(57)【要約】  本発明はヒトＥＧＦＲ遺伝子における癌誘発突然変異を検出するための試薬及び方法を含む。更に当該突然変異の検出方法及び治療方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のヒト上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）核酸内の突然変異を検出する方法であって、
（ａ）前記試料中の核酸を、配列番号２、１０、１８、２７、３２、５１、６０、７１、８２、９３、及び１０４から選択されるオリゴヌクレオチドの一次配列を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｂ）前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件下で前記試料をインキュベートし、
（ｃ）前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸を含む増幅産物を生成し、
（ｄ）前記増幅産物の存在を検出することにより、前記ＥＧＦＲ核酸内の突然変異の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
配列番号１の対応部位に対し、少なくとも１つの追加のミスマッチを更に含むオリゴヌクレオチドに、前記試料中の核酸を接触させる、請求項１の方法。
【請求項３】
環外アミノ基において修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを更に含むオリゴヌクレオチドに、前記試料中の核酸を接触させる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記の環外アミノ基において修飾された塩基を有するヌクレオチドが、tert−ブチル−ベンジル−デオキシアデニン、tert−ブチル−ベンジル−デオキシシトシン、メチル−デオキシアデニン、メチル−デオキシキシトシン（deoxyxytosine）、エチル−デオキシアデニン、及びエチル−デオキシシトシンから選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
増幅をリアルタイムＰＣＲで行う、請求項１の方法。
【請求項６】
悪性腫瘍を有する患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答し得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）前記患者由来の試料中の核酸を、配列番号２、１０、１８、２７、３２、５１、６０、７１、８２、９３、及び１０４から選択されるオリゴヌクレオチドの一次配列を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｂ）前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件下で前記試料をインキュベートし、前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸を含む増幅産物を生成し、
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出することにより、前記ＥＧＦＲ核酸内の突然変異の存在を検出し、突然変異が存在する場合には、
（ｄ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答し得ると決定する
ことを含む方法。
【請求項７】
配列番号１の対応部位に対し、少なくとも１つの追加のミスマッチを更に含むオリゴヌクレオチドに、前記試料中の核酸を接触させる、請求項６の方法。
【請求項８】
環外アミノ基において修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに、前記試料中の核酸を接触させる、請求項６の方法。
【請求項９】
前記の環外アミノ基において修飾された塩基を有するヌクレオチドが、tert−ブチル−ベンジル−デオキシアデニン、tert−ブチル−ベンジル−デオキシシトシン、メチル−デオキシアデニン、メチル−デオキシキシトシン（deoxyxytosine）、エチル−デオキシアデニン、及びエチル−デオキシシトシンから選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）の増幅及び工程（ｃ）の検出をリアルタイムＰＣＲで行う、請求項６の方法。
【請求項１１】
前記ＥＧＦＲ阻害剤がセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、又はゲフィチニブである、請求項６の方法。
【請求項１２】
ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子内の突然変異を検出するキットであって、
（ａ）配列番号２〜７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｂ）配列番号１０〜１５のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１６のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｃ）配列番号１８〜２４のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２５のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｄ）配列番号２７〜２９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号３０のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｅ）配列番号３２〜４８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号４９のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｆ）配列番号５１〜５７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号５８のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｇ）配列番号６０〜６８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号６９のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｈ）配列番号７１〜７９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８０のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｉ）配列番号８２〜９０のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号９１のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｊ）配列番号９３〜１０１のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０２のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｋ）配列番号１０４〜１０６のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０７のオリゴヌクレオチドとの対、
から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチド対を含むキット。
【請求項１３】
更に追加のオリゴヌクレオチドとして、
オリゴヌクレオチド対（ａ）を有するキットの場合、更に配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｂ）を有するキットの場合、更に配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｃ）を有するキットの場合、更に配列番号２６のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｄ）を有するキットの場合、更に配列番号３１のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｅ）を有するキットの場合、更に配列番号５０のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｆ）を有するキットの場合、更に配列番号５９のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｇ）を有するキットの場合、更に配列番号７０のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｈ）を有するキットの場合、更に配列番号８１のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｉ）を有するキットの場合、更に配列番号９２のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｊ）を有するキットの場合、更に配列番号１０３のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｋ）を有するキットの場合、更に配列番号１０８のオリゴヌクレオチドを含む、
請求項１２のキット。
【請求項１４】
前記追加のオリゴヌクレオチドが標識されてなる、請求項１２のキット。
【請求項１５】
更にヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝剤を含む、請求項１２のキット。
【請求項１６】
ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子内の突然変異を検出するための反応混合物であって、
（ａ）配列番号２〜７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｂ）配列番号１０〜１５のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１６のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｃ）配列番号１８〜２４のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２５のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｄ）配列番号２７〜２９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号３０のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｅ）配列番号３２〜４８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号４９のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｆ）配列番号５１〜５７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号５８のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｇ）配列番号６０〜６８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号６９のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｈ）配列番号７１〜７９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８０のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｉ）配列番号８２〜９０のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号９１のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｊ）配列番号９３〜１０１のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０２のオリゴヌクレオチドとの対、
（ｋ）配列番号１０４〜１０６のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０７のオリゴヌクレオチドとの対、
から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチド対を含む反応混合物。
【請求項１７】
更に追加のオリゴヌクレオチドとして、
オリゴヌクレオチド対（ａ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号９のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｂ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号１７のオリゴヌクレオチド;
オリゴヌクレオチド対（ｃ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号２６のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｄ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号３１のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｅ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号５０のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｆ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号５９のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｇ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号７０のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｈ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号８１のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｉ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号９２のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｊ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号１０３のオリゴヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチド対（ｋ）を有する反応混合物の場合、更に配列番号１０８のオリゴヌクレオチドを含む、
請求項１６の反応混合物。
【請求項１８】
配列番号２、１０、１８、２７、３２、５１、６０、７１、８２、９３及び１０４から選択されるオリゴヌクレオチドの一次配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号１の対応部位に対する少なくとも１つの追加のミスマッチを更に含む、請求項１８のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
環外アミノ基において修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを更に含む、請求項１８のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記の環外アミノ基において修飾された塩基を有するヌクレオチドが、tert−ブチル−ベンジル−デオキシアデニン、tert−ブチル−ベンジル−デオキシシトシン、メチル−デオキシアデニン、メチル−デオキシキシトシン（deoxyxytosine）、エチル−デオキシアデニン、及びエチル−デオキシシトシンから選択される、請求項２０のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３〜７、１１〜１５、１９〜２４、２８、２９、３３〜４８、５２〜５７、６１〜６８、７２〜７９、８３〜９０、９４〜１０１、１０５、及び１０６から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号８、１６、２５、３０、４９、５８、６９、８０、９１、１０２、及び１０７から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号９、１７、２６、３１、５０、５９、７０、８１、９２、１０３、及び１０８から選択されるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌診断及び癌治療のためのコンパニオン診断に関する。特に本発明は、診断及び予後、並びに癌の処置の有効性を予測するのに有用な、突然変異の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）、別名ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１は、成長因子受容体の１型チロシンキナーゼファミリーの一員である。これらの膜結合タンパク質は細胞内チロシンキナーゼドメインを有し、これがＲａｓ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、及びＡＫＴ経路を含む種々のシグナル伝達経路と相互作用する。これらの経路を通じて、ＨＥＲファミリータンパク質は、細胞増殖、分化、及び生存を調節している。
【０００３】
一部の癌はＥＧＦＲキナーゼドメイン（エクソン１８〜２１）内に突然変異を有することが示されている（Pao et al. (2004). "EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib", P.N.A.S. 101 (36): 13306-13311;  Sordella et al. (2004), "Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways", Science 305 (5687): 1163-1167.）。
【０００４】
ＥＧＦＲを標的とする治療法が開発されてきた。例えば、セツキシマブ（ERBITUX（登録商標））及びパニツムマブ（VECTIBIX（登録商標））は、抗ＥＧＦＲ抗体である。エルロチニブ（TARCEVA（登録商標））及びゲフィチニブ（IRESSA（登録商標））は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの経口用選択的阻害剤として有用なキナゾリンである。これらの薬物が最も有効なのは、ＥＧＦＲ遺伝子に突然変異を有する患者である。例えば、Mok et al. (2009) "Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma", N Eng J Med 361:947-957 は、ＥＧＦＲ突然変異陽性腫瘍を有する患者において、IRESSA（登録商標）により、化学療法と比べて無進行生存（progression-free survival：ＰＦＳ）が延長されたことを示している。ＥＧＦＲに突然変異を有さない腫瘍の場合には、逆の結果が得られた。ＰＦＳはIRESSA（登録商標）よりも化学療法の方が有意に長くなった。従って、患者の処置が成功する可能性を高めるには、ＥＧＦＲの突然変異状態を把握する必要がある。
【０００５】
癌組織のＥＧＦＲ遺伝子内に存在する突然変異は多数同定されている（米国特許第７，９６０，１１８号及び同第７，２９４，４６８号公報）。ＥＧＦＲキナーゼドメイン内に存在する突然変異のうち一部は頻発するが、他のものは発生頻度がより低い。しかし、ＥＧＦＲの突然変異の臨床試験は、できるだけ多くの突然変異を、十分な感度を以って検出することが不可欠である。これにより、希な突然変異を有する患者が、「偽陰性」（false negative）の試験結果となり、救命治療の可能性が断たれてしまうのを防ぐことが可能となる。ここで課題となるのは、できるだけ多くの癌関連ＥＧＦＲ突然変異を高い費用効率で調べるためのアッセイを設計することである。
【０００６】
多重化（multiplexing）に感受性であり、その影響を受けやすい技術の一つが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（allele-specific PCR：ＡＳ−ＰＣＲ）である。この技術は、ある核酸配列の野生型変異体の存在下で、当該核酸配列内の突然変異又は多形を検出する。対立遺伝子特異的ＰＣＲが首尾よく実施されれば、標的核酸の所望の変異体が増幅されれる一方、他の変異体は、少なくとも検出可能なレベルに増幅されることはない。対立遺伝子特異的ＰＣＲでは、少なくとも１つのプライマーが対立遺伝子に特異的である。これにより、当該配列の特定の変異体が存在する場合にのみ、プライマー伸長が生じる。同一の反応混合物内に、１又は２以上の多形部位を標的とする１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーが存在していてもよい。首尾よく機能する対立遺伝子特異的プライマーが設計できるか否かは予測し得ない。既知の配列を基準としてプライマーを設計するのが通常であるが、極めて類似する複数の配列を識別可能なプライマーを設計する場合には、定石は存在しない。
【０００７】
診断アッセイにおいては、正確な識別が要求される。例えば、ＥＧＦＲ突然変異検出においては、対立遺伝子特異的プライマーの性能が、患者の癌治療の方針を左右する場合もある。
【０００８】
対立遺伝子特異的ＰＣＲは、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異の検出にも利用されている（米国特許出願公開第２００８／０２６１２１９号公報）。しかし、最大数のＥＧＦＲ突然変異を最高の特異性及び感度で検出可能な、包括的なアッセイ法 が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様によれば、本発明は、試料中のヒト上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）核酸内の突然変異を検出する方法であって、前記試料中の核酸を請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ；前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件下で前記試料をインキュベートし；前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸を含む増幅産物を生成し；前記増幅産物の存在を検出することにより、前記ＥＧＦＲ核酸内の突然変異の存在を検出することを含む方法である。
【００１０】
更なる態様によれば、本発明は、上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）遺伝子内に突然変異を有する細胞を含有する可能性のある腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記患者由来の試料中の核酸を請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ；前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件下で前記試料をインキュベートし；前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸を含む増幅産物を生成し；前記増幅産物の存在を検出することにより、前記ＥＧＦＲ核酸内の突然変異の存在を検出し、突然変異が存在する場合には、前記変異遺伝子によりコードされる変異ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物を患者に投与することを含む方法である。
【００１１】
更に別の態様によれば、本発明は、悪性腫瘍を有する患者のＥＧＦＲ阻害剤による治療が有効である可能性が高いか否かを決定する方法であって、前記患者由来の試料中の核酸を請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ；前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件下で前記試料をインキュベートし；前記ＥＧＦＲ核酸内の標的核酸を含む増幅産物を生成し；前記増幅産物の存在を検出することにより、前記ＥＧＦＲ核酸内の突然変異の存在を検出し、突然変異が存在する場合には、治療が有効である可能性が高いと決定することを含む方法である。
【００１２】
更なる態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号２〜７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８のオリゴヌクレオチドとの対、（ｂ）配列番号１０〜１５のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１６のオリゴヌクレオチドとの対、（ｃ）配列番号１８〜２４のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２５のオリゴヌクレオチドとの対、（ｄ）配列番号２７〜２９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号３０のオリゴヌクレオチドとの対、（ｅ）配列番号３２〜４８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号４９のオリゴヌクレオチドとの対、（ｆ）配列番号５１〜５７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号５８のオリゴヌクレオチドとの対、（ｇ）配列番号６０〜６８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号６９のオリゴヌクレオチドとの対、（ｈ）配列番号７１〜７９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８０のオリゴヌクレオチドとの対、（ｉ）配列番号８２〜９０のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号９１のオリゴヌクレオチドとの対、（ｊ）配列番号９３〜１０１のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０２のオリゴヌクレオチドとの対、（ｋ）配列番号１０４〜１０６のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０７のオリゴヌクレオチドとの対、から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチド対を含むキットである。
【００１３】
更に別の態様によれば、本発明は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子内の突然変異を検出するための反応混合物であって、（ａ）配列番号２〜７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８のオリゴヌクレオチドとの対、（ｂ）配列番号１０〜１５のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１６のオリゴヌクレオチドとの対、（ｃ）配列番号１８〜２４のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２５のオリゴヌクレオチドとの対、（ｄ）配列番号２７〜２９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号３０のオリゴヌクレオチドとの対、（ｅ）配列番号３２〜４８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号４９のオリゴヌクレオチドとの対、（ｆ）配列番号５１〜５７のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号５８のオリゴヌクレオチドとの対、（ｇ）配列番号６０〜６８のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号６９のオリゴヌクレオチドとの対、（ｈ）配列番号７１〜７９のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号８０のオリゴヌクレオチドとの対、（ｉ）配列番号８２〜９０のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号９１のオリゴヌクレオチドとの対、（ｊ）配列番号９３〜１０１のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０２のオリゴヌクレオチドとの対、（ｋ）配列番号１０４〜１０６のうち１のオリゴヌクレオチドと、配列番号１０７のオリゴヌクレオチドとの対、から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチド対を含む反応混合物である。
【００１４】
更に別の態様によれば、本発明は、配列番号２、１０、１８、２７、３２、５１、６０、７１、８２、９３及び１０４から選択されるオリゴヌクレオチドの一次配列を含むオリゴヌクレオチドである。別の態様によれば、本発明は、配列番号３〜７、１１〜１５、１９〜２４、２８、２９、３３〜４８、５２〜５７、６１〜６８、７２〜７９、８３〜９０、９４〜１０１、１０５及び１０６から選択されるオリゴヌクレオチドである。更に別の態様によれば、本発明は、配列番号８、１６、２５、３０、４９、５８、６９、８０、９１、１０２及び１０７から選択されるオリゴヌクレオチドである。更に別の態様によれば、本発明は、配列番号９、１７、２６、３１、５０、５９、７０、８１、９２、１０３及び１０８から選択されるオリゴヌクレオチドであって、任意により検出可能なレベルを含んでいてもよいオリゴヌクレオチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａ〜ＣはヒトＥＧＦＲ遺伝子のコーディング配列（配列番号１）である。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義：
この開示の理解を容易にするために、本明細書に使用される用語の次の定義が提供される。
【００１７】
用語「Ｘ［ｎ］Ｙ」とは、アミノ酸配列内の位置［ｎ］でのアミノ酸Ｙによるアミノ酸Ｘの置換をもたらすミスセンス変異を言及する。例えば、用語「Ｂ７１９Ａ」とは、位置７１９でのグリシンがアラニンにより置換されている突然変異を言及する。
【００１８】
用語「対立遺伝子−特異的プライマー（対立遺伝子特異的primer）」又は「ＡＳプライマー（AS primer）」とは、標的配列の１よりも多くの変異体にハイブリダイズするが、しかし１つの変異体とのみ、プライマーは適切な条件下で核酸ポリメラーゼにより効果的にエクステンドされることにおいて、標的配列の変異体間で識別できるプライマーを言及する。標的配列の他の変異体とは、エクステンション（extension）はあまり効率的でないか又は非効率的である。
【００１９】
用語「共通プライマー（common primer）」とは、対立遺伝子−特異的プライマーを含むプライマー対における第二プライマーを言及する。共通プライマーは、対立遺伝子−特異的ではなく、すなわち遺伝子−特異的プライマーが識別する標的配列の変異体間を識別しない。
【００２０】
用語「相補的（complementary）」又は「相補性（complementarity）とは、ワトソン−クリック塩基対合規則により関連付けられるポリヌクレオチドの逆並行鎖を参照して使用される。用語「完全に相補的（perfectly complementary）」又は「１００％相補的（100％ complementary）」とは、逆並行鎖間のすべての塩基のワトソン−クリック対合を有する、すなわちポリヌクレオチド重複体（duplex）におけるいずれかの２個の塩基間にミスマッチが存在しない相補的配列を言及する。しかしながら、重複体は、完全な相補性の不在下でさえ、逆平行鎖間で形成される。用語「部分的に相補的（partially complementary）」又は「不完全に相補的（incompletely complementary）」とは、１００％未満、完全である（例えば、ポリヌクレオチド重複体に少なくとも１つのミスマッチ又は不整合塩基が存在する）、逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基のいずれかのアラインメントを言及する。部分的相補鎖間の重複体は一般的に、完全な相補鎖間の重複体ほど安定ではない。
【００２１】
用語「試料（sample）」とは、核酸を含むか又は含むと推定されるいずれかの組成物を言及する。これは、個人から単離された組織又は体液、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、臓器及び腫瘍の試料、及びまた、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそれから単離された核酸の試料を包含する。
【００２２】
用語「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」及び「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、交換可能的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを説明するために時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、企画されるヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０−１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５−３０個のヌクレオチドから構成され得る。
【００２３】
用語「一次配列（primary sequence）」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列を言及する。ヌクレオチド修飾、例えば含窒素塩基修飾、糖修飾又は他の骨格修飾は、一次配列の一部ではない。ラベル、例えばオリゴヌクレオチドに接合される発色団もまた、一次配列の一部ではない。従って、２つのオリゴヌクレオチドは、同じ一次配列を共有することができるが、しかし修飾及びラベルに関して異なる。
【００２４】
用語「プライマー（primer）」とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして合成のために適切な条件下で核酸の相補的鎖に沿っての合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを言及する。本明細書において使用される場合、用語「プローブ（probe）」とは、標的核酸中の配列とハイブリダイズし、そして通常、検出可能的ラベルされるオリゴヌクレオチドを言及する。プローブは、修飾、例えばプローブを、核酸ポリメラーゼ及び１又は２以上の発色団により非エクステンション可能性にする3’−末端修飾を有することができる。同じ配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つのアッセイにおいてプライマーとして、及び異なったアッセイにおいてプローブとして機能することができる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、用語「標的配列（target sequence）」、「標的核酸（target nucleic acid）」又は「標的物（target）」とは、増幅されるか、検出されるか、又は両者である核酸配列の一部を言及する。
【００２６】
用語「ハイブリダイズされる（hybridized）」及び「ハイブリダイゼーション（hybridization）」とは、重複体の形成をもたらす２つの核酸間の塩基対合相互作用を言及する。２つの核酸は、ハイブリダイゼーションを達成するのにそれらの全長にわたって１００％相補性を有することは必要条件ではない。
【００２７】
ヒトＥＧＦＲ  ｃＤＮＡ（配列番号１）のコーディング部分は、図１（１Ａ−１Ｃ）上に示されており（Ensemble参照番号ENST00000275493、www.ensembl.org、Hubbard et al. (2009), Ensembl 2009, Nucl. Acids Res. 37 (suppl 1): D690-D697を参照のこと）、これは、完全ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ_005228.3）の一部である。癌患者において頻繁に変異されるコドンのいくつかは、下線を引かれ、そして太字で示されている。
【００２８】
対立遺伝子−特異的ＰＣＲは、米国特許第６，６２７，４０２号に記載されている。対立遺伝子−特異的ＰＣＲにおいては、識別プライマーは、標的配列の所望する変異体に対して相補的であるが、しかし標的配列の所望しない変異体とはミスマッチされる配列を有する。典型的には、プライマーにおける識別ヌクレオチド、すなわち標的配列のわずか１つの変異体をマッチングするヌクレオチドは、3’−末端ヌクレオチドである。しかしながら、プライマーの3’末端は、特異性の多くの決定因子の単なる１つである。対立遺伝子−特異的ＰＣＲの特異性は、マッチしたプライマーのエクステンション速度よりもミスマッチプラマーのより遅いエクステンション速度に起因し、究極的には、ミスマッチ標的物の相対的増幅効率を低める。低められたエクステンション動力学及び従って、ＰＣＲ特異性は、多くの要因、例えば酵素の性質、反応成分及びそれらの濃度、エクステンション濃度及びミスマッチの全体的な配列コンテクスト（sequence context）により影響される。個々の特定のプライマーに対するそれらの要因の効果は、確実には定量化され得ない。信頼できる定量的ストラジーなしには、及び莫大に多くの変数を伴っては、対立遺伝子−特異的プライマーの企画は、しばしば驚くべき結果を伴っての試行錯誤の問題である。下記ＥＧＦＲの変異対立遺伝子の場合、試験されるプライマーの一部のみが、適切な性能、すなわち許容可能なＰＣＲ効率及び同時に、変異体と野生型鋳型との間の識別性を与えられた。
【００２９】
対立遺伝子−特異的プライマーの特異性を高めるための１つのアプローチは、末端ミスマッチの他に、内部ミスマッチヌクレオチドを含むことによってである。２００９年１０月２０日に出願された米国特許出願番号２０１０／００９９１１０号を参照のこと。プライマー中の内部ミスマッチヌクレオチドは、所望する及び所望しない両標的配列とミスマッチされ得る。ミスマッチは所望する及び所望しない両鋳型とのプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化するので、ミスマッチのいくつかは、両鋳型の増幅を妨げ、そしてＰＣＲの失敗を引起す。従って、特定の対立遺伝子−特異的ＰＣＲプライマーに対するそれらの内部ミスマッチの効果は、予測され得ない。
【００３０】
プライマーの好結果をもたらすエクステンションのためには、プライマーは、標的配列に対しての少なくとも部分的相補性を有する必要がある。一般的に、プライマーの3’−末端での相補性は、プライマーの5’−末端での相補性よりもより決定的である（Innis et al. Eds., PCR Protocols, (1990) Academic Press, Chapter 1, pp. 9-11）。従って、本発明は、表１−７に開示されるプライマー、及び5’−末端変異を有するそれらのプライマーの変異体を包含する。
【００３１】
一般的にＰＣＲ増幅に関しては、プライマー特異性はプライマー中のヌクレオチドの化学的修飾の使用より高められ得ることは、これまでに記載されている。環外アミノ基の共有結合修飾を有するヌクレオチド及びＰＣＲへのそのようなヌクレオチドの使用は、アメリカ特許第６，００１，６１１号に記載されている。修飾は所望する及び所望しない両鋳型を有するプライマー−鋳型ハイブリッドにおけるワトソン−クリック水素結合を破壊するので、修飾のいくつかは両鋳型の増幅を妨げ、そしてＰＣＲの失敗を引起すことができる。従って、対立遺伝子−特異的ＰＣＲに対するそれらの共有結合修飾の効果は予測され得ない。
【００３２】
一つの態様によれば、本発明は、表１−７に開示されるプライマーを用いて、ＥＧＦＲ突然変異を検出するための診断方法である。前記方法は、核酸の試験試料と、表１−７から選択されるＥＧＦＲ突然変異のための１又は２以上の対立遺伝子−特異的プライマーとを、その対応する第二プライマー（任意には、また表１−７から選択される）、ヌクレオシド三リン酸及び核酸ポリメラーゼの存在下で接触せしめ、その結果、前記１又は２以上の対立遺伝子−特異的プライマーが、ＥＧＦＲ突然変異が試料に存在する場合でのみ、効果的にエクステンドされ；そしてエクステンション産物の存在又は不在を検出することにより、ＥＧＦＲ突然変異の存在又は不在を検出することを含んで成る。
【００３３】
特定の態様によれば、エクステンション産物の存在は、プローブにより検出される。この態様の変動によれば、プローブは表１−７から選択される。プローブは、放射性、蛍光性又は発色団ラベルによりラベルされ得る。例えば、突然変異は、リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）によりエクステンション産物の増幅を検出することにより検出され得、ここでエクステンション産物へのプローブのハイブリダイゼーションがプローブの酵素消化及び得られる蛍光の検出をもたらす（TaqMan（登録商標）プローブ方法、Holland et al. (1991), P.N.A.S. USA 88:7276-7280）。ｒｔ−ＰＣＲにおける増幅産物の存在はまた、プローブとエクステンション産物との間での核酸重複体の形成による蛍光変化を検出することにより検出され得る（米国特許出願番号２０１０／０１４３９０１号）。他方では、エクステンション産物及び増幅産物の存在は、例えばSambrook, J. and Russell, D.W. (2001), Molecular Cloning, 3rd ed. CSHL Press, Chapters 5 and 9に記載されるように、ゲル電気泳動、続く染色又はブロティング及びハイブリダイゼーションにより検出され得る。
【００３４】
別の態様によれば、本発明は、変異ＥＧＦＲ遺伝子により、腫瘍をたぶん保持する細胞を有する患者を治療する方法である。前記方法は、患者からの試料と、表１−７から選択されるＥＧＦＲ突然変異のための１又は２以上の対立遺伝子−特異的プライマーとを、対応する第二プライマー（任意には、また表１−７選択される）の存在下で接触せしめ、対立遺伝子−特異的増幅を実施し、そしてエクステンション産物の存在又は不在を検出することによりＥＧＦＲ突然変異の存在又は不在を検出し、そして少なくとも１つの突然変異が見出される場合、突然変異誘発された遺伝子によりコードされる変異ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物を患者に投与することを含んで成る。個々の突然変異に関して、検出は対応するプローブ（任意には、また表１−７から選択される）を用いて実施され得る。
【００３５】
別の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤による悪性腫瘍を有する患者の治療が成功する可能性があるかどうかを決定する方法である。前記方法は、患者からの試料と、表１−７から選択されたＥＧＦＲ突然変異のための１又は２以上の対立遺伝子−特異的プライマーとを、１又は２以上の対応する第二プライマー（任意には、また表１−７から選択される）の存在下で接触せしめ、対立遺伝子−特異的増幅を実施し、そしてエクステンション産物の存在又は不在を検出することによりＥＧＦＲ突然変異の存在又は不在を検出し、そして少なくとも１つの突然変異が見出される場合、治療が成功する可能性があることを決定することを含んで成る。個々の突然変異に関して、検出は対応するプローブ（任意には、また表１−７から選択される）を用いて実施され得る。この態様の変動によれば、ＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブ（cetuximab）、パニツムマブ（panitumumab）、エルロチニブ（erlotinib）及びゲフィチニブ（gefitinib）である。
【００３６】
さらなる別の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を検出するために必要な試薬を含むキットである。試薬は、表１−７から選択されたＥＧＦＲ突然変異のための１又は２以上の対立遺伝子−特異的プライマー、１又は２以上の対応する第二プライマー（任意には、また表１−７から選択される）、及び任意には、１又は２以上のプローブ（任意には、また表１−７から選択される）を含む。キットはさらに、増幅及び検出アッセイの実施のために必要な試薬、例えばヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記ポリメラーゼの機能のために必要な緩衝液を含む。いくつかの態様によれば、プローブは検出可能的にラベルされる。そのような態様によれば、キットはラベリングし、そしてラベルを検出するための試薬を含むことができる。
【００３７】
さらなる別の態様によれば、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異を検出するための反応混合物である。前記反応混合物は、表１−７から選択されたＥＧＦＲ突然変異のための１又は２以上の対立遺伝子−特異的プライマー、１又は２以上の対応する第二プライマー（任意には、また表１−７から選択される）、及び任意には、１又は２以上のプローブ（任意には、また表１−７から選択される）を含む。反応混合物はさらに、試薬、例えばヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記ポリメラーゼの機能のために必要な緩衝液を含む。
【００３８】
さらなる別の態様によれば、本発明は単一の管に、複数のＥＧＦＲ突然変異を同時に検出するためのオリゴヌクレオチドを含む。１つの態様によれば、本発明は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（表１−７）における突然変異を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチド（配列番号２−１０８）を含む。それらのプライマーのいくつかは、表１−７に示されるように内部ミスマッチ及び共有結合修飾を含む。オプションとして、本発明の対立遺伝子−特異的プライマーは、「共有（common）」の、すなわち対立遺伝子−特異的でない第二プライマーと対合され得る。開示される第二プライマーの使用は任意である。いずれか他の適切な下流プライマーが、本発明の対立遺伝子−特異的プライマーと対合され得る。
【実施例】
【００３９】
典型的な反応条件：
プライマーの性能を試験するために使用される典型的な反応条件は次の通りである。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH８．０）、８０−１００ｍMの塩化カリウム、２００μMの個々のdＡＴＰ、dＣＴＰ及びdＧＴＰ、４００μMのｄUTP、０．１μMの個々の選択及び共通プライマー、０．０５μMのプローブ、標的DNA（変異体を含む１０，０００コピーのプラスミド又は１０，０００コピーの野生型ゲノムDNA）（プールされたゲノムDNA、Clontech、Mountain View、Calif., カタログ番号６３６４０１）、０．０２U／μｌのウラシル−N−グリコシラーゼ、２００ｎＭのＮＴＱ２１−４６Ａアプタマー（aptamer）、２０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２．６ｍＭの酢酸マグネシウムを含むＰＣＲ混合物。増幅及び分析は、Roche LightCycler（登録商標） 480 計測計 (Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)を用いて行われた。次の温度プロフィールを用いた：９５℃で１分（又は２サイクルの９５℃（１０秒）〜６２℃（２５秒））、続いて、９９サイクルの９２℃（１０秒）〜６２℃（２５−３０秒）。蛍光データを、個々の６２℃段階の開始で集めた。任意には、反応は、内因性の陽性対照鋳型を含んだ。
【００４０】
野生型と変異体配列との間の識別は、野生型及び変異体標的物においての閾値までのサイクル数（cycles-to-threshold）（ΔＣｔ）値間の差異として測定された。例えば、２９サイクルのΔＣｔを、変異体標的物との反応が２６サイクルの後、閾値サイクルに達し、そして野生型標的物との反応が５５サイクルの後、閾値サイクルに達した場合に記録した。
【００４１】
表の説明：
次の略語を、修飾された塩基ヌクレオチド（modified-base nucleotides）のために使用した：「t-bb-dA」及び「t-bb-dC」はそれぞれ、Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル−デオキシアデニン及びＮ４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル−デオキシシトシンを意味し；用語「et-dC」はＮ４−エチル−デオキシシトシンを意味し；用語「met-dC」はＮ４−メチル−デオキシシトシンを意味し；そして用語「５−ｐ−ｄＬ」は５−プロピニル−デオキシウラシルを意味する。プライマー及びプローブ配列においては、太字の下線を引かれたヌクレオチドは、修飾された塩基ヌクレオチド、又は野生型及び変異体配列の両者によりミスマッチされたヌクレオチドである。
【００４２】
実施例１
ヒトＥＧＦＲ遺伝中の突然変異Ｇ７１９Ａを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２１５６  Ｇ−＞Ｃに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表１に示されている。突然変異は、配列番号２−７から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号８であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号９であり得る。
【００４３】
【表１】
2014500028.tif 000002
【００４４】
この実施例に開示される対立遺伝子−特異的プライマーは、反応条件に依存して、野生型配列と、６８サイクルまでのΔＣｔのＧ７１９Ａ突然変異との間の識別を達成した。
【００４５】
実施例２
ヒトＥＧＦＲ遺伝中の突然変異Ｇ７１９Ｃを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２１５６  Ｇ−＞Ｔに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表２に示されている。突然変異は、配列番号１０−１５から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号１６であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号１７であり得る。
【００４６】
【表２】
2014500028.tif 000003
【００４７】
この実施例に開示される対立遺伝子−特異的プライマーは、反応条件に依存して、野生型配列と、６９サイクルまでのΔＣｔのＧ７１９Ａ突然変異との間の識別を達成した。
【００４８】
実施例３
ヒトＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異Ｇ７１９Ｓを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２１５５−２１５６  ＧＧ−＞ＴＣに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表３に示されている。突然変異は、配列番号１８−２４から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号２５であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号２６であり得る。
【００４９】
【表３】
2014500028.tif 000004
【００５０】
実施例４
ヒトＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異Ｔ７９０Ｍを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２３６９Ｃ−＞Ｔに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表４a及び４bに示されている。突然変異は、配列番号２７−２９から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号３０であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号３１であり得る。アンチセンス鎖が使用される場合、突然変異は、配列番号３２−４８から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号４９であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号５０であり得る。
【００５１】
【表４ａ】
2014500028.tif 000005
【００５２】
【表４ｂ】
2014500028.tif 000006
【００５３】
この実施例に開示される対立遺伝子−特異的プライマーは、反応条件に依存して、野生型配列と、５１サイクルまでのΔＣｔのＴ７９０Ｍ突然変異との間の識別を達成した。
【００５４】
実施例５
ヒトＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異Ｌ８５８Ｒを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２５７３Ｔ−＞Ｇに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表５及び４bに示されている。突然変異は、配列番号５１−５７から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号５８であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号５９であり得る。アンチセンス鎖が使用される場合、突然変異は、配列番号６０−６８から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号６９であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号７０であり得る。
【００５５】
【表５】
2014500028.tif 000007
【００５６】
この実施例に開示される対立遺伝子−特異的プライマーは、反応条件に依存して、野生型配列と、６９サイクルまでのΔＣｔのＬ８５８Ｒ突然変異との間の識別を達成した。
【００５７】
実施例６
ヒトＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異Ｌ８６１Ｑを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２５８２Ｔ−＞Ａに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表６及び４bに示されている。突然変異は、配列番号７１−７９から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号８０であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号８１であり得る。アンチセンス鎖が使用される場合、突然変異は、配列番号８２−９０から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号９１であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号９２であり得る。
【００５８】
【表６】
2014500028.tif 000008
【００５９】
この実施例に開示される対立遺伝子−特異的プライマーは、反応条件に依存して、野生型配列と、５７．５サイクルまでのΔＣｔのＬ８６１Ｑ突然変異との間の識別を達成した。
【００６０】
実施例７
ヒトＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異Ｓ７６８Ｉを検出するためのプライマー：
この突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子（配列番号１）中のヌクレオチド変化２３０１Ｇ−＞Ｔに起因する。突然変異を検出するためのプライマー及びプローブは、表７及び４bに示されている。突然変異は、配列番号９３−１０１から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号１０２であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号１０３であり得る。アンチセンス鎖が使用される場合、突然変異は、配列番号１０４−１０６から選択された対立遺伝子−特異的プライマー及び共通プライマーを用いて検出され得る。任意には、共通プライマーは、配列番号１０７であり得る。増幅は、対立遺伝子−特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域にハイブリダイズするプローブを用いて検出され得る。任意には、プローブは配列番号１０８であり得る。
【００６１】
【表７】
2014500028.tif 000009
【００６２】
この実施例に開示される対立遺伝子−特異的プライマーは、野生型配列と、７１サイクルまでのΔＣｔのＳ７６８Ｉ突然変異との間の識別を達成した。
【図１Ａ】
2014500028.tif 000010
【図１Ｂ】
2014500028.tif 000011
【図１Ｃ】
2014500028.tif 000012
【配列表】
2014500028000001.app
【国際調査報告】
2014500028.tif 000013
2014500028.tif 000014
2014500028.tif 000015
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