(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の化合物：【化１】2014505662.tif 000044またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物、この化合物の合成方法、これらを含む医薬組成物、および炎症性疾患を治療するための医薬としてのこれらの使用に関する。
2014505662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、またはその塩、プロドラッグまたは溶媒和物：
【化１】
2014505662.tif 000035
（式中、
Ｐｈはフェニルであり；
ｎは、２、３または４であり；
Ｒ１は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、式−［［ＣＨ（Ｒ３）］ｍ−Ｒ４］の基であり、ここで、
ｍは１であり；
Ｒ３は、水素、フェニルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、非置換ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基および置換アリール基からなる群から選択され
（ここで、置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ（ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択される）からなる群から選択され）；
または
Ｒ１および／またはＲ３が水素ではない場合、Ｒ４はまた非置換フェニルであってもよく；
または
Ｒ１とＲ２が、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換または非置換のヘテロアリール基（ここで、置換基は上に定義したとおりである）を形成するが；
ただし、
２−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−フェノール、
３−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−フェノール、
５−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−２−メトキシ−フェノール、
４−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−２，６−ジフルオロ−フェノール、
ベンジル−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−エチル−アミン、
６−クロロ−９−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−９Ｈ−プリン、
９−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン、および
５−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−イソオキサゾロ［４，５−ｃ］ピリジン−３−オール
は、式（Ｉ）に含まれない）。
【請求項２】
前記各置換基が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ（ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択され；Ｒｃは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルからなる群から選択されるが、ただし、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）が−ＮＨ２ではない）からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＡ）：
【化２】
2014505662.tif 000036
（式中、Ｐｈ、ｎ、Ｒ１、Ｒ４は、先行する請求項のいずれかに定義されるとおりである）で表される、先行する請求項のいずれかに記載の化合物、またはその塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物。
【請求項４】
Ｒ４が、非置換ヘテロアリールであるか、またはチエニル、フリル、ピリジル、１Ｈ−ベンズイミダゾール、９Ｈ−プリン、１Ｈ−イミダゾールおよび１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンからなる群から選択される置換ヘテロアリールである、先行する請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４が、式（Ｖ）または（ＶＩ）の基であり：
【化３】
2014505662.tif 000037
（式中、
ＡおよびＢは、独立して、−ＣＨ−および−Ｎ−から選択され；
Ｄは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−および−ＮＨ−からなる群から選択され；
ｐは、０、１、２または３からなる群から選択される整数であり；
Ｒ５はそれぞれ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル、フェニルメチル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ（ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択され、ただし、式（Ｖ）の化合物において、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）は−ＮＨ２ではない）からなる群から選択され；
この式（Ｖ）または（ＶＩ）の基が、任意の位置において分子の残りの部分と結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１とＲ２が、これらが結合している窒素原子と一緒になって、１Ｈ−ベンズイミダゾール、９Ｈ−プリン、１Ｈ−イミダゾールおよび１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンからなる群から選択される基を形成している、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４が式（ＶＩＩ）の基であり：
【化４】
2014505662.tif 000038
（式中、Ｒ６は、−ＯＣＦ３、ＯＣ１〜Ｃ３アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉおよび−ＣＮからなる群から選択され；ｑは、１、２または３からなる群から選択される整数である）、この式（ＶＩＩ）の基が、任意の位置において分子の残りの部分と結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１が水素またはメチルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
以下からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、またはその塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物。
【化５】
2014505662.tif 000039
【化６】
2014505662.tif 000040
【化７】
2014505662.tif 000041
【化８】
2014505662.tif 000042
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に定義された式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１１】
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物。
【請求項１２】
炎症性疾患を治療する医薬として使用するための、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物：
【化９】
2014505662.tif 000043
（式中、
Ｐｈはフェニルであり；
ｎは、２、３または４であり；
Ｒ１は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、式−［［ＣＨ（Ｒ３）］ｍ−Ｒ４］の基であり、ここで、
ｍは、１、０または２からなる群から選択される整数であり；
Ｒ３はそれぞれ、必要な場合には、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、非置換ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、非置換アリール基および置換アリール基からなる群から選択され
（ここで、置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ（ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択される）からなる群から選択され；
または
Ｒ１とＲ２が、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換または非置換のヘテロアリール基（ここで、置換基は上に定義したとおりである）を形成する）。
【請求項１３】
炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、良性前立腺過形成、バレット病、喘息、骨格筋および腱の修復、潰瘍性大腸炎、リーシュマニア症および自己免疫疾患、好ましくはクローン病からなる群から選択される、請求項１２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１４】
癌の治療に使用するための請求項１２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１５】
癌が、転移癌、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸上皮癌、胃癌、白血病、メラノーマ、子宮上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、前立腺癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、膵臓上皮癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽細胞腫、リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジフェニル誘導体、その合成方法、ジフェニル誘導体を含む組成物、および免疫調節療法（例えば、免疫疾患または特定の種類の癌）のための医薬の調製におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、毒素または細胞損傷にさらされた炎症部位での白血球および血漿タンパク質の蓄積および活性化からなる血管組織に固有の複雑な免疫系反応である。
【０００３】
血管での白血球動員を促進する変化に伴い、炎症が始まる。
【０００４】
局所に適応する免疫応答が炎症を刺激することがある。このことは、感染を制御し、組織の修復を促進する保護効果を有するが、組織の損傷および疾患を引き起こすこともある。
【０００５】
いわゆる免疫による炎症は、抗原に対し適応する免疫応答の結果である。炎症部位に侵入した細胞は、Ｔ細胞によって産生されるサイトカインの作用の結果として動員される自然免疫系の細胞（例えば、好中球およびマクロファージ）を含んでいてもよい。
【０００６】
サイトカインは、多くの固有の免疫および適応する免疫応答に介在するタンパク質群である。同じサイトカインは、多くの細胞種において産生可能であり、またあるサイトカインおよび同じサイトカインは、しばしば異なる細胞で作用する。
【０００７】
サイトカインは、炎症性刺激または抗原刺激に対する応答として合成され、通常は、自己分泌または傍分泌の様式で局所的に作用し、標的細胞中に存在する高親和性受容体に結合する。ある種のサイトカインは、循環し、内分泌作用を発揮するのに十分な量で産生さる。サイトカインは、さらに、多くの細胞種にとって成長因子として作用する。
【０００８】
サイトカインは、ある限定された数の構造ファミリーに属する受容体に対して高親和性結合することによって、その作用が起こる。異なるサイトカインは、特殊なシグナル伝達経路（例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路）を使用する。
【０００９】
固有の免疫に介在するサイトカインは、主に、活性化された小食細胞によって産生され、微生物に対する急性炎症性反応のメディエーターとしてのＴＮＦおよびＩＬ−１；炎症病巣での白血球動員因子としてのケモカイン；マクロファージによって活性化するサイトカイン（ＩＦＮ−γ）産生刺激因子としてのＩＬ−１２；抗ウイルス性サイトカインとしてのＩ型インターフェロン、マクロファージ阻害剤としてのＩＬ−１０ａが挙げられる。
【００１０】
適応する炎症の活性化およびエフェクター段階を調整し、制御するサイトカインは、主に、抗原によって刺激されたＴ細胞によって産生され、主なＴ細胞成長因子としてのＩＬ−２；ＩｇＥ合成および一緒に働く未使用のＴ細胞からのＴｈ２細胞の成長の刺激因子としてのＩＬ−４；好酸球活性因子としてのＩＬ−５；マクロファージ活性化因子としてのＩＦＮ−γ、Ｔ細胞増殖および白血球活性化阻害剤としてのＴＧＦ−βが挙げられる。
【００１１】
ＣＤ４＋と一緒に働くＴ細胞は、ＩＦＮ−γを分泌し、食細胞が介在する免疫を好む特殊なＴｈ１エフェクター細胞へと分化することができ、またはＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌し、ＩｇＥ、好酸球およびマスト細胞が介在する免疫を好むＴｈ２細胞へと分化することができる。
【００１２】
まとめると、サイトカインは、宿主を病原体から守るのに重要な多くの機能を発揮し、固有免疫と適応する免疫との間の結合の束を提供する。サイトカインは、免疫応答の大きさおよび性質も調整し、リンパ球の成長および分化に影響を及ぼす。最後に、サイトカインは、少数のリンパ球を、抗原を除外する種々のエフェクター機構を活性化する任意の抗原に特異的にする重要な増幅機能を与える。サイトカインの産生または作用が過剰になると、病的な結果をもたらすことがある。
【００１３】
サイトカイン、サイトカインの可溶性受容体または阻害剤の投与は、急性および慢性の免疫疾患および炎症性疾患の両方に関連する生体応答を変えるための、現時点での、新規かつ有効な手法であり、また、多くの種類の癌の治療にも新規かつ有効な手法である。癌患者を免疫戦略によって治療するという可能性は、癌の免疫学者および生物学者に希望を与えている。関心の主な理由は、現在の癌治療が、分割する細胞を破壊するか、または細胞分裂を遮断する薬物によるものであり、これらの治療が、癌患者の正常に増殖しつつある細胞にも重大な影響を与えるという事実による。したがって、癌治療は、かなりの疾病率および死亡率をもたらす。これらの治療とは異なり、免疫調節療法は、想像し得る限り最大の特異性と最小の毒性を有する治療になる可能性がある。
【００１４】
しかし、これらの新しい治療手技のほぼすべてが生体由来であり、一つのサイトカインへの特異性が高い。このことは、忍容性のリスク、複雑な免疫系でかなりの不均衡を伴う免疫反応および誘発反応を生じるといった一連のリスクを伴う。
【００１５】
本発明で提示する一連の化合物は、低分子でありかつ生体化合物ではないことに加え、関連する一以上のサイトカインに対して明らかに作用し、他のサイトカインには作用しないという特殊性があり、細胞の生存および正常細胞の生理機能を変えることなく、厳格な阻害剤としてよりも調整剤として作用する可能性があるが、急性または慢性の炎症性疾患にある宿主、またはある種類の癌に罹患している宿主にあっても実際の免疫学的機構を正常に戻す方向に向かわせる能力を有する。
【００１６】
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８、４３、２４０４には、マウスＧＡＢＡトランスポーターの阻害剤としてのベンジル−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−アミン、２−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−フェノール、３−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−フェノール、５−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−２−メトキシ−フェノールおよび４−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−２，６−ジフルオロ−フェノールが開示されている。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９３、２８、５５５、７２７および７８３には、ベンジル−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−アミンおよびこの化合物の想定される治療用途として血管拡張が開示されている。Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１９９９、１、８４９には、ベンジル−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−エチル−アミンが開示されているが、この化合物の生体活性はなんら報告されていない。米国特許５，７９５，７５６号には、６−クロロ−９−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−９Ｈ−プリンおよび９−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン、すなわち
【化１】
2014505662.tif 000003
がアデニルシクラーゼ阻害剤として記載されている。また、Ｆａｌｃｈ、Ｅ．らは、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．、１９９０、２１、１６９−１８８において、５−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−イソオキサゾロ［４，５−ｃ］ピリジン−３−オール
【化２】
2014505662.tif 000004
をＧＡＢＡ取り込み阻害剤として記載している。
【発明の概要】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物が、免疫調節療法にとって興味深い活性を示すことを発見した。
【００１８】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその塩、プロドラッグまたは溶媒和物に関する：
【化３】
2014505662.tif 000005
（式中、
Ｐｈはフェニルであり；
ｎは、２、３または４であり；
Ｒ１は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、式−［［ＣＨ（Ｒ３）］ｍ−Ｒ４］の基であり、ここで、
ｍは１であり；
Ｒ３は、水素、フェニルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、非置換ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基および置換アリール基からなる群から選択され
（ここで、置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ（ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択される）からなる群から選択される）；
または
Ｒ１および／またはＲ３が水素ではない場合、Ｒ４はまた非置換フェニルであってもよく；
または
Ｒ１とＲ２が、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換または非置換のヘテロアリール基（ここで、置換基は上に定義したとおりである）を形成するが、
ただし、
２−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−フェノール、
３−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−フェノール、
５−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−２−メトキシ−フェノール、
４−［（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニルアミノ）−メチル］−２，６−ジフルオロ−フェノール、
ベンジル−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−エチル−アミン、
６−クロロ−９−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−９Ｈ−プリン、
９−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン、および
５−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−イソオキサゾロ［４，５−ｃ］ピリジン−３−オール
は、式（Ｉ）に含まれない）。
【００１９】
さらなる態様によれば、本発明は、上に定義した式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、医薬として使用するための上に定義した式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物を指す。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、炎症性疾患を治療する医薬として使用するための式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物に関する：
【化４】
2014505662.tif 000006
（式中、
Ｐｈはフェニルであり；
ｎは、２、３または４であり；
Ｒ１は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、式−［［ＣＨ（Ｒ３）］ｍ−Ｒ４］の基であり、ここで、
ｍは、１、０または２からなる群から選択される整数であり；
Ｒ３はそれぞれ、必要な場合には、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、非置換ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、非置換アリール基および置換アリール基からなる群から選択され
（ここで、置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ（ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択される）からなる群から選択される）；
または
Ｒ１とＲ２が、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換または非置換のヘテロアリール基（ここで、置換基は上に定義したとおりである）を形成してよい）。
【００２２】
さらなる態様によれば、本発明は、炎症性疾患を治療するための医薬の調製における式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物の使用に関する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、炎症性疾患を治療する方法であって、このような治療が必要な患者に、治療に有効な量の上に記載する少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物を投与することを含む方法に関する。
【００２４】
さらなる態様によれば、本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物を合成する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ビヒクル投与のコントロール群と比較した場合の、異種移植動物モデルにおける慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の化合物３による阻害。
【図２】ビヒクル投与のコントロール群と比較した場合の、異種移植動物モデルにおける多発性骨髄腫（ＭＭ）の化合物３による阻害。
【図３】慢性リンパ球性白血病患者由来の細胞の生存率。
【図４】同所性動物モデルにおける結腸癌の化合物３による阻害。Ａ：ビヒクル投与のコントロール群と比較した場合の、化合物３、５−Ｆウラシル（５−ＦＵ；試験した実験条件では活性ではない）およびオキサリプラチン（ＯＸＡ）の腫瘍容積低下効果を示す写真。Ｂ：化合物３（ＮＦ）、オキサリプラチン（ＯＸＡ）、５−Ｆウラシル（５−ＦＵ）およびこれらの組み合わせで治療したマウスに由来するヒト結腸直腸癌の腫瘍重量を示すグラフ。
【図５ＡＢＣ】ビヒクル投与のコントロール群と比較した場合の、同所性動物モデルにおけるメラノーマの化合物３による阻害。Ａ：ｉｎ  ｖｉｖｏでのメラノーマ腫瘍ルシフェラーゼ活性のＰＥＴ写真。Ｂ：治療終了時の動物に由来するｅｘ  ｖｉｖｏでのメラノーマ腫瘍。Ｃ：コントロールまたは化合物３で治療した後のメラノーマ腫瘍の重さ（ｎ＝４）。
【図５Ｄ】コントロールまたは化合物３で治療した後のメラノーマ腫瘍の重さ（ｎ＝９）。
【図６】ビヒクル投与のコントロール群と比較した場合の、同所性動物モデルにおける卵巣癌の化合物３による阻害。Ａ：ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍ルシフェラーゼ活性のＰＥＴ写真。Ｂ：コントロールおよび化合物３で治療した動物に由来するルシフェラーゼシグナルの定量。
【図７】化合物３（１０μＭ）で治療したＥＨＥＢ細胞（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）。Ａ：ＥＨＥＢ細胞において化合物３によって誘発されるアポトーシスを示すヒストグラム。Ｂ：化合物３で治療したＥＨＥＢ細胞における異なるタンパク質の発現。
【図８】化合物３（１０μＭ）で治療したＨＣＴ−１１６細胞（結腸内皮細胞）。Ａ：ヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６細胞において化合物３によって誘発されるアポトーシスを示すヒストグラム。Ｂ：化合物３治療中にアポトーシスに関連する異なるタンパク質の発現。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の内容において、下記用語は、以下に示す意味を有する。
【００２７】
「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」との用語は、炭素原子と水素原子からなり、不飽和を含まず、１〜６個、好ましくは１〜３個の炭素原子を含み（「Ｃ１〜Ｃ３アルキル」）、分子の残りの部分に単結合によって接続している直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖基を指し、例えば、非限定的な観点で、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどが挙げられる。
【００２８】
「アリール」との用語は、特に断らない限り、６〜１８個、好ましくは６〜１０個、さらになお好ましくは６個または１０個の炭素原子を含み、炭素−炭素結合によって結合しているか、または縮合した１、２または３個の芳香族核を含む芳香族基を指し、例えば、非限定的な観点で、フェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルなどを含む。好ましくは、「アリール」はフェニルを指す。
【００２９】
「ヘテロアリール」は、炭素原子と、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなる安定な３〜１０員環の芳香族環基、好ましくは、５員環または６員環の芳香族環を指す。本発明の目的のために、ヘテロアリールは、それぞれが安定な３〜１０員環の芳香族環基、好ましくは、５員環または６員環の芳香族環であり、炭素原子と、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなる単環、二環または三環の環系であってもよく、縮合した環系であってもよい。ヘテロアリール基の窒素原子、炭素原子または硫黄原子は、場合により酸化されていてもよく、または、窒素原子は、場合により四級化されていてもよい。このようなヘテロアリールの例としては、限定されないが、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、フラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、ピリミジン、イソチアゾール、イミダゾール、インドール、プリン、キノリン、チアジアゾールが挙げられる。好ましくは、「ヘテロアリール」は、フラン、チオフェン、ピリジン、ベンズイミダゾールを指す。
【００３０】
「アラルキル」は、ベンジルおよびフェネチルのようなアルキル基によって分子の残りの部分に接続したアリール基を指す。
【００３１】
「ハロゲン」との用語は、ブロモ、クロロ、ヨードまたはフルオロを指す。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物
好ましい実施形態によれば、「置換された」とは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ７〜Ｃ１１アリールアルキル、フェニル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅからなる群から選択される基を指し、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択され；Ｒｃは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルからなる群から選択され、ただし、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）は−ＮＨ２ではない。置換された基（例えば、アリールまたはヘテロアリール）は、これらの自由な位置にあってもよい。本発明の一実施形態では、置換された基は、それらの位置のうち、１位、２位、３位または４位、好ましくは１位または２位で置換される。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、置換基は、メチル、イソプロピル、フェニルメチル、フェニル、チオフェン、ピリジン、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、アミノ、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびチオメトキシからなる群から選択される。
【００３４】
本発明の一つの実施形態は、式（ＩＡ）の化合物、またはその塩、プロドラッグまたは溶媒和物に関する：
【化５】
2014505662.tif 000007
（式中、Ｐｈ、ｎ、Ｒ１、およびＲ４は、上に定義したとおりである）。
【００３５】
本発明の一つの実施形態によれば、Ｒ４は、チエニル、フリル、ピリジル、１Ｈ−ベンズイミダゾール、９Ｈ−プリン、１Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンからなる群から選択されるヘテロアリールであり、それぞれの基は、上に定義したように置換されていてもよい。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、式（Ｉ）または（ＩＡ）の化合物またはその塩、プロドラッグまたは溶媒和物であり、ここで、Ｒ４は、式（Ｖ）または（ＶＩ）の基であり：
【化６】
2014505662.tif 000008
（式中、
ＡおよびＢは、独立して、−ＣＨ−および−Ｎ−から選択され；
Ｄは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−および−ＮＨ−からなる群から選択され；
ｐは、０、１、２または３からなる群から選択される整数であり；
各Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニル、フェニルメチル、５員環または６員環のヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＳＲｄまたは−Ｃ（Ｏ）Ｒｅからなる群から選択され；Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、フェニルおよびトリフルオロメチルから選択され、ただし、式（Ｖ）の化合物において、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）は−ＮＨ２を表さない）、この式（Ｖ）または（ＶＩ）の基が、任意の自由な位置において分子の残りの部分と結合している。
【００３７】
本発明の一つの実施形態によれば、各Ｒ５は、存在する場合には、独立して、メチル、イソプロピル、フェニルメチル、フェニル、チオフェン、ピリジン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、トリフルオロメチル、シアノ、アミノ、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびチオメトキシからなる群から選択される。さらなる実施形態によれば、ｐは、１または２である。
【００３８】
本発明の一つの実施形態によれば、Ｒ４は、式（ＶＩＩ）の基であり：
【化７】
2014505662.tif 000009
（式中、Ｒ６は、−ＯＣＦ３、ＯＣ１〜Ｃ３アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉおよび−ＣＮからなる群から選択され；ｑは、０、１、２または３からなる群から選択される整数である）、この式（ＶＩＩ）の基が、任意の自由な位置によって分子の残りの部分と結合している。
【００３９】
本発明の一つの実施形態によれば、Ｒ１とＲ２が、これらが接続する窒素原子とともに、１Ｈ−ベンズイミダゾール、９Ｈ−プリン、１Ｈ−イミダゾールおよび１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンからなる群から選択される基を形成する。
【００４０】
本発明の一つの実施形態によれば、Ｒ１は、水素またはメチルである。
【００４１】
本発明の一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下のものからなる群またはその塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物から選択される。
【化８】
2014505662.tif 000010
【化９】
2014505662.tif 000011
【化１０】
2014505662.tif 000012
【化１１】
2014505662.tif 000013
【００４２】
式（Ｉ）の化合物は、塩、好ましくは医薬的に許容される塩の形態、溶媒和物の形態、またはプロドラッグの形態であってもよい。「その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ」との用語は、受容者に投与すると、ある化合物（例えば、本明細書に記載の化合物）を（直接的または間接的に）与えることができる塩、溶媒和物またはプロドラッグに関する。これにかかわらず、医薬的に許容されない塩も、医薬的に許容される塩の調製に有用な場合があるため、本発明の範囲内にあることが見いだされるだろう。塩、プロドラッグおよび誘導体を当該技術分野の技術常識で知られている方法によって調製することができる。「医薬的に許容される」は、好ましくは、生理学的に忍容性があり、典型的には、ヒトまたは動物に投与したとき、アレルギー反応または同様の好ましくない反応（例えば、胃の障害、めまいなど）を引き起こさない分子部分および組成物に関する。「医薬的に許容される」との用語は、政府または州政府の監督機関によって承認されたものを意味するか、または米国薬局方または動物（さらに特定的にはヒト）に使用するための他の一般的に認識されている薬局方で列挙されている。
【００４３】
本発明によれば、「溶媒和物」との用語は、別の分子（ほとんどの場合、極性溶媒であると思われる）が非共有結合を介して接続した本発明の活性化合物の任意の形態を意味すると理解すべきである。溶媒和物の例としては、水和物およびアルコラート、例えば、メタノラートが挙げられる。好ましくは、溶媒和物は、医薬的に許容される溶媒和物である。
【００４４】
塩および溶媒和物の調製は、当該技術分野で既知の方法によって行うことができる。例えば、本明細書に提供される化合物の医薬的に許容される塩は、１個以上の塩基性部分を含む親化合物から従来の化学方法によって合成される。一般的に、このような塩は、例えば、水中または有機溶媒中、またはこの２種の混合物中、これらの化合物の遊離塩基の形態と、適切な塩基または酸とを反応させることによって調製される。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水系媒体が好ましい。酸付加塩の例としては、鉱物酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩）、有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩が挙げられる。好ましい実施形態では、塩は、塩酸塩またはフマル酸塩である。
【００４５】
ある好ましい医薬的に許容される形態は、結晶形態である（医薬組成物中の結晶形態を含む）。塩および溶媒和物の場合、さらなるイオン性部分および溶媒部分も非毒性でなければならない。本発明の化合物は、異なる多形形態で存在していてもよく、本発明がこのようなあらゆる形態を包含することを意図している。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物のプロドラッグである任意の化合物は、本発明の範囲内である。「プロドラッグ」との用語は、最も広い意味で用いられ、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の化合物に変換される誘導体を包含する。所与の作用を起こす化合物のプロドラッグを製造するよく知られた方法の例は、当業者には知られており、例えば、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎおよびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００２年４月）の中に見つけることができる。このような誘導体は、当業者なら容易に思いつくと思われ、分子中に存在する官能基に依存して、限定されないが、親化合物の以下の誘導体が挙げられる。エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属塩、スルホン酸エステル、カルバメート、アミド。
【００４７】
本発明の化合物は、１つ以上の同位体を豊富に含む原子が存在することのみが異なる化合物を含むことも意味している。例えば、本発明の構造を有するが、水素を重水素または三重水素に置き換えた化合物、または炭素を１３Ｃまたは１４Ｃを豊富に含む炭素で置き換えたもの、または窒素を１５Ｎを豊富に含む窒素と置き換えたものは、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
上に記載した式（Ｉ）によってあらわされる本発明の化合物は、多重結合の存在に依存するキラル中心または異性体の存在に依存して、エナンチオマーを含んでいてもよい（例えば、Ｚ、Ｅ）。１種類の異性体、エナンチオマーまたはジアスレテレオ異性体およびこれらの混合物は、本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
式（Ｉ）の化合物の使用
好ましい実施形態によれば、炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、良性前立腺過形成、バレット病、喘息、骨格筋および腱の修復、潰瘍性大腸炎、リーシュマニア症および自己免疫疾患、好ましくはクローン病から選択される。さらなる実施形態によれば、疾患は、癌であり、例えば、転移癌、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸上皮癌、胃癌、白血病、メラノーマ、子宮上皮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、前立腺癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、膵臓上皮癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽細胞腫、リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される。
【００５０】
「治療」または「治療するため」または「治療すること」との用語は、本明細書の内容では、疾患またはこの疾患に関連する１つ以上の症状を予防、軽減するか、またはなくすための本発明の化合物または製剤の投与を意味する。「治療」は、その疾患の生理学的な後遺症を予防、軽減するか、またはなくすことも包含する。
【００５１】
「軽減する」との用語は、本明細書の内容では、主観的（患者の感覚）または客観的（測定されるパラメータ）のいずれかで、治療される患者の状況のなんらかの改善を意味すると理解される。
【００５２】
医薬組成物
さらなる態様によれば、本発明は、上に定義した式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００５３】
「担体」との用語は、活性成分とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、滅菌液（例えば、水、および石油、動物由来、植物由来または合成由来、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む油）であってもよい。水または生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液は、好ましくは担体として使用され、特に、注射用溶液のための担体として使用される。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２１版、２００５年；または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅ  Ｃ．Ｒ．；Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｓ．；Ｍａｒｉａｎ  Ｅ．Ｑ．、第１６版に記載されている。好ましくは、本発明の担体は、政府または州政府の監督機関によって承認されているか、または米国薬局方、または米国薬局方または動物（さらに特定的にはヒト）に使用するための他の一般的に認識されている薬局方に列挙されている。
【００５４】
本発明の医薬組成物を投与するのに望ましい医薬形態を製造するのに必要な担体および補助物質は、特に、選んだ投与医薬形態によって変わるだろう。このような医薬組成物を投与する医薬形態は、当業者が知っている従来の方法にしたがって製造されるだろう。異なる活性成分投与方法、使用すべき賦形剤、およびこれらを製造する方法の総説は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２１版、２００５年；または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅ  Ｃ．Ｒ．；Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｓ．；Ｍａｒｉａｎ  Ｅ．Ｑ．、第１６版の中に見いだすことができる。
【００５５】
医薬組成物の例としては、経口投与、局所投与または非経口投与のための任意の固体（錠剤、丸薬、カプセル、顆粒など）または液体（溶液、懸濁物またはエマルション）の組成物が挙げられる。
【００５６】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、経口形態である。経口投与に適切な投薬形態は、錠剤またはカプセルであってもよく、当該技術分野で既知の従来からある賦形剤、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン）；フィラー（例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）；錠剤化滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；崩壊剤（例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、ナトリウムデンプングリコラート、または微結晶性セルロース）；または医薬的に許容される湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含んでいてもよい。
【００５７】
ブレンド、充填または錠剤化といった従来の方法によって固体経口組成物を調製してもよい。大量のフィラーを利用する組成物全体に活性薬剤を分布させるために、ブレンド操作を繰り返してもよい。このような操作は、当該技術分野で従来からある。錠剤を、例えば、湿式または乾式の顆粒化によって調製し、場合により、通常の医薬品実務でよく知られた方法にしたがって、特に、腸溶性コーティングを用いてコーティングしてもよい。
【００５８】
また、医薬組成物を非経口投与に合うように、例えば、適切な単位投薬形態の滅菌溶液、懸濁物または凍結乾燥製品になるように調節してもよい。増量剤、緩衝剤または界面活性剤のような適度の賦形剤を使用することができる。
【００５９】
上述の製剤は、例えば、スペイン国薬局方および米国薬局方および類似の参考文献に記載されているか、または参照されている標準的な方法を用いて調製される。
【００６０】
一般的に、本発明の化合物の有効投与量は、選択した化合物の相対的な効力、治療される障害の重篤度、罹患者の体重によって変わる。しかし、活性化合物は、典型的には、１日に１回以上（例えば、１日に１、２、３または４回）投与され、典型的な１日の合計投薬量は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００６１】
本発明の医薬組成物を、他の活性成分（例えば、炎症性疾患の治療に使用するためのさらなる化合物）と組み合わせて使用することができる。この組成物は、同時、別個、または順次といった様式で投与するために、各構成要素（式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物と、さらなる活性成分）の製剤として使用することができる。
【００６２】
式（Ｉ）の化合物の合成
本発明の化合物を、利用可能な合成方法によって多段階の連続で合成することができる。例えば、本発明の化合物を、以下に示す一般的なスキーム１にまとめた方法によって調製することができる。
【化１２】
2014505662.tif 000014
【００６３】
具体的な実施形態では、塩基および有機溶媒が存在する状態で、誘導体（ＩＩ）をＲ１基およびＲ２基を有するアミンで置換する反応によって式（Ｉ）の化合物を調製することができる。好ましい実施形態によれば、ジイソプロピルエチルアミンまたは炭酸カリウムを塩基として使用する。別の好ましい実施形態によれば、有機溶媒は、アセトニトリルまたはエタノールである。化合物（ＩＩ）中に存在する脱離基（ＬＧ）は、好ましくは、ハロゲンおよびスルホネートから選択される。さらに好ましくは、脱離基はブロミドである。
【００６４】
さらに、アミンが一級アミン（Ｒ１＝Ｈ）である場合、得られた化合物（Ｉ）を塩基存在下、ハロゲン化アルキル（Ｒ１−Ｘ；Ｒ１がＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ７〜Ｃ１５アラルキルである）で処理することによって、さらにアルキル化することができる。
【００６５】
具体的な実施形態では、フェニル−リチウムハロゲン化物を式（ＩＶ）のエステルに付加し、さらに脱水反応によって式（ＩＩ）の化合物を調製することができる。好ましい実施形態によれば、有機リチウム化合物は、ｎ−ブチルリチウムをハロゲン化フェニルに付加することによって調製される。別の好ましい実施形態によれば、脱水工程は、酸存在下で行われる。好ましい実施形態では、酸はＨ２ＳＯ４である。好ましくは、化合物（ＩＩ）の合成は、エーテル系溶媒存在下で行われる。さらに好ましくは、ジエチルエーテルおよびテトラヒドロフランから選ばれる。
【００６６】
具体的な実施形態では、式（ＶＩ）の化合物（すなわちＲ１が水素であり、Ｒ２が−［［ＣＨ（Ｒ３）］ｍ−Ｒ４］−であり、ｍが０であり、Ｒ４が本明細書に定義する置換または非置換ヘテロアリールである式（Ｉ）の化合物）は、塩基および有機溶媒が存在する状態で、式（ＶＩＩＩ）のアミンと、対応する置換または非置換のハロゲン化ヘテロアリール誘導体（Ｈｅｔ−Ｘ；Ｘは、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩ）との反応によって調製することができる。好ましい実施形態によれば、ジイソプロピルエチルアミンまたは炭酸カリウムを塩基として使用する。別の好ましい実施形態によれば、有機溶媒はエタノールである。アミンをアルキル化するさらなる条件は、当業者に知られている。
【００６７】
具体的な実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、ＤＭＦ中、化合物（ＩＩＩ）とナトリウムアジドとを反応させた後、ＴＨＦ中、このアジドをトリフェニルホスフィンで還元することによって調製することができる。
【００６８】
以下、実施例によって本発明をさらに説明する。この説明は、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定することを意味するものであってはならない。
【実施例】
【００６９】
本発明の式（Ｉ）の化合物を、以下に詳細に記載する一般的な調製戦略にしたがって調製した。いくつかの化合物の詳細な調製を以下に記載する。使用する反応剤はすべて市販されている。
【００７０】
実施例１：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−フルオロ−ベンジル）−アミン塩酸塩（化合物３）の合成
工程１．  ５−ブロモ−１，１−ビスフェニルペンテンの合成
【化１３】
2014505662.tif 000015
ブロモベンゼン（２０．８６ｍＬ、０．２２５ｍｏｌ）の無水Ｅｔ２Ｏ（６０ｍＬ）溶液を、アルゴン雰囲気下、温度を５〜１０℃に維持しつつ、２．５Ｍ  ｎ−ブチルリチウム（１００ｍＬ、０．２５０ｍｏｌ）と無水Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）の混合物に加えた。攪拌を１０℃でさらに１５分間続けた後、混合物を−７０℃まで冷却した。温度を−６５℃未満に維持しつつ、５−ブロモ吉草酸エチル（１４．５４ｍＬ、０．０９０ｍｏｌ）の無水Ｅｔ２Ｏ（６０ｍＬ）溶液を加えた。添加が終了したら、混合物を−７０℃で２．５時間攪拌した。温度を０℃未満に維持しつつ、冷水（７５ｍＬ）および冷１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３５ｍＬ）を続けて加えた。反応混合物を１５分間攪拌して温度を０℃より高い温度まで上げ、相を分離させた。水相をＥｔ２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、水（６０ｍＬ）および塩水（６０ｍＬ）で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させ、固体４６．５ｇを得て、これを２−プロパノール（２２５ｍＬ）に溶解した。２０％Ｈ２ＳＯ４水溶液（２５ｍＬ）を加え、環流状態で混合物を１時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させて残渣を得て、これをＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３溶液（７５ｍＬ）とに分配した。相を分離させ、水相をさらにＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、水（７５ｍＬ）、塩水（７５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、５−ブロモ−１−１−ビスフェニルペンテン（２０．０ｇ、７３．７％）を黄色油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．２−７．４（ｍ，１０Ｈ）；６．２（ｔ，１Ｈ）；３．３（ｔ，２Ｈ）；２．３（ｑ，２Ｈ）；１．９（ｑ，２Ｈ）。
【００７１】
さらなる化合物
工程２.  （５,５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−フルオロ−ベンジル）−アミンの合成
【化１４】
2014505662.tif 000016
４−フルオロ−ベンジルアミン（０．６２ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（０．７ｇ、５ｍｍｏｌ）を、５−ブロモ−１−１−ビスフェニルペンテン（０．７５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル２５ｍＬ溶液に加えた。この反応物を撹拌しつつ、加熱して１６時間環流させた。溶媒を減圧下で除去し、水を加え、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（５０ｍＬ×３回）。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させて油状物を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン／ＴＥＡ  ４５：５５：１）によって精製し、（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−フルオロ−ベンジル）−アミン０．５８ｇ（収率６７．１％）を黄色油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．２−７．５（ｍ，１２Ｈ）；７．０−７．１（ｍ，２Ｈ）；６．２（ｔ，１Ｈ）；３．８（s，２Ｈ）；２．７（ｔ，２Ｈ）；２．３（ｃ，２Ｈ）；１．７（ｑ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１６３．２；１４３．４；１４１．９；１３９．５；１３２．５；１３２．３；１２９．６；１２８．３；１２８．１；１２７．１；１２６．６；１２５．７；１１６．３；１１５．９；４９．６；４５．３；２６．７；２５．８。
【００７２】
工程３．  （５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−フルオロ−ベンジル）−アミン塩酸塩（化合物３）の合成
【化１５】
2014505662.tif 000017
（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−フルオロ−ベンジル）−アミン（１ｇ、３ｍｍｏｌ）の無水Ｅｔ２Ｏ  １００ｍＬ溶液に、ＨＣｌの１Ｍ無水Ｅｔ２Ｏ溶液（３ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を１０分以内に加えた。反応物を３０分間撹拌した。固体を濾過し、結晶化皿に移し、減圧オーブン中、５０℃で乾燥させた（０．９ｇ、収率８４．７％）。ＭＰ＝１２８．０〜１３０．１℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：９．９（ｂs，２Ｈ）；７．６−７．５（ｍ，２Ｈ）；７．３−７．０（ｍ，１２Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．０（ｂs，２Ｈ）；２．７（ｔ，２Ｈ）；２．２−１．９（ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１６３．２；１４３．４；１４１．９；１３９．５；１３２．５；１３２．３；１２９．６；１２８．３；１２８．１；１２７．１；１２６．６；１２５．７；１１６．３；１１５．９；４９．６；４５．３；２６．７；２５．８。
【００７３】
式（Ｉ）の化合物について上に記載した一般的な合成方法にしたがって、具体的には、５−ブロモ−１−１−ビスフェニルペンテンと、対応するアリールベンジルアミンとの反応によって以下の化合物を得た。
【００７４】
実施例２：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−トリフルオロメトキシベンジル）アミン塩酸塩（化合物２） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．２（ｍ，１４Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．８（s，２Ｈ）；２．７（ｔ，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．７（ｍ，２Ｈ）。
【００７５】
実施例３：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−トリフルオロメチルベンジル）アミン塩酸塩（化合物１）  ｍ．ｐ．：１２１．４〜１２２．７℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．１（s，２Ｈ，）；７．７−７．６（ｍ，４Ｈ）；７．０−６．８（ｍ，１０Ｈ）；５．９（ｔ，２Ｈ，）；４．０（s，２Ｈ）；２．６（ｂｓ  ２Ｈ）；２．１−１．９（ｍ，４Ｈ）。
【００７６】
実施例４：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（４−メトキシベンジル）アミン塩酸塩（化合物４）  ｍ．ｐ．：６９．２〜７３．８℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：９．７（ｂｓ，２Ｈ）；７．４（ｄ，２Ｈ）；７．３−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．８（ｄ，２Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；３．９（ｂｓ  ２Ｈ）；３．７（s，３Ｈ）；２．６（ｂs，２Ｈ，）；２．１−１．９（ｍ，４Ｈ）。
【００７７】
実施例５：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−チオフェン−３−イルメチルアミン塩酸塩（化合物５）  ｍ．ｐ．：１０８．０−１０９．７℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：９．８（ｂs，２Ｈ）；７．５−７．４（ｍ，１Ｈ）；７．３−７．０（ｍ，１２Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．０（ｂｓ，２Ｈ）；２．７（ｂs，２Ｈ）；２．１−１．９（ｍ，４Ｈ）。
【００７８】
実施例６：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−チオフェン−２−イルメチル−アミン塩酸塩（化合物６）  ｍ．ｐ．：１６１．０〜１６１．６℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．４−７．１（ｍ，１１Ｈ）；６．９（ｍ，２Ｈ；）；６．１（ｔ，１Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；２．７（ｔ，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．６（ｍ，２Ｈ）。
【００７９】
実施例７：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）ピリジン−２−イルメチルアミン塩酸塩（化合物７）  ｍ．ｐ．：１２５．０〜１２６．９℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．５（ｍ，１Ｈ）；７．８（ｍ，２Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１１Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．４（s，２Ｈ）；２．９（ｔ，２Ｈ）；２．２−２．０（ｍ，４Ｈ）。
【００８０】
実施例８：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）フラン−２−イルメチルアミン塩酸塩（化合物８）  ｍ．ｐ．：１３９．０〜１４１．３℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：９．５（ｂs，２Ｈ）；７．７（ｍ，１Ｈ）；７．５−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．６（ｍ，１Ｈ）；６．５（ｍ，１Ｈ）；６．０（ｔ，１Ｈ）；４．１（ｂs，２Ｈ）；２．８（ｂs，２Ｈ）；）；２．１−２．０（ｍ，２Ｈ）；１．８−１．７（ｍ，２Ｈ）。
【００８１】
実施例９：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（３−トリフルオロメトキシ−ベンジル）アミン塩酸塩（化合物９）  ｍ．ｐ．：１０２．４〜１０４．０℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．０（ｂｓ  ２Ｈ）；７．６−７．０（ｍ，１４Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；２．７（ｂs，２Ｈ）；２．１−１．９（ｍ，４Ｈ）。
【００８２】
実施例１０：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（２−トリフルオロメトキシベンジル）アミン塩酸塩（化合物１０）  ｍ．ｐ．：１０９．０〜１１０．７℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．０（ｂs，２Ｈ），８．０（ｍ，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１３Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．２（s，２Ｈ）；２．７（ｂs，２Ｈ）；２．１−２．０（ｍ，４Ｈ）。
【００８３】
実施例１１：（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルメチル）−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）アミン塩酸塩（化合物１１）  ｍ．ｐ．：２５１．０−２５３．８℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１０．１（ｂs，２Ｈ）；７．８−７．１（ｍ，１４Ｈ）；６．２（ｂｓ  ２Ｈ，）；６．１（ｔ，１Ｈ）；４．６（s，２Ｈ）；３．０（ｂs，２Ｈ）；２．１−２．０（ｍ，２Ｈ）；１．８−１．０（ｍ，２Ｈ）。
【００８４】
実施例１２：（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−（４−トリフルオロメトキシベンジル）アミン塩酸塩（化合物１２）  ｍ．ｐ．：１２６−１２８．℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．１（s，１Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；７．５（ｄ，２Ｈ）；７．３−７．０（ｍ，１２Ｈ）；３．９（s，２Ｈ）；２．８（ｍ，２Ｈ）；２．６（ｍ，２Ｈ）。
【００８５】
実施例１３：（４.４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−チオフェン−２−イルメチル−アミン塩酸塩（化合物１３）  ｍ．ｐ．：１６３−１６５．５℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：２．３（ｑ，２Ｈ）；２．８（ｔ，２Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；６．９（ｍ，２Ｈ）；７．０（ｍ，８Ｈ）；７．４（ｍ，３Ｈ）。
【００８６】
実施例１４：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（４−トリフルオロメトキシベンジル）アミン塩酸塩（化合物１４）  ｍ．ｐ．：１０９〜１１０．５℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．０（ｍ，２Ｈ）；７．６（ｄ，２Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１４Ｈ）；６．０（ｔ，１Ｈ）；３．９（s，２Ｈ）；２．７（s，２Ｈ）；２．１（ｑ，２Ｈ）；１．８（ｍ，２Ｈ）；１．５（ｍ，２Ｈ）。
【００８７】
実施例１５：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（３−トリフルオロメトキシベンジル）アミン塩酸塩（化合物１５）  ｍ．ｐ．：９６．６〜９８．５℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．４−７．０（ｍ，１３Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．８（s，２Ｈ）；２．６（ｔ，２Ｈ），２．２（ｑ，２Ｈ）；１．６（ｍ，４Ｈ）。
【００８８】
実施例１６：ベンジル−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−メチル−アミン塩酸塩（化合物１６） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１２．５（s，１Ｈ）；７．０−７．６（ｍ，１５Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．１（s，２Ｈ）；２．９−２．６（ｍ，２Ｈ）；２．６（s，３Ｈ）；２．２−１．８（ｍ，４Ｈ）。
【００８９】
実施例１７：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（１−フェニル−エチル）−アミン塩酸塩（化合物１７） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．１（ｂｓ  １Ｈ）；９．８（ｂs，１Ｈ）；７．６−７．０（ｍ，１５Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．１６（ｔ，１Ｈ）；２．６（ｂs，２Ｈ）；２．０（ｍ，４Ｈ）；１．９（ｄ，３Ｈ）。
【００９０】
実施例１８：ベンズヒドリル−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−アミン塩酸塩（化合物１８） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．３（ｂs，２Ｈ）；７．６−７．０（ｍ，２０Ｈ）；５．８（ｔ，１Ｈ）；５．１（ｂｓ，１Ｈ）；２．５（ｂｓ  ２Ｈ）；１．９−１．７（ｍ，４Ｈ）。
【００９１】
実施例１９：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（２−フルオロベンジル）アミン塩酸塩（化合物１９） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１０．０（s，２Ｈ）；７．４−６．９（ｍ，１５Ｈ）；６．０（ｔ，１Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；２．７（ｍ，２Ｈ）；２．２−２．０（ｍ，４Ｈ）。
【００９２】
実施例２０：（４−クロロベンジル）−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）アミン塩酸塩（化合物２０） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１．７（ｍ，２Ｈ）；２．２（ｍ，．２Ｈ）；２．７（ｍ，２Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；７．５−７．０（ｍ，１４Ｈ）；１０．０（ｂs，２Ｈ）。
【００９３】
実施例２１：４−［（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニルアミノ）−メチル］ベンゾニトリル塩酸塩 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．２（s，２Ｈ）；７．８−７．６（ｍ，４Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１０Ｈ）；５．９（ｔ，１Ｈ）；４．１（s，２Ｈ）；２．７（ｍ，２Ｈ）；２．２（ｍ，２Ｈ）；２．０（ｍ，２Ｈ）。
【００９４】
実施例２２：（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−（４−トリフルオロメチルベンジル）アミン塩酸塩 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１１．０（ｂs，２Ｈ）；７．６（ｍ，４Ｈ）；７．４−７．２（ｍ，８Ｈ）；７．１（ｍ，２Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；２．９（ｔ，２Ｈ）；２．６（ｍ，２Ｈ）。
【００９５】
実施例２３：（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−（４−フルオロ−ベンジル−アミン塩酸塩 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．０（s，２Ｈ）；７．６−７．４（ｍ，１０Ｈ）；７．０−６．８（ｍ，４Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．９（ｍ，２Ｈ）；２．８（ｍ，２Ｈ）；２．５（ｍ，２Ｈ）。
【００９６】
実施例２４：ベンジル−（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）アミン塩酸塩 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．０（ｂs，２Ｈ）；７．５−７．２（ｍ，１３Ｈ）；７．０（ｍ，２Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．９（ｓ,２Ｈ）；２．９（ｍ，２Ｈ）；２．６（ｍ，２Ｈ）。
【００９７】
実施例２５：（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−（３−トリフルオロメトキシｌベンジル）アミン塩酸塩 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ（ｐｐｍ）：１０．２（ｂs，２Ｈ）；７．８（ｄ，１Ｈ）；７．６（ｍ，２Ｈ）；７．５（ｍ，１Ｈ）；７．７−７．４（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；２．９（ｍ，２Ｈ）；２．６（ｍ，２Ｈ）。
【００９８】
実施例２６：（４，４−ジフェニル−ブタ−３−エニル）−（３−フルオロベンジル）アミン塩酸塩 １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１０．０（ｂs，２Ｈ）；７．４−７．７（ｍ，１４Ｈ）；６，１（ｔ，１Ｈ）；４．０（s，２Ｈ）；２．９（ｍ，２Ｈ）；２．６（ｍ，２Ｈ）。
【００９９】
実施例２７：（１−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（化合物２７）の合成
【化１６】
2014505662.tif 000018
２−メチル−ベンズイミダゾール（０．６６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ２０ｍＬ溶液をあらかじめ冷却しておき（氷／水冷却浴）、これに水素化ナトリウム（０．２４ｇ、６０％油分散物、６．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。２時間後、５−ブロモ−１，１−ビスフェニルペンテン（１．５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を２０時間撹拌した。気体の発生が収まるまでメタノール（３ｍＬ）を加えることによって反応を停止させた。水（１２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２５ｍＬ×３回）。有機抽出物を塩水で洗浄し（２０ｍＬ×１回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、低圧下で溶媒を除去して残渣（１．９ｇ）を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９８：２）によって精製し、黄色固体１．５ｇ（４．２ｍｍｏｌ、収率６０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．７（ｍ，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１３Ｈ）；６．０（ｔ，１Ｈ）；４．０（ｔ，２Ｈ）；２．５（s，３Ｈ）；２．３（ｑ，２Ｈ）；１．９（ｍ，２Ｈ）。
【０１００】
類似の様式で以下の化合物を調製した。
【０１０１】
実施例２８：１−（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−１Ｈ−イミダゾール（化合物２８） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．５−７．２（ｍ，１１Ｈ）；７．０（s，１Ｈ）；６．８（s，１Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．９（ｔ，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．９（ｍ，２Ｈ）。
【０１０２】
実施例２９：（２−クロロ−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−アミン（化合物２９）の合成
工程１．  ６−アジド−１，１−ジフェニル−１−ヘキセン中間体［Ｄ］の合成
【化１７】
2014505662.tif 000019
６−ブロモ−１，１−ジフェニル−１−ヘキセン（５０．０ｇ、１５８ｍｍｏｌ）およびナトリウムアジド（３１．０ｇ、４７６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）の混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄した（１００ｍＬ×３回）。有機抽出物を塩水で洗浄し（６０ｍＬ×１回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒物を低圧で除去し、無色油状物４１ｇ（１４８ｍｍｏｌ、９６．６８％）を得て、６−アジド−１，１−ジフェニル−１−ヘキセンであると特定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．４−７．１（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．２（ｔ，２Ｈ）；２．１（ｍ，２Ｈ）；１．５（ｍ，４Ｈ）。
【０１０３】
類似の様式で中間体［Ａ］（実施例２７を参照）とナトリウムアジドとを反応させることによって、以下の中間体化合物を調製した。
中間体［Ｅ］  ５−アジド−１，１−ジフェニル−１−ペンテン。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．４−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；３．３（ｔ，２Ｈ）；２．１（ｍ，２Ｈ）；１．６（ｍ，２Ｈ）。
【０１０４】
工程２．  ６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニルアミン  中間体［Ｆ］の合成
【化１８】
2014505662.tif 000020
６−アジド−１，１−ジフェニル−１−ヘキセン（２．７ｇ、９．７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３．１ｇ、１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）および水（２．５ｍＬ）と混合し、この混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去して油状物を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ  ９５：５：５）によって精製し、６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニルアミンを黄色油状物として得た（２．４ｇ、収率９８％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：１．４（ｍ，４Ｈ）；７．３（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；２．６（ｍ，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．６（s，２Ｈ）。
【０１０５】
類似の様式で以下の中間体化合物を調製した。
中間体［Ｇ］  ５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニルアミン １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．４−７．２（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；２．７（ｔ，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．９（s，２Ｈ）；１．６（ｍ，２Ｈ）。
【０１０６】
工程３．  （２−クロロ−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−アミン
【化１９】
2014505662.tif 000021
６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニルアミン（２５．６ｇ、１０３ｍｍｏｌ）のエタノール（５００ｍＬ）溶液に、プリン（１７．０ｇ、９０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１５．７ｍＬ、９０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を加熱して３時間環流させた。この時間が経過したら、低圧で溶媒を除去し、水（１５０ｍＬ）を加え、沈殿を濾過し、メタノールで洗浄し、（２−クロロ−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−アミンを白色固体として得た（３１．７６ｇ、（７８．６ｍｍｏｌ、収率８７．３％）（ｍ．ｐ．：２０５．７℃〜２０７．０℃）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．１（s，２Ｈ）；７．５−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；２．５（ｍ，２Ｈ）；２．１（ｍ，２Ｈ）；１．７−１．４（ｍ，４Ｈ）。
【０１０７】
類似の様式で、６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニルアミンと対応する市販の６−クロロプリン誘導体または４−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体とを反応させることによって、以下の化合物を調製した。市販されていない化合物は、例えば、米国特許第６９３６７１３号；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、２００３、３８、１９９−２１４；ＷＯ２００５／００９３４８；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９９４、１４０１；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５６、７８、７８４−７９０；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５、６８８７；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６、１５４９；および／またはＥｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、２００４、９３９に記載されるような既知の文献の方法によって調製した。
【０１０８】
実施例３０：（９−ベンジル−２−ヨード−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン塩酸塩（化合物３０）  ６−クロロ−２−ヨード−９Ｈ−プリンとの反応によって表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．５（s，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１５Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．７（ｓ，１Ｈ）；５．３（s，２Ｈ）；３．６（s，２Ｈ）；２．１（ｑ，２Ｈ）；１．６（ｍ，５Ｈ）。
【０１０９】
実施例３１：９−ベンジル−Ｎ−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−９Ｈ−プリン−２，６−ジアミン（化合物３１）  ９−ベンジル−６−クロロ−９Ｈ−プリン−２−イルアミンとの反応によって表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７，４−７．１（ｍ，１５Ｈ），６．１（ｔ，１Ｈ），５．５（ｍ，１Ｈ，ＮＨ）；５．２（s，２Ｈ）；４．７（s，２Ｈ，ＮＨ２）；３．５（ｍ，２Ｈ）；２．２（ｍ，２Ｈ）；１．６（ｍ，４Ｈ）。
【０１１０】
実施例３２：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（２−フェニル−９Ｈ−プリン−６−イル）アミン（化合物３２）  ６−クロロ−２−フェニル−９Ｈ−プリンとの反応によって表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：８．２（ｍ，２Ｈ）；７．７（s，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１４Ｈ）；６．９（ｂs，１Ｈ）；６．０（ｔ，１Ｈ）；３．６（ｍ，２Ｈ）；２．１（ｑ，２Ｈ）；１．８−１．４（ｍ，４Ｈ）。
【０１１１】
実施例３３：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（９−メチル−２−トリフルオロメチル−９Ｈ−プリン−６−イル）アミン（化合物３３）  ６−クロロ−９−メチル−２−トリフルオロメチル−９Ｈ−プリンとの反応によって表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．８（ｓ，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．８（ｂs，１Ｈ）；３．９（s，３Ｈ）；３．６（ｂs，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．８−１．５（ｍ，４Ｈ）。
【０１１２】
実施例３４：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル）アミン（化合物３４）  ６−クロロ−９−メチル−９Ｈ−プリンとの反応によって表題化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．４（s，１Ｈ）；７．７（s，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．７（s，１Ｈ，ＮＨ）；３．９（s，３Ｈ）；３．６（ｍ，２Ｈ）；２．３（ｑ，２Ｈ）；１．９（ｍ，２Ｈ）。
【０１１３】
実施例３５：（２−クロロ−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン（化合物３５）の合成
【化２０】
2014505662.tif 000022
（２−クロロ−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−アミン（２．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（１．４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、得られた懸濁物をヨウ化メチル（０．５ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を周囲温度で７２時間撹拌した。水（２５０ｍＬ）を加え、得られた混合物を酢酸エチルで抽出した（５０ｍＬ×３回）。有機抽出物を塩水で洗浄し（２５ｍＬ×１回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、低圧下で溶媒を除去し、固体残渣（２．３０ｇ）を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン  ６０：３０）によって精製し、２−クロロ−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン（１．４５ｇ、収率７０％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．７（s，１Ｈ）；７．４−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．９（ｂｓ，１Ｈ）；３．８（s，３Ｈ）；３．６（ｂs，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．７−１．５（２ｑ，４Ｈ）。
【０１１４】
実施例３６：（９−ベンジル−２−メチルスルファニル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン（化合物３６）の合成
【化２１】
2014505662.tif 000023
２５０ｍＬの高圧反応器に、（９−ベンジル−２−ヨード−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−アミン（化合物３０）溶液（２．４ｇ、エタノール（３０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）の混合物中４．１ｍｍｏｌ）をナトリウムチオメトキシド（１．４ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）で処理した。反応容器を閉じ、混合物を１３０℃で６時間加熱した（最大内圧：２ｂａｒ）。この時間が経過したら、低圧下で溶媒を除去し、水（１２０ｍＬ）を加え、得られた混合物を酢酸エチルで抽出した（５０ｍＬ×３回）。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させて残渣を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン  １：１）によって精製し、（９−ベンジル−２−メチルスルファニル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン（１．６８ｇ、３．３ｍｍｏｌ、８１％）を黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．５５（s，１Ｈ）；７．４５−７．１２（ｍ，１５Ｈ）；６．０７（１Ｈ，ｔ）；５．６５（ｂs，１Ｈ）；５．２９（s，２Ｈ）；３．５８（ｂs，２Ｈ）；２．５５（s，３Ｈ）；２．１６（ｑ，２Ｈ）；１．７９−１．５１（ｍ，４Ｈ）。
【０１１５】
実施例３７：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（９−メチル−２−フェニル−９Ｈ−プリン−６−イル）アミン（化合物３７）
【化２２】
2014505662.tif 000024
２−クロロ−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン（３．０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１．３ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、フェニルホウ酸（１．０５ｇ、８．６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１．２１ｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１５ｍｏｌ％）のＤＭＥ（５０ｍＬ）懸濁物をＡｒ下、１００℃で４０時間撹拌した。この時間が経過したら、溶媒を低圧で除去し、水（３４ｍＬ）を加えた。得られた混合物を１０分間撹拌し、沈殿を濾過し、水で洗浄し（２０ｍＬ×２回）、エーテルで洗浄した（２０ｍＬ×２回）。このようにして得られた物質を減圧下で乾燥させ、２−クロロ−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン（２．６ｇ、５．７ｍｍｏｌ、収率８１％）を黄色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．５（ｄ，２Ｈ）；７．７（s，１Ｈ）；７．５−７．１（ｍ，１３Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．７（ｍ，１Ｈ，ＮＨ）；３．９（s，３Ｈ）；３．７（ｍ，２Ｈ）；２．３（ｑ，２Ｈ）；１．８（ｍ，２Ｈ）；１，６（ｑ，２Ｈ）。
【０１１６】
類似の様式で、２−クロロ−９−メチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミンと、対応するヘテロアリールホウ酸誘導体とを反応させることによって以下の化合物を調製した。
【０１１７】
実施例３８：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（９−メチル−２−チオフェン−２−イル−９Ｈ−プリン−６−イル）アミン（化合物３８） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：７．７−７．５（ｍ，２Ｈ）；７．５−７．０（ｍ，１１Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．４（ｂs，１Ｈ）；３．７（s，３Ｈ）；３．６（ｂs，２Ｈ）；２．１（ｑ，２Ｈ）；１．８−１．５（２ｑ，４Ｈ）。
【０１１８】
実施例３９：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（９−メチル−２−ピリジン−４−イル−９Ｈ−プリン−６−イル）アミン（化合物３９） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．７（ｄ，２Ｈ）；８．３（ｄ，２Ｈ）；７．７（s，１Ｈ）；７．３−７．０（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５，５（ｂs，１Ｈ）；３．９（s，３Ｈ）；３．７（ｂs，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．８−１．５（２ｑ，４Ｈ）。
【０１１９】
実施例４０：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミン（化合物４０） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１２．８１（ｂs，１Ｈ）；８．２２（s，１Ｈ）；７．９２（s，１Ｈ）；７．０２−７．２６（ｍ，１０Ｈ）；６．８０（ｂs，１Ｈ）；５．９５（ｔ，１Ｈ）；３．４１−３．４５（ｍ，２Ｈ）；２．４５−２．５８（ｍ，２Ｈ）；２．０３−２．１０（ｍ，２Ｈ）；１．４２−１．６２（ｍ，４Ｈ）。
【０１２０】
実施例４１：（５，５−ジフェニル−ペンタ−４−エニル）−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミン（化合物４１） １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１３．３５（ｂs，１Ｈ）；８．１１（ｂs，１Ｈ）；８．０４（s，１Ｈ）；７．０５−７．３３（ｍ，１０Ｈ）；６．１６（ｔ，１Ｈ）；３．４２−３．４９（ｍ，２Ｈ）；２．０８−２．１５（ｍ，２Ｈ）；１．７２−１．７７（ｍ，２Ｈ）。
【０１２１】
化合物３５と類似の様式で、化合物４１と、対応するハロゲン化アルキルベンジル誘導体とを反応させることによって以下の化合物を調製した。
【０１２２】
実施例４２：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミン塩酸塩（化合物４２） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．３５（ｂs，１Ｈ）；７．８３（s，１Ｈ）；７．１４−７．３９（ｍ，１０Ｈ）；６．０７（ｔ，１Ｈ）；４．０４（s，３Ｈ）；３．５−３．６（ｍ，２Ｈ）；２．１９（ｑ，２Ｈ）；１．６７−１．７５（ｍ，２Ｈ）；１．５６−１．６３（ｍ，２Ｈ）。
【０１２３】
実施例４３：（１−ベンジル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）−（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）アミン塩酸塩（化合物４３） １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ（ｐｐｍ）：８．４（ｂs，１Ｈ）；７．９（s，１Ｈ）；７．４−７．２（ｍ，１６Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．６（s，２Ｈ）；３．６−３．５（ｍ，２Ｈ）；２．２（ｑ，２Ｈ）；１．９−１．８（ｍ，２Ｈ）；１．６−１．５（ｍ，２Ｈ）。
【０１２４】
実施例４４：（６，６−ジフェニル−ヘキサ−５−エニル）−（１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミン塩酸塩（化合物４４） １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），δ（ｐｐｍ）：１１．０（ｂs，１Ｈ）；８．８（s，１Ｈ）；８．４（s，１Ｈ）；７．３−７．１（ｍ，１０Ｈ）；６．１（ｔ，１Ｈ）；５．０（ｈｅｐｔ，１Ｈ）；３．７−３．４（ｍ，２Ｈ）；２．１−１．９（ｍ，２Ｈ）；１．７−１．６（ｍ，２Ｈ）；１．６−１．４０（ｍ，２Ｈ）；１．３９（ｄ，６Ｈ）。
【０１２５】
生物学的アッセイ
形質移入体の作成
すべての形質移入体は、細胞における共通の、試験対象経路の重要な受容体を欠いていた。分泌したホスファターゼｓＰａｓｅを、リン酸ニトロフェノールと化学的に類似する基質の加水分解に基づいて培地から得られる発光性基質または発色性基質を処理する能力について、リポーターとして使用した。５種類の形質移入体の作成を記載のように行った。
１．ＩＬ−４Ｒ。非造血細胞の中で共通の鎖であるＩＩ型ＩＬ−４ｒの鎖を形質移入し、ＩＬ−４ｒによる核シグナル伝達経路の重要な分子であるＳＴＡＴ６、最後に、ＳＴＡＴ６に対する応答を測定するためのリポーター遺伝子を導入した。細胞は、ｐ６２／ａＰＫＣを介してＳＴＡＴ６と関係があることがすでに知られているＪａｎｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ  １（ＪＡＫ１）を内部に有していた。
２．ＩＬ−６Ｒ。ＩＬ−６Ｒの鎖を形質移入し、ＳＴＡＴ３に対する応答を測定することが可能なリポーター遺伝子を導入した。よく知られているように、ＳＴＡＴ３は、形質導入分子であり、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの標準的な応答で生理学的に産生される核内因子である。
３．ＴＮＦ−Ｒ。この場合、形質導入分子であり、ＴＮＦ−αに対する応答で生理学的に産生される核内因子であるという理由で、ＮＦ−ｋＢに対する応答を測定することが可能なリポーター遺伝子を導入した。ＴＮＦ−α形質移入体は、ＬＰＳのようなＮＦｋＢの強力なアクチベーターに対して応答しなかった。
４．ＴＬＲ４／ＭＤ２／ＣＤ１４によってあらわされるＬＰＳ−受容体複合体。上の場合と同様に、ＮＦｋＢに応答する構成要素を含むリポーター遺伝子を使用したが、ＬＰＳ−Ｒ複合体の構成要素を同時トランスフェクションすることによって選択性を達成した。ＬＢＰとして知られるある血漿タンパク質に対するユニオンによって、血清からＬＰＳを捕捉し、ＬＰＳを膜タンパク質ＣＤ１４に移す。ＬＢＰを含むことで、ＬＢＰを含まない培地または培養物と比較して感度が１０００倍上がることとなる。ＣＤ１４分子は、ＬＰＳ−受容体ではなく、ＬＢＰを捕捉する受容体複合体の一要素であり、ＭＤ２に対する細胞表面にＬＰＳを移動させる。ＣＤ１４は、細胞質尾部を有しておらず、シグナル伝達体になることはできないが、このシステムの感度をかなり上げる。同様の様式で、ＭＤ２は、シグナル伝達体ではないが、ＣＤ１４とＭＤ２を組み合わせることで感度を１００００倍上げることができる。
５．ＩＬ−１Ｒ。上の場合と同様に、ＮＦｋＢに応答する構成要素を含むリポーター遺伝子を使用したが、受容体複合体ＩＬ−１Ｒに属する構成要素の発現によって選択性を達成した。ＩＬ−１Ｒは、ＴＩＲ形質導入体ドメイン（Ｔｏｌｌ様ＩＬ−１Ｒ）を使用する受容体スーパーファミリーに属する。ＩＬ−１Ｒ経路が、ＪＮＫ型の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化し、ひいてはＡＰ−１のような転写的に活性な核内因子を生成することが知られている。リポーター遺伝子は、生理学的刺激を模倣するために鎖状に接続したＮＦｋＢおよびＡＰ−１部位を含む。
【表１】
2014505662.tif 000025
【０１２６】
マウス内毒素血症：ＴＮＦ−αの血清濃度に対する化合物１１および化合物８の活性
材料および方法：制御された標準的な条件で飼育した体重３０〜３５ｇの雄ＣＤ１マウスを使用した。これらの動物を、絶食させ（１４〜１６時間、１グループに１２匹、約５００ｃｍ２の１つのかごに６匹）、サッカロース（８％）およびＮａＣｌ（０．２％）から作られた栄養溶液は自由に摂取させた。経口試験による治療は、１０ｍｌ／ｋｇの容積比で、懸濁物（ビヒクル：Ｔｗｅｅｎ８０  ０．１％−ＮａＣｌ  ０．９％）で与えられた。１時間後、血清型０５５：Ｂ５のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−２８８０）から得られるリポ多糖を１ｍｇ／ｋｇの投薬量および１０ｍｌ／ｋｇの容積比で滅菌塩水に溶解して腹腔内注射することによって、マウス内毒素血症を誘発させた。ＬＰＳを注射（腹腔内）してから９０分後、イソフルランで麻酔しつつ、心臓穿孔によって血液０．５〜０．８ｍｌを抜き取り、血液サンプルを遠心分離処理し（６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、２つの血清サンプルを採取し、血清ＴＮＦ−α濃度を測定する（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＥＩＡ：Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ／ＴＮＦＳＦ１Ａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）まで、−７０℃で凍結させておいた。
【０１２７】
化合物１１および８を経口で１００ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌの投薬量で与えると、Ｅ．ｃｏｌｉによって誘発されたマウス内毒素血症から得たこのＬＰＳ（腹腔内）実験モデルにおいて活性を示し、ビヒクルのグループに関し、ＴＮＦ−αの血清濃度がそれぞれ統計学的に有意な様式で３５．４２％および３７．７％減少する。
【０１２８】
副甲状腺ホルモンで治療したマウスにおけるＩＬ６の血清濃度。化合物１５の活性
材料および方法：制御された標準的な条件で飼育した５〜７週の雄ＣＤ１マウスを使用した。これらの動物を、絶食させ（１４〜１６時間、１グループに１２匹、約１１００ｃｍ２の１つのかごに６匹）、固体および液体の食事は自由に摂取させた。
【０１２９】
５日間にわたって、ｐＴＨ−ｒｐ（１−３４、ヒト）１５μｇ／０．１ｍＬ／注射で８回腹腔内投与し、動物を治療した。経口試験による治療は、ｐＴＨ注射の１時間後に１０ｍｌ／ｋｇの容積比で、懸濁物（ビヒクル：Ｔｗｅｅｎ８０  ０．１％−ＮａＣｌ０．９％）で与えられた。
【０１３０】
最後のｐＴＨ投与から２時間後、イソフルランで麻酔しつつ、心臓穿孔によって血液０．５〜０．８ｍｌを抜き取り、血液サンプルを遠心分離処理し（６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、２つの血清サンプルを採取し、血清ＩＬ−６濃度を測定する（ＥＩＡ：リファレンス番号５５５２４０。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）まで、−７０℃で凍結させておいた。
【０１３１】
２５ｍｇ／ｋｇ／１０ｍｌの投薬量で経口で与えた化合物１５は、この実験モデルに活性を示し、ビヒクルのグループに関し、ＩＬ−６の血清濃度が統計学的に有意な様式で６４．５８％減少する。
【０１３２】
抗腫瘍活性
細胞株ＮＣＩパネル（一次スクリーニング）
この試験で使用する別個のヒト細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得て、１０％（ｖ／ｖ）の熱で不活化した胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、加湿した９５％の空気および５％  ＣＯ２の下、３７℃で培養した。別個の量の指数関数的に成長するヒト細胞株を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに最終容積が１００μｌになるように播種し、５％ＣＯ２／空気９５％の加湿雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートし、細胞をプレートに付着させた。次いで、５％ＣＯ２／空気９５％の雰囲気下、異なる濃度の評価される化合物とともに細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。ＸＴＴ（３’−［１−（フェニルアミノ）カルボニル］−３，４−テトラゾリウム−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム塩水和物）細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、マンハイム、ドイツ）を用い、製造業者の指示にしたがって細胞増殖を定量した。簡単に言うと、それぞれのウェルに、ＸＴＴ標識試薬およびＰＭＳ（Ｎ−メチルジベンゾピラジンメチルサルフェート）電子カップリング試薬を含む新しく調製した混合物溶液（５０μｌ）を加えた。得られた混合物をさらに加湿雰囲気（３７℃、５％  ＣＯ２）中、４時間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーを用い、試験波長４９０ｎｍおよびリファレンス波長６５５ｎｍで、生成したホルマザン産物の吸光度を測定した。次いで、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を、細胞増殖を５０％阻害する薬物濃度として計算した。４つの独立した実験をそれぞれ３組で行った平均値（±Ｓ．Ｄ．）としてデータを示す。表１は、３細胞株パネルおよび６０細胞株パネルの両方でスクリーニングした後の試験化合物のＩＣ５０濃度の一部を示す。
【表２】
2014505662.tif 000026
【表３】
2014505662.tif 000027
【表４】
2014505662.tif 000028
【０１３３】
メラノーマ（Ｂ１６−Ｆ１、ＭＡＬＭ−３Ｍ）、結腸癌（ＨＣＴ−１１６、ＳＷ２６０）、ヘパトーマ（ＨｅｐＧ２）、膠芽細胞腫（ＳＦ２６８）および肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０）細胞株における、化合物６、８、４０、４１、４４のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性
ＳＲＢ法に従った（Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｖ．ら、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、第１巻、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．、Ｒｏｓａｌｙｎ  Ｄ．Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ編集。Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー、２００５）。
【０１３４】
細胞を９６ウェルのマイクロプレートに播種した。それぞれのウェルにおいて、細胞種に応じて、特定の数の細胞を２００マイクロリットル播種した。これらの条件で、細胞を指数関数増殖段階に到達させ、産生物の細胞毒性を評価する目的で、細胞を３日間培養した。治療当日に、ストック溶液（１０ｍＭ）を解凍した後に産生物の濃縮物を得た。播種した細胞を含むマイクロプレートを３日間育てた後、培地を捨て、それぞれのウェルについて新しい培地１５０μｌと交換した。その後、それぞれのウェルについて、最終的な容積である２００マイクロリットル中の最終濃度が計画したとおりになるように、対応する産物の希釈物５０μｌを加えた。この産物を、細胞が成長している単層とアッセイする濃度で７２時間接触させ、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。最後に、冷ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）５０％を５０μｌ（ウェル中の最終濃度１０％）加え、細胞の成長を止めた。次いで、ＳＲＢを用いた洗浄および染色を開始するまでに、マイクロプレートを４℃で６０分間維持し、細胞タンパク質を固定した。
【０１３５】
細胞生存率（％）＝（処置したウェルの細胞集合／標準曲線の最大細胞集合）×１００
【０１３６】
評価する濃度において、それぞれのウェルで得られた値から、それぞれの濃度について平均生存率の値を計算した。
【０１３７】
７種類の異なる細胞種について、試験した化合物のＩＣ５０濃度は第２表に示されるとおりであった。
【表５】
2014505662.tif 000029
【０１３８】
ヒト非腫瘍細胞（二次スクリーニング）
線維芽細胞、ＨＵＶＥＣ細胞および休止ＰＢＬ（末梢血リンパ球）において、ヒト非腫瘍細胞に対する化合物の細胞毒性を試験した。
【０１３９】
試験した化合物は、ＨＵＶＥＣ細胞および線維芽細胞に対し、１０−５Ｍの範囲で特定の細胞毒性を示す。他のＰＢＬだと、化合物は、１０−４ＭであってもＰＢＬにほとんど影響を及ぼさない。化合物は、１０−５〜１０−６Ｍの濃度範囲で血液癌細胞株のアポトーシスを誘発するため、これらのデータは、正常な血液細胞と比較して、血液癌に対する治療域を示す。
【０１４０】
ヒト臍帯をＩ型コラゲナーゼで処理し、Ｈａｎｋ培地中０１％の濃度で、３７℃で２０分間インキュベートすることによってＨＵＶＥＣ細胞を得た。その後、細胞を集め、２０％  ＦＢＳ、１％  Ｐ／Ｓおよび２５ｍｇ／５００ｍｌのＥＣＧＦ培地を追加したＭ１９９培地で培養し、細胞を０．２％ゼラチンマトリックス中で成長させた。
【０１４１】
別個の量の指数関数的に成長する細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに最終容積が１００μｌになるように播種し、５％ＣＯ２／空気９５％の加湿雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートし、細胞をプレートに付着させた。次いで、５％ＣＯ２／空気９５％の雰囲気下、異なる濃度の評価される化合物とともに細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。ＸＴＴ細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、マンハイム、ドイツ）を用い、製造業者の指示にしたがって細胞増殖を定量した。簡単に言うと、それぞれのウェルに、ＸＴＴ標識試薬およびＰＭＳ（Ｎ−メチルジベンゾピラジンメチルサルフェート）電子カップリング試薬から新しく調製した混合物溶液（５０μｌ）を加えた。得られた混合物をさらに加湿雰囲気（３７℃、５％  ＣＯ２）中、４時間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーを用い、試験波長４９０ｎｍおよびリファレンス波長６５５ｎｍで、生成したホルマザン産物の吸光度を測定した。次いで、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）を、細胞増殖を５０％阻害する薬物濃度として計算した。４つの独立した実験をそれぞれ３組で行った平均値としてデータを示す。結果は第３表に示されるとおりであった。
【表６】
2014505662.tif 000030
【０１４２】
正常な末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離するために、健康な志願者から得た新しいヒト末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの密度勾配型遠心分離によって単核細胞を得て、これをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、文献に記載されるように、１０％（ｖ／ｖ）の熱で不活化したＦＢ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが入ったＲＰＭＩ−１６４０培地に再び懸濁した（Ｃａｂａｎｅｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １２７：８１３−８２５．１９９９）。一晩インキュベートした後、培養皿への付着によって単球を除いた。非付着性のＴ細胞（リンパ球）をＰＢＳで洗浄し、集めた。ＰＢＬ調製物は、典型的には、ＣＤ３＋が７０〜７５％、ＣＤ１９＋が２４〜２９％、ＣＤ１４＋が０．４％未満であった。
【表７】
2014505662.tif 000031
【０１４３】
化合物３および６は、１０−４ＭであってもＰＢＬにほとんど影響を及ぼさず、ここでもドキソルビシンよりも細胞毒性が低いことを示している。これらの化合物は、１０−６Ｍの濃度範囲で血液癌細胞株のアポトーシスを誘発するため、このデータは、正常な血液細胞と比較したときに血液癌の治療域を示す。
【０１４４】
慢性リンパ球性白血病異種移植動物モデルにおける化合物３のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
１０％（ｖ／ｖ）熱で不活化した胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが入ったＲＰＭＩ−１６４０培地中、加湿した９５％の空気および５％  ＣＯ２の下、３７℃で慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）のＥＨＥＢ細胞株を培養した。細胞をマイコプラズマ感染について周期的に試験し、陰性であることがわかった。ＣＢ１７重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ、リヨン、フランス）を、温度２２℃、１２／１２時間の明／暗サイクルでスペイン国の法律に準拠した法律のガイドラインにしたがって保存し、取り扱い、標準的な餌と酸性水を不断給餌の状態で与えておいた。１００μｌ  ＰＢＳおよび１００μｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ基底膜マトリックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１．５×１０７ＥＨＥＢ細胞を入れ、これをＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスに、下側背部から皮下接種した。腫瘍が触診可能になったら、マウスをランダムに１０匹ごとの群に分け、尾から化合物を静脈投与した（３回／週）。各静脈投与で使用する容積は２００μｌであり、最終的な薬物濃度を２．５ｍｇ／ｋｇ（体重）とした。これに並行して、等容積のビヒクルをマウスに静脈投与した。キャリパーによって腫瘍の最小直径および最大直径を測定し、以下の標準式を用いて腫瘍の体積（１０−３ｃｍ３）を計算した。（最小直径）２×（最大直径）×０．５。腫瘍の直径が３ｃｍに達したとき、または顕著な毒性がみとめられたとき、法律によるガイドラインにしたがって動物を殺した。動物の体重および何らかの罹患の徴候について監視した。薬物による治療を４１日間続けた。次いで、腫瘍異種移植片を取り出し、測定し、計量し、腫瘍および別個の臓器に関する解剖分析を行った。全ての値を平均±ＳＤとしてあらわした。統計的な群間差について、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて評価した。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意であるとみなした。結果を図１に示す。化合物３は、コントロール群（ビヒクル投与）と比較して、有意に（＊＊、ｐ＜０．０１）ＣＬＬ腫瘍の成長を阻害した。
【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが終了した後、コントロールおよび化合物３で治療したマウスを殺し、腫瘍異種移植片を取り出し、腫瘍の重さと体積を測定し、化合物３で治療したマウスについて、コントロールの未治療群と比較して、腫瘍の大きさおよび重量が顕著かつ有意に（ｐ＜０．０１）減少していることが示されている。
【表８】
2014505662.tif 000032
【０１４６】
マウスを殺したら、腫瘍および別個の臓器に関する解剖分析を行った。分析した別個の臓器について、解剖分析後に、有意な事象または変化はなんら検出されなかった。マウスの重量は、未治療コントロールと治療したマウスの両方で同等であった。これらのデータは、化合物３を用いたマウスの治療において、顕著な副作用がみられないことを示唆している。化合物３で治療したマウスから取り出した腫瘍は、薬物を用いない腫瘍を有するコントロールマウスと比較して、血管形成が非常にわずかであることが示され、このことは、化合物３が、抗腫瘍性となる細胞毒性活性を高めることができる抗血管形成活性を有し得ることを示唆している。これらの結果は、化合物３が、ＣＬＬ異種移植マウスモデルにおいて有意かつ強力なｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すことを示している。それに加え、両薬物を用いた治療は、忍容性が十分にあり、解剖検査で明らかな毒性はなんら検出されなかった。
【０１４７】
全測定日にわたって、コントロールに対する化合物３の差は、統計的に有意なものであった（ｐ＜０．０５）。
【０１４８】
多発性骨髄腫異種移植動物モデルにおける化合物３のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
１０％（ｖ／ｖ）熱で不活化した胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが入ったＲＰＭＩ−１６４０培地中、加湿した９５％の空気および５％  ＣＯ２の下、多発性骨髄腫（ＭＭ）のＭＭ１Ｓ細胞株を３７℃で培養した。細胞をマイコプラズマ感染について周期的に試験し、陰性であることがわかった。ＣＢ１７重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リヨン、フランス）を、温度２２℃、１２／１２時間の明／暗サイクルでスペイン国の法律に準拠した法律のガイドラインにしたがって保存し、取り扱い、標準的な餌と酸性水を不断給餌の状態で与えておいた。１００μｌ  ＰＢＳおよび１００μｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ基底膜マトリックス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に３×１０７ＭＭ１Ｓ細胞を入れ、これをＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスに、下側背部から皮下接種した。腫瘍が触診可能になったら、マウスをランダムに１０匹ごとの群に分け、尾から化合物を静脈投与した（３回／週）。各静脈投与で使用する容積は２００μｌであり、最終的な薬物濃度を２．５ｍｇ／ｋｇ（体重）とした。これに並行して、等容積のビヒクルをマウスに静脈投与した。キャリパーによって腫瘍の最小直径および最大直径を測定し、以下の標準式を用いて腫瘍の体積（１０−３ｃｍ３）を計算した。（最小直径）２×（最大直径）×０．５。腫瘍の直径が３ｃｍに達したとき、または顕著な毒性がみとめられたとき、法律によるガイドラインにしたがって動物を殺した。動物の体重および何らかの罹患の徴候について監視した。薬物による治療を１ヶ月間続けた。次いで、腫瘍を取り出し、測定し、計量し、腫瘍および別個の臓器に関する解剖分析を行った。
全測定日にわたって、コントロールに対する化合物３の差は、統計的に有意なものであった（ｐ＜０．０５）。結果を図２に示す。以下の表は、治療終了時のｅｘ  ｖｉｖｏでの腫瘍データを示す。
【表９】
2014505662.tif 000033
【０１４９】
患者から得た慢性リンパ球性白血病細胞に対する化合物３の抗腫瘍活性
異なるＺＡＰ７０発現パターンを示す６人のヒト患者の慢性リンパ球性白血病細胞群を選択した（第５表に示される細胞遺伝学的変化を参照）。化合物３の存在下、細胞をインキュベートした。この試験の結果（生存率を示す）は図３に示されるとおりであった。
【表１０】
2014505662.tif 000034
【０１５０】
ＺＡＰ７０の発現量が低い細胞の方が、用量に依存する様式での生存率の低下が顕著であった。
【０１５１】
変異したＫｒａｓ結腸癌同所性動物モデルにおける化合物３のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
Ｋｒａｓ変異を有する患者から得た結腸直腸癌細胞に基づき、マウスの結腸領域に移植した動物モデル（Ｙａｏ、Ｍ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＮＳ−３９８  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｄｅｌａｙｓ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００４年２月９日；９０（３）：７１２−９）を用い、化合物３の効果を試験した。
【０１５２】
図４Ａの写真は、ヒト結腸直腸癌の腫瘍体積について、明らかに減少させる効果があることを示している。化合物３および５−ＦＵおよびオキサリプラチン（ＯＸＡ）という２種類の異なる結腸癌について広範囲に使用される抗腫瘍薬物を直接比較した効果を示している。
【０１５３】
化合物３（ＮＦ）、オキサリプラチン（ＯＸＡ）、５−Ｆウラシル（５−ＦＵ）およびこれらの組み合わせで治療したマウスから得たヒト結腸癌腫瘍の重さを図４Ｂに示す。
【０１５４】
メラノーマ同所性動物モデルにおける化合物３のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
Ｂ１６メラノーママウス細胞に基づく動物モデルを用い（Ｓｚｅｎｄｅ、Ｂら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００３）８８、１３２−１３６）、化合物３は、メラノーマ同所性マウスモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示した。化合物３の用量は、これらの実験すべてで腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇであった。結果を図５に示す。
【０１５５】
図５Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのメラノーマ腫瘍ルシフェラーゼ活性のＰＥＴ写真をあらわす。シグナルの強度は、増殖性細胞を多く含む腫瘍ほど大きい。図５Ｂは、この治療終了時に動物から得たｅｘ  ｖｉｖｏメラノーマ腫瘍を示す。図５Ｃは、コントロールまたは化合物３で治療した後のメラノーマ腫瘍の重さを示すグラフである。１グループあたりｎ＝４の動物を用いた４種類の異なる独立した実験を行った。図５Ｄは、１グループあたりｎ＝９の動物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、メラノーマＢ１６に対する独立した実験を示すグラフである。
【０１５６】
卵巣腫瘍同所性動物モデルにおける化合物３のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
化合物３は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍領域を小さくする強力な抗腫瘍活性を示す。クローン化したルシフェラーゼリポーターを含むＭＯＳＥＣ  ＩＤ８細胞（マウス卵巣表面上皮細胞）およびマウス卵巣領域に移植した細胞を用い、実験を行った（Ｙｕ−Ｈｕｎｇ  Ｈｕａｎｇら、Ｃｌａｕｄｉｎ−３ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．３４２６−３４３０  ＰＮＡＳ  ２００９．ｖｏｌ．１０６、ｎｏ．９）。結果を図６に示す。
【０１５７】
図６Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍のルシフェラーゼ活性のＰＥＴ写真をあらわす（化合物３で治療したマウス：３０ｍｇ／Ｋｇ、腹腔内、１週間に５日を２週間）。図６Ｂは、コントロールまたは化合物３で治療した後の動物からのルシフェラーゼシグナルの定量結果を示す。
【０１５８】
作用機序
血液癌細胞株
化合物３を異なるヒト血液癌細胞株（ＣＬＬ細胞株、ＭＭ細胞株、急性Ｔ細胞株および急性骨髄性白血病細胞株を含む）とともにインキュベートすると、初期アポトーシスに特徴的な、Ｇ１よりもＤＮＡ癌流量が少ない細胞の外観によって評価されるように、アポトーシスを誘発した（Ｇ１前のピーク；治療から６〜９時間後）。１０μＭの化合物３と、ＥＨＥＢ細胞（ＣＬＬ）、ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＭＭ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ細胞白血病）およびＨＬ−６０細胞（急性骨髄性白血病）とを用いて２４時間治療した後、２０％を超えるアポトーシスが誘発された。
【０１５９】
アポトーシスによる細胞死の誘発は、カスパーゼ−３の基質であるＰＡＲＰの迅速な開裂、およびカスパーゼ−３の活性化によってさらに裏付けられた。ＥＨＥＢ細胞を化合物３で処理する場合、カスパーゼ−９も活性化し、このことは、この薬物の作用に、固有のミトコンドリアが介在するシグナル伝達が関与していることを示唆している。カスパーゼ−４が活性化するが、このことは、小胞体のストレスが関与している可能性を示唆している。興味深いことに、インキュベート時間中に、脂質化された微小管関連タンパク質１の軽鎖３（ＬＣ３−ＩＩ）が多く発生することによって評価されるように、化合物３で処理した後に、非常に迅速かつ強力な自食作用の誘発がみられた。
【０１６０】
化合物３によるＥＨＥＢ細胞のアポトーシス誘発（図７Ａ）：１０μＭの化合物３を用い、所定の時間、ＥＨＥＢ細胞をインキュベートし、次いで、フローサイトメトリーによる細胞周期分析において、Ｇ１前領域にある細胞の割合としてアポトーシスを定量化した。Ｇ１前ピーク（低二倍性）の位置をアポトーシス細胞によって積分し、Ｇ０／Ｇ１ピークおよびＧ２／Ｍピークを矢印で示す。並行して未処理のコントロール細胞について実施した。Ｇ１よりＤＮＡ含有量が少ない細胞（Ｇ１前）の細胞の割合を各ヒストグラムに示す。ここに示す実験は、３回行った実験の代表例である。簡単に言うと、細胞（５×１０５）を遠心分離処理し、７０％エタノールを用い、４℃で一晩固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡおよび２０μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウムを用い、室温で１時間インキュベートし、次いで、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（サンノゼ、ＣＡ）を用いて細胞周期を分析した。細胞周期分析において、Ｇ１前の領域（低二倍性）にある細胞の割合として、アポトーシス細胞の定量結果を計算した。
【０１６１】
化合物３で処理したＥＨＥＢ細胞における異なるタンパク質の発現（図７Ｂ）：１０μＭの化合物３を用い、所定の時間かけて細胞を処理し、所定のタンパク質に特異的な抗体を用い、免疫ブロット法によって分析した。異なるタンパク質の移動位置を示す。ローディングコントロールとしてβ−アクチンを使用した。ここに示すデータは、３回の実験を実施したうちの代表例である。
【０１６２】
結腸上皮癌細胞
得られた結果は、化合物３が、細胞周期分析およびカスパーゼ活性化におけるＧ１前のピーク（低二倍性）の外観によって評価されるように、ヒト結腸上皮癌細胞株（ＳＷ６２０、ＨＣＴ−１１６）のアポトーシスを誘発することを示している。化合物３によって誘発されるアポトーシスに、ミトコンドリアが介在する本質的なアポトーシスシグナル伝達が関与しているという推察は、カスパーゼ−９の誘発によって示唆される。さらに、化合物３は、Ｍｃｌ−１Ｓ（短）と呼ばれる骨髄細胞白血病−１（Ｍｃｌ−１）の代わりとなる接合した小さな遺伝子産物の発現を誘発し、これがアポトーシスのプロモーターとなる。化合物３を用いた治療によって、タンパク質ｐ５３の量も増加した。まとめると、このデータは、化合物３がＭｃｌ−１Ｓおよびｐ５３の上方制御を促進し、これが結腸癌細胞の死に関与している可能性を示している。
【０１６３】
ヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６細胞株における、化合物３によるアポトーシスの誘発（図８Ａ）  細胞周期分析のＧ１前領域（低二倍性）にある細胞の割合として、アポトーシスの誘発を定量化した。簡単に言うと、細胞（５×１０５）を遠心分離処理し、７０％エタノールを用い、４℃で一晩固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡおよび２０μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウムを用い、室温で１時間インキュベートし、次いで、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（サンノゼ、ＣＡ）を用いて細胞周期を分析した。１０μＭの化合物３を用い、所定の時間、ＨＣＴ−１１６細胞をインキュベートし、次いで、フローサイトメトリーによる細胞周期分析において、Ｇ１ピークより前の領域にある細胞の割合としてアポトーシスを定量化した。Ｇ１ピークより前の位置（低二倍性）を、アポトーシス細胞によって積分し、Ｇ０／Ｇ１ピークおよびＧ２／Ｍピークを矢印で示す。並行して未処理のコントロール細胞について実施した。Ｇ１よりＤＮＡ含有量が少ない細胞（Ｇ１前）の細胞の割合を各ヒストグラムに示す。ここに示す実験は、３回行った実験の代表例である。
【０１６４】
化合物３で処置している間の異なるアポトーシス関連タンパク質の発現（図８Ｂ）  ＨＣＴ−１１６細胞およびＳＷ６２０細胞を１０μＭの化合物３で所定の時間かけて処理し、所定のタンパク質に特異的な抗体を用い、免疫ブロット法によって分析した。異なるタンパク質の移動位置を示す。ローディングコントロールとしてβ−アクチンを使用した。ここに示すデータは、３回の実験を実施したうちの代表例である。遠心分離処理によって、約１０７の細胞をペレット状にし、ＰＢＳで洗浄し、溶解させた。タンパク質（２０μｇ）をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で処理し、ニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中、５％（ｗ／ｖ）の脱脂乳を用い、室温で９０分間かけて固定し、以下の特異的な抗体とともに室温で１時間、または４℃で一晩インキュベートした。抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）（１：１０００希釈）マウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗Ｂｃｌ−ＸＬ（１：５００希釈）ウサギポリクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗Ｂｃｌ−２（１：２５０希釈）マウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗カスパーゼ−３（１：５００希釈）ウサギポリクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗カスパーゼ−９（１：１０００希釈）ウサギポリクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）；抗Ｍｃｌ−１（１：１０００希釈）ウサギポリクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗ｐ５３（１：５００希釈）マウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗β−アクチン（１：５０００希釈）マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）。マウス、ウサギ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびヤギ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の二次ＨＲＰ抗体を、ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）の脱脂乳中、１：５０００希釈状態で、室温で１時間インキュベートした。改良した化学発光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い、シグナルを増幅させた。
【図１】
2014505662.tif 000045
【図２】
2014505662.tif 000046
【図３】
2014505662.tif 000047
【図４】
2014505662.tif 000048
【図５ＡＢＣ】
2014505662.tif 000049
【図５Ｄ】
2014505662.tif 000050
【図６】
2014505662.tif 000051
【図７】
2014505662.tif 000052
【図８】
2014505662.tif 000053
【国際調査報告】
2014505662.tif 000054
2014505662.tif 000055