(57)【要約】  本発明は、β−ＴＣＰ結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の全て又は一部を含む組成物及びその使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を含む組成物。
【請求項２】
前記β−ＴＣＰがβ−ＴＣＰスキャフォールドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記スキャフォールドがポリラクチド−ｃｏ−グリシドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記スキャフォールドが１つ以上のポロゲンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポロゲンがスクロースである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドの２つ以上のコピーが、前記β−ＴＣＰの１つ以上のコピーに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記β−ＴＣＰに結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドを約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０リピート含む連結多量体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記多量体が、前記β−ＴＣＰに結合した前記β−ＴＣＰ結合ペプチドを１０リピート含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、アミノ酸配列：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
各β−ＴＣＰ結合ペプチドが、リンカーを介してさらなるペプチド又はタンパク質の各々と融合している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、成長因子又はサイトカインの全て又は一部と融合している、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、骨形成タンパク質（ＯＰ−１）、コラーゲン結合タンパク質又はそれらの組み合わせである、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リンカーがコイルドコイルリンカーである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記コイルドコイルがロイシンジッパーである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合した前記β−ＴＣＰを１０リピート含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であって、ＥＧＦが前記１０リピートの前記β−ＴＣＰ結合ペプチドの各々のＣ末端側端部に結合している、組成物。
【請求項１７】
間葉系幹細胞をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記エンドトキシン値が約１０００ＥＵ／ｍｇ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
配列番号２９、配列番号３０又は配列番号３１を含む組成物。
【請求項２０】
アミノ酸配列：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）又はそれらの組み合わせを含むβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）結合ペプチド。
【請求項２１】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合している、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、さらなるペプチド又はタンパク質の各々とリンカーを介して融合している、請求項２０又は２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、成長因子又はサイトカインの全て又は一部と融合している、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、骨形成タンパク質（ＯＰ−１）、コラーゲン結合タンパク質又はそれらの組み合わせである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リンカーがコイルドコイルリンカーである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記コイルドコイルがロイシンジッパーである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合した前記β−ＴＣＰを１０リピート含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物であって、前記１０リピートの前記β−ＴＣＰ結合ペプチドの各々のＣ末端端部にＥＧＦが結合している、組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項２９】
約１０００ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン値の、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
上皮成長因子（ＥＧＦ）を、それを必要としている個体に送達する方法であって、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を含む組成物の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法において、前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが上皮成長因子（ＥＧＦ）と融合している、方法。
【請求項３１】
前記組成物が創傷部位に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記創傷部位が骨損傷を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を前記個体に投与するステップをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＭＳＣが、組成物あたり約１００〜約１，０００，０００ＭＳＣの細胞播種密度で投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、アミノ酸配列：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）又はそれらの組み合わせを含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
必要としている個体における骨の修復方法であって、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）スキャフォールドを含む組成物の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法において、前記１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドがＥＧＦと融合している、方法。
【請求項３７】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を前記個体に投与するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＭＳＣが自家ＭＳＣである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記個体が自家骨移植を受けている、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、アミノ酸配列：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）又はそれらの組み合わせを含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
必要としている個体において間葉系幹細胞（ＭＳＣ）増殖を増加させる方法であって、ＭＳＣ、及び１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウムスキャフォールド（β−ＴＣＰ）を含む組成物の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法において、前記１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドがＥＧＦと融合している、方法。
【請求項４２】
前記ＭＳＣが自家ＭＳＣである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、アミノ酸配列：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）又はそれらの組み合わせを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養する方法であって、
ａ）１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）スキャフォールドを含む組成物にＭＳＣを接触させ、それにより細胞培養物を生成するステップであって、前記１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドがＥＧＦと融合している、ステップと、
ｂ）前記ＭＳＣが増殖する条件下に前記細胞培養物を維持するステップであって、それにより前記ＭＳＣを培養するステップと、
を含む、方法。
【請求項４５】
約３０，０００個のＭＳＣを、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合した前記組成物β−ＴＣＰスキャフォールドと接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＭＳＣが分化を起こす、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＭＳＣの分化をアッセイするステップをさらに含む、請求項４４、４５又は４８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＭＳＣが、ＭＳＣの対照培養物の増殖と比較して約２０％〜約６５％の増殖の増加を起こす、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞培養物が血清飢餓条件下で維持される、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞培養物が、増殖培地、骨形成培地又はそれらの組み合わせに維持される、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＭＳＣがヒトＭＳＣである、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記β−ＴＣＰ結合ペプチドが、アミノ酸配列：ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）又はそれらの組み合わせを含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６１／４１９，９４６号明細書の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の教示の全体が、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ：ＮＩＨ）により付与された補助金交付番号第６８９８３６０号及び第６９１７７９２号並びに米軍医科学研究所（Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＡＦＲＩＭＳ）により付与された補助金交付番号第６９１８００３号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ又はＢＴＣＰ）は、骨修復に幅広い用途を有する臨床的に重要な材料である。β−リン酸三カルシウムは、骨空洞を埋める外科手技で広く用いられており、創傷の幾可学的形状に容易に適合するパテ及びペーストなどの様々な整形外科用組成物における重要な材料として役立っている。医療用品としてのその継続的な進化は、直接的な化学表面修飾を許容しないその材料特性、及びその取扱いを制限するその物理的特性により制約されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、生物学的機能性を拡張し、且つ臨床成績を改善し得る分子表面処理の設計が可能となるようにＢＴＣＰの表面を修飾するための組成物及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、ＢＴＣＰ結合ペプチド（本明細書ではβＴＣＰｂｐ又はＢＴＣＰｂｐとも称される）の発見と、それに続く、ＢＴＣＰに対するさらなるタンパク質及び／又はペプチド（例えば上皮成長因子）の安定した表面係留を可能にするかかるペプチドの操作が記載される。
【０００７】
本明細書では、３Ｄ  ＢＴＣＰスキャフォールドで培養されるプライマリヒトＭＳＣの初期分化を損なうことのない増殖の増加をもたらす係留ＥＧＦを用いて本発明を例示する。また、係留ＥＧＦが、長期間にわたり血清飢餓条件下で培養されるＭＳＣに強い生存優位性を付与することも示す。本明細書に記載される組成物及び方法は、術後の創傷に存在し得る過酷な条件を模擬する。当業者は理解するであろうとおり、ここに記載する手法は、ＢＴＣＰの表面を様々なタンパク質又はペプチドで修飾して所望の表現型を実現するのに適し得る。
【０００８】
従って、一態様において本発明は、β−ＴＣＰ結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の全て又は一部を含む組成物に関する。本発明はまた、β−ＴＣＰ結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の全て又は一部を含む医薬組成物にも関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、β−ＴＣＰに係留されたタンパク質及び／又はペプチドを、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここでβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、さらなるタンパク質及び／又はペプチドと融合している。特定の態様において、本発明は、ＥＧＦを、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここでβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、ＥＧＦと融合している。
【００１０】
別の態様において、本発明は、必要としている個体において骨を修復する方法に関し、この方法は、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）スキャフォールドを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、ＥＧＦと融合している。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、必要としている個体においてＭＳＣ増殖を増加させる方法に関し、この方法は、ＭＳＣ及び１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、ＥＧＦと融合している。
【００１２】
別の態様において、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養する方法に関し、この方法は、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰスキャフォールドを含む組成物にＭＳＣを接触させ、それにより細胞培養物を生成するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、ＥＧＦと融合している。細胞培養物は、ＭＳＣが増殖する条件下で維持され、それによりＭＳＣが培養される。特定の態様において、ＭＳＣは分化を起こす。従って、この方法は、ＭＳＣの分化をアッセイするステップをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＢＴＸＩＩ結合ペプチド（ＴＣＰＢＰ）を使用したリガンド係留の概念を示す。コンストラクトＣ１からコイル領域を保持することにより、単一リガンド（図１Ａ）又は二価リガンド（図１Ｂ）のいずれの係留も可能である。コンストラクトＣ１は、ビオチン化配列及びエピトープタグが後に続くコイルドコイルドメインと融合したプロテアーゼ耐性親水性スペーサーアームと融合したＥＧＦドメインのヒト配列を含む。ＥＧＦは、任意のペプチド又はタンパク質に置き換えられてもよい。コイルドコイルドメインは、同種のコイルを含むリガンドによる二価構造の形成を可能にする。コイル配列は既発表の研究から選択しており、いくつかの研究者によってＫｄが１０−１５Ｍもの低さを示すことが報告されている（Ｍｏｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：６４９（２００１）；Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：１０１３６−１０１３７（２００５）；Ｓｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，５：１５３−１５８（２００６）。二価構造の形成は、強力に結合するコイルドコイル相互作用によって媒介される。これにより、様々な多価リガンド組成物の形成が可能となる。
【図１Ｂ】ＢＴＸＩＩ結合ペプチド（ＴＣＰＢＰ）を使用したリガンド係留の概念を示す。コンストラクトＣ１からコイル領域を保持することにより、単一リガンド（図１Ａ）又は二価リガンド（図１Ｂ）のいずれの係留も可能である。コンストラクトＣ１は、ビオチン化配列及びエピトープタグが後に続くコイルドコイルドメインと融合したプロテアーゼ耐性親水性スペーサーアームと融合したＥＧＦドメインのヒト配列を含む。ＥＧＦは、任意のペプチド又はタンパク質に置き換えられてもよい。コイルドコイルドメインは、同種のコイルを含むリガンドによる二価構造の形成を可能にする。コイル配列は既発表の研究から選択しており、いくつかの研究者によってＫｄが１０−１５Ｍもの低さを示すことが報告されている（Ｍｏｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：６４９（２００１）；Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：１０１３６−１０１３７（２００５）；Ｓｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，５：１５３−１５８（２００６）。二価構造の形成は、強力に結合するコイルドコイル相互作用によって媒介される。これにより、様々な多価リガンド組成物の形成が可能となる。
【図２Ａ】ＴｈｅｒｉＦｏｒｍ（商標）３ＤＰプラットフォームを示す；この略図は、一面に広げられ（ステージ１）、構築プラットフォーム上にある（ステージ２）生体材料の薄層を示す。生体材料にバインダーを、プログラムされた順序で目的の形に堆積させる。
【図２Ｂ】Ｔｈｅｒｉｃｓ  Ｔｈｅｒｉｌｏｋ（商標）β−ＴＣＰスキャフォールド（十字形の移植片）の写真及び走査型電子顕微鏡写真を示す。高倍率は、このようなスキャフォールドの詳細な細孔構造を示す。３ＤＰプラットフォームを使用して、十字形のＴＣＰ骨空洞充填材を作製した。移植片は約５×５×３ｍｍである。十字形は、個々のグラフトを相互にかみ合わせ、安定したグラフト充填を提供するのに役立つ。ＳＥＭ顕微鏡写真は、骨の内方成長、血液成分の吸上及び栄養素移動を促進する開放型の海綿状細孔構造を示す。移植片は約６０％の多孔性であり、約５〜約９００ミクロンの細孔範囲を有する。
【図３】ファージクローン配列の多重配列アラインメント（配列番号１〜２３）（左）及び連結ペプチドクローニングの態様（右）を示す。このアラインメントから、強いコンセンサス配列が直ちに明らかであった。２９個の配列中８個が同一であった（２８％）。陰影付きはＢＬＯＳＵＭ６２スコアに基づく。複数のＴＣＰＢＰ領域が連結することにより、β−ＴＣＰに対する親和性が増加した。フランキング配列を有しないプライマー内にＴＣＰＢＰコード領域全体を含むプライマーで連結多量体を生成することにより、ＰＣＲ反応毎の多重挿入クローンの作成を促進した。
【図４】ＴＣＰＢＰ結合の特性決定を示す。左側は、（ＴＣＰＢＰ）５−ＥＧＦ又はＴＣＰＢＰ領域のない対照タンパク質で処理した篩別後のＴＣＰ粉末に対するＴＣＰＢＰ−ＥＧＦ結合の免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡写真である。画像はいずれも３秒間の露光である。インキュベーションは、（ｉ）１０μＭ及び（ｉｉ）１μＭの（ＴＣＰＢＰ）５−ＥＧＦ、及び（ｉｉｉ）１０μＭの対照ＥＧＦで実施した。
【図５】ＴＣＰＢＰリピート数の増加に伴うＢＴＣＰに対するＴＣＰＢＰの親和性を示す。図５Ａは、３個、５個、及び１０個のＴＣＰＣＰ配列リピートを組み込むクローンをＴＣＰに対する結合についてアッセイしたものを示す。図５Ｂは、結合したタンパク質をスキャフォールドから溶離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法によりアッセイしたものを示す。図５Ｃは、免疫ブロット法のバンドのデンシトメトリーから、ＴＣＰＢＰリピート数が増加するに従い、同じインキュベーション濃度のＴＣＰＢＰについて回収されたタンパク質の量が増加することが明らかになったことを示す。図５Ｄは、リピート数に対してプロットしたフィッティング線の傾きから、ＴＣＰＢＰリピート数に対する強い依存が明らかであることを示す。
【図６】ＢＴＣＰに対する（ＴＣＰＢＰ）１０・ＥＧＦ親和性の定量を示す。図６Ａは、（ＴＣＰＢＰ）１０−ＥＧＦ及び対照ＥＧＦの２マイクロリットルの標準曲線希釈液をニトロセルロース膜に滴下し、ヤギ−ａ−ＥＧＦ一次抗体及びａ−ヤギ−ＩＲＤｙｅ８００二次抗体でプローブしたことを示す。図６Ｂは、スポット強度が検出までのタンパク質滴下量と相関したことを示す。（図６Ｃ）さらなる定量化に用いた線形範囲：０〜９００ｎｇ。
【図７】ＢＴＣＰに対する（ＴＣＰＢＰ）１０−ＥＧＦ親和性の定量を示す。図７Ａは、２マイクロリットルの溶離した（ＴＣＰＢＰ）１０−ＥＧＦ又は溶離した対照ＥＧＦをニトロセルロース膜に滴下し、ヤギ−ａ−ＥＧＦ一次抗体及びａ−ヤギ−ＩＲＤｙｅ８００二次抗体でプローブしたことを示す。溶離した対照タンパク質は検出されなかった。図７Ｂは、溶離したタンパク質画分を定量化し、インキュベーション濃度の関数としてプロットしたことを示す。２パラメータ結合モデルをこのデータにフィットした：見かけのＫｄ＝３．５ｍＭ、ヒル係数＝２．３、アビディティの指標。図７Ｃは、様々な（ＴＣＰＢＰ）１０−ＥＧＦ濃度におけるＢＴＣＰの結合能力を示す。この曲線は、適切なインキュベーション濃度の選択によるＢＴＣＰ上の（ＴＣＰＢＰ）１０−ＥＧＦ面密度の調整に用いることができる。
【図８】ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ベースの細胞増殖アッセイの標準曲線を示す。各培養条件下における細胞数とＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）蛍光との相関を用いて、７日までの各日数時点における３Ｄ培養の結果を較正した。骨形成培地で培養した細胞は、より小さい経時的傾きの変化を示した。
【図９】様々な細胞播種密度及びＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０係留濃度での３Ｄ  ＴＣＰスキャフォールドにおける増殖培地中のＭＳＣの増殖を示す。スキャフォールドはいずれもＥＸ培地でインキュベートし、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）ベースの細胞増殖アッセイを用いて終点エンドポイントでアッセイした。高い播種密度（５０Ｋ）での細胞増殖は、４日目に明確な最小値を示した。この効果は、播種密度が低下するに従い弱まった。細胞増殖は、全ての播種密度で表面ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０係留密度に対して二相性の関係を示した。試験した係留濃度は、２，０００個；４００個；及び６０個のＥＧＦ分子／μｍ２の表面密度に対応した；＊ｐ＝０．０５（対同日対照）、ｎ＝６、±ｓ．ｄ．
【図１０】３Ｄ  ＴＣＰスキャフォールド上でのＭＳＣの増殖を示す。ｔＥＧＦは、ＥＸ培地及びＯＳ培地の双方でＭＳＣ増殖を促進する。ＯＳ条件下では、ｔＥＧＦで処理したスキャフォールドで培養されたＭＳＣについて、７日目及び１４日目にそれぞれ６２％及び２５％の増加が観察された。ｎ＝６、±ｓ．ｄ．  ＊ｐ＝０．０５（対それぞれの対照）。
【図１１】アルカリホスファターゼ活性アッセイ（７日目）を示す。示される条件下で３Ｄ  ＴＣＰスキャフォールドにおいて培養したプライマリヒトＭＳＣのアルカリホスファターゼ活性を計測した。ｔＥＧＦ  ＯＳ条件で培養した細胞は、ＯＳ単独と同等のＡＬＰ活性を示した。重要なことに、ｓＥＧＦでは、ＡＬＰ活性の低下によりこの効果が損なわれた。ＯＳ  ｔＥＧＦは、ＥＸ対照又はＯＳ＋ｓＥＧＦとｐ＝０．０５で有意に異なった。ｎ＝３、±ｓ．ｄ．（ｓＥＧＦは、１ｎｇ／ｍＬの可溶性ＥＧＦであり、ｔＥＧＦは、先述のとおりＴＣＰＢＰで処理したＴＣＰである）。
【図１２】骨形成マーカーのｑＲＴ−ＰＣＲの経時変化を示す。４日目、７日目、及び１４日目における一組の４つの骨形成マーカー：オステオネクチン、オステオカルシン、オステリックス、及びＲＵＮＸ２に関するｑＲＴ−ＰＣＲデータから、初期骨形成分化マーカーの発現レベルに対する係留ＥＧＦの効果が示された。４つのマーカー全てが、ＥＸ対照と比べて１４日目に統計的に有意な上方制御を示す（ｐ＜０．０５）。ｎ＝３生物学的レプリケート及びｍ＝３技術的レプリケート、±ｓ．ｄ．
【図１３】血清飢餓下及びｔＥＧＦ下でのｈｔＭＳＣの長期生存を示す。図１３Ａは、（ＴＣＰＢＰ）５−ＥＧＦによるＢＴＣＰの表面処理が、Ｃｙｔｏｘ−１６核ＤＮＡ染色で分かるとおり無血清培地で２３日間培養したｈｔＭＳＣ細胞の生存を促進したことを示す。未処理のスキャフォールドは細胞残屑のエビデンスを示し、生細胞核は認められなかった。図１３Ｂは、（ＴＣＰＢＰ）５−ＥＧＦで処理したスキャフォールドのパラフィン包埋組織学的切片のヘキスト染色及びエオシン染色から、細胞の細孔構造深部への侵入及び生存ｈｔＭＳＣとの形態学的一致が示されたことを示す。未処理のスキャフォールドの組織学的分析からは、いかなる細胞内方成長も明らかでなかった。
【図１４Ａ−１】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ａ−２】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｂ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｃ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｄ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｅ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｆ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｇ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１４Ｈ】本明細書に記載されるポリペプチドの詳細な設計特徴を提供する。
【図１５】ＰＢＳ中に所定時間保存した後の３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドに係留した（係留濃度＝２．７ｕＭ）ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの定量を示す（ドットブロット定量法の詳細に関しては方法セクションを参照のこと）。ＰＢＳ中における種々の保存時間後にスキャフォールドに残るＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの量に統計的に有意な差はなかった（ｐ値＞０．０５、Ｎ＝４）ことから、ＰＢＳ中に５日間保存した後にも係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの有意な放出はなかったことが示される。時間＝０では、３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドあたりに係留されている平均質量の大きさは、９２２ナノグラムのＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦであった。
【図１６】ＰＢＳ中に所定時間保存した後の３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドに係留した（係留濃度＝３．８ｕＭ）ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの定量を示す（ドットブロット定量法の詳細に関しては方法セクションを参照のこと）。ＰＢＳ中における種々の保存時間後にスキャフォールドに残るＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの量に統計的に有意な差はなかった（ｐ値＞０．０５）ことから、ＰＢＳ中に５日間保存した後にも係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの有意な放出はなかったことが示される。時間＝０では、３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドあたりに係留されている平均質量の大きさは、８５２ナノグラムのＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦであった。
【図１７】ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦドットブロットの標準曲線を示す。０．１５６ｎｇ〜１０ｎｇの範囲の特定の量のＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦをニトロセルロース膜に滴下し、３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドに係留されたＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの分析用標準曲線を作成した。
【図１８】ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦドットブロットの拡張標準曲線を示す。０．３１２ｎｇ〜２０ｎｇの範囲の特定の量のＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦをニトロセルロース膜に滴下し、３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドに係留されたＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの分析用標準曲線を作成した。
【図１９】種々の時間点で係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを定量化する最初の実験のドットブロットを示す。上の画像は、各スポットの赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度値なしにドットブロットを示し、下の画像は上の画像と同じであるが、各スポットの赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度値を示す。バックグラウンド強度はスポットがない領域から取り、このブロットの強度値は２．７９であった。
【図２０】種々の時間点で係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを定量化する反復実験のドットブロットを示す。上の画像は、各スポットの赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度値なしにドットブロットを示し、下の画像は上の画像と同じであるが、各スポットの赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度値を示す。バックグラウンド強度はスポットがない領域から取り、このブロットの強度値は２．９５であった。
【図２１】図１８に示される拡張ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦドットブロット標準曲線に対応するドットブロットを示す。上の画像は、各スポットの赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度値なしにドットブロットを示し、下の画像は上の画像と同じであるが、各スポットの赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度値を示す。バックグラウンド強度はスポットがない領域から取り、このブロットの強度値は３．０５であった。このブロットの各スポットはデュプリケートで行った。
【図２２】ＭＳＣ増殖は１．８〜９ｕＭの間で増強されることから、９ｕＭを上回る係留は、それ以上増殖を増強しないと推測されることを示す。様々な濃度でＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを係留したＢＴＣＰスキャフォールドにＭＳＣを播種した。スキャフォールドはいずれもＥＸ培地でインキュベートし、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅベースの細胞増殖アッセイを用いて終点エンドポイントで増殖を計測した。＊ｐ＝０．０５（対０ｕＭ）、ｎ＝６、±ｓ．ｄ．
【図２３】ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦドットブロット標準曲線の５日間放出のグラフである。
【図２４】２４時間放出ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦドットブロット標準曲線のグラフである。
【図２５】Ｃ１コイル及びＣ２コイル及びそれらのそれぞれの電荷の説明である。
【図２６】ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１コイル−ＥＧＦがＢＴＣＰｂｐ−Ｃ２コイル−ＥＧＦより良好に３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドに結合することを示すグラフである。
【図２７】アビディティによるＢＴＣＰとのＢＴＣＰｂｐ結合において役割を果たすＣ１／Ｃ２コイルドコイルのホモ二量体化／多量体化の略図である。
【図２８】臨床的に関連性のある（ＣＲ）バージョンのＢＴＣＰｂｐ−ＥＧＦ融合物の設計を示す図である。
【図２９】臨床的に関連性のあるバージョンから取り除かれる潜在的な免疫原性ドメインを示す図である。
【図３０】ＢＴＣＰｂｐのコイルドコイルリンカーを介した相互作用に起因するＴＣＢＰｂｐの滞留時間の増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書には、ＢＴＣＰ結合ペプチド又はタンパク質の発見が記載される。この問題に対処するためにとられた手法は、ファージディスプレイを用いて、ＢＴＣＰとの強力な結合を示すペプチド配列を発見することであった（Ｗｈａｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，６６５−６６８（２０００）；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ａ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ４，４９６−５０２（２００５）；Ｋｅｎａｎ，ＤＪ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，６９５−７００（２００６））。また、本明細書には、ＢＴＣＰ基材に対するタンパク質リガンドの強力な結合をもたらす融合パートナーとしての、ファージディスプレイにより発見された配列の使用も記載される。本発明の詳細な態様は図１に示され、それには単一リガンド設計及び多価（例えば二価）リガンド設計による特徴が含まれる。
【００１５】
組成物
従って、一態様において本発明は、β−ＴＣＰ結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の全て又は一部を含む組成物に関する。他の態様では、本発明は、β−ＴＣＰ結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の全て又は一部から本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。
【００１６】
リン酸三カルシウムＣａ３（ＰＯ４）２を焼結すると、その構造がβ−ＴＣＰに変換される。本明細書で使用されるとき、「β−ＴＣＰ」、又は「ＢＴＣＰ」は、低ｐＨに容易に溶解することにより骨石灰化を補助し、且つ細胞が付着する剛性基材として働く骨誘導性材料を指す（Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８６，１５４１−１５５８（２００４）；Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｊｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｆ．，Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，Ｃ．Ｂ．＆  Ｉｓａｄｏｒ，Ｈ．脊椎固定を促進するためのヒト骨髄骨芽前駆体の術中採取及び濃縮（Ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈａｒｖｅｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ）．Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００４））。Ｍｕｓｃｈｌｅｒらはこれを自家採取骨髄と併せて使用することで転帰を改善している。この種の手技では、ＢＴＣＰを骨髄穿刺液でフラッシュすることによりＭＳＣが播種され、骨形成がさらに促進される（Ｆｌｅｍｉｎｇ  Ｊｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｆ．，Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，ｃ．Ｂ．＆  Ｉｓａｄｏｒ，Ｈ．脊椎固定を促進するためのヒト骨髄骨芽前駆体の術中採取及び濃縮（Ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈａｒｖｅｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ）．Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００４））。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「骨誘導性材料」には、骨格の形成を促進する（例えば骨移植片）；骨細胞がそこに付着し、移動し、成長し、且つ分裂することができる構造として機能する能力を有する；骨石灰化を補助する等の材料が含まれる。
【００１８】
当業者により理解されるであろうとおり、β−ＴＣＰは様々な形態で使用することができる。かかる形態の例としては、顆粒形態、多孔質形態、粉末、パテ（例えば、成形用パテ）、ペースト及び／又はスキャフォールドが挙げられる。加えて、β−ＴＣＰは様々な形状（例えば、十字形、梯子形、円形、四角形、三角形等）及びサイズ（例えば、約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ等）で使用することができる。詳細な実施形態において、β−ＴＣＰは、多孔質（例えば、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％）である。他の実施形態において、β−ＴＣＰは、約２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ）の細孔径を有する。一態様において、β−ＴＣＰは、約６０ミクロンの平均細孔直径及び約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００ミクロンの細孔直径範囲を有する約６０％の多孔性である。加えて、及び当業者により理解されるであろうとおり、ＢＴＣＰはプロゲン（ｐｒｏｇｅｎ）などのさらなる要素を含んでもよい。プロゴゲン（ｐｒｏｇｏｇｅｎ）の例はスクロースである。
【００１９】
本明細書で使用されるとき「β−ＴＣＰ結合ペプチド」（又は「ＴＣＰＢＰ」）は、β−ＴＣＰに特異的に結合するペプチドである。一態様において、β−ＴＣＰ結合ペプチドはβ−ＴＣＰと強く結合し、又はβ−ＴＣＰに対して高親和性を有する。本明細書で使用されるとき、「高親和性」は、約３μｍ、２．８μｍ、２．６μｍ、２．４μｍ、２．２μｍ、２．０μｍ、１．８μｍ、１．６μｍ、１．４μｍ、１．２μｍ、１．０μｍ、０．８μｍ、０．６μｍ、０．４μｍ、０．２μｍ、１００ナノモル、８０ｎｍｏｌ、６０ｎｍｏｌ、４０ｎｍｏｌ、２０ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、８００ピコｍｏｌ、６００ピコｍｏｌ、４００ピコｍｏｌ、２００ピコｍｏｌ、１００ピコｍｏｌ、８０ピコｍｏｌ、６０ピコｍｏｌ（ｐｉｃｏｎｍｏｌ）、４０ピコｍｏｌ、２０ピコｍｏｌ、１０ピコｍｏｌ又は１ピコｍｏｌの結合親和性を指す。特定の態様において、結合定数ｋＤは、（ＴＣＰＢＰ）１０について２．３ｕＭである。
【００２０】
当業者により理解されるであろうとおり、より高い親和性は、ポリペプチドを修飾してその結合パートナーに対するその親和性を増加させることにより達成することができる。例えば、組成物に対するβ−ＴＣＰ結合ペプチドの付加；１つ又は複数のβ−ＴＣＰ結合ペプチド又はβ−ＴＣＰ結合ペプチド間の１つ又は複数のリンカー（例えば、各β−ＴＣＰ結合ペプチド間の少数のアミノ酸を使用）の特異的突然変異生成；及び／又はエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、それによるペプチドの可動性を高める配列の導入）を用いて、より高い親和性を達成することができる。
【００２１】
一態様において、β−ＴＣＰ結合ペプチドはβ−ＴＣＰに非共有結合的に結合する。他の態様では、β−ＴＣＰ結合タンパク質はまた、（１つ以上の）さらなるタンパク質及び／又はペプチドとの結合能（例えば融合能）を有し、例えばそれによりさらなる（１つ以上の）タンパク質及び／又はペプチドをβ−ＴＣＰに係留する。
【００２２】
詳細な態様では、β−ＴＣＰ結合ペプチドは、アミノ酸配列ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、又はＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）を含む。
【００２３】
他の態様では、β−ＴＣＰ結合ペプチドは、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、又はＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
β−ＴＣＰの全て又は一部と結合するβ−ＴＣＰ結合ペプチドの一部分もまた、本明細書に提供される組成物及び方法において使用することができる。かかる一部分は、β−ＴＣＰの全て又は一部と結合するβ−ＴＣＰ結合ペプチドの一部分を含む。詳細な実施形態において、β−ＴＣＰ結合ペプチドのこの一部分はまた、（１つ以上の）さらなるタンパク質及び／又はペプチドとの結合能（例えば融合能）も有し、例えばそれによりさらなる（１つ以上の）タンパク質及び／又はペプチドをβ−ＴＣＰに係留する。例えば、当業者により理解されるであろうとおり、β−ＴＣＰ結合ペプチドの一部分には、本明細書に提供される配列（例えば、配列番号１〜２２）の一つを含むペプチドであって、（１つ以上の）Ｎ末端又は（１つ以上の）Ｃ末端アミノ酸が取り除かれているペプチドが含まれる。
【００２５】
当業者には明らかであろうとおり、β−ＴＣＰペプチドの配列の変異体を、本明細書に提供される組成物及び方法において使用することができる。かかる変異体は、対立遺伝子変異又は一塩基変異多型の場合など、天然に存在する変異体であってもよく、又は様々な突然変異原及び変異原性過程により誘導されるものなど、天然に存在しない変異体であってもよい。対象となる変異としては、限定はされないが、保存的又は非保存的なアミノ酸変化、例えば付加及び欠失をもたらし得る１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の付加、欠失、及び置換が挙げられる。好ましくは、アミノ酸変化はサイレントであるか、又は保存的であり；すなわち、アミノ酸変化によってβ−ＴＣＰ結合ペプチドの特性又は活性が変わることはない。例えば、対応する残基との保存的置換であるアミノ酸残基は、置換された残基と物理的又は機能的に同様であり、例えば、同様のサイズ、形状、電荷、化学的性質（すなわち共有結合又は水素結合の形成能）を有する。保存的置換は、典型的には、あるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に置換することを含み、例えば以下の群の範囲内での置換である：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン（ａｓｐａｒｇｉｎｅ）、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【００２６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるとおりの（１つ以上の）単離β−ＴＣＰ結合ペプチド、その一部分及びその変異体を含む、それから本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。「単離された」は、臓器、生体、組織、血液、又は培養培地から単離されるなど、ＢＴＣＰｂｐが存在する複合体（例えば細胞）環境に対して実質的に単離されているＢＴＣＰｂｐを指す。ある場合には、単離材料はまた、組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出物）、緩衝液系、培養系又は試薬混合物の一部を形成し得る。他の状況では、材料は本質的に均一になるまで精製され得る。
【００２７】
詳細な態様では、本発明は、アミノ酸配列ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、又はＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）、その一部分及び変異体を含むβ−ＴＣＰ結合ペプチドを含む、それから本質的になる、又はそれからなる組成物に関する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号２）、ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号６）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号７）、ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）、ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）、ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、又はＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離β−ＴＣＰ結合ペプチドに関する。
【００２９】
β−ＴＣＰ結合ペプチドのかかる一部分及び変異体は、本明細書に提供される指針及び当業者に公知のルーチン技術を用いて作製することができる。加えて、本明細書に提供される指針及び当業者に公知のルーチン技術を用いて、β−ＴＣＰ結合ペプチドのかかる一部分及び変異体を、β−ＴＣＰとの結合（例えば特異的結合）について評価することができる。結合を検出するアッセイの例としては、抗体ベースのアッセイ、細胞ベースのアッセイ（例えば、増殖アッセイ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｓａｙ））、ラジオイムノアッセイ、及びカイザータンパク質アッセイが挙げられる。
【００３０】
当業者により理解されるであろうとおり、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドを１つ以上のβ−ＴＣＰに結合させることができる。一部の態様では、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合タンパク質が単一のβ−ＴＣＰに結合する。他の態様では、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合タンパク質が１つ以上のβ−ＴＣＰに結合する。詳細な態様では、本発明は、少なくとも２つの単位リピート（繰り返し単位）を含む連結多量体又は連結リピートの組成物に関し、ここで各単位は、β−ＴＣＰと結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドを含む（図３を参照）。当業者により理解されるであろうとおり、単一の連結多量体の各リピート単位において同じβ−ＴＣＰ結合ペプチドがβ−ＴＣＰと結合することができる。或いは、単一の連結多量体においてβ−ＴＣＰと結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、各単位によって異なるものを含んでもよく、又は単一の連結多量体において一部の単位が有するβ−ＴＣＰと結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドが同じものであってよく、且つ他の単位が有するβ−ＴＣＰと結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドが異なるものであってもよい。一部の態様では、組成物は、β−ＴＣＰに結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドを約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０リピート（単位）含む連結多量体である。特定の態様において、組成物は、β−ＴＣＰに結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドを１０リピート含む連結多量体である。
【００３１】
本明細書に示されるとおり、本組成物は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと融合した１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質をさらに含むことができる。すなわち、一態様において組成物は、β−ＴＣＰ結合ペプチドの全て又は一部と結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の全て又は一部を含み、ここでβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合している（それにより、一価又は多価（例えば、二価、三価）の設計をもたらす。従って、詳細な態様では、β−ＴＣＰに結合しているβ−ＴＣＰ結合ペプチドと、１つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドとの間に融合タンパク質が作成され、それによりさらなる１つ以上のタンパク質又はペプチドがβ−ＴＣＰに係留される。他の態様では、組成物は、１つ以上のさらなるペプチド又はタンパク質と融合したＢＴＣＰｂｐの全て又は一部を含む。
【００３２】
当業者により理解されるであろうとおり、様々なタンパク質及び／又はペプチドをβ−ＴＣＰ結合ペプチドと融合することができる。さらなるタンパク質及び／又はペプチドは、β−ＴＣＰ結合ペプチドのＮ末端側端部、β−ＴＣＰ結合ペプチドのＣ末端側端部又はβ−ＴＣＰ結合ペプチド内のいずれかに融合することができる。かかるタンパク質及びその一部分（例えばペプチド）の例としては、成長因子（例えば、上皮成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ（ＴＧＦ−α；ＴＧＦ−β））、サイトカイン（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ホルモン、インスリン、及び酵素が挙げられる。具体的な例としては、ヘレグリン、ニューレグリン（ＮＲＧ、例えばＮＲＧβ１）、形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）、骨形成タンパク質（ＯＰ、例えばＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、マトリックス結合タンパク質、例えばヒアルロン酸結合タンパク質、及びコラーゲン結合タンパク質が挙げられる。一態様において、さらなるタンパク質は上皮成長因子（ＥＧＦ）である。特定の態様において、組成物は、β−ＴＣＰに結合したβ−ＴＣＰ結合ペプチドを１０リピート含む連結多量体であり、ここで各β−ＴＣＰ結合タンパク質はＥＧＦと結合している。
【００３３】
詳細な態様では、組成物は二価リガンド係留を提供する。例えば、一部の態様では、この設計により、同じタンパク質又はペプチドの二価係留（例えば、二価ＥＧＦ（２個のＥＧＦ）、二価ＮＲＧ（２個のＮＲＧ））、及び／又は異なるタンパク質又はペプチドの二価係留（例えば、二価ＥＧＦ−ＮＲＧ）が可能となる。
【００３４】
分化能を損なうことなく前駆細胞集団を拡大する能力は、再生医学の主要な目的の一つであり、重要な臨床的意義を有する。多くの手技が自家ＭＳＣ移植に頼るため、患者の天然の前駆細胞集団を増加させて骨創傷治癒を改善することは、重要な目的である。
【００３５】
多くの研究が、インビトロ及びインビボでの組織に対するＥＧＦの効果を特徴付けている。ＥＧＦは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のカノニカルなリガンドであり、この経路を誘導すると、増殖（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １５，２４５２−２４６７（１９９６）；Ｔｚａｈａｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，５２７６−５２８７（１９９６）；Ｔａｍａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，６８６（２００６）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｌ．Ｇ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９６１，８３−９５（２００２）；Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８６，１５４１１５５８（２００４）；Ｂｕｂｌｉｌ，Ｅ．Ｍ．＆  Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９，１２４−１３４（２００７）；Ｃｉｔｒｉ，Ａ．＆  Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ７，５０５−５１６（２００６））、移動（Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ，ＰＪ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２，６９−７３（１９９９）；Ｇｉｂｂｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ８，１９２−２０３（２０００）；Ｔｏｋｕｍａｒｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５１，２０９−２２０（２０００）；Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７６，２８１４−２８２３（１９９９））、恒常性（Ｔａｍａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，６８６（２００６））、及び他のリガンドと共に投与されたときの相乗効果により生じる分化（Ｔｒａｖｅｒｓｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，６９４−７０１（１９９４）；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｍ．Ｃｅｌｌ  ８７，６５１−６６０（１９９６）；Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ，ＰＪ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１２７（１９９９））を生じさせることができる。このリガンドの広範な効果は、下流シグナル伝達ネットワークの多様性によるもので、従ってＥＧＦは創傷治癒のコンテキストにおいて重要な刺激である。ＭＳＣでは、ＥＧＦは、コンテキスト特異的な形で複数の細胞挙動に影響を及ぼすことが示されている。ＥＧＦは、増殖（Ｔａｍａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，６８６（２００６））、骨形成分化（Ｋｒａｔｃｈｍａｒｏｖａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌ．３０８  １４７２−１４７７（米国科学振興協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），２００５））、及び生存（Ｆａｎ，Ｖ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，１２４１（２００７））を促進することができる。創傷治癒コンテキストでは、ＥＧＦは、術後の骨の発育及び恒常性につながる重要な手がかりとして働き得る（Ｗａｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ��ｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９，５３８４８（２００４）；Ｓｉｂｉｌｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０，４５１５−４５２５（２００３）；Ｑｉｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８０，３９７４（２００５）；Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｙ．＆  Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５，３８６９３−３８６９８（２０００））。ＥＧＦはまた、ＭＳＣ挙動の制御因子としての役割を果たすことも示されており（Ｋｒａｔｃｈｍａｒｏｖａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌ．３０８  １４７２−１４７７（米国科学振興協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），２００５）；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９７，５６１−５７０（１９９７）；Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６９，９−１２（１９８８）；Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｓ．＆  Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．Ｂｌｏｏｄ  ８５，９２９−９４０（１９９５）；Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．，骨髄ＣＦＵ−Ｆの骨形成分化のインビトロクローン解析（Ｃｌｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｒｏｗ  ＣＦＵ−Ｆ），Ｖｏｌ．８７  ７３１−７３８（１９８７）；Ｓａｔｏｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １７７，４２６−４３８（１９９８））、分化を誘導することなくＭＳＣの増殖を生じさせることができる（Ｔａｍａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，６８６（２００６））。
【００３６】
ＥＧＦを空間的に制御された形で傷害部位へと、特に臨床的に重要な基材上で送達する実行可能な方法なしには、これらの効果の臨床的有用性を完全に利用することはできない。一つのかかる臨床的に重要な基材はＢＴＣＰであり、これは整形外科手技でルーチンに使用されている（Ｅｒｂｅ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  １０，Ｓ１４１−１４６（２００１））。
【００３７】
ＢＴＣＰの固有の特性は多くの臨床応用で骨折治癒機転に有利に働くが、移植時に骨形成成長因子ＢＭＰ−２及びＯＰ−１をＢＴＣＰスキャフォールドに加えると、実験動物モデル及び臨床応用の双方で治癒が促進される（Ｆｒｉｅｄｌａｅｎｄｅｒ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌ．８３  １５１−１５８（ＪＢＪＳ，２００１））。本明細書に示されるとおり、幹細胞及び／又は前駆細胞の供給源（例えば骨髄穿刺液）を加えて骨形成原細胞の局所的な不足を解消する場合、係留された成長因子、例えばＥＧＦの提示により細胞生存が亢進され、初期前駆細胞の増殖が刺激されたことで、例えばＢＭＰ活性の上流のその部位に細胞が集中した（Ｆａｎ，Ｖ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，１２４１（２００７）；Ｍａｒｃａｎｔｏｎｉｏ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０（２７），４６２９−２６３８（２００９）；Ｐｌａｔｔ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００９））。ＢＴＣＰに対するＰＤＧＦの物理吸着は、インビトロでＢＴＣＰスキャフォールド上の骨形成原細胞の増殖を亢進することが示されているが、インビボでの成長因子の喪失は、インビトロで観察されるその喪失よりはるかに速い（Ｂａｔｅｍａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ７６，１８３３−１８４１（２００５））。本明細書に示されるとおり、整形外科手技用の既存の基材としてのＢＴＣＰの有用性は、ＥＧＦなどの生物活性成分のβ−ＴＣＰに対する安定した付着を可能にする本明細書に記載される表面処理を用いて増強される。
【００３８】
ＢＴＣＰｂｐは１つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドと、直接、又はリンカーの使用によって、融合することができる。当業者により理解されるであろうとおり、様々なリンカーを使用することができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照。好適なリンカーの例としては、コイルドコイルリンカー（例えば、ロイシンジッパーコイルドコイル）が挙げられる。本明細書に示されるとおり、本組成物で使用されるリンカーの具体例として、コイルＣ１又は「ＲＲ」及びコイルＣ２又は「ＥＥ」が挙げられる。ＲＲ又はＣ１は、アミノ酸配列ＫＧＧＧＬＥＩ  ＲＡＡＦＬＲＲ  ＲＮＴＡＬＲＴ  ＲＶＡＥＬＲＱ  ＲＶＱＲＬＲＮ  ＩＶＳＱＹＥＴ  ＲＹＧＰＬ（配列番号３２）を含み、ＥＥ又はＣ２は、アミノ酸配列ＬＥＩＥＡＡＦＬＥＱＥＮＴＡＬＥＴＥＶＡＥＬＥＱＥＶＱＲＬＥＮＩＶＳＱＹＥＴＲＹＧＰＬＧＧＧＫ（配列番号３３）を含む。コイルＣ１は、１０−１５モル濃度のＣ２に対する結合親和性を有する。これらの配列の末端リジン（ｋ）は必須ではなく、共役化学を可能にするために付加した。Ｓｔｅｖｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８６（３１），２７７２９−２７７４０（２０１１年８月５日）及びＭｏｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０，６４９（２００１）を参照のこと。
【００３９】
本明細書にさらに示されるとおり、本組成物は、さらなる成分又は薬剤（例えば生物活性剤）をさらに含み得る。例えば、組成物は、組成物に剛性又は柔軟性を付与するアミノ酸配列などのスペーサーをさらに含み得る。当業者には明らかであろうとおり、本明細書に記載される組成物では様々なスペーサーを使用することができる。本明細書に記載されるとおりのスペーサーの例は、アミノ酸配列：ＡＳＧＡ  ＧＧＳＥ  ＧＧＧＳＥ  ＧＧＴＳ  ＧＡＴＧＡ（配列番号３４）を含む可動性のプロテアーゼ耐性リンカーである。これは、最大限の可動性をもたらす親水性のプロテアーゼ耐性非剛体スペーサーである。
【００４０】
本明細書に記載されるとおり、一態様において本発明は、ＢＴＣＰに結合したＢＴＣＰｂｐの全て又は一部を含む組成物に関し、ここでＢＴＣＰｂｐは、１つ以上のさらなるペプチド（タンパク質）と融合（結合）していてもよい。他の態様では、本発明は、１つ以上のさらなるペプチド（タンパク質）と融合（結合）したＢＴＣＰｂｐの全て又は一部を含む組成物に関する。当業者により理解されるであろうとおり、この組成物の構造は様々な形態をとり得る。例えば、一態様では、組成物の様々な構成要素を以下の方法で、又は以下の順序で連結し得る：（ｉ）ＢＴＣＰ−（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ、式中、ｎはＢＴＣＰＢｐの数（１以上）である；（ｉｉ）ＢＴＣＰ−（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｉｉｉ）ＢＴＣＰ−（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−リンカー−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｉｖ）ＢＴＣＰ−（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−スペーサー−リンカー−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｖｉ）ＢＴＣＰ−（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−スペーサー−リンカー−スペーサー−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｖｉｉ）（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｖｉｉｉ）（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−リンカー−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｉｘ）（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−スペーサー−リンカー−（タンパク質又はペプチド）ｎ；（ｘ）（ＢＴＣＰｂｐ）ｎ−スペーサー−リンカー−スペーサー−（タンパク質又はペプチド）ｎ等。
【００４１】
詳細な態様では、本発明は、配列番号２９を含む組成物、配列番号３０を含む組成物及び配列番号３１を含む組成物に関する。
【００４２】
加えて、本組成物は、１つ以上のさらなる配列（例えば、プロテアーゼ耐性配列、制限酵素認識部位；挿入部位、スプライシング領域など）、細胞型又は組織をさらに含むことができる。細胞及び／又は組織は、哺乳動物起源（例えば、ヒトなどの霊長類）、細菌起源（例えば、有益細菌）などであってもよい。かかる細胞型の例としては、前駆細胞（例えば、脂肪由来前駆細胞）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ））、骨髄細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、上皮細胞、線維芽細胞、及び神経細胞（例えば、神経幹細胞）が挙げられる。かかる組織の例としては、骨髄、結合組織（例えば、腱、軟骨、靱帯）、自家骨、皮膚、及び骨膜（ｐｅｒｉｏｓｔｉｕｍ）が挙げられる。詳細な態様では、ヒト細胞及び／又は組織が用いられ、さらに別の態様では、自家性ヒト細胞及び／又は組織が用いられる。
【００４３】
同様に本明細書で示されるとおり、本発明の組成物は、約１０００ＥＵ／ｍｇ、９００ＥＵ／ｍｇ、８００ＥＵ／ｍｇ、７００ＥＵ／ｍｇ、６００ＥＵ／ｍｇ、５００ＥＵ／ｍｇ、４００ＥＵ／ｍｇ、３００ＥＵ／ｍｇ、２００ＥＵ／ｍｇ、１００ＥＵ／ｍｇ、５０ＥＵ／ｍｇ、又は４０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシン値で得ることができる。一実施形態において、組成物は、約３８．９ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン値で得ることができる。
【００４４】
作製方法
β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を含む組成物、及びβ−ＴＣＰ結合ペプチドと融合した１つ以上のさらなるタンパク質又はペプチドをさらに含む組成物の作製は、本明細書に記載される方法及びルーチン技術を用いて実施することができる。例えば、本明細書に記載されるとおり、β−ＴＣＰスキャフォールドを作成するため、顆粒化したβ−ＴＣＰ粉末を焼結し、篩別し、十字の形に加工した。詳細な態様では、β−ＴＣＰの純度は、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％純度である。他の態様では、β−ＴＣＰは同様の方法を用いて、しかしポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）などの他の薬剤との複合材として作られる。
【００４５】
当業者には明らかであろうとおり、本組成物は、本明細書においてポロゲンと称される１つ以上の細孔形成剤をさらに含むことができる。ポロゲンの例としては、塩化ナトリウムなどの無機塩類、糖類（例えば、スクロース、グルコース）、ゼラチン（例えば、ゼラチン球）、又はパラフィン（例えばパラフィン球）が挙げられる。
【００４６】
β−ＴＣＰ結合ペプチドとさらなるタンパク質又はペプチドとの間に融合タンパク質を作成する方法もまた、当業者に周知されている。例えばこれは、（１つ以上の）さらなるタンパク質又はペプチドをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ）を、（１つ以上の）β−ＴＣＰ結合ペプチドをコードする核酸を含むフレームにおいて発現ベクターにクローニングすることにより達成することができる。
【００４７】
当業者には明らかであろうとおり、様々なリンカーを用いて、β−ＴＣＰ結合ペプチドをさらなるタンパク質及び／又はペプチドと融合させてもよい（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照のこと。好適なリンカーの例としては、コイルドコイルリンカー（例えば、ロイシンジッパーコイルドコイル）が挙げられる。
【００４８】
β−ＴＣＰ結合ペプチドとさらなるタンパク質又はペプチドとの間の融合タンパク質のβ−ＴＣＰ上への係留は、例えば、β−ＴＣＰを融合タンパク質と接触させて（例えばインキュベートして）組み合わせを生成し、融合タンパク質のβ−ＴＣＰ結合タンパク質がβ−ＴＣＰに結合する条件下でその組み合わせを維持することにより、達成することができる。
【００４９】
医薬組成物
本発明はまた、医薬組成物にも関する。一態様において、この医薬組成物は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を含む。別の態様において、医薬組成物は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を含み、ここでさらなるタンパク質又はペプチドがβ−ＴＣＰ結合ペプチドと融合している。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を含み、ここでさらなるタンパク質又はペプチドがβ−ＴＣＰ結合ペプチドと融合しており、及びＭＳＣをさらに含む。β−ＴＣＰ結合ペプチドを含む医薬組成物もまた含まれる。当業者により理解されるであろうとおり、医薬組成物は、医薬組成物を調製する生理学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に製剤化することができる。担体及び組成物は無菌であってよい。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。
【００５０】
好適な薬学的に許容可能な担体としては、限定はされないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロース又はデンプンなど、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。医薬製剤は、必要であれば、活性化合物と有害に反応することのない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、香味料及び／又は芳香物質などと混合されてもよい。
【００５１】
本組成物は、必要であれば、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含み得る。組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は散剤であってもよい。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体と共に、坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含み得る。
【００５２】
このような組成物の導入方法としては、限定はされないが、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内が挙げられる。本発明の医薬組成物はまた、他の化合物との併用療法の一部として投与されてもよい。
【００５３】
組成物は、ルーチン手順に従い、ヒトへの投与に適した医薬組成物として製剤化することができる。例えば、静脈内投与用の組成物は、典型的には滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位の痛みを緩和する局所麻酔薬も含み得る。概して、成分は、例えば活性化合物の量を指示するアンプル又はサシェットなどの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水不含の濃縮物として、単位投薬形態で個別に供給されるか、或いは合わせて混合される。組成物が点滴投与される場合、組成物は、滅菌医薬品グレード水、生理食塩水又はデキストロース／水が入った輸液ボトルで分注することができる。組成物が注射投与される場合、成分を投与前に混合し得るように、滅菌注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００５４】
局所適用には、局所適用に適合し、且つ好ましくは水より高い動粘度の担体を含む噴霧不可能な形態、粘性乃至半固形又は固形形態が用いられ得る。好適な製剤としては、限定はされないが、溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、粉末、浣腸、ローション、ゾル、リニメント剤、軟膏、エアロゾル等が挙げられ、これは必要であれば、滅菌され、又は助剤、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液又は浸透圧に影響を及ぼす塩等と混合される。化合物は、化粧品製剤中に組み込まれてもよい。局所適用には、噴霧可能なエアロゾル製剤もまた好適であり、ここで活性成分は、好ましくは固体又は液体の不活性担体材料との組み合わせで、スクイーズボトル中に、又は加圧揮発分、通常はガス噴射剤、例えば加圧空気と混合されてパッケージされる。
【００５５】
本明細書に記載される化合物は、中性形態又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの遊離アミノ基で形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの遊離カルボキシル基で形成されるものが含まれる。
【００５６】
化合物は、治療有効量で投与される。特定の障害又は病態の治療において治療上有効となり得る化合物の量は、障害又は病態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、場合によりインビトロ又はインビボアッセイを用いることにより、最適な投薬量範囲の同定を促進し得る。製剤中に用いられる正確な用量もまた、投与経路、及び治療する病態の症状の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導き出される用量反応曲線から推定され得る。
【００５７】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬品パック又はキットも提供する。場合により、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって規定された形式の通知が、１つ又は複数のかかる容器に付随してもよく、この通知は、その機関によってヒト投与向けの製造、使用又は販売が承認されていること示す。パック又はキットには、投与方法、薬物投与順序（例えば、個別的、逐次的又は同時）などに関する情報が表示され得る。パック又はキットは、併用療法の単一の単位投薬量であってもよく、又は複数の単位投薬量であってもよい。特に、化合物は、分けられ、任意の組み合わせで共に混合され、単一のバイアル又は錠剤に存在し得る。ブリスターパック又は他の分配手段にまとめられた化合物が好ましい。本発明の目的上、単位投薬量とは、各化合物の個別的な薬力学に依存する、且つ標準的な時間的経過においてＦＤＡ承認済みの投薬量で投与される投薬量を意味することが意図される。
【００５８】
使用方法
本明細書に提供される組成物はまた、様々な方法で使用することができる。一態様において、本発明は、タンパク質及び／又はペプチド（例えば、ＥＧＦ、ＢＭＰ−２、ＯＰ−１）を、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合した１つ以上のβ−ＴＣＰを含む組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、送達しようとするタンパク質及び／又はペプチドと融合している。特定の態様において、本発明は、ＥＧＦを、それを必要としている個体に送達する方法に関し、この方法は、β−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここでβ−ＴＣＰ結合ペプチドはＥＧＦと融合している。組成物は、例えば、骨損傷などの創傷部位に投与され得る。この方法は、ＭＳＣを個体に投与するステップをさらに含み得る（例えば、約１００〜約１，０００，０００ＭＳＣ／組成物の細胞播種密度で投与される）。ＭＳＣは、例えば、別個に送達されても、又はβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰを含む組成物上に播種されてもよい。
【００５９】
別の態様において、本発明は、必要としている個体において骨を修復する方法に関し、この方法は、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）スキャフォールドを含む組成物を個体に投与するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドはＥＧＦと融合している。この方法は、個体にＭＳＣを投与する（例えば、自家骨移植を受けている個体に自家ＭＳＣを投与する）ステップをさらに含むことができる。本明細書で使用されるとき、骨の修復には、新生骨及び／又は軟骨の形成が含まれる。
【００６０】
さらに別の態様において、本発明は、必要としている個体においてＭＳＣ増殖を増加させる方法に関し、この方法は、ＭＳＣ及び１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰを含む組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドはＥＧＦと融合している。
【００６１】
本明細書において考察されるとおり、β−ＴＣＰは生体内で骨誘導性材料として使用されており、従って、本組成物をそれを必要としている個体に送達する方法は、当業者には明らかであろう。例えば、組成物は、それを必要としている個体に外科的に移植されても、又は注入されてもよい。組成物は、典型的には治療有効量（すなわち、疾患に関連する症状を軽減し、疾患の発生を予防し又は遅延させ、及び／又は、また疾患の症状の重症度又は頻度を低下させることによるなど、疾患を治療するのに十分な量）で投与される。特定の個体の障害又は病態の治療において治療上有効となり得る量は、疾患の症状及び重症度に依存し、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、場合によりインビトロ又はインビボアッセイを用いることにより、最適な投薬量範囲の同定を促進し得る。製剤中に用いられる正確な用量もまた、投与経路、及び疾患又は障害の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導き出される用量反応曲線から推定され得る。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、個体とは、動物、及び詳細な態様では哺乳動物を指す。哺乳動物の例としては、霊長類（例えばヒト）、イヌ科動物（例えば飼いイヌ）、ネコ科動物（例えば飼いイヌ）、げっ歯類（例えばマウス、ラット）、ウマ科動物（例えばウマ）、ウシ亜科動物、ヒツジ属動物（ｏｒｖｉｎｅ）などが挙げられる。
【００６３】
別の態様において、本発明はＭＳＣを培養する方法に関し、この方法は、１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドと結合したβ−ＴＣＰスキャフォールドを含む組成物にＭＳＣを接触させ、それにより細胞培養物を生成するステップを含み、ここで１つ以上のβ−ＴＣＰ結合ペプチドは、ＥＧＦと融合している。この方法では、ＭＳＣの様々な播種密度を用いることができる。この方法で用いられる播種密度の例としては、約１０００；５０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７５，０００；８０，０００；８５，０００；９０，０００；９５，０００；又は１００，０００細胞の播種密度が挙げられる。
【００６４】
細胞培養物は、ＭＳＣが増殖する条件下で維持され、それによりＭＳＣが培養される。特定の態様においてＭＳＣは分化を起こす。従って、この方法は、ＭＳＣの分化をアッセイするステップをさらに含み得る。詳細な態様では、ＭＳＣは、対照ＭＳＣ培養物の増殖と比較して約２０％〜約６５％の増殖の増加を起こす。詳細な態様では、ＭＳＣは、対照ＭＳＣ培養物の増殖と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％の増殖の増加を起こす。ＭＳＣが増殖する条件下での細胞培養物の維持には様々な方法を用いることができ、それらは当業者に公知である。かかる方法には、細胞培養物を血清飢餓条件下、増殖培地、骨形成培地又はそれらの組み合わせに維持することが含まれる。
【実施例】
【００６５】
実施例１  ＢＴＣＰ結合ペプチドの発見及び応用
ＢＴＣＰ及びＢＴＣＰ−ポリマー複合材スキャフォールドの作製
スキャフォールドは、Ｔｈｅｒｉｃｓ（Ａｋｒｏｎ，ＯＲ）において、ＴｈｅｒｉＦｏｒｍ（商標）３Ｄラピッドプロトタイピングプラットフォームを使用して、ＢＴＣＰ又はＢＴＣＰとポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）との複合材のいずれかから作製した（Ｚｅｌｔｉｎｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７，５５７−５７２（２００１））。簡潔に言えば、ＢＴＣＰスキャフォールドを作成するため、顆粒化したＢＴＣＰ粉末を焼結し、篩別した。リン酸カルシウムとポロゲンとしてのスクロースとの混合物を含むＢＴＣＰ粉体層上にバインダーをプログラムされた順序で堆積させることにより、スキャフォールドを十字の形に作製した。次にスキャフォールドを２０時間焼結し、１日乾燥させ、２日間浸出させてポロゲンを取り除き、１日乾燥させることにより、５×５×３ｍｍの寸法の十字体を得た（図２Ｂ）。各移植片は約６０％の多孔性で、平均細孔直径が６０ミクロン及び細孔直径範囲が５〜９００ミクロンであった。
【００６６】
内部構造は開放型の海綿状構造を示した（図２Ｂ）。複数の十字体を詰めると、充填空孔率は約８３％である。化学的には、スキャフォールドは＞９５％ＢＴＣＰで、残りの部分は他の吸収性のある形態のリン酸カルシウムであった。ＰＬＧＡ及びＢＴＣＰ粉末をポロゲンと混合することにより、複合材ＢＴＰＣ−ＰＬＧＡスキャフォールドを同様の方法で作製した。
【００６７】
ＢＴＣＰスキャフォールドに対するファージディスプレイ
ＢＴＣＰスキャフォールドを砕いて粉末状にし、１２１℃で３５分間オートクレーブ処理し、全ての実験まで乾燥滅菌条件下に保存した。得られた滅菌ＢＴＣＰ粉末を、滅菌ろ過したサケタンパク質緩衝液（Ｌｉｃｏｒ）又はリン酸緩衝生理食塩水中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）のいずれかにより、穏やかな撹拌下に４℃で２４時間ブロックした。ブロックしたＢＴＣＰ粉末を、２０００ＲＰＭ、２分間でペレット化し、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ線状１２ｍｅｒ  Ｐｈ．Ｄ．キット（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）を使用して３ラウンドのファージディスプレイに供した。直交性にブロックしたＢＴＣＰ（すなわちサケタンパク質に対してＢＳＡでブロックした）が、ブロッキング緩衝液の成分に対するパニングとの対照を提供した。さらなる対照には、粉末状に砕き、同様にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はサケタンパク質緩衝液でブロックしたβ−ＴＣＰ／ＰＬＧＡ複合材スキャフォールド、並びにチューブ成分に対するパニングとの対照をとるためのモックチューブを含めた。３ラウンドのパニング後、各条件から１０プラークを取り、増幅し、次に配列決定した（モック条件及びＢＳＡでブロックしたＢＴＣＰ／ＰＬＧＡは、それぞれ第２ラウンド及び第３ラウンド後にプラークを生じなかった）。ＪａｌＶｉｅｗ多重配列アラインメントエディターを使用して、配列をコンセンサスについて解析した（Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．Ｄ．，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．多重アラインメント構築・解析ワークベンチ（Ａ  ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９（１９９１）；Ｃｌａｍｐ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＧＪ．，Ｖｏｌ．２０４２６−４２７（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，２００４））。図３は、アラインメントした配列を示す。
【００６８】
突然変異生成
第３ラウンドのファージディスプレイパニングから最も高順位に位置づけられた配列ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）を、ＰＣＲ突然変異生成及び短鎖プライマーを使用してｐＭＡＬ発現カセットに逐次クローニングすることにより、上皮成長因子と融合した多量体挿入のライブラリを作成した（図３）。ＰＣＲ突然変異生成は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）からのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｔｈｔｎｉｎｇ  ＩＩキットで実施した。様々なエピトープが融合したヒト上皮成長因子を発現するｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を構築した。図１４Ａ〜図１４Ｆを参照のこと。ＰＣＲプライマーは、完全にＢＴＣＰ結合ペプチドコード領域内でプライミングするように設計し、従って単一のＰＣＲ突然変異生成ラウンドにおける複数の挿入が可能となった。多量体クローンを配列決定することにより標的配列とのＤＮＡ同一性を確認し、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、アンピシリンＬＢ寒天に播いた。評価したライブラリには、（ＴＣＰＢＰ）ｎ＝１、２、３、５、８、及び１０のクローンが含まれた。
【００６９】
タンパク質発現
ＯＤ  ０．６まで３７℃で成長させ、次にＩＰＴＧで誘導して２２℃で４時間インキュベートした１ＬのＬＢ培養物において、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒ、５ｍｅｒ、８ｍｅｒ、及び１０ｍｅｒのＴＣＰＢＰ配列（ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ）のクローンを発現させた。培養物を４℃で３０分間、Ａｌｌｅｇｒａ  Ｇ３．８ロータにおいて３７００ＲＰＭでペレット化し、次にペレットを−８０℃で一晩凍結し、続いてＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補足したＢｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して細胞を溶解することにより、タンパク質を回収した。溶解した細胞を４℃で１時間、Ａｌｌｅｇｒａ  Ｇ３．８ロータにおいて３７００ＲＰＭで遠心した。次に上清をトリス緩衝生理食塩水に１：４希釈し、製造者の指示（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従いマルトース結合タンパク質アフィニティークロマトグラフィーに供した。プール画分を５０，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜のＶ−ｔｕｂｅ濃縮機（Ｎｏｖａｇｅｎ）での限外ろ過に供し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２回交換した。濃縮したタンパク質を０．２ミクロンフィルタで滅菌ろ過した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）により純度を確認した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ａ２８０分光光度計でタンパク質の定量化を実施した。濃縮したタンパク質は、使用時まで−８０℃で保存した。中程度の結合親和性を示した１ｍｅｒ及び２ｍｅｒでの先行試験の結果に基づき、さらなる評価用に３ｍｅｒ、５ｍｅｒ、及び１０ｍｅｒを選択した。
【００７０】
ＢＴＣＰスキャフォールドに対するＴＣＰＢＰ−ＥＧＦの係留及び結合特性の決定
ＢＴＣＰスキャフォールド又は篩別した純粋なＢＴＣＰ粉末をサケ血清緩衝液で１時間ブロックし、次にサケ血清緩衝液に希釈した精製ＴＣＰＢＰタンパク質において室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、スキャフォールド又は粉末を３容量の２０ｍＭトリス緩衝生理食塩水ｐＨ７．４において３回洗浄し、続いて最終洗浄してＰＢＳ中に保存した。図４に示されるとおりＦＩＴＣ−抗ＨＩＳタグ抗体及びヤギ抗ｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）一次及びＴＭＲ−抗ヤギ二次を使用して、蛍光顕微鏡法により結合の定性的評価を実施した。ＴＣＰＢＰ領域（ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ）ｎを除くＴＣＰＢＰ配列の全てのエレメントを組み込む対照タンパク質を、全ての実験における非特異的結合についての陰性対照として使用した（図４、右下）。多量体挿入を増やすことにより結合親和性が増加するかどうかを決定し、及びその効果が限界値に達するかどうかを決定するためには、ＴＣＰＢＰの連結多量体の各々の結合特性を決定する必要がある。３−多量体、５−多量体、及び１０−多量体のＴＣＰＢＰの段階希釈物を、上記に記載したとおりＢＴＣＰとインキュベートした。次にＰＢＳにおいてスキャフォールドを洗浄し、スキャフォールドをｐＨ２．２のグリシン緩衝液で１時間インキュベートすることにより結合タンパク質を溶離させ、溶離液中のＴＣＰＢＰの量を、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線フラットベッドスキャナで読み取るウエスタンブロットフォーマットを用いたＩＲｄｙｅ免疫蛍光法で定量化した。この分析の結果は図５Ａ〜図５Ｄに示す。
【００７１】
ＴＣＰＢＰ結合親和性は、予想どおり、多量体数に強い依存を示す。親和性の相対的変化は、図５Ｃ及び図５Ｄに示す。（ＴＣＰＢＰ）ｎインキュベーション濃度の関数としての反応シグナルの傾きから、所与の濃度における親和性を反映する維持されたタンパク質の相対的な指標が得られる。図５Ｄは、リピート数が相対的親和性に強く依存することを示している。図５Ａ〜図５Ｃに示される多量体結合スクリーニングに基づき、１０ｍｅｒのＴＣＰＢＰをさらなる実験に選択した。
【００７２】
（ＴＣＰＢＰ）１０の段階希釈物を上記に記載したとおり処理した３５ｍｇのインタクトなＴＣＰスキャフォールドとインキュベートすることにより結合の定量分析を実施し、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線フラットベッドスキャナで読み取る定量的スポットブロットフォーマットを用いて分析した。この分析の結果は図６Ａ〜図６Ｃ及び図７Ａ〜図７Ｃに示す。
【００７３】
結合タンパク質の量を定量化するには、試料及び対照タンパク質の双方について標準曲線を作成する必要があった。図６Ａ〜図６Ｃは標準曲線の結果を示す。各曲線を作成するため、既知量の（ＴＣＰＢＰ）１０又は対照（図４に示されるとおりのＣ１タンパク質、右下）を４レプリケートでニトロセルロース膜にブロットし、上記に記載される方法を用いてプローブした。得られたシグナルは、曲線の高い方の端部で飽和し始める単調増加シグナルを生じた（図６Ｂ）。この曲線の最初の６点は線形範囲であり、標準曲線の作成に使用した。双方のコンストラクトでプローブしたエピトープは同じであったため、対照及び試料タンパク質がいずれも同じ傾きの標準曲線を生じたことは意外ではなかった。この標準を用いて正確に定量化することができるタンパク質の範囲は、０〜９００ｎｇ／μＬスポットであった。
【００７４】
ＢＴＣＰに対する（ＴＣＰＢＰ）１０結合の分析を図７Ａ〜図７Ｃに示す。標準曲線により、結合タンパク質の直接的な定量化及び結合曲線（図７Ｂ）の作成が可能となった。この分析から、２．３ｕＭの結合定数ｋＤの推定値が求められた。結合曲線はまた、ヒル係数が２．３のアビディティも示した。これは、多量体タンパク質相互作用と整合した。５点圧力分析を用いたＢＴＣＰスキャフォールドのブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）分析から、０．８ｍ２／ｇのＮ２接触可能表面積が明らかとなった。これにより、（図７Ｃ）に示されるとおり最小表面数密度を推定することができた。細孔径分布によりＥＧＦ−（ＴＣＰＢ）１０がスキャフォールドの特定の領域に接触することが妨げられた場合、ＥＧＦ−（ＴＣＰＢ）１０が接触可能な表面積は完全なＮ２接触可能表面積未満であった。本分析の目的上、この効果によって生じる差異は無視できるものとした。
【００７５】
図７Ａ〜図７Ｃにおけるデータは、特徴的なＥＧＦＲ発現レベルと併せて考えると、係留されたＥＧＦ−（ＴＣＰＢ）１０の面密度が、ＭＳＣを最高レベルで刺激するのに十分な程度を超えていたことを示している。例えば、１μＭの係留溶液濃度では、係留された表面数密度は２００ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０／μｍ２であった。ある播かれた細胞がその基質と接触する表面積を約５００ミクロン２有すると、その細胞は約１００，０００個のＥＧＦ分子に露出することになる。比較すると、典型的なＭＳＣは１０，０００個のＥＧＦＲを発現する。それらのうち大きい割合が、数分の間に係留ＥＧＦに遭遇し得る。このシステムではＥＧＦは基材表面に制約され、可溶性ＥＧＦのように自由には拡散せず、従って受容体リガンド相互作用の動態は、可溶性の場合から直ちに類推されるものではない。
【００７６】
ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０表面結合を予備的に特徴付けたことにより、臨床的に関連性のある細胞型に対する細胞効果を分析することが可能となった。次に、ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０で処理したＢＴＣＰスキャフォールド上での低い継代数（Ｐ３）のプライマリヒト間葉系幹細胞の培養を調べた。
【００７７】
細胞培養
全ての細胞培養実験前に、継代２代目のプライマリヒト間葉系幹細胞（テキサスＡ＆Ｍ健康科学センター医科大学再生医学研究所（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）からのもの）を培養増殖することにより、十分な数の継代３代目ＭＳＣを提供した。増殖培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１６．５％ウシ胎仔血清、及びペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度１００単位／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むαＭＥＭからなった。骨形成培地は、１９２ｍｌの増殖培地、１０ｎＭのデキサメタゾン（２０μｌのＭＱ水中１ｍＭストック１：１０希釈物）、２０ｍＭのβ−グリセロールリン酸（８ｍｌの増殖培地中０．５Ｍストック）、及び５０μＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸（２００μｌのＭＱ水中５０ｍＭストック溶液）からなった。
【００７８】
滅菌ＢＴＣＰスキャフォールドを、ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０で処理した、又は処理しないままとしたサケ血清緩衝液でブロックし、個別に９６ウェルプレートのウェルに播いた。１，０００〜５０，０００個の細胞（記載のとおり）を、ウェルあたり２００／μＬの血清含有培地（ｈＴＭＳＣ）又は増殖培地（プライマリＭＳＣ）においてスキャフォールド上に直接播種した。播種した細胞を２４時間インキュベートし、次に新鮮な培地が入った隣接するウェルに移すことによって、スキャフォールド上に播種されなかった細胞の効果を除いた。この方法の播種効率は、スキャフォールド上及び残りのウェル中の双方の細胞をカウントして決定するとき、一貫して４０％であった（次節に記載する）。
【００７９】
増殖アッセイ
ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｎｉｖｅｌｌｅ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、播種後の様々な時間点で細胞増殖を決定した。各時間点で、製造者の指示に従いＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）色素試薬を骨形成培地又は増殖培地のいずれかと混合した。計測毎に６つの生物学的レプリケートを播種した。次に係留ＢＴＣＰスキャフォールドを、ＭＤＶシリーズのフィルタプレートアダプタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に取り付けた紫外（ＵＶ）滅菌済みＦａｌｃｏｎ（商標）９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＪ  ＵＳＡ）に移した。次にＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）色素試薬を、係留ＢＴＣＰスキャフォールドが入った各ウェルに添加し、次に３７℃、５％ＣＯ２で４時間、２０分毎に手動で穏やかに混合しながらインキュベートした。次にフィルタプレートユニットを１０００ＲＰＭで２分間遠心した。この方法により、色素−培地混合物を完全に回収することができた。得られた色素−培地混合物の１００ｕＬを収集プレートユニットから新しい平底９６ウェルプレートに移し替え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２ｅマルチウェル蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．ＣＡ，ＵＳＡ）により５７０ｎｍの励起波長及び５８５ｎｍの放出波長で読み取った。既知の数の細胞に関して、１２ウェルプレートに播き、それぞれの時間点に対応するように１日間、４日間、又は７日間培養して同じアッセイを行うことにより、標準曲線を求めた。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイは非破壊式であるため、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）シグナル応答を実際の細胞数に較正するために、ＶｉＣｅｌｌ（商標）血球計（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞を直接カウントすることが可能であった。
【００８０】
従って、各培養条件（増殖培地「ＥＸ」及び骨形成培地「ＯＳ」）及び最長７日の各日数時点についての標準曲線を作成することにより、ばらつきの大きさを評価した。様々な条件下で代謝率は異なり得る。図８に示されるとおり、各標準曲線の傾きは、当該の条件における細胞の代謝活性の指標であった。異なる日数におけるＥＸ系列の傾きのばらつきから、当該の細胞において数日間続き得る播種後の代謝に変化が起きることが示された。ＯＳ培地下では、１日目のＥＸと比較して傾きは大幅には変化しなかった（播種条件）。各培養条件及び時間点についてのそれぞれの傾きを用いて、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）データを対応する３Ｄスキャフォールド条件から細胞数に変換した。１４日目及び２１日目培養物は、それぞれの７日目の傾きを使用した。１４日目及び２１日目の標準曲線は、これらの時間点における高いコンフルエンス及び細胞死のため、信頼性がなかった。
【００８１】
ＭＳＣ増殖に対する細胞播種密度及びｔＥＧＦ用量の影響
多くの哺乳動物細胞の生存及び増殖は、局所細胞密度に強い依存を示す。細胞は様々なオートクリン因子を分泌し、これらのオートクリン因子は低い細胞密度で生存及び増殖を亢進し、及び高い細胞密度で増殖を阻害する。高い細胞密度でオートクリン因子の濃度が上昇すると、ｔＥＧＦは細胞増殖を亢進するものと予想されたが、極めて低いプレーティング密度でｔＥＧＦが細胞を保護できるかどうか、又は高密度での阻害に打ち勝つことができるかどうかは不明であった。従ってある範囲の細胞播種密度及びｔＥＧＦの表面係留密度を用いて、ＭＳＣのｔＥＧＦに対する増殖応答を評価した。
【００８２】
典型的な時間的経過における増殖プロファイルに対する播種密度の効果をスクリーニングすることにより、その後の実験で用いるのに好適な密度を選択することが可能であった。加えて、ＢＴＣＰ上のＥＧＦの面密度が細胞の増殖応答に影響を及ぼすことが予想された。ＥＧＦは、２ＤではＥＣ５０前後の濃度（１ｎＭ）で細胞増殖に対して二相性の効果を及ぼすことが観察されている。本明細書に記載されるシステムでは、ＥＧＦは表面に係留され、等価なＥＣ５０は実験的に決定できるのみであった。この実験の目的上、図９に示されるとおり用量反応の代用として細胞増殖を用いた。
【００８３】
２００ｕｌ（各スキャフォールドの播種に使用した容量）あたり１，０００；２５，０００、及び５０，０００細胞の細胞播種密度を増殖培地で評価した。図９において、増殖に対する播種密度の効果は５０，０００細胞レベルで明らかに認められた（一番右のプロット）。４日目に細胞数の大幅な減少が認められ、７日目までに回復している。この効果は、２５，０００細胞播種レベル（中央のプロット）ではそれほど顕著でなく、１，０００細胞播種レベルでは明らかでなかった。これらの結果に基づき、スキャフォールドあたり３０，０００細胞の播種密度を選択した。この播種レベルが、増殖における望ましくない二相性効果と他の分析用に十分な細胞材料（ｑＲＴＰＣＲ用のＲＮＡ又はアルカリホスファターゼ活性用のタンパク質など）を得るために要する時間との間の良好な妥協点であった。
【００８４】
全ての細胞播種密度において、７日目までに細胞増殖は表面ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０係留密度に関して二相性の関係を示し、見かけの最大は１．８μＭ係留濃度であった。これは４００個のＥＧＦ分子／μｍ２に対応した。これらの結果に基づき、係留について１μＭのＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０濃度を選択した。係留ＥＧＦの増殖及び骨形成分化に対する効果の詳細な調査を実施した。これを次節に記載する。
【００８５】
３Ｄ  ＢＴＣＰスキャフォールドにおけるプライマリＭＳＣ増殖に対するｔＥＧＦの効果
ＥＸ及びａｓの双方の培地におけるＭＳＣ増殖に対するｔＥＧＦの効果の詳細な試験結果を図１０に示す。スキャフォールドあたり３０，０００の細胞播種密度及び１μＭ  ＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０の係留濃度を用いた。ＥＸ培地では、ＭＳＣは７日目に対照と比べて約５０％の増殖増加を示した。１４日目には、この効果はもはや明らかでなく、ｔＥＧＦと対照との間に有意な差はなかった。１４日目にこのように同等となったのは、高い細胞密度でのスキャフォールドの担持可能量によってもたらされた可能性が高い。スキャフォールドあたり４００，０００細胞を超えると、拡散輸送が限界となり、それによりＥＧＦ刺激性の増殖に制約がかかる可能性が高い。ＯＳ培地では、ｔＥＧＦの効果はより顕著であった。７日目及び１４日目、ｔＥＧＦは対照と比べてそれぞれ６２％及び２５％の増加を生じた。３Ｄスキャフォールドにおける利用可能なＭＳＣの増加は、自家ＭＳＣが用いられ得る場合にＭＳＣの不足によって手技の範囲が限られる臨床状況では、特に興味深い。
【００８６】
創傷部位でＭＳＣの数が２０〜６０％増加すると、転帰が大幅に改善され、現行の方法と同じ数を実現するのに低い播種密度を利用することにより治療し得る欠損のサイズが大きくなる。
【００８７】
分化アッセイ
ＭＳＣが骨形成分化を生じる能力は、そのような細胞の効力の評価に有用な基準である。初期骨形成分化は、典型的には誘導細胞のアルカリホスファターゼ活性を非誘導細胞と比較することにより計測される。後期のマーカーには、定量的結果が得られるｑＲＴＰＣＲにより計測するときの骨形成転写物のパネルが含まれる。さらに後には（２１日）、沈着したカルシウムを染色するアリザリンレッド染色などの石灰化アッセイが用いられ得る。カルシウム含有スキャフォールドでの３Ｄ培養によって課される限界を考慮して、骨形成誘導の評価にはアルカリホスファターゼアッセイ及びｑＲＴＰＣＲに焦点を合わせた。
【００８８】
ｐ−ニトロフェノール比色アッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性を計測した。スキャフォールドをＰＢＳで２回リンスし、続いて凍結−融解を２サイクル行った（−７０℃で２０分間、続いて２５℃で１０分間）。同じ条件からの２つのスキャフォールドをエッペンドルフ（ｅｐｉｎｄｏｒｆ）管に添加し、次にピペット先端によって手動で砕いた。各管に１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２中０．２％ＮＰ−４０を２００μｌ添加することにより、細胞を溶解した。管を適度に振盪しながら４℃で１５分間インキュベートした。水浴中で５分間音波処理した後、試料を１３，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上清を溶解緩衝液でｌ０倍希釈及び１００倍希釈した。希釈試料ライセート及び溶解緩衝液を９６ウェルプレートに入れ、全てが溶解緩衝液の試料をバックグラウンド対照として使用した。２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、１．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ１０．３、２５８Ｃ（Ｓｉｇｍａ，Ｑ１７）とｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムのストック基質溶液（Ｓｉｇｍａ）との１：１溶液を試料に添加し、３７℃で３０分間インキュベートし；水酸化ナトリウムを添加して反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２ｅマルチウェル蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して４０５ｎｍの吸光度を読み取った。ブランク対照からのバックグラウンドシグナルを、全読取り値から減じた。水酸化ナトリウム中のｐ−ニトロフェノールの段階希釈物を使用して、Ｕ／ｍＬ単位で標準曲線を作成した：単位は、３７℃で毎分１ｍｍｏｌのｐ−ニトロフェノールの遊離を触媒する酵素の量として定義される。結果はＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて総タンパク質量により正規化した。
【００８９】
可溶性ＥＧＦ及び／又は係留ＥＧＦを含む及び含まないＥＸ培地及びＯＳ培地で成長させたＭＳＣの７日目のアルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）を、図１１に示すとおり比較した。ＯＳ（陽性対照）とＯＳ＋ｔＥＧＦとは、予想どおり同等のレベルを生じ、これらが種々の条件中で最も高かった。１ｎｇ／ｍＬの可溶性ＥＧＦを添加すると、骨形成培地の効果が消失し、ＥＸ（陰性対照）と同等の活性がもたらされた。興味深いことに、Ｏｓ＋ｔＥＧＦ条件に可溶性ＥＧＦを添加すると、全体的なＡＬＰ活性が約４０％低下した。この結果から、表面係留ＥＧＦが骨形成誘導能力の維持によってｓＥＧＦと比べたときの優位性を提供するという先の観察が裏付けられた。
【００９０】
定量的（ｑａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＲＴＰＣＲ）
ｑ−ＲＴＰＣＲに好適な一組の骨形成マーカーを、骨形成分野の既刊文献及び先行研究に基づき選択した（Ｐｌａｔｔ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００９）；Ｚｉｒｏｓ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，２３９３４−２３９４１（２００２）；Ｔｅｒｍｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２６，９９−１０５（１９８１）；Ｇａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４１，１０１−１１０（２００４）；Ｂｒａｄｓｈａｗ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １００，６０４５−６０５０（２００３））。骨形成に特に関連がある４つのマーカーを、以下で考察する。
【００９１】
ＲＵＮＸ２は、機械的ストレスを受けた前骨芽細胞において上方制御される転写因子であり、骨形成活性の信頼できる指標である。骨芽細胞におけるＲＵＮＸ２活性化には伸展依存性及び伸展非依存性の双方があり、この活性化がマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードを引き起こす。ＲＵＮＸ２とｐＥＲＫ２との間の相互作用によりＲＵＮＸ２活性が増強される（Ｚｉｒｏｓ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，２３９３４−２３９４１（２００２））。ｔＥＧＦによってＨＥＲ１を介してｐＥＲＫ１／２が刺激されると、単純にｐＥＲＫ２が上方制御することによって伸展非依存性機序によりＲＵＮＸ２活性が増幅し得る。従ってｔＥＧＦ処理スキャフォールド上で培養されるＭＳＣのＲＵＮＸ２活性の上方制御を観察すれば、共通のＥＲＫシグナル伝達ノードを所与として少なくとも１つの機構的説明が示され得る。
【００９２】
オステオカルシン（骨γ−カルボキシグルタミン酸タンパク質）は、石灰化した骨基質に関連する小タンパク質である。Ｈｏａｎｇは、オステオカルシンが、天然骨のヒドロキシアパタイト結晶格子中のカルシウムイオンを補完する配向で５個のカルシウムイオンを配位する負電荷の表面を含むことを見出した（Ｈｏａｎｇ，Ｑ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，９７７−９８０（２００３））。オステオカルシンはＲＵＮＸ２の下流にあり、ＲＵＮＸ２の上方制御後に上方制御された状態になることが示されている（Ｍｉｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３６２，３６８−３７３（２００７））。
【００９３】
オステリックス（ＳＰ７）は、ジンクフィンガー転写因子であり、且つＲＵＮＸ２の下流で働くと報告されている骨細胞分化の制御因子である（Ｇａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４１，１０１−１１０（２００４）；Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３，２９１１９（２００８））。このエビデンスは、図１２に見ることができる（下側のプロット）。ここで、４日目のｔＥＧＦ条件下における初期ＲＵＮＸ２上方制御後の１４日目のオステリックスの再発現は、この効果が現れたものと思われる。
【００９４】
オステオネクチンは、細胞周期進行を阻害し、且つ細胞形態の変化を誘発するマトリックスタンパク質である。オステオネクチンはまた、骨形成状況での細胞外マトリックスの合成に対しても影響を及ぼし（Ｂｒａｄｓｈａｗ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １００，６０４５−６０５０（２００３））、骨コラーゲンが石灰化を起こす能力を担う遠位部位でヒドロキシアパタイト及び膠原繊維に結合する（Ｔｅｒｍｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２６，９９−１０５（１９８１））。
【００９５】
３Ｄ  ＢＴＣＰスキャフォールドを、上記に記載したとおり１μＭのＥＧＦ（ＴＣＰＢＰ）１０で処理し、スキャフォールドあたり３０，０００細胞で播種した。示される時間点において、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＩＩキットを使用して条件あたり９個の生物学的レプリケートからＲＮＡを回収した（スキャフォールドは３個の生物学的レプリケートにプールした）。得られたＲＮＡを定量化し、等濃度に正規化し、次にＱｉａｇｅｎ  Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ  Ｑｕｉｃｋキットを使用して２段階ｑ−ＲＴＰＣＲ反応に供し、光センサトップを備えたＣｈｒｏｍｏｐｈ０４サーマルサイクラーで実行した。各生物学的レプリケートを３つの技術的レプリケートに分割した。各ランが終わる度に融解曲線を分析し、汚染生成物が存在しないことを確認した。各遺伝子用のプライマーは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマーバンクから入手した。
【００９６】
図１２に示されるとおり、４つ全ての遺伝子産物が、ｔＥＧＦ条件で１４日目に統計的に有意な上方制御を示した。５倍のＲＵＮＸ２の初期上方制御が、オステオカルシン及びオステリックスなどの下流因子の初期上方制御因子として機能したと考え得る。１４日目におけるオステオネクチンの６倍の上方制御は、後の時間点で予想され得たとおりのマトリックス沈着の増加を示すものである。７日目で最大となるオステオカルシン、オステリックス、及びＲＵＮＸ２の二相性発現は、増殖データに認められるとおり（図１０）、細胞周期進行が増殖へと変化したことを示すものであり得る。３Ｄ細胞培養における主要な骨形成因子の発現に対するｔＥＧＦの効果は、特に増殖に対する効果を考慮するとき、有望な結果である。これらの結果をまとめると、ｔＥＧＦが初期骨形成分化を損なうことなくＭＳＣの増殖を大幅に増加させるという強い示唆が得られる。
【００９７】
ｈｔＭＳＣを使用した長期生存アッセイ
ＭＳＣ上での生存に対するｔＥＧＦの影響については、既に本明細書及び文献に記載がある。３Ｄ組織培養におけるこれらの結果を裏付けることにより、これらの結果を臨床的に関連性のある状況に拡張することが可能となり得る。以下の節では、ｔＥＧＦの効果を評価するために設計した長期ｈＴＭＳＣ生存アッセイについて記載する。
【００９８】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素不死化ヒト間葉系幹細胞（ｈｔＭＳＣ又はｈｔｅｒｔＭＳＣ）を、ｈｔｅｒｔＭＳＣには１０％ウシ胎仔血清、及びプライマリヒトＭＳＣには１６．５％、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸塩、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸補助剤、及びペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度１００単位／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補足したダルベッコ変法イーグル培地でルーチンに培養した。指示する場合に特定の実験では、この培地から血清を省いた。ｔＥＧＦ処理スキャフォールドの核染色及び組織学的分析の双方により、３Ｄ  ＢＴＣＰスキャフォールドへの細胞侵入量及び２３日目の相対的生存効果の顕著な差が明らかとなった。
【００９９】
図１３Ａ〜図１３Ｂに観察されるこの著しい差は、広範囲に及ぶ創傷サイズが細胞生存にとって極めて過酷な条件を呈し得る手術状況において一層関連性が高いものと思われる。過酷な創傷環境において既にまばらにしかないＭＳＣのレスキューには、多大な臨床的有益性がある。
【０１００】
結論
本明細書に記載されるこの研究は、ＥＧＦを係留したＢＴＣＰスキャフォールド上で培養されるＭＳＣが未処理のスキャフォールド上で培養されるＭＳＣと比べて高率で増殖し、及びこの増殖の増加はＭＳＣの初期分化能を損なわないことを実証する。重要なことに、可溶性ＥＧＦは同じ優位性をもたらさないことが示されており、従ってマトリックスに結合したリガンドとして提供されるときのＥＧＦ生物活性の調節が示唆される。また、係留ＥＧＦが、血清飢餓などの極限条件下で培養されるときのｈｔＭＳＣに強い生存優位性を付与することも明らかである。
【０１０１】
本明細書に記載される方法を用いて生物活性成分をＢＴＣＰスキャフォールドの表面に安定的に係留する能力により、組織再生の広範囲の基礎研究が可能になるとともに、臨床的に有用な手法がもたらされ得る。一つの特定領域は、再生骨の血管新生及び骨軟骨界面の再生などの空間的に誘導される組織再生の領域である。
【０１０２】
実施例２  ＢＴＣＰ結合ペプチドの特性決定及び修飾
ＢＴＣＰを含むスキャフォールドにＥＧＦを結合する場合の臨床解釈に対処するため、ファージディスプレイを含めたプロテインエンジニアリング手法を用いて、ＢＴＣＰに対して高親和性結合を示すペプチドとのＥＧＦの融合タンパク質を作成した；これらの２つの部分をプロテアーゼ耐性スペーサーにより分離し、ＥＧＦの接触可能性を高めた（図２８及び図２９を参照）。タンパク質の収率及び特性の改善を図るために用いる特異的タンパク質配列の連続的な繰り返しを調べた；修飾には、精製部分の性質及びスペーサーの組成が含まれた。また、いくつかの精製戦略を研究した。配列及び精製戦略を定義し、ここでこの戦略の重要な一面は、＜１０００ＥＵ／ｍｇに設定されている商業規格の１０倍低い３８．９ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン値である最終生成物を生成するようにエンドトキシンを除去するステップ（表）を含むことであった。この生成物、ＥＧＦと融合したＢＴＣＰ結合ペプチド（（ＢＴＣＰｂｐ）１０−Ｃ１−ＥＧＦ）を、再現性よく作製及び精製することにより、低エンドトキシン生成物を提供した。
【０１０３】
また、ＢＴＣＰ−Ｃ１−ＥＧＦ融合タンパク質のＢＴＣＰ骨スキャフォールドとの連係の安定性に関する懸念にも対処した。市販のＢＴＣＰ骨空洞充填材スキャフォールド（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合したＢＴＣＰ−Ｃ１−ＥＧＦについてのこの連係の安定性を、飽和濃度で吸着したタンパク質を使用して、且つＰＢＳ上清中にタンパク質を５日間放出させた後に計測した。飽和濃度（２〜４ｕＭ）を決定した（図２２、図２３、図２４）。この実験は、時間点毎にｎ＞３個のスキャフォールドで行った。さらに、再現性についてエビデンスを提供するため、同じバッチからのタンパク質を使用した実験を繰り返した。この反復実験から、統計的に区別できない結果が得られ、＞９０％の精製ＥＧＦ融合タンパク質が５日間の期間にわたりスキャフォールドに維持されることが示された（図１５及び図１６、表２及び表３）。これらのデータは、１０件を超える別の実験におけるこのタンパク質の生物学的効果と整合し（４，６，１０）、そこでは５日以上の培養期間におけるＭＳＣ成長又はコロニー形成の増加が認められた。表３に、５日後のタンパク質放出に関するデータを要約する。これらのデータは、５日の間に約１〜２％の係留タンパク質が放出されることを示している。参考までに、各３ｍｍ  ＴＣＰスキャフォールドは、これらの係留濃度で平均して約０．９〜１マイクログラムのタンパク質を結合するが、５日の間に溶液中に放出されるタンパク質は１５ナノグラム（０．０１５マイクログラム）未満である。これは、非常に強力な結合であることを示している。この融合タンパク質は、骨髄由来の間質細胞が生体内移植に関連性のある精製された形態である場合に、それを移植することによる生体内での組織再生に関連性のある著しい生物学的効果を有する。
【０１０４】
ＴＣＰ結合ペプチドとｂ−ＴＣＰ基材材料との間の結合に加え、別の相互作用が存在し、これは、記載されるタンパク質のそのＴＣＰ基材に対する全体的な親和性を増加させるのに重要である。これはアビディティ相互作用によって達成される。コイル領域（Ｃ１コイル又はＣ２コイルのいずれか）はホモ二量体化する。Ｃ１−Ｃ１ホモ二量体化親和性は２．５Ｅ−７モル濃度であり、Ｃ２−Ｃ２ホモ二量体化親和性は４．４Ｅ−５モル濃度である。このホモ二量体化は、コイルドコイル相互作用によって隣接するタンパク質を結合することにより、ＴＣＰに対するＴＣＰ結合ペプチド含有タンパク質の結合を補完することができる。この相互作用により、ＴＣＰ表面に対する隣接タンパク質のＴＣＰ結合ペプチドの滞留時間（及び局所有効濃度）が増加し、従ってアビディティ相互作用が生じる。これは図３０に示す。
【０１０５】
図２５〜図２７は、各種コイル（Ｃ１又はＣ２）を用いることで得られる結合の差を説明する。示されるとおり、Ｃ１コイルを含むタンパク質構築物は、アビディティ効果により、ｂ−ＴＣＰに対してより高い結合親和性を示す。
【０１０６】
方法
ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦタンパク質の生成及びエンドトキシン除去
ファージディスプレイによってＢＴＣＰ結合ペプチドを見出し、ＥＧＦと融合したＢＴＣＰ結合ペプチドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生成し、精製した。計画されたインビボ研究のため、さらなる精製によるエンドトキシン除去を用いた。エンドトキシンを除去するためのオンカラム（アミロースカラム）法を、既発表のプロトコル（Ｃｈｅｎｇ，ＨＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，６１（１）：６５−７２（２００８））に基づき設計した。簡潔に言えば、この方法は、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を含有する大量のカラム緩衝液でアミロース樹脂結合ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを洗浄し、次にカラム緩衝液で洗浄して過剰なＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を除去することを伴った。クリーブランドクリニックラーナー研究所リサーチ・コア・サービシーズ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｅｒｎｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ）におけるセントラル・セル・サービシーズ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のメディア・プレパレーション・ラブ（Ｍｅｄｉａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｌａｂ）によるＬＡＬアッセイにより、最終生成物のエンドトキシン値を決定した。この施設はストリンジェントなＱＣプログラムを有し、ラーナー研究所（Ｌｅｒｎｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の研究者によって提供されるあらゆる培地、溶液、ブロス、緩衝液及び試料のエンドトキシン及びマイコプラズマの計測を担っている。
【０１０７】
ＢＴＣＰスキャフォールドへのＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの吸着及びそこからの放出
精製したエンドトキシン不含ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦのストック溶液を、ＰＢＳ中に飽和濃度２〜４ｕＭとなるよう希釈した（各実験の正確な値についてはデータを参照）。３ｍｍ十字の形のＢＴＣＰスキャフォールドをＩｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、９６ウェルプレートのウェルに置き、ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦ溶液と共に１５０ｒｐｍで振盪しながら４℃で３６時間インキュベートした。係留後、スキャフォールドをＰＢＳで２回リンスし、新鮮なＰＢＳ溶液に入れ、４℃で０時間、２４時間又は５日間保存した。安定性を計測するため、３つの時間点（０日、１日、５日）の各々につき４つのレプリケート十字体を規定の時点でＰＢＳから取り出し、ＰＢＳで２回リンスした。当初は結合したファージをＢＴＣＰから剥ぎ取るために用いられた標準的なプロトコル（ＮＥＢ，Ｐｈ．Ｄ．（商標）−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ；ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｍａｎｕａｌｆｉｌｅｓ／ｍａｎｕａｌｅ８１０１．ｐｄｆ）に従い、変性０．２Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ＝２．２を使用して結合タンパク質を遊離させることにより、各十字体と連係したＥＧＦの量を評価した。このプロトコルにより、タンパク質がＢＴＣＰの表面から完全に剥がれた。Ｉｎｔｅｇｒａから受け取った３ｍｍＢＴＣＰ十字体は、質量に１６％のばらつきがあった（十字体あたり１１．９±１．９ｍｇ、Ｎ＝１０）。十字体質量のばらつき及び溶液中での部分的な崩壊に起因する質量の損失が、係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの最終的な測定における約２０％の誤差に寄与した。この誤差は定量化アッセイとは無関係で、係留に利用可能なＢＴＣＰ十字体の表面積が質量損失に起因して変化することによるものであった。
【０１０８】
ＢＴＣＰスキャフォールドから放出された係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦのドットブロットアッセイによる定量化
主な論点は、どれだけのＥＧＦがスキャフォールドと連係したまま残るかであったため、ＢＣＡ（感度＝５ｎｇ総タンパク質量／ｕＬ）などの比較的感度の低い非特異的な総タンパク質量アッセイから活性タンパク質の量を推測するのでなく、高感度のドットブロット免疫測定法プロトコル（感度＝０．０７８ｎｇのＥＧＦ／ｕＬ）を用いてＥＧＦを直接計測した。簡潔に言えば、グリシン緩衝液によりＢＴＣＰスキャフォールドから放出された係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを、ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦ標準と共にニトロセルロース膜に滴下した（２ｕＬ／スポット）。スポットあたり０．１５６ｎｇ〜１０ｎｇの範囲のＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦ標準を同じブロット上に滴下した。一部のスキャフォールドはスポットあたり１０ｎｇより多い係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを有したため、スポットあたり０．１５６ｎｇ〜２０ｎｇの範囲のＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦ標準について、別個のブロットを作製した。標準曲線は、スポットあたり２０ｎｇのＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦまで線形であった。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステムにより、ｈＥＧＦに対する一次抗体、赤外色素タグ付き二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｗｗｗ．ｌｉｃｏｒ．ｃｏｍ／ｂｉｏ／ＰＤＦ／ＩＲｑｕａｎｔ．ｐｄｆ）を使用してドットブロットを分析した（９，１０）。標準曲線を用いて、グリシン緩衝液により３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドから取り除かれた係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの量を定量化した。０時間、２４時間又は５日間ＰＢＳ中に保存した後にグリシン緩衝液によって取り除かれた係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの量を、図１５及び図１６に示す。標準曲線は図１７及び図１８に示す。赤外ＬＩ−ＣＯＲ強度有り及び無しのドットブロットを図１９、図２０、及び図２１に示す。時間点の間の統計的有意差をｔ検定により評価した。
【０１０９】
【表１】
2014500276.tif 000002
【０１１０】
【表２】
2014500276.tif 000003
【０１１１】
【表３】
2014500276.tif 000004
【０１１２】
まとめ
飽和係留濃度（２〜４ｕＭ）で、３ｍｍ  ＢＴＣＰスキャフォールドあたり平均９００ｎｇのＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦを係留することができる。これにより、３Ｄスキャフォールド表面上であってもこの係留戦略に再現性があることが実証された。
【０１１３】
係留濃度にかかわらず、ＰＢＳ中に５日間保存した後の係留ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦに著しい放出はなかった。このデータは望ましい放出特性を実証するものであったともに、ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦとＢＴＣＰスキャフォールド表面との間の高親和性相互作用のエビデンスであった。
【０１１４】
ＢＴＣＰスキャフォールドへのＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの吸着及びそこからの放出は、０．１５６ｎｇ〜２０ｎｇ／２ｕＬスポットの間で線形であった。
【０１１５】
ＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦからのエンドトキシン除去に成功した。現在、これはタンパク質製造の商業規格を１０倍下回る。インビボ研究に対するＦＤＡのエンドトキシン制限値は０．５ＥＵ／ｃｍ３と指定され、タンパク質のＥＵ／ｍｇの具体的な比率には基づいていない。生体内実験に対するＦＤＡ制限値の範囲内とするには、本発明者らは単に各部位に加えるＢＴＣＰｂｐ−Ｃ１−ＥＧＦの質量を制限すればよく、０．５ＥＵ／ｃｍ３を超過しないように調節することができる。
【０１１６】
本明細書に引用される全ての特許、公開出願及び参考文献の教示は、全体として参照により援用される。
【０１１７】
この発明は、特にその例示的な実施形態を参照して図示及び説明されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、そこに形態及び詳細の様々な変化を加え得ることを理解するであろう。
【図１Ａ】
2014500276.tif 000005
【図１Ｂ】
2014500276.tif 000006
【図２Ａ】
2014500276.tif 000007
【図２Ｂ】
2014500276.tif 000008
【図３】
2014500276.tif 000009
【図４】
2014500276.tif 000010
【図５】
2014500276.tif 000011
【図６】
2014500276.tif 000012
【図７】
2014500276.tif 000013
【図８】
2014500276.tif 000014
【図９】
2014500276.tif 000015
【図１０】
2014500276.tif 000016
【図１１】
2014500276.tif 000017
【図１２】
2014500276.tif 000018
【図１３】
2014500276.tif 000019
【図１４Ａ−１】
2014500276.tif 000020
【図１４Ａ−２】
2014500276.tif 000021
【図１４Ｂ】
2014500276.tif 000022
【図１４Ｃ】
2014500276.tif 000023
【図１４Ｄ】
2014500276.tif 000024
【図１４Ｅ】
2014500276.tif 000025
【図１４Ｆ】
2014500276.tif 000026
【図１４Ｇ】
2014500276.tif 000027
【図１４Ｈ】
2014500276.tif 000028
【図１５】
2014500276.tif 000029
【図１６】
2014500276.tif 000030
【図１７】
2014500276.tif 000031
【図１８】
2014500276.tif 000032
【図１９】
2014500276.tif 000033
【図２０】
2014500276.tif 000034
【図２１】
2014500276.tif 000035
【図２２】
2014500276.tif 000036
【図２３】
2014500276.tif 000037
【図２４】
2014500276.tif 000038
【図２５】
2014500276.tif 000039
【図２６】
2014500276.tif 000040
【図２７】
2014500276.tif 000041
【図２８】
2014500276.tif 000042
【図２９】
2014500276.tif 000043
【図３０】
2014500276.tif 000044
【配列表】
2014500276000001.app
【国際調査報告】
2014500276.tif 000045
2014500276.tif 000046
2014500276.tif 000047
2014500276.tif 000048
2014500276.tif 000049
2014500276.tif 000050
2014500276.tif 000051
2014500276.tif 000052
2014500276.tif 000053
2014500276.tif 000054