(57)【要約】  本発明者等は、オプソニン、特にオプソニン抗体の産生を誘導する抗原性ポリペプチド、および、人畜共通のグラム陰性細菌種を含む、動物の細菌性病原体、特に農業的に重要な動物種および愛玩動物の細菌性病原体から守るワクチンにおける該抗原性ポリペプチドの使用を開示する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の細菌性病原体から単離したポリペプチドを含有するワクチン組成物であって、該ポリペプチドが、
ｉ）  配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０、３３、３８、４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）前記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠損または置換により修飾されており、ヘム結合活性の亢進および／または溶血性活性の低減を保つまたは持っているアミノ酸配列、
である、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０、３３、３８または４０に示すアミノ酸配列を含むか、またはからなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：１、２、５または６から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
ｉ）    配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３９または４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
ｉｉ）  遺伝子コードの結果として（ｉ）に定義されるヌクレオチド配列と縮重しているヌクレオチド配列を含む核酸分子、および
ｉｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｉ）およびｉｉ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子の相補鎖であって、ヘム結合タンパク質をコード化する核酸分子、
から選択される、動物の病原体から単離された抗原性ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するワクチン組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が、配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３９または４１に示すヌクレオチド配列を含むか、またはからなる、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、配列番号：３、４、７または８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはからなる、請求項４または５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が、関連する核酸分子の転写に適するプロモーターに操作可能に連結された抗原性ポリペプチドをコード化する核酸分子を含む転写カセットを含む、請求項４から６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記核酸分子がベクターの一部である、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドまたは核酸分子が動物のグラム陰性細菌性病原体から単離される、請求項１から８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドまたは核酸分子が人畜共通の動物のグラム陰性細菌性病原体から単離される、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記動物細菌性病原体が、マンヘミア属種、アクチノバチルス属種、パスツレラ属種、ヘモフィルス属種、またはエドワージエラ属種からなる属群から選択される、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記動物細菌性病原体が、ブルセラ属種、カンピロバクター属種、ビブリオ属種、エルシニア属種、サルモネラ属種、およびアビバクテリウム属種からなる群から選択される、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記組成物がさらにアジュバントまたはキャリアを含有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
オプソニンの産生に使用するための、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０、３３、３８または４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、動物の細菌性病原体から単離される抗原性ポリペプチド。
【請求項１５】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：１、２、５または６を含むか、またはからなる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記抗原性ポリペプチドが、配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３９または４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはからなる核酸分子によってコードされる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記核酸分子が配列番号：３、４、７または８を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記オプソニンが抗体である、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
ヒト以外の病原性細菌種に対してヒト以外の動物を免疫化する方法であって、
ｉ）有効量の用量の請求項１から１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物をヒト以外の動物被検体に投与して、防御免疫を誘導すること、場合によって、
ｉｉ）防御免疫を誘導するために十分な一または複数の更なる用量の該ワクチン組成物を該被検体に投与すること
を含む方法。
【請求項２０】
ヒト以外の動物被検体の病原性グラム陰性細菌感染の治療に用いるための請求項１から１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
ヒト以外の動物の細菌性病原体から単離した抗原に対するオプソニンの産生方法であって、
ｉ）請求項１から１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物を提供すること、
ｉｉ）オプソニン産生を誘導するために十分な有効量の該組成物をヒト以外の動物被検体に投与すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示内容は、オプソニン、特にオプソニン抗体の産生を誘導する抗原性ポリペプチド、および、人畜共通のグラム陰性細菌種を含む、動物の細菌性病原体、特に農業的に重要な動物種および愛玩動物の細菌性病原体から守るワクチンにおける該抗原性ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原細菌は、動物を襲う感染症の主要な原因である。動物同士が互いに近接しているために、農業的に重要な動物種における細菌感染の制御は問題となっており、この近接状態が群れ全体へ感染を伝播しうる。多くの割合の動物が特定の感染性因子に対して免疫がある場合には集団免疫が存在するが、ひとたびかなりの数の免疫を持たない動物がその集団に存在すればその集団免疫は損なわれうる。集団免疫を実現するためには、感染しやすい集団内の個体の感染制御について動物を継続的に監視する必要がある。細菌感染の制御は、労働集約的で実行するのに費用がかかる様々な方法によるものであり、検疫；感染保有動物の排除；環境制御（すなわち、きれいな水と食餌の供給、糞便の衛生的廃棄、空気の衛生の維持）；抗生物質の使用；非病原性細菌の増殖を促し、病原性細菌の増殖を抑制するプロバイオティクスの使用；および、集団の耐性個体数を増やすための積極的な予防接種が含まれる。一般に、細菌感染に耐性がある集団の生産は免疫を誘導するワクチンの基礎を形成する抗原の同定が必要である。
【０００３】
さらに、動物種はヒトにも感染する細菌性病原体を持っている。動物原性感染症は、ヒト以外の動物とヒトとの間で伝播しうる感染病である。グラム陰性細菌が原因となる人畜共通細菌感染症の例には、感染した牛乳および肉からヒトに伝播される、ブルセラ属種によって引き起こされるブルセラ症；カンピロバクター属種によって引き起こされるカンピロバクター症；ビブリオ・コレラエによって引き起こされるコレラ；感染した未調理の生肉または未低温殺菌の牛乳からのエルシニア属種によって引き起こされるエルシニア感染症；および、感染した肉、特に豚肉および鶏卵からのサルモネラ属種によって引き起こされるサルモネラ症が含まれる。
【０００４】
近年の多くのワクチンは、分子クローニングにより単離され、副作用を生じる物質から精製された病原体の防御抗原から作られている。これらのワクチンは「サブユニットワクチン」として知られている。サブユニットワクチンの開発は、近年、非常に研究の焦点となっている。新たな病原体の出現および抗生物質耐性の成長により、新たなワクチンを開発し、サブユニットワクチンの開発に有用なさらなる候補分子を同定する必要が生じている。同様に、ゲノムおよびプロテオミクス研究から新規のワクチン抗原を発見することにより、特に細菌性病原体に対して新しいサブユニットワクチン候補の開発が可能となっている。しかしながら、サブユニットワクチンは死亡又は弱毒化病原体ワクチンの副作用を避ける傾向にあるが、それらの「純粋な」状態はサブユニットワクチンが常に防御を付与するのに十分な免疫原性を持つわけではないことを意味する。
【０００５】
前述のように、ワクチンは、特定の誘導抗原を発現する標的生物に対して抗体および／または細胞溶解性T細胞の産生を誘導する。保護を与えうる抗原は、病原体の細胞表面で発現されるもの、あるいは、周囲環境に分泌されて免疫系に接触可能なものである傾向がある。誘導された抗体はオプソニンとして知られているプロセスで機能することができる。オプソニン作用は、微生物病原体が免疫系の食細胞による摂取の対象となるプロセスである。オプソニンの結合は、細菌性病原体の破壊をもたらす食細胞を引き付ける。貪食は、マクロファージや多形核白血球により媒介され、微生物、破損または死んだ細胞、細胞の破片、不溶性粒子、および活性化凝固因子の摂取と消化が含まれる。オプソニンは上記の異物の貪食を促進する薬剤である。ゆえに、オプソニン抗体は同じ機能を提供する抗体である。オプソニンの例は、抗体のFc部分または補体成分C3である。
【０００６】
本開示内容は、標的動物（すなわちヒト以外）の細菌性病原体、例えばウシ／ヒツジの病原体マンヘミア・ヘモリチカおよびヘモフィルス・ソムナスに対するオプソニンの産生を有利ではあるが排他的でなく誘導する防御抗原の類の同定に関する。
【０００７】
Ｇｌｙ１抗原は、分泌されたタンパク質であり、ヘムおよびヘモグロビンでの髄膜炎菌の増殖に必須であることが示されている。Ｇｌｙ１の欠損表現型変異体は増殖しないので、Ｇｌｙ１は鉄代謝に関与し、必須機能を付与している。発明者等は、Ｇｌｙ１およびその配列変異体を含むワクチン組成物、およびヒト以外の動物の予防用および治療用のワクチン接種でのその使用を開示する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の態様によると、動物の細菌性病原体から単離したポリペプチドを含有するワクチン組成物であって、該ポリペプチドが、
ｉ）  配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０、３３、３８、４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）  前記ｉ）に定義されるアミノ酸配列であって、一または複数のアミノ酸残基の付加、欠損または置換により修飾されており、ヘム結合活性の亢進および／または溶血性活性の低減を保つまたは持っているアミノ酸配列、
を有している、ワクチン組成物が提供される。
【０００９】
本明細書中で開示する修飾ポリペプチドは、いずれの組み合わせでも存在しうる一または複数の置換、付加、欠損、短縮化により、アミノ酸配列が異なっていてよい。好適な変異型には、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドから変化しているものがある。このような置換は、類似の性質を持つ他のアミノ酸によって所定のアミノ酸を置換するものである。以下のアミノ酸の非限定的列挙は保存的置換（類似）と見なされる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン、およびｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。最も好ましくは、変異する前の参照ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を保つまたは亢進する変異体である。
【００１０】
ある実施態様では、変異ポリペプチドは、本明細書中に示す完全長アミノ酸配列と、少なくとも３５％の同一性、より好ましくは少なくとも４０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも４５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【００１１】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０、３３、３８または４０に示すアミノ酸配列を含むかまたはからなる。
【００１２】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：１、２、５または６から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはからなる。
【００１３】
本発明の他の態様によると、動物の細菌性病原体から単離された抗原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するワクチン組成物であって、該核酸分子は、
ｉ）    配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３９または４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
ｉｉ）  遺伝子コードの結果として（ｉ）に定義されるヌクレオチド配列と縮重しているヌクレオチド配列を含む、そして
ｉｉｉ）  ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｉ）およびｉｉ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子の相補鎖であって、ヘム結合タンパク質をコード化する核酸分子である、
ワクチン組成物が提供される。
【００１４】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が互いに多くの水素結合を受ける場合に生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸周辺の環境条件、ハイブリダイゼーション法の性質、および使用した核酸分子の組成および長さによって異なりうる。ある一定のストリンジェンシーに達するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する算出は、Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)；および、Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York, 1993)のTijssen, Laboratory Techniquesにおいて論じられている。Ｔｍは、所定の鎖の核酸分子の５０％がその相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は一連のハイブリダイゼーションの例であるが、限定するものではない。
【００１５】
超高ストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６５℃、５×ＳＳＣ、１６時間
２回の洗浄：            室温（ＲＴ）、２×ＳＳＣ、各々１５分間
２回の洗浄：            ６５℃、０．５×ＳＳＣ、各々２０分間
高ストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６５℃〜７０℃、５×〜６×ＳＳＣ、１６〜２０時間
２回の洗浄：            ＲＴ、２×ＳＳＣ、各々５〜２０分間
２回の洗浄：            ５５℃〜７０℃、１×ＳＳＣ、各々３０分間
低ストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：ＲＴ〜５５℃、６×ＳＳＣ、１６〜２０時間
少なくとも２回の洗浄：  ＲＴ〜５５℃、２×〜３×ＳＳＣ、各々２０〜３０分間
【００１６】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子は、配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３９または４１に示すヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。
【００１７】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子は、配列番号：３、４、７または８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。
【００１８】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子は、関連する核酸分子の転写に適するプロモーターに操作可能に連結された抗原性ポリペプチドをコード化する核酸分子を含む転写カセットを含む。
【００１９】
本発明の好適な実施形態では、前記プロモーターは恒常的プロモーターである。
【００２０】
本発明の他の好適な実施形態では、前記プロモーターは、調節可能なプロモーター、好ましくは誘導プロモーターおよび／または組織／細胞特異的プロモーターである。
【００２１】
「プロモーター」とは、当分野で認識された用語であり、明確にするために、例示として以下の特徴を含む。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位の5'に見られることが多いｃｉｓ作動性核酸配列である（エンハンサーは遺伝子配列の３’にも見られ、またはイントロン配列にさえも配置しうる）。エンハンサーはエンハンサーが連結している遺伝子の転写率を高めるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているｔｒａｎｓ作動性転写因子に応答する。転写因子の結合／活性（David S LatchmanによるEukaryotic Transcription Factors, Academic Press Ltd, San Diegoをご参照下さい）は、多くの生理学的／環境的要因に応答する。プロモーターエレメントは、いわゆるＴＡＴＡボックスおよび、転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択配列も含む。これら配列は、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促すように機能するポリペプチドにも結合する。
【００２２】
本発明の好適な実施形態では、前記プロモーターは骨格筋特異的プロモーターである。
【００２３】
筋特異的プロモーターは当分野で知られている。例えば、国際公報第０００９６８９号は、横紋筋優先発現遺伝子および同族プロモーターであるＳＰＥＧ遺伝子を開示している。欧州特許第１０７２６８０号はミオスタチン遺伝子の調節領域を開示している。この遺伝子は、圧倒的に遺伝子発現の筋肉特異的パターンを示す。米国特許第５７９５８７２号は、筋肉組織での外来タンパク質の高レベルの発現を達成するために、クレアチンキナーゼプロモーターの使用を開示している。筋肉特異的遺伝子であるＭｙｏＤも筋芽細胞に限定した発現パターンを示す。さらなる例は国際公報第０３／０７４７１１号に開示されている。
【００２４】
好ましくは、前記恒常的プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、β−グロビンＲＳＶエンハンサー／プロモーターホスホグリセリン酸キナーゼ（マウスＰＧＫ）プロモーター、α−アクチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンプロモーター、転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）プロモーターからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の好適な実施形態では、前記核酸分子はベクターの一部である。
【００２６】
本発明の好適な実施形態では、前記ベクターは、本発明に係る前記抗原性ポリペプチドをコードする前記核酸分子の発現に適する発現ベクターであり、好ましくは、前記核酸分子は少なくとも一のプロモーター配列に操作可能に連結している。
【００２７】
一般に、発現ベクター構築と組換えＤＮＡ技術に関しては非常に多くの公表された文献がある。Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY and references therein; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK；DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)をご参照下さい。
【００２８】
治療剤としてのウイルスまたは「ウイルスベクター」の使用は当分野で十分に知られている。さらに、外来遺伝子の運搬のためにベクターとして多くのウイルスが一般に用いられている。一般に用いられるベクターには、組み換えて修飾されたエンベロープありまたはエンベロープなしのＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、好ましくはレトロウイルスバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選択されるものが含まれる。また、それぞれの親のベクター性質の有利なエレメントを利用するキメラベクターも用いられてよい（例としてFeng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870を参照のこと）。このようなウイルスベクターは、野生型であっても、組換えＤＮＡ技術により修飾して複製能を欠損させるか、条件的に複製させるか、複製能を与えてもよい。好適なベクターは、レトロウイルスゲノム（例えばレンチウイルス）由来であるか、アデノウイルスベースである。
【００２９】
ウイルスベクターは、条件的な複製または複製の能力を有していてよい。条件的に複製可能なウイルスベクターは、有害な広域スペクトル感染を避けつつ特定の細胞種における選択的な発現を達成するために用いられる。条件的に複製可能なベクターの例は、Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343；Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8):1165-1171に記載されている。選択的に複製可能なベクターの他の例には、ウイルスの複製に必須の遺伝子が、特定の細胞種又は細胞状態にのみ活性となるプロモーターの制御下にあってこの遺伝子の発現がなければウイルスは複製しないベクターが含まれる。このようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日発行のHenderson, et al.の米国特許第５６９８４４３号、および１９９９年２月１６日発行のHenderson, et al.の米国特許第５８７１７２６号に記載されており、これらの教示内容全体は出典明記によって本明細書中に援用される。
【００３０】
さらに、ウイルスゲノムは、ある条件下でのみの複製または発現を達成する誘導性プロモーターを含むように修飾されてよい。誘導性プロモーターの例は科学文献において知られている（例としてYoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430；Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059；Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131；Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105；およびDreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371）。
【００３１】
本発明の好適な実施形態では、前記ポリペプチドまたは前記核酸分子は動物のグラム陰性細菌性病原体から単離される。
【００３２】
本発明の好適な実施形態では、前記ポリペプチドまたは前記核酸分子は人畜共通の動物のグラム陰性細菌性病原体から単離される。
【００３３】
本発明の好適な実施形態では、前記動物細菌性病原体は、マンヘミア属種、アクチノバチルス属種、パスツレラ属種、ヘモフィルス属種、エドワージエラ属種またはアビバクテリウム属種、例えばＡ．パラガリナルムからなる属群から選択される。
【００３４】
他の細菌性病原体には、ブルセラ属種、カンピロバクター属種、ビブリオ属種、例えばＶ．イクチオエンテリ、エルシニア属種、およびサルモネラ属種、例えばサルモネラ・エンテリカから選択される人畜共通の属種が含まれる。
【００３５】
本発明の好適な実施形態では、前記組成物はさらにアジュバントまたはキャリアを含有する。
【００３６】
アジュバント（免疫増強因子または免疫調節因子）はワクチン抗原に対する免疫応答を改善するためにここ数十年間使用されている。ワクチン製剤へのアジュバントの混入は、ワクチン抗原に対して特異的な免疫応答を亢進する、加速するおよび延長することを目的としている。アジュバントの利点は、弱い抗原の免疫原性の強化、免疫化の成功に必要な抗原量の削減、必要な追加免疫の頻度の減少、および高齢者や免疫不全ワクチン受診者の免疫応答の改善を含む。選択的に、アジュバントは、例えば免疫グロブリンクラスおよび細胞障害性またはヘルパーＴリンパ球の誘導に関して望ましい免疫応答を最適化するためにも用いられ得る。さらに、ある種のアジュバントは、粘膜表面での抗体応答を促進するために用いられ得る。水酸化アルミニウムおよびアルミニウムまたはリン酸カルシウムは、ヒトワクチンに日常的に用いられている。さらに最近では、ＩＲＩＶ（免疫刺激性再構築インフルエンザビロソーム）に混入される抗原およびエマルジョンベースのアジュバントＭＦ５９を含有するワクチンが各国で認可されている。アジュバントは、その起源、作用のメカニズムおよび物理的又は化学的性質に従って分類することができる。最も一般的に記載されるアジュバント分類は、ゲルタイプ、微生物、油エマルジョンおよび乳化剤ベース、微粒子、合成およびサイトカインである。複数のアジュバントが最終ワクチン生成物中に存在してもよい。それらはワクチン中に存在する単一の抗原またはすべての抗原と組み合わされてもよいし、各アジュバントをある特定の抗原と組み合わせてもよい。現在使用されるまたは開発中のアジュバントの起源と性質は非常に多様である。例えば、アルミニウムベースのアジュバントは単純な無機化合物から構成され、ＰＬＧは重合炭水化物であり、ビロソームは異種ウイルス粒子に由来しうるものであり、ＭＤＰは細菌の細胞壁に由来するものであり、サポニンは植物起源のものであり、スクアレンはサメ肝臓由来のものであり、そして組換え内因性免疫調節因子は組換え細菌、酵母または哺乳動物細胞由来のものである。
【００３７】
動物用ワクチンには、ヒトへの使用では反応が強すぎる鉱物油エマルジョンなど、様々なアジュバントが認可されている。同様に、完全フロイントアジュバントは、最も強力なアジュバントの一つとして知られているがヒトへの使用には適さない。
【００３８】
キャリアは、第二分子に結合した場合に後者への免疫応答を増強する免疫原性分子である。キャリアなる用語は以下のように解釈される。キャリアは、第二分子に結合した場合に後者への免疫応答を増強する免疫原性分子である。いくつかの抗原は、本来免疫原性ではないが、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイドのような外来タンパク質分子と結合した場合に抗体反応を生成することができる。このような抗原はＢ細胞エピトープを含むがＴ細胞エピトープは含んでいない。このようなコンジュゲートのタンパク質部分（「キャリア」タンパク質）は、抗原特異的Ｂ細胞を順に刺激してプラズマ細胞に分化させ、抗原に対する抗体を産生するヘルパーＴ細胞を刺激するＴ細胞エピトープを提供する。
【００３９】
本発明の好適な実施形態では、前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、アルミニウムまたはリン酸カルシウムからなる群から選択される。
【００４０】
本発明の好適な実施形態では、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００４１】
本発明の更なる他の実施形態では、前記アジュバントは、ＴＬＲアゴニスト、例としてＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリル脂質Ａ、ポリＩ：Ｃ及びその誘導体である。
【００４２】
本発明の好適な実施形態では、前記アジュバントは、細菌細胞壁誘導体、例としてムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコレート（ＴＤＭ）である。
【００４３】
本発明の他の態様によると、オプソニンの産生に使用するための、配列番号：１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０、３３、３８または４０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、動物の細菌性病原体から単離される抗原性ポリペプチドが提供される。
【００４４】
本発明の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：１、２、５または６から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはからなる。
【００４５】
本発明の他の好適な実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、配列番号：３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３４、３９または４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはからなる核酸分子によってコードされる。
【００４６】
好ましくは、前記核酸分子は配列番号：３、４、７または８を含む。
【００４７】
本発明の好適な実施形態では、前記オプソニンは抗体である。
【００４８】
本発明の態様によると、病原性細菌に対してヒト以外の動物を免疫化する方法であって、
ｉ）有効量の用量の本発明に係るワクチン組成物をヒト以外の動物被検体に投与して、防御免疫を誘導すること、場合によって、
ｉｉ）防御免疫を誘導するために十分な一または複数の更なる用量のワクチンを前記被検体に投与すること
を含む方法が提供される。
【００４９】
本発明の他の態様によると、ヒト以外の動物被検体の病原性グラム陰性細菌感染の治療に用いるための本発明に係るワクチン組成物が提供される。
【００５０】
本発明の他の態様によると、ヒト以外の動物の細菌性病原体に由来する抗原に対するオプソニンの産生方法であって、
ｉ）本発明に係るワクチン組成物を提供すること、
ｉｉ）オプソニン産生を誘導するために十分な有効量の前記組成物をヒト以外の動物被検体に投与すること
を含む方法が提供される。
【００５１】
本発明のワクチン組成物は、注入を含め任意の従来の経路によって投与されうる。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、または皮内であってよい。本発明のワクチン組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独でまたは更なる投薬で所望の応答を生成するワクチン組成物の量である。特定の細菌性疾患を治療する場合には、感染性作用物質によって刺激されると所望の応答は防御を提供する。
【００５２】
概して、個々の成分またはそれらの組み合わせの最大用量が免疫を誘発するために十分に用いられることが好ましい。この量はつまり正当な獣医の判断による安全性の高い用量である。動物被検体に投与されるワクチンの用量は、異なるパラメーターに従って、特に用いる投与様式および動物被検体の状態に従って選択されうる。被検体の応答が用いた初期用量では不十分である場合には、より高用量（または異なるより局在的な運搬経路による効果的な高用量）が許容範囲内で用いられてよい。一般に、複数用量のワクチンが製剤化され、当分野で標準的な手順に従って有効な免疫化用量で投与される。ワクチン組成物の投与のための他のプロトコールは当業者に知られており、その場合、投薬量、注入計画、注入部位、投与様式などは前述から変更されうる。
【００５３】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、「含む」および「含有する」なる語句およびこれら語句の変形、例えば「含んでいる」および「含み」は、「含むがこれらに限定しない」ことを意味し、他の部分、付加物、成分、整数または工程を除くことを意図しない（または除かない）。
【００５４】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の必要性がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、明細書は、文脈上別段の必要性がない限り、複数形および単数形を考慮しているものと理解される。
【００５５】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分、または基は、本明細書において記載されている任意の他の態様、実施形態、または実施例と矛盾しない限り、それらに適用可能であると理解される。
【００５６】
本発明の実施形態は、以下の図を参照して例示としてのみ記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】マンヘミア・ヘモリチカとエドワージエラ・イクタルリからの組換えＧｌｙ１遺伝子のＰＣＲベースの増幅を示す臭化エチジウム染色したアガロースゲルを示す。ゲルは、１）プライマーＧｌｙ１＿ｍａｎ．ｆおよびＧｌｙ１＿Ｍａｎ．ｒによるＭ．ヘモリチカ、２）プライマーＧｌｙ１＿ｍａｎ．ｆおよびＧｌｙ１＿ｍａｎ．Ｈ６．ｒによるＭ．ヘモリチカ、３）プライマーＧｌｙ１＿ｃａｔ．ｆおよびＧｌｙ１＿ｃａｔ．ｒ、によるエドワージエラ・イクタルリ、４）Ｇｌｙ１＿ｃａｔ．ｆおよびＧｌｙ１＿ｃａｔ．ｈ６．ｒによるＥ．イクタルリの二重試料を示す。レーン５はネガティブコントロールを示す。
【図２】Ｃ末端ヒスチジンタグ組換えＧｌｙ１ＯＲＦ１ホモログの発現の、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｕ−非誘導およびＩ−誘導した細胞ペレット。１−Ｍ．ヘモリチカＳ２  Ｃ−ｈｉｓ  Ｇｌｙ１ＯＲＦ１ホモログ、２−Ｍ．ヘモリチカＣ−ｈｉｓ  Ｇｌｙ１ＯＲＦ１ホモログ。矢印は誘導されたタンパク質に相当するバンドを示す。
【図３】ＮｉキレートカラムによるＣ末端ｈｉｓタグを有するＭ．ヘモリチカＧｌｙ１ＯＲＦ１ホモログの生成を示す、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。１−細胞溶解物のＮｉカラムにロードされた溶解分画、２−フロースルー、３−洗浄、レーン４〜１４−溶出分画。
【図４】ＭａｎｈＧｌｙ１添加後のヘミンスペクトルの変化。マンヘミア属Ｇｌｙ１のヘミン可視的スペクトルが変化すると、これら分子が相互作用していることを示す。
【図５】ＭａｎｈＧｌｙ１の選択的結合を示すヘミン−アガロースビーズのプルダウンアッセイのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｗ−ヘミンビーズとインキュベートする前のＭａｎｈＧｌｙ１とＢＳＡ、Ｂ−Ｗで示すタンパク質混合物とインキュベートし、洗浄してＳＤＳ中で煮沸したビーズ、Ｓ−ビーズをペレット上にした後にＭａｎｈＧｌｙ１をインキュベートした上清Ｗ。矢印はＢＳＡに相当するバンドを示す。ヘミン−アガロースビーズは混合物由来のＭａｎｈＧｌｙ１を選択的に除去する。
【図６】サルモネラ・エンテリカＧｌｙ１ホモログのクローニング、発現およびウエスタンブロッティングを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、タンパク質サイズマーカー（Ｍ）、誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）のＣ−ｈｉｓタグ付加ＳａｌＧｌｙ１の組換え遺伝子を持つＭ７２細胞からの総タンパク質を示す。溶解後、可溶性タンパク質（レーン３）、タンパク質はニッケルキレート（レーン４）およびイオン交換クロマトグラフィ（レーン５）によって精製した。右手側のパネルは、１：５０００の希釈でラットにおいて生じた一次抗血清と示した量のＳａｌＧｌｙ１タンパク質を用いたウエスタンブロットの結果を示す。
【実施例】
【００５８】
材料と方法
クローニング：  プラスミドｐＪＯＮＥＸ４（J. R. Sayers, F. Eckstein, Nucleic Acids Res. 19, 4127 (1991)）をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、２つのオリゴヌクレオチド（C1 5’ GATCCTGCAGGATGACGATGACAAACACCATCATCACCATCATTAG、およびC2 5’ AGCTCTAATGATGGTGATGATGGTGTTTGTCATCGTCATCCTGCAG）からなる二本鎖ＤＮＡとライゲートして、ｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳと称するプラスミドを作製した。このプラスミドはコンピテント大腸菌へ形質移入して、子孫プラスミドはＤＮＡ配列決定によって特徴付けた。
【００５９】
エドワージエラ・イクタルリのゲノムＤＮＡを、以下のプライマー：Ｇｌｙ１＿ｃａｔ．ｆ（5’-TTTCGAATTCTAGAGGAAACAAAAATGGGCAGGGTAATCCGTATC）とＧｌｙ１＿ｃａｔ．ｒＨ６（5’-TTCCCAGATCTCGGCCGGCATCGGGTAAAAGATAG）またはＧｌｙ１＿ｃａｔ．ｒ（5’-TTTATAAGCTTGCTTTATGCCCGCGCGGTGTT）とにより鋳型として用いた。Ｇｌｙ１＿ｃａｔ．ｆはＥｃｏＲＩ部位を含み、Ｇｌｙ１＿ｃａｔ．ｒＨ６はベクター内の適合性ＢａｍＨＩを用いて前記のｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳベクター内にクローニングするためのＢｇｌＩＩ部位を含む。Ｇｌｙ１＿ｃａｔ．ｒはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。
【００６０】
マンヘミア・ヘモリチカのゲノムＤＮＡ(Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim, Germany)をＰＣＲの鋳型として用いた。プライマーＧｌｙ１＿ｍａｎ．ｆ（TTTCGAATTCTAGAGGAAACAAAAATGCGTAAATTATTAGTAATT）およびＧｌｙ１＿ｍａｎ．ｈ６．ｒ（TGTTGGATCCCTAAAGTATTCATCAAATGAACATC）を用いて、標準的な方法によりＣ末端ｈｉｓタグ付加Ｍ．ヘモリチカｇｌｙ１（ＭａｎｈＧｌｙ１  Ｃ６Ｈ−タグ）をコードするＰＣＲ産物を製造した。同様に、プライマーＧｌｙ１＿ＭａｎＳ２．ｆ（TTTAGAATTCTAAGGAGTTACATTTATGAGTAAATTATTAGTAATTACTGC）とプライマーＧｌｙ１＿ｍａｎ．ｈ６．ｒとを用いてコドン２（Ａｒｇ）がセリンコドンに置換している変異型を構築し、該タンパク質の変更（より高度に発現される）バージョンを作製した。
【００６１】
増幅生成物を制限酵素エンドヌクレアーゼであるＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、（同じ制限酵素で切断した）ｐＪＯＮＥＸ４にライゲートし、組換え遺伝子を持つプラスミドを生成した。この結果、Ｃ末端エンテロキナーゼ認識部位、６つのヒスチジン残基および停止コドンを有するＧｌｙ１コード領域のインフレーム融合物が生じた。結果として生じたプラスミドを、Ａｒｇ２またはＳｅｒ２変異型タンパク質をそれぞれ発現するｐＪＯＮＧＬＹ−Ｍａｎ１およびｐＪＯＮＧＬＹＭａｎ２とした。新たに構築したＤＮＡをＬＢ−アンピシリンプレート上で２８℃でＭ７２（λ）に形質移入させた。生じた組換えコンストラクトを標準的なＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いて配列決定した(Core Genomics Facility, University of Sheffield Medical School)。
【００６２】
タンパク質生成：  １００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５ＹＴ培地中で生育した所要のプラスミドを持つＭ７２（λ）の終夜培養物（１００ｍｌ）を１．５Ｌの５ＹＴ／カルベニシリン培地を含む２Ｌの発酵槽に播種し、７５０ｒｐｍで攪拌し、２Ｌ／分の給気を行いながら３０℃でインキュベートした。中央対数期には、温度を４２℃に上げて３時間置いた。次いで、室温で１００００×ｇにて２０分間遠心して細胞を上清から取り除いた。同様な手法を他のｇｌｙ１ホモログにも行った。
【００６３】
タンパク質精製：  上清中のタンパク質は、硫酸アンモニウムを３Ｍ終濃度まで添加して沈殿させ、次いで、１０℃で４００００×ｇにて２０分間遠心して回収した。ペレット上のタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水またはトリス緩衝生理食塩水ｐＨ８に再懸濁し、大規模に透析し、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィカラムに通した。次いで、カラムを洗浄し、標準的なプロトコールに従ってイミダゾール勾配または酸勾配にて溶出し、精製をＳＤＳ−ＰＡＧＥにてモニターした。別法では、発現された融合タンパク質を含む細胞ペレットを用いた。発酵槽細胞ペレットは、ペレット１ｇ当たり５ｍｌの懸濁緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ［ｐＨ  ８．２］、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁した。細胞を溶解するために、リゾチーム(Sigma)を２００μｇ／ｍｌの終濃度まで添加し、混合物に粘稠性が出るまで（およそ３０分）氷上で攪拌した。次いで、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を２３μｇ／ｍｌの終濃度まで添加し、溶解液中に存在するセリンプロテアーゼの活性を阻害した。このプロテアーゼはＧｌｙ１ＯＲＦ１を分解したものである。その後、デオキシコール酸ナトリウムを５００μｇ／ｍｌの終濃度まで添加し、混合物を２０分間氷上で撹拌した。
【００６４】
細菌細胞溶解物から放出されるゲノムＤＮＡを分画化するために、超音波処理を行った。振幅を２０〜３０％に設定し、ＶｉｂｒａｃｅｌｌＴＭＶＣＸ４００超音波処理器(Sonics and Materials Inc, Danbury, CT, USA)を用いて氷上で１５秒間、３回の超音波処理を行った。４℃で４０分間攪拌した後、ゲノムＤＮＡが小断片に剪断されて試料の粘稠性がなくなるまで前記の超音波処理を繰り返した。次いで、４００００×ｇにて３０分間試料を遠心して、溶解物の不溶性部分をペレット化した。次いで、上清を硫酸アンモニウム中に３Ｍに調整し、１０℃で４３０００×ｇにて３０分間遠心してタンパク質を沈殿させた。次いで、タンパク質は前記のように精製した。
【００６５】
別法として、タンパク質は、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（１ｇの血中血球当たり１０ｍｌ）、その後固形塩酸塩グアニジウム中の血中血球（packed cell）に再懸濁し、懸濁液が透明になるまで撹拌することによって細胞ペレットから抽出した。超音波処理によって粘稠性を低減し、室温で４３０００×ｇにて３０分間遠心してデブリを取り除いた。次いで上清を取り除き、塩酸塩グアニジウムにおよそ３Ｍとなるように希釈し、前記のように遠心して、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィカラムにかけた。カラムを１０容量の適合性緩衝液にて洗浄し、その後酸またはイミダゾール勾配にて洗浄することによって塩酸塩グアニジウムを取り除き、溶出を実施した。
【００６６】
ヘム（ヘミン）結合アッセイ：  Ｇｌｙ１結合および非結合のヘミンの可視的ＵＶスペクトルの変化を分光法によって、キャリアであるＢＳＡとＧｌｙ１との混合物からＧｌｙ１タンパク質を引き下ろす（プルダウンする）ためにアフィニティマトリクスとしてヘミン−アガロースビーズを用いて調査した。
【００６７】
抗体の産生：  組み換えＧｌｙ１タンパク質試料を用いて、標準的なプロトコールによりウサギを免疫化することができる。その後、これら抗体を概説したように血清殺菌性抗体アッセイに用いることができる：標的生物の希釈物は、抗Ｇｌｙ１抗体の異なる希釈物（１／１０〜１／１００００）と補体の供給源として働く適切な血清との存在下で１％ ＦＣＳを含むＰＢＳ中でおよそ１５００ｃｆｕとなるように９６ウェルプレートに作製する。抗体および／または血清を含まないコントロールを平行して作製する。３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした後、各反応物から２０μｌの試料を適切な選択培地プレート上に播き、３７℃（好ましくは５％ＣＯ２）で１６時間生育する。インキュベート後、生きている細胞を数える。このようにして、特定の細菌Ｇｌｙ１タンパク質に対する抗体が、選択した標的動物における血清殺菌活性を生じさせることができるか否かが決定されうる。
【００６８】
サルモネラ・エンテリカＧｌｙ１ホモログの構築および合成
サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾナ菌のアミノ酸配列（ＹＰ＿００１５７３３０９）、ナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎菌）ＧＬＹ１ＯＲＦ１ホモログをコードする合成ＤＮＡは、遺伝子合成(Eurofins MWG)によって構築し、隣接するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位によりｐＪＯＮＥＸ４プラスミドにクローニングした。同様に、停止コドンをＢａｍＨＩにより部位に置き換えてＹＰ＿００１５７３３０９をＣ末端６ヒスチジンタグとインフレーム融合した融合タンパク質配列として発現するようにしたＤＮＡコンストラクトを調製し、ｐＪＯＮＥＸ−ＣＨＩＳにサブクローニングした。組み換えプラスミドを用いてタグ付加および非タグ付加のＳ．エンテリカＧｌｙ１ホモログ（ＳａｌＧＬＹ１）を作製した。
【００６９】
抗血清。  ＳａｌＧＬＹ１タンパク質を用いてラット(BioServ Ltd)に抗血清を生じさせた。次いで、血清をウェスタンブロットに用いた。図６を参照のこと。
【００７０】
実施例
組み換えＧｌｙ１遺伝子は、マンヘミア・ヘモリチカおよびエドワージエラ・イクタルリのゲノムＤＮＡと適切なプライマーのＰＣＲから得られたＤＮＡ断片に例示されるように、ＰＣＲによって容易に増幅することができる。これは図１に示される。
【００７１】
図２に示すように、組み換えマンヘミア・ヘモリチカＧｌｙ１タンパク質は大腸菌において容易に製造した。タンパク質は図３に示すように標準的な方法を用いて精製することができる。
【００７２】
図４に示されるように、ヘミンの可視的スペクトルの変化として現れたマンヘミア・ヘモリチカのＧｌｙ１タンパク質は、互いに結合していることを示す。
【００７３】
図５に示されるように、Ｇｌｙ１タンパク質とヘム（ヘミン）との相互作用は、ヘミン−アガロースビーズによるプルダウンアッセイを用いて確認することができる。例として、これは、Ｇｌｙ１とウシ血清アルブミンとの混合物からヘムが選択的にＭ．ヘモリチカＧｌｙ１タンパク質を結合することを示す。
【００７４】
図６は、タンパク質サイズマーカー（Ｍ）、誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）のＣ−ｈｉｓタグ付加ＳａｌＧｌｙ１の組換え遺伝子を持つＭ７２細胞からの総タンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶解後、溶解性タンパク質（レーン３）、タンパク質はニッケルキレート（レーン４）およびイオン交換クロマトグラフィ（レーン５）によって精製した。右手側のパネルは、１：５０００の希釈でラットにおいて生じた一次抗血清と示した量のＳａｌＧｌｙ１タンパク質を用いたウエスタンブロットの結果を示す。
【図１】
2014505700.tif 000003
【図２】
2014505700.tif 000004
【図３】
2014505700.tif 000005
【図４】
2014505700.tif 000006
【図５】
2014505700.tif 000007
【図６】
2014505700.tif 000008
【図７】
2014505700.tif 000009
【配列表】
2014505700000001.app
【国際調査報告】
2014505700.tif 000010
2014505700.tif 000011
2014505700.tif 000012
2014505700.tif 000013