(57)【要約】本明細書において、活性物質を安定化するための方法および組成物を提供する。活性物質は、シルクフィブロインマトリクスの中に分散、混合、または埋め込まれ、それによって保存および／または輸送の際に活性物質の生物活性を保持する。いくつかの態様において、保存安定ワクチンシルク組成物も本明細書において提供する。2014518557.tif 000025
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物を維持する段階を含む方法であって、該組成物が、シルクフィブロインマトリクスと、その中に分散されている少なくとも1つの活性物質とを含み、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方の場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、前記方法。
【請求項２】
活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約50％を保持する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約80％を保持する、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
組成物が少なくとも約1ヶ月間維持される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
組成物が少なくとも約6ヶ月間維持される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
組成物が、薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
組成物が凍結乾燥される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
組成物が微粉化される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
組成物が添加剤をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、またはその任意の組み合わせから選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、約0℃〜室温より高い温度で維持される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
組成物がほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
組成物が37℃より高い温度で維持される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
光曝露下で組成物が維持される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
組成物が少なくとも約10％の相対湿度で維持される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
活性物質が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、光合成およびエネルギーハーベスティング化合物（energy-harvesting compound）、香料、抗生物質、治療物質、診断物質、ウイルスベクター、および抗毒素物質からなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
活性物質が免疫原である、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、ならびに合成ペプチド、炭水化物、および抗原からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型（Haemophilus influenzae Type B）、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌（Neisseria meningitides C）、インフルエンザ、水痘、または結核菌（Mycobacteria tuberculosis）カルメットゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌（Bordetella pertussis）に由来する、請求項19または20記載の方法。
【請求項２２】
免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、請求項19または20記載の方法。
【請求項２３】
免疫原が生弱毒ウイルスである、請求項19または20記載の方法。
【請求項２４】
生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスが水痘である、請求項23〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ウイルスがインフルエンザである、請求項23〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
生弱毒ウイルスが麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、請求項19または20記載の方法。
【請求項３０】
非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
免疫原が細菌である、請求項19記載の方法。
【請求項３２】
細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
免疫原が細菌サブユニットである、請求項19記載の方法。
【請求項３４】
細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、またはB群連鎖球菌（Group B streptococcus）に由来する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
細菌サブユニットが多糖類である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
免疫原がウイルスサブユニットである、請求項19記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
免疫原が組み換え型である、請求項19記載の方法。
【請求項３９】
免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、請求項19記載の方法。
【請求項４０】
シルクフィブロインマトリクス対活性物質の比率が約1：1000〜約1000：1である、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
シルクフィブロインマトリクスとその中に分散される活性物質とを含む保存安定組成物であって、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方の場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、前記保存安定組成物。
【請求項４２】
活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約50％を保持する、請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約80％を保持する、請求項41または42記載の組成物。
【請求項４４】
少なくとも約1ヶ月間維持される、請求項41〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
少なくとも約6ヶ月間維持される、請求項41〜44のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、請求項41〜45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４７】
凍結乾燥されている、請求項41〜46のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４８】
微粉化されている、請求項41〜47のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４９】
微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項49記載の組成物。
【請求項５１】
シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、請求項41〜50のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５２】
添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、またはその任意の組み合わせから選択される、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
約0℃〜室温より上の温度で維持される、請求項41〜52のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５４】
ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、請求項41〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
37℃より高い温度で維持される、請求項41〜54のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５６】
光曝露下で維持される、請求項41〜55のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも約10％の相対湿度で維持される、請求項41〜56のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５８】
活性物質が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、光合成およびエネルギーハーベスティング化合物、香料、抗生物質、治療物質、診断物質、ウイルスベクター、抗毒素物質、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項41〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５９】
活性物質が免疫原である、請求項41〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、ならびに合成ペプチド、炭水化物、および抗原からなる群より選択される、請求項59記載の組成物。
【請求項６１】
免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、請求項59または60記載の組成物。
【請求項６２】
免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、請求項59または60記載の組成物。
【請求項６３】
免疫原が生弱毒ウイルスである、請求項59または60記載の組成物。
【請求項６４】
生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項64記載の組成物。
【請求項６６】
ウイルスが水痘である、請求項63〜65のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６７】
ウイルスがインフルエンザである、請求項63〜65のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６８】
生弱毒ウイルスが、麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、請求項63記載の組成物。
【請求項６９】
免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、請求項59または60記載の組成物。
【請求項７０】
非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
免疫原が細菌である、請求項59記載の組成物。
【請求項７２】
細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、請求項71記載の組成物。
【請求項７３】
免疫原が細菌サブユニットである、請求項59記載の組成物。
【請求項７４】
細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、請求項73記載の組成物。
【請求項７５】
細菌サブユニットが多糖類である、請求項73記載の組成物。
【請求項７６】
免疫原がウイルスサブユニットである、請求項59記載の組成物。
【請求項７７】
ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、請求項76記載の組成物。
【請求項７８】
免疫原が組み換え型である、請求項59記載の組成物。
【請求項７９】
免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、請求項59記載の組成物。
【請求項８０】
シルクフィブロインマトリクス対活性物質の比率が約1：1000〜約1000：1である、請求項41〜79のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８１】
以下の段階を含む、請求項41〜80のいずれか一項記載の保存安定組成物を調製する方法：
a．少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロイン溶液を提供する段階；および
b．段階（a）のシルクフィブロイン溶液を乾燥させる段階であって、固体状態のシルクフィブロインを形成し、それによって保存時に少なくとも1つの活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する組成物を得る、段階。
【請求項８２】
乾燥させる段階が凍結乾燥である、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
乾燥させる段階が風乾である、請求項81記載の方法。
【請求項８４】
段階（b）の固体状態シルクフィブロインを凍結乾燥する段階をさらに含む、請求項81〜83のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
組成物の後処置をさらに含む、請求項81〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
後処置が、組成物の結晶性を変化させる、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
後処置が、組成物にメタノールまたはエタノールを接触させる段階である、請求項85または86記載の方法。
【請求項８８】
後処置が、組成物を剪断応力に供する段階である、請求項85〜87のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
後処置が、組成物を電場に供する段階である、請求項85〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
後処置が、組成物を圧力に供する段階である、請求項85〜89のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
後処置が組成物に塩を接触させる段階である、請求項85〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
微粉化粒子を得るために機械的手段によって、段階（b）の固体状態シルクフィブロインを減少させる段階をさらに含む、請求項81〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
機械的手段が、微粉化、粉砕、破砕、すりつぶし、凍結乾燥、またはその任意の組み合わせから選択される、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
微粉化粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項92または93記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも1つの活性物質が、保存時にその当初の生物活性の少なくとも約80％を保持する、請求項81〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
保存が少なくとも約6ヶ月の期間にわたる、請求項81〜95のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
保存が、ほぼ室温〜約37℃の温度で行われる、請求項81〜96のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
保存が37℃より高い温度で行われる、請求項81〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
免疫原性組成物を維持する段階を含む方法であって、該組成物が、シルクフィブロインマトリクスと、その中に分散されている少なくとも1つの免疫原とを含み、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方である場合に、免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約30％を保持する、前記方法。
【請求項１００】
免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約50％を保持する、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約80％を保持する、請求項99または100記載の方法。
【請求項１０２】
組成物が少なくとも約1ヶ月間維持される、請求項99〜101のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
組成物が少なくとも約6ヶ月間維持される、請求項99〜102のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
組成物が、薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、請求項99〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
組成物が凍結乾燥される、請求項99〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
組成物が微粉化される、請求項99〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
組成物が、シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、請求項99〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
糖類がスクロースである、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
組成物が、約0℃〜室温より上の温度で維持される、請求項99〜112のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
組成物が、ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、請求項99〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
組成物が37℃より高い温度で維持される、請求項99〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
光曝露下で組成物が維持される、請求項99〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１７】
組成物が、少なくとも約10％の相対湿度で維持される、請求項99〜116のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１８】
免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、合成ペプチド、炭水化物、抗原、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項99〜117のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１９】
免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２０】
免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２１】
免疫原が生弱毒ウイルスである、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
ウイルスが水痘である、請求項121〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
ウイルスがインフルエンザである、請求項121〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２６】
生弱毒ウイルスが麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、請求項121記載の方法。
【請求項１２７】
免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
非エンベロープウイルスがロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
免疫原が細菌である、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３０】
細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、請求項129記載の方法。
【請求項１３１】
免疫原が細菌サブユニットである、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３２】
細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、請求項131記載の方法。
【請求項１３３】
細菌サブユニットが多糖類である、請求項131記載の方法。
【請求項１３４】
免疫原がウイルスサブユニットである、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
免疫原が組み換え型である、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン；腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、請求項99〜118のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３８】
シルクフィブロインマトリクス対免疫原の比率が約1：1000〜約1000：1である、請求項99〜137のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
シルクフィブロインマトリクスとその中に分散されている免疫原とを含む保存安定免疫原性組成物であって、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方である場合に、免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約30％を保持する、前記保存安定免疫原性組成物。
【請求項１４０】
免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約50％を保持する、請求項139記載の組成物。
【請求項１４１】
免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約80％を保持する、請求項139または140記載の組成物。
【請求項１４２】
少なくとも約1ヶ月間維持される、請求項139〜141のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４３】
少なくとも約6ヶ月間維持される、請求項139〜142のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４４】
薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、請求項139〜143のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４５】
凍結乾燥されている、請求項139〜144のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４６】
微粉化されている、請求項139〜145のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４７】
微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項146記載の組成物。
【請求項１４８】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項147記載の組成物。
【請求項１４９】
シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、請求項139〜148のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５０】
添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項149記載の組成物。
【請求項１５１】
安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項150記載の組成物。
【請求項１５２】
糖類がスクロースである、請求項151記載の組成物。
【請求項１５３】
約0℃〜室温より上の温度で維持される、請求項139〜152のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５４】
ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、請求項139〜153のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５５】
37℃より高い温度で維持される、請求項139〜154のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５６】
光曝露下で維持される、請求項139〜155のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５７】
少なくとも約10％の相対湿度で維持される、請求項139〜156のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５８】
免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、合成ペプチド、炭水化物、抗原、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項139〜157記載の組成物。
【請求項１５９】
免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６０】
免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６１】
免疫原が生弱毒ウイルスである、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６２】
生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項161記載の組成物。
【請求項１６３】
エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項162記載の組成物。
【請求項１６４】
ウイルスが水痘である、請求項161〜163のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６５】
ウイルスがインフルエンザである、請求項161〜163のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６６】
生弱毒ウイルスが麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、請求項161記載の組成物。
【請求項１６７】
免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６８】
非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、請求項167記載の組成物。
【請求項１６９】
免疫原が細菌である、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７０】
細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、請求項169記載の組成物。
【請求項１７１】
免疫原が細菌サブユニットである、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７２】
細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、請求項171記載の組成物。
【請求項１７３】
細菌サブユニットが多糖類である、請求項171記載の組成物。
【請求項１７４】
免疫原がウイルスサブユニットである、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７５】
ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、請求項174記載の組成物。
【請求項１７６】
免疫原が組み換え型である、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７７】
免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、請求項139〜158のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７８】
シルクフィブロインマトリクス対免疫原の比率が約1：1000〜約1000：1である、請求項139〜177のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７９】
以下の段階を含む、請求項139〜178のいずれか一項記載の保存安定免疫原性組成物を調製する方法：
a．少なくとも1つの免疫原を含むシルクフィブロイン溶液を提供する段階；および
b．段階（a）のシルクフィブロイン溶液を乾燥させる段階であって、固体状態のシルクフィブロインを形成し、それによって保存時に少なくとも1つの免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約30％を保持する免疫原性組成物を得る、段階。
【請求項１８０】
乾燥させる段階が凍結乾燥である、請求項179記載の方法。
【請求項１８１】
乾燥させる段階が風乾である、請求項179記載の方法。
【請求項１８２】
段階（b）の固体状態シルクフィブロインを凍結乾燥する段階をさらに含む、請求項179〜181のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８３】
組成物の後処置をさらに含む、請求項179〜182のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８４】
後処置が、組成物の結晶性を変化させる、請求項183記載の方法。
【請求項１８５】
後処置が、組成物にメタノールまたはエタノールを接触させる段階である、請求項183または184記載の方法。
【請求項１８６】
後処置が、組成物を剪断応力に供する段階である、請求項183〜185のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８７】
後処置が、組成物を電場に供する段階である、請求項183〜186のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８８】
後処置が、組成物を圧力に供する段階である、請求項183〜187のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８９】
後処置が組成物に塩を接触させる段階である、請求項183〜188のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９０】
微粉化粒子を得るために機械的手段によって、段階（b）の固体状態シルクフィブロインを減少させる段階をさらに含む、請求項179〜189のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９１】
機械的手段が、微粉化、粉砕、破砕、すりつぶし、フリーズドライ、またはその任意の組み合わせから選択される、請求項190記載の方法。
【請求項１９２】
微粉化粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項190または191記載の方法。
【請求項１９３】
少なくとも1つの免疫原が、保存時にその当初の免疫原性の少なくとも約80％を保持する、請求項179〜192のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９４】
保存が少なくとも6ヶ月間にわたる、請求項179〜193のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９５】
保存が、ほぼ室温〜約37℃の温度で行われる、請求項179〜194のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９６】
保存が37℃より高い温度で行われる、請求項179〜195のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９７】
シルクフィブロインマトリクスとその中に分散されている少なくとも1つの生弱毒ウイルスとを含む免疫原性組成物であって、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも24時間維持した場合に、生弱毒ウイルスがその当初の感染性の少なくとも約30％を保持する、前記免疫原性組成物。
【請求項１９８】
ウイルスがその当初の感染安定性の少なくとも約50％を保持する、請求項197記載の組成物。
【請求項１９９】
ウイルスがその当初の感染安定性の少なくとも約80％を保持する、請求項197または198記載の組成物。
【請求項２００】
少なくとも約6ヶ月間維持される、請求項197〜199のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０１】
ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、請求項197〜200のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０２】
37℃より高い温度で維持される、請求項197〜201のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０３】
凍結乾燥される、請求項197〜202のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０４】
生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項197〜203のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０５】
エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項204記載の組成物。
【請求項２０６】
エンベロープウイルスが、水痘、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、黄熱病ウイルス、またはインフルエンザウイルスである、請求項204または205記載の組成物。
【請求項２０７】
生弱毒ウイルスが非エンベロープウイルスである、請求項197〜203のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０８】
非エンベロープウイルスがロタウイルスである、請求項207記載の組成物。
【請求項２０９】
添加剤をさらに含む、請求項197〜208のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１０】
添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項209記載の組成物。
【請求項２１１】
安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項210記載の組成物。
【請求項２１２】
糖類がスクロースである、請求項211記載の組成物。
【請求項２１３】
シルクフィブロインマトリクスとその中に分散されている感染性ウイルスとを含む無細胞安定化ウイルス調製物であって、該調製物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方である場合に、ウイルスがその当初の感染性の少なくとも約30％を保持する、前記無細胞安定化ウイルス調製物。
【請求項２１４】
ウイルスおよびシルクフィブロインマトリクスが凍結乾燥される、請求項213記載の調製物。
【請求項２１５】
ウイルスが、その当初の感染性の少なくとも約80％を保持する、請求項213または214記載の調製物。
【請求項２１６】
少なくとも約6ヶ月間維持される、請求項213〜215のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２１７】
ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、請求項213〜216のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２１８】
37℃より高い温度で維持される、請求項213〜217のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２１９】
ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項213〜218のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２０】
ウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項213〜218のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２１】
ウイルスが非エンベロープウイルスである、請求項213〜218のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２２】
ウイルスがバクテリオファージである、請求項213〜218のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２３】
ウイルスが組み換え型ウイルスである、請求項213〜218のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２４】
ウイルスがウイルスベクターである、請求項213〜218のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２５】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項224記載の調製物。
【請求項２２６】
請求項41〜80、139〜178、または197〜212のいずれか一項記載の少なくとも1つの組成物を含む調製物。
【請求項２２７】
錠剤、ロゼンジ、懸濁剤、流動性粉末、エアロゾル、カプセル剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項226記載の調製物。
【請求項２２８】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項226〜227のいずれか一項記載の調製物。
【請求項２２９】
請求項41〜80、139〜178、もしくは197〜212のいずれか一項記載の少なくとも1つの組成物、または請求項213〜225、もしくは226〜228のいずれか一項記載の調製物を含むパッケージ。
【請求項２３０】
容器が、バイアル、アンプル、カプセル、チューブ、シリンジ、ボトル、パケット、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項229記載のパッケージ。
【請求項２３１】
シリンジが無針である、請求項230記載のパッケージ。
【請求項２３２】
請求項229〜231のいずれか一項記載のパッケージと、薬学的に許容される溶液とを含むキット。
【請求項２３３】
少なくとも1つのシリンジをさらに含む、請求項232記載のキット。
【請求項２３４】
消毒剤をさらに含む、請求項232または233記載のキット。
【請求項２３５】
少なくとも1つの小室が、請求項41〜80、139〜178、または197〜212のいずれか一項記載の組成物の既定量を含み、排出口が組成物のための出口を提供する、排出口を有する少なくとも1つの小室を含む送達装置。
【請求項２３６】
シリンジ、ドライパウダー注入器、点鼻スプレー、ネブライザー、インプラント、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項235記載の装置。
【請求項２３７】
インプラントがマイクロチップである、請求項235記載の装置。
【請求項２３８】
排出口を通しての組成物の放出を制御するためにアクチュエータをさらに含む、請求項235〜237のいずれか一項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C§119(e)の下で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2011年4月21日に提出された米国特許仮出願第61/477,737号の恩典を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成金番号EB002520、および米国空軍によって与えられたFA9550-07-1-0079により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、全般的に活性物質を安定化するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
活性物質は通常、不安定であり、周囲の条件、たとえば温度、湿度、および／または光の変化に対して感受性であることから、活性物質の安定化は、多くの応用において重要な特色である。活性物質が、所定の反応にとって有用であることが同定された場合であっても、処理条件での長期間の安定性の欠如により、その応用は難しいことが多い。
【０００５】
活性物質、たとえば酵素および治療タンパク質を安定化させるために、異なる応用に関して凍結乾燥から共有結合固定化に至るまで様々な様式が研究されている。一般的に、多くの活性物質は、固定化されると、おそらく運動性が減少して、疎水性水和の変化を防止して、これにより凝集および活性の喪失を防止することにより、安定性が改善することが証明されている。活性物質、たとえば酵素を固定化する技術は通常、4つのカテゴリーに分類される：（1）担体材料表面に対する酵素の非共有結合吸着；（2）材料表面に対する共有結合；（3）材料マトリクスへの物理的捕捉；および（4）構造を「ロックする」ための酵素の架橋化。これらのアプローチは全て、上記の利点を得ながら高い触媒活性を維持するための妥協である。活性物質の大量のローディングおよびその活性を保持するために特異的表面結合部位または相対的親水性／疎水性微小環境を提供する材料がないことにより、上記の担体を主材料とする固定化アプローチの応用は制限される。さらに、多くの応用に関して、担体材料は、生物医学応用にとって生分解性および生物適合性である必要があり、このためほとんどの合成ポリマー材料は使用できない。
【０００６】
最近、活性物質、たとえば酵素の安定性および活性を改善するために、新しい固定化アプローチが開発されている。たとえば、担体材料の微小環境を、非特異的結合部位を減少させるために遮断物質を用いることによって工学操作してもよい。または、活性物質の近位に親水性高分子を導入してもよく、または活性物質と材料表面とのあいだに親水性スペーサーを用いてもよい。さらに、ゾル-ゲル材料が固定化のために用いられているが、これらの材料は、微小環境に閉じこめる効果により、酵素、たとえばリパーゼの活性を100倍まで増強することが見いだされている。
【０００７】
さらに、酵素架橋法を、タンパク質結晶化と組み合わせて、本来の酵素と比較して酵素の安定性および選択性が増加した架橋酵素結晶（CLEC）が生成されている。この方法は、治療タンパク質薬を調合するために製薬企業によって用いられているが、タンパク質の結晶化は複雑で、しばしば予測不可能である。架橋酵素凝集体（CLEA）は、タンパク質を沈殿させた後にグルタルアルデヒドとの架橋によって得ることができる。ペニシリンアシラーゼのCLEAは、アンピシリンの合成においてCLECと同じ活性を有した。磁気ナノ粒子もまた、酵素の共有結合固定化のために、このように酵素の安定性の増強のために用いられている。これらの固定化法はいずれも、生物適合性／生分解性であり、周囲の保存条件（たとえば室温）で長期間安定性を提供しながら単純に用いられる。
【０００８】
特に、ワクチンの安定化は積年の難題であり、保存が不適切であるために大量のワクチンが廃棄されている。地球規模での免疫により、現在毎年2〜3百万人の子供の生命が救われているものの、1050万人の子供が毎年死亡しており、250万人は、ワクチンによって予防可能な疾患のために死亡している。麻疹、ムンプス、および風疹は、それぞれ麻疹ウイルス、ムンプスウイルス（パラミクソウイルス）、および風疹ウイルス（トガウイルス）によって引き起こされる3つの一般的な小児疾患であるが、これらは重篤な合併症および／または死亡に関連しうる。たとえば、肺炎および脳炎は、麻疹によって引き起こされる。ムンプスは無菌性髄膜炎、難聴、および精巣炎に関連し、ならびに妊娠中の風疹は、感染した母親の乳児において先天性風疹症候群を引き起こしうる。米国における各々の疾患の自然発症に及ぼす麻疹、ムンプス、および風疹ワクチン接種の影響は、ワクチン使用前の所定の年に報告された麻疹、ムンプス、および風疹症例の最大数を、1995年に報告された各疾患の症例数と比較することによって定量することができる。麻疹に関して、1941年に894,134例が報告されたのに対し、1995年に報告された症例数は288例であり、報告例は99.97％減少した；ムンプスに関して、1968年に152,209例が報告されたのに対し、1995年に報告された症例は840例であり、報告例は99.45％減少した；および風疹に関して、1969年に報告された57,686例に対し、1995年に報告されたのは200例であり、99.65％減少した。Monthly Immunization Table, 45 MMWR 24 (1996)（非特許文献1）。
【０００９】
ワクチンは、特に輸送および保存中に熱くなりすぎるまたは冷たくなりすぎると、その有効性を急速に失いうる生物学的物質である。不注意な凍結、8℃より上への加温、またはコールドチェーンのその他の中断により、効能の欠如またはワクチンの廃棄が起こりうる。WHOによれば、2006年から2015年までに米国だけでも地球規模のワクチン接種プログラムのために350億ドルを資金提供することになる。約3分の1がワクチンに費やされ、残りは、ワクチン輸送システムに費やされる。コールドチェーンの不備によるたとえ1％のワクチン廃棄でもかなりの合計になることは明白である。実際に、米国の5つの州における1％から5％という平均的な廃棄の費用は、およそ600万から3100万ドルである。世界の他の地域では、ワクチンの廃棄は10％に達しうる。2つの最も一般的な型の廃棄は、熱安定性および貯蔵寿命に関連しており、不注意な凍結がもう1つの重要な問題である。それゆえ、保存安定活性物質、たとえば様々な厳しい環境条件で、たとえばコールドチェーンの遵守を必要とすることなく、効能を維持することができるより長い貯蔵寿命を有する保存安定ワクチンが非常に必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Monthly Immunization Table, 45 MMWR 24 (1996)
【発明の概要】
【００１１】
概要
本明細書において記述される様々な態様は、組成物を少なくとも1回の状態変化サイクルに供した場合、および／または明記された条件下で一定期間維持した場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、シルクフィブロインマトリクスとその中に分散させた活性物質とを含む保存安定組成物を提供する。1つの態様において、状態変化サイクルは、凍結融解サイクルである。1つの態様において、活性物質を維持する期間は少なくとも約24時間である。いくつかの態様において、明記された条件は、活性物質が保存および／または輸送される環境条件でありうる。環境条件の非制限的な例には、温度、気圧、湿度、および光への曝露が挙げられる。いくつかの態様において、活性物質は免疫原である。いくつかの態様において、活性物質はワクチンである。
【００１２】
たとえば、生物医学分野において有用なキットおよび送達装置も同様に本明細書において提供される。例示的な送達装置には、シリンジ、ドライパウダー注入器、点鼻スプレー、ネブライザー、およびインプラントが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。そのようなキットおよび装置は、本明細書に記述される保存安定組成物と、任意で薬学的に許容される溶液とを含む。1つの態様において、キットはさらに、本明細書において記述される保存安定組成物を対象に投与するための少なくとも1つの送達装置、および／または消毒剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】麻疹、ムンプス、および風疹に関するワクチン試料のlog10希釈とCt値との比例関係を示す。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２】遮光して25℃で保存した細胞接種前の水中で24、18、12、および6時間での再構成したMMRワクチンの結果を示す。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図３】9％（w/v）シルク薄膜中で3ヶ月間保存した麻疹、ムンプス、および風疹ウイルスの安定性を示す。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図４】安定化添加剤MgCl2、MgSO4、およびスクロースを添加したシルク薄膜中の麻疹、ムンプス、および風疹ウイルスの初回回収力価を比較する棒グラフである。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図５】遮光して25℃で保存した細胞接種前の70％スクロース中で24、18、12および6時間での再構成したMMRワクチンを示す。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図６】4℃（図6A）もしくは37℃（図6C）の水、または4℃（図6B）もしくは37℃（図6D）の70％スクロース中の再構成したMMRワクチンの残存力価の比較を表す。ワクチンを、遮光して25℃で保存した細胞接種前の水または70％スクロース中で24、18、12、および6時間で再構成した。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図７】ワクチン封入シルク薄膜加工および感染性アッセイの概要を示す。（1）凍結乾燥ワクチン粉末を滅菌シルク水溶液中で再構成する。（2a）ワクチン-シルク混合物の少量をテフロンコーティング表面で成型して、室温で遮光した滅菌フード内で12時間乾燥させることによって、ワクチン封入シルク薄膜を調製した。（3a）個々の乾燥薄膜を、安定性試験のために適切な温度でエッペンドルフチューブ中で保存した。（2b）凍結乾燥したワクチン粉末を滅菌シルク水溶液中で再構成した後、ワクチン-シルク混合物の少量を96ウェルプレートで成型して凍結乾燥することによって、凍結乾燥ワクチン封入シルク薄膜を調製した。（3b）個々の凍結乾燥薄膜をウェルプレートから取り出して、血清用ガラスバイアルに移し、窒素および真空条件で凍結乾燥ストッパーおよびアルミシールによって蓋をした。（4）感染性試験に関して、薄膜をヌクレアーゼフリー滅菌水に再溶解して、溶液を、24ウェルプレートにおいて培養したM199培地中で生育させたVero細胞に直接添加した。細胞を3日間インキュベートして、ウイルスを複製させた後、RNAを単離して、cDNAに変換してリアルタイムPCRを用いて定量した。（5）TRIzol/クロロホルムを用いてRNAをVero細胞から単離して、RNAを精製して逆転写を行って、リアルタイムRT-PCRのためのcDNAを合成した。
【図８】4℃（図8A）、25℃（図8B）、および37℃（図8C）で保存した、異なる時間水中で再構成した凍結乾燥ワクチンの麻疹、ムンプス、および風疹成分の残存力価のグラフを示す。（◆）麻疹、（○）ムンプス、（■）風疹。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図９】9％（w/v）シルク薄膜において4℃（図9A）、25℃（図9B）、37℃（図9C）、および45℃（図9D）で6ヶ月間保存したMMRワクチンの麻疹ウイルス成分の安定性のグラフを示す。（◆）MMR-シルク薄膜、（□）MMR粉末。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１０】9％（w/v）シルク薄膜において4℃（図10A）、25℃（図10B）、37℃（図10C）、および45℃（図10D）で6ヶ月間保存したMMRワクチンのムンプスウイルス成分の安定性のグラフを示す。（◆）MMR-シルク薄膜、（□）MMR粉末。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１】9％（w/v）シルク薄膜において4℃（図11A）、25℃（図11B）、37℃（図11C）、および45℃（図11D）で6ヶ月間保存したMMRワクチンの風疹ウイルス成分の安定性のグラフを示す。（◆）MMR-シルク薄膜、（□）MMR粉末。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１２】9％（w/v）凍結乾燥シルク薄膜において4℃（図12A）、25℃（図12B）、37℃（図12C）、および45℃（図12D）で6ヶ月間保存したMMRワクチンの麻疹ウイルス成分の安定性のグラフを示す。（◆）MMR-シルク凍結乾燥薄膜、（□）MMR粉末。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１３】9％（w/v）凍結乾燥シルク薄膜において4℃（図13A）、25℃（図13B）、37℃（図13C）、および45℃（図13D）で6ヶ月間保存したMMRワクチンのムンプスウイルス成分の安定性のグラフを示す。（◆）MMR-シルク凍結乾燥薄膜、（□）MMR粉末。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１４】9％（w/v）凍結乾燥シルク薄膜において4℃（図14A）、25℃（図14B）、37℃（図14C）、および45℃（図14D）で6ヶ月間保存したMMRワクチンの風疹ウイルス成分の安定性のグラフを示す。（◆）MMR-シルク凍結乾燥薄膜、（□）MMR粉末。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１５】絶対温度の逆数の関数としてのワクチンの麻疹（図15A）、ムンプス（図15B）、および風疹（図15C）成分の分解速度のアレニウスプロットを示す。（◆）凍結乾燥シルク薄膜、（○）シルク薄膜、（■）粉末。
【図１６】温度の関数としての麻疹（図16A）、ムンプス（図16B）、および風疹（図16C）ウイルス成分の予測半減期のグラフならびに半減期の対応する上限および下限を示す。予測半減期は、ウイルス成分が最初の値の50％に分解するまでに要する推定時間を表す。（◆）凍結乾燥シルク薄膜、（○）シルク薄膜、（■）粉末。
【図１７】示差走査熱量測定、固体状態DSCのグラフを示す。凍結乾燥シルク薄膜の固体状態DSCは、178℃でガラス転移（Tg）を示す。製造元が提供したMMRワクチン粉末（広く多様な賦形剤および安定化剤を含む）のTgは68.9℃であった。凍結乾燥MMR-シルク薄膜は、89.2℃でTgを示し、MMR粉末にシルクを添加すると、Tgの増加によって反映されるようにワクチンの安定性の増加を示した。しかし、MMR-シルク凍結乾燥薄膜曲線は、116.6℃と164.8℃で2つのピークを示し、これはTmとTdを示し、ワクチン成分のアンフォールディングまたは分解を説明する。
【図１８】ナノ示差走査熱量測定、ナノ-DSCのグラフを示す。精製ウイルス粒子のTmは、16.8℃付近に出現する。シルクが存在すると、ウイルス粒子のTmは68.3℃に増加する。Tm後の急激な低下は、Tmでのタンパク質のアンフォールディングの結果としての凝集による可能性が最も高い発熱事象である。シルクのTgは178℃付近であり、Tg値の上昇は、封入されたウイルスタンパク質に及ぼすシルクの効果のためであった。
【図１９】水中での精製ウイルス粒子およびシルク溶液中での精製ウイルス粒子の動的光散乱の比較を示すグラフを示す。MMRウイルス粒子の平均有効径の平均値は約250 nmであった。精製MMR溶液の平均有効径は、およそ16℃で増加し始め、熱量の増加によるウイルス粒子の凝集を示している。MMR-シルク溶液は70℃まで凝集の徴候を示さず、シルクが構造的安定性を提供してウイルスタンパク質の凝集を防止したことを示している。
【図２０】（図20A）シルク薄膜および（図20B）凍結乾燥シルク薄膜からのMMR放出のグラフを示す。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２１】（図21A）シルクハイドロゲルおよび（図21B）シルクミクロスフェアからのMMR放出のグラフを示す。N＝3、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２２】模式図を示す。図22A、麻疹およびムンプスはパラミクソウイルス科に属し、その構造は、脂質二重層内のヌクレオカプシドに封入された一本鎖ネガティブセンスRNAからなる。ウイルスエンベロープは、マトリクスタンパク質（M）、ヘマグルチニンタンパク質（H）および融合タンパク質（F）によって形成される。構造的に無傷のHおよびFタンパク質が、動物細胞に対するウイルス粒子の結合および融合に関与する。図22B、疎水性相互作用と制限された鎖の運動性の組み合わせにより、シルク捕捉ウイルス粒子は、上昇した温度で構造活性を維持する。図22C、FおよびHタンパク質は、受容体CD46およびCD150（集合的にSLAMとして知られる）に結合して、細胞内への入口を獲得してウイルス複製を開始する。図22D、表面タンパク質の変性は、ウイルス粒子の凝集を引き起こしうる。タンパク質に乱れがあると、タンパク質は細胞によって認識されなくなり、流入が拒絶されうる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本明細書において記述される特定の方法論、プロトコール、および試薬等は変化しうることから、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書において用いられる用語は、特定の態様を記述する目的に限られ、唯一特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限すると意図されない。
【００１５】
本明細書および特許請求の範囲において、本文が明らかにそれ以外であることを示している場合を除き、単数形は複数形を含みその逆もまた同じである。実施例以外において、またはそれ以外であると示している場合を除き、本明細書において用いられる成分または反応条件の量を表記する数字は全て、全ての例において「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。
【００１６】
同定された全ての特許および他の刊行物は、たとえば本発明に結びつけて用いられうるそのような刊行物に記述される方法論を説明および開示する目的で参照により明白に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、その開示が単に本出願の提出日より前になされたために提供される。この点においていかなるものも、先行発明に基づいてまたはいかなる他の理由にせよ本発明者らがそのような開示の日付を早める権利がないと自認したと解釈すべきではない。日付に関する全ての声明またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関していかなる承認も与えない。
【００１７】
それ以外であると定義されている場合を除き、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。いかなる公知の方法、装置、および材料も、本発明の実践または試験において用いてもよいが、この点における方法、装置、および材料を本明細書において説明する。
【００１８】
本明細書において提供される1つの局面は、活性物質の生物活性を維持または安定化させる方法および組成物に関する。方法は、組成物がシルクフィブロインマトリクスと、その中に分散される、混合される、または埋め込まれる少なくとも1つの活性物質とを含み、および活性物質の生物活性を阻害または減少させる明記された条件に一定期間組成物を供した場合に、少なくとも1つの活性物質が、その当初の生物活性の少なくとも約30％を保持するかまたは安定化させる、組成物を維持する段階を含む。そのような条件には、状態変化サイクル、温度、気圧、湿度、および光の曝露を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。1つの態様において、状態変化サイクルは凍結融解サイクルである。
【００１９】
本明細書において記述される様々な局面の態様は、活性物質をシルクフィブロインマトリクスに分散する、混合する、または埋め込むことによって、活性物質の安定化が得られる安定化活性物質を提供する。シルクフィブロインマトリクスは、シルクフィブロイン溶液または固体状態のシルクフィブロインマトリクスでありうる。このアプローチは、活性物質が保存および／または輸送されるコールドチェーンおよび／または環境条件によらず、活性物質が生物活性を保持することを提供する。例示的な環境条件には、温度、気圧、湿度、および光の曝露が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、コールドチェーンは、製薬産業において活性物質を安定化させるための標準的な実践であり、コールドチェーンを維持することにより、活性物質が、使用時まで製造元の推奨する温度範囲（たとえば、2℃から8℃、またはゼロより下の温度）に従って輸送および保存されることが確保される。
【００２０】
ある態様において、本明細書において記述される活性物質は、免疫原である。1つの態様において、免疫原はワクチンである。ほとんどのワクチンは、それらが保存および／または輸送される環境条件に対して感受性である。たとえば、凍結は、いくつかのワクチン（たとえば、HepBおよびDTaP/IPV/HIB）に関して反応原性（たとえば、免疫反応を引き起こす能力）を増加させうる、および／または力価の喪失を増加させうる、または容器に毛細状のひびを生じさせ、汚染を引き起こしうる。さらに、いくつかのワクチン（たとえば、BCG、水痘、およびMMR）は、熱に対して感受性である。多くのワクチン（たとえば、BCG、MMR、水痘、C型髄膜炎（Meningococcal C）結合体、およびほとんどのDTaP含有ワクチン）は、光感受性である。たとえば、Galazka et al., Thermostability of vaccines, in Global Programme for Vaccines & Immunization (World Health Organization, Geneva, 1998); Peetermans et al., Stability of freeze-dried rubella virus vaccine (Cendehill strain) at various temperatures, 1 J. Biological Standardization 179 (1973)を参照されたい。このように、本明細書において記述される組成物および方法はまた、コールドチェーンおよび／または他の環境条件によらず、ワクチンの安定化を提供する。
【００２１】
活性物質の安定化
「安定化する（stabilizing）」、「安定化する」、「安定性」、および「安定化」という用語は、本明細書において、シルクフィブロインマトリクスにおいて少なくとも1つの活性物質の生物活性を維持または保持することに関連して用いられる。本明細書において用いられる「活性物質の安定化」という句は、シルクフィブロインマトリクスに分散、混合、または埋め込まれた1つまたは複数の活性物質が、その当初の生物活性の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれより上を含む、その当初の生物活性の少なくとも約30％を保持することを意味する。活性物質の生物活性に関連した「安定化する」および「保持する」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００２２】
本明細書において用いられる「維持する（maintaining）」、「維持する」、および「維持」という用語は、組成物または活性物質に関連する場合、ある条件に活性物質を供した場合にシルクフィブロインマトリクス中で少なくとも1つの活性物質の生物活性を維持、持続、または保持することを意味する。いくつかの態様において、シルクフィブロインマトリクスに分散される1つまたは複数の物質は、その当初の生物活性の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれより上を含む、その当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する。
【００２３】
本明細書において活性物質に関連して用いられる「生物活性」という用語は、一般的に、活性物質が生物学的標的と相互作用する能力および／または生物学的標的に対して効果を生じる能力を意味する。たとえば、生物活性には、生物学的標的における刺激、阻害、調節、毒性、または致死反応の誘発を挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。生物学的標的は分子または細胞でありうる。たとえば、生物活性は、酵素の効果／活性を調整する、受容体を遮断する、受容体を刺激する、1つもしくは複数の遺伝子の発現レベルを調整する、細胞増殖を調整する、細胞分裂を調整する、細胞形態学を調整する能力、またはその任意の組み合わせを意味することができる。いくつかの例において、生物活性は、化合物が細胞において毒性効果を生じる能力を意味しうる。
【００２４】
生物活性は、細胞の反応をアッセイすることによって決定することができる。例示的な細胞の反応には、溶解、アポトーシス、生育の阻害、および生育の促進；細胞によるタンパク質または他の関心対象分子の産生、分泌、および表面露出；受容体活性化を含む膜表面分子の活性化；膜を超えてのイオンの輸送；転写調節；細胞の生存率の変化；細胞形態学の変化；細胞の内部成分の存在または発現の変化；細胞内で産生された核酸の存在または発現の変化；細胞内で産生された酵素の活性の変化；および受容体の存在または発現の変化が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。異なる細胞応答をアッセイする方法、たとえば細胞の内因性のタンパク質の存在もしくは発現の変化を決定するためのウェスタンブロット、または活性物質に反応した細胞の形態学をモニターするための顕微鏡は、当業者に周知である。
【００２５】
抗体に関連して、「生物活性」という用語には、エピトープまたは抗原結合親和性、抗体のインビボおよび／またはインビトロ安定性、たとえばヒト対象に投与した場合の抗体の免疫原特性、および／またはインビボまたはインビトロで標的分子の生物活性を中和または拮抗する能力が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。上記の特性または特徴は、シンチレーション近接アッセイ、ELISA、ORIGENイムノアッセイ（IGEN）、蛍光消光、蛍光ELISA、競合的ELISA、BIAcoreバイオセンサーを用いるSPR分析を含むがこれらに限定されるわけではないSPR分析、インビトロおよびインビボ中和アッセイ（たとえば、国際出願WO2006/062685を参照されたい）、受容体結合、およびヒト、霊長類、または必要に応じて他の任意の起源を含む異なる起源からの組織切片による免疫組織化学が挙げられるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において認められた技術を用いて、観察または測定することができる。免疫原に関連して、「生物活性」は、免疫原性を含み、その定義は後で詳細に考察する。ウイルスに関連して、「生物活性」は感染性を含み、その定義は後で詳細に考察する。コントラスト剤、たとえば色素に関連して、「生物活性」は、対象に投与した場合に、対象の体内の構造または液体のコントラストを増強するコントラスト剤の能力を意味する。コントラスト剤の生物活性はまた、生物環境と相互作用する能力、および／またはある条件下でもう1つの分子の反応に影響を及ぼす能力を意味する。
【００２６】
活性物質に関連して「当初の生物活性」とは、一般的に、活性物質をシルクフィブロインマトリクスに導入する直前または直後に測定した活性物質の生物活性を意味する。すなわち、活性物質の当初の生物活性は、たとえば、活性物質をシルクフィブロインマトリクスに導入する前または後の約20分以内に測定することができる。いくつかの例において、活性物質の当初の生物活性は、活性物質をシルクフィブロイマトリクスに導入する前または後の、約10秒、約15秒、約20秒、約25秒、約30秒、約1分、約2分、約3分、約4分、約5分、約6分、約7分、約8分、約9分、約10分、約11分、約12分、約13分、約14分、約15分、約16分、約17分、約18分、約19分、または約20分で測定することができる。1つの態様において、シルクフィブロインマトリクスは、固体状態のシルクフィブロインマトリクスである。そのような態様において、活性物質は、それが固体状態のシルクフィブロインマトリクスに分散される前の取り扱いの際にその生物活性のいくつかを失うことがありうる。もう1つの態様において、本明細書において用いられる「当初の生物活性」という用語は、活性物質をシルクフィブロインマトリクスに導入する前の活性物質の生物活性を記述するために用いることができる。いくつかの態様において、「当初の生物活性」という用語は、活性物質の最大の生物活性、たとえば活性物質を、たとえば再構成または温度を増加させることによって活性化した直後に測定した生物活性を意味する。たとえば、活性物質が最初に粉末である場合、活性物質の当初の生物活性は、再構成直後に測定することができる。いくつかの態様において、「当初の生物活性」という用語は、製造元によって明記された条件下でシルクフィブロインマトリクスの非存在下で保存または輸送される場合の活性物質の生物活性を意味する。いくつかの態様において、「当初の生物活性」という用語は、製造元によって明記された条件下で、本明細書において記述される保存-安定組成物で保存または輸送する場合の活性物質の生物活性を意味する。本明細書において記述される「当初の生物活性」という用語の定義はまた、本明細書において後に用いられる「当初の免疫原性」および「当初の感染性」という用語にも適用される。
【００２７】
本明細書において記述される方法に従って、シルクフィブロインマトリクスに活性物質を分散、混合、または埋め込む段階は、環境または保存条件（たとえば、状態変化サイクル、温度、湿度、または光の曝露）によらず、活性物質の生物活性、たとえばその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持または安定化させる。シルクフィブロインマトリクスは、溶液または固体状態でありうる。様々な態様において、活性物質をシルクフィブロインマトリクスに分散させて、そのような組成物を状態変化サイクルに供し、および／または明記された条件下で一定期間維持した場合、活性物質は、その当初の生物活性の少なくとも約30％、たとえばその当初の生物活性の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、またはそれより上を保持することができる。1つの態様において、活性物質は、その当初の生物活性の少なくとも約80％を保持することができる。別の言い方をすれば、シルクフィブロインマトリクス中の活性物質の安定性（すなわち、活性物質が、シルクフィブロインマトリクスにおいてその生物活性（たとえば、その当初の生物活性の少なくとも約30％）を保持する能力）は、シルクフィブロインマトリクスの非存在下での活性物質の安定化と比較して少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％増加させることができる。1つの態様において、活性物質は、その当初の生物活性の少なくとも約80％を保持することができる。
【００２８】
本明細書において記述される組成物は、任意の期間、たとえば数時間、数日、数週間、数ヶ月、または数年間維持することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、0℃より上の温度で少なくとも約3時間、少なくとも約6時間、少なくとも約9時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間またはそれより長く維持することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、またはそれより長く維持することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間またはそれより長く維持することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約4ヶ月、少なくとも約5ヶ月、少なくとも約6ヶ月、少なくとも約7ヶ月、少なくとも約8ヶ月、少なくとも約9ヶ月、少なくとも約10ヶ月、少なくとも約11ヶ月、少なくとも約12ヶ月、またはそれより長く維持することができる。
【００２９】
本明細書において記述される方法および組成物において、本明細書において記述される組成物は、任意の温度で、または活性物質に関して明記された製造元の推奨温度で維持することができる。いくつかの態様において、組成物は、液体窒素またはドライアイス中で維持することができる。いくつかの態様において、組成物は、たとえば約-80℃から約-20℃を含む範囲、または約-20℃から約0℃を含む範囲で維持することができる。いくつかの態様において、組成物は、0℃より上の温度で維持することができる。それらの態様において、組成物は、約0℃からほぼ周囲温度までの温度で維持することができる。本明細書において用いられる、「周囲温度」という用語は、本明細書において記述される組成物が維持される周辺の温度を記述するために用いられ、これには、0℃から60℃、0℃から50℃、または0℃から40℃の温度が含まれる。いくつかの態様において、周囲温度は、冷蔵庫の温度（たとえば、0℃から15℃を含む範囲）である。いくつかの態様において、周囲温は、対象のほぼ体温である（たとえば、ヒト対象に関しては36℃から38℃を含む範囲、または他の動物に関してはこれより高いまたは低い体温範囲）。いくつかの態様において、周囲温度は、室温、たとえば20℃から35℃であり、これは地理的条件によって変化しうる。たとえば、室温は温暖な気候の地域、たとえばアフリカでは、一般的に冷涼な気候の地域、たとえば米国または英国より、暖かくなりうる。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも約37℃または37℃より高い温度で維持することができる。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも約40℃または40℃より高い温度で維持することができる。いくつかの態様において、組成物は少なくとも約45℃または45℃より高い温度で維持することができる。
【００３０】
本明細書において記述されるいくつかの態様は、活性物質が、一定期間にその当初の生物活性の少なくとも30％またはそれより多く（少なくとも約40％、少なくとも約60％、少なくとも約80％またはそれより多くを含む）を保持することができる植え込み型薬物送達装置の開発にとって有益である。いくつかの態様において、植え込み型薬物装置における組成物または活性物質は、その当初の生物活性の少なくとも約30％またはそれより多くを、植え込み後少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約4ヶ月、少なくとも約5ヶ月、少なくとも約6ヶ月、または少なくとも1年後もしくはそれより長く保持することができる。
【００３１】
いくつかの態様において、1つまたは複数の活性物質、たとえばシルクフィブロインマトリクスの注射剤形（たとえば、ハイドロゲル、ゲル様粒子、および／またはミクロスフェアであるが、これらに限定されない）に封入されたワクチンなどの免疫原を、活性物質（たとえば、ワクチン）を長期間にわたって、たとえば数時間、数日、数週間、または数ヶ月間デポー剤から持続的にまたは間欠的に放出することができるように、活性物質のデポー剤（たとえば、ワクチンデポー）として対象に投与することができる（たとえば、皮下注射などの注射によって）。いくつかの態様において、活性物質（たとえば、ワクチン）は、封入された活性物質の少なくとも約1％（少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、またはそれより多くを含む）が、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間またはそれより長いあいだ放出される速度で放出することができる。いくつかの態様において、活性物質（たとえば、ワクチン）は、封入された活性物質の少なくとも約10％（少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、またはそれより多くを含む）が、5日間のあいだに、1週間のあいだに、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、またはそれより長いあいだ放出される速度で放出することができる。
【００３２】
いくつかの態様において、活性物質は、その当初の生物活性の少なくとも約30％、たとえば、当初の生物活性の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、またはそれより多くを、約4℃、約25℃、約37℃、約45℃、またはそれより高い温度で少なくとも6ヶ月まで保持する。いくつかの態様において、活性物質は、約37℃またはそれより高い温度で当初の生物活性の少なくとも約8％を少なくとも6ヶ月間保持する。
【００３３】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、光、たとえば異なる波長および／または異なる起源の光に曝露された状態で維持することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、UVまたは赤外線照射に曝露された状態で維持することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、可視光線の下で維持することができる。
【００３４】
いくつかの態様において、保存または輸送される本明細書において記述される組成物を、少なくとも1つの状態変化サイクルに供することができる。本明細書において用いられる「状態変化サイクル」という用語は、固体状態から流体状態へ、または流体状態から固体状態を含むがこれらに限定されるわけではない材料の状態変化を意味する。流体状態には、液体、気体、スラリー、流動性ペースト、プラズマ、およびその任意の組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。固体状態は、流動性ではない状態を意味するが、これはまた、半固体、たとえばゲルも包含することができる。本明細書において記述される組成物は、もう1つの状態へと変化する前に、任意の期間、たとえば、数秒間、数分間、数時間、数週間、数ヶ月間、または数年間、ある状態で維持することができる。状態変化サイクルは、本明細書において記述される環境条件の少なくとも1つの変化、たとえば温度変化、周囲の気圧の変化、光の条件、湿度、またはその任意の組み合わせに起因することができる。
【００３５】
1つの態様において、状態変化サイクルは、凍結融解サイクルを意味する。そのような態様において、保存または輸送される本明細書において記述される組成物を、少なくとも1回の凍結融解サイクル、少なくとも2回の凍結融解サイクル、少なくとも3回の凍結融解サイクル、少なくとも4回の凍結融解サイクル、少なくとも5回の凍結融解サイクル、少なくとも6回の凍結融解サイクル、少なくとも7回の凍結融解サイクル、少なくとも8回の凍結融解サイクル、少なくとも9回の凍結融解サイクル、少なくとも10回の凍結融解サイクル、またはそれより多くのサイクルに供することができる。「凍結融解サイクル」という用語は、本明細書において、凍結と融解を連続して交互に行うことを記述するために用いられ、同様に、凍結（固体）状態と流体状態を連続して交互に行うことも包含する。たとえば、1回の凍結融解サイクルは、凍結（固体）状態と流体状態のあいだの状態変化を伴う。凍結と融解の間隔、または凍結状態と流体状態の間隔は、任意の期間、たとえば数時間、数日間、数週間、または数ヶ月間でありうる。たとえば、活性物質組成物が凍結されているかまたは凍結状態で存在する場合、これはゼロより下の温度で、たとえば約-20℃から-80℃の温度で、再度使用するために融解する必要があるまで、凍結状態で持続的に保存することができる。組成物の凍結は、迅速に、たとえば液体窒素中で行うことができ、または徐々に、たとえば凍結温度で、たとえば約-20℃から-80℃で行うことができる。凍結した組成物の融解は、0℃より上の任意の温度で急速に、たとえば室温で、または徐々に、たとえば氷中で行うことができる。典型的に、非シルクフィブロインマトリクス中の活性物質は、1回または複数回の凍結融解サイクルでその活性を失いうる。本明細書において記述されるように、活性物質をシルクフィブロインマトリクス中に分散させると、活性物質の安定性を増加させて、このように1回または複数回の凍結融解サイクルのあいだ、その生物活性を保持することができる。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％またはそれより高い相対湿度で維持することができる。本明細書において用いられる「相対湿度」という用語は、空気と水蒸気の混合物中の水蒸気の量の測定である。これは一般的に、空気-水混合物中の水蒸気の部分圧として定義され、それらの条件下での飽和蒸気圧の百分率として与えられる。
【００３７】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、保存の際の残存水分を減少させるために凍結乾燥することができる。いくつかの態様において、残存水分は、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％減少する。
【００３８】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、任意の気圧下で維持することができ、または任意の気圧に供することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、ほぼ大気圧またはそれより上、たとえば、約1 atm、約2 atm、約3 atm、約4 atm、約5 atm、約6 atm、約7 atm、約8 atm、約9 atm、または約10 atmで維持することができ、または供することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、真空で維持することができ、または真空に供することができる。
【００３９】
1つの態様において、組成物は、本明細書において明記される2つまたはそれより多くの条件で維持される。
【００４０】
理論に拘束されることを望むものではないが、シルクは、上昇した温度（たとえば、少なくとも約20℃、少なくとも約30℃、少なくとも約40℃、またはそれより高い温度を含む室温またはそれより上の温度）での免疫原（たとえば、ワクチン）の分解速度を減少させることができる。このように、シルクフィブロインマトリクス中に分散した免疫原（たとえば、ワクチン）は、シルクマトリクスを有しない免疫原と比較して、上昇した温度（たとえば、少なくとも約20℃、少なくとも約30℃、少なくとも約40℃、またはそれより高い温度を含む室温またはそれより上の温度）で、少なくとも約1.5倍（たとえば、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、またはそれより上）長い半減期を有することができる。本明細書において用いられる「半減期」という用語は、物質がその当初の生物活性（当初の免疫原性または当初の感染性を含む）の約50％を保持する時間を意味する。したがって、たとえば上昇した温度（たとえば、少なくとも約20℃、少なくとも約30℃、少なくとも約40℃、またはそれより高い温度を含む室温またはそれより上の温度）で免疫原（たとえば、ワクチン）の半減期を延長させる方法も同様に、本明細書において提供される。方法は、組成物がシルクフィブロインマトリクスと、その中に分散される少なくとも1つの免疫原（たとえば、ワクチン）とを含み、および組成物を少なくともほぼ室温またはそれより高い温度で少なくとも約24時間維持した場合に、免疫原（たとえば、ワクチン）がその当初の免疫原性（たとえば、感染性）の少なくとも約30％を保持する、免疫原組成物を維持する段階を含む。いくつかの態様において、免疫原（たとえば、ワクチン）は、その当初の免疫原性（たとえば、感染性）の少なくとも約80％を保持することができる。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも約6ヶ月まで維持することができる。いくつかの態様において、組成物は、37℃より高い、または45℃より高い、またはそれより高い温度で維持することができる。
【００４１】
保存安定組成物
本明細書において記述されるもう1つの局面は、組成物を少なくとも1回の状態変化サイクルに供した場合、および／または本明細書において明記された1つまたは複数の条件下で一定期間維持した場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、シルクフィブロインマトリクスとその中に分散、混合、または埋め込まれる活性成分とを含む保存安定組成物である。1つの態様において、状態変化サイクルは凍結融解サイクルである。1つの態様において、活性物質を維持する期間は、少なくとも約24時間である。いくつかの態様において、明記された条件は、活性物質が保存および／または輸送される環境条件でありうる。環境条件の非制限的な例には、温度、気圧、湿度、および光の曝露が挙げられる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、免疫原性でありうる。そのような態様において、活性物質は免疫原である。いくつかの態様において、活性物質はワクチンである。
【００４２】
本明細書において記述される任意の組成物は、任意の材料状態、たとえば薄膜、繊維、粒子、ゲル、ミクロスフェア、またはハイドロゲルで存在することができる。様々な態様において、本明細書において記述される組成物の材料状態は、シルクフィブロインマトリクスの状態、たとえば薄膜、繊維、粒子、ゲル、ミクロスフェア、またはハイドロゲルによって変化しうる。いくつかの態様において、シルクフィブロインマトリクスは固体状態で存在する。他の態様において、シルクフィブロインマトリクスは溶液でありうる。
【００４３】
シルクフィブロイン対活性物質の任意の比率を用いてもよい。様々な態様において、シルクフィブロインマトリクス対活性物質の比率は約1:1000から約1000：1、約1:500から約500：1、約1：250から約250:1、約1：125から約125：1、約1：100から約100：1、約1：50から約50：1、約1：25から約25:1、約1:10から約10:1、約1:5から約5:1、約1:3から約3：1、または約1:1である。シルクフィブロインマトリクス対活性物質の比率は、活性物質の選択、保存条件および期間、シルクフィブロインマトリクスの濃度、ならびにシルクフィブロインマトリクスの形状を含む多数の要因によって変化しうる。当業者は、たとえば、明示された条件、たとえば0℃より上の温度で予め明示された期間、本明細書において記述される様々な比率で保持された活性物質の生物活性を測定することによって、シルクフィブロインマトリクス対活性物質の適切な比率を決定することができる。本明細書において記述される様々な活性物質、たとえば酵素、ワクチン、タンパク質、抗体、および核酸の生物活性を測定する方法は、当技術分野において周知である。例として、シルクフィブロイン中の所定の活性物質の安定性または生物活性は、時間と温度の組み合わせに基づいて決定されうる。たとえば、安定化試験を6ヶ月間行うことができる。活性アッセイは、たとえば2週間後、4週間後、その後毎月行うことができる。試料は、各時点でN＝3を提供するように調製することができる。評価される温度保存条件の範囲には、4℃（冷蔵）、25℃（室温）、37℃（体温）、45℃、および／または50℃を含む温度が含まれる。さらに、活性は、1回、2回、3回またはそれより多くの凍結融解サイクル後にアッセイすることができる。これらの変数を網羅的に組み合わせて、活性物質の長期間の安定性に関して最適な製剤を十分に特徴付けすることができる。いくつかの態様において、凍結乾燥活性物質調製物の製造元が推奨する保存条件（たとえば、4℃）での安定性の改善を目的として、シルク関連活性物質の安定性の結果を、たとえば同じ保存条件での凍結乾燥活性物質調製物と比較することができる。
【００４４】
シルクフィブロインマトリクスが固体状態である場合、これをさらに処理することができる。いくつかの態様において、固体状態シルクフィブロインマトリクスを含む組成物をさらに、微粉化することができる。「微粉化」という用語は、本明細書において、平均サイズが約1000μmまたはそれ未満である粒子に関連して用いられ、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子を包含する。本明細書において用いられる「ナノ粒子」という用語は、約1 nmから約1000 nm、約5 nmから約900 nm、または約10 nmから約800 nmの範囲の平均サイズを有する粒子として定義される。「マイクロ粒子」という用語は、約1μmから1000μm、約5μmから約900μm、または約10μmから約800μmの範囲の平均サイズを有する粒子を意味する。「微粉化」は、バルクまたは他の形状、たとえば固体状態シルクフィブロイン薄膜として存在する材料の機械的すりつぶし、粉砕、衝突ジェットなどの微細分割によって産生されている粒子のみを意味するのではないと理解すべきである。いくつかの態様において、微粉化粒子はまた、たとえば溶液中またはインサイチューでの形成などの、当技術分野において公知の他の機械的、化学的、または物理的方法によっても形成することができる。本明細書において記述される組成物は、たとえば、粉砕、破砕、すりつぶし、フリーズドライ、またはその任意の組み合わせによって微粉化することができる。
【００４５】
シルクフィブロイン
シルクフィブロインは、たとえばその処理が全て水性であるために（Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139 (2001); Perry et al., 20 Adv. Mater. 3070-72 (2008)）、官能化が比較的容易であるために（Murphy et al., 29 Biomat. 2829-38 (2008)）、および生物適合性であるために（Santin et al., 46 J. Biomed. Mater. Res. 382-9 (1999)）、本明細書において記述される様々な局面の態様のために用いられる特に魅力的なバイオポリマー候補物質である。たとえば、シルクは、米国食品医薬品局によってヒトインプラントにおける組織工学スキャフォールドとして承認されている。Altman et al., 24 Biomaterials: 401 (2003)を参照されたい。
【００４６】
シルクは、生物活性分子を安定化させることができる固定化マトリクスを提供することができる。シルクマトリクスに捕捉された酵素、抗体、および抗生物質の捕捉に関するこれまでの報告から、上昇した温度であっても、特別な保存条件または添加剤の添加を必要とすることなく、安定化および活性の回復が示されている（Pritchard et al., "Silk fibroin encapsulated powder reservoirs for sustained release of adenosine" Journal of Controlled Release (2010) 144:159-167; Lu et al., "Stabilization of enzymes in silk films" Biomacromolecules (2009) 10:1032-1042）。しかし、これらの報告は、生物学的調製物で温度感受性であるワクチン（たとえば、生ワクチン）を、シルクフィブロインが安定化できることを記述していない。
【００４７】
本明細書において用いられる「シルクフィブロイン」という用語は、カイコのフィブロインおよび昆虫またはクモのシルクタンパク質を含む。たとえば、Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958)を参照されたい。任意のタイプのシルクフィブロインを、本明細書において記述される様々な局面に従って用いることができる。カイゴガ（Bombyx mori）などのカイコによって産生されるシルクフィブロインは、最も一般的で、環境に優しい再生可能な資源を表す。例として、シルク薄膜において用いられるシルクフィブロインは、カイコガのマユからセリシンを抽出することによって得られうる。有機カイコのマユはまた市販されている。しかし、クモのシルク（たとえば、アメリカジョロウグモ（Nephila clavipes）から得られる）、トランスジェニックシルク、細菌、酵母、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物のシルクなどの遺伝子操作シルク（たとえば、WO 97/08315；米国特許第5,245,012号を参照されたい）および用いることができるその変種を含む、異なる多くのシルクが存在する。
【００４８】
様々な態様において、シルクフィブロインマトリクスは、異なる生物医学応用のために修飾することができる。例として、組織工学または薬物送達目的のためにインビボで植え込まれたシルクフィブロインマトリクスに分散された活性物質の安定性を増加させるために、シルク粒子を、繊維状タンパク質ドメインと鉱化作用ドメインとを含む融合ポリペプチドを含めることなどの、シルクのさらなる修飾を提供する遺伝子改変することができる。WO 2006/076711を参照されたい。さらに、シルクマトリクスを、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、アルジネート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸およびその他などの1つまたは複数の生物適合性ポリマーと混合することができる。たとえばWO 04/062697；WO 05/012606を参照されたい。いくつかの態様において、シルクフィブロインはまた、シルクタンパク質の物理的特性および機能性を変化させるために、たとえばジアゾニウムもしくはカルボジイミドカップリング反応、アビジン-ビオジン（biodin）相互作用、または遺伝子改変およびその他を通して、化学修飾することができる。たとえば、WO 2011/011347、Functionalization of Silk Material by Avidin-Biotin Interaction；WO 2010/057142、Surface Modification of Silk Fibroin Matrices with PEG Useful as Anti-Adhesion Barriers & Anti-Thrombotic Materials；米国特許出願第12/192,588号、Diazonium Salt Modification of Silk Polymerを参照されたい。さらに、シルクフィブロインマトリクスを、たとえばマトリクスの柔軟性に影響を及ぼすグリセロールなどの化学物質と組み合わせることができる。たとえば、WO 2010/042798, Modified Silk films Containing Glycerolを参照されたい。
【００４９】
活性物質
本明細書において用いられる「活性物質」という用語は、そのような分子、化合物、または組成物が、少なくとも1回の状態変化サイクルに供される、および／または本明細書において記述されるある条件下で維持される場合に、その生物活性が安定化されることが望ましい任意の分子、化合物、または組成物を意味する。本明細書において記述される方法および組成物に関して、任意の活性物質を、シルクフィブロインマトリクス内で維持することができる。活性物質の例には、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部（たとえば、抗体様分子）、酵素、核酸（たとえば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、siRNA、shRNA）、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、光合成およびエネルギーハーベスティング化合物（energy-harvesting compound）、香料、抗生物質、治療物質、コントラスト剤または色素などの診断物質、ウイルスベクター、および抗毒素物質が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００５０】
本明細書において用いられる「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において、隣接する残基のαアミノ基とカルボキシ基とのペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を表すために、互換的に用いられる。本明細書において互換的に用いられる「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能によらず、修飾アミノ酸（たとえば、リン酸化、グリケート等）およびアミノ酸アナログを含むタンパク質アミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関連して用いられ、「ペプチド」はしばしば、小さいポリペプチドに関連して用いられるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は、重なり合い、変化する。本明細書において用いられる「ペプチド」という用語は、それ以外であると示している場合を除き、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびタンパク質の断片を意味する。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片について言及する場合、本明細書において互換的に用いられる。このように、例示的なペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、相同体、オルトログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変種、断片、およびアナログが挙げられる。
【００５１】
本明細書において用いられる「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、および適切であれば、リボ核酸（RNA）、その一本鎖または二本鎖型のポリマーなどのポリヌクレオチドを意味する。具体的に制限されている場合を除き、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。それ以外であると示されている場合を除き、特定の核酸配列はまた、明示されている配列のみならず、その保存的修飾変種（たとえば、縮重コドン置換）および相補的配列を暗に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換されている配列を生成することによって行われうる（Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985), and Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。「核酸」という用語はまた、ヌクレオチドアナログから作製されたRNAまたはDNAのいずれかの同等物、誘導体、変種およびアナログ、ならびに一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解すべきである。
【００５２】
本明細書において「低分子干渉RNA」とも呼ばれる「低分子干渉RNA」（siRNA）という用語は、たとえばRNAiによって標的遺伝子の発現を阻害するように機能する物質として定義される。siRNAは、化学合成することができ、インビトロ転写によって産生することができ、または宿主細胞内で産生することができる。siRNA分子はまた、1つの鎖が不活化されるメッセージと同一である二本鎖RNAの切断によって生成することができる。「siRNA」という用語は、RNA干渉（RNAi）経路を誘導する低分子阻害性RNA二重鎖を意味する。これらの分子は、長さが多様であり（一般的に18〜30塩基対）、アンチセンス鎖におけるその標的mRNAに対して多様な程度の相補性を含むことができる。全てではないが、いくつかのsiRNAは、センス60鎖および／またはアンチセンス鎖の5'または3'末端において対を形成していないオーバーハング塩基を有する。「siRNA」という用語は、二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成することができる一本鎖のみならず、2つの個別の鎖の二重鎖を含む。
【００５３】
本明細書において用いられる「shRNA」という用語は、RNAiおよび／またはsiRNA種として機能するが、shRNA種が、安定性を増加させるために二本鎖ヘアピン様構造であるという点において異なる、低分子ヘアピンRNAを意味する。本明細書において用いられる「RNAi」という用語は、遺伝子発現を阻害する核酸分子、またはそのアナログ、たとえばRNA骨格の分子である干渉RNAまたはRNA干渉分子を意味する。RNAiは、選択的な転写後遺伝子沈黙化の手段を意味する。RNAiによって、特異的mRNAの破壊が起こりうるか、またはmRNAなどのRNAのプロセシングもしくは翻訳が防止される。
【００５４】
本明細書において用いられる「酵素」という用語は、反応の終了時に破壊されることなくまたは実質的に変化することなく、他の物質の化学反応を触媒するタンパク質分子を意味する。この用語は、天然に存在する酵素および生物工学による酵素またはその混合物を含みうる。酵素ファミリーの例には、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、GTPアーゼ、カルボキシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ、トランスアミナーゼ、ラセマーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、およびα-ケトカルボキシラーゼが挙げられる。
【００５５】
本明細書において用いられる「ワクチン」という用語は、対象の体に導入した場合に、免疫系の活性化、抗体形成、および／またはT細胞および／またはB細胞応答の生成を引き起こすことによって特異的疾患に対する免疫を生じる、死滅微生物、生弱毒生物、サブユニット抗原、トキソイド抗原、結合体抗原、または他のタイプの抗原性分子の任意の調製物を意味する。一般的に、微生物に対するワクチンは、ウイルス、細菌、寄生虫、マイコプラズマ、または他の感染物質の少なくとも一部に向けられる。1つの態様において、シルクフィブロインマトリクスに封入されるワクチンは、生ワクチンである。
【００５６】
本明細書において用いられる「アプタマー」という用語は、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を特異的に認識することができる一本鎖、部分的一本鎖、部分的二本鎖、または二本鎖ヌクレオチド配列を意味する。いくつかの態様において、アプタマーは、ワトソン-クリックの塩基対形成以外のメカニズムまたは三重鎖形成によって、非オリゴヌクレオチド分子または分子群を認識する。アプタマーには、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、ならびに骨格修飾、分岐点、および非ヌクレオチド残基、基、または架橋を含むヌクレオチドを含む、定義された配列セグメントおよび配列が含まれうるがこれらに限定されるわけではない。分子に対する結合に関してアプタマーを選択する方法は、当技術分野において広く公知であり、当業者によって容易にアクセス可能である。
【００５７】
本明細書において用いられる「抗体」または「複数の抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン、またはFc（結晶化可能断片）領域を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合断片、またはFc領域のFcRn結合断片を意味する。「抗体」という用語はまた、抗体の断片、たとえば抗原結合断片などの「抗体様分子」を含む。抗原結合断片は、組み換えDNA技術、または無傷の抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生することができる。「抗原結合断片」には、中でもFab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、および相補性決定領域（CDR）断片、一本鎖抗体（scFv）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ディアボディ、およびポリペプチドに対して特異的抗原結合を付与するために十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。直線状の抗体もまた、本明細書において記述される目的のために含まれる。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2、およびFvという用語は、標準的な免疫学的意味で使用される（Klein, Immunology ( John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); and Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)）。様々な抗原に対して特異的な抗体または抗原結合断片は、R&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences、およびMiltenyiなどの販売元から販売されているか、または当業者に公知の方法によってこれらの細胞表面マーカーに対して作製することができる。
【００５８】
本明細書において用いられる「相補性決定領域」（CDR、すなわちCDR1、CDR2、およびCDR3）という用語は、その存在が抗原結合にとって必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは典型的に、CDR1、CDR2、およびCDR3として同定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域は、Kabatによって定義される「相補性決定領域」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基およそ24〜34（L1）、50〜56（L2）、および89〜97（L3）ならびに重鎖可変ドメインにおける31〜35（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）：Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）および／または「超可変ループ」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基およそ26〜32（L1）、50〜52（L2）、および91〜96（L3）ならびに重鎖可変ドメインにおける26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含みうる。いくつかの例において、相補性決定領域は、Kabatおよび超可変ループに従って定義される両方のCDR領域のアミノ酸を含むことができる。
【００５９】
「直線状抗体」という表現は、Zapata et al. , Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)に記述される抗体を意味する。簡単に説明すると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、抗原結合領域の対を形成する、縦列のFdセグメントの対（VH-CH1-VH-CH1）を含む。直線状抗体は二重特異性または単特異性でありうる。
【００６０】
本明細書において用いられる「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片という表現は、これらのドメインが1つのポリペプチド鎖に存在する抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体断片を意味すると意図される。好ましくは、Fvポリペプチドはさらに、VHおよびVLドメインのあいだにポリペプチドリンカーを含み、それによってscFvは抗原結合にとって望ましい構造を形成することができる（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)）。
【００６１】
本明細書において用いられる「ディアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（VH-VL）において軽鎖可変ドメイン（VL）に結合した重鎖可変ドメイン（VH）を含む、2つの抗原結合部位を有する低分子抗体断片を意味する。同じ鎖の2つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、強制的にもう1つの鎖の相補的ドメインと対を形成して、2つの抗原結合部位を作製する。（EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, P0:6444-6448 (1993)）。
【００６２】
本明細書において用いられる「低分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、分子量約10,000グラム/モル未満を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、分子量約5,000グラム/モル未満を有する有機または無機化合物、分子量約1,000グラム/モル未満を有する有機または無機化合物、分子量約500グラム/モル未満を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形状が挙げられるがこれらに限定されるわけではない天然または合成分子を意味する。
【００６３】
本明細書において用いられる「細菌」という用語は、細菌の全ての変種、たとえば原核生物およびシアノバクテリアを包含すると意図される。細菌は、小さく（典型的に長軸方向の長さが約1 m）、分画がなく、環状のDNAおよび70Sリボソームを有する。
【００６４】
「抗生物質」という用語は、本明細書において、微生物の生存を減少させる、または微生物の生育もしくは繁殖を阻害する化合物または組成物を記述するために用いられる。本開示において用いられるように、抗生物質にはさらに、抗菌剤、静菌剤、または殺菌剤が含まれると意図される。例示的な抗生物質には、ペニシリン、セファロスポリン、ペネム、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、スルホンアミド、マクロライド、テトラサイクリン、リンコシド、キノロン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、メトロニダゾール、リファンピン、イソニアジド、スペクチノマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、およびその他が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００６５】
本明細書において用いられる「細胞」という用語は、植物、酵母、虫、昆虫、および哺乳動物を含む原核または真核の任意の細胞を意味する。哺乳動物細胞には、霊長類、ヒト、ならびにマウス、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、イヌ、ネコなどの家畜動物を含むがこれらに限定されるわけではない任意の関心対象動物の細胞が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。細胞は、造血細胞、神経細胞、間葉細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、間質細胞、筋細胞、脾細胞、細網内皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、消化管細胞、肺細胞、T細胞等などの、しかしこれらに限定されない広く多様な組織タイプの細胞でありうる。造血、神経、間質、筋、心血管、肝、肺、消化管幹細胞等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない、幹細胞、胚幹（ES）細胞、ES由来細胞、および幹細胞前駆体も同様に含まれる。酵母細胞も同様に、いくつかの態様において細胞として用いることができる。いくつかの態様において、細胞はエクスビボまたは培養細胞、たとえばインビトロ細胞でありうる。たとえば、エクスビボ細胞に関して、細胞は、健康である対象、および／または疾患に罹患している対象から得ることができる。細胞は、非制限的な例として、生検または当業者に公知の他の外科的手段によって得ることができる。
【００６６】
「光合成およびエネルギーハーベスティング化合物」という用語は、光からエネルギーを得るまたは吸収することができる分子、たとえば葉緑素を意味する。
【００６７】
本明細書において用いられる「ウイルスベクター」という用語は典型的に、宿主細胞に挿入されることが望まれ、発現カセットを通常含む外来DNAを含む。外来DNAは、転写単位全体、すなわちプロモーター遺伝子-ポリAを含むことができ、またはベクターは、関心対象遺伝子のみが挿入される必要があるように、プロモーター／転写終止配列を含むように工学操作することができる。これらのタイプの制御配列は、当技術分野において公知であり、リボソーム結合部位配列に沿って、任意でオペレーターと共に転写開始のためのプロモーターを含む。ウイルスベクターには、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、EPV、EBV、またはその変種もしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。Avigen, Inc.（Alameda, Calif.；AAVベクター）、Cell Genesys（Foster City, Calif.；レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびレンチウイルスベクター）、Clontech（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Genovo, Inc.（Sharon Hill, Pa.；アデノウイルスおよびAAVベクター）、Genvec（France；アデノウイルスベクター）、IntroGene（Leiden, Netherlands；アデノウイルスベクター）、Molecular Medicine（レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびヘルペスウイルスベクター）、Norgen（アデノウイルスベクター）、Oxford BioMedica（Oxford, United Kingdom；レンチウイルスベクター）、ならびにTransgene（Strasbourg, France；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない様々な企業が、そのようなウイルスベクターを販売目的で製造している。
【００６８】
本明細書において用いられる「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合物質が結合することができ、およびさらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体の産生を誘発するために動物において用いることができる分子または分子の一部を意味する。抗原は、1つまたは複数のエピトープを有しうる。「抗原」という用語は、抗体、またはMHC分子によって提示されればT細胞受容体（TCR）が結合することができる分子を意味する。本明細書において用いられる「抗原」という用語はまた、T細胞エピトープも包含する。抗原はさらに、免疫系が認識することができ、および／または液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することができ、それによってB-および／またはT-リンパ球を活性化させることができる。しかし、これは、少なくともある場合において、抗原がTh細胞エピトープを含むまたはTh細胞エピトープに結合して、アジュバントと共に投与されることを必要としうる。抗原は、1つまたは複数のエピトープ（B-およびT-エピトープ）を有することができる。先に言及した特異的反応とは、抗原が好ましくはその対応する抗体またはTCRと典型的に非常に選択的に反応するが、他の抗原によって誘発されうる多数の他の抗体またはTCRとは反応しないことを示すことを意味する。本明細書において用いられる抗原はまた、いくつかの個々の抗原の混合物でありうる。
【００６９】
本明細書において用いられる「ウイルス」という用語は、タンパク質にカプシド形成された核酸で構成される感染物質を意味する。そのような感染物質は、自律複製を行うことができない（すなわち、複製は宿主細胞の機構を用いることを必要とする）。ウイルスゲノムは、一本鎖（ss）または二本鎖（ds）、RNA、またはDNAでありえて、逆転写酵素（RT）を用いることができる、または用いることができない。さらに、ssRNAウイルスは、センス（+）またはアンチセンス（-）でありうる。例としてのウイルスには、dsDNAウイルス（たとえば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ssDNAウイルス（たとえば、パルボウイルス）、dsRNAウイルス（たとえば、レオウイルス）、(+)ssRNAウイルス（たとえば、ピコルナウイルス、トガウイルス）、(-)ssRNAウイルス（たとえば、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス）、ssRNA-RTウイルス、すなわちライフサイクルにおいてDNA中間体を有する(+)センスRNA（たとえば、レトロウイルス）、およびdsDNA-RTウイルス（たとえば、ヘパドナウイルス）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、ウイルスはまた、野生型（天然の）ウイルス、死滅ウイルス、生弱毒ウイルス、改変ウイルス、組み換え型ウイルス、またはその任意の組み合わせを含むことができる。ウイルスの他の例には、エンベロープウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、非エンベロープウイルス、バクテリオファージ、組み換え型ウイルス、およびウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられる「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染するウイルスを意味する。
【００７０】
本明細書において用いられる「抗毒素」という用語は、有毒な噛み傷または刺し傷の処置において用いられる生物学的産物を意味する。抗毒素物質は、所望のヘビ、クモ、または昆虫から毒液を押し出すことによって作製される。次に毒液を希釈して、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはネコに注射する。対象動物は、毒液に対する免疫応答を受けて、毒液の活性分子に対する抗体を産生し、次にこれを動物の血液から採取して、毒物注入を処置するために用いることができる。
【００７１】
「治療物質」という用語は、当技術分野において認識され、対象において局所または全身的に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的活性物質である任意の化学部分を意味する。「薬物」とも呼ばれる治療物質の例は、the Merck Index、the Physicians Desk Reference、およびThe Pharmacological Basis of Therapeuticsなどの周知の参考文献に記述され、それらには、薬剤；ビタミン；ミネラル補助剤；疾患もしくは病気の処置、予防、診断、治癒、もしくは緩和のために用いられる物質；体の構造もしくは機能に影響を及ぼす物質；または生理的環境に置かれた後に生物活性となる、もしくはより活性となるプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。対象への投与によって、本発明の組成物から隣接する組織または体液中に放出することができる様々な形状の治療物質が用いられうる。例には、ステロイドおよびステロイドエステル（たとえば、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アンドロステロン、コレステロール、ノルエチンドロン、ジゴキシゲニン、コール酸、デオキシコール酸、およびケノデオキシコール酸）、ホウ素含有化合物（たとえば、カルボラン）、化学療法ヌクレオチド、薬物（たとえば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤）、エンジイン（たとえば、カリケアマイシン、エスペラミシン、ダイネミシン、ネオカルジノスタチンクロモフォア、およびケダルシジンクロモフォア）、重金属錯体（たとえば、シスプラチン）、ホルモンアンタゴニスト（たとえば、タモキシフェン）、非特異的（非抗体）タンパク質（たとえば、糖オリゴマー）、オリゴヌクレオチド（たとえば、標的核酸配列（たとえば、mRNA配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、タンパク質、抗体、光力学物質（たとえば、ローダミン123）、放射性核種（たとえばI-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67、およびCu-64）、毒素（たとえば、リシン）、および転写に基づく薬剤が挙げられる。
【００７２】
「診断物質」は、診断のために用いることができる任意の化学部分である。たとえば、診断物質には、インジウムまたはテクネチウムなどの放射性同位元素を含む造影剤；ヨウ素、ガドリニウム、またはシアンを含むコントラスト剤または色素；西洋ワサビペルオキシダーゼ、GFP、アルカリホスファターゼ、またはβ-ガラクトシダーゼなどの酵素；ユーロピウム誘導体などの蛍光物質；N-メチルアクリジウム誘導体などの発光物質またはその他が挙げられる。
【００７３】
免疫原およびワクチン
ある態様において、活性物質は免疫原である。いくつかの態様において、免疫原はワクチンである。本明細書において示されるように、シルク担体に捕捉されてその後回収されるモデルワクチンであるMMR生弱毒ワクチンは、非シルク捕捉ワクチンと比較して有意な生物活性を維持した。1つの態様において、本明細書において、当初の活性の実質的な部分を維持しながら数週間のあいだ周囲温度で保存することができる安定化MMRワクチンが提供される。生弱毒ワクチンの安定化は、免疫プログラムにおいて重要な画期的成果を提供し、輸送、装備、および訓練のコストを削減し、廃棄物を削減し、およびこのように免疫プログラムを拡大する。
【００７４】
「免疫原」という用語は、生物において免疫応答を誘発することができる任意の物質、たとえばワクチンを意味する。「免疫原」は、対象に投与した場合に自身に対する免疫応答を誘導することができる。本明細書において免疫応答に関連して用いられる「免疫学的」という用語は、レシピエント対象における免疫原に対する液性（抗体によって媒介される）および／または細胞性（抗原特異的T細胞またはその分泌産物によって媒介される）応答の発生を意味する。そのような応答は、免疫原もしくは免疫原性ペプチドを対象に投与することによって誘導される能動応答、または免疫原に対する抗体もしくはプライミングされたT細胞の投与によって誘導される受動応答でありうる。細胞性免疫応答は、抗原特異的CD4+ Tヘルパー細胞および／またはCD8+細胞障害性T細胞を活性化するためにクラスIまたはクラスII MHC分子と会合したポリペプチドエピトープの提示によって誘発される。そのような応答はまた、単球、マクロファージ、NK細胞、好塩基球、樹状細胞、アストロサイト、ミクログリア細胞、好酸球、または生得免疫の他の成分の活性化を伴いうる。
【００７５】
「免疫原性」という用語は、抗原またはエピトープなどの物質が、対象において液性および／または細胞性免疫応答を誘発する能力を意味する。当業者は、物質の免疫原性を容易に測定することができる。細胞性免疫応答の存在は、当技術分野において認識された任意の方法、たとえば増殖アッセイ（CD4+ T細胞）、CTL（細胞障害性Tリンパ球）アッセイ（Burke、前記；Tigges、前記を参照されたい）、または免疫原の投与後の単球およびマクロファージなどの活性化細胞の存在を決定するための対象の組織切片による免疫組織化学によって決定することができる。当業者は、任意の十分に確立された方法によって対象における液性免疫応答の存在を容易に決定することができる。たとえば、血液などの生物試料中で産生された抗体レベルを、ウェスタンブロット、ELISA、または抗体検出に関して公知の他の方法によって測定することができる。
【００７６】
本明細書において記述される様々な局面のいくつかの態様において有用な免疫原には、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、および合成ペプチド、炭水化物およびその結合体、ならびに抗原が挙げられる。本明細書において用いられる「病原体」という用語は、任意の疾患発生物質（特に、ウイルスまたは細菌または他の微生物）を意味する。
【００７７】
「死滅病原体」という用語は、本明細書において、これまでビルレントであったが（すなわち、疾患を引き起こすことができる）、化学物質または熱によって破壊されている病原体に関連して用いられる。死滅病原体を含むワクチンの例には、インフルエンザワクチン、コレラワクチン、腺ペストワクチン、ポリオワクチン、A型肝炎ワクチン、および狂犬病ワクチンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００７８】
本明細書において用いられる「生弱毒病原体」という用語は、不活化されている病原体、すなわち許容細胞において複製することができ、特異的免疫応答を誘導することができるが、対象において対応する野生型病原体によって引き起こされる疾患を誘導しない病原体を意味する。生弱毒病原体は、そのような免疫応答を生じるために、たとえばそのビルレント特性を無能力にする条件で野生型病原体を培養することによって、または近縁であるがよりビルレントでない生物を用いることによって、当業者が産生することができる。例示的な生弱毒病原体には、ウイルス疾患である黄熱病、麻疹、風疹、およびムンプス、ならびに細菌疾患である腸チフスが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、生結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ワクチンは、感染性の株から作製されていないが、ワクチンに対する免疫応答を誘発するために用いられる「BCG」と呼ばれるビルレント改変株を含む。ペスト菌（Yersinia pestis）株EVを含む生弱毒ワクチンは、ペストの免疫のために用いられる。
【００７９】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物において用いられる免疫原は、病原体よりむしろ疾患を引き起こす不活化毒素でありうる。そのような非制限的な組成物には、破傷風およびジフテリアが挙げられる。いくつかの態様において、免疫原は、病原体からの不活化化合物、たとえば不活化毒素を含むことができるが、合成のペプチド、炭水化物、または抗原も同様に、本明細書において記述される免疫原性組成物における免疫原として用いることができる。
【００８０】
ある態様において、本明細書において記述される組成物において用いられる免疫原は、タンパク質サブユニット、すなわち、死滅または生弱毒病原体の断片、またはその結合体を含むことができる。そのような例示的な例には、ウイルスの表面タンパク質（これまでは慢性感染患者の血清から抽出されていたが、現在ではウイルス遺伝子の酵母への組み換えによって産生される）のみで構成されるB型肝炎ウイルスに対するサブユニットワクチン、ウイルスの主要カプシドタンパク質で構成されるヒトパピローマウイルス（HPV）に対するウイルス様粒子（VLP）ワクチン、ならびにインフルエンザウイルスのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼサブユニットが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。そのような態様において、ある病原体は、より免疫原性が低い多糖類外皮を有する。これらの外皮をタンパク質（たとえば、毒素）に連結させることによって、免疫系は、タンパク質抗原であるかのように多糖類を認識することができる。例示的な結合体免疫原は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）B型ワクチンにおいて用いられる免疫原である。したがって、結合体免疫原も同様に、本明細書において記述される局面に含まれる。
【００８１】
免疫原のさらなる例には、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌（Neisseria meningitides C）、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、または百日咳菌（Bordetella pertussis）に由来しうる免疫原が挙げられる。免疫原はまた、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、またはDTaP hep B Hib IPVなどの複合免疫原でありうる。
【００８２】
いくつかの態様において、免疫原は、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌などの細菌である。細菌免疫原は、死滅または弱毒でありうる。免疫原は、細菌サブユニットを含みうる。例としての免疫原性細菌サブユニットには、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、B群連鎖球菌（Group B streptococcus）、または百日咳菌に由来するサブユニットが挙げられる。細菌免疫原は組み換え型でありうる。細菌サブユニットは、多糖類でありうる、または多糖類を含みうる。なお他の態様において、免疫原は、たとえばB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来するウイルスサブユニットである。ウイルス免疫原はまた、組み換え型でありうる。ウイルス免疫原はまた、死滅ウイルスを含みうる。
【００８３】
本明細書において記述される安定化された免疫原は、ワクチン製品、たとえばBIOTHRAX（登録商標）（吸着炭疽ワクチン、Emergent Biosolutions, Rockville, MD）; TICE（登録商標）BCG生（膀胱内使用のためのカルメットゲラン桿菌、Organon Tekina Corp. LLC, Durham, NC）; MYCOBAX（登録商標）BCG生（Sanofi Pasteur Inc）; DAPTACEL（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイドおよび無細胞百日咳[DTaP]吸着ワクチン、Sanofi Pasteur Inc.）; INFANRIX（登録商標）（DTaP吸着ワクチン、GlaxoSmithKline）; TRIPEDIA（登録商標）（DTaPワクチン、Sanofi Pasteur）; TRIHIBIT（登録商標）（DTaP/Hib#、 sanofi pasteur）; KINRIX（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイド、無細胞百日咳吸着および不活化ポリオウイルスワクチン、GlaxoSmithKline）; PEDIARIX（登録商標）（DTaP- HepB-IPV、GlaxoSmithKline）; PENTACEL（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイド、および無細胞破傷風吸着、不活化ポリオウイルス、およびインフルエンザ菌b型結合体[破傷風トキソイド結合型]ワクチン、sanofi pasteur）;ジフテリアおよび破傷風トキソイド、吸着（小児用、Sanofi Pasteur）; DECAVAC（登録商標）（ジフテリアおよび破傷風トキソイド、吸着、成人用、Sanofi Pasteur）; ACTHIB（登録商標）（インフルエンザ菌b型破傷風トキソイド結合型ワクチン、Sanofi Pasteur）;PEDVAXHIB（登録商標）（Hibワクチン、Merck）; Hiberix（インフルエンザ菌b型破傷風トキソイド結合型ワクチン、追加免疫用量、GlaxoSmithKline）; COMVAX（登録商標）（B型肝炎-Hibワクチン、Merck）;HAVRIX（登録商標）（A型肝炎ワクチン、小児用、GlaxoSmithKline）; VAQTA（登録商標）（A型肝炎ワクチン、小児用、Merck）; ENGERIX-B（登録商標）（B型肝炎、小児用、青年用、GlaxoSmithKline）;RECOMBIVAX HB（登録商標）（B型肝炎ワクチン、Merck）; TWINRIX（登録商標）（A型/B型肝炎ワクチン、18歳以上用、GlaxoSmithKline）; CERVARIX（登録商標）（2価ヒトパピローマウイルス[16および18型]ワクチン、組み換え型、GlaxoSmithKline）; GARDASIL（登録商標）（2価ヒトパピローマウイルス[6、11、16、および18型]ワクチン、組み換え型、Merck）; AFLURIA（登録商標）（インフルエンザワクチン、18歳以上用、CSL）; AGRIFLU（商標）（筋注用インフルエンザウイルスワクチン、Novartis Vaccines）; FLUARIX（登録商標）（インフルエンザワクチン、18歳以上用、GaxoSmithKline）; FLULAVAL（登録商標）（インフルエンザワクチン、18歳以上用、GaxoSmithKline）; FLUVIRIN（登録商標）（インフルエンザワクチン、4歳以上用、Novartis Vaccine）; FLUZONE（登録商標）（インフルエンザワクチン、生後6ヶ月以上用、Sanofi Pasteur）; FLUMIST（登録商標）（インフルエンザワクチン、2歳以上用、Medlmmune）; IPOL（登録商標）（e-IPVポリオワクチン、sanofi Pasteur）; JE-VAX（登録商標）（不活化日本脳炎ウイルスワクチン、BIKEN, Japan）; IXIARO（登録商標）（不活化日本脳炎ウイルスワクチン、Novarits）; MENACTRA（登録商標）（髄膜炎[A、C、Y、およびW-135群]およびジフテリアワクチン、Sanofi Pasteur）; MENOMUNE（登録商標）-A/C/Y/W-135（髄膜炎菌多糖類ワクチン、sanofi pasteur）; MMRII（登録商標）（MMRワクチン、Merck）; MENVEO（登録商標）（髄膜炎菌[A、C、YおよびW-135群]オリゴ糖ジフテリアCRM197結合型ワクチン、Novartis Vaccines）; PROQUAD（登録商標）（MMRおよび水痘ワクチン、Merck）; PNEUMOVAX 23（登録商標）（肺炎球菌多糖類ワクチン、Merck）; PREVNAR（登録商標）（肺炎球菌ワクチン、7���、Wyeth/Lederle）; PREVNAR-13（登録商標）（肺炎球菌ワクチン、13価、Wyeth/Lederle）; POLIOVAX（商標）（不活化ポリオウイルス、sanofi pasteur）; IMOVAX（登録商標）（狂犬病ワクチン、Sanofi Pasteur）; RABAVERT（商標）（狂犬病ワクチン、Chiron）; ROTATEQ（登録商標）（ロタウイルスワクチン、生、経口、5価、Merck）;ROTARIX（登録商標）（ロタウイルス、生、経口ワクチン、GlaxoSmithKline）; DECAVAC（商標）（破傷風およびジフテリアトキソイドワクチン、sanofi pasteur）; Td（ジェネリック）（破傷風およびジフテリアトキソイド、吸着、Massachusetts Biol. Labs）; TYPHIMVI（登録商標）（腸チフスVi多糖類ワクチン、Sanofi Pasteur）; ADACEL（登録商標）（破傷風トキソイド、弱毒ジフテリアトキソイドおよび無細胞百日咳、sanofi pasteur）; BOOSTRIX（登録商標）（破傷風トキソイド、弱毒ジフテリアトキソイドおよび無細胞百日咳、GlaxoSmithKline）;VIVOTIF（登録商標）（腸チフスワクチン、生、経口、Ty21a、Berna Biotech）; ACAM2000（商標）（痘瘡（ワクシニア）ワクチン、生、Acambis, Inc.）; DRYVAX（登録商標）（痘瘡（ワクシニア）ワクチン）;VARIVAX（登録商標）（水痘[生]ワクチン、Merck）; YF-VAX（登録商標）（黄熱病ワクチン、Sanofi Pasteur）;ZOSTAVAX（登録商標）（水痘-帯状疱疹、Merck）またはその任意の組み合わせでありうる。米国疾病管理予防センター（CDC）のデータベースに記載されるいかなるワクチン製品も同様に、本明細書において記述される組成物に含まれうる。
【００８４】
いくつかの態様において、イヌおよびネコのワクチンなどの動物ワクチンも同様に、本明細書において記述される方法および組成物に含めることができる。動物ワクチンの例には、DURAMUNE（登録商標）MAX 5（5種混合ワクチン: イヌジステンパー、イヌ感染性肝炎、2型アデノウイルス、パラインフルエンザ、およびパルボウイルス、Fort Dodge）; NEO PAR（登録商標）（パルボウイルス、Neo Tech）；VANGUARD（登録商標）PLUS 5（イヌジステンパー、1型および2型アデノウイルス、 パラインフルエンザおよびパルボウイルス; Pfizer）；BRONCHI-SHIELD（登録商標）III（イヌパラインフルエンザ；Fort Dodge）；およびECLIPSE（登録商標）4（ネコ鼻気管支炎、カリシウイルスおよび汎白血球減少症ウイルス、およびオウム病クラミジア、Schering-Plough/Intervet）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。市販の任意の動物ワクチンを本明細書において記述される組成物に含めることができる。
【００８５】
生弱毒ウイルス
生弱毒免疫原性組成物、たとえば生弱毒ワクチンは、一般的により持続可能な免疫応答を誘発することができる。このように、それらは時に、対象、たとえば健康な哺乳動物に投与するための好ましい組成物である。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物において用いられる免疫原は、生弱毒病原体である。特定の態様において、免疫原は、生弱毒ウイルスである。したがって、少なくとも1つの生弱毒ウイルス（少なくとも2つの生弱毒ウイルス、少なくとも3つの生弱毒ウイルス、またはそれより多くを含む）を含む方法および免疫原性組成物も同様に本明細書において記述される。免疫原性組成物は、シルクフィブロインマトリクスと、その中に分散される少なくとも1つの生弱毒ウイルス（少なくとも2つの生弱毒ウイルス、少なくとも3つの生弱毒ウイルス、またはそれより多くを含む）とを含み、生弱毒ウイルスは、組成物を（a）少なくとも1回の状態変化サイクルに供した場合、および／または（b）明記された条件で一定期間維持した場合に、その当初の感染性の少なくとも約30％を保持する。いくつかの態様において、生弱毒ウイルスは、当初の感染性の少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％またはそれより上を保持することができる。
【００８６】
本明細書においてウイルスに関連して用いられる「感染性」という用語は、感受性がある宿主に侵入する、そこで生存する、および複製する、または宿主において免疫応答を引き起こす能力を具体化するウイルスの特徴を意味する。ウイルスの感染性を決定するために当業者に公知の任意の方法を、本明細書において記述される目的のために用いることができ、たとえば実施例1に記述されるインビトロ感染性アッセイを使用することができる。
【００８７】
特定の態様において、生弱毒ウイルスは、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス、またはレトロウイルス科などのエンベロープウイルスでありうる。これらのエンベロープを有する生弱毒ウイルスは、水痘、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、黄熱病ウイルス、またはインフルエンザウイルスでありうる。「エンベロープウイルス」とは、そのタンパク質カプシドを取り巻く脂質含有またはリポタンパク質含有膜を含むウイルスを意味する。これらのウイルスエンベロープは、宿主細胞膜の一部（リン脂質およびタンパク質）に由来しうるが、いくつかのウイルス糖タンパク質を含みうる。機能的に、ウイルスエンベロープは、ウイルスが宿主細胞に入るのを助けるために用いられうる。たとえば、エンベロープ表面上の糖タンパク質は、宿主の膜上の受容体部位を同定してこれに結合する働きをする。次に、ウイルスエンベロープは宿主の膜と融合して、カプシドおよびウイルスゲノムを宿主の中に入らせて感染する。しかし、ウイルスエンベロープは乾燥、熱、および洗浄剤に対して比較的感受性が高く、これらのエンベロープウイルスは、非エンベロープウイルスより容易に滅菌することができ、このように、宿主環境外では生存が限られている。したがって、本明細書において提供される方法および免疫原性組成物は、宿主環境外での生弱毒エンベロープウイルスの生存を維持するために、およびこのように宿主細胞に導入された後のその感染性を維持するために特に重要である。
【００８８】
他の態様において、生弱毒ウイルスは、非エンベロープウイルス、すなわち、上記のウイルスエンベロープを有しないウイルスでありうる。非エンベロープウイルスは、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、および／またはポリオウイルスでありうる。
【００８９】
本明細書においてさらに、調製物を（a）少なくとも1回の状態変化サイクルに供した場合、および／または（b）本明細書において明記された条件下で一定期間維持した場合に、ウイルスがその当初の感染性の少なくとも約30％を保持する、シルクフィブロインマトリクスと、その中に分散、混合、または埋め込まれる感染性ウイルスとを含む無細胞安定化ウイルス調製物が提供される。
【００９０】
添加剤および薬学的に許容される担体
本明細書において記述される組成物の様々な態様はさらに、シルクフィブロインマトリクスに分散、混合、または埋め込まれる添加剤を含みうる。いくつかの態様において、添加剤は安定化剤である。「安定化剤」を本明細書において記述される組成物に添加すると、活性物質の安定性をさらに増加させることができ、すなわち活性物質は、安定化剤の非存在下での生物活性と比較して、より高い生物活性を保持することができる。いくつかの態様において、安定化剤は、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される。1つの態様において、糖類、たとえばスクロースが、本明細書において記述される組成物に添加される。
【００９１】
例として、追加の安定化剤をシルクフィブロイン溶液またはマトリクスに添加することができる。本明細書において考察される安定化剤のみならず、経口ポリオワクチンに対して有効であることが既に示されている例としての安定化剤を用いることができる。安定化剤には、陽イオン安定化剤（安定化効果の高い順に記載）：(CH3)4N+＞Mg2+、K+＞Na+、NH4+＞Li+；陰イオン安定化剤（安定化効果の高い順に記載）：CH3COO-、SO4-、PO42-＞Cl-、SCN-；および重水（D2O）が挙げられうる（Dorval et al, 1989）。たとえば、Mirchamsy et al., Stabilizing effect of magnesium chloride and sucrose on Sabin live polio vaccine, 41 Devel. Biol. Standardization 255 (1978); Rapp et al., Protection of measles virus by sulfate ions against thermal inactivation, 90 J. Bact. 132 (1965)を参照されたい。たとえば他のワクチンを安定化するための、当技術分野において公知の他の安定化剤、たとえばグルタミン酸ナトリウム、アルギニン、リジン、およびシステインなどのアミノ酸；グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびマンノースなどの単糖類；スクロース、マルトース、およびラクトースなどの二糖類；ソルビトールおよびマンニトールなどの糖アルコール；オリゴ糖、デンプン、セルロース、およびその誘導体などの多糖類；ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミン；ゼラチンおよび加水分解ゼラチンなどのゼラチン誘導体、ならびに抗酸化剤としてのアスコルビン酸も同様に、本明細書において記述される組成物に含めることができる。これらの材料は、刊行物、たとえば"Toketsu-Kanso To Hogo Busshitsu (Lyophilization And Protective Materials) "written by Nei, p. 1-176, published by Tokyo Daigaku Shuppan Kai (Publishing Association of the University of Tokyo), Japan in 1972; and "Shinku Gijutsu Koza (8): Sinku Kanso (Lecture on Vacuum Technology (8): Vacuum Drying)" written by Ota et al., p.176-182, published by Nikkan Kogyo Shimbun Co., Ltd., Japan in 1964に記述されている。
【００９２】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物または調製物は、さらに、薬学的に許容される担体を含みうる。選択される投与経路に応じて、組成物または調製物は、任意の剤形、たとえば錠剤、ロゼンジ、懸濁剤、流動性粉末、エアロゾル、およびカプセルでありうる。本明細書において用いられる「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなく、妥当な利益／リスク比に釣り合って、ヒトおよび動物の組織に接触させて用いるために適した化合物、材料、組成物、および／または投与剤形を意味する。
【００９３】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書において記述される活性物質を投与するための薬学的に許容される材料、組成物、または媒体を意味する。薬学的に許容される担体には、活性物質の活性と適合性で、対象に対して生理的に許容される任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤およびその他が挙げられる。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には、（i）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（ii）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（iii）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（iv）粉末トラガカント；（v）麦芽；（vi）ゼラチン；（vii）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの潤滑剤；（viii）カカオバターおよび坐剤用ロウなどの賦形剤；（ix）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；（x）プロピレングリコールなどのグリコール；（xi）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG）などのポリオール；（xii）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（xiii）寒天；（xiv）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（xv）アルギン酸；（xvi）発熱物質フリー水；（xvii）等張食塩水；（xviii）リンゲル液；（xix）エチルアルコール；（xx）pH緩衝液；（xxi）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリアンヒドリド；（xxii）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（xxiii）血清アルブミン、HDLおよびLDLなどの血清成分；（xxiv）エタノールなどのC2-C12アルコール；ならびに（xxv）薬剤において使用される他の非毒性の適合性の物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香料、香味料、保存剤、および抗酸化剤も同様に製剤に存在することができる。経口投与される本明細書において記述される組成物または調製物に関して、薬学的に許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色料、および保存剤などの薬学的に許容される賦形剤が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。適した不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、およびラクトースが挙げられるが、コーンスターチおよびアルギン酸は適した崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが挙げられうるが、潤滑剤が存在する場合、潤滑剤は一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。望ましければ、消化管での吸収を遅らせるために、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料によってコーティングしてもよい。
【００９４】
薬学的に許容される担体は、投与経路および製剤に応じて、本明細書において記述される調製物において多様でありうる。本明細書において記述される組成物および調製物は、当業者に公知の任意の投与様式により送達することができる。たとえば、本明細書において記述される組成物および調製物は、経口、ならびに静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下を含む非経口などの、しかしこれらに限定されない投与経路を介して全身に送達することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物および調製物は、注射にとって適した剤形である。他の態様において、本明細書において記述される組成物および調製物は、経口投与のために調合される。
【００９５】
非経口投与する場合、本明細書において記述される組成物および調製物は一般的に、単位投与注射剤形（液剤、懸濁剤、乳剤）で調合することができる。注射にとって適した組成物および調製物には、滅菌水溶液または分散液が挙げられる。担体は、たとえば水、細胞培養培地、緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩液）、ポリオール（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他）、その適した混合物を含む溶媒または分散媒体でありうる。いくつかの態様において、薬学的担体は緩衝液（たとえば、PBS）でありうる。
【００９６】
経口組成物は、錠剤、カプセル剤、乳剤、および水性懸濁剤、分散剤、および液剤が挙げられるがこれらに限定されるわけではない経口で許容される任意の投与剤形で調製することができる。錠剤のために一般的に用いられる担体には、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も同様に、典型的に錠剤に添加される。カプセル剤で経口投与する場合、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤または乳剤を経口投与する場合、活性成分を、乳化剤または懸濁剤と混合した油相に懸濁または溶解することができる。望ましければ、ある甘味料、香料、または着色料を添加することができる。経口投与のための液体調製物はまた、使用前に適した溶媒によって再構成されるドライパウダーの剤形で調製することができる。
【００９７】
組成物はまた、投与経路および望ましい調製物に応じて、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、ゲル化剤、または増粘添加剤、保存剤、着色剤、およびその他などの補助物質を含むことができる。参照により本明細書に組み入れられる、"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985などの標準テキストを参考にして不適当な実験を行うことなく適した調製物が調製されうる。しかし、本明細書において記述される組成物に関して、用いられるいかなる媒体、希釈剤、または添加剤も、本明細書において記述される活性物質と生物適合性でなければならない。当業者は、活性物質に対して生物適合性であるように組成物の成分を選択すべきであることを認識するであろう。このことは、化学および薬学の当業者にとっては問題ではなく、または標準テキストを参考にすることによって、もしくは単なる実験によって（不適当な実験を伴わない）、問題を容易に回避することができる。
【００９８】
いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物および調製物は、乳剤またはゲルに調合することができる。そのようなゲル組成物および調製物は、対象の疾患組織領域に局所に植え込むことができる。
【００９９】
インビボ投与に関して、本明細書において記述される組成物または調製物は、送達装置、たとえばシリンジによって投与することができる。したがって、本明細書において記述されるさらなる局面は、少なくとも1つの小室が本明細書において記述される任意の組成物の既定量を含み、排出口が小室内部に封入された組成物のための出口を提供する、排出口を有する少なくとも1つの小室を含む送達装置を提供する。いくつかの態様において、本明細書において記述される送達装置はさらに、排出口を通しての組成物の放出を制御するためにアクチュエータを含むことができる。そのような送達装置は、本明細書において記述される任意の組成物の対象への投与を容易にするための任意の装置、たとえばシリンジ、ドライパウダー注入器、点鼻スプレー、ネブライザー、またはたとえば、本明細書において記述される任意の組成物の持続的放出または制御された放出のためのマイクロチップなどのインプラントでありうる。
【０１００】
本明細書において記述される組成物のいくつかの態様において、シルクフィブロインマトリクス自身を、その分解を制御して、このように活性物質の放出を制御するように、たとえば放出が、数時間から数日、または数ヶ月の範囲の期間にわたって起こるように、修飾することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物は、当業者に入手可能で公知の他のタイプの送達システムと組み合わせることができる。それらには、たとえばポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリアンヒドリド、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、および／またはその組み合わせなどのポリマーを主成分とするシステムが挙げられる。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、たとえば米国特許第5,075,109号に記述される。他の例には、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、ならびに脂肪酸、またはモノ、ジ、およびトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質を主成分とする非ポリマーシステム；ハイドロゲル放出システム；リポソームを主成分とするシステム；リン脂質を主成分とするシステム；シラスティックシステム；ペプチドを主成分とするシステム；または部分融合インプラントが挙げられる。特異的な例には、組成物がマトリクス内のある剤形で含まれる浸食システム（たとえば、米国特許第4,452,775号、第4,675,189号、第5,736,152号、第4,667,014号、第4,748,034号、および第295,239,660号に記述される）、または活性成分が放出速度を制御する拡散システム（たとえば、米国特許第3,832,253号、第3,854,480号、第5,133,974号、および第5,407,686号に記述される）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。製剤は、たとえばミクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリクス、または重合システムとしての製剤でありうる。いくつかの態様において、システムは、たとえば、組成物を含む製剤の拡散または浸食／分解速度の制御を通して、組成物の持続的なまたは制御された放出を可能にしうる。さらに、ポンプを主体とするハードウェア送達システムを用いて、本明細書において記述される組成物または調製物の1つまたは複数の態様を送達することができる。長期間の徐放性製剤またはインプラントを用いることは、糖尿病などの慢性疾患の処置にとって特に適切でありうる。本明細書において用いられる長期間の放出は、本明細書において記述される組成物または調製物を、少なくとも30日間、または少なくとも60日間、治療レベルで送達するように、製剤またはインプラントが作製されて準備されることを意味する。いくつかの態様において、長期間の放出は、数ヶ月のあいだ治療レベルで活性物質を送達するように構成される製剤またはインプラントを意味する。
【０１０１】
保存安定組成物を調製するための方法
本明細書において記述される保存安定組成物を調製する方法を提供する。いくつかの態様において、保存安定組成物は、免疫原性である。方法は、明記された条件で一定期間保存または輸送した場合に、その当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロインマトリクスを提供または得る段階を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、シルクフィブロインマトリクスにおいて少なくとも1つの活性物質を混合または添加する段階を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、明記された条件で一定期間保存または輸送した場合に、その当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロインマトリクスを乾燥させて、固体状態シルクフィブロインを形成する段階を含む。これらの態様において、シルクフィブロインマトリクスは、溶液またはゲル様溶液でありうる。少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロインマトリクスは、空気もしくは窒素中で、または凍結乾燥によって乾燥することができる。1つの態様において、明記された条件（たとえば、37℃、45℃、または45℃より上の温度での保存または輸送）で一定期間（たとえば、少なくとも6ヶ月、または6ヶ月まで）保存または輸送した場合に、その当初の生物活性（たとえば、ウイルス力価、たとえば実施例3を参照されたい）の少なくとも約60％、少なくとも約70％、または少なくとも約80％を保持する少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロインマトリクス（たとえば、シルク溶液）を凍結乾燥に供して、活性物質をロードした凍結乾燥された固体状態のシルクフィブロインを形成することができる。
【０１０２】
いくつかの態様において、方法は、たとえば組成物の残存水分をさらに減少させるために、明記された条件（たとえば、37℃、45℃、または45℃より上の温度での保存または輸送）で一定期間（たとえば、少なくとも6ヶ月、または6ヶ月まで）保存または輸送した場合に、その当初の生物活性（たとえば、ウイルス力価、たとえば実施例3を参照されたい）の少なくとも約60％、少なくとも約70％、または少なくとも約80％を保持する少なくとも1つの活性物質を含む固体状態または乾燥シルクフィブロインの凍結乾燥を含むことができる。
【０１０３】
1つの態様において、固体状態の保存安定組成物を産生する方法は、（a）少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロインマトリクスを提供または得る段階；および（b）明記された条件下で一定期間保存または輸送した場合にその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロイマトリクスを乾燥させて、固体状態のシルクフィブロインを形成する段階を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、たとえば0℃より上の温度、たとえば30℃より高い、37℃より高い、40℃より高い温度で、活性物質の当初の活性の少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％を保持するために、段階（b）の固体状態シルクフィブロインを凍結乾燥させる段階（c）を含む。いくつかの態様において、段階（b）の固体状態シルクフィブロインは、段階（c）の凍結乾燥前に、後処置、たとえば、メタノール、エタノール、剪断応力、電場、圧力等による処置に供される。いくつかの態様において、活性物質は、免疫原性組成物である。1つの態様において、免疫原性組成物は1価のワクチンを含む。もう1つの態様において、免疫原性組成物は、多価（multivalent）または多価（polyvalent）ワクチン、たとえば2価ワクチンまたは3価ワクチンを含む。
【０１０４】
本明細書において用いられる「1価のワクチン」という用語は、1つの抗原または1つの微生物に対して免疫するように設計されるワクチンを意味する。
【０１０５】
本明細書において用いられる「多価または多価ワクチン」という用語は、微生物の2つもしくはそれより多くの異なる株に対して、または2つもしくはそれより多くの異なる微生物に対して免疫するように設計されたワクチンを意味する。たとえば、2価ワクチンは、一般的に、微生物の異なる2つの株または異なる2つの微生物に対して免疫するように設計されたワクチンである。3価ワクチンは、一般的に、微生物の3つの異なる株または3つの異なる微生物に対して免疫するように設計されたワクチンである。例示的な3価ワクチンは、麻疹、ムンプス、および風疹に対して免疫するように設計されたワクチンである。
【０１０６】
理論に拘束されることを望むものではないが、シルクは、ウイルスタンパク質が熱によって誘導される凝集を受けないように防止して、および／またはワクチンのガラス転移温度（ウイルスタンパク質の融解点）を上昇させて、このようにして上昇した温度で感染性を維持することができる。したがって、いくつかの態様において、本明細書において記述される免疫原性組成物を調製する方法は、ウイルスがシルクマトリクスの非存在下でそうでなければ凝集する温度でウイルスタンパク質が凝集する可能性を減少させるまたは凝集を予防するために使用することができる。たとえば、いくつかの態様において、本明細書において記述される免疫原性組成物を調製する方法は、シルクフィブロインマトリクスを有しない免疫原と比較して、ウイルスタンパク質が凝集する可能性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、またはそれより多く減少させるために用いることができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される免疫原性組成物中のウイルスタンパク質凝集は、シルクフィブロインマトリクスを有しない免疫原と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、またはそれより多く減少させることができる。ウイルスタンパク質の凝集は、たとえば、実施例3に示される動的光散乱を用いてウイルス粒子の有効径を測定することによって決定することができる。
【０１０７】
別の言い方をすれば、いくつかの態様において、本明細書において記述される免疫原性組成物を調製する方法は、シルクフィブロインマトリクスを有しない免疫原と比較して、ウイルスタンパク質凝集温度を、少なくとも約10℃、少なくとも約20℃、少なくとも約30℃、少なくとも約40℃、少なくとも約50℃、少なくとも約60℃、少なくとも約70℃、少なくとも約80℃、少なくとも約90℃、少なくとも約100℃、またはそれより多く増加させるために使用することができる。ウイルスタンパク質凝集温度は、たとえば、実施例3に示される動的光散乱を用いて広範囲の温度に対してウイルス粒子の有効径を測定することによって、決定することができる。ウイルス粒子の有効径が増加し始める温度が、ウイルスタンパク質凝集温度でありうる。
【０１０８】
いくつかの態様において、本明細書において記述される免疫原性組成物を調製する方法は、シルクフィブロインマトリクスを有しない免疫原と比較して、ワクチンのガラス転移温度および／または融解点を少なくとも約10℃、少なくとも約20℃、少なくとも約30℃、少なくとも約40℃、少なくとも約50℃、少なくとも約60℃、少なくとも約70℃、少なくとも約80℃、少なくとも約90℃、少なくとも約100℃、少なくとも約125℃、少なくとも約150℃、またはそれより多く増加させるために使用することができる。ワクチンのガラス転移温度および／または融解点は、たとえば実施例3に示される示差走査熱量測定によって決定することができる。
【０１０９】
固体状態シルクフィブロインを作製するために用いられるシルクフィブロイン水溶液は、当技術分野において公知の技術を用いて調製することができる。活性物質を埋め込むまたは運ぶために用いられる溶液中のシルクフィブロインの濃度を、特定の活性物質に適合させることができる。任意の濃度のシルクフィブロイン溶液を用いてもよい。1つの態様において、たとえばワクチンを安定化するために、シルクの濃度は、少なくとも約2％、少なくとも約4％、少なくとも約5％、少なくとも約6％、少なくとも約7％、少なくとも約8％、少なくとも約9％、少なくとも約10％、少なくとも約12％、少なくとも約14％、少なくとも約15％、少なくとも約16％、少なくとも約18％、または少なくとも約20％（w/v）を含む濃度でありうる。シルクフィブロイン溶液を調製するための適したプロセスは、たとえば、米国特許出願公開第11/247,358号；WO/2005/012606；およびWO/2008/127401において開示される。次に、シルク水溶液を、シルク薄膜、等角コーティングまたは層、または三次元スキャフォールド、またはシルクリフレクターへとさらに処理するための電界紡糸繊維などのシルクマトリクスに処理することができる。精密濾過段階を本明細書において用いてもよい。たとえば、調製されたシルクフィブロイン溶液は、シルクマトリクスへとさらに加工する前に遠心分離およびシリンジによる精密濾過によってさらに処理されうる。
【０１１０】
さらなるポリマー、たとえば生物適合性で生分解性のポリマーもまた、シルクフィブロインに混和することができる。たとえば、キトサンなどのさらなるバイオポリマーは、望ましい力学的特性を示し、水中で処理することができ、シルクフィブロインと混和することができ、一般的に薄膜を形成することができる。キトサン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、キチン、ポリヒドロキシアルカノエート、プラン、デンプン（アミロースアミロペクチン）、セルロース、アルジネート、フィブロネクチン、ケラチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ペクチン、デキストラン、および関連するバイオポリマー、またはその組み合わせなどの他のバイオポリマーを、特異的応用において利用することができ、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリフマル酸、ポリアンヒドリドおよび関連コポリマーなどの合成生分解性ポリマーも同様に選択的に用いられうる。
【０１１１】
シルクフィブロインマトリクスは、溶液または固体状態でありうる。固体状態シルクフィブロインマトリクスは、シルク繊維、電界紡糸繊維、薄膜、マット、3D-スキャフォールド、乾燥ゲル、球体（ミクロスフェアおよび／またはナノスフェアを含む）、粒子、または本明細書において記述されるシルク材料の1つまたは複数の異なるフォーマットの複合体などの、任意の材料フォーマットでありうる。他の態様において、固体状態シルクフィブロインは粒子である。
【０１１２】
1つの態様において、固体状態シルクフィブロインは、シルク薄膜である。たとえば、シルクフィブロイン薄膜は、シルクフィブロイン含有溶液（たとえば、約3％（w/v）から約30％（w/v）、または約5％（w/v）から約15％（w/v））を支持基板に沈着させる段階、およびシルクフィブロイン溶液を乾燥させて薄膜にする段階によって調製することができる。この点において、シルクフィブロインを主成分とする溶液によってコーティングされた基板は、12時間などの一定期間空気に曝露されうる。シルクフィブロイン溶液を沈着させる段階は、たとえば高さが均一でない薄膜に加工させるために、シルクフィブロイン溶液を基板上にスピンコーティングするスピンコーティング法を用いて、または基板の上部にシルクフィブロイン溶液を単に注ぐことによって行うことができる。他の成分の厚さおよび含有量などのシルクフィブロイン薄膜の特性は、基板に適用されるシルクフィブロイン溶液の濃度および／または容積、ならびにシルクフィブロイン溶液をシルク薄膜に処理するために用いられる技術に基づいて変化しうる。例として、シルク薄膜の厚さは、溶液中のシルクフィブロインの濃度を変化させることによって、または所望の体積のシルクフィブロイン溶液を用いることによって制御され、それによって厚さおよそ2 nmから1 mmの範囲の厚さを有するシルクフィブロイン薄膜が得られる。1つの態様において、シルクフィブロインを基板上にスピンコーティングして、様々な濃度のシルクフィブロインおよびスピン速度を用いて約2 nmから約100μmの厚さを有する薄膜を作製することができる。
【０１１３】
いくつかの態様において、1つまたは複数の活性物質（たとえば、免疫原）を含むシルクフィブロイン溶液を空気または窒素などの気体中で乾燥させる代わりに、シルクフィブロイン溶液を含む活性物質を凍結乾燥に供して、凍結乾燥シルクフィブロインマトリクス、たとえば凍結乾燥シルクフィブロイン薄膜を形成させることができる。1つまたは複数の活性物質（たとえば、ワクチンなどの免疫原）を含むシルクフィブロイン溶液を乾燥させるために凍結乾燥に供すると、加工プロセスの際の活性物質（たとえば、ワクチンなどの免疫原）の初回回収を改善するのみならず、上昇した温度（たとえば、室温もしくはそれより上、または37℃もしくはそれより上、または45℃もしくはそれより上）で長期間、たとえば少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約4週間、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約4ヶ月、少なくとも約5ヶ月、少なくとも約6ヶ月、またはそれより長いあいだ、意外にも活性物質（たとえば、ワクチンなどの免疫原）のより大きい安定化を提供する。
【０１１４】
いくつかの態様において、固体状態のシルクフィブロインは、シルクフィブロインの1つまたは複数の層の複合体でありうる。シルクフィブロインの各層は、同じまたは異なる組成または特性を保有することができる。例として、シルクフィブロインの各層は、同じまたは異なる濃度のシルクフィブリンを保有することができ、および／または各層は、同じまたは異なる力学的および／または分解特性を保有することができる。1つの態様において、固体状態シルクフィブロインは、たとえば特異的波長を反射するように調整することができる多層シルクフィブロインでありうる。
【０１１５】
いくつかの態様において、固体状態シルクフィブロインは、シルクハイドロゲルでありうる。シルクハイドロゲルを作製する方法は当技術分野において公知である。たとえば、シルクハイドロゲルは、シルクフィブロイン溶液（免疫原などの1つまたは複数の活性物質と、約0.5％（w/v）から約20％（w/v）または約1％（w/v）から約15％（w/v）、または約2％（w/v）から約10％（w/v）の濃度のシルクフィブロインとを含む）に剪断応力を適用することによって産生することができる。そのような態様において、活性物質（たとえば、免疫原）対シルク溶液の重量比は、約1：10から約10：1の範囲でありうる。1つの態様において、活性物質（たとえば、免疫原）対シルク溶液の重量比は、およそ1：1でありうる。たとえば、封入および送達のために渦により誘発されるシルクフィブロインのゲル化を生じる方法に関して、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際出願WO 2011/005381を参照されたい。制限されないが、超音波（たとえば、米国特許出願第2010/0178304号および国際出願WO 2008/150861）、またはpHの調節（たとえば、米国特許出願第2011/0171239号）などによって、本明細書において分散される免疫原などの1つまたは複数の活性物質を有するシルクハイドロゲルを作製する他の方法も同様に用いることができる。それらの特許出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１６】
いくつかの態様において、固体状態のシルクフィブロインは、シルクミクロスフェアを含むことができる。シルクミクロスフェアまたはナノスフェアを産生する様々な方法が当技術分野において公知である。いくつかの態様において、シルクマイクロ粒子またはナノ粒子は、たとえばその内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際出願WO2011/041395に記述されるポリビニルアルコール（PVA）相分離法によって産生することができる。そのような態様において、PVA相分離法において用いられるシルク濃度は、約0.5％（w/v）から約20％（w/v）または約1％（w/v）から約15％（w/v）、または約3％（w/v）から約10％（w/v）の範囲でありうる。1つの態様において、PVA相分離法において用いられるシルク濃度は約5％（w/v）でありうる。いくつかの態様において、活性物質（たとえば、免疫原）対シルク溶液の重量比は、約1：300から約1：2000、または約1：500から約1：1500でありうる。1つの態様において、活性物質（たとえば、免疫原）対シルク溶液の重量比は、約1：1000でありうる。たとえば米国特許出願第2010/0028451号および国際出願WO 2008/118133（シルクミクロスフェアまたはナノスフェアを作製するための鋳型として脂質を用いる）、およびWenk et al. J Control Release 2008; 132: 26-34（シルクミクロスフェアまたはナノスフェアを産生するために噴霧法を用いる）に記述されるシルクミクロスフェアまたはナノスフェアを産生する他の方法を、本明細書において記述される免疫原などの活性物質を封入するシルクマイクロ粒子またはナノ粒子を作製する目的のために用いることができる。
【０１１７】
いくつかの態様において、たとえば、免疫原などの活性物質の放出を一定期間持続させるために、シルクミクロスフェアまたはナノスフェアを、さらにバイオポリマーに埋め込むことができる。いくつかの態様において、バイオポリマーは、活性物質（たとえば、免疫原）をロードしたシルクミクロスフェアまたはナノスフェアを封入するためのシルクハイドロゲルでありうる。たとえば、抗生物質を送達するためのシルクフィブロインスキャフォールドを産生する方法に関する国際出願WO2010/141133を参照されたい。
【０１１８】
いくつかの態様において、たとえばシルクフィブロインの分解速度を修飾するために、固体状態のシルクフィブロイン組成物（本明細書において記述される保存安定組成物）を後処置に供することができる。追加の処置には、有機溶媒処置、機械的処置、または電磁的処置が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例として、シルクフィブロインの分解速度は、たとえばβ-シート結晶の量および／または結晶方向を修飾することによって制御することができる。したがって、シルクフィブロイン中のβ-シート結晶量および／または結晶方向は、当技術分野において確立されているように、アルコール、たとえばメタノールまたはエタノールをシルクフィブロインに接触させることによって制御することができる。いくつかの態様において、β-シート結晶量および／または結晶方向配列を変化させるために、シルクフィブロインを、たとえば機械的力、たとえば伸展または剪断応力に供することができる。いくつかの態様において、シルクフィブロインを、電場または圧力に供することができる。いくつかの態様において、シルクフィブロインに塩を接触させることができる。
【０１１９】
理論に拘束されることを望むものではないが、シルクフィブロインマトリクスからの活性物質の放出速度は、シルクフィブロインマトリクスのβ-シート結晶構造の内容量、シルク濃度および／または有孔性によって制御することができる。シルクマトリクス中に孔を形成する方法は、当技術分野において公知であり、たとえば孔形成物質浸出法、フリーズドライ法、および／または気体形成法がある。そのような方法は、たとえば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第2010/0279112号、第2010/0279112号、および第7842780号に記述される。
【０１２０】
いくつかの態様において、本明細書において記述される保存安定組成物を調製する方法はさらに、本明細書において定義される微粉化粒子を得るために機械的手段によって乾燥固体状態シルクフィブロインを減少させる段階を含みうる。微粉化粒子を得るための例示的な機械的手段には、微粉化、粉砕、破砕、すりつぶし、フリーズドライ、またはその任意の組み合わせが挙げられる。
【０１２１】
慣例的な実践に従って、本明細書において記述される組成物は、望ましくは、予め滅菌されている成分を用いて無菌的条件下で処理される。保存時の無菌性は、チメロサールなどの抗原適合性の殺菌物質を組み入れることによって維持することができる。
【０１２２】
キットおよび装置
少なくとも1つの保存安定組成物または調製物を含むパッケージおよびキットも同様に、本明細書において記述される。パッケージは、バイアル、アンプル、カプセル、チューブ、送達装置、ボトル、およびパケットからなる群より選択することができる様々なタイプの容器中で調製することができる。いくつかの態様において、送達装置はシリンジである。いくつかの態様において、シリンジは無針シリンジでありうる。パッケージに含まれる保存安定組成物は、ハイドロゲル、ゲル様粒子、粉末、ミクロスフェア、ナノスフェアの形状、またはその任意の組み合わせでありうる。いくつかの態様において、パッケージに含まれる保存安定組成物は凍結乾燥することができる。いくつかの態様において、保存安定組成物は、注射用シリンジにロードすることができる。
【０１２３】
本明細書において提供されるキットは、本明細書において記述されるパッケージ、および薬学的に許容される溶液、たとえばPBSを含む。いくつかの態様において、キットは、さらに、本明細書において記述される組成物または調製物を対象に投与するための少なくとも1つの送達装置を含む。他の態様において、キットはさらに、消毒剤を含みうる。ある態様において、本明細書において記述されるそのようなパッケージおよびキットは、ワクチン接種目的のために用いることができる。
【０１２４】
本明細書において用いられる、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜動物または競技用動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、たとえばアカゲザルが挙げられる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。家畜および競技用動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、たとえば家畜のネコ、イヌ種、たとえばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、たとえばニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、たとえば、マス、ナマズ、およびサケが挙げられる。本明細書において記述される局面のある態様において、対象は哺乳動物、たとえば霊長類、たとえばヒトである。対象は雄性または雌性でありうる。好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるがこれらの例に限定されるわけではない。さらに、本明細書において記述される方法および組成物は、家畜動物および／またはペットを処置するために用いることができる。
【０１２５】
本明細書において記述される少なくとも1つの組成物または調製物を予めロードした送達装置もまた、本明細書において記述される様々な局面の範囲内である。送達装置の態様は、少なくとも1つの小室が本明細書において記述される組成物の既定量を含み、排出口が組成物のための出口を提供する、排出口を有する少なくとも1つの小室を含む。
【０１２６】
本明細書において用いられる「小室」という用語は、本明細書において記述される組成物を保存および／または運ぶために構成される任意の構造を意味する。小室は、ユーザーの応用、必要性、および／または選択に応じて、任意の形状または任意のサイズの小室でありうる。例示的な小室には、樽状部分、チューブ、カセット、およびへこみ、たとえばマイクロウェルが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２７】
いくつかの態様において、本明細書において記述される送達装置はさらに、排出口を通しての組成物の放出を制御して、それによってその中の組成物を対象に投与するアクチュエータを含むことができる。本明細書において用いられる「アクチュエータ」という用語は、装置の排出口の中に組成物を移動させるために任意の種類のエネルギーを変換することができる機械的装置である。例として、アクチュエータは、電気エネルギーを変換して、排出口の中に組成物を移動させるまたは排出口を通しての組成物の放出を制御することができる。いくつかの態様において、アクチュエータは、圧力を変換して、排出口を通して組成物を除去または組成物の放出を制御することができる。たとえば、シリンジのプランジャーは、力または圧力を変換して、組成物を樽状部分（小室）から放出させて、それによって組成物を対象に注射する。
【０１２８】
本明細書において記述される送達装置の例には、シリンジ、ドライパウダー注入器、点鼻スプレー、ネブライザー、およびインプラントが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、インプラントはマイクロチップ、たとえば米国特許第5797898号；第6669683号；第7052488号；および第7582080号に記載されるマイクロチップでありうる。いくつかの態様において、送達装置はワクチン接種のために用いることができる。そのような態様において、ワクチン送達装置／システムには、米国特許出願第2004/0133160号；第2004/0096455号；第2005/0112135号；第2005/0123565号；第2009/0043280号；および第2009/0143724号、ならびに米国特許第5346481号；および第5900238号に記載される装置／システムが挙げられうるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２９】
「既定量」という用語は、一般的に、たとえば応用または処置に応じて、ユーザーにとって望ましいおよび／またはユーザーによって決定された組成物の量に関連して用いられる。いくつかの態様において、「既定量」という用語は、疾患もしくは障害を処置または予防するために、たとえば疾患に対する免疫を増加させるために、疾患の少なくとも1つの症状を減少、阻害、もしくは遅らせるために；または疾患の改善、たとえば有益なもしくは所望の臨床結果を生じるために、有効な組成物の量を意味する。本明細書において記述される様々な局面の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかによらず、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（たとえば、悪化しない）、疾患の進行の遅延または遅れ、疾患の状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、処置する段階は、処置を受けない場合に予想される生存と比較した生存の延長を意味することができる。このように、当業者は、処置が疾患状態を改善しうるが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることを認識する。免疫原性組成物またはワクチン組成物に関連して、「既定量」という用語は、特定の疾患に対する免疫を提供するまたは増加させるために有効な組成物の量を意味することができる。血液検査または当業者に公知の任意の方法を用いて、免疫をチェックすることができる。したがって、いくつかの態様において、送達装置は、免疫原性組成物またはワクチン組成物の有効量を含む。
【０１３０】
本明細書において記述される様々な局面の態様は、以下の番号を受けたパラグラフによって例証されうる。
1. 組成物を維持する段階を含む方法であって、該組成物が、シルクフィブロインマトリクスと、その中に分散されている少なくとも1つの活性物質とを含み、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方の場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、前記方法。
2. 活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約50％を保持する、パラグラフ1記載の方法。
3. 活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ1または2記載の方法。
4. 組成物が少なくとも約1ヶ月間維持される、パラグラフ1〜3のいずれかに記載の方法。
5. 組成物が少なくとも約6ヶ月間維持される、パラグラフ1〜4のいずれかに記載の方法。
6. 組成物が、薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、パラグラフ1〜5のいずれかに記載の方法。
7. 組成物が凍結乾燥される、パラグラフ1〜6のいずれかに記載の方法。
8. 組成物が微粉化される、パラグラフ1〜7のいずれかに記載の方法。
9. 微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、パラグラフ8記載の方法。
10. ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、パラグラフ9記載の方法。
11. 組成物が添加剤をさらに含む、パラグラフ1〜10のいずれかに記載の方法。
12. 添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、またはその任意の組み合わせから選択される、パラグラフ11記載の方法。
13. 組成物が、約0℃〜室温より高い温度で維持される、パラグラフ1〜12のいずれかに記載の方法。
14. 組成物がほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、パラグラフ13記載の方法。
15. 組成物が37℃より高い温度で維持される、パラグラフ1〜14のいずれかに記載の方法。
16. 光曝露下で組成物が維持される、パラグラフ1〜15のいずれかに記載の方法。
17. 組成物が少なくとも約10％の相対湿度で維持される、パラグラフ1〜16のいずれかに記載の方法。
18. 活性物質が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、光合成およびエネルギーハーベスティング化合物（energy-harvesting compound）、香料、抗生物質、治療物質、診断物質、ウイルスベクター、および抗毒素物質からなる群より選択される、パラグラフ1〜17のいずれかに記載の方法。
19. 活性物質が免疫原である、パラグラフ1〜18のいずれかに記載の方法。
20. 免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、ならびに合成ペプチド、炭水化物、および抗原からなる群より選択される、パラグラフ19記載の方法。
21. 免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型（Haemophilus influenzae Type B）、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌（Neisseria meningitides C）、インフルエンザ、水痘、または結核菌（Mycobacteria tuberculosis）カルメットゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌（Bordetella pertussis）に由来する、パラグラフ19または20記載の方法。
22. 免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、パラグラフ19または20記載の方法。
23. 免疫原が生弱毒ウイルスである、パラグラフ19または20記載の方法。
24. 生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、パラグラフ23記載の方法。
25. エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ24記載の方法。
26. ウイルスが水痘である、パラグラフ23〜25のいずれかに記載の方法。
27. ウイルスがインフルエンザである、パラグラフ23〜25のいずれかに記載の方法。
28. 生弱毒ウイルスが麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、パラグラフ23記載の方法。
29. 免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、パラグラフ19または20記載の方法。
30. 非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、パラグラフ29記載の方法。
31. 免疫原が細菌である、パラグラフ19記載の方法。
32. 細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、パラグラフ31記載の方法。
33. 免疫原が細菌サブユニットである、パラグラフ19記載の方法。
34. 細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、またはB群連鎖球菌（Group B streptococcus）に由来する、パラグラフ33記載の方法。
35. 細菌サブユニットが多糖類である、パラグラフ33記載の方法。
36. 免疫原がウイルスサブユニットである、パラグラフ19記載の方法。
37. ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、パラグラフ36記載の方法。
38. 免疫原が組み換え型である、パラグラフ19記載の方法。
39. 免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、パラグラフ19記載の方法。
40. シルクフィブロインマトリクス対活性物質の比率が約1：1000〜約1000：1である、パラグラフ1〜39のいずれかに記載の方法。
41. シルクフィブロインマトリクスとその中に分散される活性物質とを含む保存安定組成物であって、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方の場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、前記保存安定組成物。
42. 活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約50％を保持する、パラグラフ41記載の組成物。
43. 活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ41または42記載の組成物。
44. 少なくとも約1ヶ月間維持される、パラグラフ41〜43のいずれかに記載の組成物。
45. 少なくとも約6ヶ月間維持される、パラグラフ41〜44のいずれかに記載の組成物。
46. 薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、パラグラフ41〜45のいずれかに記載の組成物。
47. 凍結乾燥されている、パラグラフ41〜46のいずれかに記載の組成物。
48. 微粉化されている、パラグラフ41〜47のいずれかに記載の組成物。
49. 微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、パラグラフ48記載の組成物。
50. ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、パラグラフ49記載の組成物。
51. シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、パラグラフ41〜50のいずれかに記載の組成物。
52. 添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、またはその任意の組み合わせから選択される、パラグラフ51記載の組成物。
53. 約0℃〜室温より上の温度で維持される、パラグラフ41〜52のいずれかに記載の組成物。
54. ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、パラグラフ41〜53のいずれかに記載の方法。
55. 37℃より高い温度で維持される、パラグラフ41〜54のいずれかに記載の組成物。
56. 光曝露下で維持される、パラグラフ41〜55のいずれかに記載の組成物。
57. 少なくとも約10％の相対湿度で維持される、パラグラフ41〜56のいずれかに記載の組成物。
58. 活性物質が、タンパク質、ペプチド、抗原、免疫原、ワクチン、抗体またはその一部、抗体様分子、酵素、核酸、siRNA、shRNA、アプタマー、ウイルス、細菌、低分子、細胞、光合成およびエネルギーハーベスティング化合物、香料、抗生物質、治療物質、診断物質、ウイルスベクター、抗毒素物質、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ41〜57のいずれかに記載の組成物。
59. 活性物質が免疫原である、パラグラフ41〜58のいずれかに記載の組成物。
60. 免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、ならびに合成ペプチド、炭水化物、および抗原からなる群より選択される、パラグラフ59記載の組成物。
61. 免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、パラグラフ59または60記載の組成物。
62. 免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、パラグラフ59または60記載の組成物。
63. 免疫原が生弱毒ウイルスである、パラグラフ59または60記載の組成物。
64. 生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、パラグラフ63記載の組成物。
65. エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ64記載の組成物。
66. ウイルスが水痘である、パラグラフ63〜65のいずれかに記載の組成物。
67. ウイルスがインフルエンザである、パラグラフ63〜65のいずれかに記載の組成物。
68. 生弱毒ウイルスが、麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、パラグラフ63記載の組成物。
69. 免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、パラグラフ59または60記載の組成物。
70. 非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、パラグラフ69記載の組成物。
71. 免疫原が細菌である、パラグラフ59記載の組成物。
72. 細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、パラグラフ71記載の組成物。
73. 免疫原が細菌サブユニットである、パラグラフ59記載の組成物。
74. 細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、パラグラフ73記載の組成物。
75. 細菌サブユニットが多糖類である、パラグラフ73記載の組成物。
76. 免疫原がウイルスサブユニットである、パラグラフ59記載の組成物。
77. ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、パラグラフ76記載の組成物。
78. 免疫原が組み換え型である、パラグラフ59記載の組成物。
79. 免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、パラグラフ59記載の組成物。
80. シルクフィブロインマトリクス対活性物質の比率が約1：1000〜約1000：1である、パラグラフ41〜79のいずれかに記載の組成物。
81. 以下の段階を含む、パラグラフ41〜80のいずれかに記載の保存安定組成物を調製する方法：
a．少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロイン溶液を提供する段階；および
b．段階（a）のシルクフィブロイン溶液を乾燥させる段階であって、固体状態のシルクフィブロインを形成し、それによって保存時に少なくとも1つの活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する組成物を得る、段階。
82. 乾燥させる段階が凍結乾燥である、パラグラフ81記載の方法。
83. 乾燥させる段階が風乾である、パラグラフ81記載の方法。
84. 段階（b）の固体状態シルクフィブロインを凍結乾燥する段階をさらに含む、パラグラフ81〜83のいずれかに記載の方法。
85. 組成物の後処置をさらに含む、パラグラフ81〜84のいずれかに記載の方法。
86. 後処置が、組成物の結晶性を変化させる、パラグラフ85記載の方法。
87. 後処置が、組成物にメタノールまたはエタノールを接触させる段階である、パラグラフ85または86記載の方法。
88. 後処置が、組成物を剪断応力に供する段階である、パラグラフ85〜87のいずれかに記載の方法。
89. 後処置が、組成物を電場に供する段階である、パラグラフ85〜88のいずれかに記載の方法。
90. 後処置が、組成物を圧力に供する段階である、パラグラフ85〜89のいずれかに記載の方法。
91. 後処置が組成物に塩を接触させる段階である、パラグラフ85〜90のいずれかに記載の方法。
92. 微粉化粒子を得るために機械的手段によって、段階（b）の固体状態シルクフィブロインを減少させる段階をさらに含む、パラグラフ81〜91のいずれかに記載の方法。
93. 機械的手段が、微粉化、粉砕、破砕、すりつぶし、凍結乾燥、またはその任意の組み合わせから選択される、パラグラフ92記載の方法。
94. 微粉化粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、パラグラフ92または93記載の方法。
95. 少なくとも1つの活性物質が、保存時にその当初の生物活性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ81〜94のいずれかに記載の方法。
96. 保存が少なくとも約6ヶ月の期間にわたる、パラグラフ81〜95のいずれかに記載の方法。
97. 保存が、ほぼ室温〜約37℃の温度で行われる、パラグラフ81〜96のいずれかに記載の方法。
98. 保存が37℃より高い温度で行われる、パラグラフ81〜97のいずれかに記載の方法。
99. 免疫原性組成物を維持する段階を含む方法であって、該組成物が、シルクフィブロインマトリクスと、その中に分散されている少なくとも1つの免疫原とを含み、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方である場合に、免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約30％を保持する、前記方法。
100. 免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約50％を保持する、パラグラフ99記載の方法。
101. 免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ99または100記載の方法。
102. 組成物が少なくとも約1ヶ月間維持される、パラグラフ99〜101のいずれかに記載の方法。
103. 組成物が少なくとも約6ヶ月間維持される、パラグラフ99〜102のいずれかに記載の方法。
104. 組成物が、薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、パラグラフ99〜103のいずれかに記載の方法。
105. 組成物が凍結乾燥される、パラグラフ99〜104のいずれかに記載の方法。
106. 組成物が微粉化される、パラグラフ99〜105のいずれかに記載の方法。
107. 微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、パラグラフ106記載の方法。
108. ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、パラグラフ107記載の方法。
109. 組成物が、シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、パラグラフ99〜108のいずれかに記載の方法。
110. 添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ109記載の方法。
111. 安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ110記載の方法。
112. 糖類がスクロースである、パラグラフ111記載の方法。
113. 組成物が、約0℃〜室温より上の温度で維持される、パラグラフ99〜112のいずれかに記載の方法。
114. 組成物が、ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、パラグラフ99〜113のいずれかに記載の方法。
115. 組成物が37℃より高い温度で維持される、パラグラフ99〜114のいずれかに記載の方法。
116. 光曝露下で組成物が維持される、パラグラフ99〜115のいずれかに記載の方法。
117. 組成物が、少なくとも約10％の相対湿度で維持される、パラグラフ99〜116のいずれかに記載の方法。
118. 免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、合成ペプチド、炭水化物、抗原、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ99〜117のいずれかに記載の方法。
119. 免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
120. 免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
121. 免疫原が生弱毒ウイルスである、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
122. 生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、パラグラフ121記載の方法。
123. エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ122記載の方法。
124. ウイルスが水痘である、パラグラフ121〜123のいずれかに記載の方法。
125. ウイルスがインフルエンザである、パラグラフ121〜123のいずれかに記載の方法。
126. 生弱毒ウイルスが麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、パラグラフ121記載の方法。
127. 免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
128. 非エンベロープウイルスがロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、パラグラフ127記載の方法。
129. 免疫原が細菌である、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
130. 細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、パラグラフ129記載の方法。
131. 免疫原が細菌サブユニットである、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
132. 細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、パラグラフ131記載の方法。
133. 細菌サブユニットが多糖類である、パラグラフ131記載の方法。
134. 免疫原がウイルスサブユニットである、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
135. ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、パラグラフ134記載の方法。
136. 免疫原が組み換え型である、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
137. 免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン；腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、パラグラフ99〜118のいずれかに記載の方法。
138. シルクフィブロインマトリクス対免疫原の比率が約1：1000〜約1000：1である、パラグラフ99〜137のいずれかに記載の方法。
139. シルクフィブロインマトリクスとその中に分散されている免疫原とを含む保存安定免疫原性組成物であって、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方である場合に、免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約30％を保持する、前記保存安定免疫原性組成物。
140. 免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約50％を保持する、パラグラフ139記載の組成物。
141. 免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ139または140記載の組成物。
142. 少なくとも約1ヶ月間維持される、パラグラフ139〜141のいずれかに記載の組成物。
143. 少なくとも約6ヶ月間維持される、パラグラフ139〜142のいずれかに記載の組成物。
144. 薄膜、繊維、粒子、ゲル、またはハイドロゲルである、パラグラフ139〜143のいずれかに記載の組成物。
145. 凍結乾燥されている、パラグラフ139〜144のいずれかに記載の組成物。
146. 微粉化されている、パラグラフ139〜145のいずれかに記載の組成物。
147. 微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子である、パラグラフ146記載の組成物。
148. ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、パラグラフ147記載の組成物。
149. シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、パラグラフ139〜148のいずれかに記載の組成物。
150. 添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ149記載の組成物。
151. 安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ150記載の組成物。
152. 糖類がスクロースである、パラグラフ151記載の組成物。
153. 約0℃〜室温より上の温度で維持される、パラグラフ139〜152のいずれかに記載の組成物。
154. ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、パラグラフ139〜153のいずれかに記載の組成物。
155. 37℃より高い温度で維持される、パラグラフ139〜154のいずれかに記載の組成物。
156. 光曝露下で維持される、パラグラフ139〜155のいずれかに記載の組成物。
157. 少なくとも約10％の相対湿度で維持される、パラグラフ139〜156のいずれかに記載の組成物。
158. 免疫原が、死滅病原体、生弱毒病原体、タンパク質サブユニットおよびその結合体、不活化毒素、合成ペプチド、炭水化物、抗原、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ139〜157記載の組成物。
159. 免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
160. 免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
161. 免疫原が生弱毒ウイルスである、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
162. 生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、パラグラフ161記載の組成物。
163. エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ162記載の組成物。
164. ウイルスが水痘である、パラグラフ161〜163のいずれかに記載の組成物。
165. ウイルスがインフルエンザである、パラグラフ161〜163のいずれかに記載の組成物。
166. 生弱毒ウイルスが麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、パラグラフ161記載の組成物。
167. 免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
168. 非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、パラグラフ167記載の組成物。
169. 免疫原が細菌である、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
170. 細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、パラグラフ169記載の組成物。
171. 免疫原が細菌サブユニットである、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
172. 細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、パラグラフ171記載の組成物。
173. 細菌サブユニットが多糖類である、パラグラフ171記載の組成物。
174. 免疫原がウイルスサブユニットである、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
175. ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、パラグラフ174記載の組成物。
176. 免疫原が組み換え型である、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
177. 免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、パラグラフ139〜158のいずれかに記載の組成物。
178. シルクフィブロインマトリクス対免疫原の比率が約1：1000〜約1000：1である、パラグラフ139〜177のいずれかに記載の組成物。
179. 以下の段階を含む、パラグラフ139〜178のいずれかに記載の保存安定免疫原性組成物を調製する方法：
a．少なくとも1つの免疫原を含むシルクフィブロイン溶液を提供する段階；および
b．段階（a）のシルクフィブロイン溶液を乾燥させる段階であって、固体状態のシルクフィブロインを形成し、それによって保存時に少なくとも1つの免疫原がその当初の免疫原性の少なくとも約30％を保持する免疫原性組成物を得る、段階。
180. 乾燥させる段階が凍結乾燥である、パラグラフ179記載の方法。
181. 乾燥させる段階が風乾である、パラグラフ179記載の方法。
182. 段階（b）の固体状態シルクフィブロインを凍結乾燥する段階をさらに含む、パラグラフ179〜181のいずれかに記載の方法。
183. 組成物の後処置をさらに含む、パラグラフ179〜182のいずれかに記載の方法。
184. 後処置が、組成物の結晶性を変化させる、パラグラフ183記載の方法。
185. 後処置が、組成物にメタノールまたはエタノールを接触させる段階である、パラグラフ183または184記載の方法。
186. 後処置が、組成物を剪断応力に供する段階である、パラグラフ183〜185のいずれかに記載の方法。
187. 後処置が、組成物を電場に供する段階である、パラグラフ183〜186のいずれかに記載の方法。
188. 後処置が、組成物を圧力に供する段階である、パラグラフ183〜187のいずれかに記載の方法。
189. 後処置が組成物に塩を接触させる段階である、パラグラフ183〜188のいずれかに記載の方法。
190. 微粉化粒子を得るために機械的手段によって、段階（b）の固体状態シルクフィブロインを減少させる段階をさらに含む、パラグラフ179〜189のいずれかに記載の方法。
191. 機械的手段が、微粉化、粉砕、破砕、すりつぶし、フリーズドライ、またはその任意の組み合わせから選択される、パラグラフ190記載の方法。
192. 微粉化粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、パラグラフ190または191記載の方法。
193. 少なくとも1つの免疫原が、保存時にその当初の免疫原性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ179〜192のいずれかに記載の方法。
194. 保存が少なくとも6ヶ月間にわたる、パラグラフ179〜193のいずれかに記載の方法。
195. 保存が、ほぼ室温〜約37℃の温度で行われる、パラグラフ179〜194のいずれかに記載の方法。
196. 保存が37℃より高い温度で行われる、パラグラフ179〜195のいずれかに記載の方法。
197. シルクフィブロインマトリクスとその中に分散されている少なくとも1つの生弱毒ウイルスとを含む免疫原性組成物であって、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも24時間維持した場合に、生弱毒ウイルスがその当初の感染性の少なくとも約30％を保持する、前記免疫原性組成物。
198. ウイルスがその当初の感染安定性の少なくとも約50％を保持する、パラグラフ197記載の組成物。
199. ウイルスがその当初の感染安定性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ197または198記載の組成物。
200. 少なくとも約6ヶ月間維持される、パラグラフ197〜199のいずれかに記載の組成物。
201. ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、パラグラフ197〜200のいずれかに記載の組成物。
202. 37℃より高い温度で維持される、パラグラフ197〜201のいずれかに記載の組成物。
203. 凍結乾燥される、パラグラフ197〜202のいずれかに記載の組成物。
204. 生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、パラグラフ197〜203のいずれかに記載の組成物。
205. エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ204記載の組成物。
206. エンベロープウイルスが、水痘、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、黄熱病ウイルス、またはインフルエンザウイルスである、パラグラフ204または205記載の組成物。
207. 生弱毒ウイルスが非エンベロープウイルスである、パラグラフ197〜203のいずれかに記載の組成物。
208. 非エンベロープウイルスがロタウイルスである、パラグラフ207記載の組成物。
209. 添加剤をさらに含む、パラグラフ197〜208のいずれかに記載の組成物。
210. 添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ209記載の組成物。
211. 安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ210記載の組成物。
212. 糖類がスクロースである、パラグラフ211記載の組成物。
213. シルクフィブロインマトリクスとその中に分散されている感染性ウイルスとを含む無細胞安定化ウイルス調製物であって、該調製物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方である場合に、ウイルスがその当初の感染性の少なくとも約30％を保持する、前記無細胞安定化ウイルス調製物。
214. ウイルスおよびシルクフィブロインマトリクスが凍結乾燥される、パラグラフ213記載の調製物。
215. ウイルスが、その当初の感染性の少なくとも約80％を保持する、パラグラフ213または214記載の調製物。
216. 少なくとも約6ヶ月間維持される、パラグラフ213〜215のいずれかに記載の調製物。
217. ほぼ室温〜約37℃の温度で維持される、パラグラフ213〜216のいずれかに記載の調製物。
218. 37℃より高い温度で維持される、パラグラフ213〜217のいずれかに記載の調製物。
219. ウイルスがエンベロープウイルスである、パラグラフ213〜218のいずれかに記載の調製物。
220. ウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、パラグラフ213〜218のいずれかに記載の調製物。
221. ウイルスが非エンベロープウイルスである、パラグラフ213〜218のいずれかに記載の調製物。
222. ウイルスがバクテリオファージである、パラグラフ213〜218のいずれかに記載の調製物。
223. ウイルスが組み換え型ウイルスである、パラグラフ213〜218のいずれかに記載の調製物。
224. ウイルスがウイルスベクターである、パラグラフ213〜218のいずれかに記載の調製物。
225. ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ224記載の調製物。
226. パラグラフ41〜80、139〜178、または197〜212のいずれかに記載の少なくとも1つの組成物を含む調製物。
227. 錠剤、ロゼンジ、懸濁剤、流動性粉末、エアロゾル、カプセル剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ226記載の調製物。
228. 薬学的に許容される担体をさらに含む、パラグラフ226〜227のいずれかに記載の調製物。
229. パラグラフ41〜80、139〜178、もしくは197〜212のいずれかに記載の少なくとも1つの組成物、またはパラグラフ213〜225、もしくは226〜228のいずれかに記載の調製物を含むパッケージ。
230. 容器が、バイアル、アンプル、カプセル、チューブ、シリンジ、ボトル、パケット、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ229記載のパッケージ。
231. シリンジが無針である、パラグラフ230記載のパッケージ。
232. パラグラフ229〜231のいずれかに記載のパッケージと、薬学的に許容される溶液とを含むキット。
233. 少なくとも1つのシリンジをさらに含む、パラグラフ232記載のキット。
234. 消毒剤をさらに含む、パラグラフ232または233記載のキット。
235. 少なくとも1つの小室が、パラグラフ41〜80、139〜178、または197〜212のいずれかに記載の組成物の既定量を含み、排出口が組成物のための出口を提供する、排出口を有する少なくとも1つの小室を含む送達装置。
236. シリンジ、ドライパウダー注入器、点鼻スプレー、ネブライザー、インプラント、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ235記載の装置。
237. インプラントがマイクロチップである、パラグラフ235記載の装置。
238. 排出口を通しての組成物の放出を制御するためにアクチュエータをさらに含む、パラグラフ235〜237のいずれかに記載の装置。
【０１３１】
本明細書において記述し例証した様々な態様のいずれも、本明細書において開示する他の態様のいずれかに示される特色を組み入れるために、まだ示していない範囲までさらに変更してもよいことが、当業者には理解されるであろう。
【０１３２】
以下の実施例は、本発明のいくつかの態様および局面を例証する。様々な変更、追加、置換、およびその他を行うことができ、それでも本発明の精神または範囲を変化させず、そのような変更および変化が以下の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲に含まれることは、関連技術分野の当業者に明らかであろう。以下の実施例は、本発明をいかなるようにも制限しない。
【実施例】
【０１３３】
実施例1．シルクフィブロイン中でのMMRワクチンの安定性
3価ワクチン、MMR（登録商標）II（麻疹、ムンプス、および風疹ウイルス生ワクチン）（Merck & Co., INC., USA）の市販のバッチを用いた。この凍結乾燥生ウイルスワクチンは、Endersの弱毒Edmonston麻疹、Jeryl Lynnムンプス、およびWistar RA 27/3風疹ウイルスを含む。使用前に、提供された希釈剤にワクチンを再構成すると、各0.5 mL用量は、1,000 TCID50（組織培養感染量）を下回らない麻疹ウイルス、12,500 TCID50を下回らないムンプスウイルス、および1,000 TCID50を下回らない風疹ウイルスを含む。製造条件は、ワクチンは再構成の8時間以内に使用し、4℃で保存しなければならず、そうでなければ廃棄しなければならないと述べている。ワクチンの各用量は、ソルビトール（14.5 mg）、リン酸ナトリウム、スクロース（1.9 mg）、塩化ナトリウム、加水分解ゼラチン（14.5 mg）、組み換え型ヒトアルブミン（≦0.3 mg）、ウシ胎児血清（＜1 ppm）、他の緩衝液および培地成分、ならびにネオマイシンおよそ25 mcgを含むと計算される。製品は保存剤を含まない。再構成前、凍結乾燥ワクチンは淡黄色の圧縮された栓子状結晶である。
【０１３４】
滅菌9％（w/v）シルク溶液と再構成MMRワクチンとの混合物を、MMR対シルク溶液の重量比で1：1の濃度で調製した。次に、薄膜をテフロンコーティング表面で成型した。薄膜を無菌的フードにおいて室温（RT）で24時間乾燥させた。24時間溶液中においた再構成したワクチン試料を同様に比較のために調製した。
【０１３５】
再構成したワクチンを1 log10希釈として見なして、ワクチン溶液を0.5 log10きざみで1.5 log10から3.5 log10まで連続希釈することによって検量線を作製した。シルク薄膜を少量の水に再溶解して、これによって溶液中のワクチンの最終濃度は1.5 log10に希釈された。Vero細胞（アフリカミドリザル腎細胞；ATCC, Manassas, VA）をコンフルエンスになるまで生育させて、トリプシン処理して、計数し、50,000個/mLに調節して、24ウェルプレートにおいて平板培養した。次に、ワクチン希釈液50μL、再溶解したシルク薄膜、および24時間保存した再構成ワクチンを、Vero細胞のウェルに1試料当たり3個ずつ加えた。ウイルスを細胞において3日間複製させた後、感染細胞からのRNAを単離して、cDNAに変換し、qPCRを用いて定量した。蛍光がバックグラウンド（閾値サイクル、Ct）より上に上昇すると、標的RNA量とPCRサイクルのあいだには対数比例関係が存在する。試料中に存在するウイルスの生存数が多ければ、Ct値はより低下する。
【０１３６】
qPCR感染性アッセイの結果は、ワクチン希釈の増加とCt値の増大とのあいだに正比例関係があることを示す（図1）。アッセイは、ウイルス希釈が低ければより多くの量の生存ウイルスを含むことから予想通りの結果を生じ、それゆえより低いCt値を生じた。この結果を検量線として用いて、シルク封入ワクチン試料および再構成ワクチン試料の結果を、そのCt値から最終log10希釈を外挿することによって定量することができる。
【０１３７】
次に、log10希釈値をlog10 TCID50/用量の力価値に変換した。MMRシルク薄膜のlog10 TCID50/用量値を、それらが成型された元の希釈のlog10 TCID50/用量（1.5 log10希釈）に関連させると、残存力価が得られた。RTで24時間保存された再構成対照ワクチンは、Ct値を生じなかったが、このことは、このワクチンが全てではないがその力価のほとんどを失ったことを示している。麻疹、ムンプス、および風疹に関してMMR-シルク薄膜から回収された初回力価はそれぞれ、75.89％、58.04％、および62.48％であった（表1）。
【０１３８】
（表１）1：1（w/w）MMR-シルク薄膜の初回力価回収
2014518557.tif 000003
【０１３９】
これは、室温で同じ期間保存した再構成対照ワクチンの残存力価が検出限界未満であったことと比較すると実質的な改善である。シルクに埋め込まれたワクチンの力価の初回喪失はおそらく、ワクチンとシルクの相互作用の効果よりむしろ、薄膜の調製時に凍結乾燥ワクチンを再構成することによって引き起こされた可能性があった。MMR-シルクが、完全に薄膜へと乾燥する前になおも溶液状態であったあいだに活性の喪失が起こった可能性が高かったことを示すために、凍結乾燥ワクチンの少量を、細胞接種前に室温で24、18、12、および6時間水中に再構成した（図2）。
【０１４０】
図2に見られるように、ワクチンの力価は、それが溶液中に留まる時間が長ければ有意に減少する。細胞接種前の24時間のあいだ溶液状態であったワクチン試料は、いかなるウイルス成分の残存力価も示さなかった。薄膜を乾燥させて保存した後、シルクは、ワクチンに対して安定化効果を示した。図3に見られるように、室温で3ヶ月間保存後、シルク薄膜は、麻疹、ムンプス、および風疹ウイルスに関してそれぞれ、96％、92％、および80％力価を保持した。結果は、非処理シルク薄膜で保存したMMRワクチンのみが、RTで市販の凍結乾燥ワクチンの力価を延長させることができることを示している。
【０１４１】
実施例2．添加物の添加
安定化添加物を付加すると、ウイルスの熱安定性をさらに増加させるか否かを調べた。経口ポリオウイルスワクチン（OPV）、同様に生弱毒ワクチンは、広く用いられており、MgCl2安定化剤を添加して販売用に調製された。OPVに及ぼす安定化添加剤の効果に関する研究が行われており、既に試験された安定化剤には、スクロース、硫酸マグネシウム、および塩化マグネシウムが挙げられる（Mirchamsy et al., 1978; Rapp et al., 1965）。次に、MMR-シルク薄膜をMMR、シルク、および安定化剤の溶液から調製した。1 M MgCl2、1 M MgSO4、および70％スクロースによって安定化したMMR-薄膜の初回回収を図4に示す。MgCl2はOPVの優れた安定化剤であるが、これは、麻疹、ムンプス、および風疹に対して負の安定化効果を有した。MgSO4は、ワクチンの麻疹成分の最善の安定化を提供したが、ムンプスに対してはほとんど効果を示さず、風疹に対して負の効果を有した。しかし、スクロースは、MMRワクチンの3つ全ての成分の安定化剤として作用した。さらに、スクロースにおいて安定化されたウイルス成分の初回回収は、MMR-シルクのみの薄膜の初回回収に対して改善を示す（表1）。同様に、RTで70％スクロース溶液にワクチンを再構成すると（図5）、RTで水に再構成したワクチンより高く保持されたウイルス力価を24時間以上示した（図2）。水に再構成したMMRワクチンと比較すると、70％スクロースに再構成したワクチンはまた、4℃および37℃でより良好な安定性を提供した（図6）。スクロースなどの安定化添加剤を用いると、薄膜調製時のワクチン活性の初回喪失を最小限にする可能性がある。スクロースは、MMRおよびシルクがなおも溶液状態である薄膜乾燥プロセスの際にワクチンを安定化させることができる。
【０１４２】
実施例3．麻疹、ムンプス、および風疹ワクチンの長期間安定化
本発明者らは、シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜に捕捉されたワクチンが、45℃もの高い保存温度で半減期を有意に延長させることを示している。シルクの存在下では、ウイルスタンパク質の分解速度は減少する。生物物理学的特徴から、シルクが、保存の際に残存水分を減少させて、ウイルスタンパク質の融解点を増加させることによってワクチンに対して構造の安定性を提供することが証明されている。このように、本発明者らは、冷蔵の必要なくワクチン力価を延長させることができるワクチン安定化システムを紹介する。シルクを、特異的安定化および送達の必要に合わせて作製することができる薄膜、ハイドロゲル、ミクロスフェアおよび微小針を含む多様な送達システムに成型することができる。この材料システムは、生物医学装置におけるシルクの使用が生物適合性でありFDAによって承認されたという経緯により、送達媒体としてエクスビボまたはインビボで用いられうる。
【０１４３】
シルク薄膜における固定化後の残存ワクチン活性
シルク薄膜をワクチン対シルクの1：1の重量比で調製した。薄膜の加工プロセスの際にワクチンの感染性がどれほど多く失われたかを決定するために、薄膜を調製した直後の初回回収ワクチン力価を決定した。ワクチンをシルク溶液に組み入れるために、凍結乾燥ワクチンを再構成しなければならない。細胞接種の直前に凍結乾燥ワクチンを再構成した。凍結乾燥ワクチンを再構成した後、力価は急速に減少し（Galazka, 1998; WHO 2006）、製造元の仕様書に従うと、MMRワクチンは、再構成の8時間以内に使用するか、またはそうでなければ廃棄しなければならない。一度完全に乾燥させた後、凍結乾燥ワクチンの同量を含む薄膜を、滅菌水に溶解して、力価を試験するために溶液をVero細胞に添加した。初回回収力価を確立するために、シルク薄膜の力価の結果を凍結乾燥ワクチンの力価と比較した。MMR-シルク薄膜から観察された最初の残存力価を、表2に要約し、麻疹、ムンプス、および風疹成分に関してそれぞれ、84.7％、73.9％、および87.0％の残存力価が得られる。
【０１４４】
（表２）ワクチン捕捉シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜の初回回収ウイルス力価の比較
2014518557.tif 000004
【０１４５】
十分なワクチンを捕捉したシルク薄膜を、この風乾法によって加工して、6ヶ月試験のために保存して、異なる4つの温度（4℃、25℃、37℃、および45℃）での長期間の安定性を評価した。しかし、本発明者らは、薄膜について観察されたウイルス力価の喪失の大部分が、MMR-シルクが調製プロセスのために溶液状態であるあいだに起こったという仮説を立てた。この仮説を確認するために、凍結乾燥ワクチンを、製造元によって提供された希釈剤に再構成して、溶液を4℃、25℃、および37℃で保存した（図8A〜8C）。力価の測定は、再構成後6時間、12時間、18時間、および24時間で行った。予想されたように、ワクチンは溶液中では数時間以内に急速に力価を失い、高温で保存すると、力価はより急速に低下した。薄膜の乾燥時間と比較すると、4℃の溶液中で12時間では、麻疹、ムンプス、および風疹成分に関してそれぞれ、53.4％、73.4％、76.3％の残存力価が残る。25℃で12時間では、麻疹、ムンプス、および風疹に関してそれぞれ、57.8％、53.1％、46.6％の残存力価が得られたに過ぎなかった。37℃で12時間再構成したワクチンについては、麻疹、ムンプス、および風疹力価に関してそれぞれ、36.5％、46.6％、および23.9％が回収されたに過ぎず、より劇的な低下が観察された。これらの結果に基づいて、本発明者らは、最初のワクチンが溶液状態である時間を減少させることが回収率を改善させると仮定した。それゆえ、MMR-シルクの溶液段階を短縮するために、凍結乾燥MMR-シルク薄膜を調製した。凍結乾燥プロセスは、シルク薄膜におけるワクチンの長期間の熱安定性を有意に改善した。表2に示されるように、風乾したシルク薄膜から回収した初回力価と比較すると、凍結乾燥薄膜は、麻疹、ムンプス、および風疹の回収率をそれぞれ、94.7％、89.6％、98.4％へと改善した。
【０１４６】
ワクチン封入シルク薄膜の熱安定性
ワクチンの安定性を、保存後の薄膜について観察された残存力価として定量的に表記した。残存力価を測定して、初回残存力価（表2）と比較してワクチンの安定性を証明した。4℃での保存を例外として、シルク薄膜において6ヶ月間保存したワクチンの全てのウイルス成分の残存力価を測定したところ、同じ温度で保存した製造元の凍結乾燥ワクチンと比較して、より高い残存力価を示すことによって、シルク薄膜が麻疹、ムンプス、および風疹ウイルス粒子の安定化を増強するという全体的な傾向が示された。図9A〜9Dは、4℃、25℃、37℃、および45℃で6ヶ月間保存したシルク薄膜および凍結乾燥MMRワクチン粉末に関するワクチンの麻疹成分の残存力価の比較を示す。4℃での保存を例外として、シルク薄膜は、ワクチンのより大きい残存力価を示した。4℃であっても、シルク薄膜の残存力価はMMR粉末の力価と類似であった。粉末の残存力価は変動しなかったが、シルク薄膜はこの温度での測定力価により大きい変動を示した。最初の3ヶ月間では、シルク薄膜は、回収された残存力価がより高く、粉末より優れていた。最後の3ヶ月では、シルク薄膜は残存力価のわずかな減少を示したが、粉末の力価は比較的一定のままであった。6ヶ月試験の終了時、シルク薄膜において保存したMMRワクチンの麻疹成分の残存力価は、87.2％であったのに対し、粉末は92.2％であった。しかし、シルク薄膜は、25℃、37℃、および45℃で保存した場合に、麻疹の残存力価の改善を示した。25℃で保存すると、シルク薄膜は、各時点でより大きい回収力価を示し、6ヶ月の終了時では、粉末の74.5％と比較して83.9％の回収力価を示した。
【０１４７】
シルクによって提供される安定化は、上昇した温度、すなわち37℃および45℃で保存した薄膜および粉末に関してさらにより明白であった。37℃では、シルク薄膜は、6ヶ月間を通して麻疹の感染性の安定性の劇的な改善を示し、それによって、粉末の9.9％と比較して56.5％の力価が回収された。45℃で保存した薄膜および粉末の場合、ワクチンの麻疹成分は、20週間保存後では全ての力価を失ったが、シルク薄膜は24週後で53.5％の活性を保持した。類似の傾向がムンプス（図10A〜10D）および風疹成分（図11A〜11D）の両方に関して示された。この場合も、麻疹成分の結果と類似のように、シルク薄膜は37℃および45℃でムンプス成分のより大きい安定化を示した。いずれの温度においても、シルク薄膜は、最初の1ヶ月間の保存の際に残存活性のわずかな低下を示したが、1ヶ月を超えると、残存力価の減少は保存粉末のワクチン活性の減少よりかなり遅かった。試験終了時、37℃で保存したシルク薄膜は、ムンプス感染性の61.3％を保持したのに対し、粉末が保持したのは13.0％であった。45℃で6ヶ月保存後では、シルク薄膜はムンプス力価の59.6％を回収したが、粉末は20週間後に全ての力価を失った。風疹成分の力価は、類似の傾向を示した。4℃、25℃、37℃、および45℃で保存したシルク薄膜に関してそれぞれ、88.4％、78.4％、60.3％、および58.3％の残存力価が回収された。4℃で保存した粉末を例外として、これらの結果は、シルクが粉末と比較して力価の安定化および維持の増強を提供することを示した。粉末の残存力価は、4℃、25℃、37℃、および45℃でそれぞれ、89.4％、56.3％、15.3％および0％であった。
【０１４８】
凍結乾燥シルク薄膜は当初、薄膜加工プロセスの際に失われるワクチンの初回回収を改善するために調製されたが、それらは、上昇した温度でワクチンのさらにより大きい安定化を提供した。凍結乾燥シルク薄膜において保存した麻疹、ムンプス、および風疹成分の残存力価をそれぞれ、図12A〜12D、13A〜13D、および14A〜14Dに示す。保存温度によらず、凍結乾燥薄膜は、ワクチンの全ての成分に対して同等の安定化レベルを提供した。凍結乾燥シルク薄膜は、全ての温度で安定化の改善および回収された残存力価の改善を示したが、安定化のレベルは高温のほうがより劇的であった。6ヶ月間保存後、凍結乾燥シルク薄膜は、37℃および45℃でそれぞれ、85.2％および85.1％の残存麻疹力価を保持した。同様に、ムンプス力価は、37℃および45℃で保存した場合にそれぞれ、6ヶ月後に86.2％および86.0％が残った。風疹成分は、凍結乾燥シルク薄膜によって最も安定化されるように思われ、37℃で6ヶ月保存後にウイルス力価の88.2％が残ったが、45℃での保存でもなおも、ウイルス力価の87.5％が保持された。
【０１４９】
分解動態による熱安定性の評価
各温度に関する分解速度kobsを、週で表記する曝露時間に対するウイルス力価のlog10低下の直線回帰によって計算した。得られた曲線の勾配は、分解速度を表す。次に、kobsおよびその標準誤差から各温度でのウイルスの半減期（t1/2）および対応する95％信頼区間を計算した。ウイルスの半減期は、予測半減期または平均力価が初回の値の50％に減少するまでに要する時間である。各ウイルス成分およびワクチン封入法に関する推定分解速度および対応する半減期を、表3に要約して、半減期を図16A〜16Cにおいて温度に対してプロットする。調べた温度範囲での3つのシステムの分解速度も同様に、アレニウスプロットに良好に適合した（図14A〜15C）。プロットから認められるように、粉末ワクチン剤形の勾配の値は、いずれのシルクシステムよりも一貫して高く、保存温度が増加すると粉末の分解速度がより速く増加することを示している。
【０１５０】
（表３）ワクチン粉末ならびにシルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜封入ワクチンの分解速度および予測半減期の要約
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【０１５１】
4℃で保存した試料を例外として、シルクおよび凍結乾燥シルク封入ワクチンシステムは、麻疹、ムンプスおよび風疹成分に関して25℃、37℃、および45℃で粉末ワクチンより低い分解速度を示した。分解速度の減少は予測半減期の増加に対応する。表から、全てのウイルス成分に関して傾向は類似であるように思われ、上昇した温度では、シルク薄膜は、粉末製剤と比較してワクチンの半減期を増加させ、凍結乾燥シルク薄膜は、粉末およびシルク薄膜の両方と比較してワクチン半減期の劇的な改善を示した。さらに、保存温度が増加すると、粉末およびシルク薄膜製剤の両方に関して、分解速度および予測半減期はそれぞれ、有意に増加および減少した。しかし、凍結乾燥シルク薄膜試料は、調べた全ての保存温度に対して遅い分解速度を維持した。4℃から45℃での麻疹成分の分解速度の変化を評価すると、粉末ワクチンは、0.0136±0.0025から0.0401±0.0010 log10 TCID50/週まで分解速度の1,444％の増加を示したが、MMR-シルク薄膜および凍結乾燥MMR-シルク薄膜はそれぞれ、温度範囲に対して、0.0.139±0.0261から0.009±0.0005 log10 TCID50/週への分解速度の195％増加、および0.0128±0.0019から0.009±0.0001 log10 TCID50/週への分解速度の42％増加を示した。ムンプスおよび風疹成分も類似の傾向を示す。4℃での保存は例外であり、データは、麻疹に関して粉末ワクチンにおいて178.6週間という予測半減期を示し、これはシルク薄膜の96.6週間および凍結乾燥シルク薄膜の135.3週間より長かったが、シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜は、上昇した温度ではウイルスの半減期のかなりより劇的な増加を示した。差は、37℃および45℃でのウイルスの予測半減期では特に明白であった。35℃では、シルク薄膜の21.9週間の半減期は、粉末によって提供される9.4週間に対して有意な改善であったが、凍結乾燥シルク薄膜は、93.8週間へと半減期を劇的に増加させた。45℃での保存は、粉末、シルク薄膜、および凍結乾燥シルク薄膜と類似の結果を提供し、それぞれ、5.1、19.8、および94.9週間の半減期を示した。
【０１５２】
ワクチン分解速度の温度依存性を、回帰分析を用いてさらに評価した。粉末、シルク薄膜、および凍結乾燥シルク薄膜システムに関する時間に対するウイルス力価の低下のプロット（示していない）から、データは、妥当に直線に近似することができ、擬ゼロ次挙動を示す。時間に対するウイルス力価低下のプロットは、残存力価曲線に対応して、それと類似の傾向を示す。プロットから見られるように、ウイルス濃度の変化が線形反応であることは、分解メカニズムが、ゼロ次動態に従うことを示唆している。データを厳密に精査すると、時間に対するウイルス力価の低下の直線性は長期間で減少する。これらのデータは、分解速度がより長い期間のあいだにゼロ次挙動から逸脱して減少しうることを示唆している。それゆえ、時間に対するワクチンの分解の動態モデルは、偽ゼロ次モデルであると見なされる。通常、経時的にモニターされるのは活性薬物成分の濃度の変化のみであるが、分析されない他の反応体および緩衝剤成分が大量に存在することから、薬物安定性試験では擬似反応次数が見られる（Zhou et al., 2009）。それゆえ、一次反応は、ゼロ次反応、または擬ゼロ次反応であるように思われうる。ゼロ次反応では、反応速度は、反応体の濃度に依存せず、一定である。ゼロ次速度等式は以下のとおりであり：
2014518557.tif 000006
および各温度で得たデータを以下の等式を用いて適合させた：
2014518557.tif 000007
式中Ctは、時間tでのlog10 TCID50で表記した測定力価であり、C0は、ゼロ時間で測定された力価であり、kobsは、直線回帰によって決定された分解速度であり、およびtは週で表記した保存期間である。予測半減期t1/2は、平均力価が初回の値の50％に減少するまでに要する時間である。各温度の半減期を、以下の等式によって推定した：
2014518557.tif 000008
3つのワクチンシステムの熱分解速度は、以下の等式で示されるように、絶対温度に関してアレニウスの法則に従うはずである：
2014518557.tif 000009
式中、kは、熱分解速度であり、Aは、頻度因子であり、Eは活性化エネルギーであり、Rは気体定数であり、およびTは絶対温度である。絶対温度の逆数に対する分解速度のプロットは、大きい温度範囲に対して温度依存的分解傾向を示すことができる。アレニウスプロットは、粉末ワクチンが最も急な勾配を有し、両方のシルクシステムより、分解が温度により大きく依存することを示す。比較すると、シルクシステムのより緩やかな勾配は、上昇した温度でのワクチンの分解速度をシルクが大きく減少させること、および高い周囲温度でワクチン力価を維持できることを証明する。3つのワクチンシステムの半減期の比較において見られるように、シルクシステムの改善された半減期は、保存温度が増加すると、より明白で劇的となる。
【０１５３】
ワクチンシステムの残存水分に及ぼす処理条件の効果
MMRワクチンはフリーズドライ型で供給されるが、水分含有量を減少させるためにワクチンに安定化剤を加えることによって、その熱安定性は大きく改善している（Galazka et al., 1998）。凍結乾燥ワクチンの貯蔵寿命は、コールドチェーンの遵守および低い残存水分含有量の維持の両方に依存する。保存温度が増加すると、空気中に存在する水の量が増加する。それゆえ、MMR-シルク薄膜を周囲条件で加工して風乾させると、凍結乾燥MMR粉末および凍結乾燥MMR-シルク薄膜の両方よりも高い初回残存水分を有した。乾燥状態の決定直後に計算したMMR-シルク薄膜の残存水分は、4.42％±0.65であると決定された。MMR粉末および凍結乾燥MMR-シルク薄膜の残存水分はそれぞれ、2.39％±0.23および1.89％±0.13であると計算された。MMR-シルク薄膜を例外として、凍結乾燥ワクチンシステムを4℃で6ヶ月間保存すると、残存水分に生じた変化は非常に小さかった。実際に、全ての温度点で6ヶ月間保存した凍結乾燥薄膜の残存水分は、初回測定値から非常に小さい異常を示したに過ぎず、初回の値から45℃で記録された最高値までの残存水分の真の増加は6.9％に過ぎなかった。処理条件により、MMR-シルク薄膜は、より高い残存水分を有したが、45℃で6ヶ月間保存した際に記録された最高の残存水分への真の増加は、MMR粉末システムで示された61.5％増加と比較して30.1％に過ぎなかった。ワクチンシステムの残存水分含有量は残存力価に対応した。温度が上昇すると、MMR粉末は、シルク薄膜より大きい力価の喪失を示し、これは残存水分のより大きい増加と良好に相関した。同様に、凍結乾燥MMRシルク薄膜では残存水分の増加が最少であったことにより、ウイルス力価のより大きい保持が得られた。
【０１５４】
（表４）明記された保存条件でのMMR粉末、MMR-シルク薄膜および凍結乾燥MMR-シルク薄膜の残存水分の比較
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【０１５５】
ワクチンシルクシステムの構造的特徴付け
シルクがワクチンに対して増強された熱安定性をどのように提供するかを調べるために、熱量測定および光散乱を用いる物理的測定を調べた。DSC（図17）を用いて、シルク封入体が、ワクチンのガラス転移温度（Tg）を増加させることによってワクチンに安定化を提供することを証明した。凍結乾燥シルク薄膜の固体状態のDSCは、178℃でTgを示した。MMR粉末のDSCサーモグラムは、68.9℃のTgを示したが、凍結乾燥MMR-シルク薄膜は89.2℃のTgを示したのみならず、116.6℃および164.8℃の2つのピークを示し、これはTm、融解温度およびTd、分解温度を示しうるであろう。Tgのシフトが、シルクによる構造の安定化によるのか、またはワクチン試料中に存在する様々な賦形剤とシルクとの相互作用によるのかは不明である。次に、ワクチンを精製して、添加された賦形剤を除去した。得られた溶液は、滅菌ヌクレアーゼフリー水中に浮遊させた精製ウイルス粒子を含んだ。ウイルス試料は液体溶液であることから、ナノDSCをこれらの試料について行った。水中の精製ウイルス粒子のナノ-DSCサーモグラム（図18）は、16.8℃でTmを示し、ウイルスタンパク質がコンフォメーションの変化を受けていることを示した。シルク中の精製ウイルス粒子の溶液は、68.3℃という上昇したTmを示した。ナノDSCの範囲は、シルクのTgを示すほど十分には広くはないが、いずれのTg値もシルク構造の変化が原因ではないことを例証するために、シルク溶液のサーモグラムをなおも示す。Tmが、凝集によるウイルス粒子の変性に対応するか否かを調べるために、ウイルス粒子のサイズをDLSによって調べた（図19）。裸のウイルス粒子の平均有効径の平均値はおよそ約250 nmである。これは麻疹、ムンプス、および風疹について報告された値と一貫する（Russell et al., 1967; Hall and Martin, 1973）。結果は、精製ウイルス溶液が、およそ16℃で平均有効径の増加を示すことを示し、タンパク質凝集が存在することを示した。一方、シルク溶液中のウイルス粒子のDLSは、およそ70℃まで平均有効径の増加を示さず、より上昇した温度でタンパク質凝集を示した。DLSの結果は、光の散乱によって検出された凝集が、DSCによって測定されたタンパク質アンフォールディングの温度範囲内で起こることから、ナノDSCの結果と良好に一致する。
【０１５６】
シルク薄膜、凍結乾燥シルク薄膜、シルクハイドロゲルおよびシルクミクロスフェアからのワクチン放出
シルクがワクチンの安定化を提供するのみならず、ワクチン放出動態に対しても制御することを証明するために、多様なシルク製剤について放出試験を行った。各シルク製剤（薄膜、凍結乾燥薄膜、ハイドロゲルおよびミクロスフェア）は、同じ初回量のワクチンを含んだ。ワクチン封入シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜の累積放出プロファイルを、図20A〜20Bに示す。これらの2つのシステムのインビトロ放出試験を、ゼラチンハイドロゲルの2つのブロックのあいだに1つの薄膜を留置して行い、シルク薄膜がハイドロゲルに溶解するとワクチンを放出させた。8％（w/v）シルク溶液から調製したワクチン捕捉シルク薄膜は、拡散による放出の典型であるわずかなバースト放出を示した。6時間での最後の収集時、ワクチンの92.43％が回収されて活性であったことから、ほぼ全ての封入ワクチンが放出された。4％（w/v）で調製したシルク薄膜は、類似の放出プロファイルを示したが、放出量はより急速に完全な放出に近かったことから、バースト放出のみがより速かった。凍結乾燥シルク薄膜は、8％シルク薄膜が、ハイドロゲルに留置した10分以内にロードしたMMRの44％を放出し、4％シルク薄膜が56％を放出したことからより顕著なバースト効果を示した。凍結乾燥シルク薄膜は、ロードされたほぼ全てのMMRを90分以内に放出した。シルクハイドロゲルおよびミクロスフェア調製物は、比較すると、数日という単位でかなり遅い放出を示した（図21A〜21B）。4％および8％シルクハイドロゲルは、ワクチンの放出を8日まで延長させた。さらに、8日までに放出されたのはワクチンの73.53％に過ぎなかったことから、16％シルクハイドロゲルは、放出をさらに延長させることができた。シルクミクロスフェアからのワクチン放出は、長期間の徐放性システムとして大きい可能性を示した。同様に、ミクロスフェアのシルク濃度を増加させても、放出速度を遅らせた；16％シルクミクロスフェアはロードされたワクチンの65.35％を8日までに放出した。16％シルクミクロスフェアからの放出の相対的直線性もまた、曲線の回帰係数（R2）が0.988であったことから重要であり、ほぼゼロ次の放出を示している。
【０１５７】
熱量測定および光散乱を用いた麻疹、ムンプス、および風疹ワクチンの生物物理学的特徴から、ワクチン保存の際の上昇した温度の関数としてのウイルスの物理的安定化を説明することが可能であった。ワクチンの温度感受性により、ワクチンの流通および保存のプロセスは壊れやすく、これらの問題はしばしばかなりの物流費用がかかる（Zweig, 2006）。酵素などの生物活性分子は固定化することによって、取り扱いを改善しながら安定性が増加することは公知である。固定化は、pH、温度、またはイオン強度などの変化に対して生物活性分子を保護するための一定の環境条件を維持することから重要である（Kumakura, 1995）。シルクの化学、構造、および構築は独自のナノスケール環境を生成して、このタンパク質ポリマーは、長期間にわたって生物活性分子を安定化するための魅力的な候補物質となる（Jin and Kaplan, 2003）。化学的処理を行わなくとも、シルクは、水溶液から両親媒性の自己集合体ドメインの中に生物活性分子を捕捉するために用いることができる。
【０１５８】
MMR（登録商標）IIは、生弱毒麻疹、ムンプス、および風疹ワクチンであり、使用時に再構成される凍結乾燥調製物として提供される。再構成前、ワクチンは2から8℃で保存しなければならず、24ヶ月間安定であるが、再構成すると8時間以内に使用しなければならない。麻疹、ムンプス、および風疹ワクチンの熱安定性に関するWHOの要件は、安定性の2つの指標を使用する：1）ワクチンは、37℃で7日間インキュベートした後、ヒトの各用量中に少なくとも1,000個の生きたウイルス粒子を保持するべきである；および2）ウイルス力価は、保存の際に1 log10より多く減少してはならない（WHO, 1982；WHO, 1994）。生ウイルスワクチンは、他のワクチン剤形とは異なり、適切な免疫応答を確立するためにその免疫原性に依存し、これには生きたウイルス粒子の十分数が保持される必要がある。これらの熱不安定なウイルス粒子の保存は、安定化剤の添加を必要とする。MMR（登録商標）IIの各用量は、ソルビトール14.5 mg、リン酸ナトリウム、スクロース1.9 mg、塩化ナトリウム、加水分解ゼラチン14.5 mg、組み換え型ヒトアルブミン≦0.3 mg、ウシ胎児血清＜1 ppm、他の緩衝液および培地成分、ならびにネオマイシンおよそ25μg中で安定化される。
【０１５９】
推奨される保存条件より上の温度への過剰な曝露によって、多数の方法でワクチンに損傷を与えることができ、最も特にウイルスタンパク質の三次元構造の変化、ウイルス感染性の減少、およびそれによるワクチン力価の減少が起こる（Chen and Kristensen, 2009）。タンパク質構造の変化によって、凝集および細胞の取り込みの変化が起こりえて、ワクチン活性に影響を及ぼしうる（Brandau et al., 2003; Manning et al., 1989; Middaugh, 1996）。麻疹およびムンプスは、パラミクソウイルス科に属し、ウイルスの表面上に発現された融合（F）およびヘマグルチニン（H）糖タンパク質によって取り囲まれる一本鎖ネガティブセンスウイルスRNAを封入するヌクレオカプシドを含有するエンベロープウイルスという特徴を有する（図22A）（Kingston et al., 2008; Woelk et al., 2002）。同様に、風疹ウイルスは、トガウイルス科に属し、一本鎖ポジティブセンスウイルスRNAを封入する正二十面体のヌクレオカプシドを取り巻く2つのウイルス特異的糖タンパク質E1およびE2を有するエンベロープウイルスである（Dorsett et al., 1985; Nakhasi et al., 1991）。
【０１６０】
パラミクソウイルスを感染させる方法は、ヘマグルチニン（H）糖タンパク質と融合（F）糖タンパク質の両方の相互作用によって、宿主細胞のCD46およびCD 150受容体にウイルスを結合させる段階を伴う（図22C）（Wild et al., 1991; Malvoisin and Wild, 1993; Moss and Griffin, 2006）。ウイルスと細胞の融合によってウイルスが流入してウイルス核酸材料を細胞の中に放出することができる。ウイルス不活化の主な原因は、ウイルス表面タンパク質の破壊であり、温度上昇などのストレスはウイルスタンパク質のコンフォメーションの変化を誘導することができる（Rexroad et al., 2006; Ausar et al., 2006）。これらのコンフォメーションの変化は、細胞の結合および取り込みを防止するウイルス粒子凝集を誘導することによってウイルスの安定性に影響を及ぼして、このようにウイルスの不活化に至りうる（図22D）（Ohtake et al., 2010）。熱損傷に対して抵抗性であるワクチン製剤を開発して、ワクチンの熱安定性を改善させることは、貯蔵寿命の延長、ワクチンの損失の減少、およびコールドチェーン必要条件に対する依存性の減少を含む、主要な利益を有するであろう。
【０１６１】
シルクタンパク質によって提供されるワクチン安定性の改善は、37℃および45℃の上昇した温度でより顕著であったが、4℃および25℃で保存した製造された粉末型では安定性は同等であるかまたはわずかに良好であった。凍結乾燥ワクチンは、多様な賦形剤によって安定化され、製造元によれば、少なくとも2年間安定で活性であるはずである。しかし、コールドチェーンが中断されてワクチンが冷蔵温度より上で保存された場合に、ワクチンの損傷が起こる。そのような場合、シルクは広範囲の環境条件に対して安定性を維持するためにワクチンに対して十分な安定性を提供するであろう。ウイルス粒子が水和状態に留まる時間が長ければ、不安定性に寄与しうる加水分解および脱アミノ化などの分解反応に粒子が曝露される可能性が高くなることから、MMR-シルク薄膜の凍結乾燥は、回収される初回ワクチン力価を改善した（Li, 1994）。6ヶ月間より長く保存した凍結乾燥シルク薄膜によって提供された持続的な安定化の増強はまた、部分的に凍結乾燥薄膜の保存条件によってもたらされるであろう。通常のシルク薄膜は、Eppendorfチューブに保存されるが、凍結乾燥薄膜はより残存水分が少ない真空密封バイアルに保存される。
【０１６２】
アンフォールディングおよび分解の動態モデルによる実験的力価データの評価は、同様に力価データを、生物物理学的特徴付けによって説明される温度によるコンフォメーション変化に関連させながら、選択した温度での異なるワクチンシステムの予想される加速安定性を例証するために役立つ。加速安定性試験条件では、タンパク質製剤の固有の安定性はしばしば劇的に減少する。上昇した温度では、タンパク質のアンフォールディング速度は増加して、タンパク質の脱安定化に関係するほとんどの化学的相互作用が、低温と比較して加速する（Creighton, 1990）。上昇した温度での保存によって分解プロセスを加速させることによって、不活化プロセスを阻害するための適した候補安定化剤としてシルクを評価することができる。力価データを調べると、3つのワクチンシステムによって観察された分解が、ゼロ次動態システムに適合しうることが示唆された。ゼロ次、一次、および二次反応の濃度-時間プロファイルを観察すると、ゼロ次動態が常に、3つの中で時間の関数として組成物の最大程度を予測することを示している。それゆえ、反応の次数を予測する場合、ゼロ次動態モデルの仮定は、今後何らかの時間に起こりうる分解の最大量を予測するであろう（Zhou et al., 2009）。それゆえ、分解プロファイルをモデルとするためにゼロ次動態を用いてMMRウイルスの分解が擬ゼロ次であると仮定して、本発明者らは、ワクチン封入シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜システムの半減期に関する最も控えめな推定値を予測した。
【０１６３】
3つ全てのウイルス成分について観察された全般的傾向は、両方のタイプのシルク薄膜がウイルスの分解速度を減少させるが、凍結乾燥シルクシステムは最も低い分解速度を示し、このように3つのシステムの中で最大の半減期を有したが、粉末型のワクチンは調べた全ての温度点でより早く分解したことであった。4℃試料では、粉末ワクチンは、非凍結乾燥シルク薄膜と比較して高い予測半減期で、より低い分解速度を示すことから、この傾向からの逸脱が観察された。この結果に関して考えられる説明は、粉末ワクチンが通常のシルク薄膜と比較して凍結乾燥調製物の長所を有する点である。薄膜調製の際に、さらなる水分が封入ワクチンに導入され、これが製造元の提供したワクチン粉末と比較して、分子間移動を増加させて、シルク薄膜内での分解の機会を与えた。間違いなく、シルク薄膜は、追加の水分というハンディキャップがあったとしても、上昇した温度では増加した安定性を提供する。しかし、凍結乾燥ワクチン粉末は、2から8℃の最適な温度範囲で安定なままであるように調合されている。凍結乾燥のこの利点はまた、凍結乾燥シルク薄膜がシルクおよび凍結乾燥の両方によって与えられる安定性を提供することから、ワクチンの安定化における凍結乾燥シルク薄膜の成功を説明することができるであろう。
【０１６４】
力価データを用いて行われた動態試験に加えて、結果を確証するために熱量測定および光分散を用いる生物物理学的特徴付けを行った。シルクフィブロインの178℃という高いガラス転移温度により、シルクタンパク質は、一度β-シートコンフォメーションへと自己構築すると、熱力学的に安定である。これらの特色は、ワクチンを安定化するための環境を提供する。ワクチン-シルク溶液は、本来の型のワクチン分子と、ランダムコイルで主に存在するシルクフィブロインからなった。薄膜を成型した後、フィブロインの、疎水性領域を含むβ-シートへのいくつかの変換が起こるが、ランダムコイルはより親水性の領域を含む。ワクチンは、おそらくフィブロイン鎖との相互作用または鎖の運動性の拘束によりこの環境下で安定化されるように思われる（図21B）。固体状態DSC（図17）は、68.9℃でMMR粉末のTgを示した。しかしこの値は、これがウイルス粒子自身のTgおよび対応する構造変化を反映するのではなく、むしろMMR粉末ワクチン製剤に既に存在する様々なタンパク質賦形剤および安定化剤の関与による平均値を表す可能性があることから、誤った方向に導きうる。MMR-シルク薄膜は、89.2℃でのTgを示し、これはシルクの存在によりワクチンのTgがシフトしたことを示している。しかし、凍結乾燥MMR-シルク薄膜のサーモグラムはまた、116.6℃および164.8℃での2つの発熱性ピークの存在を示した。116.6℃のピークはTmである可能性が最も高く、タンパク質のアンフォールディングを示すが、第二のピークは分解、Tdであった。アンフォールディングおよび分解が、ワクチン製剤中に存在するウイルスタンパク質または様々な賦形剤に寄与したか否かは決定することができない。それゆえ、シルクの存在下でのワクチンのTgの増加が、ウイルス粒子の構造的安定性に直接関与していたと、断定的に言うのは難しい。
【０１６５】
状況を明確にするために、ワクチンを精製して賦形剤を除去した。精製の結果は液体調製物であることから、ウイルス粒子はより安定性の低い環境に存在する。それゆえ、ウイルス粒子溶液を、使用するまで-80℃で保存した。ナノDSCによるTmは、タンパク質がアンフォールドして、疎水性および親水性領域を水性緩衝液に露出すると出現した。隣接する疎水性タンパク質分子は凝集して、これらの領域を周辺の水溶液から隠すであろう。タンパク質のアンフォールド状態は、本来の状態より多くの表面積を有することから、シルクの安定化剤によって提供される低構造化状態の選択的除外の程度により、この安定化型の化学的ポテンシャルは、本来の状態の化学的ポテンシャルより上に上昇するであろう（Brandau et al., 2003）。この安定性の増加は、タンパク質のアンフォールディング遷移の中央点、すなわちTmの増加として反映されうる。ワクチン封入シルク溶液のTmの上昇は、ウイルスタンパク質の変性および凝集を防止するためにシルクによって提供された構造的安定化による。16.8℃というTm値は、おそらくウイルス粒子に適用された上昇した熱によるウイルス表面糖タンパク質（麻疹およびムンプスのFおよびN、ならびに風疹のE1よびE2）のアンフォールディングによる。この変性によっておそらく、ウイルス粒子の凝集が起こる可能性が最も高く（図22D）、ウイルス粒子と動物細胞との結合および融合が防止され（図22C）、ウイルス粒子および全体としてのワクチンの感染性の喪失に至る。この関連する凝集は、DSCサーモグラムにおいてTm直後の熱流の鋭い変化として示される。発熱プロセスである凝集は、タンパク質の吸熱性のアンフォールディングの直接の結果であるように思われる。Tmピークが広いことは、試料中に存在するいくつかのタンパク質のアンフォールディングが複合的に関与した結果である可能性が最も高い。さらに、タンパク質の凝集はまた、変性的吸熱と重なりあうことによって広いピークに寄与しうる（Packer et al., 2002）。MMRの感染性は、ウイルスタンパク質のコンフォメーションの安定性に依存する（Kissman et al., 2008）。シルク分子の存在によるTmの増加は、シルクが熱変性から遮蔽する構造的安定性をウイルスタンパク質に提供したことを示している。ウイルス粒子とシルクの疎水性領域との相互作用は、鎖の運動性の制限と共に、ウイルスタンパク質の凝集を防止して（図22B）、それによってウイルスおよびワクチン感染性を保存する可能性がある。
【０１６６】
タンパク質のアンフォールディングは、部分的または完全にアンフォールドしたタンパク質状態が不安定で凝集体を形成することから、通常その流体力学的サイズの増加に関連する（Roberts, 2007）。光散乱の結果から、裸のウイルス粒子がシルク中のウイルス粒子の溶液よりかなり低い温度で凝集することが示された。DLSによって確認した粒子凝集の開始は、DSCによって示されたタンパク質のアンフォールディングとほぼ同じ温度で起こり、タンパク質のアンフォールディングによって直接凝集が起こったことを示している。DLSの結果は、シルクがウイルス粒子、特にウイルス表面の糖タンパク質に対して構造的安定性を提供して、分子間衝突を防止して、このように上昇した温度での凝集を最小限にする、というDSCの結果を確証する。
【０１６７】
湿度もまた、システムに導入された過剰な水によって、ウイルスタンパク質の運動性および対応する反応性が増加しうることから、ワクチン製品に対して有意な効果を有しうる（Waterman and Adami, 2005）。薄膜の残存水分分析により、安定性試験の経過のあいだの特に高温範囲での残存水分の増加は、Eppendorfチューブによって水分制御環境が提供されないことによる可能性が最も高いことが判明している。MMR粉末および凍結乾燥MMR-シルク薄膜は極めて吸湿性であることから、それらは、凍結乾燥バイアルおよびストッパーによって提供され、窒素に富む環境で密封される低湿度条件で保存されたが、MMR-シルク薄膜は、真空密封バイアルより大気中の湿度を容器に吸収する機会がより大きいEppendorfチューブに保存された。Eppendorfチューブにおける水の活性の増加はまた、シルク薄膜に関連する最初の水量が、粉末および凍結乾燥薄膜の両方よりおよび当初のパッケージの相対湿度より既に高レベルであるためである。上昇した温度でシルク薄膜において示された残存水分の増加はまた、風乾させたもののシルクマトリクス内で分子間結合した微量の水分子をなおも含むシルクからの起こりうる離水によって説明することができるであろう（Hu et al., 2007）。その上、室温で保存したシルク薄膜の場合、天気のパターンによって左右される大気湿度の変動は、Eppendorfチューブ内部の相対湿度に影響を及ぼすであろう。
【０１６８】
ワクチンに及ぼす残存水分の効果を考慮に入れるが、最少の処理条件でおよび特殊な保存を考慮することなく、ワクチン捕捉シルク薄膜が、同じ温度で試験した市販の凍結乾燥ワクチンと比較して、上昇した温度で安定性の増強を示すことができることを単に示すために、シルク薄膜をEppendorfチューブにおいて保存した。水分および温度による運動性の増加は、凍結乾燥シルク薄膜が、通常のシルク薄膜の安定性のそのような劇的な増加を示した理由を説明するであろう。凍結乾燥薄膜の凍結乾燥プロセスおよび低い水分保存により、高温でのウイルスタンパク質の運動が有意に制限され、ウイルスタンパク質は、熱によるアンフォールディングおよび関連凝集に対してより抵抗性となる。シルク薄膜の絶対残存水分がたとえMMR粉末の水分より高い場合でも、試験した温度範囲に対する粉末中の残存水分の％増加は、シルク薄膜において観察された増加より大きい。温度の増加は、シルク薄膜より粉末における温度誘導水分により大きい影響を有したように思われる。シルクは、保存時の分子運動の阻害を提供して、タンパク質のアンフォールディングおよびその後の凝集を防止したが、粉末における温度誘導水分に起因する水の活性の増加は、シルクによって提供されるコンフォメーションの安定性がなければ、ウイルスタンパク質の凝集を増加させたように思われる。
【０１６９】
シルクがワクチンを安定化させて放出動態を制御することができることを示すために、多様なワクチン捕捉シルク送達媒体について放出試験を行った。ワクチンをロードしたシルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜は、無処置で水溶性であった。それらは、皮下注射針と比較して経皮薬物送達に対する安全で無痛の代替物である微小針などの送達フォーマットに成型される可能性を有する（Tsioris et al., 2011）。おそらく、パッチを皮膚に適用して、ワクチンをロードしたシルク微小針が皮膚を穿刺すると、シルクの針が溶解してワクチンを皮下に放出するであろう。シルク薄膜の放出プロファイルは、この目標に対して有望性を示す。シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜の放出試験を、組織と類似のなめらかさによりゼラチンハイドロゲルにおいて行った（Wightmas et al., 2007）。4％および8％シルクから成型されたシルク薄膜は類似の放出プロファイルを示し（図20A〜20B）、最初に放出のバーストを示した後、放出速度の減少を示した。4％シルク薄膜は、シルクタンパク質の濃度がより低いためにより急速な放出を示し、薄膜をより急速に溶解させながら、ワクチンをマトリクスからより速やかに拡散させた。シルク濃度を8％に増加させると、放出速度は薄膜のβ-シート含有量の増加により遅くなり、より堅固なマトリクスを形成して、ハイドロゲルへのワクチンの拡散を遅らせた。凍結乾燥シルク薄膜の放出プロファイルは、より顕著な初回バースト効果を示した。ハイドロゲルとの最初の接触によりシルクから急速に拡散するワクチンよりむしろ、凍結乾燥薄膜からの初回バーストは、凍結乾燥薄膜の急速な溶解による可能性が最も高い。その後の放出はおそらく、非溶解薄膜からのワクチンの拡散による可能性が高かった。シルク薄膜と同じ理由から、4％凍結乾燥シルク薄膜は、8％より速やかな放出プロファイルを示した。シルク薄膜放出の時間尺度は時間の単位であったが、封入MMRの96.85％が90分までに放出された。
【０１７０】
ワクチン-シルク送達媒体をまた、シルクハイドロゲルおよびミクロスフェアの不溶性フォーマットにも加工した。これらの形状は、長期間にわたってワクチンを徐々に放出することができる皮下ワクチンデポー剤を形成する注射可能なワクチン送達に組み入れることができる。ハイドロゲルおよびミクロスフェアは、ワクチンを数日間にわたって放出した。薬物放出がより遅いことは、ハイドロゲルおよびミクロスフェアのβ-シート含有量の増加によって制限されるワクチンの拡散によって説明することができる。同様に、ハイドロゲルおよびミクロスフェアの濃度が増加すると、放出速度の減少に対応して、放出の直線性が改善された。ハイドロゲルのシルク濃度が増加すると、ワクチン放出速度は減少した。しかし、MMR-シルクミクロスフェアのシルク濃度を増加させると、放出速度が遅くなり、放出速度はより直線的になり、ゼロ次に近づいた。8％ミクロスフェアは回帰係数（R2）0.95を有し、16％シルクでは、この値は0.988であった。ミクロスフェアからのワクチン放出が直線性に増加するのは、体積が小さいためであり、これによってワクチン粒子がバルク相の中を交差する際に生成される拡散勾配はより小さくなりうる。
【０１７１】
これらの結果は、これらのシルク捕捉ワクチンシステムが、制御された持続的なワクチン送達システムとして機能しながら、上昇した温度でワクチンに熱安定性を提供するように加工することができることを示している。凍結乾燥シルク薄膜におけるMMRワクチンの捕捉は、製造元のワクチンの期間をはるかに超える期間、推奨されるコールドチェーン外での上昇した温度で安定性の増強を示した。封入ポリマーとしてのシルクの選択はまた、シルクが生物適合性で生分解性のFDA承認生物材料であることから（Altman et al, 2003; Horan et al, 2005）、植え込み可能なまたは注射可能なワクチン-シルクシステムの安全性を支持する。
【０１７２】
ワクチン封入シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜は、麻疹、ムンプス、および風疹ワクチンの長期間の熱安定化にとって非常に有効な担体を提供する。いずれのシルク薄膜システムもまた、25℃、37℃、および45℃で製造元の提供するワクチンと比較してワクチンの3つ全てのウイルス成分の半減期を増加させることができた。シルクは、上昇した温度での保存する際の試料の残存水分を減少させることによって、および同様に、ワクチンに構造的安定性を提供してウイルスタンパク質が変性する温度を上昇させることによって、温度によるウイルスタンパク質のアンフォールディングを減少させてその後の凝集を減少させる。さらに、シルク担体は、ワクチンの放出動態に合わせて作製することができる異なる送達媒体に加工することができる。このシルク担体システムは、特殊な処理の検討を必要とすることなく容易に加工され、コールドチェーンを厳密に遵守する必要性がなく、ワクチンの力価を維持することができる新規ワクチン送達システムを提供する。
【０１７３】
実施例3．方法
3価ワクチン
力価の推定に関して、本発明者らは、Enders弱毒Edmonston麻疹、Jeryl LynnムンプスおよびWistar RA 27/3風疹を含む滅菌凍結乾燥生ウイルスワクチンである市販の3価の麻疹、ムンプス、風疹ワクチンMMR（登録商標）II（Merck & Co., Inc., USA）を用いた。使用前、ワクチンを希釈剤に再構成すると、各0.5 mL用量は、1,000 TCID50（組織培養感染量）を下回らない麻疹ウイルス、12,500 TCID50を下回らないムンプスウイルス、および1,000 TCID50を下回らない風疹ウイルスを含んだ。製造元の条件は、ワクチンは再構成の8時間以内に使用し、4℃で保存しなければならないか、そうでなければ廃棄しなければならないと述べている。各0.5 mL用量は、ソルビトール（14.5 mg）、リン酸ナトリウム、スクロース（1.9 mg）、塩化ナトリウム、加水分解ゼラチン（14.5 mg）、組み換え型ヒトアルブミン（＜0.3 mg）、ウシ胎児血清（＜1 ppm）、他の緩衝液および培地成分、ならびにネオマイシンおよそ25μgを含む。
【０１７４】
シルクフィブロイン精製
シルクフィブロイン水溶液を既に記述したように（Wang et al., 2008）調製した。カイコガのマユのシルクを0.02 M Na2CO3水溶液中で30分間煮沸した後、dI水によって十分にすすいでセリシンを抽出した。乾燥後、シルクを60℃の9.3 M LiBr溶液中で4〜6時間溶解した後、Slide-a-Lyzer透析カセット（MWCO 3,500, Pierce）を用いて48時間蒸留水に対して透析した。溶液を遠心分離してシルク凝集体および他の不溶性残渣を除去した。シルクフィブロインの最終濃度は、およそ9％（w/v）であった。次に、溶液を滅菌するためにオートクレーブ処置した。
【０１７５】
ウイルスの精製
凍結乾燥ワクチン粉末を滅菌水に再構成して、0.5 kDa透析チューブ（Sigma Aldrich）にロードして、0.15 M NaCl溶液に対して透析して、賦形剤をワクチン溶液から除去した。回収されたワクチン溶液を、PD-10脱塩カラム（GE Healthcare）の中に通して過剰な塩を除去した。スピンプロトコールは、製造元の仕様書に従った。回収された精製ウイルス粒子溶液を、Eppendorfチューブに収集して使用するまで-80℃で保存した。
【０１７６】
シルク薄膜におけるワクチンの捕捉
ワクチン封入シルク薄膜加工のプロセスを図7に例証する。滅菌9％（w/v）シルク溶液と凍結乾燥MMRワクチンの混合物をMMR対シルク溶液の重量比で1：1の濃度で調製した。薄膜をテフロンコーティング表面上に成型した。薄膜を室温の滅菌フード内で遮光して12時間乾燥させた。個々の薄膜を、周囲条件でEppendorfチューブに入れて、安定性試験のために、4℃、25℃、37℃、および45℃で保存した。
【０１７７】
ワクチン捕捉シルク薄膜の凍結乾燥
MMR-シルク溶液（1：1重量比）を96ウェルプレートに分注して、VirTis 25L Genesis SQ Super XL-70 Freeze Dryerを用いてフリーズドライした。試料を-45℃で480分間凍結した。一次乾燥は-20℃で2,400分間行い、二次乾燥は35℃で620分間行った。試料を、凍結乾燥器から取り出すまで-45℃で保持した。薄膜をウェルプレートから採取して5 ccガラス製血清バイアルに移した。5 mm凍結乾燥ストッパーを、MBRAUN LABmasterグローブボックス（Garching, Germany）において窒素および真空条件下でバイアルに載せて、5 mmクリンパーを用いてバイアル上で5 mmアルミシールを締めた。バイアルを安定性試験のために4℃、25℃、37℃、および45℃で保存した。バイアル、ストッパー、シールおよびクリンパーは、VWR（Bridgeport, NJ）によって供給された。
【０１７８】
シルクハイドロゲルにおけるワクチンの捕捉
シルク溶液を2〜5重量％の濃度に調節した後滅菌するためにオートクレーブ処置した。次にシルク溶液1 mLをオートクレーブした2 mL  Fisherガラスバイアルに移して、溶液をガラスバイアル中でFisherボルテクサーを用いて3,200 rpmで7分間混合した。混濁した溶液を回収して2 mL Eppendorfチューブに移して、ワクチンを1：1の重量比で溶液中で混合した。ワクチン-シルク溶液をEppendorfチューブ中で室温でゲル化するまでインキュベートした。ゲルを長期間保存するために冷蔵した。
【０１７９】
シルクミクロスフェアにおけるワクチンの捕捉
シルク／PVA混和物からのワクチンロードミクロスフェアの産生は、Wang et al.(2010)によって記述される技法を用いた。ワクチン粉末を、1：1000の重量比に達するように、5重量％シルク溶液に添加した。この溶液を5％（w/v）PVA（ポリビニルアルコール、モル重量30,000〜70,000, Sigma Aldrich）保存溶液と軽く混和した。1：4の一貫した重量比を用いて、5重量％シルク溶液1 mLを5重量％PVA溶液4 mLと混合することによって、5％（w/v）シルク-PVA溶液を調製した。シルク溶液を滅菌するためにオートクレーブ処置した。混合後、溶液を室温で2時間撹拌した。次に、5％（w/v）溶液を35 mmペトリ皿に移した。溶液を燻煙フード中で終夜乾燥させた。乾燥した薄膜を超純水30 mL中に室温で10分間軽く振とうさせながら溶解した後、16,000 rpmで4℃で20分間遠心分離した。上清を捨てて、沈降物を超純水30 mLに浮遊させて、再度遠心分離した。最終沈降物を超純水2 mLに浮遊させた。
【０１８０】
定量的リアルタイムRT-PCR感染性アッセイ
滅菌水に再構成したワクチンのみの溶液を連続希釈することによって、検量線を作製した。再構成したワクチンを1 log10希釈と見なして、これを0.5 log10きざみで1.5 log10から3.5 log10まで連続希釈した。MMR-シルク薄膜（ワクチンの1 log10希釈液を含む）を、少量の水に再溶解して、溶液を培養細胞に直接添加した。Vero細胞（アフリカミドリザル腎細胞）（ATCC, Manassas, VA）を、25 mM hepesおよびL-グルタミン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, USA）および5％仔ウシ胎児血清（Invitrogen）を有するM199培地中で培養した。細胞をトリプシン処理して、計数して、50,000個/mLに調節し、24ウェルプレートにおいて平板培養した。次に、ワクチン希釈液50μLおよび再溶解シルク薄膜をVero細胞のウェルに1試料あたり3個ずつ加えた。ウイルスを細胞において3日間複製させた後、感染細胞からのRNAを単離して、cDNAに変換して、qPCRを用いて定量した。蛍光がバックグラウンド（閾値サイクル、Ct）より上に上昇すると、標的RNA量とPCRサイクルのあいだには対数比例関係が存在する。試料中に存在するウイルスがより多く生存すると、PCR産物の蛍光がバックグラウンドより上になるために要する時間はより速やかに、サイクルはより少なくなり、それゆえCt値はより低くなる。多様な細胞の生育を説明するために、アッセイを行うたびに、MMR-シルク薄膜にロードされたワクチンの同量を含むワクチン溶液を連続希釈することによって、検量線を作製した。ベースラインの活性（時間0）を確立するために、ウイルスの感染性を初回薄膜調製の直後に測定した。その後の時点での測定を0時間の値と比較して、残存力価を確立した。シルク薄膜からの初回回収力価、薄膜を成型直後のウイルス活性は、MMR-シルク薄膜から測定されたウイルス感染性を、シルク薄膜にロードされたワクチンの同じ濃度を含むワクチン単独の溶液の感染性と比較することによって決定した。MMR-シルク薄膜の残存力価を、初回回収力価と比較してある時点で測定したウイルス感染性によって計算し、およびシルク薄膜からの初回回収力価を決定するために用いられたワクチン溶液の感染性と比較したウイルス活性の比較によって、保存の際のワクチン粉末の残存力価を決定した。対照としてのウイルスの活性は、ワクチンをロードしていないシルク薄膜の測定であった。
【０１８１】
RNAをTRIzol試薬（Invitrogen）およびクロロホルムを用いてVero細胞から単離した。RNAを、Qiagen RNEasyキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて精製した。High Capacity cDNA逆転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、精製RNAにおいて逆転写を行ってcDNAを合成した。リアルタイムRT-PCRをStrategene Mx3000P QPCRシステム（Strategene, La Jolla, CA）において行った。PCR反応をTaqMan Universal PCR Mater Mix（1×）（Applied Biosystems, Foster City, CA）、0.9μMの各PCRプライマーおよび0.25μMのプローブならびにcDNA試料5μLを含む50μL混合物量で行った。麻疹を検出するために、114 bp断片（ヌクレオチド584-697）を、フォワードプライマー
2014518557.tif 000011
、リバースプライマー
2014518557.tif 000012
、およびプローブ
2014518557.tif 000013
によって増幅した。風疹を検出するために、フォワードプライマー
2014518557.tif 000014
、リバースプライマー
2014518557.tif 000015
およびプローブ
2014518557.tif 000016
を用いて129 bp領域（ヌクレオチド195-323）を増幅した（Hubschen et al., 2008）。ムンプスウイルスの134 bpの領域を検出するために、フォワードプライマー
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、リバースプライマー
2014518557.tif 000018
、およびプローブ
2014518557.tif 000019
を用いた（Kubar et al., 2004）。プライマーおよびプローブは全て、Sigma- Aldrich（St. Louis, MO）から得た。PCR反応条件は50℃で2分、95℃で10分、ならびに95℃で15秒および60℃で1分を50サイクルであった。
【０１８２】
インビトロワクチン放出
インビトロワクチン放出試験を37℃で行った。シルク薄膜および凍結乾燥シルク薄膜の放出試験をゼラチンハイドロゲルモデルにおいて行った。Knox（商標）オリジナル無香料ゼラチン粉末4.5 gを、煮沸したDI水40 mLと共に混合して、0.112 g/mLハイドロゲルを得ることによって、ゼラチンハイドロゲルを調製した。溶液を35 mmペトリ皿に注いで、冷却した。放出試験を開始するために、薄膜をハイドロゲルの2つのスラブのあいだに置いた。ある時点に達すると、薄膜をゲルから取り出して放出を停止させた。次に、ハイドロゲルを1 mg/mLコラゲナーゼ（Sigma Aldrich）400μLによって37℃で2時間消化した。次に、放出されたMMRをVero細胞感染性アッセイによって定量した。
【０１８３】
シルクハイドロゲルおよびミクロスフェアのインビトロ放出を2 mL Eppendorfチューブにおいて行った。各ハイドロゲルまたはミクロスフェア溶液を、滅菌PBS 1.5 mLを加えたEppendorfチューブに入れた。各時点で、Eppendorfチューブ内のPBSを除去して、もう1つのEppendorfチューブに移し、-80℃で保存した。新鮮なPBSをチューブに加えて供給を補充した。全ての試料を設定時点で採取した後、溶液にVero細胞感染性アッセイを行って、放出されたMMRの量を定量した。放出値は、放出された累積MMRとして報告した。
【０１８４】
残存水分の決定
凍結乾燥ワクチン粉末、MMR-シルク薄膜、および凍結乾燥MMR-シルク薄膜の残存水分を、80℃で1時間乾燥後の各ワクチンシステムの3つの試料の平均重量を推定する、Worrall et al., 2001によって改変された熱重量分析法によって測定した。乾燥ワクチンシステムから失われた水の重量を百分率として表記する。
【０１８５】
示差走査熱量測定（DSC）
5 mgをアルミニウムパンに封入して、TA Instrument Q100 DSC（New Castle, DE）において50 mL/分の乾燥窒素ガス流パージによって加熱した。Tgは、熱流対温度の不連続曲線の開始温度として記録された。測定は全て10℃/分で行った。試料を最初、-20℃で5分間平衡にした後、200℃に加熱して、200℃で5分間維持した後、20℃に冷却した。CSC Model 6100 Nano II示差走査熱量計（Lindon, UT）においてナノDSC測定を行った。試料を1 mg/mlの濃度で調製した。走査速度を、0℃から100℃の加熱および冷却の両方に関して1℃/分で設定した。
【０１８６】
動的光散乱（DLS）
温度の関数としての麻疹、ムンプス、および風疹ウイルス粒子のサイズをDLSによってモニターした。2 mg/mL試料溶液の400μLアリコートを0.45μmシリンジフィルター（GE, Fairfield, CT）を通して濾過した。DynaPro DLSシステム（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を用いて、パラメータを、獲得時間60秒間、獲得回数10回、およびレーザー出力75 mWに設定してDLSを行った。試料の100μLアリコートを、DLSに挿入されるRNアーゼフリー、DNアーゼフリー、タンパク質フリーUVette Eppendorfキュベットに移した。累積法（Koppel, 1972）を用いてストークス-アインシュタインの等式によって拡散係数から有効流体力学直径を計算した。
【０１８７】
実施例3  参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月12日(2014.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルクフィブロインマトリクスとその中に分散される活性物質とを含む保存安定組成物であって、該活性物質が、生弱毒ウイルス、不活化ウイルス、ウイルスサブユニット、ウイルスベクター、生弱毒細菌、死滅細菌、不活化細菌、細菌サブユニット、および病原体からの不活化毒素からなる群より選択される免疫原であり、また、該組成物を（a）少なくとも1回の凍結融解サイクルに供した場合、または（b）0℃より上の温度で少なくとも約24時間維持した場合、または（c）（a）および（b）の両方の場合に、活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する、前記保存安定組成物。
【請求項２】
シルクフィブロインマトリクスが溶液である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
シルクフィブロインマトリクスが固体状態の形態である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
固体状態の形態が、薄膜、繊維、粒子、ゲル、ハイドロゲル、またはそれらの複合体である、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
凍結乾燥されている、請求項1または4記載の組成物。
【請求項６】
微粉化されている、請求項1、4、および5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
微粉化組成物がナノ粒子またはマイクロ粒子を含む、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が約10 nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
シルクフィブロインマトリクスの中に分散されている添加剤をさらに含む、請求項1および4〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
添加剤が、安定化剤、薬学的に許容される担体、またはその任意の組み合わせから選択される、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
免疫原が、B型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌B型、ポリオウイルス、C型髄膜炎菌、インフルエンザ、水痘、または結核菌カルメットゲラン桿菌、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および百日咳菌に由来する、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
免疫原が、DTaP、DTwP、DTwP hepB、DTP hep B Hib、DTaP hep B Hib IPV、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される混合免疫原である、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
免疫原が生弱毒ウイルスである、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
生弱毒ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
エンベロープウイルスが、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
ウイルスが水痘である、請求項13〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
ウイルスがインフルエンザである、請求項13〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
生弱毒ウイルスが、麻疹、ムンプス、または風疹を引き起こす、請求項13記載の組成物。
【請求項１９】
免疫原が生弱毒非エンベロープウイルスである、請求項1記載の組成物。
【請求項２０】
非エンベロープウイルスが、ロタウイルス、レオウイルス、肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、またはポリオウイルスである、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
免疫原が生弱毒細菌、死滅細菌、または不活化細菌である、請求項1記載の組成物。
【請求項２２】
細菌が、結核菌カルメットゲラン桿菌、または百日咳菌である、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
免疫原が細菌サブユニットである、請求項1記載の組成物。
【請求項２４】
細菌サブユニットが、C型髄膜炎菌、インフルエンザ菌B型、肺炎連鎖球菌、またはB群連鎖球菌に由来する、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
細菌サブユニットが多糖類である、請求項23記載の組成物。
【請求項２６】
免疫原がウイルスサブユニットである、請求項1記載の組成物。
【請求項２７】
ウイルスサブユニットがB型肝炎ウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
免疫原が組み換え型である、請求項1記載の組成物。
【請求項２９】
免疫原が、炭疽ワクチン（BioThrax）；BCG（カルメットゲラン桿菌）（Tice, Mycobax）；DTaP（Daptacel）；DTaP（Infanrix）；DTaP（Tripedia）；DTaP/Hib（TriHIBit）；DTaP-IPV（Kinrix）；DTaP-HepB-IPV（Pediarix）；DtaP-IPV/Hib（Pentacel）；DT（ジフテリアワクチンプラス破傷風ワクチン）（Sanofi）；Hibワクチン（ACTHib）；DT（Massachusetts）；Hib（PedvaxHib）；Hib/Hep B（Comvax）；Hep A（Havrix）、A型肝炎ワクチン; Hep A（Vaqta）、A型肝炎ワクチン; Hep B（Engerix-B）、B型肝炎ワクチン; Hep B（Recombivax）、B型肝炎ワクチン; HepA/HepBワクチン（Twinrix）；ヒトパピローマウイルス（HPV)（Gardasil）；インフルエンザワクチン（Afluria）；インフルエンザワクチン（Fluarix）；インフルエンザワクチン（Flulaval）；インフルエンザワクチン（Fluvirin）；インフルエンザワクチン（Fluzone）；インフルエンザワクチン（FluMist）；IPV（Ipol）、ポリオワクチン；日本脳炎ワクチン（JE-Vax）；日本脳炎ワクチン（Ixiaro）；髄膜炎ワクチン（Menactra）；MMRワクチン（MMR-II）；MMRVワクチン（ProQuad）；肺炎球菌ワクチン（Pneumovax）；肺炎球菌ワクチン（Prevnar）；不活化ポリオウイルス（Poliovax）、ポリオワクチン; 狂犬病ワクチン（Imovax）；狂犬病ワクチン（RabAvert）；ロタウイルスワクチン（RotaTeq）；ロタウイルスワクチン（Rotarix）；Tdワクチン（Decavac）；Tdワクチン（Massachusetts）；Tdapワクチン（Adacel）；Tdapワクチン（Boostrix）；腸チフス（不活化―Typhim Vi）、チフスワクチン;腸チフス（経口―Ty21a）、チフスワクチン; ワクシニア（ACAM2000）；水痘ワクチン（Varivax）；黄熱病ワクチン（YF-Vax）；帯状疱疹ワクチン（Zostavax）；およびその任意の組み合わせからなる群より選択されるワクチン製品である、請求項1記載の組成物。
【請求項３０】
安定化剤が、糖類、糖アルコール、イオン、界面活性剤、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項10記載の組成物。
【請求項３１】
糖類がスクロースである、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
生弱毒ウイルスまたは不活化ウイルスが、水痘、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、黄熱病ウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群より選択されるエンベロープウイルスである、請求項1記載の組成物。
【請求項３３】
以下の段階を含む、請求項1および4〜32のいずれか一項記載の保存安定組成物を調製する方法：
a．少なくとも1つの活性物質を含むシルクフィブロイン溶液を提供する段階；および
b．段階（a）のシルクフィブロイン溶液を乾燥させる段階であって、固体状態のシルクフィブロインを形成し、それによって保存時に少なくとも1つの活性物質がその当初の生物活性の少なくとも約30％を保持する組成物を得る、段階。
【請求項３４】
段階（b）の固体状態シルクフィブロインを凍結乾燥する段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
組成物の後処置をさらに含む、請求項33または34記載の方法。
【請求項３６】
後処置が、組成物の結晶性を変化させる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
後処置が、組成物にメタノールまたはエタノールを接触させる段階、組成物を剪断応力に供する段階、組成物を電場に供する段階、組成物を圧力に供する段階、または組成物に塩を接触させる段階である、請求項35または36記載の方法。
【請求項３８】
微粉化粒子を得るために機械的手段によって、段階（b）の固体状態シルクフィブロインを減少させる段階をさらに含む、請求項33、34、35、36、または37記載の方法。
【請求項３９】
免疫原とシルクフィブロイン溶液をする段階を含む、免疫原を安定化させる方法であって、該免疫原が、生弱毒ウイルス、不活化ウイルス、ウイルスサブユニット、ウイルスベクター、生弱毒細菌、死滅細菌、不活化細菌、細菌サブユニット、および病原体からの不活化毒素からなる群より選択される、前記方法。
【請求項４０】
シルクフィブロイン溶液から固体状態の形態を形成する段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
固体状態の形態が、薄膜、繊維、ハイドロゲル、スキャフォールド、マット、粒子、凍結乾燥マトリックス、針、またはそれらの複合体からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014518557.tif 000058
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