(57)【要約】  【解決手段】  クローン病を含むＩＢＤの診断および治療に有用な組成および方法が開示される。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者が炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）を発症するリスクの上昇またはヒト被験者にＩＢＤが存在する可能性の上昇を決定する方法であって、
（ｉ）前記被験者のサンプルにおいて、図１で提供された、少なくとも１つの特異的に発現したｍｉＲＮＡの濃度を測定する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ濃度を対照サンプルの濃度および／または内部標準ｍｉＲＮＡと比較する工程であって、工程（ｉｉ）の対照濃度と比較した前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子産物濃度の上昇が、前記被験者のＩＢＤ発症リスクが上昇していること、またはＩＢＤが存在する可能性の上昇を示しているものである、前記比較する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、発現濃度の前記上昇はクローン病と関連しているものである方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、１若しくはそれ以上のｍｉＲＮＡの量の上昇を検出する工程は、
（ｉ）前記被験者の血清サンプルから単離した全ＲＮＡまたは小型ＲＮＡのｍｉＲＮＡを標識する工程と、
（ｉｉ）前記標識されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡマイクロアレイでｍｉＲＮＡプローブにハイブリダイズする工程と、
（ｉｉｉ）前記マイクロアレイを洗浄する工程と、
（ｉｖ）前記マイクロアレイに残った前記標識されたｍｉＲＮＡを検出する工程と
を有するものである方法。
【請求項４】
ＩＢＤを有するヒト被験者において、治療に対する反応を決定する方法であって、
（ｉ）前記被験者の血清サンプルにおいて、図１で提供された、少なくとも１つの特異的に発現したｍｉＲＮＡの濃度を測定し、且つ前記被験者にＩＢＤの治療に有用な治療薬を投与する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前記サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの濃度を治療後の濃度と比較する工程であって、工程（ｉｉ）の治療前濃度と比較した、前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子産物濃度の減少は、前記治療薬がＩＢＤの治療に有用であることを示しているものである、前記比較する工程と
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願書類では、２０１０年９月２７日に提出された米国仮出願第第６１／３８６，７５４号の優先権を請求し、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、炎症および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の分野に関する。より具体的には、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）濃度の検出および操作により、炎症性疾患および疾病、さらに詳しくは、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を診断および治療するための組成および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明が関与する技術の状況を説明するため、いくつかの文献および特許文書が本明細書の中で引用されている。これらの引用それぞれは、省略せずに説明されるように、本明細書に参照により盛り込まれている。
【０００４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、症状発症後わずか数ヵ月または数年で診断されることが多い。ＩＢＤのいくつかの血清学的指標が同定され、一般に、これらは腸内ミクロビオームの微生物により発現する抗原に向かう抗体である（１−４）。例えば、抗サッカロマイセス・セレヴィシエ抗体（ＡＳＣＡ）はこの酵母種のマンノースエピトープと相互作用し、ＣＤ患者の４８％〜８０％に存在する（５，６）。一般に、これらのマーカーはＩＢＤに特異的であるが、感度は低い。
【０００５】
ＣＤのバイオマーカーも、疾患活動性の指標および転帰の予測因子として、診断確定後に有用である可能性がある。利用できる血清学的マーカーは、このような状況で有用であることは証明されていない（７−１３）。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および糞便カルプロテクチンなど、他の血清および糞便マーカーは炎症および胃腸障害で上昇するが、ＩＢＤに特異的なものではない（１４−１９）。さらなる高感度、特異的、および非侵襲的診断マーカーを導入すれば、ＩＢＤの診断に役立ち、侵襲的検査が減ることで患者のリスクと不快感が軽減され、新しい治療の研究が加速される可能性がある。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写産物の分解または翻訳抑制により標的ｍＲＮＡを制御する短鎖非コードＲＮＡである。細胞および組織特異的ｍｉＲＮＡの発現プロフィールは多くの疾患状態で変化している（２０−３０）。腸内ｍｉＲＮＡがすべて消失すると、バリア機能に障害が起こり、ＩＢＤと同様の炎症がおこる（３１）。胃癌および結腸直腸癌を除き（３２，３３）、腸疾患におけるｍｉＲＮＡの機能についてはほとんど知られていない。Ｗｕら（３４）は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、不確定大腸炎、感染性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、および過敏性腸症候群の大腸生検でｍｉＲＮＡの発現を分析した。正常な対照組織と比較し、ＵＣの組織では１１種類のｍｉＲＮＡに重大な変化が確認され、そのうち５種類は少なくとも２倍変化していた。著者らは、マイクロＲＮＡ−１９２（ｍｉＲ−１９２；活動性ＵＣでは１．９倍少ない）に焦点を当て、ｍｉＲ−１９２が結腸上皮に限局し、結腸上皮細胞株のケモカインＣＸＣＬ２（ＭＩＰ−２ａ）の発現を抑制できることを示した。彼らは、ＵＣではｍｉＲ−１９２値が低下し、上皮細胞のＣＸＣＬ２分泌が上昇することで腸炎になることを示している。同グループは回腸および結腸のｍｉＲＮＡ発現についても検討し、ＣＤで値が変化しているｍｉＲＮＡを数種類同定した。
【０００７】
循環血液中ｍｉＲＮＡのプロセシングが極めて安定であることが最近発見されたことから、非侵襲的バイオマーカーとしての潜在的価値が多くの研究で検討された（３６，３７）。循環血液中ｍｉＲＮＡの特異的プロフィールは、現在様々な疾患、特に癌について報告されている（３６−４１）。いくつかの事例では、これらの循環血液中ｍｉＲＮＡのプロフィールが疾患組織のｍｉＲＮＡ発現の変化と関連していることが知られている（４１，４２）。さらに、循環血液中ｍｉＲＮＡのプロフィールの変化は標準的な血液バイオマーカーの変化に先行して起こると考えられ（３９，４１）、いくつかの疾患特異的プロフィールは診断的および予測的価値を有することが知られている（４３，４４）。総合すると、これらの特徴から、ｍｉＲＮＡは魅力的な血液に基づく非侵襲的バイオマーカーであると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、ヒト被験者が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を発症するリスクの上昇またはヒト被験者にＩＢＤが存在する可能性の上昇を決定する方法が提供される。典型的な方法では、
（ｉ）図１に提供され、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８種類、またはそれ以上、またはすべての特異的に発現されたｍｉＲＮＡ濃度を被験者のサンプルで測定する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前記サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ濃度を対照サンプルの濃度および／または少なくとも１種類の内部標準ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１５０および／またはｍｉＲ−３４２−３ｐ）と比較する工程において、工程（ｉｉ）の対照濃度と比較した前記サンプルのｍｉＲＮＡ濃度の上昇が、前記被験者のＩＢＤ発症リスクの上昇、またはＩＢＤが存在する可能性の上昇を示している工程と
が必要である。特定の実施形態では、前記ｍｉＲＮＡ発現濃度の上昇がクローン病の存在と関連している。特定の実施形態では、前記特異的に発現されたｍｉＲＮＡが図１で発現量の差が最も大きいｍｉＲＮＡである。
【０００９】
患者のＩＢＤ治療に対する反応性を測定する方法も提供される。典型的な方法では、
（ｉ）図１に提供され、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８種類、またはそれ以上、またはすべての特異的に発現されたｍｉＲＮＡ濃度を被験者の血清サンプルで測定し、前記被験者にＩＢＤの治療に有用な治療薬を投与する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前記サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ濃度を治療前および／または治療後の濃度と比較する工程において、工程（ｉｉ）の投与前濃度と比較した前記サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡ遺伝子産物濃度の減少が、前記治療薬がＩＢＤの治療に有用であることを示している工程と
が必要である。特定の実施形態では、前記特異的に発現されたｍｉＲＮＡが図１で発現量の差が最も大きいｍｉＲＮＡである。
【００１０】
最後に、ＩＢＤ、特にクローン病の診断および治療上の検査で有用な、一連の特異的に発現されたｍｉＲＮＡが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】小児ＣＤ患者の血清ｍｉＲＮＡの低密度アレイ（ＬＤＡ）の解析。Ａ、ＬＤＡによりすべてのサンプルで検出された６８種類のｍｉＲＮＡを用い、階層的クラスター分析を示した系統樹。Ｂ、ＬＤＡおよび個々のｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した、１１種類のＣＤ関連ｍｉＲＮＡおよび２種類の未変化対照ｍｉＲＮＡの相対的血清ｍｉＲＮＡ濃度。白丸：対照サンプル、黒丸：ＣＤサンプル、ｒ：スピアマンの順位相関係数。Ｃ、個々のｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した、対照およびＣＤサンプルにおけるＣＤ関連ｍｉＲＮＡの相対的濃度の比較。データは、対照と比較した倍数の変化として示している。＊Ｐ<０．０５。ＣＤ＝クローン病、ＬＤＡ＝低密度アレイ、ｍｉＲＮＡ＝マイクロＲＮＡ、ｑＲＴ−ＰＣＲ＝定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法。
【図２】ＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡの検証。Ａ、対照（ｎ＝３２）およびＣＤ症例（ｎ＝４６）と、セリアック病症例（ｎ＝１２）およびそれに対応する対照（ｎ＝１２）を個別にセットで検証した、血清ＣＤ関連ｍｉＲＮＡの箱ひげ図。箱：２５％〜７５％、ひげ：隣接する値の上限、下限、ライン：中央値、点：外れ値。データは、対照と比較した倍数の変化として示している。Ｂ、小児ＣＤ患者（ｎ＝４６）および健常対照者（ｎ＝３２）の血清における２つのＣＤ関連ｍｉＲＮＡの受信者動作特性曲線。ＡＵＣ＝血中濃度時間曲線下面積、ＣＤ＝クローン病、ｍｉＲＮＡ＝マイクロＲＮＡ。
【図３】治療後のＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡの反応。Ａ、診断時および治療６ヵ月後の小児ＣＤ患者の血清に含まれる２つのＣＤ関連ｍｉＲＮＡのドットプロット（ｎ＝２４）。データは、診断時の濃度と比較した倍数の変化として示している。実線は各患者のデータポイントを結んでいる。点線＝中央値、＊Ｐ＝０．００３、ｎ．ｓ．＝ウィルコクソンの符号付順位和検定により有意ではない。Ｂ、診断時および治療６ヵ月後の小児ＣＤ患者の血清ｍｉＲＮＡ濃度（ｎ＝２４）。データは、診断時の濃度と比較した倍数の変化として示している。＊ウィルコクソンの符号付順位和検定によりｍｉＲ−４８４ではＰ＝０．００３、ｍｉＲ−１９５ではＰ＝０．０３７。ＣＤ＝クローン病、ｍｉＲＮＡ＝マイクロＲＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
循環血液中のｍｉＲＮＡは、小児クローン病の高感度で特異的な指標となることが確認された。これらのｍｉＲＮＡは、血清または血漿の無細胞液に存在する。血清ｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして利用する利点は、数回凍結／解凍サイクルを行っても室温で数時間安定であること、正常者では変化が少ないことなどである。従って、本発明に従い、ＩＢＤのバイオマーカーを調べる新規非侵襲的アッセイが開示される。このアッセイは、１）治療を開始するために不可欠な、迅速で正確な診断を提供し、２）ＵＣおよびＩＢＤの診断と関連した他の疾患とＣＤを区別するために効果的であり、３）利用できる選択肢の範囲から治療の選択を導くために必要な転帰の予測を容易にすることができる。最後に、本明細書で開示される一連のｍｉＲＮＡの特徴により、そのようなマーカーを標的とすることができる新規治療の開発が可能となる。多数のＩＢＤのバイオマーカーが報告されているが、これらは感度が低い、疾患活動性との関連性が低い、および／またはコストのため制限されている。
【００１３】
定義：
「炎症性腸疾患またはＩＢＤ」の表現は、主に潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を指す。これらは原因が不確定の慢性疾患であり、腹痛が頻発することで特徴付けられ、下痢が伴うことが多い。潰瘍性大腸炎およびクローン病にはいずれも明確な病理学的所見があるが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者のかなりの割合で所見が予測できない。クローン病は限局性腸炎、末端回腸炎、または肉芽腫性回結腸炎とも呼ばれる。
【００１４】
「マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ」は、およそ２２個の小さなヌクレオチド非コードＲＮＡのファミリーを指す。ｍｉＲＮＡは特異的遺伝子から転写され、一般に２回の開裂段階を経て、成熟ｍｉＲＮＡとなる。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解を亢進するか、翻訳を抑制することにより、転写後遺伝子抑制を引き起こす。
【００１５】
本明細書で説明するとおり、「ｍｉＲ特異的インヒビター」の用語は、マイクロＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的、または基本的に相補的で、標的遺伝子転写産物への結合または活性を阻害する核酸分子を指す。ｍｉＲ特異的インヒビターは前記ｍｉＲＮＡと直接相互作用するか、標的転写産物のｍｉＲＮＡ結合部位と相互作用して、ｍｉＲＮＡとの相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、前記ｍｉＲ特異的インヒビターが、マイクロＲＮＡ分子のシード領域に（すなわち、前記マイクロＲＮＡ分子５’末端の１〜１０位に）相補的な少なくとも５個の連続したヌクレオチド、少なくとも６個の連続したヌクレオチド、少なくとも７個の連続したヌクレオチド、少なくとも８個の連続したヌクレオチド、または少なくとも９個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態では、前記ｍｉＲ特異的インヒビターが、２〜８位でマイクロＲＮＡ分子のシード領域に相補的な、少なくとも６個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。前記マイクロＲＮＡに相補的な、これらの連続したヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ結合部位とも呼ばれる。
【００１６】
ｍｉＲ特異的インヒビターは一本鎖分子と考えられる。前記ｍｉＲ特異的インヒビターは化学的に合成するか、プラスミドによってコードされている。一部の実施形態では、前記ｍｉＲ特異的インヒビターがＲＮＡを有する。他の実施形態では、前記ｍｉＲ特異的インヒビターがＤＮＡを有する。他の実施形態では、前記ｍｉＲ特異的インヒビターが化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含む。例えば、Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌ．  ３（３）：  ｐｅ８５を参照。
【００１７】
一部の実施形態では、ｍｉＲ特異的インヒビターが抗ｍｉＲＮＡ（抗ｍｉＲ）オリゴヌクレオチドである（ＷＯ２００５０５４４９４；  Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ２：Ｅ９８；  Ｏｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｇｅｎｅ  ３７２：１３７−１４１を参照）。抗ｍｉＲは一本鎖分子と考えられる。抗ｍｉＲはＲＮＡまたはＤＮＡを有し、非ヌクレオチド成分を有する。抗ｍｉＲに関する別の実施形態は、ｍｉＲ特異的インヒビターについて上述したとおりである。抗ｍｉＲは、広範な配列相補性により成熟マイクロＲＮＡとアニーリングし、これを阻害する。一部の実施形態では、抗ｍｉＲが全ｍｉＲＮＡと完全に相補的なヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、抗ｍｉＲが２〜８位でマイクロＲＮＡ分子と相補的であり、前記ｍｉＲＮＡの残りの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％相補的な、少なくとも６個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、前記抗ｍｉＲがさらにフランキング配列を有し、隣接する一次（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）配列と相補的である。抗ｍｉＲについては、２’−Ｏ−メチル；ＬＮＡ；および２’−Ｏ−メチル，ホスホロチオエート，コレステロール（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）；２’−Ｏ−メトキシエチルなどの化学的修飾が報告されている（ＷＯ２００５０５４４９４；  Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ２：ｅ９８；  Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  ＲＮＡ  １０：５４４−５０；  Ｏｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｇｅｎｅ  ３７２：１３７−４１；  ＷＯ２００５０７９３９７；  Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：６８５−６８９；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３４：２２９４−２３０４；  Ｅｓａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ３：８７−９８）。化学的に修飾された抗ｍｉＲは、これに限定されるものではないが、Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｅｘｉｑｏｎ、およびＤｈａｒｍａｃｏｎを含む様々な供給業者から市販されている。
【００１８】
「ｍｉＲＮＡ模倣体」は、化学的に合成された核酸ベースの分子であり、好ましくは、細胞への移入後の成熟内因性ｍｉＲＮＡを模倣した二本鎖ＲＮＡである。
【００１９】
「遺伝子変化」の用語は、１若しくはそれ以上の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を指す。遺伝子変化には、制限なく、既知配列の核酸分子から、少なくとも１つのヌクレオチドで塩基対置換、付加、および欠失が起こった場合を含む。
【００２０】
本明細書で用いるとおり、「固体基質」の用語は、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェルまたは試験管、ディップスティック、またはフィルターの表面など、何らかの形態を指す。前記基質の材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースとすることができる。
【００２１】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を指す場合の「基本的に〜から成る」という表現は、特定の配列ＩＤ番号：の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、前記表現はそれ自体の配列と、前記配列の機能的および新しい特徴に影響しない分子修飾を含む。
【００２２】
本発明で使用される核酸に関して、「単離核酸」の用語が使用されることもある。この用語はＤＮＡに当てはめた場合、由来する生物の天然型ゲノムに（５’および３’方向で）すぐ隣接した配列から単離されるＤＮＡ分子を指す。例えば、前記「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されるか、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ分子を有することがある。「単離核酸分子」はｃＤＮＡ分子も有する。ベクターに挿入された単離核酸分子は、本明細書において、組み換え核酸分子と呼ばれることもある。
【００２３】
ＲＮＡ分子に関して、「単離拡散」の用語は主に、上記に定義した単離ＤＮＡ分子にコードされるｍｉＲＮＡ分子を指す。代わりに、前記用語が、天然の状態で（つまり、細胞または組織中で）関連するだろうＲＮＡ分子から十分分離され、「実質的に純粋な」形態で存在するＲＮＡ分子を指すこともある。
【００２４】
核酸と関連して「濃縮」の用語を使用することで、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常細胞または配列を取り出した細胞よりも、有意に高い割合（２〜５倍）の全ＤＮＡまたは全ＲＮＡが対象の細胞または溶液に存在することを意味する。これは、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量を優先的に減少させる、または、前記特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量を優先的に増加させる、または、前記２つの方法を組み合わせることで、人為的に引き起こすことができる。しかし、「濃縮」は他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないということは意味せず、単に対象配列の相対量が大きく増加しているだけであることに注意する必要がある。
【００２５】
一部の目的においては、ヌクレオチド配列が精製された形態であることも好都合である。核酸と関連した「精製」の用語は、（均質な調合液のように）完全に純粋である必要はなく、代わりに、その配列が自然環境よりも（自然の濃度と比較して。この濃度は例えばｍｇ／ｍｌで少なくとも２〜５倍高いはずである）相対的に純粋であることを示す。ｃＤＮＡライブラリーから単離した個々のクローンは、電気泳動で均質な程度まで精製することができる。これらのクローンから得られる請求項のＤＮＡ分子は、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから直接得ることができる。前記ｃＤＮＡクローンは天然型ではないが、好ましくは部分的に生成した天然型物質（メッセンジャーＲＮＡ）を操作することで得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作成には、合成物質（ｃＤＮＡ）の作成が関与し、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、前記ｃＤＮＡライブラリーを持つ細胞をクローン選択することで、前記合成ライブラリーから単離可能である。従って、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作成と異なるｃＤＮＡクローンの単離が含まれるプロセスでは、天然型の伝達よりも約１０−６倍精製される。従って、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、および、より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。
【００２６】
「相補的」の用語は、２つのヌクレオチドが互いに複数の好ましい相互作用を形成することができることを説明する。例えば、アデニンは２つの水素結合を形成することができるため、チミンと相補的である。同様に、グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成することができるため相補的である。従って、核酸配列にチミン、アデニン、グアニン、およびシトシンの塩基配列が含まれる場合、この核酸分子の「相補体」はチミンの位置にアデニン、アデニンの位置にチミン、グアニンの位置にシトシン、シトシンの位置にグアニンを含む分子となる。前記相補体は親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるため、そのような相補体はその親分子と高い親和性で結合することができる。
【００２７】
一本鎖核酸、特にオリゴリボヌクレオチドについて、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当該分野で利用される事前に決定された条件下、そのようなハイブリダイゼーションが可能となるような十分相補的な配列の一本鎖ヌクレオチド２分子間の関連性を指す（「実質的に相補的」と呼ばれることもある）。特に、前記用語は、事実上、非相補的配列の一本鎖核酸と前記オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを除き、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを指す。相補性が様々な一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションが可能となる適切な条件も、当該分野で周知である。
【００２８】
例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密な条件を計算するための、１つの一般式を以下に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ（二本鎖）
上式の説明として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］およびホルムアミドを５０％とし、ＧＣの含有量を４２％、平均プローブサイズを２００塩基とすると、前記Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴｍは相同性が１％低下するごとに１〜１．５℃低下する。従って、約７５％以上の配列同一性を有する標的は、ハイブリダイゼーション温度４２℃で観察されることになる。
【００２９】
前記ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳密性は、主に前記溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、前記プローブのその標的へのアニーリング速度を最大限とするため、前記ハイブリダイゼーションは通常、前記ハイブリッドについて計算したＴｍ未満の２０〜２５℃の塩および温度条件で行う。洗浄条件は、前記標的に対する前記プローブの同一性について、可能な限り厳密にする必要がある。一般に、洗浄条件は前記ハイブリッドのＴｍ未満の約１２〜２０℃に選択する。本発明の核酸について、中等度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、４２℃での６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％  ＳＤＳ、および変性したサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌにおけるハイブリダイゼーションと定義し、２Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳにおいて５５℃で１５分間洗浄した。高度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、４２℃での６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％  ＳＤＳ、および変性したサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌにおけるハイブリダイゼーションと定義し、１Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳにおいて６５℃で１５分間洗浄した。非常に高度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、４２℃での６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート液、０．５％  ＳＤＳ、および変性したサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌにおけるハイブリダイゼーションと定義し、０．１Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳにおいて６５℃で１５分間洗浄した。
【００３０】
「オリゴヌクレオチド」の用語は、本明細書で使用するとおり、２若しくはそれ以上、好ましくは４つ以上のリボ−またはデオキシヌクレオチドを含む核酸分子として定義される。前記オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因によって、および前記オリゴヌクレオチドの特定の応用および使用によって決まる。プローブおよびプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから前記核酸分子の全長までのあらゆる長さとすることができ、明確に、前記ポリヌクレオチドの３から全長までのあらゆる可能な連続核酸数を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは少なくとも約１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である。典型的なｍｉＲＮＡは約２２リボヌクレオチド長である。
【００３１】
本明細書に用いる「プローブ」の用語は、精製された制限酵素の消化で自然に発生するか、合成されたかによらず、前記プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか、特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの核酸を指す。プローブは一本鎖または二本鎖の可能性がある。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブ供給源、および前記方法の利用を含む多くの要素によって決まる。例えば、診断に応用する場合、標的配列の複雑さにより、前記オリゴヌクレオチドプローブは典型的に１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないオリゴヌクレオチドを含むこともある。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的となるように選択される。これは、一連の事前に決定された条件下、前記プローブがそれぞれの標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」またはアニーリングすることができるよう、十分相補的である必要があることを意味する。従って、前記プローブの配列は前記標的の厳密に相補的な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントが前記プローブの５’または３’末端に結合し、前記プローブ配列の残りの部分が前記標的鎖と相補的となることも考えられる。代わりに、前記プローブ配列が前記標的核酸の配列と十分相補的で、それと特異的にアニーリングするという条件で、非相補的塩基またはそれよりも長い配列が前記プローブに散在する可能性もある。
【００３２】
本明細書に用いられる「プライマー」の用語は、ＲＮＡかＤＮＡかであり、一本鎖か二本鎖かであり、生態系に由来するか制限酵素消化で作成したか合成したオリゴヌクレオチドを指し、適切な環境に置いた場合、鋳型依存的核酸合成のイニシエーターとして機能することができる。適切な核酸の鋳型、適した核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適した補助因子、および適した温度およびｐＨなどの条件を提示した場合、ポリメラーゼの作用またはプライマーが伸長した生成物を生じる同等の活性により、ヌクレオチドを添加することで、前記プライマーをその３’末端で伸長することができる。前記プライマーの長さは、特定の条件および応用の要件によって変化する可能性がある。例えば、診断に応用する場合、前記オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド長は典型的には１５〜２５またはそれ以上となる。前記プライマーは、望みの伸長生成物の合成を開始するため、つまり、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成開始に利用する場合と適切に並べ、前記プライマーの３’ヒドロキシ部分を提供するのに十分な方法で望みの鋳型鎖とアニーニングできるように、望みの鋳型に十分相補的である必要がある。前記プライマー配列が望みの鋳型と正確に相補的である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、それ以外は相補的なプライマーの５’末端に結合することができる。代わりに、前記プライマー配列が望みの鋳型鎖の配列と十分相補的で、前記伸長生成物の合成に用いられる鋳型プライマー複合体を機能的に提供するという条件で、非相補的塩基が前記オリゴヌクレオチドプライマー配列に散在することも可能である。
【００３３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）については、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、および第４，９６５，１８８号に報告があり、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
「ベクター」の用語は、細胞に感染、移入、または形質転換し、独立してまたは宿主細胞ゲノム内で複製することのできる、一本鎖または二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は、制限酵素で処理すると、切断し、それによって直線化することができる。各種ベクター、制限酵素、および制限酵素の標的となる前記ヌクレオチド配列の知識は、当業者が容易に利用することができ、別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が結合し、前記結合した配列または要素を複製することができる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなどのレプリコンを含む。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断し、２つの遺伝子片を結合することで、ベクターに挿入することができる。
【００３５】
前記発現構成物を原核生物または真核生物に形質転換、移入、または形質導入しやすくする多くの技術を当業者は利用できる。「形質転換」、「移入」、および「形質導入」の用語は、核酸および／または発現構成物を細胞または宿主生物に挿入する方法を指す。これらの方法には、前記細胞を高濃度の塩、電界、または界面活性剤で処理し、前記宿主細胞の外膜または細胞壁に対象の核酸分子、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合などに対する透過性を与えるなど、様々な技術が関与する。
【００３６】
「プロモーター要素」の用語は、ベクターに組み込まれ、一度適切な細胞に入ると、転写因子および／またはポリメラーゼの結合、およびその後、ベクターＤＮＡの一部のｍＲＮＡへの転写を促すことができるヌクレオチド配列を説明する。１つの実施形態では、本発明のプロモーター要素が対象核酸分子の５’末端の前にあり、対象核酸分子がｍＲＮＡに転写される。この後、宿主細胞の機構によりｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。
【００３７】
当業者は、核酸ベクターには、前記プロモーター要素および前記対象核酸分子以外の核酸要素が含まれる可能性があることを認めるだろう。これらの他の核酸要素には、これに限定されるものではないが、複製開始点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、またポリペプチドの精製に有用なシグナルをコードする核酸配列を含む。
【００３８】
「レプリコン」は例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、またはウイルスなどの遺伝的要素であり、大部分は独自の制御で複製することができる。レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡである可能性があり、一本鎖または二本鎖である可能性がある。
【００３９】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど、転写および翻訳制御配列を有し、宿主細胞または生物のポリペプチドコード配列の発現を促す核酸セグメントを指す。
【００４０】
本明細書で使用するとおり、「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」の用語は、核酸が遺伝子を有し、この遺伝子は、発現されると、例えば、生物学的試験、免疫測定、放射免疫測定、または比色分析、蛍光発生的、化学発光、または他の方法により、容易に測定できるレポーターシグナルを発する生成物をコードする、有効な遺伝子系を意味する。前記核酸はＲＮＡまたはＤＮＡ、直鎖または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンスまたはセンスの方向性とすることができ、前記レポーター遺伝子産物を発現させるために必要な制御要素と有効な結合を持つ。前記必要な制御要素は、レポーター系の性質、および前記レポーター遺伝子がＤＮＡの形態かまたはＲＮＡの形態かによって異なるが、これに限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素を含む。
【００４１】
導入された核酸は、受容細胞または生物の核酸に組み込む（共有結合する）ことができる場合とできない場合がある。細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞では、例えば、前記導入された核酸がエピソーム要素、またはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持される。代わりに、前記導入された核酸が前記受容細胞または生物の核酸に組み込まれ、この細胞または生物で安定に維持され、さらに前記受容細胞または生物の子孫細胞または生物に伝搬または受け継がれることもある。最後に、前記導入された核酸は前記受容細胞または宿主生物に一時的にしか存在することができない。
【００４２】
「選択可能なマーカー遺伝子」の用語は、発現されると、抗生物質耐性などの選択可能な表現型を形質転換細胞に与える遺伝子を指す。
【００４３】
「操作により結合される」の用語は、コード配列の発現が行われるように、ＤＮＡ分子中の前記コード配列に対して適切な位置に、前記コード配列の発現に必要な制御配列を入れることを意味する。これと同じ定義は、発現ベクター中の転写単位の配列および他の転写制御要素（例えば、エンハンサー）にも当てはまることがある。
【００４４】
「組み換え生物」または「トランスジェニック生物」の用語は、新しい組合せの遺伝子または核酸分子を有する生物を指す。遺伝子または核酸分子の新しい組合せは、当業者が利用できる多様な核酸操作法により生物に導入することができる。「生物」の用語は、少なくとも１つの細胞を有するすべての生体に関する。生物は、１つの真核細胞のように単純なもの、または哺乳類のように複雑なものである可能性もある。従って、「組み換え生物」の表現は、組み換え細胞、および真核または原核生物も含む。
【００４５】
「単離タンパク質」または「単離および精製タンパク質」の用語が本明細書で使用されることもある。この用語は主に、単離核酸分子が発現することで生成したタンパク質を指す。代わりに、この用語が、天然で関連するだろう他のタンパク質と十分分離され、「実質的に純粋な」形態で存在するタンパク質を指すこともできる。「単離」は、他の化合物または物質との人工または合成混合物、または、基本的活性に干渉せず、例えば、不完全な精製、安定剤の追加、または例えば、免疫原性調合液または薬学的に許容される調合液に混合したために存在する不純物の存在を排除することは意味しない。
【００４６】
「特異的結合ペア」は特異的な結合成分（ｓｂｍ）と結合パートナー（ｂｐ）を有し、互いに独特の特異性を持ち、通常の状態では、他の分子に優先して互いに結合する。特異的結合ペアの例は、抗原と抗体、リガンドと受容体、および相補的ヌクレオチド配列である。当業者は多数の他の例を知っている。さらに、「特異的結合ペア」の用語は、特異的な結合成分およびその結合パートナーのいずれかあるいは両方が高分子の一部を有する場合にも当てはまる。特異的結合ペアが核酸配列を有する実施形態では、前記アッセイの条件下で互いにハイブリダイズできる長さとし、好ましくは１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチド、および、最も好ましくは２２ヌクレオチド長となる。
【００４７】
「サンプル」または「患者サンプル」または「生体サンプル」は、特定分子を検査することができるサンプルを指す。サンプルには、これに限定されるものではないが、細胞、また血液、血清、血漿、尿、唾液、胃腸液などの体液を含む。
【００４８】
「試薬」および「試験化合物」の用語は本明細書では同義で使用され、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳類）の細胞または組織など、生物由来物質から作られた抽出物を意味する。生体高分子には、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および本明細書で説明される標的核酸またはそのコードタンパク質の活性を調節することができる核酸を基本とした分子が含まれる。試薬の考えられる生物活性については、本明細書で以下に説明するスクリーニングアッセイに含めることで評価される。
【００４９】
ＩＢＤの発症傾向を診断する方法
特定のマイクロＲＮＡ分子がＩＢＤを有する患者では特異的に発現されるという発見は、そのような疾患の発症傾向を診断または検出する方法を提供する。図１に示した、他の特異的に発現されたｍｉＲＮＡの発現レベルは、対象の生体サンプルで評価することができる。１つの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルが測定される。特定の実施形態では、発現量の差が最も大きく異なるｍｉＲＮＡの発現が測定される。特定の実施形態では、前記患者から単離されたｍｉＲＮＡの発現レベルを、事前にＣＤの存在を示すと判断されたレベルと比較している。特定の実施形態では、前記ＩＢＤ関連ｍｉＲＮＡ濃度を患者自身のｍｉＲ−１５０および／またはｍｉＲ−３４２−３ｐ（内部標準ｍｉＲＮＡ）濃度と比較し、それによって対照サンプルと比較する必要がなくなる。これに限定されるものではないが、体液（血清、胃腸液、および痰など）、すべての細胞タイプ（腸細胞、白血球、単核細胞など）、または体組織を含むあらゆるタイプの生体サンプルで、ｍｉＲＮＡ発現レベルを検出するアッセイを行うことができる。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ濃度が血清サンプルで評価される。
【００５０】
ＩＢＤ関連ｍｉＲＮＡをスクリーニングする特定の実施形態では、含まれる全ＲＮＡが１μｇ以下の少量サンプルを分析することのできる新しい検出法により、前記ｍｉＲＮＡが同定される。例えば、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎは、ｍｉＲＮＡの逆転写に全ＲＮＡの１０ｎｇを利用するキットおよび方法を提供している。従来の蛍光技術とは対照的に、共鳴光散乱（ＲＬＳ）技術を利用し、ビオチン標識しハイブリダイズした標的および抗ビオチン抗体を用い、数回の測定で少量のＲＮＡを検出することができる。ＰＣＲ増幅に代わる別の方法には、シグナル／ノイズ比を増加させ、バックグラウンド干渉を抑制する平面波ガイド技術（ｐｌａｎａｒ  ｗａｖｅ  ｇｕｉｄｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰＷＧ）が含まれる。いずれの技術もＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（米国）から市販されている。
【００５１】
従って、上述の技術すべてを利用し、ＩＢＤ関連ｍｉＲＮＡマーカーの発現を検出または定量し、それに従って、ＩＢＤなどの炎症性疾患の発症傾向を診断することができる。
【００５２】
キットおよび製造品
前述の製品はすべて、陽性対照ｍｉＲＮＡまたはＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐに埋め込まれた１若しくはそれ以上の前記マーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ラベル、マーカー、またはレポーター、薬学的に許容される担体、生理的に許容される担体、使用説明書、血清の容器、投与容器、アッセイ基質、またはそのいずれかの組合せを含むことができるキットに組み入れることができる。
【００５３】
治療薬を開発するため、ｍｉＲＮＡの調節を利用する方法
本発明者は、数種類のｍｉＲＮＡ分子がＩＢＤ患者で特異的に発現され、これは血清サンプルで検出可能であることを発見した。特に、これらのｍｉＲＮＡ分子は炎症の調節および制御に関与する様々なタンパク質と相同性を示すため、様々な異なる医学的疾患で観察される異常炎症経路を抑制または軽減する治療薬として利用することができる。そのような試薬は、ＩＢＤなどの炎症性疾患を含む様々な疾患の治療に有用である。
【００５４】
分子モデリングは、本明細書で開示されるｍＲＮＡおよび本明細書で開示される他の特異的に発現されたｍｉＲＮＡの作用を模倣した特異的有機分子を同定しやすくするはずである。コンビナトリアルケミストリーのアプローチを利用し、活性が最も高い分子を同定し、次にこれらの分子を複製してさらにスクリーニングサイクルを行う。特定の実施形態では、候補薬物を合成または天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングすることができる。１つの例は、ヒトに使用することのできる化合物のＦＤＡ承認ライブラリーである。さらに、化合物ライブラリーは、これに限定されるものではないが、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（英国コーンウォール州Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（米国ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（米国コネティカット州Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ＭｉｌｗａｕｋｅｅＩ）、ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（スイス、Ｂａｓｅｌ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（フランス、Ｐａｒｉｓ）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、Ａｕｒｏｒａ（オーストリア、Ｇｒａｚ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｂｉｏｎｅｔ（英国、Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＣｈｅｍＤｉｖ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ  Ｌｔ（ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ  （ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｌｔｄ（ロシア、Ｏｂｎｉｎｓｋ）、Ｅｎａｍｉｎｅ（ウクライナ、Ｋｉｅｖ）、Ｅｖｏｔｅｃ（ドイツ、Ｈａｍｂｕｒｇ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（米国ニュージャージー州Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ），  Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  （ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランス、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ）、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．（米国コネティカット州Ｏｒａｎｇｅ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ．（ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、Ｏｔａｖａ（カナダ、オンタリオ州Ｔｏｒｏｎｔｏ）、ＰｈａｒｍＥｘ  Ｌｔｄ．（ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（米国ニュージャージー州Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（米国ニューハンプシャー州Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｓｓｉｐｅｅ）、Ｓｐｅｃｓ（オランダ、Ｄｅｌｆｔ）、ＴｉｍＴｅｃ（米国デラウェア州Ｎｅｗａｒｋ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（カナダ、オンタリオ州Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ウクライナ、Ｋｉｅｖ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ（ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ロシア、Ｍｏｓｃｏｗ）、およびＢｉｃｏｌｌ（中国、上海）を含む多数の企業から市販されている。
【００５５】
細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは市販されており、または、当業者に既知の方法で容易に調製することができる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物資源、および海洋サンプルなどの天然資源から単離した化合物は、潜在的に有用な医薬品の存在を示す候補資源としてアッセイできると提案されている。スクリーニングされる前記医薬品は、化学的組成または人工化合物に由来するか、これらから合成できることは理解される。いくつかの市販ライブラリーを前記スクリーニングに使用することができる。
【００５６】
薬物スクリーニングアッセイに利用される試薬は、溶液中で遊離しているか、固体支持材に加えてあるか、細胞内にある。薬物スクリーニングの１つの方法では、好ましくは競合的結合試験において前記ｍｉＲＮＡを発現した組み換えポリヌクレオチドまたはその模倣体により安定して形質転換される真核または原核宿主細胞を利用する。そのような細胞は、生存可能な形態または固定された形態で、標準的な結合試験に利用することができる。例えば、前記ｍｉＲＮＡと被験試薬の間の複合体形成を決定する、または、前記ｍｉＲＮＡと前記標的ｍＲＮＡの３’末端の間の複合体形成は前記被験試薬にどの程度干渉されるかを検討することができる。
【００５７】
薬物をスクリーニングするためのさらなる技術には、非機能的または変化したＩＢＤ関連ｍｉＲＮＡ分子を有する（上述したような）宿主真核細胞株または細胞の利用が関与する。これらの宿主細胞株または細胞は不完全なｍｉＲＮＡ機能を示す。前記宿主細胞株または細胞は薬物化合物存在下で増殖し、前記細胞は、未処理細胞と比較した処理細胞における化合物で誘導される変化を評価する。本発明で使用することを意図した宿主細胞には、これに限定されるものではないが、哺乳類細胞、特に胃腸管に存在する細胞タイプを含む。核酸分子を導入する方法も当業者に周知である。そのような方法はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．  １９９５に説明されており、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
修飾して本発明のｍｉＲＮＡを発現することのできる、様々な発現ベクターが利用できる。本明細書で例示されている具体的なベクターは単に説明のためのものであり、本発明の範囲を制限する意図はない。発現方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．３−１７．４４  （１９８９）に説明されている。サッカロミセス属の発現方法も、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８９）に説明されている。
【００５９】
本発明の発現ベクターで使用するプロモーターには、真核細胞で使用可能なプロモーターが含まれる。真核細胞で使用可能なプロモーターには、エプスタイン・バーウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターなどのバキュロウイルスプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーターなどのピキアプロモーター、およびｇａｌ４誘導プロモーターおよびＰＧＫ構成的プロモーターなどのサッカロミセスプロモーター、およびＴｈｙ−１プロモーターが含まれる。さらに、本発明のベクターには、形質転換宿主細胞の選択を容易にする、様々な多数のマーカーのうちのいずれか１つを含む。そのようなマーカーには、温度感受性に関係する遺伝子、薬剤耐性、または前記宿主生物の表現型の特徴に関与する酵素が含まれる。
【００６０】
本発明のｍｉＲＮＡを発現した宿主細胞は、炎症の発症を調節できる可能性のある化合物または薬物をスクリーニングする系を提供する。従って、１つの実施形態では、本発明の核酸分子を利用し、炎症性腸疾患経路の態様を調製する薬物を同定するアッセイに利用する、組み換え細胞株を作成することができる。
【００６１】
別の実施形態では、前記特異的に発現されたｍｉＲＮＡが腸の炎症プロセスに関与していることを特定すれば、そのようなｍｉＲＮＡの発現濃度が変化した実験マウス系を作成することができる。これらのｍｉＲＮＡ分子を発現したトランスジェニックマウスは、ＩＢＤの発症およびＩＢＤへの進行における前記ｍｉＲＮＡの役割を検討するためのモデル系を提供する。実験マウスにトランス遺伝子を導入する方法は当業者に周知である。一般的な方法は３つあり、１．初期胚に対象の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを組み込む、２．新たに受精した卵の前核にＤＮＡを注入する、および３．初期胚に遺伝子操作した胚幹細胞を組み込むなどである。上述のトランスジェニックマウスの作成は、標的タンパク質が様々な細胞炎症プロセスに果たしている役割の分子的解明を促す。そのようなマウスは、動物モデル全体で想定される治療薬を研究するｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングツールを提供し、本発明に含まれる。
【００６２】
「動物」の用語は本明細書で使用され、ヒトを除くすべての脊椎動物を含める。この用語には、胚および胎仔の段階を含むすべての発達段階にある個々の動物も含む。「トランスジェニック動物」は、組み換えウイルスによる標的組み換えまたはマイクロインジェクションまたは感染など、細胞以下のレベルでの意図的遺伝子操作により直接的または間接的に変化または受け取った遺伝子情報を有する、１若しくはそれ以上の細胞を含む動物である。「トランスジェニック動物」の用語は古典的な交雑育種またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精を含むことを意味しないが、１若しくはそれ以上の細胞が組み換えＤＮＡ分子により変化しているか、組み換えＤＮＡ分子を受け取っている動物を含むことを意味する。この分子は、規定の遺伝子座を特異的に標的とし、染色体内に無作為に組み込まれ、または染色体外の複製ＤＮＡである可能性がある。「胚細胞株トランスジェニック動物」の用語は、前記遺伝子変化または遺伝子情報が胚細胞株に導入されることで、前記遺伝子情報を子孫に伝える能力が与えられるトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が、実際前記変化または遺伝子情報の一部またはすべてを有する場合、この子孫もトランスジェニック動物である。
【００６３】
遺伝子情報の変化は、受容者が属する動物種と異質であるか、または特定の個々の受容者と異質であるか、または前記受容者がすでに有している遺伝子情報である。最後のケースでは、前記変化または導入された遺伝子は自然の遺伝子とは異なって発現される。そのような変化したまたは異質の遺伝子情報は、ヌクレオチド配列をコードするｍｉＲＮＡの導入を含む。
【００６４】
標的遺伝子を変化させるために使用されるＤＮＡは、様々な技術によって得られ、これに限定されるものではないが、遺伝子源の単離、単離したｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接的合成またはその組合せを含む。
【００６５】
トランス遺伝子を導入する標的細胞の好ましい種類は、胎児幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した移植前の胚から得られる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；  Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；  Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８３：９０６５−９０６９）。トランス遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルスを介した形質導入など、標準的な方法により前記ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、この後、ヒト以外の動物の胚盤胞と合わせることができる。前記導入されたＥＳ細胞はこの後前記胚に定着し、得られたキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【００６６】
個々の遺伝子およびその発現生成物の寄与を決定する際の問題に対する１つのアプローチは、遺伝子をコードする単離ｍｉＲＮＡを挿入カセットとして使用し、（上述したような）全能性ＥＳ細胞の野生型遺伝子を選択的に不活化し、トランスジェニックマウスを作成するものである。遺伝子標的トランスジェニックマウスの作成に遺伝子標的ＥＳ細胞を利用する方法については報告があり、別の文献でレビューされている（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｃｅｌｌ  ５６：１４５−１４７；  Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４−５３９）。
【００６７】
標的相同的組み換えを利用し、染色体対立遺伝子に特異的変化を挿入することで、遺伝子領域を不活化する、または望みの変異に変化させる方法が利用できる。しかし、１００％に近い頻度で発生する相同的染色体外組み換えと比較し、相同的プラスミド−染色体組み換えは、当初、１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されないと報告された。非相同的プラスミド−染色体相互作用は、同等の相同的挿入よりも１０５〜１０２倍高い頻度で発生する。
【００６８】
このように、マウスＥＳ細胞の標的組み換えの割合が低いことを克服するため、まれな相同的組み換えを検出または選択する様々な戦略が開発された。相同的な変化のイベントを検出する１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用し、相同的挿入が起こった形質転換細胞プールをスクリーニングし、この後個々のクローンをスクリーニングする。代わりに、マーカー遺伝子を作成する正の遺伝子選択アプローチが開発され、このアプローチでは相同的挿入が起こる場合にしか活性化しないマーカー遺伝子が作成され、これらの組み換えを直接選択することが可能となっている。相同的組み換えを選択するために開発された最も強力なアプローチの１つは、変化の直接的な選択が行われない遺伝子用に開発されたポジティブ・ネガティブ・セレクション（ＰＮＳ）法である。前記ＰＮＳ法は、前記マーカー遺伝子が独自のプロモーターを有するため、高濃度で発現されない遺伝子のターゲティングに、さらに効率的である。非相同的組み換えは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を用い、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）または（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフルラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）など、有効なヘルペス薬を用い、非相同的挿入と対抗選択することで、選択する。この対抗選択により、生存形質転換細胞の相同的組み換えの数が増加する可能性がある。
【００６９】
本明細書に用いるとおり、ノックイン動物は、外因性のマウス遺伝子が、例えば本発明の遺伝子をコードするヒトｍｉＲＮＡと置換された動物である。そのようなノックイン動物はＩＢＤ発症に関する研究に理想的なモデル系を提供する。
【００７０】
本明細書で用いるとおり、ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を、特定の組織または細胞タイプに前記コードされたｍｉＲＮＡを発現させる制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に操作により結合させるベクターを用い、ｍｉＲＮＡをコードする核酸の発現を「組織特異的に」または「細胞タイプ特異的に」ターゲティングことができる。そのような制御要素を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの用途の両方で利益をもたらすことができる。組織特異的タンパク質を管理するプロモーターは当該分野で周知であり、本明細書に説明されている。
【００７１】
前記ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列には、トランスジェニック動物の発現に関わる、様々な異なるプロモーター配列を操作により結合させることができる。そのようなプロモーターには、これに限定されるものではないが、Ｔｈｙ−１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、およびＣＭＶプロモーターを含む。本発明のトランスジェニックマウスを使用する方法についても、本明細書で提供する。前記ｍｉＲＮＡをコードする核酸が導入されたトランスジェニックマウスは、例えばＩＢＤの発症を調節することができる治療薬を特定するスクリーニング法の開発に有用である。
【００７２】
医薬品およびｍｉＲＮＡ療法
本明細書で説明するとおり、炎症にｍｉＲＮＡが果たしている役割を解明することで、ＩＢＤなどの炎症性疾患の治療および診断に有用な医薬品の開発が促される。これらの組成は、上記基質の１つに加え、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を有する。そのような材料は非毒性であり、前記活性成分の有効性に干渉しない。前記担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、経皮または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存する。
【００７３】
個体に投与されるものがポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または本発明の他の薬学的に有用な化合物であろうとなかろうと、投与は「予防的に有用な量」または「治療上有用な量」であることが好ましく（ただし、場合によっては、予防が治療と考えられることもある）、これは前記個体に利益を示すのに十分な量である。
【００７４】
本明細書で説明した特定のｍｉＲＮＡは治療に用いることができる。これらは、膜透過配列に選択的に結合できる。「膜透過ペプチド配列」は、細胞膜のｍｉＲＮＡの貫通および侵入を容易にするペプチド配列を指す。典型的なペプチドには、制限なく、カポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列、ＨＩＶ  ｔａｔペプチド（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：１６０１０−１６０１７，  １９９７）、プロタミンの非毒性膜移行ペプチド（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９（１１）：１５５５−７，  ２００５）、ＣＨＡＲＩＯＴ（登録商標）輸送試薬（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ；  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，８４１，５３５）、および抗菌ペプチドＢｕｆｏｒｉｎ  ２を含む。
【００７５】
本発明に関する１つの実施形態では、治療上の利益を示すようにｍｉＲＮＡが送達される。本発明のｍｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで投与し、ＩＢＤなどの炎症性疾患を治療する方法はいくつかあり、これに限定されるものではないが、裸のｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡの接合および送達、リボソーム担体を介した送達、ポリマー担体の送達、ナノ粒子組成、プラスミドによる方法、ウイルスの利用を含む。
【００７６】
本発明のｍｉＲＮＡ組成は、被験者に投与するためのリポソームを含む送達媒体、担体および希釈剤およびその塩を有することができ、および／または薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。これは、ｍｉＲＮＡが細胞膜を貫通し、分解を逃れるために必要である可能性がある。核酸分子の送達法については、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  ２，  １３９；  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ｅｄ．  Ａｋｈｔａｒ，  １９９５，  Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．，  １６，  １２９−１４０；  Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  １９９９，  Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １３７，  １６５−１９２に報告されており、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．，  ７５２，  １８４−１９２；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ  ＷＯ  ９４／０２５９５では、さらに、核酸分子を送達する一般的方法について説明している。これらのプロトコールは、事実上すべての核酸分子の送達に利用することができる。
【００７７】
前記ｍｉＲＮＡの患者への投与頻度は、これに限定されるものではないが、治療する炎症性疾患の種類および重症度、投与経路、患者の年齢および全体的な健康状態、ｍｉＲＮＡの性質などを含む、いくつかの要因によって決まる。前記ｍｉＲＮＡの患者への投与頻度は、１ヵ月約１回から、１週間約１回、１日約１回、１日約数回まで異なると考えられる。
【００７８】
本発明の方法に有用な医薬品は、非経口、経口固体および液体製剤で全身投与するか、眼科用剤、坐剤、エアロゾル、局所製剤、または他の同様の製剤で投与することができる。前記適切なｍｉＲＮＡに加え、これらの医薬品は、薬物の投与を亢進および促すことが知られている、薬学的に許容される担体および他の成分を含むことができる。従って、そのような組成は選択的に、例えば、水酸化アルミニウムおよびマグネシウムの水性懸濁液といった補助剤、および／または食塩水など他の薬学的に許容される担体など、他の成分を含む。ナノ粒子、リポソーム、再封赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、および免疫学的系など、他の考えられる製剤を使用し、本発明の方法に従い、患者に適切なｍｉＲＮＡを投与することもできる。ｍｉＲＮＡを送達するためのナノ粒子の使用、および使用できる細胞膜透過性ペプチド担体については、Ｃｒｏｍｂｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｖ３５：ｐ４４  （２００７）に報告されている。
【００７９】
特異的に発現されたｍｉＲＮＡまたはその模倣体を有する医薬品を、例えば、経口または静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内、皮下、眼窩内、鼻腔内、関節包内、腹腔内（ｉ．ｐ．）、大槽内、気管内（ｉ．ｔ．）、または関節内などの非経口、または受動または促進吸収を含む様々な経路で被験者に投与することができることは、当業者の理解するところである。同じ投与経路を、例えば、上述の小さな分子、核酸分子、ペプチド、抗体、およびポリペプチドなどの他の薬学的に有用な化合物に利用することができる。
【００８０】
望ましい場合は、そのような特異的に発現されたｍｉＲＮＡまたは模倣体を有する医薬組成物もリポソーム、ミクロスフェア、微小気泡、または他のポリマー基質に組み込むことができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ｔｏ  ＩＩＩ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌａ．  （１９９３））。例えば、リン脂質または他の脂質から成るリポソームは、作成および投与が比較的簡単な、薬学的に許容でき、代謝可能な非毒性担体である。
【００８１】
ｍｉＲＮＡまたは模倣体分子を発現する発現ベクターでは、好ましくは構成的または調節性の強いプロモーターを利用する。そのようなプロモーターは当該分野で周知であり、これに限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６およびＨ１を含む（例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９：２５０２  ０９を参照）。
【００８２】
核酸分子は、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  １０，  １０６８−１０７４；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ  ０３／４７５１８号および第ＷＯ  ０３／４６１８５号を参照）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開第ＵＳ  ２００２１３０４３０号を参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着ミクロスフェア、またはタンパク性ベクター（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／５３７２２号）など、他の媒体に組み込むことで細胞に投与することができる。
【００８３】
陽イオン性脂質およびポリマーは、負電荷のｍｉＲＮＡまたは模倣体と複合体を形成することのできる、２種類の非ウイルスｍｉＲＮＡまたは模倣体送達系である。ｍｉＲＮＡを凝縮、保護するため、自己集合ＰＥＧ化ポリカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）も利用されてきた（Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：  １４１−１１０）。前記ｍｉＲＮＡまたは模倣体複合体をナノ粒子に凝縮し、前記ｍｉＲＮＡまたは模倣体をエンドサイトーシスにより効率的に取り込むことができる。また、プロタミンの核酸凝縮性を特異的抗体と組み合せることでｍｉＲＮＡまたは模倣体を送達し、本発明に利用することができる（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３：７０９−７１７）。
【００８４】
ｍｉＲＮＡを有する医薬組成物はエアロゾル製剤として投与することができ、この製剤には噴霧剤または溶媒と噴霧剤との混合物に溶解、懸濁、または乳化した形態で前記ｍｉＲＮＡを含む。前記エアロゾル製剤は、次に呼吸系または鼻腔に投与する。
【００８５】
炎症性疾患、特に前記疾患のより重症な形態に罹患した患者では、ｍｉＲＮＡの投与を、例えば、そのような疾患を治療する従来型の薬物または炎症プロセスに関与するタンパク質の発現または機能を調節する別のｍｉＲＮＡと併用投与とした場合に特に有用である可能性がある。当業者は、前記患者に示された臨床徴候および症状に基づき、単独、または第２の薬物またはｍｉＲＮＡとの併用でｍｉＲＮＡを投与し、ルーティンな方法によりそのような治療の有用性をモニターすることができる。
【００８６】
ｍｉＲＮＡは、例えば、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、およびブデソニドなどのコルチコステロイドを含むステロイド性抗炎症薬と併用投与することができる。ｍｉＲＮＡは、アスピリン（アセチルサリチル酸）、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、スリンダク、オキサプロジン、ジフルニサル、ブロムフェナク、ピロキシカム、エトドラク、およびフェノプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬と併用投与することもできる。ｍｉＲＮＡは、サイトカイン受容体の阻害薬または作動薬、サイトカインまたはその受容体に対する抗体、または免疫系シグナル伝達経路に作用する薬物など、他の免疫調節因子と投与することもできる。ｍｉＲＮＡが別の抗炎症薬と併用される場合、ｍｉＲＮＡと抗炎症薬のいずれかまたは両方を低用量で投与することができる。
【００８７】
ｍｉＲＮＡを１若しくはそれ以上の他の抗炎症薬と併用投与する場合、前記ｍｉＲＮＡおよび他の抗炎症薬は、同じ製剤で同時に投与することができる。代わりに、前記ｍｉＲＮＡおよび他の抗炎症薬は、別の製剤で同時に投与することもできる。前記医薬品の投与は、好ましくは「予防的に有効な量」または「治療上有効な量」（ただし、場合によっては、予防が治療と考えられる）とし、前記患者に利益を示すのに十分である。この量は、患者のＩＢＤ症状を予防、軽減、寛解し、またはその重症度を低下させる。
【００８８】
前記医薬品は、投与しやすく、投与量を均一にするため、投与単位に製剤化する。投与単位形態は、本明細書で使用するとおり、治療を受ける患者に適した医薬品の物理的に個別の単位を指す。各投与単位には、選択された薬学的担体と関連して望みの作用を生成するように計算された一定量の活性成分を含む必要がある。前記適切な投与単位を決定する方法は、当業者に周知である。
【００８９】
以下の材料と方法は、本発明を実施しやすくするために示す。
【００９０】
血清サンプル
小児ＣＤ患者および健常対照者の血清は、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｍ．Ｔ．およびＭ．Ｂ．Ｌ．）で施設内審査委員会により承認された研究の一環として得られ、ＣＤの診断はこれまでに報告されたとおり、標準的なパラメーターにより確認された（４７−４９）。疾患部位はモントリオール分類により定義した（５０）。ＣＤ活性は小児ＣＤ活性指標（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｒｏｈｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ：ＰＣＤＡＩ）により評価した（５１）。対照群は成長および栄養状態の研究のため募集し、身長および体格指数は正常で慢性疾患の既往はなかった。ＣＤ患者および対照の特徴は表１にまとめている。小児セリアック病の血清サンプルおよび対照はメリーランド大学医学部のＡｌｅｓｓｉｏ  Ｆａｓａｎｏ博士から入手した。溶血の根拠が確認されたサンプルは本研究から除外した。血清はＲＮＡを単離するまで−８０℃で保存した。
【００９１】
【表１】
2014500707.tif 000002
【００９２】
ＲＮＡの単離
製造業者の使用説明書に従い、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）を用いて、血清６０ｍＬから全ＲＮＡを単離した。外因性Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトｍｉＲＮＡを、血清が変性した直後に正規化の対照として加えた。ＲＮＡは、−８０℃で１００ｍＬの溶出液（９５℃）により溶出し、保存した。全ＲＮＡ製剤の品質は、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）により、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて確認した。
【００９３】
低密度アレイによるｍｉＲＮＡ分析
製造業者の使用説明書に従い、ＴａｑＭａｎヒトマイクロＲＮＡアレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を用いて血清ｍｉＲＮＡの内容量を定量した。逆転写（ＲＴ）生成物を事前に増幅し、アレイをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により処理、分析した。ｍｉＲＮＡ濃度は、ＲＮＡ単離時に等量で加えた外因性ヒト胎児特異的ｍｉＲＮＡ（プールＡのアレイではｍｉＲ−３０２ａおよびｍｉＲ−３７２、プールＢのアレイではｍｉＲ−３０２ｄ）に対して正規化し、アレイのばらつきをコントロールした（５２）。
【００９４】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の使用説明書に従い、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写およびｍｉＲＮＡアレイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＲＮＡ量１．３３μＬを逆転写し、増幅した。反応は２回ずつ行った。ｍｉＲＮＡ濃度は、ＲＮＡ単離時に加えたヒト配列（ｃｅｌｍｉＲ−５４およびｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８）と相同性のない２種類の外因性Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｉＲＮＡ濃度に対して正規化した（３６）。
【００９５】
酵素免疫抗体法
製造業者の使用説明書に従い、市販の酵素免疫抗体法キット（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖａｌｌｅｙ；ＡＬＰＣＯ、米国ニューハンプシャー州Ｓａｌｅｍ）を用いて対照およびＣＤ患者のＣＲＰおよびＡＳＣＡ  ＩｇＧの血清レベルを決定した。
【００９６】
統計解析
前記低密度アレイ（ＬＤＡ）実験から有意に変化したｍｉＲＮＡを、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、米国カリフォルニア州Ｓｔａｎｆｏｒｄ）を用いて同定した。他の統計計算はすべて、Ｓｔａｔａ  １１．０（ＳｔａｔａＣｏｒｐ、米国テキサス州Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ）を用いて行った。フィッシャーの直接確率検定、マン・ホイットニー検定、およびウィルコクソンの符号付順位和検定を用い、有意性を決定した。１２種類のＬＤＡサンプルすべてで検出された６８種類のｍｉＲＮＡを用い、階層的クラスター分析（ユークリッド距離（Ｌ２）を用いた完全連結法）を行った。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の解析を利用し、診断的有用性を決定した。ｍｉＲＮＡ間の相関は、スピアマンの相関を用いて決定した。
【００９７】
以下の例は、本発明を実施しやすくするために提供される。これらの例はいかなる方法でも、本発明を制限する意図はない。
【実施例１】
【００９８】
低密度アレイｑＲＴ−ＰＣＲを用いたＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡの発見
６６７種類の成熟ヒトｍｉＲＮＡを検出可能なマイクロ流体定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）のＬＤＡプラットホームを使用し、年齢および性別をマッチさせた健常対照群と比較し、活動性疾患を有するＣＤ患者の探索的コホート（１２．５±１．４歳、男児６７％、ＰＣＤＡＩ＝３２．５±８．４、ｎ＝６）におけるＣＤ関連ｍｉＲＮＡを特定した。階層的クラスター分析では、対照と比較したＣＤ患者の血清ｍｉＲＮＡプロフィールの変化が明らかになった（図１Ａ）。群による個別患者の血清ｍｉＲＮＡ値の差は、マイクロアレイの有意性解析により特定した（５４）。ＣＤ患者において、合計２４種類のｍｉＲＮＡが少なくとも５０％上昇し、偽発見率は６％であった。２４種類のｍｉＲＮＡのうち１０種類が発癌性を持つ３種類のパラロガスゲノムｍｉＲＮＡクラスター、つまり、ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５、およびｍｉＲ−１０６ａ−３６３（５５−５７）の構成要因であった。ＣＤ患者では、循環血液中ｍｉＲＮＡは有意に低下しなかった。ｑＲＴ−ＰＣＲにより直接確認するため、一連の１１種類のｍｉＲＮＡを選択した。３種類のパラロガスｍｉＲＮＡクラスターからそれぞれ１種類ずつ（ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−９３、およびｍｉＲ−１０６ａ）を含めた。前記アレイと個々のｑＲＴ−ＰＣＲの検証結果では良好な一致が観察された（図１Ｂ）。選択したｍｉＲＮＡのうち、１種類を除くすべてがＣＤ血清で少なくとも２．５倍と有意に増加した（図１Ｃ）。
【００９９】
独立したサンプルセットにおけるＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡの確認
ＣＤ患者と対照群との血清ｍｉＲＮＡ濃度の差を確認するため、人口統計学的特徴および疾患の特徴が探索的コホートと同等のＣＤ新規発生例のより大規模で明確な群（ｎ＝４６）、および対照被験者（ｎ＝４６）において、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った（表１）。対照群と比較し、ＣＤ患者の血清では、選択した１１種類のｍｉＲＮＡそれぞれがＰ<０．０００１で有意に上昇していた（２．７〜８．７倍の範囲）（表２）。ｍｉＲ−１０６ａおよびｍｉＲ−４８４の結果が図２Ａに示されている。ｍｉＲＮＡ値または白血球数または赤血球数の間に関連性は認められず、ｍｉＲＮＡ値の変化は単に血液学的変化を反映しているのではないことを示している。ｍｉＲＮＡ値もアルブミン濃度、赤血球沈降速度、またはＣＲＰ値と関連していなかった（データ図示せず）。
【０１００】
ＣＤの血清は健常対照患者の血清と比較したため、あらゆる種類の腸炎時に観察された一連のｍｉＲＮＡの上昇が起こる可能性がある。この可能性を取り上げるため、活動性セリアック病小児およびセリアック病に罹患していない、年齢、人種、および性別をマッチさせた対照群の血清において、ｍｉＲＮＡ値を測定した（表３）。ＣＤの血清で上昇していた一連のｍｉＲＮＡ  １１種類はすべて、健常対照者と比較し、セリアック病患者の血清では変化していなかった（表２および図２Ａ）。データからは、活動性セリアック病には近位小腸粘膜の炎症による障害が関与しているため、ＣＤと関連した循環血液中のｍｉＲＮＡ値上昇は、腸管炎症および破壊後の一般的な結果ではないことが示唆される。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
スピアマンの順位相関では、各ＣＤ関連ｍｉＲＮＡに他のＣＤ関連ｍｉＲＮＡそれぞれと正の相関が認められる（Ｐ<０．０００１）ことが明らかとなった。前記ｍｉＲＮＡの中で、最もｍｉＲＮＡ−ｍｉＲＮＡ相関が強かったのは（ｒ＝０．９８３）、それぞれｍｉＲ−２０ａとｍｉＲ−１０６ａ、パラロガスクラスターの構成要因ｍｉＲ−１７−９２とｍｉＲ−１０６ａ−３６３であり、一方、相関が最も弱かったのは（ｒ＝０．７０９）、ｍｉＲ−１９２とｍｉＲ−４８４であった。対照的に、ＣＤ関連ｍｉＲＮＡ濃度は、ＰＣＤＡＩスコアで決定される疾患活動性とは関連していなかった。興味深いことに、食道疾患の関与は８種類のＣＤ関連ｍｉＲＮＡの血清濃度が高いことと有意に関連していた（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９２、およびｌｅｔ−７ｂを除くすべて、Ｐ<０．０５）。
【０１０４】
ＣＤのバイオマーカーとしての循環血液中ｍｉＲＮＡの臨床成績
ＣＤ関連ｍｉＲＮＡの診断的有用性を評価するため、その受信者動作特性を決定した。ＲＯＣ曲線からは、前記ＣＤ関連ｍｉＲＮＡが有望な診断特性を有し、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）値は０．８２〜０．９２（表４および図２Ｂ）、感度は７０％〜８３％、特異度は７５％〜１００％あることが明らかとなった（表５）。これらの値は、標準的な診断閾値を用い、赤血球沈降速度の値およびＣＲＰ、ＡＳＣＡ  ＩｇＧ、およびアルブミンの血清値と比べても遜色がなかった。
【０１０５】
ＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡ濃度は投与により変化するか否かを決定するため、診断時および６ヵ月後の時点で、人口統計学的データおよび疾患重症度の点から、我々の大規模コホートと同様の新規発生ＣＤ患者２４例の血清を分析した。ベースラインから６ヵ月までに、ＰＣＤＡＩスコアの中央値は有意に低下した（Ｐ<０．００１）。６ヵ月の研究のための診察の時点で、この間隔に投与した薬物と治験被験者の割合は、全身ステロイド１６（６７％）、メトトレキセート１（４％）、６−メルカプトプリンまたはアザチオプリン１０（４２％）、およびインフリキシマブ２（８％）であった。ｍｉＲ−４８４濃度とｍｉＲ−１９５濃度には有意な減少が観察された（図３）。他の一連のｍｉＲＮＡはすべて、投与後も有意な変化を示さなかったが、ほとんどは低下する傾向があった（図３Ｂ）。一連のｍｉＲＮＡ濃度およびＰＣＤＡＩスコアの変化には有意な関連性がなかった。これらの結果は、ＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡが、治療介入に対する反応のマーカーを提供することを示している。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
内部標準ｍｉＲＮＡを用いた、ＣＤと関連した循環血液中ｍｉＲＮＡの分析
バイオマーカーとして循環血液中ｍｉＲＮＡを臨床的に利用することの１つの障害は、その細胞がない性質に由来する。細胞ｍｉＲＮＡのアッセイでは、様々な「ハウスキーピング」ＲＮＡ種を一般的に用い、組織重量、ＲＮＡ収量、または品質の差を補正する。循環血液中ｍｉＲＮＡのアッセイではそのような内部標準がないため、我々の初期アッセイでは、２種類の人工Ｃ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｉＲＮＡをＲＮＡ精製時に加え、代理標準として用いた（患者と方法を参照）。しかし、我々のＬＤＡ分析では、ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−３４２−３ｐがＣＤ患者と対照に同等レベルで存在することが認められた。従って、我々は、これらを内部標準ｍｉＲＮＡとして使用できるか否かを検討した。内因性標準ｍｉＲＮＡを用いて得られた結果は、外因性標準ｍｉＲＮＡを用いて得られた結果とほぼ同一であった。これらの結果は、今後の研究では外因性ｍｉＲＮＡの利用を排除できることを示している。
【０１０９】
考察
循環血液中ｍｉＲＮＡは、最近、疾患、特に癌のバイオマーカー候補として浮上した（３６，３７，３９，５８）。本研究は、小児ＣＤの非侵襲的バイオマーカーとしての循環血液中ｍｉＲＮＡの可能性を証明した初の研究である。マイクロ流体ｑＲＴ−ＰＣＲアレイによるＣＤ患者の初期スクリーニングでは、健常対照者と比較し、血清ｍｉＲＮＡプロフィールが有意に変化していることを特定した。その後、これらの所見は、はるかに大きな症例および対照セットにおいて妥当性が確認された。
【０１１０】
ＣＤの血清で有意に変化していた２４種類のｍｉＲＮＡはすべて上昇した。ＩＢＤの発症機序は、炎症のシグナル伝達、腸のリンパ球浸潤、および上皮細胞の障害が関与した複雑なプロセスである。これらの各プロセスにより、循環血液中ｍｉＲＮＡ濃度が上昇する可能性がある。例えば、炎症シグナル伝達の過程で分泌されたエキソソームは、血液循環に特異的ｍｉＲＮＡを運ぶ。腸は非常に血管に富んだ臓器であるため、固有層中の活性化リンパ球が循環血液中ｍｉＲＮＡに寄与している可能性がある。さらに、心臓または肝臓の損傷で組織ｍｉＲＮＡに観察された事象と同様、腸管上皮の損傷により、血液循環中の上皮特異的ｍｉＲＮＡが増加する可能性がある（３９，５９）。例えば、我々は、ＣＤでは循環血液中のｍｉＲ−１９２が上昇し、ｍｉＲ−１９２は腸管上皮で最も多く発現されたｍｉＲＮＡであることも発見した（３１）。
【０１１１】
ＣＤにおける腸のｍｉＲＮＡ濃度に関する研究では、Ｗｕら（３５）がアップレギュレートされているｍｉＲＮＡをいくつか同定し、これには我々が報告したｍｉＲＮＡのうち４種類（ｍｉＲ−１６、−２０ａ、−２１、および−１０６ａ）が含まれている。Ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ１６、およびｍｉＲ−２１は、ヒト樹状細胞で多く発現され、ＣＤの慢性炎症の一因となっている可能性がある（６０，６１）。対照的に、内部標準のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−３４２−３ｐ）は、腸管上皮に検出されない（６２）。一連のｍｉＲＮＡの中で単一の細胞タイプに限定されているものはないが、それでもこれらは互いに大きく関連しており、ＣＤが炎症および腸炎をいずれも反映する特定の循環血液中ｍｉＲＮＡの特徴と関連している可能性があることを示唆している。
【０１１２】
この患者集団では、現在のマーカーはスクリーニングツールとしては最適ではないことが根拠から示されているが、ＩＢＤが疑われる小児の診断には血清学的検査が利用されることが多く、感度は５５％〜７１％の範囲であることが報告された（６３−６５）。従って、ＣＤの診断は最終的に組織病理学的根拠から行う必要があるが、改良された非侵襲的検査を導入することで、症状の発症と最終的な診断とのギャップを埋める役に立ち、早期治療が可能となる可能性がある。逆に、スクリーニング検査の結果が陰性であれば、不必要な内視鏡検査／結腸内視鏡検査を減らす役に立つ可能性がある。
【０１１３】
ここで検討した血清ｍｉＲＮＡは、有望な診断的有用性を示し、一部の標準的血清学的マーカーと比較して好ましい性能を示した。健常対照者と比較し、ＭｉＲ−４８４およびｌｅｔ−７ｂそれぞれの感度は８０％を超え、３種類は特異度が９０％を超えていた。さらに、一連のｍｉＲＮＡそれぞれは、年齢、人種、および性別をマッチさせた対照群と比較し、セリアック病患者の血清で変化がなく、これらのｍｉＲＮＡは、一般に単純な腸炎の指標というより、ＩＢＤまたはＣＤに特異的であることを示唆していた。この所見は、非ＩＢＤ腸疾患に存在することが多い、現在のＩＢＤ血清学的マーカーと対比される。例えば、ＡＳＣＡは高い割合のセリアック病患者で検出されるが、核周囲の抗好中球細胞質抗体もセリアック病または顕微鏡的大腸炎に存在する可能性がある（９，１２，１３）。
【０１１４】
一度ＩＢＤと診断されると、成人および小児患者のいずれにおいても、現在のＣＤの血清学的マーカーは疾患の活動性または転帰とあまり関連していないため、限定的にしか利用されていない（６６，６７）。循環血液中ｍｉＲＮＡに関する研究では、より動的なバイオマーカーであることが示唆され、例えば、心臓で最も豊富に発現されているｍｉＲＮＡである血漿ｍｉＲ−１濃度（６８）は、急性心筋梗塞と診断された時点で上昇し、退院時までに正常に戻る（３８）。同様に、腫瘍細胞から放出されるｍｉＲＮＡは、循環血液中ｍｉＲＮＡ濃度を有意に変化させる可能性があり、循環血液中ｍｉＲＮＡ濃度は腫瘍の切除後は正常化する（４２，６９，７０）。我々は、６ヵ月の治療後、血清ｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−１９５濃度は診断時に観察された濃度から有意に低下することを見出した。一連のｍｉＲＮＡ濃度の低下は、ＰＣＤＡＩスコアの改善と有意に関連していなかった。しかし、臨床スコア化システム、また他の代理マーカーとして、血清ｍｉＲＮＡは正確に粘膜レベルで改善を示し、粘膜治癒とはあまり関連していない可能性が依然としてある（７１，７２）。
【０１１５】
まとめると、この予備的研究では、小児ＣＤ患者の血清で多数のｍｉＲＮＡが有意に上昇していることを特定した。これらのＣＤ関連ｍｉＲＮＡは、有望な臨床的有用性を見せている。従って、循環血液中ｍｉＲＮＡ、および他のＣＤの臨床検査マーカーおよび遺伝的マーカーを決定することで、全体的にＩＢＤ、特にＣＤの感度と特異度が改善した複合モデルができる。
【０１１６】
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【０１１７】
本発明の好適な実施例のいくつかは上述し、具体的に例示してきたが、本発明をそのような実施例に限定する意図はない。以下の請求項に示すとおり、本発明の範囲と精神から離れずに、そこに様々な修正を加えることができる。
【図１Ａ】
2014500707.tif 000007
【図１Ｂ】
2014500707.tif 000008
【図１Ｃ】
2014500707.tif 000009
【図２Ａ】
2014500707.tif 000010
【図２Ｂ】
2014500707.tif 000011
【図３Ａ】
2014500707.tif 000012
【図３Ｂ】
2014500707.tif 000013
【国際調査報告】
2014500707.tif 000014
2014500707.tif 000015
2014500707.tif 000016