(57)【要約】  本発明の目的は、ヒト転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基の特異的リン酸化を阻害して、様々な病理的状態を伴う分裂終了細胞における体細胞性核内倍加過程を阻害することに基づく。本発明は、タンパク質リン酸化を特異的に阻害する現在公知の方法（ｐ３８ＭＡＰＫによりリン酸化されるＴｈｒ残基の無いＥ２Ｆ４の変異形態の発現を含む）または、ヒト転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基に適用しうる将来開発される方法をカバーするものである。
2014534257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害するための阻害剤であって、体細胞性倍数性を伴う病状の予防および／または治療に用いるための、阻害剤。
【請求項２】
配列番号１を有する転写因子Ｅ２Ｆ４の変異形態である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
配列番号１を有する転写因子Ｅ２Ｆ４の変異形態が、ｐ３８ＭＡＰＫによりリン酸化できないアミノ酸でＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基が置換されているものである、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
リン酸化できないアミノ酸がアラニンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項５】
ｐ３８ＭＡＰＫによる内在性Ｅ２Ｆ４のリン酸化に干渉することに関して同一の能力を有する、配列番号１に含まれるＥ２Ｆ４断片である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項６】
保存されたＴｈｒ残基上に変異を有する他の種に由来するＥ２Ｆ４の形態である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項７】
他の種に由来するＥ２Ｆ４の形態が、配列番号２および／または配列番号３から選択される、請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
Ｔｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基がアラニンで置換された、配列番号１の転写因子Ｅ２Ｆ４の変異形態を模倣する合成分子である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項９】
体細胞性倍数性が、分裂終了細胞における核内倍加の結果として生じる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
分裂終了細胞が、神経細胞および／または筋細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
体細胞性倍数性を伴う病状が、下記群：神経変性疾患、虚血、肥大型心筋症、高血圧および加齢に伴う血管病状から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１２】
体細胞性倍数性を伴う病状が、神経変性疾患である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１４】
体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療する方法であって、患者に配列番号１の転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤の有効量を投与することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
阻害剤が、細胞への取り込みを促進するほかの細胞膜浸透性ペプチドと関連したペプチドまたはタンパク質中に含まれてなる、請求項１４に記載の予防および／または治療する方法。
【請求項１６】
阻害剤が、神経細胞および／または筋細胞に感染することができるベクターである、請求項１４に記載の予防および／または治療する方法。
【請求項１７】
ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１６に記載の予防および／または治療する方法。
【請求項１８】
ウイルスベクターが、レンチウイルスである、請求項１７に記載の予防および／または治療する方法。
【請求項１９】
体細胞性倍数性を伴う病状の予防および／または治療における、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害するための阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野に属し、特に治療ツールを開発するための分子標的同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
新しいＤＮＡ合成をその後に伴う分裂終了細胞における細胞周期の再活性化と神経細胞（神経変性、虚血など）および筋細胞（肥大型心筋症、高血圧および加齢に伴う血管病状）に影響する様々な病理的過程との間に存在する関連性が知られている。多くの場合、細胞周期の再活性化は、細胞分裂を伴わず、むしろ、体細胞性倍数性（ある細胞タイプにのみ影響し、世代から世代へと伝わらない倍数性）を生み出すことにつながる、核内倍加メカニズムの一部である（Ullah et al., 2009）。体細胞性倍数性を伴う病状の一例はおそらくアルツハイマー病（ＡＤ）である。この疾患において神経細胞は変性前に細胞周期を再活性化させることが知られ（Yang et al., 2003）、核のＤＮＡ量を増加させる（Arendt et al., 2010）。これらの神経細胞は、その生存を損なう形態学的および機能的修正を経験しているようである（Frade and Lopez-Sanchez, 2010）。実際、高倍数性の神経細胞が、ＡＤを有する患者の脳で優勢に変性するものであることが記載されている（Arendt et al., 2010）。心筋組織は、倍数性筋細胞をある割合で含み、その割合は病理的状況において変化している（Yabe and Abe, 1980; Vliegen et al., 1995）。血管平滑筋もまた、倍数性を伴う欠陥に苦しみうる（McCrann et al. 2008）。これらの理由で、核内倍加に関わる分子的基礎の知識は、体細胞性倍数性を伴う病状を防ぐ治療ツールの設計を促進する。ヒトの病状を伴う体細胞性核内倍加を防ぐことを目的とする治療ツールは現在まで開発されていない。これは、大概は新しい考え方が出現したばかりのとても最近の研究分野であるためである。
【０００３】
US20080139517A1は、細胞周期の初期フェーズにおいて、または、加齢に伴う記憶障害（ＡＡＭＩ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ＡＤ、脳血管性認知症およびその他の後退性神経変性疾患における分裂刺激を低下させることにより、神経細胞の細胞周期の進行を阻害することができる１以上の薬剤を投与することを提案する。しかし、この特許文献は、変性過程は従来型の細胞周期の進展に伴うものであり、核内倍加ではない。さらに、この特許文献は倍数性を生み出す細胞周期の再活性化が記載されまたは記載され得るほかの神経系および心疾患にスペクトラムを拡大するものではない。
【０００４】
Morillo et al., 2010では、神経細胞の４倍体性を生み出す神経における核内倍加過程が胚発生中に自然に生じること、これにより、大きなサイズ、大きな軸索およびその標的組織における差のある神経伝達領域を獲得する特定の神経細胞集団を生み出す（Morillo et al., 2010）。これらの神経細胞における核内倍加は、ニューロトロフィン受容体ｐ７５（ｐ７５ＮＴＲ）の神経成長因子ＮＧＦ媒介性活性化の応答として生じることが知られている。これらの神経細胞はそのＤＮＡを倍加させ、Ｇ２／Ｍ遷移を防ぐＴｒｋＢ受容体を解して働くニューロトロフィンＢＤＮＦの効果によりＧ２様状態にとどまる。それゆえに、神経細胞の４倍体化が、ｐ７５ＮＴＲを介するＮＧＦ媒介性の神経系発生の間に起こり、転写因子Ｅ２Ｆ１の活性化を誘発して細胞周期を再開する。ＢＤＮＦシグナルを十分に受け取らないこれらの４倍体神経細胞は、有糸分裂を行おうとしてその後アポトーシス性の細胞死を起こす。アルツハイマー病患者のほうでは、冒された領域においてｐ７５ＮＴＲとＮＧＦの存在が知られている。このことは、冒された領域で観察される４倍体性が神経系の発生の間に４倍体神経細胞を生み出すのと同一のメカニズムにより引き起こされ得ることを示唆する。疾患の進行基に観察されるＴｒｋＢレベルの低減は、神経細胞死を促進し得た（Frade and Lopez-Sanchez, 2010におけるこのモデルの発展を参照）。
【０００５】
Deschenes et al. 2004は、ヒト小腸上皮細胞の増殖と分化を制御するメカニズムを参照し、転写因子Ｅ２Ｆ４のｐ３８ＭＡＰＫによるリン酸化の可能性を示す。しかし、この文献は、ヒト小腸上皮細胞の増殖と分化を制御するメカニズムの一部としてｐ３８ＭＡＰＫにより転写因子Ｅ２Ｆ４のどの残基がリン酸化されるかを調査する必要性が現在あると結論している。
【０００６】
これらのいずれの文献も、病理的倍数体化を阻害する治療標的としての候補分子を同定していない。従って、新しい治療標的を同定する手段による治療方法として、分裂終了細胞における病理的倍数体化を引き起こす核内倍加を防ぐ必要が現在ある。
【発明の簡単な説明】
【０００７】
本発明は、体細胞性倍数性を伴う病状の予防および／または治療に用いるための阻害剤であって、転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のｐ３８ＭＡＰＫによるリン酸化を阻害することに用いる阻害剤に関する。
【０００８】
同様に、本発明は、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療する方法であって、配列番号１の転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤の治療上有効量を患者に投与することを含んでなる、方法に関する。
【０００９】
最後に本発明は、体細胞性倍数性を伴う病状の予防および／または治療における治療標的としての、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明の好ましい態様では、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療することに用いるための、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤は、転写因子Ｅ２Ｆ４の変異形態であり、そのアミノ酸配列は、配列番号１（ヒト）として同定される。配列番号１を有する転写因子Ｅ２Ｆ４の前記変異形態は、好ましくは、Ｔｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基において、ｐ３８ＭＡＰＫによるリン酸化され得ないアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸以外のアミノ酸）に置換されている。リン酸化され得ない前記アミノ酸は、より好ましくはアラニンである。
【００１１】
本発明の他の好ましい態様では、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療することに用いるための、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤は、配列番号１に含まれるＥ２Ｆ４の断片であって、ｐ３８ＭＡＰＫによる内在性Ｅ２Ｆ４のリン酸化に干渉することに関して同一の能力を有する、断片である。
【００１２】
本発明の他の好ましい態様では、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療することに用いるための、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤は、保存されたＴｈｒ残基に変異を有する他の種由来のＥ２Ｆ４の形態である。他の種由来のＥ２Ｆ４の前記形態は、好ましくは、配列番号２（ニワトリ）および配列番号３（マウス）である（図１参照）。
【００１３】
本発明の他の好ましい態様では、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療することに用いるための、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤は、Ｔｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基がアラニンで置換された配列番号１の転写因子Ｅ２Ｆ４の前記変異形態を模倣する合成分子である。
【００１４】
他方、本発明は、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療することに用いるための、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤であって、前記体細胞性倍数性は、分裂終了細胞における核内倍加の結果として生じる、阻害剤に関する。前記分裂終了細胞は、好ましくは神経細胞および／または筋細胞である。
【００１５】
加えて、本発明は、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療することに用いるための、ｐ３８ＭＡＰＫによる転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤であって、前記体細胞性倍数性を伴う病状は、以下の群：神経変性疾患、虚血、肥大型心筋症、高血圧および加齢に伴う血管病状から選択される、阻害剤に関する。前記体細胞性倍数性を伴う病状は、好ましくは神経変性疾患である。前記神経変性疾患は、さらにより好ましくはアルツハイマー病である。
【００１６】
本発明の他の好ましい態様では、体細胞性倍数性を伴う病状を予防および／または治療する方法は、配列番号１の転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を阻害する阻害剤の治療上有効量を患者に投与することを含んでなり、前記阻害剤は、細胞への取り込みを促進する他の細胞膜透過性ペプチドと関連するペプチドまたはタンパク質のいずれかに含まれてなるか、神経細胞および／または筋細胞に感染することができるベクター（好ましくは遺伝子治療に適したベクター）中に含まれてなることができ、前記ベクターは、より好ましくはウイルスベクターであり、さらにより好ましくはレンチウイルスである。
【００１７】
発明者らの研究室では、胚発生中にニワトリの神経細胞における細胞周期再活性化を誘導する、ＮＧＦ／ｐ７５ＮＴＲにより用いられるメカニズムを明らかにした。効果は、核内倍加および神経の４倍体化を生み出す（Morillo et al., 2010）。前記メカニズムは、影響を受けた細胞の核においてＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼｐ３８ＭＡＰＫの活性化（図２）、および続いて起こる転写因子Ｅ２Ｆ４のスレオニン残基のリン酸化（図３）に基づく。分裂終了細胞においてｐ３８ＭＡＰＫを活性化する他の如何なるシグナル経路も、転写因子Ｅ２Ｆ４を用いる高倍数化を生じ得る。ニワトリでは、ｐ３８ＭＡＰＫによりリン酸化され得る２つの残基、すなわち、スレオニン残基Ｔｈｒ２６１およびＴｈｒ２６３のみが存在する（図１）。NetPhosK 1.0ソフトウェアを用いると、ヒトおよびマウスＥ２Ｆ４タンパク質と保存されたドメイン中に含まれていることが予想される（図１）。ヒトＥ２Ｆ４タンパク質の場合、NetPhosK 1.0ソフトウェアにより予測される、ｐ３８ＭＡＰＫによりリン酸化され得るスレオニン残基は、スレオニン残基Ｔｈｒ２４８である（ｐ３８ＭＡＰＫによるリン酸化のコンセンサス部位は、スレオニンの後ろに位置する連続するＰｒｏ残基、ＴＰ配列である）。ヒトＴｈｒ２５０残基も、連続したＰｒｏ残基を欠いているが、保護されていると考えられている。理由は、いずれも連続するＰｒｏ残基を有するマウスＴｈｒ２５１スレオニン残基とニワトリＴｈｒ２６３スレオニン残基との保存の程度、および、ｐ３８ＭＡＰＫによりリン酸化され得るスレオニン残基としてNetPhosK 1.0により予測されるからである。
【００１８】
Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２６１／Ｔｈｒ２６３残基のリン酸化は、神経分化過程において、ニワトリ胚網膜細胞でのｐ７５ＮＴＲを介したＮＧＦにより誘導される細胞周期再活性化に重要である（図４）。そのような細胞周期再活性化は神経細胞の４倍体化を引き起こす（Morillo et al., 2010）。発明者らは、Ｔｈｒ２６１およびＴｈｒ２６３残基がＧｌｕ（Ｔｈｒのリン酸化状態を模倣する正に荷電したアミノ酸）で置換されているニワトリＥ２Ｆ４の構成的活性化形態の使用が、網膜神経細胞へのNGFの効果を模倣することができることを観察した（図４Ａおよび４Ｂ）。ｐ３８ＭＡＰＫによるリン酸化を防ぐドミナントネガティブ形態のニワトリＥ２Ｆ４（Ｔｈｒ２６１Ａｌａ／Ｔｈｒ２６３Ａｌａ）の使用が、神経原性網膜培養物における細胞周期に対するＮＧＦの効果を阻害することができることを示した（図４Ｃおよび４Ｄ）。従って、上記病状を伴う影響された神経細胞または筋細胞中で、この変異形態Ｔｈｒ２６１Ａｌａ／Ｔｈｒ２６３Ａｌａ（またはヒト形態Ｔｈｒ２４８Ａｌａ／Ｔｈｒ２５０Ａｌａ）を発現させると、核内倍加過程およびその後の高倍数体化を抑制し、これが疾患進展を防止、少なくとも遅延できる。本発明は、分裂終了細胞（神経細胞および筋細胞）を冒す様々な疾患において高倍数体化および関連した病体効果を防ぐための前記変異形態のＥ２Ｆ４の使用に関する。
【００１９】
従って、本発明は、ヒトＥ２Ｆ４のＴｈｒ２４８およびＴｈｒ２５０の保存された相同のＴｈｒ残基におけるリン酸化が、網膜神経細胞における核内倍加の誘発に重要であることを示した。
【００２０】
本発明はまた、ヒト転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化（以降、ｐｈｏｓｐｈｏＥ２Ｆ４）を特異的に阻害する方法を保護する。前記リン酸化の阻害は、分裂終了細胞におけるＤＮＡ合成を誘発するＥ２Ｆ４の能力を阻害し、明らかな治療的利益を有する。
【００２１】
本発明は、ｐ３８ＭＡＰＫ／ｐｈｏｓｐｈｏＥ２Ｆ４シグナルを阻害する方法に関し、好ましくは、発明者の研究室でニワトリＥ２Ｆ４で実施されたように、Ｔｈｒ２４８残基および／またはＴｈｒ２５０残基がＡｌａで置換されており、Ｅ２Ｆ４の変異形態によるものである。
【００２２】
代わりに、本発明は、ｐ３８ＭＡＰＫ／ｐｈｏｓｐｈｏＥ２Ｆ４シグナルを抑制するその他の方法に関し、例えば、
−  Ｔｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化され得ない他のアミノ酸での置換、
−  内在性Ｅ２Ｆ４のリン酸化を阻害することに関して同じ能力を有するＥ２Ｆ４断片の使用、
−  保存されたＴｈｒ残基に変異を有する他の種由来のＥ２Ｆ４の形態の使用、
−  Ｅ２Ｆ４の変異形態を模倣する合成分子の使用、などである。
【００２３】
本発明は、影響された細胞にＥ２Ｆ４の前記の変異形態を特異的に送達するあらゆる方法を保護するものであり、例えば、細胞膜を通過することができる適切なベクターおよびペプチドの方法によるものである。
【００２４】
本発明は、下記段階を含む：
１）標的細胞内でヒト転写因子Ｅ２Ｆ４のリン酸化を遮断する遮断分子を産生すること。
【００２５】
ヒトＥ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を遮断するために選択された分子（ヒトＥ２Ｆ４若しくは他の種のＥ２Ｆ４の配列をコードする遺伝子、ヒトＥ２Ｆ４若しくは他の種のＥ２Ｆ４のペプチド配列、ヒトＥ２Ｆ４若しくは他の種のＥ２Ｆ４の配列をコードする部分遺伝子、ヒトＥ２Ｆ４若しくは他の種のＥ２Ｆ４の部分ペプチド配列、または、ヒト転写因子Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基のリン酸化を遮断することができる、Ｅ２Ｆ４とｐ３８ＭＡＰＫとの相互作用領域を模倣する他の分子）は、化学合成により、または、遺伝子治療に適したベクターを産生するプラスミド中にそのｃＤＮＡ配列をクローニングすることにより、産生される。
【００２６】
この最後のケースでは、コード配列はまず、細胞株またはヒト起源の組織から事前に得られたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから、プルーフリード能を有する耐熱性酵素を用いて増幅できる。配列をクローニングするために、クローニング用に選択されるベクターのポリリンカーに適合した制限部位を含むプライマーが用いられる。前記ベクターは、標的細胞に選択された配列を導入する、実施例４で用いられる方法に基づいて選択される。配列がクローニングされると、Ｔｈｒ２４８および／またはＴｈｒ２５０残基をコードするＡＣＴコドンに、ＧｌｕまたはＡｓｐ以外のアミノ酸に特異的なコドンを導入するために、該コドンの特異的改変を導く標準的な部位特異的変異導入過程が実施される。そのようにして生み出されたプラスミドは、目的のベクターをパッケージングできる適切な細胞株にトランスフェクションされる。
【００２７】
２）標的細胞においてヒト転写因子Ｅ２Ｆ４のリン酸化を遮断する遮断分子を発現させること。
【００２８】
ｐ３８ＭＡＰＫ−Ｅ２Ｆ４シグナル経路が活性化された細胞では、ｐ３８ＭＡＰＫが、ｐ３８ＭＡＰＫには結合できるが、リン酸化されないＥ２Ｆ４の変異形態を模倣する過剰な分子に結合する際に阻害されると予測される。前記細胞における核内倍加過程はそれゆえに遮断される。遮断分子は、ＤＮＡの形態で導入されると、同じ標的細胞により発現され得る（例えば、レンチウイルスなどの適切なベクターを用いて）。代わりに、遮断分子は、多かれ少なかれ標的細胞型特異性を有する細胞膜を通過することができるペプチドの方法で導入され得る。
【００２９】
明細書および特許請求の範囲を通じて、「含んでなる」およびその変形は、他の技術的特徴、添加物、構成成分または行程を除外することを意図しない。当業者には本発明の他の目的、利点および特徴が本発明の記載から一部および本発明の実践から一部推測できる。下記図面および実施例は、例示のために提供されるのであって、本発明を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、転写因子Ｅ２Ｆ４の構造、機能ドメイン、および配列の保存を示す。図は、ヒト転写因子Ｅ２Ｆ４（H. sapiens）、マウス（M. musculus）転写因子Ｅ２Ｆ４、ニワトリ（G. gallus）転写因子Ｅ２Ｆ４、カエルXenopus laevis（X. laevis）転写因子Ｅ２Ｆ４、およびゼブラフィッシュ（D. rerio）転写因子Ｅ２Ｆ４のアミノ酸配列の比較を図示する。ＤＮＡ結合（ＤＢ）領域、二量体化（ＤＩＭ）ドメイン、マークドボックス（ＭＢ）およびトランスアクティベーション（ＴＡ）ドメインなどの様々な既知の機能ドメインが示されている。他の種で保存されたヒト配列のＴｈｒ２４８およびＴｈｒ２５０残基を含む領域（小さい四角で示される）もまた、示されている：マウス配列におけるＴｈｒ２４９およびＴｈｒ２５１残基、ニワトリ配列におけるＴｈｒ２６１およびＴｈｒ２６３残基、カエルにおけるＴｈｒ２２８およびゼブラフィッシュにおけるＴｈｒ２１７。この領域は、調節領域（RD）として参照されている。調節領域において完全に保存されたアミノ酸は、ドットで示される。
【図２】図２は、ＮＧＦに対する応答における核内ｐ３８ＭＡＰＫの活性化が、Ｅ６におけるニワトリ胚網膜細胞神経原性培養物における細胞周期再活性化に必要であることを示す。これらの細胞は、体細胞４倍体化（核内倍加）を導く細胞周期再活性化を誘発することによりＮＧＦに応答する（Morillo et al., 2010）。Ａ．１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦで示された回数処理された前記神経原生培養物の核抽出物中における抗活性化ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ）および抗ｐ３８ＭＡＰＫのウェスタンブロット。Ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫおよびｐ３８ＭＡＰＫのレベルの標準化された比が下に示されている。Ｂ．１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦで２０分間処理した前記神経原性培養物における抗活性化型ｐ３８ＭＡＰＫ抗体（Ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ）による免疫組織化学染色。核は、ビスベンズイミド（Ｂｉｓｂ．）によりラベルされている。ＮＧＦで処理した細胞の核内でのシグナルの増加に注意。Ｃ．Ｇ１／Ｓ遷移中にＥ２Ｆ４に応答することで知られるｃＭｙｃ遺伝子プロモーターの制御下のルシフェラーゼ発現プラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼの構成的発現を伴う他のプラスミドをトランスフェクションしたニワトリ胚網膜細胞神経原性培養物Ｅ６の抽出物におけるルシフェラーゼアッセイ。ルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼ比の値が、「ルシフェラーゼ活性」として描かれている。１００ ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦ処理がｃＭｙｃプロモーターの活性化を伴い、これは細胞周期の再活性化を示す。この効果は、ｐ３８ＭＡＰＫ特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭで用いる）で遮断される。Ｄ．ＢｒｄＵの取り込みは、ニワトリ胚網膜細胞神経原性培養物Ｅ６においてＳ期への進入を示す。１００ ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦ処理がＳ期の細胞の割合の増加を伴い、この効果は、ｐ３８ＭＡＰＫ特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０により遮断されるが、ＪＮＫ特異的阻害剤ＳＰ６００１２５（７μＭで用いる）によっては遮断されない。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５（ステューデントのＴ−テスト）。
【図３】図３は、Ｅ６におけるニワトリ胚網膜細胞神経原性培養物におけるＥ２Ｆ４のスレオニン残基の、ＮＧＦ促進性リン酸化を示す。上部は、１００ ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦおよび選択的阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭで用いる）の異なる組合せで処理した、示されている培養物に由来する、抗Ｅ２Ｆ４抗体を用いて免疫沈降した抽出物において抗ｐｈｏｓｐｈｏＴｈｒ抗体（αｐ−Ｔｈｒ）を用いて実施したウェスタンブロットを示す。下部は、免疫沈降せずに同一の抽出物（ＩＮＰＵＴ）において抗Ｅ２Ｆ４抗体を用いて実施したウェスタンブロットを示す。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在はそのようなリン酸化を阻害した一方で、ＮＧＦの存在は、スレオニン残基のリン酸化の増加を伴うことが見られる。
【図４】図４は、Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２６１／Ｔｈｒ２６３残基のリン酸化は、Ｅ６におけるニワトリ胚網膜細胞神経原性培養物における細胞周期再活性化を誘発することができることを示す。Ａ．図２Ｃで記載したように分析されたルシフェラーゼ活性。Ｔｈｒ２６１Ｇｌｕ／Ｔｈｒ２６３Ｇｌｕ置換により特徴付けられるＥ２Ｆ４の構成的活性化形態（Ｅ２Ｆ４−ＣＡ）の発現はｃＭｙｃプロモーター活性を誘発し、この効果は、選択的ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭで用いた）の存在下であっても観察される。Ｂ． ＢｒｄＵの取り込みは、Ｅ２Ｆ４の構成的活性化形態（Ｅ２Ｆ４−ＣＡ）をトランスフェクションした細胞において顕著に増加し、この効果は、選択的ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０（５μＭで用いた）の存在下であっても観察される。パネルＡおよびＢに示される結果に基づいて、ｐ３８ＭＡＰＫが他ではなくＴｈｒ２６１／Ｔｈｒ２６３残基を介して働くことが分かる。Ｃ．図２Ｃで記載されたように解析したルシフェラーゼ活性。Ｔｈｒ２６１Ａｌａ／Ｔｈｒ２６３Ａｌａ置換により特徴付けられるＥ２Ｆ４のドミナントネガティブ形態（Ｅ２Ｆ４−ＮＤ）の発現は、ｃＭｙｃプロモーター活性に対する１００ ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦの効果を防ぐ。Ｄ．Ｅ２Ｆ４のドミナントネガティブ形態（Ｅ２Ｆ４−ＮＤ）の発現は、網膜神経原性培養物におけるＢｒｄＵの取り込みに対する１００ ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦの効果を防ぐ。
【図５】図５は、例えば、遺伝子治療に適したベクター（レンチウイルスなど）を産生するプラスミドへのＥ２Ｆ４コード配列のクローニング方法のダイアグラムを示す。ヒト組織または細胞から得られたｍＲＮＡは、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換される。ヒトＥ２Ｆ４のコード配列は、灰色の三角形で描かれており、Ｔｈｒ２４８残基をコードするコドンが示されている。このコドンは、２つの特異的制限部位（ＣおよびＤ）と並んでいる。２つのプライマーがその５’末端（ＡおよびＢ）の２つの特異的制限部位と、コード領域の末端配列に基づいて設計される。これらの標的は、発現ベクターのポリリンカーに見出されるものであり、前記ベクターにＥ２Ｆ４コード配列をクローニングするために用いられる。Ｐ：Ｅ２Ｆ４タンパク質の転写をもたらすプロモーター。ｐｏｌ：ベクターにより産生されるｍＲＮＡにポリ（Ａ）テールを導入するために用いられるポリアデニル化配列。
【図６】図６は、Ｅ２Ｆ４コード配列の変異導入過程のダイアグラムを示す。特異的制限部位ＣおよびＤ（外部の矢印）と並ぶ外部プライマーペアおよびその配列内にＴｈｒ２４８の変異コドン（内部の矢印）を含む他の重なる内部プライマーペアが設計される。２つのＰＣＲ増幅反応が、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを用いて実施され、反応生成物は共に変性させられる。ＤＮＡの復元（renature）後に、他の可能性の中でダイアグラムに示される状況が得られる。ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕの伸長は、その末端に外部プライマーの配列を有するＤＮＡ二重ヘリックスを生み出す。これらの配列は、前記プライマーで指数関数的に増幅され、制限部位ＣおよびＤと並ぶ、Ａｌａに変異させたＴｈｒ２４８残基を有するＤＮＡ断片を生ずる。変異を含む配列は、その目的のための制限部位ＣおよびＤを用いて発現ベクターにサブクローンされ得る。
【００３１】
参照文献
2014534257.tif 000003
【実施例】
【００３２】
実施例
この特許文献で提供される下記の特定の実施例は、本発明の性質を例示するものである。これらの実施例は、例示的な目的のためにのみ含まれるのであって、ここで特許請求される発明を限定するように解釈されてはならない。従って、下記に記載される実施例は、その応用分野を限定することのない発明を例示する。
【００３３】
実施例１：ヒトＥ２Ｆ４コード配列のクローニング
ヒト Ｅ２Ｆ４コード配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＭ＿００１９５０を有する配列の６４−１３０５位）（配列番号４）は、遺伝子治療に適したベクター（例えば、レンチウイルス）を産生できるプラスミドにクローニングされる。コード配列は、ヒト由来の細胞株または組織から事前に得られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼ酵素Ｐｆｕを用いて事前に増幅されなければならない。配列をクローニングするため、レンチウイルス発現ベクターのポリリンカーと互換のＥｃｏＲＶおよびＰａｃＩ制限部位（この段落の末尾に示される配列中で下線で示される）を含むプライマーが用いられる（図５の前記ベクターの単純なダイアグラムを参照、ダイアグラム中ではＥｃｏＲＶ部位はＡに対応し、ＰａｃＩ部位はＢに対応する）。これらのオリゴヌクレオチドの例は、下記野通りである。
配列番号５：５’オリゴ： 5’-CAACAGATATCATGGCGGAGGCCGGGCCACA-3’
配列番号６：３’オリゴ： 5’-CCATTAATTAAGGGTCCCAGCCACACAGGGC-3’
【００３４】
最初のオリゴヌクレオチドは、ヒトＥ２Ｆ４配列の６４−８３位におけるヌクレオチドに対応し、１３１９−１３３８位におけるヌクレオチドに相補的である。
【００３５】
このようにして得られた増幅産物は、ＥｃｏＲＶまたはＰａｃＩ制限部位を有さないｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングされ、セクション２で記載される部位特異的変異導入が行われる。
【００３６】
実施例２：Ｔｈｒ２４８残基の変異（Ｔｈｒ２５０残基は、Ｔｈｒ２４８Ａｌａ変異が導入されると同様の方法で変異導入される）
ヒトＥ２Ｆ４配列がｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターにクローニングされると、オリゴヌクレオチドは、配列番号４に対応するヒトＥ２Ｆ４コード配列の７３１−７５４位間に含まれる領域内に設計される。
【００３７】
これらのオリゴヌクレオチドは、Ａｌａ特異的コドン（ＧＣＴ配列）として変異させられた（ヒトＥ２Ｆ４コード配列の７４２−７４４位において）Ｔｈｒ２４８をコードするＡＣＴコドンを含む。これらのオリゴヌクレオチドの例は、
配列番号７：５’変異オリゴ： 5’-TCAGCTCGCTCCCACTGCTG-3’（７３５−７５４位）
配列番号８：３’変異オリゴ： 5’-CAGTGGGAGCGAGCTGAGGA-3’（７３２−７５１位）
である。
【００３８】
これらのオリゴヌクレオチド（下線で示された変異を含む）は、図６で示される２つの独立した反応のプライマーとして用いられる。酵素ＢｓｐＥＩ制限部位と並ぶ他のプライマーペア（図６のＣおよびＤとして示される）は、これらの反応のために設計される。ヒトＥ２Ｆ４をコードするＤＮＡ配列は、３７４−３７９位および９７９−９８４位にＴＣＣＧＧＡを有する２つのＢｓｐＥＩを含む。これらのプライマーの例は、
配列番号９：５’非変異オリゴ： 5’-AAGGTGTGGGTGCAGCAGAG-3’（３５２−３７１位）
配列番号１０：３’非変異オリゴ： 5’-GGTCTGCCTTGATGGGCTCA-3’（１００５−１０２５位）
である。
【００３９】
２回のＰＣＲ増幅反応は、図６のダイアグラムに示されるようにＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを用いて続いて実施され（３’変異オリゴと５’非変異オリゴ、および３’非変異オリゴと５’変異オリゴ）、反応生成物は一緒に変性させた。ＤＮＡの復元の後に、他の可能性の中で、図６のダイアグラムに示される状況が得られた。ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを用いたこれらのハイブリッドの伸長は、外部プライマー（５’非変異オリゴおよび３’非変異オリゴ；図６参照）で増幅され得るＤＮＡ二重ヘリックスを生み出す。制限部位ＣおよびＤと並ぶＡｌａに変異させたＴｈｒ２４８残基を有するＤＮＡ断片（図６参照）は、そうして得られた。変異を含む配列は、その後、その目的のための制限部位ＣおよびＤ（ＢｓｐＥＩ）を用いてポイント１に生み出されるｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターにサブクローニングされる。改変されたクローンをシークエンスした後に、適した方向で取り込まれた配列を有するクローンを選択する。
【００４０】
実施例３：神経系に感染できる治療用ベクターの産生
変異ヒトＥ２Ｆ４コード配列（Ｔ２４８Ａ）を有するｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙプラスミドは、ＥｃｏＲＶおよびＰａｃＩ酵素で開裂させて前記配列を切り離し、ＥｃｏＲＶおよびＰａｃＩ部位を含むレンチウイルス発現ベクター pSMPUW-Hygro (Cell Biolabs, Inc.)のポリリンカーにサブクローニングされる。このようにして生産されたベクターは、目的のベクターをパッケージングできる適切な細胞株にトランスフェクションされる。
【００４１】
実施例４：標的細胞におけるＥ２Ｆ４の変異形態の発現
ｐ３８ＭＡＰＫ−Ｅ２Ｆ４シグナル経路が活性化されている神経細胞または筋細胞においては、ｐ３８ＭＡＰＫは、分化過程においてＮＧＦで処理された神経細胞において見られるのと同様に、過剰量の変異Ｅ２Ｆ４分子に結合する際に阻害されていると予想される。従って、前記細胞における核内倍加過程は遮断されている。Ｅ２Ｆ４のＴｈｒ２４８残基のリン酸化が核内倍加を除く他の細胞機能において生じないならば、他の細胞におけるその存在は、副作用ではなかったはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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