(57)【要約】本発明は、試料中の加水分解酵素の存在または量を、該酵素のための新規基質に基づいて決定するための新規方法を提供し、また、このような加水分解酵素のための高感度アッセイ法を提供する組成物および方法も提供する。一態様では、本発明は、特定の加水分解酵素のための基質、これらの基質を含有する組成物、および基質を処理することができる加水分解酵素の存在を決定するために、これらの基質を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、加水分解酵素を、例えばＥＬＩＳＡなどのアッセイ系のための標識として使用することができ、またはオリゴヌクレオチドの発現が、機能的加水分解酵素を含むポリペプチドを生成するような方式で発現されるオリゴヌクレオチドに、加水分解酵素をコードする核酸を付着させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物である加水分解酵素基質
【化３９】
2014505059.tif 000043
［式中、
Ａは、芳香族基もしくは複素芳香族基、１−アルケン、または１−アルキンであり、そのそれぞれは、必要に応じて置換されており、
各Ｒは、独立に、Ｈ、または必要に応じて置換されているＣ１−Ｃ４アルキルもしくはアリールであり、
ｎは、１〜４の整数であり、
Ｘは、基質部分を含む基であり、
ここで、該基質部分は、加水分解酵素のための基質の認識成分を含み、ここで、該加水分解酵素の活性は、該式（Ｉ）の化合物を加水分解して、化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を形成することができる］。
【化４０】
2014505059.tif 000044
【請求項２】
Ａが、必要に応じて置換されている芳香族基または複素芳香族基である、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項３】
Ａが、必要に応じて置換されているフェニルまたはナフチルである、請求項２に記載の加水分解酵素基質。
【請求項４】
Ａが、式（ＩＶ）の１−アルケンである
【化４１】
2014505059.tif 000045
［式中、
波線が、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、各Ｇ、Ｇ’およびＧ’’が、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されている基である］、
請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項５】
Ａが、式（Ｖ）の１−アルキンである
【化４２】
2014505059.tif 000046
［式中、
波線が、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、Ｇが、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されているメンバーである］、
請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項６】
Ｒが、Ｈ、Ｍｅまたはフェニルである、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項７】
Ｘが糖を含む、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項８】
前記化合物が、式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）を有する、請求項７に記載の加水分解酵素基質
【化４３】
2014505059.tif 000047
［式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ２ＯＱであり、各Ｑは、独立に、Ｈ、または単糖、二糖もしくはオリゴ糖であり、Ａ、Ｒおよびｎは、請求項１に定義されている通りである］。
【請求項９】
前記化合物が、式（ＶＩＩ）のエステルである、請求項１に記載の加水分解酵素基質
【化４４】
2014505059.tif 000048
［式中、Ｒ３は、Ｈ、または必要に応じて置換されているアリール基、ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ８アルキル基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基もしくはＣ３−Ｃ８ヘテロシクリル基であり、Ａ、Ｒおよびｎは、請求項１に定義されている通りである］。
【請求項１０】
Ｒ３が、Ｍｅ、Ｅｔおよびフェニルからなる群から選択され、または、ここで、ＨＯ２Ｃ−Ｒ３がアルファ−アミノ酸である、請求項９に記載の加水分解酵素基質。
【請求項１１】
前記化合物が、式（ＶＩＩＩ）を有する、請求項１に記載の加水分解酵素基質
【化４５】
2014505059.tif 000049
［式中、Ｚは、Ｎ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＰまたはＰ−ＯＨであり、Ｒ４は、Ｏ、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールである］。
【請求項１２】
Ｘがリン酸基を含む、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項１３】
前記化合物が、式（ＩＸ）を有する化合物
【化４６】
2014505059.tif 000050
またはその塩である、請求項１２に記載の加水分解酵素基質。
【請求項１４】
Ａが、必要に応じて置換されているフェニル基である、請求項１から３または６から１３のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
【請求項１５】
前記フェニル基が、非置換であるか、またはハロ、ヒドロキシ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’２、ＯＲ’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’もしくはＳＯ２ＮＲ’２から選択される１〜３個の基で置換されており、
ここで、各Ｒ’が、独立に、Ｈまたは必要に応じて置換されているＣ１−４アルキルであり、同じまたは隣接する原子上の２つのＲ’が、一緒になって、必要に応じて置換されているＣ３−Ｃ８複素環式環を形成することができる、
請求項１４に記載の加水分解酵素基質。
【請求項１６】
アルキル基および複素環式基の任意選択の置換基が、ハロ、オキソ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’’、ＣＯＮＲ’’２、ＮＲ’’２、ＯＲ’’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’’またはＳＯ２ＮＲ’’２から選択され、ここで、各Ｒ’’が、独立に、ＨまたはＣ１−４アルキルである、先行する請求項のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
【請求項１７】
Ａが、式（Ｘ）の基である
【化４７】
2014505059.tif 000051
［式中、
波線が、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、
各Ｇが、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されている基である］、
請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項１８】
ＲがＨである、先行する請求項のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
【請求項１９】
ｎが１である、先行する請求項のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
【請求項２０】
Ｘが、グリコシダーゼのための基質部分を含む、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項２１】
前記グリコシダーゼが、ベータ−ガラクトシダーゼである、請求項２０に記載の加水分解酵素基質。
【請求項２２】
Ｘが、エステラーゼのための基質部分を含む、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項２３】
前記エステラーゼが、カルボキシルエステラーゼ、アセチルエステラーゼおよびアルファ−アミノ酸エステラーゼからなる群から選択される、請求項２２に記載の加水分解酵素基質。
【請求項２４】
Ｘが、ホスファターゼのための基質部分を含む、請求項１に記載の加水分解酵素基質。
【請求項２５】
前記ホスファターゼが、アルカリホスファターゼである、請求項２４に記載の加水分解酵素基質。
【請求項２６】
ａ）請求項１から２５のいずれかに記載の加水分解酵素基質と、
ｂ）加水分解酵素であって、該加水分解酵素基質を切断して、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、該加水分解酵素によって触媒される該切断反応の生成物として生成することができる加水分解酵素（該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子は、前記式（ＩＩ）の構造を有し、
【化４８】
2014505059.tif 000052
式中、Ａ、Ｒおよびｎは、請求項１に定義されている通りである）
とを含む、組合せ物。
【請求項２７】
前記加水分解酵素が、エステラーゼ、ホスファターゼまたはグリコシダーゼである、請求項２６に記載の組合せ物。
【請求項２８】
前記加水分解酵素が、アセチルエステラーゼ、アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される、請求項２７に記載の組合せ物。
【請求項２９】
前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、請求項２７に記載の組合せ物。
【請求項３０】
前記加水分解酵素が、α−アミノ酸エステラーゼである、請求項２８に記載の組合せ物。
【請求項３１】
前記加水分解酵素が、ベータ−ガラクトシダーゼである、請求項２７に記載の組合せ物。
【請求項３２】
前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼである、請求項２７に記載の組合せ物。
【請求項３３】
前記加水分解酵素が触媒する前記切断反応によって生成された前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化することができる酸化試薬をさらに含む、請求項２６に記載の組合せ物。
【請求項３４】
前記酸化試薬が、酸素の存在下で、前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼである、請求項３３に記載の組合せ物。
【請求項３５】
前記Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む、請求項３４に記載の組合せ物。
【請求項３６】
前記Ｈ２Ｏ２を測定するための前記試薬が、ペルオキシダーゼ、４−ＡＡおよび／またはアニリン類似体を含む、請求項３５に記載の組合せ物。
【請求項３７】
前記酸化試薬が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項３３に記載の組合せ物。
【請求項３８】
ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をさらに含む、請求項３７に記載の組合せ物。
【請求項３９】
前記ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定するための試薬をさらに含む、請求項３８に記載の組合せ物。
【請求項４０】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で前記アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼとをさらに含む、請求項３４に記載の組合せ物。
【請求項４１】
前記Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む、請求項４０に記載の組合せ物。
【請求項４２】
前記Ｈ２Ｏ２を測定するための前記試薬が、ペルオキシダーゼ、アンチピリン、フェノールおよび／またはアニリン類似体の少なくとも１つを含む、請求項４１に記載の組合せ物。
【請求項４３】
前記加水分解酵素基質が、β−グリコシダーゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼである、請求項２６に記載の組合せ物。
【請求項４４】
ａ）前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下で酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼと、
ｂ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、
ｃ）該アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼと、
をさらに含む、請求項４３に記載の組合せ物。
【請求項４５】
Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む、請求項４４に記載の組合せ物。
【請求項４６】
前記加水分解酵素基質が、アルカリホスファターゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、請求項２６に記載の組合せ物。
【請求項４７】
ａ）前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下で酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼと、
ｂ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、
ｃ）該酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼと、
をさらに含む、請求項４６に記載の組合せ物。
【請求項４８】
Ｈ２Ｏ２を測定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項４７に記載の組合せ物。
【請求項４９】
前記組合せ物の成分が、キットに含まれる、請求項２６から４８のいずれかに記載の組合せ物。
【請求項５０】
標的のためのアッセイ系、単離系および／または生成系に含まれる、請求項２６から４９のいずれかに記載の組合せ物。
【請求項５１】
前記標的が、無機分子、有機分子および／またはその複合体である、請求項５０に記載の組合せ物。
【請求項５２】
前記標的が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体からなる群から選択される有機分子である、請求項５１に記載の組合せ物。
【請求項５３】
前記系が、免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションおよび／または配列決定のための系である、請求項５２に記載の組合せ物。
【請求項５４】
試料中の加水分解酵素の活性および／または量を評価する方法であって、
ａ）実施形態１から２５のいずれかに記載の、式（Ｉ）：
【化４９】
2014505059.tif 000053
の構造を有する加水分解酵素基質を、
加水分解酵素を含有するか、または加水分解酵素を含有すると疑われる試料と、該加水分解酵素が該試料中に存在する場合には該基質を切断する条件下で接触させて、式（ＩＩ）の構造を有するアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子および式（ＩＩＩ）の構造を有する化合物
【化５０】
2014505059.tif 000054
［式中、Ａ、Ｒ、ｎおよびＸは、請求項１に定義されている通りである］
を生成するステップと、
ｂ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価して、該試料中の該加水分解酵素の活性および／または量を評価するステップと
を含む、方法。
【請求項５５】
前記加水分解酵素が、エステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはグリコシダーゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記加水分解酵素が、アセチルエステラーゼ、アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼおよびホスファターゼからなる群から選択されるエステラーゼである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記加水分解酵素が、α−アミノ酸エステラーゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記加水分解酵素が、ベータ−ガラクトシダーゼである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価する前記ステップが、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、酸素の存在下で、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子をアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、Ｈ２Ｏ２を生成し、該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子をアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、該ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、
ａ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）該アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、該還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下で該アリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加のアリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）該Ｈ２Ｏ２の存在および／もしくは量、またはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の量を評価することと
によって評価される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、アンチピリン、フェノールおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記加水分解酵素基質が、β−グリコシダーゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６８】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価する前記ステップが、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成し、該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、４−ＡＡおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、該ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、
ａ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）該酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、該還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下で該アリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加の酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することと
によって評価される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記加水分解酵素基質が、アルカリホスファターゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項７５】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価する前記ステップが、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成し、該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、該ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、
ａ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）該酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、該還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下で該アリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加の酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することと
によって評価される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
標的のアッセイ、単離および／または生成の一部として実施される、請求項５４から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記標的が、無機分子、有機分子および／またはその複合体である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記有機分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションまたは配列決定の一部として実施される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
ＲＮＡまたはＤＮＡの配列決定をモニタするために使用される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、請求項８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／４３３，９０９号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の内容は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、特定のヒドロラーゼ酵素基質およびその使用に関する。特に、本発明は、いくつかの加水分解酵素のための基質として機能する新規化合物を提供し、それによってその加水分解酵素は、ヒドロラーゼ基質を、例えば本明細書に記載されている酵素的方法によって容易に検出できる加水分解生成物に転換する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
酵素は、ＥＬＩＳＡ系などの免疫アッセイ、ならびにＰＣＲおよび配列決定系などの核酸アッセイを含むいくつかの生化学系において、感度の高い標識として広範に利用されている。酵素は、しばしばそれらの活性に基づいて、一般には酵素による基質から生成物への変換、または例えば酸化状態と還元状態の間の補助因子の変換に基づいて間接的に検出される。
【０００４】
いくつかの実装形態では、検出される酵素は、抗体などの高度に特異的な複合化剤または結合剤に付着している。抗体が、検出される標的分子に結合する場合、その抗体複合体は、それに付着している酵素標識の存在を観察することによって検出することができ、酵素は、その活性に基づいて容易に検出される。他の系では、発現されるオリゴヌクレオチドは、標識として機能できる酵素をコードするヌクレオチドに連結させることによって標識される。オリゴヌクレオチドが発現される場合、酵素標識を含むタンパク質生成物により、この場合もやはり酵素活性に基づいて、検出が容易になる。
【０００５】
酵素活性を検出することによって、非常に効率的なシグナル増幅が得られる。少量で存在することが多い酵素（または標的化合物）を検出するのではなく、酵素活性、すなわち相対的に多量に添加することができる公知の基質に対するその効果を求める。単一の酵素分子は、数多くの基質分子の変換を触媒することができ（例えば、酵素は、１分当たり１０７回の反応を触媒することができる：ＴＨＥ  ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ、第３版、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９４頁（２００５年））、したがって、実際に検出される化学種は、酵素自体ではなく、酵素によって形成された生成物であり、または酵素によって消費された基質もしくは補助因子の消失量であり得る。したがって、酵素活性を観察する場合は、酵素自体ではなく、シグナルを高度に増幅する多数の基質分子または生成物分子を検出する。
【０００６】
このようないくつかの酵素標識は公知であり、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）で最も一般的に使用されるものには、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。使用されている他のものには、酢酸キナーゼ、ホタルルシフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。同文献の１９４〜１９５頁。
【０００７】
しかし、生化学的化学種を標識して、極度に少量でも検出しやすくするための新しい方法が依然として必要であり、したがって、新規な酵素標識系が必要である。また、痕跡量の加水分解酵素を、それらの酵素が標識として同様には使用されない他の状況において検出する方法が、依然として必要である。本発明は、このような方法、ならびにこれらの方法および条件において使用するための化合物および組成物を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、特定の加水分解酵素のための基質、これらの基質を含有する組成物、および基質を処理することができる加水分解酵素の存在を決定するために、これらの基質を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、加水分解酵素を、例えばＥＬＩＳＡなどのアッセイ系のための標識として使用することができ、またはオリゴヌクレオチドの発現が、機能的加水分解酵素を含むポリペプチドを生成するような方式で発現されるオリゴヌクレオチドに、加水分解酵素をコードする核酸を付着させることができる。本明細書に記載されている組成物および方法は、これらおよび他の系において加水分解酵素を検出するのに有用である。
【０００９】
一態様では、本発明は、目的の加水分解酵素のための基質である、次式の化合物を提供する
【００１０】
【化１】
2014505059.tif 000002
［式中、
Ａは、芳香族基もしくは複素芳香族基、１−アルケン、または１−アルキンであり、そのそれぞれは、必要に応じて置換されており、
各Ｒは、独立に、Ｈ、または必要に応じて置換されているＣ１−Ｃ４アルキルもしくはＣ６−Ｃ１０アリールであり、
ｎは、１〜４の整数であり、
Ｘは、基質部分を含む基であり、
基質部分は、加水分解酵素のための基質である分子断片を含み、加水分解酵素の活性は、式（Ｉ）の化合物を加水分解して、化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を形成することができる］。
【００１１】
【化２】
2014505059.tif 000003
これらの化合物において、Ａは、芳香族基または複素芳香族基、例えばＮ、ＯおよびＳから選択される最大３つのヘテロ原子を環員として必要に応じて含有する５〜６員の芳香族環、または８〜１０環員（そのうち４員までは、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であってよい）を有する二環式環系であってよい。いくつかの実施形態では、Ａは、フェニルまたはナフチルである。Ａは、本明細書に記載されている通り、一般に、アリール基またはヘテロアリール基に適している置換基として本明細書に記載されている基から選択される最大３個の置換基で、必要に応じて置換されていてもよい。
【００１２】
代替の実施形態では、Ａは、一般に２〜１０個の炭素原子、好ましくは２〜６個の炭素原子を含有する１−アルケニル基または１−アルキニル基である。これらの実施形態では、Ａは、原子価によって置換が可能となる範囲内で、アルキル基に適した基として本明細書に記載されている基で置換されていてもよい。一般にこれらの実施形態では、Ａは、最大３つの置換基で置換されている。
【００１３】
これらの化合物の特定の実施形態では、ｎは１である。Ａは、ｎが１である場合には、アリール、ヘテロアリール、１−アルケンまたは１−アルキンになるので、化合物は、次式を有する。
【００１４】
【化３】
2014505059.tif 000004
Ａ基は、式ＩＩＢのアルコールを、ベンジル型、アリル型、プロパルギル型のまたは同様に活性化されたヒドロキシルにするので、これらの実施形態は、示されているヒドロキシル基を酸化するように活性化される。これらの化合物は、アリールアルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび／またはアリールアルコールデヒドロゲナーゼ酵素による酸化にとって特に適している。これらの化合物のいくつかの実施形態では、ＲはＨであり、酸化生成物はアルデヒドであり、例えば生成物は、Ａがフェニル部分である場合にはベンズアルデヒドになる。
【００１５】
【化４】
2014505059.tif 000005
これらの実施形態はまた、検出可能なシグナルを増幅し、感度を実質的に増大するサイクリング系において使用するのに非常に適している。サイクリング系では、加水分解反応の最初の生成物（上記で示したアルコールＩＩＢ）を酸化して、式ＩＩ−ｏｘの酸化生成物を形成する追加の酵素と、酸化生成物を還元してアルコールＩＩＢに戻す還元酵素の存在が必要である。
【００１６】
【化５】
2014505059.tif 000006
これによって、式Ｉの基質の最初の加水分解から生じる有効なシグナルを増幅することができるサイクリング系が生成される。このサイクリングは、Ｇｕｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０巻（８号）：２８１１〜１７頁（１９９４年）に記載のアリールアルコールオキシダーゼおよびアリールアルコールデヒドロゲナーゼなどの任意の適切な試薬を使用して実施することができる。サイクリング系は、少量のまたは低レベルの目的の加水分解酵素を、例えば、ミリモル、マイクロモル、ナノモル、ピコモル、フェムトモル、アトモルまたはさらにはサブアトモル、例えばゼプトモルまたはヨクトモルレベルで検出するのに使用することができる。
【００１７】
本発明の系では、循環プロセス（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ）によって分析物の量が増大するが、この量は、酵素活性レベルを用いて検出することができ、酵素活性レベルと相関し得る。最初の加水分解生成物は、酸化形態と還元形態の間で循環するので、酵素の直接作用によって形成される加水分解生成物だけを検出することは、良好な感度を既に提供している場合もあるが、その代わりに、酸化反応または酸化生成物（ケトンまたはアルデヒド）のその後の反応のいずれかにおいて生成される、サイクリング反応から生じる副生成物を検出することもできる。上記で示したサイクリング反応は、このような副生成物、例えば酸化反応で生成されるＨ２Ｏ２、または還元反応で生成されるＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋を多量に生成することができる。さらにまたはあるいは、サイクリング反応系の操作中に関与する還元反応で消費されるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消失量をモニタすることもできる。これらの検出可能な化学種の量は、サイクリング反応に起因して、加水分解酵素基質の量よりもかなり多量になり得るので、感度は、このようなサイクリング方法を使用することによって著しく増大することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、酸化は、Ｏ２をオキシダントとして使用し、Ｈ２Ｏ２を副生成物として生成するアリールアルコールオキシダーゼによって達成される。このＨ２Ｏ２を検出して、反応における加水分解酵素の存在または量を決定することができる。少量のＨ２Ｏ２を決定するための方法は、当技術分野で周知である。Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬には、ペルオキシダーゼ酵素、アミノアンチピリン（例えば、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ））、フェノールおよび／またはアニリン類似体が含まれる。例えば、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応を使用することができ、この反応は、フェノールまたはアニリン類似体、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、および４−ＡＡを必要とする。この方法は、還元酵素またはサイクリング反応を必要とせずに実施することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、還元酵素、一般にデヒドロゲナーゼ（アリールアルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）が試験環境に含まれ、還元補助因子（例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）は、しばしば過剰に含まれる。補助因子は、サイクリング反応中に酸化されると、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を形成し、この酸化形態（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）の出現または還元形態（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）の消失量は、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。反応混合物は、式（ＩＩ）または（ＩＩｂ）のアルコールを酸化する酵素も含有するので、その結果は、本明細書でさらに記載されるサイクリングアッセイ系であり得る。
【００２０】
加水分解酵素、アルコールオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび／またはアリールアルコールデヒドロゲナーゼを含む様々な試薬および／または酵素は、任意の適切な形態で提供することができ、かつ／または使用することができる。いくつかの実施形態では、様々な試薬および／または酵素は、単離形態で提供され、かつ／または使用される。他の実施形態では、様々な試薬および／または酵素は、混合物で提供され、かつ／または使用される。
【００２１】
本発明の特定の実施形態のより詳細な記載を、以下に提示して、本発明の範囲および操作を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】図１．１は、ベータ−ガラクトシダーゼと反応してベンジルアルコールを放出し、次いでそれが、アリールアルコールオキシダーゼおよび酸素によって酸化されてベンズアルデヒドおよび過酸化水素になる、ベンジル置換ガラクトースを有する本発明の酵素基質の反応を図示している。
【図１−２】図１．２は、ベータ−ガラクトシダーゼによって加水分解されてアリルアルコールを放出し、続いてそのアリルアルコールが酸化されて、アルデヒドおよび過酸化水素になる、オレフィン含有ガラクトシド（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｉｃ）酵素基質を図示している。
【図２】図２は、ベータ−ガラクトシダーゼによって加水分解されてベンジルアルコールを形成し、続いてそのベンジルアルコールが追加の酵素（アリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ）によって酸化される、ベンジルガラクトシド酵素基質を図示している。酵素による酸化は、補因子であるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を使用し、それらは酸化ステップによって還元されてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを形成する。
【図３】図３は、本発明の加水分解酵素基質に作用する加水分解酵素によって生成されるベンジルアルコールを酸化させてベンズアルデヒドおよび過酸化水素を形成するためのアリールアルコールオキシダーゼおよび酸素の使用、続いて、そのベンズアルデヒドを還元してベンジルアルコールに戻すことを図示している。還元は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよびアルコールデヒドロゲナーゼを使用して、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を生成する。
【図４】図４は、アルカリホスファターゼによって加水分解されてホスフェートおよびベンジルアルコールを生成する加水分解酵素基質としてのリン酸ベンジルエステルを図示している。次いで、そのベンジルアルコールは、アリールアルコールオキシダーゼおよび酸素によって酸化されてベンズアルデヒドおよび過酸化水素を生成し；その際、反応速度を測定して、存在するアルカリホスファターゼの量を検出および／または定量化するために、過酸化水素形成をモニタすることができる。
【図５】図５は、アセチルエステラーゼのための加水分解酵素基質として作用し、ベンジルアルコールを放出し、次いでそれがアリールアルコールオキシダーゼなどの追加の酵素および酸素によって酸化される、ベンジルエステルを図示している。反応生成物はベンズアルデヒドおよび過酸化水素を包含し、それらは当分野で公知の方法によって測定することができる。
【図６】図６は、アルファ−アミノ酸エステラーゼのための加水分解酵素基質として作用するアルファ−アミノ酸のベンジルエステルを図示している。その酵素反応はベンジルアルコールを放出し、次いでそれが、アリールアルコールオキシダーゼなどの追加の酵素および酸素によって酸化される。反応生成物はベンズアルデヒドおよび過酸化水素を包含し、それらは当分野で公知の方法によって測定することができる。
【図７】図７は、カルボキシルエステラーゼのための加水分解酵素基質として作用し、ベンジルアルコールを放出し、次いでそれがアリールアルコールオキシダーゼなどの追加の酵素および酸素によって酸化される、ベンジルエステルを図示している。反応生成物はベンズアルデヒドおよび過酸化水素を包含し、それらは当分野で公知の方法によって測定することができる。
【図８】図８は、図１に示されている通りのベータ−ガラクトシダーゼ基質を図示しており、かつ図１で生成されるベンズアルデヒドを還元してサイクリング酵素系を得るために、還元酵素（アリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ）を使用するオプションを図示している。還元ステップは、ベンジルアルコールを再生し、酸化補因子（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）を生成するが、その際、還元補因子の消費速度または酸化補因子の形成速度をモニタして、存在するベータ−ガラクトシダーゼの量を測定することができる。別法では、またはそれに加えて、図８に示されている通り、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応を使用して、生成された過酸化水素を測定して、存在するベータ−ガラクトシダーゼの量を決定することができる。
【図９】図９は、アルカリホスファターゼと反応してホスフェートおよびベンジルアルコールを生成する、加水分解酵素基質としてのリン酸ベンジルエステルを図示している。次いで、図４に示されている通り、ベンジルアルコールはアリールアルコールオキシダーゼおよび酸素によって酸化されてベンズアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。図９はさらに、ベンズアルデヒドを還元してサイクリング酵素系を得るための還元酵素（アリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ）の使用を図示している。還元ステップは、ベンジルアルコールを再生し、酸化補因子（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）を生成するが、その際、還元補因子の消費速度または酸化補因子の形成速度をモニタして、存在するアルカリホスファターゼの量を測定することができる。別法では、またはそれに加えて、図８に示されている通り、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応を使用して、生成された過酸化水素を測定し、存在するアルカリホスファターゼの量を決定することができる。
【図１０】図１０は、例示的なＡＡＯ／ＡＡＤサイクリング系を用いてのアリールアルコールの検出を図示している。
【図１１】図１１は、例示的なＡＡＯ／ＡＡＤサイクリング系を用いてのアルカリホスファターゼの検出を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、高度に有効な酵素活性検出系用の加水分解酵素のための基質を提供する。該基質は、対象の加水分解酵素によって基質が特異的に認識され得るようにし、かつ加水分解酵素のための基質の一部として機能し得る認識部分を包含する。認識部分は、加水分解酵素の作用によって切断され得る分子断片に共有結合している。これらの基質の適切な例は、図１〜９に図示されている。
【００２４】
開示を明瞭にするためであって、限定ではないが、本発明の詳細な記載を、下記のサブセクションに分割する。
【００２５】
Ａ．定義
別段に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で参照される特許、出願、公開出願および他の刊行物はすべて、その全体が参照によって組み込まれる。このセクションに示されている定義が、参照によって本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願および他の刊行物に示されている定義に反するか、またはその他の点で矛盾する場合には、このセクションに示されている定義が、参照によって本明細書に組み込まれる定義よりも優位である。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１個（種）」または「１個（種）または複数」を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「試料」は、分析物アッセイが望ましい分析物を含有し得る任意のものを指す。試料は、生物学的流体または生物学的組織などの生体試料であってよい。生物学的流体の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水などが包含される。生物学的組織は、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織を包含するヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造物の構造材料のうちの１つを形成する、その細胞間物質と一緒になっている細胞、通常は特定の種類の細胞の凝集物である。生物学的組織の例には他にも、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞（複数可）が包含される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「血液試料」は、全血試料または全血試料に由来する血漿もしくは血清の画分を指す。好ましくは、血液試料は、全血または全血に由来する血漿もしくは血清の画分などのヒト血液試料を指す。他にも好ましくは、ヘモグロビン分子からの酸化的干渉を排除するか、または有意に低減するために、アッセイの前に、実質的にすべてのヘモグロビン（すなわち、赤血球）を除去することによって、血液試料を前処理する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「全血」という用語は、分画されておらず、細胞成分および流体成分の両方を含有する血液試料を指す。本明細書で使用される場合、「全血」は、新たに採血され凝固する前に試験される血液か、またはバキュテナー内に採血されていてよく、リチウム−ヘパリン、ＥＤＴＡなどの抗凝固剤を含有してよいか、または１種もしくは複数の他の標準的な臨床薬（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）が常套的な臨床試験の過程において加えられていてよい慣用の方法で採血された血液試料を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「実質的にすべてのヘモグロビンが除去されている」という語句は、試料中のすべてのヘモグロビン含有赤血球のうちの好ましくは少なくとも約５０％、６０％または７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、９０％または９５％、かつ最も好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９または１００％が除去されて、ヘモグロビンからの酸化的干渉が排除されているか、または有意に低減されている血液試料を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「血漿」という用語は、全血の流動性非細胞成分を指す。使用される分離方法に応じて、血漿は細胞成分を完全に含まないことがあり得るか、または様々な量の血小板および／もしくは少量の他の細胞成分を含有することがあり得る。血漿はフィブリノーゲンなどの様々な凝固因子を包含するので、「血漿」という用語は、下記で示されている通りの「血清」とは区別される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「血清」という用語は、全ヒト血清などの全哺乳動物血清を指す。さらに本明細書で使用される場合、「血清」は、凝固因子（例えば、フィブリノーゲン）が除去されている血漿を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「流体」という用語は、流動し得る任意の組成物を指す。したがって流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」という用語は、例えば、感染または遺伝的欠陥から生じていて、同定可能な症状によって特徴付けられる生体における病理学的状態を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「接触させること」は、２種以上の成分を一緒にすることを意味する。「接触させること」は、流体または半流体混合物中ですべての成分を混合することによって達成され得る。「接触させること」はまた、１種または複数の成分を１種または複数の他の成分と、固体の組織切片または基質などの固体表面上で接触させるときにも達成され得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「色素形成基質」という用語は、特定の酵素反応に、反応のドナーまたはアクセプターのいずれかとして関与することができ、かつ反応の間に色を変化させる化学的組成物を指す。例えば、ミエロペルオキシダーゼは、ドナー分子から２個の水素原子を借用することによって、過酸化水素を水に変換する。ドナー分子が色素形成基質であるとき、色素形成基質の酸化は、基質を検出可能な色へと変化させる。例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、還元状態では無色であるが、酸化状態では青色またはジアミン状態では黄色である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「非色素形成補助基質」という用語は、色素形成基質として同じ酵素反応に関与するが、反応の間に色を変化させない化学的組成物を指す。上記の例では、水および過酸化水素は両方とも無色であるので、過酸化水素は、非色素形成補助基質である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「比較すること」という用語は一般に、２つ以上の値の間での類似性または差異を表すために調査することを意味する。好ましくは、「比較すること」は、例えば、一方の値から他方の値を引くこと、２つの値の比を計算すること、他方の値に対する一方の値のパーセンテージを計算することなどの定量比較、またはこれらの種類の計算を組み合わせて、単一の数を生成することを指す。本明細書で使用される場合、「比較すること」はさらに、ヒトが成した比較、コンピューターまたは他のプロセッサーが成した比較およびコンピューターまたは他のプロセッサーと組んでヒトが成した比較を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」は、別段指定されない限り、それらが置換されていない場合にはＣおよびＨだけを含有する、直鎖、分岐鎖および環式の一価のヒドロカルビルラジカル、ならびにこれらの組合せを含む。その例には、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２−プロペニル、３−ブチニル等が含まれる。本明細書では、このようなそれぞれの基において炭素原子の総数が記載されていることがあり、例えば基が最大１０個の炭素原子を含有することができる場合、その基は、１−１０Ｃ、またはＣ１−Ｃ１０もしくはＣ１−１０と表すことができる。ヘテロ原子（例えば、一般にＮ、ＯおよびＳ）が、例えば、ヘテロアルキル基におけるように炭素原子を置き換えることができる場合、基を説明する数は、例えばＣ１−Ｃ６と記載されていようとも、その基の炭素原子の数と、記載されている環または鎖の炭素原子を置き換えるものとして含まれるこのようなヘテロ原子の数の合計を表す。
【００４０】
一般に、本発明のアルキル置換基、アルケニル置換基およびアルキニル置換基は、１−１０Ｃ（アルキル）、または２−１０Ｃ（アルケニルまたはアルキニル）を含有する。好ましくは、それらは１−８Ｃ（アルキル）、または２−８Ｃ（アルケニルまたはアルキニル）を含有する。ときに、それらは１−４Ｃ（アルキル）、または２−４Ｃ（アルケニルまたはアルキニル）を含有する。単一の基は、複数のタイプの多重結合、または複数の多重結合を含むことができる。このような基は、それらが少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する場合には、用語「アルケニル」の定義に含まれ、それらが少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する場合には、用語「アルキニル」に含まれる。
【００４１】
用語「１−アルケン」および「１−アルキン」は、本明細書で使用される場合、アルケンまたはアルキン部分の隣接する炭素原子に二重結合または三重結合している炭素原子を介して、記載されている基本分子（ｂａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）にそれぞれ付着しているアルケンまたはアルキンを指す。
【００４２】
アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、置換が化学的に理にかなう範囲内でしばしば置換されている。典型的な置換基には、それに限定されるものではないが、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲおよびＮＯ２が含まれ、ここで、各Ｒは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、Ｃ４−Ｃ１０ヘテロシクリルアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｃｌａｌｋｙｌ）、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６−Ｃ１０アリールまたはＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールであり、各Ｒは、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’およびＮＯ２で必要に応じて置換されており、ここで、各Ｒ’は、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、Ｃ４−Ｃ１０ヘテロシクリルアルキル、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６−Ｃ１０アリールおよびＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールから選択される非置換基である。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基はまた、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６−Ｃ１０アリールまたはＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールによって置換されていてもよく、これらのそれぞれは、特定の基に適した置換基によって置換されていてもよい。置換基が、同じまたは隣接する原子に２つのＲ基またはＲ’基を含有する場合（例えば、−ＮＲ２または−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｒ）、その２つのＲ基またはＲ’基は、必要に応じてそれらが付着している置換基の原子と一緒になって、５〜８個の環員を有する環を形成することができ、その環は、ＲまたはＲ’自体に許容される通り置換されていてもよく、追加のヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳ）を環員として含有することができる。
【００４３】
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」等は、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニルおよびアルキニル）基と同様に定義されるが、「ヘテロ」という用語は、骨格残基の中に１〜３個のＯ、ＳもしくはＮヘテロ原子またはその組合せを含有する基を指す。したがって、対応するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基の少なくとも１つの炭素原子が、特定のヘテロ原子の１つによって置き換えられると、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基またはヘテロアルキニル基が形成される。アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基のヘテロ形態の典型的な好ましい大きさは、一般に、対応するヒドロカルビル基と同じであり、ヘテロ形態に存在し得る置換基は、ヒドロカルビル基について上に記載した置換基と同じである。化学的安定性の理由で、このような基は、オキソ基がニトロ基またはスルホニル基のようにＮまたはＳに存在する場合を除き、別段特定されない限り、２個を超える連続するヘテロ原子は含まないことも理解されたい。
【００４４】
「アルキル」は、本明細書で使用される場合、シクロアルキル基およびシクロアルキルアルキル基を含むが、用語「シクロアルキル」は、本明細書では環の炭素原子を介して接続されている炭素環式非芳香族基を具体的に記載するために使用することができ、「シクロアルキルアルキル」は、アルキルリンカーを介して分子に接続されている炭素環式非芳香族基を記載するために使用することができる。同様に、「ヘテロシクリル」（またはそれに相当する用語「ヘテロシクロアルキル」）は、少なくとも１つのヘテロ原子を環員として含有し、ＣまたはＮであってよい環原子を介して分子に接続されている非芳香族環式基を記載するために使用することができ、「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを介して別の分子に接続されているこのような基を記載するために使用することができる。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキル基に適した大きさおよび置換基は、アルキル基について上に記載したものと同じである。本明細書で使用される場合、これらの用語は、環が芳香族でない限り、１つまたは２つの二重結合を含有する環も含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「アシル」は、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価位置の１つに付着しているアルキルラジカル、アルケニルラジカル、アルキニルラジカル、アリールラジカルまたはアリールアルキルラジカルを含む基を包含し、ヘテロアシルは、カルボニル炭素以外の少なくとも１つの炭素が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子によって置き換えられている、対応する基を指す。したがって、ヘテロアシルは、例えば−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ならびに−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリールを含む。
【００４６】
アシル基およびヘテロアシル基は、それらがカルボニル炭素原子の空いている原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）を介して付着する任意の基または分子に結合している。一般に、アシル基およびヘテロアシル基は、ホルミル基、アセチル基、ピバロイル基およびベンゾイル基を含むＣ１−Ｃ８アシル基、ならびにメトキシアセチル、エトキシカルボニルおよび４−ピリジノイルを含むＣ２−Ｃ８ヘテロアシル基である。ヒドロカルビル基、アリール基およびこのような基のヘテロ形態はアシル基またはヘテロアシル基を含み、それらはアシル基またはヘテロアシル基の対応する成分のそれぞれに一般に適した置換基として本明細書に記載されている置換基で置換され得る。
【００４７】
「芳香族」部分または「アリール」部分は、芳香族性の周知の特徴を有する、単環式部分または縮合二環式部分を指し、その例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。同様に、「複素芳香族」および「ヘテロアリール」は、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を環員として含有する、Ｃ５−Ｃ６単環式環系またはＣ８−Ｃ１０縮合二環式環系を指す。ヘテロ原子が含まれることにより、５員環ならびに６員環において芳香族性が可能になる。典型的な複素芳香族系には、単環式Ｃ５−Ｃ６芳香族基、例えばピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリルおよびイミダゾリル、ならびにこれらの単環式基の１つを、フェニル環または複素芳香族単環式基のいずれかと縮合させてＣ８−Ｃ１０二環式基を形成することによって形成される縮合二環式部分、例えばインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニル等が含まれる。環系への電子分布の観点から芳香族性の特徴を有する任意の単環式系または縮合環二環式系が、この定義に含まれる。この定義はまた、分子の残りに少なくとも直接付着している環が芳香族性の特徴を有する二環式基を含む。一般に、環系は、５〜１２個の環員原子を含有する。好ましくは、単環式ヘテロアリールは、５個または６個の環員を含有し、二環式ヘテロアリールは、８、９または１０個の環員を含有する。
【００４８】
アリール部分およびヘテロアリール部分は、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１２アリール、Ｃ１−Ｃ８アシルおよびこれらのヘテロ形態を含む様々な置換基で置換されていてもよく、これら自体、それぞれがさらに置換され得る。アリール部分およびヘテロアリール部分の他の置換基には、ハロ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲおよびＮＯ２が含まれ、ここで、各Ｒは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、Ｃ４−Ｃ１０ヘテロシクリルアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールアルキルまたはＣ６−Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは、アルキル基について上に記載した通り、必要に応じて置換されている。置換基が、同じまたは隣接する原子に２つのＲ基またはＲ’基を含有する場合（例えば、−ＮＲ２または−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｒ）、その２つのＲ基またはＲ’基は、必要に応じてそれらが付着している置換基の原子と一緒になって、５〜８個の環員を有する環を形成することができ、その環は、ＲまたはＲ’自体に許容される通り置換され得、追加のヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳ）を環員として含有することができる。アリール基またはヘテロアリール基上の置換基は、当然のことながら、このような置換基のそれぞれのタイプに適するまたは置換基の各成分に適する基として本明細書に記載されている基でさらに置換されていてもよい。したがって、例えばアリールアルキル置換基は、アリール部分上で、アリール基に典型的な置換基として本明細書に記載されている置換基で置換されていてもよく、アルキル部分上で、アルキル基に典型的なまたは適した置換基として本明細書に記載されている置換基でさらに置換されていてもよい。
【００４９】
同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」は、置換または非置換の、飽和または不飽和の、環式または非環式のリンカーを含む、アルキレンなどの連結基を介して付着点に結合している芳香族環系および複素芳香族環系を指す。一般に、リンカーは、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはそのヘテロ形態である。これらのリンカーは、カルボニル基を含むこともでき、したがってそのことにより、リンカーは、アシル部分またはヘテロアシル部分として置換基を提供することができる。アリールアルキル基またはヘテロアリールアルキル基のアリール環またはヘテロアリール環は、アリール基について上に記載したものと同じ置換基で置換されていてもよい。好ましくは、アリールアルキル基は、アリール基について上記で定義した基で必要に応じて置換されているフェニル環、および非置換であるか、または１つもしくは２つのＣ１−Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されているＣ１−Ｃ４アルキレンを含み、この場合、アルキル基またはヘテロアルキル基は、必要に応じて環化して、シクロプロパン、ジオキソランまたはオキサシクロペンタンなどの環を形成することができる。同様に、ヘテロアリールアルキル基は、好ましくは、アリール基に、典型的な置換基として上に記載した基で必要に応じて置換されているＣ５−Ｃ６単環式ヘテロアリール基、および非置換であるか、または１つもしくは２つのＣ１−Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されているＣ１−Ｃ４アルキレンを含み、あるいは、必要に応じて置換されているフェニル環またはＣ５−Ｃ６単環式ヘテロアリール、および非置換であるか、１つまたは２つのＣ１−Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されているＣ１−Ｃ４ヘテロアルキレンを含み、この場合、アルキル基またはヘテロアルキル基は、必要に応じて環化して、シクロプロパン、ジオキソランまたはオキサシクロペンタンなどの環を形成することができる。
【００５０】
アリールアルキル基またはヘテロアリールアルキル基が、必要に応じて置換されているものとして記載されている場合、その置換基は、基のアルキル部分もしくはヘテロアルキル部分、またはアリール部分もしくはヘテロアリール部分のいずれかにあってよい。アルキル部分またはヘテロアルキル部分に必要に応じて存在する置換基は、一般にアルキル基について上記で記載した置換基と同じであり、アリール部分またはヘテロアリール部分に必要に応じて存在する置換基は、一般にアリール基について上に記載した置換基と同じである。
【００５１】
「アリールアルキル」基は、本明細書で使用される場合、それらが非置換である場合にはヒドロカルビル基であり、環およびアルキレンまたは同様のリンカーの炭素原子の総数によって記載される。したがって、ベンジル基は、Ｃ７−アリールアルキル基であり、フェニルエチルは、Ｃ８−アリールアルキルである。
【００５２】
上記の「ヘテロアリールアルキル」は、連結基を介して付着しているアリール基を含む部分を指し、アリール部分の少なくとも１つの環原子または連結基の１つの原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であるという点で、「アリールアルキル」とは異なっている。ヘテロアリールアルキル基は、本明細書では、組み合わされる環およびリンカーの原子の総数に従って記載され、それらはヘテロアルキルリンカーを介して連結しているアリール基、アルキレンなどのヒドロカルビルリンカーを介して連結しているヘテロアリール基、およびヘテロアルキルリンカーを介して連結しているヘテロアリール基を含む。したがって、例えばＣ７−ヘテロアリールアルキルには、ピリジルメチル、フェノキシおよびＮ−ピロリルメトキシが含まれることになる。
【００５３】
「アルキレン」は、本明細書で使用される場合、二価のヒドロカルビル基を指し、それが二価であるため、２つの他の基を一緒になって連結することができる。一般にアルキレンは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは１〜８であり、好ましくは、ｎは１〜４である）を指し、特定されている場合であっても、アルキレンは、他の基によって置換され得、他の長さであってもよく、空いている原子価は、鎖の反対端にある必要はない。したがって、−ＣＨ（Ｍｅ）−および−Ｃ（Ｍｅ）２−も、アルキレンと呼ぶことができ、シクロプロパン−１，１−ジイルなどの環式基も同様にアルキレンと呼ぶことができる。アルキレン基が置換されている場合、その置換基には、本明細書に記載されているアルキル基に一般に存在する置換基が含まれる。
【００５４】
一般に、置換基に含有されている任意のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アシル基、またはアリール基もしくはアリールアルキル基、またはこれらの基の１つの任意のヘテロ形態は、それ自体が追加の置換基によって必要に応じて置換されていてもよい。これらの置換基の性質は、その置換基が別段記載されていない場合には、一次置換基自体に関して列挙した性質と同様である。したがって、例えばＲ７の一実施形態が、必要に応じて置換されているアルキルである場合、このアルキルは、置換が化学的に意味をなし、アルキル自体に提供される大きさの限界を損なわない場合には、Ｒ７の実施形態として列挙されている残りの置換基によって必要に応じて置換されていてもよく、例えば、アルキルまたはアルケニルによって置換されているアルキルは、これらの実施形態の炭素原子の上限を単に拡大することになり、含まれない。しかし、アリール、アミノ、アルコキシ、＝Ｏ等によって置換されているアルキルは、本発明の範囲に含まれることになり、これらの置換基の原子は、記載されているアルキル、アルケニル等の基を説明するために使用される数には算入されない。置換基の数が特定されていない場合、このようなそれぞれのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アシル基またはアリール基は、その利用可能な原子価に従っていくつかの置換基で置換されていてもよく、特にこれらの基のいずれかは、例えばその利用可能な原子価のいずれかまたはすべてにおいて、フッ素原子で置換されていてもよい。
【００５５】
「ヘテロ形態」は、本明細書で使用される場合、指定の炭素環式基の少なくとも１つの炭素原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子によって置き換えられている、アルキル、アリールまたはアシルなどの基の誘導体を指す。したがって、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリールおよびアリールアルキルのヘテロ形態は、それぞれヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアシル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルである。オキソ基がＮまたはＳに付着してニトロ基またはスルホニル基を形成している場合を除き、普通は２個以下のＮ、ＯまたはＳ原子が逐次的に接続することを理解されたい。
【００５６】
「必要に応じて置換されている」は、本明細書で使用される場合、記載されている１つもしくは複数の特定の基が、非水素置換基を有していなくてもよく、またはその１つもしくは複数の基が、１つもしくは複数の非水素置換基を有していてもよいことを示す。別段特定されない限り、存在し得るこのような置換基の総数は、記載されている基の非置換形態に存在するＨ原子の数に等しい。カルボニル酸素（＝Ｏ）などの任意選択の置換基が二重結合を介して付着している場合、その基は、２つの利用可能な原子価を占め、したがって、含まれ得る置換基の総数は、利用可能な原子価の数に従って減少する。
【００５７】
「ハロ」は、本明細書で使用される場合、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。フルオロおよびクロロが、しばしば好ましい。
【００５８】
「アミノ」は、本明細書で使用される場合、ＮＨ２を指すが、アミノが「置換されている」または「必要に応じて置換されている」と記載されている場合には、用語アミノはＮＲ’Ｒ’’を含み、ここで、各Ｒ’およびＲ’’は、独立に、Ｈ、またはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アシル基、アリール基もしくはアリールアルキル基、またはこれらの基の１つのヘテロ形態であり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アシル基、アリール基もしくはアリールアルキル基、またはこれらの基の１つのヘテロ形態のそれぞれは、対応する基に適した置換基として本明細書に記載されている置換基で必要に応じて置換されている。この用語はまた、Ｒ’およびＲ’’が一緒になって連結して３〜８員環を形成する形態を含み、この３〜８員環は、飽和、不飽和もしくは芳香族であってよく、Ｎ、ＯおよびＳから独立に選択される１〜３個のヘテロ原子を環員として含有しており、アルキル基に適している置換基として記載されている置換基で必要に応じて置換されており、またはＮＲ’Ｒ’’が芳香族基である場合には、ヘテロアリール基に典型的な置換基として記載されている置換基で必要に応じて置換されている。
【００５９】
「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、アミノ置換カルボン酸化合物を指す。典型例は、２０種類の一般的なアルファ−アミノ酸、ならびにカルボン酸に対してベータまたはガンマ位にアミンを有するその類似体である。「アルファ−アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、式ＨＯ２Ｃ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｒａのアミノ酸を指す（Ｒａは、必要に応じて置換されているＣ１−Ｃ６アルキル基、または必要に応じて置換されているアリール基もしくはアリールアルキル基、または必要に応じて置換されているヘテロアリール基もしくはヘテロアリールアルキル基である）。具体例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リシン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、アルギニン、アスパラギンおよびプロリンが含まれる。
【００６０】
「糖」は、本明細書で使用される場合、一般に分岐または非分岐鎖の糖の、１つまたは複数の糖を含有する炭水化物部分を指す。糖は、一般に、式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する（ｎは、１〜１０００または３〜５０または５〜２５などの整数である）。典型例は、グルコース、スクロース、デンプンおよびセルロースである。これらの糖は、単糖、二糖または多糖であってよい。用語「オリゴ糖」は、約３〜２５個の糖基からなる、通常は非分岐鎖の糖を記載するために使用される。
【００６１】
「加水分解酵素のための基質の認識成分」または「認識部分」は、加水分解酵素を酵素基質分子に結合させる、加水分解酵素のための天然基質の一部に十分に類似している、酵素基質分子の一部を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「エステラーゼ」は、加水分解と呼ばれる水との化学反応において、エステルを酸とアルコールに分割する酵素を指す。基質特異性、タンパク質構造および生物学的機能が異なる、広範な異なるエステラーゼが存在する。例示的なエステラーゼには、アセチルエステラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ（またはホスホモノエステラーゼ）、ホスホジエステラーゼ、三リン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ（スルファターゼ）、二リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸トリエステルヒドロラーゼ、エキソヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ）およびエンドヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ）が含まれる。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないエステラーゼを包含することを企図する。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「グリコシドヒドロラーゼ（グリコシダーゼとも呼ばれる）」は、グリコシド結合の加水分解を触媒して、より小さい糖を放出させる酵素を指す。グリコシドヒドロラーゼは、一般に、Ｏ−またはＳ−グリコシドの加水分解を触媒する酵素としてＥＣ３．２．１に分類されている。グリコシドヒドロラーゼは、加水分解反応の立体化学的な結果に従って分類することもできる。したがって、グリコシドヒドロラーゼは、保持型または転化型の酵素のいずれかに分類することができる。グリコシドヒドロラーゼは、オリゴ糖／多糖鎖の（通常、非還元性の）末端または中間部のいずれで作用するかに応じて、それぞれエキソ作用型またはエンド作用型と分類することもできる。グリコシドヒドロラーゼは、配列または構造に基づく方法によって分類することもできる。例示的なグリコシドヒドロラーゼには、β−ガラクトシダーゼ（ベータ−ｇａｌまたはβ−ｇａｌとも呼ばれる）、グルコシダーゼ、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎｎａｓｅ）、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼおよびリゾチームが含まれる。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないグリコシドヒドロラーゼを包含することを企図する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ホスファターゼ」は、リン酸モノエステルを、リン酸イオンと遊離ヒドロキシル基を有する分子に加水分解することによって、その基質からリン酸基を除去する酵素を指す。ホスファターゼは、チロシン特異的ホスファターゼ、セリン／スレオニン特異的ホスファターゼ、二重特異性ホスファターゼ、ヒスチジン特異的ホスファターゼおよび脂質ホスファターゼなど、それらの基質特異性に基づいて細分することができる。例示的なホスファターゼには、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、ＡＬＫＰ）が含まれる。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないホスファターゼを包含することを企図する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「アルコールオキシダーゼ」は、以下の化学反応を触媒する酵素を指す。
【００６６】
【数１】
2014505059.tif 000007
この酵素クラスの組織名は、アルコール：酸素オキシドレダクターゼである。この酵素は、エタノールオキシダーゼとも呼ばれる。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないアルコールオキシダーゼを包含することを企図する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「アリールアルコールオキシダーゼ」は、以下の化学反応を触媒する酵素を指す。
【００６８】
【数２】
2014505059.tif 000008
この酵素クラスの組織名は、アリール−アルコール：酸素オキシドレダクターゼである。一般的な使用における他の名称には、ベラトリルアルコールオキシダーゼおよび芳香族アルコールオキシダーゼが含まれる。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないアリールアルコールオキシダーゼを包含することを企図する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「アリールアルコールデヒドロゲナーゼ」は、以下の化学反応を触媒する酵素を指す。
【００７０】
【数３】
2014505059.tif 000009
この酵素クラスの組織名は、アリール−アルコール：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼである。一般的な使用または例における他の名称には、ｐ−ヒドロキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼおよびコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないアリールアルコールデヒドロゲナーゼを包含することを企図する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）」は、多くの生体に存在し、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元によってアルコールとアルデヒドまたはケトンの間の相互転換を容易にするデヒドロゲナーゼ酵素の群を指す。保存的アミノ酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないアルコールデヒドロゲナーゼを包含することを企図する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「評価する」は、試料中に存在する分析物の量または濃度の絶対値を得、また試料中の分析物のレベルを示す指標、比率、百分率、視覚値（ｖｉｓｕａｌ  ｖａｌｕｅ）または他の値を得るという意味で、定量的および定性的な決定を含むことを企図する。評価は、直接的であっても間接的であってもよく、実際に検出される化学種は、当然のことながら分析物自体である必要はなく、例えば、その誘導体またはいくつかのさらなる物質であってよい。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「結合試薬（または結合剤）」は、所望の親和性および／または特異性で標的または分析物に結合する任意の物質を指す。結合試薬の非限定的な例には、細胞、細胞器官、ウイルス、粒子、微粒子、分子、またはその凝集体もしくは複合体、または分子の凝集体もしくは複合体が含まれる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「抗体」には、完全ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特異的抗体、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変配置が含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体、および必ずしも任意の特定のクラスではない抗体が含まれる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」とは、結合試薬、例えば抗体が、定義された分析物または標的に優先的に結合するような特異性を指す。結合試薬または抗体が特定の分析物または標的を、他の潜在的標的の存在下で認識することは、このような結合の１つの特徴である。いくつかの実施形態では、分析物に特異的に結合する結合試薬は、試験される試料における他の１つまたは複数の干渉部分とは結合しない。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「結合しない（ａｖｏｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、特定の結合試薬、例えば抗体または抗体断片の特異性を指す。特定の部分とは結合しない結合試薬、抗体または抗体断片は、一般に、高い百分率の特定の部分が、このような結合試薬、抗体または抗体断片によっては結合されないという特異性を含む。この百分率は、一般に、特定の標的の検出を対象とする結合試薬または抗体を利用するアッセイに対する干渉部分との、許容される交差反応の百分率の範囲に含まれる。しばしば、本開示の結合試薬、抗体または抗体断片は、干渉部分の約９０％超と結合しないが、百分率はそれよりも高い方が好ましく、また明確に検討されている。例えば、本開示の結合試薬、抗体または抗体断片は、干渉部分の約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％および約９９％以上と結合しない。頻度は低いが、本開示の結合試薬、抗体または抗体断片は、干渉部分の約７０％超、または約７５％超、または約８０％超、または約８５％超と結合しない。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「哺乳動物」は、哺乳動物種クラスのいずれかを指す。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、しばしばヒト、ヒト被験体またはヒト患者を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、特定の種または試料のタイプに限定されない。例えば、用語「被験体」は、患者、しばしばヒト患者を指すことができる。しかし、この用語はヒトには限定されず、したがって様々な哺乳動物種を包含する。
【００７９】
本明細書で使用される場合、核酸ハイブリダイゼーション反応の「厳密性」は、当業者によって容易に決定され得るものであり、一般に、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的算出値である。一般に、プローブが長いほど、適切なアニーリングにはより高い温度が必要となり、プローブが短いほど、より低い温度が必要となる。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境に存在する場合、変性核酸配列の再アニーリング能に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の度合いが高いほど、使用できる相対温度は高くなる。結果として、相対温度が高いほど、反応条件がより厳密になる傾向があり、温度が低いほど厳密ではなくなる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性の追加の詳細および説明については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９年）、Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：１５８５〜１５８８頁（１９８５年）を参照されたい。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、材料がその元の環境から除去され、その天然状態から変化することを指す。例えば、単離されたポリペプチドは、キャリアにカップリングすることができるが、そのポリペプチドは元の環境にはないので、まだ「単離された」ものであり得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「被験物質（または候補化合物）」は、標的に対する効果が本明細書で開示され、かつ／または特許請求されている方法によって決定される、化学的に定義された化合物（例えば、有機分子、無機分子、有機／無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、多糖、糖またはこれらの分子のハイブリッド、例えば糖タンパク質等）、または化合物の混合物（例えば、試験化合物のライブラリー、天然抽出物または培養上清等）を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、疾患標的に対して、多様な化学構造の試料などの数多くの試料を試験して、「的中（ｈｉｔ）」を同定するプロセスを指す（例えば、Ｂｒｏａｃｈら、Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３８４巻：１４〜１６頁（１９９６年）、Ｊａｎｚｅｎら、Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｌａｂ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ：  ８２６１〜２６５頁（１９９６年）、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ、Ｐ．Ｂ．、Ｌｅｔｔｅｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２巻：１頁（１９９７年）、Ｂｕｒｂａｕｍら、Ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、１巻：７２〜７８頁（１９９７年）参照）。ＨＴＳの操作は、試料調製物、アッセイ手順、およびその後の大量のデータ処理に対処するために、高度に自動化され、コンピューター化されている。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「植物」は、胚芽を生成し、葉緑体を含有し、セルロース細胞壁を有し、自発運動をしないことを特徴とする、植物界の様々な光合成的な多細胞真核生物のいずれかを指す。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「動物」は、自発運動能、非光合成性代謝、刺激に対する顕著な応答、増殖の制限、および固定した身体構造を特徴とする、動物界の多細胞生物を指す。動物の非限定的な例には、ニワトリなどの鳥、脊椎動物、例えば魚、ならびにマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「細菌」は、区画に分けられていない環状ＤＮＡおよび約７０Ｓのリボソームを有する小さい原核生物（約１ミクロンの線寸法）を指す。細菌のタンパク質合成は、真核生物のタンパク質合成とは異なる。多くの抗菌抗生物質は、細菌のタンパク質合成を妨害するが、感染宿主には影響を及ぼさない。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「真正細菌」は、古細菌以外の細菌の主な細分を指す。ほとんどのグラム陽性細菌、ラン藻、マイコプラズマ、腸内細菌、シュードモナスおよび葉緑体は、真正細菌である。真正細菌の細胞膜は、エステル連結した脂質を含有しており、細胞壁（存在する場合）にはペプチドグリカンが存在する。真正細菌にはイントロンが発見されていない。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「古細菌」は、真正細菌以外の細菌の主な細分を指す。古細菌には、高度好塩菌、メタン生成菌および硫黄依存性の高度好熱菌の３つの主な目がある。古細菌は、リボソーム構造、イントロンの所有（幾つかの場合）、および膜組成を含む他の特徴が、真正細菌とは異なっている。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「ウイルス」は、生存しているが非細胞の性質であり、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質被膜からなる偏性細胞内寄生体を指す。ウイルスは、直径が約２０〜約３００ｎｍの範囲である。Ｉ型ウイルス（ボルティモア分類）は、二本鎖ＤＮＡをそれらのゲノムとして有する。ＩＩ型ウイルスは、一本鎖ＤＮＡをそれらのゲノムとして有する。ＩＩＩ型ウイルスは、二本鎖ＲＮＡをそれらのゲノムとして有する。ＩＶ型ウイルスは、正の一本鎖ＲＮＡをそれらのゲノムとして有し、ゲノム自体がｍＲＮＡとして作用する。Ｖ型ウイルスは、負の一本鎖ＲＮＡをそれらのゲノムとして有し、ｍＲＮＡ合成の鋳型として使用する。ＶＩ型ウイルスは、正の一本鎖ＲＮＡゲノムを有するが、複製だけでなくｍＮＲＡ合成においてもＤＮＡ中間体を用いる。ウイルスの大部分は、植物、動物および原核生物においてそれらが引き起こす疾患によって認識される。原核生物のウイルスは、バクテリオファージとして公知である。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「真菌」は、根、茎や葉がなしに不規則な塊で増殖し、光合成できる葉緑素や他の色素をもたない真核生物の門を指す。各生物体（葉状体）は、単細胞性から糸状であり、グルカンまたはキチンまたはその両方を含有する細胞壁によって取り囲まれている分岐した体細胞構造（菌糸）を有し、真核を含有する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、ＮＡＤ＋は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、またはアセチル−ＮＡＤ＋もしくはチオ−ＮＡＤ＋などの適切な誘導体を指す。ＮＡＤＨは、ＮＡＤ＋の還元形態、およびアセチル−ＮＡＤＨまたはチオ−ＮＡＤＨなどの適切な誘導体を指す。ＮＡＤＰ＋は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、またはアセチル−ＮＡＤＰ＋もしくはチオ−ＮＡＤＰ＋などの適切な誘導体を指す。ＮＡＤＰＨは、ＮＡＤＰ＋の還元形態、およびアセチル−ＮＡＤＰＨまたはチオ−ＮＡＤＰＨなどの適切な誘導体を指す。
【００９１】
Ｂ．加水分解酵素
酵素は、基質（複数可）に作用して生成物（複数可）を生じる触媒的タンパク質である。加水分解酵素またはヒドロラーゼは、水の付加により化学的結合の加水分解を触媒する酵素である。例えば、以下の反応：Ａ−Ｂ＋Ｈ２Ｏ→Ａ−ＯＨ＋Ｂ−Ｈを触媒する酵素が、ヒドロラーゼである。酵素学において、ヒドロラーゼは、一般に、酵素のＥＣ番号による分類ではＥＣ３と分類されている。保存アミノ的酸置換または機能的断片を有し、その活性を実質的に変えないヒドロラーゼを包含することを企図する。
【００９２】
ヒドロラーゼは、それらが作用を及ぼす結合に基づいて、いくつかのサブクラスにさらに分類することができる。例えば、ＥＣ３．１．：エステル結合（エステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ）、ＥＣ３．２．：糖（グリコシドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．３．：エーテル結合、ＥＣ３．５．：ペプチド結合以外の炭素−窒素結合、ＥＣ．３．６．：酸無水物（ヘリカーゼおよびＧＴＰａｓｅを含む酸無水物ヒドロラーゼ）、ＥＣ３．７．：炭素−炭素結合、ＥＣ３．８．：ハライド結合、ＥＣ３．９．：亜リン酸−窒素結合、ＥＣ３．１０：硫黄−窒素結合、ＥＣ３．１１：炭素−亜リン酸結合、ＥＣ３．１２：硫黄−硫黄結合、ＥＣ３．１３：炭素−硫黄結合。
【００９３】
本明細書に記載されている方法は、任意の適切な加水分解酵素、すなわち水の分子を付加する一方で、基質分子を、一方がヒドロキシル化有機分子となる２つの生成物に分割する任意の酵素と共に使用することができる。グリコシダーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼおよびホスファターゼが、典型的な例である。グリコシダーゼは、グリコシル化アルコールを加水分解して、糖と遊離アルコールを生成する。エステラーゼは、エステルを加水分解して、カルボン酸と遊離アルコールを生成する。ホスファターゼは、一般に、リン酸エステルを加水分解して、ホスフェート（またはジホスフェートもしくはトリホスフェート）とアルコールを生成する。
【００９４】
特に興味深いいくつかのグリコシダーゼには、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼが含まれる。特に興味深いいくつかのエステラーゼには、アルファ−アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、アセチルエステラーゼ等が含まれる。特に興味深いいくつかのホスファターゼには、キャリアまたは抗体に容易にコンジュゲートすることができるアルカリホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ等が含まれる。ウシアルカリホスファターゼは、ＥＬＩＳＡアッセイで使用されることが周知の、適切な一例である。
【００９５】
Ｃ．加水分解酵素基質
本発明の加水分解酵素基質は、一般に、加水分解酵素によって認識される認識部分に、切断できる結合によって連結しているアルコールを、その基質の一部として含む。この認識部分により、加水分解酵素基質は、選択された加水分解酵素に対して特異性を示すようになり、例えば認識部分により、基質は、選択された加水分解酵素による変換を受けやすくなり、典型的な系に存在し得る他の酵素では、同程度には変換されなくなる。
【００９６】
いくつかの特異的な加水分解酵素の認識部分の例を、図１〜９に示す。図１．１に示した基質のガラクトシル環は、ベンジル型基質が、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼによって特異的に認識され、加水分解され得るようにする認識部分である。同様に、図４の基質のホスフェートにより、その加水分解酵素基質は、アルカリホスファターゼの加水分解作用を特異的に受けやすくなる。図５の基質のアセチルエステルは、アセチルエステラーゼによって選択的に認識される基質を提供し、図６の基質のアルファ−アミノ酸エステルは、アルファ−アミノ酸エステラーゼ活性によって選択的に加水分解される基質を提供する。
【００９７】
一般に、加水分解酵素基質は、本明細書に記載されているアッセイ法で使用される１つまたは複数の追加の酵素（アリールアルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アリールアルコールデヒドロゲナーゼ等）のための基質ではなく、適切な加水分解酵素によって加水分解されて初めて、本明細書に記載されているアッセイ系で使用される酸化酵素および／または還元酵素のための基質として働く。
【００９８】
本発明の加水分解酵素基質は、式（Ｉ）の化合物を含む
【００９９】
【化６】
2014505059.tif 000010
［式中、
Ａは、芳香族基もしくは複素芳香族基、１−アルケン、または１−アルキンであり、そのそれぞれは、必要に応じて置換されており、
各Ｒは、独立に、Ｈ、または必要に応じて置換されているＣ１−Ｃ４アルキルもしくはアリールであり、
ｎは、１〜４の整数であり、
Ｘは、基質部分を含む基であり、
ここで、基質部分は、加水分解酵素のための基質の認識成分を含み、ここで、加水分解酵素の活性は、式（Ｉ）の化合物を加水分解して、検出可能な式ＩＩの生成物を形成することができる］。
【０１００】
【化７】
2014505059.tif 000011
いくつかの実施形態では、加水分解酵素と、式（Ｉ）の加水分解酵素基質の反応は、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の副生成物を生成する。
【０１０１】
【化８】
2014505059.tif 000012
これらの化合物における「Ｘ」は、目的の特定の加水分解酵素のための認識部分を含む。式（ＩＩＩ）の副生成物の例は、図１〜９に示すことができる。これらの副生成物には、ガラクトース、ホスフェート、カルボン酸、アミノ酸等が含まれる。
【０１０２】
本発明の加水分解酵素基質のいくつかの実施形態では、Ａは、必要に応じて置換されている芳香族基または複素芳香族基である。適切な芳香族基には、フェニルおよびナフチルが含まれる。適切な複素芳香族基には、例えばピリジル、ピリミジニル、トリアジニル、インドリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピラゾリル、ベンゾピラゾリル、キノリニル、イソキノリニル、チエニル、フラニル、ピロリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリルおよびイソチアゾリルが含まれる。これらのアリール基およびヘテロアリール基は、本明細書でさらに記載される通り置換されていてもよく、または非置換であってもよい。
【０１０３】
本発明の加水分解酵素基質の他の実施形態では、Ａは、１−アルケンまたは１−アルキンである。いくつかの実施形態では、Ａは、式（ＩＶ）の１−アルケンである
【０１０４】
【化９】
2014505059.tif 000013
［式中、波線は、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、各Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されている基である］。これらの実施形態のいくつかでは、Ａは、式（ＩＶｂ）の基である
【０１０５】
【化１０】
2014505059.tif 000014
［Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は、式（ＩＶ）で定義されている］。このタイプの化合物の一例は、実施例ではＨＤＥＧＰとして示されている。
【０１０６】
加水分解酵素基質の他の実施形態では、Ａは、式（Ｖ）の１−アルキンである
【０１０７】
【化１１】
2014505059.tif 000015
［式中、波線は、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、Ｇは、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されているメンバーである］。いくつかのかかる実施形態では、Ｇは、必要に応じて置換されているフェニルであってよい。
【０１０８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｒは、例えば、Ｈ、メチルまたはフェニルであってよい。好ましい実施形態では、ＲはＨであり、したがって式（ＩＩ）の生成物は、第一級アルコールである。ｎが１である場合、この生成物は、Ａがフェニルであればベンジルアルコールになり、Ａが１−アルケンであればアリルアルコールになり、Ａが１−アルキンであればプロパルギルアルコールになる。好ましい実施形態には、ＲがＨであり、ｎが１である化合物が含まれる。
【０１０９】
本発明の加水分解酵素基質のいくつかの実施形態では、Ｘは、糖、例えば単糖または二糖を含む。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｄ−ガラクトシル環、またはグルコース、アロース、マンノース、キシロース、グロース、タロース、アルトロース、イドース、リボース、アラビノース、リキソースなどの別のＤ−糖である。いくつかの実施形態では、加水分解酵素基質は、式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）の化合物である
【０１１０】
【化１２】
2014505059.tif 000016
［式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ２ＯＱであり、各Ｑは、独立に、Ｈ、または単糖、二糖もしくはオリゴ糖であり、Ａ、Ｒおよびｎは、式（Ｉ）で定義されている通りである］。いくつかの実施形態では、各ＱはＨであり、いくつかの実施形態では、ｎは１であり、ＲはＨであってよく、いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＣＨ２ＯＨまたはＨである。
【０１１１】
他の実施形態では、加水分解酵素基質は、式（ＶＩＩ）のエステルである
【０１１２】
【化１３】
2014505059.tif 000017
［式中、Ｒ３は、Ｈ、または必要に応じて置換されているアリール基、ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ８アルキル基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基もしくはＣ３−Ｃ８ヘテロシクリル基であり、Ａ、Ｒおよびｎは、式（Ｉ）で定義されている通りである］。
【０１１３】
これらの化合物のＲ３は、目的の加水分解酵素のための認識部分として作用するという条件で、広範に変わり得る。特定の実施形態では、Ｒ３は、Ｍｅ、Ｅｔおよびフェニルからなる群から選択され、またはＨＯ２Ｃ−Ｒ３がアルファ−アミノ酸になるようなアミノ酸ラジカルである。したがって−Ｒ３は、式−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｒａａの基であり得る（Ｒａａは、一般に認識されている２０種類の必須アミノ酸の１つの側鎖である）。これらの実施形態のいくつかでは、ｎは１である。
【０１１４】
他の実施形態では、加水分解酵素基質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物であり得る
【０１１５】
【化１４】
2014505059.tif 000018
［式中、Ｚは、Ｎ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＰまたはＰ−ＯＨであり、Ｒ４は、Ｏ、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールである］。これらは、例えばホスファターゼ基質、例えばＸがリン酸基を含み、したがって式（ＶＩＩ）のＺがＰ−ＯＨとなる式Ｉの化合物であってよい。これらの例は、式（ＩＸ）の化合物
【０１１６】
【化１５】
2014505059.tif 000019
またはその塩である。
【０１１７】
上記の加水分解酵素基質では、ｎは１であってよく、Ａは、アリール基となり得る場合はいつでも、必要に応じて置換されているフェニル基であってよい。これらの実施形態では、フェニル基は、非置換であってよく、またはハロ、ヒドロキシ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’２、ＯＲ’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’もしくはＳＯ２ＮＲ’２から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、ここで、各Ｒ’は、独立に、Ｈまたは必要に応じて置換されているＣ１−４アルキルであり、同じまたは隣接する原子上の２つのＲ’は、一緒になって、必要に応じて置換されているＣ３−Ｃ８複素環式環を形成することができる。
【０１１８】
加水分解酵素基質のさらなる実施形態では、Ａは、式（Ｘ）の基であり得る
【０１１９】
【化１６】
2014505059.tif 000020
［式中、波線は、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、各Ｇは、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されている基である］。
【０１２０】
上記の実施形態のいずれかでは、アルキル基、アルケニル基  アルキニル基および複素環式基のための任意選択の置換基は、下記の通りであってよく、または、それらはハロ、オキソ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’’、ＣＯＮＲ’’２、ＮＲ’’２、ＯＲ’’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’’もしくはＳＯ２ＮＲ’’２から選択することができ、ここで、各Ｒ’’は、独立に、ＨまたはＣ１−４アルキルである。同様に、アリール基およびヘテロアリール基のための任意選択の置換基は、本明細書の定義に記載されている通りであってよく、または、それらはハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’’、ＣＯＮＲ’’２、ＮＲ’’２、ＯＲ’’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’’もしくはＳＯ２ＮＲ’’２から選択することができ、ここで、各Ｒ’’は、独立に、ＨまたはＣ１−４アルキルである。
【０１２１】
上記の加水分解酵素基質のいずれかの好ましい実施形態では、ＲはＨであり、ｎは１である。
【０１２２】
本発明の基質のための好ましい加水分解酵素には、グリコシダーゼ、エステラーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−アミノ酸エステラーゼおよびホスファターゼが含まれる。適切なエステラーゼは、カルボキシルエステラーゼ、アセチルエステラーゼまたはアルファ−アミノ酸エステラーゼであり得る。
【０１２３】
Ｄ．加水分解酵素基質組成物
本発明の加水分解酵素基質は、基質を加水分解する加水分解酵素に加えて、少なくとも１つの追加の酵素と組み合わせて使用することができる。追加の酵素は、加水分解酵素の活性を有する最初の生成物である式（ＩＩ）の化合物の効率的な検出を、該化合物を別の化学種に転換することによって促進する酵素である。したがって、上記の加水分解酵素基質および少なくとも１つの追加の酵素を含む組成物は、目的の加水分解酵素の存在を検出および／または定量化するためのアッセイ系の成分として有用である。同様に、加水分解酵素基質と、本明細書に記載した方法のいくつかの実施形態で必要とされる他の材料との組合せも、これらのアッセイに有用であり、本発明の一態様ともなる。
【０１２４】
したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている加水分解酵素基質のいずれかを、本明細書に記載されている追加の酵素、または加水分解酵素による加水分解酵素基質の加水分解生成物を検出もしくは定量化するために使用できる酵素補助因子、または加水分解酵素基質の加水分解生成物を検出するための試薬と組み合わせて含む組成物を提供する。
【０１２５】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、上記の加水分解酵素基質と、以下の少なくとも１つとの組合せを含む組成物を提供する：
−抗体などの認識要素とのコンジュゲートとして存在することができ、もしくは検出前に機能的酵素として発現されるポリヌクレオチド配列として存在することができる、加水分解酵素基質を認識して加水分解する加水分解酵素、
−本発明の加水分解酵素基質に対する加水分解酵素の作用によって生成される式（ＩＩ）の生成物を、多くの場合には酸化反応によって新しい化学種に変換することができる追加の酵素（例えば、アリールアルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアリールアルコールデヒドロゲナーゼ）、
−本発明の加水分解酵素基質に対する加水分解酵素の作用によって生成される式（ＩＩ）の生成物の変換を助けることができる、追加の酵素によって利用される補助因子、例えば、式ＩＩの化合物から式Ａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ＩＩ−ｏｘ）のカルボニル化合物への酸化を促進することができるＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋、および
−式（ＩＩ）の生成物が追加の酵素によって別の化学種に変換されるときに形成される副生成物を検出するための試薬、例えば式ＩＩＢのアリールアルコールが式Ａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ（ＩＩ−ｏｘ）のカルボニル化合物に酸化すると形成される過酸化水素を検出するための試薬、および／または
−式（ＩＩ）の化合物の酸化によって形成されるカルボニル化合物から、検出を容易にする別の化学種への変換を助けることができる酵素もしくは補助因子、例えばカルボニル化合物を転換して式（ＩＩ）のアルコールに戻す本明細書に記載されている還元酵素、もしくはこのような還元酵素のための補助因子。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、例えば加水分解酵素は、検出される標的に直接連結することができるので、加水分解酵素は、これらの試薬の組合せ物には含まれない。組合せ物は、加水分解酵素を含有する別個の試料と接触させられるように調製することができる。例えば、加水分解酵素は、目的の標的をコードするだけでなく加水分解酵素もコードする核酸から生成される、融合タンパク質の一部であってよい。あるいは、加水分解酵素は、試薬の組合せ物に含まれていてもよく、試料と接触する反応混合物は、目的の標的を対象とする抗体などの特異的認識部分と連結またはコンジュゲートすることができる加水分解酵素をしばしば含有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の実施形態のいずれかの加水分解酵素基質と、その特定の基質に対応する加水分解酵素、すなわち、特定の加水分解酵素基質を切断して、検出可能な式（ＩＩ）の生成物を生成することができる加水分解酵素との組合せを提供する。いくつかの実施形態では、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子は、その加水分解性切断反応の生成物であり、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子は、前記式（ＩＩ）の構造を有する
【０１２８】
【化１７】
2014505059.tif 000021
［式中、Ａ、Ｒおよびｎは、式（Ｉ）について定義されている通りである］。
【０１２９】
これらの実施形態のいくつかでは、加水分解酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼまたはグリコシダーゼである。特定の実施形態では、加水分解酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。例えば、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼであってよい。
【０１３０】
いくつかの特定の実施形態では、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼ、α−アミノ酸エステラーゼ、ガラクトシダーゼまたはβ−グリコシダーゼであってよい。
【０１３１】
これらの実施形態のいくつかでは、組合せ物は、加水分解酵素が触媒する切断反応によって生成されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化することができる酸化試薬をさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、酸化試薬は、酸素の存在下で、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子（ＲはＨであると想定される）およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたはアルコールオキシダーゼである。
【０１３２】
酸化試薬が使用され、Ｈ２Ｏ２が、酸化反応の副生成物として生成され得る場合、いくつかの実施形態では、組合せ物は、Ｈ２Ｏ２を検出および／または測定するための試薬も含む。適切な試薬は、当技術分野で周知の試薬であり、それにはＴｒｉｎｄｅｒ反応で使用される試薬が含まれる。したがって、適切な試薬には、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、フェノールなどのフェノール、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）などのアンチピリンおよび／またはアニリン類似体が含まれる。これらの改変型Ｔｒｉｎｄｅｒ反応で使用されることが公知のいくつかの適切なアニリン類似体には、ＡＤＯＳ、ＡＤＰＳ、ＡＬＰＳ、ＤＡＰＳ、ＤＡＯＳ、ＴＯＯＳ、ＭＡＯＳおよびＭＡＰＳが含まれる。本発明の方法で使用することができるいくつかの適切なＴｒｉｎｄｅｒ反応成分については、例えば米国特許第５，１５６，９５５号を参照されたい。
【０１３３】
これらの組合せ物のいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物をカルボニル化合物（ＲがＨである場合にはアルデヒド、ＲがＨでない場合にはケトン）に酸化する酸化試薬は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化して、カルボニル化合物およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである。これらの実施形態では、組合せ物は、必要に応じてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をさらに含み、このＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋は、酸化反応を促進するための補助因子として作用し、酸化反応によってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換される。必要に応じてこれらの実施形態では、組合せ物は、この酸化反応によって形成されるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定するための試薬をさらに含む。
【０１３４】
本発明の組合せ組成物は、加水分解酵素基質と、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨと、および／またはＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子（ＲがＨである式ＩＩ−ｏｘの化合物）を還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼもしくはアルコールデヒドロゲナーゼとの組合せを含む。これらの組合せ物は、必要に応じて、最初に形成された式ＩＩの加水分解生成物を、上記の通りカルボニル化合物（例えば、式ＩＩ−ｏｘ）に酸化することができる酸化酵素も含む。好ましくは、酸化酵素は、アリールアルデヒドまたは不飽和脂肪族アルデヒドを還元するための酵素とは異なり、好ましくは異なる酵素は、同じ補助因子を共有していない。好ましい一実施形態では、酸化酵素は、Ｏ２を使用して、式（ＩＩ）の化合物の酸化を促進するアルコールオキシダーゼまたはアリールアルコールオキシダーゼであり、還元酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用して、アルデヒドを還元して式ＩＩのアルコールに戻すデヒドロゲナーゼである。
【０１３５】
このような相補的な酸化酵素および還元酵素が用いられる場合には、サイクリング反応系が形成され（例えば、図３参照）、それによって、アッセイ系の感度を大きく増大するシグナル増幅が達成され得る。サイクリングアッセイ系は、過酸化水素形成を測定し、還元反応におけるＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの消費を測定し、かつ／または還元反応におけるＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の形成を測定することによってモニタすることができる。これらの組成物のいくつかの実施形態では、組合せ物は、Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む。Ｈ２Ｏ２を測定するのに適した試薬には、ペルオキシダーゼ、アンチピリン、２−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、４−クロロフェノール、２，６−ジクロロフェノールなどのフェノール、および／またはＤＭＡ、ＴＯＯＳ、ＴＯＰＳ、ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＡＤＰＳ、ＡＬＰＳ、ＤＡＰＳ、ＤＡＯＳ、ＨＤＡＰＳ、ＨＤＡＯＳ、ＭＡＯＳ、ＭＡＰＳもしくはＥＭＡＥなどのアニリン類似体の少なくとも１つが含まれ得る。
【０１３６】
上記の組合せ物のいくつかの実施形態では、加水分解酵素基質は、β−グリコシダーゼ基質分子の少なくとも一部を含み、加水分解酵素は、β−グリコシダーゼである。その他の実施形態では、加水分解酵素基質は、リン酸エステルを含み、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼである。他の実施形態では、加水分解酵素基質は、ベータ−ガラクトシド基を含み、加水分解酵素は、ベータ−ガラクトシダーゼである。他の実施形態では、加水分解酵素基質は、エステルであり、加水分解酵素は、アルファ−アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼまたはアセチルエステラーゼである。
【０１３７】
これらの組成物のいくつかでは、組合せ物は、本明細書に記載されている加水分解酵素基質のいずれかと、以下の少なくとも１つとを含む：
ａ）アリールアルコール分子もしくは不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下で酸化して、アリールアルデヒド分子もしくは不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼもしくは脂肪族アルコールオキシダーゼ、ならびに／または
ｂ）ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、ならびに／または
ｃ）アリールアルデヒド分子もしくは不飽和脂肪族アルデヒド分子を、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの存在下で還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼもしくはアルコールデヒドロゲナーゼ、ならびに／または
ｄ）Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、本発明の目的に適した加水分解酵素基質として本明細書に記載されている化合物のいずれか、および必要に応じて上記の組合せ組成物のいずれかを含む、加水分解酵素の量を決定および／または定量化するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、上記の組合せ物のいずれか１つは、キットの形態で提供される。キットは、別個にパッケージされた組合せ物の成分を含むことができ、または単一容器内で予めミックスされた、組合せ物の一実施形態の成分の混合物（これらの成分は、混合するのに適合性がある）を含むことができる。キットは、アッセイ系の較正に有用な１つまたは複数の標準物質、および加水分解酵素基質または組合せ組成物を用いてアッセイを実施するための指示をさらに含むことができる。
【０１３９】
上記の組合せ物のいずれかは、生成または検出される標的のためのアッセイ系、単離系および／または生成系に含まれていてもよい。標的は、検出もしくは定量化される分析物、または生成され、検出もしくは定量化される生成物であり、上記の組合せ物およびキットは、ＰＣＲプライマーまたは抗体などの、標的に特異的な部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的は、無機分子、有機分子および／またはその複合体である。いくつかの実施形態では、標的は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体からなる群から選択される有機分子である。
【０１４０】
本発明の組合せ物では、任意の適切なアルコールオキシダーゼを使用することができる。例えば、米国特許第７，１６０，７０８号、同第５，１６６，３２９号、同第４，９５６，２９０号、同第４，７２９，９５６号および同第４，６１９，８９８号に開示され、かつ／または特許請求されているアルコールオキシダーゼを使用することができる。別の例では、ＪａｎｓｓｅｎおよびＲｕｅｌｉｕｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．、１５１巻（２号）：３３０〜４２頁（１９６８年）およびＳｕｙｅ、Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４巻（６号）：３７４〜７頁（１９９７年）に開示されているアルコールオキシダーゼを使用することができる。
【０１４１】
本発明の組合せ物では、任意の適切なアリールアルコールオキシダーゼを使用することができる。例えば、米国特許第３，１８３，２３５号、同第３，２９０，３２６号および同第６，８３５，２１２号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２００９／０５３７８０Ａ１号に開示され、かつ／または特許請求されているアリールアルコールオキシダーゼを使用することができる。別の例では、Ｆａｒｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ７４巻：２５７〜６２頁（１９６０年）およびＧｕｉｌｌｅｎおよびＥｖａｎｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６０巻（８号）：２８１１〜２８１７頁（１９９４年）に開示されているアリールアルコールオキシダーゼを使用することができる。
【０１４２】
本発明の組合せ物では、任意の適切なアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、米国特許第４，０２０，０７０号、同第５，１８２，２０９号、同第６，２６２，２９５号、同第７，７５０，１３５号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２００９／０１７５１０Ａ１号、同第ＵＳ２００９／１８６９００Ａ１号、同第ＵＳ２００６／０７４０６０Ａ１号およびＪＰ２１４７９５６Ａに開示され、かつ／または特許請求されているアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。別の例では、Ｓｕｈａｒａら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１３０巻（１号）：４２２〜９頁（１９６９年）およびＹａｍａｎａｋａおよびＭｉｎｏｓｈｉｍａ、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、４８巻：１１６１〜１１７１頁（１９８４年）に開示されているアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。
【０１４３】
本発明の組合せ物では、任意の適切なアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、米国特許第７，７５０，１３５号、同第７，３５４，７５１号、同第６，５５２，２４９号、同第６，４３２，６８８号、同第６，２５５，０９２号、同第６，２２５，０９９号、同第５，９０８，９２４号、同第５，８５５，８８１号、同第５，６９５，９７３号、同第５，４４５，９４３号、同第５，３８５，８３３号、同第５，３４４，７７７号、同第５，１６２，５１６号、同第５，１６２，２０３号、同第４，２４１，１８４号、同第４，１３１，７２７号および同第４，１１１，７５１号に開示され、かつ／または特許請求されているアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。別の例では、ＹａｋｕｓｈｉおよびＭａｔｓｕｓｈｉｔａ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８６巻（５号）：１２５７〜６５頁（２０１０年）およびＹｉｎ、Ａｌｃｏｈｏｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．、２巻：１１３〜９頁（１９９４年）に開示されているアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。
【０１４４】
本発明の組合せ物は、免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションまたは配列決定のための系などの系で具体化することができる。例示的な免疫アッセイには、サンドイッチアッセイまたは競合アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティング、免疫沈降、免疫染色、ラテラルフロー免疫アッセイ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ｕ−キャプチャーアッセイ、阻害アッセイおよびアビディティアッセイが含まれる。例示的な核酸配列決定技術には、加水分解酵素、例えばアルカリホスファターゼを使用して、シグナル読取り値を得るＤＮＡ配列決定技術が含まれる。例えば、ＰａｔｅｌおよびＮａｓｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８巻（２号）：３２８〜３３頁（１９９５年）を参照されたい。
【０１４５】
本発明の組合せ物は、任意の適切なアッセイの型式または配置で使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組合せ物は、不均一アッセイ型式で使用することができる。他の実施形態では、本発明の組合せ物は、均一アッセイ型式で使用することができる。例示的な均一アッセイ型式には、クローン化酵素ドナー免疫アッセイ（ＣＥＤＩＡ）、増幅免疫アッセイ技術（ＥＭＩＴ）、アポ酵素再活性化免疫アッセイ（ＡＲＩＡ）、補因子標識化免疫アッセイおよび阻害剤標識化免疫アッセイが含まれる。例えば、米国特許第４，７０８，９２９号、同第５，１２０，６５３号、同第５，２４４，７８５号および同第５，３６２，６２５号、ＷＯ９６／４１１７２Ａ１、ならびにＪｅｎｋｉｎｓ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１５０巻：９１〜９７頁（１９９２年）を参照されたい。
【０１４６】
Ｅ．加水分解酵素基質を使用する方法
別の態様では、本発明は、上記の加水分解酵素基質および／または組合せ物を使用して、試料中の加水分解酵素の存在または量を検出するための方法を提供し、いくつかの実施形態では、該方法は、試料中の標的分子の存在または量を検出するために使用される。標的分子は、例えば酵素が標識として機能する場合に、加水分解酵素とコンジュゲートすることができ、または加水分解酵素は、標的分子に特異的な結合部分、例えば、標的分子を特異的に認識して結合する抗体、もしくはサンドイッチアッセイの一部としての別の酵素などの別の部分と標的分子の複合体に付着もしくはコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、加水分解酵素自体が、検出または定量化される化学種であってもよい。
【０１４７】
加水分解酵素は、一般に試料中に存在し、この試料は、任意の適切な組成であってよい。多くの場合、試料は、主に水性の溶液または懸濁液であり、加水分解酵素が機能するのに適したｐＨを維持するために、適切な緩衝剤を含有する。適切な温度、ｐＨおよび濃度、ならびに他のパラメータの選択は、所与の加水分解酵素の通常の技術レベルの範囲内である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の加水分解酵素の活性および／または量を評価するための方法であって、
ａ）加水分解酵素を含有するか、または含有すると疑われる試料を、式（Ｉ）の構造を有する加水分解酵素基質と、
【０１４９】
【化１８】
2014505059.tif 000022
前記加水分解酵素が前記試料中に存在する場合には前記基質を切断する条件下で接触させて、式（ＩＩ）の構造を有するアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子および式（ＩＩＩ）の構造を有する化合物を生成するステップと
【０１５０】
【化１９】
2014505059.tif 000023
［式中、Ａ、Ｒ、ｎおよびＸは、式（Ｉ）について上に定義されている通りである］、
ｂ）前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価して、前記試料中の前記加水分解酵素の活性および／または量を評価するステップと
を含む方法を提供する。
【０１５１】
アリールアルコールまたは不飽和脂肪族アルコールの量または存在は、任意の好都合な方法によって、直接的または間接的に評価することができる。いくつかの実施形態では、アルコールの存在または量は、一般に酵素的酸化によって、本明細書に記載されている通りアルコールをカルボニル化合物に転換することによって検出される。酸化は、本明細書に記載されている様々な酵素（例えば、アリールアルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アリールアルコールデヒドロゲナーゼ）を用いて達成することができる。加水分解酵素基質は、検出される加水分解酵素と適合性を示すように選択され、したがって、その加水分解酵素に特異的な認識部分を含有し、その加水分解酵素によって加水分解され得ることを条件に、上記の基質のいずれであってもよい。
【０１５２】
したがって該方法は、試料を、単独のまたは上記の組合せのいずれかの加水分解酵素基質と接触させることを含むアッセイである。アッセイ条件は、加水分解酵素が存在する場合には、上で論じた通り加水分解酵素基質を加水分解して生成物を生成するように選択される。一般には、存在する可能性がある酵素の量に対して、過剰量の加水分解酵素基質が含まれ、したがって生成物の量は、酵素の量を上回り得、こうして有効なシグナル強度が強化され、アッセイがより感度の高いものになり、生成物が実質的に直線速度（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｔｅ）で形成される。
【０１５３】
本明細書に記載されているアッセイは、定量的または定性的であり得ることを理解されよう。定性的には、多くの場合には、いくらかの生成物が形成されたことを確認する好都合な変色または分光光度アッセイによって、形成された生成物を検出して、加水分解酵素が存在することを確認することができる。定量的結果が望ましい場合には、酵素の量を直接的に記載するよりも、一般には生成物の形成速度を反映するアッセイからのデータを解釈するために、多くの場合、１つまたは複数の標準物質を試験する必要がある。したがって、生成物の形成速度のデータから存在する加水分解酵素の量を決定するために、多くの場合、試験試料に加えて、公知の量の加水分解酵素を有する少なくとも１種類の、必要に応じて２種類以上の標準試料をアッセイで試験する必要がある。このような較正方法は、当業者に周知である。
【０１５４】
これらの方法のいくつかの実施形態では、加水分解酵素は、エステラーゼまたはグリコシダーゼである。いくつかの実施形態では、加水分解酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノ酸エステラーゼおよびカルボキシルエステラーゼからなる群から選択されるエステラーゼであり、いくつかの実施形態では、酵素は、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼまたはホスファターゼである。いくつかの特定の実施形態では、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼである。他の特定の実施形態では、加水分解酵素は、α−アミノ酸エステラーゼまたはβ−グリコシダーゼである。
【０１５５】
これらの方法のいくつかの実施形態では、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価するステップは、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む。ＲがＨである場合、酸化生成物はアルデヒドであり、Ｒがアルキルまたはアリールである場合、酸化生成物はケトンである。いくつかの好ましい実施形態では、ｎは１であり、ＲはＨであり、したがって酸化生成物は、式Ａ−ＣＨＯのアルデヒドである（Ａは、式（Ｉ）に記載されている通りである）。
【０１５６】
これらの実施形態のいくつかでは、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量は、酸素の存在下で、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子をアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、Ｈ２Ｏ２を生成し、Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される。過酸化水素の存在または量を評価するための方法は、当技術分野で周知であり、それには、Ｔｒｉｎｄｅｒ反応の変形が含まれる。いくつかのかかる実施形態では、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体の少なくとも１つを含む試薬を使用して、Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を検出する。適切な試薬は、例えば米国特許第５，１５６，９５５号に論じられている。
【０１５７】
代替法として、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子をアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される。ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを使用して反応をモニタする方法は、当技術分野で周知であり、これらのアッセイ法に好都合に適用される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量は、
ａ）アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加のアリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）Ｈ２Ｏ２の存在および／もしくは量、またはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の量を評価することと
によって評価される。
【０１５９】
これらの実施形態では、２種類の異なる酵素が使用され、一方はアルコールをアルデヒドに酸化し、他方はアルデヒドを還元してアルコールに戻す。異なる酵素は、異なる補助因子を使用し、異なる副生成物を生成する。同時に機能する２種類の異なる酵素の組合せは、加水分解酵素基質の最初の加水分解から生じるシグナルを有効に増幅するサイクリングアッセイ系を提供する。循環する酸化／還元の組合せから形成される副生成物の量は、使用される加水分解酵素基質の量をはるかに上回り得る。したがってこの系では、酵素の量から加水分解された基質の量までの最初の増幅と、加水分解された基質分子を、酸化状態および還元状態の間で循環させることによって提供されるさらなる増幅の、２つの増幅ステップが導入される。
【０１６０】
Ｈ２Ｏ２の量または存在は、上で論じた通りＴｒｉｎｄｅｒ反応などの公知の方法によって測定することができ、存在する補助因子の量も同様に測定することができる。これらの方法では、過酸化水素の形成と、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＨの形成速度の両方をモニタすることも可能である。
【０１６１】
これらの方法のいくつかの実施形態では、加水分解酵素基質は、β−グリコシダーゼ基質分子の少なくとも一部（認識部分）を含み、加水分解酵素は、β−グリコシダーゼである。
【０１６２】
他の実施形態では、加水分解酵素基質は、アルカリホスファターゼ基質分子の少なくとも一部（例えば、必要に応じて置換されているリン酸ベンジル）を含み、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼである。
【０１６３】
本明細書に記載されている方法は、標的の存在を検出するための分析アッセイとして、または標的のための単離方法の一部として、または標的分子の生成のためのプロセスの一部として使用することができる。標的分子は、上記の通り有機または無機または複合体であってよい。いくつかの実施形態では、標的は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体からなる群から選択される有機分子である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、該方法は、免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションまたは配列決定において利用される。いくつかの実施形態では、該方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列決定系において使用される。これらの実施形態では、アルカリホスファターゼが、好ましい加水分解酵素である。
【０１６５】
本発明の方法では、任意の適切なアルコールオキシダーゼを使用することができる。例えば、米国特許第７，１６０，７０８号、同第５，１６６，３２９号、同第４，９５６，２９０号、同第４，７２９，９５６号および同第４，６１９，８９８号に開示され、かつ／または特許請求されているアルコールオキシダーゼを使用することができる。別の例では、ＪａｎｓｓｅｎおよびＲｕｅｌｉｕｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．、１５１巻（２号）：３３０〜４２頁（１９６８年）およびＳｕｙｅ、Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４巻（６号）：３７４〜７頁（１９９７年）に開示されているアルコールオキシダーゼを使用することができる。
【０１６６】
本発明の方法では、任意の適切なアリールアルコールオキシダーゼを使用することができる。例えば、米国特許第３，１８３，２３５号、同第３，２９０，３２６号および同第６，８３５，２１２号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２００９／０５３７８０Ａ１号に開示され、かつ／または特許請求されているアリールアルコールオキシダーゼを使用することができる。別の例では、Ｆａｒｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ７４巻：２５７〜６２頁（１９６０年）ならびにＧｕｉｌｌｅｎおよびＥｖａｎｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６０巻（８号）：２８１１〜２８１７頁（１９９４年）に開示されているアリールアルコールオキシダーゼを使用することができる。
【０１６７】
本発明の方法では、任意の適切なアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、米国特許第４，０２０，０７０号、同第５，１８２，２０９号、同第６，２６２，２９５号、同第７，７５０，１３５号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２００９／０１７５１０Ａ１号、同第ＵＳ２００９／１８６９００Ａ１号、同第ＵＳ２００６／０７４０６０Ａ１号およびＪＰ２１４７９５６Ａに開示され、かつ／または特許請求されているアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。別の例では、Ｓｕｈａｒａら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１３０巻（１号）：４２２〜９頁（１９６９年）ならびにＹａｍａｎａｋａおよびＭｉｎｏｓｈｉｍａ、Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、４８巻：１１６１〜１１７１頁（１９８４年）に開示されているアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。
【０１６８】
本発明の方法では、任意の適切なアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、米国特許第７，７５０，１３５号、同第７，３５４，７５１号、同第６，５５２，２４９号、同第６，４３２，６８８号、同第６，２５５，０９２号、同第６，２２５，０９９号、同第５，９０８，９２４号、同第５，８５５，８８１号、同第５，６９５，９７３号、同第５，４４５，９４３号、同第５，３８５，８３３号、同第５，３４４，７７７号、同第５，１６２，５１６号、同第５，１６２，２０３号、同第４，２４１，１８４号、同第４，１３１，７２７号および同第４，１１１，７５１号に開示され、かつ／または特許請求されているアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。別の例では、ＹａｋｕｓｈｉおよびＭａｔｓｕｓｈｉｔａ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８６巻（５号）：１２５７〜６５頁（２０１０年）ならびにＹｉｎ、Ａｌｃｏｈｏｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．、２巻：１１３〜９頁（１９９４年）に開示されているアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。
【０１６９】
本発明の方法は、免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションまたは配列決定などの任意の適切なアッセイにおいて使用することができる。例示的な免疫アッセイには、サンドイッチアッセイまたは競合アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティング、免疫沈降、免疫染色、ラテラルフロー免疫アッセイ、ｕ−キャプチャーアッセイ、阻害アッセイおよびアビディティアッセイが含まれる。例示的な核酸配列決定技術には、加水分解酵素、例えばアルカリホスファターゼを使用して、シグナル読取り値を得るＤＮＡ配列決定技術が含まれる。例えば、ＰａｔｅｌおよびＮａｓｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８巻（２号）：３２８〜３３頁（１９９５年）を参照されたい。
【０１７０】
本発明の方法は、任意の適切なアッセイの型式または配置で使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、不均一アッセイ型式で使用することができる。他の実施形態では、本発明の方法は、均一アッセイ型式で使用することができる。例示的な均一アッセイ型式には、クローン化酵素ドナー免疫アッセイ（ＣＥＤＩＡ）、増幅免疫アッセイ技術（ＥＭＩＴ）、アポ酵素再活性化免疫アッセイ（ＡＲＩＡ）、補因子標識化免疫アッセイおよび阻害剤標識化免疫アッセイが含まれる。例えば、米国特許第４，７０８，９２９号、同第５，１２０，６５３号、同第５，２４４，７８５号および同第５，３６２，６２５号、ＷＯ９６／４１１７２Ａ１、ならびにＪｅｎｋｉｎｓ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１５０巻：９１〜９７頁（１９９２年）を参照されたい。
【０１７１】
本発明の組合せ物および／または方法は、任意の適切な試料液体における分析物を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、液体試料は、全血、血清、血漿、尿試料または口腔液などの体液試料であってよい。このような体液試料は、直接使用することができ、または使用前に処理することができ、例えば富化、精製もしくは希釈することができる。他の実施形態では、液体試料は、ファージ、ウイルス、細菌細胞、真核生物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、細胞構造物もしくは細胞内構造物、細胞凝集体、組織または器官などの固体または半固体の生物学的材料に由来する液体抽出物、懸濁物または溶液であってよい。特定の実施形態では、試料液体は、哺乳動物またはヒト供給源から得られ、または哺乳動物またはヒト供給源に由来する。さらに他の実施形態では、液体試料は、生物学的供給源、法医学の供給源、食品供給源、生物戦争の（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ）供給源または環境の供給源に由来する試料である。他の実施形態では、試料液体は、臨床試料、例えばヒトまたは動物の臨床試料である。さらに他の実施形態では、試料液体は、人工試料、例えば品質管理または較正目的のための標準試料である。
【０１７２】
本発明の組合せ物および／または方法は、任意の適切な試料液体における分析物の存在、非存在および／または量を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の試験デバイスは、任意の適切な試料液体における分析物の存在または非存在を検出するため、すなわちイエスまたはノーの答えを得るために使用される。他の実施形態では、本発明の試験デバイスは、液体試料における分析物の量を定量化または半定量化するために使用される。
【０１７３】
組合せ物および／または方法は、任意の適切な試料液体における単一の分析物の存在、非存在および／または量を検出するために使用することができる。あるいは、本発明の試験デバイスは、液体試料における複数の分析物の存在、非存在および／または量を検出するために使用することができる。さらに他の実施形態では、本発明の試験デバイスは、液体試料における複数の分析物の量を定量化または半定量化するために使用することができる。
【０１７４】
組合せ物および／または方法は、試料液体における任意の適切な分析物の存在、非存在および／または量を検出するために使用することができる。例示的な分析物には、無機分子、有機分子またはその複合体が含まれる。例示的な有機分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはそのハイブリッド、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体であってよい。いくつかの実施形態では、分析物は、細胞、ウイルスまたは分子である。他の実施形態では、分析物は、疾患または障害のマーカー、感染性生物の抗原、感染性生物に対する抗体等である。
【０１７５】
組合せ物および／または方法は、任意の適切な目的で使用することができる。例えば、本発明の組合せ物および／または方法は、臨床診断、予後、危険性の評価および予測、層別化、ならびに処置のモニタリングおよび調節のために使用することができる。別の例では、本発明の組合せ物および／または方法は、基礎研究、薬物候補スクリーニング、動物研究および臨床試験などの様々な研究目的のために使用することができる。さらに別の例では、本発明の組合せ物および／または方法は、標準設定、品質管理、違法薬物スクリーニング、食品安全性、環境安全性、工業安全性および汚染等に関する試験において使用することができる。本発明の組合せ物および／または方法は、実験室、クリニック、病院、診療所、家庭、自然環境および戦場での試験などの任意の適切な状況において使用することができる。
【０１７６】
Ｆ．例示的実施形態
加水分解酵素は、研究および臨床診断のためのバイオアッセイにおいて幅広く使用されている。バイオアッセイにおいて最も一般的に使用されている加水分解酵素のうちの２種は、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。ベータ−ガラクトシダーゼは多くの場合に、ホルモン、ビタミン、治療薬を包含する様々な分析物を検出するための臨床診断および薬物乱用に関する試験などの多くのアッセイで幅広く使用されているＣＥＤＩＡ（クローン化酵素ドナー免疫アッセイ）プラットフォームのための酵素として使用されている（例えば、米国特許第４，７０８，９２９号、同第５，１２０，６５３号、同第５，２４４，７８５号および同第５，３６２，６２５号およびＷＯ９６／４１１７２Ａ１を参照されたい）。
【０１７７】
ＣＥＤＩＡアッセイでは、典型的には組換えＤＮＡ技術によって調製されるベータ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）の２つの断片が使用される。より大きな断片は、酵素アクセプターまたはＥＡと称され、より小さな断片は、酵素ドナーまたはＥＤと称される。それらが別々になっているときには、断片は両方とも、酵素として不活性である。これらの断片が溶液中で混合されると、それらは自発的に集合して、天然ベータ−ガラクトシダーゼのような完全に活性な酵素になる。臨床診断を包含する多くのアッセイにおいて均一系アッセイが望ましい。なぜなら、均一系アッセイは時間の節約となり、試薬の節約となり、かつ自動化が容易であるからである。均一系アッセイは、未結合の構成成分を除去するための、長時間で、時間を浪費する洗浄ステップを必要とすることなく、単純な「混合および読み取り」プロセスを可能にする。
【０１７８】
ＣＥＤＩＡアッセイは、所望の臨床試験要件の幾つかを満たす均一系アッセイである。ＣＥＤＩＡ均一系アッセイプラットフォームは、標的−バインダーを介してのＥＡおよびＥＤの自発的集合、例えば、抗原−抗体反応を制御することによって操作される。一部の実施形態では、分析物またはバイオマーカーをＥＤに共有結合で付着させて、そのＥＤコンジュゲートがＥＡと混合されるときに、活性なベータ−ガラクトシダーゼ酵素の形成において干渉が存在しないようにすることができる。系に、分析物またはバイオマーカーに対するバインダーまたは抗体を加えると、酵素の自発的集合が阻害される。この系を、試料、例えば、患者の血清中の分析物について競合させると、試料中の遊離の未知の分析物またはバイオマーカーの量に正比例して、活性酵素が作り出される。作り出される酵素の量を、ｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドまたはクロロフェノールレッド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどの適切な酵素基質の加水分解を介してモニタする。しかしながら、これらの基質は、その吸光係数において限界があり、ＣＥＤＩＡアッセイを、化学発光に基づく不均一系免疫アッセイと同様の高感度アッセイ系にするには適していない。
【０１７９】
一部の実施形態では、本発明者らは、ＣＥＩＤＡ系を改良するために、ベータ−ガラクトシダーゼのための一連の新たな基質を設計した。新たな基質に特有の特徴の１つは、アリールアルコール分子がそのヒドロキシル基を介してベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドに結合することである。ベータ−ガラクトシダーゼによってこれらの基質が加水分解されると、遊離のアリールアルコール分子が生成し、これは、アリールアルコールオキシダーゼによって酸化されて、アリールアルデヒドになり、その際、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の随伴形成を伴う。次いで、アリールアルデヒドを酵素アリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼによって還元して、アリールアルコールに戻す。この酸化および還元反応は、酵素サイクリングを形成し、その際、反応副生成物であるＨ２Ｏ２の蓄積を伴うが、それは、各反応サイクルにおいて指数的に増幅される。
【０１８０】
任意の適切なアリールアルコールオキシダーゼおよびアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、真菌、例えば、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ由来のアリールアルコールオキシダーゼおよびアリールアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる（ＧｕｉｌｌｅｎおよびＥｖａｎｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６０巻（８号）：２８１１〜２８１７頁（１９９４年））。本明細書に記載されているアッセイでは、ベータ−ガラクトシダーゼのための新規基質を使用することによって、検出用の反応シグナルを有意に増幅して、ＣＥＤＩＡ均一系プラットフォームのアッセイ感度を改良する、共役している酵素サイクリング反応が可能となる。
【０１８１】
他の例として、アルカリホスファターゼは、ＥＬＩＳＡおよびＤＮＡ配列決定などの免疫アッセイを包含する様々なアッセイにおいてレポーティング酵素として幅広く使用されている酵素である。本明細書に記載されている新たな基質は、ヒドロキシル基をリン酸基（Ｈ２ＰＯ４）と結合させるアリールアルコール類似体を包含する。アルカリホスファターゼによってこれらの基質が加水分解されることで、遊離のアリールアルコール分子が生成し、それが、アリールアルコールオキシダーゼのための基質として役立ち、かつシグナル増幅のためのアリールアルコールオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼに基づく酵素サイクリング系に共役され得る。このことによって、免疫アッセイおよびＤＮＡ配列決定のためのより高い感度の検出が得られる。
【０１８２】
次に列挙される実施形態は、本発明のある種の態様を提示している：
１．式（Ｉ）の化合物である加水分解酵素基質
【０１８３】
【化２０】
2014505059.tif 000024
［式中、
Ａは、芳香族基もしくは複素芳香族基、１−アルケン、または１−アルキンであり、そのそれぞれは、必要に応じて置換されており、
各Ｒは、独立に、Ｈ、または必要に応じて置換されているＣ１−Ｃ４アルキルもしくはアリールであり、
ｎは、１〜４の整数であり、
Ｘは、基質部分を含む基であり、
ここで、該基質部分は、加水分解酵素のための基質の認識成分を含み、ここで、該加水分解酵素の活性は、該式（Ｉ）の化合物を加水分解して、化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を形成することができる］。
【０１８４】
【化２１】
2014505059.tif 000025
２．Ａが、必要に応じて置換されている芳香族基または複素芳香族基である、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
３．Ａが、必要に応じて置換されているフェニルまたはナフチルである、実施形態２に記載の加水分解酵素基質。
４．Ａが、式（ＩＶ）の１−アルケンである
【０１８５】
【化２２】
2014505059.tif 000026
［式中、
波線が、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、各Ｇ、Ｇ’およびＧ’’が、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されている基である］、
実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
５．Ａが、式（Ｖ）の１−アルキンである
【０１８６】
【化２３】
2014505059.tif 000027
［式中、
波線が、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、Ｇが、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されているメンバーである］、
実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
６．Ｒが、Ｈ、Ｍｅまたはフェニルである、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
７．Ｘが糖を含む、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
８．前記化合物が、式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）を有する、実施形態７に記載の加水分解酵素基質
【０１８７】
【化２４】
2014505059.tif 000028
［式中、Ｒ２は、Ｈまたは−ＣＨ２ＯＱであり、各Ｑは、独立に、Ｈ、または単糖、二糖もしくはオリゴ糖であり、Ａ、Ｒおよびｎは、実施形態１に定義されている通りである］。
９．前記化合物が、式（ＶＩＩ）のエステルである、実施形態１に記載の加水分解酵素基質
【０１８８】
【化２５】
2014505059.tif 000029
［式中、Ｒ３は、Ｈ、または必要に応じて置換されているアリール基、ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ８アルキル基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル基もしくはＣ３−Ｃ８ヘテロシクリル基であり、Ａ、Ｒおよびｎは、実施形態１に定義されている通りである］。
１０．Ｒ３が、Ｍｅ、Ｅｔおよびフェニルからなる群から選択され、または、ここで、ＨＯ２Ｃ−Ｒ３がアルファ−アミノ酸である、実施形態９に記載の加水分解酵素基質。
１１．前記化合物が、式（ＶＩＩＩ）を有する、実施形態１に記載の加水分解酵素基質
【０１８９】
【化２６】
2014505059.tif 000030
［式中、Ｚは、Ｎ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＰまたはＰ−ＯＨであり、Ｒ４は、Ｏ、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールである］。
１２．Ｘがリン酸基を含む、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
１３．前記化合物が、式（ＩＸ）を有する化合物
【０１９０】
【化２７】
2014505059.tif 000031
またはその塩である、実施形態１２に記載の加水分解酵素基質。
１４．Ａが、必要に応じて置換されているフェニル基である、実施形態１から３または６から１３のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
１５．前記フェニル基が、非置換であるか、またはハロ、ヒドロキシ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’２、ＯＲ’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’もしくはＳＯ２ＮＲ’２から選択される１〜３個の基で置換されており、
ここで、各Ｒ’が、独立に、Ｈまたは必要に応じて置換されているＣ１−４アルキルであり、同じまたは隣接する原子上の２つのＲ’が、一緒になって、必要に応じて置換されているＣ３−Ｃ８複素環式環を形成することができる、
実施形態１４に記載の加水分解酵素基質。
１６．アルキル基および複素環式基の任意選択の置換基が、ハロ、オキソ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＯＲ’’、ＣＯＮＲ’’２、ＮＲ’’２、ＯＲ’’、必要に応じて置換されているＣ１−４アルキル、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’’またはＳＯ２ＮＲ’’２から選択され、ここで、各Ｒ’’が、独立に、ＨまたはＣ１−４アルキルである、先行する実施形態のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
１７．Ａが、式（Ｘ）の基である
【０１９１】
【化２８】
2014505059.tif 000032
［式中、
波線が、式（Ｉ）の−［ＣＨ（Ｒ）］ｎ−Ｏ−ＸへのＡの付着点を示し、
各Ｇが、独立に、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される、必要に応じて置換されている基である］、
実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
１８．ＲがＨである、先行する実施形態のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
１９．ｎが１である、先行する実施形態のいずれかに記載の加水分解酵素基質。
２０．Ｘが、グリコシダーゼのための基質部分を含む、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
２１．前記グリコシダーゼが、ベータ−ガラクトシダーゼである、実施形態２０に記載の加水分解酵素基質。
２２．Ｘが、エステラーゼのための基質部分を含む、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
２３．前記エステラーゼが、カルボキシルエステラーゼ、アセチルエステラーゼおよびアルファ−アミノ酸エステラーゼからなる群から選択される、実施形態２２に記載の加水分解酵素基質。
２４．Ｘが、ホスファターゼのための基質部分を含む、実施形態１に記載の加水分解酵素基質。
２５．前記ホスファターゼが、アルカリホスファターゼである、実施形態２４に記載の加水分解酵素基質。
２６．ａ）実施形態１から２５のいずれかに記載の加水分解酵素基質と、
ｂ）加水分解酵素であって、該加水分解酵素基質を切断して、アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、該加水分解酵素によって触媒される該切断反応の生成物として生成することができる加水分解酵素（該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子は、前記式（ＩＩ）の構造を有し、
【０１９２】
【化２９】
2014505059.tif 000033
式中、Ａ、Ｒおよびｎは、実施形態１に定義されている通りである）
とを含む、組合せ物。
２７．前記加水分解酵素が、エステラーゼ、ホスファターゼまたはグリコシダーゼである、実施形態２６に記載の組合せ物。
２８．前記加水分解酵素が、アセチルエステラーゼ、アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される、実施形態２７に記載の組合せ物。
２９．前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、実施形態２７に記載の組合せ物。
３０．前記加水分解酵素が、α−アミノ酸エステラーゼである、実施形態２８に記載の組合せ物。
３１．前記加水分解酵素が、ベータ−ガラクトシダーゼである、実施形態２７に記載の組合せ物。
３２．前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼである、実施形態２７に記載の組合せ物。
３３．前記加水分解酵素が触媒する前記切断反応によって生成された前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化することができる酸化試薬をさらに含む、実施形態２６に記載の組合せ物。
３４．前記酸化試薬が、酸素の存在下で、前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼである、実施形態３３に記載の組合せ物。
３５．前記Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む、実施形態３４に記載の組合せ物。
３６．前記Ｈ２Ｏ２を測定するための前記試薬が、ペルオキシダーゼ、４−ＡＡおよび／またはアニリン類似体を含む、実施形態３５に記載の組合せ物。
３７．前記酸化試薬が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼである、実施形態３３に記載の組合せ物。
３８．ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋をさらに含む、実施形態３７に記載の組合せ物。
３９．前記ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定するための試薬をさらに含む、実施形態３８に記載の組合せ物。
４０．ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で前記アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼとをさらに含む、実施形態３４に記載の組合せ物。
４１．前記Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む、実施形態４０に記載の組合せ物。
４２．前記Ｈ２Ｏ２を測定するための前記試薬が、ペルオキシダーゼ、アンチピリン、フェノールおよび／またはアニリン類似体の少なくとも１つを含む、実施形態４１に記載の組合せ物。
４３．前記加水分解酵素基質が、β−グリコシダーゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼである、実施形態２６に記載の組合せ物。
４４．ａ）前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下で酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼと、
ｂ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、
ｃ）該アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼと、
をさらに含む、実施形態４３に記載の組合せ物。
４５．Ｈ２Ｏ２を測定するための試薬をさらに含む、実施形態４４に記載の組合せ物。
４６．前記加水分解酵素基質が、アルカリホスファターゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、実施形態２６に記載の組合せ物。
４７．ａ）前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下で酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成することができるアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼと、
ｂ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、
ｃ）該酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で還元することができるアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼと、
をさらに含む、実施形態４６に記載の組合せ物。
４８．Ｈ２Ｏ２を測定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、実施形態４７に記載の組合せ物。
４９．前記組合せ物の成分が、キットに含まれる、実施形態２６から４８のいずれかに記載の組合せ物。
５０．標的のためのアッセイ系、単離系および／または生成系に含まれる、実施形態２６から４９のいずれかに記載の組合せ物。
５１．前記標的が、無機分子、有機分子および／またはその複合体である、実施形態５０に記載の組合せ物。
５２．前記標的が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体からなる群から選択される有機分子である、実施形態５１に記載の組合せ物。
５３．前記系が、免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションおよび／または配列決定のための系である、実施形態５２に記載の組合せ物。
５４．試料中の加水分解酵素の活性および／または量を評価する方法であって、
ａ）実施形態１から２５のいずれかに記載の、式（Ｉ）：
【０１９３】
【化３０】
2014505059.tif 000034
の構造を有する加水分解酵素基質を、
加水分解酵素を含有するか、または加水分解酵素を含有すると疑われる試料と、該加水分解酵素が該試料中に存在する場合には該基質を切断する条件下で接触させて、式（ＩＩ）の構造を有するアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子および式（ＩＩＩ）の構造を有する化合物
【０１９４】
【化３１】
2014505059.tif 000035
［式中、Ａ、Ｒ、ｎおよびＸは、実施形態１に定義されている通りである］
を生成するステップと、
ｂ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価して、該試料中の該加水分解酵素の活性および／または量を評価するステップと
を含む、方法。
５５．前記加水分解酵素が、エステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはグリコシダーゼである、実施形態５４に記載の方法。
５６．前記加水分解酵素が、アセチルエステラーゼ、アミノ酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼおよびホスファターゼからなる群から選択されるエステラーゼである、実施形態５５に記載の方法。
５７．前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、実施形態５６に記載の方法。
５８．前記加水分解酵素が、α−アミノ酸エステラーゼである、実施形態５６に記載の方法。
５９．前記加水分解酵素が、ベータ−ガラクトシダーゼである、実施形態５５に記載の方法。
６０．前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼである、実施形態５５に記載の方法。
６１．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価する前記ステップが、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む、実施形態５４に記載の方法。
６２．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、酸素の存在下で、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子をアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、Ｈ２Ｏ２を生成し、該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、実施形態６２に記載の方法。
６４．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子をアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、該ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される、実施形態５４に記載の方法。
６５．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、
ａ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）該アリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、該還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下で該アリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加のアリールアルデヒド分子または不飽和脂肪族アルデヒド分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）該Ｈ２Ｏ２の存在および／もしくは量、またはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の量を評価することと
によって評価される、実施形態５４に記載の方法。
６６．前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、アンチピリン、フェノールおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、実施形態６５に記載の方法。
６７．前記加水分解酵素基質が、β−グリコシダーゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、β−グリコシダーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼである、実施形態５４に記載の方法。
６８．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価する前記ステップが、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む、実施形態６７に記載の方法。
６９．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成し、該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される、実施形態６７に記載の方法。
７０．前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、４−ＡＡおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、実施形態６９に記載の方法。
７１．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、該ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される、実施形態６７に記載の方法。
７２．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、
ａ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）該酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、該還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下で該アリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加の酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することと
によって評価される、実施形態６７に記載の方法。
７３．前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、実施形態７２に記載の方法。
７４．前記加水分解酵素基質が、アルカリホスファターゼ基質分子の少なくとも一部を含み、前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、実施形態５４に記載の方法。
７５．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量を評価する前記ステップが、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を酸化試薬で酸化させるステップを含む、実施形態７４に記載の方法。
７６．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成し、該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することによって評価される、実施形態７４に記載の方法。
７７．前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、実施形態７６に記載の方法。
７８．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成し、該ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在および／または量を評価することによって評価される、実施形態７４に記載の方法。
７９．前記アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子の存在および／または量が、
ａ）該アリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、酸素の存在下でアリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼで酸化して、酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成することと、
ｂ）該酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子を、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でアリールアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼで還元して、該還元されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子が、酸素の存在下で該アリールアルコールオキシダーゼまたは脂肪族アルコールオキシダーゼによって酸化されて、追加の酸化されたアリールアルコール分子または不飽和脂肪族アルコール分子およびＨ２Ｏ２を生成する反応サイクルを形成することと、
ｃ）該Ｈ２Ｏ２の存在および／または量を評価することと
によって評価される、実施形態７４に記載の方法。
８０．前記Ｈ２Ｏ２の存在および／または量が、該Ｈ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ、フェノール、アンチピリンおよび／またはアニリン類似体と接触させることによって評価される、実施形態７９に記載の方法。
８１．標的のアッセイ、単離および／または生成の一部として実施される、実施形態５４から８０のいずれかに記載の方法。
８２．前記標的が、無機分子、有機分子および／またはその複合体である、実施形態８１に記載の方法。
８３．前記有機分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびその複合体からなる群から選択される、実施形態８２に記載の方法。
８４．免疫アッセイ、タンパク質配列決定、核酸増幅、ハイブリダイゼーションまたは配列決定の一部として実施される、実施形態８２に記載の方法。
８５．ＲＮＡまたはＤＮＡの配列決定をモニタするために使用される、実施形態８４に記載の方法。
８６．前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼである、実施形態８５に記載の方法。
【０１９５】
本発明を、次の例示的な実施形態によってさらに説明する。
【実施例】
【０１９６】
（実施例１）
基質の合成
本発明の組成物および方法で使用するのに適した加水分解酵素基質は、公知の出発材料を使用して慣用の方法によって作製することができる。そのような加水分解酵素基質の例には、保護された形態の公知の臭化ガラクトシル（テトラアセテート）から、ジクロロメタン中で酸化銀（Ｉ）を使用し、続いて、メタノール中でメトキシドを用いて加水分解してアセテート保護基を除去することで作製することができるｐ−ＭＯＢＧ（ｐ−メトキシベンジルガラクトース）およびＨＤＥＧＰが包含される。
【０１９７】
ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｐ−ＭＯＢＧ）（ＭＷ：３００．３）の合成
１）．ｐ−メトキシベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐ−ＭＢＡＧＰ）（ＭＷ：４６８．３８）
アセトブロモ−α−Ｄ−ガラクトース２．６４ｇ（６．４２ｍｍｏｌ）およびｐ−メトキシベンジルアルコール１．３８ｍＬ（１１．０６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン２０ｍＬ中の溶液に、分子ふるい（４Ａｏ）１．５ｇを加えた。室温で２０分間撹拌した後に、酸化銀（Ｉ）１．５ｇ（６．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで濾過し、濃縮した。シリカゲル上で残渣をクロマトグラフィー処理して、生成物１．０ｇ（８０．６４％）を無色のシロップとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ＝７．２２，  ６．８８（２  ｄ，  ４Ｈ，  フェニル），  Ｃ２２Ｈ２８Ｏ１１：計算値４６８．５，  実測値４９１．６  （Ｍ＋２３Ｎａ）。
【０１９８】
２）．ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｐ−ＭＯＢＧ）（ＭＷ：３００．３）
Ｐ−メトキシベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐ−ＭＢＡＧＰ）１．０ｇ（２．１４ｍｍｏｌ）を無水メタノール（３×１０ｍＬ）と共蒸発させた後に、無水メタノール１０ｍＬおよび０．５Ｍのナトリウムメトキシド１ｍＬを加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで２ＮのＨＣｌを加えることによって、ｐＨ７．０まで中和した。２０℃〜３０℃での蒸発によって溶媒を除去した後に、残渣を、酢酸エチルによって、次いで酢酸エチル／エタノール（５／１）によって溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物：白色の固体０．４ｇ。収率：６２．２％。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ＝９０／１０）：  δ＝７．２，  ６．７６（２ｄ，  ４Ｈ，  フェニル），  ４．７４，  ４．４６（２ｄ，  ２Ｈ，  ＣＨ２−フェニル），  ４．１８（Ｄ，  １Ｈ，  Ｊ１，２＝７．６  Ｈｚ，  １−Ｈ），  ３．７０（ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３Ｏ−），  ３．３０−３．７８（ｍ，  ６Ｈ）。  Ｃ１４Ｈ２０Ｏ７：  計算値３００．３，  実測値２９９．２  （Ｍ−１）および３２３．２  （Ｍ＋２３Ｎａ）。
【０１９９】
【化３２】
2014505059.tif 000036
同様の手順によって、基質ＨＤＥＧを合成した。
【０２００】
（実施例２）
ベータ−ガラクトシダーゼによる加水分解
本発明の加水分解酵素基質は、基質に合った適切な酵素によって加水分解され得るので；上記で示されている通りのＰＭＯＢＧまたはＨＤＥＧＰは、次に図示されている通り、ベータ−ガラクトシダーゼによって加水分解され得る。
【０２０１】
【化３３】
2014505059.tif 000037
１０ｍＭのｐ−ＭＯＢＧを１０ユニット／ｍｌのベータ−ガラクトシダーゼおよび２０ユニット／ｍｌのアリールアルコールオキシダーゼと共に３７℃で３０分間インキュベートすると、Ｈ２Ｏ２が発生し、これは、４−ＡＡおよびＴＯＯＳの存在下でペルオキシダーゼによって５６０ｎｍで検出された。ｐ−ＭＯＢＧがアリールアルコールオキシダーゼのみと共にインキュベートされると、検出されるＨ２Ｏ２はなく、このことは、ｐ−ＭＯＢＧがアリールアルコールオキシダーゼのための基質ではないが、ベータ−ガラクトシダーゼによってｐ−ＭＯＢＧが加水分解されて初めて、アリールアルコールオキシダーゼのための基質になることを示している。この実施例で使用されるアリールアルコールデヒドロゲナーゼは、ＧｕｉｌｌｅｎおよびＥｖａｎｓ、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０巻（８号）：２８１１〜１７頁（１９９４年）ならびにＲｅｉｓｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻（４５号）：２８１５２〜２８１５９頁（１９９４年）の記載に基づき組み換えによって生成された。
【０２０２】
酵素サイクリング反応と共役している加水分解反応のいくつかの具体的な実施例。
【０２０３】
（実施例３）
試薬１
ベータ−ガラクトシダーゼ：５０ユニット／ｍｌ
基質ｐ−ＭＯＢＧ：３ｍＭ
アリールアルコールオキシダーゼ：２０ユニット／ｍｌ
アリールアルコールデヒドロゲナーゼ：３０ユニット／ｍｌ
ＮＡＤＨ：２ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、５０ｍＭ
試薬２：
リン酸緩衝液、ｐＨ６．３、１００ｍＭ
４−ＡＡ  ５ｍＭ
Ｔｏｏｓ：５ｍＭ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ：１０ユニット／ｍｌ
【０２０４】
【化３４】
2014505059.tif 000038
この研究では、試薬１  １８０μｌを試験される試料２０μｌと混合し、混合物を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、試薬２  ６０（６０）μｌを混合物に加え、３７℃でさらに５分間インキュベートする。５６０ｎｍでの吸光度の変化を、試薬２を加えてから２〜５分間にわたって測定する。
【０２０５】
（実施例４）
試薬１：
ベータ−ガラクトシダーゼ：３０ユニット／ｍｌ
基質ＨＤＥＧ：３ｍＭ
アリールアルコールオキシダーゼ：１５ユニット／ｍｌ
アルコールデヒドロゲナーゼ：４０ユニット／ｍｌ
ＮＡＤＰＨ：１ｍＭ
ホウ酸緩衝液、ｐＨ９．１、３０ｍＭ
試薬２：
クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０、１００ｍＭ
４−ＡＡ：３ｍＭ
アニリン類似体：５ｍＭ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ：１５ユニット／ｍｌ
【０２０６】
【化３５】
2014505059.tif 000039
この研究では、試薬１  １８０μｌを試験される試料２０μｌと混合し、混合物を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、試薬２  ６０（６０）μｌを混合物に加え、３７℃でさらに４分間インキュベートする。５６０ｎｍでの吸光度の変化を、試薬２を加えてから１〜４分間にわたって測定する。
【０２０７】
（実施例５）
試薬１
アルカリホスファターゼ：５０ユニット／ｍｌ
基質ＡＰ：３ｍＭ
アリールアルコールオキシダーゼ：２０ユニット／ｍｌ
アリールアルコールデヒドロゲナーゼ：３０ユニット／ｍｌ
ＮＡＤＨ：２ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、５０ｍＭ
試薬２：
リン酸緩衝液、ｐＨ６．３、１００ｍＭ
４−ＡＡ  ５ｍＭ
Ｔｏｏｓ：５ｍＭ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ：１０ユニット／ｍｌ
【０２０８】
【化３６】
2014505059.tif 000040
ＡＰの構造は、図４に示されている。一部の実施例では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素であり、Ｒ３は−ＯＣＨ３である。この研究では、試薬１  １８０μｌを試験される試料２０μｌと混合し、混合物を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、試薬２  ６０（６０）μｌを混合物に加え、３７℃でさらに５分間インキュベートする。５６０ｎｍでの吸光度の変化を、試薬２を加えてから２〜５分間にわたって測定する。
【０２０９】
（実施例６）
試薬１：
アセチルエステラーゼ：３０ユニット／ｍｌ
基質ＡＥ：３ｍＭ
アリールアルコールオキシダーゼ：１５ユニット／ｍｌ
アルコールデヒドロゲナーゼ：４０ユニット／ｍｌ
ＮＡＤＰＨ：１ｍＭ
ホウ酸緩衝液、ｐＨ９．１、３０ｍＭ
試薬２：
クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０、１００ｍＭ
４−ＡＡ：３ｍＭ
アニリン類似体：５ｍＭ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ：１５ユニット／ｍｌ
【０２１０】
【化３７】
2014505059.tif 000041
ＡＥの構造は図５に示されている。一部の実施例では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素であり、Ｒ３は−ＯＣＨ３である。この研究では、試薬１  １８０μｌを試験される試料２０μｌと混合し、混合物を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、試薬２  ６０（６０）μｌを混合物に加え、３７℃でさらに４分間インキュベートする。５６０ｎｍでの吸光度の変化を、試薬２を加えてから１〜４分間にわたって測定する。
【０２１１】
（実施例７）
アリールアルコールオキシダーゼ（ＡＡＯ）およびアリールアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）を使用する例示的なＡＡＯ／ＡＡＤサイクリング系を使用して、アリールアルコールを検出した（下記を参照されたい）。
【０２１２】
【化３８】
2014505059.tif 000042
Ｇｕｉｌｌｅｎ，  Ｆ．ら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｒｙｌ−ａｌｃｏｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０９巻：６０３〜６１１頁（１９９２年）に記載されている手順を使用して、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉからＡＡＯを精製した。精製ステップは、濃縮、アニオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを包含する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＡＤを組換え生成するためのＤＮＡ構築物は、Ｓｈａｗ，  Ｊ．  Ｐ．ら、「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＴＯＬ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＷＷ０」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６８巻：１０８４２〜１０８５０頁（１９９３年）に開示されているＤＮＡ配列を基に作製し、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＡＤは、Ｅ．ｃｏｌｉ内での過剰発現によって作製した。サイクリング系を化学発光（ルミノール−過酸化水素−ホースラディッシュペルオキシダーゼ）反応と組み合わせて、高感度アッセイを形成した。
【０２１３】
ＡＡＯでは、Ｋｐ−アニシル−ＯＨ＝３７±８μＭ；およびｋｃａｔ＝１１７／ｓ。ＡＡＤでは、ＫＮＡＤＨ＝９．１±２μＭ；Ｋｐ−アニシルアルデヒド＝６．６±０．８μＭ；およびｋｃａｔ＝３０／ｓ。
【０２１４】
反応条件：全体積２００μｌ中、トリス−ＨＣＬ、ｐＨ７、１００ｍＭ；ＮＡＤＨ  １００μＭ；ＥＤＴＡ  １００ｍＭ；ＨＲＰ、１．５Ｕ；Ｇ６ＰＨ、１ｍＭ；Ｇ６ＰＤＨ、２Ｕ；ルミノール／増強剤、５μｌ；ＡＡＯ、２０μｌ（６ｍｇ／ｍｌ）；ＡＡＤ、２０μｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）。ＡＡＤを最後に加えて、サイクリング反応を開始させた。Ｍｏｎｏｂｉｎｄ  Ｉｎｃ．製のインパルス２、ＣＬＩＡリーダーを使用して、反応を１０分間モニタした。
【０２１５】
図１０に示されている通り、ＡＡＯ／ＡＡＤサイクリング系を用いると、アリールアルコールは０．２ｎＭの低さまで検出され得る。ＡＡＯのみによって触媒される反応と比較すると、ＡＡＯ／ＡＡＤサイクリング系を用いた場合のアリールアルコールに対する検出限界は、少なくとも１，０００倍高く増大し得る。
【０２１６】
（実施例８）
実施例７に記載されている通りのアリールアルコールオキシダーゼ（ＡＡＯ）およびアリールアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）を使用する例示的なＡＡＯ／ＡＡＤサイクリング系を使用して、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を検出した。
【０２１７】
反応条件：ＡＬＰ反応系５０μｌ；トリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０（１００ｍＭ）；アニシルホスフェート（４０μＭ）、ＡＬＰ反応緩衝液５μｌ。ＡＬＰ反応を５分間維持した。
【０２１８】
サイクリング系２００μｌ：ＡＬＰ反応系５０μｌ；ＡＡＯ  １０μｌ（２．５ｍｇ／ｍｌ）；ＡＡＤ  １０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）；ＮＡＤＨ、２０μＭ；Ｇ６ＰＨ、２ｍＭ；Ｇ６ＰＤＨ、２Ｕ；ＨＲＰ、１．５Ｕ；Ｈｙｐｅｒｂｌｕｅ、１０μｌ；およびトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０（２００ｍＭ）。ＡＡＤを最後に加えて、サイクリング反応を開始させた。Ｍｏｎｏｂｉｎｄ  Ｉｎｃ．製のインパルス２、ＣＬＩＡリーダーを使用して、反応を３０分間モニタした。
【０２１９】
図１１に示されている通り、基質として４０μＭのアニシルホスフェートを使用して、溶液中でアルカリホスファターゼを検出するために上記アッセイを使用する場合、ＡＬＰ２．６アトモルを検出することができる。検出感度は、アトモル以下に達し、ＡＬＰ基質濃度を最適化し、酵素濃度および反応時間を増大させると、さらに改良することができる。
【０２２０】
上記の実施例は、単に例示を目的として包含されていて、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。上記の実施例に対して多くの変形形態が可能である。上記の実施例に対する変更形態および変形形態は当業者には明らかであるので、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図されている。
【図１−１】
2014505059.tif 000055
【図１−２】
2014505059.tif 000056
【図２】
2014505059.tif 000057
【図３】
2014505059.tif 000058
【図４】
2014505059.tif 000059
【図５】
2014505059.tif 000060
【図６】
2014505059.tif 000061
【図７】
2014505059.tif 000062
【図８】
2014505059.tif 000063
【図９】
2014505059.tif 000064
【図１０】
2014505059.tif 000065
【図１１】
2014505059.tif 000066
【国際調査報告】
2014505059.tif 000067
2014505059.tif 000068
2014505059.tif 000069