(57)【要約】  本明細書においては、とりわけ、高密度のタンパク質ナノクラスターを含むタンパク質分散系、及び、その作製方法が提供される。希釈すると、該クラスターは、可逆的に解離して、生物活性の高い本来のタンパク質分子となり得る。該ナノクラスター分散系の粘性は、小体積の皮下注射を可能にするだけ十分に低いと考えられる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系であって、前記分散系が複数のナノクラスターを含み、前記複数のナノクラスターのそれぞれが複数のタンパク質を含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有する、分散系。
【請求項２】
前記複数のナノクラスターのそれぞれの平均直径が約２０から約１，０００ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項３】
前記平均直径が水力学的直径の平均値である、請求項２に記載の分散系。
【請求項４】
前記平均直径が、前記複数のナノクラスターの最長寸法の平均値である、請求項２に記載の分散系。
【請求項５】
前記複数のナノクラスター中の前記複数のタンパク質の５％未満が不可逆的に凝集している、請求項１に記載の分散系。
【請求項６】
前記複数のナノクラスター中の前記複数のタンパク質の２％未満が不可逆的に凝集している、請求項１に記載の分散系。
【請求項７】
前記複数のナノクラスター中の前記複数のタンパク質の１％未満が不可逆的に凝集している、請求項１に記載の分散系。
【請求項８】
粘度が約１センチポアズから約１０００センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項９】
粘度が約１センチポアズから約５００センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１０】
粘度が約１センチポアズから約２５０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１１】
粘度が約１センチポアズから約１００センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１２】
粘度が約１センチポアズから約９０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１３】
粘度が約１センチポアズから約８０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１４】
粘度が約１センチポアズから約７０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１５】
粘度が約１センチポアズから約６０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１６】
粘度が約１センチポアズから約５０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１７】
粘度が約１センチポアズから約４０センチポアズの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１８】
粘度が約５０センチポアズであり、せん断速度が約１０００秒-1である、請求項１に記載の分散系。
【請求項１９】
粘度が約２５センチポアズから約７５センチポアズの間であり、せん断速度が約１０００秒-1である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２０】
粘度が約１０センチポアズから約９０センチポアズの間であり、せん断速度が約１０００秒-1である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２１】
粘度が約５０センチポアズであり、せん断速度が約１００秒-1から約５００００秒-1の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２２】
粘度が約２５センチポアズから７５センチポアズの間であり、せん断速度が約１００秒-1から約５００００秒-1の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２３】
粘度が約２５センチポアズから７５センチポアズの間であり、せん断速度が約１０００秒-1から約１００００秒-1の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２４】
前記粘度が、注射器装填法により測定される、請求項８から２３のいずれか一項に記載の分散系。
【請求項２５】
前記分散系は注射可能であるが、同一濃度の前記複数のタンパク質の水溶液は注射可能ではない、請求項１に記載の分散系。
【請求項２６】
粘度が、同一濃度の前記複数のタンパク質の水溶液の粘度の約２分の１である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２７】
粘度が、同一の濃度の前記複数のタンパク質の水溶液の粘度の約５分の１である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２８】
粘度が、同一の濃度の前記複数のタンパク質の水溶液の粘度の約１０分の１である、請求項１に記載の分散系。
【請求項２９】
約２００ｍｇ／ｍＬから約６００ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３０】
約２００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３１】
約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３２】
約２００ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３３】
約２００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３４】
約３００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３５】
約４００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３６】
約５００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３７】
約６００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３８】
光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満であり、前記光減衰量測定値が、波長４００ｎｍから７００ｎｍの間での平均の光減衰量を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項３９】
光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満であり、前記光減衰量測定値が、波長６００ｎｍで得られるものである、請求項１に記載の分散系。
【請求項４０】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約８００ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４１】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約６００ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４２】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約４００ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４３】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約２００ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４４】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約１００ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４５】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約７５ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４６】
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約５０ナノメートルの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４７】
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約８０％の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４８】
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約７０％の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項４９】
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約６０％の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５０】
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約５０％の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５１】
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約５０％から約６０％の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５２】
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約６０％から約７４％の間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５３】
クラウダーを含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項５４】
クラウダーを含み、前記クラウダーが単糖である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５５】
クラウダーを含み、前記クラウダーが、グルコース、マンノース、フルクトース、アラビノース、キシロース、リボース、及びガラクトースから選択される単糖である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５６】
クラウダーを含み、前記クラウダーが二糖である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５７】
クラウダーを含み、前記クラウダーが、トレハロース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース、マルトース、又はスクロースから選択される二糖である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５８】
クラウダーを含み、前記クラウダーが多糖である、請求項１に記載の分散系。
【請求項５９】
クラウダーを含み、前記クラウダーが多価電解質である、請求項１に記載の分散系。
【請求項６０】
クラウダーを含み、前記クラウダーがポリ酸である、請求項１に記載の分散系。
【請求項６１】
クラウダーを含み、前記クラウダーがポリ（エチレングリコール）である、請求項１に記載の分散系。
【請求項６２】
クラウダーを含み、前記クラウダーが、ＰＥＧ２００からＰＥＧ５０００の間の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、請求項１に記載の分散系。
【請求項６３】
クラウダーを含み、前記クラウダーが塩である、請求項１に記載の分散系。
【請求項６４】
クラウダーを含み、前記クラウダーがデキストランである、請求項１に記載の分散系。
【請求項６５】
クラウダーを含み、前記クラウダーがポラキサマーである、請求項１に記載の分散系。
【請求項６６】
クラウダーを含み、前記クラウダーがアルコールである、請求項１に記載の分散系。
【請求項６７】
クラウダーを含み、前記クラウダーがアミノ酸又はペプチド又はタンパク質である、請求項１に記載の分散系。
【請求項６８】
前記タンパク質のクラウダーが、ジペプチド、トリペプチド、４個のアミノ酸から成るペプチド、又は５個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項６７に記載の分散系。
【請求項６９】
クラウダーを含み、前記クラウダーが界面活性剤である、請求項１に記載の分散系。
【請求項７０】
トレハロース、ポリ（エチレングリコール）、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、バッファー、又はそれらの組合せから成る群から選択されるクラウダーを含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７１】
タンパク質対クラウダーを約１：１の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７２】
タンパク質対クラウダーを約２：１の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７３】
タンパク質対クラウダーを約３：１の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７４】
タンパク質対クラウダーを約４：１の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７５】
タンパク質対クラウダーを約１：２の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７６】
タンパク質対クラウダーを約１：３、１：４、又は１：１０の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７７】
タンパク質対クラウダーを約１０：１の重量比で含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７８】
前記複数のナノクラスターが、多数の異なるタンパク質種を含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項７９】
前記複数のナノクラスターが第１の複数のナノクラスターであり、前記複数のタンパク質が第１の複数のタンパク質であり、前記分散系が第２の複数のナノクラスターをさらに含み、前記第２の複数のナノクラスターのそれぞれが第２の複数のタンパク質を含み、前記第２の複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記第２の複数のタンパク質が前記第１の複数のタンパク質とは異なる、請求項１に記載の分散系。
【請求項８０】
前記複数のナノクラスターが、制御放出成分又は制御放出ポリマーをさらに含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項８１】
前記複数のナノクラスターのそれぞれが低分子量化合物をさらに含み、前記低分子量化合物が、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、金属、金属酸化物、又はアプタマーである、請求項１に記載の分散系。
【請求項８２】
複数のナノ粒子をさらに含む、請求項１に記載の分散系。
【請求項８３】
前記複数のナノ粒子が、Ａｕ、磁性剤、光学剤、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、金属、金属酸化物、又はアプタマーから選択される複数の化合物を含む、請求項８２に記載の分散系。
【請求項８４】
ｐＨが、前記複数のタンパク質のほぼ等電点の値である、請求項１に記載の分散系。
【請求項８５】
ｐＨが、前記複数のタンパク質の等電点とは異なる、約２．５未満、約２．０未満、約１．５未満、約１．０未満、約０．８未満、約０．７５未満、約０．５未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１未満、又は約０．０５未満のｐＨ単位である、請求項１に記載の分散系。
【請求項８６】
ｐＨが、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、又は約９．５である、請求項１に記載の分散系。
【請求項８７】
ヒト血液に対して等張である、請求項１に記載の分散系。
【請求項８８】
ヒト血液に対して低張である、請求項１に記載の分散系。
【請求項８９】
容量オスモル濃度が約３００ｍＯｓｍｏ／Ｌである、請求項１に記載の分散系。
【請求項９０】
容量オスモル濃度が、約２５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項９１】
容量オスモル濃度が約１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから４５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項９２】
容量オスモル濃度が約１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから６００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間である、請求項１に記載の分散系。
【請求項９３】
前記複数のタンパク質のそれぞれが、抗体、抗体断片、ペグ化タンパク質、脂質付加タンパク質、成長因子若しくは成長因子拮抗薬、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬、受容体若しくは受容体拮抗薬、抗原、ワクチン、又は抗炎症剤である、請求項１に記載の分散系。
【請求項９４】
前記複数のタンパク質が複数のコンジュゲートであり、前記コンジュゲートのそれぞれが、低分子量化合物と結合しているタンパク質であり、前記低分子量化合物が、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、又はアプタマーである、請求項１に記載の分散系。
【請求項９５】
前記複数のタンパク質が、自己群集している、請求項１に記載の分散系。
【請求項９６】
前記複数のタンパク質が複数のコンジュゲートではなく、前記タンパク質のそれぞれがアミノ酸から成る、請求項１から９５のいずれか一項に記載の分散系。
【請求項９７】
請求項１から９６のいずれか一項に記載の分散系を含む医薬組成物であって、前記複数のタンパク質が、複数の薬学的に活性なタンパク質である、医薬組成物。
【請求項９８】
２１から２７ゲージの針に取り付けられている注射器内に入っている、請求項９７に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、タンパク質−クラウダー配合液を濃縮し、それにより前記分散系を形成するステップを含み、前記分散系が複数のナノクラスターを含み、前記複数のナノクラスターのそれぞれが複数のタンパク質を含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含み、前記分散系が、複数のクラウダーを含む、方法。
【請求項１００】
前記濃縮するステップに先立ち、前記タンパク質の溶液を、容器中でクラウダーと配合してタンパク質−クラウダー配合液を形成するステップを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記タンパク質−クラウダー配合液が、タンパク質ナノクラスターの平均直径が、前記濃縮するステップにより形成される前記複数のタンパク質ナノクラスターの平均直径とは異なる、タンパク質ナノクラスター分散系を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質をクラウダー及び分散液と配合し、それにより、複数の前記タンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含む、方法。
【請求項１０３】
前記配合するステップに先立ち、タンパク質混合物から溶媒を除去し、それにより前記粉末形態のタンパク質を形成するステップを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記タンパク質混合物が、タンパク質分散系又はタンパク質溶液である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記除去するステップが、前記タンパク質混合物を粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、若しくは噴霧フリーズドライ、噴霧凍結するステップを含む、又は、前記除去するステップが、前記タンパク質混合物に、渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記溶媒が水である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質を分散液と配合し、それにより、複数の前記タンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含む、方法。
【請求項１０８】
前記配合するステップに先立ち、タンパク質−クラウダー混合物から溶媒を除去し、それにより前記粉末形態のタンパク質を形成するステップを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記タンパク質−クラウダー混合物が、タンパク質分散系又はタンパク質溶液である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記除去するステップが、前記タンパク質−クラウダー混合物を粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、若しくは噴霧フリーズドライ、噴霧凍結するステップを含む、又は、前記除去するステップが、前記タンパク質−クラウダー混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記溶媒が水である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記分散液が、水、水性液、又は非水性液である、請求項１０２又は１０７に記載の方法。
【請求項１１３】
前記分散液が、安息香酸ベンジル、又は、安息香酸ベンジルと、ベニバナ油、ゴマ油、ヒマシ油、綿実油、キャノーラ油、サフラン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、ａ−トコフェロール、Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２、及びオレイン酸エチルから選択される１つ若しくは複数の油とを合わせたものである、請求項１０２又は１０７に記載の方法。
【請求項１１４】
前記除去するステップが、前記混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む、請求項１０３又は１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
ＳＷＩＦＴを適用するステップが、
１．前記混合物を含有するバイアルを、極低温剤と接触させながら回転させるステップと、
２．前記混合物をすべて凍結するステップであり、前記バイアルの内側表面上の前記凍結された混合物の薄いフィルム、及び、前記バイアルの中心部に向かってらせん方向に１つ又は複数の後続のフィルムが得られるステップと、
３．前記凍結された混合物を凍結乾燥するステップと
を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約３００ｍｇ／ｍＬ超である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約４００ｍｇ／ｍＬ超である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約５００ｍｇ／ｍＬ超である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約６００ｍｇ／ｍＬ超である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約３００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬの間である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約４００ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの間である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記クラウダーが、グリセロール、エリトリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリ（エチレングリコール）、アミノ酸、ペプチド、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、有機共溶媒であって、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テタヒドロフルフリルアルコール、ジグリム、乳酸エチルから選択される有機共溶媒、それらの塩、バッファー、又は組合せである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記クラウダーが多糖である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記クラウダーがポリ（エチレングリコール）である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記クラウダーがＮＭＰ又はアルコールである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記クラウダーがアミノ酸である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記濃縮するステップが、ろ過を用いて実施される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１２９】
前記濃縮するステップが、遠心ろ過を用いて実施される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３０】
前記濃縮するステップが、正の気体圧力又は機械的圧力を用いて実施される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記濃縮するステップが、接線流ろ過、透析、又はバッファーの吸収を用いて実施される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３２】
クラウダー又は前記タンパク質が、前記濃縮するステップの間に前記タンパク質−クラウダー配合液に加えられる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３３】
ろ過により前記分散系を滅菌するステップをさらに含む、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
直径約２００ｎｍの細孔を備えるフィルターを通したろ過により前記分散系を滅菌するステップをさらに含む、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの解凍後の平均直径が、前記複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１％以内である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの解凍後の平均直径が、前記複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約５％以内である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの解凍後の平均直径が、前記複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１０％以内である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の粘度が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の解凍後の粘度が、前記分散系の凍結前の粘度の約１％以内である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の解凍後の粘度が、前記分散系の凍結前の粘度の約５％以内である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の解凍後の粘度が、前記分散系の凍結前の粘度の約１０％以内である、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１日間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約３日間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１週間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１カ月間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１年間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
当該治療を必要とする患者における疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１から９６のいずれか一項に記載の分散系を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１４９】
前記投与される分散系が、前記患者の体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ、約１０ｍｇのタンパク質を含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系のタンパク質ナノクラスターの平均直径を修正する方法であって、前記分散系中のクラウダー又は前記タンパク質の濃度を増加又は減少させるステップを含み、前記分散系が複数のナノクラスターを含み、前記複数のナノクラスターのそれぞれが複数のタンパク質を含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含む、方法。
【請求項１５１】
請求項１から９６のいずれか一項に記載の分散系又は請求項９７若しくは９８に記載の医薬組成物を備えるキット。
【請求項１５２】
粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物と分散液とを備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許仮出願第６１／５８７，６４８号（２０１２年１月１７日出願、発明の名称「ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＤＩＳＰＥＲＳＩＯＮＳ」）及び米国特許仮出願第６１／４５１，５７１号（２０１１年３月１０日出願、発明の名称「ＬＯＷ  ＶＩＳＣＯＳＩＴＹ  ＨＩＧＨ  ＣＯＮＣＮＥＴＲＡＴＩＯＮ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＤＩＳＰＥＲＳＩＯＮＳ」）の優先権を主張するものである。ここに言及した各出願の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発下でなされた発明への権利に関する声明
本発明は、国立科学財団により授与された助成金ＮＳＦＳＴＣ−ＣＨＥ−９８７６６７４号、ＣＢＥＴ−０９６８０３８号、ＣＢＥＴ−１０６５３５７号の下に政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般には、高濃度のタンパク質分散系の分野、及び、タンパク質ナノ粒子分散系を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
当技術分野においては、様々な用途（例えば、皮下投与用の医薬製剤など）のための高度に濃縮されたタンパク質分散系が必要とされている。本発明は、当技術分野におけるこのような様々な必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系が提供される。分散系は、複数のナノクラスターを含む。複数のナノクラスターのそれぞれは複数のタンパク質を含み、複数のタンパク質のそれぞれはアミノ酸配列同一性を共有する。
【０００６】
第２の態様において、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系のいずれかを含む医薬組成物であって、複数のタンパク質が、複数の薬学的に活性なタンパク質である医薬組成物が提供される。
【０００７】
第３の態様において、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系又は医薬組成物を備えるキットが提供される。
【０００８】
第４の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、タンパク質−クラウダー配合液（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｒｏｗｄｅｒ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を濃縮し、それにより分散系を形成することを含む方法が提供される。分散系は複数のナノクラスターを含み、複数のナノクラスターのそれぞれは複数のタンパク質を含み、複数のタンパク質のそれぞれはアミノ酸配列同一性を共有する。分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度のタンパク質を含み、分散系は、複数のクラウダーを含む。
【０００９】
第５の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質をクラウダー及び分散液と配合し、それにより、複数のタンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含む方法が提供される。複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度のタンパク質を含む。
【００１０】
第６の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質を分散液と配合し、それにより、複数のタンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含む方法が提供される。複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度のタンパク質を含む。
【００１１】
第７の態様において、当該治療を必要とする患者における疾患を治療するための方法であって、有効量の本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系のうちいずれか１つを患者に投与することを含む方法が提供される。
【００１２】
第８の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系のタンパク質ナノクラスターの平均直径を修正するための方法であって、分散系中のクラウダー又はタンパク質の濃度を増加又は減少させることを含む方法が提供される。分散系は複数のナノクラスターを含み、複数のナノクラスターのそれぞれは複数のタンパク質を含む。複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度のタンパク質を含む。
【００１３】
さらなる一態様において、粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物と分散液とを備えるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の透明分散系のデジタル画像である。図１Ａは、１５７ｍｇ／ｍｌ  −  ０．０８φP／０．１６φNであり、図１Ｂは、２７５ｍｇ／ｍｌである。表１における分散系は全て、見た目が非常に似ている。
【図２】ナノクラスターの動的光散乱（ＤＬＳ）水力学的直径を示す図である。図２Ａ：トレハロースが、唯一の外因性クラウダー（extrinsic crowder）であり、トレハロース対タンパク質の質量比は、１：１である（１４２ｍｇ／ｍｌ、φT＝０．０９における）。図２Ｂ：φP＝０．１６又は０．２４による１５７ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ分散系。さらなる試料情報は、表１に見ることができる。
【図３】タンパク質溶解度を決定するための、一定の外因性クラウダー濃度におけるＤＬＳ水力学的直径対タンパク質を示す図である。図３Ａ：２５０ｍｇ／ｍｌトレハロース（φT＝０．１５）による、ｐＨ６．４バッファーにおける最初の２５０ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ。タンパク質単量体溶解度は、約３１〜５０ｍｇ／ｍｌの間である。図３Ｂ：０．１６φN／０．０８φP及び２００ｍｇ／ｍｌトレハロース（φE＝０．３４）による、ｐＨ６．４バッファーにおける最初の２００ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ。タンパク質単量体溶解度は、約１．５〜２．５ｍｇ／ｍｌの間である。
【図４】表１における１５７ｍｇ／ｍｌ  −  ０．０８φP／０．１６φN  ＩｇＧ分散系の代表的な低温ＳＥＭ（cryo-SEM）（図４ａ）及びＳＴＥＭ（図４ｂ）画像である。
【図５Ａ】図５Ａは、５０ｍｇ／ｍｌの一定のＩｇＧ濃度におけるタンパク質ナノクラスターの水力学的直径を示す図である。経路１において、一定のＩｇＧ濃度を維持するためのＩｇＧ：トレハロース（１：１ｗ／ｗ）の２００ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧの少量の分散系と共に、ｐＨ６．４リン酸バッファーにおける５００ｍｇ／ｍｌトレハロースを用いてトレハロース濃度を増加させた。糖濃度セットを減少させるため、同じ仕方で一定のＩｇＧ濃度を維持しつつ純粋バッファーを添加した。経路２において、５０ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ溶液に固体の糖結晶を添加して、糖濃度を増加させた。経路３において、純粋なｐＨ６．４リン酸バッファー及び重量によって１：１のＩｇＧ：トレハロースによる２００ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ分散系を用いて、経路１における減少と同様の仕方でトレハロース濃度を減少させた。理論から得られるクラスター直径の値もプロットに重ねる。
【図５Ｂ】図５Ｂは、両者共に３０ｍｇ／ｍｌで一定のＩｇＧ及びトレハロース濃度を示す図である。一定のＩｇＧ及びトレハロース濃度を維持するための１：１重量比のＩｇＧ及びトレハロースを含む凍結乾燥粉末と共に、１：２容量のＰＥＧ３００：ＮＭＰ溶液を添加することにより、ＰＥＧ３００及びＮＭＰの体積分率を増加させた。
【図６】図５Ａにおける異なる溶液調製経路の異なる濃度のトレハロースにおける、図５Ａから選択された試料に関するＤＬＳから得られた水力学的直径分布のプロットを示す図である。
【図７】増加トレハロース濃度（プラス符号）純粋糖クラウダーによる、図５ＡにおけるデータのＤＬＳにより測定された水力学的直径の普遍的スケーリングを示す図である。（菱形）図５Ｂの条件における増加ＮＭＰ／ＰＥＧ３００による、一定のφT＝０．０１８。
【図８】一定の０．０８φP／０．１６φNによるタンパク質／トレハロースナノクラスター分散系の希釈における静的光散乱（ＳＬＳ）データを示す図である。
【図９】図９Ａ：静電気的に安定化されたタンパク質単量体と添加クラウダー、図９Ｂ：ｐＩ付近の不安定なタンパク質単量体と添加クラウダー、図９Ｃ：ｐＩ付近の静電気的に安定化されたタンパク質ナノクラスター（１電荷／タンパク質分子を仮定）と添加クラウダー及び図９Ｄ：ｐＩ付近の静電気的に安定化されたタンパク質ナノクラスター（２電荷／タンパク質分子を仮定）と添加クラウダーに対する、総ポテンシャル（potential）（Ｖtot（ｒ））、ファンデルワールスからの引力ポテンシャルＶvdw（ｒ）、特定短距離引力（specific short-range attraction）Ｖsr（ｒ）、０．５ｎｍ半径クラウダーの枯渇引力（depletion-attraction）Ｖdep（ｒ）、及び静電反発ポテンシャルＶ静電を示す図である。
【図１０】本明細書に記載されている理論に基づくタンパク質分散系の状態図である。急勾配の実線はゲル線であり、それより上で溶液がゲル相を形成する。各線は、同一サイズ又は凝集数のクラスターを示す。レジェンドにおける数値は、この特定の曲線のクラスター直径（ナノメートル）である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明に係る３００ｍｇ／ｍｌのトレハロースによる２００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの透明分散系のデジタル画像を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、１Ｂ７ナノクラスター（１１Ｂ）のＳＥＭ画像を示す。この図において、その周りにトレハロース分子のハローを有する球状のタンパク質単量体を観察できる。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ヒツジＩｇＧナノクラスター（１１Ｃ）のＳＥＭ画像を示す。この図において、その周りにトレハロース分子のハローを有する球状のタンパク質単量体を観察できる。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、濃縮ナノクラスター分散系及び一定のクラウダー（トレハロース）濃度２７０ｍｇ／ｍｌにおけるタンパク質希釈のＤＬＳによる水力学的直径の分布を示す。ナノクラスターのサイズは、濃度が５０ｍｇ／ｍｌタンパク質に降下するまで殆ど一定であることが分かる。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ＩｇＧ対トレハロースの質量比１：０．５におけるヒツジＩｇＧの高濃度分散系のＤＬＳから得られる水力学的直径の分布を示し、この結果は、より高濃度における概念を立証する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、様々な範囲の糖濃度に対するＤＬＳから得られる１Ｂ７クラスターの水力学的直径の分布を示す。１Ｂ７の濃度は、これら分散系の全てに対し７０ｍｇ／ｍｌに一定に維持される。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本明細書に記載されている理論に基づく理論的予測及び実際の実験により観察されたサイズから得られる平均クラスターサイズ対クラウダー濃度を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、図１０におけるプロットと同様のプロットであり、これは、ｍＡｂ  １Ｂ７の状態図をもたらすクラスターサイズの理論的予測である。これは、外因性クラウダーの体積分率に対するタンパク質体積分率を示す。ゲル線は、それより上では分散系がゲル化する（gel up）と予測されるポイントの座位を示し、一方、プロットにおける他の曲線は、一定のクラスターサイズを示す曲線である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、タンパク質ナノクラスター間のポテンシャルを示すプロットである。静電反発力及び引力、即ち、特定短距離力、枯渇力及びファンデルワールス力は共に、約１９ｋＴのポテンシャル障壁を生じる。この障壁は、タンパク質ナノクラスターが一体に凝集するのを妨げるよう作用する。
【図１３】異なる投与方法によりマウスに投与された１Ｂ７の薬物動態を示す図である。異なる時点における抗体の濃度をＥＬＩＳＡによりモニターした。分散系は、溶液における２３５ｍｇ／ｍｌトレハロースによる２３５ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７であった。
【図１４】荒削りの（coarse grained）モデルからの計算に基づくタンパク質の体積分率に応じた、フォールディングしたタンパク質の分率を示す図である。高体積分率において、タンパク質は自己群集（self-crowded）し、これによりタンパク質分子はフォールディング形態をとり易くなる。
【図１５】緩慢凍結し凍結乾燥したヒツジＩｇＧを凍結乾燥した後の、タンパク質対トレハロースの重量比１：１により２０ｍｇ／ｍｌで凍結した乾燥ＩｇＧ粉末のＳＥＭ顕微鏡写真（図１５Ａ〜Ｃ）を示す図である。
【図１６】小型の円錐状バイアルにおける様々な溶液標準を用いた粘度測定のための較正曲線を示す図である。ＤＩ水（ηo＝１ｃＰ）、ＰＥＧ２００（ηo＝５０ｃＰ）、ＰＥＧ３００（ηo＝７０ｃＰ）、ＰＥＧ４００（ηo＝９０ｃＰ）及び安息香酸ベンジル（ηo＝８．８ｃＰ）。毎秒３０画像の大量に積み重ねられた画像へと変換された溶液のビデオから、小型の円錐状バイアルにおいて０．４”から０．１”へと液面が引く時間を測定した。
【図１７】ヒツジＩｇＧ溶液のＩＥＦ解析を示す図であり、レーンは左から右に、ＩＥＦマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２μｇヒツジＩｇＧ及び１μｇヒツジＩｇＧである。Ｂ）ヒツジＩｇＧ溶液におけるゼータ電位測定値を示す図である。
【図１８】水力学的直径分布を示す図である。図１８Ａは、２９８ｎｍ球体の濃縮（１０％固体重量）ポリスチレン標準における、ＤＬＳから得られる水力学的直径分布であり、一方、図１８Ｂは、Ａにおける試料、生データ（Ｇ２（Ｒａｗ））及びＣＯＮＴＩＮアルゴリズムを用いた適合（Ｇ２（Ｒｅｃ））の相関関数である。
【図１９】ナノクラスターのフラクタル次元を決定するための、様々な角度における静的光散乱測定値を示すプロットである。図１９Ａは、２５０ｍｇ／ｍｌトレハロースによる５０ｍｇ／ｍｌのナノクラスターに関し、図１９Ｂは、８％ＰＥＧ３００／１６％ＮＭＰによる１０ｍｇ／ｍｌのナノクラスターに関する。
【図２０】様々な濃度の尿素におけるＩｇＧ試料から測定された最大発光波長のプロットを示す図である。
【図２１】リン酸緩衝溶液ｐＨ６．４を用いて系列希釈した、ＩｇＧ対トレハロース重量比１：１のヒツジＩｇＧ分散系のＤＬＳから得られる水力学的直径分布のプロットを示す図である。サイズは、溶液が希釈されるにつれ減少することが分かる。
【図２２】クラスターの形態を示す、１Ｂ７クラスターのＳＥＭ画像である。
【図２３】そのｐＩ付近のタンパク質の単量体間（inter-monomer）距離に応じた２個の単量体タンパク質分子間のポテンシャルのプロットを示す図である。
【図２４】４００ｍｇ／ｍｌ及び３５０ｍｇ／ｍｌの高濃度のＢＳＡのナノクラスターのＤＬＳから得られる水力学的直径の分布を示す図である。
【図２５】ＳＷＩＦＴ凍結工程の模式図である。円柱状バイアル内に未凍結タンパク質溶液を横倒しにして置き、液体窒素に曝露しつつ転がす。この操作により、バイアル内部の縁においてタンパク質溶液の薄いフィルムが凍結し、続いて、後続のフィルムがバイアル中央に向かって形成されてタンパク質溶液の凍結した弁輪を生じ、これを凍結乾燥機に置いて水を除去する。
【図２６】ｍＡｂ  １Ｂ７の等電点（ｐＩ）を決定するための、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルの画像である。レーン１：ＩＥＦ標準、４．４５〜９．６の範囲（ＢｉｏＲａｄ）；２：１ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７；３：２ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７；４：５ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７。
【図２７Ａ】図２７Ａは、抗百日咳毒素活性ＥＬＩＳＡの較正データである。図２７Ａは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＰｒｏソフトウェアにおいてＥＣ50を決定するための、１００μｇ／ｍｌスパイク血清標準に適合された平行線を用いて解析された試料スパイク血清百日咳ＥＬＩＳＡアッセイを示す：１００μｇ／ｍｌスパイク血清標準のＥＣ50で割った試料ＥＣ50の自然対数、対、スパイク血清濃度。試料毎に、ＥＣ50／１００μｇ／ｍｌ標準のＥＣ50の自然対数を用いて、血清ｍＡｂ  １Ｂ７濃度を決定する。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、抗百日咳毒素活性ＥＬＩＳＡの較正データである。図２７Ｂは、標準間の相関の測定を示す：１００μｇ／ｍｌスパイク血清標準のＥＣ50で割った試料ＥＣ50の自然対数、対、スパイク血清濃度。試料毎に、ＥＣ50／１００μｇ／ｍｌ標準のＥＣ50の自然対数を用いて、血清ｍＡｂ  １Ｂ７濃度を決定する。
【図２８】ＳＷＩＦＴ凍結工程の模式図及び乾燥粉末ＳＥＭである。Ａ）円柱状バイアルにおける未凍結タンパク質溶液を横倒しにして置き、液体窒素に曝露しつつ転がす。この操作により、バイアル内部の縁においてタンパク質溶液の薄いフィルムが凍結し、続いて、後続のフィルムがバイアル中央に向かって形成されてタンパク質溶液の凍結した弁輪を生じ、これを凍結乾燥機に置いて水を除去する。Ｂ）ＳＥＭによる、凍結乾燥後のＳＷＩＦＴ粉末の形態。
【図２９】ＤＬＳによる未加工、凍結乾燥及び分散１Ｂ７の比較を示す図である。全試料を５ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳにおいて希釈した。
【図３０】抗体活性をモニターするための、ＰＴｘ  ＥＬＩＳＡによる未加工、凍結乾燥及び分散１Ｂ７の比較を示す図である。
【図３１】バイアル内部におけるリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）のＳＷＩＦＴ凍結温度プロファイルを示す図である。１５ｍｍ直径を有するバイアルにおける４ｍｌ及び２．６ｍｌの総液体体積に対応する、異なるフィルム厚２．６ｍｍ及び０．６ｍｍに溶液を凍結した。冷却材温度は８０Ｋであり、バイアル回転速度は３０ｒｐｍであった。
【図３２】分散バッファー中の粒子サイズにおける抗体濃度の効果を示す図である。分散バッファーにおける高濃度（２００ｍｇ／ｍｌ）では、動的光散乱（ＤＬＳ）は、約２００ｎｍの大型の粒子のみを検出する。分散バッファーにおいて５ｍｇ／ｍｌとなるよう希釈すると、ナノ粒子は、大型の２００ｎｍとより小型の５０ｎｍナノクラスターとの間で平衡する。溶解度限界（２．５及び５ｍｇ／ｍｌ）を下回るように分散バッファーでさらに希釈すると、単量体ＩｇＧに予想されるサイズである、約１０ｎｍサイズの粒子しか検出しない。
【図３３】分散系の外観を示す図である。図３３Ａは、懸濁された粒子のデジタル画像であり、図３３Ｂは、分散バッファーにおいて１００ｍｇ／ｍｌとなるよう希釈し、凍結乾燥により水を除去しつつ急速に凍結したｍＡｂ  １Ｂ７分散系（２００ｍｇ／ｍｌ）のＳＥＭ画像である。
【図３４】分散系から回収された抗体の特性評価を示す図である。図３４Ａは、未加工の、精製ｍＡｂ  １Ｂ７（レーン１）及びＰＢＳにおいて２００から１ｍｇ／ｍｌへと希釈された分散系（レーン２）を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像であり、図３４Ｂは、抗体活性をモニターするための、ＰＴｘ  ＥＬＩＳＡによる未加工、凍結乾燥及び分散１Ｂ７の比較を示す。
【図３５】終末（terminal）血清試料におけるビオチン化１Ｂ７を検出するための非還元ウエスタンブロットを示す図である。血清試料から得られた４μｇの１Ｂ７を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと組み合わせ、煮沸し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した後、ブロットを５％ＢＳＡでブロッキングし、ＳＡ−ＨＲＰをプローブとして、ｍＡｂ  １Ｂ７インタクト及び断片を検出した。レーンは、次のマウス試料を含有する。１：ＩＶ溶液、マウス＃２；２：ＩＶ溶液＃５；３：ＳＱ溶液＃７；４：ＳＱ溶液＃１０；５：ＳＱ低用量分散系＃１３；６：ＳＱ低用量分散系＃１７；７：ＳＱ高用量分散系＃２０；８：ＳＱ高用量分散系＃２４；９：ＳＱ分散バッファーのみ＃１８。レーン９に用いた血清の量は、最も薄い試料（ＳＱ低用量分散系＃１３）において用いた血清の量に対応した。
【図３６】トレハロースを外因性クラウダーとして用いた１Ｂ７抗体のナノクラスター形態を示す図である。Ａ．タンパク質クラスターの模式図であり、図中、大きな丸はタンパク質を表し、小さいドットは対イオンを表し、中程度の丸は外因性クラウダーを表す。同様のクラスターは、有機溶媒におけるコロイドに観察される。Ｂ．ｃ＝ｃE＝２２０ｍｇ／ｍｌにおける透明分散系。Ｃ．密に集合した自己群集性タンパク質を示す、３６ＢのＳＥＭ画像（構成粒子における「ハロー」は、試料調製の際のトレハロース沈着のアーチファクトである）。Ｄ．一定の縮尺で描いたナノクラスターの分散系の模式図。
【図３７】外因性クラウダーとしてトレハロースを用いた１Ｂ７抗体及びポリクローナルヒツジＩｇＧのＤＬＳによる水力学的直径を示す図である。Ａ．１Ｂ７；ｃ／ｃE＝１となるよう、バッファーにおいて系列希釈。Ｂ．１Ｂ７；図３６ａの通り出発ｃ＝ｃE＝２２０ｍｇ／ｍｌによるｐＨ７．２リン酸バッファーにおける希釈（正方形）及び出発ｃEが２７０ｍｇ／ｍｌである、７０ｍｇ／ｍｌの一定のｃによる減少ｃE（菱形）。エラーバーは、ピーク幅における±ｓ．ｄ．を示す。Ｅｑ．１４の予測は、定性的に一致している。Ｃ．１Ｂ７；７０ｍｇ／ｍｌの一定のｃにおいて、レジェンドに示す２７０から１５０ｍｇ／ｍｌへとトレハロースｃEを減少させ、続いて、２７０ｍｇ／ｍｌ−２として表示する、ｃEが２７０ｍｇ／ｍｌへと再度上昇する最終点に向かう。Ｄ．ポリクローナルヒツジＩｇＧ；５０ｍｇ／ｍｌの一定のｃにおいて、増加（菱形）、続いて減少（正方形）するトレハロース濃度。可逆性は、平衡クラスター挙動を示唆する。Ｅｑ．１４の理論的予測は、データと定性的に一致している。
【図３８】高タンパク質濃度に対するＢＳＡナノクラスターサイズを示す図である。ｃ＝４００ｍｇ／ｍｌ及びｃE＝２４０ｍｇ／ｍｌにて処方された高濃度ＢＳＡ分散系は、４０ｎｍの水力学的直径を有するナノクラスターを形成する。より低濃度のＢＳＡ及び／又はトレハロースで処方された分散系は、漸進的に小さいナノクラスターを生じる。３〜４ｎｍ直径のＢＳＡ単量体も示されている。
【図３９】抗体立体構造及び活性を示す図である。Ａ．モノクローナル抗体１Ｂ７対照及び２６７ｍｇ／ｍｌ分散系の円二色性スペクトル。全試料を０．１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに希釈し、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５ＣＤ分光計において解析した。Ｂ．抗体ナノクラスターに見られる高Φint＝０．６において天然状態が有利であることを示唆する、フォールディングタンパク質分率の理論的予測（Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）。
【図４０Ａ】ナノクラスター分散系におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−クラスター及びクラスター−クラスター階層的相互作用を示す図である。（Ａ）平均力のポテンシャルは、特定短距離（ｓｓｒ）、枯渇引力（ｄｅｐ）及び静電気（ｅｌ）構成成分を包含する：Ｖ（ｒ）＝Ｖssr（ｒ）＋Ｖdep（ｒ）＋Ｖel（ｒ）。
【図４０Ｂ】ナノクラスター分散系におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−クラスター及びクラスター−クラスター階層的相互作用を示す図である。（Ｂ）ｐＩにおける及びｐＩから３ｐＨ単位離れたタンパク質単量体のＶ（ｒ）の構成成分。Ｂ．予測されるクラスター直径等高線（contour）。三角形は、表１６に示す通り、１Ｂ７のｃ＝２３５ｍｇ／ｍｌにおける、マウスに注射された分散系の条件を表示する。対角パスウェイは、分散系の希釈を表す（図３７ａ）。
【図４０Ｃ】ナノクラスター分散系におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−クラスター及びクラスター−クラスター階層的相互作用を示す図である。（Ｃ）ポリクローナルＩｇＧの実験的ゼータ電位に基づく２個の５０ｎｍナノクラスターのＶ（ｒ）。挿入図：弧は、２個のクラスターの縁における長距離（long-ranged）反発の範囲を示し、丸の周りの環は、短距離クラスター間（inter-cluster）引力を示す。
【図４１】濃縮された１Ｂ７分散系及び溶液対照の薬物動態を示す図である。静脈内溶液、皮下溶液又は皮下分散系の投与後の、用量により正規化された血清抗体濃度の経時的変化。尾静脈から血清試料を回収し、１Ｂ７濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【図４２】溶液におけるクラウダー（小さな丸）の存在により誘導された、２個のタンパク質粒子（大きな灰色の丸）間の枯渇引力の模式図である。引力は、このようにクラウダーの中心に排除された体積が重複領域のサイズにより低下される等、立体配置のエントロピー優先度を反映する。
【図４３】外因性クラウダーとしてトレハロースを有する抗体ナノクラスターのＳＥＭ画像を示す図である。Ａ、ｃ＝ｃE＝２２０ｍｇ／ｍｌ（図３６ｃのものと同一条件）における１Ｂ７抗体ナノクラスターの複数のＳＥＭ画像の再現性。ＳＥＭ顕微鏡写真は、４個のクラスターに対し、分散系における約３００ｎｍクラスターのサイズにおける優れた再現性を明らかに示し、これは図３７ａにおけるＤＬＳ結果と一致する。画像は、ナノクラスターを銅メッシュに載せた通常の炭素膜銅ＴＥＭグリッドから得た。およそ１０ｎｍの個々のタンパク質単量体は、その周りにハローを有するように見える。このハローは、ＳＥＭの試料調製における凍結及び凍結乾燥の際に沈着したトレハロースの層である。Ｂ、ｃ＝ｃE＝２６０ｍｇ／ｍｌにおけるポリクローナルＩｇＧナノクラスター。画像処理はレイシー炭素（lacey carbon）ＴＥＭグリッドにおいて行い、ナノクラスターはレイシー炭素の鎖の上に載っている。
【図４４】フラクタル次元を決定するための静的光散乱を示す図である。ｃ＝７０ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ及びｃE＝２７０ｍｇ／ｍｌトレハロースにおいて、８０ｎｍのヒツジＩｇＧナノクラスターが形成された。測定された計数率として見積もられる強度を、４５°〜９０°の様々な角度における散乱ベクトル４πｓｉｎ（θ／２）／λに対してプロットした。線の傾きは、−１を乗じたデータにより適合する、即ち、２．６がフラクタル次元である（Ｈｉｅｍｅｎｚ  ａｎｄ  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  １９９７）。静的光散乱において、本出願人らは、構造因子は散乱ベクトルの関数ではなく、したがって、強度はフラクタル次元による散乱ベクトルに関連していると仮定する。
【図４５】バッファー希釈後のポリクローナルＩｇＧナノクラスターのＤＬＳによる水力学的直径（ｃ／ｃE＝１）を示す図である。タンパク質濃度をレジェンドに示す。一定のｃ／ｃEにおけるリン酸バッファーによる連続希釈は、ｃ＝ｃE＝４７ｍｇ／ｍｌにおいて約１０ｎｍの水力学的直径を有する単量体タンパク質が観察されるまで、漸進的に小さいナノクラスターを生じる。ナノクラスター解離の挙動及び機序は、図３７ａ及びｂにおけるモノクローナル抗体１Ｂ７に観察されるものと同様のものである。
【図４６】高濃度におけるポリクローナルＩｇＧナノクラスターサイズを示す図である。トレハロースによるｃ／ｃE＝１：０．５の３００及び３５０ｍｇ／ｍｌタンパク質によりポリクローナルヒツジＩｇＧ分散系を処方し、得られたナノクラスター水力学的直径をＤＬＳにより測定した。
【図４７】分散系希釈後の単量体濃度のＨＰＬＣ  ＳＥＣを示す図である。全試料を１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに希釈し、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷ及びＧ３０００ＳＷXLカラムを備えるＷａｔｅｒｓ  Ｂｒｅｅｚｅ  ＨＰＬＣにより解析した。移動相は、１００ｍＭリン酸ナトリウム及び３００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を含み、吸光度２１４ｎｍにより溶出液をモニターした。Ａ．（１）溶液対照１Ｂ７、（２）凍結乾燥し、再構成した１Ｂ７並びに（３）２６０ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７及び２６０ｍｇ／ｍｌトレハロースにより処方された分散系のクロマトグラフを示す。分散系形成、クラスター希釈及びトレハロースによるクラスター再編成を通して凝集体濃度の増加は見られなかった。Ｂ．図３７ａ及び３７ｂに示す、広範囲の表示実験の％単量体値をここに示す。表示されている誤差は±ｓ．ｄ．である。
【図４８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した、より大きい分子量の凝集体の非存在を示す。解析に先立ち全分散系を１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳで希釈した。５μｇの各試料を非還元ローディングバッファーと組み合わせ、プレキャスト４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）にロードした。レーン（１）分子量マーカー（Ｓｐｅｃｔｒａ  ＢＲ）；（２）溶液対照１Ｂ７；（３）および（４）１Ｂ７凍結乾燥後；（５）分子量マーカー（Ｓｐｅｃｔｒａ  ＢＲ）；（６）および（７）希釈した２６０ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７分散系；（８）および（９）さらに希釈した、７５ｍｇ／ｍｌとなるよう希釈した２６０ｍｇ／ｍｌ分散系。いずれの試料も、いかなる分子量変化又はより高分子量の凝集体の形成も示さなかった。
【図４９】小型の円錐状バイアルによる測定の粘度較正曲線を示す図である。次の溶液標準を用いて較正曲線を作成した：ＤＩ水（ηo＝１ｃＰ）、安息香酸ベンジル（ηo＝８．８ｃＰ）、ＰＥＧ２００（ηo＝５０ｃＰ）、ＰＥＧ３００（ηo＝７０ｃＰ）及びＰＥＧ４００（ηo＝９０ｃＰ）。小型の円錐状バイアル（０．１ｍＬ  Ｖ−バイアル、Ｗｈｅａｔｏｎ）において液面が０．４”から０．１”に引く時間を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて毎秒３０画像の大量に積み重ねられた画像に変換した、溶液のビデオ（Ｋｏｄａｋ  ＥａｓｙＳｈａｒｅ  Ｚ８１２  ＩＳにより撮影）から測定した。プランジャーの端を１ｍｌマークに維持しつつ、０．０５秒以内まで少なくとも３回、時間を測定して平均した。注射器内の空洞の１０％の最大容積に分散系を充填して、圧力降下における変動を最小化した。
【図５０】遠心ろ過濃縮方法使用前後  −  凍結前後の分散系特徴を示す図である。２１７ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ及び７０ｍｇ／ｍＬトレハロースにより分散系を処方し、１カ月間凍結した。
【図５１】変動する波長における分散系濁度を示す図である。Ｃａｒｙ  ３Ｅ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において濁度を測定した。濁度はろ過前分散系のものを提示する。
【図５２】外因性クラウダーとしてアルギニンを用いた抗体ナノクラスターのＳＥＭ画像である。レイシー炭素膜を備える銅ＴＥＭグリッド上に滴下する前に、クラウダーとしてＮＭＰを用い、０．０７７の一定のクラウダー体積分率において分散系を４倍希釈した。各画像は、レイシー炭素グリッドの上に単一のナノ粒子を含有しており、これは５０〜１００ｎｍの間の直径である。
【図５３】遠心ろ過濃縮により分散系を形成するための模式図である。タンパク質を添加してタンパク質溶液を形成する。このタンパク質溶液に、クラウダーを添加する。この溶液を遠心ろ過濃縮のためのチューブに移す。フィルター通過の際にクラウダーを一部失いつつ、遠心分離後に濃縮を達成する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の多様な実施形態の実施及び使用について以下に詳細に論ずるが、本発明が、多種多様な特定の場面において具現できる多くの応用可能な発明概念を提供することは理解されるべきである。本明細書において論ずる特定の実施形態は、本発明を実施及び使用する特定の方式を単に例証するものであるにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１６】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００１７】
本明細書において使用する場合、用語「ナノクラスター」は、不可逆的に凝集していない１０個以上のタンパク質又はペプチドを指し、直径が２０から１，０００ナノメートルの間であり、場合により、追加的な化合物、成分、又は組成物と物理的に結び付いていてもよい。いくつかの実施形態において、直径は、水力学的直径である。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、より大きいクラスターを形成する、タンパク質又はペプチドのサブクラスターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、自己群集していてもよく、この場合の群集は、タンパク質又はペプチドが原因で生じるものである。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、外因性クラウダーの存在下で形成してもよい。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、大部分が自己群集していてもよい。用語「ナノクラスター」には、タンパク質やペプチドの結晶は含まれない。
【００１８】
本明細書において使用する場合、用語「注射器使用可能な（ｓｙｒｉｎｇａｂｌｅ）」及び「注射可能な（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｌｅ）」は、互換的に使用され、対象に送達するための最終組成物で、注射器（例えば、２１から２７ゲージの針の付いた注射器）を通って流動可能なだけ十分に流動性であるものを指す。例えば、「注射器使用可能な」組成物は、過度の力をかけずに注射器に装填し注射器から対象に注射するだけ十分に粘度が低く、この場合の過度の力とは、送達に際してかけられる力が単独の原因となって患者に有害作用が及ぶことなく、注射器（例えば、２１から２７ゲージの針の付いた注射器）を通して組成物を患者に送達する（例えば、ｉｖ注射、ＳＱ注射により）ために医療分野の当業者（例えば、医師、看護師）が加える力を超える量である。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「底に沈まない」又は「再分散可能な（ｒｅｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ）」は、組成物が、長期間、例えば、１時間、２時間、１日、３日、５日、１週間、１カ月、３カ月、６カ月、１年、又はそれを超える期間を経ても溶液相中に留まっている（すなわち、沈降しない）ことを指す。例えば、ある組成物が、再分散時に、薬物投与が可能な状態に戻せないほど急速に軟凝集しない場合、その組成物は「再分散可能な」ものである。
【００２０】
本明細書において使用する場合、用語「添加物（複数可）」は、塩、糖、有機物、バッファー、ポリマーなどの組成物を指し、そのような組成物としては以下が挙げられる：エデト酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、グルコヘプトン酸ナトリウム、ナトリウムアセチルトリプトファネート、炭酸水素ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、過テクネチウム酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、クエン酸アンモニウム、塩化カルシウム、カルシウム、塩化カリウム、酒石酸カリウムナトリウム、酸化亜鉛、亜鉛、塩化第一スズ、硫酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、二酸化チタン、ＤＬ−乳酸／グリコール酸、アスパラギン、Ｌ−アルギニン、塩酸アルギニン、アデニン、ヒスチジン、グリシン、グルタミン、グルタチオン、イミダゾール、プロタミン、硫酸プロタミン、リン酸、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、アスコルビン酸、塩酸システイン、塩酸、クエン酸水素、クエン酸三ナトリウム、塩酸グアニジン、マンニトール、ラクトース、スクロース、アガロース、ソルビトール、マルトース、トレハロース、界面活性剤、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、ソルビタンモノオレエート、トリトンｎ１０１、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、エタノールアミン、グリセリン、ホスホリルエタノールアミン、トロメタミン、２−フェニルオキシエタノール、クロロブタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、プロピレングリコール、ポリオキシル３５ヒマシ油、ヒドロキシ安息香酸メチル、トロメタミン、コーン油−モノ−ジ−トリグリセリド、ポリオキシル４０硬化ヒマシ油、トコフェロール、ｎ−アセチルトリプトファン、オクタフルオロプロパン、ヒマシ油、ポリオキシエチル化オレイン酸グリセリド、ポリオキシエチル化ヒマシ油、フェノール（消毒薬）、グリシルグリシン、チメロサール（消毒薬、抗真菌薬）、パラベン（保存剤）、ゼラチン、ホルムアルデヒド、ダルベッコ変法イーグル培地、ヒドロコルチゾン、ネオマイシン、フォンウィルブランド因子、グルタルアルデヒド、塩化ベンゼトニウム、白色ワセリン、ｐ−アミノフェニル−ｐ−アニセート、グルタミン酸一ナトリウム、β−プロピオラクトン、酢酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリス、カルボマー１３４２（アクリル酸と長鎖メタクリル酸アルキルとのコポリマーで、ペンタエリトリトールのアリルエーテルで架橋されたもの）、グルコースの星型ポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン４０、ポロキサマー（酸化エチレンと酸化プロピレンとのトリブロックコポリマー）。
【００２１】
用語「ａ」又は「ａｎ」は、本明細書において使用する場合、１つ又は複数を意味する。加えて、語句「［ｎ］で置換されている」は、本明細書において使用する場合、特定された基が、そこに名前の挙げられた置換基の任意のもののうち１つ若しくは複数又はその置換基すべてで置換されていてもよいことを意味する。例えば、アルキル基又はヘテロアリール基などの基が「置換されていないＣ1〜Ｃ20アルキル又は置換されていない２から２０員のヘテロアルキルで置換されている」場合、当該基は、１つ又は複数の置換されていないＣ1〜Ｃ20アルキル及び／又は１つ若しくは複数の置換されていない２から２０員のヘテロアルキルを含有してもよい。さらに、ある部分がＲ置換基で置換されている場合、当該基は「Ｒで置換されている」と呼ぶことがある。ある部分がＲで置換されている場合、当該部分は、少なくとも１つのＲ置換基で置換されており、各Ｒ置換基は異なっていてもよい。
【００２２】
「有効量」は、表明された目的（例えば、投与の目的である効果を達成する、疾患を治療する、酵素活性を低下させる、又は疾患若しくは病態の１つ若しくは複数の症状を低減させる）を達成するだけ十分な量である。「有効量」の例は、疾患の１つ又は複数の症状の治療、予防、又は低減に寄与するだけ十分な量であり、「治療的有効量」と呼ぶこともできよう。１つ又は複数の症状の「低減」（及び、この語句と文法的に等価な語句）は、症状（複数可）の重症度若しくは頻度の低下、又は症状（複数可）の消失を意味する。薬物の「予防的有効量」は、対象に投与されると、意図された予防的効果、例えば、傷害、疾患、病状、若しくは病態の発生（若しくは再発）を予防する若しくは遅らせる効果、又は、傷害、疾患、病状、若しくは病態、若しくはそれらの症状の発生（若しくは再発）の可能性を低下させる効果があると考えられる薬物の量である。完全な予防的効果は、１回分の用量の投与によって必ずしも起こるものではなく、一連の用量を投与した場合にのみ生じることがある。したがって、予防的有効量は、１回又は複数回投与の形で投与してもよい。「活性を低下させる量」は、本明細書において使用する場合、酵素の活性を、ある組成物（例えば、拮抗薬）の不在下と比較して低下させるために必要とされる当該組成物（例えば、拮抗薬、タンパク質、低分子量化合物）の量を指す。「機能を崩壊させる量」は、本明細書において使用する場合、酵素又はタンパク質の機能を、ある拮抗薬の不在下と比較して崩壊させるために必要とされる当該拮抗薬の量を指す。正確な量は、治療の目的によって決まるであろうし、公知の手法を用いて当業者が確認できよう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（第１〜３巻、１９９２）；Ｌｌｏｙｄ、Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ、（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ、Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ、（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２００３、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと）。
【００２３】
「対照」又は「対照実験」は、そのごく普通の意味に従って使用され、実験の対象又は試薬が、当該実験の手順、試薬、又は変数の省略以外は、並行した実験と同様に扱われる実験を指す。場合により、対照は、実験効果を評価する際の比較の標準として用いられる。
【００２４】
「接触すること」は、そのごく普通の意味に従って使用され、少なくとも２つの別個の種（例えば、生体分子、タンパク質、抗体、又は細胞などの化合物）を、反応し、相互作用し、又は物理的に触れるほど近位になるようにするプロセスを指す。但し、結果として得られる反応生成物は、添加された試薬間の反応により直接生成されることもあれば、反応混合物中で生成する可能性がある、添加された試薬の１つ若しくは複数に由来する中間体から生成されることもあることは理解されるべきである。
【００２５】
本明細書において定義するように、用語「阻害」、「〜を阻害する」、「〜を阻害すること」などは、タンパク質−阻害薬間の相互作用について言及する場合、タンパク質の活性又は機能に、阻害薬の不在下での当該タンパク質の活性又は機能と比較して負の方向に影響すること（例えば、低下させること）を意味する。いくつかの実施形態において、阻害は、疾患又は疾患の症状の低減を指す。いくつかの実施形態において、阻害は、疾患に関係のあるタンパク質の存在の低減を指す。したがって、阻害には、少なくとも部分的に、部分的に、又は完全に、刺激を遮断すること、活性化を減少させる、予防する、若しくは遅らせること、又は、シグナル伝達若しくは酵素活性若しくはタンパク質の量を、不活性化させる、感度低下させる、若しくは下方調節させることが含まれる。同様に「阻害薬」は、タンパク質の活性又はタンパク質の産生を、例えば、結合すること、刺激（例えば、産生）を部分的若しくは完全に遮断すること、活性化を減少させる、防止する、若しくは遅らせること、又は、シグナル伝達若しくは酵素活性を不活性化させる、感度低下させる、若しくは下方調節させることにより阻害する化合物である。阻害は、タンパク質の量を、当該タンパク質のクリアランス又は分解を促進することにより減少させる場合もある。いくつかの実施形態において、阻害薬は、抗体である。
【００２６】
用語「モジュレーター」は、標的分子のレベル又は標的分子の機能を向上又は低下させる組成物を指す。
【００２７】
「薬学的に許容される添加剤」及び「薬学的に許容される担体」は、活性剤の対象への投与及び対象による吸収を助け、患者に著しい有害な毒物学的作用を及ぼす原因となることなく本発明の組成物中に含ませることができる物質を指す。薬学的に許容される添加剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、通常生理食塩溶液、乳酸加リンゲル液、通常スクロース、通常グルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味料、香味料、塩溶液（リンゲル液など）、アルコール、油、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、又はデンプンなど）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、及び色素などが挙げられる。そのような調製物は、滅菌でき、必要に応じ、本発明の組成物（例えば、タンパク質、クラウダー、ナノクラスター、分散系）と有害に反応しない補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、バッファー、着色剤、及び／又は芳香族物質などと混合することができる。当業者には、本発明において、他の医薬用添加剤も有用であることが認識されよう。
【００２８】
用語「調製物」は、封入材料を担体として用いた活性組成物（例えば、タンパク質ナノクラスター、タンパク質−クラウダーナノクラスター、分散系）の製剤を包含することが意図されており、この封入材料は、活性成分（他の担体を伴うか否かを問わない）が担体により取り巻かれており、それにより活性成分が担体と結び付いているカプセルをもたらす。同様に、カシェ剤及びロゼンジ剤が包含される。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、及びロゼンジ剤は、経口投与に適した固形剤形として使用できる。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される」は、「生理学的に許容される」及び「薬理学的に許容される」と同義的に使用される。医薬組成物は、一般に、緩衝化及び貯蔵時における保存のための薬剤を含むであろうし、投与経路によっては、適切な送達のためのバッファー及び担体を含むことができる。
【００３０】
用語「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」は、本来の状態で見出された場合には伴っていることが普通である成分を実質的又は本質的に含んでいない材料を指す。生体分子（例えば、核酸又はタンパク質）の純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学手法を用いて決定される。調製物中に存在する支配的な種であるタンパク質は、実質的に精製されたものである。用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じさせることを表すことがある。いくつかの実施形態において、核酸又はタンパク質は、少なくとも５０％の純度、場合により少なくとも６５％の純度、場合により少なくとも７５％の純度、場合により少なくとも８５％の純度、場合により少なくとも９５％の純度、及び場合により少なくとも９９％の純度である。例として、単離された細胞又は単離された試料細胞は、それらの細胞が本来の状態にあるとき又は本来の状態から最初に取り出されたときには伴っていることが普通である成分の多くを実質的に含んでいない単一の細胞型である。ある特定の実施形態において、単離された細胞試料は、細胞を所望の状態で維持するために必要となる、その本来の状態由来の成分を保持する。いくつかの実施形態において、単離された（例えば、精製された、分離された）１つ又は複数の細胞は、試料中で実質的に唯一の細胞型である細胞である。精製された細胞試料は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の、１種類の細胞を含有し得る。単離された細胞試料は、細胞マーカー又は細胞マーカーの組合せを用いて入手し得るが、そのようなマーカーはいずれも、未精製の細胞試料中の１つの細胞型に特有のものである。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞選別機を用いて単離される。いくつかの実施形態においては、細胞は、細胞タンパク質に対する抗体を使用して単離する。
【００３１】
用語「水力学的直径」は、化学分野におけるそのごく普通の意味を有し、観察下での（例えば、動的光散乱法により測定した場合の）、分子と同じスピードで媒体を通って拡散する仮想的な剛体球の見かけの直径を指す。
【００３２】
本明細書において使用する場合、用語「透明な」は、材料が光を通過させる物理的特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が所与の波長（複数可）の入射光の大半を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光（例えば、可視光、６００ｎｍ、４００〜７００ｎｍ）の約７５％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約８０％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約８５％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９０％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９５％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９６％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９７％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９８％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９９％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９９．５％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９９．６％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９９．７％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９９．８％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、材料が特定の波長の入射光の約９９．９％超を通過させる特性を指す。いくつかの実施形態において、タンパク質ナノクラスター分散系の透明性に言及するとき、前記の百分率（％）（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％のうちいずれか１つの値）は、当該タンパク質を欠く対照試料（この対照試料の値を、特定の波長の入射光が材料を通過する値１００％と決める）と比較した値である。いくつかの実施形態において、透明性は、光減衰量により測定され、用語「光減衰量」は、本明細書において使用する場合、入射光の角度から０度での入射光の吸収量と散乱量とを合わせた量を指す。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約０．０５ｃｍ-1未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約０．１ｃｍ-1未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約０．２５ｃｍ-1未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約０．５ｃｍ-1未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約１％未満であることを意味する。いくつかの実施���態において、「透明な」は、光減衰量が約２％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約３％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約４％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約５％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約１０％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約１５％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約２０％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、「透明な」は、光減衰量が約２５％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、光減衰量に関連してタンパク質ナノクラスター分散系の透明性に言及するとき、前記の比率（％）（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のうちいずれか１つの値）は、当該タンパク質を欠く対照試料（この対照試料の値を、光減衰量の値０％と決める）と比較した値である。「光減衰量測定値」は、当業者により物理的に測定された光減衰値を指す。
【００３３】
用語「粘性、粘度、粘稠性（ｖｉｓｏｃｉｔｙ）」は、液体及び流体に適用される場合、化学分野におけるそのごく普通の意味を有する。
【００３４】
本明細書において使用する場合、用語「低粘性（ｖｉｓｏｃｉｔｙ）」は、粘度が約１００センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約９０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約８０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約７０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約６０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約５０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約４０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約３０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約２０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、粘度が約１０センチポアズ未満であることを指す。いくつかの実施形態において、低粘性は、粘度計、レオメーター、又は、本明細書に記載の注射器装填法（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定される。いくつかの実施形態において、低粘性は、約１００秒-1、約２００秒-1、約３００秒-1、約４００秒-1、約５００秒-1、約６００秒-1、約７００秒-1、約８００秒-1、約９００秒-1、約１０００秒-1、約２０００秒-1、約３０００秒-1、約４０００秒-1、約５０００秒-1、約６０００秒-1、約７０００秒-1、約８０００秒-1、約９０００秒-1、約１００００秒-1、約２００００秒-1、約３００００秒-1、約４００００秒-1、約５００００秒-1、約６００００秒-1、約７００００秒-1、約８００００秒-1、約９００００秒-1、又は約１０００００秒-1のせん断速度で測定される。いくつかの実施形態において、せん断速度の平均値は、本明細書に記載の注射器装填法を用いて、流量及び幾何学的特性から決定し得る。いくつかの実施形態において、「低粘性」は、以下の表／マトリックスに示す粘度とせん断速度との組合せ（１から２８０の番号を付けてある）の任意の１つを指し、表／マトリックスの各セルは、その列の粘度及びその行のせん断速度に対応している：
【００３５】
【表１】
2014514275.tif 000003
いくつかの実施形態において、粘度は先頭列に記載の値、せん断速度は先頭行に記載の値であり、それが共に、直前に掲げた表のセル番号１から２８０のいずれか１つに対応している。いくつかの実施形態において、前表における粘度とせん断速度との組合せは、本明細書に記載の注射器装填法により測定される。
【００３６】
本明細書において使用する場合、用語「高タンパク質濃度」又は「高タンパク質」は、タンパク質濃度が約２００ｍｇ／ｍＬ超であることを指す。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約３００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約４００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約５００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約６００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約７００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約８００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約９００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約１０００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、１つのタンパク質種（実質的に同一のタンパク質）の濃度である。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、混合物中のすべてのタンパク質の濃度である。いくつかの実施形態において、「高タンパク質濃度」又は「高タンパク質」は、タンパク質濃度が約２００ｍｇ／ｍＬ超、約３００ｍｇ／ｍＬ超、約４００ｍｇ／ｍＬ超、約５００ｍｇ／ｍＬ超、約６００ｍｇ／ｍＬ超、約７００ｍｇ／ｍＬ超、約８００ｍｇ／ｍＬ超、約９００ｍｇ／ｍＬ超、又は約１０００ｍｇ／ｍＬ超であることを指す。いくつかの実施形態において、「高タンパク質濃度」又は「高タンパク質」は、タンパク質濃度の範囲を指し、この範囲は、全体で、約２００ｍｇ／ｍＬ超、約３００ｍｇ／ｍＬ超、約４００ｍｇ／ｍＬ超、約５００ｍｇ／ｍＬ超、約６００ｍｇ／ｍＬ超、約７００ｍｇ／ｍＬ超、約８００ｍｇ／ｍＬ超、約９００ｍｇ／ｍＬ超、又は約１０００ｍｇ／ｍＬ超である。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「分散系」は、化学の分野におけるそのごく普通の意味を有し、異なる組成の連続相中に粒子が分散されている（例えば、液相中にナノ粒子又はナノクラスターが分散されている）系を指す。いくつかの実施形態において、分散系は懸濁液であってもよく、この場合の懸濁液は、化学分野におけるそのごく普通の意味を有し、連続液相中に固体粒子を有する分散系を指しており、この場合の固体粒子は、沈降するだけ十分に大きい。いくつかの実施形態において、分散系はコロイドであってもよく、この場合のコロイドは、化学分野において使用されるそのごく普通の意味を有する。いくつかの実施形態において、分散系は、連続液相中に分散されているナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、分散されている粒子は、タンパク質ナノクラスターである。いくつかの実施形態において、異なる組成の連続相は、溶液中にタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、溶液中のタンパク質は、分散系（すなわち、粒子と連続相とが合わさったもの）中の総タンパク質の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満、約０．１％未満である。
【００３８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書においては互換的に使用されてアミノ酸残基のポリマーを指し、この場合のポリマーは、アミノ酸から成っていない部分（例えば、小分子量化合物）と場合によりコンジュゲートされていてもよい。これらの用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーだけでなく、天然型アミノ酸ポリマー及び非天然型アミノ酸ポリマーにも適用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アミノ酸残基のポリマーとコンジュゲートされている（例えば結合されている）非タンパク質組成物（例えば、低分子量化合物）を含む（「コンジュゲート」又は「コンジュゲートタンパク質」と総称される）。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アミノ酸のポリマーから成る（「非コンジュゲートタンパク質」）。いくつかの実施形態において、タンパク質は、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１０００個、約２０００個、約３０００個、約４０００個、又は約５０００個のアミノ酸残基から成るポリマーである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のアミノ酸残基から成るポリマーである。
【００３９】
用語「アミノ酸」は、天然型アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに、天然型アミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然型アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるもの、並びに、後で修飾された天然型アミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然型アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素と結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然型アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然型アミノ酸と類似した様式で機能する、化学化合物を指す。
【００４０】
本明細書においては、アミノ酸を、広く公知の３文字の記号、又は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が推奨する１文字の記号、そのいずれかで呼ぶことがある。同様に、ヌクレオチドも、広く受け入れられている単一文字のコードで呼ぶことがある。
【００４１】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾されたバリアントは、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする当該核酸を指す、又は、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードは縮重していることから、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵというコドンはすべて、アラニンというアミノ酸をコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定されるすべての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載された対応するコドンのいずれにも変わる可能性がある。そのような核酸の変異が「サイレント変異」であり、これは、１種の保存的に修飾された変異である。ポリペプチドをコードする、ここでいうすべての核酸配列には、当該核酸のすべての可能性のあるサイレント変異も記載されている。当業者には、核酸中の各コドン（但し、普通はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び、普通はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることは認識されよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現産物に関する各配列の記載には潜在しているが、実際のプローブ配列に関しては潜在していない。
【００４２】
アミノ酸配列に関して、当業者には、コードされた配列における単一のアミノ酸又はわずかな百分率のアミノ酸を改変、付加、又は削除する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、削除、又は付加は、改変の結果、あるアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸に置換する「保存的に修飾されたバリアント」であることは認識されよう。機能的に類似したアミノ酸を示してある保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多形バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に追加されるものであり、それらを排除するものではない。
【００４３】
次の８つの群には、それぞれ、互いに保存的置換されるアミノ酸が入っている：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（１９８４）を参照のこと）。
【００４４】
「同一の」、又は配列「同一」率、又は「アミノ酸配列同一性を共有する」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関する場合、２つ以上の配列又は部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）について、それらが同じであること、又は、それらが、特定の領域にわたり同じであるアミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｅ）残基若しくはヌクレオチドをある百分率で有すること、又は、それらが、同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを特定の百分率で有すること（すなわち、比較ウィンドー（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）又は指定された領域にわたり最大一致度（ｍａｘｉｍｕｍ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）について比較及びアラインメントを行った際、特定の領域にわたり、約６０％の同一性、好ましくは、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、又はより高い同一性を有すること）を指し、この測定は、以下に記載の初期設定パラメータを有するＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、又は、手動アラインメント及び目視検査により行われる［例えば、ＮＣＢＩのウェブサイト（アドレスは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）などを参照のこと］。この場合、そのような配列を「実質的に同一」であると言う。また、この定義は、試験用配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を指す、又はそれに適用されることがある。また、この定義には、削除及び／又は付加が行われている配列、並びに、置換が行われている配列も含まれる。用いられるアルゴリズムにより、ギャップなどを説明できる。
【００４５】
配列比較の場合、典型的には、１つの配列が参照配列の役を果たし、試験用配列は、これと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する際は、試験用配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。好ましくは、初期設定のプログラムのパラメータを使用でき、又は、代替的なパラメータを指定できる。次いで、プログラムのパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが、参照配列に対する試験用配列の配列同一率を計算する。
【００４６】
「比較ウィンドー」は、本明細書において使用する場合、２０個から６００個、一般的には約５０個から約２００個、さらに一般的には約１００個から約１５０個で成る群から選択される隣接する位置の番号のうち任意の１つのセグメントへの言及を含んでおり、比較ウィンドー内では、ある配列を、隣接する位置の同じ番号の参照配列と比較し得るが、その前に、２つの配列を最適にアラインメントさせておく。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２、４８２ページ、（１９８１）の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、４４３ページ、（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、２４４４ページ、（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、提供先：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、又は、手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、補遺）を参照のこと）により、実行できる。
【００４７】
配列同一率及び配列類似率の決定に適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらのアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、３３８９〜３４０２ページ、（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３〜４１０ページ、（１９９０）にそれぞれ記載されている。
【００４８】
アプタマーは、非ワトソン・クリック様式で多種多様な標的と結合するように設計される核酸である。したがって、アプタマーを使用して、自己免疫疾患、炎症性の自己免疫疾患、癌、感染性疾患などの疾患に関連するタンパク質など、ほぼすべての対象とする分子を検出又は他の形で標的化することができる。アプタマーの結合の特徴を構築及び決定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、そのような手法は、米国特許第５，５８２，９８１号、同第５，５９５，８７７号、及び同第５，６３７，４５９号に記載されている。アプタマーは、典型的には、少なくとも５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、又は４０ヌクレオチドの長さであり、安定性を向上させるために修飾核酸から構成することができる。構造を安定化させるには、例えば、アプタマー中で三次元構造を形成するために、フランキング配列を加えることができる。
【００４９】
本明細書において使用する場合、用語「クラウダー」は、溶媒（例えば、分散液）中に濃縮されたタンパク質と共に存在すると、非不可逆的に凝集したタンパク質のナノクラスターを含有する安定なコロイド状の分散系の形成を助ける化合物を指す。いくつかの実施形態において、クラウダーは、タンパク質自体（例えば、自己群集性のタンパク質）であってもよい。いくつかの実施形態において、クラウダーは、アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、クラウダーは、第２のタンパク質種（例えば、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、コンジュゲートタンパク質、非コンジュゲートタンパク質）であってもよい。いくつかの実施形態において、クラウダーは、非タンパク質クラウダー、例えば、多糖、多価電解質、ポリ酸、デキストラン、ポロキサマー、界面活性剤、グリセロール、エリトリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリ（エチレングリコール）、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、有機共溶媒であり、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジグリム、乳酸エチルから選択される有機共溶媒、塩、バッファー、又はそれらの組合せであってもよい。
【００５０】
用語「多糖」、「多価電解質」、「ポリ酸」、「ポラキサマー」、「界面活性剤」、「バッファー」は、化学の分野におけるそのごく普通の意味を有する。
【００５１】
本明細書において使用する場合、用語「デキストラン」は、グルコース分子を含む分枝多糖を指す。いくつかの実施形態において、デキストランの分子量は、約１から２０００キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、デキストランは、１キロダルトンである。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１から１０キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１から１００キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１から１０００キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１０から１００キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１０から５０キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１０から２０００キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１００から２０００キロダルトンの間である。いくつかの実施形態において、該分子量は、約１００から５００キロダルトンの間である。
【００５２】
本明細書において使用する場合、用語「約」は、数値（例えば、量、測定値、サイズ、粘度、直径、濃度）を修飾するときは、ある範囲の値（その数値、並びに、その数値より大きい及び／又は小さい値を含む）を指し、この場合の範囲は、ちょうどその数値の場合に適用される機能と比較したとき、本明細書（その実施形態を含む）に記載の組成物又は方法の機能又は使用に影響しないと思われる量である。いくつかの実施形態において、その範囲は、機能にあまり影響しないと思われる。いくつかの実施形態において、その範囲は、機能に実質的に影響しないと思われる。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書（その実施形態を含む）に記載のナノクラスターである。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書（その実施形態を含む）に記載のナノクラスター分散系である。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書（その実施形態を含む）に記載の医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書（その実施形態を含む）に記載のキットである。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書（その実施形態を含む）に記載の分散系を作製する方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書（その実施形態を含む）に記載の、疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書（その実施形態を含む）に記載の、ナノクラスター分散系を改変する方法である。いくつかの実施形態において、「約」には、その数値の０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、又は０．９倍高い値、低い値、又は両方が含まれる。いくつかの実施形態において、「約」は、ちょうどその数値である。いくつかの実施形態において、「約」は、当該測定値を得るための一般的な手法又は装置を用いて数値測定の当業者が測定したときの、その数値の標準偏差である。いくつかの実施形態において、「約」には、その数値の０．１倍、１．０倍、又は１０倍が含まれる。いくつかの実施形態において、「約」には、その数値のプラスマイナス０．１倍が含まれる（例えば、約２００ｍｇ／ｍＬは、１８０〜２２０ｍｇ／ｍＬである）。
【００５３】
本明細書において使用する場合、用語「平均直径」は、ナノクラスターに適用されるときは、試料中のナノクラスターの平均直径を指す。いくつかの実施形態において、平均直径は、水力学的直径の平均値である。いくつかの実施形態において、平均直径は、ナノクラスターの最長軸の長さの平均値である。いくつかの実施形態において、平均直径は、動的光散乱法により測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、静的光散乱法により測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、顕微鏡観察法により測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、走査型電子顕微鏡法により測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、低温電子顕微鏡法により測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、透過型電子顕微鏡法により測定される。いくつかの実施形態において、平均直径は、Ｘ線散乱法（例えば、小角Ｘ線散乱法）により測定される。
【００５４】
本明細書において使用する場合、用語「複数」は、２つ以上を指す。
【００５５】
本明細書において使用する場合、用語「不可逆的に凝集している」は、液体媒体を含む混合物中でタンパク質が物理的に結び付き合っていることを指し、この状況で、混合物がクラウダーを含有する場合にタンパク質の濃度又はクラウダーの濃度を希釈すると、タンパク質は凝集体から解離せず、そのため、媒体、及び、タンパク質がそれまで凝集していなかった場合のタンパク質の濃度にとって適切な二次、三次、及び四次構造を有する機能的なタンパク質は形成されない。不可逆的に凝集しているタンパク質は、「不安定な」タンパク質と称されることもある。「安定な」タンパク質（例えば、抗体）は、クラウダーが存在する場合にタンパク質濃度又はクラウダー濃度のいずれかを希釈するとタンパク質凝集体又はタンパク質クラスターから解離するタンパク質であり、タンパク質凝集体又はタンパク質クラスターの形成を促進して、媒体、及び、タンパク質がそれまで凝集していなかった場合のタンパク質の濃度にとって適切な二次、三次、及び四次構造を有する機能的な（例えば、活性な、酵素的に活性な）タンパク質を形成した。
【００５６】
本明細書において使用する場合、用語「低分子量化合物」は、分子量が１キロダルトン未満の組成物を指す。いくつかの実施形態において、低分子量化合物は、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、常磁性剤（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、ペプチド、又は毒素であってもよい。いくつかの実施形態において、低分子量化合物は、別の組成物（例えば、タンパク質、抗体）とコンジュゲートして（例えば、結合して）いてもよい。
【００５７】
本明細書において使用する場合、用語「診断剤」は、疾患状態又は疾患状態の症状の有無の検出に有用な組成物を指す。いくつかの実施形態において、診断剤は、標識又は検出可能な部分であってもよい。
【００５８】
「標識」又は「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的な手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度の試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン、及びタンパク質などの実体で、例えば放射性標識を標的ペプチドと特異的に反応するペプチド又は抗体中に組み込むことにより、検出可能にすることができるものが挙げられる。抗体を標識とコンジュゲートさせるための当技術分野において公知の任意の方法を用いてもよく、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載されている方法を用いる。
【００５９】
本明細書において使用する場合、「医薬品」は、疾患又は疾患の症状の治療において有用な組成物を指す。
【００６０】
本明細書において使用する場合、「薬学的に活性なタンパク質」は、疾患又は疾患の症状の治療において有用なタンパク質を指す。
【００６１】
用語「治療すること」又は「治療」は、傷害、疾患、病状、又は病態の治療又は回復が上首尾であることの何らかの徴候を指し、その例としては、何らかの客観的又は主観的なパラメータ、例えば、軽快；寛解；症状の軽減、又は、傷害、病状、若しくは病態に対する患者の忍容性を高めること；変性又は減退の速度を低下させること；変性の最終点の衰弱度を抑えること；患者の身体的又は精神的な幸福の改善が挙げられる。症状の治療又は回復は、客観的又は主観的なパラメータに基づくものであってもよく、そのようなパラメータとしては、理学的検査、神経精神医学的検査、及び／又は精神医学的な評価の結果が挙げられる。例えば、本明細書に示す方法であれば、癌の発現率を減少させること、及び／又は、癌の寛解の原因となることにより、首尾よく癌を治療することができよう。用語「治療すること」及びその活用形には、傷害、病状、病態、又は疾患の予防が含まれる。
【００６２】
「疾患」又は「病態」は、本明細書において提供される組成物、分散系、又は方法を用いて治療することが可能な患者又は対象の生命の状態又は健康状態を指す。
【００６３】
本明細書において使用する場合、用語「造影剤」は、対象に投与されると、医療用の画像化のための方法、手法、又は装置（例えば、Ｘ線写真の機器、Ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、超音波）の検出限界又は検出能力を高める組成物を指す。造影剤は、対象内の異なる構造又は体液と関係のあるシグナルの対比を増強し得る。
【００６４】
「患者」又は「その必要がある対象」は、本明細書において提供される医薬組成物の投与により治療できる疾患又は病態に罹患している又は罹りやすい生体を指す。非限定的な例としては、ヒト、他の哺乳動物、ウシ亜科の動物、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、及び他の非哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、患者は、ヒトである。
【００６５】
本明細書において使用する場合、用語「発蛍光団」は、化学分野におけるそのごく普通の意味を有し、分光法の蛍光画像化において使用される発色団を指す。発蛍光団は、第１の波長範囲内の光を吸収し、第２の波長範囲内の光を放射する。
【００６６】
本明細書において使用する場合、用語「せん断速度」は、化学分野及び流体力学におけるそのごく普通の意味を有し、せん断のかかる速度（例えば、秒-1）を指し、この場合のせん断は、物体（例えば、変形可能な物体、液体、固体の物体）にかけられる、所与の軸に対して垂直方向の力又は圧力であり、軸の一方の側に、他方と比較してより大きい値でかかるもの（すなわち、より大きい力又は圧力）を指す。円筒を通る流れの場合、壁面でのせん断速度は、流量を半径の三乗で割った値に比例する。
【００６７】
本明細書において使用する場合、用語「注射器装填法」は、注射器に取り付けられた針の中の同じ圧力低下を用いることにより液体（例えば、分散系、溶液、懸濁液、混合物）の粘度を測定する方法を指し、この方法では、注射器のピストンは一定量だけ動かされて、直径及び長さが既知である針を通る流れを生じさせる。測定対象である液体の未知の粘度を、この測定とまったく同じ方式で、粘度が既知である液体に対して行われた複数の測定による値と比較する。いくつかの実施形態において、針のゲージは２１から２７の間である。いくつかの実施形態において、針は、２５ゲージ針である。いくつかの実施形態において、注射器は、１ｍＬ注射器である。いくつかの実施形態において、針は、１．５インチの長さである。いくつかの実施形態において、円錐形のバイアル中のある高さ（液体メニスカスから円錐の底までの距離は０．４インチである）から、ある高さ（液体メニスカスから円錐の底までの距離は０．１インチである）まで、４８マイクロリットルの体積に相当する液体（例えば、分散系）を引きこむ時間を測定する。いくつかの実施形態において、注射器装填法は、本出願の実施例ＶＩに記載のパラメータを用いる、本明細書に先に記載の方法である。
【００６８】
本明細書において使用する場合、用語「充填率」は、第１の物体又は複数の物体及び第２の物体又は複数の物体を含有する規定空間の体積に対する第１の物体又は複数の第１の物体により占有される体積の比率を指す。いくつかの実施形態において、充填率は、ナノクラスターの体積に対するナノクラスター内のタンパク質の比率である。いくつかの実施形態において、充填率は、ナノクラスターの体積に対するナノクラスター内のタンパク質の体積の複数の比率の平均値である。
【００６９】
本明細書において使用する場合、用語「制御放出成分」は、本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物と配合されると、制御された速度で組成物を患者体内に放出する化合物を指す。そのような化合物としては、高分子量の、陰イオン性の粘液模倣（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃ）ポリマー、ゲル化する多糖、及び微粉化された薬物担体基質が挙げられる。これらの成分は、米国特許第４，９１１，９２０号、同第５，４０３，８４１号、同第５，２１２，１６２号、及び同第４，８６１，７６０号に、より詳細に論じられている。これらの特許の全体の内容は、すべての目的について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、制御放出成分は、持続放出、持続作用、長期放出、時間放出、時限放出、制御放出、調節放出、又は連続放出化合物であってもよい。いくつかの実施形態において、該化合物は、該化合物及び組成物が経口投与された場合、投与部位（例えば、皮下、静脈内）又は消化管（例えば、胃、腸）内で、患者により分解される。いくつかの実施形態において、制御放出成分は、ポリマーであり、「制御放出ポリマー」と呼ばれることもある。
【００７０】
本明細書において使用する場合、用語「常磁性剤」は、画像診断法（例えば、磁気共鳴画像化法）において造影剤として有用な常磁性の化合物を指す。いくつかの実施形態において、常磁性剤は、ガドリニウム、酸化鉄、鉄、白金、又はマンガンを含む。
【００７１】
本明細書において使用する場合、用語「等張の」は、２つの液体が同じ浸透圧を有することを指す。ある液体が、所与の細胞種の膜を隔てた細胞内部の液体と同じ有効浸透圧を有する場合、その液体はもう１つの液体と等張である。いくつかの実施形態において、分散系は、血液と等張である。いくつかの実施形態において、分散系は、患者における分散系の投与部位と等張である。いくつかの実施形態において、分散系は、分散系の皮下投与部位と等張である。
【００７２】
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、抗原と特異的に結合し抗原を認識する免疫グロブリン遺伝子又はその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεに分類され、これらの重鎖により、免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥがそれぞれ規定される。典型的に、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性及び親和性において最も決定的なものであろう。いくつかの実施形態において、抗体又は抗体の断片は、異なる生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ラクダなどに由来するものであってもよい。本発明の抗体としては、１つ又は複数のアミノ酸位置で修飾又は変異導入されており、抗体の所望の機能（例えば、グリコシル化、発現、抗原認識、エフェクター機能、抗原結合、特異性など）を改善又は調節する抗体を挙げることができる。
【００７３】
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与している約１００から１１０個以上のアミノ酸から成る可変領域を規定する。用語「可変軽鎖（ＶL）」及び「可変重鎖（ＶH）」は、それぞれ、このような軽鎖及び重鎖を指す。
【００７４】
抗体は、例えば、完全型免疫グロブリン、又は、多様なペプチダーゼでの消化により産生されるいくつかのよく特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’2、すなわち、それ自体がジスルフィド結合によりＶH−ＣH１と接合されている軽鎖であるＦａｂの二量体を産生する。Ｆ（ａｂ）’2を穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊し、それにより、Ｆ（ａｂ）’2二量体をＦａｂ’単量体に変換させてもよい。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである［Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３）を参照のこと］。多様な抗体断片は、完全型抗体の消化に関連して定義されるが、当業者には、そのような断片は、化学的に、又は、組換えＤＮＡの方法論を用いて、そのいずれかにより新規に合成してもよいことは理解されよう。したがって、用語「抗体」には、本明細書において使用する場合、完全な状態の抗体の改変により産生された抗体断片、組換えＤＮＡの方法論（例えば、単鎖Ｆｖ）を用いて新規に合成された抗体断片、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片、そのいずれも含まれる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５５２〜５５４ページ、（１９９０）を参照のこと）。
【００７５】
非ヒト抗体をヒト化又は霊長類化する（ｐｒｉｍａｔｉｚｉｎｇ）ための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，５３０，１０１号、同第５，８５９，２０５号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第５，７７７，０８５号、同第６，１８０，３７０号、同第６，２１０，６７１号、及び同第６，３２９，５１１号；ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願０１７３４９４；Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２ページ；及びＶｅｒｈｏｙｅｎら、（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４ページ）。ヒト化抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３ページにさらに記載されている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、移入残基（ｉｍｐｏｒｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ばれることが多く、典型的に、移入された可変ドメインから取り出される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８１、６８５１〜６８５５ページ、（１９８４）；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５ページ、（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７ページ、（１９８８）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４、６５〜９２ページ、（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６ページ、（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２、５９３〜５９６ページ、（１９９２）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、２８、４８９〜４９８ページ、（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、３１（３）、１６９〜２１７ページ、（１９９４）を参照のこと）に従って、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することにより実施することができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的に比較的少ない完全型のヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯動物抗体中の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域をコードする第１の配列と、所望の免疫グロブリンの相補性決定領域をコードする第２の配列セットとを含むポリヌクレオチドは、合成により、又は、適切なｃＤＮＡとゲノムＤＮＡのセグメントとを組み合わせることにより、作製することができる。ヒト定常領域のＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞から、周知の手順によって単離できる。
【００７６】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域若しくはその一部が、変性、置換え、若しくは交換されており、そのため、抗原結合部位（可変領域）が、異なる若しくは改変されているクラス、エフェクター機能、及び／又は種の定常領域と連結する、又は、そのキメラ抗体に新しい特性を授けるまったく異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などと連結する；或いは（ｂ）可変領域若しくはその一部が、異なる若しくは変性されている抗原特異性を有する可変領域で変性、置換え、若しくは交換されている、抗体分子である。本発明の好ましい抗体、及び、本発明による使用のための好ましい抗体としては、ヒト化されている及び／又はキメラのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００７７】
一実施形態において、抗体は、「エフェクター」部分とコンジュゲートされている。エフェクター部分は、任意の数の分子（放射性標識若しくは蛍光標識などの標識化部分を含む）であってもよく、又は、治療的な部分であってもよい。一態様において、抗体は、タンパク質の活性を調節する。そのようなエフェクター部分としては、抗腫瘍薬、毒素、放射性の薬剤、サイトカイン、二次抗体、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、プロドラッグを細胞傷害性の薬剤に変換させる酵素と連結される。
【００７８】
免疫複合体は、エフェクター部分を標的分子又は標的分子陽性細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）に標的化するために使用できる。そのような相違は、試験試料及び対照試料がほぼ同様に担持されているゲルのバンドを見れば容易に明らかにできる。細胞傷害性の薬剤（例えば、毒素）の例としては、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、及びグルココルチコイド、及び他の化学療法薬、並びに放射性同位体が挙げられるが、これらに限定されない。適当な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
治療剤を抗体とコンジュゲートするための手法は、周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、収録先：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６ページ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、収録先：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３ページ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、収録先：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６ページ、（１９８５）；及びＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２、１１９〜５８ページ、（１９８２）を参照のこと）。
【００８０】
抗体と「特異的に（若しくは選択的に）結合する」、又は「〜と特異的に（若しくは選択的に）免疫反応性の」という語句は、タンパク質又はペプチドに言及する場合、多くの場合はタンパク質及び他の生物学的薬剤の不均一集団における、タンパク質の有無を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイの条件下では、特定された抗体は、特定のタンパク質と、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０から１００倍を超えて、結合する。そのような条件下での抗体との特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性を有することで選択される抗体を必要とする。例えば、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり他のタンパク質とは免疫反応性ではないポリクローナル抗体のみが得られるように、ポリクローナル抗体を選択できる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を除外することにより達成してもよい。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するには、様々なイムノアッセイフォーマットを使用し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために常法に従って使用される（例えば、特定の免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイのフォーマット及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（１９９８）を参照のこと）。
【００８１】
タンパク質レベルは、当該タンパク質、天然のリガンド、小分子、アプタマーなどに特異的な抗体又は抗体断片を使用して検出することができる。
【００８２】
抗体ベースの手法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及び、Ｈａｒｌｏｗ、（１９９８）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｗｉｌｄ、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第３版、（２００５）；及び、Ｌａｗ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、（１９９６）に記載されている。アッセイは、分子標的（例えば、タンパク質若しくは抗原）、又は、細胞、組織、生体試料、液体試料、又は、抗体若しくは抗体標的を有していると思われる表面の検出を目的に行うことができる。
【００８３】
イムノアッセイの非網羅的なリストとしては以下が挙げられる：競合的及び非競合的なフォーマット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ、ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、マイクロスポットアッセイ、ウェスタンブロット、ゲルろ過及びクロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィー、免疫組織化学、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、マイクロアレイ、他。そのような手法は、例えば画像診断のために、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏでも使用できる。
【００８４】
本明細書において使用する場合、用語「タンパク質−クラウダー配合液」は、複数のタンパク質と複数のクラウダーとを含む液体混合物を指す。いくつかの実施形態において、タンパク質−クラウダー配合液は、タンパク質ナノクラスター分散系である。いくつかの実施形態において、タンパク質−クラウダー配合液は、複数のタンパク質と複数のクラウダーとを含むナノクラスター分散系である。いくつかの実施形態において、タンパク質−クラウダー配合液は、複数のタンパク質を含むナノクラスターの懸濁液である。いくつかの実施形態において、タンパク質−クラウダー配合液は、複数のタンパク質と複数のクラウダーとを含む溶液である。
【００８５】
本明細書において使用する場合、用語「タンパク質−クラウダー混合物」は、タンパク質とクラウダーとの混合物を指し、場合により、追加的な成分又は化合物を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、「タンパク質−クラウダー混合物」は、「タンパク質−クラウダー配合液」である。
【００８６】
本明細書において使用する場合、用語「分散液」は、分散系の連続的な液体混合物を指す。いくつかの実施形態において、分散液は、タンパク質ナノクラスターが分散されている液体の溶液である。いくつかの実施形態において、分散液は、タンパク質ナノクラスターが分散されている非水性液である。いくつかの実施形態において、分散液は、タンパク質ナノクラスターが分散されている水性液である。
【００８７】
本明細書において使用する場合、用語「極低温剤（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）」は、温度が摂氏−１５０度未満である組成物を指す。いくつかの実施形態において、極低温剤は、液体窒素である。いくつかの実施形態において、極低温剤は、液体ヘリウムである。
【００８８】
本明細書において使用する場合、用語「遠心ろ過」は、混合物の１つ又は複数の（但し、すべてではない）成分を、フィルターを通して流すことにより、混合物中の成分をろ過又は分離するプロセスを指し、このプロセスにおいては、成分は、遠心力によりフィルターを通り抜ける。いくつかの実施形態において、混合物及びフィルターは、遠心分離機中で回される。いくつかの実施形態において、ろ過は、Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、又はＣｅｎｔｒｉｃｏｎの器具（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能）を用いて実施される。
【００８９】
本明細書において使用する場合、用語「接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」は、フィルターを通過する前の液体混合物の動きの大半が、フィルターの表面に対して接線方向である、ろ過の方法を指す。用語「交差流ろ過（ｆｉｌｔａｔｉｏｎ）」は、「接線流ろ過」と互換的に使用してもよい。
【００９０】
本明細書において使用する場合、用語「タンパク質溶液」は、液体媒体（例えば、水、バッファー）中の複数のタンパク質の混合物を指し、この場合のタンパク質は、平均直径が２０から１０００ｎｍのナノクラスターを形成しない。いくつかの実施形態において、タンパク質溶液は、液体中で混合されるタンパク質の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）及びタンパク質の濃度に適した四次状態（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｓｔａｔｅ）を有するタンパク質を含んでおり、１０個以上のタンパク質から成るクラスターを形成しない。いくつかの実施形態において、タンパク質分散系は、タンパク質溶液中にタンパク質ナノクラスター分散系を含んでもよい。
【００９１】
本明細書において使用する場合、用語「薄膜凍結（ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）」は、冷却された固体表面上で液体を凍結することを含む方法であって、液体が、表面上に、厚さが５００マイクロメートル未満で表面積対体積比が２５から５００ｃｍ-1の間の薄いフィルムを形成する方法を指す。いくつかの実施形態において、液体の温度と表面の温度とは摂氏約３０度以上異なる。液体は、冷却された固体表面に小滴として送達してもよい。いくつかの実施形態において、この小滴は、冷却された固体表面への接触の５０ミリ秒以内、７５ミリ秒以内、１００ミリ秒以内、１２５ミリ秒以内、１５０ミリ秒以内、１７５ミリ秒以内、２００ミリ秒以内、２５０ミリ秒以内、５００ミリ秒以内、１，０００ミリ秒以内、又は２，０００ミリ秒以内に凍結する。いくつかの実施形態において、小滴の平均直径は、室温で０．１ｍｍから５ｍｍであってもよい。いくつかの実施形態において、小滴の冷却速度は、５０から２５０Ｋ／秒の間であろう。冷却された固体表面は、バイアル、ベルト、プラテン、皿、ローラー、大皿、又はコンベアーの表面の内部表面であってもよい。
【００９２】
本出願を通じて、当該の代用可能なものはマーカッシュ群の形式で書かれている（例えば、２つ以上のアミノ酸を含有する可能性のある各アミノ酸位置）ことに注意すべきである。マーカッシュ群の各構成要素は、別々に考慮されるべきであり、それにより別の実施形態を含むこと、及び、マーカッシュ群は単一の単位として読まれるべきではないことは、特に企図される。
【００９３】
ＩＩ．組成物
第１の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系が提供される。該分散系は、複数のナノクラスターを含む。該複数のナノクラスターのそれぞれは複数のタンパク質を含み、該複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、完全なアミノ酸配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、実質的に同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約７５％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約８０％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約８５％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９０％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９５％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９６％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約７５％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９７％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９８％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９９％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９９．５％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９９．６％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９９．７％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９９．８％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、約９９．９％同一である。いくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、転写又は翻訳における誤りに起因する配列のずれを除いて同一である。いくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターは、異なるアミノ酸配列を有するタンパク質の混合物を含む。
【００９５】
本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターのそれぞれの平均直径は、約２０から約１，０００ナノメートルの間である。本分散系のいくつかの実施形態において、該平均直径は、水力学的直径の平均値である。本分散系のいくつかの実施形態において、該平均直径は、該複数のナノクラスターの最長寸法の平均値である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスター中の複数のタンパク質の５％未満は、不可逆的に凝集している。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスター中の複数のタンパク質の２％未満は、不可逆的に凝集している。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスター中の複数のタンパク質の１％未満は、不可逆的に凝集している。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約１０００センチポアズの間（例えば、１センチポアズから１０００センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約５００センチポアズの間（例えば、１センチポアズから５００センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約２５０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから２５０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約１００センチポアズの間である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約９０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから９０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約８０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから８０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約７０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから７０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約６０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから６０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約５０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから５０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、約１センチポアズから約４０センチポアズの間（例えば、１センチポアズから４０センチポアズの間）である。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、注射器装填法により測定される。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、粘度計（例えば、Ｓｔｏｒｍｅｒ粘度計、震動式粘度計（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）、回転式粘度計、Ｍａｒｓｈファンネル粘度計、Ｕ字管粘度計、落球粘度計、落下式ピストン粘度計（ｆａｌｌｉｎｇ  ｐｉｓｔｏｎ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）、振動式ピストン粘度計（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  ｐｉｓｔｏｎ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）、Ｓｔａｂｉｎｇｅｒ粘度計、泡粘度計、又はＣａｎｎｏｎ−Ｆｅｎｓｋｅ粘度計）を用いて測定される。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、レオメーターを用いて測定される。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、ザーンカップを用いて測定される。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、フォード粘度カップを用いて測定される。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、注射器（例えば、サイズが２１ゲージから２７ゲージの間の針、又は２５ゲージ針、又は１．５インチの長さの針、又は２５ゲージで１．５インチの長さの針が装着されている注射器）を用いて測定される。いくつかの実施形態において、粘度（例えば、分散系の粘度）は、可塑度計を用いて測定される。いくつかの実施形態において、分散系の粘度は約５０センチポアズであり、分散系のせん断速度は約１０００秒-1である（例えば、５０センチポアズ及び１０００秒-1）。いくつかの実施形態において、分散系の粘度は、約２５センチポアズから約７５センチポアズの間であり、分散系のせん断速度は、約１０００秒-1である（例えば、２５センチポアズから７５センチポアズの間、及び、１０００秒-1）。いくつかの実施形態において、分散系の粘度は約１０センチポアズから約９０センチポアズの間であり、分散系のせん断速度は、約１０００秒-1である（例えば、１０センチポアズから９０センチポアズの間、及び、１０００秒-1）。いくつかの実施形態において、分散系の粘度は約５０センチポアズであり、分散系のせん断速度は約１００秒-1から約５００００秒-1の間である（例えば、５０センチポアズ、及び、１００秒-1から５００００秒-1の間）。いくつかの実施形態において、分散系の粘度は約２５センチポアズから７５センチポアズの間であり、分散系のせん断速度は約１００秒-1から約５００００秒-1の間である（例えば、２５センチポアズから７５センチポアズの間、及び、１００秒-1から５００００秒-1の間）。いくつかの実施形態において、分散系の粘度は約２５センチポアズから７５センチポアズの間であり、分散系のせん断速度は約１０００秒-1から約１００００秒-1の間である（例えば、２５センチポアズから７５センチポアズの間、及び、１０００秒-1から１００００秒-1の間）。いくつかの実施形態において、本分散系は注射可能であるが、同一濃度の該複数のタンパク質の水溶液は注射可能ではない。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、同一濃度の該複数のタンパク質の水溶液の粘度の約２分の１（例えば、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．１分の１、２．２分の１、２．３分の１、２．４分の１）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、同一濃度の該複数のタンパク質の水溶液の粘度の約５分の１（例えば、４．６分の１、４．７分の１、４．８分の１、４．９分の１、５分の１、５．１分の１、５．２分の１、５．３分の１、５．４分の１）である。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、同一濃度の該複数のタンパク質の水溶液の粘度の約１０分の１（例えば、９．６分の１、９．７分の１、９．８分の１、９．９分の１、１０分の１、１０．１分の１、１０．２分の１、１０．３分の１、１０．４分の１）である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、直後に掲げる表／マトリックス中の、１から２４０の番号を有するセルの任意の１つに対応する約２つの粘度の値（すなわち、列の粘度１つと行の粘度１つ）の間であり、その間には、２つの粘度の値のうちいずれかが含まれる：
【００９８】
【表２】
2014514275.tif 000004
【００９９】
いくつかの実施形態において、本分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬから約６００ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質（例えば、２００ｍｇ／ｍＬから６００ｍｇ／ｍＬの間）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質（例えば、２００ｍｇ／ｍＬから４００ｍｇ／ｍＬの間）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質（例えば、２００ｍｇ／ｍＬから３００ｍｇ／ｍＬの間）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質（例えば、２００ｍｇ／ｍＬから２５０ｍｇ／ｍＬの間）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超のタンパク質（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約３００ｍｇ／ｍＬ超のタンパク質（例えば、３００ｍｇ／ｍＬ超）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約４００ｍｇ／ｍＬ超のタンパク質（例えば、４００ｍｇ／ｍＬ超）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約５００ｍｇ／ｍＬ超のタンパク質（例えば、５００ｍｇ／ｍＬ超）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、約６００ｍｇ／ｍＬ超のタンパク質（例えば、６００ｍｇ／ｍＬ超）を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本分散系は、光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、約０．１ｃｍ-1未満、約０．２５ｃｍ-1未満、又は約０．５ｃｍ-1未満であり、該光減衰量測定値が、波長４００ｎｍから７００ｎｍの間での平均の光減衰量（例えば、０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満）を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、約０．１ｃｍ-1未満、約０．２５ｃｍ-1未満、又は約０．５ｃｍ-1未満であり、該光減衰量測定値が、波長６００ｎｍで得られるもの（例えば、０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満）である。いくつかの実施形態において、本分散系は、光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、約０．１ｃｍ-1未満、約０．２５ｃｍ-1未満、又は約０．５ｃｍ-1未満であり、該光減衰量測定値が、波長４００ｎｍから７００ｎｍの間（例えば、０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満であり、波長４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、若しくは７００ｎｍ、又は任意の他の介在する波長）で得られるものである。
【０１０１】
本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約８００ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから８００ナノメートルの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約６００ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから６００ナノメートルの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約４００ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから４００ナノメートルの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約２００ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから２００ナノメートルの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約１００ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから１００ナノメートルの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約７５ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから７５ナノメートルの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの平均直径は、約２０ナノメートルから約５０ナノメートルの間（例えば、２０ナノメートルから５０ナノメートルの間）である。
【０１０２】
本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの充填率の平均値は、約３０％から約８０％の間（例えば、３０％から８０％の間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの充填率の平均値は、約３０％から約７０％の間（例えば、３０％から７０％の間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの充填率の平均値は、約３０％から約６０％の間（例えば、３０％から６０％の間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの充填率の平均値は、約３０％から約５０％の間（例えば、３０％から５０％の間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの充填率の平均値は、約５０％から約６０％の間（例えば、５０％から６０％の間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの充填率の平均値は、約６０％から約７４％の間（例えば、６０％から７４％の間）である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本分散系は、クラウダーを含む。いくつかの実施形態において、クラウダーは単糖である。いくつかの実施形態において、クラウダーは、グルコース、マンノース、フルクトース、アラビノース、キシロース、リボース、及びガラクトースから選択される単糖である。いくつかの実施形態において、クラウダーは二糖である。いくつかの実施形態において、クラウダーは、トレハロース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース、マルトース、又はスクロースから選択される二糖である。いくつかの実施形態において、クラウダーは多糖である。いくつかの実施形態において、クラウダーは多価電解質である。いくつかの実施形態において、クラウダーはポリ酸である。いくつかの実施形態において、クラウダーはポリ（エチレングリコール）である。いくつかの実施形態において、クラウダーは、ＰＥＧ２００からＰＥＧ５０００の間の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である。いくつかの実施形態において、クラウダーは塩である。いくつかの実施形態において、クラウダーはデキストランである。いくつかの実施形態において、クラウダーはポラキサマーである。いくつかの実施形態において、クラウダーはアルコールである。いくつかの実施形態において、クラウダーはアミノ酸又はタンパク質である。いくつかの実施形態において、クラウダーは、ジペプチド、トリペプチド、４個のアミノ酸から成るペプチド、５個のアミノ酸から成るペプチド、又はオリゴペプチドである。いくつかの実施形態において、クラウダーは、コンジュゲートタンパク質である。いくつかの実施形態において、クラウダーは、非コンジュゲートタンパク質である。いくつかの実施形態において、クラウダーは、非タンパク質クラウダーである。いくつかの実施形態において、クラウダーは界面活性剤である。いくつかの実施形態において、本分散系は、トレハロース、ポリ（エチレングリコール）、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、バッファー、又はそれらの組合せから成る群から選択されるクラウダーを含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１：１の重量比（例えば、１：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約２：１の重量比（例えば、２：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約３：１の重量比（例えば、３：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約４：１の重量比（例えば、４：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約５：１の重量比（例えば、５：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約６：１の重量比（例えば、６：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１０：１の重量比（例えば、１０：１の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１：２の重量比（例えば、１：２の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１：３の重量比（例えば、１：３の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１：４の重量比（例えば、１：４の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１：５の重量比（例えば、１：５の重量比）で含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、タンパク質対クラウダーを約１：１０の重量比（例えば、１：１０の重量比）で含む。
【０１０４】
本分散系のいくつかの実施形態において、分散系のｐＨは、該複数のタンパク質のほぼ等電点の値である（例えば、等電点の値である）。本分散系のいくつかの実施形態において、分散系のｐＨは、該複数のタンパク質の等電点とは異なる、約２．５未満、約２．０未満、約１．５未満、約１．０未満、約０．８未満、約０．７５未満、約０．５未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１未満、又は約０．０５未満のｐＨ単位（例えば、２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、０．９５未満、０．９未満、０．８５未満、０．８未満、０．７５未満、０．７未満、０．６５未満、０．６未満、０．５５未満、０．５未満、０．４５未満、０．４未満、０．３５未満、０．３未満、０．２５未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、０．０９未満、０．０８未満、０．０７未満、０．０６未満、０．０５未満、０．０４未満、０．０３未満、０．０２未満、又は０．０１未満のｐＨ単位）である。いくつかの実施形態において、分散系のｐＨは、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、又は約９．５である。いくつかの実施形態において、本分散系は、ヒト血液に対して等張である。いくつかの実施形態において、本分散系は、ヒト血液に対して低張である。いくつかの実施形態において、本分散系の容量オスモル濃度は、約３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ（例えば、３００ｍＯｓｍｏ／Ｌ）である。いくつかの実施形態において、本分散系の容量オスモル濃度は、約２５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから約３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ（例えば、２５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）の間である。いくつかの実施形態において、本分散系の容量オスモル濃度は、約１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから約４５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ（例えば、１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから４５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）の間である。いくつかの実施形態において、本分散系の容量オスモル濃度は、約１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから約６００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間（例えば、１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから６００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間）である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のタンパク質のそれぞれは、抗体、抗体断片、ペグ化タンパク質、脂質付加タンパク質、成長因子若しくは成長因子拮抗薬、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬、受容体若しくは受容体拮抗薬、抗原、ワクチン、又は抗炎症剤である。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は複数のコンジュゲートであり、該コンジュゲートのそれぞれは、低分子量化合物と結合しているタンパク質であり、該低分子量化合物は、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、又はアプタマーである。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は、自己群集している。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のタンパク質は複数のコンジュゲートではなく、該タンパク質のそれぞれはアミノ酸から成る（すなわち、非コンジュゲートタンパク質）。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターは、多数の異なるタンパク質種を含む。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターは第１の複数のナノクラスターであり、該複数のタンパク質は第１の複数のタンパク質であり、本分散系は第２の複数のナノクラスターをさらに含み、該第２の複数のナノクラスターのそれぞれは第２の複数のタンパク質を含み、該第２の複数のタンパク質のそれぞれはアミノ酸配列同一性を共有し、該第２の複数のタンパク質は該第１の複数のタンパク質とは異なる。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターは、制御放出ポリマーをさらに含む。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターは、制御放出成分をさらに含む。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターのそれぞれは、低分子量化合物をさらに含み、該低分子量化合物は、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、金属、金属酸化物、又はアプタマーである。本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、複数のナノ粒子をさらに含む。本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノ粒子は、Ａｕ、磁性剤（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、光学剤（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、金属、金属酸化物、又はアプタマーから選択される複数の化合物を含む。
【０１０６】
第２の態様において、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系のいずれかを含む医薬組成物であって、該複数のタンパク質が、複数の薬学的に活性なタンパク質である医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、２１から２７ゲージの針に取り付けられている注射器内に入っている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、浸透圧ポンプ内に入っている。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、制御放出成分、リポソーム、又は微小球内に入っている。
【０１０７】
第３の態様において、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系又は医薬組成物を備えるキットが提供される。いくつかの実施形態において、本キットは、キットに備えられている分散系又は医薬組成物を使用するための取扱説明書を備える。いくつかの実施形態において、本キットは、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系又は医薬組成物を含有する容器を備える。
【０１０８】
さらなる一態様において、粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物と分散液とを備えるキットが提供される。いくつかの実施形態において、本キットは、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系又は医薬組成物を作製する方法において使用してもよい。いくつかの実施形態において、本キットは、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系を作製するための取扱説明書を備える。いくつかの実施形態において、本キットは、粉末形態のタンパク質と分散液とを備える。いくつかの実施形態において、本キットは、粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物と分散液とを備える。いくつかの実施形態において、本キットは、注射器及び針を備える。いくつかの実施形態において、本キットは、粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物を分散液と混合するための取扱説明書を備える。いくつかの実施形態において、本キットは、粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物を分散液と混合して、その結果得られる分散系を自己投与するための取扱説明書を備える。
【０１０９】
本発明は、サブミクロンの抗体粒子分散系を含む新規の組成物、及びその作製方法を開示する。本明細書に記載の組成物は、実質的に透明であり、高度に濃縮された抗体（約２００ｍｇ／ｍｌ）の皮下注射を可能にする。モノクローナル抗体（例えば、１Ｂ７）の溶液を、新規の渦巻き式その場凍結技術法（ｓｐｉｒａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、ＳＷＩＦＴ）を用いて、速やかに凍結し、凍結乾燥して、非晶質粒子を発生させた。穏やかに撹拌すると、１つ又は複数の薬学的に許容される群集化剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、トレハロース、ポリエチレングリコール、及びｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を含有するバッファー中で、透明なタンパク質分散系が速やかに形成された。抗体の等電点に近い製剤は１分子当たりの帯電を最小化させることから、引力は、大きい粒子、具体的には、タンパク質分子で構成されるクラスター（直径約２００ｎｍ）で見かけの粘性が低い（約２４ｃｐ）ものを形成するだけ十分であった。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、各粒子内では抗体の三次構造に検出可能な変化はないが、その理由は、タンパク質の本来の状態がタンパク質の自己群集化により安定化されており、アンフォールディングによる凝集が限定されるからである。いくつかの実施形態において、本分散系をｉｎ  ｖｉｔｒｏで希釈すると、動的光散乱法及びＥＬＩＳＡによりモニタリングした場合、粒子は、完全な活性を有するモノマータンパク質に戻る。いくつかの実施形態において、静脈内用の溶液として、皮下用の溶液として、又は皮下用の分散系として、類似の用量（４．６〜７．３ｍｇ／ｋｇ）でマウスに投与すると、分布及び排泄動態は類似したものとなった。いくつかの実施形態において、分散系製剤は超高用量での投与を可能にした（５１．６ｍｇ／ｋｇ）が、この製剤は、類似した薬物動態プロファイルも呈した。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合及び細胞中和アッセイによる消失相の血清試料の分析から、皮下の分散系として送達された抗体は、１４日間の試験期間にわたり完全な活性を保持することが示される。
【０１１１】
本明細書に記載の、高濃度、低粘性の、サブミクロンの抗体粒子分散系を発生させる方法は、容易に一般化可能であり、投与及び患者コンプライアンスの改善に繋がり、バイオテクノロジー産業に新しい機会をもたらす可能性があると考えられる。
【０１１２】
モノクローナル抗体は、大きな市場シェアを占め続けており、様々な治療適応のための臨床試験が行われているものが多数ある。これらのモノクローナル抗体は、治療薬として相当な関心を生んできたが、その理由は、モノクローナル抗体は、別個の抗原を特異的に標的とし、好ましい薬物動態学的プロファイル、産生プロファイル、及び安全性プロファイルを有するからである。現在、２８種類のモノクローナル抗体が、多種多様な疾患の治療用としてＦＤＡ認可を受けており、年間の市場規模は２００億ドルを超えている。多くの場合、治療有効性を得るために必要とされる用量は高用量であり、抗体の送達及び投与の選択肢は限られている。組換えＤＮＡ手法によって、溶解性、安定性、及び結合親和性など鍵となる生物物理学的特性の調整を可能にするタンパク質薬の開発（Ｍａｙｎａｒｄ、Ｍａａｓｓｅｎら）において進歩が見られるにも関わらず、これらの巨大分子を所望の用量（体重１ｋｇ当たり抗体２ｍｇ超）で送達するための選択肢はほとんど開発されていない。典型的に、化学的及び物理的な不安定化、並びに、その結果としての、高濃度製剤に伴うタンパク質活性の低下を回避するために、大量の希薄なタンパク質溶液が静脈内に送達される。自己投与される皮下注射には、利便性及び患者コンプライアンスの向上、並びに疼痛及びコストの低下など、静脈内注入を上回るいくつかの主要な利点がある。しかし、必要とされる治療用量は、皮下注射の場合の最大体積を１．５ｍｌと仮定した場合、１００ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度となるであろう。
【０１１３】
このような高濃度での治療用タンパク質の製剤化は、本来は困難であり、新しい製品それぞれに合わせて作られた溶液を要する。多くの場合、高濃度での製剤化は、タンパク質溶解性の低さ、タンパク質の不安定性、及び、短距離引力によるタンパク質−タンパク質相互作用に起因する溶液粘性の高さから不可能である。このような相互作用としては、疎水性相互作用、水素結合、及び双極子の電荷の揺らぎが挙げられ、これらは最大約１ｎｍの距離を超えて作用する。高タンパク質濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ超）では、個々の抗体分子間の平均分離距離は、１０ｎｍ未満に減少する（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。したがって、２つのタンパク質分子が１ｎｍ未満離れる確率は高く、タンパク質分子間の短距離引力相互作用の効果は著しいものとなる。このことは、タンパク質活性、薬物動態、及び免疫原性に有害作用を及ぼす可能性がある可逆的及び不可逆的な凝集体の濃度依存的な形成に繋がる。最も厄介なものは、本来の構造が改変され活性が低下しているモノマーから成っている不可逆的な凝集体、高分子量の凝集体であり、このような凝集体は、混濁した溶液又は沈殿を生じさせる可能性がある。このような凝集体の形成は、タンパク質にきわめて特有のものであり、露出された疎水性残基を有する部分的にアンフォールディングしたモノマーを介した物理学的な機序により、又は、システイン残基又はメチオニン残基上での反応性チオールにより媒介された分子間結合の形成を介した化学的な機序により、形成される可能性がある。
【０１１４】
低粘性の製剤におけるタンパク質の構造及び活性は、このような短距離の相互作用の効果を最小化することにより、高タンパク質濃度で保存できる。例えば、タンパク質微小粒子を非水溶性の有機溶媒に懸濁させた濃縮懸濁液、及び、タンパク質結晶の水性懸濁液で低粘性のものが報告されている。これらの製剤は、タンパク質モノマーではなくミクロンサイズの（５〜２０μｍ）タンパク質粒子を用い、それによりタンパク質粒子間の平均距離を増加させて所与のタンパク質濃度とすることにより、首尾よく得られる。しかし、タンパク質を有機溶媒に溶解した製剤は、患者にやさしいものではない場合があり、その理由は、そのような製剤は、大口径の針を必要とし、余計な副作用（注射部位の発赤及び腫脹など）を招く可能性があるからである。加えて、高度に濃縮された水性の結晶インスリン懸濁液には臨床使用歴があるものの、免疫グロブリンなどの大きいタンパク質分子は、高分子量であること、表面にオリゴ糖があること、及びセグメントの柔軟性が高いことから、常法に従って結晶化させることが難しい。同様に、非水性又は水性の媒体を有するポリマー性マトリックス中にタンパク質が封入されている制御放出製剤も探索されている。これらの場合、粒子内のタンパク質の担持率が低い（約１５〜２０質量％）ことから、多くの場合、粒子体積分率が高くても、送達可能な用量は低くなる。さらに、大半のポリマー性の送達系は、不妊、タンパク質の安定性、不完全なタンパク質放出、及び免疫原性の増加の面で難題を抱えている。
【０１１５】
本発明者らは、これまでに、非晶質のタンパク質ナノクラスターを有する濃縮分散系の形態において、低粘性を達成しつつ高濃度の条件でタンパク質活性を保存するための新規のアプローチを報告した（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。「クラウダー」分子としてトレハロースを添加すると、大きな体積が占有され、短距離のタンパク質−タンパク質引力の相互作用が増加する（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。結果的に、タンパク質分子の大半は、濃縮されて、高密度に詰まった平衡ナノクラスターとなる（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。ナノクラスターの形成及び安定化の機序は、弱い静電反発力とのバランスが保たれた特定の短距離引力、ファンデルワールス引力、及び枯渇引力に関連して説明された。弱い静電反発力は、タンパク質がわずかに帯電しているにすぎないタンパク質等電点（ｐＩ）近くでの製剤化により得られた。同時に、ナノクラスターは凝集しなかったが、その理由は、ナノクラスターのサイズが大きいことから、ナノクラスター間の短距離引力相互作用の影響が低下するからである。さらに、数百から数千のわずかに帯電しているタンパク質モノマーの累積効果から、静電反発力が増加する（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。このような引力と反発力との相互作用が階層的に生じる結果、低粘性を有するコロイド状に安定なタンパク質ナノクラスター分散系が得られる。加えて、ナノクラスター内のタンパク質の体積分率の高さは、タンパク質溶液を用いた場合に可能な値よりはるかに高く、自己群集、エントロピーの安定化機序により、タンパク質の本来の構造を維持する（Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）。今日まで、治療用タンパク質のナノクラスターの形成、及び、当該製剤の薬物動態については、単一の外因性（ｅｘｔｒｉｎｉｓｉｃ）クラウダー、すなわちトレハロースが報告されているのみである（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。
【０１１６】
本発明には、高度に濃縮された活性なモノクローナル抗体粒子の安定な分散系を創出するために使用し得る３つの群集化剤から成る多成分混合物についての記載が含まれているが、この多成分混合物は、マウスに皮下投与した際に高い活性及びバイオアベイラビリティーを保持する。群集化剤の多成分混合物は、特定のタンパク質の具体的な生化学的特徴（高いタンパク質溶解性など）に応じて、製剤に柔軟性をもたらす。
【０１１７】
本発明は、サブミクロンの抗体粒子分散系を含む新規の組成物、及びその作製方法を開示する。本明細書に記載の組成物は、実質的に透明であり、高度に濃縮された抗体（約２００ｍｇ／ｍｌ）の皮下注射を可能にする。モノクローナル抗体（例えば、１Ｂ７）の溶液を、新規の渦巻き式その場凍結技術法（ＳＷＩＦＴ）を用いて、速やかに凍結し、凍結乾燥して、非晶質粒子を発生させた。穏やかに撹拌すると、１つ又は複数の薬学的に許容される群集化剤、トレハロース、ポリエチレングリコール、及びｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を含有するバッファー中で、透明なタンパク質分散系が速やかに形成された。抗体の等電点に近い製剤は１分子当たりの帯電を最小化させることから、引力は、大きい粒子、具体的には、タンパク質分子で構成されるクラスター（直径約２００ｎｍ）で見かけの粘性が低い（約２４ｃｐ）ものを形成するだけ十分であった。
【０１１８】
本発明の新規の低粘性、高濃度のタンパク質分散系の例として、サブミクロンの抗体粒子製剤２種類を調製した：（ｉ）従来のトレー凍結式の凍結乾燥により発生させた非晶質のタンパク質粒子を含むポリクローナルヒツジＩｇＧ分散系、及び（ｉｉ）新しい凍結方法、すなわち、渦巻き式その場凍結法（ＳＷＩＦＴ）を介して発生させた非晶質のタンパク質粒子を含むネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗体１Ｂ７。
【０１１９】
診断と療法との組合せ（セラノスティクス）
いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物（例えば、タンパク質分散系）は、医薬剤及び診断剤を含んでもよい。用語「セラノスティクス」は、治療剤と診断剤の両方を含む単一の組成物を記載するために一般的に使用される。治療とモニタリング又は診断との間の相乗作用は、治療をより有効に標的化するため、及び、適切な用量を選択するために有用であると考えられる。いくつかの実施形態において、本組成物は、高用量のタンパク質治療薬と、高量でありながら非毒性量の診断剤（例えば、画像化剤、造影剤）とを含んでもよい。画像化剤は、タンパク質と化学的に結び付いているもの（例えば、コンジュゲート）であってもよく、又は、タンパク質と共に分散していてもよい。いくつかの実施形態において、画像化剤は、それ自体がナノ粒子、例えば、光学的画像化のためのＡｕ、又は、磁気画像化のための酸化鉄であってもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ナノクラスター中のタンパク質と化学的に結び付いていてもよく、又は、ナノクラスターは、非コンジュゲートタンパク質及び診断剤、又は、診断剤を含むナノ粒子を含んでもよい。本明細書に記載の組成物のいくつかの実施形態において、分散系は、複数のタンパク質ナノクラスター及び複数の診断剤（例えば、Ａｕ、造影剤、常磁性剤、磁性剤、光学剤）ナノ粒子を含む。
【０１２０】
磁性を有するナノ粒子の使用に際しては、タンパク質の治療的機能性と共に、ＭＲＩなどの磁気画像化法を用いてもよい。光学的手法において有用なナノ粒子の使用に際しては、タンパク質の治療的機能性と共に、光音響画像化、蛍光画像化、又は光干渉断層撮影法などの方法を用いてもよい。本明細書に記載の組成物又は方法のいくつかの実施形態において、多数の機能性、例えば、光学的及び磁気画像化の機能性を組み合わせて、本タンパク質分散系から二機能性だけでなく多機能性の製剤を創出してもよい。
【０１２１】
本明細書に記載の組成物のいくつかの実施形態において、コンジュゲートタンパク質（すなわち、コンジュゲートされたタンパク質）分散系は、タンパク質で架橋されたアプタマー（例えば、前立腺癌のためのアプタマー−ゲロニン治療薬（Ｃｈｕら（２００６）））を含んでもよい。いくつかの実施形態において、アプタマーは、タンパク質（例えば、ゲロニン）が重大な毒性を有していても、標的化能力（例えば、前立腺特異性の膜抗原と結合すること）を示す。本明細書に記載の組成物のいくつかの実施形態において、化学療法薬とコンジュゲートされたｍＡｂ（モノクローナル抗体）（例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４）とＫｒｏｐら（２０１０）の両方に記載されているもの）は、多様な癌の治療に使用できる。コンジュゲートのいくつかの実施形態において、ｍＡｂは、腫瘍細胞の表面上に唯一、又は過剰に、そのいずれかの形態で発現されるタンパク質のための標的化剤であり、コンジュゲートされた細胞傷害性の薬剤として用いられる。アブラキサンは、臨床用の非経口ナノ粒子癌療法薬であり、このような療法薬では、パクリタキセルを血清アルブミンと複合体化させ、それによりアルブミンがアブラキサンの送達を助ける。
【０１２２】
本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系が凍結、貯蔵、及び解凍されている場合、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。凍結、貯蔵、及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１％以内（例えば、１％以内）である。凍結、貯蔵、及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約５％以内（例えば、５％以内）である。凍結、貯蔵、及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系が凍結及び解凍されている場合、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。凍結及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１％以内（例えば、１％以内）である。凍結及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約５％以内（例えば、５％以内）である。凍結及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。本明細書において使用する場合、用語「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、凍結された分散系に適用される場合、分散系を凍結状態で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−４０度の温度で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−４０度未満の温度で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−８０度の温度で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−２０度の温度で維持することを指す。
【０１２３】
本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系が凍結、貯蔵、及び解凍されている場合、本分散系の粘度は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。凍結、貯蔵、及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１％以内（例えば、１％以内）である。凍結、貯蔵、及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約５％以内（例えば、５％以内）である。凍結、貯蔵、及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。凍結及び解凍されている、本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。凍結及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１％以内（例えば、１％以内）である。凍結及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約５％以内（例えば、５％以内）である。凍結及び解凍されている本分散系のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。
【０１２４】
本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、約１日（例えば、１日）間凍結され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、約３日（例えば、３日）間凍結され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、約１週間（例えば、１週間）凍結され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、約１カ月（例えば、１カ月）間凍結され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、約１年（例えば、１年）間凍結され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。
【０１２５】
本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１日（例えば、１日）間維持（例えば、貯蔵）され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約３日（例えば、３日）間維持（例えば、貯蔵）され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１週間（例えば、１週間）維持（例えば、貯蔵）され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１カ月（例えば、１カ月）間維持（例えば、貯蔵）され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。本明細書（実施形態を含む）に記載の透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系のいくつかの実施形態において、該分散系は、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１年（例えば、１年）間維持（例えば、貯蔵）され、複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。
【０１２６】
ＩＩＩ．分散系を作製する方法
第４の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、タンパク質−クラウダー配合液を濃縮し、それにより該分散系を形成するステップを含む方法が提供される。該分散系は複数のナノクラスターを含み、該複数のナノクラスターのそれぞれは複数のタンパク質を含み、該複数のタンパク質のそれぞれはアミノ酸配列同一性を共有する。該分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、該分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度のタンパク質を含み、該分散系は、複数のクラウダーを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、濃縮するステップに先立ち、タンパク質の溶液を、容器中でクラウダーと配合してタンパク質−クラウダー配合液を形成するステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質−クラウダー配合液は、タンパク質ナノクラスターの平均直径が、濃縮するステップにより形成される複数のタンパク質ナノクラスターの平均直径とは異なる、タンパク質ナノクラスター分散系を含む。透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する本方法のいくつかの実施形態において、該分散系は、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系から選択される。
【０１２７】
第５の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質をクラウダー及び分散液と配合し、それにより、複数の該タンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含む方法が提供される。該複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。該分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、該分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度の該タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、該配合するステップに先立ち、タンパク質混合物から溶媒を除去し、それにより粉末形態のタンパク質を形成するステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、該タンパク質混合物は、タンパク質分散系又はタンパク質溶液である。本方法のいくつかの実施形態において、該除去するステップは、該タンパク質混合物を粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、若しくは噴霧フリーズドライ、噴霧凍結するステップを含む、又は、該除去するステップは、該タンパク質混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、該除去するステップは、薄膜凍結を含む。本方法のいくつかの実施形態において、溶媒は、水である。透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する本方法のいくつかの実施形態において、該分散系は、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系から選択される。
【０１２８】
第６の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質を分散液と配合し、それにより、複数の該タンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含む方法が提供される。該複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。該分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、該分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度の該タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、該配合するステップに先立ち、タンパク質−クラウダー混合物から溶媒を除去し、それにより粉末形態のタンパク質を形成するステップを含み、これは、場合により、クラウダーを含有していてもよい。本方法のいくつかの実施形態において、該タンパク質−クラウダー混合物は、タンパク質分散系又はタンパク質溶液である。本方法のいくつかの実施形態において、該除去するステップは、該タンパク質−クラウダー混合物を粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、若しくは噴霧フリーズドライ、噴霧凍結するステップを含む、又は、該除去するステップは、該タンパク質−クラウダー混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、溶媒は、水である。透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する本方法のいくつかの実施形態において、該分散系は、本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系から選択される。
【０１２９】
本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、分散液は、水、水性液、又は非水性液である。本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、分散液は、安息香酸ベンジル、又は、安息香酸ベンジルと、ベニバナ油、ゴマ油、ヒマシ油、綿実油、キャノーラ油、サフラン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、α−トコフェロール、Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２、及びオレイン酸エチルから選択される１つ又は複数の油とを合わせたものである。
【０１３０】
本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、該除去するステップは、該混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む。本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、ＳＷＩＦＴを適用するステップは、（１）該混合物を含有するバイアルを、極低温剤と接触させながら回転させるステップと、（２）該混合物をすべて凍結するステップであり、該バイアルの内側表面上の該凍結された混合物の薄いフィルム、及び、該バイアルの中心部に向かってらせん方向に１つ又は複数の後続のフィルムが得られるステップと、（３）該凍結された混合物を凍結乾燥するステップとを含む。いくつかの実施形態において、ＳＷＩＦＴは、バイアルを、極低温剤の代わりに低温の物質（例えば、ドライアイス）と接触させるステップを含んでいてもよい。
【０１３１】
本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約３００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、３００ｍｇ／ｍＬ超）である。本方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約４００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、４００ｍｇ／ｍＬ超）である。本方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約５００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、５００ｍｇ／ｍＬ超）である。本方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約６００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、６００ｍｇ／ｍＬ超）である。本方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間（例えば、２００ｍｇ／ｍＬから３００ｍｇ／ｍＬの間）である。本方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約３００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬの間（例えば、３００ｍｇ／ｍＬから４００ｍｇ／ｍＬの間）である。本方法のいくつかの実施形態において、該分散系中のタンパク質の濃度は、約４００ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの間（例えば、４００ｍｇ／ｍＬから５００ｍｇ／ｍＬの間）である。
【０１３２】
本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、グリセロール、エリトリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリ（エチレングリコール）、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、有機共溶媒であり、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テタヒドロフルフリルアルコール、ジグリム、乳酸エチルから選択される有機共溶媒、塩、バッファー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、又はそれらの組合せである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは多糖である。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーはポリ（エチレングリコール）である。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーはＮＭＰ又はアルコールである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーはアミノ酸である。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーはペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２から１００個の間のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２から７５個の間のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２から５０個の間のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２から２５個の間のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２から１０個の間のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２から５個の間のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、２個のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、３個のアミノ酸から成るペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダーは、４個のアミノ酸から成るペプチドである。
【０１３３】
本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、ろ過を用いて実施される。本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、遠心ろ過を用いて実施される。本方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、正の気体圧力（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇａｓ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）又は機械的圧力を用いて実施される。本方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、接線流ろ過、透析、又はバッファーの吸収を用いて実施される。本方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、液体を吸収する能力がある化合物（例えば、分子篩）を用いて実施される。本方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、タンパク質−クラウダー混合物に化合物（例えば、分子篩）を加えるステップを含み、このとき加えられる化合物は、液体を吸収する。本方法のいくつかの実施形態において、該濃縮するステップは、タンパク質−クラウダー混合物に化合物（例えば、分子篩）を加えるステップを含み、このとき加えられる化合物は、タンパク質−クラウダー混合物中の水を、バルク溶液から除去することにより減少させる。本方法のいくつかの実施形態において、クラウダー又はタンパク質は、該濃縮するステップの間にタンパク質−クラウダー配合液に加えられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を滅菌するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、ろ過により該分散系を滅菌するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、直径約２００ｎｍ（例えば、直径２００ｎｍ）の細孔を備えるフィルターを通したろ過により該分散系を滅菌するステップをさらに含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。本分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１％以内（例えば、１％以内）である。本分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約５％以内（例えば、５％以内）である。本分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含み、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。本分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１％以内（例えば、１％以内）である。本分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約５％以内（例えば、５％以内）である。本分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該複数のナノクラスターの解凍後の平均直径は、該複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。本明細書において使用する場合、用語「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、凍結された分散系に適用される場合、該分散系を凍結状態で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−４０度の温度で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−４０度未満の温度で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−８０度の温度で維持することを指す。いくつかの実施形態において、「〜を貯蔵する」又は「〜を貯蔵すること」は、本分散系を摂氏約−２０度の温度で維持することを指す。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、本分散系の粘度は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。本分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１％以内（例えば、１％以内）である。本分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約５％以内（例えば、５％以内）である。本分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含み、本分散系の粘度は、解凍後と凍結前とでほぼ同じである（例えば、同じである）。本分散系を凍結すること及び解凍することをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１％以内（例えば、１％以内）である。本分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約５％以内（例えば、５％以内）である。本分散系を凍結するステップ及び解凍するステップをさらに含む本方法のいくつかの実施形態において、該分散系の解凍後の粘度は、該分散系の凍結前の粘度の約１０％以内（例えば、１０％以内）である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を約１日（例えば、１日）間凍結するステップ及び該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を約３日（例えば、３日）間凍結するステップ及び該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を約１週間（例えば、１週間）凍結するステップ及び該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を約１カ月（例えば、１カ月）間凍結するステップ及び該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を約１年（例えば、１年）間凍結するステップ及び該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１日（例えば、１日）間維持するステップ（例えば、貯蔵するステップ）、次いで、該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約３日（例えば、３日）間維持するステップ（例えば、貯蔵するステップ）、次いで、該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１週間（例えば、１週間）維持するステップ（例えば、貯蔵するステップ）、次いで、該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１カ月（例えば、１カ月）間維持するステップ（例えば、貯蔵するステップ）、次いで、該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。いくつかの実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法は、該分散系を、凍結された固体として（例えば、摂氏−４０度で）約１年（例えば、１年）間維持するステップ（例えば、貯蔵するステップ）、次いで、該分散系を解凍するステップをさらに含み、このとき、該複数のナノクラスターの平均直径は、解凍後と凍結前とでほぼ同じ（例えば、同じ）である。
【０１３９】
ＩＶ．疾患を治療する方法
第７の態様において、当該治療を必要とする患者における疾患を治療するための方法であって、有効量の本明細書（実施形態を含む）に記載の分散系のうちいずれかひとつを該患者に投与するステップを含む方法が提供される。疾患を治療する本方法のいくつかの実施形態において、該投与される分散系は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ、約１０ｍｇのタンパク質（例えば、体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇのタンパク質）を含む。
【０１４０】
本発明の組成物（例えば、タンパク質ナノクラスター、タンパク質−クラウダーナノクラスター、分散系）は、患者に、単独で投与できる、又は、共投与できる。共投与は、本組成物を個々に又は組み合わせて（２つ以上の組成物）、同時又は逐次的に投与することを包含することを意味している。したがって、調製物は、必要に応じ、他の活性物質と組み合わせる（例えば、代謝による分解を抑制するために）こともできる。本明細書に記載の組成物は、疾患の治療において有用であることが公知の他の活性剤と、又は、単独では有効ではないことがあるが活性剤の有効性に寄与し得る助剤と、又は、診断剤と、互いに組み合わせて使用できる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、共投与は、１つの活性剤を、第２の活性剤投与の０．５時間以内、１時間以内、２時間以内、４時間以内、６時間以内、８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１６時間以内、２０時間以内、又は２４時間以内に投与することを含む。共投与は、２つの活性剤を、同時に、ほぼ同時に（例えば、互いに約１分以内、約５分以内、約１０分以内、約１５分以内、約２０分以内、若しくは約３０分以内）、又は逐次的に任意の順序で投与することを含む。いくつかの実施形態において、共投与は、共製剤、すなわち、両方の活性剤を含む単一の医薬組成物を調製することにより実現することができる。他の実施形態において、活性剤は、別々に製剤化できる。別の実施形態において、活性剤及び／又は助剤は、互いに連結又はコンジュゲートしていてもよい。
【０１４２】
本発明の組成物（例えば、タンパク質ナノクラスター、タンパク質−クラウダーナノクラスター、分散系）は、多種多様な経口、非経口、及び局所的な剤形で調製及び投与することができる。経口の調製物としては、錠剤、丸剤、散剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ロゼンジ剤、カシェ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤など、患者による摂取に適したものが挙げられる。本発明の組成物は、注射により、つまり、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内、又は腹腔内に、投与することもできる。また、本明細書に記載の組成物は、吸入により、例えば、鼻腔内に投与できる。加えて、本発明の組成物は、経皮投与できる。本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物を投与するための多数の投与経路（例えば、筋肉内、経口、経皮）を用いることができることも想定される。したがって、本発明は、薬学的に許容される添加剤と１つ又は複数の本発明の組成物とを含む医薬組成物も提供する。本明細書において開示する組成物は、当技術分野において公知の任意の手段により投与できる。例えば、組成物は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａｌｙ）、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋肉内に、くも膜下腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼内に、経口的に、局所的に、吸入により、注射により、注入により、連続的な注入により、局所的な灌流により、カテーテルを介して、洗浄液を介して、クリーム剤中で、又は脂質組成物中で、対象に投与することを含んでもよい。投与は、局所投与、例えば、疾患部位（例えば、癌の場合は腫瘍）への投与又は全身投与であってもよい。
【０１４３】
本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物から医薬組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は、固体又は液体のいずれであってもよい。固形の調製物としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、及び分散性の顆粒剤が挙げられる。固体担体は、１つ又は複数の物質であってもよく、このような担体は、賦形剤、香味剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、又は封入材料としても作用し得る。
【０１４４】
散剤の場合、担体は、混合物中の微粉化された固体であり、これに、微粉化された活性成分が加えられる（例えば、本明細書において提供される組成物）。錠剤の場合、活性組成物は、必要な結合特性を有する担体と、適当な割合で混合し、所望の形状及びサイズに圧縮される。散剤及び錠剤は、約５％から約７０％の活性組成物を含有し得る。
【０１４５】
適当な固体の添加剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：炭酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；タルク；ペクチン；デキストリン；デンプン；トラガント；低融点ワックス；ココアバター；炭水化物；糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールなどであるが、これらに限定されない）、デンプン（トウモロコシ、コムギ、イネ、バレイショ、又は他の植物に由来するもの）；セルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム；及びガム（アラビアガム及びトラガントガムなど）；並びに、タンパク質（ゼラチン及びコラーゲンなどであるが、これらに限定されない）。必要に応じ、崩壊剤又は可溶化剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はその塩（アルギン酸ナトリウムなど）を加えてもよい。
【０１４６】
糖衣錠のコアは、適当なコーティング、例えば、濃縮糖溶液を施して提供され、そのようなコーティングは、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を含有することもできる。製品の識別用に、又は活性化合物の量（すなわち、用量）を特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに加えてもよい。医薬調製物は、経口でも使用でき、その場合は、例えば、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ  ｃａｐｓｕｌｅ）、並びに、ゼラチン製の密封型の軟カプセル及びコーティング（グリセロール又はソルビトールなど）を使用する。
【０１４７】
坐剤の調製には、低融点ワックス（脂肪酸グリセリドの混合物又はココアバターなど）をまず溶融し、その中に、撹拌しながら、活性組成物を均質に分散させる。次いで、溶融された均質な混合物を、手頃なサイズの型の中に注ぎ、冷却させ、それにより固形化させる。
【０１４８】
非経口の用途が必要又は所望の場合、本組成物に特に適した混合物は、注射可能な滅菌済の溶液、好ましくは油性又は水性溶液、並びに、分散系、懸濁液、エマルション、又はインプラント（坐剤を含む）である。とりわけ、非経口投与のための担体としては、デキストロースの水溶液、生理食塩水、純水、バッファー、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ピーナッツ油、ゴマ油、ポリオキシエチレン−ブロックポリマーなどが挙げられる。アンプルは、便利な単位剤形（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ）である。本組成物は、リポソーム中に組み込む又は経皮用のポンプ又はパッチ剤を介して投与することもできる。使用に適した医薬混合物は、当業者に周知であり、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）及びＷＯ９６／０５３０９に記載されており、これら両文献の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
経口使用に適した水溶液は、活性成分を水に溶解し、必要に応じ、適当な着色料、香味料、安定化剤、及び増粘剤を加えることにより調製できる。経口使用に適した水性懸濁液は、微粉化された活性成分を粘稠性の材料と共に水に分散させることにより作製でき、このような材料は、例えば、天然又は合成のガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム及びアラビアガム、及び分散剤又は湿潤剤、例えば、天然型のホスファチド（例えば、レシチン）、酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール（ｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ））、酸化エチレンと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又は酸化エチレンと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）である。水性懸濁液は、１つ又は複数の保存剤（エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなど）、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の香味剤、及び１つ又は複数の甘味剤（スクロース、アスパルテーム、又はサッカリンなど）を含有することもできる。製剤は、容量オスモル濃度について調節できる。水性懸濁液又は分散系は、水にクラウダーを加えて、又は、非水性溶媒を加えて（クラウダーは加えても加えなくてもよい）、作製できる。
【０１５０】
使用直前に経口投与用の液体形態の調製物に変換させることを意図された固体形態の調製物も包含される（例えば、粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物、又は別の固体形態）。そのような液体形態としては、分散系、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。これらの調製物は、活性成分に加え、着色料、香味料、安定化剤、バッファー、人工甘味料及び天然甘味料、分散系、増粘料、可溶化剤などを含有してもよい。
【０１５１】
油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含有できる。甘味剤を加えて味のよい経口調製物を得ることができ、このような甘味剤は、グリセロール、ソルビトール、又はスクロースなどである。これらの製剤は、酸化防止剤（アスコルビン酸など）の添加により保存することができる。注射用の油性ビヒクルの例としては、Ｍｉｎｔｏ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２８１、９３〜１０２ページ、１９９７を参照のこと。医薬製剤は、水中油エマルションの形態であってもよい。油性相は、前述の植物油又は鉱油であってもよく、これらの混合物であってもよい。適当な乳化剤としては、天然型のガム（アラビアガム及びトラガントガムなど）、天然型のホスファチド（大豆レシチンなど）、脂肪酸とヘキシトール無水物とに由来するエステル又は部分エステル（ソルビタンモノオレエートなど）、及びこれらの部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなど）が挙げられる。エマルションは、シロップ剤及びエリキシル剤の製剤と同様に、甘味剤及び香味剤を含有することもできる。そのような製剤は、粘滑剤、保存剤、又は着色剤を含有することもできる。
【０１５２】
本医薬調製物は、好ましくは、単位剤形の形態である。そのような形態において、該調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分化される。単位剤形は、パッケージ化された調製物であってもよく、このパッケージは、量が分かれている調製物、例えば、小さな包みになった錠剤、カプセル剤、及び、バイアル又はアンプルに入った散剤を含有する。また、単位剤形は、それ自体がカプセル剤、錠剤、カシェ剤、若しくはロゼンジ剤であってもよく、又は、これらのうち任意のものが適切な数だけパッケージ化された形態になっているものであってもよい。単位剤形は、凍結された分散系であってもよい。
【０１５３】
本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物は、加えて、持続放出及び／又は快適性をもたらすための成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、高分子量の、陰イオン性の粘液模倣ポリマー、ゲル化する多糖、及び微粉化された薬物担体基質が挙げられる。これらの成分は、多数の機能を果たし得るが、その理由は、このような成分は、ナノクラスターの形成を助けるクラウダーとしても作用し得るからである。これらの成分は、米国特許第４，９１１，９２０号、同第５，４０３，８４１号、同第５，２１２，１６２号、及び同第４，８６１，７６０号に、より詳細に論じられている。これらの特許の全体の内容は、すべての目的について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本ナノクラスター分散系は、薬物送達の分野における当業者に公知の実体に担持させて、制御（例えば、持続）放出をさらに可能にしてもよく、そのような実体の例としては、リポソーム、微小球、カプセル、浸透圧ポンプ、ポリマーシェルのコーティング、マトリックス、及び埋込み可能な器具が挙げられる。別の実施形態において、本ナノクラスター分散系は、乾燥させ、次いで、これらの実体に担持させてもよい。
【０１５４】
本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物は、局所的な経路により経皮送達することができ、アプリケータースティック、分散系、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ゼリー剤、ペイント、散剤、及びエアゾール剤として製剤化できる。
【０１５５】
本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物は、体内でゆっくり放出させるために、微小球として送達させることもできる。例えば、微小球は、皮下にゆっくり放出する薬物を含有する微小球を皮内注射することにより、投与することができる（Ｒａｏ、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．、第７版、６２３〜６４５ページ、１９９５を参照のこと）、又は、生分解性の注射用ゲル製剤として（例えば、Ｇａｏ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１２、８５７〜８６３ページ、１９９５を参照のこと）、又は、経口投与用の微小球として（例えば、Ｅｙｌｅｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４９、６６９〜６７４ページ、１９９７を参照のこと）投与できる。経皮経路及び皮内経路はいずれも、数週間又は数カ月にわたる一定の送達をもたらす。
【０１５６】
本医薬組成物は、塩として提供することができ、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸など多くの酸を用いて形成できる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性又は他のプロトン溶媒によりよく溶解する傾向がある。
【０１５７】
別の実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物は、非経口投与、例えば、静脈内（ＩＶ）投与、又は、体腔、若しくは器官の管腔中への投与に有用である。用いることができる、許容されるビヒクル及び溶媒には、水及びリンゲル液、等張性の塩化ナトリウムがある。加えて、滅菌済の固定油は、溶媒又は懸濁媒として慣用的に用いることができる。この目的のために、合成のモノグリセリド又はジグリセリドなど、任意の無刺激性の固定油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製において同様に使用できる。これらの溶液は、滅菌済であり、一般に、望ましくない物が含まれていない。これらの製剤は、従来の周知の滅菌法（例えば、ろ過）により滅菌し得る。ＩＶ投与の場合は、製剤は、滅菌済の注射用調製物、例えば、滅菌済の注射用の水性分散系であってもよい。
【０１５８】
別の実施形態において、本明細書（実施形態を含む）に記載の組成物の製剤は、細胞膜と融合する、又はエンドサイトーシスされるリポソームの使用により、すなわち、リポソームに結び付いている、又はオリゴヌクレオチドと直接結び付いており、細胞表面の膜タンパク質受容体と結合してエンドサイトーシスをもたらすリガンドを用いることにより、送達できる。リポソームを使用することにより、特に、リポソーム表面が、標的細胞に特異的なリガンドを有している、又は、他の形で優先的に特定の器官に向けられている場合には、本発明の組成物の送達先の焦点をｉｎ  ｖｉｖｏの標的細胞に合わせることができる（例えば、Ａｌ−Ｍｕｈａｍｍｅｄ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．、１３、２９３〜３０６ページ、１９９６；Ｃｈｏｎｎ、Ｃｕｒｒ．、Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６、６９８〜７０８ページ、１９９５；Ｏｓｔｒｏ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．、４６、１５７６〜１５８７ページ、１９８９を参照のこと）。
【０１５９】
医薬組成物は、活性成分が、治療的有効量で、すなわち、その意図された目的を達成するのに有効な量で含有されている組成物を含む。特定の用途に有効な実際の量は、とりわけ、治療が行われている条件によって決まるであろう。疾患を治療する方法において投与される際、そのような組成物は、所望の結果、例えば、標的分子の活性の調節、及び／又は、疾患の症状の低減、消失、若しくはその進行速度の低下を達成するのに有効な量の活性成分を含有するであろう。本発明の化合物の治療的有効量の決定は、特に、本明細書における詳細な開示に照らせば、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【０１６０】
哺乳動物に投与される投与量及び頻度（単回又は複数回投与の用量）は、様々な因子によって変化する可能性があり、そのような因子としては、例えば、当該哺乳動物が別の疾患に罹患しているかどうか、及びその投与経路；投与を受ける者のサイズ、年齢、性別、健康、体重、体格指数、及び食餌；治療対象となっている疾患の性質及び症状の程度、併用治療の種類、治療対象となっている疾患に由来する合併症、又は他の健康に関係した問題がある。他の治療計画又は薬剤を、本明細書（実施形態を含む）に記載の方法及び組成物と共に使用できる。確立されている投与量（例えば、頻度及び継続期間）の調節及び操作は、十分、当業者の技量の範囲内である。
【０１６１】
本明細書に記載のすべての組成物について、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにより決定することができる。標的濃度は、本明細書に記載の又は当技術分野において公知の方法を用いて測定した、本明細書に記載の方法を達成する能力のある活性化合物（複数可）の当該濃度となろう。
【０１６２】
当技術分野において周知のように、ヒトにおける使用のための治療的有効量は、動物モデルにより決定することもできる。例えば、動物において有効であることが見出されている濃度を達成するように、ヒト用の用量を製剤化できる。ヒトにおける投与量は、前述のように、化合物の有効性をモニタリングし、その投与量を上方又は下方調節することにより、調節できる。前述した方法及び他の方法に基づいて、ヒトにおける最大有効性を達成するための用量を調節することは、十分、当業者の能力の範囲内である。
【０１６３】
投与量は、患者の要件、及び、用いられている化合物に応じて変化させてもよい。患者に投与される用量は、時間の経過と共に当該患者における有益な治療応答をもたらすだけ十分なものであるべきである。用量サイズは、有害な副作用の有無、性質、及び程度によっても決定されよう。特定の状況の場合の適切な投与量の決定は、専門家の技能の範囲内である。一般に、治療は、当該化合物の最適な用量を下回る、より少量の投与量で開始される。その後、投与量は、状況下での最適効果に達するまで、少しずつ増加させる。
【０１６４】
投与量及び投与間隔は、投与される化合物のレベルが、治療対象である特定の臨床適応症に有効なものとなるように、個々に調節できる。これにより、当該個体の疾患状態の重症度と釣り合う治療計画が得られよう。
【０１６５】
本明細書において提供される教示を利用して、実質的な毒性の原因とならず、さらには特定の患者が示す臨床症状を治療するのに有効である、有効な予防的又は治療的な治療計画を策定することができる。この計画策定には、化合物の効力、相対的バイオアベイラビリティー、患者の体重、有害な副作用の存在及び重症度、好ましい投与様式、及び、選択された薬剤の毒性プロファイルなどの因子を考慮することにより活性化合物を慎重に選ぶことが含まれるべきである。
【０１６６】
Ｖ．ナノクラスターサイズを修正する方法
第８の態様において、透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系のタンパク質ナノクラスターの平均直径を修正するための方法であって、該分散系中のクラウダー又はタンパク質の濃度を増加又は減少させるステップを含む方法が提供される。該分散系は複数のナノクラスターを含み、該複数のナノクラスターのそれぞれは複数のタンパク質を含む。該複数のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列同一性を共有する。該分散系は、透明な、低粘性の分散系であり、該分散系は、約２００ｍｇ／ｍＬ超（例えば、２００ｍｇ／ｍＬ超）の濃度の該タンパク質を含む。
【０１６７】
ＶＩ．追加的な組成物及び方法
別の態様において、低粘性、高濃度の抗体分散系、並びに、その作製方法が提供される。別の態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方における治療活性を保持する、実質的に透明な、立体配座的に安定化されているタンパク質ナノクラスターを有する組成物が提供される。いくつかの実施形態において、希釈されると、クラスターは可逆的に解離して、生物活性が高く粘性が低い本来のモノマータンパク質分子となる。いくつかの実施形態において、このアプローチは、アミノ酸配列の修飾を要さずに、広範なクラスのタンパク質に広く適用可能である。
【０１６８】
別の態様において、分散媒中に、実質的に透明な、低粘性、高濃度のナノクラスター分散系を有する組成物であって、該ナノクラスターがタンパク質又はペプチドを含み、ナノクラスターの平均直径が２０から１，０００ナノメートルの間であり、該タンパク質又はペプチドが、安定であり、クラスター化されてナノクラスターになっている組成物が提供される。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本明細書においてこれまで開示した組成物は、グリセロール、エリトリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリ（エチレングリコール）、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、有機共溶媒であり、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テタヒドロフルフリルアルコール、ジグリム、乳酸エチルから選択される有機共溶媒、塩、バッファー、又はそれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数のクラウダーを含む。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、２つ以上の異なるペプチド又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本分散系は、第１のナノクラスター分散系と第２のナノクラスター分散系との混合物であり、この場合の第１のナノクラスター及び第２のナノクラスターは、それぞれ、異なるタンパク質又はペプチドを有する。いくつかの実施形態において、本分散系は、それぞれが２つ以上の異なるペプチド又はタンパク質を有するナノクラスターを含む。いくつかの実施形態において、分散媒は、該タンパク質又はペプチドの等電点又はそれに近い。いくつかの実施形態において、分散媒は、該タンパク質又はペプチドの等電点である、２．５以内、２．０以内、１．５以内、１．０以内、０．８以内、０．７５以内、０．５以内、０．３以内、０．２以内、０．１以内、０．０５以内のｐＨ単位である。いくつかの実施形態において、本組成物は、ろ過により滅菌される。いくつかの実施形態において、本組成物は、長期放出組成物である。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ナノクラスター中のタンパク質は、タンパク質濃度、クラウダー、又はその両方が低下／減少すると、生物学的に安定なモノマーになる。いくつかの実施形態において、本低粘性、高濃度の分散系中のペプチド及びタンパク質の総濃度は、２５ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１５０ｍｇ／ｍＬ以上、２００ｍｇ／ｍＬ以上、２５０ｍｇ／ｍＬ以上、３００ｍｇ／ｍＬ以上、３５０ｍｇ／ｍＬ以上、４００ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以上である。いくつかの実施形態において、本低粘性、高濃度の分散系の粘度は、１００センチポアズ未満、９０センチポアズ未満、８０センチポアズ未満、７０センチポアズ未満、６０センチポアズ未満、５０センチポアズ未満、４０センチポアズ未満、３０センチポアズ未満、２０センチポアズ未満、又は１０センチポアズ未満である。いくつかの実施形態において、ナノクラスターの直径は、およそ２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、又は１０００ｎｍである。いくつかの実施形態において、ナノクラスターの直径は、水力学的直径である。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のタンパク質又はペプチドは、抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’）、ペグ化タンパク質、脂質付加タンパク質、成長因子又は拮抗薬、サイトカイン又は拮抗薬、受容体若しくは受容体拮抗薬、抗原、ワクチン、抗炎症剤、治療用のポリペプチド若しくはペプチド、又はそれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、本発明の分散系の粘度は、等価濃度の該タンパク質又はペプチドの溶液の粘度を下回る。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、等価濃度の該タンパク質又はペプチドの溶液が不安定な濃度で安定である。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、非経口投与されると解離して安定なモノマータンパク質となる、一次タンパク質粒子を有する可逆性のクラスターである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、クラスター内で自己群集して、安定な立体配座を維持する。いくつかの実施形態において、本低粘性、高濃度の分散系は、２１から２７ゲージの針を通して注射可能である。
【０１７２】
別の態様において、１つ又は複数のタンパク質又はペプチドは、粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）、噴霧フリーズドライ、液体中への噴霧凍結、薄膜凍結、及び投与容器中での直接凍結から成る群から選択される１つ又は複数の手法により、ミクロン又はサブミクロンサイズの粒子になる。また別の態様において、本低粘性、高濃度の分散系は、該ミクロン又はサブミクロンサイズの粒子を分散媒に分散させることにより作製される。いくつかの実施形態において、分散媒としては、薬学的に許容される溶媒、例えば、薬学的に許容される水性溶媒、薬学的に許容される非水性溶媒、又は組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明において使用してもよい薬学的に許容される溶媒としては、安息香酸ベンジル、又は、安息香酸ベンジルと、ベニバナ油、ゴマ油、ヒマシ油、綿実油、キャノーラ油、サフラン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、ａ−トコフェロール、Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２、及びオレイン酸エチルから選択される１つ又は複数の油とを合わせたものが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に先に記載した組成物は、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、塩、バッファー、アミノ酸、小ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、共溶媒、及びそれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数の添加物を含んでもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、自己群集している。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドの少なくとも半分は、溶液中にはない。いくつかの実施形態において、分散媒からの希釈に続いて、ナノクラスター中のタンパク質又はペプチドは、モノマー形態に戻る。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、分散媒から希釈されると、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の活性を保持する。
【０１７３】
本明細書において先に開示した組成物中のタンパク質の安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー、分析用超遠心分離、ＣＤ分光法、ＦＴＩＲ分光法、動的光散乱法、静的光散乱法、ＥＬＩＳＡ、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲル、又は生物活性アッセイにより測定してもよい。いくつかの実施形態において、本組成物（例えば、分散系）は、該タンパク質又は該ペプチドの注射用溶液と比較した場合、注射時に、実質的に類似した薬物動態学的な特性を呈し、この場合の薬物動態学的な特性としては、最高血清中濃度（Ｃmax）、注射後の最高濃度到達時間ｔmax、曲線下面積（ＡＵＣ）に代表される利用可能な最大用量、組織分布（ｔ1/2−α）、及び消失時間（ｔ1/2−β）、又はそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、注射される投与量は、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇである。いくつかの実施形態において、曲線下面積（ＡＵＣ）／血中用量は、終了時を２から３０日の間とした場合、静脈内送達の場合に観察される値の５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％である。いくつかの実施形態において、ＡＵＣ／血中用量は、終了時を２から１４日の間とした場合、静脈内送達の場合に観察される値の５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％である。いくつかの実施形態において、合計ＡＵＣは、終了時を２日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日、及び３０日とした場合、皮下用の（ＳＱ）溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍である。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、２０日間の合計ＡＵＣは、ＳＱ溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍であり、１４日間の合計ＡＵＣは、ＳＱ溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍であり、又は１０日間の合計ＡＵＣは、ＳＱ溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍である。いくつかの実施形態において、本組成物のＣmaxは、ＳＱ溶液注射の場合のＣmaxの０．５倍、０．７倍、０．９倍、１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍に達する。いくつかの実施形態において、ｔmaxは、静脈内の、経口の、非経口の、又はＳＱ溶液の場合のｔmaxの１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２．０倍遅れる。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、分散媒から希釈されると、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の活性を保持する。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、合計ＡＵＣの半分の値は、１日、２日、３日、５日、１０日、２０日、又は３０日にわたり、血中で観察される。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、３０日のうち１日、２日、３日、５日、１０日、２０日にわたり、血清中で完全な生物活性を保持する。いくつかの実施形態において、ｃ／ｃmaxは、２日、５日、１０日、２０日、若しくは３０日時点で０．５以上、ｃ／ｃmaxは、２日、５日、１０日、２０日、若しくは３０日時点で０．３以上、又は、ｃ／ｃmaxは、２日、５日、１０日、２０日、若しくは３０日時点で０．１以上である。いくつかの実施形態において、本組成物は、静脈内投与、皮下投与、非経口投与、又は経口投与用に構成される。
【０１７６】
別の態様において、哺乳動物を治療するための方法であって、本明細書に先に記載の治療的有効量の本組成物（例えば、分散系）を該哺乳動物に投与するステップを含み、該哺乳動物が、製剤中のタンパク質での治療を必要とする障害を有する、方法が提供される。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【０１７７】
別の態様において、その必要がある患者に治療的有効量の本明細書に記載の製剤を投与することにより百日咳を治療する方法が提供される。
【０１７８】
別の態様において、その必要がある患者に治療的有効量の前述の製剤を投与し、抗生物質を共投与する、百日咳の治療方法が提供される。
【０１７９】
別の態様において、組成物（例えば、分散系）を作製する方法であって、分散媒中の高濃度のナノクラスター分散系を形成するステップを含み、該ナノクラスターがタンパク質又はペプチドを含み、該ナノクラスターの平均直径が２０から１，０００ナノメートルの間であり、該タンパク質又はペプチドが安定であり、該組成物が、実質的に透明な、高濃度、低粘性のタンパク質又はペプチド分散系である方法が提供される。本方法のいくつかの実施形態において、ナノ粒子は、粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）、噴霧フリーズドライ、液体中への噴霧凍結、薄膜凍結、及び投与容器中での直接凍結から成る群から選択される１つ又は複数の手法によりさらに加工される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、１つ又は複数の添加物を該１つ又は複数のサブミクロン又はミクロンサイズの粒子に加えることにより、さらに加工される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、１つ又は複数の添加物を水性媒体中の該１つ又は複数のサブミクロン又はミクロンサイズの粒子に加えることにより、さらに加工される。本明細書に先に記載した本方法のいくつかの実施形態において、ナノ粒子のサイズを所望の水力学的直径に調節することは、所定のクラウダー濃度を加え、ｉｎ  ｓｉｔｕで穏やかに混合して該サイズを調節することにより行われる。本明細書に先に記載した本方法のいくつかの実施形態において、ナノ粒子のサイズを所望の水力学的直径に調節することは、所定のクラウダー濃度を加え、ｉｎ  ｓｉｔｕで水性媒体と穏やかに混合して該サイズを調節することにより行われる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、同じバイアル中で作製及び貯蔵され、組成物は、ろ過により滅菌され、又は、タンパク質若しくはペプチドは、安定で自己群集している。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において用いられるクラウダーとしては、グリセロール、エリトリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリ（エチレングリコール）、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、有機共溶媒であり、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テタヒドロフルフリルアルコール、ジグリム、乳酸エチルから選択される有機共溶媒、塩、バッファー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、コンジュゲートタンパク質、非コンジュゲートタンパク質、又はそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、それぞれのナノクラスターは、２つ以上の異なるペプチド又はタンパク質を含む。本方法の別の実施形態において、本分散系は、それぞれが２つ以上の異なるペプチド又はタンパク質を有するナノクラスターを含む。別の実施形態において、本方法は、分散媒のｐＨを、個々のタンパク質又はペプチドの等電点又は近くに調節して、１つ又は複数のナノクラスターの形成を支援するステップをさらに含む。別の実施形態において、分散媒は、タンパク質又はペプチドの等電点又は近くである。別の実施形態において、分散媒は、タンパク質又はペプチドの等電点である、２．５、２．０、１．５、１．０、０．８、０．７５、０．５、０．３、０．２、０．１、０．０５のｐＨ単位内である。
【０１８１】
別の実施形態において、本発明の方法の分散媒としては、薬学的に許容される溶媒、例えば、薬学的に許容される水性溶媒、薬学的に許容される非水性溶媒、又は組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される溶媒としては、安息香酸ベンジル、又は、安息香酸ベンジルと、ベニバナ油、ゴマ油、ヒマシ油、綿実油、キャノーラ油、サフラン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、ａ−トコフェロール、Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２、及びオレイン酸エチルから選択される１つ又は複数の油とを合わせたものが挙げられる。いくつかの実施形態において、本組成物は、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、塩、アミノ酸、小ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、共溶媒、及びそれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数の添加物を含むことができる。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度が低下する又はクラウダーが減少すると、ナノクラスター中のタンパク質は、生物学的に安定なモノマーとなる。いくつかの実施形態において、本低粘性、高濃度の分散系の濃度は、２５ｍｇ／ｍＬ超、５０ｍｇ／ｍＬ超、１００ｍｇ／ｍＬ超、１５０ｍｇ／ｍＬ超、２００ｍｇ／ｍＬ超、２５０ｍｇ／ｍＬ超、３００ｍｇ／ｍＬ超、３５０ｍｇ／ｍＬ超、４００ｍｇ／ｍＬ超、５００ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、本低粘性、高濃度の分散系の粘度は、１００センチポアズ未満、９０センチポアズ未満、８０センチポアズ未満、７０センチポアズ未満、６０センチポアズ未満、５０センチポアズ未満、４０センチポアズ未満、３０センチポアズ未満、２０センチポアズ未満、又は１０センチポアズ未満である。いくつかの実施形態において、ナノクラスターの水力学的直径は、およそ２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、又は１０００ｎｍである。いくつかの実施形態において、ナノクラスターの直径は、およそ２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、又は１０００ｎｍである。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用される１つ又は複数のタンパク質又はペプチドは、抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’）、ペグ化タンパク質、脂質付加タンパク質、成長因子又は拮抗薬、サイトカイン又は拮抗薬、受容体若しくは受容体拮抗薬、抗原、ワクチン、抗炎症剤、治療用のポリペプチド若しくはペプチド、又はそれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、本分散系の粘度は、等価濃度の該タンパク質又はペプチドの溶液の値を下回る。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、等価濃度の該タンパク質又はペプチドの溶液が不安定である濃度で安定である。いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、非経口投与されると解離して安定なモノマータンパク質となる、一次タンパク質を含む可逆性のクラスターである。いくつかの実施形態において、本低粘性、高濃度の分散系は、２１から２７ゲージの針を通して注射可能である。
【０１８３】
本明細書において開示する方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドの１つ又は複数のミクロン又はサブミクロンサイズの粒子は、トレー凍結乾燥により形成される。本明細書において開示する方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドの１つ又は複数のミクロン又はサブミクロンサイズの粒子は、ＳＷＩＦＴにより形成される。いくつかの実施形態において、ＳＷＩＦＴによりタンパク質又はペプチドの１つ又は複数のミクロン又はサブミクロンサイズの粒子を形成するステップは、（ｉ）濃縮され精製されたタンパク質又はペプチドのバッファー溶液を用意するステップであり、この場合のバッファーが、凍結の間、タンパク質又はペプチドの完全性、安定性、及び活性を維持するように選択されるステップと、（ｉｉ）該精製されたタンパク質又はペプチド溶液に凍結保護剤を加えるステップと、（ｉｉｉ）該タンパク質又はペプチド溶液を膜ろ過により滅菌するステップと、（ｉｖ）固定された体積の該滅菌されたタンパク質又はペプチド溶液を、滅菌済の凍結用バイアルに移すステップと、（ｖ）横置きにした該凍結用バイアルを、底部を液体窒素又は任意の他の適当な極低温剤と接触させながら回転させるステップと、（ｖｉ）全体積の該タンパク質又はペプチド溶液を凍結して粉末を形成するステップであり、該バイアルの内側表面上で、該凍結されたタンパク質又はペプチド溶液の最初の薄いフィルムが形成され、及び、該バイアルの中心部に向かってらせん方向に１つ又は複数の後続のフィルムが形成されるステップと、（ｖｉｉ）該凍結された粉末に、１回又は複数回の凍結乾燥サイクルを実施するステップとを含む。
【０１８４】
別の実施形態において、本方法は、凍結された粉末をバッファーに再構成させた後のタンパク質又はペプチドの活性を検証するステップを含む。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、自己群集している。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、溶液中にはない。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、分散媒から希釈されると、モノマー形態に戻る。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、分散媒から希釈されると、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の活性を保持する。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、該タンパク質又は該ペプチドの注射用溶液と比較した場合、注射時に、実質的に類似した薬物動態学的な特性を呈し、この場合の薬物動態学的な特性としては、最高血清中濃度（Ｃmax）、注射後の最高濃度到達時間（ｔmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）に代表される利用可能な最大用量、組織分布（ｔ1/2−α）及び消失時間（ｔ1/2−β）、又はそれらの組合せが挙げられる。別の実施形態において、本組成物は、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇの注射される投与量をもたらすように製剤化される。別の実施形態において、本組成物は、終了時を２から３０日の間とした場合、静脈内送達の場合に観察される値の５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％の曲線下面積（ＡＵＣ）／血中用量をもたらす。
【０１８５】
本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、終了時を２から１４日の間とした場合、静脈内送達の場合に観察される値の５０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％のＡＵＣ／血中用量をもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、２日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日、及び３０日間にわたり、皮下の（ＳＱ）溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍の合計ＡＵＣをもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、（ｉ）２０日間でＳＱ溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、（ｉｉ）１４日間でＳＱ溶液の場合の合計ＡＵＣの値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、又は（ｉｉｉ）１０日間でＳＱ溶液の場合の合計ＡＵＣ１０の値の１倍、２倍、５倍、６倍、８倍、１０倍の合計ＡＵＣをもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、ＳＱ溶液注射の場合のＣmaxの０．５倍、０．７倍、０．９倍、１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍に達するＣmaxをもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、静脈内の、経口の、非経口の、又は皮下の溶液の場合のｔmaxの１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２．０倍遅れるｔmaxをもたらす。
【０１８６】
本方法のいくつかの実施形態において、分散媒から希釈されると、タンパク質又はペプチドは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の活性を保持する。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、１日、２日、３日、５日、１０日、２０日、又は３０日にわたり、血中で観察される合計ＡＵＣの１／２を示す。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、１日、２日、３日、５日、１０日、２０日、又は３０日にわたり血清中で完全な生物活性を保持する、治療用タンパク質又はペプチドである。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、（ｉ）２日、５日、１０日、２０日、若しくは３０日時点で０．５以上、（ｉｉ）２日、５日、１０日、２０日、若しくは３０日時点で０．３以上、又は（ｉｉｉ）２日、５日、１０日、２０日、若しくは３０日時点で０．１以上のｃ／ｃmaxをもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、静脈内、皮下、非経口、又は経口投与用に構成される。本方法のいくつかの実施形態において、タンパク質は、本分散系内で、また、希釈後、内在性トリプトファン蛍光、ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法（ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎｆｒａ−ｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＥＣ、ＡＵＣ、ＨＰＬＣ、光散乱、質量分析法、ＳＥＣ、ＤＬＳ、ゲル電気泳動、抗原特異的な又はポリクローナルＥＬＩＳＡ、及び特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイにより測定した場合に、本来の立体配座及び活性を保持する。本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、本明細書に先に記載の方法により作製し得る。
【０１８７】
別の態様において、１つ又は複数の選択された薬物動態学的な特性を必要とする用途に向けたタンパク質又はペプチドナノクラスター組成物を投与するための方法であって、該薬物動態学的な特性が、所与の媒体中で測定され、所与の経路により施される方法が提供される。本方法は、（ｉ）該１つ又は複数の選択された薬物動態学的な特性の同定可能な値を有するタンパク質又はペプチド分子を、媒体内で、また、可溶性の形態で用意するステップと、（ｉｉ）１つ又は複数のタンパク質又はペプチドナノクラスター、及び、０、１つ、又は複数のクラウダーを有するタンパク質又はペプチドナノクラスター組成物を分散媒中で形成するステップであり、該ナノクラスターが、タンパク質又はペプチドを含み、該ナノクラスターの平均直径が２０から１，０００ナノメートルの間であり、該タンパク質又はペプチドが、安定であり、クラスター化されてナノクラスターになっているステップと、（ｉｉｉ）該タンパク質又はペプチドナノ粒子組成物を対象に投与するステップであり、該ナノ粒子組成物の、該選択された薬物動態学的な特性の値が、媒体中で測定されたとき及び所与の経路により投与されたときの同定可能な値と実質的に同じであるステップとを含む。
【０１８８】
別の態様において、１つ又は複数の選択された薬物動態学的な特性を必要とする用途に向けたタンパク質又はペプチドナノ粒子組成物を投与するための方法であって、該薬物動態学的な特性が、所与の媒体中で測定され、所与の経路により施され、（ｉ）該１つ又は複数の選択された薬物動態学的な特性の同定可能な値を有するタンパク質又はペプチド分子を、媒体内で、また、可溶性の形態で用意するステップと、（ｉｉ）１ナノ粒子当たり８０から２５０個の間のタンパク質又はペプチドを含む１つ又は複数の自己群集性のタンパク質又はペプチドナノ粒子を含むタンパク質又はペプチドナノ粒子組成物を分散媒中で形成するステップであり、該ナノ粒子が、溶液中にはなく、該タンパク質又はペプチドが、その個々の等電点又は近くであるときには安定で自己群集し、クラスター化されており、該組成物が、注射時に、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬの該タンパク質又はペプチドをもたらすステップと、（ｉｉｉ）該タンパク質又はペプチドナノ粒子組成物を対象に投与するステップであり、該ナノ粒子組成物の、該選択された薬物動態学的な特性の値が、媒体中で測定されたとき及び所与の経路により投与されたときの同定可能な値と実質的に同じであるステップとを含む方法が提供される。
【０１８９】
別の態様において、タンパク質又はペプチドから成る１つ又は複数のナノ粒子を分散媒中で形成するプロセスにより作製される滅菌済のナノクラスター分散系であって、水力学的直径の平均値が２０から１，０００ナノメートルの間であるタンパク質又はペプチドナノクラスターを形成する条件下で、場合によりクラウダーを含み、タンパク質又はペプチドが安定であり、組成物が実質的に透明な、高濃度、低粘性のタンパク質又はペプチド分散系である分散系が提供される。
【実施例】
【０１９０】
実施例Ｉ
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントルイス）からポリクローナルヒツジＩｇＧ（製品番号１５１３１）を購入し、分子篩、高速（fast）タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によりさらに精製した。α−αトレハロース、平均分子量３００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ３００）、ｎ−メチル２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び他のあらゆる化学薬品は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ニュージャージー州フェアローン）から購入した。
【０１９１】
粉末及び分散系形成：ｐＨ５．５、６．４及び７．４の２０ｍＭヒスチジンバッファーにおけるゼータ電位から、タンパク質のｐＩが６．４であると決定し、等電点ゲル電気泳動により確認した（図１７）。１：１ｗｔ比のα−αトレハロースによるヒスチジンバッファーｐＨ５．５における初濃度２０ｍｇ／ｍｌのＦＰＬＣ精製ＩｇＧ溶液を、−４０℃において予冷した凍結乾燥機トレー上の８ｍｌバイアルにおいて６時間かけて徐々に凍結させた（ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）。次に、１００ｍトルにおける−４０℃、１２時間の一次乾燥と、続いて６時間かけて２５℃へと傾斜させ、２５℃におけるさらに６時間の二次乾燥により、試料を凍結乾燥させて乾燥粉末を生成した。凍結乾燥により生成した粉末の走査型電子顕微鏡画像を（図１５Ａ〜１５Ｃ）に示す。０．０３９〜０．０８ｇ±０．０００５ｇの間の粉末を０．１ｍｌ円錐状バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製品番号９８６２１１）にスパチュラを用いて詰め込んだ。２０〜２００μｌマイクロピペットを用いて１００＋１μｌの水性ベースのバッファーを円錐状バイアルに添加して、約０．１ｍｌの総分散系容量を得た。５０ｍＭ  ｐＨ６．４リン酸バッファー（ヒツジＩｇＧ３８のｐＩ）にＮａＣｌを添加して、１５４ｍＭの総イオン強度を得た。粉末及びバッファーの混合物を、低いせん断で２５ｇ針の先端を用いて穏やかに撹拌して、エア・ポケットを除去し、肉眼に見えるいかなる不均質性も出現しない透明分散系を生成した（図１Ａ及び１Ｂ）。粉末における高度に可溶性のトレハロースが溶解し、分散系における外因性群集化剤となった。特定の試験において、水性バッファーは、追加的なクラウダーとして公知の容量のＰＥＧ３００又はＰＥＧ３００とＮＭＰの混合物を含有した。ＩｇＧ及びトレハロースの公知の質量及び密度（部分モル体積から）並びに他の（液体）構成成分の公知の添加容量に基づく、濃縮分散系における様々な構成成分の総容量を表１に示す。構成成分の体積分率（φ＝Φ、ＩはＩｇＧ、Ｔはトレハロース、ＰはＰＥＧ３００、ＮはＮＭＰ）を表１に示す。この基礎手順も用いて、試験全体にわたり体積分率を決定した。
【０１９２】
水性クラウダー溶液におけるナノクラスター及び／又はタンパク質単量体の水力学的直径、Ｄh＝Ｄcは、他に断りがなければ、様々な散乱角で約２３℃の温度にて６３２．８ｎｍレーザー、光ファイバー検出器及びアバランシェフォトダイオード（avalanche photodiode）を備える特注の（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）装置において、様々な濃度における動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。０．１２〜０．２１にわたる高φにおける測定を１６０〜１６５°散乱角で行って、特殊化した約６０μｌ試料セル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔ  ＃Ａ５４０９４）による多重散乱（Ｈｏｒｎ  ２０００）を最小化して、必要とされるタンパク質の量を最小化した。濃縮分散系の多重散乱の最小化を確実にするため、第２の散乱角１３５°における追加的な測定を行い、１６０°における測定値の１０％以内のＤhを生じることを見出した。デジタル自己相関器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ−９０００ＡＴ）を用いたＣＯＮＴＩＮによりデータ解析を行った。表１におけるＤＬＳ測定値は、３回複製して行った。報告された平均直径は、ＤＶ５０に相当、或いは累積的試料容量が５０％を下回る直径であった。全試料は、２０％未満のピーク幅における相対標準偏差を生じる、狭い分布の１個のピークを含有した（詳細な解析は表６を参照）。ＮＭＰなしでＰＥＧ３００を含有する特定の試料（表１における列３及び４）は、同セルを用いたが、散乱角１６５°においてＤｅｌｓａナノ粒子サイズ分析計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）により測定した。図１８Ａ及び１８Ｂに示す通り、ポリスチレン標準（φ＝０．３）によりこの技法を検証した。２ｍｌアンプル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製品＃１７６７７６）におけるさらに低い濃度のタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）により、以前に報告された通り３０°〜９０°の散乱角で種々の試験を行った。その上、より大容量の低濃度分散系の平均計数率を静的光散乱（ＳＬＳ）の測定された強度として記録して、空隙率及び第２の浸透圧ビリアル係数を決定した。
【０１９３】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）により粒子形態をさらに特徴付けるため、水性分散系を４０ｍｇ／ｍｌとなるよう希釈し、凍結乾燥した。濃縮し分散した粒子内のＩｇＧのフォールディングの程度を、完全にアンフォールディングしたタンパク質（３５０ｎｍ）対フォールディングしたタンパク質（３３６ｎｍ）におけるトリプトファン残基のλmax蛍光からモニターした。２５。ヒツジＩｇＧのアンフォールディング対変性剤である尿素の濃度の検量線を図２０に示す。１０μｌの分散系を１ｍｇ／ｍｌとなるようリン酸バッファーに希釈した後、ポリクローナル捕捉用酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質活性を特徴付けた。これらの試料を３０°におけるＤＬＳによっても測定してタンパク質単量体ピークを特徴付け、あらゆる不可逆的凝集体の存在を同定した。ＤＬＳにより得られた単量体ピークは、本明細書及び表５に記載されている通り、分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によっても検証した。
【０１９４】
粘度測定：ＩｇＧナノクラスター分散系の見かけ上の粘度は、１ｍｌツベルクリンスリップチップ（slip tip）注射器に取り付けた２５ゲージ（ＩＤ＝０．１ｍｍ）１．５”長の針を用いて、ハーゲン・ポアズイユ（Hagen-Pouiselle）方程式に従って、１０％相対標準偏差により３回複製して測定した。ビデオカメラ（Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア）により、錐体の底からの高さ０．４”から高さ０．１”（−５０μｌ）まで分散系を引く時間に基づいて、針を通る速度を決定した。プランジャーの端を１ｍｌマークに保持することにより殆ど一定の吸引力（suction force）を維持しつつ、０．０５秒以内まで少なくとも３回時間を測定し、平均化した。注射器内の空洞の１０％の最大容量に分散系を充填して、圧力降下における変動を最小化した。円錐状バイアルから０．０５ｍｌ引く時間と、様々な較正流体の粘度との間の直線相関を図１６に示す（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。キャノン・フェンスケ（Cannon-Fenske）較正した粘度計チューブ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄカタログ番号１３−６１７Ｂ）を用いて、混合した水性ベースの溶媒混合物の粘度（タンパク質なし）を少なくとも３回測定し、平均化した。
【０１９５】
高度に濃縮されたナノクラスター分散系の形成：水性ｐＨ６．４リン酸バッファーにおける高濃度の凍結乾燥ＩｇＧ：トレハロース（１：１）粒子の穏やかな撹拌により透明分散系を生成した（図１Ａ及び１Ｂ）。この透明な外観は、高タンパク質濃度、１５０〜２７５ｍｇ／ｍｌのｃi＝ｃにもかかわらず、タンパク質（約１．４２）と水性溶媒（約１．３３〜１．３７）との間の屈折率における差が異常に低いことの結果である。低い濁度は、あらゆる場合において巨視的粒子が存在しないことを目視により観察できるようにし、これは、非経口的治療法におけるこれらの分散系の使用のための重要な発見的問題解決法となるであろう。
【０１９６】
ＤＬＳ結果は、表１において高度に濃縮された分散系を先ず提示し、次に、ＩｇＧの「ＤＬＳ溶解度」を決定し、パスウェイを変動させて平衡に達したクラスターを証明するためのより特化した試験を示す。散乱角１６０°において、タンパク質ナノクラスターのＤhは、個々のＩｇＧ分子の値１０ｎｍよりもおよそ一桁大きかった（表１）。最初の２列における唯一の外因性クラウダーとしてトレハロースを用いる最も単純な事例に関して、２１４及び２７５ｍｇ／ｍｌのｃiではＤh  −  ８５〜８８ｎｍであった（図２Ａ及び表１）。角度１４５°及び１３５°における追加的な測定により、散乱角１６０°におけるＤhを正確に測定する能力を決定して、１０％以内の粒子サイズを確認した。代表的な１回のＤＬＳランに関する図２Ａにおいて、サイズ分布におけるより大きな凝集体及び１０％未満の相対標準偏差を有するピークは観察されない。表１に報告されている全Ｄh値は、３回以上の個々のランの平均及び標準偏差である。より低濃度のクラウダーとしてのトレハロース及び１４２ｍｇ／ｍｌのｃi（φT＝０．０９）では、より小型の５８ｎｍクラスターが形成された（図２Ａ）。ＰＥＧ３００を添加して、総外因性クラウダー体積分率ΦEを０．２５及び０．３４に上昇させた場合（φN＝０．１６〜０．２４）、Ｄhは１１１ｎｍへと若干増加した（図２Ｂ）。ＮＭＰなしの場合と同様の総ΦE、０．３３であったにもかかわらず、φp＝０．０８及びφN＝０．１６の混合物により幾分より大型の２５８ｎｍクラスターが観察された。
【０１９７】
図３Ａ及び３Ｂに示す通り、分散系におけるＩｇＧ濃度ｃiを、一定の組成の全外因性クラウダーにおいて希釈して、「ＤＬＳ溶解度」を定義した。Ｄhが約５０ｎｍ超からＩｇＧの水力学的半径、１１ｎｍへとシフトしたｃiを、外因性クラウダー溶液におけるＩｇＧの溶解度であると定義した。このＤＬＳ溶解度技法により、２５０ｍｇ／ｍｌトレハロース（φT＝０．１５）によるｐＩ（ｐＨ６．４）におけるＩｇＧ溶解度は、３１〜５０ｍｇ／ｍｌの間のｃiであったが、その理由は、５０ｍｇ／ｍｌにおいて依然として大型のクラスターが見られたが、３１ｍｇ／ｍｌにおいて可溶性の単量体しか見られなかったためである（図３Ａ）。２００ｍｇ／ｍｌトレハロースにより０．１６φN及び０．０８φPをクラウダー（φE＝０．３４）として組み合わせて用いる場合、ＩｇＧ溶解度は１．２５〜２．５ｍｇ／ｍｌの間へと１桁減少した（図３Ｂ）。ＰＥＧ３００及びトレハロースの外因性クラウダー組み合わせ等、他のクラウダー条件におけるＤＬＳ溶解度も調査した（表１）。ＤＬＳ  ＩｇＧ希釈方法を用いて、添加した０．２４φPの溶解度が１ｍｇ／ｍｌ未満であると検出した（表１）。散乱レーザー光の強度が弱過ぎたため、１ｍｇ／ｍｌ未満の溶解度は、ＤＬＳにより検出できなかった。
【０１９８】
急速に凍結及び凍結乾燥した濃縮ナノクラスター分散系のＳＥＭ及びＳＴＥＭ画像は、粒子サイズを裏付け、添加された外因性クラウダー０．１６φN及び０．０８φPにより形成されたクラスターの形態を示す（φE＝０．３３、図４Ａ及び４Ｂ）。ＳＥＭ（図４Ａ１）及びＳＴＥＭ（図４Ｂ）の両方により分かる通り、粒子は、約５０ｎｍからなる一次粒子より低いクラスターである。様々な散乱角（３０°、４５°、７５°及び９０°）におけるＤＬＳと同時発生的に測定されたＳＬＳから、ナノクラスターのフラクタル次元を、散乱ベクトル及びＳＬＳ強度のｌｏｇ−ｌｏｇプロットから指数部として決定することができる。クラスターのフラクタル次元、δfは、粒子における固体の体積分率、φIを、一次粒子直径、Ｄ及びクラスター直径、Ｄcと関連させることにより凝結粒子の構造を特徴付ける。
【０１９９】
【数１】
2014514275.tif 000005
【０２００】
高密度に充填された粒子で構成されるクラスターに関して、δfは３に接近する。２５０ｍｇ／ｍｌトレハロース（φT＝０．１５）で形成されたナノクラスターに関して、２．４のδfが実験的に測定され（図１９Ａ）、０．２９の個々のタンパク質のφIを生じた。０．１６φN及び０．０８φP（φE＝０．３４）で形成されたクラスターに関して、２．６の測定されたδfを用いて０．２９のφIが計算された（図１９Ｂ）。
【０２０１】
平衡ナノクラスター直径におけるクラウダー濃度の効果：一定のｃiにおいて種々の経路によりφEを増加及び減少させることにより、タンパク質ナノクラスターのサイズにおける総外因性クラウダー体積分率（φE）の効果を決定した（図５Ａ）。図５Ａ経路１において、トレハロースの濃縮溶液（５００ｍｇ／ｍｌトレハロース）からトレハロースを添加することにより、φTは５０ｍｇ／ｍｌから最大３００ｍｇ／ｍｌへと増加した。Ｄhの測定に先立ち少容量の２００ｍｇ／ｍｌ濃縮タンパク質分散系を２００ｍｇ／ｍｌトレハロースと同時に添加することにより、各ポイントにおいてｃiを５０ｍｇ／ｍｌに維持した。ＤＬＳによると、５０ｍｇ／ｍｌトレハロース濃度において、約１０ｎｍのＤhから分かる通りタンパク質は単量体として存在しており、この状態はトレハロース濃度１５０ｍｇ／ｍｌまで続く。トレハロースが１５０ｍｇ／ｍｌを超えると、増加するＤhにより示される通り、タンパク質はクラスターを形成した。タンパク質クラスター直径は、トレハロース濃度と共に直線的に増加し、３００ｍｇ／ｍｌのトレハロース濃度において約８０ｎｍに達した（図６）。図７において、トレハロースの質量密度（１．６４ｇ／ｍｌ）を用いることにより、トレハロースの質量をφTに変換した。クラスターサイズの再現性を別個のパスウェイにより検証するため、３００ｍｇ／ｍｌから出発するトレハロース濃度を、純粋バッファー溶液を添加することにより減少させた。この場合も先と同様に、上述の少量の濃縮タンパク質分散系を添加することにより、ｃiを５０ｍｇ／ｍｌに維持した。実験により測定したクラスターサイズは、φTに基づくと、トレハロースを添加しつつ増加させた場合と同じ速度で減少した（図５Ａ、経路１後の糖濃度減少）。別個の実験において（図５Ａ経路２）、代替法を用いて、トレハロース濃度を増加させた。５０ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ及び５０ｍｇ／ｍｌトレハロースのタンパク質溶液にトレハロース結晶を直接的に溶解して、トレハロース濃度を増加させた。各トレハロース濃度において、両方の方法により作製されたタンパク質クラスターのサイズは、増加トレハロース濃度であれ減少トレハロース濃度であれ、密接に一致した。さらに、トレハロース濃度３００ｍｇ／ｍｌ及び一定のＩｇＧ濃度５０ｍｇ／ｍｌにより試験を開始し、ｐＨ６．４リン酸バッファーと、５０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度を維持するための必要な少量の２００ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ分散系を用いることにより、これを１００ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧに希釈して、経路３を試みた。これらの異なる経路は全て、試行した異なるトレハロース濃度において互いに十分に一致するサイズを生じ、同一直線上に位置するように見える。
【０２０２】
第２のクラウダー組成、１：２容量のＰＥＧ３００及びＮＭＰの溶液も用いて、様々な総φEにおける粒子サイズを決定した。この場合、少量の１：１ｗｔ比のタンパク質：トレハロース凍結乾燥粉末の添加により一定のタンパク質及びトレハロース濃度３０ｍｇ／ｍｌを維持しつつ、測定された容量の１：２容量のＰＥＧ３００及びＮＭＰの溶液を添加して、総φEを増加させた。ＰＥＧ３００及びＮＭＰのφEが０．１５及びそれ以上へと増加するにつれ、クラスター成長が観察された。０．３のＰＥＧ３００及びＮＭＰのφEにおいて、約１８０ｎｍの最も大型の粒子が観察された。
【０２０３】
図５ＡにおけるＤＬＳにより得られた選択された一部の試料の実際の水力学的直径分布を図６に示す。図から分かる通り、分布は相当に狭く、平均値にまたがり１０％未満の相対標準偏差を有する。また、図５Ａに示す通り異なる経路のクラスターサイズが十分にマッチするだけでなく、図６から分かる通り、分布も十分にマッチすることが判明する。図７において、トレハロースクラウダーのみ及び１：２のＰＥＧ３００：ＮＭＰクラウダー系の両方に対して形成されたタンパク質クラスターのサイズを、総外因性クラウダー体積分率に対しプロットした。いずれの種類のクラウダー系も、図７に示す通り、タンパク質クラスターサイズの非常に同等な線形成長を生じる。実際に、どちらのクラウダー系も殆ど同じ線上に位置する。
【０２０４】
ナノクラスター分散系の特性（低い粘度及び高い分子安定性）：２０４ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ（０．０８φP／０．１６φN）による最後の列を除く表１における全条件に対し、注射器使用できる（Syringable）粘度（例えば、＜５０ｃＰ）を得た。０．１６〜０．２４の間のφPを有する試料の粘度は、ＮＭＰ−ＰＥＧ混合物の粘度よりもやや高かった。ＰＥＧ３００のさらにより高い体積分率、０．５０は、１５０ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧにおいて注射器使用（syringeable）できなくなるポイントまで粘度を増加させた。外因性群集化剤としてトレハロースのみを使用する場合、２１４ｍｇ／ｍｌにおけるタンパク質分散系の粘度は、３７ｃＰであった。このような高濃度の治療タンパク質のこのように低い粘度は、仮に報告されたとしても滅多にない。さらに、多くの場合、２００〜３００ｍｇ／ｍｌにおいて溶液は形成されないが、その理由として、タンパク質溶解度がこれほど高くないためである。
【０２０５】
見かけ上の分散系粘度は通常、クリーガー・ドアティ（Krieger-Dougherty）の方程式（Ｅｑ．２）を用いた、固有粘度［η］、粒子の最大体積分率、φmax及び溶媒粘度η0の関数として説明される。
【０２０６】
【数２】
2014514275.tif 000006
【０２０７】
η0又は［η］（剛体球コロイドに対し最小２．５である）を低くし、φmaxを増加させることにより、ηを低下させることができる。表１において、φIは、タンパク質の体積分率であり、Φmax＝０．５５である。溶媒中に存在するタンパク質と等しい質量のトレハロースを有するため、可溶性糖が原因で溶媒粘度は増加する。ＰＥＧ−ＮＭＰ製剤のそれぞれに対し、［η］は、１３〜１６の間と相当に低かった。クラウダーとして唯一の糖を有する２７５ｍｇ／ｍｌ濃度のＩｇＧにおいて、タンパク質分散系の［η］は、ほぼ同一値の１４である。添加クラウダーとしてＰＥＧのみを有する３種の試験に関して、［η］値は、ＮＭＰ−ＰＥＧ試料のものよりもやや大きい（１９〜２０）が、１００もの高さの固有粘度を有する多くの報告されたタンパク質のものよりも依然として小さい。
【０２０８】
分散系が、高濃度で低い粘度を生じることを考慮して、分散系内及び希釈後のタンパク質安定性を検査する。クラウダーが存在する濃縮分散系から希釈された１００ｍｇ／ｍｌのｃiにおいて、蛍光アッセイを利用して、濃縮分散系におけるタンパク質フォールディングを示した。単離されたタンパク質アミノ酸側鎖のトリプトファンと、それよりも低い程度ではあるがチロシンは、２９５ｎｍで励起すると、３５０ｎｍの最大シグナルを放射する。完全にフォールディングしたタンパク質内の局所環境により、ヒツジＩｇＧの最大発光波長（λmax）は、３３６ｎｍへとシフトする（図２０）。タンパク質が完全にアンフォールディングすると、アミノ酸残基の局所環境が変化し、λmaxは３５０ｎｍへと増加する。よって、３３６〜３５０の間の波長における発光のスキャンは、分散した粒子を２９５ｎｍで励起し、最大発光波長を記録することにより、ナノクラスター内のタンパク質のフォールディングを示すであろう。純粋糖クラウダー及びＮＭＰとＰＥＧ両方の分散系に対し、３３６ｎｍのλmaxは、タンパク質の完全にフォールディングした状態を示す（表２）。水性分散系から１ｍｇ／ｍｌとなるようｐＨ７．０リン酸バッファーに希釈・溶解したタンパク質における、単量体タンパク質の高い保持率及び抗体活性を表２に示す。これらの初期試験において用いたヒツジＩｇＧは単一の標的と結合しないため、ポリクローナル抗ヒツジＩｇＧ捕捉ＥＬＩＳＡを用いて、変性による立体構造エピトープの損失をモニターした。約１．１の相対ＥＣ50は同様の標準ＩｇＧ結合を示し、実験誤差内である（表２）。１に近い相対ＥＣ50値は、無視できる活性変化を示す。１ｍｇ／ｍｌのナノクラスターからの溶解ＩｇＧのＤＬＳ測定によると、タンパク質は、ヒツジＩｇＧのＤhである約１０ｎｍのＤhまで溶解する（表２）。ｐＨ７．０バッファー希釈後のタンパク質の％単量体を定量化するための、追加的な分子篩クロマトグラフィーを本明細書に記す（表５）。
【０２０９】
タンパク質ナノクラスター相互作用：静的光散乱（ＳＬＳ）により第２のビリアル係数、Ｂ2を測定することにより、分散系におけるナノクラスターの粒子間（Interparticle）相互作用を定量化した。濃縮分散系を希釈して、多重散乱を除去することが必要であったため、ＮＭＰ−ＰＥＧ系のみを利用した。ＫｃＰ（θ）／Ｒθ対ｃのプロットを用いて、以下の関係性によりＢ2を決定した。
【０２１０】
【数３】
2014514275.tif 000007
（式中、Ｋは光学定数である）
【０２１１】
【数４】
2014514275.tif 000008
【０２１２】
ここで、ｎ0は、溶媒の屈折率であり、λは、入射ビームの波長である）。追加的なクラウダー及びナノクラスターの形成はｄｎ／ｄｃの値に影響を及ぼすとは予測されないため、ナノクラスターの屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、タンパク質水溶液（０．１８５ｍｌ／ｇ）のものと同一であると解釈した。ナノクラスターにおいて、粒子内（intraparticle）干渉は、測定された強度に影響を与える。この効果を低下させるため、追加的な因子、Ｐ（θ）をＥｑ．３に加えて、純粋レイリー散乱からデバイ（Debye）散乱への変化を説明した（Ｅｑ．５）。
【０２１３】
【表３】
2014514275.tif 000009
【０２１４】
【表４】
2014514275.tif 000010
【０２１５】
【数５】
2014514275.tif 000011
【０２１６】
小さい散乱角、３０°を選んで、１／Ｐ（θ）方程式（Ｅｑ．５）の第２の項を低下させた。図７における傾きは、６．６＊１０-5ｍｏｌ＊ｍｌ／ｇ2の正のＢ2を示し、よって、ナノクラスター粒子間相互作用が、僅かに反発的であることを示す。ナノクラスター粒子間相互作用の反発的な性質は、他の間接的特性評価技法により支持される。仮にナノクラスター粒子間相互作用が誘引性であるとすれば、本出願人らは、ＳＥＭ又はＤＬＳにより別々の個々の粒子を観察できないであろう。
【０２１７】
単分散系タンパク質ナノクラスターの非ゲル化分散系の集合は、適切に均衡を保つ階層的マルチスケール相互作用に依存する。タンパク質分子は、互いに引き合うべきであり（クラスター形成に有利）、個々のタンパク質は、クラスターと中立的に相互作用するべきであり（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）（クラスターサイズを制限）、ナノクラスターは、互いに反発し合うべきである（ゲル化を回避）。
【０２１８】
本出願人らは、ナノクラスターについて論じる前に、先ず２個のタンパク質間の平均力のポテンシャルの分子レベルでの検査から始める。図４０ａは、２個の１Ｂ７分子の平均力のポテンシャルＶ（ｒ）に対する寄与の見積もりを示す（この事例において用いたパラメータを表１４に記す）。ｐＩからｐＨ３単位離れると、Ｖel（ｒ）は強く反発的になる。予想して然るべきことに、これらの条件において、リゾチームで観察された通りに非常に小型のクラスターしか観察されなかった（Ｓｔｒａｄｎｅｒ、Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００４）。ｐＩ付近では、Ｖelは、非常に弱くなり、よってｃE＝２２０ｍｇ／ｍｌの強いＶdepにより、Ｖ（ｒ）は誘引性である。すると、平衡自由エネルギーモデルによって説明される通り、この引力は、クラスターを形成させることが示される。
【０２１９】
クラスター形成機序を理解するために、タンパク質のｐＩ付近の条件におけるタンパク質及び相対的に濃縮されたクラウダー分子の水溶液を考慮する。弱く荷電した単量体間の静電反発力の大きさは、短距離枯渇引力と比較して無視できるほどに小さいため、この系における２個のタンパク質分子は、互いに強く引き合うであろう（図３６Ａ及び４０Ａ）。しかし、単量体は、短距離枯渇引力に加えて、クラスター内の荷電タンパク質からの多くの弱いより長距離反発の正味の影響を感知するため、タンパク質単量体とタンパク質クラスターとの間の相互作用はより複雑である。この相互作用は、クラスターのサイズに依存して引力的とも反発的ともなり得る（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）。クラスターが十分に大きい場合、このような反発は枯渇引力と釣り合い、さらなるクラスター成長を制限する（図３６Ａ）。平衡クラスターサイズは、タンパク質単量体間の枯渇相互作用の強さが増加するにつれて（例えば、クラウダー濃度が増加するにつれ）増加し、反発的相互作用の強さが増加するにつれて（例えば、ｐＩからｐＨ単位数が離れるにつれて）減少する。その集団的な静電反発力のため、溶液における完全に成長したクラスターは互いに引き合わないことが示されよう。
【０２２０】
図４０Ｂに示すタンパク質クラスター直径、Ｄcの等高線は、有機溶媒におけるポリマー型コロイドのクラスタリングを理解するために以前に適用された（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４）単純平衡自由エネルギーモデル（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）の拡張からコンピュータ処理した。このモデルにおいて、短距離粒子間引力と、弱いより長距離の静電反発力との間の均衡によりＤcが決定される。
【０２２１】
平衡モデルを理解するために、図３６Ａに示す通り、溶液において半径Ｒcのクラスターを形成する半径Ｒのｎcのタンパク質を考慮する。本出願人らの解析において、本出願人らが明確に考慮する唯一の引力は、（上に説明する通り）強いクラスタリング条件下における優勢な引力相互作用であるクラウダー媒介性枯渇相互作用である。２個のタンパク質間の枯渇相互作用が−εであり、各タンパク質がクラスター内部においてＣ最短距離を有する場合、クラスター内部におけるタンパク質１分子当たりの自由エネルギーに対する有効枯渇の寄与は、−εＣ／２となるであろう。クラスター表面におけるタンパク質の枯渇相互作用の「喪失」は、有効表面エネルギー項（４πＲc2γ）（式中、表面張力は、γ＝ε／４πＲ2として近似される）の追加により説明される。即ち、枯渇引力は、次式においてクラスター自由エネルギーに寄与する。
【０２２２】
【数６】
2014514275.tif 000012
【０２２３】
クラスター内で、電荷が無視できるほど僅かに遮蔽（screen）されると仮定すると（本明細書の他の部分に記す通り）、その反発的自己エネルギーは、クラスター半径Ｒcを有する球体の体積における点電荷の均一な分布のエネルギーで近似され得る。即ち、
【０２２４】
【数７】
2014514275.tif 000013
（式中、λは、ビエルム（Bjerrum）長（λ＝ｅ2／４πΕrΕ0ｋBＴ）であり、Εrは、培地の相対誘電率であり、ｑは、タンパク質当たりの電荷である）。Ｒc（又はｎc）に関するＦ＝Ｆatt＋Ｆrepの最小化を次に記す。
【０２２５】
【数８】
2014514275.tif 000014
この単純な結果は、平衡ｎcが、引力と共に増加し、静電反発力と共に減少することを例証する。
【０２２６】
タンパク質分子から解離する対イオンの並進運動（translational）及びコンビナトリアル（combinatorial）エントロピーの観点からクラスター自由エネルギーをさらに理解するためには、次式が有益である（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）。
【０２２７】
【数９】
2014514275.tif 000015
量ｑ0は、非常に小さい値のζポテンシャルに対応する条件のための全体的なクラスター自由エネルギー（下のＥｑ．１０も参照）を最小化する、タンパク質当たりの電荷ｑを表す（式中、λ／Ｒc→０；即ち、ここで対象とする弱く荷電した系）。これは、次の通りに表すことができる。
【０２２８】
【数１０】
2014514275.tif 000016
（式中、ｎdは、タンパク質表面における解離できる部位の数であり、ｂは、対イオンとタンパク質表面における電荷との間の最接近距離であり、Φは、溶液におけるタンパク質の体積分率である）。より多くのタンパク質が系に存在すると、対イオン並進運動エントロピーにおいて同量の増加を達成するために解離する必要があるタンパク質当たりの対イオンがより少なくなるため、他の文献において詳しく記されている通りに（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）、より大きい値のΦは一般に、より小さいｑ0を生じる。項を組み合わせ、（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）により提示された、クラスターのタンパク質当たりの自由エネルギーを次に示す。
【０２２９】
【数１１】
2014514275.tif 000017
【０２３０】
タンパク質クラスターの空隙率を考慮に入れるため、本出願人らは、クラスター半径を次の通りに表すことにより、元々のモデルを修正する。
【０２３１】
【数１２】
2014514275.tif 000018
（式中、δfは、フラクタル次元である（２．６、図４４から））。得られた修正自由エネルギー方程式を次に示す。
【０２３２】
【数１３】
2014514275.tif 000019
ｑ＝ｑ0におけるｎcに関するｆc最小化により、平衡凝集数（ｎ*）の次の見積もりが得られる。
【０２３３】
【数１４】
2014514275.tif 000020
予想される通り、クラスターサイズは、引力、εの強さが増加するにつれて増加する。そこで本出願人らは、Ｖssr（水素結合、疎水性相互作用等）の大きさが、クラウダー媒介性枯渇引力よりも小さい場合（図４０Ａ）に興味があるため、Ｅｑ．１６［−ε（φE，Ｒ／ＲE）＝Ｖdep（ｒ＝２Ｒ）］における枯渇ポテンシャルの接触値とεを近似させる。δf＝３を有する固体クラスターの限界において、Ｅｑ．１４は、Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  ＫｅｇｅｌにおけるＥｑ．２３（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）と基本的に同じＥｑ．８となる。唯一の差は、他の文献で説明されている係数にある（Ａｒｆｋｅｎ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  １９９５）。
【０２３４】
表１５は、図４０ＢにおけるＲc等高線を決定するためのモデルに対する本出願人らの入力変数をまとめる。Ｒcは、Ｅｑ．９からＥｑ．７への設定ｎ*から決定される。所定のｐＨ下のタンパク質単量体における解離できる部位の総数、ｎdは、以前の見積もりに基づき５０を選んだ（Ｃｈａｒｉ、Ｊｅｒａｔｈら、２００９）。フラクタル次元は、ＳＥＭ画像及びＳＬＳ測定に基づき２．６を選んだ（図４４）。本明細書の他の部分で詳細に説明する通りに、クラスター内側のεrは、２５を選んだ。イオン結合における反対の電荷間の距離を約０．１ｎｍと解釈し、タンパク質直径は１１ｎｍとする（表１５）（Ｈａｒｎ、Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌら、２０１０）。
【０２３５】
ＲcにおけるΦ及びΦEの効果を、クラスターのフラクタル次元を説明するよう拡大されたコロイドクラスタリングの平衡モデルから、図４０Ｂにおいて例証する（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）（Ｅｑ．１４を参照）。本出願人らは、図４０Ａに基づき、タンパク質間の短距離引力相互作用が、接触において明らかな通り、高い値のΦEにおける枯渇引力（Ｅｑ．１６）により優位に立つことを仮定した。この引力は、高密度のクラスター内の無視できる静電気的遮蔽を有する弱い長距離反発により均衡を保つ（本明細書の他の部分において記載）。図４０Ｂにおける水平パスウェイにおいて、固定Φにおける増加ΦEは、Ｖdep（群集）を強化し、したがって、Ｒcを増加させる。このパスウェイは、タンパク質単量体間の枯渇引力を上昇させ（より高いε）、したがって、Ｅｑ．１４（同様にＥｑ．８）における分数の分子（numerator）を大きくし、これによりＲcを増加させる。モデルの予測は、クラスターサイズがｃEの増加と共に増加するという、図３７Ｂ及び図３７Ｄに示す実験データと理にかなって一致する。その上、垂直パスウェイにおいて、固定ΦEにおける増加Φは、系におけるエントロピーとエネルギーとの間で同一バランスを得るために、タンパク質当たりの対イオンの解離がより少なくなる必要があるため（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）、クラスターにおけるタンパク質当たりの電荷を少なくし、これはＲcも増加させる。対角傾斜に沿って希釈後にΦ及びΦEを減少させる複合的変化のため、Ｒcが減少する（図４０Ｂ）。そこで、枯渇引力の減少及びより低いΦと電荷におけるその効果の両方は、Ｒcの減少を生じる。先と同様に、この予測は、図３７Ａ〜Ｄに示す実験データと一致する。本出願人らの新たなモデルは、（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）に基づくモデルと共に、単に定性予測を提供することを目的とする。モデルは、クラスター内電荷遮蔽、クラスターの内側及び外側におけるεrの差及びｒとの引力相互作用における変動を考慮しない。しかし、単純な平衡モデルは、可逆性平衡ナノクラスターの新規の実験的発見を実証し、Ｄcにおける実験的傾向を定性的に予測する。
【０２３６】
図４０ＡにおけるそのｐＩ付近の個々のタンパク質間の主たる引力相互作用とは対照的に、得られたナノクラスター相互作用は、高度に反発的である（図４０Ｃ）。クラスター間反発の優占は、クラスター当たりの多数の弱く荷電したタンパク質（＞１０００タンパク質／クラスターであり、約１素電荷／タンパク質）と、Ｒcと共に増減する（scale）より長距離のＶel（Ｅｑ．１９）によるものである。対照的に、Ｖdep及びＶssr（Ｅｑｓ．１６及び１７）の範囲は、＜１ｎｍであり、よって、クラスター間間隔に対して殆ど無視できる（図４０Ｃ挿入図）。
【０２３７】
引力の均衡を保つには静電反発力が不十分な（即ち、非常に高いクラウダー又はタンパク質濃度）条件下において、タンパク質はゲルを形成し得る（Ｌｕ、Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉら、２００８）。クラスタリングモデル（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）の文脈におけるこの遷移に関連するスピノーダル不安定性は、ｄ2ｆcl／ｄｑ2＝０のポイントの座位として定義することができる（図４０Ｂにおける灰色の線を参照）。実験データ及び理論的クラスターサイズ等高線によると、様々なサイズを有する平衡クラスターがゲル相境界前に形成され得ることに留意されたい。
【０２３８】
周囲の培地の存在下における２個のタンパク質間の平均力のポテンシャル
培地における他の分子の存在下において、タンパク質単量体であれナノクラスターであれ２個のタンパク質粒子間の平均力のポテンシャルＶ（ｒ）は、関連するマルチスケール相互作用を理解するための基盤を提供する。これは通常、枯渇（ｄｅｐ）相互作用、特定短距離（ｓｓｒ）相互作用及びファンデルワールス（ｖｄｗ）相互作用と共に静電（ｅｌ）相互作用を包含する構成成分の和としてモデル化することができる。即ち、
Ｖ（ｒ）＝Ｖdep（ｒ）＋Ｖssr（ｒ）＋Ｖ（ｒ）vdw＋Ｖel（ｒ）    （１５）
（式中、ｒは、粒子中心間の分離距離である）である。枯渇引力（Ａｓａｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｏｏｓａｗａ  １９５８；Ｍｉｎｔｏｎ  ２００７；Ｚｈｏｕ  ２００８；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）（通常、「群集」と称される）は、溶液におけるより小さな共溶質（cosolute）又は「外因性クラウダー」（本明細書において、トレハロース分子）の存在により粒子が経験する有効（浸透圧）相互作用である。エントロピーは、タンパク質粒子が互いに近い微小状態（microstates）、即ち、より小さなクラウダーが利用できる体積がさらに多くなる立体配置を好むため、この構成が生じる（図４２）。図４２において、タンパク質の近接により、２個の大きい灰色の丸の間にある暗灰色の陰付き部分によって表される実際には三次元の体積（二次元の図で示す）は、トレハロース分子に利用できるようになる。
【０２３９】
枯渇引力は、多くの場合、朝倉・大沢（Asakura-Oosawa）ポテンシャル（Ｓ．Ａｓａｋｕｒａ  １９５４；Ａｓａｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｏｏｓａｗａ  １９５８）によって説明される。
【０２４０】
【数１５】
2014514275.tif 000021
（式中、Ｒは、タンパク質粒子半径であり、ΦE及びＲEは、外因性（extrinisic）クラウダーのそれぞれ体積分率及び半径を表す）（Ｔｕｉｎｉｅｒ、Ｒｉｅｇｅｒら、２００３）。枯渇引力の強さは、ΦEに比例するため、クラウダー濃度を改変することにより実験的に調整することができる。この引力の範囲は、ＲE（トレハロース約０．５ｎｍ）と共に増減するため、Ｒ（タンパク質単量体約５．５ｎｍ）よりも相当に小さい。
【０２４１】
本出願人らがタンパク質粒子間の特定短距離引力と命名したものは、水素結合、露出した無極性タンパク質パッチ間の疎水性相互作用及び揺らぐ電荷双極子を包含する分子スケールの相互作用の組み合わせを表す（ｔｅｎ  Ｗｏｌｄｅ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｋｅｌ  １９９７；Ｃｕｒｔｉｓ、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚら、１９９８；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｋｕｌｋａｒｎｉら、１９９９；Ｋｕｌｋａｒｎｉ、Ｄｉｘｉｔら、２００３）。単純化のために、これは多くの場合、井戸型（asquare-well）ポテンシャルとしてモデル化される。
【０２４２】
【数１６】
2014514275.tif 000022
（式中、Ｖ0／ｋBＴは、井戸の深さ（モノクローナル抗体のＶ0／ｋBＴは約２．７（Ｂａｊａｊ、Ｓｈａｒｍａら、２００７））であり、幅（２ＲΔ）は約１ｎｍである）（ｔｅｎ  Ｗｏｌｄｅ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｋｅｌ；Ｃｕｒｔｉｓ、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚら；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｋｕｌｋａｒｎｉら；Ｋｕｌｋａｒｎｉ、Ｄｉｘｉｔら；Ｓｔｒａｄｎｅｒ、Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００４）。特定短距離相互作用の範囲（２ＲΔ）が一定であり、よって粒子サイズ（Ｒ）と無関係である、即ち、ΔはほぼＲ-1であると仮定することは妥当である（Ｃｕｒｔｉｓ、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚら；Ｋａｎａｉ、Ｌｉｕら；Ｙａｄａｖ、Ｌｉｕら）。よって、１ｎｍ  ｓｓｒ相互作用の影響の範囲は、１０ｎｍタンパク質分子に対する１００ｎｍタンパク質コロイドを無視できるようになり、これは、ナノクラスター分散系の低粘性の鍵となる役割を果たすことが示されよう。
【０２４３】
２粒子間のファンデルワールス引力は、（Ｈｉｅｍｅｎｚ  ａｎｄ  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  １９９７）の通り、水Ａpwpによる２タンパク質間のハマカー（Hamaker）定数の観点から表すことができる。
【０２４４】
【数１７】
2014514275.tif 000023
これは、本試験において考慮される他の相互作用と比較して相対的に弱く（水におけるＡpwp／ｋBＴは、約０．０４しかない）、したがって、これは、本出願人らの解析において明確に考慮されない。
【０２４５】
粒子間の静電反発力は、（Ｈｉｅｍｅｎｚ  ａｎｄ  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  １９９７）により提示されている。
【０２４６】
【数１８】
2014514275.tif 000024
（式中、Γ0は、ψ0粒子表面ポテンシャルの関数であり（Ｈｉｅｍｅｎｚ  ａｎｄ  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  １９９７）、η∞は、バルクイオン（bulk ion）濃度（５０ｍＭ）であり、κは、逆（inverse）デバイ長（バルクバッファー（bulk buffer）溶液のκ-1＝０．７ｎｍ）である）。静電反発力の大きさは、粒子の電荷及びサイズの両方に依存することに留意されたい。
【０２４７】
ＩｇＧクラスターの表面ポテンシャル及びゼータ電位
ｃ＝５０ｍｇ／ｍｌ及びｃE＝２７０ｍｇ／ｍｌによる図４７のものと同一の粉末の分散系から生成されたポリクローナルヒツジＩｇＧの５０ｎｍクラスターのゼータ電位を測定したところ、ｐＩ６．４付近のｐＨ６．４において３．９±０．７５ｍＶであった。この値及びデバイ長２ｎｍから、本出願人らは、各タンパク質分子表面における約１〜２有効電荷を次の関係性から見積もった。
【０２４８】
【数１９】
2014514275.tif 000025
（式中、Ｑは、粒子における表面電荷であり、Ｒsは、せん断面における粒子の半径であり、これは、粒子の半径（Ｒc）に等しいものとして近似され、κは、逆デバイ長である）。このＱに基づき、ＩｇＧナノクラスターに対し６４ｍＶの表面ポテンシャルを計算した。
【０２４９】
【数２０】
2014514275.tif 000026
この表面ポテンシャルは、凝集に対しクラスターを安定化する、図４ｃに示す２個のタンパク質クラスターの平均力のポテンシャルにおける約１５ｋBＴのポテンシャル障壁を生じる。ζの測定に必要とされる大量のタンパク質を考慮すると、１Ｂ７に対するこれらの測定は実行できなかった。しかし、タンパク質の同様の分子量並びにｎc及び他の特性に関する同様の結果を考慮すると、本出願人らは、同様の大きな表面ポテンシャルが、１Ｂ７クラスターを安定化するのであろうと考える。
【０２５０】
クラスター内の低い有効比誘電率
平衡クラスター形成の概念は、低い比誘電率に好まれる、クラスターにおける長距離静電力を仮定する（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）。クラスター内の水の比誘電率は、タンパク質表面間の閉じ込め（confinement）により影響され得る。これと類似して、各高密度タンパク質クラスター内の不均一環境は、バルク水の不均一環境とは大幅に異なる。本文に記す通り、本出願人らは、ＩｇＧクラスターにおけるＳＥＭ画像及びＳＬＳ測定値に基づき、クラスターにおけるΦintが約０．６０であると見積もった。
【０２５１】
【数２１】
2014514275.tif 000027
（式中、Ｄmは、タンパク質単量体の直径である）。有効媒質理論に従ったクラスターにおける比誘電率Εを次の通りに記す（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ  １９４５；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ａｎｄ  Ｈｏｕｇｈ  １９５７）。
【０２５２】
【数２２】
2014514275.tif 000028
（式中、Ε1は、タンパク質比誘電率（５）であり、Ε2は、水の比誘電率（８０）であり、Φ1は、媒質におけるタンパク質の体積分率である）。計算されたΕは、０．６のΦ1に対し２０である。この値は、表１７における２５の選択と同様のものである。
【０２５３】
Φint＝０．６におけるＲ＝５．５ｎｍの均一な間隔の球状タンパク質の仮定は、単純幾何学から（Ｖ球体＝０．６Ｖ立方体である場合、立方体に含有される各球状タンパク質と、並べて配置されるとタンパク質クラスターを形成する立方体を仮定すれば）、クラスターの内側の水が、タンパク質表面間のおよそ１ｎｍ以下のチャネルに限局される（（Ｒｉｎｔｏｕｌ  ａｎｄ  Ｔｏｒｑｕａｔｏ  １９９８）を参照）ことを暗示する。この閉じ込めレベルにおいて（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ２００３；Ｂｉｓｗａｓ、Ｒｏｈｍａｎら、２００８）（Ｓｅｎａｐａｔｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｄｒａ  ２００１；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｎ  ２００７；Ａｈｍａｄ、Ｇｕら、２０１１）、水の有効比誘電率は、約４０に低下する（Ａｈｍａｄ、Ｇｕら、２０１１）。また、タンパク質から解離するイオンと、僅かな外来性イオンのみが、これらの極度に限局した空間に存在する傾向がある（Ｋｒａｌｃｈｅｖｓｋｙ、Ｄａｎｏｖら、２０１１）。クラスター内のこの低いイオン濃度及び低いΕは、バルク水バッファー溶液と比較してより低いデバイ遮蔽を生じるであろう。この低い遮蔽レベルは、クラスターサイズに影響するより長距離静電反発力をさらに増強するであろう。
【０２５４】
クラスター溶解時間
ナノクラスターにおけるタンパク質の溶解時間は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ希釈実験と、より重要なことに、ｉｎ  ｖｉｖｏ皮下注射後のクラスター解離を理解するために興味深い。タンパク質の固体球体を仮定して、収縮する球体モデルから３００ｎｍクラスターの溶解時間ｔFを計算した（ＭｃＣａｂｅ、Ｓｍｉｔｈら、１９８５）。
【０２５５】
【数２３】
2014514275.tif 000029
（式中、ρは、タンパク質の密度（１．３４ｇ／ｍｌ）であり、Ｄvは、水における単一タンパク質の拡散係数（４．５×１０-7ｃｍ2／ｓ、ストークス・アインシュタイン（Stokes-Einstein）方程式を用いて計算）であり、ｃsatは、飽和タンパク質溶液の濃度（５０ｍｇ／ｍｌであると仮定）であり、ｃbulkは、約０ｍｇ／ｍｌである）。３００ｎｍ直径クラスターの溶解時間は、７ｍｓであることが判明した。タンパク質単量体への急速溶解は、高いバイオアベイラビリティのための急速な薬物動態に有利である。これは、タンパク質変性が起こり得る濃縮タンパク質が流体に曝露される時間の最小化にも有益となり得る。
【０２５６】
図１０は、φcの関数としての所定のφpの２０〜２３０ｎｍの範囲にわたるクラスターサイズの一揃いの等高線を提示する。φpに依存する算出されたｚ0（＝ｑ0）は、補足セクションに示す通り、ｐＩ付近でおよそ１電荷／タンパク質分子である（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｃｈａｄ、Ｊｅｒａｔｈら、２００９）。εr及びｚo（＝ｑ0）における不確実性を考慮すると、Εの値は、φcに依存するＥｑ．７における枯渇ポテンシャルの接触値として近似させ、一方、他の引力項は、群集により影響されないため無視した。実験的研究において用いてもよい、φp又はφcのいずれかを変動させるための水平及び垂直パスウェイを、図１０において明確に示す。所定のφpに関して、φcの増加は、タンパク質単量体間の枯渇引力を上昇させ、したがって、図５Ａに示すデータと合理的な一致をして、クラスター直径、Ｄを増加させる。図５Ａにおけるクラスターサイズにより示される通り、図１０に示す理論から予測されるサイズは、実験と合理的な一致をし、モデルの単純さを示した。例えば、モデルは、電荷遮蔽、クラスターの内側及び外側におけるεrの差並びにＨとの引力相互作用における変動を考慮しない。同様に、φpが増加する場合、所定のφcにおいて、図３Ａ及び３Ｂにおけるデータに対応する垂直黒破線によって示される通りにＤは増加する。そこで、より大型のクラスターは、φpによるｚ0（＝ｑ0）の減少、よって、クーロン力反発の減少の結果である。数例の特定の事例も表示する。１００ｍｇ／ｍｌ糖及びφp０．０３７の事例１に関して（図１０及び表３）、予測σは約３５ｎｍであり、一方、実験値は１０ｎｍであった。２７５ｍｇ／ｍｌ糖及びφp０．０３７に関して、σの予測値及び測定値は、約６０ｎｍであった。事例３（列２、表１、２７５ｍｇ／ｍｌ糖及びタンパク質）に関して、実験による測定サイズ８８ｎｍと比較して、σは約１４０ｎｍであった。
【０２５７】
【表５】
2014514275.tif 000030
【０２５８】
【表６】
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【０２５９】
【表７】
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【０２６０】
【表８】
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【０２６１】
大型のクラスターは、凝集数＜５、寿命約２５ｎｓの、等電点から離れたｐＨ約８における高電荷のリゾチーム単量体の小型のクラスターと対比することができる（Ｐｏｒｃａｒ、Ｆａｌｕｓら、２０１０）。小型のサイズ及び短い寿命は、引力と比べて高電荷粒子の大きな反発の優占と一致する。表３において、結果は、数種のパラメータがタンパク質クラスターと同様のものである、オルト−ジクロロベンゼン（εr＝２９）におけるベーマイトロッドのクラスターのために示される（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）。しかし、低ｚ0（＝ｑ0）は、実験的に観察され、理論的に説明される通り、凝集数２００，０００の大規模クラスターをもたらす（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１）。現在の研究におけるナノクラスターは、これら２事例の中間の電荷を有し、これにより、ｎが約１０2〜１０3の長寿命の平衡クラスターを生じる。その上、サイズは、所定のφPにおけるφEを変動させることにより操作することができる。
【０２６２】
クラスター間相互作用：タンパク質単量体の数は、ゲルポイントをはるかに下回る平衡ナノクラスターに対して十分に定義されているため、ナノクラスターは、個々のコロイド粒子として考慮され得る。２個のナノクラスター間の十分な反発的Ｖtotは、クラスターの凝集を防ぎ、低粘性を維持するのに必要とされる。図９Ｃに示す通り、ｐＩ付近の８５ｎｍタンパク質ナノクラスターに対し、大きな反発的障壁が存在し、表１におけるφc＝０．１７の事例の安定的ナノクラスター分散系と一致する。対照的に、タンパク質単量体分散系は、次のパラメータ：１電荷／タンパク質単量体、Δσ＝１ｎｍ及びφc＝０．１７が一定に保持された図９Ｂにおいて不安定であった。クラスター内の約２７７個のタンパク質分子に対し、約２７７の大きな電荷は、僅か０．７１ｍＶの単量体の値をはるかに上回る約２４ｍＶの表面ポテンシャルを生じる。よって、ｐＩに近接しているにもかかわらず、ＶELはナノクラスターにとって相当に大きく、同時に、単量体にとって無視できる。さらに、ＶELは、反発の範囲がＶDEP（＜１ｎｍ）及びＶSSR（Δσ約１ｎｍ）よりもさらに長くなるように、Ｒpと共に増減する。これらの引力の範囲は、Ｒpによって有意に影響されないため、タンパク質単量体及びナノクラスターで同様である。よって、ナノクラスターの＜約１．０１のこれら引力相互作用の低下した範囲、ｒ／σは、タンパク質単量体の約１．１をはるかに下回る。対照的に、ＶEL対ｒ／σは、Ｒpに対し相対的に無反応（insensitive）である。ＶELは、ナノクラスターで優勢であるため、これらは凝集せず、４．６３＊１０7のＷによりコロイド的安定性を維持する。
【０２６３】
ナノクラスターの様々な引力相互作用のうち、ＶＤＷ相互作用の範囲は、σと共に増減するため最長となる。しかし、ナノクラスターは、ＳＥＭ及びＳＴＥＭ画像（図４Ａ及び４Ｂ）に示す通り多孔質であるため、ハマカー定数は低下する。図９Ｃ及び９Ｄにおいて、ハマカー定数は、２．５ｋＴへと２分の１に低下する。ＶＤＷ引力を包含する場合であっても、静電相互作用は、総引力相互作用よりもさらに強く、より長距離であった8。より高い０．３のクラウダー体積分率及びより大きい電荷（表１列５における実験条件と同様）により形成される２５０ｎｍタンパク質ナノクラスターに対し、静電反発力は、図９Ｄに示す通りさらに優勢であった。約５８７０個のタンパク質単量体により、より大きな電荷は、約３２ｍＶのより高い表面ポテンシャルに相当し、Ｗは６＊１０16に達した。６．６×１０-5ｍｏｌ＊ｍｌ／ｇ2のＢ2により、ナノクラスター間の反発的相互作用をＳＬＳにより測定した（図８）。
【０２６４】
この事例において、ＶDEPの貢献は非常に小さいｒにおいて発散するため、ＶtotからＢ2の理論的決定は、明確に定義されない。図９Ｂ及び９Ｃにおけるポテンシャルの直接比較は、階層的相互作用の新規概念を明らかにし、この概念において、Ｖtotはタンパク質単量体に対し強く誘引性であり、同時にナノクラスターに対し非常に反発的であり、これは実験データと一致する。この差は主として、ＶSSR及びＶDEPの相互作用の範囲の無視できる変化と比べた、Ｑ及びＲpの増加によるＶELの範囲及び強さの増加によるものである。ｒ／σ＝１．１における強く引きつけるクラスター内相互作用は、ナノクラスターの生成に役立つが、一方、同じｒ／σにおける弱いクラスター間引力は、凝集を防ぐ。階層的コロイド相互作用を制御する能力は普遍的であり、多種多様なペプチド及びタンパク質に適用できると予想することができる。
【０２６５】
ナノクラスター分散系対タンパク質溶液における粘度減少：最終的には，静電反発力が引力の平衡を保つには不十分となるポイントにおいて、タンパク質はゲルを形成する。ゲルポイントは、ｑに関するｆ電荷の二次導関数がゼロであるスピノーダル曲線により定義することができる。図１０は、算出されたスピノーダル曲線及び平衡ナノクラスターのゲルを生じる実験条件（ゲルポイント）を示す。実験ポイントと相対的なゲル曲線の位置は、モデルの単純さ及びクラスターとの静電相互作用の複雑さを考慮すると相当に合理的である。
【０２６６】
タンパク質安定性セクション：有害免疫原性反応を誘導せずに活性を保持する治療用タンパク質のためには、回収及び製剤の際に天然の三次元立体構造を維持することが重要である（Ｓａｌｕｊａ  ａｎｄ  Ｋａｌｏｎｉａ）。高レベルのタンパク質可動性は、タンパク質変性及び内部疎水性パッチの露出を容易にして、可逆性分子間会合と、最終的には不可逆的凝集をもたらすため、現在、抗体を溶液として高濃度で処方する挑戦がなされている。しかし、添加した群集化剤からの排除体積相互作用は、天然タンパク質状態の安定性を熱力学的に増加させる。φcが増加するにつれ、タンパク質分子は、アンフォールディング状態よりも、天然にフォールディングした状態の体積低下をエントロピー的に好むようになる（Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）。群集化剤としての糖に関して、タンパク質と糖との間の負の選択的結合パラメータの観点から、タンパク質溶液の安定性の増加が観察された。よって、タンパク質ナノクラスターの外因により密集した溶液環境は、タンパク質分子のアンフォールディングを防ぐ又は低下させるであろう。
【０２６７】
観察された低レベルのタンパク質変性は、試料加工におけるタンパク質天然状態の安定化に役立つ。凍結乾燥は、生物製剤加工において広く用いられており、タンパク質分子を無定形固体において動力学的にトラップして、凝集を生じ得るタンパク質可動性を低下させることにより、タンパク質天然状態を安定化することが示されてきた。凍結乾燥におけるクラウダー、トレハロースの添加は、排除体積により、また、タンパク質との水素結合形成による脱水により、溶液におけるタンパク質天然状態をさらに安定化する。タンパク質ナノクラスター内において、固体状態が維持され、溶液と比べて粒子内及び粒子表面上の両方におけるタンパク質可動性を制限する。
【０２６８】
生理的バッファーにおけるタンパク質単量体の高い粒子表面積及び溶解度を考慮すると（群集化剤の希釈後）、希釈後の粒子溶解は、急速に起こる（約１秒間）。溶解バッファーにおけるトレハロース及びＰＥＧ３００等、希釈クラウダーの存在は、排除体積によりエントロピー的に有利に働くことにより、天然タンパク質状態をさらに好む。
【０２６９】
実施例ＩＩ
百日咳（whooping cough）感染症に関連する百日咳毒素（ＰＴｘ）と結合し、これを中和するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体１Ｂ７（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ）。新しい凍結方法、渦巻き式その場（spiral-wound in situ）凍結技法（ＳＷＩＦＴ）により無定形タンパク質粒子を作製した。対照的に、以前のタンパク質ナノクラスター試験は、トレー凍結を用いてタンパク質粒子を形成した（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。従来的なトレー凍結による凍結乾燥とは対照的に、さらに急速なＳＷＩＦＴ凍結は、噴霧フリーズドライ、液体への噴霧凍結及び薄膜凍結に対して示されてきた通り、高いタンパク質安定性を達成するための利点を提供することができる。他の急速凍結工程とは異なり、ＳＷＩＦＴにおいては、加工を単純化するために粒子は実際の投薬バイアルにおいて生成される。低粘性を付与し１Ｂ７溶解度を制限して粒子溶解を妨げるための３種の薬学的に許容される群集化剤、水溶性有機ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びトレハロースにより増大させた、おおよその１Ｂ７  ｐＩへと調整されたヒスチジンバッファーからなる分散バッファー中に無定形粒子を穏やかに分散させた。このような条件下において、ＤＬＳにより測定される通り、透明分散系は、２．５〜５ｍｇ／ｍｌの溶解１Ｂ７と平衡にある約２００ｎｍの１Ｂ７粒子により、高抗体濃度であっても低粘性を提示する（２００ｍｇ／ｍｌにおいて＜５０ｃＰ）。重要なことに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡ解析により希釈分散系及び未処理１Ｂ７の活性を比較すると分かる通り、タンパク質天然構造は保存される。
【０２７０】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス薬物動態試験を行って、抗体溶液の従来的なＩＶ及びＳＱ投与により、３種の異なる皮下投与した分散系のバイオアベイラビリティを比較した。同様の投薬量における分散系及び溶液対照を比較するため、本出願人らは、大量の１００μｌ容量における標準投薬量（約５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。１Ｂ７分布及び排出半減期は、これら３群で非常に類似していたが、血清濃度がピークに達する時間（ｔmax）は、ＳＱ注射で遅延し、この注射部位からのより遅い拡散動態の予想と一致した。続いて、分散系を高濃度（２００ｍｇ／ｍｌ）で調製して、少容量（１μｌ）標準用量注射及び大容量（１００μｌ）高用量（５２ｍｇ／ｋｇ）注射から得られる薬物動態を比較した。この場合も先と同様に、少容量注射は僅かにより短いｔmaxを有していたが、薬物動態プロファイルは、全ＳＱ群で著しく類似し、小注射のより急速な拡散動態が、薬物動態全体に影響を与え得ることを示し、これは単一クラウダー、トレハロース系の結果と一致する（Ｍｉｌｌｅｒ，  ２０１１）。ＥＬＩＳＡによる総１Ｂ７タンパク質及び特異的ＰＴｘ結合活性に関する終末血清試料の解析並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＴｘ中和検定は、１４日の期間にわたり１Ｂ７活性の減少又は抗１Ｂ７免疫応答の発達を検出することができなかった。注射における高いタンパク質安定性、皮下組織における滞留及び血流への輸送は、フォールディングしたタンパク質分子が、平衡ナノクラスターの表面から急速に拡散する、以前に報告されたｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ（Ｍｉｌｌｅｒ，  ２０１１）と一致することが示される。極度に高い投薬量の過酷な試験に対し高い安定性を達成する能力は、皮下注射における投薬量におけるより控えめな増加のための新たな機会を提供することができる。分散系は、活性を保存し、有利な薬物動態を付与する高度に濃縮された低粘性のタンパク質製剤に有望なアプローチである。さらに、分散系は、溶液により達成され得るものよりも少なくとも１０倍高い投薬量を達成することができ、種々の薬学的に許容される薬剤と共に処方することができる。
【０２７１】
抗体発現、精製及びビオチン化：ＩｇＧ２ａ抗体１Ｂ７を産生するマウスハイブリドーマ細胞を、以前に報告された通りに（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９；Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）、細胞死するまでＴ−フラスコ内のハイブリドーマＳＦＭ無血清培地において３７℃、５％ＣＯ2下で増殖させた。簡潔に説明すると、抗体の精製は、３０００ｒｐｍにおける２０分間の遠心分離と、続く０．４５μｍフィルターを用いたろ過滅菌、結合バッファー（２０ｍＭ  ｐＨ７．０リン酸ナトリウム）による１：１希釈及び前平衡化プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）における結合バッファーによるローディングからなる。ベースライン安定化後に、溶出バッファー（０．１ＭグリシンｐＨ２．７）を用いて、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を含有する採取チューブへと１Ｂ７を溶出させた。マイクロ（micro）ビシンコニン酸（bicinchonoinic acid）（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）によりタンパク質濃度を測定しつつ、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質標本の均一性及び純度を検証した。精製された１Ｂ７を、ＥＺ−ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を用いてビオチンで標識した。ビオチン試薬の５ｍＭ溶液を、５：１モル比で、ＰＢＳにおける１Ｂ７の１ｍｇ／ｍｌ溶液へと室温で添加し、３０分間反応させた。５０，０００ＭＷＣＯ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器を用いたＰＢＳによるバッファー交換により、過剰なビオチンを除去した。
【０２７２】
渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）による粒子形成：精製しビオチン化した１Ｂ７を、上述のＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを用いて２０ｍＭ  ｐＨ５．５ヒスチジンバッファーにバッファー交換した。タンパク質濃度を再度測定し、凍結保護物質として固体α−αトレハロースを１：１ｗｔ比となるよう添加し、穏やかに混合して溶解させた。得られた溶液をろ過滅菌し（０．２２μｍ）、２０ｍｇ／ｍｌタンパク質となるよう希釈し、ＳＷＩＦＴ凍結のための無菌８ｍｌ（１．９ｃｍ×４．８ｃｍ）ガラスバイアルに移した。ＳＷＩＦＴの際に、バイアルを横倒しにして回転させつつ（約１回転／秒）バイアルの底部を液体窒素に接触させ、バイアル内部の縁に凍結溶液の薄いフィルムが生じ、後続の薄いフィルムがバイアル中心に向かって渦巻き状に凍結した。全容量を凍結させた（約１０〜４０秒）後、−４０℃に予冷した凍結乾燥機の棚に試料を直立させて置いた。次に、試料を１２時間、−４０℃、１００ｍトルにて凍結乾燥し、続いて６時間かけて５０ｍトルにて２５℃へと傾斜させ、二次乾燥のため２５℃、５０ｍトルにて少なくともさらに６時間維持した。凍結後のタンパク質活性を評価するため、後述する動的光散乱（ＤＬＳ）及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による解析のために粉末を５ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに再構成した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）解析のため、凍結乾燥後の乾燥粉末の試料を粘着カーボンテープ（adhesive carbon tape）上に置いて、試料をＳＥＭスタブ（stub）に固定した。Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ２０８卓上スパッタ塗布器を用いて、各ＳＥＭ試料を１０ｎｍ厚に白金−パラジウムスパッタコーティングした。加速電圧５ｋＶによるＺｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ４０ＶＰ走査型電子顕微鏡を用いて顕微鏡写真を撮像した。
【０２７３】
分散系形成：分散系を形成するため、ＳＷＩＦＴ凍結し、凍結乾燥した１Ｂ７タンパク質粉末を、総粉末重量が０．０４±０．００１ｇとなるよう０．１ｍｌ円錐状バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製品番号９８６２１１）に詰め込んだ。測定された抗体ｐＩ（ｐＨ７．２、図２６を参照）と一致するようｐＨを調整した５０ｍＭリン酸バッファーにおける１０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３００及び２０％（ｖ／ｖ）ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を含有する水性ベースの溶媒分散バッファーを、凍結乾燥したタンパク質に添加した。針の先端による穏やかな撹拌によりエア・ポケットを除去して、最終１Ｂ７濃度１６０〜２００ｍｇ／ｍｌを有する、均一な光学的に透徹した分散系を得た。超音波処理も激しい混合も、均一な透明分散系の形成には必要とされなかった。
【０２７４】
粘度測定：１Ｂ７分散系の見かけ上の粘度は、ヒツジＩｇＧ分散系に関して以前に報告された通り、１ｍｌツベルクリンスリップチップ注射器に取り付けた２５ゲージ、１．５”長の針内へと５０μｌの分散系を引く時間として測定した。簡潔に説明すると、分散系を含有する円錐状バイアルのビデオを撮影し、錐体の底からの高さ０．４”から錐体の底からの高さ０．１”へと引くのにかかる時間を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて測定した。様々な粘度を有する公知の溶液を用いた検量線は、円錐状バイアルから０．０５ｍｌ引く時間と粘度との間に、０．９９を超えるｒ2値の直線相関を生じた。これらの結果は、指定量の試料を注射器内に引き上げる時間が粘度と直線的に相関することを見出した、モデルタンパク質の懸濁液及びタンパク質溶液による以前の研究と一致する。
【０２７５】
コロイドサイズ決定／特性評価：動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて、最大１６５°の後方散乱角を包含するよう修正された特注ＤＬＳ装置を用いて、精製１Ｂ７標本、濃縮１Ｂ７分散系及び分散系の希釈液に存在する粒子のサイズを測定した（Ｍｉｌｌｅｒ，  ２０１１）。少容量セル（６０μｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＃Ａ５４０９４）により、約２３℃、１６０°散乱角にて濃縮分散系における粒子サイズを測定し、一方、他のあらゆる測定は、約２３℃で、関連する粒子サイズを検出するよう最適化された散乱角にて標準１ｍｌセルにおいて行った。分散バッファーにおける１Ｂ７の溶解度を見積もるため、２００ｍｇ／ｍｌ分散系を、分散バッファーにおいて１：４０、１：８０及び１：１６０希釈し、粒子サイズを９０°散乱角で測定した。ＤＬＳによりタンパク質単量体ピークが観察される１Ｂ７の濃度を溶解度として定義する（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。粒子サイズにおける希釈の効果を模倣して、凝集体の形成を検出するため、分散系をＰＢＳにおいて１：４０希釈して最終５ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７濃度とし、得られた粒子サイズを散乱角３０°で測定した。ＰＢＳにおける精製１Ｂ７単量体抗体のサイズを５ｍｇ／ｍｌ、散乱角３０°にて測定した。
【０２７６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体活性及び凝集アッセイ：発光最大はトリプトファン側鎖の局所環境に基づきシフトするため、固有のトリプトファン蛍光により、分散した粒子内の１Ｂ７三次構造を評価した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、波長２９５ｎｍにおいてタンパク質試料に蛍光を発生させ、発光スペクトル３１０〜３８０ｎｍの間を１ｎｍ増分で記録した。１Ｂ７に関して、フォールディングしたタンパク質の３４２ｎｍから、完全にアンフォールディングしたタンパク質の３５０ｎｍへの発光最大のシフトが観察される。このアプローチを用いて、２００ｍｇ／ｍｌにおける２００ｎｍ粒子に分散したタンパク質の三次タンパク質構造変化の証拠を定性的に探究した。その後に行われるタンパク質活性及び構造的安定性のあらゆるアッセイは、１ｍｇ／ｍｌになるようＰＢＳに希釈した１Ｂ７分散系において行った。対照は、凍結乾燥した１Ｂ７（１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳにおいて再構成）及びさらなる加工なしの精製１Ｂ７（ＰＢＳにおける１ｍｇ／ｍｌ）を包含した。先ず、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより不溶性かつジスルフィド結合した凝集体の形成をモニターした。簡潔に説明すると、３μｇの１Ｂ７試料をローディングバッファーと組み合わせ、４〜２０％プレキャスト直線勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において分離し、Ｇｅｌ−Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色した。
【０２７７】
リガンド結合活性をモニターするため、以前に報告された通りに間接的ＰＴｘ  ＥＬＩＳＡを利用した（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９；Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳにおける０．７５μｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴｘ、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。アッセイバッファーにおける５０μｇ／ｍｌから出発する√１０系列希釈スキームにおける１Ｂ７試料の添加に先立ち、ウェルをアッセイバッファー（ＰＢＳ−１％ミルク）で１時間ブロッキングした。室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回反復して洗浄した後、５０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（アッセイバッファーに１：２０００希釈、Ｓｉｇｍａ）を１時間室温でインキュベートした。プレートを３回反復して洗浄し、テトラメチルベンジジン二塩酸塩（ＴＭＢ）基質（Ｐｉｅｒｃｅ）によりシグナルを発生させ、１Ｎ  ＨＣｌによりクエンチし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５機器を用いて４５０ｎｍにおいて得られた吸光度を記録した。用量反応曲線の線形範囲から、最大吸光度の５０％に相当する抗体濃度としてＥＣ50値を計算した（Ｅｑ．２５）。
【０２７８】
【数２４】
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【０２７９】
試料間の比較のため、試料ＥＣ50：未加工の対照抗体ＥＣ50の比として相対ＥＣ50を計算した。全試料のランを３回複製して行った。
【０２８０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティ：１群当たり４〜６匹の健康な２４〜２７ｇ、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、１Ｂ７分散系及び対照溶液のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験を１４日の期間にわたり行った。低（４．６〜７．３ｍｇ  １Ｂ７／ｋｇ体重）又は高（５１．６ｍｇ／ｋｇ）用量の１Ｂ７の１又は１００μｌ皮下（ＳＱ）注射一回をマウスに投与した。本試験において比較する５種の試料群は、以前に報告された（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）１００μｌの１Ｂ７溶液（最終５．６ｍｇ／ｋｇ用量のための１．４ｍｇ／ｍｌ溶液）の（１）ＩＶ及び（２）ＳＱ注射の２群と共に、（３、４）低（４．６ｍｇ／ｋｇ）及び高（５１．６ｍｇ／ｋｇ）用量の１００μｌ抗体分散系のＳＱ注射と、（５）分散バッファー（表７を参照）における低（７．３ｍｇ／ｋｇ）用量の抗体分散系の１μｌのＳＱ注射を包含した。ＰＢＳに溶解した２０ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７溶液から、１．４ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに希釈して、以前に報告された溶液試料（群１及び２）を調製し（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）、一方、分散系試料においては、群３は１．２ｍｇ／ｍｌ、群４は１２．９ｍｇ／ｍｌ、群５は１８２ｍｇ／ｍｌ濃度となるよう、２００ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７分散系から注射直前に分散バッファーに希釈した。
【０２８１】
注射前及び１２〜３３６時間の間の追加的な８時点においてマウスを秤量し、尾静脈から血液試料（約２０μｌ）を採取した。採取後に試料を凝血させ、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を新しいチューブに移した。終末時点（３３６時間）においてマウスを麻酔し、０．２〜１ｍｌの間の血清を心穿刺により採取した。これらの試料をＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いて、血清における１Ｂ７の総濃度及び活性濃度を測定し、終末時点に関しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにより抗体活性を測定して、マウス抗１Ｂ７応答の初期見積もりを得た。本試験は、実験動物福祉局（Office of Laboratory Animal Welfare）の指針を遵守しつつ、テキサス大学オースティン校の施設内実験動物委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）による承認の下に行った（プロトコール＃ＡＵＰ−２０１０−５  ０００７０）。
【０２８２】
【表９】
2014514275.tif 000035
【０２８３】
血清試料における１Ｂ７の測定：血清試料における活性１Ｂ７の濃度を決定するため、以前に報告された通りに次の修正を加えつつ標準ＥＬＩＳＡアプローチを用いた（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。ＰＢＳにおける１．５μｇ／ｍｌのＰＴｘでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。全ステップにおいて希釈液として用いたアッセイバッファーは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）における４％ウシ血清アルブミン、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０からなる。アッセイバッファーでブロッキングした後、２．３μｌの血清試料を、ウェル当たり５０μｌのアッセイバッファーにおいて系列的に１：√１０希釈した。各プレートは、陰性対照としてのマウス血清（Ｓｉｇｍａ）と、マウス血清に初濃度１００μｇ／ｍｌとなるよう希釈した１Ｂ７検量線を包含した。ＥＬＩＳＡプレートにおけるストレプトアビジンコーティングを用いて検出される総タンパク質に関して、追加的な試料を解析してビオチン化１Ｂ７を検出した。
【０２８４】
その結果得られた吸光度を測定した後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５を用いて、それぞれの曲線毎に４パラメータロジスティック（４ＰＬ）モデルを用いた血清希釈に基づきＥＣ50値を計算した。検量線におけるｌｏｇ［（試料ＥＣ50）／（標準ＥＣ50）］対公知の１Ｂ７濃度のｌｏｇ間の直線相関から、各血清試料における活性１Ｂ７の濃度を計算した。少なくとも５回の独立的な検量線から適合＞０．９５による直線相関を決定した（図２７）。
【０２８５】
ＣＨＯ細胞中和アッセイによる活性抗体の測定：血清１Ｂ７の濃度を決定するための直交性活性測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＰＴｘ活性を中和することができるため、本出願人らは、ＣＨＯ細胞中和アッセイを利用した（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）。公知の濃度の精製１Ｂ７の検量線と対比した、ＰＴｘ誘導性ＣＨＯ細胞クラスタリングを完全に阻害した血清希釈として中和抗体の濃度を測定した。簡潔に説明すると、１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）における１．５ｎｇ／ｍｌ百日咳５０μｌを、無菌９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに直接的に添加した。１：√１０希釈スキームを用いて終末血清試料（２．３μｌ）を系列希釈して、一定のＰＴｘ濃度を維持した。３０分間３７℃、５％二酸化炭素においてインキュベーションした後、１０5細胞／ｍｌの新たにトリプシン処理したＣＨＯ細胞を１００μｌ／ウェル、各ウェルに播種した。３７℃、５％ＣＯ2における２４時間のインキュベーションの後、０が伸長（非クラスター化）、３が完全クラスター化である０〜３スケールを用いて、ウェルをＣＨＯクラスタリングに関して点数化した。
【０２８６】
ＳＷＩＦＴ凍結により作製された安定的タンパク質粒子：濃縮水性分散系の調製における第１のステップとして、タンパク質粒子の乾燥粉末を形成した。凍結方法の選択は、凍結の間の抗体構造及び活性の保護並びにコロイド的に安定的な分散系を得るための適切なサイズ及び形態の粒子の作製の両方にとって重大な意味を持つ。これらの懸案事項に取り組むため、凍結乾燥に先立ち直接的に最終包装バイアルにおいて抗体溶液を急速に凍結させる新規凍結技法、ＳＷＩＦＴを開発した（図２５）。この技法の開発における論拠は、凍結の際のタンパク質変性の２つの主要な起源が、噴霧フリーズドライにおける液気界面への曝露と、より大容量では凍結速度が遅く、これにより凍結濃縮及びその後の濃度依存性凝集を生じ得ることである。液体窒素と接触させつつタンパク質溶液のバイアルを回転させることにより、同心円状の層それぞれが１秒未満で凍結する。残る液体を回転により穏やかに混合することにより、いかなる濃度勾配も正常化される。
【０２８７】
ＳＷＩＦＴを用い、続いて凍結乾燥して、分散系に用いる１Ｂ７抗体のサブミクロン粒子を形成した。凍結におけるタンパク質凝集を妨げるため、タンパク質溶液を、凍結保護物質として１：１重量比のトレハロースを含有するように調整した。選択されたバッファー、２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．５は通常、凍結乾燥ステップにおいて用いられる。凍結及び凍結乾燥した１Ｂ７のＳＥＭ解析は、最終分散系に望ましいサイズと同様の、サブミクロン粒子の存在を明らかに示す（図２８）。重要なことに、この仕方で加工された抗体は、ＰＢＳにより５ｍｇ／ｍｌになるよう再構成した後に天然の立体構造及び活性を保持する。この濃度において、ＤＬＳは、抗体単量体に予想される、約１０ｎｍの水力学的直径を有する単一種を検出した（図２９）。より大型の粒子の非存在は、抗体が、ＳＷＩＦＴ及び凍結乾燥において不可逆的凝集体を形成しなかったことを示す。その上、再構成した抗体の特異的ＰＴｘ結合活性をモニターするためのＥＬＩＳＡは、未処理対照と対比して、加工ステップが原因の有意な活性変化がないことを明らかにした（図３０）。
【０２８８】
ＳＷＩＦＴプロセスを設計して、タンパク質構造及び活性を保護しつつ、所望の形態の粒子を作製した。これは、関連プロセス、薄膜凍結（ＴＦＦ）から発想を得たゴールである、最小液気界面による急速な凍結により達成される。ＳＷＩＦＴにおいて、１回のバイアル回転に対応する各フィルム層は、約２００ｎｍの厚さである。ヒート・シンクとしての液体窒素との間接的な接触は、約１０2Ｋ／ｓの冷却速度を付与する。ＴＦＦにおいて、少容量のタンパク質溶液は、極低温で冷却した表面上に沈着して約２１０ｎｍ厚に広がり、１秒以内で凍結する。等容量における凍結時間を比較するためにスケールアップしたところ、ＴＦＦは、タンパク質溶液１ｍｌ当たり約５．１秒の速度で凍結し、一方、ＳＷＩＦＴは、同様の速度、約７．５秒／ｍｌが得られた（図３１）。
【０２８９】
凍結速度及びフィルム厚の類似性の結果、同様のタンパク質溶液のＴＦＦ及びＳＷＩＦＴ加工は、同様の形態の乾燥粒子を生じる（図２８）。ＴＦＦ、ひいてはＳＷＩＦＴに関して、急速冷却及び凍結速度は、氷点降下効果により溶質分子を排除する多数の氷核を生じる。氷核間の薄いチャネルに存在する残りの液体は、溶解したクラウダー分子及びタンパク質で過飽和するようになる。急速な凍結によるこれら液体チャネルの急速なガラス化は、タンパク質及び糖分子／粒子の間の衝突頻度を減少させる。過飽和によりこれらが沈殿するにつれ、小粒子の凝固が、より大型の粒子を生じる。その上、未凍結の液体において溶解した溶質の濃度が上昇するにつれ、関連する粘度増加が、成長中の粒子核の可動性をさらに低下させるであろう。対照的に、より遅い凍結速度を用いた従来的なトレー凍結の凍結乾燥は、さらにより大きな液体チャネル及び乾燥後のより大きな最終粒子を含有する。よって、図２８に示す通り、ＳＷＩＦＴ凍結において、標準トレー凍結の凍結乾燥と対比してより小型のサブミクロンタンパク質粒子が形成される。
【０２９０】
ＳＷＩＦＴ及び従来的なトレー凍結乾燥のどちらによっても、凍結及び凍結乾燥における天然のタンパク質構造の動力学及び熱力学的安定化により、低レベルのタンパク質変性及び凝集が達成される。無定形固体におけるタンパク質分子の動力学的トラップによる、凝集を生じ得るタンパク質可動性の低下により、天然のタンパク質状態は、凍結乾燥において安定化される。凍結乾燥における凍結乾燥保護物質（lyoprotectant）トレハロースの添加は、凍結において天然のフォールディング状態をエントロピー的に有利にすることにより、また、脱水においてタンパク質と水素結合を形成することによりタンパク質天然状態をさらに熱力学的に安定化する。しかし、噴霧フリーズドライ（ＳＦＤ）等、サブミクロンタンパク質粒子を形成するプロセスは、噴霧ステップにおける大きな気液界面のために、標準トレー凍結の凍結乾燥と対比してタンパク質凝集を増加させることを示してきた。１０μｍ噴霧液滴に関する、ＳＦＤにおける約６０００ｃｍ-1の気液界面の大きな面積／体積は、界面におけるタンパク質吸着、変性及び凝集をもたらし得る。ＳＷＩＦＴの場合、液体タンパク質溶液が空気に触れる唯一の部位が、ガラスバイアルの内側の液体界面であるため、気液界面は最小化される。その結果、推定気液界面は、約４ｃｍ-1のＳＦＤと比較して３桁減少する。よって、１Ｂ７は、ＳＷＩＦＴ凍結及び凍結乾燥後の乾燥粉末形態から単量体へと再構成した後に安定性を維持すると予測され、それは実際に判明した。
【０２９１】
ＴＦＦ及びＳＦＤ等、他の急速な凍結技法と比較したＳＷＩＦＴ凍結の実際的な利点の一つに、最終投薬バイアルにおいて直接的に凍結する能力がある。このアプローチは、無菌的条件を維持しつつ固体を移動する、コストのかかるステップの必要を回避する。この場合、２０ｍｇ／ｍｌ濃度の８０ｍｇ投薬量のタンパク質が必要とされるのであれば、本試験において用いる８ｍｌバイアルは、凍結及び再構成バイアルの両方として機能することができる。しかし、ＳＷＩＦＴ凍結の冷却速度は、用いる液体寒剤及びガラスバイアルの厚さ並びに用いる材料の熱伝達係数により管理されるため、バイアルは、容易にスケールアップ又はダウンして、投薬量要件を満たすことができる。その上、最終バイアルへの移動ステップを除くことにより、凍結乾燥後のタンパク質を全て回収し、最終投薬量の生成において利用することができる。
【０２９２】
分散系における１Ｂ７粒子のコロイド特性評価：コロイド的に安定的な透明分散系を形成するため、ＳＷＩＦＴにより作製された抗体及びトレハロースの乾燥サブミクロン粒子を、特別に処方した分散バッファーと組み合わせた。タンパク質溶解度を低下させるため、このバッファーは、抗体ｐＩ（ｐＨ７．２）となるよう調整した５０ｍＭリン酸バッファー並びに２種の追加的な群集化剤：容量による２０％ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び１０％ポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ３００）を包含する。ＳＷＩＦＴ粒子及び分散バッファーを組み合わせた後、乾燥粉末に含有されるトレハロースは溶解するであろう。トレハロースの画分は溶液中に拡散し、ヒツジＩｇＧに対して以前に観察された通り、群集化剤の体積分率を増加させるであろう（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。十分な分散バッファーを乾燥粉末に添加して、群集化剤の最終体積分率（φ）が０．３４である最終抗体濃度１６０〜２００ｍｇ／ｍｌを得た。
【０２９３】
これらの条件下において、低容量（６０μ１）セルを用いた分散系のＤＬＳ解析は、約２００＋／−１４ｎｍ直径を有する粒子の単一集団を同定する。各回３回複製して測定した３回の別個の試験においてこのコロイドサイズが再現され、その代表的な曲線を図３２に示す。１００ｍｇ／ｍｌとなるよう分散バッファーに希釈し、ＳＥＭステージ上で急速に凍結及び凍結乾燥した後の分散系のＳＥＭ画像により、この粒子サイズをさらに確認した（図３３）。図３３は、ＤＬＳ測定値と一致するサイズであるが、結晶化したトレハロースでコーティングされているために異なる形状のナノ粒子を示す。以前に、より低いトレハロース濃度における分散したヒツジＩｇＧ及び１Ｂ７粒子のＳＥＭ及びＳＴＥＭ画像は、より小型の粒子のクラスターとして分散した粒子を可視化した（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。分散バッファーを添加してトレハロース濃度を低下させ、同時に１Ｂ７濃度を４０ｍｇ／ｍｌに低下させた後、現在の製剤に対して同様の画像を得た（図１５Ｃ）。これらの結果が、１Ｂ７ナノ粒子の溶解に影響されていないことを確認するため、以前に報告された方法を用いて、分散バッファーにおける１Ｂ７溶解度を測定した（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。２００ｍｇ／ｍｌ分散系から出発して、添加する分散バッファーを漸進的に加えてタンパク質濃度を低下させ、得られた粒子サイズをＤＬＳにより測定した（図３２）。タンパク質濃度が２．５ｍｇ／ｍｌ以下に低下するまで、約２００ｎｍにおける単一ピークが観察できた。この濃度において、単一のモノクローナル抗体分子の水力学的直径に相当する、単一の約１０ｎｍピークのみ存在した。これらのデータから、この分散バッファーにおける１Ｂ７の溶解度が、約２．５ｍｇ／ｍｌであり、トレハロース、ＰＥＧ及びＮＭＰにより形成された１Ｂ７ナノ粒子が、完全に可逆的であると結論することができる。
【０２９４】
分散した粒子を形成し、それぞれタンパク質分子及びコロイドレベルにおける分子間引力的及び反発的相互作用のバランスを取ることによるコロイド安定性を提示した（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。簡潔に説明すると、個々のタンパク質分子は、低いタンパク質溶解度を生じる疎水性相互作用、水素結合及び電荷双極子相互作用等、高度に引力的な枯渇及び特定短距離相互作用を受ける（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。１Ｂ７のｐＩ付近では、静電反発力は相対的に弱く、よって、個々のタンパク質分子間で引力が優位に立つ。しかし、ひとたびこれらの分子がナノクラスターに集合すると、粒子間の相互作用は僅かに反発的となり、優勢なサイズを安定化する（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。クラスター表面上の各タンパク質単量体は、少数の電荷を有するであろう。粒子表面における全単量体を合計すると、反発的相互作用は有意となる（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。クラスター間の平均距離は、コロイドサイズが増加するにつれて増加するため、クラスター間の引力特異的（Attractive specific）及び短距離枯渇引力相互作用は最小化されるが、これらの力が作用する距離は固定化される。同一の力を発揮するため、１０ｎｍタンパク質単量体における１ｎｍ範囲との相互作用は、２００コロイドにおける２０ｎｍにわたり作用する必要があるであろう。クラスター間において、短距離引力相互作用は、ヒツジＩｇＧに関して以前に示された通りに（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）、タンパク質ナノクラスターのコロイド的に安定的な分散系を生じる静電反発力と相対的に無視できる。安定的な抗体分散系を処方し、斥力の平衡を保つため、枯渇引力は、群集化剤の濃度を変動させることにより調整される必要がある（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１１）。本明細書及び以前に（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）に観察された通り、クラウダー濃度の増加は、枯渇引力相互作用により１Ｂ７溶解度を劇的に低下させる。１Ｂ７及びヒツジＩｇＧ分散系はどちらも、単一群集化剤、トレハロースと処方することができるが、本明細書における三元クラウダー系は、溶解度を調整するため、高度に可溶性のタンパク質を有する分散系を処方するため、或いはナノクラスターサイズ、タンパク質安定性、分散系粘度及び送達の際のナノクラスター分解をさらに制御するためのさらなる柔軟性を提供する。
【０２９５】
約１９０ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７分散系の見かけ上の低粘度、２４ｃＰを、２５ゲージ１．５インチ針を通る粘度として測定した。この粘度測定は、モノクローナル抗体及びリゾチーム（lyosyzme）の非水性懸濁液の高度に濃縮された溶液の皮下注射に関して以前に特徴付けた。見かけ上の分散系粘度は通常、クリーガー・ドアティ方程式（Ｅｑ．２６）を用いた固有粘度、［η］、粒子の最大体積分率、φmax及び溶媒粘度、ηoの関数として説明される。
【０２９６】
【数２５】
2014514275.tif 000036
【０２９７】
ηo又は［η］（剛体球コロイドで最小２．５）を下げ、φmaxを増加させることにより、ηを低下させることができる。溶液における高濃度、例えばΦ＝０．１〜０．３のタンパク質分子のため、強い短距離特異的引力相互作用は、多くの場合、剛体球値の５〜１００倍の粘度を生じる。１５０ｍｇ／ｍＬ濃度のモノクローナル抗体溶液のため、１００ｃＰを超える粘度は、分析的超遠心による測定値に基づき、タンパク質分子の可逆的自己会合に起因した。対照的に、ナノクラスター分散系の本試験において観察された低粘性は、以前に報告された通り（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）、ナノクラスター間の弱い相互作用と一致し得る。
【０２９８】
【表１０】
2014514275.tif 000037
【０２９９】
分散系の滅菌ろ過：クラウダーとしてトレハロースを用いて、１６０〜１７０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン分散系（６６ｋＤａタンパク質）を形成した。分散系は、ＤＬＳによりおよそ６０ｎｍの水力学的半径を有することが判明した（詳細に関しては表９を参照）。次に、０．２２ミクロンＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ注射器フィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦメンブレン、直径１３ｍｍ）を通してこれらの分散系をろ過した。ろ過後の濃度は、本来の分散系とは５％未満異なり、ナノクラスターはＤＬＳにより観察することができた。
【０３００】
【表１１】
2014514275.tif 000038
【０３０１】
分散系における１Ｂ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分子安定性：複数の技法を用いて、分散系内に含有される及び希釈後の抗体の立体構造を評価した。ヒツジＩｇＧに関して以前に報告された（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）トリプトファン蛍光アッセイにおいて、トリプトファン蛍光アッセイにより測定された、溶媒曝露したトリプトファンの最大発光波長の変化は観察されず、この結果は、分散した粒子内における活性タンパク質構造の保存を示唆する。２００ｍｇ／ｍｌ分散系からＰＢＳに１０倍希釈した後に、ＤＬＳは、単一抗体単量体に予想される通り、約１０ｎｍ水力学的直径を有する単一種を測定した（図３２）。ＳＷＩＦＴ凍結し凍結乾燥した粉末から再構成された１Ｂ７と同様に、より大型の粒子の欠如は、抗体が分散後に不可逆的凝集体を形成せず、急速な希釈後にその個々の単量体サイズを回復できることを示唆する。このことは、抗体単量体に相当する約１５０ｋＤａの分子量を有する単一バンドが観察される、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに確認され（図３４Ａ）、不可逆的チオール結合したＳＤＳ抵抗性凝集体の非存在を示す。最後に、抗体の特異的ＰＴｘ結合活性をモニターするためのＥＬＩＳＡは、未処理対照と対比して、分散系の形成又は希釈により活性に有意な変化がないことを明らかにする（図３４Ｂ）。
【０３０２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ注射後に有害免疫原性応答を誘導することなく治療上の有効性を維持するため（Ｓａｌｕｊａ  ａｎｄ  Ｋａｌｏｎｉａ）、抗体の立体構造的安定性は、乾燥、凍結乾燥した粉末の作製から、分散バッファーにおける粉末の分散までの加工及び送達ステップを経る度に維持されなければならない。タンパク質分子の不安定性は、化学的分解と物理的変性の両方を包含するが、物理的変性のタンパク質濃度におけるより高次の依存性は、安定的高タンパク質濃度製剤の開発成功のためのより過酷な課題であると予想され、よってさらに詳細に検査される（Ｓａｌｕｊａ  ａｎｄ  Ｋａｌｏｎｉａ）。上文に記す通り、ＳＷＩＦＴ凍結及び凍結乾燥により形成されるタンパク質粉末は、活性を失わず、バッファーにおける再構成後に凝集体を発生しなかった。分散した粒子内におけるタンパク質の安定性は、各粒子内の高いタンパク質体積分率により維持される。高いタンパク質体積分率は、タンパク質自己群集性効果に、タンパク質の天然にフォールディングした最小表面積立体構造の熱力学的適合性を生じさせる（Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６；Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。天然にフォールディングしたタンパク質の分率を増加させる自己群集性の概念は、セル内のタンパク質が、高濃度の分子群集化剤により安定化されるという考えと同様のものである。自己群集性の事例において、唯一の差は、タンパク質が、それ自身の分子群集化剤として作用することである（Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）。固体タンパク質結晶と比較した場合の結果として、本明細書において形成される無定形タンパク質粒子と、結晶性タンパク質粒子との間の差は、タンパク質の天然立体構造の安定性の低下をもたらさない。自己群集性による天然タンパク質状態のエントロピー安定化は、理論的議論において以前に示されたことがあるが（Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）、しかし、タンパク質溶液は必要とされる高い（＞０．１５）体積分率を達成できないため、これは、タンパク質分散系に対して近年ようやく実現された（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。その上、分散系におけるタンパク質分子のアンフォールディング及び凝集も、溶液状態と対比した、固体状態のタンパク質可動性減少により低下する。動力学的には、分散系における粒子の外側のタンパク質分子も、凝集体形成をもたらし得る衝突の低下により安定化される（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。
【０３０３】
濃縮分散系からの希釈後における活性タンパク質の保持及び検出可能なタンパク質凝集体の欠如は、潜在的なｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質安定性の重要な兆候である。５０ｍｇ／ｍｌを超える溶解度を有する高表面／体積２００ｎｍ粒子のＮｏｙｅｓ−Ｗｈｉｔｎｅｙ方程式を用いて予測されるＰＢＳにおける溶解時間は、１秒未満である。以前の試験において、ミスフォールディングしたタンパク質は、遅い溶解過程においてリフォールディングしていた（Ｗｅｂｂ  ２００２）。本試験において、タンパク質は、フォールディング状態から始まり、急速溶解においてアンフォールディングする時間は殆どない。その上、分散系製剤に存在する分子クラウダーは、タンパク質粒子周囲の境界層においても同時に存在し、フォールディング状態の保存に役立つであろう（Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）。１Ｂ７に関して、ＤＬＳ及びＥＬＩＳＡ測定により、一定のクラウダー濃度でタンパク質を希釈した後に高いタンパク質安定性が観察され、この急速な溶解／群集化機序と一致した（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。クラスターが天然にフォールディングし、可逆性であるという事実は、クラスターの溶解におけるタンパク質安定性の維持に非常に有益である。ヒツジＩｇＧにより、一定のタンパク質濃度において、ナノ粒子サイズの着実な減少が、単一の低分子量クラウダー、トレハロースの希釈により達成されて、引力を弱めた（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。各ステップにおいて、クラスターにおけるタンパク質はフォールディングしていることが判明し、クラスターの溶解によるタンパク質の完全活性がＥＬＩＳＡにより確認された（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。クラスター表面におけるタンパク質分子は内部タンパク質分子により密集され、外面においては糖分子により密集される。フォールディング分子は、クラスター表面からＰＢＳ培地へと急速に拡散すると、ＤＬＳ及びＥＬＩＳＡ試験によって示される通りフォールディングを維持する。
【０３０４】
分散系からの安定的１Ｂ７のｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティ：皮下注射後に急速に溶解する（＜１秒の予測溶解時間）分散系のｉｎ  ｖｉｖｏ溶解を模倣する、信頼のおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは存在しない。よって、マウスモデルを用いて、薬物動態パラメータと共に、ｉｎ  ｖｉｖｏ溶解した抗体材料の比活性を測定した。５種の処理群は、３種の対照群を包含して、低容量、高濃度及び大容量、高濃度分散系被験群の直接的なＰＫ比較を可能にした。対照群に、標準抗体用量（１００μｌにおける４．６〜５．６ｍｇ／ｋｇ送達）を与えて、抗体溶液の皮下分散系注射並びに静脈内及び皮下送達に由来する薬物動態の直接的な比較を可能にした。第４の群は、ｉｎ  ｖｉｖｏ溶解速度及び得られる薬物動態における分散系濃度及び送達容量の複合効果を評価するよう設計した。これらマウスに、少量の１μｌ容量における高濃度分散系（１８２ｍｇ／ｍｌ）として投与した標準用量（７．３ｍｇ／ｋｇ）を与えた。第５の群は、分散系等、高濃度、低粘性の製剤によってのみ達成できる超高用量を投与するよう設計した。これらマウスに、他の群よりも１０倍高い用量（１００μｌにおける５１．６ｍｇ／ｋｇ）を与えた。全群に対して、１４日間にわたり尾静脈から血清試料を採取し、それぞれストレプトアビジン及びＰＴｘ捕捉ＥＬＩＳＡにより、各試料における合計及び活性１Ｂ７抗体の濃度を測定した。終末時点に存在する抗体の効力を、抗体を介した毒素活性阻害に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイによっても評価した。
【０３０５】
全体的に見て、１Ｂ７薬物動態プロファイルは全群で非常に似ており、殆ど同一の分布及び排出動態を有する。主要な差は、注射部位及び注射容量に起因し、最大濃度に達する時間（ｔmax）及び最大濃度の値（Ｃmax／用量）に影響を及ぼす。３種の対照群に先ず着目すると、皮下分散系による送達は、溶液のＩＶ及びＳＱ送達と比較して、爆発相の低下（より低いＣmax／用量及び遅延したｔmax）をもたらした（表７；図１３）。ＩＶ溶液群は、第１の測定時点（１２時間）において最大血清濃度に達し、続いて抗体が組織全体に分布するにつれて急速に減少した（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。比較において、ＳＱ溶液群は、僅かに低下したＣmax／用量（２４対１８μｇ／ｍｌ／ｍｇ／ｋｇ）及び統計学的に有意に遅延したｔmax（１２対２１時間；ｐ＜０．０５）を表示した。ＩＶ投与した材料は、血液容量において直ちに希釈されるが、ＳＱ投与した材料は、注射部位から間質液を通って拡散して、血液容量における分布前にリンパ管及び血管に達して、これらのＰＫパラメータを遅延させるに違いない（図１５Ａ）（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）。ＳＱ分散系注射は、ＳＱ溶液と同様の傾向を提示するが、ＳＱ溶液と比較してより低いＣmax及び遅延したｔmaxを有していた。効果は、１００μｌ容量の代わりに１μｌ容量として注射されるＳＱ分散系２により最小化されるため、これは、混合及び抗体拡散における分散バッファーの効果を反映し得る。この試料に関して、ｔmaxは、ＳＱ溶液のものと同一（誤差内）であった。
【０３０６】
最大血清濃度が達成されると、全群は、同様の１Ｂ７薬物動態を示す。図１３から分かる通り、これらのデータは、ＰＴｘ  ＥＬＩＳＡにより測定される１Ｂ７濃度に基づき、全群で実験誤差内のα分布及びβ排出時間定数を有する二相性指数関数的プロファイルに適合する（表７）。総タンパク質ＥＬＩＳＡアッセイ（結果図示せず）を用いて測定した場合、β排出半減期も全群で誤差内であった。分布相は、１Ｂ７濃度勾配及び高まった血管圧により推進される、十分に混合した血液容量から他の組織への受動的抗体拡散を表すが、抗体排出速度は、ＦｃＲｎ等、特異的な受容体との相互作用により制御される。とりわけ、どちらの機序も、単量体の適切にフォールディングした抗体分子を必要とする。可溶性凝集体は、より大きなサイズを有し、結果的に、より大きな拡散定数及びより遅いｔｌ／２ａを有し、一方、ミスフォールディングした単量体又は可溶性凝集体は、ＦｃＲｎに対し異なる結合動態及び異なるｔｌ／２ベータを提示するであろう。活性１Ｂ７単量体が分散系希釈後に急速に回復される、本出願人らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ観察と同様に、全群で観察される同様の動態は、ＳＱ分散系として送達される抗体が、活性、単量体形態を保持しつつナノクラスターから解離し、注射部位から拡散することができることを示す。
【０３０７】
上文に記載されている試験をマウスにおいて行い、大量の体重当たりの注射容量（１００μｌ／２５ｇ）により、同一濃度で処方された溶液及び分散系間の直接比較を可能にした。ＳＱ注射は、約１．５ｍｌ容量に制限されているため、ヒトにおける同様の比較は不可能である。分散系が、ヒトに適した投薬量を達成できることを立証するため、ヒト用量のスケールダウンバージョンとして群４を用意した。そこで、最終７．６ｍｇ／ｋｇマウス投薬量のため、１μｌ容量の高度に濃縮した分散系（１８２ｍｇ／ｍｌ）を皮下投与した。ヒト投薬量を計算するためにスケールアップしてみると、１８２ｍｇ／ｍｌ分散系を１．５ｍｌ容量で投与することができ、これは、現在の投薬指針（２ｍｇ／ｋｇ）を超える４．３ｍｇ／ｋｇヒト用量と同等である。分散系が、溶液では現在まだ達成できていない超高抗体投薬量の低頻度の投与をもたらす可能性を評価するため、群５マウスに、５１．６ｍｇ／ｋｇ用量のために、大量の１００μｌ注射容量の高度に濃縮した分散系（１８２ｍｇ／ｍｌ）を与えた。この群も、同様の薬物動態（同様のｔmax、ｔ1/2,α、ｔ1/2,β）及び１Ｂ７バイオアベイラビリティを提示し、濃度及び用量非依存的な薬物動態を示した。
【０３０８】
抗体の質の直交性測定値を得て、抗原ＥＬＩＳＡを補完するため、本出願人らは、終末時点から得た血清を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＨＯ細胞中和アッセイによる１Ｂ７生物活性を測定した。遊離型ＰＴｘは、細胞表面受容体と結合し、受容体介在性エンドサイトーシスと、最終的にはＧi/oカップルした受容体のＡＤＰ−リボシル化を行うであろう。これは表現型としては、接触阻害の喪失を生じ、ＣＨＯ細胞はクラスター型形態へと成長する。抗体を介したＰＴｘの中和は、細胞への毒素侵入を遮断し、正常な成長表現型を保護する。固定されたＰＴｘ濃度の存在下で血清を希釈し、ＣＨＯ細胞を添加し、２４時間の成長後、正常又はクラスター化形態に関して点数化した。ＣＨＯ細胞クラスタリングを完全に妨げる最高血清希釈を記録し、精製した対照１Ｂ７抗体に対して比較した。このアッセイは、１μｇ抗体基盤当たりの力価において群間に統計学的有意差を生じなかった。このアッセイに基づく、注射部位（ＳＱ対ＩＶ）又は製剤の結果による抗体効力の喪失の証拠はない（表７）。ウエスタンブロット解析を用いて、不溶性又はジスルフィド結合した凝集体の形成等、製剤及び投与経路に起因する血清抗体における肉眼的物理的変化がないことを立証した（図３５）。
【０３０９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏデータの両方により示される通り、分散系内のタンパク質は、いかなる加工ステップにおいても、或いは溶解及び全身吸収後に、天然立体構造の検出可能な喪失を示さない。分散系内において以前に記載された通り、天然立体構造は、タンパク質自己群集性により維持され、群集化剤の添加は、天然立体構造をエントロピー的に安定化する（Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００９）。溶解後に凝集が起こるには、天然タンパク質が、凝集を起こし易い中間体へと可逆的にアンフォールディングし、別の凝集を起こし易いタンパク質分子と衝突する必要があり、これにより、タンパク質の不可逆的不活性化をもたらす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ希釈実験と同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて当初、分散系内のクラウダー（トレハロース、ＰＥＧ及びＮＭＰ）は、粒子が溶解する際に存在し続けており、よって、タンパク質がアンフォールディングするのをエントロピー的に妨げる。速い溶解時間により、分散系由来の近くのクラウダーは、タンパク質のアンフォールディング防止に役立つであろう。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、分散系由来のクラウダーは希釈されるため、ＳＱ注射周囲の細胞外環境又は血流中における追加的なクラウダーは、タンパク質安定性の維持に役立つであろう。よって、注射部位付近における１Ｂ７のｉｎ  ｖｉｖｏ粒子溶解及び分布において、クラウダーの安定化は、注射由来であれ、体内における自然発生であれ、凝集を起こし易いタンパク質中間体の数を低下させる。さらに、速い溶解動態は、治療用タンパク質を希釈し、凝集体の形成をもたらす衝突数を減少させるであろう。溶解したクラウダーは注射後に希釈されるため、個々のタンパク質分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験と同様にナノクラスター表面から拡散する場合、自己群集性による安定化が、ナノクラスター中の残りのタンパク質分子に依然として存在するであろう。いずれの試料においても抗薬物抗体産生の傾向が検出されないため、予備的免疫原性試験は、この結論を支持する。したがって、ＣＨＯアッセイの結果により、分散系由来のタンパク質粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射後であっても恐らく天然抗体状態を保持するであろう。
【０３１０】
本明細書に記載されているナノクラスター分散系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体構造又は活性における検出可能な喪失がなく、マウスに皮下投与されると同様の薬物動態を有する、高濃度且つ低粘性のモノクローナル抗体の製剤を可能にする。治療関連の抗体、１Ｂ７（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）の高度に濃縮された約２００ｍｇ／ｍｌ水性ベースの分散系を、トレハロース、ＰＥＧ及びＮＭＰ等、複数の群集化剤を有する水性バッファーにおいて１：１重量比のトレハロースを含有する安定的、サブミクロンタンパク質粒子（例えば、ナノクラスター）から形成した。渦巻き式その場フィルム技術（ＳＷＩＦＴ）を用いた、投薬バイアルにおける急速な凍結によりこれらの粒子を作製して、タンパク質変性及び凝集を最小化した。薬学的に許容される群集化剤、ＰＥＧ３００及びＮＭＰを、トレハロースと共に乾燥粉末から添加して、分散系の形成を容易にすることにより、１Ｂ７の溶解度は、水性ベースの溶媒において低下した。
【０３１１】
タンパク質におけるトリプトファン残基の蛍光により示される通り、本明細書に記載されているタンパク質粒子は、分散系におけるその天然立体構造を保持した。分散系を純粋バッファーに希釈した後の追加的な解析、ＥＬＩＳＡ、ＤＬＳ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質が、完全活性を有する単量体形態を急速に回復することを示す。同様のｉｎ  ｖｉｖｏ分布及び排出半減期は、同様の用量の分散系及び溶液製剤から測定し、一方、ピーク血清濃度（ｔmax）までの時間は、ＳＱ注射において遅延し、この注射部位からの予想されるさらに遅い拡散動態と一致した。ＥＬＩＳＡと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＴｘ中和検定による特異的ＰＴｘ結合活性は、１Ｂ７活性又は抗１Ｂ７免疫応答発生の喪失を検出することができなかった。本発明に記載されている低粘性且つ有利なバイオアベイラビリティを有する、安定的で高度に濃縮したタンパク質療法の分散系を形成する能力は、恐らくは多くの慢性疾患の治療のための皮下注射の潜在的使用を増加させるであろう。
【０３１２】
実施例ＩＩＩ
細胞内の密集した巨大分子環境（約４００ｍｇ／ｍｌ）は、アンフォールディングした立体構造よりも、詰め込まれた天然状態のタンパク質を好むことが知られている（Ｈａｒｔｌ  ａｎｄ  Ｈａｙｅｒ−Ｈａｒｔｌ  ２００２；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）。スケール粒子理論（Ｄａｖｉｓ−Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｓａｕｎｄｅｒｓら、２００１；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）、シミュレーション（Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ  ２００３；Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｋｅｔｔ  ２００５；Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）及び実験（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１９９８；Ｋｒｉｓｈｎａｎ、Ｃｈｉら、２００２；Ｃｈｅｕｎｇ、Ｋｌｉｍｏｖら、２００５；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８；Ｄｈａｒ、Ｓａｍｉｏｔａｋｉｓら、２０１０）により記載されている通り、細胞内のみならず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ  ２００３；Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｋｅｔｔ  ２００５；Ｃｈｅｕｎｇ、Ｋｌｉｍｏｖら、２００５；Ｏｃｏｎｎｏｒ、Ｄｅｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、２００７；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８；Ｄｈａｒ、Ｓａｍｉｏｔａｋｉｓら、２０１０；Ｐｉｅｌａｋ  ａｎｄ  Ｍｉｋｌｏｓ  ２０１０）において、タンパク質は、他の巨大分子（体積分率Φ約０．３〜０．４）の存在によりアンフォールディングに対して安定化され、これにより、より拡張した、非天然タンパク質立体構造を効果的に「締め出す（crowd out）」（即ち、エントロピー的に不利にする）。荒削りのモデル（Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｋｅｔｔ  ２００５；Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）によるシミュレーション及び理論も、溶液における高濃度（ｃ＞４００ｍｇ／ｍｌ）の単一種類のタンパク質が、相互又は自己群集性機序による詰め込まれたフォールディング状態を好むことを予測する。しかし、タンパク質は、可溶性があまり高くなく、一部には特定短距離引力相互作用、特に水素結合及び疎水性相互作用により相当に低濃度でゲル化する傾向があるため、このような超高濃度の安定的タンパク質溶液は、実験により実現されていなかった（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｚａｍｏｒａら、１９９６；ｔｅｎ  Ｗｏｌｄｅ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｋｅｌ  １９９７；Ｓｈｉｒｅ、Ｓｈａｈｒｏｋｈら、２００４；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８；Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｌｉｕら、２０１０）。実際には、１００〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度において、溶液におけるタンパク質は通常、不可逆的凝集（Ｆｉｅｌｄｓ、Ａｌｏｎｓｏら、１９９２；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８；Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ２００９；Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｌｉｕら、２０１０）、ゲル化及び沈殿（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｚａｍｏｒａら、１９９６；ｔｅｎ  Ｗｏｌｄｅ  ａｎｄ  Ｆｒｅｎｋｅｌ  １９９７；Ｓｈｉｒｅ、Ｓｈａｈｒｏｋｈら、２００４；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７）を行う。したがって、ゲル化を回避するため、自己群集性により天然立体構造を安定化するのに十分なほど高い「局所的」タンパク質濃度を同時に達成しつつ、新規の種類の安定的且つ可逆的タンパク質集合体（例えば、ナノクラスター）が必要とされる。
【０３１３】
タンパク質溶液のナノクラスター形成及び相挙動への洞察は、モデルポリマー型コロイド懸濁液の検討から得ることがきる（Ｇａｓｔ、Ｈａｌｌら、１９８３；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、Ｚａｍｏｒａら、１９９６；Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４；Ｓｔｒａｄｎｅｒ、Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００４；Ｌｕ、Ｃｏｎｒａｄら、２００６；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７；Ｌｕ、Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉら、２００８）。後者において、調節可能な短距離コロイド引力（例えば、共溶質誘導性枯渇相互作用）が多くの場合存在する（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４；Ｌｕ、Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉら、２００８）。このような引力の強化（例えば、共溶質濃度を増加させることによる）は、パーコレートし、続いてコロイド相分離境界付近でゲル化する高度に多分散の粒子集合体の形成をもたらす（Ｌｕ、Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉら、２００８）、（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４；Ｐａｎ、Ｖｅｋｉｌｏｖら、２０１０）。相分離及びゲル化は、高濃度の無電荷コロイド間の強い引力に起因する一方（Ｌｕ、Ｃｏｎｒａｄら、２００６；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７；Ｌｕ、Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉら、２００８）、粒子間の弱い、より長距離の静電反発力も存在する場合、物理特性は定性的に変化する（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７）。このような事例において、平衡モデルにより予測される通り（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４）、一次コロイド粒子の長寿命の非常に大型のクラスター（即ち、クラスター／対粒子直径比５〜１０、低いクラスターサイズ多分散による）が、単相有機溶媒において観察された（図３６ａ）（Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００１；Ｇｒｏｅｎｅｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｋｅｇｅｌ  ２００４；Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４；Ｓｔｒａｄｎｅｒ、Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００４；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７）。単量体スケールにおける短及び長距離相互作用の存在によりこれらのクラスターが形成され、これは次に、粒子分散系の自己集合及び輸送特性の両方に影響を及ぼす多様なマルチスケール（単量体−単量体、単量体−クラスター及びクラスター−クラスター）相互作用を生じる。
【０３１４】
今までに観察された水におけるタンパク質のクラスターは、小さく（Ｓｔｒａｄｎｅｒ、Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００４；Ｐｏｒｃａｒ、Ｆａｌｕｓら、２０１０）（Ｎ約１０、クラスター／粒子直径比２．５）、薄く（Ｐａｎ、Ｖｅｋｉｌｏｖら、２０１０）、短寿命（Ｐｏｒｃａｒ、Ｆａｌｕｓら、２０１０）であった。近年、水におけるＡｕ粒子の可逆的クラスターは、弱く吸着する非電解質によりＡｕ粒子における電荷を調整することにより、直径３０〜１００ｎｍ（クラスター／粒子直径比６〜２０）で集合した（Ｔａｍ、Ｍｕｒｔｈｙら、２０１０；Ｔａｍ、Ｔａｍら、２０１０）。さらに近年、ナノクラスターはＣｄＳｅに関して報告されていた（Ｘｉａ、Ｎｇｕｙｅｎら、２０１１）。引力的及び反発的相互作用の平衡を適切に保ち、大きなタンパク質クラスターを形成することは、依然として課題である。
【０３１５】
上に記すモデルコロイド系と類似して、溶液における有効タンパク質−タンパク質引力の強さは、共溶質の存在により調整することができる。例えば、タンパク質と弱く相互作用する共溶質であっても、タンパク質−タンパク質枯渇引力を生じる（Ｄａｖｉｓ−Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｓａｕｎｄｅｒｓら、２００１；Ｐｉｎｇ、Ｙａｎｇら、２００６；Ｏｃｏｎｎｏｒ、Ｄｅｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、２００７）。これらの枯渇引力は、２個のタンパク質分子の表面が、介在するギャップから共溶質を除外するのに十分なほどに近づいて接近する時に生じる浸透圧不均衡を反映する（図４２）。これは、ダイマー又は少数オリゴマーを生成するタンパク質会合の平衡挙動（Ｍｉｎｔｏｎ  １９９９；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）及び速度（ｄｅｌ  Ａｌａｍｏ、Ｒｉｖａｓら、２００５；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）に強く影響することが知られている。しかし、この挙動は、タンパク質フォールディング及び／又は部位結合における低（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ  １９８１；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１９９８；Ｄａｖｉｓ−Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｓａｕｎｄｅｒｓら、２００１；Ｋｒｉｓｈｎａｎ、Ｃｈｉら、２００２；Ｃｈｉ、Ｋｒｉｓｈｎａｎら、２００３；Ｏｃｏｎｎｏｒ、Ｄｅｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、２００７）及び高（Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ  ２００３；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８；Ｄｈａｒ、Ｓａｍｉｏｔａｋｉｓら、２０１０；Ｐｉｅｌａｋ  ａｎｄ  Ｍｉｋｌｏｓ  ２０１０）分子量共溶質（クラウダー）が有する、他の関連群集（即ち、排除体積）効果よりもはるかに低い注目を受けた。タンパク質間の枯渇引力の平均力のポテンシャル、Ｖdep（ｒ）は、スケール粒子理論（Ｄａｖｉｓ−Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｓａｕｎｄｅｒｓら、２００１；Ｏｃｏｎｎｏｒ、Ｄｅｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、２００７）又は朝倉・大沢モデル（Ａｓａｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｏｏｓａｗａ  １９５８；Ｖｒｉｊ  １９７６；Ｇａｓｔ、Ｈａｌｌら、１９８３；Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ｗａｌｚ  １９９６；Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、Ｅｇｅｌｈａａｆら、２００４；Ｐｉｎｇ、Ｙａｎｇら、２００６；Ｍｕｔｃｈ、ｖａｎ  Ｄｕｉｊｎｅｖｅｌｄｔら、２００７；Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉ  ２００７）により説明される共溶質（外因性クラウダー）の体積分率ΦEに比例する。固定された高濃度におけるモデル単量体及びオリゴマー共溶質のため、Ｖdepは、広範囲の直径において強く引きつける浸透圧性第２のビリアル係数（外因性クラウダー対タンパク質単量体の比）０．０２〜１を生じることができる（Ａｓａｋｕｒａ  ａｎｄ  Ｏｏｓａｗａ  １９５８；Ｖｒｉｊ  １９７６；Ｔｕｉｎｉｅｒ、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔら、２０００；Ｌｕ、Ｃｏｎｒａｄら、２００６；Ｌｕ、Ｚａｃｃａｒｅｌｌｉら、２００８）。直径比０．１の一例として、１０ｎｍタンパク質分子及び１ｎｍ二糖が挙げられる。よって、モデルコロイドの挙動と同様に、高濃度のトレハロース等、小型のクラウダーによる枯渇引力は、弱い静電相互作用の平衡を保ち、大型のタンパク質クラスターを形成するのに十分な引力を生じるよう潜在的に利用することができる。
【０３１６】
本明細書において、本出願人らは、バッファーに希釈した後に安定的タンパク質単量体へと解離する、タンパク質（ｍＡｂ  １Ｂ７、ポリクローナルヒツジＩｇＧ及びＢＳＡ）の約１００ｎｍ平衡クラスターを集合させる。ナノクラスターは、単に、トレハロースを含有する凍結乾燥したタンパク質粉末とバッファー溶液とを、ｍＡｂ  １Ｂ７は最大２６７ｍｇ／ｍｌ、ＩｇＧは３５０ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡは４００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度となるよう穏やかに混合することにより形成される。水における大型のクラスターを形成させるため、本出願人らは、（１）ｐＩ付近のバッファーｐＨにより正味のタンパク質電荷を最小化して静電反発力を弱め、（２）高濃度の共溶質（外因性クラウダー）、トレハロースを添加して、強い枯渇引力をもたらす。クラスターのサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）により示される通り、共溶質（クラウダー）の濃度を変動させることにより、連続体にわたり可逆的に増加又は減少する。クラスターサイズは、より早い自由エネルギーモデルの拡張により定性的に予測され、クラスターのフラクタル次元（δf）を説明する。ΦE及びｐＨを調整することにより、本出願人らは、超高内部体積分率（Φ＞０．５又はｃ＞約７００ｍｇ／ｍｌ）を有する殆ど単分散系の、弱く相互作用するタンパク質ナノクラスターの流体分散系の集合を促進するような仕方で、階層的（タンパク質−タンパク質、タンパク質−クラスター及びクラスター−クラスター）相互作用の平衡を保つ。高い内部ｃは、理論により示される通り、自己群集性によりタンパク質をそのフォールディング状態で安定化する（Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｋｅｔｔ  ２００５；Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）。
【０３１７】
クラスターからの送達後のタンパク質の安定性は、タンパク質療法における関心事である。ナノクラスターをバッファーに希釈した後、タンパク質ナノクラスターがタンパク質単量体に解離することが、動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｈｏｒｎ  ２０００）、分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により示される。タンパク質は、円二色性（ＣＤ）によりフォールディング型であり、見かけ上の融解温度（Ｔm）の決定により熱力学的に安定的であり（Ｌａｖｉｎｄｅｒ、Ｈａｒｉら、２００９）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により生物活性がある（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）と立証される。最後に、弱いクラスター間相互作用に起因する４０ｃＰの低粘性は、最大２６７ｍｇ／ｍｌ等の濃度の濃縮クラスターの皮下注射を可能にする。これら分散系が解離して活性タンパク質を送達する能力を示すため、マウスによりｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティ試験を行う。血流におけるタンパク質の活性をＥＬＩＳＡ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体中和アッセイの両方により定量化することにより、分散したタンパク質ナノクラスター用量の薬物動態プロファイルを、希釈抗体溶液の皮下及び静脈内用量の両方と比較する（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｃｈａｎｇら、２０１１）。
【０３１８】
トレハロース及びバッファー希釈によるナノクラスター形態及び同調性（tunability）
図３６ｂは、凍結乾燥したタンパク質粉末（１：１質量比のトレハロース対タンパク質を含有）を、ｐＩ（ｐＨ７．２）のリン酸緩衝溶液に穏やかに撹拌した後直ちに生成されるモノクローナル抗体１Ｂ７（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）のコロイド的に安定的な透明分散系を示す。タンパク質の濃度、ｃ及び外因性クラウダー、トレハロースの濃度、ｃEは、それぞれ２２０ｍｇ／ｍｌであった。低濁度は、小さいＤc並びに多孔質クラスター及び溶媒の屈折率の小さい差の結果である。図３６ｄに示す分散系におけるこれらクラスターのグラフィックによる可視化を利用して、冷凍調製後の分散系のＳＥＭ画像は、タンパク質単量体とほぼ同じサイズである約１１ｎｍの一次粒子で構成された、約３００ｎｍナノクラスターを明らかにした（図３６ｃ及び図４３）。ナノクラスターの一次粒子の「ハロー」は、ＳＥＭ試料調製におけるトレハロース沈着の結果であり、よって、大した関心事ではない。ｃ＝ｃE＝２２０ｍｇ／ｍｌに関して、動的光散乱（ＤＬＳ）によるクラスターの平均水力学的直径、Ｄcは、３１５ｎｍ（平均値にまたがる６％のピーク幅の標準偏差）であり、ＳＥＭ画像と一致した（図３７ａ）。多孔質クラスターに関して、フラクタル次元（δf）の関数としてのクラスター内のタンパク質の体積分率Φintを測定したところ（Ｅｑ．２２）、静的光散乱（ＳＬＳ、図４４）により０．６であった。δfは、散乱ベクトルに対する強度のｌｏｇ−ｌｏｇプロットにおける傾きである。８０ｎｍ  ＩｇＧクラスターの場合におけるフラクタル次元は、２．６対３、２及び１（それぞれ完全に空間充填した球体、円盤及び長く細い棒）であると判明し、これは、タンパク質がナノクラスター内部に高い体積分率を有することを示唆する。
【０３１９】
一定のｃ／ｃE比を維持するよう２２０ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７分散系をリン酸バッファーにおいて連続的に希釈した後、タンパク質分子がクラスター表面から離れたため、Ｄcは連続して減少した（図３７ａ及び３７ｂ）。続いて、Ｄcは、ｃ＝ｃE＝７５ｍｇ／ｍｌに対し約１２．３ｎｍでプラトーに達し、これは抗体単量体の予想サイズであった。同様に、ｃを７０ｍｇ／ｍｌ  １Ｂ７に固定したまま、ｃEの２７０から１５０ｍｇ／ｍｌへの希釈を用いて、それを下回ると約１０ｎｍの種、恐らく抗体単量体しか観察されないｃEに達するまで、クラスターサイズを調整した（図３７ｂ及び３７ｃ）。ｐＨ７．２リン酸バッファーを、ｃ＝ｃE＝１００ｍｇ／ｍｌの少量の分散系と共に用いて、一定のｃを維持しつつトレハロース濃度を減少させた。その後、ｃEを再び２７０ｍｇ／ｍｌに増加させることにより、本来のＤc値約３００ｎｍを回復した。ポリクローナルヒツジＩｇＧ混合物を用いた同様の実験（図３７ｄ並びに図４３ｂ及び４５）は、同じ傾向を生じた。図４３ｂは、５０ｍｇ／ｍｌに希釈し、続いて冷凍調製した、ｃ＝ｃE＝２６０ｍｇ／ｍｌの分散系由来のヒツジＩｇＧのナノ（nanco）クラスターを示す。ＩｇＧナノクラスターサイズは、ｃE＝２７０ｍｇ／ｍｌにおける約８０ｎｍから、一定のｃ＝５０ｍｇ／ｍｌにおけるｃE＝１５０ｍｇ／ｍｌの約１０ｎｍ（単量体タンパク質）へと減少した（図３７ｄ）（ｃEを増加させる場合、ｐＨ６．４リン酸バッファー（ＩｇＧのｐＩ）における５００ｍｇ／ｍｌトレハロース溶液をｃ＝ｃE＝２００ｍｇ／ｍｌの少量の分散系と共に用いて、一定のｃを維持する）。トレハロース濃度の増加、或いは減少により、よく似た値のＤcが観察された。自由エネルギーモデルからの予測により後にさらに説明する通り、ナノクラスターサイズにおけるこの可逆性は、ナノクラスターが平衡状態にあることを示唆する。図４５に示す通り、分散系をｐＨ６．４リン酸バッファーに、ｃ＝ｃE＝２６０ｍｇ／ｍｌからｃ＝ｃE＝４７ｍｇ／ｍｌへと順次希釈すると、ヒツジＩｇＧのクラスターサイズも８０ｎｍから１１ｎｍ（単量体タンパク質）に減少する。総合すると、これらのデータは、可逆的平衡挙動を有する（これは予想外であった）、水性培地における新規種類の長寿命の（数時間検査した）、十分に定義されたナノクラスターを立証する（Ｓｔｒａｄｎｅｒ、Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００４；Ｐａｎ、Ｖｅｋｉｌｏｖら、２０１０；Ｐｏｒｃａｒ、Ｆａｌｕｓら、２０１０）。
【０３２０】
この技法の普遍性をさらに立証するため、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．３００）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）及びデキストラン（Ｍ．Ｗ．１０，０００）等、巨大分子クラウダーによるクラスターも形成した。１６２ｍｇ／ｍｌ濃度のヒツジＩｇＧと、１６２ｍｇ／ｍｌトレハロース及び２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−３００を用いたところ、クラスター直径は１１０ｎｍであった。１５７ｍｇ／ｍｌ濃度のヒツジＩｇＧと、１５７ｍｇ／ｍｌトレハロース、１０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−３００及び２０％（容量）ＮＭＰに関して、クラスターは直径約２５０ｎｍであった。また、３１５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと、５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３００及び２０％（ｖ／ｖ）エタノールは、３０ｎｍサイズ（ＢＳＡ単量体は４〜５ｎｍ）のクラスターを生じた。巨大分子クラウダーによるこれらの例は、本技法の普遍性を例証する。それとは別に、概念実証としてより高いタンパク質濃度における本技法の使用の可能性を立証するため、より高濃度のタンパク質分散系を調製した。図３８は、非常に高いｃ、４００ｍｇ／ｍｌ及びｃE＝２４０ｍｇ／ｍｌにおける、Ｄc＝４０ｎｍを有するＢＳＡのナノクラスターを示す。クラスターにおけるタンパク質単量体の数、約１０００個は、ｍＡｂ  １Ｂ７及びヒツジＩｇＧから形成されたクラスターと同じ規模である。ヒツジＩｇＧの高度に濃縮された分散系も図４６に示すが、図中、トレハロースが外因性クラウダーであるｃ＝３００及び３５０ｍｇ／ｍｌ並びにｃ／ｃE＝１：０．５に対し、約１００ｎｍのＤcを有するナノクラスターが観察された。
【０３２１】
ナノクラスター希釈後のタンパク質安定性
高濃度のタンパク質製剤化の重大な懸念は、個々のタンパク質単量体がミスフォールディングし、不可逆的な凝集体を形成する可能性である。これらの事象は、タンパク質分子の動的性質に起因し得る。任意の所定のモーメントにおいて、同一分子の系は、関連する三次元構造のアンサンブルを示し、その一部は、正常に埋まった疎水性パッチを一過的に露出させる。タンパク質は、低濃度においては、その天然立体構造を高頻度で回復させるが、高濃度では、疎水性パッチが露出した２個のタンパク質が衝突し、不可逆的に会合する確率が高くなる（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１９９８）。このようなミスフォールディングし、不可逆的に凝集したタンパク質は天然構造を示さず、したがって効力低下と、その修飾された見かけ上のサイズ及び露出した表面電荷のため、薬物動態変化を提示する。さらに、このような非天然表面が免疫系に提示されると、治療用タンパク質に対する応答を誘導する可能性があり、これによりそれ自体が生物活性及び薬物動態を変化させるであろう（Ｔａｂｒｉｚｉ、Ｔｓｅｎｇら、２００６）。
【０３２２】
後述する通り、以前の試験（Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｋｅｔｔ  ２００５；Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６；Ｚｈｏｕ、Ｒｉｖａｓら、２００８）のシミュレーション結果は、フォールディング状態が、高濃度（即ち、ナノクラスター内の局所的タンパク質濃度に匹敵する値）のモデルタンパク質に非常に好ましいことを示唆する。この仮説を調査するため、ナノクラスターにおけるタンパク質が、ナノクラスターがタンパク質単量体に解離した後にフォールディング状態であるか決定するための、実際の抗体における実験的な試験が必要とされる。不可逆的タンパク質凝集体が、２６７ｍｇ／ｍｌの本出願人らの１Ｂ７ナノクラスター分散系に存在するか決定するため、本出願人らは、一連の生物物理学的及び生化学的検定を行った。長期貯蔵安定性は本研究の範囲外であるため、製剤化の数時間後に分散系を希釈した（実用においては、分散系を生成したらその直後に患者に注射することができる）。しかし、分散系内のタンパク質は、最初の粘度検査によりストレスを加えられ、２５ゲージ針を通して引かれ、９５００ｓ-1もの高さであると見積もられるせん断速度の有意なせん断力に付されたため、ニュートン流体を仮定する。際立つことに、１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに希釈した後に、本出願人らは、溶液における対照抗体と比べて、タンパク質立体構造又は活性の変化を検出できなかった（表１０）。分散系に先立つＰＢＳにおける対照１Ｂ７抗体溶液の解析は、見かけ上の熱アンフォールディング遷移温度（Ｔm）６８℃（表１０）と、６．２Ｍ尿素にアンフォールディング中間点を有する、モノクローナル抗体に特有の安定性（Ｇａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ２００７）を提示した。分散系の希釈後、Ｔmを再度測定したところ６８℃であった（表１０）。２〜３度のＴm変化は立体構造安定性の変化を示すため、本データは、平均１Ｂ７熱安定性が変化しなかったことを立証する（Ｋｕｍａｒ、Ｓｈａｒｍａら、２００９）。円二色性（ＣＤ）を用い、特定の波長における偏光の吸収に応じて、タンパク質における二次構造要素の存在をモニターした。対照溶液及び希釈した分散系のどちらも、２１７ｎｍにおいて同じ強い負の（negative）シグナルを保持し、抗体に特徴的なフォールディングしたβシート構造を示した（図３９ａ及び表１１）（Ｃｈａｒｉ、Ｊｅｒａｔｈら、２００９）。表１１は、ＣＤＳＳＴＲ適合アルゴリズムを用いたＤｉｃｈｒｏｗｅｂにより推定された二次構造を示す。＜０．１の正規化された平均二乗偏差（ＮＲＭＳＤ）は、優れた適合を示すと一般に受け入れられている（Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊａｎｅｓら、２００９）。表１１に示す通り、計算されたパーセントβ−シート構造（抗体における主たる二次構造）は、１Ｂ７対照溶液と希釈分散系との間で差がない。
【０３２３】
最後に、２通りの追加的なサイズ決定方法を用いて、ミスフォールディングした、より大きい分子量の凝集体の小集団が存在するか否か直接的に評価した。高濃度抗体溶液の解析とは対照的に（Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｌｉｕら、２０１０）、希釈した分散系のＨＰＬＣ分子篩クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、初期溶液対照と比較して、より高分子量の凝集体の無視できる程度の増加しか示さない（表１０並びに図４７及び４８）。ＤＬＳでは、鋭敏な単量体ピークにおける凝集体の存在も明らかにされなかった（図３７ａ及び３７ｃ）。ＨＰＬＣ分子篩クロマトグラフィーは、非共有結合性及び共有結合性の凝集体から抗体単量体を識別することができ、一方、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、共有結合性マルチマーを検出する。図４７も、図３７ａ及び３７ｃにおいてＤＬＳにより示された１Ｂ７分散系の希釈実験における中間ステップのＨＰＬＣ−ＳＥＣデータを示す。全事例において、初期溶液対照を超える凝集体の増加は存在しなかった。
【０３２４】
【表１２】
2014514275.tif 000039
【０３２５】
【表１３】
2014514275.tif 000040
【０３２６】
これらの生物物理学的検査（ＳＥＣ、ＤＬＳ、ＣＤ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、タンパク質構造撹乱又は凝集を検出しなかったが、分散した試料が、生物活性を保持しないフォールディングした単量体タンパク質を有する可能性もある。よって、タンパク質濃度＜１０ｎｇ／ｍｌに求められる活性を決定するために、高感度の生物学的アッセイを用いた。リガンド結合活性をモニターするため、捕捉分子として百日咳毒素を用いた間接的ＥＬＩＳＡは、相対５０％有効濃度（ＥＣ50、分散系／ＥＣ50、対照）の観点から１Ｂ７活性を測定した。この比は、分散系（１ｍｇ／ｍＬに希釈後）対無修飾対照溶液の、最大ＥＬＩＳＡ応答の５０％を生じる抗体の濃度である。すると、希釈した分散系は１．０３±０．２０の相対活性を生じ、これは、溶液対照による測定値からは識別不能である（表１０）（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｏｒ  １９９５）。この結果は、タンパク質活性の有力な尺度である抗原結合能力が、分散系希釈後に回復された抗体と、溶液対照とで同一であることを立証する。
【０３２７】
大型の自己群集ナノクラスターにおける天然タンパク質状態の実験的に立証された安定性は、荒削りの球状タンパク質モデルから予測することができる（Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｋｅｔｔ  ２００５；Ｓｈｅｎ、Ｃｈｅｕｎｇら、２００６）（図３９ｂ）。具体的には、ナノクラスター内のタンパク質の極めて高い体積分率（Φint約０．６）のため、フォールディングしたタンパク質の分率は、単位元（unity）に近接する。これは、より拡張した非天然立体構造へのアンフォールディングのエントロピー自己群集性（図３９ｂ、３６ｃ及び３６ｄにおける挿入図）ペナルティを反映し、これは、本来であれば低密集環境において天然状態を不安定化し得る他の要因（例えば、アンフォールディングによる鎖立体構造的エントロピー及び有利な疎水性タンパク質−タンパク質相互作用の両方の増加）を圧倒する。重要なことに、クラスターなしの溶液中の場合タンパク質が凝集しアンフォールディングする全体的なΦ値であっても、クラスター（＞４００ｍｇ／ｍｌ）内の高いΦintは、自己群集性による天然状態を強く好む。
【０３２８】
タンパク質安定性及び立体構造を考慮すると、タンパク質は、希釈後に明らかに活性があり、安定的であり、単量体である。よって、高タンパク質濃度にもかかわらず、不可逆的凝集体はナノクラスター内に存在しなかったと思われる。上に記す通り、ナノクラスター内において、天然立体構造は、タンパク質自己群集性によりエントロピー的に安定化されていると予想される。その上、約７００ｍｇ／ｍｌの高いクラスター内濃度を付与するクラスターにおけるタンパク質の相対的に低い可動性は、本来であれば疎水性パッチ間の接触をもたらし、非天然複合体及び凝集状態を安定化させ得るタンパク質立体構造的変化を動力学的に妨げることができる。
【０３２９】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ希釈実験において、急速溶解（推定＜１ｍ秒）も、本来であれば不可逆的凝集を生じ得るタンパク質衝突の確率を下げる。希釈直後に、濃度及び溶解度勾配は、クラスター内に埋まった分子の自己群集を維持しつつ、ナノクラスター表面から抗体分子を放出させ、よって、クラスター内の安定的にフォールディングしたタンパク質に有利となるであろう。この仮説は、図４７及び４８に示す通り、Ｄcを減少させるクラスター希釈後のＨＰＬＣ−ＳＥＣデータ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥデータに基づく、凝集体増加の欠如により支持される。最後に、分散系内のトレハロースは、ナノクラスターが溶解する際に存在し、よって、フォールディングしたタンパク質に有利となる。
【０３３０】
ナノクラスター分散系の粘度
クラスター間の非常に弱い引力は、ｃ＝２６７ｍｇ／ｍｌの１Ｂ７の分散系に、注射器使用できる値である僅か４０ｃＰの粘度を生じた（表１２）。同様に、ｃ＝２７５ｍｇ／ｍｌのポリクローナルヒツジＩｇＧの値は、６３ｃＰであった。しかし、タンパク質がナノクラスターを形成しないｃE＝０のｃ＝３００ｍｇ／ｍｌにおいて、ＩｇＧ溶液の粘度は、溶液が流動しないゲル形態であったため測定できないことが判明した。このゲル化は、間隔の狭いタンパク質分子間の引力の顕在化であった。対照的に、ナノクラスター分散系は、粘度２５０ｃＰで、ｃ＝ｃEである当該ｃにおいて流動した。将来的には、外因性クラウダーの組成を最適化することにより、粘度をさらに下げることができよう。
【０３３１】
【表１４】
2014514275.tif 000041
【０３３２】
マウスにおけるタンパク質安定性及び薬物動態のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
タンパク質ナノクラスター分散系の薬物送達の可能性を検査するため、本出願人らは、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態（ＰＫ）試験を行った。対照群に、静脈内（intraveneous）又は皮下注射により１００μｌの希釈抗体溶液を与え、完全バイオアベイラビリティとして定義されるベースラインを得た。高度に濃縮した２３５ｍｇ／ｍｌナノクラスター分散系を用いて、ｐＨ７．２において１μｌを皮下注射した（表１３）。この分散系の粘度は、４０ｃＰをはるかに下回り（表１２を参照）、これは、皮下注射のための一般的な限界５０ｃＰを下回る。際立つことに、正規化されたバイオアベイラビリティ（ＡＵＣ／用量）、Ｃmax/用量、ｔmax及び排出動態等、得られたＰＫパラメータは、２種の皮下群のパラメータから統計学的に識別不能であった（図４１）。同様のバイオアベイラビリティは、容易に解離した（バッファーにおける予測時間は７ｍｓ、Ｅｑ．２４）ナノクラスターにおける抗体分子が、注射部位から輸送されて血流に進入することを示唆するが、同一アルファ及びベータ率は、血液における主に単量体の抗体の存在を示す。仮に抗体が溶解の際に凝集又はミスフォールディングするとすれば、分子量及び表面特性が変化し、続いて腎臓及び肝臓クリアランス速度に影響を及ぼすであろう（Ｔａｂｒｉｚｉ、Ｔｓｅｎｇら、２００６）。最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒素中和検査による終末血液試料における抗体活性の解析は、対照抗体と対比して同様の活性を示し、抗体立体構造に加えて、活性も影響を受けなかったことを示す。ＢＳＡに対し４００ｍｇ／ｍｌ、ポリクローナルＩｇＧに対し３５０ｍｇ／ｍｌの最大分散系濃度が達成されたことを考慮すると、このナノクラスター薬物送達概念は、さらに高い投薬量に拡張することができると思われる（図３８及び４６）。分散系は、粉末及びバッファーを混合し、続いて長期貯蔵安定性の必要性を回避するため、その後直ちに注射することにより生成することができた。生理的ｐＨから２単位を超えて離れた等電点のタンパク質に関して、このアプローチは、静電反発力を克服するためさらに濃い濃度のクラウダーを必要とし得る。
【０３３３】
【表１５】
2014514275.tif 000042
【０３３４】
凍結乾燥したタンパク質、外因性クラウダー及びバッファーを単に混合することにより、希釈後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで高い立体構造的安定性及びｉｎ  ｖｉｖｏで高い生物活性を有する、単分散系平衡ナノクラスターにおける濃縮タンパク質の低粘性分散系を生成した。１Ｂ７ナノクラスターの希釈により実験的に確認された通り、異常な高濃度７００ｍｇ／ｍｌにおけるナノクラスター内タンパク質の高度の自己群集性は、フォールディングを好むことが理論的に示される。実験及び自由エネルギーモデルの両方により示される通り、ナノクラスターのサイズは、ｐＩ付近においてタンパク質及び外因性クラウダー濃度を調整することにより調節可能である。自己群集したクラスター及び低粘性を同時に達成する能力は、タンパク質単量体レベルで優勢の引力、クラスター間レベルの反発及び単量体−クラスター相互作用における両者の中立的なバランスによる、マルチスケール相互作用調整の一般概念に起因する。クラスター間反発は、ゲル化なしのコロイド的安定性及び低粘性を好む。際立つことに、種々の物理的、化学的及び生物学的アッセイによる解析は、ナノクラスター分散系の希釈後にタンパク質活性を全く失わない、立体構造的に安定的なタンパク質単量体を示した。分散した抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ皮下投与は、対照抗体溶液と比較して識別不能な薬物動態及び活性をもたらした。群集化剤による等電点付近のｐＨのタンパク質ナノクラスターの分散系を処方するためのこの一般的なアプローチは、溶液として処方すると本来であればゲル化してしまう、種々の治療用生物製剤の皮下投与の可能性を生じる。
【０３３５】
ナノクラスター分散系の形成
以前に報告（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）された通りにマウスＩｇＧ２ａ抗体１Ｂ７を発現、精製及び特性評価した後、銀染色した等電点電気泳動ゲルによりｐＩを決定した。凍結乾燥に先立ち、５０，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを用いて、１Ｂ７溶液を２０ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ５．５）へとバッファー交換し、１：１のタンパク質：トレハロース重量比となるよう凍結保護物質として固体α，α−トレハロースを添加した。溶液をろ過滅菌（０．２２μｍ）し、２０ｍｇ／ｍｌタンパク質となるよう２０ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ５．５）で希釈し、無菌８ｍｌガラスバイアルに移した。これを予冷した凍結乾燥機トレーにおいて−４０℃で６時間にわたり凍結し（ＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）、続いて、−４０℃における１２時間の一次乾燥と、続く６時間かけて２５℃へと傾斜させ、２５℃におけるさらに６時間の二次乾燥により、１５０ｍトルで凍結乾燥した。分散系を作製するため、通常２８ｍｇ±０．０２ｍｇの凍結乾燥したタンパク質を、風袋重量を計った（tared）０．１ｍｌ円錐状バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に詰め込んだ。５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）を添加した後、得られた分散系を２５ゲージ針の先端で穏やかに撹拌した。公知の質量に基づく理想混合並びに仮説上の純粋液体タンパク質（１．３５ｇ／ｃｍ3）及びトレハロース（１．６４ｇ／ｃｍ3）密度を仮定して、無限希釈におけるそれらの部分モル体積（Ｐｉｌｚ、Ｐｕｃｈｗｅｉｎら、１９７０；Ｍｉｌｌｅｒ、ｄｅＰａｂｌｏら、１９９７）及び公知のバッファー容量から構成成分の総体積及び体積分率を計算した。ＢＣＡアッセイ又は質量消衰（mass extinction）係数１．３７Ｌ／ｇ・ｃｍによる２８０ｎｍにおける吸光度を用いて（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、最終タンパク質濃度が、予測値の実験誤差内であることを検証した。
【０３３６】
ナノクラスター分散系の特性評価
ＣＯＮＴＩＮ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ−９０００ＡＴ）を用いた約２３℃における６３２．８ｎｍ（赤色）レーザー及びアバランシェフォトダイオードによる動的光散乱（ＤＬＳ）により、タンパク質単量体及びナノクラスターの水力学的直径を測定した。６０μｌ試料セル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、散乱角は、多重散乱を最小化するために１３５°から１６５°の範囲に及んだ（Ｈｏｒｎ  ２０００）。本技法の精度を検証するために、２９８ｎｍポリスチレン標準の水力学的直径をΦ約０．１において測定したところ、実際のサイズの５％以内であることが判明した。タンパク質単量体又はナノクラスターの試料毎に、１３５°、１５０°又は１６５°からなる２つの別個の角度で散乱測定を行ったところ、サイズは、２つの角度で５〜１０％以内であることが判明した。濃縮コロイドのＤＬＳ及びレオロジーの試験によると、溶媒粘度に基づくストークス・アインシュタイン方程式からの水力学的直径の計算は、本出願人らの最高Φ０．２５において比較的正確である（Ｈｏｒｎ  ２０００）。より高いΦにおいて、測定の時間スケールにおける粒子間の相互作用は、ストークス・アインシュタイン方程式からのさらに大きな逸脱を生じ得る。このような複雑性を回避するため、粒子サイズは、小角Ｘ線散乱から決定することができる（Ｒｏｏｓｅｎ−Ｒｕｎｇｅ、Ｈｅｎｎｉｇら、２０１１）。ＩｇＧナノクラスターのフラクタル次元を決定するために（図４４）、円柱状の２ｍｌ容量アンプルを用いて、４５°〜９０°の間の散乱角において５°毎に散乱したレーザー光強度を測定した。
【０３３７】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−５５００、３０ＫＶ）のための試料を調製するため、分散系を希釈して、クラウダーとしてＰＥＧ３００を用いて、一定のクラウダー体積分率０．１８（２２０ｍｇ／ｍｌの本来の分散系に相当）における４０ｍｇ／ｍｌとし、ホルムバール（formvar）でコーティングした炭素膜を備える銅ＴＥＭグリッド上に置き、過剰な液体を拭き取って除去し、液体窒素中に浸漬することにより急速に凍結し、凍結乾燥した。ハーゲン・ポアズイユの方程式に従い、１ｍｌ注射器に取り付けた２５ゲージ（ＩＤ＝０．１ｍｍ）１．５”の長さの針を用いて、ナノクラスター分散系の粘度を３回複製して測定した。デジタルビデオの解析から、約５０μＬの容量に相当する、錐体の底からの高さ０．４”から０．１”へと分散系を引く時間を決定した（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｎｇｓｔｒｏｍら、２０１０）。様々な較正流体を円錐状バイアルから０．０５ｍｌ引く時間と粘度との間の直線相関を図４９に示す（Ｌｉｕ、Ｎｇｕｙｅｎら、２００５；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｎｇｓｔｒｏｍら、２０１０）。変化したせん断速度は、粘度と共に減少し、５０ｃｐの粘度で１０００ｓ-1であった。トレハロース溶液の粘度は、Ｕｃｈｉｄａら（Ｕｃｈｉｄａ、Ｎａｇａｙａｍａら、２００９）から計算した。
【０３３８】
タンパク質構造及び活性の特性評価
抗体構造及びリガンド結合活性をモニターするため、溶液対照抗体と対比する一連の生物物理学的及び生化学的アッセイによる解析に先立ち、凍結乾燥し分散させたタンパク質を１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに希釈した。通常、希釈は、分散系形成の約４〜６時間以内に行った。Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５  ＣＤ分光計を用いて、２６０〜１８５ｎｍの円二色性（ＣＤ）測定値を０．１ｎｍ刻みで収集した。希釈タンパク質の５μｇ試料の４〜２０％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける解析により、不溶性のジスルフィド結合した凝集体の形成をモニターした。非共有結合性凝集体の形成をＳＥＣによりモニターし、２０μｇの希釈分散系をＷａｔｅｒｓ  Ｂｒｅｅｚｅ  ＨＰＬＣにより解析した。リガンド結合活性を解析するため、以前に記載された通りに（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｃｈａｎｇら、２０１１）、間接的ＰＴｘ  ＥＬＩＳＡを行い、試料対溶液対照の５０％有効濃度値（ＥＣ50）の比として報告した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製７９００ＨＴサーモサイクラー（thermocycler）及びＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いることにより、熱融解温度（Ｔm）を定量化した（Ｌａｖｉｎｄｅｒ、Ｈａｒｉら、２００９）。
【０３３９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティ
１４日の期間にわたり、２４〜２７ｇ、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、１Ｂ７分散系及び対照溶液のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験を行った。３種の試料群は、（１）１００μｌの希釈１Ｂ７溶液の静脈内（ＩＶ）及び（２）皮下（ＳＱ）対照注射並びに（３）検査条件、抗体分散系（１μｌ容量における２３５ｍｇ／ｍｌとして、９．４ｍｇ／ｋｇ用量を得る）のＳＱ注射を包含した。注射前と、１２〜３３６時間の間の８つの追加的な時点において、尾静脈から血清試料（約２０μｌ）を採取した。終末時点において、マウスを麻酔し、心穿刺により血清を採取した。本試験は、テキサス大学オースティン校の施設内実験動物委員会（プロトコール＃ＡＵＰ−２０１０−０００７０）の承認の下、実験動物福祉局の指針を遵守しつつ行われた。各血清試料における活性１Ｂ７の濃度を決定するため、以前に記載された通りに（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）間接的ＰＴｘ  ＥＬＩＳＡを行った。各プレートは、陰性対照としてのマウス血清（Ｓｉｇｍａ）と、マウス血清に希釈した１Ｂ７検量線を包含した。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５を用いて、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）モデルを用いた血清希釈と、検量線から計算した血清試料に存在する活性１Ｂ７の総濃度に基づきＥＣ50値を計算した。終末時点の血清を用いて、ＰＴｘのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＨＯ細胞中和に基づく直交性抗体活性アッセイを行った（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ  ２００９）。
【０３４０】
【表１６】
2014514275.tif 000043
【０３４１】
【表１７】
2014514275.tif 000044
【０３４２】
【表１８】
2014514275.tif 000045
【０３４３】
実施例ＩＶ
所望の分散バッファーにおいてポリクローナルヒツジＩｇＧ（ＩｇＧと省略、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ又はＲｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の溶液（通常５０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。バッファーは、１５０ｍＭイオン強度、タンパク質のｐＩの範囲内、通常１又は２ｐＨ単位以内のｐＨとなるよう処方した。質量消衰係数１．３７Ｌ／ｇ・ｃｍにより２８０ｎｍにおける吸光度を用いて濃度を検証した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。一部の事例において、後述する通りにＦＰＬＣによりタンパク質を精製した。
【０３４４】
水性培地の除去によるナノクラスターの形成
遠心分離フィルターアセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−５０メンブレン、５０ｋＤの名目上の分子量限界、フィルター直径０．２５”直径）の風袋重量を計った。必要量のクラウダー（例えば、トレハロース、スクロース、低分子量ポリエチレングリコール、デキストラン又はアミノ酸）をフィルターアセンブリのリテンテート（retentate）チャンバー内で秤量した。所望の容量のタンパク質溶液をピペット採取してリテンテートチャンバーに入れ、ピペット先端で溶液を混合して、クラウダーの溶解を確実にした。次に、１０，０００ｒｃｆにて通常１時間未満である一定量の時間、フィルターアセンブリを遠心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４１５Ｄ）。遠心分離後に、透過チューブの秤量により、或いは透過チューブ又はフィルターカプセルそれ自体におけるメニスカス（meniscus）高さのコンピュータ支援画像解析により、フィルターを通った流動量を測定した。遠心分離を反復して、所望の濃度レベルを得た。
【０３４５】
十分な水溶液が除去されて、所望の濃度に達したら、フィルターアセンブリを反転してリテンテート回収チューブに入れ、３〜４分間、１，０００ｒｃｆで遠心分離することにより、リテンテートにおける分散されたタンパク質を回収した。得られた分散系を、０．１ｍＬ円錐状バイアル（Ｖ−バイアル、Ｗｈｅａｔｏｎ）に移し、２８０ｎｍにおける吸光度を用いて分光光度計により（spectrophotometically）濃度を検証した。クラウダーの濃度は、出発濃度として表示することになる。
【０３４６】
粘度測定
ハーゲン・ポアズイユ方程式に従い、１ｍｌ注射器（Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋ（商標）チップを備えるＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．１ｍＬ注射器）に取り付けた２５ゲージ（ＩＤ＝０．１ｍｍ）１．５”長の針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｇｌｉｄｅ  Ｎｅｅｄｌｅ）を用いて、ナノクラスター分散系の粘度を３回複製して測定した。４８μＬの容量に相当する、錐体の底からの高さ０．４”から０．１”へと分散系（０．１ｍＬ円錐状バイアルにおける）を引く時間を、デジタルビデオから決定した。この時間は、表１９に示す通り、公知の粘度を有する一連の標準に由来する較正曲線の粘度と相関した。
【０３４７】
水力学的直径の測定
ＣＯＮＴＩＮアルゴリズム（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ−９０００ＡＴ）を用いた６３２．８ｎｍレーザー及びアバランシェフォトダイオードによる約２３℃における、１３５°の角度における動的光散乱（ＤＬＳ）により、タンパク質単量体及びナノクラスターの水力学的直径を測定した。試料を６０μｌ試料セル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）内に置いた。
【０３４８】
非共有結合性凝集体の解析のために、試料を移動相（１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７）において１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈した。ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＴＳＫｇｅｌ３０００ＳＷＸＬ及び直列のＴＳＫｇｅｌ２０００ＳＷ  カラムを用いたＷａｔｅｒｓ  Ｂｒｅｅｚｅ  ＨＰＬＣにより、吸光度２１４ｎｍにより溶出液をモニターしつつ、２０μｇのタンパク質を含有する希釈した分散系の体積を解析した。
【０３４９】
緊張度
注射可能な投与における課題の一つは、材料が等張性である必要があることである。培地は、所定の種類の細胞の膜を隔てた細胞内部の液体と同じ有効浸透圧を有する場合、それと等張性である。この緊張度は、特定の溶質分子に対する細胞膜の透過性の関数であり、したがって、関与する細胞の種類及び溶質分子の正体に応じて変動する。等張溶液（血液と比較して）は一般に、溶液１００ｍｌにつき０．９ｇのＮａＣｌを含有する塩化ナトリウム溶液と同一の束一的特性を有する溶液として定義される。Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（第１２版）及びＳｉｎｋｏ  ２００６における、生体膜を通した相対透過性に応じて一覧表にした塩化ナトリウム均等物に基づき、等張性条件における重量オスモル濃度と比べた、その賦形剤を含有する所定の製剤の重量オスモル濃度を計算した。重量オスモル濃度は、個々の構成成分に対し直線的に相加的であると仮定された。
【０３５０】
皮下投与用のタンパク質ナノクラスター分散系の形成に用いることのできる多糖等の群集化剤は、溶液の緊張度に影響を及ぼすであろう。身体への注射のため、一部の実施形態において、製剤は、注射による苦痛を回避するため、可能な限り等張性に近づかなくてはならない。低張性流体に関して、膜輸送は、流体に隣接する細胞のサイズに影響を及ぼすであろう。このような変化は、免疫原性に潜在的に影響を及ぼし得る。したがって、群集化剤は、粘度を５０ｃｐ又は１００ｃｐ又は１５０ｃｐを超えて上昇させることなく、緊張度及びクラスターサイズの制御に対し最適化することができる。最後に、一部の実施形態において、製剤は、投与により免疫原性の原因とならず、タンパク質は、所望の薬物動態及び生物活性を有する。
【０３５１】
１００ｍｇ／ｍｌ以上のトレハロースによる、水を除去することによる高張性タンパク質分散系の形成
対応する量のトレハロースで処方した、表２０に収載されているタンパク質濃度の分散系を以前に記載された遠心分離方法により調製し、注射器を用いてその粘度を測定した。粘度がより低いことが観察され、表２０の最初の３列における５〜６の範囲内の固有粘度である。その中により多量の凝集体を有する（より高い粘度を説明できる）、異なるサプライヤー（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得たヒツジＩｇＧを用いた列番号４及び５の事例において、固有粘度はより高かった。これらの低い固有及び溶液粘度は、分散系を作製するための新たな技法の結果であった。溶液におけるより少量のトレハロースは、より低い溶媒粘度をもたらした。この方法は、凍結乾燥により作製されたタンパク質粉末の分散に基づく方法に優る利点を提供することができる。凍結乾燥粉末の溶解ステップを回避する能力は、より高い粘度を生じ得る潜在的な複合コロイド状ゲル状態を回避することができる。この新たな技法は、凍結乾燥ステップを回避し、タンパク質濃度を徐々に増加させることにより、タンパク質に加えるストレスも少ない。新たな技法は、凍結保護物質分子が必要とされないため、製剤における柔軟性も生じる。
【０３５２】
これらのナノクラスターの水力学的直径は、３０〜３５ｎｍ前後であることが観察され（表２０）、これは、本明細書に記載されている通りに形成されたヒツジＩｇＧナノクラスターに観察される約８０ｎｍ直径よりもさらに小さい。より小さいサイズは、分散系に存在するより低レベルのトレハロースの結果であると思われ、これは、より規模の小さい誘引的な枯渇引力をもたらし、より小さいクラスターサイズのクラスターを形成させる。クラスターが滅菌フィルターをより容易に通過でき、分散系をより容易に滅菌できるとの観点から、より小さいクラスターは有益である。その上、ＳＥＣデータは、タンパク質分子の間で不可逆的凝集が殆どないとの証拠を提供する。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから提供される無修飾ポリクローナルヒツジＩｇＧは、９２．６３％単量体であり、表２０から分かる通り、遠心分離によるクラスター形成のプロセスと、その後の粘度測定のための注射器の針を通したせん断は、溶液における単量体タンパク質量の有意な減少を生じない。したがって、クラスタリングプロセスは、タンパク質の不可逆的凝集を生じず、タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける希釈後に単量体に再び解離する。
【０３５３】
凍結乾燥により形成された、低張性又は等張性の、低濃度の群集化剤による高濃度又は中濃度分散系：溶液及びより大型のクラスターとの比較
表２１における列１〜３に対して、凍結乾燥したタンパク質粉末と、凍結保護物質、トレハロースから、本明細書に記載されている通りにナノクラスターを作製した。表２１における列１、２及び３に示す３５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質ナノクラスターの分散系を作製するために、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈヒツジＩｇＧの凍結乾燥粉末を、溶解トレハロースを含有するバッファーにおいて直接的に分散させた。これらの分散系の濃度を重量及び容量により決定した。ナノクラスターは、列２及び３において安定的コロイド分散系を形成した。これらの実験において、本出願人らは、タンパク質の立体構造的安定性又はタンパク質凝集体の形成を測定しなかった。列１に対しては、トレハロース又は他の群集化剤を添加せず、その結果タンパク質は溶液となり、注射器使用できない高度に粘稠性のゲルを形成した。ナノクラスターは形成されなかった。この場合、溶液におけるタンパク質分子間の引力がゲル化を生じた。しかし、表２１、列２及び３に示す通り、トレハロースの添加によりナノクラスターが形成され、分散系は注射器使用でき、さらにより低く測定可能な粘度を有した。ナノクラスターのより低い粘度は、コロイド力に基づいて予想される。表２１、列２及び３に示すＤＬＳにより測定されるクラスター水力学的直径に証明される通り、トレハロースは、タンパク質をクラスターに集合させる。これら２事例において、重量オスモル濃度／等張性条件における重量オスモル濃度は、単位元より低かった。
【０３５４】
通常、凍結保護物質：タンパク質の比は、凍結乾燥プロセスにより作製された粒子の重量／重量で１：１である。２００ｍｇ／ｍｌのタンパク質に関して、この比は、２００ｍｇ／ｍｌトレハロースに相当し、等張性条件の約１００ｍｇ／ｍｌの限界を優に超える（スクロース及びラクトース等の二糖に関して、等張性溶液の濃度は、それぞれ９２．５ｍｇ／ｍｌ及び９７．５ｍｇ／ｍｌである（Ｓｉｎｋｏ  ２００６、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ））。緊張度の問題は、より高いタンパク質濃度に対しさらにより過酷なものとなる。この高緊張度を回避するための一方法は、凍結乾燥においてより少ない凍結保護物質（又は凍結乾燥保護物質）を用いることであろう。しかし、凍結保護物質が少ないと、タンパク質は凍結乾燥プロセスにおいて変性を生じ得る。表２１の列１〜３において、凍結乾燥プロセスにおいて凍結保護物質を用いなかった。
【０３５５】
水の除去により形成された、低濃度の群集化剤による高濃度又は中濃度の、低張性又は等張性分散系
表２１における凍結乾燥した粉末から形成された列２〜３におけるこれら分散系の高粘性は、ナノクラスターを作製するために代替プロセスが有益であることを示す。タンパク質粉末作製における大量の凍結保護物質の必要を克服するための別の方法は、混合によるナノクラスターの形成であり、これならば、凍結乾燥又は他のフリーズドライプロセスを回避できるであろう。この例において、単量体タンパク質溶液から水を除去することにより、水性培地における分散系としてのナノクラスターを形成した。本出願人らは、水及びトレハロース等の小分子の通過が可能な遠心ろ過を用いて、これによりタンパク質濃度を増加させることにより、これを立証する。タンパク質が濃縮されるにつれ、溶液における群集化剤の量及びタンパク質濃度に応じてナノクラスターが形成される。凍結乾燥による粉末作製に凍結乾燥保護物質を必要としないこの種のプロセスにおいて、群集化剤対タンパク質の比は、さらにより小さくすることができ、これは即ち、１：２から、さらには１：５重量／重量以下となる。そこで、ナノクラスターの希釈後にタンパク質が安定的である場合、凍結又は凍結乾燥による粉末形成プロセスにおける凍結乾燥保護物質の必要を迂回することができる。
【０３５６】
溶液におけるより少量の凍結保護物質は、より低い溶媒粘度をもたらす。より低い溶媒粘度ηoは、方程式２５に基づきより低い有効分散系粘度を生じるであろう。また、この方法において、凍結乾燥のステップと、ナノクラスターを形成するための凍結乾燥した粉末の分散を回避することが可能になる。粉末の分散において、タンパク質は、高度に濃縮した粉末形態から開始する。これが水性溶媒と混合されるにつれ、粘度を上昇させる可能性のある複合コロイド状ゲル状態が形成される（表２１の列１〜３を参照）。
【０３５７】
水性培地を除去してタンパク質を濃縮する新たなプロセスにおいて、物質移動経路は、水性培地による混合能力の事例とは反対である。上述の通り、水性溶媒を添加するのではなく、遠心分離により除去している。水性溶媒の除去により、タンパク質濃度が、最終分散系におけるタンパク質濃度を上回ることはない。この新たな技法は、凍結乾燥ステップを回避し、タンパク質濃度を徐々に増加させることにより、タンパク質に加えるストレスも少ない。
【０３５８】
本明細書に記載されている実験及び自由エネルギーモデルにより示される通り、ナノクラスターの形成は、関連するコロイド相互作用に依存する。最終タンパク質濃度は、３００ｍｇ／ｍｌであると想定される。続いて、表２１の列４〜１１における実際の実験による具体例と、本明細書において先に提示したコロイド理論に示される通り、多くの場合僅か１００ｍｇ／ｍｌ又はそれ以下のクラウダー濃度であっても、依然としてナノクラスターの形成をもたらす。これらの実験において、クラウダー濃度は、本明細書に記載されている多くの先の例よりも低い。
【０３５９】
列４において、重量オスモル濃度／等張性条件における重量オスモル濃度の比は、単位元を大きく上回る値ではなく、一方、列５においては、基本的に単位元であり、その後の列６〜１１において、比は単位元を下回った。列５〜８の分散系は、ＤＬＳにより２８〜４５ｎｍ範囲の水力学的直径のクラスターを有することが判明し、タンパク質単量体は直径僅か１１ｎｍであるため、この結果は、これら全事例においてタンパク質がナノクラスターの形態で存在することを証明する。よって、列５〜１１におけるコロイド的に安定的なナノクラスター分散系は、極度に高いタンパク質濃度を維持しながら、等張性又は等張性よりも低かった。低張性条件に関しては、さらにバッファー又は塩を添加して、分散系等張性を達成するのが単純明快であろう。
【０３６０】
これら実施例全体における先の事例の一リン酸ナトリウム及び重リン酸ナトリウムバッファーの５０ｍＭと対比して、より低い総塩濃度２０ｍＭを有するバッファーにおいて、列６及び７における分散系を作製した。このより低濃度のバッファーは、分散系を依然として等張性に維持しつつ、より高いクラウダー濃度の使用を可能にする。さらに、表２０と比べて表２１におけるより低いクラウダー濃度の使用は、緊張度を下げる。
【０３６１】
タンパク質の濃度は、列４〜５、７及び９〜１０において２９０ｍｇ／ｍｌを上回る。列９及び１０において、相対的に低いクラウダー濃度は、相対的に低い溶媒粘度を生じる。さらに、固有粘度は、８を下回る。これらの要因は、非常に高いタンパク質濃度にもかかわらず溶液粘度が１２０ｃｐを下回るという事実に寄与する。
【０３６２】
クラウダーの濃度を、５０ｍｇ／ｍｌまで減少させた（表２１の列１２を参照）。この分散系は、高度に粘稠性であり、光を十分に散乱せず、この結果は、均一なナノクラスターを形成していないことを示した。しかし、僅かに高濃度のクラウダーによる同様の濃度の分散系（表２１の列４）は、およそ５０％低い粘度を有し、均一なクラスターを形成した。よって、都合よい粘度のナノクラスターの分散系を形成するには、十分量のクラウダーが必要とされる。より低いクラウダー濃度において、形態は、文献におけるコロイド状ゲルでよく知られている通り、制御できない形態の溶液からゲル化したタンパク質のものである。
【０３６３】
クラスターの形態、コロイド特性並びに貯蔵安定性の意味における凍結融解又は凍結、貯蔵及び解凍後のタンパク質安定性。臨床用途に受け入れられるためには、これら高濃度製剤は、調製時から注射される時まで安定的である必要がある。そこで、製剤を冷凍庫における貯蔵によって安定化させる。分散系（表２１における列６）を凍結し、気密となるよう密封したガラス円錐状バイアルにおいて−４０℃で１週間貯蔵した。１週間経過後、分散系を冷蔵庫において４℃で、数時間の経過にわたり徐々に解凍し、次に、解凍した分散系を特性評価した。バイアルは撹拌も振盪もしなかった。かき混ぜる必要なく、分散系においてナノクラスターを発見した。分散系の粘度、水力学的直径及び濃度を定量化したところ（表２２を参照）、第１の例の分散系の凍結前に測定された値と同一であることが判明した。その次の２例に関して、サイズは凍結後のみ示され、１００ｎｍをはるかに下回ることが判明した。この結果は、分散系が、凍結、貯蔵及び解凍後に安定的であることを立証する。凍結状態でのタンパク質貯蔵に関する最先端の知識を考慮すると、貯蔵時間数カ月からさらには１年間でこのアプローチを用いることができると考え得る。さらに、凍結ナノクラスターとしてのタンパク質の貯蔵は、タンパク質を溶液として貯蔵する場合よりもさらに高い安定性をもたらす可能性がある。
【０３６４】
粘度及び他の特性における、より小さいクラスターサイズの効果及びより高い充填率効果
次の実験は、ナノクラスターの分散系粘度と形態を関連付ける。表２１の列８及び９において、トレハロースの濃度は僅か７０ｍｇ／ｍｌであり、高タンパク質濃度にもかかわらず、各事例において低粘性の等張性分散系をもたらした。水力学的直径は、表２１の列８において４０ｎｍであることが観察される。このサイズは、トレハロース濃度がさらに高い本明細書に記載されているヒツジＩｇＧナノクラスターで観察される約８０ｎｍ直径よりもさらに小さい。本明細書において自由エネルギーモデルにより説明される通り、より少量の外因性群集化剤トレハロースを考慮すると、表２１におけるナノクラスターのより小さいサイズが予想された。表２０及び表２１の列８〜１０に示すナノクラスターの固有粘度並びにこれらの事例及び表２１の列１１における分散系粘度値は、凍結乾燥／混合プロセスによる同等のタンパク質濃度により達成される値よりも低かった。
【０３６５】
物理学的議論を用いて、クラスターサイズ及びクラスター内のタンパク質の充填率（packing fraction）が、どのようにナノクラスターの分散系の粘度に影響を及ぼすか説明することができる。粘度は、表１９に示すΦmaxに対するナノクラスター体積分率Φの値と他の要因によって決まる。タンパク質がナノクラスターの形態である分散系における所定のタンパク質濃度に関して、次に、有効体積分率Φeffは、各ナノクラスターの密度又は充填率により決まることが示される。充填率増加は、クラスターにおける空間全体を占有しないタンパク質の結果である。タンパク質に占有されない体積がクラスター内に存在する。非占有体積には水が存在する。充填率は、クラスター形態によって決まり、クラスター形態は、タンパク質分子の形状及び分散系の組成によって決まる。単一ナノクラスター内のタンパク質の内部体積分率Φintは、次式により得られる。
【０３６６】
【数２６】
2014514275.tif 000046
（式中、Ｄcは、クラスター直径であり、Ｄｍは、タンパク質単量体直径であり、δｆは、クラスターのフラクタル次元である）。クラスター体積分率の有効値Φeffは、Φ／Φintとして定義できる。ｅｑ．２６における粘度は、本事例においてはナノクラスターであるコロイド粒子に占有された体積分率に依存するため、ΦではなくΦeffの関数である。
【０３６７】
Φintの増加は、ナノクラスター分散系における所定の全タンパク質濃度に対するΦeffの減少に用いることができる。Φeffの減少は、ｅｑ２６によればより低い分散系粘度を好むであろう。さらに、Φeffの減少は、クラスター間のより大きい間隔に相当するであろう。より大きな間隔は、より弱い相互作用、したがってより弱い固有粘度を好み、これもまた分散系粘度を下げるであろう。要約すると、Φintを上昇させる能力は、ｅｑ．２６によればより低い分散系粘度を好むという理論的観点から予想することができる。
【０３６８】
有効クラスター体積分率Φｅｆｆの値は、本明細書に記載されている通りに得られるＳＬＳによるΦｉｎｔ、約０．６に基づいて、Φ／Φintとして定義された。これは、小角Ｘ線散乱及び小角中性子散乱によって測定することもできる。所定のタンパク質及びδｆに関して、クラスターサイズ、Ｄｃが増加するにつれ、Φint。フラクタル物体に関して、充填率は、物体の中心から外側へと減少する。よって、Φintは、小型のクラスターに対してより低くなると予想することができる。したがって、クラスター間の短距離引力が十分に弱ければ、小型のナノクラスターを形成するより少量の群集化剤の使用は、より低い粘度を好むであろう。最終的に、群集化剤の量が少な過ぎる場合、表２１の列１に示す通り分散系はゲル化する。よって、群集化剤の濃度を群集化剤の組成と共に最適化して、最低分散系粘度を達成することができる。例えば、３０〜４０ｎｍ前後のクラスターサイズは、本明細書に記載されているサイズ８０ｎｍの一定のクラスターに対する約８の相対的により高い値と比較して、固有粘度がより低い（６〜７、表２０における列１〜３及び表２１における列８〜１１）。
【０３６９】
群集化剤の分子量を変動させることにより、ナノクラスターサイズと緊張度に関して群集のバランスを取る。高濃度且つ低粘性の分散系の形成は、自由エネルギーモデルに基づき群集化剤濃度及び分子量に高度に依存性である。枯渇引力におけるクラウダーサイズの効果は、方程式６により説明される。クラウダーサイズの増加は、枯渇引力の範囲を増加させ、これは、タンパク質単量体間の引力全体をさらに増加させることができる。枯渇引力の増加は、クラスターサイズを増加させる。クラウダーの分子量及び組成は、緊張度と溶媒粘度にも影響を及ぼす。
【０３７０】
表２１における列１０に示す通り、クラウダーとして１００ｍｇ／ｍｌの１ｋＤ分子量デキストランを用いてナノクラスター分散系を生成した。分散系の緊張度は、表２０及び２１における他の事例の大部分よりも低く、より高分子量のクラウダーの利益を示す。固有粘度は、表２０により作製された分散系と同じ範囲内であることが判明した。したがって、溶液においてクラスターを形成させるために、溶液において他の群集化剤を用いることが可能である。多糖デキストランも、群集化剤として作用する。デキストランは、自由エネルギーモデルに示す通り、タンパク質分子間の枯渇引力を生じることによりクラスターを形成させる。デキストラン溶液の溶液粘度は、同じ質量濃度のトレハロース溶液の粘度と比べてより高い。しかし、所定の質量濃度において、デキストランは、そのより高い分子量、したがってより少ない数の粒子により、より低い程度で溶液の重量オスモル濃度に寄与するであろう。よって、分子量を上昇させることにより、等張性条件を維持しつつ、外因性クラウダーの濃度を増加させることができる。最終的に、分子量が大きくなり過ぎるにつれて、溶媒粘度は、桁違いに大きくなるであろう。よって、群集化剤分子量は、緊張度、クラスターサイズ、溶媒粘度及び分散系粘度の制約を満足させるよう最適化されなければならない。これは、タンパク質安定性にも影響するであろう。
【０３７１】
クラウダー濃度を上昇させてクラスターを形成することにより、溶液と比べて粘度が低下することの立証。粘度を下げ分散系を安定化するための、賦形剤としての界面活性剤の使用。表２１の列１１において、クラウダーとしてトレハロースを包含した分散系は、賦形剤として１％ポリソルベート８０（ＰＳ８０）も含有していた。タンパク質分子は、その表面に疎水性、親水性又は電荷のあるパッチを有する。疎水性パッチ間の相互作用は短距離且つ誘引性であり、溶液におけるタンパク質又はクラスター間の引力を増加させ、より高い固有粘度、したがって有効粘度増加をもたらす（方程式２６）。ＰＳ８０等の界面活性剤は、疎水性パッチをコーティングし、これを親水性パッチに変換するであろう。疎水性のマスキングは、引力低下、したがって分散系粘度低下をもたらし得る。これに加えて、特定短距離引力低下により、界面活性剤の利用は、分散系における遊離タンパク質単量体の凝集傾向を低下させるであろう。特定短距離力は、疎水性パッチ相互作用によるクラスター間を架橋せず、固有粘度を増加させるため、タンパク質単量体間の特定短距離引力低下は、溶液粘度の減少にも有用である。これらの概念は、表２１における列１１に示す通り、タンパク質ナノクラスターの約３５０ｍｇ／ｍｌ分散系で測定された約１５０ｃＰの極度の低粘性と一致する。列１３において、同様の効果を達成できるとの考えから、トレハロースに加えてエタノールを添加した。
【０３７２】
【表１９】
2014514275.tif 000047
【０３７３】
表１７におけるデータは、実施例Ｉと同様の仕方で製造された分散系から得た。表中の濃度により示される通り、ＩｇＧは、凍結保護物質としての所望の量のトレハロース（質量比１：１のタンパク質対トレハロース、或いは１：０．５のタンパク質対トレハロースのいずれか）と共に凍結乾燥される。凍結乾燥したら、タンパク質−トレハロース粉末をバイアル内で秤量し、バッファー溶液（上述のｐＨ）を添加して、分散系を作製する。列２及び３は、粘度測定に関してこれらの分散系が再現性を有することを立証する。第２の方法において、バッファー溶液に粉末を添加する。いずれの方法においても、１０を下回る固有粘度を達成することが可能であった。
【０３７４】
実施例Ｖ
タンパク質−クラウダー液体組み合わせが濃縮される濃縮プロセス（より具体的にはろ過プロセスとなり得る）における反復回数。濃縮プロセスとして、遠心ろ過、機械的ろ過、接線流ろ過及び透析が挙げられる。濃縮（例えば、ろ過）プロセスは、一回反復して行うことができる。或いは、複数回反復して行ってもよい。濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおいて種々の戦略を行って、このプロセスにより作製される分散系の特性を制御することができる。これらの差異は、濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおける物質移動経路に影響を及ぼすであろう。供給口（feed）（例えば、ろ過プロセスにおけるフィルター）に様々な薬剤を添加してよい。薬剤は、連続的に添加しても、少しずつ添加してもよい。濃縮（例えば、ろ過）は、１回反復して行うことができる。或いは、複数回反復（interation）して行ってもよい。複数回反復して行われる場合、薬剤（例えば、クラウダー）は、反復と反復の間に添加しても、反復において添加しても、或いはその両方であってもよい。
【０３７５】
濃縮（例えば、ろ過）において添加される薬剤は、ナノクラスター形態に影響を及ぼすクラウダーとなることができる。或いは、薬剤は、濃縮（例えば、ろ過）補助剤（例えば、ろ過（filtation）におけるタンパク質によるフィルターの汚れを最小化するための）であってもよい。クラウダーの添加によるクラスターサイズの調整は、ΦがΦEに対しプロットされる図１２の概念に基づき設計することができる。これら含量のいずれかの増加は、ナノクラスターサイズを上昇させる。これらは、クラスターの充填率にも影響を及ぼすであろう。濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおけるクラスターサイズ及び充填率の変化は、最終クラスターサイズ及び充填率に影響を及ぼすであろう。これらの形態学的側面は、外因性クラウダー及び自己クラウダーに影響されるタンパク質フォールディングにも影響を及ぼすであろう。
【０３７６】
分散系における構成成分は、濃縮（例えば、ろ過）プロセス（例えば、ろ過のためのフィルターを通した浸透）におけるその保持又は低下に影響を与えるよう設計することができる。多糖やアミノ酸やペプチドやタンパク質等、外因性群集化剤は、濃縮（例えば、ろ過）プロセス（例えば、ろ過におけるバッファーによるフィルターを通した透過）において保持されるよう、或いは保持されないように設計することができる。薬剤は、アルコール、ｎｍｐ又は別の有機溶媒若しくは塩等、タンパク質に対し非溶媒となることができる。これは、ｐＨを変化させる薬剤となることができる。薬剤は、濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおいて除去されない又は減少しない（例えば、ろ過の場合はフィルターを通過しない）、より高分子のデキストラン若しくはポリエチレングリコール、又はペプチド及びタンパク質並びにアルギン酸塩やキトサン等の天然ポリマー等、他のポリマー型クラウダーであってもよい。
【０３７７】
濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおいて低下する（例えば、ろ過用フィルターを通過する）クラウダーに関して、Φの増加は、ナノクラスターサイズを上昇させる。この場合、タンパク質の体積分率全体が増加するため、クラウダーの濃度は、濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおいて減少する。濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおいて保持される（例えば、フィルターを通過しない）クラウダーに関して、その濃度は、バッファーが透過するにつれて高まるであろう。よって、図１２における概念から明らかな通り、この非透過型クラウダーの場合、ナノクラスターサイズはさらに増加するであろう。一方が低下し、もう一方が保持される（例えば、それぞれろ過において一方が透過し、もう一方が透過しない）クラウダーの混合物の製剤を作製してもよい。
【０３７８】
出発材料が単量体のタンパク質溶液である場合の濃縮（例えば、ろ過）プロセスにおけるタンパク質の出発及び終点濃度
出発及び終点タンパク質濃度Φは、ナノクラスター特性に影響を与えるであろう。小さいΦにおける所定のΦEにおいて、タンパク質は、単量体から出発することができる。ろ過等、濃縮プロセスにおいて、Φが増加するにつれて、クラスターは、図１２の通りに形成されるであろう。Φ若しくはΦEのいずれか又はその両方の増加は、クラスターサイズを上昇させるであろう。出発Φ及び最終Φの間の差並びにろ過の際のΦにおける経路の変化は、ナノクラスター形態及びタンパク質安定性に影響を与えるであろう。
【０３７９】
出発材料が既にナノクラスター分散系である場合のろ過プロセスにおけるタンパク質の出発及び終点濃度
出発材料は、最初からナノクラスター分散系であってよい。この場合、濃縮、例えばろ過におけるΦ又はΦEの増加は、ナノクラスター形態に影響を与え、ナノクラスターサイズを上昇させるであろう。
【０３８０】
希釈によるナノクラスターサイズの低下
バッファー（例えば、水性バッファー）を添加して、タンパク質及び／又は外因性クラウダー濃度を下げて、出発サイズよりもナノクラスターサイズを下げることができる。
【０３８１】
実施例ＶＩ
【０３８２】
【表２０】
2014514275.tif 000048
【０３８３】
注射器粘度計の原理は、ピストンを一定量変位することにより、針における圧力降下における相対的に小さい変動を生じ、公知の直径の針を通じた流動を生じることである。分散系容量は一般に、流動において１ｍＬ注射器容量の＜５％を要するため、圧力降下は、ほんの少量変化する。注射器プランジャーは、各実験で同一量変位されるため、圧力降下は一定である。流速及び粘度は、本明細書に記載されている通り、較正により関連付けられ、そのデータを表１８に示す。粘度に関しては、表１８に収載されており（粘度標準を表１９に収載する）、較正により流速を決定する。針は円柱であるため、壁にスリップが保持されていない管を通る流動の方程式を仮定し、該粘度から計算された流速に基づき、壁におけるせん断速度を計算する。せん断速度は、流体の流動速度の関数であり、したがってより高い粘稠性の流体は、流動に対しより強い抵抗を有し、その結果、流体はより遅く流動し、したがって針においてより低いせん断速度を生じる。ニュートン挙動から逸脱した流体であっても、おおよそのせん断速度を表１８に示す。
【０３８４】
【表２１】
2014514275.tif 000049
【０３８５】
【表２２】
2014514275.tif 000050
【０３８６】
【表２３】
2014514275.tif 000051
【０３８７】
*Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ未精製タンパク質使用  −  処理前では９２．６％単量体。**凍結、貯蔵及び解凍後に測定。列６〜１４は、ｆｐｌｃにより精製され、Ｒｏｃｋｌａｎｄ製である。本文書におけるその他全ては、未精製である。列４及び５は、Ｒｏｃｋｌａｎｄ製の未精製である。これら以外の表２０及び２１におけるその他全ては、ｓｉｇｍａ製のｆｐｌｃなしである。
【０３８８】
【表２４】
2014514275.tif 000052
【０３８９】
実施例ＶＩＩ
群集化剤としてのアミノ酸によるヒツジＩｇＧナノクラスターと、群集化剤としてのトレハロースによるナノクラスターの滅菌ろ過
【０３９０】
群集化剤としてのアミノ酸の使用：表２３の列１において、群集化剤として１００ｍｇ／ｍＬアルギニンを用いて２９８ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧの分散系を作製した。アミノ酸及びペプチドは、タンパク質製剤において用いられることが多い。その上、アルギニンは、タンパク質溶液における安定化効果を有することが示されており｛Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ、２００６、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ｝、タンパク質クラスターにおいても同じ効果を有しているに相違ない。２９８ｍｇ／ｍｌと非常に高いタンパク質濃度であるにもかかわらず、粘度は僅か７３ｃｐであった。この概念は、クラウダーとしての多種多様なアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド及びオリゴペプチドに利用することができる。ｍｇ／ｍｌ単位の所定のアミノ酸又はペプチド質量濃度において、緊張度（tonicty）は、ペプチドの分子量と共に減少する筈である。
【０３９１】
ナノクラスター分散系の滅菌ろ過：表２３の列２ａ及び２ｂにおいて、群集化剤として７０ｍｇ／ｍＬトレハロースを用いて、２２３ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧの分散系を作製した。ナノクラスターのサイズは、表２１における同様のナノクラスター形成条件に基づき、４０ｎｍよりも小さいと見積もることができる。次に、分散系を、Ｍｉｌｌｅｘ  ＰＶＤＦ０．２２μｍ注射器フィルター（４ｍｍ直径）を通してろ過して容器に入れ、透過した濃度を測定した。ろ液を収容する容器は少量の水を含有しており、これはごく僅かな濃度減少の原因となった。この実験は、これらの分散系を非無菌的環境で作製し、続いて滅菌ろ過（例えば、充填プロセスの一部として）できることを示し、このことは、製造コストを減少させることができる。フィルターを通した後の最終濃度は、１９９ｍｇ／ｍｌであり、ろ過において少量のタンパク質しか失われなかったことを示す。
【０３９２】
荷電群集化分子。表２３の列３において、群集化剤として１００ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウムを用いて、２３８ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧの分散系を作製した。クエン酸ナトリウムは、クラウダーとして作用できるトレハロースと同様のサイズの荷電分子であり、ナノクラスターの分散系が、荷電及び非荷電分子の両方により形成され得ることを規定する。
【０３９３】
【表２５】
2014514275.tif 000053
【０３９４】
実施例ＶＩＩ
これらの実験は、他に断りがなければ実施例４及び６における実験と同様に行った。全試料は、使用前にＦＰＬＣにより精製（９９．９％単量体）されたポリクローナルヒツジＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製造）を用いた。遠心分離後の濃度を次の通りに測定した。２．００μｌの分散系を、分散系が存する緩衝溶液の塩濃度に対応して、２０ｍＭ又は５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．４）９９８μｌに希釈した。手動で振盪することにより試料を十分に混合し、続いて１ｍＬ  Ｈｅｌｌｍａ  ＱＳ  １０ｍｍセルに移した。Ｃａｒｙ  ３Ｅ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計により２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、続いて、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓにより提供された消衰係数（Ｅ0.1%）１．４３によりＢｅｅｒｓの法則を用いて濃度に変換した。
【０３９５】
Ｅ0.1%消衰係数は、１ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液の参照状態により一般に用いられるモル濃度消衰係数である。この正規化は、モル濃度消衰係数、εのＭ-1ｃｍ-1から、Ｅ0.1%係数の（ｍｇ／ｍＬ）-1ｃｍ-1への単位の変化として現れる。これら２種の含量は、式ε＝（Ｅ0.1%）ＭＷにより関連付けられる。Ｂｅｅｒｓの法則におけるＥ0.1%消衰係数の使用は、タンパク質濃度をｍｇ／ｍＬで直接的に示し、一方、モル濃度消衰係数εは、モル濃度を生じる。特に分子量が正確に知られていない場合、Ｅ0.1%消衰係数は、直接質量濃度測定に対してより実用的である。
【０３９６】
クラウダーとしてトレハロースを用いて、表２４及び表２５に結果を示す遠心ろ過濃縮によりヒツジＩｇＧのナノクラスターを生成した。以前に記載された通りに注射器を用いることにより、分散系粘度を決定した。動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて、クラスターの水力学的直径を決定し、分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、不可逆的凝集体の存在を点検した。等張性である表２５における列３を例外として、各事例において、分散系は僅かに低張性であった。提示されている通り、より長い遠心分離時間は、その結果、より濃縮された分散系と同等であり、粘度を増加させた。分散系の粘度及び水力学的直径を報告する。
【０３９７】
【表２６】
2014514275.tif 000054
【０３９８】
【表２７】
2014514275.tif 000055
【０３９９】
アルギニンは、タンパク質溶液における安定化効果を有することが示されたため（Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ、２００６、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ）、クラウダーとしてのアルギニンの使用も検査した。表２６に示す通り、クラウダーとしてアルギニンを用いて遠心ろ過により、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ製ヒツジＩｇＧのナノクラスターを生成した。ＤＬＳにおける計数率は、およそ１０００カウント／秒（counts per second）（それに対し、トレハロースを含有する分散系は数万カウント／秒）であり、よって、正確な自己相関関数を得るには小さすぎる。最終タンパク質濃度２９６ｍｇ／ｍｌに対し、僅か７の固有粘度により粘度は僅か７３ｃｐであった。ｍｇ／ｍｌ単位の所定のアミノ酸又はペプチド質量濃度において、緊張度はペプチドの分子量と共に減少するため、クラウダーとしてのアルギニン及び他のアミノ酸の使用には利点がある。
【０４００】
ｐＨ６．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーにおける１００ｍｇ／ｍＬアルギニンクラウダーからなる２９６ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ分散系（表２６における列３）を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により解析した。ＳＥＭ（３０ＫＶにおけるＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ−５５００走査型電子顕微鏡を使用）用のアルギニン試料を調製するため、クラウダーとしてＮＭＰを用いて、一定のクラウダー体積分率０．０７７（２９６ｍｇ／ｍｌの本来の分散系におけるクラウダー分率の体積に相当）において約７５ｍｇ／ｍｌ（本来のタンパク質濃度の４分の１）となるよう分散系を希釈し、レイシー炭素膜を備える銅ＴＥＭグリッド上に滴下し、過剰な液体を拭き取って除去し、液体窒素中に浸漬することにより急速に凍結し、続いて凍結乾燥した。図５２において個々のナノクラスターの画像を見ることができる。各画像は、レイシー炭素グリッド上における単一のナノ粒子を含有する。ナノクラスターは、直径５０〜１００ｎｍの間である。
【０４０１】
【表２８】
2014514275.tif 000056
【０４０２】
貯蔵安定性。外因性クラウダーとしてトレハロースを用いて調製した分散系の貯蔵安定性を解析し、これを表２７及び図５０に報告する。図５３に示す通り、遠心ろ過濃縮方法により形成された、５０ｍＭリン酸バッファー（０．９２の重量オスモル濃度／等張性濃度における重量オスモル濃度）における２１７ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ、７０ｍｇ／ｍＬトレハロース分散系を約１カ月間凍結した。−４０℃における凍結状態で１カ月間貯蔵した後、試料を４℃の冷蔵庫で解凍し、続いて解析した。粘度及び水力学的直径は、貯蔵後に殆ど変化しなかった。
【０４０３】
【表２９】
2014514275.tif 000057
【０４０４】
無菌分散系の生成は全製造コストを低下させるため、産業上の利用に有益となり得る。したがって、滅菌ろ過の使用を解析した。表２７にも示す試料の滅菌ろ過の結果を表２８に示す。分散系を形成した後、滅菌ろ過実験を行った。５０ｍＭリン酸バッファー（０．９２の重量オスモル濃度／等張性濃度における重量オスモル濃度）における２１７ｍｇ／ｍＬ  ＩｇＧ、７０ｍｇ／ｍＬトレハロース分散系を最初に調製し、０．２２μｍフィルターに通した。次に、表２７に示す条件に従って分散系を凍結し、貯蔵し、解凍した。その後、水力学的直径を測定した。ろ過前後で同様のサイズは、フィルターを通り抜けたナノクラスターを示す。
【０４０５】
Ｃａｒｙ  ３Ｅ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において分散系の濁度を測定し、これを表２９６に報告する。図５１は、変動波長においてろ過前の濁度が非常に低いことを立証し、よって、分散系の光学的透明度を強化する。
【０４０６】
【表３０】
2014514275.tif 000058
【０４０７】
【表３１】
2014514275.tif 000059
【０４０８】
本明細書に記されているいずれかの実施形態は、本発明のいずれかの方法、キット、試薬又は組成物に関して実行することができ、逆もまた同じであると考えられる。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
【０４０９】
本明細書に記載されている特定の実施形態は、例証として示されており、本発明を限定するものではないことが理解されよう。本発明の主要な特色は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において利用することができる。当業者であれば、本明細書に記載されている特定の手順の数多くの均等物を認識できる、或いは単なるルーチン実験により確認することができる。このような均等物は、本発明の範囲内に収まるものと考慮され、特許請求の範囲により網羅される。
【０４１０】
本明細書において言及されているあらゆる刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技能水準を示す。あらゆる刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願それぞれが、参照により援用されていると明確且つ個々に示されているのと同じ程度まで、参照によりここに援用する。
【０４１１】
本明細書における用語「又はこれらの組み合わせ」は、この用語に先行して列挙されている項目のあらゆる並べ替え及び組み合わせを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はこれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣのうち少なくとも１つを包含するよう企図されており、特定の文脈において順序が重要であるならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも包含するよう企図されている。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等々、１つ又は複数の項目又は用語の反復を含有する組み合わせが明らかに包含されている。当業者であれば、他の事柄が文脈から明らかでない限り、通常、任意の組み合わせにおける項目又は用語の数に限界が存在しないことを理解されよう。
【０４１２】
本明細書において開示及び請求されている組成物及び／又は方法は全て、本開示を踏まえることにより、必要以上に実験することなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物及び／又は方法並びに方法のステップ又は一連のステップに変化を加えてよいことは、当業者にとって明らかであろう。当業者にとって明らかなこのような類似の代替及び修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の内に収まるものと考えられる。
【０４１３】
本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、単に例証目的のためのものであり、これを踏まえた様々な修正又は変化が当業者に示唆され、本願の精神及び権限並びに添付の特許請求の範囲の内に包含されるべきものであることが理解される。本明細書に引用されているあらゆる刊行物、特許及び特許出願は、これによりあらゆる点においてその全内容を参照により援用される。
【０４１４】
ＶＩＩ．実施形態
実施形態１
透明な、低粘性、高タンパク質濃度の分散系であって、前記分散系が複数のナノクラスターを含み、前記複数のナノクラスターのそれぞれが複数のタンパク質を含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有する、分散系。
【０４１５】
実施形態２
前記複数のナノクラスターのそれぞれの平均直径が約２０から約１，０００ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４１６】
実施形態３
前記平均直径が水力学的直径の平均値である、実施形態２に記載の分散系。
【０４１７】
実施形態４
前記平均直径が、前記複数のナノクラスターの最長寸法の平均値である、実施形態２に記載の分散系。
【０４１８】
実施形態５
前記複数のナノクラスター中の前記複数のタンパク質の５％未満が不可逆的に凝集している、実施形態１に記載の分散系。
【０４１９】
実施形態６
前記複数のナノクラスター中の前記複数のタンパク質の２％未満が不可逆的に凝集している、実施形態１に記載の分散系。
【０４２０】
実施形態７
前記複数のナノクラスター中の前記複数のタンパク質の１％未満が不可逆的に凝集している、実施形態１に記載の分散系。
【０４２１】
実施形態８
粘度が約１センチポアズから約１０００センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２２】
実施形態９
粘度が約１センチポアズから約５００センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２３】
実施形態１０
粘度が約１センチポアズから約２５０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２４】
実施形態１１
粘度が約１センチポアズから約１００センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２５】
実施形態１２
粘度が約１センチポアズから約９０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２６】
実施形態１３
粘度が約１センチポアズから約８０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２７】
実施形態１４
粘度が約１センチポアズから約７０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２８】
実施形態１５
粘度が約１センチポアズから約６０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４２９】
実施形態１６
粘度が約１センチポアズから約５０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３０】
実施形態１７
粘度が約１センチポアズから約４０センチポアズの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３１】
実施形態１８
粘度が約５０センチポアズであり、せん断速度が約１０００秒-1である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３２】
実施形態１９
粘度が約２５センチポアズから約７５センチポアズの間であり、せん断速度が約１０００秒-1である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３３】
実施形態２０
粘度が約１０センチポアズから約９０センチポアズの間であり、せん断速度が約１０００秒-1である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３４】
実施形態２１
粘度が約５０センチポアズであり、せん断速度が約１００秒-1から約５００００秒-1の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３５】
実施形態２２
粘度が約２５センチポアズから７５センチポアズの間であり、せん断速度が約１００秒-1から約５００００秒-1の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３６】
実施形態２３
粘度が約２５センチポアズから７５センチポアズの間であり、せん断速度が約１０００秒-1から約１００００秒-1の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４３７】
実施形態２４
前記粘度が、注射器装填法により測定される、実施形態８から２３のいずれか一項に記載の分散系。
【０４３８】
実施形態２５
前記分散系は注射可能であるが、同一濃度の前記複数のタンパク質の水溶液は注射可能ではない、実施形態１に記載の分散系。
【０４３９】
実施形態２６
粘度が、同一濃度の前記複数のタンパク質の水溶液の粘度の約２分の１である、実施形態１に記載の分散系。
【０４４０】
実施形態２７
粘度が、同一濃度の前記複数のタンパク質の水溶液の粘度の約５分の１である、実施形態１に記載の分散系。
【０４４１】
実施形態２８
粘度が、同一濃度の前記複数のタンパク質の水溶液の粘度の約１０分の１である、実施形態１に記載の分散系。
【０４４２】
実施形態２９
約２００ｍｇ／ｍＬから約６００ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４３】
実施形態３０
約２００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４４】
実施形態３１
約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４５】
実施形態３２
約２００ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬの間の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４６】
実施形態３３
約２００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４７】
実施形態３４
約３００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４８】
実施形態３５
約４００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４４９】
実施形態３６
約５００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４５０】
実施形態３７
約６００ｍｇ／ｍＬ超の前記タンパク質を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４５１】
実施形態３８
光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満であり、前記光減衰量測定値が、波長４００ｎｍから７００ｎｍの間での平均の光減衰量を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４５２】
実施形態３９
光減衰量測定値が約０．０５ｃｍ-1未満、０．１ｃｍ-1未満、０．２５ｃｍ-1未満、又は０．５ｃｍ-1未満であり、前記光減衰量測定値が、波長６００ｎｍで得られるものである実施形態１に記載の分散系。
【０４５３】
実施形態４０
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約８００ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４５４】
実施形態４１
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約６００ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４５５】
実施形態４２
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約４００ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４５６】
実施形態４３
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約２００ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４５７】
実施形態４４
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約１００ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４５８】
実施形態４５
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約７５ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４５９】
実施形態４６
前記複数のナノクラスターの平均直径が、約２０ナノメートルから約５０ナノメートルの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６０】
実施形態４７
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約８０％の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６１】
実施形態４８
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約７０％の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６２】
実施形態４９
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約６０％の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６３】
実施形態５０
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約３０％から約５０％の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６４】
実施形態５１
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約５０％から約６０％の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６５】
実施形態５２
前記複数のナノクラスターの充填率の平均値が、約６０％から約７４％の間である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６６】
実施形態５３
クラウダーを含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４６７】
実施形態５４
クラウダーを含み、前記クラウダーが単糖である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６８】
実施形態５５
クラウダーを含み、前記クラウダーが、グルコース、マンノース、フルクトース、アラビノース、キシロース、リボース、及びガラクトースから選択される単糖である、実施形態１に記載の分散系。
【０４６９】
実施形態５６
クラウダーを含み、前記クラウダーが二糖である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７０】
実施形態５７
クラウダーを含み、前記クラウダーが、トレハロース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース、マルトース、又はスクロースから選択される二糖である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７１】
実施形態５８
クラウダーを含み、前記クラウダーが多糖である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７２】
実施形態５９
クラウダーを含み、前記クラウダーが多価電解質である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７３】
実施形態６０
クラウダーを含み、前記クラウダーがポリ酸である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７４】
実施形態６１
クラウダーを含み、前記クラウダーがポリ（エチレングリコール）である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７５】
実施形態６２
クラウダーを含み、前記クラウダーが、ＰＥＧ２００からＰＥＧ５０００の間の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７６】
実施形態６３
クラウダーを含み、前記クラウダーが塩である、実施形態１に記載の分散系。
【０４７７】
実施形態６４
クラウダーを含み、前記クラウダーがデキストランである、実施形態１に記載の分散系。
【０４７８】
実施形態６５
クラウダーを含み、前記クラウダーがポラキサマーである、実施形態１に記載の分散系。
【０４７９】
実施形態６６
クラウダーを含み、前記クラウダーがアルコールである、実施形態１に記載の分散系。
【０４８０】
実施形態６７
クラウダーを含み、前記クラウダーがアミノ酸又はペプチド又はタンパク質である、実施形態１に記載の分散系。
【０４８１】
実施形態６８
前記タンパク質のクラウダーが、ジペプチド、トリペプチド、４個のアミノ酸から成るペプチド、又は５個のアミノ酸から成るペプチドである、実施形態６７に記載の分散系。
【０４８２】
実施形態６９
クラウダーを含み、前記クラウダーが界面活性剤である、実施形態１に記載の分散系。
【０４８３】
実施形態７０
トレハロース、ポリ（エチレングリコール）、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、バッファー、又はそれらの組合せから成る群から選択されるクラウダーを含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４８４】
実施形態７１
タンパク質対クラウダーを約１：１の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４８５】
実施形態７２
タンパク質対クラウダーを約２：１の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４８６】
実施形態７３
タンパク質対クラウダーを約３：１の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４８７】
実施形態７４
タンパク質対クラウダーを約４：１の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４８８】
実施形態７５
タンパク質対クラウダーを約１：２の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４８９】
実施形態７６
タンパク質対クラウダーを約１：３、１：４、又は１：１０の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４９０】
実施形態７７
タンパク質対クラウダーを約１０：１の重量比で含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４９１】
実施形態７８
前記複数のナノクラスターが、多数の異なるタンパク質種を含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４９２】
実施形態７９
前記複数のナノクラスターが第１の複数のナノクラスターであり、前記複数のタンパク質が第１の複数のタンパク質であり、前記分散系が第２の複数のナノクラスターをさらに含み、前記第２の複数のナノクラスターのそれぞれが第２の複数のタンパク質を含み、前記第２の複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記第２の複数のタンパク質が前記第１の複数のタンパク質とは異なる、実施形態１に記載の分散系。
【０４９３】
実施形態８０
前記複数のナノクラスターが、制御放出成分又は制御放出ポリマーをさらに含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４９４】
実施形態８１
前記複数のナノクラスターのそれぞれが低分子量化合物をさらに含み、前記低分子量化合物が、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、金属、金属酸化物、又はアプタマーである、実施形態１に記載の分散系。
【０４９５】
実施形態８２
複数のナノ粒子をさらに含む、実施形態１に記載の分散系。
【０４９６】
実施形態８３
前記複数のナノ粒子が、Ａｕ、磁性剤、光学剤、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、金属、金属酸化物、又はアプタマーから選択される複数の化合物を含む、実施形態８２に記載の分散系。
【０４９７】
実施形態８４
ｐＨが、前記複数のタンパク質のほぼ等電点の値である、実施形態１に記載の分散系。
【０４９８】
実施形態８５
ｐＨが、前記複数のタンパク質の等電点とは異なる、約２．５未満、約２．０未満、約１．５未満、約１．０未満、約０．８未満、約０．７５未満、約０．５未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１未満、又は約０．０５未満のｐＨ単位である、実施形態１に記載の分散系。
【０４９９】
実施形態８６
ｐＨが、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、又は約９．５である、実施形態１に記載の分散系。
【０５００】
実施形態８７
ヒト血液に対して等張である、実施形態１に記載の分散系。
【０５０１】
実施形態８８
ヒト血液に対して低張である、実施形態１に記載の分散系。
【０５０２】
実施形態８９
容量オスモル濃度が約３００ｍＯｓｍｏ／Ｌである、実施形態１に記載の分散系。
【０５０３】
実施形態９０
容量オスモル濃度が、約２５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０５０４】
実施形態９１
容量オスモル濃度が約１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから４５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０５０５】
実施形態９２
容量オスモル濃度が約１５０ｍＯｓｍｏ／Ｌから６００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間である、実施形態１に記載の分散系。
【０５０６】
実施形態９３
前記複数のタンパク質のそれぞれが、抗体、抗体断片、ペグ化タンパク質、脂質付加タンパク質、成長因子若しくは成長因子拮抗薬、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬、受容体若しくは受容体拮抗薬、抗原、ワクチン、又は抗炎症剤である、実施形態１に記載の分散系。
【０５０７】
実施形態９４
前記複数のタンパク質が複数のコンジュゲートであり、前記コンジュゲートのそれぞれが、低分子量化合物と結合しているタンパク質であり、前記低分子量化合物が、診断剤、医薬剤、造影剤、発蛍光団、放射性同位体、毒素、常磁性剤、又はアプタマーである、実施形態１に記載の分散系。
【０５０８】
実施形態９５
前記複数のタンパク質が、自己群集している、実施形態１に記載の分散系。
【０５０９】
実施形態９６
前記複数のタンパク質が複数のコンジュゲートではなく、前記タンパク質のそれぞれがアミノ酸から成る、実施形態１から９５のいずれか一項に記載の分散系。
【０５１０】
実施形態９７
実施形態１から９６のいずれか一項に記載の分散系を含む医薬組成物であって、前記複数のタンパク質が、複数の薬学的に活性なタンパク質である、医薬組成物。
【０５１１】
実施形態９８
２１から２７ゲージの針に取り付けられている注射器内に入っている、実施形態９７に記載の医薬組成物。
【０５１２】
実施形態９９
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、タンパク質−クラウダー配合液を濃縮し、それにより前記分散系を形成するステップを含み、前記分散系が複数のナノクラスターを含み、前記複数のナノクラスターのそれぞれが複数のタンパク質を含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含み、前記分散系が、複数のクラウダーを含む、方法。
【０５１３】
実施形態１００
前記濃縮するステップに先立ち、前記タンパク質の溶液を、容器中でクラウダーと配合してタンパク質−クラウダー配合液を形成するステップを含む、実施形態９９に記載の方法。
【０５１４】
実施形態１０１
前記タンパク質−クラウダー配合液が、タンパク質ナノクラスターの平均直径が、前記濃縮するステップにより形成される前記複数のタンパク質ナノクラスターの平均直径とは異なる、タンパク質ナノクラスター分散系を含む、実施形態９９に記載の方法。
【０５１５】
実施形態１０２
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質をクラウダー及び分散液と配合し、それにより、複数の前記タンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含む、方法。
【０５１６】
実施形態１０３
前記配合するステップに先立ち、タンパク質混合物から溶媒を除去し、それにより前記粉末形態のタンパク質を形成するステップを含む、実施形態１０２に記載の方法。
【０５１７】
実施形態１０４
前記タンパク質混合物が、タンパク質分散系又はタンパク質溶液である、実施形態１０３に記載の方法。
【０５１８】
実施形態１０５
前記除去するステップが、前記タンパク質混合物を粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、若しくは噴霧フリーズドライ、噴霧凍結するステップを含む、又は、前記除去するステップが、前記タンパク質混合物に、渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む、実施形態１０３に記載の方法。
【０５１９】
実施形態１０６
前記溶媒が水である、実施形態１０３に記載の方法。
【０５２０】
実施形態１０７
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系を作製する方法であって、粉末形態のタンパク質を分散液と配合し、それにより、複数の前記タンパク質を含む複数のナノクラスターを含む分散系を形成するステップを含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含む、方法。
【０５２１】
実施形態１０８
前記配合するステップに先立ち、タンパク質−クラウダー混合物から溶媒を除去し、それにより前記粉末形態のタンパク質を形成するステップを含む、実施形態１０７に記載の方法。
【０５２２】
実施形態１０９
前記タンパク質−クラウダー混合物が、タンパク質分散系又はタンパク質溶液である、実施形態１０８に記載の方法。
【０５２３】
実施形態１１０
前記除去するステップが、前記タンパク質−クラウダー混合物を粉砕、沈殿、透析、篩過、噴霧乾燥、凍結乾燥、若しくは噴霧フリーズドライ、噴霧凍結するステップを含む、又は、前記除去するステップが、前記タンパク質−クラウダー混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む、実施形態１０８に記載の方法。
【０５２４】
実施形態１１１
前記溶媒が水である、実施形態１０８に記載の方法。
【０５２５】
実施形態１１２
前記分散液が、水、水性液、又は非水性液である、実施形態１０２又は１０７に記載の方法。
【０５２６】
実施形態１１３
前記分散液が、安息香酸ベンジル、又は、安息香酸ベンジルと、ベニバナ油、ゴマ油、ヒマシ油、綿実油、キャノーラ油、サフラン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、ａ−トコフェロール、Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２、及びオレイン酸エチルから選択される１つ若しくは複数の油とを合わせたものである、実施形態１０２又は１０７に記載の方法。
【０５２７】
実施形態１１４
前記除去するステップが、前記混合物に渦巻き式その場凍結技術（ＳＷＩＦＴ）を適用するステップを含む、実施形態１０３又は１０８に記載の方法。
【０５２８】
実施形態１１５
ＳＷＩＦＴを適用するステップが、
１．前記混合物を含有するバイアルを、極低温剤と接触させながら回転させるステップと、
２．前記混合物をすべて凍結するステップであり、前記バイアルの内側表面上の前記凍結された混合物の薄いフィルム、及び、前記バイアルの中心部に向かってらせん方向に１つ又は複数の後続のフィルムが得られるステップと、
３．前記凍結された混合物を凍結乾燥するステップと
を含む、実施形態１１４に記載の方法。
【０５２９】
実施形態１１６
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約３００ｍｇ／ｍＬ超である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３０】
実施形態１１７
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約４００ｍｇ／ｍＬ超である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３１】
実施形態１１８
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約５００ｍｇ／ｍＬ超である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３２】
実施形態１１９
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約６００ｍｇ／ｍＬ超である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３３】
実施形態１２０
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３４】
実施形態１２１
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約３００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬの間である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３５】
実施形態１２２
前記分散系中の前記タンパク質の濃度が約４００ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの間である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３６】
実施形態１２３
前記クラウダーが、グリセロール、エリトリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリ（エチレングリコール）、アミノ酸、ペプチド、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、有機共溶媒であり、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テタヒドロフルフリルアルコール、ジグリム、乳酸エチルから選択される有機共溶媒、それらの塩、バッファー、又は組合せである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３７】
実施形態１２４
前記クラウダーが多糖である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３８】
実施形態１２５
前記クラウダーがポリ（エチレングリコール）である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５３９】
実施形態１２６
前記クラウダーがＮＭＰ又はアルコールである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５４０】
実施形態１２７
前記クラウダーがアミノ酸である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５４１】
実施形態１２８
前記濃縮するステップが、ろ過を用いて実施される、実施形態９９に記載の方法。
【０５４２】
実施形態１２９
前記濃縮するステップが、遠心ろ過を用いて実施される、実施形態９９に記載の方法。
【０５４３】
実施形態１３０
前記濃縮するステップが、正の気体圧力又は機械的圧力を用いて実施される、実施形態９９に記載の方法。
【０５４４】
実施形態１３１
前記濃縮するステップが、接線流ろ過、透析、又はバッファーの吸収を用いて実施される、実施形態９９に記載の方法。
【０５４５】
実施形態１３２
クラウダー又は前記タンパク質が、前記濃縮するステップの間に前記タンパク質−クラウダー配合液に加えられる、実施形態９９に記載の方法。
【０５４６】
実施形態１３３
ろ過により前記分散系を滅菌するステップをさらに含む、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５４７】
実施形態１３４
直径約２００ｎｍの細孔を備えるフィルターを通したろ過により前記分散系を滅菌するステップをさらに含む、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５４８】
実施形態１３５
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５４９】
実施形態１３６
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの解凍後の平均直径が、前記複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１％以内である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５０】
実施形態１３７
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの解凍後の平均直径が、前記複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約５％以内である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５１】
実施形態１３８
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの解凍後の平均直径が、前記複数のナノクラスターの凍結前の平均直径の約１０％以内である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５２】
実施形態１３９
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の粘度が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５３】
実施形態１４０
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の解凍後の粘度が、前記分散系の凍結前の粘度の約１％以内である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５４】
実施形態１４１
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の解凍後の粘度が、前記分散系の凍結前の粘度の約５％以内である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５５】
実施形態１４２
前記分散系を凍結するステップ、貯蔵するステップ、及び解凍するステップをさらに含み、前記分散系の解凍後の粘度が、前記分散系の凍結前の粘度の約１０％以内である、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５６】
実施形態１４３
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１日間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５７】
実施形態１４４
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約３日間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５８】
実施形態１４５
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１週間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５５９】
実施形態１４６
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１カ月間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５６０】
実施形態１４７
前記分散系を凍結するステップ、前記凍結された分散系を約１年間貯蔵するステップ、及び前記分散系を解凍するステップをさらに含み、前記複数のナノクラスターの平均直径が、解凍後と凍結前とでほぼ同じである、実施形態９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【０５６１】
実施形態１４８
当該治療を必要とする患者における疾患を治療する方法であって、有効量の実施形態１から９６のいずれか一項に記載の分散系を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【０５６２】
実施形態１４９
前記投与される分散系が、前記患者の体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ、約１０ｍｇのタンパク質を含む、実施形態１４８に記載の方法。
【０５６３】
実施形態１５０
透明な、低粘性、高タンパク質のタンパク質ナノクラスター分散系のタンパク質ナノクラスターの平均直径を修正する方法であって、前記分散系中のクラウダー又は前記タンパク質の濃度を増加又は減少させるステップを含み、前記分散系が複数のナノクラスターを含み、前記複数のナノクラスターのそれぞれが複数のタンパク質を含み、前記複数のタンパク質のそれぞれがアミノ酸配列同一性を共有し、前記分散系が、透明な、低粘性の分散系であり、前記分散系が、約２００ｍｇ／ｍＬ超の濃度の前記タンパク質を含む、方法。
【０５６４】
実施形態１５１
実施形態１から９６のいずれか一項に記載の分散系又は実施形態９７若しくは９８に記載の医薬組成物を備えるキット。
【０５６５】
実施形態１５２
粉末形態のタンパク質又は粉末形態のタンパク質−クラウダー混合物と分散液とを備えるキット。
【０５６６】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【国際調査報告】
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