチド、またはその断片；
ＣｒｍＡポリペプチドまたはその断片；および
ＳｅｒｐｉｎＡ３ポリペプチドまたはその断片
からなる群から選択される。
【０１１７】
別の態様において、本発明の方法、組成物、および使用における使用に適したグランザイムＢ阻害剤としては、例えば、Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ（ＩＵＰＡＣ名：５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸）ＭＦ：Ｃ１９Ｈ２４ＣｌＮ３Ｏ７  ＣＩＤ：１６７６０４７４；Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ；グランザイムＢ阻害剤ＩＶまたはカスパーゼ−８阻害剤ＩＩＩ（ＩＵＰＡＣ：（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸）ＭＦ：Ｃ２２Ｈ３４Ｎ４Ｏ９  ＣＩＤ：１６７６０４７６；およびＡｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ；カスパーゼ−８阻害剤ＩまたはグランザイムＢ阻害剤ＩＩ（ＩＵＰＡＣ：（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸）ＭＦ：Ｃ２１Ｈ３４Ｎ４Ｏ１０  ＣＩＤ：および１６７６０４７５が挙げられる。
【０１１８】
さらに別の態様において、本発明の方法、組成物、および使用において使用するためのグランザイムＢ阻害剤としては、以下のもののいずれか１種以上を挙げることができ：グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：本明細書においてＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０と呼ぶアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド、５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−［（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルアセチル）アミノ］−３−メチル−１−オキソペンチル］アミノ］−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イルメチル）−、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２１９７〜２２００からの化合物２０）；Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、プロテアーゼ阻害剤−９またはその誘導体、ＣｒｍＡ、ｓｅｒｐ−２、ＺＩＮＣ０５７２３７６４、ＺＩＮＣ０５７２３７８７、ＺＩＮＣ０５３１６１５４、ＺＩＮＣ０５７２３４９９、ＺＩＮＣ０５７２３６４６、ＺＩＮＣ０５３９８４２８、ＺＩＮＣ０５７２３５０３、ＺＩＮＣ０５７２３４４６、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＺＩＮＣ０５���１５４６０、ＺＩＮＣ０５３１６８５９、およびＺＩＮＣ０５６０５９４７の１種以上から選択される。
【０１１９】
あるいは、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０、ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、およびＮＣＩ６３０２９５の１種以上から選択することができる。グランザイムＢ阻害剤としては、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ等）、ペプチドおよび小分子を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２０】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：本明細書においてＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０と呼ぶアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド、５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−［（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルアセチル）アミノ］−３−メチル−１−オキソペンチル］アミノ］−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イルメチル）−、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２１９７〜２２００からの化合物２０）；Ｂｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−テトラアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシル）アミノ］−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−５−｛［（２Ｒ）−３−メチル−２−ピリジン−２−イルブタノイル］アミノ｝−４−オキソ−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；（２Ｓ，５Ｓ）−４−オキソ−５−｛［Ｎ−（フェニルアセチル）−Ｌ−イソロイシル］アミノ｝−Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミド；５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸；（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸、プロテアーゼ阻害剤−９またはその誘導体、ＣｒｍＡ、ｓｅｒｐ−２、ＺＩＮＣ０５７２３７６４、ＺＩＮＣ０５７２３７８７、ＺＩＮＣ０５３１６１５４、ＺＩＮＣ０５７２３４９９、ＺＩＮＣ０５７２３６４６、ＺＩＮＣ０５３９８４２８、ＺＩＮＣ０５７２３５０３、ＺＩＮＣ０５７２３４４６、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＺＩＮＣ０５３１５４６０、ＺＩＮＣ０５３１６８５９、およびＺＩＮＣ０５６０５９４７の１つ以上を含むがこれらに限定されない本明細書において���述する例のうちの１種から選択することができる。あるいは、グランザイムＢ阻害剤は、以下のもの：Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０、ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、およびＮＣＩ６３０２９５の１種以上から選択することができる。
【０１２１】
一態様において、本発明の組成物、使用および方法のいずれかにおいて使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、核酸分子である。
【０１２２】
本明細書において使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー、およびそれらの任意の化学修飾を指す。そのような修飾物としては、主鎖修飾、メチル化、および普通でない塩基対合組合せが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において詳述する通り、「核酸」という用語は、限定なく、ＲＮＡｉ技術を含む。例えば、グランザイムＢを阻害するのに使用するＲＮＡ化合物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）化合物であってもよい。
【０１２３】
一態様において、本発明の組成物、使用および方法において使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、干渉性核酸分子である。
【０１２４】
「干渉性核酸分子」または「干渉性核酸」という用語は、本明細書において使用する場合、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ｓｓＤＮＡｉオリゴヌクレオチド）、二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなど）、自己送達性ＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ；例えば、それら全ての全内容を参照により本明細書に組み込む米国特許公開第２００９１３１２０３４１号、同第２００９１３１２０３１５号、および同第２０１１１３０６９７８０号を参照されたい）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０７８９４１号を参照されたい）、または干渉性核酸が標的遺伝子もしくは配列と同じ細胞内に存在する場合に（例えば、干渉性ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することまたは翻訳を阻害することにより）標的遺伝子もしくは配列の発現（したがって、活性）を低減もしくは阻害することができるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／１０４１９９号を参照されたい）を含む。干渉性核酸とは、したがって、２本の相補鎖または単一の自己相補鎖により形成される標的ｍＲＮＡ配列または二本鎖ＲＮＡに相補的な一本鎖核酸分子を指す。干渉性核酸は、標的遺伝子または配列に対して実質的または完全な同一性を有していてもよく、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。干渉性核酸の配列は、全長標的遺伝子、またはその部分配列に対応することができる（例えば、グランザイムＢの遺伝子、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、知られており、例えば、その全内容を参照により本明細書に組み込むＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２２１６２５５２７、および配列番号８に記載されている）。好ましくは、干渉性核酸分子は、化学的に合成される。上記特許文献の各々の開示は、あらゆる目的のために、参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む。
【０１２５】
本明細書において使用する場合、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対して１００％の相補性を有さない干渉性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）配列の一部を指す。干渉性核酸は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上のミスマッチ領域を有していてもよい。ミスマッチ領域は、隣接していてもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のヌクレオチドにより分離されていてもよい。ミスマッチモチーフまたは領域は、単一のヌクレオチドを含んでいてもよく、または２つ、３つ、４つ、５つ以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０１２６】
干渉性核酸は、ヌクレオチド配列を含み、これは、タンパク質をコード化する「センス」核酸に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的または遺伝子のコード鎖に相補的である。したがって、干渉性核酸は、アンチセンス核酸であり、センス核酸に水素結合することができる。
【０１２７】
一態様において、本発明の干渉性核酸は、「小型干渉性ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」分子である。別の態様において、本発明の干渉性核酸分子は、「自己送達性ＲＮＡ」または「ｓｄＲＮＡ」分子である。一態様において、本発明の干渉性核酸は、ＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して、ｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する、転写後標的遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ、Ｐ．Ａ．およびＺａｍｏｒｅ、Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１〜２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ、Ｐ．Ｄ．ら。Ｃｅｌｌ  １０１、２５〜３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ、Ｔ．ら。Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１〜３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  Ｔ  Ｒ、およびＤｏｅｒｉｎｇ  Ｔ  Ｌ．２００３。Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７〜４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３。Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９〜１０；ＭｃＭａｎｕｓ  Ｍ  ＴおよびＳｈａｒｐ  Ｐ  Ａ．２００２。Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７〜４７）。該プロセスは、内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを切断して、短い、例えば、２１または２２ヌクレオチド長のＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる）とした場合に発生する。次いで、小さい方のＲＮＡセグメントにより標的ｍＲＮＡの分解が媒介される。ＲＮＡｉの合成用のキットは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓまたはＡｍｂｉｏｎから市販されている。一態様において、アンチセンスＲＮＡにおいて使用するための本明細書に記載の化学物質の１種以上は、ＲＮＡｉを媒介する分子において採用することができる。
【０１２８】
干渉性核酸としては、例えば、約１０〜６０、１０〜５０、または１０〜４０（二重鎖）ヌクレオチド長、より一般に約８〜１５、１０〜３０、１０〜２５、または１０〜２５（二重鎖）ヌクレオチド長、約１０〜２４、（二重鎖）ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡおよびｓｄＲＮＡが挙げられる（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、または１０〜２５ヌクレオチド長、約１０〜２４、１１〜２２、または１１〜２３ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、または１０〜２５塩基対長である）。ｓｉＲＮＡおよびｓｄＲＮＡ二重鎖は、約１、２、３、４、５、または約６ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび５’−リン酸末端を含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡおよびｓｄＲＮＡの例としては、限定なく、２つの別個の鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、他方は相補的アンチセンス鎖である）；一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、センスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーにより連結している）；自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有する２つ以上のループ構造とステムを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、環状ポリヌクレオチドをインビボまたはインビトロでプロセシングして、活性二本鎖ｓｉＲＮＡ（またはｓｄＲＮＡ）分子を生成することができる）が挙げられる。本明細書において使用する場合、「ｓｉＲＮＡ」および「ｓｄＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖ならびにＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０７８９４１号を参照されたい）。
【０１２９】
好ましくは、ｓｉＲＮＡおよびｓｄＲＮＡは、化学的に合成される。ｓｉＲＮＡおよびｓｄＲＮＡは、大腸菌ＲＮａｓｅ  ＩＩＩまたはダイサーを用いた長いｄｓＲＮＡ（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５ヌクレオチド長以上のｄｓＲＮＡ）の切断により生成することもできる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、生物活性ｓｉＲＮＡとする（例えば、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：９９４２〜９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１４２３６（２００２）；Ｂｙｒｏｍら、Ａｍｂｉｏｎ  ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ、１０（１）：４〜６（２００３）；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１：９８１〜９８７（２００３）；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：２２６９〜２２７１（２００１）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：８２（１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド〜約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチド長以上もの長さであってもよい。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写物全体または遺伝子転写物の一部をコード化することができる。場合によっては、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、プラスミドによりコード化することができる（例えば、自動的に折り畳まれてヘアピンループを有する二重鎖となる配列として転写される）。
【０１３０】
当技術分野において知られており本明細書に開示しているグランザイムＢをコード化するコード鎖配列（配列番号８）を考慮すると、本発明の干渉性核酸は、ワトソンとクリックの塩基対合規則に従って設計することができる。干渉性核酸分子は、グランザイムＢ  ｍＲＮＡのコード化領域全体に相補的であることができるが、より好ましくは、グランザイムＢ  ｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、干渉性オリゴヌクレオチドは、ユビキチンおよびグランザイムＢ  ｍＲＮＡのプロセシング部位を取り囲んでいる領域に相補的であることができる。干渉性ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であることができる。本発明の干渉性核酸は、当技術分野において知られている手順を使用した化学合成および酵素的連結反応を使用して構成することができる。例えば、干渉性核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。干渉性核酸を生成するのに使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（xantine）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。細胞における発現を阻害するために、１種以上の干渉性核酸分子を使用することができる。あるいは、干渉性核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に生産することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の��的核酸に対してアンチセンス配向となる）。
【０１３１】
干渉性核酸としては、グランザイムＢ遺伝子に対して配列相同性を有し、グランザイムＢタンパク質の発現を修飾することができる任意のＲＮＡ化合物を挙げることができる。グランザイムＢの発現を修飾することができる干渉性核酸の例は、ＵＳ６，１５９，６９４；ＵＳ６，７２７，０６４；ＵＳ７，０９８，１９２；およびＵＳ７，３０７，０６９に記載されており、これら全ての全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０１３２】
グランザイムＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｍｕｎｄｏｌｓｈｅｉ、Ｆｒａｎｃｅ）により設計および製造されており、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｉｇｅｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１巻、１３５２５〜１３５３２（２００６）およびＢｒｕｎｏら、Ｂｌｏｏｄ、９６巻、１９１４〜１９２０（２０００）に記載されている。
【０１３３】
別の態様において、本発明の組成物、方法および使用において使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、ペプチドである。
【０１３４】
本明細書において使用する場合、「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結したアミノ酸の短いポリマーを指す。当業者は、当技術分野においてアミド結合としても知られているペプチド結合が、２つの分子間で、一方の分子のカルボキシル基が他方の分子のアミン基と反応し、それにより水（Ｈ2Ｏ）の分子を放出したときに形成される共有化学結合であることを理解しよう。ペプチドは、当業者によく知られている様々な従来の様式で修飾することができる。修飾の例としては以下のものが挙げられる。ペプチドおよび／またはアミノ酸側鎖の末端アミノ基および／またはカルボキシル基をアルキル化、アミド化、またはアシル化により修飾して、エステル、アミドまたは置換アミノ基を得ることができる。ヘテロ原子を脂肪族修飾基に含むことができる。これは、従来の化学合成法を使用して行われる。他の修飾としては、グルタミルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミノ化；プロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリンまたはトレオニンのヒドロキシル基のリン酸化；ならびにリジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化が挙げられる（例えば：Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９８３を参照されたい）。
【０１３５】
別の側面において、ペプチドの一方または両方、通常は一方の末端は、親油性基、通常脂肪族またはアラルキル基で置換されていてもよく、これは、ヘテロ原子を含んでいてもよい。鎖は、飽和でも不飽和でもよい。好都合なことに、市販されている脂肪族脂肪酸、アルコールおよびアミン、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸およびミリスチルアルコール、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸およびステアリルアミン、オレイン酸、リノール酸、ドコサヘキサエン酸等などを使用することができる。（例えば：米国特許第６，２２５，４４４号を参照されたい）。好ましいのは、１４〜２２炭素原子長の間の非分枝の天然脂肪酸である。他の親油性分子としては、グリセリル脂質およびステロール、例えば、コレステロールなどが挙げられる。親油性基は、従来の方法に従って、オリゴペプチドの担体への結合部位に応じて、しばしば、担体上での合成の間に、オリゴペプチド上の適切な官能基と反応させることができる。脂質結合は、オリゴペプチドを他の治療薬と共にリポソームのルーメンに導入して、オリゴペプチドおよび治療薬を宿主に投与し得る場合に有用である。
【０１３６】
それらの意図した使用に応じて、特に哺乳類宿主への投与のために、目的のペプチドは、キャリア分子への組込み、ペプチドバイオアベイラビリティーを変えること、半減期を延長または短縮すること、様々な組織への分布または血流を制御すること、血液成分への結合を減少または強化すること等の目的のために、他の化合物への結合により修飾することもできる。前述の例は、一例であり、非限定的なものである。
【０１３７】
ペプチドは、多数の様式で調製することができる。ペプチドの化学合成は、当技術分野においてよく知られている。固相合成が一般に使用され、様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．；Ｂｅｃｋｍａｎによる自動合成機等が利用可能である。特に大規模製造については、液相合成法も使用することができる。
【０１３８】
ペプチドは、塩の形態で、一般に医薬として許容される塩形態で存在することもできる。これらとしては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン等の無機塩が挙げられる。ペプチドの様々な有機塩も、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香（benozic）酸、桂皮酸、サリチル酸等が挙げられるがこれらに限定されないものを用いて作製することができる。
【０１３９】
ペプチドは、ペプチドをコード化する発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞において細胞内で作製することもできる。そのような発現ベクターは、標準的技術により作製することができる。ペプチドは、別のタンパク質またはペプチドとの融合（例えば、ＧＳＴ融合）として細胞内で発現することができる。次いで、合成ペプチドは、ペプチドを細胞（例えば、リポソーム等）に導入するための当技術分野において知られている様々な手段により細胞に導入することができる。
【０１４０】
一態様において、本発明の方法、組成物、および使用において使用するためのペプチドは、セルピンである。セルピンは、セリンプロテアーゼを阻害する天然タンパク質の群である。一態様において、セルピンは、グランザイムＢに結合し、グランザイムＢ阻害機能を有する。
【０１４１】
一態様においてグランザイムＢ阻害剤は、ＰＩ９ペプチド、またはそのグランザイムＢ阻害断片である（例えば、その全内容を参照により本明細書に組み込む米国特許公開第２００３／０１４８５１１号を参照されたい）。ＳｅｒｐｉｎＢ９としても知られているＰＩ９は、グランザイムＢを阻害するヒトセルピンである（例えば、Ｂｉｒｄ、１９９９  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７７、４７〜５７の概説を参照されたい）。ＳｅｒｐｉｎＢ９のアミノ酸およびヌクレオチド配列は知られており、例えば、その全内容を参照により本明細書に組み込むＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＩ：２２３９４１８５９、ならびに配列番号９および１０で知ることができる。一態様において、ペプチドはＳｅｒｐｉｎＢ９であり、グランザイムＢに直接結合したＳｅｒｐｉｎＢ９からの配列、すなわち、ＧＴＥＡＡＡＳＳＣＦＶＡＥＣＣＭＥＳＧ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１）の一部または全てを含む。この配列は、ＳｅｒｐｉｎＢ９の「反応中心」または「反応中心ループ」を含有する。別の態様において、グランザイムＢ阻害剤、例えば、ＳｅｒｐｉｎＢ９ペプチドは、ＶＥＶＮＥＥＧＴＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＥＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号１８）；ＶＥＶＮＥＥＧＴＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＤＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号１９）；ＶＥＶＮＥＥＧＴＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＡＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号２０）；およびＶＥＶＮＥＥＧＲＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＥＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
別の態様において、グランザイムＢ阻害剤は、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎペプチド、またはそのグランザイムＢ阻害断片である。Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎは、ＳｅｒｐｉｎＡ３としても知られている。ＳｅｒｐｉｎＡ３のアミノ酸およびヌクレオチド配列は知られており、例えば、それらの全内容を参照により本明細書に組み込むＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＩ：７３８５８５６２、ならびに配列番号１２および１３で知ることができる。
【０１４３】
別の態様において、グランザイムＢ阻害剤は、牛痘ウイルスタンパク質、ＣｒｍＡペプチド、またはそれらのグランザイムＢ阻害断片である（例えば、Ｑｕａｎら（１９９５）２７０、１０３７７〜１０３７９を参照されたい）（ＣｒｍＡのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号１４および１５に記載されている）。一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、アミノ酸配列ＩＤＶＮＥＥＹＴＥＡＡＡＡＴＣＡＬＶＡＤＣＡＳＴＶＴＮＥＦＣＡＤＨＰＦＩ（配列番号２２）を含むＣｒｍＡペプチドである。
【０１４４】
別の態様において、グランザイムＢ阻害剤は、Ｓｅｒｐ２ペプチド、またはそのグランザイムＢ阻害断片である。Ｓｅｒｐ２は、ＳｅｒｐｉｎＡ３としても知られている。ＳｅｒｐｉｎＡ３のアミノ酸およびヌクレオチド配列は知られており、例えば、その全内容を参照により本明細書に組み込むＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＩ：５８２１９０１１、ならびに配列番号１６および１７で知ることができる。
【０１４５】
本発明の方法、組成物、または使用のいずれかにおいて使用するための他の適切なグランザイムＢ阻害性ペプチドとしては、例えば、Ｚ−ＡＡＤ−ＣＨ2Ｃｌ（Ｚ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−クロロメチルケトン）、Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＣＨＯ（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）、Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＩＥＴＤ−ｃｈｏ、およびｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋが挙げられる。
【０１４６】
さらに別の態様において、本発明の組成物、方法および使用において使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、抗体、例えば、抗グランザイムＢ抗体である。一態様において、抗グランザイムＢ抗体は、ヒト抗体である。別の態様において、抗グランザイムＢ抗体は、ヒト化抗体である。別の態様において、抗グランザイムＢ抗体は、ラクダ抗体である。
【０１４７】
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、対応する抗原に特異的に結合し、共通の免疫グロブリンの一般的構造を有するタンパク質を含む組成物を指す。抗体という用語は、特に、それらが所望の生物活性を示すのであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二量体、多量体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む。「抗体」という用語は、限定なく、ラクダ抗体を含む。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラとしてもよく、または他の種に由来していてもよい。一般に、抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結した少なくとも２本の重鎖および２本の軽鎖を含み、これらを組み合わせると、抗原と相互作用する結合ドメインが形成する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）および重鎖定常部領域（ＣH）からなる。重鎖定常部領域は、３つのドメイン、ＣH１、ＣH２およびＣH３からなり、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）アイソタイプであってもよい。同様に、軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）および軽鎖定常部領域（ＣL）からなる。軽鎖定常部領域は、１つのドメイン、ＣＬからなり、カッパまたはラムダアイソタイプであり得る。ＶHおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域と共に散在している。各ＶHおよびＶLは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常部領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、効果細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介することができる。重鎖定常部領域は、免疫グロブリンの宿主組織または宿主因子への、特に細胞の受容体、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ等）などを通した結合を媒介する。本明細書において使用する場合、抗体は、抗原に結合する能力を保持する免疫グロブリンの抗原結合部分も含む。これらの例としては、Ｆ（ａｂ）、ＶLＣLおよびＶHＣH抗体ドメインの一価断片；およびＦ（ａｂ’）2断片、ジスルフィド架橋によりヒンジ領域で連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片が挙げられる。抗体という用語は、組換え単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）および二重特異性分子、例えば、ダイアボディー（diabodies）、トリアボディー（triabodies）、およびテトラボディー（tetrabodies）なども指す（例えば、米国特許第５，８４４，０９４号を参照されたい）。
【０１４８】
抗体は、抗体複合体を含めた多くの形態で生産し使用することができる。本明細書において使用する場合、「抗体複合体」という用語は、１種以上の抗体と別の抗体もしくは抗体断片（複数可）との複合体、または２種以上の抗体断片の複合体を指す。
【０１４９】
本明細書において使用する場合、「抗原」という用語は、概括的に解釈されるものであり、ある抗体に特異的に結合することができる任意の分子、組成物、または粒子を指す。抗原は、抗体と相互作用する１種以上のエピトープを有するが、それは、必ずしもその抗体の生産を誘発するとは限らない。
【０１５０】
本明細書において使用する場合、「エピトープ」という用語は、ある抗体に特異的に結合することができる決定基を指す。エピトープは、一般に分子の表面に存在しており、抗体との相互作用に利用しやすい化学的特性である。一般的な化学的特性は、アミノ酸および糖部分であり、これらは、三次元構造特性ならびに電荷、親水性、および親油性を含めた化学的性質を有する。立体配座エピトープは、根底にある化学構造は全く変化しない分子の空間構成要素の変化後の抗体との反応性の低下により、非立体配座エピトープから区別される。「エピトープ」という用語は、当業者により、「抗原決定基」としても理解される。例えば、Ｂ細胞により分泌される抗体は、巨大分子の一部のみを認識し；認識される部分がエピトープである。前述の例は、単に一例として示すものであり、「エピトープ」という用語の範囲を限定することを意図したものではない。エピトープは、Ｂ細胞およびＴ細胞を含めた多数の細胞型により認識される。
【０１５１】
本明細書において使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、ヒト免疫グロブリンにおいては、レシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラットまたはウサギなどのＣＤＲからの残基によって置きかえられている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置きかえられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも存在しない残基も含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および一般に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、これらのドメインにおいては、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク（ＦＲ）領域である。ヒト化抗体は、一般にヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常部領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む免疫グロブリンも包含する（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；およびＲｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８）。本明細書において使用する場合、「抗体断片」という用語は、抗体分子の断片を指す。抗体断片としては、限定なく、単一ドメイン、Ｆａｂ断片、および単鎖Ｆｖ断片が挙げられる。本明細書において使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、唯一の親細胞のクローンから産生されるので同一である単一特異性抗体を指す。上で詳述した通り、「抗体」という用語は、限定なく「モノクローナル抗体」を含む。
【０１５２】
一態様において、グランザイムＢ阻害剤は、小分子である。
【０１５３】
本明細書において使用する場合、「小分子」という用語は、バイオポリマー、例えば、タンパク質、核酸、または多糖類などに結合した低分子量有機化合物を指す。小分子の結合相手の前述の例は、非限定的である。
【０１５４】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、本明細書において詳述する例のうちの１種から選択することができ、この例としては、以下の式のアゼピン化合物：
【化１】
2014500271.tif 000003
【０１５５】
またはそれらの医薬として許容される塩もしくは水和物が挙げられるが、これらに限定されず、式中、ｎは、０、１、または２であり；Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して：水素、Ｃ1~6アルキル、Ｃ1~6アルコキシ、Ｃ3~6シクロアルキル、アリール、ＨＥＴおよび−Ｎ（Ｒ10）2からなる群から選択され（ここで、（ａ）前記Ｃ1~6アルキル、Ｃ1~6アルコキシおよびＣ3~6シクロアルキルは、任意に、独立してハロおよびヒドロキシからなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されており；（ｂ）前記アリールおよびＨＥＴは、任意に、独立して、ハロ、ヒドロキシおよびＣ1~4アルキル（任意に１〜３個のハロ基で置換されている）からなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されている）；あるいはＲ1およびＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意にＳ、ＯおよびＮ（Ｒ10）からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する５または６員単環式環を形成していてもよく（ここで、前記環は、任意に１〜３個のＲ10基で置換されているが、ただし、Ｒ1およびＲ2は、いずれも水素ではない）；Ｒ3およびＲ7の各々は、独立して、水素およびＣ1~4アルキル（任意に１〜３個のハロ基で置換されている）からなる群から選択され；Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ8の各々は、独立して、水素、ハロ、ヒドロキシおよび（任意に１〜３個のハロ基で置換されている）Ｃ1~4アルキルからなる群から選択され；Ｒ９は、任意に、独立して、ハロ、ヒドロキシおよび（任意に１〜３個のハロ基で置換されている）Ｃ1~4アルキルからなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されたＨＥＴであり；Ｒ10は、水素、Ｃ1~4アルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｃ1~4アルキル（前記−Ｃ（Ｏ）Ｃ1~4アルキルは、任意にＮ（Ｒ11）2で置換されている）、ＨＥＴおよびアリール（前記アリールは、任意に１〜３個のハロ基で置換されている）からなる群から選択され；Ｒ11は、水素およびＣ1~4アルキル（任意に１〜３個のハロ基で置換されている）から選択され；ＨＥＴは、Ｏ、ＳおよびＮ（Ｒ12）から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有し、任意に１〜２個のオキソ基で置換された、５〜１０員の芳香族、部分的芳香族または非芳香族の単環式または二環式環であり；Ｒ12は、水素およびＣ1~4アルキル（任意に１〜３個のハロ基で置換されている）からなる群から選択される。
【０１５６】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、本明細書において詳述する例のうちの１種から選択することができ、この例としては、以下のものの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない：
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２】
2014500271.tif 000004
【０１５７】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化３】
2014500271.tif 000005
【０１５８】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化４】
2014500271.tif 000006
【０１５９】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセタミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化５】
2014500271.tif 000007
【０１６０】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化６】
2014500271.tif 000008
【０１６１】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化７】
2014500271.tif 000009
【０１６２】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化８】
2014500271.tif 000010
【０１６３】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化９】
2014500271.tif 000011
【０１６４】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１０】
2014500271.tif 000012
【０１６５】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソキサゾール−３−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１１】
2014500271.tif 000013
【０１６６】
、本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１２】
2014500271.tif 000014
【０１６７】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イソキサゾール−５−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１３】
2014500271.tif 000015
【０１６８】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（チアゾール−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１４】
2014500271.tif 000016
【０１６９】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１５】
2014500271.tif 000017
【０１７０】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリダジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１６】
2014500271.tif 000018
【０１７１】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１７】
2014500271.tif 000019
【０１７２】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１８】
2014500271.tif 000020
【０１７３】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化１９】
2014500271.tif 000021
【０１７４】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−イルメチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２０】
2014500271.tif 000022
【０１７５】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタンアミド）−Ｎ−（（３ａ，７ａ−ジヒドロベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）メチル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２１】
2014500271.tif 000023
【０１７６】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｒ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２２】
2014500271.tif 000024
【０１７７】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−３−メチル−２−（ピリジン−２−イル）ブタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２３】
2014500271.tif 000025
【０１７８】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−フェニルアセタミド）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２４】
2014500271.tif 000026
【０１７９】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２５】
2014500271.tif 000027
【０１８０】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２６】
2014500271.tif 000028
【０１８１】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２７】
2014500271.tif 000029
【０１８２】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ジメチルアミノ）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２８】
2014500271.tif 000030
【０１８３】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）アセトアミド）−３−メチルペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化２９】
2014500271.tif 000031
【０１８４】
本明細書において、（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，５Ｓ）−２−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルカルバモイル）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−５−イル）−３−アセチル−５，５−ジメチルチアゾリジン−４−カルボキサミドとも呼ぶ
【化３０】
2014500271.tif 000032
【０１８５】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−メチル−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタンアミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化３１】
2014500271.tif 000033
【０１８６】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−シクロペンチルアセタミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化３２】
2014500271.tif 000034
【０１８７】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロプロピルアセタミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化３３】
2014500271.tif 000035
【０１８８】
本明細書において（２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−（（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（（Ｓ）−２−アセトアミド−２−シクロペンチルアセタミド）−４−オキソ−１，２，４，５，６，７−ヘキサヒドロアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶ
【化３４】
2014500271.tif 000036
【０１８９】
またはそれらの塩もしくは溶媒和物。
【０１９０】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、本明細書において詳述する例のうちの１種から選択することができ、この例としては、以下のものの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない：
本明細書においてＢｉｏ−ｘ−ＩＥＰＤP−（ＯＰｈ）2とも呼ぶ
【化３５】
2014500271.tif 000037
【０１９１】
本明細書においてアゼピノ［３，２，１−ｈｉ］インドール−２−カルボキサミドとも呼ぶとも呼ぶ
【化３６】
2014500271.tif 000038
【０１９２】
本明細書において（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ）−２−アセトアミド−４−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［２−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］カルバモイル］ピロリジン−１−イル］−５−オキソペンタン酸とも呼ぶ
【化３７】
2014500271.tif 000039
【０１９３】
本明細書において（４Ｓ）−４−［［（２Ｓ，３Ｓ）−２−アセトアミド−３−メチルペンタノイル］アミノ］−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−［［（２Ｓ）−４−ヒドロキシ−１，４−ジオキソブタン−２−イル］アミノ］−１−オキソブタン−２−イル］アミノ］−５−オキソペンタン酸とも呼ぶ
【化３８】
2014500271.tif 000040
【０１９４】
本明細書において５−クロロ−４−オキソ−３−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸とも呼ぶ
【化３９】
2014500271.tif 000041
【０１９５】
本明細書において５−クロロ−４−オキソ−２−［２−［２−（フェニルメトキシカルボニルアミノ）プロパノイルアミノ］プロパノイルアミノ］ペンタン酸とも呼ぶ
【化４０】
2014500271.tif 000042
【０１９６】
またはそれらの塩もしくは溶媒和物。
【０１９７】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、以下のものから選択される：
本明細書において、ＺＩＮＣ０５７２３７６４およびＮＣＩ６４４７５２とも呼ぶ
【化４１】
2014500271.tif 000043
【０１９８】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５７２３７８７およびＮＣＩ６４４７７７とも呼ぶ
【化４２】
2014500271.tif 000044
【０１９９】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５３１６１５４およびＮＣＩ６４１２４８とも呼ぶ
【化４３】
2014500271.tif 000045
【０２００】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５７２３４９９およびＮＣＩ６４１２３５とも呼ぶ
【化４４】
2014500271.tif 000046
【０２０１】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５７２３６４６およびＮＣＩ６４２０１７とも呼ぶ
【化４５】
2014500271.tif 000047
【０２０２】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５３９８４２８およびＮＣＩ６４１２３０とも呼ぶ
【化４６】
2014500271.tif 000048
【０２０３】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５７２３５０３およびＮＣＩ６４１２３６とも呼ぶ
【化４７】
2014500271.tif 000049
【０２０４】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５７２３４４６およびＮＣＩ６４０９８５とも呼ぶ
【化４８】
2014500271.tif 000050
【０２０５】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５３１７２１６およびＮＣＩ６１８７９２とも呼ぶ
【化４９】
2014500271.tif 000051
【０２０６】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５３１５４６０およびＮＣＩ６３０２９５とも呼ぶ
【化５０】
2014500271.tif 000052
【０２０７】
本明細書において、ＺＩＮＣ０５３１６８５９およびＮＣＩ６１８８０２とも呼ぶ
【化５１】
2014500271.tif 000053
【０２０８】
ならびに本明細書において、ＺＩＮＣ０５６０５９４７およびＮＣＩ６２３７４４とも呼ぶ
【化５２】
2014500271.tif 000054
【０２０９】
またはそれらの塩もしくは溶媒和物。
【０２１０】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、
【化５３】
2014500271.tif 000055
【０２１１】
またはその塩もしくは溶媒和物である。
【０２１２】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、
【化５４】
2014500271.tif 000056
【０２１３】
またはその塩もしくは溶媒和物である。
【０２１４】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、
【化５５】
2014500271.tif 000057
【０２１５】
またはその塩もしくは溶媒和物である。
【０２１６】
本発明の方法、組成物、および使用において使用するためのグランザイムＢ阻害剤は、合成阻害剤、例えば、イソクマリン、ペプチドクロロメチルケトン、またはホスホン酸ペプチドなどであることもできる（例えば、Ｋａｍら、２０００を参照されたい）。
【０２１７】
任意に、本明細書において使用するグランザイムＢ阻害剤は、
【化５６】
2014500271.tif 000058
【化５７】
2014500271.tif 000059
【０２１８】
の１つ以上である。
【０２１９】
イソクマリン誘導体（左上）：３，４−ジクロロイソクマリン、ＤＣＩ、Ｘ＝Ｈ、Ｙ＝Ｃｌ；７−アミノ−４−クロロ−３−（３−イソチウレイドプロポキシ（isothiureidopropoxy））イソクマリン、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ（ＣＨ2）3−ＳＣ（＝ＮＨ+2）ＮＨ2；４−クロロ−３−エトキシ−７−グアニジノイソクマリン、Ｘ＝ＮＨＣ（＝ＮＨ+2）ＮＨ2、Ｙ＝ＯＣＨ2ＣＨ3。ＦＵＴ−１７５類似体（右上）。最下行：ペプチド基質、ホスホン酸ペプチドおよび４−アミジノフェニルグリシンホスホネート［（４−ＡｍＰｈＧｌｙ）P（ＯＰｈ）2］誘導体の構造。後者は、アルギニン類似体である。
【０２２０】
ＩＩＩ．医薬組成物
多くのグランザイムＢ阻害剤は、水溶性であり、塩として形成することができる。そのような場合、グランザイムＢ阻害剤の組成物は、当業者に知られている生理学的に許容される塩を含んでいてもよい。調製物は、一般に、調製物の投与のモードに許容される１種以上のキャリアを含み、投与のモードは、局所投与、洗浄、表皮投与、表皮下投与、真皮投与、真皮下投与、皮下投与、全身性投与、注入、吸入、経口、または選択した処置に適した他のモードでもよい。適切なキャリアは、そのような投与のモードにおいて使用することが当技術分野において知られているものである。
【０２２１】
適切な組成物は、当技術分野において知られている手段ならびに当業者により決定されるそれらの投与のモードおよび用量により製剤化することができる。非経口投与のために、化合物は、滅菌水もしくは生理食塩水、または非水可溶性化合物の投与に使用される医薬として許容されるビヒクル、例えば、ビタミンＫのために使用されるものなどに溶解することができる。経腸投与のために、化合物は、錠剤、カプセルの形態で投与するか、または液体の形態で溶解することができる。錠剤またはカプセルは、腸溶コーティングするか、または持続放出用の製剤とすることができる。多くの適切な製剤が知られており、これには、化合物を投与するために局所的もしくは局在的に使用することができる、放出される化合物を封入しているポリマーもしくはタンパク質微粒子、軟膏、ペースト、ゲル、ヒドロゲル、フォーム、クリーム、粉末、ローション、油、半固体、石鹸、薬用石鹸、シャンプー、薬用シャンプー、スプレー、フィルム、または溶液が含まれる。持続放出性パッチまたはインプラントを採用して、長期間にわたる放出を実現することができる。当業者に知られている多くの技術は、Ａｌｆｏｎｓｏ  ＧｅｎｎａｒｏによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、（２０００）に記載されている。製剤は、例えば、賦形剤、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールなど、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含有していてもよい。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を制御することができる。修飾化合物の他の潜在的に有用な送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み式注入系、およびリポソームが挙げられる。製剤は、賦形剤、例えば、ラクトースを含有することができ、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、またはドロップの形態で、もしくはゲルとして投与するための油状の溶液であってもよい。
【０２２２】
グランザイムＢ阻害剤を含有する組成物は、浸透剤も含むことができる。浸透剤は、グランザイムＢ阻害剤の皮膚の深層まで送達される能力を改善することができる。使用することができる浸透剤は、当業者に知られており、ヒアルロン酸、インスリン、リポソーム等、ならびにＬ−アルギニンまたはアルギニン含有アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
グランザイムＢ阻害剤の化合物または組成物は、単独で、または他の創傷処置材、例えば、創傷用調製物、創傷被覆剤、および閉鎖デバイスなどと併せて投与することができる。
【０２２４】
任意に、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化される。例えば、グランザイムＢ阻害剤の局所投与用の製剤は、溶液、懸濁液、軟膏、および固体挿入物を含めた様々な剤形のいずれかと仮定することができる。これらの例は、経真皮用途等を含めた皮膚および粘膜を通した吸収用のクリーム、ローション、ゲル、軟膏、坐剤、スプレー、フォーム、リニメント、エアロゾル、頬側および舌下錠、様々な受動性および活性局所デバイスである。
【０２２５】
グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療と共に投与するために製剤化することができる。他の創傷治療は、以下のもの：局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、以下のもの：創傷被覆剤、創傷フィラー、およびインプラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、以下のもの：吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；真皮マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラー、またはインプラントに局所適用のために製剤化される。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラーまたはインプラントに含浸のために製剤化される。本明細書において意図する対象は、哺乳動物であってもよい。さらに、本明細書において意図する対象は、ヒトであってもよい。
【０２２６】
任意に、グランザイムＢ阻害剤は、局所投与用に製剤化することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、他の創傷治療と共に投与するために製剤化することができる。任意に、創傷処置材は、局所抗菌剤；清浄剤；創傷ゲル；コラーゲン；エラスチン；組織成長促進剤；酵素的壊死組織除去用調製物；抗真菌剤；抗炎症剤；バリア；保湿剤；およびシーラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、創傷被覆剤、創傷フィラーおよびインプラントの１種以上から選択することができる。任意に、他の創傷治療は、吸収性ドレッシング；アルギン酸塩ドレッシング；フォームドレッシング；ハイドロコロイドドレッシング；ハイドロファイバードレッシング；圧迫ドレッシングおよびラップ；複合ドレッシング；接触層；創傷ゲル含浸ガーゼ；創傷ゲルシート；透明フィルム；創傷フィラー；真皮マトリックス生成物または組織スキャフォールド；ならびに閉鎖デバイスの１種以上から選択することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラー、またはインプラントに局所適用のために製剤化することができる。任意に、グランザイムＢ阻害剤は、創傷被覆剤、創傷フィラーまたはインプラントに含浸のために製剤化することができる。任意に、使用は、哺乳動物である対象を含むことができ；任意に、使用は、ヒトである対象を含むことができる。
【０２２７】
ＩＶ．動物モデルおよびスクリーニング法
別の側面において、老化に関連した創傷修復を研究するためのモデルを開示している。該モデルは、高脂肪食餌で飼育したアポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを含み、高脂肪食餌は、該マウスに黄色腫症の皮膚病変を生じるのに十分であり、皮膚の非黄色腫性領域の早老をもたらすのに十分である。黄色腫を含有していない皮膚領域において、これらのマウスは、高脂肪食餌を供給された場合、低減した皮膚厚さ、低減したコラーゲン、および低減した弾性の形態の皮膚の老化の証拠も発生させる。
【０２２８】
別の側面において、インビボでのグランザイムＢタンパク質発現を研究するためのモデルを開示している。該モデルは、高脂肪食餌で飼育したアポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを含み、高脂肪食餌は、該マウスに黄色腫症の皮膚病変を生じるのに十分であり、該皮膚病変がグランザイムＢを発現する。グランザイムＢは、皮膚が老化するにつれて、ならびに皮膚潰瘍形成の間に損傷および分離し易い領域である表皮真皮接合部に豊富である。この領域は、大量のグランザイムＢ基質デコリンも含有する。
【０２２９】
別の側面において、皮膚における早老を研究するためのモデルを開示している。該モデルは、高脂肪食餌で飼育したアポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを含み、高脂肪食餌は、皮膚の早老をもたらすのに十分である。
【０２３０】
別の側面において、創傷修復に関与している化合物をスクリーニングするためのモデルを開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、該マウスにおいて老化に関連した皮膚の変化の加速、菲薄化、および／または皮膚病変を生じるのに十分である）と；該マウスの皮膚病変に化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴う。本明細書において意図するモニタリングは、皮膚病変の修復の任意の生物学的兆候を含む。修復をモニターすることができるモードの例としては、以下のもの：新たに形成される組織の存在または非存在のモニタリング、ならびに病変、脱毛および／または病変の回復の幅および／またはサイズのモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。採用することができる他の方法としては、以下のもの：皮膚表面温度のモニタリング、経表皮水分喪失の測定、ＥＣＭ異常の存在または非存在、弾力線維症、コラーゲン形態、コラーゲン密度、デコリンの存在、および適当な皮膚厚さの回復のモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、皮膚応力研究を採用する。さらに、一例として、デコリンは、創傷治癒および線維症の領域において低減する。
【０２３１】
別の側面において、創傷修復に関与している化合物をスクリーニングする方法を開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分であり、該皮膚病変がグランザイムＢを発現する）と；該マウスの皮膚病変に化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴う。
【０２３２】
別の側面において、皮膚病変の阻害または低減に関与している化合物をスクリーニングする方法を開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、化合物を該マウスに投与しない場合、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分である）と；該マウスに該化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴う。
【０２３３】
別の側面において、皮膚病変の阻害または低減に関与している化合物をスクリーニングする方法を開示している。該方法は、アポリポタンパク質Ｅ−ノックアウトマウスを高脂肪食餌で飼育すること（ここで、高脂肪食餌は、化合物を該マウスに投与しない場合、該マウスに皮膚病変を生じるのに十分であり、該皮膚病変がグランザイムＢを発現する）と；該マウスの皮膚病変に該化合物を投与することと；該マウスの皮膚病変をモニタリングすることとを伴う。
【０２３４】
別の側面において、本発明は、慢性創傷治癒の促進に有用な化合物を同定するための方法を提供する。該方法は、デコリンおよびグランザイムＢを含むインジケーター組成物を提供することと；インジケーター組成物と複数の試験化合物の各々とを接触させることと；デコリンの切断に対する複数の試験化合物の各々の効果を判定しグランザイムＢ（グランザイムＢ）、インジケーター組成物中のデコリンの切断を阻害する化合物を選択し、それにより慢性創傷治癒の促進に有用な化合物を同定することとを含む。
【０２３５】
該方法は、コラーゲン密度および組織、封鎖されたサイトカイン、例えば、ＴＧＦ−βの放出、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、細胞外プロテオグリカン、例えば、ビグリカンなどの切断、ならびに／あるいは皮膚の引張強さの化合物の効果を判定することをさらに含んでいてもよい。
【０２３６】
試剤、候補化合物または試験化合物の例としては、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子および他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。試剤は、当技術分野において知られているコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができ、これらのアプローチには、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法が含まれる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５；米国特許第５，７３８，９９６号；および米国特許第５，８０７，６８３号、これらは、それぞれ、参照によりその全体を本明細書に組み込む）。
【０２３７】
分子ライブラリーの合成ための方法の例は、当技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に記載されており、これらは、それぞれ、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【０２３８】
化合物のライブラリーは提示することができ、例えば、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上において提示することができ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９００  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８〜６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０）、これらは、それぞれ、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【０２３９】
インジケーター組成物は、グランザイムｂおよび／またはデコリンタンパク質を発現する細胞、例えば、該タンパク質（複数可）を自然に発現するか、または該タンパク質（複数可）をコード化する発現ベクターを細胞に導入することにより該タンパク質（複数可）を発現するように改変された細胞とすることができる。
【０２４０】
あるいは、インジケーター組成物は、該タンパク質（複数可）を含む無細胞組成物（例えば、精製された天然または組換えタンパク質のいずれかを含む、例えば、細胞抽出物または組成物）とすることができる。
【０２４１】
例えば、インジケーター細胞は、発現ベクターでトランスフェクトし、試験化合物の存在下および非存在下でインキュベートすることができ、分子の発現または生物学的応答に対する該化合物の効果を判定することができる。
【０２４２】
様々な細胞型がスクリーニングアッセイにおけるインジケーター細胞としての使用に適している。対象アッセイにおいて使用するための細胞としては、真核細胞が挙げられる。例えば、一態様において、細胞は、脊椎動物細胞、例えば、鳥類細胞または哺乳類細胞（例えば、マウス細胞、またはヒト細胞）である。
【０２４３】
例えばデコリンの発現に使用することができる組換え発現ベクターは、当技術分野において知られている。例えば、標準的分子生物学技術を使用して、ｃＤＮＡが組換え発現ベクターに最初に導入される。ｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した増幅により、または適切なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。（例えば、ヒト、マウスおよび細菌）を含むシグナル伝達経路のｃＤＮＡのヌクレオチド配列またはその中の分子は、当技術分野において知られており、標準的ＰＣＲ法によりｃＤＮＡの増幅を可能にするＰＣＲプライマーのデザイン、または標準的ハイブリダイゼーション法を使用したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用することができるハイブリダイゼーションプローブのデザインに使用することができる。
【０２４４】
別の態様において、インジケーター組成物は、無細胞組成物である。宿主細胞または培養物媒体中で組換え法により発現したタンパク質は、タンパク質精製のための標準的方法を使用して、宿主細胞、または細胞培養媒体から単離することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および免疫親和性精製（抗体を使用）を使用して、無細胞組成物において使用することができる精製または半精製されたタンパク質を生成することができる。あるいは、目的のタンパク質を発現する細胞の溶解物または抽出物を、無細胞組成物としての使用のために調製することができる。
【０２４５】
ある試験化合物が、前述の多様な方法のうちの１つにより、例えば、デコリン切断を直接または間接的に修飾すると同定されると、選択した試験化合物（または「目的の化合物」）は、次いで、細胞に対するその効果を、例えば目的の化合物と細胞とをインビボ（例えば、目的の化合物を生物に投与する）またはエクスビボ（例えば、生物から細胞を単離し、単離した細胞と目的の化合物とを接触させる、または、あるいは、目的の化合物と細胞株とを接触させる）のいずれかで接触させ、適切な対照（例えば、未処理の細胞もしくは対照化合物で処理した細胞、または生物学的応答を修飾しないキャリアなど）と比較した、目的の化合物の細胞に対する効果を判定することにより、さらに評価することができる。
【０２４６】
別の側面において、本発明は、本明細書に記載のアッセイの２つ以上の組合せに関する。
【０２４７】
さらに、本明細書に記載の通り同定された化合物（例えば、アンチセンス核酸分子、または特定の抗体、または小分子）を動物モデルにおいて使用して、そのような修飾物質を用いた処理の効力、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載の通り同定された修飾物質を動物モデルにおいて使用して、そのような修飾物質の作用の機序を決定することができる。
【０２４８】
本発明は、対象スクリーニングアッセイにおいて同定された化合物にも関する。
【実施例】
【０２４９】
ここで使用する略語：ＣＴＬ、細胞傷害性リンパ球；ＤＣＩ、３，４−ジクロロイソクマリン；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＥＣＭ、細胞外マトリックス；Ｅｒｋ、細胞外信号調節キナーゼ；ＧＡＧ、グリコサミノグリカン；グランザイムＢ、グランザイムＢ；ＨＣＡＳＭＣ、ヒト冠動脈平滑筋細胞；ＮＫ、ナチュラルキラー細胞；ＬＡＰ、潜伏関連ペプチド；ＬＬＣ、大型の潜在型ＴＧＦ−β複合体；ＬＴＢＰ、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質；ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＭＴ−ＭＭＰ１、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１；ＳＬＣ、小型の潜在型ＴＧＦ−β複合体；ＴＧＦ−β、トランスフォーミング成長因子ベータ。
【０２５０】
例１
グランザイムＢは、細胞外マトリックスタンパク質を切断する。
【０２５１】
方法。インビトロ細胞外マトリックス切断アッセイのために、細胞をコンフルエンシーまで成長させ、溶解させ、無傷のＥＣＭをプレートに残した。次いで、ＥＣＭをビオチン化した。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄し、３７℃で、グランザイムＢと共に、および／またはグランザイムＢ阻害剤、３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）と共に、４および２４時間、室温でインキュベートした。次いで、上清を収集し、切断断片について評価した。断片は、ウェスタンブロットまたはＮ末端配列決定により決定した。切断の確認は、その後、精製した基質を用いて実施した。
【０２５２】
結果：細胞外グランザイムＢ基質を同定するために、組換えデコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、およびブレビカンを、精製したグランザイムＢと共に２４時間インキュベートした。反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液を用いて停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜のポンソー染色により画像化した。図１Ａに示す通り、グランザイムＢは、組換えデコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、およびブレビカンを切断する。
【０２５３】
グランザイムＢが平滑筋細胞（ＳＭＣ）由来のＥＣＭも切断するかどうかを決定するために、ＥＣＭ合成のための５〜７日間の血清飢餓の後、水酸化アンモニウムを使用してヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）を６ウェルプレートから除去した。グランザイムＢをＥＣＭ上で２４時間インキュベートし、上清をフィブリリン−１、フィブリリン−２またはフィビュリン−２についてウェスタンブロットした（図１Ｂ）。
【０２５４】
図２は、グランザイムＢが平滑筋細胞由来のデコリンおよびビグリカンも切断することを示す。十分なＥＣＭ合成のために、ＨＣＡＳＭＣをコンフルエンシーにおいてインキュベートした。細胞を除去し、グランザイムＢをＥＣＭと共にインキュベートし、デコリンおよびビグリカン切断断片をウェスタン免疫ブロットにより検出した。
【０２５５】
例２
グランザイムＢは、プロテオグリカンを切断し、細胞外マトリックスから封鎖されたＴＧＦ−βを放出する。
【０２５６】
方法：ＥＣＭ切断アッセイのために、グランザイムＢおよび／または阻害剤３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）を、デコリン、ビグリカンまたは可溶性ベータグリカンと共に４および２４時間、室温でインキュベートし、ポンソー染色により可視化した。切断部位同定のために、切断断片にエドマン分解を施した。
【０２５７】
ＴＧＦ−βは、前述のプロテオグリカンにより封鎖されるので、グランザイムＢをＴＧＦ−β結合プロテオグリカンと共にインキュベートして、グランザイムＢ切断により、封鎖されたＴＧＦ−βの放出が生じたのかどうかを決定した。サイトカイン放出を、上清においてウェスタンブロットを使用して評価した。
【０２５８】
グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βが活性であるかどうかを決定するために、上記放出アッセイからの上清をヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）上でインキュベートし、ＳＭＡＤ／Ｅｒｋ活性化をウェスタンブロットにより検査した。
【０２５９】
結果：グランザイムＢは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンを切断し、２５ｎＭもの低さのグランザイムＢ濃度でのタンパク質分解が明白であった。タンパク質分解は、ＤＣＩにより阻害されたが、溶媒対照ＤＭＳＯによっては阻害されなかった。エドマン分解分析により、アスパラギン酸のＰ１残基を用いてＰＧにおけるグランザイムＢ切断部位を決定し、これは、グランザイムＢ切断特異性と調和していた。
【０２６０】
サイトカイン放出アッセイにおいて、ＴＧＦ−βは、２４ｈのインキュベーション後、デコリン、ビグリカン、およびベータグリカンからグランザイムＢ依存的に遊離した。ＴＧＦ−βは、グランザイムＢの非存在下またはグランザイムＢがＤＣＩにより阻害された場合、放出されず、このことは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンからの放出が特異的であることを示していた。さらに、グランザイムＢにより遊離されたＴＧＦ−βは、１６ｈのインキュベーション後、活性なままであり、ＨＣＡＳＭＣにおけるＳＭＡＤ−３およびＥｒｋ−２リン酸化を誘発した（以下を参照されたい）。
【０２６１】
例３
グランザイムＢは、デコリン、ビグリカンおよび可溶性ベータグリカンを切断し、活性トランスフォーミング成長因子−βを放出する
方法：プロテオグリカン切断アッセイ。組換えヒトＰＧ、デコリン（０．５μｇ、Ａｂｎｏｖａ、Ｗａｌｎｕｔ、ＣＡ）、ビグリカンおよびベータグリカン（１．５〜５ｕｇ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、室温で２４ｈ、２５〜５００ｎＭの精製したヒトグランザイムＢ（Ａｘｘｏｒａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に、５０ｍＭのトリス緩衝剤、ｐＨ７．４においてインキュベートした。阻害剤研究のために、グランザイムＢを、２００μＭのセリンプロテアーゼ阻害剤３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）または阻害剤溶媒対照、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在または非存在下で４ｈまたは２４ｈインキュベートした。インキュベーション後、タンパク質は変性し、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写された。ポンソー染色（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、切断断片を検出した。
【０２６２】
Ｎ末端配列決定。エドマン分解のために、２〜５μｇ／レーンのビグリカンおよびベータグリカンを１００〜５００ｎＭのグランザイムＢと共に２４ｈインキュベートした。ゲル上で泳動させ、ＰＶＤＦ膜に転写させた時点で、切断断片がポンソー染色により同定された。蒸留水を用いた洗浄により染色を除去し、該膜を乾燥させ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  ＫｉｄｓのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ）で分析した。
【０２６３】
ＴＧＦ−β放出アッセイ。ＭＭＰについて先に記載したのと同様の方法（Ｉｍａｉら、１９９７）を使用して、ＴＧＦ−β放出アッセイを行った。つまり、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカン（１５μｇ／ｍＬ）を４８ウェル組織培養物プラスチックプレート上にコーティングし、ＰＢＳ、ｐＨ７．４において一晩４℃でインキュベートさせた。１％のウシ血清アルブミンを用いてブロックした後、１ウェル当たり２０ｎｇの活性ＴＧＦ−β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を、カルシウムおよびマグネシウムを含有するＤＰＢＳ（＃１４０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にＲＴで５ｈ添加した。次いで、グランザイムＢを、ＤＣＩと共にまたはなしで、該ウェルに添加した。２４ｈ後、上清を除去し、変性させ、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ニトロセルロース膜に転写し、１０％のスキムミルクを用いてブロックすると、ラット抗ヒトＴＧＦ−β１抗体（１：２００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）およびＩＲＤｙｅ（登録商標）８００共役親和性精製抗ラットＩｇＧ（１：３０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を使用して該膜を調べた。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用してバンドを画像化した。
【０２６４】
ヒト冠動脈平滑筋細胞ＴＧＦ−βバイオアベイラビリティーアッセイ。バイオアベイラビリティーアッセイのために、継代３〜５代目のＨＣＡＳＭＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、平滑筋細胞成長媒体（ＳｍＧＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）＋５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスまで成長させた。このとき、細胞を血清除去により２４ｈ静止させ、その後、１５０μｌの放出アッセイ上清（上記の通り）または１０ｎｇのＴＧＦ−β陽性対照を細胞に１６ｈ添加した。細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットにより、リン酸化Ｅｒｋ１／２（ｐ−Ｅｒｋ１／２；１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、総Ｅｒｋ１／２（ｔ−Ｅｒｋ１／２；１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、リン酸化ＳＭＡＤ３（ｐ−ＳＭＡＤ３；１：２０００、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、総ＳＭＡＤ３（ｔ−ＳＭＡＤ３；１：５００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および負荷対照β−アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはβ−チューブリン（１：３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）について評価した。二次ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００共役抗体（１：３０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ）を利用し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて画像化した。濃度測定分析をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムで実行し、ｐ−ＳＭＡＤ−３／β−チューブリンおよびｐ−Ｅｒｋ／β−アクチン比により図式的に表示した。
【０２６５】
結果：グランザイムＢは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンを切断する。デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムＢとのインキュベーションにより、複数の切断断片が濃度依存的に発生した（図３ａ〜ｃ）。全長デコリン（約６５ｋＤａ）ならびに約５０ｋＤａおよび約３０ｋＤａでの４つのデコリン切断断片がグランザイムＢインキュベーション後に認められた。ビグリカンは、約４０ｋＤａで同定され、約２５ｋＤａおよび１５ｋＤａで切断断片が認められたが、組換え可溶性ベータグリカン（約１００ｋＤａ）のグランザイムＢとのインキュベーションにより、複数の切断断片が約６０ｋＤａおよび４０ｋＤａで生じた。これらの基質の全てがＰＧであり、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を含有するので、全長タンパク質および断片の見掛けＭＷは、グリコシル化によりゲルを通る動きが変わる恐れがあるので、正確ではない可能性がある。そのため、タンパク質およびタンパク質断片のうちのいくつかは、濃縮されたバンドとは対照的にスメアとして観察される。
【０２６６】
図３を参照すると、用量依存的なグランザイムＢ媒介のデコリン、ビグリカンおよびベータグリカンの切断がそこに示されている。増大する濃度のグランザイムＢ（２５、５０、１００および２００ｎＭ）をデコリン（ａ）、ビグリカン（ｂ）、およびベータグリカン（ｃ）と共にＲＴで２４ｈインキュベートした。図３において使用する場合、マーク*は全長タンパク質を示し、矢印は切断断片を示し、＾は、グランザイムＢを示す。
【０２６７】
デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンタンパク質分解がグランザイムＢにより媒介されることを確認するために、ＤＣＩを反応に４ｈまたは２４ｈ含めた（図４ａ〜ｃ）。より高い濃度のＰＧ基質およびグランザイムＢを、切断断片の最適検出のためのこのアッセイにおいて利用した。ＤＣＩは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカン切断を両方の時点で効果的に阻害したが、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）は、効果がなかった（図４ａ〜ｃ）。
【０２６８】
グランザイムＢ切断部位同定。グランザイムＢ切断部位をエドマン分解によりビグリカンおよびベータグリカンにおいて特徴付けた（図４ｂ〜ｃ）。デコリンのＮ末端配列の結果は、何回も試したにもかかわらず、低い断片収率が原因で得ることができなかった。ビグリカンにおいて、切断部位は、ＡｓｐのＰ１残基を用いてＡｓｐ91Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐで同定された（図４ｂ）。興味深いことに、ベータグリカンについて６つの独特なバンドの配列決定をしたにもかかわらず、１つの独特な切断部位、該タンパク質のｃ末端近くのＡｓｐ558Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒしか特徴付けられなかった（図２ｃ）。１により標識されたベータグリカン断片のＮ末端配列は、該タンパク質のＮ末端に対応しており、２で標識された断片のＮ末端配列は、切断部位に対応していた（図４ｃ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける見掛けサイズの違いは、グリコシル化の違いが原因である可能性が最も高い。グリコシル化におけるこの不均一性は、全長タンパク質がスメアとしてゲルの最上部を泳動するので、全長タンパク質において明白である（図４ｃにおいて*により示す）。
【０２６９】
図４を参照すると、ＰＧのグランザイムＢ媒介切断が４ｈおよび２４ｈでＤＣＩにより阻害され、グランザイムＢ切断部位がアスパラギン酸をＰ１残基で含有することがそこに示されている。より具体的には、グランザイムＢを、デコリン（ａ）、ビグリカン（ｂ）およびベータグリカン（ｃ）、＋／−ＤＣＩおよび溶媒対照ＤＭＳＯと共に４ｈおよび２４ｈインキュベートした。ビグリカンおよびベータグリカンにおける切断部位は、Ｎ末端エドマン分解により同定された。図４で利用する場合、マーク*は全長タンパク質を示し、矢印は切断断片を示し、切断部位は右側に表示する。
【０２７０】
ビグリカン、デコリンおよびベータグリカンのグランザイムＢ依存的切断により、活性ＴＧＦ−β１の放出が生じる。デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンは活性ＴＧＦ−β１を封鎖するので、ＴＧＦ−β放出アッセイを利用して、これらのタンパク質のグランザイムＢ媒介切断により活性ＴＧＦ−β放出が生じたかどうかを決定した（図５）。インキュベーションの２４ｈ後、最小限のＴＧＦ−βがグランザイムＢの非存在下でプレートから解離しており、このことは、ＰＧ／ＴＧＦ−β複合体がインキュベーション時間中ずっと安定であったことを示唆している。グランザイムＢ処理の２４ｈ後、３つ全てのＰＧからＴＧＦ−βが上清に放出された。この放出は、ＤＣＩにより阻害され、このことは、該プロセスが活性グランザイムＢに依存していたことを示唆している。ベータグリカンは、一貫してデコリンおよびビグリカンより多くのＴＧＦ−βを放出した。
【０２７１】
図５を参照すると、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムＢ切断が活性ＴＧＦ−βの放出につながることを示している。より具体的には、ＴＧＦ−β１結合デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンでコーティングした４８ウェルプレートをグランザイムＢ、ＤＣＩ、および／または阻害剤溶媒対照で２４ｈ処理した。上清（放出されたＴＧＦ−βを含有）を収集し、放出されたＴＧＦ−βをウェスタンブロットにより検出した。これは、各ＰＧについて２〜３回繰り返したうちの代表的なウェスタンブロットである。
【０２７２】
グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βは活性なままであり、平滑筋細胞におけるＳＭＡＤおよびＥｒｋシグナル伝達を誘発する。グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βが活性なままであり、阻害断片に結合していなかったことを決定するために、ベータグリカン放出アッセイからの上清をヒト冠動脈平滑筋細胞上で１６ｈインキュベートした（図６）。ＳＭＡＤ−３およびＥｒｋ１／２のリン酸化（phoshoporylation）および活性化を通してＴＧＦ−βシグナル伝達を検査した。ＨＣＡＳＭＣは、１０ｎｇのＴＧＦ−β陽性対照群に良好に応答し、１６ｈでＳＭＡＤ−３およびＥｒｋ１／２リン酸化が増大した。グランザイムＢによりベータグリカンから放出されたＴＧＦ−βは、ＳＭＡＤおよびＥｒｋシグナル伝達を誘発し、このことにより、グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βが活性なままであったことが確認される。予想どおり、グランザイムＢの非存在下またはＤＣＩの存在下では、ＴＧＦ−βシグナル伝達は限定的であった。総Ｅｒｋおよび総ＳＭＡＤレベルは、ＴＧＦ−β処理により変化しなかった。図６を参照すると、グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βは、活性であり、ＨＣＡＳＭＣにおいてＳＭＡＤ−３およびＥｒｋ−２リン酸化を誘発する。より具体的には、グランザイムＢ＋／−ＤＣＩをベータグリカン／ＴＧＦ−β複合体上で２４ｈインキュベートした。上清（放出されたＴＧＦ−βを含有）をＨＣＳＭＣに１６ｈ添加し、リン酸化Ｅｒｋならびにリン酸化ＳＭＡＤ−３レベルを検査した。グランザイムＢ依存的リン酸化における同様の傾向が２つのさらなる実験において観察された（図７）。
【０２７３】
前述の例において、グランザイムＢの３つの新規の細胞外基質：デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンが同定された。さらに、グランザイムＢによるこれらのＰＧの切断時に、活性ＴＧＦ−βが放出されることが示された。報告書は、グランザイムＢのおおよそ３分の１を免疫細胞会合／脱顆粒の間に非特異的に放出することができ、細胞傷害性リンパ球が標的細胞会合の非存在下でグランザイムＢを恒常的に放出することを示していた（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら、２００８を参照されたい）。ある程度、ここで得られた結果に基づいて、グランザイムＢは、病変形成において細胞外での役割を果たす。この研究において、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムＢ切断部位が同定された。この研究において、グランザイムＢがこれらのＰＧ基質をＡｓｐのＰ１残基（ビグリカン：Ｄ91、ベータグリカン：Ｄ558）で切断したことが示された。さらに、ここに記載の研究において、ＴＧＦ−β１は、３つ全ての基質から放出された。プロテアーゼを欠いた陰性対照において、またはグランザイムＢを不可逆的阻害剤ＤＣＩと共にコインキュベートした場合、放出は認められなかった。さらに、グランザイムＢにより放出されたＴＧＦ−βは、ＳＭＡＤ−３およびＥｒｋ−２リン酸化を誘発し、それにより、グランザイムＢが活性ＴＧＦ−βを放出し、ＴＧＦ−β活性を変えないことが確認される。
【０２７４】
ベータグリカン切断により、一貫してビグリカンおよびデコリンより多くのＴＧＦ−βが放出され、これは、ベータグリカンが複数のＴＧＦ−βの結合部位を有すること、およびグランザイムＢが２つ以上の結合部位からサイトカインを潜在的に放出することが原因の可能性がある。
【０２７５】
要約すると、この例は、グランザイムＢの３つの新規の因子の同定を示し、細胞外環境におけるグランザイムＢの蓄積が、ＥＣＭによる成長因子抑制にどのように負の影響を及ぼすのかを示す。
【０２７６】
例４
アポリポタンパク質Ｅノックアウトマウスにおける皮膚のマトリックス再構築および老化におけるグランザイムＢの役割。
【０２７７】
ここで使用する略語：アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）；ノックアウト（ＫＯ）；二重ノックアウト（ＤＫＯ）；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）；グランザイムＢ（グランザイムＢ）；紫外線（ＵＶ）；高脂肪食餌（ＨＦＤ）；第２高調波発生（ＳＨＧ）。
【０２７８】
材料および方法：マウス。全ての動物手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＣｏｌｕｍｂｉａのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された動物実験用のガイドラインに従って実施した。雄のＣ５７ＢＬ／６およびａｐｏＥ−ＫＯマウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｄｅｌｓ（ＧＥＭ）施設（Ｊａｍｅｓ  Ｈｏｇｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＵＢＣ／Ｓｔ．Ｐａｕｌ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）に収容した。ＡｐｏＥ／グランザイムＢ二重ノックアウトマウスを現場で生成し、同様にＧＥＭ施設に収容した。全てのマウスに、高脂肪（２１．２％脂肪、ＴＤ．８８１３７、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）または通常の固形飼料（等量のＰｉｃｏＬａｂ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｅｔ  ２０：５０５８およびＰｉｃｏＬａｂ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ２０：５０５３、ＬａｂＤｉｅｔ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＩＮ）の食餌のいずれかを、６〜８週齢で開始し、０、５、１５または３０週間のいずれかにわたって不断給餌した。それぞれの時点で、マウスを秤量し、二酸化炭素吸入により安楽死させた。寿命は、３０週の時点まで飼育することを意図したマウス、ならびに開放性皮膚病変および黄色腫症の病変の形態の重症の病気が原因で必要とされる安楽死の結果としての死亡率のみを使用して測定した。安楽死を必要とする疾患重症度の程度は、ＧＥＭ施設内で、独立した動物ケア技術者により盲検下で判定した。つまり、動物は、軽減することができない窮迫または疼痛状態にあるように見える場合に安楽死を検討された。動物は、鎮痛薬を服用することができないので、マウスは、安楽死が必要とされる開いた皮膚病変または重症の黄色腫が原因で苦しんでいると考えられる。
【０２７９】
組織の収集および処理。安楽死の後、マウスの背中の毛を剃り、背側の皮膚を中背部から下背部にかけて除去した。皮膚試料の半分を１０％のリン酸緩衝ホルマリン中で固定した。組織学的検査および免疫組織化学的検査のために、固定した皮膚切片を処理し、パラフィンに包埋し、断面が５μｍとなるように切断した。背側の皮膚試料の残りの半分は、脱毛クリームで処理して、全ての毛を皮膚の表面から完全に除去した。次いで、これらの皮膚試料は、液体Ｎ2において瞬間凍結し、多光子顕微鏡検査でさらに使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０２８０】
組織学的検査および免疫組織化学的検査。パラフィン包埋した皮膚断面を、形態の評価のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で、ならびにコラーゲン含量を検査するためにピクロシリウスレッドで染色した。Ｌｕｎａのエラスチンを使用して、弾性線維を検査した。皮膚厚さの測定は、４０Ｘ対物レンズおよび較正された接眼マイクロメータースケールを使用して完了した。測定は、皮膚の断面全体にわたって複数の部位で行い、各マウスについて平均化した。コラーゲンは、１００％の偏光を使用してピクロシリウスレッド染色切片において観察し、固定露光で写真を撮影した。グランザイムＢ免疫組織化学的検査は、脱パラフィンしたスライドをクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５ｍｉｎ沸騰させることにより実施した。背景染色は、スライドを１０％のヤギ血清と共にインキュベートすることによりブロックした。使用した一次抗体は、１：１００希釈のウサギ抗マウスグランザイムＢ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）であり、４℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを、１：３５０希釈のビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共に、その後、ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。染色は、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（peroxidise substrate）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて可視化した。デコリン免疫組織化学的検査は、脱パラフィンしたスライドをクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に８０℃で１０ｍｉｎ浸漬することにより実施した。スライドは、１０％のウサギ血清を用いてブロックし、スライドを４℃で一晩インキュベートしている間、ヤギ抗マウスデコリン抗体（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用した。ビオチン化ウサギ抗ヤギ二次抗体（１：３５０）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、上記のＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＤＡＢ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に使用した。
【０２８１】
多光子顕微鏡検査。毛を完全に除去した凍結皮膚試料を室温で解凍し、小型皿の内部の平坦な表面に固定化した。皮膚試料を複数回洗浄し、リン酸緩衝（buffed）生理食塩水に浸漬した。第２高調波発生（ＳＨＧ）信号が皮膚試料中のコラーゲンにより放射され、これをコラーゲン密度の尺度として定量化した。使用した方法は、先に記載したものと同様であった（Ａｂｒａｈａｍら、２００９年）。つまり、使用したレーザーは、モード同期フェムト秒Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｔｓｕｎａｍｉ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）であり、２０Ｘ／０．５  ＮＡ  ＨＣＸ  ＡＰＯ  Ｌ水浸対物レンズを通して試験片に焦点を合わせた。８８０ｎｍの励起波長を使用し、対物レンズを通して試料からの後方散乱したＳＨＧ放射を収集した。Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＴＣＳ  ＳＰ２を画像取得に使用した。取得した画像（８ビット）を１０回フレーム平均処理して、ランダムノイズを最小化した。各試料について、組織深さが減少していく状況で、約２００〜２５０枚の厚さ約０．６３μｍのＺ断面画像を取得し、試料当たりの厚さ測定は合計でおおよそ１３０〜１６０μｍであった。これらの測定は、観察した最も薄い真皮層が２５０μｍであったので、完全に各試料の真皮内で行い、したがって、信号の低下は、真皮コラーゲン材料の欠如ではなく密度の低下が原因である。Ｚ断面画像を編集し、最終的にＶｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して３Ｄ画像復元を実施した。カーネルサイズが３×３のノイズ除去フィルターをこれらの３Ｄ画像に適用し、Ｖｅｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）を使用して設定閾値内のＳＨＧ信号を３Ｄ画像全体について定量化した。
【０２８２】
統計分析。生存率データを、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ試験を使用し、Ｐ＜０．０５を有意と見なして、有意性について分析した。群比較分析のために、必要に応じてボンフェローニ事後試験を伴う一または二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【０２８３】
結果：罹患率および皮膚病態。３０週の前に安楽死を必要とした事例は全て、重症の開放性皮膚病変または黄色腫症の皮膚病変に起因していた。先の報告と矛盾なく、この研究におけるａｐｏＥ−ＫＯマウスは、野生型の対照と比較して顕著な健康の低下を示し、その結果、３０週の期間にわたる罹患率および安楽死が必要となる頻度の増大が生じた（図８Ａ）。野生型のマウスをＨＦＤで飼育しても生存率は３０週の期間にわたって変わらなかったが、ａｐｏＥ−ＫＯマウスにＨＦＤを供給した場合、安楽死の必要性は有意に増大し、たった約６９％しか３０週の時点まで生存していなかった（図８Ａ）。
【０２８４】
図８Ｂに示す通り、ａｐｏＥ−ＫＯマウスは、脆弱化、脱毛、白毛化の兆候ならびにそれらの背中および肩での皮下病変または黄色腫の形成を３０週で示した。これらの表現型は、ａｐｏＥ−ＫＯマウスにＨＦＤを供給した場合、より苛酷であり、早く発生した（図８Ｂ）。３０週の群において通常の固形食餌で飼育した全てのａｐｏＥ−ＫＯマウスのうち、９／３１（２９％）が黄色腫／皮膚病態の証拠を示し、最も早い事例では１８週で示し、ほとんどの事例（７／９）は、３０週で検査したときに明らかとなった。ＨＦＤを供給した場合、１３／３２（４１％）のａｐｏＥ−ＫＯマウスが黄色腫／皮膚病態の証拠を示し、１０／１３は、３０週の時点より前に発生した。これらのデータは、ＨＦＤがこれらの病変の頻度および発症を加速させることを示す。興味深いことに、重症の黄色腫の出現は、安楽死を必要とする最初の事例が１９．９週で現れ、観察された皮膚病態の総発生率はたった３／１４（２１％）であったので、ＨＦＤを供給したＤＫＯマウスにおいて遅延された（図８Ａ）。比較すると、１９．９週で、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ群からの８匹のマウス（２５％）が既に安楽死を必要とし、最初の発生は、７週という早さであった（表１）。通常の固形食餌を供給したＤＫＯマウスは、黄色腫を発生していると見られる場合もあった（２／１１または１８％）が、３０週の前に安楽死を必要とするほど苛酷ではなかった（図８Ａ）。これらの結果は、グランザイムＢが病変重症度に寄与すること、およびグランザイムＢの低減によりこれらの皮膚病態の発症が遅延されることを示す。表１は、全ての群における皮膚病変の発生率および重症度の概要を示す。
【表１】
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【０２８５】
体重増加。ＨＦＤにより、Ｃ５７ＢＬ／６対照マウスにおいて３０週の時点で有意な体重増加が生じたが、ＨＦＤで飼育したａｐｏＥ−ＫＯマウスは、固形飼料を供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスと比較して有意な体重の増大を示さず、３０週でＨＦＤを供給したＣ５７ＢＬ／６マウスより有意に体重が少なかった（図８Ｆ）。体重増加を０、５、１５および３０週の時点で検査すると、ＨＦＤで飼育したＣ５７ＢＬ／６マウスは、その食餌で飼育して５週間という早さで、固形飼料を供給した対照と比較して体重の有意な増大を示し、研究の間ずっと高いままであった（図８Ｃ）。ＡｐｏＥ欠損だけでは、固形飼料を供給した対照と比較して、体重増加における違いは３０週まで生じず、３０週では、固形飼料を供給したａｐｏＥ−ＫＯ群の体重増加が止まり（図８Ｄ）、脆弱な表現型をとった（図８Ｂ）。ａｐｏＥ−ＫＯマウスにＨＦＤを供給した場合、それらは、対照群と同様の速度で体重が増加しているように見え、おそらく、１５週ではより大幅に体重が増加した。しかし、３０週までには、それらは、実際には体重が減少したように見え（図８Ｅ）、脆弱で病的な皮膚を示した場合が多かった（図８Ｂ）。このプロセスにおけるグランザイムＢの役割を検査するために、通常の固形飼料またはＨＦＤのいずれかで飼育したＤＫＯマウスを３０週まで維持した。いずれの群のＤＫＯマウスも、Ｃ５７ＢＬ／６固形飼料を供給した対照群またはａｐｏＥ−ＫＯ群のいずれかと比較して、３０週で体重における有意な違いを示さなかった（図８Ｆ）。
【０２８６】
図８を参照すると、Ｃ５７ＢＬ／６固形飼料（ＣＣ）、Ｃ５７ＢＬ／６高脂肪（ＣＨ）、ａｐｏＥ−ＫＯ固形飼料（ＡＣ）、ａｐｏＥ−ＫＯ高脂肪（ＡＨ）、ＤＫＯ固形飼料（ＧＤＣ）およびＤＫＯ高脂肪（ＧＤＨ）である。（Ａ）高脂肪（ｎ＝１８）または通常の固形飼料（ｎ＝１９）食餌のいずれかで飼育したＣ５７ＢＬ／６野生型のマウスの全てが３０週の時点まで生存していたが、固形飼料を供給したａｐｏＥ−ＫＯマウス（ｎ＝３１）の９４％が３０週間生き続けていた。ＨＦＤは、対照ＣＣ群と比較して、ａｐｏＥ−ＫＯマウス（ｎ＝３２）における生存率を有意に（Ｐ＜０．０１）低減し、３０週の期間生存するのに十分健康なままなのはわずか６９％であった。固形飼料を供給したＤＫＯマウス（ｎ＝１１）の１００％が３０週の時点まで生存していたが、ＨＦＤを供給したＤＫＯマウス（ｎ＝１４）における罹患は、ＡＨ群と比較して遅延したように見えた。（Ｂ）３０週の時点でのマウスの代表的画像。（Ｃ〜Ｅ）ＣＣと比較したＣＨ、ＡＣおよびＡＨ群の０、５、１５および３０週にわたる体重増加。（Ｆ）３０週の時点での全ての群のマウスの平均体重（エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す）。（Ｄ〜Ｆ）。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１。
【０２８７】
より具体的には、図８Ｂに関して、そこの写真は、以下のものを示す：Ｃ５７ＢＬ／６固形飼料−対照マウス、一般的な健康なサイズおよび体重。正常な外観の黒色の毛。Ｃ５７ＢＬ／６高脂肪−対照マウスと比較して太っているように見え、毛および皮膚は、その他の点では通常である。ＡｐｏＥ−ＫＯ固形飼料−このマウスは、対照マウスと比較して脆弱であるように見え、白毛化の証拠および一部の領域の毛の菲薄化／脱毛を示す。ＡｐｏＥ−ＫＯ高脂肪−このマウスも対照マウスと比較してより脆弱であるように見え、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのように高脂肪食餌により体重を増加することができない。このマウスも、それらの背中に出現する白毛化、脱毛および炎症性皮膚病変（黄色腫）の証拠を示す。ＤＫＯ固形飼料−これらのマウスは、対照マウスと比較して体重増加の観点から相対的に正常であるように見え、ａｐｏＥ−ＫＯ固形飼料群と比較して脱毛、白毛化および皮膚病変形成の発生率および重症度が低減した。ＤＫＯ高脂肪−この群も、一般に、ａｐｏＥ−ＫＯ高脂肪群より健康であるように見え、脱毛、白毛化および皮膚病変の発生率および重症度が低減した。
【０２８８】
皮膚病理組織検査。図９に示す通り、ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚は不均一であり；正常な「普通」の外観の皮膚（図９Ａ）および黄色腫症の病変を特徴とする他の領域（図９Ｂ）を示している。これらの病変は、マウスの背中に発生することが多く、年齢と共に、およびＨＦＤを供給すると、重症度および頻度の増大と共に生じる。Ｃ５７ＢＬ／６野生型のマウスでは、食餌を問わず、３０週の期間にわたるいずれの時点でも黄色腫症を示したものはなかった。ａｐｏＥ−ＫＯマウスにおける黄色腫症の病変の組織学的検査により、皮膚肥厚が示され、これには、表皮の肥厚、相当な免疫浸潤、正常な脂肪組織の損失、ＥＣＭ変性およびコレステロール結晶の存在が含まれていた（図９Ｂ）。黄色腫発生は、ａｐｏＥ−ＫＯマウスにおいてよく見られたが、全てのマウスがこの表現型を示したわけではなく、場合によっては、マウスは、相対的に正常に見える皮膚を有していた（図９Ａ）。
【０２８９】
図９を参照すると、ＡｐｏＥ−ＫＯマウス皮膚は、不均一であり、皮膚の特定の領域は「普通」に見えるが、他の領域は黄色腫症の病変を含有する（Ｈ＆Ｅ染色）。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６固形飼料（ＣＣ）、Ｃ５７ＢＬ／６高脂肪（ＣＨ）、ａｐｏＥ−ＫＯ固形飼料（ＡＣＲ）、ａｐｏＥ−ＫＯ高脂肪（ＡＨＲ）、ＤＫＯ固形飼料（ＧＤＣＲ）およびＤＫＯ高脂肪（ＧＤＨＲ）からの３０週の時点での「普通」な外観の皮膚。（Ｂ）コレステロール結晶（矢印）を示している、３０週の時点まで生存していたＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウス（ＡＨＸ）からの黄色腫、ならびに（Ｃ）該病変の重症度が原因で１４．９週で安楽死を必要としたＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスからの黄色腫。Ｅ：表皮；Ｄ：真皮；Ａ：脂肪組織。（Ａスケールバー＝２００μｍ、ＢおよびＣスケールバー＝１００μｍ）。
【０２９０】
皮膚厚さ。皮膚菲薄化および萎縮症は、ヒトとマウスの両方において年齢と共に発生する特徴的な特色である（例えば、ＢｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａおよびＴｈｏｍａｓ、２００４を参照されたい）。ａｐｏＥ−ＫＯマウスがこの体質を示すかどうかを決定するために、本発明者らは、固形飼料またはＨＦＤを供給したＣ５７ＢＬ／６およびａｐｏＥ−ＫＯマウスのホルマリン固定した中背部から下背部からの皮膚切片を、Ｈ＆Ｅ染色を使用して０、５、１５および３０週で分析し、表皮、真皮、脂肪および骨格筋層を含めた総皮膚厚さを測定した（図１０Ａ）。ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚の不均一な性質および黄色腫発生が皮膚厚さに対して劇的な効果を有するという事実（図９）に起因して、ａｐｏＥ−ＫＯマウスからの皮膚試料を、黄色腫組織の存在に応じて２つの群：「普通」の皮膚および黄色腫の皮膚に分離した。ＨＦＤを供給した場合、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスは、５、１５および３０週の時点で対照群より有意に厚い皮膚を有していた（図１０Ａ）。ＡｐｏＥ欠損単独では、図１０Ｂに示す通り、対照と比較して経時的に有意な違いは生じなかった。興味深いことに、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ群からの皮膚は、厚さを経時的に測定すると、３０週では対照群より有意に薄いが、１５週では対照群よりわずかに厚いように見えた（図１０Ｃ）。このことは、これらの変化が、野生型の対照と比較して、単純に発育上の違いの結果ではなく、むしろ、時間とともに加速的に発生する変化であることを示す。グランザイムＢの欠損により皮膚菲薄化および脆弱化が防がれるかどうかを決定するために、通常の固形飼料またはＨＦＤで飼育したＤＫＯマウスからの皮膚を３０週で検査し、他の群と比較した。上述の通り、ＨＦＤは、Ｃ５７ＢＬ／６群において有意な皮膚厚さの増大を引き起こしたが、ａｐｏＥ−ＫＯ群においては有意な厚さの低下を引き起こした（図１０Ｇ）。ＨＦＤを供給したＤＫＯマウスは、３０週でＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ群と比較して総皮膚厚さの有意な増大を示し（図１０Ｇ）、グランザイムＢがａｐｏＥ−ＫＯマウスにおける老化関連の皮膚菲薄化および脆弱化に寄与することを示している。
【０２９１】
皮膚の個々の層のより厳密な分析により、「普通」の皮膚試料における総皮膚厚さの変化が、主に真皮および／または脂肪組織層の変化に起因していたことが示された。３０週の時点ではいずれの群についても表皮厚さの有意な違いは観察されなかった（図１０Ｄ）が、真皮の厚さは、固形飼料を供給したＤＫＯ群において固形飼料を供給した対照群と比較して有意に厚かった（図１０Ｅ）。興味深いことに、ＨＦＤを供給した場合、ＤＫＯ群は、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ群より有意に厚い真皮を有していた（図１０Ｅ）。脂肪組織層の厚さの変化が最も多様であり、ＨＦＤを供給したＣ５７ＢＬ／６群が有意な増大を示し、ａｐｏＥ−ＫＯ群および固形飼料を供給したＤＫＯ群のいずれも、固形飼料を供給した対照より有意に薄い脂肪組織層を有していた（図１０Ｆ）。ＨＦＤを供給したＤＫＯマウスは、固形飼料を供給した対照またはａｐｏＥ−ＫＯ群のいずれかと比較して、脂肪組織厚さの有意な違いを示さなかった（図１０Ｆ）。これらの結果は、ａｐｏＥ欠損により総皮膚厚さの低下が生じること、およびこのことが、脂肪組織の低下にある程度起因しており、一方、グランザイムＢの欠損により、真皮厚さの増大にある程度起因して皮膚菲薄化が防がれることを示している。
【０２９２】
図１０を参照すると、（Ａ〜Ｃ）は、Ｃ５７ＢＬ／６固形飼料（ＣＣ）、Ｃ５７ＢＬ／６高脂肪（ＣＨ）、ａｐｏＥ−ＫＯ固形飼料（ＡＣＲ）およびａｐｏＥ−ＫＯ高脂肪（ＡＨＲ）の皮膚厚さを、非病的な「普通」の皮膚切片を使用して０、５、１５および３０週で測定した。個々の皮膚層をＣＣ、ＣＨ、ＡＣＲ、ＡＨＲ、ＤＫＯ固形飼料（ＧＤＣＲ）およびＤＫＯ高脂肪（ＧＤＨＲ）について３０週で測定し、これには、（Ｄ）表皮、（Ｅ）真皮、（Ｆ）脂肪および（Ｇ）骨格筋を含めた総皮膚厚さが含まれていた。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５対ＣＣ；**Ｐ＜０．０１対ＣＣ；***Ｐ＜０．００１対ＣＣ；†Ｐ＜０．０５対ＡＨＲ；††Ｐ＜０．０１対ＡＨＲ；†††Ｐ＜０．００１対ＡＨＲ。
【０２９３】
ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚におけるコラーゲンおよびエラスチン異常。ａｐｏＥ−ＫＯマウスの病的な黄色腫皮膚病変において発生するコラーゲン変化を調査するために、皮膚切片をピクロシリウスレッドで染色し、偏光を使用して可視化した。図１１Ｃおよび１２Ｋに示す通り、皮膚病変は、対照マウスからの普通の皮膚と比較して、コラーゲン組織および構造の明らかな変性を示している（図１１Ａ）。コラーゲン線維は、病的な皮膚において、より平行な配向で配置され、コラーゲン束がより薄いことが多く（図１１Ｃ）、これにより、これらの病変において観察された増大した剛性および皮膚脆弱化が説明される。真皮の一部の領域は、正常なコラーゲンのほぼ完全な損失／分解および真皮表皮バリアへの損傷の証拠を示していた（図１２Ｉ）。
【０２９４】
病的な皮膚におけるエラスチン含量を検査するために、Ｌｕｎａのエラスチン染色を使用した。野生型の対照マウスは、拡散したエラスチン分布ならびに細い弾性線維および最低限の大型のエラスチン束を示した（図１１Ｅ）。病的な皮膚において、本発明者らは、真皮乳頭層におけるエラスチン沈着の増大ならびに真皮における異常なエラスチン束沈着を観察した（図１１ＦおよびＧ）。
【０２９５】
図１１を参照すると、固形飼料を供給したＣ５７ＢＬ／６マウスからの皮膚切片は、厚い高密度コラーゲン線維を示すが、ＨＦＤで飼育したａｐｏＥ−ＫＯマウスは、しばしば、対照と比較して低減した密度と共にコラーゲン形態が変化した領域を示す。（Ａ）固形飼料食餌で３０週間飼育したＣ５７ＢＬ／６マウスからの皮膚コラーゲンの画像（Ｅ：表皮；Ｄ：真皮；Ａ：脂肪組織）。（Ｂ）ＨＦＤで３０週間飼育したａｐｏＥ−ＫＯマウスからの「普通」の皮膚試料からの皮膚コラーゲン。（Ｃ）黄色腫を含有する病的な領域からのＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚コラーゲン。（Ｄ）ＨＦＤを供給したＤＫＯマウスの３０週での「普通」の皮膚からの皮膚コラーゲンの例。（Ｅ）固形飼料食餌で３０週間飼育したＣ５７ＢＬ／６マウスからのエラスチン（エラスチンは濃い紫色に染まる−矢印）。（ＦおよびＧ）病的な皮膚を有する３０週間ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスからの異常なエラスチン沈着（矢印）の例。偏光の下で見たピクロシリウスレッド染色（Ａ〜Ｄ）およびＬｕｎａのエラスチン染色（Ｅ〜Ｇ）。（Ａ〜ＤおよびＦ〜Ｇスケールバー＝１００μｍ、Ｅスケールバー＝１０μｍ）。
【０２９６】
図１１において、コラーゲンをモニターしている。図１１Ａにおいて、コラーゲンを正常な（非ノックアウトマウス）からのこのスライドに高密度に充填している。図１１Ｂは、ａｐｏＥ−ＫＯマウスからのスライドである。コラーゲンは、それほど高密度に充填されていないように見える。図１１Ｃにおいて、このスライドは、ａｐｏＥ−ＫＯマウスからの病的な皮膚を示している。コラーゲンは、直線的であるように見え、それほど弾性ではない。図１１Ｄにおいて、このスライドは、グランザイムＢ−／−ＡｐｏＥ−ＫＯマウスにおけるコラーゲンを示している。コラーゲンは、単一ノックアウトａｐｏＥ−ＫＯマウス組織と比較してより高密度に充填されているように見える。図１１Ｅおよび１１Ｆにおいて、エラスチンをモニターしている。図１１Ｅは、正常なマウスからのデータである。右側のパネルは、エラスチン線維を示している（矢印を参照されたい）。
【０２９７】
皮膚ａｐｏＥ−ＫＯマウスにおけるデコリン再構築およびグランザイムＢ発現。コラーゲン組織崩壊は、病的なａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚において容易に観察された（図１２Ｉ）。皮膚の一部の領域において最低限の違いが観察された（図１２Ｂ）が、病的な皮膚切片を抗デコリン抗体で染色することにより、ａｐｏＥ−ＫＯマウスの病的な皮膚の他の領域においてデコリンの明確な損失が示された（図１２ＣおよびＤ）。デコリン分解の領域は、コラーゲン損失および再構築の領域と一致した（図１２ＩおよびＪ）。ＤＫＯマウスは、特に真皮表皮接合の近くの非病的な皮膚切片において増大したデコリン含量を示した（図１２ＥおよびＦ）。さらに、デコリン損失の領域は、ＤＫＯマウスからの病的な皮膚切片において、ａｐｏＥ−ＫＯマウスほど観察されなかった（図１２ＧおよびＨ）。ａｐｏＥ−ＫＯマウスからの黄色腫皮膚切片を抗グランザイムＢ抗体で染色した場合、グランザイムＢは、特定の領域の病変において観察され、真皮表皮接合近くの真皮乳頭層に局在していることが多かった（図１２Ｋ）。興味深いことに、該病変における局在型グランザイムＢ発現のこれらの領域は、染色連続切片から明らかなように、コラーゲン／デコリンの損失および再構築の領域と直接一致した（図１２Ｉ〜Ｋ）。これらの結果は、デコリンの切断を通して皮膚のコラーゲン再構築にグランザイムＢが関与していることを示す。
【０２９８】
図１２を参照すると、（Ａ）は、固形飼料を供給したＣ５７ＢＬ／６（Ｂ〜Ｄ）ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯからの皮膚におけるデコリン染色であり、（Ｅ〜Ｆ）は、真皮表皮接合近くの真皮乳頭層でより濃いデコリン染色（矢印）を示すＨＦＤを供給したＤＫＯの「普通」の皮膚であり、（Ｇ〜Ｈ）は、ＤＫＯの病的な皮膚である。（Ｉ）コラーゲン、（Ｊ）デコリンおよび、（ＫおよびＬ）グランザイムＢを染色したＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ皮膚の連続切片。（Ａ〜ＨおよびＬスケールバー＝５０μｍ、Ｉ〜Ｋスケールバー＝２００μｍ）
図１２Ａにおいて、正常なマウスにおけるデコリン染色を示す。染色は、表皮真皮接合部に向かって強くなっている。図１２Ｂは、ａｐｏＥ−ＫＯマウスにおけるデコリン染色を示す。染色は、より拡散している。図１２Ｃおよび１２Ｄは、ａｐｏＥ−ＫＯマウス組織からの皮膚の病的な部分にデコリン染色がほぼ存在していないことを示す。図１２Ｅおよび１２Ｆは、グランザイムＢ−／−ａｐｏＥ−／−マウス組織からの普通の皮膚を示す。強いデコリン染色が存在している。図１２Ｇおよび１２Ｈは、グランザイムＢ−／−ａｐｏＥ−／−マウス組織からの病的な皮膚を示す。図１２Ｈにおいて、デコリンは表皮に存在している。図１２Ｉ、１２Ｊ、および１２Ｋは、コラーゲン、デコリン、およびグランザイムＢをそれぞれモニタリングしている連続切片であり、全て、ａｐｏＥ−ＫＯマウス組織からのものである。図１２Ｌは、図１２Ｋからのズームイン写真である。図１２Ｋにおいて、グランザイムＢ染色が増大している。
【０２９９】
コラーゲン密度および組織。ａｐｏＥ−ＫＯマウスが普通の非黄色腫皮膚においてコラーゲン含量の違いを示すかどうかを決定するために、ホルマリン固定した皮膚切片にピクロシリウスレッド染色を使用し、コラーゲン含量および構造の変化について分析した。固形飼料を供給した対照群からの真皮コラーゲンは、３０週の時点で厚い高密度コラーゲン線維の一般的な赤色／オレンジ色の染色を示した（図１１Ａ）。対照的に、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスは、緩く充填され、対照群ほど構造化されていない真皮コラーゲンを示すことが多かった（図１１Ｂ）。これは、ＨＦＤを供給したＤＫＯ群を含めた他の群においては容易に観察されず（図１１Ｄ）、このことは、ＨＦＤとａｐｏＥ欠損を組み合わせると、ａｐｏＥ−ＫＯマウス皮膚におけるコラーゲン構造および密度に影響が及ぶこと、ならびにグランザイムＢ欠損により厚い線維の形成およびコラーゲン密度の損失が予防されることを示唆している。
【０３００】
固定した薄くスライスした切片の分析により、コラーゲン含量および構造に関して有用な情報を得ることができるが、重要な三次元および組織に関する性質は、処理の間に損なわれるまたは変性する可能性がある。本発明者らは、コラーゲンの複屈折（bifringent）性質を利用して、三次元空間において多光子顕微鏡検査を使用して、固定していない非染色の厚い皮膚試料におけるコラーゲン構造および組織を視覚化した。高秩序の原線維形成コラーゲン（タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ等）は、第２高調波発生（ＳＨＧ）信号を生成し、外因性の標識を必要としない（例えば、Ｚｉｐｆｅｌら、２００３を参照されたい）。これらのＳＨＧ信号は、総コラーゲン含量ではなくコラーゲンマトリックスの密度および組織と相関する。コラーゲンマトリックス（灰色）に由来する代表的な平面化した（flattened）三次元ＳＨＧ画像を、３０週の時点での全ての群について図１３Ａに示す。非病的な皮膚のみをこれらの実験に使用して、観察されたＥＣＭ変化が、確実に、黄色腫形成の結果ではなく、むしろ、より内因性の老化プロセスの結果であるようにする。コラーゲン密度を経時的にモニターした場合、０週の時点では、Ｃ５７ＢＬ／６およびａｐｏＥ−ＫＯ群が同様であるように見えた（図１３Ｂ〜Ｄ）。固形飼料を供給した対照群は、経時的にコラーゲン密度のわずかな低下を示すように見えたが、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスは、年齢の関数としてＳＨＧ信号の低減を示し、これは、５週で、野生型の対照より早い速度で開始し、これは、コラーゲン修飾および組織崩壊の速度増大を示しており、３０週間でコラーゲン密度の有意な損失が生じた（図１３Ｄ）。これらの実験において使用した皮膚が普通の非黄色腫皮膚であったことを確認するために、これらの実験に続いて皮膚試料を１０％の緩衝ホルマリンに固定し、Ｈ＆Ｅ染色を使用して組織学的に検査した。組織学的検査をすると、これらの実験のために選択したＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ皮膚は、黄色腫症の証拠を示さず、観察されたコラーゲン密度の変化が黄色腫形成によりもたらされたのではなく内因性の性質であることを確認した（データ図示せず）。これらの結果は、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚において、老化関連ＥＣＭ変化が、黄色腫が形成されていない皮膚切片においてさえも、野生型のマウスと比較して増大した速度で発生しており、早すぎる皮膚の老化につながることを示す。
【０３０１】
図１３を参照すると、（Ａ）は、固形飼料を供給したＣ５７ＢＬ／６（ＣＣ）、ａｐｏＥ−ＫＯマウス（ＡＣＲ）およびＤＫＯマウス（ＧＤＣＲ）、ならびにＨＦＤを供給したＣ５７ＢＬ／６（ＣＨ）、ａｐｏＥ−ＫＯマウス（ＡＨＲ）およびＤＫＯマウス（ＧＤＨＲ）から３０週で得た新たなｅｘ−ｖｉｖｏの固定していない非染色のマウスの「普通」の皮膚組織の代表的３Ｄマージ平面画像である。灰色は、コラーゲンマトリックスを表す。（Ｂ〜Ｄ）は、（それらのそれぞれの食餌で０、５、１５および３０週間飼育した）ＣＣ、ＣＨ、ＡＣＲおよびＡＨＲ群についての、ＳＨＧ信号の強度として表される時間の関数としてのコラーゲン密度である。（Ｃ）は、６つ全ての群についての３０週の時点でのコラーゲン密度である。ノックアウトグランザイムＢは、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスにおいて失われたＳＨＧ信号強度を回復させる。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５対ＣＣ；**Ｐ＜０．０１対ＣＣ；†Ｐ＜０．０５対ＡＨＲ；††Ｐ＜０．０１対ＡＨＲ。スケールバー＝８０μｍ。
【０３０２】
観察されたコラーゲン密度の損失におけるグランザイムＢの役割をさらに検査するために、固形飼料またはＨＦＤを（この時点で大部分の極端な違いが観察されたので）３０週間供給した後でＤＫＯマウスの皮膚もＳＨＧを使用して検査した。言及した通り、３０週の時点で、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスのみが、ＳＨＧ信号の減少により示される通り、固形飼料を供給した対照群と比較して有意に減少した皮膚のコラーゲン密度を示し（図１３Ｅ）、このことは、ａｐｏＥ欠損とＨＦＤを組み合わせると、皮膚コラーゲン密度の損失が生じることを示唆している。いずれかの食餌で飼育したＤＫＯマウスのいずれの群も、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯ群と比較した場合、皮膚コラーゲン密度の有意な増大を示し、このことは、皮膚における内因性の老化プロセスにおいて、真皮コラーゲンの年齢依存的な組織崩壊を促進することによりグランザイムＢが関与していることを示していた（図１３Ｅ）。
【０３０３】
グランザイムＢは、デコリンを切断し、デコリン分解の領域に存在している。図１４を参照すると、グランザイムＢの添加により、全長グリコシル化デコリンの分解および損失が２４ｈで生じる。このことは、強力なグランザイムＢ阻害剤、化合物２０が含まれる場合に防止される。（図１４Ａ；アステリスク＝全長タンパク質）。野生型の固形飼料（ＷＴ）、ａｐｏＥ−ＫＯ高脂肪（ＡｐｏＥ−脂肪）およびＤＫＯ高脂肪（ＤＫＯ−脂肪）群からの非病的な皮膚におけるデコリン免疫染色（濃い灰色）。矢印は、真皮表皮接合の近くの増大したデコリンを指し示す（スケールバー＝５０μｍ）（図１４Ｂ）。ＡｐｏＥ−脂肪およびＤＫＯ−脂肪群からの病的な皮膚におけるデコリン免疫染色（濃い灰色）（スケールバー＝５０μｍ）（図１４Ｃ）。ＡｐｏＥ−脂肪マウスからの病的な皮膚におけるグランザイムＢ免疫染色（濃い灰色）。Ｅは、「表皮」を示し、Ｄは、「真皮」を示す。矢印は、真皮表皮接合の領域を指し示す（スケールバー＝１００μｍ）（図１４Ｄ）。肥満細胞およびグランザイムＢを二重染色したＡｐｏＥ−脂肪マウスからの病的な皮膚切片。矢印は、肥満細胞（濃い灰色）内のグランザイムＢ（薄い灰色）を指し示す（スケールバー＝２５μｍ）（図１４Ｅ）。
【０３０４】
前述の例における結果の検討：本研究において、ＨＦＤがａｐｏＥ−ＫＯマウスにおける皮膚の老化に対して相当な効果を有することが示された。ＨＦＤは、マウスの老化に伴う炎症性皮膚疾患の頻度に影響を及ぼすだけではなく、ＥＣＭの構造的組織における有意な老化に関連した変性と共に、脆弱で薄くなった皮膚の状態ももたらす。本発明者らは、セリンプロテアーゼ、グランザイムＢが、皮膚の老化および疾患において、鍵となるＥＣＭタンパク質およびプロテオグリカンの再構築を通して重要な役割を果たすことも示す。ａｐｏＥ−ＫＯマウスにＨＦＤを３０週間供給した場合、それらは、脆弱化および野生型の対照と比較して増大した罹患率を示した（図８）。このことは、皮下脂肪組織の損失と共に、皮膚病変の増大および皮膚菲薄化の形態で組織学的にも観察された（図９および１０）。黄色腫の発生は、食餌を問わずａｐｏＥ−ＫＯマウスにおいて発生したが、特定の内因性老化表現型、例えば、皮膚菲薄化およびコラーゲン密度の損失などを観察するのにＨＦＤが必要であった（図１０および１３）。ａｐｏＥ−ＫＯマウスにおける皮膚病変の発症および重症度と同様に、ＨＦＤは、これらの老化特徴を加速し、固形飼料を供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスも、３０週を超えたより遅い時点での検査でこれらの表現型を示す。
【０３０５】
この研究において、通常の固形飼料またはＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスは、３０週で脂肪層厚さの低下を示したが、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウス皮膚における皮膚厚さ全体は、１５〜３０週の時点で減少した（図１０）。このことは、グランザイムＢ欠損により、真皮厚さを保存することによりこの皮膚菲薄化表現型の救助がある程度促進されることを示す（図１０）。黄色腫皮膚試料におけるコラーゲンおよびエラスチンの分析により、光老化した皮膚において見られることが多い日光弾力線維症と類似の異常なエラスチン沈着と共にコラーゲンの相当な再構築が示された。「普通」のａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚における老化に関連した変化の存在は、黄色腫皮膚の肥厚し再構築した炎症促進性状態と共に、ａｐｏＥ−ＫＯマウスが内因性／経時的皮膚の老化と光老化と同様の外因性老化の両方の特色を示し、いずれの場合も、ヒトにおけるこれらの形態の皮膚の老化を模倣するＥＣＭ変化が生じることを示す。
【０３０６】
この研究において、セリンプロテアーゼグランザイムＢが、ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚のコラーゲンおよびデコリンの分解および再構築の領域において発現する証拠が得られた（図１２）。本発明者らの結果は、グランザイムＢが、老齢のａｐｏＥ−ＫＯマウスにおいて観察された脆弱な／薄い皮膚および高密度コラーゲンの欠如に寄与することも示す。
【０３０７】
さらに、病的な皮膚試料において観察されたグランザイムＢの苔癬様の発現により、病変形成およびＥＣＭ分解の新規の機序が提示される。苔癬様の炎症は、複数の炎症性皮膚疾患の特徴的な特色である。この領域におけるグランザイムＢの存在により、グランザイムＢが真皮表皮接合またはその付近のＥＣＭを破壊することも示される。実際に、ＤＫＯマウスは、真皮表皮接合近くの皮膚においてデコリン染色の明らかな増大を示した（例えば、図１２ＥおよびＦを参照されたい）。
【０３０８】
病的な皮膚に加えて、ＨＦＤを供給したが通常の固形食餌は供給していないａｐｏＥ−ＫＯマウスが、「普通」の皮膚試料における３０週の期間にわたるＳＨＧおよび多光子顕微鏡検査により示される、真皮におけるコラーゲン密度の有意な損失を示した（図１３）。これらの実験は、新たな厚い組織切片に対して行い、それにより、任意の固定または処理法の前に３Ｄの皮膚のコラーゲン含量に独特な展望がもたらされる。これらの皮膚組織のその後の固定および組織学的分析により、ＨＦＤを供給したａｐｏＥ−ＫＯマウスにおけるコラーゲン密度の低下が「普通」の非黄色腫皮膚において発生したこと、およびＳＨＧ信号の減少は、単純に黄色腫の存在が原因ではないことが確認された（データ図示せず）。固定した皮膚切片をピクロシリウスレッドで染色することにより、ａｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚において、対照と比較してより拡散したコラーゲンパターンも示した（図１１Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、ＤＫＯマウスを使用して、このコラーゲン密度および組織信号の低下を、グランザイムＢ活性をブロックすることにより救助できることを示す（例えば、図１１および１３を参照されたい）。
【０３０９】
要約すると、これらの発見は、ａｐｏＥ−欠損により、皮膚における炎症促進性状態の増大が生じ、これが、ＥＣＭ再構築および観察された他の老化に関連した変化に寄与すること、およびＨＦＤが、グランザイムＢ媒介機序を通してこれらの変化を悪化させることを示す。これらの発見は、デコリンの切断および真皮コラーゲンの再構築を伴う、皮膚におけるグランザイムＢの新規の役割も示し、これは、ＥＣＭ構造、老化および疾患における皮膚の脆弱性、ならびに創傷修復において重要な意味を有するプロセスである。
【０３１０】
例５
特定の小分子阻害剤（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０）を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりベータグリカン切断が阻害される。
【０３１１】
この例において、特定の小分子阻害剤（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０）を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害により、ベータグリカン切断が阻害される。図１５に示す通り、インキュベーションを室温で２４時間実施し、総反応体積は３０μｌであった。試料を１０％のゲル上で泳動させ、ポンソー染色を用いて画像化し、走査した。図１５に示す通り、アステリスクは全長タンパク質を示し；矢印は切断断片を示す。
【０３１２】
例６
特定の小分子阻害剤（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０）を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりプロテオグリカン封鎖ＴＧＦ−βの放出が阻害される。
【０３１３】
この例において、２０ｕｇ／ｍｌのベータグリカンを４８ウェルプレート上にコーティングし、１０ｎｇのＴＧＦ−βと共にインキュベートした。過剰なＴＧＦ−βを洗浄してプレートから取り除き、ベータグリカン／ＴＧＦ−β複合体をグランザイムＢ＋／−阻害剤と共にＲＴで２４ｈインキュベートした。上清（放出されたＴＧＦ−βを含有）を収集し、ＴＧＦ−βについてウェスタンブロットした。グランザイムＢの非存在下では、ＴＧＦ−βの上清への非特異的解離はほとんどなかった（２；図１６を参照されたい）。ＴＧＦ−βは、２４ｈのインキュベーション後、グランザイムＢにより放出される（４；図１６を参照されたい）。放出は、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０（特定のグランザイムＢ阻害剤）により阻害され（５；図１６を参照されたい）、ＤＣＩにより部分的に阻害される（非特異的セリンプロテアーゼ阻害剤）（６；図１６を参照されたい）。
【０３１４】
例７
特定の小分子阻害剤（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０）を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりデコリン切断が阻害される。
【０３１５】
この例において、インキュベーションをＲＴで２４ｈ実施し、総反応体積は３０ｕｌであった。試料を１０％のゲル上で泳動させ、クーマシーブルー染色により画像化した。図１７を参照すると、アステリスク＝全長タンパク質である。
【表２】
2014500271.tif 000061
【０３１６】
例８
グランザイムＢ（グランザイムＢ）の小分子阻害剤の同定。
【０３１７】
小分子ライブラリー（ＺＩＮＣ−Ｉｒｗｉｎ  ＪＪおよびＳｈｏｉｃｈｅｔ  ＢＫ、２００５。Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｆ  Ｍｏｄｅｌ  ４５９１：１７７〜１８２；ＮＣＩ−Ｖｏｉｇｔ、Ｊ．Ｈ．ら。Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２００１、４１、７０２〜７１２）を、グランザイムＢ阻害性化合物候補についてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでスクリーニングした。複数の小分子阻害剤候補が同定され、インビトログランザイムＢ阻害アッセイを施した。より具体的には、基質Ａｃ−ＩＥＰＤ−ｐＮＡを用いてグランザイムＢ活性の連続比色（colormetric）アッセイを実施した。つまり、８ｕｇ／ｍｌのグランザイムＢ、２０μＭの基質、および増大する濃度の目的の阻害剤をインキュベートし、最終反応体積は５０ｕｌであった。反応緩衝剤は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０％のスクロース、０．１％のＣＨＡＰＳおよび５ｍＭのＤＴＴからなっており、反応は、３７℃で行った。ｐＮＡ放出およびグランザイムＢ阻害を、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅマイクロプレートリーダーで４０５ｎｍでモニターした。アッセイにおいて、グランザイムＢは、４μｇ／ｍｌ（０．１４５μＭ）の濃度で使用し、これは、対象において観察されるものより約８００００倍高いと推定され、本発明者らの発見は、Ｇｒ  Ｂの病態的レベルが、５０ｐｇ／ｍｌ超〜約１５０ｐｇ／ｍであることを示していた。結果は、表Ｂに示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【０３１８】
ここで詳述する通り、およびこの例の表ＡおよびＢにおいて詳述する通り、阻害剤候補、および阻害アッセイから得られたＩＣ50濃度は、以下に示す。化合物ＮＣＩ６４４７５２、ＮＣＩ６４４７７７、ＺＩＮＣ０５３１７２１６、ＮＣＩ６３０２９５は、約１００μＭ以下のＩＣ50を示し（「高い阻害」）；化合物ＮＣＩ６４１２４８、ＮＣＩ６４１２３５、ＮＣＩ６４２０１７、ＮＣＩ６４１２３０、ＮＣＩ６４１２３６、ＮＣＩ６４０９８５、ＮＣＩ６１８８０２、ＮＣＩ６２３７４４は、約３２０μＭ以下のＩＣ50を示した（「低い阻害」）。
【０３１９】
例９
小分子阻害剤は、デコリンのグランザイムＢ切断を阻害する。
【０３２０】
この例の詳細は、代表的に図１８に示す。より具体的には、図１８は、小分子阻害剤を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりＥＣＭ切断が阻害されることを示す。そこで詳述する通り、アステリスクは、全長タンパク質をマークする。矢印は切断断片を示し、星印は、全長タンパク質を示す。
【０３２１】
より具体的には、図１８との関係において、内因性ＥＣＭを合成するために、ヒト冠動脈平滑筋細胞を６ウェルプレートに播種し、血清飢餓媒体（ＳＭＧＭ＋０．２％のＦＢＳ）中でコンフルエンシーにおいて７日間インキュベートした。０．２５Ｍの水酸化アンモニウムを用いた２０ｍｉｎのインキュベーションにより、細胞をプレートから除去した。この処理により、細胞は除去されるが、周囲の細胞外マトリックスは無傷のまま残る。その後、１００ｎＭのグランザイムＢおよび目的の阻害剤を内因性ＥＣＭ上で２４ｈインキュベートした。プレートからの上清（切断断片を含有）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、フィブロネクチンまたはデコリンについてウェスタンブロットした。ＤＭＳＯ溶媒対照は、冗長になるので含まなかった。アステリスク＝全長タンパク質；矢印＝切断断片、星印は、全長を示す。
【０３２２】
例１０
小分子阻害剤を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりＥＣＭ切断が阻害される。
【０３２３】
本明細書の図１９に示す通り、内因性ＥＣＭを合成するために、ヒト冠動脈平滑筋細胞を６ウェルプレートに播種し、血清飢餓媒体（ＳＭＧＭ＋０．２％のＦＢＳ）中でコンフルエンシーにおいて７日間インキュベートした。０．２５Ｍの水酸化アンモニウムを用いた２０ｍｉｎのインキュベーションにより、細胞をプレートから除去した。この処理により、細胞は除去されるが、周囲の細胞外マトリックスは無傷のまま残る。その後、１００ｎＭのグランザイムＢおよび目的の阻害剤を内因性ＥＣＭ上で２４ｈインキュベートした。プレートからの上清（切断断片を含有）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、フィブロネクチンまたはデコリンについてウェスタンブロットした。ＤＭＳＯ溶媒対照は、冗長になるので含まなかった。アステリスク＝全長タンパク質；矢印＝切断断片、星印は、全長を示す。
【０３２４】
例１１
ＮＣＩ６４４７７７を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりベータグリカン切断が阻害される。
【０３２５】
本明細書の図２０に示す通り、インキュベーションをＲＴで４ｈ実施し、総反応体積は３０μｌであった。試料を１０％のゲル上で泳動させ、ポンソー染色を用いて画像化し、走査した。化合物ＮＣＩ６４４７５２は、１００μＭでベータグリカンのグランザイムＢ切断を阻害しない（しかし、１５０μＭでデコリン切断に対して有効であることが先に示された）。化合物ＮＣＩ６４４７７７は、グランザイムＢを５０μＭで部分的に、および１００μＭで完全に阻害する。ＤＭＳＯビヒクル対照は、冗長になるので含まなかった。アステリスク＝全長タンパク質；矢印＝切断断片。グランザイムＢ／ベータグリカンレーンの妨害物は、最初の２つの切断断片に影響を及ぼしている。
【０３２６】
例１２
Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０を使用したグランザイムＢ（グランザイムＢ）の阻害によりフィブロネクチン切断が阻害される。
【０３２７】
本明細書の図２１ＡおよびＢに示す通り、フィブロネクチン（ＦＮ）およびグランザイムＢを用いて、阻害剤Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０の非存在下および阻害剤Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０の存在下の両方で、本明細書に記載のインキュベーションを実施した。化合物Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ２０は、３．１２ｎＭでＦＮのグランザイムＢ切断を阻害する。さらに、図２１Ａは、ＨＭＶＥＣ添加（ヒト微小血管内皮細胞）の結果およびその後の細胞数を示し、フィブロネクチン（ＦＮ）のグランザイムＢ切断により、ＦＮへのＥＣ癒着が用量依存的に低減することを示す。図２１Ｂは、グランザイムＢが特異的および用量依存的にフィブロネクチンを切断し、その結果、フィブロネクチン断片の放出が生じることを示す。
【０３２８】
例１３
グランザイムＢの阻害によりインビボで慢性創傷におけるデコリン分解が予防される。
【０３２９】
図２３において示す通り、デコリン分布は、閉じた創傷組織においてｓｅｒｐｉｎａ３ｎの影響を受ける。７週齢の野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスに、直径１ｃｍの全層創傷を背中に与えた。次いで、マウスに、生理食塩水（上部パネル）またはグランザイムＢ阻害剤、ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ（下部パネル）のいずれかを、創傷手順の直後に６０μｌの適切な溶液を直接創傷に適用することにより与えた。創傷を１６日間治癒させ、その時点でマウスを屠殺し、閉じた創傷組織を収集した。デコリンの免疫組織化学的検査により、新たに形成された真皮におけるデコリン分布のパターンの２つの群の間の違いが示された。生理食塩水で処理されたマウスは、真皮表皮接合の近くでデコリンの漸進的な増大を示した。Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎで処理されたマウスは、真皮表皮接合の近くで強いデコリン染色を示したが、より深い真皮への強いデコリン染色も示し、グランザイムＢ阻害により、急性または慢性創傷における過剰なデコリン分解が予防されることを示した。したがって、新たに形成された真皮の全体にわたるデコリンの増大により、より組織化したコラーゲン、より少ない瘢痕化および増大した引張強さがもたらされる。
【０３３０】
特定の本発明の態様について説明および例示してきたが、そのような態様は、単に本発明を例示するものと見なすべきであり、本発明を限定するものと見なすべきではなく、添付の特許請求の範囲に従って解釈されると見なすべきである。本発明の他の特色および利点は、以下の図面および発明の説明から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【非公式の配列一覧】
【０３３１】
Ａｓｐ91Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ＜ビグリカン切断配列＞（配列番号１）
Ａｓｐ558Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ＜ベータグリカン切断配列＞（配列番号２）
Ａｓｐ31Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ＜デコリン切断配列＞（配列番号３）
Ａｓｐ69Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｌｙｓ＜デコリン切断配列＞（配列番号４）
Ａｓｐ82Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ＜デコリン切断配列＞（配列番号５）
Ａｓｐ261Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ＜デコリン切断配列＞（配列番号６）
ヒトグランザイムＢアミノ酸配列：
ＭＱＰＩＬＬＬＬＡＦＬＬＬＰＲＡＤＡＧＥＩＩＧＧＨＥＡＫＰＨＳＲＰＹＭＡＹＬＭＩＷＤＱＫＳＬＫＲＣＧＧＦＬＩＲＤＤＦＶＬＴＡＡＨＣＷＧＳＳＩＮＶＴＬＧＡＨＮＩＫＥＱＥＰＴＱＱＦＩＰＶＫＲＰＩＰＨＰＡＹＮＰＫＮＦＳＮＤＩＭＬＬＱＬＥＲＫＡＫＲＴＲＡＶＱＰＬＲＬＰＳＮＫＡＱＶＫＰＧＱＴＣＳＶＡＧＷＧＱＴＡＰＬＧＫＨＳＨＴＬＱＥＶＫＭＴＶＱＥＤＲＫＣＥＳＤＬＲＨＹＹＤＳＴＩＥＬＣＶＧＤＰＥＩＫＫＴＳＦＫＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＫＶＡＱＧＩＶＳＹＧＲＮＮＧＭＰＰＲＡＣＴＫＶＳＳＦＶＨＷＩＫＫＴＭＫＲＹ（配列番号７）
ヒトグランザイムＢヌクレオチド配列：
ＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＡＴＣＴＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧＧＧＧＣＣＣＡＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＣＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＡＣＧＣＣＡＴＴＡＴＴＡＣＧＡＣＡＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＴＡＡＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＡＣＣＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号８）
ヒト（Huamn）ＳｅｒｐｉｎＢ９
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ヒト（Huamn）ＳｅｒｐｉｎＢ９
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ヒト（Huamn）ＳｅｒｐｉｎＢ９からの断片
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ヒトＳｅｒｐｉｎＡ３
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ヒトＳｅｒｐｉｎＡ３
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ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）
牛痘ＣｒｍＡ
ＭＤＩＦＲＥＩＡＳＳＭＫＧＥＮＶＦＩＳＰＰＳＩＳＳＶＬＴＩＬＹＹＧＡＮＧＳＴＡＥＱＬＳＫＹＶＥＫＥＡＤＫＮＫＤＤＩＳＦＫＳＭＮＫＶＹＧＲＹＳＡＶＦＫＤＳＦＬＲＫＩＧＤＮＦＱＴＶＤＦＴＤＣＲＴＶＤＡＩＮＫＣＶＤＩＦＴＥＧＫＩＮＰＬＬＤＥＰＬＳＰＤＴＣＬＬＡＩＳＡＶＹＦＫＡＫＷＬＭＰＦＥＫＥＦＴＳＤＹＰＦＹＶＳＰＴＥＭＶＤＶＳＭＭＳＭＹＧＥＡＦＮＨＡＳＶＫＥＳＦＧＮＦＳＩＩＥＬＰＹＶＧＤＴＳＭＶＶＩＬＰＤＮＩＤＧＬＥＳＩＥＱＮＬＴＤＴＮＦＫＫＷＣＤＳＭＤＡＭＦＩＤＶＨＩＰＫＦＫＶＴＧＳＹＮＬＶＤＡＬＶＫＬＧＬＴＥＶＦＧＳＴＧＤＹＳＮＭＣＮＳＤＶＳＶＤＡＭＩＨＫＴＹＩＤＶＮＥＥＹＴＥＡＡＡＡＴＣＡＬＶＡＤＣＡＳＴＶＴＮＥＦＣＡＤＨＰＦＩＹＶＩＲＨＶＤＧＫＩＬＦＶＧＲＹＣＳＰＴＴＮ（配列番号１４）
牛痘ＣｒｍＡ
ＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴ
ＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＡ
ＣＧＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡＣＴＧＴＴＴＡＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴ
ＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＴＡＣＧＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＣＧＴＣＡＣＡＣＡＡ
ＣＡＡＡＡＴＣＧＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＴＣ
ＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＡＴＣＴＣＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＡＣＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＴＡＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＡ
ＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＡＴ
ＡＴＧＧＧＣＧＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡ
ＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＴＧＴＡＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴ
ＣＣＡＣＴＡＴＴＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＡＧＣＡＡＴＴＡＧＴＧＣＣＧＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡ
ＡＡＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＡＣＧＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴ
ＡＧＡＴＧＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＣＴＡＴＧＴＡＣＧＧＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＡＡＴＣＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣ
ＴＴＴＴＣＡＡＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＡＴＧ
ＧＡＣＴＡＧＡＡＴＣＣＡＴＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴ
ＧＴＴＴＡＴＣＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧＴＴＴＡＡＧＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＧ
ＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＣＧ
ＡＣＧＣＴＡＴＧＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＡＴＡＧＡＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＧＴＧＣ
ＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＴＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＡＴＴ
ＡＧＧＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＣＴ
ＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡ
ＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＴＡＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＣＣ（配列番号１５）
ヒトＳｅｒｐ２
ＭＶＡＫＱＲＩＲＭＡＮＥＫＨＳＫＮＩＴＱＲＧＮＶＡＫＴＬＲＰＱＥＥＫＹＰＶＧＰＷＬＬＡＬＦＶＦＶＶＣＧＳＡＩＦＱＩＩＱＳＩＲＭＧＭ（配列番号１６）
ヒトＳｅｒｐ２
ＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＴＡＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＡＣＧＣＣＴＴＧＣＣ
ＡＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣ
ＡＧＧＧＧＧＡＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴ
ＧＧＣＴＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧ
ＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＣ
ＡＧＡＴＣＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＴＡＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＧＡ
ＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡ
ＡＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣ
ＴＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＣＡＣＧＣＧＧ
ＧＴＣＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＡＡＴＧＣＧＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＧＡ
ＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＣ
ＴＴＣＧＴＴＣＡＡＣＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡ（配列番号１７）
ＰＩ９ペプチド
ＶＥＶＮＥＥＧＴＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＥＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号１８）
ＶＥＶＮＥＥＧＴＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＤＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号１９）
ＶＥＶＮＥＥＧＴＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＡＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号２０）
ＶＥＶＮＥＥＧＲＥＡＡＡＡＳＳＣＦＶＶＡＥＣＣＭＥＳＧＰＲＦＣＡＤＨＰＦＬ（配列番号２１）
ＣｒｍＡペプチド
ＩＤＶＮＥＥＹＴＥＡＡＡＡＴＣＡＬＶＡＤＣＡＳＴＶＴＮＥＦＣＡＤＨＰＦＩ  Ｐ（配列番号２２）
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【０３３２】
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【図１】
2014500271.tif 000067
【図２】
2014500271.tif 000068
【図３】
2014500271.tif 000069
【図４】
2014500271.tif 000070
【図５】
2014500271.tif 000071
【図６】
2014500271.tif 000072
【図７】
2014500271.tif 000073
【図８】
2014500271.tif 000074
【図９】
2014500271.tif 000075
【図１０】
2014500271.tif 000076
【図１１】
2014500271.tif 000077
【図１２】
2014500271.tif 000078
【図１３】
2014500271.tif 000079
【図１４】
2014500271.tif 000080
【図１５】
2014500271.tif 000081
【図１６】
2014500271.tif 000082
【図１７】
2014500271.tif 000083
【図１８】
2014500271.tif 000084
【図１９】
2014500271.tif 000085
【図２０】
2014500271.tif 000086
【図２１】
2014500271.tif 000087
【図２２】
2014500271.tif 000088
【図２３】
2014500271.tif 000089
【配列表】
2014500271000001.app
【国際調査報告】
2014500271.tif 000090
2014500271.tif 000091
2014500271.tif 000092
2014500271.tif 000093