(57)【要約】  ヒト対象の血管内皮機能の評価するための方法は、該対象の上肢の皮膚組織細胞からのＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度における変化をモニタリングすることを含み、ここで前記変化は、前記対象の同一上肢における血流の遮断および解除に起因する反応性充血から生じる。ヒト対象の血管内皮機能を評価するためのシステムは、該対象の上肢の皮膚に励起光を当てるための手段、該皮膚から発せられた蛍光シグナル強度を測定し、該蛍光シグナル強度の経時的な変化を記録するための手段、および、該対象の上肢の血流を遮断し解除するための制限手段を含む。
2014518730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象の血管内皮機能を評価するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ベースラインを得るために、前記対象の上肢に対して選択した位置の皮膚組織細胞から発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度を、時間の関数として測定および記録すること；
（ｂ）時間の関数として大きくなりつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、前記上肢への血流を、前記の選択した位置に対して上流側で遮断すること；
（ｃ）定常状態が得られるまで、時間の関数として変化しつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、血流の遮断を解除すること；ならびに
（ｄ）前記強度の変化の経過から内皮機能を示すパラメータを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
ヒト対象の血管内皮機能の評価のためのパラメータを決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ベースラインを得るために、前記対象の上肢に対して選択した位置における皮膚組織細胞から発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度を、時間の関数として測定および記録すること；
（ｂ）時間の関数として大きくなりつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、前記上肢への血流を、前記の選択した位置に対して上流側で遮断すること；
（ｃ）定常状態が得られるまで、時間の関数として変化しつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、血流の遮断を解除すること；ならびに
（ｄ）前記強度の変化の経過から内皮機能を示すパラメータを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項３】
選択した位置が、前腕または手である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）において、血流を遮断した状態のＮＡＤＨ蛍光シグナル強度の最高レベルと、血流の遮断を解除した後のＮＡＤＨ蛍光強度の最低レベルとの差ΔＩを決定することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
血流を遮断する前のステップ（ａ）におけるＮＡＤＨ蛍光シグナルのベースライン強度と、ステップ（ｂ）における血流を遮断した状態のＮＡＤＨ蛍光シグナル強度の最高レベルとの差ΔＩ１を決定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）において、血流の遮断を解除した後の、ＮＡＤＨ蛍光シグナル強度の最低レベルと、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度の定常状態との差ΔＩ２を決定することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）における血流の遮断を解除した後のその最低レベルから、血流の遮断を解除した後のＮＡＤＨ蛍光シグナル強度の最低レベルと定常状態との間の差ΔＩ２の半分まで、ＮＡＤＨ蛍光シグナル強度が上昇するのに必要な半分の時間ｔ１／２を決定することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において、血流の遮断を解除してから、ＮＡＤＨ蛍光シグナル強度の定常状態に達するまでの時間ｔｇを決定することを含む、請求項１〜７のいずれか一項の記載の方法。
【請求項９】
血流の遮断および解除が、それぞれ、上肢周囲の制限手段を締め付けること、および解除することにより得られる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
制限手段が、可膨張性の制限手段である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
可膨張性の制限手段が、圧力カフである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＡＤＨ蛍光が、３００ｎｍから４００ｎｍまでの波長範囲の励起光を、上肢に当てることにより得られる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
励起光が、約３５０ｎｍの波長を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＡＤＨ蛍光シグナルが、４２０ｎｍから４８０ｎｍまでの波長範囲で測定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＡＤＨ蛍光シグナルが、約４６０ｎｍで測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト対象の血管内皮機能を評価するためのシステムであって、該システムは、前記対象の上肢の皮膚組織に励起光を当てるための手段、前記皮膚から発せられた蛍光シグナルの強度を測定し、該蛍光シグナルの強度の経時的な変化を記録するための手段、および、前記対象の上肢の血流を遮断し解除するための制限手段を含む、前記システム。
【請求項１７】
励起光が、３００ｎｍから４００ｎｍまでの範囲の波長を有する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
励起光が、約３５０ｎｍの波長を有する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
ＮＡＤＨ蛍光が、４２０ｎｍから４８０ｎｍまでの波長範囲で測定される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
ＮＡＤＨ蛍光が、約４６０ｎｍで測定される、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
制限手段が、可膨張性の制限手段である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
可膨張性の手段が、圧力カフである、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、血管内皮機能を評価するための非侵襲的方法と、該方法を実施するためのシステムとに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
血管内皮は、動脈および静脈を含む血管の内側部を埋め尽くす細胞層である。内皮は、以下のこと：血管緊張を調整すること；血管壁の細胞成分への溶質輸送、局所的な細胞成長および細胞外マトリックスの沈着を調節すること；血中に循環する物体および細胞の潜在的傷害の影響から血管を保護すること；ならびに、局所傷害に対する止血反応、炎症反応および修復反応を調節することによって、心血管機能を調節し、血管のホメオスタシスを維持する、代謝的に活性な自己分泌／傍分泌／内分泌の重要な器官であると現在みなされている。内皮の主要な機能の１つは、収縮および拡張する能力を含む、容積、弾性、透過性および反応性などの血管の性状を制御する酸化窒素（ＮＯ）などの物体を産生または放出することである。内皮由来のメディエーターは、血流ならびに透過性、血管弾性、反応性および構造のみならず、局所的および全身的な炎症反応ならびに血管の凝血抵抗性もまた調節する。酸化窒素（ＮＯ）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）、ブラジキニン（Ｂｋ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、トロンボモデュリン（ＴＭ）またはＡＤＰアーゼなどの血管保護性の内皮メディエーターは、抗血栓作用、抗炎症作用および血管保護作用を発揮する。
【０００３】
他方、内皮による、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、イソプロスタン、アンギオテンシンＩＩ（ａｎｇ  ＩＩ）、エンドセリン（ＥＴ−１）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）、組織因子（ＴＦ）、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ケモカイン（例えば単球走化性（chemotactive）タンパク質ＭＣＰ−１）、サイトカイン（例えばＩＬ−６）の過剰産生、および接着分子（例えばセレクチンＰ、ＩＣＡＭ−１）の発現増加は、アテローム性動脈硬化症の発症をいずれはもたらし得る、血管壁の炎症および血栓症を促進する。したがって、健常な内皮が心血管系の円滑な機能に必須である一方、内皮機能不全は、そのさまざまな病状をもたらす。とりわけ、内皮機能不全は、アテローム発生にとって極めて重要であり、それは、動脈疾患の後期と同様、最初期段階（例えば先立つ血管造影法または超音波による閉塞性プラークが証拠）にも存在し、組織の損傷に関する臨床的続発症（例えば虚血、梗塞および臓器不全）をもたらす。
【０００４】
内皮機能不全は、最も一般的な言い方をすると、刺激に対して適切な血管拡張性応答を生み出す内皮細胞層の能力の障害を指す。多くの研究によって、内皮機能不全（ＮＯ依存性血管拡張の障害に基づき評価された）が有害心血管事象の発生の予後因子とみなされ得るという証拠が提供された。実際、冠状動脈または末梢の内皮機能不全の証拠がある場合、有害転帰の相対リスクは約１０倍に上昇する。
【０００５】
高コレステロール血症、全身性高血圧、喫煙、糖尿病、鬱血性心不全、肺高血圧、エストロゲン欠乏、高ホモシステイン血症を含む様々な病気、および老化過程それ自体は、内皮の機能障害（機能不全）に関連する。その結果、これらの病気の血管壁は、炎症、リポタンパク質の酸化、平滑筋増殖、細胞外マトリックスの沈着または溶解、脂質に富む物質の蓄積、血小板活性化および塞栓形成を促進し得る。内皮機能不全のこれらの影響の全ては、アテローム性動脈硬化の発症および臨床的発現をもたらし得る。内皮機能不全の潜在的な影響はさらに、心筋虚血を生み出す、肉体的もしくは精神的なストレスの間の冠状動脈の狭窄または不適切な拡張；不安定狭心症または心筋梗塞を引き起こす、プラークの断裂および血栓症；ならびに、血栓溶解後の再かん流傷害を含む。
【０００６】
血管内皮の健康状態のin vivoでの非侵襲的評価のためのいくつかの方法および器具が開発されている。
とりわけ、反応性充血後の患者の四肢の動脈の生理的状態またはその特徴をモニタリングすることに基づく方法が知られている。
【０００７】
反応性充血は、患者の主幹動脈を遮断（または閉塞）した後に生じる生理現象である。上腕動脈などの四肢の動脈のかかる遮断または閉塞は、典型的には、約５分間、収縮期圧よりわずかに高い圧で血圧カフ（blood pressure cuff）を膨張させることにより行う。閉塞された動脈から下流側での四肢における無酸素症または重度の低酸素症は、通常かかる遮断の結果である。遮断の急な解除によって、内皮細胞は、ＮＯの生成および拡張の反応を示す。反応性充血の現象は、予備テストの血液量値に戻るまでに、最長１０分間持続する。血流は動脈に特徴的なものであり、反応性充血を負っている動脈、静脈または四肢を通る血流は、平常の血流と比較して有意に多い。
【０００８】
これまでに最も普及していた方法は、２次元超音波およびドップラー超音波を用いて反応性充血後の動脈の直径をモニタリングすることに基づく非侵襲的技術である流量依存性拡張（ＦＭＤ）である。その結果は、冠状動脈アテローム性動脈硬化症の存在および重症度と同様に、侵襲的な冠状動脈内皮テストとも良好に相関する。この技術は、例えば、S. Patel. and D. S. Celermajer, Pharmacological Reports 2006, 58, suppl. 3-7の総説に記載されている。しかしながら、この方法は極めて高価であり、精巧な機器および高度に専門化した技師を要し、技師に大いに依存し、測定のばらつきおよび動脈の大きさに対する分解能の低さによって再現性に乏しい。それゆえに、その使用は制限され、この方法はより一般的な方式で適用することができない。
【０００９】
血管内皮機能を評価する目的で、反応性充血に応答する他の身体的パラメータの変化もまた使用されており、例えば、指先の皮膚温度（WO2005118516; N. Ahmadi et al. Int. J. Cardiovasc. Imaging (2009) 25:725-738）、プレチスモグラフィを使用する指の血圧（脈波振幅）（EP1360929, EP1992282, WO00/57776, EP2110074）および末梢の動脈緊張（WO2000/074551, WO2002/034105）などである。
【００１０】
反応性充血後の四肢に存在する物体のレベルの変化に関する血流のモニタリングに基づく内皮機能不全の検出のための非侵襲的技術は、WO03/051193に開示されている。その方法は、内皮機能を刺激するために四肢の血流を遮断すること、その後、時間の関数としてその変化を観察、測定および記録するために血流遮断を解除することを含み、該変化は内皮機能不全を示す。前記物体は、発光体または造影剤などの、静脈中に注入されるトレーサー物質であり得、四肢中へのトレーサーの侵入は、例えばガンマ線検出手段により検出および測定される。２つの対向する四肢の一対におけるトレーサー測定は実施するべきものであり、トレーサーの存在を両肢の間で比較するべきである。あるいは、温度もしくは色などの四肢の物理的特徴またはＯ２、ＣＯ２もしくは還元ヘモグロビンなどの血流遮断の解除後の四肢に循環する代謝産物もしくは他の生化学的産物は、好適な技術により測定される。好適な技術としては、皮膚表面を通して皮膚表面にある細胞内へのガス放出、可視反射率(visible-reflectance)ハイパースペクトル解析などのスペクトル分析器または光伝送／拡散検出器などの光学技術、およびＥＰＲ／ＮＭＲ技術を意味する。枯渇した物質の出現率または蓄積産物の消失（枯渇）のいずれかを検出することができる。閉塞または遮断の解除直後に測定されたパラメータの変化率は、内皮機能不全の決定における主な要因と考えられる。トレーサーを使用する場合、遮断された四肢と対側の対照四肢との両方の前記比率を測定する。
【００１１】
内皮機能不全は、早期事象であって、アテローム性動脈硬化症の主要なリスク要因であり、心血管疾患のリスクの早期診断を可能にする、医療専門家にとっての重要な指針であることが確立されている。
【００１２】
したがって、内皮機能のテストは、特に一見したところ健常な個人、すなわち心血管疾患の兆候を何ら示さない個人において、一連の様々な生化学的テストの実施に基づく診断的アプローチの大いに所望される代替手段である。
【００１３】
機能不全を改善する予防的もしくは治療的な介入、および／または、さらにより詳細かつ複雑な診断テストを要する患者を同定するために、障害の早期に機能を評価し、任意の機能不全を検出することを可能にするテスト方法が必要とされる。
【００１４】
信頼性があり、容易に実行され、安価であって、よって例えばスクリーニング目的で大規模な患者集団にテストを適用することができる、内皮機能を評価するための非侵襲的テストを提供する必要性がある。
【００１５】
心血管疾患の医療処置に対する患者の反応をモニターし制御することを可能にする簡単、迅速かつ安価なテストへの必要性もある。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の概要
かかるテストが本発明によって提供される。本発明は、ＵＶ光を当てた状態の上肢の皮膚組織細胞から発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度と、反応性充血を引き起こすための上肢の血流の遮断および解除に応答した、時間の関数としての該蛍光シグナルの強度の変化とをモニタリングすることによって、血管内皮機能を非侵襲かつ簡単に評価するための方法およびシステムに関する。
【００１７】
本発明はまた、前記方法を使用してヒト対象の血管内皮機能を評価するためのシステムも提供する。
本発明を、図面に添付された図を参照し、より詳細に以下で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の説明
【図１】図１は、曲線の特徴的なパラメータを伴った、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの記録された強度対時間の例示的な経過を示す。
【図２−７】図２〜７は、テストされた対象のＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度曲線の記録を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細な説明
本発明は、ヒト対象の血管内皮機能を評価するための方法を提供するものであり、該方法は以下を含む：
（ａ）ベースラインを得るために、前記対象の上肢に対して選択した位置における皮膚組織細胞から発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度を、時間の関数として測定および記録すること；
（ｂ）時間の関数として大きくなりつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、前記上肢への血流を、前記の選択した位置に対して上流側で遮断すること；
【００２０】
（ｃ）定常状態が得られるまで、時間の関数として変化しつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、血流の遮断を解除すること；ならびに
（ｄ）前記強度の変化の経過から内皮機能を示すパラメータを決定すること。
【００２１】
他の側面において、本発明は、ヒト対象の血管内皮機能の評価のためのパラメータを決定する方法に関し、該方法は以下を含む：
【００２２】
（ａ）ベースラインを得るために、前記対象の上肢に対して選択した位置における皮膚組織細胞から発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度を、時間の関数として測定および記録すること；
（ｂ）時間の関数として大きくなりつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、前記上肢への血流を、前記の選択した位置に対して上流側で遮断すること；
【００２３】
（ｃ）定常状態が得られるまで、時間の関数として変化しつつある前記強度を測定および記録をし続けながら、血流の遮断を解除すること；ならびに
（ｄ）前記強度の変化の経過から内皮機能を示すパラメータを決定すること。
【００２４】
前腕、手または指などの前記上肢に対して選択した位置における皮膚組織細胞から発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度を測定し記録する。好ましい態様において、前記の選択した位置は、前腕または手、例えば手の甲側または掌側（掌の背部または掌の内側）である。
【００２５】
組織にＵＶ光を当て吸収された状態で、ＮＡＤＨ蛍光シグナルが細胞のＮＡＤＨにより発せられることは、当業者に理解されるだろう。
【００２６】
ＮＡＤＨ蛍光シグナルが、四肢の血流を遮断した下流側の位置で測定されることも、当業者に理解されるだろう。
換言すると、血流は、ＮＡＤＨ蛍光の測定およびモニタリングの場所の上流側で遮断し解除される。
【００２７】
励起光の波長は、ＮＡＤＨに吸収されるＵＶ範囲、すなわち３００〜４００、好ましくは３１５〜４００、より好ましくは３４０〜３６０ｎｍ、最も好ましくは３５０±５ｎｍであろう。蛍光光の波長は、励起光の吸収のＮＡＤＨにより発せられる範囲、すなわち４２０〜４８０ｎｍ、好ましくは４５０〜４７０ｎｍ、もっとも好ましくは４６０±５ｎｍであろう。
【００２８】
したがって、本発明の方法は、対象の上肢（例えば前腕、手または指、好ましくは前腕または手）の選択された位置にＵＶ光を当てること、ならびに、反応性充血を引き起こすため、選択した位置から上流側での血流遮断の前、間および後、それから血流遮断を解除した複数の時点で、発せられたＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度と、時間の関数としてのその変化とを測定し記録し続けることを含む。次に、内皮機能を示すパラメータまたはデータを該変化から決定する。
【００２９】
本発明の方法におけるＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度のモニタリングは、典型的には、下記のやり方で実施される。
【００３０】
ステップ（ａ）において、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度の測定および記録は、ベースラインを得るために血流を遮断する前の第１の時間帯にわたって実施する。ステップ（ａ）の第１の時間帯における測定および記録は、蛍光強度レベルの安定したベースラインを記録するために、十分に長く持続する。
【００３１】
通常、ベースラインを記録するのに十分な期間は、最長１〜２分間、典型的には約２分間である。安定したベースラインを得るためには、状況次第で、より長い時間を要することがあり、例えば最長３分間、最長４分間または最長５分間であることを、当業者は理解するだろう。
【００３２】
次に、ベースラインを得た後、ステップ（ｂ）において、前述のとおり、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度を第２の時間帯にわたって測定し記録し続けながら、上肢の血流を遮断する。第２の期間の間、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度は大きくなり、その最高レベルに達する。いくつかの対象において、最高レベルに達した状態で、前記強度を、ある時間このレベルでさらに安定化させてもよい。通常、ステップ（ｂ）におけるこの第２の時間帯は、最長５分間、例えば１、２、３、４または５分間、持続する。
【００３３】
その後、ステップ（ｃ）において、血流の遮断を解除し、血流遮断を解除した状態で第３の時間帯にわたって測定および記録をし続ける。その第３の期間の間、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度は、ステップ（ｂ）で達したその最高レベルから減少し、最低レベルに達し、該蛍光レベルの新しい定常レベルが得られるまで、最低レベルから再び大きくなる。この新しい定常レベルは、血流を遮断する前のステップ（ａ）において決定された最初のベースラインに、本質的に相当するものである。通常、この第３の時間帯は、最長１５分間、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５分間など、好ましくは２〜７分間持続する。
【００３４】
よって、測定および記録のすべての時間帯は、典型的には、最長２５分間、通常最長２０分間である。
【００３５】
本発明の方法は、上腕動脈などの動脈を閉塞することによって、上肢の血流を遮断することを要する。本明細書の目的において、用語「遮断する」は、対象の四肢に外部から適用して機械的に遮断することを指し、用語「閉塞」と同じ意味を有し、両方の用語は互いに交換可能に使用することができることは理解されるだろう。
【００３６】
血流の遮断を解除することによって、上肢の血管系における血流は元の状態に戻る。よって、用語「血流を解除する」および「血流の遮断を解除する」は、同じ意味を有し、血流を遮断する機械的な手段を解除することによって動脈の閉塞後の血流を元の状態に戻すことを指す。
【００３７】
本発明の方法において、前記の遮断すること、および前記の血流の遮断を解除することは、それぞれ、上肢周囲の制限手段を締め付け、および解除することによって有利に得られる。
【００３８】
好ましくは、前記の締め付けること、および解除することは、上肢（腕）の上腕動脈周囲で実施する。前記制限手段は、四肢周囲を締め付けることができる任意の手段、例えば締め付け用の輪またはベルトなどであり得る。
【００３９】
しかしながら、前記制限手段は、好ましくは可膨張性の制限手段、最も好ましくは可膨張性の圧力カフ（pressure cuff）、例えば血圧計カフなどである。好ましくは、血圧計カフなどの可膨張性の圧力カフは、検査を受けている対象の収縮期圧を超えた圧力（例えば収縮期圧を超えた５０ｍｍなど）まで膨張する。
【００４０】
本発明の方法の一態様において、四肢周囲の締め付け手段の解除は、迅速に（素早く）行い、好ましくは自動的に行う。
一態様において、本測定は、対象の上腕または手の甲側もしくは掌側において実施する。
【００４１】
本発明の他の目標は、前述した本発明の方法に従い、ヒト対象の血管内皮機能の評価を実施するためのシステムである。
【００４２】
本発明のシステムは、前記対象の上肢の皮膚に３００〜４００ｎｍの範囲の励起光を当てるための手段、該皮膚からの蛍光シグナルの強度を検出し測定するための手段、時間の関数として該蛍光シグナルの強度の変化を測定し記録するための手段、および、該対象の上肢の血流を遮断し解除するための制限手段を含む。
【００４３】
組織細胞からのＮＡＤＨ蛍光シグナルを取得、検出、測定および記録する技術（ＮＡＤＨ蛍光光度法）は、当該技術分野において周知であり、従来型の蛍光測定用の器具またはシステムのいずれも、本発明の方法を実施するために使用することができる。
【００４４】
前述のとおり、照明、検出、測定、記録および作図するための前記手段は、かかる蛍光測定に集約することができる。
一般的に、蛍光測定用の器具またはシステムは、少なくとも以下を備えるべきである：
―ＮＡＤＨに吸収される範囲、すなわち３００〜４００ｎｍの波長範囲のＵＶ光を発することができる励起光の光源；
【００４５】
―励起光シグナルを光源から選択した位置へ伝えることができる光ガイドを有し、対象の皮膚に近い選択した場所に置かれたプローブ；
―前記組織から発せられた蛍光を受け取るための蛍光集光器；
【００４６】
―少なくともＮＡＤＨにより発せられた範囲、すなわち４００〜６００ｎｍの波長範囲の蛍光シグナルの検出器；
―シグナルの処理ユニット；および
―蛍光曲線を記録するための記録／作図ユニット。
【００４７】
一般的に、先に挙げたすべての必須要素が含まれるなら、前記器具の配置には融通が利く。
【００４８】
当該技術分野において知られている励起光の従来型の光源を使用することができ、例えば水銀もしくはキセノンランプ、発光ダイオードＬＥＤ、レーザーダイオードまたはパルスレーザーなどのフィルター処理したスペクトルランプを含む。その有利な光源は、発光ダイオードＬＥＤである。
【００４９】
従来型の光ガイドのいずれも、励起光を伝えるため、および集光するために使用することができ、例えば、光ファイバー、任意に柔軟な覆いを有する光ファイバーである。光ガイドを有するプローブは、皮膚に直接接触して、または皮膚に接近して、皮膚の近くに置かれる。
【００５０】
一態様において、測定は、前腕または手の掌側で実施し、光ガイドは、手を置くための支持体または手に固定されたベルトに伝えられる。
他の態様において、測定は、三脚などの支持体上に置かれた手の甲側で実施し、固い光ガイドは、手の上方で固定される。
【００５１】
他の態様において、測定は、光ガイド末端のカップ、輪またはカフによって指で実施され、このカップ、輪またはカフは、指の大きさに応じて指の周囲に堅く締め付けられる。
さらに他の態様において、測定は、マルチポイント方式で実施する。例えば、いくつかの光ガイドは、前腕または指の周囲に取り付けられたベルトに伝えることができる。
【００５２】
従来型の検出器、例えばフォトダイオード検出器、高速フォトダイオード検出器、光子増倍管などを使用することができる。
当該技術分野において知られている典型的なシグナル処理ユニット、記録ユニットを、ＮＡＤＨ蛍光の強度の曲線を作図するために使用することができる。
【００５３】
全ての生存細胞中にあり、酸化還元反応の補酵素として代謝に欠くことのできない役割を果たす還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、すなわちＮＡＤＨが、３００〜４００ｎｍ範囲のほぼ全てのＵＶＡスペクトル領域のＵＶ光を吸収し、ＵＶ光の照明に応答して、約４８０ｎｍにピークを有する４００〜６００ｎｍ範囲の蛍光光を発することは、知られている。ＮＡＤＨ蛍光の強度は、ミトコンドリアＮＡＤＨの濃度に比例する。この現象は、選択されモニターされる器官に応じ、他のさらなるパラメータの検査と組み合わせて、ミトコンドリアＮＡＤＨ蛍光の実時間測定およびモニタリングによるin vivoでのミトコンドリア機能（すなわちエネルギー産生）および組織または器官の活力を診断する技術の根幹である。ミトコンドリア機能のモニタリングを、in vivoで血液がかん流された器官に対して実施する場合、ＮＡＤＨ蛍光シグナルは、組織血液量の変化の影響を受ける。これら血行動態のアーティファクトは、血液量変化に依存する照明された組織からの反射率シグナルと好適なアルゴリズムとを使用して、測定された蛍光シグナルから排除する必要がある。その方法と、装置―かかるモニタリングのための蛍光光度計／反射率計とは、例えばWO/2002/024048およびA. Mayevsky et al., J. of Biomedical Optics 9(5), 1028-1045 (2004) に記載されている。
【００５４】
理論的な考察に拘泥するつもりはないが、本発明の方法において、物理的な要因の影響がない中の、皮膚組織細胞からin vivoで発せられたＮＡＤＨ蛍光の強度は、ミトコンドリアＮＡＤＨ（還元型）の濃度に比例すると考えられる。酸素供給の変化によって引き起こされるＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ系の酸化還元状態におけるいかなる変化も、発せられた蛍光の強度に反映される。
【００５５】
動脈の閉塞による血管系の血流の遮断によって組織への血液による酸素の供給が減少することは、酸化還元平衡を、より還元状態の方に移動させ、これによって、初期ベースラインを超えた新しい平衡まで、ＮＡＤＨ蛍光の強度の測定レベルが増加することになる。血流遮断の解除は、細胞への血液による酸素の供給を急激に増加させ、酸化還元平衡をより還元されていない状態の方に移動させ、よって、ＮＡＤＨ蛍光の強度の測定レベルが減少する。ＮＡＤＨ蛍光は、最初にベースラインレベルを下回って落ち込むことがあり、その後、再び増加してその平衡に達し、蛍光の初期ベースラインレベルに本質的に相当する定常状態に戻る。
【００５６】
本発明の方法において、定常状態（ベースライン）における蛍光の初期強度は、個人によって異なり、四肢、皮膚の状態および色などへの測定システム（特にプローブ）の適合のようなかかる要因にある程度依存し得、同じ人におけるさらなる観察のための基準である。ベースライン蛍光の差は、異なる患者において得られた結果を比較するための方法の校正のために使用され得る。
【００５７】
蛍光シグナルのベースライン強度が、関係する器具―関連ユニット（例えば励起光の強度、光ガイドの効率、測定の配置などの要因に依存し得る）で測定されるため、同じ器具および異なる患者において比較可能である。ベースライン蛍光の差は、異なる器具による測定を校正するためか、またはそのシステムの技術的な修正に対して使用することができる。
【００５８】
蛍光レベルが本発明の方法に従うテストの間に観察された初期ベースラインに本質的に相当する定常状態に戻ることは、細胞の代謝過程が初期平衡に戻ることによるだけではない。代謝過程のかかる平衡は、１分間にも満たないはるかに短い時間で達するからである。予想外であり、かつ驚くべきことに、本発明の方法において観察されたその過程の期間は、より長く、血流の増加と関連がある物理的な変化と元の平衡の遅い回復とに主に依存する。
【００５９】
ステップ（ａ）の初期ベースラインレベルに本質的に相当する定常状態に対する、ステップ（ｃ）の血流遮断の解除後の蛍光レベルの期間および戻る速度は、血管系の応答の尺度、かつ収縮および拡張の機能を果たす内皮の能力であり、内皮の機能を査定することを可能にする。
【００６０】
ステップ（ｃ）における血流遮断の解除後、蛍光シグナルレベルの強度のその最低レベルから定常状態への増加の半分の時間（half-time）は、定常状態に戻る過程の動態を示し、内皮機能のさらなる尺度である。
【００６１】
したがって、図１に示す曲線強度対時間の以下のパラメータは、血管内皮の機能の指針、すなわち、様々な刺激に応答して適切に収縮および拡張するその傾向である：
【００６２】
―ステップ（ｂ）において血流を遮断した状態のＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度の最高レベルと、ステップ（ｃ）における血流遮断を解除した後のＮＡＤＨ蛍光の強度の最低レベルとの差ΔＩ；
【００６３】
―血流を遮断する前のステップ（ａ）におけるＮＡＤＨ蛍光シグナルのベースライン強度と、該遮断状態のステップ（ｂ）におけるＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度の最低レベルとの差ΔＩ１；
【００６４】
―ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度の最低レベルと、ステップ（ｃ）における血流遮断の解除後の定常状態でのそのレベルとの差ΔＩ２；
【００６５】
―ステップ（ｃ）においてＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度が、血流を遮断する前のステップ（ａ）のベースラインに本質的に相当する定常状態に戻るまでの、ステップ（ｃ）における血流遮断を解除してからの期間（ｔｇ）；
【００６６】
―ステップ（ｃ）における血流遮断の解除後のその最小値から、上で定義した差（ΔＩ２）、すなわちＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度の最低レベルとステップ（ｃ）における血流遮断の解除後の定常状態でのそのレベルとの差が半分になるまで、ＮＡＤＨ蛍光シグナルの強度が増加するのに必要な半分の時間（ｔ１／２）。
【００６７】
本発明を、以下の例においてより詳細に説明する。
例１
ヒト患者の手の皮膚細胞からのＮＡＤＨ蛍光および上腕動脈の閉塞と血流の解除とに伴うこの蛍光の強度の変化を測定した。患者の健康は検査しなかった。
【００６８】
測定は、キセノン閃光電球を備えたCarry Eclipse蛍光分光光度計、固体の表面からの発光を測定するのに好適なプローブを有するファイバー光学システムおよびＰＭＴ検出器を使用して実施した。
【００６９】
励起光の波長は３５０ｎｍであり、モニターした発光シグナルの波長は４６０ｎｍであった。
親指と人差指（「指針」指）との間の患者の掌の甲側からの蛍光シグナルの強度は、初期ベースラインに相当する定常状態に達する間の２分間（第１の時間帯）記録した。
【００７０】
２分後、収縮期圧を超えて、患者の腕の周囲の可膨張性の血圧計カフの拡張および締め付けを行うことによって、同じ手の上腕動脈の血流を、第２の時間帯―閉塞時間、遮断した。
【００７１】
蛍光シグナルの強度の測定を、さらに４分の期間（第２の時間帯―閉塞時間）続け、その間、カフを締め付けた時点から始まった蛍光シグナルの増大を観察した。
【００７２】
４分後、血圧計カフをしぼませることによって素早く解除し、蛍光シグナルの強度の測定を、さらに１４分の期間（第３の時間帯）続けた。蛍光シグナルの最低レベルまでの速い減少は、カフを解除した状態で最初に観察され、その後、初期ベースラインのレベルに本質的に相当する定常状態が第１の時間帯で記録されるまで、該シグナルの漸増が続いた。
【００７３】
図１は、前記測定の間に記録された蛍光シグナル強度曲線の経過と、血管内皮の機能に特徴的な該曲線のパラメータの決定とを示す。
【００７４】
前述のパラメータΔＩ、ΔＩ１およびΔＩ２の値を測定した。
また、前述の期間ｔｇおよび半分の時間ｔ１／２も、曲線の作図から決定した。
【００７５】
前述したものと同じやり方で、下記の測定を実施した：
―  ２７歳の非喫煙者、図２に示される蛍光曲線の記録を有する；
―  ７１歳の非喫煙者、図３に示される蛍光曲線の記録を有する；
【００７６】
―  ３２歳の非喫煙者、図４に示される蛍光曲線の記録を有する；
―  ２６歳の非喫煙者、図５に示される蛍光シグナルの記録を有する；
―  ２８歳の非喫煙者、図６に示される蛍光シグナルの記録を有する；および
【００７７】
―  ５３歳の喫煙者、図７に示される蛍光シグナルの記録を有する。
これに見られるとおり、強度曲線の記録は、患者間で異なる。
【００７８】
高齢者の曲線の記録（図３）は、血流閉塞後の極めて小さな減少（ベースラインと最小強度値との差）と、閉塞の解除後に定常状態まで戻るのが極めて緩やかな速度とを有し、血管内皮の機能が悪いことを示す。
【００７９】
喫煙者の記録（図５および７）は、定常状態まで戻るのに緩やかな速度を有し、血管内皮の機能が低下していることを示す。
【００８０】
図４および６に示される２名の若年非喫煙者の記録は、血管内皮の機能に差があることを示す。戻る速度がより大きい図５の患者は、戻る速度がより小さい図３の患者と比較して血管内皮の機能がより良好である証拠を示す。
【００８１】
また、血管内皮の機能は、ほぼ同年齢の喫煙者と非喫煙者との間で比較することができる：図５の２６歳の喫煙患者は、定常状態まで戻る速度がより小さいため、図６の２８歳の非喫煙患者と比較して、血管内皮の機能がより悪いことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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