(57)【要約】本発明は、抗体全体、抗体のＦａｂ断片、単鎖抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質、および／または抗血管新生性ＰＤＧＦ受容体などの抗体に基づく足場をコードする核酸配列およびポリペプチド配列を提供する。そのような抗血管新生抗体足場、ＶＥＧＦ受容体、および／またはＰＤＧＦ受容体をコードする細胞株も包含される。本発明は、そのような抗血管新生抗体足場、ＶＥＧＦ受容体、および／またはＰＤＧＦ受容体を送達することができるカプセル封入細胞療法デバイス、ならびに眼科疾患、血管疾患、炎症性疾患、および細胞増殖疾患を含めた、患者における障害を医学的に治療するために抗血管新生抗体足場、ＶＥＧＦ受容体、および／またはＰＤＧＦ受容体を送達するためのこれらのデバイスの使用方法も提供する。
2014506119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含む細胞株であって、該１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が反復トランスフェクションプロセスによって該ＡＲＰＥ−１９細胞に導入され、該反復トランスフェクションが、１回のトランスフェクション、２回のトランスフェクション、または３回のトランスフェクションを含む細胞株。
【請求項２】
前記反復トランスフェクションが１回のトランスフェクションである場合に、前記細胞株が、細胞１０６個当たり１日当たり１０，０００〜３０，０００ｎｇの前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
前記細胞株が、細胞１０６個当たり１日当たり約１５，０００ｎｇの前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生する、請求項２に記載の細胞株。
【請求項４】
前記反復トランスフェクションが２回のトランスフェクションである場合に、前記細胞株が、細胞１０６個当たり１日当たり３０，０００〜５０，０００ｎｇの前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項５】
前記細胞株が、細胞１０６個当たり１日当たり約３５，０００ｎｇの前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生する、請求項４に記載の細胞株。
【請求項６】
前記反復トランスフェクションが３回のトランスフェクションである場合に、前記細胞株が、細胞１０６個当たり１日当たり５０，０００〜７５，０００ｎｇの前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項７】
前記細胞株が、細胞１０６個当たり１日当たり約７０，０００ｎｇの前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生する、請求項６に記載の細胞株。
【請求項８】
前記ＡＲＰＥ−１９細胞が、配列番号１の核酸配列によりコードされる可溶性ＶＥＧＦ受容体を含むベクターを用いて遺伝子操作されている、請求項１に記載の細胞株。
【請求項９】
前記ＡＲＰＥ−１９細胞が、配列番号２のアミノ酸配列を含む可溶性ＶＥＧＦ受容体を含むベクターを用いて遺伝子操作されている、請求項１に記載の細胞株。
【請求項１０】
治療有効量の１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含む細胞株であって、該治療有効量が細胞１０６個当たり１日当たり少なくとも１０，０００ｎｇである細胞株。
【請求項１１】
ａ．請求項１に記載の細胞株または請求項１０に記載の細胞株を含むコアと、
ｂ．該１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が通って拡散するのを許容する、該細胞株または細胞の周囲の半透性膜と
を含む埋め込み型細胞培養デバイス。
【請求項１２】
前記コアが０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含有する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記コアが、前記半透性膜の内部に配置されたマトリックスをさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記マトリックスが複数のモノフィラメントを含み、該モノフィラメントが、
ａ．撚り合わせて糸にされているか、もしくは織って網目にされているか、または
ｂ．撚り合わせて不織撚糸状の糸にされており、
ここで、前記細胞がその上に分布している、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記モノフィラメントが、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブテステル、絹、綿、キチン、炭素、および生体適合性金属からなる群から選択される生体適合性材料を含む、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記モノフィラメントが、前記デバイスの内容積の４０〜８５％を占めるポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
つなぎアンカーをさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記つなぎアンカーがアンカーループを含む、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記アンカーループが、前記デバイスを眼構造につなぎ止めるように適合させている、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
眼または脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および腹膜腔からなる群から選択される別の標的領域に埋め込まれる、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２１】
硝子体、房水、テノン嚢下腔、眼周囲腔、後眼房、または前眼房に埋め込まれる、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記半透性膜が、選択透過性免疫保護性膜を含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記半透性膜が、限外濾過膜または精密濾過膜を含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記半透性膜の細孔サイズの中央値が１００ｎｍである、請求項２２または２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記半透性膜が無孔膜材料を含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記無孔膜材料がヒドロゲルまたはポリウレタンである、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記半透性膜の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）が５００ｋＤである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２９】
カプセルが中空繊維または平らなシートとして構成されている、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３０】
長さが４ｍｍ〜１１ｍｍである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３１】
内径が０．９ｍｍ〜１．２ｍｍである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３２】
メタクリル酸メチルを使用して端部が密閉されている、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３３】
少なくとも１種の追加的な生物活性分子を前記デバイスから共送達する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の追加的な生物活性分子が非細胞性供給源由来である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の追加的な生物活性分子が細胞性供給源由来である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の追加的な生物活性分子が、前記コア内の１またはそれより多くの遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞によって産生される、請求項３５に記載のデバイス。
【請求項３７】
ａ．前記コアが、０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含むこと；
ｂ．前記デバイスの長さが４ｍｍ〜１１ｍｍであること；
ｃ．前記デバイスの内径が０．９ｍｍ〜１．２ｍｍであること；
ｄ．前記デバイスの端部がメタクリル酸メチルを使用して密閉されていること；
ｅ．前記半透性膜の細孔サイズの中央値が約１００ｎｍであること；
ｆ．前記半透性膜の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）が５００ｋＤであること；
ｇ．前記半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍであること；
ｈ．前記コアが内部足場を含み、該足場が、前記デバイスの内容積の４０〜８５％を占めるポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含むこと；および
ｉ．それらの組み合わせ
からなる群から選択される１またはそれより多くの追加的な特性をさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記追加的な特性のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全てを含む、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を、被験体の眼に適切な治療用量で送達するための、請求項１１に記載のデバイスの使用であって、前記治療用量が眼当たり１日当たり少なくとも１００ｎｇである使用。
【請求項４０】
眼科障害を治療するための方法であって、請求項１１に記載の埋め込み型細胞培養デバイスを患者の眼に埋め込むステップと、前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を該デバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦとＰＤＧＦの両方に結合させ、それにより、前記眼科障害を治療するステップとを含む方法。
【請求項４１】
前記眼科障害が、未熟児網膜症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、白内障の形成、網膜芽細胞腫および網膜虚血からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
加齢黄斑変性症が滲出型加齢黄斑変性症である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記眼科障害が糖尿病性網膜症である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
１日当たり患者当たり眼当たり０．１ｐｇ〜１０００μｇの前記抗血管新生抗体足場または前記抗血管新生分子が眼内に拡散し、前記抗血管新生分子が可溶性ＶＥＧＦ受容体または可溶性ＰＤＧＦ受容体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
内皮細胞の増殖または血管化を阻害するための方法であって、請求項１１に記載の埋め込み型細胞培養デバイスを、細胞増殖障害に罹患している患者に埋め込むステップと、前記抗血管新生抗体足場または前記抗血管新生分子を該デバイスから拡散させ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦとＰＤＧＦの両方に結合させるステップとを含み、該結合により、該患者における内皮細胞の増殖または血管化が阻害される方法。
【請求項４６】
前記障害が、血液障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の亢進および悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
１日当たり患者当たりの治療有効量の前記抗血管新生抗体足場または前記抗血管新生分子が前記デバイスから拡散する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子をレシピエント宿主に送達する方法であって、請求項１１に記載の埋め込み型細胞培養デバイスを該レシピエント宿主の標的領域に埋め込むステップを含み、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞が、該標的領域において該抗血管新生抗体足場または該抗血管新生分子を分泌する方法。
【請求項４９】
前記標的領域が、脳、脳室、脊髄を含めた中枢神経系、眼の房水および硝子体液、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、ならびに腹膜腔からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗血管新生抗体足場または前記抗血管新生分子が１日当たり患者当たりの治療有効量で前記標的領域内に拡散する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１１に記載の埋め込み型細胞培養デバイスを作製するための方法であって、
ａ．少なくとも１つのＡＲＰＥ−１９細胞を、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を分泌するように遺伝子操作するステップと、
ｂ．前記遺伝子改変されたＡＲＰＥ−１９細胞を半透性膜の中にカプセル封入するステップであって、該半透性膜が、該１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が該半透性膜を通って拡散するのを許容する、ステップと
を含む方法。
【請求項５２】
前記１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１２月２日出願の米国特許出願第６１／４１９，１３８号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、カプセル封入細胞療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多くの臨床的状態、欠損、および疾患は、患者に、生細胞によって産生される１またはそれより多くの生物活性分子を供給することによって、または、患者から、生細胞により代謝される有害因子を取り除くことによって軽減または緩和することができる。多くの場合、これらの分子は、臓器または組織の機能の欠陥または損失から回復させること、またはそれを補償することができる。したがって、多くの研究者が、臓器全体、臓器組織、および／または細胞を移植し、それにより分泌物をもたらすまたは代謝機能に影響を及ぼすことによって臓器または組織の機能を再構成することを試みてきた。しかし、そのような移植は、劇的な利益をもたらし得るが、その適用は、移植術に適しかつ利用可能な臓器が比較的少数であることによって限定される。さらに、一般に、移植患者は、移植体機能が損失し、最終的に、移植された組織または細胞が壊死することになる移植体の免疫学的拒絶反応を防ぐために免疫抑制されなければならない。同様に、多くの場合、移植体は、長期間、患者の寿命の残りでさえ、機能的なままでなければならない。患者を相当な期間、免疫抑制された状態に維持することは望ましくなく、かつ費用がかかる。
【０００４】
追加的な有効な療法が未だに必要とされている一例は、視覚を脅かす眼の障害である。そのような疾患の治療における１つの主要な問題は、血液網膜関門が存在することが原因で治療剤を眼内に送達し、そこで治療剤を治療的に有効な濃度で維持することができないことである。
【０００５】
多くの増殖因子により、眼の疾患の治療における見込みが示された。例えば、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦは、種々の動物モデルにおいて網膜神経節細胞の変性を遅くし、光受容体の変性を減少させることが示されている。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗｓ、１３巻１号（１９９３年１月）を参照されたい。さらに、神経増殖因子は、視神経の切開術後の網膜の神経節細胞の生存を増強することが示されており、また、虚血後の網膜神経細胞の回復を促進することも示されている。例えば、非特許文献１を参照されたい。つい最近、例えば、抗体全体（例えば、ベバシズマブ）および抗体足場Ｆａｂ断片（例えば、ラニビズマブ）、および免疫グロブリンＦｃ（例えば、アフリバーセプト）を含めた、抗体足場に基づく生物製剤が設計され、眼障害に対して使用されている。
【０００６】
移植処置に対する望ましい代替は、栄養分、代謝産物、および分泌物は拡散させるが、免疫学的拒絶反応の細胞エフェクターおよび分子エフェクターは遮断する物理的関門の内側に細胞または組織を埋め込むことである。選択された産物を産生する組織または細胞を免疫系から保護する種々のデバイスが探究されている。例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、特許文献１；特許文献２；特許文献３；および特許文献４を参照されたい。これらのデバイスとしては、例えば、血管外拡散チャンバー、血管内拡散チャンバー、血管内限外濾過チャンバー、およびカプセル封入細胞の埋め込みが挙げられる。非特許文献２を参照されたい。例えば、非特許文献３；非特許文献４；特許文献５；および特許文献６を参照されたい。そのようなデバイスの使用により、患者を免疫抑制された状態に維持する必要性が緩和される。しかし、これらの手法はいずれも、長期の移植片機能をもたらすためには十分でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，１５８，８８１号明細書
【特許文献２】国際公開第９２／０３３２７号
【特許文献３】国際公開第９１／００１１９号
【特許文献４】国際公開第９３／００１２８号
【特許文献５】国際公開第９３／０３９０１号
【特許文献６】米国特許第５，００２，６６１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｉｌｉｐｒａｎｄｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ＆  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．、３４巻、３２３２〜３２４５頁（１９９３年）
【非特許文献２】Ｓｃｈａｒｐ，  Ｄ．  Ｗ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．、８巻、２２１〜９頁（１９８４年）
【非特許文献３】Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１０巻：９０８〜９１０頁（１９８０年）
【非特許文献４】Ｓｕｎ，  Ａ．  Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３７巻：５７５〜５７９頁（１９８８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、例えば、神経栄養因子、抗血管新生因子、抗炎症因子、酵素、ホルモン、または他の因子などの必要物質を適切な分量で送達する方法、または他の必要な代謝機能を眼または体の他の部分に長期間もたらす方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書では、抗体足場、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体を含めた抗血管新生タンパク質をコードする単離された核酸であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択される配列を含む、またはそれからなる核酸が提供される。本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子も提供する。
【００１１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２のいずれかと少なくとも９５％同一である配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。あるいは、核酸分子は、そのような核酸分子の相補物であってよい。本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ならびにその誘導体、断片およびホモログを含むものとする。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸分子とは、その核酸の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいてその核酸に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まないことが好ましい。例えば、種々の実施形態では、本発明の核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてその核酸分子に隣接する約５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有してよい。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技法によって作出される場合は他の細胞性材料もしくは培地を、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてよい。例えば、「単離された」核酸は、もともとはファージディスプレイスクリーニングによってもたらされた完全な合成分子であってよいことが当業者には理解されよう。したがって、この場合、「単離された」核酸は、他の細胞性材料、培地、化学的前駆体、化学物質などを実質的に含まない合成分子であってよい。
【００１３】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択される配列を有するポリペプチドまたはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補物をコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子）は、標準の分子生物学技法および本明細書において提供される配列情報を用いて作製することができる。これらの核酸配列の全部または一部を用いて、ハイブリダイゼーションプローブ、または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体分子を、標準のハイブリダイゼーションおよびクローニング技法を用いて単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３年に記載の通り）。
【００１４】
本発明の核酸はいずれも、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいは、鋳型としてゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準のＰＣＲ増幅および組み立て技法に従って増幅することができる。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。さらに、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準の合成技法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一連の連結したヌクレオチド残基を指し、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において使用するために十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づいてよい、またはそれから設計することができ、特定の細胞または組織における同一の、同様のまたは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するため、確認するため、またはその存在を示すために使用される。オリゴヌクレオチドは、長さが約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さが約１５ｎｔ〜３０ｎｔである核酸配列の部分を含む。一実施形態では、長さが１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１の少なくとも６つの連続したヌクレオチド、またはその相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドは化学的に合成することができ、プローブとして使用することができる。
【００１６】
他の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示されているヌクレオチド配列の相補物である核酸分子を含む。これらのヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、ミスマッチをほとんどまたは全く伴わずに水素結合し、それにより、安定な二重鎖を形成することができる、ヌクレオチド配列と十分に相補的な核酸分子である。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン−クリック塩基対合またはフーグスティーン塩基対合を指し、「結合」という用語は、２つのポリペプチドもしくは化合物または関連するポリペプチドもしくは化合物またはそれらの組み合わせの間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合としては、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的な相互作用は、直接的であっても間接的であってもよい。間接的な相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を通じたもの、またはそれに起因するものであってよい。直接的な結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の作用を通じて、またはそれに起因して起こらないが、その代わりに、他の実質的な化学的中間体を伴わない相互作用を指す。
【００１８】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２、２９、または３１の核酸配列の一部、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用することができる断片、または本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体のいずれかの生物活性のある部分をコードする断片を含んでよい。本明細書で提供される断片は、少なくとも６つの（連続した）核酸または少なくとも４つの（連続した）アミノ酸の配列と定義され、この長さはそれぞれ、核酸の場合では特異的なハイブリダイゼーションを可能にするために、またはアミノ酸の場合ではエピトープの特異的な認識を可能にするために十分な長さであり、長くても全長配列よりも短い一部分である。断片は、選択された核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から得ることができる。誘導体とは、ネイティブな化合物から、直接、または修飾もしくは部分的な置換によって形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体とは、ネイティブな化合物と同様であるが同一ではない構造を有するが、特定の成分または側鎖に関してネイティブな化合物とは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、合成であってよい、または進化的起源が異なってよく、野生型と比較して同様または逆の代謝活性を有し得る。ホモログとは、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００１９】
誘導体および類似体は、誘導体または類似体が、修飾された核酸またはアミノ酸を含有する場合、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体としては、これらに限定されないが、本発明の核酸またはタンパク質と、種々の実施形態では、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に対して、またはアラインメントされた配列と比較して少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％の同一性（好ましい同一性は５０〜９５％である）により、実質的に相同な領域を含む分子が挙げられ、アラインメントは、当技術分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによって行う、またはそれをコードする核酸は、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、上述のタンパク質をコードする配列の相補物とハイブリダイズすることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３年、および下記を参照されたい。
【００２０】
本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示されているヌクレオチド配列とは遺伝暗号の縮退により異なり、したがって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示されているヌクレオチド配列によりコードされるものと同じ抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、長さが少なくとも６ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする。別の実施形態では、核酸は、長さが少なくとも１０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、１５００ヌクレオチド、２０００ヌクレオチド、またはそれ以上である。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１とハイブリダイズする。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、一般には互いと少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するものとする。さらに、本明細書で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。長い配列は短い配列よりも高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度およびｐＨにおける特異的な配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、平衡状態で、標的配列と相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする温度（定義済みのイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）である。一般に標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。一般には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、一般には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）に対しては少なくとも約３０℃であり、長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現することもできる。
【００２３】
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６に見いだすことができる。条件は、互いと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が一般に互いにハイブリダイズしたままであるような条件であることが好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩濃度の緩衝液中、６５℃でハイブリズさせた後、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中、５０℃で１回または複数回洗浄するものである。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中、５５℃でハイブリダイズさせ、その後１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１回または複数回洗浄するものである。用いることができる他の中程度のストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸中、４０℃でハイブリダイズさせ、その後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１回または複数回洗浄するものである。用いることができる他の低ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である（例えば、異種間ハイブリダイゼーションのために用いられる）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８巻：６７８９〜６７９２頁を参照されたい。
【００２４】
本明細書に記載の核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチドも提供される。例えば、これらのポリペプチドは、抗血管新生抗体足場および／または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体であってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場および／または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体は、ＶＥＧＦに結合する（例えば、優先的に）。これらの抗血管新生抗体足場および／または可溶性ＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦの結合により、またはＰＤＧＦ受容体とＰＤＧＦの結合と併せて、内皮細胞の増殖および血管透過性が阻害される。
【００２５】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％同一である、単離されたポリペプチドにも関する。あるいは、単離されたポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片（すなわち、少なくとも６つの連続したアミノ酸）と少なくとも８０％相同である。さらに、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体、類似体、またはホモログと少なくとも８０％相同である、単離されたポリペプチドも包含する。同様に、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０  ２２、２４、２６、２８、３０、または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体と少なくとも８０％同一である、単離されたポリペプチドも提供する。そのようなポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子によりコードされるべきであることが当業者には理解されよう。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、互換的であるものとする。本発明の新規のポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に配列が提供される抗血管新生抗体足場および可溶性のＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体ポリペプチドが挙げられる。本発明は、その残基のいずれかが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示されている対応する残基から変化している可能性があるが、それでもその抗血管新生抗体足場および／または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体の活性および生理機能を維持するポリペプチドまたはその機能的断片（複数可）をコードする突然変異体または変異体ポリペプチドも包含する。突然変異体または変異体タンパク質では、残基の２０％またはそれ以上に至るまでがそのように変化し得る。
【００２７】
一般に、抗血管新生性または可溶性のＶＥＧＦＲ様またはＰＤＧＦＲ様機能が保存されている抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体の変異体としては、配列内の特定の位置における残基が他のアミノ酸で置換されている任意の変異体が挙げられ、これは、親タンパク質の２つの残基間に追加的な１またはそれより多くの残基が挿入される可能性、ならびに親配列から１またはそれより多くの残基が欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換（複数可）、挿入（複数可）、または欠失（複数可）が本発明に包含される。好都合な状況では、置換は、保存された置換である。
【００２８】
本発明は、単離された抗血管新生抗体足場および可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドまたはＰＤＧＦＲポリペプチド、およびその生物活性のある部分、またはその誘導体、断片、類似体もしくはホモログにも関することが当業者には理解されよう。本明細書に記載の抗血管新生抗体足場および可溶性のＶＥＧＦＲ構築物またはＰＤＧＦＲ構築物は、細胞または組織供給源から、標準のタンパク質の精製技法を用いた適切な精製スキームによって単離することができる。別の実施形態では、本発明の抗血管新生抗体足場および可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドまたはＰＤＧＦＲポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって作出される。組換え発現に対する代替として、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲタンパク質もしくはポリペプチドを、標準のペプチド合成技法を用いて化学的に合成することができる。
【００２９】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはその生物活性のある部分は、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドが由来する細胞または組織供給源由来の細胞性材料または他の汚染タンパク質またはポリペプチドを実質的に含まない、または、化学的に合成された場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性材料を実質的に含まない」という語は、ポリペプチドが、ポリペプチドをそれから単離した、またはそれから組換えによって作出した細胞の細胞性成分から分離されている抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドの調製物を含む。例えば、「細胞性材料を実質的に含まない」という語は、約３０％（乾燥重量で）未満の非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲタンパク質（本明細書では「汚染タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲタンパク質、さらに好ましくは約１０％未満の非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲタンパク質、最も好ましくは、約５％未満の非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲタンパク質を有する、抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドの調製物を含む。抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドまたはその生物活性のある部分を組換えによって作出する場合、培地を実質的に含まない、すなわち、培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当することも好ましい。
【００３０】
同様に、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という語は、ポリペプチドが、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドの調製物を含む。例えば、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という語は、約３０％（乾燥重量で）未満の化学的前駆体または非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲ化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲ化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲ化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非抗血管新生抗体足場または非ＶＥＧＦＲもしくは非ＰＤＧＦＲ化学物質を有する抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドの調製物を含む。
【００３１】
本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチド構築物もしくはＰＤＧＦＲポリペプチド構築物の生物活性のある部分は、本明細書に記載の全長の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲ構築物もしくはＰＤＧＦＲ構築物よりも少ないアミノ酸を含み、本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドの少なくとも１つの活性を示す、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドのアミノ酸配列、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示されているアミノ酸配列と十分に相同である、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。一般には、生物活性のある部分は、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。
【００３２】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント相同性を決定するために、最適に比較するために配列をアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。さらに、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内のある位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、それらの分子は、その位置において相同である（すなわち、本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等しい）。
【００３３】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定することができる。相同性は、当技術分野で公知のコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰソフトウェアなどを使用して決定することができる。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  １９７０年  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８巻：４４３〜４５３頁を参照されたい。「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって残基ごとに同一である程度を指す。「配列同一性の百分率」という用語は、２つの最適にアラインメントされた配列をその比較領域にわたって比較し、両方の配列に存在する核酸塩基（例えば、核酸の場合ではＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が同一である位置の数を決定して、マッチする位置の数をもたらし、マッチする位置の数を、比較領域（すなわち、ウィンドウサイズ）内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率をもたらすことによって算出される。「実質的な同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、比較領域にわたって、参照配列と比較して少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８５パーセントの同一性、および多くの場合、９０〜９５パーセントの配列同一性、通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列の特性を指す。
【００３４】
本発明は、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦもしくはＰＤＧＦＲ受容体のキメラタンパク質または融合タンパク質も提供する。本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲのキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって作出することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従来の技法に従って、例えば、ライゲーション用の平滑末端または付着末端、適切な末端をもたらすための制限酵素消化、必要に応じて突出末端を埋めること、望ましくない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションを用いることによって、一緒にインフレームでライゲーションする。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成機を含めた従来の技法によって融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行い、その後それをアニーリングし、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照されたい）。さらに、すでに融合部分をコードしている多くの発現ベクターが市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。
【００３５】
本発明は、さらに、本発明の核酸分子のいずれかを含有するベクターを提供する。詳細には、本発明は、ベクター、好ましくは、本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチド、またはその誘導体、断片、類似体もしくはホモログをコードする核酸を含有する発現ベクターにも関する。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結した別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。「プラスミド」はベクターの１種であり、追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルスのゲノムに追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる。特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびトランスポゾンに基づく組換え系）などを含むものとする。
【００３６】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の任意の核酸を、宿主細胞において核酸を発現するために適した形態で含み、これは、組換え発現ベクターが、発現のために用いる宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に作動可能に連結した１またはそれより多くの調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターでは、「作動可能に連結した」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列が発現すること（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターを宿主細胞に導入した場合は宿主細胞において）が可能になるように調節配列（複数可）に連結していることを意味するものとする。
【００３７】
「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）に記載されている。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導く調節配列（例えば、組織特異的な調節配列）が挙げられる。当業者には、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選出、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に左右され得ることが理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書に記載の核酸によりコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含めたタンパク質またはペプチドを産生させることができる（例えば、抗血管新生抗体足場、可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドまたはＰＤＧＦＲポリペプチド、抗血管新生抗体足場の突然変異体型、可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドまたはＰＤＧＦＲポリペプチドの突然変異体型、融合タンパク質など）。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲ構築物もしくはＰＤＧＦＲ構築物を原核細胞または真核細胞において発現させるために設計することができる。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系が当技術分野で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  第２版、第１６章および１７章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい）。
【００３９】
さらに、本発明は、そのようなベクター（または本明細書に記載の任意の核酸分子）を含有する宿主細胞または細胞株も提供する。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。続く世代では、突然変異または環境の影響のいずれかによって特定の改変が起こり得るので、そのような後代は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
【００４０】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。非限定的な例として、宿主細胞は、ＡＲＰＥ−１９細胞であってよい。しかし、他の適切な宿主細胞が当業者に公知である。
【００４１】
ベクターＤＮＡは、慣習的な形質転換またはトランスフェクション技法によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈澱または塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿細孔を含めた、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当技術分野で認められている種々の技法を指すものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）、および他の実験マニュアルに見いだすことができる。
【００４２】
哺乳動物の細胞の安定なトランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法に応じて、細胞のごく一部のみが、それらのゲノム内に外来ＤＮＡを組み込み得ることが公知である。これらの組み込み体を同定し選択するために、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、対象の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。種々の選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキサート、および／またはブラストサイジンなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体構築物もしくはＰＤＧＦ受容体構築物をコードするベクターと同じベクター上で、宿主細胞に導入することができる、または別々のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組み入れられた細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ）。
【００４３】
培養物中の原核宿主細胞または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞を用いて、本明細書に記載の任意の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチド構築物もしくはＰＤＧＦＲポリペプチド構築物を産生させる（すなわち、発現させる）ことができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いてこれらの抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドを産生させるための方法を提供する。一実施形態では、該方法は、本発明の宿主細胞（抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲをコードする組換え発現ベクターが導入された）を、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲポリペプチドもしくはＰＤＧＦＲポリペプチドが産生されるように適切な培地中で培養することを含む。別の実施形態では、該方法は、培地または宿主細胞から抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦＲもしくはＰＤＧＦＲを単離することをさらに含む。
【００４４】
同様に、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群から選択される核酸配列によりコードされる抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体の治療量を産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞の細胞株も提供する。同様に、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞の細胞株も提供する。
【００４５】
治療量は、６ｍｍのデバイス当たり１日当たり少なくとも１ｐｇ〜１０００μｇであることが好ましい。治療量はこの範囲（両端を含む）に入る任意の量であってよいことが当業者には理解されよう。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３週間にわたって発現することができる。いくつかの実施形態では、治療量は１日当たり少なくとも１００〜１０，０００ｎｇである。非限定的な一実施形態では、この量は少なくとも１日当たり４μｇである。
【００４６】
本明細書には、本発明の細胞株（すなわち、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場および／または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦＲ受容体のいずれかの治療量で産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞）のうちの１つまたは複数、およびコアの周囲の、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体が通って拡散するのを許容する半透膜を含有する埋め込み型（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ）細胞培養デバイスも記載されている。「カプセル」および「デバイス」という用語は、本明細書では、互換的に使用され、遺伝子操作された細胞および細胞株（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞または細胞株）を含有する任意のバイオ人工臓器を指す。
【００４７】
いくつかの実施形態では、コアは、半透膜の内部に配置されたマトリックスをさらに含有する。非限定的な例として、マトリックスは、ヒドロゲルまたは細胞外マトリックス成分を含んでよい。例えば、ヒドロゲルは、多価イオンと架橋したアルギン酸を含有してよい。他の実施形態では、マトリックスは、撚り合わせて糸にした、もしくは織って網目にした、または撚り合わせて不織撚糸（ｎｏｎ−ｗｏｖｅｎ  ｓｔｒａｎｄ）状の糸にした複数のモノフィラメントを含み、その上に細胞または組織が分布している。繊維状の細胞支持マトリックスは、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブテステル（ｐｏｌｙｂｕｔｅｓｔｅｒ）、絹、綿、キチン、炭素、および／または生体適合性金属からなる群から選択される生体適合性材料から作製することができることが当業者には理解されよう。本明細書で使用される場合、「内部足場」とは、本発明の任意のデバイスにおいて使用するために適した「マトリックス」の非限定的な一例である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞カプセル封入デバイスは、つなぎアンカーも有する。例えば、つなぎアンカーは、カプセルを眼構造につなぎ留めるために適したアンカーループであってよい。本明細書に記載のデバイスはいずれも、眼、または脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および腹膜腔から選択される別の体の標的領域に埋め込むために適している。非限定的な例として、硝子体、房水、テノン嚢下腔、眼周囲腔、後眼房、および／または前眼房にカプセルを埋め込むことができる。
【００４９】
本明細書に記載のデバイスの包被は、選択透過性免疫隔離性（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｏｒｙ）膜で作製することが好ましい。例えば、包被は限外濾過膜または精密濾過膜で作製する。限外濾過膜の細孔サイズは一般には１〜１００ｎｍであり、精密濾過膜の細孔サイズは一般には０．１〜１０μｍであることが当業者には理解されよう。他の実施形態では、包被は、無孔膜材料（例えば、ヒドロゲルまたはポリウレタン）で作製することができる。「包被」および「半透性膜」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５０】
本明細書に記載のデバイスのいずれにおいても、カプセルは中空繊維または平板として構成することができる。さらに、種々の実施形態では、少なくとも１種の追加的な生物活性分子をこれらのデバイスから共送達することができる。例えば、少なくとも１種の追加的な生物活性分子は、非細胞性供給源または細胞性供給源（すなわち、少なくとも１種の追加的な生物活性分子が、コア内の１またはそれより多くの遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞によって産生される）由来であってよい。
【００５１】
本明細書では、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを患者の眼に埋め込み、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それにより、眼科障害を治療することによって眼科障害を治療するための方法も提供される。例えば、治療される眼科障害は、未熟児網膜症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、白内障の形成、網膜芽細胞腫および網膜虚血からなる群から選択することができる。好ましい一実施形態では、加齢黄斑変性症は滲出型（ｗｅｔ  ｆｏｒｍ）加齢黄斑変性症である。別の好ましい実施形態では、眼科障害は糖尿病性網膜症である。
【００５２】
本発明は、さらに、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを、細胞増殖障害に罹患している患者に埋め込み、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから拡散させ、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに結合させることによって内皮細胞の増殖を阻害するための方法であって、その結合により、患者における内皮細胞の増殖が阻害される方法を提供する。例えば、障害は、血液障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の亢進および悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００５３】
本明細書に記載の埋め込み型細胞培養デバイスをレシピエント宿主の標的領域に埋め込むことによって、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をレシピエント宿主に送達する方法であって、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞が、標的領域において抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌する方法も提供される。好ましい標的領域としては、脳、脳室、脊髄、または眼の房水および硝子体液を含めた中枢神経系が挙げられる。他の標的領域としては、これらに限定されないが、全身送達については全身、ならびに／または乳房、結腸、脾臓、卵巣、精巣、および／もしくは骨髄などの体内の臓器の内部またはその付近に局在する標的部位を挙げることができる。
【００５４】
眼への埋め込みおよび／または眼の障害に関する本明細書に記載の任意の方法では、本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を、埋め込み型細胞培養デバイスから１日当たり患者当たり０．１ｐｇ〜１０００μｇ拡散させることができることが当業者には理解されよう。しかし、体の他の標的領域への全身的な埋め込みに関しては、治療有効量は１日当たり患者当たり１０００ｍｇを上回り得る。そのような全身的適応のためには、はるかに大きなＥＣＴデバイスを使用しなければならないことが当業者には理解されよう。
【００５５】
眼への埋め込みに関して、治療量は６ｍｍのデバイス当たり１日当たり１ｐｇ〜１０００μｇ（両端を含む）の任意の量であることが好ましい。いくつかの実施形態では、治療量は１日当たり少なくとも１０００ｎｇ（１．０ｐｃｄ）である。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３週間にわたって発現することができる。
【００５６】
さらに、本発明は、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを作製するための方法も提供する。１つの方法では、少なくとも１つのＡＲＰＥ−１９細胞を、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群から選択される核酸配列によりコードされる抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌するように遺伝子操作し、遺伝子改変されたＡＲＰＥ−１９細胞を、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を通って拡散するのを許容する半透膜内部にカプセル封入する。別の方法では、少なくとも１つのＡＲＰＥ−１９細胞を、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌するように遺伝子操作し、遺伝子改変されたＡＲＰＥ−１９細胞を、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体が通って拡散するのを許容する半透膜内部にカプセル封入する。
【００５７】
本発明は、眼における血管障害を含めた血管障害を、例えば、デバイスを患者の眼に、または、局在化かつ標的化された抗血管新生因子の送達のためには、他の疾患にかかっている部位に埋め込むことによって治療するための、本発明による埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかの製造における、本発明のポリペプチドのいずれか（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２）を産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞の使用についても記載する。
【００５８】
さらに、本明細書に記載の埋め込み型細胞培養デバイスはいずれも、デバイスを患者の眼に埋め込むことによって、および本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させることによって、眼科障害を治療するために使用することができる。
【００５９】
本発明の埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかを患者の眼に埋め込むことによって、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに結合させることによって、眼科障害を治療するための、本発明のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞も提供される。
【００６０】
本明細書に記載の単離された核酸分子はいずれも、患者の眼に本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを埋め込むことによって、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに結合させることによって眼科障害を治療するための、本発明のポリペプチドのうちの１つを産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞の製造においても使用することができる。さらに、本発明の単離された核酸分子はいずれも、眼科障害を治療するためにも使用することができ、治療は、患者の眼に本発明による埋め込み型細胞培養デバイスを埋め込むこと、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させることを含み、前記デバイス内の前記１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、前記単離された核酸分子を用いて、単離された本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作されている。
【００６１】
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、血管障害は、これに限定されないが、例えば、未熟児網膜症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症（例えば、滲出型（ｗｅｔ  ｆｏｒｍ）加齢黄斑変性症）、緑内障、網膜色素変性症、白内障の形成、網膜芽細胞腫および網膜虚血から選択される。本明細書に記載のデバイスはいずれも、種々の眼以外の血管障害を治療するためにも使用することができることが当業者には理解されよう。
【００６２】
本発明は、細胞増殖障害に罹患している患者の眼にデバイスを埋め込むことによって、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それにより、前記患者における内皮細胞の増殖を阻害することによって内皮細胞の増殖を阻害するための、本発明による埋め込み型細胞培養デバイスの製造における、本発明のポリペプチド（例えば、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子）を産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞の使用も提供する。同様に、本発明は、細胞増殖障害に罹患している患者の眼にデバイスを埋め込むことによって、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それにより、前記患者における内皮細胞の増殖を阻害することによって内皮細胞の増殖を阻害するための、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスも提供する。
【００６３】
他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかを、細胞増殖障害に罹患している患者の眼に埋め込むことによって、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに結合させ、それにより、前記患者における内皮細胞の増殖を阻害することによって内皮細胞の増殖を阻害するための、本発明のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞を提供する。
【００６４】
細胞増殖障害に罹患している患者の眼に本発明による埋め込み型細胞培養デバイスを埋め込むことによって、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦに結合させ、それにより、前記患者における内皮細胞の増殖を阻害することによって内皮細胞の増殖を阻害するための、本発明のポリペプチド（複数可）を産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞の製造における、本明細書に記載の単離された核酸分子のいずれかの使用も意図されている。
【００６５】
さらに、本発明は、内皮細胞の増殖を阻害するための本発明による単離された核酸分子のいずれかも提供し、治療は、細胞増殖障害に罹患している患者の眼に本発明による埋め込み型細胞培養デバイスを埋め込むこと、および抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それにより、前記患者における内皮細胞の増殖を阻害することを含み、前記デバイス内の前記１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、前記単離された核酸分子を用いて、本発明のポリペプチドを産生するように遺伝子操作されている。
【００６６】
細胞増殖障害は、血液障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の亢進および悪性腫瘍からなる群から選択することができ、これに限定されないが、眼を含めた体の種々の部分に局在し得ることが当業者には理解されよう。したがって、言及された障害を治療するために、これらの局在領域の近くにＥＣＴデバイスを置くことができる。
【００６７】
本明細書では、デバイスをレシピエント宿主の標的領域に埋め込むことによって抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をレシピエント宿主に送達するための、本発明による埋め込み型細胞培養デバイスであって、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞が、標的領域において抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌するデバイスの製造における、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞の使用も提供される。同様に、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスはいずれも、デバイスをレシピエント宿主の標的領域に埋め込むことによって、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をレシピエント宿主に送達するために使用することができ、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、標的領域において抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌する。
【００６８】
さらに、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかをレシピエント宿主の標的領域に埋め込むことによって抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をレシピエント宿主に送達するために使用することができ、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、標的領域において抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌する。
【００６９】
同様に、本明細書に記載の単離された核酸分子はいずれも、レシピエント宿主の標的領域に本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを埋め込むことによって抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をレシピエント宿主に送達するための、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞の製造において使用することができ、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、標的領域において抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌する。
【００７０】
本明細書に記載の単離された核酸分子はいずれも、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をレシピエント宿主に送達するためにも使用することができ、前記送達は、レシピエント宿主の標的領域に本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを埋め込むことを含み、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、標的領域において抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌し、前記デバイス内の前記１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞は、前記単離された核酸分子を用いて、本発明のポリペプチドのいずれかを産生するように遺伝子操作されている。
【００７１】
標的領域は、脳、脳室、脊髄、および眼の房水および硝子体液を含めた中枢神経系から選択されることが当業者には理解されよう。他の標的領域が体内の他の所に位置し得、ＥＣＴデバイスをそれらの領域の近くに置く。領域としては、これらに限定されないが、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および腹膜腔を挙げることができる。
【００７２】
さらに、本発明は、単離されたポリペプチドを作出する方法も提供し、該方法は、本明細書に記載の単離された核酸分子のいずれかを発現させ、発現されたポリペプチドを回収することを含む。
【００７３】
本発明は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を治療有効量で産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞（例えば、細胞１０６個当たり１日当たり少なくとも１０，０００ｎｇ）を含む細胞株も提供する。細胞株により、少なくとも３ヶ月間にわたって（すなわち、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２１ヶ月、２４ヶ月、またはそれ以上）治療有効量が産生されることが好ましい。
【００７４】
いくつかの非限定的な実施形態では、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子は、反復トランスフェクションプロセスを用いてＡＲＰＥ−１９細胞に導入することができる。詳細には、反復トランスフェクションは、１回のトランスフェクション、２回のトランスフェクション、３回のトランスフェクション、またはそれ以上のトランスフェクション（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上のトランスフェクション）であってよい。反復トランスフェクションプロセスが１回のトランスフェクションである場合、細胞株は、１つの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を含有することになる。反復トランスフェクションプロセスが２回のトランスフェクションである場合、細胞株は、２つの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を含有することになる。これらは、同じ抗血管新生抗体足場もしくは抗血管新生分子、または異なる抗血管新生抗体足場もしくは抗血管新生分子であってよい。反復トランスフェクションプロセスが３回のトランスフェクションである場合、細胞株は、３つの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を含有することになる。これらは、同じ抗血管新生抗体足場もしくは抗血管新生分子、または異なる抗血管新生抗体足場もしくは抗血管新生分子であってよい。反復トランスフェクションプロセスにおけるトランスフェクションの数により、生じる細胞株における（同じまたは異なる）抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子の数が決定されることが当業者には理解されよう。
【００７５】
いくつかの実施形態では、反復トランスフェクションが１回のトランスフェクションである場合に、細胞株は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり１０，０００〜３０，０００ｎｇ産生する。細胞株は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり、約１５，０００ｎｇ、または少なくとも１５，０００ｎｇ産生することが好ましい。他の実施形態では、反復トランスフェクションが２回のトランスフェクションである場合に、細胞株は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり３０，０００〜５０，０００ｎｇ産生する。細胞株は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり、約３５，０００ｎｇ、または少なくとも３５，０００ｎｇ産生することが好ましい。さらに他の実施形態では、反復トランスフェクションが３回のトランスフェクションである場合に、細胞株は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり５０，０００〜７５，０００ｎｇ産生する。細胞株は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり、約７０，０００ｎｇまたは少なくとも７０，０００ｎｇ産生することが好ましい。
【００７６】
抗血管新生分子は、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体および／または可溶性ＰＤＧＦ受容体であってよい。
【００７７】
反復トランスフェクションプロセスを用いて、同じ抗血管新生抗体足場（複数可）および／または抗血管新生分子（複数可）の多数のコピーをＡＲＰＥ−１９細胞に導入することができる。あるいは、反復トランスフェクションプロセスを用いて、異なる抗血管新生抗体足場（複数可）および／または抗血管新生分子（複数可）の多数のコピーをＡＲＰＥ−１９細胞に導入することもできる。
【００７８】
一実施形態では、ＡＲＰＥ−１９細胞を、配列番号１の核酸配列によりコードされる可溶性ＶＥＧＦ受容体または配列番号２のアミノ酸配列を含む可溶性ＶＥＧＦ受容体を含むベクターを使用して遺伝子操作する。
【００７９】
本発明は、さらに、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を治療有効量で産生するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含む任意の細胞株を提供し、ここで、治療有効量は、細胞１０６個当たり１日当たり少なくとも１０，０００ｎｇ（例えば、細胞１０６個当たり１日当たり少なくとも１５，０００ｎｇ、２０，０００ｎｇ、２５，０００ｎｇ、３０，０００ｎｇ、３５，０００ｎｇ、４０，０００ｎｇ、４５，０００ｎｇ、５０，０００ｎｇ、５５，０００ｎｇ、６０，０００ｎｇ、６５，０００ｎｇ、７０，０００ｎｇ、７５，０００ｎｇ、またはそれ以上）である。そのような細胞株は、この治療有効量を少なくとも３ヶ月（例えば、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２１ヶ月、または２４ヶ月）またはそれよりも長くにわたって産生することができる。そのような細胞株は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の反復トランスフェクションプロセスを用いて作出することができることが当業者には理解されよう。しかし、当技術分野で公知の他の方法を用いて、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を治療有効量で産生させることもできる。
【００８０】
本明細書に記載の細胞株はいずれも、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群から選択される核酸配列によりコードされる抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌するように遺伝子操作することができる。同様に、本明細書に記載の細胞株はいずれも、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体を分泌するように遺伝子操作することができる。
【００８１】
本明細書には、本発明の細胞株（すなわち、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子のいずれかを治療有効量で産生するように反復トランスフェクションプロセスを用いて遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞、または細胞１０６個当たり１日当たり少なくとも１０，０００ｎｇを分泌するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞）のうちの１つまたは複数を含有するコア、およびコアの周囲の、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子が通って拡散するのを許容する半透膜を含有する埋め込み型細胞培養デバイスも記載されている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、コアは、０．５〜１．０×１０６個の細胞を含有する。
【００８３】
コアは、半透膜の内部に配置されたマトリックスさらに含有してよい。他の実施形態では、マトリックスは、撚り合わせて糸にした、もしくは織って網目にした、または撚り合わせて不織撚糸状の糸にした複数のモノフィラメントを含み、その上に細胞または組織が分布している。モノフィラメントは、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブテステル、絹、綿、キチン、炭素、および／または生体適合性金属から選択される生体適合性材料から作製することができることが当業者には理解されよう。例えば、モノフィラメントは、デバイスの内容積の４０〜８５％を占めるポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維である。
【００８４】
本明細書に記載の細胞カプセル封入デバイスは、つなぎアンカーも有してよい。例えば、つなぎアンカーは、デバイスを眼構造につなぎ留めるために適したアンカーループであってよい。
【００８５】
本明細書に記載のデバイスはいずれも、眼または別の体の標的領域、例えば、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および／または腹膜腔などに埋め込むことができる（または、埋め込むためのものである）。非限定的な例として、デバイスは、硝子体、房水、テノン嚢下腔、眼周囲腔、後眼房、および／または前眼房に埋め込むことができる（または、埋め込むためのものである）。
【００８６】
本明細書に記載のデバイスの半透性膜は、選択透過性免疫保護性（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）膜から作製することが好ましい。他の実施形態では、半透性膜は限外濾過膜または精密濾過膜から作製する。半透性膜の細孔サイズの中央値は一般には約１００ｎｍであることが当業者には理解されよう。
【００８７】
さらに他の実施形態では、半透性膜は、無孔膜材料（例えば、ヒドロゲルまたはポリウレタン）から作製することができる。本明細書に記載のデバイスのいずれにおいても、半透性膜の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）は５００ｋＤである。半透性膜の厚さは約９０〜１２０μｍであることが好ましい。本明細書に記載のデバイスはいずれも、中空繊維または平板として構成することができる。デバイスの長さは、約４ｍｍ〜１１ｍｍであってよい。いくつかの実施形態では、デバイスの内径（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）は約０．９ｍｍ〜１．２ｍｍである。好ましい一実施形態では、デバイスの端部がメタクリル酸メチルを使用して密閉されている。
【００８８】
本発明の任意のデバイスは、以下の追加的な特性の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは全てを含んでよい：
ａ．コアが、０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含有すること；
ｂ．デバイスの長さが４ｍｍ〜１１ｍｍであること；
ｃ．デバイスの内径（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）が０．９〜１．２ｍｍであること；
ｄ．デバイスの端部がメタクリル酸メチルを使用して密閉されていること；
ｅ．半透性膜の細孔サイズの中央値が約１００ｎｍであること；
ｆ．半透性膜の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）が５００ｋＤであること；
ｇ．半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍであること；
ｈ．コアが、デバイスの内容積の４０〜８５％を占めるポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含む内部足場を含有すること；および
ｉ．その任意の組み合わせ（複数可）。
【００８９】
さらに、種々の実施形態では、少なくとも１種の追加的な生物活性分子をこれらのデバイスから共送達することができる。例えば、少なくとも１種の追加的な生物活性分子は、非細胞性供給源由来または細胞性供給源由来（すなわち、少なくとも１種の追加的な生物活性分子が、コア内の１またはそれより多くの遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞によって産生される）であってよい。
【００９０】
本発明は、さらに、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を被験体の眼に適切な治療用量で送達するための、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかの使用を提供し、ここで、治療用量は、眼当たり１日当たり少なくとも１００ｎｇ（例えば、眼当たり１日当たり少なくとも１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇ、１５００ｎｇ、２０００ｎｇ、２５００ｎｇ、３０００ｎｇ、３５００ｎｇ、４０００ｎｇ、またはそれ以上）である。同様に、本発明は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を被験体の眼に適切な治療用量で送達することによって、それを必要とする被験体を治療することにおいて使用するための、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子も提供し、ここで、治療用量は、眼当たり１日当たり少なくとも１００ｎｇ（例えば、眼当たり１日当たり少なくとも１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇ、１５００ｎｇ、２０００ｎｇ、２５００ｎｇ、３０００ｎｇ、３５００ｎｇ、４０００ｎｇ、またはそれ以上）である。
【００９１】
本明細書では、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかを患者の眼に埋め込み、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子をデバイスから眼内に拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させ、それにより、眼科障害を治療することによって眼科障害を治療するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、眼科障害の治療において使用するための細胞株（すなわち、本明細書に記載の細胞株のいずれか）を提供し、ここで、細胞株は埋め込み型細胞培養デバイスに組み入れられ、デバイスは患者の眼に埋め込まれ、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子がデバイスから拡散し、眼内のＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合し、それにより、眼科障害が治療される。
【００９２】
例えば、治療される眼科障害は、未熟児網膜症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、白内障の形成、網膜芽細胞腫および網膜虚血から選択することができる。好ましい一実施形態では、加齢黄斑変性症は滲出型（ｗｅｔ  ｆｏｒｍ）加齢黄斑変性症である。好ましい一実施形態では、眼科障害は糖尿病性網膜症である。
【００９３】
本発明は、さらに、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを、細胞増殖障害に罹患している患者に埋め込み、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子をデバイスから拡散させ、ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦに結合させることによって内皮細胞の増殖または血管化を阻害するための方法であって、結合により、患者における内皮細胞の増殖または血管化が阻害される方法を提供する。例えば、障害は、血液障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の亢進および悪性腫瘍から選択することができる。そのような方法では、１日当たり患者当たりの治療有効量の抗血管新生抗体足場（複数可）または抗血管新生分子（複数可）がデバイスから拡散する。
【００９４】
本明細書に記載の埋め込み型細胞培養デバイスのいずれかをレシピエント宿主の標的領域に埋め込むことによって抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子をレシピエント宿主に送達する方法であって、カプセル封入された１またはそれより多くのＡＲＰＥ−１９細胞が、標的領域において抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を分泌する方法も提供される。好ましい標的領域としては、これらに限定されないが、脳、脳室、脊髄、眼の房水および硝子体液、脾臓、耳、心臓、結腸、肝臓、腎臓、乳房、関節、骨髄、皮下、および／または腹膜腔を含めた中枢神経系を挙げることができる。他の標的領域としては、これらに限定されないが、全身送達については全身、ならびに／または乳房、結腸、脾臓、卵巣、精巣、および／もしくは骨髄などの体内の臓器の内部またはその付近に局在する標的部位を挙げることができる。そのような方法では、１日当たり患者当たりの治療有効量の抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が標的領域内に拡散する。
【００９５】
眼への埋め込みおよび／または眼の障害に関する本明細書に記載の任意の方法では、１日当たり患者当たりの治療有効量の本発明の抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が埋め込み型細胞培養デバイスから拡散することが当業者には理解されよう。例えば、１日当たり患者当たり０．１ｐｇ〜１０００μｇの本発明の抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を埋め込み型細胞培養デバイスから拡散させることができる（例えば、標的領域（複数可）内に）。
【００９６】
本発明は、本発明の埋め込み型細胞培養デバイスを作製するための方法も提供する。例えば、少なくとも１つのＡＲＰＥ−１９細胞を、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７  配列番号２９および配列番号３１からなる群から選択される核酸配列によりコードされるもの）を分泌するように遺伝子操作し、遺伝子改変されたＡＲＰＥ−１９細胞を、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子が通って拡散するのを許容する半透膜の中にカプセル封入する。好ましい一例では、本発明の抗血管新生分子は、可溶性ＶＥＧＦ受容体および／または可溶性ＰＤＧＦ受容体である。
【００９７】
特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書に支配される。さらに、材料、方法、および実施例は単に例示的なものであり、限定するものではない。
【００９８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、ｐＣｐＧｆｒｅｅ−ｖｉｔｒｏ発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）Ｍａｐを示す概略図である。
【図２−１】図２は、分子ｐ８３４を発現している細胞を用いた細胞株のスクリーニングおよびヒットの決定の例を示す。
【図２−２】図２は、分子ｐ８３４を発現している細胞を用いた細胞株のスクリーニングおよびヒットの決定の例を示す。
【図３】図３は、分子ｐ８３４およびｐ８７３のウエスタンブロットの結果ならびに分子ｐ８３４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図４】図４は、ｐ８３４およびｐ８３８のＨＵＶＥＣバイオアッセイを示す。
【図５】図５は、ｐ８３４の溶液結合アッセイを示す。
【図６】図６は、ｐ８３４を発現している細胞株の安定性を示す。
【図７】図７は、容器内で４週間保持した後のｐ８３４  ＥＣＴデバイスの組織切片を示す。
【図８】図８は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギの眼に埋め込んだ３ヶ月後の、外植したｐ８３４  ＥＣＴデバイスの組織学的検査を示す。
【図９】図９は、８３４タンパク質を産生する細胞株のＰＣＤを質量対効力プロットで示す。第１、第２および第３のトランスフェクション／反復細胞株がプロットされている。
【図１０】図１０は、ｐ９６３およびｐ９６４によってトランスフェクトした細胞によって産生されるＰＤＧＦＲベータＦｃ融合タンパク質の検出ＥＬＩＳＡを示す。
【図１１】図１１は、ＰＤＧＦＲ−Ｄ１−Ｄ５−ｈＩｇＧ１  Ｆｃを産生するクローン細胞株例を示す。
【図１２】図１２は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、および受容体Ｆｃを含めた抗血管新生分子を分泌する代表的な細胞株を示す。
【図１３】図１３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＣＴ形式での代表的なＭａｂ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、および受容体Ｆｃ細胞株のデバイスタンパク質の生産量を示す。
【図１４】図１４は、ｐ８３４、ｐ８７３、およびｐ９１７の類縁構造を示す概略図である。
【図１５】図１５は、ｐ８３４、ｐ８７３、およびｐ９１７の配列アラインメントである。
【図１６】図１６は、ｐ８３４およびアフリバーセプトの配列アラインメントである。
【図１７】図１７は、複合ローディングデバイスから分泌されるＰＤＧＦＲ−ＦｃおよびＶＥＧＦＲ−Ｆｃの、抗ＰＤＧＦＲプラス抗Ｆｃによる検出ウエスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
タンパク質は、眼疾患の治療において使用される治療薬の優勢なクラスである。しかし、大きな抗体に基づくタンパク質薬物は血液網膜関門を回避することができず、したがって、治療するためには繰り返し眼内投与する必要がある。ヒト臨床試験において、２年間一貫して、カプセル封入細胞技術（ＥＣＴ）眼内デバイスにより生物学的治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）を眼に直接送達することができることが以前実証されており、これにより、この技術を他の眼科用生物製剤、例えば滲出型（ｗｅｔ）ＡＭＤに関連するものにも拡張することができることが示されている。
【０１０１】
例えば、抗体全体、抗体のＦａｂ断片、単鎖の（ＳｃＦｖ）抗体、および融合受容体−Ｆｃ分子を含めた抗体足場生物製剤の主要なクラスを表すｃＤＮＡ配列を合成した。ｃＤＮＡ発現ベクターを使用して、所望の抗体に基づく生物製剤を分泌する安定なヒト細胞株を創出した。その後、細胞株をカプセル封入して、眼用のＥＣＴ埋め込み物を創出した。タンパク質分泌の速度をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１０２】
培養したクローン細胞株は抗体足場タンパク質の全てのクラスを分泌し、その多くがＣＨＯ細胞株に基づく製造系と同等であった。クローン細胞株は頑強な組換えタンパク質分泌を示し、一部の細胞株のレベルは１日当たり細胞百万個当たり２００〜２０，０００ｎｇ（２０ｐｃｄ）に近づいた。いくつかの実施形態では、１回、２回、３回またはそれ以上のトランスフェクションの反復トランスフェクションプロセスを用いて、細胞を遺伝子操作することができる。驚いたことに、反復ＤＮＡトランスフェクションおよび選択により、細胞株の、組換えタンパク質分泌を生じさせる能力が、１日当たり細胞百万個当たり５０，０００ｎｇから７０，０００ｎｇ超（７０ｐｃｄ）まで有意に増大する。反復トランスフェクションプロセスを用いて、同じまたは異なる抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子の多数のコピーを細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）導入することができる。１回のトランスフェクションを伴う反復トランスフェクションプロセスで作出した分子は、「第１世代」分子と称することができる。２回のトランスフェクションを伴う反復トランスフェクションプロセスで作出した分子は、「第２世代」分子と称することができる。３回のトランスフェクションを伴う反復トランスフェクションプロセスで作出した分子は、「第３世代」分子と称することができる。
【０１０３】
活性な抗体足場に基づく生物製剤および受容体融合タンパク質を産生する細胞株を首尾よくカプセル封入し、個々のＥＣＴデバイスからの組換えタンパク質の最初の産生が１日当たり５０〜１０００ｎｇに至るまでのレベルで最初に検出された。その後の反復的にＤＮＡトランスフェクトした細胞株により、培地の最適化と関連して、眼科用ＥＣＴデバイスのレベルが１日当たり４，０００ｎｇ〜１０，０００ｎｇに至るまで上昇した。
【０１０４】
したがって、これらのＥＣＴデバイスは、眼科適応症、ならびに局在的適応症および／または全身的適応症に対する、抗体、抗体足場、および／または受容体融合タンパク質を含めた大きな生物学的分子の有効な薬物送達プラットフォームであり得る。
【０１０５】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、胚循環系の形成である脈管形成と、既存の脈管構造からの血管の成長である血管新生のどちらにも関与するシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦは主に、血管内皮の細胞に対するその効果が公知であるが、広範囲の他の細胞種、例えば、単球／マクロファージ遊走の刺激、ニューロン、癌細胞、腎臓上皮細胞などにも影響を及ぼす。
【０１０６】
ＶＥＧＦファミリーにはいくつものタンパク質が存在し、これは、ｍＲＮＡの代替スプライシングの結果として生じる。種々のスプライス変異体により、生じたタンパク質が血管新生促進性であるか、または抗血管新生性であるかが決定されるので、それらはＶＥＧＦの機能に影響を与える。さらに、スプライス変異体は、細胞表面上でのＶＥＧＦとヘパラン（ｈｅｐａｒｉｎ）硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）およびニューロピリン（ｎｅｕｒｉｐｉｌｉｎ）コレセプターとの相互作用に影響を及ぼし、今度は、それにより、ＶＥＧＦの、ＶＥＧＦシグナル伝達受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、それを活性化する能力が増強される。
【０１０７】
ＶＥＧＦスプライス変異体は、グリコシル化されたジスルフィド結合二量体として細胞から放出される。構造的に、ＶＥＧＦはシステインノット増殖因子のＰＤＧＦファミリーに属し、したがって、いくつかの密接に関連するタンパク質、すなわち、増殖因子のＶＥＧＦサブファミリーを共に構成する胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄが存在する。ＶＥＧＦ自体は、一般には、これらの他の関連する増殖因子と区別するためにＶＥＧＦ−Ａと称される。
【０１０８】
タンパク質のＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦＲまたは細胞表面上に存在するチロシンキナーゼ受容体に結合することによって細胞の応答を刺激する。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外部分、単一の膜貫通領域、および開裂チロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分を有する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）のどちらにも結合する。ＶＥＧＦＲ１は、全長の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）として、ならびに可溶性の形態で発現され、細胞外ドメインのみを保有する。ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦに対する公知の細胞応答のほとんど全てを媒介すると思われ、血管芽細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）および血管芽細胞（ａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）に分化する運命にある中胚葉前駆細胞において発現される。ＶＥＧＦＲ−１の機能はあまり明確には定義されていないが、ＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を調節すると考えられている。ＶＥＧＦ−Ａは違うが、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄも第３の受容体（ＶＥＧＦＲ−３）のリガンドであり、リンパ脈管新生を媒介する。
【０１０９】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、同様に血管新生において役割を果たす増殖因子である。ＰＤＧＦの多数の形態が存在し、２つのＡ鎖（ＡＡ）、２つのＢ鎖（ＢＢ）、または混合Ａ／Ｂ鎖（ＡＢ）を含有する二量体を構成する。ＰＤＧＦは、内皮細胞の増殖に対する支持体としての機能を果たす細胞のクラスである周皮細胞に対する強力なマイトジェンである。ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）は、アルファおよびベータの２つの形態で存在する。ＰＤＧＦＲベータはＰＤＧＦ−ＢＢに対する親和性が最も高く、融合タンパク質−Ｆｃの形態で、または細胞外可溶性受容体としてのいずれかで、分泌タンパク質として抗血管新生性の生物学的効果を発揮することが示されている。最近、抗ＶＥＧＦ分子と拮抗ＰＤＧＦ分子の組み合わせを伴うマウス眼血管新生モデルにおいて、強力な相乗的抗血管新生活性が実証された。したがって、抗ＰＤＧＦ、抗ＶＥＧＦ併用療法では、抗ＶＥＧＦ療法単独よりも高い抗血管新生活性が発揮される可能性がある。
【０１１０】
対象の遺伝子（すなわち、本発明によるＶＥＧＦ受容体構築物またはＰＤＧＦ受容体構築物などの所与の抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子をコードする遺伝子）を、当技術分野で公知の標準の技法を用いて適切な発現ベクターのクローニング部位に挿入することができる。ＶＥＧＦ受容体分子をコードするヒト（および他の哺乳動物）遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９９７，９２９号；同第５，１４１，８５６号；同第５，３６４，７６９号；同第５，４５３，３６１号；ＷＯ９３／０６１１６；ＷＯ９５／３０６８６を参照されたい。
【０１１１】
本発明では、種々の特異的な切断されたＶＥＧＦ受容体構築物および／またはＰＤＧＦ受容体構築物が意図されている。ＶＥＧＦとその受容体の結合またはＰＤＧＦとその受容体の結合を攪乱する抗血管新生抗体足場（すなわち、抗体および抗原結合性断片およびそれらの誘導体、単鎖抗体など）も意図されている。例えば、本明細書に記載の可溶性ＶＥＧＦＲ受容体タンパク質は、分泌性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＲ１）、分泌性ＶＥＧＦ受容体２（ｓＶＲ２）の断片、および／またはＶＥＧＦ受容体１のＶＥＧＦ結合ドメインと分泌性ＶＥＧＦ受容体２のＶＥＧＦ結合ドメインのキメラを含む。これらの分泌性タンパク質はＶＥＧＦと結合し、また、多数のＩｇ様ドメインを含有する。ＶＲ１由来およびＶＲ２由来の両方のいくつかの免疫グロブリン様ドメインが、本明細書に開示されている可溶性ＶＥＧＦ受容体構築物において使用されている。ドメイン２（Ｄ２）はｓＶＲ１のＶＥＧＦ結合ドメイン（「ＶＢＤ」）であるが、ＶＥＧＦの親和性の高い結合のためにはドメイン３（Ｄ３）が必要であることが当業者には理解されよう。ドメイン１〜３（Ｄ１〜３）またはドメイン２〜３（Ｄ−３）を含有するｓＶＲ１の切断体は、ドメイン２単独よりも高い親和性でＶＥＧＦと結合する。さらに、これらの切断体は、ＶＥＧＦの血管新生作用の中和もする。ＶＲ２は、親和性の高いＶＥＧＦ結合のために同様の要件を有するが、さらに、単量体型は非常に低い親和性で結合するので、二量体でなければならない。本明細書に記載の種々の受容体構築物としては、ＶＲ２のドメイン１、２、および３ならびにＶＲ１のドメイン２とＶＲ２のドメイン３のキメラが挙げられる。型は、単量体の形態または二量体の形態であってよい。本明細書に記載されている可溶性ＶＥＧＦ受容体構築物の二量体形成成分は全長のＦｃ領域である。
【０１１２】
別の例では、ＰＤＧＦＲベータの細胞外ドメイン１〜５は、ＰＤＧＦと結合することが示されている。ＰＤＧＦＲベータの細胞外ドメインを１〜３に切断してもＰＤＧＦと結合する。したがって、これらの可溶性のネイティブな細胞外ドメインを組み合わせることにより、または融合タンパク質として、ＰＤＧＦに対する可溶性アンタゴニストを創出することが可能になる。眼の新血管形成の多数のモデルにおいて示されているように、ＰＤＧＦＲベータアンタゴニストの使用により、ＶＥＧＦアンタゴニストの抗血管新生作用が補足される（Ｊｏら、２００６年）。
【０１１３】
本発明は、公知の抗ＶＥＧＦ化合物およびその生体反応性断片に由来する（および／またはそれに対するバイオシミラーである）抗血管新生抗体足場および受容体融合タンパク質も提供する。例えば、公知の抗ＶＥＧＦ化合物としては、これらに限定されないが、抗ＶＥＧＦ受容体断片（すなわち、アフリバーセプト）および／または抗ＶＥＧＦ抗体（またはその抗原結合性断片）（すなわち、ベバシズマブ、ＤｒｕｇＢａｎｋ  ＤＢ００１１２；またはラニビズマブ  ＤｒｕｇＢａｎｋ  ＤＢ０１２７０））が挙げられる。これらの公知の抗ＶＥＧＦ化合物の配列は当技術分野で公知である。他の例では、生理活性拮抗ＰＤＧＦ受容体断片も文献に記載されている（Ｈｅｉｄａｒａｎら、１９９０年；Ｈｅｉｄａｒａｎら、１９９５年；Ｎａｋａｍｕｒａら、２００１年）。
【０１１４】
本発明の特異的な抗血管新生抗体足場およびＶＥＧＦ受容体構築物は、
１）ｐ８３４（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ＃１、［ＲＳ−ＶＥＧＦ受容体１、ドメイン２およびＶＥＧＦ受容体２、ドメイン３（Ｒ１Ｄ２−Ｒ２Ｄ３）］−ＥＦＥＰＫＳＣ−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）
２）ｐ８３８（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ＃２、［ＶＥＧＦ受容体２、ドメイン１、２、および３（Ｒ２Ｄ１−Ｒ２Ｄ２−Ｒ２Ｄ３）］）
３）ｐ８７６（ＶＥＧＦ抗体ＳｃＦｖ＃１、Ｈｉｓタグを有する）
４）ｐ９１３（ＶＥＧＦ抗体ＳｃＦｖ＃２、Ｈｉｓタグを有さない）
５）ｐ８７３（アフリバーセプト、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ＃３、ＶＥＧＦ受容体１、ドメイン２およびＶＥＧＦ受容体２、ドメイン３（Ｒ１Ｄ２−Ｒ２Ｄ３）ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）
６）ｐ８７４／ｐ８７５（ベバシズマブ、ＶＥＧＦ抗体全体＃１、重鎖／軽鎖）
７）ｐ９１５／ｐ９１４（ラニビズマブ、ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ、重鎖断片／軽鎖）
８）ｐ９１６／ｐ９１４（ラニビズマブ、ＶＥＧＦ抗体全体＃２、重鎖／軽鎖）
９）ｐ９１７（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ＃１、［ＲＳ−ＶＥＧＦ受容体１、ドメイン２およびＶＥＧＦ受容体２、ドメイン３（Ｒ１Ｄ２−Ｒ２Ｄ３）］−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）
を含む。
【０１１５】
本明細書において初めて記載されたＶＥＧＦ構築物は、ＷＯ０９／１４９２０５に記載のＶＥＧＦ受容体構築物よりも優れている。詳細には、Ｆｃ尾部を欠くＶＥＧＦ受容体構築物（例えば、ＷＯ０９／１４９２０５の配列番号１２を参照されたい）は、動物モデルにおいて高度に炎症性であるか、または安定な細胞株にすることができない可能性がある。ＷＯ０９／１４９２０５出願の構築物のそれぞれは、ＩｇＧヒンジ領域を含むが、Ｆｃ尾部は含まない。結果として、これらの構築物は全てＦ（ａｂ）−２様分子である。Ｆ（ａｂ）’２タンパク質は免疫原性を示すことが報告されていることが当業者には理解されよう。（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｕｍｉａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４５巻：２９５１〜６１頁（２００８年）；Ｌｕｔｚら、Ａｕｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７巻：５０８〜１３頁（２００８年）を参照されたい）。
【０１１６】
本発明の１つの驚くべき発見は、ＩｇＧヒンジ領域プラスＦｃ尾部を含有するＶＥＧＦ受容体構築物、例えば、構築物ｐ８３４（配列番号１）などにより生じる免疫学的応答は、ウサギにおいてははるかに少なく、臨床の場では全くないことである。
【０１１７】
本明細書に記載の構築物のうちの３種、ｐ８３４（ＶＥＧＦ−Ｆｃ）、ｐ８７３（アフリバーセプト）、およびｐ９１７（アフリバーセプトＲＳ）は、わずかに異なるアミノ酸配列を有する。例えば、ｐ８３４とｐ８７３の間の差異としては、以下が挙げられる：
ａ．８３４は、シグナルペプチドと成熟タンパク質の間にＲＳアミノ酸を含有する
ｂ．８３４は、ヒンジにおいてＥＦＥＰＫＳＣを含有する
ｃ．８３４は、末端のＫ（天然）を含有する
ｄ．８７３は、５’ａｔｔＢ１および３’ａｔｔＢ２組換え部位（翻訳されない）を含有する
さらに、ｐ８７３に基づくが、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２を取り除き、シグナルペプチドと成熟タンパク質の間にＲＳアミノ酸を戻した新規のアフリバーセプトＲＳ分子（ｐ９１７）を創出した。これらの配列の差異が図１４に概略的に例示されており、また、配列アラインメントが図１５に示されている。ｐ８３４とアフリバーセプトの配列アラインメントが図１６に示されている。
【０１１８】
驚いたことに、ｐ８３４は、予想外に、ｐ８７３構築物およびｐ９１７構築物のどちらよりも優れていた（すなわち、抗血管新生抗体足場がより多く産生された）。
【０１１９】
したがって、ｐ８３４は、当技術分野で公知の他の構築物（すなわち、ｐ８７３）およびこれらの公知の構築物に基づいて生成された構築物（すなわち、ｐ９１７）とは構造的に異なり、それらに勝る驚くべき予想外の利点を示した。
【０１２０】
８３４、８７３、および９１７に基づいて細胞株を生成し、抗血管新生抗体足場生産量を測定した。結果が以下に要約されている。
【０１２１】
【化１】
2014506119.tif 000003
【０１２２】
ｐ８３４（同様にｐ９１０、ｐ９６９も）をトランスフェクトすることにより、高発現クローンが毎回生成する。したがって、ｐ８３４に関して、８７３または９１７にはない、いくつかの利点−潜在的に、追加的な分子の安定性を付与する付加的なシステインを有する長いヒンジであることが存在すると思われる。
【０１２３】
本発明の特異的な抗血管新生性ＰＤＧＦ受容体構築物としては、
１０）ｐ９６４（ＰＤＧＦＲ−ベータドメイン１〜５受容体−ＩｇＧ４Ｆｃ融合体）
１１）ｐ９６３（ＰＤＧＦＲ−ベータドメイン１〜５受容体−ＩｇＧ１Ｆｃ融合体）
１２）ｐ９７４（ＰＤＧＦＲ−ベータドメイン１〜３受容体−ＩｇＧ１Ｆｃ融合体）
１３）ｐ９７８（ＰＤＧＦＲ−ベータドメイン１〜５受容体）
１４）ｐ９７７（ＰＤＧＦＲ−ベータドメイン１〜５受容体プラスＨｉｓ６タグ）
が挙げられる。
【０１２４】
これらの構築物のそれぞれの特定のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が以下に示されている。
【０１２５】
明瞭にするために、本出願では、本発明の構築物、細胞株および抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子を以下の通り識別する：「ｐＸＸＸ」とは、プラスミドを指し（例えば、プラスミドｐ８３４）、「ＸＸＸ−Ｘ−ＸＸ」とは、細胞株を指し（例えば、細胞株８３４−１０−５）、「ＸＸＸ」とは、分子を指す（例えば、分子８３４）。しかし、本発明に基づく足場および構築物および細胞株はいずれも、本明細書では互換的に称し、識別し、かつ／または区分することができることが当業者には理解されよう。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、同じ分子を異なる発現ベクターに導入し、それにより、異なるプラスミドを作製することができる。例えば、分子８３４のｃＤＮＡを、ｐＣｐＧ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｅｅブラストサイジン耐性ベクターに導入して、プラスミドｐ８３４のｃＤＮＡを作製することができる。あるいは、分子８３４をｐＣｐＧ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｅｅネオマイシン耐性ベクターに導入して、プラスミドｐ９１０を作製すること；またはｐＣｐＧハイグロマイシン耐性ベクターに導入して、プラスミドｐ９６９を作製することもできる（実施例７を参照されたい）。
【０１２７】
本明細書に記載の反復トランスフェクションプロセスを用いて、同じ（または異なる）抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子の多数のコピーを、細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）に組み入れることができる。例えば、反復トランスフェクションプロセスにより２回のトランスフェクションを導入する場合、第２世代の構築物（９１０）が生成し、これは、８３４のｃＤＮＡの２つのコピーを含有する。同様に、反復トランスフェクションプロセスにより３回のトランスフェクションを導入する場合、第３世代の構築物（９６９）が生成し、これは、８３４のｃＤＮＡの３つのコピーを含有する。
【０１２８】
図１７に示されている通り、９６３ＰＤＧＦＲ−Ｆｃ細胞株および９１０（８３４）第２世代ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ細胞株を、単一の細胞株としてか、または細胞株の混合物として（「複合ローディング」）、単一のＥＣＴデバイスにカプセル封入した。２時間培養した後のデバイス馴化培地のウエスタンブロット分析により、複合ローディングデバイスが９６３ＰＤＧＦＲ−Ｆｃタンパク質および９１０（８３４）ＶＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質の両方を同時に分泌することが示されている。
【０１２９】
【化２】
2014506119.tif 000004
【０１３０】
【化３】
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【０１３１】
【化４】
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【０１３２】
【化５】
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【０１３３】
【化６】
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【０１３４】
【化７】
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【０１３５】
【化８】
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【０１３６】
【化９】
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【０１３７】
【化１０】
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【０１３８】
【化１１】
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【０１３９】
多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを使用して、増殖因子、または他の対象の生物活性分子（複数可）をコードする遺伝子を発現させることができる。長期の安定なｉｎ  ｖｉｖｏ発現は、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子、例えば、ＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体などをコードする遺伝子が、哺乳動物宿主にｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込んだ際に下方制御に向かわないプロモーターに作動可能に連結されている発現ベクター（すなわち、組換えＤＮＡ分子）を使用して実現される。適切なプロモーターとしては、例えば、強力な構成的な哺乳動物のプロモーター、例えば、ベータアクチン、ｅＩＦ４Ａ１、ＧＡＰＤＨなどが挙げられる。ストレス誘導性プロモーター、例えば、メタロチオネイン１（ＭＴ−１）プロモーターまたはＶＥＧＦプロモーターなども適切であり得る。さらに、コアプロモーターおよびカスタム５’ＵＴＲまたはエンハンサーエレメントを含有するハイブリッドプロモーターを用いることができる。遺伝子発現を制御することができる他の公知の非レトロウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーターまたはアデノウイルスなどが適切である。ストレス環境、例えば、低Ｏ２などの下で追加的な遺伝子発現を付与するために、エンハンサーエレメントを置くことができる。一例は、低酸素誘導されると関連する遺伝子エレメントの上方制御を付与するエリスロポエチンエンハンサーである。
【０１４０】
次いで、対象の遺伝子を含有する発現ベクターを使用して、所望の細胞株をトランスフェクトすることができる。標準のトランスフェクション技法、例えば、リポソーム、リン酸カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたは電気穿細孔などを利用することができる。市販の哺乳動物トランスフェクションキット、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などを購入することができる。さらに、ウイルスベクターを使用して、所望の細胞株を変換することができる。適切なウイルスベクターの例は市販のｐＬｅｎｔｉファミリーのウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ヒト哺乳動物の細胞を使用することができる。全ての場合において、デバイスに含有される細胞または組織が、汚染されていない、または不純物が混和していないことが重要である。重鎖成分および軽鎖成分を必要とする抗体足場タンパク質については、それぞれが関連する抗体の重鎖または軽鎖をコードする二重構築物を同時トランスフェクトし、それにより、機能的な二価のＦａｂおよび四価の抗体全体分子を発現する細胞株をもたらすことができる。
【０１４１】
開示されている構築物において使用する好ましいプロモーターとしては、図１に示されている通り、ＳＶ４０プロモーターおよびＣＭＶ／ＥＦ１アルファプロモーターが挙げられる。
【０１４２】
他の有用な発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメント、例えば、ＳＶ４０の種々の公知の誘導体および公知の細菌プラスミドなど、例えば、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２を含めたＥ．ｃｏｌｉ由来のｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）プラスミド、ｐＣＲ１、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体からなってよい。ジェネテシン（Ｇ４１８）薬物選択遺伝子、ハイグロマイシン薬物選択遺伝子またはブラストサイジン薬物選択遺伝子を含有する発現ベクター（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｐ．  Ｊ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８巻、３１５頁（１９８１年）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｐ．  Ｊ．およびＢｅｒｇ，  Ｐ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、３２７頁（１９８２年））も有用である。これらのベクターでは、種々の異なるエンハンサー／プロモーター領域を使用して、対象の生物遺伝子および／またはＧ４１８、ハイグロマイシンＢ、またはブラストサイジンなどの毒素による選択に対する耐性を付与する遺伝子の発現を駆動することができる。種々の異なる哺乳動物プロモーターを使用して、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢの遺伝子および／または対象の生物遺伝子の発現を導くことができる。Ｇ４１８耐性遺伝子は、培地に添加されたＧ４１８（１００〜１０００μｇ／μｌ）を酵素的に不活化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする。ＡＰＨ遺伝子を発現している細胞のみが薬物選択を生き抜くことになり、通常、これにより、第２の生物遺伝子も発現する。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）遺伝子は、ハイグロマイシン毒素を特異的に修飾し、それを不活化する酵素をコードする。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子と同時トランスフェクトされた、またはそれと同じプラスミド上に含有される遺伝子は、ハイグロマイシンＢが５０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で存在する際に優先的に発現される。
【０１４３】
使用することができる発現ベクターの例としては、これらに限定されないが、市販のｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＣ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＤＮＡ１ＮＥＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＧＳベクター系（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が挙げられる。他の適切な市販のベクターとしては、ｐＢｌａｓｔ、ｐＭｏｎｏ、またはｐＶｉｔｒｏが挙げられる。好ましい一実施形態では、発現ベクター系は、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびブラストサイジン耐性遺伝子（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））と一緒に利用可能なｐＣｐＧｆｒｅｅ−ｖｉｔｒｏ発現ベクターである（図１参照）。
【０１４４】
一実施形態では、突然変異体ＤＨＦＲのｃＤＮＡおよびポリリンカーを含むｐＵＣ１８配列全体を含有するｐＮＵＴ発現ベクターを使用することができる。例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ、Ｐ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５８巻、１２７５〜１２７７頁（１９９４年）；Ｂａｅｔｇｅら、ＰＮＡＳ、８３巻、５４５４〜５８頁（１９８６年）を参照されたい。ｐＮＵＴ発現ベクターは、ＤＨＦＲコード配列がＧ４１８薬物耐性またはハイグロマイシン薬物耐性のコード配列で置き換わるように改変することができる。ｐＮＵＴ発現ベクター内のＳＶ４０プロモーターを上記のものなどの任意の適切な構成的に発現される哺乳動物プロモーターと交換することもできる。
【０１４５】
任意の他の適切な、市販の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡファミリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢｌａｓｔ、ｐＭｏｎｏ、ｐＶｉｔｒｏ、またはｐＣｐＧ−ｖｉｔｒｏ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））も使用することができることが当業者には理解されよう。一般には、発現を調節する主要なエレメントが発現カセット内に見いだされる。これらのエレメントとしては、プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が挙げられる。プラスミドの組み込みまたは発現のためには適切な発現ベクターの他のエレメントが重要である可能性があるが、それは容易に明らかでない場合がある。当業者は、特許請求された発明において使用するために適切な発現ベクターを設計し、構築することができる。適切なベクターの選択、設計、および／または構築は、十分当業者の常套的なレベルの範囲内である。
【０１４６】
ＶＥＧＦ１受容体、ＶＥＧＦ２受容体、ＰＤＧＦアルファ受容体、およびＰＤＧＦベータ受容体をコードする遺伝子およびｃＤＮＡがクローニングされ、それらのヌクレオチド配列が公開されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｕ０１１３４およびＡＦ０６３６５８、ＮＭ＿００６２０６、ＢＣ０３２２２４）。公的に入手可能でない、本発明において有用な生物活性分子をコードする他の遺伝子は、標準の組換えＤＮＡ法、例えば、ＰＣＲ増幅、オリゴヌクレオチドプローブを用いたゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングなどを用いて得ることができる。生物活性分子をコードする公知の遺伝子はいずれも本発明の方法において用いることができる。
【０１４７】
選択された細胞は、自然に生じる連続的なヒト網膜色素上皮細胞株であるＡＲＰＥ−１９細胞株である。しかし、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＲＰＥ（初代細胞または不死化細胞）を含めた他の適切な細胞も使用することができることが当業者には理解されよう。細胞の選択は、意図された適用に左右される。特定の抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体構築物の分泌のために、カプセル封入細胞を選択することができる。活性である、構築物のアゴニスト、類似体、誘導体または断片を合成し、分泌する細胞も使用することができる。他の適切な細胞型を、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体構築物のいずれかを分泌するように遺伝子操作することもできることが当業者には理解されよう。
【０１４８】
カプセル封入細胞に基づく送達系のためのプラットフォーム細胞株であるためには、細胞株は、以下の特性をできるだけ多く有するべきである：（１）細胞は、ストリンジェントな条件下で頑丈であるべきである（カプセル封入細胞は、無血管性組織腔において、例えば、中枢神経系または眼において、特に眼内の環境においてなどで機能的であるべきである）；（２）細胞は、遺伝子改変することができるべきである（所望の治療因子を工学的に操作して細胞内に入れることが必要である）；（３）細胞は、比較的長い寿命を有するべきである（細胞は、預け、特徴付け、工学的に操作し、安全性試験し、臨床的なロット製造するために十分な後代を生じるべきである）；（４）細胞は、好ましくはヒト起源であるべきである（カプセル封入細胞と宿主の間の適合性が増す）；（５）細胞は、１ヶ月より長い期間にわたってｉｎ  ｖｉｖｏにおいてデバイス内で８０％超の生存能力を示すべきである（それにより長期送達が確実になる）；（６）カプセル封入細胞は、有用な生物学的製剤を効果的な分量で送達するべきである（これにより、治療の有効性が確実になる）；（７）細胞は、低レベルの宿主免疫応答を有するべきである（これにより、移植片の長寿命が確実になる）；（８）細胞は非腫瘍形成性であるべきである（デバイスが漏出した場合に、宿主に安全性をもたらすために）。
【０１４９】
ＡＲＰＥ−１９細胞株（Ｄｕｎｎら、６２巻  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  １５５〜６９頁（１９９６年）、Ｄｕｎｎら、３９巻  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．２７４４〜９頁（１９９８年）、Ｆｉｎｎｅｍａｎｎら、９４巻  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １２９３２〜７頁（１９９７年）、Ｈａｎｄａら、６６巻  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ．４１１〜９頁（１９９８年）、Ｈｏｌｔｋａｍｐら、１１２巻  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３４〜４３頁（１９９８年）、Ｍａｉｄｊｉら、７０巻  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８４０２〜１０頁（１９９６年）；米国特許第６，３６１，７７１号）により、カプセル封入細胞に基づく送達系のための上首尾のプラットフォーム細胞の特性の全てが実証される。ＡＲＰＥ−１９細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３０２）。ＡＲＰＥ−１９細胞は、正常な網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり、網膜色素上皮細胞に特異的なマーカーであるＣＲＡＬＢＰおよびＲＰＥ−６５を発現する。ＡＲＰＥ−１９細胞は、形態学的極性および機能的極性を示す安定な単層を形成する。
【０１５０】
本発明の遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞は、抗血管新生抗体足場および／または抗血管新生分子を治療量で産生するための１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または本発明の抗血管新生分子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞は、細胞１０６個当たり１日当たり少なくとも１０，０００ｎｇ産生することができる。これらの細胞は、この量を少なくとも３ヶ月間にわたって産生することができることが好ましい。
【０１５１】
他の実施形態では、これらの分子は、反復トランスフェクションプロセスを用いてＡＲＰＥ−１９細胞に導入することができる。反復トランスフェクションは、少なくとも１回のトランスフェクション、２回のトランスフェクション、３回のトランスフェクション、またはそれ以上のトランスフェクション（例えば、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上）のトランスフェクションを含有する。本発明の細胞株は、反復トランスフェクションが１回のトランスフェクションである場合に、１またはそれより多くの抗体足場に基づく生物製剤および受容体融合タンパク質（すなわち、抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子）を細胞１０６個当たり１日当たり１０，０００〜３０，０００ｎｇ、好ましくは細胞１０６個当たり１日当たり約１５，０００ｎｇまたは少なくとも１５，０００ｎｇ産生することができる。あるいは、細胞株は、反復トランスフェクションが２回のトランスフェクションである場合に、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり３０，０００〜５０，０００ｎｇ、好ましくは細胞１０６個当たり１日当たり約３５，０００ｎｇまたは少なくとも３５，０００ｎｇ産生することができる。他の実施形態では、細胞株は、反復トランスフェクションが３回のトランスフェクションである場合に、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞１０６個当たり１日当たり５０，０００〜７５，０００ｎｇ、好ましくは細胞１０６個当たり１日当たり約７０，０００ｎｇまたは少なくとも７０，０００ｎｇを産生する。いくつかの実施形態では、そのような反復トランスフェクションを用いて同じ抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞に導入することができる。あるいは、反復トランスフェクションの各トランスフェクションで異なる抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を細胞に導入する。
【０１５２】
本発明のデバイスを使用する場合、好ましくは工学的に操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を１０２〜１０８個、最も好ましくは本明細書に記載の１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体構築物またはＰＤＧＦ受容体構築物を分泌するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を０．５〜１．０×１０６個または５×１０２〜６×１０５個、各デバイスにカプセル封入する。投与量は、少数または多数のカプセル、好ましくは患者当たり１〜５０個のカプセルを埋め込むことによって調節することができる。本明細書に記載の眼科用デバイスにより、抗血管新生抗体足場（複数可）または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体構築物（複数可）を、１日当たり患者当たり眼当たり約０．１ｐｇ〜１０００μｇ送達することができる。非限定的な一例では、治療量は、眼当たり定常状態で５００〜５０，０００ｎｇである。別の例では、治療量は、眼当たり定常状態で少なくとも１０μｇ／ｍｌである。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３ヶ月間にわたって発現することができる。
【０１５３】
選択された産物を産生する細胞または組織を隔離するための技法および手順は当業者に公知である、または、常套的な実験だけを用いて公知の手順から適合させることができる。
【０１５４】
隔離しようとする細胞が複製性細胞である、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖に適合させた細胞株である場合、これらの細胞の細胞バンクを生成することが特に有利である。細胞バンクの特定の利点は、それが、同じ培養物または細胞のバッチから調製された細胞性供給源であることである。すなわち、全ての細胞が同じ細胞性供給源から生じ、同じ条件およびストレスに曝露されている。したがって、バイアルを均一な培養物として処理することができる。移植の状況では、これにより、同一または代替のデバイスの作出が著しく容易になる。これにより、埋め込まれた細胞がレトロウイルスなどを含まないことが保障される簡易化試験プロトコールも可能になる。これにより、ビヒクルをｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで平行してモニタリングすることも可能になり、ｉｎ  ｖｉｖｏに残留することに独特の影響または因子を調査することが可能になる。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「個体」または「レシピエント」または「宿主」という用語は、互換的に使用され、ヒトまたは動物被験体を指す。
【０１５６】
「生物活性分子」（「ＢＡＭ」）とは、本発明のデバイスが埋め込まれる個体の体に対する生物学的に有用な作用を発揮することができる物質である。例えば、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場およびＶＥＧＦ受容体構築物がＢＡＭの例である。
【０１５７】
「カプセル」および「デバイス」および「ビヒクル」という用語は、本明細書では、互換的に使用され、本発明のＥＣＴデバイスを指す。
【０１５８】
別段の指定がない限り、「細胞」という用語は、これらに限定されないが、組織内に保持される細胞、細胞クラスター、および個別に隔離された細胞を含めた、任意の形態の細胞を意味する。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「生体適合性カプセル」または「生体適合性デバイス」または「生体適合性ビヒクル」とは、カプセルまたはデバイスまたはビヒクルにより、個体に埋め込まれた際に、カプセルの拒絶反応がもたらされる、またはカプセルが、例えば分解によって作動不能になるのに十分な有害な宿主応答が引き出されないことを意味する。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「免疫隔離性カプセル」または「免疫保護性カプセル」または「免疫隔離性デバイス」または「免疫保護性デバイス」または「免疫隔離性ビヒクル」または「免疫保護性ビヒクル」とは、カプセルが、個体に埋め込まれた際に、デバイスの細胞性内容物を好都合に分配し、そのコア内部の細胞に対する宿主の免疫系の有害作用を最小限にすることを意味する。
【０１６１】
本明細書で使用される「生物活性分子の長期の安定発現」とは、生物活性分子が、１ヶ月を超える期間、好ましくは３ヶ月を超える期間、最も好ましくは６ヶ月を超える期間にわたって、その有用な生物活性が維持されるのに十分なレベルで継続して産生されることを意味する。デバイスの埋め込みおよびその内容物は、３ヶ月超にわたって、多くの場合には１年より長く、いくつかの場合には２年以上、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能性を保持することができる。
【０１６２】
「包被」および「半透性膜」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１６３】
「内部足場」という用語は、本明細書に記載のデバイスにおいて使用することができる「マトリックス」の一例である。
【０１６４】
コアの周囲の包被膜の「半透性」により、細胞によって産生される分子（例えば、代謝産物、栄養分および／または治療用物質）がデバイスから周囲の宿主眼組織に拡散するが、コア内の細胞を、宿主による有害な免疫学的攻撃から保護するためには十分に不浸透性であることが可能になる。
【０１６５】
標的細胞または組織の細胞溶解が生じるのにＩｇＧ単独では不十分であるので、ビヒクルのコアからＩｇＧを排除することは免疫隔離（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ）の試金石ではない。したがって、免疫隔離性カプセルに関して、最大１０００ｋＤの包被の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）値が意図されている。好ましくは、ＭＷＣＯは５０〜７００ｋＤである。最も好ましくは、ＭＷＣＯは７０〜３００ｋＤである。例えば、ＷＯ９２／１９１９５を参照されたい。好ましい一実施形態では、ＭＷＣＯは５００ｋＤである。
【０１６６】
本発明は、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場または可溶性ＶＥＧＦ受容体のうちの１つまたは複数を眼に送達するための生体適合性、場合によって免疫隔離性かつ／または免疫保護性のデバイスにも関する。そのようなデバイスは、抗血管新生抗体足場、ＶＥＧＦ受容体、またはＰＤＧＦ受容体を産生または分泌する生細胞を含有するコアと、コアの周囲の生体適合性包被を含有し、包被は、抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体が、眼内、および脳、脳室、脊髄を含めた中枢神経系に拡散することを可能にする分画分子量（「ＭＷＣＯ」）を有する。
【０１６７】
本発明は、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を産生または分泌する細胞を有するコアと、１またはそれより多くの抗血管新生抗体足場または抗血管新生分子を通して拡散させる、細胞の周囲の半透性膜とを含有する、生体適合性かつ埋め込み型であり、場合によって免疫隔離性かつ／または免疫保護性のデバイスも提供する。
【０１６８】
そのようなデバイスは、以下の追加的な特性の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは全てを含んでよい：
ａ．コアが約０．５〜１．０×１０６個のＡＲＰＥ−１９細胞を含有すること；
ｂ．デバイスの長さが約４ｍｍ〜１１ｍｍであること；
ｃ．デバイスの内径（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）が０．９ｍｍ〜１．２ｍｍであること；
ｄ．デバイスの端部がメタクリル酸メチルを使用して密閉されていること；
ｅ．半透性膜の細孔サイズの中央値が約１００ｎｍであること；
ｆ．半透性膜の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）が５００ｋＤであること；
ｇ．半透性膜の厚さが９０〜１２０μｍであること；
ｈ．コアが、デバイスの内容積の４０〜８５％を占めるポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）繊維を含む内部足場を含有すること；
ｉ．その任意の組み合わせ（複数可）。
【０１６９】
種々の生体適合性カプセルは、本発明による分子を送達するために適している。有用な生体適合性ポリマーカプセルは、（ａ）液体培地に浮遊させたか、または生体適合性マトリックスの内部に固定化した１またはそれより多くの細胞を含有するコアと、（ｂ）隔離された細胞を含有せず、生体適合性であり、かつ、細胞により産生される生物活性分子を眼内に拡散させる膜を含む、周囲の包被とを含む。
【０１７０】
多くの形質転換された細胞または細胞株は、例えば、栄養培地を含み、場合によって細胞の生存能力および機能を持続させるための追加的な因子の供給源を含有する液体コアを有するカプセルの内部に有利に隔離される。本発明のデバイスのコアは、増殖因子（例えば、プロラクチン、またはインスリン様増殖因子２）、増殖調節物質、例えば、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）など、または網膜芽細胞腫遺伝子タンパク質または栄養分輸送エンハンサー（例えば、コア内の溶存酸素の濃度を増強することができるパーフルオロカーボン）の貯蔵器として機能し得る。特定のこれらの物質は、液体培地内に含めるためにも適している。
【０１７１】
さらに、当該デバイスはいずれも、必要な薬物または生物学的治療薬を制御送達するための貯蔵器として使用することもできる。そのような場合では、コアは、選択された薬物または生物学的治療薬（単独で、または細胞または組織と組み合わせて）を高濃度で含有する。さらに、本発明によるデバイスが埋め込まれる体の領域内の好適な環境を調製または創出する物質を含有するサテライトビヒクルもレシピエントに埋め込むことができる。そのような例では、免疫隔離された細胞を含有するデバイスを、例えば、レシピエントからの炎症性応答を下方調節または阻害する物質（例えば、抗炎症性ステロイド）、または毛細血管床の内植を刺激する物質（例えば、血管新生因子）を制御された量で放出するサテライトビヒクルと一緒に領域内に埋め込む。
【０１７２】
あるいは、コアは、細胞の位置を安定化するヒドロゲルの生体適合性マトリックスまたは他の生体適合性材料（例えば、細胞外マトリックス成分）を含んでよい。「ヒドロゲル」という用語は、本明細書では、架橋した親水性ポリマーの三次元網状構造を指す。この網状構造は、実質的に水で構成されるゲルの形態であり、ゲルは９０％超が水であることが好ましい。ヒドロゲルを形成する組成物は３つのクラスに入る。第１のクラスは、正味の負電荷を有する（例えば、アルギン酸）。第２のクラスは、正味の正電荷を有する（例えば、コラーゲンおよびラミニン）。市販の細胞外マトリックス成分の例としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＶｉｔｒｏｇｅｎ（商標）が挙げられる。第３のクラスは、正味の中性の電荷である（例えば、高度に架橋結合したポリエチレンオキシド、またはポリビニルアルコール）。
【０１７３】
沈殿キトサン、合成ポリマーおよびポリマー混和物、マイクロキャリアなどを含めた任意の適切なマトリックスまたはスペーサーを、カプセル封入される細胞の増殖特性に応じてコア内に用いることができる。
【０１７４】
あるいは、デバイスは、内部足場を有してよい。足場により、細胞が凝集することを防ぎ、デバイス内の細胞分布を改善することができる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０２６４６号を参照されたい）。足場により、カプセル封入細胞の微小環境が規定され、細胞がコア内によく分布した状態に保たれる。特定のデバイスに対する最適な内部足場は、使用する細胞型に高度に左右される。そのような足場の不在下では、接着細胞が凝集してクラスターを形成する。
【０１７５】
例えば、内部足場は、糸または網目であってよい。糸または網目状の内部足場を形成するために使用するフィラメントは、生体適合性であり、実質的に非分解性の任意の適切な材料から形成されている（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３０３，１３６号および同第６，６２７，４２２号を参照されたい）。本発明のカプセルは、参照により組み込まれるＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９２／１９１９５号または同第ＷＯ９５／０５４５２号；または参照により組み込まれる米国特許第５，６３９，２７５号；同第５，６５３，９７５号；同第４，８９２，５３８号；同第５，１５６，８４４号；同第５，２８３，１８７号；または同第５，５５０，０５０号に記載されているものに類似することが好ましい。糸または織網目の形成において有用な材料としては、例えば、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブテステルなどの繊維に形成することができる任意の生体適合性ポリマー、または、綿、絹、キチンもしくは炭素などの天然繊維が挙げられる。繊維形成性を有する任意の適切な熱可塑性ポリマー、熱可塑性エラストマー、または他の合成材料または天然材料を、予め製作された中空繊維膜または平膜板から形成された中空の円柱に挿入することができる。例えば、材料を縫合するため、または移植血管の製造において使用される絹、ＰＥＴまたはナイロンフィラメントは、この種類の適用を高度に促す。他の実施形態では、金属リボンまたは針金を用い、織ることができる。これらのフィラメント材料はそれぞれ、よく制御された表面および幾何的性質を有し、大量生産することができ、埋め込み使用の長い歴史を有する。ある特定の実施形態では、フィラメントは、粗い表面および細胞突起が付着し得る「取っ手」をもたらすために「テクスチャライズ」することができる。フィラメントは、フィラメントへの細胞の接着を増強するために、細胞外マトリックス分子でコーティングすること、または表面処理（例えば、血漿放射線照射）することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、非ランダムな一方向に組織化されていることが好ましいフィラメントを束に撚り合わせて、厚さおよび空隙容量がさまざまである糸を形成する。空隙容量は、フィラメント間に存在する空間と定義される。糸の空隙容量は、２０〜９５％で変動するべきであるが、５０〜９５％であることが好ましい。好ましい一実施形態では、内部足場は、ＰＥＴ繊維から作製され、それはデバイスの内容積の４０〜８５％を満たす。好ましいフィラメント間の空隙空間は、糸の長さに沿って足場に細胞を播種することを可能にするため、および細胞がフィラメントに付着することを可能にするために十分な２０〜２００μｍである。糸を構成するフィラメントの好ましい直径は５〜１００μｍである。これらのフィラメントは、束に撚り合わせて糸を構成することを可能にするために十分な機械的強度を有するべきである。フィラメント断面の形状は変動し得、環状、直角、楕円形、三角形、および星印の形状の断面が好ましい。
【０１７７】
あるいは、フィラメントまたは糸は織って網目にすることができる。網目は、製紐機で、織っている間に糸またはフィラメントを網目に供給するために役立つ、モノフィラメントまたはマルチフィラメントを含有する糸巻きに類似した担体を使用して作出することができる。担体の数は調整可能であり、同じフィラメント、または組成および構造が異なるフィラメントの組み合わせに巻きつけることができる。ピックカウントによって規定される組みひもの角度は、担体の回転速度および作出スピードによって制御される。一実施形態では、心棒を使用して網目の中空管を作出する。ある特定の実施形態では、組みひもは単層として構築され、他の実施形態では、組みひもは多層構造である。組みひもの引っ張り強さは個々のフィラメントの引っ張り強さの線形和である。
【０１７８】
他の実施形態では、管状の組みひもを構築する。細胞を播種する中空繊維膜に組みひもを挿入することができる。あるいは、細胞を網目管の壁に浸透させて、細胞を付着させるために利用可能な表面積を最大にすることができる。そのような細胞の浸透が起こる場合、組みひもは細胞の足場マトリックスとして、およびデバイスの内部支持体としての両方の機能を果たす。組みひもに支持されたデバイスの引っ張り強さの増加は、代替の手法よりも有意に高い。
【０１７９】
言及した通り、免疫学的特権がない埋め込み部位、例えば、眼周囲の部位、ならびに前眼房（房水）および後眼房（硝子体）の外側の他の領域などに対しては、カプセルは免疫隔離性であることが好ましい。生体適合性材料の成分は、周囲の半透膜および内部の細胞支持足場を含んでよい。上記の選択透過性膜によりカプセル封入された足場上に形質転換された細胞を播種することが好ましい。また、張り合わせた繊維構造を、細胞を埋め込むために使用することができる。（参照により組み込まれる米国特許第５，５１２，６００号を参照されたい）。生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（乳酸）ＰＬＡ、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ＰＬＧＡ、およびポリ（グリコール酸）ＰＧＡおよびそれらの等価物で構成されるものが挙げられる。移植細胞を接着させることができる表面をもたらすために発泡足場が使用されている（ＰＣＴ国際特許出願第９８／０５３０４号、参照により組み込まれる）。移植血管として織った網目管が使用されている（ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９９／５２５７３号、参照により組み込まれる）。さらに、コアは、細胞の位置を安定化する、ヒドロゲルから形成された固定化マトリックスで構成されてよい。ヒドロゲルは、実質的に水で構成されるゲルの形態の、架橋した親水性ポリマーの三次元網状構造である。
【０１８０】
周囲の半透膜を製造するために、ポリアクリレート（アクリル共重合体を含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル−ｃｏ−塩化ビニル）、ならびにそれらの誘導体、共重合体および混合物を含めた種々のポリマーおよびポリマー混和物を使用することができる。周囲の半透膜は、生体適合性半透性の中空繊維膜であることが好ましい。そのような膜、およびそれらを作製する方法は、参照により組み込まれる米国特許第５，２８４，７６１号および同第５，１５８，８８１号に開示されている。周囲の半透膜は、参照により組み込まれる米国特許第４，９７６，８５９号または米国特許第４，９６８，７３３号に記載されているものなどのポリエーテルスルホン中空繊維から形成する。代替の周囲の半透膜材料はポリスルホンである。
【０１８１】
カプセルは、例えば、円柱状、直角、円板形状、パッチ形状、卵形、星状、または球状を含めた、生物活性を維持するため、および産物または機能を送達するための進路をもたらすために適した任意の構成であってよい。さらに、カプセルは、渦巻き状に巻くこと、または網目様構造または入れ子状の構造に巻きつけることができる。カプセルを埋め込み後に回収する場合、埋め込み部位からのカプセルの移動を導きやすい構成、例えば、レシピエント宿主の血管内を移行するのに十分小さな球状カプセルなどは好ましくない。四角形、パッチ、円板、円柱、および平板などの特定の形状は、高度な構造的完全性をもたらし、回収が望まれる場合に好ましい。
【０１８２】
デバイスは、埋め込まれている間のデバイスの位置を維持するために役立ち、回収に役立つつなぎを有することが好ましい。そのようなつなぎは、カプセルを定位置に固定するように適合させた任意の適切な形状を有してよい。例えば、縫合は、ループ、円板、または縫合糸であってよい。いくつかの実施形態では、つなぎは鳩目様の形状であり、したがって、縫合糸を用いてつなぎ（したがってデバイス）を強膜、または他の適切な眼構造に固定することができる。別の実施形態では、つなぎは一方の端がカプセルと接続され、他方の端で予め糸が通された縫合針を形成する。好ましい一実施形態では、つなぎは、カプセルを眼構造につなぎ留めるように適合させたアンカーループである。つなぎは、形状記憶金属および／または任意の他の適切な当技術分野で公知の医療グレード材料で構築することができる。
【０１８３】
中空繊維の構成では、繊維の内径（ｉｎｓｉｄｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）は２０００ミクロン未満であり、１２００ミクロン未満であることが好ましい。外径（ｏｕｔｓｉｄｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）が３００〜６００ミクロン未満であるデバイスも意図されている。好ましい一実施形態では、内径（ｉｎｎｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）は０．９ｍｍ〜１．２ｍｍである。中空繊維の構成で眼に埋め込むためには、カプセルは長さ０．４ｃｍ〜１．５ｃｍであることが好ましく、長さ０．４〜１．０ｃｍであることが最も好ましい。好ましい一実施形態では、デバイスの長さは４ｍｍ〜１１ｍｍである。より長いデバイスを眼内に適応させることができるが、安全かつ適切な設置のためには曲がった形状または弓状の形状が必要になり得る。眼内に設置するためには中空繊維の構成が好ましい。
【０１８４】
眼周囲に設置するためには、中空繊維の構成（実質的に上記の寸法を有する）または平板の構成のいずれかが意図されている。平板に対する上限は、平方形状であると仮定するとおよそ５ｍｍ×５ｍｍである。表面積がだいたい同じである他の形状も意図されている。
【０１８５】
抗血管新生抗体足場、可溶性ＶＥＧＦＲまたは可溶性ＰＤＧＦＲを送達するために製造されるマイクロデバイスは、長さ１〜２．５ミリメートル、内径（ｉｎｎｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）３００〜５００ミクロン、外径（ｏｕｔｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）４５０〜７００ミクロンであってよい。そのような微粒子化デバイスでは、１０〜６０モノフィラメントのＰＥＴを含有する内部足場を利用することができる。これらの微粒子化デバイスからの分画分子量範囲は１００〜２０００ｋＤａである。対照的に、７０ｋＤａのデキストランの受動拡散は、１００〜２０００×１０−１０ｃｍ２／秒にわたる。これらの微粒子化デバイスでは本明細書に記載の任意の適切な膜材料（複数可）を使用することができるが、２つの好ましい材料はポリエーテルスルホンおよび／またはポリスルホンである。さらに、マイクロデバイスは、適切な材料（例えば、ニチノール）で作製されたアンカーを伴っても伴わなくても製造することができる。微粒子化デバイスについての徹底した考察については、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０７８９２２を参照されたい。
【０１８６】
本明細書に記載の抗体足場、ＶＥＧＦＲ構築物およびＰＤＧＦＲ構築物の送達において使用することが意図されている膜の選択透過性の特徴は、当業者に公知の転相プロセスにより、膜の内面層内に存在するように作られている。内部表面上に拒絶性皮の選択透過性の特徴が発生することにより、細孔構造の製造の一貫性および拒絶性の制御が改善され、同時に膜の性質もカプセル封入デバイスの下流の製造全体を通して保護される。治療的必要性に求められる分子サイズを通過させることを可能にするために、本発明に記載されている膜の選択透過性の特徴を発生させるが、この特性は、必要な最大サイズを放出させながら、意図されたタンパク質サイズよりもほんのわずかだけ大きな分子がカプセルに進入することは制限することを可能にするためにも最適化されている。
【０１８７】
本発明において使用される細胞と宿主レシピエントとの間の相互作用は同種性であるので、拒絶反応に対する最大の懸念は、細胞溶解性補体に媒介される攻撃複合体に由来するもの、または抗体と補体の相互作用によるものではなく、移植されたカプセル封入細胞に対する宿主の免疫細胞複合体に媒介される直接攻撃に由来するものである。本発明において使用する膜は、免疫グロブリンＧのサイズに至るまでの分子の通過が可能になるように設計するが、それでも膜は、細胞の攻撃複合体の組み立てに必要な最大分子であるＣｌｑ（約４００ｋＤａ）などの分子の輸送を制限する。したがって、本発明において使用する膜の設計により、宿主との栄養分および代謝産物の交換速度は最大になり、移植された細胞の宿主での長期の生存能力が支持され、標的治療分子をカプセル封入細胞から宿主に実質的に送達することが可能になり、同時にカプセル封入細胞の補体認識および細胞が宿主と直接接触することが防止される。
【０１８８】
本明細書に記載の抗血管新生抗体足場、ＶＥＧＦＲ構築物およびＰＤＧＦＲ構築物と一緒に使用することが意図されている有孔膜（ｏｐｅｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の公称分画分子量（ＭＷＣＯ）値は最大で１０００ｋＤである。ＭＷＣＯは５０〜７００ｋＤであることが好ましく、およそ３００ｋＤであることが理想的である。好ましい一実施形態では、ＭＷＣＯは５００ｋＤである。意図されている膜の公称細孔サイズの公称細孔サイズはおよそ１００ｎｍであり、細孔のガウス分布に基づいて、最大の絶対的細孔は１５０ｎｍ未満である。サイズが７０ｋＤａのデキストラン分子の受動拡散は１００〜２０００×１０−１０ｃｍ２／秒であり、７０ｋＤａのデキストランの拡散係数は２０００×１０−１０ｃｍ２／秒により近いことが好ましい。抗血管新生抗体足場およびＶＥＧＦＲ構築物と一緒に使用する有孔膜の透水率の上限値はおよそ１００ｍｌｓ／分／ｍ２／ｍｍＨｇである。あるいは、非常に細孔の多い膜（ｖｅｒｙ  ｏｐｅｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を利用しない場合、より「免疫隔離性」かつ／または「免疫保護性」の膜を使用する。そのような免疫隔離性の膜については、透水率は一般には０．４〜１７０ｍｌｓ／分／ｍ２／ｍｍＨｇの範囲内、例えば、０．５〜１００ｍｌｓ／分／ｍ２／ｍｍＨｇであり、１５〜５０ｍｌｓ／分／ｍ２／ｍｍＨｇの範囲内であることが好ましい。当業者に理解される単一の分子量阻止率を決定するための試験手順を用いると、より「免疫隔離性」の膜の公称分画分子量は、ウシのアルブミンの９０％を阻止するが、７０ｋＤａのデキストラン分子の拡散フラックスは、およそ２０００×１０−１０ｃｍ２／秒のままである。Ｄｉｏｎｎｅら、ＡＳＡＩＯ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、９９頁（１９９３年）、およびＣｏｌｔｏｎら、Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ編、Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｂ  ＭおよびＲｅｃｔｏｒ  Ｆ  Ｃ、２４２５〜８９頁（１９８１年）に記載されている通り定義し、測定し、算出したカプセルのグルコース物質移動係数は、１０−６ｃｍ／秒超であり、１０−４ｃｍ／秒超であることが好ましい。
【０１８９】
好ましい一実施形態では、細孔サイズの中央値は約１００ｎｍである。当該デバイスのコアを囲む周囲または周辺の領域（包被）は、選択透過性、生体適合性、かつ／または免疫隔離性であってよい。包被は、隔離された細胞を含まず、コアを完全に取り囲み（すなわち、隔離）、それにより、コア内およびレシピエントの体内のいかなる細胞との接触も防止されるように作出する。生体適合性半透性の中空繊維膜、およびそれらを作製する方法は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２８４，７６１号および同第５，１５８，８８１号に開示されている（ＷＯ９５／０５４５２も参照されたい）。例えば、カプセル包被は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９７６，８５９号および同第４，９６８，７３３号、および同第５，７６２，７９８号に記載のものなどのポリエーテルスルホン中空繊維から形成されていてよい。
【０１９０】
選択透過性にするために、包被は、デバイスを埋め込んだ後に起こることが予測される免疫学的応答の種類および程度、ならびにデバイスを出入りして眼に入ることが望ましい最も大きな物質の分子サイズの両方に適した範囲の分画分子量（「ＭＷＣＯ」）を有するように形成する。デバイスを埋め込んだ後にレシピエントにより開始される可能性がある免疫学的攻撃の種類および程度は、一部はデバイス内に隔離された部分の種類（複数可）に左右され、一部はレシピエントとの同一性（すなわち、レシピエントがＢＡＭの供給源と遺伝的にどのくらい密接に関連するか）に左右される。埋め込まれた組織または細胞がレシピエントと同種異系である場合、免疫学的拒絶反応は、埋め込まれた細胞に対するレシピエントの免疫細胞による細胞媒介性攻撃を通じて大きく進行し得る。組織または細胞がレシピエントに対して異種である場合、抗体と相補物の相互作用だけでなく、レシピエントの細胞溶解性補体攻撃複合体の組み立てを通じた分子攻撃が優性であり得る。
【０１９１】
包被は、所定のサイズまでの物質は通過させるが、それよりも大きな物質の通過は妨げる。より詳細には、周囲または周辺の領域は、所定の範囲のサイズの細孔または空隙を有するように作出し、その結果として、デバイスは選択透過性になる。周囲の包被のＭＷＣＯは、コアに対する免疫学的攻撃を行うために必要な物質の出入りを妨げるために十分に低いが、それでも抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体をレシピエントに送達させるために十分に高くければならない。切断された抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体を使用する場合、本発明のデバイスの生体適合性包被のＭＷＣＯは約１ｋＤ〜約１５０ｋＤであることが好ましい。しかし、切断されていない抗血管新生抗体足場または受容体を送達することが望まれる場合、ＭＷＣＯが２００ｋＤを超える有孔膜を使用するべきである。
【０１９２】
デバイスの包被に関して本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、デバイスおよびその内容物を集合的に指す。詳細には、生体適合性とは、埋め込まれたインタクトなデバイスおよびその内容物の、体の種々の保護系の有害な影響を回避する能力、および、かなりの期間にわたって機能的なままである能力を指す。本明細書で使用される場合、「保護系」という用語は、当該ビヒクルが埋め込まれた個体の免疫系により開始される可能性のある免疫学的攻撃の種類、ならびに他の拒絶反応機構、例えば、線維形成反応、異物反応および個体の体に外来物が存在することによって誘導される可能性がある他の種類の炎症性応答などを指す。免疫系による防御応答または異物線維形成反応からの回避に加えて、「生体適合性」という用語は、本明細書で使用される場合、ビヒクルおよびその内容物によって、特異的な望ましくない細胞傷害性または全身性の影響、例えばビヒクルまたはその内容物の所望の機能に干渉する影響が引き起こされないことも意味する。
【０１９３】
デバイスの外面は、選択された部位への埋め込みに特に適するように選択または設計することができる。例えば、外面は、周囲の組織の細胞が付着することが望ましいかどうかに応じて、平滑、点状または粗面であってよい。形状または構成は、選択された埋め込み部位に特に適するように選択または設計することもできる。
【０１９４】
デバイスの周囲または周辺の領域（包被）の生体適合性は、因子の組み合わせによって作出する。生体適合性および継続した機能性に重要であるのは、デバイスの形態、疎水性および望ましくない物質がデバイス自体の表面上にも存在せず、そこから浸出することもないことである。したがって、異物反応を引き出すブラシ表面、ひだ、中間層または他の形状または構造は回避する。さらに、デバイスを形成する材料は、望ましくない物質がデバイス材料自体から浸出しないことを保証するために十分に純粋である。さらに、デバイスを調製した後、デバイスに接着し、またはそれに吸収され、その後、デバイスの生体適合性を害する可能性がある、流体または材料（例えば、血清）を用いたデバイスの外面の処理は回避する。
【０１９５】
第１に、デバイス包被を形成するために使用する材料は、デバイスが埋め込まれたレシピエントの組織と適合し、許容されるそれらの能力に基づいて選択された物質である。レシピエントまたは隔離された細胞に対して有害でない物質を使用する。好ましい物質としては、ポリマー材料、すなわち、熱可塑性ポリマーが挙げられる。特に好ましい熱可塑性ポリマー物質は、疎水性がそれほど大きくない物質、すなわち、Ｂｒａｎｄｒｕｐ  Ｊ．ら  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９８９年）において定義されている通り、溶解パラメータが８〜１５（ジュール／ｍ３）１／２、またはより好ましくは、９〜１４（ジュール／ｍ３）１／２である物資である。ポリマー物質は、溶解パラメータが、有機溶媒に可溶性であるように十分低いが、それでも分配して適切な膜を形成するために十分に高くなるように選択する。そのようなポリマー物質は、不安定な求核性部分を実質的に含まず、安定化剤の不在下であってもオキシダントおよび酵素に対して高度に耐性であるべきである。特定のビヒクルについて意図されているｉｎ  ｖｉｖｏにおける残留期間も考慮しなければならず、生理的条件およびストレスに曝露させた時に適切に安定である物質を選択するべきである。長期にわたるｉｎ  ｖｉｖｏにおける残留期間、例えば、１年または２年を超える期間などにおいてさえも十分に安定である多くの熱可塑性物質が公知である。
【０１９６】
デバイスを構築するために使用する材料の選択は、参照により本明細書に組み込まれるＤｉｏｎｎｅ  ＷＯ９２／１９１９５に詳細が記載されている通り、いくつもの因子によって決定される。簡単に述べると、種々のポリマーおよびポリマー混和物を使用してカプセル包被を製造することができる。デバイスおよびその中の増殖表面を形成するポリマー膜としては、ポリアクリレート（アクリル共重合体を含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルジフルオリド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ポリオレフィン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリスルホン、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル−ｃｏ−塩化ビニル）、ならびにそれらの誘導体、共重合体および混合物が挙げられ得る。
【０１９７】
好ましい膜キャスティング溶液は、水混和性溶媒ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣＳＯ）に溶解させたポリスルホンまたは水混和性溶媒ブチロラクトンに溶解させたポリエーテルスルホンのいずれかを含む。このキャスティング溶液は、場合によっては、完成した膜の浸透特性に影響を及ぼす親水性または疎水性の添加物を含んでよい。ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンに対して好ましい親水性添加物はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。他の適切なポリマーは、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリエチレンオキシド、ポリオレフィン（例えば、ポリイソブチレンまたはポリプロピレン）、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）、および／またはセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロースまたは酪酸セルロース）を含む。これらおよび他の適切なポリマーおよび共重合体に適合する水混和性溶媒は米国特許第３，６１５，０２４号の教義において見いだされる。
【０１９８】
第２に、デバイスの生体適合性包被の調製に使用する物質は、浸出可能な発熱性または他の点で有害な物質、刺激性物質または免疫原性物質を含まないか、または徹底的に精製して、そのような有害な物質が除去されている。その後、埋め込む前のデバイスの製造および維持の全体を通して最新の注意を払い、デバイスまたは包被に、その生体適合性に悪影響を及ぼす物質が不純物混和またはコンタミネーションすることを防ぐ。
【０１９９】
第３に、テクスチャーを含めたデバイスの外部構成は、それにより、埋め込んだ後にレシピエントの眼との最適なインターフェースがもたらされるように形成する。特定のデバイスの幾何学的配置により、異物線維形成反応が特異的に引き出されることが見いだされており、これは回避するべきである。したがって、デバイスは、中間層を有する構造、例えば、ブラシ表面またはひだなどを含有するべきではない。一般に、同じビヒクルまたは近接するビヒクル由来の向かい合うビヒクル表面または辺は、少なくとも１ｍｍ、好ましくは２ｍｍ超、最も好ましくは５ｍｍ超離れているべきである。好ましい実施形態は、外径（ｏｕｔｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）が約２００〜１６００μｍであり、長さが約０．４〜１ｍｍである円柱を含む。本発明のデバイスのコアの体積はおよそ２μｌ〜２０μｌであることが好ましい。しかし、コア体積が０．５μｌ未満（例えば、約０．３μｌ）である「微粒子化」デバイスを使用することも可能であることが当業者には理解されよう。
【０２００】
生体適合性デバイスの周囲の包被は、場合によって、埋め込まれたビヒクルに対する局所的な炎症性応答を減少させるまたは抑止する物質および／または埋め込まれた細胞または組織に適した局所的な環境を生成または助長する物質を含んでよい。例えば、１またはそれより多くの免疫応答のメディエーターに対する抗体を含めることができる。利用可能な潜在的に有用な抗体、例えば、リンフォカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する抗体、およびインターフェロン（ＩＦＮ）に対する抗体などをマトリックス前駆体溶液に含めることができる。同様に、抗炎症性ステロイドを含めることができる。参照により本明細書に組み込まれるＣｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔ．  Ｒｅｓ．、２３、７０５〜７１８頁（１９８９年）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，  Ｌ．、Ｐｈ．Ｄ．  ｔｈｅｓｉｓ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９８９年を参照されたい。あるいは、血管新生（毛細血管床の内植）を刺激する物質を含めることができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本デバイスの包被は、免疫隔離性かつ／または免疫保護性である。すなわち、包被により、デバイスのコア内の細胞がデバイスを埋め込む個体の免疫系から保護される。これは、（１）個体の体の有害な物質のコアへの進入を妨げることによって、（２）個体と、コア内に存在する可能性がある炎症性材料、抗原性材料、または他の点で有害な材料との接触を最小にすることによって、および（３）隔離された部分と個体の免疫系の有害な部分との免疫学的接触を妨げるために十分な空間的関門および物理的関門をもたらすことによってなされる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、外部の包被は、限外濾過膜または微細孔性膜のいずれかであってよい。限外濾過膜は、細孔サイズの範囲が約１〜約１００ナノメートルのものであり、一方、微細孔性膜の範囲は約１〜約１０ミクロンであることが当業者には理解されよう。
【０２０３】
この物理的関門の厚さは変動してよいが、常に、関門のいずれかの側面上の細胞および／または物質の間の直接接触を妨げるために十分な厚さである。この領域の厚さは、一般に、５〜２００ミクロンにわたり、１０〜１００ミクロンの厚さが好ましく、２０〜５０ミクロンまたは２０〜７５ミクロンの厚さが特に好ましい。好ましい一実施形態では、半透性膜は厚さ９０〜１２０μｍである。当該デバイスを使用することによって妨げるまたは最小限にすることができる免疫学的攻撃の種類としては、マクロファージ、好中球による攻撃、細胞性免疫応答（例えば、ナチュラルキラー細胞および抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞溶解（ＡＤＣＣ））、および体液性応答（例えば、抗体依存性補体媒介性細胞溶解）が挙げられる。
【０２０４】
カプセル包被は、ポリアクリレート（アクリル共重合体を含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル−ｃｏ−塩化ビニル））、ならびにそれらの誘導体、共重合体および混合物を含めた種々のポリマーおよびポリマー混和物から製造することができる。そのような材料から製造されたカプセルは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２８４，７６１号および同第５，１５８，８８１号に記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９７６，８５９号および同第４，９６８，７３３号に記載のものなどの、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）繊維から形成されたカプセルも使用することができる。
【０２０５】
外面の形態に応じて、カプセルは、１型（Ｔ１）、２型（Ｔ２）、１／２型（Ｔ１／２）、または４型（Ｔ４）にカテゴリー化されている。そのような膜は、例えば、Ｌａｃｙら、「Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉａ  Ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｉｃｅ  Ｂｙ  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  Ｏｆ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｉｓｌｅｔｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、１７８２〜８４頁（１９９１年）、Ｄｉｏｎｎｅら、ＷＯ９２／１９１９５およびＢａｅｔｇｅ、ＷＯ９５／０５４５２に記載されている。平滑な外面の形態が好ましい。
【０２０６】
選択透過性、免疫隔離性の膜を有するカプセル包被は、免疫学的特権のない部位に対して好ましいことが当業者には理解されよう。対照的に、微細孔性膜または選択透過性膜が免疫学的特権部位に適する場合がある。免疫学的特権部位に埋め込むためには、ＰＥＳ膜またはＰＳ膜から作製されたカプセルが好ましい。
【０２０７】
ポリマー接着剤および／または圧着、節止めおよび熱密閉の使用を含めた、当技術分野で公知のカプセルを密閉する任意の適切な方法を用いることができる。さらに、任意の適切な「乾燥」密閉方法も使用することができる。そのような方法では、細胞を含有する溶液がそれを通じて導入される実質的に無孔の取り付け具が提供される。充填後、カプセルを密閉する。そのような方法は、例えば、米国特許第５，６５３，６８８号；同第５，７１３，８８７号；同第５，７３８，６７３号；同第６，６５３，６８７号；同第５，９３２，４６０号；および同第６，１２３，７００号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。１つの好ましい方法では、デバイスの端部を、メタクリル酸メチルを使用して密閉する。
【０２０８】
本発明の方法に従って、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体に加えて、他の分子を共送達することができる。例えば、栄養因子（複数可）を抗血管新生因子と一緒に送達することが好ましい場合がある。
【０２０９】
共送達は、いくつものやり方で実現することができる。本実施例では、抗体および抗体断片は、軽鎖配列および重鎖配列をコードする構築物を必要とする。第１に、細胞に、記載の分子をコードする遺伝子を含有する別々の構築物をトランスフェクトすることができる。第２に、細胞に、２種以上の遺伝子ならびに必要な制御エレメントを含有する単一の構築物をトランスフェクトすることができる。第３に、２つ以上の別々に工学的に操作された細胞株を、一緒にカプセル封入すること、または２つ以上のデバイスを対象の部位に埋め込むことができる。
【０２１０】
いくつかの適応症については、ＢＡＭを眼内の２つの異なる部位に同時に送達することが好ましい場合がある。例えば、神経栄養因子を硝子体に送達して、神経網膜（ＲＰＥに対する神経節細胞）を補うこと、およびテノン嚢下腔を介して抗血管新生因子（例えば、本発明の抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体のうちの１つまたは複数など）を送達して脈絡膜の脈管構造を補うことが望ましい場合がある。
【０２１１】
本発明は、治療レジメンの過程中に異なる細胞型を使用することも意図している。例えば、患者に、第１の細胞型（例えば、ＢＨＫ細胞）を含有するカプセルデバイスを埋め込むことができる。その後、患者においてその細胞型に対する免疫応答が発生したら、カプセルを回収する、または外植することができ、そして、第２の細胞型（例えば、ＣＨＯ細胞）を含有する第２のカプセルを埋め込むことができる。このように、患者においてカプセル封入細胞型のうちの１つに対する免疫応答が発生した場合でさえ、治療分子を連続的に提供することが可能である。
【０２１２】
本発明の方法およびデバイスは、霊長類、好ましくはヒト宿主、レシピエント、患者、被験体または個体において使用することが意図されている。本発明のデバイスおよび方法のために、いくつもの異なる眼への埋め込み部位が考えられている。適切な埋め込み部位としては、これらに限定されないが、眼の房水および硝子体液、眼周囲腔、前眼房、および／またはテノン嚢下が挙げられる。体内の埋め込み部位は、皮下、腹腔内、またはＣＮＳ内を含んでよい。さらに、埋め込みは、所望の生物学的療法を必要とする病変またはその付近への局在化送達に向けることができる。そのような疾患部位の例は、炎症を起こした関節、脳およびＣＮＳ病変、良性腫瘍または悪性腫瘍の部位であってよい。デバイスが循環系に出入りすることにより、体内の潜在的な疾患部位の範囲を患部臓器および組織からさらに遠位に広げることができる。
【０２１３】
レシピエントによる、埋め込まれたデバイスに対する免疫学的応答の種類および程度は、レシピエントとコアの内部に隔離された細胞との関係に影響される。例えば、コアが、同系の細胞を含有する場合、レシピエントがデバイスの内部の特定の細胞型または組織型に対して自己免疫に罹患していない限り、これらは活発な免疫学的応答を引き起こさない。同系の細胞または組織はほとんど利用できない。多くの場合、同種異系または異種の細胞または組織（すなわち、予想されるレシピエントと同じ種由来、またはそれとは異なる種由来のドナー）が利用可能であり得る。免疫隔離性デバイスを使用することにより、同種異系または異種の細胞または組織を、レシピエントを同時に免疫抑制する必要なく埋め込むことが可能になる。また、免疫隔離性カプセルを使用することにより、不適合細胞（非自己（ａｌｌｏｇｒａｐｈ））を使用することも可能になる。したがって、当該デバイスにより、慣習的な移植技法により治療することができる個体よりもはるかに多くの個体を治療することが可能になる。
【０２１４】
異種移植組織に対する免疫応答の種類および強さは、同系または同種異系の組織をレシピエントに埋め込んだ場合に起こる応答とは異なることが予想される。この拒絶反応は、主に細胞媒介性攻撃によって、または相補物媒介性攻撃によって進行し得る。ビヒクルのコアからＩｇＧを排除することは、標的細胞または組織の細胞溶解が生じるのにＩｇＧ単独では不十分であるので、免疫保護（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の試金石ではない。免疫学的攻撃の媒介に必要な重要な物質が免疫隔離性カプセルから排除されるのであれば、免疫隔離性デバイスを用いて、必要な高分子量産物を送達すること、または高分子量物質に関する代謝機能をもたらすことが可能である。これらの物質は、補体攻撃複合体成分Ｃｌｑを含んでよい、または、食作用性細胞または細胞傷害性細胞を含んでよい。免疫隔離性カプセルを使用することにより、これらの有害な物質と隔離された細胞の間に保護的な関門がもたらされる。
【０２１５】
本発明のデバイスはマクロカプセルであるが、例えば、Ｒｈａ、Ｌｉｍ、およびＳｕｎに記載のものなどのマイクロカプセルも用いることができることが当業者には理解されよう（Ｒｈａ，  Ｃ．  Ｋ．ら、米国特許第４，７４４，９３３号；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３７巻、５７５〜５７９頁（１９８８年）；米国特許第４，６５２，８３３号；米国特許第４，４０９，３３１号を参照されたい）。一般に、マイクロカプセルは、（１）細胞がデバイスの外層から完全に排除されること、および（２）デバイスの外層の厚さにより、マクロカプセルとは異なる。一般には、マイクロカプセルの体積はおよそ１μｌであり、１０４個未満の細胞を含有する。より詳細には、マイクロカプセル封入では、一般に、カプセル当たりおよそ５００〜５０，０００個の細胞がカプセル封入される。
【０２１６】
低ＭＷＣＯのカプセルを使用して、患者の免疫系の分子とカプセル封入細胞の相互作用をさらに妨げることができる。
【０２１７】
本明細書に記載の方法に従って使用されるデバイスはいずれも、隔離された細胞の生存能力および機能を維持するために、少なくとも１次元において、コア内の隔離された細胞のいずれかをレシピエントの周囲の眼組織に対して十分に極めて近傍にもたらされなければならない。しかし、全ての場合にデバイスを形成するために使用する材料の拡散の制限だけによってその構成上の制限が規定されるのではない。基本的なビヒクルの拡散性、または栄養分または酸素の輸送性を変化させるまたは増強する特定の添加物を使用することができる。例えば、コアの内部の培地に、酸素飽和型のパーフルオロカーボンを補充し、したがって即時に血液由来の酸素と接触させる必要性を低下させることができる。これにより、隔離された細胞または組織を、例えば、アンジオテンシンの勾配をビヒクルから周囲の組織内に放出し、毛細血管の内植を刺激する間、生存可能なままにすることが可能になる。パーフルオロカーボンを使用するための参考文献および方法は、参照により本明細書に組み込まれるＦａｉｔｈｆｕｌ，  Ｎ．  Ｓ．  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ、４２巻、２３４〜２４２頁（１９８７年）およびＮＡＳＡ  Ｔｅｃｈ  Ｂｒｉｅｆｓ  ＭＳＣ−２１４８０、Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｔ．  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．  ２０４０２により得られる。あるいは、ＰＣ１２細胞などのクローン細胞株については、遺伝子操作されたヘモグロビン配列を細胞株に導入して、優れた酸素の貯蔵庫を作出することができる。ＮＰＯ−１７５１７  ＮＡＳＡ  Ｔｅｃｈ  Ｂｒｉｅｆｓ、１５巻、５４頁を参照されたい。
【０２１８】
カプセル封入細胞は、分泌を増強するために、環境制御および主要栄養素および微量栄養素の補充によってさらに刺激することができる。組換え細胞の上流の開発の分野において、培地、ｐＨおよび温度を最適化することが、細胞の増殖、密度および組換えタンパク質の生産量に極めて大きな影響を有し得ることが周知である。そのように刺激した細胞およびＥＣＴデバイスを宿主に埋め込むと生産性が増大し、それにより、療法に対して有用であり得る持続性の増強した生産性表現型が可能になり得る。例として、そのような栄養化合物は、これらに限定されないが、トリス、ＨＥＰＥＳ、グルコース、スクロース、リン脂質、コレステロール、アスコルビン酸、マグネシウム、ナトリウム、ビタミン、カリウム、およびカルシウム、細胞の馴化培地、ウシ胎仔血清、アルブミン、レシチン、スフィンゴミエリン、リポタンパク質、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ポリアミン、エタノールアミン、フィブロネクチン、転移、ラミニン、コレラ毒素、ヒドロコルチゾンおよび他のステロイド、プロスタグランジン、インスリン、ＥＧＦ、ＦＧＦ２および他の増殖因子、デキサメタゾン、ベータ−メルカプトエタノールおよび他の還元剤、およびセレンであってよい。さらに、商業的な培地の供給者、例えば、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＪＲＨ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｉｇｍａ、ＰＡＡおよびＩｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどからの予め配合された培地を用いることができる。
【０２１９】
デバイス包被の厚さは、デバイスの存在に対する患者による免疫応答を妨げるために十分であるべきである。この目的のために、デバイスの最小の厚さは１μｍ以上であり、細胞を含まないことが好ましい。
【０２２０】
さらに、強化性の構造エレメントもデバイスに組み入れることができる。例えば、これらの構造エレメントは、不浸透性であり、デバイスをレシピエントの眼組織につなぐ、または縫合するように適切に構成されるように作製することができる。ある特定の状況では、これらのエレメントは、包被を安全に密閉し（例えば、円柱の端において）、それにより、コア材料の隔離を完全にする（例えば、成形熱可塑性クリップ）ように作用し得る。多くの実施形態では、これらの構造エレメントが選択透過性の包被のかなりの面積を塞がないことが望ましい。
【０２２１】
本発明のデバイスは、埋め込み後に完全に回収するために十分なサイズおよび耐久性のものである。本発明の１つの好ましいデバイスは、体積がおよそ１〜３μＬのコアを有する。微粒子化デバイスの内部の幾何学的形状の体積はおよそ０．０５〜０．１μＬである。
【０２２２】
本明細書に記載の抗血管新生抗体足場および／または可溶性ＶＥＧＦ受容体と一緒に、少なくとも１つの追加的なＢＡＭも、デバイスから眼に送達することができる。例えば、少なくとも１つの追加的なＢＡＭを、細胞性供給源または非細胞性供給源からもたらすことができる。非細胞性供給源から少なくとも１つの追加的なＢＡＭがもたらされる場合、追加的なＢＡＭ（複数可）を、これらに限定されないが、（ａ）密閉材；（ｂ）足場；（ｃ）包被膜；（ｄ）つなぎアンカー；および／または（ｅ）コア培地を含めた細胞系の１またはそれより多くの成分にカプセル封入すること、その中に分散させること、またはそれに付着させることができる。そのような実施形態では、非細胞性供給源からのＢＡＭの共送達は、細胞性供給源からのＢＡＭと同じデバイスから起こってよい。
【０２２３】
あるいは、２つ以上のカプセル封入細胞系を使用することができる。例えば、少なくとも１つの追加的な生物活性分子は、核酸、核酸断片、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、有機分子、無機分子、治療剤、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。詳細には、治療剤は、抗血管新生性薬、ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、抗有糸分裂薬、抗腫瘍薬、駆虫薬、ＩＯＰ低下剤、ペプチド薬、および／または商業用途について認可された任意の他の生物活性分子薬物であってよい。
【０２２４】
適切な賦形剤としては、これらに限定されないが、任意の非分解性ポリマーまたは生分解性ポリマー、ヒドロゲル、溶解性エンハンサー、疎水性分子、タンパク質、塩、または製剤として認可された他の複合剤が挙げられる。
【０２２５】
非細胞性投与量は、当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、治療剤の濃度および／もしくは眼当たりのデバイスの数を変動させること、ならびに／またはカプセル封入賦形剤の組成を改変することによって変動させることができる。細胞性投与量は、（１）デバイス当たりの細胞の数、（２）眼当たりのデバイスの数、および／または（３）細胞当たりのＢＡＭ産生のレベルを変化させることによって変動させることができる。細胞による産生は、例えば、形質導入された細胞におけるＢＡＭの遺伝子のコピー数、またはＢＡＭの発現を駆動するプロモーターの効率を変化させることによって変動させることができる。細胞性供給源からの適切な投与量は、１日当たり約１ｐｇ〜約１０００ｍｇにわたってよい。
【０２２６】
本発明は、本明細書に記載のマクロカプセルデバイスを作製するための方法にも関する。デバイスは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によっても形成することができる。（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３６１，７７１号；同第５，６３９，２７５号；同第５，６５３，９７５号；同第４，８９２，５３８号；同第５，１５６，８４４号；同第５，２８３，１３８号；および同第５，５５０，０５０号を参照されたい）。
【０２２７】
使用する膜は、抗血管新生抗体足場または可溶性ＶＥＧＦ受容体などの分子の拡散を、それらの分子量に基づいて制御するために合わせて調整することもできる（Ｌｙｓａｇｈｔら、５６巻  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９６頁（１９９６年）、Ｃｏｌｔｏｎ、１４巻  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５８頁（１９９６年）を参照されたい）。カプセル封入技法を用いて、細胞を宿主に、免疫抑制薬を使用して、または使用せずに、免疫拒絶反応を伴わずに移植することができる。カプセルは、宿主に埋め込んだ後に、カプセルの拒絶反応がもたらされる、またはカプセルが、例えば分解によって作動不能になるのに十分な有害な宿主応答を引き出さない生体適合性材料から作製することができる。生体適合性材料は、宿主の免疫系の成分などの大きな分子に対しては比較的不浸透性であるが、インスリン、増殖因子、および栄養分などの小分子に対しては浸透性であり、同時に、代謝廃棄物は除去される。種々の生体適合性材料が、本発明の組成物によって増殖因子を送達するために適している。種々の外面形態および他の機械的特性および構造特性を有する多数の生体適合性材料が公知である。
【０２２８】
熱可塑性またはポリマーの膜の包被を有するデバイスが望まれる場合、細孔のサイズの範囲および分布は、米国特許第３，６１５，０２４号により教示されている通り、前駆体材料の溶液（キャスティング溶液）の固体含有量、水混和性溶媒の化学組成を変動させることによって、または場合によって、親水性または疎水性の添加物をキャスティング溶液に含めることによって決定することができる。細孔サイズは、凝固薬および／または槽の疎水性を変動させることによっても調整することができる。
【０２２９】
一般には、キャスティング溶液は、溶解させた水不溶性のポリマーまたは共重合体を含有する極性有機溶媒を含む。このポリマーまたは共重合体の沈殿物は、溶媒混和性の水相と接触すると、インターフェースの部位で選択透過性膜を形成する。膜内の細孔のサイズは、水相が溶媒相に拡散する速度に左右され、親水性または疎水性の添加物は、この拡散の速度を変更することによって細孔サイズに影響を及ぼす。水相が溶媒中をより遠くへ拡散するにつれ、残りのポリマーまたは共重合体が沈殿して小柱状の支持体が形成され、これにより、完成したデバイスに機械的強度が付与される。
【０２３０】
デバイスの外面は、溶解したポリマーまたは共重合体を沈殿させる条件（すなわち、有孔の小柱状または海綿様の外皮を生成する空気への曝露、平滑な選択透過性膜二重層をもたらす水を含む沈殿槽への浸漬、または中間の構造をもたらす水蒸気を含んだ空気への曝露）によって同様に決定される。
【０２３１】
デバイスの表面テクスチャーは、一部において、押出しノズルが槽の上に位置するか、または槽中に浸漬しているかに左右され、ノズルが槽の表面の上に位置する場合には粗い外皮が形成され、ノズルが槽に浸漬している場合には平滑な外面が形成される。
【０２３２】
周囲または周辺のマトリックスまたは膜は、コアを形成する材料を充填し（例えば、シリンジを使用して）、その後、コア材料が完全にカプセル封入されるように密閉することによって前もって形成することができる。次いで、マトリックス前駆体材料がコアに存在する場合は、デバイスを、コアマトリックスの形成をもたらす条件に曝露させる。
【０２３３】
本発明のデバイスにより、完全に分化した細胞または組織、足場依存性の細胞または組織、胎児もしくは新生児の細胞または組織、または形質転換された、足場非依存性の細胞または組織を含めた多様な細胞型または組織型の埋め込みをもたらすことができる。隔離される細胞は、ドナー（すなわち、成人の細胞または組織、新生児の細胞または組織、および胎児の細胞または組織を含めた初代細胞または組織）から、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製する細胞（すなわち、遺伝子改変された細胞を含めた不死化細胞または細胞株）から調製する。全ての場合において、必要な産物を有効なレベルで産生させるため、または必要な代謝機能を有効なレベルで供給するために十分な数量の細胞を、一般に滅菌条件下で調製し、隔離する前に適切に維持する（例えば、ハンクス塩などの平衡塩類溶液中で、またはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２などの栄養培地中で）。
【０２３４】
本発明のＥＣＴデバイスは、患者由来の栄養分が細胞内に容易に到達すること、または代謝機能をもたらすように細胞が作用する患者のタンパク質が細胞に進入することを可能にするために、デバイスの中心部と包被の最も近い部分の距離を縮小しやすい形状である。その点で、非球状の形状、例えば、円柱などが好ましい。
【０２３５】
本発明のデバイスのコアの内部に置かれる細胞の数または組織の量（すなわち、ローディング密度）に影響を及ぼす４つの重要な因子は：（１）デバイスのサイズおよび幾何学的形状；（２）デバイス内部での有糸分裂活性；（３）コアの調製および／またはローディングのための粘性の必要性；および（４）埋め込み前のアッセイおよび定性化の必要性である。
【０２３６】
第１のこれらの因子に関して（デバイスのサイズおよび幾何学的形状）、重要な栄養分および代謝性要求の細胞内への拡散ならびに代謝産物の細胞からの拡散は、細胞の生存能力の継続に欠かせない。ＡＲＰＥ−１９細胞などのＲＰＥ細胞の場合では、隣接する細胞は瀕死の細胞を食菌し、壊死組織片をエネルギー供給源として使用することができる。
【０２３７】
代謝性要求の中で、デバイス内への物質の拡散と適合するのは酸素の要求である。特異的な細胞の酸素要求を、選択された細胞について決定しなければならない。Ｗｉｌｓｏｎ  Ｄ．  Ｆ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻、２７１２〜２７１８頁、（１９８８年）において示されている酸素代謝の決定についての方法および参考文献を参照されたい。
【０２３８】
第２の因子（細胞分裂）に関して、選択された細胞が、デバイス内にある間活発に分裂することが予測される場合、その細胞は、利用可能な空間を満たすまで、または接触阻止などの現象によりさらなる分裂が制限されるまで分裂し続ける。複製性細胞については、デバイスコアが完全に満たされることが、拡散が制限されることに起因した重要な栄養分の欠乏につながらないように、デバイスの幾何学的形状およびサイズを選択する。
【０２３９】
第３の因子（コア材料の粘性）に関して、デバイス容積の最大７０％を占有する密度の細胞が生存可能であるが、この濃度範囲の細胞溶液はかなりの粘性を有する。非常に粘性の溶液中の細胞をデバイスに導入することは極めて難しい。一般に、二段階押出し戦略および同時押出し戦略のどちらについても、細胞のローディング密度が３０％を超えるとほとんど有用ではなく、一般に、最適なローディング密度は２０％以下である。例えば、組織の断片については、内部細胞の生存能力を保存するために、上記と同じ一般的なガイドラインに従うことが重要であり、組織断片は、直径２５０ミクロンを超えるべきではなく、それらと、最も近い拡散表面の間に１５個未満、好ましくは１０個未満の細胞を有する内部細胞を伴う。
【０２４０】
最後に、第４の因子（埋め込み前アッセイの必要性）に関して、多くの場合、デバイスの調製と埋め込みの間に一定の時間が必要になる。例えば、デバイスをその生物活性の点で定性化することが重要であり得る。したがって、有糸分裂が活発な細胞の場合では、好ましいローディング密度は、定性化アッセイを実施するために存在しなければならない細胞の数も考慮する。
【０２４１】
ほとんどの場合、ｉｎ  ｖｉｖｏに埋め込む前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、デバイスの内部のＢＡＭ（例えば、抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体）の有効性を確立することが重要になる。デバイスは、細胞当たりまたは単位容積に基づいてビヒクルの有効性を決定することを可能にするために分析されたモデル系を使用して構築することができる。
【０２４２】
デバイスのローディングおよびデバイスの有効性の決定についてこれらのガイドラインに従って、次に、埋め込むための実際のデバイスサイズを、特定の適用のために必要な生物活性の量によって決定する。デバイスの数およびデバイスサイズは、埋め込んだ際に治療効果をもたらすために十分であるべきであり、特定の適用のために必要な生物活性の量によって決定される。治療用物質を放出する分泌性細胞の場合では、当技術分野で公知の標準の投与量の考察および基準を使用して、必要な分泌物質の量を決定する。考慮される因子としては、レシピエントのサイズおよび体重；細胞の生産性または機能レベル；および、適切な場合には、機能が交換または増強された臓器または組織の正常な生産性または代謝活性が挙げられる。細胞の一部分が免疫隔離および埋め込み手順で生き残らない可能性があることを考慮することも重要である。さらに、レシピエントが埋め込みの有効性に干渉する可能性がある既存の状態を有するかどうかも考慮しなければならない。何千もの細胞を含有する本発明のデバイスは容易に製造することができる。例えば、現行の眼科用臨床デバイスは、２００，０００〜７５０，０００個の細胞を含有するが、微粒子化デバイスは、１０，０００〜１００，０００個の細胞を含有する。他の大規模デバイスは、１，０００，０００〜１００，０００，０００個の細胞を含有し得る。
【０２４３】
カプセル封入細胞療法は、細胞を、宿主に埋め込む前に半透性の生体適合性材料を有する周囲の細胞によってレシピエント宿主の免疫系から隔離するという概念に基づく。例えば、本発明は、遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞が免疫隔離性カプセル内にカプセル封入されており、レシピエント宿主に埋め込まれると、デバイスのコア内のＡＲＰＥ−１９細胞に対する宿主の免疫系の有害作用を最小限にするデバイスを包含する。ＡＲＰＥ−１９細胞は、それを微細孔性膜によって形成された埋め込み型のポリマーカプセル内にカプセル封入することによって宿主から免疫隔離する。この手法により、宿主と埋め込まれた組織の間の細胞間の接触が防がれ、それにより、直接提示による抗原認識が排除される。
【０２４４】
本明細書に記載の抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体はいずれも（単独でまたは任意の組み合わせで）、眼内に（例えば、前眼房および硝子体腔内に）、眼周囲に（例えば、テノン嚢の内部または下に）、またはその両方に送達することができる。本発明のデバイスは、眼への影響を有する種々の眼科障害、眼科疾患、および／または他の疾患を治療するために抗血管新生抗体足場または受容体の制御放出および持続的放出をもたらすためにも用いることができる。
【０２４５】
本明細書に記載の抗血管新生抗体足場または可溶性ＶＥＧＦ受容体のいずれかなどの抗血管新生因子を、眼内（好ましくは硝子体内）または眼周囲（好ましくはテノン嚢下空間または領域）に、１日当たり患者当たり眼当たり０．１ｐｇ〜１０００μｇ（例えば、０．１ｐｇ〜５００μｇ；０．１ｐｇ〜２５０μｇ；０．１ｐｇ〜１００μｇ；０．１ｐｇ〜５０μｇ；０．１ｐｇ〜２５μｇ；０．１ｐｇ〜１０μｇ；０．１ｐｇ〜５μｇ；０．１ｐｇ〜１００ｎｇ；０．１ｐｇ〜５０ｎｇ；０．１ｐｇ〜２５ｎｇ；０．１ｐｇ〜１０ｎｇ；または０．１ｐｇ〜５ｎｇ）の投与量範囲で送達することが意図されている。非限定的な一例では、治療量は、眼において定常状態で少なくとも０．５〜５０μｇ／ｍｌである。適切な治療量は、例えば、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２９μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２μｇ、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、６０μｇ、６１μｇ、６２μｇ、６３μｇ、６４μｇ、６５μｇ、６６μｇ、６７μｇ、６８μｇ、６９μｇ、７０μｇ、７１μｇ、７２μｇ、７３μｇ、７４μｇ、７５μｇ、７６μｇ、７７μｇ、７８μｇ、７９μｇ、８０μｇ、８１μｇ、８２μｇ、８３μｇ、８４μｇ、８５μｇ、８６μｇ、８７μｇ、８８μｇ、８９μｇ、９０μｇ、９１μｇ、９２μｇ、９３μｇ、９４μｇ、９５μｇ、９６μｇ、９７μｇ、９８μｇ、９９μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇを含んでよい。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３ヶ月間にわたって発現することができる。
【０２４６】
本発明の種々の実施形態によって治療することができる眼科障害としては、これらに限定されないが、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑浮腫、増殖性網膜症、網膜の血管疾患、血管異常、加齢黄斑変性症および他の後天性障害、眼内炎、感染症、炎症性非感染症、ＡＩＤＳ関連障害、眼虚血症候群、妊娠に関連する障害、末梢性網膜変性症、網膜変性症、毒性網膜症、網膜腫瘍、脈絡膜腫瘍、脈絡膜障害、硝子体障害、網膜剥離および増殖性硝子体網膜症、非穿通性外傷、穿通性外傷、白内障手術後合併症、および炎症性の視神経症が挙げられる。
【０２４７】
加齢黄斑変性症としては、これらに限定されないが、滲出型（ｗｅｔ）加齢黄斑変性症、萎縮型（ｄｒｙ）加齢黄斑変性症、滲出型（ｅｘｕｄａｔｉｖｅ）加齢黄斑変性症、および近視性変性が挙げられることが当業者には理解されよう。
【０２４８】
いくつかの好ましい実施形態では、治療される障害は、滲出型（ｗｅｔ  ｆｏｒｍ）加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症である。本発明は、眼の新血管形成、多くの眼の疾患および障害に付随する状態を治療するためにも有用であり得る。例えば、網膜虚血に付随する眼の新血管形成は、糖尿病および多くの他の疾患における失明の主要な原因である。
【０２４９】
本発明の細胞株およびデバイスは、眼の症状および眼以外の症状の両方を有する疾患または状態によって生じる眼の症状を治療するためにも用いることができる。一部の例として、ＡＩＤＳならびに他の状態および硝子体障害におけるサイトメガロウイルス網膜炎；妊娠の結果としての網膜における高血圧性の変化；および種々の感染症、例えば、結核、梅毒、ライム病、寄生虫症、イヌ回虫、眼蛆病（ｏｐｈｔｈａｌｍｏｎｙｉａｓｉｓ）、嚢虫症（ｃｙｓｔ  ｃｅｒｃｏｓｉｓ）および真菌感染症などの眼への影響が挙げられる。
【０２５０】
デバイスおよび細胞株は、他の眼内の新血管形成に基づく疾患に関する状態を治療するためにも用いることができる。例えば、そのような新血管形成は、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、および、おそらく加齢黄斑変性症などの疾患において起こり得る。角膜の新血管形成は、それにより、視覚が妨げられ、患者に角膜の移植片不全の素因を与えるので、主要な問題である。大多数の重篤な視力喪失は、眼の新血管形成を招く障害に関連づけられる。
【０２５１】
本発明は、眼の環境内またはその外の体内の所望の標的位置における細胞増殖性障害、例えば、血液障害、アテローム性動脈硬化症、炎症、血管透過性の亢進、および悪性腫瘍などを治療するための、抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体の方法および送達にも関する。
【０２５２】
本明細書に記載のデバイスおよび技法の使用により、他の送達経路を超えるいくつかの有利な点がもたらされる：抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体またはＰＤＧＦ受容体は、眼に直接送達することができ、これにより、望ましくない末梢性の副作用が減少するまたは最小限になり、また、局部的適用と比較して非常に低用量の抗血管新生抗体足場または受容体（すなわち、ミリグラムではなく、ナノグラムまたは低マイクログラムの分量）を送達することができ、これによっても、潜在的に副作用が緩和される。さらに、生存細胞は新しく合成された抗血管新生抗体足場および受容体を連続的に産生するので、これらの技法は、注射間で用量が著しく上下する抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体の注射による送達よりも優れているはずであり、また、抗血管新生抗体足場または受容体は連続的に分解されるが、連続的に補給はされない。
【０２５３】
本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性ＶＥＧＦ受容体を分泌するように遺伝子操作された生細胞および細胞株は、本発明のデバイスにカプセル封入し、眼の任意の適切な解剖学的構造に外科的に挿入（眼球後の麻酔下で）することができる。例えば、デバイスは、眼の硝子体に外科的に挿入することができ、そこで、デバイスは、除去を補助するために強膜とつながれていることが好ましい。デバイスは、所望の予防法または療法を実現するために必要な限りは硝子体に残すことができる。例えば、所望の療法は、ニューロンもしくは光受容体の生存もしくは修復を促進すること、または網膜もしくは脈絡膜の血管新生を阻害すること、および／もしくは逆転させること、ならびにぶどう膜の炎症、網膜の炎症および視神経の炎症を阻害することを含んでよい。硝子体に設置すると、抗血管新生抗体足場またはＶＥＧＦ受容体を、網膜または網膜色素上皮（ＲＰＥ）に送達することができる。
【０２５４】
他の実施形態では、細胞をローディングしたデバイスを、硝子体に埋め込むよりも浸潤性の低い、眼周囲、テノン嚢として公知の空間の内部またはその下に埋め込む。したがって、硝子体出血および／または網膜剥離などの合併症は潜在的に排除される。この投与経路により、本明細書に記載の抗血管新生抗体足場または可溶性のＶＥＧＦ受容体もしくはＰＤＧＦ受容体をＲＰＥまたは網膜に送達することも可能になる。脈絡膜血管新生ならびに視神経およびぶどう膜の炎症を治療するためには、眼周囲の埋め込みが特に好ましい。一般に、眼周囲の埋め込み部位から送達することにより、抗血管新生抗体足場または可溶性ＶＥＧＦ受容体が脈絡膜の脈管構造、網膜の脈管構造、および視神経を循環することが可能になる。
【０２５５】
抗血管新生因子、例えば、本発明の抗血管新生抗体足場または可溶性ＶＥＧＦ受容体などを、本明細書に記載のデバイスおよび方法を用いて脈絡膜の脈管構造に（眼周囲に）、または硝子体に（眼内に）直接送達することにより、先行技術の治療方法およびデバイスに付随する問題を軽減または緩和することができ、また、十分に定義されていないまたは肉眼で見えない脈絡膜血管新生を治療することが可能になり、さらに、補助的療法または維持療法による脈絡膜血管新生の再発を低下または予防する手段がもたらされる。
【０２５６】
本発明の生体適合性デバイスの埋め込みは、滅菌条件下で実施する。デバイスは、シリンジまたは当業者に公知の任意の他の方法を用いて埋め込むことができる。一般に、デバイスは、レシピエントへの分泌物または機能の適切な送達、および埋め込まれた細胞または組織への栄養分の適切な送達を可能にし、デバイスを回収および／または交換するために接近することも可能にするレシピエントの体内の部位に埋め込む。いくつもの異なる埋め込み部位が意図されている。これらとしては、例えば、房水、硝子体液、テノン嚢下、眼周囲腔、および前眼房が挙げられる。免疫学的特権のない埋め込み部位、例えば、眼周囲の部位、ならびに前眼房（房水）および後眼房（硝子体）の外側の他の領域などに対しては、カプセルは免疫隔離性であることが好ましい。
【０２５７】
デバイスの内部に固定化された細胞が、埋め込みの前後どちらにおいても適正に機能することを検証することが好ましい。当技術分野で周知の任意のアッセイまたは診断検査をこれらの目的のために用いることができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、クロマトグラフィーによるアッセイまたは酵素的アッセイ、または分泌物に特異的なバイオアッセイを用いることができる。所望であれば、埋め込み物の分泌機能を、適切な試料（例えば、血清）をレシピエントから採取し、それをアッセイすることによって経時的にモニターすることができる。
【０２５８】
先行技術のデバイスおよび外科的技法の多くは、その使用により、多数の網膜剥離を招く。本発明のデバイスおよび方法はいくつかの他の療法と比較して浸潤性が低いので、この合併症の出現は減少する。
【０２５９】
本明細書に記載の抗血管新生抗体足場およびＶＥＧＦ受容体の、修飾された、切断されたおよび／または突然変異したタンパク質の形態も、本発明に従って使用することができる。さらに、これらの抗血管新生抗体足場または受容体の活性断片（すなわち、治療効果を実現するために十分な生物活性を有する断片）の使用も意図されている。１またはそれより多くのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の反復ポリマー部分ならびにこれらのタンパク質およびそのポリシストロニック型の組み合わせを付着させることによって修飾された抗血管新生抗体足場または受容体分子も意図されている。
【０２６０】
本明細書に記載の方法に従って多くの状態を治療するには、適切な治療用量を供給するために、眼当たりただ１つ、または最大で５０個未満の埋め込まれたデバイスが必要である。治療的な投与量は、１日当たり患者当たり眼当たり約０．１ｐｇ〜１０００μｇ（例えば、１日当たり患者当たり眼当たり０．１ｐｇ〜５００μｇ；０．１ｐｇ〜２５０μｇ、０．１ｐｇ〜１００μｇ；０．１ｐｇ〜５０μｇ；０．１ｐｇ〜２５μｇ；０．１ｐｇ〜１０μｇ；０．１ｐｇ〜５μｇ；０．１ｐｇ〜１００ｎｇ；０．１ｐｇ〜５０ｎｇ；０．１ｐｇ〜２５ｎｇ；０．１ｐｇ〜１０ｎｇ；または０．１ｐｇ〜５ｎｇ）であり得る。非限定的な一例では、治療量は、眼において定常状態で少なくとも０．５〜５０μｇ／ｍｌである。適切な治療量は、例えば、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、２１μｇ、２２μｇ、２３μｇ、２４μｇ、２５μｇ、２６μｇ、２７μｇ、２８μｇ、２９μｇ、３０μｇ、３１μｇ、３２μｇ、３３μｇ、３４μｇ、３５μｇ、３６μｇ、３７μｇ、３８μｇ、３９μｇ、４０μｇ、４１μｇ、４２μｇ、４３μｇ、４４μｇ、４５μｇ、４６μｇ、４７μｇ、４８μｇ、４９μｇ、５０μｇ、５１μｇ、５２μｇ、５３μｇ、５４μｇ、５５μｇ、５６μｇ、５７μｇ、５８μｇ、５９μｇ、６０μｇ、６１μｇ、６２μｇ、６３μｇ、６４μｇ、６５μｇ、６６μｇ、６７μｇ、６８μｇ、６９μｇ、７０μｇ、７１μｇ、７２μｇ、７３μｇ、７４μｇ、７５μｇ、７６μｇ、７７μｇ、７８μｇ、７９μｇ、８０μｇ、８１μｇ、８２μｇ、８３μｇ、８４μｇ、８５μｇ、８６μｇ、８７μｇ、８８μｇ、８９μｇ、９０μｇ、９１μｇ、９２μｇ、９３μｇ、９４μｇ、９５μｇ、９６μｇ、９７μｇ、９８μｇ、９９μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇを含んでよい。さらに、本発明の細胞株およびデバイスは、この治療量を少なくとも３ヶ月間にわたって発現することができる。
【０２６１】
本発明の眼科用デバイスのそれぞれは、個体内に約１，０００〜約７５０，０００個の細胞を貯蔵すること、または、それらの種類に応じてクラスター形成することができる。
【０２６２】
以下の実施例において本発明がさらに説明され、これにより特許請求の範囲に記載の本発明の範囲は限定されない。
【実施例】
【０２６３】
（実施例１）
細胞のサブクローニング
種々の抗血管新生抗体足場および可溶性ＶＥＧＦ受容体をＮＴＣ−２００細胞において発現させた。「ＮＴＣ−２００」および「ＡＲＰＥ−１９細胞」という用語は、本明細書で記載される場合、本発明の抗血管新生抗体足場および可溶性のＶＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体を発現するように遺伝子操作された好ましい細胞型を記載するために互換的に使用される。
【０２６４】
タンパク質の分泌を実現するために、構築物はネイティブなまたはＩｇＳＰマウス免疫グロブリンリーダー配列を含有し、後者は、ＮＴＣ−２００細胞からのＣＮＴＦの分泌を導くために以前に使用した。意図されているタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列および対応する核酸配列は、本明細書では以下の通り記載されている：
１）ｐ８３４
２）ｐ８３８
３）ｐ８７６
４）ｐ８７３
５）ｐ８７４
６）ｐ８７５
７）ｐ９１５
８）ｐ９１４
９）ｐ９１６
１０）ｐ９１３
１１）ｐ９１７
１２）ｐ９６４
１３）ｐ９６３
１４）ｐ９７４
１５）ｐ９７８
１６）ｐ９７７
可溶性ＶＥＧＦ受容体（例えば、ｐ８３４、ｐ８３８、およびｐ８７３）については、所望の産物に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対を使用したＰＣＲによって、ｓＶＥＧＦＲ１（ｈＦｌｔ）またはｓＶＥＧＦＲ２（ｈＫＤＲ）のｃＤＮＡ（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１１３４およびＡＦ０６３６５８）から遺伝子断片を増幅した。本明細書に記載の抗血管新生抗体足場（例えば、ｐ８７６、ｐ８７４、ｐ８７５、ｐ８９５、ｐ８９６、ｐ９１３およびｐ８９７）をベバシズマブおよびラニビズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの公知の抗ＶＥＧＦ化合物の配列の部分に基づいて設計した。増幅産物を適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、図１に概略図が示されているＮｅｕｒｏｔｅｃｈ哺乳動物発現ベクターｐＣｐＧｆｒｅｅ−ｖｉｔｒｏ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にライゲーションした。ｐＣｐＧｆｒｅｅ−ｖｉｔｒｏは、ＣｐＧジヌクレオチドを完全に欠くだけでなく、戦略的に位置付けられたＳ／ＭＡＲＳインスレーターが組み入れられ、したがってサイレンシングまたは遺伝子相互作用の可能性が低下した市販のベクターである。さらに、Ｓ／ＭＡＲＳ配列は、宿主ゲノム内の染色体の組み込みに役立ち得る。この設計により、挿入された遺伝子の発現が細胞機構によりサイレンシングされる（オフになる）可能性が低くなる。他の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ、ｐＫａｎ、ｐＣＩ−Ｎｅｏなど）と比較すると、ｐＣｐＧｆｒｅｅ−ｖｉｔｒｏは、安定な、高産生組換え細胞株を一貫して生成する。ｐＣｐＧｆｒｅｅ−ｖｉｔｒｏベクター系は、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、またはハイグロマイシン耐性遺伝子のいずれかの存在により区別される３つの形態の発現ベクターを含む。同一のｃＤＮＡ配列をネオマイシン耐性に基づく発現ベクター、ブラストサイジン耐性に基づく発現ベクターおよびハイグロマイシン耐性に基づく発現ベクターのそれぞれにサブクローニングすることによって、細胞株を、各反復に対して異なる選択マーカーを使用して繰り返しトランスフェクトすることができる。そのような方法により、一般にはＣＨＯ製造細胞株において見いだされるＤＨＦＲ株を生成することを必要とせずに遺伝子量（ｇｅｎｅ  ｄｏｓｅ）を増幅することが可能になる。
【０２６５】
形質転換された組換えクローンを、ブラストサイジンもしくはネオマイシン（Ｇ４１８）、またはハイグロマイシンを用いて選択し、精製されたミニプレッププラスミドＤＮＡを、制限消化およびアガロースゲル電気泳動分析によって分析した。適切な挿入断片を含有する推定上のプラスミドクローンを全て、自動ジデオキシ配列決定（ＧｅｎｅＷｉｚ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、その後のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ１０．０配列解析ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用したクロマトグラムの組み立てによって検証した。
【０２６６】
（実施例２）
細胞株構築
検証されたプラスミドクローンを使用して、ＮＴＣ−２００細胞をトランスフェクトして、安定なポリクローナル細胞株を得た。簡単に述べると、１８時間前に播いた細胞２００〜３００Ｋ個に、６．０μｌのＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を製造者の推奨に従って用いて、３．０μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションは１０％ＦＢＳ、内皮ＳＦＭを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２培地またはＯｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）３．０ｍｌ中で実施した。２４〜４８時間後、細胞に１．０μｇ／μｌのＧ４１８を含有する新鮮な培地を供給したか、または細胞を、Ｇ４１８を含有するＴ−２５組織培養フラスコに継代した。細胞株を、１４〜２１日間、正常な増殖が再開するまで選択下で継代し、その後、薬物を除去し、細胞を回復させた（約１週間）後に特徴付けた。
【０２６７】
これらのポリクローナル細胞株を分散させ、次いで、ディッシュに播種した。適切に増殖させた後、何百から何千もの個々のコロニーを顕微鏡によって見分け、選び取り、クローンとして拡大した。サブクローン上清を、組換え分子の産生についてＥＬＩＳＡによって分析し、細胞数の決定と組み合わせ、クローンの生産性の順位の作成を可能にした。安定性、生産性およびＥＣＴデバイス内でのｉｎ  ｖｉｖｏ生物物理学的特性および動物試験における生物学的生産量について望ましいクローン細胞株を選択した。
【０２６８】
これらの細胞株による組換えタンパク質の発現の安定性を、数週間にわたって、ヒトｓＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）またはポリクローナル抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。簡単に述べると、１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２中の１２ウェル組織培養物プレートに予め播いておいた細胞５０Ｋ個を、ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で２回洗浄し、次いで、１．０ｍｌの内皮ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を２時間パルスした。パルス培地を−２０℃で保管し、採取してから１週間以内に、製造者のプロトコールの通りアッセイした。
【０２６９】
以下の抗血管新生抗体足場および切断されたＶＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体によりコードされるタンパク質を分泌する安定な細胞株が首尾よく創出された：
１）ｐ８３４
２）ｐ８３８
３）ｐ８７６
４）ｐ８７３
５）ｐ８７４
６）ｐ８７５
７）ｐ９１５
８）ｐ９１４
９）ｐ９１６
１０）ｐ９１３
１１）ｐ９１７
１２）ｐ９６４
１３）ｐ９６３
１４）ｐ９７４
１５）ｐ９７８
１６）ｐ９７７
【０２７０】
（実施例３）
細胞株のスクリーニングおよびヒットの決定
抗血管新生分子を発現している組換えＮＴＣ−２００細胞株を記載の通り生成し、スクリーニング選択の一例が、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ分子である分子ｐ８３４についてここに示されている。クローンの上清に対して抗ＶＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡアッセイを適用し、細胞計数キット８法（ＣＣＫ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｉｎｃ．）を用いて分析したクローンの細胞数を数え上げた。本実施例では、クローンの順位付けにより、このスクリーニングＥＬＩＳＡにおいて１日当たり細胞百万個当たり１０，０００ｎｇ（１日当たり細胞当たり１０ピコグラム（ｐｃｄ））を超える生産性を有する少なくとも８つのクローンのヒットが示されている。図２に示されている散布図では、ｐ８３４サブクローンを、ＥＬＩＳＡ生産量対細胞数を用いてプロットし、有益なＥＣＴ規模拡大繁殖に有益な増殖性および分泌性を示し得るクローン株の可視化を可能にした。
【０２７１】
表１に示されている通り、９種の異なる抗体および受容体に基づくＦｃ分子の現行の細胞株による産生により、７〜２０ｐｃｄの範囲内の細胞株による生産量がもたらされる。これらのレベルは、常套的なＣＨＯ株による製造プロセスによって得られる生産量レベルと同等である。それぞれの場合において、ＥＣＴについて首位に順位付けされたクローンに加えて、各分子実体について少なくとも５種の独立したサブクローンを、バックアップ細胞株として選択した。細胞株に基づく抗体および受容体Ｆｃの高生産性の生成の成功により、ＮＴＣ−２００細胞株／ｐＣｐＧ発現系を生物学的治療薬分子、特に公知のＣＨＯにより製造された産物に代表されるものに広範に適用することができることが示されている。
【０２７２】
【表１】
2014506119.tif 000014
【０２７３】
（実施例４）
タンパク質の特徴付け
タンパク質の発現
ｐ８３４分子の構造は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインとインフレームで分子融合したキメラＶＥＧＦ−受容体１ドメイン２およびＶＥＧＦ−受容体２ドメイン３に基づく。細胞株馴化培地中のｐ８３４−１０−５タンパク質の予測二量体分子量は１００ｋＤａ（グリコシル化されていない）であり、非還元ウエスタンブロットにおける実測は約１３０ｋＤａ（グリコシル化されている）である。８３４−１０−５の予測単量体分子量は５０ｋＤａであり、還元ウエスタンブロットにおける実測分子量は約６０ｋＤａ（グリコシル化されている）である。８３４−１０−５細胞株馴化培地のプロテインＧアフィニティー精製では、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの下で単一のバンドが示され、これはウエスタンブロット分析において観察された結果と一致する。ハイパーフラスコ培養物１リットル当たり１５ｍｇの収量で、８３４−１０−５細胞株の高い生産性が実証された。（図３参照）。
【０２７４】
ＨＵＶＥＣバイオアッセイ
ＶＥＧＦ−Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激するその能力について公知である。したがって、ＶＥＧＦ−Ａ阻害を測定するための適切なバイオアッセイは、ＨＵＶＥＣ細胞の刺激器としての公知量のＶＥＧＦ−Ａに対する阻害性分子を滴定することである（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ｐ８３４−１０−５細胞株由来の馴化培地を回収し、段階的に希釈して、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ−Ａ刺激を阻害した。図４に示されている通り、このアッセイではｐ８３４−１０−５馴化培地がＥＣ５０＝約５０ｐＭ、１００％阻害＝約１００ｐＭを示すことが見いだされた。ｐ８３４−１０−５の阻害活性は、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の生物活性と同様であり、ｐ８３８−６ポリクローナル細胞株馴化培地の生物活性とも同様である。要約すると、これらの細胞株由来の組換えタンパク質は、対照タンパク質（ＶＲ１  Ｄ１−３−Ｆｃ）と同様に内皮細胞の増殖を効率的に阻害することができる。しかし、偽トランスフェクトした親の細胞（ＷＴ）由来の馴化培地ではＨＵＶＥＣの増殖は阻害されなかった。
【０２７５】
溶液結合アッセイ
トランスフェクトされた細胞株由来の馴化培地を用いたＶＥＧＦの溶液結合試験を実施した。簡単に述べると、滴定量の馴化培地を、ＶＥＧＦの存在下、室温で一晩インキュベートした。遊離のＶＥＧＦを、高感度ＥＩＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して測定し、非線形回帰分析を実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０２７６】
ｐ８３４−１０−５ＥＣＴ由来の組換え分子の結合活性を、ｐ８３４−１０−５ＥＣＴ硝子体および外植片の馴化培地試料の、市販のＶＥＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の応答性を阻害する能力またはそれに干渉する能力によって生物物理学的に検証した。図５に示されている通り、ｐ８３４−１０−５試料はＩＣ５０＝約１２ｐＭを示し、約１００ｐＭで＞９０％阻害が観察される。この阻害活性は、ｐ８３４−１０−５ＥＣＴデバイスを含有する免疫抑制されていないウサギ硝子体由来の精製タンパク質から（１ヶ月の時点または３ヶ月の時点で）、またはウサギの外植したｐ８３４−１０−５ＥＣＴデバイスから産生される分泌タンパク質から検出された。陰性対照として、偽トランスフェクトした親の細胞（ＷＴ）由来の馴化培地はＶＥＧＦと結合しなかったことが示された。
【０２７７】
（実施例５）
デバイスの特徴付けおよび埋め込みの結果
細胞株安定性試験
組換え細胞株の製造可能性についての１つの基準は、クローンの拡大による生産性の限界である。４０世代のクローン細胞の増殖および生産性の分析により、生産量の安定性が確認され、マスター細胞バンク（約１７継代まで）およびワーキング細胞バンク（約２３継代まで）の創出についての十分な情報が供給されることが算出された。１つのワーキング細胞バンクは、少なくとも１００，０００，０００個のデバイスを製造するために十分であると算出される。ｐ８３４−１０−５細胞株を段階的に継代することにより、組織培養物中で４０世代を超えて安定であり、アッセイの一連の時点にわたる平均生産量が１０．４ｐｃｄ（ピコグラム／細胞／日）であることが明らかになった。（図６参照）。
【０２７８】
デバイスによる生産量の時間経過の試験
研究細胞バンクの一定分量から拡大したｐ８３４−１０−５細胞株を拡大した後にデバイスに充填した。細胞を、ポリスルホン半透膜で構築された壁を有する６ｍｍのＥＣＴデバイスに注射し、細胞を付着させるためのポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）糸を充填することによってカプセル封入した。デバイスを、栄養培地を伴う密閉容器の一次包装内に個別に置き、３７℃で１０週間インキュベートした。インキュベーション保持の時間経過の間、ＥＣＴデバイスからの組換えタンパク質の生産量を、包装から取り出すことにより定期的に調査し、ｐ８３４−１０−５タンパク質分泌についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果は、最初のデバイスによる生産量はデバイス１日当たりｐ８３４−１０−５タンパク質４８０ｎｇであり、６週間後の、デバイス１日当たり約６０ｎｇのベースラインの生産量まで徐々に減少したことを示している。図７では、２つのデバイスの組織切片は、頑強な８３４−１０−５細胞の内部での増殖を示し、これは、１ヶ月のデバイス培養を通じた高い生存能力を実証している。
【０２７９】
ｐ８３８ＶＥＧＦＲ構築物およびｐ８３４ＶＥＧＦＲ構築物を分泌するように遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９細胞を含有するデバイスは、埋め込みの１ヶ月後および３ヶ月後に優れた安全性プロファイルを示した。さらに、これらのデバイス（「ＮＴ−５０３デバイス」）は、埋め込みの１ヶ月後および３ヶ月後にｉｎ  ｖｉｖｏで安定である。
【０２８０】
表２は、これらのＮＴ−５０３デバイスについてのＰＫデータを示す：
【０２８１】
【表２】
2014506119.tif 000015
【０２８２】
表３は、ＮＴ−５０３デバイスの貯蔵寿命の結果を示す：
【０２８３】
【表３】
2014506119.tif 000016
【０２８４】
上記の通り、ｐ８３４デバイスにより、ｐ８３８と比較して１３倍高いレベルのＶＥＧＦ受容体が送達された。それにもかかわらず、ＮＴ−５０３について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるデバイスによる生産量およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける性能（硝子体におけるレベルについて測定した）はどちらも安定に維持された。さらに、埋め込まれたＮＴ−５０３デバイスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの保持期間および対応するｉｎ  ｖｉｖｏにおける性能の評価により、４週間に至るまでの貯蔵寿命安定性が実証された。
【０２８５】
したがって、ｐ８３４デバイスを、ヒトにおける概念の上首尾の証拠を確実にするために持続的なヒト臨床試験に利用する。さらに、この臨床試験（現行のｐ８３８細胞株はポリクローナル細胞株である）の第２のコホートのための高産生ｐ８３８クローンを選択するために追加的な研究を行う。
【０２８６】
最後に、可能であれば、ＮＴ−５０３デバイスの貯蔵寿命を、４週間を越えて延長するための継続した試みを行う。しかし、現在は、当技術分野において使用される大多数の細胞療法製品の貯蔵寿命は１週間であるので、これは必要ではない。
【０２８７】
（実施例６）
動物試験
包装した４週間後に、デバイスを免疫抑制されていないＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギの眼に埋め込んだ。埋め込みの１ヶ月後および３ヶ月後のｐ８３４−１０−５による生産量を決定するために、動物の眼球を摘出し、抽出した硝子体からｐ８３４−１０−５の濃度を数量化し、外植デバイスの生産性と比較した。埋め込みの１ヶ月後に、外植デバイスからのｐ８３４−１０−５タンパク質は１００ｎｇ／ｍｌ／日を超え、定常状態の硝子体における濃度は２５０ｎｇ／ｍｌ超であった。埋め込みの３ヶ月後には、外植デバイスによる産生は２００ｎｇ／ｍｌ超で継続されたが、硝子体における濃度は、７００ｎｇ／ｍｌ超が検出された（表４参照）。１年後、ウサギ硝子体試料は、３５０ｎｇ／ｍｌのｐ８３４−１０−５タンパク質を含有し、これは、１２ヶ月の間、組換え受容体が継続して産生されていることを実証している。
【０２８８】
図８に示されている通り、埋め込みの３ヶ月後の外植デバイスの組織学的検査により、図７に示されている容器で保持したデバイス由来の試料において観察された細胞の形態と類似した頑強な細胞の増殖が明らかになった。眼科獣医が定期的に検査したところ、試験期間中、処置したウサギの眼において臨床的に有意な有害事象は観察されなかった。
【０２８９】
【表４】
2014506119.tif 000017
【０２９０】
（実施例７）
反復的な遺伝子投薬により、組換えタンパク質の産生が増加する
反復トランスフェクションを用いて、特にｐ８３４  ｃＤＮＡの遺伝子量（ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ）を増加させた。同一の８３４  ｃＤＮＡを有する３種の発現プラスミド：ｐ８３４  ｐＣｐＧ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｅｅ（ブラストサイジン耐性）、ｐ９１０  ｐＣｐＧ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｅｅ（ネオマイシン耐性）およびｐ９６９  ｐＣｐＧ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｅｅ（ハイグロマイシン耐性）を作出した。ｐ９１０をブラストサイジン耐性ｐ８３４−１０−５細胞株にトランスフェクトし、生じた二重の組み込み体クローンを、ネオマイシン選択を適用することによって回収し、ｐ８３４−１０−５のＰＣＤ生産量レベルを超えるサブクローンを単離した。図９に示されている通り、最初の１回（「１×」）のトランスフェクションにより、上述のｐ８３４−１０−５細胞株がもたらされ、裸の細胞の生産量レベル（Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ）は１５〜２０ＰＣＤであった。親の８３４−１０−５クローンからｐ９１０クローンをトランスフェクションし選択することにより、９１０（８３４−１０−５）−４−４７クローンがもたらされ、生産量レベルは３５〜４０ＰＣＤであった。ｐ９６９を９１０（８３４−１０−５）−４−４７サブクローンに反復トランスフェクションし選択することにより、多数のハイグロマイシン耐性ｐ９６９由来クローンがもたらされ、最初の分離株は５０ＰＣＤ〜＞１００ＰＣＤにわたるレベルの組換えタンパク質を分泌した。３つ全ての遺伝子組み込み事象からの発現の維持を、９６９個のクローン株をブラストサイジン培地、ハイグロマイシン培地、およびネオマイシン培地のそれぞれにおいて培養することによって確認した。組換えタンパク質とＶＥＧＦを結合させたプレートの直接結合、その後の抗ヒトＦｃを使用した検出に基づいたＥＬＩＳＡアッセイによって決定された通り、効力の最小の損失が実証された三重トランスフェクションクローンが存在していた。驚いたことに、３×トランスフェクションに基づいて遺伝子量（ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ）を単純に算術的付加した８倍に至るまでの組換えタンパク質の値が検出され、これは、段階的なトランスフェクション（例えば、反復トランスフェクションプロセスを用いた）による遺伝子量（ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ）の増加に、予想外の相乗的な生物学的選択が関与することを示唆している。
【０２９１】
（実施例８）
反復的にトランスフェクトされた細胞株の用量漸増の前臨床試験
実施例６の方法に従って、二重トランスフェクタント細胞株９１０（８３４−１０−５）−４−４７、および三重トランスフェクタント細胞株９６９（９１０（８３４−１０−５）−４−４７）−３３を用いて、ＥＣＴデバイスを生成し、その後、ウサギに埋め込んだ。埋め込みの１ヶ月後に、ウサギの眼球を摘出し、硝子体を抽出して８３４タンパク質のレベルを定量化した。同時に、デバイスを外科的に除去し、外植デバイスを細胞の増殖培地でさらに培養して、デバイスによる組換えタンパク質の生産性を確認した。表５に示されているように、９１０デバイスおよび９６９デバイスからの生産量により、８３４の１回トランスフェクトタンパク質で観察されたレベルの、それぞれほぼ５倍および１０倍の定常状態の硝子体８３４タンパク質のレベルがもたらされた（表５）。細胞株のＰＣＤ生産量データと一致して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察された８３４タンパク質の定常状態の濃度は、段階的にトランスフェクトした遺伝子量（ｇｅｎｅ  ｄｏｓｅ）の単純な相加効果により予測される濃度よりも高く（表６対表４）、これにより、反復トランスフェクション方法体系による相乗的な分泌増強の予想外の相乗的な生物学的選択が重ねて示唆されている。
【０２９２】
【表５】
2014506119.tif 000018
【０２９３】
【表６】
2014506119.tif 000019
【０２９４】
（実施例９）
８３４−１０−５細胞株に適用したｐ５４４（ＣＮＴＦ）のトランスフェクション
逐次的なＤＮＡトランスフェクションの一実施形態では、関連のない（すなわち、異なる）ｃＤＮＡをコードする発現ベクターを使用して、異なる機能を有する２つの異なるタンパク質を分泌する細胞株を生成することができる。網膜色素変性症患者および地図状萎縮患者の網膜において神経保護作用を有するサイトカインである毛様体神経栄養因子をコードするＣＮＴＦ発現ベクターｐ５４４を、８３４−１０−５細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を抗生物質に対して選択し、ＣＮＴＦおよび８３４タンパク質を産生する最高産生細胞株を、それぞれのＥＬＩＳＡアッセイに基づいて回収した。反復トランスフェクションを用いて、いくつものＣＮＴＦ／８３４陽性クローンを得、それが表６に記載されている。
【０２９５】
興味深いことに、これらの首位の産生クローンでは、親の８３４−１０−５クローンに基づいて、またはｐ５４４由来のＣＮＴＦ発現により、歴史的なＣＮＴＦ細胞株対照（約０．５ｐｃｄ）と比較して産生の損失は観察されず、これは、親の発現レベルと比較して産生忠実度の損失を伴わない、二重発現細胞株のカプセル封入による併用療法の潜在性を実証している。これらの結果は、ＥＣＴ療法が単一の分子実体の産生に限定されないこと、および多数の治療分子を分泌する細胞株を生成することができることを示している。この場合、ＣＮＴＦは萎縮型ＡＭＤに対する神経保護療法として機能し、ＶＥＧＦアンタゴニストは滲出型（ｗｅｔ）ＡＭＤに対する抗血管新生療法として機能する。
【０２９６】
ｐ５４４の核酸およびアミノ酸配列が以下に提供される：
【０２９７】
【化１２】
2014506119.tif 000020
【０２９８】
【表７】
2014506119.tif 000021
【０２９９】
（実施例１０）
可溶性ＰＤＧＦＲアンタゴニスト
二重分子コンビナトリアルＥＣＴ療法を、例えば、別々の抗血管新生因子を分泌する二重デバイス、または２つの異なる分子を分泌する組み合わせ細胞株により、血管新生にターゲティングすることができる。例えば、抗血管新生抗体足場および／またはＰＤＧＦＲ可溶性アンタゴニスト細胞株を、それぞれが可溶性受容体として、または可溶性融合タンパク質としてＰＤＧＦＲベータをコードするプラスミドｐ９６３、ｐ９６４、ｐ９７４、ｐ９７８、およびｐ９７７を使用して構築した。捕捉抗体が抗Ｆｃであり、検出抗体が抗ＰＤＧＦＲベータ抗体であるＰＤＧＦＲベータに特異的なＥＬＩＳＡを展開し（図１０）、これによりＮＴＣ−２００細胞を一過性にトランスフェクションすることにより、ｐ９６３  ＰＤＧＦＲ−ＩｇＧ１  Ｆｃ、およびｐ９６４  ＰＤＧＦＲ−ＩｇＧ４  Ｆｃの予測された構造に対応する免疫原性材料が産生されることが示されている。
【０３００】
（実施例１１）
ＰＤＧＦＲ−Ｆｃ産生細胞株
以前の実施例において言及されているＶＥＧＦアンタゴニスト産生細胞株を生成するための手法と同様の手法を用いて、ＰＤＧＦＲアンタゴニスト産生細胞株も生成した。表８に示されているように、ｐ９６３のクローン選択により、クローン９６３Ｇ２がもたらされ、産生速度は７．７ｐｃｄであった。反復トランスフェクションによる９６３Ｇ２のさらなる操作を用いて、ｐ９６３タンパク質の産生速度を上昇させることができる。
【０３０１】
【表８】
2014506119.tif 000022
【０３０２】
（実施例１２）
ＥＣＴにおける他の抗血管新生抗体足場、およびデバイスによる生産量に対する培地の影響
８３４−１０−５  ＶＥＧＦＲ−Ｆｃアンタゴニストに加えて、１回のトランスフェクションおよびクローンの選択から他の細胞株を得た。図１２の一例に示されているように、モノクローナル抗体（Ｍａｂ−ｐ８７４）、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ−ｐ９１５）、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ−ｐ９１８）およびＶＥＧＦＲ−Ｆｃ（受容体−Ｆｃ−ｐ８３４）を示す細胞株を生成し、これは８ｐｃｄ〜３５ｐｃｄ（Ｍａｂ）を産生した。ＥＣＴデバイス形式に置くと、広範囲の組換えタンパク質の生産量が観察され、これは、使用する細胞株に左右された。さらに、試験したＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ培地および内皮の血清を含まない培地（Ｅｎｄｏ−Ｇｉｂｃｏ）に基づいて、培地がタンパク質分泌において大きな役割を果たすことも注目に値した。
【０３０３】
８３４−１０−５受容体Ｆｃデバイスおよび９１３−９−４５Ｆａｂデバイスにおいて見られるように、デバイスによる生産量のわずかな差異を、ｅｎｄｏまたはＤＭＥＭ１０％ＦＢＳでの培養物に基づいて測定した。しかし、９１８−４−３５ＳｃＦｖデバイスおよび８７４−１−２３Ｍａｂデバイスは、Ｅｎｄｏにおける培養物に対して感度が高く、ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳで培養した際に、Ｍａｂについて最大デバイス当たり１日当たり３μｇの最高の生産量がもたらされた。
【０３０４】
これらの結果は、宿主に埋め込む前に細胞を最適化するために、適切な培地を用いてデバイスを前準備することが必要な場合があり、それにより、最大の産生速度および生存性が可能になることを示唆している。
【０３０５】
例えば、８７４−１−２３デバイスをＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で４週間馴化させた後にウサギの眼に埋め込んだ。埋め込みの１ヶ月後にウサギの眼球を摘出し、８７４Ｍａｂタンパク質の硝子体におけるレベルを、ＶＥＧＦ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡにより評価し、Ｆｃ−ＥＬＩＳＡによっても評価した。表９に見られるように、４００ｎｇ／ｍｌ〜最大１．７μｇ／ｍｌの８７４Ｍａｂタンパク質が、ＥＣＴデバイスに埋め込まれたウサギ硝子体において検出された。
【０３０６】
【表９】
2014506119.tif 000023
【０３０７】
さらに、８７４−１−２３ＥＣＴデバイスを、ＳＣＩＤマウスを用いて全身性環境におけるＭａｂ生産量について評価した。８７４は抗ＶＥＧＦ抗体であるが、ヒトＶＥＧＦに対するその特異性は報告されているが、げっ歯類ＶＥＧＦに対する特異性は報告されていない。したがって、この分子の抗ヒト血管新生機能は、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて有害な生理作用を有さないと推定された。各マウスについて、４つの８７４−１−２３ＥＣＴデバイスをＤＭＥＭ１０％ＦＢＳで培養した後に、ＳＣＩＤマウスの背中の皮下に埋め込み、合計６匹のマウスを試験した。１ヶ月後に、マウス血清を心臓穿刺によって抽出し、８７４タンパク質の血清濃度をＶＥＧＦ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０３０８】
【表１０】
2014506119.tif 000024
【０３０９】
したがって、表１０に見られるように、ＶＥＧＦ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡの直接結合によって測定したところ、８７４−１−２３ＥＣＴ埋め込み物は、定常状態で最大１９μｇ／ｍｌの８７４Ｍａｂを産生することができた。これらのＥＣＴデバイス切片を接着組織と一緒に組織学的検査することにより、埋め込みの極めて近傍において多数の新しく発生した血管化が見られた。ＥＣＴデバイス表面の血管化が実現され、これにより、拡散した組換えタンパク質の動物の循環系への取り込みおよび輸送が可能になった。
【０３１０】
等価物
本発明の１またはそれより多くの実施形態の詳細が上記の添付明細書に記載されている。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において引用されている特許および刊行物は全て、参照により組み込まれる。
【０３１１】
前述の説明は、単に例示するために提示されており、本発明を開示されている形態そのものに限定されるものではないが、添付されている特許請求の範囲により限定される。
【図１】
2014506119.tif 000025
【図２−１】
2014506119.tif 000026
【図２−２】
2014506119.tif 000027
【図４】
2014506119.tif 000028
【図５】
2014506119.tif 000029
【図６】
2014506119.tif 000030
【図７】
2014506119.tif 000031
【図８】
2014506119.tif 000032
【図９】
2014506119.tif 000033
【図１０】
2014506119.tif 000034
【図１１】
2014506119.tif 000035
【図１２】
2014506119.tif 000036
【図１３】
2014506119.tif 000037
【図１４】
2014506119.tif 000038
【図１５】
2014506119.tif 000039
【図１６】
2014506119.tif 000040
【図３】
2014506119.tif 000041
【図１７】
2014506119.tif 000042
【配列表】
2014506119000001.app
【国際調査報告】
2014506119.tif 000043
2014506119.tif 000044
2014506119.tif 000045