(57)【要約】両親媒性溶媒組および疎水性溶媒組を用いた、植物材料、とりわけ無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法。いくつかの実施形態は、無傷の藻類細胞を脱水すること、および次いで藻類細胞から中性脂質を抽出すること、を含む。方法は、抽出混合液の乳化作用を避けながら、湿潤藻類バイオマスからの藻類中性脂質の効果的な分離を可能にする単一および複数段階抽出工程を提供する。中性脂質は、極性脂質画分とタンパク質画分をまず取り出した後に、取り出される。これらの中性脂質は、再生可能燃料ならびに食物産物およびサプリメントを産出するために使用可能である。
2014514923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法であって、
タンパク質、極性脂質および中性脂質を含む、無傷の藻類細胞を含む湿潤藻類バイオマスを提供することと、
細胞外水を除去することによって前記湿潤バイオマスを脱水して、前記湿潤藻類バイオマスの固体含量を、５％〜５０％まで増加させて、部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを産出することと、
前記部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、第一の両親媒性溶媒組と第一の疎水性溶媒組と混合して、第一の重相と第一の軽相を含む第一の抽出混合物を産出することであって、前記第一の重相が第一の両親媒性溶媒組、中性脂質、タンパク質および部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを含み、前記第一の軽相が、第一の疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、
前記抽出混合物の前記軽相を前記抽出混合物の前記重相から分離することと、
前記部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、前記抽出混合物の前記第一の重相中の前記第一の両親媒性溶媒組から分離し、中性脂質を含む分離した部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスと、タンパク質、水および第一の両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、
前記分離した部分的に脱水した藻類バイオマスを、第二の両親媒性溶媒組と第二の疎水性溶媒組と混合して、第二の重相と第二の軽相を含む第二の抽出混合物を産出することであって、前記第二の重相は、第二の両親媒性溶媒組と、分離した部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを含み、前記第二の軽相は、前記第二の疎水性溶媒組と中性脂質を含むことと、
前記第二の重相を前記第二の軽相から分離することと、および
中性脂質を前記第二の軽相から分離することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記湿潤藻類バイオマスの脱水は、遠心、濾過、沈降または浮遊画分化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノン、ジメチルエーテルおよびプロピオンアルデヒド、２−プロパノール、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、１−プロパノール、水、重水（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコール、グリセリンまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一および第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが、プロパン、ブタン、ペンタン、ブテン、プロペン、ナフサ、アルカン類、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、エステル類、酢酸エチル、酢酸ブチル、ケトン類、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、芳香族類、トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、ハロアルカン類、クロロホルム、トリクロロエチレン、エーテル類、ジエチルエーテル、ディーゼル、ジェット燃料、ガソリンまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第二の重相が、傾斜、膜濾過または遠心によって、前記第二の軽相から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第二の軽相を、中性脂質を前記第二の軽相から分離する前に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第二の疎水性溶媒組が、蒸発または蒸留によって前記第二の軽相から除去され、それによって中性脂質画分が産出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが蒸発させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一および第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一および第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが冷却され、回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが冷却され、回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが加熱される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、マイクロ波、水、スチームまたは熱油または電気にて加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、大気圧にて加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、加圧反応器中で加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記加圧反応器が、バッチまたは連続反応器である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法であって、
タンパク質、極性脂質および中性脂質を含む、無傷の藻類細胞を含む湿潤藻類バイオマスを提供することと、
前記湿潤藻類バイオマスを、第一の両親媒性溶媒組と第一の疎水性溶媒組と混合して、第一の重相と第一の軽相を含む第一の抽出混合物を産出することであって、前記第一の重相は第一の両親媒性溶媒組、中性脂質、タンパク質、および湿潤藻類バイオマスを含み、前記第一の軽相は第一の疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、
前記抽出混合物の前記第一の軽相を、前記抽出混合物の前記第一の重相から分離することと、
湿潤藻類バイオマスを前記抽出混合物の前記第一の重相から分離して、中性脂質を含む分離された湿潤藻類バイオマスと、タンパク質、水および第一の両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、
前記分離した藻類バイオマスを、第二の両親媒性溶媒組と第二の疎水性溶媒組を混合して、第二の重相と第二の軽相を含む第二の抽出混合物を産出することであって、前記第二の重相が第二の両親媒性溶媒組と、分離した湿潤藻類バイオマスを含み、前記第二の軽相が第二の疎水性溶媒組と中性脂質を含むことと、
前記第二の軽相から前記第二の重相を分離することと、および
中性脂質を前記第二の軽相から分離して、中性脂質画分を産出すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連明細書の相互参照
本出願は、「二溶媒方法による中性脂質の抽出法」（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｂｙ  ａ  Ｔｗｏ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ）という表題の、２０１１年１１月１日に出願された、米国特許出願第１３／２８６，９１０号の優先権を主張する。米国特許出願第１３／２８６，９１０号は、「油性材料からの油およびタンパク質性物質の画分化を伴う抽出」（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）という表題の、２０１１年４月６日に申請された米国特許第１３／０８１，１９７号の一部継続出願であり、米国特許第１３／０８１，１９７号は、「油性材料からの油およびタンパク質性物質の抽出および画分化」（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）という表題の２０１０年４月６日に申請された米国特許仮出願第６１／３２１，２９０号、および「油性物質からの油および副産物の画分化による抽出」（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｃｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）という表題の、２０１０年４月６日に申請された米国特許仮出願第６１／３２１，２８６号の利益を請求し、それらの全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、油およびタンパク質を含むが、限定はされない、藻類産物を抽出すること、および画分化することに関する。具体的には、本明細書で開示される方法およびシステムは、極性脂質の分離に関する。より具体的には、本明細書で記述されるシステムおよび方法は、湿潤藻類バイオマスを処理するために、両親倍性および疎水性溶媒での段階抽出および画分化を利用する。
【背景技術】
【０００３】
石油は、主に炭化水素からなる天然資源である。大地より石油を抽出することは、高価であり、危険であり、しばしば環境を犠牲にする。さらに、世界の油の貯蔵は急速に低下している。輸送と、石油のガソリンおよびジェット燃料のような使用可能な燃料への変換に必要とされる処理のためにコストも増加する。
【０００４】
藻類は、環境を壊さず利用可能な燃料を産出するために使用可能な、脂質を産出するそれらの能力を考えると、近年、明かな重要性を獲得している。この能力は、再生可能な燃料を産出する、世界的気候変動を減少させる、および廃水を処理するために利用され得る。バイオ燃料フィードストックとしての藻類の優位性は、典型的な陸生油作物と比較して高い単位面積当たりの産出量、非食物に基づいたフィードストック資源、それ以外では生産性が低い、耕作に適さない土地の利用、広く種々の水供給源（新鮮な、汽水性、生理食塩水および廃水）の利用、バイオ燃料と、カロテノイドおよびクロロフィルのような価値のある副産物両方の産出を含む、種々の要因からもたらされる。
【０００５】
数千種の藻類が、過去数十年にわたり、世界的な脂質産出のために選別され、研究されている。これらのうち、脂質を豊かに産出する約３００種が特定されている。脂質組成物および含量は、ライフサイクルの異なるステージにて異なり、環境および培養条件によって影響を受ける。抽出の戦略およびアプローチは、藻類細胞壁の生化学組成および物理的性質における著しい多様性のために、使用される個々の藻類種／株に依存して異なる。押し出しのような、従来の物理的抽出工程は、藻類細胞の細胞壁の厚さ、および小さな大きさ（約２〜約２０ｎｍ）考えると、藻類では良好に機能しない。さらに、種子から回収された典型的な油と比較して、藻類油中の大量の極性脂質が、精製の問題をもたらす。
【０００６】
採集に際して、培養物中の典型的な藻類の濃度は、約０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲である。これは、藻類の単位重量あたり、１０００倍の水分量が、油抽出を試みる前に除去されなければならないことを意味する。現在、油性材料のための既存の油抽出方法は、抽出される油の収率および品質を改善するために、ほとんど完全に乾燥したフィードを厳密に必要とする。藻類塊を加熱して十分乾燥させるために必要とされるエネルギーの量に起因して、藻類からバイオ燃料を生成する工程は不経済となる。典型的に、抽出を促進するために、フィードが高温で押し出されるか、または薄片にされる。これらの段階は、藻類の単一細胞のミクロン単位の性質のために、既存の装置では機能しない可能性がある。さらに、藻類油は、二重結合長鎖脂肪酸の存在のために、非常に不安定である。従来の抽出方法にて使用される高温が、油の分解を引き起こし、それによってそのような方法のコストが増加する。
【０００７】
溶媒としてヘキサンを用いることによって、乾燥させた藻類塊から油を抽出することが本技術分野で公知である。この工程は、エネルギーを大量に消費する。この種類の処理が、脂質およびタンパク質分解を引き起こすので、乾燥させるために熱、および抽出するためにヘキサンを使用すると、より低品質の産物を産出する。
【０００８】
藻類油の抽出は、２つの種類、すなわち破壊的または非破壊的方法に分類することができる。
【０００９】
破壊的方法には、機械的、温度、酵素または化学方法によって細胞を溶解することが含まれる。ほとんどの破壊的方法は、乳濁液をもたらし、高価な清掃工程を必要とする。藻類油は、中性脂質の乳化を促進する、大きな割合の極性脂質およびタンパク質を含む。乳化はさらに、溶液中に残る栄養素および塩成分によって安定化する。乳濁液は複雑な混合液であり、中性脂質、極性脂質、タンパク質および他の藻類産物を含み、バイオ燃料に変換されるフィードである、中性脂質を単離する高価な精製工程である。
【００１０】
非破壊的方法は低収率である。ミルキングは、生長している藻類培養から脂質を抽出するための、溶媒または化学物質の利用である。時々、藻類産物を抽出するために使用されるが、ミルキングは、溶媒毒性と細胞壁破壊のために、いくつかの種の藻類では、機能しない可能性がある。この複雑な事態が、一般的な工程の開発を難しくする。さらに、必要な溶媒の量は、培地中の溶媒の最大到達可能濃度のために、天文学的であり得る。
【００１１】
したがって、これらの困難を乗り越えるために、本技術分野において、藻類産物、とりわけ藻類油、藻類タンパク質および藻類カロテノイドの抽出および画分化のための改善された方法およびシステムに対して必要性が存在する。本工程はさらに、非常に非極性の溶媒を抽出システムに導入し、それによって抽出のために使用した溶媒のすべてを蒸発させ、リサイクルするコストを避けることによって改善可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書で記述する実施形態は一般に、例えば藻類バイオマスを含む、油性物質から種々の極性の脂質を抽出するためのシステムおよび方法に関する。具体的には、本明細書で記述する実施形態は、種々の極性の溶媒および／または一連の膜フィルタを用いて、藻類バイオマスから種々の極性の脂質を抽出することに関係する。いくつかの実施形態において、フィルタはマイクロフィルタである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態において、単一の溶媒と水を使用して、油性材料中に存在する成分を抽出、および画分化する。他の実施形態において、これらの成分は、タンパク質、極性脂質および中性脂質を含むが、それらに限定されない。さらに他の実施形態において、１つより多い溶媒を使用する。さらに他の実施形態において、溶媒の混合液を使用する。開示される方法は、湿潤藻類バイオマスの成分の分離と画分化を可能にする。本明細書で記述されるシステムおよび方法のもう一つの態様は、システム中の疎水性溶媒が、産物を、さらに脂質と非脂質成分に選択的に分離するので、初期精製を達成するための能力である。使用する両親媒性溶媒の量は、システム中の水の量に依存する。疎水性溶媒の量は、溶媒を除去するための後の処理を減少させるために、最少にされる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書で記述される方法およびシステムは、油性材料から脂質の副産物を抽出するために有用である。そのような副産物の例には、タンパク質性物質、クロロフィルおよびカロテノイドが含まれるが、それらに限定はされない。本発明の実施形態は、燃料および栄養産物両方の産出を可能にする様式で、藻類バイオマスからの藻類産物の同時抽出および画分化を可能にする。
【００１５】
本発明の１つの実施形態の下では、油およびタンパク質性物質の画分化を伴う、油性材料からの抽出のための方法が提供される。
【００１６】
もう一つの実施形態の下では、本質的に無傷の藻類細胞を含む藻類バイオマスから産物を選択的に取り出す方法は、藻類バイオマスと第一の溶媒組を混合し、第一の抽出混合物を産出して、その第一の抽出混合物には、第一の実質的に固体の相と第一の液体相が含まれることと、第一の抽出混合物の第一の液体相の少なくとも一部分を、第一の実質的に固体の相から分離することと、第一の実質的に固体の抽出相と第二の溶媒組を混合して、第二の抽出混合物を産出して、第二の抽出混合物には、第二の実質的に固体の相と第二の液体相が含まれ、そこでは、第二の抽出混合物は、第一の抽出混合物よりも極性が低いことと、第二の抽出混合物の第二の液体相の少なくとも一部を第二の実質的に固体の相から分離することと、第二の実質的に固体の抽出相と第三の溶媒組を混合して、第三の抽出混合物を産出して、第三の抽出混合物には、第三の実質的に固体の相と第三の液体相が含まれ、そこでは、第三の抽出混合物は、第二の抽出混合物よりも極性が低いことと、および、第三の抽出混合物の第三の液体相の少なくとも一部分を、第三の実質的に固体の相から分離することと、が含まれる。
【００１７】
本発明のいくつかの態様において、方法にはさらに、第一の液体相の分離された部分から、第一の溶媒組の少なくとも一部を除去して、第一の抽出産物を得ることが含まれる。他の態様において、方法にはさらに、第二の液体相の分離された部分から、第二の溶媒組の少なくとも一部を除去して、第二の抽出産物を得ることが含まれる。また他の態様において、方法にはさらに、第三の液体相の分離された部分から、第三の溶媒組の少なくとも一部分を除去して、第三の抽出産物を得ることが含まれる。
【００１８】
また他の態様において、溶媒組は、水混和性または水非混和性溶媒を含む。いくつかの態様において、溶媒組は、２つの水混和性または２つの水非混和性溶媒を含む。他の態様において、溶媒組は、１つまたはそれ以上の水混和性溶媒と、１つまたはそれ以上の水非混和性溶媒を含む。さらに他の態様において、第一、第二および／または第三の抽出混合物が、その沸点より低い温度まで熱せられる。さらなる態様において、抽出混合物は、大気圧より高い圧力下である。いくつかの態様において、第一、第二および第三の溶媒組のうちの少なくとも１つは、１つまたはそれ以上の両親媒性溶媒を含む。またさらなる態様において、その１つまたはそれ以上の水混和性溶媒のうちの少なくとも１つは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルおよびアセトニトリルからなる群より選択される。他の態様において、第一、第二および第三の溶媒組のうちの少なくとも１つはエタノールを含む。さらに他の態様において、溶媒組は、１：１重量／重量比にてバイオマスに加えられる。
【００１９】
他の態様において、藻類バイオマスを含む細胞は乾燥していないか、または破壊されていない。さらにもう一つの態様において、藻類バイオマスは凍結されていない。本発明のもう一つの態様において、方法はさらに、第一、第二および第三の抽出混合物のうちの少なくとも１つのｐＨを調節して、タンパク質抽出を最適化することが含まれる。本発明のさらに他の態様において、産物が藻類バイオマスから選択的に抽出される一方で、藻類バイオマスを同時に、少なくとも部分的に脱水させる。本発明のさらに他の態様において、第一、第二および第三の実質的に固体の抽出相は、実質的に無傷の藻類細胞を含む。
【００２０】
本発明の実施形態は、無傷の藻類細胞から極性脂質を分離する方法を含み、その方法は、極性脂質を含む無傷の藻類細胞を含む、湿潤藻類バイオマスを提供することと、細胞外水を減少させることによって湿潤藻類バイオマスを脱水し、湿潤藻類バイオマスの固体含量を約５％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗまで増加させて、結果として部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスとなるようにすることと、部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、両親媒性溶媒組および疎水性溶媒組と混合させて、重相および軽相を含む抽出混合物を産出して、重相は両親媒性溶媒組と部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを含み、軽相は疎水性溶媒層と極性脂質を含むようにすることと、抽出混合物の重相を抽出混合物の軽相から分離すること、および極性脂質を軽相から分離して、極性脂質画分を産出することと、を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態は、無傷の藻類細胞からタンパク質を分離する方法を含み、その方法は、水、藻類タンパク質および極性脂質を含む、無傷の藻類細胞を含む湿潤藻類バイオマスを提供することと、細胞外水を除去することによって、湿潤藻類バイオマスを脱水し、約５％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗまで増加させて、部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスをもたらすことと、部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、両親媒性溶媒組および疎水性溶媒組と混合させて、重相および軽相を含む抽出混合物を産出して、重相には水、両親媒性溶媒組、部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスおよび藻類タンパク質が含まれ、軽相には疎水性溶媒層と極性脂質が含まれることと、抽出混合物の重相を抽出混合物の軽相から分離することと、部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを抽出混合物の重相から分離して、タンパク質、水および両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、およびタンパク質をタンパク質混合物から分離して、タンパク質画分を産出することと、を含む。
【００２２】
さらに他の実施形態は、無傷の藻類細胞からタンパク質を分離する方法を含み、その方法は、水、藻類タンパク質および極性脂質を含む無傷の藻類細胞を含む、湿潤藻類バイオマスを提供することと、湿潤藻類バイオマスを、両親媒性溶媒組と疎水性溶媒組と混合して、重相と軽相を含む抽出混合物を産出して、重相は、水、両親媒性溶媒組、湿潤藻類バイオマスおよび藻類タンパク質を含み、軽相は疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、抽出混合物の重相を抽出混合物の軽相から分離することと、湿潤藻類バイオマスを抽出混合物の重相から分離して、タンパク質、水および両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、およびタンパク質をタンパク質混合物から分離して、タンパク質画分を産出することと、を含む。
【００２３】
さらなる実施形態は、無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法を含み、その方法は、タンパク質、極性脂質および中性脂質を含む無傷の藻類細胞を含む、湿潤藻類バイオマスを提供することと、湿潤藻類バイオマスを、第一の両親媒性溶媒組および第一の疎水性溶媒組と混合して、第一の重相と第一の軽相を含む第一の抽出混合物を産出し、第一の重相は第一の両親媒性溶媒組、中性脂質、タンパク質および湿潤藻類バイオマスを含み、第一の軽相は、第一の疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、抽出混合物の第一の軽相を抽出混合物の第一の重相から分離することと、湿潤藻類バイオマスを抽出混合物の第一の重相から分離して、中性脂質を含む分離された湿潤藻類バイオマス、およびタンパク質、水および第一の両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、分離された藻類バイオマスを、第二の両親媒性溶媒組と第二の疎水性溶媒組と混合して、第二の重相と第二の軽相を含む第二の抽出混合物を産出し、第二の重相は第二の両親媒性溶媒組と、分離された湿潤藻類バイオマスを含み、第二の軽相は、第二の疎水性溶媒組と中性脂肪を含むことと、第二の重相を第二の軽相から分離することと、および中性脂質を第二の軽相から分離して、中性脂質画分を産出することと、を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態はさらに、遠心、濾過、沈降または浮遊画分化によって実施される脱水を含む。さらに他の実施形態は、疎水性溶媒組の添加の前に、抽出混合物の極性指数を約６．５〜６．７に調節する量で両親媒性溶媒組を添加することを含む。さらに他の実施形態は、両親媒性溶媒組の添加後に、抽出混合物の極性指数を約５．７〜５．９に調節する量で疎水性溶媒組を添加することを含む。またさらなる実施形態において、両親媒性溶媒組はアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ジメチルエーテルおよびプロピオンアルデヒド、２−プロパノール、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、１−プロパノール、水、重（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコール、グリセリンまたはこれらの組み合わせである。さらに他の実施形態において、疎水性溶媒組は、プロパン、ブタン、ペンタン、ブテン、プロペン、ナフサ、アルカン類、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、エステル類、酢酸エチル、酢酸ブチル、ケトン類、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、芳香族類、トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、ハロアルカン類、クロロホルム、トリクロロエチレン、エーテル類、ジエチルエーテル、ディーゼル、ジェット燃料、ガソリンまたはこれらの組み合わせである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、重相を軽相から分離することは、傾斜、膜濾過または遠心を含む。他の実施形態において、極性脂質を軽相から分離することは、蒸発または蒸溜を含む。さらに他の実施形態において、疎水性溶媒組が回収される。さらに他の実施形態において、疎水性溶媒組が濃縮され、回収される。さらに他において、両親媒性溶媒組が回収される。さらに他において、両親媒性溶媒組が濃縮され、回収される。
【００２６】
さらに他の実施形態において、抽出混合物を加熱する。さらなる実施形態において、抽出混合液をマイクロ波、水、スチーム、熱油または電気で熱する。いくつかの実施形態において、抽出混合物を大気圧にて加熱する。またさらなる実施形態において、抽出混合物を加圧反応器下で加熱する。またさらなる実施形態において、加圧反応器は浴または連続反応器である。
【００２７】
さらなる実施形態は、無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法を含み、その方法は、タンパク質、極性脂質および中性脂質を含む、無傷の藻類細胞を含む湿潤藻類バイオマスを提供することと、細胞外水を除去することによって、湿潤藻類バイオマスを脱水し、５％〜５０％まで、湿潤藻類バイオマスの固体含量を増加させて、部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを産出することと、部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、第一の両親媒性溶媒組と第一の疎水性溶媒組と混合して、第一の重相と第二の軽相を含む第一の抽出混合物を産出し、第一の重相は第一の両親媒性溶媒組、中性脂質、タンパク質および部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを含み、第一の軽相は、第一の疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、抽出混合物の第一の軽相を抽出混合物の第一の重相から分離することと、部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを抽出混合物の第一の重相中の第一の両親媒性溶媒組から分離して、中性脂質を含む、分離された部分的に脱水された湿潤藻類バイオマス、およびタンパク質、水および第一の両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、分離された部分的に脱水された藻類バイオマスを、第二の両親媒性溶媒組と第二の疎水性溶媒組と混合して、第二の重相と第二の軽相を含む、第二の抽出混合物を産出し、第二の重相は第二の両親媒性溶媒組と、分離された部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを含み、第二の軽相は、第二の疎水性溶媒組と中性脂質を含むことと、第二の重相を第二の軽相から分離することと、および中性脂質を第二の軽相から分離することと、を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、第二の軽相を、中性脂質を第二の軽相から分離する前に加熱する。いくつかの実施形態において、第二の疎水性溶媒組は、蒸発または蒸留によって第二の軽相から除去され、それによって中性脂質画分が産出される。他の実施形態において、第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つを蒸発させる。さらに他の実施形態において、第一および第二の疎水性溶媒のうちの少なくとも１つが回収される。さらに他の実施形態において、第一および第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが冷却され、回収される。またさらなる実施形態において、第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが冷却され、回収される。さらなる実施形態において、第一および第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが回収される。またさらなる実施形態において、第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが熱せられる。さらに他の実施形態において、第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、マイクロ波、水、スチームまたは熱油または電気で熱せられる。いくつかの実施形態において、第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つを大気圧にて熱する。さらに他において、第一および第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つを、加圧反応器中で熱する。いくつかの実施形態において、加圧反応器は浴または連続反応器である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】本開示の例示的実施形態にしたがった方法に関与する段階のフローチャートである。
【図１Ｂ】本開示にしたがった脱水工程の例となる実施形態の略図ダイアグラムである。
【図２】本開示にしたがった抽出システムの例となる実施形態の略図ダイアグラムである。
【図３】最大非破壊的藻類油抽出効率と、極性および非極性脂質抽出における極性の影響を示す、完全極性範囲を包含している溶媒のアレイを用いた、凍結乾燥藻類バイオマスのＳｏｈｘｌｅｔ抽出を示す比較グラフである。
【図４】ＡおよびＢは、３つの異なる温度にて、メタノールおよび石油を用いた、二段階溶媒抽出工程における中性脂質の（Ａ）純度および（Ｂ）回収率を示すグラフ表示である。
【図５】ＡおよびＢは、３つの異なる温度にて、メタノール水溶液および石油エーテルを用いた、二段階溶媒抽出工程における中性脂質の（Ａ）純度および（Ｂ）回収率を示すグラフである。
【図６】３つの異なる温度にて、メタノール水溶液および石油を用いた、二段階溶媒抽出工程における脂質回収率を示すグラフである。
【図７】溶媒の固体バイオマスに対する比の、脂質回収率に対する効果を示すグラフである。
【図８】乾燥バイオマスにおける、メタノール水溶液の一段階抽出回収での異なる水性抽出溶液の効率を示すグラフである。
【図９】多段階メタノール抽出の、累積総脂質収率と中性脂肪純度に対する効果を示すグラフである。
【図１０】湿潤バイオマスとエタノールを用いた、脂質の累積回収率を示すグラフである。
【図１１】マイクロ波補助抽出と従来の抽出システムの抽出時間の比較を示すグラフである。
【図１２Ａ】タンパク質抽出の段階を含む、本開示の例となる実施形態に従った方法に包含される段階のフローチャートである。図１２Ａ中の全ての単位はポンドである。
【図１２Ｂ】本開示にしたがった例となる抽出工程に包含される段階のフローチャートである。
【図１３】１０００ｌｂｓ（ポンド）（約４５４ｋｇ）の藻類バイオマスが、藻類バイオマスから中性脂質、極性脂質およびタンパク質を分離するために、抽出および画分化を通して処理される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートおよび質量バランスダイアグラムである。
【図１４】藻類塊が、種々の産物を形成するために処理可能である、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図１５】藻類の中性脂質が、種々の産物を形成するために処理される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図１６】藻類中性脂質が、燃料産物を形成するために処理される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図１７】藻類タンパク質が、淡水藻類バイオマスから選択的に抽出される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図１８】藻類タンパク質が、海水藻類バイオマスから選択的に抽出される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図１９】選択された藻類タンパク質が、海水または淡水藻類バイオマスから抽出される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図２０】選択された藻類タンパク質が、海水または淡水藻類バイオマスから抽出される、本発明の実施形態の１つを記述するフローチャートである。
【図２１】本明細書で記述した方法を用いた、抽出の前後での、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｃｅｍｕｓ  ｓｐ．）細胞を示している写真である。細胞は実質的に、抽出前後両方で無傷である。
【図２２】単一溶媒（両親媒性）系によるタンパク質の抽出のための、例示的抽出スキームの略図である。
【図２３】二溶媒（両親媒性/疎水性）系による、極性脂質とタンパク質の抽出のための例示的抽出スキームの略図である。
【図２４】二溶媒（両親媒性/疎水性）系による、中性脂質とタンパク質の抽出のための例示的抽出スキームの略図である。
【図２５】二溶媒（両親媒性/疎水性）系による、中性脂質、極性脂質およびタンパク質の抽出のための例示的抽出スキームの略図である。
【図２６】エタノール抽出の概念を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書で使用する「導管」という用語、または任意のその変形は、流体がそれを通って運ばれ得る任意の構造を含む。導管の非限定例には、パイプ、チューブ、チャンネルまたは他の封入構造を含む。
【００３１】
本明細書で使用する「貯留容器」という用語または任意のその変形は、流体を維持可能な任意の本体構造を含む。貯留容器の非限定例には、池、タンク、湖、タブまたは他の同様の構造を含む。
【００３２】
本明細書で使用する「約」または「およそ」という用語は、本技術分野の当業者によって理解されるものと近いものとして定義され、１つの非限定実施形態において、本用語は、１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内、もっとも好ましくは０．５％以内であると定義される。
【００３３】
本明細書で使用する「阻害すること」または「減少させること」という用語またはこれらの任意の変形は、望む結果を達成するための、任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００３４】
本明細書で使用する「効果的」という用語は、望まれる、予期される、または意図される結果を達成するのに適切であることを意味する。
【００３５】
本明細書で語句「含む」とともに使用される場合、用語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味するが、「１つまたはそれ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つ以上」の意味とも合致する。
【００３６】
本明細書で使用する「または」という用語は、本開示が、選択肢のみおよび「および／または」を引用する定義を支持するけれども、選択肢のみを引用することが明確に示唆されるか、選択肢が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味する。
【００３７】
本明細書使用する「湿潤」という用語の使用は、約５０％〜約９９．９％の水含有量を含むことを意味するために使用される。水含有量は、細胞内または細胞外いずれかで存在し得る。
【００３８】
本明細書で使用する「溶媒組」という用語は、１つまたはそれ以上の溶媒を含む組成物を意味するために使用される。これらの溶媒は、両親媒性（また両親媒性またはわずかに非極性として知られる）、親水性または疎水性（油溶性としても知られる）であり得る。いくつかの実施形態において、これらの溶媒は、水混和性であり、他において、これらは水中で混和しない。本発明の方法を実施するために使用してよい溶媒の非限定例には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルおよびアセトニトリル、アルカン（ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン）、エステル（酢酸エチル、酢酸ブチル）、ケトン（メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ））、芳香族（トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン）、ハロアルカン（クロロホルム、トリクロロエチレン）、エーテル（ジエチルエーテル）および混合物（ディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）が挙げられる。
【００３９】
両親媒性溶媒の非限定例には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリルおよびこれらの組み合わせが挙げられる。食物グレードエタノールがまた、開示された方法での利用のために望ましい。
【００４０】
疎水性溶媒の非限定例には、アルカン（ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン）、エステル（酢酸エチル、酢酸ブチル）、ケトン（メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ））、芳香族（トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン）、ハロアルカン（クロロホルム、トリクロロエチレン）、エーテル（ジエチルエーテル）、混合物（ディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
溶媒回収方法の非限定例には、蒸発、パーベーパレーション、溶媒成分の選択的吸着、スチームストリップおよびこれらの組み合わせが挙げられる。パーベーパレーションは、浸透側上に真空を形成することによる、重合膜を通した、溶媒成分の蒸気を選択的に除去する工程である。選択的吸着は、ゼオライトを用いて、エタノール水溶液から、少量の水を除去するために、エタノール産業において使用される。スチームストリップは、非温度感受性操作のために使用可能である。
【００４２】
本明細書で使用すると「界面層」という用語は、その中で、溶媒組の極性指数が、他の、隣接している溶媒組の極性指数から有意に異なる、相境界を含む、および隣接する領域を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する「極性指数」という用語は、Ｓｎｙｄｅｒ，Ｌ．Ｒ．「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｌｉｑｕｉｄｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，９２（２）：２２３−２３０（１９７４年５月）によって記述される、無次元のＳｎｙｎｅｒによる極性指数を指す。
【００４４】
本明細書で使用する「油」という用語は、中性脂質および極性脂質を含む組成物を含む。本明細書で使用する「藻類油（ａｌａｇｅ  ｏｉｌ）」および「藻類油（ａｌｇａｌ  ｏｉｌ）」とういう用語は相互互換的に使用される。
【００４５】
本明細書で使用する「透析物」または「浸透」という用語は、フィルタまたは膜を含むが限定はされない、分離デバイスを通して通過した材料を意味し得る。
【００４６】
本明細書で使用する「残余物」という用語は、透析物が分離デバイスを通して通過した後に残る材料を意味し得る。
【００４７】
本明細書で使用する「含むこと」という用語（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のような、任意の「含むこと」の形）、「有すること」（および「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」のような、任意の「有すること」の形）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」のような、任意の「含む」の形）、または「包含すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｉｇ）」（および「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「包含する（ｃｏｎｔａｉｎ）」のような、任意の「包含すること」の形）は、包括的であるか、開かれたものであり、さらなる、列挙されていない要素または方法段階を排除しない。
【００４８】
本明細書で使用する「極性脂質」という用語またはその任意の変形は、リン脂質およびグ糖質を含むが、限定されない。
【００４９】
本明細書で使用する「中性脂質」という用語またはその任意の変形は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、カロテノイド、ワックス、ステロールを含むが、限定されない。
【００５０】
本明細書で使用するところの語句「固相」は、一般に、固体ではないというよりは、より固体である物質の集団を意味し、相中の材料のすべてが固体であることを意味することを意図するものではない。したがって、いくらか液体が残っているが、著しい量の固体を有する相が、本語句の意味内に包含される。一方、本明細書で使用する「液相」は、一般に、液体ではないというよりは、より液体である物質の集団を意味し、そのような集団は、固体材料を含み得る。
【００５１】
本明細書で使用する「バイオディーゼル」という用語は、藻類から得られる脂肪酸のメチルまたはエチルエステルを意味する。
【００５２】
本明細書で使用する「栄養補助」は、健康および／または医学上の利益を提供する食物産物を意味する。非限定例には、カロテノイド、カロテン、ゼアキサチンのようなキサントフィル、アスタキサンチンおよびルテインが挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用する「バイオ燃料」という用語は、生物学的供給源から得られる燃料を意味する。非限定例には、バイオディーゼル、ジェット燃料、ディーゼル、ジェット燃料ブレンドストックおよびディーゼルブレンドストック挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用する「不純物」という用語は、極性脂質と関連して使用される場合、一緒に抽出される、または対象の産物と同一の特性を有する、目的とする産物以外のすべての成分を指す。
【００５５】
本明細書で使用する「潤滑油」という用語は、極性脂質と関連して使用される場合、Ｃ１６〜Ｃ２０アルカンのような水素処理された藻類脂質を指す。
【００５６】
本明細書で使用する「界面活性剤」という用語は、極性脂質と関連して使用される場合、グリコ脂質、リン脂質およびそれらの誘導体を指す。
【００５７】
本明細書で使用する「食物添加物」は、極性脂質と関連して使用される場合、藻類から得られた大豆レシチン代替物またはリン脂質を指す。
【００５８】
本明細書で使用する「非グリセリン物質」という用語は、グリセリン画分とともに分離する任意の不純物を意味する。さらなる清浄段階により、存在するほとんどのものが除去され、医薬品グレードグリセリンが産出される。
【００５９】
本明細書で使用する「不飽和脂肪酸」は、少なくとも１つの二重炭素結合を有する脂肪酸を意味する。不飽和脂肪酸の非限定例には、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、オクタデカノン酸、リノレン酸、ガンマ−リノレン酸、アルファリノレン酸、アラキジン酸、エイコセノン酸、ホモガンマリノレン酸、アラキドン酸、エイコサペネノイン酸、ベヘン酸、ドコサジエノン酸、ヘネイコサペンタエノン酸、ドコサテトラエノイン酸が挙げられる。骨格中に２０以上の炭素原子を有する脂肪酸は一般に、「長鎖脂肪酸」と称される。骨格中に１９以下の炭素原子を有する脂肪酸は一般に、「短鎖脂肪酸」と称される。
【００６０】
不飽和長鎖脂肪酸には、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸およびオメガ−９脂肪酸が挙げられるが、限定されない。本明細書で使用する「オメガ−３脂肪酸」という用語は、表１に列記された脂肪酸を指すが、限定はされない。
【表１】
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【００６１】
本明細書で使用する「ジェット燃料ブレンドストック」という用語は、ジェット燃料としての使用のために適切な炭素鎖長を有するアルカンを指す。
【００６２】
本明細書で使用する「ディーゼルブレンドストック」という用語は、ディーゼルとしての利用のために適切な炭素鎖長を有するアルカンを指す。
【００６３】
本明細書で使用する「動物餌」は、動物に対する栄養支援を提供するために消費され、使用できる藻類から得られる物質を指す。
【００６４】
本明細書で使用する「ヒト食物」は、人々に対する栄養支援を提供するために消費され、使用できる藻類から得られる物質を意味する。藻類から得られるヒト食物産物は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミンまたはミネラルのような必須栄養素を含み得る。
【００６５】
本明細書で使用する「バイオレメディエーション」は、産業廃水または地方自治体廃水からの硝酸塩、リン酸塩および重金属のような、しかし限定されない、汚染物質を除去するための、藻類生長の使用を指す。
【００６６】
本明細書で使用する「廃水」は、硝酸塩、リン酸塩および重金属を含むが、限定されない種々の夾雑物または汚染物質を含む、産業廃水または地方自治体廃水を指す。
【００６７】
本明細書で使用する「濃縮された」は約５０％以上の含有量を意味するものとする。
【００６８】
本明細書で使用する「実質的に」は、ほとんどを意味するものとする。
【００６９】
本明細書で使用する「グロブリンタンパク質」という用語は塩可溶性タンパク質を指す。
【００７０】
本明細書で使用する「アルブミンタンパク質」という用語は水溶性タンパク質を指す。
【００７１】
本明細書で使用する「グルテリンタンパク質」という用語は、アルカリ可溶性タンパク質を指す。
【００７２】
本明細書で使用する「ピロラミンタンパク質」という用語は、アルコール可溶性タンパク質を指す。プロラミンタンパク質の非限定例は、グリアジン、ゼイン、ホルデイン、アベニンである。
【００７３】
本明細書で使用する「藻類培養物」という用語は培養培地中の藻類細胞を指す。
【００７４】
本明細書で使用する「藻類バイオマス」という用語は、少なくとも部分的に脱水された藻類培養物を指す。
【００７５】
本明細書で使用する「脱水された」という用語は、少なくともいくらかの水の除去を指す。
【００７６】
本明細書で使用する「藻類ペースト」という用語は、流れることを可能にする流体特性を有する部分的に脱水された藻類培養物を指す。一般に、藻類ペーストは、約９０％の水含有量を有する。
【００７７】
本明細書で使用する「藻類ケーキ」という用語は、藻類ペーストの流体特性を欠き、凝集する傾向にある、部分的に脱水した藻類培養物を指す。一般に藻類ケーキは約６０％以下の水含量を有する。
【００７８】
海水藻類細胞は、海洋および汽水性藻類種を含むが、これに限定はされない。海水藻類細胞は、限定されないが、海、海洋および河口のような、水本体中で自然に見られる。海水藻類種の非限定例には、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ドウナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）が挙げられる。
【００７９】
淡水藻類細胞は、限定されないが、湖および池のような水本体中で自然に見られる。淡水藻類種の非限定例には、イカダモ（Ｓｃｅｎｄｅｓｃｅｍｕｓ  ｓｐ．）、（Ｈａｅｍｏｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）を含む。
【００８０】
本発明の方法とともに使用できる微小藻類の非限定例は、以下の分類の１つのメンバーである。Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、ＣｙａｎｏｐｈｙｔａおよびＨｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ。特定の実施形態において、本発明の方法とともに使用される微小藻類は、以下のクラスの１つのメンバーである。Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ、ＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅおよびＣｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ。特定の実施形態において、本発明の方法とともに使用される微小藻類は以下の属の１つのメンバーである。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、  Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｅｌｅｎａｓｔｒｕｍ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、ＡｍｐｈｏｒａおよびＯｃｈｒｏｍｏｎａｓ。
【００８１】
本発明の方法とともに使用できる微小藻類種の非限定例には、以下が挙げられる：Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｓｐｐ．、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｖａｒ．  ｌｉｎｅａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｖａｒ．  ｐｕｎｃｔａｔａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｖａｒ．  ｔａｙｌｏｒｉ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｃｏｆｆｅｉｆｏｒｍｉｓ  ｖａｒ．  ｔｅｎｕｉｓ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｄｅｌｉｃａｔｉｓｓｉｍａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｄｅｌｉｃａｔｉｓｓｉｍａ  ｖａｒ．    ｃａｐｉｔａｔａ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｆａｌｃａｔｕｓ、Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ  ｈｏｏｇｌａｎｄｉｉ、Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｎｏｒ、Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｅｄｉｏｎｕｃｌｅａｔｕｓ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ｖａｒ．  ｓｕｂｓａｌｓｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍａｓ  ｐｅｒｉｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｎｉｔｒａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｄｅｓｉｃｃａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ  ｖａｒ．  ｖａｃｕｏｌａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｇｌｕｃｏｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ  ｖａｒ．  ａｃｔｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ  ｖａｒ．  ａｕｘｅｎｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｏｂｏｐｈｏｒａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ｖａｒ．  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ｖａｒ．  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｉａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｎｏｃｔｕｒｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｏｖａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐａｒｖａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｈｏｔｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ｖａｒ．  ａｃｉｄｉｃｏｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｍｉｎｉｍａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ｖａｒ��  ｕｍｂｒｉｃａｔａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｉｓｉｇｌｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ  ｖａｒ．  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｏｒａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｎｎｉｅｌｌｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆｏ．  ｔｅｒｔｉａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆｏ．  ｔｅｒｔｉａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｖａｒ．  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｆｏ．  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｘａｎｔｈｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｍｅｎｅｇｈｉｎｉａｎａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄａｗｉｌ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂｉｏｃｕｌａｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌａｔｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐａｒｖａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｅｉｒｃｅｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ  ｓｐ．、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｅｉａ  ｓｐ．、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ  ｃｒｏｔｏｎｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ  ｓｐ．、Ｇｌｅｏｃａｐｓａ  ｓｐ．、Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ  ｓｐ．、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、ｌｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ａｆｆ．  ｇａｌｂａｎａ、ｌｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ａｃｃｅｐｔａｔａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｂｉｓｋａｎｔｅｒａｅ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｓｅｕｄｏｔｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓｐ．、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．、Ｎｉｔｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ａｌｅｘａｎｄｒｉｎａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｄｉｓｓｉｐａｔａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｆｒｕｓｔｕｌｕｍ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｈａｎｔｚｓｃｈｉａｎａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ  ｅｌｌｉｐｔｉｃａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐｕｓｉｌｌａ  ｍｏｎｏｅｎｓｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｑｕａｄｒａｎｇｕｌａｒ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖａ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｕｓｉｌｌａ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｌｉｍｎｅｔｉｃａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｕｂｂｒｅｖｉｓ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｐａｓｃｈｅｒｉａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐ．、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｍｕｔｕｍ、Ｐｈａｇｕｓ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｄｅｎｔａｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｃａ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎｏｉｄ  ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｒｍａｔｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｆ、Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ、Ｔａｇｅｔｅｓ  ｐａｔｕｌａ、Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ、およびＶｉｒｉｄｉｅｌｌａ  ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａｎａを含む。
【００８２】
他の実施形態において、バイオマスは、大豆、トウモロコシ、パーム、カメリナ、ジャトロファ、キャノーラ、ココナッツ、ピーナッツ、ひまわり、綿の実、亜麻仁、ひまわり、米ぬかおよびオリーブを含むが、限定はしない、植物材料であり得る。
【００８３】
例えば藻類バイオマスを含む、湿潤油性材料からの様々な極性の脂質および副産物（例えばタンパク質）を抽出するためのシステムおよび方法が開示される。具体的には、本明細書で開示される方法およびシステムは、両親媒性／疎水性溶媒と、次第に極性がなくなる水混合液（すなわち溶媒中の水／水比が、１つの抽出段階から次へ進めるにつれて、次第に減少する）での連続抽出を実施することによって、藻類成分を抽出および画分化両方を行う能力に関する。言い換えれば、最初に藻類中の藻類内に存在する間質水（藻類の重量のおよそ７５％）が、両親媒性／疎水性溶媒の共沸混合物まで、両親媒性／疎水性溶媒によって徐々に置き換わる。このことは、結果として、各段階において発展した極性にて可溶性である成分の抽出という結果となり、それによって、抽出された成分の同時画分化をもたらす。
【００８４】
本工程は、２つの相、すなわち１つはより軽く、１つはより重い相を含む混合物をもたらす。軽相は、疎水性溶媒と極性脂質を含む。非極性脂質もまた本相中に存在する。重相は、両親媒性溶媒、水および残りの藻類バイオマスを含む。疎水性溶媒の存在は、総抽出物中に存在する他の藻類成分からの、脂質成分の選択的抽出を可能にする。これは、ほとんどタンパク質も水溶性藻類生成内容物も含まないより純粋な脂質生成物をもたらす。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態において、単一の溶媒および水を、油性材料中に存在する成分を抽出および画分化するために使用する。他の実施形態において、溶媒組および水を、油性材料中に存在する成分を抽出および画分化するために使用する。いくつかの実施形態において、油性材料は湿潤である。他の実施形態において、油性材料は藻類である。
【００８６】
極性脂質回収率は主に、そのイオン性電荷、水溶性および位置（細胞内、細胞外または膜結合）に依存する。極性脂質の例は、リン脂質および糖脂質を含むが、これらに限定はされない。極性脂質を分離し、精製するために使用可能な戦略は、大まかにはバッチまたは連続モードに分けることができる。バッチモードの例には、沈殿（ｐＨ、有機溶媒）、溶媒抽出および結晶化が挙げられる。連続モードの例には、遠心、吸着、泡分離および沈殿、および膜技術（接線フロー濾過、透析および沈殿、超濾過）が挙げられる。
【００８７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記述から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な記述および実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、例示説明のみとして提供される。さらに、本発明の精神および範囲内での変更および改変が、この詳細な記述から、当業者に明らかになるであろうことが企図される。
【００８８】
驚くべきことに、提案される非破壊的抽出工程は、９０％以上の回収率をもたらす。残っているバイオマス中の少量の極性脂質が、残っているバイオマスをフィードのために使用する場合に、その価値を増強させる。これは、少なくとも部分的に、バイオマスの超長鎖不飽和脂肪酸含量による。加えて、エタノール抽出物をさらに、直接エステル交換することができる。さらに、現存する従来の方法とは異なり、本明細書で記述される方法およびシステムは、任意の藻類に対して一般的であり、水混和性有機溶媒勾配の利用によって、藻類中の、極性脂質を含む、価値のある成分のかなりの部分の回収を可能にする。
【００８９】
本発明の利用によって得た中性脂質画分は、低金属含量を有し、それによって脂質画分の安定性を増強し、続く処理段階をへらす。金属は、酸化を触媒するそれらの能力により、中性脂質を不安定にする傾向にある。さらに、金属は、水素処理触媒を阻害し、中性脂質混合物が純化できる前に、それらの除去を必要とする。本明細書で開示したシステムおよび方法は、タンパク質および／または極性脂質画分中に金属の抽出を可能にする。このことは、タンパク質および極性脂質が金属曝露によって大きくは影響を受けないので、利点であり、いくつかの場合で、実際にそれらは金属によって安定化される。
【００９０】
本明細書で開示されるシステムおよび方法は、湿潤バイオマスで開始可能でき、乾燥および脱水コストを減少させる。従来の抽出工程と比較して、開示される抽出および画分化工程は、溶媒リサイクルとともに、穏やかな温度と圧力状態のために、比較的低操作コストでとなるであろう。さらに、従来の抽出工程は、コストが非常にかさみ、市場の要望に合うことができない。
【００９１】
本明細書で記述するシステムおよび方法の他の態様は、抽出工程の間の、中性脂質からの極性脂質の分離である、予備再生を達成する能力である。例となる実施形態にて使用する藻類油と、以前の実施形態にて使用された植物油間の差は、脂質の個々のクラスの割合（％）を含む。例示藻類未精製油組成を、植物油と比較して、以下の表２に示す。
【表２】
2014514923.tif 000004
【００９２】
極性脂質（例えば糖脂質およびリン脂質）を除去するために植物油の脱ガム化（物理的および／または化学的）を行う。化学的に脱ガム化された植物油は、有意な量の中性脂質を維持する。この中性脂質画分をさらに、溶媒抽出または超臨界／臨界未満流体抽出または膜技術を用いて、脱ガム化された材料から取り出す。それとは対照的に、油性藻類バイオマスからの中性脂質の分離は、藻類油中で典型的にみられる大量の極性脂質の存在により、植物油フィードストックからよりも極めて難しい（表２を参照のこと）。これは、藻類油中に存在するより多くの割合の極性脂質が、中性脂質の乳化を促進するからである。乳化はさらに、溶液中に残る栄養および塩成分によって安定化される。金属とともに、極性脂質の存在が、中性脂質の分離および利用に対する工程の難しさをもたらす。しかしながら、極性脂質には既存の市場が存在するので、これらの回収が、燃料を産出するために、藻類油の利用に対して、有意な価値を加え得る。
【００９３】
極性脂質は、それらの分子構造により、生来界面活性剤であり、大きな既存マーケットが存在する。極性脂質を産出するための既存の技術の多くは、原材料であるか、または法外にコストがかかる。糖脂質およびリン脂質のための代替のフィードストックは、主に藻類油、オートムギ油、小麦胚種油および植物油である。藻類油は典型的に、種、細胞の生理学的状態、培養条件、採集の時間および抽出のために使用した溶媒に依存して、約３０〜８５％（ｗ／ｗ）の極性脂質を含む。さらに、各極性脂質のグリセロール骨格は、中性脂質トリアシルグリセロール中に見られるような３つではなく、結合した２つの脂肪酸基を有する。極性脂質のエステル交換は、重量基準あたりにおいて、中性脂肪のエステル交換と比べて、わずか２／３の最終産物、すなわちエステル化脂肪酸を産出し得る。したがって、極性脂質の除去および回収は、藻類からの高品質のバイオ燃料またはトリグリセリドを産出することにおいて非常に有益であるのみでなく、藻類に基づくバイオ燃料産出と関連したコストを相殺可能な、価値を加えた副産物糖脂質およびリン脂質も産出する。藻類によって産出された種々の油および副産物を簡単に回収および画分化する能力は、藻類油工程の経済的な成功に対して有利である。
【００９４】
本明細書で記述する方法およびシステムのさらなる態様は、藻類バイオマスのような、油性材料からタンパク質を抽出する能力である。藻類バイオマスからの油性材料の抽出の本明細書で開示される方法は、抽出および画分化の柔軟性があり、高くカスタマイズ可能な工程を含む。例えば、いくつかの実施形態において、抽出および画分化は、単一段階で起こり、それによって非常の効率のよい工程が提供される。そのようなバイオマスから供給されるタンパク質は、動物餌、食物成分および工業産物のために有用である。例えば、そのようなタンパク質は、繊維、接着剤、コーティング、セラミック、インク、化粧品、織物、チューインガムおよび生物分解性プラスチックのような適用において有用である。
【００９５】
本明細書で記述される方法およびシステムのもう一つの態様は、抽出されるべき成分に基づいて、溶媒に対する藻類バイオマスの比を変えることが包含される。１つの実施形態において、藻類バイオマスを、等重量の溶媒と混合する。もう一つの実施形態において、藻類バイオマスを、より少ない重量の溶媒と混合する。またさらに一つの実施形態において、藻類バイオマスを、より大きな重量の溶媒と混合する。いくつかの実施形態において、藻類バイオマスと混合する溶媒の量は、使用されるべき溶媒と藻類バイオマス／溶媒混合物の望む極性に基づいて計算される。さらに他の実施形態において、藻類塊はいくつかの段階で抽出される。例となる実施形態において、藻類バイオマスは、まずわずかに非極性の、水混和性溶媒で、約５０〜６０％のその重量で、連続して抽出される。第二に残っている藻類固体が、溶媒中固体の重量約７０％を用いて抽出される。第三の抽出をついで、約９０％の溶媒中の固体重量を用いて実施する。本発明のこれらの態様が知らされることで、当業者は、選択的に藻類産物を抽出するために、藻類バイオマスおよび／または固体残余物の、望む極性に対する比を調整することによって、異なる極性の異なる溶媒を使用することが可能であろう。
【００９６】
例えば、好ましい実施形態において、使用される溶媒はエタノールである。成分が、溶媒の比を変えることによって選択的に単離され得る。藻類バイオマスから、タンパク質は約５０％エタノールによって、極性脂質は約８０％エタノールよって、そして中性脂質は約９５％以上のエタノールによって抽出可能である。メタノールが使用される場合、藻類バイオマスからタンパク質を抽出するための溶媒濃度は、約７０％であろう。極性脂質は、約９０％のメタノールを必要とし、中性脂質は約１００％メタノールを必要とするであろう。
【００９７】
本明細書で記述されるシステムおよび方法の実施形態は、驚くべき、そして予期せぬ結果を示す。まず最初に、回収／抽出工程が、湿潤バイオマス上で実施可能である。これは、例となる実施形態が、細胞を乾燥させ、破壊するために必要な大量のエネルギーの利用を避けるので、主要な経済的利点である。乾燥藻類バイオマスからの中性脂質の抽出は、本発明のシステムおよび方法を用いると、極めてより効果的である。開示された工程から得られた収率は、従来の抽出によって得られたものよりも、有意に高く、純粋である。これは、従来の抽出が頻繁に乳濁物をもたらし、成分分離を極めて難しくするからである。
【００９８】
例となる実施形態は、任意の藻類または非藻類油性材料に適用され得る。例となる実施形態は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルおよびアセトニトリルを含むが、限定はされない、任意の水混和性の、わずかに非極性な溶媒を用いることができる。特定の実施形態は、エタノールのような、環境に優しい再生可能溶媒を用いることができる。試験したアルコール溶媒は、単離された中性脂質のより高い収率および純度をもたらした。エタノールは、本明細書で開示される他の溶媒と比較して、購入が比較的経済的である。いくつかの例となる実施形態において、抽出および画分化は、一段階で実施可能であり、続いて必要であれば膜に基づく精製が続く。得られたバイオマスは、ほぼ水を欠いており、水性藻類スラリーよりも少ないエネルギーで、完全に乾燥可能である。
【００９９】
いくつかの例となる実施形態において、抽出するために使用する溶媒はエタノールである。他の実施形態は、シクロヘキサン、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、トルエン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、イソプロパノールおよびメタノールを含むが、限定はされない。いくつかの実施形態において、同一の溶媒が、連続抽出段階で使用される。他の実施形態において、異なる溶媒が、各抽出段階で使用される。さらに他の実施形態において、１つまたはそれ以上の抽出段階で、２つまたはそれ以上の溶媒を混合し、使用する。
【０１００】
本明細書で記述される方法のいくつかの実施形態において、任意の抽出段階で使用する２つ以上の溶媒の混合物は、少なくとも１つの疎水性溶媒と、少なくとも１つの親水性溶媒を含む。そのような混合物を用いる時、親水性溶媒が、拡散を介して、バイオマスより材料を抽出する。一方、比較的少量の疎水性溶媒が、組み合わせで使用され、目的の物質が、少量の疎水性溶媒中で濃縮されるように、液体−液体分離中に含まれる。２つの異なる溶媒がついで、二層系を形成し、これは、本技術分野で公知の技術を用いて分離することができる。そのような実現形態において、疎水性溶媒は、アルカン、エステル、ケトン、芳香族、ハロアルカン、エーテルまたは市販されている混合物（例えばディーゼル、ジェット燃料、ガソリン）のうちの１つ以上のいずれでもあり得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本明細書で記述される抽出工程は、１つ以上の段階でｐＨ逸脱を含む。そのようなｐＨ逸脱は、タンパク質性物質を単離するために有用である。いくつかの実施形態において、抽出工程のｐＨは酸性である（例えば、約５より低い）。いくつかの実施形態において、抽出工程のｐＨはアルカリ性である（例えば約１０より高い）。
【０１０２】
従来の抽出手順におけるヘキサンの利用は、藻類バイオマスを汚染し、副産物が食物製品中で使用されなくなりう得る。本発明の実施形態は、極めてより低いエネルギーの使用を必要とし、製品を、燃料ならびに食料および栄養補助剤としての利用に対して好適であるようにするので、本技術分野で公知なものに対して優れている。
【０１０３】
本明細書中で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法またはシステムに関して実行可能であり、その逆もある。さらに、本発明のシステムは、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【０１０４】
例となる実施形態の記述
藻類からの油の溶媒抽出のために、最良のケースシナリオは、選択的にトリアセチルグリセロール（ＴＡＧ）を抽出し、ワックス、ステロールのような、全ての極性脂質および非ＴＡＧ中性脂質を、高回収にて藻類細胞中に残す溶媒である。第二の選択肢は、極性脂質を選択的に抽出し、ついで極性脂質を欠くより純粋な中性脂質を抽出して、高回収をもたらすことであろう。最後のオプションは、全ての脂質を抽出し、１または２段階で、非常に高収率が達成されることであろう。
【０１０５】
ここで図１Ａを参照すると、フローチャート１００は、藻類含有バイオマスからの脂質の画分化および精製において使用される方法の例となる実施形態中に含まれる段階の概要を示す。第一の段階１１０にて、藻類細胞を採集する。続く段階１２０にて、水を藻類細胞から除去して、１０〜２５％固体バイオマスを産出する。段階１３０にて、溶媒ベースの抽出がバイオマスに対して実施され、画分が回収される。いくつかの実施形態において、段階１３０はまたｐＨベースの抽出および画分回収を含む。最後に、濾過、デカンタおよび遠心のような技術を含むが、限定はされない、固体／液体相分離を、より少ない脂質成分を分離するために、段階１４０で実施することができる。
【０１０６】
段階１１０にて採集された時に、藻類バイオマスは典型的に、約１〜５ｇ／Lの総固体からなる。バイオマスを、気泡浮上分離法、膜濾過、綿状沈殿、沈降、濾過加圧、傾斜または遠心を含むが、限定されない技術を用いて、段階１２０にて部分的に脱水することができる。脱水は、固体または半固体基質から、いくらかの、ほとんどの、または全ての水を除去することである。本発明の実施形態は、採集した藻類バイオマスから水を除去するために、脱水技術を利用する。脱水は、本明細書で記述される任意の方法のうちの任意の１つまたは組み合わせを用いて、ならびに当業者に公知の任意の他の方法によって実施することができる。
【０１０７】
段階１２０からもたらされた脱水藻類バイオマスは、典型的には、約１０〜３０％の固体からなる。このバイオマスをついで、各ステージで画分を分離する、多ステージの逆流溶媒抽出工程で、水混和性のわずかに極性の溶媒（例えばアルコール）により抽出可能である。この種類の工程は、資本および営業経費両方を減少させ得る。いくつかの実施形態において、バイオマスまたは、タンパク質物質を画分化するために、酸および／またはアルカリ抽出を受ける。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、藻類バイオマスの脱水を、採集した藻類バイオマスをエタノールのような溶媒で処理することによって実施することができる。藻類バイオマスをついで、溶液から沈降するようにし、限定されないがサイフォンで吸い出すことのような方法によって液体を除去することができる。脱水のこの新規の方法は、公知の方法よりも低い資本および営業経費を有し、溶媒リサイクルを可能にし、バイオマスを乾燥させるコストを減少させ、藻類成分の抽出および／または分離の開始前に、藻類バイオマスの極性を減少させるさらなる利点を有する。事実、本明細書で記述される溶媒に基づく沈降工程が、部分的に、有機溶媒が藻類表面上の陰性の電荷を減少させるか、中和するという事実により、効果的であることが理論づけられている。本発明のいくつかの実施形態において、脱水方法が、さらなる水を除去するために組み合わせられる。いくつかの実施形態において、脱水工程の間の溶媒の添加が、抽出の工程を開始する。
【０１０９】
図１Ｂは、脱水工程３００の例となる実現形態を示す。約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ（すなわち０．１〜１％  ｗ／ｗ）の最終乾燥重量を有する藻類培養３１０を、水分離工程３２０に供する。工程３２０は、遠心、傾斜、沈降または濾過を含み得る。１つの実施形態において、焼結した金属チューブフィルタを使用して、培養物の水から藻類バイオマスを分離する。そのようなフィルタを使用する場合、回収された水３３０を、他の藻類培養物に対してリサイクルする。その間、回収された藻類バイオマスは約２００ｇ／Ｌ（すなわち１０〜２０％  ｗ／ｗ）という高い藻類濃度で「藻類ペースト」に濃縮されている。この濃縮された藻類ペーストをついで、溶媒に基づく沈降工程３５０中、溶媒３４０で処理する。
【０１１０】
沈降工程３５０には、溶媒３４０を藻類ペーストに加えて、約１：１〜約１：１０の重量／重量溶媒対バイオマス比を有する混合液を達成することが含まれる。藻類を、沈降瓶中で沈降させ、溶媒／水混合物３６０を、例えばサイフォンによる吸い上げおよび／または傾斜によって除去する。溶媒を、蒸留および／またはパーベーパレイションのようなよく公知の技術によって回収し、再利用することができる。残った湿潤バイオマス３７０は、アルコールおよび水溶液中、約３０％〜約６０％ｗ／ｗの固体含量を有すると推定される。
【０１１１】
脱水のために理想的な溶媒は、１．１ｇ／ｍＬより上、または０．９ｇ／ｍＬより下の密度を有する産業上一般的な水溶性溶媒である。例には、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、エタノール、メタノール、１−プロパノール、重水（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコールおよび／またはグリセリンが挙げられる。溶媒密度が１．１ｇ／ｍＬより高い場合、藻類バイオマスは、沈降瓶の底にて沈降を作り出すのではなく、浮遊する。
【０１１２】
図２は、抽出システム２００の例となる実施形態の概略ダイアグラムである。湿潤または乾燥藻類バイオマスを、限定されないが、移動ベルト、スクリューコンベア、または抽出チャンバを通すことを含む、本技術分野で公知の方法を用いて運搬する。抽出のための溶媒は、各バイオマススロット位置に割り当てられた保存タンクから再循環される。抽出混合物を濾過し、バイオマス固体をスロット内に戻し、抽出物を保存タンク内に戻す。ベルト上の固体が、抽出のための在留時間要求に基づいて周期的に移動する。各保存タンク内の抽出物を、飽和にて補充するか、新鮮な溶媒によって連続して置き換えてよい。これによりまた、下流の処理時間およびコストが劇的に減少することとなる。本実施形態は、主要貯留容器２１０、輸送機構２２０、複数の分離デバイス２４１〜２４８（例えば膜濾過デバイス）、複数の抽出貯留容器２６１〜２６８、および複数のリサイクルポンプ２８１〜２８７を含む。本実施形態において、主要貯留容器２１０は、複数数の入口貯留容器２１１〜２１８に分けられる。
【０１１３】
操作の間、藻類バイオマス２０１を、輸送機構２２０の第一末端２２１近くの第一入口貯留容器２１１に配置する。さらに、溶媒２０５を、輸送機構２２０の第二末端２２２の近くの入口貯留容器２１８内に配置する。輸送機構２２０は、第一末端２２１から第二末端２２２への輸送機構２２０にそって藻類バイオマスを移動させる。藻類バイオマスは輸送されると、複数の分離デバイス２４１〜２４８を通り、種々の極性の画分に分離される。分離デバイス２４１〜２４８を通る透析物部分が、貯留容器２６１〜２６８に移動される。
【０１１４】
例えば、第一の分離デバイス２４１を通る藻類バイオマスの透析物部分（例えば、分離デバイス２４１を通るのに十分小さな液体および粒子を含む部分）が第一の貯留容器２６１に移動される。第一の貯留容器２６１から、透析物部分を、第一の入口貯留容器２０１にリサイクルすることができる。第一の分離デバイス２４１を通らない藻類バイオマスの残余物部分はついで、輸送機構２２０によって、第二の入口貯留容器２１２と第二の分離デバイス２４２へ移動させることができ、このデバイスは第一の分離デバイス２４１よりも微小な分離または濾過メディアを含み得る。
【０１１５】
第二の分離デバイス２４２を通る透析物部分のセグメントを第二の貯留容器２６２に移動させることができ、ついでリサイクルポンプ２８２を介して第二の入口貯留容器２１２にリサイクルできる。第二の分離デバイス２４２を通らない藻類バイオマスの残余物または抽出された部分は、第三の入口貯留容器２１４へ、輸送機構２２０によって移動させることができる。この工程は、各ステージにおける残留部分が、続く入口貯留容器に対して移動されるように、入口貯留容器２１３〜２１８と分離デバイス２４３〜２４８に対して繰り返すことができ、一方で透析部分が、リサイクル貯留容器に対して移動され、現在の入口貯留容器にリサイクルされる。
【０１１６】
例となる実施形態において、第一画分は、最も高い水対わずかに非極性の溶媒比、すなわち最も極性の混合物で抽出され、最後の画分は、もっとも純粋なわずかに非極性の溶媒、すなわち最小極性混合物で抽出される。したがってこの工程は、画分で、極性が減少する順番で成分を抽出する。第一画分の機能は、残余水を除去し、溶媒抽出工程を促進することである。続く画分は、極性脂質が豊富であり、一方最後の画分は中性脂質が豊富である。
【０１１７】
油画分を、長鎖不飽和脂肪酸を開放するためにエステル化することができる。カルテノイドおよび長鎖不飽和脂肪酸は、非分子蒸留と合わせた分子蒸留のような工程を用いて、油から分離することができる。すべての脂肪酸を、分子蒸留を用いてカロテノイドから分離することができる。蒸留物を、単純な蒸留カラムを用いて画分化して、精製のために低鎖脂肪酸を分離することができる。長鎖不飽和脂肪酸は、カラム内で、高沸点残余物として残る。
【０１１８】
いくつかの非限定の実施形態において、本明細書で記述した抽出システムおよび方法は、油性材料（例えば藻類バイオマス）からタンパク質物質を単離するための１つ以上の段階を含む。そのようなタンパク質抽出段階は、タンパク質の単離および抽出を達成するために、ｐＨ調節（複数可）を使用する。例えば、１つの非限定の実施形態において、第一分離デバイス中の溶媒のｐＨが、タンパク質抽出のために最適化され、タンパク質物質が豊富である第一画分をもたらす。タンパク質抽出段階のｐＨを、目的のタンパク質のｐＫａに応じて調節する。目的のタンパク質のｐＫａは、Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｚｍａｎｎ等式、経験的方法、分子動力学に基づいた方法または滴定曲線の利用を含むが、限定されない、当業者に公知の方法を用いて解明することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、溶媒のｐＨはアルカリ性である。例えば、いくつかの実施形態において、溶媒のｐＨは、約１０より高い。他の実施形態において、溶媒のｐＨは、約１０〜約１２の範囲である。さらなる実施形態において、溶媒のｐＨは約１０、約１１または約１２である。他の実施形態において、溶媒のｐＨは酸性である。例えば、いくつかの実施形態において、溶媒のｐＨは約５より低い。他の実施形態において、溶媒のｐＨは約２〜約５の範囲である。さらなる実施形態において、溶媒のｐＨは約２、約３、約４、約４．５または約５である。第一の分離デバイスの抽出部分がついで、極性に基づく抽出および画分化を達成するために、続く入口貯留容器に移動される。もう一つの非限定実施形態において、タンパク質物質が、同様の方法（すなわち溶媒のｐＨ調節）によって、最終の分離デバイス中で分離される。
【０１２０】
溶媒のｐＨの調節は、当業者に公知の方法にしたがって達成される。例えば、酸性ｐＨは、溶媒気流内への適切な酸の混合によって達成される。タンパク質抽出のために有用な例となる酸には、リン酸、硫酸および塩酸が挙げられるが、限定はされない。同様に、アルカリ性ｐＨは溶媒流内への適切な塩基の添加および混合によって達成される。タンパク質抽出のために有用な例となる塩基には、水酸化カリウムおよび水酸化ナトリウムが挙げられるが、限定されない。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、タンパク質抽出が、本明細書で記述される抽出および画分化システムとは別のシステム内で実施される。例えば、いくつかの実施形態において、藻類バイオマスが、ｐＨ調節溶媒混合液中に浸され、続いて適切な分離技術（例えば遠心または濾過）を介して単離される。残った固体をついで、本明細書で記述されるように、極性に基づいた抽出および画分化内に導入する。同様に、いくつかの実施形態において、極性に基づいた抽出および画分化工程からの残っている抽出物をｐＨ調節溶媒混合液に曝露し、抽出工程の終了時に、タンパク質物質を単離する。
【０１２２】
図３で示すように、溶媒選択および極性に基づいた画分化の理論が、溶媒の広範囲な解析と、固体材料からの脂質の分離を可能にする、Ｓｏｈｘｌｅｔ抽出工程を用いる抽出における効果によって開発された。Ｓｏｈｘｌｅｔ抽出システムは、脂質クラスの選択性および回収に対する迅速なスクリーニング溶媒のために使用された。アルカン、シクロアルカン、ハロゲン化アルキル、エステル、ケトンのような広い範囲の極性を含む種々の化学クラスが試験された。抽出の前に、バイオマスの脂質含量と組成を、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ脂質抽出法のような藻類油推定のための標準の方法を用いて三重で試験した。バイオマスは、２２．１６％の総脂質を含み、そのうち４９．５２％が中性脂質であった。
【０１２３】
図３は、Ｓｏｈｘｌｅｔ抽出工程と組み合わせた、種々の極性および非極性溶媒を用いた乾燥藻類質量の抽出によって集めたデータを示す。アルカン溶媒の鎖長に依存して、６０〜７０％の純度の中性脂質と、１５〜４５％の総脂質回収率が、破砕および溶媒抽出なしに達成できる。試験した最も長い鎖アルカン溶媒であるヘプタンは、６０％の中性脂質と４２％の総脂質を回収した。図３で示すように、ヘキサンのような溶媒と従来の抽出方法を用いた乾燥藻類質量の抽出の結果は不十分で、高価であり、結果として収率が低い。本明細書で開示されるシステムおよび方法は、成分の欠損が最小で、異なる極性の成分を分離するために、わずかに非極性の溶媒の水に対する比率を制御することによって、これらの非効率性に対処する。
【０１２４】
炭素がより少ないアルコール溶媒は、極性脂質に対してより選択的であった。中性脂質純度はメタノールでは２２％、エタノールでは４５％であった。イソプロピルアルコールは、極性および非極性脂質間にいかなる選択性も示さず、５２％の純粋な中性脂質産物をもたらした。メタノールは、６７％の総脂質および９０％超の極性脂質を回収した。したがって、メタノールが本発明の実施形態に対する優れた候補であり、そこでメタノールは、ヘプタンまたはヘキサンを用いて中性脂質を抽出する前に、油性材料から極性脂質を選択的に抽出するために使用することができる。試験した他の溶媒クラスは、本来のバイオマス中に存在する脂質組成物と同様に、中性脂質純度が４９％に近かったので、脂質クラスに向かう選択性は示さなかった。さらに、これらの溶媒にて達成された総脂質回収率は約１５〜３５％の範囲であり、これらの溶媒を、特定の脂質クラスの選択的抽出または総脂質抽出に対して不適切とする。
【０１２５】
Ｓｏｈｘｌｅｔ解析からの結果を、実施例１にて以下記述する標準ベンチスケールバッチ溶媒抽出器具を用いて確認した。選択した溶媒は、極性脂質を回収するために、第一の段階に対してメタノールであり、中性脂質の回収のために第二段階において石油エーテルであった。すべての抽出を、１：１０固体:溶媒比で実施した。本実験における各抽出段階は１時間であった。実施した他の実験（データは示していない）は、約４５分以上で、抽出にとって成功するために十分長いことを示唆している。本保持時間は、システムの熱および質量伝達に依存する。
【０１２６】
メタノール抽出を、どれが最適であるか決定するために、異なる温度、４０℃、５０℃および６５℃にて実施した。石油エーテル抽出を、溶媒の沸点に近い３５℃にて実施した。その中性脂質に対する高い選択性、低沸点、および抽出後に観察される産物品質から、石油エーテルを選択した。
【０１２７】
図４Ａは、６５℃にてメタノール抽出段階後実施した石油エーテル抽出中の中性脂質純度が８０％を越えることを示しており、これら２つの抽出段階の組み合わせが、最終未精製油産物の中性脂質含量を増強したことを示している。図４Ｂは、総中性脂質回収率が低く、第一の段階においてかなりの量の中性脂質欠損が存在したことを示している。
【０１２８】
メタノール抽出段階における中性脂質の欠損を最小化するために、溶媒の極性を、水を溶媒に加えることによって増加させることができる。図５Ａおよび５Ｂは、７０％ｖ／ｖメタノール水溶液での前述したバイオマスの抽出、続く石油エーテルでの抽出の結果を示す。図５Ａは、中性脂質純度が、純粋なメタノールの使用によって達成されたものよりも、石油エーテル抽出においてより高かったことを示している。さらに、中性脂質の欠損は、第一の抽出段階において、メタノール水溶液を使用することによって大きく減少した。図５Ｂにて見られるように、より高い温度でのメタノール抽出が、中性脂質純度を改善したが、続く段階において、総脂質回収をわずかに減少させた。
【０１２９】
いくつかの例となる実施形態において、抽出工程の温度を、藻類バイオマス中に存在する藻類成分の最適な安定性を確かにするために制御する。藻類タンパク質、カロテノイドおよびクロロフィルは、温度に対する敏感性を示す藻類成分の例である。他の実施形態において、温度を、温度に対して敏感な藻類成分が藻類バイオマスから抽出された後に上昇させる。
【０１３０】
さらに他の例となる実施形態において、抽出工程の温度を、望む産物の収率を最適化するために調節する。抽出は、室温から、抽出混合物の沸点までだがそれより低いで実施することができる。さらに他の実施形態において、抽出工程の温度は、望む産物の可溶性に応じて変化させる。さらに他の実施形態において、抽出温度は、抽出されるべきバイオマスの藻類株に応じて最適化される。上昇した抽出温度は、望む化合物の可溶性を増加させ、抽出混合物の粘度を減少させて、抽出回収率を増強する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、抽出を、抽出混合物の沸点を上昇させるために、圧力下で実施する。これらの実施において、圧力は、抽出混合物の温度を、任意の所望する産物が分解、変性、腐食、または破壊を開始するであろう温度より低い温度に維持しながら、沸騰が起こらないようにするために必要な程度まで増加させる。
【０１３２】
いくつかの例となる実施形態において、抽出が実施される（例えば大気圧または上昇圧）条件にて、抽出は使用された溶媒の沸点近くで実施される。他の実施形態において、抽出は、抽出混合物の沸点近くで実施され、ここでも他の抽出条件が考慮される。そのような温度では、溶媒の藻類細胞内への蒸気相浸潤が、より低い質量伝達抵抗によりより速い。抽出温度が、溶媒の沸点を有意に超えることが許される場合、溶媒−水システムは共沸混合物を形成可能である。したがって、溶媒の沸点にて、またはその近くでシステムを維持することは、支出を減少させる一方で、抽出を増強するのに十分な蒸気を産出することとなる。さらに、油の溶解性が高温では上昇し、そのことが、さらに溶媒沸点温度に近い温度にて抽出の効果を増加させることができる。図６は、メタノール水溶液石油エーテル抽出スキーム中の総脂質回収率を示している。その沸点近くでメタノール抽出を実施することで、図５Ｂで観察されたように中性脂質回収率はわずかに減少するが、総脂質回収を増加させる。
【０１３３】
他の実施形態において、抽出を周囲照明条件下で実施する。他の実施形態において、抽出は、分解から光に敏感な藻類成分を保護するために、鋼管または鋳造物の等の、しかし限定されない、不透明容器中で実施される。カロテノイドは光に敏感な藻類成分である。
【０１３４】
他の例となる実施形態において、抽出は、通常の大気条件下で実施する。さらに他の実施形態において、抽出は、酸化する傾向にある藻類成分を保護するために、窒素環境下で実施する。また他の実施形態において、抽出は、酸化する傾向にある藻類成分を保護するために、不活性気体の環境下で実施する。酸化する傾向にある藻類成分には、カルテノイド、クロロフィルおよび脂質が挙げられる。
【０１３５】
例となる実施形態において、抽出のために溶媒対固体比は、バイオマス中の固体の乾燥重量に基づいて３〜５である。残余藻類バイオマスは、炭水化物（例えばデンプン）が豊富であり、抽出のために使用される溶媒を産出するためにフィードストックとして使用できる。
【０１３６】
図７は、総脂質回収率に対する、溶媒対固体比の効果を示す。溶媒対固体比が増加すると、対応する総脂質回収率の劇的な増加があった。これは、ヘキサンのような他の一般に使用される油抽出溶媒と比較して、メタノール中の脂質の可溶性が低いためであったと考えられる。
【０１３７】
化合物の可溶性は、抽出工程で使用する溶媒の極性によって影響を受ける。望む産物の可溶性特性を、望む産物を選択的に抽出するため、溶媒に対する湿潤バイオマスの適切な比を決定するために使用することができる。本二溶媒抽出システムにおいて、疎水性溶媒量は、両親媒性溶媒の可溶性と、疎水性溶媒中の脂質に基づいて計算される。
【０１３８】
約６．５〜６．７の極性指数が、タンパク質および、糖および塩のような他のアルコール可溶性材料を抽出する。そのような抽出混合物からのアルコールとタンパク質の除去後、残っている材料は優れた発酵培地であることがわかった。極性脂質と中性脂質の抽出のための混合物の極性指数は、それぞれ約５．６〜５．９および５．３〜５．５であると計算される。所望の成分を抽出することに関する重要な点は、疎水性および両親媒性溶媒の量を変えること、常に湿潤藻類バイオマス中に存在する水を考慮することによって、抽出混合物の極性を操作することである。溶媒の既知の極性指数を使用することによって、溶媒の量を、所望の抽出混合極性を達成するために調節することができる。
【０１３９】
例えば、４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスは、各１００ｇの湿潤バイオマスにつき、４０ｇのバイオマスと６０ｇの水を有する。１００ｇのエタノールをこの混合物に加える場合、エタノールの湿潤バイオマスに対する比は、１部分のエタノールに対して１部分の湿潤バイオマスであり、混合物中のエタノールの濃度は、液相中１００／（１００＋６０）＝約６２％ｗ／ｗのエタノールである。エタノール水混合液中の６２％ｗ／ｗエタノールは、重量および成分の極性の平均化によって計算され、６．６の極性指数に対応する。６２％エタノールと３８％水を含む混合液中、５．２の極性指数を有するエタノールと、９の極性指数を有する水は、（０．６２＊５．２＋．３８＊９）約６．６の極性指数をもたらす。極性脂質と中性脂質の抽出のための混合液の極性指数はそれぞれ、約５．８と５．４であると計算される。
【０１４０】
例えば、４０％ｗ／ｗの湿潤バイオマスは、各１００ｇの湿潤バイオマスにつき、４０ｇバイオマスと６０ｇの水を有する。１００ｇのエタノールをこの混合物に加える場合、エタノールの湿潤バイオマスに対する比は、１部分のエタノールに対して１部分の湿潤バイオマスであり、混合物中のエタノールの濃度は、液相中１００／（１００＋６０）＝約６２％ｗ／ｗのエタノールである。エタノール水混合液中の６２％ｗ／ｗエタノールは、重量および成分の極性の平均化によって計算され、６．６の極性指数に対応する。６２％エタノールと３８％水を含む混合液中、５．２の極性指数を有するエタノールと、９の極性指数を有する水は、（０．６２＊５．２＋．３８＊９）約６．６の極性指数をもたらす。極性脂質と中性脂質の抽出のための混合液の極性指数はそれぞれ、約５．８と５．４であると計算される。アセトニトリルを疎水性溶媒として使用する場合、約２％である、エタノール／アセトニトリル／水共沸物質中の水の量のおよそ二倍の界面層体積であるので、アセトニトリルの量は、エタノールの量の約２％〜４％であり得る。
【０１４１】
もう一つの例において、４０％ｗ／ｗ湿潤バイオマスは、１００ｇの湿潤バイオマスにつき、４０ｇのバイオマスと６０ｇの水を有する。１００ｇのエタノールをこの混合物に加える場合、エタノールの湿潤バイオマスに対する比は、１部分のエタノールに対して１部分の湿潤バイオマスであり、混合物中のエタノールの濃度は、液相中１００／（１００＋６０）＝約６２％ｗ／ｗのエタノールである。エタノール水混合液中の６２％ｗ／ｗエタノールは、重量および成分の極性の平均化によって計算され、６．６の極性指数に対応する。６２％エタノールと３８％水を含む混合液中、５．２の極性指数を有するエタノールと、９の極性指数を有する水は、（０．６２＊５．２＋．３８＊９）約６．６の極性指数をもたらす。極性脂質と中性脂質の抽出のための混合液の極性指数はそれぞれ、約５．８と５．４であると計算される。ヘキサンを疎水性溶媒として使用する場合、ヘキサンの量は、エタノールの量の約６％である、エタノール／アセトニトリル／水共沸物質中の水の量のおよそ二倍の界面層体積であるので、約６％〜１２％であり得る。これは、界面層の大きさが、系中で使用する２つの溶媒の混和性に関連し、さらに抽出混合物中に存在するタンパク質と種々の脂質の界面活性剤様効果によって影響を受けるからである。界面層の大きさはまた、混合物の温度に関連する。温度が上昇すると、２つの溶媒はより混和性となり、それによって界面層の大きさが増加する。
【０１４２】
もう一つの例において、抽出溶媒が、イソプロパノールアルコールとエタノールの１：１混合液である場合、この溶媒の極性は、（（３．９＋５．４）／２）、すなわち約４．６５である。湿潤バイオマスに対する溶媒の比は、極性を合わせるように計算され得る。６．６極性指数を得るために、以下の代数等式を解くことによって計算された、ＩＰＡ−水混合物の５５％ｗ／ｗを作成することが必要である。
【数１】
2014514923.tif 000005
溶媒混合水中の５５％ｗ／ｗの溶媒
【０１４３】
したがって、４０％ｗ／ｗ湿潤バイオマスに対して、ＩＰＡに対する湿潤バイオマスの比は（１−０．５５）／０．６〜０．７５である。
【０１４４】
４０％ｗ／ｗ湿潤バイオマスでは、これは７５部分溶媒混合液に対する１００部分湿潤バイオマスの比に対応する。４０％ｗ／ｗ湿潤バイオマスは、各１００ｇの湿潤バイオマスにつき、４０ｇのバイオマスと６０ｇの水を有する。７５ｇの溶媒混合液を本混合物に加える場合、混合液中の溶媒の濃度は、（７５／（７５＋６０））であり、溶媒混合液−水溶液中、約５５％ｗ／ｗの溶媒混合液である。これらの計算を、各抽出ステージにおける、および各産物に対する、溶媒バイオマス比を得るために使用することができる。溶媒組のいくつかの非限定例を表３Ａおよび３Ｂに示す。
【表３】
2014514923.tif 000006
【表４】
2014514923.tif 000007
【０１４５】
すべての例にて記述した抽出混合物は、実質的に固体相と実質的に液体の相からなる。これらの相をついで抽出後に分離する。これについで、液体溶媒の液相からの除去が続き、抽出産物が得られる。いくつかの実施形態において、溶媒を蒸発させる。そのような実現形態において、液体−液体抽出技術を、蒸発させる必要がある溶媒の量を減少させるために使用できる。使用する任意の溶媒を、条件が許せばリサイクルすることができる。
【０１４６】
抽出の前の藻類バイオマスの処理が、脂質抽出の生産性と効率を増強することが理論化された。この方向において、実験を、表面特性を変化させ、抽出を増強するために、塩基または他の有機性溶媒を藻類バイオマスに加える効果を比較して実施した。メタノール水溶液、水酸化ナトリウム水溶液およびＤＭＳＯ水溶液を含む種々の処理を試みた。図８が示すように、５％ＤＭＳＯの添加が、脂質回収を３倍増加させる。これらの抽出段階は、メタノール抽出段階を劇的に減少させるために利用し得る。しかしながら、以上の実験で使用した溶液は、高い費用、粘度、およびＤＭＳＯを回収およびリサイクルする能力のために、より大きなスケールでの利用のために理想的ではない可能性がある。
【０１４７】
図９は、累積総脂質収率および抽出された中性脂質の純度に対する、８段階メタノール抽出の効果を示すチャートである。本実施形態において、１１２グラムの湿潤バイオマス（２５．６％乾燥重量）を、３５０ｍＬの純粋なメタノールで抽出し、各段階にて、１６０Ｗ放射出力にて１０分間熱した。これは、約７５度の抽出温度をもたらし、この温度は抽出混合物の沸点に近かった。この工程を使用して、一旦極性脂質の大部分が抽出されると、藻類油から非常に純粋な中性脂質を得ることが可能であることが決定された。図９は、一旦極性脂質がすべて抽出されると、高い純度の中性脂質を単離することが可能であることを示す。この場合、総バイオマスの５％収率が、メタノール抽出段階５〜８にて、９０％を超える中性脂質で達成された。さらに、抽出混合物の沸点のために、バイオマス中のほとんどの水が、炭水化物、タンパク質および金属と一緒に、最初の抽出段階で完全に抽出される。
【０１４８】
図１０は、脂質の回収が、湿潤バイオマスから脂質およびタンパク質を抽出するためにエタノールを使用することによってより効率的になり得ることを示す。エタノールを用いることによって、８０％の総脂質回収率が、一般にメタノールによって必要とされる９段階ではなく約４段階で達成することができる。この回収の増加は、メタノールと比較して、エタノール中での脂質のより大きな可溶性に寄与し得る。さらに、エタノール水溶液の沸点は、メタノール水溶液より高く、脂質のさらなる回収を促進する。これは、より高い温度が、油の粘性を低くするからであり、これによって拡散性を改善する。本工程の他の明確な利点は、エステル変換のために油画分中の残余エタノールを用いること、ならびにバイオマス乾燥操作における熱負荷を低下させることである。
【０１４９】
さらに、図１０は、初期画分は、タンパク質および他の非常の極性の分子を含む、非脂質が豊富で、つづいて極性脂質が豊富な画分と最後に中性脂質画分が続くことを示す。したがって、抽出器具の適切な設計により、単一の抽出および画分化工程において、３つすべての産物を回収することができる。
【０１５０】
本発明のもう一つの実施形態は、抽出を補助するためにマイクロ波を使用する。本明細書で開示した先に収集したデータに基づくと、メタノールが藻類からのすべての脂質の抽出のために、もっともよい単一の溶媒であることが示される。したがって、一溶媒マイクロ波抽出システムの効率のデータを集めるために、本明細書の実施例１にて記述したような単一溶媒多段階抽出を実施した。
【０１５１】
図１１は、従来の抽出と、マイクロ波補助抽出の、抽出時間と総脂質回収率を比較する対数プロットである。曲線の傾きに基づいて、マイクロ波システムが約５倍またはそれ以上まで、抽出時間を減少させることが計算された。従来の方法がより高い正味脂質回収率を有するが、これは極性脂質のより高い回収による。これらの結果に基づいて、マイクロ波補助あり、および無しで、溶媒を用いる乾燥藻類バイオマスの抽出のための条件が最適化された。本発明のいくつかの実施形態は、通常のマイクロ波器具を用い、これは、水分子を励起する波長を放射する。本発明のさらなる実施形態は、異なる溶媒を励起できる特別仕様のマイクロ波器具を使用する。本発明のさらに他の実施形態は、藻類バイオマス中に存在する脂質を励起できる特別仕様のマイクロ波器具を利用する。いくつかの実施形態において、藻類バイオマス中に存在する脂質が、マイクロ波によって励起され、それによって藻類バイオマスからの脂質成分の分離および抽出を増強する。
【０１５２】
水分含量は、油抽出の効率に影響を与え得るバイオマスのもう一つのパラメータである。本発明のいくつかの実施形態において、乾燥藻類質量を抽出し、画分化する。他の実施形態において、藻類塊は湿潤である。１０％、２５％および３３％の藻類塊含量でのバイオマス試料を使用して、抽出性能における水分の影響を調査した。
【０１５３】
図１２Ａは、藻類バイオマスからの産物の段階を踏んだ抽出のための工程４００を図解する。図１２Ａ中のすべての単位はポンドである。図１２Ａは、工程４００の塊バランスを示しており、一方で工程を実施するための器具および／またはシステムの詳細は本明細書の他の場所で記述している。５ポンド（約２．２７ｋｇ）の藻類を含むバイオマスは、約０．６３ポンド（約０．２９ｋｇ）の極性脂質、１．８７ポンド（約０．８５ｋｇ）の中性脂質、１ポンド（約０．４５ｋｇ）のタンパク質、および１．５ポンド（約０．６８ｋｇ）の炭水化物を含む。このバイオマスと、１０００ポンド（約４５４ｋｇ）の水が、脱水段階４０５で処理され、混合物から９５０ポンド（約４３１ｋｇ）の水が分離され、４５ポンド（約２０．４ｋｇ）の水中５ポンド（約２．２７ｋｇ）の藻類が第一の抽出段階４１０に通過する。本明細書で開示される任意の脱水技術を、スズ脱水工程４０５で使用することができる。第一の抽出段階４１０にて、２３８ポンド（約１０８ｋｇ）のエタノールと１２ポンド（約５．４４ｋｇ）の水を、先の段階からの藻類と水と混合する。第一の抽出段階４１０は、約８０．９％ｗ／ｗエタノールの液体相を有する。２３１ポンド（約１０５ｋｇ）の水、５３ポンド（約２４．０ｋｇ）の水および０．５ポンド（約０．２２７ｋｇ）の藻類タンパク質の第一の液体相を回収し、そこから水およびエタノールが、例えば蒸発によって除去され、タンパク質が豊富な産物４１５が残る。蒸発から回収した溶媒を、第一の抽出段階４１０にリサイクルすることができる。
【０１５４】
第一の抽出段階４１０からの第一固体相を、第二の抽出段階４２０に通し、この第一固体相は、４．５（約２．０４ｋｇ）ポンドの藻類、２．６ポンド（約１．１８ｋｇ）の水、および１０．９ポンド（約４．９４ｋｇ）のエタノールを含む。８６ポンド（約３９．０ｋｇ）のエタノールと４ポンド（約１．８１ｋｇ）の水を、先の段階からの第一固体相に加える。第二の抽出段階４２０は、約９３．６％ｗ／ｗメタノールの液体相を有する。８５．９ポンド（約３９．０ｋｇ）のエタノール、５．９ポンド（約２．６８ｋｇ）の水および０．６ポンド（約０．２７ｋｇ）の極性脂質の第二の液体相を回収し、そこから水およびエタノールを、例えば蒸発によって除去し、極性脂質が豊富な産物４２５が残る。蒸発から回収した溶媒を、第二の抽出段階４２０にリサイクルできる。
【０１５５】
第二の抽出段階４２０からの第二の固体相を、第三の抽出段階４３０に通過させ、この第一固体相は、３．９ポンド（約１．７７ｋｇ）の藻類、０．７ポンド（約０．３２ｋｇ）の水および１１ポンド（約４．９９ｋｇ）のエタノールを含む。７０．５ポンド（約３２．０ｋｇ）のエタノールと３．５ポンド（約１．５９ｋｇ）の水を、先の段階からの第二の固体相に加える。第三の抽出段階４３０は、約９５．４％ｗ／ｗエタノールの液体相を有する。７８．９ポンド（約３５．８ｋｇ）のエタノール、３．９ポンド（約１．７７ｋｇ）の水および１．６ポンド（約０．７２６ｋｇ）の中性脂質の第三の液体相を回収し、これより水およびエタノールを例えば蒸発によって除去し、中性脂質が豊富な産物４３５が残る。蒸発から回収した溶媒を、第二の抽出段階４３０にリサイクルすることができる。２．３ポンド（約１．０４ｇ）の藻類、０．３ポンド（約０．１３６ｋｇ）の水および６．６ポンド（約２．９９ｋｇ）のエタノールの固体相が残る。
【０１５６】
図１２Ａにて示すように、各連続エタノール抽出段階での得られた液体プロファイルは、開始藻類中の水分含量によって大きく影響を受けた。工程４００のモデルを、３つの異なるバイオマスの集団上で走らせ、それぞれは、異なる初期水含量を有した。開始水含量が減少したので、最大脂質回収段階が、第三の抽出段階から第四に変化した（示していない）。しかしながら、これらの３つのバイオマス試料からの総脂質回収は極めて類似しており、すべてが、藻類バイオマスの総脂質含量の９５％超である。
【０１５７】
より高い水分含量を有する藻類質量を使用した際、エタノール水溶液混合液中のエタノール濃度ははるかに低く、その結果として未精製抽出物中の中性脂質割合もまたより低かった。９０％の水を有する藻類ペーストを脱水することは、非常にエネルギー集約の工程であることが報告されている。本明細書で記述した方法は、予想外に、主に水を含む藻類塊を首尾よく抽出し、画分化するために使用することができる。総脂質回収は、従来の抽出方法と異なり、９０％水（１０％藻類固体）を含む藻類ペーストから開始することによって大幅な影響を受けなかったので、本明細書で開示される方法は、エネルギー集約の乾燥段階野利用を必要としない。
【０１５８】
図１２Ｂは、工程４００の抽出段階の１つの例となる実現形態５００を示す。藻類バイオマスおよび溶媒混合物５０５を、抽出容器５１０に提供する。（本明細書の他の場所で記述するように）藻類を抽出した後、混合物を、液体相と固体相に分離する、焼結された金属チューブフィルタのような、粗濾過システム５１５に混合液を提供する。固体相を、下流の抽出段階に通過させる。液体相を、溶媒除去システム５２０、例えば蒸発装置に通過させ、液体相中の溶媒（例えばエタノール）含量を減少させる。溶媒除去後に残っている液体相を任意に、遠心器５２５に通過させる。溶媒除去システム中に残っている任意の固体をリサイクルするか、または破棄する。遠心器５２５は、液体相中の任意の残っている液体および／または固体から、望む藻類産物（例えばタンパク質または脂質）を分離することを補助する。
【０１５９】
図１４は、１つ以上の藻類産物を形成するか、回収するために藻類塊が処理可能な工程６００の例を示す。本例において、藻類バイオマスが、本明細書で開示される方法を用いて、フロント−エンド工程６０５中、段階を踏んだ様式にて抽出される。抽出および分離段階についで、エステル化工程６１０、加水分解工程６１５、水素処理工程６２０および／または蒸留工程６２５が続き、さらに成分および産物を単離する。成分および産物は、藻類脂質、藻類タンパク質、グリセリン、カロテノイド、栄養素（例えば長鎖不飽和油および／またはエステル）、燃料エステル（一般に、Ｃ２０またはそれより短い鎖長を有するエステル）、燃料、燃料添加物、ナフサ、および／または液体石油置換物を含む。好ましい実施形態において、燃料エステルはＣ１６鎖長である。他の実施形態において、燃料エステルはＣ１８鎖長である。また他の実施形態において、燃料エステルは、Ｃ２０またはそれより短い鎖長の混合物である。
【０１６０】
エステル化工程６１０、加水分解工程６１５、水素処理工程６２０および蒸留工程６２５は任意であり、種々の順番で使用することができる。破線の矢印および点線の矢印は、加水分解、水素処理および／または蒸留工程を、脂質画分の処理にて実施してよい時に対するいくつかの、しかし全てではない選択肢を示している。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、抽出および／または分離を実施した後、中性脂質画分を、燃料産物および／または添加物を作製するために、直接水素処理することができる。あるいは、他の実施形態において、中性脂質画分を、エステル化工程６１０に通過させることができる。
【０１６１】
エステル化工程６１０は、酸／塩基触媒のような本技術分野で公知の技術を含むことができ、エステル交換を含むことができる。塩基触媒は、いくつかの産物を産出するために除外されないが、酸触媒が、これらの技術が、下流工程を複雑化し得る、塩基触媒の間に形成される石けんを回避するので好ましい。酵素的エステル交換技術もまた使用できる。エステル化は、実質的に純粋な脂質物質（本明細書で使用する際、７５％以上の脂質）を処理することができる。エステル化の後、グリセリン副産物を除去することができる。エステル化脂質を、ついで、異なる鎖長のエステル化脂質ならびに脂質画分中に存在するカロテノイドを分離するために、分子および／または非分子蒸留（工程６２５）に供することができる。エステル化した脂質をついで、水素処理工程６２０に通し、ジェット燃料、バイオディーゼルおよび他の燃料産物を産出することができる。本技術分野で知られている任意の水素処理工程を使用することができる。そのような工程は、水素を脂質分子に加え、酸素分子を除去する。水素処理のための例となる条件は、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステルを、６００ｐｓｉ（約４１３７ｋＰａ）の範囲の高圧、および６００°Ｆ（約３１６℃）の範囲内の温度下、水素と反応させることを含む。一般に使用される触媒は、ＮｉＭｏまたはＣｏＭｏである。
【０１６２】
原脂質ではなく、燃料エステルを水素処理することは、いくつかの利点を有する。第一に、エステル化工程６１０は、藻類油中に存在する特定のリンおよび金属化合物のレベルを減少させる。これらの物質は、典型的に水素処理工程で使用される触媒に対して毒である。したがって、水素処理前のエステル化は、水素処理触媒の寿命を延ばす。また、エステル化は、水素処理している化合物の分子量を減少させ、それによって水素処理工程６２０の性能を改善する。さらにまた、蒸気形態で水素処理されるべき蒸留工程６２５から燃料エステルを維持することが有利であり、そのようにして、水素処理に必要なエネルギーを減少させる。
【０１６３】
本発明のいくつかの実施形態において、中性藻類脂質を、脂質を燃料産物および添加物に変換するために、直接水素処理する。他の実現形態では、蒸留工程６２５を介して、中性脂質をエステル化し、カルテノイド、長鎖不飽和エステル、エイコサペンタノイン酸（ＥＰＡ）エステルおよび／または燃料エステルに分離する。蒸留工程６２５は、分子蒸留ならびに任意の本技術分野で公知の蒸留技術が含まれ得る。例えば、蒸留物を、単一蒸留カラムを用いて画分化して、精製するために、低鎖脂肪酸を分離することが可能である。長鎖不飽和脂肪酸は、カラム中、高沸点残余物として残る。いくつかの実施形態において、残っている蒸気をついで、水素処理工程に送ることができる。本発明の利点の２つは、以上で記述されたように、純粋なフィード、ならびにエネルギー集約水素処理反応を好む、蒸気産物を産出することである。
【０１６４】
本発明のいくつかの実施形態において、極性脂質（および任意で中性脂質）を、エステル化工程に通す前に、加水分解工程６１５にて加水分解する。そのようにすることで、藻類脂質の脂肪酸をほどき、より多くの量の藻類脂質が有用な産物に形成されることを可能にする。
【０１６５】
図１５は、中性脂肪からの栄養補助産物を産出するための、工程７００を示すフローチャートである。工程７００の１つの実現形態において、中性脂質を、ＥＰＡが豊富な油からカロテノイドを分離する、吸収工程７０５に供する。中性脂質は、本明細書で開示される任意の選択的抽出技術によって藻類供給源から産出できる。しかしながら、中性脂質は、植物供給源のような、他の供給源からであり得る。
【０１６６】
吸収工程７０５は、ベータカロテンおよびキサントフィルのような、カロテノイドを吸収するために、中性脂質を、吸着剤と接触させることを含む。１つの実現形態において、吸着剤はＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０ＳＳ（ＩＴＯＣＨＵ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ，より市販されている）である。中性脂質を、バッチ型の工程にて吸着剤と接触可能であり、そこでは中性脂質と吸着剤が、選択された時間、容器の中に維持される。接触時間の後、吸着剤と脂質を、本技術分野で公知の技術を用いて分離する。他の実現形態において、吸着剤は、吸着剤ベッド内に維持され、中性脂質は吸着剤ベッドを通る。吸着剤ベッドを通した通過に際して、中性脂質のカルテノイド含量が減少し、それによってＥＰＡが豊富な油が産出される。
【０１６７】
カルテノイドは、吸収剤を、エタノール、イソプロパノールアルコール、ブタノールのようなアルコール、酢酸エチルまたは酢酸ブチルのようなエステル、ヘキサンおよびペンタンのようなアルカンを含むが、限定はされない、適切な溶媒で処理することによって、吸着剤材料から回収することができる。
【０１６８】
図１６は、中性脂質８０５から燃料産物８３０を産出するための工程８００を示すフローチャートである。中性脂質は、本明細書で開示されている任意の選択的抽出技術によって産出された藻類供給源からのものであり得る。しかしながら、中性脂質は、植物供給源のような他の供給源からのものであり得る。中性脂質は、脱ガム工程８１０にて処理され、そこで脂質は、酸洗浄されて、中性脂質中の金属およびリン脂質のレベルが減少する。いくつかの実現形態において、リン酸の比較的希釈された溶液を中性脂質に加え、混合液を加熱し撹拌する。沈殿したリン脂質と金属をついで、例えば遠心によって、残りの油から分離する。
【０１６９】
処理した油をついで、漂白工程８１５に通して、クロロフィルと他の着色化合物を除去する。いくつかの実現形態において、漂白工程８１５は、油を、油中のクロロフィルおよび他の着色化合物のレベルを減少させる粘土、または漂白粘土（すなわちベントナイトまたはフィラ土）のような他の吸着剤と接触させることを含む。処理した油をついで、燃料産物、例えばジェット燃料混合物、ディーゼル燃料添加物およびプロパンを形成するために、油の成分を水素添加および酸素除去する、水素処理工程８２０に通す。さらに、水素処理工程８２０はまた、いくつかのクラッキングと、ＬＰＧおよびナフサのようなより小さな鎖化合物の産出を引き起こす。本明細書で記述する任意の水素処理工程を、水素処理工程８２０のために使用することができる。
【０１７０】
水素処理工程８２０にて作製された化合物の混合物を、蒸留工程８２５に通して、種々の燃料産物８３０へ分離する。蒸留工程８２５は、本明細書で記述される、または燃料化合物の分離のために、本技術分野で公知の、任意の分子および非分子蒸留技術が含まれ得る。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質を藻類バイオマスから選択的に抽出し得る。開示される方法を用いるタンパク質の抽出は、多くの利点を提供する。とりわけ、藻類細胞は、望むタンパク質を抽出する前に溶解する必要がない。これは、抽出を単純化し、コストを減少させる。本発明の方法は、藻類培養物、バイオマス、ペーストまたはケーキから選択的に抽出し、画分化するために、異なるクラスのタンパク質の可溶性特性を生かす。
【０１７２】
例えば、藻類バイオマスを、加熱と混合に供して、アルブミンおよびグロブリンと呼ばれる塩、水と塩可溶性タンパク質を抽出し得る。この混合物をついで、ｐＨ変化に供し、グルテリンと呼ばれるアルカリ可溶性タンパク質を回収する。この段階の後に、プロラミンと呼ばれるアルコール可溶性タンパク質の溶媒ベースの分離を続けることができる。残っているバイオマスは、炭水化物と脂質が豊富であることとなる。
【０１７３】
タンパク質を、図１７および１８にて示すように、海水および淡水藻類細胞両方から抽出できる。海水藻類培養物またはバイオマス中の塩の存在が、異なるクラスのタンパク質の抽出に影響を与えるが、本明細書で開示した方法は、淡水、または海水藻類いずれかからタンパク質を選択的に抽出することを可能にする。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、淡水藻類細胞からのタンパク質の抽出は、図１７で示す新規工程によって達成される。淡水藻類細胞または淡水藻類バイオマスを加熱し、混合する。混合は、撹拌、撹拌およびロッキングを含むが、限定はされない、本技術分野で公知の種々の方法によって達成可能である。本工程は、第一の実質的に液体の相と第一の実質的に固体の相からなる、第一の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。固体相および液体相をついで分離する。分離は、遠心、傾斜、フローテーション、沈降および濾過を含むが、限定はしない、本技術分野で公知の種々の方法によって達成できる。この第一の実質的に液体の相はアルブミンタンパク質が豊富である。
【０１７５】
第一の実質的に固体の相をついで、塩水と混合し、加熱して、第二の実質的に液体の相と第二の実質的に固体の相からなる、第二の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。塩水は天然の海水であってよく、または塩水溶液であってよい。そのような溶液の例には、主にＮａＣｌを含む約典型的に３５ｇ／Ｌが含まれ得る。固体および液体相をついで分離する。この第二の実質的に脂質の層はグロブリンタンパク質が豊富である。
【０１７６】
第二の実質的に固体の相をついで水と混合し、加熱して、第三の実質的に液体の相と第三の実質的に固体の相からなる、第三の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。本第三の抽出混合物またはスラリーのｐＨをついで、約９以上に上昇させ、第三の実質的に液体の相を、グルテリンタンパク質で濃縮する。固体および液体相をついで分離し、第三の実質的に液体の相はグルテリンタンパク質が豊富である。
【０１７７】
第三の実質的に固体の相をついで、溶媒組と混合し、加熱して、第四の実質的に液体の相と第四の実質的に固体の相からなる、第四の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。１つの好ましい実施形態において、溶媒組は、エタノールを含む。他の非限定実施形態において、溶媒組は、以下の溶媒のうちの１つ以上を含む：メタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルおよびアセトニトリル。固体および液体相をついで分離する。この第四の実質的に液体の相はプロラミンタンパク質が豊富である。残っている第四の実質的に固体の相は、開始藻類バイオマスの組成に依存して、脂質が豊富である。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、海水藻類細胞からのタンパク質の抽出は、図１８で示す新規工程によって達成される。海水藻類細胞または海水藻類バイオマスを加熱し、混合する。混合は、撹拌、撹拌およびロッキングを含むが、限定はされない、本技術分野で公知の種々の方法によって達成できる。本工程は、第一の実質的に液体の相と第一に実質的に固体の相からなる、第一の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。固体相および液体相をついで分離する。分離は、遠心、傾斜、フローテーション、沈降および濾過を含むが、限定はしない、本技術分野で公知の種々の方法によって達成できる。この第一の実質的に液体の相はグロブリンタンパク質が豊富である。
【０１７９】
第一の実質的に固体の相をついで、水と混合し、加熱して、第二の実質的に液体の相と第二の実質的に固体の相からなる、第二加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。固体および液体相をついで分離する。この第二の実質的に脂質の相はアルブミンタンパク質が豊富である。
【０１８０】
第二の実質的に固体の相をついで水と混合し、加熱して、第三の実質的に液体の相と第三の実質的に固体の相からなる、第三の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。本第三の抽出混合物またはスラリーのｐＨをついで、約９以上に上昇させ、第三の実質的に液体の相は、グルテリンタンパク質が豊富である。固体および液体相をついで分離し、第三の実質的に液体の相はグルテリンタンパク質が豊富である。
【０１８１】
第三の実質的に固体の相をついで、溶媒組と混合し、加熱して、第四の実質的に液体の相と第四の実質的に固体の相からなる、第四の加熱抽出混合物またはスラリーを産出する。１つの好ましい実施形態において、溶媒組は、エタノールを含む。他の非限定実施形態において、溶媒組は、１つまたはそれ以上の以下の溶媒のうちの１つ以上を含む：メタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルおよびアセトニトリル。固体および液体相をついで分離する。この第四の実質的に液体の相はプロラミンタンパク質が豊富である。残っている第四の実質的に固体の相は、開始藻類バイオマスの組成に依存して、脂質が豊富である。
【０１８２】
開示された方法はまた、図１７〜２０で示すような、異なる型のタンパク質の選択的抽出を提供する。上述の抽出工程の任意の段階を、単一タンパク質産物を選択的に抽出するために、段階の残りから離して実施可能である。この２つの例が、抽出段階１ａ周辺の点線箱にて示されるように、図１７および１８にて見られる。
【０１８３】
非限定例において、グロブリンタンパク質を、淡水藻類バイオマスから、前記バイオマスを塩水と混合し、加熱することによって選択的に抽出して、実質的に液体の相と実質的に固体の相からなる、加熱抽出混合物またはスラリーを産出できる。固体および液体相をついで分離することができる。液体相はグロブリンタンパク質が豊富である。図１７、抽出段階１ａを参照のこと。
【０１８４】
他の非限定例において、アルブミンタンパク質が、海水藻類バイオマスから、前記バイオマスを水と混合して、加熱することによって選択的に抽出して、実質的に液体の相と実質的に固体の相からなる、加熱抽出混合物またはスラリーを産出できる。固体および液体相をついで分離することができる。液体相はグロブリンタンパク質が豊富である。図１８、抽出段階１ａを参照のこと。
【０１８５】
さらなる非限定例において、プロラミンタンパク質を、図１９にて示すように、淡水または海水藻類バイオマスいずれかから選択的に抽出することができる。選択的抽出は、藻類バイオマスを溶媒組と混合し、加熱し、実質的に液体の相と実質的に固体の相からなる、加熱抽出混合物またはスラリーを産出することによって達成される。固体および液体相をついで分離することができる。液体相はプロラミンタンパク質が豊富である。
【０１８６】
さらにもう一つの非限定例において、タンパク質画分を、図２０にて示すように、淡水または海水藻類バイオマスいずれかから選択的に抽出することができる。選択的抽出は、藻類バイオマスを溶媒組と混合して、抽出混合物またはスラリーを産出すること、および混合液中でｐＨ変化を生じさせることによって達成される。混合液は、実質的に液体の相と実質的に固体の相からなる。固体および液体相をついで分離可能である。液体相はタンパク質が豊富である。
【０１８７】
図２２は、単一溶媒（両親媒性）システムによるタンパク質の抽出のための例となる抽出システムの略図である。例となるシステムは、直接ポンプされるか、または維持タンク中に保存され得る、藻類培養物（２２０１）、遠心器（２２０２）、抽出器（２２０３）、固体分離フィルタ（２２０４）、ヒーター（２２０５）、溶媒回収システム（２２０６）、および冷却器（２２０７）を含む。ポンプ（２２１３）が、各段階からの産物を次の段階に移動させることにおいて補助する。
【０１８８】
図２３は、１つの例となる実施形態にしたがって、タンパク質と極性脂質を、湿潤藻類バイオマスから抽出するための例となるシステムを示す。例となるシステムは、直接ポンプされるか、または維持タンク（２３０１）中に保存され得る、藻類培養物、遠心器（２３０２）、抽出器（２３０３）、デカンタ（２３０４）、ヒーター（２３０５）、溶媒回収システム（２３０６）、冷却器（２３０７）、維持タンク（２３０８）、固体分離器（２３０９）、第二のヒーター（２３１０）、第二の溶媒分離システム（２３１１）および第二の冷却器（２３１２）を含む。ポンプ（２３１３）が、各段階からの産物を次の段階に移動させることにおいて補助する。
【０１８９】
直接ポンプされるか、または維持タンク（２３０１）中に保存されてよい、藻類培養物を遠心して（２３０２）、濃縮ペーストを得、抽出器（２３０３）にポンプする。遠心ユニット（２３０２）は、膜システム、または溶解空気フローテーションユニット、または凝集沈降ユニットなどのような、固体分離器で置き換えてもよい。両親媒性および疎水性溶媒の混合液を抽出器に加える。抽出器は、一定の時間、そして溶媒混合液の沸点より低い温度で、溶液を混合し加熱する。加熱は、マイクロ波、水、蒸気、熱油または電気での加熱のような、種々の方法で達成することができる。抽出は、大気圧にて、または加圧条件下で実施して、抽出の効果を増強し得る。
【０１９０】
抽出物をついで、デカンタ内にポンプし、より軽い、そしてより重い相を分離する。この段階はまた、膜濾過を用いて、または遠心することによって実施可能でもある。より軽い相は、疎水性溶媒と極性脂質を含む。より重い相は、両親媒性溶媒、水および藻類からなる。疎水性層を、ヒーター（２３０５）を通して、溶媒回収システム（２３０６）内にポンプする。蒸気を冷却器（２３０７）を通して通過させ、リサイクルのために回収する。残余物は、ほとんど極性脂質を含む濃縮物である。より重い相を、維持タンク（２３０８）内に回収し、固体液体分離器（２３０９）を通してポンプする。固体は、更に抽出または乾燥できる抽出藻類バイオマスを含む。液体部分を、第二のヒーター（２３１０）を通して、第二の溶媒回収システム（２３１１）内に通過させる。このシステムからの蒸気を、第二の冷却器（２３１２）を通して通過させ、両親媒性溶媒を回収し、リサイクルする。水およびタンパク質が、溶媒回収ユニット中の残余物を形成する。
【０１９１】
図２４は、二溶媒（両親媒性／疎水性）系による、中性脂質とタンパク質の抽出のための、例示抽出スキームの略図である。例となるシステムは、直接ポンプされるか、または維持タンク中に保存されてよい、藻類培養物（２４０１）、遠心器（２４０２）、抽出器（２４０３）、デカンタ（２４０４）、ヒーター（２４０５）、溶媒回収システム（２４０６）、冷却器（２４０７）、維持タンク（２４０８）、固体液体分離器（２４０９）、第二のヒーター（２４１０）、第二の溶媒回収システム（２４１１）、および第二の冷却器（２４１２）を含む。ポンプ（２４１３）は、各段階の産物をから次の段階へ移動させることを補助する。
【０１９２】
図２５は、１つの例となる実施形態にしたがって、湿潤藻類バイオマスからタンパク質、極性脂質および中性脂質を抽出するための例となるシステムの略図である。例となるシステムは、直接ポンプされるか、または維持タンク中に保存されてよい、藻類培養物（２５０１）、遠心器（２５０２）、抽出器（２５０３）、デカンタ（２５０４）、ヒーター（２５０５）、溶媒回収システム（２５０６）、冷却器（２５０７）、維持タンク（２５０８）、固体液体分離器（２５０９）、第二のヒーター（２５１０）、第二の溶媒回収システム（２５１１）および第二の冷却器（２５１２）を含む。
【０１９３】
藻類培養物（２５０１）を遠心して（２５０２）、濃縮ペーストを得、抽出機（２５０３）にポンプする。遠心ユニット（２５０２）は、膜システム、または溶解空気フローテーションユニット、または凝集沈降ユニットなどのような、固体分離器で置き換えてもよい。両親媒性および疎水性溶媒の混合液を抽出器に加える。抽出器は、一定の時間、そして溶媒混合液の沸点より低い温度で、溶液を混合し加熱する。加熱は、マイクロ波、水、蒸気、熱油または電気での加熱のような、種々の方法で達成することができる。抽出は、大気圧にて、または加圧条件下で実施して、抽出の効果を増強してよい。抽出物をついで、デカンタ内にポンプし、より軽い、そしてより重い相を分離する。この段階はまた、膜濾過を用いて、または遠心することによって実施可能でもある。
【０１９４】
より軽い相は、疎水性溶媒と極性脂質を含む。より重い相は、両親媒性溶媒、水および藻類からなる。疎水性層を、ヒーター（２５０５）を通して、溶媒回収システム（２５０６）内にポンプする。蒸気を冷却器（２５０７）を通して通過させ、リサイクルのために回収する。残余物は、主に極性脂質を含む濃縮物である。より重い相を、維持タンク（２５０８）内に集め、固体液体分離器（２５０９）を通してポンプする。固体は、更に抽出または乾燥できる抽出藻類バイオマスを含む。液体部分を、第二のヒーター（２５１0）を通して、第二の溶媒回収システム（２５１１）内に通過させる。このユニットからの蒸気を、第二の冷却器（２５１２）を通して通過させ、両親媒性溶媒を回収し、リサイクルする。水およびタンパク質が、溶媒回収ユニット中の残余物を形成する。固体液体分離器（２５０９）からの抽出した固体をさらに、第二の抽出機（２５１８）中、システム内の水に対する両親媒性溶媒の比で、再びさらに抽出する。両親媒性および疎水性溶媒の第二の混合液を第二の抽出器に加える。第二の抽出器が、一定の時間、そして溶媒混合液の沸点より低い温度で、溶液を混合し加熱する。第二の抽出物をついで、第二デカンタ（２５１９）内にポンプして、より軽い相とより重い相に分離する。より軽い相は、疎水性溶媒と極性脂質を含む。より重い相は、両親媒性溶媒、水および藻類からなる。疎水性層を、ヒーター（２５２０）を通して、溶媒回収システム（２５２１）内にポンプする。蒸気を冷却器（２５２２）を通して通過させ、リサイクルのために回収する。残余物は、主に極性脂質を含む濃縮物である。より重い相を、維持タンク（２５１８）にリサイクルするか、乾燥させる。ポンプ（２５１３）は、各段階の産物をから次の段階へ移動させることを補助する。
【０１９５】
図２６は、エタノール抽出の概念を示す略図である。エタノールの量が、システム中の水と疎水性溶媒の量と比例して変化するので、異なる成分が選択的に抽出され得る。
【０１９６】
本発明のこれらの態様を通知したことで、当業者は、単一段階抽出工程、または多段階抽出工程のいずれかによって、淡水または海水藻類バイオマスいずれかから、望む極性脂質またはタンパク質を選択的に抽出できるであろう。本開示を考慮すると、当業者は、藻類塊のタンパク質含量と、対象のタンパク質の可溶性特性を考慮に入れることを条件に、以上で開示した多段階抽出スキームの順番を交換可能であろう。開示される方法の他の実施形態は、各抽出段階間に洗浄段階が組み込まれてよい。
【０１９７】
任意の開示されたタンパク質抽出方法のために、抽出混合物／スラリーを、一定期間加熱温度にて維持してよい。いくつかの実施形態において、抽出混合物を、約２０分〜約９０分間、加熱温度にて維持する。いくつかの態様において、抽出混合物を、約２０分〜約６０分間、加熱温度にて維持する。他の態様において、抽出混合物を、約４５分〜約９０分間、加熱温度で維持する。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、抽出混合物／スラリーを、約５０℃より低い温度まで熱してよい。いくつかの態様において、アルブミン、グロブリンおよびグルテリンタンパク質を、約５０℃より低い温度にて抽出する。他の実施形態において、抽出混合物／スラリーを、抽出混合物／スラリーの沸点に近い温度まで加熱する。いくつかの態様において、プロラミンタンパク質を、抽出混合物／スラリーの沸点近くの温度にて抽出する。他の実施形態において、抽出を促進するために、加熱および混合段階の間、圧力を大気圧より高く、５０ｐｓｉ（約３４５ｋＰａ）まで（その圧力を含んで）増加させる。
【０１９９】
藻類バイオマスの保存可能期間は、間質および細胞外水の除去によって増加できる。これは、一定期間にわたる、バイオマスの低微生物増殖および低汚染をもたらす。これは、加熱しない条件下で、両親媒性溶媒を、藻類培養物またはバイオマスと混合することによって達成することができる。この工程によって産物は抽出されないが、水がバイオマスまたは培養物から除去され、溶媒で置き換えられる。いくつかの実施形態において、溶媒は、藻類培養物またはバイオマス中の水の５０〜９０％を置き換える。いくつかの実施形態において、両親媒性溶媒は、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロパノール、ブタノン、ジメチルエーテルおよびプロピオンアルデヒド、２−プロパノール、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、１−プロパノール、水、重水（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコール、グリセリンまたはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、両親媒性溶媒は、イソプロパノールで変性したエタノールである。他の実施形態において、溶媒はイソプロパノールである。また他の実施形態において、溶媒は水性である。またさらなる実施形態において、間質および細胞外水の除去は、冷却条件下で実施される。材料の水含量の減少は、保存可能期間の増強を導く。
【実施例】
【０２００】
実施例１
微小緑藻類であるイカダモ（Ｓｃｅｎｄｅｓｍｕｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ（ＳＤ））を、野外パネル光バイオリアクタ中で培養した。種々の液体含量のＳＤ試料を採集した。遠心によるバルク水の除去後、藻類試料を３〜５ｃｍ藻類ケーキとして、使用まで−８０℃にて保存した。湿潤藻類バイオマスの事前に計算した量（１５グラム乾燥藻類重量等価物）と９０ｍＬのエタノール溶媒を、濃縮器、機械的攪拌機および熱電温度計を備える三首フラスコ内に加えた。１つの実験において、混合物をマイクロ波照射下、１０分間かん流した。第二の実験では、混合物を電気加熱にて１時間、かん流した。その後、混合液を室温まで冷却し、濾過によって透析物と残余物に分離した。
【０２０１】
藻類試料の総脂質を、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの脂質抽出法にしたがって、クロロホルム−メタノール−水系を用いて解析した。この総脂質値を、脂質回収計算のための参照値として使用した。総脂質をさらに、６０〜２００メッシュシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏｒｐ．，独国）を用いる標準カラムクロマトグラフィー方法によって、中性脂質と極性脂質に分離した。各脂質画分を、先に計量しおいたバイアルに移し、まず回転蒸発装置（Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて３０℃にて蒸発させ、ついで高真空下で乾燥させた。乾燥した残余物を、窒素下に置き、ついで計量した。各試料の脂肪酸特性を、内部標準としてヘプタデカノン酸（Ｃ１７：０）を用いて、脂肪酸メチルエステルに誘導した後に、ＧＣ−ＭＳによって定量した。
【０２０２】
結果（データは示していない）により、マイクロ波補助抽出が、第一の抽出段階における極性脂質の除去のために最適であること、および中性脂質の分離に対して幾分効果が少ないことが示唆された。電気的加熱は、抽出効果においてより一貫性がある。最終収率は、マイクロ波補助抽出と、電気的加熱補助抽出間で同等であるが、マイクロ波補助抽出が有意に速い。
【０２０３】
実施例２
藻類バイオマスからのタンパク質の抽出
（１）酸浸出：藻類バイオマスを、ｐＨ４．５にて１時間、水中に浸した。試料をついで３０００ｒｐｍにて３分間遠心し、上清を除去した。残っている固体を、希釈酸（ｐＨ４．５）で３回洗浄し、凍結乾燥させた。
【０２０４】
（２）アルカリ抽出：藻類バイオマスを、ｐＨ１１にて１時間水中に浸し、つづいてｐＨ調節水を添加した。試料をついで、３０００ｒｐｍにて３分間遠心して、上清を除去した。遠心につづいて、上清を酸（ｐＨ４．５）で中和した。残っている固体を、希釈酸（ｐＨ４．５）にて３回洗浄し、凍結乾燥させた。
【０２０５】
酸浸出とアルカリ抽出の結果を以下表４に示す。
【表５】
2014514923.tif 000008
【０２０６】
タンパク質収率を、凍結乾燥固体の重量を、ｐＨ調節水中に浸す前の藻類バイオマスの重量と比較して、重量基準にて計算した。タンパク質純度は、各工程の凍結乾燥固体中の窒素の量を測定して、Ｏｆｆｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｂａ−２ａ−３８）によって決定した。タンパク質が、藻類産物抽出の価値を付加する重要な産物であるので、この情報により、本明細書で開示されるシステムおよび方法において、タンパク質の種々のレベルを有するフィードストックの利用を可能とする。
【０２０７】
実施例３
海水藻類バイオマスからのタンパク質の抽出  
最初に海水中約１〜１０％ｗ／ｗ固体からなる海水藻類培養物を、５０℃まで熱し、この温度にて１時間維持した。得られたスラリーを遠心して、液体相を固体相から分離した。液体相が、グロブリンタンパク質が豊富であることを測定した（本来の藻類バイオマス中に存在する総タンパク質の約１０％）。
【０２０８】
固体をついで新鮮な水中に懸濁し、約５０℃まで熱して、約１時間維持した。得られたスラリーを再び遠心して液体を固体相から分離した。液体相は、アルブミンタンパク質が豊富であることを測定した（本来の藻類バイオマス中に存在する総タンパク質の約１０％）。
【０２０９】
固体をついで、エタノール中で懸濁して、７０％ｗ／ｗ混合液を達成した。この混合液を約７５℃まで熱し、この温度にて約１時間維持した。得られたスラリーを遠心して、液体を固体相から分離した。液体相は、アルブミンタンパク質が豊富であることを測定した（本来の藻類バイオマス中に存在する総タンパク質の約３０％）。
【０２１０】
固体をついでアルカリ溶液（水性ＮａＯＨ、ｐＨ９）中に懸濁させ、約５０℃まで熱し、その温度で約１時間維持した。得られたスラリーを遠心して、液体を固体相から分離した。液体相が、グルテリンタンパク質が豊富であることを測定した（本来の藻類バイオマス中に存在する総タンパク質の約５０％）。
【０２１１】
実施例４
エタノールによる藻類バイオマスの段階画分化と抽出
１０００ポンド（約４５４ｋｇ）のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）バイオマス（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｇａｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１０４８から得た、株２０２．０より培養した）を採集し、藻類が約３５％ｗ／ｗを含むまで脱水し、ついで最終的に凍結した。
【０２１２】
抽出段階を、４００ガロン（約１５１４Ｌ）のヒンジ縁を有するジャケットケトル中で実施した。蓋をストラップで結び、シリコーンで密封した。システムはまた、２つの刃シャフトを有する２馬力防爆モータを備えるミキサを含んだ。凍結した藻類材料をタンク内にあけ、等重量のエタノールを、空気圧式ドラムポンプを用いてポンプした。材料を１５分間撹拌し、ジャケットをスチームで加熱して、各抽出段階にて所望の温度を得た。望む温度は、混合物の沸点近く、３℃以内を意味するが、沸騰はしない。この所望の温度は、混合物の沸点が、エタノールの比率が変化すると変化するので、各抽出段階で異なる。所望の温度に到達すると、システムを、ケトルの含有物が均一に加熱されることを確かにするために、６０分間望む温度で連続して維持して撹拌した。
【０２１３】
ケトルの含有物をついで、約１ガロン（約３．７９Ｌ）／分の空気圧性Ｖｉｋｉｎｇ羽根ポンプを用いて、抽出容器からポンプして出し、Ｓｈａｒｐｌｅｓデカンタ遠心器内にいれた。デカンタ遠心器ローター速度を約６０００ｒｐｍに設定した。固体を、封入プラスチックドラム内に回収し、液体に対して、約５０％ｗ／ｗ固体を含んだ。これらの固体をケトルに戻し、そこで上記抽出段階を繰り返した。デカンタからの液体の流れを、フィードタンク内に回収し、ついで膜濾過システムにフィードした。使用した膜は、Ｇｒａｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造された０．３７５平方フィート（約３４８ｃｍ２）ＳＳ膜であった。操作条件は、６０℃±５℃であり、平均圧力勾配は４０ｐｓｉ（約２７６ｋＰａ）であった。膜システムを加圧空気で約１５分ごとに逆流させて、流れを維持した。膜システムから回収された通過物は、粒子状物質を含まなかった。残余物を回収し、デカンタにリサイクルした。
【０２１４】
この抽出および画分化は、各抽出における工程を通した溶媒の極性における変化によるものである。図１３に示した抽出において、工程は、約６５％の純粋な水を含む約１０００ポンド（約４５４ｋｇ）の湿潤藻類バイオマスで開始した（３５％ｗ／ｗ藻類固体）。これを、８６０ポンド（約３９０ｋｇ）の変性エタノール（９５％エタノールおよび５％メタノール）と混合し、約５５％エタノール水溶液を含む混合液を得た。固体および液体を、以上で記述したようなデカンタを用いて分離した。湿潤固体部分は、５２５ポンド（約２３８ｋｇ）の重量であり、４０％乾燥質量であった。合計５２５ポンド（約２３８ｋｇ）の９５％変性エタノールを固体に加え、約８５％エタノール水溶液からなる混合液を得た。固体と液体を、以上で記述したようなデカンタを用いて分離した。固体部分は、３５４．５ポンド（約４５４ｋｇ）の重量であり、４０％乾燥質量であった。この塊に、また７００ポンド（約１６１ｋｇ）の変性エタノールを加え、約９５％エタノール水溶液の混合液を得た。固体と液体を、以上で記述したようなデカンタを用いて分離した。得られた固体は約４０％乾燥質量であった。このバイオマスは、乾燥させるまでに６０％少ないエネルギーを必要とし、それは水とエタノールの潜在熱に基づいて計算した。
【０２１５】
いくつかの実験において（データは示していない）、他の種類の変性エタノールを試した。９５％エタノールと５％イソプロパノールアルコールを含む変性エタノールを抽出にて使用したが、９５％エタノールと５％メタノールほど効果的ではないことがわかった。１００％エタノールの利用が、本発明の好ましい実施形態であるが、一般にコストの制約により利用可能ではない。
【０２１６】
膜システムからの透過物の流れを、社内製バッチスチールを用いて蒸発させた。操作条件は、真空蒸留の間約８０℃であった。透過物中のすべてのエタノールが蒸発した。これらの抽出段階を三回繰り返し、図１３で示すように、４つの産物プールを得た。これは、各抽出段階で、極性が混合物に対する水の添加で変化し、各段階で異なる成分の抽出を可能としたからである。産物１は、藻類タンパク質を含み、結果として、操作条件か蒸発できなかったシステム中の過剰な水が残った。産物２は極性脂質を含んだ。産物３は、中性脂質を含んだ。最後に産物４は、カロテノイドのような可能性のある副産物を含む、残余バイオマスであった。
【０２１７】
実施例５
エタノールによる、藻類バイオマスの脱水と抽出
採集時、藻類バイオマスは典型的に、約０．１〜０．５％（ｗ／ｗ）固体を含む。これは、膜濾過、遠心、加熱、沈降または浮選を含むが、限定はされない、藻類産業にて公知の任意の方法を用いて脱水することができる。凝集が、浮選または沈降いずれかにおいて補助可能である。そのような方法の典型的な結果は、約１０％ｗ／ｗの固体を含む藻類スラリーである。さらに脱水するために、他の脱水方法を使用して、残っている遊離水のいくらかを除去し、４０％ｗ／ｗに近い固体濃度を得ることができる。しかしながら、脱水のコストは、最初の脱水を実施した後、飛躍的に増加する。本明細書で開示するシステムおよび方法の利点は、たった一回の脱水ラウンドを実施した藻類質量の抽出および画分化を可能にすることである。
【０２１８】
そのような工程の例は、実施例３にて記述したプロトコールに続いて、最初の抽出ラウンドにて、９０％純水を含む１０００ポンド（約４５４ｋｇ）の湿潤バイオマスを１０００ポンド（約４５４ｋｇ）の変性エタノール（９５％ＥｔＯＨおよび５％ＭｅＯＨ）と混合し、約５０％エタノール水溶液の溶媒混合物を得ることである。得られたバイオマス（３５０ポンド（約１５９ｋｇ））は４０％乾燥である。これらの湿潤固体の溶媒組成は、５０％エタノール水溶液である。さらなる３５０ポンド（約１５９ｋｇ）の変性エタノールでは、混合物の組成は、約８１％エタノール水溶液であることとなる。得られるバイオマス（２３５ポンド（約１０７ｋｇ））は４０％乾燥である。これらの湿潤固体の溶媒組成は、８１％エタノール水溶液である。さらなる４７０ポンド（約２１３ｋｇ）の変性エタノールでは、混合物の組成は、約９５％エタノール水溶液であることとなる。得られる固体は、約９５％エタノールにて４０％乾燥となる。この湿潤バイオマスは、水およびエタノールの潜熱に基づいて、乾燥させるために６０％少ないエネルギーを必要とする。この場合、１００ポンド（約４５．４ｋｇ）の藻類が、１８２０ポンド（約８２６ｋｇ）のエタノールを用いて抽出されたこととなる。開始材料が４０％藻類固体である、実施例３と比較すると、３５０ポンド（約１５９ｋｇ）の乾燥藻類等価物が、２０８５ポンド（約９４６ｋｇ）のエタノールで抽出された。
参考文献
以下の参考文献は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
米国特許第７，１４８，３６６号明細書
【表６】
2014514923.tif 000009
【図１Ａ】
2014514923.tif 000010
【図１Ｂ】
2014514923.tif 000011
【図２】
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【図３】
2014514923.tif 000013
【図４Ａ】
2014514923.tif 000014
【図４Ｂ】
2014514923.tif 000015
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2014514923.tif 000017
【図６】
2014514923.tif 000018
【図７】
2014514923.tif 000019
【図８】
2014514923.tif 000020
【図９】
2014514923.tif 000021
【図１０】
2014514923.tif 000022
【図１１】
2014514923.tif 000023
【図１２Ａ】
2014514923.tif 000024
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2014514923.tif 000026
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2014514923.tif 000029
【図１７】
2014514923.tif 000030
【図１８】
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【図１９】
2014514923.tif 000032
【図２０】
2014514923.tif 000033
【図２３】
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【図２４】
2014514923.tif 000035
【図２５】
2014514923.tif 000036
【図２６】
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【図２１】
2014514923.tif 000038
【図２２】
2014514923.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月6日(2013.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法であって、
両親媒性溶媒および水の混合液中で可溶なタンパク質、極性脂質および中性脂質を含む、無傷の藻類細胞を含む湿潤藻類バイオマスを提供することと、
細胞外水を除去することによって前記湿潤バイオマスを脱水して、前記湿潤藻類バイオマスの固体含量を、５％〜５０％まで増加させて、部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを産出することと、
前記部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、重量で、約1部の湿潤藻類バイオマスに対して約１部の第一の両親媒性溶媒組の比で、第一の両親媒性溶媒組と第一の疎水性溶媒組と混合して、第一の重相と第一の軽相を含む第一の抽出混合物を産出することであって、前記第一の重相が第一の両親媒性溶媒組、中性脂質、両親媒性溶媒および水の混合液中で可溶なタンパク質、および部分的に脱水された湿潤藻類バイオマスを含み、前記第一の軽相が、第一の疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、
前記抽出混合物の前記軽相を前記抽出混合物の前記重相から分離することと、
前記部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを、前記抽出混合物の前記第一の重相中の前記第一の両親媒性溶媒組から分離し、中性脂質を含む分離した部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスと、両親媒性溶媒および水の混合液中で可溶なタンパク質、水および第一の両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出することと、
前記分離した部分的に脱水した藻類バイオマスを、重量で約1部の分離された部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスに対して約１部の第二の両親媒性溶媒組の比で、第二の両親媒性溶媒組と第二の疎水性溶媒組と混合して、第二の重相と第二の軽相を含む第二の抽出混合物を産出することであって、前記第二の重相は、第二の両親媒性溶媒組と、分離した部分的に脱水した湿潤藻類バイオマスを含み、前記第二の軽相は、前記第二の疎水性溶媒組と中性脂質を含むことと、
前記第二の重相を前記第二の軽相から分離することと、および
中性脂質を前記第二の軽相から分離することであって、前記第一の軽相は、第二の軽相よりも高い濃度の極性脂質を含み、前記第二の軽相は、第一の軽相よりも高い濃度の中性脂質を含むことと、
を含む方法。
【請求項２】
前記湿潤藻類バイオマスの脱水は、遠心、濾過、沈降または浮遊画分化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のおよび第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノン、ジメチルエーテルおよびプロピオンアルデヒド、２−プロパノール、アセトニトリル、ｔ−ブチルアルコール、１−プロパノール、水、重水（Ｄ２Ｏ）、エチレングリコール、グリセリンまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のおよび第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが、プロパン、ブタン、ペンタン、ブテン、プロペン、ナフサ、アルカン類、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、エステル類、酢酸エチル、酢酸ブチル、ケトン類、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、芳香族類、トルエン、ベンゼン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、ハロアルカン類、クロロホルム、トリクロロエチレン、エーテル類、ジエチルエーテル、ディーゼル、ジェット燃料、ガソリンまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第二の重相が、傾斜、膜濾過または遠心によって、前記第二の軽相から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第二の軽相を、中性脂質を前記第二の軽相から分離する前に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第二の疎水性溶媒組が、蒸発または蒸留によって前記第二の軽相から除去され、それによって中性脂質画分が産出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のおよび第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが蒸発させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のおよび第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のおよび第二の疎水性溶媒組のうちの少なくとも１つが冷却され、回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のおよび第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが冷却され、回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一のおよび第二の両親媒性溶媒組のうちの少なくとも１つが回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のおよび第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが加熱される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一のおよび第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、マイクロ波、水、スチームまたは熱油または電気にて加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一のおよび第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、大気圧にて加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一のおよび第二の抽出混合物のうちの少なくとも１つが、加圧反応器中で加熱される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記加圧反応器が、バッチまたは連続反応器である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
無傷の藻類細胞から中性脂質を分離する方法であって、
両親媒性溶媒および水の混合液中で可溶なタンパク質、極性脂質および中性脂質を含む、無傷の藻類細胞を含む湿潤藻類バイオマスを提供することと、
前記湿潤藻類バイオマスを、重量で約1部の湿潤藻類バイオマスに対して約１部の第一の両親媒性溶媒組の比で、第一の両親媒性溶媒組と第一の疎水性溶媒組と混合して、第一の重相と第一の軽相を含む第一の抽出混合物を産出することであって、前記第一の重相は第一の両親媒性溶媒組、中性脂質、両親媒性溶媒および水の混合液中で可溶なタンパク質、および湿潤藻類バイオマスを含み、前記第一の軽相は第一の疎水性溶媒組と極性脂質を含むことと、
前記抽出混合物の前記第一の軽相を、前記抽出混合物の前記第一の重相から分離することと、
湿潤藻類バイオマスを前記抽出混合物の前記第一の重相から分離して、中性脂質を含む分離された湿潤藻類バイオマスと、両親媒性溶媒および水の混合液中で可溶なタンパク質、水および第一の両親媒性溶媒組を含むタンパク質混合物を産出すること、
前記分離した藻類バイオマスを、約1部の湿潤藻類バイオマスに対して約１部の第一の両親媒性溶媒組の比で、第二の両親媒性溶媒組と第二の疎水性溶媒組を混合して、第二の重相と第二の軽相を含む第二の抽出混合物を産出することであって、前記第二の重相が第二の両親媒性溶媒組と、分離した湿潤藻類バイオマスを含み、前記第二の軽相が第二の疎水性溶媒組と中性脂質を含むことと、
前記第二の重相を前記第二の軽相から分離することと、および
中性脂質を前記第二の軽相から分離して、中性脂質画分を産出することであって、前記第一の軽相は、第二の軽相よりも高い濃度の極性脂質を含み、前記第二の軽相は、第一の軽相よりも高い濃度の中性脂質を含むことと、
を含む方法。
【国際調査報告】
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