(57)【要約】本出願は、リンカーを介して付着した標識を含む標識ヌクレオチドを開示し、その標識ヌクレオチドは、以下の式を有し、式中、Ｒ１は、リン酸基および硫酸基からなる群より好ましくは選択される、正味の負電荷を有する残基であり；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ２、ＯＨ２、およびＯからなる群より選択され；「ｎ」は、０〜１６の整数であり；「ａ」は、１〜１０の整数であり；ＳＰは、存在しないか、またはスペーサーであり；Ｘは、前記標識であり；Ｙは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドである。本明細書ではさらに、本発明に従う標識ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、および増幅ベースの方法におけるプライマーとしての使用が開示される。2014515920.tif 000009
2014515920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介して付着した標識を含む標識ヌクレオチドであって、前記標識ヌクレオチドは、式：
【化４】
2014515920.tif 000008
を有し、式中、
Ｒ１は、リン酸基および硫酸基からなる群より好ましくは選択される、正味の負電荷を有する残基であり；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ２、ＯＨ２、およびＯからなる群より選択され；
「ｎ」は、０〜１６の整数であり；
「ａ」は、１〜１０の整数であり；
ＳＰは、存在しないか、またはスペーサーであり；
Ｘは、前記標識であり；
Ｙは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドである、
標識ヌクレオチド。
【請求項２】
Ｒ１がリン酸基である、請求項１に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項３】
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２である、請求項１または２に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項４】
ｎが１であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、かつ「ａ」が２である、請求項１から３のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項５】
Ｘが、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、および化学発光物質、または酵素からなる標識の群より選択され、好ましくは、５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素、例えば、ＣＹ３（商標）、ＣＹ５（商標）、ＣＹ３．５（商標）、ＣＹ５．５（商標）、Ｃｙ７（商標）、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロ−フルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ（登録商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（６−ｃａｒｂｏｘｙ−４’，５’−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２’，７’−ｄｉｍｅｔｈｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＪＯＥ（商標））、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  ６Ｇ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ウンベリフェロンなどのクマリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８などのベンズイミド；フェナントリジン、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＰＥＴ（登録商標）、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎ）色素、Ａｔｔｏ  ３９０、Ａｔｔｏ  ４２５、Ａｔｔｏ  ４６５、Ａｔｔｏ  ４８８、Ａｔｔｏ  ４９５、Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｔｔｏ  ５６５、Ａｔｔｏ  ５９０、Ａｔｔｏ  ５９４、Ａｔｔｏ  ６２０、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｔｔｏ  ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ＲｈｏＧ６、Ａｔｔｏ  Ｒｈｏ１１、Ａｔｔｏ  Ｒｈｏ１２、Ａｔｔｏ  Ｒｈｏ１０１、ＢＭＮ（商標）−５、ＢＭＮ（商標）−６、ＣＥＱ８０００  Ｄ２、ＣＥＱ８０００  Ｄ３、ＣＥ���８０００  Ｄ４、ＤＹ−４８０ＸＬ、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＤＹ−４９５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５３０、ＤＹ−５４７、ＤＹ−５５０、ＤＹ−５５５、ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５１、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７７６、ＤＹ−７８０、ＤＹ−７８１、ＤＹ−７８２、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  ＲＥＤ  ５９０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、６−（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジフェニル−３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−６−カルボキサミド）−ヘキシル−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（ＳＩＭＡ）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、ＬＩＺ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  Ｒｅｄ、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６１０、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６４０、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６７０、およびＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）７０５からなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項６】
Ｙが、リボースヌクレオチド、２’−デオキシリボースヌクレオチド、２’，３’−ジ−デオキシ−リボースヌクレオチド、一リン酸ヌクレオシド、二リン酸ヌクレオシド、および三リン酸ヌクレオシドからなる群より選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項７】
Ｙが、プリンヌクレオチドおよびピリミジンヌクレオチドからなる群より選択され、好ましくは、アデニンヌクレオチド、チミジンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、ウリジンヌクレオチド、７−メチル−グアニンヌクレオチド、５−メチル−シトシンヌクレオチド、イノシンヌクレオチド、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イノシン、キサントシン（ｘａｎｔｈｉｎｏｓｉｎｅ）、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および５−メチルシチジン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項８】
保護基をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの標識ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの５’端または前記オリゴヌクレオチドの３’端にある、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの標識ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの内部位置にある、請求項９または１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１３】
核酸増幅方法におけるプライマーとして、またはハイブリダイゼーションプローブとしての、請求項９から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１２に記載のキットの使用。
【請求項１４】
核酸を配列決定するかまたは増幅し、そして検出するための方法であって、前記方法は：
ｉ）請求項１から８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたは核酸プライマーを提供するステップと、
ｉｉ）前記少なくとも１つの核酸プライマーを用いて、標的核酸を増幅するための酵素および試薬を提供するステップと、
ｉｉｉ）標的核酸プライマーの増幅に適する条件下で反応の成分をインキュベートするステップと、
ｉｖ）前記標識ヌクレオチドの標識を介して、増幅された核酸を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップｉｖ）が、前記増幅された核酸をそれらの長さに従い分離するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学の分野にあり、より具体的には、分子生物学の分野にある。より特定すれば、本発明は、核酸増幅ならびに好ましいＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子の検出の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
今日、ＤＮＡなど、核酸の増幅および検出は、異なる手法において用いられる。多くの日常的な診断法では、増幅された核酸の解析を、キャピラリー電気泳動を介して実行する。この方法では、ＤＮＡ分子の長さに従い分析物を分離し、蛍光標識を介してそれらを検出する。結果として得られる電気泳動図では、ピークにより、特定の長さのＤＮＡ分子を同定する。しかし、分解産物またはプライマーなどのアーチファクトに起因する、ベースラインを上回る小さなピーク（バックグラウンドピーク）が、感度の喪失を結果としてもたらすと考えられる。これらのバックグラウンドピークは、遊離蛍光標識および／または標識を含む短鎖オリゴヌクレオチド（１〜８塩基）を表す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の根底をなす１つの問題は、バックグラウンドピークを低減し、検出感度を増大させるように、安定性を増大させた標識オリゴヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用であって、前記オリゴヌクレオチドが、本明細書の下記で開示される、負に荷電した残基を含むＣリンカーを介して標識へと付着されたヌクレオチドを含む使用により、増幅産物の解析におけるバックグラウンドピークが低減されることを予測外に見出した。よって、本発明は、リンカーを介して付着した標識を含む標識ヌクレオチドに関し、この標識ヌクレオチドは、式：
【０００５】
【化１】
2014515920.tif 000003
を有し、式中、
Ｒ１は、リン酸基および硫酸基からなる群より好ましくは選択される、正味の負電荷を有する残基であり；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ２、ＯＨ２、およびＯからなる群より選択され；
ｎは、０〜１６の整数であり；
「ａ」は、１〜１０の整数であり；
ＳＰは、存在しないか、またはスペーサーであり；
Ｘは、前記標識であり；
Ｙは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドである。
【０００６】
本発明は、本発明に従う少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドにさらに関する。
【０００７】
さらに、本発明は、本発明に従う標識ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。
【０００８】
本発明はまた、本発明に従うオリゴヌクレオチドの、核酸増幅方法におけるプライマーとしての使用にも関する。さらに、本発明は、本発明に従うオリゴヌクレオチドの、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１：本発明に従う標識ヌクレオチドの効果。０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの各々により、鋳型ＤＮＡを伴わないＰＣＲを実施した。その後、キャピラリー電気泳動により、ＰＣＲプローブを解析した。（Ａ）では、標準的な標識プライマーによる鋳型を伴わない対照（ＮＴＣ）ＰＣＲの結果を示す。特異的な標識プライマー（配列番号１：すなわち、本発明に従う標識ヌクレオチドを含む）を用いるＮＴＣ−ＰＣＲの結果を（Ｂ）に示す。本発明に従う標識ヌクレオチドを含むプライマーは、望ましくないアーチファクトピークの量および高さを著明に低減する。極めて重要な１３０〜５５０ｂｐの範囲では、ベースラインが完全に平坦である。
【図２】図２：０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの各々により、鋳型ＤＮＡを伴わないＰＣＲを実施した。その後、キャピラリー電気泳動により、ＰＣＲプローブを解析した。本発明に従う標識ヌクレオチドを含む標識プライマー（配列番号４）を用いる、鋳型を伴わない対照（ＮＴＣ）ＰＣＲの結果を示す。Ｃ３修飾プライマーは、望ましくないアーチファクトピークの量および高さを著明に低減する。１３０〜５５０ｂｐの範囲では、ベースラインが完全に平坦である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に従う標識ヌクレオチドは、リンカーを介して付着した標識を含み、前記標識ヌクレオチドが、上記で概括された式：
【００１１】
【化２】
2014515920.tif 000004
を有する。しかし、好ましい実施形態は、以下で記載される。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、Ｒ１が、リン酸基である。
【００１３】
本発明者らは、反復の数（「ａ」で表される）を増大させることにより、電気泳動図における色素ブロブの減衰が増大することを見出した。しかし、当業者はまた、Ｃ３反復の数を増大させることが、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの費用も増大させることを認識するであろう。よって、本発明の一実施形態では、「ａ」が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の群より選択される。本発明者らは、２つの反復の数が、オリゴヌクレオチドおよび増幅産物の安定性に関して良好な特性を付与することを予測外に見出した。よって、本発明の好ましい実施形態では、「ａ」が、１、２、および３の群より選択され、好ましくは「ａ」が２である。
【００１４】
本発明の一実施形態では、ｎが１であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、「ａ」が２である。
【００１５】
反復の長さは、必要に応じて変化しうる。よって、本発明の一実施形態では、ｎが０〜１６の整数である。しかし、本発明者らは、３の反復の長さが特に良好な特性を示すことを予測外に見出した。よって、本発明の一実施形態では、ｎが１である。この場合、標識ヌクレオチドは、式：
【００１６】
【化３】
2014515920.tif 000005
を有し、式中、
Ｒ１は、リン酸基および硫酸基からなる群より好ましくは選択される、正味の負電荷を有する残基であり；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ２、ＯＨ２、およびＯからなる群より選択され；
「ａ」は、１〜１０の整数であり；
ＳＰは、存在しないか、またはスペーサーであり；
Ｘは、前記標識であり；
Ｙは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドである。
【００１７】
式１に適用可能な、すなわち、「ｎ」に関する実施形態を除く、本明細書で開示される全ての実施形態はまた、式２にも適用される。しかし、式２の一実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、「ａ」が２である。
【００１８】
一実施形態ではＸが、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、化学発光物質、および酵素からなる標識の群より選択される。好ましい実施形態では、Ｘが、好ましくは、５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素、例えば、ＣＹ３（商標）、ＣＹ５（商標）、ＣＹ３．５（商標）、ＣＹ５．５（商標）、Ｃｙ７（商標）、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ（登録商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ｄｉｍｅｔｈｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＪＯＥ（商標））、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  ６Ｇ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ウンベリフェロンなどのクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８などのベンズイミド；フェナントリジン、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＰＥＴ（登録商標）、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎ）色素、Ａｔｔｏ  ３９０、Ａｔｔｏ  ４２５、Ａｔｔｏ  ４６５、Ａｔｔｏ  ４８８、Ａｔｔｏ  ４９５、Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｔｔｏ  ５６５、Ａｔｔｏ  ５９０、Ａｔｔｏ  ５９４、Ａｔｔｏ  ６２０、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｔｔｏ  ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ＲｈｏＧ６、Ａｔｔｏ  Ｒｈｏ１１、Ａｔｔｏ  Ｒｈｏ１２、Ａｔｔｏ  Ｒｈｏ１０１、ＢＭＮ（商標）−５、ＢＭＮ（商標）−６、ＣＥＱ８０００  Ｄ２、ＣＥＱ８０００  Ｄ３、ＣＥＱ���０００  Ｄ４、ＤＹ−４８０ＸＬ、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＤＹ−４９５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５３０、ＤＹ−５４７、ＤＹ−５５０、ＤＹ−５５５、ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５１、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７７６、ＤＹ−７８０、ＤＹ−７８１、ＤＹ−７８２、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  ＲＥＤ  ５９０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、６−（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジフェニル−３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−６−カルボキサミド）−ヘキシル−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（ＳＩＭＡ）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、ＬＩＺ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  Ｒｅｄ、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６１０、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６４０、ＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）６７０、およびＬＣ  Ｒｅｄ（登録商標）７０５を含むフルオロフォアの群より選択されるフルオロフォアである。さらに好ましい本発明の実施形態では、Ｘが、Ａｔｔｏ  ４６５、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＦＡＭ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＤＹ−４９５、Ａｔｔｏ  ４９５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＪＯＥ、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ５４０、ＤＹ−５２１ＸＬ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  ６Ｇ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＨＥＸ、ＳＩＭＡ、Ａｔｔｏ  ＲｈｏＧ６、ＶＩＣ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＤＹ−５３０、ＴＡＭＲＡ（商標）、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｃｙ３（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＤＹ−５５０、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＰＥＴ（登録商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  ＲＥＤ  ５９０、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３１、ＬＩＺ、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、ＤＹ−６３５、およびＣｙ５（商標）からなるフルオロフォアの群より選択される。さらにまた好ましい実施形態では、Ｘが、ＦＡＭ（商標）、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５３０、およびＡｔｔｏ  ５５０からなるフルオロフォアの群より選択される。さらにま���好ましい本発明の実施形態では、ｎが１であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、ａが２であり、Ｘが、Ａｔｔｏ  ４６５、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＦＡＭ（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＤＹ−４９５、Ａｔｔｏ  ４９５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＪＯＥ、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  Ｇｏｌｄ  ５４０、ＤＹ−５２１ＸＬ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  ６Ｇ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＨＥＸ、ＳＩＭＡ、Ａｔｔｏ  ＲｈｏＧ６、ＶＩＣ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＤＹ−５３０、ＴＡＭＲＡ（商標）、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｃｙ３（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＤＹ−５５０、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＰＥＴ（登録商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  ＲＥＤ  ５９０、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３１、ＬＩＺ、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、ＤＹ−６３５、およびＣｙ５（商標）からなるフルオロフォアの群より選択される。なおより好ましい本発明の実施形態では、ｎが１であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、ａが２であり、Ｘが、ＦＡＭ（商標）、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５３０、およびＡｔｔｏ  ５５０からなるフルオロフォアの群より選択される。
【００１９】
さらに、リンカーは、先行技術から公知であるスペーサー（ＳＰ）を含みうる。本発明の文脈では、リンカーを、リン酸基（ＰＯ４）を介して、それぞれ、ＣＲ４またはＣＲ３に付着する。例えば、本発明に従う標識とリンカーとの間では、Ｃ５スペーサーまたはＣ６スペーサーを用いることができ、好ましくは、スペーサーが、分枝状または非分枝状のアミノリンカーである。さらに好ましい実施形態では、スペーサーが、Ｃ２〜Ｃ１８スペーサーの群より選択され、好ましくは、スペーサーが、Ｃ３スペーサー〜Ｃ１２スペーサーの群に由来する。極めて特殊な実施形態では、スペーサーが、Ｃ５スペーサーまたはＣ６スペーサーである。本発明の好ましい実施形態では、ｎが１であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、ａが２であり、Ｘが、ＦＡＭ（商標）、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５３０、およびＡｔｔｏ  ５５０からなるフルオロフォアの群より選択され、Ｘが、好ましくは、Ｃ２〜Ｃ１８スペーサーの群に由来し、より好ましくは、Ｃ３スペーサーまたはＣ１２スペーサーの群に由来し、なおより好ましくは、Ｃ５スペーサーまたはＣ６スペーサーであり、好ましくは、Ｃ５アミノリンカーまたはＣ６アミノリンカーである、フルオロフォアとリンカーとの間のスペーサーを含む。
【００２０】
本発明の文脈におけるアミノリンカーは一般に、１〜３０の炭素または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ｎ＝２〜４００）により示されるポリエチレングリコールを有する炭素鎖を指す。アミノリンカーは、分枝状の場合もあり、非分枝状の場合もある。アミノリンカーを用いて、一級アミノ基を、オリゴヌクレオチドの５’端、３’端、環外アミノ基、または修飾２’位へと組み込むことができる。活性アミノ基は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態にある標識化剤を用いて、オリゴヌクレオチドを標識するのに用いることができる。
【００２１】
本発明の文脈における「ヌクレオチド」という用語は、五炭糖（リボースまたは２’−デオキシリボースのいずれか）および１つ〜３つのリン酸基へと連結された核酸塩基（窒素塩基）に関する。核酸塩基と五炭糖とは、ヌクレオシドを形成する。リン酸基は、糖の２’−炭素に結合する場合もあり、３’−炭素に結合する場合もあり、５’−炭素に結合する場合もある。しかし、好ましい実施形態では、リン酸基が、５’−炭素に結合する。別段に条件づけない限り、本発明の文脈におけるヌクレオチドは、糖の５’−炭素においてリン酸基を伴うヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、ヌクレオチドが、一リン酸ヌクレオシド、二リン酸ヌクレオシド、および三リン酸ヌクレオシドの群より選択される。好ましい実施形態では、ヌクレオチドが、プリンヌクレオチドおよびピリミジンヌクレオチドの群より選択され、好ましくは、アデニンヌクレオチド、チミジンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、ウリジンヌクレオチド、およびイノシンヌクレオチドからなる群より選択される。また、ヌクレオチド塩基が、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、キサントシン（ｘａｎｔｈｉｎｏｓｉｎｅ）、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、５−メチルシチジンである修飾ヌクレオチド塩基も包含される。本発明にはさらに、上記分子のｄｄＮＴＰも包含される。
【００２２】
当業者は、後続の化学反応で用いるため、または保存を目的として、本発明に従うヌクレオチドを保護することが所望でありうることを認識するであろう。よって、本発明の一実施形態では、標識ヌクレオチドが、保護基をさらに含む。当業者には、保護基が公知である。保護基は、例えば、５’−ヒドロキシル基またはアミノ基を保護するための、ジメトキシトリチル、５’−Ｏ−（α−メチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル）、トリフルオロアセチル、モノメトキシトリチル、メトキシメチルエーテル、β−メトキシエトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ｐ−メトキシフェニル、トシル；例えば、環外アミノ基を保護するためのベンゾイル、ベンジル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル（ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｙ）、４−イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミド；例えば、リン酸基および亜リン酸基を保護するための２−シアノエチルおよびメチル；例えば、２’−ヒドロキシ基を保護するためのｔ−ブチルジメチルシリルまたはｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチルからなる群より、例えば、選択することができる。
【００２３】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドへと組み込まれた、本発明に従う標識ヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドの安定性を結果として増大させることを予測外に見出した。さらに、前記オリゴヌクレオチドを、核酸を増幅するためのプライマーとして用いると、増幅産物の安定性が大幅に増強された。よって、本発明はまた、本発明に従う少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドにも関する。当業者は、本発明に従う標識ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの異なる位置、例えば、オリゴヌクレオチドの５’端または内部位置に配置しうることを認識するであろう。本発明に従うオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、本発明に従う標識ヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドの３’端にも存在させることができる。しかし、本発明に従うオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態では、本発明に従う標識ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの５’端に配置する。当業者は、本発明に従うリンカーを、ヌクレオチドの糖の炭素へと付着することもでき、核酸塩基へと付着することもできることを容易に理解するであろう。本発明の一実施形態では、リンカーをヌクレオチドの核酸塩基、好ましくは、核酸塩基の環外アミノ基へと付着する。本発明の好ましい実施形態では、リンカーを、糖の５’−炭素へと付着する。本発明のより好ましい実施形態では、Ｒ１がリン酸基であり、Ｙがヌクレオシドの炭素のうちの５’−炭素である。
【００２４】
本発明のとりわけ好ましい実施形態では、ｎが１であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々がＨ２であり、Ｒ１がリン酸基であり、「ａ」が２であり、Ｘが、ＦＡＭ（商標）、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５３０、およびＡｔｔｏ  ５５０からなるフルオロフォアの群より選択され、ＳＰがＣ２〜Ｃ１８スペーサー、より好ましくは、Ｃ３〜Ｃ１２スペーサー、なおより好ましくは、Ｃ５スペーサーまたはＣ６スペーサー、さらにより好ましくは、Ｃ６スペーサーであり、Ｙがヌクレオシドの糖の５’−炭素である。
【００２５】
当業者には、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを標識へと連結する方法が公知である。当業者は、例えば、所望のリンカー、すなわち、単一の反復単位、例えば、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈまたはＢｅｒｒｙなど、公知の販売元によるＣ３リンカーを注文し、それらをヌクレオチドまたはヌクレオシドおよび標識またはスペーサーのそれぞれへと連結することができる。しかし、当業者は、リンカーを生成させる方法についてもさらに承知している。当業者には、例えば、多様な保護基（ＤＭＴｒ、ＴＢＤＭＳ、Ｌｅｖ）（例えば、Ｃ３−ホスホルアミダイト；（３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト）を含有するホスホルアミダイトを生成させ、次いで、これをリンカーとして用いる方法が公知である（例えば、Ｓｕ  Ｊｅｏｎｇ  Ｋｉｍら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ」、Ｓｙｎｌｅｔｔ、２００３年、１２号；ＤＯＩ：１０．１０５５／ｓ−２００３−４１４０６を参照されたい）。
【００２６】
当業者は、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、異なる適用に適することを認識するであろう。本発明に従うオリゴヌクレオチドが、本発明に従う１つより多い標識ヌクレオチドを含むことが所望でありうる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドが、本発明に従う１〜４つの標識ヌクレオチド、好ましくは、本発明に従う１〜３つの標識ヌクレオチド、より好ましくは、本発明に従う１つまたは２つの標識ヌクレオチド、なおより好ましくは、本発明に従う１つの標識ヌクレオチドを含む。
【００２７】
本発明の文脈における「内部位置」とは、本発明に従う標識ヌクレオチドが、本発明に従うオリゴヌクレオチドの５’端にも３’端にもないことを意味する。本発明に従う標識ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの内部位置に存在する場合、この位置は、３’端および／または５’端までの距離が最小限であることが所望でありうる。本発明の好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが以下の配列：
５’−ＮｂＺＮｃ−３’
を有し、式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドであることが可能であり、
「ｂ」および「ｃ」は、ヌクレオチド数を表し、１〜１５０、好ましくは、３〜５０、なおより好ましくは、３〜２５、さらにより好ましくは、４〜１５の範囲でありうる。さらなる実施形態では、「ｂ」が１〜１５０、好ましくは、３〜５０、なおより好ましくは、３〜２５、さらにより好ましくは、４〜１５である。さらなる実施形態では、「ｃ」が１〜１５０、好ましくは、３〜５０、なおより好ましくは、３〜２５、さらにより好ましくは、４〜１５である。
【００２８】
方法に応じて、オリゴヌクレオチドは、さらなる標識、消光剤、修飾ヌクレオチド、または脱塩基部位を含むことが所望でありうる。よって、本発明の一態様では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、さらなる標識および／または消光剤および／または修飾ヌクレオチドおよび／または非天然ヌクレオチドおよび／または脱塩基部位をさらに含む。
【００２９】
消光とは、所与の物質の蛍光強度を減少させる任意の過程を指す。本発明の文脈における「消光剤」は、例えば、活性化を伴わない標識の基本的な蛍光を消光させるのに適する残基に関する。励起状態の反応物による消光、エネルギー移動による消光、複合体形成による消光、および衝突による消光など、多様な過程が、消光を結果としてもたらしうる。結果として、消光は、圧力および温度に大きく依存することが多い。酸素分子およびヨウ化物イオンは、一般的な化学消光剤である。消光は、レーザー誘起蛍光など、非即時的分光光度法の問題を提起する。消光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの基盤である。特定の分子生物学的標的との相互作用時における消光および脱消光は、分子イメージング用の活性化可能な光学造影剤の基盤である。エネルギーを２つの色素であるドナーとアクセプターとの間で非放射的に（光子の吸収または放射を伴わずに）移動させうる異なる機構がいくつか存在する：フェルスター共鳴エネルギー移動、デクスターエネルギー移動、エキシプレックス（励起状態錯体）の形成、および静的消光（また、接触消光とも称する）。当業者は、必要に従い消光剤を選択することができる。
【００３０】
当業者には「修飾ヌクレオチド」が公知である。しかし、本発明の一実施形態では、修飾ヌクレオチドが、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される。
【００３１】
本発明の文脈における「脱塩基部位」（また、ＡＰ部位（脱プリン／脱ピリミジン部位）としても公知である）は、プリン塩基もピリミジン塩基も有さない核酸／オリゴヌクレオチド内の位置である。脱塩基部位については、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」（ＵＳ−Ｂ１  ６，３６１，９４０）のほか、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ＤＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ」（ＵＳ−Ｂ１  ６，５７９，６８０）および２００３年７月４日にウェブ上で公開された「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｂａｓｉｃ  Ｓｉｔｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｓｔｒａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ」、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、ＪＡＣＳ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓにおいて言及されている。
【００３２】
当業者は、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、異なる種類の核酸からなることをさらに認識するであろう。よって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはＬＮＡからなる。
【００３３】
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、異なる長さからなりうる。本発明の一実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さが、３〜３００ヌクレオチド、好ましくは、５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは、６〜５０ヌクレオチド、なおより好ましくは、１５〜３０ヌクレオチドである。
【００３４】
当業者には、本発明に従うオリゴヌクレオチドを、異なる目的、すなわち、プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブに用いうることが認知されるであろう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｓｃｏｒｐｉｏｎハイブリダイゼーションプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、または当業者に公知の別の機能的オリゴヌクレオチドである。
【００３５】
しかし、さらなる実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドがプローブである。多様な種類の標識プローブが公知である。これらは、例えば、消光剤および標識を含む。ＴａｑＭａｎプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ、分子ビーコン、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ、ＬＵＸプローブ、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブが好ましい。
【００３６】
ＴａｑＭａｎプローブとは、リアルタイムＰＣＲアッセイの特異性を増大させるようにデザインされた加水分解プローブである。ＴａｑＭａｎプローブの原理は、相補的な標的配列とのハイブリダイゼーションおよびフルオロフォアベースの検出において二重標識プローブを切断する、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性に依拠する。他のリアルタイムＰＣＲ法の場合と同様、結果として得られる蛍光シグナルは、ＰＣＲの指数関数的増幅段階における産物の蓄積の定量的測定を可能とするが、ＴａｑＭａｎプローブは、検出の特異性を著明に増大させる。
【００３７】
ＴａｑＭａｎプローブと同様、分子ビーコンプローブもまた、合成されたＰＣＲ産物を、オリゴヌクレオチドの５’端とカップリングさせたフルオロフォアおよびオリゴヌクレオチドの３’端へと付着させた消光剤を介して検出および定量化するのにＦＲＥＴを用いる。ＴａｑＭａｎプローブとは異なり、分子ビーコンプローブは、増幅反応中に無傷のままであるようにデザインされており、シグナルを測定するために、各増幅サイクルにおいて標的に再度結合させなければならない。分子ビーコンプローブは、溶液中で遊離しているとき、ステムループ構造を形成する。したがって、フルオロフォアと消光剤とが近接すると、プローブの蛍光発光が防止される。分子ビーコンプローブが標的とハイブリダイズすると、フルオロフォアと消光剤とが分離され、ＦＲＥＴは生じず、照射すると蛍光色素が発光する。
【００３８】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブでは、単一のオリゴヌクレオチドを用いて、配列特異的なプライミングおよびＰＣＲ産物の検出が達成される。ハイブリダイズしていない状態では、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、ステムループ立体配置を維持する。フルオロフォアは５’端に付着し、３’端へとカップリングさせた部分により消光させる。ステムの３’部分はまた、プライマーの伸長産物と相補的な配列も含有する。この配列を、増幅不可能な単量体を介して、特異的なプライマーの５’端へと連結する。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーの伸長後、特異的なプローブ配列は、伸長したアンプリコン内のその相補体へと結合し、これにより、ヘアピンループを開裂させることが可能である。これは、蛍光の消光を阻止し、シグナルが観察される。
【００３９】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦＲＥＴプローブシステムとは、一本鎖蛍光標識オリゴヌクレオチドの対である。プローブ１（ドナープローブ）は、その３’端においてドナーフルオロフォア（一般に、フルオレセイン）により標識され、プローブ２（アクセプタープローブ）は、その５’端  において４つ利用可能なフルオロフォア（Ｒｅｄ  ６１０、６４０、６７０、または７０５）のうちの１つにより標識される。プローブ２の遊離３’−ヒドロキシル基は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止するために、リン酸基（Ｐ）でブロックしなければならない。両方のプローブにおけるドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間のあらゆる立体的な問題を回避するため、１〜５ｎｔ（４〜２５Åの距離）のスペーサーを置いて、２つのプローブを互いから分離するべきである。任意のリアルタイム定量的ＰＣＲ反応を行う前に、チューブ内の蛍光バックグラウンドを観察することができる。
【００４０】
好ましくは、オリゴヌクレオチドが、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ、分子ビーコンプローブ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ、ＬＵＸプローブ、およびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブの群より選択されるプローブであり、プローブが、本発明に従う少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む。
【００４１】
さらに、異なる長さの核酸を、本発明に従う標識ヌクレオチドで標識することも所望でありうる。よって、本発明はまた、本発明に従う標識ヌクレオチドを含む核酸にも関する。本発明に従う核酸はまた、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上の本発明に従う標識ヌクレオチドも含む。標識ヌクレオチドは、前記核酸内の異なる位置に配置することができる。本発明の一実施形態では、本発明に従う標識ヌクレオチドを、本発明に従う核酸の５’端に配置する。さらなる実施形態では、本発明に従う標識ヌクレオチドを、本発明に従う核酸の３’端に配置する。またさらなる実施形態では、本発明に従う標識ヌクレオチドを、本発明に従う核酸の内部位置に存在させる。
【００４２】
本発明は、核酸を配列決定するかまたは増幅し、そして検出するための方法にさらに関し、この方法は：
ｉ）本発明に従う少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたは核酸プライマーを提供するステップと、
ｉｉ）前記少なくとも１つの核酸プライマーを用いて、標的核酸を増幅するための酵素および試薬を提供するステップと、
ｉｉｉ）標的核酸プライマーの増幅に適する条件下で反応の成分をインキュベートするステップと、
ｉｖ）本発明に従う標識ヌクレオチドの標識を介して、増幅された核酸を検出するステップと
を含む。
【００４３】
一実施形態では、本発明に従う方法が、それらの長さに従い増幅産物を分離するステップを含む。よって、本発明に従う方法の一実施形態では、ステップｉｖ）が、それらの長さに従い増幅された核酸を、好ましくは、標識ヌクレオチドを介して増幅された核酸を検出する前に分離するステップを含む。当業者は、それらの長さに従い核酸を分離する多数の方法について承知している。一般に用いられる１つの方法は、ゲル電気泳動である。よって、本発明の一実施形態では、増幅された核酸のそれらのサイズに従う分離を、ゲル電気泳動を用いて実施する。ゲル電気泳動とは、ゲルマトリックスへと印加される電界を用いて核酸分子を分離するのに用いられる技法である。「ゲル」という用語は、標的分子を含有し、次いで、これを分離するのに用いられるマトリックスを指す。大半の場合に、ゲルとは、その組成および多孔性が、解析される標的の比重／長さ、および組成に基づき選択される架橋ポリマーである。小さな核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド）を分離する場合、ゲルは通常、異なる濃度のアクリルアミドおよびポリアクリルアミドによる異なるサイズのメッシュネットワークをもたらす架橋剤からなる。アクリルアミドは、例えば、アクリルアミド、直鎖状のポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、またはポリイソプロピルアクリルアミドの群のうちのものでありうる。より大きな核酸（数百塩基を超える）を分離する場合は、精製アガロースをマトリックスとして選択することができる。いずれの場合にも、ゲルは固体ではあるが、多孔性マトリックスを形成する。アガロースは、高分子および高分子複合体の分離を可能とする大きな孔（ｐｏｒｅ）を有するゲルを結果としてもたらす、架橋を伴わない非荷電炭水化物の長い非分枝状鎖からなる。よって、本発明の一実施形態では、核酸の分離に用いられるマトリックスは、ポリアクリルアミドまたはアガロースである。
【００４４】
ゲル電気泳動は、法医学、分子生物学、遺伝学、微生物学、および生化学で用いられる。結果は、例えば、レーザーによって標識の蛍光を励起させる光源を通常含むイメージングデバイスを用いてゲル内の標識核酸を視覚化することにより、定量的に解析することができる。標識に由来するシグナルを検出デバイスで記録し、バンドまたはスポットの強度を測定する。測定および解析は大部分、検出されたシグナルを、核酸の長さおよび検出された核酸の量に従い電気泳動図へと変換する専門的なソフトウェアにより行う。本発明の好ましい実施形態では、増幅された核酸の分離を、キャピラリーゲル電気泳動により実施する。
【００４５】
本発明に従う方法の文脈では、「核酸」とは、特定のクラスの核酸、とりわけ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ＬＮＡ（ロックト核酸）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリア）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｎＲＮＡ（核ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ））、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（低分子核小体ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ））、ｓｃａＲＮＡ（低分子カハール体特異的ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  Ｃａｊａｌ  Ｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ））、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｓｎＤＮＡ（低分子核ＤＮＡ）など、または試料中のバルク核酸から識別可能な他の任意のクラスまたはサブクラスの核酸を意味する。
【００４６】
本発明は、本発明に従う標識ヌクレオチドを含むキットにさらに関する。別の実施形態では、キットが、本発明に従うオリゴヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、キットが、ポリメラーゼをさらに含み、ｄＮＴＰおよび／またはＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰを場合によってさらに含む。キットはまた、核酸を増幅するための緩衝液および試薬も含む。
【００４７】
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、核酸増幅法における核酸プローブとしてまたはプライマーとして用いることができる。
【００４８】
しかし、本発明者らは、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド自体ならびに増幅産物により高度の安定性を付与することを見出した。よって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、核酸増幅法のためのプライマーである。好ましい実施形態では、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応  （ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自己持続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）およびＱβ増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼに依存する増幅（ＨＤＡ）、スマート増幅工程（ｓｍａｒｔ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳＭＡＰ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）からなる群より選択される方法における、本発明に従うオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
ＰＣＲは、以下の通りに実行した：
０．２μｌのＭｕｌｔｉ  Ｔａｑ２  ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ホットスタート用ＤＮＡポリメラーゼとして用いた。２．５μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ  ＭｉｘＢ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＣＲ緩衝液として用いた。
【００５０】
全てＢｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ  （Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製である、０．４μＭの未標識ＴＨ０１＿ｒｅｖリバースプライマー（５’−ａｔｔｃｃｔｇｔｇｇｇｃｔｇａａａａｇｃｔｃ−３’；配列番号３）と組み合わせた、０．４μＭの標識フォワードプライマーであるＴＨ０１−Ｐ−２×Ｃ３（５’−ＤＹ５３０−Ｃ６−Ｃ３−Ｃ３−ｇｔｇａｔｔｃｃｃａｔｔｇｇｃｃｔｇｔｔｃ−３’；配列番号１）または０．４μＭの標識フォワードプライマーであるＴＨ０１−Ｐ−ＤＹ５３０（５’−ＤＹ５３０−Ｃ６−ｇｔｇａｔｔｃｃｃａｔｔｇｇｃｃｔｇｔｔｃ−３’；配列番号２）を、ＰＣＲ増幅に用いた。ヌクレアーゼ不含水（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、容積２５μｌにした。ＰＣＲは、以下のプロトコールにより、サーモサイクラー９７００  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実行した。
【００５１】
【表１】
2014515920.tif 000006
【００５２】
【表２】
2014515920.tif 000007
１μｌのサイクリングされた（ｃｙｃｌｅｄ）ＰＣＲプローブを、１２μｌのＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および０．５μｌのＤＮＡサイズ標準５５０（ＢＴＯ）（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へと添加し、９５℃で３分間にわたりインキュベートした。
【００５３】
変性させたＰＣＲプローブを、標準的な条件下で３５００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いるキャピラリー電気泳動により解析した。結果を図１に示す。
【００５４】
これらの結果は、本発明に従う標識ヌクレオチドを含む標識プライマー、すなわち、本発明に従うリンカーを伴う標識プライマーを使用すると、結果として望ましくないアーチファクトピークが低減されることを明確に裏付ける。これらの例では、極めて重要な１３０〜５５０ｂｐの範囲におけるベースラインが、Ｃ３修飾ＰＣＲプライマーを用いることにより完全にノイズがない。この範囲外でも、望ましくないアーチファクトピークは、高さおよび量において著明に低減されている。これに対し、５’端で標識された標準的なＰＣＲプライマーは、最大１１０相対蛍光単位（ｒｆｕ）の、多数のアーチファクトピークを引き起こす。最小量の鋳型ＤＮＡによるＰＣＲ増幅は、典型的に約２００ｒｆｕのピークを与えるＰＣＲ産物を結果としてもたらす。標準的な標識プライマーを用いると、電気泳動図の解釈は、多数の高いアーチファクトピーク（色素ブロブ）により損なわれ、その結果、プローブの評価が不完全となる。リンカー修飾プライマーを用いると、２００ｒｆｕのＰＣＲ産物を、特に、１３０〜５５０ｂｐの範囲における色素ブロブから明確に識別することができる。これらの利益は、方法の感度において極めて大きな利点をもたらす。
【００５５】
（実施例２）
Ｃ３リンカー（「ｎ」が１であり、「ａ」が３である）の２回の反復を含むリンカーにより修飾されたプライマーを用いると、上記の通り、バックグラウンドノイズの大幅な低減が明らかである。しかし、さらなる実験では、標識プライマーへと付着した、異なる数のリンカーの反復を解析した。一例では、その５’位において本発明に従う標識ヌクレオチドを含むプライマーであって、未標識リバースプライマーであるＴＨ０１＿ｒｅｖ（５’−ａｔｔｃｃｔｇｔｇｇｇｃｔｇａａａａｇｃｔｃ−３’；配列番号３）と一緒に逐次的な３つのＣ３の反復を含む、すなわち、「ａ」が３である（ＴＨ０１−Ｐ−３×Ｃ３：５’−ＤＹ５３０−Ｃ６−Ｃ３−Ｃ３−Ｃ３−ｇｔｇａｔｔｃｃｃａｔｔｇｇｃｃｔｇｔｔｃ−３’；配列番号４）プライマーについて、上記の方法により解析した。結果を図２に示す。
【００５６】
これらの結果は、本発明に従う標識ヌクレオチドを含むプライマーであって、反復回数３つのＣ３の反復を含むプライマーはまた、バックグラウンドノイズの低減も結果としてもたらすことを裏付ける。標準的な標識プライマー（図１を参照されたい）と比較して、１３０〜５５０ｂｐの極めて重要な範囲におけるベースラインは、完全にノイズがない。さらにまたこの範囲外でも、本発明に従う標識ヌクレオチドを含むプライマーを用いることにより、望ましくないアーチファクトピークは、高さおよび量において著明に低減される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2014515920000001.app
【国際調査報告】
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2014515920.tif 000014
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