(57)【要約】本発明は、副甲状腺ホルモンおよび／または副甲状腺ホルモン関連タンパク質類似体、その組成物およびそのための方法を提供する。本発明は、望ましい特性を有する新規のｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、１つまたは複数の非天然アミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、１つまたは複数のノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２と≧８０％同一であるアミノ酸配列を有する、１〜８４アミノ酸の長さの副甲状腺ホルモンペプチドであって、残基Ｘ１、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１６、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ５２、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ５９、Ｘ６０、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ６３、Ｘ６４、Ｘ７０、Ｘ７４、Ｘ７６、Ｘ７９、Ｘ８１またはＸ８３に対応する１つまたは複数の位置に非天然アミノ酸を含む、副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項２】
少なくとも１つのノルロイシン（Ｎｌｅ）および／またはメトキシニン（Ｍｏｘ）残基を含む、請求項１に記載の副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項３】
残基８、残基１８およびそれらの組み合わせに対応する位置にノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む、請求項１に記載の副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項４】
配列番号３、配列番号４および配列番号５の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項５】
以下のうちの少なくとも１つが当てはまる、請求項３に記載の副甲状腺ホルモンペプチド：
Ｘ１が、Ｓ、Ａ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ７がＦ、Ｌ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ１６がＮ、Ｓ、Ａ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ１８がＭ、Ｌ、Ｖ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ２１がＶ、Ｍ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、および
Ｘ２２がＥ、Ｑ、ＮｌｅまたはＭｏｘである。
【請求項６】
以下のうちの少なくとも１つが当てはまる、請求項４に記載の副甲状腺ホルモンペプチド：
Ｘ３６がＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ３９がＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ４５がＤ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ４８がＳ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ５６がＤ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ５８がＶ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ６０がＶ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ６１がＥ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ６２がＥ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ７０がＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、
Ｘ７４がＤ、ＮｌｅまたはＭｏｘである、および
Ｘ８１がＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘである。
【請求項７】
少なくとも１つのグリカン基でグリコシル化されている、請求項１に記載の副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項８】
セリン残基またはトレオニン残基においてグリコシル化されている、請求項７に記載の副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化８６】
2014508765.tif 000087
から選択される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化８７】
2014508765.tif 000088
である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化８８】
2014508765.tif 000089
である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１２】
アスパラギン残基またはグルタミン残基においてグリコシル化されている、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化８９】
2014508765.tif 000090
から選択される、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化９０】
2014508765.tif 000091
である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化９１】
2014508765.tif 000092
である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化９２】
2014508765.tif 000093
である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのグリカン基が、
【化９３】
2014508765.tif 000094
である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１８】
配列番号１５と≧８０％同一であるアミノ酸配列を有する、１〜３７アミノ酸の長さの副甲状腺ホルモンペプチドであって、残基８、残基１８およびそれらの組み合わせに対応する位置にノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む、副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項１９】
配列番号１４と≧８０％同一である要素を含むアミノ酸配列を有する副甲状腺ホルモンペプチドであって、残基８、残基１８およびそれらの組み合わせに対応する位置にノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む、副甲状腺ホルモンペプチド。
【請求項２０】
配列番号８と≧８０％同一であるアミノ酸配列を有する、１〜１４１アミノ酸の長さの副甲状腺ホルモン関連ペプチド。
【請求項２１】
請求項２に記載の副甲状腺ホルモンペプチド、請求項７に記載のグリコシル化された副甲状腺ホルモン断片、または請求項１８に記載の副甲状腺ホルモン関連タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２２】
生物学的に活性なホルモンまたはグリコペプチドを調製する方法であって、システインまたはメチオニン以外のアミノ酸残基における少なくとも１回のネイティブケミカルライゲーションによるカップリングを含む方法。
【請求項２３】
前記ネイティブケミカルライゲーションによるカップリングが、アラニン、バリン、トレオニン、ロイシンおよびプロリンから選択される残基において起こる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的に活性なホルモンが、副甲状腺ホルモン（１−３４）、副甲状腺ホルモン（１−３７）、副甲状腺ホルモン（１−３９）、副甲状腺ホルモン（１−８４）、Ｎ−グリコシル化副甲状腺ホルモン、Ｏ−グリコシル化副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（１−１３９）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（１−１４１）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（１−１７３）から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的に活性なホルモンが副甲状腺ホルモン（１−３４）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）断片ＩとＩＩのネイティブケミカルライゲーションによって断片Ｖを調製するステップ：
【化９４】
2014508765.tif 000095
（ｉｉ）断片ＩＩＩとＩＶのネイティブケミカルライゲーションによって断片ＶＩを調製するステップ：
【化９５】
2014508765.tif 000096
（ｉｉｉ）断片ＶＩを脱保護して断片ＶＩＩを生成するステップ：
【化９６】
2014508765.tif 000097
（ｉｖ）断片ＶとＶＩＩをネイティブケミカルライゲーションによってカップリングして断片ＶＩＩＩを生成するステップ：
【化９７】
2014508765.tif 000098
および
（ｖ）断片ＶＩＩＩを還元してｈＰＴＨペプチドを生成するステップ：
【化９８】
2014508765.tif 000099
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的に活性なホルモンが副甲状腺ホルモン関連タンパク質（１−１４１）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
断片ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩおよびＸＸＸＩＩＩのネイティブケミカルライゲーションによるカップリングを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩ、ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶ、ＸＸＸＶＩまたはＸＸＸＶＩＩからなる群から選択されるネイティブケミカルライゲーション断片。
【請求項３０】
副甲状腺機能低下症に関連する疾患、障害および／または症状を処置する方法であって、治療有効量のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を投与するステップを含む方法。
【請求項３１】
前記疾患、障害および／または症状が、骨粗鬆症、低カルシウム血症および低カルシウム尿症から選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年３月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４８，０６４号の優先権を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援の言及
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号Ｃａ２８８２４−３３、およびＮＩＤＤＫ−１１７９４により一部は支援された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
ＰＣＴ規則５．２に従って、テキストファイル形式の配列表（表題「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１２年２月２８日作成、サイズ１７キロバイト）が本明細書と共に提出され、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）は、８４アミノ酸を含有するペプチドとして副甲状腺から分泌される生物学的メッセンジャーである。ｈＰＴＨは、細胞外液中のカルシウムおよび亜リン酸の（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）濃度の最も重要な内分泌調節因子である。細胞外液中のカルシウムイオン濃度（Ｃａ２＋）が正常値を下回った場合、ｈＰＴＨは、骨吸収を刺激すること、腎臓および腸におけるカルシウムの再吸収を増強すること、ならびに／または尿中へのカルシウム損失を抑制することにより、そのレベルを正常範囲内に回復させることができる。カルシウム濃度が上昇するとともに、血液中のリン酸イオンの濃度が低下する。血中カルシウムレベルが高い場合であっても低レベルのｈＰＴＨが分泌される。
【０００５】
副甲状腺の機能が低下すると副甲状腺機能低下症に至り、また、副甲状腺ホルモンのレベルが低下する。その結果生じる低カルシウム血症により、手指および足指の刺痛、筋肉の痙直および攣縮、痙攣、疼痛および乾燥皮膚などの症状が生じる。副甲状腺機能低下症は骨密度の増加をもたらすが、副甲状腺ホルモン活性の不在下での不完全な骨リモデリングに起因すると考えられる非常に虚弱な状態も伴う。さらに、副甲状腺ホルモンの慢性的分泌または連続的注入により、骨の脱灰、および骨量損失がもたらされ、ある特定の状況では、組換え副甲状腺ホルモンで処置することにより、骨量および骨強度の増加を実際に刺激することができる。この表面上は逆説的な作用は、そのホルモンをパルスで（例えば、毎日１回の注射によって）投与した際に起こり、このような処置は骨粗鬆症などの疾患に対する有効な治療であるようである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、望ましい特性を有する新規のｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、１つまたは複数の非天然アミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、１つまたは複数のノルロイシン残基および／またはメトキシニン（ｍｅｔｈｏｘｉｎｉｎｅ）残基を含む。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、実質的に全長のｈＰＴＨ内に１つまたは複数のノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、配列番号２の残基８および／または残基１８に対応する位置に１つまたは複数のノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体はグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体はＯ−グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体はＮ−グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２の残基１および／または残基３３に対応する位置においてグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、糖タンパク質の化学合成において一般に使用される炭水化物からなる群から選択される１つまたは複数のグリカンでグリコシル化されている。
【０００９】
とりわけ、本発明は、ｈＰＴＨ治療の安定性および半減期が増大することにより、より許容度の高い投与およびよりすぐれた患者のコンプライアンスが容易になるという認識を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、より安定なｈＰＴＨ治療薬を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨ類似体は、配列番号１のｈＰＴＨよりも安定性が高い（例えば、ヒト血清でのｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド安定性アッセイにおいて測定した場合）。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数の提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体および／またはそれらを含有する組成物は、医療において、例えば、副甲状腺ホルモンのレベルが不十分であることに関連する疾患、障害、または状態を処置する方法において有用である。とりわけ、本発明は、提供される組成物またはｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む処置方法を提供する。
【００１２】
本発明は、システイン残基および／またはメチオニン残基に依拠しないネイティブケミカルライゲーション技術も包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、有用なシステイン残基および／またはメチオニン残基を含まないペプチドまたはペプチド類似体を生成するためのネイティブケミカルライゲーション技術を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、有用なシステイン残基および／またはメチオニン残基を含まない１つまたは複数のホルモンを生成するためのネイティブケミカルライゲーション技術を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体を生成するためのネイティブケミカルライゲーション技術を提供する。
【００１３】
本明細書に記載の通り提供されるネイティブケミカルライゲーション技術としては、例えば、ケミカルライゲーションによって作用物質（ａｇｅｎｔ）を調製する方法、ケミカルライゲーション反応に関与する試薬、および／またはケミカルライゲーションによる合成において開発および／または利用される中間体が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ｈＰＴＨ（１−８４）のレトロ合成的分析を示す図である。
【図２】図２は、ヒト副甲状腺ホルモンの化学合成を示す図である：（ａ）Ｈ−Ｔｒｐ−ＳＰｈ、ＥＤＣＩ、ＨＯＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＳＯ、３時間；（ｂ）ＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）、４５分間；（ｃ）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＳＯ、１時間；（ｄ）ＴＦＥ：ＡｃＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（８：１：１）、２時間；（ｅ）Ｈ−Ｇｌｙ−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ、ＥＤＣＩ、ＨＯＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＳＯ、１時間；（ｆ）Ｈ−Ｌｅｕ−ＳＰｈ、ＥＤＣＩ、ＨＯＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＳＯ、２時間；（ｇ）Ｂｏｃ−Ｖａｌ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＳＯ、１時間；（ｈ）６ＭのＧｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５、９時間；（ｉ）ＭｅＯＮＨ２・ＨＣｌ、ｐＨ４、２．５時間；（ｊ）６ＭのＧｎ・ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭのＭＰＡＡ、および２０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．９；（ｋ）ＶＡ−０４４、ｔＢｕ−ＳＨ、ＴＣＥＰ、Ｈ２Ｏ、ＭｅＣＮ、３７℃、２時間。
【図３】図３は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３４）の化学合成を示す図である。
【図４】図４は、Ｏ−グリコシル化されている［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３４）の化学合成を示す図である。
【図５】図５は、Ｎ−グリコシル化されている［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３４）の化学合成を示す図である。
【図６】図６は、Ｎ−グリコシル化されている［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３４）の化学合成を示す図である。
【図７】図７は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）の化学合成を示す図である。
【図８】図８は、Ｏ−グリコシル化されている［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）の化学合成を示す図である。
【図９】図９は、Ｎ−グリコシル化されている［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）の化学合成を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｎ−グリコシル化されている［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）の化学合成を示す図である。
【図１１】図１１は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）のレトロ合成的分析を示す図である。
【図１２】図１２は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）の化学合成を示す図である：（ａ）ＨＣｌ・Ｈ２Ｎ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｏ−（２−ＳＳＥｔ）−Ｐｈ、ＨＯＯＢｔ、ＥＤＣ、ＣＨＣｌ３、ＴＦＥ、室温（ｒｔ）；（ｂ）カクテルＢ（トリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］１０ｍＬ、フェノール２００ｍｇ、Ｈ２Ｏ、０．６６ｍＬおよびトリイソプロピルシラン［ＴＩＳ］０．４６ｍＬ）、室温；（ｃ）Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｅｔ、ＨＯＯＢｔ、ＥＤＣ、ＣＨＣｌ３、ＴＦＥ、室温；（ｄ）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、室温；（ｅ）ＨＯＡｃ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１：８）、室温；（ｆ）ＨＣｌ・Ｈ２Ｎ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−（２−ＳＳＥｔ）−Ｐｈ、ＨＯＯＢｔ、ＥＤＣ、ＣＨＣｌ３、ＴＦＥ、室温；（ｇ）ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２緩衝液、室温；（ｈ）ＴＣＥＰ、ＭＰＡＡ、ｐＨ７．２緩衝液、室温；（ｉ）ＴＣＥＰ、ｔ−ＢｕＳＨ、ＶＡ−０４４、３７℃。
【図１３】図１３は、ｈＰＴＨの円偏光二色性スペクトルを示すグラフである。ｈＰＴＨの非正規化円偏光二色性スペクトルである。２０８ｎｍおよび２２２ｎｍにある最下点（ｎａｄｉｒ）はα−ヘリックス構造の特性である。要点：（ａ）濃度１４μＭにおける合成ＰＴＨと組換えＰＴＨのＣＤ比較である；（ｂ）濃度１４μＭおよび７μＭにおける合成ＰＴＨのＣＤスペクトルである。
【図１４】図１４は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図１５】図１５は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＩＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＩＶのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図１８】図１８は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＶのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図１９】図１９は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＶＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２０】図２０は、ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＶＩＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２１】図２１は、ｈＰＴＨ（１−８４）のＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２２】図２２は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＩＸのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２３】図２３は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＸのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２４】図２４は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＸＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２５】図２５は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）断片ＸＩＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２６】図２６は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）断片ＸＩＶのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２７】図２７は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）断片ＸＶのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２８】図２８は、［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）のＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２９】図２９は、ｈＰＴＨ（１−３９）の三次元表示を示す図である。
【図３０】図３０は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３１】図３１は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３２】図３２は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３３】図３３は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＩＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３４】図３４は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＩＶのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３５】図３５は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＶのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３６】図３６は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＶＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３７】図３７は、ｈＰＴＨｒＰ（１−１４１）断片ＸＸＸＶＩＩのＨＰＬＣスペクトルおよびＬＣ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３８】図３８は、７日間貯蔵した後のｈＰＴＨ（１−８４）の安定性を示すグラフである。
【図３９】図３９は、７日間貯蔵した後の［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）の安定性を示すグラフである。
【図４０】図４０は、７日間貯蔵した後のｈＰＴＨ（１−３７）の安定性を示すグラフである。
【図４１】図４１は、７日間貯蔵した後の［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）の安定性を示すグラフである。
【図４２】図４２は、ｈＰＴＨ類似体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。ＰＴＨ類似体の結合性を、材料および方法に記載の通りヒトＰＴＨＲ１をＲ０コンフォメーション（Ａ）またはＲＧコンフォメーション（Ｂ）のいずれかで発現するようにトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から調製した膜を使用して実施した競合アッセイにおいて評価した。ｈＰＴＨＲ１を発現するように一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞においてｃＡＭＰアッセイを実施した；リガンド刺激した後に細胞内ｃＡＭＰを放射免疫測定法によって測定した（Ｃ）ｃＡＭＰ−応答エレメントを含有するプロモーターによる転写制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポータープラスミド（ＣＲＥ−Ｌｕｃ）を共トランスフェクトした（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞においてもｃＡＭＰシグナル伝達を評価し、ＰＴＨ類似体の濃度の変動に応答した発光を測定した（Ｄ）。データは、それぞれ２連で実施した３回の実験の平均値（±ｓ．ｅ．ｍ．）である。表１にアッセイパラメータが報告されている。
【図４３】図４３は、ｈＰＴＨ類似体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す図である。マウスにおける血中Ｃａ＋＋レベルに対するＰＴＨ類似体の効果。９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（全部で３２〜３５匹）に、ビヒクルまたはＰＴＨ類似体（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を皮下注射し、その後、示されている時間に尾静脈血を採取し（ｔ＝０は、注射する直前に採取した血液を指し、ｔ＝１、２、４または６は、注射後の時間を指す）、血中Ｃａ＋＋イオンの濃度について評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
生物学的に活性な。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」という句は、生物系、特に生物体内で活性を有する任意の作用物質の特性を指す。例えば、生物体に投与したときに、その生物体に対する生物学的効果を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドに生物学的に活性である特定の実施形態では、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有する該タンパク質またはポリペプチドの一部は、一般には、「生物学的に活性な」部分と称される。
【００１６】
キャリア。「キャリア」という用語は、活性作用物質（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、本発明のペプチドおよび／または類似体）を含有する組成物に、該作用物質の安定性および／または活性（例えば、該作用物質の生物活性）に有意に干渉することなく組み入れることができる任意の化学的実体を指す。ある特定の実施形態では、「キャリア」という用語は、薬学的に許容されるキャリアを指す。本明細書における例示的なキャリアは水である。
【００１７】
組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）。本明細書で使用される場合、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）」という用語およびそれに関連する用語は、被験体が２種以上の本発明による治療剤に同時に曝露されることを指す。例えば、本発明の化合物は、別の治療剤と一緒に、別々の単位剤形で、または単一の単位剤形にまとめて、同時にまたは逐次的に投与することができる。したがって、本発明は、とりわけ、少なくとも本発明のペプチド、追加の治療剤、および薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、またはビヒクル（薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、またはビヒクルは、一般には、ペプチドおよび追加の治療剤の一方または両方に付随する）を投与するステップを包含する投薬レジメンを提供する。
【００１８】
に対応する。本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、多くの場合、副甲状腺ホルモンペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を示すために使用される。当業者には、本明細書では、わかりやすくするために標準的な番号付けシステム（野生型ｈＰＴＨ−例えば、配列番号１に基づいて）が利用されており、したがって、例えば、１９位の残基「に対応する」アミノ酸は実際に特定のアミノ酸鎖の１９番目のアミノ酸である必要はなく、野生型ｈＰＴＨの１９位に見いだされる残基に対応することが理解されよう；当業者には、対応するアミノ酸をどのように同定するかが容易に理解される。
【００１９】
製剤。「製剤」という用語は、少なくとも１つの活性作用物質（例えば、本発明のペプチドおよび／または類似体）を、患者に投与するための１種または複数種のキャリア、賦形剤または他の薬学的添加物と一緒に含む組成物を指す。一般に、特定のキャリア、賦形剤および／または他の薬学的添加物は、活性作用物質（複数可）の所望の安定性、放出、分布および／または活性を実現するための当技術分野における知見、ならびに、どれが特定の投与経路に適するかに従って選択される。
【００２０】
単離された。「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）それが最初に生じた（自然状態であろうが実験的環境であろうが）際に付随していた構成成分の少なくとも一部から分離されたか、または（ｉｉ）人間の手によって生成されたかのいずれかの作用物質または実体を指す。単離された作用物質または実体は、それらが最初に付随していた他の構成成分の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多くから分離することができる。いくつかの実施形態では、単離された作用物質は９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超純粋である。
【００２１】
非天然アミノ酸。「非天然アミノ酸」という句は、アミノ酸の化学構造（すなわち、
【００２２】
【化１】
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を有し、したがって少なくとも２つのペプチド結合に関与することができるが、天然でアミノ酸に見いだされるものとは異なるＲ基を有する実体を指す。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、水素ではない第２のＲ基を有してもよく、かつ／または、アミノ部分および／またはカルボン酸部分に１つまたは複数の他の置換を有してよい。非天然アミノ酸の非限定的な例としては、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メトキシニン（Ｍｏｘ）、ランチオニン、デヒドロアラニン、オルニチン、シトルリン、または２−アミノ−イソ酪酸が挙げられる。
【００２３】
副甲状腺ホルモン類似体：本明細書に記載の通り、副甲状腺ホルモン類似体は、そのアミノ酸配列が、野生型ヒト副甲状腺ホルモンと比較して少なくとも１つの点変異を含む副甲状腺ホルモンペプチドである。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモン類似体は、本明細書に記載の非天然アミノ酸残基を少なくとも１つ含む。
【００２４】
副甲状腺ホルモンペプチド：一般に、本明細書で使用される場合、「副甲状腺ホルモンペプチド」という用語は、少なくとも約３〜８５アミノ酸長であり、野生型副甲状腺ホルモンの対応する部分に対して少なくとも８０％の全体的な配列同一性を示すポリペプチドまたはその部分を指す。いくつかの実施形態では、全体的な配列同一性は、野生型副甲状腺ホルモンに対して≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％である。本明細書の多くの実施形態では、野生型副甲状腺ホルモンは、例えば配列番号１に記載の野生型ヒト副甲状腺ホルモンである。いくつかの実施形態では、この全体的な配列同一性に加えて、提供される副甲状腺ホルモンペプチドは、例えば本明細書に記載の特定の配列要素を１つまたは複数含む。いくつかの実施形態では、そのような特定の配列要素は、一般的に副甲状腺ホルモンにまたは副甲状腺ホルモンの特定のサブセットに特徴的であり、かつ／または保存されている要素である。副甲状腺ホルモンペプチドの特定の実施形態は、本明細書において、下にさらに詳細に記載されている。
【００２５】
非経口的。「非経口的」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への注射または注入技法を包含する。組成物は、経口的に、腹腔内にまたは静脈内に投与されることが好ましい。本発明の組成物の滅菌注射用形態は、水性または油性の懸濁剤であり得る。これらの懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技法に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液剤または懸濁剤、例えば、１，３−ブタンジオール中の液剤などであってよい。使用することができる許容できるビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液および等張食塩溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油が溶媒または懸濁媒として慣習的に使用される。
【００２６】
患者。「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、製剤または製剤を含む組成物が投与される哺乳動物を意味し、いくつかの実施形態では、ヒトを含む。
【００２７】
薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、またはビヒクル。「薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、それらを用いて製剤化される上記化合物の薬理活性を破壊しない無毒性のキャリア、アジュバント、またはビヒクルを指す。本発明の組成物に使用することができる、薬学的に許容されるキャリア、アジュバントまたはビヒクルとしては、これらだけに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和型植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【００２８】
ポリペプチド。「ポリペプチド」とは、一般的に述べると、ペプチド結合によって互いに結合した一続きの少なくとも２つのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも３〜５アミノ酸を含んでよく、そのそれぞれが少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合している。ポリペプチドは、ときには、非天然ではあるがそれでもポリペプチド鎖内に組み込むことができる「非天然」アミノ酸または他の実体を含むことが当業者には理解されよう。
【００２９】
純粋な。本明細書で使用される場合、作用物質または実体は、他の構成成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。例えば、約９０％超の特定の作用物質または実体を含有する調製物は、一般には純粋な調製物であるとみなされる。いくつかの実施形態では、作用物質または実体は少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。
【００３０】
治療剤。本明細書で使用される場合、「治療剤」という句は、生物体に投与したときに所望の生物学的効果または薬理学的効果を引き出す任意の作用物質を指す。
【００３１】
治療有効量および有効量。本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、作用物質の「治療有効量」および「有効量」という用語は、疾患、障害、または状態の処置、予防および／または管理、例えば、処置される疾患、障害または状態に関連する１つまたは複数の症状の発症を遅延させることまたは最小限にする（例えば、発生率および／または重大さ（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を低下させる）ことにおいて治療効果がもたらされるのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、組成物は、治療レジメンの状況内で単回投与（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）として施行したときに有効である量を含有する場合に、「治療有効量」の作用物質を含有するとされ得る。いくつかの実施形態では、治療有効量は、投薬レジメンの一部として投与したときに、統計学的に、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状または副作用の発症を遅延させるまたは最小限にする（発生率および／または重大さを低下させる）可能性がある量である。いくつかの実施形態では、「治療有効量」は、組成物と組み合わせて投与される別の作用物質の治療効果を増強する量である。いくつかの実施形態では、ヒトに投与するための治療有効量は、当技術分野で公知の通り、参照量（例えば、マウスモデルなどの動物モデルにおける治療有効量）に対応し、それは動物モデルの体表面積と比較してヒトの体表面積に対して調整される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら、「Ｄｏｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ」、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２巻：６５９〜６６１頁（２００７年）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、例えば、本明細書に記載の通り、マウスモデルにおいて治療的に有効な量である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効量は、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その参照治療有効��は、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。ｈＰＴＨは、現在、１日当たり２０マイクログラム（ｍｃｇ）の用量で投与されている。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドおよび／または類似体の治療有効量は、１日当たり０．１〜５０ｍｃｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドおよび／または類似体の治療有効量は、１日当たり１０〜１００ｍｃｇの範囲内である。
【００３２】
処置するまたは処置すること。「処置する」または「処置すること」という用語は、本明細書で使用される場合、障害、疾患または状態、あるいは障害、疾患または状態の１つ以上の症状もしくは徴候を部分的にまたは完全に緩和すること、阻害すること、その発症を遅らせること、その発生率を低下させること、その予防法をもたらすこと、それを改善すること、および／または軽減することを指す。
【００３３】
単位用量。「単位用量」という表現は、本明細書で使用される場合、処置される被験体に適した（例えば、単回投与に適した）製剤の物理的に別個の単位を指し、各単位が、治療レジメンに従って投与したときに所望の治療効果がもたらされるように選択された所定の分量の活性作用物質を、必要に応じて、所定量で供給することができる薬学的に許容されるキャリアと一緒に含有する（所望の効果または最適な効果を実現するためには複数回投与が必要になる場合があることが理解されている）。単位用量は、例えば、所定の分量の１つまたは複数の治療剤を含有する液体（例えば、許容できるキャリア）、固形の１つまたは複数の治療剤の所定量、所定量の１つまたは複数の治療剤を含有する持続的放出製剤または薬物送達デバイスなどの体積であってよい。単位用量は、治療剤（複数可）に加えて、種々の構成成分を含有してよいことが理解されよう。例えば、許容できるキャリア（例えば、薬学的に許容されるキャリア）、希釈剤、安定剤、バッファー、保存剤などを下記の通り含めることができる。しかし、本発明の製剤の毎日の総使用量は、主治医により、良好な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されよう。任意の特定の被験体または生物体に対する特定の有効用量レベルは、処置されている障害および障害の重症度；使用される特定の活性化合物の活性；使用される特定の組成物；被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；使用される特定の活性化合物の投与時間、および排出速度；処置の持続時間；使用される特定の化合物（複数可）と組み合わせて、または同時に用いられる薬物および／または追加の治療、ならびに医学の分野で周知の同様の因子を含めた種々の因子に左右され得る。
【００３４】
有用なシステイン残基またはメチオニン残基。本明細書で使用される場合、「有用な」または「有用なシステイン残基および／またはメチオニン残基」という用語は、標的のペプチドまたはタンパク質を合成することが可能になる位置にある残基を指す。「有用な」システイン残基および／またはメチオニン残基により、中程度のサイズの断片（＞１５アミノ酸長または＜５０アミノ酸長）を合成することが可能になる。「有用な」システイン残基および／またはメチオニン残基は、好ましくないアミノ酸、例えば、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）およびプロリン（Ｐｒｏ）のＮ末端側に位置しない残基である。そのような「有用な」システイン残基および／またはメチオニン残基は当業者にはすぐに理解される。
【００３５】
野生型。当技術分野で理解されている通り、「野生型」という句は、一般に、天然に見いだされるとおりのタンパク質または核酸の通常の形態を指す。
【００３６】
特定の実施形態の詳細な説明
副甲状腺ホルモンペプチド
ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）は、８４アミノ酸を含有するペプチドとして副甲状腺から分泌される生物学的メッセンジャーである（Ｐｏｔｔｓ  ＪＴ．  ２００５年「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ｐａｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔ．」Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １８７巻：３１１〜２５頁；Ｐｏｔｔｓ  ＪＴ、Ｇａｒｄｅｌｌａ  ＴＪ．  ２００７年「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，  ｐａｒａｄｏｘ，  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｖｅｒ  ｆｉｖｅ  ｄｅｃａｄｅｓ．」Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １１１７巻：１９６〜２０８頁）。ｈＰＴＨは、その受容体に結合することによって血液中のカルシウム（Ｃａ２＋）の濃度を増強することができる。（Ｔａｌｍａｇｅ  ＲＶ、Ｍｏｂｌｅｙ  ＨＴ．  ２００８年。「Ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ．」Ｇｅｎ．  Ｃｏｍｐ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５６巻：１〜８頁）。その重要な生理的役割に起因して、現在、断片ｈＰＴＨ（１−３４）が、骨折の危険性が高い男性および閉経後の女性における副甲状腺機能低下症および骨粗鬆症を処置するために、皮下注射によって与えられている。（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ＬＪ、Ｓｃａｌｉｓｉ  Ｒ、Ｂａｒｂａｇａｌｌｏ  Ｍ．  ２０１０年。「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．」Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍｅｄ．  ８１巻、増刊１：５５〜６５頁；Ｅｌｌｅｇａａｒｄ  Ｍ、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＮＲ、Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｐ．  ２０１０年。「Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｈｅａｌｉｎｇ．」Ｃａｌｃｉｆ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．  ８７巻：１〜１３頁；Ｆｒａｓｅｒ  ＷＤ．  ２００９年。「Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ．」Ｌａｎｃｅｔ  ３７４巻：１４５〜５８頁）。
【００３７】
大半のホルモン薬物と同様に、組換えｈＰＴＨ治療薬はヒトの体内での半減期が非常に短く、少なくとも１日１回摂取する必要がある。（Ｂｉｅｇｌｍａｙｅｒ  Ｃ、Ｐｒａｇｅｒ  Ｇ、Ｎｉｅｄｅｒｌｅ  Ｂ．  ２００２年。「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｒｅｅ  ｒａｐｉｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｙ．」Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４８巻：１７３１〜１８頁；Ａｂｒａｈａｍ  ＡＫ、Ｍａｇｅｒ  ＤＥ、Ｇａｏ  Ｘ、Ｌｉ  Ｍ、Ｈｅａｌｙ  ＤＲ、Ｍａｕｒｅｒ  ＴＳ．  ２００９年。「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｂａｓｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．」Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ３３０巻：１６９〜７８頁）。また別の不都合として、連続して毎日皮下注射する必要性があり、これによりこのホルモンの使用が限定される。さらに、すでに確立されかつ重篤な骨粗鬆症を有する患者には特に、これによって不快感が引き起こされる可能性があり、長期合併症に至る恐れがある。したがって、より安定な形態のｈＰＴＨを生成することが望ましい。（Ｐｏｔｔｓ  ＪＴ、Ｊｒ．、Ｇａｒｄｅｌｌａ  ＴＪ、Ｊｕｐｐｎｅｒ  Ｈ、Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＭ．  １９９７年。「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎａｌｏｇｓ．」Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５４巻、増刊：Ｓ１５〜２１頁；Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｓ、Ｉｍｈｏｆ  Ｄ．  ２００４年。「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．」Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １１巻：２８２３〜４４頁）。したがって、より安定かつ効果的なｈＰＴＨの類似体が必要である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨ治療および／またはｈＰＴＨｒＰ治療の安定性および半減期が増大することにより、より許容度の高い投与およびよりすぐれた患者のコンプライアンスが容易になるという認識を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、安定なｈＰＴＨ治療薬を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨ類似体は、配列番号２のｈＰＴＨよりも安定性が高い（例えば、ヒト血清でのｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド安定性アッセイにおいて測定した場合）。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）ペプチドおよび／または類似体を提供する。
【００４０】
全長の野生型ｈＰＴＨ配列は配列番号１で示される。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と、全体的に≧８０％、≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号６または配列番号７と、全体的に≧８０％、≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１４または配列番号１５と、全体的に≧８０％、≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４３】
ある特定の実施形態では、本発明は、３〜８４アミノ酸の長さの副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体を提供する。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、少なくとも最小長であり、最大長以下であるアミノ酸配列を有し、ここで、上記最小長とは、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７またはそれより長いアミノ酸であり、上記最大長とは、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１または７０以下のアミノ酸の長さである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、８４アミノ酸の長さである。
【００４５】
ある特定の実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、３４アミノ酸の長さである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、３７アミノ酸の長さである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、３９アミノ酸の長さである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、ノルロイシン、メトキシニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２の残基８および／または残基１８に対応する位置に非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２の残基８および／または残基１８に対応する位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２の残基８に対応する位置に非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２の残基１８に対応する位置に非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２の残基８および残基１８に対応する位置に２つの非天然アミノ酸を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号２の残基Ｘ１、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１６、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２６、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ５２、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ５９、Ｘ６０、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ６３、Ｘ６４、Ｘ７０、Ｘ７４、Ｘ７６、Ｘ７９、Ｘ８１またはＸ８３に対応する１つまたは複数の位置に非天然アミノ酸を含む。
【００５０】
配列番号３、配列番号４および配列番号５は、種々の種における野生型副甲状腺ホルモンペプチドに見いだされる保存された配列要素を示す。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号３、配列番号４および配列番号５の少なくとも１つを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号６と≧７９％、≧８２％、≧８５％、≧８８％、≧９１％、≧９４％または≧９７％同一の要素を含むアミノ酸配列を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号７と≧７９％、≧８２％、≧８５％、≧８８％、≧９１％、≧９４％または≧９７％同一の要素を含むアミノ酸配列を有する。
【００５３】
グリコシル化された副甲状腺ホルモンペプチド。グリコシル化は、ペプチドおよびタンパク質の特性に影響を及ぼすことが公知の一般的な翻訳後修飾である。特に、グリコシル化  は、ペプチドおよびタンパク質の折りたたみ、安定性および機能に影響を及ぼし得る。しかし、ペプチド配列を生物系において組換えによって発現させることはできるが、高い特異性を有する、生合成によるグリコペプチドを産生させることは依然として難しい。より詳細には、生物系におけるグリコシル化により、ａ）均一でなく、ｂ）多様な組成がもたらされ、したがって、均一な調製物を得るために特定の精製ステップが必要である。対照的に、本発明のペプチドおよび／または類似体を化学合成することにより、特異的または特定のグリカンをペプチド配列内に正確に組み込むことが可能になる。
【００５４】
ペプチドは、当業者に公知のいくつかの方法のうちの任意の１つによってグリコシル化することができる。より詳細には、アミノ酸を、ペプチドに組み入れる前にグリコシル化する。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのグリカン基でグリコシル化された副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのグリカン基は、
【００５６】
【化２】
2014508765.tif 000003
【００５７】
【化３】
2014508765.tif 000004
から選択される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体はＯ−グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基においてグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、
【００５９】
【化４】
2014508765.tif 000005
から選択されるグリカンでＯ−グリコシル化されている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体はＳ１においてグリコシル化されている。
【００６１】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体はＮ−グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、１つ以上のアスパラギン残基またはグルタミン残基においてグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、
【００６２】
【化５】
2014508765.tif 000006
から選択されるグリカンでＮ−グリコシル化されている。
【００６３】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体はＮ３３においてグリコシル化されている。
【００６４】
特定のＰＴＨペプチドおよび／または類似体
本開示を読んでいる当業者には、ある特定の実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、上で個別に考察されているような２つ以上の特徴を特徴とすることが理解されよう。例えば、ある特定の実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％同一であるアミノ酸配列を有し、上記副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかのそのような実施形態では、上記少なくとも１つの非天然アミノ酸は、ノルロイシンおよび／またはメトキシニンからなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、配列番号２と≧８０％同一であるアミノ酸配列を有し、上記副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号２の残基８および／または残基１８に対応する位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかのそのような実施形態では、上記少なくとも１つの非天然アミノ酸は、ノルロイシンおよび／またはメトキシニンからなる群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、８４アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列は少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、８４アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列はノルロイシン、メトキシニンおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、３７アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列は少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、３７アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列はノルロイシン、メトキシニンおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、３９アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列は少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、３９アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列はノルロイシン、メトキシニンおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、３４アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列は少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、３４アミノ酸の長さの配列を有し、そのアミノ酸配列はノルロイシン、メトキシニンおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号３、配列番号４および配列番号５の少なくとも１つを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、提供される副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘ１はＳまたはＡであり、Ｘ７はＦまたはＬであり、Ｘ１６はＮ、ＳまたはＡであり、Ｘ１８はＭ、ＬまたはＶであり、Ｘ２１はＶまたはＭであり、およびＸ２２はＥまたはＱである。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘ１はＳ、Ａ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ７はＦ、Ｌ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ１６はＮ、Ｓ、Ａ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ１８はＭ、Ｌ、Ｖ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ２１はＶ、Ｍ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ２２はＥ、Ｑ、ＮｌｅまたはＭｏｘである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘ３６の少なくとも１つはＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ３９はＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ４５はＤ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ４８はＳ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ５６はＤ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ５８はＶ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ６０はＶ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ６１はＥ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ６２はＥ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ７０はＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ７４はＤ、ＮｌｅまたはＭｏｘであり、Ｘ８１はＡ、ＮｌｅまたはＭｏｘである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１４と≧９４％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、８位および１８位に対応する残基は、メチオニン、メトキシニン、ノルロイシン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１４と≧９４％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、８位および１８位に対応する残基は、メチオニン、メトキシニン、ノルロイシン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ただし、８位に対応する残基と１８位に対応する残基がどちらもノルロイシンということはない。
【００７５】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１４と≧９４％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、８位および１８位に対応する残基は、メチオニン、メトキシニン、ノルロイシン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ただし、８位に対応する残基と１８位に対応する残基がどちらもメチオニンということはない。
【００７６】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、少なくとも１つのグリカン基でグリコシル化されている。いくつかのそのような実施形態では、上記少なくとも１つのグリカン基は、
【００７７】
【化６】
2014508765.tif 000007
【００７８】
【化７】
2014508765.tif 000008
から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｏ−グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、セリンまたはトレオニンにおいてグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｓ１においてグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｓ１においてグリコシル化されており、ここで、グリカンは、
【００８０】
【化８】
2014508765.tif 000009
から選択される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ３３においてグリコシル化されており、ここで、グリカンは、
【００８２】
【化９】
2014508765.tif 000010
【００８３】
【化１０】
2014508765.tif 000011
から選択される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ３３においてグリコシル化されており、ここで、グリカンは、
【００８５】
【化１１】
2014508765.tif 000012
である。
【００８６】
他の実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ３３においてグリコシル化されており、ここで、グリカンは、
【００８７】
【化１２】
2014508765.tif 000013
である。
【００８８】
ある特定の実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ３３においてグリコシル化されており、ここで、グリカンは、
【００８９】
【化１３】
2014508765.tif 000014
である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体は、配列番号１または配列番号２と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ３３においてグリコシル化されており、ここで、グリカンは、
【００９１】
【化１４】
2014508765.tif 000015
である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１５と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であって、残基８、残基１８、およびそれらの組み合わせに対応する位置にノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体を提供する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１４と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一である要素を含むアミノ酸配列を有し、残基８、残基１８、およびそれらの組み合わせに対応する位置にノルロイシン残基および／またはメトキシニン残基を含む、副甲状腺ホルモンペプチドおよび／または類似体を提供する。
【００９４】
副甲状腺ホルモン関連タンパク質ペプチド
本発明は、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）ペプチドも提供する。副甲状腺ホルモン関連タンパク質は、内分泌ホルモン、自己分泌ホルモン、パラ分泌ホルモンおよび細胞内分泌ホルモンとして作用し、軟骨内の骨発生を、軟骨内の骨端軟骨板を一定の幅に維持することによって調節する。ｈＰＴＨｒＰは、さらに乳腺形成中の上皮−間葉相互作用を調節し、カルシウム感知受容体と共同して、乳汁分泌期中のカルシウムの乳への動員および移行を調節することができる。
【００９５】
ｈＰＴＨｒＰは正常組織および悪性組織において広範に発現される。ｈＰＴＨｒＰは、１３９アミノ酸を含有するペプチド、１４１アミノ酸を含有するペプチドおよび１７３アミノ酸を含有するペプチドの３つのアイソフォームで存在する。３つのアイソフォームは全て、共通の遺伝子から合成され、カルボキシル最末端のみが異なる。１９８７年にｈＰＴＨｒＰの一次構造が同定されたことにより、ｈＰＴＨｒＰの構造と活性の関連性の特徴付けが開始された。ｈＰＴＨｒＰのＮ末端とｈＰＴＨは配列が類似しているので、ｈＰＴＨｒＰは、ｈＰＴＨのＮ末端によって媒介される機能とほぼ同一の機能を発揮し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨｒＰの類似体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、安定なｈＰＴＨｒＰ治療薬を提供する。いくつかの実施形態では、ｈＰＴＨｒＰ類似体は、野生型ｈＰＴＨｒＰおよび／またはそのアイソフォームよりも安定性が高い（例えば、ヒト血清におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド安定性アッセイにおいて測定した場合）。
【００９６】
ｈＰＴＨｒＰは、ｈＰＴＨのＣ末端ドメインとは少ししか配列相同性を共有しない。これらの配列の差異により、正常組織およびがん組織におけるｈＰＴＨｒＰの別個の機能が可能になる。
【００９７】
ヒトｈＰＴＨｒＰの配列は配列番号８に示されている。いくつかの実施形態では、本発明は、副甲状腺ホルモン関連タンパク質ペプチドおよび／または類似体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、３〜１８０アミノ酸の長さのｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を提供する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、少なくとも最小長であり、最大長以下であるアミノ酸配列を有し、ここで、上記最小長とは、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０またはそれより長いアミノ酸であり、上記最大長とは、１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５、１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６４、１６３、１６２、１６１、１６０、１５９、１５８、１５７、１５６、１５５、１５４、１５３、１５２、１５１、１５０、１４９、１４８、１４７、１４６、１４５、１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１または１３０以下のアミノ酸の長さである。
【００９８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨｒＰの１つまたは複数のアイソフォームを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、１３９アミノ酸の長さのｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を提供する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、１４１アミノ酸の長さのｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を提供する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明は、１７３アミノ酸の長さのｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を提供する。
【０１０１】
配列番号８は、ｈＰＴＨｒＰの１つの野生型アイソフォームを示す。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号８と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号９と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号１６と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号１７と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号８、９、１６または１７と、全体的に≧８０％、≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０２】
配列番号１０、１１、１２および１３は、種々の種にわたって保存されているｈＰＴＨｒＰの領域を示す。したがって、いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのグリカン基でグリコシル化されているｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を提供する。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのグリカン基は、
【０１０４】
【化１５】
2014508765.tif 000016
【０１０５】
【化１６】
2014508765.tif 000017
から選択される。
【０１０６】
特定の副甲状腺ホルモン関連タンパク質類似体
いくつかの実施形態では、ｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号８と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の少なくとも１つを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、配列番号９と≧８０％、≧８５％、≧９０％または≧９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の少なくとも１つを含む。
【０１０８】
ペプチド合成
ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰの生物学的機能を試験するためには、まずｈＰＴＨおよびｈＰＴＨｒＰおよびそれらの断片を純粋な形態で入手できることが必要条件である。ｈＰＴＨｒＰは、システイン残基を含有しないので、ｈＰＴＨｒＰをネイティブケミカルライゲーションによって化学合成することには問題がある。一般に、本明細書に記載のとおりの、提供されるｈＰＴＨおよび／またはｈＰＴＨｒＰポリペプチドを生成するためには生物学的方法および／または化学的方法を用いることができる。しかし、生物学的方法（例えば、組換えＤＮＡに基づく方法など）は、非天然アミノ酸を組み入れるため、および特に複数の非天然アミノ酸を組み入れるためには適さない場合があることが当業者には理解されよう。（Ｖｏｌｏｓｈｃｈｕｋ  Ｎ、Ｍｏｎｔｃｌａｒｅ  ＪＫ．  ２０１０年。「Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ．」Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｙｓｔ．  ６巻：６５〜８０頁）。
【０１０９】
ペプチドおよび／またはタンパク質の生成において化学合成を利用することにより、生物医科学における多数の問題が解決される可能性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）がもたらされる。化学合成は、タンパク質組成物に対する優れた制御を発揮することができる。さらに、化学合成により、望ましい特性を有する新規のタンパク質の創製を容易にすることができる。歴史的に、生物学的治療タンパク質およびそれらの類似体の化学的調製はＫｅｎｔおよび共同研究者の有力なシステインに基づくネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）方法を用いることに依拠してきた。（Ｄａｗｓｏｎ  ＰＥ、Ｍｕｉｒ  ＴＷ、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ、Ｋｅｎｔ  ＳＢ（１９９４年）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６巻：７７６〜７７９頁；Ｔａｍ  ＪＰ、Ｌｕ  ＹＡ、Ｌｉｕ  ＣＦ、Ｓｈａｏ  Ｊ（１９９５年）Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２巻：１２４８５〜１２４８９頁；Ｈｕａ  ＱＸ、Ｎａｋａｇａｗａ  ＳＨ、Ｊｉａ  Ｗ、Ｈｕａｎｇ  Ｋ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＮＢ、Ｈｕ  ＳＱ、Ｗｅｉｓｓ  ＭＡ．  ２００８年）。「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３巻：１４７０３〜１６頁）。しかし、天然ではシステイン残基が相対的に欠乏していることを考慮すると、現行のＮＣＬ方法体系は、特定のペプチドまたはタンパク質を生成するために有用でも有効でもないことも多い。ｈＰＴＨはシステイン残基を欠く多くのタンパク質のうちの１つであり、したがって、ｈＰＴＨの化学的類似体を効率的に作製するためにはＮＣＬは非実用的になる。（Ｄａｗｓｏｎ  ＰＥ、Ｍｕｉｒ  ＴＷ、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ、Ｋｅｎｔ  ＳＢ．  １９９４年。「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６巻：７７６〜９頁）。
【０１１０】
以前は、ｈＰＴＨの化学合成には、類似体を作製するためには時間がかかりかつ非実用的である長さ８４ｍｅｒのペプチドの固相合成または完全に保護されたペプチドセグメントの組み立てのいずれかが必要であった。（Ｋｉｍｕｒａ  Ｔ、Ｔａｋａｉ  Ｍ、Ｍａｓｕｉ  Ｙ、Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｔ、Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  Ｓ．  １９８１年。「Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  −  ａｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ−Ｈｏｒｍｏｎｅ［ｈＰＴＨ（１−８４）］．」Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０巻：１８２３〜３２頁；Ｆａｉｒｗｅｌｌ  Ｔ、Ｈｏｓｐａｔｔａｎｋａｒ  ＡＶ、Ｒｏｎａｎ  Ｒ、Ｂｒｅｗｅｒ  ＨＢ、Ｊｒ．、Ｃｈａｎｇ  ＪＫ、Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍ、Ｚｉｔｚｎｅｒ  Ｌ、Ａｒｎａｕｄ  ＣＤ．  １９８３年。「Ｔｏｔａｌ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−（１−８４）．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２巻：２６９１〜７頁；Ｇｏｕｄ  ＮＡ、ＭｃＫｅｅ  ＲＬ、Ｓａｒｄａｎａ  ＭＫ、ＤｅＨａｖｅｎ  ＰＡ、Ｈｕｅｌａｒ  Ｅ、Ｓｙｅｄ  ＭＭ、Ｇｏｕｄ  ＲＡ、Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＳＷ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＪＥ、Ｌｅｖｙ  ＪＪら、１９９１年。「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（１−８４）．」Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ６巻：７８１〜９頁；Ｆｕｅｎｔｅｓ  Ｇ、Ｐａｇｅ  Ｋ、Ｃｈａｎｔｅｌｌ  ＣＡ、Ｐａｔｅｌ  Ｈ、Ｍｅｎａｋｕｒｕ  Ｍ．  ２００９年。「Ｆａｓｔ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  １−８４．」Ｃｈｉｍ．  Ｏｇｇｉ  ２７巻：３１〜３頁）。
【０１１１】
他の方法によるよりも魅力的な、ｈＰＴＨおよびその類似体の化学合成を行うために、研究者らはネイティブケミカルライゲーション方法の適用性を相当拡張してきた。（Ｗａｎ  Ｑ、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ  ＳＪ．  ２００７年。「Ｆｒｅｅ−ｒａｄｉｃａｌ−ｂａｓｅｄ，  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ａｄｖａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．」Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．編、４６巻：９２４８〜５２頁；Ｃｈｅｎ  Ｊ、Ｗａｎ  Ｑ、Ｙｕａｎ  Ｙ、Ｚｈｕ  Ｊ、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ  ＳＪ．  ２００８年。「Ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｔ  ｖａｌｉｎｅ：ａ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．編、４７巻：８５２１〜４頁；Ｃｈｅｎ  Ｊ、Ｗａｎｇ  Ｐ、Ｚｈｕ  ＪＬ、Ｗａｎ  Ｑ、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ  ＳＪ．  ２０１０年。「Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｓｉｔｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６６巻：２２７７〜８３頁；Ｔａｎ  Ｚ、Ｓｈａｎｇ  Ｓ、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ  ＳＪ．  ２０１０年。「Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｅｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎｓ．」Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．編、４９巻：９５００〜９５０３頁）。システインに基づかないライゲーション／脱硫を結びつけた戦略を用いて、小さな合成ペプチド断片から全長のｈＰＴＨ分子を組み立てることができ、それにより今度はその天然の構造を可撓性に修飾することが可能になる。（Ｔａｍ  ＪＰ、Ｙｕ  ＱＴ．  １９９８年。「Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ．」Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４６巻：３１９〜２７頁）。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本発明は、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質および／もしくはペプチドならびに／またはその類似体の合成方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨ、ｈＰＴＨｒＰおよびペプチドならびに／またはその類似体の合成方法であって、システインまたはメチオニン以外のアミノ酸残基における少なくとも１回のネイティブケミカルライゲーションによるカップリングを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨ、ｈＰＴＨｒＰおよび／もしくはペプチドならびに／またはその類似体の合成方法であって、アラニン、バリン、トレオニン、ロイシンおよびプロリンから選択されるアミノ酸残基における少なくとも１回のネイティブケミカルライゲーションによるカップリングを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１：
【０１１３】
【化１７】
2014508765.tif 000018
のｈＰＴＨを合成する方法を提供する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのネイティブケミカルライゲーションを行うステップを含むｈＰＴＨの合成を提供する：
【０１１５】
【化１８】
2014508765.tif 000019
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＩとＩＩをネイティブケミカルライゲーションして断片Ｖを生成するステップを含むｈＰＴＨの合成を提供する：
【０１１６】
【化１９】
2014508765.tif 000020
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＩＩＩとＩＶをネイティブケミカルライゲーションして断片ＶＩを生成するステップを含むｈＰＴＨの合成を提供する：
【０１１７】
【化２０】
2014508765.tif 000021
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＩＩＩとＩＶをネイティブケミカルライゲーションして断片ＶＩを生成し、その後、そのＮ末端を脱保護して断片ＶＩＩを生成するステップを含むｈＰＴＨの合成を提供する：
【０１１８】
【化２１】
2014508765.tif 000022
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＶとＶＩＩのネイティブケミカルライゲーションを行うステップを含むｈＰＴＨの合成を提供する：
【０１１９】
【化２２】
2014508765.tif 000023
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＶとＶＩＩをネイティブケミカルライゲーションし、その後、断片ＶＩＩＩを脱硫してｈＰＴＨ（１−８４）を得るステップを含むｈＰＴＨの合成を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨペプチドを調製する方法であって、
（ｉ）断片ＩとＩＩをネイティブケミカルライゲーションして断片Ｖを生成するステップ：
【０１２１】
【化２３】
2014508765.tif 000024
（ｉｉ）断片ＩＩＩとＩＶをネイティブケミカルライゲーションして断片ＶＩを生成するステップ：
【０１２２】
【化２４】
2014508765.tif 000025
（ｉｉｉ）断片ＶＩを脱保護して断片ＶＩＩを生成するステップ：
【０１２３】
【化２５】
2014508765.tif 000026
（ｉｖ）断片ＶとＶＩＩをネイティブケミカルライゲーションして、断片ＶＩＩＩを生成するステップ：
【０１２４】
【化２６】
2014508765.tif 000027
および
（ｖ）断片ＶＩＩＩを還元してｈＰＴＨペプチドを生成するステップ：
【０１２５】
【化２７】
2014508765.tif 000028
を含む方法を提供する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、残基８および１８に対応する位置にノルロイシンを配列に含む、配列番号１４のｈＰＴＨ類似体Ａ：
【０１２７】
【化２８】
2014508765.tif 000029
を合成する方法を提供する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＩＸとＸＶＩＩのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１２９】
【化２９】
2014508765.tif 000030
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ａの合成を提供する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＶＩＩＩとＸＩＸのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１３１】
【化３０】
2014508765.tif 000031
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ａの合成を提供する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドが少なくとも１つのグリカン基でグリコシル化されている、配列番号１４のｈＰＴＨ類似体を合成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドが少なくとも１つのグリカン基でグリコシル化されており、残基８および１８に対応する位置にノルロイシンを配列に含む、配列番号１４のｈＰＴＨ類似体を合成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化されたｈＰＴＨ類似体Ｂ：
【０１３３】
【化３１】
2014508765.tif 000032
ここで、
【０１３４】
【化３２】
2014508765.tif 000033
を合成する方法を提供する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＸ、ＸＸＩおよびＸＸＩＩのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１３６】
【化３３】
2014508765.tif 000034
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ｂの合成を提供する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化されたｈＰＴＨ類似体Ｃ：
【０１３８】
【化３４】
2014508765.tif 000035
ここで、
【０１３９】
【化３５】
2014508765.tif 000036
を合成する方法を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１４１】
【化３６】
2014508765.tif 000037
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ｃの合成を提供する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化されたｈＰＴＨ類似体Ｄ：
【０１４３】
【化３７】
2014508765.tif 000038
ここで、
【０１４４】
【化３８】
2014508765.tif 000039
を合成する方法を提供する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＩＩおよびＸＸＶのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１４６】
【化３９】
2014508765.tif 000040
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ｄの合成を提供する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、残基８および１８に対応する位置にノルロイシンを配列に含む、配列番号１のｈＰＴＨ類似体Ｅ：
【０１４８】
【化４０】
2014508765.tif 000041
を合成する方法を提供する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＩＸ、ＩＩおよびＸのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１５０】
【化４１】
2014508765.tif 000042
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ｅの合成を提供する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、残基８および１８に対応する位置にノルロイシンを配列に含む、配列番号１のグリコシル化された類似体Ｆ：
【０１５２】
【化４２】
2014508765.tif 000043
ここで、
【０１５３】
【化４３】
2014508765.tif 000044
を合成する方法を提供する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＸ、ＸＸＶＩおよびＩＩおよびＸのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１５５】
【化４４】
2014508765.tif 000045
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ｆの合成を提供する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、残基８および１８に対応する位置にノルロイシンを配列に含む、配列番号１のグリコシル化された類似体Ｇ：
【０１５７】
【化４５】
2014508765.tif 000046
ここで、
【０１５８】
【化４６】
2014508765.tif 000047
を合成する方法を提供する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＸＶＩＩ、ＸＸＶＩＩＩおよびＸのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１６０】
【化４７】
2014508765.tif 000048
を含むｈＰＴＨ類似体Ｇの合成を提供する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、残基８および１８に対応する位置にノルロイシンを配列に含む、配列番号１のグリコシル化された類似体Ｈ：
【０１６２】
【化４８】
2014508765.tif 000049
ここで、
【０１６３】
【化４９】
2014508765.tif 000050
を合成する方法を提供する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＸＶＩＩ、ＸＸＩＸおよびＸのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１６５】
【化５０】
2014508765.tif 000051
を含む、ｈＰＴＨ類似体Ｈの合成を提供する。
【０１６６】
ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパク質は、システイン残基もメチオニン残基も含有せず、したがって、従来のネイティブケミカルライゲーション方法によって合成することができない。いくつかの実施形態では、本発明は、断片ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩおよびＸＸＸＩＩＩのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１６７】
【化５１】
2014508765.tif 000052
を含む、配列番号８のｈＰＴＨｒＰペプチドを合成する方法を提供する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本発明は、中間体ＸＸＸおよびＸＸＸＩのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１６９】
【化５２】
2014508765.tif 000053
を含む、中間体ＸＸＸＩＶ：
【０１７０】
【化５３】
2014508765.tif 000054
の合成を提供する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、中間体ＸＸＸＩＩおよびＸＸＸＩＩＩのネイティブケミカルライゲーションを行うステップ：
【０１７２】
【化５４】
2014508765.tif 000055
を含む、中間体ＸＸＸＶ：
【０１７３】
【化５５】
2014508765.tif 000056
の合成を提供する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明は、中間体ＸＸＸＩＶおよびＸＸＸＶのネイティブケミカルライゲーションを行うステップを含む、中間体ＸＸＸＶＩ：
【０１７５】
【化５６】
2014508765.tif 000057
の合成を提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、脱硫剤を用いて中間体ＸＸＸＶＩを還元するステップを含む、ｈＰＴＨｒＰ  ＸＸＸＶＩＩ：
【０１７７】
【化５７】
2014508765.tif 000058
の合成を提供する。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ネイティブケミカルライゲーションの中間体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ネイティブケミカルライゲーションの中間体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩ、ＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩを提供する。
【０１７９】
化合物および薬学的に許容される組成物の使用
いくつかの実施形態によると、本発明は、必要に応じて薬学的に許容される塩、エステル、または他のその誘導体の形態の本発明のペプチドおよび／または類似体と、薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、またはビヒクルとを含む組成物を提供する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される組成物は、治療有効量のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を含み、かつ／または、投与される際に、治療有効量のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体をもたらす。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される組成物は、治療有効量のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を含み、かつ／または、投与される際に、治療有効量のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体をもたらす。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体と、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨペプチドおよび／または類似体と、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアとを含み、追加の治療剤をさらに含む薬学的組成物を提供する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体と、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体と、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアとを含み、追加の治療剤をさらに含む薬学的組成物を提供する。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、そのような組成物を必要とする患者に投与するために製剤化する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、患者に経口投与するために製剤化する。
【０１８４】
本発明の組成物は、副甲状腺ホルモンのレベルが不十分であることに関連する症状、疾患および／または障害の処置において有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、副甲状腺機能低下症に関連する症状、疾患および／または障害の処置において有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、副甲状腺ホルモンの活性が低い（ｕｎｄｅｒａｃｔｉｖｅ）ことに関連する症状、疾患および／または障害の処置において有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、骨粗鬆症の処置において有用である。
【０１８５】
本発明の組成物は、任意の適切な経路によって、例えば、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、経鼻的に、口腔内に、膣に、または埋め込んだレザバーを介して、投与することができる。
【０１８６】
非経口投与するために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性の不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に許容できる油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型と同様に、注射剤の調製において有用である。これらの油液剤または油懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースなどの長鎖アルコール希釈剤または分散剤、またはエマルションおよび懸濁剤を含めた薬学的に許容される剤形の製剤化において一般に使用される同様の分散剤も含有してよい。他の一般に使用される界面活性物質、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造において一般に使用される他の乳化剤または生物学的利用能増強剤も、製剤化のために用いることができる。いくつかの実施形態では、提供されるペプチドおよび／または類似体を非経口的に投与する。
【０１８７】
本発明の薬学的に許容される組成物は、これらだけに限定されないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含めた、任意の経口的に許容できる剤形で経口投与することができる。経口的に用いるための錠剤の場合では、一般に使用されるキャリアとして、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も一般に添加される。カプセル形態で経口投与するためには、有用な希釈剤として、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口的に用いるために水性懸濁剤が必要である場合には、活性成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。所望であれば、特定の甘味剤、香味剤または着色剤も添加してよい。
【０１８８】
あるいは、本発明の薬学的に許容される組成物は、直腸投与するための坐剤の形態で投与することができる。これらは、作用物質を、室温では固体であるが直腸の温度では液体であり、したがって、直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。そのような材料としては、カカオバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１８９】
本発明の薬学的に許容される組成物は、特に、眼、皮膚、または下部腸管の疾患を含め、処置の標的が、局所的適用が容易に到達できる領域または臓器を含む場合には、局所的に投与することもできる。これらの領域または臓器のそれぞれに対して適切な局所用製剤が容易に調製される。
【０１９０】
下部腸管に対する局所的適用は、直腸の坐薬製剤で（上記を参照されたい）または適切な浣腸製剤で実施することができる。局所経皮パッチ剤を使用することもできる。
【０１９１】
局所的適用のために、提供される薬学的に許容される組成物は、１種または複数種のキャリアに懸濁または溶解させた活性成分を含有する適切な軟膏剤に製剤化することができる。本発明の化合物を局所投与するためのキャリアとしては、これらだけに限定されないが、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられる。あるいは、提供される薬学的に許容される組成物は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリアに懸濁または溶解させた活性成分を含有する適切なローション剤またはクリーム剤に製剤化することができる。適切なキャリアとしては、これらだけに限定されないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。
【０１９２】
眼に使用するために、提供される薬学的に許容される組成物は、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの保存剤を伴う、または伴わないかのいずれかで、等張性のｐＨ調整した滅菌食塩水中の微粒子化懸濁剤として、または、好ましくは、等張性のｐＨ調整した滅菌食塩水中液剤として製剤化することができる。あるいは、眼に使用するために、薬学的に許容される組成物をワセリンなどの軟膏剤に製剤化することができる。
【０１９３】
本発明の薬学的に許容される組成物は、鼻エアロゾルまたは鼻吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技法に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤または分散剤を使用して、食塩水中液剤として調製することができる。
【０１９４】
単一剤形の組成物を生成するためにキャリア材料と組み合わせることができる本発明の化合物の量は、処置される宿主、特定の投与形式に応じて変動する。好ましくは、提供される組成物は、阻害薬１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０１から１００ｍｇの間の投与量を、これらの組成物を受ける患者に投与することができるように製剤化されるべきである。
【０１９５】
任意の特定の患者に対する特定の投与量および処置レジメンは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別（ｓｅｘ／ｇｅｎｄｅｒ）、食事、投与時間、排出速度、薬物の組み合わせ、および処置担当医師の判断ならびに処置されている特定の疾患の重症度を含めた種々の因子に左右されることも理解されるべきである。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物中の特定の化合物にも左右される。
【０１９６】
ＦＯＲＴＥＯ（登録商標）として販売されているテリパラチドは、骨折の危険性が高い骨粗鬆症の閉経後の女性の処置に関して連邦医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって現在承認されている、３４アミノ酸の長さのｈＰＴＨペプチドである。テリパラチドは、骨折の危険性が高い、持続性全身性グルココルチコイド治療に関連する骨粗鬆症の男性および女性の両方の処置に関しても承認されている。テリパラチドは、さらに、骨折の危険性が高い、原発性骨粗鬆症または生殖機能不全の骨粗鬆症の男性の骨量を増加させる。
【０１９７】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は本明細書に記載の活性を有する。いくつかの実施形態では、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体は、血清カルシウムレベルの回復を促進する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、副甲状腺のレベルが不十分であることを特徴とする疾患および／または障害を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の化合物、または薬学的に許容されるその組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰのレベルが不十分であることに関連する症状、疾患または障害を処置する方法を提供する。いくつかのそのような実施形態では、本発明は、甲状腺機能低下症を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、骨粗鬆症を処置するまたはその重症度を緩和するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、骨粗鬆症を処置するまたはその重症度を緩和するための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、閉経後の女性における骨粗鬆症を処置するまたはその重症度を緩和するための方法を提供する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、骨粗鬆症を処置するまたはその重症度を緩和するための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を、カルシウムおよび／またはビタミンＤと組み合わせて投与するステップを含む方法を提供する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明は、骨塩密度を増加させるための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、骨塩密度を増加させるための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を、カルシウムおよび／またはビタミンＤと組み合わせて投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明は、原発性骨粗鬆症または生殖機能不全の骨粗鬆症に罹患している男性において骨量を増加させるための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、原発性骨粗鬆症または生殖機能不全の骨粗鬆症に罹患している男性において骨量を増加させるための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を、カルシウムおよび／またはビタミンＤと組み合わせて投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、ｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体を、カルシウムおよび／またはビタミンＤと組み合わせて投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本発明のペプチドおよび／または類似体、または薬学的に許容されるその組成物を、１種または複数種の追加の治療剤と組み合わせて投与する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体、またはその薬学的組成物を、１つもしくは複数の抗増殖剤または化学療法剤と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、提供されるｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体、またはその薬学的組成物を、アバレリクス、アルデスロイキン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、生ＢＣＧ、ベバクジマブ（Ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）、フルオロウラシル、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン、デニロイキン（Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ）、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン（中性）、塩酸ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、酢酸ゴセレリン、酢酸ヒストレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、酢酸リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、６−ＭＰ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、リンゴ酸スニチニブ、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、ＶＭ−２６、テストラクトン、チオグアニン、６−ＴＧ、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ＡＴＲＡ、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、またはゾレドロン酸のうちの任意の１つ以上から選択される１つもしくは複数の抗増殖剤または化学療法剤と組み合わせて投与する。
【０２０５】
同様に本発明の化合物と組み合わせることができる作用物質の他の例としては、これらだけに限定することなく、アルツハイマー病に対する処置薬、例えば、Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標）およびＥｘｃｅｌｏｎ（登録商標）；パーキンソン病に対する処置薬、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡ／カルビドパ、エンタカポン、ロピニロール（ｒｏｐｉｎｒｏｌｅ）、プラミペキソール、ブロモクリプチン、ペルゴリド、トリヘキシフェニジル（ｔｒｉｈｅｘｅｐｈｅｎｄｙｌ）、およびアマンタジン；多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための作用物質、例えば、ベータインターフェロン（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＲｅｂｉｆ（登録商標））、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）、およびミトキサントロン；喘息に対する処置薬、例えば、アルブテロールおよびＳｉｎｇｕｌａｉｒ（登録商標）；統合失調症を処置するための作用物質、例えば、ジプレキサ、リスパダール、セロクエル、およびハロペリドール；抗炎症剤、例えば、コルチコステロイド、ＴＮＦ遮断薬、ＩＬ−１ＲＡ、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびスルファサラジン；免疫調節剤および免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、インターフェロン、コルチコステロイド、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｐｈａｍｉｄｅ）、アザチオプリン、およびスルファサラジン；神経栄養因子、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＭＡＯ阻害薬、インターフェロン、抗痙攣薬、イオンチャネル遮断薬、リルゾール、および抗パーキンソン病薬；心臓血管疾患を処置するための作用物質、例えば、ベータ−遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、利尿薬、ニトレート、カルシウムチャネル遮断薬、およびスタチン；肝疾患を処置するための作用物質、例えば、コルチコステロイド、コレスチラミン、インターフェロン、および抗ウイルス薬；血液障害を処置するための作用物質、例えば、コルチコステロイド、抗白血病薬、および成長因子；ならびに、免疫不全障害を処置するための作用物質、例えば、ガンマグロブリンが挙げられる。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、本発明のｈＰＴＨまたはｈＰＴＨｒＰペプチドおよび／または類似体、または薬学的に許容されるその組成物を、モノクローナル抗体またはｓｉＲＮＡ治療薬と組み合わせて投与する。
【０２０７】
これらの追加の作用物質は、発明の化合物を含有する組成物とは別々に、複数回の投薬レジメンの一部として投与することができる。あるいは、これらの作用物質は、本発明の化合物と一緒に混合して単一の組成物にした単一剤形の一部であってよい。複数回の投与レジメンの一部として投与する場合、２種の活性作用物質は同時に、逐次的に、または互いに、ある期間内にもたらすことができる。
【０２０８】
本発明のペプチドおよび／または類似体と、キャリア材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる追加の治療剤（上記の通り追加の治療剤を含む組成物中））との両方の量は、処置される宿主および特定の投与形式に応じて変動する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、投与量１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇから１００ｍｇの間で類似体を投与することができるように製剤化される。
【０２０９】
追加の治療剤を含む組成物では、その追加の治療剤と本発明の化合物は、相乗的に作用し得る。したがって、そのような組成物中の追加の治療剤の量は、その治療剤のみを利用する単独治療において必要な量よりも少ない。そのような組成物では、投与量１日当たり体重１ｋｇ当たり０．００１μｇから１，０００μｇの間で追加の治療剤を投与することができる。
【０２１０】
本発明の組成物中に存在する追加の治療剤の量は、その治療剤を唯一の活性作用物質として含む組成物中で通常投与される量以下である。現在開示されている組成物中の追加の治療剤の量は、その作用物質を唯一の治療上活性な作用物質として含む組成物に通常存在する量の約５０％〜１００％の範囲であること好ましい。
【０２１１】
本発明の化合物、またはその薬学的組成物は、埋め込み型の医学的デバイス、例えば、人工器官、人工弁、血管移植片、ステントおよびカテーテルをコーティングするための組成物に組み込むこともできる。血管ステントは、例えば、再狭窄（傷害後に血管壁が再度狭小化すること）を克服するために使用されている。しかし、ステントまたは他の埋め込み型デバイスを使用している患者は、血餅形成または血小板活性化の危険性がある。これらの望ましくない影響は、デバイスを、治療剤を含む薬学的に許容される組成物を用いて予めコーティングすることによって予防することまたは減ずることができる。本発明の化合物でコーティングされた埋め込み型デバイスは本発明の別の実施形態である。
【実施例】
【０２１２】
市販材料（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ、Ｎｏｖａ）は全て、さらに精製することなく使用した。溶媒は全て試薬グレードまたはＨＰＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ）であった。無水ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ＣＨ２Ｃｌ２、トルエン、およびベンゼンは、乾燥溶媒系から得（アルミナのカラムを通過させた）、さらに乾燥させることなく使用した。全ての反応を、予め精製した乾燥Ａｒ（ｇ）雰囲気下で実施した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＩＩ  ６００  ＭＨｚまたはＢｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＤＲＸ−５００  ＭＨｚでＮＭＲスペクトル（１Ｈおよび１３Ｃ）を記録し、ＴＭＳまたは残留溶媒を基準とした。ＪＯＥＬ  ＪＭＳ−ＤＸ−３０３−ＨＦ質量分光計またはＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ質量分光計を用いて低分解能質量スペクトル解析を実施した。Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ２５４プレートで分析的ＴＬＣを実施し、Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（４０〜６３ｍｍ）でフラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した。収率は、クロマトグラフィーで純粋な化合物について指す。
【０２１３】
ＨＰＬＣ：分離は全て、水中０．０５％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）（溶媒Ａ）／アセトニトリル中０．０４％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）の移動相を伴った。ＬＣＭＳ分析を、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  １００−５、Ｃ１８  １５０×２．０ｍｍおよびＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ３００−５、Ｃ４  ２５０×２．０ｍｍのカラムを備えたＷａｔｅｒｓ２６９５分離モジュールおよびＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ検出器を使用し、流速０．２ｍＬ／分で実施した。ＵＰＬＣ−ＭＳ分析を、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｌ、２．１×１００ｍｍ、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ８、１．７μｌ、２．１×１００ｍｍ、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  ３００  Ｃ４、１．７μｌ、２．１×１００ｍｍのカラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｒｅｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを使用し、流速０．３ｍＬ／分で実施した。調製用分離を、Ｒａｉｎｉｎ  ＵＶ−１検出器を備えたＲａｎｉｎ  ＨＰＬＣ溶媒送達系およびＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  １００−５、Ｃ１８  ２５０×２１．４ｍｍおよびＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ３００−５、Ｃ４  ２５０×２１．４ｍｍのカラムを使用したＶａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘを使用して、流速１６．０ｍＬ／分で実施した。
【０２１４】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｉｏｎｅｅｒ連続フローペプチド合成機で自動ペプチド合成を実施した。標準の自動Ｆｍｏｃプロトコール（ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ）の下でペプチドを合成した。デブロッキング溶液はＤＭＦ／ピペリジン／ＤＢＵの１００／５／５混合物（１００／５／５）であった。ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍからの以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。０．０５ｍｍｏｌ規模の自動合成が達成されたら、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄した。ＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１：８）またはＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）を使用して切断を行った。濾過することによって樹脂を除去し、生じた溶液を濃縮した。エーテルを用いて残渣を沈殿させ、遠心分離した。ペレットをアセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１）に再懸濁させ、凍結乾燥した。
【０２１５】
Ａｖｉｖ  ４１０円偏光二色分光偏光計でＣＤスペクトルを得た。タンパク質の濃度を、Ｔｒｐ残基の数に従って算出した吸光係数に基づいて決定した。全ての実験について溶媒は１：１のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏであった。スペクトルは１ｍｍの経路長のキュベットを用い、タンパク質の濃度１４μＭおよび７μＭで収集した。
【０２１６】
（実施例１）
ｈＰＴＨ（１−８４）の合成
ｈＰＴＨの一次構造が図１に示されている。ｈＰＴＨポリペプチド鎖を、そのアミノ酸配列に基づいて、４つの断片、ｈＰＴＨ（１−２３）Ｉ、ｈＰＴＨ（２４−３８）ＩＩ、ｈＰＴＨ（３９−５９）ＩＩＩ、およびｈＰＴＨ（６０−８４）ＩＶから収束戦略によって組み立てることができる。各ペプチド断片はそれぞれ２３アミノ酸残基、１５残基、２１残基、および２５残基を含有し、したがって、固相ペプチド合成によって容易に作製することができる。上記断片を、ｈＰＴＨにおいて最も豊富なアミノ酸のうちの３つ、Ｌｅｕ２４、Ａｌａ３９、およびＶａｌ６０を用いることによって一緒に結合させる（図１）。
【０２１７】
ｈＰＴＨの合成が図２に示されている。完全に保護されたペプチドを、０．０５ｍｍｏｌ規模で、Ｆｍｏｃ化学によって手動で合成した。ロイシンおよびバリン代用物を、完全に保護されたペプチドのＮ末端にＨＡＴＵによって結合させた。Ｓａｋａｋｉｂａｒａおよび共同研究者によって開発された非エピマー化条件下でＥＤＣＩ媒介性アミド形成反応を用いて、完全に保護されたペプチドからＣ末端チオエステルを担持するペプチド断片を調製した。断片Ｉのチオエステルと断片ＩＩの選択的ロイシンライゲーションを９時間で完了させて、ペプチドＶを収率５９％で得た。断片ＩＩＩと断片ＩＶの反応をｐＨ７．５のグアニジン緩衝液中で５時間行ってペプチドＶＩを得た。ライゲーションが完了した後、ペプチドＶＩ内のチアゾリジンを、メトキシルアミン・ＨＣｌ、ｐＨ４．０を用いて処理することによってワンポットでＮ末端システインに変換し、二段階で収率８６％を得た（図２Ｂ）。これらの合成後、２００ｍＭの（４−メトキシフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）触媒の存在下でペプチドＶのチオエステルとＶＩＩをライゲーションすることにより、ＶＩＩＩが収率６３％で生じる。ＶＩＩＩの脱硫を２時間で完了させ、最終の全長の生成物を得た。ＨＰＬＣによって精製することにより、純粋なｈＰＴＨが収率８６％でもたらされた。
【０２１８】
ペプチドチオフェニルエステルＩの合成：
【０２１９】
【化５８】
2014508765.tif 000059
完全に保護されたペプチジル酸（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｃｉｄ）を、上記の一般的な手順を用いたＳＰＰＳによって調製した。切断した後、粗ペプチド１５６．４ｍｇを得た（収率６８％）。
【０２２０】
完全に保護されたペプチジル酸（７１．７ｍｇ、１５．８μＭ、１．１当量）およびＣＨＣｌ３／ＴＦＥ（ｖ／ｖ＝３／１、６２０μＬ）中ＨＣｌ・Ｈ−Ｔｒｐ−ＳＰｈ（４．８ｍｇ、１４．４μＭ、１．０当量）を−１０℃まで冷却した。ＨＯＯＢｔ（２．６ｍｇ、１５．８μＭ、１．１当量）およびＥＤＣＩ（２．８μＬ、１５．８μＭ、１．１当量）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。次いで、穏やかなＮ２の流れの下で溶媒を飛ばし、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）を加えた。４５分間にわたって脱保護した後、ＴＦＡを飛ばし、油性残渣をジエチルエーテルですりつぶした。沈殿物をペレットにし、その後そのエーテルをデカントした。得られた固体をＨＰＬＣによって精製して、１１．５ｍｇの断片Ｉを２８％の収率で得た。化学式：Ｃ１２４Ｈ１９３Ｎ３５Ｏ３５Ｓ３、予測質量：２８２８．３６、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｍ／ｚ＝１４１５．１８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝９４３．７９。
【０２２１】
チオロイシン（ｔｈｉｏｌｅｕｃｉｎｅ）を含有するペプチドアルキルチオエステルＩＩの合成。
【０２２２】
【化５９】
2014508765.tif 000060
Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ由来のペプチド樹脂（６．４９μｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（２００μＬ）中、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ（２．０ｍｇ、６．４９μｍｏｌ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（７．６ｍｇ、１９．５μｍｏｌ、３．０当量）およびＤＩＥＡ（６．８μＬ、３９．０μｍｏｌ、６．０当量）と混合し、室温で１０分間攪拌した。樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨを用いて数回洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥した樹脂を、ＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１：８）を用いて２×１時間処理することによって切断して、完全に保護されたペプチジル酸を得た。
【０２２３】
ＣＨＣｌ３／ＴＦＥ（ｖ／ｖ＝３／１、４３５μＬ）中の上記の粗ペプチジル酸（６．４９μＭ、１．０当量）およびＨＣｌ・Ｈ−Ｇｌｙ−３−チオプロピオン酸エチルエステル（７．７９μＭ、１．２当量）を−１０℃まで冷却した。ＨＯＯＢｔ（６．４９μＭ、１．０当量）およびＥＤＣＩ（６．４９μＭ、１．０当量）を加えた。反応混合物を、室温で３．５時間攪拌した。次いで、穏やかなＮ２の流れの下で溶媒を飛ばし、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）を加えた。２０分間にわたって脱保護した後、ＴＦＡを飛ばし、油性残渣をジエチルエーテルですりつぶした。沈殿物をペレットにし、その後そのエーテルをデカントした。得られた固体をＨＰＬＣによって精製して、３．７ｍｇのチオエステルＩＩを３０％の収率（樹脂の重量に基づいて算出した）で得た。化学式：Ｃ８５Ｈ１４２Ｎ２４Ｏ２１Ｓ３、予測質量：１９３０．９９、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｍ／ｚ＝９６６．５０。
【０２２４】
ペプチドチオフェニルエステルＩＩＩの合成。
【０２２５】
【化６０】
2014508765.tif 000061
完全に保護されたペプチジル酸を、上記の一般的な手順を用いたＳＰＰＳによって調製した。切断した後、粗ペプチド４５．５ｍｇを得た（収率２３％）。
【０２２６】
ＣＨＣｌ３／ＴＦＥ（ｖ／ｖ＝３／１、４４０μＬ）中の完全に保護されたペプチジル酸（４５．５ｍｇ、１１．３μＭ、１．１当量）およびＨＣｌ・Ｈ−Ｌｅｕ−ＳＰｈ（２．７ｍｇ、１０．３μＭ、１．０当量）を−１０℃まで冷却した。ＨＯＯＢｔ（１．８ｍｇ、１１．３μＭ、１．１当量）およびＥＤＣＩ（２．０μＬ、１１．３μＭ、１．１当量）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。次いで、穏やかなＮ２の流れの下で溶媒を飛ばし、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）を加えた。４５分間にわたって脱保護した後、ＴＦＡを飛ばし、油性残渣をジエチルエーテルですりつぶした。沈殿物をペレットにし、その後そのエーテルをデカントした。得られた固体をＨＰＬＣによって精製して、７．２ｍｇのチオフェニルエステルＩＩＩを２８％の収率で得た。化学式：Ｃ１０５Ｈ１７２Ｎ３４Ｏ３０Ｓ２、予測質量：２４５３．２４、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｍ／ｚ＝１２２７．６２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝８１８．７５。
【０２２７】
チオバリン（ｔｈｉｏｖａｌｉｎｅ）を含有するペプチドＩＶの合成。
【０２２８】
【化６１】
2014508765.tif 000062
Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ由来のペプチド樹脂（６．６４μｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（２００μＬ）中、Ｂｏｃ−Ｖａｌ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ（２．０ｍｇ、６．６４μｍｏｌ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（７．６ｍｇ、１９．９μｍｏｌ、３．０当量）およびＤＩＥＡ（６．９μＬ、３９．８μｍｏｌ、６．０当量）と混合し、室温で１０分間攪拌した。樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨを用いて数回洗浄し、真空下で乾燥させた。ペプチドを切断し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）を用いて１時間１０分間処理することによって脱保護した。次いで、ＴＦＡを飛ばし、油性残渣をジエチルエーテルですりつぶした。沈殿物をペレットにし、その後そのエーテルをデカントした。得られた固体をＨＰＬＣによって精製して、８．９ｍｇのチオエステルＩＶを４９％の収率（樹脂の重量に基づいて算出した）で得た。化学式：Ｃ１１４Ｈ１９３Ｎ３３Ｏ４２Ｓ２、予測質量：２７６０．３４、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｍ／ｚ＝１３８１．１７、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝９２１．１１。
【０２２９】
ペプチドＶの合成。
【０２３０】
【化６２】
2014508765.tif 000063
動力学的に制御されたライゲーション条件下でＶの合成を行った。ペプチドＩ（６．１ｍｇ、２．２μｍｏｌ、１．１当量）およびペプチドＩＩ（３．７ｍｇ、１．９μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（６００μＬ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）に溶解させた。反応混合物を室温で９時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、５．２ｍｇのライゲーションされたペプチドＶを５９％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ分析によって推定される通り、ＩＩの環化生成物とライゲーション生成物Ｖの間の比率は１：１０である。化学式：Ｃ２０２Ｈ３２７Ｎ５９Ｏ５６Ｓ４、予測質量：４６０３．３４、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｍ／ｚ＝２３０２．６７、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１５３５．４５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１１５１．８４、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝９２１．６７。
【０２３１】
ライゲーションされたペプチドＶＩの合成。
【０２３２】
【化６３】
2014508765.tif 000064
ペプチドＩＩＩ（２．７ｍｇ、１．１μｍｏｌ、１．６当量）およびペプチドＩＶ（１．８ｍｇ、０．６７μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（３００μＬ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）に溶解させた。反応混合物を室温で９時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、粗ペプチドＶＩをさらなる精製をせずに直接脱保護した。
【０２３３】
ペプチドＶＩＩの合成。
【０２３４】
【化６４】
2014508765.tif 000065
０．２ＭのメトキシルアミンＨＣｌ、ｐＨ４．０を加えることによって、Ｔｈｚ基をシステインに変換した。反応混合物を室温で５時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、２．９ｍｇの脱保護されたペプチドＶＩＩを８６％の収率で得た。化学式：  Ｃ２１１Ｈ３５７Ｎ６７Ｏ７２Ｓ２、予測質量：５０４５．５８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１６８２．８６、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１２６２．４０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１０１０．１２、［Ｍ＋６Ｈ］７＋ｍ／ｚ＝８４１．９３、［Ｍ＋７Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝７２１．８１。
【０２３５】
ライゲーションされたペプチドＶＩＩＩの合成。
【０２３６】
【化６５】
2014508765.tif 000066
ペプチドＶ（１．１ｍｇ、０．２４μｍｏｌ、１．１当量）およびペプチドＶＩＩ（１．１ｍｇ、０．２２μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（１００μＬ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＭＰＡＡ、２０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．９）に溶解させた。反応混合物を室温で４時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、１．３ｍｇのライゲーションされたペプチドＶＩＩＩを５９％の収率で得た。化学式：Ｃ４０８Ｈ６７４Ｎ１２６Ｏ１２６Ｓ５、予測質量：９５１４．８８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１９０３．９８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝１５８６．８１、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ｍ／ｚ＝１３６０．２７、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ｍ／ｚ＝１１９０．３６、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ｍ／ｚ＝１０５８．２１、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ｍ／ｚ＝９５２．４９、［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ｍ／ｚ＝８６５．９９、［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ｍ／ｚ＝７９３．９１、［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ｍ／ｚ＝７３２．９１。
【０２３７】
脱硫ペプチドｈＰＴＨの合成。
【０２３８】
【化６６】
2014508765.tif 000067
精製したライゲーションされたペプチドＶＩＩＩ（０．７ｍｇ）の脱気ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１、０．２ｍｌ）中溶液に、０．５Ｍのｂｏｎｄ−ｂｒｅａｋｅｒ（登録商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）０．２ｍｌ、２−メチル−２−プロパンチオール０．０２ｍｌおよびラジカル開始剤（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ）０．２ｍｌを加えた。反応混合物を３７℃で２時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、０．６ｍｇのｈＰＴＨ、８６％を得た。化学式：Ｃ４０８Ｈ６７４Ｎ１２６Ｏ１２６Ｓ２、予測質量：９４１８．９６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１８８４．７９、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝１５７０．８３、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ｍ／ｚ＝１３４６．５７、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ｍ／ｚ＝１１７８．３７、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ｍ／ｚ＝１０４７．５５、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ｍ／ｚ＝９４２．９０、［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ｍ／ｚ＝８５７．２７、［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ｍ／ｚ＝７８５．９１、［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ｍ／ｚ＝７２５．５４。
【０２３９】
（実施例２）
［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）の合成
ペプチドフェノールエステルＩＸの合成：
【０２４０】
【化６７】
2014508765.tif 000068
完全に保護されたペプチジル酸を、上記の一般的な手順を用いた固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製した。切断した後、粗ペプチド１５１．０ｍｇを得た（収率６６％）。
【０２４１】
ＣＨＣｌ３／ＴＦＥ（ｖ／ｖ＝３／１、１ｍＬ）中の完全に保護されたペプチジル酸（８７．８ｍｇ、１９．３μＭ、１．１当量）およびＨＣｌ・Ｈ−Ｔｒｐ−Ａｒ（７．２ｍｇ、１７．５μＭ、１．０当量）を−１０℃まで冷却した。ＨＯＯＢｔ（３．１ｍｇ、１９．３μＭ、１．１当量）およびＥＤＣＩ（３．４μＬ、１９．３μＭ、１．１当量）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。次いで、穏やかなＮ２の流れの下で溶媒を飛ばし、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）７ｍＬを加えた。４５分間にわたって脱保護した後、ＴＦＡを飛ばし、油性残渣を、ジエチルエーテル５ｍＬを用いてすりつぶした。沈殿物をペレットにし、その後そのエーテルをデカントした。得られた固体をＨＰＬＣによって精製して、１１．０ｍｇのフェノールエステルＩＸを２２％の収率で得た。化学式：Ｃ１２８Ｈ２０１Ｎ３５Ｏ３６Ｓ２；予測質量：２８６８．４４、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｍ／ｚ＝１４３５．２２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝９５７．１５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝７１８．１１。
【０２４２】
ペプチドＸの合成：
【０２４３】
【化６８】
2014508765.tif 000069
完全に脱保護されたペプチジル酸Ｘを、上記の一般的な手順を用いたＳＰＰＳによって調製した。ＨＰＬＣによって精製した後、２８．１ｍｇのペプチドを得た（収率１１％）。化学式：Ｃ２１５Ｈ３６５Ｎ６７Ｏ７２Ｓ２、予測質量：５１０１．６４、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１７０１．５５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１２７６．４１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１０２１．３３、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝８５１．２７、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ｍ／ｚ＝７２９．８１、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ｍ／ｚ＝６３８．７０。
【０２４４】
ライゲーションされたペプチドＸＩ：
【０２４５】
【化６９】
2014508765.tif 000070
動力学的に制御されたライゲーション条件下でＸＩの合成を行った。ペプチドＩＸ（５．３ｍｇ、１．８５μｍｏｌ、１．２７当量）およびペプチドＩＩ（２．８ｍｇ、１．４５μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（６００μＬ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）に溶解させた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、１．３ｍｇのライゲーションされたペプチドＸＩを２０％の収率で得た。化学式：Ｃ２０４Ｈ３３１Ｎ５９Ｏ５６Ｓ２、予測質量：４５６７．４３、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１５２３．４８、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１１４２．８６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝９１４．４９、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝７６２．２４。
【０２４６】
ライゲーションされたペプチドＸＩＩ：
【０２４７】
【化７０】
2014508765.tif 000071
ペプチドＸＩ（２．０ｍｇ、０．４３８μｍｏｌ、１．１当量）およびペプチドＸ（２．０ｍｇ、０．３９８μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（２００μＬ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＭＰＡＡ、２０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．９）に溶解させた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、１．６ｍｇのライゲーションされたペプチドＸＩＩを４３％の収率で得た。
【０２４８】
脱硫ペプチド［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）（ＸＩＩＩ）：
【０２４９】
【化７１】
2014508765.tif 000072
精製したライゲーションされたペプチドＸＩＩ（１．６ｍｇ）の脱気ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１、０．２ｍｌ）中溶液に、０．５Ｍのｂｏｎｄ−ｂｒｅａｋｅｒ（登録商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）０．２ｍｌ、２−メチル−２−プロパンチオール０．０２ｍｌおよびラジカル開始剤（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ）０．２ｍｌを加えた。反応混合物を３７℃で２時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、０．９ｍｇの［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）（ＸＩＩＩ）を５７％の収率で得た。化学式：Ｃ４１０Ｈ６７８Ｎ１２６Ｏ１２６、予測質量：９３８３．０５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１８７７．６１、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝１５６４．８４、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ｍ／ｚ＝１３４１．４４、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ｍ／ｚ＝１１７３．８８、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ｍ／ｚ＝１０４３．５６、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ｍ／ｚ＝９３９．３０、［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ｍ／ｚ＝８５４．００、［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ｍ／ｚ＝７８２．９２、［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ｍ／ｚ＝７２２．７７、［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ｍ／ｚ＝６２６．５４。
【０２５０】
（実施例３）
［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）の合成
ペプチドＸＩＶの合成：
【０２５１】
【化７２】
2014508765.tif 000073
Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ由来のペプチド樹脂（９．１２μｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（５００μＬ）中、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ（４．８ｍｇ、１５．５０μｍｏｌ、１．７当量）、ＨＡＴＵ（１７．３ｍｇ、４５．６μｍｏｌ、５．０当量）およびＤＩＥＡ（１５．９μＬ、９１．２μｍｏｌ、１０．０当量）と混合し、室温で１０分間攪拌した。樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨを用いて数回洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥した樹脂を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）を用いて４０分間処理し、ＴＦＡをＮ２によって飛ばし、油性残渣をジエチルエーテルですりつぶした。沈殿物をペレットにし、その後そのエーテルをデカントした。得られた固体をＨＰＬＣによって精製して、８．２ｍｇのペプチドＸＩＶを５１％の収率（樹脂に基づいて算出した）で得た。
【０２５２】
ペプチドＸＶの合成：
【０２５３】
【化７３】
2014508765.tif 000074
ペプチドＩＸ（１．８ｍｇ、０．６２８μｍｏｌ、１．５当量）およびペプチドＸＩＶ（０．７４ｍｇ、０．４１８μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（１６７μＬ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）に溶解させた。反応混合物を室温で２．５時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（１：１：５％）溶液１ｍＬを用いてクエンチした。ＨＰＬＣを用いて精製することにより、０．８ｍｇのペプチドＸＶ（４４％）を得た。化学式：Ｃ１９７Ｈ３２０Ｎ５８Ｏ５４Ｓ、予測質量：４３９４．３８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１４６５．７９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１０９９．５９、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝８７９．８８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝７３３．４０。
【０２５４】
脱硫ペプチド［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）（ＸＶＩ）：
【０２５５】
【化７４】
2014508765.tif 000075
精製したライゲーションされたペプチドＸＶ（０．８ｍｇ）の脱気ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１、０．２ｍｌ）中溶液に、０．５Ｍのｂｏｎｄ−ｂｒｅａｋｅｒ（登録商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）０．２ｍｌ、２−メチル−２−プロパンチオール０．０２ｍｌおよびラジカル開始剤（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ）０．２ｍｌを加えた。反応混合物を３７℃で４時間攪拌した。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターし、ＨＰＬＣによって直接精製して、０．３ｍｇの［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）（ＸＶＩ）、３８％を得た。化学式：Ｃ１９７Ｈ３２０Ｎ５８Ｏ５４、予測質量：４３６２．４１、［２Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１７４５．９６、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１４５５．１４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１０９１．６０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝８７３．４８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝７２８．０７。
【０２５６】
（実施例４）
ｈＰＴＨｒＰ（ＸＸＸＶＩＩ）の合成
ペプチドＸＸＸの合成：
【０２５７】
【化７５】
2014508765.tif 000076
完全に保護されたペプチドＨ−ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲＲＦＦＬＨＨＬＩＡＥＩＨＴＡＥＩＲ−ＯＨ（５１０．００ｍｇ、６７．６μｍｏｌ、１．０当量）を、溶媒（１．５ｍｌ、ＣＨＣｌ３／ＴＦＥ＝３：１ｖ／ｖ）中、（２Ｓ）−１−（２−（エチルスルフィノチオイル（ｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｏｔｈｉｏｙｌ））フェノキシ）−１−オキソ−５−（３−（（２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタン−２−アミニウムクロリド（８５．３７ｍｇ、２．０当量）およびＨＯＯＢｔ（２２．０６ｍｇ、２．０当量）と混合し、次いで、−１０℃まで冷却した。混合物に、ＥＤＣ（２３．９μｌ、２．０当量）をゆっくり加えた。その後、混合物を２３℃まで温め、３時間攪拌し、ＵＰＬＣを用いてモニターした。得られた混合物を、水中５％のＨＯＡｃ（２．０ｍｌ）を用いて処理し、有機層を分離した。次いで、有機層をカクテルＢ溶液（３０．０ｍｌ）に注入し、１．５時間攪拌した。その後、その溶液をＮ２の流れの下で濃縮し、冷ジエチルエーテル（３０．０ｍｌ）に注ぎ込むことによって粗生成物を沈殿させた。懸濁液を遠心分離し、上部のエーテル層をデカントした。沈殿物をジエチルエーテル（２×３０．０ｍｌ）でパージし、沈殿物を水性ＭｅＣＮ（２０．０ｍｌ）中に溶解させ、凍結乾燥した（ｌｙｏｐｈｏｌｉｚｅｄ）。得られた粗生成物を、調製用ＨＰＬＣを用いてさらに精製して、３３．１２ｍｇのペプチドＸＸＸ（収率１１％）を得た。化学式：Ｃ２０５Ｈ３２５Ｎ６３Ｏ５３Ｓ２、予測質量４５８１．４１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１１４６．９、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝９１７．８。
【０２５８】
ペプチドＸＸＸＩの合成：
【０２５９】
【化７６】
2014508765.tif 000077
完全に保護されたペプチドＨ−ＴＳＥＶＳＰＮＳＫＰＳＰＮＴＫＮＨＰＶＲＦＧＳＤＤＥＧＲＹ−ＯＨ（１４７．０ｍｇ、２５．６μｍｏｌ、１．０当量）を、溶媒（０．２５ｍｌ、ＣＨＣｌ３／ＴＦＥ＝３：１ｖ／ｖ）中、（Ｓ）−エチル３−（（２−アミノ−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）フェニル）プロパノイル）チオ）プロパノエート（１８．１２ｍｇ、２．０当量）およびＨＯＯＢｔ（７．９６ｍｇ、２．０当量）と混合し、次いで、−１０℃まで冷却した。その混合物に、ＥＤＣ（９．１μｌ、２．０当量）をゆっくり加えた。その後、混合物を２３℃まで温め、３時間攪拌し、ＵＰＬＣを用いてモニターした。得られた混合物を、水中５％のＨＯＡｃ（０．５ｍｌ）を用いて処理し、有機層を分離した。次いで、有機層をカクテルＢ溶液（２０．０ｍｌ）に注入し、１．５時間攪拌した。その後、その溶液をＮ２の流れの下で濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０．０ｍｌ）に注ぎ込むことによって粗生成物を沈殿させた。懸濁液を遠心分離し、上部のエーテル層をデカントした。沈殿物をジエチルエーテル（２×２０．０ｍｌ）でパージし、沈殿物を水性ＭｅＣＮ（１５．０ｍｌ）中に溶解させ、凍結乾燥した。得られた粗生成物を、調製用（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）を用いてさらに精製して、２５．３４ｍｇのペプチドＸＸＸＩ（収率２９％）を得た。化学式：Ｃ１４７Ｈ２２９Ｎ４３Ｏ５１Ｓ３、予測質量３５０８．５８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１１７０．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝８７８．９。
【０２６０】
ペプチドＸＸＸＩＩの合成：
【０２６１】
【化７７】
2014508765.tif 000078
Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ由来のペプチド樹脂（０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）中、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（ＳＳＭｅ）−ＯＨ（３１．９１ｍｇ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（１１４．０２ｍｇ、３．０当量）、およびＤＩＥＡ（１０４μｌ、６．０当量）と混合し、２３℃で１０分間攪拌した。その樹脂（ｒｅａｓｉｎ）をＤＭＦ、ＤＣＭ、およびＭｅＯＨを用いて数回洗浄し、真空下で乾燥させた。樹脂を、ＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１：８）を用いて２×１時間処理することによって切断して、完全に保護されたペプチジル酸を得た。
【０２６２】
完全に保護されたペプチジル酸（２６６．８０ｍｇ、２９．７μｍｏｌ、１．０当量）および（２Ｓ）−２−（エチルスルフィノチオイル）フェニル  ２−アミノ−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）プロパノエート（１９．５８ｍｇ、２．０当量）を溶媒（５９４μｌ、ＣＨＣｌ３／ＴＦＥ＝３：１ｖ／ｖ）中に溶解させた。この混合物にＨＯＯＢｔ（９．６９ｍｇ、２．０当量）を加えた。次いで、その混合物を超音波処理し、−１０℃まで冷却した。混合物にＥＤＣ（１１．０μｌ、２．０当量）を、攪拌しながらゆっくり加えた。その後、混合物を２３℃まで温め、３時間攪拌し、ＵＰＬＣを用いてモニターした。得られた混合物を、水中５％のＨＯＡｃ（１．０ｍｌ）を用いて処理し、有機層を分離した。次いで、有機層をカクテルＢ溶液（３０．０ｍｌ）に注入し、１．５時間攪拌した。その後、その溶液をＮ２の流れの下で濃縮し、冷ジエチルエーテル（３０．０ｍｌ）に注ぎ込むことによって粗生成物を沈殿させた。その懸濁液を遠心分離し、上部のエーテル層をデカントした。沈殿物をジエチルエーテルで２回パージし（それぞれ３０．０ｍｌ）、沈殿物を水性ＭｅＣＮ（１：１ｖ／ｖ、２０ｍｌ）中に溶解させ、凍結乾燥した。得られた粗生成物を、ＨＰＬＣを用いてさらに精製して、４６．４６ｍｇのペプチドＸＸＸＩＩ（全体の収率９％）を得た。化学式：Ｃ２２５Ｈ３９１Ｎ７１Ｏ６４Ｓ４、予測質量５２３９．８４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝１３１１．９、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１０４９．５。
【０２６３】
ペプチドＸＸＸＩＩＩの合成：
【０２６４】
【化７８】
2014508765.tif 000079
ＸＸＸＩＩＩの合成をＦｍｏｃ−ＳＰＰＳによって直接遂行した（０．０５ｍｍｏｌ規模）。化学式：Ｃ１４５Ｈ２３１Ｎ４３Ｏ５５Ｓ２、予測質量３５１８．６０、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ｍ／ｚ＝１１７４．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ｍ／ｚ＝８８１．２。
【０２６５】
ペプチドＸＸＸＩＶの合成：
【０２６６】
【化７９】
2014508765.tif 000080
ペプチドＸＸＸ（２．５ｍｇ、０．３９μｍｏｌ、１．００当量）およびペプチドＸＸＸＩ（１．５４ｍｇ、０．４４μｍｏｌ、１．１２当量）を、水性ＭｅＣＮに溶解させ、凍結乾燥した。得られた出発材料に、ライゲーション緩衝液（３００μｌ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．２）を加えた。その混合物をアルゴン下、２３℃で３時間攪拌し、ＵＰＬＣを用いてモニターし、次いで、調製用ＨＰＬＣを用いて精製して、１．６３ｍｇのペプチドＸＸＸＩＶ（収率４９％）を得た。化学式：Ｃ３５７Ｈ６０２Ｎ１１４Ｏ１１８Ｓ２、予測質量８４３８．４１、［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ｍ／ｚ＝７６８．３２、［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ｍ／ｚ＝８４５．３９。
【０２６７】
ペプチドＸＸＸＶの合成：
【０２６８】
【化８０】
2014508765.tif 000081
ペプチドＸＸＸＩＩ（３．５３ｍｇ、０．７７μｍｏｌ、１．０当量）およびペプチドＸＸＸＩＩＩ（２．７０ｍｇ、０．７７μｍｏｌ、１．０当量）を、ライゲーション緩衝液（３５０μｌ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．２）に溶解させた。その混合物をアルゴン下、２３℃で３時間攪拌し、ＵＰＬＣを用いてモニターし、次いで、調製用ＨＰＬＣを用いて精製して、３．３５ｍｇのペプチドＸＸＸＶ（収率５６％）を得た。化学式：Ｃ３４０Ｈ５３６Ｎ１０６Ｏ１０３Ｓ２、予測質量７８１５．９４、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ｍ／ｚ＝１５６４．８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ｍ／ｚ＝１３０４．１。
【０２６９】
ペプチドＸＸＸＶＩの合成：
【０２７０】
【化８１】
2014508765.tif 000082
動力学的に制御された条件下でペプチドＸＸＸＩＶとペプチドＸＸＸＶのライゲーションを行った。ペプチドＸＸＸＩＶ（２．２８ｍｇ、０．２９μｍｏｌ、１．０当量）およびペプチドＸＸＸＶ（２．９５ｍｇ、０．３５μｍｏｌ、１．２当量）をライゲーション緩衝液（２９２μｌ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭのＴＣＥＰ、２００ｍＭのＭＰＡＡ、ｐＨ７．２）に溶解させた。その混合物をアルゴン下、２３℃で１６時間攪拌した。ＵＰＬＣを用いて反応をモニターし、次いで、調製用ＨＰＬＣを用いて精製して、６．９１ｍｇのペプチドＸＸＸＶＩ（酸化から保護するためのＴＣＥＰを含有する）を得た。化学式：Ｃ６９２Ｈ１１２８Ｎ２２０Ｏ２１９Ｓ３、予測質量１６１２０．３１、［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ｍ／ｚ＝１１５３．０３、［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ｍ／ｚ＝１０７６．２９、［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ｍ／ｚ＝１００９．１７、［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ｍ／ｚ＝９４９．８８、［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ｍ／ｚ＝８９７．１３。
【０２７１】
ペプチドＸＸＸＶＩＩの合成：
【０２７２】
【化８２】
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ペプチドＸＸＸＶＩを、緩衝液（１．４ｍｌ、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２）中に溶解させた。この緩衝液に、ＶＡ−０４４（３２．０ｍｇ）およびＢｏｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ（６００μｌ、ＴＣＥＰの０．５Ｍ溶液）およびｔＢｕＳＨ（１００μｌ）を加えた。この系をアルゴン雰囲気下、３７℃で２時間攪拌した。さらにＶＡ−０４４（水１．０ｍｌ中３２．０ｍｇ）およびｔＢｕＳＨ（１００μｌ）をその混合物に加え、混合物をさらに１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳを用いて反応をモニターした。生成物を、調製用ＨＰＬＣを用いて直接精製して、０．９２ｍｇのＸＸＸＶＩＩ（二段階で収率２０％）を得た。化学式：Ｃ６９２Ｈ１１２８Ｎ２２０Ｏ２１９、予測質量１６０２４．３９、［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ｍ／ｚ＝１１４７．２６、［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ｍ／ｚ＝１０７１．１５、［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ｍ／ｚ＝１００３．３９、［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ｍ／ｚ＝９４４．７４、［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ｍ／ｚ＝８９２．７６。
【０２７３】
（実施例５）
副甲状腺ホルモン類似体のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、その受容体であるＰＴＨＲ１またはＰＴＨＲを介して、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）および無機リン酸（Ｐｉ）の正常な血中濃度の維持において重要な役割を果たす。したがって、血中Ｃａ＋＋濃度の減少に対する急速な応答において、ＰＴＨは副甲状腺から分泌され、骨に作用して石灰化マトリックスの吸収を促進させ、また、腎臓に作用して糸球体濾液からのＣａ＋＋の再吸収を促進させる。骨および腎臓におけるこれらの調和した作用は、血液および体液中のＣａ＋＋レベルを狭い範囲内（約１．２ｍＭ±１０％）で維持することに役立つ。ＰＴＨＲ１は、主にＧαｓ／ｃＡＭＰ／ＰＫＡ二次メッセンジャー経路を介してシグナル伝達するクラスＢのＧタンパク質−共役受容体である。
【０２７４】
ＰＴＨ類似体のＰＴＨ受容体との結合親和性の分析
類似体の、ＰＴＨＲにＧタンパク質非依存性コンフォメーションであるＲ０で結合する能力、およびＧタンパク質依存性コンフォメーションであるＲＧで結合する能力を、膜に基づく競合アッセイにおいて評価した。Ｒ０についてのアッセイは、１２５Ｉ−ＰＴＨ（１−３４）トレーサー放射性リガンドを使用し、過剰なＧＴＰγＳの存在下で実施した。これらのＲ０条件の下で、各類似体は、低ナノモル濃度範囲〜中ナノモル濃度範囲の親和性で結合した（ＩＣ５０ｓ＝４ｎＭ〜４０ｎＭ；ＬｏｇＭ＝−８．４〜−７．４；図３４Ａ、表１）。ＲＧ結合についてのアッセイは、１２５Ｉ−Ｍ−ＰＴＨ（１−１５）トレーサー放射性リガンドおよび高親和性のＧαｓ変異体を発現している細胞由来の膜を使用して実施した。これらのＲＧ条件下で、各類似体は、ナノモル濃度以下の範囲の親和性で結合した（ＩＣ５０ｓ＝０．１２ｎＭ〜０．２５ｎＭ；ＬｏｇＭ＝−９．９〜−９．６；図３４Ｂ、表１）。
【０２７５】
ｃＡＭＰアッセイ：上記類似体のシグナル伝達特性を、ヒトＰＴＨＲ１を発現するように一過性にトランスフェクトしたインタクトなＨＥＫ−２９３細胞を使用して評価した。細胞を、ＩＢＭＸの存在下でリガンドを用いて３０分間処理し、その細胞において細胞内ｃＡＭＰレベルをＲＩＡによって測定した。その類似体を、ヒトＰＴＨＲ１およびｃＡＭＰ−応答エレメントを含有するプロモーターによる転写制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するＣＲＥ−Ｌｕｃ  ｃＡＭＰレポータープラスミドを発現するように一過性に共トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を使用してもアッセイした。これらのアッセイでは、類似体は、低ナノモル濃度〜中ナノモル濃度範囲の効力を示した（ＥＣ５０ｓ＝約１ｎＭ〜０．１ｎＭ；ＬｏｇＭ＝−９．０〜−９．９；（図３４ＣおよびＤ、表１）。
【０２７６】
（実施例６）
副甲状腺ホルモン類似体のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
マウスにおける血中Ｃａ＋＋レベルに対するＰＴＨ類似体の効果。類似体の、血中Ｃａ＋＋の増加を刺激する能力を、正常な９週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて評価した。注射する前の野生型マウスにおける血中Ｃａ＋＋濃度は約１．２４ｍＭであった（図３５Ａおよび３５Ｂ）。ＰＴＨ類似体を注射した後、血中Ｃａ＋＋レベルは大きく上昇し、注射後１時間までに約１．３６ｍＭのピークに到達した。次いで、血中Ｃａ＋＋レベルは試験した各類似体について６時間までにビヒクル対照レベルまで戻った。
【０２７７】
材料および方法
ペプチドおよび試薬：使用したＰＴＨ誘導体は、記載の通り調製したヒトＰＴＨ（１−３４）ＮＨ２、および放射性リガンド１２５Ｉ−ＰＴＨ（１−３４）（［１２５Ｉ−［Ｎｌｅ８，２１，Ｔｙｒ３４］ラット（ｒａｔ）ＰＴＨ（１−３４）ＮＨ２）および１２５Ｉ−Ｍ−ＰＴＨ（１−１５）（１２５Ｉ−［Ａｉｂ１，３，Ｎｌｅ８，Ｇｌｎ１０，Ｈａｒ１１，Ａｌａ１２，Ｔｒｐ１４，Ｔｙｒ１５］ＰＴＨ（１−１５）ＮＨ２）を含んだ。
【０２７８】
ＰＴＨ結合およびシグナル伝達アッセイ：２つの薬理学的に別個のコンフォメーション、ＲＧおよびＲ０にあるヒトＰＴＨＲへの結合を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞膜を使用して９６ウェルプレートで実施した競合反応によって評価した。簡単に述べると、Ｇタンパク質非依存性コンフォメーションであるＲ０への結合を、１２５Ｉ−ＰＴＨ（１−３４）をトレーサー放射性リガンドとして使用し、反応にＧＴＰγＳ（１×１０−５Ｍ）を含めて評価した。Ｇタンパク質依存性コンフォメーションであるＲＧへの結合を、高親和性のネガティブ・ドミナントＧαＳサブユニット（ＧαＳＮＤ）を含有する膜、およびトレーサー放射性リガンドとして１２５Ｉ−Ｍ−ＰＴＨ（１−１５）を使用して評価した。
【０２７９】
ｃＡＭＰ経路を介したシグナル伝達を、ヒトＰＴＨＲを発現するように一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞において評価した。９６ウェルプレート内の細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＩＢＭＸ、およびＰＴＨ類似体を含有する緩衝液を用いて３０分間処理し、次いで、緩衝液を５０ｍＭのＨＣｌと交換することによって細胞を溶解させ、プレートをドライアイス上で凍結させ、次いで、溶解物中のｃＡＭＰをＲＩＡによって定量化した。
【０２８０】
ｃＡＭＰの刺激についても、ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイを用い、ＷＴ  ｈＰＴＨＲをｃＡＭＰ応答エレメント／ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物（Ｃｒｅ−Ｌｕｃ）と一緒に発現するように一過性に共トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を使用して評価した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、４時間、培地中のリガンドで細胞を処理し、その後、ＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して発光を記録した。
【０２８１】
マウスにおけるＰＴＨ類似体の効果の測定：Ｃ５７ＢＬ／６系統の９週齢の雄のマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、Ｍ．Ｇ．Ｈに採用されている倫理ガイドラインに従って処置した。マウスに、ビヒクル（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ５．０）またはＰＴＨ類似体を含有するビヒクルを皮下注射した。ペプチドを２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で注射した。Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＲａｐｉｄＬａｂ  ３４８Ｃａ＋＋／ｐＨ分析機器を使用してＣａ＋＋濃度を分析するために、注射する直前、および注射後の折々に、尾静脈血を採取した。
【０２８２】
データの算出。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０ソフトウェアパッケージを使用して処理した。
【０２８３】
（実施例７）
副甲状腺ホルモン類似体の安定性試験。
【０２８４】
高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を用いて、４種の合成化合物の分解をある期間にわたってモニターした。周囲条件下（室温、空気、水溶液、および中性のｐＨ）では、分析結果により、天然のＰＴＨ（１−８４）は経時的に著しく分解され、７日間の後にはＰＴＨの９０％超（ＵＶシグナルに基づいて推定した）が断片または他の副産物に分解されることが示唆された。対照的に、類似体［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−８４）は同じ条件下でよりよい安定性を示し、７日間の後に観察された分解は１０％未満であった。２種の他の類似体、ｈＰＴＨ（１−３７）および［Ｎｌｅ８，１８］ｈＰＴＨ（１−３７）は同様の保存安定性を示し、分析結果により、どちらの場合でも７日間の後に約７０％が分解されることが示唆された。
【０２８５】
【化８３】
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【０２８６】
【化８４】
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【０２８７】
【化８５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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