(57)【要約】ＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後修飾、例えばＳＵＭＯ化またはアセチル化のモジュレーターの治療有効量を投与することを含む、心臓血管疾患、詳細には心不全を処置する方法が提供される。また、ＳＥＲＣＡ２ａ分解を阻害することによって心臓血管疾患を処置する方法が提供される。さらに、ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体が存在するかを決定することまたはＳＵＭＯ１の心筋細胞での発現のレベルを決定することを含む、心不全を発症する傾向を診断する方法が提供される。本開示はまた、例えば翻訳後のＳＵＭＯ化および／またはアセチル化をモジュレートすることによって、ＳＥＲＣＡ２ａの翻訳後修飾をモジュレートする治療薬についてスクリーニングする方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において心機能不全を処置する方法であって、治療有効量のＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後修飾のモジュレーターを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記心機能不全は、心不全、圧負荷誘導型心機能不全およびカルシウム減衰の阻害によって誘導される心機能不全からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心不全は、収縮機能不全を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記心不全は、ＴＡＣ誘導型心不全である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モジュレーターは、ＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後ＳＵＭＯ化をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記モジュレーターは、ＳＥＲＣＡ２ａおよびＳＵＭＯ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする発現可能コード領域を含むベクターであり、前記コード領域は、少なくとも１つの発現制御エレメントに作動可能に連結している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モジュレーターは、ＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後アセチル化をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記モジュレーターは、Ｓｉｒｔ１デアセチラーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＥＲＣＡ２ａ分解を阻害することにより被験体における心臓血管障害を処置する方法であって、治療有効量のＳＵＭＯ１薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記ＳＵＭＯ１薬剤は、ＳＥＲＣＡ２ａおよびＳＵＭＯ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする発現可能コード領域を含むベクターであり、前記コード領域は、少なくとも１つの発現制御エレメントに作動可能に連結している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
心不全を発症する傾向を診断する方法であって、ヒトＳＥＲＣＡ２ａ（配列番号２）の４７９〜４８２位および／または５８４〜５８７位のいずれかからなる群より選択される位置に対応するアミノ酸を決定することを含む、方法。
【請求項１７】
心不全を発症する傾向を診断する方法であって、ヒトＳＥＲＣＡ２ａ（配列番号１）のアミノ酸４７９〜４８２または５８４〜５８７のいずれかに対応するアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を決定することを含む、方法。
【請求項１８】
心不全を発症する傾向を診断する方法であって、被験体の心筋細胞におけるＳＵＭＯ１の発現のレベルを決定すること、およびこのレベルを健康な対照の心筋細胞におけるＳＵＭＯ１の発現のレベルと比較することを含み、前記対照と比較したＳＵＭＯ１の発現の低減は、心不全を発症する傾向の指標となる、方法。
【請求項１９】
心不全を処置するための治療薬をスクリーニングする方法であって、ＳＵＭＯ１とＳＥＲＣＡ２ａとを候補治療薬の存在下および非存在下で接触させること、ならびにＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化のレベルが、前記候補治療薬の非存在下と比較して前記候補治療薬の存在下でより高い場合に、前記候補治療薬を治療薬として同定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／５０７，５２６号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、心臓病の予防および処置に関し、より具体的には、心臓病を予防および／もしくは処置するか、またはその症状を緩和するＳＥＲＣＡ２ａのモジュレーションに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＳＥＲＣＡ２ａは、興奮収縮連関の間の心筋細胞によるＣａ２＋再取り込みを担う、重要なＡＴＰアーゼである。ＳＥＲＣＡ２ａの下方制御は、不全心臓において見出される主要な異常の１つである。この観察と一致して、遺伝子移入によるＳＥＲＣＡ２ａの回復は、ヒトならびにモデル動物における心臓機能の正常化において有効であることが証明されている。
【０００４】
心不全（ＨＦ）は、多くの場合、アテローム性動脈硬化症、心筋症および高血圧を含む種々の心臓血管障害の最終結果である、病態生理学的状態を表す。ＨＦの発生率は、世界中で上がり続けている。ＨＦは、大部分が筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋循環異常に起因する収縮機能不全によって特徴付けられる（非特許文献１；非特許文献２）。正常なヒト心筋細胞において、ＳＥＲＣＡ２ａの活性は、心臓拡張期の間のＳＲへの細胞質Ｃａ２＋の７０％を超える移動に寄与する。ＳＥＲＣＡ２ａは、したがって、その次の拍動におけるＳＲ  Ｃａ２＋含有量を決定することによって、筋収縮動態学に影響を及ぼす（非特許文献３）。ＳＥＲＣＡ２ａの発現レベルの低下および活性の低減に起因するＳＲ  Ｃａ２＋取り込み不全は、不全ヒト心臓において報告されている（Ｍｅｙｅｒら、１９９５年；Ｍｉｎａｍｉｓａｗａら、１９９９年；Ｚａｒａｉｎ−Ｈｅｒｚｂｅｒｇら、１９９６年）。遺伝子移入によるＳＥＲＣＡ２ａレベルの回復は、ＨＦのげっ歯類モデル（ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅら、２００１年）およびブタモデル（Ｂｙｒｎｅら、２００８年；Ｋａｗａｓｅら、２００８年）において、収縮期および拡張期の機能不全を改善することが公知である。
【０００５】
翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、環境刺激に応答して酵素の活性、局在化、安定性または代謝回転速度に影響を及ぼすことにより、種々の細胞性タンパク質の機能をモジュレートする重要な方法である。ＳＥＲＣＡ２ａ活性は、ＰＴＭ、例えばグルタチオン化（Ａｄａｃｈｉら、２００４年；Ｄｒｅｍｉｎａら、２００７年；Ｌａｎｃｅｌら、２００９年）およびニトロ化（Ｋｎｙｕｓｈｋｏら、２００５年）によってモジュレートされ得ることが以前に示されている。ＳＥＲＣＡ２ａの等電点は、不全心臓において、正常な心臓と比較して、より酸性および塩基性の両方になることもまた、公知である。さらに、遺伝子移入によるＳＥＲＣＡ２ａレベルの回復はまた、不全心臓において変化したＳＥＲＣＡ２ａの等電点を部分的に回復した（図Ｓ１）。これらのデータは、ＨＦの発症に関連するＳＥＲＣＡ２ａの多数のＰＴＭが存在することを示した。
【０００６】
ユビキチンと１８％の配列相同性を有する低分子ユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）は、標的タンパク質のリシン残基にコンジュゲートし得る。このＰＴＭは、ＳＵＭＯ化と呼ばれる。ヒトにおいて、３つのＳＵＭＯアイソフォーム（ＳＵＭＯ１〜３）が、共通の基質および別個の基質の両方を修飾すると考えられる（Ｗｅｌｃｈｍａｎら、２００５年）。具体的には、ＳＵＭＯ１は、正常状態および病理学的状態において、転写調節、核輸送、ＤＮＡ修復、細胞周期、細胞膜脱分極およびシグナル伝達を含む種々の細胞内プロセスをモジュレートする際に重要な役割を果たすことが示されている（ＳａｒｇｅおよびＰａｒｋ−Ｓａｒｇｅ、２００９年）。心臓転写因子、例えばＧＡＴＡ４（Ｗａｎｇら、２００４年）およびＮｋｘ２．５（Ｗａｎｇら、２００８年）のＳＵＭＯ−媒介型調節は、心筋細胞の分化および心臓構造の発生に関連する。ＳＵＭＯ−媒介型修飾はまた、電位作動型カリウムチャネル（Ｂｅｎｓｏｎら、２００７年）を含む心臓イオンチャネル活性をも調節する。加えて、ＥＲＫ５のＳＵＭＯ化は、近年、糖尿病関連の心臓状態に関連付けられている（Ｓｈｉｓｈｉｄｏら、２００８年）。
【０００７】
過去数年にわたって、多くの研究が、ＳＵＭＯ化は、正常およびヒト病因（神経変性疾患、癌および家族性拡張型心筋症を含む）の両方における種々のタンパク質の活性を調節し得ることを示してきた（ＫｉｍおよびＢａｅｋ、２００６年；Ｓｔｅｆｆａｎら、２００４年；ＺｈａｎｇおよびＳａｒｇｅ、２００８年）。近年、糖尿病の心臓におけるＥＲＫ５のＳＵＭＯ化の重要な役割が報告されている（ＷｏｏおよびＡｂｅ、２０１０年）。
ＳＵＭＯ化は、標的タンパク質の生化学的特性、例えば酵素の活性および安定性に影響を及ぼし得る。根底にある分子機構は、大部分が未知であるが、３つの可能性が示唆されている。ＳＵＭＯの付着は、標的とその結合パートナー（ＤＮＡまたはタンパク質）との間の相互作用を、現存する結合部位のマスキングまたはＳＵＭＯ中に存在する界面の付加により、変化させ得る。あるいは、ＳＵＭＯ化は、酵素活性の上昇または低下のいずれかをさせ得る標的タンパク質の立体構造の変化を誘導し得る。最後に、ＳＵＭＯ化は、リシン残基における他のＰＴＭ、例えばユビキチン化およびアセチル化を遮断し得、このことは、標的タンパク質の機能的特性における変化をもたらす。
【０００８】
ＳＥＲＣＡ２ａは、酸化的ＰＴＭの標的であることが示されている。ＳＥＲＣＡ２ａのニトロ化の蓄積は、高コレステロール血症性大動脈および虚血性ヒト心臓において電気的刺激を受けている骨格筋において観察されている。チロシン２９４および２９５におけるニトロ化は、ＳＥＲＣＡ２ａのＣａ２＋ＡＴＰアーゼ活性の低減と相関していた。ＳＥＲＣＡ２ａの機能的に鍵となる膜領域内かつ負電荷を帯びた側鎖に近接したこれらのチロシンの位置は、効率的なニトロ化とカルシウム輸送の速度低下の機構との両方を確実にすると考えられる。加えて、ＳＥＲＣＡ２ａの酸化還元感受性のシステイン残基（システイン６７４）の酸化は、糖尿病のブタにおいて検出された（Ｙｉｎｇら、２００８年）。この酸化的修飾は、虚血性心臓（Ｆｒｅｎｃｈら、２００６年）および過酸化水素に曝露されたＨ９ｃ２細胞におけるＳＥＲＣＡの分解の加速（Ｉｈａｒａら、２００５年）に関連し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｗａｔｈｍｅｙ，Ｊ．Ｋ．、Ｃｏｐｅｌａｓ，Ｌ．、ＭａｃＫｉｎｎｏｎ，Ｒ．、Ｓｃｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．、Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｄ．、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｗ．およびＭｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｐ．  Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（１９８７）６１、７０〜７６
【非特許文献２】Ｇｗａｔｈｍｅｙ，Ｊ．Ｋ．およびＨａｊｊａｒ，Ｒ．Ｊ．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｆｏｒｃｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｗｉｔｃｈ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ（１９９０）１１、５３１〜５３８
【非特許文献３】ＭａｃＬｅｎｎａｎ，  Ｄ．Ｈ．およびＫｒａｎｉａｓ，Ｅ．Ｇ．  Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ：  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００３）４、５６６〜５７７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当技術分野において、ヒトおよび他の動物についての、心不全などの心臓血管疾患の処置の、安全かつ有効な治療法および方法に対する需要は、存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書中で開示される主題は、当技術分野における心臓血管疾患を処置する治療法および方法についての上述の需要の少なくとも１つを満たす。詳細には、本明細書で開示される実験は、ＳＥＲＣＡ２ａがＳＵＭＯ化されることを確立する。ＳＵＭＯ１レベルおよびＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化は、不全心臓において大きく低減した。ＳＵＭＯ１過剰発現は、ＳＥＲＣＡ２ａの酵素活性および安定性の増大を通して不全心臓における心機能障害を部分的に回復した。一方で、ＳＵＭＯ１下方制御は、心機能不全をもたらした。このデータは、ＰＴＭによるＳＥＲＣＡ２ａ機能の調節に対する新規な病識を提供し、そして、ＨＦについての新規な治療戦略の設計についての基礎を提供する。
【００１２】
開示の主題の種々の局面は、以下に列挙するパラグラフにおいて記載される。
【００１３】
１．治療有効量のＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後修飾のモジュレーターを被験体に投与することを含む、被験体において心機能不全を処置する方法。
【００１４】
２．心機能不全は、心不全、圧負荷誘導型心機能不全およびカルシウム減衰の阻害によって誘導される心機能不全からなる群より選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【００１５】
３．心不全は、収縮機能不全を含む、パラグラフ２に記載の方法。
【００１６】
４．心不全は、ＴＡＣ誘導型心不全である、パラグラフ２に記載の方法。
【００１７】
５．被験体はヒトである、パラグラフ１に記載の方法。
【００１８】
６．モジュレーターは、ＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後ＳＵＭＯ化をモジュレートする、パラグラフ１に記載の方法。
【００１９】
７．モジュレーターは、ＳＥＲＣＡ２ａおよびＳＵＭＯ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする発現可能コード領域を含むベクターであり、コード領域は、少なくとも１つの発現制御エレメントに作動可能に連結している、パラグラフ６に記載の方法。
【００２０】
８．ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスである、パラグラフ７に記載の方法。
【００２１】
９．組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ１である、パラグラフ８に記載の方法。
【００２２】
１０．モジュレーターは、ＳＥＲＣＡ２ａ翻訳後アセチル化をモジュレートする、パラグラフ１に記載の方法。
【００２３】
１１．モジュレーターは、Ｓｉｒｔ１デアセチラーゼである、パラグラフ１０に記載の方法。
【００２４】
１２．治療有効量のＳＵＭＯ１薬剤を投与することを含む、ＳＥＲＣＡ２ａ分解を阻害することにより被験体における心臓血管障害を処置する方法。
【００２５】
１３．ＳＵＭＯ１薬剤は、ＳＥＲＣＡ２ａおよびＳＵＭＯ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする発現可能コード領域を含むベクターであり、コード領域は、少なくとも１つの発現制御エレメントに作動可能に連結している、パラグラフ１２に記載の方法。
【００２６】
１４．ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスである、パラグラフ１３に記載の方法。
【００２７】
１５．組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ１である、パラグラフ１４に記載の方法。
【００２８】
１６．ヒトＳＥＲＣＡ２ａ（配列番号２）の４７９〜４８２位および／または５８４〜５８７位のいずれかからなる群より選択される位置に対応するアミノ酸を決定することを含む、心不全を発症する傾向を診断する方法。
【００２９】
１７．ヒトＳＥＲＣＡ２ａ（配列番号１）のアミノ酸４７９〜４８２または５８４〜５８７のいずれかに対応するアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を決定することを含む、心不全を発症する傾向を診断する方法。
【００３０】
１８．心不全を発症する傾向を診断する方法であって、被験体の心筋細胞におけるＳＵＭＯ１の発現のレベルを決定すること、およびこのレベルを健康な対照の心筋細胞におけるＳＵＭＯ１の発現のレベルと比較することを含み、対照と比較したＳＵＭＯ１の発現の低減は、心不全を発症する傾向の指標となる、方法。
【００３１】
１９．ＳＵＭＯ１とＳＥＲＣＡ２ａとを候補治療薬の存在下および非存在下で接触させること、ならびにＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化のレベルが、候補治療薬の非存在下と比較して存在下で大きい場合に、候補治療薬を治療薬として同定することを含む、心不全を処置するための治療薬についてスクリーニングする方法。
【００３２】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。しかし、この詳細な記載および具体的な実施例は、好ましい実施形態を示すが、本発明の精神および範囲内の種々の変化および改変が、詳細な記載から当業者に明らかになるので、説明のためにのみ提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＳＥＲＣＡ２ａ複合体を示す。（Ａ）ＳＥＲＣＡ２ａ複合体の２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ＳＥＲＣＡ２ａによって免疫沈降した１２ｋＤａのスポット（矢印）を示す。ＳＥＲＣＡ２ａの富化は、ウサギ抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体（抗Ｓ２ａ）によって免疫沈降したＳＥＲＣＡ２ａ複合体から得られるウェスタンブロッティングによって確認された。ウサギＩｇＧ（抗ＩｇＧ）複合体は、陰性対照として使用された。（Ｂ）タンデム質量分析によって同定されたＳＵＭＯ１についての代表的ペプチドフィンガープリント。適合するペプチドを有するＳＵＭＯ１のタンパク質配列は、太字で示される。（Ｃ）ｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１を発現するＨＥＫ２９３細胞におけるインビボＳＥＲＣＡ２ａ  ＳＵＭＯ化。沈降したｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１コンジュゲートは、抗ＳＥＲＣＡ２ａによって分析された。（Ｄ）ＳＥＲＣＡ２ａとＵｂｃ９との間の相互作用。ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付加したＵｂｃ９およびＳＥＲＣＡ２ａのための発現ベクターまたはｐｃＤＮＡベクター（陰性対照）によってトランスフェクトした。細胞溶解物を、抗ｍｙｃによる免疫沈降（ＩＰ）に供し、得られた沈降物を、抗ＳＥＲＣＡ２ａによるウェスタンブロッティングに供した。
【図２】図２は、内在性ＳＵＭＯ１タンパク質レベルが実験モデルおよびヒト心不全の両方において低下することを示す。（Ａ）ヒト心臓組織におけるＳＥＲＣＡ２ａ  ＳＵＭＯ化。タンパク質発現を示す代表的ブロットおよびその後の定量（各群につきｎ＝５）。Ｓ−ＳＥＲＣＡ２ａ：ＳＵＭＯ化ＳＥＲＣＡ２ａ。（Ｂ）心不全のＴＡＣ誘導マウスモデルにおけるＳＵＭＯ１およびＳＥＲＣＡ２ａのウェスタンブロッティングおよびその後の定量。ＴＡＣ誘導不全心臓（ＴＡＣ、ｎ＝５）；偽手術された対照心臓（偽、ｎ＝８）。（Ｃ）１つの代表的実験のウェスタンブロッティングおよびその後の定量。８匹のブタの心臓におけるＳＵＭＯ１およびＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質量を、分析した。ＭＲ誘導型不全ブタ心臓（ＭＲ、ｎ＝３）；偽手術された対照心臓（偽、ｎ＝５）。タンパク質バンド強度を、ＩｍａｇｅＪ  システムを用いた濃度測定によって評価した。ＧＡＰＤＨの内部標準を、等量のタンパク質ローディングについて規準化するために使用した。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。ＴＡＣ：大動脈縮窄術、ＭＲ：僧帽弁逆流症、ＮＦ：不全なしまたは正常な心臓。
【図３−１】図３は、ＳＵＭＯ１が、ＳＥＲＣＡ２ａのリシン４８０および５８５とコンジュゲートし、ＳＥＲＣＡ２ａ機能に必要であることを示す。（Ａ）ＳＥＲＣＡ２ａのＮドメイン。それぞれ配列番号２、４、６および８の３６０〜６０３位からのヒト、ブタ、ラットおよびマウスのＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質配列アラインメント。推定ＳＵＭＯ共通モチーフ（ψＫＸＥ、ここで、ψは、疎水性アミノ酸である）は、ＳＥＲＣＡ２ａのリシン４８０およびリシン５８５を含んだ。ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ修飾部位を、黒の外形線によって示す。ヒドロラーゼドメインを、点線で囲う。（Ｂ）ＳＥＲＣＡ２ａのインビボＳＵＭＯ化。ＨＥＫ２９３細胞を、ｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１およびｍｙｃタグ付加Ｕｂｃ９ならびにＷＴまたは突然変異体ＳＥＲＣＡ２ａを発現するプラスミドによって同時トランスフェクトした。ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化形態を、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出した。（Ｃ）ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化におけるＳＵＭＯ１発現の用量応答。ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付加Ｕｂｃ９およびＷＴまたはＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体によって同時トランスフェクトした。示した量のｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１または等量の対応する空ベクターを加えた。ウェスタンブロッティングは、ＳＥＲＣＡ２ａ  ＳＵＭＯ化に対するＳＵＭＯ１の用量効果を示す。（Ｄ）さらなるＳＵＭＯ１の存在下および非存在下におけるＷＴおよびＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体のＣａ２＋依存性ＡＴＰアーゼ活性。示したデータは、各二連で実施した３つの独立した実験から得られた。（Ｅ）ＷＴおよびＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰ結合能力。示したプラスミドによってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞溶解物を、ＡＴＰ−セファロースによって親和性沈降させ、その後、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体によるウェスタンブロッティングに供した。（Ｆ）また、ウェスタンブロッティングも、異なる時点で示した抗体により実施した。すなわち、一連の経時的ＨＥＫ２９３細胞溶解物を、ＡＴＰ−セファロースによって親和性精製し、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体によるウェスタンブロット分析に供した。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＷＴおよびＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体のタンパク質安定性に対するＳＵＭＯ１過剰発現の効果。定量データを、０日目（ｎ＝３）の相対比として表す。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。
【図３−２】図３は、ＳＵＭＯ１が、ＳＥＲＣＡ２ａのリシン４８０および５８５とコンジュゲートし、ＳＥＲＣＡ２ａ機能に必要であることを示す。（Ａ）ＳＥＲＣＡ２ａのＮドメイン。それぞれ配列番号２、４、６および８の３６０〜６０３位からのヒト、ブタ、ラットおよびマウスのＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質配列アラインメント。推定ＳＵＭＯ共通モチーフ（ψＫＸＥ、ここで、ψは、疎水性アミノ酸である）は、ＳＥＲＣＡ２ａのリシン４８０およびリシン５８５を含んだ。ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ修飾部位を、黒の外形線によって示す。ヒドロラーゼドメインを、点線で囲う。（Ｂ）ＳＥＲＣＡ２ａのインビボＳＵＭＯ化。ＨＥＫ２９３細胞を、ｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１およびｍｙｃタグ付加Ｕｂｃ９ならびにＷＴまたは突然変異体ＳＥＲＣＡ２ａを発現するプラスミドによって同時トランスフェクトした。ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化形態を、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出した。（Ｃ）ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化におけるＳＵＭＯ１発現の用量応答。ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付加Ｕｂｃ９およびＷＴまたはＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体によって同時トランスフェクトした。示した量のｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１または等量の対応する空ベクターを加えた。ウェスタンブロッティングは、ＳＥＲＣＡ２ａ  ＳＵＭＯ化に対するＳＵＭＯ１の用量効果を示す。（Ｄ）さらなるＳＵＭＯ１の存在下および非存在下におけるＷＴおよびＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体のＣａ２＋依存性ＡＴＰアーゼ活性。示したデータは、各二連で実施した３つの独立した実験から得られた。（Ｅ）ＷＴおよびＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰ結合能力。示したプラスミドによってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞溶解物を、ＡＴＰ−セファロースによって親和性沈降させ、その後、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体によるウェスタンブロッティングに供した。（Ｆ）また、ウェスタンブロッティングも、異なる時点で示した抗体により実施した。すなわち、一連の経時的ＨＥＫ２９３細胞溶解物を、ＡＴＰ−セファロースによって親和性精製し、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体によるウェスタンブロット分析に供した。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＷＴおよびＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ突然変異体のタンパク質安定性に対するＳＵＭＯ１過剰発現の効果。定量データを、０日目（ｎ＝３）の相対比として表す。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。
【図４】図４は、ＳＵＭＯ１過剰発現が、心筋細胞収縮性および正常心筋細胞および不全心筋細胞の両方においてカルシウム過渡状態を増大することを示す。心筋細胞修飾の平均パラメータを、決定した（偽収縮、ｎ＝６マウス／１４３細胞；ＨＦ収縮、ｎ＝８マウス／１８１細胞）、Ｃａ２＋過渡状態特性の平均パラメータを、決定した（偽カルシウム過渡状態、ｎ＝４マウス／６５細胞；ＨＦカルシウム過渡状態、ｎ＝６マウス／１３１細胞）。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。
【図５−１】図５は、ＳＵＭＯ１過剰発現がＴＡＣ誘導型心機能不全を回復することを示す。（Ａ）コンディショナルＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスの産生。心臓ＳＵＭＯ１は、α−ＭＨＣプロモーターの制御の下で発現する。（Ｂ）ウェスタンブロッティングは、トランスジェニックマウスにおける心臓ＳＵＭＯ１過剰発現を表す。ＷＴ：野生型同腹仔、ＴＧ：ＳＵＭＯ１トランスジェニックマウス。（Ｃ）ＴＡＣ手術３カ月後時点でのＷＴおよびＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスにおける代表的な心臓全体（上左）、ヘマトキシリンおよびエオシンの染色（下左）およびＭモード画像化（右）は、心臓の形態、左心室機能および寸法を示す。（Ｄ）拡張末期（ＬＶＩＤｄ）、収縮末期（ＬＶＩＤｓ）、短縮率（ＦＳ）および駆出率（ＥＦ）における内部径の心エコー測定。偽：ＷＴ、ｎ＝１２；ＴＧ、ｎ＝１０；ＴＡＣ：ＷＴ、ｎ＝１４；ＴＧ、ｎ＝１２。（Ｅ）ＴＡＣ手術に応答したカプランマイヤー生存曲線。ＷＴは、点線を表し（ｎ＝１５）およびＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスは、実線を表す（ｎ＝１４）。（Ｆ）代表的ウェスタンブロッティングは、ＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスにおける心臓タンパク質発現の変化（左）を示す。バンド強度は、濃度測定およびＧＡＰＤＨ対照による規準化によって定量される。データは、相対比によって表される（各群あたりｎ＝４、右）。（Ｇ）偽手術を受けたＷＴ心臓からの調製物（白丸）、偽手術を受けたＳＵＭＯ１トランスジェニックマウス心臓からの調製物（黒丸）、ＴＡＣ手術を受けたＷＴ心臓からの調製物（白逆三角）およびＴＡＣ手術を受けたＳＵＭＯ１トランスジェニックマウス心臓からの調製物（黒三角）（各群あたりｎ＝３）におけるＳＥＲＣＡ２ａにおけるＣａ２＋依存性ＡＴＰアーゼ活性。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。ＮＳ：有意でない。
【図５−２】図５は、ＳＵＭＯ１過剰発現がＴＡＣ誘導型心機能不全を回復することを示す。（Ａ）コンディショナルＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスの産生。心臓ＳＵＭＯ１は、α−ＭＨＣプロモーターの制御の下で発現する。（Ｂ）ウェスタンブロッティングは、トランスジェニックマウスにおける心臓ＳＵＭＯ１過剰発現を表す。ＷＴ：野生型同腹仔、ＴＧ：ＳＵＭＯ１トランスジェニックマウス。（Ｃ）ＴＡＣ手術３カ月後時点でのＷＴおよびＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスにおける代表的な心臓全体（上左）、ヘマトキシリンおよびエオシンの染色（下左）およびＭモード画像化（右）は、心臓の形態、左心室機能および寸法を示す。（Ｄ）拡張末期（ＬＶＩＤｄ）、収縮末期（ＬＶＩＤｓ）、短縮率（ＦＳ）および駆出率（ＥＦ）における内部径の心エコー測定。偽：ＷＴ、ｎ＝１２；ＴＧ、ｎ＝１０；ＴＡＣ：ＷＴ、ｎ＝１４；ＴＧ、ｎ＝１２。（Ｅ）ＴＡＣ手術に応答したカプランマイヤー生存曲線。ＷＴは、点線を表し（ｎ＝１５）およびＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスは、実線を表す（ｎ＝１４）。（Ｆ）代表的ウェスタンブロッティングは、ＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスにおける心臓タンパク質発現の変化（左）を示す。バンド強度は、濃度測定およびＧＡＰＤＨ対照による規準化によって定量される。データは、相対比によって表される（各群あたりｎ＝４、右）。（Ｇ）偽手術を受けたＷＴ心臓からの調製物（白丸）、偽手術を受けたＳＵＭＯ１トランスジェニックマウス心臓からの調製物（黒丸）、ＴＡＣ手術を受けたＷＴ心臓からの調製物（白逆三角）およびＴＡＣ手術を受けたＳＵＭＯ１トランスジェニックマウス心臓からの調製物（黒三角）（各群あたりｎ＝３）におけるＳＥＲＣＡ２ａにおけるＣａ２＋依存性ＡＴＰアーゼ活性。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。ＮＳ：有意でない。
【図６−１】図６は、ＳＵＭＯ１レベル低減が心機能不全を加速したことを示す。（Ａ）ＳＵＭＯ１  ｓｈＲＮＡ構築物設計。ｒＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下で、ＳＵＭＯ１  ｓｈＲＮＡ配列を発現する。スクランブル発現カセットを、同じウイルスベクター内にクローニングした。（Ｂ）ｒＡＡＶ９発現スクランブル対照ｓｈＲＮＡ（ｒＡＡＶ９／ＳＣ）またはＳＵＭＯ１（ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１）に対するｓｈＲＮＡを送達された、注射３週間後のマウス由来の心臓組織抽出物の代表的ウェスタンブロッティング（左）。全抽出物を、示した抗体でプロービングした。心臓ＳＵＭＯ１発現の阻害を、測定した（各群あたりｎ＝５、右）。（Ｃ）代表的な心臓全体（上左）、心臓の切片（上右）およびＭモード画像化（下）は、ｒＡＡＶｓを注射した、注射６週間後のマウスにおける心臓形態、心機能および寸法を示す。（Ｄ）ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＣおよびｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１の拡張末期（ＬＶＩＤｄ）、収縮末期（ＬＶＩＤｓ）、短縮率（ＦＳ）および駆出率（ＥＦ）における内部径の評価。心エコーパラメータを、決定した（各群あたりｎ＝１４）。（Ｅ）ＳＵＭＯ１のｒＡＡＶ９媒介型心臓ノックダウンを有する動物の生存。カプランメイヤー法を使用し、異なる用量のｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射（各群あたりｎ＝１４）またはｒＡＡＶ９／ｓｈＳＣ注射（ｎ＝２４）によって得られた動物の生存期間を分析した。（Ｆ）代表的ウェスタンブロッティングは、心臓タンパク質の発現レベルを示す（左パネル）。ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＣ（ｎ＝４）またはｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１（ｎ＝７）による尾静脈注射の６週間後を、示した抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。データは、相対率で表される。（Ｇ）ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性のＣａ２＋依存を、スクランブルを注射した心臓からの調製物（黒丸）およびＳＵＭＯ１を注射した心臓に対するｓｈＲＮＡ（黒丸）において実証した（各群あたりｎ＝３）。各濃度について、上方データ点は、ｒＡＡＶ９／ＳＣである；下方データ点は、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１である。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。ＮＳ：有意でない。
【図６−２】図６は、ＳＵＭＯ１レベル低減が心機能不全を加速したことを示す。（Ａ）ＳＵＭＯ１  ｓｈＲＮＡ構築物設計。ｒＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下で、ＳＵＭＯ１  ｓｈＲＮＡ配列を発現する。スクランブル発現カセットを、同じウイルスベクター内にクローニングした。（Ｂ）ｒＡＡＶ９発現スクランブル対照ｓｈＲＮＡ（ｒＡＡＶ９／ＳＣ）またはＳＵＭＯ１（ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１）に対するｓｈＲＮＡを送達された、注射３週間後のマウス由来の心臓組織抽出物の代表的ウェスタンブロッティング（左）。全抽出物を、示した抗体でプロービングした。心臓ＳＵＭＯ１発現の阻害を、測定した（各群あたりｎ＝５、右）。（Ｃ）代表的な心臓全体（上左）、心臓の切片（上右）およびＭモード画像化（下）は、ｒＡＡＶｓを注射した、注射６週間後のマウスにおける心臓形態、心機能および寸法を示す。（Ｄ）ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＣおよびｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１の拡張末期（ＬＶＩＤｄ）、収縮末期（ＬＶＩＤｓ）、短縮率（ＦＳ）および駆出率（ＥＦ）における内部径の評価。心エコーパラメータを、決定した（各群あたりｎ＝１４）。（Ｅ）ＳＵＭＯ１のｒＡＡＶ９媒介型心臓ノックダウンを有する動物の生存。カプランメイヤー法を使用し、異なる用量のｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射（各群あたりｎ＝１４）またはｒＡＡＶ９／ｓｈＳＣ注射（ｎ＝２４）によって得られた動物の生存期間を分析した。（Ｆ）代表的ウェスタンブロッティングは、心臓タンパク質の発現レベルを示す（左パネル）。ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＣ（ｎ＝４）またはｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１（ｎ＝７）による尾静脈注射の６週間後を、示した抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。データは、相対率で表される。（Ｇ）ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性のＣａ２＋依存を、スクランブルを注射した心臓からの調製物（黒丸）およびＳＵＭＯ１を注射した心臓に対するｓｈＲＮＡ（黒丸）において実証した（各群あたりｎ＝３）。各濃度について、上方データ点は、ｒＡＡＶ９／ＳＣである；下方データ点は、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１である。全てのデータは、平均±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１、各対照に対し、スチューデントｔ検定を用いる。ＮＳ：有意でない。
【図７】図７は、ＳＵＭＯ化によるＳＥＲＣＡ２ａ機能の調節のための作動モデルを示す。基底条件の下で、ＳＵＭＯ化は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質安定性およびＣａ２＋ポンプ機能を増強し、心収縮を調節するが、非ＳＵＭＯ化ＳＥＲＣＡ２ａ形態の増加、その後の低いＳＵＭＯ１タンパク質プールが、病理学的条件下でのＳＥＲＣＡ２ａ障害および心機能不全を誘発する。
【図８−１】図８は、アラインしたアミノ酸配列を示す。ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、配列番号２）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、配列番号４）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、配列番号６）およびマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号８）に由来する野生型ＳＥＲＣＡ２ａのアラインしたアミノ酸配列を提示する。ＳＥＲＣＡ２ａ修飾に関与する本明細書中に記載される残基は、４８０位および５８５位における保存的リシン残基ならびに６７４位における保存的システインによって証明されるように、保存的である。
【図８−２】図８は、アラインしたアミノ酸配列を示す。ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、配列番号２）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、配列番号４）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、配列番号６）およびマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号８）に由来する野生型ＳＥＲＣＡ２ａのアラインしたアミノ酸配列を提示する。ＳＥＲＣＡ２ａ修飾に関与する本明細書中に記載される残基は、４８０位および５８５位における保存的リシン残基ならびに６７４位における保存的システインによって証明されるように、保存的である。
【図９−１】図９は、アラインしたポリヌクレオチド配列を示す。ヒト、ブタ、ラットおよびマウスにおける野生型ＳＥＲＣＡ２ａをコードするアラインしたポリヌクレオチドコード領域配列。これらのポリヌクレオチドコード領域配列は、ヒトＳＥＲＣＡ２ａについて、配列表における配列番号１の５６４〜３５５７位、ブタＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における配列番号３の１４〜３００７位、ラットＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５０７〜３５００位、ならびにマウスＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５４１〜３５３７位において提示される。
【図９−２】図９は、アラインしたポリヌクレオチド配列を示す。ヒト、ブタ、ラットおよびマウスにおける野生型ＳＥＲＣＡ２ａをコードするアラインしたポリヌクレオチドコード領域配列。これらのポリヌクレオチドコード領域配列は、ヒトＳＥＲＣＡ２ａについて、配列表における配列番号１の５６４〜３５５７位、ブタＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における配列番号３の１４〜３００７位、ラットＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５０７〜３５００位、ならびにマウスＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５４１〜３５３７位において提示される。
【図９−３】図９は、アラインしたポリヌクレオチド配列を示す。ヒト、ブタ、ラットおよびマウスにおける野生型ＳＥＲＣＡ２ａをコードするアラインしたポリヌクレオチドコード領域配列。これらのポリヌクレオチドコード領域配列は、ヒトＳＥＲＣＡ２ａについて、配列表における配列番号１の５６４〜３５５７位、ブタＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における配列番号３の１４〜３００７位、ラットＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５０７〜３５００位、ならびにマウスＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５４１〜３５３７位において提示される。
【図９−４】図９は、アラインしたポリヌクレオチド配列を示す。ヒト、ブタ、ラットおよびマウスにおける野生型ＳＥＲＣＡ２ａをコードするアラインしたポリヌクレオチドコード領域配列。これらのポリヌクレオチドコード領域配列は、ヒトＳＥＲＣＡ２ａについて、配列表における配列番号１の５６４〜３５５７位、ブタＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における配列番号３の１４〜３００７位、ラットＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５０７〜３５００位、ならびにマウスＳＥＲＣＡ２ａについて配列表における５４１〜３５３７位において提示される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ＳＥＲＣＡ２ａがリシン残基４８０および５８５においてＳＵＭＯ化され、そしてこのＳＵＭＯ化は、ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性および安定性を維持することを確立するデータが、本明細書において開示される。ＳＵＭＯ化の重要性は、ＳＵＭＯ化残基を欠くＳＥＲＣＡ２ａ改変体（Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ）は、ＡＴＰアーゼ活性および安定性の有意な低減を有する観察によってさらに実証された。単離された心筋細胞において、アデノウイルス媒介型ＳＵＭＯ１過剰発現は、加速するカルシウム減衰によって、収縮性およびカルシウム過渡状態を増加した。導入遺伝子媒介型ＳＵＭＯ１過剰発現は、ＳＥＲＣＡ２ａ機能の上昇と同時に、圧負荷誘導型心機能不全を救済した。対照的に、ｓｈＲＮＡを用いたＳＵＭＯ１レベルの下方制御は、ＳＥＲＣＡ２ａ機能の低下を伴う圧負荷誘導型の心機能の悪化を加速させた。まとめると、本明細書中で開示される研究は、ＳＵＭＯ化が、ＳＥＲＣＡ２ａ機能を調節する重要な翻訳後修飾であること、ならびに、心臓における細胞内カルシウムを修飾することによって、心機能不全または心機能障害、例えば心不全を処置するための方法を提供する。ＳＥＲＣＡ２ａ（ｒＡＡＶ１／ＳＥＲＣＡ２ａ）をコードする組換えアデノ随伴ウイルスによるヒト臨床試験は、開始されており、結果は、ＳＥＲＣＡ２ａを標的化することは、ヒトＨＦの処置のための安全かつ有効な療法であることを示す。
【００３５】
２つのリシン残基におけるＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化が、まず、本明細書中で開示される。興味深いことに、ＳＥＲＣＡ２ａレベルおよびＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化の両方は、不全心臓において有意に低減した。説得力のある証拠は、以下の詳細な説明において開示され、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化の低減は、不全心臓におけるＳＵＭＯ１レベルの低減の直接的な結果であることを確立した。このＳＵＭＯ化の低減は、ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性の低減およびＳＥＲＣＡ２ａ安定性の低減に厳密に相関する。さらに、ＳＵＭＯ１の回復は、不全心臓における収縮機能不全を回復させた。これらの結果は、図７にまとめられる。
【００３６】
ＳＥＲＣＡ２ａのアミノ酸配列の保存的性質は、図８において説明され、これは、ヒト（配列番号２）、ブタ（配列番号４）、ラット（配列番号６）およびマウス（配列番号８）のＳＥＲＣＡ２ａについてアラインしたアミノ酸配列を提供する。図９において、ヒト（配列番号１）、ブタ（配列番号３）、ラット（配列番号５）およびマウス（配列番号７）ポリヌクレオチド配列を有する、これらのＳＥＲＣＡ２ａアミノ酸配列をコードするアラインしたポリヌクレオチド配列が提示される。図３の簡単な説明に記載されるＳＵＭＯ化モチーフは、４７９〜４８２位（ＭＫＫＥ、ヒト、ブタ、ラットおよびマウスについてそれぞれ、配列番号１０、１２、１４および１６）および５８４〜５８７位（ＩＫＹＥ、配列番号１０、１２、１４および１６）において見出される。これらの４アミノ酸モチーフのいずれかまたは両方における１アミノ酸変化は、心機能に対するその効果をモジュレートする様式で、ＳＥＲＣＡ２ａを修飾することが予測される。これらの改変体のほとんどが、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化を妨害するかまたは阻害し、ＨＦなどの心臓血管疾患の蓋然性を高めることがさらに予測される。したがって、心臓血管疾患への素因を診断するための１つの方法は、患者から生物学的サンプルを得ることおよび４７９〜４８２位および／または５８４〜５８７位においてＳＥＲＣＡ２ａのアミノ酸配列を決定すること、ならびにアミノ酸配列が本明細書中で開示される野生型配列と異なっている場合に心臓血管疾患への素因を診断することを含む。類似の診断方法が、コードポリヌクレオチド配列について企図される。
【００３７】
心機能に影響を及ぼすＳＥＲＣＡ２ａのＰＴＭを媒介するＳＵＭＯ−１タンパク質のアミノ酸配列もまた、ヒト（配列番号１０）、ブタ（配列番号１２）、ラット（配列番号１４）およびマウス（配列番号１６）について提示される。これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒト、ブタ、ラットおよびマウスについてそれぞれ配列番号９、１１、１３および１５において示される。
【００３８】
理論に縛られることを望まないが、ＳＥＲＣＡ２ａ  ＡＴＰアーゼ活性におけるＳＵＭＯ化の効果は、ＳＥＲＣＡ２ａにおいて誘導された立体構造変化からもたらされる；あるいは、ＳＵＭＯ化は、ＡＴＰ結合のためのさらなる界面を生じ、ＡＴＰアーゼ活性の上昇をもたらし得る。また、ＳＵＭＯ化は、ＳＥＲＣＡ２ａの他の転写後修飾（ＰＴＭ）、例えば特定の残基のアセチル化に影響を及ぼし得る可能性もある。以前の研究は、調節性タンパク質の宿主が、ＳＵＭＯ化およびアセチル化によって相互にそして競合的に調節されることを示した。例えば、腫瘍抑制遺伝子ＨＩＣ１の転写活性は、ＳＵＭＯ化によって促進され、そしてアセチル化によって阻害される（Ｖａｎ  Ｒｅｃｈｅｍら、２０１０年）。興味深いことに、ＳＥＲＣＡ２ａのアセチル化は、近年、癌細胞株におけるヒトアセチロームの大規模分析において同定されている（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙら、２００９年）。また、ＳＥＲＣＡ２ａは、アセチル化されていること、およびこのアセチル化は、不全心臓においてより顕著であり、Ｓｉｒｔ１デアセチラーゼによって反転され得ることも、見出されている。
【００３９】
ＳＵＭＯ化およびユビキチン化の相互調節は、ＳＥＲＣＡ２ａを安定化させるＳＵＭＯ化と一貫する。タンパク質分解のこの種のＳＵＭＯ化媒介型阻害は、他のタンパク質について示されている。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達のネガティブレギュレーターであるアキシンのＳＵＭＯ化は、ユビキチン化を防ぎ、それによって、アキシンの半減期を延長させた（Ｋｉｍら、２００８年）、同様に、ｐ６８およびｐ７２  ＲＮＡヘリカーゼのＳＵＭＯ化は、ユビキチン−プロテアソーム媒介型タンパク質分解の低減によってこれらのタンパク質の安定性を上昇させた（Ｍｏｏｎｅｙら、２０１０年）。
【００４０】
本明細書中で開示されるデータは、ＳＵＭＯ１レベルは、不全心臓において有意に低減すること、細胞性ＳＵＭＯ１レベルが正確に維持されそして心筋細胞の正しい機能について制御されるべきであるという見解についての実験的根拠を提供することを確立する。ＳＵＭＯ１の補充がＴＡＣ誘導型不全表現型を反転させたという本明細書中で開示された知見は、ＳＵＭＯ１レベルの低減が収縮機能不全の直接的な原因であることを示した。ＳＵＭＯ１遺伝子移入の治療効果は、重大であった。ＳＵＭＯ１レベルの低減とは対照的に、ＳＵＭＯ化および脱ＳＵＭＯ化の酵素であるＵｂｃ９およびＳＥＮＰ１のタンパク質レベルは、不全心臓においておよびｓｈＳＵＭＯ１が投与された際に変わらなかった。Ｕｂｃ９およびＳＥＮＰ１のレベルはまた、ＳＵＭＯ１レベルが回復した際にも変わらなかった。したがって、ＳＵＭＯ化の特異性および能力は、不全心臓において変わる見込みがない。最も重要なことは、ＳＵＭＯ１の供給の低減であると考えられる。この点で、細胞性ユビキチンレベルの枯渇は、ニューロン機能障害および死を引き起こすために十分であることに、興味深く言及する（Ｒｙｕら、２００８年）。
【００４１】
本明細書中以下で開示される実験において、ＳＵＭＯ化が、ＳＥＲＣＡ２ａ活性および心筋細胞の収縮特性全体に影響を及ぼすかまたはモジュレートすることによって、新規な調節メカニズムが開示される。さらに、心臓収縮性および生存におけるＳＵＭＯ１の印象的な有益効果は、ＳＵＭＯ１を標的化することは心不全の処置において治療的価値を有することを示す。
【００４２】
以下の実施例は、開示の実施形態を説明する。実施例１は、本明細書中で記載される実験において使用された材料および方法を開示する。実施例２は、ＳＵＭＯ１はＳＥＲＣＡ２ａと相互作用することを確立するデータを開示する。実施例３は、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化は不全心臓において低減することを示す。実施例４は、ＳＥＲＣＡ２ａがリシン残基Ｋ４８０およびＫ５８５においてＳＵＭＯ化されることを明らかにする。実施例５は、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化はＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性を上昇することを示す。実施例６は、ＳＵＭＯ化はＳＥＲＣＡ２ａ安定性を増大することを確立する。実施例７は、ＳＵＭＯ１過剰発現は、心筋細胞収縮性を増大し、単離された心筋細胞におけるＣａ２＋過渡状態を増大することを示す。実施例８は、ＴＡＣ誘導型心不全においてＳＵＭＯ１過剰発現が心機能を改善することを示す。実施例９は、小ヘアピンＲＮＡが、心機能不全を加速するＳＵＭＯ１の下方制御を媒介することを示す。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
本実施例は、本明細書中で開示される実験において使用された材料および方法の記載を提供する。
【００４４】
インビボＳＵＭＯ化アッセイ
細胞内のＳＵＭＯ化を分析するために、リポフェクタミン２０００を使用し、ＨＥＫ２９３細胞をＳＥＲＣＡ２ａ野生型（ＷＴ）またはＳＥＲＣＡ２ａ  ＳＵＭＯ化部位突然変異体をコードするプラスミドによってｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１およびｍｙｃタグ付加Ｕｂｃ９と共にトランスフェクトした。細胞を、氷冷した２０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドを含む溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、完全プロテアーゼインヒビター［１０ｍｌあたり１錠；Ｒｏｃｈｅ］、およびタンパク質ホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ））中の超音波処理によって溶解した。溶解物を、３０，０００ｇにて２０分間の遠心分離によって明瞭化した。次いで、細胞溶解物を、ｆｌａｇ特異的親和性マトリクスゲル（Ｓｉｇｍａ）と共の４℃にて一晩のインキュベーションによって免疫沈降に供し、その後、免疫沈降物を、冷溶解緩衝液中で洗浄した。免疫複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、そしてＳＥＲＣＡ２ａ特異的抗体、すなわち抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体によるウェスタンブロッティングに供した。
【００４５】
新鮮な組織抽出物を、インビボＳＵＭＯ化アッセイのための溶解緩衝液中で調製した。各実験群および対照群由来の心臓を、液体窒素中で凍結させた。凍結組織を砕き、ＭＰホモジネートシステムを用いて上に記載されるように溶解緩衝液中でホモジナイズした（ＦａｓｔＰｒｅｐホモジナイザー）。不溶性部分を、３０，０００ｇにて２０分間の遠心分離によって除去した。抽出物を、抗ＳＵＭＯ１アガロース樹脂と共に、一晩撹拌しながらインキュベートした。ＳＵＭＯコンジュゲート形態を、特異的一次抗体によるウェスタンブロッティングによって検出した。
【００４６】
ＳＥＲＣＡ２ａ活性アッセイ
粗ミクロソームを、以前に記載されたように調製した（Ｃｌａｒｋｅら、１９８９年）。ＳＥＲＣＡ２ａ活性アッセイを、以前に記載されたように（Ｈａｊｊａｒら、１９９７年）、ピルベート／ＮＡＤＨ共役反応を用いて実施した。Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼの活性を、以下のように計算した：Δ吸光度／６．２２×タンパク質×時間（ｎｍｏｌ  ＡＴＰ／ｍｇタンパク質×分）。全てのアッセイを、３連で行った。
【００４７】
コンディショナルＳＵＭＯ１トランスジェニックマウスの産生
αＭＨＣ−ｆｌｏｘマウスＳＵＭＯ１トランスジーンを、２つのｌｏｘＰ部位間にＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを有するｐＭＬ２Ｇベクター内にサブクローニングした。ＤＮＡ構築物を、Ｂ６Ｃ３マウス由来の受精卵に微量注入し、導入遺伝子の組み込みを、ＰＣＲによって確認した。
【００４８】
統計学的分析
この分析を、スチューデントｔ検定を用いて実施した。有意差を、ｐ＜０．０５を示す１つのアスタリスク（＊）によって、またはｐ＜０．００１を示す２つのアスタリスク（＊＊）によって画定した。図中のデータは、平均±ＳＤを表す。
【００４９】
（実施例２）
ＳＵＭＯ１は、ＳＥＲＣＡ２ａと相互作用する
ＳＥＲＣＡ２ａの新規な修飾因子を同定するアプローチとして、ＳＥＲＣＡ２ａ関連タンパク質複合体を、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体を用いた免疫沈降によってブタ心臓溶解物から単離し、その後、２次元電気泳動法によって分析した（図１Ａ）。染色したタンパク質スポットのＭＳ／ＭＳ分析は、ＳＵＭＯ１は、ＳＥＲＣＡ２ａと共に同時沈降することを明らかにした。図１Ｂにおいて、ＳＵＭＯ１についての代表的ＭＳ／ＭＳペプチドフィンガープリントを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＥＲＣＡ２ａおよびｆｌａｇタグ付加ＳＵＭＯ１をコードするプラスミドによって同時トランスフェクトした。抗ｆｌａｇ抗体による免疫沈降およびその後の抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体を用いたウェスタンブロッティングは、ＳＥＲＣＡ２ａが実際にＳＵＭＯ１に結合することを示した（図１Ｃ）。類似の実験を、ＳＥＲＣＡ２ａおよびＳＵＭＯコンジュゲート酵素であるＭＹＣタグ付加Ｕｂｃ９をコードするプラスミドによって同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞によって実施し、ＳＥＲＣＡ２ａがＵｂｃ９（図１Ｄ）に結合することをも確認した。これらのデータは、ＳＥＲＣＡ２ａがＳＵＭＯ化の標的であることを確立する。
【００５０】
（実施例３）
ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化は、不全心臓において低減する
本発明者らは、心臓においてＳＥＲＣＡ２ａが実際にＳＵＭＯ化されるか否かを試験した。ヒト心臓溶解物を、抗ＳＵＭＯ１抗体によって免疫沈降し、そして抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体でプロービングした。正常なＳＥＲＣＡ２ａバンド（約１１０ｋＤａ）に加えて、ゆっくりと移動するＳＥＲＣＡ２ａバンド（１５０〜２５０ｋＤａ）を、検出した（図２Ａ、上）。これは、ＳＵＭＯ化ＳＥＲＣＡ２ａを表す。ＳＵＭＯ化ＳＥＲＣＡ２ａのレベルは、正常心臓（ＮＦ）と比較して、不全心臓（ＨＦ）において有意に低減した。加えて、ＳＥＲＣＡ２ａレベルは、不全心臓において有意に低減した。これは、以前の報告と一貫しており、心臓サンプル調製の妥当性を支持する。この低減したＳＥＲＣＡ２ａレベルと共に、ＳＵＭＯ１レベルもまた、不全心臓において有意に低減した。対照的に、それぞれ重要なＳＵＭＯ化酵素および脱ＳＵＭＯ化酵素であるＵｂｃ９およびＳＥＮＰ１のレベルは、不全心臓において変わらなかった（図２Ａ、下）これらのデータは、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化の低減は、ＳＵＭＯ化活性の低減または脱ＳＵＭＯ化活性の上昇に起因せず、ＳＵＭＯ１のレベルの低減に主に起因し得ることを示した。
【００５１】
本発明者らはまた、ＳＵＭＯ１レベルおよびＳＥＲＣＡ２ａレベルが、ＨＦのマウスモデルにおいて圧負荷により（図２Ｂ）、およびＨＦのブタモデルにおいて容量負荷により（図２Ｃ）、有意に低減したことを観察した。これらの結果は、ＳＵＭＯ１レベルの低減によるＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化の低減は、種々の哺乳動物種におけるＨＦの発症に関連する普及した特徴であることを確立した。
【００５２】
（実施例４）
ＳＥＲＣＡ２ａは、リシン４８０および５８５においてＳＵＭＯ化される
標的タンパク質のＳＵＭＯ化は、高度保存認識モチーフψＫχＥ／Ｄ（ここで、ψは大型の疎水性アミノ酸を表し、χは任意のアミノ酸を表す）の上でリシン残基上に生じることが公知である（Ｓａｍｐｓｏｎら、２００１年）。３つの独立したＳＵＭＯ化予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｌｃｄ−ｕｓｔｃ．ｏｒｇ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｇｅｎｔ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｄｏｃ／ｓｕｍｏｐｌｏｔ、ｈｔｔｐ：／／ｓｕｍｏｓｐ．ｂｉｏｃｕｃｋｏｏ．ｏｒｇ／ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｐｈｐ）は、ＳＥＲＣＡ２ａにおける２つの推定ＳＵＭＯコンジュゲート部位、リシン４８０（Ｋ４８０）および５８５（Ｋ５８５）を同定した。これらのリシン残基は、ＡＴＰが結合し、マウス、ラット、ブタおよびヒトのＳＥＲＣＡ２ａにおいて完全に保存される細胞質ヌクレオチド結合ドメイン中に配置される（図３Ａ）。
【００５３】
ＳＵＭＯ化の間のＳＥＲＣＡ２ａ  Ｋ４８０およびＫ５８５の役割を調べるために、本発明者らは、Ｋ４８０またはＫ５８５がアルギニンによって置き換えられる（それぞれＫ４８０ＲおよびＫ５８５Ｒ）かまたはＫ４８０およびＫ５８５の両方がアルギニンによって置き換えられる（Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ）、３つのＳＥＲＣＡ２ａ改変体を産生した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型（ＷＴ）およびこれらのＳＥＲＣＡ２ａ改変体をコードするプラスミドによってトランスフェクトし、次いで、細胞溶解物を、抗ＳＵＭＯ１抗体によって免疫沈降し、そして抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体でプロービングした。Ｋ４８０ＲおよびＫ５８５ＲがＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａから識別不能にＳＵＭＯ化される一方、Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒは、完全にＳＵＭＯ化されなかった（図３Ｂ）。ＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化は、漸増量のＳＵＭＯ１プラスミドが用量依存的様式で同時トランスフェクトされた際に増大した一方で、Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５ＲのＳＵＭＯ化は、完全に消失した（図４Ｃ）。まとめると、これらの結果は、Ｋ４８０残基およびＫ５８５残基においてＳＥＲＣＡ２ａは、ＳＵＭＯ化されることを示す。
【００５４】
（実施例５）
ＳＵＭＯ化は、ＳＥＲＣＡ２ａ  ＡＴＰアーゼ活性を上昇させる
ＳＵＭＯ化リシン残基Ｋ４８０およびＫ５８５はＳＥＲＣＡ２ａのヌクレオチド結合ドメイン中に存在するので、ＳＵＭＯ化は、ＳＥＲＣＡ２ａ  ＡＴＰアーゼ活性に影響を及ぼし得る。ＷＴおよびＳＵＭＯ化欠損Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａは、対応するプラスミドによって、空プラスミドまたはＳＵＭＯ１発現プラスミドと共にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の溶解物から免疫沈降され、ＡＴＰアーゼ活性が決定された。Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒは、ＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａと比較して有意に低下したＶｍａｘ値（ＷＴ；９４．６０±１．６３、Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ；３７．９５±５．４０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）およびＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａと比較して有意に上昇したＥＣ５０値（ＷＴ；０．２４±０．０９、Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ；０．７６±０．１７μｍｏｌ  Ｃａ２＋／Ｌ）を有した。ＳＵＭＯ１の同時発現は、ＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａにおいてＶｍａｘを有為に上昇させ（９８．５８±１．８３ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）そしてＥＣ５０を有為に低下させた（０．１１±０．０９μｍｏｌ  Ｃａ２＋／Ｌ）一方で、Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５ＲのＡＴＰアーゼ活性には影響を及ぼさない（図３Ｄ）。
【００５５】
さらなる試験は、ＳＵＭＯ化がＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰ結合親和性に影響を及ぼすか否かに向けられた。ＨＥＫ２９３細胞を、ＷＴまたはＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ発現プラスミドによって、空プラスミドまたはＳＵＭＯ１発現プラスミドと共にトランスフェクトした。細胞溶解物を、ＡＴＰ−セファロースと共にインキュベートし、生じた沈降物を、抗ＳＥＲＣＡ２ａ抗体でプロービングした。この結果は、ＳＵＭＯの同時発現は、ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰ結合親和性を有意に上昇させることを示した。対照的に、Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒは、有為に低減したＡＴＰ結合親和性を有し、これはＳＵＭＯ１の同時発現によって影響されなかった（図３Ｅ）。これらのデータは、ＳＵＭＯ化は、少なくとも部分的にＡＴＰ結合親和性を増大することによってＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性を上昇させたことを確立する。
【００５６】
（実施例６）
ＳＵＭＯ１は、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の安定性を増大する
本明細書中で開示されるデータは、不全心臓においてＳＥＲＣＡ２ａレベルが低減し、同時にＳＵＭＯ１レベルが低減したことを確立する（図２）。結果として、ＳＵＭＯ化がＳＥＲＣＡ２ａの安定性に影響を及ぼす可能性を、調査した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＷＴまたはＫ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒ  ＳＥＲＣＡ２ａ発現プラスミドによって、空プラスミドまたはＳＵＭＯ１発現プラスミドと共にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、タンパク質合成のインヒビターであるシクロヘキシミドで処理し、ＳＥＲＣＡ２ａのデノボの合成をさらに遮断した。さらに３日間および５日間にわたるインキュベーションの後に、ＳＥＲＣＡ２ａレベルを、ウェスタンブロッティングによって決定した。ＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａの推定した半減期は、４．９０±０．７０日であるが、一方で、ＳＵＭＯ１が同時発現された場合、５．９０±０．２０日に延びる。Ｋ４８０Ｒ／Ｋ５８５Ｒの推定した半減期は、ＷＴ  ＳＥＲＣＡ２ａと比較して有意に低減した（それぞれＳＵＭＯ１の同時発現ありおよびなしで、２．４２±０．５０日および２．３５±０．８０日）（図３Ｆ）。これらのデータは、ＳＵＭＯ化がＳＥＲＣＡ２ａの安定性を増大させたことを示す。
【００５７】
（実施例７）
ＳＵＭＯ１過剰発現は、心筋細胞収縮性および単離した心筋細胞におけるＣａ２＋過渡状態を増大する
ＳＵＭＯ１の生理学的機能を試験するために、マウス成体心筋細胞を、正常な（偽）心臓またはＴＡＣ誘導型不全心臓（ＨＦ）から単離し、次いで、β−ｇａｌを発現するアデノウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）またはＳＵＭＯ１を発現するアデノウイルス（Ａｄ−ＳＵＭＯ１）によって感染させた。収縮特性を、ビデオエッジ検出システムを備えた二重励起分光蛍光光度計を用いて決定した。Ａｄ−ＳＵＭＯ１によって感染させた際、正常な心筋細胞は、Ａｄ−β−ｇａｌ感染した心筋細胞と比較して、細胞短縮において１１％の上昇、最大収縮率において１７％の上昇、および最大の弛緩において９％の上昇を伴う、増大した収縮性を示した。収縮性におけるより顕著な増大は、不全心筋細胞がＡｄ−ＳＵＭＯ１に感染した際に、細胞短縮において２７％の上昇、最大収縮率において３０％の上昇、および最大の弛緩において２７％の上昇を伴って観察された。Ａｄ−ＳＵＭＯ１感染した心筋細胞は、Ａｄ−β−ｇａｌ感染した心筋細胞と比較して上昇したカルシウム振幅およびＣａ２＋減衰を示した。ＳＵＭＯ１過剰発現の変力性効果全体は、ＳＥＲＣＡ２ａを過剰発現した際の効果と同等であった（図４）。ＳＵＭＯ１過剰発現は、少なくとも部分的にＳＥＲＣＡ２ａの酵素活性および安定性の上昇を通して心筋細胞収縮性を増大したと予測される。
【００５８】
（実施例８）
ＳＵＭＯ１過剰発現は、ＴＡＣ誘導型心不全における心機能を改善する
本発明者らは、インビボのＳＵＭＯ１過剰発現の生理学的結果を定義することに進んだ。この目的のために、本発明者らは、ＥＧＦＰ発現の代わりにタモキシフェンの投与が心臓特異的ＳＵＭＯ１過剰発現を誘導したＣｒｅ／ｌｏｘＰコンディショナル発現システムを利用した（図５Ａ）。明らかな心機能不全は、トランスジェニックマウスにおいて見られなかった（表Ｓ１）。ウェスタンブロッティングは、トランスジェニックマウス（ＴＧ）におけるタモキシフェン誘導型ＳＵＭＯ１発現レベルは、野生型同腹仔（ＷＴ）よりも、およそ５倍高かったことを明らかにした（図５Ｂ）。
【００５９】
ＷＴマウスおよびＴＧマウスを、ＴＡＣ手術に供した。短縮率（ＦＳ）におけるおよそ４０〜５０％の低下を有するＨＦは、２カ月間で発症した。次いで、タモキシフェンが４日間にわたって投与され、ＳＵＭＯ１過剰発現を誘導した。上昇したＳＵＭＯ１レベルと共に、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化およびタンパク質レベルは、タモキシフェンの投与によって有意に誘導された（図Ｓ２）。１カ月後（全体でＴＡＣの３カ月後）を、組織学および心エコーによって試験した。代表的な心臓切片およびＭモード心エコーデータを、図５Ｃに示す。ＷＴマウスおよびＴＧマウスは、ベースラインにて識別不能であった。ＴＡＣ３カ月後、ＷＴマウスは、顕著な左心室（ＬＶ）拡張ならびにＦＳおよび駆出率（ＥＦ）の低減を有する重症の不全表現型を示した。しかし、タモキシフェン誘導型ＳＵＭＯ１過剰発現は、これらの不全表現型を劇的に反転させ、ＬＶ拡張の縮小（ＬＶ内部拡張期寸法（ＬＶＩＤｄ）、ＴＧにおいて３．２４±０．３３ｍｍ対ＷＴにおいて４．４０±０．５７ｍｍ、ｐ＜０．００１；ＬＶ内部収縮寸法（ＬＶＩＤｓ）、ＴＧにおいて１．４４±０．３０ｍｍ対ＷＴにおいて２．９３±０．５４ｍｍ、ｐ＜０．００１）ならびに改善したＦＳ（ＴＧにおいて５５．９１±６．７０％対ＷＴにおいて３４．３０±５．５６％、ｐ＜０．００１）およびＥＦ（ＴＧにおいて９０．２６±４．２７％対ＷＴにおいて６９．５７±７．２８％、ｐ＜０．００１）を伴った（図５Ｄ）。
【００６０】
血行動態分析もまた、ＴＧにおいて改善したＬＶ機能を示した。ＬＶにおける収縮末期圧容量相関性（ＥＳＰＶＲ）は、ＷＴ動物よりもＴＧ動物において僅かに急勾配であり、心臓収縮性の上昇を示唆する（図Ｓ３）。対照的に、ＬＶ拡張末期圧容量相関性（ＥＤＰＶＲ）の勾配は、ＴＧマウスにおいて低下し、拡張末期ＬＶ室の堅さの低下を示す。心拍出量、拡張末期容量および収縮末期容量を含むＬＶ拡張のパラメータとしては、ＴＧにおいて同様に回復した。加えて、心臓重量対体重比の上昇は、ＴＧにおいて有意に阻害された（表Ｓ２）。
【００６１】
ＳＵＭＯ１による心機能不全の回復はまた、長期の圧負荷下でＴＧの生存の上昇によっても顕在化した（図５Ｅ）。タモキシフェンの投与の１００日後に生き残ったマウスは、ＴＧにおいて１４匹中１４匹（１００％）であり、一方、ＷＴにおいては１５匹中７匹（４７％）のみであった。
【００６２】
本発明者らは、ウェスタンブロッティングを実施し、Ｃａ２＋ホメオスタシスに関与する鍵となる調節タンパク質の発現レベルをモニタリングした。ＴＡＣの下での著しい変化は、ＳＥＲＣＡ２ａレベルの低減であり（偽に対して６５％低下）、これは、多くの以前の報告と一貫し、ＮＣＸ１レベルにおいて上昇した（偽に対して５６％上昇）。ＮＣＸ１は、拡張の間の細胞質Ｃａ２＋消失を担う。ＳＥＲＣＡ機能における低下は、不全心臓（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒら、２００３年；Ｓｔｕｄｅｒら、１９９４年）において、ならびにＳＥＲＣＡ２ａに対してｓｉＲＮＡの送達後の単離された心筋細胞において（Ｓｅｔｈら、２００４年）、ＮＣＸ機能の上昇と結びつくことが以前に示されている。ＳＥＲＣＡ２ａおよびＮＣＸ１のレベルにおけるこれらのＴＡＣ誘導型変化は、ＴＧにおいて規準化された（図５Ｆ）。
【００６３】
ＴＡＣは、ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性における有意な低減、ＷＴにおいてＶｍａｘにおける５０％低下（ＴＡＣ；４０．３９±５．０８、偽；８１．０３±７．１１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）およびＥＣ５０における１２０％上昇（ＴＡＣ；０．３１±０．０２１、偽；０．１４±０．０８μｎｍｏｌ  Ｃａ２＋／Ｌ）をもたらした。しかし、ＡＴＰアーゼ活性におけるこのＴＡＣ誘導型低減を、有意に緩和し、ＴＧにおいてＶｍａｘにおける１５％の低下（ＴＡＣ；７０．３２±５．５４、偽；８２．２９±５．３９ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）およびＥＣ５０における５９％の上昇（ＴＡＣ；０．２７±０．１２、偽；０．１６６±０．０９μｎｍｏｌ  Ｃａ２＋／Ｌ）をもたらした。
【００６４】
まとめると、これらのデータは、ＳＵＭＯ１過剰発現は、圧負荷によって誘導された心機能不全を回復することを示す。
【００６５】
（実施例９）
ＳＵＭＯ１のｓｈＲＮＡ媒介型下方制御は、心機能不全を加速する
心臓におけるＳＵＭＯ１の下方制御の効果を評価するために、本発明者らは、Ｕ６プロモーターの制御下でＳＵＭＯ１を指向する短ヘアピンＲＮＡ、すなわちｓｈＲＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ９）（ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１）またはスクランブル化配列を発現する組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ９／ＳＣ）を産生した（図６Ａ）。これらのｒＡＡＶ構築物を、Ｂ６Ｃ３／Ｆ１雄マウス内に、尾静脈を通して、５×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／マウスの用量で注射した。注射の３週間後、心臓抽出物によるウェスタンブロッティングは、ＳＵＭＯ１レベルは、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射心臓においておよそ７０％低減したが、ｒＡＡＶ９／ＳＣ注射心臓においては低減しなかったことを明らかにした。ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、Ｕｂｃ９およびＳＥＮＰ１の発現レベルは、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１によって影響を受けなかった（図６Ｂ）。
【００６６】
注射の６週間後、心機能を評価した。心臓の全体的形態および心エコー分析の代表的Ｍモード画像を、図６Ｃに示す。ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射マウス由来の心臓は、ｒＡＡＶ９／ＳＣ注射マウス由来の心臓と比較して、顕著な左心室（ＬＶ）膨張および機能低下を示し、上昇した左心室内部寸法−拡張期、すなわちＬＶＩＤｄ、（ｓｈＳＵＭＯ１；３．８５±０．１７ｍｍ、ＳＣ；３．４２±０．１９ｍｍ、ｐ＜０．００１）および左心室内部寸法−収縮期、すなわちＬＶＩＤｓ、（ｓｈＳＵＭＯ１；２．０２±０．１７ｍｍ、ＳＣ；１．３０±０．１２ｍｍ、ｐ＜０．００１）、ならびに低下したＦＳ（ｓｈＳＵＭＯ１；４７．６３±３．０７％、ＳＣ；６１．７７±４．７７％、ｐ＜０．００１）およびＥＦ（ｓｈＳＵＭＯ１；８４．５１±２．６３％、ＳＣ；９３．８５±１．２３％、ｐ＜０．００１）を伴う（図６Ｄ）。
【００６７】
血行動態分析は、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１の注射は、右肩上がりのＬＶ圧容量ループ、および収縮末期圧容量相関性すなわちＥＳＰＶＲの低下をもたらすことを示し、このことは、ＳＵＭＯ１下方制御のネガティブな変力性効果を示す。漸増用量のｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１の注射は、より重篤な心機能不全をもたらした（図Ｓ４Ａおよび図Ｓ４Ｂ）。上昇した心臓重量対体重比もまた、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射心臓において観察された（表Ｓ３）。
【００６８】
ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１誘導型心機能不全は、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射マウスの突然死によって顕在化した。１×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１を受けた全てのマウスは、３週間以内に死んだ。ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１の３×１０１０ｖｇおよび５×１０１０ｖｇを受けたマウスの死亡率は、ｒＡＡＶ９／ＳＣを受けた対照マウスの死亡率よりも僅かに高かったが、統計学的に有意ではなかった。実験期間の間、死んだ対照マウスはいなかった（図６Ｅ）。
【００６９】
ウェスタンブロッティングは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質レベルは、ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１注射心臓においておよそ４０％低下したことを明らかにした。これに関連して、ナトリウム／カルシウム交換体ＮＣＸ１タンパク質レベルは、僅かに上がったが、統計学的に有意ではなかった。しかし、ＰＬＮ（ホスホランバン）およびＲｙＲ２（リアノジンレセプター２）のタンパク質レベルは、変わらなかった。予測されたように、ＳＥＲＣＡ２ａのＳＵＭＯ化もまた、有意に鈍った（図６Ｆ）。ＰＬＮおよびＲｙＲ２のＳＵＭＯ化は、変わらなかった（図Ｓ４Ｃ）。これらの結果は、ＳＵＭＯ１はＳＥＲＣＡ２ａ  ＳＵＭＯ化およびＳＥＲＣＡ２ａ安定性を上昇させることを確立する。
【００７０】
ｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１の注射によるＳＵＭＯ１下方制御は、ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性を抑制し、Ｖｍａｘの低減（ｓｈＳＵＭＯ１；４８．１１±６．３４、ＳＣ；６１．１２±６．４９ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）および上昇したＥＣ５０（ｓｈＳＵＭＯ１；５．６９±０．２３、ＳＣ；０．１０±０．０７μｍｏｌ／Ｌ）を伴った（図６Ｇ）。ＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性は、より高用量のｒＡＡＶ９／ｓｈＳＵＭＯ１が注射された際に、より重篤な不全であった（図Ｓ４Ｄ）。
【００７１】
まとめると、本明細書中で開示されたデータは、ＳＵＭＯ１は、心臓におけるＳＥＲＣＡ２ａ機能の本質的なレギュレーターであることを確立する。
【００７２】
本明細書中で挙げられた参考文献の各々は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００７３】
【化１】
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【００７４】
【化２】
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【００７５】
【化３】
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【００７６】
【化４】
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【００７７】
【化５】
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本発明の具体的な実施形態が。説明の目的で本明細書中で記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが、上記から理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2014524919.tif 000023
2014524919.tif 000024