(57)【要約】  本発明は、抗酸化活性を有する組成物に関する。さらに、本発明は、抗酸化活性を有するプロバイオティクス細菌およびそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bifidobacterium lactis、Lactobacillus acidophilus および Lactobacillus brevisを含む群から選択される種に属し、抗酸化特性を有する少なくとも１種の細菌株を含む混合物を包含する医薬としての使用を目的とする組成物。
【請求項２】
抗酸化特性を有する少なくとも１種の細菌株が、
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３２のBifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666)；
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３３のLactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683)；および
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３４のLactobacillus brevis LBR01 (ID 1685)
から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
酸化ストレスと関係する疾患または障害の、好ましくは、酸化ストレスが薬物の摂取の結果として誘発された場合の、処置における使用のための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Bifidobacterium lactis、Lactobacillus acidophilus および Lactobacillus brevisを含む群から選択される種に属し、抗酸化特性を有する少なくとも１種の細菌株（好ましくは、抗酸化特性を有する少なくとも１種の細菌株は、請求項２に記載の細菌株から選択される）を含む混合物を包含する食品組成物またはサプリメント。
【請求項５】
該組成物が、１ｘ１０６ないし１ｘ１０１１ ＣＦＵ／ｇの混合物、好ましくは、１ｘ１０８ないし１ｘ１０１０ ＣＦＵ／ｇの混合物からなる濃度で細菌を包含し、さらにより好ましくは該組成物が、１用量当たり、１ｘ１０６ないし１ｘ１０１１ ＣＦＵ、好ましくは１ｘ１０８ないし１ｘ１０１０ ＣＦＵからなる濃度で細菌を包含する、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
混合物が、７５℃以下、好ましくは４５ないし６５℃の融点を有し、飽和脂肪酸のモノ−およびジ−グリセリド、飽和脂肪酸および遊離飽和脂肪酸でエステル化されたポリグリセロールから選択される、少なくとも１種の飽和植物性油でコーティングされた細菌を含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
コーティングされた細菌が、オリーブ油、コーン油、ダイズ油、亜麻仁油、ピーナッツ油、ゴマ油、魚油および米油ならびに特にトマト種子油のような他の種子油を含む群から選択される植物由来の油に添加される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が、例えば、セレン、亜鉛、マグネシウム、マンガン、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、リコピン、トマト種子油、ケルセチン、チロソール、レスベラトロール、ヒドロキシチロソール、オレウロペイン、ルテイン、スピルリナ、アルファ−脂肪酸、ω−３不飽和脂肪酸、例えばドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ビルベリー、クランベリーのようなベリー抽出物、スグリの実およびグレープ種子抽出物、緑茶抽出物、サボテン、チョウセンアザミ、パパイヤ、メロン、リンゴ、ホップ、ツバキ、アカツメクサ、エルダーベリー、ローズマリー、ココア、オリーブの葉、松樹皮およびカキ抽出物ならびに１重量％以上のポリフェノールを含む他の植物抽出物（好ましくは、該抽出物は、予め発酵されている）のような抗酸化活性を有する要素または物質をさらに含む、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
酸化ストレス、好ましくは、薬物使用の結果もたらされた酸化ストレスを処置するための医薬の製造を目的とする、Bifidobacterium lactis、Lactobacillus acidophilus および Lactobacillus brevisを含む群から選択される種に属し、抗酸化特性を有する少なくとも１種の細菌株の使用。
【請求項１０】
細菌株が、
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３２のBifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666)；
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３３のLactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683)；および
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３４のLactobacillus brevis LBR01 (ID 1685)
から選択される、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、抗酸化活性を有する組成物に関する。さらに、本発明は、抗酸化活性を有するプロバイオティクス細菌およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての生物は、それらの細胞内の還元環境を維持することが周知である。酸化還元状態の何らかの変化は、過酸化物および遊離ラジカルの産生およびその後の蓄積による毒性作用を引き起こし得る。それは専ら、酸化ストレスに関与するその過剰が、アテローム性動脈硬化症、動脈性高血圧症、パーキンソン病、アルツハイマー病、真性糖尿病、大腸炎、リウマチ性関節炎のような多くのヒトの病状に関係しているよう思われる。
【０００３】
生理的条件下において、正常な細胞代謝中に産生された遊離ラジカルのレベルと、酸化的損傷から組織を保護することが可能な内因性の抗酸化剤のレベルとの間に平衡が存在する。この平衡状態の破壊は、ラジカルの産生増加および抗酸化剤レベルの減少の両方により、結果として我々の細胞の構造および機能の変化の始まりを生じる。細胞は、酵素的および非酵素的性質の両方共の、特定の生体防御反応の存在のおかげで、遊離ラジカルに対する抗酸化作用およびその結果の保護作用を実行する能力を生理的に備えている。
【０００４】
我々の細胞が防衛力を備えているとしても、日常生活の多くの要因がそれを低減させる原因となっている。
【０００５】
例えば、タバコの煙、アルコールおよび薬物の摂取、ならびに電離放射線への過度の無制御な暴露が、細胞の防衛力の減弱に寄与し得ることは周知である。
【０００６】
さらに、我々の身体は、果物、野菜および魚をほとんど含まない偏食と関連する日常生活のために、高抗酸化活性を有するビタミン、ミネラルおよび微量元素の適切な供給を受容できない。
【０００７】
故に、ヒト身体内部の抗酸化活性を実際に維持できる、一定量の特定の抗酸化物質を備えた食事を補うことが必要とされている。特に、酸化ストレスを減らすことに貢献するような方法で、身体へ導入さると、体内に通常存在する抗酸化物質の量を補足することができる組成物が必要とされている。
【０００８】
最後に、酸化ストレスが外部要因によって引き起こされた後に、例えば薬の摂取の後に抗酸化防御を有効に高く維持することができる組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
故に、本発明の主題は添付の特許請求の範囲に記載の特徴を有する組成物である。添付の特許請求の範囲に記載の通り、本発明の主題は、該組成物の使用にさらに関する。本発明の他の好ましい態様は、以下に記載されており、特許請求の範囲の従属項において主張され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、−Ｃ（ベースライン条件下の対照サンプル）、−Ｔ２（ベースライン条件下、本発明のプロバイオティクス細菌１０８用量／日で処理した対照サンプル）、−Ｃ＋ＤＯＸ（ドキソルビシンで処理した対照サンプル）、−Ｔ１＋ＤＯＸ（本発明のプロバイオティクス細菌１０９用量／日およびドキソルビシンで処理したサンプル）、−Ｔ２＋ＤＯＸ（本発明のプロバイオティクス細菌１０８用量／日およびドキソルビシンで処理したサンプル）、および−Ｔ３＋ＤＯＸ（本発明のプロバイオティクス細菌１０７用量／日およびドキソルビシンで処理したサンプル）に関する、総抗酸化活性（ＴＡＡ）値を示すヒストグラムを示す。
【図２】図２は、−Ｃ（ベースライン条件下の対照サンプル）、−Ｔ２（ベースライン条件下、本発明のプロバイオティクス細菌１０８用量／日で処理した対照サンプル）、−Ｃ＋ＤＯＸ（ドキソルビシンで処理した対照サンプル）、−Ｔ１＋ＤＯＸ（本発明のプロバイオティクス細菌１０９用量／日およびドキソルビシンで処理したサンプル）、−Ｔ２＋ＤＯＸ（本発明のプロバイオティクス細菌１０８用量／日およびドキソルビシンで処理したサンプル）、および−Ｔ３＋ＤＯＸ（本発明のプロバイオティクス細菌１０７用量／日およびドキソルビシンで処理したサンプル）に関する、抗酸化能の評価としての、血漿グルタチオン（グルタチオンの抗酸化形態は、還元型グルタチオン、ＧＳＨと称される）の濃度値を示すヒストグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
表１は、本発明の内容に有効な適用を有する微生物群を例として示す。
【００１２】
本発明者らは、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus brevisおよび Bifidobacterium lactisを含む群から選択される種に属する細菌株が、顕著な抗酸化活性を示し、酸化ストレスを低減するための医薬として使用するための組成物に該選択された菌種を使用し得る可能性を検討した後、鋭意研究を行った。有利には、本発明の組成物は、酸化ストレスが薬物療法を受けている対象による薬物摂取の結果として引き起こされる場合に適用される。
【００１３】
好ましい態様において、本発明の組成物は、Lactobacillus acidophilus 種に属する１種またはそれ以上の細菌株、例えば２または３つの細菌株；Lactobacillus brevis種に属する１種またはそれ以上の細菌株、例えば２または３つの細菌株；ならびに、Bifidobacterium lactis種に属する１種またはそれ以上の細菌株、例えば２または３つの細菌株を含む、細菌株の混合物を含み得る。
【００１４】
好ましい態様において、本発明の組成物は、
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３２のBifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666)；および／または、
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３３のLactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683)；および／または
− 2009年10月13日にProbiotical SpA, Novara社（イタリア）とDSMZ社（ドイツ）によって寄託された、寄託番号ＤＳＭ２３０３４のLactobacillus brevis LBR01 (ID 1685)
を含む群から選択される、少なくとも１種の細菌株を含む混合物を含む。
【００１５】
有利には、細菌株の混合物は、Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666)  ＤＳＭ２３０３２、Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683)  ＤＳＭ２３０３３およびLactobacillus brevis LBR01 (ID 1685)  ＤＳＭ２３０３４から構成される。
【００１６】
本明細書中、細菌株は、生細菌または死細菌またはそれらの細胞成分、細胞抽出物および／または不活性化細菌、溶解細菌または透過性細菌の形態であり得る。
【００１７】
本発明の組成物は、食品組成物、例えばシンバイオティクス組成物、または他のサプリメントもしくは医薬組成物であり得る。
【００１８】
好ましい態様において、組成物は、表２に列記した１種またはそれ以上の細菌株をさらに含み得る。
【００１９】
好ましくは、組成物は、表２に列記した細菌株から選択される１種ないし６種の細菌株、さらにより好ましくは、１種ないし３種の細菌株をさらに含み得る。
【００２０】
特に好ましい細菌株は、カラム左に示す番号で同定される表２に列記した細菌株：Ｎｏ．５、Ｎｏ．２０、Ｎｏ．４２、Ｎｏ．４９、Ｎｏ．８０、Ｎｏ．８１、Ｎｏ．９２、Ｎｏ．９３、Ｎｏ．９９、Ｎｏ．１００、およびＮｏ．１０１から選択される。
【００２１】
細菌株Ｎｏ．９９、Ｎｏ．１００、およびＮｏ．１０１は、それらが顕著な抗酸化活性を有するために、特に好ましい。
細菌株Ｎｏ．５およびＮｏ．２０はまた、該細菌株の中でも、抗炎症特性を有する。
細菌株Ｎｏ．４２、Ｎｏ．８０およびＮｏ．８１はまた、感染症、例えばカンジダ感染を含む腸の酵母感染症に有効であり得る。
細菌株Ｎｏ．４９はまた、腸において葉酸を産生し得る。
細菌株Ｎｏ．５、Ｎｏ．９２およびＮｏ．９３はまた、大腸菌に拮抗作用を有し得る。
【００２２】
本明細書に記載および／特許請求した細菌株の全ては、ブタペスト条約に基づき国際寄託されており、所轄寄託機関によって要請に基づき公開され利用可能となっている。
【００２３】
有利には、本発明の組成物は、抗酸化活性、例えば、セレン、亜鉛、マグネシウム、マンガン、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、カロテノイド、リボフラビン、タウリン、Ｌ−カルノシン、アスタキサンチン、リコピン、トマト種子油、ケルセチン、チロソール、レスベラトロール、ヒドロキシチロソール、オレウロペイン、ルテイン、スピルリナ、カプサイシン、プロポリス、朝鮮人参、イチョウ、コエンザイムＱ１０、アルファ−脂肪酸、ω−３不飽和脂肪酸、例えばドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ビルベリー、クランベリーのようなベリー抽出物、スグリの実およびグレープ種子抽出物、緑茶抽出物、サボテン、チョウセンアザミ、パパイヤ、メロン、リンゴ、ホップ、ツバキ、アカツメクサ、エルダーベリー、ローズマリー、ココア、オリーブの葉、松樹皮およびカキ抽出物ならびに１重量％以上のポリフェノールを含む他の植物抽出物のような抗酸化活性を有する要素または物質を含み得る。
【００２４】
有利には、該抽出物は、少なくとも１回の発酵工程により予め発酵されていてよい。本発明の好ましい態様において、発酵パパイヤが使用される。発酵パパイヤは、パパイヤフルーツおよび数種の熱帯ハーブから、酵母（好ましくは、サッカロミセス属の酵母）おより細菌により発酵されて産生および抽出される。発酵パパイヤは、本発明の細菌株の活性である抗酸化活性を増強するだけでなく、遊離ラジカルの還元、脂質過酸化反応の阻害、免疫系の強化、アルカリ化特性、ならびに腸内感染の原因である微生物に対するその結果として起こる防腐作用を有するインビトロおよびインビボの実験系の両方での遷移金属のキレート化をもたらす。
【００２５】
上記の抗酸化活性を有する要素または物質は、最終組成物の重量に対して、０．０００１重量％ないし３０重量％含まれるよう添加され、抗酸化活性を有する物質の濃度および／または定義される推奨栄養摂取量（recommended daily allowance：ＲＤＡ）によって変わる。
【００２６】
セレンは、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸二ナトリウム(sodium selenite)および亜セレン酸水素ナトリウム(sodium acid selenite)の形態、ならびに微生物、例えばセレンに富む酵母の形態で、最終組成物の重量に対して、０．０００５重量％ないし０．００５重量％の量が含まれるように存在し得て、いずれの場合にも、セレンを、好ましくは１０μｇないし１５０μｇ含むのに十分である。
【００２７】
好ましい態様において、本発明の組成物は、１種またはそれ以上の、セレンを取り込み得る細菌株をさらに含む。
【００２８】
特に、本明細書に記載される細菌株は、本発明の抗酸化活性を有する細菌株と関係する、BIOMAN S.r.l.社, Via Alfieri 18, 10100 Turinにより寄託された細菌株、すなわち2004年4月5日にDSMZによって寄託されたLactobacillus buchneri LB26BM(寄託番号 DSM 16341)；2004年1月17日にDSMZにより寄託された、Lactobacillus ferintoshensis LB6BM（寄託番号DSM 16144）；2004年1月17日にDSMZにより寄託された、Lactobacillus reuteri LB2BM（寄託番号DSM 16143）である。
【００２９】
実際に、該細菌株は、培地中に好適なセレン源が存在する状態で増殖したとき、セレンを、とりわけ有機形態で大量に細胞内に蓄積し得る。
【００３０】
グルタチオンは強力な抗酸化剤であり、身体が産生し得るもののうち最も重要な物質の１つである。それは、過酸化水素、亜硝酸塩、硝酸塩、安息香酸および他の物質のような遊離ラジカルおよび分子の両方に対して顕著な作用を有する。それは、溶血を引き起こし得る危険な酸化ストレスから細胞を保護することで、赤血球の重要な作用を行なう。特に、抗酸化形態は、還元型グルタチオン(または、ＧＳＨ)と称される。
【００３１】
好ましい態様において、組成物は、最終組成物の重量に対して、還元型グルタチオンおよびセレンを０．５重量％ないし１０重量％まで含む。
【００３２】
有利には、グルタチオンは経口摂取されたとき部分的に不活性化され得るため、組成物は、硫黄アミノ酸システインおよび／またはＮ−アセチルシステインおよび／またはそれらの混合物を含み得る。
【００３３】
好ましい態様において、本発明の抗酸化細菌株と関連して、特に、顕著な抗酸化活性を有するカロチノイドであるリコピンを豊富に含むトマト種子油が使用される。
【００３４】
本発明の組成物において、細菌株の混合物は、最終組成物の重量に対して、０．５ないし２０重量％、好ましくは２．５ないし８重量％の含有量である。
【００３５】
好ましい態様において、組成物は、少なくとも１種のプレバイオティクス食物繊維および／またはビフィズス菌特異的増殖作用(bifidogenic action)を有する炭水化物、例えば、イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖およびトランスガラクトオリゴ糖（ＧＯＳおよびＴＯＳ）、グルコ−オリゴ糖（ＧＯＳα）、キシロ−オリゴ糖（ＸＯＳ）、キトサンオリゴ糖（ＣＯＳ）、大豆オリゴ糖（ＳＯＳ）、イソマルトース−オリゴ糖（ＩＭＯＳ）、難消化性デンプン、ペクチン、オオバコ種子、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシラン、乳果オリゴ糖、ラクツロース、ラクチトールならびにゴム、アラビアゴム、イナゴマメ、オート麦または竹繊維の種々の他のタイプ、柑橘系繊維、ならびに一般的に、可溶性および不溶性部分を含む繊維を互いに種々の比でさらに含み得る。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、組成物は、上記のうちの１種および／または何れかの相対的割合のその好適な混合物から選択される、少なくとも１種のプレバイオティクス食物繊維を含む。
【００３７】
組成物中に存在するとき、プレバイオティクス食物繊維の量および／またはビフィズス菌特異的増殖作用を有する炭水化物の量は、組成物の全重量に対して、０ないし６０重量％、好ましくは５ないし４５重量％、さらにより好ましくは１０ないし３０重量％包含される。この場合、組成物またはサプリメントは、シンバイオティクス活性および機能的特性を有する。
【００３８】
さらに、食品またはサプリメントの内容はまた、有効成分の種類およびその推奨される日用量によって変わり、定義されるとき、組成物の全重量に対して、ビタミン、ミネラル、生物活性ペプチド、抗酸化活性を有する物質、コレステロール低下剤、血糖低下剤、抗炎症活性剤、抗−甘味剤のような他の有効成分および／または構成成分を、一般的に、０．００１重量％ないし２０重量％、好ましくは０．０１重量％ないし５重量％の量で含む。
【００３９】
例えば、シンバイオティクス組成物、または他のサプリメントまたは医薬組成物である、本発明の食品組成物は、当業者に公知の方法および装置を用いて製造される。
【００４０】
好ましい態様において、組成物は、混合物の１ｘ１０６ないし１ｘ１０１１ ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１ｘ１０８ないし１ｘ１０１０ ＣＦＵ／ｇの濃度で細菌を含む。
【００４１】
好ましい態様において、組成物は、１ｘ１０６ないし１ｘ１０１１ ＣＦＵ／用量、好ましくは１ｘ１０８ないし１ｘ１０１０ ＣＦＵ／用量の濃度で細菌を含む。
【００４２】
用量は、０．２ないし１０ｇ、例えば０．２５ｇ、１ｇ、３ｇ、５ｇまたは７ｇであり得る。
【００４３】
本明細書で用いるプロバイオティクス細菌は、固形、特に粉末、乾燥粉末または凍結乾燥形態であり得る。
【００４４】
好ましい態様において、細菌株の混合物は、Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032、Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 および Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034から選択される少なくとも１種の細菌株をマイクロカプセル化形態で含み、すなわち、該少なくとも１種の細菌株（または３種全ての細菌株）は、少なくとも１種の脂質、好ましくは野菜起源の脂質を含む組成物でコーティングされている。その後、該マイクロカプセル化細菌は、当業者に公知の方法を用いて、油性懸濁液を提供するために、油性液体組成物に添加される。
【００４５】
油性液体組成物に添加される上記の細菌は、マイクロカプセル化された細菌および／または“そのままの”マイクロカプセル化されていない細菌、またはそれらの混合物の形態であり得る。
【００４６】
Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032、Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 および Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034から選択される細菌、好ましくはマイクロカプセル化形態の細菌は、当業者に公知の通常の技術を用いてマイクロカプセル化され得る。例えば、流動床技術（例えば、トップスプレーまたはボトムスプレー法）が使用され得て、そこで、脂質性のコーティング物質が使用され得る。
【００４７】
好ましい態様において、飽和植物性脂肪は、７５℃以下、好ましくは４５ないし６５℃の融点を有するものが使用される。
【００４８】
好ましい態様において、任意の親水性度を有する飽和植物性脂肪が使用され得て、それらは、飽和脂肪酸のモノ−およびジ−グリセリド、飽和脂肪酸および遊離飽和脂肪酸でエステル化されたポリグリセロールから選択され得る。
【００４９】
例えば、ジステアリン酸ポリグリセリル（商品名  Plurol Stearique WL 1009）、パルミトステアリン酸グリセリン（商品名  Precirol Ato 5）、飽和脂肪酸（商品名  Revel C）または非ラウリン酸源の硬化植物性脂肪が使用され得る。
【００５０】
好ましい態様において、凍結乾燥微生物とそれをコートする脂質含有物質の重量比は、５０：５０または４０：６０である。
【００５１】
第一態様において、硬化パーム脂肪（Ｔｍ＝６０℃）およびジパルミトステアリン酸グリセロール（Ｔｍ＝５７−６０℃）から選択される２種の脂質は、凍結乾燥細菌(lyophilate)上に連続して噴霧され、すなわち、凍結乾燥細菌に対し、硬化パーム脂肪による第１のコーティングと、ジパルミトステアリン酸グリセロールによる第２のコーティングの２層被膜が、互いに３：１の比で塗布される。セル（cell）を二層コーティングすることで、細菌をよりしっかりと周囲環境から密閉でき、外部と連通する細孔（pore）のない連続した膜を作製する。しかしながら、この外層部（wrapper）は、腸の段階で開放されて、細菌を放出させコロニーを形成させなければならない。選択される脂質は、実際、酸性ｐＨに対し抵抗性であるため、コーティングは、胃中では無傷のままであるが、腸を通過中にコーティングに穴を形成できるように、わずかな塩基性ｐＨに対してさえも感受性である。
【００５２】
好ましい態様において、本発明の組成物は、上記のコーティングされた乳細菌を含む油性組成物である。該組成物は、当業者に公知の方法に従い製造される。
【００５３】
実際には、一定量の油を撹拌および加熱手段を具備する容器に入れる。次いで、塊および凝集体の形成を避けるために撹拌しながら、固形の被覆プロバイオティクス細菌を徐々に添加する。細菌の添加の完了後、要すれば、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３５℃の間の温度まで穏やかに加熱しながら、油性懸濁液を１〜３０分間撹拌し続ける。
【００５４】
得られる組成物は、油性懸濁液と同様である。組成物は、組成物の総重量と比較して３０重量％以内、０．０５重量％ないし２０重量％の細菌を含み、好ましくは、懸濁液の総重量に対して０．５重量％ないし１０重量％、より好ましくは１．５重量％ないし５重量％の細菌を含む。
【００５５】
組成物は、小児対象に投与するのに適する少なくとも１種の食用油を含み、オリーブ油、コーン油、ダイズ油、亜麻仁油、ピーナッツ油、ゴマ油、魚油および米油ならびにそれらの以外の種子油(特に、トマト種子油が使用され得る)を含む群から選択される。
【００５６】
該油は、個別に、または好適な混合物として適当な重量比で共に使用され得る。
有利には、該油は生物学グレードであり、調製時に、精製工程および／またはコールドプレス（cold pressing）工程が含まれ得る。
【００５７】
組成物は、少なくとも１種の油を含み、その量は、懸濁液の総重量に対して７０重量％以上、好ましくは７５重量％ないし９５重量％、有利には少なくとも９０重量％である。
【００５８】
有利には、組成物は、オリーブ油のみ、またはコーン油および／またはダイズ油および／または亜麻仁油および／またはトマト種子油と混合したオリーブ油を含有する。有利には、オリーブ油は、エキストラバージンオイルであり、生物学グレードである。
【００５９】
好ましい態様において、組成物は、シリカ、二酸化ケイ素、シリカゲル、コロイド状シリカ、沈殿シリカ、サイロイド（ｓｙｌｏｉｄ（登録商標））２４４、タルク、ケイ酸マグネシウム、酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、レシチン、モノステアリン酸グリセリルのようなモノ−またはジ−グリセリド、モノオレイン酸グリセリル、プルロール（ｐｌｕｒｏｌ）−オレイン酸、デンプン、加工デンプン、コンニャクガム、キサンタンガム、ジェランガムおよびカラギナンを含む群から選択される、少なくとも１種の微粉化した食用化合物をさらに含む。
【００６０】
該物質は、組成物の総重量に対して０．１重量％ないし１５重量％、好ましくは５重量％ないし１０重量の量で存在する。
【００６１】
この場合、調製工程では、一定量の油に、撹拌下で、微粉化した食用化合物、例えば二酸化ケイ素を加える。その後、該物質を含む油を、完全に溶解するまで、撹拌しながら約６０℃に加熱する。
【００６２】
あるいは、二酸化ケイ素は冷却して添加することも可能であるが、溶解にかかる時間がより長くなる。その後、組成物を６０℃から室温まで冷却させる。次いで、凍結乾燥細菌を秤量して、完全かつ均一な分散体が得られるまで、懸濁液に撹拌しながら添加する。得られる組成物は、油性懸濁液と同様である。
【実施例】
【００６３】
本発明の好ましい組成物の例を表３に示す（実施例１−４）。
実施例１−４は、本発明の非限定的な例を単に記載するものであり、３０日の処置期間に適する油性懸濁液の容量が考慮される。示される生菌数は生細胞数(ＢＬＮ)で表され、故に３０回分を意味する。製造時に、実施例１および２において１．５億／株および実施例３および４において２．５億／株の単一用量が提供され得る。
【００６４】
本発明者らは、より短い処置期間に適する、異なる容量、例えば５ｍｌの油性懸濁液が使用可能であることを見出した。
【００６５】
好ましい態様において、油性懸濁液はさらに、懸濁液の総重量と比較して、イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖およびトランスガラクトオリゴ糖（ＧＯＳおよびＴＯＳ）、グルコオリゴ糖（ＧＯＳα）、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）、キトサンオリゴ糖（ＣＯＳ）、ダイズオリゴ糖（ＳＯＳ）、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯＳ）、マルトデキストリン、難消化性デンプン、ペクチン、オオバコ（ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシラン、ラクトスクロース、ラクツロース、ラクチトール、アカシアファイバー、カルーバ（ｃａｒｒｕｂａ）ファイバー、オーツファイバー、竹繊維およびシトラスファイバーから選択される、少なくとも１種のプレバイオティックファイバーおよび／または少なくとも１種のビフィズス菌炭水化物を０．５ないし２５重量％の量で含み得る。
【００６６】
プレバイオティックファイバーおよび炭水化物は、二重機能を有する。第１に、プレバイオティクス効果を提供する。第２に、増粘剤および安定剤としての技術的効果を提供する。
【００６７】
有利には、該少なくとも１種のファイバーおよび該少なくとも１種の炭水化物は、グルコオリゴ糖（ＧＯＳα）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリンおよび／またはマルトデキストリンのなかから選択される。懸濁液は、７５℃以下の融点、好ましくは４５ないし６５℃の融点を有する少なくとも１種の脂質を用いてマイクロカプセル化された微生物の細菌株を含む。
【００６８】
懸濁液は、例えば、小児対象における腸疝痛のような腸内の障害の処置のための医薬としての使用が記載される。
【００６９】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、サシェ剤に製剤化される。表４は実施例５−８を示す。
【００７０】
実施例６において、Lactobacillus buchneri LB26BM (DSM 16341) 株は、セレニウムメチオニンおよびセレニウムシステインの形態で細胞内に蓄積される５０μｇ／ｇのセレンを含む。故に、１グラムは、該エレメントのＲＤＡの９０％を提供することができる。
【００７１】
実施例７において、組成物は、B. lactis BS05 (DSM 23032)株と共に相乗的に作用する３グラムの発酵パパイヤを含む。
【００７２】
以下に、細菌株Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032、Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033およびLactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034の培養条件を記載する。該条件は、他に特記しない限り、全ての細菌株に使用される。
ｉ）用いる培地：ＴＰＹブロス＋DSM 23032についてＣｙｓ ＨＣｌ ０．５ｇ／ｌ、およびDSM 23033およびDSM 23034についてDifco MRS ref. 288130。
ｉｉ）滅菌前の培地のｐＨ：DSM 23032についてｐＨ７．１０、およびDSM 23033およびDSM 23034についてｐＨ７．００。
ｉｉｉ）滅菌：１２１℃で１５分。
ｉｖ）滅菌後の培地のｐＨ：DSM 23032についてｐＨ６．６０、およびDSM 23033およびDSM 23034についてｐＨ６．５０。
ｖ）酸素との関係：DSM 23032について絶対嫌気性細菌、およびDSM 23033およびDSM 23034について、任意に嫌気性または微好気性の細菌。
ｖｉ）インキュベーション温度：３７℃。
ｖｉｉ）インキュベーション時間：DSM 23032について１７時間、およびDSM 23033およびDSM 23034について１５時間。
ｖｉｉｉ）短期間貯蔵温度：５℃．
ｉｘ）トランスファー時間：２日。
ｘ）長期貯蔵温度：−２５℃。
ｘｉ）生存率を試験するための条件：DSM 23032について、ＴＰＹブロス中で３７℃にて一晩または十分な濁度に達するまで増殖させ、DSM 23033およびDSM 23034について、ＭＲＳブロス中で３７℃にて一晩増殖させる。
ｘｉｉ）記述的事項：DSM 23032の場合、種々の形状の桿状体、グラム陽性菌、酸性度の急速でない形成、胞子形成なし、嫌気性、グルコース排出の低下、フルクトース−６−ホスフェート  ホスホケトラーゼ経路経由でのみのグルコースの分解；球形の、１本鎖または鎖状の桿状体、３７℃で良好に増殖、およびDSM 23033について絶対同種発酵性細菌、DSM 23034について絶対異種発酵性細菌。
【００７３】
実験部分
本発明者らは、抗酸化活性を有する１種またはそれ以上の微生物を同定することを目的として、多数のプロバイオティクス細菌の大規模スクリーニングを行った。
【００７４】
第一スクリーニング活性を、一連のインビトロ試験にて行った。特に、全細胞および細胞抽出物の両方の総抗酸化活性（ＴＡＡ）を評価した。
【００７５】
全細胞の場合、可能性のある抗酸化活性を２種の試験方法を用いて調べた。
−アスコルビン酸の自動酸化  ＡＡ％
−リノレン酸の酸化  ＬＡ％。
【００７６】
両試験は、酸化からアスコルビン酸またはリノレン酸を保護するために、全細胞として用いて、細菌株の能力を定量化する。
【００７７】
詳細には、アスコルビン酸の自動酸化の動力学は、デヒドロアスコルビン酸の存在を２６５ｎｍにて分光光度法で記録して決定され、故に、該自動酸化反応を阻害する能力として評価される抗酸化力の一つの指標を提供し得る。
【００７８】
代わりに、リノレン酸の過酸化反応を阻害する細菌株の能力をモニターするために、チオバルビツール酸アッセイを用いた。実際、リノレン酸の酸化は、異なるラジカル種の形成をもたらす自己触媒鎖をもたらす。ラジカル種の分解生成物の１種はマロンアルデヒドであり、それは、該酸と反応して、５３４ｎｍにて分光光度法で決定され得る赤色発色複合体を形成し得るため、チオバルビツール酸アッセイにおける酸化ストレスの指標として使用され得る。
【００７９】
代わりに、細胞抽出物を用いて行なわれた研究は、以下の試験を含んだ。
−Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）等価抗酸化能（ＴＥＡＣ）％測定
−グルタチオン（ＧＳＨ）ｎｍｏｌｅ／ｍｇ
−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）Ｕ／ｍｇ。
【００８０】
第一の試験は、抗酸化分子と陽イオンラジカル ＡＢＴＳ・＋（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート））の反応に基づく。
【００８１】
このラジカルは還元され得て、結果として吸光度が減少し、酸化剤からのスカベンジャー能が７３４ｎｍにて分光光度法的に測定され得る。試験は、３７℃で行われ、結果は、分析下の物質の１ｍＭ溶液の抗酸化能と同程度の抗酸化能を有するＴｒｏｌｏｘ（登録商標）溶液のミリモル濃度で定義するために、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）（合成抗酸化剤、水溶性ビタミンＥ類縁体）との比較により得られた（ＴＥＡＣ）。
【００８２】
第２および第３試験は、単一の細菌株が生成可能な還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酵素スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の濃度を測定する。両分子は、抗酸化活性を有することが公知である。
【００８３】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の活性は、エピネフリンエピネフリン（４−［１−ヒドロキシ−２−（メチルアミノ）−エチル］−１，２−ベンゼンジオール）の酸化の酵素阻害の原理を利用した分光光度法によって決定される。Ｏ２による酸化が、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の生成と共にアルカリ性ｐＨで起こり、それは、溶液中に蓄積することにより、エピネフリンのアドレノクローム（３−ヒドロキシ−１−メチル−５，６−インドリンジオン）という反応経路が吸収度の測定に基づいてモニターされることを可能にする色の付いた化合物への変換を促進する。
【００８４】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の存在は、Ｏ２イオンを除去し、アドレノクロームの形成速度および量を低減させる。酸化の阻害％は、ＳＯＤ濃度の双曲線関数である。
【００８５】
グルタチオンの定量分析は、エルマンの酵素反応を利用する分光光度法を用いて行なわれ得る。グルタチオン（ＧＳＨ）のスルフヒドリル基（sulphidrilic）は５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応して、黄色の化合物５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成する。同時に、酸化型グルタチオンは、グルタチオンレダクターゼにより再び還元されて、ＴＮＢのさらなる形成をもたらす。ＴＮＢの形成速度は、細胞抽出液中に存在するタンパク質１ｍｇ当たりのナノモルとして表される、総ＧＳＨ濃度に正比例する。
【００８６】
結果を表１に示す。
表１から、細菌株が、全細胞および細胞抽出物の両方で観察される、顕著な抗酸化活性を有することが推論され得る。
【００８７】
次いで、インビボモデルにおける本発明の細菌株の細菌株を確認するために、本発明者らは動物実験を行った。
特に、該実験を、４８匹の健康な成熟ウィスターラット(Harlan, Milano, Italy)のサンプル個体群を用いて行い、それらは７日間の間、標準餌を与えられた。
【００８８】
次いで、該４８匹のラットを以下の群に分けた。
−グループＣ：プロバイオティクス不含有の標準餌のみを１８日間与えられた２０匹のラットを含む対照群。
−グループＴ１：１：１：１の重量比で細菌株Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032、Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033およびLactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034を含む細菌混合物（簡略にするために、以下、Ｍと示す）を１ｘ１０９ＣＦＵ／日の濃度で添加した餌を１８日間与えた７匹のラットを含む実験群。詳しくは、上記のプロバイオティクス細菌株は、合計１ｘ１０９ＣＦＵが、単一の動物に毎日平均量で摂取されるように存在するような濃度でラットの餌に混合された。
−グループＴ２：上記のＭ混合物を１ｘ１０８ＣＦＵ／日の濃度で添加した餌を１８日間与えられた１４匹のラットを含む実験群。
−グループＴ３：上記のＭ混合物を１ｘ１０７ＣＦＵ／日の濃度で添加した餌を１８日間与えられた７匹のラットを含む実験群。
【００８９】
１８日目の最終に、グループＣおよびグループＴ２のラットを、それぞれ１０匹毎および７匹毎のラットにさらに下位群に分けた：一方の下位群（ＣｆおよびＴ２ｆ）には生理食塩を注射し、他方の群には、強力な酸化ストレスを誘導し得る酸化促進活性を有する抗腫瘍薬であるドキソルビシン溶液（略して、ＤＯＸ）を体重１ｇあたり２０μｇ注射した（ＣＤＯＸおよびＴ２ＤＯＸ）。グループＴ１およびＴ３の全てのラットに、同じ用量のドキソルビシンを注射した（Ｔ１ＤＯＸおよびＴ３ＤＯＸ）。
【００９０】
次いで、ラットを生理食塩水またはＤＯＸの注射後２４時間以内に殺した。その後、血漿サンプルを、インビトロでの総抗酸化活性（ＴＡＡ）および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを定量するために、採取した（図１および２）。
【００９１】
ＣＤＯＸおよびＴ１ＤＯＸ、Ｔ２ＤＯＸおよびＴ３ＤＯＸを比較することにより、ドキソルビシンにより誘導される酸化ストレスに対するプロバイオティクス混合物の可能な保護を評価し、また、投与される生細胞数による用量−反応関係を明らかにすることができる。
【００９２】
ＣｆとＴ２ｆとの比較は、生理学的条件下の、故にドキソルビシンによって誘導された酸化ストレスのない、プロバイオティクス細菌株によって誘導された抗酸化活性における可能性のある増加を明らかにし可能な増加を明らかにする。
【００９３】
図１および２(それぞれ、総抗酸化活性、ＴＡＡおよび血漿グルタチオン)において、酸化ストレス(対照群ＣＤＯＸとグループＴ１ＤＯＸ、Ｔ２ＤＯＸおよびＴ３ＤＯＸとの差異)の場合におけるプロバイオティクスでの処理の影響を、ＤＯＸを受容した全てのラットを比較して、ＡＮＯＶＡ統計分析によって評価した。ドキソルビシン投与の影響を、ＡＮＯＶＡ試験(Tukey postテストを用いて)によって評価し、ＤＯＸで処理した群およびベースライン対照(Ｃｆ)のすべての比較により評価した。対照群(Ｃｆ)とベースライン条件下のプロバイオティクスで処理された群(Ｔ２ｆ)との差異を、スチューデントt検定で評価した。
【００９４】
図１から、ベースライン条件下（ＣおよびＴ２）では、プロバイオティクスでの処理がＴＡＡを改変しないことが観察され得る（有意差なし、ｎ．ｓ．）。プロバイオティクスで処理されなかったラットにおいて、ＤＯＸの投与は、ベースライン値と比較してＴＡＡの顕著な低下をもたらす（ｔ検定、ｐ＜０．００１）。同様に、プロバイオティクスで処理されたラットにおいて、ＤＯＸの投与は、ベースライン値（Ｃｆ）と比較してＴＡＡの低下をもたらすが、高濃度のプロバイオティクスでの処理において（Ｔ１およびＴ２）、その低下はより小さい（ｔ検定、ｐ＜０．０２）。低濃度のプロバイオティクスで処理されたラット（Ｔ３）において、ＤＯＸの投与後、ＴＡＡの低下がより顕著である（ｔ検定、ｐ＜０．００１）。ＤＯＸで処理した群間の相違は、有意である（ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０５）。
【００９５】
図２において、ＧＳＨの濃度を、抗酸化能力の基準として用いる。酸化ストレス下、ＧＳＨのレベルは低下する。
Ｃ  対  Ｔ２：ｔ検定  ｐ＞０．０５（統計的に有意ではない、ｎ．ｓ．）。
ＣとＤＯＸで処理した全ての群とを比較するＡＮＯＶＡ試験：  ｐ＜０．００１。
Post test (Tukey)：
Ｃ  対  Ｃ＋ＤＯＸ  ｐ＜０．００１
Ｃ  対  Ｔ１＋ＤＯＸ  ｎ．ｓ．
Ｃ  対  Ｔ２＋ＤＯＸ  ｐ＜０．０５
Ｃ  対  Ｔ３＋ＤＯＸ  ｐ＜０．０１。
【００９６】
図２は、ベースライン条件下では、対象ラットとＭ混合物で処理されたラットとに違いがないことを示す。対照ラットにおいて、酸化ストレスは、ＧＳＨ濃度の大きな減少をもたらす（ｐ＜０．００１）。最も高い濃度でＭ混合物で処理されたラット（Ｔ１）では、ＤＯＸの投与は、ＧＳＨのレベルの顕著な減少をもたらさない（ｎ．ｓ．）。Ｍ混合物の中間用量で処理されたラットでは、減少がベースライン対照と比較して観察されるが、統計的有意差はより低い（ｐ＜０．０５）。最小用量でプロバイオティクスで処理されたラットでは、ＧＳＨレベルの減少はさらに明らかである（ｐ＜０．０１）。ＤＯＸで処理された種々の群における相違は有意である（ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０５）。
【００９７】
全ての上記のデータは、３種のプロバイオティクス細菌株の混合物（Ｍ混合物）の投与が、酸化促進作用を有する抗新生物薬であるドキソルビシン注射により誘導される酸化ストレスを低減し得ることを示す（図１参照、Ｃ＋ＤＯＸとＴ１＋ＤＯＸとの比較）。
【００９８】
酸化ストレスを、血漿レベルでの総抗酸化活性の減少および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の減少の両方で評価した。グルタチオンは、酸化ストレスに対抗し、血漿中に存在する遊離ラジカルを中和し得る重要な分子である。
【００９９】
最も興味深い比較が、グループＣ＋ＤＯＸ（対照グループ、プロバイオティクス処理なし＋１８日後のドキソルビシン注入あり）とＴ１＋ＤＯＸ／Ｔ２＋ＤＯＸグループ（それぞれ１０９および１０８ＣＦＵ／日のプロバイオティクスで処理されたグループ、１８日後にドキソルビシン注入あり）との比較である。最低濃度のプロバイオティクス、すなわち１０７ＣＦＵ／日（グループＴ３）は、ドキソルビシンにより誘導された酸化ストレスを低減する際により限られた有用性であることが示された。
【０１００】
いずれにせよ、本発明者らは、ラットにおける１０８ＣＦＵ／日の濃度が、ヒトで常用される量（１０１０−１０１１ＣＦＵ／日）の代表例であり得ると考える。
【０１０１】
【表１】
2014508186.tif 000002
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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