(57)【要約】  本発明は、抗凝固薬、特にダビガトランに対する抗体分子、及びこのような抗凝固薬の解毒剤としてのそれらの使用に関する。
2014515740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダビガトランに対する抗体分子であって、配列番号１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、及び６７からなる群より選択されるＣＤＲ１、配列番号２、８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、及び６８からなる群より選択されるＣＤＲ２、並びに配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、及び６３からなる群より選択されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、及び６４からなる群より選択されるＣＤＲ１、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、及び６５からなる群より選択されるＣＤＲ２、並びに配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、及び６９からなる群より選択されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、抗体分子。
【請求項２】
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２及び配列番号９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２及び配列番号１２のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項４】
配列番号１３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２及び配列番号１５のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１６のＣＤＲ１、配列番号１７のＣＤＲ２及び配列番号１８のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項５】
配列番号１９のＣＤＲ１、配列番号２０のＣＤＲ２及び配列番号２１のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２及び配列番号２４のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項６】
配列番号２５のＣＤＲ１、配列番号２６のＣＤＲ２及び配列番号２７のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２及び配列番号３０のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項７】
配列番号３１のＣＤＲ１、配列番号３２のＣＤＲ２及び配列番号３３のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号３４のＣＤＲ１、配列番号３５のＣＤＲ２及び配列番号３６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項８】
配列番号３７のＣＤＲ１、配列番号３８のＣＤＲ２及び配列番号３９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４０のＣＤＲ１、配列番号４１のＣＤＲ２及び配列番号４２のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項９】
配列番号４３のＣＤＲ１、配列番号４４のＣＤＲ２及び配列番号４５のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４６のＣＤＲ１、配列番号４７のＣＤＲ２及び配列番号４８のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１０】
配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号５２のＣＤＲ１、配列番号５３のＣＤＲ２及び配列番号５４のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１１】
配列番号５５のＣＤＲ１、配列番号５６のＣＤＲ２及び配列番号５７のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のＣＤＲ２及び配列番号６０のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１２】
配列番号６１のＣＤＲ１、配列番号６２のＣＤＲ２及び配列番号６３のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６４のＣＤＲ１、配列番号６５のＣＤＲ２及び配列番号６６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１３】
配列番号６７のＣＤＲ１、配列番号６８のＣＤＲ２及び配列番号９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６４のＣＤＲ１、配列番号６５のＣＤＲ２及び配列番号６９のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１４】
配列番号７０の重鎖可変ドメインと、配列番号７１の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１５】
配列番号７２の重鎖可変ドメインと、配列番号７３の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１６】
配列番号７４の重鎖可変ドメインと、配列番号７５の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１７】
配列番号７６の重鎖可変ドメインと、配列番号７７の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１８】
配列番号７８の重鎖可変ドメインと、配列番号７９の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項１９】
配列番号８０の重鎖可変ドメインと、配列番号８１の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２０】
配列番号８２の重鎖可変ドメインと、配列番号８３の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２１】
配列番号８４の重鎖可変ドメインと、配列番号８５の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２２】
配列番号８６の重鎖可変ドメインと、配列番号８７の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２３】
配列番号８８の重鎖可変ドメインと、配列番号８９の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２４】
配列番号９０の重鎖可変ドメインと、配列番号９１の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２５】
配列番号９２の重鎖可変ドメインと、配列番号９３の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２６】
配列番号９２の重鎖可変ドメインと、配列番号９４の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項２７】
軽鎖可変ドメインが配列番号９７の定常ドメインに融合されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２８】
重鎖可変ドメインが配列番号９８の定常ドメインに融合されている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２９】
配列番号９５の重鎖と、配列番号９６の軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３０】
配列番号９９の重鎖と、配列番号１００の軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３１】
配列番号９９の重鎖と、配列番号１０１の軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３２】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、特に一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディ、又は設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３３】
医薬に使用するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３４】
抗凝固治療の副作用の治療若しくは予防に使用するための、及び／又は抗凝固薬の過剰投与をリバースするための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３５】
副作用が出血事象である、請求項３４に記載の抗体分子。
【請求項３６】
抗凝固治療の副作用、又は抗凝固治療での過剰投与事象を処置又は予防する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体分子の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体分子を製造する方法であって、
（ａ）発現コントロール配列と機能的に結合した前記抗体分子をコードする１つ以上の核酸を含むホスト細胞を提供すること、
（ｂ）前記ホスト細胞を培養すること、及び
（ｃ）細胞培養物から抗体分子を回収すること
を含む、方法。
【請求項３８】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体又はその医薬組成物を含む、キット。
【請求項３９】
（ａ）請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体又はその医薬組成物；
（ｂ）容器；及び
（ｃ）ラベル
を含む、キット。
【請求項４０】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体、及びダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩を含む、キット。
【請求項４１】
ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和又は部分的に中和するための方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体又はその医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４２】
患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和又は部分的に中和するための方法であって：
（ａ）患者がダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されていたこと、及び患者によって取り込まれた量を確認すること；
（ｂ）凝固若しくは血液凝固の試験又はアッセイを行う前に、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体でダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和すること、ここでダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドは試験又はアッセイの結果の正確な読み出しを妨害するであろう；
（ｃ）患者から採取されたサンプルで凝固若しくは血液凝固の試験又はアッセイを行って、ダビガトランもダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドも存在しない場合の血餅形成レベルを測定すること；並びに
（ｄ）患者における血餅形成と分解との間の適切なバランスを達成するために、患者に投与されるダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩の量を調整すること
を含む、方法。
【請求項４３】
ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者の血漿中のダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの濃度を低下させるための方法であって、患者におけるダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項４４】
ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの抗凝固作用をリバースする方法であって、患者におけるダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤を投与する工程を含み、ここで患者が致死的と考えられる大量出血をしているか、若しくは血行動態の悪化に向かっているか、又は患者が緊急の医療措置を必要としている、方法。
【請求項４５】
凝固能力障害又は外傷により出血を経験しているか、又は出血のリスクがある患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性をリバース又は低下させるための方法であって、
（ａ）患者の中に存在するダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの量を測定する工程；
（ｂ）患者において測定されたダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性をリバース又は低下させるのに有効な量の薬剤を投与する工程；及び
（ｃ）患者のトロンビン凝固時間をモニタリングして、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性のリバース又は低下が達成されたことを確認する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
リバース剤がダビガトランに対する抗体分子である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者において使用するための、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤であって、患者が致死的と考えられる大量出血をしているか、若しくは血行動態の悪化に向かっているか、又は患者が緊急の医療措置を必要としている、リバース剤。
【請求項４８】
ダビガトランに対する抗体分子である、請求項４７に記載のリバース剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、特に抗凝固治療の分野に関する。
【０００２】
背景の情報
抗凝固薬は、血液凝固を防止する物質である；すなわち、抗凝固薬は、血液が凝固するのを妨げる。抗凝固薬は、血栓性障害のための薬物療法としてのヒトの治療、例えば易罹患者における深部静脈血栓、肺塞栓、心筋梗塞及び脳卒中の一次予防並びに二次予防に広く使用されている。
【０００３】
重要なクラスの経口抗凝固薬、例えばワルファリンを含むクマリンは、ビタミンＫの効果を拮抗することによって作用する。第二のクラスの化合物は、アンチトロンビンＩＩＩ又はヘパリンコファクターＩＩなどのコファクターを介して間接的に血液凝固を阻害する。これには、アンチトロンビンＩＩＩを介して主に第Ｘａ因子（及び低い程度にはトロンビン）の阻害を触媒するいくつかの低分子量ヘパリン製品（ベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン）が挙げられる。より小さなオリゴ糖鎖（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス）は、アンチトロンビンＩＩＩを介して第Ｘａ因子だけを阻害する。ヘパリノイド（ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸）は、両方のコファクターを介して作用し、第Ｘａ因子及びトロンビンの両方を阻害する。第三のクラスは、血液凝固の直接阻害剤に相当する。直接第Ｘａ因子阻害剤には、アピキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバンが挙げられ、直接トロンビン阻害剤には、二価ヒルジン（ビバリルジン、レピルジン、デシルジン）、並びに一価化合物であるアルガトロバン及びダビガトランが挙げられる。
【０００４】
血液凝固は出血を止める生物学的メカニズムなので、抗凝固治療の副作用は、望まれない出血事象であり得る。従って、抗凝固薬に関連するこのような出血事象が起こったときにそれを止めることができる解毒剤を提供することが望ましい（Zikria and Ansell, Current Opinion in Hematology 2009, 16(5): 347-356）。これを達成するための一方法は、投与後に患者の中に存在する抗凝固化合物の活性を中和することによる。
【０００５】
抗凝固薬の現在入手可能な解毒剤は、プロタミン（ヘパリンの中和用）、及びワルファリンのようなビタミンＫアンタゴニストを中和するためのビタミンＫである。新鮮凍結血漿及びリコンビナント第ＶＩＩａ因子もまた、低分子量ヘパリン処置下の患者であって、大外傷又は重度出血を患っている患者において、非特異的解毒剤として使用されている（Lauritzen, B. et al, Blood, 2005, 607A-608A.）。ヘパリン又は低分子量ヘパリン解毒剤としてのプロタミンフラグメント（米国特許第６，６２４，１４１号）及び小型合成ペプチド（米国特許第６，２００，９５５号）；並びにトロンビン阻害剤用の解毒剤としてのトロンビンムテイン（米国特許第６，０６０，３００号）も報告されている。プロトロンビンの中間体及び誘導体は、ヒルジン及び合成トロンビン阻害剤に対する解毒剤として報告されている（米国特許第５，８１７，３０９号及び第６，０８６，８７１号）。直接第Ｘａ因子阻害剤については、不活性第Ｘａ因子アナログが解毒剤として提案されている（国際公開公報第２００９０４２９６２号）。さらに、リコンビナント第ＶＩＩａ因子が、フォンダパリヌクス及びイドラパリヌクスなどの間接アンチトロンビンＩＩＩ依存性第Ｘａ因子阻害剤の効果をリバース（reverse）するのに使用されている（Bijsterveld, NR et al, Circulation, 2002, 106: 2550-2554; Bijsterveld, NR et al, British J. of Haematology, 2004 (124): 653-658）。抗凝固薬をリバースする方法の総説は、Schulman and Bijsterveld, Transfusion Medicine Reviews 2007, 21(1): 37-48に提供されている。
【０００６】
国際公開公報第２０１１０８９１８３号には、ダビガトランに結合し、ダビガトランの活性を中和し得る抗体が開示されている。
【０００７】
抗凝固治療についての改良された解毒剤、特に特異的解毒剤がこれまでのところ開示されていないダビガトランのような直接トロンビン阻害剤のための解毒剤を提供する必要性がある。
【０００８】
発明の簡単な概要
一態様では、本発明は、抗凝固薬の活性を中和できる抗体分子に関する。
【０００９】
さらなる態様では、抗体分子は、抗凝固薬に対する結合特異性を有する。
【００１０】
さらなる態様では、抗凝固薬は、直接トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、又はビタミンＫアンタゴニストである。
【００１１】
さらなる態様では、抗凝固薬は、ダビガトラン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アピキサバン、オタミキサバン、エドキサバン、リバロキサバン、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンＩＩＩ、又はドロトレコギンアルファである。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、及び／又はダビガトランのＯ−アシルグルクロニドに対する抗体分子に関する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、及び／又はダビガトランのＯ−アシルグルクロニドに対する抗体分子であって、ヒトにおける減少した免疫原性を有する抗体分子に関する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、及び／又はダビガトランのＯ−アシルグルクロニドに対する抗体分子であって、改善された物理化学的特性、特に、改善された水性溶媒溶解性を有する抗体分子に関する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、及び／又はダビガトランのＯ−アシルグルクロニドに対する抗体分子であって、改善されたホスト細胞生産性を有する抗体分子、特に、改善された生産収率をもたらす抗体分子に関する。
【００１６】
さらなる態様では、抗体分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、特に一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、ナノボディ（nanobody）、ダイアボディ（diabody）、又はＤＡＲＰｉｎである。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、医薬に使用するための上記抗体分子に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固治療の副作用の治療又は予防に使用するための上記抗体分子に関する。
【００１９】
さらなる態様では、副作用は出血事象である。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固治療の副作用の処置又は予防の方法であって、それを必要とする患者に上記抗体分子の有効量を投与することを含む方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、容器及びラベルと一緒に前記抗体分子を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】トロンビン凝固時間アッセイを用いて、ダビガトランの濃度の増加とともに凝固時間の増加が見られた。濃度２００nMは、ベースラインに対して約５倍の凝固時間延長をもたらし、この濃度を第１及び第２セットの実験に使用した。最終セットの実験には濃度５００nM（治療濃度を超える）を使用した。
【図２】ダビガトランに対する４種の異なる抗体（Ａ〜Ｄ）はすべて、ヒト血漿でのダビガトランの凝固時間延長を中和した。ヒト血漿でのベースライン凝固は１０．９秒であり、２００nMのダビガトランを血漿と一緒にプレインキュベーションしたところ、凝固は５１秒に延長した。２００nMのダビガトランと一緒にプレインキュベーションした血漿に各抗体を添加し、さらに５分間インキュベーションした。次に、トロンビンを添加することによってトロンビン凝固時間を開始させた。各抗体は、ダビガトランの凝固時間を異なる程度にリバースすることができた。最高濃度の溶液が、抗凝固活性の最大のリバースをもたらした。
【図３】２００nMのダビガトランと一緒にプレインキュベーションしたヒト血漿に、漸増濃度のポリクローナル抗体（抗体Ｄ）を添加した作用を測定した。ベースライン凝固時間は１１秒であり、ダビガトランの添加は、凝固を６３．７秒に延長した。次に、抗体の漸増希釈物が、ダビガトランによるトロンビン凝固時間延長のリバースに対して及ぼす作用を試験した。最低濃度は、トロンビン凝固時間を４３．９秒に短縮した。より高濃度は、トロンビン凝固時間をベースラインレベルにまで完全に短縮させ、ダビガトランの抗凝固作用の完全な中和をもたらした。非特異的ウサギポリクローナル抗体（四角）の添加は、ダビガトランの抗凝固作用のリバースに対して効果を有しなかった。
【図４】５００nMのダビガトランと一緒にプレインキュベーションしたヒト血漿に、漸増濃度のポリクローナル抗体（抗体Ｄ）を添加した作用を測定した。ベースライン凝固時間は１０．９秒であり、このより高濃度のダビガトランの添加は、凝固を１１１．７秒に延長した（約１０倍の増加）。抗体又は原液の１：２希釈溶液の作用は、ダビガトランによるトロンビン凝固時間延長を濃度依存的にリバースした。最高濃度もまた、トロンビン凝固時間をベースラインレベルにまで完全にリバースし、治療濃度をはるかに超えるダビガトランの抗凝固作用を完全に中和した。
【図５】マウスモノクローナル抗体（クローン２２）は、ヒト血漿及びヒト全血でのダビガトランの抗凝固作用をリバースする。３０nMのダビガトランと一緒にプレインキュベーションしたヒト血漿又は全血に、漸増濃度のマウス抗体を添加した。１．５〜２U/mLのトロンビンを添加することによってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％のダビガトラン活性は、化合物の存在下及び非存在下の凝固時間の差と定義した。抗体は、ダビガトランを介した凝固時間延長を用量依存的に阻害した。
【図６】クローン２２抗体から作成したマウスＦａｂは、ヒト血漿でのダビガトランの抗凝固作用をリバースする。７nMのダビガトランと一緒にプレインキュベーションしたヒト血漿に、漸増濃度のマウスＦａｂを添加した。インタクトな抗体もまた、ポジティブコントロールとして試験した。０．４U/mLのトロンビンを添加することによってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％阻害は、ダビガトランを介した凝固時間の増加を完全に遮断することと定義した。Ｆａｂは、ヒト血漿中で、ダビガトランにより誘導される凝固時間延長を用量依存的に阻害した。
【図７】マウスモノクローナル抗体（クローン２２）は、ヒト血漿でのダビガトランアシルグルクロニドの抗凝固作用をリバースする。７nMのダビガトランアシルグルクロニド又はダビガトランと一緒にプレインキュベーションしたヒト血漿に、漸増濃度のマウス抗体を添加した。０．４U/mLのトロンビンを添加することによってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％阻害は、化合物を介した凝固時間の増加を完全に遮断することと定義した。抗体は、ヒト血漿中で、ダビガトランアシルグルクロニドにより誘導される凝固時間延長を用量依存的に阻害した。
【図８】選択したキメラ抗体は、トロンビン凝固時間アッセイにおいて、ダビガトラン活性を阻害する。７nMのダビガトランと一緒にプレインキュベーションしたヒト血漿に、漸増濃度の抗体を添加した。インタクトな抗体もまた、ポジティブコントロールとして試験した。０．４U/mLのトロンビンを添加することによってアッセイを開始し、凝固時間を測定した。１００％阻害は、ダビガトランを介した凝固時間の増加を完全に遮断することと定義した。抗体は、ヒト血漿中で、ダビガトランにより誘導される凝固時間延長を用量依存的に阻害した。
【図９】Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８（配列番号９９及び配列番号１００）及びＶＨ５ｃ／Ｖｋ２１（配列番号９９及び配列番号１０１）は、トロンビン凝固時間血漿アッセイにおいて、ダビガトラン活性を阻害する。アッセイは、上記のように実施した。
【図１０】Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８（配列番号９９及び配列番号１００）及びＶＨ５ｃ／Ｖｋ２１（配列番号９９及び配列番号１０１）は、血漿及び全血トロンビン凝固時間アッセイにおいて、ダビガトラン活性を阻害する。アッセイは、上記のように実施した。
【図１１】Ｆａｂ−ダビガトラン複合体の結晶構造。Ａ：ダビガトランとの複合体におけるＦａｂ  １８／１５（国際公開公報第２０１１０８９１８３号）の結晶構造。Ｂ：ダビガトランとの複合体におけるＦａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８（配列番号９９及び配列番号１００）の結晶構造。Ｃ：Ｆａｂ  １８／１５を含む結晶構造で見られるダビガトランのコンフォメーション。Ｄ：ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８を含む結晶構造で見られるダビガトランの展開したコンフォメーション。
【図１２】ＣＤＲ（左のパネル）又は全Ｆｖ領域（右のパネル）を含む（Ａ）Ｆａｂ  １８／１５（Ｂ）Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８及び（Ｃ）Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ２１について計算した空間的凝集傾向（ＳＡＰ）。
【図１３】対応するＦａｂ発現構築物でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞のフェドバッチラン（fed batch runs）からの（Ａ）Ｆａｂ  １８／１５（Ｂ）Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８及び（Ｃ）Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ２１の力価。
【００２３】
発明の詳細な説明
一態様では、本発明は、抗凝固薬の活性を中和できる抗体分子に関する。
【００２４】
抗体（免疫グロブリン、略してＩｇとしても公知である）は、脊椎動物の血液又は他の体液中に見られ得るガンマグロブリンタンパク質であり、細菌及びウイルスなどの異物を特定及び中和するために免疫系によって使用される。抗体は、典型的には、基本構造ユニットで作られており、それぞれが２本の大きな重鎖及び２本の小さな軽鎖を有し、例えば、１個のユニットを有するモノマー、２個のユニットを有するダイマー又は５個のユニットを有するペンタマーを形成する。抗体は、抗原として公知の他の分子又は構造に非共有相互作用によって結合することができる。この結合は、抗体が高親和性で特定の構造だけに結合するという意味で特異的である。抗体によって認識される抗原の独特な部分は、エピトープ又は抗原決定基と呼ばれる。エピトープに結合する抗体の部分は、時にパラトープと呼ばれ、抗体のいわゆる可変ドメイン、又は可変領域（Ｆｖ）に位置する。可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって空間的に離れた３個のいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２５】
本発明の文脈において、ＣＤＲへの参照は、Chothia(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917)及びKabat(E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983))の定義に基づく。
【００２６】
当該技術により、抗体がさらに開発されており、医学及び工学における多用途の道具になっている。従って、本発明の文脈において、「抗体分子」又は「抗体」という用語（本明細書において同義語として使用される）は、例えば２本の軽鎖及び２本の重鎖、又はラクダ科の種のように２本の重鎖だけを含む、自然界に見出されうる抗体を含むだけではなく、抗原への結合特異性及び免疫グロブリンの可変ドメインとの構造類似性を有する少なくとも１個のパラトープを含むすべての分子もさらに包含する。
【００２７】
従って、本発明の抗体分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、特に一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モジュール免疫薬（Small Modular Immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディでありうる。
【００２８】
ポリクローナル抗体は、異なるアミノ酸配列を有する抗体分子の集合を表し、当技術分野で周知のプロセスにより抗原で免疫処置した後に、脊椎動物の血液から得ることができる。
【００２９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ又はｍｏＡｂ）は、アミノ酸配列が同一の単一特異性抗体である。それらは、ハイブリドーマ技術によって、特異的抗体を産生するＢ細胞と骨髄腫（Ｂ細胞ガン）細胞の融合体のクローンを意味するハイブリッド細胞系（ハイブリドーマと呼ばれる）から製造することができる（Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.）。あるいは、モノクローナル抗体は、ホスト細胞でのリコンビナント発現によって製造することができる（Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1): 77-87；下記も参照されたい）。
【００３０】
ヒトに適用するために、マウスのような他の種に本来は由来する抗体の免疫原性を減少させることが望ましいことが多い。これは、キメラ抗体の構築によって、又は「ヒト化」と呼ばれるプロセスによって行うことができる。この文脈において、「キメラ抗体」は、別の種（例えば、ヒト）に由来する配列部分（例えば、定常ドメイン）と融合したある種（例えば、マウス）に由来する配列部分（例えば、可変ドメイン）を含む抗体であると理解される。「ヒト化抗体」は、非ヒト種に本来は由来する可変ドメインを含む抗体であって、その可変ドメインの全体的な配列がヒト可変ドメインの配列により密接に類似するように、あるアミノ酸が突然変異された抗体である。抗体をキメラ化及びヒト化する方法は、当技術分野において周知である（Billetta R, Lobuglio AF. "Chimeric antibodies". Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76; Riechmann L, ClarkM, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323.）。
【００３１】
さらに、例えば、ファージディスプレイによって、又はトランスジェニック動物を使用してヒトゲノムに由来する配列に基づき抗体を作り出すための技術が開発されている（国際公開公報第９０／０５１４４号； D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.; Brueggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.）。このような抗体は、本発明の文脈において「ヒト抗体」である。
【００３２】
本発明の抗体分子には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗原結合特性を保持する免疫グロブリンのフラグメントも挙げられる。このようなフラグメントは、免疫グロブリンのフラグメント化によって、例えばタンパク質分解によって、又はこのようなフラグメントのリコンビナント発現によって得ることができる。例えば、免疫グロブリンの分解は、通常の技術によって、例えばパパイン若しくはペプシン（国際公開公報第９４／２９３４８号）、又はエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Kleemann, et al, Anal. Chem. 80, 2001-2009, 2008）を使用して達成することができる。抗体のパパイン又はＬｙｓ−Ｃ分解によって、典型的には、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合フラグメント（いわゆるＦａｂフラグメント）及び残余のＦｃフラグメントが製造される。ペプシン処理によってＦ（ａｂ’）２が生産される。ホスト細胞でのリコンビナント発現によってＦａｂ分子を製造する方法を下記により詳細に概説する。
【００３３】
免疫グロブリンの可変ドメイン又はこのような可変ドメインに由来する分子を異なる分子事情に配置するために、多数の技術が開発されている。それらもまた、本発明による「抗体分子」と見なすべきである。一般に、これらの抗体分子は、免疫グロブリンと比較してサイズが小さく、単一のアミノ酸鎖を含み得るか、又は数本のアミノ酸鎖から構成され得る。例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域が短いリンカー、通常はセリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ）で一緒に結合されている融合体である（国際公開公報第８８／０１６４９号；国際公開公報第９１／１７２７１号； Huston et al; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195 - 217）。「単一ドメイン抗体」又は「ナノボディ」は、単一のＩｇ様ドメインに抗原結合部位を有する（国際公開公報第９４／０４６７８号；国際公開公報第０３／０５０５３１号、Ward et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6; Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24, 2005）。同一又は異なる抗原に対して結合特異性を有する１つ以上の単一ドメイン抗体が一緒に結合されてもよい。ダイアボティは、２個の可変ドメインを含む２本のアミノ酸鎖からなる二価抗体分子である（国際公開公報第９４／１３８０４号、Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8）。抗体様分子の他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体である（ＩｇＳＦ； Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96）。異なる考え方が、定常ドメインＣＨ１を持たない一本鎖ヒンジ及びエフェクタードメインに結合したＦｖドメインを含む、いわゆる小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）につながっている（国際公開公報第０２／０５６９１０号）。
【００３４】
さらなる態様では、本発明の抗体分子は、免疫グロブリン可変ドメインに匹敵するある一定の結合特異性及び親和性を有する限り、免疫グロブリン可変ドメインとわずかな構造関連性だけさえ有してもよいし、このような関係を全く有しなくてもよい。このような非免疫グロブリン「抗体模倣物」は、時に「足場タンパク質」と呼ばれ、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、及びチオレドキシンの遺伝子に基づくものであってもよい（Skerra, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18(4): 295-304）。本発明の文脈における好ましい実施態様は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Designed Ankyrin Repeat Protein）である（ＤＡＲＰｉｎ；Steiner et al., J Mol Biol. 2008 Oct 24;382(5): 1211-27; Stumpp MT, Amstutz P. Curr Opin Drug Discov Devel. 2007 Mar;10(2):153-9）。
【００３５】
抗体分子は、その抗体分子の特性に所望の影響を与える他の分子実体に融合されてもよいし（融合タンパク質として）、別の方法で結合されてもよい（共有結合又は非共有結合により）。例えば、特に一本鎖抗体又はドメイン抗体の場合、抗体分子の薬物動態特性、例えば血液などの体液中での安定性を改善することが望ましいことがある。これに関して、特に循環中でのこのような抗体分子の半減期を延長するために多数の技術が開発されており、例えば、ＰＥＧ化（国際公開公報第９８／２５９７１号；国際公開公報第９８／４８８３７号；国際公開公報第２００４０８１０２６号）、抗体分子を、アルブミンのような血清タンパク質に対して親和性を有する別の抗体分子と融合させるか若しくは別の方法で共有結合させること（国際公開公報第２００４０４１８６５号；国際公開公報第２００４００３０１９号）、又はアルブミン若しくはトランスフェリンのような血清タンパク質の全部又は一部との融合タンパク質として抗体分子を発現させること（国際公開公報第０１／７９２５８号）が挙げられる。
【００３６】
さらなる態様では、抗体分子は、抗凝固薬に対する結合特異性を有する。「結合特異性」は、抗体分子が、構造的に無関係の分子よりも抗凝固薬に対して有意に高い結合親和性を有することを意味する。
【００３７】
親和性は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と単一のエピトープとの間の相互作用である。親和性は、結合定数ＫＡ＝ｋａｓｓ／ｋｄｉｓｓ、又は解離定数ＫＤ＝ｋｄｉｓｓ／ｋａｓｓによって表される。
【００３８】
本発明の一態様では、抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴分析によって測定される場合に、０．１pM〜１００μM、好ましくは１pM〜１００μM、好ましくは１pM〜１μMの範囲のＫＤ値の親和性で抗凝固薬に結合する（Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.", Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.）。抗体親和性はまた、結合平衡除外アッセイ（kinetic exclusion assay）（KinExA）技術を用いて測定することもできる（Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657）。
【００３９】
抗体分子の結合親和性は、親和性成熟として公知のプロセスによって高めることができる（Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783; Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155）。従って、親和性成熟抗体もまた、本発明に包含される。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、抗体分子は、抗凝固薬の活性を中和できる。すなわち、抗凝固薬は、抗体分子に結合すると、もはやその抗凝固活性を発揮することができないか、又は有意に減少した大きさでこの活性を発揮する。好ましくは、抗凝固活性は、抗体が結合すると、問題の当該抗凝固薬にとって適切な活性アッセイで、特にエカリン凝固時間又はトロンビン凝固時間などの、トロンビン感受性の凝固アッセイで測定される場合に、少なくとも２倍、５倍、１０倍又は１００倍減少する（H. Bounameaux, Marbet GA, Lammle B, et al. "Monitoring of heparin treatment. Comparison of thrombin time, activated partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behaviour of antithormbin III". American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1): 68-72）。
【００４１】
本発明の抗体分子を製造するために、当業者は、当技術分野で周知の多様な方法より選択することができる（Norderhaug et al., J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77-87; Kipriyanow and Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004; Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39）。
【００４２】
抗凝固薬は、上記に概説するように当技術分野において周知である。本発明のさらなる態様では、抗凝固薬は、直接トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、又はビタミンＫアンタゴニストである。ビタミンＫアンタゴニストの例は、ワルファリンを含むクマリンである。主に第Ｘａ因子の間接阻害剤の例は、アンチトロンビンＩＩＩの活性化を介して作用するヘパリン群の物質であり、それらには、いくつかの低分子量ヘパリン製品（ベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン）、ある種のオリゴ糖（フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス）、ヘパリノイド（ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸）、及び直接第Ｘａ因子阻害剤（アピキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン）が挙げられる。トロンビン阻害剤の例には、二価ヒルジン（ビバリルジン、レピルジン、デシルジン）、並びに一価化合物アルガトロバン及びダビガトランが挙げられる。
【００４３】
従って、さらなる態様では、抗凝固薬は、ダビガトラン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アピキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンＩＩＩ、又はドロトレコギンアルファである。
【００４４】
本発明の文脈における好ましい抗凝固薬は、化学式（ＩＩ）：
【化１】
2014515740.tif 000003
を有するダビガトラン（ＣＡＳ２１１９１４−５１−１、Ｎ−［２−（４−アミジノフェニルアミノメチル）−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イルカルボニル］−Ｎ−（２−ピリジル）−β−アラニン）である。
【００４５】
ダビガトランは、トロンビン阻害作用及びトロンビン時間延長作用を有する化合物を１−メチル−２−［Ｎ−（４−アミジノフェニル）−アミノメチル］−ベンゾイミダゾール−５−イル−カルボン酸−Ｎ−（２−ピリジル）−Ｎ−（２−ヒドロキシカルボニルエチル）−アミドの名称で開示している国際公開公報第９８／３７０７５号から公知である。Hauel et al. J Med Chem 2002, 45 (9): 1757-66も参照されたい。
【００４６】
ダビガトランは、式（ＩＩＩ）：
【化２】
2014515740.tif 000004
のプロドラッグとして適用される。
【００４７】
式ＩＩＩの化合物（名称ダビガトランエテキシラート、ＣＡＳ２１１９１５−０６−９；エチル３−［（２−｛［４−（ヘキシルオキシカルボニルアミノ−イミノ−メチル）−フェニルアミノ］−メチル｝−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−プロピオナート）は、体内に入った後で活性化合物（ＩＩ）に変換される。ダビガトランエテキシラートの好ましい多形体は、ダビガトランエテキシラートメシラートである。
【００４８】
ダビガトランの主な適用は、深部静脈血栓の術後予防、確立した深部静脈血栓の処置及び心房細動を有する患者における発作の予防である（Eriksson et al., Lancet 2007, 370 (9591): 949-56; Schulman S et al, N Engl J Med 2009, 361 (24): 2342-52; Connolly S et al., N Engl J Med 2009, 361 (12): 1139-51; Wallentin et al., Lancet 2010, 376 (9745): 975-983）。
【００４９】
ヒトの体内では、カルボキシラート部分のグルクロン酸抱合がダビガトランの主なヒト代謝経路である（Ebner et al., Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75）。それは、１−Ｏ−アシルグルクロニド（βアノマー）の形成をもたらす。１−Ｏ−アシルグルクロニドは、わずかに加水分解されてアグリコンになるのに加えて、水溶液中で非酵素的アシル転移を受けて、２−Ｏ−アシルグルクロニド、３−Ｏ−アシルグルクロニド、及び４−Ｏ−アシルグルクロニドを形成し得る。精製１−Ｏ−アシルグルクロニド及びその異性体性転位生成物を用いた実験により、ダビガトランと比較して活性化部分トロンボプラスチン時間の延長効力が等しいことが明らかになった。
【００５０】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトラン及びダビガトランエテキシラートの両方に結合する。
【００５１】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトラン及びダビガトランのＯ−アシルグルクロニド、特にダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの両方に結合する。
【００５２】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランの２−Ｏ−アシルグルクロニド、３−Ｏ−アシルグルクロニド、及び４−Ｏ−アシルグルクロニドにさらに結合する。
【００５３】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトラン及びダビガトランのＯ−アシルグルクロニド、特にダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和できる。
【００５４】
以下において、配列番号についての言及は、表１及び配列表（特に示されない限り、これは本出願の一部である）の配列番号を指す。
【００５５】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、及び６７からなる群より選択されるＣＤＲ１、配列番号２、８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、及び６８からなる群より選択されるＣＤＲ２、並びに配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、及び６３からなる群より選択されるＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、及び６４からなる群より選択されるＣＤＲ１、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、及び６５からなる群より選択されるＣＤＲ２、並びに配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、及び６９からなる群より選択されるＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００５６】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００５７】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２及び配列番号９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２及び配列番号１２のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００５８】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号１３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２及び配列番号１５のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１６のＣＤＲ１、配列番号１７のＣＤＲ２及び配列番号１８のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００５９】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号１９のＣＤＲ１、配列番号２０のＣＤＲ２及び配列番号２１のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２及び配列番号２４のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６０】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号２５のＣＤＲ１、配列番号２６のＣＤＲ２及び配列番号２７のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２及び配列番号３０のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６１】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号３１のＣＤＲ１、配列番号３２のＣＤＲ２及び配列番号３３のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号３４のＣＤＲ１、配列番号３５のＣＤＲ２及び配列番号３６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６２】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号３７のＣＤＲ１、配列番号３８のＣＤＲ２及び配列番号３９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４０のＣＤＲ１、配列番号４１のＣＤＲ２及び配列番号４２のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６３】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号４３のＣＤＲ１、配列番号４４のＣＤＲ２及び配列番号４５のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４６のＣＤＲ１、配列番号４７のＣＤＲ２及び配列番号４８のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６４】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号５２のＣＤＲ１、配列番号５３のＣＤＲ２及び配列番号５４のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６５】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号５５のＣＤＲ１、配列番号５６のＣＤＲ２及び配列番号５７のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のＣＤＲ２及び配列番号６０のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６６】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号６１のＣＤＲ１、配列番号６２のＣＤＲ２及び配列番号６３のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６４のＣＤＲ１、配列番号６５のＣＤＲ２及び配列番号６６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６７】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ダビガトランに対する結合特異性を有し、配列番号６７のＣＤＲ１、配列番号６８のＣＤＲ２及び配列番号９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６４のＣＤＲ１、配列番号６５のＣＤＲ２及び配列番号６９のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６８】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号７０の重鎖可変ドメインと、配列番号７１の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００６９】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号７２の重鎖可変ドメインと、配列番号７３の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７０】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号７４の重鎖可変ドメインと、配列番号７５の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７１】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号７６の重鎖可変ドメインと、配列番号７７の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７２】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号７８の重鎖可変ドメインと、配列番号７９の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７３】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号８０の重鎖可変ドメインと、配列番号８１の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７４】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号８２の重鎖可変ドメインと、配列番号８３の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７５】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号８４の重鎖可変ドメインと、配列番号８５の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７６】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号８６の重鎖可変ドメインと、配列番号８７の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７７】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号８８の重鎖可変ドメインと、配列番号８９の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７８】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９０の重鎖可変ドメインと、配列番号９１の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７９】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９２の重鎖可変ドメインと、配列番号９３の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００８０】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９２の重鎖可変ドメインと、配列番号９４の軽鎖可変ドメインとを含む。
【００８１】
本発明の別の態様では、前記軽鎖可変ドメインのいずれか１つは、配列番号９７の定常ドメインに融合されている。
【００８２】
本発明の別の態様では、前記重鎖可変ドメインのいずれか１つは、配列番号９８の定常ドメインに融合されている。
【００８３】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９５の重鎖と、配列番号９６の軽鎖とを含む。
【００８４】
特定の態様では、本発明は、ダビガトランに対する抗体であって、水媒体中での高い溶解性、及び低い凝集傾向を有する抗体に関する。
【００８５】
本発明の別の態様では、抗体分子は、ｓｃＦｖ分子である。この形式では、本明細書に開示された可変ドメインは、適切なリンカーペプチドで互いに融合されてもよい。その構築物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（重鎖可変ドメイン）−（リンカーペプチド）−（軽鎖可変ドメイン）、又は（軽鎖可変ドメイン）−（リンカーペプチド）−（重鎖可変ドメイン）の順序でこれらの要素を含み得る。
【００８６】
ｓＦｖ構築物をコードする核酸を、ホスト細胞（イー・コリィ（E. coli）、ピキア  パストリス(Pichia pastoris)、又は哺乳動物細胞株、例えばＣＨＯ若しくはＮＳ０など）でリコンビナント発現させて、機能的ｓｃＦｖ分子を得るプロセスは、当技術分野において公知である（例えば、Rippmann et al., Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki et al., J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda et al., Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253を参照されたい）。
【００８７】
特に、本発明のｓｃＦｖ抗体分子は、以下のように製造することができる。構築物は、Ｗ３１１０、ＴＧ１、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＭＭ２９４のような異なるE. coli株において誘導性プロモーターのコントロール下で発現させることができる。このプロモーターは、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、Ｔ７、ｔｒｐ、ｔｒｃ、Ｔ５、ａｒａＢより選択することができる。培養培地は、好ましくは、Wilmsら、２００１（Wilms et al., Biotechnology and Bioengineering 2001, 73(2): 95-103）、DeLisaら、１９９９（DeLisa et al., Biotechnology and Bioengineering 1999, 65(1): 54-64）に従って十分に定義されているものか、又は同等のものである。しかしながら、バッチ培地、並びに／又はイソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン及びバリンなどのアミノ酸を含む流加培地、又はダイズペプトン若しくは酵母抽出物などの複合培地成分の補充が有益であり得る。発酵のためのプロセスは、フェドバッチモードで行う。条件：温度２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜７．５、ＤＯは２０％よりも高く保つ。初期炭素源の消費後に、培養物に上記流加培地（又は同等物）を供給する。発酵槽中で４０〜１００g/Lの乾燥細胞重量に達したときに、使用されるプロモーター系に対応する適切な誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ、ラクトース、アラビノース）で培養物を誘導する。誘導は、パルス完全誘導として、若しくはそれぞれの誘導物質を発酵槽中に長時間供給することによる部分誘導として、又はそれらの組み合わせのいずれかで行うことができる。生産期は、少なくとも４時間持続すべきである。細胞は、ボウル遠心分離機、管状ボウル遠心分離機又はディスクスタック遠心分離機での遠心分離によって回収し、培養上清は廃棄する。
【００８８】
E. coli細胞塊を、４〜８倍量の溶解緩衝液（リン酸緩衝液又はトリス緩衝液、ｐＨ７〜８．５）中に再懸濁する。細胞溶解は、好ましくは、高圧ホモジナイズに続いて、ボウル遠心分離機、管状ボウル遠心分離機又はディスクスタック遠心分離機での遠心分離によるペレットの回収によって行う。ｓｃＦｖ封入体を含有するペレットを、２０mMトリス、１５０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、２Ｍ尿素、０．５％トリトンＸ−１００（ｐＨ８．０）で２〜３回洗浄した後に、２０mMトリス、１５０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を使用して洗浄段階を２回行う。最後に、ｓｃＦｖ封入体を、ボウル遠心分離機、管状ボウル遠心分離機又はディスクスタック遠心分離機での遠心分離によって回収する。ｓｃＦｖ封入体の可溶化は、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ又は８〜１０mM尿素などのカオトロピック剤を含有する１００mMグリシン／ＮａＯＨ、５mM  ＥＤＴＡ、２０mMジチオトレイトール（ｐＨ９．５〜１０．５）中で行うことができる。３０〜６０分間インキュベーションした後に、溶液を遠心分離し、その後の再フォールディングのためにターゲットタンパク質を含有する上清を回収する。再フォールディングは、好ましくは、フェドバッチモードで、タンパク質溶液を再フォールディング緩衝液中で１：１０〜１：５０希釈して０．１〜０．５mg/mlの最終タンパク質濃度にすることによって行われる。再フォールディング緩衝液は、５０〜１００mMトリス及び／又は５０〜１００mMグリシン、５０〜１５０mM  ＮａＣｌ、１〜３Ｍ尿素、０．５〜１Ｍアルギニン、例えばシステイン／シスチン又は酸化／還元型グルタチオンなどの２〜６mMの酸化還元系（ｐＨ９．５〜１０．５）を含有し得る。４℃で２４〜７２時間インキュベーションした後に、再フォールディング溶液を、場合により０．２２μmフィルターを使用してろ過し、希釈し、ｐＨをｐＨ７．０〜８．０に調整する。タンパク質を、結合モードの陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Toyopearl GigaCap S-650M、ＳＰセファロースＦＦ又はS HyperCel（商標））によりｐＨ７．０〜８．５で分離する。溶離を、漸増するＮａＣｌの直線勾配によって行う。ターゲットタンパク質を含有する画分をプールし、次に非結合モードの陰イオン交換カラム（例えば、Toyopearl GigaCap Q-650M、Ｑ−セファロースＦＦ、Q HyperCel（商標））で分離した後に、陽イオン交換の仕上げ工程（例えば、ＳＰセファロースＨＰ）を行う。最低９０％の純度レベルのターゲットタンパク質を含有する画分をプールし、ＰＢＳ中、ダイアフィルトレーション又はサイズ排除クロマトグラフィーによって製剤化する。製造されたｓｃＦｖ分子の同一性及び製品品質を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その場合ｓｃＦｖは、約２６kDaの１本の主バンドで検出することができる。ｓｃＦｖの特性決定のためのさらなるアッセイには、質量分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣが挙げられる。
【００８９】
本発明の別の態様では、抗体分子は、Ｆａｂ分子である。その形式では、上に開示された可変ドメインは、好ましくはヒト起源の免疫グロブリン定常ドメインにそれぞれ融合されてもよい。従って、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメイン（いわゆるＦｄフラグメント）に融合されてもよいし、軽鎖可変ドメインは、ＣＬドメインに融合されてもよい。
【００９０】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９９の重鎖と、配列番号１００の軽鎖とを含む。好ましくは、抗体分子は、Ｆａｂ分子である。
【００９１】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９９の重鎖と、配列番号１０１の軽鎖とを含む。好ましくは、抗体分子は、Ｆａｂ分子である。
【００９２】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９９の重鎖と、配列番号１００の軽鎖とからなるＦａｂ分子である。
【００９３】
本発明の別の態様では、抗体分子は、配列番号９９の重鎖と、配列番号１０１の軽鎖とからなるＦａｂ分子である。
【００９４】
E. coli、Pichia pastoris、又は哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ又はＮＳ０）のようなホスト細胞でこのような重鎖及び軽鎖を発現させるために、Ｆａｂ構築物をコードする核酸を使用することができる。これらの鎖を適切にフォールディング、会合、及びジスルフィド結合させて、Ｆｄフラグメント及び軽鎖を含む機能的Ｆａｂ分子にする方法は、当技術分野において公知である（Burtet et al., J. Biochem. 2007, 142(6), 665-669; Ning et al., Biochem. Mol. Biol. 2005, 38: 204-299; Quintero-Hernandez et al., Mol. Immunol. 2007, 44: 1307-1315; Willems et al. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003;786:161-176.）。
【００９５】
特に、本発明のＦａｂ分子は、以下のようにＣＨＯ細胞で製造することができる。無血清培地中に懸濁状態で成長しているＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Urlaub,G., Kas,E., Carothers,A.M., and Chasin,L.A. (1983). Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33, 405-412.）に、Lipofectamine（商標）及びPlus（商標）試薬（Invitrogen）を製造業者の説明書に従って使用して、Ｆａｂ分子の重鎖及び軽鎖をコードする発現構築物をトランスフェクションする。４８時間後に、２００μg/mLの抗生物質Ｇ４１８を含有し、ヒポキサンチン及びチミジンを含まない培地中で細胞を選択に供し、安定的にトランスフェクションされた細胞集団を作成する。続いて、メトトレキサート（ＭＴＸ）を漸増濃度（最大１００又は４００nM）で培養培地に添加することによって、これらの安定トランスフェクタントを遺伝子増幅に供する。細胞が適応したら、それらを１０〜１１日間フェドバッチ発酵に供し、Ｆａｂタンパク質材料を製造する。
【００９６】
化学的に定義された無血清培養培地中でＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びその安定トランスフェクタントの懸濁培養物をインキュベーションする。播種用保存培養物を２〜３日毎にそれぞれ細胞３×１０５〜２×１０５個／mLの播種密度で継代培養する。細胞を振盪フラスコ中、Multitron HTインキュベーター（Infors）で５％ＣＯ２、３７℃及び１２０rpmで成長させる。フェドバッチ実験のために、細胞を振盪フラスコの中で抗生物質もＭＴＸも含まないＢＩ独自の生産培地中に細胞３×１０５個／mLで播種する。培養物を１２０rpmで３７℃及び５％ＣＯ２にて撹拌し、細胞数が増加するにつれてＣＯ２をその後２％に減少させる。細胞数、生存率、ｐＨ、グルコース及び乳酸濃度を含む培養パラメーターを毎日測定し、必要に応じて炭酸塩を使用してｐＨをｐＨ７．０に調整する。ＢＩ独自の栄養溶液を２４時間毎に添加する。異なる時点で上清からサンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによってＦａｂ産物濃度を測定する。１０〜１１日後に、細胞培養液を遠心分離によって回収し、精製研究室に移送する。
【００９７】
Ｆａｂ分子を、フェドバッチ培養の上清からクロマトグラフィー及びろ過によって精製する。一次捕捉工程として、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＧ又はプロテインＬを適用する。あるいは、低結合親和性及び低結合能の場合、Ｆａｂを、分子のｐＩを利用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって捕捉する。さらなる直交精製工程によって、ホスト細胞タンパク質及び混入物、例えばＤＮＡ又はウイルスを除去する。
【００９８】
製造されたＦａｂ分子の同一性及び製品品質を、電気泳動法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、それによって約５０kDaの１本の主バンドとしてＦａｂを検出することができる。Ｆａｂ産物の特性決定のためのさらなるアッセイには、質量分析、等電点電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。結合活性をBIAcore分析によって追跡する。
【００９９】
細胞培養上清中のＦａｂ又は完全長ＩｇＧ分子の定量を、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により行う。完全長ＩｇＧは、ヒト−Ｆｃフラグメント（Jackson Immuno Research Laboratories）及びヒトκ軽鎖に対して産生された抗体（ペルオキシダーゼ標識されたもの、Sigma）を使用して検出することができる。Ｆａｂフラグメントを、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｈ及びＬ、Novus）によって固定化し、ヒトＩｇＧに対して産生されたヒツジポリクローナル抗体（ペルオキシダーゼ標識されたもの、The Binding Site）によって検出する。
【０１００】
Ｆａｂ分子はまた、酵素的切断によって完全長抗体分子から作成することができる。このアプローチの利点は、堅調かつ効率的な発酵及び精製のためのプラットホームプロセスであって、所望の製品品質でのスケールアップ及び高収量に修正可能なプラットホームプロセスが適用可能であることである。精製のために、リコンビナントプロテインＡ樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーを一次捕捉工程として使用することができ、それにより通常は高い純度が得られる。
【０１０１】
この目的のために、Ｆａｂ配列をコードする重鎖を、ヒトＩｇＧ抗体分子のＦｃ領域に融合する。次に、得られた発現構築物を、無血清培地中に懸濁状態で成長しているＣＨＯ−ＤＧ４４細胞にリポフェクションを用いてトランスフェクションする。４８時間後に、２００μg/mLの抗生物質Ｇ４１８を含有しヒポキサンチン及びチミジンを含まない培地中で細胞を選択に供し、安定的にトランスフェクションされた細胞集団を作成する。続いて、メトトレキサート（ＭＴＸ）を漸増濃度（最大１００又は４００nM）で培養培地に添加することによって、これらの安定トランスフェクタントを遺伝子増幅に供する。細胞が適応したら、それらを１０〜１１日間フェドバッチ発酵に供し、ＩｇＧタンパク質材料を製造する。
【０１０２】
ＩｇＧタンパク質を、リコンビナントプロテインＡ−アフィニティークロマトグラフィーを使用することによって培養上清から精製する。次に、所望の中和Ｆａｂフラグメントを得るために、ヒンジ領域内でＩｇＧを切断するパパインの存在下で完全長ＩｇＧをインキュベーションし、それによって２本のＦａｂフラグメント及びＦｃ部分を放出させる。
【０１０３】
Ｆａｂ分子を、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＧ又はプロテインＬによって単離する。あるいは、低結合親和性及び低結合能の場合、Ｆａｂを、分子のｐＩを利用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって捕捉する。さらなる直交精製工程によって、ホスト細胞タンパク質及び混入物、例えばパパイン、ＤＮＡ又はウイルスを除去する。
【０１０４】
本発明の別の態様では、抗体分子は、本明細書において記載される抗体分子のアミノ酸配列変異体である。
【０１０５】
抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。このような変異体には、例えば、本明細書における実施例の抗体のアミノ酸配列内の残基から欠失させたもの、及び／又はそれに挿入したもの、及び／又はそれを置換したものが挙げられる。最終構築物が所望の性質を有するという条件で、その最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが作られる。また、アミノ酸変化により、グリコシル化部位の数又は位置が変化されるなど、ヒト化抗体又は変異抗体の翻訳後プロセスが変更されてもよい。
【０１０６】
抗体の特定の残基又は領域であって、突然変異誘発に好ましい位置の残基又は領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham及びWells(Science, 244:1081-1085 (1989))によって記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、ターゲット残基のうちの一残基又は群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性又は負電荷のアミノ酸（典型的には、アラニン）で置換してアミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次に、置換部位で若しくは置換部位のためにさらなる変異又は他の変異を導入することによって、置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置を絞り込む。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位を予め決定する一方で、突然変異の性質それ自体を予め決定する必要はない。例えば、所定部位での突然変異の成果を分析するために、アラニンスキャニング又はランダム突然変異誘発をターゲットコドン又はターゲット領域で実行し、所望の活性について、発現された抗体変異体をスクリーニングする。
【０１０７】
アミノ酸配列挿入体には、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合体及び／又はカルボキシル末端融合体、並びに単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入体が挙げられる。末端挿入体の例には、エピトープタグに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドの抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が挙げられる。
【０１０８】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内で少なくとも１個のアミノ酸残基が除去されており、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発について最も関心のある部位には、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換を、以下の表に「好ましい置換」の見出しで示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、「例示的な置換」と示されるより実質的な変化、又はアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されるようなより実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングしてもよい。
【０１０９】
【化３】
2014515740.tif 000005
【０１１０】
タンパク質化学において、抗体の生物学的特性は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の、例えばシート又はヘリカルコンフォメーションとしての構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の荷電若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさを維持することに及ぼす作用が顕著に異なる置換を選択することによって達成できることが、一般に認められている。天然に存在する残基は、共通の側鎖性質に基づき群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１１１】
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つの一メンバーを別のクラスに交換することを伴うものである。
【０１１２】
一般に、ヒト化抗体又は変異抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基もセリンで置換して、分子の酸化的安定性を改善するか、異常な架橋を防止するか、又は細胞毒性化合物若しくは細胞増殖抑制性化合物への所定の結合点を与えることができる。逆に、抗体にシステイン結合を加えて、その安定性を改善することができる（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０１１３】
置換変異体の１種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる開発のために選択されて得られた変異体は、それらが作成された親抗体と比較して改善された生物学的特性を有する。このような置換変異体を作成するのに便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を突然変異させて、考えられるすべてのアミノ置換を各部位に作成する。そのように作成された抗体変異体は、線維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として一価的にディスプレイされる。次に、ファージディスプレイされた変異体をそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、又は加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトダビガトランとの間の接触点を同定することが有益であり得る。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述される技術による置換の候補である。このような変異体を作成したら、変異体のパネルを本明細書において記載されるスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイで優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１１４】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させる。「変化させる」は、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を除去すること、及び／又は抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体を改変してグリコシル化部位を付加することが望ましいことがある。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基側鎖に炭水化物部分を結合させることを指す。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖に炭水化物部分を酵素的に結合させるための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位が生じる。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニン（もっとも５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンも使用することができる）に、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つを結合させることを指す。従って、所定のタンパク質、例えば抗体をグリコシル化するためには、１つ以上の上記トリペプチド配列を含有するようにタンパク質のアミノ酸配列を操作する（Ｎ−結合型グリコシル化部位の場合）。また、１つ以上のセリン又はトレオニン残基を元の抗体配列に付加するか、又はそれらの残基で置換することによって、変化させてもよい（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。
【０１１６】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の多様な方法によって調製される。これらの方法には、天然の供給源から単離すること（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又は本明細書において記載される抗体分子の先に調製した変異体型若しくは非変異体型をオリゴヌクレオチド介在性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発することによって調製することが挙げられるが、これらに限定されない。上記に概説するように、本発明の抗体分子の抗原は、抗凝固薬である。抗原は、動物の免疫処置によって、又はファージディスプレイ法のように配列ライブラリーから抗体配列を選択することによって抗体分子を作成するのに使用される。
【０１１７】
動物のための免疫処置プロトコールは、当技術分野において周知である。適切な免疫応答を達成するために、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、スクアレン、又はフロイント完全アジュバント／フロイント不完全アジュバントのようなアジュバントに抗原を結合させることが必要なことがある。ダビガトランのような本発明の文脈における抗原は、主に比較的小型の有機分子であって、動物に投与されたときに抗体の形成を刺激しないことがある有機分子である。従って、抗原をハプテンのような巨大分子に結合させることが必要なことがある。
【０１１８】
さらなる態様では、本発明は、医薬に使用するための上記抗体分子に関する。
【０１１９】
さらなる態様では、本発明は、前記抗体分子及び薬学的な担体を含む医薬組成物に関する。
【０１２０】
治療に使用するために、抗体分子は、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適切な医薬組成物に含められる。抗体分子の典型的な製剤は、抗体分子を生理学的に許容しうる担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、凍結乾燥若しくは別の方法で乾燥された製剤、あるいは水性溶液又は水性懸濁液若しくは非水性懸濁液の形態で調製することができる。担体、賦形剤、調整剤又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で非毒性である。それらには、緩衝系、例えばリン酸、クエン酸、酢酸及び他の無機酸又は有機酸並びにそれらの塩；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料、例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン；単糖、二糖、オリゴ糖又は多糖及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリン又はデキストラン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は、イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）又は脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル若しくは糖エステルが挙げられる。エタノール又はイソプロパノールなどの有機溶媒もまた、抗体製剤に含められ得る。賦形剤はまた、放出改変機能又は吸収改変機能を有してもよい。
【０１２１】
一態様では、医薬組成物は、水性緩衝液中に１０〜２０mg/mlの濃度で抗体分子を含むか、又はこのような溶液から作られた凍結乾燥物を含む。
【０１２２】
好ましい適用様式は、注入又は注射（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内）による非経口的なものであるが、吸入、経皮、鼻腔内、口腔、経口などによる他の適用様式もまた適用可能であり得る。
【０１２３】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固治療の副作用、特に出血事象の治療又は予防に使用するための上記抗体分子に関する。
【０１２４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載される疾患若しくは障害、特に抗凝固治療の副作用の処置又は予防のための医薬品を製造するための、本明細書において記載される抗体分子の使用に関する。
【０１２５】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固薬、特にダビガトラン又はダビガトランエテキシラートの過剰投与をリバースするに使用するための上記抗体分子に関する。
【０１２６】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固薬、特にダビガトラン又はダビガトランエテキシラートの解毒剤として使用するための上記抗体分子に関する。
【０１２７】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固治療の副作用を治療又は予防する方法であって、それを必要とする患者に上記抗体分子の有効量を投与することを含む方法に関する。
【０１２８】
さらなる態様では、本発明は、抗凝固治療における過剰投与事象を処置する方法であって、それを必要とする患者に上記抗体分子の有効量を投与することを含む方法に関する。
【０１２９】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者の血漿中のダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの濃度を低下させるための方法であって、患者におけるダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤を投与する工程を含む方法に関する。
【０１３０】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者に使用するためのダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤であって、患者が致死的と考えられる大量出血をしているか、若しくは血行動態の悪化に向かっているか、又は患者が緊急の医療措置を必要としている、リバース剤に関する。
【０１３１】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はそれらの薬学的に許容しうる塩で処置されている患者の血漿中のダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの濃度を低下させるための方法であって、患者におけるダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤を投与する工程を含み、ここで患者が致死的と考えられる大量出血をしているか、若しくは血行動態の悪化に向かっているか、又は患者が緊急の医療措置を必要としている、方法に関する。
【０１３２】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩で処置されている患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの抗凝固作用をリバースする方法であって、患者におけるダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するリバース剤を投与する工程を含み、ここで患者が致死的と考えられる大量出血をしているか、若しくは血行動態の悪化に向かっているか、又は患者が緊急の医療措置を必要としている、方法に関する。
【０１３３】
好ましい実施形態では、リバース剤は、ダビガトランに対する抗体分子であって、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート及び／又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの抗凝固活性を中和できる抗体分子である。別の好ましい実施形態では、リバース剤は、本明細書において記載されるダビガトランに対する抗体分子である。
【０１３４】
好ましくは、血漿中のダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの濃度は、０nMよりも高いが１０００μM未満であり、ダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するのに使用されるリバース剤は、リバース剤に対するダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの化学量論量で存在する。
【０１３５】
さらなる態様では、血漿中のダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの濃度は、０nMよりも高いが１０００μM未満であり、ダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するのに使用されるリバース剤は、リバース剤に対するダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドのモル比が１：１〜１：１００で存在する。
【０１３６】
さらなる態様では、血漿中のダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの濃度は、３０nM〜１０００μMであり、ダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性を中和するのに使用されるリバース剤は、リバース剤に対するダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの比が３０nM〜１０００μMで存在する。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、凝固能力障害又は外傷により出血を経験しているか、又は出血のリスクがある患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性をリバース又は低下させるための方法であって、
（ａ）患者の中に存在するダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの量を測定する工程；
（ｂ）患者において測定されたダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性をリバース又は低下させるのに有効な量の薬剤を投与する工程；及び
（ｃ）患者のトロンビン凝固時間をモニタリングして、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性のリバース又は低下が達成されたことを確認する工程
を含む方法に関する。
【０１３８】
好ましい態様では、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性のリバースは、１００％である。さらに好ましい態様では、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの活性の低下は、患者におけるダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの１０〜９９％である。
【０１３９】
投与されるべき抗体の「治療有効量」は、抗凝固治療の副作用を予防、改善、又は治療するのに必要な最小量、特に出血を止めるのに有効な最小量である。これは、抗体分子の化学量論量で達成することができる。
【０１４０】
ダビガトランは、例えば、推奨用量で投与された場合に、２００nM程度の血漿濃度に達し得る。分子量約５０ｋＤの一価抗体分子が使用される場合、ボーラスのように静脈内投与すると、例えば、約１mg/kgの用量で中和に達し得る。別の実施態様では、ヒト患者に適用されるＦａｂ分子の用量は、適用１回あたり５０〜１０００mg、例えば１００、２００、５００、７５０、又は１０００mgであり得る。状況に応じて、例えば、ダビガトランが患者に過剰投与された場合、さらにより高い用量、例えば適用１回あたり１２５０、１５００、１７５０又は２０００mgを適用することが適切であり得る。適切な用量は、投与される抗凝固薬の種類及び用量；このような投与からの経過時間、抗原分子の性質、患者の状態、並びに他の要因に応じて相違し得る。熟練の専門家は、治療的に有効かつ安全な用量を確立するための方法を知っている。
【０１４１】
さらなる態様では、本発明は、ダビガトラン及び／又はダビガトランエテキシラートに対する結合親和性を有する抗体分子に関する。好ましくは、抗体分子は、例えば、表面プラズモン共鳴分析（Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics. "Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.）又は結合平衡除外アッセイ（KinExA）技術（Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657）により測定される場合に、０．１pM〜１００μM、好ましくは１pM〜１００μM、より好ましくは１pM〜１μMの範囲のＫＤ値を有する親和性でダビガトラン及び／又はダビガトランエテキシラートに結合する。
【０１４２】
また、本発明の抗体分子の分析及び診断の手順に使用して、例えば血漿、血清、又は他の体液などのサンプル中の抗原濃度を測定することができる。例えば、抗原分子は、実施例に記載されるような酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用することができる。従って、さらなる態様では、本発明は、本明細書において記載される抗体分子を含む分析キット及び診断キット、並びに分析及び診断の各方法に関する。
【０１４３】
さらなる態様では、本発明は、前記請求項のいずれか一項に記載の抗体分子を製造する方法であって、
（ａ）発現コントロール配列と機能的に結合した前記抗体分子をコードする１つ以上の核酸を含むホスト細胞を提供すること、
（ｂ）前記ホスト細胞を培養すること、及び
（ｃ）細胞培養物から抗体分子を回収すること
を含む方法に関する。
【０１４４】
本発明は、経口抗凝固薬、特に直接トロンビン阻害剤の中和に有用な材料を含有する製品及びキットをさらに提供する。製品は、ラベル付きの容器を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、及び試験管が挙げられる。容器は、ガラス、金属、プラスチック又はそれらの組み合わせなどの多様な材料から形成されてもよい。容器は、本明細書において記載される抗体又はダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ若しくはその薬学的に許容しうる塩を含む医薬組成物を収容する。医薬組成物中の活性薬剤は、特定の抗体又はダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ若しくはその薬学的に許容しうる塩である。抗体の容器上のラベルは、医薬組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏでダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を中和又は部分的に中和するのに使用されることを示す。
【０１４５】
本発明のキットは、１つ以上の上記容器を含む。キットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を含む添付文書などの商業的及び利用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０１４６】
本発明の一実施態様では、キットは、本明細書において記載されるいずれかの抗体のうちの１つの抗体又はその医薬組成物を含む。例えば、キットは、（１）本明細書において記載されるいずれかの抗体又はその医薬組成物、（２）容器及び（３）ラベルを含み得る。
【０１４７】
別の実施態様では、キットは、本明細書において記載されるいずれかの抗体のうちの１つの抗体又はその医薬組成物、及びダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を含む。ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩の形態は、固体、液体又はゲルの形態であり得る。好ましい実施態様では、ダビガトランエテキシラートの薬学的に許容しうる塩は、メシラート塩である。さらに別の好ましい実施態様では、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩の投与単位あたりの量は、約５０mg〜約４００mg、約７５mg〜約３００mg、約７５mg〜１５０mg、又は約１１０mg〜約１５０mgであり、１日１回（ＱＤ）又は１日２回（ＢＩＤ）投与される。例えば、キットは、（１）本明細書において記載されるいずれかの抗体又はその医薬組成物、（２）ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩の医薬組成物、（３）容器及び（４）ラベルを含み得る。
【０１４８】
別の実施態様では、キットは、（１）ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を含む第１の医薬組成物、（２）本明細書において記載されるいずれかの抗体又はその組み合わせを含む第２の医薬組成物、（３）患者に前記第１及び第２の医薬組成物を別々に投与するための説明書を含み、ここで、前記第１及び第２の医薬組成物は、別々の容器に含まれており、前記第２の医薬組成物は、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドの中和又は部分的な中和を必要としている患者に投与される。本発明はまた、ダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩で処置されている患者においてダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和又は部分的に中和するための診断方法であって、本明細書において記載される抗体のいずれか１つ、その組み合わせ又はその医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的には、本発明は、患者においてダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和又は部分的に中和するための方法であって、（ａ）患者がダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩で処置されていたこと、及び患者によって取り込まれた量を確認する工程；（ｂ）凝固若しくは血液凝固の試験又はアッセイを行う前に、本明細書において記載される抗体いずれか１つ又はその組み合わせでダビガトラン又は１−Ｏ−アシルグルクロニドを中和する工程、ここで、ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドは試験又はアッセイの結果の正確な読み出しを妨害するであろう；（ｃ）患者から採取されたサンプルで凝固若しくは血液凝固の試験又はアッセイを行って、ダビガトランもダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドも存在しない場合の血餅形成レベルを測定する工程；並びに（ｄ）患者における血餅形成と分解との間の適切なバランスを達成するために、患者に投与されるダビガトラン、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランのプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩の量を調整する工程を含む方法を提供する。ダビガトラン又はダビガトランの１−Ｏ−アシルグルクロニドに対する抗体のモル比は、０．１〜１００、好ましくは０．１〜１０のモル比である。試験又はアッセイの結果の正確な読み出しは、フィブリノゲンレベル、活性化プロテインＣ抵抗性又は関連試験の正確な読み出しでもよい。
【０１４９】
実施例
Ｉ．ポリクローナル抗ダビガトラン抗体の製造
ポリクローナル抗ダビガトラン抗体の製造のために、２種の異なるハプテン及び異なるモル投入量比のハプテンと担体タンパク質（ＢＳＡ）を用いて、３種の異なる免疫原を製造した。
【０１５０】
スクリーニングのために、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲートを製造し、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。
【０１５１】
ポリクローナル抗体のさらなる精製は、プロテインＡセファロースＦＦのアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０１５２】
１．材料及び方法
試験化合物（ダビガトラン）
【表１】
2014515740.tif 000006
【０１５３】
１．１  免疫原及びトレーサーの合成に使用したハプテン
【表２】
2014515740.tif 000007
【０１５４】
１．２  ハプテンの合成
ハプテン（ハプテン１及びハプテン２）を以下のように合成した：
ハプテン１  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（４−アミノ−ブチルカルバモイル）−エチル］−フェニル−アミド
【化４】
2014515740.tif 000008
【０１５５】
１ａ  ３−［（４−メチルアミノ−３−ニトロ−ベンゾイル）−フェニル−アミノ］−プロピオン酸メチルエステル
【化５】
2014515740.tif 000009
【０１５６】
４−メチルアミノ−３−ニトロ−安息香酸クロリド（２３．３mmol）及び３−フェニル−アミノ−プロピオン酸メチルエステル（２３．３mmol）を８０mLの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させた溶液に、トリエチルアミン（５０．２mmol）を撹拌しながら室温で滴下した。３時間後に、反応混合物を蒸発乾固し、残った固体を水と一緒に摩砕し、固体生成物をろ過により単離した。
収率：９９％
Ｃ１８Ｈ１９Ｎ３Ｏ５（３５７．３６）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール１９：１）：Ｒｆ＝０．４８
【０１５７】
１ｂ  ３−［（３−アミノ−４−メチルアミノ−ベンゾイル）−フェニル−アミノ］−プロピオン酸メチルエステル
【化６】
2014515740.tif 000010
【０１５８】
触媒としてＰｄ（炭上に１０％）を用いてエタノール中、室温で水素化することによって生成物１ａのニトロ基を還元した。
収率：９９％
Ｃ１８Ｈ２１Ｎ３Ｏ３（３２７．３８）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール９：１）：Ｒｆ＝０．２３
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３２８
【０１５９】
１ｃ  ３−（｛３−［２−（４−シアノ−フェニルアミノ）−アセチルアミノ］−４−メチルアミノ−ベンゾイル｝−フェニル−アミノ）−プロピオン酸メチルエステル
【化７】
2014515740.tif 000011
【０１６０】
ＣＤＩ（２３．２mmol）を用いて、生成物１ｂ（２３．２mmol）及びＮ−（４−シアノ−フェニル）−グリシン（２３．２mmol）を無水ＴＨＦ中、室温でカップリングさせた。反応の完了後に、混合物を蒸発乾固させ、さらに精製せずに粗生成物を使用した。
収率：９７％
Ｃ２７Ｈ２７Ｎ５Ｏ４（４８５．５４）
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４８６
【０１６１】
１ｄ  ３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−フェニル−アミノ）−プロピオン酸メチルエステル
【化８】
2014515740.tif 000012
【０１６２】
生成物１ｃ（２２．６mmol）を１００mLの濃酢酸に溶解させた溶液を１時間加熱還流した。次に、その溶液を蒸発乾固し、残った固体を水と一緒に摩砕し、撹拌しながらｐＨを約８〜９に調整した。酢酸エチルで抽出することによって粗生成物を単離し、シリカゲルのクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／エタノール１：１）によって精製した。
収率：５８％
Ｃ２７Ｈ２５Ｎ５Ｏ３（４６７．５２）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール９：１）：Ｒｆ＝０．７１
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６８
【０１６３】
１ｅ  ３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−フェニル−アミノ）−プロピオン酸
【化９】
2014515740.tif 000013
【０１６４】
生成物１ｄ（１３．０mmol）を１００mLのメタノールに溶解させた溶液に、水酸化ナトリウム（２０．０mmol）を添加した。混合物を４０℃で２．５時間撹拌し、次に蒸発乾固した。残った固体を１００mLの水と一緒に撹拌し、濃酢酸でｐＨを約６に調整した。沈殿した生成物をろ過によって単離し、水で洗浄し、６０℃で乾燥させた。
収率：８８％
Ｃ２６Ｈ２３Ｎ５Ｏ３（４５３．４９）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール９：１）：Ｒｆ＝０．３３
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４５４
【０１６５】
１ｆ  ｛４−［３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−フェニル−アミノ）−プロピオニルアミノ］−ブチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
【化１０】
2014515740.tif 000014
【０１６６】
生成物１ｅ（５．２３mmol）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、５．２３mmol）及びＮ−メチル−モルホリン（５．２３mmol）を２０mLのＤＭＦに溶解させた溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、（４−アミノ−ブチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．２３mmol）を添加し、混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。次に、混合物を水（１００mL）で希釈し、酢酸エチルで抽出することによって生成物を単離した。
収率：９２％
Ｃ３５Ｈ４１Ｎ７Ｏ４（６２３．７５）
ＴＬＣ（シリカゲル；ジクロロメタン／エタノール９：１）：Ｒｆ＝０．５１
【０１６７】
１ｇ  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（４−アミノ−ブチルカルバモイル）−エチル］−フェニル−アミド
【化１１】
2014515740.tif 000015
【０１６８】
生成物１ｆ（４．８１mmol）をＨＣｌの飽和エタノール溶液（２５０mL）に溶解させ、混合物を室温で一晩撹拌し、次に３０℃で蒸発乾固した。残った粗物質を２００mLの無水エタノールに溶解させ、次に炭酸アンモニウム（４８．１mmol）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、残った粗物質を約５mLのエタノールと一緒に摩砕し、不溶性物質をろ過によって分離し、溶媒を３０℃で蒸発させた。次に、生成物を３０mLの水に溶解させ、この溶液を約２ｇの炭と一緒に撹拌し、ろ過し、蒸発乾固した。
収率：９０％
Ｃ３０Ｈ３６Ｎ８Ｏ２（５４０．６７）
ＴＬＣ（逆相ＲＰ−８；メタノール／５％ＮａＣｌ水溶液９：１）：Ｒｆ＝０．７９
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５４１
［Ｍ＋Ｃｌ］−＝５７５／７
【０１６９】
ハプテン２  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（２−アミノ−エチルカルバモイル）−エチル］−ピリジン−２−イル−アミド
【化１２】
2014515740.tif 000016
【０１７０】
２ａ  ３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−ピリジン−２−イル−アミノ）−プロピオン酸
【化１３】
2014515740.tif 000017
【０１７１】
水酸化ナトリウム（５０．０mmol）を５００mLのエタノール及び５０mLの水に溶解させた溶液に、３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−ピリジン−２−イル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル（４１．４mmol）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次に約３５０mLのエタノールを留出させ、約１００mLの水を添加し、ｐＨを６に調整した。次に、ジエチルエーテル（５０mL）を添加し、混合物を一晩撹拌した。生成物をろ過により単離し、さらに精製せずに使用した。
収率：７８％
Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６Ｏ３（４５４．４８）
【０１７２】
２ｂ  ｛２−［３−（｛２−［（４−シアノ−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝−ピリジン−２−イル−アミノ）−プロピオニルアミノ］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
【化１４】
2014515740.tif 000018
【０１７３】
生成物２ａ（２．２０mmol）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、２．２０mmol）及びＮ−メチル−モルホリン（２．２０mmol）を無水テトラヒドロフラン（１００mL）に溶解させた溶液を室温で１５分間撹拌した。次に、（２−アミノ−エチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．２０mmol）を添加し、混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。次に、混合物を４０mLの水で希釈し、酢酸エチルで抽出することによって生成物を単離し、クロマトグラフィー（シリカゲル；ジクロロメタン／メタノール１５：１）によって精製した。
収率：６１％
Ｃ３２Ｈ３６Ｎ８Ｏ４（５９６．６８）
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝５９７
［Ｍ＋Ｈ］−＝５９５
【０１７４】
２ｃ  ２−［（４−カルバムイミドイル−フェニルアミノ）−メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸［２−（２−アミノ−エチルカルバモイル）−エチル］−ピリジン−２−イル−アミド
【化１５】
2014515740.tif 000019
【０１７５】
生成物２ｂ（１．３４mmol）をＨＣｌの飽和無水エタノール溶液（３０mL）に添加した。この溶液を室温で５時間撹拌し、次に３０℃で蒸発乾固した。エタノール（３０mL）及び炭酸アンモニウム（１３．０mmol）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。次に、溶媒を蒸発させ、残った物質をジクロロメタン／メタノール（３０：１）混合物約４mLと一緒に５回摩砕し、ろ過し、蒸発させて、無機塩から生成物を分離した。
収率：２７％
Ｃ２７Ｈ３１Ｎ９Ｏ２（５１３．６１）
質量スペクトル（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｃｌ］−＝５４８／５０
［Ｍ＋ＨＣｌ＋Ｃｌ］−＝５８４／６
［Ｍ＋Ｈ］＋＝５１４
【０１７６】
２．化学物質
２．１  試薬合成用の化学物質
【表３】
2014515740.tif 000020
【０１７７】
２．２  ＥＬＩＳＡ用の化学物質
【表４】
2014515740.tif 000021
【０１７８】
２．３  ＥＬＩＳＡ用の緩衝液
【表５】
2014515740.tif 000022
Elgastat Maxima-HPLC超純水処理システムからの水を使用して、緩衝溶液を調製した。
【０１７９】
３．免疫原の合成
ウサギの免疫系を刺激してダビガトランに対するポリクローナル抗体を産生させるために、カップリング試薬として１，４−ベンゾキノン又は１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を使用して、ハプテン（ハプテン１及びハプテン２）を担体タンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））にカップリングさせることによって、３種の免疫原（ロット番号ＧＬ２５６、ＧＬ２５８、及びＧＬ２６２）を合成した。
【０１８０】
ＧＬ２５６の合成のために、２個の反応部位を有するホモ二官能性化合物として１，４−ベンゾキノンを使用した。まず、それを、酸性ｐＨで２個の部位のうち一方のみにおいてアミノ基と反応させ、そしてアルカリ性ｐＨでもう一方の部位において反応させて、ポリマー化を最低限とする。ＧＬ２５８及びＧＬ２６２は、カップリング試薬として１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を使用し、担体タンパク質に対して異なる投入量比のハプテンを用いて合成した。
【０１８１】
３．１  ＧＬ２５６の合成
０．７５μMolのＢＳＡを８．５mLの０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ＝４．５）に溶解させた溶液に、０．４１６mMolの１，４−ベンゾキノン（エタノール１．５mL中）を添加し、室温、暗中で１．５時間インキュベーションした。その後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ２５カラムにこの溶液を通して、過剰の１，４−ベンゾキノン（最終体積１２．５mL）を除去した。
【０１８２】
５２５μMolのハプテン（ハプテン１）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ＝８．５）２mLに溶解させた溶液に、２．５mL（０．１５μMol）の精製ＢＳＡ溶液を撹拌しながらゆっくりと添加した。ＢＳＡ溶液を添加する間に、ｐＨを約８．０に調整した。ハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は、３５００：１であった。
【０１８３】
室温で一晩インキュベーション後に、免疫原を１リットルの蒸留水に対して６回透析した。薄層クロマトグラフィーにより、非結合ハプテンのスポットは、ハプテン−担体コンジュゲート中に残っていないことが示された。
【０１８４】
免疫原を等分して−２０℃で凍結保存した。免疫原の上清におけるハプテンによるＢＳＡの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって測定したところ、約１：１８であった。最終溶液中の免疫原の含量は、ＧＬ２５６  ０．７５mg/mLであった。
【０１８５】
３．２  ＧＬ２５８の合成
１５８μMolのハプテン２を６．３mLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた溶液を室温で調製した。１５８μMolの１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を添加し、まず１０℃で４時間インキュベーションし、その後に室温で３０分間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックしたところ、約２０〜２５％であった。次に、０．７５μMolのＢＳＡを２mLの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解させ、１mLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を撹拌しながら滴下した。ｐＨを約８．３に調整した。その後、ハプテン溶液（６．３mL）及び４mLの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３をＢＳＡ溶液に撹拌しながら滴下し、ｐＨを８．４に調整した。免疫原ＧＬ２５８について、ハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は、２１０：１であった。
【０１８６】
撹拌条件下、室温で一晩インキュベーションした後に、免疫原を１リットルの蒸留水に対して６回透析した。薄層クロマトグラフィーにより、非結合ハプテンのスポットは、ハプテン−担体コンジュゲート中に残っていないことが示された。
【０１８７】
免疫原を等分して−２０℃で凍結保存した。免疫原の上清におけるハプテンによるＢＳＡの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって測定したところ、約１：５であった。最終溶液中の免疫原の含量は、ＧＬ２５８  ０．２８mg/mLであった。
【０１８８】
３．３  ＧＬ２６２の合成
２２５μMolのハプテン２を８．７５mLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた溶液を室温で調製した。２２５μMolの１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を添加し、１０℃で４時間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックしたところ、約２０〜２５％であった。
【０１８９】
次に、０．４９μMolのＢＳＡを２mLの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解させ、１mLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を撹拌しながら滴下した。ｐＨを約８．２に調整した。その後、ハプテン溶液（８．７５mL）及び６mLの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３をＢＳＡ溶液に撹拌しながら滴下し、ｐＨを８．３に調整した。免疫原ＧＬ２６２について、ハプテンと担体タンパク質のモル投入量比は、４６０：１であった。
【０１９０】
撹拌条件下、室温で一晩インキュベーションした後に、免疫原を１リットルの蒸留水に対して６回透析した。薄層クロマトグラフィーにより、非結合ハプテンのスポットは、ハプテン−担体コンジュゲート中に残っていないことが示された。
【０１９１】
免疫原を等分して−２０℃で凍結保存した。免疫原の上清におけるハプテンによるＢＳＡの置換度は、３０２nmでＵＶ吸収分光法によって測定したところ、約１：３２であった。最終溶液中の免疫原の含量は、ＧＬ２６２  ０．７１mg/mLであった。
【０１９２】
４．コンジュゲートの合成
４．１  ＧＬ２６１の合成
３７．４μMolのハプテン２を１．５mLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた溶液を室温で調製した。３７．５μMolの１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）を添加し、まず１０℃で４時間インキュベーションし、その後に室温で３０分間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィーで化学反応をチェックしたところ、約２０〜２５％であった。
【０１９３】
次に、１．１２５μMolの酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．４mLの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解させ、０．２６７mLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を撹拌しながら滴下した。ｐＨを約８．２に調整した。その後、０．９mLのハプテン溶液（２２．５μMol）及び０．５７mLの０．１３Ｍ  ＮａＨＣＯ３をＨＲＰ溶液に撹拌しながら滴下し、ｐＨを８．４に調整した。ＨＲＰコンジュゲートＧＬ２６１について、ハプテンとＨＲＰのモル投入量比は、２０：１であった。
【０１９４】
撹拌条件下、室温で一晩インキュベーションした後に、ゲルクロマトグラフィーによって、有機溶媒及び過剰のハプテンからＨＲＰコンジュゲートを分離した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ２５カラムにこの溶液を通した。
【０１９５】
最終濃度のハプテン−ＨＲＰコンジュゲート（トレーサー、５．６４mg/mL）をＢＳＡでスパイクして濃度を約１０mg/mLにして、等体積のグリセリン（凍結防止のため）及びチモールの結晶（細菌の成長を防止するため）を加えた。トレーサー溶液をロット番号ＧＬ２６１とラベルし、等分して−２０℃で保存した。
【０１９６】
ハプテンによるＨＲＰの置換度は、３０２nmでＵＶ分光法によって測定したところ、１：０．２であった。
【０１９７】
ＢＳＡでブロッキングしたマイクロタイタープレートにおいて、基質としてｏ−フェニレン−ジアミン（ＯＰＤ）及び対照物質としてネイティブなＨＲＰを使用して、トレーサーの比活性を測定した。希釈したＨＲＰ標準又はハプテン−ＨＲＰコンジュゲートと基質溶液との混合物を暗中で３０分間インキュベーションし、硫酸で停止させ、吸光度を４９０nmで測定した。残りの活性はネイティブなＨＲＰの９４％であり、グリセリン中でのコンジュゲート形成の比活性は６１１U/mLであった。
【０１９８】
トレーサーの規格の概要：
【表６】
2014515740.tif 000023
【０１９９】
５．免疫処置及び抗体の製造
５．１  ウサギの免疫処置
１００μgの免疫原ＧＬ２５６、ＧＬ２５８及びＧＬ２６２を０．５mLの０．９％ＮａＣｌ溶液及び０．５mLのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）のエマルションで、１２匹の雌チンチラウサギ（３月齢）を免疫処置した。続いて翌月に、追加免疫処置を何回か行った。３回目の免疫処置については、０．５mLのフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用した。４箇所の皮下部位及び４箇所の筋肉内部位に各免疫処置を行った。
【０２００】
Ａ群−免疫原ＧＬ２５６
ウサギ１  ＃５０
ウサギ２  ＃５１
ウサギ３  ＃５２
ウサギ４  ＃５３
【０２０１】
Ｂ群−免疫原ＧＬ２５８
ウサギ５  ＃５４
ウサギ６  ＃５５
ウサギ７  ＃５６
ウサギ８  ＃５７
【０２０２】
Ｃ群−免疫原ＧＬ２６２
ウサギ９    ＃４６
ウサギ１０  ＃４７
ウサギ１１  ＃４８
ウサギ１２  ＃４９
【０２０３】
【表７】
2014515740.tif 000024
【０２０４】
５．２  ウサギ血清の分析
ウサギの凝固血液を遠心分離することによって、血清を調製した。硫酸アンモニウム沈殿、及びセファデックスＧ２５カラムを通して脱塩することによって、タンパク質画分を得た。
【０２０５】
標準的なＥＬＩＳＡ法によって、ウサギ血清からの個々のタンパク質画分を、抗ダビガトラン力価についてスクリーニングした。
【０２０６】
スクリーニング−ＥＬＩＳＡ
【表８】
2014515740.tif 000025
【０２０７】
５．３  ウサギ血清中の抗ダビガトラン抗体の検出
最後の３個の欄：値はダビガトランに関するものである。
【０２０８】
【表９】
2014515740.tif 000026
2014515740.tif 000027
【０２０９】
採血２からの全ウサギのタンパク質画分をスクリーニングした後、好ましいハプテン（ハプテン２）を用いて抗ダビガトラン抗体の力価が最も高いのは、ウサギ番号５（＃５４）であることが明らかになった。さらに、低濃度の分析物（ダビガトラン）だけを用いて、抗体結合部位からトレーサーを置換することが可能であった。
【０２１０】
最後の採血３のスクリーニングについては、使用した免疫原に関する情報が欠落しているので、低濃度の分析物（ダビガトラン）を用いた抗体結合部位からのトレーサーの置換を主な決定基準として使用した。従って、ウサギ番号２、３及び５をさらなる精製に使用した。
【０２１１】
５．４  ポリクローナル抗体の精製
ウサギ番号５（＃５４）、採血番号２及びウサギ番号２、３及び５、採血番号３（最後の採血）の抗血清を硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿物を４５００Ｕ／分、１０℃で３０分間遠心分離し、溶液から分離し、トリス緩衝液中に再溶解させた。この手順を繰り返した。プロテインＡセファロースＦＦのアフィニティークロマトグラフィーによって、さらなる精製を行った。カラム緩衝液は０．０１Ｍトリス（ｐＨ＝７．５）であり、０．１Ｍグリシン（ｐＨ＝３．０）を溶離に使用した。ウサギＩｇＧを含有する画分を合わせた。タンパク質濃度は、２８０nmでのＵＶ分光法によって測定した。
【０２１２】
抗体の規格の概要：
【表１０】
2014515740.tif 000028
【０２１３】
ＩＩ．ダビガトランの中和
２系列の実験を行って、ダビガトラン抗凝固活性に対する抗体の作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した。４種のポリクローナル抗体を実験室で受け取り、ヒト血漿でさらに試験した。これを機能的アッセイ（トロンビン凝固時間）で試験した。
【０２１４】
アッセイの説明：
簡潔に言えば、ヒト血漿は、全血を３．１３％クエン酸ナトリウムに入れることによって得る。次に、これを遠心分離して無血小板血漿を得て、別個のチューブに移し、アッセイの日に必要とされるまで凍結する。アッセイの日に血漿を３７℃で解凍する。
【０２１５】
トロンビン凝固時間は以下のように行う。まず、付属の緩衝液（Dade Behring Test kit）中で、製造業者の指定通りにトロンビンを希釈し（３ＩU/mLトロンビン）、３７℃に予熱する。調製してから２時間以内に、それを使用する。すべてのアッセイを市販のＣＬ４凝固測定機（Behnk Electronics, Norderstadt, Germany）で行った。磁気スターラーを備える付属のキュベットに５０μLの血漿をピペットで入れ、ＣＬ４機器において、３７℃に予熱したウェルの中で２分間撹拌する。この時点で、１００μLのトロンビン溶液を添加し、血漿サンプルが凝固するのに必要な時間をＣＬ４によって自動的に記録する。付属のキュベットに入れた血漿中でダビガトランを５分間プレインキュベーションしてからトロンビンを添加し、測定を開始する。抗体も試験する場合（最大５０μLの原液）、３７℃でさらに５分間インキュベーションしてから凝固を開始する（すなわち、ダビガトランと一緒に合計１０分間インキュベーションし、抗体と一緒に合計５分間インキュベーションし、次にトロンビンで凝固を開始させる）。
【０２１６】
最初に、ヒト血漿に漸増濃度のダビガトランを添加し、トロンビンを添加してから凝固までの時間を測定することによって、ダビガトランの標準曲線を作成した（図１）。トロンビン凝固時間は、ダビガトラン濃度の増加とともに濃度依存的に増加した。
【０２１７】
最初のセットの中和実験については、中和のために、臨床的に関連する濃度である２００nMのダビガトランをすべての血漿サンプルに添加した。４個の抗体調製物はすべて、ダビガトランを含有する血漿での凝固時間を短縮することができた（図２）。中和度は、各抗体調製物中のタンパク質濃度に相関していた。次に、最高濃度の抗体溶液（Ｄ）を系列希釈し、別々の実験セットにおいて、２００nMのダビガトランの抗凝固活性を中和する能力について試験した。ダビガトラン誘導性の抗凝固活性は、抗体濃度の増加とともに濃度依存的に阻害されたことが、図３で分かる。加えて、ダビガトランを含有する血漿に非特異的ウサギポリクローナル抗体（青色四角）を添加したところ、抗凝固活性を中和する能力はなかった。濃度依存性及び非特異的抗体の中和欠如は、抗体による抗血液凝固のリバースがダビガトランに特異的であることを示している。
【０２１８】
しかしながら、これらの濃度のダビガトランは臨床的に意義があるものであり、出血又は過剰投与は、おそらくより高濃度で起こるであろう。従って、抗体が、図１の標準曲線における最高濃度のダビガトラン（５００nM）の抗凝固活性を阻害する能力も試験した。図４は、抗体Ｄが高濃度のダビガトランも阻害することができたことを示す。
【０２１９】
ＩＩＩ．モノクローナル抗ダビガトラン抗体の製造及び特性決定
１．モノクローナル抗ダビガトラン抗体及びＦａｂの製造
ヘモシアニンなどの担体タンパク質にコンジュゲーションしたハプテン１（実施例１．１を参照されたい）でマウスを免疫処置し、標準的な手順により免疫グロブリン及びハイブリドーマを作成した。培養上清から精製したモノクローナル抗体は、ダビガトラン−タンパク質コンジュゲートに結合し、この結合は溶液中のダビガトランで競合することができ、半最大阻害濃度は１〜１０nMの範囲であった。モノクローナル抗体をパパインで切断し、続いてプロテインＡによりＦｃドメインを除去することによって、Ｆａｂを作成した。
【０２２０】
マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をクローニングし、標準方法を用いて配列決定した。抗体の質量分析及びＮ−末端配列決定によるタンパク質分析によって、配列を確認した。特異的マウス可変領域及びヒトＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体をコードするＤＮＡ構築物を作成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でタンパク質を発現させ、精製した。
【０２２１】
潜在的な免疫原性を減少させるために、マウスモノクローナル抗体クローン３５Ｅ６及び２７Ａ９の配列を上記標準方法によってヒト化した。ヒト化Ｆａｂは、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３；ＣＨＯ細胞）で一過的にトランスフェクションすることによって製造し、ベンズアミジンセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーをした後にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２２２】
２．モノクローナル抗ダビガトラン抗体及びＦａｂの特性決定
９種のモノクローナル抗体クローンＤＢＧ２２（クローン２２）、３５Ｅ６、４５Ｂ９、４８Ｅ１、４９Ｆ８、６Ａ７Ｆ１、２Ｆ１Ｅ５、３Ｂ４Ｅ７、１Ｆ６Ｇ８、２Ｄ２Ｅ３及び２７Ａ９の可変ドメイン配列を表１に示す。配列番号６７、６８、６９、９２、９３、９４、９９、１００及び１０１は、最適化及び／又はヒト化した配列を表す。Ｆａｂ化合物ＶＨ５Ｃ／ＶＫ１８は、重鎖としてＨＣＶＨ５Ｃ（配列番号９９）及び軽鎖としてＬＣＶＫ１８（配列番号１００）を含む。Ｆａｂ化合物ＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１は、重鎖としてＨＣＶＨ５Ｃ（配列番号９９）及び軽鎖としてＬＣＶＫ２１（配列番号１０１）を含む。従って、ＶＨ５Ｃ／ＶＫ１８及びＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１は両方とも、配列番号６７のＣＤＲ１、配列番号６８のＣＤＲ２及び配列番号９のＣＤＲ３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６４のＣＤＲ１、配列番号６５のＣＤＲ２及び配列番号６９のＣＤＲ３を有する軽鎖可変ドメインとを含む。両Ｆａｂは、配列番号９２（ＶＨ５Ｃ）の重鎖可変領域が共通している。ＶＨ５Ｃ／ＶＫ１８は、配列番号９３（ＶＫ１８）の軽鎖可変領域を含み、ＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１は、配列番号９４（ＶＫ２１）の軽鎖可変領域を含む。
【０２２３】
表１において、「ＣＤＲ」という文字は相補性決定領域を意味し、「ＶＨ」は重鎖可変領域を意味し、「ＶＫ」はκ軽鎖可変領域を意味し、「ＣＬ」は軽鎖定常領域を意味し、「ＣＨ」は重鎖定常領域を意味し、「ＬＣ」は抗体分子の軽鎖を意味し、「ＨＣ」は抗体分子の重鎖を意味する。例えば、「ＶＨＣＤＲ１  ＤＢＧ２２」は、クローンＤＢＧ２２の重鎖可変ドメインの第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）を意味し、「ＤＢＧ２２ＶＨ」は、クローンＤＢＧ２２の重鎖可変領域を意味する。
【０２２４】
【表１１】
2014515740.tif 000029
2014515740.tif 000030
2014515740.tif 000031
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2014515740.tif 000035
【０２２５】
実施例ＩＩに概説したトロンビン凝固時間アッセイにおいて、ヒト血漿中でのダビガトランの抗凝固活性を中和する能力について、マウスモノクローナル抗体クローン２２を試験した。この抗体は、ヒト血漿中で、ダビガトランを介したトロンビン依存性凝固延長を用量依存的に完全にリバースした（図５）。この抗体はまた、ヒト全血中で、ダビガトランの機能を効果的に阻害した。この抗体から作成したＦａｂは、ヒト血漿中でダビガトランの活性を遮断したが、このことは、一価の抗原結合ドメインが化合物の抗凝固活性を中和できることを示している（図６）。
【０２２６】
ヒトにおけるダビガトランの主な代謝経路は、カルボン酸部分のグルクロン酸抱合による。ダビガトランアシルグルクロニドは、薬理学的に活性であることが示されている（Ebner et al., Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75）。マウスモノクローナル抗体クローン２２がこれらの代謝物を中和できるかどうかを試験するために、ダビガトランで処置したアカゲザルの尿からダビガトランアシルグルクロニドを精製し、トロンビン凝固時間アッセイで評価した。抗体は、ヒト血漿中で、ダビガトランアシルグルクロニドを介したトロンビン依存性凝固延長を、ダビガトランで見られたのと類似の効力で用量依存的にリバースした（図７）。従って、この抗体は、ヒトで見られるダビガトラン代謝物の抗凝固活性を遮断するのに有効である。
【０２２７】
Ｆａｂと、クローン２２の可変ドメインを含むマウス−ヒトキメラ抗体との親和性は、Kinexa技術を用いて測定した。一定濃度のＦａｂ又はキメラ抗体を、様々な濃度のダビガトランと一緒に、平衡に到達するまでインキュベーションした。このインキュベーションの後に、ビオチン標識ダビガトランアナログとカップリングしたニュートラアビジンビーズ上に抗体を捕捉することによって、遊離抗体の濃度を測定した。捕捉したＦａｂを、ＦＩＴＣでラベルした抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて検出した。捕捉したキメラ抗体を、Ｃｙ５標識抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。解離定数は、１：１結合モデルを用いて計算した。これらの実験の結果を以下の表に要約する。
【０２２８】
抗ダビガトラン抗体の親和性
【表１２】
2014515740.tif 000036
【０２２９】
Ｆａｂ及びキメラ抗体は両方とも、高親和性でダビガトランに結合する。
【０２３０】
トロンビン凝固時間アッセイ
簡潔に言えば、ヒト血漿は、全血を３．１３％クエン酸ナトリウムに入れることによって得る。次に、これを遠心分離して無血小板血漿を得て、別個のチューブに移し、アッセイの日に必要とされるまで凍結する。アッセイの日に血漿を３７℃で解凍する。
【０２３１】
トロンビン凝固時間は以下のように行う。まず、付属の緩衝液（Dade Behring Test kit）中で、製造業者の指定通りにトロンビンを希釈し（３ＩU/mLトロンビン）、３７℃に予熱する。調製してから２時間以内に、それを使用する。すべてのアッセイを市販のＣＬ４凝固測定機（Behnk Electronics, Norderstadt, Germany）で行った。磁気スターラーを備える付属のキュベットに５０μLの血漿をピペットで入れ、ＣＬ４機器において、３７℃に予熱したウェルの中で２分間撹拌する。この時点で、１００μLのトロンビン溶液を添加し、血漿サンプルが凝固するのに必要な時間をＣＬ４によって自動的に記録する。付属のキュベットに入れた血漿中でダビガトランを５分間プレインキュベーションしてからトロンビンを添加し、測定を開始する。抗体も試験する場合（最大５０μLの原液）、３７℃でさらに５分間インキュベーションしてから凝固を開始する（すなわち、ダビガトランと一緒に合計１０分間インキュベーションし、抗体と一緒に合計５分間インキュベーションし、次にトロンビンで凝固を開始させる）。
【０２３２】
トロンビン時間アッセイにおけるキメラ抗体及びヒト化Ｆａｂの活性は、それぞれ図８〜１０に示す。
【０２３３】
親和性測定（Kinexa法）
Ｆａｂ及びマウス−ヒトキメラ抗体の親和性は、Kinexa（登録商標）技術を用いて測定した。一定濃度のＦａｂ又はキメラ抗体を、様々な濃度のダビガトランと一緒に、平衡に到達するまでインキュベーションした。このインキュベーションの後に、ビオチン標識ダビガトランアナログとカップリングしたニュートラアビジンビーズ上に抗体を捕捉することによって、遊離抗体の濃度を測定した。捕捉したＦａｂを、ＦＩＴＣでラベルした抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて検出した。捕捉したキメラ抗体を、Ｃｙ５標識抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。解離定数（ＫＤ）は、１：１結合モデルを用いて計算した。
【０２３４】
KinExA（登録商標）機器を用いて速度定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を測定するために、Kinetics Direct法を使用した。この方法では、結合パートナーを溶液中で混合し、活性結合部位は複合体の形成により消耗されるので、遊離活性結合部位濃度を経時的に調べる。データ点を特定の時間間隔で収集し、シグナルを分析する。この方法では、ｋｏｎは直接測定し、ｏｆｆ速度ｋｏｆｆはｋｏｆｆ＝ＫＤｘｋｏｎとして計算する。
【０２３５】
【表１３】
2014515740.tif 000037
【０２３６】
【表１４】
2014515740.tif 000038
【０２３７】
Ｆａｂ−ダビガトラン複合体の形成及び結晶化
Ｆａｂを１０mg/mlに濃縮し、２モルを超えるダビガトランと混合し、４℃で１時間インキュベーションした。複合体及び結晶化溶液を１：１で混合した。複合体は、２５％ＰＥＧ１５００、０．１Ｍ  ＳＰＧ緩衝液（ｐＨ７）中で結晶化する。
【０２３８】
データ収集及び構造決定
すべての結晶のデータセットは、Paul Scherrer InstitutのSwiss light Source beamline PXI - X06SAで収集した。すべてのデータセットは、autoPROC package (Vonrhein, C., Flensburg, C., Keller, P., Sharff, A., Smart, O., Paciorek, W., Womack, T. & Bricogne, G. (2011). Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Cryst. D67, 293-302.)で処理した。
【０２３９】
Ｆａｂ  ＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１：ダビガトラン結晶は、空間群Ｐ２１２１２１で成長し、ａ＝５９．９７Å、ｂ＝７８．３９Å、ｃ＝８７，６７Åの単位格子寸法及び２．２Åの分解能回折を有していた。複合体の構造は、初期サーチモデルとして相同的なＦａｂ構造（ＰＤＢ−ＩＤ  １Ｃ１Ｅ）を使用して、program phaser (Collaborative Computational Project, number 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763. Phaser crystallographic software. McCoy AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD, Winn MD, Storoni LC, Read RJ. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674.)による分子置換によって解明した。電子密度図の分析により、ダビガトランの明確な電子密度が示された。完全な構造は、Cootによるモデル構築及びautoBUSTERによる改良を複数ラウンド行うことにより改善した（Coot: model-building tools for molecular graphics" Emsley P, Cowtan K Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 60: 2126-2132 Part 12 Sp. Iss. 1 DEC 2004. Bricogne G., Blanc E., Brandl M., Flensburg C., Keller P., Paciorek W., Roversi P, Sharff A., Smart O.S., Vonrhein C., Womack T.O. (2011). BUSTER version 2.11.2. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd）。
【０２４０】
Ｆａｂ  ＶＨ５Ｃ／ＶＫ１８：ダビガトラン結晶は、それぞれ空間群Ｐ２１及びＰ２１２１２１で成長した。空間群Ｐ２１の結晶は、ａ＝５１．８１Å、ｂ＝１２８．９２Å、ｃ＝６０．２６Åの単位格子寸法及び１．９Åの分解能回折を示した。空間群Ｐ２１２１２１の結晶は、ａ＝４８．２０Å、ｂ＝５９．７４Å、ｃ＝１２７．６９Åの単位格子寸法及び２．２Åの分解能回折を示した。両複合体の構造は、初期サーチモデルとしてＦａｂ  ＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１の構造を使用して、program phaserによる分子置換によって解明した。電子密度図の分析により、ダビガトランの明確な電子密度が示された。完全な構造は、Cootによるモデル構築及びautoBUSTERによる改良を複数ラウンド行うことにより改善した。
【０２４１】
空間的凝集傾向（ＳＡＰ）のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析
各原子及び各残基の空間的凝集傾向（ＳＡＰ）は、残基の疎水性パラメーターを（２）から取り入れた以外は、（１）に記載したように計算した。Ｆｖ  ＳＡＰは、抗体の可変ドメインにおける正電荷残基の全ＳＡＰ値の合計として計算する。ＣＤＲ  ＳＡＰは、抗体の相補性決定領域における正電荷残基の全ＳＡＰ値の合計として計算する。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの８５０個の異なる抗体構造についてＦｖ  ＳＡＰ及びＣＤＲ  ＳＡＰを計算して、両特性について平均（μＦｖ及びμＣＤＲ）及び標準偏差（σＦｖ及びσＣＤＲ）の値を出した。
【０２４２】
次に、
Ｚ−スコア（Ｆｖ  ＳＡＰ）＝（Ｆｖ  ＳＡＰ−μＦｖ）／σＦｖ及び
Ｚ−スコア（ＣＤＲ  ＳＡＰ）＝（ＣＤＲ  ＳＡＰ−μＣＤＲ）／σＣＤＲ
に従って、抗体のＦｖ  ＳＡＰ及びＣＤＲ  ＳＡＰについてのＺ−スコアを計算した。
結果（図１１）：
ヒト化Ｆａｂ  １８／１５：
Ｚ−スコア（Ｆｖ  ＳＡＰ）＝１．０６
Ｚ−スコア（ＣＤＲ  ＳＡＰ）＝１．００
ヒト化Ｆａｂ  ＶＨ５Ｃ／ＶＫ１８：
Ｚ−スコア（Ｆｖ  ＳＡＰ）＝−０．６１
Ｚ−スコア（ＣＤＲ  ＳＡＰ）＝−０．８４
ヒト化Ｆａｂ  ＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１：
Ｚ−スコア（Ｆｖ  ＳＡＰ）＝−０．６１
Ｚ−スコア（ＣＤＲ  ＳＡＰ）＝−０．７８
【０２４３】
Ｆａｂ  １８／１５（国際公開公報第２０１１０８９１８３号を参照されたい）は、タンパク質データバンクにおける公知の抗体の平均よりも溶媒に曝露した疎水性表面が多い。
【０２４４】
驚くべきことに、ＶＨ５Ｃ／ＶＫ１８（配列番号９９／配列番号１００）及びＶＨ５Ｃ／ＶＫ２１（配列番号９９／配列番号１０１を含む）は両方とも、タンパク質データバンクにおける公知の抗体の平均よりも溶媒に曝露した疎水性表面が少ない（ネガティブなＺ−スコア）。これは、これらの化合物が、水媒体中での増加した溶解性、及び低い凝集傾向を有することを意味しており、これによりこれらの化合物は、高い抗体濃度で薬物を安定的に製剤化するのにより適したものとなっている。
【０２４５】
（１）Chennamsetty et. al., Proc Natl Acad Sci; 2009, 106(29), pg 11937-11942
（２）Cowan and Whittaker, Pept Res; 1990, 3(2), pg 75-80
【０２４６】
ＣＨＯ細胞におけるＦａｂの発現
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞に一過的にトランスフェクションすることによってＦａｂを製造し、続いて、安定的な細胞プールを選択及び作成した。図１３は、Ｆａｂ  １８／１５（国際公開公報第２０１１０８９１８３号を参照されたい）、Ｆａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８及びＦａｂ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ２１を用いたフェドバッチランの力価を示す。驚くべきことに、Ｆａｂｓ  ＶＨ５ｃ／Ｖｋ１８及びＶＨ５ｃ／Ｖｋ２１は、Ｆａｂ  １８／１５と比較して５〜１０倍高い力価を示している。
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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