(57)【要約】  本発明は、試料体積１１１中の磁性粒子ＭＰのクラスタＣ、特にサンドイッチ構造体で標的分子に結合される異なる結合部位を持つ二つの磁性粒子ＭＰからなるクラスタＣの検出のための方法とセンサ装置１００に関する。磁性粒子ＭＰのクラスタＣとの入力光Ｌ１の相互作用から生じる出力光Ｌ２が検出される。さらに、磁性粒子ＭＰ，Ｃが駆動磁場Ｂによって駆動され、当該駆動は休止によって少なくとも一度中断される。このようにして特異的結合クラスタＣの量を正確に反映する高出力信号が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料体積中の磁性粒子のクラスタの検出のための方法であって、
ａ）入力光で前記試料体積を照射するステップと、
ｂ）駆動磁場によって前記試料体積中の磁性粒子を駆動するステップであって、前記駆動磁場が休止によって少なくとも一度中断される、ステップと、
ｃ）前記試料体積中の磁性粒子のクラスタとの前記入力光の相互作用から生じる出力光を検出するステップとを有する、方法。
【請求項２】
試料中の磁性粒子のクラスタの検出のためのセンサ装置であって、
ａ）中に磁性粒子を伴う試料が供給され得る試料体積を持つ試料容器と、
ｂ）前記試料体積中に入力光を放出するための光源と、
ｃ）前記試料体積中の磁性粒子のクラスタを駆動する駆動磁場を生じるための磁場発生器と、
ｄ）前記クラスタの駆動が休止によって少なくとも一度中断されるように前記磁場発生器を制御するための制御ユニットと、
ｅ）前記試料体積中の磁性粒子のクラスタとの前記入力光の相互作用から生じる出力光を検出するための光検出器とを有する、センサ装置。
【請求項３】
前記休止の持続時間及び／又は前記休止の回数がキャリブレーション測定から決定される、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項４】
前記休止の持続時間が約０．１秒乃至約１０秒、好適には約１秒乃至約２秒に及ぶ、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項５】
前記駆動磁場が約１０乃至約５０の休止によって中断される、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項６】
前記駆動磁場が回転する、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項７】
検出されるクラスタが二つの磁性粒子によって形成される、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項８】
前記試料がサンドイッチ構造体で前記試料中の標的成分に結合し得る二種の磁性粒子を有する、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項９】
前記出力光が磁性粒子のクラスタによって散乱された入力光を有する、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載のセンサ装置。
【請求項１０】
分子診断学、生物試料分析、化学試料分析、食品分析、及び／又は法医学分析のための請求項２乃至９のいずれか一項に記載のセンサ装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料体積中の磁性粒子のクラスタの検出のための方法及びセンサ装置に関し、当該クラスタは磁場によって検出中に駆動される。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ２００７／１２００９５  Ａ１は磁性粒子の凝集が分散媒中のそれらのブラウン緩和時間を決定することによって観察され得るセンサ装置を開示する。所要励起磁場の時間を消費する周波数掃引を回避するために、パルス励起磁場を使用することが提案されている。しかしながら記載された測定結果は複雑で実現が困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は比較的単純でロバストな手順で磁性粒子のクラスタの信頼できる検出を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的は請求項１に記載の方法、請求項２に記載のセンサ装置、及び請求項１０に記載の使用法によって達成される。好適な実施形態は従属請求項に開示される。
【０００５】
本発明にかかる方法は試料体積中の磁性粒子のクラスタの検出に役立つ。この文脈において、"磁性粒子"という語は永久磁性粒子及び磁化可能粒子の両方、例えば超常磁性ビーズを有するものとする。磁性粒子のサイズは典型的には３ｎｍ乃至５０μｍに及ぶ。"クラスタ"とは何らかの結合によって結合した二つ以上の磁性粒子の凝集である。ここで特に興味深いのは化学結合（単に磁化粒子間の磁気引力によって生じる結合とは対照的に）、特に特別な化学基及び／又は関心のある中間成分を介する特異的結合である。方法は以下のステップを有する：
ａ）試料体積の入力光照射。好適にはこの入力光はコリメート及び／又はフォーカス光ビームとして試料体積に向けられる。
ｂ）駆動磁場による試料体積中の磁性粒子（すなわち単一磁性粒子及び／又は磁性粒子のクラスタ）の駆動。定義により、"駆動"とは機械的効果の発生、特に磁性粒子に対する力の発揮及び／又は磁性粒子の運動を有する。本発明によれば、当該駆動は休止によって少なくとも一度中断されるものとする。これは少なくとも一つの時間間隔（長さ非ゼロ）があり、その間は駆動磁場がゼロであるか若しくは少なくとも磁性粒子が（検出可能な方法で）駆動されないほど小さいことを意味する。
ｃ）試料体積中の磁性粒子のクラスタと上述の入力光の相互作用から生じる出力光の検出。クラスタとの相互作用のために、出力光のある特徴（例えば量、色、方向など）はクラスタの存在（及び典型的には量も）に依存する。従って検出される出力光は試料体積中のクラスタの存在／量について結論を導き出すことを可能にし、これが方法の実際の目的である。
【０００６】
第２の態様によれば、本発明は特に上記類の方法にかかる、試料中の磁性粒子のクラスタの検出のためのセンサ装置に関する。センサ装置は以下の構成要素を有する：
ａ）中に磁性粒子を伴う試料が供給され得る試料体積を持つ試料容器。試料容器は例えば射出成形によってプラスチックから作られる使い捨てカートリッジとして実現され得る。
ｂ）試料体積に入力光を放出するための光源。光源は例えばレーザダイオード若しくはＬＥＤであり得る。
ｃ）試料体積中の磁性粒子を駆動する駆動磁場を発生させるための例えば永久磁石若しくは電磁石を有する磁場発生器。
ｄ）クラスタの駆動が休止によって少なくとも一度中断されるように磁場発生器を制御するための制御ユニット。制御ユニットは専用電子ハードウェア、付随ソフトウェアを伴うデジタルデータ処理ハードウェア、若しくは両者の混合で実現され得る。
ｅ）試料体積中の磁性粒子のクラスタと入力光の相互作用から生じる出力光を検出するための光検出器。光検出器は例えばフォトダイオード、フォトレジスタ、フォトセル、ＣＣＤチップ、若しくは光電子増倍管であり得る。
【０００７】
本発明の方法及びセンサ装置は磁性粒子のクラスタのロバストで正確な検出を可能にする。これは第１に入力光とクラスタの相互作用が観察される光学測定によって達成される。第２に、本発明の重要な態様は磁性粒子（クラスタを含む）が駆動磁場によって駆動されることである。この駆動が出力光の検出中に起こるとき、関心のあるクラスタから生じる出力光の成分と他のソースから生じる出力光の成分を区別することが可能である。本発明の第３の重要な特徴は磁気駆動が少なくとも一回の休止によって中断されることである。この手段は、出力光の観察に対する磁気駆動の前述の好影響がこうした休止の時間中得られないため、矛盾であるように見える。しかしながら実験は、磁気駆動が連続的ではなく中断される場合に検出の感度と精度が著しく増加され得ることを示す。
【０００８】
以下、上記方法とセンサ装置の両方に関する本発明の様々な好適な実施形態が記載される。
【０００９】
磁気駆動が中断されるべき休止の回数及び／又は休止の持続時間（並びに他の関連パラメータ）は好適にはキャリブレーション測定から決定される。これは複数の実験が既知の組成の試料で実行されることを意味し、休止の回数及び／又は持続時間（若しくは他のパラメータ）は各実験において変更され、そして所定基準について最良の結果をもたらす実験（例えば関心のあるクラスタの存在を示す最高出力信号）が休止の回数及び／又は持続時間にとって最適な選択を示す。
【００１０】
多くの実質的に重要な実施例において、休止の適切な持続時間は約０．１秒乃至約１０秒、好適には約０．５秒乃至約５秒、最も好適には約１秒乃至約２秒に及ぶ。これらの値は例えば直径約５００ｎｍの磁性粒子が使用される場合に適している。
【００１１】
駆動磁場の中断（休止）の好適な回数は約１０乃至約５０に及ぶ。
【００１２】
磁場がアクティブ（"オン"）である間隔は好適には約０．１乃至１０秒の持続時間を持つ（０．０１乃至１００の典型的なデューティサイクルをもたらす）。
【００１３】
本発明の別の好適な実施形態によれば、駆動磁場は存在する時間中に回転する。駆動磁場の回転は磁性粒子の、特にクラスタに凝集している粒子の対応する回転を誘導し得る。クラスタは典型的には形状が異方性であるため、それらの回転は（異方性の）入力光との相互作用に影響を及ぼす。従って出力光は駆動磁場の回転に依存する変調を有し、そしてこれはそれらが起源とする磁性粒子若しくはクラスタについての結論を可能にする。
【００１４】
方法及びセンサ装置によって検出される磁性粒子のクラスタは好適には二つの磁性粒子によって形成されるクラスタであり得る。これら二粒子クラスタは実質的に重要であり顕著な異方性を持ち、このことがこれらを（回転）駆動磁場における検出に適したものにする。
【００１５】
試料は好適にはサンドイッチ構造体で試料中の標的成分に結合し得る二つの異なる種類の磁性粒子を有し得る。試料は例えば第１抗体で被覆される磁性粒子と第２抗体で被覆される磁性粒子を有し、これら抗体の各々は試料中の標的分子上の異なるエピトープに結合し得る。これら標的分子の存在及び／又は量が典型的には実際に関心のある値である。これは標的分子によって結合される異なる種類の二つの磁性粒子の上述のサンドイッチ構造体によって形成されるクラスタの検出を介して決定され得る。従ってかかる二粒子クラスタの検出量が試料中の標的成分の量の指標である。
【００１６】
出力光は特に磁性粒子のクラスタによって散乱された入力光を有し得る。散乱光の観察はその量（強度）が散乱成分の量に比例するという利点を持つ。従って少量のこれら成分は、処理されなければならない高いベースライン信号がないため、高感度光検出器で最適に取り扱われ得る。出力光は関心のあるクラスタによって及び単一磁性粒子若しくは他の凝集体によって散乱された光を有することが多いことが留意されるべきである。関心のあるクラスタに関連する出力光の成分を別々に決定するために、これらクラスタは駆動磁場によって特定の方法で駆動され、これはそれらの出力光成分の対応する特徴的変調をもたらす。
【００１７】
本発明はさらに分子診断学、生物試料分析、化学試料分析、食品分析、及び／又は法医学分析のための上記センサ装置の使用に関する。分子診断学は例えば標的分子に直接的に若しくは間接的に結合した磁気ビーズ若しくは蛍光粒子を利用して達成され得る。
【００１８】
本発明のこれらの及び他の態様は以降に記載の実施形態から明らかとなりそれらを参照して解明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】磁性粒子が標的分子に結合してクラスタを形成する、試料中の事象を概略的に描く。
【図２】二つの磁性粒子と一つの標的分子のサンドイッチ構造体の拡大図である。
【図３】本発明にかかるセンサ装置を概略的に描く。
【図４】駆動磁場における休止の持続時間（水平軸）に依存する出力信号の差（垂直軸）をあらわす図である。
【図５】標的成分の濃度（水平軸）に依存する出力信号（垂直軸）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
近年、より広範で効果的なヘルスケアシステムに対する需要の増加がｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断界に影響を及ぼしており、効果的なポイントオブケアソリューションの達成に重点を置いている。こうした目標の達成はポイントオブケア診断の要件のために特に要求が厳しい。試験が患者の場所で実行される必要があるため、これらは迅速で、高感度で、定量的で、正確でなければならない。さらに試験が実行されるプラットフォームは携帯可能で簡便である必要がある。
【００２１】
磁気クラスタアッセイはボリュメトリックで表面のないアーキテクチャを提供するので、本質的に迅速であり費用効率が高い。図１は効果的なクラスタ形成を可能にする磁性ナノ粒子ＭＰの磁気閉じ込めに基づく典型的な磁気クラスタアッセイの４連続ステップを概略的に描く。
【００２２】
第１ステップ（図１左上）として、抗体で被覆された磁性粒子ＭＰが供給される。第２ステップ（図１右上）において、抗原ＡＧが加えられ磁性粒子に結合する。第３ステップ（図１右下）において、試料が磁場Ｂに晒され、粒子鎖若しくはクラスタＣの形成を生じる。最終ステップ（図１左下）において、試料が光源Ｌで照らされ、クラスタによって散乱された光が検出される。
【００２３】
文献は磁気鎖形成が粒子対粒子結合過程の反応速度論を増進するのに特に強力であり、非常に高速なアッセイを可能にするという事実を記載している（Ｂａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００６，１０３，（４４），１６０７６）。磁気鎖形成は磁性粒子を集めそれらの反発性にかかわらずそれらを互いに密接したままにすることによって効果的なクラスタ形成を可能にする。
【００２４】
典型的な磁気駆動プロトコルは例えば検出すべき標的生体分子で培養されているナノ粒子を含む試料に均一磁場を加えることにある。場がアクティブであるとき、ナノ粒子は自身を鎖に整列させ、互いにごく接近しながら自由に振動し回転する。その結果として図１に描く通り特異的結合が効果的に形成され得る。
【００２５】
図２に図示の通り、磁性ナノ粒子ＭＰが異なるモノクローナル抗体ＡＢ１及びＡＢ２で被覆されるときに特定の状況が生じる。抗体は光源ＡＧの異なる部位に特異的に結合し得るので、サンドイッチ構造体で二粒子クラスタを形成する（図２）。
【００２６】
特に上述のアッセイのために、ここでは繰り返しパルスの観点で"動的な"駆動を用いることが提案される。以下でより詳細に説明する通り、繰り返しパルスの適用は非特異的相互作用を驚くほど削減し、結合事象の回数を増加し得る。
【００２７】
磁気クラスタアッセイにおけるパルス駆動の導入は二重の目的にかなう。主として、検出する生体分子はサンドイッチ構造体を用いてとらえられ、ここで抗原の異なるエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体が使用される（図２参照）。特異的結合の数を最大化するために、多数のランダム衝突が、相補的抗体で被覆された粒子が抗原と遭遇し効果的に相互作用し得る可能性をより好ましくするように、磁気駆動フェーズ中に衝突の回数が最大化される必要がある。
【００２８】
第２の関連する態様は、超常磁性粒子が水溶液に分散するとき、それらが分離されたままにし、非特異的クラスタリングを回避するのに役立つ小さな負電荷をそれらが保持するという事実に関する。粒子をかき混ぜるための磁気の使用は、粒子が静電反発力を克服するのを可能にし、粒子は互いにごく接近したままにされ、これはクラスタ形成の反応速度論を高速化するために有益であるが、無視できない量の非特異的相互作用も導入する。その結果、磁気の使用は特異的クラスタの生成を最適化し非特異的クラスタの数を最小化するように注意深く評価されバランスをとる必要がある。
【００２９】
本発明によって提案されるアプローチは図３に描かれるセンサ装置１００（光磁気プラットフォーム）で実施され得る。このセンサ装置１００は中に磁性粒子若しくはビーズＭＰを伴う試料流体が供給され得る試料体積１１１を持つ試料容器若しくはカートリッジ１１０を有する。図示の実施例において、試料カートリッジ１１０は正方形断面のガラス管である。
【００３０】
センサ装置１００はリーダをさらに有し、そのうち最も関連する構成要素のみが概略的に描かれる。これらの構成要素は以下を有する：
図示の実施例では四つの電磁石１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄから成る磁場発生器１２０。これらの磁石は長方形若しくは正方形の角に配置され、それらの軸を試料体積１１１内のある中心へ向けて整列している。電磁石における電流の適切な逐次制御により、均一な回転磁場Ｂが試料体積内に生成され得る。
試料体積１１１へレンズ１３１によってフォーカスされる入力光Ｌ１のコリメート（レーザ）ビームを放出する光源、例えばレーザダイオード１３０若しくはＬＥＤ。
光検出器１４０、例えばフォトダイオード若しくは画像センサ。試料体積１１１から来る出力光Ｌ２は薄レンズ１４１を用いて光検出器のアクティブ面上にフォーカスされる。出力光Ｌ２は図示の実施形態において試料体積の成分によって、特に磁性粒子ＭＰ及び／又はこれら粒子のクラスタＣによって散乱された入力光Ｌ１から成る。
磁場発生器１２０と光検出器１４０に、それらを制御し光検出器１４０によって提供される測定信号を処理するために結合した制御ユニット１５０。
【００３１】
上記センサ装置が作動するとき、磁場発生器１２０は磁性粒子のクラスタＣの対応する回転を誘導する回転磁場Ｂを生じる。回転しながら、これらクラスタＣは時間依存断面を入射光Ｌ１に晒し、従って試料によって散乱される光強度Ｌ２の変調を導入する。かかる変調は、クラスタが対称でありそれらの断面が１８０°回転後同じであるため、クラスタの回転数のほとんど２倍である。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムが記録信号に適用され、磁場の周波数の２倍のＦＦＴの振幅が関心のあるクラスタの量を示す信号Ｓと定義され得る。
【００３２】
上記概念を証明するために、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のエピトープ１０及び６６に対する抗体で被覆された５００ｎｍ磁性粒子ＭＰで実験がなされた。採用された駆動スキームは２５ｍＴの均一回転磁場パルスを２秒間２０回加えることにあった。さらに、結果として生じるパルスの発射間に磁場の存在しない可変の"休止"が適用された。０秒の休止の持続時間の場合、１Ｈｚで回転する均一回転磁場が駆動プロトコルの全持続時間にわたって適用されるという意味で駆動は"連続的"である。
【００３３】
図４は休止の持続時間ｄ（水平軸）に依存する、１００ｐＭのＰＳＡ濃度における（三回の独立測定結果の）平均信号と、０ｐＭでの（三回の独立測定結果の）平均信号の間の信号の差ΔＳを報告する。パルス駆動を導入してほとんど倍数３の特異的信号の改善があることが明らかに見られる。
【００３４】
実験はさらに休止持続時間ｄについて特異的信号の最適条件があることを示す（これは実際の粒子濃度及び粒子の磁気特性に依存する）。図示の実施例において、この最適条件は約１秒にある。従ってこのような実験は磁気駆動の最適動作パラメータを見つけるためのキャリブレーション手順として使用され得る。
【００３５】
パルス駆動の使用及び結果として生じる信号の増加は再現性のある高感度アッセイを実現するためにも基本的である。これは図５に関して図示され、パルス駆動に基づくＰＳＡアッセイについての用量反応曲線を示す。（予備）実験はほぼ１０ｐＭの検出限界を示す。
【００３６】
パルス駆動が非特異的相互作用の量を減らすために有益であり得ることを証明するために、さらなる実験が実行され、０ｐＭのＰＳＡを含む試料に対して磁気駆動前後の信号が測定された。連続駆動の場合倍数３．５に近いクラスタリングの量の増加が記録されたが、一方パルス駆動を利用しながら、信号の増加は倍数２未満であった。
【００３７】
上述の実験は以下のパルスシーケンスを適用することによって実行されている：振幅３．５ｍＴの磁場が２秒間加えられ、それから４秒の休止間は磁場の振幅はゼロであった。使用された粒子濃度は０．１ｍｇ／ｍｌの５００ｎｍ磁性粒子（ＡｄｅｍＴｅｃｈ）であった。
【００３８】
本発明は図面と上記説明において詳細に図示され記載されているが、かかる図示と記載は説明若しくは例示であって限定ではないと見なされるものである。本発明は開示の実施形態に限定されない。開示の実施形態への他の変更は図面、開示及び添付の請求項の考察から、請求される発明を実施する上で当業者によって理解されもたらされることができる。請求項において、"有する"という語は他の要素若しくはステップを除外せず、不定冠詞"ａ"若しくは"ａｎ"は複数を除外しない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されるという単なる事実は、これら手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示さない。請求項における任意の参照符号は範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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