(57)【要約】  本発明の主題は、抗腫瘍化合物を含むリポソーム製剤であって、活性化合物を、脂質成分の組成物を形成するリポソームベシクルに封入された状態で、脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部、好ましくは脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部の比率で含むとともに、ビタミン又はその誘導体を含むリポソーム製剤、その製造方法、並びに斯かる製剤を含む組成物である。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍化合物を含むリポソーム製剤であって、活性化合物を、脂質成分の組成物を形成するリポソームベシクルに封入された状態で、脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部、好ましくは脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部の比率で含むとともに、ビタミン又はその誘導体を含むリポソーム製剤。
【請求項２】
活性化合物としてアントラサイクリンを含む、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
ビタミンがアスコルビン酸又はその塩、好ましくはアスコルビン酸アンモニウム、葉酸又はその塩、好ましくは葉酸アンモニウム、又はパントテン酸、好ましくはそのアンモニウム塩である、請求項４に記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
ビタミン誘導体がメトトレキサートである、請求項１〜３の何れか一項に記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
抗腫瘍活性化合物を含むリポソーム製剤を製造する方法であって、
ａ）リン脂質の混合物、好ましくは水素化大豆又は卵レシチン又はジステアリルホスファチジルコリン並びにコレステロールを、好ましくはビタミン又はその誘導体、好ましくはアスコルビン酸又は葉酸又はパントテン酸のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液中、３０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌの量で用いて、水和することにより、多層膜リポソーム（multilamellar liposomes）を調製し；
ｂ）ビタミン塩又はその誘導体の溶液中にリポソームを含む懸濁液を、主要脂質の相転移温度を超える温度で、液体窒素及び温水を用いて凍結及び融解することにより、リポソーム膜の両側において、ビタミン塩又はその誘導体の濃度を平衡化し；
ｃ）リポソームを、好ましくは高圧押出機により適切な細孔径のポリカーボネートフィルターを通じて押し出し、或いは高圧ホモジナイザーでホモジナイズすることにより、リポソームのサイズ及び層数を低減し；
ｄ）リポソームの外部溶液を、好ましくは透析又は分子篩により、中性緩衝剤、好ましくはＰＢＳと交換して、ｐＨ／イオン勾配を形成し；
ｅ）抗腫瘍活性化合物、好ましくはアントラサイクリンを加え；
ｆ）懸濁液を、リポソームを形成する主要リン脂質の相転移温度、好ましくは６０℃を超える温度に加熱する
ことを含む方法。
【請求項６】
段階ａ）において、リポソームを血液循環系中で安定化するべく、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミンを加える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
段階ａ）で使用されるビタミン誘導体が、メトトレキサート又はそのアンモニウム塩である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
医薬的に許容し得る担体及び／又は補助化合物と、治療有効量の抗腫瘍活性化合物とを含む非経口投与用医薬組成物であって、抗腫瘍化合物を、脂質成分の組成物を形成するリポソームベシクルに封入された状態で、脂質成分３〜１２質量部当たり活性化合物１質量部、好ましくは脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部の比率で含むと共に、ビタミン又はその誘導体を含むリポソーム製剤を含む組成物。
【請求項９】
メトトレキサート又はその塩と、アントラサイクリンから選ばれる化合物とを含む、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、抗腫瘍活性化合物を含むリポソーム製剤、当該製剤を製造する方法、及び、医薬として用いられる、当該製剤を含む医薬組成物である。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは単層膜（unilamellar）又は多層膜（multilamellar）で包囲された構造体であって、二重層の両親媒性脂質が微小水滴を包囲し（単層膜リポソーム）、或いは、複数の脂質膜が同心球状に形成されて水層に分散されてなる（多層膜リポソーム）。二重層を形成する両親媒性脂質は、極性の親水性基と、１又は２以上の線状疎水性炭素鎖（＞Ｃ８）とを有する。極性基としては、リン酸や硫酸の誘導体、窒素化合物等が挙げられるが、最も一般に用いられるのはリン脂質、特に天然由来のもの、例えば植物脂質の精製法を用いて得られるホスファチジルコリンや、合成リン脂質、市販のリン脂質製剤、例えばエチレングリコールやコレステロールの誘導体を用いて化学的に修飾されたリン脂質等である。薬剤はその溶解性に応じて、リポソームの水層又は脂質層に存在する。
【０００３】
リポソームの生成には幾つかの方法がある。多層リポソームを製造する旧来の方法は、脂質の有機溶媒溶液から溶媒を蒸発させ、医薬化合物の水溶液を含む脂質膜構造を再水和する方法である（J. Mol. Biol. 13 (1965), 238-252）。他の方法としては、脂質を乳化させて水相と脂質を含む有機相とからなる二相混合物を形成すると同時に、有機溶媒を蒸発させる手法（例えば米国特許第４，５２２，８０３号、第５，０３０，４５３号及び第５，１６９，６３７号明細書）、油中水（water-in-oil）型エマルションの形成後に有機相を蒸発させてゲル化し、次いでこれを混合してオリゴラメラ（oligolamellar）リポソームを形成する方法（米国特許第４，２３５，８７１号明細書）、多回の凍結／融解サイクルによる方法（米国特許第５，００８，０５０号明細書）等が挙げられる。単層膜リポソームは、多層膜リポソームを超音波、押し出し（例えば米国特許第４，９７５，２８２号明細書）、ホモジェナイゼーション、及び脂質のエーテル又はエタノール溶液を水相に注入する方法等が挙げられる（Deamer R., Uster, P. "Liposome prepa比n; Methods and Mechanisms", in: "Liposomes", ed. M.Ostro, Marcel Dekker, New York, 1987）。
【０００４】
多様な治療薬の分野では、活性化合物のベシクルへの封入効率と、リポソームの安定性（インビトロ及びインビボ）とが、重要な技術的課題となる。特に、大豆レシチンや合成リン脂質類似体を主成分とする、水への溶解性が極めて低い旧来のタキソイド類のリポソーム製剤（Bartoli et al., J. Microencapsulation, 7, 1990, 191-197; Riondel et al., In Vivo 6, 1992,23-28）は、凝集し易い上に、不安定であり、活性化合物のリポソームからの「脱落」（leakage）や結晶化を生じる。多くの場合、有効な脂質／薬物比を有する抗腫瘍化合物のリポソーム製剤を製造するには、特別な製法を使用する必要がある。例えば、国際公開第９２／０２２０８号公報や欧州特許出願第５４６９５１号公報に記載のように、負帯電リン脂質の添加、或いは特開平６−２５４３７９号公報に記載のように、ポリヒドロキシアルコール及び四級アンモニウム塩の添加等である。脂質二重層表面の立体安定化を通じて安定性の向上を図った改良型のリポソーム構造は、いわゆる「ステルス」（Stealth）リポソームにより達成される（D. D. Lasic, F. Martin "Stealth Liposomes", CRC Press Boca Raton, 1995）。より耐久性に優れた形態のリポソームの設計を目的とする方法の一つとして、国際公開第９４／２２４２９号に記載のような、親水性ポリエチレングリコールによる被覆が挙げられる。斯かる医薬として、ポリエチレングリコールで被覆したリポソーム封入型ドキソルビシンが、商標名Doxil（登録商標）として発表されている。このDoxil（登録商標）製剤は、ドキソルビシンがステルスリポソーム担体に封入されてなるが、このリポソーム担体は三種の脂質成分からなる。即ち、水素化大豆レシチン、コレステロール、そして、ジステアリルホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコール２０００のメトキシ誘導体とを適切なモル比で組み合わせたカルバメートコンジュゲートである。半減期が長く薬物の漏出が少ないステルスリポソームを得るためには、独自の封入法を用いて、高い担持効率と長期の薬物保持を達成する必要がある。斯かる方法の例としては、電解質勾配（欧州特許出願第３６１８９４号公報）やｐＨ勾配（国際公開第８８／０６４４２号公報）下での担持が挙げられる。国際公開第８８／０６４４２号公報では、脂質層の成分として、旧来の脂質化合物、例えば天然及び合成のホスファチジルコリン等に、場合によりコレステロールを添加して用いるとともに、封入プロセス時にｐＨ勾配を用いる。本公報によれば、封入された生物活性化合物の漏出率が低減されるが、これは脂質膜両側のｐＨ差によるものである。しかし、ｐＨ勾配担持法の対象は、弱酸又は弱塩基である水溶性薬物のみに限定される。トポテカンと脂質とを０．０５：０．２の比で含む、ｐＨ勾配又はイオノフォア担持法を用いたリポソーム製剤は、国際公開第０２／０２０７８号公報に記載されている。この脂質層はスフィンゴミエリン及びコレステロールを含む。国際公開第９９／１５１５３号公報は、タキソール含有リポソーム等を開示するが、当該リポソームは、リポソーム内の活性化合物の濃度が５ｍｇ／ｍｌ未満であると共に、合成レシチンジラウロイルホスファチジルコリンを脂質として含むことを特徴とする。本公報の著者らは、薬物：脂質比が１：１〜１：２０００の範���内であり、好ましくは１：３０であることを記載するが、抗腫瘍化合物を吸入投与することを意図したこれらのリポソーム製剤の安定性については、何ら情報を提供してない。
【０００５】
これまで、安定なリポソーム製剤の取得は、主に特別な製法の使用や、活性化合物分子の修飾、即ち炭化水素鎖、ポリマー鎖、又はペプチド鎖等の付加等により行われてきた。ポーランド特許第１９００７７号及び第１９００７８号各公報には、ドキソルビシン及びミトキサントロンを好適な薬物比で、リポソーム製剤の脂質内に高い効率で封入させた製剤が、脂質層組成物の修飾の結果として得られる旨を開示する。斯かる修飾された脂質層組成物は、旧来の成分である卵レシチン及び水素化卵レシチンに加えて、レゾルシンの水素硫酸アシル誘導体を含む。パクリタキセルの安定なリポソーム製剤は、カルジオリピンを脂質製剤に添加することにより得られる（米国特許第５，４２４，０７３号、第５，６４８，０９０号、第５，９３９，５６７号、及び第６，１４６，６５９号各公報）。米国特許第６，１４６，６５９号公報は、この場合におけるパクリタキセルのリポソームベシクルへの組み込み効率は９０％を超え、活性化合物の脂質担体に対する質量比は約７％である旨を開示する。一般に、パクリタキセルをその高い疎水性を利用してリポソームに組み込んだ場合、その割合は脂質担体に対して１〜１０％（ｗ／ｗ）、多くの場合は２〜８％（ｗ／ｗ）である。この係数は、パクリタキセル分子の修飾、例えば炭化水素鎖の付加等を施しても、僅かしか改善されない（最高で１２〜１４％ｗ／ｗ）（米国特許第５，９１９，８１５、５，９３９，５６７、及び６，１１８，０１１号各公報）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、医薬リポソーム製剤、特に疎水性抗腫瘍化合物含有リポソーム製剤であって、好ましい脂質／活性化合物比を有し、或いは従来よりも少ない脂質担体量で同量の活性化合物を送達することが可能な製剤の設計が、依然として求められている。
【０００７】
達成されていないもう一つの要請として、治療効果の改善及び高安定性を特徴とする組み合わせ治療のための、二つの抗腫瘍化合物を含有するリポソームの送達が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
予測外にも、上述の課題は本発明により解決される。
【０００９】
本発明の第一の主題は、抗腫瘍化合物を含むリポソーム製剤であって、活性化合物を、脂質成分の組成物を形成するリポソームベシクルに封入された状態で、脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部、好ましくは脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部の比率で含むとともに、ビタミン又はその誘導体を含むリポソーム製剤である。好ましくは、本発明に係るリポソーム製剤は、活性化合物としてアントラサイクリンを含むことを特徴とする。好ましくは、本発明に係るリポソーム製剤は、ビタミンがアスコルビン酸又はその塩、好ましくはアスコルビン酸アンモニウム、葉酸又はその塩、好ましくは葉酸アンモニウム又はパントテン酸、好ましくはそのアンモニウム塩であることを特徴とする。同様に好ましくは、本発明に係るリポソーム製剤は、ビタミン誘導体がメトトレキサートであることを特徴とする。
【００１０】
本発明の第二の主題は、抗腫瘍活性化合物を含むリポソーム製剤を製造する方法であって、
ａ）リン脂質の混合物、好ましくは水素化大豆又は卵レシチン又はジステアリルホスファチジルコリン並びにコレステロールを、好ましくはビタミン又はその誘導体、好ましくはアスコルビン酸又は葉酸又はパントテン酸のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液中、３０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌの量で用いて、水和することにより、多層膜リポソーム（multilamellar liposomes）を調製し；
ｂ）ビタミン塩又はその誘導体の溶液中にリポソームを含む懸濁液を、主要脂質の相転移温度を超える温度で、液体窒素及び温水を用いて凍結及び融解することにより、リポソーム膜の両側において、ビタミン塩又はその誘導体の濃度を平衡化し；
ｃ）リポソームを、好ましくは高圧押出機により適切な細孔径のポリカーボネートフィルターを通じて押し出し、或いは高圧ホモジナイザーでホモジナイズすることにより、リポソームのサイズ及び層数を低減し；
ｄ）リポソームの外部溶液を、好ましくは透析又は分子篩により、中性緩衝剤、好ましくはＰＢＳと交換して、ｐＨ／イオン勾配を形成し；
ｅ）抗腫瘍活性化合物、好ましくはアントラサイクリンを加え；
ｆ）懸濁液を、リポソームを形成する主要リン脂質の相転移温度、好ましくは６０℃を超える温度に加熱する
ことを含む方法である。
【００１１】
同様に好ましくは、本発明に係る方法は、段階ａ）において、リポソームを血液循環系中で安定化するべく、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミンを加えることを特徴とする。好ましくは、本発明に係る方法は、段階ａ）で使用されるビタミン誘導体が、メトトレキサート又はそのアンモニウム塩であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の第三の主題は、医薬的に許容し得る担体及び／又は補助化合物と、治療有効量の抗腫瘍活性化合物とを含む非経口投与用医薬組成物であって、抗腫瘍化合物を、脂質成分の組成物を形成するリポソームベシクルに封入された状態で、脂質成分３〜１２質量部当たり活性化合物１質量部、好ましくは脂質成分５質量部当たり活性化合物１質量部の比率で含むと共に、ビタミン又はその誘導体を含むリポソーム製剤を含む組成物である。同様に好ましくは、本発明に係る組成物は、メトトレキサート又はその塩と、アントラサイクリンから選ばれる化合物とを含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明に係るリポソームは、所望の脂質／活性化合物比を有すると共に、本明細書に記載の封入方法において５〜１０分後における、リポソームへの薬物の封入効率が高いことを特徴とする。加えて、本発明に係る方法によれば、治療効果を向上させるために２つの異なる薬物を併用する、いわゆる組み合わせ治療のためのリポソームを調製することができる。即ち、この場合には、一方の薬物を用いて第二の薬物を封入させることにより、結果として二種の薬物を単一のリポソームの構造内に封入することが可能となる。更にこの方法によれば、ビタミン誘導体複合体、例えばメトトレキサート及びアントラサイクリンを、リポソーム内で安定化し、その漏出を低減することができる。メトトレキサートの場合、薬物水溶液の存在ゆえに、静脈内投与後あまりにも早く漏出してしまうという課題があるが、当該薬物の沈殿形は、その安定性が改善されているので好ましい。
【００１４】
本発明の複数の態様を図に示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに、アスコルビン酸のアンモニウム塩を３００ｍＭのイオン勾配で用いてエピルビシンを封入した製剤の動態を示すグラフである。薬物封入の条件は実施例１Ａ〜Ｃに示す。
【図２】図２は、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに、アスコルビン酸のアンモニウム塩を３００ｍＭのイオン勾配で用いてエピルビシンを封入する際の封入効率に対して、薬物：脂質比が与える影響を示す。薬物封入の条件は実施例２Ａに示す。
【図３】図３は、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに、アスコルビン酸のアンモニウム塩を３００ｍＭのイオン勾配で用いてエピルビシンを封入した製剤の、エピルビシンの保持性を示す。薬物を封入する際の条件は実施例３Ａに示す。
【図４】図４は、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに、葉酸、パントテン酸及びメトトレキサートのアンモニウム塩をそれぞれ３００ｍＭのイオン勾配で用いてエピルビシンを封入する際の封入効率を示す。薬物封入の条件は実施例４Ａ〜Ｄに示す。
【実施例】
【００１６】
実施例１
Ａ．アスコルビン酸含有リポソームの生成
１００ｍｌの丸底フラスコに、３５．２８ｍｇの水素化大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、１３．０２ｍｇのコレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び、１１．６７ｍｇのＰＥＧ化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を含むクロロホルム溶液を入れ、有機溶媒を真空蒸発器で蒸発させた。得られた乾燥脂質膜に、濃度３００ｍＭのアスコルビン酸アンモニウム塩溶液（ｐＨ＝４．０）１．５ｍｌを加え、温度６４℃で水和することにより、多層膜リポソームを得た。
【００１７】
このリポソーム懸濁液を、液体窒素及び温度６４℃の水で交互に処理することにより繰り返し凍結融解し、次いで圧力校正器を用いて、細孔径１００ｎｍのポリカーボネートフィルターを、温度６４℃で通過させた。
【００１８】
Ｂ．アスコルビン酸のアンモニウム塩のイオン勾配の生成
Ａで得られたリポソームを、Sephadex G-50 ファインゲルを充填し、ＰＢＳで平衡化したカラム（１×２０ｃｍ）に装荷し、脱塩すると同時に、外部溶液（アスコルビン酸のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液）をリン酸緩衝剤（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に交換した。リポソームを分離した後、ステュワート法を用いて脂質濃度を決定した。
【００１９】
Ｃ．ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームへのエピルビシンの封入
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームの懸濁液（３００ｍＭのアスコルビン酸アンモニウム塩含有）に、濃度６ｍｇ／ｍｌの塩酸エピルビシン溶液（１５０ｍＭＮａＣｌ含有）を、脂質５質量部に対して薬物１質量部の比率となるように加えた。得られた懸濁液を混合し、温度６０℃で６０分間加熱するとともに、所定の時間間隔で懸濁液のサンプルを採収した。インキュベーション後、薬物の封入効率を測定したところ、１０分後の時点で９８％であった。最終脂質濃度が１５ｍｇ／ｍｌとなるように実験条件を設定した。薬物封入の詳細な説明を図１に示す。
【００２０】
実施例２
Ａ．ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに、アスコルビン酸のアンモニウム塩を３００ｍＭのイオン勾配で用いてエピルビシンを封入する際の封入効率に対して、薬物：脂質比が与える影響。
１：５（０．２）から１：１（１．０）まで幾つかの薬物／脂質質量比について薬物封入を実施した他は、実施例１Ａ〜Ｃの記載と同様にリポソームを調製した。薬物封入時間は、何れの例でも６０℃で１０分に設定した。各インキュベーション工程後に、未封入薬物からリポソームを分離し、薬物の封入効率を決定した。得られた結果を図２に示す。
【００２１】
実施例３
Ａ．ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに、アスコルビン酸のアンモニウム塩を３００ｍＭのイオン勾配で用いてエピルビシンを封入した製剤における、４℃でのリポソームの保存時間がエピルビシンの保持に与える影響。
実施例１で得られたリポソームを１０分間インキュベートして薬物を封入し、次いでSephadex G-50 ファインゲルを充填した０．５×７ｃｍのミニカラムを用いて、未封入薬物をリポソームから分離した。分離されたリポソームを採収し、脂質量を決定してから、ＰＢＳ緩衝剤（ｐＨ＝７．４）で希釈し、最終脂質濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。リポソームは４℃で保存した。最終的に得られたリポソーム画分から、所定の間隔を以て５０μｌのリポソームのサンプルを採収し、次いで分離を行うことにより、遊離薬物量を決定した。得られた結果を図３に示す。
【００２２】
実施例４
Ａ．葉酸、パントテン酸、及びメトトレキサートのアンモニウム塩を含むリポソームの生成
アスコルビン酸のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液（ｐＨ＝４．０）の代わりに、葉酸のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液（ｐＨ＝７．８）、又はパントテン酸のアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液（ｐＨ＝７．８）、又はメトトレキサートのアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液を用いた他は、実施例１Ａ、Ｂの記載と同様の手順でリポソームを調製した。
【００２３】
Ｂ．ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに対する、葉酸のアンモニウム塩のイオン勾配を用いたエピルビシンの封入。
A ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームの懸濁液（３００ｍＭの葉酸のアンモニウム塩を含有）に、濃度６ｍｇ／ｍｌの塩酸エピルビシン溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含有）を、、脂質５質量部に対して薬物１質量部の比率となるように加えた。得られた懸濁液を混合し、温度１０℃で６０分間加熱した。インキュベーション後、薬物の封入効率を測定したところ、９９％であった。最終脂質濃度が１５ｍｇ／ｍｌとなるように実験条件を設定した。薬物封入の詳細な説明を図４に示す。
【００２４】
Ｃ．ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに対する、パントテン酸のアンモニウム塩のイオン勾配を用いたエピルビシンの封入。
３００ｍＭの葉酸のアンモニウム塩（ｐＨ＝７．８）の代わりに、３００ｍＭのパントテン酸のアンモニウム塩をリポソームに含有させた他は、実施例４Ｂと同様にリポソームへの薬物の封入を実施した。薬物封入効率は９７％であった。
【００２５】
Ｄ．ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を５．５：４：０．５モル／モルの比率で有するリポソームに対する、メトトレキサートのアンモニウム塩の３００ｍＭ溶液（ｐＨ＝７．８）のイオン勾配を用いたエピルビシンの封入。
３００ｍＭの葉酸のアンモニウム塩（ｐＨ＝７．８）の代わりに、３００ｍＭのメトトレキサートのアンモニウム塩をリポソームに含有させた他は、実施例４Ｂと同様にリポソームへの薬物の封入を実施した。薬物封入効率は９７％であった。
【００２６】
上記Ｂ〜Ｄで得られた、葉酸、パントテン酸、及びメトトレキサートの３００ｍＭ塩の封入結果を、図４に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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