(57)【要約】本発明は、特定のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸；そのようなポリペプチドを調製するための方法に；そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞に；組成物に、及び、特に、予防的、治療的、又は診断的な目的のためにそのようなポリペプチドを含む医薬的組成物に関する。特に、本発明は、ＣＸＣＲ７媒介性の腫瘍成長を阻害する免疫グロブリンの単一可変ドメインを提供する。
2014511680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ならびにＣＸＣＲ７（配列番号１）のアミノ酸残基ＷＦ１９、ならびに、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも１つのＩＳＶＤを含むコンストラクト。
【請求項２】
腫瘍成長を低下させるための及び／又は癌、好ましくは頭頸部癌もしくはＧＢＭを処置するための医薬としての使用のための、請求項１記載のコンストラクト。
【請求項３】
１００nM未満の平均Ｋｉならびに５０%以上の平均ＳＤＦ−１及びＩ−ＴＡＣ置換を伴うヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＳＤＦ−１及びＩ−ＴＡＣを特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項４】
１００nM未満の平均Ｋｉならびに５０%以上の平均ＳＤＦ−１置換を伴うヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＳＤＦ−１を特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項５】
１００nM未満の平均Ｋｉならびに５０%以上の平均Ｉ−ＴＡＣ置換を伴うヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＩ−ＴＡＣを特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項６】
平均Ｋｉが５０nM以下である、請求項３〜５のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項７】
平均Ｋｉが１０nM以下である、請求項３〜５のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項８】
平均ＳＤＦ−１又はＩ−ＴＡＣ置換が８０%以上である、請求項３〜７のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項９】
ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、５０nM未満のＫｄで結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１０】
ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１１】
ＣＸＣＲ７（配列番号１）のアミノ酸残基ＷＦ１９、ならびに、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５に結合する及び／又はそれを認識する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１２】
腫瘍成長を低下させるための及び／又は癌、好ましくは頭頸部癌もしくはＧＢＭを処置するための医薬としての使用のための、請求項１０又は１１記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１３】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、
ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、
ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１４】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、
ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、
ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１５】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１６】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１７】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１８】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項１９】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項２０】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項２１】
請求項３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項２２】
フレームワーク領域（ＦＲ）は、配列番号４〜８、９２、１０３、１０４、又は１０６（ＦＲ１）、１４〜１８、９４、１１１、１１２、又は１１４（ＦＲ２）、２４〜２８、９６、１１９、１２０、又は１２２（ＦＲ３）、及び／又は３４〜３８、９８、１２７、１２８、又は１３０（ＦＲ４）のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する、請求項１〜２１のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項２３】
請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチド。
【請求項２４】
免疫グロブリンの単一可変ドメインは、配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインからなる群より選択される、請求項２３記載のポリペプチド。
【請求項２５】
加えて、少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、場合により、配列番号４９〜５８を伴うリンカーの群より選択されるリンカーを含む、請求項２３〜２４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
加えて、ＡＬＢ８（配列番号２）を含み、場合により、配列番号４９〜５８を伴うリンカーの群より選択されるリンカーを含む、請求項２３〜２５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドは、配列番号４４〜４８、７８〜８９、及び１３１〜１４０のポリペプチドと８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項２３〜２６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
以下からなる群より選ばれるコンストラクト：
−  ＣＸＣＲ７（配列番号１）のアミノ酸残基ＷＦ１９、ならびに、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むコンストラクトであって、ここで、前記の少なくとも２つのＩＳＶＤは、同じでありうる又は異なりうる；
−  ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むコンストラクトであって、ここで、前記の少なくとも２つのＩＳＶＤは、同じでありうる又は異なりうる；
−  少なくとも１つのグループ１のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ２のＩＳＶＤを含むコンストラクト；
−  少なくとも１つのグループ１のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ３のＩＳＶＤを含むコンストラクト；
−  少なくとも１つのグループ２のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ３のＩＳＶＤを含むコンストラクト；ならびに
−  少なくとも１つの０１Ｃ１０様配列及び少なくとも１つの１４Ｇ０３様配列を含むコンストラクト。
【請求項２９】
腫瘍成長を低下させるための及び／又は癌、好ましくは頭頸部癌もしくはＧＢＭを処置するための医薬としての使用のための、請求項２８記載のコンストラクト。
【請求項３０】
以下をコードする核酸配列
ｉ）請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉｉ）請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド；又は
ｉｉｉ）請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項３１】
以下を含む医薬的組成物
ｉ）請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉｉ）請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド；又は
ｉｉｉ）請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクト；
及び、場合により、医薬的に許容可能な賦形剤。
【請求項３２】
請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは癌、好ましくは頭頸部癌、ＧＢＭ、及び／又は炎症性疾患における使用のための請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項３３】
請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは関節リウマチにおける使用のための請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項３４】
請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは多発性硬化症における使用のための請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項３５】
請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクトを産生するための方法であって、前記方法が、少なくとも以下の工程を含む：
ａ）適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、請求項３０に記載の核酸又はヌクレオチド配列を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ）請求項３〜２２のいずれかに記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項２３〜２７のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは請求項１、２、２８、又は２９のいずれかに記載のコンストラクトを単離及び／又は精製すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、生物学的材料、及びポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸を含むＣＸＣＲ７に関連する方法；そのようなポリペプチドを調製するための方法；そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞；例えば、予防的、治療的、又は診断的な目的などのために、そのようなポリペプチドを含む医薬的組成物を含む組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
当技術分野において、ｉ）ＣＸＣＲ４遮断と共に用いられるＣＸＣＲ７の遮断は、ＳＤＦ−１依存的な腫瘍進行及び転移の処置のために有用でありうる（RB Maksym et al., 2009, The role of stromal-derived factor-1 - CXCR7 axis in development of cancer, European Journal of Pharmacology, 625 (1-3), pages 31-40）及びｉｉ）一部の小分子阻害剤、例えば  ＣＣＸ７３３又はＣＣＸ２６６、ｓｉＲＮＡ及び遮断抗体（クローンＭａｂ  １１Ｇ８、Ｍａｂ  ９Ｃ４、例、ＵＳ２００７０１６７４４３を参照のこと；クローン３５８４２６（R&D Systems）；Ｍａｂ  ８Ｆ１１（Biolegend））などが、インテグリンのＣＸＣＲ４媒介性の活性化を伴う治療的干渉のために有用でありうる。（TN Hartmann et al., 2008, A crosstalk between intracellular CXCR7 and CXCR4 involved in rapid CXCL12-triggered integrin activation but not in chemokine-triggered motility of human T lymphocytes and CD34+ cells, Journal of Leukocyte Biology, 84, pages 11301140）ことが示唆されているが、ＣＸＣＲ７の生物学は、依然として、不十分にしか理解されていない。なぜなら、ＣＸＣＲ７が作用する作用機構は不明であるからである。なぜなら、ｉ）それは、細胞型に依存して、デコイ又はシグナル伝達受容体の一種として作用しうるからであり（RM Maksym et al.，上記）、そして、ｉｉ）Ｉ−ＴＡＣ及びＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１の間の相互作用は不明であるからである。
【０００３】
選択的な治療的に効果的な抗ＣＸＣＲ７薬剤の同定は、その不十分にしか理解されていない生物学（例えば、例、潜在的なアゴニストＣＣＸ７３３又はＣＣＸ２６６対アンタゴニストの作用機構、ＣＸＣＲ４との相互作用、重要なエピトープの認識、化合物ＣＣＸ７３３又はＣＣＸ２６６の交差反応、及び関連する毒性など）のため、難しいだけでなく、また、当技術分野において（例、Naunyn-Schmied Archives Pharmacology 379: 385-388を参照のこと）、抗ＧＰＣＲ治療的薬剤（例えば抗ＣＸＣＲ７薬剤など）の生成は困難であることが認められている。なぜなら、ｉ）癌細胞における活性ＣＸＣＲ７の天然の立体構造は、厳密には公知ではなく、及び、ｉｉ）ＣＸＣＲ７が低い免疫原性（また、非常に保存されている細胞外表面に曝露されたアミノ酸残基の限定された数に起因する、例、マウス−ヒトＣＸＣＲ７は９６%相同である）を示すと予測されるからである。
【０００４】
さらに、化合物（ＣＣＸ７３３，  ＣＣＸ７５４）、それらはＣＸＣＲ７へのＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ１２の結合を選択的に遮断することができ、ホモ二量体化に関して、ケモカインリガンドとように機能する、即ち、それらは、ＣＸＣＲ７ホモ二量体化を、２．５及び３．５倍だけ増強し、有意な増加（Ｐ＜０．０５）が、１０及び１００nMで最初に検出される（KE Luker et al., 2009, Imaging chemokine receptor dimerization with firefly luciferase complementation, FASEB journal, 23, pages 823-834）。
【０００５】
ＣＸＣＲ７は、腫瘍発生における潜在的な役割に起因している。なぜなら、その発現は、成長及び生存の利点を伴う細胞を提供するためである。近年、ＣＸＣＲ７が、乳房及び肺腫瘍の成長を促進し、肺転移を増強することが実証された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007 104: 15735-15740）。さらに、ＣＸＣＲ７発現は、前立腺癌における腫瘍の攻撃性と相関している（J. Biol. Chem 2008 283: 4283-4294）。ＣＸＣＲ７への小分子アンタゴニストの投与は、動物モデルにおいて腫瘍成長の妨害をもたらし、新規の癌治療薬の開発のための標的としてのＣＸＣＲ７の検証する（J. Exp. Med. 2006 203: 2201-2213）。
【０００６】
頭頸部癌は、世界において最も蔓延している腫瘍の間にある。頭頸部腫瘍の処置における進歩にもかかわらず、これらの癌を伴う患者の生存は、この疾患の局所及び遠隔転移を制御できないこと及び不十分な理解のため、過去数十年間にわたり著しくは改善されていない。頭頸部癌は、一貫して、世界において６つの最も高頻度に診断された癌の間にランクされる。口腔及び咽頭単独の癌は、世界中で約３００，０００の新たな症例及び毎年２００，０００を少し下回る死亡を占める。頭頸部癌の９０%超が、上気道消化管（口腔、咽頭、喉頭、及び副鼻腔を含む）の扁平上皮癌である。また、上皮頭頸部腫瘍は、唾液腺及び甲状腺において生じうる。頭頸部癌の本発明者らの理解における進歩ならびにその防止及び処置における進歩にもかかわらず、頭頸部癌を伴う患者の生存は、過去数十年間にわたり有意には改善されていない。
【０００７】
発明の概要
ＷＯ２００６／１１６３１９及びＷＯ２００８／０４８５１９の両方で、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）への抗体の産生が、悪名高く困難であると記述されている。実際に、従来の抗ＣＸＣＲ７抗体の生成が、限定された数の場合においてだけ、例、従来の抗体１１Ｇ８、６Ｅ１０についてのＷＯ２００６／１１６３１９において及び従来の抗体８Ｆ１１についてのZabel et al.において記載されてきた（Zabel et al., 2009, Elucidation of CXCR7 mediated signalling events and inhibition of CXCR4 mediated tumor cell transendothelial migration by CXCR7 ligands. J Immunol.; 183 (5): 3204-11）。しかし、広範な研究にもかかわらず、現在、これらの又は類似の抗体が医学的適用のために適しているか否かは不明である。
【０００８】
Zheng et al.は、肝細胞癌組織における増加したＣＸＣＲ７発現を報告した。ＣＸＣＲ７発現の下方制御は、ＨＣＣの異種移植モデルにおける腫瘍成長の低下をもたらす。しかし、著者らはＳＭＭＣ−７７２１細胞を使用したが、それは、以前にＣＸＣＲ７  ｓｈＲＮＡによりインビトロでトランスフェクトされた（Zheng et al. 2010 "Chemokine receptor CXCR7 regulates the invasion, angiogenesis and tumour growth of human hepatocellular carcinoma cells" J. Exp. Clin. Cancer Res. 29: 31）。
【０００９】
小分子は、副作用及び不要な効果について公知である。小分子ＣＣＸ７７１はＣＸＣＬ１２結合を遮断し（Carbajal et al; 2010 "Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis Proc Natl Acad Sci USA. 107: 11068-11073を参照）、他方で、それは、合成ＣＸＣＲ７リガンドＣＣＸ７７１として記載されており、それは、また。内因性ケモカインリガンドよりも大きな効力及び有効性を伴い、ＣＸＣＲ７へのβアレスチン動員を強力に刺激する（Zabel et al. 2009 "Elucidation of CXCR7-Mediated Signaling Events and Inhibition of CXCR4-Mediated Tumor Cell Transendothelial Migration by CXCR7 Ligands" J. Immun. 183: 0000-0000）。同様に、小化合物ＶＵＦ１１４０３（VU Amsterdam）は、βアレスチンアッセイにおいてアゴニストとして挙動する。
【００１０】
現在、抗ＣＸＣＲ７薬物は市場又は臨床にはない。
【００１１】
従って、この標的の医学的な潜在能力を探索及び確立することができる強力な抗ＣＸＣＲ７薬剤についての必要性がある。さらに、診断的、防止的、及び／又は治療的に適した抗ＣＸＣＲ７薬剤（例えば、本明細書において提供するものなど）についての必要性がある。
【００１２】
ＣＸＣＲ７は、多くのヒト腫瘍細胞上で（しかし、大半の健常細胞上ではない）発現される。本発明者らの腫瘍モデル系において、本発明者らは、免疫グロブリンの単一可変ドメインによるＣＸＣＲ７の低下又は阻害が、インビボで腫瘍形成を低下又は消失させることを見出した。
【００１３】
免疫グロブリン配列、例えば抗体及びそれらに由来する抗原結合フラグメント（例、免疫グロブリンの単一可変ドメイン）などを使用し、研究及び治療的適用においてそれらのそれぞれの抗原を特異的に標的にする。免疫グロブリンの単一可変ドメイン（例えば、例、ＶＨＨなど）の生成は、実験動物（例えばラマなど）の免疫化、免疫組織からのファージライブラリーのビルディング、抗原結合免疫グロブリンの単一可変ドメインをディスプレイするファージの選択、ならびに所望の特異性についての前記ドメイン及びそれらの操作コンストラクトのスクリーニングを含みうる（ＷＯ  ９４／０４６７８）。あるいは、免疫グロブリンの単一可変ドメイン（例えば、例、ｄＡｂなど）を、天然又は合成ライブラリーから直接的に抗原結合免疫グロブリンの単一可変ドメインをディスプレイするファージを選択すること、ならびに、その後の、所望の特異性について前記ドメイン及びそれらの操作コンストラクトのスクリーニングにより生成することができる（Ward et al, Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli, Nature, 1989, Oct 12; 341 (6242): 544-6）；Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11): 484-490；ならびに、例えば、ＷＯ  ０６／０３０２２０、ＷＯ  ０６／００３３８８及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願）。
【００１４】
血清アルブミンを標的にし、生物学的分子（例えば、例、免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）の半減期を延長することが、例、ＷＯ２００８／０２８９７７において記載されている。
【００１５】
一局面において、本発明は、ｉ）１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる第１ビルディングブロック（ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、ＣＸＣＲ７に対して、特に、ヒトＣＸＣＲ７に対して向けられている）；及び、ｉｉ）１つ又は複数の（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる第２ビルディングブロック（ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、血清アルブミンに対して、特に、ヒト血清アルブミンに対して向けられている（及び、さらにより好ましくは、ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、Ａｌｂ８（本明細書において定義する通り）である））を含む又はそれから実質的になるポリペプチドに関する。さらに、本発明は、また、そのようなポリペプチドをコードする核酸に；そのようなポリペプチドを調製するための方法に；そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞に；組成物に、及び、特に、そのようなポリペプチド、核酸、及び／又は宿主細胞を含む医薬的組成物に；ならびに、予防的、治療的、又は診断的な目的のための、そのようなポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び／又は組成物の使用に関する。本発明の他の局面、実施態様、利点、及び適用は、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＦＡＣＳを使用したＳＤＦ−１競合実験を示す。
【図２】図２に、ＦＡＣＳを使用したＭａｂ  １１Ｇ８競合実験を示す。
【図３】図３は、原発性腫瘍の切片におけるＣＸＣＲ７発現の免疫組織化学的分析を示す。
【図４】図４は、ｑＰＣＲによる、頭頸部癌細胞株１１Ｂ、２２Ａ、２２Ｂ、ＦａＤｕ、ＯＥ、及び９３−ＶＵ−１４７におけるＣＸＣＲ７  ｍＲＮＡのプロファイリングを示す。
【図５】図５は、リガンドＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ナノボディ０９Ａ０４、及びネガティブコントロール：無コンペティター（「−」により命名し、全結合（ＴＢ）を示している）；及びＣＸＣＬ１０（ａ特異的競合を示している）を用いた、頭頸部癌細胞株１１Ｂ、２２Ａ、２２Ｂ、ＦａＤｕ、ＯＥ、及び９３−ＶＵ−１４７での［１２５Ｉ］−ＣＸＣＬ１２競合実験を示す。
【図６】図６は、ヌードマウスにおける２２Ａ移植片を用いたインビボＣＸＣＲ７ナノボディ治療を示す：「−」ネガティブコントロール（ＰＢＳ）；ポリペプチドコンストラクトクローン０６０、クローン０８３、クローン０８５、及びクローン０９３。
【図７】図７は、ヌードマウスにおける２２Ａ移植片を用いたインビボＣＸＣＲ７ナノボディ治療を用いた５０日間の処置後の腫瘍容積を示す：「−」ネガティブコントロール（ＰＢＳ）；ポリペプチドコンストラクトクローン０８５及びクローン０９３。
【図８】図８は、２mg/ml  ＨＳＡの存在における、ＨＥＫ２９３Ｔ  ｈＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合の阻害を示す。
【００１７】
発明の説明
定義：
ａ）他に示さない又は定義しない限り、使用する全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは、当業者に明らかであろう。参照が、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ４６のパラグラフａ）において言及される標準的なハンドブックに作られる。
【００１８】
ｂ）他に示さない限り、用語「免疫グロブリンの単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）を、一般的な用語として使用し、しかし、限定しないが、抗原結合ドメイン又はフラグメント（例えばＶＨＨドメイン又はＶＨもしくはＶＬドメインなど）をそれぞれ含む。用語、抗原結合分子又は抗原結合タンパク質を互換的に使用し、また、用語ナノボディを含む。免疫グロブリンの単一可変ドメインは、さらに、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）、又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）である；より具体的には、それらは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列でありうる。したがって、免疫グロブリンの単一可変ドメインが、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適している免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（しかし、限定しないが、ＶＨＨ配列を含む）でありうる。本発明は、異なる由来の免疫グロブリン配列を含み、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、及びラクダ免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリンの単一可変ドメインは、完全にヒト、ヒト化、他に配列最適化又はキメラ免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び免疫グロブリンの単一可変ドメインの構造は、しかし、それらに限定されることを伴わず、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」から成ると考えることができるが、それらは、当技術分野において及び本明細書において「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及され；それらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」により中断され、それらは、当技術分野において、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及される。用語ナノボディ又はナノボディは、Ablynx N.V.の登録商標であり、このように、またナノボディ（登録商標）及び／又はナノボディ（登録商標）として言及されうることが記述されている。
【００１９】
ｃ）他に示さない限り、用語「免疫グロブリン配列」、「配列」「ヌクレオチド配列」、及び「核酸」は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ４６のパラグラフｂ）において記載される通りである。用語ナノボディは、また、ＷＯ  ０８／０２００７９において定義する通りであり、本明細書において記載する通り、一般的に、ＶＨＨドメイン（例、ラクダ科において生じる「重鎖だけの」抗体からのＶＨドメイン）の機能的及び／又は構造的特徴を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを指し、そのようなものとして、特に、（天然）ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨ（例えばラクダ化ヒトＶＨなど）でありうる。
【００２０】
ｄ）他に示さない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、及びマニピュレーションを実施することができ、それ自体が公知の様式において実施されており、当業者に明かであろう通りである。参照が、例えば、再び、標準的なハンドブック及び本明細書において言及する一般的な背景技術に、ならびに、本明細書において引用するさらなる参考文献に；ならびに、例えば、以下の総説、Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6):640-56；Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57；Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45；Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43に作られ、それらは、タンパク質操作のための技術、例えば親和性成熟及びタンパク質（例えば免疫グロブリンなど）の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術などを記載する。
【００２１】
ｅ）アミノ酸残基は、標準的な３文字又は１文字アミノ酸コードに従って示されうる。参照が、Ablynx N.V.の国際出願ＷＯ  ０８／０２００７９、表題「Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with Il-6 mediated signalling」のページ４８の表Ａ−２に作られる。
【００２２】
ｆ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを、ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ４９のパラグラフｅ）において記載される通りに算出又は決定してもよく、例えば、［第２ヌクレオチド配列中の対応する位置でヌクレオチドと同一である、第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］により割り、［１００%］により乗じることによるなど、ここで、第２ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各々の欠失、挿入、置換、又は付加は、第１ヌクレオチド配列と比較し、単一ヌクレオチド（位置）での違いとして考えられる；あるいは、適したコンピューターアルゴリズム又は技術を使用し、再び、ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ４９のパラグラフｅ）において記載される通り。
【００２３】
ｇ）２つ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は他のアミノ酸配列（例えば、本発明のポリペプチドなど）を比較する目的のために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージ（また、本発明において、「アミノ酸同一性」として言及する）を、ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ４９及び５０のパラグラフｆ）において記載される通りに算出又は決定してもよく、例えば、［第２アミノ酸配列中の対応する位置でアミノ酸残基と同一である、第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１アミノ酸配列中のアミノ酸の総数］により割り、［１００%］により乗じることによる、ここで、第２アミノ酸配列中のアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換、又は付加は、第１アミノ酸配列と比較し、単一アミノ酸残基（位置）での違いとして、即ち、本明細書において定義する通りの「アミノ酸の違い」として考えられる；あるいは、適したコンピューターアルゴリズム又は技術を使用することによる、再び、ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ４９及び５０のパラグラフｆ）において記載される通り。
【００２４】
また、２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインの間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れうる（ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５０に記載する通り）。
【００２５】
本明細書において記載するポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、また、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978により開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸バリエーションの頻度の分析に、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978により開発された潜在能を形成する構造の分析に、ならびにEisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984；Kyte & Doolittle;J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986により開発されたタンパク質における疎水性パターンの分析に基づきうる（全てが、本明細書において、それらの全体において、参照により組み入れられる）。ナノボディの一次、二次、及び三次構造に関する情報を、本明細書における記載において及び上に引用する一般的な背景技術において与える。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造を、例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996)；Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757；及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)により与える。従来のＶＨドメインにおいて、ＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換をこれらの位置で形成するアミノ酸残基の一部に関するさらなる情報を、上に引用する先行技術において見出すことができる。
【００２６】
ｈ）免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び核酸配列は、それらが、それらの全長にわたり１００%配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する場合、「厳密に同じ」であると言う。
【００２７】
ｉ）２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを比較する場合、用語「アミノ酸の違い」は、第２配列と比較した、第１配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す；２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインが、１、２、以上のそのようなアミノ酸の違いを含みうることが理解されている。
【００２８】
ｊ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ「含む」、あるいは、別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「から実質的になる」と言う場合、これは、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５１−５２のパラグラフｉ）において与えられる意味を有する。
【００２９】
ｋ）用語「実質的に単離された形態において」は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５２及び５３のパラグラフｊ）において、それに与えられる意味を有する。
【００３０】
ｌ）用語「ドメイン」及び「結合ドメイン」は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５３のパラグラフｋ）において、それに与えられる意味を有する。
【００３１】
ｍ）用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は、それらは、また、本明細書において互換的に使用してもよく、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５３のパラグラフｌ）において、それに与えられる意味を有する。
【００３２】
ｎ）ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５３のパラグラフｍ）にさらに記載する通り、（特異的に）結合することができ、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原、又はタンパク質について（又は、その少なくとも１つの部分、フラグメント、又はエピトープについて）親和性を有する及び／又は特異性を有するアミノ酸配列（例えば抗体、本発明のポリペプチド、又は、一般的に、抗原結合タンパク質もしくはポリペプチド又はそのフラグメントなど）は、前記の抗原決定基、エピトープ、抗原、又はタンパク質に「対する」又は「対して向けられる」と言われる。
【００３３】
ｏ）用語「特異性」は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５３−５６のパラグラフｎ）において、それに与えられる意味を有する；及び、本明細書において言及する通り、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のポリペプチドなど）分子が結合することができる異なる型の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ５３−５６に記載される通り、親和性及び／又は結合力に基づいて決定することができ、それは、また、抗原結合分子（例えば、本発明のポリペプチドなど）と関連抗原の間の結合を測定するための一部の好ましい技術を記載する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）は、それらの抗原に、１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、及び、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、及び、好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）を伴い（即ち、１０５〜１０１２リットル／モル以上、及び、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、及び、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）を伴い）結合しうる。１０４モル／リットル（又は１０４M-1より低い任意のＫＡ値）リットル／モルより大きい任意のＫＤ値は、一般的に、非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価免疫グロブリンの単一可変ドメインは、所望の抗原に、親和性５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満などを伴い結合する。抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的な結合は、それ自体が公知の任意の適した様式（例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイなど）及び当技術分野においてそれ自体が公知のその異なるバリアント；ならびに本明細書において言及する他の技術において決定することができる。当業者に明かであろう通り、及びＷＯ  ０８／０２００７９のページ５３−５６に記載される通り、解離定数は、実際の又は見かけ上の解離定数でありうる。解離定数を決定するための方法は、当業者に明らかであろうが、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５３−５６に言及される技術を含む。
【００３４】
ｐ）本発明のアミノ酸配列、化合物、又はポリペプチドの半減期は、一般的に、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）に記載する通りに定義することができ、本明細書において言及する通り、アミノ酸配列、化合物、又はポリペプチドの血清濃度が、５０%だけ、インビボで、例えば、自然の機構による、配列もしくは化合物の分解及び／又は配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離に起因して低下するために要する時間を指す。本発明のアミノ酸配列、化合物、又はポリペプチドのインビボでの半減期を、それ自体が公知の任意の様式において、例えば薬物動態解析により決定することができる。適した技術が当業者に明らかであろうが、例えば、一般的には、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）に記載される通りでありうる。また、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）に言及される通り、半減期は、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などを使用して表すことができる。参照が、例えば、下の実験部分に、ならびに、標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)など）に作られる。参照が、また、"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)に作られる。用語「半減期における増加」又は「増加した半減期」は、また、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）において定義する通りであり、特に、ｔ１／２ベータにおける増加（ｔ１／２アルファ及び／又はＡＵＣあるいは両方における増加を伴う又は伴わない）を指す。
【００３５】
ｑ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の用語「相互作用部位」は、リガンド、受容体、又は他の結合パートナーへの結合のための部位である標的又は抗原上のアミノ酸残基の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン、又はストレッチ、触媒部位、切断部位、アロステリック相互作用のための部位、標的又は抗原の多量体化（例えばホモ二量体化又はヘテロ二量体化など）に含まれる部位；あるいは標的又は抗原の生物学的作用又は機構に含まれる標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン、又はストレッチを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが結合することができ、標的又は抗原（及び／又は、標的もしくは抗原が含まれる任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構、又は生物学的効果）が調節されるようになる（本明細書において定義する通り）標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン、又はストレッチでありうる。
【００３６】
ｒ）免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドは、第１抗原に、前記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２標的又はポリペプチドに結合する親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、及び、好ましくは、少なくとも１０００倍、及び、１０，０００倍以上良い親和性／結合力（上に記載する通りで、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度、及び／又はＫｏｎ速度として適切に表現される）を用いて結合する場合、第２標的又は抗原と比較し、第１標的又は抗原について「特異的」であると言う。例えば、第１抗原は、標的又は抗原に、前記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２標的又はポリペプチドに結合するＫＤよりも、少なくとも１０倍少ない、例えば少なくとも１００倍少ない、及び、好ましくは、少なくとも１０００倍少ない、例えば１０．０００倍少ない又はそれよりさらに少ないＫＤ値を用いて結合しうる。好ましくは、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドが、第２標的又は抗原と比較し、第１標的又は抗原に「特異的」である場合、それは、前記の第１標的又は抗原に対して向けられるが（本明細書において定義する通り）、しかし、前記の第２標的又は抗原に対して向けられない。
【００３７】
ｓ）用語「交差遮断する」、「交差遮断された」、及び「交差遮断している」は、本明細書において互換的に使用され、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドが、所与の標的への本発明の他の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドのアロステリック調節を通じて、直接的に又は間接的に結合と干渉する能力を意味する。本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドが、標的への別のものの結合と干渉することができる程度は、従って、それが、本発明に従って交差遮断すると言うことができるか否かをと問わず、競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの特定の適した定量的交差遮断アッセイでは、ＦＡＣＳ又はＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用し、本発明に従った標識（例、Ｈｉｓタグ付き又は放射活性標識）免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドと他の結合薬剤の間の競合を、標的へのそれらの結合に関して測定する。実験部分は、一般的に、結合分子が、本発明に従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドを交差遮断する又は交差遮断することが可能であるかを決定するための適したＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、又は放射リガンド置換ベースのアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが認められるであろう。このように、一般的に、本発明に従った交差遮断するアミノ酸配列又は他の結合薬剤は、例えば、標的に、上の交差遮断アッセイにおいて結合しうるものであり、アッセイの間に、及び本発明の第２アミノ酸配列又は他の結合薬剤の存在において、本発明に従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドの記録された置換が、０．０１mM以下の量中に存在しているテストされる潜在的な交差遮断薬剤（交差遮断薬剤は、別の従来のモノクローナル抗体、例えばＩｇＧ、古典的な一価抗体フラグメント（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）などでありうる）及び操作バリアント（ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ）により、最大の理論的置換（例、交差遮断する必要がある、コールド（例、非標識）免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドによる置換）の６０%と１００%の間（例、ＥＬＩＳＡ／放射リガンドベースの競合アッセイにおいて）又は８０%と１００%の間（例、ＦＡＣＳベースの競合アッセイにおいて）にあるようにする。
【００３８】
ｔ）アミノ酸配列（例えば、本発明に従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドなど）は、２つの異なる抗原又は抗原決定基（例えば哺乳動物の２つの異なる種からの血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミンなど）について「交差反応性」であると言う（それが、これらの異なる抗原又は抗原決定基の両方について特異的（本明細書において定義する通り）である場合）。
【００３９】
ｕ）ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ５８及び５９のパラグラフｑ）においてさらに記載される通り、免疫グロブリンの単一可変ドメインのアミノ酸残基が、Kabat et al.（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）により与えられるＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従ってナンバリングされ、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195の文献においてラクダ科からのＶＨＨドメインに適用される通りであり、したがって、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＦＲ１は、位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＣＤＲ１は、位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＦＲ２は、位置３６〜４９のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＣＤＲ２は、位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＦＲ３は、位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＣＤＲ３は、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、及び、免疫グロブリンの単一可変ドメインのＦＲ４は、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【００４０】
ｖ）図、配列リスト、及び実験部分／実施例は、本発明をさらに例示するためだけに与え、本明細書において他に明らかに示されない限り、本発明の及び／又は添付の請求項の範囲を任意の方法で限定しているとして解釈又は理解すべきではない。
【００４１】
１．  本発明のポリペプチド及びその使用
１．１．  抗ＣＸＣＲ７ビルディングブロック
本発明のポリペプチドを、一般的に、使用し、ＣＸＣＬ１２（及び／又はＣＸＣＬ１１）及び特にヒトＣＸＣＬ１２（ＮＭ＿０００６０９）ならびに／あるいは特にヒトＣＸＣＬ１１（Ｕ６６０９６）へのＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の結合を調節、ならびに、特に、阻害及び／又は防止し、このように、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）ならびに／あるいはＣＸＣＬ１２（及び／又はＣＸＣＬ１１）及び特にヒトＣＸＣＬ１２（ＮＭ＿０００６０９）ならびに／あるいは特にヒトＣＸＣＬ１１（Ｕ６６０９６）により媒介されるシグナル伝達を調節、ならびに、特に、阻害又は防止し、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）ならびに／あるいはＣＸＣＬ１２（及び／又はＣＸＣＬ１１）及び特にヒトＣＸＣＬ１２（ＮＭ＿０００６０９）ならびに／あるいは特にヒトＣＸＣＬ１１（Ｕ６６０９６）が関与する生物学的経路を調節し、ならびに／あるいは、そのようなシグナル伝達又はこれらの経路に関連する生物学的な機構、応答、及び効果を調節する。
【００４２】
そのようなものとして、本発明のポリペプチド及び組成物を、本発明の疾患及び障害（本明細書において、また、「本発明の疾患及び障害」）の診断、防止、及び処置のために使用することができ、しかし、限定されないが、癌、例えば、癌腫、神経膠腫、中皮腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、及びバーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道の癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢癌、小腸の癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頚癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵臓内分泌癌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病又はＡＩＤＳ関連原発性滲出リンパ腫、神経外胚葉性腫瘍、横紋筋肉腫（追加の癌については、Cancer, Principles and practice (DeVita, V.T. et al. eds 1997）を参照のこと）；好ましくは、頭頸部癌、ならびに脳及び神経機能障害、例えばアルツハイマー病及び多発性硬化症など；腎不全、腎同種移植片拒絶；鼻ポリープ；慢性関節リウマチ；心臓の同種移植片拒絶；心機能不全；アテローム性動脈硬化症；喘息；糸球体腎炎；接触性皮膚炎；炎症性腸疾患；炎症性大腸疾患；乾癬；再灌流傷害；ならびに本明細書に記載する他の障害及び疾患を含む。特に、本発明のポリペプチド及び組成物は、ＣＸＣＲ７媒介性転移、走化性、細胞接着、経内皮移動、細胞増殖、及び／又は生存を含む疾患の診断、防止、及び処置のために使用することができる。
【００４３】
一般的に、前記「本発明の疾患及び障害」は、それを必要とする被験者（即ち、疾患もしくは障害又はその少なくとも１つの症状を有する及び／又は疾患もしくは障害を誘引又は発生するリスクのある）に、本発明のポリペプチド又は組成物のいずれかの（及び、特に、その医薬的に活性な量の）ならびに／あるいはＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）又はＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）が含まれる生物学的経路又は機構に対して活性である公知の活性成分の（及び、特に、その医薬的に活性な量の）適した投与により、それぞれ、診断、防止、及び／又は処置することができる疾患及び障害として定義することができる。
【００４４】
特に、本発明のポリペプチドは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）により媒介される過剰な及び／又は不要なＣＸＣＬ１２及び特にヒトＣＸＣＬ１２シグナル伝達により、あるいはＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）が関与する経路（例、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ−ＣＸＣＲ７軸）により特徴付けられる本発明の疾患及び障害の診断、防止、及び処置のために使用することができる。本発明のそのような疾患及び障害の例は、再び、本明細書における開示に基づき、当業者に明らかであろう。
【００４５】
このように、それに限定されることを伴わず、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドを、例えば、使用し、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）媒介性シグナル伝達（例えば本明細書において引用する先行技術において言及されるものなど）を調節することができる活性成分を用いて、現在、診断、防止、又は処置されている全ての疾患及び障害を診断、防止、及び／又は処置することができる。また、本発明のポリペプチドを使用し、全ての疾患及び障害（それらのために、そのような活性成分を用いた処置が、現在、開発されている、提案されてきた、又は、将来、提案又は開発されるであろう）を診断、防止、及び／又は処置することができることが想定される。また、本明細書においてさらに記載する通りのそれらの有利な特性のため、本発明のポリペプチドが、これらの公知の活性成分が使用されている又は提案もしくは開発されるであろうもの以外の他の疾患及び障害の診断、防止、及び処置のために使用されうること；及び／又は、本発明のポリペプチドが、本明細書において記載する疾患及び障害を処置するための新たな方法及びレジメンを提供しうることが想定される。
【００４６】
本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドの他の適用及び使用は、本明細書におけるさらなる開示から、当業者に明らかになるであろう。
【００４７】
一般的に、本発明の疾患及び／又は障害の診断、防止、及び／又は処置において使用することができる、薬理学的に活性な薬剤、ならびに同を含む組成物を提供すること；そのような薬剤及び組成物の投与及び／又は使用を含む、そのような疾患及び障害の診断、防止、及び／又は処置のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【００４８】
特に、当技術分野において現在使用されている及び／又は公知である薬剤、組成物、及び／又は方法と比較し、特定の利点を有するそのような薬理学的に活性な薬剤、組成物、及び／又は方法を提供することが本発明の目的である。これらの利点は、下のさらなる記載から明らかになるであろう。
【００４９】
さらに特に、本発明の疾患及び／又は障害の、ならびに本明細書において言及するさらなる疾患及び障害の診断、防止、及び／又は処置のための薬理学的に活性な薬剤、ならびに同を含む組成物として使用することができる治療的タンパク質を提供すること；ならびに、そのような治療的タンパク質及び組成物の投与及び／又は使用を含むそのような疾患及び障害の診断、防止、及び／又は処置のための方法を提供することが本発明の目的である。
【００５０】
したがって、ＣＸＣＲ７に対して、特に、温血動物からのＣＸＣＲ７、さらに特に哺乳動物（例えばマウスなど）からのＣＸＣＲ７に対して、特に、ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられている免疫グロブリンの単一可変ドメインを提供すること；ならびに、少なくとも１つのそのような免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む又はそれから実質的になるタンパク質及びポリペプチドを提供することが本発明の特定の目的である。
【００５１】
特に、温血動物、特に哺乳動物、さらに特にヒトにおける予防的、治療的、及び／又は診断的使用のために適しているそのような免疫グロブリンの単一可変ドメインならびにそのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することが、本発明の特定の目的である。
【００５２】
さらに特に、ＣＸＣＲ７に関連する及び／又はＣＸＣＲ７により媒介される１つ又は複数の疾患、障害、又は状態（例えば、本明細書において言及する疾患、障害、及び状態など）の防止、処置、軽減、及び／又は診断のために、温血動物において、特に哺乳動物において、さらに特にヒトにおいて使用することができるそのような免疫グロブリンの単一可変ドメインならびにそのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することが、本発明の特定の目的である。
【００５３】
また、ＣＸＣＲ７に関連する及び／又は媒介される１つ又は複数の疾患、障害、又は状態（例えば、本明細書において言及する疾患、障害、及び状態など）の防止及び／又は処置のために、温血動物において、特に哺乳動物において、さらに特にヒトにおいて医薬的又は獣医学的組成物の調製物中で使用することができるそのような免疫グロブリンの単一可変ドメインならびにそのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することが、本発明の特定の目的である。
【００５４】
本発明において、一般的に、これらの目的は、本明細書において記載する、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、及び組成物の使用により達成される。
【００５５】
一般的に、本発明は、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられる（本明細書において定義する通り）及び／又はそれに特異的に結合することができる（本明細書において定義する通り）免疫グロブリンの単一可変ドメイン；ならびに、少なくとも１つのそのようなアミノ酸配列を含む、化合物及びコンストラクト、ならびに、特に、タンパク質及びポリペプチドを提供する。
【００５６】
さらに特に、本発明は、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、本明細書において定義する通りである親和性（ＫＤ値（実際の又は見かけ上の）、ＫＡ値（実際の又は見かけ上の）、Ｋｏｎ速度及び／又はＫｏｆｆ速度として、あるいはＩＣ５０値として適切に測定される及び／又は表され、本明細書においてさらに記載する通り）を用いて結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチド；ならびに、少なくとも１つのそのようなアミノ酸配列を含む、化合物及びコンストラクト、ならびに、特に、タンパク質及びポリペプチドを提供する。
【００５７】
特定の局面において、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、それらは：
−  ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、１００nMより低い、より好ましくは５０nMより低い、さらにより好ましくは２０nMより低い、最も好ましくは１０nMより低いＥＣ５０を伴い、結合ＦＡＣＳアッセイにおいて、例えば、実験部分（実施例８）において記載する通りに結合し、ここで、ポリペプチドは、１つだけのヒトＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン単位を含む；
及び／又は、それらは：
−  ヒトＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）を、ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）から、１００nM以下の平均Ｋｉ値で、より好ましくは２０nM以下の平均Ｋｉ値で、さらにより好ましくは１０nM以下の平均Ｋｉ値で、アッセイにおいて、例えば、実験部分（実施例９及び１０）に記載する通りに、完全に置換し、ここで、ポリペプチドは、１つだけのヒトＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン単位を含み、ここで、完全置換は、約６０%〜８０%及びそれ以上の平均ＣＸＣＬ１２置換を意味し（実施例９のリガンド置換アッセイに従って測定した場合）、又は、ここで、完全置換は、約８０%〜１００%及びそれ以上の平均ＣＸＣＬ１２置換を意味し（実施例１０のＦＡＣＳベースの競合アッセイに従って測定した場合）；
及び／又は、それらは：
−  ヒトＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）を、ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）から、１０００nM以下の平均Ｋｉ値で、より好ましくは平均Ｋｉ値５００nM以下で、さらにより好ましくは平均Ｋｉ値１００nM以下で、さらにより好ましくは２０nM以下の平均Ｋｉ値で、さらにより好ましくは１０nM以下の平均Ｋｉ値で、アッセイにおいて、例えば、実験部分（実施例９及び１０）に記載する通りに、完全に置換し、ここで、ポリペプチドは、１つだけのヒトＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン単位を含み、ここで、完全置換は、約６０%〜８０%及びそれ以上の平均ＣＸＣＬ１１置換を意味し（実施例９のリガンド置換アッセイに従って測定した場合）、又は、ここで、完全置換は、約８０%〜１００%及びそれ以上の平均ＣＸＣＬ１２置換を意味し（実施例１０のＦＡＣＳベースの競合アッセイに従って測定した場合）；
及び／又は、それらは：
−  ヒトＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）を、ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）から、１００nM以下の平均Ｋｉ値で、より好ましくは２０nM以下の平均Ｋｉ値で、さらにより好ましくは１０nM以下の平均Ｋｉ値で、アッセイにおいて、例えば、実験部分（実施例９及び１０）に記載する通りに、部分的に置換し、ここで、ポリペプチドは、１つだけのヒトＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン単位を含み、ここで、部分的置換は、約４０%〜６０%の平均ＣＸＣＬ１２置換を意味し（実施例９のリガンド置換アッセイに従って測定した場合）、又は、ここで、部分的置換は、約５０%〜８０%の平均ＣＸＣＬ１２置換を意味し（実施例１０のＦＡＣＳベースの競合アッセイに従って測定した場合）；
及び／又は、それらは：
−  ヒトＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）を、ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）から、１０００nM以下の平均Ｋｉ値で、より好ましくは平均Ｋｉ値５００nM以下で、さらにより好ましくは平均Ｋｉ値１００nM以下で、さらにより好ましくは２０nM以下の平均Ｋｉ値で、さらにより好ましくは１０nM以下の平均Ｋｉ値で、アッセイにおいて、例えば、実験部分（実施例９及び１０）に記載する通りに、部分的に置換し、ここで、ポリペプチドは、１つだけのヒトＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン単位を含み、ここで、部分的置換は、約４０%〜６０%の平均ＣＸＣＬ１１置換を意味し（実施例９のリガンド置換アッセイに従って測定した場合）、又は、ここで、部分的置換は、約５０%〜８０%の平均ＣＸＣＬ１２置換を意味し（実施例１０のＦＡＣＳベースの競合アッセイに従って測定した場合）；
及び／又は、それらは：
−  ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、１００nM以下の平均Ｋｄ値を伴い、より好ましくは５０nM以下の平均Ｋｄ値で、さらにより好ましくは４０nM以下、例えば３０未満、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、３ｎＭ以下など、例えば１nM未満など、あるいは、最も好ましくはさらに０．１nM未満の平均Ｋｄ値で結合する。
【００５８】
（ヒト）ＣＸＣＲ７への本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの結合は、本明細書において記載する通り、（ヒト）ＣＸＣＲ７からの（ヒト）ＣＸＣＬ１１及び／又はＣＸＣＬ１２の置換をもたらしうることが認められるはずである。（ヒト）ＣＸＣＲ７への本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの結合は、本明細書において記載する通り、その同族受容体、例えば（ヒト）ＣＸＣＲ７などへの（ヒト）ＣＸＣＲ１１及び／又はＣＸＣＲ１２の結合の阻害をもたらしうることがさらに認められるはずである。
【００５９】
既に言及した通り、一部の特定の、しかし、非限定的な局面（本明細書においてより詳細に記載する）において、本発明は以下を提供する：
ＣＸＣＲ７に対して向けられている（本明細書において定義する通り）及びリガンド結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、本明細書においてさらに記載する通り）すること、ならびに、特に、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１の結合（本明細書においてさらに記載する通り）を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、本明細書においてさらに記載する通り）することが可能であるアミノ酸配列。これらのアミノ酸配列は、また、本明細書において、「ＣＸＣＲ−７結合アミノ酸配列」又は「ＣＸＣＲ７結合ブロック」として言及される。好ましくは、これらのＣＸＣＲ７結合アミノ酸配列はＩＳＶＤ（本明細書において記載する通り）であり、その場合において、それらは、また、「ＣＸＣＲ７結合ＩＳＶＤ」として言及される。好ましくは、任意のＣＸＣＲ７結合アミノ酸配列、ＣＸＣＲ７結合ビルディングブロック、又はＣＸＣＲ７結合ＩＳＶＤは、それらが、遮断活性を有する、即ち、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、、例えばAlphascreenアッセイにより又はＦＡＣＳ競合アッセイ（例、本明細書において記載する通り）により決定することができる。好ましくは、遮断活性を、実施例９に記載する通り、ＦＡＣＳ競合アッセイにより決定する。好ましくは、ＩＳＶＤは、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ７細胞において、ＣＸＣＲ７への遮断又は競合ＳＤＦ−１結合の遮断活性又は競合能力を有し、６００nM未満、しかし、好ましくは、５００nM、４００nM、３００nM、２００nM、１００nM又はさらにそれより低い平均Ｋｉを伴う。
【００６０】
−  例えば、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて遮断活性又は競合能力を有し、１００nM未満、より好ましくは７５nM、５０nM未満、又はさらにそれより低く、例えば４０nM又は３０nM、２５nM又は２４nM未満など、あるいはさらにより好ましくは２２ｎＭ未満の平均Ｋｉを伴う。
【００６１】
−  例えば、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤは、このアッセイにおいて遮断活性又は競合能力を有し、１５０nM未満、より好ましくは１００nM、９０nM、８０nM未満、又はさらにそれより低く、例えば７０nM又は６０nM、５０nM又は４０nM、３０nM、２０nM、１５nM又は１０nM、５nM、あるいはさらにより好ましくは４nM未満の平均Ｋｉを伴う。
【００６２】
１つの特定の、しかし、非限定的な局面において、「ＣＸＣＲ−７結合アミノ酸配列」又は「ＣＸＣＲ７結合ブロック」（の一部）は、それらが、βアレスチン動員を阻害又は遮断することが可能であるようになりうる（及び、好ましくは、また、そうなる）。好ましくは、任意のＣＸＣＲ７結合アミノ酸配列、ＣＸＣＲ７結合ビルディングブロック、又はＣＸＣＲ７結合ＩＳＶＤは、それらが遮断活性を有するようにするが（即ち、ＳＤＦ−１媒介性ＣＸＣＲ７シグナル伝達を部分的に又は完全に遮断又は阻害する）、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより（例えば、任意の適したβアレスチン動員アッセイにより）、本明細書において記載する通りに決定することができる。
【００６３】
好ましくは、遮断活性又は阻害能力は、実施例１５において記載する通り、βアレスチンアッセイにより決定する。好ましくは、ＩＳＶＤは、PathHunter eXpress βアレスチンアッセイ（DiscoverX）においてリガンド（例、ＳＤＦ−１）誘導性βアレスチンの遮断活性又は阻害能力を有し、２５%を上回る、３０%を上回る、しかし、好ましくは、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%又はさらにそれ以上のβアレスチン動員の%阻害を伴う。
【００６４】
−  例えば、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤは、遮断活性又は阻害能力をこのアッセイにおいて有し、５０%を上回る、より好ましくは６０%を上回る、７０%又はさらにそれを上回る、例えば７５%又は８０%を上回るなど、８５%又はさらにそれを上回る、好ましくは９０%を上回る%阻害を伴う。
【００６５】
ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドの結合、置換、移動、あるいは他のインビボ及び／又はインビトロでの効力についての一部の好ましい技術的値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【００６６】
また、本記載及び請求項において、以下の用語を、以下の通りに定義する：
【００６７】
Ａ）０１Ｃ１０様配列：「０１Ｃ１０様配列」、「０１Ｃ１０様ＩＳＶＤ」、「０１Ｃ１０様ビルディングブロック」又は「グループ１  ＩＳＶＤ」を、以下を含むＩＳＶＤ（本明細書において記載される通り）として定義する：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから実質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶＤ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＣＸＣＬ１１及び／又はＣＸＣＬ１２結合を部分的に又は完全に遮断する（上に記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００６８】
また、本明細書において言及する通り、０１Ｃ１０様配列（の一部）が、それらが、ＳＤＦ−１結合（実施例９及び１０を参照のこと）を、例えば、実施例１０において使用する置換アッセイにおいて、阻害、遮断、又は置換することが可能であるようにしうる（及び、好ましくは、また、そうである）。好ましくは、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００６９】
例えば、そのような０１Ｃ１０様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる。特に、０１Ｃ１０様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）を含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）を含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）を含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる。再び、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。具体的に好ましい局面において、「０１Ｃ１０様配列」、「０１Ｃ１０様ＩＳＶＤ」、「０１Ｃ１０様ビルディングブロック」、又は「グループ１  ＩＳＶＤ」は、以下を含むＩＳＶＤである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；ここで、そのようなＩＳＶＤ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれ、ｄ）及びｅ）の下で定義され；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義され；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される。より好ましくは、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれ、ｄ）、ｅ）、及びｆ）の下で定義される。再び、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７０】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った０１Ｃ１０様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、０１Ｃ１０様配列が、この局面に従っている場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７１】
特に好ましい０１Ｃ１０様配列：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）である。
【００７２】
このパラグラフＡ）に記載する全ての０１Ｃ１０様配列において、フレームワーク配列が、さらに、本明細書において記載されうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、０１Ｃ１０のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、０１Ｃ１０の配列と所与の配列の配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲを無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果としての０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７３】
１つの特定の局面において、０１Ｃ１０様配列は、アミノ酸配列０１Ｃ１０（配列番号９１）と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%など、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶＤである。例えば、この局面に従った０１Ｃ１０様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうるが、特に（しかし、限定を伴わず）、ＮＹＡＭＧ（配列番号９３）（ＣＤＲ１）；ＡＩＴＰＲＡＦＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）（ＣＤＲ２）；及びＱＬＶＧＳＧＳＮＬＧＲＱＥＳＹＡＹ（配列番号９７）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような０１Ｃ１０様ＩＳＶＤ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果としての０１Ｃ１０様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。１つの特別な局面において、任意の０１Ｃ１０様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【００７４】
Ｂ）１４Ｇ０３様配列：「１４Ｇ０３様配列」、「１４Ｇ０３様ＩＳＶＤ」、「１４Ｇ０３様ビルディングブロック」又は「グループ２  ＩＳＶＤ」を、以下を含むＩＳＶＤ（本明細書において記載される通り）として定義する：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから実質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶＤ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＣＸＣＬ１１及び／又はＣＸＣＬ１２結合を部分的に又は完全に遮断する（上に記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはβアレスチン動員を阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７５】
また、本明細書において言及する通り、１４Ｇ０３様配列（の一部）が、それらが、ＳＤＦ−１結合（実施例９及び１０を参照のこと）を、例えば、実施例１０において使用する置換アッセイにおいて、阻害、遮断、又は置換することが可能であるようにしうる（及び、好ましくは、また、そうである）。好ましくは、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７６】
例えば、そのような１４Ｇ０３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる。特に、１４Ｇ０３様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）を含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）を含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）を含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから実質的になりうる。再び、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７７】
具体的に好ましい局面において、「１４Ｇ０３様配列」、「１４Ｇ０３様ＩＳＶＤ」、「１４Ｇ０３様ビルディングブロック」、又は「グループ２  ＩＳＶＤ」は、以下を含むＩＳＶＤである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶＤ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはβアレスチン動員を阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれｄ）、ｅ）、及びｆ）の下に定義される通りである。再び、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７８】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った１４Ｇ０３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、１４Ｇ０３様配列が、この局面に従っている場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断する（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおいて腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する（全て、本明細書において記載する通り）。
【００７９】
特に好ましい１４Ｇ０３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）である。
【００８０】
このパラグラフＡ）に記載される全ての１４Ｇ０３様配列において、フレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載される通りでありうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、１４Ｇ０３のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、所与の配列と、１４Ｇ０３の配列との配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲは無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果としての１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断し（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおける腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはβアレスチン動員を阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識するようにする（全てが本明細書において記載する通り）。
【００８１】
１つの特定の局面において、１４Ｇ０３様配列は、アミノ酸配列１４Ｇ０３（配列番号４３）と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%、例えば、少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶＤである。例えば、この局面に従った１４Ｇ０３様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうる、特に（しかし、限定を伴わず）、ＩＮＹＭＧ（配列番号１３）（ＣＤＲ１）；ＴＬＴＳＧＧＳＴＮＹＡＧＳＶＫＧ（配列番号２３）（ＣＤＲ２）；及びＧＧＴＬＹＤＲＲＲＦＥＳ（配列番号３３）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような１４Ｇ０３様ＩＳＶＤ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果としての１４Ｇ０３様ＩＳＶＤが遮断活性を有する、例えば、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を部分的に又は完全に遮断し（本明細書において記載する通り）、ならびに／あるいは異種移植片モデルにおける腫瘍形成を低下及び／又は阻害し、ならびに／あるいはβアレスチン動員を阻害し、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識するようにする（全てが本明細書において記載する通り）。１つの特別な局面において、任意の１４Ｇ０３様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【００８２】
ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への結合のために、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドは、通常、そのアミノ酸配列内に、１つ又は複数のアミノ酸残基あるいはアミノ酸残基の１つ又は複数のストレッチ（即ち、互いに隣接している又は互いに近接近している、即ち、アミノ酸配列の一次又は三次構造において、２つ又はアミノ酸残基を含む各々の「ストレット」を伴う）を含み、それを介して、本発明のアミノ酸配列は、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができ、そのアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチは、このように、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合するための「部位」を形成する（また、本明細書において、「抗原結合部位」として言及する）。
【００８３】
本発明により提供された免疫グロブリンの単一可変ドメインは、好ましくは、実質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）にあり、又は、本発明のタンパク質又はポリペプチドの部分を形成し（本明細書において定義する通り）、それは、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含みうる又はそれから実質的になりうる、及び、それは、場合により、１つ又は複数のさらなる免疫グロブリンの単一可変ドメイン（全てが、場合により、１つ又は複数の適したリンカーを介して連結される）、及び／又は１つ又は複数のさらなる結合ドメイン、結合単位、アミノ酸配列、又は他の（官能）基もしくは部分を含みうるが、それらは、好ましくは、また、１つ又は複数の所望の特性をコンストラクトに付与する（同の一部の非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう）。
【００８４】
本発明により提供されるポリペプチド又は免疫グロブリンの可変ドメインは、優先的に、腫瘍形成をインビボで低下させる。
【００８５】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ７に対する少なくとも２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むコンストラクトを提供する。より好ましくは、ＣＸＣＲ７に対する前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインは、以下の表Ｂ−２に関するセクション１．５において定義する通り、ＣＸＣＲ７に対するポリペプチド及び免疫グロブリンの単一可変ドメインのバリアントより選択され（例、グループ２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン）、ここで、ＣＸＣＲ７に対する前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインは、同じ又は異なりうる。好ましくは、ＣＸＣＲ７に対する前記の２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインが、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤ（例えば１４Ｇ０３、０８Ａ０５、０８Ａ１０、０７Ｃ０３、及び０７Ｂ１１など）から選ばれる。別のさらに好ましい実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ７に対する少なくとも２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むコンストラクトを提供し、以下の表Ｂ−２（例、グループ１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン）に関して、セクション１．５において定義する通り、ＣＸＣＲ７に対するポリペプチド及び免疫グロブリンの単一可変ドメインのバリアントより選択され、ここで、ＣＸＣＲ７に対する前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインは同じ又は異なりうる。好ましくは、ＣＸＣＲ７に対する前記の２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインは、０１Ｃ１０（配列番号９１）、０１Ｂ１２（配列番号１００）、０１Ｆ１１（配列番号１０１）、又は０１Ｂ１０（配列番号１０２）より選ばれる。
【００８６】
少なくとも１つのグループ１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び少なくとも１つのグループ２のＩＳＶＤを含む二特異的コンストラクトが、腫瘍成長をインビボで低下させるために特に適していることが、予想外に実証されている。特に、これらのコンストラクトが、ＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合を阻害し、腫瘍成長をインビボで阻害し、ならびにβアレスチン動員を阻害することが示されてきた。さらに、グループ２のＩＳＤＶの結合有効性の観点から、例えば、ＳＤＦ−１置換により特徴付けられる通り、少なくとも１つのグループ１のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ２のＩＳＶＤを含むこれらのコンストラクトが、標的により良く結合する（例、実施例１７を参照のこと）。これは、腫瘍成長を阻害するためのより低い用量をもたらしうる。また、βアレスチン動員の同時阻害は、長期間の抗腫瘍効果をもたらしうる。
【００８７】
したがって、さらなる好ましい実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ７に対する少なくとも２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むコンストラクトを提供し、ここで、ＣＸＣＲ７に対する前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つ（即ち、ＣＸＣＲ７に対する「第１」免疫グロブリンの単一可変ドメイン）は、０１Ｃ１０様、例えば０１Ｃ１０（配列番号９１）、０１Ｂ１２（配列番号１００）、０１Ｆ１１（配列番号１０１）、又は０１Ｂ１０（配列番号１０２）、あるいは以下の表Ｂ−２に関するセクション１．５において定義する通りのそれらのバリアントであり（例、グループ１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン）、ここで、ＣＸＣＲ７に対する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（即ち、ＣＸＣＲ７に対する「第２」免疫グロブリンの単一可変ドメイン）が、ＣＸＣＲ７に対する「第１」免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はそのバリアントとは異なる、以下の表Ｂ−２に関するセクション１．５において定義する通りのポリペプチド及び免疫グロブリンの単一可変ドメインのバリアントより選択される。好ましくは、ＣＸＣＲ７に対する前記「第１」免疫グロブリンの単一可変ドメインは０１Ｃ１０であり、ＣＸＣＲ７に対する前記「第２」免疫グロブリンの単一可変ドメインは、１４Ｇ０３様、例えば１４Ｇ０３、０８Ａ０５、０８Ａ１０、０７Ｃ０３、及び０７Ｂ１１などから選ばれる。
【００８８】
実施例１１に記載する通り、０１Ｃ１０により表される通り、グループ１の免疫グロブリンの単一可変ドメインによるＣＸＣＲ７への結合は、Ｗ１９を変異させることにより影響される。対照的に、全てのテストされた免疫グロブリンの単一可変ドメインの結合が、Ｍ３３変異の影響を受けたが、グループ１のＩＳＶＤは受けなかった。グループ１のＩＳＶＤは、好ましくは、Ｓ２３及びＤ２５を認識し、及び／又は、また、それらに結合することがさらに示された（データ示さず）。
【００８９】
グループ１のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、「グループ１のエピトープ」を結合／認識することにより特徴付けることができる。グループ１のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合する及び／又はそれを認識する。グループ１のエピトープは、ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｓ２３及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５を含む。グループ１のＩＳＶＤは、とりわけ、０１Ｃ１０（配列番号９１）、０１Ｂ１２（配列番号１００）、０１Ｆ１１（配列番号１０１）、又は０１Ｂ１０（配列番号１０２）により表され、明らかに、グループ２のエピトープとは別個のエピトープをヒットする；
【００９０】
グループ２のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、「グループ２のエピトープ」を結合／認識することにより特徴付けることができる。グループ２のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｗ１９、アミノ酸残基Ｓ２３、及び／又はアミノ酸残基Ｄ２５に結合しない及び／又はそれを認識しない。グループ２のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、及び、場合によりアミノ酸残基Ｖ３２、及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する。グループ２のエピトープは、ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、及び、場合によりアミノ酸残基Ｖ３２、及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７を含む。グループ２のＩＳＶＤは、１４Ｇ０３様ＩＳＶＤ、例えば、１４Ｇ０３（０９Ａ０４）、０８Ａ０５、０８Ａ１０、及び０７Ｃ０３により表され、明らかに、グループ１とは別個のエピトープをヒットする。好ましくは、グループ２のＩＳＶＤは、本明細書において定義する通り、βアレスチン動員を阻害する；及び、
【００９１】
グループ３のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、「グループ１」エピトープ（の部分）ならびに「グループ２」エピトープ（の部分）を結合する／認識することにより特徴付けることができる。グループ３のＩＳＶＤ又はポリペプチドは、０７Ｂ１１により表され、明らかに、グループ１及びグループ２の中間である。
【００９２】
当業者は、エピトープを決定するための当技術分野において一般的な方法に精通している（例えば、実施例１１において提供するものなど：本発明の「エピトープマッピング」）。
【００９３】
したがって、本発明は、ポリペプチドＩＳＶＤ、ならびに、ＣＸＣＲ７中のＷ１９、及び、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５を認識及び／又は結合する、（従来の）抗体、又はその部分（例えばＦｃ、Ｆａｂ、ミニボディなど）に関する。
【００９４】
上に記載する抗ＣＸＣＲ７／ＣＸＣＲ７二特異的コンストラクトは、適切に半減期が延長されうるが（例、ペグ化、血清アルブミンへの融合、あるいは血清タンパク質、例えば血清アルブミンなどに結合することができるペプチド又は結合単位への融合による、本明細書においてさらに記載する通り）、このように、例えば、場合により１つ又は複数の適したスペーサー又はリンカーを介して連結されている、血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメイン（例えば本明細書において記載するものなど）をさらに含みうる。
【００９５】
再び、そのようなさらなる結合ドメイン、結合単位、アミノ酸配列、又は他の（官能）基もしくは部分は、１つ又は複数の他の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えば１つ又は複数の（単一）ドメイン抗体、ｄＡｂ又はナノボディ（例、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨ）を含み、本発明の「二特異的」タンパク質又はポリペプチドを提供する（即ち、少なくとも１つ、例えば１つ又は２つの、ＣＸＣＲ７に対して向けられた免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び少なくとも１つ、例えば１つ又は２つの、別の標的に対して向けられた免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む、本発明のポリペプチド）。
【００９６】
例えば、特定の、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のコンストラクト、タンパク質、又はポリペプチドが、増加した半減期を伴い、例えば、機能化により、及び／又は、コンストラクト中に、コンストラクトの半減期を増加させる部分又は結合単位を含むことにより提供されたであろう。そのような機能化、部分、又は結合単位の例は、当業者に明らかでありうるが、例えば、ペグ化、血清アルブミンへの融合、又は血清タンパク質（例えば血清アルブミンなど）に結合することができるペプチドもしくは結合単位への融合を含みうる。
【００９７】
後者のコンストラクト（即ち、少なくとも１つ、例えば１つ又は２つの、本発明のアミノ酸配列及び少なくとも１つ、例えば１つ又は２つの、血清タンパク質、例えば血清アルブミンなどに結合することができるペプチド又は結合単位を含む融合コンストラクト）において、血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインは、コンストラクトの半減期を増加させることが可能である任意の適した血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインでありうるが（血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインを伴わない同じコンストラクトと比較し）、特に、出願者によりＷＯ  ２００８／０６８２８０において（ならびに、特に、ＷＯ  ２００９／１２７６９１及びＷＯ  ２０１１／０９５５４５において、両方が出願者による）記載される通りの血清アルブミン結合ペプチド、又は血清アルブミン結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン（例えば血清アルブミン結合ナノボディ；例えば、Ａｌｂ−１又はＡｌｂ−１のヒト化バージョン、例えばＡｌｂ−８など。その参照が、例えば、ＷＯ  ０６／１２２７８７に作られる）でありうる。
【００９８】
半減期に関して、本明細書において記載する種々の半減期延長技術を使用することにより（例えば、ＷＯ  ２００８／０６８２８０、ＷＯ  ２００９／１２７６９１、及び／又はＷＯ  ２０１１／０９５５４５に従った血清アルブミン結合ペプチドを適切に選ぶことによる）、本発明のコンストラクト又はポリペプチドの半減期が、意図される（治療的及び／又は診断的）適用のために（好ましくは）適切に「合わせ」、ならびに／あるいは、所望の治療的及び／又は薬理学的効果と可能な非所望の副作用の間での最善のバランスを得ることができることを、本発明において注目すべきである。
【００９９】
このように、例えば、限定を伴わず、本発明の好ましい局面は、ヒトＣＸＣＲ７に対して向けられた１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（又は、あるいは、ヒトＣＸＣＲ７に対して向けられた２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（それらは同じ又は異なりうる）、それらが同じ又は異なる場合、本発明の「二価」ポリペプチド、あるいは、それらが異なる場合、本発明の「二親性」ポリペプチドを提供する）及びヒト血清アルブミンに対して向けられた１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ペプチドリンカーにより連結されている）（本明細書において定義する通り）から実質的になる「二特異的」ポリペプチドを提供し、本発明の二特異的ポリペプチドをそれぞれ提供する（全てが、本明細書において記載する通り）。そのようなタンパク質又はポリペプチドは、また、実質的に単離形態でありうる（本明細書において定義する通り）。
【０１００】
別の特定の、しかし、非限定的な局面において、本発明のアミノ酸配列（例えばナノボディなど）又は本発明のポリペプチド（例えば本発明の二価、二親性、又は二特異的ポリペプチドなど）は、毒素に又は（細胞）傷害性残基、部分、もしくはペイロードに（再び、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して）適切に連結されうる。例えば、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドに連結し、細胞傷害性化合物（即ち、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドに基づく抗体−薬物コンジュゲート又は「ＡＤＣ」）を提供することができる適した（細胞）傷害性部分、化合物、ペイロード、又は残基の例が、当業者に明らかであろう。参照が、例えば、Ducry and Stump, Bioconjugate Chem., 2010, 21 (1), pp.5-13による総説に作られる。本発明のそのような細胞傷害性アミノ酸配列又はポリペプチドは、特に、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが（例、癌の処置において）向けられる標的を発現する細胞を殺す、あるいは、そのような細胞の成長及び／又は増殖を低下又は遅らせることが意図される、それらの適用のために有用でありうる／適しうる。通常は、しかし、限定を伴わず、本発明の（細胞）傷害性ポリペプチドは、半減期が延長されていない、あるいは、限定された及び／又は厳密に制御された半減期の延長だけを有しうる。
【０１０１】
別の局面において、本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列（即ち、ＣＸＣＲ７に対する免疫グロブリンの単一可変ドメイン）は、ＣＸＣＲ４に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインに適切に連結してもよく、ＣＸＣＲ７及びＣＸＣＲ４の両方に対して向けられている本発明の二特異的ポリペプチドを提供する。
【０１０２】
例えば、この局面において、少なくとも１つ（例えば１つ又は２つなど）の本発明のアミノ酸配列を、少なくとも１つ（例えば１つ又は２つなど）のＣＸＣＲ４に対する免疫グロブリンの単一可変ドメインに適切に連結してもよい。
【０１０３】
そのようなコンストラクトにおいて使用することができる、ＣＸＣＲ４に対する免疫グロブリンの単一可変ドメインの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、以下である（又は、以下より適切に選んでもよい）：
−  Ablynx N.V.による国際出願ＷＯ  ０９／１３８５１９からの、ＣＸＣＲ４に対する免疫グロブリンの単一可変ドメイン（特に、ナノボディの１つ）（例えば、限定を伴わず、ＷＯ  ０９／１３８５１９の表Ｂ−１．１中の２３８Ｄ２／配列番号２３８及び２３８Ｄ４／配列番号２３９）；ならびに／あるいは
−  ２０１０年６月２５日に出願されたAblynx N.V.による非公開前米国出願において記載されるアミノ酸配列２３８Ｄ２及び２３８Ｄ４の配列最適化／改善バリアント；ならびに／あるいは
−  ２０１０年１０月４日に出願されたAblynx N.V．によるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４７６６において記載される通りの２３８Ｄ２及び／又は２３８Ｄ４と同じエピトープに結合することが可能である免疫グロブリンの単一可変ドメイン；ならびに／あるいは
−  ２０１１年１月７日に出願されたAblynx N.V.によるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１５６のページ７〜１３に記載されている１０Ｅ９型配列、２８１Ｅ１０型配列、１０Ｅ１２型配列、１０Ａ１０型配列、１０Ｇ１０型配列、１４Ａ２型配列、１５Ａ１型配列、１５Ｈ３型配列、及び／又は２８３Ｂ６型配列；ならびに／あるいは
−  ２０１１年１月７日に出願されたAblynx N.V．によるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１５６のページ１５〜４７に記載されている１０Ｅ９型配列、２８１Ｅ１０型配列、１０Ｅ１２型配列、１０Ａ１０型配列、１０Ｇ１０型配列、１４Ａ２型配列、１５Ａ１型配列、１５Ｈ３型配列、及び／又は２８３Ｂ６型配列。
【０１０４】
上に記載する抗ＣＸＣＲ７／ＣＸＣＲ４二特異的コンストラクト（ならびに、本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、他の二特異的コンストラクト）は、適切に半減期が延長されうるが（例、ペグ化、血清アルブミンへの融合、あるいは血清タンパク質、例えば血清アルブミンなどに結合することができるペプチド又は結合単位への融合による、本明細書においてさらに記載する通り）、このように、例えば、場合により１つ又は複数の適したスペーサー又はリンカーを介して連結されている、血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメイン（例えば本明細書において記載するものなど）をさらに含みうる。
【０１０５】
このように、本発明の１つの特定の、しかし、非限定的な局面は、ＣＸＣＲ７に対する１つ又は２つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（本明細書において定義する通り、好ましくは１つ又は２つのナノボディ）、ＣＸＣＲ４に対する１つ又は２つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（本明細書において定義する通り、好ましくは１つ又は２つのナノボディ）、及び（ヒト）血清アルブミンに対するペプチド又は免疫グロブリンの単一可変ドメイン（場合により１つ又は複数の適したスペーサー又はリンカーを介して連結されている）を含むポリペプチドである。
【０１０６】
上の抗ＣＸＣＲ７／ＣＸＣＲ４二特異的コンストラクト（ならびに本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む他の二特異的コンストラクト）は、また、毒素に又は（細胞）傷害性残基、部分、もしくはペイロードに（本明細書においてさらに記載する通り）適切に連結されうる（再び、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して）。再び、本発明のそのような（細胞）傷害性の二特異的ポリペプチドは、半減期が延長されていない、あるいは、限定された及び／又は厳密に制御された半減期の延長だけを有しうる。
【０１０７】
本発明は、その最も広い意味において、また、本発明のアミノ酸配列（例、ナノボディ）の及び本発明のポリペプチドの誘導体を含む。そのような誘導体は、一般的に、本発明のアミノ酸配列（例、ナノボディ）及び本発明のポリペプチドの、ならびに／あるいは本発明のナノボディを形成するアミノ酸残基の１つ又は複数の修飾により、特に、化学的及び／又は生物学的（例、酵素的）修飾により得ることができる。
【０１０８】
そのような修飾の例、ならびにそのような様式で修飾する（即ち、タンパク質骨格上、しかし、好ましくは、側鎖上のいずれか）ことができる本発明のアミノ酸配列（例、ナノボディ）及びポリペプチド内のアミノ酸残基の例、そのような修飾を導入するために使用することができる方法及び技術、ならびにそのような修飾の潜在的な使用及び利点が、当業者に明らかであろう。
【０１０９】
例えば、そのような修飾は、１つ又は複数の官能基、残基、又は部分の、本発明のアミノ酸配列（例、ナノボディ）及び本発明のポリペプチド中への又は上への、ならびに、特に、１つ又は複数の所望の特性又は機能性を付与する１つ又は複数の官能基、残基、又は部分の、本発明のナノボディへの導入（例、共有結合的連結による又は別の適した様式において）を含みうる。そのような官能基の例は、当業者に明らかであろう。
【０１１０】
例えば、そのような修飾は、本発明のナノボディの半減期、溶解性及び／又は吸収を増加させる、本発明のナノボディの免疫原性及び／又は毒性を低下させる、本発明のナノボディの任意の望ましくない副作用を除去又は減弱させる、ならびに／あるいは本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドに他の有利な特性を付与する及び／又はその非所望の特性を低下させる１つ又は複数の官能基（例、共有結合的連結による又は別の適した様式において）；あるいは先行するものの任意の組み合わせの導入を含みうる。そのような官能基の及びそれらを導入するための技術の例は、当業者に明らかであろうが、一般的に、本明細書において上に引用する一般的な背景技術において言及する全ての官能基及び技術、ならびに医薬的タンパク質の修飾のための、及び、特に、抗体又は抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）の修飾のための、それ自体が公知の官能基及び技術を含みうるが、それらについて、参照が、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)に作られる。そのような官能基は、例えば、本発明のナノボディに、又は、場合により、適したリンカーもしくはスペーサーを介して、直接的に（例えば、共有結合的に）連結してもよく、再び、当業者に明かであろう通りである。
【０１１１】
医薬的タンパク質の半減期を増加させる及び／又は免疫原性を低下させるための最も広く使用される技術の１つは、適した薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧなど）などの付着を含む。一般的に、ペグ化の任意の適した形態を使用することができる（例えば、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含む）のための当技術分野において使用するペグ化など）；参照が、例えば、Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); by Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), by Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)に及びＷＯ  ０４／０６０９６５に作られる。タンパク質のペグ化のための種々の試薬が、また、商業的に利用可能であり、例えば、Nektar Therapeutics, USAからである。
【０１１２】
好ましくは、部位特異的ペグ化を、特に、システイン残基を介して使用する（例えば、Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)を参照のこと）。例えば、この目的のために、ＰＥＧを、本発明のナノボディにおいて自然発生するシステイン残基に付着してもよく、本発明のナノボディを修飾し、ＰＥＧの付着のために１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入してもよく、又は、ＰＥＧの付着のために１つ又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のナノボディのＮ及び／又はＣ末端に融合してもよく、全てで、当業者にそれ自体が公知のタンパク質操作の技術を使用する。
【０１１３】
好ましくは、本発明のナノボディ及びタンパク質について、ＰＥＧを使用し、５０００を上回る、例えば１０，０００を上回る及び２００，０００未満、例えば１００，０００未満など；例えば、２０，０００〜８０，０００の範囲中の分子量を伴う。
【０１１４】
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、通常は翻訳時及び／又は翻訳後修飾の部分としての、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化を含み、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存する。
【０１１５】
さらに別の修飾は、１つ又は複数の検出可能な標識又は他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含みうるが、標識ナノボディの意図される使用に依存している。それらを付着、使用、及び検出するための適した標識及び技術が、当業者に明らかであろうが、例えば、しかし、限定しないが、蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性同位体、金属、金属キレート、金属カチオン、発色団、及び酵素（例えばＷＯ  ０８／０２００７９のページ１０９に言及するものなど）を含む。他の適した標識は、当業者に明らかであろうが、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲスペクトロスコピーを使用して検出することができる部分を含む。
【０１１６】
本発明のそのような標識ナノボディ及びポリペプチドは、例えば、特定標識の選択に依存して、インビトロ、インビボ、又はインサイチュアッセイ（それ自体が公知のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、及び他の「サンドイッチアッセイ」などを含む）ならびにインビボ診断及び撮像目的のために使用してもよい。
【０１１７】
当業者に明かであろう通り、別の修飾は、キレート基の導入を含みうるが、例えば、上で言及する金属又は金属陽イオンの１つをキレート化する。適したキレート基は、例えば、限定を伴わず、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。
【０１１８】
さらに別の修飾は、特定の結合対、例えばビオチン（ストレプト）アビジン結合対などの１つの部分である官能基の導入を含みうる。そのような官能基を使用し、本発明のナノボディを別のタンパク質、ポリペプチド、又は化学的化合物（結合対の他の半分に、即ち、結合対の形成を通じて結合されている）に連結してもよい。例えば、本発明のナノボディをビオチンに共役し、別のタンパク質、ポリペプチド、化合物、又は担体（アビジン又はストレプトアビジンに共役されている）に連結してもよい。例えば、そのような共役ナノボディを、レポーターとして、例えば、診断システムにおいて使用してもよく、そこでは、検出可能なシグナル産生薬剤をアビジン又はストレプトアビジンに共役する。そのような結合対を、例えば、また、使用し、本発明のナノボディを担体（医薬的な目的のために適した担体を含む）に結合してもよい。１つの非限定的な例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)により記載されるリポソーム製剤である。そのような結合対を、また、使用し、治療的に活性な薬剤を本発明のナノボディに連結してもよい。
【０１１９】
他の潜在的な化学的及び酵素的修飾が、当業者に明らかであろう。そのような修飾は、また、研究目的のために（例、機能‐活性関係を試験するために）導入されうる。参照が、例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)に作られる。
【０１２０】
本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、そのようなものとして、好ましくは、ジスルフィド架橋を介して、任意の他のアミノ酸配列又は鎖に連結されていない（しかし、１つ又は複数の分子内ジスルフィド架橋を含みうる又は含まないであろう）単一のアミノ酸鎖から実質的になる。例えば、本発明の薬剤（本明細書において記載される通り）は、時折、ＣＤＲ３とＣＤＲ１又はＦＲ２の間にジスルフィド架橋を含みうることが公知である。しかし、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、互いに及び／又は他の免疫グロブリンの単一可変ドメインに（例、ジスルフィド架橋を介して）連結され、また、本発明において有用でありうるペプチドコンストラクト（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＳｃＦｖコンストラクト、「ダイアボディ」、及び他の多特異的コンストラクト）を提供しうることに注目すべきである。参照が、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36の総説に作られる。
【０１２１】
一般的に、本発明のアミノ酸配列（又は、同を含む化合物、コンストラクト、又はポリペプチド）が、被験者への投与のために（例えば、本明細書において記載する通りの、治療的及び／又は診断的目的のために）意図される場合、それは、好ましくは、前記被験者において自然発生しないアミノ酸配列；又は、それが前記被験者において自然発生する場合、実質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）のいずれかである。
【０１２２】
また、医薬的な使用のために、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ならびに同を含む化合物、コンストラクト、及びポリペプチド）が、好ましくは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられているのに対し；獣医的な目的のために、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、好ましくは、処置すべき種からのＣＸＣＲ７に対して向けられている、又は、処置すべき種からのＣＸＣＲ７と少なくとも交差反応性であることが、当業者に明らかであろう。
【０１２３】
さらに、本発明のアミノ酸配列は、場合により、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する結合のための少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質、又は標的に対する結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含む。
【０１２４】
本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドの、ならびに同を含む組成物の有効性を、含まれる特定の疾患又は障害に依存して、任意の適したインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、及び／又はそれ自体が公知の動物モデル、あるいは、それらの任意の組み合わせを使用してテストすることができる。適したアッセイ及び動物モデルが、当業者に明らかであろうが、例えば、リガンド置換アッセイ（Burns et al, J. Exp. Med. 2006 4; 203(9): 2201-13）、ベータアレスチン動員アッセイ（Zabel et al., J. Immunol. 2009  1; 183(5): 3204-11）、二量体化アッセイ（Luker et al, Faseb J. 2009 23(3): 823-34）、シグナル伝達アッセイ（Wang et al, J Immunol. 2009 Sep 1; 183(5): 3204-11）、増殖アッセイ（Wang et al, J Immunol. 2009 Sep 1; 183(5): 3204-11; Odemis et al., J Cell Sign. 2010 April 1; 123(Pt 7): 1081-8）、生存アッセイ（Burns et al, J. Exp. Med. 2006 4; 203(9): 2201-13）、細胞付着アッセイ（Burns et al, J. Exp. Med. 2006 4; 203(9): 2201-13）及び経内皮移動アッセイ（Mazzinghi et al, J. Exp. Med. 2008 Feb 18; 205(2): 479-90）、内皮細胞発芽アッセイ（Wang et al, J Immunol. 2009 Sep 1; 183(5): 3204-11）、筋肉分化（Melchionna et al., Muscle Nerve, 2010 Feb 11）及びインビボの異種移植モデル（Burns et al, J. Exp. Med. 2006 4; 203(9): 2201-13）、コラーゲン誘導性関節炎モデル（Hegen et al, Ann Rheum Dis. 2008 Nov; 67(11): 1505-15）、及び実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル（Wekerle, Ann Rheum Dis. 2008 Dec; 67 Suppl 3: iii56-60）ならびに以下の実験部分及び本明細書において引用する先行技術において使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。
【０１２５】
また、本発明に従い、温血動物の第１種からのＣＸＣＲ７に対して向けられている免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、温血動物の１つ又は複数の他の種からのＣＸＣＲ７と交差反応性を示しうる又は示さないであろう。例えば、ヒトＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、霊長類（例えば、限定を伴わず、マカク属からのサル（例えば、特に、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及び／又はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）など）ならびにヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ）など）の１つ又は複数の種からのＣＸＣＲ７と、及び／又は、疾患についての動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、又はイヌ）において、特に、ヒトＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）と関連する疾患及び障害についての動物モデル（例えば、本明細書において言及する種及び動物モデルなど）においてしばしば使用される動物の１つ又は複数の種からのＣＸＣＲ７と交差反応性を示しうる又は示さないであろう。この点において、そのような交差反応性が、存在する場合、薬物開発の観点から利点を有しうることが当業者に明らかであろう。なぜなら、それは、ヒトＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドを、そのような疾患モデルにおいてテストすることを可能にするからである（例、実施例１２を参照のこと）。
【０１２６】
より一般的には、哺乳動物の複数の種からのＣＸＣＲ７と交差反応性である本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、通常、獣医学的な適用における使用のために有利でありうる。なぜなら、それは、同じアミノ酸配列又はポリペプチドが、複数の種にわたり使用されることを可能にするからである。このように、動物の１つの種からのＣＸＣＲ７に対して向けられた免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチド（例えばヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドなど）を、免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの使用が、処置される種において所望の効果を提供する限り、動物の別の種の処置において使用することができることが、また、本発明の範囲内に包含される。
【０１２７】
本発明は、その最も広い意味において、また、特に限定されないが、又は、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドが向けられるＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）（適用可能な場合）により定義される。例えば、免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、ＣＸＣＬ１１／ＣＸＣＬ１２相互作用部位及び／又はＣＸＣＲ７／ＣＸＣＲ７ホモ二量体化部位及び／又はＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７ヘテロ二量体化部位（又は、ＣＸＣＲ７と他のケモカイン受容体、例えば、例、ＣＸＣＲ３などへのヘテロ二量体化）に対して向けられうる又は向けられないことがあり、本明細書においてさらに定義する通りである。
【０１２８】
本明細書においてさらに記載する通り、本発明のポリペプチドは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられている本発明の２つ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含みうる。一般的には、そのようなポリペプチドは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、本発明の単一アミノ酸配列と比較し、増加した結合力を伴い結合しうる。そのようなポリペプチドは、例えば、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の同じ抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）（適用可能な場合）に対して向けられている本発明の２つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含みうる（それは、相互作用部位でありうる又はそうではないこともある）；あるいは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の第１の同じ抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）（適用可能な場合）に対して向けられている本発明の少なくとも１つの「第１」アミノ酸配列（それは、相互作用部位でありうる又はそうではないこともある）（例えばグループ１のエピトープなど）；ならびに、第１とは異なる、第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）（適用可能な場合）に対して向けられている本発明の少なくとも１つの「第２」アミノ酸配列（それは、再び、相互作用部位でありうる又はそうではないこともある）（例えばグループ２のエピトープなど）を含む。好ましくは、本発明のそのような「二親性」ポリペプチドにおいて、本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列が、相互作用部位（本明細書において定義する通り）に対して向けられているが、本発明は、その最も広い意味において、それに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、二親性の方法において、フォーマットしてもよく、実験部分において特徴付けする通り、異なるエピトープに対して向けられた一価ビルディングブロックを組み合わせる（実施例９〜１７を参照のこと）。「二価」ポリペプチドの個々の免疫グロブリンの単一可変ドメインの結合定数（例、会合及び解離定数）は、「二親性」ポリペプチドの個々の免疫グロブリンの単一可変ドメインの結合定数を上回り全般的に良好であるが、本発明は、完全に予想外に、本発明の「二親性」ポリペプチドが、生物学的アッセイ（例、βアレスチンアッセイ）において、「二価」ポリペプチドよりも効果的であることを実証する。
【０１２９】
また、標的が結合対（例えば、受容体−リガンド結合対）の部分である場合、免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、それらが、同族の結合パートナー、例えば、ＣＸＣＬ１１（また、Ｉ−ＴＡＣとして言及される）及び／又はＣＸＣＬ１２（また、ＳＤＦ−１として言及される）と、ＣＸＣＲ７への結合について競合するようにする、ならびに／あるいは、それらが、標的への結合パートナーの結合を（完全に又は部分的に）中和するようにする。
【０１３０】
また、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、一般的に、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の全ての自然発生する又は合成の類似体、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分、及びフラグメントに；あるいは、少なくとも、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドが、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合する抗原決定基又はエピトープと実質的に同じである１つ又は複数の抗原決定基又はエピトープを含む、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）のそれらの類似体、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分、及びフラグメントに結合することが予測される。再び、そのような場合において、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、そのような類似体、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分、及びフラグメントに、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインが（野生型）ＣＸＣＲ７に結合する親和性及び特異性と同じである、あるいは、それとは異なる（即ち、より高い又はより低い）親和性及び／又は特異性を伴い結合しうる。
【０１３１】
ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）が、単量体形態で、及び、１つ又は複数の多量体形態で、例えば、ホモ二量体形態で、また、ＣＸＣＲ４、例、ヒトＣＸＣＲ４（RM Maksym et al., supra; KE Luker et al.、上記）とのヘテロ二量体形態で存在する場合、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドが、ｉ）単量体形態のＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）だけに結合する、ｉｉ）多量体／二量体（ホモ及び／又はヘテロ二量体）形態のＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）だけに結合する、あるいはｉｉｉ）単量体形態及び多量体形態の両方に結合することが、本発明の範囲内である。本発明の好ましい局面において、本発明のポリペプチドは、ホモ二量体ヒトＣＸＣＲ７複合体及び／又はヘテロ二量体ヒトＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７複合体の形成を防止する。本発明の別の好ましい局面において、本発明のポリペプチドは、ホモ二量体ヒトＣＸＣＲ７複合体及び／又はヘテロ二量体ヒトＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ７複合体の形成を誘導しない（より高い濃度でさえ、例えば１０nM以下、５０nM以下、１００nM以下、あるいは５００nM以下など）。再び、そのような場合において、本発明のポリペプチドは、単量体形態に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、多量体形態に結合する親和性及び特異性と同じである、あるいは、それとは異なる（即ち、より高い又はより低い）親和性及び／又は特異性を伴い結合しうる。
【０１３２】
また、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）が、他のタンパク質又はポリペプチドと会合し、タンパク質複合体（例、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣを用いて）を形成することができる場合、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドが、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、その非会合状態において結合し（例、リガンド結合を防止する）、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、その会合状態において結合し、又は、その両方に（好ましくは、非会合状態に）結合することは、本発明の範囲内である。全てのこれらの場合において、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、そのような会合タンパク質複合体に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドが、その非会合状態にあるＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合する親和性及び特異性と同じ、又はそれとは異なりうる（即ち、より高い又はより低い）親和性及び／又は特異性を伴い結合しうる。
【０１３３】
また、当業者に明らかであろう通り、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた２つ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、対応する単量体アミノ酸配列よりも高い結合力を伴い結合しうる。例えば、限定を伴わず、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の異なるエピトープに対して向けられた２つ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドは、異なる単量体の各々よりも高い結合力を伴い（通常は）結合しうる、ならびに、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた２つ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドは、また、よりも高い結合力を伴い、ＣＸＣＲ７の多量体（例、ホモ二量体、ＣＸＣＲ４とのヘテロ二量体）及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の多量体（例、ホモ二量体、ヒトＣＸＣＲ４とのヘテロ二量体）に（通常は）結合しうる。
【０１３４】
一般的に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、少なくとも、生物学的及び／又は治療的な観点から最も関連しているＣＸＣＲ７及び特のヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）のそれらの形態（単量体、多量体、会合した異なる立体構造形態を含む）に結合しうるが、当業者に明かであろう通りである。
【０１３５】
また、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドの部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、対立遺伝子、及び／又は誘導体を使用すること、ならびに／あるいは、そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、対立遺伝子、及び／又は誘導体の１つ又は複数を含む又はそれらから実質的になるタンパク質又はポリペプチドを使用することは、これらが、本明細書において想定される使用のために適している限り、本発明の範囲内である。そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、及び／又は誘導体は、通常、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する結合のための機能的な抗原結合部位（の少なくとも部分）を含みうる；より好ましくは、ＣＸＣＲ７及び特のヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への特異的な結合が可能であり、さらにより好ましくは、ＣＸＣＲ７及び特のヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への結合が可能でありうる、本明細書においてさらに記載する通り、例えば、本明細書において定義する実験部分において、ＥＣ５０値、平均Ｋｉ、結合に関するＩＣ５０値、移動、置換、及び／又は増殖遮断、ならびに／あるいは効力についての他の測定を伴い、そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、対立遺伝子、及び／又は誘導体が、より強力で、より安定で、より可溶性でありうる、及び、同じエピトープを有しうる。そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、誘導体、タンパク質、及び／又はポリペプチドの一部の非限定的な例は、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。本発明の追加のフラグメント又はポリペプチドは、また、本明細書において記載する通りの１つ又は複数の（より小さな）部分又はフラグメントを適切に組み合わせることにより（即ち、連結又は遺伝子融合により）提供されうる。
【０１３６】
免疫グロブリンの単一可変ドメインの一般的な記載については、参照が、下のさらなる記載に、ならびに本明細書において引用する先行技術に作られる。この点において、しかし、この記載及び先行技術が、主に、いわゆる「ＶＨ３クラス」の免疫グロブリンの単一可変ドメイン（即ち、ＶＨ３クラスのヒト生殖系列配列と高い程度の配列相同性を伴う免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１、又はＤＰ−２９など）について記載していることに注目すべきであり、それは、本発明の好ましい局面を形成する。しかし、本発明は、そのもっと広い意味において、一般的に、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた免疫グロブリンの単一可変ドメインの任意の型を対象にし、例えば、また、いわゆる「ＶＨ４クラス」（即ち、ＶＨ４クラスのヒト生殖系列配列（例えばＤＰ−７８など）と高い程度の配列相同性を伴う免疫グロブリンの単一可変ドメイン）に属する免疫グロブリンの単一可変ドメインを対象にすること（例えば、ＷＯ  ０７／１１８６７０において記載される通り）に注目すべきである。
【０１３７】
一般的に、免疫グロブリンの単一可変ドメイン（特に、ＶＨＨ配列及び配列最適化された免疫グロブリンの単一可変ドメイン）は、特に、フレームワーク配列（再び、本明細書においてさらに記載する通り）の１つ又は複数における１つ又は複数の「ホールマーク残基」（本明細書において記載する通り）の存在により特徴付けることができる。
【０１３８】
このように、一般的には、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、以下の（一般的な）構造を伴うアミノ酸配列として定義することができる：
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を指し、及び、ここで、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ、相補性決定領域１〜３を指す。
【０１３９】
好ましい局面において、本発明は、以下の（一般的な）構造を伴うアミノ酸配列である少なくとも免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供する：
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を指し、及び、ここで、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ、相補性決定領域１〜３を指し、及び、ここで：
ｉ）Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８のアミノ酸残基の少なくとも１つが、下の表Ａ−１において言及されるホールマーク残基より選ばれる。及び／又は、ここで：
ｉｉ）前記アミノ酸配列が、ＷＯ  ２００９／１３８５１９に示す通りの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ＷＯ  ２００９／１３８５１９における配列番号１〜１２５を参照のこと）の少なくとも１つと少なくとも８０%、より好ましくは９０%、さらにより好ましくは９５%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列中でＸを用いて示される）を無視し；及び／又は、ここで：
ｉｉｉ）ＣＤＲ配列は、一般的に、本明細書においてさらに定義される通りであり（例、表Ｂ−２中に提供する通り、組み合わせにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３。ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って算出されることに注意すること）；及び／又は、ここで：
ｉｖ）ＦＲ配列が、一般的に、本明細書においてさらに定義される通りであり、例えば、表Ｂ−２に提供する通り、組み合わせにおけるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４であり、ならびに／あるいは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４は、表Ｂ−２に提供する通り、ＦＲの、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の少なくとも１つと、少なくとも８０%、より好ましくは９０%、さらにより好ましくは９５%のアミノ酸同一性を有する（ここで、ＦＲの定義は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って算出される）。
【０１４０】
【表Ａ−１】
2014511680.tif 000003
【０１４１】
再び、そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、任意の適した様式において、及び、任意の適した供給源から由来しうるが、例えば、自然発生するＶＨＨ配列（即ち、ラクダの適した種、例えばラマから）又は合成もしくは半合成ＶＨもしくはＶＬ（例、ヒトから）でありうる。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、「ヒト化」又は他の「配列最適化された」ＶＨＨ、「ラクダ化」免疫グロブリン配列（及び、特に、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列、即ち、ラクダ化ＶＨ）、ならびに、技術、例えば、親和性成熟（例えば、合成、無作為、又は自然発生する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲ移植、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメントの組み合わせ、オーバーラッププライマーを用いたＰＣＲアセンブリー、及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術；又は、先行するもののいずれかの任意の適した組み合わせ（本明細書においてさらに記載する通り）などにより変えられている、ヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ラクダＶＨＨを含みうる。
【０１４２】
さらなる好ましい局面において、本発明は、配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）を伴うアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を伴う１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び増加した半減期を提供する部分からなる群より選択されたアミノ酸配列を伴う免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供する（下を参照のこと）。
【０１４３】
さらなる好ましい局面において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になるアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を伴う、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列は、配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも７０%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０%のアミノ酸同一性、例えば９５%のアミノ酸同一性以上など、又は、さらに実質的に１００%のアミノ酸同一性を有する（表Ｂ−２及びＢ−３を参照のこと）。アミノ酸同一性のこの程度は、例えば、前記アミノ酸配列と配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−２及びＢ−３を参照のこと）の配列の１つ又は複数の間でのアミノ酸同一性の程度を決定する（本明細書において記載する様式において）ことにより決定することができ、ここで、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。本発明のそのようなポリペプチド及び／又は免疫グロブリンの単一可変ドメインは、さらに、以下を提供しうる：
１．ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた（本明細書において定義する通り）、及び、配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%、例えば９０%又は９５%以上の配列同一性を有する、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチド；
２．ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられている（本明細書において定義する通り）、ならびに、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つの結合を交差遮断（本明細書において定義する通り）し、ならびに／あるいは、配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への結合について競合する、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチド；及び
３．その免疫グロブリンの単一可変ドメインは、本明細書においてさらに記載する通りでありうる；ならびに、そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つ又は複数を含む、本発明のポリペプチド（それは、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。例えば、二特異的（例、また、血清アルブミンに結合する）及び／又は二親性ポリペプチドでありうる）、ならびに、そのような免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドをコードする核酸配列。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、任意の自然発生するリガンドを含まない。
【０１４４】
本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む又はそれから実質的になる。本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例を、配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２に与える（表Ｂ−３を参照のこと）。
【０１４５】
１．２．  血清アルブミン結合ビルディングブロック又は半減期を増加させる他のビルディングブロック
別の局面において、本発明は、ヒトＣＸＣＲ７（又はその適したフラグメント）に向けられた１つ又は複数の（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む又はそれから実質的になる、及び、場合により、１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含む、化合物又はコンストラクト、及び特にタンパク質又はポリペプチド（また、本明細書において、「本発明の化合物」又は「本発明のポリペプチド」としてそれぞれ言及される）に関する。本明細書におけるさらなる開示から当業者に明らかになるであろう通り、そのようなさらなる基、残基、部分、結合単位、又は免疫グロブリンの単一可変ドメインは、さらなる機能性を本発明のアミノ酸配列（及び／又は、それが存在する化合物又はコンストラクト）に提供しうる又は提供しないであろう、及び、本発明のアミノ酸配列の特性を修飾しうる又は修飾しないであろう。
【０１４６】
上のさらなる記載から及び本明細書において明らかでありうる通り、これは、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、本発明のポリペプチドを形成するための「ビルディングブロック」として、即ち、それらを、他の基、残基、部分、又は結合単位と適切に組み合わせることにより、本明細書において記載する通りの化合物又はコンストラクト（例えば、限定を伴わず、本明細書において記載する、本発明の二親性、二／多価、及び二／多特異的ポリペプチドなど）を形成するために使用することができ、それは、１つの分子内で、１つ又は複数の所望の特性又は生物学的機能を組み合わせる。
【０１４７】
本発明の化合物又はポリペプチドは、一般的に、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインを、１つ又は複数のさらなる基、残基、部分、又は結合単位に、場合により、１つ又は複数の適したリンカーを介して、適切に連結する少なくとも１つの工程を含む方法により調製することができ、本発明の化合物又はポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、また、一般的に、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供し、前記核酸を適した様式において発現させ、及び本発明の発現ポリペプチドを回収する工程を少なくとも含む。そのような方法は、それ自体が公知の様式において実施することができ、それは、当業者に明らかであろうが、例えば、本明細書にさらに記載する方法及び技術に基づく。
【０１４８】
本発明の化合物又はポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスは、本発明のアミノ酸配列から開始し、また、本明細書において、本発明の前記アミノ酸配列を「フォーマットする」として言及する；及び、本発明の化合物又はポリペプチドの部分を作る本発明のアミノ酸は、本発明の前記化合物又はポリペプチドを「フォーマットされる」又は「フォーマット中」にあると言われる。本発明のアミノ酸配列をフォーマットすることができる方法の例及びそのようなフォーマットの例は、本明細書における開示に基づき、当業者に明らかでありうる；そのようなフォーマットされた免疫グロブリンの単一可変ドメインは、本発明のさらなる局面を形成する。
【０１４９】
例えば、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、１つ又は複数の追加の免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうるが、化合物又はコンストラクトは（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるようにする。好ましいが、しかし、非限定的な局面において、前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位は、免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリンの単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリンの単一可変ドメイン、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適している免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はナノボディからなる群より選ばれる。あるいは、そのような基、残基、部分、又は結合単位は、例えば、化学的な基、残基、部分でありうるが、それらは、それ自体が、生物学的に及び／又は薬理学的に活性でありうる又はそうではないであろう。例えば、限定を伴わず、そのような基は、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインに連結してもよく、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの「誘導体」を提供する（本明細書においてさらに記載する通り）。
【０１５０】
また、本発明の範囲内にあるのは、化合物又はコンストラクトであって、それは、本明細書において記載する通りの１つ又は複数の誘導体を含み又はそれから実質的になり、場合により、場合により、１つ又は複数のリンカーを介して連結された、１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含む。好ましくは、前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位は、免疫グロブリンの単一可変ドメインである。上に記載する化合物又はコンストラクトにおいて、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び１つ又は複数の基、残基、部分、又は結合単位を、互いに、及び／又は、１つ又は複数の適したリンカーもしくはスペーサーを介して直接的に連結してもよい。例えば、１つ又は複数の基、残基、部分、又は結合単位が、免疫グロブリンの単一可変ドメインである場合、リンカーは、また、免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうるが、結果としての化合物又はコンストラクトは、融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）であるようにする。
【０１５１】
本発明の１つの特定の、しかし、非限定的な局面において、それは本明細書においてさらに記載されうるが、本発明のポリペプチドは、それらが由来している免疫グロブリンの単一可変ドメインと比較し、血清中での増加した半減期を有する（本明細書においてさらに記載する通り）。例えば、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインは、半減期を延長する１つ又は複数の基又は部分（例えばＰＥＧなど）に（化学的又は他で）連結してもよく、増加した半減期を伴う本発明のアミノ酸の誘導体を提供する。
【０１５２】
本発明の１つの特定の局面において、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列と比較し、増加した半減期を有しうる。そのような化合物及びポリペプチドの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、本明細書におけるさらなる開示に基づき、当業者に明らかになるであろうが、例えば、化学的に修飾され（例えば、ペグ化を用いて）、その半減期が増加している、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチド；血清タンパク質への結合のための少なくとも１つの追加の結合部位を含む本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；本発明のアミノ酸配列の半減期を増加させる少なくとも１つの部分（及び、特に、少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドを含む。そのような半減期を延長する部分又は免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書におけるさらなる開示に基づき、当業者に明らかになるであろう；例えば、限定を伴わず、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、１つ又は複数の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適したフラグメントなど）あるいは血清タンパク質（例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリンの単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリンの単一可変ドメイン、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適している免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は血清タンパク質、例えば血清アルブミンなど（例えばヒト血清アルブミンなど）に結合することができるナノボディ、血清中免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）、又はトランスフェリン；参照が、本明細書において言及するさらなる記載及び参考文献に作られる）に結合することができる１つ又は複数の結合単位に適切に連結されているポリペプチド；本発明のアミノ酸配列が、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃなど）又はその適した部分もしくはフラグメントに連結されているポリペプチド；あるいは、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の小さなタンパク質又はペプチド（例えば、限定を伴わず、ＷＯ  ９１／０１７４３、ＷＯ  ０１／４５７４６、ＷＯ  ０２／０７６４８９、ＷＯ２００８／０６８２８０、ＷＯ２００９／１２７６９１に記載されるタンパク質及びペプチドなど）に適切に連結されているポリペプチドを含む。
【０１５３】
一般的に、増加した半減期を伴う本発明の化合物又はポリペプチドは、好ましくは、本発明の対応するアミノ酸配列それ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を上回る大きい半減期を有する。例えば、増加した半減期を伴う本発明の化合物又はポリペプチドは、ヒトにおいて、本発明の対応するアミノ酸配列それ自体と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回るなど、又はさらに２４、４８、又は７２時間を上回る増加した半減期を有しうる。
【０１５４】
本発明の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明のそのような化合物又はポリペプチドは、ヒトにおいて、本発明の対応するアミノ酸配列それ自体と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回るなど、あるいはさらに２４、４８、又は７２時間を上回る増加した血清中半減期を有する。
【０１５５】
別の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明のそのような化合物又はポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、又は１４日を上回る（例えば約１４〜１９日）の半減期を有しうる。
【０１５６】
本発明の特定の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明は、ｉ）本明細書において記載する通りの１つのＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及びｉｉ）本明細書において記載する通りの１つ又は複数の（好ましくは１つの）血清アルブミン結合免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む、本発明のポリペプチドを提供する。
【０１５７】
さらなる好ましい局面において、本発明は、ｉ）本明細書において記載する通りの１つ又は複数のＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及びｉｉ）配列番号２（表Ｂ−１）の１つ又は複数の（好ましくは１つの）血清アルブミン結合免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む、本発明のポリペプチドを提供する。
【０１５８】
さらに好ましい局面において、本発明は、ｉ）本明細書において記載する通りの１つ又は複数のＣＸＣＲ７結合免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及びｉｉ）ＣＤＲ（Ｋａｂａｔナンバリングに従って定義される）を伴う、配列番号２（表Ｂ−２、Ｂ−１）の、１つ又は複数の（好ましくは１つの）血清アルブミン結合免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む、本発明のポリペプチドを提供する。
【０１５９】
このように、例えば、さらなる参照（及び、このように、参照により組み入れられる）が、特に、ＷＯ２００８／０６８２８０の実験部分及びさらなる記載に作られ、ここで、配列番号２に関するさらなる詳細が作られ、例えば、アカゲザルにおける前記配列を含む免疫グロブリンの単一可変ドメインコンストラクトの半減期が開示される。
【０１６０】
一般的に、単一の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む又はそれから実質的になるタンパク質又はポリペプチドは、本明細書において、「一価」タンパク質もしくはポリペプチドとして又は「一価コンストラクト」として言及される。２つ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメイン（例えば本発明の少なくとも２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は本発明の少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び少なくとも１つの他の免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）を含む又はそれから実質的になるタンパク質及びポリペプチドは、本明細書において、「多価」タンパク質もしくはポリペプチドとして又は「多価コンストラクト」として言及されうるが、これらは、本発明の対応する一価免疫グロブリンの単一可変ドメインと比較し、特定の利点を提供しうる。そのような多価コンストラクトの一部の非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【０１６１】
別の特定の、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び少なくとも１つの他の結合単位（即ち、別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質、又はポリペプチドに対して向けられる）（それは、好ましくは、また、免疫グロブリンの単一可変ドメインである）を含む又はそれから実質的になる。そのようなタンパク質又はポリペプチドは、また、本明細書において、「多特異的」タンパク質もしくはポリペプチドとして又は「多特異的コンストラクト」として言及され、これらは、本発明の２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えばＣＸＣＲ７に対して向けられた１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び血清アルブミンに対する１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインからなりうる。そのような多特異的コンストラクトは、本明細書における開示に基づき、当業者に明らかであろう；そのような多特異的な免疫グロブリンの単一可変ドメインの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、配列番号４４〜４８、８０〜８１、８３〜８５、及び８８〜８９ならびに１３１〜１４０のコンストラクト（表Ｂ−４を参照のこと）、ならびにクローン００９、０１３、０１８〜０２９、０３１〜０３８、０４４、０４６、０４８〜０５３、０５５〜０５８、０６０、０６１、０６３、０６５、０６８、０６９、０７２、０８１〜０８６、及び０９３（表Ｂ−１２〜Ｂ−１４）である。
【０１６２】
さらに別の特定の、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、場合により、１つ又は複数のさらなる免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ならびに、少なくとも１つの所望の特性を、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／及び結果としての融合タンパク質に付与する、少なくとも１つの他のアミノ酸配列（例えばタンパク質又はポリペプチドなど）を含む又はそれから実質的になる。再び、そのような融合タンパク質は、本発明の対応する一価免疫グロブリンの単一可変ドメインと比較し、特定の利点を提供しうる、例えば、増加した半減期を提供しうる。
【０１６３】
上のコンストラクトにおいて、１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び／又は他の免疫グロブリンの単一可変ドメインは、互いに直接的に連結されうる及び／又は互いに１つ又は複数のリンカー配列を介して適切に連結されうる。そのようなリンカーの一部の適した、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【０１６４】
一実施態様において、免疫グロブリンの単一可変ドメインを連結するリンカー配列は、配列番号４９〜５８（表Ｂ−５を参照のこと）、又は両方の組み合わせであり、又は、当技術分野において公知の通りである。
【０１６５】
さらに別の特定の、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号３９〜４３及び９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つ又は複数と、８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る、例えば９９%以上の「配列同一性」（本明細書において定義する通り）を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインからなる群より選ばれうるが、ここで、ポリペプチドは、好ましくは、本明細書においてさらに定義する通りであり、即ち、ＣＸＣＲ７に対して向けられた１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び１つの血清アルブミンに対する１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインの好ましいフォーマットにある。
【０１６６】
さらに別の特定の、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号４４〜４８のポリペプチドの１つ又は複数と８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る、例えば９９%以上の「配列同一性」（本明細書において定義する通り）を有するポリペプチドからなる群より選ばれうる（表Ｂ−４を参照のこと）。本発明の二親性及び二特異的ポリペプチドの一部の例示的な、非限定的な例を、配列番号７８〜８９ならびに配列番号１３１〜１４０、又はクローン００９、０１３、０１８〜０２９、０３１〜０３８、０４４、０４６、０４８〜０５３、０５５〜０５８、０６０、０６１、０６３、０６５、０６８、０６９、０７２、０８１〜０８６、及び０９３に与える（表Ｂ−１２〜Ｂ−１４）。
【０１６７】
１．３．  本発明の組成物
一般的に、医薬的使用のために、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１つのポリペプチド及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又はアジュバント、ならびに、場合により、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、医薬的調製物又は組成物として製剤化されうる。非限定的な例を用いて、そのような製剤は、経口投与のため、非経口投与のために（例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射又は静脈内注入などによる）、局所投与のために、吸入による、皮膚パッチによる、インプラントによる、座剤などによる投与のために適した形態でありうるが、ここで、非経口投与が好ましい。そのような適した投与形態（投与の様式に依存して、固形、半固形、又は液体でありうる）ならびに方法及びその調製物中での使用のための担体が、当業者に明らかでありうるが、本明細書においてさらに記載される。そのような医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において、「医薬的組成物」として言及されるであろう。非ヒト生物における使用のための医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において、「獣医用組成物」として言及されるであろう。
【０１６８】
このように、さらなる局面において、本発明は、本発明の少なくとも１つのアミノ酸、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、又は本発明の少なくとも１つポリペプチド及び少なくとも１つの適した担体、希釈剤、又は賦形剤（即ち、医薬的使用のために適する）、及び、場合により、１つ又は複数のさらなる活性物質を含む医薬的組成物に関する。
【０１６９】
一般的に、本発明のポリペプチドは、それ自体が公知の任意の適した様式において製剤化及び投与することができる。参照は、例えば、上に引用する一般的な背景に（及び、特にＷＯ  ０４／０４１８６２、ＷＯ  ０４／０４１８６３、ＷＯ  ０４／０４１８６５、ＷＯ  ０４／０４１８６７、及びＷＯ  ０８／０２００７９に）ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；又はthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007に作られる（例えば、ページ２５２〜２５５を参照のこと）。
【０１７０】
本発明のポリペプチドは、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）ならびに他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体が公知の任意の様式で製剤化及び投与されうる。同を調製するためのそのような製剤及び方法は、当業者に明らかであろうが、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内、又はくも膜下腔内投与）のために又は局所（即ち、経皮又は皮内）投与のために適した調製物を含む。
【０１７１】
非経口投与のための調製物は、例えば、注入又は注射のために適している滅菌溶液、懸濁剤、分散剤、又は乳剤でありうる。そのような調製物のための適した担体又は希釈剤は、例えば、限定を伴わず、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１４３に言及されるものを含む。一実施態様において、調製物は水性溶液又は懸濁液である。
【０１７２】
本発明のポリペプチドは、送達の遺伝子治療方法を使用して投与することができる。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。それは、参照により、その遺伝子治療の送達方法のために組み入れられる。送達の遺伝子治療方法を使用し、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする遺伝子を用いてトランスフェクトした初代細胞を、追加で、組織特異的プロモーターを用いてトランスフェクトし、特定の器官、組織、移植片、腫瘍、又は細胞を標的とすることができ、加えて、細胞内での局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列を用いてトランスフェクトすることができる。
【０１７３】
このように、本発明のポリペプチドは、全身的に、例えば、医薬的に許容可能な媒質（例えば不活性希釈剤又は同化可能な食用担体など）との組み合わせにおいて経口的に投与してもよい。それらは、硬質又は軟質シェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、又は患者の食事の食物に直接的に組み入れてもよい。経口的な治療投与のために、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハなどの形態において使用してもよい。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１%の本発明のポリペプチドを含むべきである。組成物及び調製物中のそれらのパーセンテージは、もちろん、変動しうるが、便利には、所与の単位投与形態の重量の約２〜約６０%の間でありうる。そのような治療的に有用な組成物中での本発明のポリペプチドの量は、効果的な投与量レベルが得られるようにする。
【０１７４】
腫瘍切除の部位での局所投与のために、本発明のポリペプチドを、生物分解性ポリマー薬物送達系、徐放性ポリ（乳酸）−ｃｏ−グリコール酸製剤などにおいて使用してもよい（Hart et al., Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jul 16; (3): CD007294）。
【０１７５】
本発明のさらに好ましい局面において、本発明のポリペプチド、例えば、１つの一価抗ヒトＣＸＣＲ７免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び一価抗ヒト血清アルブミン免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる（ＧＳリンカーにより連結されている）ポリペプチドなどは、従来の抗体（例えばＩｇＧなど）と比較し、固形腫瘍において有益な分布及び動態プロファイルを有しうる。
【０１７６】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、また、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤及び甘味剤又は香味剤、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１４３〜１４４に言及されるものを含みうる。単位投与形態がカプセルである場合、それは、上の型の材料に加えて、液体担体（例えば植物油又はポリエチレングリコールなど）を含みうる。種々の他の材料が、コーティングとして存在しうる、又は、他に、固形の単位投与形態の物理的形態を修飾しうる。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラック、又は糖などを用いてコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシルは、本発明のポリペプチド、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及び香料（例えばチェリー又はオレンジフレーバーなど）を含みうる。もちろん、任意の単位投与形態を調製する際に使用される任意の材料は、医薬的に許容可能であり、用いられる量において実質的に非毒性でなければならない。また、本発明のポリペプチドは、持続放出調製物及びデバイス中に組み入れてもよい。
【０１７７】
経口投与のための調製物及び製剤は、また、本発明のコンストラクトが、胃環境に耐性であり、腸中へ通過することを許しうる腸溶コーティングを伴い提供されうる。より一般的には、経口投与のための調製物及び製剤を、胃腸管の任意の所望の部分中への送達のために適切に製剤化してもよい。また、適した坐剤を、胃腸管中への送達のために使用してもよい。
【０１７８】
本発明のポリペプチドは、また、注入又は注射により、静脈内又は腹腔内に投与してもよい。特定の例は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１４４及び１４５にさらに記載されている通りである。
【０１７９】
局所投与のために、本発明のポリペプチドを、純粋な形態（即ち、それらが液体である場合）において適用してもよい。しかし、一般的に、それらを、皮膚に、組成物又は製剤として、皮膚科学的に許容可能な担体（それは、固体又は液体でありうる）との組み合わせにおいて投与することが望ましいであろう。特定の例が、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１４５にさらに記載されている通りである。
【０１８０】
一般的に、液体組成物（例えばローションなど）中での本発明のポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５ｗｔ−%から、好ましくは約０．５〜１０ｗｔ−%からでありうる。半固形又は固形組成物（例えばゲル又は粉末など）中での濃度は、約０．１〜５ｗｔ−%、好ましくは約０．５〜２．５ｗｔ−%でありうる。
【０１８１】
処置における使用のために要求される本発明のポリペプチドの量は、選択された特定のポリペプチドだけでなく、しかし、また、投与の経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態に伴い変動しうるが、最終的には、担当医又は臨床医の判断によるであろう。また、本発明のポリペプチドの投与量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片、又は器官に依存して変動する。
【０１８２】
所望の用量は、便利に、単一用量中で又は適切な間隔で投与される分割用量として（例えば、２、３、４以上のサブ用量／日として）提示されうる。サブ用量自体は、さらに、例えば、多数の別々の緩く間隔を置いた投与中に分割されうる。
【０１８３】
投与レジメンは、長期間の毎日の処置を含みうる。「長期間」により、少なくとも２週間及び好ましくは、いくつかの週、月、又は年の持続期間を意味する。この投与量の範囲における必要な改変が、当業者により、本明細書において与えられた教示の通常の実験だけを使用して決定されうる。Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。投与量は、また、任意の合併症の事象において個々の医師により調整することができる。
【０１８４】
別の局面において、本発明は、ＣＸＣＲ７に関連する少なくとも１つの疾患及び障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のポリペプチド及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１８５】
本発明の文脈において、用語「防止及び／又は処置」は、疾患を防止及び／又は処置することを含むだけでなく、しかし、また、一般的に、疾患の発症を防止すること、疾患の進行を遅らせる又は逆転させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状の発生を防止する又は遅らせること、疾患に関連する１つ又は複数の症状を低下及び／又は軽減すること、疾患の及び／又はそれに関連する任意の症状の重症度及び／又は持続時間を低下させること、ならびに／あるいは、疾患の及び／又はそれに関連する任意の症状の重症度におけるさらなる増加を防止すること、疾患により起こされる任意の生理学的な傷害を防止、低下、又は逆転させること、ならびに、一般的に、処置されている患者に有益である任意の薬理学的な作用を含む。
【０１８６】
処置すべき被験者は、任意の温血動物、しかし、特に哺乳動物、さらに特にヒトでありうる。当業者に明らかであろう通り、処置される被験者は、特に、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ、又はそのリスクがある人でありうる。
【０１８７】
本発明は、ＣＸＣＲ７に関連する少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、その生物学的又は医薬的な活性を伴い、及び／又はＣＸＣＲ７が含まれる生物学的な経路又はシグナル伝達を伴い、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のアミノ酸配列、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチド、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。一実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ７、その生物学的又は薬理学的な活性、及び／又はＣＸＣＲ７が含まれる生物学的な経路又はシグナル伝達を調節することにより処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のポリペプチド及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。一実施態様において、前記の医薬的に効果的な量は、ＣＸＣＲ７、その生物学的又は薬理学的な活性、及び／又はＣＸＣＲ７が含まれる生物学的な経路又はシグナル伝達を調節するために十分である量；ならびに／あるいは、ＣＸＣＲ７、その生物学的又は薬理学的な活性、及び／又はＣＸＣＲ７が含まれる生物学的な経路又はシグナル伝達を調節するために十分である循環中の本発明のポリペプチドのレベルを提供する量でありうる。
【０１８８】
一実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物を、患者に投与することにより、防止及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関する。一実施態様において、方法は、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【０１８９】
一実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ７へのＣＸＣＬ１２及び／又はＣＸＣＬ１１の結合を、特定の細胞において、又は、処置されている被験者の特定の組織において阻害することにより（及び、特に、ＣＸＣＲ７へのＣＸＣＬ１２及び／又はＣＸＣＬ１１の結合を、癌細胞において、又は、処置されている被験者において存在する腫瘍において阻害することにより）防止及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【０１９０】
一実施態様において、本発明は、本明細書において列挙する疾患及び障害からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法であって、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物を投与することを含む。
【０１９１】
一実施態様において、本発明は、免疫療法のため、特に受動免疫療法のための方法に関し、その方法は、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ又はそのリスクがある被験者に、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１９２】
上の方法において、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド及び／又は同を含む組成物を、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、任意の適した様式で投与することができる。このように、本発明のポリペプチド及び／又は同を含む組成物を、例えば、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、経口、腹腔内（例、静脈内、皮下、筋肉内、又は胃腸管内を回避する他の任意の投与経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所、坐剤を用いて、吸入により投与することができる。臨床医は、そのような投与において使用される適した投与経路及び適した医薬的製剤又は組成物を、防止又は処置すべき疾患又は障害ならびに臨床医に周知である他の因子に依存して、選択することができるであろう。
【０１９３】
本発明のポリペプチド及び／又は同を含む組成物を、防止又は処置すべき疾患又は障害を防止及び／又は処置するために適している処置レジメンに従って投与する。臨床医は、一般的に、適した処置レジメンを、因子、例えば、防止又は処置すべき疾患又は障害、処置すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用すべき本発明のポリペプチド、使用すべき特定の投与経路及び医薬的製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、ならびに臨床医に周知の同様の因子などに依存して、決定することができるであろう。
【０１９４】
一般的に、処置レジメンは、本発明の１つ又は複数のポリペプチドの、又は同を含む１つ又は複数の組成物の、１つ又は複数の医薬的に効果的な量又は用量における投与を含みうる。投与される特定の量又は用量は、臨床医により、再び、上に引用する因子に基づき、決定することができる。
【０１９５】
一般的に、本明細書において言及する疾患及び障害の防止及び／又は処置のために、処置すべき特定の疾患又は障害、使用される本発明の特定のポリペプチドの効力、特定の投与経路、及び使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、本発明のポリペプチドは、一般的に、１グラム〜０．０１マイクログラム/kg体重/日、好ましくは０．１グラム〜０．１マイクログラム/kg体重/日、例えば約１、１０、１００、又は１０００マイクログラム/kg体重/日の量で、連続的（例、注入による）、単一の１日用量として又は１日の間の複数の分割用量として投与されうる。臨床医は、一般的には、適した一日用量を、本明細書において言及する因子に基づき、決定することができるであろう。また、特定の場合において、臨床医は、これらの量から逸脱することを、例えば、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、選んでもよいことが明らかであろう。一般的に、投与される量に関する一部のガイダンスを、しかし、親和性／結合力、有効性、生物分布、半減期、及び当業者に周知の同様の因子における違いを考慮に入れて、実質的に同じ経路を介して投与される、同じ標的に対する同等の従来の抗体又は抗体フラグメントについて通常投与される量から得ることができる。
【０１９６】
一実施態様において、本発明の単一の隣接ポリペプチドを使用しうる。一実施態様において、本発明の２つ以上のポリペプチドを、組み合わせにおいて提供する。
【０１９７】
本発明のポリペプチドを、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて、即ち、組み合わせ処置レジメンとして使用してもよく、それは、相乗効果に導きうる又は導かないであろう。再び、臨床医は、そのようなさらなる化合物又は成分、ならびに適した組み合わせの処置レジメンを、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、選択することができるであろう。
【０１９８】
特に、本発明のポリペプチドを、本明細書において引用する疾患及び障害の防止及び／又は処置のために使用する又は使用することができる他の医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて使用してもよく、その結果として、相乗効果が得られうる又は得られないであろう。そのような化合物及び成分、ならびにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬的製剤又は組成物の例が、臨床医には明らかでありうるが、一般的に、処置すべき腫瘍の処置のために通常適用される細胞増殖抑制性の活性成分を含む。
【０１９９】
腫瘍学のための本発明のポリペプチドを用いた使用のための特定の熟慮される組み合わせは、しかし、限定しないが、以下を含む：例、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えば、例、ＡＭＤ３１００、他のケモカイン受容体アンタゴニスト、タキソールなど；ゲムシトビン（ｇｅｍｃｉｔｏｂｉｎｅ）；シスプラチン；ｃＩＡＰ阻害剤（例えばｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、及び／又はＸＩＡＰへの阻害剤など）；ＭＥＫ阻害剤、しかし、限定しないが、例、Ｕ０１２６、ＰＤ０３２５９０１を含む；ｂＲａｆ阻害剤、しかし、限定しないが、例、ＲＡＦ２６５を含む；及びｍＴＯＲ阻害剤、しかし、限定しないが、例、ＲＡＤ００１を含む；ＶＥＧＦ阻害剤、しかし、限定しないが、例、ベバシズマブ、スニチニブ（ｓｕｔｉｎｉｂ）、及びソラフェニブ；Ｈｅｒ  ２阻害剤、しかし、限定しないが、例、トラスツズマブ及びラパチニブを含む；ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ｓｒｃ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、及び／又はＧＳＫ３阻害剤；選択的エストロゲン受容体モジュレーター、しかし、限定しないが、タモキシフェンを含む；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター、しかし、限定しないが、フルベストラントを含む。炎症状態のための本発明のポリペプチドを伴う使用のための特定の熟慮される組み合わせは、しかし、限定しないが、例えば、インターフェロンベータ１アルファ及びベータ、ナタリズマブ；ＴＮＦアルファアンタゴニスト（しかし、限定しないが、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、エタネルセプトを含む）；疾患修飾性抗リウマチ薬物、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）など；グルココルチコイド（しかし、限定しないが、例えば、ヒドロコルチゾンを含む）；非ステロイド性抗炎症薬物（しかし、限定しないが、例えば、イブプロフェン、スリンダクを含む）。
【０２００】
本発明の化合物／ポリペプチドとの組み合わせにおいて使用することができうる他の特定の化合物／ポリペプチドは、ＣＸＣＲ４に対して向けられたアミノ酸配列及びポリペプチドであり、それらは、Ablynx N.V.による国際出願ＷＯ  ０９／１３８５１９、Ablynx N.V.による非前公開米国出願６１／３５８，４９５（２０１０年６月２５日出願）；Ablynx N.V.によるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２１０／０６４７６６（２０１０年１０月４日出願）；及び／又はAblynx N.V.によるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０１５６（２０１１年１月７日出願）において記載されている。
【０２０１】
２つ以上の物質又は成分を、組み合わせ処置レジメンの部分として使用する場合、それらは、同じ投与経路を介して、又は、異なる投与経路を介して、実質的に同じ時間に又は異なる時間に（例、実質的に同時に、連続的に、又は代わりのレジメンに従って）投与することができる。物質又は成分を、同じ投与経路を介して、同時に投与する場合、それらは、異なる医薬的製剤もしくは組成物又は組み合わせた医薬的製剤もしくは組成物の部分として投与してもよく、当業者に明らかであろう通りである。
【０２０２】
また、２つ以上の活性物質又は成分を、組み合わせ処置レジメンの部分として使用する場合、物質又は成分の各々を、化合物又は成分をそれ自体で使用する場合に使用される同じ量で、同じレジメンに従って投与してもよく、そのような組み合わせ使用は、相乗効果に導きうる又は導かないであろう。しかし、２つ以上の活性物質又は成分の組み合わせ使用が、相乗効果に導く場合、投与すべき物質又は成分の１つ、それ以上、又は全ての量を低下させ、依然として所望の治療的作用を達成することも可能でありうる。これは、例えば、物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連している任意の不要な副作用を回避、限定、又は低下させる（それらを、それらの通常の量で使用した場合で、依然として所望の医薬的又は治療的効果が得られる）ために有用であろう。
【０２０３】
本発明に従って使用される処置レジメンの有効性は、含まれる疾患又は障害についてそれ自体が公知である任意の様式で決定及び／又は追跡してもよく、臨床医に明らかでありうる通りである。臨床医は、また、適当な場合、及び、ケースバイケースに基づき、特定の処置レジメンを変化又は修飾することができ、所望の治療効果を達成し、不要な副作用を回避、限定、又は低下させ、及び／又は、一方で所望の治療効果を達成し、他方で不要な副作用を回避、限定、又は低下させる適当なバランスを達成する。
【０２０４】
一般的に、処置レジメンには、所望の治療的効果が達成されるまで及び／又は所望の治療的効果が維持される限り、従いうる。再び、これは、臨床医により決定されることができる。
【０２０５】
別の局面において、本発明は、ＣＸＣＲ７に関連する疾患及び障害の少なくとも１つの防止及び／又は処置のため；及び／又は、本明細書において言及する処置の方法の１つ又は複数における使用のための医薬的組成物の調製における本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０２０６】
処置すべき被験者は、任意の温血動物、しかし、特に哺乳動物、さらに特にヒトでありうる。獣医学的な適用において、処置すべき被験者は、商業的な目的のために産生された又はペットとして保たれた任意の動物を含む。当業者に明かであろう通り、処置すべき被験者は、特に、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ、又はそのリスクのある人でありうる。
【０２０７】
本発明は、本発明のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチド、及び／又は同の医薬的組成物を、患者に投与することにより防止及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための医薬的組成物の調製における、本発明のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチドの使用に関する。
【０２０８】
さらに特に、本発明は、ＣＸＣＲ７に関連する疾患及び障害の防止及び／又は処置のための、特に、本明細書において列挙する疾患及び障害の１つ又は複数の防止及び処置のための医薬的組成物の調製における、本発明のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチドの使用に関する。
【０２０９】
再び、そのような医薬的組成物において、本発明の１つ又は複数のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチド、及び／又は同の医薬的組成物を、また、１つ又は複数の他の活性成分（例えば本明細書において言及するものなど）と適切に組み合わせてもよい。
【０２１０】
本発明は、また、インビトロ（例、インビトロ又は細胞アッセイにおいて）又はインビボ（例、単一細胞又は多細胞生物において、特に、哺乳動物において、さらに特にヒトにおいて、例えば、本発明の疾患又は障害のリスクがある又はそれに苦しむヒトにおいて）のいずれかでの使用のための組成物（例えば、限定を伴わず、本明細書においてさらに記載する通りの医薬的組成物又は調製物など）に関する。
【０２１１】
本発明の文脈において、「調節している」又は「調節するため」は、ＣＸＣＲ７及び特にＣＸＣＲ７（配列番号１）の活性を低下又は阻害することを意味し、適したインビトロ、細胞、又はインビボアッセイ（例えば、本明細書において言及するものなど）を使用して測定される通りである。特に、ＣＸＣＲ７及び特にＣＸＣＲ７（配列番号１）の活性を、同じ条件下の同じアッセイ（しかし、本発明のポリペプチドの存在を伴わない）におけるＣＸＣＲ７及び特にＣＸＣＲ７（配列番号１）の活性と比較し、少なくとも１%、好ましくは少なくとも５%、例えば、少なくとも１０%又は少なくとも２５%だけ、例えば、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、あるいは９０%以上だけ低下又は阻害することは、適したインビトロ、細胞、又はインビボアッセイ（例えば、本明細書において言及するものなど）を使用して測定される通りである。
【０２１２】
調節は、例えば、その基質又はリガンドの１つへのＣＸＣＲ７の結合を低下もしくは阻害すること及び／又は天然リガンド（ＣＸＣＬ１１及び／又はＣＸＣＬ１２）、ＣＸＣＲ７への結合のための基質と競合することを含みうる。
【０２１３】
１．４．  本発明のポリペプチドの生成
本発明は、さらに、本明細書において記載する免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、及び組成物を調製又は生成するための方法に関する。そのような方法の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【０２１４】
一般的に、これらの方法は、以下の工程を含みうる：
ａ）免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；及び
ｂ）ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインについての免疫グロブリンの単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること。
【０２１５】
そのような方法において、免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーは、免疫グロブリンの単一可変ドメインの任意の適したセット、コレクション、又はライブラリーでありうる。例えば、免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーは、免疫グロブリン配列のセット、コレクション、又はライブラリー（本明細書において記載する通り）、例えば免疫グロブリン配列のナイーブセット、コレクション、又はライブラリー；免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション、又はライブラリー；及び／又は、親和性成熟に供されている免疫グロブリン配列のセット、コレクション、又はライブラリーでありうる。
【０２１６】
また、そのような方法において、免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーは、重又は軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ、ＶＨ、又はＶＨＨドメインなど）のセット、コレクション、又はライブラリーでありうる。例えば、免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーは、ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体のセット、コレクション、又はライブラリーでありうる、あるいは、ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体として機能することが可能である免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーでありうる。
【０２１７】
この方法の好ましい局面において、免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーは、例えば、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）を用いて、あるいは、それに基づく又はそれに由来する適した抗原決定基（例えば、その抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ、又は他のエピトープなど）を用いて、適切に免疫化されている哺乳動物に由来する、免疫グロブリン配列の免疫セット、コレクション、又はライブラリーでありうる。１つの特定の局面において、前記の抗原決定基は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ、又は他の細胞外エピトープでありうる。
【０２１８】
上の方法において、免疫グロブリンの単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーは、ファージ、ファージミド、リボソーム、又は適した微生物（例えば酵母など）上でディスプレイしてもよく、スクリーニングを促進させる。免疫グロブリンの単一可変ドメイン（のセット、コレクション、又はライブラリー）をディスプレイ及びスクリーニングするための適した方法、技術、及び宿主生物は、当業者に、例えば、本明細書におけるさらなる開示に基づき、明らかであろう。参照が、また、Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)による総説に作られる。
【０２１９】
別の局面において、免疫グロブリンの単一可変ドメインを生成するための方法は、少なくとも以下の工程を含む：
ａ）免疫グロブリンの単一可変ドメインを発現する細胞のコレクション又はサンプルを提供すること；
ｂ）ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞についての細胞の前記コレクション又はサンプルをスクリーニングすること；及び
ｃ）ｉ）前記アミノ酸配列を単離し；又はｉｉ）前記細胞から、前記アミノ酸配列をコードする核酸配列を単離し、それに続き、前記アミノ酸配列を発現させること。
【０２２０】
別の局面において、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられたアミノ酸配列を生成するための方法は、少なくとも以下の工程を含みうる：
ａ）免疫グロブリンの単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；
ｂ）ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列について核酸配列の前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）前記核酸配列を単離し、それに続き、前記アミノ酸配列を発現させること。
【０２２１】
そのような方法において、免疫グロブリンの単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリーは、例えば、免疫グロブリン配列のナイーブセット、コレクション、又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリー；免疫グロブリン配列の合成又は半合成セット、コレクション、又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリー；及び／又は、親和性成熟に供されている免疫グロブリン配列のセット、コレクション、又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリーでありうる。
【０２２２】
別の局面において、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられるアミノ酸配列を生成するための方法は、少なくとも以下の工程を含みうる：
ａ）免疫グロブリンの単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；
ｂ）ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列をコードする、ならびに、交差遮断される又は本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインもしくはポリペプチド（例、配列番号３９〜４３、９１又は９９〜１０２（表Ｂ−３））を交差遮断している核酸配列について核酸配列の前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）前記核酸配列を単離し、それに続き、前記アミノ酸配列を発現させること。
【０２２３】
本発明は、また、上の方法により、又は、代わりに、上の方法の１つを含む方法により、及び、また、少なくとも、前記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する；及び、それ自体が公知の様式において前記アミノ酸配列を発現又は合成する（例えば、適した宿主細胞又は宿主生物における発現により、あるいは化学合成により）工程により得られる。
【０２２４】
また、上の工程に続き、本発明の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインを、適切にヒト化、ラクダ化、又は他に配列最適化（例、製造可能性、安定性、及び／又は溶解性について最適化した配列）してもよい；及び／又は、このようにして得られたアミノ酸配列を、互いにあるいは１つ又は複数の他の適した免疫グロブリンの単一可変ドメインに（場合により、１つ又は複数の適したリンカーを介して）連結してもよい。また、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列を、適切にヒト化、ラクダ化、又は他に配列最適化（例、製造可能性、安定性、及び／又は溶解性について最適化した配列）してもよい；及び／又は、本発明のアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の核酸配列を、互いにあるいは他の適した免疫グロブリンの単一可変ドメインをコードする１つ又は複数の核酸配列に（場合により、１つ又は複数の適したリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して）連結してもよく、その後、このようにして得られたヌクレオチド配列を、適切に発現させてもよく、本発明のポリペプチドを提供する。
【０２２５】
本発明は、さらに、本明細書に記載する免疫グロブリンの単一可変ドメイン、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、及び組成物の適用及び使用、ならびにＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に関連する疾患及び障害のための診断、防止、及び／又は処置のための方法に関する。一部の好ましいが、しかし、非限定的な適用及び使用が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【０２２６】
本発明は、また、治療における使用のための、本明細書において記載する免疫グロブリンの単一可変ドメイン、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、及び組成物に関する。
【０２２７】
特に、本発明は、また、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのアミノ酸配列、化合物、コンストラクト、又はポリペプチド（の医薬的に効果的な量）を投与することにより防止又は処置することができる疾患又は障害の治療における使用のための、本明細書において記載する免疫グロブリンの単一可変ドメイン、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、及び組成物に関する。
【０２２８】
さらに特に、本発明は、癌の治療における使用のための、本明細書において記載する免疫グロブリンの単一可変ドメイン、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、及び組成物に関する。
【０２２９】
１．５．  本発明のポリペプチド及び免疫グロブリンの単一可変ドメインのバリアント
本発明のポリペプチド及び免疫グロブリンの単一可変ドメイン（それは、本発明のポリペプチドの部分を形成する）は、効力又は他の所望の特性をさらに改善するために、変えてもよい。
【０２３０】
一般的に、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１：
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４を伴うポリペプチドとして定義することができ、
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれ、フレームワーク領域１〜４を指し、及び、ここで、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ、相補性決定領域１〜３を指す。
【０２３１】
ＣＤＲ配列の一部の特に好ましいが、しかし、非限定的な組み合わせ、ならびにＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の好ましい組み合わせが、表Ｂ−２に言及されており、それは、本発明の多数の好ましい（しかし、非限定的な）免疫グロブリンの単一可変ドメイン中に存在しているＣＤＲ配列及びフレームワーク配列を列挙する。当業者に明らかであろう通り、同じクローン中で生じるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の組み合わせ（即ち、表Ｂ−２中の同じ行又は列で言及されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列）が通常好ましいであろう（もっとも、本発明は、その最も広い意味において、それらに限定されず、また、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ配列の他の適した組み合わせを含む）。また、同じクローン中で生じるＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の組み合わせ（即ち、表Ｂ−２中の同じ行又は列で言及されるＣＤＲ配列及びフレームワーク配列）が通常好ましいであろう（もっとも、本発明は、その最も広い意味において、それらに限定されず、また、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の他の適した組み合わせ、ならびにそのようなＣＤＲ配列及び他の適したフレームワーク配列の組み合わせを含み、例えば、本明細書においてさらに記載する通りである）。
【０２３２】
また、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲの組み合わせを含む、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、各々のＣＤＲは、言及するＣＤＲと、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインからなる群より選ばれるＣＤＲにより置換することができ；ここで：
ｉ）そのようなＣＤＲ中の任意のアミノ酸置換は、好ましくは、表Ｂ−２中で言及する対応するＣＤＲ配列と比較し、保存的なアミノ酸置換（本明細書において定義する通り）であり；及び／又は
ｉｉ）任意のそのようなＣＤＲ配列は、好ましくは、表Ｂ−２中で言及する対応するＣＤＲ配列と比較し、アミノ酸置換だけを含み、アミノ酸の欠失又は挿入はない；及び／又は
ｉｉｉ）任意のそのようなＣＤＲ配列は、それ自体が公知の親和性成熟のための技術を用いて由来するＣＤＲであり、特に、表Ｂ−２中で言及する対応するＣＤＲ配列から開始する。
【０２３３】
しかし、当業者に明らかであろう通り、ＣＤＲ配列（の組み合わせ）、ならびに表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列（の組み合わせ）が、一般的に好ましいであろう。
【０２３４】
このように、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つが、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より；あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、それぞれ、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の「配列同一性」（本明細書において定義する通り）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の群より；ならびに／あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、それぞれ、３、２、又はわずか１の「アミノ酸の違い」（本明細書において定義する通り）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２３５】
この文脈において、「適切に選ぶ」により、適用可能な場合、ＣＤＲ１配列が適したＣＤＲ１配列（即ち、本明細書において定義する通り）より選ばれ、ＣＤＲ２配列が適したＣＤＲ２配列（即ち、本明細書において定義する通り）より選ばれ、及び、ＣＤＲ３配列が適したＣＤＲ３配列（即ち、本明細書において定義する通り）より選ばれることをそれぞれ意味する。さらに特に、ＣＤＲ配列は、好ましくは、本発明のナノボディが、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、本明細書において定義する親和性（ＥＣ５０値として、又は、代わりに、ＩＣ５０値として、本明細書においてさらに記載する通り、種々のインビトロ及び／又はインビボ効力あるいは他のアッセイにおいて適切に測定及び／又は表現される）を伴い結合するように選ぶ。
【０２３６】
特に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３配列が、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３配列からなる群より、あるいは、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ３配列からなる群より；ならびに／あるいは、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２３７】
好ましくは、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つが、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より、あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、それぞれ、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より；ならびに／あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、それぞれ、３、２、又はわずか１の「アミノ酸の違い」を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２３８】
特に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３配列が、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３配列からなる群より、あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ３配列の群より適切に選ばれ；ならびに、存在するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つが、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の群より、あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと、それぞれ、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の群より；ならびに／あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと、それぞれ、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２３９】
最も好ましくは、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より、あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、それぞれ、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の群より；ならびに／あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと、それぞれ、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２４０】
さらにより好ましくは、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つが、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。好ましくは、この局面において、存在する他の２つのＣＤＲ配列の少なくとも１つ又は好ましくは両方が、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ配列より；ならびに／あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、対応する配列の少なくとも１つと、それぞれ、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２４１】
特に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３配列が、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３からなる群より適切に選ばれる。好ましくは、この局面において、存在するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つ及び好ましくは両方が、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列と、それぞれ、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の群より；ならびに／あるいは、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと、それぞれ、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２４２】
さらにより好ましくは、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つが、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。好ましくは、この局面において、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ｂ−２に列挙する、対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群より；ならびに／あるいは、表Ｂ−２に列挙する、対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２４３】
特に、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、少なくともＣＤＲ３配列が、表Ｂ−２に列挙するＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれ、ＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列のいずれかが、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列からなる群より適切に選ばれる。好ましくは、この局面において、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ｂ−２に列挙する、対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群より；ならびに／あるいは、表Ｂ−２に列挙する、対応するＣＤＲ配列と、３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２４４】
さらにより好ましくは、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在する全て３つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列が、それぞれ、表Ｂ−２に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列からなる群より適切に選ばれる。
【０２４５】
また、一般的に、表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲの組み合わせ（即ち、表Ｂ−２中の同じ行又は列に言及されるもの）が好ましい。このように、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン中のＣＤＲが、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ配列である、又は、表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ配列と、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群より；及び／又は、表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ配列と３、２、又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選ばれる場合、他のＣＤＲの少なくとも１つ及び好ましくは両方が、表Ｂ−２中の同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列（即ち、表Ｂ−２中の同じ行又は列に言及される）より適切に選ばれる、あるいは、同じ組み合わせに属しているＣＤＲ配列と、少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９９%の配列同一性（本明細書において定義する通り）を有するＣＤＲ配列の群より、及び／又は同じ組み合わせに属しているＣＤＲ配列と３、２，又はわずか１のアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列の群より適切に選ばれることが一般的に好ましい。上のパラグラフ中に示す他の優先度を、また、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲの組み合わせに適用する。
【０２４６】
このように、非限定的な例を用いて、本発明のポリペプチドは、例えば、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−２中に言及する（しかし、異なる組み合わせに属している）ＣＤＲ２配列の１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有するＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含みうる。
【０２４７】
本発明の一部の好ましい免疫グロブリンの単一可変ドメインは、例えば、以下を含みうる：（１）表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ１配列；表Ｂ−２中に言及する（しかし、異なる組み合わせに属している）ＣＤＲ２配列の１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有するＣＤＲ２配列；及び、表Ｂ−２中に言及する（しかし、異なる組み合わせに属している）ＣＤＲ３配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ３配列；又は（２）表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ１配列；ＣＤＲ２配列、及び表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ３配列の１つ；又は（３）ＣＤＲ１配列；表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ２配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ２配列；及び、ＣＤＲ２配列と同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ３配列と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するＣＤＲ３配列。
【０２４８】
本発明の一部の特に好ましい免疫グロブリンの単一可変ドメインは、例えば、以下を含みうる：（１）表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ１配列；同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ２配列と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するＣＤＲ２配列；及び、同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ３配列と８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ３配列；（２）ＣＤＲ１配列；表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ２及び表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ３配列（ここで、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は、異なる組み合わせに属しうる）。
【０２４９】
本発明の一部のさらにより好ましい免疫グロブリンの単一可変ドメインは、例えば、以下を含みうる：（１）表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列の１つと８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ１配列；同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ２配列；及び、異なる組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ３配列；又は、（２）表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列；同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ２配列と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するＣＤＲ２配列；及び、同じ又は異なる組み合わせに属する、表Ｂ−２中に列挙するＣＤＲ３配列と８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ３配列。
【０２５０】
本発明の特に好ましい免疫グロブリンの単一可変ドメインは、例えば、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ１配列、同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ２配列と８０%を上回る配列同一性を有するＣＤＲ２配列；及び、同じ組み合わせに属する、表Ｂ−２中に言及するＣＤＲ３配列を含みうる。
【０２５１】
本発明の最も好ましい免疫グロブリンの単一可変ドメインにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、それぞれ、表Ｂ−２中に列挙する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列の組み合わせの１つより適切に選ばれる。
【０２５２】
本発明の別の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、（ａ）ＣＤＲ１は、１〜１２の間のアミノ酸残基、及び、通常、２〜９の間のアミノ酸残基、例えば５、６、又は７のアミノ酸残基などの長さを有する；及び／又は（ｂ）ＣＤＲ２は、１３〜２４の間のアミノ酸残基、及び、通常、１５〜２１の間のアミノ酸残基、例えば１６及び１７のアミノ酸残基などの長さを有する；及び／又は（ｃ）ＣＤＲ３は、２〜３５の間のアミノ酸残基、及び、通常、３〜３０の間のアミノ酸残基、例えば６〜２３の間のアミノ酸残基などの長さを有する。
【０２５３】
別の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明は、ＣＤＲ配列（本明細書において定義する通り）が、配列番号３９〜４３又は９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列と、８０%を上回る、より好ましくは９０%を上回る、好ましくは９５%を上回る、例えば９９%以上の配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する。
【０２５４】
本発明の別の好ましいが、しかし、非限定的な局面は、配列番号３９〜４３又は９１ならびに９９〜１０２（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインのヒト化バリアントに関し、それは、対応する天然ＶＨＨ配列と比較し、少なくとも１つのヒト化置換（本明細書において定義する通り）、及び特に少なくとも１つのヒト化置換を、そのフレームワーク配列（本明細書において定義する通り）の少なくとも１つにおいて含む。
【０２５５】
本明細書において「好ましい」（又は「より好ましい」、又は「さらにより好ましい」、など）として言及されている免疫グロブリンの単一可変ドメインが、また、本明細書において記載するポリペプチド中での使用のために好ましい（又はより好ましい、又はさらにより好ましい、など）ことが当業者に明かであろう。このように、本発明の１つ又は複数の「好ましい」免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む又はそれから実質的になるポリペプチドが、一般的に好ましく、本発明の１つ又は複数の「より好ましい」免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む又はそれから実質的になるポリペプチドが、一般的により好ましい、など。
【０２５６】
１．６．  本発明のヌクレオチド、宿主細胞
本発明の別の局面は、本発明のアミノ酸配列（例えば本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）をコードする核酸又は同を含む本発明のポリペプチドに関する。再び、本明細書において一般的に記載される通り、そのような核酸は、本明細書において定義する通り、遺伝子コンストラクトの形態でありうる。本発明のこの局面の特定の実施態様が、表Ｂ−６、配列番号５９〜６３及び７３〜７７に提供される。
【０２５７】
別の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明は、免疫グロブリンの単一可変ドメインの核酸配列に関し、ここで、配列（本明細書において定義する通り）は、配列番号５９〜６３又は７３〜７７（表Ｂ−６を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインの核酸配列の少なくとも１つの配列と、８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る、例えば９９%以上の配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する。
【０２５８】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンの単一可変ドメインの核酸配列を含む核酸配列に関し、ここで、配列（本明細書において定義する通り）は、配列番号５９〜６３又は７３〜７７（表Ｂ−６を参照のこと）の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つの配列と、８０%を上回る、好ましくは９０%を上回る、より好ましくは９５%を上回る、例えば９９%以上の配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する。
【０２５９】
別の局面において、本発明は、本発明のアミノ酸配列（例えば免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）及び／又は同を含む本発明のポリペプチドを発現する又は発現することが可能である；ならびに／あるいは本発明の核酸を含む宿主又は宿主細胞に関する。そのような宿主又は宿主細胞の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【０２６０】
当業者に明らかであろう通り、本発明のポリペプチドを調製するための１つの特に有用な方法は、一般的に、以下の工程を含む：
ｉ）適した宿主細胞もしくは宿主生物（また、本明細書において「本発明の宿主」として言及される）における、又は本発明の前記のアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする核酸（また、本明細書において「本発明の核酸」として言及される）の別の適した発現系における発現、
場合により、以下が続く：
ｉｉ）このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
特に、そのような方法は、以下の工程を含みうる：
ｉ）本発明の前記宿主が、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを発現及び／又は産生する条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持すること；場合により、以下が続く：
ｉｉ）このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【０２６１】
本発明の核酸は、一本又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形態でありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、意図する宿主細胞又は宿主生物における発現のために特に適応されているコドン使用を伴うＤＮＡなど）でありうる。
【０２６２】
本発明の一局面に従い、本発明の核酸は、本明細書において定義する通り、実質的に単離形態である。
【０２６３】
本発明の核酸は、また、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣなど）の形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、それは、再び、実質的に単離形態でありうる。
【０２６４】
本発明の核酸は、本明細書において与えられる本発明のポリペプチドについての免疫グロブリンの単一可変ドメインに関する情報に基づき、それ自体が公知の様式において調製する又は得ることができ、ならびに／あるいは適した自然の供給源から単離することができる。類似体を提供するために、自然発生するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を、例えば、部位特異的変異誘発に供することができ、前記類似体をコードする本発明の核酸を提供する。また、当業者に明らかであろう通り、本発明の核酸を調製するために、また、いくつかのヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列及び例えば１つ又は複数のリンカーをコードする核酸を、適した様式において一緒に連結することができる。
【０２６５】
本発明の核酸を生成するための技術は、当業者に明らかであろうが、例えば、しかし、限定しないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つ以上の自然発生する及び／又は合成配列（あるいはその２つ以上の部分）を組み合わせること、切断発現産物の発現に導く変異の導入；１つ又は複数の制限部位の導入（例、適した制限酵素を使用して簡単に消化及び／又は連結されうるカセット及び／又は領域を作製すること）、及び／又は、１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用し、例えば、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）の自然発生形態の配列を鋳型として使用したＰＣＲ反応を用いて変異の導入を含む。これら及び他の技術は、当業者に明らかであろうが、参照が、再び、上に言及する、標準的なハンドブック、例えば、Sambrook et al. and Ausubel et al.など、ならびに下の実施例に作られる。
【０２６６】
本発明の核酸は、また、遺伝子コンストラクトの形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、それは、当業者に明らかであろう通りであり、ＷＯ  ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ１３１〜１３４に記載される通り。そのような遺伝子コンストラクトは、一般的に、場合により、それ自体が公知の遺伝子コンストラクトの１つ又は複数のエレメント、例えば、１つ又は複数の適した調節エレメント（例えば適したプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び本明細書において言及される遺伝子コンストラクトのさらなるエレメントなどに連結された少なくとも１つの本発明の核酸を含む。本発明の少なくとも１つの核酸を含むそのような遺伝子コンストラクトは、また、本明細書において、「本発明の遺伝子コンストラクト」として言及されうる。
【０２６７】
本発明の遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子コンストラクトは、また、意図する宿主細胞又は宿主生物の形質転換のために適した形態で、意図する宿主細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡ中への組込みのために適した形態で、あるいは意図する宿主生物における独立した複製、維持、及び／又は遺伝のために適した形態でありうる。例えば、本発明の遺伝子コンストラクトは、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンなどの形態でありうる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、発現をインビトロ及び／又はインビボで（例、適した宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）提供することができるベクターでありうる。
【０２６８】
好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明の遺伝子コンストラクトは以下を含む
ｉ）本発明の少なくとも１つの核酸；動作可能に、以下に接続される
ｉｉ）１つ又は複数の調節エレメント、例えばプロモーター及び場合により適したターミネーターなど；及び、場合により、
ｉｉｉ）それ自体が公知の遺伝子コンストラクトの１つ又は複数のさらなるエレメント；
ここで、用語「動作可能に接続された」及び「動作可能に連結された」は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３１〜１３４に与えられる意味を有し；及び、ここで、「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「さらなるエレメント」は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３１〜１３４に記載される通りであり；及び、ここで、遺伝子コンストラクトは、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３１〜１３４にさらに記載される通りでありうる。
【０２６９】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子コンストラクトを使用し、宿主細胞又は宿主生物を、即ち、本発明のポリペプチドの発現及び／又は産生のために形質転換してもよい。適した宿主又は宿主細胞は、当業者に明らかであろうが、例えば、任意の適した真菌、原核、又は真核細胞もしくは細胞株あるいは任意の適した真菌、原核、又は真核生物、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３４及び１３５に記載されるもの；ならびに、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の発現及び産生のための、それ自体が公知の全ての他の宿主又は宿主細胞でありうるが、それらは、当業者に明らかであろう。参照が、また、本明細書において上で引用する一般的な背景技術に、ならびに、例えば、ＷＯ  ９４／２９４５７；ＷＯ  ９６／３４１０３；ＷＯ  ９９／４２０７７に作られる。
【０２７０】
本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドは、例えば、また、トランスジェニック動物の乳汁中で、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ、又は羊の乳汁中で（例えば、哺乳動物中にトランスジーンを導入するための一般的な技術については、ＵＳ−Ａ−６，７４１，９５７、ＵＳ−Ａ−６，３０４，４８９、及びＵＳ−Ａ−６，８４９，９９２を参照のこと）、植物又は植物の部分中で（しかし、限定しないが、それらの葉、花、果実、種子、根、又は塊茎を含む）（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファにおいて）、あるいは、例えば、カイコＢｏｍｂｉｘ  ｍｏｒｉの蛹中で産生することもできる。
【０２７１】
さらに、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドを、また、無細胞発現系において発現及び／又は産生することができ、そのような系の適した例は、当業者に明かであろう。一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、小麦胚芽系における；ウサギ網状赤血球ライセートにおける；又は大腸菌Ｚｕｂａｙ系における発現を含む。
【０２７２】
上に言及する通り、免疫グロブリンの単一可変ドメインの使用の利点の１つは、それに基づくポリペプチドを、適した細菌系における発現を通じて調製することができることであり、適した細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節エレメントなどは、例えば、上に引用する参考文献から、当業者に明らかであろう。しかし、本発明は、その最も広い意味において、細菌系における発現に限定されないことに注目すべきである。
【０２７３】
好ましくは、本発明において、本発明のポリペプチドを、医薬的使用のために適している形態において提供する（インビボ又はインビトロ）発現系（例えば細菌発現系など）を使用し、そのような発現系は、再び、当業者に明かであろう。また、当業者に明かであろう通り、医薬的使用のために適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成のための技術を使用して調製することができる。
【０２７４】
工業規模での産生のために、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むタンパク質治療薬の（工業）産生のための好ましい異種宿主は、大規模発現／産生／発酵のために、及び特に大規模な医薬的な（即ち、ＧＭＰグレード）発現／産生／発酵のために適している大腸菌、ピキア・パストリス、Ｓセレビシエの株を含む。そのような株の適した例が、当業者に明らかであろう。そのような株及び産生／発現系は、また、企業、例えばRichter Helm（Hamburg, Germany）又はCMC Biologics（Soeborg, Denmark）などにより利用可能になる。
【０２７５】
あるいは、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模発現／産生／発酵のために、及び特に大規模な医薬的な発現／産生／発酵のために使用することができる。再び、そのような発現／産生系が、また、上に言及する企業の一部により利用可能になる。
【０２７６】
特定の発現系の選択は、部分的には、特定の翻訳後修飾、より具体的には、グリコシル化についての要求に依存しうる。グリコシル化が望ましい又は要求される免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む組換えタンパク質の産生は、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物の発現宿主の使用を必要としうる。この点において、得られたグリコシル化パターン（即ち、サッカライドの性質、付着した残基の数及び位置）が、発現のために使用される細胞又は細胞株に依存しうることが当業者に明らかであろう。好ましくは、ヒト細胞又は細胞株のいずれかを使用し（即ち、ヒトのグリコシル化パターンを実質的に有するタンパク質に導く）、あるいは、別の哺乳動物細胞を使用し、それは、ヒトのグリコシル化と実質的及び／又は機能的に同じである、あるいは少なくともヒトのグリコシル化を模倣するグリコシル化パターンを提供することができる。一般的に、原核生物の宿主（例えば大腸菌など）は、タンパク質をグリコシル化する能力を有さず、より低い真核生物（例えば酵母など）の使用は、通常、ヒトのグリコシル化とは異なるグリコシル化パターンに導く。それにもかかわらず、全ての先行する宿主細胞及び発現系を、本発明において、得るべき所望のポリペプチドに依存して使用することができることを理解すべきである。
【０２７７】
このように、本発明の１つの非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドをグリコシル化する。本発明の別の非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは非グリコシル化である。
【０２７８】
本発明の１つの好ましいが、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、細菌細胞中で、特に、大規模な医薬品産生のために適した細菌細胞（例えば上に言及する株の細胞など）中で産生される。
【０２７９】
本発明の別の好ましいが、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、酵母細胞中で、特に、大規模な医薬品産生のために適した酵母細胞（例えば上に言及する種の細胞など）中で産生される。
【０２８０】
本発明のさらに別の好ましいが、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞中で、特に、ヒト細胞中で又はヒト細胞株の細胞中で、さらに特に、ヒト細胞中で又は大規模な医薬品産生のために適しているヒト細胞株（例えば、本明細書において上で言及する細胞株など）の細胞中で産生される。
【０２８１】
ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３８及び１３９にさらに記載される通り、宿主細胞中での発現を使用し、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、及び本発明のポリペプチドを産生する場合、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びポリペプチドを、細胞外で（例、サイトゾル中で、ペリプラズム中で、又は封入体中で）産生し、次に、宿主細胞から単離し、場合により、さらに精製することができる；又は、細胞外で（例、宿主細胞を培養した培地中で）産生し、次に、培養培地から単離し、場合により、さらに精製することができる。このように、本発明の１つの非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、細胞外で産生された、及び宿主細胞から、特に細菌細胞から、又は細菌細胞中の封入体から単離されたアミノ酸配列、ポリペプチドである。本発明の別の非限定的な局面に従い、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドは、細胞外で産生された、及び宿主細胞を培養した培地から単離されたアミノ酸配列又はポリペプチドである。
【０２８２】
これらの宿主細胞との使用のための一部の好ましいが、しかし、非限定的なプロモーターは、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３９及び１４０に言及されるものを含む。
【０２８３】
これらの宿主細胞との使用のための一部の好ましいが、しかし、非限定的な分泌配列は、ＷＯ  ０８／０２００７９のページ１３９及び１４０に言及されるものを含む。
【０２８４】
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するための適した技術が、当業者に明らかであろうが、ならびに、意図される宿主細胞／宿主生物及び使用される遺伝子コンストラクトに依存しうる。参照が、再び、上に言及するハンドブック及び特許出願に作られる。
【０２８５】
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子コンストラクトを用いて成功裏に形質転換されているそれらの宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択するための工程を実施してもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子コンストラクト中に存在する選択可能なマーカーに基づく選択工程又は本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程（例、特異的抗体を使用する）でありうる。
【０２８６】
形質転換された宿主細胞（それは、安定な細胞株の形態でありうる）又は宿主生物（それは、安定な変異体系統又は株の形態でありうる）は、本発明のさらなる局面を形成する。好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、それらが、本発明のポリペプチド（宿主生物の場合において：その少なくとも１つの細胞、部分、組織、又は器官において）を発現する、又は発現することが（少なくとも）可能である（例、適した条件下で）ようにする。本発明は、また、例えば、細胞分裂により又は有性もしくは無性生殖により得られうる、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代、及び／又は子孫を含む。
【０２８７】
本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインの発現を産生する／得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物を、一般的に、条件下で保ち、維持し、及び／又は培養してもよく、本発明の（所望の）アミノ酸配列又はポリペプチドを発現／産生するようにする。適した条件は当業者に明らかであろうが、通常、使用する宿主細胞／宿主生物に、ならびに本発明の（関連）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに依存しうる。再び、参照が、本発明の遺伝子コンストラクトに関するパラグラフにおいて上に言及するハンドブック及び特許出願に作られる。
【０２８８】
一般的に、適した条件は、適した培地の使用、食物の適した供給源及び／又は適した栄養物の存在、適した温度の使用、ならびに、場合により、適した誘導因子又は化合物の存在（例、本発明のヌクレオチド配列が、誘導可能なプロモーターの制御下にある場合）を含みうるが；それらの全てが当業者により選択されうる。再び、そのような条件下で、本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインを、構成的な様式において、一過性の様式において、又は適切に誘導された場合だけで、発現されうる。
【０２８９】
また、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを、（最初に）未成熟形態（上に言及する通り）において生成してもよく、それを、次に、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、翻訳後修飾に供してもよいことが当業者に明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを、再び、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、グリコシル化してもよい。
【０２９０】
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを、次に、宿主細胞／宿主生物から及び／又は前記宿主細胞又は宿主生物を培養した培地から、それ自体が公知のタンパク質単離及び／又は精製技術、例えば（調製的）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、沈殿差技術、親和性技術（例、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用して）、及び／又は調製的な免疫学的技術（即ち、単離すべきアミノ酸配列に対する抗体を使用して）を使用して単離してもよい。
【０２９１】
本願を通じて引用する参考文献（文献・参考文献、発行された特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全ての全内容が、本明細書により、参照により、特に、本明細書において上に参照する教示について、明確に組み入れられる。
【０２９２】
１．７  ＣＸＣＲ７のモジュレーター
多数の異なるスクリーニングプロトコールを利用し、細胞中での、特に、哺乳動物細胞中での、及び、特に、ヒト細胞中でのＣＸＣＲ７の活性又は機能のレベルを調節する薬剤を同定することができる。一般的な用語において、スクリーニング方法は、例えば、ＣＸＣＲ７又はそのフラグメントに結合すること、及び、本発明のポリペプチド又はＩＳＶＤ（例えば、配列番号３９〜４８、７８〜８９、９１、９９〜１０２、又は１３２〜１４０のいずれか１つを含む）がＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することを防止することにより、薬剤又は複数の薬剤をスクリーニングし、（ヒト）ＣＸＣＲ７（配列番号１）と相互作用する１つ又は複数の薬剤を同定することを含む。一部の実施態様において、薬剤は、別のタンパク質についての薬剤の親和性の少なくとも約１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、３００、５００、又は１０００倍を伴いＣＸＣＲ７に結合する。一部の実施態様において、本明細書において記載するエピトープを含む（及び、場合により、Ｎ及び／又はＣ末端にさらなる非ＣＸＣＲ７アミノ酸を含む）ＣＸＣＲ７のフラグメントは、わずか、例えば、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０以下のアミノ酸である。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ７フラグメントは、完全長ＣＸＣＲ７ポリペプチド中の全てより少ないアミノ酸を有する任意のフラグメントである。
【０２９３】
一部の実施態様において、ＣＸＣＲ７モジュレーターは、ＣＸＣＲ７ポリペプチド又はそのフラグメントへの結合からの、本発明のポリペプチド又はＩＳＶＤと競合する分子についてのスクリーニングにより同定する。当業者は、競合分析を実施するための多数の方法（例えば、本明細書にのいて開示するものなど）があることを認識するであろう。一部の実施態様において、ＣＸＣＲ７を伴うサンプルを、本発明の標識ポリペプチド又はＩＳＶＤ（例えば、配列番号３９〜４８、７８〜８９、９１、９９〜１０２、又は１３２〜１４０のいずれか１つを含む）を用いてプレインキュベートし、次に、潜在的なコンペティター分子と接触させる。テスト化合物の存在におけるＣＸＣＲ７に結合したポリペプチド又はＩＳＶＤの量の変化（例、減少）は、テスト化合物が潜在的なＣＸＣＲ７モジュレーターであることを示す。
【０２９４】
１．８  診断的及び／又は予後的適用における使用のためのキット
上に示唆する診断的、研究、及び治療的適用における使用のために、キットが、また、本発明により提供される。診断的及び研究適用において、そのようなキットは、以下のいずれか又は全てを含みうる：アッセイ試薬、緩衝液、及び本発明の抗ＣＸＣＲ７ポリペプチド又はＩＳＶＤ。治療的産物は、滅菌生理食塩水又は別の医薬的に許容可能な乳剤及び懸濁基剤を含みうる。
【０２９５】
また、キットは、本発明の方法の実行のための指導（即ち、プロトコール）を含む指示材料を含みうる。指示材料は、典型的には、書面又は印刷の材料を含むが、それらは、そのようなものに限定されない。そのような指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることが可能な任意の媒体が、本発明により熟慮される。そのような媒体は、しかし、限定しないが、電子記憶媒体（例、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例、ＣＤ−ＲＯＭ）などを含む。そのような媒体は、そのような指示材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含みうる。
【０２９６】
本発明を、本明細書において、さらに、以下の非限定的な好ましい局面、図、及び実施例を用いて記載する。
【０２９７】
好ましい非限定的な局面：
局面Ａ−１：ＣＸＣＲ７及び特定のヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に向けられた及び／又は特異的に結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０２９８】
局面Ａ−２：実質的に単離形態である、局面Ａ−１に従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０２９９】
局面Ａ−３：被験者への投与のための局面Ａ−１又はＡ−２に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、前記被験者において自然に生じない。
【０３００】
局面Ａ−４：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、解離定数（ＫＤ）１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、及び、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、及び、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルを用いて、特異的に結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。
【０３０１】
局面Ａ−５：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、会合速度（Ｋｏｎ速度）１０２M-1s-1〜約１０７M-1s-1の間、好ましくは１０３M-1s-1〜１０７M-1s-1の間、より好ましくは１０４M-1s-1〜１０７M-1s-1の間、例えば１０５M-1s-1〜１０７M-1s-1の間などを伴い、特異的に結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。
【０３０２】
局面Ａ−６：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、解離速度（Ｋｏｆｆ速度）１s-1〜１０−６s-1の間、好ましくは１０−２s-1〜１０−６s-1の間、より好ましくは１０−３s-1〜１０−６s-1の間、例えば１０−４s-1〜１０−６s-1の間などを伴い、特異的に結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。
【０３０３】
局面Ａ−７：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、親和性５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満などを伴い、特異的に結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。
【０３０４】
局面Ａ−８：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＳＤＦ−１及び／又はＩ−ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１及び／又はＣＸＣＬ１２）を、５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば１nM未満の平均ＫＩ及び５０%以上、より好ましくは７５%以上、さらにより好ましくは８０%以上の平均ＳＤＦ−１及び／又はＩ−ＴＡＣ置換を伴い、特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。そのような平均Ｋｉ及び／又は平均置換値は、例えば、実施例９又は１０に記載する通りのアッセイにおいて決定してもよい。
【０３０５】
局面Ａ−９：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＳＤＦ−１及び／又はＩ−ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１及び／又はＣＸＣＬ１２）を、２０nM未満の平均ＫＩ及び７０%以上の平均ＳＤＦ−１及び／又はＩ−ＴＡＣ置換を伴い、特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。そのような平均Ｋｉ及び／又は平均置換値は、例えば、実施例９又は１０に記載する通りのアッセイにおいて決定してもよい。
【０３０６】
局面Ａ−１０：４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３０７】
局面Ａ−１１：免疫グロブリン配列である、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３０８】
局面Ａ−１２：自然発生する免疫グロブリン配列（任意の適した種からの）又は合成もしくは半合成の免疫グロブリン配列である、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３０９】
局面Ａ−１３：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は技術（例えば親和性成熟など）により得られている免疫グロブリン配列である、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１０】
局面Ａ−１４：軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）から；又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）から実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１１】
局面Ａ−１５：従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１２】
局面Ａ−１６：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適している免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（しかし、限定しないが、ＶＨＨ配列を含む）でありうる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１３】
局面Ａ−１７：ナノボディから実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１４】
局面Ａ−１８：以下であるナノボディから実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン：
ｉ）ＷＯ  ２００９／１３８５１９の配列番号１〜２２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視し；
及び、ここで：
ｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８でアミノ酸残基の１つ又は複数が、表Ａ−１に言及するホールマーク残基より選ばれる。
【０３１５】
局面Ａ−１９：以下である免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン
ｉ）配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視し；；
及び、ここで：
ｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８でアミノ酸残基の１つ又は複数が、表Ａ−１に言及するホールマーク残基より選ばれる。
【０３１６】
局面Ａ−２０：以下を含むポリペプチドから実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン
ｉ）配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインの群より選択される免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する第１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視し；
及び、それは以下からなる：
ｉｉ）配列番号２を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する第２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視し；及び、場合により、以下を含む
ｉｉｉ）リンカー。
【０３１７】
局面Ａ−２１：ヒト化された又は他に配列最適化された免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１８】
局面Ａ−２２：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する結合のための少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質、又は標的に対する結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含む、先行する局面のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３１９】
ＣＤＲベースの局面
局面Ｂ−１：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた及び／又はそれに特異的に結合することができる、ならびに、以下からなる群より選ばれるアミノ酸残基の１つ又は複数の（好ましくは１つの）ストレッチを含む免疫グロブリンの単一可変ドメイン：
ａ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｄ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｇ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
あるいはそれらの任意の適した組み合わせ。
そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ又は配列最適化されたＶＨＨ（例えばヒト化、安定化、及び／又は可溶化ＶＨＨなど）でありうる。
【０３２０】
局面Ｂ−２：局面Ｂ−１に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、アミノ酸残基の前記ストレッチの少なくとも１つが、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する結合のための抗原結合部位の部分を形成する。
【０３２１】
局面Ｂ−３：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた及び／又はそれに特異的に結合することができる、ならびに、以下からなる群より選ばれるアミノ酸残基の２つ以上のストレッチを含む免疫グロブリンの単一可変ドメイン：
ａ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｄ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｇ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
（ｉ）アミノ酸残基の第１ストレッチが、ａ）、ｂ）、又はｃ）に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２ストレッチが、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、又はｉ）に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つに対応するようになり；（ｉｉ）アミノ酸残基の第１ストレッチが、ｄ）、ｅ）、又はｆ）に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２ストレッチが、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）、又はｉ）に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つに対応するようになり；（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１ストレッチが、ｇ）、ｈ）、又はｉ）に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２ストレッチが、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、又はｆ）に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインの１つに対応するようになる。
そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ又は配列最適化されたＶＨＨ（例えばヒト化、安定化、及び／又は可溶化ＶＨＨなど）でありうる。
【０３２２】
局面Ｂ−４：局面Ｂ−３に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、アミノ酸残基の少なくとも２つのストレッチが、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する結合のための抗原結合部位の部分を形成する。
【０３２３】
局面Ｂ−５：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた及び／又はそれに特異的に結合することができる、ならびに、アミノ酸残基の３つ以上のストレッチを含む免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、アミノ酸残基の第１ストレッチが、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９〜１３、９３又は１０７〜１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；アミノ酸残基の第２ストレッチが、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１９〜２３、９５又は１１５〜１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、アミノ酸残基の第３ストレッチが、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号２９〜３３、９７又は１２３〜１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ又は配列最適化されたＶＨＨ（例えばヒト化、安定化、及び／又は可溶化ＶＨＨなど）でありうる。
【０３２４】
局面Ｂ−６：局面Ｂ−５に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、アミノ酸残基の少なくとも３つのストレッチが、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対する結合のための抗原結合部位の部分を形成する。
【０３２５】
局面Ｂ−７：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた及び／又はそれに特異的に結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号３９〜４３、９１又は９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列と、少なくとも７０%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０%のアミノ酸同一性、例えば９５%のアミノ酸同一性以上の、あるいはさらに実質的に１００%のアミノ酸同一性を有する。ＣＤＲ配列は、本明細書において定義する通り、Ｋａｂａｔを介して優先的に決定される。
そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、ＶＨＨ又は配列最適化されたＶＨＨ（例えばヒト化、安定化、及び／又は可溶化ＶＨＨなど）でありうる。
【０３２６】
局面Ｃ−１：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられ、ならびに、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つ、あるいは配列番号４４〜４８、７８〜８９、又は１３１〜１４０のポリペプチドの結合を交差遮断する、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチド。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、局面Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに従った及び／又は局面Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。また、好ましくは、そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に特異的に結合することができる。
【０３２７】
局面Ｃ−２：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられ、ならびに、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）への配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つ、あるいは配列番号４４〜４８、７８〜８９、又は１３１〜１４０のポリペプチドによる結合から交差遮断される、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチド（例えば抗体又はそのフラグメントなど）。そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、局面Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに従った及び／又は局面Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。また、好ましくは、そのような免疫グロブリンの単一可変ドメインは、ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に特異的に結合することができる。
【０３２８】
局面Ｃ−３：局面Ｃ−１又はＣ−２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドであって、ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが交差遮断する又は交差遮断される能力は、置換アッセイにおいて検出される（例、下の実施例９及び／又は１０に記載する通り）。
【０３２９】
局面Ｃ−４：局面Ｃ−１又はＣ−３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドであって、ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが交差遮断する又は交差遮断される能力は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出される。
【０３３０】
局面Ｄ−１：実質的に単離形態である、局面Ｂ−１〜Ｂ−７又はＣ−１〜Ｃ−７のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３１】
局面Ｄ−２：被験者への投与のための局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ１のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、前記被験者において自然に生じない。
【０３３２】
局面Ｄ−３：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、解離定数（ＫＤ）１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、及び、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、及び、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルを用いて、特異的に結合することができる局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ１〜Ｄ−２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３３】
局面Ｄ−４：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、解離定数（ＫＤ）１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、及び、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、及び、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルを用いて、特異的に結合することができる局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ１〜Ｄ−３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３４】
局面Ｄ−５：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、解離速度（Ｋｏｆｆ速度）１s-1〜１０−６s-1の間、好ましくは１０−２s-1〜１０−６s-1の間、より好ましくは１０−３s-1〜１０−６s-1の間、例えば１０−４s-1〜１０−６s-1の間などを伴い、特異的に結合することができる局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ１〜Ｄ−４のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３５】
局面Ｄ−６：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、親和性５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満などを伴い、特異的に結合することができる局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ１〜Ｄ−５のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。局面Ｄ−１〜Ｄ−６に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、局面Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。
【０３３６】
局面Ｅ−１：自然発生する免疫グロブリンの単一可変ドメイン（任意の適した種からの）又は合成もしくは半合成の免疫グロブリンの単一可変ドメインである、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ１〜Ｄ−６のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３７】
局面Ｅ−２：配列最適化されている、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３８】
局面Ｅ−３：安定化されている、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＤ−１もしくはＤ−２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３３９】
局面Ｅ−４：自然発生する免疫グロブリン配列（任意の適した種からの）又は合成もしくは半合成の免疫グロブリン配列である、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４０】
局面Ｅ−５：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は技術（例えば親和性成熟など）により得られている免疫グロブリン配列である、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−４のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４１】
局面Ｅ−６：軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）から；又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）から実質的になる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−５のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４２】
局面Ｅ−７：従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−６のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４３】
局面Ｅ−８：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適している免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適している免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（しかし、限定しないが、ＶＨＨ配列を含む）でありうる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−７のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４４】
局面Ｅ−９：ナノボディから実質的になる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−８のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４５】
局面Ｅ−１０：以下である免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−９のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン：
ｉ）本明細書において記載する免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視し；
及び、ここで：
ｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８でアミノ酸残基の１つ又は複数が、表Ｂ−２に言及するホールマーク残基より選ばれる。
【０３４６】
局面Ｅ−１１：以下である免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１０のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン：
ｉ）配列番号３９〜４３、９１、又は９９−１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視し；
及び、ここで：
ｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８でアミノ酸残基の１つ又は複数が、表Ｂ−２に言及するホールマーク残基より選ばれる。
【０３４７】
局面Ｅ−１２：ヒト化免疫グロブリンの単一可変ドメインから実質的になる、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−８のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３４８】
局面Ｅ−１３：ＣＤＲ配列により形成される結合のための少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質、又は標的に対する結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含む、局面Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−８のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。局面Ｅ−１〜Ｅ−１３に従った免疫グロブリンの単一可変ドメインは、特に、局面Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。
【０３４９】
ポリペプチド
局面Ｋ−１：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、場合により、さらに、１つ又は複数のペプチドリンカーを含むポリペプチド。
【０３５０】
局面Ｋ−２：加えて、血清アルブミンに対して向けられた１つ又は複数の（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む、局面Ｋ−１に従ったポリペプチド。
【０３５１】
局面Ｋ−３：血清アルブミンに対して向けられた前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインがヒト血清アルブミンに対して向けられている、局面Ｋ−１又はＫ−２に従ったポリペプチド。
【０３５２】
局面Ｋ−４：血清アルブミンに対して向けられた前記の１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインが配列番号２を伴う免疫グロブリンの単一可変ドメインである、局面Ｋ−１又はＫ−３のいずれかに従ったポリペプチド。
【０３５３】
局面Ｋ−５：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、１つ又は複数の細胞傷害性ペイロードを含み、及び、場合により、さらに、１つ又は複数のペプチドリンカーを含むポリペプチド。
【０３５４】
局面Ｋ−６：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ＣＸＣＲ４に対して向けられた１つ又は複数の（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ナノボディ）、及び、場合により、さらに、１つ又は複数のペプチドリンカーを含む又はそれらから実質的になるポリペプチド。
【０３５５】
局面Ｋ−７：（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）及び少なくとも１つの（細胞）傷害性の基、部分、又はペイロード（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３５６】
局面Ｋ−８：（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）、（ヒト）ＣＸＣＲ４に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）、及び少なくとも１つの（細胞）傷害性の基、部分、又はペイロード（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３５７】
局面Ｋ−９：（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）及び（ヒト）ＣＸＣＲ４に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３５８】
局面Ｋ−１０：（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）、（ヒト）ＣＸＣＲ４に対して向けられた少なくとも１つの（好ましくは１つの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）、及び（ヒト）血清アルブミンに対して向けられたペプチド又は免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３５９】
局面Ｋ−１１：それらは同じである（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３６０】
局面Ｋ−１２：それらは互いに異なる（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３６１】
局面Ｋ−１３：それらは同じである（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）及び（ヒト）血清アルブミンに対して向けられたペプチド又は免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３６２】
局面Ｋ−１４：それらは互いに異なる（ヒト）ＣＸＣＲ７に対して向けられた２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）及び（ヒト）血清アルブミンに対して向けられたペプチド又は免疫グロブリンの単一可変ドメイン（好ましくはナノボディ）（場合により、化学的に、あるいは１つ又は複数の適したリンカー又はスペーサーを介して連結されている）を含む又はそれから実質的になるポリペプチド。
【０３６３】
核酸
局面Ｍ−１：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列。
【０３６４】
局面Ｍ−２：配列番号５９〜６３、７３〜７７、又は９９を伴う核酸又はヌクレオチド配列（表Ｂ−６）。
【０３６５】
宿主細胞
局面Ｎ−１：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドを発現する、又は、適した状況下で、発現することが可能であり；及び／又は、局面Ｍ−１〜Ｍ−２に従った核酸もしくはヌクレオチド配列を含む、宿主又は宿主細胞。
【０３６６】
組成物
局面Ｏ−１：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従った少なくとも１つのポリペプチド、又は局面Ｍ−１〜Ｍ−２に従った核酸もしくはヌクレオチド配列を含む組成物。
【０３６７】
局面Ｏ−２：医薬的組成物である、局面Ｏ−１に従った組成物。
【０３６８】
局面Ｏ−３：医薬的組成物であり、それが、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、ならびに、場合により、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、局面Ｏ−２に従った組成物。
【０３６９】
本発明の薬剤及び組成物の作製
局面Ｐ−１：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は、少なくとも、以下の工程を含む：
ａ）適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、局面Ｍ−１又は局面Ｍ−２に従った核酸又はヌクレオチド配列を発現させること；
場合により、以下が続く：
ｂ）局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【０３７０】
局面Ｐ−２：局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、少なくとも以下の工程を含む：
ａ）局面Ｎ−１に従った宿主又は宿主細胞を、前記の宿主又は宿主細胞が、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で培養及び／又は維持すること；
場合により、以下が続く：
ｂ）局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【０３７１】
スクリーニングの方法
局面Ｑ−１：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に対して向けられた免疫グロブリンの単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む：：
ａ）免疫グロブリンの単一可変ドメインをコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；
ｂ）ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインをコードする、ならびに、交差遮断される又は本発明のナノボディ（例、配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２（表Ｂ−３））、又は本発明のポリペプチドもしくはコンストラクト（例、配列番号４４〜４８、７８〜８９、又は１３１〜１４０（表Ｂ−４を参照のこと））を交差遮断している核酸配列について核酸配列の前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）前記核酸配列を単離し、それに続き、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインを発現させること。
【０３７２】
本発明の薬剤の使用
局面Ｒ−１：癌及び炎症性疾患（例えば、本明細書において言及する）の防止及び／又は処置のための方法であって、前記方法が、それを必要とする被験者に、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド；あるいは局面Ｏ−２又はＯ−３に従った組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０３７３】
局面Ｒ−２：ＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、その生物学的又は薬理学的活性に、ならびに／あるいはＣＸＣＲ７及び特にヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）が含まれる生物学的経路又はシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法であって、前記方法が、それを必要とする被験者に、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド；あるいは局面Ｏ−２又はＯ−３に従った組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０３７４】
局面Ｒ−３：それを必要とする被験者に、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド；あるいは局面Ｏ−２又はＯ−３に従った組成物を投与することにより防止及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法であって、前記方法が、それを必要とする被験者に、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド；あるいは局面Ｏ−２又はＯ−３に従った組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０３７５】
局面Ｒ−４：免疫療法のための方法であって、前記方法が、それを必要とする被験者に、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド；あるいは局面Ｏ−２又はＯ−３に従った組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０３７６】
局面Ｒ−５：局面Ｒ−１〜Ｒ−３に従った方法の１つ又は複数における使用のための、局面Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド、Ｏ−２又はＯ−３に従った医薬的組成物。
【０３７７】
局面Ｒ−６：癌の診断、防止、及び／又は処置のための、局面Ｋ−１〜Ｋ−４のいずれかに従ったポリペプチド。
【０３７８】
さらなる局面：
１．  ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）ならびにＣＸＣＲ７（配列番号１）のアミノ酸残基ＷＦ１９、ならびに、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも１つのＩＳＶＤを含むコンストラクト。
【０３７９】
２．  腫瘍成長を低下させるための及び／又は癌、好ましくは頭頸部癌もしくはＧＢＭを処置するための医薬としての使用のための、局面１に従ったコンストラクト。
【０３８０】
３．  １００nM未満の平均Ｋｉならびに５０%以上の平均ＳＤＦ−１及びＩ−ＴＡＣ置換を伴うヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＳＤＦ−１及びＩ−ＴＡＣを特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８１】
４．  １００nM未満の平均Ｋｉならびに５０%以上の平均ＳＤＦ−１置換を伴うヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＳＤＦ−１を特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８２】
５．  １００nM未満の平均Ｋｉならびに５０%以上の平均Ｉ−ＴＡＣ置換を伴うヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）上でＩ−ＴＡＣを特異的に置換することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８３】
６．  平均Ｋｉが５０nM以下である、局面３〜５のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８４】
７．  平均Ｋｉが１０nM以下である、局面３〜５のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８５】
８．  平均ＳＤＦ−１又はＩ−ＴＡＣ置換が８０%以上である、局面３〜７のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８６】
９．  ヒトＣＸＣＲ７（配列番号１）に、５０nM未満のＫｄで結合することができる免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８７】
１０．  ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８８】
１１．  ＣＸＣＲ７（配列番号１）のアミノ酸残基ＷＦ１９、ならびに、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５に結合する及び／又はそれを認識する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３８９】
１２．  腫瘍成長を低下させるための及び／又は癌、好ましくは頭頸部癌もしくはＧＢＭを処置するための医薬としての使用のための、局面１０又は１１に従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９０】
１３．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９１】
１４．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９２】
１５．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９３】
１６．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９４】
１７．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９５】
１８．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９６】
１９．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９７】
２０．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９８】
２１．  局面３〜１２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；及び、
ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｂ）配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｃ）配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｅ）配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
及び、ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｈ）配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉ）配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインと３、２、又は１アミノ酸の違いを有する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【０３９９】
２２．  局面１〜２１のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、ここで、フレームワーク領域（ＦＲ）は、配列番号４〜８、９２、１０３、１０４、又は１０６（ＦＲ１）、１４〜１８、９４、１１１、１１２、又は１１４（ＦＲ２）、２４〜２８、９６、１１９、１２０、又は１２２（ＦＲ３）、及び／又は３４〜３８、９８、１２７、１２８、又は１３０（ＦＲ４）のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する。
【０４００】
２３．  局面３〜２２のいずれかの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチド。
【０４０１】
２４．  局面２３に従ったポリペプチドであって、ここで、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、配列番号３９〜４３、９１、又は９９〜１０２の免疫グロブリンの単一可変ドメインと８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインからなる群より選択される。
【０４０２】
２５．  局面２３〜２４のいずれかに従った、加えて、少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、場合により、配列番号４９〜５８を伴うリンカーの群より選択されるリンカーを含む、ポリペプチド。
【０４０３】
２６．  局面２３〜２５のいずれかに従った、加えて、ＡＬＢ８（配列番号２）を含み、場合により、配列番号４９〜５８を伴うリンカーの群より選択されるリンカーを含む、ポリペプチド。
【０４０４】
２７．  局面２３〜２６のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号４４〜４８、７８〜８９、及び１３１〜１４０のポリペプチドと８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【０４０５】
２８．  以下からなる群より選ばれるコンストラクト：
−  ＣＸＣＲ７（配列番号１）のアミノ酸残基ＷＦ１９、ならびに、場合により、Ｓ２３及び／又はＤ２５に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むコンストラクトであって、ここで、前記の少なくとも２つのＩＳＶＤは、同じでありうる又は異なりうる；
−  ＣＸＣＲ７（配列番号１）中のアミノ酸残基Ｍ３３、ならびに、場合により、アミノ酸残基Ｖ３２及び／又はアミノ酸残基Ｍ３７に結合する及び／又はそれを認識する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むコンストラクトであって、ここで、前記の少なくとも２つのＩＳＶＤは、同じでありうる又は異なりうる；
−  少なくとも１つのグループ１のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ２のＩＳＶＤを含むコンストラクト；
−  少なくとも１つのグループ１のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ３のＩＳＶＤを含むコンストラクト；
−  少なくとも１つのグループ２のＩＳＶＤ及び少なくとも１つのグループ３のＩＳＶＤを含むコンストラクト；ならびに
−  少なくとも１つの０１Ｃ１０様配列及び少なくとも１つの１４Ｇ０３様配列を含むコンストラクト。
【０４０６】
２９．  腫瘍成長を低下させるための及び／又は癌、好ましくは頭頸部癌もしくはＧＢＭを処置するための医薬としての使用のための、局面２８に従ったコンストラクト。
【０４０７】
３０．  以下をコードする核酸配列
ｉ）局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉｉ）局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド；又は
ｉｉｉ）局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクト。
【０４０８】
３１．  以下を含む医薬的組成物
ｉ）局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン；
ｉｉ）局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド；又は
ｉｉｉ）局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクト；
及び、場合により、医薬的に許容可能な賦形剤。
【０４０９】
３２．  局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド、あるいは癌、好ましくは頭頸部癌、ＧＢＭ、及び／又は炎症性疾患における使用のための局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクト。
【０４１０】
３３．  局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド、あるいは関節リウマチにおける使用のための局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクト。
【０４１１】
３４．  局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド、あるいは多発性硬化症における使用のための局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクト。
【０４１２】
３５．  局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド、あるいは局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクトを産生するための方法であって、前記方法が、少なくとも以下の工程を含む：
ａ）適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、局面３０に従った核酸又はヌクレオチド配列を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ）局面３〜２２のいずれかに従った免疫グロブリンの単一可変ドメイン、局面２３〜２７のいずれかに従ったポリペプチド、あるいは局面１、２、２８、又は２９のいずれかに従ったコンストラクトを単離及び／又は精製すること。
【０４１３】
３６．  式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号９の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号１９の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号２９の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４１４】
３７．式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号２０の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号３０の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４１５】
３８．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１１の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号２１の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号３１の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４１６】
３９．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１２の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号２２の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号３２の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４１７】
４０．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１３の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインであｒ；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号３３の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４１８】
４１．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号９３の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号９５の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号９７の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４１９】
４２．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１０７の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号１１５の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号１２３の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４２０】
４３．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１０８の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号１１６の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号１２４の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４２１】
４４．  式１を伴うアミノ酸配列を含む免疫グロブリンの単一可変が、式１
ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  （１）
を伴うアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリンの単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；
ここで、ＣＤＲ１が、配列番号１１０の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；
ここで、ＣＤＲ２が、配列番号１１８の免疫グロブリンの単一可変ドメインであり；及び
ここで、ＣＤＲ３が、配列番号１２６の免疫グロブリンの単一可変ドメインである。
【０４２２】
実験部分：
配列：
【０４２３】
【表Ｂ−１】
2014511680.tif 000004
【０４２４】
【表Ｂ−２】
2014511680.tif 000005
2014511680.tif 000006
【０４２５】
【表Ｂ−３】
2014511680.tif 000007
【０４２６】
【表Ｂ−４】
2014511680.tif 000008
2014511680.tif 000009
2014511680.tif 000010
2014511680.tif 000011
2014511680.tif 000012
2014511680.tif 000013
【０４２７】
【表Ｂ−５】
2014511680.tif 000014
【０４２８】
【表Ｂ−６】
2014511680.tif 000015
2014511680.tif 000016
2014511680.tif 000017
2014511680.tif 000018
【０４２９】
実施例１：クローニング
ヒトＣＸＣＲ７（ｈＣＸＣＲ７）、マウスＣＸＣＲ７（Open Biosystems）、及びｃＤＮＡをコードするカニクイザル（表Ｂ−１）を、ｐＶＡＸ−１（Invitrogen）及び／又はｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen）中にクローン化した。ｐＶＡＸ１−ｈＣＸＣＲ７及びｐＣＤＮＡ３．１ヒト（マウス）（カニクイザル）ＣＸＣＲ７コンストラクトのＨｅｋ２９３細胞中でのトランスフェクションは、ＣＸＣＲ７細胞表面発現をもたらしたが、ヒトＣＸＣＲ７特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）１１Ｇ８（R&D Systems）及び抗体を検出するＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Inc.）を使用したＦＡＣＳ分析により示される通りであった。
【０４３０】
実施例２：免疫化
遺伝子による免疫化のために、エンドトキシン不含のｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ７プラスミドを産生し、０．９%生理食塩水中に濃度２mg/mlで溶解し、−２０℃で保存した。４匹のラマ（３９１、３９５、３９６、及び３９７）を、２mgのｐＶＡＸ１−ｈＣＸＣＲ７を用いて、皮内Ｊｅｔ注射（Akra DermoJet France）を介して、２週間間隔を伴い、４回にわたり免疫化した。最後のＤＮＡ免疫化から３週間後、４匹の動物が、ｈＣＸＣＲ７を安定発現するラクダ腎臓（ＣＡＫＩ）細胞（Nguyen et al. 2001. Adv. Immunol. 79: 261-296）（２×１０７個細胞）を用いた追加免疫を受けた。
【０４３１】
３匹のラマ（３８５、３８７、及び４０４）を、ｐＣＤＮＡ３．１−ｈＣＸＣＲ７を用いてトランスフェクトした２×１０７個のＨＥＫ２９３の４つの注射を用いて、２週間間隔を伴い免疫化した。ラマ３９１、３９５、３９６、及び３９７から、末梢血リンパ球を、最後のＤＮＡ免疫化後４日及び１０日目ならびに細胞追加免疫後３日目及び９日目に収集した。ラマ３８５、３８７、及び４０４から、末梢血リンパ球を、最後の細胞注射後４及び８日目に収集した。加えて、触知可能な弓リンパ節（ｂｏｗ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）（ＬＮ）の生検を、各々のラマから、局所外科手術を介して、最後の細胞追加免疫後３日目に収集した。免疫組織を持つ全てのリンパ球から、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製するための鋳型として使用した。
【０４３２】
実施例３：ライブラリービルディング
ライブラリーは、全てのラマから収集した免疫組織からビルディングした。簡単には、ｃＤＮＡを、抽出した全ＲＮＡサンプル（実施例２）から調製し、使用し、以前に記載された通りに（ＷＯ  ０２／０８５９４５及びＷＯ  ０４／０４９７９４）、ネステッドＰＣＲを介して、ｃＤＮＡレパートリーを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳｆｉＩ（ネステッドＰＣＲを介して、ＦＲ１プライマー領域中に導入した）及びＢｓｔＥＩＩ（ＦＲ４中に自然発生する制限部位）を用いて消化し、ゲル電気泳動に続き、約４００ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲルから精製した。増幅したｃＤＮＡレパートリーを、ＳｆｉＩ−  ＢｓｔＥＩＩ消化されたファージディスプレイベクター（ｐＡＸ５０）の対応する制限部位中に連結し、大腸菌ＴＧ１のエレクトロポレーション後にライブラリーを得た。このディスプレイベクターは、ファージ粒子の産生を許し、個々のＶＨＨ（本明細書において以上、また、ナノボディとして言及される）を、Ｃ末端Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６タグ（本明細書において以上、また、ＴＡＧ−１又は配列番号７１）を伴う及び遺伝子ＩＩＩ産物を伴う融合タンパク質として発現する。
【０４３３】
ライブラリーを、細菌を対数期（ＯＤ６００＝０．５）まで成長させることによりレスキューし、ヘルパーファージを用いた感染が続き、ｐＩＩＩ融合タンパク質としてファージの先端にクローン化ナノボディを発現する組換えファージを得た。ファージを、ろ過滅菌後、４℃で、さらなる使用のために保存した。
【０４３４】
実施例４：ヒトＣＸＣＲ７結合ナノボディをディスプレイするファージの選択
上のライブラリーからのファージを、ｈＣＸＣＲ７ウイルス様粒子（ＶＬＰ; Integral Molecular）、インタクトなＣＸＣＲ７発現細胞、ＣＸＣＲ７発現細胞からの膜抽出物、及びペプチド上での選択のために使用した。
【０４３５】
第１選択ラウンドにおいて、ｈＣＸＣＲ７トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に由来する１０単位のＶＬＰを、９６ウェルMaxisorpプレート（Nunc）にコーティングし、低脂肪乳粉末（ＰＢＳ中Marvell  ４%）を用いて遮断した。レスキューしたファージを用いた２時間のインキュベーション後、トリプシン溶出（１mg/ml）を１５分間にわたり室温で許し、２０回のＰＢＳ洗浄が続いた。プロテアーゼ活性を、直ちに、１６mMプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することにより中和した。ラウンド１ファージアウトプットをレスキューし、第２選択ラウンドを、１０又は１単位のプレート固定化ｈＣＸＣＲ７  ＶＬＰ上で実施した。１０又は１単位プレート固定化ｈＣＸＣＲ７  ＶＬＰ上で選択されたラウンド２ファージアウトプットを、ＴＧ１細胞中に感染させ、寒天プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ＋２%グルコース）上に蒔いた。
【０４３６】
選択後に得られた溶出ファージプールを用いて感染させた大腸菌ＴＧ１の個々のクローンをピックアップし、９６深底ウェルプレート中で成長させ、ヘルパーファージの添加後にモノクローナルファージを産生した。モノクローナルナノボディの産生は、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。ナノボディを含むペリプラズム画分を、次に、ＰＢＳ中での細菌ペレットの凍結融解及び細胞断片を除去するためのその後の遠心により調製した。
【０４３７】
実施例５：ファージＥＬＩＳＡによるＣＸＣＲ７特異的ナノボディの同定
全てのラウンド２選択のアウトプットから、クリーンを、ファージＥＬＩＳＡにおいて、２単位の固定化ＣＸＣＲ７  ＶＬＰ上で、ファージ上清の１０倍希釈物を適用してスクリーニングした。ＨＲＰ共役モノクローナル抗Ｍ１３抗体（GE, Cat# 363761）を用いたインキュベーション及び数回の洗浄後、ファージ結合を、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して明らかにした。反応を、Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させ、吸光度を、４５０nMで、Sunrise TECAN分光光度計（TECAN）を使用して測定した。ｈＣＸＣＲ７  ＶＬＰ上で非トランスフェクトコントロールＶＬＰを上回る最低２倍の増加したＥＬＩＳＡシグナルを示すナノボディは、ＣＸＣＲ７特異的であると考えられた。ＣＸＣＲ７特異的ナノボディを配列決定し、重複するナノボディ（同一のＡＡ配列）を除去した。これは、４５の別個のナノボディＢ細胞系統に属する、７８の固有配列の同定をもたらした。別個のナノボディＢ細胞系統からの代表的なクローンについてのファージＥＬＩＳＡデータを表Ｂ−７に表し、ナノボディがＶＬＰ上のヒトＣＸＣＲ７に結合することを示す。顕著には、全てのナノボディが、細胞追加免疫後のＰＢＬに由来した（ナノボディ０１Ｃ１０を除く）（実施例２を参照のこと）。他のＣＸＣＲ７特異的ナノボディに対して評価し、ナノボディ０１Ｃ１０は酷く弱い結合剤であったが、それは、最初の例において、比較の理由のために使用された（データ示さず）。
【０４３８】
【表Ｂ−７】
2014511680.tif 000019
【０４３９】
実施例６：ＦＡＣＳ分析によるＣＸＣＲ７特異的ナノボディの同定
別個のナノボディＢ細胞系統を表すクローンを、細胞表面露出ＣＸＣＲ７へのそれらの結合について、ペリプラズム抽出物としてテストした。このアッセイにおいて、ペリプラズム抽出物の５倍希釈物を、Ｈｅｋ２９３  ｈＣＸＣＲ７及びＨｅｋ２９３ｗｔ細胞を用いてインキュベートした。ナノボディの結合を、マウス抗ｍｙｃ（Serotec）、それに続く抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson Immununoresearch）を使用して検出した。選択されたナノボディクローンの結合シグナル（ｍｃｆ値及び結合の比率）を表Ｂ−８に表し、ナノボディが細胞のヒトＣＸＣＲ７に結合することを示す。
【０４４０】
【表Ｂ−８】
2014511680.tif 000020
【０４４１】
実施例７：ＣＸＣＲ７特異的ナノボディの発現
選択されたナノボディを、大腸菌発現ベクターｐＡＸ１００中に再クローン化し、Ｃ末端連結ｍｙｃ、Ｈｉｓ６（以下、また、Ｔａｇ−２又は配列番号７２）タグ付きタンパク質として発現させた。種々のナノボディを、また、Ａｌｂ８（ナノボディ−リンカー−Ａｌｂ８−ｍｙｃ−Ｈｉｓ６）（配列配列番号４４〜４８−表Ｂ−４を参照のこと）を含む融合タンパク質として又はタグなしナノボディとして発現させた。発現をＩＰＴＧにより誘導し、４時間にわたり３７℃で継続することを許した。細胞培養物をスピンさせた後、ペリプラズム抽出物を、ペレットを凍結融解することにより調製した。ナノボディを、これらの抽出物から、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びＤ−ＰＢＳへの緩衝液交換を使用して精製した。
【０４４２】
実施例８：ＣＸＣＲ７特異的ナノボディの結合ＦＡＣＳ分析
精製タンパク質の連続希釈物（濃度範囲：４００nM〜１８０pM）を、安定なＨＥＫ−ＣＸＣＲ７細胞と３０分間にわたり４℃でインキュベートし、結合を、抗マウス抗ｍｙｃ（Serotec）及び抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson Immunoresearch）を使用して検出した。選択されたクローンの半最高有効濃度（ＥＣ５０）値及び上プラトーレベルを表Ｂ−９に描写する。これらのデータは、スクリーニングデータを確認し、示したナノボディが、細胞のヒトＣＸＣＲ７に結合することを強調する。
【０４４３】
【表Ｂ−９】
2014511680.tif 000021
【０４４４】
実施例９：ナノボディは、ＳＤＦ−１と、ＣＸＣＲ７結合について競合する（置換アッセイ）。
【０４４５】
競合能力を評価するために、ナノボディを、ＳＤＦ−１リガンド置換アッセイにおいて、安定なＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ７細胞を使用して評価した。細胞を播種して２４時間後、細胞を１時間にわたり４℃で、精製した一価ナノボディの希釈系列及びヒト血清アルブミン結合ナノボディＡｌｂ８への対応するＣ末端Ｔａｇ−２タグ付き融合タンパク質（表Ｂ−４：配列番号４４〜４８を参照のこと。ここで、ポリペプチドは全てＴａｇ−２を用いてＣ末端タグ化されている）を用いて、プレインキュベートした。また、参照分子Ｍａｂ  ８Ｆ１１（Biolegend）、Ｍａｂ  １１Ｇ８（Ｒ＆Ｄ）、及び非標識ＳＤＦ−１をアッセイ中に含めた。放射標識［１２５Ｉ］−ＣＸＣＬ１２を希釈し、細胞に加え、最終濃度７５ｐＭに達した。細胞を３時間にわたり４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解し、１２５Ｉシグナルを測定した。平均Ｋｉ値及びコールドＳＤＦ−１の置換と比べた置換のパーセンテージを表Ｂ−１０に示す。グループ１のテストしたナノボディ及びＭａｂ  ８Ｆ１１の競合は、非標識ＳＤＦ−１との競合と比べ、７３〜８３%の間である。置換のこのレベルは、ＣＸＣＲ７タンパク質の１００%遮断に対応する。なぜなら、残りのＳＤＦ−１結合は、ＣＸＣＲ７媒介性であるとは考えられず、しかし、ヘパリン硫酸プロテオグリカンとのＳＤＦ−１相互作用に起因する。ヒト血清アルブミン結合ナノボディＡｌｂ８への融合は、Ｋｉ値に対して有意な効果を有さない。
【０４４６】
【表Ｂ−１０】
2014511680.tif 000022
【０４４７】
実施例１０：ナノボディは、ＳＤＦ−１と、ＣＸＣＲ７結合について競合する（ＦＡＣＳアッセイ）
【０４４８】
ＳＤＦ−１と競合するナノボディ０７Ｃ０３及びＭａｂ  ８Ｆ１１（Biolegend）の効力を、ＨＥＫ−ｈＣＸＣＲ７細胞を用いた競合ＦＡＣＳにおいて評価した。細胞を、同時に、４nMビオチン化ＳＤＦ−１（R&D）を用いて及び希釈したテスト分子を用いて２時間にわたり４℃でインキュベートした。ビオチン化ＳＤＦ−１の結合を、ストレプトアビジンＰＥを使用して検出した。競合曲線を図１に描写する。このアッセイにおいて、Ｍａｂ  ８Ｆ１１及び０７Ｃ０３競合は、非標識ＳＤＦ−１との競合と比べて、完全であり（＞９５%）、ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ７相互作用の完全阻害を強調する。
【０４４９】
実施例１１：エピトープマッピング
Ｍａｂ  １１Ｇ８の最小エピトープは、ＣＸＣＲ７  Ｎ末端に位置付けられるＦ１４ＳＤＩＳＷＰ２０であるとして公知である（例、ＷＯ２００８／０４８５１９を参照のこと）。細胞を、同時に、２０nM  Ｍａｂ  １１Ｇ８  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ）を用いて及び希釈したテスト分子を用いて２時間にわたり４℃でインキュベートした。競合曲線を図１に描写する。Ｍａｂ  １１Ｇ８  ＡＰＣとの競合のレベルは、〜２０から１００%の範囲であり、それぞれのナノボディエピトープが、高い程度まで（競合の高い%）、Ｍａｂ  １１Ｇ８エピトープと、又は低い程度まで（競合の低い%）マッチする、あるいは、Ｍａｂ  １１Ｇ８結合に影響を及ぼすアロステリック変化を誘導する。これらのデータは、選択されたナノボディが、多岐にわたるが、しかし、恐らくは、オーバーラップするエピトープに結合することを示す。
【０４５０】
ナノボディ０８Ａ０５、０８Ａ１０、０７Ｃ０３、０７Ｂ１１、０１Ｃ１０及び１４Ｇ０３、Ｍａｂ  ８Ｆ１１（Biolegend）、Ｍａｂ  １１Ｇ８（R&D）、ならびにＭａｂ  ９Ｃ４（ＭＢＬ）を、さらに、Ａｌｅｘａ６４７標識１４Ｇ０３との競合について、ＦＡＣＳ分析においてテストした。ナノボディ０８Ａ０５、０８Ａ１０、０７Ｃ０３、０７Ｂ１１、Ｍａｂ  ８Ｆ１１、Ｍａｂ  １１Ｇ８、及びＭａｂ  ９Ｃ４は、ＣＸＣＲ７への１４Ｇ０３結合と競合し、０１Ｃ１０はしない。０１Ｃ１０が、他の選択されたナノボディによるヒットとは別個のエピトープをヒットすることを示唆する。
【０４５１】
第３アプローチにおいて、ナノボディは、ＣＸＣＲ７の１０の点変異のセット（Ｓ９Ａ、Ｆ１４Ｙ、Ｉ１７Ｌ、Ｓ１８Ｎ、Ｗ１９Ａ、Ｓ２３Ｇ、Ｄ２５Ａ、Ｖ３２Ａ、Ｍ３３Ｑ、Ｎ３６Ｔ）へのそれらの結合についてテストし、それらは、個々のナノボディエピトープに関する情報をもたらした。ナノボディ０８Ａ０５、０８Ａ１０、０７Ｃ０３、０７Ｂ１１、及び１４Ｇ０３について、エピトープは残基Ｍ３３を含んだが、０１Ｃ１０のそれは含まなかった。０１Ｃ１０（及び０７Ｂ１１）の結合は、Ｗ１９Ａ変異による影響を受けたが、この変異は、０８Ａ０５、０８Ａ１０、０７Ｃ０３、及び１４Ｇ０３の結合には影響を及ぼさなかった。再び、これらのデータは、０１Ｃ１０が別個のエピトープをヒットすることを示す。
【０４５２】
実施例１２：マウス／カニクイザル交差反応性
ｐＣＤＮＡ３．１−ｈＣＸＣＲ７及びｐＣＤＮＡ３．１−ｍＣＸＣＲ７を用いてそれぞれトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用し、マウスＣＸＣＲ７へのナノボディの交差反応性結合をＦＡＣＳ分析においてテストした。細胞を、３２nM  Ｍａｂ  １１Ｇ８（R&D）、Ｍａｂ  ９Ｃ４（ＭＢＬ）、Ｍａｂ  ８Ｆ１１（Biolegend）を用いて又は８００nMナノボディを用いて２時間にわたり４℃でインキュベートした。ナノボディ結合を、マウス抗ｍｙｃ（Serotec）及び抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson Immunoresearch）を使用し、Ｍａｂ結合を、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson Immunoresearch）を使用して検出した。ナノボディ０８Ａ１０、１４Ｇ０３、０７Ｂ１１、及びＭａｂ９Ｃ４はマウスＣＸＣＲ７に交差反応性ではなく、ナノボディ０８Ａ０５及び０７Ｃ０３はマウスＣＸＣＲ７と部分的に交差反応性であり、Ｍａｂ  ８Ｆ１１、Ｍａｂ  １１Ｇ８、及び０１Ｃ１０はマウスＣＸＣＲ７と交差反応性である（表Ｂ−１１）。
【０４５３】
カニクイザルＣＸＣＲ７への交差反応性結合を、同じ方法において評価した。ナノボディ０８Ａ１０、１４Ｇ０３、０７Ｂ１１、０８Ａ０５、０７Ｃ０３、０１Ｃ１０ならびにＭａｂ  ９Ｃ４、Ｍａｂ  ８Ｆ１１、及びＭａｂ  １１Ｇ８は、全て、カニクイザルＣＸＣＲ７に交差反応性である（表Ｂ−１１）。
【０４５４】
【表Ｂ−１１】
2014511680.tif 000023
【０４５５】
実施例１３：二価及び三価ナノボディのビルディング
二価ナノボディを、１つのＮ末端ＣＸＣＲ７特異的なビルディングブロック（０１Ｃ１０、１４Ｇ０３、０８Ａ０５、０８Ａ１０、又は０７Ｃ０３のいずれか、しかし、また、さらにそれほど効力のないビルディングブロック（０８Ｃ０２、０１Ｃ０７、０１Ｄ０４など）、それらは、上の実施例において列挙されなかった）及びＣ末端ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）特異的なビルディングブロック（ＡＬＢ８）を用いてビルディングし、インビボで延長した半減期を伴うナノボディを提供する。三価ナノボディは、ＳＤＦ−１を受容体から置換するためのナノボディの効力及び有効性を改善するために、もう１つのＣＸＣＲ７特異的なビルディングブロックからなった。二価及び三価ナノボディを、Ｔａｇ−２伸張を伴い、ピキアにおいて発現させた。
【０４５６】
実施例１４：二価及び三価ナノボディのＣＸＣＲ７へのＳＤＦ−１結合との競合
二価及び三価ナノボディを、実施例９に記載する通りに、ＳＤＦ−１置換アッセイにおいてスクリーニングした。サンプルを、ＨＳＡの存在又は非存在においてインキュベートし、ナノボディへのＨＳＡ結合の効果をアッセイの間に推定した。二価ナノボディの効力が、ＨＳＡの存在において劇的に下がったが、それらは、三価ナノボディについてずっと良く保存されている（表Ｂ−１２）。
【０４５７】
【表Ｂ−１２】
2014511680.tif 000024
【０４５８】
実施例１５：二価及び三価ナノボディのβアレスチン動員の阻害
PathHunter eXpress βアレスチンアッセイ（DiscoverX）を使用し、βアレスチンの動員に対する三価ナノボディのアンタゴニスト効果を評価した。３７の三価ナノボディ（クローン）のパネルを、１００nM濃度で、アッセイにおいてスクリーニングした。結果を、表Ｂ−１３に、阻害の効率に基づきランク付けする。最も効率的な三価分子は、０１Ｃ１０（別個のエピトープをヒットするナノボディ）との組み合わせを構成する。（実施例１１を参照）。これらのナノボディ（クローン）は、二重の様式で、１つのＣＸＣＲ７単量体に結合することができる。
【０４５９】
先行する結果に基づき、ナノボディは３つのグループに分類されうる：
−  グループ１：０１Ｃ１０により表され、明らかに、グループ２とは別個のエピトープをヒットする；
−  グループ２：１４Ｇ０３、０８Ａ０５、０８Ａ１０、及び０７Ｃ０３により表され、明らかに、グループ１とは別個のエピトープをヒットする；及び
−  グループ３：０７Ｂ１１により表され、明らかに、グループ１及びグループ２の中間である。
【０４６０】
グループ２（及びグループ３）のナノボディは、一価又は二価のいずれかで、グループ１の対応するナノボディよりも優れた結合及び競合特徴を実証するが、グループ２のナノボディと組み合わせたグループ１のナノボディは、βアレスチン動員アッセイにおいて全く予想外の最善の結果を与えた。
【０４６１】
【表Ｂ−１３】
2014511680.tif 000025
【０４６２】
実施例１６：二価及び三価ナノボディの最適化
選択された二価及び三価ナノボディを、βアレスチン動員アッセイにおいて、さらに特徴付け、効力を評価した。アッセイを、ＨＳＡの存在及び非存在において実行し、アッセイの間でのナノボディへのＨＳＡ結合の効果を推定した。ＡＬＢ８ビルディングブロックに先行するより長いリンカーを評価し、ナノボディへのＨＳＡ結合の立体的な干渉を最小限にした（表Ｂ−１４）。
【０４６３】
【表Ｂ−１４】
2014511680.tif 000026
【０４６４】
実施例１７：タグなしナノボディの特徴付け
ナノボディの効力に対するＴａｇ−３の任意の影響を除外するために、選択されたナノボディを、Ｔａｇ−３を伴わずに発現させ、βアレスチン動員アッセイ及びＳＤＦ−１競合ＦＡＣＳの両方において、２mg/ml  ＨＳＡの存在において特徴付けし（実施例１０においてさらに実質的に記載する通り）、効力を評価した（表Ｂ−１５及び図８）。「グループ２のＩＳＶＤ」−「グループ２のＩＳＶＤ」を含むコンストラクト（例、クローン０８６により代表される）及び「グループ２のＩＳＶＤ」−「グループ１のＩＳＶＤ」を含むコンストラクト（例、クローン０８５により代表される）は、「グループ１のＩＳＶＤ」−「グループ１のＩＳＶＤ」を含むコンストラクト（例、クローン０９３により代表される）よりも、ＳＤＦ−１置換においてより有効である。「グループ１のＩＳＶＤ」−「グループ１のＩＳＶＤ」を含むコンストラクト（例、クローン０９３により代表される）との競合は、あまり効果的ではない。
【０４６５】
これらのデータは、一価０１Ｃ１０がテストされた、放射性リガンドの競合アッセイを裏付ける（表Ｂ−１０を参照：０１Ｃ１０について３１%）。このように、グループ２のＩＳＶＤは、優れたＳＤＦ−１置換体である。
【０４６６】
【表Ｂ−１５】
2014511680.tif 000027
【０４６７】
実施例１８：原発腫瘍切片におけるＣＸＣＲ７発現の免疫組織化学分析
【０４６８】
ＣＸＣＲ７発現について分析された腫瘍切片は、ヌードマウスにおいて１回継代された変動する癌型のヒト原発腫瘍に由来した。パラフィン包埋腫瘍を、５μｍ切片に切断し（Leica RM 2135マイクロトームを用いて）、乾燥させ、脱ろうし、ヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色した。その後、１つの代表的な領域を、これらの腫瘍切片上で印をつけ、Tissue Micro Array（ＴＭＡ）を組み立てるための１mM直径の円錐を打ち出すことができた。ＴＭＡを、次に、Mirlacher and Storzに従い、Beecher Instruments Micro Tissuearrayerを使用して調製した（Mirlacher M. and Storz M., 2000, Gewebe-Chips fur die molekulare Untersuchung von Tumoren, Labmed., 293-297）。アレイ切片を、Instrumedics Sectioning Aid Systemを使用して切断し、「Starfrost」スライドを使用して特異的にコートした。
【０４６９】
ＣＸＣＲ７発現組織の免疫組織化学的染色を、以下の通りに実施した：（１）パラフィンを組織から除去し、組織を脱水し、洗浄した；（２）内因性ペルオキシダーゼを、蒸留水中の３%  Ｈ２Ｏ２の添加により不活性化した；（３）検体を洗浄時に乾燥させた；（４）非特異的結合を、ＰＢＳ中の１０%ＢＳＡにより遮断した；（５）抗ヒト／マウスＣＸＣＲ７モノクローナル抗体（Biolegend、クローンＭａｂ  ８Ｆ１１）又はアイソトープコントロール抗体（Biolegend、ＩｇＧ２ｂ）を、濃度２５μg/mLでインキュベートし、その後、組織を洗浄した；（６）第二抗体ヤギ抗マウスビオチン化ＩｇＧ（JacksonImmunoResearch）を、最終濃度２．８μg/mLでインキュベートし、組織を後に洗浄した；（７）検出は、Vectastain ABCキット（Vector）のＡＢＣ溶液及びペルオキシダーゼ基質を用いて実施し、各々の工程には、洗浄工程；（８）ヘマトキシリンを用いた対比染色及び（９）組織の脱水が続いた。
【０４７０】
ＴＭＡ（１７０の腫瘍モデル）を、半定量的に、Zeiss Axiovert 35顕微鏡を使用して評価した。写真を、Zeiss AxioCam MRcカメラを用いて撮った。全ての腫瘍サンプルを、二通りに評価した。染色を、陽性染色された細胞の割合にならびにシグナル強度に基づいて解釈した。サンプルを以下のカテゴリーにグループ化した：０、無染色（抗原が非存在）；１、弱染色；２、中程度の染色；３、強染色。
【０４７１】
図３は、異なる腫瘍型に割り当てられたスコアの概要を与える。２つの組織パッチの少なくとも１つにおける高いＣＸＣＲ７発現（スコア＝３）が、テストされた１７０の腫瘍の内の５５（＝３２．４%）において見出された。９つの腫瘍は、ＣＸＣＲ７発現を示さなかった（染色スコア＝０）。異種移植組織の残りについて、弱い又は中間の発現（スコア１及び２）が見出された。顕著には、結腸癌腫瘍（１９／２３又は８２．６%）及び胃癌腫瘍（８／１２又は６６．７%）の大半が、無染色又は弱い染色（スコア≦１）だけを呈したのに対し、テストされた頭頸部腫瘍の全て（７／７又は１００%）が、比較的高いＣＸＣＲ７発現（スコア≧２）を示した。他の組織型において、しかし、ＣＸＣＲ７染色は、個々の腫瘍モデルの間で高度に変動していた。
【０４７２】
一部の腫瘍サンプルについて、染色強度を、全腫瘍切片上で確認した。
【０４７３】
実施例１９：ＣＸＣＲ７ナノボディは、頭頸部癌の異種移植片の腫瘍成長をインビボで低下させる
１９．１  材料及び方法
１９．１．１  細胞株
細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−１１Ｂ（１１Ｂ）を、患者が化学療法を受けた後、原発性喉頭癌の生検から培養した。細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ａ（２２Ａ）は、中咽頭の原発性扁平上皮癌に由来した。細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）は、中咽頭の転移性扁平上皮癌に由来した。ヒト頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞株ＦａＤｕ及びＨＮＸ−ＯＥがより早期に記載されている（Hermsen et al., (1996) "Centromeric breakage as a major cause of cytogenetic abnormalities in oral squamous cell carcinoma" Genes Chromosomes Cancer 15:1-9; Ranger (1972) "A new human cell line (FaDu) from a hypopharyngeal carcinoma" Cancer 29: 117-121）。ＨＮＸ−ＯＥ及び９３−ＶＵ−１４７Ｔ細胞株が、Vrije Universiteit Amsterdamで樹立されたのに対し（Hermsen et al. ibid）、ＦａＤｕ株は、Karl-Heinz Heiderから得られた（Boehringer Ingelheim Austria）。
【０４７４】
１９．１．２  定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、頭頸部癌細胞株から、QiagenからのRNeasyキットを用いて、製造者のプロトコールに従って抽出した。メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡを、ｃＤＮＡに、BioRad iScript cDNA合成キットを使用して変換した。その後、ｍＲＮＡ発現レベルを、SyberGreen（BioRad）を用いて、OrigeneからのＣＸＣＲ７及びβアクチン特異的プライマーを使用して検出した。ＣＸＣＲ７発現レベルを、βアクチンのものに対して標準化し、異なる細胞株の比較を許した。
【０４７５】
１９．１．３  放射性リガンド結合
頭頸部癌細胞株を、ポリＬリジンコーティングした９６ウェルプレート上に播種し、一晩成長させた。次の日、結合緩衝液（５０mM  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７．４、１mM  ＣａＣｌ２、５mM  ＭｇＣｌ２、０．１M  ＮａＣｌ）に、０．５%  ＢＳＡを添加し、ケモカイン（１０−７Ｍ）又はＣＸＣＲ７特異的ナノボディ９Ａ４（１０−６M）のいずれかの非存在又は存在において、細胞に加えた。その後、放射標識［１２５Ｉ］−ＣＸＣＬ１２（Perkin-Elmer）を加え、最終濃度７５ｐＭに達した。細胞を３時間にわたり４℃でインキュベートし、０．５M  ＮａＣｌを含む結合緩衝液を用いて２回洗浄した。サンプルを、溶解緩衝液を用いて回収した後、残りの細胞結合放射活性をカウントした。
【０４７６】
１９．１．４  動物実験
全ての動物実験を、実験動物ケアのＮＩＨ原則及びオランダ国内法令［"Wet op de Dierproeven" (Stb 1985, 336)］に従って行い、VU University Medical CenterからのDierexperimentencommissieにより承認され、プロトコールＦａＣｈ  １０−０１に準拠して実施した。頭頸部癌細胞２２Ａを、８〜１０週齢の雌ドナーヌードマウス（Ｈｓｄ、無胸腺ｎｕ／ｎｕ、Harlan laboratories）の側腹部に皮下注射した。異種移植腫瘍を、２００−５００mm3のサイズまで成長させ、その後、切除し、等しいサイズの小片に切断し、レシピエントヌードマウスの側腹部に皮下移植した。移植された腫瘍が正しく生着した場合、マウスに、隔週で、ＰＢＳ、又は１ｍｇの二価ナノボディもしくは１．５mgの三価ナノボディのいずれかを用いて腹腔内注射した。
【０４７７】
１９．２  結果
１９．２．１  ＣＸＣＲ７のｍＲＮＡ発現
【０４７８】
頭頸部癌細胞株を、最初に、ＣＸＣＲ７  ｍＲＮＡ発現についてテストした。テストした６つの細胞株の内、４つの細胞株が、ＣＸＣＲ７のｍＲＮＡ発現を示した（即ち、２２Ａ、２２Ｂ、ＯＥ、及び９３−ＶＵ−１４７細胞株）（図４）。
【０４７９】
１９．２．２  ＣＸＣＲ７のタンパク質発現
ＣＸＣＲ７  ｍＲＮＡは、ヒトにおいて、広範囲の組織中で発現される。しかし、ｍＲＮＡ発現は、タンパク質の細胞表面発現とは常には相関しない。従って、ＣＸＣＲ７タンパク質の存在をさらに評価するために、ＣＸＣＲ７のタンパク質発現が、［１２５Ｉ］−ＣＸＣＬ１２放射性リガンド結合アッセイにおいて確認された。ＣＸＣＲ７特異的発現を、放射性リガンドを、コールドのケモカインＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＬ１１（しかし、ＣＸＣＬ１０ではない）を用いて置換することにより決定した。加えて、一価ナノボディ０９Ａ０４は、ＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ１２と同様の程度で、［１２５Ｉ］−ＣＸＣＬ１２を置換した（図５）。
【０４８０】
これらのデータによって、ｍＲＮＡ及びタンパク質ＣＸＣＲ７が、４つの頭頸部癌細胞株において発現していることが確認された。
【０４８１】
１９．２．３  ＣＸＣＲ７ナノボディは、腫瘍成長を阻害することができる
ＣＸＣＲ７発現細胞株を、異種移植モデルにおいてインビボで使用し、そこでは、腫瘍成長を測定した。２２Ａ細胞株を、異種移植腫瘍モデルとして選んだ。なぜなら、側腹部当たり２×１０６個の細胞を用いて皮下注射されたヌードマウスは、異種移植腫瘍形成を許したからである。次に、異なる群（処置対非処置）からのマウスが、治療実験のために同様の初めの腫瘍サイズを提示することを確実にするために、本発明者らは、腫瘍移植を実施した。最初に、ドナーヌードマウスに、初めに、２×１０６個の２２Ａ細胞を用いて、それらの側腹部に皮下注射した。腫瘍を、２００−５００mm3のサイズまで成長させ、その後、摘出し、等しいサイズの小片に切断し、レシピエントヌードマウスに皮下移植した。生着した腫瘍が成長を開始した場合、マウスを、無作為に、５群に分布し、それらに、隔週で、ナノボディを伴う又は伴わない４００μlのＰＢＳを用いて注射した。治療についてテストしたコンストラクトは、クローン０６０、クローン０８３、クローン０８５及びクローン０９３である。二価及び三価ナノボディを、それぞれ、１及び１．５mg/注射で投与した。５０日の治療期間にわたり、コントロール（ＰＢＳ）群ならびにクローン０６０群及びクローン０８３群は、同様の程度まで腫瘍を成長させた（有意に異なるサイズはない）（図６）。クローン０８５及びクローン０９３を用いて処置されたマウスは、治療実験の終了時に、ＰＢＳ注射マウスと比較し、より遅い腫瘍成長及び有意に小さなサイズを呈した（腫瘍容積ＰＢＳ＝２７４±４７mm3、クローン０８５＝１１９±３０mm3及びクローン０９３＝１１４±３２mm3）（図７）。
【０４８２】
このように、ＣＸＣＲ７ナノボディは、頭頸部癌細胞の成長をインビボで低下させる。
【０４８３】
この試験は、ナノボディの抗腫瘍有効性だけでなく、しかし、また、優れた安全性プロファイル（その高度に標的化された特異的活性プロファイルの反映）を支持し、それは、基本的に、開発中又は販売中の多くの他の細胞傷害性薬物とは異なる。
【０４８４】
実施例２０：ＣＸＣＲ７ナノボディは、異種移植腫瘍の成長をインビボで低下させる
実施例１９において、ＣＸＣＲ７ナノボディは、頭頸部癌により例示される通り、腫瘍を阻害することができることが実証されている。
【０４８５】
ナノボディが、また、ＣＸＣＲ７が（過剰）発現している他の腫瘍において、頭頸部癌よりも効果的であることをインビボで実証する第１相において、さらなる異種移植モデルを使用することができる。グリオーマは、原発性ヒト脳腫瘍の最も一般的な形態であり、それらは、しばしば、臨床的な４グレードに分類される。最も侵襲性の腫瘍（グレード４の腫瘍）は、また、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）として公知であり、高い死亡率及び罹患率に関連する。ＧＢＭにより罹患された患者の生存は、外科手術、放射線、及び化学療法における進歩にもかかわらず、過去数十年の間、実質的に不変のままである（即ち、診断後６〜１２ヶ月）。ＧＢＭ異種移植モデルを、実質的に、例えば、Yi et al.（EGFR Gene Overexpression Retained in an Invasive Xenograft Model by Solid Orthotopic Transplantation of Human Glioblastoma Multiforme Into Nude Mice" Cancer Invest. 2011 29: 229-239）により記載する通りに、使用することができる。
【０４８６】
実質的には、実施例１９に記載する通りに設定した異種移植片を用いるが、しかし、原発腫瘍に由来する異種移植片を使用し、それは外科的処置を受けた患者から得られる。これらの腫瘍に由来する細胞を、４〜６週齢の先天性無胸腺ヌードマウス（雌、Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕバックグラウンド）中に注射する。マウスを、特定病原体除去のバリア環境下で維持する。移植及び撮像のために、マウスを、体重１グラム当たり０．１０mgの塩酸ケタミン溶液を用いて腹腔内に麻酔する。必要な場合、腫瘍を、実施例１９に記載する通りに、切除し、他のマウスに再移植する。
【０４８７】
治療を、１．５mgのＰＢＳ、クローン０６０、クローン０８３、クローン０８５、及びクローン０９３のいずれかの隔週注射を用いて開始する。腫瘍サイズを４日毎に測定する。腫瘍サイズをノギスにより測定し、腫瘍容積を、式（長さ×幅２）／２を使用して計算する。マウスの腫瘍容積の発生を、３０日間にわたり追跡する。３０日目に、マウスを屠殺する。腫瘍を重量測定し、４%ポリホルムアルデヒド中で固定する。腫瘍切片を、免疫組織化学的分析のために切除する。
【０４８８】
図３において列挙する腫瘍を、同様に、樹立された細胞株の又は原発腫瘍に由来する異種移植片によりテストする。高パーセンテージのＣＸＣＲ７を有する腫瘍が、初期テストのための好ましい。
【０４８９】
実施例２１：グループ１免疫グロブリンの単一可変ドメイン
結合、競合、及び／又はβアレスチンの結果の観点から、種々のＩＳＶＤは、初期スクリーニング後にさらに評価されなかった。しかし、実施例１９〜２０のインビボでの結果は、本発明者らが、グループ１のＩＳＶＤの他のファミリーメンバーの存在をさらに評価することを促した。
【０４９０】
配列を評価した後、少なくとも以下の４つのグループ１のＩＳＶＤを同定した：０１Ｃ１２（配列番号９９）、０１Ｂ１２（配列番号１００）、０１Ｆ１１（配列番号１０１）、及び０１Ｂ１０（配列番号１０２）（表Ｂ−３）。
【０４９１】
実施例２２：ＣＸＣＲ７ナノボディは、頭頸部癌異種移植腫瘍の成長をインビボで低下させる
実施例１９において、ＣＸＣＲ７ナノボディが、頭頸部癌細胞の成長をインビボで低下させることが実証された。実施例１９において、マウスは、１．５mgのクローン０８５（グループ１のＩＳＶＤ−グループ２のＩＳＶＤ）又はクローン０９３（グループ１のＩＳＶＤ−グループ１のＩＳＶＤ）のいずれかを受けた。
【０４９２】
グループ２のＩＳＶＤの結合有効性の観点から、グループ１のＩＳＶＤ−グループ２  のＩＳＶＤ（例、クローン０８５）を含むコンストラクトは、グループ１のＩＳＶＤ−グループ１のＩＳＶＤ（例、クローン０９３）よりも効率的でありうると予測される。
【０４９３】
したがって、実施例１９のインビボ異種移植モデルを使用し、この仮説をテストする。再び、マウスを、無作為に、５匹毎の１１群に分布し、それらに、隔週で、コンストラクトを伴う又は伴わない４００μlのＰＢＳを用いて注射した。治療についてテストしたコンストラクトは、クローン０８５及びクローン０９３である。
【０４９４】
投与は以下のスキームに従う：
【表１】
2014511680.tif 000028
【０４９５】
腫瘍サイズを４日毎に測定する。腫瘍サイズをノギスにより測定し、腫瘍容積を、式（長さ×幅２）／２を使用して計算する。マウスの腫瘍容積の発生を、３０日間にわたり追跡する。５０日目に、マウスを屠殺する。腫瘍を重量測定し、４%ポリホルムアルデヒド中で固定する。腫瘍切片を、免疫組織化学的分析のために切除する。
【図１】
2014511680.tif 000029
【図２】
2014511680.tif 000030
【図３】
2014511680.tif 000031
【図４】
2014511680.tif 000032
【図５】
2014511680.tif 000033
【図６】
2014511680.tif 000034
【図７】
2014511680.tif 000035
【図８】
2014511680.tif 000036
【配列表】
2014511680000001.app
【国際調査報告】
2014511680.tif 000037
2014511680.tif 000038
2014511680.tif 000039
2014511680.tif 000040
2014511680.tif 000041