(57)【要約】  本発明は、肺癌に罹患し、ＥＧＦＲ阻害剤の処置下にある患者の臨床転帰を決定する方法に関する。該方法はＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対する耐性を付与するＥＧＦＲ遺伝子における突然変異の存在の検出に基づくものであり、患者の体液における前記突然変異の出現が、該患者が該疾患の再発を受ける高い確率を示す。本発明はまた、該患者の治療方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌患者のＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する臨床応答を予測する方法であって、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなり、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、かつ、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陰性臨床応答を示し、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陽性臨床応答を示す、方法。
【請求項２】
前記第１の時点と第２の時点で、前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することをさらに含んでなり、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば陰性応答を示し、または第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば陽性応答を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異が、エキソン２０においてＴ７９０Ｍ突然変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が進行性肺癌を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者に第１の時点の前に手術が施されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の時点での患者の腫瘍からの組織サンプルが、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異に関して陽性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法が第１の時点の前、または第１の時点と第２の時点の間に開始されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記体液が血清である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、二重ＥＧＦＲ阻害剤、二重ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、または耐性突然変異を有するＥＧＦＲに特異的なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異が、Ｌ８５８Ｒ突然変異およびエキソン１９における（Ｅ）ＬＲＥＡ欠失から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＧＦＲの少なくとも１つの感受性突然変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数が、
（ｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異の前記特異的領域に相当する核酸配列を、タンパク質−核酸プローブを用いるＰＣＲの手段により増幅すること（前記タンパク質−核酸プローブは、ＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識してそれとハイブリダイズし、それによりその増幅を阻害することができる）、
（ｉｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの感受性突然変異の核酸配列のコピー数を定量すること
により測定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記臨床応答が無増悪生存、応答、生存または再発として決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者が第１の時点と第２の時点との間に再発症状を示さない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記再発症状が咳、疼痛またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
肺癌患者において肺癌の治療に用いるための、ＥＧＦＲ阻害剤を含んでなる組成物であって、前記患者が、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなる方法により選択され、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、かつ
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加している、組成物。
【請求項１９】
前記の患者を選択する方法が、前記第１の時点および第２の時点で、前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することをさらに含んでなり、かつ、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加している患者がさらに選択される、請求項１８に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異が、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異である、請求項１９に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記肺癌が進行性肺癌である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２３】
前記方法が、第１の時点での腫瘍からの組織サンプルがチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異に関して陽性であるような患者を選択することをさらに含んでなる、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
前記体液が血清である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を含んでなる、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２６】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異が、Ｌ８５８Ｒ突然変異およびエキソン１９における（Ｅ）ＬＲＥＡ欠失から選択される、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２８】
前記患者が第１の時点および／または第２の時点で再発症状を持たない、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２９】
前記再発症状が咳、疼痛またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊である、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬理ゲノミクスの分野に関し、より詳細には、肺癌患者の、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に基づく化学療法に対する臨床応答を、前記患者の体液においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子における１つの感受性突然を検出することに基づき予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は総ての肺癌の約８０％を占め、毎年世界で１２０万の新しい症例が出ている。ＮＳＣＬＣは２００１年には世界で１００万人を超える死者を出し、男性と女性の両方において癌関連死亡の主因となっている（それぞれ３１％および２５％）。進行したＮＳＣＬＣの予後は不良である。最近の米国東海岸癌臨床試験グループによる患者１１５５人の治験では、使用した化学療法間で差は見られなかった：シスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセルおよびカルボプラチン／パクリタキセル。進行するまでの総期間の中央値は３．６カ月であり、生存期間は７．９カ月であった。
【０００３】
診断時に、ＮＳＣＬＣ患者は、疾患の程度および治療アプローチの両方を反映した３群に分けることができる。
【０００４】
・第一群の患者は、外科的に切除可能ば腫瘍を持つ（一般に、ステージI腫瘍、ステージＩＩ腫瘍および選択されたステージＩＩＩ腫瘍）。この群の予後は、最も良い。
【０００５】
・第二群は、局部的（Ｔ３〜Ｔ４）および／または領域的（Ｎ２〜Ｎ３）のいずれかの進行性肺癌を有する患者を含む。切除不可能またはＮ２〜Ｎ３疾患を有する患者は、放射線療法と化学療法とを併用して処置される。Ｔ３またはＮ２疾患を有する選択された患者は、外科的切除および術前または術後の化学療法または放射線化学療法で効果的に処置することができる。
【０００６】
・最後の群は、遠隔転移（Ｍ１）を有する患者を含む。この群は、苦痛緩和放射線療法または化学療法で処置することができる。
【０００７】
過去数年間、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＥＧＦＲに対して直接的な標的療法の開発に努力が向けられてきた。ＥＧＦＲは、大部分のＮＳＣＬＣに存在する。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む密接に関連した受容体のＥｒｂＢファミリーに属する。ＥＧＦＲの活性化により、受容体チロシンキナーゼ活性および一連の下流シグナル伝達事象が生じ、これが細胞の増殖、運動、接着、浸潤、アポトーシスの遮断、および化学療法に対する耐性の増加に介在する。ＥＧＦＲとそのリガンド、ＥＧＦおよびトランスフォーミング増殖因子αは、８０％を超えるＮＳＣＬＣで発現される。リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、ホモ二量体化するか、またはＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとヘテロ二量体を形成し、受容体のリン酸化および下流シグナル伝達事象の活性化をもたらす。ＥＧＦＲの活性化により、Ｓｈｅ、Ｇｒｂ２、Ｓｒｃ、ＪＡＫ、ＰＬＤ、ＰＬＣＧＡＭＭＡおよびＰＩ３Ｋなどの複数のシグナル伝達メディエーターとの会合、続いてＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、ＪＮＫ、ＳＴＡＴおよびＡｋｔなどのシグナル伝達トランスデューサーの活性化が起こる。腫瘍形成におけるこのＥＧＦＲの重要性から、その機能を遮断する治療薬の開発および商業化が促進された。
【０００８】
最近、ＮＳＣＬＣ患者の一部でＥＧＦＲの２つの低分子阻害剤ゲフィチニブ（イレッサ）およびエルロチニブ（タルセバ）の治療が成功したことから、ＥＧＦＲが有効な標的であるという前提がさらに確実なものとなった。いくつかのグループがそれぞれ、肺腺癌において、ＥＧＦＲ遺伝子のキナーゼドメインにおける頻発体細胞突然変異を確認した。これらは、米国において配列決定された肺腺癌検体の１６％、およびアジアにおいて配列決定された肺腺癌検体の４０％に見られる。これらの突然変異は、ゲフィチニブとエルロチニブの両方に対する感受性と関連しており、これらの薬剤による治療に対する希少かつ劇的な臨床応答を部分的に説明する。その後、複数のグループによる研究で、現在では、数多くのさらなる肺癌患者からＥＧＦＲキナーゼドメイン突然変異が同定されている。これらの突然変異は、４つの群または領域に集まっている；エキソン１９の欠失、エキソン２０の挿入、ならびにＧ７１９ＳおよびＬ８５８Ｒにおける点突然変異。これらのキナーゼドメイン突然変異の発生は、扁平上皮癌などの他の組織学的サブタイプの肺癌におけるよりも腺癌において多い。最近得られたデータでも、免疫組織化学およびＥＧＦＲ遺伝子コピー数により評価されるＥＧＦＲ発現が、より応答しやすい患者を同定するのに等しく重要な役割を果たし得ること、およびゲフィチニブまたはエルロチニブで治療した際の生存期間がより長いことが示唆されている。
【０００９】
しかしながら、最初にエルロチニブおよびゲフィチニブに応答したほぼ総ての患者がその後再発する。身体的再発症状（咳、疼痛またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊）が現れる前に再発を起こしている、または起こすであろう患者を早期のうちに特定することができれば、医師は別の療法を選択することができるので、このことの重要性は極めて大きい。再発の早期診断は、肺癌患者の生存率の上昇をもたらすであろう。
【００１０】
よって、当技術分野において、身体的再発症状が現れる前に肺癌患者において再発を予測するためのさらなる診断ツールの必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
第１の側面において、本発明は、肺癌患者のＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する臨床応答を予測する方法であって、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなり、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、かつ、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば、前記患者の前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する臨床応答が陰性であることを示し、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば、前記患者の前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する臨床応答が陽性であることを示す方法に関する。
【００１２】
第２の側面において、本発明は、肺癌患者において肺癌の治療に用いるための、ＥＧＦＲ阻害剤を含んでなる組成物であって、前記患者が、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなる方法により選択され、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、かつ
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加している、
組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ステージＩＶ肺腺癌（肝臓、骨）に罹患している軽度喫煙者の４０歳女性に相当する患者ＤＸ２８２のデータ。
【図２】ステージＩＶ肺腺癌（肺、リンパ節）に罹患している非喫煙者の３８歳男性に相当する患者ＤＸ２７１のデータ。
【図３】ステージＩＶ大細胞癌（脳、骨、肝臓、リンパ節）に罹患している非喫煙者の４２歳男性に相当する患者ＤＸ１０４のデータ。
【図４】ステージＩＶ肺腺癌（２カ所の脳転移）に罹患している非喫煙者の４４歳女性に相当する患者ＤＸ１３８のデータ。
【図５】進行性疾患に罹患している前喫煙者の６０歳男性に相当する患者ＤＸ４８５のデータ。
【図６】非喫煙者の３８歳男性に相当する患者ＤＸ３５３のデータ。
【発明の具体的説明】
【００１４】
患者の臨床転帰を決定する方法
本発明者らは、肺癌に罹患し、かつ、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で処置された患者の再発が、臨床症状の出現前または画像データによる進行／再発の確認前であっても、患者の体液においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を付与する１以上の突然変異を有するＥＧＦＲをコードする核酸のコピーの出現の増加を検出することによって決定可能であることを見出した。本発明の実施例に示されるように、患者の体液における、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤に対する感受性に関連するＥＧＦＲ遺伝子における突然変異の出現は、臨床症状の出現により認められるような疾患の再発に先行し、逆に、これらのタイプの突然変異が存在しないことは、再発がないこと、および疾患のエビデンスがないことと相関する。
【００１５】
従って、この方法は、外科的応答または化学的応答後の患者を、再発を受けるリスクに関して監視するための高感度法として特に適している。
【００１６】
よって、第１の側面において、本発明は、肺癌患者のＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する臨床応答を予測する方法であって、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなり、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、かつ、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陰性臨床応答を示し、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陽性臨床応答を示す方法（以下、本発明の第１の方法）に関する。
【００１７】
本明細書において用語「予測する」とは、所与の療法に対して患者が好ましい応答を示すかまたは好ましくない応答を示す可能性を決定することを意味する。特に、本明細書において用語「予測」とは、患者の進展を決定するのに有用であり得る任意のパラメーターの個々の評価に関する。当業者に理解されるように、生物学的薬剤による治療に対する臨床応答の予測は、好ましいものではあるが、診断または評価される被験者の１００％に対して正しい必要はない。しかしながら、この用語は、被験者の統計学的に有意な一部が、陽性応答を有する高い確率を示すと同定されることが求められる。被験者が統計学的に有意であるかどうかは、当業者ならば、種々の周知の統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントのｔ検定、マンホイットニー検定などを用いて、たやすく決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983に見出せる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは０．２、０．１または０．０５である。
【００１８】
本明細書において用語「臨床応答」とは、生物学的薬剤で治療可能な病態に罹患している被験体の、該生物学的薬剤に対する応答を意味する。標準的判定基準は疾患ごとに異なり得る。それは、被験者の疾患がどのように進行するか、および回復または再発の機会があるかどうかの医師の予測を表す。
【００１９】
本明細書において用語「患者」とは、哺乳動物として分類される総ての動物を意味し、限定されるものではないが、飼育動物および農場動物、霊長類およびヒト、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類が挙げられる。好ましくは、患者は、年齢または人種を問わず男性または女性のヒトである。一態様では、肺癌を有していた患者はなお肺癌を有するとみなされる。
【００２０】
好ましい態様では、本発明の第１の方法に従ってスクリーニングされた患者は、第１の時点での前記患者の腫瘍からの組織サンプルが、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異に関して陽性であることを特徴とする。用語「チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異」とは、以下に詳細に定義される。
【００２１】
好ましい態様では、患者は、第１の時点および／または第２の時点のいずれかに再発症状を示さない。さらにより好ましい態様では、患者は、第１の時点でも第２の時点でも再発症状を示さない。陽性応答の判定基準として使用可能な再発症状は、咳、疼痛またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊である。
【００２２】
用語「肺癌」とは、肺のいずれかの癌を意味するものとし、非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む。好ましい態様では、本発明の方法は、ＮＳＣＬＣに罹患している被験者および／またはＮＳＣＬＣに罹患したことがある被験者に適用できる。特定の態様では、ＮＳＣＬＣは、肺の扁平上皮癌、肺の大細胞癌および肺の腺癌から選択される。さらに、本発明の方法は、ＮＳＣＬＣの任意のステージ（ステージ０、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＶ）に罹患したことがある、または罹患している被験者にも適用できる。好ましい態様では、患者は進行性肺癌に罹患していたことがある。
【００２３】
本明細書において用語「ＥＧＦＲ阻害剤に基づく化学療法」とは、ＥＧＦＲ活性を阻害することができる１以上の化合物を含む任意の治療計画を意味する。
【００２４】
用語「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」および「上皮細胞増殖因子受容体」は、本明細書において互換的に使用され、シグナル伝達経路ならびに細胞の増殖および生存を調節し、かつ、ＥＧＦ分子に親和性を示すチロシンキナーゼを意味する。ＥｒｂＢファミリー受容体は、４種の密接に関連したサブタイプからなる：ＥｒｂＢ１（上皮細胞増殖因子受容体［ＥＧＦＲ］）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）ならびにそれらの変異体（例えば、Humphrey et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:4207-4211)の場合のような欠損変異体ＥＧＦＲ）。好ましい態様では、ＥＧＦＲはヒトである。
【００２５】
好ましい態様では、治療計画は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。本発明の方法に従って使用するためのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤療法のタイプは特に限定されず、上述の阻害剤のいずれもを含み得る。好ましい態様では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、二重ＥＧＦＲ阻害剤、二重ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤または耐性突然変異を有するＥＧＦＲに特異的なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。
【００２６】
本明細書において用語「二重ＥＧＦＲ阻害剤」とは、ＥＧＦＲの細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性ならびに細胞外ドメインへのリガンドの結合によるその活性化を同時に阻害し得る組成物を意味する。このような阻害剤の例示的および非例示的例は、例えば、細胞外ドメインの阻害剤としてのセツキシマブ（Ｃ２２５）と細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性の阻害剤としてのエルロチニブ（Ｅ）とを含んでなる組成物である。
【００２７】
本明細書において用語「二重ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤」とは、ＥＧＦＲ活性とＨＥＲ２活性を同時に阻害し得る化合物を意味する。このような化合物の例としては、ＥＧＦＲとＨＥＲ２阻害剤ＣＩ−１０３３（旧称ＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＧＦＲとＨＥＲ２阻害剤ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６または二トシル酸ラパチニブとしても知られる；ＧＳＫ）；ＥＧＦＲとＪＡＫ２／３阻害剤ＡＧ４９０（チルホスチン）；ＥＧＦＲとＨＥＲ２阻害剤ＡＲＲＹ−３３４５４３（Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）；不可逆的二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２キナーゼ阻害剤ＢＩＢＷ−２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。
【００２８】
好ましい態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に基づく化学療法は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤である。本明細書において「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤」という表現は、ＡＴＰのγ−リン酸基を、上皮細胞増殖因子の受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼドメインにより触媒されるタンパク質における特異的チロシンの水酸基に転移させる「チロシンキナーゼ」を阻害する化学物質に関する。チロシンキナーゼ活性は、タンパク質のリン酸化を検出することにより測定される。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は当技術分野で公知である。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＴＰからタンパク質チロシン残基への、チロシンにより媒介される転移リン酸基の減少を検出することにより同定される。
【００２９】
チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ｅｒｂＢチロシンキナーゼ阻害剤である。あるいは、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼ阻害剤は、可逆的チロシンキナーゼ阻害剤である。あるいは、チロシンキナーゼ阻害剤は、不可逆的チロシンキナーゼ阻害剤である。可逆的チロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＨＫＩ−２７２、ＢＩＢＷ２９９２、ＥＫＢ−５６９またはＣＬ−３８７，７８５またはそれらのミメティクスもしくは誘導体が挙げられる。他のチロシンキナーゼ阻害剤としては、米国特許第６，３８４，０５１号および同第６，２８８，０８２号ならびに米国特許出願第２００５００５９６７８号（それぞれ引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）に記載されているものが挙げられる。
【００３０】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤として、例えば、キナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリミドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピロロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピラゾロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フェニルアミノピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、オキシインドールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ならびにチルホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えば、以下の特許公報に記載されているもの、ならびに前記ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の総ての薬学的に許容可能な塩および溶媒和物が挙げられる：国際公開ＷＯ９６／３３９８０、ＷＯ９６／３０３４７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／３００４４、ＷＯ９７／３８９９４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９７／３８９８３、ＷＯ９５／１９７７４、ＷＯ９５／１９９７０、ＷＯ９７／１３７７１、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９８／０２４３８、ＷＯ９７／３２８８１、ＷＯ９８／３３７９８、ＷＯ９７／３２８８０、ＷＯ９７／３２８８、ＷＯ９７／０２２６６、ＷＯ９７／２７１９９、ＷＯ９８／０７７２６、ＷＯ９７／３４８９５、ＷＯ９６／３１５１０、ＷＯ９８／１４４４９、ＷＯ９８／１４４５０、ＷＯ９８／１４４５１、ＷＯ９５／０９８４７、ＷＯ９７／１９０６５、ＷＯ９８／１７６６２、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９９／０７７０１およびＷＯ９２／２０６４２；ヨーロッパ特許出願ＥＰ５２０７２２、ＥＰ５６６２２６、ＥＰ７８７７７２、ＥＰ８３７０６３およびＥＰ６８２０２７；米国特許第５，７４７，４９８号、同第５，７８９，４２７号、同第５，６５０，４１５号および同第５，６５６，６４３号；ならびに独国特許出願ＤＥ１９６２９６５２。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる非限定例としては、Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12): 1599-1625に記載のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００３１】
本発明に従って使用可能な低分子量ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の好ましい具体例としては、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ−７７４、エルロチニブまたはタルセバ（商標）（エルロチニブＨＣｌ）としても知られる；ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第５，７４７，４９８号；国際公開ＷＯ０１／３４５７４およびMoyer, J. D. et al. (1997) Cancer Res. 57:4838-4848)；ＣＩ−１０３３（旧称ＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒ）(Sherwood et al., 1999, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 40:723)；ＰＤ−１５８７８０（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ−１４７８（カリフォルニア大学）；ＣＧＰ−５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６または二トシル酸ラパチニブとしても知られる；ＧＳＫ）；ならびにゲフィチニブ（ＺＤ１８３９またはイレッサ（商標）としても知られる；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）(Woodburn et al., 1997, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633)が挙げられる。本発明に従って使用可能な特に好ましい低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（すなわち、エルロチニブ）、その塩酸塩（すなわち、エルロチニブＨＣｌ、タルセバ（商標））または他の塩形態（例えば、メシル酸エルロチニブ）である。
【００３２】
また、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＥＧＦＲキナーゼに対して活性を有するマルチキナーゼ阻害剤、すなわち、ＥＧＦＲキナーゼおよび１以上のさらなるキナーゼを阻害する阻害剤が挙げられる。このような化合物としては、例えば、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２阻害剤ＣＩ−１０３３（旧称ＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２阻害剤ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６または二トシル酸ラパチニブとしても知られる；ＧＳＫ）；ＥＧＦＲおよびＪＡＫ２／３阻害剤ＡＧ４９０（チルホスチン）；ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２阻害剤ＡＲＲＹ−３３４５４３（Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）；不可逆的二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２キナーゼ阻害剤ＢＩＢＷ−２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．）；ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２阻害剤ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＶＥＧＦ−Ｒ２およびＥＧＦＲ阻害剤ＺＤ６４７４（ザクティマ（商標）としても知られる；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）ならびにＥＧＦＲおよびＨＥＲ２阻害剤ＢＭＳ−５９９６２６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。
【００３３】
抗体型チロシンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、天然リガンドによるＥＧＦＲ活性化を部分的または完全に遮断することができるいずれの抗ＥＧＦＲ抗体または抗体フラグメントも含まれる。抗体型ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の非限定例として、Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cancer 67:247-253; Teramoto, T., et al., 1996, Cancer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M., et al., 1999, Cancer Res. 15:59(8):1935-40;およびYang, X., et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243に記載されているものが挙げられる。従って、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体Ｍａｂ  Ｅ７．６．３(Yang, X. D. et al. (1999) Cancer Res. 59: 1236-43)もしくはＭａｂ  Ｃ２２５（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−８５０８）またはそれらの結合特異性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであり得る。好適なモノクローナル抗体ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブまたはエルビタックス（商標）としても知られる；Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）およびＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）が挙げられる。
【００３４】
別の態様では、アンチセンス法を使用して変異体ＥＧＦＲのキナーゼ活性を妨げてもよい。このアプローチでは、例えば、アンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスキングするか、またはリボザイムでｍＲＮＡを切断することにより、特定のｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンス核酸またはリボザイムを利用してもよい。アンチセンス技術についての一般的な考察は、例えば、Antisense DNA and RNA (Cold Spring Harbor Laboratory, D. Melton, ed., 1988)を参照。
【００３５】
変異体ＥＧＦＲ遺伝子転写の可逆的短期阻害もまた有用であり得る。このような阻害は、ｓｉＲＮＡを使用することにより達成され得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの低分子ＲＮＡを用いることにより、遺伝子の発現を妨げる。この技術では、ＲＮＡｉが、植物から昆虫、哺乳動物に至るまで数多くの生物のほとんどの細胞における遺伝子をサイレンシングするための天然の生物学的機構であるということを利用するものである(McManus et al., Nature Reviews Genetics, 2002, 3(10) p. 737)。ＲＮＡｉは、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡコピーである分子中間体を確実に破壊することにより、遺伝子が機能的タンパク質を産生することを抑制する。ｓｉＲＮＡは、下記のように、裸の形態で使用し、ベクターに組み込むことができる。さらに、アプタマーを使用して変異体ＥＧＦＲ遺伝子の転写を特異的に阻害することもできる（例えば、米国特許第６，６９９，８４３号参照）。本発明に有用なアプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて同定することができる。ＳＥＬＥＸの方法は、例えば、米国特許第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号および同第５，６６０，９８５号に記載されている。
【００３６】
「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子における相補的塩基と細胞質条件下でハイブリダイズした際にその役割を阻害する一本鎖核酸分子である。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸は逆方向転写物またはｍＲＮＡ干渉相補的核酸である。現在使用されているように、「アンチセンス」は、広義にはＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイム、ＲＮＡｉ、アプタマーおよびＲｎａｓｅ−Ｈ介在性停止を含む。
【００３７】
リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡ分子をＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに多少類似している方法で特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、あるｍＲＮＡが自身のイントロンを切除する能力を有するという知見から見出された。これらのリボザイムのヌクレオチド配列を改変することにより、研究者は、ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチド配列を認識してそれを切断する分子を設計することができた(Cech, 1989, Science 245(4915) p. 276)。これらは配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化される。
【００３８】
アンチセンス核酸分子は、細胞での発現のための組換え遺伝子によりコードされ得るか（例えば、米国特許第５，８１４，５００号；同第５，８１１，２３４号）あるいはまた合成により生産され得る（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。
【００３９】
ｓｉＲＮＡは、Brummelkamp et al., Science 296; 550-553,2002、Jaque et a1., Nature 418; 435-438, 2002、Elbashir S. M. et al. (2001) Nature, 411: 494-498、McCaffrey et al. (2002), Nature, 418: 38-39、Xia H. et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010、Novina et al. (2002), Nat. Med. 8: 681-686および米国特許出願第２００３０１９８６２７号に記載されている。
【００４０】
変異型受容体および正常受容体の両方を阻害するゲフィチニブまたはエルロチニブなどの薬物を使用することに対するこのような治療法の重要な利点は、変異型ＥＧＦＲに特異的に向けられたｓｉＲＮＡは、野生型ＥＧＦＲを阻害しないはずであるということである。下痢および皮膚炎を含むゲフィチニブ治療の「副作用」は、その機能を必要とする正常組織におけるＥＧＦＲの阻害の結果であると一般的に考えられるので、このことは重要である。
【００４１】
別の態様では、本化合物は、そのキナーゼドメインに少なくとも１つの相違があるＥＧＦＲをコードするヒト配列に特異的なアンチセンス分子である。投与される治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、天然核酸からの化学修飾を有する合成オリゴヌクレオチド、またはＲＮＡなどのアンチセンス分子を発現する核酸構築物であり得る。アンチセンス配列は、標的ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する（例えば、Nyce et al. (1997) Nature 385:720参照）。アンチセンス分子は、ＲＮＡｓｅＨの活性化または立体障害により、翻訳に利用できるｍＲＮＡの量を減少させることで遺伝子発現を阻害する。１つまたは複数のアンチセンス分子の組合せを投与することもでき、組合せは、単一の標的遺伝子とは異なる複数の配列、またはいくつかの異なる遺伝子を補完する配列を含んでなり得る。
【００４２】
好ましい標的遺伝子は、キナーゼドメインに少なくとも１つの核酸の相違を有するＥＧＦＲである。一般に、アンチセンス配列は、動物宿主と同じ種に起源する。
【００４３】
アンチセンス分子は、適当なベクター中の標的遺伝子配列の総てまたは一部の発現により産生してもよく、この場合、ベクターは、標的細胞に導入され、発現される。転写開始は、アンチセンス鎖をＲＮＡ分子として産生するように配向させる。アンチセンスＲＮＡは、内在センス鎖ｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより、標的遺伝子の発現を遮断する。天然転写開始領域または外来転写開始領域を用いてもよい。
【００４４】
プロモーターは、in vitro組換え法によるか、または染色体への配列の相同組み込みの結果として導入され得る。筋細胞中で活性な多くの強力なプロモーターは、βアクチンプロモーター、ＳＶ４０前期および後期プロモーター、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、レトロウイルスＬＴＲをはじめ、当該技術分野で公知である。転写ベクターは、一般に、核酸配列の挿入を提供するプロモーター配列付近に位置する都合のよい制限部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含んでなる転写カセットを作製してもよい。転写カセットを、種々のベクター、例えば、プラスミド；レトロウイルス、例えば、レンチウイルス；アデノウイルスなどに導入してもよく、ここで、これらのベクターは、一時的または安定的に、通常少なくとも約１日、より通常には少なくともほぼ数日間、細胞に維持され得る。
【００４５】
また、アプタマーも有用である。アプタマーは、有望な新しい種類の治療用オリゴヌクレオチドまたはペプチドであり、in vitroで、例えば、リガンド受容体などの高親和性を有する一定の標的に特異的に結合させるために選択される。それらの結合特性は、オリゴヌクレオチドが分子内核酸塩基対合により一緒に保持される三次元構造を形成する能力を反映したものと思われる。アプタマーは、標的タンパク質、リガンド（脂質、炭水化物、代謝物質など）と相互作用する、正常および改変型であってもよい合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド配列（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、チオリン酸化ＤＮＡなど）である。さらなる態様では、変異体ＥＧＦＲに特異的なＲＮＡアプタマーを、治療薬として細胞に導入するか、または細胞で発現させることができる。
【００４６】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ある点では、オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体と同様であり、従って、ＤＮＡおよびＲＮＡを模倣し得る。ＰＮＡにおいては、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、偽ペプチド主鎖により置換されている(Nielsen et al. 1991 Science 254, 1457-1500)。各サブユニットまたはモノマーは、この主鎖に結合した天然または非天然核酸塩基を有する。このような主鎖の１つは、アミド結合を介して連結したＮ（２−アミノエチル）グリシンの繰り返し単位から構成されている。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合およびヘリックスフォールドにより相補的核酸とハイブリダイズする。偽ペプチド主鎖により、優れたハイブリダイゼーション特性(Egholm et al. Nature (1993) 365, 566-568)、酵素分解耐性(Demidov et al. Biochem. Pharmacol. (1994) 48, 1310-1313)および種々の化学修飾の容易さ(Nielsen and Haaima Chemical Society Reviews (1997) 73-78)が提供される。変異体ＥＧＦＲに特異的なＰＮＡは、治療薬として細胞に導入するかまたは細胞中で発現させることができる。ＰＮＡは、例えば、米国特許出願第２００４００６３９０６号に記載されている。
【００４７】
好ましい態様によれば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブまたはゲフィチニブである。
【００４８】
本発明の第１の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤が、それまでに化学療法による処置を受けたことがない患者に第一選択治療として使用される場合、ならびにＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、それまでに通常の化学療法による処置を受けたことがあるが応答しなかったか、または応答が停止した患者に第二選択治療として使用される場合の両方で、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する、ＥＧＦＲに少なくとも１つの感受性突然変異を有する肺癌患者の応答を予測するのに好適である。
【００４９】
本明細書において用語「第一選択治療（first-line treatment）」または「第一選択療法（first-line therapy）」は、当技術分野において認識されている用語であり、第一治療（primary treatment）または第一療法（primary therapy）とも称される外科手術および／または放射線療法と組み合わせてもよい癌の第一化学療法処置を意味するものと理解される。肺癌の治療のための第一選択として使用することができる典型的な抗腫瘍化合物としては、限定されるものではないが、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびエトポシドなどの植物性アルカロイド；ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンを含むアントラサイクリン系抗生物質；フルオロウラシル；ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、ダクチノマイシンを含む抗生物質；カンプトテシンおよびその類似体などのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびにシスプラチンおよびその類似体、例えば、カルボプラチンを含む白金化合物が挙げられる。使用するのに好適な他の従来の化学療法剤は当業者に公知であり、アスパラギナーゼ、ブスファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、リン酸エストラムスチンナトリウム、フロクシウリジン、フルオロウウラシル（５−ＦＵ）、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン(mitsxantrone)、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオグアニン、チオテパ、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビスグアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンが挙げられる。
【００５０】
本明細書において用語「第二選択治療（second-line treatment）」または「第二選択療法（second -line therapy）」は、当技術分野において認識されている用語であり、初回または第一治療（第一選択療法または第一療法）の効力がないか、あるいは効力が停止した場合に行われる化学療法処置を意味するものと理解される。
【００５１】
好ましい態様では、本発明の第１の方法に従ってスクリーニングされる患者は、第１の時点における決定の前に外科手術により処置されている。一般に、外科手術は周辺の肺組織を一部伴って腫瘍を除去するために使用され、肺葉の一部だけが除去される区域切除または楔状切除、一肺葉（区域）が除去される肺葉切除、または全肺が除去される肺切除を含み得る。
【００５２】
第１工程において、患者の臨床転帰（clinical outcome）を予測する方法は、第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対する少なくとも１つの感受性突然変異を含むＥＧＦＲの核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数との比を決定することを含んでなる。
【００５３】
本明細書において「体液（bio-fluid）」は、被験者から得ることができる任意の体液に関する。サンプルは、体液（body fluid）サンプル、血液、血清、唾液を含む痰、血漿、乳頭吸引液、滑液、脳脊髄液、汗、尿、糞便、膵液、骨梁液、脳脊髄液、涙、気管支洗浄液、スワブ、気管支吸引液、精液、前立腺液、前頸部液、膣液、および射精前液などを含む、哺乳動物（例えば、ヒト）の種々の供給源から採取することができる。好ましい態様では、体液は血液または血清である。
【００５４】
本発明の実施において、血液などの体液は、標準的な方法で採取管に抜き取る。血液の場合、前記採取管は好ましくはシリコン処理ガラスを含んでなり、血清の調製のためには抗凝固剤を伴わずに、または血漿の調製のためにはＥＤＴＡ、ヘパリンもしくは同様の抗凝固剤、最も好ましくは、ＥＤＴＡを伴う。血漿はその後、場合により、抗凝固処理した血漿を同容量の塩化カルシウムとともに３７℃で短時間、最も好ましくは１〜３分間、凝固が起こるまでインキュベートすることによって血清に変換させることができる。次に、血餅を短時間の遠心分離によりペレット化し、除タンパク血漿を別の試験管に取り出せばよい。あるいは、遠心分離を省いてもよい。血清はまた、クロットアクチベーターチューブを用いて得ることもできる。
【００５５】
用語「核酸」は、ホスホジエステル結合により結合されてＤＮＡなどのポリヌクレオチドを形成する、ヌクレオシドもしくは窒素複素環式塩基を有するヌクレオシド類似体、または塩基類似体を含んでなる多量体化合物を意味する。
【００５６】
用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味する。ＤＮＡ配列はデオキシリボ核酸配列である。ＤＮＡは、ヌクレオチドの長いポリマーであり、タンパク質において遺伝コードを用いてアミノ酸残基の配列をコードしている。
【００５７】
本明細書において用語「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与するＥＧＦＲ遺伝子における突然変異」または「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を付与する突然変異」とは、エルロチニブなどの阻害剤による処置に応答してＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の阻害の増強をもたらすＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける突然変異体を意味する。チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性の増強を示すＥＧＦＲ突然変異体としては、限定されるものではないが、エキソン２１におけるＬ８５８位の突然変異、例えば、活性化ループ（エキソン２１）におけるＬ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｐ、Ｌ８６１ＱまたはＬ８６１点突然変異、ＥＬＲＥＡ配列（エキソン１９）におけるインフレーム欠失／挿入突然変異、例えば、Ｅ７４６−Ｒ７４８欠失、Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、Ｅ７４９ＱとＡ７５０Ｐ置換を伴うＥ７４６−Ｒ７４８欠失、ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９欠失とＡ７５０Ｐ置換の組合せ、Ｌ７４７Ｓ置換とＲ７４８−Ｐ７５３欠失の組合せ、Ｌ７４７−Ｓ７５２欠失とＥ７４６Ｖ置換の組合せ、Ｌ７４７−Ｔ７５１欠失とセリン挿入の組合せ、Ｍ７６６−Ａ７６７位におけるＡＩ挿入、Ｓ７６８−Ｖ７６９位におけるＳＶＡ挿入、またはＧ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１０Ｓなどのヌクレオチド結合ループ（エキソン１８）における７１９位での置換が挙げられる。
【００５８】
好ましい態様では、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を示す。さらにより好ましい態様では、患者は、Ｌ８５８Ｒ置換およびＥＬＲＥＡ欠失の群から選択される第１の突然変異を示す。
【００５９】
ＥＧＦＲをコードする変異型核酸の検出は、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらの転写物およびタンパク質における突然変異の検出に基づくものであり得る。突然変異が被験体において実際に発現されるようにするためには、転写物および／またはポリペプチドの分析によりゲノムＤＮＡにおける突然変異を確認することが望ましいと考えられる。
【００６０】
ゲノム核酸における突然変異は、有利には、増幅された核酸断片における移動度のシフトに基づく技術によって検出される。例えば、Chen et al. (Anal[Biochem., 1996, 239:61-9)は、競合的移動度シフトアッセイによる一塩基突然変異の検出を記載している。  さらに、Marcelino et al., BioTechniques 26(6): 1134-1148 (June 1999)の技術に基づくアッセイも市販されている。好ましい例では、キャピラリーヘテロ二本鎖分析を用いて、ミスマッチの結果として、キャピラリー系において二本鎖核酸の移動度シフトに基づき突然変異の存在を検出することができる。
【００６１】
サンプルからの分析用核酸の形成には一般に核酸増幅が必要である。多くの増幅法が、酵素的連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応または自己持続型配列複製）またはそれがクローニングされるベクターの全部もしくは一部の複製に頼るものである。好ましくは、本発明による増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応により示されるような指数関数的増幅である。
【００６２】
多くの標的およびシグナル増幅法が文献に記載されている（例えば、これらの方法の概論としては、Landegren, U., et al., Science 242:229-237 (1988)およびLewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990))。これらの増幅法は本発明者の発明の方法で使用可能であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、in situ ＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑｂｅｔａバクテリオファージレプリカーゼ、転写増幅システム(transcription-based amplification system)（ＴＡＳ）、転写物配列決定を伴うゲノム増幅(genomic amplification with transcript sequencing)（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence-based amplification)（ＮＡＳＢＡ）およびin situハイブリダイゼーションが含まれる。種々の増幅技術に使用するのに好適なプライマーは、当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。
【００６３】
核酸が増幅されれば、一塩基対突然変異の検出にいくつかの技術を利用できる。このような技術の１つが一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）である。ＳＣＣＰ検出は、電気泳動において一本鎖変異型ＤＮＡの移動度が参照ＤＮＡと異なることに基づく。突然変異は、一本鎖ＤＮＡにコンフォメーション変化を生じ、移動度シフトをもたらす。蛍光ＳＣＣＰは、検出を助けるために蛍光標識プライマーを用いる。従って、参照ＤＮＡおよび変異型ＤＮＡは蛍光標識プライマーを用いて増幅される。増幅されたＤＮＡを変性され、急冷して一本鎖ＤＮＡ分子とし、これらを非変性ゲル電気泳動によって調べる。
【００６４】
化学的ミスマッチ切断(Chemical mismatch cleavage)（ＣＭＣ）は、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウムおよびピペリジンの組合せによるＤＮＡミスマッチ塩基対の認識および切断に基づく。よって、参照ＤＮＡと変異型ＤＮＡの両方を、蛍光標識プライマーを用いて増幅させる。アンプリコンをハイブリダイズさせた後、ミスマッチＴ塩基と結合する四酸化オスミウム、またはミスマッチＣ塩基と結合するヒドロキシルアミン、次いで、修飾された塩基の部位で切断するピペリジンを用いて切断処理を施す。次に、切断された断片を電気泳動により検出する。
【００６５】
また、制限酵素断片多型(restriction fragment polymorphisms)（ＲＦＬＰ）に基づく技術も使用可能である。多くの一塩基多型（ＳＮＰ）は従来のＲＦＬＰ分析を許容しないが、プライマー誘導型制限酵素分析ＰＣＲ(primer-induced restriction analysis PCR)（ＰＩＲＡ−ＰＣＲ）は、ＰＣＲプライマーを用いてＳＮＰ依存的に制限部位を導入するために使用することができる。好適な制限部位を導入するＰＩＲＡ−ＰＣＲのためのプライマーは、例えば、Xiaiyi et al. (2001) Bioinformatics 17:838-839に記載のように、コンピューター解析により設計することができる。
【００６６】
さらに、ＷＡＶＥ分析に基づく技術を使用することもできる(Methods Mol. Med. 2004; 108: 173-88)。このＤＮＡ断片分析システムは一塩基多型を検出するために使用することができ、温度調節型液体クロマトグラフィーおよび高分解マトリックス(Genet Test. 1997-98;1 (3):201-6)に基づく。
【００６７】
リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲまたはＲＴＱ−ＰＣＲとしても知られる）は、ＤＮＡ定量と増幅を同時に行う方法である(Expert Rev. MoI. Diagn. 2005(2):209-19)。ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応により特異的に増幅される。各増幅の後にＤＮＡを定量する。一般的な定量法は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素と相補的ＤＮＡとハイブリダイズした際に蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（プローブと呼ぶ）の使用を含む。
【００６８】
本発明の特定の態様では、本発明の方法の検出工程は核酸シーケンシングの手段により行われる。核酸シーケンシング法の例示的な非限定例はサイクルシーケンシング(Sarkar et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 1269-70)またはサンプルから採取された対象ＤＮＡの一部または全部をシーケンシング反応の鋳型として用いる直接的ジデオキシヌクレオチドシーケンシングである。対象遺伝子またはＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマーセットが標準的なシーケンシング反応で用いられる。ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションのための多くのオリゴヌクレオチドを含有する「チップ」を用いるシーケンシング（例えば、Affymetrix Corp.; Ramsay et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 40-44; Marshall et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 27-31により記載されているものなど）、ＨＰＬＣによるシーケンシング(DeDionisio et al., 1996, J Chromatogr A 735: 191-208)、およびマルチプレックス対立遺伝子特異的診断アッセイ(multiplex allele-specific diagnostic assay)(MASDA; Shuber et al., 1997, Hum. Molec. Genet. 6: 337-47)、ジデオキシフィンガープリント法(Sarkar et al., 1992, Genomics 13: 441-3; Martincic et al., 1996, Oncogene 13: 2039-44)、ならびに蛍光プローブに基づくＰＣＲ法(Taqman; Perkin-Elmer Corp.; Heid et al., 1996, Genome Res. 6: 986-94)および切断に基づく方法などのＤＮＡシーケンシング法の改変法といった他のＤＮＡシーケンシング法も使用可能である。
【００６９】
あるいは、適宜標識されたプライマーを用いて増幅を行うことができ、増幅されたプライマー伸長産物を標識の検出のための手順および器具を用いて検出することができる。好ましくは、本発明のプローブは少なくとも１つの検出可能な部分で標識され、この１または複数の検出可能な部分は、コンジュゲート、分岐検出システム、発色団、蛍光団、スピンラベル、放射性同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび発光化合物からなる群から選択される。本発明の方法において、例示的な非限定例としては、使用プライマーは蛍光団により標識され得る。より詳しくは、本発明の方法のリバースプライマーは、その５’末端において６−ＦＡＭ蛍光団で標識される。この蛍光団は、５２２ｎｍの極大波長で蛍光を発する。例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣまたはＮＥＤ色素のいずれかで標識したプライマーの１つを用いてＰＣＲを行うことができる。
【００７０】
本発明の好ましい態様では、本発明の方法で増幅されたＤＮＡの事後検出および分析は、ＥＰ２０４６９８５に例示されているように、ＧｅｎｅＳｃａｎ技術によって行われる。よって、本発明の方法の検出工程を実施するための例示的な非限定例として、ＰＣＲ反応のアリコート（一般に１μｌ）を９μｌのホルムアミドＨＩ−ＤＩおよび０．２５μｌのＧｅｎｅＳｃａｎマーカー−５００  ＬＩＺサイズ標準品に加える。変性後、サンプルをＡＢＩ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒに入れ、キャピラリー電気泳動を行う。生データを、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウエアを用いて解析する。ＰＣＲ産物はサンプル内サイズ標準品に対する外挿によりサイズ分画されるので、この解析は極めて重要である。この技術を使用すれば、発明者らは極めて正確かつ厳密に対象とする突然変異を検出することができる。
【００７１】
変異型ＤＮＡを検出するために用いる方法とは独立に、ＥＧＦＲ遺伝子の、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対する少なくとも１つの感受性突然変異の核酸配列のコピー数は、検量曲線を用いて決定することができる。用語「検量曲線」とは、前記変異型ＤＮＡのコピー数が定義されたサンプルを用いて、同じ変異型ＤＮＡ検出法を用いて作製された曲線を意味する。よって、患者のサンプルから得られた結果を、前記曲線と比較して前記変異型ＤＮＡの対応するコピー数を決定することができる。
【００７２】
非変異型ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数は、変異型配列のコピー数の決定に関して記載したものと同様の方法を用いて決定することができる。当業者に理解されるように、サンプル中の非変異型ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の決定のために使用されるプローブは、非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の配列を検出するように適合されている。
【００７３】
本発明の特定の態様では、血清または血漿は変異型ＤＮＡの同定および定量のためにそのまま使用してもよい。別の特定の態様では、本発明の最初の工程として血漿または血清から核酸が抽出される。このような場合、前記サンプルから抽出された全ＤＮＡが次の増幅のために好適な有効材料となる。
【００７４】
サンプルが得られれば、核酸の増幅が行われる。特定の態様では、ＤＮＡの増幅はＰＣＲの手段により行われる。ＰＣＲの使用など、核酸の増幅および検出のための一般原則および条件は当業者に周知である。特に、本発明の方法により行われるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、ＥＧＦＲ標的配列を特異的に増幅するのに適当かつ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたは増幅オリゴヌクレオチドを用いる。用語「オリゴヌクレオチドプライマー」または「増幅オリゴヌクレオチド」は、本明細書では相違なく用いられ、一般に１，０００未満の残基を有するポリマー核酸を意味し、下限は約２〜５残基、上限は約５００〜９００残基を有するサイズ範囲のものを含む。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、下限は約５〜約１５残基、上限は約１００〜２００残基を有するサイズ範囲である。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、下限は約１０〜約１５残基、上限は約１７〜１００残基を有するサイズ範囲である。オリゴヌクレオチドプライマーは天然核酸から精製してもよいが、一般には、様々な周知の酵素法または化学法を用いて合成される。本発明の特定の態様では、このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における特異的ヌクレオチドの欠失に相当するＤＮＡ断片の特異的増幅を可能とする。
【００７５】
従って、特定の態様では、本発明の方法は、エキソン１９におけるＥＬＲＥＡ欠失の検出のために使用することができる。好ましい態様では、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における９、１２、１５、１８または２４個のヌクレオチド欠失の検出のための方法に関する。
【００７６】
別の特定の態様では、本発明の方法は、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１におけるＬ８５８Ｒ突然変異の検出のために使用することができる。別の態様では、本発明の方法は、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１におけるＴ７９０Ｍ突然変異の検出のために使用することができる。
【００７７】
用語「増幅オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸またはその相補物とハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドを意味する。増幅オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの３’末端が別の核酸鎖を鋳型として用いて酵素的に伸長されるプライマーおよびプロモーター−プライマーを含む。いくつかの態様では、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（またはその相補鎖）の一領域と相補的な少なくとも約１０の連続する塩基、より好ましくは約１２の連続する塩基を含む。標的結合塩基は、それが結合する配列と好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％〜１００％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは好ましくは約１０〜約６０塩基長であり、修飾ヌクレオチドまたは塩基類似体を含んでもよい。
【００７８】
用語「増幅する」または「増幅」とは、複数コピーの標的核酸配列またはその相補物もしくはその断片（すなわち、増幅産物は完全に満たない標的配列を含み得る）を生産する手法を意味する。例えば、標的核酸の内部の位置とハイブリダイズし、そこから重合が始まる増幅オリゴヌクレオチドを使用して、標的核酸の一部を増幅することによって断片を作製してもよい。既知の増幅法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、レプリカーゼ介在増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写関連または転写介在増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅では、ＤＮＡポリメラーゼ、反対鎖のプライマーおよび複数コピーのＤＮＡまたはｃＤＮＡを合成するためのサーマルサイクリングを使用する。レプリカーゼ介在増幅では、ＲＮＡ配列を増幅するためにＱＢレプリカーゼを使用する。ＬＣＲ増幅では、イブリダイゼーション、連結および変性のサイクルを使用することにより、標的の相補鎖を増幅するために少なくとも４つの異なるオリゴヌクレオチドを使用する。ＳＤＡでは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーと、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れ、その後、一連のプライマー伸長と鎖置換工程を行うエンドヌクレアーゼを使用する。エンドヌクレアーゼニッキングに頼らない等温鎖置換増幅法も知られている。転写関連または転写介在増幅では、プロモーター配列を含むプライマーと、標的配列から複数の転写物を産生し、従って標的配列を増幅するための、プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを使用する。
【００７９】
本発明の好ましい態様は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅において本増幅オリゴヌクレオチドを用いてＥＧＦＲ標的配列を増幅する。当業者ならば、これらの増幅オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼにより媒介されるプライマー伸長を使用する核酸増幅の他の方法に容易に使用できることが分かるであろう。
【００８０】
ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼドメインにおける突然変異を検出するための方法は当技術分野で公知であり、いくつかの対応する診断ツールがＦＤＡにより承認され、市販されており、例えば、非小細胞肺癌患者における上皮細胞増殖因子受容体突然変異の検出のためのアッセイがある(Genzyme Corp.；また、Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 24, No 18S (June 20 Supplement), 2006: Abstract 10060も参照)。好ましい態様では、ＥＧＦＲにおける突然変異は、特異的サソリプローブと増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）との組合せの使用に基づき(Nucleic Acids Res., 1989, 17:2503-2516およびNature Biotechnology, 1999, 17:804-807)、ＷＯ０７０３９７０５号に記載されているように血清サンプルで判定する。
【００８１】
好ましい態様では、ＥＧＦＲの少なくとも１つの感受性突然変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数は、
（ｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異の前記特異的領域に相当する核酸配列を、タンパク質−核酸プローブを用いるＰＣＲの手段により増幅する工程（前記タンパク質−核酸プローブは、ＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識してそれとハイブリダイズし、それによりその増幅を阻害することができる）、および
（ｉｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの感受性突然変異の核酸配列のコピー数を定量する工程
を含んでなる方法により測定される。
【００８２】
さらにより好ましい態様では、ＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識してそれとハイブリダイズし、それにより、その増幅を阻害し得るタンパク質−核酸プローブは、ＷＯ０８００９７４０に記載されているものなど、配列番号３（エキソン１９におけるＥＬＲＥＡ欠失を検出するため）および配列番号１０（エキソン２１におけるＬ８５８Ｒ突然変異を検出するため）からなる群から選択される配列を有する。
【００８３】
増幅工程では、ＥＧＦＲ遺伝子の特異的領域に相当する核酸配列が、タンパク質−核酸（ＰＮＡ）プローブを用いたＰＣＲの手段により増幅される。ＰＮＡプローブは、天然核酸の糖リン酸主鎖が、通常はＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から形成された合成ペプチド主鎖によって置換されて、キラルで非荷電のミミックとなっている核酸類似体である。この新たな分子は化学的に安定であり、加水分解（酵素的）切断に耐性があり、従って、生細胞内では分解されるとは思われない。天然核酸からのこれらの変更にもかかわらず、ＰＮＡはなお、ワトソン−クリック水素結合規則に従ってＤＮＡならびにＲＮＡと配列特異的に結合することができる。そのハイブリッド複合体は驚くべき熱安定性を示し、独特なイオン強度特性を示す。多くの適用で、ＰＮＡプローブは、低塩条件下で脱安定化される核酸／核酸二本鎖とは異なり、ＰＮＡ／核酸二本鎖は極めて低塩の条件下で形成され、安定を維持することから、核酸プローブよりも好ましい。核酸ハイブリダイゼーションの熟練者ならば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを課す、または制御するために慣用される因子として、ホルムアミド濃度（または他の化学変性試薬）、塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨおよびカオトロープの有無が含まれることを認識するであろう。プローブ／標的配列の組合せに最適なストリンジェンシーは、前述のストリンジェンシー因子のいくつかを固定し、次いで、単一のストリンジェンシー因子を変更することの効果を決定するという周知の技術によって見出される場合が多い。ＰＮＡのハイブリダイゼーションがイオン強度にあまり依存しないことを除けば、同じストリンジェンシー因子を調節して、核酸に対するＰＮＡのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御することができる。アッセイに最適なストリンジェンシーは、所望の程度の差が得られるまで各ストリンジェンシー因子を検討することにより、実験的に決定することができる。
【００８４】
ＰＮＡオリゴマーは、ペプチドの標準的固相合成プロトコールに従い、固相支持体として例えば、（メチル−ベンズヒドリル）アミンポリスチレン樹脂を用いて作製することができる(Merrifield, B. 1986. Solid-phase synthesis. Science 232, 341-347)。ＰＮＡは、ＰＮＡオリゴマーがＤＮＡオリゴマーと融合されているＰＮＡ／ＤＮＡキメラなどのキメラ人工物を含んでもよい。
【００８５】
臨床サンプルは、変異型対立遺伝子を有するＤＮＡ分子に加えて、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ分子を含む。従って、通常の条件下では、野生型ＥＧＦＲ遺伝子（野生型対立遺伝子）の大きなバックグラウンド中でＥＧＦＲ突然変異（変異型対立遺伝子）を検出することは困難である。特定の場合で、本発明者らにより利用されるＰＮＡプローブは、野生型ＥＧＦＲ配列を特異的に認識してそれとハイブリダイズすることができる。例示的な非限定例として、本発明の方法を実施するために使用されるＰＮＡプローブは、本発明に付随する実施例で配列番号３または配列番号１０として記載されるＰＮＡプローブを含んでなる。このようなプローブをＰＣＲ反応混合物に加えると、野生型対立遺伝子の増幅が阻害され、サンプル中に存在する変異型対立遺伝子、すなわち、ＥＧＦＲ変異体の増幅に有利となり、その事後検出が容易となる。当業者ならば、好適なＰＮＡプローブは、機能を持たせるためにこれらのプロービング核酸配列を正確に持つ必要はなく、多くの場合では特定のアッセイ条件に応じて変更されることが分かるであろう。例えば、Ｔｍを低くし、かつ／またはストリンジェンシーの調節を行うためにハイブリッドの安定性を改変する必要がある場合には、核酸配列の末端切断によって短いＰＮＡプローブを作製することができる。同様に、ＰＮＡプローブの配列内で核酸配列の識別が保持される限り、核酸配列は、一方の末端を末端切断し、他方の末端を長い状態としてもよい。本明細書に記載のパラメーターの範囲内でのプロービング核酸配列のこのような変更も本発明の態様とみなされる。
【００８６】
用語「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの感受性突然変異の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比」とは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの感受性突然変異の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の関係（割り算）を意味する。
【００８７】
用語「非変異型ＥＧＦＲ遺伝子」とは、ＥＧＦＲタンパク質またはその機能的変異体を分ける遺伝子を意味する。好ましくは、ＥＧＦＲ遺伝子はヒトＥＧＦＲ遺伝子である。
【００８８】
ある突然変異体がチロシンキナーゼ活性に対する感受性を付与するかどうかを判定する方法は従来技術に詳述され、とりわけ、ゲフィチニブ（イレッサ（商標））またはパニツムマブによる処置に応答してＥＧＦＲを過剰発現する細胞において測定されるような、ＥＧＦＲの自己リン酸化能の検出に基づくＷＯ２００６０９１８８９に記載の方法が挙げられる。
【００８９】
第２の工程では、本発明の方法は、第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含む。
【００９０】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数との比の決定は、第１の工程で行ったものと本質的に同様に決定される。
【００９１】
本明細書において「第２の時点は第１の時点より後である」という表現は、患者の監視中の異なる時点に所与の感受性突然変異に関して変異型遺伝子と野生型遺伝子の比を決定することを意味する。好ましくは、第１の測定と第２の測定の間の時間の違いは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年またはより長期である。
【００９２】
好ましい態様では、本方法が適用される患者は、第１の測定が行われる時点および／または第２の測定が行われる時点では、再発症状または病徴を示さない。本明細書において用語「再発症状または病徴を示さない」とは、限定されるものではないが、咳、疼痛、胸部ラジオグラフまたはコンピューター断層撮影法での異常（明らかな塊、縦隔拡張、無気肺（虚脱）、硬化（肺炎）など）を含む、疾患の１以上の臨床的または生化学的特徴が存在しないこと、画像データ（ＩＥ  ＰＥＴスキャン）または胸水による疾患のエビデンスがないことを意味する。
【００９３】
変異型遺伝子の数と野生型遺伝子の数の比が決定されれば、本発明の方法は、それらの比を比較することをさらに含んでなり、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比よりも高ければ陰性臨床応答を示し、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陽性臨床応答を示す。
【００９４】
本明細書においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による処置に関して「陽性応答」という表現は、生理食塩水対照またはプラセボで得られるものよりも実質的に良好な応答を意味する。
【００９５】
本明細書においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による処置に関して「陰性応答」という表現は、生理食塩水対照またはプラセボで得られるものよりも実質的に不良の応答を意味する。
【００９６】
この応答（陽性または陰性）は、限定されるものではないが、（１）減速および完全な成長停止を含む腫瘍成長のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）隣接する末梢器官および／または組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、減少、減速または完全停止）；（５）転移の阻害；（６）腫瘍の退行または拒絶を生じる可能性のある抗腫瘍免疫応答の増強；（７）腫瘍と関連する１以上の症状のある程度の軽減；（８）治療後の生存期間の延長；および／または（９）治療後の一定の時点での死亡率の減少を含む、患者に対して利益を示す任意のエンドポイントを用いて評価することができる。
【００９７】
また、臨床応答は臨床転帰の種々の測定値で表すこともできる。陽性臨床転帰もまた、同等の臨床診断を有する患者集団の転帰に対する個々の転帰の関連において考えることができ、無再発期間（ＲＦＩ）の増加、集団における全生存期間（ＯＳ）と比較した生存時間の増加、無病生存期間（ＤＦＳ）の増加、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の増加などの種々のエンドポイントを用いて評価することができる。陽性臨床応答の可能性の増加は、癌再発の可能性の減少に相当する。
【００９８】
個々の患者の応答は、完全応答、部分的応答、安定疾患および進行性疾患（これらの用語は当技術分野で理解されている）として特性決定することができる。特定の態様では、応答は、病理学的完全応答である。例えば、外科手術または生検時に取り出された組織の検査後に病理学者により決定された病理学的完全応答は一般に、外科的検体に浸潤性腫瘍細胞の組織学的エビデンスがないことを意味する。
【００９９】
陽性または陰性応答はまた、当業者に公知のマーカーを用いて決定することもできる。患者が陽性応答を有するかどうかを決定するために好適なマーカーとしては、限定されるものではないが、ＷＨＯが記載している判定基準(Miller AB. et al., 1981, Cancer 47:207-214)ならびにTherasse P. et al. (J. Natl. Cancer Inst., 2000; 92:205-216)が、またEisenhauer et al. (European Journal of Cancer, 2009, 45:228-247)が記載しているResponse Evaluation Criteria In Solid Tumors (RECIST)の判定基準が挙げられ、これには、
・完全応答（ＣＲ）：総ての標的病巣の消失
・部分的応答（ＰＲ）：ベースライン合計ＬＤを参照として、標的病巣の最大直径（ＬＤ）の合計における少なくとも３０％の減少、
・安定疾患（ＳＤ）：処置開始以来の最小合計ＬＤを参照として、ＰＲに入るほどの十分な退縮がなく、ＰＤに入るほどの十分な増加もない、
・進行性疾患（ＰＤ）：処置開始以来の最小合計ＬＤを参照として、標的病巣のＬＤの合計における少なくとも２０％の増加または１以上の新たな病巣の出現
が含まれる。
【０１００】
本明細書において「第１の時点での比が第２の時点での比よりも高い」という表現は、第２の時点での比の値が第１の時点での比よりも統計学的に高いことを示す。好ましくは、第２の時点での比は、第１の時点での比の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれを超えるものである。
【０１０１】
用語「陰性応答」とは、患者の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が上記のエンドポイントパラメーターに関して陰性結果を有する状況と理解される。
【０１０２】
逆に、本発明の方法において、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比よりも低ければ、陽性臨床転帰を示す。「陽性臨床転帰」とは、患者の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が上記のエンドポイントパラメーターに関して陽性結果を有する状況と理解される。
【０１０３】
好ましい態様では、本発明による方法は、前記第１の時点と第２の時点で、患者の体液において、ＥＧＦＲのＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対する耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することをさらに含んでなり、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば、陰性臨床応答を示す。
【０１０４】
本明細書において用語「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの耐性を付与する突然変異」とは、エルロチニブなどの阻害剤による処置に応答して、野生型タンパク質に対してＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の阻害の低下をもたらす、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける突然変異体を意味する。ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤に対する耐性を付与する突然変異としては、限定されるものではないが、エキソン２０挿入突然変異体Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  ＮＰＧ）、Ｄ７７０＿（ｉｎｓ  ＳＶＱ）およびＤ７７０＿（ｉｎｓ  Ｇ）Ｎ７７１Ｔ、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異およびＤ７６１Ｙ突然変異が挙げられる。好ましい態様では、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異は、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異である。
【０１０５】
ＥＧＦＲ遺伝子に耐性突然変異を有する核酸のコピー数を決定する方法、および前記遺伝子と野生型遺伝子の比を決定する方法は、本質的に感受性突然変異に関して記載した通りである。好ましい態様では、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤に対する耐性を付与する突然変異を含むＥＧＦＲ核酸のコピー数の決定は、結合するＰＮＡプローブの存在下でＲＴ−ＰＣＲにより行われ、このＰＮＡプローブはＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識し、それとハイブリダイズし、それによりその増幅を阻害することができる。好ましい態様では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対する耐性を付与するＥＧＦＲ遺伝子における突然変異の検出は、
（ｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異の前記特異的領域に相当する核酸配列を、タンパク質−核酸プローブを用いるＰＣＲの手段により増幅すること（前記タンパク質−核酸プローブは、ＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識してそれとハイブリダイズし、それによりその増幅を阻害することができる）、および
（ｉｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの耐性突然変異の核酸配列のコピー数を定量すること
により行われる。
【０１０６】
好ましい態様では、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異は、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異である。さらにより好ましい態様では、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対する耐性を示すＥＧＦＲ変異体を生じるＥＧＦＲ遺伝子における耐性突然変異の存在は、ＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異の前記特異的領域に相当する核酸配列を、タンパク質−核酸プローブを用いるＰＣＲ手段により増幅するＰＣＲ増幅（前記タンパク質−核酸プローブは、ＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識し、それとハイブリダイズし、それにより、その増幅を阻害することができる）と、その後に、ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの耐性突然変異の核酸配列のコピー数を定量することにより）により決定される。
【０１０７】
さらにより好ましい態様では、Ｔ７９０Ｍ突然変異の検出に用いるＰＮＡプローブは、配列番号１５の配列を含んでなる。
【０１０８】
本発明の治療法
本発明者らは、驚くべきことに、肺癌に罹患しており、再発の高い確率を示す患者が、前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を付与する突然変異を有するＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の増加を示すことを見出した。この増加は、患者が無症候性を維持している場合や腫瘍関連症状および／または進行の画像エビデンスが現れる前であっても検出され得る。従って、これらの患者は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による処置の候補となる。よって、別の側面では、本発明は、患者において、肺癌の治療に用いられるＥＧＦＲ阻害剤を含んでなる組成物に関し、この場合、該患者は、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなる方法により選択され、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、かつ
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加している。
【０１０９】
「肺癌」、「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に基づく化学療法に対する陽性応答」、「患者」、「第１の時点」、「第２の時点」、「体液」、「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する突然変異」、「第２の時点は第１の時点より後である」という表現は、本発明の第１の方法に関して定義されており、本明細書に記載の治療法にも同じく適用することができる。
【０１１０】
本明細書において「治療する」またはその文法上同等の用語は、治療的利益および／または予防的利益を達成することを意味する。治療的利益とは、治療される、基礎にある傷害の根絶または改善を意味する。また、治療的利益は基礎にある障害に関連する１以上の生理学的症状の根絶または改善を持って達成され、その結果、患者が基礎にある障害になお侵されている場合であっても、その患者において改善が見られる。予防的利益については、これらの組成物は、この疾患の診断がまだなされていなくとも、特定の疾患を発症するリスクのある患者または疾患の１以上の生理学的症状を訴えている患者に投与することができる。
【０１１１】
用語「ＥＧＦＲ阻害剤」は、本発明の第１の方法に関して詳述した。好ましい態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を含んでなる。さらにより好ましい態様では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、二重ＥＧＦＲ阻害剤、二重ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、または耐性突然変異を有するＥＧＦＲに特異的なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の群から選択される。いっそうより好ましい態様では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤はエルロチニブまたはゲフィチニブである。
【０１１２】
次に、チロシンキナーゼ阻害剤を、当技術分野において知られているような患者に投与する。投与経路は、経口、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、くも膜下腔内（Ｉ．Ｔ．）、胸膜内、子宮内、直腸、膣内、局所的、腫瘍内などであり得る。チロシンキナーゼ阻害剤は、注射によるか、または一定時間にわたる点滴により非経口投与することができ、蠕動手段により送達することもできる。
【０１１３】
投与は、経粘膜的手段または経皮的手段によるものでよい。経粘膜的投与または経皮的投与には、バリアの透過に適切な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、当技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜的投与については、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、界面活性剤を使用して浸透を促進してもよい。経粘膜的投与は、例えば、鼻内噴霧によるか、または坐剤を用いて行ってもよい。
【０１１４】
経口投与の場合、チロシンキナーゼ阻害剤は、カプセル、錠剤およびトニックなどの通常の経口投与形に処方する。
【０１１５】
局所投与の場合、医薬組成物（キナーゼ活性阻害剤）を、当技術分野において一般に知られている軟膏、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤に処方する。
【０１１６】
一般に、チロシンキナーゼ阻害剤は、単位用量の投与により経口投与される。本発明の治療組成物に関して用いる場合の用語「単位用量」とは、被験者にとって一回用量として好適な物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルと組み合わせて、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の有効物質を含有する。
【０１１７】
組成物は、投与処方物と適合する方法で、かつ、治療上有効な量で投与される。投与すべき量とタイミングは、治療される被験者、被験者系の有効成分の利用能、および所望の治療効果の程度により異なる。投与する必要のある有効成分の正確な量は、医師の判断により異なり、各個体に特有なものである。
【０１１８】
本発明の方法を実施するのに有用なチロシンキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載されている。当業者に一般に知られているように、意図する使用に好適である有効成分を含有する処方物または薬物送達系を使用することができる。経口、直腸、局所または非経口（吸入、皮下、腹腔内、筋肉内および静脈内を含む）投与に好適な薬学的に許容可能な担体は、当業者に知られている。担体は、処方物の他の成分と適合し、かつ、その受容者に有害ではないという意味で薬学的に許容可能なものである。
【０１１９】
本明細書において用語「薬学的に許容可能」、「生理学上耐用性のある」およびそれらの文法的な変形は、組成物、担体、希釈剤および試薬に関する場合、互換的に使用され、これらの物質が望ましくない生理学的作用を生じることなく哺乳動物に投与することができることを表す。
【０１２０】
非経口投与に好適な処方物は、好都合には、好ましくは受容者の血液と等張である有効化合物の無菌水性製剤を含む。従って、このような処方物は、好都合には、蒸留水、蒸留水中５％のブトウ糖または生理食塩水を含有する。また、有用な処方物には、適当な溶媒で希釈すると上記非経口投与に好適な溶液となる、該化合物を含有する濃縮溶液または個体が含まれる。
【０１２１】
腸内投与の場合、化合物を、カプセル、カシェ剤、錠剤またはトローチ剤などの個別単位の不活性担体に配合することができ、この場合、各個別単位は、所定量の有効化合物を、粉末または顆粒として、または水性液体もしくは非水性液体中の懸濁液もしくは溶液、例えば、シロップ、エリキシル、エマルションまたはドラフトとして含有する。好適な担体は、澱粉または糖であってよく、滑沢剤、矯味矯臭剤、結合剤および同じ性質の他の物質であってもよい。
【０１２２】
錠剤は、場合により１種以上の補助成分とともに、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠剤は、好適な機械で、有効化合物を、流動性形態、例えば、粉末状または顆粒状で、場合により補助成分、例えば、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合して、圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、好適な機械で、粉末状有効化合物と任意の好適な担体との混合物を成形することにより作製することができる。
【０１２３】
シロップまたは懸濁液は、有効化合物を糖、例えば、スクロースの濃縮水溶液に添加（これにまた任意の補助成分を添加してもよい）することにより作製することができる。このような補助成分は、矯味矯臭剤、糖結晶化抑制剤または他の成分の溶解度を高める薬剤、例えば、多価アルコール、例えば、グリセロールまたはソルビトールを含有してもよい。
【０１２４】
直腸投与用処方物は、坐剤基剤用の通常の担体、例えば、カカオ脂またはＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｓ５５（Ｄｙｎａｍｉｔｅ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社の商標、ドイツ）を用いた坐剤として提供してもよい。
【０１２５】
経口投与用処方物は、促進剤とともに提供してもよい。経口的に許容される吸収促進剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、パルミトイルカミチン(palmitoyl camitine)、ラウレス−９、ホスファチジルコリン、シクロデキストリンおよびそれらの誘導体などの界面活性剤；デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムおよびフシジン酸ナトリウムなどの胆汁塩；ＥＤＴＡ、クエン酸およびサリチル酸塩を含むキレート化剤；ならびに脂肪酸（例えば、オレイン酸、ラウリン酸、アシルカミチン、モノおよびジグリセリド）などが挙げられる。他の経口吸収促進剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ＣＨＡＰＳ（３−（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオールプロパンスルホネ−ト）、Ｂｉｇ−ＣＨＡＰＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド）、クロロブタノール、オクトキシノール−９、ベンジルアルコール、フェノール類、クレゾール類およびアルキルアルコール類が挙げられる。本発明にとりわけ好ましい経口吸収促進剤は、ラウリル硫酸ナトリウムである。
【０１２６】
あるいは、チロシンキナーゼ阻害剤は、リポソームまたはミクロスフェア（または微小粒子）で投与してもよい。患者への投与用リポソームおよびミクロスフェアを調製する方法は当業者に周知である。米国特許第４，７８９，７３４号（その内容は引用することにより本明細書の一部とされる）は、生物学的物質をリポソームに封入する方法を記載している。本質的には、物質を水溶液に溶解し、適当なリン脂質および脂質を、必要であれば界面活性剤とともに添加し、必要に応じて透析または音波処理を施す。既知の方法の総説はG. Gregoriadis, Chapter 14,"Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979)により提供される。
【０１２７】
ポリマーまたはタンパク質から形成されたミクロスフェアは、当業者には周知であり、胃腸管を介して直接血流に入るように適合させることができる。あるいは、該化合物を配合し、ミクロスフェアまたはミクロスフェア複合体を埋め込み、数日〜数カ月の範囲の期間にわたって徐放させることもできる。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号、同第４，９２５，６７３号および同第３，６２５，２１４号ならびにJein, TIPS 19:155-157 (1998)（これらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる）参照。
【０１２８】
一態様によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、静脈内投与後に毛細血管床に留まる好適な大きさにしたリポソームまたは微小粒子に処方することができる。リポソームまたは微小粒子が虚血組織の周囲の毛細血管床に留まると、薬剤は最も有効であり得る部位に局所投与することができる。虚血組織を標的とするのに好適なリポソームは一般に約２００ナノメータ未満であり、また典型的には、例えば、「Liposomal targeting of ischemic tissue」と題されたBaldeschweilerの米国特許第５，５９３，６８８号（その内容は、引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているような単ラメラ小胞である。
【０１２９】
好ましい微小粒子は、ポリグリコリド、ポリラクチドおよびそれらの共重合体などの生分解性ポリマーから調製されたものである。当業者ならば、所望の薬物放出速度および所望の用量を含む種々の因子に応じて適当な担体系を容易に決めることができる。
【０１３０】
一態様では、これらの処方物は、カテーテルを介して血管内に直接に投与される。投与は、例えば、カテーテル孔を介して行うことができる。有効化合物の半減期が比較的長い（１日〜１週間またはそれを超える程度）これらの態様では、処方物は、生分解性高分子ヒドロゲル、例えば、Hubbell et al.の米国特許第５，４１０，０１６号に開示されているものに含ませることができる。これらの高分子ヒドロゲルは、組織内腔に送達し、ポリマーが分解するにつれて経時的に有効化合物を放出させることができる。所望により、高分子ヒドロゲルは、そこに分散された有効化合物を含む微小粒子またはリポソームを含むことができ、有効化合物を制御放出するもう１つの機構を提供する。
【０１３１】
処方物は、単位投与形での提供が都合よく、薬学技術で周知の方法のいずれによって調製してもよい。総ての方法は、有効化合物を１種以上の補助成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、処方物は、有効化合物を液状担体または微細固体担体と均一かつ緊密に会合させた後、必要に応じて生成物を成形して所望の単位投与形とすることにより作製される。
【０１３２】
処方物はさらに、医薬処方物の技術分野で利用されている１種以上の任意の補助成分、例えば、希釈剤、緩衝液、矯味矯臭剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、沈殿防止剤、保存剤（酸化防止剤を含む）などを含んでもよい。
【０１３３】
本方法の化合物は、気道への投与のために、噴霧器用の鼻吸入剤もしくはエアゾールもしくは溶液として、または吹送用の超微粒粉末として、単独またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせて提供してもよい。このような場合、有効化合物の粒子は好適には、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、より好ましくは２〜５ミクロンの間の直径を有する。
【０１３４】
一般に、鼻腔投与の場合、弱酸性ｐＨが好ましい。好ましくは、本発明の組成物のｐＨは約３〜５であり、より好ましくは約３．５〜約３．９であり、最も好ましくは３．７である。ｐＨの調整は、塩酸などの適当な酸を添加することにより行われる。
【０１３５】
有効成分を溶解または分散して含有する薬理学的組成物の調製は当技術分野においてよく理解されており、処方に基づいて制限する必要はない。典型的には、このような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製されるが、使用前に液体中で溶液または懸濁液とするのに好適な固体形態を調製することもできる。製剤は、乳化させることもできる。
【０１３６】
有効成分は、薬学上許容され、かつ、有効成分と適合し、本明細書に記載されている治療法に使用するのに好適な量の賦形剤と混合することができる。このような賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せがある。さらに、必要に応じて、組成物は、有効成分の有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含有することができる。
【０１３７】
本発明に従って投与されるチロシンキナーゼ阻害剤は、その成分の薬学的に許容可能な塩を含むことができる。薬学的に許容可能な塩としては、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸などを伴って形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基を伴って形成される）が挙げられる。また、遊離カルボキシル基を伴って形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導することもできる。
【０１３８】
生理学上耐用性のある担体は当技術分野で周知である。液状担体の例として、有効成分および水の他に物質を含有しないか、または生理学的ｐＨ値でのリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水またはそれらの両方、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を含有する無菌水溶液がある。さらにまた、水性担体は、２種以上の緩衝塩と、塩、例えば、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコールおよび他の溶質とを含有することができる。
【０１３９】
液体組成物は、水の他、また、水を除外して液相を含有することもできる。このような付加的液相の例としては、グリセリン、植物油、例えば、綿実油および油中水型エマルションがある。
【０１４０】
チロシンキナーゼ阻害剤が、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ）に基づくものである場合、ｓｉＲＮＡは、in vitro転写などを用いて化学合成し、生成することができる。さらに、ｓｉＲＮＡ分子を、腫瘍に確認される突然変異に正確に対応するように、個々の患者に合わせて特注することができる。ｓｉＲＮＡは、一ヌクレオチドしか異なっていないヌクレオチド配列間を識別することができるので、一ヌクレオチド置換またはいくつかのヌクレオチドの小さな欠失（両方とも本明細書に記載の腫瘍において確認されている）と関連しているＥＧＦＲ遺伝子の突然変異型を特異的に標的とするｓｉＲＮＡを設計することができる。
【０１４１】
腫瘍へのｓｉＲＮＡの送達は、現在入手可能ないくつかの遺伝子送達「ビヒクル」のいずれかにより達成することができる。これらには、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルス、ならびに化学物質介在遺伝子送達系（例えば、リポソーム）、または機械的ＤＮＡ送達系（ＤＮＡ銃）が挙げられる。このような遺伝子発現のｓｉＲＮＡ介在阻害のために発現されるオリゴヌクレオチドは、１８〜２８ヌクレオチド長の間である。
【０１４２】
好ましい態様では、本発明に従って用いられる組成物が患者に投与されるが、その選択は、患者の体液において、ＥＧＦＲのＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対する耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と、患者の体液中の非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することをさらに含み、患者はさらに、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば陰性臨床転帰を示す場合に選択される。さらにより好ましい態様では、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異は、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異である。
【０１４３】
好ましい態様では、患者は進行性肺癌に罹患している。さらにより好ましい態様では、肺癌は非小細胞肺癌である。
【０１４４】
好ましい態様では、本発明に従って用いられる組成物は、前記患者の腫瘍サンプルにおける、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対する耐性を示すＥＧＦＲを生じるＥＧＦＲ遺伝子における突然変異の存在に基づいて選択された患者に投与される。
【０１４５】
好ましい態様では、肺癌に罹患していた患者は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に基づく化学療法に加えて外科手術を受けていた。
【０１４６】
別の好ましい態様では、体液は血清である。
【０１４７】
別の好ましい態様では、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異は、Ｌ８５８Ｒ突然変異およびエキソン１９における（Ｅ）ＬＲＥＡ欠失から選択される。
【０１４８】
別の好ましい態様では、本発明に従って用いられる組成物は、第１の時点および／または第２の時点において再発症状を示さない患者に投与される。さらにより好ましい態様では、再発症状は咳、疼痛またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊である。
【０１４９】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示とみなされ、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１５０】
方法：血清におけるＥＧＦＲ突然変異の監視
血液サンプル
患者から血液（１５ｍＬ）を３本のＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）（血清用に２本、血漿用に１本）に採取した。チューブを２３００ｒｐｍで１０分間２回遠心分離し、上清（血清または血漿）を分取した。０．４ｍＬの血清または血漿から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて標準的な手順によりＤＮＡを精製し、２０μＬの水に再懸濁させた。各患者について、ＤＮＡ抽出と突然変異分析を、２サンプルの血清と２サンプルの血漿の４反復で行った。細胞株ＰＣ−９からのＤＮＡをエキソン１９の変異型対照として、また、エキソン２０および２１の野生型対照として用いた。Ｈ１９７５細胞株からのＤＮＡをエキソン１９の野生型対照として、また、エキソン２０および２１の変異型対照として用いた。
【０１５１】
エキソン１９におけるＥＧＦＲ欠失に関する蛍光標識ＰＣＲ産物のネステッドレングス分析(Nested length analysis)
第１のＰＣＲでは、プライマーを次の通りとした：フォワード5’-GTGCATCGCTGGTAACATCC-3’（配列番号１）およびリバース5’-TGTGGAGATGAGCAGGGTCT-3’（配列番号２）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）：5’-AGATGTTGCTTCTCTTA-3’（配列番号３）。第１のＰＣＲは、２μｌのサンプル、０．１２５μｌのＥｃｏｔａｑポリメラーゼ（Ｅｃｏｇｅｎ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）、２．５μＬのＰＣＲバッファー１０倍、０．６２５μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．７５μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、１．２５ｐｍｏｌの各プライマー（１０μＭ）および１２．５μＬの１０ｍＭ  ＰＮＡプローブを加えて２５μｌ容量で行った。増幅は次の通りとした：９４℃で３０秒、６４℃で３０秒および７２℃で１分の２５サイクル（エキソン１９および２１）、または９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で１分の３５サイクル（エキソン２０）。
【０１５２】
レングス分析では、以下のプライマー：フォワード5’-ACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG-3’（配列番号４）およびリバース5’-FAM-CCACACAGCAAAGCAGAAACTC-3’（配列番号５）を用いて増幅を行った。増幅（３５サイクル）は、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で１分、２μｌのサンプル、０．１μｌのＥｃｏｔａｑポリメラーゼ（Ｅｃｏｇｅｎ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）、２．５μＬのＰＣＲバッファー１０倍、０．６２５μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、１．２５ｐｍｏｌの各プライマー（１０μＭ）および７．５μＬの１０ｍＭ  ＰＮＡプローブを加えて２５μｌ容量で行った。１／２００希釈の各ＰＣＲ産物１μｌを、０．５μｌのサイズ標準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合し、９μｌのホルムアミド中、９０℃で５分間変性させた。分離は４色レーザー誘導蛍光キャピラリー電気泳動システム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。収集したデータは、ＧｅｎｅＳｃａｎ分析ソフトウエア（Ａｐｐｌｅｒａ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で評価した。
【０１５３】
エキソン２０（Ｔ７９０Ｍ）および２１（Ｌ８５８Ｒ）におけるＥＧＦＲ突然変異に関するＴａｑＭａｎアッセイ
プライマーおよびプローブは次の通りとした：エキソン２１（フォワードプライマー5’-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3’（配列番号６）、リバースプライマー5’-TTCTCTTCCGCACCCAGC-3’（配列番号７）；プローブ5’-FAM-CAGATTTTGGGCGGGCCAAAC-TAMRA-3’（配列番号８）；および5’-VIC-TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAAC-TAMRA-3’（配列番号９）、ＰＮＡ：AGTTTGGCCAGCCCA（配列番号１０）ならびにエキソン２０（フォワードプライマー5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’（配列番号１１）、リバースプライマー5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’（配列番号１２）；プローブ5’VIC-CTCATCACGCAGCTCATG-MGB-3’（配列番号１３）；および5’-FAM-CTCATCATGCAGCTCATG-MGB-3’（配列番号１４）、ＰＮＡ：TCATCACGCAGCTC(配列番号１５))。増幅は、１のサンプル、６．２５μｌのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．７５μｌの各プライマー（１０μＭ）、０．２５μＬのプローブ（１０μＭ）および０．６２５μｌのＰＮＡ（１０μＭ）を用いて１２．５μｌ容量で行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７０００リアルタイムサイクラーにてサンプルに９４℃で１５秒および６０℃で１分の５０サイクルを行った。
【０１５４】
計算
エキソン１９については、サンプルは、分析したアリコートのうち少なくとも１つで変異型対立遺伝子のピークが現れれば陽性（突然変異の検出）とみなされる。変異型ピークを示すアリコートの番号を記録する。さらに、別の指標を次のように計算する：変異型ピークの面積（４つのアリコート）／ｗｔ＋変異型ピークの総面積（この場合も４つのアリコート）
エキソン２０については、サンプルは、分析したアリコートのうち少なくとも１つが陽性であれば陽性（突然変異の検出）とみなされる。突然変異が検出されたアリコートの番号を記録する。
【０１５５】
結果
患者ＤＸ２８２（図１）：血清における感受性突然変異の動態（減少）により、放射線学的応答および臨床応答の誘発が予測される。感受性突然変異（ＤＥＬエキソン１９）の割合の増加により、ＣＴスキャンによる肝臓進行の確認前に症状の出現が予想され、相関が見られる。後に、第２選択および第３選択の化学療法の際に耐性突然変異の出現が見られる。
【０１５６】
患者ＤＸ２７１（図２）：Ｔ２およびＴ３における感受性突然変異の動態（増加）は、進行性疾患の放射線学的エビデンスの前に、新たな症状の発現との相関が見られる。さらに、この患者を、感受性突然変異の低下を示し、進行性疾患の誘発とともにその薬剤に対する耐性突然変異の出現を示すＴｏｖｏｋで処置した。ＥＧＦＲの感受性突然変異および耐性突然変異は両方とも、ＣＤＤＰ＋エルロチニブに対する新たな臨床応答とともに減少していく。
【０１５７】
患者ＤＸ１０４（図３）：この場合には、血清におけるＥＧＦＲ突然変異レベルの動態は、初期の短期持続的応答との相関がみられ、進行疾患の誘発を予想する（第２選択および第３選択の化学療法の際にその割合が高まることを注記しておく）。耐性突然変異は検出されなかった。
【０１５８】
患者ＤＸ１３８（図４）；これは感受性患者の例である。ベースラインにおいても療法中（継続中）においても血清においてＥＧＦＲ突然変異は検出されていない。エルロチニブ(Erlotininb)療法下で患者の監視を続けているが、なお応答性である。これは、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤による療法下にある無病患者における追跡調査（疾患の再発に関する）としての試験値の例である。
【０１５９】
患者ＤＸ４８５（図５）；男性６０歳、前喫煙者。診断時は進行性疾患。組織にはＥＧＦＲ突然変異は無かったが、ベースライン時に血清には有り。検出に劇的な減少が見られ、これはＧＦＲ  ＴＫ阻害剤に対する良好な応答と相関する。処置継続中。
【０１６０】
患者ＤＸ３５３（図６）；男性３８歳、非喫煙者。組織にＥＧＦＲ突然変異有り。ベースライン時に血清においては検出できなかった。良好な応答にもかかわらず、皮膚毒性のためにタルセバ（商標）の用量を推奨用量の１日１５０ｍｇから１日５０ｍｇに減らした（患者が他のセンターのその患者を担当する腫瘍学者と合意の上で決定）。血清におけるＥＧＦＲ突然変異の検出は、新たな肺病巣の誘発、すなわち、ＣＥＡ（発癌物質特異的抗原）と相関がある。タルセバの用量は推奨用量に合わせた。血清におけるＥＧＦＲ突然変異の検出の減少は、発現中の応答と相関がある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月4日(2013.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌患者のＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する臨床応答を予測する方法であって、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなり、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、
前記患者が第１の時点および第２の時点で再発症状を有さず、かつ、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陰性臨床応答を示し、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば、前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法に対する前記患者の陽性臨床応答を示す、方法。
【請求項２】
前記第１の時点と第２の時点で、前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することをさらに含んでなり、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加していれば陰性応答を示し、または第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して減少していれば陽性応答を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異が、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が進行性肺癌を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者に第１の時点の前に手術が施されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の時点での患者の腫瘍からの組織サンプルが、チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異に関して陽性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法が、第１の時点の前、または第１の時点と第２の時点の間に開始されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記体液が血清である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、二重ＥＧＦＲ阻害剤、二重ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、または耐性突然変異を有するＥＧＦＲに特異的なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異が、Ｌ８５８Ｒ突然変異およびエキソン１９における（Ｅ）ＬＲＥＡ欠失から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＧＦＲの少なくとも１つの感受性突然変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数が、
（ｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異の前記特異的領域に相当する核酸配列を、タンパク質−核酸プローブを用いるＰＣＲの手段により増幅すること（前記タンパク質−核酸プローブは、ＥＧＦＲ野生型配列を特異的に認識してそれとハイブリダイズし、それによりその増幅を阻害することができる）、
（ｉｉ）ＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１つの感受性突然変異の核酸配列のコピー数を定量すること
により測定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記臨床応答が、無増悪生存、応答、生存、または再発として決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記再発症状が、咳、疼痛、またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
肺癌患者において肺癌の治療に用いるための、ＥＧＦＲ阻害剤を含んでなる組成物であって、前記患者が、
（ｉ）第１の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数の間の比を決定すること、および
（ｉｉ）第２の時点で前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの感受性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することを含んでなる方法により選択され、
前記第２の時点が前記第１の時点より後であり、
前記患者が第１の時点および／または第２の時点で再発症状を有さず、かつ、
第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加している、組成物。
【請求項１８】
前記の患者を選択する方法が、前記第１の時点および第２の時点で、前記患者の体液において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲの耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含むＥＧＦＲ遺伝子の核酸配列のコピー数と非変異型ＥＧＦＲ遺伝子の核酸のコピー数の間の比を決定することをさらに含んでなり、かつ、第２の時点で決定された比が第１の時点で決定された比に対して増加している患者がさらに選択される、請求項１７に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の耐性突然変異が、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異である、請求項１８に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記肺癌が進行性肺癌である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記方法が、第１の時点での腫瘍からの組織サンプルがチロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異に関して陽性であるような患者を選択することをさらに含んでなる、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２３】
前記体液が血清である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
前記ＥＧＦＲ阻害剤に基づく療法がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を含んでなる、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項２４に記載の使用のための組成物。
【請求項２６】
前記チロシンキナーゼ活性阻害剤に対するＥＧＦＲ遺伝子の感受性突然変異が、Ｌ８５８Ｒ突然変異およびエキソン１９における（Ｅ）ＬＲＥＡ欠失から選択される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
前記再発症状が、咳、疼痛、またはＰＥＴ／ＣＴにより観察される腫瘍塊である、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2014505468.tif 000011
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