(57)【要約】  本開示は、転写可能な核酸分子の発現の窒素感受性調節のための組成物および方法を対象とする。一態様は、ＮｔｃＡ結合部位を含む転写因子領域と、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターまたはその変異体もしくは機能的断片を含むコアプロモーター領域とを含む窒素感受性発現系を提供する。別の態様は、発現系を用いて宿主細胞を形質転換する方法を提供する。また、発現カセット、形質転換された宿主細胞、およびキットも提供される。 【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｔｃＡ結合部位を含む転写因子領域と、
ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターまたはその変異体もしくは機能的断片を含むコアプロモーター領域と、を含み、
前記コアプロモーター領域は、前記転写因子領域を含むかまたはそこに作動可能に連結される、窒素感受性発現系。
【請求項２】
転写可能な核酸分子および３’転写終結核酸分子をさらに含み、
前記コアプロモーター領域は、前記転写可能な核酸分子に作動可能に連結され、
前記転写可能な核酸分子は、前記３’転写終結核酸分子に作動可能に連結される、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記転写因子領域は、ＧＴＡＮ11Ｃコンセンサス配列、ＧＴＡＮ8ＴＡＣコンセンサス配列、ＧＴＡＮ8ＴＧＣコンセンサス配列、ＧＴＮ10ＡＣコンセンサス配列、ＴＧＴＮ9ＡＣＡコンセンサス配列、またはＴＧＴＮ10ＡＣＡコンセンサス配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項４】
前記転写因子領域は、ＴＡＮ3Ｔ／Ａボックスのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項５】
前記コアプロモーター領域は、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターのポリメラーゼ結合部位を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項６】
前記コアプロモーター領域は、ノストック種ＰＣＣ７１２０、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３、もしくはアナベナＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列、またはその機能的断片に対して少なくとも約７０％の配列同一性を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項７】
プロモーター活性、並びに、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号２３４のうちのいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を有する単離された核酸分子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項８】
プロモーター活性、および
（ａ）配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号２３４のうちのいずれか１つの少なくとも９５個の連続した塩基、または
（ｂ）配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号２３４のうちのいずれか１つの機能的断片、
を有する単離された核酸分子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項９】
（ａ）ＮｔｃＡポリペプチドもしくはＮｔｃＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ＮｔｃＡポリペプチドもしくは前記ＮｔｃＢポリペプチドは、前記構築物の前記コアプロモーター領域に作動可能に連結される、ポリヌクレオチド配列、または
（ｂ）前記コアプロモーター領域に作動可能に連結される、ＮｔｃＡポリペプチドおよびＮｔｃＢポリペプチドをコードする配列番号２７９のポリヌクレオチド配列、
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１０】
プロモーター活性を有し、配列番号２３４のヌクレオチド位置１７７〜８３６、もしくはそれと少なくとも約７０％の配列同一性の、単離された核酸分子、
プロモーター活性を有し、配列番号２３４のヌクレオチド位置１〜３５２、もしくはそれと少なくとも約７０％の配列同一性の、単離された核酸分子、または
プロモーター活性を有し、配列番号２３４のヌクレオチド位置１７７〜３５２、もしくはそれと少なくとも約７０％の配列同一性の、単離された核酸分子、
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１１】
前記転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸シンターゼ活性、スクロースリン酸ホスファターゼ活性、スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ活性、トレハロースリン酸シンターゼ活性、トレハロースリン酸ホスファターゼ活性、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ活性、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ活性、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ活性、またはマンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１２】
前記転写可能な核酸分子は、
配列番号１、もしくはそれと少なくとも８０％の配列同一性ならびにスクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードすること、または
配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列、もしくはそれと少なくとも８０％類似し、スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１３】
宿主細胞において転写可能な核酸分子を発現させるための方法であって、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の発現系を用いて宿主細胞を安定に形質転換することと、
前記転写可能な核酸分子が発現される条件下で前記発現系を含む前記宿主細胞またはその子孫を成長させることと、を含み、
硝酸塩が主な窒素源である場合、前記転写可能な核酸分子の発現が抑制され、尿素またはアンモニアが主な窒素源である場合、前記転写可能な核酸分子が発現される、方法。
【請求項１４】
前記形質転換された宿主生物の成長率は、同じかもしくは実質的に同様の条件下において、非形質転換宿主生物よりも約２０％以下低いか、または、
前記形質転換された宿主生物の成長率は、同じかもしくは実質的に同様の条件下において成長させた調節されていない構築物で形質転換した宿主生物よりも約５％超高い成長率（例えば、約１０％、１５％、または２０％超より高い成長率）である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）前記宿主細胞は、窒素制御系の下でＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドを内在的に発現し、
（ｂ）前記宿主細胞は、窒素制御系の下でＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドを発現するように遺伝子操作され、
（ｃ）前記発現系は、ＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ＮｔｃＡポリペプチドまたは前記ＮｔｃＢポリペプチドは、前記構築物の前記コアプロモーター領域に作動可能に連結される、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、光合成微生物である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞は、スピルリナ・マキシマム、スピルリナ・プラテンシス、ドナリエラ・サリナ、ボトリオコックス・ブラウニイ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ピレノイドーサ、セレナストルム・カプリコミュータ、セネデスムス・クアドリカウダ、ポルフィリディウム・クルエンタム、セネデスムス・アクタス、ドナリエラ種、セネデスムス・オブリクース、アナベノプシス、アウロシラ、キリンドロスペルマム、シネコッカス種、シネコシスティス種、およびトリポスリックスからなる群から選択される光合成微生物である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）ＮｔｃＡ結合部位を含む転写因子領域と、
（ｂ）ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターまたはその変異体もしくは機能的断片を含むコアプロモーター領域と、
（ｃ）転写可能な核酸分子と、
（ｄ）３’転写終結核酸分子と、
（ｅ）任意選択的に、ＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、を含み、
前記コアプロモーター領域は、前記転写因子領域を含むか、または前記転写因子領域に作動可能に連結され、
前記コアプロモーター領域は、前記転写可能な核酸分子に作動可能に連結され、
前記転写可能な核酸分子は、３’転写終結核酸分子に作動可能に連結され、
エレメント（ａ）〜（ｄ）は、宿主生物における発現カセットの発現が、前記転写可能な核酸分子によってコードされるポリペプチド配列の生成をもたらすように、互いに対して位置付けられ、および、
エレメント（ｅ）が存在する場合、エレメント（ｅ）は、前記宿主生物における前記発現カセットの前記発現が、前記ＮｔｃＡポリペプチドまたは前記ＮｔｃＢポリペプチドの生成をもたらすように位置付けられる、発現カセット。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の発現系を含むか、
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法によって生成されるか、もしくは前記発現系を含むその子孫であるか、または
請求項１８に記載の発現カセットを含むかであり、
前記転写可能な核酸分子によってコードされる前記ポリペプチド配列の発現は、硝酸塩の存在下において抑制され、
前記転写可能な核酸分子によってコードされる前記ポリペプチド配列の発現は、尿素またはアンモニアの存在下において誘導される、遺伝子導入宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の発現系、または請求項１８に記載の発現カセット、および前記発現カセットを宿主細胞に導入するための少なくとも１つの試薬、および任意選択的に、前記発現カセットを宿主細胞に導入するための指示を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／４６７，８７３号（２０１１年３月２４日）に対する優先権の利益を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
参照による資料の組込み
本開示の一部である配列リストは、本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含むコンピュータ可読形態を含む。配列リストの内容は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発酵による材料の大規模生産は、遺伝子発現を調節することに伴うコストによって制限されることが多い。多くの場合、用いられるストラテジーは、所望の産物をもたらすタンパク質の産生を誘導するために高価な糖誘導体または他の小分子を必要とする。
【０００４】
プロモーターは、生細胞における遺伝子の全体的な発現において不可欠な役割を果たす５’調節エレメントを含む核酸分子である。宿主細胞または宿主生物において機能する単離されたプロモーターは、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を制御するのに有用であり、それによって遺伝子操作の方法を介して宿主生物または宿主細胞の表現型を修飾する。
【０００５】
ＮｔｃＡは、ＤＮＡ結合配列（ＧＴＡＮ8ＴＡＣ）を有する、シアノバクテリアの窒素レギュロンの主な制御因子である。プロモーターおよび転写開始位置に対する配置に応じて、ＮｔｃＡの結合は、転写を活性化または抑制することができる（Ｈｅｒｒｅｒｏら２００１およびＭｕｒｏ−Ｐａｓｔｏｒら２００５にて考察される）。ＮｔｃＡによって媒介される転写の制御は、エフェクター分子として機能する２−オキソグルタル酸とともに、窒素対炭素比による影響を受ける。Ｅｍｌｙｎ−Ｊｏｎｅｓら（２００３）は、窒素源を変化させることによりシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２の突然変異の頻度を制御することができる、ｍｕｔＳの発現のための亜硝酸還元酵素プロモーターの使用を開示した。
【０００６】
リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）は、生物圏において最も豊富に発現されるタンパク質の１つであるため、シアノバクテリア由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターは、最も強力な既知のプロモーターの１つであると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の種々の態様において、宿主細胞において転写可能な核酸分子を発現させるための窒素感受性発現系が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様は、窒素感受性発現系を提供する。いくつかの実施形態において、発現系は、ＮｔｃＡ結合部位を含む転写因子領域と、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターまたはその変異体もしくは機能的断片を含むコアプロモーター領域とを含む。いくつかの実施形態において、コアプロモーター領域は、転写因子領域を含むかまたはそこに作動可能に連結される。いくつかの実施形態は、３’転写終結核酸分子に作動可能に連結された転写可能な核酸分子を含む。
【０００９】
別の態様は、宿主細胞において転写可能な核酸分子を発現させるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載される発現系で安定に形質転換され、発現系を有する宿主または子孫は、転写可能な核酸分子が発現される条件下で成長させられる。発現系は、宿主細胞における転写可能な核酸分子の窒素によって調節される発現を提供することができる。いくつかの実施形態において、硝酸塩が主な窒素源である場合、転写可能な核酸分子の発現が抑制され、尿素またはアンモニアが主な窒素源である場合、転写可能な核酸分子が発現される。
【００１０】
別の態様は、発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、（ａ）ＮｔｃＡ結合部位を含む転写因子領域と、（ｂ）ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターまたはその変異体もしくは機能的断片を含むコアプロモーター領域と、（ｃ）転写可能な核酸分子と、および（ｄ）３’転写終結核酸分子とを含み、コアプロモーター領域は、転写因子領域を含むかまたはそこに作動可能に連結され、コアプロモーター領域は、転写可能な核酸分子に作動可能に連結され、転写可能な核酸分子は、３’転写終結核酸分子に作動可能に連結され、エレメント（ａ）〜（ｄ）は、宿主生物における発現カセットの発現が、転写可能な核酸分子によってコードされるポリペプチド配列の産生をもたらすように互いに対して位置付けられる。いくつかの実施形態において、発現カセットは、宿主生物における発現カセットの発現がＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドの産生をもたらすように位置付けられたＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
別の態様は、遺伝子導入宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子導入宿主細胞またはその子孫は、本明細書に記載される発現系を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子導入宿主細胞は、発現系を含む本明細書に記載される転写可能な核酸分子またはその子孫を発現させるための方法によって生成される。いくつかの実施形態において、遺伝子導入宿主細胞は、本明細書に記載される発現カセットを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、遺伝子導入宿主細胞は、硝酸塩の存在下において、転写可能な核酸分子によってコードされるポリペプチド配列を発現し、アンモニアの存在下において、転写可能な核酸分子によってコードされるポリペプチド配列の発現を抑制する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、遺伝子導入宿主細胞は、アンモニアの存在下において、転写可能な核酸分子によってコードされるポリペプチド配列を発現し、硝酸塩の存在下において、転写可能な核酸分子によってコードされるポリペプチド配列の発現を抑制する。
【００１４】
別の態様は、本明細書に記載される発現系または発現カセットのうちの１つ以上と、任意選択的に、発現カセットを宿主細胞に導入するための指示とを含むキットを提供する。
【００１５】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部は本明細書において後に指摘される。
【００１６】
当業者は、以下に記載される図面は例示目的に過ぎないことを理解するであろう。図面は、決して本発明の教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｐＬｙｂＡＬ１９の誘導体であるプラスミドｐＬｙｂＡＬ５０の構造を示す図であり、主な違いは、ａｓｆのＧＴＧ開始コドンがより従来的なＡＴＧコドンで置換され、Ｈｉｓ６−タグがａｓｆのＣ末端に付加されていることである。方法論に関するさらなる詳細は、実施例３に開示される。
【図２】「ＲｕＢｉｓＣｏの交換」を示す図である。上の矢印群は、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＲｕＢｉｓＣｏオペロンを示す。下の矢印群は、プラスミドｐＬｙｂＡＬ６７に見られるようなシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓおよびｓｐｐ遺伝子を含む合成オペロンを示す。合成シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓ／ｓｐｐオペロンは、元のシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＲｕＢｉｓＣｏオペロンと同じ転写開始シグナルおよび翻訳開始シグナルならびに終止シグナルを有するべきである。プラスミドｐＬｙｂＡＬ６６は、ｓｐｓ遺伝子のＸｍａＩ／ＳｐｅＩ断片が存在しないこと以外はｐＬｙｂＡＬ６７と同じである。方法論に関するさらなる詳細は、実施例３に開示される。
【図３】図３Ａは、ノストック種ＰＣＣ７１２０プロモーターの図解およびポリヌクレオチド配列を示す。配列は、ｒｂｃＬＸＳ（ＢａｍＨＩ部位の３ｂｐ後に始まる）と全ての１５２３（ｒｂｃＬＸＳオペロンの転写と反対方向に転写される）との間の領域を網羅し、大文字で示されている。番号付けは転写開始部位に関連する。種々の構築物から欠失させた、コアから上流および下流のヌクレオチド（プロモーター、転写開始、ならびにＮｔｃＡおよび第２因子結合部位を含む）が強調表示されている。コアの下流領域を欠失させた構築物は、リボソーム結合部位がインタクトなままである。方法論に関するさらなる詳細は、実施例４に開示される。図３Ｂは、図３Ａを拡大した部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、培地組成に従って機能遺伝子の発現を制御するための、定義された遺伝子調節配列の使用に関する。
【００１９】
本開示は、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター等の強力なプロモーター下における遺伝子発現は、十分なまたは最適な生物の成長を提供するために調節を必要とし得るという認識に少なくとも一部は基づいている。本開示はまた、ＮｔｃＡ結合部位（例えば、ｒｂｃＬ）を含むプロモーターは、標的遺伝子発現を調節するために使用することができ、標的遺伝子は、硝酸塩が唯一の窒素源である場合は抑制されるが、アンモニアの窒素、または尿素等の他の非硝酸塩還元窒素源を用いて成長させた場合には発現されるという認識にも少なくとも一部は基づいている。この系は、ＮｔｃＡ抑制系として理解される。また、本明細書に記載される発現系は、標的遺伝子の発現を調節するために使用することができ、標的遺伝子は、硝酸塩が唯一の窒素源である場合は発現されるが、アンモニアの窒素、または尿素等の他の非硝酸塩窒素源を用いて成長させた場合には抑制されることも認識されたい。この系は、ＮｔｃＡ活性化系として理解される。本明細書において報告されるように、ＮｔｃＡ結合部位を含む亜硝酸還元酵素プロモーターは遺伝子発現を調節することができるが、亜硝酸還元酵素プロモーターは相対的に弱く、容認できないほど少ないタンパク質産生量をもたらす。
【００２０】
種々の実施形態は、遺伝子調節およびタンパク質発現を制御するために培地の窒素源を用いる組成物および方法を提供する。
【００２１】
さらに、窒素感受性転写因子領域と、コアプロモーター領域、またはその変異体もしくは機能的断片とを含む構築物を提供することにより、調節された遺伝子発現が提供される。そのような構築物は、培養プロセスの所定の時点で、系において高レベルのタンパク質産生量を得ることができる。本明細書に記載される種々の系は、限定されないが、糖生合成酵素または他の産業用酵素、例えば、エステルヒドロラーゼ等を含むタンパク質材料の生成に適用することができる。本明細書に記載される系は、酵素に応じた作用によって誘導される小分子（限定されないが、糖を含む）を生成するために適用することができる。
【００２２】
本明細書において特に指定される場合を除いて、本開示の組成物およびプロセスは、２００９年１月５日に出願された米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載される組成物およびプロセスに従って実行することができる。
【００２３】
本明細書に記載される窒素によって調節される発現系は、固相バイオリアクター等のバイオリアクターとともに使用されると特に有利であり得る。バイオリアクターとともに使用される場合、フィード内の窒素源を変化させることによりタンパク質発現の迅速な調節を得ることができる。固相バイオリアクターは、２００９年１月５日に出願された米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものに従うことができる。
【００２４】
以下の定義および方法は、本発明をよりよく定義し、本発明を実践する当業者を誘導するために提供される。別途記載のない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来の使用に従って理解されるものとする。
【００２５】
本明細書で使用される用語「異種ＤＮＡ配列」、「外来性ＤＮＡセグメント」、または「異種核酸」は、それぞれ、特定の宿主細胞に対して外来性の源から生じる配列を指すか、または同じ源から生じる場合は、その本来の形態から修飾された配列を指す。よって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内在性であるが、例えば、ＤＮＡシャフリングによって修飾された遺伝子を含む。また、これらの用語は、自然に発生するＤＮＡ配列の非自然的に発生する複数のコピーも含む。よって、これらの用語は、細胞に対して外来性もしくは異種であるか、または細胞に対して相同性であるが、通常は該エレメントが見られない宿主細胞の核酸内の位置にある、ＤＮＡセグメントを指す。外来性ＤＮＡセグメントは、外来性ポリペプチドを生じるように発現される。「相同性」のＤＮＡ配列は、それが導入される宿主細胞と自然に会合しているＤＮＡ配列である。
【００２６】
発現ベクター、発現構築物、プラスミド、または組換えＤＮＡ構築物は、一般に、例えば、宿主細胞における特定の核酸の転写または翻訳を可能にする一連の特定された核酸エレメントを含む、組換え手段または直接化学合成を用いることを含む人間の介入によって作製された核酸を指すと理解される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含むことができる。
【００２７】
「プロモーター」は、一般に、核酸の転写を誘導する核酸制御配列として理解される。誘導性プロモーターは、一般に、特定の刺激に応じて、作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介するプロモーターとして理解される。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントのように、転写開始部位の近くの必須核酸配列を含むことができる。プロモーターは、任意選択的に、転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。
【００２８】
本明細書で使用される「転写可能な核酸分子」は、ＲＮＡ分子に転写されることができるあらゆる核酸分子を指す。転写可能な核酸分子が、翻訳され、その結果、タンパク質産物として発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写される様式で細胞に構築物を導入するための方法は既知である。また、構築物は、対象となる特定のＲＮＡ分子の翻訳を阻害するために、アンチセンスＲＮＡ分子を発現させることができるように構築されてもよい。本開示の実践のために、構築物および宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００６）Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９７７１７、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＩＳＢＮ−１０：０４７１２５０９２９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５７７３、Ｅｌｈａｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｌｋ，Ｃ．Ｐ．１９８８．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６７，７４７−７５４を参照）。
【００２９】
「転写開始部位」または「開始部位」は、位置＋１としても定義される、転写される配列の一部である第１のヌクレオチドを取り囲む位置である。この部位に関連して、遺伝子の他の全ての配列およびその制御領域に番号を付けることができる。下流の配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）は正の数字で表示することができ、上流の配列（大部分は５’方向の制御領域）は負の数字で表示される。
【００３０】
「作動可能に連結される」または「機能的に連結される」とは、好ましくは、一方の機能が他方の機能による影響を受けるような単一の核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、調節ＤＮＡ配列がコード化ＤＮＡ配列の発現に影響を与える（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）ように２つの配列が配置された場合に、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」または「会合する」と言われる。コード化配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。２つの核酸分子は、単一の近接する核酸分子の一部であってもよく、また隣接していてもよい。例えば、プロモーターが、細胞中の対象となる遺伝子の転写を調節または媒介する場合、該プロモーターは、対象となる遺伝子に作動可能に連結される。
【００３１】
「構築物」は、一般に、１つ以上の核酸分子が作動可能に連結された核酸分子を含む、ゲノム組込みまたは自己複製が可能な、任意の源に由来するプラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製核酸分子、ファージ、または線形もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子等の、あらゆる組換え核酸分子として理解される。
【００３２】
本開示の構築物は、３’転写終結核酸分子に作動可能に連結された転写可能な核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。さらに、構築物は、限定されないが、例えば、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）由来のさらなる調節核酸分子を含むことができる。構築物は、限定されないが、翻訳開始において重要な役割を果たすことができ、かつ発現構築物中の遺伝子構成成分でもあり得るｍＲＮＡ核酸分子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むことができる。これらのさらなる上流および下流の調節核酸分子は、プロモーター構築物に存在する他のエレメントに対して天然または異種である源に由来し得る。
【００３３】
「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な形質をもたらす、宿主細胞のゲノム内への核酸断片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主細胞は、「遺伝子導入」細胞と称され、遺伝子導入細胞を含む生物は、「遺伝子導入生物」と称される。
【００３４】
「形質転換された」、「遺伝子導入された」、および「組み換えられた」は、異種核酸分子が導入された細菌、シアノバクテリア、動物、もしくは植物等の宿主細胞または宿主生物を指す。核酸分子は、当該技術分野において一般的に知られるおよび開示されるように、ゲノム中に安定に組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  １９８９；Ｉｎｎｉｓ  １９９５；Ｇｅｌｆａｎｄ  １９９５；Ｉｎｎｉｓ＆Ｇｅｌｆａｎｄ  １９９９）。既知のＰＣＲ法は、限定されないが、プライマー対、入れ子プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマー等を使用する方法を含む。「非形質転換の」という用語は、形質転換プロセスを経験していない正常な細胞を指す。
【００３５】
「野生型」は、いずれの既知の突然変異も持たない、自然において見出されるウイルスまたは生物を指す。
【００３６】
発現系の構成成分
一態様は、成長培地または発酵培地等の培地の窒素源に感受性を示す発現調節系を提供する。
【００３７】
種々の実施形態において、発現調節系は、転写因子領域と、標的配列に作動可能に連結されたコアプロモーター領域とを含む。
【００３８】
転写可能な核酸分子配列は、培地中の窒素源を変更することによって転写レベルで調節することができる。例えば、転写可能な核酸分子配列のｍＲＮＡ転写は、硝酸塩の存在下ではスイッチがオフになり得るか、または還元窒素の非硝酸塩源、例えば、アンモニアもしくは尿素等の存在下ではスイッチがオンになり得る。よって、本明細書に記載される発現調節系は、廉価なリプレッサー硝酸塩および誘導因子アンモニウムを使用して、異種遺伝子の制御可能な発現を提供することができる。
【００３９】
別の例として、転写可能な核酸分子配列のｍＲＮＡ転写は、還元窒素の非硝酸塩源、例えばアンモニアもしくは尿素等の存在下ではスイッチがオフになり得るか、または硝酸塩の存在下ではスイッチがオンになり得る。よって、本明細書に記載される発現調節系は、廉価な誘導因子硝酸塩およびリプレッサーアンモニウムを使用して、異種遺伝子の制御可能な発現を提供することができる。
【００４０】
終止領域制御配列の組込みは任意選択的であり、用いられる場合は、終止領域は比較的互換性があるため、その選択は主として利便性の１つである。終止領域は、転写開始領域（プロモーター）に対して天然であり得るか、対象となるＤＮＡ配列に対して天然であり得るか、または別の源から得られてもよい。
【００４１】
本開示のプロモーターは、記載されるようにマーカー遺伝子を使用して構築物に組み込むことができ、安定な宿主系において遺伝子発現の適応について検査することができる。本明細書において使用される場合、「マーカー遺伝子」という用語は、いくつかの方法においてその発現をスクリーニングまたはスコア化できるあらゆる転写可能な核酸分子を指す。
【００４２】
転写因子領域
窒素感受性転写因子領域を含むことができる発現調節系を本明細書において提供する。本明細書に記載されるような窒素調節系の実施形態を使用して、培地（例えば、発酵ブロス）中で硝酸塩からアンモニアの窒素（または別の非硝酸塩還元型の窒素、例えば、尿素）に切り替えることにより、作動可能に連結された遺伝子の発現を阻害する抑制の損失をもたらすことができ、それによって培養プロセス中の所定の時点でタンパク質産生を効果的に活性化する。別の実施形態において、培地中でアンモニアの窒素（または別の非硝酸塩還元型の窒素、例えば、尿素）から硝酸塩に切り替えることにより、作動可能に連結された遺伝子の発現を阻害する抑制の損失をもたらすことができ、それによって培養プロセス中の所定の時点でタンパク質産生を効果的に活性化する。
【００４３】
本開示は、シアノバクテリアの窒素レギュロンの主な制御因子であるＮｔｃＡに関連する観察に少なくとも一部基づいている。本明細書に提示される結果は、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３およびシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２から単離された亜硝酸還元酵素プロモーター（ＮｔｃＡ結合部位を含む）に作動可能に連結された遺伝子は、硝酸塩が唯一の窒素源である場合は発現されるが、アンモニアの窒素を用いて成長させた場合には抑制されることを示している（実施例２を参照）。そのような系は、ＮｔｃＡによって活性化されるプロモーター系と一致する（Ｈｅｒｅｒｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５，４１６を参照）。これらの結果は、タンパク質発現の制御、ひいては天然産物の生成が、廉価な窒素源の変更によって達成され得ることを実証するものである。Ｅｍｌｙｎ−Ｊｏｎｅｓら（２００３）等による以前の報告により、遺伝子調節のための亜硝酸還元酵素プロモーターの使用が報告されているが、本発明の発明者は、ある程度の発現の制御は達成され得るものの、従来の系における亜硝酸還元酵素プロモーターは相対的に弱く、容認できないほど少ないタンパク質産生量をもたらすことを発見した（実施例２を参照）。
【００４４】
転写因子領域は、コアプロモーター領域に作動可能に連結することができる。また、本開示は、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター等の強力なプロモーターに作動可能に連結されたＮｔｃＡ結合配列の使用による観察に少なくとも一部基づいている。本明細書に提示される結果は、ノストック種ＰＣＣ７１２０から単離されたｒｂｃＬプロモーター（ＮｔｃＡ結合部位を含む）またはその機能的断片に作動可能に連結された遺伝子は、アンモニアが唯一の窒素源である場合は発現されるが、アンモニアの窒素を用いて成長させた場合には抑制されることを示している（実施例２を参照）。そのような系はＮｔｃＡ抑制プロモーター系と一貫している（Ｈｅｒｅｒｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５，４２０を参照）。
【００４５】
転写因子領域は、コアプロモーター領域に関連する種々の位置を有することができる。例えば、転写因子領域は、コアプロモーター領域の上流または下流にあってもよい。転写因子領域は、コアプロモーター領域の近位にあってもよい。転写因子領域は、コアプロモーター領域の遠位にあってもよい。転写因子領域は、コアプロモーター領域内に含まれてもよい。例えば、転写因子領域は、コアプロモーター領域の配列内に組み込まれてもよい。
【００４６】
転写因子領域は、窒素感受性転写因子を含むことができる。転写因子は、一般に、例えば、典型的には転写開始部位の上流の部位でＤＮＡに結合することにより発現を活性化または抑制することによって、種々の生物において遺伝子発現を調節することに関与することができる。転写因子は、コード化ＤＮＡ分子にポリメラーゼを動員することによってそれらの機能を発揮することができる。転写因子、または配列特異的ＤＮＡ結合因子は、一般に、特異的ＤＮＡ配列に結合し、それによってＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝子情報の転写を制御するタンパク質として理解される。転写因子は、ＤＮＡからＲＮＡへ、そして特異的遺伝子へと遺伝子情報の転写を行う酵素であるＲＮＡポリメラーゼの動員を促進する（アクチベーター）またはブロックする（リプレッサー）ことにより、単独で、または複合体中の他のタンパク質とともにこの機能を実行することができる。転写因子の特徴の１つは、それらが調節する遺伝子に隣接するＤＮＡの特異的配列に付着することができる１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むということである。
【００４７】
窒素感受性発現調節系は、窒素代謝関連遺伝子と会合したプロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。窒素感受性発現調節系は、亜硝酸還元酵素遺伝子のプロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。例えば、窒素感受性発現調節系は、シアノバクテリア由来の亜硝酸還元酵素遺伝子のプロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。さらなる例として、窒素感受性発現調節系は、シネコシスティスまたはシネココッカスから単離された、ＮｔｃＡによって調節される亜硝酸還元酵素プロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。内在性亜硝酸還元酵素プロモーターのＮｔｃＡ結合部位は、転写開始部位からのその距離を用いてアクチベーター部位として機能すると理解される（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５を参照）。さらなる例として、窒素感受性発現調節系は、ＮｔｃＢによって調節される亜硝酸還元酵素プロモーターを含むことができる。
【００４８】
窒素感受性発現調節系は、窒素によって調節される遺伝子のプロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。窒素感受性発現調節系は、窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏ遺伝子のプロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。例えば、窒素感受性発現調節系は、ＮｔｃＡ結合部位またはＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列のうちの１つ以上を含むプロモーターを含むことができる。別の例として、窒素感受性発現調節系は、ＮｔｃＢ結合部位またはＮｔｃＢ結合部位コンセンサス配列のうちの１つ以上を含むプロモーターを含むことができる。別の例として、窒素感受性発現調節系は、は、ＮｔｃＡ結合部位およびＮｔｃＢ結合部位またはＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列およびＮｔｃＢ結合部位コンセンサス配列のうちの１つ以上を含むプロモーターを含むことができる。さらなる例として、窒素感受性発現調節系は、藻類またはシアノバクテリア由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏ遺伝子のプロモーターを含むことができる。さらなる例として、窒素感受性発現調節系は、ノストック、シネコシスティス、またはシネココッカス由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏ遺伝子のプロモーターまたはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。ノストック由来の内在性ｒｂｃＬプロモーターのＮｔｃＡ結合部位は、転写開始部位までのその近接を用いてリプレッサー部位として機能すると理解される（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５を参照）。
【００４９】
ＮｔｃＡは、種々の結合ドメインで窒素によって調節される遺伝子のプロモーターに結合するヘリックスターンヘリックス転写調節因子であると理解される（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１６），５１５６−５１７１、Ｌｌａｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（３５），１５３９７−４０２を参照）。内在性シアノバクテリアのＮｔｃＡレギュロンにおいて、アンモニウムが好ましい窒素源である場合、他の窒素源の同化のための遺伝子の発現は、アンモニウムが豊富な環境において抑制され、アンモニウムが制限された環境において、代替窒素源の取り込みおよび代謝に関与する遺伝子は、遺伝子のプロモーター領域におけるＮｔｃＡのｃｉｓ−調節エレメントへの結合によって誘導することができる。
【００５０】
転写因子領域は、ＮｔｃＡ窒素感受性転写因子結合部位、ＮｔｃＢ窒素感受性転写因子結合部位、またはそれらの変異体もしくは機能的断片のうちの１つ以上を含むことができる。転写因子領域は、ＮｔｃＡ窒素感受性転写因子結合部位およびＮｔｃＢ窒素感受性転写因子結合部位、またはそれらの変異体もしくは機能的断片のうちの少なくとも各１つを含むことができる。例えば、転写因子領域は、配列番号２７９（その配列はＮｔｃＡおよびＮｔｃＢに作動可能に連結されたＮｉｒＡプロモーターである）に存在するＮｔｃＡ窒素感受性転写因子結合部位およびＮｔｃＢ窒素感受性転写因子結合部位もしくはその断片、またはそれと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
【００５１】
転写因子領域は、ＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列またはＮｔｃＢ結合部位コンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。転写因子領域は、ＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列およびＮｔｃＢ結合部位コンセンサス配列の両方を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。転写因子領域は、配列番号２７９（その配列はＮｔｃＡおよびＮｔｃＢに作動可能に連結されたＮｉｒＡプロモーターである）に存在するＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列およびＮｔｃＢ結合部位コンセンサス配列の両方を含む配列もしくはその断片、またはそれと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００５２】
本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、ノストック、シネコシスティス、またはシネココッカス等の生物の窒素によって調節される遺伝子と機能的に会合したＮｔｃＡ結合配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。例えば、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、窒素によって調節される遺伝子（例えば、窒素によって調節されるシアノバクテリア遺伝子）のプロモーター領域と機能的に会合したＮｔｃＡ結合配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。ｎｉｒオペロン、ｎｉｒＢ−ｎｔｃＢ、ｎｔｃＡ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ａｍｔｌ、ｕｒｔオペロン、ｎｔｃＢ、ｈｅｔＣ、ｄｅｖＢＣＡ、ｉｃｄ、ｒｐｏＤ２−Ｖ、ｎｒｔＰ、ｇｌｎＮ、ｎｉｆＰ、ｐｅｔＨ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＯＲＦ１、ｖｎｆＤＧ、およびｎｉｆＨＤＫのプロモーター領域は、ＮｔｃＡによって活性化されるプロモーターとして作用すると理解されるかまたは予測される（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５，４１７，４１８を参照）。ｒｂｃＬ、ｈａｎＡ  ｇｏｒ、ｇｉｆＡ、およびｇｉｆＢプロモーター領域は、ＮｔｃＡによって抑制されるプロモーターとして作用すると理解されるかまたは予測される（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５を参照）。ＮｔｃＡ結合部位を含む他のプロモーター領域は、ｘｉｓＡ、ｇｌｂＮ、およびｎｉｆＨを含む。ＮｔｃＡ結合部位を含む上記配列、またはその変異体もしくは機能的断片のうちのいずれも、本明細書に記載される発現系に含まれることができる。
【００５３】
例えば、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、ｎｉｒＡのプロモーター領域（配列番号２６、配列番号３２）と機能的に会合したＮｔｃＡ結合配列と同じかもしくは類似する配列、またはそれと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列もしくはその断片を有することができる。
【００５４】
例えば、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、以下のゲノムのうちの１つ以上におけるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる：グロエオバクター・ビオラセウスＰＣＣ７４２１（ＰＣＣ７４２１）、ノストック種ＰＣＣ７１２０（ＰＣＣ７１２０）、プロクロロコッカス・マリナスＣＣＭＰ１３７５（ＰＣＣ１３７５）、プロクロロコッカス・マリナスＭＥＤ４（ＭＥＤ４）、プロクロロコッカス・マリナスＭＩＴ９３１３（ＭＩＴ９３１３）、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ６３０１（ＰＣＣ６３１０）、シネココッカス種ＷＨ８１０２（ＷＨ８１０２）、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３（ＰＣＣ６８０３）、およびサーモシネココッカス・エロンガタスＢＦ−１（サーモシネココッカス）。別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１６），５１５６−５１７１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３２７，５１３−５１７（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。
【００５５】
別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列に含まれるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３（Ｎｓｐ７１２０  ｒｂｃプロモーター）、配列番号２２７（Ｓｓｐ６８０３  ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター）、配列番号２３１（Ｓｅｌｏ７９４２  ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター）、または配列番号２３４（Ｎｓｐ７１２０  ｒｂｃプロモーター）に含まれるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。
【００５６】
別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、プラスミドｐＬｙｂＤＢ２（配列番号１８８）、ｐＬｙｂＤＢ３（配列番号１８９）、ｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０、ｐＬｙｂＤＢ５（配列番号１９１）、ｐＬｙｂＤＢ６（配列番号２３５）、ｐＬｙｂＤＢ７（配列番号２３６）、またはｐＬｙｂＤＢ９（配列番号２３７）に含まれるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、プラスミドｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）に含まれるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。
【００５７】
別の例として、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列またはＮｔｃＢ結合部位配列は、プラスミドｐＬｙｂＡＬ１０６（配列番号２７２）またはｐＬｙｂＡＬ１０７（配列番号２７３）に含まれるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。例えば、本明細書に記載される構築物のＮｔｃＡ結合部位配列は、プラスミドｐＬｙｂＡＬ１０６（配列番号２７２）に含まれるＮｔｃＡ結合部位と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。
【００５８】
転写因子領域は、ＮｔｃＡの正準な結合部位コンセンサス配列であり得るＧＴＡＮ11Ｃコンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。ＧＴＡトリプレットは、このコンセンサス配列の最も保存された領域であると考えられる。本発明に記載される発現系の構成成分として、ＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列は、ＮｔｃＡの結合が転写可能な核酸分子の発現の制御をもたらすように位置付けることができる。例えば、ＧＴＡＮ11Ｃドメインは、転写開始部位の３９．５〜４０．５ヌクレオチド上流で中央に位置することが分かっており、上流位置−１０９．５および−１８０．５でいくつかのプロモーターにおいて見ることもできる。そのような位置付けは例であって、機能性を維持する他の位置も企図されることを理解されたい。
【００５９】
転写因子領域は、ＧＴＡＮ8ＴＡＣコンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。ＧＴＡＮ8ＴＡＣ結合ドメインは、ＮｔｃＡの正準な結合部位コンセンサス配列であると考えられる。
【００６０】
転写因子領域は、ＧＴＡＮ8ＴＧＣコンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６１】
転写因子領域は、ＧＴＮ10ＡＣコンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６２】
転写因子領域は、ＴＧＴＮ9ＡＣＡコンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。転写因子領域は、ＴＧＴＮ10ＡＣＡコンセンサス配列を含む配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６３】
転写因子領域は、ＴＡＮ3Ｔ／Ａの形態の−１０様ボックス等のさらなる結合ドメインを含むことができる。例えば、転写因子領域は、ＴＡＮ3Ｔ結合ドメインを含むことができる。別の例として、転写因子領域は、ＴＡＮ3Ａ結合ドメインを含むことができる。そのような結合ドメインは、大腸菌σ70タイプ３プロモーターに存在する−３５ボックスにとって代わる、ＮｔｃＡ結合部位（上述したものであり得る）を有するＴＡＮ3Ｔの形態の大腸菌σ70様−１０ボックスに類似し得る（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１６），５１５６−５１７１を参照）。いくつかの実施形態において、−１０様ボックスは、Ｎｔｃａによって活性化されるプロモーター構築物に存在し得る（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５，  ４１８，４１９を参照）。ＴＡＮ3Ｔボックス結合ドメインは、例えば、転写開始部位から５〜６ヌクレオチド上流に位置し得る。ＴＡＮ3Ｔボックス結合ドメインは、例えば、ＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列から２２または２３ヌクレオチド上流に位置し得る。ＴＡＮ3Ｔボックス結合ドメインは、例えば、ＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列から約２１、約２２、約２３、または約２４ヌクレオチド上流に位置し得る（Ｈｅｒｒｅｒｏ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２）４１１−４２５，４１９を参照）。
【００６４】
いくつかの実施形態において、上述のようなＮｔｃＡ結合部位は、例えば、ＮｔｃＡ結合がアクチベーターとして作用する構築物において、−１０様ボックスの約２１〜約２４、例えば、２２または２３ヌクレオチド下流にあってもよい。いくつかの実施形態において、上述のようなＮｔｃＡ結合部位は、例えば、ＮｔｃＡ結合がリプレッサーとして作用する構築物において、転写開始部位の付近にあってもよいか、または−１０様ボックスと重複していてもよい。
【００６５】
転写因子領域は、ＮｔｃＡ結合部位配列またはＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、転写因子領域は、上記任意のＮｔｃＡ結合部位配列またはＮｔｃＡ結合部位コンセンサス配列のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上を含むことができる。
【００６６】
窒素感受性転写因子領域を含む発現制御系の実施形態におけるインデューサーおよびリプレッサーとしての窒素源の選択は、転写因子とともに機能することが分かっている化合物に従うことができる（参照により本明細書に組み込まれるＨｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３（２），４１１−４２５を参照）。例えば、いくつかの実施形態において、硝酸塩（＋５の窒素酸化状態を有する）の存在下で、ＮｔｃＡによって活性化されるプロモーター系に作動可能に連結された場合に転写可能な核酸分子の発現が生じ得るが、アンモニア（−３の窒素酸化状態を有する）等の還元窒素源の存在下で、そのような系からの発現が抑制される。反対に、他の実施形態において、硝酸塩（＋５の窒素酸化状態を有する）の存在下で、ＮｔｃＡによって抑制されるプロモーター系に作動可能に連結された場合に転写可能な核酸分子の発現が抑制され、アンモニア（−３の窒素酸化状態を有する）等の還元窒素源の存在下で、そのような系からの発現が活性化される。つまり、いくつかの実施形態において、硝酸塩よりも低い酸化状態を有する窒素源は、ＮｔｃＡによって調節される系に対して反対の効果を有し得る。換言すると、硝酸塩よりも低い酸化状態を有する窒素源（例えば、アンモニア、尿素）は、ＮｔｃＡによって活性化されるプロモーター系において発現リプレッサーとして作用することができ、硝酸塩よりも低い酸化状態を有する窒素源（例えば、アンモニア、尿素）は、ＮｔｃＡによって抑制されるプロモーター系において発現インデューサーとして作用することができる。
【化１】
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【００６７】
硝酸塩は、その塩、例えば、硝酸カリウムまたは硝酸ナトリウム等を含むことができる。硝酸塩よりも低い酸化状態を有する窒素化合物は、限定されないが、尿素、シアン酸、アンモニア、硫酸アンモニウム、アミノ酸、二酸化窒素、一酸化窒素、または亜酸化窒素を含むことができる。好ましくは、硝酸塩よりも低い酸化状態を有する窒素化合物は、アンモニアまたは尿素等の可溶性窒素化合物である。
【００６８】
窒素レギュロン調節タンパク質
いくつかの実施形態において、過剰な窒素レギュロン調節タンパク質を系に添加することにより、非誘導条件下での発現をさらに低下させるかまたは排除することができる。上述のように、発現調節系は、窒素レギュロン調節タンパク質（例えば、硝酸塩誘導性の窒素レギュロン調節タンパク質）に感受性を示す窒素感受性転写因子領域を含むことができる。いくつかの実施形態において、過剰な窒素レギュロン調節タンパク質（例えば、ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢ）の添加は、非誘導条件下にある標的ヌクレオチド配列の発現をさらに低下させるかまたは排除することができる（例えば、実施例９を参照）。
【００６９】
本明細書に記載される構築物は、ＮｔｃＡもしくはＮｔｃＢまたはその両方のうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、本明細書に記載される構築物は、ＮｔｃＡもしくはＮｔｃＢまたはその両方をコードする部分を含む配列番号２７９のヌクレオチド配列またはその断片、または配列番号２７９に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有し、ＮｔｃＡもしくはＮｔｃＢまたその両方をコードするヌクレオチドまたはその断片を含むことができる。別の例として、ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢをコードする部分を含むヌクレオチドを含む構築物は、ｐＬｙｂＡＬ９８（配列番号２６５）であってもよい。
【００７０】
ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢのうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列は、転写因子領域の上流にあってもよい。ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢのうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列は、転写因子領域の下流にあってもよい。
【００７１】
ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢのうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列は、構築物の発現がＮｔｃＡポリペプチドまたはＮｔｃＢポリペプチドの発現をもたらすように、本明細書に記載される構築物内に位置付けられてもよい。ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢのうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列は、コアプロモーター領域の上流にあってもよい。ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢのうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列は、コアプロモーター領域の下流にあってもよい。例えば、ＮｔｃＡまたはＮｔｃＢのうちの１つ以上のコピーをコードするヌクレオチド配列は、ｎｉｒＡプロモーターの下流にあってもよい（例えば、実施例９を参照）。
【００７２】
コアプロモーター領域
コアプロモーター領域を含むことができる窒素感受性発現調節系を本明細書において提供する。本明細書に記載されるような窒素調節系の実施形態を使用して、転写因子領域（例えば、Ｎｔｃａによって抑制される構成におけるＮｔｃＡ結合配列）に作動可能に連結されたコアプロモーター領域（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター由来）は、転写可能な核酸分子の調節された発現をもたらすことができ、培地（例えば、発酵ブロス）中の硝酸塩は、発現を効果的に不活性化することができ、アンモニアの窒素または尿素等の非硝酸塩還元窒素源は、培養プロセス中の所定の時点でタンパク質産生を効果的に活性化することができる。他の実施形態において、
【００７３】
別の実施形態において、転写因子領域（例えば、ＮｔｃＡによって活性化される構成におけるＮｔｃＡ結合配列）に作動可能に連結されたコアプロモーター領域は、培地（例えば、発酵ブロス）中のアンモニアの窒素または尿素等の非硝酸塩窒素源を硝酸塩に切り替えると、転写可能な核酸分子の調節された発現をもたらすことができ、それによって培養プロセス中の所定の時点でタンパク質産生を効果的に活性化する。
【００７４】
本開示は、強力なＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの使用による観察に少なくとも一部基づいている。以前の報告により、強力なＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの使用が報告されているが、本発明の発明者は、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターが、レギュロン（ＮｔｃＡレギュロン等）の非存在下では、宿主細胞の成長および生存率を犠牲にして、転写可能な核酸分子の無制御な発現をもたらすことを発見した。本明細書に提示される結果は、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３またはシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターに作動可能に連結された遺伝子は強く発現されるが、宿主生物は、経時的に極めて緩徐な成長および生存率の損失を示したことを示している（実施例４を参照）。
【００７５】
本開示はまた、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター等の強力なプロモーターに作動可能に連結されたＮｔｃＡおよびそのＤＮＡ結合配列の使用による観察に少なくとも一部基づいている。ＮｔｃＡ結合部位を含むインタクトなＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを用いた最初の実験では、標的遺伝子発現がほとんど生じなかった。本明細書に提示される結果は、（切断されていない）ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターに作動可能に連結された遺伝子では、標的遺伝子発現がほとんど得られなかったことを示している（実施例６を参照）。
【００７６】
驚くべきことに、ＮｔｃＡ結合部位を含むＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの上流切断または下流切断によって、窒素源によって著しく調節される標的遺伝子発現をもたらすことができることが発見された。本明細書に提示される結果は、プロモーター配列の前部領域または後部領域のいずれかが欠失した（すなわち、上流切断または下流切断）、ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターに作動可能に連結された遺伝子は、それぞれ、アンモニアの存在下で著しい標的遺伝子発現を示したことを示している（実施例６を参照）。
【００７７】
しかしながら、ＮｔｃＡ結合部位を含むＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの上流領域および下流領域の両方の切断では、遺伝子発現はほとんど引き起こされない。本明細書に提示される結果は、配列の両方のフランキング領域が欠落した（すなわち、上流切断および下流切断された）ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターに作動可能に連結された遺伝子では、遺伝子発現がほとんど得られなかったことを示している（実施例６を参照）。
【００７８】
コアプロモーター領域は、転写因子領域に作動可能に連結することができる。例えば、コアプロモーター領域は、転写因子領域の上流または下流にあってもよい。コアプロモーター領域は、転写因子領域を含むことができる。例えば、転写因子領域は、コアプロモーター領域の配列内に組み込まれてもよい。コアプロモーター領域に対する転写因子領域の場所は、本明細書においてさらに記載されるように、その系が、還元アンモニアの存在下で活性化される系であるかまたは抑制される系であるかに影響を及ぼし得る。例えば、ｒｂｃＬプロモーターの場合のように、転写因子領域がコアプロモーター領域に近位のＮｔｃＡ結合部位である場合、発現系はＮｔｃＡリプレッサー系であってもよく、アンモニアまたは尿素等の還元窒素源の存在は、作動可能に連結された転写可能な核酸分子の発現を活性化することができ、硝酸塩の存在は発現を不活性化することができる。
【００７９】
コアプロモーター領域は、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列、またはその変異体、もしくは機能的断片を含むことができる。
【００８０】
コアプロモーター領域は、ノストック、シネコシスティス、またはシネココッカス等の生物のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。例えば、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、以下のゲノムのうちの１つ以上におけるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる：グロエオバクター・ビオラセウスＰＣＣ７４２１（ＰＣＣ７４２１）、ノストック種ＰＣＣ７１２０（ＰＣＣ７１２０）、プロクロロコッカス・マリナスＣＣＭＰ１３７５（ＰＣＣ１３７５）、プロクロロコッカス・マリナスＭＥＤ４（ＭＥＤ４）、プロクロロコッカス・マリナスＭＩＴ９３１３（ＭＩＴ９３１３）、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ６３０１（ＰＣＣ６３１０）、シネココッカス種ＷＨ８１０２（ＷＨ８１０２）、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３（ＰＣＣ６８０３）、およびサーモシネココッカス・エロンガタスＢＦ−１（サーモシネココッカス）。
【００８１】
別の例として、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、アナベナＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列の変異体または機能的断片であってもよい。
【００８２】
本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ＲｕＢｉｓＣｏ（ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列またはその変異体もしくは機能的断片と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。例えば、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ノストック種ＰＣＣ７１２０のｒｂｃプロモーター領域、例えば、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、または配列番号１８３と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。別の例として、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、次のような配列番号２３４のＮｓｐ７１２０のｒｂｃプロモーター領域と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。
【化２】
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【００８３】
例えば、記載される構築物のコアプロモーター領域は、配列番号２３４、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２および配列番号１８３のうちのいずれか１つに対して、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％の配列同一性を有することができる。
【００８４】
本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、プラスミドｐＬｙｂＤＢ２（配列番号１８８）、ｐＬｙｂＤＢ３（配列番号１８９）、ｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）、ｐＬｙｂＤＢ５（配列番号１９１）、ｐＬｙｂＤＢ６（配列番号２３５）、ｐＬｙｂＤＢ７（配列番号２３６）、またはｐＬｙｂＤＢ９（配列番号２３７）に含まれるコアプロモーター領域と同じかまたは類似する（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性）配列を有することができる。
【００８５】
本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、本明細書で論じられる任意のプロモーター配列の機能的断片であってもよい。例えば、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ＲｕＢｉｓＣｏ（例えば、ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列の機能的断片であってもよい。ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の機能的断片は、プロモーター活性を保持するＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列（例えば、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のｒｂｃＬＳプロモーター）の、少なくとも約５０個、少なくとも約７５個、少なくとも約９５個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２５個、少なくとも約１５０個、少なくとも約１７５個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４５０個、少なくとも約５００個、少なくとも約５５０個、少なくとも約６００個、少なくとも約６５０個、少なくとも約７００個、少なくとも約７５０個、または少なくとも約８００個の近接する塩基を有する核酸配列であってもよい。
【００８６】
本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ＲｕＢｉｓＣｏ（例えば、ｒｂｃＬＳ）プロモーター配列の切断型であってもよい。例えば、本明細書に記載される構築物のコアプロモーター領域は、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の切断型であってもよい。
【００８７】
ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の切断は、上流切断であってもよい。例えば、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列は−３１９〜−１６２位（転写開始部位に関連する番号付け、図３を参照）が上流切断されていてもよい（実施例６、実施例７を参照）。ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の上流切断は、約−３００位、約−２５０位、約−２００位、約−１９０位、約−１８０位、約−１７０位、約−１６０位、約−１５０位、約−１４０位、約−１３０位、約−１２０位、約−１１０位、約−１００位、約−９０位、または約−８０位を介して生じ得る。図３に示されるようなノストック種ＰＣＣ７１２０の−３１９〜−１６２位は、配列番号２３４の置１〜１７６位に対応する。
【００８８】
ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の切断は、下流切断であってもよい。例えば、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列は、＋２６〜＋４９１位（転写開始部位に関連する番号付け、図３を参照）が下流切断されていてもよい（実施例６、実施例７を参照）。ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の下流切断は、約＋１０位、約＋２０位、約＋３０位、約＋４０位、約＋５０位、約＋６０位、約＋７０位、約＋８０位、約＋９０位、約＋１００位、約＋１５０位、約＋２００位、約＋２５０位、約＋３００位、約＋３５０位、約＋４００位、約＋４５０位、約＋４８０位、または約＋４９０位で生じ得る。ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の下流切断は、例えば、ｒｂｃＬの第１のコドンまたはその近くに存在する制限部位（例えば、＋４９９位のＢａｍＨＩ制限部位）を介して生じ得る。図３に示されるようなノストック種ＰＣＣ７１２０の＋２６〜＋４９１位は、配列番号２３４の３５３〜８１８位に対応する。
【００８９】
転写可能な核酸分子
本明細書に記載されるように、転写可能な核酸分子等の標的ヌクレオチド配列は、成長培地または発酵培地等の培地の１つ以上の構成成分に感受性を示す発現調節系に作動可能に連結することができる。例えば、転写可能な核酸分子は、培地中に存在する窒素源に感受性を示す発現調節系に作動可能に連結することができる。
【００９０】
本開示の構築物に組み込むための例示的な転写可能な核酸分子は、例えば、宿主種以外の種に由来する核酸分子もしくは遺伝子、またはさらには同じ種から発生するかもしくは同じ種に存在する遺伝子を含むが、古典的な複製または繁殖技術よりもむしろ遺伝子操作によってレシピエント細胞に組み込まれる。外来性遺伝子または遺伝的エレメントは、レシピエント細胞に導入される任意の遺伝子または核酸分子を指すことが企図される。外来性核酸分子に含まれる核酸分子の種類は、既に宿主細胞中に存在する核酸分子、別の生物からの核酸分子、異なる生物からの核酸分子、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含む核酸分子等の外部で作製される核酸分子、または人工版もしくは改良版の遺伝子をコードする核酸分子を含む。
【００９１】
転写可能な核酸分子は、対象となるポリペプチドをコードするいずれの配列であってもよい。例えば、転写可能な核酸分子は、対象となる特定の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【００９２】
転写可能な核酸分子は、スクロース生合成活性を有するポリペプチドをコードすることができる。転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる。転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる。転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸シンターゼ活性およびスクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００９３】
転写可能な核酸分子は、ＳＰＳ生合成機能およびＳＰＰ生合成機能の両方を有するａｓｆ遺伝子産物ＡＳＦを生成するシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来の活性なｓｐｓ／ｓｐｐ融合（ａｓｆ）遺伝子であってもよい（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号、実施例５を参照）。いくつかの実施形態において、標的ＡＳＦをコードするヌクレオチド配列が、その天然の源（例えば、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２）からクローン化される。いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、配列番号１のａｓｆポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、配列番号２のＡＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、転写可能な核酸分子は、配列番号１に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、またはｓｐｓおよびｓｐｐ活性を有し、かつ配列番号２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一例として、転写可能な核酸分子は、配列番号１に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列は、ＡＳＦ、ＳＰＳ、またはＳＰＰ活性を示す。一例として、転写可能な核酸分子は、配列番号２に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列は、ＡＳＦ、ＳＰＳ、またはＳＰＰ活性を示す。別の例として、転写可能な核酸分子は、ストリンジェントな条件下で配列番号１の全長にわたって配列番号１にハイブリダイズし、活性なＳＰＳ／ＳＰＰ融合（ＡＳＦ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。さらなる例として、転写可能な核酸分子は、上記配列のうちのいずれかに対する相補を含むことができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸シンターゼ（ｓｐｓ）（例えば、ｓｐｓ遺伝子をコードする配列番号３およびＳＰＳポリペプチドをコードする配列番号４を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸シンターゼを発現するように配列番号３の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号３に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号４に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＳＰＳ活性を示す。
【００９５】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸ホスファターゼ（ｓｐｐ）（例えば、ｓｐｐ遺伝子をコードする配列番号５およびＳＰＰポリペプチドをコードする配列番号６を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸ホスファターゼを発現するように配列番号５の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、スクロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号５に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号６に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＳＰＰ活性を示す。
【００９６】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、ａｓｆ、ｓｐｓ、またはｓｐｐのうちの１つ以上を含むことができる。例えば、転写可能な核酸分子は、ａｓｆおよびｓｐｓ、ａｓｆおよびｓｐｐ、ｓｐｓおよびｓｐｐ、またはａｓｆ、ｓｐｓ、およびｓｐｐを含むことができる。
【００９７】
転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸シンターゼ活性もしくはトレハロースリン酸ホスファターゼ活性、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ活性もしくはグルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ活性、またはマンノシルフルクトースリン酸シンターゼ活性もしくはマンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸シンターゼ（ｔｐｓ）（例えば、ｔｐｓ遺伝子をコードする配列番号７６およびＴＰＳポリペプチドをコードする配列番号７７を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸シンターゼを発現するように配列番号７６の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号７６に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号７７に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＴＰＳ活性を示す。
【００９９】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸ホスファターゼ（ｔｐｐ）（例えば、ｔｐｐ遺伝子をコードする配列番号７８およびＴＰＰポリペプチドをコードする配列番号７９を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸ホスファターゼを発現するように配列番号７８の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、トレハロースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号７８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号７９に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＴＰＰ活性を示す。
【０１００】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ（ｇｐｓ）（例えば、ｇｐｓ遺伝子をコードする配列番号８０およびＧＰＳポリペプチドをコードする配列番号８１を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼを発現するように配列番号８０の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、グルコシルグリセロールリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号８０に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号８１に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＧＰＳ活性を示す。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ（ｇｐｐ）（例えば、ｇｐｐ遺伝子をコードする配列番号８２およびＧＰＰポリペプチドをコードする配列番号８３を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼを発現するように配列番号８２の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号８２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号８３に少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＧＰＰ活性を示す。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ（ｍｐｓ）（例えば、ｍｐｓ遺伝子をコードする配列番号８４およびＭＰＳポリペプチドをコードする配列番号８５を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼを発現するように配列番号８４の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、マンノシルフルクトースリン酸シンターゼを有するポリペプチドをコードする配列番号８４に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号８５に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＭＰＳ活性を示す。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、転写可能な核酸分子は、マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ（ｍｐｐ）（例えば、ｍｐｐ遺伝子をコードする配列番号８６およびＭＰＰポリペプチドをコードする配列番号８７を参照）またはその相同体を含む。例えば、転写可能な核酸分子は、マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼを発現するように配列番号８６の配列を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号８６に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のパーセント同一性を有するヌクレオチドを含むことができる。別の例として、転写可能な核酸分子は、配列番号８７に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、発現される配列はＭＰＰ活性を示す。
【０１０４】
代替として、転写可能な核酸分子は、例えば、アンチセンス、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）または共抑制媒介機構を介して、内在性遺伝子の発現の標的阻害を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、宿主細胞または宿主生物の表現型を生じさせることができる。ＲＮＡはまた、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を切断するように遺伝子操作された触媒性ＲＮＡ分子（すなわち、リボザイム）であってもよい。対象となる表現型または形態の変化を表すタンパク質またはｍＲＮＡをコードするあらゆる核酸分子が、本開示の実践に有用であり得る。
【０１０５】
宿主
宿主生物または宿主細胞は、１つ以上の培地構成成分に感受性を示す発現調節系に作動可能に連結された転写可能な核酸分子を含む構築物で形質転換することができる。例えば、宿主生物または宿主細胞は、培地中に存在する窒素源に感受性を示す発現調節系に作動可能に連結された転写可能な核酸分子を含む構築物で形質転換することができる。
【０１０６】
本明細書に記載される構築物は、宿主ゲノムに基づくかまたは組み込まれたプラスミドであってもよい。例えば、本明細書に記載される構築物（例えば、プラスミドｐＬｙｂＤＢ４、配列番号１９０）は、プラスミドとして宿主中に存在することができる（例えば、実施例１１を参照）。別の例として、本明細書に記載される構築物（例えば、プラスミドｐＬｙｂＡＬ９８、配列番号２６５）は、宿主（例えば、ＬＹＢ５１１株）のゲノム中に組み込まれてもよい（例えば、実施例９、実施例１１、実施例１２を参照）。いくつかの実施形態において、宿主のゲノム中への組込みは、標的ヌクレオチドの誘導性発現を増加させることができる（実施例１１と実施例１２とを比較）。
【０１０７】
形質転換された宿主生物または宿主細胞は、対象となる遺伝子の存在、および本開示の発現系によって付与された発現レベルまたはプロファイルについて分析することができる。当業者は、形質転換された宿主の分析のために利用可能な多くの方法を認識している。例えば、宿主分析のための方法は、限定されないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲに基づくアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、および免疫診断アッセイを含む。
【０１０８】
宿主生物は、真核生物または原核生物であってもよい。
【０１０９】
宿主生物は、光合成微生物であってもよい。宿主生物は、例えば、シアノバクテリア等の天然光合成微生物、または人工光合成細菌等の遺伝子操作された光合成微生物であってもよい。天然光合成微生物であるか、または光合成をするように遺伝子操作することができるかのいずれかである例示的な微生物は、限定されないが、細菌、真菌、古細菌、原生生物、微小植物（例えば、緑藻類）、ならびにプランクトン、プラなリア、およびアメーバ等の動物を含む。自然に発生する光合成微生物の例として、限定されないが、スピルリナ・マキシマム、スピルリナ・プラテンシス、ドナリエラ・サリナ、ボトリオコックス・ブラウニイ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ピレノイドーサ、セレナストルム・カプリコミュータ、セネデスムス・クアドリカウダ、ポルフィリディウム・クルエンタム、セネデスムス・アクタス、ドナリエラ種、セネデスムス・オブリクース、アナベノプシス、アウロシラ、キリンドロスペルマム、シネコッカス種、シネコシスティス種、またはトリポスリックスが挙げられる。
【０１１０】
好ましくは、宿主光合成微生物は、シアノバクテリアである。シアノバクテリアはまた、藍藻としても知られ、幅広い酸素発生型の光独立栄養生物である。宿主シアノバクテリアは、藍藻植物門由来のいずれの光合成微生物であってもよい。宿主シアノバクテリアは、単細胞形態またはコロニー形態（例えば、フィラメント、シート、またはボール）を有することができる。好ましくは、宿主シアノバクテリアは、単細胞シアノバクテリアである。宿主生物となり得るシアノバクテリアの例として、限定されないが、シネコシスティス、シネココッカス、サーモシネココッカス、ノストック、プロクロロコッカス、ミクロシスティス、アナベナ、スピルリナ、およびグロエオバクター属が挙げられる。好ましくは、宿主シアノバクテリアは、シネコシスティス種またはシネココッカス種である。より好ましくは、宿主シアノバクテリアは、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２（ＡＴＣＣ３３９１２）またはシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３（ＡＴＣＣ２７１８４）である。
【０１１１】
宿主細胞または宿主生物は、内在性窒素制御系を含むことができる。宿主細胞または宿主生物のゲノムは、ＮｔｃＡポリペプチドをコードすることができる。宿主細胞または宿主生物は、窒素制御系に従ってＮｔｃＡポリペプチドを発現することができる。代替として、宿主細胞または宿主生物は、ＮｔｃＡポリペプチドをコードするように、または窒素源に応じてＮｔｃＡポリペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。
【０１１２】
本明細書に記載されるように、転写可能な核酸分子の無調節な発現は、宿主細胞もしくは宿主生物の成長率を低下させ得るか、または宿主細胞もしくは宿主生物の生存率を低下させ得る（実施例４を参照）。本明細書に記載される発現系の種々の実施形態は、転写可能な核酸分子の発現の窒素感受性調節を提供することができ、それによって、無調節な発現と比較して形質転換された宿主の成長率または生存率の増加を提供する。本明細書に記載される発現系を使用して、形質転換された宿主細胞または宿主生物は、同じかまたは実質的に類似する条件下で、形質転換されていない宿主細胞または宿主生物よりも約２０％未満より低い成長率（例えば、約１５％、１０％、５％未満より低い成長率）を有することができる。本明細書に記載される発現系を使用して、形質転換された宿主細胞または宿主生物は、同じかまたは実質的に類似する条件下で成長させた無調節な構築物で形質転換した宿主細胞または宿主生物よりも約５％超より高い成長率（例えば、約１０％、１５％、または２０％超より高い成長率）を有することができる。上記考察は、生存率を成長率に置き変えた場合、生存率にも等しく適用される。
【０１１３】
キット
また、キットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載される薬剤または組成物を含むことができ、特定の実施形態においては、投与のための指示を含むことができる。そのようなキットは、本明細書に記載される方法の性能を高めることができる。キットとして供給される場合、組成物の異なる構成成分を個別の容器に梱包して、使用直前に混合することができる。構成成分は、限定されないが、本明細書に記載される発現系もしくは発現カセット、またはその構成成分もしくは配列を含む。そのような構成成分の梱包は、所望の場合、組成物を含む１つ以上の単位投与形態を含み得る包装または分注デバイス内に存在してもよい。包装は、例えば、金属箔または、例えばブリスターパック等のプラスチック箔を含む。そのような構成成分の梱包は、特定の場合において、構成成分の活性を失うことなく、個別に長期保存を可能にすることができる。
【０１１４】
キットはまた、例えば、個別に包装された凍結乾燥した活性構成成分に加えられる滅菌水または生理食塩水等の試薬を別の容器に含んでもよい。例えば、密封されたガラス製アンプルが凍結乾燥した構成成分を含んでもよく、別のアンプルに、滅菌水、滅菌生理食塩水、または滅菌されたものを含み、それらの各々は、窒素等の中性の非反応性気体の下で梱包される。アンプルは、ガラス、有機ポリマー（例えば、ポリカーボネート）、ポリスチレン、セラミック、金属、または試薬を保持するために典型的に用いられる任意の他の材料等の任意の好適な材料から構成されてもよい。好適な容器の他の例として、アンプルと同様の物質から製造され得る瓶、およびアルミニウムまたは合金等の箔で裏打ちされた内部から構成され得るエンベロープが挙げられる。他の容器は、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、注射器等を含む。容器は、皮下注射針によって穿孔することができるストッパーを有する瓶等の滅菌アクセスポートを有してもよい。他の容器は、除去されると構成成分の混合を可能にする容易に除去可能な膜によって分離された２つの区画を有してもよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム等であってもよい。
【０１１５】
特定の実施形態において、キットは、指示材料とともに供給されてもよい。指示は、紙もしくは他の基板上に印刷されてもよいか、またはフロッピー（登録商標）ディスク、ミニＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ等の電子可読媒体として供給されてもよい。詳細な指示は、キットと物理的に関連していない可能性がある：代わりに、ユーザは、キットの製造業者または配給業者によって指定されたインターネットウェブサイトへと誘導される場合がある。
【０１１６】
分子の遺伝子操作
上記の必要とされるパーセント同一性を有し、かつ必要とされる発現タンパク質の活性を保持する変異体ヌクレオチドおよびそれらのコードされたポリペプチドの設計、作製、および試験は、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、変異株の定向進化および迅速な単離は、限定されないが、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５（９），６８０−６８８、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  ９７（１），１１９−１２３、Ｇｈａｄｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（８）４５５２−４５５７を含む参考文献に記載される方法に従うことができる。よって、当業者は、本明細書に記載される基準配列に対して、例えば、少なくとも９５〜９９％の同一性を有する大量のヌクレオチドまたはポリペプチド変異体を作製することができ、当該技術分野において日常的な方法に従って所望の表現型についてスクリーニングすることができる。一般に、保存的置換は、必要とされる活性が保持される限り、いずれの位置で行われてもよい。
【０１１７】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性パーセント（％）は、２つの配列を最適に整列させた（比較ウィンドウにわたって、適切な挿入、欠失、またはギャップの合計が基準配列の約２０パーセント未満である）ときに、基準配列と比較して、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして理解される。パーセント同一性を決定するために、配列を同一させ、必要があれば、ギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を得る。パーセント同一性を決定するための配列整列化の手順は、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの相同性整列化アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの類似性検索法のツール、そして好ましくは、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装を用いること（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）を含む。大抵の場合、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアが配列を整列させるために使用される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列化を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列化を測定するための適切なパラメータを決定することができる。配列を整列させると、所与の配列Ｂへの、該配列との、または該配列に対する所与の配列Ａのパーセント配列同一性（代替として、所与の配列Ｂへの、該配列との、または該配列に対して特定のパーセント配列同一性を有するまたは含む所与の配列Ａとも言える）は、以下のように算出することができる：パーセント配列同一性＝Ｘ／Ｙ１００（式中、Ｘは、ＡおよびＢの配列整列化プログラムまたはアルゴリズムの整列化によって完全一致としてスコア化される残基の数であり、Ｙは、Ｂにある残基の合計数である）。配列Ａの長さが配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するパーセント配列同一性は、ＢのＡに対するパーセント配列同一性と等しくない。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「実質的なパーセント配列同一性」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはより大きな配列同一性、例えば、約９８％もしくは約９９％の配列同一性であるパーセント配列同一性を指す。よって、一実施形態は、本明細書に記載される核酸配列と、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはより大きな配列同一性、例えば、約９８％もしくは約９９％の配列同一性を有する核酸分子である。作動可能に連結された転写可能な核酸分子の転写を制御することができ、本明細書に提供される発現系の核酸配列に対する実質的なパーセント配列同一性を有する核酸分子は、本開示の範囲内に包含される。
【０１１９】
「高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、６×ＳＳＣ緩衝液（すなわち、０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）中、６５℃でのハイブリダイゼーションとして定義される。これらの条件を前提として、２つの配列間の二本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔm）を算出することによって、所与の配列のセットがハイブリダイズするかどうかを決定することができる。特定の二本鎖が、６×ＳＳＣの塩条件において６５℃よりも低い融解温度を有する場合、これらの２つの配列はハイブリダイズしない。一方、同じ塩条件において融解温度が６５℃を超える場合、これらの配列はハイブリダイズする。一般に、任意のハイブリダイズしたＤＮＡ：ＤＮＡ配列の融解温度は、次の式を使用して決定することができる：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］）＋０．４１（Ｇ／Ｃ含量の割合）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／１）。さらに、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴmは、ヌクレオチドの同一性が１％減少するたびに１〜１．５℃減少する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００６を参照）。
【０１２０】
宿主細胞は、当該技術分野で既知の様々な標準的な技術を使用して形質転換することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００６）Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９７７１７、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＩＳＢＮ−１０：０４７１２５０９２９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５７７３、Ｅｌｈａｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｌｋ，Ｃ．Ｐ．１９８８．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６７，７４７−７５４を参照）。そのような技術は、限定されないが、ウイルス感染、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル媒介送達、受容体媒介取り込み、細胞融合、エレクトロポレーション等を含む。宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供するために、トランスフェクトされた細胞を選択して増殖させることができる。
【０１２１】
本明細書に記載されるアプローチに従って開発された宿主株は、当該技術分野で既知の多くの方法によって評価することができる（例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．４１（１），２０７−２３４；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，ｅｄ．（２００５）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＩＳＢＮ−１０：３５２７３１０３６３、Ｂａｎｅｙｘ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，ＩＳＢＮ−１０：０９５４５２３２５３を参照）。
【０１２２】
遺伝子を下方制御またはサイレンシングする方法は当該技術分野で既知である。例えば、発現されたタンパク質活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質アプタマー、ヌクレオチドアプタマー、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して下方制御または排除することができる（例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよび低分子ヘアピンＲＮＡについて記載するＦａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｄｓ（２００６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３，２８９−３０３Ｇ、デオキシリボヌクレオチド配列の標的化について記載するＨｅｌｅｎｅ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０，２７−３６；Ｍａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５、アプタマーについて記載するＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０，１−８、ＲＮＡｉについて記載するＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（３），３２６−３３０、ＲＮＡｉについて記載するＰｕｓｈｐａｒａｊ  ａｎｄ  Ｍｅｌｅｎｄｅｚ（２００６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３３（５−６），５０４−５１０、ＲＮＡｉについて記載するＤｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ６７，１４７−１７３、ＲＮＡｉについて記載するＤｙｋｘｈｏｏｒｎ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  （２００５）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５６，４０１−４２３を参照）。ＲＮＡｉ分子は、様々な源（例えば、Ａｍｂｉｏｎ（ＴＸ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。様々なアルゴリズムを使用するいくつかのｓｉＲＮＡ分子設計プログラムが当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｅｎｉｘ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，Ａｍｂｉｏｎ；ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｓｉＲＮＡ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌｓ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇを参照）。最適なｓｉＲＮＡ配列を定義する際に影響力のある形質は、ｓｉＲＮＡの終端におけるＧ／Ｃ含量、ｓｉＲＮＡの特定の内部ドメインのＴｍ、ｓｉＲＮＡの長さ、ＣＤＳ（コード化領域）内の標的配列の位置、および３’オーバーハングのヌクレオチド含量を含む。
【０１２３】
本明細書に記載される定義および方法は、本開示をさらに定義し、本開示を実践する当業者を誘導するために提供される。別途記載のない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来の使用に従って理解されるものとする。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、成分の量、特性（分子量、反応条件等）を表す数字は、本開示の特定の実施形態が、いくつかの場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきであることを説明および主張するために使用される。いくつかの実施形態において、用語「約」は、値を測定するために用いられるデバイスまたは方法の平均値の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態において、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて異なり得る近似値である。いくつかの実施形態において、数値パラメータは、報告された有効桁の数値を考慮して、通常の四捨五入法を適用することにより解釈されるべきである。本開示のいくつかの実施形態の広い範囲を既定する数値範囲および数値パラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。本開示のいくつかの実施形態に提示される数値は、それら各々の試験測定法に見出される標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を含み得る。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に属するそれぞれ別の値を個別に言及する簡単な方法としての役割を果たすことが企図されるに過ぎない。本明細書において別途指示のない限り、それぞれ個別の値は、あたかも本明細書に個別に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、具体的な実施形態に関する内容において使用される用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、ならびに同様の言及（特に、添付の特許請求の範囲のいくつかの内容において）は、別途特に記載の限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈することができる。いくつかの実施形態において、特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される用語「ｏｒ」は、代替物のみを指すか、または代替手段が相互に排他的であることを指すと明示的に示されていないかぎり、「および／または」を意味するために使用される。
【０１２６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、非限定的な連結動詞である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等のこれらの動詞のうちの１つ以上のいずれの形態または時制も非限定的である。例えば、１つ以上のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」いずれの方法も、それらの１つ以上のステップのみを有することに限定されるのではなく、列挙されていない他のステップも包含することができる。同様に、１つ以上の特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」いずれの組成物またはデバイスも、それらの１つ以上の特徴のみを有することに限定されるのではなく、列挙されていない他の特徴を包含することができる。
【０１２７】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別途指示のない限り、またはさもなければ明らかに文脈と矛盾しない限り、いずれの好適な順序で行われてもよい。本明細書において特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、本開示をより理解し易くすることを意図しているに過ぎず、別途特許請求の範囲に記載されない限り、本開示の範囲に制限を加えるものではない。本明細書におけるいずれの言語も、本開示の実施に必要不可欠な任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１２８】
本明細書に開示される本開示の代替の要素または実施形態のグループ分けは、限定的であると解釈されるべきではない。各グループの構成単位は、個別に、または本明細書に見出されるグループの他の構成単位もしくは他の要素との任意の組み合わせにおいて、参照または特許請求され得る。グループの１つ以上の構成単位は、利便性または特許性の理由からグループに含まれ得るかまたは削除され得る。いずれかのそのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、修正された通りにグループを含むものと見なされ、よって、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの書面による記載を満たす。
【０１２９】
本出願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、または他の参考文献が、あらゆる目的のために、参照によりその全体が組み入れられるように個々に指示されたのと同じ程度まで、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書における参考文献の引用は、それらが本開示に対する先行技術であることを認めるものであると解釈されるべきではない。
【０１３０】
本開示について詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲から逸脱することなく、修正例、変形例、および均等な実施形態が考えられることは明白であろう。さらに、本開示の全ての実施例は、非限定的な例として提供されることを認識されたい。
【実施例】
【０１３１】
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに例示するために提供される。当業者は、以下の実施例において開示される技術は、発明者が本開示の実践において良好に機能することを発見したアプローチを表しており、よって、その実践のための様式の例を構成すると考えられることを理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえると、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく、なおも同じかまたは同様の結果を得ることができることを理解されたい。
【０１３２】
実施例１：細胞からのインベルターゼ活性の除去
インベルターゼは、スクロースを細胞内で正常な代謝官能基に再同化されるグルコースおよびフルクトースに加水分解するため、スクロースを蓄積させるために、細胞からインベルターゼ（β−フルクトフラノシダーゼ）活性を除去するようにシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３を遺伝子操作した。ＡＴＣＣ２７１８４（ＬＹＢ４２６）からインベルターゼをコードする遺伝子ｌｉｍ１７（配列番号１４０）を欠失させてＬＹＢ４７１を得た。野生型株（ＬＹＢ４６７）からも該遺伝子を欠失させてＬＹＢ４７２を得た。経時的に、ＬＹＢ４２６による運動性の損失等、これらの株の間で相違が生じた（Ｋａｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０１３３】
最初に、ネオマイシン耐性マーカーを使用して、インベルターゼをコードする遺伝子ｌｉｍ１７をＬＹＢ４２６から欠失させ、ＬＹＢ４４３を作製した。連続ＰＣＲを使用して、大きな一続きの隣接するＤＮＡを残すようにｌｉｍ１７（配列番号１４０）に欠失を作製した。Ｓｓｐｉｎｖｄｅｌ−Ｆ（配列番号１４２）およびＳｓｐｉｎｖｄｅｌ−Ｒ（配列番号１４３）をプライマーとして使用して、ＬＹＢ４２６全細胞のゲノムＤＮＡテンプレート上で最初のＰＣＲ反応を行った。Ｓｓｐ６８０３インベルターゼ欠失ＰＣＲ２（配列番号１４６）を作製するためのテンプレートとして再びＬＹＢ４２６全細胞ゲノムＤＮＡを使用して、この反応の産物（Ｓｓｐ６８０３インベルターゼ欠失ＰＣＲ１、配列番号１４４）を第２の反応（Ｓｓｐｉｎｖｄｅｌ−Ｒ２（配列番号１４５を用いて））においてプライマーとして使用した。２番目のＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＳｐｈＩで消化し、次いで、同様に消化したｐＵＣ１９（配列番号１３９）にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ３８（配列番号１４７）を作製した。オリゴヌクレオチドｂｓｕｐｐｋａｎｍｃｓ−ＦおよびｂｓｕｐｐｋａｎＰｓｔＩ−Ｒを用いて、枯草菌１６８（Ｂｓ  ｕｐｐ  ａｐｈ  ＰＣＲ）（配列番号２２０）由来のアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈ）およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｕｐｐ）を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＬｙｂＡＬ８ｆ（配列番号６９）から増幅した。このＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＰｓｔＩで消化し、次いで、ｌｉｍ１７（配列番号１４０）隣接配列の間に見出されるＳｂｆＩおよびＳａｌＩで消化したｐＬｙｂＡＬ３８（配列番号１４７）にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ４１（配列番号２２１）を作製した。次いで、ｐＵＣ１９（配列番号１３９）の骨格内に見出されるＡａｔＩＩを用いた制限酵素消化によりプラスミドｐＬｙｂＡＬ４１を直線化し、次いで、若干修正されたＥａｔｏｎ−Ｒｙｅ（２００４）のプロトコルによりＬＹＢ４２６内に形質転換した。具体的には、膜で寒天プレートの上を覆う代わりに、形質転換混合物を寒天プレート上に直接配置した。次いで、寒天を持ち上げ、ペトリ皿の底に抗生物質を加え、次いで皿の中に寒天を戻し入れることにより、抗生物質を投与した。この変更は、必要な寒天プレートの数を３分の１に減らすためにのみ行われた。２５μｇ／ｍｌネオマイシンを含むＢＧ１１−Ａプレート上で組込みを選択した。オリゴヌクレオチドＳｓｐｉｎｖｄｅｌｓｃｒｅｅｎ−ＦおよびＳｓｐｉｎｖｄｅｌｓｃｒｅｅｎ−Ｒを使用した全細胞からのゲノムＤＮＡの増幅により、染色体の全コピーにわたる適切な組込みおよび完全な分離についてコロニーを分析した。野生型の増幅により２．８ｋｂｐの産物を得、ネオマイシン耐性マーカーおよび枯草菌のｕｐｐ遺伝子を有するｌｉｍ１７（配列番号１４０）の欠失により３．７ｋｂｐの産物を得た。
【０１３４】
次いで、ＬＹＢ４４３中のネオマイシン耐性マーカーをスペクチノマイシン耐性のためのマーカーと交換し（加えたｕｐｐ遺伝子も除去した）、インベルターゼをＬＹＢ４６７から欠失させた。オリゴヌクレオチドｓｐｅｃＳａｌＩ−ＦおよびｓｐｅｃＳｂｆＩ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性マーカーをプラスミドｐＢＳＬ１７５から増幅した（Ａｌｅｘｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。この反応の産物を、次いでＳａｌＩおよびＳｂｆＩで消化し、次いで、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ４１にライゲーションしてｐＬｙｂＡＬ５８を作製した。ＬＹＢ４４３株およびＬＹＢ４６７株を用いて上述のように二重相同性組換えを行い、それぞれＬＹＢ４７１株およびＬＹＢ４７２株を得た。２５μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＢＧ１１−Ａプレート上で組換えを選択した。オリゴヌクレオチドＳｓｐｉｎｖｄｅｌｓｃｒｅｅｎ−ＦおよびＳｓｐｉｎｖｄｅｌｓｃｒｅｅｎ−Ｒを使用した全細胞からのゲノムＤＮＡの増幅により、適切な組込みおよびコロニーの完全な分離について再度調べた。スペクチノマイシン耐性マーカーを有するｌｉｍ１７（配列番号１４０）の欠失により２．６ｋｂｐの産物を得た。
【０１３５】
１）塩暴露条件下で実行したＬＹＢ４２６（野生型）とＬＹＢ４４３との間の比較の結果、野生型において測定可能なスクロースは得られなかったが、ＬＹＢ４４３のバックグラウンドに３倍の増加が見られたこと、および２）ａｓｆ遺伝子を用いて形質転換し、機能的プロモーターの制御下で実験を行ったＬＹＢ４４３により、細胞内および培地中にスクロースが蓄積したことが示唆されたことから明らかなように、インベルターゼの欠失によりスクロースが可能になった。
【０１３６】
実施例２：菌体外多糖の発現の低下
さらに、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３は、通常の培養物の熟成に応じて、または細胞に対する環境ストレス条件下で、著しい量の菌体外多糖（ＥＰＳ）を生成することが分かっている（Ｐａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。大量のＥＰＳは、スクロースの生成を導くことができる炭素および全体的な代謝フラックスの著しい分配を意味する。ＥＰＳ変異株が選択されているにもかかわらず、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３における菌体外多糖生成の遺伝的特徴は比較的未知である（Ｐａｎｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｔ  １９８９）。内在性プラスミドｐＳＹＳＭ上の大きな遺伝子クラスター（ほぼ１８ｋｂｐのサイズ）は、既知の遺伝子に対するそれらの相同性に基づいて、ＥＰＳの生成に大きく寄与していると推測されている（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。この目的を達成するために、ＥＰＳ生合成に関連する重要な生合成経路に寄与すると考えられる推定上の遺伝子をＬＹＢ４７２から除去してＬＹＢ４７６を作製した。
【０１３７】
推定上のＥＰＳ座位の欠失にはインベルターゼの欠失と同様のストラテジーを用いた。上述と同様に、一次オリゴヌクレオチドｅｐｓｋｏ−Ｆおよびｅｐｓｋｏ−Ｒ、次いで二次ヌクレオチドｐＳＹＳＭ−Ｒ２を用いて連続ＰＣＲを行った。二次ＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＳｐｈＩで消化し、次いで、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ４１にライゲーションしてｐＬｙｂＡＬ６１を得た。オリゴヌクレオチドＭＬＳＳａｌＩ−ＦおよびＭＬＳＳｂｆＩ−Ｒを用いて、プラスミドｐＥ１９４由来のエリスロマイシン耐性マーカー（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｂｌｕｍ  １９８２）を増幅した。得られた産物をＳａｌＩおよびＳｂｆＩで消化し、次いで、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ６１にライゲーションしてｐＬｙｂＡＬ６２を得た。上述のように、直線化したｐＬｙｂＡＬ６２を用いてＬＹＢ４７２の二重相同性組換えを行い、ＬＹＢ４７６株を作製した。オリゴヌクレオチドＥＰＳＫＯｓｃｒｅｅｎ−ＦおよびＥＰＳＫＯｓｃｒｅｅｎ−Ｒを用いた全細胞ＤＮＡのＰＣＲによりコロニーを適切な組込みについて分析した。欠失により、野生型株の１８．７ｋｂｐの産物の代わりに３．２ｋｂｐの産物を生じさせた。３．２ｋｂｐの欠失は容易に観察することができたが、１８．７ｋｂｐの野生型産物の増幅には困難が認められたため、完全な分離が存在するかどうかを増幅によって判定することは適切ではなくなった。代わりに、オリゴヌクレオチド対ＥＰＳＫＯｓｃｒｅｅｎ−Ｆ／ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｒ１、ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｆ２／ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｒ２、ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｆ３／ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｒ３、ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｆ４／ＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｒ４、およびＥＰＳＫＯｉｎｔ−Ｆ１／ＥＰＳＫＯｓｃｒｅｅｎ−Ｒを使用した複数のＰＣＲ産物の損失によって完全な分離を評価した（オリゴヌクレオチドの一方または両方が、欠失された領域内に見られる）。これらのオリゴヌクレオチドを用いた野生型ＤＮＡの増幅により、産物ＥＰＳ  ＫＯ  Ｓｒｅｅｎ＿Ｂｏｒｄｅｒ１、ＥＰＳ  ＫＯ  ｉｎｔ  ＰＣＲ２、ＥＰＳ  ＫＯ  ｉｎｔ  ＰＣＲ３、ＥＰＳ  ＫＯ  ｉｎｔ  ＰＣＲ４、およびＥＰＳ  ＫＯ  Ｓｒｅｅｎ＿Ｂｏｒｄｅｒ２をそれぞれ得た。
【０１３８】
結果は、上記ＥＰＳ遺伝子の欠失により、Ｐａｎｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｔ，１９８９およびＬａｕｒｅｎｔｉｎ  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ，２００３によって記載される抽出および比色アッセイによって測定した場合に、ＥＰＳ産生量の＞８０％損失を示す新しい遺伝子操作された生物が生じたことを示した。さらに、ＥＰＳの生合成の低下を伴う修飾された生物は、成長率または全体的な生存率を低下させないと考えられる。
【０１３９】
実施例３：亜硝酸還元酵素プロモーターからのＡＳＦの発現
以下の実施例は、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３またはシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２の亜硝酸還元酵素プロモーターからのＡＳＦの発現を示す。
【０１４０】
ａｓｆ遺伝子（ｐＬｙｂＡＬ１８）の前にシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来の亜硝酸還元酵素プロモーターを含むが、ＥＰＳの発現が低いプラスミドを保持するシネコシスティス種の株であるＬＹＢ４７６を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。（プラスミドｐＬｙｂＡＬ１８およびその作製については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載される。同じく米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるように、三親接合によりプラスミドｐＬｙｂＡＬ１８をＬＹＢ４７６に導入した。）白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を、２０ｍＭ硝酸カリウムおよび２５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む５０ｍｌの新しいＢＧ１１培地（ｐＨ９．０）に再分散させた。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。遠心分離により細胞から培地を分離し、酵素に基づく比色法を使用してスクロース濃度について培地をアッセイした（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  Ｋ６２６番）。細胞を界面活性剤による溶解に供し、上記酵素に基づく方法を使用して、精製した上清をスクロース濃度についてアッセイした。
【０１４１】
ｐＬｙｂＡＬ１８プラスミドを介してａｓｆ遺伝子を保持するＬＹＢ４７６は、培地中にスクロースを発現し、元の培養物中の細胞の乾燥バイオマスの３０〜５０重量％を占めていた。溶解時に細胞から遊離したスクロースの濃度は、培養物中に観察された全スクロースの１０重量％未満に相当した。
【０１４２】
ａｓｆ遺伝子ｐＬｙｂＡＬ１６の前にシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３由来の亜硝酸還元酵素プロモーターを有する異なるプラスミドでＬＹＢ４７６を選択的に形質転換し、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。（プラスミドｐＬｙｂＡＬ１６およびその作製については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載される。米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるように、三親接合によりプラスミドｐＬｙｂＡＬ１６をＬＹＢ４７６に導入した。）白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を、２０ｍＭ硝酸カリウムおよび２５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む５０ｍｌの新しいＢＧ１１培地（ｐＨ９．０）に再分散させた。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。遠心分離により細胞から培地を分離し、酵素に基づく比色法を使用してスクロース濃度について培地をアッセイした（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  Ｋ６２６番）。細胞を界面活性剤による溶解に供し、上記酵素に基づく方法を使用して、精製した上清をスクロース濃度についてアッセイした。
【０１４３】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ１６を保持するＬＹＢ４７６の結果は、元の培養物中の細胞の乾燥バイオマスの３０〜５０重量％を占める培地においてスクロースが主に観察されたことを示した。溶解時に細胞から遊離したスクロースの濃度は、培養物中に観察された全スクロースの１０重量％未満に相当した。
【０１４４】
実施例４：シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３またはシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターからのＡＳＦの発現、ならびにシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＲＵＢＩＳＣＯプロモーターからのＳＰＳおよびＳＰＰの共発現
シアノバクテリア由来のリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）は、生物圏において最も豊富に発現されるタンパク質の１つであるため、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターは、最も強力な既知のプロモーターの１つであると考えられる。シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３およびシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２の両方からのこのプロモーターの単離およびクローン化、ならびにスクロースを生成するａｓｆ遺伝子の前への配置が成功裏に達成され、検証された。結果は、恐らくはスクロース生成に向けての資源の過剰な配分に起因して、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの制御下でａｓｆを発現させることによるスクロースの生成が、成長の阻害を導くことを示唆していた。これらの結果はさらに、バイオマスの蓄積期間中にスクロース生成を調節することが必要であることを示唆している。
【０１４５】
（米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるような）プラスミドｐＬｙｂＡＬ１９のλΡRプロモーターおよびＣＩをシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３およびシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターで置換した。オリゴヌクレオチド対ＳｓｐｒｂｃＬ−Ｆ／ＳｓｐｒｂｃＬ−ＲおよびＳｅｌｏｒｂｃＬ−Ｆ／ＳｅｌｏｒｂｃＬ−Ｒをそれぞれ使用して、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３およびシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを全細胞ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ１９にライゲーションし、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３およびシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターのためにｐＬｙｂＡＬ４２およびｐＬｙｂＡＬ４３をそれぞれ作製した。
【０１４６】
（米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるように）三親接合を用いてプラスミドｐＬｙｂＡＬ４２およびｐＬｙｂＡＬ４３をＬＹＢ４７２株に挿入した。しかし、接合完了体が現れ、次いで褐色に変わり、プラスミドを保持する株を大腸菌ドナーおよびヘルパー株から精製するためにそれらを再画線した時点で死滅した。これは過剰なスクロース生成によるものであり得ると考えられた。
【０１４７】
また、相同性組換えスクロース産生系も生成され、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３ＲｕＢｉｓＣｏオペロン（ｒｂｃＬＸＳ）（配列番号２３３）に関連して、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓおよびｓｐｐ遺伝子がシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの後に配置され、推定上のｒｂｃＬＸＳターミネーターによって終結される。Ｃ末端Ｈｉｓ6−タグ化ｓｐｓ翻訳領域は、ｒｂｃＬの開始点から始まりｒｂｃＸの末端で終端していた。Ｃ末端Ｈｉｓ6−タグ化ｓｐｐ翻訳領域でｒｂｃＳを置換した。この構築物を組み立てるために、ｓｐｓ内の１．３ｋｂｐのＸｍａＩ／ＳｐｅＩ断片を除いて隣接するＸｂａＩおよびＰｍｅＩ部位を含む人工オペロンを合成した（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）。このＸｂａＩ／ＰｍｅＩ断片をＸｂａＩおよびＣｌａＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化）で消化したプラスミドｐＬｙｂＡＬ５０（誘導体ｐＬｙｂＡＬ１９）内に配置し、プラスミドｐＬｙｂＡＬ６６を作製した。オリゴヌクレオチドＳｓｐ６８０３ｓｐｓＸＳ−ＦおよびＳｓｐ６８０３ｓｐｓＸＳ−Ｒを用いて、ＰＣＲによりＬＹＢ４６７全細胞ゲノムＤＮＡからｓｐｓのＸｍａＩ／ＳｐｅＩ断片を増幅した。この産物をＸｍａＩおよびＳｐｅＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ６６にライゲーションしてｐＬｙｂＡＬ６７を作製した。
【０１４８】
ｐＬｙｂＡＬ６６およびｐＬｙｂＡＬ６７の両方を三親接合によりＬＹＢ４７２に導入した。ｐＬｙｂＡＬ６６の接合完了体（不完全ｓｐｓを有する）は健康そうに見えた。しかし、ｐＬｙｂＡＬ６７の接合完了体（完全ｓｐｓを有する）は、ｐＬｙｂＡＬ４２およびｐＬｙｂＡＬ４３の接合完了体と同じ挙動を示した。経時的に、ｐＬｙｂＡＬ６７を含むＬＹＢ４７２の緑色コロニーが数個現れた。これらのうちのいくつかを２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＢＧ１１−Ａ中で成長させた。Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、ペレットを再懸濁した後に、ビーズ破砕機にてさらに１分間ガラスビーズで処理した。少量の精製プラスミドＤＮＡを形質転換により大腸菌ＮＥＢ５α（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中に増幅した。ＤＮＡを再びミニプレップし、制限分析に供したところ、いくつかの分離株は元のプラスミドＤＮＡとマッチしなかった。制限分析によって正しく見えた分離株は、恐らくは、非常に小さい欠失／挿入、または点変異のいずれかを含んでいたと考えられる。いずれの場合でも、これらのプラスミドの配列のさらなる分析は行わなかった。
【０１４９】
しかしながら、いくつかのｐＬｙｂＡＬ６７接合完了体をスクロース生成について定性的に分析した。端的に述べると、滅菌した延伸ガラス製ウィスカーチューブを使用して、プラスミドｐＬｙｂＡＬ６６またはｐＬｙｂＡＬ６７のいずれかを保持するＬＹＢ４７２の小さな単離コロニーを寒天プレートから回収し、クロラムフェニコールを添加した５０μリットルのＢＧ１１Ａ培地に移した。次いで、この微小培養物を、懸滴溶液の蒸発による損失を回避するために、無細胞培地のプールの１ｍｌ超の懸滴として滅菌マルチウェルトレー内に配置した。７日後、液滴を回収し、遠心分離によってバイオマスを除去し、スクロースの存在について上清（消費された培養ブロス）をアッセイした。ｐＬｙｂＡＬ６７を保持するＬＹＢ４７２を成長させた培養物に強い比色応答が観察されたのに対し、プラスミドを含まないＬＹＢ４７２またはＬＹＢ４７２のｐＬｙｂＡＬ６６の培養物は、有意な応答を示さなかった。試料中のバイオマスレベルが非常に低いことを考慮すると、これらの試料中のスクロースの定量的アッセイは不可能であったが、定性的分析により、ｐＬｙｂＡＬ６７を保持するＬＹＢ４７２の場合、ａｓｆ遺伝子の上流にある完全に機能的なＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを用いると著しいスクロース生成が観察されたことが示唆された。ｐＬｙｂＡＬ６７を保持するＬＹＢ４７２の量の調節を試みると非常に緩徐な成長が見られたが数日後に停止し、経時的に生存率が損失すると考えられた淡黄色〜白っぽい細胞が得られた。
【０１５０】
実施例５：ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲＵＢＩＳＣＯプロモーターの変異からのエステラーゼ発現
以下の実施例は、ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの変異からのエステラーゼ発現を示す。
【０１５１】
ｐＬｙｂＡＬ４２、ｐＬｙｂＡＬ４３、ｐＬｙｂＡＬ６６、およびｐＬｙｂＡＬ６７の結果は、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーターは、スクロース生成のために十分な酵素を合成することができるかもしれないが、バイオマス蓄積の段階では生成が下方制御される必要があることを示唆していた（実施例３を参照）。さらに、商品を経済的に生産するために、調節は廉価であるべきである。以前の報告は、発現を制御するためにＮｔｃＡが使用されたことを示しているが（例えば、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｈｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｍｕｒｏ−Ｐａｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５を参照）、シネコシスティス種ＰＣＣ６８２３における使用は報告されていない。
【０１５２】
容易にアッセイすることができる単純な酵素系である好熱性カルボキシルエステラーゼ上で、シネコシスティス種ＰＣＣ６８２３におけるＮｔｃａ系を最初に検査した。オリゴヌクレオチドＥ０２０−ＦおよびＥ０２０−Ｒを使用して、翻訳領域にＣ末端Ｈｉｓ6−タグを付加したプラスミドｐＣＥ０２０ＲからＰＣＲにより好熱性カルボキシルエステラーゼ遺伝子を増殖した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＣｌａＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ５０にライゲーションして、ＬｙｂＡＬ５０のａｓｆ遺伝子がエステラーゼ遺伝子で置換されたｐＬｙｂＡＬ６８を作製した。
【０１５３】
次に、ＣＩおよびλＰＲプロモーターを、ノストック種ＰＣＣ７１２０のｒｂｃＬＸＳプロモーターの種々の断片で置換した。全領域、コア＋下流領域、コア＋上流領域、およびコア単独を含む４つの異なる構築物を作製した。ノストック種ＰＣＣ７１２０の精製した染色体のＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号２７８９３Ｄ−５）のＰＣＲ増幅によりこれらの断片を得た（それぞれ、オリゴヌクレオチド対Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｆ１／Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｒ１、Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｆ２／Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｒ１、Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｆ１／Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｒ２、およびＮｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｆ２／Ｎｓｐ７１２０ｒｂｃｐｒｏｍ−Ｒ２）。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ６８にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ６９、ｐＬｙｂＡＬ７０、ｐＬｙｂＡＬ７１、およびｐＬｙｂＡＬ７２をそれぞれ作製した。
【０１５４】
（米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるように）三親接合によりプラスミドをＬＹＢ４７６に導入した。
【０１５５】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ６９（ＬＹＢ  Ｅ０２０遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加した５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。遠心分離により細胞から培地を分離し、細胞を界面活性剤による溶解に供し、ｐ−ニトロフェノールアセテートによる比色アッセイを使用して、精製した上清をエステラーゼ活性についてアッセイした。端的に述べると、１００μΜのｐ−ニトロフェニルアセテート（アセトニトリル中の１ｍＭ原液から）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に分散させた。０．１μｌの粗溶解物の添加により反応を開始させ、加水分解反応から遊離したｐ−ニトロフェニレートの形成は、３４８ｎｍ（ニトロフェノール／ニトロフェニレートイオンの等吸収点）で追跡した。
【０１５６】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ７０（ＬＹＢ  Ｅ０２０遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）の株を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。遠心分離により細胞から培地を分離し、細胞を界面活性剤による溶解に供し、上述のように、ｐ−ニトロフェノールアセテートによる比色アッセイを使用して、精製した上清をエステラーゼ活性についてアッセイした。
【０１５７】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ７１（ＬＹＢ  Ｅ０２０遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）の株を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。遠心分離により細胞から培地を分離し、細胞を界面活性剤による溶解に供し、上述のように、ｐ−ニトロフェノールアセテートによる比色アッセイを使用して、精製した上清をエステラーゼ活性についてアッセイした。
【０１５８】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ７２（ＬＹＢ  Ｅ０２０遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）の株を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μΕの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。遠心分離により細胞から培地を分離し、細胞を界面活性剤による溶解に供し、上述のように、ｐ−ニトロフェノールアセテートによる比色アッセイを使用して、精製した上清をエステラーゼ活性についてアッセイした。
【０１５９】
結果は、カルボキシエステラーゼ遺伝子の発現が、ポリペプチドのカルボキシ末端上に６ＸＨｉｓｉｄｉｎｅタグを含むようにクローン化および遺伝子操作された好熱性エステラーゼに対応することを示した。酵素は極めて安定しており、組換え生物の宿主において可溶性の高い活性酵素として良好に発現されることが示された。酵素活性に関する比色アッセイは、タンパク質発現収率を測定するための極めて感受性の高い定量的手段である。この目的を達成するために、ＮＥ０２０遺伝子を含むプラスミド構築物の検査によって、検査した構築物の全体的なタンパク質の発現に対する明確な応答が得られた。各系で測定された総タンパク量に相関する酵素代謝回転の初期速度を用いることにより、生成された酵素の指標が提供された。さらに、タンパク質に付加した６ＸＨｉｓタグに対して産生させた抗体を使用した溶解バイオマスのウエスタンブロッティング分析により、各試料において発現されたタンパク質のレベルに関する見解が提供され、また、動的アッセイのデータを検証するための手段も提供された。
【０１６０】
実施例６：ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲＵＢＩＳＣＯプロモーターの変異からのＡＳＦの発現
以下の実施例は、ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーターの変異からのＡＳＦ発現を示す。
【０１６１】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ６９、ｐＬｙｂＡＬ７０、ｐＬｙｂＡＬ７１、およびｐＬｙｂＡＬ７２由来のカルボキシエステラーゼ（Ｅ０２０）遺伝子をプラスミドｐＬｙｂＡＬ５０由来のａｓｆ遺伝子（Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを保持する）で置換した。ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩを用いた消化によりｐＬｙｂＡＬ５０中のａｓｆ遺伝子を除去し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ６９、ｐＬｙｂＡＬ７０、ｐＬｙｂＡＬ７１、およびｐＬｙｂＡＬ７２内に配置して、ｐＬｙｂＤＢ２（配列番号１８８）、ｐＬｙｂＤＢ３（配列番号１８９）、ｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）、およびｐＬｙｂＤＢ５（配列番号１９１）をそれぞれ作製した。
【０１６２】
（米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるように）三親接合によりプラスミドをＬＹＢ４７６に導入した。
【０１６３】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ２（配列番号１８８）（ａｓｆ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を４８時間振盪した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１６４】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ３（配列番号１８９）（ａｓｆ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節される切断されたＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１６５】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）（ａｓｆ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節される切断されたＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を４８時間振盪した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１６６】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ５（配列番号１９１）（ａｓｆ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節される切断されたＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を２４時間振盪した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１６７】
ノストック種ＰＣＣ７１２０由来のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列の構造は表１に従った。
表１  ノストック種ＰＣＣ７１２０プロモーターの領域（図３を参照）
【表１】
2014518611.tif 000005
【０１６８】
図３に示される領域は、ｒｂｃＬ（ＲｕＢｉｓＣｏの大きなサブユニット）の第１のコドンを通ってＳｂｆＩ部位が導入された点から始まる。公開されたゲノム（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ８，２０５−２１３）からＤＮＡ配列を採用した。番号付けは転写の開始（＋１）に関連する。小文字は、ＳｂｆＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入するために作製された変異を意味する。プロモーターとして特定された配列は、通常は典型的な大腸菌タイプσ70プロモーターとして特定されるであろう領域を網羅している。−１０コンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）は、転写の開始に関連して特定することができる。ＤＮＡフットプリント分析を使用してＮｔｃＡが２ヶ所でＤＮＡに結合することを示した（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ８，２０５−２１３を参照）。図３で強調されているＮｔｃＡコンセンサス部位１は、ＧＴＮ10ＡＣである。図３で強調されているＮｔｃＡコンセンサス部位２は、ＧＴＮ9ＡＣである。どちらもＡｓおよびＴｓに隣接されている。ＤＮＡフットプリント分析により、第２のタンパク質（第２因子）がプロモーター領域に結合することが示唆されている（Ｒａｍａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７６，１２１４−１２２３を参照）。
【０１６９】
無細胞消費培地でスクロース測定を行い、総乾燥バイオマスに対して基準化し、各試料のバックグラウンドグルコースに対して補正した。
【０１７０】
結果は、窒素によって制御されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを取り囲むセグメント領域全体から構成されるプロモーター構築物では、配列の両方の隣接領域が欠損した構築物と同様に検出可能なスクロースがほとんど得られなかったことを示した。配列の前部領域または後部領域のいずれかが欠失した構築物は、それぞれ、著しいスクロース生成を示した（０．１５〜０．９グラムの糖／乾燥バイオマス１グラム）。アンモニアを含む培養物では、硝酸塩から構成される培養液と比較して糖の収率に３〜５倍の増加が得られ、スクロースの収率が培地の窒素源に依存することが示された。ａｓｆ（６ＸＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグを含む）タンパク質の存在を検出するために行ったウエスタンブロット分析により、単一の前部配列領域または後部配列領域が切断された構築物に測定可能な量のタンパク質が示された：これは、スクロース生成の知見と一致する。アンモニアまたは硝酸塩を含む培地を用いた対照実験により、生物の成長特性に大きな変化をきたすことなく、該生物が窒素源の切り換えに耐えたことが実証された。
【０１７１】
実施例７：ノストック種ＰＣＣ７１２０のＲＵＢＩＳＣＯプロモーターの変異からのＳＰＳ／ＳＰＰ２つの遺伝子のオペロン発現
プラスミドｐＬｙｂＡＬ６９、ｐＬｙｂＡＬ７０、ｐＬｙｂＡＬ７１、およびｐＬｙｂＡＬ７２由来のカルボキシエステラーゼ（Ｅ０２０）遺伝子を、それらのオペロン構造においてプラスミドｐＬｙｂＡＬ６７由来のｓｐｓおよびｓｐｐ遺伝子（それぞれがＣ末端Ｈｉｓ６タグを保持する）で置換した。オリゴヌクレオチドＳＰＳＳＰＰ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ２番およびＳＰＳＳＰＰ  Ｒｅｖｅｒｓｅを用いて、ＰＣＲによりｐＬｙｂＡＬ６７テンプレートからｓｐｓおよびｓｐｐ遺伝子を保持する断片を増幅した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮａｒＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化したプラスミドｐＬｙｂＡＬ６９、ｐＬｙｂＡＬ７０、およびｐＬｙｂＡＬ７２内に配置し、プラスミドｐＬｙｂＤＢ６（配列番号２３５）、ｐＬｙｂＤＢ７（配列番号２３６）、およびｐＬｙｂＤＢ９（配列番号２３７）をそれぞれ作製した。ｐＬｙｂＤＢ８と名付けられたプラスミドｐＬｙｂＡＬ７１（Ｅ０２０）およびｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）（ａｓｆ）のｓｐｓ／ｓｐｐの相当物は、その構築中に遭遇した困難のために破棄された。
【０１７２】
（米国特許出願公開第２００９／０１８１４３４号に記載されるように）三親接合によりプラスミドをＬＹＢ４７６に導入した。
【０１７３】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ６（配列番号２３５）（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓ／ｓｐｐ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を４８時間振盪した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１７４】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ７（配列番号２３６）（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓ／ｓｐｐ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節される切断されたＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を４８時間振盪した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１７５】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ９（配列番号２３７）（シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓ／ｓｐｐ遺伝子の前の、ノストック種ＰＣＣ７１２０由来の窒素によって調節される切断されたＲｕＢｉｓＣｏプロモーター配列）を保持するシネコシスティス種（ＬＹＢ４７６）を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび窒素源として硝酸カリウムの代わりに４ｍＭ塩化アンモニウムを添加し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いてｐＨ８．０に調節した５０ｍｌのＢＧ１１培地中で培養した。白色ＬＥＤを用いて１００μＥの照射下、２５０ＲＰＭで振盪フラスコ中、２８℃で培養を行った。４日間の発酵後、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、１×体積の滅菌脱イオン水で１回洗浄した。ペレット化した細胞を最小限の滅菌水に再分散させ、等しく分割し、４ｍＭ塩化アンモニウムまたは２０ｍＭ硝酸カリウムのいずれかと、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含む、それぞれｐＨ８．０またはｐＨ９．０の２５ｍｌの新しいＢＧ１１培地に播種した。１００ｍＥの照射下、２５０ＲＰＭおよび２８℃で培養物を４８時間振盪した。培地から細胞を分離し、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎの結合酵素バイオアッセイを使用して消費培地中のスクロース含量を分析した。消費培地中のスクロースの量を、培養のバイオマス蓄積段階で用いられたアンモニア消費培地の残留試料に対して行われた同様のスクロース測定値と比較した。対照実験を行って、最終的な誘導培養およびそれに続く最終細胞ペレットの溶解後に、細胞内の残留スクロース含量を測定した。
【０１７６】
無細胞消費培地のスクロース測定を行い、総乾燥バイオマスに対して基準化し、各試料のバックグラウンドグルコースに対して補正した。
【０１７７】
ａｓｆ構築物に関して観察された結果によれば、ｓｐｓ／ｓｐｐ遺伝子上流の窒素によって制御されるＲｕＢｉｓＣｏプロモーターを取り囲むセグメント領域全体から構成されるプロモーター構築物では、検出可能なスクロースがわずかしか得られなかった。配列の両方の隣接領域が欠損した構築物は、中程度のスクロース収率を示した：これは、ａｓｆ構築物に関して得られた結果と矛盾するものである。
【０１７８】
配列の前部セグメントが欠失した構築物を作製する予定であった：しかしながら、配列の後部が欠失した領域に著しいスクロース生成が見られた（０．１５〜０．３グラムの糖／乾燥バイオマス１グラム）。硝酸塩およびアンモニアの両方の窒素源が同様のレベルの糖産生をもたらしたことから、スクロースの収率は窒素源に感受性を示さないことが分かった。スクロースの収率は、ｓｐｓ／ｓｐｐ構築物において比較的著しく減少し、全体的な調節による制御も効果的に実現された。
【０１７９】
実施例８：プラスミドの構築
製造業者によって細胞当たり約２０コピーであると記載される低コピーベクターｐＳＭＡＲＴＧＣ  ＬＫ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）（配列番号１９２）を、大腸菌ＮＥＢ５α（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）における構築のための骨格として初期プラスミドに使用した。その次に、ｐＳＭＡＲＴＧＣ  ＬＫをｐＬＧ３３８（配列番号２０２）（細胞当たり６〜８コピー）で置換した。全てのＰＣＲ増幅は、製造業者（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって記載されるようにＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用して行った。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドＳｓｐｕｐｐｉｎｓ−Ｆ（配列番号１９３）およびＳｓｐｕｐｐｉｎｓ−Ｒ（配列番号１９４）を用いて、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡからシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｕｐｐ座位を増幅し、製造業者によって記載されるようにｐＳＭＡＲＴＧＣ  ＬＫベクターにクローン化し、ｐＬｙｂＡＬ７３ｆ（配列番号１９５）を作製した。遺伝子を分割し、ＦｓｐＩおよびＫｐｎＩでｐＬｙｂＡＬ７３ｆを消化することにより複数のクローン化部位を加え、次いで、リン酸化、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＳｓｐｕｐｐＭＣＳ−Ｆ（配列番号１９６）およびＳｓｐｕｐｐＭＣＳ−Ｒ（配列番号１９７）を挿入し、プラスミドｐＬｙｂＡＬ７４ｆ（配列番号１９８）を得た。次いで、ＦｓｐＩおよびＳｐｈＩでｐＬｙｂＡＬ７４ｆを消化し、リン酸化、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＳｅｌｏ７９４２ｒｂｃＴｅｒｍ−Ｆ（配列番号１９９）およびＳｅｌｏ７９４２ｒｂｃＴｅｒｍ−Ｒ（配列番号２００）にライゲーションすることにより、ｐＬｙｂＡＬ７４ｆからプラスミドｐＬｙｂＡＬ７５ｆ（配列番号２０１）を作製した。こうしてシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏオペロン転写ターミネーターを複数のクローン化部位の前に配置して、ｕｐｐプロモーターによって生成されたリードスルー転写物からのａｓｆ（配列番号１）の発現を防止した。次に、それぞれの産物を直線化し、次いで染色体内に組み込むためにＬＹＢ４７６中に形質転換することができるように、ｐＬｙｂＤＢ３（配列番号１８９）およびｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）からｐＬｙｂＡＬ７５ｆ内にそれぞれのプロモーターと一緒にａｓｆをクローン化する努力が行われたが、正しい産物は得られなかった。
【０１８１】
次いで、さらにコピー数がより少ないベクターｐＬＧ３３８（配列番号２０２）（細胞当たり６〜８コピー）を選択した。ＳｐｈＩを用いた部分的消化、その後のＥｃｏＲＶを用いた消化、ＳｐｈＩ部位を平滑化するためのＴ４ポリメラーゼによる処理、次いで、５．４ｋｂｐのベクターの再ライゲーションにより、ｐＬＧ３３８からプラスミドｐＬｙｂＡＬ７８Ａ（配列番号２０３）を構築した。次いで、ＰｓｈＡＩおよびＮｈｅＩでプラスミドｐＬｙｂＡＬ７８Ａを消化し、次いで、ｐＬｙｂＡＬ７５ｆ（配列番号２０１）由来の転写ターミネーターおよび複数のクローン化部位が介在するシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｕｐｐ座位を保持するＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔ４ポリメラーゼで処理）−ＸｂａＩ断片を挿入し、ｐＬｙｂＡＬ７９（配列番号２０４）を作製した。次いで、ｐＬｙｂＤＢ３（配列番号１８９）およびｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）由来のそれぞれのプロモーターとともにａｓｆを保持するＳｐｈＩ−ＣｌａＩ（Ｔ４ポリメラーゼで処理）断片をＳｐｈＩおよびＮｏｔＩ（Ｔ４ポリメラーゼで処理）で消化したｐＬｙｂＡＬ７９に成功裏に挿入し、ｐＬｙｂＡＬ８０（配列番号２０５）およびｐＬｙｂＡＬ８１（配列番号２０６）をそれぞれ作製した。
【０１８２】
抗生物質耐性マーカーの共組込みによる選択を可能にするために、オリゴヌクレオチドａｓｆｃｍｌｉｎｔ−Ｆ（配列番号２４２）およびａｓｆｃｍｌｉｎｔ−Ｒ（配列番号２４３）を使用して増幅し、ＳａｃＩＩで消化したｐＫＤ３２（配列番号２４１）由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をｓａｃＩＩ部位に挿入することにより、ｐＬｙｂＡＬ７９、ｐＬｙｂＡＬ８０、およびｐＬｙｂＡＬ８１から、プラスミドｐＬｙｂＥＡ８（配列番号２３８）、ｐＬｙｂＥＡ９（配列番号２３９）、およびｐＬｙｂＥＡ１０（配列番号２４０）をそれぞれ作製した。こうして、転写ターミネーターが介在しない、ａｓｆ遺伝子および下流クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が収束的に転写されたプラスミドを得た。ＳａｃＩＩで消化および再ライゲーションすることにより、プラスミドｐＬｙｂＥＡ８、ｐＬｙｂＥＡ９、およびｐＬｙｂＥＡ１０の配向とは反対の配向でクロラムフェニコール耐性マーカーを含むプラスミドを構築し、プラスミドｐＬｙｂＡＬ８４（配列番号２４４）、ｐＬｙｂＡＬ８５（配列番号２４５）、およびｐＬｙｂＡＬ８６（配列番号２４６）をそれぞれ作製した。
【０１８３】
インベルターゼの座位で組み込むためのベクターの構築は、プラスミドｐＬｙｂＡＬ８７ｂ（配列番号２４７）から始まった。複数のクローン化部位が介在するインベルターゼの座位を保持するＰＣＲ産物を挿入することにより、ｐＬｙｂＥＡ８からプラスミドｐＬｙｂＡＬ８７ｂを作製した。オリゴヌクレオチドＳｓｐｉｎｖｉｎｔ−Ｆ（配列番号２４８）およびＳｓｐｉｎｖｉｎｔ−Ｒ（配列番号２４９）を用いたシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３野生型染色体のＤＮＡの連続ＰＣＲ、続いて、第１の反応産物およびプライマーとしてオリゴヌクレオチドＳｓｐｉｎｖｉｎｔ−Ｒ２（配列番号２５０）を使用した二次増幅により、このＰＣＲ産物を作成した。この最終ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、１．４ｋｂｐの産物をｐＬｙｂＥＡ８のＥｃｏＲＩ断片（４．９ｋｂｐ）に挿入することで、その介在する複数のクローン化部位およびクロラムフェニコール耐性マーカーとともにｕｐｐ座位を置換した。再び、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のＲｕＢｉｓＣｏオペロン転写ターミネーターを複数のクローン化部位の上流に配置して、上流プロモーターによるａｓｆ遺伝子のリードスルー転写を防止した。ＮｏｔＩおよびＳｐｈＩでプラスミドｐＬｙｂＡＬ８７ｂを消化し、リン酸化、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＳｅｌｏ７９４２ｒｂｃＴｅｒｍ−Ｆ２（配列番号２５１）およびＳｅｌｏ７９４２ｒｂｃＴｅｒｍ−Ｒ２（配列番号２５２）を挿入し、ｐＬｙｂＡＬ８８ｂ（配列番号２５３）を作製した。最終構築物のａｓｆ遺伝子の前に配置されたプロモーターからクロラムフェニコール耐性マーカーが不必要にさらに発現するのを回避するために、プラスミドｐＬｙｂＡＬ８５（配列番号２４５）のａｓｆ遺伝子とクロラムフェニコール耐性マーカーとの間に転写ターミネーターも配置した。ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩの両方を用いてプラスミドｐＬｙｂＡＬ８５を部分的に消化し、次いで、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のｐｓｂＡＩＩ転写ターミネーターを含む、リン酸化、アニーリングしたオリゴヌクレオチドＳｅｌｏ７９４２ＡＩＩＴｅｒｍ−Ｆ（配列番号２５４）およびＳｅｌｏ７９４２ＡＩＩＴｅｒｍ−Ｒ（配列番号２５５）を９．５ｋｂｐのベクターに挿入し、ｐＬｙｂＡＬ８９（配列番号２５６）を作製した。プラスミドｐＬｙｂＡＬ８８ｂおよびｐＬｙｂＡＬ８９を組み合わせてｐＬｙｂＡＬ９０（配列番号２５７）を作製した。ｐＬｙｂＡＬ８９由来の３．９ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ断片をｐＬｙｂＡＬ８８ｂ由来の６．３ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ断片にライゲーションした。次いで、プラスミドｐＬｙｂＡＬ８６由来の０．３７ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＬｙｂＡＬ９０由来の９．６ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片と組み合わせてｐＬｙｂＡＬ９１（配列番号２５８）を作製した。プラスミドｐＬｙｂＡＬ９１は、転写ターミネーターによって分割されたインベルターゼの座位、ｐＬｙｂＤＢ４由来のノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター断片、ａｓｆ、別の転写ターミネーター、そしてａｓｆと同じ方向に転写されたその独自のプロモーターを有するクロラムフェニコール耐性マーカーを含む。
【０１８４】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ８８ｂのインベルターゼの座位を、菌体外多糖の座位と２段階で交換した。最初に、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３野生型染色体のＤＮＡをオリゴヌクレオチドＳｓｐＥＰＳｉｎｔ−Ｆ（配列番号２５９）およびＳｓｐＥＰＳｉｎｔ−Ｒ（配列番号２６０）を用いて増殖した。この反応の０．６７ｋｂｐの産物をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ８８ｂの５．７ｋｂｐ断片にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ９３（配列番号２６１）を形成した。次に、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３野生型染色体のＤＮＡをオリゴヌクレオチドＳｓｐＥＰＳｉｎｔ−Ｆ２（配列番号２６２）およびＳｓｐＥＰＳｉｎｔ−Ｒ２（配列番号２６３）を用いて増殖した。この反応の１．１ｋｂｐの産物をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ９３の５．６ｋｂｐ断片にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ９４（配列番号２６４）を形成した。次いで、ｐＬｙｂＡＬ９４の６．７ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ断片を、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ９１の３．６ｋｂｐ断片とライゲーションすることにより、プラスミドｐＬｙｂＡＬ９８（配列番号２６５）を作製した。プラスミドｐＬｙｂＡＬ９８は、転写ターミネーターによって分割された菌体外多糖の座位、ｐＬｙｂＤＢ４由来のノストック種ＰＣＣ７１２０のＲｕＢｉｓＣｏプロモーター断片、ａｓｆ、別の転写ターミネーター、そしてａｓｆと同じ方向に転写されたその独自のプロモーターを有するクロラムフェニコール耐性マーカーを含む。
【０１８５】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ９４の菌体外多糖の座位を、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓ座位と２段階で交換した。最初に、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３野生型染色体のＤＮＡをオリゴヌクレオチドＳｓｐｓｐｓｉｎｔ−Ｆ（配列番号２６６）およびＳｓｐｓｐｓｉｎｔ−Ｒ（配列番号２６７）を用いて増殖した。この反応の１．３ｋｂｐの産物をＲｓｒＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ９４の５．６ｋｂｐ断片にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ９５（配列番号２６８）を形成した。次に、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３野生型染色体のＤＮＡをオリゴヌクレオチドＳｓｐｓｐｓｉｎｔ−Ｆ２（配列番号２６９）およびＳｓｐｓｐｓｉｎｔ−Ｒ２（配列番号２７０）を用いて増殖した。この反応の０．９２ｋｂｐの産物をＭｒｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ９５の６．３ｋｂｐ断片にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ９６（配列番号２７１）を形成した。
【０１８６】
カナマイシン抵抗性マーカーをシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｓｐｓ座位に組み込むと同時に、硝酸塩誘導性窒素レギュロン調節タンパク質およびインベルターゼ遺伝子をそれぞれ組み込むために、プラスミドｐＬｙｂＡＬ１０６（配列番号２７２）およびｐＬｙｂＡＬ１０７（配列番号２７３）を構築した。最初に、ＭｌｕＩを用いた消化および８．７ｋｂｐ断片の追放によりｐＬｙｂＡＬ９０のカナマイシン抵抗性マーカーを欠失させ、ｐＬｙｂＡＬ１００（配列番号２７４）を作製した。次いで、ｐＬｙｂＡＬ１００のクロラムフェニコール耐性マーカーをｐＫＤ１３（配列番号２７５）のカナマイシン抵抗性マーカーで置換した。ｐＫＤ１３のカナマイシン抵抗性マーカーをオリゴヌクレオチドｎｅｏｆｌｐｉｎｔ−Ｆ（配列番号２７６）およびａｓｆｃｍｌｉｎｔ−Ｒ（ａ）（配列番号２７７）を用いて増殖した。１．３ｋｂｐの産物をＰａｃＩおよびＳａｃＩＩで消化し、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ１００の７．７ｋｂｐ断片にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ１０１（配列番号２７８）を作製した。シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来のｎｉｒＡプロモーター（配列番号３２）、その後にシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来のｎｔｃＡおよびｎｔｃＢ（ＰｎｉｒＡ＿ｎｔｃＡ＿ｎｔｃＢ）（配列番号２７９）またはインベルターゼ（ＰｎｉｒＡ＿ｌｉｍ１７）（配列番号２８０）遺伝子のいずれかを含む断片をＢｌｕｅｈｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で合成した。誤った染色体の組換えを制限するために、シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３由来の遺伝子の代わりにシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２由来の遺伝子を使用した。これらの断片（１．９および１．７ｋｂｐ）をＳｂｆＩおよびＰｍｅＩで消化し、ｐＬｙｂＡＬ１０１の６．２ｋｂｐ断片内に配置して、ｐＬｙｂＡＬ１０２（配列番号２８１）およびｐＬｙｂＡＬ１０３（配列番号２８２）をそれぞれ作製した。ｓｐｓ座位に組み込むために、ｐＬｙｂＡＬ１０２およびｐＬｙｂＡＬ１０３由来の硝酸塩誘導性遺伝子およびカナマイシン抵抗性マーカーをｐＬｙｂＡＬ９６と組み合わせた。ｐＬｙｂＡＬ１０２およびｐＬｙｂＡＬ１０３由来の３．２ｋｂｐおよび３．１ｋｂｐのＳｂｆＩ−ＳａｃＩＩ断片を、同様に消化したｐＬｙｂＡＬ９６の７．２ｋｂｐ断片にライゲーションし、ｐＬｙｂＡＬ１０６（配列番号２７２）およびｐＬｙｂＡＬ１０７（配列番号２７３）をそれぞれ得た。
【０１８７】
実施例９：組込み
シネコシスティス種ＰＣＣ６８０３の株への組込みのために、ＢＧ１１−Ａ（ＨＥＰＥＳを用いてｐＨ８．０、またはＣＨＥＳを用いてｐＨ９．０のいずれかに緩衝した）にて約０．４のＯＤ730まで細胞を成長させ、遠心分離によりペレット化し、次いで、新しい培地に２．５のＯＤ730まで再懸濁した。ＣＨＥＳを用いてｐＨ９．０に緩衝した場合により良好な成長が観察されたが、ネオマイシンおよび５−フルオロウラシル等の塩基感受性化合物を培地に添加した場合は、ｐＨ８．０のＨＥＰＥＳを使用した。２〜１０μｇのＤＮＡ（ＡｆｌＩＩおよびＭｌｕＩで直線化した）を５００μｌのこの細胞懸濁液と混合することにより形質転換を行い、透明なプラスチック製チューブ内にて光の下で３時間インキュベートし、混合し、次いでさらに３時間インキュベートした。次いで、０．３％チオ硫酸ナトリウムを含むＢＧ１１−Ａ寒天プレートに細胞懸濁液を適用した。絶えず照射下にてプレートを一晩インキュベートした。細胞を播種した時から２４時間後、プレート上の寒天を持ち上げ、寒天の下に抗生物質の５０％を適用した。３６時間後に、残りの５０％の抗生物質を適用した。クロラムフェニコール、ネオマイシン、および５−フルオロウラシルの最終濃度は、それぞれ、２５、２５、および１μｇ／ｍｌであった。抗生物質を含むプレート上に候補を再画線し、次いでコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。完全な分離が観察されるまでこのプロセスを繰り返した。完全に分離した時点で、今度は抗生物質の不在下で、再び候補を再画線した。コロニーＰＣＲにより候補を再びスクリーニングし、完全な分離が維持されていると判断した。
【０１８８】
組換え領域外のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより組込みを分析した。オリゴヌクレオチドＳｓｐｕｐｐｉｎｔｓｃｒｎ−Ｆ（配列番号２８３）およびＳｓｐｕｐｐｉｎｔｓｃｒｎ−Ｒ（配列番号２８４）を用いてｕｐｐ座位における組込みをスクリーニングした。ＬＹＢ４７６株に見られるような野生型ｕｐｐは、０．８９ｋｂｐの産物を生じた。ｐＬｙｂＡＬ８１（配列番号２０６）、ｐＬｙｂＥＡ８（配列番号２３８）、ｐＬｙｂＥＡ１０（配列番号２４０）、ｐＬｙｂＡＬ８４（配列番号２４４）、およびｐＬｙｂＡＬ８６（配列番号２４６）を用いた適切な組込みは、それぞれ、３．４、２．０、４．５、２．０、および４．５ｋｂｐの産物を生じた。オリゴヌクレオチドＳｓｐｉｎｖｄｅｌｓｃｒｅｅｎ−Ｆ（配列番号１５３）およびＳｓｐｉｎｖｄｅｌｓｃｒｅｅｎ−Ｒ（配列番号１５４）を用いてインベルターゼ（ｌｉｍ１７）の座位における組込みをスクリーニングした。ＬＹＢ４７６株からのインベルターゼの座位の増幅により２．６ｋｂｐの産物を得た。ｐＬｙｂＡＬ９１（配列番号２５８）を用いた適切な組込みにより５．３ｋｂｐの産物を得た。オリゴヌクレオチドＥＰＳＫＯｓｃｒｅｅｎ−Ｆ（配列番号１６７）およびＥＰＳＫＯｓｃｒｅｅｎ−Ｒ（配列番号１６８）を用いて菌体外多糖の座位における組込みをスクリーニングした。ＬＹＢ４７６株からの菌体外多糖の座位の増幅により３．２ｋｂｐの産物が得られた。ｐＬｙｂＡＬ９８（配列番号２６５）を用いた適切な組込みにより５．６ｋｂｐの産物が得られた。オリゴヌクレオチドＳｓｐ６８０３ｓｐｓｓｃｒｅｅｎ−Ｆ（配列番号２８５）およびＳｓｐ６８０３ｓｐｓｓｃｒｅｅｎ−Ｒ（配列番号２８６）を用いてｓｐｓ座位における組込みをスクリーニングした。ＬＹＢ４７６株に見られるような野生型ｓｐｓは、４．０ｋｂｐの産物を生じた。プラスミドｐＬｙｂＡＬ１０６（配列番号２７２）およびｐＬｙｂＡＬ１０７（配列番号２７３）を用いた適切な組込みにより、それぞれ５．６ｋｂｐおよび５．４ｋｂｐの産物が得られた。
【０１８９】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ１０６およびｐＬｙｂＡＬ１０７を直線化し、ＬＹＢ４７６株に形質転換し、それぞれＬＹＢ５０９およびＬＹＢ５１０を得た。プラスミドｐＬｙｂＡＬ９８を直線化し、ＬＹＢ５０９およびＬＹＢ５１０に形質転換し、それぞれ、ＬＹＢ５１１およびＬＹＢ５１２を得た。
【０１９０】
ｕｐｐ座位におけるａｓｆの組込み
ｐＬｙｂＡＬ８１を使用してシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３のｕｐｐ座位にａｓｆを組み込むという試みがなされたが、成功しなかった。プラスミドｐＬｙｂＡＬ８１（配列番号２０６）をＡｆｌＩＩおよびＭｌｕＩで直線化し、ＬＹＢ４７６に形質転換し、次いで、１μｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを含むＢＧ１１−Ａプレート上で形質転換体を選択した。オリゴヌクレオチドＳｓｐｕｐｐｉｎｔｓｃｒｎ−Ｆ（配列番号２８３）およびＳｓｐｕｐｐｉｎｔｓｃｒｎ−Ｒ（配列番号２８４）を使用して、ＰＣＲ増幅によりゲノムＤＮＡから候補をスクリーニングした。適切な組込みは、野生型０．８９ｋｂｐの代わりに３．４ｋｂｐのＰＣＲ産物を生じた。得られた５−フルオロウラシル耐性候補からのゲノムＤＮＡの増幅によるＰＣＲ産物は、野生型ＤＮＡの大きさであった。これらの候補は、ａｓｆの組込みの代わりに、ｕｐｐ座位または別の座位における５−フルオロウラシル耐性変異株の自然選択から生じた可能性がある。しかしながら、それらは特徴づけされなかった。
【０１９１】
プラスミドｐＬｙｂＥＡ８（配列番号２３８）およびｐＬｙｂＥＡ１０（配列番号２４０）を使用した抗生物質耐性マーカーの共組込みにより、ｕｐｐ座位におけるａｓｆの組込みを選択することが決定された。プラスミドｐＬｙｂＥＡ８がクロラムフェニコール耐性マーカーのみを含むのに対し、ｐＬｙｂＥＡ１０は、プラスミドｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）に見られるノストックＰＣＣ７１２０のｒｕｂｉｓｃｏプロモーター断片から転写されたａｓｆ遺伝子も含む。コロニーは、ａｓｆ遺伝子を欠損したプラスミドである直線化したｐＬｙｂＥＡ８を用いたＬＹＢ４７６の形質転換からのみ得られた。プライマーｓｓｐｕｐｐｉｎｔｓｃｒｎ−Ｆ（配列番号２８３）およびｓｓｐｕｐｐｉｎｔｓｃｒｎ−Ｒ（配列番号２８４）を用いて、ＰＣＲによりｕｐｐ座位を分析した。適切な組込みは、野生型０．８９ｋｂｐの代わりに２．０ｋｂｐのＤＮＡ片を生成するはずである。野生型および組込み体断片の両方が検出されたことから、不完全な分離が示唆された。抗生物質の選択による反復的な再画線によって完全な分離を生じさせることはできなかった。ａｓｆを含むプラスミドであるｐＬｙｂＥＡ１０の形質転換ではコロニーは得られなかった。
【０１９２】
クロラムフェニコール耐性マーカーの適切な発現がａｓｆの組込みを得るための問題ではなかったことを確認するために、ｐＬｙｂＡＬ８４（配列番号２４４）およびｐＬｙｂＡＬ８６（配列番号２４６）のそれぞれにおいてプラスミドｐＬｙｂＥＡ８およびｐＬｙｂＥＡ１０のマーカーの配向を逆向きにした。ａｓｆの強力な発現が下流の収束性ｃａｔ遺伝子の発現を減衰させるかもしれないことが予測された。しかしながら、同様の結果が得られた。
【０１９３】
インベルターゼおよび菌体外多糖の座位におけるａｓｆの組込み
以前の研究から、これらの遺伝子の欠失の完全な分離は問題ではなかったことが分かっていたため、インベルターゼおよび菌体外多糖の座位における組込みを選択し、ｕｐｐ座位における組込みを中止した。染色体上のインベルターゼ（ｌｉｍ１７）の座位および大きなプラスミドｐＳＹＳＭ上に位置する菌体外多糖の座位にａｓｆ遺伝子を組み込むために、直線化したｐＬｙｂＡＬ９１（配列番号２５８）およびｐＬｙｂＡＬ９８（配列番号２６５）を用いてＬＹＢ４７６を形質転換した。組込み手順により、その時は現れ始めたがすぐに死滅した、非常に小さなコロニーを得た。
【０１９４】
修飾された宿主におけるインベルターゼおよび菌体外多糖の座位におけるａｓｆの組込み
組込みが成功しないのは、たとえ硝酸塩を含む培地で成長させた場合であっても発現されるＡＳＦによるスクロース生成の結果ではないかと考えられた。プラスミドｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）に関する以前の結果により、非誘導条件下にあっても発現は完全に停止されないことが示された。これは、ａｓｆ発現の基本レベルを減少させるか（過剰なＮｔｃＡおよびＮｔｃＢの添加）または毒性の原因となるスクロースの分解（インベルターゼ活性の付加）によってスクロースの毒性（恐らくは深刻な浸透圧の不均衡による）を低下させようとする努力に至った。硝酸塩上で成長する間は誘導されるが、アンモニア上で成長する間は抑制されるシネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２のｎｉｒＡ  プロモーターの後に、これらのタンパク質をコードする遺伝子を配置した。プラスミドｐＬｙｂＡＬ１０６（配列番号２７２）およびｐＬｙｂＡＬ１０７（配列番号２７３）を使用して、これらの構築物をｓｐｓ座位に組み込み、ＬＹＢ５０９株よびＬＹＢ５１０株を得た。これらの株は、いずれの困難も伴わずに構築された。
【０１９５】
プラスミドｐＬｙｂＡＬ９１（配列番号２５８）を用いたＬＹＢ５０９株およびＬＹＢ５１０株のインベルターゼの座位におけるａｓｆの組込みはなおも不成功であった。しかしながら、これらの株におけるプラスミドｐＬｙｂＡＬ９８（配列番号２６５）を用いた菌体外多糖の座位におけるａｓｆの組込みにより、それぞれＬＹＢ５１１およびＬＹＢ５１２を得た。
【０１９６】
プラスミドｐＬｙｂＤＢ４（配列番号１９０）を保持するＬＹＢ４７６からの以前のデータによれば、尿素の誘導に応答してスクロース生成の増加が示されている。尿素によって誘導される細胞は、硝酸塩中で成長させた細胞よりも約３倍多くのスクロースを分泌した。我々の結果は、ＬＹＢ５１１ａｓｆ組込み体も、尿素の誘導に応答してスクロースを分泌することを示している。ＬＹＢ５１１は、硝酸塩よりも尿素に応答して、スクロースの分泌において４〜５倍の増加を示した。興味深いことに、尿素で処理したＬＹＢ５１１は、尿素で処理したｐＬｙｂＤＢ４を保持するＬＹＢ４７６よりも４倍多くのスクロースを分泌した。さらに、硝酸塩で処理したＬＹＢ５１１も、硝酸塩で処理したｐＬｙｂＤＢ４を保持するＬＹＢ４７６よりも３倍多くのスクロースを分泌した。これらの結果は、プラスミド由来の外来性であるａｓｆの発現と比較して、ａｓｆ組込み体が全体的により多くのスクロースを生成することを示唆している。細胞溶解物から得られたスクロースの量は、全試料間で同様であった。これらの結果は、細胞は分泌前の内部スクロースの有限濃度にのみ耐えることができることを示唆している。スクロースアッセイの結果も、ａｓｆ遺伝子の安定した内在性発現を暗示している。
【０１９７】
ＬＹＢ５１２株は、尿素に応答したスクロース生成の増加を示さなかった。さらなるインベルターゼ発現の窒素調節による制御には漏れがあるか、またはインベルターゼは経時的に非常に安定しているかのいずれかでなければならない。
【０１９８】
実施例１０：液相フォトバイオリアクターにおける組み込まれた窒素によって制御されるスクロース生成
ＬＹＢ５１１株をＢＧ１１寒天培地上で培養し、単一コロニーを５０ｍｌの液体ＢＧ１１培地に移し、培養物が７３０ｎｍの光学密度測定値によって判定される対数期成長に至ったと判断されるまで（通常３〜４日）、５０マイクロアインシュタインの白色光下、２５０ＲＰＭ、３０℃で振盪させた。３０℃に維持した５００ｍｌの撹拌したＢＧ１１培養ブロスに対数期の培養物を無菌的に移し、１５０マイクロアインシュタインの白色蛍光下、１分当たり１体積の濾過空気で通気した。培養物が中対数期成長に達した時点で、遠心分離により細胞を無菌的に回収し、脱イオン水で１回洗浄した。細胞ペレットを１０ｍｌの脱イオン水に分散させ、５ｍｌを２０ｍＭ硝酸ナトリウムまたは１０ｍＭ尿素を添加した５００ｍｌのＢＧ１１培養ブロスに導入した。１５０マイクロアインシュタインの白色蛍光下、撹拌しながら、かつ１分当たり１体積で通気しながら、３０℃で培養物を成長させた。４日間にわたって毎日１０ｍｌの培養ブロスを除去し、ｐＨ、バイオマス密度、およびスクロース濃度を測定した。
【０１９９】
結果は、窒素源として硝酸ナトリウムを含む培養物では、４日間の試験中にバイオマス蓄積が２．２５倍増加し、ピークスクロース濃度は９．３マイクロモルであったことを示した。窒素源として尿素を含む培養物では、４日間の試験中にバイオマス蓄積はわずか１．２倍増加したのみであり、ピークスクロース濃度は８３マイクロモルであった。両方の培養物において、ｐＨは７から７．８に徐々に増加した。
【０２００】
実施例１１：固相フォトバイオリアクターにおけるプラスミドに基づいた窒素によって調節されるスクロースの生成
プラスミドｐＬｙｂＤＢ４を保持するＬＹＢ４７６株をＢＧ１１寒天培地上で培養し、単一コロニーを５０ｍｌの液体ＢＧ１１培地に移し、培養物が７３０ｎｍの光学密度測定値によって判定される対数期成長に至ったと判断されるまで（通常３〜４日）、５０マイクロアインシュタインの白色光下、２５０ＲＰＭ、３０℃で振盪させた。３０℃に維持した３０００ｍｌの撹拌したＢＧ１１培養ブロスに対数期の培養物を無菌的に移し、１５０マイクロアインシュタインの白色蛍光下、１分当たり１体積の濾過空気で通気した。
【０２０１】
培養物が中対数期成長に達した時点で、細胞を無菌トラフに無菌的に移した。６平方インチの大きさの（米国特許出願第２００９０１８１４３４号に記載されるような）固相フォトバイオリアクターの布をトラフに沈め、暗所にて室温で一晩インキュベートさせた。ガスおよび培地配管が装着された状態で固相フォトバイオリアクター内に布を無菌的に設置した。ガス源は濾過された大気であり、１分当たり０．１リットルで導入された。１分当たり０．２ｍｌの流速で１５分能動的にポンピングして、４時間の一定間隔で反応器に培地を導入した。１５０マイクロアインシュタインの白色蛍光下、３０℃で培養物を成長させた。初期培地は、窒素源として２０ｍＭ硝酸ナトリウムを含むＢＧ１１から構成され、５日後に、窒素源として１０ｍＭ尿素を含むＢＧ１１に切り替えられ、７日間にわたって発酵を継続した。試験期間にわたって毎日１０ｍｌの培養ブロスを除去し、ｐＨおよびスクロース濃度を測定した。培養中、回収された流出液のｐＨは７．２のままであった。
【０２０２】
結果は、硝酸塩相供給中のピークスクロース生成では、８．８ｍＭスクロースの濃度で０．１６ミリモルを得たことを示した。尿素相供給中のピークスクロース生成では、５２ｍＭスクロースの濃度で０．９４ミリモルを得た。
【０２０３】
実施例１２：固相フォトバイオリアクターにおける組み込まれた窒素によって調節されるスクロース生成
ＬＹＢ５１１株をＢＧ１１寒天培地上で培養し、単一コロニーを５０ｍｌの液体ＢＧ１１培地に移し、培養物が７３０ｎｍの光学密度測定値によって判定される対数期成長に至ったと判断されるまで（通常３〜４日）、５０マイクロアインシュタインの白色光下、２５０ＲＰＭ、３０℃で振盪させた。３０℃に維持した３０００ｍｌの撹拌したＢＧ１１培養ブロスに対数期の培養物を無菌的に移し、１５０マイクロアインシュタインの白色蛍光下、１分当たり１体積の濾過空気で通気した。培養物が中対数期成長に達した時点で、細胞を無菌トラフに無菌的に移した。６インチ×６インチの大きさの（特許出願第２００９０１８１４３４号に記載されるような）固相フォトバイオリアクターの布をトラフに沈め、暗所にて室温で一晩インキュベートさせた。ガスおよび培地配管が装着された状態で固相フォトバイオリアクター内に布を無菌的に設置した。ガス源は濾過された大気であり、１分当たり０．１リットルで導入された。１分当たり０．２ｍｌの流速で１５分能動的にポンピングして、４時間の一定間隔で反応器に培地を導入した。１５０マイクロアインシュタインの白色蛍光下、３０℃で培養物を成長させた。初期培地は、窒素源として２０ｍＭ硝酸ナトリウムを含むＢＧ１１から構成され、５日後に、窒素源として１０ｍＭ尿素を含むＢＧ１１に切り替えられ、７日間にわたって発酵を継続した。試験期間にわたって毎日１０ｍｌの培養ブロスを除去し、ｐＨおよびスクロース濃度を測定した。培養中、回収された流出液のｐＨは７．２のままであった。
【０２０４】
結果は、硝酸塩相供給中のピークスクロース生成では、１８ｍＭスクロースの濃度で０．３２ミリモルを得たことを示した。尿素相供給中のピークスクロース生成では、９１ｍＭスクロースの濃度で１．６ミリモルを得た。
【０２０５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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