(57)【要約】  本明細書は、イソブチレートを再生可能に生成するための細胞及び方法を開示する。いくつかの場合において、細胞は、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒する少なくとも１つの酵素をコードする異種ＤＮＡを含むことができる。他の場合において、細胞は、酵素の野生型バージョンよりも大幅にイソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒する遺伝子的に改変された酵素を含むことができる。他の場合において、細胞は、２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する１つ以上の酵素を含むことができる。一般的に、方法は、細胞がイソブチレートに変換することができる炭素源を含む培地において細胞を生育することを含む。
2014506466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型対照と比較して、増加したイソ酪酸の生合成を示すために改変された組み換え微生物細胞。
【請求項２】
前記細胞が、真菌細胞である、請求項１に記載の組み換え微生物細胞。
【請求項３】
前記真菌細胞が、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項４】
前記真菌細胞が、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２に記載の組み換え細胞。
【請求項５】
前記細胞が、細菌細胞である、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項６】
前記細菌細胞が、プロトバクテリア門（ｐｈｙｌｕｍ Ｐｒｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーである、請求項５に記載の組み換え細胞。
【請求項７】
前記細菌細胞が、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項６に記載の組み換え細胞。
【請求項８】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の組み換え細胞。
【請求項９】
前記細菌細胞が、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項６に記載の組み換え細胞。
【請求項１０】
前記細菌細胞が、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、請求項９に記載の組み換え細胞。
【請求項１１】
前記細菌細胞が、ファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のメンバーである、請求項５に記載の組み換え細胞。
【請求項１２】
前記細菌細胞が、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１３】
前記細菌細胞が、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１２に記載の組み換え細胞。
【請求項１４】
前記細菌細胞が、ストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
前記細菌細胞が、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）である、請求項１４に記載の組み換え細胞。
【請求項１６】
イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項１７】
前記イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドが、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項１６に記載の組み換え細胞。
【請求項１８】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＰａｄＡ）を含む、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項１９】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＢ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＨ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コハク酸セミアルデヒドデヒロドゲナーゼ（ＧａｂＤ）、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）γ‐アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ）を含む、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項２０】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、Ｂ．アンビファリア（Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨba）を含む、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項２１】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨpp）を含む、請求項１７に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンをさらに含み、ここで前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２３】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドがアルコールデヒロドゲナーゼを含む、請求項２２に記載の組み換え細胞。
【請求項２４】
前記アルコールデヒロドゲナーゼが、遺伝子的に改変されたａｄｈＥ又は遺伝子的に改変されたａｄｈＰによってコードされるポリペプチドを含む、請求項２３に記載の組み換え細胞。
【請求項２５】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、エタノールアミン利用タンパク質を含む、請求項２２に記載の組み換え細胞。
【請求項２６】
前記エタノールアミン利用タンパク質が、遺伝子的に改変されたｅｕｔＧによってコードされるポリペプチドを含む、請求項２５に記載の組み換え細胞。
【請求項２７】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、遺伝子的に改変されたｙｉａＹ、遺伝子的に改変されたｙｑｈＤ、又は遺伝子的に改変されたｙｉｇＢによってコードされるポリペプチドを含む、請求項２２に記載の組み換え細胞。
【請求項２８】
前記触媒活性の低下が、野生型と比較して、少なくとも５０％低下を含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項２９】
２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する経路のメンバーであるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含む、請求項１、２又は５に記載の組み換え細胞。
【請求項３０】
前記２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する経路のメンバーであるポリペプチドが、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項２９に記載の組み換え細胞。
【請求項３１】
前記２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する経路のメンバーであるポリペプチドが、チオエステラーゼを含む、請求項３０に記載の組み換え細胞。
【請求項３２】
前記チオエステラーゼが、ＴｅｓＡ又はＴｅｓＢを含む、請求項３１に記載の組み換え細胞。
【請求項３３】
前記細胞が、ピルビン酸の、乳酸塩、ギ酸塩、及び酢酸塩の任意の１つ以上への変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンをさらに含み、ここで遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型のポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項３４】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、乳酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項３３に記載の組み換え細胞。
【請求項３５】
前記乳酸デヒドロゲナーゼが、遺伝子的に改変されたｌｄｈＡによってコードされるポリペプチドを含む、請求項３４に記載の組み換え細胞。
【請求項３６】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、ピルビン酸ギ酸リアーゼＩを含む、請求項３３に記載の組み換え細胞。
【請求項３７】
前記ピルビン酸ギ酸リアーゼＩが、遺伝子的に改変されたｐｆｌＢによってコードされるポリペプチドを含む、請求項３６に記載の組み換え細胞。
【請求項３８】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、ピルビン酸オキシダーゼを含む、請求項３３に記載の組み換え細胞。
【請求項３９】
前記ピルビン酸オキシダーゼが、遺伝子的に改変されたｐｏｘＢによってコードされるポリペプチドを含む、請求項３５に記載の組み換え細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、アセチル‐ＣｏＡのエタノール又はアセチル‐Ｐへの変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンをさらに含み、ここで前記遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドが、野生型のポリペプチドを比較して、触媒活性の低下を示す、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項４１】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項４０に記載の組み換え細胞。
【請求項４２】
前記アルコールデヒドロゲナーゼが、遺伝子的に改変されたａｄｈＥによってコードされるポリペプチドを含む、請求項４１に記載の組み換え細胞。
【請求項４３】
前記遺伝子的に改変されたポリペプチドが、リン酸アセチルトランスフェラーゼを含む、請求項４０に記載の組み換え細胞。
【請求項４４】
前記リン酸アセチルトランスフェラーゼが、遺伝子的に改変されたｐｔａによってコードされるポリペプチドを含む、請求項４３に記載の組み換え細胞。
【請求項４５】
２‐ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドをさらに含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、２‐ケト酸デカルボキシラーゼを含む、請求項４５に記載の組み換え細胞。
【請求項４７】
ピルビン酸の２‐ケトイソ吉草酸への変換を連続して触媒する複数のポリペプチドをさらに含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の組み換え細胞。
【請求項４８】
前記複数のポリペプチドが、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、及びアセト乳酸シンターゼの１つ以上を含む、請求項４７に記載の組み換え細胞。
【請求項４９】
イソブチレートを生成するために組み換え細胞に有効な条件下、炭素源を含む培地において、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の組み換え細胞をインキュベートすることを含む方法であって、ここで前記炭素源が、グルコース、図１の化合物６、図１の化合物７、図１の化合物８、図１の化合物９、及び図１の化合物１０の１つ以上を含む、方法。
【請求項５０】
改変された宿主細胞が、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結した、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入することを含む方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記真菌細胞が、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記真菌細胞が、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、細菌細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌細胞が、プロトバクテリア門（ｐｈｙｌｕｍ Ｐｒｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌細胞が、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細菌細胞が、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記細菌細胞が、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細菌細胞が、ファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のメンバーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細菌細胞が、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細菌細胞が、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細菌細胞が、ストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のメンバーである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記細菌細胞が、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記宿主細胞が、請求項１６〜４８のいずれか１項以上の組み換え細胞を含む、請求項５０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
イソブチレートを他の化合物に変換する１つ以上のステップをさらに含む、請求項４９〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
イソブチルアルデヒドをイソブチレートに変換する能力を増加するために改変された少なくとも１つの内因性酵素を含む、遺伝子的に改変された微生物細胞。
【請求項６８】
前記改変された酵素が、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒する、請求項６７に記載の遺伝子的に改変された微生物細胞。
【請求項６９】
前記改変された酵素が、高レベルのイソブチレートを含む環境に耐えるための細胞能力を増加する、請求項６７に記載の遺伝子的に改変された微生物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１１年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４１，９３９号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
イソ酪酸（また、本明細書において「イソブチレート（ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ）」という）は、繊維、樹脂、プラスチック、及び染料の製造に使用され、そして医薬品、化粧品、及び食品添加物の製造における中間体として使用される。イソ酪酸は、また、さらに、汎用化学品であるメタクリレート（すなわち、メタクリル酸‐ＭＡＡ）に変換することができる。
【０００３】
ＭＡＡは、しばしば、プラスチックの製造において使用される主な汎用品、ＭＭＡ（メチルメタクリレート）にエステル化される。ＭＭＡは、しばしば、ポリメチルメタクリレートプラスチックを製造するために使用されるだけでなく、例えば、エチレンメタクリレート（ＥＭＡ）、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、アクリル酸ドープ、接着剤、イオン交換樹脂、革処理薬品、潤滑添加剤、及び架橋剤を製造するために使用される。従来の化学合成技術を介して、ＭＡＡを生成するための多くの経路がある。大部分の経路は、原料として天然ガス又は原油のいずれかで開始する。
【０００４】
再生可能原料から汎用化学品を製造する新規方法が必要である。再生可能材料から汎用化学品を製造することは、非再生可能原料の消費の経済的影響の可能性を減らし、そして再生可能原料を提供して経済発展に拍車をかけることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様では、本発明は、野生型対照と比較して、イソ酪酸の増加した生合成を示す改変された組み換え微生物細胞を提供する。いくつかの場合において、組み換え微生物細胞は、真菌細胞、例えば、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のメンバー、例えば、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。他の場合において、組み換え細胞は、細菌細胞、例えば、プロテオバクテリア門（ｐｈｙｌｕｍ Ｐｒｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバー、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、又はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））である。他の場合において、組み換え細胞は、細菌細胞、例えば、ファーミキューテス門のメンバー、例えば、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））である。
【０００６】
いくつかの実施態様では、組み換え微生物細胞は、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含む。
【０００７】
いくつかの場合、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドは、アルデヒドデヒロドゲナーゼ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＰａｄＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＢ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＨ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧａｂＤ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）γ‐アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ）、Ｂ．アンビファリア（Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨba）、又はＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨpp）を含む。
【０００８】
いくつかの実施態様では、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドは、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドを含む。他の実施態様では、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドは、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０００９】
いくつかの実施態様では、異種ＤＮＡ分子は、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。他の実施態様では、異種ＤＮＡ分子は、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。
【００１０】
さらに他の実施態様では、組み換え細胞は、２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する経路のメンバーであるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含むことができる。これらの実施態様では、２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する経路のメンバーであるポリペプチドは、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施態様では、２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒する経路のメンバーであるポリペプチドは、チオエステラーゼを含む。これらの実施態様では、チオエステラーゼは、ＴｅｓＡ又はＴｅｓＢを含むことができる。
【００１１】
他の態様では、本発明は、イソブチルアルデヒドをイソブチレートに変換するための能力を増加するために改変された少なくとも１つの内在性酵素を含む遺伝子的に改変された細胞を提供する。いくつかの場合において、改変酵素は、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒する。他の場合において、改変酵素は、高レベルのイソブチレートを含む環境に耐えるための細胞の能力を増加する。
【００１２】
組み換え微生物細胞又は遺伝子的に改変された微生物細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、さらに、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変したバージョンを含み、ここで、遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の減少を示す。いくつかの場合において、遺伝子的に改変したポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変したａｄｈＥ又は遺伝子的に改変したａｄｈＰによりコードされるポリペプチドを含む。他の場合において、遺伝子的に改変したポリペプチドは、エタノールアミン利用タンパク質（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えば、遺伝子的に改変したｅｕｔＧによりコードされるポリペプチドを含む。さらに他の場合において、遺伝子的に改変したポリペプチドは、遺伝子的に改変したｙｉａＹ、遺伝子的に改変したｙｑｈＤ、又は遺伝子的に改変したｙｉｇＢによりコードされるペプチドを含む。
【００１３】
組み換え微生物細胞又は遺伝子的に改変された微生物細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、さらに、ピルビン酸の、乳酸塩、ギ酸塩、及び酢酸塩のいずれか１つ以上への変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンを含み、ここで、遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す。いくつかの場合において、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、乳酸デヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変したｌｄｈＡによりコードされるポリペプチドを含む。他の場合において、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、ピルビン酸ギ酸リアーゼＩ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｆｌＢによりコードされるポリペプチドを含む。他の場合において、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、ピルビン酸オキシダーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｏｘＢによりコードされるポリペプチドを含む。
【００１４】
組み換え微生物細胞又は遺伝子的に改変された微生物細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、さらに、アセチル‐ＣｏＡのエタノール又はアセチル‐Ｐへの変換を触媒するポリペプチドの遺伝子的に改変されたバージョンを含み、ここで、遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す。いくつかの場合において、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたａｄｈＥによりコードされるポリペプチドを含む。他の場合において、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｔａによりコードされるポリペプチドを含む。
【００１５】
組み換え微生物細胞又は遺伝子的に改変された微生物細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、さらに、２‐ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒド、例えば、２‐ケト酸デカルボキシラーゼへの変換を触媒するポリペプチドを含む。
【００１６】
組み換え微生物細胞又は遺伝子的に改変した微生物細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、さらに、ピルビン酸の２‐ケトイソ吉草酸、例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、及びアセト乳酸シンターゼへの変換を順次触媒する多数のポリペプチドを含む。
【００１７】
他の態様では、本発明は、イソブチレートを製造するために細胞に有効な条件下、炭素源を含む培地において、本明細書中に記載したような組み換え細胞又は遺伝子的に改変された細胞をインキュベートすることを含む方法を提供し、ここで、炭素源は、グルコース、図１の化合物６、図１の化合物７、図１の化合物８、図１の化合物９、及び図１の化合物１０の１つ以上を含む。いくつかの場合において、本方法は、さらに、イソブチレートを他の化合物に変換するための１つ以上のステップを含む。
【００１８】
他の態様では、本発明は、改変された宿主細胞がイソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するために、宿主細胞内に、プロモーターと作動可能に連結した、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを導入することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の上記要約は、本発明の開示されたそれぞれの実施態様又はすべての実施を説明することを意図していない。より具体的には、以下の説明は、例示的な実施態様を例示している。本出願中のいくつかの箇所において、アドバイスを例のリストを通じて提供し、そして例は、さまざまな組み合わせに使用することができる。それぞれの場合において、記載されたリストは、代表的なグループとしてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、石油化学原料からのイソ酪酸の化学合成及びその代表的な応用である（ａ）。図１は、再生可能な炭素源グルコースからのイソ酪酸の生合成のための代謝経路の設計である（ｂ）。酵素「Ｘ」は、イソブチルアルデヒド（１０）からイソ酪酸（１）に効率的に変換する。
【図２】図２は、合成代謝経路を有するイソ酪酸の生合成である。図２は、イソ酪酸に向かって炭素フラックスを駆動する遺伝子過剰発現のための２つの合成オペロンの構築物である（ａ）。異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼを有する生成レベル：（ｉ）アルデヒドデヒロドゲナーゼなし；（ｉｉ）ａｌｄＢ；（ｉｉｉ）ａｌｄＨ；（ｉｖ）ｇａｂＤ；（ｖ）ｋｄｈba；（ｖｉ）ｋｄｈpp；（ｖｉｉ）ｐａｄＡ；（ｖｉｉｉ）ｙｄｃＷである（ｂ）。
【図３】図３は、生合成上の競争経路の除去効果である。内在性アルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、ｙｑｈＤは、イソブチルアルデヒドに関して、ＰａｄＡと競争し、そして副産物であるイソブタノールを生成する（ｂ）。ｙｑｈＤノックアウトは、イソ酪酸生成が非常に増加し、そしてイソブタノールレベルが減少する。
【図４】図４は、ｐＩＢＡ１のプラスミドマップである。
【図５】図５は、ｐＩＢＡ３のプラスミドマップである。
【図６】図６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるイソブチレート合成経路である。略語：ＡｌｓＳは、アセト酪酸シンターゼ；ＩｌｖＣは、２，３‐ジヒドロキシ‐イソ吉草酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ；ＩｌｖＤは、２，３‐ジヒドロキシ‐イソ吉草酸デヒドラターゼ；ＫＩＶＤは、α‐ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ；ＰａｄＡは、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【図７】図７は、振盪フラスコにおけるイソブチレート発酵のアルコールデヒドロゲナーゼノックアウトの影響である。異なるノックアウト株におけるイソブチレート産物である（Ａ）。対応するノックアウト株におけるイソブタノール形成である（Ｂ）。（ｉ）ＩＢＡ１‐１Ｃ，ΔｙｑｈＤ；（ｉｉ）ＩＢＡ１１‐１Ｃ，ΔｙｑｈＤΔａｄｈＥ；（ｉｉｉ）ＩＢＡ１２‐１Ｃ，ΔｙｑｈＤΔａｄｈＰ；（ｉｖ）ＩＢＡ１３‐１Ｃ，ΔｙｑｈＤΔｅｕｔＧ；（ｖ）ＢＩＡ１４‐１Ｃ，ΔｙｑｈＤΔｙｉａＹ；（ｖｉ）ＩＢＡ１５‐１Ｃ，ΔｙｑｈＤΔｙｊｇＢである。
【図８】図８は、振盪フラスコにおけるイソブチレート産物のＰａｄＡ発現レベルの影響である。ＰａｄＡの２つのコピーを有する異なるノックアウト株におけるイソブチレートレベルである（Ａ）。対応するイソブタノール形成である（Ｂ）。（ｉ）ＩＢＡ１‐２Ｃ，ΔｙｑｈＤ；（ｉｉ）ＩＢＡ１３‐２Ｃ，ΔｙｑｈＤΔｅｕｔＧ；（ｉｉｉ）ＩＢＡ１４‐２Ｃ，ΔｙｑｈＤΔｙｉａＹ；（ｉｖ）ＩＢＡ１５‐２Ｃ，ΔｙｑｈＤΔｙｊｇＢである。
【図９】図９は、バイオリアクターにおける半回分培養によるイソブチレートのスケールアップ発酵である。５０％ＮＨ4ＯＨ；ＩＢＡ１５‐２Ｃ株（Ａ）。１０Ｎ ＮａＯＨ；ＩＢＡ１５‐２Ｃ株（Ｂ）。２０％Ｃａ（ＯＨ）2懸濁液；ＩＢＡ１５‐２Ｃ株（Ｃ）。２０％Ｃａ（ＯＨ）2懸濁液；ＩＢＡ１‐２Ｃ株（Ｄ）。記号：黒四角形は、バイオマス；黒三角形は、酢酸塩；白丸は、イソブチレートである。
【図１０】図１０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるイソブチレート合成経路である。略号：ＡｌｓＳは、アセト酪酸シンターゼ；ＩｌｖＣは、２，３‐ジヒドロキシ‐イソ吉草酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ；ＩｌｖＤは、２，３‐ジヒドロキシ‐イソ吉草酸デヒドラターゼ；ＢＫＤＨは、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ；ＴｅｓＡは、チオエステラーゼＡ；ＴｅｓＢ、チオエステラーゼＢである。
【図１１】図１１は、ｐＩＢＡ１６のプラスミドマップである。
【図１２】図１２は、ｐＩＢＡ１７のプラスミドマップである。
【図１３】図１３は、ｐＩＢＡ１８のプラスミドマップである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
イソ酪酸は、多くのそしてさまざまな用途を有する基本骨格化学物質である。イソ酪酸を製造するための現在のプロセスは、非再生可能、非持続的石油原料及び／又は有害物質の使用を含む。天然生物は、商業的にかなりの量のイソ酪酸を製造することができない。本発明者等は、しかしながら、再生可能原料、例えば、グルコースからイソ酪酸の高レベルの生合成のための合成代謝経路を有する組み換え細胞を構築した。従って、本発明者等は、石油に依存しないイソ酪酸を合成するための新規経路を提供する。本発明者等は、さらに、イソ酪酸を合成するための新規組み換え微生物を提供する。
【００２２】
以下の説明で使用される用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、列挙した要素の１つ又はすべて又は列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味し；用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲において出現する場所において、限定的な意味を有さず；特別の定めのない限り、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、同義的に使用され、そして１つ又は２以上を意味し；そしてエンドポントによる数字上の範囲の列挙は、範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００２３】
化石ベースの資源は、一般的にエネルギー及び化学原料として利用される。石油埋蔵量の枯渇が原因で、石油ベース製品の代替品の探究についての関心が高まっている。生合成は、再生可能炭素源から特定の燃料又は特定の化学物質の持続可能な製造を可能にする有望なアプローチである（Atsumiら、2008 Nature 451:86-89; Steenら、2010 Nature 463:559-562; Causeyら、2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:825-832; Linら、2005 Metab. Eng. 7:116-127; Zeng及びBiebl, 2002 Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2002:239-259; Alperら、2005 Nat. Biotechnol. 23:612-616）。１つの課題は、多くの有用な化学物質が、生体系から天然に生成されないことである。従って、非天然代謝物の生成のために、新規代謝経路を設計し又は発展することがしばしば必要である（Zhaら、2004 J. Am. Chem. Soc. 126:4534-4535; Zhangら、2008 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:20653-20658; Yanら、2005 Appl. Environ. Microbiol. 71:3617-3623; Zhangら、2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:6234-6239）。本明細書において、本発明者等は、イソ酪酸を製造するための生合成経路の開発を報告する。
【００２４】
イソ酪酸（図１（ａ））、化合物１）は、基本骨格化学物質に有用である。それは、触媒酸化脱水素によってメタクリル酸（図１（ａ）、化合物２）に変換することができる（Millet, 1998 Catal. Rev.-Sci. Eng. 40:1-38）。メタクリル酸、メタクリル酸メチルのエステルは、ポリ（メタクリル酸メチル）の合成のために、年間２．２百万トンの量で製造される（Nagai, 2001 Appl. Catal. A-Gen. 221:367-377）。イソ酪酸は、また、年間１００，０００トンの市場規模を有する印刷用インク、自動車用塗料、及び飲料添加物に使用される乳化剤である、スクロースアセテートイソブチレート（図１（ａ））、化合物３）を製造するために使用することができる（Godshal, ''Sustainable of the Sugar and Sugar-Ethanol Industries," ACS Symposium Series 1058; American Chemical Society: Washington, DC, 2010; pp 253-268）。イソ酪酸の他の用途は、２，２，４‐トリメチル‐１，３‐ペンタンジオール モノイソブチレート（図１（ａ）、化合物４；TEXANOL, Eastman Chemical Co., Kingsport, TN）又はジイソブチレート（ＴＸＩＢ）のためである。ＴＸＩＢは、非フタル酸可塑剤であり、そしてＴＥＸＡＮＯＬは、一般的に使用される造膜助剤（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｔ）である（"Screening Information Date Set (SIDS) for High Production Volume Chemicals," Organization for Economic Cooperation and Development 2005）。イソ酪酸の他の代表的な用途は、脱炭酸的カップリングによる、イソプロピルケトン、例えば、イソブチロン（図１（ａ）、化合物５）の調製を含む（例えば、米国特許第４，７５４，０７４号を参照）。
【００２５】
イソ酪酸の１つの現在の製造プロセスは、プロピレンの酸触媒コッホ（Ｋｏｃｈ）カルボニル化を含む（図１（ａ）；例えば、米国特許第４，４５２，９９９号を参照）。この化学プロセスは、少なくとも２つの懸念を生じる。第一に、出発材料プロピレンは、通常、非再生可能資源、例えば、石油及び天然ガスに由来するより大きな炭化水素分子を分解することにより製造され、そしてその長期の持続可能な供給は、保証されない。第二に、一酸化炭素及びフッ化水素の使用は、環境破壊を引き起こすかもしれない。そのような問題は、化学合成を微生物生合成に置き換えることにより、軽減することができる。
【００２６】
酪酸を過剰生成することができるいくつかの細菌が存在するが（Liuら、2006 Enzyme Microb. Technol. 38:521-528）、天然生物が、商業的に有用な量のイソ酪酸を生成することは知られていない。本発明者等は、例えば、グルコースからイソブチルアルデヒドを生成するための天然の代謝経路に基づいた合成代謝経路を開発した。天然の代謝経路は、イソブチレート（例えば、図１（ｂ）及び図１０）の生成に向かって、この天然の代謝経路を迂回させる少なくとも１つの人工的な代謝ステップで増強される。
【００２７】
図１（ｂ）においてしめされる、１つの人工的な経路において、グルコースは、解糖を通じてピルビン酸（化合物６）に代謝される。ピルビン酸は、次に、バリン生合成酵素ＡｌｓＳ、ＩｌｖＣ、及びＩｌｖＤによって２‐ケトバリン（化合物９）に変換される（Atumiら、2008 Nature 451:86-89）。２‐ケトバリンは、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）由来のエールリッヒ経路酵素２‐ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫＩＶＤ）により、イソブチルアルデヒドに脱炭酸することができる（de la Plazaら、2004 FEMS Microbiol. Lett. 238:367-74）。この合成経路に関して、本発明者等は、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を効率的に触媒することができる、図１（ｂ）において「Ｘ」として示される酵素を同定する必要があった。
【００２８】
本発明者等は、イソブチルアルデヒドが、酵素の既知の天然又は経験に基づく基質でないにもかかわらず、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの酸化を触媒することができる酵素を同定した。本発明者等は、可能性のある候補として、７つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＡｌｄＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼＡｉｄＨ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コハク酸セミアルデヒドデヒロドゲナーゼＧａｂＤ、大腸菌（Ｅ．coli）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＰａｄＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）γ‐アミノブチルアルデヒドデヒロドゲナーゼＹｄｃＷ、バークホルデリア アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（KDHba）、及びシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨpp）から選択した。これらの酵素は、ほとんど相同性を共有せず、そして広範囲のアルデヒドの基質がイソブチルアルデヒドを含んでいないが、広範囲のアルデヒドの基質を網羅する。アルデヒドデヒドロゲナーゼの１つをコードするオリゴヌクレオチドを、ＫＩＶＤ後クローン化して、高コピープラスミド上に発現カセットＫｉｖｄ‐ｘを構築した（図２（ａ）、Ｘは、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするオリゴヌクレオチドを表す）。転写順ｉｌｖＤ‐ａｌｓＳおけるメディアコピープラスミド上の他のオペロン（図２（ａ））を、また構築して、２‐ケトバリンに向かって炭素フラックスを駆動した（ｉｌｖＤは、染色体のコピーが、その基質アセト乳酸によって誘導時に大量発現することができるので、クローン化しなかった；Wek及びHatfield, 1988 Mol. Biol. 203:643-663）。これを、それぞれのアルデヒドデヒロドゲナーゼに関して繰り返して、アルデヒドデヒドロゲナーゼの１つをそれぞれ発現する、発現カセットのライブラリーを作製した。
【００２９】
クローン化されたプラスミドを、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＷ２５１１３に形質転換した。振盪フラスコ発酵は、３０℃で４８時間おこなった。培養物を、炭素源として４０ｇ／Ｌのグルコースを含むＭ９最小培地で生育し、そして０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。発酵産物を、屈折率検出を有するＨＰＬＣ分析により定量した。図２（ｂ）から分かるように、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、さまざまなレベルのイソブチレート産物を提供した。プラスミドコードアルデヒドデヒドロゲナーゼなしで、１．３ｇ／Ｌのイソブチレートを検出し（ｉ、図２（ｂ））、そしてそれは、内在性のアルデヒドデヒドロゲナーゼの作用に由来するであろう。ＧａｂＤ、Ｋｄｈba、Ｋｄｈpp及びＹｄｃＷは、イソブチレートの生成レベルをわずかに増加した（図２（ｂ）ｉｖ、ｖ、ｖｉ、及びｖｉｉｉのそれぞれ）。比較では、ＡｌｄＢ及びＡｌｄＨを有する形質転換体は、２．３ｇ／Ｌ及び３．８ｇ／Ｌのイソブチレートを生成した（図２（ｂ）ｉｉ、ｉｉｉのそれぞれ）。ＰａｄＡを有する形質転換体は、４．８ｇ／Ｌのイソブチレートを生成した（図２（ｂ）、Ｖｉｉ）。
【００３０】
ＰａｄＡが、最も大量のイソブチレートを生成したので、本発明者等は、さらなる研究のためにそれを選択した。酵素を特徴付けるために、ＰａｄＡを、Ｎ末端６×ＨＩｓタグでタグ付けし、過剰発現し、そしてＮｉ‐ＮＴＡカラムを通して精製した。ＰａｄＡによるイソブチルアルデヒドの変換のための動態パラメータを、３４０ｎｍで、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元を測定することにより決定した。結果を表１に示す。イソブチルアルデヒドに向かうＰａｄＡ活性は、その天然の生理学的基質フェニルアセトアルデヒドに向かう活性よりもはるかに低い。ｋcat値は、４倍低いのみだが（１４９４分-1対５８１０分-1）、ｋm値は、２３０倍高い（２．６７ｍＭ対０．０１１６ｍＭ）。従って、フェニルアセトアルデヒドに向かうＰａｄＡの特異的定数ｋcat／ｋmは、非天然基質イソブチルアルデヒドに向かうものよりもほぼ１０００倍高い。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
ＰａｄＡは、イソブチルアルデヒドのための相対的に高いｋmを有するので、内在性アルコールデヒドロゲナーゼ、例えばＹｑｈＤ（km 1.8 mM; Atsumiら、2010 Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:651-657）は、アルデヒド基質のために競争し、そしてイソ酪酸よりもむしろイソブタノールを生成することができる（図３（ａ））。これは、部分的には、イソ酪酸濃度と等しい、発酵産物中の４．８ｇ／Ｌのイソブタノールの蓄積を説明できる（図３（ｂ））。本発明者等は、Ｂｗ２５１１３の染色体からｙｑｈＤ遺伝子を除去した。野生型株と比較して、ΔｙｑｈＤ変異体は、イソブタノール生成を０．８ｇ／Ｌｎｉ低下し、そしてイソブチレート生成を１１．７ｇ／Ｌに増加した（図３（ｂ））。従って、振盪フラスコ発酵において、この改変された株は、理論上の最大値の５９％である０．２９ｇ／ｇのグルコースの収率でイソブチレートを生成することができる。
【００３３】
従って、本発明者等は、グルコースからイソブチレートの生合成のための合成代謝経路を開発した。本発明者等は、本発明者等が調査した７つのアルデヒドデヒロドゲナーゼのそれぞれが、イソブチルアルデヒドをイソブチレートに変換することを発見した。これらの７つのアルデヒドデヒドロゲナーゼのＰａｄＡが、インビボにおいて、イソブチルアルデヒドをイソブチレートに酸化する際、最も有効な酵素であった。染色体から、イソブチルアルデヒドに関してＰａｄＡと競争する酵素をコードする、ｙｑｈＤ遺伝子を除去することで、イソブチレート生成が、１１．７ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌのグルコースにさらに増加した。
【００３４】
図１０で示された代替的な人工的な経路において、２‐ケトバリン（化合物９）は、イソブチレート（化合物１）を網羅する。分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼＢＫＤＨは、２‐ケトバリンを分岐鎖ＣｏＡに変換することができ、そしてそれは、順に、チオエステラーゼによりイソブチレートに変換することができる。
【００３５】
本発明者等は、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ゲノムＤＮＡからｂｋｄｈをクローン化し、そして、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡからｔｅｓＡ及びｔｅｓＢをクローン化した。プラスミドｐＩＢＡ１６は、ｂｋｄｈを含み、ｐＩＢＡ１７は、ｂｋｄｈ及びＴｅｓＡを含み、そしてｐＩＢＡ１８は、ｂｋｄｈ及びＴｅｓＢを含む。ＴｅｓＢ又はＴｅｓＡ（ｐＩＢＡ１６）を有しないＢＫＤＨを含む構築物は、５．６１±０．６７ｇ／Ｌの濃度にイソブチレートを蓄積し（表４）、ｙｑｈＤのノックアウト前のＰａｄＡ構築物により示されるイソブチレート産物よりもいくらか高い（図３（ａ））。しかしながら、チオエステラーゼの添加は、イソブチレートの収率をさらに増加した。例えば、ＢＫＤＨ＋ＴｅｓＢ（ｐＩＢＡ１８）は、４０ｇ／Ｌのグルコースから８．６ｇ／Ｌのイソブチレートを生成した（０．２２ｇ／ｇのグルコース、又は理論上の最大収率の約４４％）。
【００３６】
その結果として、本発明者等は、イソブチレート生合成を達成するためのさまざまな改変された代謝経路を示した。さらに、本発明者等は、イソブチレートを天然には生成しない内在性の生合成経路に従ってさまざまな点から生合成を迂回することにより効率的なイソブチレートの生合成を達成することができることを示した。本発明者等は、従って、イソブチレートの生合成のための一般的な基本骨格を確立した。
【００３７】
イソブチレート生成上のノックアウトの影響
本発明者等は、次に、さらなるエンジニアリングがさらに炭素収率を増加できるかどうかを調査することにより、本発明者等の最初の知見を推し進めた。本発明者等は、６つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ノックアウト株を構築し、そして１つのダブルノックアウト（ΔｙｑｈＤ、ΔｙｊｇＢ）が、シングルノックアウト株（ΔｙｑｈＤ）よりも、１７％多くイソブチレートを生成することを見出した。本発明者等は、次に、プラスミド上の構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーター下に、アルデヒドデヒドロゲナーゼのさらなるコピーを導入した。ＰａｄＡ過剰発現は、イソブタノール形成をさらに減らし、そしてイソブチレート生成をさらに増加した。従って、本発明者等は、０．３９ｇ／ｇのグルコースのイソブチレート収率、理論上の最大値の８０％を有する人工的な株を構築することに成功した。
【００３８】
本発明者等は、振盪フラスコからバイオリアクターに発酵プロセスをスケールアップした。本発明者等は、発酵中のｐＨ調節のための塩基として、Ｃａ（ＯＨ）2が、ＮＨ4ＯＨ又はＮａＯＨよりもはるかに良好であることを見出した。発酵培養物のｐＨを維持するためのＣａ（ＯＨ）2の使用が、細胞密度を増加し、酢酸塩の蓄積を減らし、そしてイソブチレートの最終蓄積を９０ｇ／Ｌに増加した。
【００３９】
図１（ｂ）及び図６で示した人工的な生合成経路において、イソブチルアルデヒドは、イソブチレートの直近の前駆体である。多くの生物において、イソブチルアルデヒドは、自然に、内在性のアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＡｄｈＥ、ＡｄｈＰ、ＥｕｔＧ、ＹｉａＹ、ＹｊｇＢ及びＹｑｈＤにより、イソブタノールに還元される。ＹｑｈＤノックアウトが、イソブチレート生成の５０％の増加を示すことができるので、ＹｑｈＤは、イソブタノール形成に関連することが知られている（Zhangら、2011 ChemSusChem 4:1068-1070）。しかしながら、ｙｑｈＤノックアウト後でさえ、イソブタノールは、０．８ｇ／Ｌの濃度で、発酵副産物としてまだ存在していた（図７Ｂ、ｉ）。従って、本発明者等は、ｙｑｈＤの欠失と組み合わせて、他のアルコールデヒドロゲナーゼのノックアウトが、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を減らし、ひいてはイソブチレートへの変換のために細胞が使用できるイソブチルアルデヒドの量を増加するかどうかを調査した。ａｄｈＥ又はａｄｈＰのさらなる欠失が、イソブチレート産物が影響を受けなかった一方で、０．９０ｇ／Ｌにイソブタノール蓄積をわずかに増加した（図７Ｂ、ｉｉ及びｉｉｉのそれぞれ）。ｅｕｔＧをノックアウトすることで、０．７６ｇ／Ｌにイソブタノールレベルを減らし、そして１２．２ｇ／Ｌにイソブチレート濃度を増加した（図７Ｂ、ｉｖ及び図７Ａ、ｉｖのそれぞれ）。興味深いことに、ｙｉａＹ又はｙｊｇＢのいずれかのさらなる欠失が、イソブタノール形成を減らさなかったが（図７Ｂ、ｖ及びｖｉのそれぞれ）、それらは、１２．４ｇ／Ｌ及び１２．９ｇ／Ｌにイソブチレート産物レベルを増加した（図７Ａ、Ｖ及びｖｉのそれぞれ）。従って、ＩＢＡ１‐１Ｃ株（ΔｙｑｈＤ、ｉ）と比較して、ＩＢＡ１５‐１Ｃ株（ΔｙｑｈＤ、ΔｙｊｇＢ、ｖｉ）は、イソブチレート産物の増加を示した。ΔａｄｈＥ株における結果は、最近発表された報告（Trinhら、2011 Environ. Microbiol. 77:4894-4904）とは異なっていた。しかしながら、本発明者等の発酵条件は準嫌気性（ｓｅｍｉａｎａｅｒｏｂｉｃ）であったが、その研究は、イソブタノール生成のためのａｄｈＥの機能を調査するために、嫌気性条件を使用した。ａｄｈＥ酵素は、酸素によって不活性化されることが知られている（Holland-Staleyら、2000 J. Bacteriol. 182:6049）。
【００４０】
イソブチレート産物上のＰａｄＡ発現レベルの影響
次に、本発明者等は、イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換するアルコールデヒロドゲナーゼに対してより競争するために、ＰａｄＡのタンパク質発現レベルを増加することに関連する、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を指示する代替的なアプローチを検討した。ｐａｄＡのさらなるコピーを高コピープラスミド上の構成的プロモーター下に導入した。本発明者等は、シングルノックアウト株ＩＢＡ１（ΔｙｑｈＤ）、並びにダブルノックアウト株ＩＢＡ１３（ΔｙｑｈＤΔｅｕｔＧ）、ＩＢＡ１４（ΔｙｑｈＤΔｙｉａＹ）、及びＩＢＡ１５（ΔｙｑｈＤΔｙｊｇＢ）に、ｐａｄＡの第二コピーを付加し、そしてそれらのそれぞれは、ｐａｄＡの１つのコピーを保有するシングルノックアウトＩＢＡ１株よりも、より多くのイソブチレートを生成した（図７Ａ）。
【００４１】
ダブル‐ＰａｄＡ株、ＩＢＡ１‐２Ｃは、シングル‐ＰａｄＡ親株、ＩＢＡ１‐１Ｃ由来の１１ｇ／Ｌと比較して、１３．７ｇ／Ｌのイソブチレートを生成した。一方、イソブタノール濃度は、０．８２ｇ／Ｌ（図７Ｂ、ｉ）から０．３５ｇ／Ｌ（図８Ｂ、ｉ）に減少した。これらの結果は、ＰａｄＡの発現増加がイソブタノール蓄積を減らし、そしてイソブチレート産物を増加したことを示す。イソブタノールの減少（０．４７ｇ／Ｌ）は、イソブチレートの増加（２．７ｇ／Ｌ）に満たない。この相違における不均衡に関する１つの可能性のある理由は、イソブチレートを生成することが、イソブタノールを生成するよりも細胞においてよりストレスが少ないので、ｐａｄＡの２つのコピーを有する細胞がより少ない量の副産物を生成し、従って、より多くの生合成エネルギーをイソブチレートの生成に向ける。例えば、他の副産物、酢酸塩の蓄積は、また、ＩＢＡ１‐１Ｃにおける０．６ｇ／ＬからＩＢＡ１‐２Ｃにおける０．１ｇ／Ｌに減少した。
【００４２】
ＰａｄＡの過剰発現の影響を、ＩＢＡ１３‐２Ｃ、ＩＢＡ１４‐２Ｃ、及びＩＢＡ１５‐２Ｃ株で同様に確認した。ｐａｄＡの２つのコピーを有する、これらの株は、約０．４ｇ／Ｌのイソブタノールを生成し（図８Ｂ、ｉｉ‐ｉｖ）、ＰａｄＡの１つのコピーを保有する株よりも有意に低かった（図７Ｂ、ｉｖ‐ｖｉ）。より重要なことは、ＩＢＡ１３‐２Ｃ、ＩＢＡ１４‐２Ｃ、及びＩＢＡ１５‐２Ｃは、それらそれぞれのシングル‐ＰａｄＡ親株と比較して（図７Ａ、ｉｖ‐ｖｉ）、イソブチレートの蓄積がまた増加した（１４．３ｇ／Ｌ、１４．６ｇ／Ｌ、及び１５．６ｇ／Ｌ（図８Ａ、ｉｉ‐ｉｖのそれぞれ））。
【００４３】
さらに、ＰａｄＡ過剰発現ダブルノックアウトＩＢＡ１３‐２Ｃ、ＩＢＡ１４‐２Ｃ、及びＩＢＡ１５‐２Ｃにおけるイソブチレート蓄積は、ＩＢＡ１‐２ＣにおけるＰａｄＡ過剰発現シングル（Δｙｑｈ）ノックアウトにおけるイソブチレート蓄積よりも高く、ダブルノックアウトが、イソブチレート生成を増加することを確認した。
【００４４】
従って、ＰａｄＡを過剰発現することにより、そしてそれは、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換に都合がよく、及び／又はイソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換に都合がよいが、イソブチルアルデヒドのためのＰａｄＡと競争することができる１つ以上のアルデヒドデヒロドゲナーゼをノックアウトすることにより、イソブタノールよりもイソブチレートの生成に都合のよい微生物を設計することができる。ＰａｄＡを過剰発現するダブルノックアウト（Δｙｑｈ、ΔｙｊｇＢ）株ＩＢＡ１５‐２Ｃは、理論上の最大値の８０％、０．３９ｇ／ｇのグルコースをもたらした。
【００４５】
半回分バイオリアクターにおける発酵条件の最適化
本発明者等は、次に、発酵を振盪フラスコからバイオリアクターにスケールアップした場合、上記の効果が維持されるかどうかを調査した。本発明者等は、ＩＢＡ１５‐２Ｃ株でバイオリアクター発酵実験を行った。バイオリアクター中での酢酸塩の過剰蓄積を避けるために、グルコース供給速度を、１０ｇ／Ｌ未満のレベルのグルコースを維持するように調節した。ＮＡＤＨの２つの分子が、生成されたイソブチレートのそれぞれの分子に関して生成されるので、溶存酸素（ＤＯ）レベルを１０％に維持して過剰なＮＡＤＨを消費した。より高いＤＯレベルを避けて、ＴＣＡサイクルを介してのＣＯ2への基質の過剰な酸化を防いだ。
【００４６】
イソブチレートの生合成の間、ｐＨは、仮に塩基を発酵培地に添加しなければ、大幅に低下するであろう。本発明者等は、ｐＨを７．０に維持するために、３つの異なる塩基、ＮＨ4ＯＨ、ＮａＯＨ、及びＣａ（ＯＨ）2の効果を調査した。図９Ａ‐Ｃに示したように（黒四角形）、すべての条件に関して、バイオマスは、最初の２０時間で指数関数的に増加し、そしてその後、徐々に減少した。ＮＨ4ＯＨ又はＮａＯＨのいずれかを使用して得られたバイオマスの最大値は、約７．５ｇ／Ｌであり、一方、Ｃａ（ＯＨ）2を使用して得られたバイオマスの最大値は、約１０ｇ／Ｌであった。この結果は、過剰なアンモニウムイオン又はナトリウムイオンが、細胞増殖に悪い影響を及ぼす可能性を示唆している。水酸化アンモニウムは、以前は、ｐＨを制御し、そして窒素源を供給するために使用されてきたが、この塩基は、イソブチレート産物を最大化するために最善ではないと思われる。イソブチレート蓄積は、１４０時間後、ＮＨ4ＯＨを使用して５１．１ｇ／Ｌ（図９Ａ，白丸）、ＮａＯＨで６５．４ｇ／Ｌ（図９Ｂ、白丸）、及びＣａ（ＯＨ）2で９０．３ｇ／Ｌ（図９Ｃ、白丸）に達した。一般的に、イソブチレートの最終蓄積は、それぞれの培養物において酢酸塩の最終蓄積に反比例して相関し：ＮＨ4ＯＨ調節培養物は、１２．６ｇ／Ｌの酢酸であったが、ＮａＯＨ調節培養物において７．１ｇ／Ｌに減少し、そしてＣａ（ＯＨ）2調節培養物において３．４ｇ／Ｌのみであった（図９Ａ‐Ｃ、黒三角形）。これは、酢酸塩が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵の主な阻害物質であるという以前の報告と一致する（Eiteman及びAltman、2006 Trends Biotechnol. 24:530-536; Kohら、1992 Biotechnol. Lett. 14:1115-1118）。要約すると、ＮＨ4ＯＨ又はＮａＯＨの使用と比較して、培養物のｐＨを７．０に維持するためのＣａ（ＯＨ）2の使用は、細胞密度を増加し、イソブチレート蓄積を増加し、そして酢酸副産物を減少した。
【００４７】
対照として、バイオリアクターにおいて、ＰａｄＡを過剰発現するシングル遺伝子（ｙｑｈＤ）ノックアウト株ＩＢＡ１‐２Ｃの発酵を、また調査した。この株は、１２２時間後、５７．６ｇ／Ｌのイソブチレート及び１．０ｇ／Ｌの酢酸を生成し、水酸化カルシウムが、酢酸形成減少及びイソブチレート生成増加を助けたことを確認した。しかしながら、ＩＢＡ１５‐２Ｃ株は、同じ条件下でＩＢＡ１‐２Ｃよりも５７％多いイソブチレートを生成し、そしてそれは、ΔｙｑｈＤ／ΔｙｇｊＢダブルノックアウトの振盪フラスコ培養物で観察された増加したイソブチレート生成を、バイオリアクター量にスケールアップできることを示唆する。
【００４８】
この研究は、イソブチレートを、人工的な微生物から、高い蓄積及び高い収率で生成できることを示す。この研究において記載されるイソブチレートの生成が、微生物発酵に従うので、本明細書に記載された改変された微生物株及び方法は、イソブチレートの商業生産のための新規基本骨格を提供することができる。
【００４９】
本発明者等は、従って、再生可能な態様で、イソブチレートを生成するための基本骨格を提供する。本発明者等は、化学合成に関連する問題、例えば、持続可能でない石油原料及び有害物質の使用に取り組んできた。本発明者等の生合成アプローチは、経済及び環境の両方の利益に関して魅力的な選択肢を提供する（Dale, 2003 J. Chem. Technol. Biotechnol. 78:1093-1103）。
【００５０】
従って、１つの態様では、本発明は、野生型対照と比較して、イソ酪酸の増加した生合成を示す改変された組み換え微生物細胞を提供する。本明細書において使用する場合、「増加した生成（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」は、野生型対照と比較したイソブチレートの生合成における相対的な増加として、所定の濃度にイソブチレートを蓄積するために微生物細胞の培養物に十分である生合成として、細胞によって生成されるイソブチレート：イソブタノールの比率の増加として、又は特定の基準原料、例えば、グルコースを使用する最大の理論上の収率のパーセントにおける増加として特徴付けることができる。
【００５１】
基準原料、例えば、グルコースを指定することは、微生物培養物を、炭素源又はエネルギー源として特定の基準原料を使用して生育することを必要としない。実際、以下でより詳細に記載するように、原料は、例えば、図１（ｂ）で示した化合物６〜９のいずれかを含むことができる。しかしながら、当業者は、任意の基準原料の代謝当量に基づいて、対応する理論上の最大収率に任意の代替的な原料を使用して、理論上の最大収率を算術的に変換することができる。
【００５２】
従って、いくつかの場合において、改変された微生物細胞は、適切な野生型対照により生成されるイソブチレートの少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％（２倍）、少なくとも２５０％、少なくとも３００％（３倍）、少なくとも４００％（４倍）、少なくとも５００％（５倍）、少なくとも６００％（６倍）、少なくとも７００％（７倍）、少なくとも８００％（８倍）、少なくとも９００％（９倍）、少なくとも１０００％（１０倍）、少なくとも２０００％（２０倍）、少なくとも３０００％（３０倍）、少なくとも４０００％（４０倍）、少なくとも５０００％（５０倍）、少なくとも６０００％（６０倍）、少なくとも７０００％（７０倍）、少なくとも８０００％（８０倍）、少なくとも９０００％（９０倍）、少なくとも１０，０００％（１００倍）、少なくとも１００，０００％（１０００倍）、０．４９ｇのイソブチレート／グルコース（ｇ）の理論上の最大値でイソブチレートを生成する所定の宿主細胞に必要である増加（倍）を含む、を示すイソブチレートの生合成の増加を示すことができる。
【００５３】
他の場合において、改変された微生物細胞は、微生物細胞を、培養物中で特定の時間生育した場合、所定の濃度にイソブチレートの蓄積により反映されるイソブチレートの生合成の増加を示すことができる。所定の濃度は、所定の用途に適したイソブチレートの任意の所定の濃度でもよい。従って、所定の濃度は、例えば、少なくとも０．１ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも５．０ｇ／Ｌ、少なくとも６．０ｇ／Ｌ、少なくとも７．０ｇ／Ｌ、少なくとも８．０ｇ／Ｌ、少なくとも９．０ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも５５ｇ／Ｌ、少なくとも６０ｇ／Ｌ、少なくとも６５ｇ／Ｌ、少なくとも７０ｇ／Ｌ、少なくとも７５ｇ／Ｌ、少なくとも８０ｇ／Ｌ、少なくとも８５ｇ／Ｌ、少なくとも９０ｇ／Ｌ、少なくとも９５ｇ／Ｌ、少なくとも１００ｇ／Ｌ、少なくとも１１０ｇ／Ｌ、少なくとも１２０ｇ／Ｌ、少なくとも１３０ｇ／Ｌ、少なくとも１４０ｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｇ／Ｌ、少なくとも１６０ｇ／Ｌ、少なくとも１７０ｇ／Ｌ、少なくとも１８０ｇ／Ｌ、少なくとも１９０ｇ／Ｌ、少なくとも２００ｇ／Ｌの濃度であってもよい。
【００５４】
バッチ培養において、特定の時間は、少なくとも１２時間、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１３２時間、又は少なくとも１４４時間の最小値を有してもよい。バッチ培養において、特定の時間は、２４０時間未満、例えば、２１６時間未満、１９２時間未満、１６８時間未満、１４４時間未満、１２０時間未満、１０８時間未満、９６時間未満、８４時間未満、７２時間未満、６０時間未満、又は４８時間未満の最大値を有してもよい。バッチ培養において、特定の時間は、任意の最小時間及び任意の適切な最大時間によって定義されるエンドポイントを有する範囲として表されてもよい。連続培養において、特定の時間は、バッチ培養と同じように、時間の絶対量として表されてもよい。あるいは、特定の時間は、連続培養において、培養の段階、例えば、恒常性の観点から表されてもよい。
【００５５】
特定の実施態様では、従って、改変された細胞は、４８時間後、少なくとも４．７ｇ／Ｌのイソブチレートを生成することで特徴付けることができるイソブチレートの生合成の増加を示すことができる。他の例示的な実施態様では、イソブチレート生成の増加は、培養の１２０時間後、少なくとも９０ｇ／Ｌのイソブチレートを蓄積する観点から表されてもよい。
【００５６】
他の場合において、改変された微生物細胞は、細胞により生成されるイソブチレート：イソブタノールの比率の観点から特徴付けられるイソブチレートの生合成の増加を示すことができる。イソブチレートの生合成の増加は、少なくとも１：１、例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１１：１、少なくとも１２：１、少なくとも１３：１、少なくとも１４：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、又は少なくとも１００：１のイソブチレート：イソブタノールの比率として表すことができる。
【００５７】
さらに他の場合において、改変された微生物細胞は、特定の基準原料、例えば、グルコースから理論上の収率の少なくとも４０％の所定のイソブチレートの収率を反映したイソブチレートの生合成の増加を示すことができる。所定のイソブチレートの収率は、例えば、理論上の最大収率の少なくとも４０％、理論上の最大収率の少なくとも５０％、理論上の最大収率の少なくとも６０％、理論上の最大収率の少なくとも７０％、理論上の最大収率の少なくとも８０％、理論上の最大収率の少なくとも９０％、理論上の最大収率の少なくとも９５％、理論上の最大収率の少なくとも９６％、理論上の最大収率の少なくとも９７％、理論上の最大収率の少なくとも９８％、又は理論上の最大収率の少なくとも９９％であってもよい。特定の実施態様では、グルコースから理論上の最大収率の約４４％、約５９％、又は約８０％で、イソブチレートを生成することができる。
【００５８】
組み換え細胞は、例えば、原核生物微生物又は真核生物微生物を含む任意の適切な微生物でもよく、又は由来してもよい。いくつかの実施態様では、細胞は、少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「又は由来する（ｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」は、微生物と関連して、イソブチレートの生合成を結果として生じる人工的な生合成経路に関与するポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ分子を含むように改変される前に、１つ以上の遺伝子的な改変を保持する「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」を単に考慮する。従って、用語「組み換え細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌｌ）」は、細胞内に導入された、例えば、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換、又は２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換のいずれかに関与するポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ分子を有する前に、２つ以上の種由来の核酸物質を含んでもよい「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」を包含する。
【００５９】
いくつかの実施態様では、組み換え細胞は、原核細胞微生物、例えば、真菌細胞でもよく、又は由来してもよい。これらの実施態様のいくつかでは、真菌細胞は、サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）のメンバー、例えば、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属のメンバー、例えば、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ）属のメンバー、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー、例えば、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）でもよく、又は由来してもよい。他の実施態様では、真菌細胞は、Ｄｉｐｏｄａｓｃａｃｅａｅ科のメンバー、例えば、ヤロウィアリポリティカであってもよい。
【００６０】
他の実施態様では、組み換え細胞は、原核細胞微生物、例えば、細菌でもよく、由来してもよい。これらの実施態様のいくつかにおいて、細菌は、プロテオバクテリア門のメンバーでもよい。プロテオバクテリア門の典型的なメンバーは、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び例えば、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））が挙げられる。他の場合において、細菌は、ファーミキューテス門のメンバーであってもよい。ファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の典型的なメンバーは、例えば、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のメンバー（例えば、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））が挙げられる。
【００６１】
以下の説明において、さまざまな実施態様の説明は、遺伝子改変をコードする異種ＤＮＡ分子を意味する。さまざまな実施態様の組み合わせが、また可能である。そのような実施態様において、２つ以上の遺伝子改変は、シングル異種ＤＮＡ分子、例えば、プラスミドベクター上に含めることができる。あるいは、異なる遺伝子改変は、異なるベクター、宿主細胞内に導入されるそれぞれのｏｐｆ上に含まれてもよい。
【００６２】
いくつかの実施態様では、細胞は、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含んでもよい。いくつかの実施態様では、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。本明細書で使用する場合、用語「アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、その一般名又は天然の機能にかかわらず、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドを意味する。典型的なアルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＰａｄＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＢ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｌｄＨ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧａｂＤ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）γ‐アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ）、Ｂ．アンビファリア（Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨba）、又はＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）α‐ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＫＤＨpp）が挙げられる。特定の実施態様では、組み換え細胞は、異種ＤＮＡ分子、又は２つ以上のアルデヒドデヒドロゲナーゼの組み合わせをコードする、複数の異種ＤＮＡ分子を含むことができる。
【００６３】
他の実施態様では、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒する異種ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチド（すなわち、異種性コード（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ‐ｅｎｃｏｄｅｄ）ペプチド）は、配列番号１〜配列番号１０６の１つ以上のアミノ酸配列を含む基準ポリペプチドを含み、又は構造的に類似している。
【００６４】
本明細書で使用する場合、異種性コードペプチドは、仮に異種性コードペプチドのアミノ酸配列が、基準ポリペプチドと比較して、特定の量の類似性及び／又は同一性を有する場合、基準ポリペプチドと「構造的に類似（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ）」している。２つのポリペプチドの構造的な類似性は、２つのポリペプチド（例えば、異種性コードポリペプチド及び例えば、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのポリペプチド）の残基を整列して、それらの配列の長さに従って、同一のアミノ酸の数を最適化することによって決定することができ；それぞれの配列におけるアミノ酸は、それでもなお、それらの適切な順番のままでなければならないが、一方又は両方の配列におけるギャップは、同一のアミノ酸の数を最適化するために、アライメントを行う際に許可されている。
【００６５】
アミノ酸配列の比較分析は、ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２、Ｍａｄｉｓｏｎ，WI）におけるＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用して行うことができる。あるいは、ポリペプチドは、Ｔａｔｉａｎａら（1999 FEMS Microbiol Lett, 174:247-250）によって記載され、そして国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト上で利用可能である、ＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して比較されてもよい。すべてのＢＬＡＳＴ２サーチパラメータのためのデフォルト値は、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１、ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝３、及びｆｉｌｔｅｒ ｏｎを使用してもよい。
【００６６】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、パーセント「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を意味してもよく、又はパーセント「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を意味してもよい。「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、同一のアミノ酸の存在を意味する。「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、同一のアミノ酸だけでなく、保存的置換の存在も意味する。本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸のための保存的置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。例えば、特定の大きさ又は特性（例えば、電荷、疎水性、及び親水性）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸は、特に生物活性に直接関連しないタンパク質の領域において、タンパク質の活性を変化しない他のアミノ酸に置換することができることがタンパク質生化学の分野において周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。保存的置換は、例えば、正電荷を維持するためにアルギニンに対してリジン及びその逆；負電荷を維持するためにアスパラギン酸に対してグルタミン酸及びその逆；遊離ＯＨを維持するためにスレオニンに対してセリン；並びに遊離ＮＨ2を維持するためにアスパラギンに対してグルタミンが挙げられる。同様に、ポリペプチドの機能的活性を排除しない１つ以上の隣接する又は隣接しないアミノ酸の欠失又は付加を含むポリペプチドの生物学的に活性なアナログも考慮される。
【００６７】
異種性コードポリペプチドは、基準アミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列類似性を有するポリペプチドを含むことができる。
【００６８】
異種性コードポリペプチドは、基準アミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。
【００６９】
典型的な基準アミノ酸配列は、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００７０】
１ＷＮＢは、ＮＡＤＨ及びベタインアルデヒドと複合化した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質ＹｄｃＷの結晶構造である（Gruezら、2004 J. Mol. Biol. 343:29-41）。結晶構造に基づいて、残基Ｙ１５０、Ｄ２７９、Ｆ４３６、及びＬ４３８は、ベタインアルデヒド基質のα炭素の５Åの半径内にある。ＰａｄＡ及びＹｄｃＷの間のホモロジーは低いが、結合ポケットはよく保存されている。ＰａｄＡの活性部位に対応する残基は、Ｆ１７５、Ｖ３０５、Ｔ４６１、及びＩ４６３である。同様の分析は、ポリペプチドの触媒活性を妨げずに改変することができるアミノ酸残基を同定するために、そして同様に重要なことは、基質結合及び／又は触媒活性に関与する可能性があるアミノ酸残基を同定するために行われてもよい。
【００７１】
いくつかの実施態様では、組み換え細胞は、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ分子を含むことができる。従って、典型的な異種ＤＮＡ分子は、基準アミノ酸配列と、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列類似性を有するポリペプチドをコードするものを含む。
【００７２】
他の実施態様では、異種ＤＮＡ分子は、配列番号１〜配列番号１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。従って、典型的な異種ＤＮＡ分子は、基準アミノ酸配列と、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするものを含む。
【００７３】
異種性コードポリペプチドは、さらに、付加配列、例えば、発現又はカラムにトラップすることによる又は抗体を使用する精製を容易にする付加されたＣ末端又はＮ末端アミノ酸のためのコード配列の付加を提供するために設計することができる。そのようなタグは、例えば、ニッケルカラム上のポリペプチドの精製を可能にするヒスチジン‐リッチタグが挙げられる。そのような遺伝子改変技術及び適切な付加配列は、分子生物学の分野において周知である。
【００７４】
他の実施態様では、組み換え細胞は、２‐ケトバリンのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡ分子を含むことができる。いくつかの実施態様では、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドは、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＫＤＨ）を含む。本明細書で使用する場合、用語「分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ‐ｃｈａｉｎ ｋｅｔｏ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、その一般名又は天然の機能にかかわらず、２‐ケトバリンの分岐鎖ＣｏＡへの変換を触媒するポリペプチドを意味する。典型的な分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、例えば、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のＢＫＤＨを含むことができる。これらの実施態様のいくつかでは、組み換え細胞は、チオエステラーゼをコードする少なくとも１つの異種ＤＮＡを含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）」は、その一般名又は天然の機能にかかわらず、分岐鎖ＣｏＡのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドを意味する。典型的なチオエステラーゼは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴｅｓＡ又はＴｅｓＢを含むことができる。
【００７５】
いくつかの実施態様では、組み換え細胞は、図１（ｂ）で示した生合成変換を触媒する１つ以上のポリペプチドをさらに含むことができる。従って、例えば、組み換え細胞は、２‐ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチド、例えば、２‐ケト酸デカルボキシラーゼ；又は例えば、ピルビン酸の２‐ケトイソ吉草酸の変換におけるステップを触媒する１つ以上のペプチド、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、及びアセト乳酸シンターゼの１つ以上をさらに含むことができる。
【００７６】
他の態様では、本発明は、少なくとも１つの内在性の酵素が、イソブチルアルデヒドをイソブチレートに変換するための能力を増強するために改変された、遺伝的に改変された細胞を提供する。いくつかの実施態様では、遺伝子的に改変された細胞は、１つ又は１つ以上の内在性酵素の変異体を含むことができる。他の実施態様では、遺伝子的に改変された細胞は、培養中の高レベルのイソブチレートに耐えるように細胞の能力を増強する１つ以上のポリペプチドの１つ以上の変異体を含むことができる。変異体は、例えば、トランスクリプトーム解析、ゲノム配列、クローニング、部位特異的突然変異、及び改変された酵素又は酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターでの微生物の形質転換の１つ以上を含む分子生物学技術を使用して、作製されてもよい。あるいは、変異体は、従来の微生物遺伝子技術、例えば、所望する自然突然変異を有する微生物を選択し及び／又は同定するために設計された培地中又は上での生育を使用して、作製されてもよい。
【００７７】
いくつかの実施態様では、組み換え細胞又は遺伝子的に改変された細胞は、イソブチルアルデヒドのイソブチレート以外の産物、例えば、イソブタノール、乳酸塩（ｌａｃｔａｔｅ）、エタノール、又はアセチル‐Ｐへの変換を触媒する遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドをさらに含むことができ、そしてそれによって、より多くのイソブチルアルデヒドを、イソブチレートの生合成に向ける。一般的に、遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドは、野生型のポリペプチドと比較して、低下した触媒活性を示すことができる。そのような遺伝子的改変は、イソブチルアルデヒドが、イソブチレート以外の産物、例えば、イソブタノール、乳酸塩、エタノール、又はアセチル‐Ｐの生合成を生じるように代謝される程度を減少し、そしてそれによって、イソブチルアルデヒドが、イソブチレートに変換される程度を増加することができる。
【００７８】
いくつかの場合において、組み換え細胞又は遺伝子的に改変された細胞は、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドを含むことができる。このタイプの典型的なポリペプチドは、例えば、遺伝子的に改変されたバージョンのアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたａｄｈＥ又は遺伝子的に改変されたａｄｈＰによってコードされるポリペプチドを含んでもよい。他の実施態様では、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、遺伝子的に改変されたバージョンのエタノールアミン利用タンパク質、例えば、遺伝子的に改変されたｅｕｔＧによって改変されたポリペプチドであってもよい。いくつかの実施態様では、遺伝子的に改変されたポリペプチドは、遺伝子的に改変されたｄｋｇＡ、遺伝子的に改変されたｙｉａＹ、遺伝子的に改変されたｙｑｈＤ、又は遺伝子的に改変されたｙｊｇＢによってコードされるポリペプチドであってもよい。
【００７９】
いくつかの場合において、組み換え細胞又は遺伝子的に改変された細胞は、ピルビン酸の、乳酸塩、ギ酸塩（ｆｏｒｍａｔｅ）、及び酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ）の任意の１つ以上への変換を触媒する遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドを含むことができ、ここで、遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す。この種類の典型的なポリペプチドは、例えば、遺伝子的に改変されたバージョンの乳酸デヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたＩｄｈＡによってコードされるポリペプチド；遺伝子的に改変されたバージョンのピルビン酸ギ酸リアーゼＩ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｆｌＢによってコードされるポリペプチド；又は遺伝子的に改変されたバージョンのピルビン酸オキシダーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｏｘＢによってコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００８０】
いくつかの場合において、組み換え細胞又は遺伝子的に改変された細胞は、アセチル‐ＣｏＡのエタノール又はアセチル‐Ｐの変換を触媒する遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドを含んでもよく、ここで、遺伝子的に改変されたバージョンのポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、触媒活性の低下を示す。この種類の典型的なポリペプチドは、例えば、遺伝子的に改変されたバージョンのアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたａｄｈＥによってコードされるポリペプチド；遺伝子的に改変されたバージョンのリン酸アセチルトランスフェラーゼ、例えば、遺伝子的に改変されたｐｔａによってコードされるポリペプチドが挙げられる。
【００８１】
触媒活性の低下は、定量的に測定し、そして適切な野生型対照の触媒活性のパーセントとして記載することができる。触媒活性は、遺伝子的に改変されたポリペプチドが、例えば、適切な野生型対照の９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の活性、又は０％の活性であってもよいことによって示される。
【００８２】
あるいは、触媒活性の低下は、触媒定数の適切な変化として表すことができる。例えば、触媒活性の低下は、Ｋcatの低下、例えば、酵素変換のＫcat値の少なくとも２倍低下、少なくとも３倍低下、少なくとも４倍低下、少なくとも５倍低下、少なくとも６倍低下、少なくとも７倍低下、少なくとも８倍低下、少なくとも９倍低下、少なくとも１０倍低下、少なくとも１５倍低下、又は少なくとも２０倍低下として表されてもよい。
【００８３】
触媒活性の低下は、ｋmの増加の観点から、例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２３０倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも３５０倍、又は少なくとも４００倍のｋmの増加としてまた表されてもよい。
【００８４】
触媒活性の増加は、定量的に測定することができ、そして適切な野生型対照の触媒活性のパーセントとして記載されてもよい。遺伝子的に改変されたポリペプチドによって示される触媒活性は、例えば、適切な野生型対照の活性の少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％（２倍）、少なくとも２５０％、少なくとも３００％（３倍）、少なくとも４００％（４倍）、少なくとも５００％（５倍）、少なくとも６００％（６倍）、少なくとも７００％（７倍）、少なくとも８００％（８倍）、少なくとも９００％（９倍）、少なくとも１０００％（１０倍）、少なくとも２０００％（２０倍）、少なくとも３０００％（３０倍）、少なくとも４０００％（４０倍）、少なくとも５０００％（５０倍）、少なくとも６０００％（６０倍）、少なくとも７０００％（７０倍）、少なくとも８０００％（８０倍）、少なくとも９０００％（９０倍）、少なくとも１０，０００％（１００倍）、又は少なくとも１００，０００％（１０００倍）であってもよい。
【００８５】
あるいは、触媒活性の増加は、ｋcatの増加、例えば、酵素変換のｋcat値の少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加、少なくとも５倍増加、少なくとも６倍増加、少なくとも７倍増加、少なくとも８倍増加、少なくとも９倍増加、少なくとも１０倍増加、少なくとも１５倍増加、又は少なくとも２０倍増加として表されてもよい。
【００８６】
触媒活性の増加は、ｋmの低下の観点から、例えば、酵素変換のｋm値の少なくとも２倍低下、少なくとも３倍低下、少なくとも４倍低下、少なくとも５倍低下、少なくとも６倍低下、少なくとも７倍低下、少なくとも８倍低下、少なくとも９倍低下、少なくとも１０倍低下、少なくとも１５倍低下、又は少なくとも２０倍低下として表されてもよい。
【００８７】
他の態様では、本発明は、改変された宿主細胞がイソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するように、プロモーターと作動可能に連結した、イソブチルアルデヒドのイソブチレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することを含む方法を提供する。さまざまな実施態様では、本方法は、上記遺伝子改変及び／又はポリペプチドコードする１つ以上の異種ポリヌクレオチドを細胞内にさらに導入することを含む。そのような異種ポリヌクレオチドは、例えば、イソブチルアルデヒドに関する生合成競争を減少し、そしてそれによって、イソブチレートへの次の変換のためのイソブチルアルデヒドの蓄積を促進することを含むことができる。そのような異種ポリヌクレオチドは、炭素源基質のイソブチルアルデヒドへの変換のステップを触媒するポリペプチドをまたコードしてもよい。
【００８８】
他の態様では、本発明は、イソブチレートを生成する組み換え細胞に有効な条件下、炭素源を含む培地において、本明細書に記載されたような組み換え細胞をインキュベートすることを含む方法を提供する。図１（ｂ）に関して、いくつかの実施態様では、組み換え細胞は、例えば、図１（ｂ）において示した生合成経路により、グルコースをピルピン酸に変換し、次にピルビン酸をイソブチルアルデヒドに変換し、次に、異種性コードポリペプチドの活性を介して、イソブチルアルデヒドをイソブチレートに変換することによって、グルコースをイソブチレートに変換することができる。他の実施態様では、しかしながら、必ずしもイソブチルアルデヒドは、任意の特定の生合成経路を通じて、任意の特定の原料の代謝に由来する必要はない。例えば、イソブチルアルデヒドは、培地において組み換え細胞に直接提供されてもよい。他の実施態様では、培地は、図１（ｂ）に示された生合成経路又はイソブチルアルデヒドを生成する任意の他の生合成経路の１つ以上の中間体を、含むことができ、又はイソブチルアルデヒドを生成するために図１（ｂ）に示された生合成経路に供給してもよい。従って、さまざまな実施態様では、炭素源は、グルコース、図１（ｂ）の化合物６、図１（ｂ）の化合物７、図１（ｂ）の化合物８、図１（ｂ）の化合物９、及び図１（ｂ）の化合物１０の１つ以上を含むことができる。
【００８９】
イソブチレートは、商品の化学物質であるため、イソブチレート合成は、他の化合物の合成に拡張することができる。例えば、イソブチレートは、メタクリル酸を生成するために脱水されてもよい３‐ヒドロキシブチレート（以下の反応Ｉの式５）の合成のための出発材料であってもよい。反応スキームＩは、３‐ヒドロキシブチレートの合成を示す。反応スキームＩは、イソブチル合成の下流の４つのステップからなる。これらのステップのそれぞれを触媒する酵素をコードする候補遺伝子が同定されている。イソブチレートは、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ＳＢ４又はフソバクテリウム ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）由来の酵素ブチル‐ＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡ‐トランスフェラーゼ（Ｉ、反応スキームＩ）によって、イソブチル‐ＣｏＡ（反応スキームＩの式２）に変換されてもよい。イソブチル‐ＣｏＡは、次に、酵素２‐メチルアシル‐ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＩＩ、反応スキームＩ）、例えば、ストレプトマイセス アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のａｃｄＨ又はドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のＡｃａｄｓｂによって、メチルアクリリル‐ＣｏＡ（反応スキームＩの式３）に脱水素化されてもよい。メチルアクリリル‐ＣｏＡは、次に、エノール‐ＣｏＡヒドラターゼ（ＩＩＩ、反応スキームＩ）、例えば、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）由来のＥＣＨＳ１又はシュードモナス フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のｅｃｈによって、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡ（反応スキームＩの式４）に水和されてもよい。３‐ヒドロキシイソブチル‐ＣｏＡは、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ（ＩＶ、反応スキームＩ）、例えば、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のＨｉｂｃｈによって、３‐ヒドロキシブチレートに変換される。
【００９０】
【化１】
2014506466.tif 000004
【００９１】
反応スキームＩの関与する典型的な酵素は、以下：
Ｉ：酵素：ブチリリル‐ＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡ‐トランスフェラーゼ
種：クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ＳＢ４
種：フソバクテリウム ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（Entrez Gene IDs 993155, 991616,又は992527, 992528）
ＩＩ：酵素：２‐メチルアシル‐ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
遺伝子：ａｃｄＨアクセッション番号：Ｇ‐９０９８（ＭｅｔａＣｙｃ）種：ストレプトマイセス アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）
遺伝子：Ａｃａｄｓｂアクセッション番号：Ｇ９０９７（ＭｅｔａＣｙｃ）種：ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｃ）
ＩＩＩ：酵素：短鎖エノール‐ＣｏＡヒドラターゼ
遺伝子：ＥＣＨＳ１：アクセッション番号：Ｇ‐９１０１（ＭｅｔａＣｙｃ）種：ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）
酵素：エノール‐ＣｏＡヒドラターゼ
遺伝子：ｅｃｈアクセッション番号：Ｇ‐９０９９（ＭｅｔａＣｙｃ）種：シュードモナス フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
ＩＶ：酵素：３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ
遺伝子：Ｈｉｂｃｈアクセッション番号：Ｇ‐９１０２（ＭｅｔａＣｙｃ）種：ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）
である。
【００９２】
イソブチレートからの他の化合物の生合成は、本明細書に記載された組み換え細胞又は本明細書に記載された遺伝子的に改変された細胞を、天然又は遺伝子操作を介してかにかかわらず、（ａ）唯一の炭素源としてイソブチレートを使用することができ、そして（ｂ）しょもうする産物を生成する代謝能力を有する微生物とを共培養することによって達成することができる。
【００９３】
例えば、改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、発酵の間、イソブチレート源として利用することができる。例えば、（Ｓ）‐３‐ヒドロキシイソブチレートを合成するために、改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、４８％の収率で、イソブチレートから３‐ヒドロキシ酸のＳ異性体を生成することができるシュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）（ＡＴＣＣ ２１２４４）株と共培養されてもよい。Ｒ異性体を合成するために、改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）（ＡＴＣＣ １０５７１）とを共培養することができる。この種は、イソブチレートから８１．８％のモル変換収率で、１５０ｇ／Ｌ（Ｒ）‐３‐ヒドロキシイソブチレートを生成することができる。
【００９４】
あるいは、イソブチレートからの他の化合物の生合成は、単一の生体触媒が生体内変換のために必要となるように、微生物中のイソブチレート同化能力を導入することによって、本明細書に記載された組み換え細胞又は本明細書に記載された遺伝子的に改変された細胞（総称して「生体触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）」）をさらに改変することによって達成されてもよい。例えば、イソブチレートは、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）により、イソブチリル‐ＣｏＡに変換されてもよい。イソブチリル‐ＣｏＡは、次に、アシル‐ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡｃｄＨ）によって、メチルアクリリル‐ＣｏＡに変わってもよい。エノール‐ＣｏＡヒドラターゼ（Ｅｃｈ）によるメチルアクリリル‐ＣｏＡの水和は、３‐ヒドロキシ‐イソブチリル‐ＣｏＡを生成し、そしてそれは、３‐ヒドロキシイソブチリル（Ｈｉｂｃｈ）によって、３‐ヒドロキシイソブチレートに加水分解されてもよい。３‐ヒドロキシイソブチレートは、３‐ヒドロキシイソブチレートデヒドロゲナーゼ（ＭｍｓＢ）によって、メチルマロン酸‐セミアルデヒドに酸化されてもよい。最終的に、アルデヒドは、メチルマロン酸‐セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＭｍｓＡ）によって、プロパノール‐ＣｏＡに変換されてもよい。プロパノール‐ＣｏＡは、生育を支えるために生合成のための中央代謝に入ることができる。Ａｃｓ、ＡｃｄＨ、Ｈｉｂｃｈ、ＭｍｓＢ、及びＭｍｓＡは、さまざまな生物から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローン化され、そして新しい宿主において、適切な発現レベル及び酵素活性を示す。そのようなタンパク質をコードする遺伝子をクローン化することができ、そして最適な発現のために合成オペロン中にそれらを構築することができる。
【００９５】
対照的に、Ｅｃｈは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローン化されておらず、そして発現されていない。研究は、細菌において、この異化酵素を同定しそして特徴付けるために行われていない。ＫＥＧＧ経路データベースから、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０に関して、１０酵素（PP_1412、PP_1845、PP_2136、PP_2217、PP_3283、PP_3284、PP_3358、PP_3491、PP_3726、PP_3732、及びPP_4030）が、Ｅｃｈ候補であると注釈を付けられた。これらのタンパク質を、他の経路酵素を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中にそれぞれクローン化することができ、そして炭素源としてイソブチレートを有する培地中で、形質転換細胞の生育を試験することができる。この生育に基づく選択方法は、仮に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における改善された酵素活性が望ましい場合、経路において任意の酵素を進化させるためにまた使用することができる。Ａｃｓ、ＡｃｄＨ、Ｅｃｈ、及びＨｉｂｃｈを、イソブチレート産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中にクローン化することができる。結果として得られる新規大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、グルコースから３‐ヒドロキシブチレートを生合成することができる。
【００９６】
個別のステップを含む本明細書で開示された任意の方法に関して、ステップは、任意の実行可能な順で行われてもよい。そして、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせが、同時に行われてもよい。
【００９７】
本発明は、以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順が、本明細書に記載されたような本発明の範囲及び趣旨に従って、広く解釈されるべきであることが理解される。
【実施例】
【００９８】
実施例１
１．ベクター構築
全てのクローニング手順を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１０‐ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）において行った。プライマー（表２）は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎから購入した。ＰＣＲ反応を、ＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｉｇｈ‐Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、メーカーの指示に従って行った。すべてのクローニングステップから生成されるプラスミドの配列を、制限マッピング及びＤＮＡシークエンシングを使用して検証した。
【００９９】
ｌａｃリプレッサーＬａｃＩをコードする遺伝子断片を、プラスミドｐＺＥ１２及びｐＺＡ２２のＳａｃＩ部位中にそれぞれ挿入して（Lutz及びBujard, 1997 Nucleic Acids Res. 25:1203-1210）、プラスミドｐＺＥｌａｃ及びｐＺＡｌａｃを得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを、プライマーｉｌｖｄ＿ａｃｃｆｗｄ及びｉｌｖｄ＿ｎｈｅｒｅｖで増幅した。得られたｉｌｖＤ遺伝子断片を、Ａｃｃ６５Ｉ及びＮｈｅＩで消化した。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アセトラクテートシンターゼ遺伝子ａｌｓＳを、オーバーラップＰＣＲを使用して、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡから、プライマーａｌｓ＿ａｃｃｒｅｍｏｖ／ａｌｓ＿ａｃｃｒｅｍｏｖ＿ｒｅｖ（ａｌｓＳにおけるＡｃｃ６５Ｉ部位を除去するため）、及びフランキングオリゴａｌｓ＿ｎｈｅｆｗｄ及びａｌｓ＿ｂｌｐｒｅｖで増幅した。ａｌｓＳのＰＣＲ産物を、次に、ＮｈｅＩ及びＢｌｐＩで消化した。精製したｉｌｖＤ及びａｌｓＳ遺伝子断片を、次に、ｐＺＡｌａｃ中にライゲーションして、プラスミドｐＩＢＡ１を作製した（図４のプラスミドマップを参照）。
【０１００】
２‐ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｋｉｖｄを、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＡＴＣＣ）のゲノム遺伝子から、プラスミドｋｉｖｄ＿ａｃｃｆｗｄ及びｋｉｖｄ＿ｘｂａｒｅｖを使用して、増幅した。ＰＣＲ産物を、Ａｃｃ６５Ｉ及びＸｂａＩで消化し、そしてｐＺＥｌａｃ中にライゲーションして、プラスミドｐＩＢＡ２を得た。ｋｉｖｄを、ｋｉｖｄ＿ａｃｃｆｗｄ及びｋｉｖｄ＿ｓｐｈｒｅｖでまた増幅し、そしてＰＣＲ産物を、ＡＣＣ６５Ｉ及びＳｐｈＩで消化した。ＹｄｃＷを、大腸菌（E. coli）ゲノムＤＮＡから、プライマーｙｄｃｗ＿ｓｐｈｆｗｄ及びｙｄｃｗ＿ｘｂａｒｅｖで増幅し、そしてそれを、次に、ＳｐｈＩ及びＸｂａＩで消化した。精製したｋｉｖｄ及びｙｄｃＷ遺伝子断片を、次に、ｐＺＥｌａｃ中にライゲーションしてプラスミドｐＩＢＡ３（図５のプラスミドマップを参照）を作製した。ＡｌｄＢを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから、プライマーａｌｄＢ＿ｓｐｈｆｗｄ及びａｌｄＢ＿ｘｂａｒｅｖで増幅し、ＳｐｈＩ及びＸｂａＩで消化し、そして次に、ｐＩＢＡ３中に挿入してプラスミドｐＩＢＡ４を得た。ＡｌｄＨを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから、プライマーａｌｄＨ＿ｓｐｈｆｗｄ及びａｌｄＨ＿ｓｐｈｒｅｍｏｖ（ａｌｄＨにおけるＳｐｈＩ部位を除去するため）で増幅した。そして、ＰＣＲ産物を、プライマーａｌｄＢ＿ｓｐｈｆｗｄ及びａｌｄＢ＿ｘｂａｒｅｖで再度増幅し、ＳｐｈＩ及びＸｂａＩで消化し、そして次にｐＩＢＡ３中に挿入してプラスミドｐＩＢＡ５を得た。同様に、ｇａｂＤを、プライマーｇａｂＤ＿ｓｐｈｆｗｄ及びｇａｂＤ＿ｘｂａｒｅｖで増幅し、そしてｐａｄＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから、プライマーｐａｄＡ＿ｓｐｈｆｗｄ及びｐａｄＡ＿ｘｂａｒｅｖで増幅した。それらを、ｐＩＢＡ３中にクローン化して、プラスミドｐＩＢＡ６及びｐＩＢＡ７を得た。ｋｄｈbaを、バークホルデリア アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ）（ＡＴＣＣ ＢＡＡ‐２４４）から、プライマーｋｄｈba＿ｓｐｈｆｗｄ及びｋｄｈba＿ｘｂａｒｅｖで増幅し、消化しそしてｐＩＢＡ３中にライゲーションしてプラスミドｐＩＢＡ８を得た。そして、ｋｄｈppを、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０（ＡＴＣＣ ４７０５４Ｄ‐５）から、プライマーｋｄｈpp＿ｓｐｈｆｗｄ及びｋｄｈpp＿ｘｂａｒｅｖで増幅し、消化しそしてｐＩＢＡ３中にライゲーションしてプラスミドｐＩＢＡ９を得た。
【０１０１】
ＰａｄＡ遺伝子断片を、プライマーｐａｄＡ＿ｂａｍｆｗｄ及びｐａｄＡ＿ｂａｍｒｅｖを使用して増幅した。ＢａｍＨＩで消化後、遺伝子断片を、発現プラスミドｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中に挿入して、ｐＩＢＡ１０を得た。
【０１０２】
【表２】
2014506466.tif 000005
【０１０３】
２．発酵手順及び産物分析
宿主株
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ‐１２株ＢＷ２５１１３（ｒｒｎＢT14ΔｌａｃＺWJ16ｈｓｄＲ５１４ΔａｒａＢＡＤAH33ΔｒｈａＢＡＤLD78）を、ｐＩＢＡ１、及びイソブチレート生成のために、任意のプラスミドｐＩＢＡ２〜ｐＩＢＡ９で形質転換した。
【０１０４】
ｙｑｈＤ遺伝子欠失株は、Ｋｅｉｏコレクション（Babaら、2006 Mol. Syst. Biol. 2:10.1038）由来であった。それを、プラスミドｐＣＰ２０で形質転換して、カナマイシン耐性マーカーを除去した。このΔｙｑｈＤ株を、イソブチレート生成のために、ｐＩＢＡ１及びｐＩＢＡ７で形質転換した。
【０１０５】
発酵プロセス
ＬＢ培地でインキュベートした一晩培養物を、１２５ｍＬの三角フラスコにおいて、０．５％酵母抽出物及び４％グルコースを補充した５ｍＬのＭ９培地中に、２５倍に希釈した。抗生物質（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ）を、適切に添加した。０．１ｍＭのイソプロピル‐ｂ‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、タンパク質発現を誘導した。培地を、０．５ｇのＣａＣＯ3の添加によって緩衝した。培地を、３０℃の振盪器（２５０ｒｐｍ）に設置し、そして４８時間インキュベートした。
【０１０６】
発酵産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００キャピラリーＨＰＬＣを使用して、屈折率検出器を有するＨＰＬＣ分析によって定量した。
【０１０７】
３．酵素アッセイ
タンパク質過剰発現及び精製
ｐＩＢＡ１０を、ｐＲＥＰ４プラスミド（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を保持するＢＬ‐２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中に形質転換した。一晩前培養物を、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリン、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含む３００ｍＬの２ＸＹＴ富栄養培地において、１００倍に希釈した。組み換えタンパク質の発現を、３０℃で一晩行った。
【０１０８】
細胞ペレットを、３０ｍＬの溶解緩衝液（２５０ｍＬのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのイミダゾール及び５０ｍＭのトリスｐＨ８．０）において超音波破砕した。細胞残屑を、１５，０００ＰＲＭ、２０分間、遠心分離により除去した。上清を、Ｎｉ‐ＮＴＡカラムに通した。次に、カラムを１０ｍＬの洗浄緩衝液（２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール及び５０ｍＭのトリスｐＨ８．０）で４回洗浄した。最後に、標的タンパク質を、１０ｍＬの溶出緩衝液（２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール及び５０ｍＭのトリスｐＨ８．０）で溶出した。溶出液を緩衝液交換し、そしてＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ遠心濾過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、保存緩衝液（１００μＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、及び２０％グリセロール）中に濃縮した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって決定した（吸光係数、７５０７０ｃｍ-1Ｍ-1）。濃縮したタンパク質溶液を、ＰＣＲチューブに分注し（１００μＬ）、そして長期保存のために−８０℃で瞬間凍結した。
【０１０９】
ＰａｄＡ活性の測定
基質イソブチルアルデヒドを、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）から購入し、そしてＮＡＤ+を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。反応混合物は、０．５ｍＭのＮＡＤ+及び０．２〜４ｍＭのイソブチルアルデヒドを、全量８０μＬで、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ）中に含む。反応を、２μＬのＫＩＤＶ（最終酵素濃度２５ｎＭ）に添加することにより開始し、そしてＮＡＤＨの生成を、３４０ｎＭで監視した（吸光係数、６．２２ｍＭ-1ｃｍ-1）。動態パラメータ（ｋcat及びｋm）を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用して、ミカエリス‐メンテンの式に、初速度データをフィットすることによって決定した。
【０１１０】
実施例２
菌株及びプラスミド
すべてのプライマーを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得て、そして表３に列挙した。本試験で使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、表３に列挙し、そしてそれは、ｙｑｈＤ欠失を有する、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ‐１２株ＢＷ２５１１３に由来した。すべてのクローニング手順を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１０‐ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｓ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）について行った。イソブチレートを生成するために使用したプラスミドｐＩＢＡ１及びｐＩＢＡ７を、以前の研究から得た（Zhangら、2011 ChemSusChem 4:1068-1070）。ｐａｄＡの２つのコピーを運ぶｐＩＢＡ１プラスミド１を構築し、ｐａｄＡ遺伝子を、オリゴｐａｄＡ＿ＳａｃＩｆｗｄ及びｐａｄＡ＿ＳａｃＩｒｅｖで、ＰＣＲによって増幅し、ＳａｃＩで消化し、そして次に、ｐＩＢＡ７中にライゲーションしてｐＩＢＡ１１を作製した。ｐＩＢＡ１１において、ｐａｄＡの追加のコピーは、構成的プロモーターの制御下、アンピシリン耐性遺伝子ｂｌａを有する同じオペロンにある。ａｄｈＥ、ａｄｈＰ、ｅｕｔＧ、ｙｉａＹ及びｙｊｇＢのＰ１ファージを、Ｋｅｉｏコレクションから得た（Babaら、2006 Mol. Syst. Biol. 2:10.1038）。ファージを使用してＩＢＡ１株に形質導入し、ダブルノックアウト株を構築した。すべてのノックアウト株を、次に、ｐＣＰ２０プラスミドで形質転換して、カナマイシンマーカーを除去した。正確なノックアウトを、ＰＣＲで検証した。イソブチレートを生成するために、それぞれの株をプラスミドｐＩＢＡ１＋ｐＩＢＡ７、又はｐＩＢＡ１＋ｐＩＢＡ１１で形質転換した。
【０１１１】
【表３】
2014506466.tif 000006
【０１１２】
細胞培養及び振盪フラスコ発酵
特に明記しない限り、細胞を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充した２ＸＹＴ富栄養培地（１６ｇ／Ｌのバクト‐トリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物及び５ｇ／ＬのＮａＣｌ）において、３７℃で、試験管中で生育した。２ＸＹＴ培地でインキュベートした２００μＬの一晩培養物を、１２５ｍＬの三角フラスコにおいて、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、４０ｇ／Ｌのグルコース、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充した５ｍＬのＭ９最小培地中に移した。イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、０．１ｍＭの濃度で添加して、タンパク質発現を誘導した。発酵培地を、０．５ｇのＣａＣＯ3の存在下、緩衝した。発酵培養物を、２５０ｒｐｍの速度の振盪器に３０℃で設置した。
【０１１３】
発酵槽用培地
以下の組成物：グルコース、１０；（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．８；Ｋ2ＨＰＯ4、８．７６；ＫＨ2ＰＯ4、２．４；クエン酸ナトリウム、１．３２；酵母抽出物、１５；アンピシリン、０．１；カナマイシン、０．０５（すべてｇ／Ｌ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養のための播種培地（ｓｅｅｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）である。バイオリアクター培養用発酵培地は、以下の組成物：グルコース、３０；（ＮＨ4）2ＳＯ4、３；Ｋ2ＨＰＯ4、１４．６；ＫＨ2ＰＯ4、４；クエン酸ナトリウム、２．２；酵母抽出物、２５；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．２５；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０１５；パントテン酸カルシウム、０．００１；チアミン、０．０１；アンピシリン、０．１；カナマイシン、０．０５（すべてｇ／Ｌ）、及び１ｍＬ／Ｌの微量金属溶液を含む。微量金属溶液は、以下：ＮａＣｌ、５；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、４；ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．４；Ｈ3ＢＯ3、０．５７５；Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．５；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４．７５（すべてｇ／Ｌ）；６Ｎ Ｈ2ＳＯ4、１２．５ｍＬを含む。供給溶液は、以下：グルコース、６００；（ＮＨ4）ＳＯ4、５；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．２５；酵母抽出物、５；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０１５；パントテン酸カルシウム、０．００１；チアミン、０．０１；アンピシリン、０．１；カナマイシン、０．０５（すべてｇ／Ｌ）；０．２ｍＭのＩＰＴＧ；及び１ｍＬ／Ｌの微量元素を含む。
【０１１４】
発酵槽培養条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養を、０．６Ｌの作業量を使用して、１．３ＬのＢｉｏｆｌｏ １１５発酵槽（ＮＢＳ；Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において行った。発酵槽を、播種培地の１０％の一晩前培養物で播種し、そして次に、細胞を、３７℃、３０％溶存酸素（ＤＯ）レベル、及びｐＨ７．０で生育した。ＯＤ600が８．０に到達した後、０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加し、そして温度を３０℃に変更して、イソブチレート生成を開始した。ｐＨを、１０Ｍの水酸化ナトリウム溶液、５０％の水酸化アンモニウム、又は２００ｇ／Ｌの水酸化カルシウム懸濁液それぞれの自動添加によって、７．０に制御した。空気流量を、すべてのプロセスにおいて、１ｖｖｍに維持した。ＤＯを、撹拌速度（３００〜８００ｒｐｍ）を調節することにより、空気飽和に関して、約１０％に維持した。発酵槽のグルコースレベルを、供給培地を自動的に添加することにより、約１０ｇ／Ｌに維持した。ＤＯが、４０％を超え、そしてイソブチレートレベルが増加しなくなったとき、発酵プロセスを停止した。異なる時点での発酵サンプルを採取して、光学濃度及び代謝産物濃度を決定した。
【０１１５】
代謝産物分析及び乾燥細胞重量決定
発酵産物を、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈカラム（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）及び屈折率検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを使用して分析した。移動相は、流速０．６ｍＬ／分で、５ｍＭのＨ2ＳＯ4であった。カラム温度及び検出温度は、それぞれ、３５℃及び５０℃であった。細胞乾燥重量を、０．４５μｍのグラスファイバーフィルター（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｆｉｂｅｒｇｌａｓｓ Ｓａｌｅｓ；Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ Ｓｈｏｒｅｓ，ＭＩ）を介して、５ｍＬの培養物を濾過することによって決定した。培地の除去後、フィルターを１５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、オーブンで乾燥し、そして次に、秤量した。細胞乾燥重量を、３連で決定した。
【０１１６】
実施例３
クローニング手順
ＢＫＤＨ酵素複合体遺伝子を、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ゲノム遺伝子から、プライマーｂｋｄｈ＿ｅｃｏｆｗｄ（TGCATCGAATTCAGGAGAAATTAACTATGAACGAGTACGCCCCCCTGCGTTTGC（配列番号１４５））及びｂｋｄｈ＿ｈｉｎｄｒｅｖ（TGCATCAAGCTTTCAGATATGCAAGGCGTGGCCCAG（配列番号１４６））で、増幅した。ＰＣＲ産物を、次に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｐＺＥ１２中に挿入してｐＩＢＡ１６を作製した。
【０１１７】
ｔｅｓＡ遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｋ１２ゲノムＤＮＡから、プライマーペアＴｅｓＡ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｆ（GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGATGAACTTCAACAATGTTTTCCG（配列番号１４７））及びＴｅｓＡ＿Ｘｂａ１＿Ｒ（GGGCCCTCTAGATTATGAGTCATGATTTACTAAAGGCT（配列番号１４８）を使用して増幅し；ｔｅｓＢを、プライマーペアＴｅｓＢ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｆ（GGGCCCAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGATGAGTCAGGCGCTAAAAAATTTACT（配列番号１４９））及びＴｅｓＢ＿Ｘｂａ１＿Ｒ（GGGCCCTCTAGATTAATTGTGATTACGCATCACCCCTT（配列番号１５０））で増幅した。ＰＣＲ後、ＤＮＡ断片を精製し、そして制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａ１を使用して消化した。ｔｅｓＡを含む消化した断片を、ｐＩＢＡ１６中に挿入してｐＩＢＡ１７を作製し；ｔｅｓＢを含む消化した断片をｐＩＢＡ１６中に挿入してｐＩＢＡ１８を作製した。
【０１１８】
発酵プロセス
ＬＢ培地でインキュベートした一晩培養物を、１２５ｍＬの三角フラスコにおいて、０．５％酵母抽出物及び４％グルコースを補充した５ｍＬのＭ９培地中に、２５倍に希釈した。抗生物質を、適切に添加した（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びカナマイシン２５ｍｇ／Ｌ）。０．１ｍＭのイソプロピル‐ｂ‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、タンパク質発現を誘導した。培地を、０．５ｇのＣａＣＯ3の添加によって緩衝した。培養物を３０℃の振盪器（２５０ｒｐｍ）に設置し、そして４８時間インキュベートした。
【０１１９】
発酵産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００キャピラリーＨＰＬＣを使用して、屈折率検出器を有するＨＰＬＣ分析によって定量した。結果を表４に示す。
【０１２０】
【表４】
2014506466.tif 000007
【０１２１】
本明細書に挙げられるすべての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑなどにおけるヌクレオチド配列寄託、及び例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどにおけるアミノ酸配列寄託、及びＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコーディング領域からの翻訳）の完全な開示は、それらの全体について参照により組み込まれる。万一、本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれた任意の文献の開示（複数）との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示が適用されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられる。不必要な限定が、そこから理解されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる当業者に明らかな変化に関して、示されそして記載された正確な詳細に限定されない。
【０１２２】
特に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用される、化合物、分子量などの量を表すすべての数字は、すべての場合について、用語「約（ａｂｏｕｔ）」によって修飾されると理解されるべきである。従って、逆に明記されない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、そして特許請求の範囲に対する均等論を制限する試みとしてではないが、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数の観点から、及び通常の四捨五入技術を適用することによって解釈されるべきである。
【０１２３】
本発明の広い範囲に示されている数値範囲及びパラメータが、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、できる限り正確に報告される。すべての数値は、しかしながら、本質的に、それらのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に起因する範囲を必然的に含む。
【０１２４】
すべての見出しは、読者の便宜のためであり、そして指定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月5日(2013.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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