(57)【要約】  本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合している、ＦＧＦ２１分子を提供する。糖尿病または糖尿病関連状態を予防または治療するための方法を含めた、本化合物の様々な使用が提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介して抗体またはその抗原結合部の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物。
【請求項２】
リンカーが、配列番号１の番号付けによるアミノ酸位置７９、１２５、または１２９における連結残基の側鎖を通じてＦＧＦ２１分子に共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
残基１２９がシステインであり、リンカーがシステイン１２９のチオール基に共有結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
リンカーが式Ｘ−Ｙ−Ｚを含み、式中、Ｘは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される任意の原子を含む生物学的に適合性の接続鎖であり、ポリマーまたはブロックコポリマーを含んでいてもよく、リンカーが直鎖状である場合は連結残基に共有結合により連結しており、Ｙは、少なくとも１つの環状構造を含む、存在してもよい認識基であり、Ｚは、抗体の結合部位におけるアミノ酸側鎖への共有結合性連結を含む結合部分である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
Ｙが、置換されていてもよい構造：
【化１】
2014500248.tif 000095
を有し、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、独立して、炭素または窒素であり、ｆは、炭素、窒素、酸素、または硫黄である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｙがフェニルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｚが、抗体に共有結合するとき、式
【化２】
2014500248.tif 000096
を有し、ｑ＝１または２である、請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ｑ＝２である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｘが、３つの成分、すなわち、Ｘｐ−Ｘｓ−Ｘｙを含む基であり、式中、Ｘｐは、ＦＧＦ２１タンパク質の連結残基の側鎖と結合できるように特に適合された基であり、Ｘｓは、Ｘ基のスペーサー領域であり、Ｘｙは、Ｙ基に結合するように適合された基である、請求項４から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｘｙが、アミド結合、エナミン結合、またはグアニジン結合から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｘｙが式：
【化３】
2014500248.tif 000097
を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｘｐが式：
【化４】
2014500248.tif 000098
を含む、請求項４から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｘｓが、
【化５】
2014500248.tif 000099
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｍは、存在するか、または存在しない、請求項４から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｘｓが式：
【化６】
2014500248.tif 000100
を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
式：
【化７】
2014500248.tif 000101
を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位で連結されており、Ｓ−ＦＧＦ２１は、連結残基のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、ｎ＝１、または２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｍは、存在するか、または存在しない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
式：
【化８】
2014500248.tif 000102
を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位で連結されており、Ｓ−ＦＧＦ２１は、連結残基のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、ｎ＝１、または２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ｎ＝１、２、３、または４である、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
式：
【化９】
2014500248.tif 000103
を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位で連結されており、Ｓ−ＦＧＦ２１は、連結残基のチオールを持つ側鎖で連結されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
リンカーが、Ｋａｂａｔ番号付けによる抗体の重鎖のリシン９３のε−アミノ基に共有結合によりコンジュゲートされている、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
抗体が、ｈ３８ｃ２もしくはｍ３８Ｃ２に由来するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ダイアボディ、ミニボディ、またはｈ３８ｃ２もしくはｍ３８Ｃ２に由来するＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される定常ドメインを含む全長抗体であり、ｈ３８Ｃ２  ＩｇＧ１であってもよい、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
抗体がアルドラーゼ抗体である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
アルドラーゼ抗体が配列番号２７を含むＶＬ領域を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
アルドラーゼ抗体が配列番号２８を含むＶＨ領域を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
アルドラーゼ抗体が配列番号２５を含む軽鎖を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
アルドラーゼ抗体が配列番号２６を含む重鎖を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＦＧＦ２１分子が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
ＦＧＦ２１分子が配列番号３の配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
ＦＧＦ２１分子が配列番号１０の配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
式
【化１０】
2014500248.tif 000104
を含み、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号２５および配列番号２６を含み、Ｓ−ＦＧＦ２１は、配列番号１０のＣｙｓ１２９のチオールを持つ側鎖である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
式
【化１１】
2014500248.tif 000105
を含み、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号２５および配列番号２６を含み、Ｓ−ＦＧＦ２１は、配列番号７のＣｙｓ１２５のチオールを持つ側鎖である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
式
【化１２】
2014500248.tif 000106
を含み、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号２５および配列番号２６を含み、Ｓ−ＦＧＦ２１は、配列番号１２のＣｙｓ７９のチオールを持つ側鎖である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
配列番号１の番号付けによる残基番号７９、１２５、または１２９に位置する連結残基において、半減期延長部分に共有結合により接続されたＦＧＦ２１分子を含む組成物。
【請求項３３】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択される組成物。
【請求項３４】
リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体が、以下の特性、すなわち、
（ａ）マウスモデルにおいて、少なくとも約３０時間のＳＣ注射後の血漿Ｔ１／２、
（ｂ）Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて、約４ｎＭ未満の効力
のうちの少なくとも１つを有し、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体が、式：
【化１３】
2014500248.tif 000107
を有することを特徴とし、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号２５および配列番号２６を含み、Ｓ−ＦＧＦ２１は、配列番号７のＣｙｓ１２５または配列番号１０のＣｙｓ１２９のいずれかのチオールを持つ側鎖である、組成物。
【請求項３５】
リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体が、以下の特性、すなわち、
（ａ）マウスモデルにおいて、少なくとも約３３時間のＳＣ注射後の血漿Ｔ１／２、
（ｂ）ラットモデルにおいて、少なくとも約３５時間のＳＣ注射後の血漿Ｔ１／２、
（ｃ）霊長類モデルにおいて、少なくとも約４５時間のＳＣ注射後の血漿Ｔ１／２、
（ｄ）Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて、約３ｎＭ未満の効力
のうちの少なくとも１つを有し、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体が、式：
【化１４】
2014500248.tif 000108
を有することを特徴とし、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号２５および配列番号２６を含み、Ｓ−ＦＧＦ２１は、配列番号１０のＣｙｓ１２９のチオールを持つ側鎖である、組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容できる担体と組み合わせて、治療有効量の前記請求項のいずれかに記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項３７】
糖尿病、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、ＨＤＬレベル、または非エステル化遊離脂肪酸もしくはアディプシンのレベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減する方法であって、治療有効量の請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物または請求項３６に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３８】
糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、ＨＤＬレベル、または非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減するための薬剤の調製における、請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物または請求項３６に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン分泌を促進し、血中グルコースレベルを低下させる新規化合物、ならびにこれらの化合物を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩ型糖尿病は、糖尿病の最も蔓延している形態である。この疾患は、インスリン抵抗性および膵β細胞不全によって引き起こされ、グルコース刺激性インスリン分泌の減少をもたらす。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２１は、ＦＧＦファミリーのメンバーであり、代謝調節因子として同定されており、肝臓組織および脂肪組織において選択的に発現され、肝臓組織および脂肪組織などの標的細胞上で、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏから構成される細胞表面受容体を通じてその生物活性を発揮する（ＷＯ０１３６６４０、およびＷＯ０１１８１７２）。受容体複合体は、細胞質シグナル伝達を始動させ、Ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路を通じてＧＬＵＴ１発現を上方制御すると考えられている。前臨床設定において明らかな有害作用を引き起こすことなく、持続的グルコース制御および持続的脂質制御をもたらし、インスリン感受性およびβ細胞機能を改善するその能力のため、ＦＧＦ２１は、２型糖尿病および関連代謝異常にとって魅力的な治療剤である。
【０００３】
ＦＧＦ２１に基づく療法の開発に向けたいくつかの取り組みがなされている。ＷＯ２００６０６５５８２、ＷＯ２００６０２８７１４、ＷＯ２００６０２８５９５、およびＷＯ２００５０６１７１２は、個々のアミノ酸置換を含むＦＧＦ２１の突然変異タンパク質に関する。ＷＯ２００６０７８４６３は、ＦＧＦ２１を使用して心血管疾患を治療する方法を対象とする。ＷＯ２００５０７２７６９は、ＦＧＦ２１およびチアゾリジンジオンの組合せを使用して糖尿病を治療する方法に関する。ＷＯ０３０５９２７０は、ＦＧＦ２１を投与するステップを含む、重病患者の死亡率を低減する方法に関する。ＷＯ０３０１１２１３は、ＦＧＦ２１を投与するステップを含む、糖尿病および肥満症を治療する方法に関する。
【０００４】
しかし、これらの提案された療法の多くは、ＦＧＦ２１のヒトにおけるインビボ半減期が１．５〜２時間の間であるという問題に悩まされている。この欠点を克服するためのいくつかの試みが行われている。ＷＯ２００５０９１９４４、ＷＯ２００６０５０２４７、およびＷＯ２００８１２１５６３は、それぞれ、リシンまたはシステイン残基、グリコシル基、および非天然アミノ酸残基を介してＰＥＧに連結されたＦＧＦ２１分子を開示している。ＷＯ２００５１１３６０６は、ポリグリシンリンカーを使用して、ＦＧＦ２１分子のＣ末端を介してアルブミン分子および免疫グロブリン分子に組換えで融合されたＦＧＦ２１分子を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、タンパク質コンジュゲートを有用な、費用効果的な医薬品に発展させることは、重要で多くの場合競合するいくつかの課題を提起する。インビボ効力、インビボ半減期、インビトロ貯蔵の安定性、ならびにコンジュゲーションの効率および特異性を含めた製造の容易さおよび効率の間でバランスを取らなければならない。一般に、コンジュゲーションプロセスは、対象とするタンパク質の所望の生物学的作用を排除しない、または著しく低減しないことが不可避である。機能に要求されるタンパク質間相互作用は、タンパク質の複数の領域が協調して作用することを必要とする場合があり、コンジュゲートが近傍に存在する状態でこれらのいずれかが混乱すると、活性部位（複数可）に支障をきたし、活性部位の機能を低減するように三次元構造を十分に変化させる場合がある。コンジュゲーションがＮ’末端またはＣ’末端を通じたものでない限り、連結を促進するための内部突然変異が必要となり得る。これらの突然変異は、タンパク質の構造および機能に対して予測不可能な効果を有する可能性がある。したがって、代替のＦＧＦ２１に基づく治療剤の必要性が依然としてある。
【０００６】
本明細書におけるいずれの技術への参照も、参照された技術が共通の一般的な知見の一部を形成するいずれの形態または示唆も承認するものではなく、こうした承認として解釈されるべきでない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合している、組成物に関する。
【０００８】
連結残基は、システインまたはリシンとすることができる。連結残基は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基番号５６、５９、６９、７９、８６、１２２、１２５、および１２９からなる群から選択される位置に位置し得る。連結残基は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基番号５６、５９、８６、および１２２からなる群から選択される位置に位置し得る。連結残基は、配列番号１の番号付けによる残基７９、１２５、および１２９からなる群から選択される位置に位置し得る。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号１の番号付けによる残基番号５６、５９、６９、７９、８６、１２２、１２５および／または１２９に位置する連結残基において、少なくとも１つの半減期延長部分（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ−ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）に共有結合により接続されたＦＧＦ２１分子を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１分子は、１つの半減期延長部分に共有結合により接続されている。いくつかの態様では、連結残基は、残基番号７９、１２５、および１２９からなる群から選択される。用語「半減期延長部分」は、ＦＧＦ２１分子に接続される場合、ＦＧＦ２１分子の循環半減期を延長し、かつ／またはＦＧＦ２１分子の腎クリアランスを阻害もしくは低減する任意の分子を指す。半減期延長部分の例として、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ホスホリルコリン含有ポリマー、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、抗体、触媒抗体（以下で論じられる）、タンパク質（アルブミンなど）、および当技術分野で公知である他の巨大分子が挙げられる。
【００１０】
連結残基の側鎖は、チオール基を含むことができる。連結残基は、システインとすることができる。
【００１１】
ＦＧＦ２１分子は、配列番号３を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号４を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択される配列を含み得る。
【００１２】
連結残基は、配列番号１の番号付けによる１２５位に位置し得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１配列は、配列番号７である。
【００１３】
連結残基は、配列番号１の番号付けによる１２９位に位置し得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１配列は、配列番号１０である。
【００１４】
連結残基は、配列番号１の番号付けによる７９位に位置し得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１配列は、配列番号１３である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、連結残基は、配列番号１の番号付けによる１、２、５６、５９、６９、および１２２からなる群から選択される位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、連結残基は、配列番号１の番号付けによる１、２、５６、５９、および１２２からなる群から選択される位置に位置し得る。連結残基は、リシンとすることができる。ＦＧＦ２１分子は、配列番号１７を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列を含み得る。
【００１６】
ある特定の適当なリンカーは、ＵＳ２００９０９８１３０に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。特に、そこで具体的かつ一般的に記載される、リンカーを記述する一般式、特定のリンカー構造、リンカーの合成、ならびにＸ基、Ｙ基、およびＺ基の様々な要素の組合せに関係するＵＳ２００９０９８１３０の態様は、本明細書に含まれている。リンカーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、１つまたは複数の炭素環基または複素環基を含んでもよい。リンカー長は、直鎖状原子の数に関してとらえることができ、芳香環などの環状部分は、環の周囲の最短経路を採用して数えられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、５〜１５原子、他の実施形態では、１５〜３０原子、さらに他の実施形態では、３０〜５０原子、さらに他の実施形態では、５０〜１００原子、およびさらに他の実施形態では、１００〜２００原子の間の直鎖状ストレッチを有する。他のリンカーの考慮事項には、得られる化合物の物理的または薬物動態学的性質、例えば、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性（より安定またはより不安定、および計画された分解）、剛性、柔軟性、免疫原性、および抗体結合の調節、ミセルまたはリポソーム中に組み込まれる能力などに対する効果が含まれる。
【００１７】
本発明のいくつかの態様では、化合物は、連結残基の側鎖に共有結合により連結されたリンカーを含む。リンカーは、式：Ｘ−Ｙ−Ｚを含むことができ、式中、Ｘは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される任意の原子を含む生物学的に適合性の接続鎖であり、ポリマーまたはブロックコポリマーを含んでいてもよく、リンカーが直鎖状である場合は連結残基に共有結合により連結しており、Ｙは、少なくとも１つの環状構造を含む、存在してもよい認識基であり、Ｚは、抗体の結合部位におけるアミノ酸側鎖への共有結合性連結を含む結合部分である。
【００１８】
存在する場合、Ｙは、置換されていてもよい構造：
【００１９】
【化１】
2014500248.tif 000002
を有することができ、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、独立して、炭素または窒素であり、ｆは、炭素、窒素、酸素、または硫黄であり、Ｙは、十分な価数の任意の２つの環位置で、独立してＸおよびＺに結合しており、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、またはｆのうちの４つ以下が同時に窒素であり、好ましくは、環状構造中のａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、それぞれ炭素である。いくつかの態様では、Ｙは、フェニルとすることができる。いずれの理論によっても束縛されることを望まないが、Ｙ基は、Ｚ基が反応性アミノ酸側鎖と反応することができるように、反応基を抗体結合部位中に配置するのを補助することができると考えられる。
【００２０】
リンカーは、抗体、タンパク質、またはこれらの断片などの巨大分子との結合を共有結合または非共有結合により形成することができる反応基を含有するように設計することができる。反応基は、特定の結合部位中の反応性残基とともに使用するために選ばれる。例えば、アルドラーゼ抗体によって修飾するための化学部分は、ケトン、ジケトン、βラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、アンヒドリド、マレイミド、α−ハロアセトアミド、シクロヘキシルジケトン、エポキシド、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン（例えば、ケタール）、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどであってもよい。本発明のペプチドをリンカーと連結する本発明の実施形態では、Ｚは反応基である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｚは、抗体の結合部位中の残基の側鎖とコンジュゲートする前に、アジチジノン（ａｚｉｔｉｄｉｎｏｎｅ）、ジケトン、アシルβ−ラクタム、活性エステル、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン基、アルデヒド、マレイミド、活性化アルケン、活性化アルキン、または一般に、求核置換もしくは求電子置換に感受性の脱離基を含む分子を形成するように配列された１つまたは複数のＣ＝Ｏ基を含む。他の基として、ラクトン、アンヒドリド、α−ハロアセトアミド、イミン、ヒドラジド、またはエポキシドを挙げることができる。抗体の結合部位中の反応性求核基（例えば、リシン側鎖またはシステイン側鎖）に共有結合により結合することができる例示的なリンカーの求電子性反応基として、アシルβ−ラクタム、単純ジケトン、スクシンイミド活性エステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン（例えば、ケタール）、ラクタム、スルホネートなど、マスクされたＣ＝Ｏ基、例えば、イミン、ケタール、アセタールなど、および任意の他の公知の求電子性基が挙げられる。ある特定の実施形態では、反応基は、アシルβ−ラクタム、単純ジケトン、スクシンイミド活性エステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、またはアルデヒドを形成するように配置された１つまたは複数のＣ＝Ｏ基を含む。Ｚは、置換アルキル、置換シクロアルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルアルキルとすることができ、ここで、少なくとも１つの置換基は、１，３−ジケトン部分、アシルβ−ラクタム、活性エステル、α−ハロケトン、アルデヒド、マレイミド、ラクトン、アンヒドリド、α−ハロアセトアミド、アミン、ヒドラジド、またはエポキシドである。Ｚ基は、本発明のペプチドに半減期の延長をもたらし得る巨大分子骨格に共有結合により連結することができる。Ｚ基は、存在する場合、抗体の結合部位に共有結合により連結することができる。
【００２２】
いくつかの態様では、コンジュゲートする前に（例えば、抗体の結合部位と）、Ｚは、構造：
【００２３】
【化２】
2014500248.tif 000003
を有し、式中、ｑ＝０〜５である。ｑは１または２であってもよい。ｑは１であってもよい。他の態様では、ｑは２であってもよい。
【００２４】
いくつかの態様では、抗体の結合部位とコンジュゲートした後に、Ｚは、構造：
【００２５】
【化３】
2014500248.tif 000004
を有し、式中、ｑ＝０〜５であり、抗体−Ｎ−は、抗体の結合部位中の側鎖への共有結合である。ｑは１または２であってもよい。ｑは１であってもよい。他の態様では、ｑは２であってもよい。
【００２６】
Ｘは、３つの成分、すなわち、Ｘｐ−Ｘｓ−Ｘｙを含む基とすることができ、式中、Ｘｐは、ＦＧＦ２１タンパク質の連結残基の側鎖と結合できるように特に適合された基であり、Ｘｓは、Ｘ基のスペーサー領域であり、Ｘｙは、Ｙ基に結合するように適合された基である。いくつかの態様では、Ｘｙは、アミド結合、エナミン結合、またはグアニジン結合から選択される。Ｘｙは、Ｙ基に隣接する（２原子以内で）水素分子をもたらすように選択することができる。理論によって束縛されることを望まないが、Ｈ原子は、特に、ｈ３８Ｃ２などの触媒抗体の結合溝の疎水性ポケットに関して、Ｈ結合相互作用を通じた疎水性ポケットのＹ基の認識を補助することができると考えられる。したがって、アミド結合は、例えば、ＮＨ基がＹ基に直接結合され、水素結合のためにＮＨ基のＨを提供するように配向することができる。あるいは、アミドのＣ＝Ｏ基は、Ｙ基に結合し、ＮＨ基のＨが、Ｙ基に最大２原子で隣接するが、Ｈ結合に依然として利用可能である場合がある。いくつかの実施形態では、Ｘｙは存在しない。いくつかの実施形態では、Ｘｙ基は、式：
【００２７】
【化４】
2014500248.tif 000005
を有する。
【００２８】
いくつかの態様では、Ｘｓは、Ｘｓが過度に反応性の基を提供しないように選択される。Ｘｓは、２〜１５原子の間のＸ基の全長をもたらすように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、２〜１０原子の間であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、４〜８原子であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、５原子であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、６原子であるように選択することができる。いくつかの態様では、Ｘｓは、以下の式のうちの１つを含むことができ：
【００２９】
【化５】
2014500248.tif 000006
式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｍは、存在するか、または存在せず、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１、２、３、または４であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。
【００３０】
いくつかの態様では、Ｘｓは、以下の式のうちの１つを含む：
【００３１】
【化６】
2014500248.tif 000007
【００３２】
Ｘｐは、理想的には、ＦＧＦ２１タンパク質の連結残基への特定の方向性の共有結合性連結ストラテジーを可能にするように選択される。例えば、連結残基が求核基を含む場合、Ｘｐは、求電子基とすることができ、逆の場合も同様である。例えば、連結残基の側鎖がアミン基、例えば、Ｋ、Ｈ、Ｙ、オルニチン、Ｄａｐ、またはＤａｂなどを含む場合、Ｘｐは、ＣＯＯＨ、または他の同様に反応性の求電子体とすることができる。連結残基がＤまたはＥである場合、Ｘｐは、アミン基などの求核基を含むことができる。これらのストラテジーのいずれも、アミド結合形成ストラテジーによって、Ｘｐ基と連結残基との間に共有結合を形成することを可能にする。連結基がアミン基である場合、Ｘｐは、式：
【００３３】
【化７】
2014500248.tif 000008
を含むことができる。
【００３４】
連結残基が、Ｃ、Ｃの同族体、または他のチオール基含有残基である場合、Ｘｐは、マレイミド基（または同様のもの）を含むことができ、チオール−マレイミド付加反応ストラテジーを可能にすることによって、Ｘｐ基を連結残基に共有結合により連結する。いくつかの態様では、Ｘｐは、チオール基を含むこともでき、連結残基とＸｐ基の間にジスルフィド架橋が形成されるのを可能にする。いくつかの態様では、Ｘｐは、マレイミド：
【００３５】
【化８】
2014500248.tif 000009
とすることができ、ここで、矢印は、ＦＧＦ２１連結残基への結合箇所を示し、波線は、リンカーのＹ基への結合を表す。ＦＧＦ２１連結残基がシステイン残基、または他のチオールを持つ側鎖である場合、コンジュゲーションの機構は、以下の通りとなり得る：
【００３６】
【化９】
2014500248.tif 000010
【００３７】
いくつかの態様では、Ｘｐ基は、置換マレイミド：
【００３８】
【化１０】
2014500248.tif 000011
を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、コンジュゲーションの前後のＸＹ成分は、以下から選択することができる：
【００４０】
【化１１】
2014500248.tif 000012
【００４１】
成分ＸＹ−１、ＸＹ−２、ＸＹ−３、およびＸＹ−４は、ＦＧＦ２１分子上のチオール基を持つ側鎖にコンジュゲートする実施形態において特に有用である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−１（Ｌ１）とすることができる：
【００４３】
【化１２】
2014500248.tif 000013
Ｌ１が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ１複合体は、式：
【００４４】
【化１３】
2014500248.tif 000014
を含むことができる。Ｌ１がＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ１−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００４５】
【化１４】
2014500248.tif 000015
を含むことができる。Ｌ１が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ１−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００４６】
【化１５】
2014500248.tif 000016
を含むことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−２（Ｌ２）とすることができる：
【００４８】
【化１６】
2014500248.tif 000017
Ｌ２が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ２複合体は、式：
【００４９】
【化１７】
2014500248.tif 000018
を含むことができる。Ｌ２がＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ２−ＦＧＦ２１複合体は、以下の式のうちの１つ：
【００５０】
【化１８】
2014500248.tif 000019
を含むことができる。Ｌ２が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ２−ＦＧＦ２１複合体は、以下の式のうちの１つ：
【００５１】
【化１９】
2014500248.tif 000020
を含むことができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−３（Ｌ３）とすることができる：
【００５３】
【化２０】
2014500248.tif 000021
Ｌ３が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ３複合体は、式：
【００５４】
【化２１】
2014500248.tif 000022
を含むことができる。Ｌ３がＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ３−ＦＧＦ２１複合体は、以下の式のうちの１つ：
【００５５】
【化２２】
2014500248.tif 000023
を含むことができる。Ｌ３が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ３−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００５６】
【化２３】
2014500248.tif 000024
を含むことができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−４（Ｌ４）とすることができる：
【００５８】
【化２４】
2014500248.tif 000025
抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ４複合体は、式：
【００５９】
【化２５】
2014500248.tif 000026
を含むことができる。ＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ４−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００６０】
【化２６】
2014500248.tif 000027
を含むことができる。Ｌ４が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ４−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００６１】
【化２７】
2014500248.tif 000028
を含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−５（Ｌ５）とすることができる：
【００６３】
【化２８】
2014500248.tif 000029
Ｌ５が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ５複合体は、式：
【００６４】
【化２９】
2014500248.tif 000030
を含むことができる。Ｌ５がＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ５−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００６５】
【化３０】
2014500248.tif 000031
を含むことができる。Ｌ５が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ５−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００６６】
【化３１】
2014500248.tif 000032
を含むことができる。
【００６７】
いくつかの態様では、リンカーは、リンカー−６（Ｌ６）とすることができる。
【００６８】
【化３２】
2014500248.tif 000033
Ｌ６が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ６複合体は、式：
【化３３】
2014500248.tif 000034
を含むことができる。Ｌ６がＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ６−ＦＧＦ２１複合体は、Ｌ５−ＦＧＦ２１についての式と同じ式を含み得る。同様に、Ｌ６が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ６−ＦＧＦ２１複合体は、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１についての式と同じ式を含み得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−７（Ｌ７）とすることができる：
【００７０】
【化３４】
2014500248.tif 000035
抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ７複合体は、式：
【００７１】
【化３５】
2014500248.tif 000036
を含むことができる。ＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ７−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００７２】
【化３６】
2014500248.tif 000037
を含むことができる。抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ７−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００７３】
【化３７】
2014500248.tif 000038
を含むことができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−８（Ｌ８）とすることができる：
【００７５】
【化３８】
2014500248.tif 000039
Ｌ８が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ８複合体は、式：
【００７６】
【化３９】
2014500248.tif 000040
を含むことができる。Ｌ８がＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、Ｌ８−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００７７】
【化４０】
2014500248.tif 000041
を含むことができる。Ｌ８が抗体およびＦＧＦ２１分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ８−ＦＧＦ２１複合体は、式：
【００７８】
【化４１】
2014500248.tif 000042
を含むことができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、Ａｂ−リンカー−ＦＧＦ２１コンジュゲートは、式：
【００８０】
【化４２】
2014500248.tif 000043
のものとすることができ、式中、抗体結合部位は、リンカーに共有結合により連結されており、Ｓ−ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１分子上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよく、ｍは、任意選択である。ｍは、存在しなくてもよい。ｍは存在してもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ａｂ−リンカー−ＦＧＦ２１コンジュゲートは、式：
【００８２】
【化４３】
2014500248.tif 000044
のものとすることができ、式中、抗体結合部位は、リンカーに共有結合により連結されており、Ｓ−ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１分子上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、組成物は、式：
【００８４】
【化４４】
2014500248.tif 000045
を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位への共有結合性連結であり、Ｓ−ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１分子上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１分子は、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１分子は、配列番号７を含む。
【００８５】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されるリンカーおよびリンカー成分、特に、それだけに限らないが、本明細書に記載されるＸ基を対象とする。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されるリンカーまたはリンカー基に共有結合によりコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合部を含む組成物を対象とする。いくつかの態様では、リンカーまたはリンカー基は、さらにペプチドまたはタンパク質に直接または間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーおよび抗体リンカーコンジュゲートの有用性は、ＦＧＦ２１分子を用いた用途に限定されず、前記Ａｂ−リンカーコンジュゲートは、他のペプチド、タンパク質、および治療剤、およびターゲティング剤とコンジュゲートすることができることが明らかになるであろう。これらの目的のために、Ｓ−ＦＧＦ２１およびＮＨ−ＦＧＦ２１を表す、本明細書に記載されるのと同じ構造は、他のタンパク質、ペプチド、および治療剤、および標的化分子に当てはまり、表されている構造のＦＧＦ２１という用語は、前記タンパク質、ペプチド、または分子に置き換えられることを理解することができる。
【００８６】
いくつかの態様では、本発明は、式：
【００８７】
【化４５】
2014500248.tif 000046
のリンカーを提供し、式中、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。ｍは、存在しなくてもよい。ｍは、存在してもよい。
【００８８】
いくつかの態様では、本発明は、式：
【００８９】
【化４６】
2014500248.tif 000047
のリンカーを提供し、式中、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。ｍは、存在しなくてもよい。ｍは、存在してもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８、ならびに本明細書に記載される他の特定のリンカーの式および一般的なリンカーの式からなる群から選択されるリンカーを含む組成物を対象とする。いくつかの態様では、本発明は、前記リンカー、およびその抗体−リンカーコンジュゲート、タンパク質−リンカーコンジュゲート、または抗体−リンカー−タンパク質コンジュゲートを作製する方法を対象とする。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体の皮下半減期が、マウスモデルにおいて少なくとも約２０時間である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、少なくとも約２５時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、少なくとも約３０時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、少なくとも約３３時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、ラットモデルにおいて少なくとも約３５時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、ラットモデルにおいて少なくとも約３６時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも約４０時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも約４５時間である。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて少なくとも約２８時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ラットモデルにおいて少なくとも約５５時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ラットモデルにおいて少なくとも約５５時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ラットモデルにおいて少なくとも約６０時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約６０時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約６５時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトにおいて少なくとも約３０時間の単回投与後のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトにおいて少なくとも約３５時間の単回投与後のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体の皮下バイオアベイラビリティーが、マウスモデルにおいて少なくとも約５０％である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、少なくとも約５５％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、少なくとも約６５％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、ラットモデルにおいて少なくとも約５０％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約５０％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約６０％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約６５％である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体の皮下バイオアベイラビリティーが、マウスモデルにおいて少なくとも約５０％である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、少なくとも約５５％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、少なくとも約６５％である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含む組成物であって、リンカーが、ＦＧＦ２１内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体が、約５ｎＭ未満のＧｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力を有する、組成物に関する。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力は、約４ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力は、約３ｎＭ未満である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体は、２つ以上の好都合な利点、例えば、ＳＣ半減期、ＩＶ半減期、グルコース取込み、効力、バイオアベイラビリティー、製造の容易さ、コンジュゲーション効率、インビボ安定性、インビトロ安定性、加水分解に対する耐性、ならびに抗体、リンカー、およびタンパク質の間の適合性などを兼ね備える。
【００９６】
抗体
ＵＳ２００６２０５６７０の内容、特に、抗体技術の他の要素の中で、抗体、これらの有用な断片および変異体および一時的変異、結合部位およびＣＤＲ、抗体調製、発現、ヒト化、アミノ酸修飾、グリコシル化、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体の血清半減期の延長、発現ベクター、哺乳動物宿主システム、および折り畳みを記述している段落［０１５３］〜［０２３３］は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００９７】
本明細書において、「結合部位」（抗体結合部位としても知られる）は、適切な抗原（または構造的に同様のタンパク質）の決定基と化合する（または化合することができる）免疫グロブリンまたはＩｇドメインの領域を指す。この用語は一般に、抗原結合に関与するＣＤＲおよび隣接フレームワーク残基を含む。
【００９８】
「アルドラーゼ抗体」は、本明細書において、阻害されていない場合（例えば、コンジュゲーションによって）、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプターとの間のアルドール付加反応を触媒する結合部位部を含有する抗体を指す。アルドラーゼ抗体は、免疫性−反応性の動物を、キャリアタンパク質にカップリングした式：
【００９９】
【化４７】
2014500248.tif 000048
の１，３ジケトンハプテンを含む免疫原で免疫することによって生成され得、抗体の結合部位において反応性ε−アミノ基を伴ったリシンを有することによってさらに特徴づけられる。アルドラーゼ抗体は、１，３−ジケトンハプテンと触媒抗体のリシンのε−アミノ基との間で複合体を形成することによって、１，３−ジケトンハプテンで阻害を受けやすいその触媒活性によってさらに特徴づけられる。
【０１００】
論じたように、ある特定の実施形態では、本発明の化合物とともに使用することができるある特定の抗体は、抗体結合部位中に反応性側鎖を必要とする場合がある。反応性側鎖は、天然に存在していてもよく、または突然変異によって抗体中に置かれてもよい。抗体結合部位の反応性残基は、この残基が、抗体を作製するのに最初に同定されるリンパ系細胞内に存在する核酸によってコードされる場合などに、抗体に付随し得る。あるいは、アミノ酸残基は、特定の残基をコードするようにＤＮＡを意図的に突然変異させることによって生じ得る（例えば、ＷＯ０１／２２９２２）。反応性残基は、例えば、本明細書で論じられるユニークコドン、ｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡを使用する生合成的組込みによって生じる非天然残基とすることができる。別の手法では、アミノ酸残基またはその反応性官能基（例えば、求核性のアミノ基またはスルフヒドリル基）は、抗体結合部位中のアミノ酸残基に結合することができる。したがって、本明細書において、「抗体の結合部位中のアミノ酸残基を通じて」起こる抗体との共有結合性連結は、抗体結合部位のアミノ酸残基に直接のもの、または抗体結合部位のアミノ酸残基の側鎖に連結された化学部分を通じたものとすることができることを意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸はシステインであり、側鎖の反応基はスルフヒドリル基である。他の実施形態では、アミノ酸残基はリシンであり、側鎖の反応基はε−アミノ基である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付けによる重鎖上のＬｙｓ９３である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ＨＣ  ｈ３８Ｃ２（配列番号２６）上のＬｙｓ−９９である。
【０１０１】
触媒抗体は、１つまたは複数の反応性アミノ酸側鎖を含む適当な結合部位を有する抗体の１つの源である。このような抗体には、アルドラーゼ抗体、βラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、およびアミダーゼ抗体が含まれる。
【０１０２】
一実施形態は、アルドラーゼ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ  ３３Ｆ１２およびｍＡｂ  ３８Ｃ２、ならびにこのような抗体の適切なキメラバージョンおよびヒト化バージョンなど（例えば、ｈ３８Ｃ２、配列番号２５および２６）を含む。マウスｍＡｂ  ３８Ｃ２（およびｈ３８Ｃ２）は、ＨＣＤＲ３の付近であるが外側に反応性リシンを有し、反応性免疫化によって生成された触媒抗体の新規クラスのプロトタイプであり、天然アルドラーゼ酵素を機構的に模倣する。Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ３世ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２０８５〜２０９２（１９９７）を参照。使用することができる他のアルドラーゼ触媒抗体には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１５を有するハイブリドーマ８５Ａ２；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１４を有するハイブリドーマ８５Ｃ７；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１７を有するハイブリドーマ９２Ｆ９；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３を有するハイブリドーマ９３Ｆ３；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２４を有するハイブリドーマ８４Ｇ３；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１８を有するハイブリドーマ８４Ｇ１１；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１９を有するハイブリドーマ８４Ｈ９；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２５を有するハイブリドーマ８５Ｈ６；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１６を有するハイブリドーマ９０Ｇ８によって生成される抗体が含まれる。反応性リシンを通じて、これらの抗体は、天然アルドラーゼのエナミン機構を使用してアルドール反応およびレトロ−アルドール反応を触媒する。アルドラーゼ抗体およびアルドラーゼ抗体を生成する方法は、米国特許第６，２１０，９３８号、同第６，３６８，８３９号、同第６，３２６，１７６号、同第６，５８９，７６６号、同第５，９８５，６２６号、および同第５，７３３，７５号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０３】
本発明の化合物は、チオエステラーゼ触媒抗体およびエステラーゼ触媒抗体の結合部位中に見出されるものなどの反応性システインに本発明の化合物を連結することによっても形成することができる。適当なチオエステラーゼ触媒抗体は、Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：２５３２〜２５３６（１９９４）によって記載されている。適当なエステラーゼ抗体は、Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１７７５〜１７８２（１９９５）によって記載されている。反応性アミノ酸含有抗体は、反応性アミノ酸をコードするように抗体結合部位の残基を突然変異させること、または反応基を含有するリンカーを用いて抗体結合部位中のアミノ酸側鎖を化学的に誘導体化することを含めて、当技術分野で周知である手段によって調製することができる。
【０１０４】
抗体は、ヒト化抗体とすることができる。本発明の化合物が抗体の結合部位に共有結合により連結され、このような抗体がヒト化される場合、このような抗体は、Ｚ基に対する高い連結親和性を保持してヒト化されることが重要である。様々な形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体が企図されている。一実施形態では、ヒト定常ドメインＣκおよびＣγ１１を有するヒト化アルドラーゼ触媒抗体ｈ３８ｃ２  ＩｇＧ１またはｈ３８ｃ２  Ｆａｂを使用する。Ｃ．Ｒａｄｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３３２：８８９〜８９９（２００３）は、ｈ３８ｃ２  Ｆａｂおよびｈ３８ｃ２  ＩｇＧ１を生成するのに使用することができる遺伝子配列およびベクターを開示している。ヒト生殖系列Ｖｋ遺伝子ＤＰＫ−９およびヒトＪｋ遺伝子ＪＫ４は、ｍ３８ｃ２のκ軽鎖可変ドメインをヒト化するためのフレームワークとして使用され、ヒト生殖系列遺伝子ＤＰ−４７およびヒトＪＨ遺伝子ＪＨ４は、ｍ３８ｃ２の重鎖可変ドメインをヒト化するためのフレームワークとして使用された。図１は、ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、およびヒト生殖系列における可変軽鎖と可変重鎖の間の配列アライメントを例示する。ｈ３８ｃ２は、そのアロタイプのいずれかを含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常ドメインを利用することができる。抗体がＧ１ｍ（ｆ）アロタイプを含むｈ３８ｃ２  ＩｇＧ１である、本発明の化合物のある特定の実施形態では、Ｚは、重鎖の９９位でリシン残基の側鎖に結合する。別の実施形態では、ｈ３８ｃ２の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）（配列番号２７および２８）、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する定常ドメインを含むキメラ抗体を使用する。抗体は、ｈ３８ｃ２に由来するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ダイアボディ、またはミニボディとすることができる。抗体は、ｈ３８ｃ２に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される定常ドメインを含む抗体であってもよい。抗体は、ｈ３８Ｃ２  ＩｇＧ１（配列番号２５および２６）であってもよい。抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体に由来する定常領域を含むマウスアルドラーゼ抗体のヒト化バージョンであってもよい。別の実施形態では、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体に由来するＶＬ領域およびＶＨ領域、ならびにヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体に由来する定常領域を含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ｍ３８Ｃ２に由来するＶＬ領域およびＶＨ領域（配列番号２９および３０）を含む。さらなる実施形態では、抗体は、天然または固有のヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体に由来するポリペプチド配列を含むマウスアルドラーゼ抗体の完全ヒトバージョンである。
【０１０５】
様々な形態のヒト化アルドラーゼ抗体断片も企図されている。一実施形態では、ｈ３８ｃ２  Ｆ（ａｂ’）２を使用する。ｈ３８ｃ２  Ｆ（ａｂ’）２は、ｈ３８ｃ２  ＩｇＧ１のタンパク質消化によって生成することができる。別の実施形態では、介在リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３１）によって接続されていてもよい、ｈ３８ｃ２に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｈ３８ｃ２  ｓｃＦｖを使用する。ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化（または触媒抗体の場合では反応性免疫化）の後に、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在では可能である。
【０１０６】
あるいは、ファージディスプレイ技術を使用することによって、免疫されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを使用して、インビトロでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。上記に示したように、ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞、例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号によって生成することもできる。
【０１０７】
本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）は、企図されている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、この残基への挿入、および／またはこの残基の置換が含まれる。最終的な構築物に到達するように、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが行われ、ただし、最終的な構築物は、所望の特性を有する。グリコシル化部位の数または位置の変化などのアミノ酸変化はまた、抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
【０１０８】
本発明の抗体または抗体部は、別の分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）に誘導体化または連結することができる。一般に、抗体またはその一部分は、リンカーの、抗体結合部位に共有結合によりコンジュゲートする能力が誘導体化または標識化によって悪影響されないように誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部は、本明細書に記載される抗体のインタクトな形態および修飾形態の両方を含むことが意図されている。例えば、本発明の抗体または抗体部は、１つまたは複数の他の分子実体、例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ）、検出剤、細胞毒性薬、医薬品、および／または別の分子（ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど）との抗体もしくは抗体部の付随を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどに機能的に連結することができる（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、または他の方法によって）。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部は、融合抗体、または別のポリペプチドに連結された抗体とすることができる。いくつかの態様では、抗体の可変領域のみがポリペプチドに連結される。いくつかの態様では、抗体は、結合部位の結合能力を妨害しないようにペプチドに共有結合によりコンジュゲートされる。
【０１１０】
ポリペプチドは、治療剤、例えば、ターゲティング剤、ペプチド、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節因子、ホルモン、毒素、成長因子、または他の調節タンパク質などであっても、西洋わさびペルオキシダーゼなどの、容易に可視化され得る酵素などの診断剤であってもよい。さらに、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作り出すことができる。これは、１本のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合に有用である。
【０１１１】
一タイプの誘導体化抗体は、２つ以上の抗体（例えば、二重特異性抗体を作り出すために、同じタイプまたは異なるタイプの）を架橋することによって生成される。適当な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離された２つの別個に反応性の基を有するヘテロ二官能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものが含まれる。
【０１１２】
別のタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。本発明の抗体または抗体部が誘導体化され得る有用な検出剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含めた蛍光化合物が含まれる。抗体は、検出に有用である酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識することもできる。抗体が検出可能な酵素で標識される場合、これは、酵素が使用する追加の試薬を添加して、見分けることができる反応生成物を生成することによって検出される。例えば、作用物質の西洋わさびペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加すると、検出可能である着色した反応生成物がもたらされる。抗体はまた、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合という間接的測定を通じて検出することができる。抗体は、ガドリニウムなどの磁性剤で標識してもよい。抗体は、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
【０１１３】
抗体は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基などで誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善する、例えば、血清半減期を延長し、または組織結合を増大させるのに有用となり得る。
【０１１４】
医薬組成物
本発明の別の態様では、本発明の組成物および／または化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物を含む作用物質を製剤化し、全身的に投与することができる。製剤化および投与のための方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出すことができる。
【０１１５】
注射用に、本発明の組成物は、液剤、乳剤、もしくは懸濁剤、もしくは非水性液剤、懸濁剤、乳剤、分散剤、または再構成して滅菌した注射用液剤もしくは分散剤にするのに適した滅菌粉末もしくは凍結乾燥物で製剤化することができる。適当な水性および非水性の希釈剤、溶媒、および担体の例として、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、これらの適当な混合物、および油が挙げられる。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散剤の場合の要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持または改善することができる。
【０１１６】
本発明の組成物は、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、またはリン酸塩などを含有する水溶液で製剤化することができる。必要な場合、このような製剤は、様々な張性調整剤、可溶化剤および／または安定化剤（例えば、塩化ナトリウムなどの塩、スクロース、マンニトール、およびトレハロースなどの糖、アルブミンなどのタンパク質、グリシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）などの界面活性剤、またはエタノール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの共溶媒）も含有することができる。本発明の組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、分散剤、ならびに保存剤なども含むことができる。本発明の組成物は、懸濁化剤、例えば、寒天、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、エトキシ化イソステアリルアルコール、微結晶性セルロース、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、ならびにトラガカント、またはこれらの混合物なども含むことができる。
【０１１７】
本発明の組成物は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸なども含むことができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。本発明の注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させることができる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって影響され得る。
【０１１８】
本発明の組成物は、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有することができる。適当な製剤材料として、それだけに限らないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン）、抗菌剤、抗酸化剤（Ｌ−メチオニン、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（酢酸ナトリウム、乳酸塩、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など）、増量剤（マンニトールもしくはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＤＰＴＡなど）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤、もしくは湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）；トロメタミン；レシチン；コレステロールもしくはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）、安定性増強剤（スクロースもしくはソルビトールなど）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム−もしくはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、ならびに／または医薬アジュバントが挙げられる。
【０１１９】
製剤成分は、投与の部位に許容される濃度で存在し得る。緩衝剤を使用することによって、組成物を生理的ｐＨ、またはわずかにより低いｐＨ、一般的に、約５〜約８のｐＨ範囲内に維持することができる。
【０１２０】
いくつかの態様では、本発明の化合物が、化合物を制御放出または徐放するために製剤化されている本発明の医薬組成物を調製することができる。例として、ヒアルロン酸など、ポリマーゲル、ビーズ、粒子、注射用ミクロスフェア、リポソーム、フィルム、マイクロカプセル、徐放マトリックス、および移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０１２１】
いくつかの態様では、本発明の医薬組成物は、単室または多室充填済みシリンジで提供される。
【０１２２】
いくつかの態様では、本発明は、医薬組成物中に使用するのに適した少なくとも１つの追加の成分と一緒に、本発明の少なくとも１つの化合物または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、患者に前記組成物を送達するための少なくとも１つの手段と一緒に、本発明の少なくとも１つの化合物または組成物を含むキットを提供する。
【０１２３】
本発明の組成物は、リンカーにＦＧＦ２１分子を共有結合により連結し、多価抗体の結合部位にリンカーをコンジュゲートすることによって合成することができる。例えば、ＦＧＦ２１−リンカーコンジュゲートは、リンカーがジケトンまたはＡＺＤ（β−ラクタム）反応性部分を含む場合、ｈ３８Ｃ２  ＩｇＧ１などのアルドラーゼ抗体０．５当量とともにインキュベートすることによって、本発明の組成物を生成することができる。
【０１２４】
使用方法
ヒトにおける治療用途について、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはヒトキメラ抗体、またはこれらの抗原結合部が、本発明の化合物または組成物の抗体部の好適な抗体形態である。
【０１２５】
本発明の一態様は、糖尿病または糖尿病関連状態を治療するための方法であって、糖尿病または糖尿病関連状態を罹患している対象に、治療有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む方法である。
【０１２６】
本発明の別の態様は、対象におけるインスリン分泌を増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１２７】
本発明の別の態様は、対象における血中グルコースレベルを減少させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１２８】
本発明の別の態様は、対象における肥満症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１２９】
本発明の別の態様は、対象における体重レベルを管理または低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３０】
本発明の別の態様は、対象における異脂肪血症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３１】
本発明の別の態様は、対象における高血圧症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３２】
本発明の別の態様は、対象における脂肪肝（ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３３】
本発明の別の態様は、対象における心血管疾患を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３４】
本発明の別の態様は、対象におけるグルカゴンレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３５】
本発明の別の態様は、対象におけるトリグリセリドレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３６】
本発明の別の態様は、対象における非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３７】
本発明の別の態様は、対象における低密度コレステロールレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３８】
本発明の別の態様は、対象におけるＣ反応性タンパク質レベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１３９】
本発明の別の態様は、対象におけるフルクトサミンレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１４０】
本発明の別の態様は、対象における血糖コントロールを管理するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１４１】
本発明の別の態様は、対象におけるアディプシンのレベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１４２】
本発明の別の態様は、対象におけるＨＤＬのレベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
【０１４３】
いくつかの態様では、本発明は、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、または非エステル化遊離脂肪酸、ＨＤＬもしくはアディプシンのレベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減する方法であって、治療有効量の本発明の化合物または医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１４４】
いくつかの態様では、本発明は、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、ＨＤＬもしくは非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減するための薬剤の調製における、本発明の組成物または医薬組成物の使用を提供する。
【０１４５】
用語「治療有効用量」は、本明細書において、治療されている疾患または障害の症状の軽減を含む、研究者、医師、または他の臨床家によって得ようとされている、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的応答または医薬の応答を誘発する、本発明の化合物、組成物、または医薬組成物の量を意味する。
【０１４６】
投与の方法および投与量
本発明の組成物の投与経路として、筋肉内、ＳＣ、または髄内注射、ならびにクモ膜下、直接心室内、ＩＶ、および腹腔内の送達を含めた非経口送達を挙げることができる。いくつかの実施形態では、投与は静脈内である。本発明の組成物は、製剤の直接注射、または注入基質、例えば、生理食塩水、Ｄ５Ｗ、乳酸化リンガー液、もしくは他の一般に使用される注入媒質などとの本発明の組成物の製剤の混合物の注入による非経口経路のいずれかを通じて投与することができる。
【０１４７】
糖尿病または糖尿病関連状態（あるいはいくつかの態様では、以下の状態の１つまたは複数：糖尿病、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、心血管疾患、高血中グルコース、低インスリンレベル、または本明細書に論じられる状態もしくは本明細書に論じられる症状と関連した状態）を有するヒトを含めた哺乳動物の治療において、治療有効量の本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体が投与される。例えば、本発明の組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇの１日のＩＶ注入として投与することができる。したがって、いくつかの実施形態では、体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約０．７５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約２．５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１０．０ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１５．０ｍｇの用量を提供する。本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体の用量は、１日に約１回〜１週間に２回、または代わりに、１週間に約１回〜１カ月に１回の間隔で投与されるべきである。いくつかの実施形態では、用量は、約．００２ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの、本発明による本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体のピーク血漿濃度を実現するように投与される。これは、適切な製剤中の投与される成分の溶液（化学の当業者に公知の任意の適当な製剤溶液を使用することができる）の滅菌注射によって実現することができる。望ましい血中レベルは、有効な分析的方法によって測定される血漿レベルによって確認される場合、本発明による本発明の組成物の持続注入によって維持することができる。
【０１４８】
個体に本発明の組成物を投与するための一方法は、個体にＦＧＦ２１−リンカーコンジュゲートを投与するステップと、これにインビボで適切な抗体の結合部位との共有結合性化合物を形成させるステップとを含む。インビボで形成する本発明の組成物の抗体部は、ＦＧＦ２１−リンカーコンジュゲートの投与の前、同時、または後に個体に投与することができる。代わりに、またはさらに、抗体は、適切な免疫原で免疫した後の個体の血液循環中に存在し得る。例えば、触媒抗体は、キャリアタンパク質にコンジュゲートした基質の反応性中間体で免疫することによって生成することができる。特に、アルドラーゼ触媒抗体は、ジケトン部分に連結したキーホールリンペットヘモシニアンを投与することによって生成することができる。
【０１４９】
したがって、組成物は、経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として、単回用量として、２回以上の用量として（これは、同じ量の所望の分子を含有していても、含有していなくてもよい）投与することができる。適切な投与量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される職務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量−応答データを使用することによって確認することができる。
【０１５０】
医薬組成物の投与経路は、公知方法によるもの、例えば、経口によるもの、ＳＣ、ＩＶ、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内の経路による注射を通じたもの；徐放システムによるもの；または移植デバイスによるものである。望まれる場合、組成物は、ボーラス注射によって、または注入により連続的に、または移植デバイスによって投与することができる。
【０１５１】
代わりに、またはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または被包された膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適当な組織または臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与を介したものとすることができる。
【０１５２】
併用療法
本発明の別の態様では、本発明の組成物は、糖尿病または糖尿病関連状態を治療し、またはインスリン分泌を増大させ、または血中グルコースレベルを減少させ、または本明細書に論じられる状態のいずれかを治療するために使用される他の治療剤と併用して使用することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、インスリン、例えば、即効型、短時間作用型、中間時間作用型、または持続型のインスリンを含めた合成ヒトインスリンなどと併用して投与することができる。他の実施形態では、本発明の組成物は、α−グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアナイド、またはチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）ファミリーに属する化合物と併用して投与することができる。本発明の組成物は、グルコキナーゼ（ＧＫ）などの代謝調節タンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）もしくはペプチド、グルコキナーゼ調節タンパク質（ＧＫＲＰ）、脱共役タンパク質２および３（ＵＣＰ２およびＵＣＰ３）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１および２（Ｇｌｐ１およびＧｌｐ２）、エキセンジン（エキセンジン−４など）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、Ｇｌｐ２ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、レプチン受容体（ＯＢ−Ｒｂ）、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、スルホニル尿素、または他のインクレチンペプチドと併用して投与することもできる。当業者は、糖尿病または糖尿病関連状態の治療に現在使用されている多種多様な作用物質が分かるはずである。
【０１５３】
糖尿病または糖尿病関連状態を治療し、インスリン分泌を増大させ、または血中グルコースレベルを減少させるために使用される他の治療剤と併用した、本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体の潜在的な治療有効性を評価するために、これらの組合せを当技術分野で公知の方法を使用して試験することができる。例えば、インスリン分泌を増大させる、本発明の組成物と別の治療剤の組合せの能力は、インビトログルコース刺激性インスリン分泌アッセイを使用して測定することができる。このようなアッセイでは、膵β細胞が、一定期間、様々な濃度のグルコースで処理され、インスリンレベルが当技術分野で公知の方法、例えば、ラジオイムノアッセイなどを使用して測定される。インスリン分泌に対する本発明の組成物と他の治療剤の効果は、対象に直接作用物質を投与し、様々な時点で体液試料中のインスリンレベルを測定することによって、インビボで測定することもできる。併用療法で使用するのに、対象に公知の治療剤を投与するための方法は、臨床医療提供者に十分に分かるであろう。
【０１５４】
投与される本発明の組成物の有効投与量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティー、および毒性のようなパラメータを扱う当業者に周知の手順を通じて決定することができる。本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体と併用して使用される治療剤の有効量は、これらの作用物質について当業者に公知の推奨用量に基づく。これらの推奨レベルまたは公知のレベルは、好ましくは、本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体と併用してこれらの投与量の有効性を試験した後、言及された投与量の１０％〜５０％下げられることになる。主治医は、毒性、骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能不全、または有害な薬物間相互作用のために投与量を下げるのに、どのようにかついつ療法を終わらせ、中断し、または調整するかが分かるはずであることに留意されるべきである。主治医は、臨床応答が不十分である場合、レベルを高めるために処置を調整することも知っているはずである（毒性を防いで）。
【０１５５】
治療有効用量は、患者における症状の寛解、または生存時間の延長をもたらすのに十分な化合物の量を指す。本発明の組成物の有効なインビトロ濃度は、ＥＣ５０を測定することによって求めることができる。インビボでのこのような作用物質の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を求めるための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性作用と治療効果の用量比は、治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことできる。大きい治療指数を示す化合物が好適である。これらの細胞培養液アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を構築するのに使用することができる。このような化合物の投与量は、ほとんどまたはまったく毒性を伴わないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形、および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変更することができる。任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養液アッセイから最初に推定することができる。ＩＣ５０（すなわち、細胞培養液中で求めた未処置対照と比較して、感染細胞からのＲＴ産生の最大半量阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現する用量を動物モデルにおいて構築することができる。このような情報を使用することによって、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。
【０１５６】
本発明の組成物が他の治療剤と併用して投与される実施形態では、作用物質の併用効果は、式：
【０１５７】
【数１】
2014500248.tif 000049
を使用して、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの多剤分析法（Ｔ．Ｃ．ＣｈｏｕおよびＰ．Ｔａｌａｌａｙ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．２２：２７〜５５（１９８４））によって計算することができ、式中、ＣＩは、併用指数であり、（Ｄｘ）１は、単独でｘパーセントの効果を生じさせるのに必要とされる薬物１の用量であり、Ｄ１は、Ｄ２と併用して、同じｘパーセントの効果を生じさせるのに必要とされる薬物１の用量である。（Ｄｘ）２および（Ｄ）２の値は、薬物２から同様に得られる。αの値は、半有効方程式（ｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）：
【０１５８】
【数２】
2014500248.tif 000050
を使用して用量効果曲線のプロットから求められ、式中、ｆａは、用量Ｄによって影響される部分であり、ｆｕは、影響されない部分であり、Ｄｍは、５０％の効果に必要とされる用量であり、ｍは、用量−効果曲線の傾きである。相互に排他的な薬物（すなわち、同様の作用機序）について、単独での薬物および半有効プロットにおけるこれらの平行線の両方。相互に非排他的な薬物（すなわち、独立した作用機序）は、半有効プロットにおいて平行線を与えることになるが、混合物では、上に凹の曲線を与えることになる。作用物質が相互に排他的である場合、αは０であり、これらが相互に非排他的である場合、αは１である。相互の非排他性を仮定して得られる値は、相互に排他的な薬物より常にわずかに大きい。１未満のＣＩ値は、相乗作用を示し、１超の値は、アンタゴニズムを示し、１に等しい値は、相加効果を示す。併用薬物効果も、Ｂｉｏｓｏｆｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）からのＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアパッケージを使用して計算することができる。
【０１５９】
本発明による化合物は、溶媒和、特に水和することができる。水和は、化合物または化合物を含む組成物を製造する間に行うことができ、または水和は、化合物の吸湿性のために経時的に起こり得る。本発明の化合物は、凍結乾燥することができる。
【０１６０】
本発明は、本発明の化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、プロドラッグ、および薬学的に許容できる塩も提供する。本発明は、本明細書に開示される配列のいずれかによる化合物も提供する。
【０１６１】
配列
【０１６２】
【表１−１】
2014500248.tif 000051
【０１６３】
【表１−２】
2014500248.tif 000052
【０１６４】
配列番号１は、Ｈ１は任意選択であり、残基１４６は、ＬまたはＰとすることができる、１８１残基の発現タンパク質を示す。コンジュゲーションについて試験される残基位置には下線が引かれ、太字である。配列番号１の番号付けは、全体を通して使用される。
【０１６５】
ヒト化３８ｃ２  ＩｇＧ１の一実施形態の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２５および２６）も示されている。可変領域（ＶＣおよびＶＨ）には下線が引かれており、相補性決定領域（ＣＤＲ）は太字で示されている。側鎖が、本明細書に記載されるリンカーと共有結合により結合するリシン９９は、ＨＣ  ＣＤＲ３に隣接する。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、およびヒト生殖系列の可変ドメインのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって定義されている。アステリスクは、ｍ３８ｃ２とｈ３８ｃ２の間またはｈ３８ｃ２とヒト生殖系列の間の差異に印をつける。
【図２】図２Ａ：Ｌ−２と比較した、リンカー−１（Ｌ−１）とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量マウス薬物動態学的試験を示す図である。若い成体の雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。すべての場合において、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３３時間のＳＣおよびＩＶ、Ｌ−２コンジュゲートについて１３〜２３時間のＳＣ、および２２〜３７時間のＩＶ）、ならびに／またはＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約１００％、Ｌ−２コンジュゲートについて４８〜５３％）に関してより良好に機能した。    図２Ｂ：Ｌ−３と比較した、リンカー−１（Ｌ−１）とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量マウス薬物動態学的試験を示す図である。若い成体の雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。すべての場合において、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３３時間のＳＣおよびＩＶ、Ｌ−３Ｌ−４コンジュゲートについて１３〜２３時間のＳＣ、および２２〜３７時間のＩＶ）、ならびに／またはＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約１００％、Ｌ−３コンジュゲートについて４８〜５３％）に関してより良好に機能した。    図２Ｃ：Ｌ−４と比較した、リンカー−１（Ｌ−１）とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量マウス薬物動態学的試験を示す図である。若い成体雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。すべての場合において、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３３時間のＳＣおよびＩＶ、Ｌ−４コンジュゲートについて１３〜２３時間のＳＣ、および２２〜３７時間のＩＶ）、ならびに／またはＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約１００％、Ｌ−４コンジュゲートについて４８〜５３％）に関してより良好に機能した。
【図３】図３Ａ：Ｌ−２と比較した、Ｌ−１とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量ラット薬物動態学的試験を示す図である。成体雄のスプラーグドーリーラットに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。両投与経路について、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３９時間のＳＣおよび約６０時間のＩＶ、Ｌ−２コンジュゲートについて約３３時間のＳＣ、および約５２時間のＩＶ）、ならびにＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約５２％、Ｌ−２コンジュゲートについて３６％）に関して、Ｌ−２コンジュゲートより良好に機能した。    図３Ｂ：Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、Ａｂ−Ｌ７−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ８−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣのＰＫの比較を示す図である。
【図４−１】図４Ａ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均グルコースＡＵＣ（ビヒクル対照の％））：ビヒクル［１００］、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［７４］）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［１０３］）（明確にするために図４Ｂに示していない）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［６６］および１ｍｇ／ｋｇ［８７］）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［１０５］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［１００］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪（ｌｅａｎ）対照［５６］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける経口糖耐性試験（ＯＧＴＴ）の間のグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４−２】図４Ｂ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均グルコースＡＵＣ（ビヒクル対照の％））：ビヒクル［１００］、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［７４］）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［１０３］）（明確にするために図４Ｂに示していない）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［６６］および１ｍｇ／ｋｇ［８７］）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［１０５］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［１００］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪対照［５６］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける経口糖耐性試験（ＯＧＴＴ）の間のグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５Ａ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均体重（ｇ）、中括弧中に平均肝重量（ｇ））：ビヒクル［２．６］｛２．４｝、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［２．５］｛２．２｝）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［３．２］｛２．４｝）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［１．７］｛２．０｝）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［２．７］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［２．６］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪対照［０．６］｛１．０｝を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間の累積体重の変化を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。    図５Ｂ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均体重（ｇ）、中括弧中に平均肝重量（ｇ））：ビヒクル［２．６］｛２．４｝、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［２．５］｛２．２｝）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［３．２］｛２．４｝）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［１．７］｛２．０｝）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［２．７］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［２．６］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪対照［０．６］｛１．０｝を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間の肝重量の変化を示す図である。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６−１】図６Ａ：単回用量（角括弧中に平均体重（ｇ））：ビヒクル［１．７］、ＦＧＦ２１ΔＨ［１．９］、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（２ｍｇ／ｋｇ［２．１］）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［１．４］）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［０．８］）、およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［０．９］）、無脂肪ビヒクル［０．６］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける累積体重変化を示す図である。ｄ０：０日目。すべてのＡｂコンジュゲートはＬ１を使用した。二元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６−２】図６Ｂ：単回用量（角括弧中に平均グルコースＡＵＣ％）：ビヒクル［１００］、ＦＧＦ２１ΔＨ［６３］、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（２ｍｇ／ｋｇ［８６］）、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｍｌ［５４］）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（１０ｍｇ／ｍｌ［５１］）、およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［５４］）、無脂肪対照［４８］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。すべてのＡｂコンジュゲートはＬ１を使用した。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。    図６Ｃ：ＦＧＦ２１ΔＨおよびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、リンカー−１とコンジュゲートさせた。ビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。    図６Ｄ：６日目にＦＧＦ２１ΔＨおよびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。ｏｂ／ｏｂ−ＰＢＳに対して＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６−３】図６Ｅ：０日目、１日目、２日目、または３日目に単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを投与された（３ｍｇ／ｋｇ）ｏｂ／ｏｂマウスにおける、６日目に行ったＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。    図６Ｆ：単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて白色脂肪組織中のＵｃｐ１発現を増大させることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。    図６Ｇ：単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて肝臓トリグリセリドを減少させることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−４】図６Ｈ：０日目、１日目、２日目、または３日目に単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける累積体重変化を示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。
【図７−１】図７Ａ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの反復投与（０日目および７日目に１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＤＩＯマウスにおける糖耐性を改善することを示す図である。ＯＧＴＴは、１０日目に行った。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。    図７Ｂ：０日目および７日目にＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを２回投与された（１０ｍｇ／ｋｇ）ＤＩＯマウスにおける累積体重変化を示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。二元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５。
【図７−２】図７Ｃ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの反復投与は、ＤＩＯマウスにおいて白色脂肪組織中のＵｃｐ１発現を増大させることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。    図７Ｄ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＤＩＯマウスにおいて血清トリグリセリドを下げることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。    図７Ｅ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＤＩＯマウスにおいて血清非エステル化脂肪酸を下げることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。
【図７−３】図７Ｆ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ肝重量。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクル（Ａ、Ｂ）に対して、およびＰＢＣ（Ｃ）に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。    図７Ｇ：ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓遺伝子発現に対するＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。ＳＣＤ１：ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ１。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。    図７Ｈ：ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓遺伝子発現に対するＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。ＭＯＧＡＴ２：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７−４】図７ｉ：ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓遺伝子発現に対するＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。ＦｏｘＡ２：フォークヘッド転写因子Ａ２。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。    図７Ｊ：１０ｍｇ／ｋｇで投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの用量関連血清レベルを示す図である。    図７Ｋ：３ｍｇ／ｋｇで投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの用量関連血清レベルを示す図である。
【図８−１】図８Ａ：高インスリン正常血糖クランプの全期間にわたる血漿グルコースレベルを示す図である。    図８Ｂ：高インスリン正常血糖クランプの全期間にわたるグルコース注入速度を示す図である。
【図８−２】図８Ｃ：基礎条件およびクランプ条件下の肝糖産生を示す図である（＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１）。
【図９−１】図９Ａ：体重に対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−２】図９Ｂ：空腹時血漿グルコースに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。    図９Ｃ：空腹時血漿インスリンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−３】図９Ｄ：空腹時血漿フルクトサミンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。    図９Ｅ：空腹時血漿グルカゴンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−４】図９Ｆ：静脈内糖耐性試験（ＩＶＧＴＴ）ΔＡＵＣグルコースに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、平均ΔＡＵＣ±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇ処置群について、統計的有意性は、ダネットの事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によってビヒクルに対して評価した。ＩＶＧＴＴ時点対ベースラインにわたる有意性は、ダネットの事後検定とともに反復測定ＡＮＯＶＡによって、ＦＧＦ２１対照タンパク質群について評価した。    図９Ｇ：ＩＶＧＴＴΔＡＵＣインスリンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、平均ΔＡＵＣ±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇ処置群について、統計的有意性は、ダネットの事後検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡによってビヒクルに対して評価した。ＩＶＧＴＴ時点対ベースラインにわたる有意性は、ダネットの事後検定とともに反復測定ＡＮＯＶＡによって、ＦＧＦ２１対照タンパク質群について評価した。
【図９−５】図９Ｈ：空腹時総血漿コレステロールに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。    図９ｉ：空腹時血漿トリグリセリドに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−６】図９Ｊ：空腹時血漿遊離脂肪酸に対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。    図９Ｋ：空腹時血漿低密度リポタンパク質コレステロールに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−７】図９Ｌ：空腹時血漿総ケトン体に対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。    図９Ｍ：空腹時血漿アディポネクチンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−８】図９Ｎ：空腹時血漿Ｃ反応性タンパク質に対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。    図９ｏ：空腹時血漿レプチンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【図９−９】図９Ｐ：空腹時血漿アディプシンに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。値は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ（対照タンパク質）についてｎ＝５、ならびにＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ  ０．１５ｍｇ／ｋｇおよびビヒクル群についてｎ＝６の平均±標準誤差を表す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、各時点における有意性は、ビヒクルに対して計算されている。ＦＧＦ２１ΔＨ群について、各時点における有意性は、ベースラインに対して計算されている。有意値は、ａ＝ｐ＜０．０５、ｂ＝ｐ＜０．０１、ｃ＝ｐ＜０．００５、およびｄ＝ｐ＜０．００１である。Ｙ軸は、ベースラインからの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１６７】
本発明の多用性は、以下の実施例によって例示されており、これらは、本発明の一般的な実施形態を例示し、特許請求の範囲または明細書を決して限定しない。
【０１６８】
（実施例１）
ＦＧＦ−２１の最適な係留部位の同定
ＦＧＦ２１を、リンカーを介して触媒抗体結合部位にコンジュゲートするための最適部位を同定するための試験を行った。２つのコンジュゲーションストラテジー、すなわち、表面リシン側鎖を通じたコンジュゲーション、および表面システイン側鎖を通じたコンジュゲーションを考察した。一般に、球状タンパク質は、その表面上に対になっていないシステイン残基を有さず、したがって、特定のコンジュゲーションのために単一部位において操作するために、タンパク質表面内の１つのシステインの組込みを使用することができる。しかし、システインを用いた表面残基の突然変異は、多くの場合、分子間二量体化、天然のジスルフィド結合の誤対合、および受容体結合に対する障害などの問題を引き起こし得る。これらの理由のために、タンパク質コンジュゲーションは、リシン残基を通じて最も一般に影響される。
【０１６９】
ＦＧＦ２１受容体の相同性モデリングおよびその活性化機構
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃおよびＦＧＦＲ４の両方に結合するが、受容体複合体は、ＦＧＦＲ１ｃを通じてのみ活性化され得る。ＦＧＦＲ１ｂとＦＧＦＲ１ｃは、８７％の同一性を共有するが（ＦＧＦＲ１ｂは、ＩＩＩｂ／ｃ代替スプライシング領域を除いてＦＧＦＲ１ｃと同一である）、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃのみを特異的に認識する。ここでは、ＦＧＦ２１−ＦＧＦＲ１ｃの複合体構造の相同性モデリングを、鋳型としてＦＧＦＲ２−ＦＧＦＲ１ｃ結晶構造を使用することによって実施した。相同性モデリングおよび構造分析のためにＭＯＥソフトウェアを使用した。受容体の活性化は、別の細胞−表面受容体、βＫｌｏｔｈｏを必要とする。βＫｌｏｔｈｏは、ヒト細胞質ゾルβ−グルコシダーゼに非常に類似した（約３５％同一）２つのドメインを有する。ヒトβＫｌｏｔｈｏ構造を、ヒト細胞質ゾルβ−グルコシダーゼを使用することによってモデル化し、ＦＧＦ２１−ＦＧＦＲ１ｃのモデル化された構造における構造を位置合わせした。このモデル化された複合体構造は、最適なリシンコンジュゲーション部位およびＦＧＦ２１中の最適なシステイン残基組込みについての合理的な指針をもたらし、これらは、ＦＧＦ２１とＦＧＦＲ１ｃの間、およびＦＧＦ２１とβＫｌｏｔｈｏの間の結合界面を遮るべきでない。
【０１７０】
コンジュゲーション部位選択のために、以下の基準を使用した。（１）残基は、可能な限り多く構造中で溶媒に曝露されるべきであり、（２）残基は、ジスルフィド結合から離れているべきであり、（３）残基は、受容体結合表面およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合表面から離れているべきである。
【０１７１】
溶媒への曝露は、アクセス可能な表面積（ＡＳＡ）に基づいて評価することができる。ＦＧＦ２１のモデル化された構造からのＡＳＡの計算は、ＣＣＰ４ソフトウェア（Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０、７６０〜７６３）および社内プログラムを用いて行った。簡単に言えば、ＣＣＰ４中のプログラムは、そのログファイルにおいて１残基当たりの平方オングストロームでの値を計算する。ＡＳＡの割合（ｆＡＳＡ）を計算するために、社内プログラムを使用することによって、１残基当たりのＡＳＡを正規化した。表１は、ＡＳＡの残基およびｆＡＳＡを示す。側鎖が表面によって覆い隠されると予測される残基は含まれない。列１は、アミノ酸名称であり、列２は、残基数であり、列３は、ＡＳＡ（平方オングストロームとして）であり、列４は、曝露される割合である。ｆＡＳＡ値は、所与のポリペプチド中のアミノ酸残基への溶媒のアクセスのしやすさを定義する。０に近いｆＡＳＡ値は、残基が溶媒にアクセス不能であることが予測されることを示し、これが、コンジュゲーションのためにリンカーにアクセス可能である可能性がより低いことを示唆する。特に可能性のある候補コンジュゲーション部位を示唆する１．００超の表面積値とともに、０．３の絶対最小ｆＡＳＡ値を使用した。
【０１７２】
ＡＳＡ分析に基づいて、Ｋ１２２（１６４．４の表面積）およびＫ５９（１１７．２の表面積）を、コンジュゲーションにとって最も有望な候補部位とみなした。Ｋ６９（表面積９１）およびＫ５６（表面積７３）も、比較による目的のためにコンジュゲートした。
【０１７３】
【表２】
2014500248.tif 000053
【０１７４】
（実施例２）
ＦＧＦ２１タンパク質および突然変異体の生成
ＦＧＦ２１  ｃＤＮＡは、ＡＴＣＣから購入した。哺乳動物発現ベクターおよび細菌発現ベクターを、それぞれ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））およびｐＥＴ２１ｂ（ＥＭＤ）を使用することによって構築した。ＦＧＦ２１の突然変異体のために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を使用して、発現ベクター中に突然変異を導入した。所望の突然変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０１７５】
哺乳動物の発現のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を使用してＦＧＦ２１の哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトし、無血清培地で増殖させた。滅菌濾過した馴化培地を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ７．５）に対して透析し、緩衝液Ａでプレ平衡化されたＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に装填した。ＦＧＦ２１タンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ７．５、および１００ｍＭのＮａＣｌ）への線形勾配を用いて溶出した。プールした画分を濃縮し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を含むセファデックス３００に装填した。得られたタンパク質溶液を濃縮し、−８０℃未満で貯蔵した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって確認した。
【０１７６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＦＧＦ２１ΔＨを生成するために、細菌発現ベクターを、宿主系統ＢＬ２１−（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））中にトランスフォームした。トランスフォーム細胞を、ＬＢ培地１リットル中で、３７℃で増殖させ、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって、発現を開始した。４時間後に細胞を回収し、−２０℃で凍結させた。凍結細胞ペーストを、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に懸濁させ、微小流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）に４回通過させた。１７，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した後、封入体（ＩＢ）含有ペレットを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５中に再懸濁させた。洗浄したＩＢスラリーを遠心分離した（３０分、１７，０００×ｇ、４℃）。このＩＢペレットを−８０℃で貯蔵した。１〜１０ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ２１で、７Ｍの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、および５０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ１０．５を用いて凍結ＩＢペレットを可溶化し、１時間撹拌することによって、タンパク質を溶解および還元した。次いで、可溶化したＩＢを、５０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ８．０中に１０倍希釈した。最終的なタンパク質濃度は、０．１〜１ｍｇ／ｍＬであった。溶液を約２日間撹拌し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５  ４リットルに対して透析した。タンパク質溶液を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清をＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に装填し、緩衝液Ａで平衡化した（上記を参照）。非結合の細菌タンパク質を、緩衝液Ａで洗浄し、ＦＧＦ２１タンパク質を、緩衝液Ｂの線形勾配を用いて溶出した。次いで、ＦＧＦ２１画分を、ＰＢＳ緩衝液でプレ平衡化されたＨｉＴｒａｐキレート化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に装填した。ＦＧＦ２１タンパク質を、ＰＢＳからＰＢＳ緩衝液と１００ｍＭのイミダゾール（ｐＨを７．４に調整した）への線形勾配を用いて溶出した。画分を収集および濃縮し（最大５０ｍｇ／ｍＬまで）、タンパク質溶液を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ｐＨ７．４）で平衡化されたサイズ排除カラム（Ｈｉｌｏａｄ２６／６０、スーパーデックス３００）に施した。精製タンパク質を０．２２μｍフィルターによって滅菌し、−８０℃で貯蔵した。培地８ＬからのＦＧＦ２１ΔＨの一般的な収量は、６００〜７００ｍｇであった。一般的な純度は、９５％超であった。一般的なエンドトキシンレベルは、約１ＥＵ／ｍｇであった。ＦＧＦ２１のシステインおよびリシンからアルギニンへの突然変異体を生成し、ＦＧＦ２１ΔＨと類似の様式で精製した。精製タンパク質の一般的な収量は、３５０〜４００ｍｇであった。遊離システインは、エルマン試薬を使用して確認した。
【０１７７】
（実施例３）
リンカー１の合成
【０１７８】
【化４８】
2014500248.tif 000054
リンカー１の合成：約３５℃で、窒素雰囲気下で、１３Ａ（例えば、約５ｇ、約２０．１ｍｍｏｌ）のメタノール（例えば、約２００ｍＬ）懸濁液に、炭素上のパラジウム（例えば、約１．０ｇ、約０．４７ｍｍｏｌ）を１回で、その後塩酸（例えば、約２．５ｍＬ、約３０．２ｍｍｏｌ）を滴下添加した。約３５℃で、溶液に水素をゆっくりとバブリングして入れ、この溶液を、その温度でおよそ約２時間撹拌した。固体をセライトのベッドに通して濾過し、収集した。濾液を減圧下で濃縮し、固体を真空下で乾燥させることによって、塩酸塩として１３Ｂを得た。化合物１３Ｂをジクロロメタン（例えば、約２００ｍＬ）および炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（例えば、約２５０ｍＬ）と混合し、ジクロロメタン層を分離した。ジクロロメタン層を飽和した塩化ナトリウム（例えば、約２５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機層を濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中約６０％の酢酸エチル）を使用して精製することによって、約６８％の収率（例えば、約２．９４ｇ）の１３Ｃを得た。１３Ｃ（例えば、約４．６５ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）、１３Ｄ（例えば、約７．００ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（例えば、約３．３ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約２．７５ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（例えば、約２００ｍＬ）溶液を、約０℃で、窒素下で５分間撹拌し、室温で約４時間撹拌した。有機層を希炭酸水素ナトリウム溶液、および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、アセトニトリル）を使用して精製することによって、リンカー１を得た（例えば、約８．２５ｇ、約７３％の収率）。
【０１７９】
（実施例４）
リンカー２の合成
【０１８０】
【化４９】
2014500248.tif 000055
シトラコン酸無水物、１４（例えば、約２．０ｍｇ、約１６．７ｍｍｏｌ）、β−アラニン、１７（例えば、約１．５ｇ、約１６．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約１０ｍＬ）溶液を、室温で約５時間撹拌した。次いで、反応溶液を約０℃に冷却し、ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約２．６ｍＬ、約１６．７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（例えば、約１．９ｇ、約１６．７ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＦ（例えば、約１０ｍＬ）溶液を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約５当量、約８３．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温に加温し、さらに約１６時間撹拌した。反応物を水中に注ぎ、１ＮのＨＣｌで酸性化し、酢酸エチル（例えば、約３×約３０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（例えば、約２×約３０ｍＬ）およびブライン（例えば、約３０ｍＬ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。所望の画分をプールし、減圧下で濃縮することによって、１７Ａを得た。
【０１８１】
化合物１７Ａ（例えば、約０．５ｇ、約２．０９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン中約１５％のトリフルオロ酢酸中で、室温で約２時間撹拌し、減圧下で濃縮して乾燥させた。遊離酸１８を、テトラヒドロフラン（例えば、約２０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（例えば、約０．２５ｇ、約２．０９ｍｍｏｌ）に添加し、その後、ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約０．３３ｍｌ、約２．０９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で約４時間撹拌した。ジイソプロピル尿素を濾別した（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｏｆｆ）。濾液を蒸発させて乾燥させた。石油エーテル（例えば、約３０ｍＬ）を残渣に添加し、粉砕し、振盪し、石油エーテル層をデカンテーションした。この手順を、石油エーテルを用いてさらに１回繰り返し、生成物１８を真空下で乾燥させた。
【０１８２】
アミン−ｐｅｇ２−ｔブチルエステル、１９（例えば、約０．５ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を、活性化された１８のＴＨＦ溶液に添加し、その後、過剰のＤＩＰＥＡ（例えば、約３当量）を添加した。この溶液を室温で最低１時間撹拌し、３４３および３９９の質量（Mass）を収集してＨＰＬＣ−ＭＳによって精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥することによって２０を収集した。残渣を、ジクロロメタン中の約１５％のトリフルオロ酢酸および数滴の水中に溶解させ、室温で約２時間撹拌した。反応物を濃縮して約１ｍｌにし、水で処理することによって生成物を沈殿させた。粗物質をＨＰＬＣ−ＭＳを使用して精製することによって２１を得た（Ｍ＋３４３）。
【０１８３】
酸２１（例えば、約６０ｍｇ、約０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（例えば、約１３７ｍｇ、約０．３６ｍｍｏｌ）、およびアニリン塩酸塩２２（例えば、約４５ｍｇ、約０．１８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約０．１４ｍｌ、約０．９０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約２ｍＬ）溶液を、室温で約３０分間撹拌し、ＨＰＬＣ−ＭＳで精製した。所望の画分をプールし、濃縮することによってＬ２（例えば、約１６ｍｇ、約０．０３ｍｍｏｌ）を収集した。
【０１８４】
（実施例５）
リンカー３の合成
【０１８５】
【化５０】
2014500248.tif 000056
シトラコン酸無水物、１４（例えば、約０．５ｇ、約１６．４ｍｍｏｌ）、アミン−ｐｅｇ２−ｔブチルエステル２３（例えば、約１．０ｇ、約４．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約１０ｍＬ）溶液を室温で約２時間撹拌した。ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約０．８ｍＬ、約５．２ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（例えば、約０．７ｇ、約６．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応物を約８０℃で約２時間加熱した。この反応物を室温まで一晩冷却させ、尿素を濾過した。濾液を水中に注ぎ、ＤＣＭで抽出した。有機層をブラインで洗浄し濃縮して油状物にした。粗生成物をアセトニトリル中約５０％の６ＮのＨＣｌ中に溶解させることによって、酸を脱保護した。生成物をＤＭＦ中に溶解させ、濾過し、ＨＰＬＣ−ＭＳを使用して精製することによって、２４（例えば、約２０８ｍｇ、約０．７ｍｍｏｌ）を収集した。
【０１８６】
マレイミド、２４（例えば、約０．１６ｇ、約０．６ｍｍｏｌ）、およびアニリン塩酸塩２２（例えば、約１５０ｍｇ、約０．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、過剰のＨＢＴＵおよびＤＩＥＡ（例えば、それぞれ約３当量超）を添加した。粗物質を、ＨＰＬＣ−ＭＳ上で約２回の注入を介して精製した。最も純粋な物質を含有する所望の画分をプールし、凍結乾燥することによって、Ｌ３（例えば、約１７．３ｍｇ、約３６．７ｍｍｏｌ）を収集した。
【０１８７】
（実施例６）
リンカー４の合成
【０１８８】
【化５１】
2014500248.tif 000057
窒素（Ｎ２）下の、シトラコン酸無水物（１４、例えば、約５１０ｍｇ、約４．５５ｍｍｏｌ）、およびｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（１３、例えば、約７１６ｍｇ、約４．５５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（例えば、ＤＭＦ、約５ｍＬ）溶液を、室温で約６時間撹拌した。反応溶液を約０℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（例えば、約１．９８ｍＬ、約１１．４ｍｍｏｌ）を添加し、その後ＤＭＦ（例えば、約３ｍＬ）中のペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸塩（例えば、約１．９６ｍＬ、約１１．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温に加温し、Ｎ２下でさらに約１６時間撹拌した。固体を濾過し、濾液を水約３０ｍＬ中に注ぎ、ジクロロメタン（例えば、約２×約３０ｍＬ）で抽出し、ジクロロメタン層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィーにより精製することによって、ペンタフルオロフェニルエステル中間体約５５０ｍｇを得た（１５、例えば、約２９％の収率）。
【０１８９】
Ｎ−メチルモルホリン（例えば、約２９０μＬ、約２．６４ｍｍｏｌ）を、ペンタフルオロフェニルエステル中間体（１５、例えば、約５５０ｍｇ、約１．３２ｍｍｏｌ）、および３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（例えば、約２９５ｍｇ、約１．３２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、例えば、約５ｍＬ）溶液に添加し、室温で約２時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をＤＭＦ中に溶解させ、分取ＨＰＬＣによって精製した。得られたｔｅｒｔ−ブチルエステル中間体を、ジクロロメタン（例えば、約４ｍＬ）中の約５０％のトリフルオロ酢酸で約３０分間処理した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製することによって、白色固体として酸中間体１６約３００ｍｇを得た（例えば、約５５％の収率；ＭＳ：４１１．２（Ｍ＋Ｈ＋））。
【０１９０】
上記酸中間体（１６、例えば、約３３ｍｇ、約０．０８ｍｍｏｌ）、１−［３−（４−アミノ−フェニル）−プロピオニル］−アゼチジン−２−オン（例えば、約１８ｍｇ、約０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（例えば、約２５ｍｇ、約０．１６ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（例えば、約６１ｍｇ、約０．１６ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルモルホリン（例えば、約４４μＬ、約０．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約１ｍＬ）溶液を、室温で約２時間撹拌した。粗混合物を分取ＨＰＬＣにより精製することによって、無色油状物としてＬ４を得た（例えば、約２２ｍｇ、４５％の収率；ＭＳ：６１１．４（ＭＨ＋））。
【０１９１】
（実施例７）
リンカー５の合成
【０１９２】
【化５２】
2014500248.tif 000058
ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約３．１１ｍＬ、約１９．８６ｍｍｏｌ、約２．９５当量）を、リンカー６（例えば、約６．６３ｇ、約２０．６９ｍｍｏｌ、約３．０７当量）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（例えば、約２．２９ｇ、約１９．８６ｍｍｏｌ、約２．９５当量）の乾燥テトラヒドロフラン（例えば、約５００ｍＬ）溶液に約０℃で添加した。混合物を約０℃で約１時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、残渣を石油エーテル（例えば、約２×約２００ｍＬ）で洗浄し、粉末を真空下で約２時間乾燥させ、後続のステップで使用した。
【０１９３】
（実施例８）
リンカー６の合成
【０１９４】
【化５３】
2014500248.tif 000059
【０１９５】
（実施例９）
リンカー７の合成
【０１９６】
【化５４】
2014500248.tif 000060
Ｉ（例えば、約４３８ｍｇ、約４．４７ｍｍｏｌ）およびＩＩ（例えば、約１．０４ｇ、約４．４７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（例えば、約２５ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下で約２．５時間撹拌した。反応物を、氷浴を使用して約０℃に冷却した。１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（例えば、約６４７ｍｇ、約５．６２ｍｍｏｌ）、およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（例えば、約１．７１ｇ、約８．９２ｍｍｏｌ）を添加し、およそ室温で一晩撹拌した。有機層をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中約７５％の酢酸エチル〜ジクロロメタン中約５％のメタノール）を使用して精製することによってＩＩＩ（例えば、約７６７ｍｇ）を得た。ＩＩＩ（例えば、約５７３ｍｇ、約１．８３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（例えば、約１５ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（例えば、約１．１６ｍＬ）中の溶液を、およそ室温で約９．５時間撹拌した。この物質を減圧下で濃縮し、真空ポンプで一晩乾燥させることによってＩＶを得た。粗製のＩＶをジクロロメタン（例えば、約１５ｍＬ）、およびジメチルホルムアミド（約２滴）中に溶解させ、塩化オキサリル（例えば、約４６５ｍｇ、約３．６６ｍｍｏｌ）とともに約２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、油状物を真空下で１時間乾燥させた。この油状物をジクロロメタン（例えば、約１５ｍＬ）中に溶解させ、１３Ｂ（例えば、約４６４ｍｇ、約１．８３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（例えば、約２．９ｍＬ、約１６．５ｍｍｏｌ）とともに、窒素下で約３０分間撹拌した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中約８５％の酢酸エチル〜約１００％の酢酸エチル）を使用して精製することによって、リンカー７を得た（例えば、約３２３ｍｇ、約３９％）。
【０１９７】
（実施例１０）
リンカー８の合成
【０１９８】
【化５５】
2014500248.tif 000061
Ｖ（例えば、約９８０ｍｇ、約１．９１ｍｍｏｌ）、１３Ｃ（例えば、約４８４ｍｇ、約１．９１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約２ｍＬ、約１１．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を、およそ室温で約６時間撹拌した。別の約１当量の１３Ｃ（例えば、約４８４ｍｇ、約１．９１ｍｍｏｌ）および約３当量のジイソプロピルエチルアミン（例えば、約１ｍＬ、約５．７３ｍｍｏｌ）を添加し、およそ室温で一晩撹拌した。この反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（約１００％酢酸エチル〜酢酸エチル中約５％のメタノール〜酢酸エチル中約１０％のメタノール）を使用して精製することによって、リンカー８を得た（例えば、約２８５ｍｇ、約２４％）。
【０１９９】
（実施例１１）
タンパク質およびリンカーのコンジュゲーション
ＦＧＦ２１変異タンパク質を、関連したリンカーと１：１０のモル比で、室温で２時間反応させた。次いで、すべてのリンカー結合ＦＧＦ２１タンパク質を、ＰＤ−１０カラムを使用して精製し、緩衝液を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に交換した。
【０２００】
（実施例１２）
タンパク質−リンカー複合体の抗体とのコンジュゲーション
すべてのリンカー結合ＦＧＦ２１タンパク質を、ｈ３８Ｃ２  ＩｇＧ１（配列番号２５および２６）（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）と６：１のモル比で、室温で一晩融合させた。タンパク質−リンカー−抗体複合体をＳＥＣによって精製した。コンジュゲーション効率は、ＬＣＭＳ分析によって確認した。
【０２０１】
（実施例１３）
タンパク質産生アッセイ
すべてのＦＧＦ２１タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。細菌によって発現されたＦＧＦ２１タンパク質は、封入体中に見出された。細胞を溶解させ、上清を除去した後、ペレットを、４℃で７Ｍの尿素、５０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ１０．５中に溶解させた。可溶化した封入体を５０ｍＭのビス−トリスプロパン、１０ｍＭの酸化型グルタチオン、ｐｈ９．０中に希釈し、２時間撹拌し、その後、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐｈ７．５に対して４℃で一晩透析した。可溶性画分をＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムによって精製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴づけた。リシン突然変異体の発現レベルは、１０〜５０ｍｇ／Ｌであった。
【０２０２】
（実施例１４）
Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイ
ｑＰＣＲ法によってＧｌｕｔ１  ｍＲＮＡ発現を測定するために、分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を使用した。一晩血清飢餓した１０〜１４日目の分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、化合物で６時間処理した。トータルＲＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｇｌｕｔ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用し、Ｔａｑｍａｎ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））で定量的リアルタイムＰＣＲ反応を実行して測定した。化合物の生物活性は、各試料からのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルによって正規化されたＧｌｕｔ１  ｍＲＮＡレベルの倍率変化によって判定した。化合物の効力の測定としてのＥＣ５０値を、アッセイにおける用量応答曲線から得た。
【０２０３】
（実施例１５）
グルコース取込みアッセイ
分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、血清の非存在下で、化合物で２４時間処理した。次いで細胞を１４Ｃ−２−デオキシグルコースとともに１時間インキュベートし、細胞内へのグルコース取込みを、Ｗａｌｌａｃ  １４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（Ｔｒｉｌｕｘ）機器で定量化した。グルコース取込みは、１分当たりのカウント（ＣＰＭ）で表した。化合物の効力の測定としてのＥＣ５０値を、アッセイにおける用量応答曲線から得た。
【０２０４】
（実施例１６）
マウスの薬物動態
ＦＧＦ２１抗体コンジュゲートのＰＫを、ＩＶまたはＳＣ投与後のマウスにおいて検査した。抗体コンジュゲートを若い成体雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２０〜２５ｇ）に注射し、血液試料を、投薬後５分〜１２０時間の時点で得た。血清中の抗体コンジュゲート濃度は、ＥＬＩＳＡを使用して求め、ＥＬＩＳＡは、９６ウェルプレートに結合したモノクローナル抗−ｈＦＧＦ２１抗体を通じて、抗体コンジュゲートのＦＧＦ２１部を捕捉した。プレートに結合したＦＧＦ２１抗体コンジュゲートは、抗ｈＦｃモノクローナル抗体を通じて検出し、濃度は、血清含有アッセイ緩衝液中に希釈されたＰＫ投薬溶液（ＰＫ  ｄｏｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の検量線を使用して求めた。ＳＣバイオアベイラビリティーは、ＳＣ血清濃度プロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）をＩＶ血清濃度プロファイルのＡＵＣで除した比として計算した。
【０２０５】
（実施例１７）
マウスでの効力
ＦＧＦ２１抗体コンジュゲートの効力を、２つのマウス肥満インスリン耐性モデル、すなわち、ｏｂ／ｏｂマウスおよび高脂肪食誘発肥満マウスにおいて評価した。両モデルについて、雄マウス（ｏｂ／ｏｂについて生後６〜８週間、年齢生後６週間で高脂肪食を開始したＤＩＯについて生後１２〜１４週間）を、２〜４／ケージで収容し、ＦＧＦ２１抗体コンジュゲートをＳＣ注射によって投与した。毎日午前中に体重を測定した。糖耐性を、経口ブドウ糖負荷試験によって評価した。簡単に言えば、マウスに、試験日の午前中４〜５時間絶食させた。基礎血液試料を得、血中グルコースレベルを、携帯型グルコメーターを使用して求めた。基礎試料の後、グルコースを経口強制飼養によって投与し、血液試料を、その１５〜１２０分後に抜き取った。糖耐性を、基礎時点から１２０分の時点までのＡＵＣとして計算した。
【０２０６】
（実施例１８）
Ｋ５６  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒ（配列番号１８）を上述したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があることが判明した（ＥＣ５０＝０．９ｎＭ；ｎ＝２）。グルコース取込みは、５．５ｎＭであることが示された。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒを、記載したようにＫ５６においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６は、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力を保持し（ＥＣ５０＝１．９ｎＭ；ｎ＝１）、１７時間のＩＶ半減期および１３時間のＳＣ半減期を示した。バイオアベイラビリティーは６６％であった。
【０２０７】
（実施例１９）
Ｋ５９  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒ（配列番号１９）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝０．６  ｎＭ；ｎ＝１）。グルコース取込みは、０．９ｎＭであった。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒを、Ｋ５９においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９は、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいてインビトロでの効力を保持し（ＥＣ５０＝６．５ｎＭ；ｎ＝２）、１３時間のＩＶ半減期を示した。
【０２０８】
（実施例２０）
Ｋ６９  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ６９の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９−Ｋ１２２Ｒ（配列番号２０）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９−Ｋ１２２Ｒは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイ（ＥＣ５０＝１．３ｎＭ；ｎ＝１）およびグルコース取込みアッセイ（ＥＣ５０＝５．２ｎＭ）の両方において効力があることが判明した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９−Ｋ１２２Ｒを、Ｋ６９においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ６９を形成した。
【０２０９】
（実施例２１）
Ｋ１２２  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ１２２の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２（配列番号２１）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２は、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイ（ＥＣ５０＝２．６ｎＭ；ｎ＝２）およびグルコース取込みアッセイ（ＥＣ５０＝１．７ｎＭ）の両方において効力があった。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２を、Ｋ１２２においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ１２２を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ１２２は、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝１．６ｎＭ；ｎ＝２）、１６時間のＩＶ半減期および１４時間のＳＣ半減期を示した。バイオアベイラビリティーは、４０％であった。
【０２１０】
（実施例２２）
Ｋ−ヌル−Ｐ２  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２（配列番号２２）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２は、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝１．２ｎＭ；ｎ＝２）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２を、Ｐ２のＮ’末端においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２は、インビトロでの効力の低減（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝１６．６ｎＭ；ｎ＝１）、および１７時間のＩＶ半減期を示した。
【０２１１】
（実施例２３）
Ｋヌル−Ｈ１Ｋ  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（配列番号２３）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝６．４ｎＭ；ｎ＝２）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋを、Ｈ１ＫにおいてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＫ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋを形成した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝４．３ｎＭ；ｎ＝２）、１６時間のＩＶ半減期、１１時間のＳＣ半減期、および５１％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した。
【０２１２】
（実施例２４）
Ｋ−ヌル−Ｓ１８１Ｋ  Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋ（配列番号２４）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝７．５ｎＭ；ｎ＝２）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋを、Ｓ１８１ＫにおいてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋを形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋは、インビトロでの効力の喪失を示した（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０≧５００ｎＭ；ｎ＝２）。
【０２１３】
（実施例２５）
リシン突然変異体の活性の結果の要約
すべてのリシン突然変異タンパク質は、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性であった。コンジュゲートさせたとき、コンジュゲートの大部分（Ｋ５６、Ｋ５９、Ｋ１２２、Ｋヌル−Ｈ１Ｋ）は、Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性を保持し、ＥＣ５０値は、天然ＦＧＦ２１タンパク質のＥＣ５０値と同様であった。Ｋヌル−Ｐ２コンジュゲートは、初期効力のいくらかの低減を示し、Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋコンジュゲートは、Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性の喪失を示した。
【０２１４】
（実施例２６）
システイン−マレイミドコンジュゲーションを使用する、ＦＧＦ２１上の最適な係留部位の同定
連結残基としてシステイン置換突然変異を導入する際の課題の１つは、システイン残基は、それ自体他の残基と接触し、かつ／または塩橋もしくは水素結合を形成する場合があることである。モデル化された構造を使用して原子レベルの距離を予測することは困難であり得るが、いくつかの残基を、ＦＧＦＲ１ｃ結合部位およびβＫｌｏｔｈｏ結合部位から遠位に位置される潜在性に基づいて選択した：Ｈｉｓ１、Ｔｈｒ４０、Ａｓｐ７９、Ｌｅｕ８６、Ｈｉｓ１２５、およびＡｌａ１２９。
【０２１５】
６つすべての残基は、構造要素（ターンおよびループ）、アクセス可能な表面積（ＡＳＡ）、ならびに環境の形状（凸面および凹面）に関して互いに異なっており、すべてをＦＧＦＲ１ｃ相互作用に対してタンパク質の反対側でモデル化した（表２）。特に、Ｈｉｓ１、Ａｓｐ７９、Ｌｅｕ８６、およびＨｉｓ１２５は、これらの部位に伴った高ＡＳＡ値のために、潜在的に魅力的なコンジュゲーション部位であると同定された。
【０２１６】
【表３】
2014500248.tif 000062
【０２１７】
（実施例２７）
Ｈ１Ｃ  ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１Ｃ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１Ｃ（配列番号１６）を生成し、発現させた。しかし、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１Ｃ突然変異体は、Ｎ’システイン基を欠いており、したがって、この突然変異体の調査を中止した。
【０２１８】
（実施例２８）
Ｔ４０Ｃ  ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｔ４０Ｃ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｔ４０Ｃ（配列番号１５）の生成により、重要な課題が示された。４０位におけるトレオニンのシステイン突然変異は、再折りたたみ後に、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてＦＧＦ２１ΔＨ−Ｔ４０Ｃの複数の化学種を生じさせた。グルタチオンを付加して、および付加しないで、タンパク質の濃度およびｐＨを変更することによって、再折りたたみプロセスを改善するためのさらなる試みを行った。再折りたたみプロセスは、ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。グルタチオンを付加すると、Ｔ４０Ｃの再折りたたみが効率的になるが、グルタチオンは、最も確実には、４０位における導入されたシステインを通じて、ＦＧＦ２１上で結合されることが判明した。グルタチオン付加体は、野生型ＦＧＦ２１ΔＨと同じ生物活性を示し、４０位は、ＦＧＦ２１による受容体活性化に関与していないことを示した。
【０２１９】
（実施例２９）
Ｄ７９Ｃ  Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（配列番号１２）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝２．１ｎＭ；ｎ＝４）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを、Ｄ７９ＣにおいてＬ１と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを形成した。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝３．７ｎＭ；ｎ＝３）、１７時間および１９時間のＩＶ半減期（ｎ＝２）、２０時間および２０時間のＳＣ半減期（ｎ＝２）、および５５％および７０％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した（ｎ＝２）。
【０２２０】
（実施例３０）
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの安定性アッセイ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ突然変異タンパク質を、上述したように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生成し、精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを培養液１Ｌから発現させた。１５０ｍｇの封入体を得、８５ｍｇの精製タンパク質を得、６０％の収率に相当した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣおよびＦＧＦ２１ΔＨ（配列番号２）の安定性を試験するために、新たに解凍した試料を７日にわたって４℃に保持し、０日目、３日目、および７日目に、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ＿ＨＰＬＣ、Ｅｌｌｍａｎアッセイ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってこれらの完全性について検査した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、中性のｐＨ７．４で安定であることが判明し、４℃で７日間インキュベートした後でさえ、わずかな量のＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃしか酸化および二量体化されないと考えられ、一方、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの半分超が、４℃で３日間インキュベートした後、ｐＨ６．０で酸化された。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、および２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）は、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの安定性の有意な差を生じなかった。
【０２２１】
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの遊離システインがｐＨ６．０よりｐＨ７．４においてより安定であった理由は明らかでない。ＷＴ  ＦＧＦ２１の計算された等電点（ｐＩ）は、５．４３であり（ｅ．ｅ．、ＦＧＦ２１−Ｈ１−Ｐ１４６）、ＦＧＦ２１ΔＨのｐＩは５．２７であり、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣのｐＩは５．４７であった。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの溶解度がｐＨ６．０で低減され得る可能性がある。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの安定性を、複数の凍結／解凍サイクルで検査した。タンパク質を９回繰り返して凍結（−８０℃）および解凍（４℃）させた。いずれの試料も、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびＥｌｌｍａｎアッセイにおいてサイクル１とサイクル９の間でまったく差を示さなかった。結論として、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、−８０℃より４℃において著しく不安定であると考えられた。
【０２２２】
（実施例３１）
Ｌ８６Ｃ  ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｌ８６Ｃ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｌ８６Ｃ（配列番号１４）を記載したように生成および精製した。ほとんどの疎水性残基は、タンパク質コア内に埋もれているが、一部の残基は、溶媒に曝露され、これがタンパク質の不溶性の原因となり得る。Ｌｅｕ８６は疎水性残基であり、ＦＧＦ２１のモデル化された構造において、溶媒に曝露されているようである。突然変異Ｌ８６Ｃは、溶解度の利点をもたらし得るとみなした。
【０２２３】
Ｌ８６Ｃ突然変異は、非効率な再折りたたみ、および低いタンパク質収率をもたらした。グルタチオンを付加すると、Ｌ８６Ｃの再折りたたみが効率的になったが、１つを超えるグルタチオンが、最も確実には、導入されたＣ８６および天然システイン残基を通じて１つのＦＧＦ２１分子上に結合されていることが判明した。グルタチオン付加体は、生物活性の約１０分の１の低減を示し、したがって、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｌ８６Ｃの調査を中止した。
【０２２４】
（実施例３２）
Ｈ１２５Ｃ  Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（配列番号７）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝１．２ｎＭ；ｎ＝３）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃを、Ｈ１２５ＣにおいてＬ１と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃを形成した。コンジュゲートされたとき、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝３．２ｎＭ；ｎ＝４）、３７時間のＩＶ半減期、３２時間のＳＣ半減期、および６７％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した。
【０２２５】
（実施例３３）
Ａ１２９Ｃ  Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（配列番号１０）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝１．４ｎＭ；ｎ＝６）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを、Ａ１２９ＣにおいてＬ１と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを形成した。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１  ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝２．７ｎＭ；ｎ＝７）、３３時間のＩＶ半減期、３７時間のＳＣ半減期、および６９％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した（マウスにおいて）。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、６０時間のラットにおけるＩＶ半減期、３９時間のラットにおけるＳＣ半減期、および５２％のラットにおけるＳＣバイオアベイラビリティーを示した。サルにおいて、ＩＶ半減期は６５時間であり、ＳＣ半減期は４８時間であり、ＳＣバイオアベイラビリティーは６８％であった。
【０２２６】
（実施例３４）
エンドトキシン純度の改善
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣおよびＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵培養よって生成した。エンドトキシンレベルを低減するために、エンドトキシンレベルを１０ＥＵ／ｍｌから０．１ＥＵ／ｍＬに低減した最初のＱの後に、追加のＱステップを利用した。精製プロトコールを以下のように改変した。ＩＢ約１０ｇを培地１Ｌから得、７Ｍの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＢＴＰ（ビス−トリスプロパン）ｐＨ１０．５  ４０ｍＬで可溶化した（１〜２時間）。ＦＧＦ２１タンパク質の還元をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。可溶化タンパク質を、５０ｍＭのＢＴＰ、ｐＨ８．０  ４００ｍＬ中に希釈することによって再折りたたみさせた（２４〜３６時間）。ＦＧＦ２１の天然ジスルフィド結合の酸化をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。再折りたたみがほとんど完了した後、溶液を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５  ４Ｌに対して２回透析した。未可溶化タンパク質を、２０，０００×ｇで６０分間、４℃で遠心分離することによって沈殿させた。上清をＨｉｔｒａｐ  Ｑ  ＦＦ上に装填し、０〜２００ｍＭのＮａＣｌの勾配（２０ＣＶ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）を用いてＦＧＦ２１タンパク質を溶出した。収集画分を、０〜１００ｍＭのイミダゾールの勾配（１０ＣＶ、０．０１ｍＭのＴＣＥＰ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を伴ったＨｉｔｒａｐ  Ｎｉ−ＮＴＡ  ＦＦ上に装填することによって、残留ＤＮＡを効率的に除去した。所望の画分を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５  ４Ｌに対して２回透析し、０〜１００ｍＭのＮａＣｌの勾配（２０ＣＶ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を伴ったＨｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  カラム上に装填して溶出した。精製タンパク質画分を収集し、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、−８０℃で貯蔵した。
【０２２７】
培地１Ｌからの一般的な収量は、約３５０〜約４００ｍｇであった。精製タンパク質の一般的な収量は、約２２０〜約２８０ｍｇであった。この精製技法により、９５％超の純度、および約１ＥＵ／ｍｇの一般的なエンドトキシンレベルを有するタンパク質を得た。振盪フラスコの代わりに発酵槽を使用すると、収量が約４〜約５倍改善した。
【０２２８】
（実施例３５）
リンカーの選択
以下のＬ１のマレイミド環は、経時的に開環およびその後の生成物分解に感受性である場合があることが公知である（Ｗｏｏｄｎｕｔｔ，Ｇ；ＩＢＣ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、「Ｂｅｙｏｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、２００９年９月２１〜２３日）。
【０２２９】
Ｌ１などのマレイミドリンカーは、スキーム１に示したように、チオールと反応してマレイミド部分とのチオール付加体を形成し得る。チオールのマレイミドへのこの付加反応は、マイケル反応と呼ばれる。その後、アミンを含有する基（抗体ｈ３８Ｃ２など）が、スキーム１に示したようにＡＺＤ（β−ラクタム）と反応することによって６を生じ得る。得られるチオール−スクシンイミド付加体は安定である。しかし、スクシンイミド環は、ゆっくりとした加水分解性開裂を経時的に起こし、７および／または８をもたらす場合がある。したがって、マイケル反応を起こすその能力を保存しつつ、加水分解性開裂に対する安定性が改善したマレイミド環を有することが望ましい。
【０２３０】
【化５６】
2014500248.tif 000063
【０２３１】
（実施例３６）
マレイミドの修飾
したがって、より安定なリンカーを、マレイミド環を修飾することによって生成することができるという予想とともに、Ｌ１中のマレイミド環の安定性を検査した。水によるマレイミド環の潜在的な加水分解性開裂を遅延させるために、３つの異なる手法（Ｌ２〜Ｌ４）を採用することによって環を修飾し、安定性を改善した。
【０２３２】
【化５７】
2014500248.tif 000064
【０２３３】
最初に、環に結合した小さいアルキル基は、スクシンイミド環の加水分解性開裂を遅延させ得ると想定した。スクシンイミド環上にメチル基を有するリンカー２を調製した。環が加水分解性開裂を起こすために、水分子がカルボニル基に付加し、遷移状態として四面体中間体を形成する。メチル基が存在すると、四面体中間体の形成が立体的かつ電子的に制限され、加水分解速度が相当に遅延するはずである。
【０２３４】
第２の修飾は、マレイミド環のカルボニル基のすぐ近くにおけるプロピオンアミドカルボニル基に目を向けた。カルボニル基は一般に、水を引きつける。マレイミド環にごく接近してカルボニル基があると、水を引きつけることが助長され、マレイミド環のカルボニル基上の攻撃が促進される。プロピオンアミドカルボニル基を除去することによって、加水分解性開環反応が遅延される。この修飾は、Ｌ３において見られる。
【０２３５】
第３の修飾は、Ｌ４において見られるように、プロピオンアミド基の代わりにシクロヘキシルメチレン基を導入することであった。シクロヘキシル環のかさ高い疎水性は、環が開いた加水分解性開裂に必要とされる、環のカルボニル基への水の付加による四面体中間体の形成に対して、電子的および立体的の両方で妨害する。これにより、加水分解性開裂が遅延されることが予想された。
【０２３６】
安定性試験
安定性試験のために、リンカーＬ１〜Ｌ４から１−（３−（４−アミノフェニル）プロパノイル）アゼチジン−２−オン部を除去した。マレイミドが３アミノ酸ペプチドのグルタチオンとコンジュゲートした４つの試験化合物（３０〜３３）を作製した。
【０２３７】
（実施例３７）
化合物３０の合成
３−（２−（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）−エトキシ）エトキシ）プロパン酸（１６４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（１５４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（５ｍＬ）溶液を、室温で１７時間撹拌した。酢酸エチル（２５ｍＬ）をこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３０  ２５２ｍｇを得た。
【０２３８】
【化５８】
2014500248.tif 000065
【０２３９】
（実施例３８）
化合物３１の合成
３−（２−（２−（３−（３−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（４２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（３７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（１．２ｍＬ）溶液を、室温で２２時間撹拌した。エーテル（１０ｍＬ）中５０％の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３１  ６７ｍｇを得た。
【０２４０】
【化５９】
2014500248.tif 000066
【０２４１】
（実施例３９）
化合物３２の合成
３−（２−（２−（３−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（６１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（２ｍＬ）溶液を、室温で２５時間撹拌した。エーテル（３０ｍＬ）中６５％の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３２  ９２ｍｇを得た。
【０２４２】
【化６０】
2014500248.tif 000067
【０２４３】
（実施例４０）
化合物３３の合成
３−（２−（２−（４−（（３−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）シクロヘキサンカルボキサミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（３７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（１．２ｍＬ）溶液を、室温で２２時間撹拌した。エーテル（１０ｍＬ）中５０％の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３３  ７５ｍｇを得た。
【０２４４】
【化６１】
2014500248.tif 000068
【０２４５】
（実施例４１）
化合物３０〜３３の安定性試験
【０２４６】
【化６２】
2014500248.tif 000069
【０２４７】
化合物３０、３１、３２、および３３を、開環生成物の形成およびグルタチオン開裂についてＬＣ−ＭＳでモニターした。これらの新規類似体を、４０℃でｐＨ＝６．５の緩衝液、４０℃でｐＨ＝７．５の緩衝液、および４℃でｐＨ＝７．５の緩衝液で、すべて２週間の期間にわたって、これらの安定性について検査した（表３Ａ〜Ｃ）。
【０２４８】
化合物３０、３１、３２、および３３を室温で緩衝液中に溶解させた。試料を４０℃でインキュベートし、緩衝液を設定間隔で分析した。規定間隔で、緩衝液１０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析計に注入して分析した。カラムからの溶離液を、２１０ｎｍおよび２５４ｎｍでＵＶ分光計を使用し、質量分析計も使用してモニターした。加水分解副生成物を、質量分析計を使用してモニターし、加水分解率を特定の質量の全イオン電流に基づいて計算した。
【０２４９】
表３Ａ〜３Ｃ中の％加水分解を示すＬＣ−ＭＳデータから、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４（３１〜３３）の修飾されたマレイミド環は、Ｌ１（３０）中のマレイミド環と比較して、４０℃でｐＨ＝６．５において５〜１０倍より安定であり、４０℃でｐＨ＝７．５の緩衝液で４〜１５倍より安定であり、４℃でｐＨ＝７．５の緩衝液で最大２０倍より安定であることが明白であった。グルタチオンコンジュゲーションの結果（表３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ中のデータを含む）は、ＩＢＣ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、「Ｂｅｙｏｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、２００９年９月２１〜２３日において論じられた。
【０２５０】
【表４】
2014500248.tif 000070
【０２５１】
【表５】
2014500248.tif 000071
【０２５２】
【表６】
2014500248.tif 000072
【０２５３】
（実施例４２）
ＦＧＦ２１にコンジュゲートされたリンカーＬ１〜Ｌ４の安定性
ＦＧＦ２１にコンジュゲートした後の４つのリンカーの２週間にわたる化学的安定性を調査するために、以下の実験を実施した。各リンカーをＦＧＦ２１にコンジュゲートさせ、＋４℃の貯蔵条件に置き、特定の時点でアリコートを取り出し、凍結させることによって急冷し、リンカーの安定性をＬＣＭＳ分析によってモニターした。
【０２５４】
４つのリンカーを、凍結乾燥ストック材料からＤＭＳＯ中に溶解させた。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質を０．１ｍＭのＴＣＥＰを用いて部分的に３０分間還元した後、１：１のリンカー：タンパク質比でリンカーストックを付加した。コンジュゲーション反応におけるＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。Ｌ１は、３０分間タンパク質と反応させ、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、２時間反応させた。コンジュゲーション反応は、サイズ排除樹脂を通じて過剰のリンカーを除去することによって停止させた。コンジュゲートされたＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質を、安定性試験のために＋４℃に置いた。ｔ＝０（安定性試験の前）、ならびにｔ＝１日、３日、８日、および１４日にアリコートを取り出した。リンカー安定性の分析を、ＬＣ−ＭＳ分析によって実施することによって、未コンジュゲートタンパク質、タンパク質＋リンカーコンジュゲーション、ならびにコンジュゲートされたタンパク質＋リンカーの１回および２回の加水分解事象の相対量を判定した。
【０２５５】
リンカーの加水分解は、本実験において極めて重要な分析的変量である。加水分解は、ＦＧＦ２１−リンカー複合体へのＨ２Ｏの後続の付加を観察することによってモニターした。Ｈ２Ｏの１つの付加、＋（１）Ｈ２Ｏは、４つすべてのリンカー上に存在する活性なＡＺＤ基の加水分解を示す可能性が高い。第２のＨ２Ｏ分子の付加、＋（２）Ｈ２Ｏは、リンカー中の加水分解（例えば、化学的不安定性）の強い指標である。Ｌ１は、マレイミド官能基が存在するので特に感受性である。
【０２５６】
以下の表４中の実験結果は、Ｌ１が＋（２）Ｈ２Ｏの最大の増加を起こすことを実証する。ｔ＝０において、Ｌ１〜Ｌ４のそれぞれは、測定される全タンパク質の６〜８％の間の＋（２）Ｈ２Ｏの測定値を有していた。２週間の間、これらの試料をモニターし、Ｌ１において観察された＋（２）Ｈ２Ｏは、１８％まで増加した一方で、残りのリンカーＬ２〜Ｌ４のそれぞれの値は、６〜８％で一定であった。このデータは、Ｌ１がＬ２〜Ｌ４と比較して相対的に不安定であることを示唆する。
【０２５７】
【表７】
2014500248.tif 000073
【０２５８】
（実施例４３）
Ｌ１〜Ｌ４とコンジュゲートされたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ
Ｌ２〜Ｌ４は、様々な条件（表３Ａ〜Ｃを参照）下でのグルタチオンコンジュゲーション、およびＦＧＦ２１（表４）を用いて、Ｌ１より安定であることが先に示された。修飾されたマレイミドリンカーＬ２〜Ｌ４は、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃと融合させ（表５に示したコンジュゲーション効率）、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性を示した（表５）：ＥＣ５０値は、ＦＧＦ２１ΔＨについての相対値に対して正規化されている）。
【０２５９】
【表８】
2014500248.tif 000074
【０２６０】
しかし、前述の意に反して、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ３−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ４−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、それぞれ、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃよりインビボで不安定であった。これは、ＩＶ投薬後の血液循環中のより低い維持レベル、ならびにＳＣ投薬後の血液循環中のより低いピークおよび維持レベルとして明白であった（図２Ａ〜Ｃ、表６）。意外にも、これらの結果は、緩衝系において小ペプチドに融合されたリンカーを用いて行った安定性試験の結果と逆になった。
【０２６１】
【表９】
2014500248.tif 000075
【０２６２】
これらの結果は、マウス血清中での追加の試験において裏付けられた。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４のそれぞれを使用してｈ３８Ｃ２にコンジュゲートさせた。各試料をマウス血清中で希釈して０．３ｍｇ／ｍｌにし、３７℃でインキュベートした後凍結させ、その後２ＤＬＣ／ＭＳによって分析した。参照標準と比較して、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、５分後に１４９％、３４時間後に６６％、７２時間後に８１％で検出され、１２０時間までに検出不可能であった。対照的に、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ３−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ４−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、すべての試料中で検出不可能であった。
【０２６３】
（実施例４４）
Ｌ１＆Ｌ２とコンジュゲートされたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃのラット試験
ＦＧＦ２１タンパク質を抗体骨格にコンジュゲートさせるのに使用したリンカーが異なる２つのバージョンのＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの単回用量薬物動態（ＰＫ）を、雄のスプラーグドーリーラットにおいて求めた。ラットにＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（マレイミドリンカー）またはＡｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（メチルマレイミドリンカー）をＩＶまたはＳＣ投与し（３ｍｇ／ｋｇ）、投与して５分後〜１４日後の期間で血液試料を抜き取った。血清Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣレベルをＥＬＩＳＡによって判定し、ＥＬＩＳＡにおいて、ＦＧＦ２１コンジュゲートは、ＦＧＦ２１に特異的なモノクローナル抗体を介して捕捉し、抗ヒトＦｃによって検出した。得られたＰＫデータは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃコンジュゲートは、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃコンジュゲート（Ｔ１／２：ＩＶ＝５２時間、ＳＣ＝３３時間；ＳＣバイオアベイラビリティー＝３６％）と比較すると、優れたＰＫ特性（Ｔ１／２：ＩＶ＝６０時間、ＳＣ＝３８時間；ＳＣバイオアベイラビリティー＝５２％）を有することを実証した（図３Ａおよび表７）。これらの結果は、小ペプチドに融合されたこれらのリンカーを用いて緩衝系において行った安定性試験の結果を考慮すると予想されなかった。
【０２６４】
【表１０】
2014500248.tif 000076
【０２６５】
（実施例４５）
Ｇｌｕｔ１  ＲＮＡに対するＬ１およびＬ２を用いたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果
８日目に、２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、カタログ番号３５３０４７）中に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を播種し、ＤＭＥＭ完全培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のＰ／Ｓ）中で、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。０．２％のＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で一晩細胞を飢餓にし（１２日目）、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣおよびＡｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いて、０．２％のＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ中で、３７℃で６時間処理した。培地を吸引し、次いで、製造者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ分光光度計を使用してＡ２６０ｎｍでＲＮＡを測定した。
【０２６６】
【表１１】
2014500248.tif 000077
【０２６７】
ＦＧＦ２１ΔＨ、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃによって３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を刺激すると、用量依存的にＧｌｕｔ１が誘導された。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃより効力があると考えられた（表８）。
【０２６８】
（実施例４６）
リンカー長試験
リンカー長のトレランスを評価するために、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、Ａｂ−Ｌ７−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ８−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを互いに試験した。すべてが、細胞ベースアッセイにおいて同様のＰＫ（図３Ｂおよび表９）ならびに同等の効力（データを示さず）を示した。
【０２６９】
【表１２】
2014500248.tif 000078
【０２７０】
（実施例４７）
残基位置およびリンカー選択の要約
Ｈ１Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｌ８６Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、およびＡ１２９Ｃを、チオール−マレイミドコンジュゲーションストラテジーを使用して、潜在的なコンジュゲーション部位として試験した。これらのうちで、Ｈ１Ｃ、Ｔ４０Ｃ、およびＬ８６Ｃは、発現および再折りたたみに問題を示した。Ｄ７９Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、およびＡ１２９Ｃは、すべてが許容できるレベルのタンパク質生成を示し、未コンジュゲート突然変異タンパク質は、効力があるままであることを実証したので、さらに探求した。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ、およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＦＧＦ２１ΔＨと同様の生物活性を示し、これらの位置での抗体のコンジュゲーションは、受容体結合を妨害しないことを示唆した。Ｄ７９Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、およびＡ１２９Ｃは、ＦＧＦ２１ΔＨと同様の安定性および生物活性を有する。
【０２７１】
試験したすべてのリシン突然変異体抗体コンジュゲートは、Ｈ１２５ＣおよびＡ１２９Ｃ抗体コンジュゲートより劣ったマウスのＰＫを示し、ＩＶ半減期は１３〜１７時間であった（表１０）。
【０２７２】
【表１３】
2014500248.tif 000079
【０２７３】
Ａｌａ１２９は、溶媒にそれほど曝露されておらず、Ｄ７９またはＨ１２５より溶媒に曝露されていないが、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、意外にも、最も安定な突然変異体および抗体コンジュゲーションついて試験した最良の位置の１つであった。これは、突然変異が非保存的であるので予期されなかった。理論によって束縛されることを望まないが、Ａ１２９Ｃにおいてコンジュゲートすることの独特の適性についていくつかの可能な理由が存在する。第１に、Ａｌａ１２９およびＨｉｓ１２５はともに、ＦＧＦ２１のモデル化された構造において柔軟であるループ領域内に位置する。これらの領域は通常、他のヘパリン結合ＦＧＦメンバーのためのヘパリン結合部位である。ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３は、ヘパリンと相互作用しないので、この領域の配列忠実度を維持することは、これらの生物学的機能にとって極めて重要ではない場合がある。この位置の柔軟性は、受容体結合の妨害を回避するための抗体−コンジュゲーションにとって有利となり得る。第２に、Ａｌａ１２９は、正に帯電した残基、すなわち、Ｈｉｓ１２５、Ａｒｇ１２６、Ａｒｇ１３１、およびＡｒｇ１３５によって囲繞されている。この正に帯電したパッチは、強い帯電反発のためにＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣのＳＳ−二量体化を回避することができる。第３に、これらの帯電残基は、マレイミドリンカーＬ１の安定化を促進することができ、これは、これらが存在しない場合、マレイミドを開環した後にカルボキシレートを生成し得る。したがって、マレイミド連結ストラテジーを使用してＦＧＦ２１をコンジュゲートする場合、Ａ１２９の特定の残基位置で連結することは、特に有利であると考えられる。
【０２７４】
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣならびにＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃはともに、マウスモデルにおいて少なくとも３０時間の高いＩＶ半減期およびＳＣ半減期、ならびに良好なバイオアベイラビリティーを示す。両コンジュゲートは、Ｇｌｕｔ１  Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて４ｎＭ未満の効力を実証する。一般に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃと比較してわずかに改善された半減期および効力を示す。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣにおいてＬ１を使用することはまた、インビトロ試験が示唆したものに対して意外なインビボでの利点を示し、試験したリンカーと比較して、全体的に最も有利なリンカーであると考えられた。
【０２７５】
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの構成要素（抗体、リンカー、連結残基位置、連結残基、タンパク質）の特定の組合せは、半減期、バイオアベイラビリティー、効力、活性、生成の容易さ、および複数の選択肢と比較した加水分解に対する耐性において最適条件をもたらすと考えられる。
【０２７６】
（実施例４８）
化合物の効力
化合物Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋで処置したｏｂ／ｏｂマウスにおいて糖耐性について試験した。両化合物は、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（図４Ａおよび４Ｂ）およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（図５Ａおよび５Ｂ）より劣っていた。対照的に、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣおよびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃは、糖耐性を改善し、体重増加を低減することが示された（図４Ａ、４Ｂ、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、および表１１）。
【０２７７】
【表１４】
2014500248.tif 000080
【０２７８】
Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、糖耐性を改善することが判明し、白色脂肪組織（ＷＡＴ）内でのＵｃｐ１発現の増大によって証明されるエネルギー消費量の増大により体重増加を低減し、肝脂肪変性を逆行させる（図６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、および表１２）。Ｕｃｐ１発現について、インビボでの効力試験から収集した凍結内臓ＷＡＴ試料をホモジナイズした。トータルＲＮＡを組織ホモジネートから抽出し、Ｇｌｕｔ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用し、Ｔａｑｍａｎ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的リアルタイムＰＣＲ反応を実行して測定した。各試料からのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルによって正規化されたＧｌｕｔ１  ｍＲＮＡレベルの倍率変化によって、処置の効果を判定した。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＷＡＴ内でのＵｃｐ１発現の増大、ＤＩＯマウスにおける血清トリグリセリドレベルおよび脂肪酸レベルの低減、ならびに肝重量の減少によって示唆されるエネルギー消費量の増大により、体重減少を引き起こした（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、および表１３）。肝重量の低減も、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて観察された（図７Ｆおよび表１４）。ｏｂ／ｏｂマウスにおいてさらに試験すると、ステアロイル−補酵素Ａデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）、モノアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＯＧＡＴ２）、およびフォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）のＲＮＡレベルの低減が実証された（図７Ｇ、７Ｈおよび７ｉ、ならびに表１５）。
【０２７９】
【表１５】
2014500248.tif 000081
【０２８０】
【表１６】
2014500248.tif 000082
【０２８１】
【表１７】
2014500248.tif 000083
【０２８２】
【表１８】
2014500248.tif 000084
【０２８３】
（実施例４９）
ｏｂ／ｏｂモデルにおけるＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの血漿薬物レベル
ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの用量関連血清レベルを、１０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで投薬後、投与して３日後、４日後、５日後、および６日後に検査した。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの血清レベルは、十分に維持されていると観察された（図７Ｊおよび７Ｋ）。これらの結果は、健康な動物における薬物動態と一致した。
【０２８４】
（実施例５０）
インスリン感受性に対するＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃのインビボでの効果
意識のある、抑制のないｏｂ／ｏｂマウスにおける全身インスリン感受性（グルコース注入速度として測定）および高インスリン正常血糖クランプの間の肝糖産生に対するＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃのインビボでの効果を判定するための試験を行った。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（３０ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．８中）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１週間に週２回ＳＣ投与した。投薬体積は、注射１回当たり２ｍＬ／ｋｇであった。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、試験の２日目および５日目に注射した。ビヒクル（３０ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．８）を、試験の２日目および５日目に、注射１回当たり２ｍＬ／ｋｇの投薬体積で週２回投与した。マウスに、手術直前にケトプロフェン２ｍｇ／ｋｇ  ＳＣおよびアンピシリン１００ｍｇ／ｋｇ  ＳＣで処置した。動物（１群当たりｎ＝８）を、これらの１日目の空腹時血漿グルコースおよび体重によって無作為化した。
【０２８５】
試験の１日目、４日目、７日目、および８日目に体重を記録した。意外にも、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、本試験において体重に対する効果を実証しなかった（データを示さず）。空腹時血漿グルコースは、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ手持ち式グルコメーター（Ｒｏｃｈｅ）を用いて１日目（４時間の絶食）、および８日目（１６時間の絶食）に求めた。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、本試験において空腹時血漿グルコースレベルに対して効果がなかった（データを示さず）。
【０２８６】
試験の７日目に、マウスを１６時間絶食させた後、８日目にクランプ手順を行った。８日目に、カテーテルを露出させ、動物を注入ラインに接続した。クランプ手順を開始する９０分前に（−９０分）、６μＣｉボーラスの［３−３Ｈ］グルコースを頸静脈中に注射し、その後、クランプの最後まで０．１μＣｉ／分の一定注入を行った。基礎ＨＧＰを求めるために、−１０分および０分に血液を収集した。時間０分に、多様なグルコース注入（５０％のデキストロース）およびインスリン２０ｍＵ／ｋｇ／分の一定注入を開始した。血漿グルコースを、尾静脈から１０分毎に測定し、定常状態に到達するまで、各動物のグルコースレベルによってグルコース注入速度を調整した。１７０分および１８０分の時点で、血液を収集してクランプされた条件下での肝糖産生（ＨＧＰ）を求めた。クランプ手順の間に、動物は、抑制がなく、意識があった。
【０２８７】
肝糖産生（ＨＧＰ）を、以下の式を使用して計算した：
ＨＰＧ＝Ｒａ−コールドグルコース注入（ｃｏｌｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）の速度、式中、
Ｒａ＝グルコース注入速度（ｄｐｍ／分）        ＝ｍｇ／ｋｇ／分
血液比活性（ｄｐｍ／ｍｇ）×体重（ｋｇ）
出現の速度（Ｒａ）（＝消滅の速度（Ｒｄ）（定常状態として））
【０２８８】
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ビヒクル処置動物と比較して、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて体重または空腹時血漿グルコースに影響しなかった。すべての動物は、順調にクランプされ、クランプの最後の３０分の間に、１００〜１１０ｍｇ／ｄｌの正常血糖性血漿グルコースレベル、および一定のグルコース注入速度に到達した。正常血糖（１００ｍｇ／ｄＬ〜１１０ｍｇ／ｄＬの血漿グルコース）は、ビヒクル処置群およびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群において到達した。血漿グルコースレベルは、高インスリン正常血糖クランプの全期間にわたって測定した（図８Ａ）。実験（クランプ期間）の最後の３０分の間で、ビヒクル処置動物とＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置動物との間に統計的差異はまったくなかった。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ビヒクルと比較してグルコース注入速度（ＧＩＲ）を著しく増大させた（図８Ｂ）。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、基礎肝糖産生（ＨＧＰ）を変化させなかったが、クランプされた（高インスリン性）条件下でＨＧＰを著しく抑制した（図８Ｃ）。
【０２８９】
結論として、本試験において、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、体重または空腹時血漿グルコースレベルに対する効果を有することなく、ビヒクル処置動物と比較して、全身インスリン感受性の尺度であるグルコース注入速度を著しく増大させ、肝糖産生を抑制した。
【０２９０】
（実施例５１）
カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）におけるＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果
本試験の目的は、週２回のＳＣ注射を介して、肥満インスリン耐性（前糖尿病性）カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）に投与したときの、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの血漿血糖指数および脂質指数、ならびに糖耐性および炎症性生物マーカーに対する効果を評価することであった。本試験はまた、ＦＧＦ２１ΔＨの毎日の投薬と比較した、サルにおけるＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの薬力学的（ＰＤ）効果の継続時間を判定するように設計した。
【０２９１】
２２匹の成体カニクイザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を本試験に含めた。サル（１３匹の雄、９匹の雌）を、性別、体重、ならびに投薬開始２週間前に収集したベースライン血漿試料で測定した基礎血糖指数および基礎脂質指数に基づいて６個体の４つの処置群に階層化した。動物を高脂肪食で維持した。動物に４週間投与し、その後、４週間のウォッシュアウト期間を設けた。動物に以下のように投与した：１．５ｍｇ／ｋｇ（群Ａ；４匹の雄（ｍ）、１匹の雌（ｆ））および０．１５ｍｇ／ｋｇ（群Ｂ；３ｍ、３ｆ）で、２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中のＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを週２回ＳＣ、ビヒクル（７．０の最終ｐＨで２５ｍＭのトリスおよび１２５ｍＭのＮａＣｌ）を週２回ｓ．ｃ．（群Ｃ；３ｍ、３ｆ）、ならびに０．３ｍｇ／ｋｇでＦＧＦ２１ΔＨを毎日１回（ＱＤ）（群Ｄ；３ｍ、２ｆ）。
【０２９２】
ウォッシュアウトの３週目に試料を収集しなかったことを除いて、投薬期間およびウォッシュアウト期間の間、血液試料を毎週収集した。一晩絶食させた後（１６〜１８時間）、サルに、筋肉内（ＩＭ）注射によってケタミン１０〜１５ｍｇ／ｋｇで鎮静した。体重を記録し、約１．８トリプシン阻害剤単位（ＴＩＵ）のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ、全血１ｍＬ当たり０．６ＴＩＵ）で前処理した、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理済みバキュテイナー管中に、経皮大腿静脈穿刺を介して血液（５ｍＬ）を収集した。管を直ちに氷上に置いた。血漿を遠心分離によって調製し、得られた血漿を分注し、−８０℃で凍結させた。
【０２９３】
血漿薬物レベルサンプリングを、投薬期間の１日目、１４日目、および２８日目に行った。血漿Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して求めた。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを、マウス抗イディオタイプｈ３８Ｃ２を使用して捕捉し、ＦＧＦ２１のＮ末端およびＣ末端に対するビオチン化マウス抗ＦＧＦ２１モノクローナル抗体の混合物を用いて検出した。Ｃ末端検出抗体は、ＦＧＦ２１の最後の４〜５アミノ酸に特異性を有し、一方、Ｎ末端検出抗体は、ＦＧＦ２１の最初の１１〜１２アミノ酸に対して産生させた。二重検出試薬アッセイのための最小の要求される希釈は、３％のＢＳＡリン酸緩衝溶液中で１：２０であった。較正範囲は０．０３〜１０μｇ／ｍＬであり、定量化範囲は０．０３〜４μｇ／ｍＬであった。
【０２９４】
データを、各薬力学的エンドポイントについて同様に処理した。各個々のサルについてのベースライン値を、各時点から減じることによってベースラインからの変化に対応する値を得た。ベースライン値からの変化を各処置群において各時点について平均し、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。結果を、試験の時間経過にわたって、各処置群についてのベースラインからの平均変化±ＳＥＭとして報告する。０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃで処置した動物について、各時点での統計的有意性を、ベースライン値からの変化およびスチューデントＴ検定（対応のない標本、不等分散）を使用して、ビヒクルに対して評価した。ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物についてのビヒクル対照群が無かったので、ベースライン値からの変化ではなく未処理のデータを使用することによって統計的有意性を評価した。この場合、スチューデントＴ検定（両側、対応のある標本）は、ベースラインに対して実施した。
【０２９５】
（実施例５２）
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの血漿薬物レベル
血漿薬物レベルを表１６に示す。測定可能な薬物レベルは、最初に投与して４時間後、および試験したすべての後続の時点で存在した。
【０２９６】
【表１９】
2014500248.tif 000085
【０２９７】
（実施例５３）
体重
両ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ投与群における２週間後、およびＦＧＦ２１対照タンパク質で処置した群における１週間後において、処置に対する体重の有意な減少があった（図９Ａ）。すべての群において、体重減少は、ウォッシュアウトの期間中、抑えられたままであったが、有意性は、両ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ群において、４週間のウォッシュアウトまでに喪失した。ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物は、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃで処置した動物より高い体重減少を示した。食物摂取量は、これらの動物において直接測定しなかったが、いずれの処置群における動物のいずれにおいても、ケアスタッフによって食欲不振は観察されなかった。
【０２９８】
（実施例５４）
空腹時血漿グルコース
血漿グルコースを、製造者の指示書に従って、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ（登録商標）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒおよび試薬（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ（登録商標）、Ｃａｌｄｗｅｌｌ、ＮＪ）を使用して、酵素比色法を介して測定した。処置群のいずれにおいても経時的な空腹時血漿グルコースの有意な変化はなく（図９Ｂ）、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いて処置を延長しても、低血糖症を引き起こさないことを示す。
【０２９９】
（実施例５５）
空腹時血漿インスリン
血漿インスリン濃度を、製造者の指示書に従って、Ｍｅｒｃｏｄｉａ（登録商標）（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）製ＥＬＩＳＡキットを使用して求めた。処置群のいずれにおいても経時的な空腹時血漿インスリン（図９Ｃ）レベルの有意な変化はなかった。
【０３００】
（実施例５６）
空腹時血漿フルクトサミン
血漿フルクトサミンを、製造者の指示書に従って、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）製キットを使用して、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、酵素比色法を介して測定した。血漿フルクトサミンレベルは、０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群においてそれぞれ処置して４週間後および３週間後、ならびにＦＧＦ２１対照タンパク質処置動物において３週間後に有意に低減した（図９Ｄ）。この有意性は、特に１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群においてウォッシュアウト期間へと持続したが、ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物については、時点にわたって一貫していなかった。経時的な血漿フルクトサミンレベルの有意な低減は、血糖コントロールの改善を示す。
【０３０１】
（実施例５７）
空腹時血漿グルカゴン
血漿グルカゴンを、製造者の指示書に従って、ＢｉｏＰｌｅｘ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）製ヒト（非ヒト霊長類と交差反応する）内分泌イムノアッセイキットを使用して測定した。グルカゴンレベルは、３つすべての処置群において減少し、試験全体にわたるある時点で有意性に到達したが、減少の有意性は、処置群にわたって、またはＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ投与群にわたって一貫していない（図９Ｅ）。
【０３０２】
（実施例５８）
静脈内糖耐性試験（ＩＶＧＴＴ）
静脈内糖耐性試験（ＩＶＧＴＴ）を、３つの時点、すなわち、ベースライン（すなわち、投薬開始の２週間前）、投薬して４週間後に再び、および最後に、投薬後ウォッシュアウトの４週間後に各動物で行った。これらの時点で、サルに鎮静剤を投与し、空腹時血液試料を上述したように収集した。５０％のデキストロース（５００ｍｇ／ｋｇ；１ｍＬ／ｋｇ）を、約３０秒にわたって末梢静脈（頸部または伏在）に注入し、その後食塩水洗浄した。デキストロース後５分、１０分、２０分、３０分、および６０分に、引き続いて血液試料をＥＤＴＡ処理済みバキュテイナー（２ｍＬ）中に収集した。
【０３０３】
グルコースおよびインスリンを、ＩＶＧＴＴ時点のそれぞれで測定した。グルコース曲線下面積およびインスリン曲線下面積を、糖耐性試験の間（０〜６０分）に計算した。ベースラインとして時間０（ｔ＝０分）の値を使用して、台形法則によって、グルコースおよびインスリン偏位曲線（ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）から、グルコースおよびインスリンについてのΔＡＵＣを計算した。０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群について、統計的有意性を、ダネット事後検定とともにＡＮＯＶＡによって、ビヒクルに対して評価した。ベースラインに対するＩＶＧＴＴ時点にわたる有意性を、ダネット事後検定とともに反復測定ＡＮＯＶＡによって、ＦＧＦ２１ΔＨ群について評価した。
【０３０４】
グルコースおよびインスリンについての平均計算ΔＡＵＣ±ＳＥＭを、それぞれ図９Ｆおよび図９Ｇに示す。処置群のいずれについても、計算されたパラメータのいずれにおいても有意な変化はなかった。
【０３０５】
（実施例５９）
総血漿コレステロール（ＴＰＣ）
ＴＰＣレベルを、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ分析器で酵素法を使用して測定した。すべての処置群において、処置して１週間後にＴＰＣの有意な減少があった（図９Ｈ）。０．１５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置動物では、ＴＰＣレベルは、投薬およびウォッシュアウト段階全体にわたって減少したままであったが、１．５ｍｇ／ｋｇおよびＦＧＦ２１ΔＨ処置群では、レベルは、ウォッシュアウト段階の間にベースラインに向かってリバウンドした。
【０３０６】
（実施例６０）
トリグリセリド（ＴＧ）
ＴＧレベルを、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ分析器で酵素法を使用して測定した。１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群およびＦＧＦ２１ΔＨ処置動物の両方において、投薬期間にわたってＴＧの有意な減少があった（図９ｉ）。ＴＧレベルの低減は、ＦＧＦ２１ΔＨ処置群において、ウォッシュアウト段階にわたって持続したが、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群におけるＴＧレベルは、ウォッシュアウト段階でベースラインに向かう傾向があった。
【０３０７】
（実施例６１）
非エステル化遊離脂肪酸（ＦＦＡ）
非エステル化遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を、製造者の指示書に従って、Ｗａｋｏ（登録商標）（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）からのプロトコールおよび試薬を使用して、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｃ３１１臨床化学分析器で、酵素法を使用して測定した。０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群において、ＦＦＡレベルの有意な変化はなかった（図９Ｊ）。ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物におけるＦＦＡレベルは、処置の最初の２週間にわたって著しく増大し、次いでウォッシュアウト段階の１週目までにベースラインレベルに戻った。
【０３０８】
（実施例６２）
高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）
ＨＤＬレベルを、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ分析器で酵素法を使用して測定した。処置群のいずれにおいても、処置期間にわたってＨＤＬコレステロールの有意な変化はなかった。
【０３０９】
（実施例６３）
低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）
ＬＤＬレベルを、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ分析器で酵素法を使用して測定した。０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群において、それぞれ処置の２週目および１週目からウォッシュアウト期間の２週目に、ＬＤＬコレステロールの有意な減少があった（図９Ｋ）。ＬＤＬコレステロールレベルの有意な減少は、ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物では、処置の１週間後にのみ観察された。この処置群におけるいずれの他の時点でも有意性は見られなかった。
【０３１０】
（実施例６４）
総ケトン体（ＴＯＴＫ）
ＴＯＴＫを、Ｗａｋｏ（登録商標）からのプロトコールおよび試薬を使用して、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｃ３１１臨床化学分析器で、酵素法を使用して測定した。０．１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置動物において、総ケトン体レベルの有意な変化はなかった（図９Ｌ）。ＴＯＴＫレベルは、処置の最初の３週間にわたって、ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物において著しく増大し、レベルは、ウォッシュアウト期間にわたってベースラインに向かう傾向があった。
【０３１１】
（実施例６５）
アディポネクチン
アディポネクチンレベルを、Ｍｅｒｃｏｄｉａ（登録商標）ＥＬＩＳＡキットを使用して求めた。血漿アディポネクチンレベルを図９Ｍに示す。３匹の動物（ビヒクル、１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、およびＦＧＦ２１ΔＨ処置群中の各１匹）を、これらのアディポネクチンレベルがアッセイの検出限界未満であったため、分析から除外した。処置群のいずれにおいても、アディポネクチンレベルの有意な変化は見られなかったが、ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物では、レベルは上昇傾向であった。
【０３１２】
（実施例６６）
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を、製造者の指示書に従って、ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）製ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。血漿ＣＲＰレベルは、２週目を除いて４週間の処置期間にわたって、０．１５および１．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置動物において有意に減少した（図９Ｎ）。レベルは、ウォッシュアウト段階の間にベースラインに戻る傾向があった。血漿ＣＲＰレベルは、ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物においても減少したが、有意性は、１週間のウォッシュアウト時点でのみ到達した。
【０３１３】
（実施例６７）
レプチン
レプチンを、製造者の指示書によるプロトコールおよび試薬を用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）カタログ番号ＨＭＨ−３４Ｋ）によって測定した。血漿レプチンレベルは、ＦＧＦ２１ΔＨ処置動物（図９ｏ）において減少したが、この減少は、時点のいずれにおいても有意性に到達しなかった。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置群におけるレプチンレベルの変化はなかった。
【０３１４】
（実施例６８）
アディプシン
アディプシンレベルを、製造者の指示書に従って、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）のヒト補体因子Ｄ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（カタログ番号ＤＦＤ００）を使用して測定した。血漿アディプシンレベルは、処置の最初の３週間の間に、すべての処置動物において有意に増大した（図９Ｐ）。レベルは、ウォッシュアウト段階の間にベースラインに戻る傾向があった。
【０３１５】
（実施例６９）
サル試験からの結論
ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、軽度から中程度にインスリン耐性のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）において、体重の低減、脂質指数（ＴＰＣ、ＴＧ、およびＬＤＬ）の改善、および炎症性生物マーカー（ＣＲＰ）の低減において効果的であった。空腹時血中グルコースレベルに対するＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣまたはＦＧＦ２１ΔＨの明らかな効果はなく、低血糖症の発症もなった。ＩＶＧＴＴによって評価した場合、インスリン感受性に対する効果はなかった。予期されなかったが、この結果は、血漿グルコースレベルに対する効果の欠如とともに、正常な健康なカニクイザルと比較して、これらのカニクイザルにおけるグルコースおよびインスリンのベースラインレベルがほんのわずかに上昇していることに起因し得る。これは、これらの動物は、ほんの軽度のインスリン抵抗性を示すことを示唆する。サル同士間の自然のばらつき、および１群当たりの少ない動物数と合わさった、ベースラインレベルの小さい変化は、血糖指数の統計的に有意な変化を観察することを困難にしている場合がある。処置期間の最後に向かって、ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ処置動物においてフルクトサミンレベルが低減していることは、これらの動物において血糖コントロールが改善されていることを確かに示す。ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの週２回の投薬（特に１．５ｍｇ／ｋｇの用量）は、対照ＦＧＦ２１タンパク質の毎日の投薬と同等の有利な効果を生じさせた。
【０３１６】
（実施例７０）
ＡＢ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃのヒト試験の最初
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（ｈ３８Ｃ２−（配列番号１０−Ｌ１）２）の無作為化、プラセボ対照、並列漸増単回ＩＶ投与試験を、２型糖尿病を有する対象において行った。対象に、ＩＶボーラス（０．５ｍｇおよび１．５ｍｇ）またはＩＶ注入（５、１５、５０、１００、２００ｍｇ）投与として、プラセボまたはＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを投与し、各活性物質処置投与群で１０人の対象を評価し、プラセボ群において１４人を評価した。これまで、最大２００ｍｇの用量レベルまでの７つのコホートを、一般に安全で耐容性良好であることが判明している最大２００ｍｇまでの単回ＩＶ投与として、最大耐量（ＭＴＤ）を同定することなく評価した。観察された安全性／耐容性、薬物動態学的および薬力学的データの予備要約をここで提示する。
【０３１７】
単回用量を投与した後、７点の平均血漿グルコースプロファイルと空腹時血漿グルコースレベルとの間に、プラセボと比較して差異はまったくなかったが、両試験およびプラセボは、減少を示した。総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、空腹時インスリン、空腹時グルカゴン、または空腹時β−ヒドロキシブチレートにおいて、用量関連傾向はまったく観察されなかった。プラセボと比較してＨＤＬコレステロールの増大が、試験した上位２つの用量レベル（１００および２００ｍｇのＩＶ）で観察された。空腹時トリグリセリドの用量依存的減少が観察された。
【０３１８】
ＦＧＦ２１のインタクトなＣ末端およびインタクトなＮ末端の薬物動態を、健康な志願者において、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを単回静脈内投与した後に別個に評価した。両方への曝露は、用量の増大と比例して増大すると考えられた。対数濃度対時間曲線の終末過程は、それぞれ、Ｃ末端について７〜９時間、およびＮ末端について３０〜３６時間の平均終末相半減期に応じていた。
【０３１９】
重篤な有害事象（ＳＡＥ）はまったく報告されず、合計６０の有害事象（ＡＥｓ）が３３人の対象において報告された。これらのＡＥのうち、５４が、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを投与されながら２８人の対象において報告された。ＡＥの大部分は、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃまたはプラセボを１５ｍｇ投与して３２．５時間後に始まって、中等度と等級付けされた吐き気のエピソードを除いて、強度が軽度であるとみなされた。吐き気のエピソードは、１６５時間続き、介入を必要とせず、治験薬処置に関係するとみなされた。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃまたはプラセボを５０ｍｇ投与して２時間後に始まり、１５６時間続いた、中等度と等級付けされた下痢のエピソードも報告された。このエピソードは、介入を必要とせず、治験薬処置に関係するとみなされた。下痢は、報告された最も頻繁なＡＥであり（１２対象中１４のエピソード）、これらのうち、９つ（９）のエピソードは、処置に関係するとみなされた。下痢の他のエピソードは、参加臨床研究ユニットで入院患者を拘束する間に１つのコホート中の対象に供給した水道水の塩素化処理の変更に関係するとみなされた。胃腸症状（腹部膨満、腹痛、下痢、消化不良、鼓腸、胃酸過多、吐き気、および嘔吐）は、５人（５）の対象で、用量を増加すると頻度が増加すると考えられ、コホート７（２００ｍｇの用量群またはプラセボ）中で９つ（９）のＧＩ  ＡＥを報告している。ＡＥの結果として試験の参加から退かれた対象はまったくなかった。
【０３２０】
ＩＧＦ−１値、臨床検査、バイタルサインにおいて、用量関連傾向は観察されず、１２誘導ＥＣＧが試験した用量にわたって観察された。２００ｍｇ処置群において、収縮期血圧（ＳＢＰ）の平均値は、他の処置群（プラセボを含む）より数値的に高い傾向があり、１日目に投与して０．５時間後における１１．２ｍｍＨｇのベースラインからの最大の上昇を伴い、７．０ｍｍＨｇで１５日目にかけて持続した。２００ｍｇ処置群において観察されたベースラインからの平均変化は、群平均ベースラインの１標準偏差以内であった。さらに、２００ｍｇ処置群中の個々の対象において、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ曝露とＳＢＰ上昇の間の相関はなかった。さらに、ＳＢＰの上昇は、治験薬ウォッシュアウトの十分後の１５日目にかけて持続した。これらの観察結果のすべては、観察された平均の上昇は、処置群のばらつきの範囲内であり、このばらつきに関係する可能性があることを示唆する。
【０３２１】
（実施例７１）
投薬レジメン
２型糖尿病患者における、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを単回投与した後のトリグリセリド低下の濃度−応答関係を、遅い薬理開始およびオフセットＰＫ／ＰＤモデル（ｏｆｆｓｅｔ  ＰＫ／ＰＤ  ｍｏｄｅｌ）を使用して説明した。ＦＩＨ（ファーストインヒューマン）トリグリセリドデータからＩＣ５０および遅い薬理動態を得たＰＫ／ＰＤモデル、ならびにｏｂ／ｏｂマウスＯＧＴＴデータから最大薬理を得たモデルを用量推定に使用した。４週間にわたる１０ｍｇのｈ３８Ｃ２−（配列番号１０−Ｌ１）２の毎週の投与または５ｍｇのＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの週２回の投与は、８％のＨｂＡ１Ｃ糖尿病患者において約２５％の空腹時血漿グルコース低下を実現することが推定される。
【０３２２】
したがって、本発明は、約５ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）の用量で患者を治療するステップを含む投薬レジメンを提供する。いくつかの態様では、約５ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）は、週２回投与される。いくつかの態様では、約５ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）は、少なくとも４週間投与される。いくつかの態様では、約５ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）は、少なくとも４週間わたって週２回投与される。
【０３２３】
したがって、本発明は、約１０ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）の用量で患者を治療するステップを含む投薬レジメンを提供する。いくつかの態様では、約１０ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）は、週１回投与される。いくつかの態様では、約１０ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）は、少なくとも４週間投与される。いくつかの態様では、約１０ｍｇの本発明の化合物（特に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ）は、少なくとも４週間にわたって、週１回投与される。
【０３２４】
いくつかの態様では、患者は、２型糖尿病を罹患している。いくつかの態様では、患者は、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）が上昇した糖尿病患者である。いくつかの態様では、投薬レジメンは、トリグリセリドレベルを低下させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、ＨＤＬを上昇させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、血中グルコースを低下させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、血中グルコースを少なくとも約２５％低下させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、２型糖尿病を治療するためのものである。
【０３２５】
（実施例７２）
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ＆Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの安定性
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ＆Ａｂ（ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ−Ｌ１）２）、およびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２）の様々な製剤を、ＵＦ−ＤＦ（３００００の分子量カットオフを使用する透析濾過および限外濾過）によって調製し、次いで滅菌濾過した。製剤を様々なストレス条件に曝した（表１７を参照）。次いで、外観アッセイ、ＵＶ（紫外吸光度）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、およびｉＣＥ（画像化キャピラリー電気泳動）を使用して試料を分析した。いくつかの試料は、生物物理学的技法、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、および分析的超遠心分離法などによって分析した。試料を様々な時点（表１７）で分析することによって、安定性傾向を評価した。ポリソルベート８０の任意の有利な効果を判定するために、ポリソルベート８０とともに、または伴わずに調製した選択された製剤を、撹拌ストレス（３００ｒｐｍの軌道振盪で４時間）にかけた。さらに、いくつかの製剤は、より高い濃度も使用することによって、コンジュゲートが高濃度で水性緩衝溶媒中に可溶性であるか否かを評価し、高濃度での安定性を評価した。
【０３２６】
【表２０】
2014500248.tif 000086
【０３２７】
外観アッセイ
様々な温度で貯蔵した後の粒状物形成：２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６製剤中の両候補（製剤ＡおよびＦ）は、５℃で４週間貯蔵し、または２５℃で４週間、４０℃で２週間、または５０℃で２週間貯蔵した後、粒状物形成を示した。これらのデータは、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６製剤は、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣおよびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを不安定にすることを示唆する。４０℃で２週間ストレスをかけたとき、酢酸塩  ｐＨ４およびリン酸塩  ｐＨ８は、同じタンパク質濃度レベルで、ヒスチジン  ｐＨ６製剤と対照的に、粒状物形成をまったく示さなかった。しかし、高いタンパク質濃度（４０〜５０ｍｇ／ｍＬ）は、より低いタンパク質濃度（７〜１０ｍｇ／ｍＬ）での同じ製剤（ヒスチジン、ｐＨ６）と比較した場合、粒状物形成を遅延させると考えられる。５℃で４週間貯蔵した後のＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣおよびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの外観データを比較した場合、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、２製剤（酢酸塩、ｐＨ４、およびリン酸塩、ｐＨ８）中で粒子物形成に対して優れた性能を示す。
【０３２８】
ポリソルベート８０を含む製剤および含まない製剤を比較する場合、ポリソルベート８０の存在は、表１７で分かるように、両候補において、撹拌ストレス誘導粒状物形成の防止に役立つ。撹拌ストレスは一般に、空気−水界面および機械的応力を伴う様々なプロセスステップに対する安定性を予測するのに使用される。
【０３２９】
ＵＶの有意な変化は、経時的にまったく観察されず、表１７に列挙した製剤のいくつかにおいて粒状物形成が観察されても、タンパク質の正味の濃度は、経時的に有意に影響されなかったことを示す。
【０３３０】
高分子量種（ＨＭＷＳ）形成
ＳＥＣを使用することによって、表１７に列挙した様々な製剤についてＨＭＷＳ形成を測定した（結果を表１８に示した）。ＳＥＣは、ＨＭＷＳを確実に分離することができ、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣおよびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの両方にとって重要な安定性指示アッセイである。ＳＥＣアッセイにおけるＨＭＷＳは、２ユニットのＦＧＦ２１を持つコンジュゲート（すなわち、ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ−Ｌ１）２およびｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２）の前に溶出する化学種として定義される。両候補についての２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６中の製剤は、ＨＭＷＳの高い初期形成および時間依存形成を示した。興味深いことに、高温（４０℃）における両候補の製剤のいくつか（酢酸塩、ｐＨ４；リン酸塩、ｐＨ８、およびヒスチジン  ｐＨ６中の高濃度製剤）は、第１週中に凝集体の初期解離を示す傾向がある。経時的なタンパク質製剤の非線形凝集傾向は、文献で公知である。２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中の製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６中の製剤と比較したとき、より少ないＨＭＷＳを示した。したがって、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中の製剤は、ＨＭＷＳ形成に関して、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６中より優れた安定性をもたらす。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、これらの結果と一致した。最後に、この２つの候補を、酢酸塩、ｐＨ４製剤中の５℃でのＨＭＷＳ形成の傾向について比較すると、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃより優れて機能すると考えられる（表１８）。
【０３３１】
【表２１】
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【０３３２】
電荷不均一性
タンパク質は、アミド分解および断片化などの翻訳語修飾によって引き起こされる電荷不均一性を有する。画像化キャピラリー等電点電気泳動法（ｉＣＥ）は、ｐＨ勾配におけるタンパク質種の電荷差（ｐＩ値）に基づいてタンパク質種を分離する。ｉＣＥは、表１９に示したＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣおよびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの様々な製剤中の電荷不均一性をモニターするのに使用した。ｉＣＥの実行条件は、２Ｍの尿素を含む約１ｍｇ／ｍＬのタンパク質、およびＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３〜１０を含む。両候補についての２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８中の製剤は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中の製剤と比較して酸性種形成のより高い傾向を示した。したがって、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中の製剤は、優れた安定性をもたらす。さらに、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中で、同じ製剤中のＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃより低い酸性種形成の傾向を示し、したがって、電荷不均一性について優れた安定性を実証した。
【０３３３】
【表２２】
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【０３３４】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
２つの候補の熱安定性を、ＤＳＣを使用して、温度誘導性アンフォールディングの転移の中間点（Ｔｍ）を測定することによって調査した。ｈ３８Ｃ２についての主要なアンフォールディング転移のＴｍ値は、７３．５℃であった。コンジュゲートは、主要なアンフォールディング転移のより高いＴｍを示し、アンフォールディングに対するより高い熱安定性を示唆した（Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２）およびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ−Ｌ１）２）の両方のＴｍは、７９℃であった）。
【０３３５】
２つの候補の熱安定性は、内在性タンパク質トリプトファン蛍光を使用して、温度誘導性アンフォールディングの転移の中間点（Ｔｍ−ＦＬ）を測定することによっても調査した。このアッセイは、高温によって誘導されたアンフォールディング後に、三次構造の変化を半定量的にモニターする。主要なアンフォールディング転移のＴｍ−ＦＬ値は、ｈ３８Ｃ２、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃについてそれぞれ、約７４．１℃、７７．７℃、および７９．７℃であった。ＤＳＣによって測定したＴｍ値と一致して、２つの候補は、ｈ３８Ｃ２のＴｍ−ＦＬよりわずかに高い同様のＴｍ−ＦＬを示し、ｈ３８Ｃ２単独より、コンジュゲートの高い熱力学的安定性を示唆する。
【０３３６】
分析的超遠心分離法アッセイ
このアッセイは、試験した、選択した製剤中のＨＭＷＳの定性的量の直交測定（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）として使用した。これは、ＳＥＣで見られたものと同様の、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６製剤中のＨＭＷＳのレベルを示す。これはまた、ＳＥＣアッセイで見られた傾向と一致して定性的に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃについての２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中のより低いレベルのＨＭＷＳを示す。分析的超遠心分離法データは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６製剤と比較して優れた安定化をもたらすという直交検証（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を提供する（表２０）。
【０３３７】
【表２３】
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【０３３８】
本実施例で論じたいくつかの安定性指標のデータを比較すると、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの全体的な安定性プロファイルは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃより優れていると考えられる。製剤のｐＨを下げると（例えば、酢酸塩、ｐＨ４）、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８）と比較して安定性がより良好になることも明白である。
【０３３９】
（実施例７３）
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣのｐＨ−緩衝液スクリーニング
様々な水性緩衝液中のＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２）の安定性を、適切な安定化媒質を見つける目的で調査した。リンカー−１の不安定性、およびタンパク質成分（すなわち、ｈ３８Ｃ２およびＦＧ２１）の任意の加水分解性切断（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）は、低分子量種（ＬＭＷＳ）の生成をもたらす。さらに、コンジュゲートが試験した製剤中で凝集する場合、高分子量種が形成され得る。製剤を、５〜８ｍｇ／ｍＬの範囲内の目標タンパク質濃度で、緩衝液交換によって調製して所望の製剤にした。製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装し、所望の温度で貯蔵した。指定時点で、試料をアッセイした。
【０３４０】
ＳＥＣによるＨＭＷＳおよびＬＭＷＳの測定
緩衝液およびｐＨの顕著な効果を、２週間にわたる温度ストレス（４０℃）の後に観察した。データを表２１に提示する。初期時点において、ＨＭＷＳの増加傾向がより高いｐＨの製剤で見られた。ヒスチジン製剤は、高い％ＨＭＷＳを示すものの中にあった。ｐＨ範囲４．５〜５中の酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウム製剤は、初期時点において相対的に少ない凝集体を示した。数週間にわたって４０℃で貯蔵すると、％ＨＭＷＳは、ｐＨ６．５および７の製剤中で実際に減少した。乳酸ナトリウム、ｐＨ４．５製剤は、％ＨＭＷＳに関して相対的に優れた性能を示した。
【０３４１】
ＬＭＷＳの傾向は、ＨＭＷＳの傾向と異なった。クエン酸ナトリウム、ｐＨ５製剤を除いて、すべての製剤は、初期時点において一貫した値の％ＬＭＷＳを示した。４０℃で２週間貯蔵すると、低ｐＨ製剤のいくつかは、おそらく断片化による％ＬＭＷＳの顕著な増加を示した。しかし、緩衝液種の効果は、ＬＭＷＳ形成に対する安定化においても役割を果たすことが明らかである。ｐＨ依存性％ＬＭＷＳの傾向は、製剤をさらに微調整すると、安定性をさらに改善することができることを示唆する。
【０３４２】
【表２４】
2014500248.tif 000090
【０３４３】
（実施例７４）
撹拌に対するＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの安定性
９〜１１ｍｇ／ｍＬの範囲内の目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した。調製した製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。３００ｒｐｍの速度で軌道振盪機を使用して撹拌を施した。指定時点で、試料をアッセイした。表２２中の結果は、ポリソルベート８０が存在すると、撹拌誘導性不安定性を防止するのに役立つことを実証する。
【０３４４】
【表２５】
2014500248.tif 000091
【０３４５】
（実施例７５）
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの凍結乾燥製剤
液体製剤を本発明の化合物とともに使用することができるが、凍結乾燥製剤は、より長い寿命の安定性をもたらし得る。実施例７２は、本発明の化合物は、酢酸ナトリウム中で最も安定であるという意外な結果を実証した。しかし、酢酸ナトリウムは昇華し、したがって、凍結乾燥した緩衝液中に組み込むことが困難である。したがって、凍結乾燥製剤において最適な長期安定性をもたらす、本発明の化合物用の代替緩衝液を開発する必要性がある。
【０３４６】
約２０ｍｇ／ｍＬを目標とする製剤ＪおよびＫを除いて、約１０ｍｇ／ｍＬの目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した。調製した製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。凍結乾燥製剤を調製するために、バイアルを、凍結乾燥し、ストッパーを付け、キャップを付けた。指定時点で試料を引き抜き、ＳＥＣ、およびｉＣＥを含む様々な分析的方法によってアッセイした。液体製剤も、安定性を評価するために２週間評価した。
【０３４７】
高温で貯蔵した後の凍結乾燥製剤の性能を評価した。表２３は、指定時点におけるＳＥＣおよびｉＣＥデータを示す。凍結乾燥製剤は、より高い温度ストレスと比較した場合でも優れて機能した。凍結乾燥製剤の中で、乳酸塩製剤および酢酸塩製剤が、相対的により良好に機能した。しかし、酢酸塩は、凍結乾燥されると昇華を起こし、ｐＨドリフトの原因となることが知られている。実際に、酢酸塩製剤は、凍結乾燥後に０．３〜０．５ｐＨ単位の上昇を示した。したがって、凍結乾燥乳酸塩製剤（製剤Ｃ）は、適切な安定性を実現するのに適しており、粒状物、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ、および酸性種の形成からの十分な保護をもたらすと結論づけられる。実施例７３で提示した製剤と比較すると、製剤Ｃ（乳酸塩、トレハロース二水和物、ＰＳ２０、ＥＤＴＡ、Ｌ−Ｍｅｔから構成される）は、リンカー不安定性およびタンパク質切断（これらはともに、ＬＭＷＳ形成を生じさせる）、ならびに凝集（粒状物およびＨＭＷＳの形成）の予防に役立つことが明らかである。実施例７２および７３は、乳酸塩のみを含むｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２の製剤は、ヒスチジンなどの他の緩衝液より優れていても、望まれるより長期間の使用に適切な安定性をもたらすことができないことを示す。凍結保護物質およびリオプロテクタントとして役割を果たす糖またはポリオールなどの様々なタイプの安定剤（例えば、トレハロース、スクロース、マンニトール）、ならびに撹拌安定性のための界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー）、ならびにキレーター（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ）、ならびに抗酸化剤（例えば、Ｌ−メチオニン）と乳酸塩を組み合わせると、安定性が相乗的に増強される。乳酸塩がリンゴ酸塩、コハク酸塩、または酢酸塩のうちの１つで置換されている表２３中の組合せ製剤は、対応する緩衝液のみの製剤と比較した場合、優れた安定性をもたらす。したがって、組合せは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの安定性を明らかに増強する。
【０３４８】
（実施例７６）
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの凍結乾燥製剤
製剤同士間で多様であった目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した。調製した製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。凍結乾燥製剤を調製するために、バイアルを、凍結乾燥し、ストッパーを付け、キャップを付けた。指定時点で、ＳＥＣ、およびｉＣＥを含む様々な分析的方法によって試料をアッセイした。さらに、液体製剤の安定性傾向を評価するために、液体製剤も２週間評価した。凍結乾燥製剤の含水量を凍結乾燥後に試験し、すべて０．５％未満であった。
【０３４９】
凍結乾燥製剤を様々な温度ストレス下で貯蔵した。表２４は、指定時点におけるＳＥＣ、ｉＣＥ、および還元ＣＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動）データを示す。ＣＧＥにより、タンパク質断片が半定量的に推定される。凍結乾燥製剤は、これらの液体対応物と比較した場合、より良好な安定性を示した。安定化賦形剤の存在下（凍結保護物質／リオプロテクタントの存在下）での乳酸（乳酸ナトリウム）の凍結乾燥製剤は、良好な安定性を示した。したがって、凍結乾燥乳酸製剤は、より長期の貯蔵安定性を試験するのに適切であると結論づけられる。乳酸製剤の中で、リンカー不安定性およびタンパク質切断による過剰な断片化を防止するために、製剤のｐＨのバランスが必要である。例えば、液体状態でのｐＨ４．５の製剤Ｆは、他の製剤と比較して、相当な断片化を生じさせる。最後に、製剤ＢとＬを比較したとき、安定剤（すなわち、ＥＤＴＡおよびＬ−メチオニン）は、断片化を最小限にし、特に液体製剤に対して相当な利点をもたらすことが分かる。金属キレーター（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ）と抗酸化剤（例えば、Ｌ−メチオニン、純粋なアスコルビン酸）の他の組合せも、安定性を実現するのに有利であると予期される。
【０３５０】
選択した製剤を、相対的な生物活性についても試験することによって、表２４のデータ中に見られる物理的劣化および化学的劣化に対して相関があるか否かを探求した。生物活性を、間接的ＦＧＦ−Ｒ／β−Ｋｌｏｔｈｏ  ＨＥＫ−２９３細胞結合ＥＬＩＳＡによって測定し、参照物質の生物活性に対して相対的な％として表した。生物活性データを表２５に提示する。データから、物理的劣化と化学的劣化は相関していると考えられ、分析的方法によってアッセイして有意な劣化を示す製剤も（表２４）、生物活性の有意な低減を示す。これらのデータは、製剤Ａの成分によってもたらされる安定性および機能的完全性のさらなる信頼度をもたらす。
【０３５１】
【表２６】
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【０３５２】
したがって、いくつかの態様では、本発明は、約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間のＦＧＦ２１−コンジュゲート、および約４〜約５．５の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間の乳酸または酢酸ナトリウム；および以下のうちの少なくとも１つを含む製剤を提供する：
（ｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質；
（ｉｉ）約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの間のキレーター；
（ｉｉｉ）約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍｌの間の抗酸化剤；
（ｉｖ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤。
いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの２つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの３つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む。
【０３５３】
いくつかの態様では、本発明は、
（ｉ）約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間のＦＧＦ２１−コンジュゲート、
（ｉｉ）約４〜約５．５の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間の乳酸；および
（ｉｉｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質；
（ｉｖ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤
を含む凍結乾燥製剤を提供する。
【０３５４】
いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの間のキレーターをさらに含むことができる。キレーターは、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡとすることができ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｍＬの間の量で存在し得る。キレーターは、約０．０５ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。
【０３５５】
いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍｌの間の抗酸化剤をさらに含むことができる。いくつかの態様では、抗酸化剤は、Ｌ−メチオニンとすることができる。抗酸化剤は、約０．０２〜約５ｍｇ／ｍＬの間の量で存在し得る。抗酸化剤は、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｍＬの間の量で存在してもよい。抗酸化剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬの量で存在することができる。
【０３５６】
いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、本明細書に記載される本発明の化合物である。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣまたはＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃである。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１コンジュゲートは、特定の化学種ｈ３８Ｃ２−（配列番号１０−Ｌ１）２である。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、約１０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【０３５７】
いくつかの態様では、乳酸は、約１〜約１００ｍＭの間の量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約３０ｍＭの量で存在する。ｐＨは、約４．３〜約５．３の間とすることができる。ｐＨは、約４．８±０．５とすることができる。ｐＨは、約４．８であってもよい。
【０３５８】
いくつかの態様では、凍結保護物質は、トレハロース二水和物、スクロース、およびマンニトールからなる群から選択される。凍結保護物質は、トレハロース二水和物とすることができる。凍結保護物質は、約５０〜約１２０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在し得る。凍結保護物質は、約９０ｍｇ／ｍｌの量で存在してもよい。
【０３５９】
いくつかの態様では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびポロキサマーからなる群から選択することができる。界面活性剤は、ポリソルベート２０とすることができる。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．０５〜約１．０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【０３６０】
いくつかの態様では、本発明は、以下のものを含む、凍結乾燥に適した製剤を含む：
（ｉ）約１０ｍｇ／ｍＬのｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２；
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０ｍＭの乳酸；
（ｉｉｉ）約９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物；
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬの二ナトリウムＥＤＴＡ二水和物；
（ｖ）約０．１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン；および
（ｖｉ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０。
【０３６１】
別段の指定のない限り、用語「Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ」が具体例の脈絡において使用される場合、これは、抗体の各アームが配列番号２６のＫ９９を通じてリンカー−１（Ｌ１）に共有結合により連結され、各Ｌ１分子が配列番号１０中のＣｙｓ１２９のチオール基に共有結合によりコンジュゲートされた、ｈ３８Ｃ２抗体（配列番号２５および２６）を指す（配列番号１の番号付けによる）。この化合物は、Ａｂ−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２、ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２、およびｈ３８Ｃ２−（配列番号１０−Ｌ１）２と記載することもできる。抗体、特定のリンカー、およびＦＧＦ２１分子の配列への軽微な修飾が可能である場合があることが明らかとなるであろう。
【０３６２】
こうして、本発明を、上述した代表的な実施形態を参照して広く開示し、例示してきた。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変を本発明に行うことができることを認識するであろう。すべての刊行物、特許出願、および発行済み特許は、各個々の刊行物、特許出願、または発行済み特許が、その全体が参照により組み込まれているように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれているテキスト中に含まれる定義は、これらが本開示における定義と矛盾する程度に応じて除外される。
【０３６３】
明確にするために別個の実施形態の脈絡において記載されている本発明のある特定の特徴は、１つの実施形態において組合せで提供することもできることが理解される。反対に、簡潔にするために１つの実施形態の脈絡において記載されている本発明の様々な特徴を、別個に、または適当なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０３６４】
本発明の一実施形態に関して論じたいずれの限定事項も、本発明の任意の他の実施形態に適用することができることが特に企図されている。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法において使用することができ、本発明の任意の方法は、本発明の任意の組成物を生成または利用するのに使用することができる。特に、請求項に記載される本発明の任意の態様は、単独で、または１つもしくは複数の追加の請求項および／もしくは明細書の態様と組み合わせて、特許請求の範囲および／または明細書の他の箇所で述べた本発明の他の態様と組み合わせられると理解されるべきである。
【０３６５】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことが明確に示され、または選択肢が相互に排他的であるのでなければ、「および／または」を意味するのに使用されるが、本開示は、選択肢のみ、および「および／または」を指す定義を支持する。
【０３６６】
本明細書において文中で使用される「ａ」または「ａｎ」は、別段の明らかな指示のない限り、１つまたは複数を意味することができる。請求項（複数可）において文中で使用される、単語「含む」とともに使用される場合の、「単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多いことを意味することができる。本明細書において、「別の」は、少なくとも第２、またはそれ以上を意味することができる。
【０３６７】
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および単語「有する／含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明を参照して本明細書で使用する場合、述べた特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を指定するのに使用されるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはこれらのグループの存在または追加を排除しない。
【０３６８】
【表２７】
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【０３６９】
【表２８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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