(57)【要約】  本発明は、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法およびこうした分子を含有する組成物を提供する。該方法は、グルコース輸送体タンパク質若しくはＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を発現する哺乳動物口腔細胞、味細胞若しくは異種細胞の該チャンネルの活性の該タンパク質の発現若しくは機能的活性に対する多様な既知若しくは新たな化合物の影響を決定することを必要とする。【選択図】  図１Ａ
2014506460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）およびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ）を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；
（ｂ）接触された細胞若しくは細胞株中のＫＡＴＰチャンネルの電子生理学的若しくは機能的活性を測定することであって；ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株のものと比較した試験分子と接触された細胞若しくは細胞株のＫＡＴＰの電気生理学的若しくは機能的活性の減少若しくは阻害が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定し、
を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法。
【請求項２】
ＳＵＲがＳＵＲ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＫｉｒがＫＩＲ６．１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞若しくは細胞株が口腔味細胞若しくは口腔味細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞若しくは細胞株がＫＡＴＰチャンネルを発現する異種細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞若しくは細胞株が、ＫＡＴＰチャンネルを発現するよう操作されている形質転換細胞若しくは細胞株である、請求項２若しくは３に記載の方法。
【請求項７】
細胞若しくは細胞株が内分泌細胞株である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
電気生理学的活性が、細胞若しくは細胞株の分極若しくは脱分極またはある種のイオン指示薬若しくは流動の変化である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ｃ）試験分子でカウンタースクリーニングアッセイを実施して該試験分子により媒介される非特異的Ｋ＋電気生理学的活性を排除すること
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ｄ）試験分子を、甘さに対する動物の生理学的応答アッセイ、電気生理学的応答アッセイ若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけること
をさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
陰性対照が、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知の対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
陰性対照が、試験若しくは対照分子により接触されない同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれかに記載の方法により同定される試験分子を含んでなる口中で甘味を提供する若しくは高める組成物。
【請求項１４】
（ａ）試験分子を、糖輸送体を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；および
（ｂ）接触された細胞若しくは細胞株による糖輸送体の発現レベル若しくは機能的活性を
測定することであって；
ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株による糖輸送体の発現若しくは糖輸送体の機能的活性の増大が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定し、
を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法。
【請求項１５】
発現レベルが糖輸送体のｍＲＮＡのレベルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
発現レベルが糖輸送体タンパク質のレベルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
糖輸送体を発現する細胞若しくは細胞株が糖輸送体を発現する口腔味細胞若しくは口腔味細胞株である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
糖輸送体を発現する細胞若しくは細胞株が糖輸送体を発現する異種細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
糖輸送体を発現する細胞若しくは細胞株が糖輸送体を発現するよう操作されている形質転換細胞若しくは細胞株である、請求項１７若しくは１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記糖輸送体を発現する細胞株が内分泌細胞株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
糖輸送体を発現する細胞若しくは細胞株が味シグナル伝達タンパク質を発現するいずれかの細胞若しくは細胞株である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
機能的活性が能動輸送活性若しくは受動的促進輸送活性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
機能的活性がグルコース若しくはナトリウムの取り込み若しくは輸送である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
糖輸送体がナトリウム・グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）である、請求項１４−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
糖輸送体が、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ３よりなる群から選択される、請求項１４−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＳＧＬＴがＳＧＬＴ１若しくはＳＧＬＴ３である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
（ｃ）試験分子でカウンタースクリーニングアッセイを実施して該試験分子の非特異的活性を排除すること
をさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
（ｄ）試験分子を、甘さに対する動物の生理学的応答アッセイ、電子生理学的応答アッセイ若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけること
をさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
陰性対照が、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知の対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
陰性対照が、試験若しくは対照分子により接触されない同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１４−３０のいずれかに記載の方法により同定される試験分子を含んでなる口中で甘味を提供する若しくは高める組成物。
【請求項３２】
（ａ）試験分子を、スルホニル尿素受容体１（ＳＵＲ１）タンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；および
（ｂ）培養物中のＳＵＲ１タンパク質への試験分子の結合を検出することであって；
ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１への試験分子の有意の量の結合の存在が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定し、
を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法。
【請求項３３】
細胞若しくは細胞株が口腔味細胞若しくは口腔味細胞株である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞若しくは細胞株がＳＵＲ１を発現する異種細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
細胞若しくは細胞株がＳＵＲ１を発現するよう操作されている形質転換細胞若しくは細胞株である、請求項３３若しくは３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞若しくは細胞株が内分泌細胞株である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
結合が試験分子に結合されている標識を使用する結合アッセイにより検出される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
（ｃ）試験分子でカウンタースクリーニングアッセイを実施して、試験分子のＳＵＲ１以外の結合活性を排除すること
をさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
（ｄ）試験分子を、甘さに対する動物の生理学的応答アッセイ、電気生理学的応答アッセイ若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけること
をさらに含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
陰性対照が、ＳＵＲ１を結合するがしかし口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知の対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
陰性対照が、試験もしくは対照分子により接触されないまたはＳＵＲ１を結合しない対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３２−４１のいずれかに記載の方法により同定される試験分子を含んでなる口中で甘味を提供する若しくは高める組成物。
【請求項４３】
（ａ）試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）およびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ）を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；
（ｂ）接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化を測定若しくは検出することであって；
ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株中のＳＵＲの核局在化に関して接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化の変化が、甘味を提供する若しくは調整する試験分子を示し、
を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法。
【請求項４４】
ＳＵＲがＳＵＲ１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＫｉｒがＫＩＲ６．１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
細胞若しくは細胞株が口腔味細胞若しくは口腔味細胞株である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
細胞若しくは細胞株がＫＡＴＰチャンネルを発現する異種細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
細胞若しくは細胞株がＫＡＴＰチャンネルを発現するよう操作されている形質転換細胞若しくは細胞株である、請求項４６若しくは４７に記載の方法。
【請求項４９】
細胞若しくは細胞株が内分泌細胞株である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ｃ）試験分子でカウンタースクリーニングアッセイを実施して、試験分子により媒介される非特異的核局在化を排除すること
をさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
（ｄ）試験分子を、甘さに対する動物の生理学的応答アッセイ、電気生理学的アッセイ若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけること
をさらに含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
陰性対照が、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知の対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
陰性対照が試験若しくは対照分子により接触されない同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４３−５３のいずれかに記載の方法により同定される試験分子を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める組成物。
【請求項５５】
スルホニル尿素（ＳＵ）化合物若しくはＳＵ誘導体を含んでなる、請求項１８、３１、４２若しくは５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
哺乳動物味細胞を請求項１８、３１、４２、５４若しくは５５のいずれかに記載の組成物とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含んでなる、口中での甘味の提供若しくは調整方法。
【請求項５７】
前記組成物が、甘味料、食品添加物、飲料若しくは製剤である、請求項１３、３１、４２、５４若しくは５５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［発明の背景］
単糖および二糖の糖（グルコース、果糖、ショ糖）、糖アルコール、小分子ノンカロリー甘味料（サッカリン、サイクラミン酸、スクラロース）、ジペプチド（アスパルテーム、ネオテーム）およびタンパク質甘味料（モネリン、タウマチン、ブラゼイン）を包含する広範な甘味化合物が、食品添加物としての使用のため、および練り歯磨き粉から製薬学的製剤までの製品を加糖するために存在する。しかしながら、ヒトは、長年にわたり開発された人工ノンカロリー甘味料を上回る天然に存在する甘味料に対する好みを有することが明確であった。
【０００２】
２種のファミリーＣ  Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）Ｔ１ｒ２＋Ｔ１ｒ３（非特許文献１に総説される）のヘテロ二量体の組合せとしての主要甘味センサーの分子同定の前に、甘味は糖輸送体若しくは糖作動性陽イオンチャンネルに頼っているかもしれないと提案された（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）、ナトリウム・グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）およびＫＡＴＰ代謝型センサーは身体全体および多くの特定の器官（例えば腸、膵、心、骨格筋、脳）におけるグルコース恒常性および代謝において重要な役割を演じている（非特許文献６：非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９に総説される）。しかしながら、これらの重要なタンパク質の味細胞中の存在および機能はほとんど未知である。Ｌｉｕら（非特許文献１０）はラット茸状味細胞中でＳＵＲ１（ＫＡＴＰの一構成要素）を同定したが、しかしＳＵＲ１がラット有郭味細胞に非存在であることを見出した。Ｌｉｕらは味細胞型特異的な発現を検査しなかった。Ｈｅｖｅｚｉら（非特許文献１１）はマカクの味細胞／味蕾で潜在的に発現される遺伝子としてＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＧＬＵＴ１０、ＧＬＵＴ１３、ＳＬＣ２Ａ４ＲＧ（ＧＬＵＴ４の調節物質）およびインスリン受容体を同定した。しかしながら、これらの著者は、味細胞中でのこれらの遺伝子の発現を確認しなかったか、若しくは特定の型の味細胞でそれらが発現されているかどうかを決定しなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂａｃｈｍａｎｏｖ  ＡＡ、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ、２００７
【非特許文献２】ＤｅＳｉｍｏｎｅ  ＪＡ、Ｈｅｃｋ  ＧＬ、Ｍｉｅｒｓｏｎ  Ｓ、Ｄｅｓｉｍｏｎｅ  ＳＫ．、１９８４
【非特許文献３】Ｍｉｅｒｓｏｎ  Ｓ、ＤｅＳｉｍｏｎｅ  ＳＫ、Ｈｅｃｋ  ＧＬ、ＤｅＳｉｍｏｎｅ  ＪＡ．、１９８８
【非特許文献４】Ｓｉｍｏｎ  ＳＡ、Ｌａｂａｒｃａ  Ｐ、Ｒｏｂｂ  Ｒ．、１９８９
【非特許文献５】Ｓｉｍｏｎ  ＳＡ、１９９１
【非特許文献６】Ｓｃｈｅｅｐｅｒｓ  Ａ、Ｊｏｏｓｔ  ＨＧ、Ｓｃｈuｒｍａｎｎ  Ａ．、２００４
【非特許文献７】ＭｃＴａｇｇａｒｔ  ＪＳ、Ｃｌａｒｋ  ＲＨ、Ａｓｈｃｒｏｆｔ  ＦＭ．、２０１０
【非特許文献８】Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＣＧ．、２００６
【非特許文献９】ＺｈａｏとＫｅａｔｉｎｇ、２００７
【非特許文献１０】Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ、２０１０
【非特許文献１１】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００９
【発明の概要】
【０００４】
［発明の要約］
一局面において、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法が、細胞中のグルコース輸送体タンパク質の発現若しくは活性に対する試験分子の影響についてスクリーニングすることにより提供される。一態様において、本方法は、試験分子をグルコース輸送体タンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；および該接触された細胞若しくは細胞株によるグルコース輸送体タンパク質の発現レベル若しくは機能的活性を測定することを必要とする。陽性若しくは陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株によるグルコース輸送体タンパク質のタンパク質発現若しくはグルコース輸送体タンパク質の機能的活性の増大が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定する。
【０００５】
別の局面において、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法が、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）サブユニットタンパク質およびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ）サブユニットタンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株に対する試験分子の影響をスクリーニングすることにより提供される。一態様において、該方法は、試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）サブユニットタンパク質およびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ）サブユニットタンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること、ならびに該接触された細胞若しくは細胞株中のＫＡＴＰチャンネルの電気生理学的若しくは機能的活性を測定することを必要とする。陰性対照細胞若しくは細胞株のものと比較した試験分子と接触された細胞若しくは細胞株のＫＡＴＰの電気生理学的若しくは機能的活性の減少若しくは阻害が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定する。
【０００６】
別の局面において、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法が、細胞中のＳＵＲ１タンパク質の結合若しくは核局在化に対する試験分子の影響についてスクリーニングすることにより提供される。一態様において、本方法は、試験分子をスルホニル尿素受容体１（ＳＵＲ１）タンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；および培養物中のＳＵＲ１タンパク質への試験分子の結合を検出することを必要とする。陽性若しくは陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株でのＳＵＲ１への試験分子の有意の量の結合の存在が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定する。
【０００７】
なお別の局面において、口中で甘味を提供する若しくは高めるこうした試験分子の使用が、こうした分子を含有する組成物がそうであるように提供される。
【０００８】
本発明の他の局面および利点は本発明の以下の詳細な記述から容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１Ａから図１Ｄは糖輸送体、ＫＡＴＰグルコースセンサーおよびインスリン受容体のｍＲＮＡの味組織での発現を示す。
【図１Ａ】有郭（ＣＶ）味組織および味蕾を欠く「味以外（ｎｏｎ−ｔａｓｔｅ）」（ＮＴ）舌上皮組織から調製されたマウスｃＤＮＡからの糖輸送体、（ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９ＢおよびＳＧＬＴ１）、ガストデューシン（ＧＵＳＴ、味ＲＮＡ対照）ならびにＧＡＰＤＨ（組織ＲＮＡ対照）のＰＣＲ増幅（３５サイクル）のゲル顕微鏡写真である。ＧＡＰＤＨは双方のｃＤＮＡサンプル中で発現され；ガストデューシンは味ｃＤＮＡ中でのみ発現される。ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９ＢおよびＳＧＬＴ１は味ｃＤＮＡ中でより高度に発現される。これらの遺伝子を発現することが既知の組織から調製されたｃＤＮＡは、正しい大きさにされた産物を増幅するプライマーの能力を確認するための陽性対照（ＣＴＲＬ）としてはたらいた。
【図１Ｂ】ＣＶ味組織および味蕾を欠く味以外ＮＴ舌上皮組織から調製されたマウスｃＤＮＡからのＫＡＴＰサブユニット（ＳＵＲ１、ＳＵＲ２Ａ、ＳＵＲ２Ｂ、Ｋｉｒ６．１、Ｋｉｒ６．２）およびインスリン受容体（ＩＮＳＲ）のＰＣＲ増幅（３５サイクル）の顕微鏡写真である。ＳＵＲ１、ＳＵＲ２Ａ、Ｋｉｒ６．１およびＩＮＳＲは味ｃＤＮＡ中でより高度に発現される。これらの遺伝子を発現することが既知の組織から調製されたｃＤＮＡは、正しい大きさにされた産物を増幅するプライマーの能力を確認するためのＣＴＲＬとしてはたらいた。
【図１Ｃ】ＣＶ（黒棒）味組織および味蕾を欠くＮＴ（灰色棒）舌上皮組織中の糖輸送体、ＫＡＴＰサブユニットおよびインスリン受容体の発現を定量化するためのＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲを使用することの結果を示すグラフである。味ｃＤＮＡの上昇された発現がＧＬＵＴ８、ＳＧＬＴ１およびインスリン受容体について観察された。各遺伝子の発現はそのサイクル閾値とＧＡＰＤＨのものの間の比の対数としてプロットする。
【図１Ｄ】ＣＶ（黒棒）味組織および味蕾を欠くＮＴ（灰色棒）舌上皮組織中の糖輸送体、ＫＡＴＰサブユニットの発現を定量化するためのＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲを使用することの結果を示すグラフである。味ｃＤＮＡの上昇された発現がＧＬＵＴ９、ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．１について観察された。各遺伝子の発現はそのサイクル閾値とＧＡＰＤＨのものの間の比の対数としてプロットする。
【図２Ａ】機能的ＫＡＴＰチャンネルがマウス味細胞に存在することを示すグラフである。ＫＡＴＰチャンネルのスルホニル尿素阻害剤グリベンクラミドはマウス茸状味細胞中の外向き（Ｋ＋）電流を阻害する。各データ点は７〜１６個の細胞からである。
【図２Ｂ】マウス味細胞中の１００μＭグリベンクラミドの適用により達成される電流の阻害に対し正規化された外向き電流（＋４０ｍＶで）のグリベンクラミド阻害についての濃度反応関数を示すグラフである。各データ点は７〜１６個の細胞からである。
【００１０】
［発明の詳細な記述］
本明細書に記述される方法および組成物は新規甘味料を同定および開発するための手段を提供する。Ｉ型味受容体の組合せすなわちＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３は甘味応答の基礎にある主要な受容体と考えられているとは言え、発明者は口腔味細胞中の糖（すなわち甘さ）の検知および従って甘味応答のキネティクスにおけるある種の腸型糖輸送体タンパク質および膵臓内分泌型代謝型グルコースセンサーの意義のある役割を確認した。理論により束縛されることを願わず、発明者は、ナトリウム塩による甘味の増強がＳＧＬＴ１を介する味細胞へのナトリウム依存性グルコース取り込みに部分的に依存していると仮定する。甘味は、味細胞代謝の糖応答性変化に応答したＴ１Ｒ３味細胞からのホルモン遊離を調節することにより高められることが提案されている。
【００１１】
Ｉ．定義
本明細書で使用される全部の科学および技術用語は、生物学、生物工学および分子生物学の分野の当業者にとって、ならびに本出願で使用される用語の多くへの一般的指針を当業者に提供する刊行された教科書を参照して、それらの既知のかつ通常の意味するところを有する。しかしながら明快さのため以下の用語を後に続くとおり具体的に定義する。すなわち、
「甘味を提供すること」により、試験分子が単独で口腔味細胞により検出される際に甘味を創成することを意味している。
【００１２】
「甘味を高めること」により、試験分子が、グルコース若しくは果糖のような天然の糖またはサッカリンのような人工甘味料、あるいは甘味が望ましい組成物例えば医薬品など中の何らかの他成分のような他の甘味料若しくは他の組成物成分の口腔味細胞により検出されるところの甘味を増大させ得ることを意味している。
【００１３】
本明細書で使用されるところの「糖輸送体タンパク質」は、グルコース、果糖および他者のような糖を能動的に輸送する、若しくは細胞内および細胞を横断する促進受動的輸送を提供するように機能するタンパク質を包含する。一態様において糖輸送体はナトリウム・グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）である。別の態様において糖輸送体はグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）である。腸の糖輸送体のこれら２ファミリーはＴ１Ｒ３含有味細胞の甘味応答に寄与すると考えられている。これらの輸送体は甘味応答のキネティクス、例えば、それらが頂端輸送体を介して味細胞に取り込まれかつその後側底糖輸送体を介して味細胞から代謝若しくは輸送される場合に、なぜ人工甘味料は遅延された開始／停止を有する一方で炭水化物甘味料は迅速な開始／停止を有するのかに関与していると理論付けられている。本明細書に記述される方法で重要なＳＧＬＴタンパク質の１つがＳＧＬＴ１若しくはＳＧＬＴ３である。本明細書に記述される方法の重要なＧＬＵＴファミリータンパク質の１つはＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ８およびＧＬＵＴ９である。これらの糖輸送体のヌクレオチドおよび／若しくはタンパク質配列は公知であり、かつ、例えばＧＥＮＢＡＮＫ、例えば、受託番号ＡＡＦ１７２４９１のマウスＳＧＬＴ１；ヒトＳＧＬＴ１  受託番号ＮＰ＿０００３３４．１；ヒトＳＧＬＴ３、受託番号Ｐ３１６３６；ヒトＧＬＵＴ１、受託番号ＮＰ００６５０７．２、マウスＧＬＵＴ１、受託番号ＮＰ０３５５５３０．２に見出しうる。なお他者は公的データベースで容易に入手可能である。
【００１４】
「ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）」はスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）サブユニットタンパク質およびカリウム内向き整流性（Ｋｉｒ）チャンネルサブユニットタンパク質の複合体である。それは膵β細胞の細胞膜に見出され、そしてＡＴＰへのその代謝を手段としてグルコースの膵臓内分泌型センサーである。発明者によれば、ＫＡＴＰは味細胞でのＴ１Ｒ非依存性糖検知にもまた関与している。持続的に（ｔｏｎｉｃａｌｌｙ）活性若しくは別の分子により活性化される場合、このチャンネルは細胞膜を超えるカリウムの持続性（ｔｏｎｉｃ）過分極性流出を制御する。該チャンネルがある種の分子との相互作用により阻害される場合、該過分極性流出が阻害され、かように膜を横断する電位を引き起こしてより陽性になる。膵臓内分泌細胞においては、この脱分極が電位依存性カルシウムイオンチャンネルを開放して細胞内カルシウムの上昇を引き起こし、これはプロインスリンの増大された分泌につながり得る。同様の機能が味細胞に存在することが予期される。
【００１５】
本明細書で使用されるところの用語「試験分子」は、甘味料若しくは甘さを調整するための分子として試験するためのいかなる既知若しくは新規の分子も指すことができる。こうした分子は典型的には、例えば動物での安全な使用のため前スクリーニングされたものを包含する分子の既知のライブラリーに見出しうる。適する試験分子は例えばＡＭＥＳライブラリーに見出すことができ、そしてＯｔａｖａ、ＴｉｍＴｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍ
Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐ．などのような供給業者から容易に得ることができる。例えばＢｈａｌら、２００７  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、４（４）：５５６−５６０を参照されたい。本発明の方法により同定される試験分子／化合物は、甘味のみを提供するかまたは組成物の他成分の甘味を調整する（所望のとおり増大する、高める若しくは阻害する）化合物、小分子、ｃＤＮＡのような核酸配列、またはペプチド若しくはポリペプチドでありうる。
【００１６】
本明細書で使用されるところの用語「スルホニル尿素化合物」（ＳＵ化合物）は、構造：
【００１７】
【化１】
2014506460.tif 000003
【００１８】
を有する分子を指す。
【００１９】
これらのスルホニル尿素誘導体化合物は、フェニル環のｐ−置換（Ｒ１）および尿素Ｎ’端基で終端する多様な基（Ｒ２）をもつ中心のＳ−フェニルスルホニル尿素構造を含有する。スルホニル尿素はＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）のＳＵＲサブユニットに結合する。本明細書に記述される方法および組成物での使用のための望ましいスルホニル尿素分子若しくは誘導体は、ＳＵＲ１を結合するがしかし膵インスリン産生を増大しないと機能的に記述されうる上の活性部分を含有する誘導体若しくは化合物である。同様に、神経血管組織に見出される非選択的ＡＴＰ感受性陽イオンチャンネルを上方制御しないＳＵが、ありそうには望ましい化合物である。ある態様において、局所で作用しかつ腸で分解若しくは再吸収される既知のＳＵもまた、ありそうには本発明の方法での使用のための化合物である。同様に、他のチャンネルサブユニット若しくは受容体を結合することにおいて有用であるＳＵは、ありそうには甘さを高めるための望ましい化合物であり、そして本明細書に記述されるこれらの方法により容易に同定可能である化合物の一群でありうる。ある態様において、Ｒ１は、ハロゲン、場合によっては置換されているＣ１ないしＣ１０アルキル、場合によっては置換されているＣ３ないしＣ８シクロアルキル、場合によっては置換されているアリール、場合によっては置換されているヘテロアリール、場合によっては置換されている複素環、ＣＮ、ＮＯ２、場合によっては置換されているＣ２ないしＣ１０アルケニル、場合によっては置換されているＣ２ないしＣ１０アルキニル、ＯＨ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＣＦ３、場合によっては置換されているＣ１ないしＣ１０アルコキシ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｏ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＮＨＣ（Ｏ）（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＮＨＳＯ２（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＳＯ２（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、若しくはＮ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）である。
【００２０】
ある態様において、Ｒ２は、場合によっては置換されているＣ１ないしＣ１０アルキル、場合によっては置換されているＣ３ないしＣ８シクロアルキル、場合によっては置換されているアリール、場合によっては置換されているヘテロアリール、場合によっては置換されている複素環、場合によっては置換されているＣ２ないしＣ８アルケニル、場合によっては置換されているＣ２ないしＣ８アルキニル、ＣＯ２Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｏ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキ
ル）、ＳＯ２（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）、若しくはＮ（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）（場合によっては置換されているＣ１ないしＣ６アルキル）である。いくつかの態様において、Ｒ２はハロゲンである。
【００２１】
用語「アルキル」は、１ないし約１０個の炭素原子および望ましくは１ないし約６個の炭素原子（すなわちＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５若しくはＣ６）を有する直鎖状および分枝状双方の鎖の飽和脂肪族炭化水素基を指すのに本明細書で使用する。
【００２２】
用語「シクロアルキル」は、たった今記述されたところのしかし構造が環状でありかつ３ないし約８個の炭素原子を有するアルキル基に本明細書で使用する。一態様において、シクロアルキル基は３ないし約８個の炭素原子を有する。別の態様において、シクロアルキル基は約３ないし約６個の炭素原子（すなわちＣ３、Ｃ４、Ｃ５若しくはＣ６）を有する。
【００２３】
用語「アルケニル」は、１個若しくはそれ以上の炭素−炭素二重結合を有しかつ約３ないし約８個の炭素原子を含有する直鎖状および分枝状双方の鎖のアルキル基を指すのに本明細書で使用する。一態様において、用語アルケニルは１若しくは２個の炭素−炭素二重結合を有するアルキル基を指す。さらなる一態様において、アルケニル基は約２ないし約８個の炭素原子を有する。別の態様において、アルケニル基は約２ないし約６個の炭素原子を有する。
【００２４】
用語「アルキニル」は、１個若しくはそれ以上の炭素−炭素三重結合を有しかつ約３ないし約８個の炭素原子を有する直鎖状および分枝状双方の鎖のアルキル基を指すのに本明細書で使用する。一態様において、用語アルキニルは、１若しくは２個の炭素−炭素三重結合を有しかつ約３ないし約６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。
【００２５】
本明細書で使用されるところの用語「アリール」は、単環または一緒に縮合若しくは結合された複数の芳香環を包含し得る芳香系を指し、ここで縮合若しくは結合された環の少なくとも一部は共役芳香系を形成する。アリール基は、限定されるものでないが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、テトラヒドロナフチル、フェナントリル、インデン、ベンゾナフチル、フルオレニルおよびカルバゾリルを挙げることができる。望ましくは、アリール基は場合によっては置換されているフェニル基である。
【００２６】
本明細書で使用されるところの用語「ヘテロアリール」は、最低１個および望ましくは１から約４個までのイオウ、酸素および窒素を包含するヘテロ原子環メンバーを包含する、場合によっては置換されている単、二、三若しくは他の多環芳香環系を指す。一態様において、ヘテロアリール基は、その中の炭素原子の範囲および特定の数の全部の組合せおよび下位組合せを包含する約３ないし約５０個の炭素原子を含有し得る。別の態様において、ヘテロアリール基は約４ないし約１０個の炭素を含有し得る。ヘテロアリール基の制限しない例は、例えばピロリル、フリル、ピリジル、１，２，４−チアジアゾリル、ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ピリミジル、キノリル、イソキノリル、チオフェニル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、プリニル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリルおよびイソキサゾリルを包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるところの用語「複素環の」は、飽和若しくは部分的に不飽和である安定な４ないし７員単環若しくは多環複素環を指す。複素環はそのバックボーンに炭素原子ならびに窒素、酸素およびイオウ原子を包含する１個若しくはそれ以上のヘテロ原子を有する。望ましくは、複素環は環のバックボーンに１ないし約４個のヘテロ原子を有す
る。複素環が環のバックボーンに窒素若しくはイオウ原子を含有する場合、該窒素若しくはイオウ原子は酸化されていることができる。用語「複素環の」は、複素環がアリール環に縮合されている多環もまた指す。複素環はヘテロ原子若しくは炭素原子によりアリール環に結合され得るが、但し結果として生じる複素環構造が化学的に安定である。多様な複素環基が当該技術分野で既知であり、そして、酸素含有環、窒素含有環、イオウ含有環、混合ヘテロ原子含有環、縮合ヘテロ原子含有環およびそれらの組合せを制限なしに包含する。複素環基は、限定されるものでないがフリル、テトラヒドロフラニル、ピラニル、ピロニル、ジオキシニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジル、ピペリジニル、２−オキソピペリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、アゼピニル、トリアジニル、ピロリジニル、アゼピニル、オキサチオリル、オキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、オキサチアゾリル、オキサチオリル、オキサジニル、オキサチアジニル、モルホリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、オキセピニル、チエピニル、ジアゼピニル、ベンゾフラニル、チオナフタレン、インドリル、ベナザゾリル（ｂｅｎａｚａｚｏｌｙｌ）、プリンジニル（ｐｕｒｉｎｄｉｎｙｌ）、ピラノピロリル、イソインダゾリル、インドキサジニル、ベンゾキサゾリル、アントラニリル、ベンゾピラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾジアゾニル、ナプチルリジニル（ｎａｐｔｈｙｌｒｉｄｉｎｙｌ）、ベンゾチエニル、ピリドピリジニル、ベンゾキサジニル、キサンテニル、アクリジニルおよびプリニル環から選択される。
【００２８】
本明細書で使用されるところの用語「アルコキシ」はＯ（アルキル）基を指し、ここで結合の点は酸素原子を通じてでありかつ該アルキル基は場合によっては置換されている。
【００２９】
本明細書で使用されるところの用語「アリールオキシ」はＯ（アリール）基を指し、ここで結合の点は酸素原子を通じてでありかつ該アリール基は場合によっては置換されている。
【００３０】
本明細書で使用されるところの用語「アルキルカルボニル」はＣ（Ｏ）（アルキル）基を指し、ここで結合の点はカルボニル部分の炭素原子を通じてでありかつ該アルキル基は場合によっては置換されている。
【００３１】
本明細書で使用されるところの用語「アルキルカルボキシ」はＣ（Ｏ）Ｏ（アルキル）基を指し、ここで結合の点はカルボキシ部分の炭素原子を通じてでありかつ該アルキル基は場合によっては置換されている。
【００３２】
本明細書で使用されるところの用語「アルキルアミノ」は二級および三級双方のアミンを指し、ここで結合の点は窒素原子を通じてでありかつ該アルキル基は場合によっては置換されている。該アルキル基は同一若しくは異なることができる。
【００３３】
本明細書で使用されるところの用語「ハロゲン」はＣｌ、Ｂｒ、Ｆ若しくはＩ基を指す。
【００３４】
用語「場合によっては置換されている」は、基礎分子が、１個若しくはそれ以上の炭素、窒素、酸素若しくはイオウ原子で、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アリール、複素環、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ若しくはアルキルアミノを制限なしに包含する１置換基で置換されうることを示すが、但し結果として生じる部分は化学的に安定である。
【００３５】
本明細書で論考される化合物は、該細胞若しくは被験体により本発明の化合物を処理することにより形成される独特の生成物である「代謝物」もまた包含する。望ましくは、代
謝物はｉｎ  ｖｉｖｏで形成される。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「味細胞」は有郭乳頭および葉状乳頭を包含する哺乳動物の口腔中の味蕾で見出される哺乳動物の知覚細胞を指す。これらの細胞は光学および電子顕微鏡検査下でそれらの典型的な外観により同定され得る。それらはα−ガストデューシン、Ｔ１Ｒ１、２、３、Ｔ２Ｒ、ＴｒｐＭ５、Ｓｎａｐ２５、ＧＬＡＳＴのような味特異的タンパク質の発現と一緒になって口腔位置によってもまた特定され得る。
【００３７】
本明細書で使用されるところの「味様細胞」は既知の味シグナル伝達タンパク質を発現する口腔の外側のいかなる細胞も指す。こうした細胞は、肺および鼻の孤立性化学受容性細胞、腸内分泌細胞、膵臓内分泌細胞および他者を包含する。これらの細胞に特徴的な既知の味シグナル伝達タンパク質の１つはＴ１ｒ１、α−ガストデューシン、Ｔ１ｒ２、Ｔ１ｒ３、Ｔ２ＲおよびＴｒｐｍ５である。
【００３８】
用語「天然の細胞」の使用により、示されるｍＲＮＡ若しくはタンパク質を天然にすなわち内因性に発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株を意味している。例えば、天然のグルコース輸送体を発現する口腔細胞若しくは細胞株は、ＧＬＵＴを天然に発現する哺乳動物口腔味細胞若しくは口腔味細胞株である。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「異種細胞若しくは細胞株」は、口腔味細胞でなくかつ／または所望のｍＲＮＡ若しくはタンパク質を天然に発現しない細胞から樹立された哺乳動物細胞若しくは細胞株を意味している。例えば、グルコース輸送体タンパク質を発現する異種細胞は、所望のＧＬＵＴタンパク質を発現するよう遺伝子改変されているヒト腎臓細胞（ＨＥＫ）細胞、またはグルコース輸送体タンパク質を天然に発現しないがしかし口腔細胞でない哺乳動物内分泌細胞若しくは細胞株でありうる。一態様において、有用な内分泌細胞若しくは細胞株は腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）すなわち腸管（ｇｕｔ）内分泌細胞若しくは細胞株である。別の態様において、内分泌細胞若しくは細胞株は膵臓内分泌細胞若しくは細胞株である。なお他者が既知でありかつ下述される方法で提供されるとおり有用である。
【００４０】
本明細書で使用されるところの「形質転換細胞若しくは細胞株」は、それが天然に発現しない若しくはそれがそれを既知の量で天然に発現しない所望のｍＲＮＡ若しくはタンパク質を発現するよう遺伝子改変されている哺乳動物細胞若しくは細胞株を指す。とりわけ望ましい細胞若しくは細胞株は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来のＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＰＥＲＣ６、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２および初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を制限なしに包含するいかなる哺乳動物種のなかからも選択される。該細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；哺乳動物細胞の型すなわち上皮、腫瘍などもそうでない。
【００４１】
「発現レベル」により、所望のタンパク質コーディング配列（例えば糖輸送体）のヌクレオチド配列（例えばｍＲＮＡ）の定量的発現若しくは所望のタンパク質（例えば糖輸送体）それ自身の定量的発現を意味している。
【００４２】
「機能的活性」により、細胞で発現される場合のある種のｍＲＮＡ若しくはタンパク質すなわちチャンネルの期待される通常の活性を意味している。例えば、ＧＬＵＴタンパク質の機能的活性は受動的な促進輸送活性のもの、すなわち細胞中へのすなわち細胞膜を横切るグルコースの取り込みすなわち輸送である。例えば、ＳＧＬＴタンパク質の機能的活性は、細胞中へのすなわち細胞膜を横切るグルコースおよびナトリウムの能動的取り込みおよび／若しくは共輸送である。双方の型の輸送を示すための既知のアッセイが存在し、
そして下述される方法で使用しうる。適するアッセイの例は、実施例１、下位段落Ｋ、およびＷｉｌｓｏｎ−Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４９（３）：９１７−２４（２００８）に見出し得る。ＫＡＴＰチャンネルの機能的活性は、電子生理学的活性、例えば、細胞の分極若しくは脱分極またはパッチクランプ若しくは記録電極で測定可能なＫ＋若しくは他の陽イオンの流動である。例えば実施例４で論考されるところのＫ＋電流の測定を参照されたい。こうした活性の別の測定方法は、脱分極を監視する指示色素、例えばＣａ＋＋指示薬若しくは特定のイオン（Ｋ＋）の流動の使用による。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「非特異的活性」により、能動的若しくは受動的グルコース輸送若しくはナトリウム輸送以外、またはカリウムイオン特異的チャンネル活性以外である細胞培養物中で試験分子により誘発される活性を意味している。非特異的活性は所望のｍＲＮＡ若しくはタンパク質を発現しない細胞中で作用する試験分子を包含し得る。別の非特異的活性は所望の機能的活性を通常阻害する阻害性化合物である。
【００４４】
「カウンタースクリーニングアッセイ（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｃｒｅｅｎ  ａｓｓａｙ）」により、指定される試験化合物を非特異的活性についてスクリーニングし得る既知アッセイを意味している。
【００４５】
「哺乳動物」により、主にヒト、しかしまた最も一般的には、他の味から甘味を識別することが可能である天然の口腔細胞若しくは味細胞を有する霊長類、マウス、ラットなどのような実験哺乳動物も意味している。
【００４６】
「甘さについての動物の生理学的若しくは行動アッセイ」により、哺乳動物試験動物若しくはヒトの口腔味細胞に適用された化合物の増大若しくは低下された甘さに応答しての生理学的若しくは行動的反応に頼る既知アッセイを意味している。既知アッセイの例は、味覚計（例えばＢｕｓｃｈら、Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２００９  Ｍａｙ；３４（４）：３４１−８を参照されたい）、リッコメーター（ｌｉｃｋｏｍｅｔｅｒ）（例えばＦｕｄｇｅら、Ｈｏｒｍ  Ｂｅｈａｖ．２００９  Ｓｅｐ；５６（３）：３２２−３１を参照されたい）、条件味覚嫌悪（例えばＡｙｅｓｔａｒａｎ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｏｃｔ  ２７；５（１０）：ｅ１５０００を参照されたい）、味覚神経記録アッセイ（例えばＤａｍａｋら、Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２００６  Ｍａｒ；３１（３）：２５３−６４を参照されたい）、および一口含みそして吐き出す（ｓｉｐ  ａｎｄ  ｓｐｉｔ）味覚アッセイ（例えばＤｅｌｗｉｃｈｅら、Ｆｏｏｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９６  Ｍａｒ；７（３−４）２９３−７を参照されたい）の使用を包含する。別の態様において、こうしたアッセイは電気生理学的応答若しくはカルシウム画像化または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライス（ｔａｓｔｅ  ｓｌｉｃｅ）を包含する。他の適するアッセイは当業者に既知であり、そして下述される方法で適用されうる。
【００４７】
用語「ある（ａ若しくはａｎ）」は１若しくはそれ以上を指し、例えば「あるアッセイ（ａｎ  ａｓｓａｙ）」は１若しくはそれ以上のアッセイを表すと理解される。であるから、用語「ある（ａ）」（若しくは「ある（ａｎ）」）、「１若しくはそれ以上」および「少なくとも１つ」は本明細書で互換性に使用する。本明細書で使用されるところの用語「約」は、別の方法で指定されない限り与えられる参照からの１０％の変動性を意味している。本明細の多様な態様が「含んでなる」言語を使用して提示される一方、他の環境下では、関連する態様は、「よりなる」若しくは「より本質的になる」言語を使用して解釈および記述されることもまた意図している。
【００４８】
ＩＩ．本発明の特定の方法
一態様において、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法は、試験分子を
糖輸送体タンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させることを必要とする。所望の特定のアッセイおよび終点に依存して、適する培養条件は約３７℃の温度；若しくは約３２から４０℃までの範囲を包含する。この温度は約１０分ないし２４時間維持される。いくつかの態様において、時間は最低約２０分、３０分、４５分、１時間、３時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間若しくはそれ以上である。遺伝子産物の発現レベル若しくは発現されるタンパク質の機能的活性に対する試験分子の影響を、発現レベルの測定のための上述されたところのいずれかの適する手段により評価および定量する。
【００４９】
陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株による糖輸送体タンパク質のタンパク質発現の増加若しくは糖輸送体タンパク質の機能的活性の増加が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定する。すなわち、糖輸送タンパク質の通常の発現若しくは活性を変える試験分子の影響は、甘味を提供する若しくは高めることに対するその影響と関係する。該影響が、該試験分子が通常の発現レベルの維持を可能にするか若しくは糖輸送タンパク質のレベルを対照のものより上に増大させることである場合、その試験分子は潜在的新規甘味化合物、若しくは最終組成物例えば食品、医薬品などの他成分の甘さを高めることにおいて有用な化合物として有用であることが示される。該影響が、該試験分子が糖輸送タンパク質の発現レベルを低下させるか若しくはその機能的活性を低下させることである場合、該試験分子は組成物中に存在する場合に甘味に対する潜在的阻害効果を有することが示される。
【００５０】
本方法で一般に使用される陰性対照は、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知である対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株である。別の態様において、本方法で一般に使用される陰性対照は、試験若しくは対照分子により接触されない同一細胞若しくは細胞株である。従って、該方法での試験分子の影響の比較は、甘味を提供する若しくは高めることと相関する結果の同定を可能にする。
【００５１】
望ましくは、該方法で使用される細胞若しくは細胞株は、天然の口腔味細胞、若しくは糖輸送体タンパク質を発現する樹立された口腔味細胞株である。別の態様において、該細胞株若しくは細胞培養物は異種（口腔以外、味以外）細胞若しくは細胞株でありうる。なお別の態様において、細胞若しくは細胞株は糖輸送体を発現するよう形質転換された異種細胞若しくは細胞株でありうる。
【００５２】
本方法の実施において、糖輸送体は望ましくはＳＧＬＴである。一態様において輸送体はＳＧＬＴ１である。別の態様において輸送体はＳＧＬＴ３である。ＳＧＬＴが発現される糖輸送体である場合、機能的活性はグルコースおよびナトリウムの能動的共輸送である。
【００５３】
本方法の別の態様、本方法の別の実施において、糖輸送体は望ましくはＧＬＵＴである。一態様において輸送体はＧＬＵＴ２である。別の態様において輸送体はＧＬＵＴ４である。別の態様において輸送体はＧＬＵＴ８である。別の態様において輸送体はＧＬＵＴ９である。別の態様において輸送体はＧＬＵＴ１である。別の態様において輸送体はＧＬＵＴ３である。なおさらなる態様において、ＧＬＵＴファミリー輸送体の組合せが発現され、そして発現レベルおよび／若しくは機能的活性を双方とも測定する。ＧＬＵＴ輸送体が発現される糖輸送体である場合、該機能的活性はグルコースの受動的促進輸送である。
【００５４】
なお他の態様において、該方法を実施して他の糖輸送体例えば果糖の糖輸送体の活性の発現を検出および定量する。
【００５５】
なお他の態様において、該方法を実施して同一細胞若しくは細胞株中の多様な糖輸送体
の組合せ、例えば異なるＧＬＵＴ若しくはＳＬＧＴおよびＧＬＵＴを検出する。
【００５６】
該方法は、試験される細胞若しくは細胞株中の試験分子の非特異的活性を排除するための試験分子についてのカウンタースクリーニングアッセイをさらに使用しうる。加えて、該方法は、試験分子を甘さに対する動物の生理学的応答、電気生理学的応答若しくは行動アッセイまたは単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけて、該試験分子が甘味を提供する若しくは高めることを確認することにより試験分子をスクリーニングすることをさらに包含しうる。
【００５７】
下で提供される実施例は本方法で有用な多様な方法およびアッセイを示す。
【００５８】
口中で甘味を提供する若しくは高める分子の別の同定方法は、試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ例えばＳＵＲ１）サブユニットおよびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ例えばＫＩＲ６．１）サブユニットを発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させることを必要とする。上で示唆されたところの適する培養条件例えば３７℃で約１０分ないし２４時間後に、ＫＡＴＰ機能的活性に対する該試験分子の影響をいずれかの適する手段により評価および定量する。
【００５９】
一態様において、接触される細胞若しくは細胞株中のＫＡＴＰチャンネルの電気生理学的若しくは機能的活性を電極により測定する。一態様において、電気生理学的活性はある種のカルシウムイオン指示薬若しくはカリウムイオン流動の変化である。一態様において、電気生理学的活性は細胞若しくは細胞株の分極若しくは脱分極である。一態様において、接触された細胞若しくは細胞株中のＫＡＴＰチャンネルの電気生理学的若しくは機能的活性を測定して、細胞膜を越えるカリウムイオンの過分極性流出の増大若しくは減少を検出する。
【００６０】
例えば、陰性対照細胞若しくは細胞株のものと比較して試験分子と接触された細胞若しくは細胞株のＫＡＴＰの電気生理学的若しくは機能的活性の低下若しくは阻害は、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定する。すなわち、細胞膜を横切るカリウムの正常の過分極性流出を変えるための試験分子の影響は甘味を提供する若しくは高めることと関係する。該影響が、該試験分子が通常のＫＡＴＰチャンネル活性の維持若しくは対照のものより上の増大された流出を可能にすることである場合、その影響は、該試験分子が潜在的な新規甘味化合物として有用でないことを示す。あるいは、その結果は、該試験分子が組成物中に存在する場合に甘味に対する潜在的阻害効果を有することを示している。該影響が、試験分子が対照のものを超えて機能的活性を低下させることである場合、該試験分子は最終組成物例えば食品、医薬品などの他成分の甘さを高めることにおいて有用であることが示される。
【００６１】
一態様において、本方法で一般に使用される陰性対照は、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知である対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株である。別の態様において、本方法で一般に使用される陰性対照は、試験若しくは対照分子により接触されない同一細胞若しくは細胞株である。従って、該方法での試験分子の影響の比較が、甘味を提供する若しくは高めることと相関する結果の同定を可能にする。
【００６２】
望ましくは、該方法で使用される細胞若しくは細胞株は、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルを発現する天然の口腔味細胞若しくは細胞株である。別の態様において、細胞株若しくは細胞培養物は異種（口腔以外、味以外）細胞若しくは細胞株、例えば膵細胞若しくは細胞株または内分泌細胞若しくは細胞株であることができる。なお別の態様において、細胞若しくは細胞株はＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルを発現するよう形質転換された異種細胞若し
くは細胞株でありうる。
【００６３】
該方法は、試験される細胞若しくは細胞株中の該試験分子により媒介される非特異的活性を排除するための、例えば非特異的Ｋ＋電気生理学的活性を排除するための該試験分子についてのカウンタースクリーニングアッセイをさらに使用しうる。加えて、該方法は、試験分子を甘さに対する動物の生理学的応答、電気生理学的応答若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけて、該試験分子が甘味を提供する若しくは高めることを確認することにより試験分子をスクリーニングすることもまた包含しうる。
【００６４】
下に提供される実施例は本方法で有用な多様な方法およびアッセイを示す。
【００６５】
別の局面において、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法は、試験分子を、スルホニル尿素受容体１（ＳＵＲ１）を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ
ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させることを必要とする。先行する方法で上述されたところの適する培養条件例えば３７℃で約１０分ないし２４時間後に、該細胞培養物を評価して培養物中のＳＵＲ１への試験分子の結合を検出する。結合の検出は多様な慣習的結合アッセイにより行ってよい。陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１への試験分子の有意の量の結合の存在が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定する。
【００６６】
本方法により、陰性対照は、ＳＵＲ１を結合するがしかし口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知の対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる。あるいは、陰性対照は、試験若しくは対照分子により接触されないまたはＳＵＲ１を結合しない対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株を含んでなる。
【００６７】
望ましくは、一態様において細胞若しくは細胞株は口腔味細胞若しくは口腔味細胞株である。あるいは、細胞若しくは細胞株はＳＵＲ１を発現する異種細胞である。なお別の態様において、細胞若しくは細胞株はＳＵＲ１を発現するよう操作されている形質転換された細胞若しくは細胞株である。ある態様において、細胞若しくは細胞株は上述されたところの内分泌細胞株である。
【００６８】
一態様において、試験分子とＳＵＲ１受容体サブユニットの間の結合は試験分子に結合された標識を使用する結合アッセイにより検出する。慣習的標識を使用する慣習的結合アッセイを本アッセイで使用しうる。慣習的な検出可能な標識は、酵素、蛍光色素、発光若しくは化学発光物質または放射活性物質を包含しうる。こうした標識の試験分子との会合方法は当業者に既知である。従って、試験分子へのＳＵＲ１結合を検出するために、一態様において、ＳＵＲ１を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株を、検出可能な標識で標識されている試験分子若しくは化合物と接触させる。該細胞をその後洗浄していかなる結合されない標識された試験分子若しくは化合物も除去する。該細胞をその後分析して、検出可能な標識を検出することにより結合された試験分子−ＳＵＲ１複合体の存在を検出する。
【００６９】
該方法はさらに、試験される細胞若しくは細胞株中の試験分子の非特異的活性を排除する、例えばＳＵＲ１以外の結合活性を排除するための試験分子についてのカウンタースクリーニングアッセイを使用しうる。カウンタースクリーニングアッセイは同時に実施され、ここでは同じ方法段階が哺乳動物細胞若しくはＳＵＲ１を発現しない細胞株を使用して実施される。該カウンタースクリーニングアッセイは陰性対照として作用し、そして発現されたＳＵＲ１に結合する試験化合物の検出を見込む。
【００７０】
加えて、該方法は、試験分子を甘さに対する動物の生理学的応答、電気生理学的応答若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけて、該試験分子が甘味を提供する若しくは高めることを確認することにより試験分子をスクリーニングすることをさらに包含しうる。
【００７１】
下に提供される実施例は本方法で有用な多様な方法およびアッセイを示す。
【００７２】
口中で甘味を提供する若しくは高める分子のなお別の同定方法は、試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ例えばＳＵＲ１）サブユニットおよびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ例えばＫＩＲ６．１）サブユニットを発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させることを含んでなる。適する培養条件、例えば３７℃で約１０分ないし約２４時間後に、接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化に対する試験分子の影響を、実施例１および２に記述されるところの間接的免疫蛍光共焦点顕微鏡検査のようないずれかの適する手段により評価、測定かつ／若しくは定量する。陰性対照細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化に関する接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化の変化は、甘味を提供する若しくは調整する試験分子を示す。
【００７３】
一態様において、本方法で一般に使用される陰性対照は、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知である対照分子により接触される同一細胞若しくは細胞株である。別の態様において、本方法で一般に使用される陰性対照は、試験若しくは対照分子により接触されない同一細胞若しくは細胞株である。従って、該方法における試験分子の効果の比較は、甘味を提供する若しくは高めることと相関する結果の同定を可能にする。
【００７４】
望ましくは、該方法で使用される細胞若しくは細胞株はＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルを発現する天然の口腔味細胞若しくは細胞株である。別の態様において、該細胞株若しくは細胞培養物は異種（口腔以外、味以外）細胞若しくは細胞株、例えば膵細胞若しくは細胞株または内分泌細胞若しくは細胞株でありうる。なお別の態様において、細胞若しくは細胞株はＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルを発現するよう形質転換された異種細胞若しくは細胞株でありうる。
【００７５】
該方法は、試験される細胞若しくは細胞株中で試験分子により媒介される非特異的活性を排除する、例えば非特異的核局在化を排除する、若しくは望ましくない特性をもつ試験分子を排除するための該試験分子についてのカウンタースクリーニングアッセイをさらに使用しうる。加えて、該方法は、試験分子を、甘さに対する動物の生理学的応答、電気生理学的応答若しくは行動アッセイまたは単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけて、該該試験分子が甘味を提供する若しくは高めることを確認することにより試験分子をスクリーニングすることをさらに包含しうる。
【００７６】
ＩＩＩ．該方法の実施で有用な一般的方法／アッセイ
下に提供される実施例は本方法で有用な多様な方法およびアッセイを示す。上で指定される方法で有用な慣習的方法の１つが発現レベルの多様な測定手段である。遺伝子産物の発現レベルは、タンパク質若しくは核酸の測定によるを包含する慣習的手段を使用して測定しうる。発現されたタンパク質の発現レベルの測定は、発現されるタンパク質に向けられるいかなる適するリガンド、例えばタンパク質を検出するための抗体（若しくはいずれかの第二のバイオマーカーに対する抗体）も使用しうる。こうした抗体は現在当該技術分野で現存しうるか、若しくは現在商業的に使用されうるか、または免疫学の分野で現在普遍的な技術により開発されうる。同様に、該リガンドは、使用されるアッセイ形式に依存して検出可能なシグナルを提供することが可能な試薬でタグをつける若しくは標識することができる。こうした標識は、単独でまたは他の組成物若しくは化合物と共同して検出可
能なシグナルを提供することが可能である。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡでのように１種以上のリガンドをある診断方法で使用する場合、標識は望ましくは検出可能なシグナルを生じるように相互作用的である。最も望ましくは、標識は視覚的に例えば比色的に検出可能である。
【００７７】
本発明の方法で利用しうる他の標識系は他の手段により検出可能であり、例えば、その中に色素が埋め込まれている着色ラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナ州）を、適応可能なアッセイで結果として生じるタンパク質−リガンド複合体の存在を示す視覚的シグナルを提供するための酵素の代わりに使用しうる。なお他の標識は蛍光化合物、放射活性化合物若しくは元素を包含する。ペプチド模倣物のような生物学的サンプル中のタンパク質の検出のための他の試薬、ＳＥ−ＣＡＤを検出することが可能な合成化合物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、免疫組織化学などのような生物学的サンプル中のＳＥ−ＣＡＤタンパク質の定量的検出のための他のアッセイ形式で使用しうる。
【００７８】
発現される核酸のレベルの測定は当該技術分野で既知の慣習的技術を使用しうる。こうした方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドのシークエンシングに基づく方法、プロテオミクスに基づく方法若しくは免疫化学技術を包含する。サンプル中のｍＲＮＡ発現の定量のための当該技術分野で既知の最も一般的に使用される方法は、ノーザンブロッティングおよびインシトゥーハイブリダイゼーション；リボヌクレアーゼ保護アッセイ；ならびに逆転写、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）若しくはｑＰＣＲのようなＰＣＲに基づく方法を包含する。あるいは、特異的ＤＮＡ−タンパク質二重鎖を認識し得る抗体を使用しうる。本明細書に記述される方法はそれらを実施するために選択される特定の技術により制限されない。
【００７９】
同様に、本明細書に記述される方法のいずれも、口中で甘味を提供若しくは調整する試験分子を同定するのに使用されるハイスループットスクリーニングアッセイを使用しうる。一態様において、こうしたアッセイは、異なる選択された試験分子（例えばヌクレオチド配列、アミノ酸配列、小分子など）を、特定の糖輸送タンパク質を発現する哺乳動物口腔細胞若しくは細胞株とマルチウェルプレートの各個々のウェル中で接触させることを必要とする。一態様において、その細胞は、前記細胞が糖輸送タンパク質を発現する場合のみルシフェラーゼ（若しくは別のマーカー遺伝子）を発現する発現系（プロモーター、タンパク質、マーカー遺伝子）でトランスフェクトされている。化合物が適切な培養条件下で発現する細胞に曝露された後に、マーカー遺伝子（すなわちルシフェラーゼ）のレベルを慣習的に測定する。試験分子のいずれかにより引き起こされる、該細胞により通常発現される特定の糖輸送タンパク質の発現のレベルの変化が、各ウェル中の該マーカーの発現若しくは発現の欠如と相関する。
【００８０】
本明細書に記述される方法での使用のための他の慣習的アッセイおよび技術もまた存在し、その方法は本明細書で参照される刊行物に記述されている。こうした他のアッセイ形式を使用することができ、かつ、本明細書に記述されるアッセイ形式は制限でない。
【００８１】
本明細書で同定される試験分子に対する構造的類似性を有する化合物は、化学的実体若しくはフラグメントが既知の化合物若しくは試験分子、例えば本明細書に記述されるＳＵ若しくはＧＬＵＴ活性化因子またはＳＬＧＴ１活性化因子と会合するか若しくはそれらを模倣するそれらの能力についてスクリーニングしかつ選択される一連の段階によって、コンピュータで評価かつ設計してもまたよい。当業者は、これらのペプチドの構造を模倣する、およびより具体的にはＳＵＲ１受容体と結合する構造を同定するそれらの能力についての化学的実体若しくはフラグメントのいくつかのスクリーニング方法の１つを使用しうる。この方法は、例えばコンピュータ画面上での三次元構造の目視検査により開始しうる
。選択されたフラグメント若しくは化学的実体をその後、構造的類似性を決定することへの多様な方向に配置しうるか、若しくは受容体の推定結合部位内でドッキングしうる。
【００８２】
本明細書の方法により同定されるものに基づき新たな試験分子を設計する方法でもまた補助しうる特化されたコンピュータプログラムは、オックスフォード大学、英国オックスフォードから入手可能なＧＲＩＤプログラム（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８５  ２８：８４９−８５７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能なＭＣＳＳプログラム（Ａ．ＭｉｒａｎｋｅｒとＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９１  １１：２９−３４）；Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能なＡＵＴＯＤＯＣＫプログラム（Ｄ．Ｓ．ＧｏｏｄｓｅｌｌとＡ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９０  ８：１９５−２０２）；およびカリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能なＤＯＣＫプログラム（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８２  １６１：２６９−２８８）、ならびにＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌのようなソフトウェア、次いでＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的分子力学力場でのエネルギー最小化および分子ダイナミクスを包含する。小分子化合物の付加的な商業的に入手可能なコンピュータデータベースは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＤａｔａｂａｓｅおよびＣＯＮＣＯＲＤデータベースを包含する（総説についてはＲｕｓｉｎｋｏ，Ａ．、１９９３、Ｃｈｅｍ．Ｄｅｓ．Ａｕｔｏ．Ｎｅｗｓ、８：４４−４７を参照されたい。
【００８３】
適する化学的実体若しくはフラグメントが一旦選択されれば、それらを単一化合物に集成し得る。集成は、受容体の構造に関してコンピュータ画面に表示される三次元像上での相互に対するフラグメントの関係の目視検査により進めてよい。個々の化学的実体若しくはフラグメントを結合する際に当業者を補助するための有用なプログラムは、カリフォルニア大学、カリフォルニア州バークレイから入手可能であるＣＡＶＥＡＴプログラム（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら、“ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ“、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．中、Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８、ｐｐ．１８２−１９６（１９８９）］；ＭＡＣＣＳ−３Ｄデータベース（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンレアンドロ）のような３Ｄデータベースシステム（例えばＹ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９２  ３５：２１４５−２１５４を参照されたい）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能なＨＯＯＫプログラムを包含する。
【００８４】
本明細書に記述される試験分子を模倣する化合物は、Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能なＬＵＤＩプログラム（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ、１９９２  ６：６１−７８）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能なＬＥＧＥＮＤプログラム（Ｙ．ＮｉｓｈｉｂａｔａとＡ．Ｉｔａｉ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９１  ４７：８９８５）；およびＴｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能なＬｅａｐＦｒｏｇプログラムのような方法を使用して、全体として若しくは「新たに」設計しうる。他の分子モデル化技術もまた使用しうる。例えばＮ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９０  ３３：８８３−８９４を参照されたい。Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａとＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２  ２：２０２−２１０もまた参照されたい。例えば、試験化合物の構造が既知である場合、試験化合物のモデルを標的受容体のモデルに重ね合わせうる。この段階を実施するための多数の方法および技術が当該技術分野で既知であり、そのいずれも使用しうる。例えばＰ．Ｓ．Ｆａｒｍｅｒ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ａｒｉｅｎｓ，Ｅ．Ｊ．編、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ  １１９−１４３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８０）；米国特許第５，３３１，５７３号明細書；米国特許第５，５００，８０７号明細書；Ｃ．Ｖｅｒｌｉｎｄｅ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９４  ２：５７７−５８７；およびＩ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２  ２５７：１０７８−１０８２を参照されたい。本明細書に記述されるモデル構築技術およびコンピュータ評価システムは制限でない。
【００８５】
かように、これらのコンピュータ評価システムを使用して、多数の化合物を迅速かつ容易に検査することができ、そして高価かつ非常に長い生物学的試験を回避しうる。さらに、多くの化合物の実際の合成の必要性が効果的に排除される。
【００８６】
ＩＶ．組成物
モデル化技術により一旦構築されれば、本明細書に記述される方法のいずれかにより同定される提案される新たな試験分子、若しくはこれらの方法でのその同定により新たな用途を有することが示される既知分子を、生物活性および適合性についてさらに試験しうる。こうした試験は実施例のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのような標準的技術を使用して最終組成物の他成分を用いて実施する。本明細書の使用のための適するアッセイは、限定されるものでないが下に実施例に示されるアッセイを挙げることができる。他のアッセイ形式を使用することができ、そしてアッセイ形式の選択は該方法の制限でない。
【００８７】
例えば、本発明のある態様において、甘味を提供する若しくは甘味を強化することを示す試験分子は、スルホニル尿素（ＳＵ）化合物若しくは誘導体、またはペプチド若しくはタンパク質であるはＳＵＲ１受容体と結合するために必要な同一の三次元形状を有する。例えば、局所で作用することが既知であるかまたは腸管で分解されるか若しくは再吸収されるスルホニル尿素化合物若しくは誘導体は有用な試験分子の一分類を提供する。あるいは、糖尿病若しくは心疾患を処置するための制限される活性を有するＳＵは、本発明の組成物のための有用な試験分子であることもまた予期される。同様に、他のチャンネル若しくは受容体に結合することが可能であるＳＵの誘導体が同様に有用でありうる。
【００８８】
他の態様において、甘味を提供する若しくは加糖を高めることが示されている試験分子はＧＬＵＴの既知の活性化因子の誘導体である。こうした既知の化合物の１つは、ある種のシアン化物およびアジド様化合物のような酸化的ホスフィレーション（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤（Ｓｈｅｔｔｙら、１９９３  ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２６８（２３）：１７２２５−１７２３２）；若しくはＴＮＦα、ホルボールエステル、オカダ酸および８−ブロモ−ｃＡＭＰ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら  １９９２  ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２６７（１２）：８３３６−４１）；ＨＩＦ−１ならびにグルコースである。
【００８９】
なお別の態様において、甘味を提供する若しくは加糖を高めることが示されている試験分子は、イソプロテレノール若しくはテルブチリンのようなＳＧＬＴ−１の既知の活性化因子の誘導体（Ａｓｃｈｅｎｂａｃｈら、２００２、Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１３２：１２５４−５７）、リポ多糖若しくはグルコースである。
【００９０】
本明細書に記述される化合物、ならびにこれらの方法により有用と同定されかつ上述されたところのスルホニル尿素化合物若しくは誘導体は、描かれる構造の生物活性を特徴とする本明細書に提供される構造の互変異性体を包含しうる。さらに、本明細書に記述され
る化合物は製薬学的若しくは生理学的に許容できる酸、塩基、アルカリ金属およびアルカリ土類金属由来の塩の形態で使用し得る。製薬学的に許容できる塩は、例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸および類似の既知の許容できる酸を包含する有機および無機酸から形成し得る。塩はまた、例えばナトリウム、リチウム若しくはカリウムを包含する無機塩基、望ましくはアルカリ金属塩、ならびに、アンモニウム塩、モノ、ジおよびトリメチルアンモニウム、モノ、ジおよびトリエチルアンモニウム、モノ、ジおよびトリプロピルアンモニウム（イソおよびノルマル）、エチルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルアンモニウム、シクロヘキシルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、ジベンジルアンモニウム、ピペリジニウム、モルホリニウム、ピロリジニウム、ピペラジニウム、１−メチルピペリジニウム、４−エチルモルホリニウム、１−イソプロピルピロリジニウム、１，４−ジメチルピペラジニウム、１−ｎ−ブチルピペリジニウム、２−メチルピペリジニウム、１−エチル−２−メチルピペリジニウム、モノ、ジおよびトリエタノールアンモニウム、エチルジエタノールアンモニウム、ｎ−ブチルモノエタノールアンモニウム、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアンモニウム、フェニルモノエタノールアンモニウムなどのような有機塩基からも形成されうる。
【００９１】
生理学的に許容できるアルカリ塩およびアルカリ土類金属塩は、エステルおよびカルバメートの形態のナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩を制限なしに包含し得る。
【００９２】
これらの塩ならびに本明細書に記述される他の化合物は、そうした形態で投与される場合にｉｎ  ｖｉｖｏで活性部分に転化するエステル、カルバメートの形態および他の慣習的「プロドラッグ」の形態にあり得る。一態様において、プロドラッグはエステルである。例えばＢ．ＴｅｓｔａとＪ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ、“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：Ｔｈｅ  “Ａｄ  Ｈｏｃ”Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｓ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ”、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６（３）：２３３−２４１、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９６）を参照されたい。
【００９３】
本明細書に記述されるとおり、本明細書に記述される化合物および／またはそれらの塩、プロドラッグ若しくは互変異性体は、本明細書に記述されるところの治療若しくは予防目的で送達される。
【００９４】
本明細書に記述される化合物は、商業的に入手可能な出発原料若しくは文献の手順を使用して製造し得る出発原料から当業者により容易に製造される。
【００９５】
上で論考された分子／化合物は、描かれる構造の生物活性を特徴とする本明細書で提供される構造の互変異性体を包含しうる。さらに、該化合物は、製薬学的若しくは生理学的に許容できる酸、塩基、アルカリ金属およびアルカリ土類金属由来の塩の形態でもまた使用しうる。
【００９６】
本明細書に記述される組成物は、それらの用途に依存して未希釈でまたは投与のための１種若しくはそれ以上の賦形剤とともに処方しうる。当業者は、こうした組成物に添加すべき適する付加的な成分を決定することが容易に可能であろう。組成物は固体若しくは液体でありうるのみならず、しかし付加的な固体および／若しくは液体担体を含有しうる。該担体は乾燥若しくは液体の形態にあることができ、そして摂取に安全でありかつ／若しくは製薬学的に許容できなければならない。
【００９７】
これらの方法により同定される試験分子は一態様において甘味料としてそれら自身有用である。あるいは、これらの試験分子は、ありそうには、他の既知の天然若しくは人工甘味料の甘味を高めてこうした甘味料をヒト消費者により訴えるようにするはずである。試験分子を添加しうるなお他の組成物は、添加された甘味料を必要とする食品、食品添加物、飲料、および経口で投与される製剤のような他の製品を包含する。本発明の化合物は、天然若しくは人工甘味料が現在使用されているいかなる組成物（例えば甘味料、食品添加物、飲料若しくは製剤）でも有用であることが予期される。これらの組成物（上の方法により同定される新たな若しくは既知の分子若しくは化合物は、哺乳動物味細胞を上述されたところの組成物とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることによる口中の甘味のいかなる提供若しくは調整方法でも使用しうる。
【００９８】
以下の実施例は具体的に説明するのみであり、そして本発明に対する制限であることを意図していない。
【実施例】
【００９９】
Ｖ．実施例
われわれはＴ１ｒ非依存性甘味の性質を検査し、そしてＴ１ｒ以外の複数の糖輸送体および糖検知分子の味細胞中の存在を確認した。われわれは、味細胞がグルコース輸送体および他組織で糖センサーとしてはたらく代謝センサーを発現しているかどうか確認することを欲した。ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、インシトゥーハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学により、われわれは味細胞が数種のグルコース輸送体（ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ８およびＧＬＵＴ９）、ナトリウム・グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ１）、ＫＡＴＰ代謝センサーの２成分（ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．１）を発現し、また、インスリン受容体が味細胞で選択的に発現されたことを確認した。甘味における役割と矛盾せず、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１およびＳＵＲ１はＴ１ｒ３陽性味細胞で優先的、選択的若しくは排他的に発現されることを見出した。
【０１００】
電気生理学的記録が、マウス茸状味細胞の全外向き電流のほぼ２０％がスルホニル尿素で阻害可能なＫＡＴＰチャンネルから構成されたことを確認した。Ｔ１ｒ３を発現する味細胞の圧倒的大多数がＳＵＲ１もまた発現し、そして逆もまた真であるため、発明者は、ＫＡＴＰチャンネルが味細胞のＴ１ｒ３サブセットのＫ＋チャンネルの主要部分を構成すると仮定する。味細胞で発現されるグルコースセンサーおよびＫＡＴＰは、従って、味細胞の甘味応答性サブセットにおける糖のＴ１ｒ非依存性甘味のメディエーターとしてはたらく。
【実施例１】
【０１０１】
材料および方法
Ａ．試薬
合成オリゴヌクレオチドはＧｅｎｅｌｉｎｋ（ニューヨーク州ホーソーン）から購入した。プラスミドおよびＤＮＡフラグメント精製のためのキットはＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）からであった。制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリー）からであった。ディスパーゼおよびコラゲナーゼＡはＲｏｃｈｅ（インディアナ州インディアナポリス）からであった。抗ＳＮＡＰ−２５抗体はＤｒ．Ｐａｕｌ  Ｂｒｅｓｌｉｎからの贈与物であり；抗ＳＬＧＴ１抗体はＤｒ．Ｓｏｒａｙａ  Ｓｈｉｒａｚｉ−Ｂｅｅｃｈｅｙからの贈与物であった。
【０１０２】
Ｂ．野生型およびトランスジェニックマウス
全実験は研究における動物の保護および使用についてのＮＩＨガイドラインのもとで実施し、そしてＭｏｎｅｌｌ若しくはユタ州立大学の施設動物管理使用委員会により承認さ
れた。本研究に使用された全マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景であった。Ｔ１ｒ３（Ｔ１ｒ３−ＧＦＰ）およびＴｒｐＭ５（ＴｒｐＭ５−ＧＦＰ）のためのプロモーター下にＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスを以前に記述された（Ｃｌａｐｐ  ＴＲら、２００６）とおり生成した。
【０１０３】
Ｃ．全ＲＮＡの単離および逆転写
２匹の成体（２〜１０月齢）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを頸部脱臼により殺し、そしてそれらの舌を摘出し、２ｍＭ  ＥＧＴＡを含有するＰＢＳ溶液に入れ、そしてＣＶ乳頭を含有する上皮を、下にある筋組織からの汚染を最小限にするよう注意を払い剥離した。味蕾を欠く味以外の舌上皮を同様の方法で舌の腹側表面から単離した。全ＲＮＡは、製造元の説明書に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰｕｒｅ−Ｌｉｎｋ  ＲＮＡミニキット（カタログ番号１２１８３０１８Ａ）を使用して単離した。汚染するゲノムＤＮＡを、Ｐｕｒｅ−Ｌｉｎｋデオキシリボヌクレアーゼ（カタログ番号１２１８５−０１０）を使用してＲＮＡ単離の間にカラム中で消化した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ装置（ＮＤ−１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。約５００ｎｇの全ＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｑＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（カタログ番号１１７５２−０５０）を使用して逆転写した。
【０１０４】
Ｄ．ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲ
研究された各遺伝子の発現をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（カタログ番号１０５７２０１４）を使用するＰＣＲにより確認した。プライマーはＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）を使用して設計した。各プライマーが異なるエキソンからであるような全プライマー対を選んだ。各遺伝子に使用したプライマーを表１に提供する。
【０１０５】
【表１】
2014506460.tif 000004
【０１０６】
ＧＡＰＤＨプライマーを用いる逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを使用して成功裏のｍＲＮＡ単離およびＲＴ反応を確認した。ガストデューシンプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲを使用して味および味以外のＲＮＡの特異性を確認した。問い合わせられた（ｑｕｅｒｉｅｄ）遺伝子が発現されることが既に知られていた組織からのｃＤＮＡを陽性対照として使用した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離し、そしてＵＶ照明下に臭化エチジウムで可視化した。
【０１０７】
各遺伝子の発現を、レポーターとしてのＦＡＭ色素、５’端の副溝結合体部分、３’端の非蛍光クエンチャー色素および受動的参照標準としてのＲＯＸを使用してＴａｑｍａｎ
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するｑＰＣＲにより定量した。Ｔａｑｍａｎ  ＦＡＳＴカスタムプレートを内部標準としてのＧＡＰＤＨおよび製造対照としての１８ｓ  ｒＲＮＡとともに使用した。各遺伝子についてのＴａｑｍａｎプローブおよびプライマーの組合せはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのウェブサイト（ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）に従って選び、そして表２に提供する。
【０１０８】
【表２】
2014506460.tif 000005
【０１０９】
マスターミックスを、２×ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、部品番号：４４４４５５７）、ヌクレアーゼフリー水およびｃＤＮＡ（０．８μｌ／反応）を使用してＣＶ若しくはＮＴサンプルについて調製した。１０μｌの反応をＳｔｅｐＯｎｅ  ２．１ソフトウェアを実行するＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ機械で実施した。各遺伝子を各運転で三重の反応により定量し、そして運転を双方のマウスからのＣＶおよびＮＴサンプルについて３回反復した。データ解析はＭＳ  Ｅｘｃｅｌを使用して行った。各遺伝子の平均δＣｔ（ＧＡＰＤＨおよび各遺伝子のＣｔ値の間の差異）のｌｏｇ１０をＣＶおよびＮＴ双方の組織についてプロットした。
【０１１０】
Ｅ．ＲＮＡプローブ
ＧＬＵＴ２（Ｓｌｃ２ａ２、クローン配列ＢＣ０３４６７５．１）、ＧＬＵＴ４（Ｓｌｃ２ａ４、クローン配列ＢＣ０１４２８２．１）、ＧＬＵＴ９（Ｓｌｃ２ａ９、クローン配列ＢＣ００６０７６）およびＳＧＬＴ１（Ｓｌｃ５ａ１、クローン配列ＢＣ００３８４５）の商業的に入手可能なマウス哺乳動物遺伝子コレクションで確認された完全長ｃＤＮＡをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アラバマ州ハンツビル）から購入し；ＳＵＲ１（Ａｂｃｃ８、クローン配列ＢＣ１４１４１１．１）をｉｍａＧｅｎｅｓ（独国ベルリン）から購入した。各ストックを液体培地中で増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡをｍｉｎｉ−ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット（カリフォルニア州バレンシア）を使用して精製した。Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの構築物をｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクター中およびｉｍａＧｅｎｅｓからｐＹＸ−ＡＳｃベクター中で得た。上のクローンからのプラスミドＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎミディプレップキットを使用して精製し、そしてＡＢＩ  ９６キャピラリー３７３０ＸＬシークエンサーを使用してペンシルバニア大学ＤＮＡシークエンシング施設で色素ターミネーター法により配列決定した。クローンＤＮＡは、アンチセンスプローブについてＳａｌＩで消化しかつＴ７若しくはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼにより転写したか、またはセンスプローブについてＮｏｔ１で消化しかつＳｐ６  ＲＮＡポリメラーゼにより転写した。プローブはＤＩＧ  ＲＮＡラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて生成しそしてＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で精製した。標識ＲＮＡプローブの濃度およびＡ２６０／Ａ２８０光学密
度をＮａｎｏＤｒｏｐリーダー（ＮＤ−１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で確認した。
【０１１１】
Ｆ．組織調製
成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６、トランスジェニックＴ１ｒ３−ＧＦＰおよびトランスジェニックＴｒｐＭ５−ＧＦＰマウス（２〜１０月齢）を頸部脱臼により殺し、その後膵、骨格筋、小腸、ならびに舌の有郭、葉状および茸状乳頭含有部分を手早く取り出しかつ氷冷ＰＢＳ中で手早くすすいだ。インシトゥーハイブリダイゼーションのため、組織を１００％エタノールドライアイス浴を使用してＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．マウント媒体（Ｓａｋｕｒａ、カリフォルニア州トランス）中で急速凍結し、その後１ｈｒ以内に薄片を作った。免疫組織化学のため、組織を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．に包埋する前に４％パラホルムアルデヒド／１×ＰＢＳ中４℃で１ｈｒ一夜固定しかつ２０％ショ糖／１×ＰＢＳ中４℃で一夜低温保存した。８ないし１２ミクロン厚切片をクライオスタットＣＭ３０５０Ｓ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、独国ヴェッツラー）を使用して調製し、そして予め被覆された顕微鏡スライドガラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）に適用した。切片を４０℃で２０ｍｉｎ乾燥し、そしてインシトゥーハイブリダイゼーションに直ちに使用したか、若しくは免疫組織化学のため−８０℃で保存した。
【０１１２】
Ｇ．インシトゥーハイブリダイゼーション
新鮮切片を４％パラホルムアルデヒド／１×ＰＢＳ中で１０ｍｉｎ固定し、１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、独国）を含有する１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．５Ｍ  ＥＤＴＡ中３７℃で１０ｍｉｎインキュベーションにより透過処理し、４％パラホルムアルデヒド／１×ＰＢＳ中で１０ｍｉｎ後固定し、その後１０ｍｉｎアセチル化した。全段階に次いで、ＤＥＰＣ処理された１×ＰＢＳで３回５ｍｉｎ洗浄した。スライドガラスをその後、ＤＥＰＣ処理水中５０％脱イオン化ホルムアミド、５×生理的食塩水／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、２５０μｌ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、２．５Ｍ  ＥＤＴＡを含有する混合物中室温で１ｈｒプレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのため、該混合物のアリコートを８５℃で１０ｍｉｎ加熱して酵母ｔＲＮＡを変性させ、そしてＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを添加して所望の濃度を生じた。以下の濃度すなわち０．５μｇ／ｍｌ  ＧＬＵＴ２、０．２５μｇ／ｍｌ  ＧＬＵＴ４、０．２５μｇ／ｍｌ  ＧＬＵＴ９、０．５μｇ／ｍｌ  ＳＧＬＴ１および０．３μｇ／ｍｌ  ＳＵＲ１を各ＲＮＡプローブに使用した。ＲＮＡプローブ混合物を８５℃で３ｍｉｎ加熱してプローブを変性させ、その後直ちに氷上で冷却した。Ｈｙｂｒｉｓｌｉｐプラスチック製カバーガラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してハイブリダイゼーションの間に切片が乾燥するのを防ぎ、そしてスライドガラスを加湿チャンバーに入れ、大型の湿ったジッパー付ビニール袋中に封止しかつ６５℃で一夜インキュベートした。プラスチック製カバーガラスを、６５℃に予め加温した５×ＳＳＣ中に浸漬することにより除去した。スライドガラスを０．２×ＳＳＣ中で各３０ｍｉｎ３回および０．１×ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で１０ｍｉｎ１回洗浄した。チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）シグナル増幅Ｐｌｕｓ  ＤＮＰ−ＡＰキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ボストン）を製造元のプロトコルに従って使用して、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ９およびＳＵＲ１のＲＮＡプローブからのシグナルを増幅した。ＳＧＬＴ１プローブとハイブリダイズされたスライドガラスは増幅段階なしで舌および腸双方の組織でかなりのｍＲＮＡ標識を表した。これらのスライドを１０％熱不活化正常ヤギ血清を用い室温で１ｈｒブロッキングし、次いでブロッキング溶液中の抗ＤＩＧ−アルカリホスファターゼ（１：１０００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と室温で３ｈｒインキュベートした。アルカリホスファターゼ標識は、レバミソール（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含むＮＢＴ＋ＢＩＣＰ（ニトロブルーテトラゾリウム＋５−ブロモ−４−クロロ−３インドリルリン酸）
混合物（Ｒｏｃｈｅ）との室温で暗所での一夜インキュベーションにより検出した。スライドガラスをＰＢＳＴで洗浄し、水中ですすぎ、増大する一連のＥＴＯＨで脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ジョージア州アトランタ）で透徹し、そしてＰｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）でカバーガラスを載せた（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄ）。アンチセンスおよびセンスＲＮＡプローブは、同等条件を確保するために同等濃度で使用しかつ同一実験で同時に実施した。各実験で、Ｔ１ｒ３若しくはガストデューシンアンチセンスプローブを伴うインシトゥーハイブリダイゼーション実験陽性対照を味組織で行ってハイブリダイゼーションが適正にはたらいたことを保証した。加えて、インシトゥーハイブリダイゼーションを陽性対照組織で行ってＲＮＡプローブの質および特異性を確認した。アンチセンスＲＮＡプローブは目的の遺伝子を発現することが既知の組織での陽性の発現について試験した一方、センスＲＮＡプローブは対照として使用した。アンチセンスプローブはＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ９およびＳＵＲ１の膵での適切な発現を示した一方、センスプローブはＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ９およびＳＵＲ１の膵での低い非特異的ハイブリダイゼーションを示した。アンチセンスプローブはＧＬＵＴ４の骨格筋での適切な発現を示した一方、センスプローブはＧＬＵＴ４の骨格筋での低い非特異的ハイブリダイゼーションを示した。アンチセンスプローブはＳＧＬＴ１の腸での適切な発現を示した一方、センスプローブはＳＧＬＴ１の腸での低い非特異的ハイブリダイゼーションを示した。データは示されない。
【０１１３】
Ｈ．免疫組織化学
標準的免疫組織化学技術を使用した。簡潔には、凍結切片をＰＢＳで再水和した。非特異的結合をブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２％ヤギ若しくはロバ血清）で室温で１〜２ｈｒブロッキングした。切片を、ウサギ抗ＧＬＵＴ２（１：１５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルズ、ｓｃ−９１１７）；ウサギ抗ＧＬＵＴ４（１：１５０、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、ａｂ３３７８０）；ウサギ抗Ｋｉｒ６．１（１：１００、Ａｂｃａｍ、ａｂ８０９７２）；ウサギ抗ＳＧＬＴ１（１：１５０、Ａｂｃａｍ、ａｂ１４６８６）；ウサギ抗ＳＵＲ１（１：１５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２５６８３）；ヤギ抗Ｔ１Ｒ３（１：２５０、Ｎｏｖｕｓ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＮＢＰ１−４６４６６）；ヤギ抗ＧＬＡＳＴ１（１：２５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−７７５７）；若しくはマウス抗ＳＮＡＰ−２５（１：２５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、マサチューセッツ州ビレリカ、ＭＡＢ３３１）に対する一次抗体と加湿チャンバー中４℃で一夜インキュベートした。ＰＢＳＴでの３回の１５ｍｉｎ洗浄後、スライドガラスを、ブロッキング緩衝液中の以下の蛍光二次抗体（１：５００）すなわちウサギ一次抗体の免疫蛍光のためＡｌｅｘａ４４８ロバ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）；Ｔ１Ｒ３−ＧＦＰマウスからの切片を用いるウサギ一次抗体の免疫蛍光のためＡｌｅｘａ５９４ロバ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１種と室温で１時間インキュベートした。全部の二重免疫蛍光標識を、細胞核を標識するためのＤＡＰＩ（１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に以下の二次抗体すなわちＡｌｅｘａ４８８ロバ抗ヤギ、Ａｌｅｘａ  ４８８ロバ抗マウス、Ａｌｅｘａ５９４ロバ抗ヤギ、若しくはＡｌｅｘａ５９４ロバ抗ヤギ（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の組合せを用いて行った。陰性対照は一次抗体の省略を包含した。グルコース輸送体抗体もまた陽性対照組織で試験した。味蕾含有切片との使用前に、全抗体を目的の遺伝子を発現することが既知の組織での陽性の発現について試験した。抗体は、膵：ＧＬＵＴ２、ＳＵＲ１；骨格筋：ＧＬＵＴ４；および小腸：ＳＧＬＴ１で適切な発現を示した（データは示されない）。一次抗体の省略はこれらの組織で二次抗体から低い非特異的バックグラウンドを示した（データは示されない）。
【０１１４】
Ｉ．画像化
明視野画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡に接続されたＮｉｋｏｎ  ＤＸＭ  １２００Ｃデジタルカメラを使用して可視化し、そしてＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｆ３．００ソフトウェアを使用して撮像し、若しくはＮｉｋｏｎ  ＳＡ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ顕微鏡に接続されたＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を用い、そしてＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ画像解析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州シルバースプリング）を使用して最小限に処理した。取得パラメータはアンチセンスおよびセンス双方のプローブを用いるインシトゥーハイブリダイゼーションについて一定に保持した。蛍光画像を、ＵＶ、Ａｒ、ＧｅＮｅおよびＨｅＮｅレーザーならびに適切な励起スペクトルを使用してＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２スペクトル共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ
Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎｃ．、独国マンハイム）で撮像した。Ｌｅｉｃａ  Ｓｃａｎｗａｒｅソフトウェアを使用して、撮像されたｚシリーズスタックを０．２５〜０．３５μｍステップサイズで取得した。画像を５１２×５１２画素形式で走査し；走査線を２回平均しかつフレームを３回走査した。取得パラメータ（すなわち利得、相殺およびＰＭＴ設定）は抗体を用いる実験および抗体を含まない対照について一定に保持した。デジタル画像をトリミングし、そしてＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して配置した。関連するアンチセンスおよびセンス画像を同一の輝度およびコントラストで調節した。図内の蛍光画像はバックグラウンド標準化のため輝度およびコントラストについて調節した。
【０１１５】
Ｊ．細胞計数
量的測定を実施して、ＧＬＵＴ４若しくはＳＵＲ１を共発現した単独でおよび二重で標識されたＩＩ型（Ｔ１ｒ３）およびＩＩＩ型（ＳＮＡＰ−２５）味細胞の比率を決定した。味蕾含有切片をＬｅｃｉａ共焦点顕微鏡で４０×対物レンズ下で走査し、そして、個々の味細胞を容易に識別し得た１００〜１５０μｍ２面積を生じるように拡大し；細胞体全体を可視化し得た味細胞のみを計数した。各味細胞型について、ＣＶ乳頭全体の１切片および葉状乳頭からの２〜３切片を計数した。
【０１１６】
Ｋ．ＳＧＬＴ−１についての糖取り込みアッセイ
味細胞を、低若しくは高グルコースを含む細胞培地中で試験化合物と２４ｈインキュベートする。糖取り込みを、ＳＧＬＴ−１に選択的でありかつ他のグルコース輸送体により輸送されないＣ１４標識糖プローブα−ＭＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用するラジオアッセイで測定する（ＫｉｍｍｉｃｈとＲａｎｄｌｅｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８１  Ｎｏｖ；２４１（５）：Ｃ２２７−３２；Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｍａｒ
２９；２７１（１３）：７７３８−４４）。α−ＭＧ取り込みは１５ｍｉｎから少なくとも２ｈまで直線的である。予備研究は、ＳＧＬＴ−１によるα−ＧＭ糖プローブの取り込みが、放射標識プローブの存在下で添加される０．５ｍＭフロリジン（Ｓｉｇｍａ）を使用して選択的であることを示す。
【０１１７】
細胞を、２５ｍＭ  ｄ−マンニトールを含有するグルコースフリーハンクス平衡塩類溶液（マンニトール−ＨＢＳＳ）で穏やかに洗浄し、そしてその後０．２ｍｌの２μＣｉ／ｍｌ（６．６５μＭ）  １４Ｃ標識α−ＧＭを含有するマンニトール−ＨＢＳＳと３７℃、５％ＣＯ２および９６％湿度で３０ｍｉｎインキュベートする。細胞を４℃でＨＢＳＳで洗浄しかつ０．１Ｎ  ＮａＯＨで可溶化する。ライセートを液体シンチレーションカクテルに混合する。糖取り込みのレベルをβ−シンチレーションカウンターを使用して測定する。値をナノモル／ｃｍ２表面積として表す。
【０１１８】
Ｌ．電気生理学
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの茸状乳頭からの味蕾を、十分に確立された手順（例えば
Ｂａｑｕｅｒｏ  ＡＦ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＴＡ  ２０１０  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００３１８．２０１０を参照されたい）により単離した。味蕾内の個々の細胞を、７．２のｐＨのＫ−グルコン酸、１４０ｍＭ；ＣａＣｌ２、１ｍＭ；ＭｇＣｌ２、２ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ；ＥＧＴＡ、１１ｍＭの標準的細胞内溶液で満たした場合に４〜１０ＭΩの抵抗まで引かれるホウケイ酸パッチピペットを用いる慣習的全細胞パッチクランプ条件を使用することから記録した。Ｎａ−グルコン酸、１４０ｍＭ；ＫＣｌ、５ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ、グルコース、１０ｍＭ；ピルビン酸Ｎａ、１０ｍＭおよびテトロドトキシン、０．５ｍＭを含有する、公称でＣａ２＋フリーの細胞外溶液を使用して、１０ｍＶ増分で−８０から＋４０ｍＶまでの０．４ｓ電圧段階の間の外向きＫ＋電流を単離した。グリベンクラミド（０．１〜１００μＭ；Ｓｉｇｍａ）をこの溶液に添加し、そして約４ｍｌ／ｍｉｎの流速で浴適用して（ｂａｔｈ−ａｐｐｌｉｅｄ）５ｓ未満での溶液変更を可能にした。直列抵抗およびキャパシタンスを記録前に最適に補償し、そしてどの記録も漏洩を差し引かなかった。電流データを記録しそしてコマンド電位をｐＣｌａｍｐソフトウェア（ｖ．８−１０）を使用して送達した。このソフトウェアはＡｘｏＰａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器およびＤｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａデータ取得システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベイル）とインターフェースされた。
【０１１９】
Ｍ．Ｃａ画像化により決定される多様な味刺激に対する味細胞の応答
使用される味細胞は実施例１で記述されるとおり単離し、そしてラット尾Ｉ型コラーゲン被覆カバーガラス上で数時間ないし１週若しくは２か月間まで培養する。例えばＢａｑｕｅｒｏ  ＡＦ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＴＡ  ２０１０  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００３１８．２０１０を参照されたい。
【０１２０】
Ｃａ画像化は後に続くとおり実施する。該カバーガラスを、１ｍＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）および２０ｍｇ／ｍｌ  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）を補充された修正ＭＨＮＫリンゲル液（８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａおよび２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ、ｐＨ７．２、モル浸透圧濃度を５Ｍ  ＮａＣｌにより３００〜３１０に調節する）中でカルシウム感受性色素と１５〜３０分間インキュベートする。カルシウム感受性色素ｆｕｒａ−２  ＡＭは、蛍光性でありかつ検出され得るｆｕｒａ−２に切断される。
【０１２１】
インキュベーション後にカバーガラスを記録チャンバーに入れ、そして灌流として適用される修正ＭＨＮＫリンゲル液で継続的に浸漬する。
【０１２２】
刺激（安息香酸デナトニウム２ｍＭおよび０．５ｍＭ、アセスルファムＫ２５０ｐｐｍ、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）３ｍＭ、シクロヘキシミド２５μＭ、グリシン１２５ｍＭおよび高Ｋ緩衝液（５ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａおよび２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−Ｎａを含む修正ＭＨＮＫリンゲル液、ｐＨ７．２、モル浸透圧濃度を５Ｍ  ＮａＣｌにより３００〜３１０に調節する）を、灌流を刺激溶液に切り替えることによりカバーガラスに適用し、これは１０秒以内のチャンバー中の浴溶液の完全な変更を見込む。
【０１２３】
カルシウム画像化記録は、Ｒｅｓｔｒｅｐｏ  Ｄ．、Ｍ．ＺｖｉｍａｎとＮ．Ｅ．Ｒａｗｓｏｎ、“Ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａ．ＳｐｉｅｌｍａｎとＪ．Ｂｒａｎｄにより編中。ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５により記述されるところの標準的画像化技
術を使用して実施する。照明は顕微鏡に接続されたＬＳＲ  ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＳＴＥＲモノクロメーターにより提供する。２００倍拡大下で細胞中のｆｕｒａ−２からの発射光を５１０ｎｍでフィルタリングしかつ冷却されたＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｉｘ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州ベセスダ）で記録する。励起波長は広帯域フィルターを使用して３４０〜３８０ｎｍでありかつ発射波長は５１０ｎｍである。画像は、照明器、カメラおよび取得を制御しかつ画像の比例拡大（ｒａｔｉｏｉｎｇ）および擬似カラー画像の表示を実施するＭｅｒｌｉｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州ベセスダ）を使用してデジタル化する。記録設定への導入後、細胞は２日を超えた間生存可能なままであり、かつ、色素漂白の可視的効果を伴わず一度に２時間連続して画像化し得る。
【０１２４】
刺激は、修正ＭＨＮＫリンゲル液で希釈しそして重力流灌流装置を介して刺激に依存して約１０〜６０秒間適用する。細胞を、選択された最低１個の細胞についてＦｕｒａ−２
ＡＭの陽性のシグナルにより示されるとおり試験される全刺激により刺激し得る。典型的には数個の細胞を試験する。
【実施例２】
【０１２５】
グルコース輸送体および代謝センサーは味細胞中で発現される
腸および／若しくは他の組織に存在することが既知のグルコース輸送体または膵でグルコース検知に関与する代謝センサーが味細胞にもまた存在しうるかどうかを確認するため、われわれは最初に味および味以外組織でのそれらのｍＲＮＡの発現を検査した。ｃＤＮＡを、マウス有郭（ＣＶ）乳頭から単離された味蕾および味細胞を欠く舌上皮細胞（「味以外」（ＮＴ）陰性対照）から調製し、その後ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、以下すなわちＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９Ｂ、ＳＧＬＴ１、ＳＵＲ１、ＳＵＲ２Ａ、ＳＵＲ２Ｂ、Ｋｉｒ６．１、Ｋｉｒ６．２およびインスリン受容体に対応するｃＤＮＡに特異的なプライマー対を使用して実施した。ＰＣＲにより、われわれは、味以外組織からより味からのｃＤＮＡ中のＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９Ｂ、ＳＧＬＴ１、ＳＵＲ１、ＳＵＲ２Ａ、Ｋｉｒ  ６．１、およびインスリン受容体のより高レベルの発現を観察した（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。ＰＣＲは、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４  ＳＵＲ２ＢおよびＫｉｒ６．２のｍＲＮＡが味以外組織に対して味でより多量で発現されなかったことを示した（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１２６】
リアルタイムＰＣＲによる量的評価はＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＳＧＬＴ１、ＳＵＲ１、Ｋｉｒ６．１およびインスリン受容体の味組織ｃＤＮＡの上昇された発現を示した（図１Ｃおよび１Ｄ）。しかしながら、ＧＬＵＴ４およびＳＵＲ２は、味組織ｃＤＮＡでより高度に発現されることが定量的ＲＴ−ＰＣＲにより見出されなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。味組織中でより高度に発現される遺伝子について、味組織中でのｍＲＮＡ発現の絶対的レベルはＧＬＵＴ８、ＳＧＬＴ１およびインスリン受容体について最高であった。しかしながら、最高の示差的発現はＳＵＲ１およびインスリン受容体で見出された。すなわち、それぞれは味以外組織からより味からのｍＲＮＡ中で約１０倍より高度に発現された。
【０１２７】
ＰＣＲ実験のためのｃＤＮＡ鋳型は、味細胞ならびに周囲の上皮および結合細胞の混合物を含有するＣＶ味組織若しくは味細胞を欠く対照の味以外組織由来であった。これらの遺伝子のｍＲＮＡが味細胞でそれら自身選択的に発現されるかどうかを確認するため、われわれはアンチセンスおよびセンス（対照）プローブを用いるインシトゥーハイブリダイゼーションを実施した。マウス有郭（ＣＶ）および葉状味乳頭からの味蕾含有組織へのインシトゥーハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いて実施した。味蕾含有切片へのインシトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ９、ＳＧＬＴ１およびＳＵＲ１のｍＲＮＡがマウス味細胞中でＣＶおよび葉
状双方の乳頭で選択的に発現されることを示した。非特異的バックグラウンドを示す味細胞中および周囲のセンスプローブ対照への味細胞のハイブリダイゼーションは、対応するアンチセンスプローブでよりも一般により低かった。データは示されない。
【０１２８】
対照実験で、これらのプローブのそれぞれをこれらのｍＲＮＡ、すなわち膵におけるＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ９およびＳＵＲ１；骨格筋におけるＧＬＵＴ４；小腸におけるＳＧＬＴ１を発現することが既知の組織切片を用いて検証した（データは示されない）。次に、マウス有郭（ＣＶ）、葉状および茸状味乳頭からの味蕾含有切片の免疫蛍光共焦点顕微鏡検査を、糖輸送体（ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４およびＳＧＬＴ１）若しくはＫＡＴＰサブユニット（ＳＵＲ１、Ｋｉｒ６．１）に対し向けられる特異的ポリクローナル抗体を用いて実施した。ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＳＬＧＴ１、ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．１のＣＶ細胞での発現を示す免疫蛍光が観察された（データは示されない）。ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＳＬＧＴ１、ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．１の葉状細胞での発現を示す免疫蛍光が観察された（データは示されない）。ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＳＬＧＴ１、ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．１の茸状細胞での発現を示す免疫蛍光が観察された（データは示されない）。
【０１２９】
ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１、ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．１に対する免疫反応性がＣＶ、葉状および茸状乳頭のマウス味細胞で観察された（データは示されない）。興味深いことに、ＳＵＲ１免疫蛍光の多くは味細胞の核内に集中されるようであった（データは示されない）。マウス有郭（ＣＶ）および葉状味乳頭からの味蕾含有切片の間接的免疫蛍光共焦点顕微鏡検査を、核染色ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（図７Ａ、７Ｄ、７Ｇ）若しくはＫＡＴＰサブユニットＳＵＲ１に対する抗体を用いて実施した。ＳＵＲ１の染色の核パターンをＤＡＰＩ染色で確認した（データは示されない）。より高い拡大はＳＵＲ１が核質内に存在したことを示した（データは示されない）。全部の一次抗体は、目的のタンパク質を発現することが既知の組織、すなわち膵でＧＬＵＴ２およびＳＵＲ１；骨格筋でＧＬＵＴ４；小腸でＳＧＬＴ１、で適切な免疫反応性を検出するそれらの能力について検証した（データは示されない）。加えて、二次抗体は、膵および小腸で一次抗体を含まない対照中の非特異的免疫反応性がないことが示された（データは示されない）。
【実施例３】
【０１３０】
ＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１およびＳＵＲ１はＴ１ｒ３陽性味細胞で選択的に発現される
上のデータは、グルコース輸送体およびＫＡＴＰサブユニットが味細胞中に存在することを複数の独立した技術により示す。これらのグルコース輸送体若しくは細胞内グルコース代謝のセンサーのいずれかがグルコースの味細胞検知で機能するはずであるならば、それらは、最もありそうには、グルコースおよび他の甘味化合物を検出することが既知である味細胞で見出されるであろう（すなわちＩＩ型味細胞のＴ１ｒ２＋Ｔ１ｒ３陽性サブセット）。この可能性を検査するため、われわれは、Ｔ１ｒ３−ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃｌａｐｐ  ＴＲら、２００６）からのＴ１ｒ３を発現する味細胞で緑色蛍光タンパク質の固有の蛍光を可視化することと一緒に、輸送体若しくはＫＡＴＰサブユニットに対する抗体を使用して味細胞を二重染色した。こうしてＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１およびＳＵＲ１がＴ１ｒ３陽性味細胞中で優先的に発現されることが見出された。二重染色はＴ１ｒ３プロモーターからトランスジーンとして発現される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の固有の蛍光を利用した。上置き画像はＧＬＵＴ４、ＳＧＬＴ１およびＳＵＲ１とのＴ１ｒ３の頻繁な共発現を示す（データは示されない）。
【０１３１】
上で示されたＳＵＲ１の核染色は葉状および有郭乳頭からの味細胞で再度確認された（データは示されない）。
【０１３２】
味細胞を、ＧＬＵＴ４およびＴ１ｒ３、ＳＵＲ１およびＴ１ｒ３若しくはＳＵＲ１およ
びＳＮＡＰ−２５について二重染色し、その後、有郭（Ａ）および葉状（Ｂ）味乳頭中の単独および二重標識された細胞を計数した。結果を下の表３に記録する。分子は遺伝子１および遺伝子２双方を発現する味細胞の数である。分母は遺伝子１を発現する味細胞の数である。遺伝子１および遺伝子２双方を発現する味細胞を遺伝子１を発現するものの比率としてカッコ内に示す。ＮＤ、未測定。ＧＬＵＴ４若しくはＳＵＲ１をＴ１ｒ３と共発現する味細胞の定量は、（１）ＧＬＵＴ４を発現する味細胞の９０〜９２％がＴ１ｒ３を発現する一方、Ｔ１ｒ３細胞の１３〜２０％はＧＬＵＴ４を発現せず；および（２）ＳＵＲ１を発現する味細胞の８０〜８５％がＴ１ｒ３を発現する一方、Ｔ１ｒ３細胞の１１〜２４％はＳＵＲ１を発現しないことを確認した。ＳＵＲ１をＳｎａｐ−２５と共発現するＣＶ味細胞の定量は、ＳＵＲ１を発現する味細胞の１７％がＳｎａｐ−２５を発現することを確認した。要するに、ほとんどのＳＵＲ１を発現する味細胞はＴ１ｒ３を発現するＩＩ型細胞であり、残りはありそうにはＳｎａｐ−２５を発現するＩＩＩ型細胞である。
【０１３３】
【表３】
2014506460.tif 000006
【０１３４】
Ｉ型（ＧＬＡＳＴ）若しくはＩＩＩ型（Ｓｎａｐ−２５）味細胞のマーカーでのＧＬＵＴ４を発現する味細胞の二重染色は、ＧＬＵＴ４がいずれの味細胞サブタイプにも存在しないことを示した（データは示されない）。マウス有郭（ＣＶ）味乳頭からの味蕾含有切片の間接的免疫蛍光共焦点顕微鏡検査を、ＧＬＵＴ４およびＳＵＲ１に対する抗体を用いて実施した（データは示されない）。二重染色を、Ｉ型味細胞（抗ＧＬＡＳＴ）、ＩＩＩ型味細胞（抗ＳＮＡＰ−２５）を標識するための抗体若しくはＩＩ型味細胞（ＴｒｐＭ５−ＧＦＰ）を標識するためのＧＦＰを用いて実施した。重ねられた画像はＧＬＡＳＴ若しくはＳＮＡＰ−２５とのＧＬＵＴ４、またはＧＬＡＳＴとのＳＵＲ１のＣＶ味細胞での共発現を示さず、また、ＳＮＡＰ−２５とのＳＵＲ１のまれな共発現を示した（データは示されない）。対照的にＣＶ味細胞中のＳＵＲ１は主としてＴｒｐＭ５を発現するＩＩ型味細胞中にある（データは示されない）。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型細胞のマーカーでのＳＵＲ１を発現する味細胞の二重染色は、ＳＵＲ１が主としてＩＩ型（ＴｒｐＭ５）味細胞中に存在する（データは示されない）が、しかしＩ型（ＧＬＡＳＴ）味細胞ではせず（データは示されない）、およびＳＵＲ１を発現する少数のＩＩＩ型（Ｓｎａｐ−２５）細胞が存在する（データは示されない）ことを示した。予備定量は、（１）大部分のＴ１ｒ３を発現するＩＩ型味細胞がＧＬＵＴ４およびＳＵＲ１を発現し、（２）全部のＧＬＵＴ４を発現する味細胞がＴ１ｒ３を発現し、ならびに（３）大部分のＳＵＲ１を発現する味
細胞がＴ１ｒ３を発現することを示す。
【実施例４】
【０１３５】
マウス味細胞は機能的ＫＡＴＰチャンネルを有する
上述された電気生理学アッセイ由来のデータは、ＫＡＴＰサブユニットＫｉｒ６．１およびＳＵＲ１が味細胞に存在し、ＳＵＲ１は主としてＴ１ｒ３を発現する味細胞で見出されることを示す。マウス味細胞に機能的ＫＡＴＰチャンネルが存在するならば、われわれは、ＳＵＲ１に結合するグリベンクラミドのようなスルホニル尿素化合物によりそれらが阻害されることを期待できよう。事実、グリベンクラミドはマウス茸状味細胞中で外向き（Ｋ＋）電流を阻害しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１３６】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの茸状乳頭から単離された６７個の味細胞のうち１８個（２６．９％）が２０μＭグリベンクラミドによる有意の可逆的阻害を示した。平均して（ｎ＝１８）、２０μｍのグリベンクラミドは茸状味細胞中の全外向き電流の１８．７０±４．３２％を阻害した。すなわち、ＫＡＴＰチャンネルは全味細胞Ｋ＋チャンネルの有意の比率を含んでなる。Ｔ１ｒ３味細胞中のＳＵＲ１の優勢な発現を考えれば、全Ｋ＋チャンネルのなかのグリベンクラミドで阻害可能なＫＡＴＰチャンネルのなおより高い比率が、ありそうにはＴ１ｒ３を発現する味細胞で見出されるとみられる。
【０１３７】
理論により束縛されることを願わず、発明者は、ＫＡＴＰチャンネルがＴ１ｒ３含有味細胞で甘味で演じている以下の機能を理論化した。膵中のＫＡＴＰチャンネルは自発的に活性であり、β細胞のグルコースが上昇しかつ代謝される際にＡＤＰに対するＡＴＰの細胞内比もまた上昇し、ＫＡＴＰチャンネル閉鎖、細胞の脱分極およびインスリン遊離につながる。グリベンクラミドで阻害可能なＫ＋電流のわれわれの記録を、Ｔ１ｒ３陽性若しくはそうでないと特異的に同定されない茸状味細胞の全般的プールを用いて行った。ＳＵＲ１を発現する味細胞の圧倒的大多数がＴ１ｒ３もまた発現する（かつ逆もまた真である）ことを考えれば、スルホニル尿素で阻害されるＫＡＴＰコンダクタンスがＴ１ｒ３陽性味細胞の基礎的全外向き電流の２０％以上に有意に寄与することがありそうである。Ｔ１ｒ３含有味細胞のＫＡＴＰチャンネルは、舌に適用される代謝可能な甘味溶液の局所濃度、または血糖若しくは循環ホルモンを介して味細胞と通信されるところの生物体の全般的代謝状態に従ってこれらの細胞の活性を調節するための確固たる手段を提供し得る。Ｔ１ｒ３味細胞のＫＡＴＰチャンネルが頂端に配置される場合には、スルホニル尿素若しくは上昇されたＡＴＰによりこのＫ＋電流を阻害することはこれらの細胞を脱分極するとみられる。代謝される場合にＴ１ｒ３味細胞のＫＡＴＰチャンネルの閉鎖を促進するグルコースのようなカロリー甘味料と一緒の、甘味細胞を脱分極するセカンドメッセンジャーシグナル伝達カスケードを開始するためのＴ１ｒ２＋Ｔ１ｒ３を介して作用するノンカロリー甘味料の組合せは、ありそうには、いずれかの甘味料単独により達成されるものを上回る甘味の高められた認識を提供するとみられる。
【０１３８】
逆に、低グルコース／低代謝条件下で、Ｔ１ｒ３細胞のＫＡＴＰチャンネルの持続性活性は、これらの味細胞を過分極して、Ｔ１ｒ２＋Ｔ１ｒ３の甘味料活性化が味細胞を脱分極してそれにより味認識に抗することをより少なくありそうにするとみられる。思うに、Ｔ１ｒ３細胞のＫＡＴＰチャンネルの調節は代謝要求に従って甘味化合物に対する味細胞の感受性を変動させるための生理学的手段でありうる。ＧＬＵＴおよびＳＧＬＴ１輸送体がＴ１ｒ３陽性味細胞中でＫＡＴＰチャンネルと一緒に共発現されることは、代謝される場合に味細胞のＡＴＰレベルを増大させ、ＫＡＴＰを活性化しかつこれらの味細胞を過分極するとみられる輸送体を介する糖の取り込みにつながり得る。さらに、味細胞のＫＡＴＰは、味細胞代謝の変化に応答してＴ１ｒ３味細胞からのホルモンおよび／若しくは神経伝達物質の遊離を調節しうる。ちょうど膵β細胞の活性化のように、ＫＡＴＰがインスリン遊離を促進し、同じように味細胞のＫＡＴＰ活性化が味細胞からのホルモン遊離を促進
しうる。
【０１３９】
味細胞中のＳＵＲ１の細胞質への局在化は際立っており、そして、それが核局在化シグナル若しくはこうした配列との別のタンパク質の会合により標的化されていることを示唆する。以前、ＳＵＲ１および機能的ＫＡＴＰチャンネルが膵β細胞の核膜で観察されている（Ｑｕｅｓａｄａら、２００２）。Ｔ１ｒ３味細胞中のこの核局在化は原形質膜から離れたスルホニル尿素受容体を封鎖するようにはたらくことができ、それにより味細胞の休止Ｋ＋電流のＫＡＴＰ成分を減少させるか、若しくはそれらをグリベンクラミドおよび他のスルホニル尿素に対し非感受性にする。別の可能性は、核膜若しくは核質中のＫＡＴＰチャンネルがＴ１ｒ３それ自身若しくは他の味シグナル伝達成分の味細胞転写に影響を及ぼすことである。転写に対するこうした影響が、長期間にわたり甘味応答を変えかつ味受容体発現を食事内容に関係付けるようはたらくことができる。
【０１４０】
本明細で引用される全部の刊行物および米国仮出願第６１／４３５，９０４号明細書は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の態様を参照して記述された一方、改変が本発明の技術思想から離れることなくなされ得ることが認識されるであろう。こうした改変は付随される請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【０１４１】
参考文献
１．Ａｍｉｃｏ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ａｎｄ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｆ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５  Ｄｅｃ；２８９（６）：Ｒ１７９８−８０６．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｓｅｐ  ８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６１５０８３６．
２．Ｂａｃｈｍａｎｏｖ  ＡＡ，Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ＧＫ．Ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．２００７；２７：３８９−４１４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７４４４８１２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７２１２７１．
３．Ｂａｃｈｍａｎｏｖ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｓａｃ）ｌｏｃｕｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２００１  Ｓｅｐ；２６（７）：９２５−３３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１５５５４８７．
４．Ｂａｃｈｍａｎｏｖ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ
ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｍａｊｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｉ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ．１９９７  Ａｕｇ；８（８）：５４５−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：９２５０８５７．
５．Ｂａｑｕｅｒｏ  ＡＦ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ  ＴＡ（２０１０）Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ（ＥＮａＣ）ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００３１８．２０１０
６．Ｂａｒｔｏｓｈｕｋ  ＬＭ，ｅｔ  ａｌ  Ｔａｓｔｅ  Ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｆｔｅｒ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ“Ｗａｔｅｒ  Ｔａｓｔｅ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９６４  Ｆｅｂ  ２８；１４３：９６７−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１４０９０１５０．
７．Ｂａｒｔｏｓｈｕｋ  ＬＭ，ｅｔ  ａｌ  Ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｏｆ  ｄｉｌｕｔｅ  ＮａＣｌ：ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｗ
ｅｅｔ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ．１９７８  Ｏｃｔ；２１（４）：６０９−１３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：７４０７８０．
８．Ｃｌａｐｐ  ＴＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｕｓｅ  ｔａｓｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｌａｃｋ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  ＳＮＡＰ−２５．ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．２００６  Ｍａｒ  ３０；４：７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６５７３８２４；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１４４４９３１．９．Ｄａｍａｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  ｕｍａｍｉ  ｔａｓｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ１ｒ３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  Ａｕｇ  ８；３０１（５６３４）：８５０−３．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｊｕｌ  １７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１２８６９７００．
１０．Ｄｅｌａｙ  ＥＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔａｓｔｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ１Ｒ３  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２００６  Ｍａｙ；３１（４）：３５１−７．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｆｅｂ  ２２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６４９５４３５．
１１．Ｄｅｓｉｍｏｎｅ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｌｉｎｇｕａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｕｓｔａｔｏｒｙ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８４  Ｍａｙ；８３（５）：６３３−５６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：６３３０２７５；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２２１５６５６．
１２．ＤｕＢｏｉｓ  ＧＥ，Ｌｅｅ  ＪＦ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｔａｓｔｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ．１９８３  ７（３−４）：２３７−２４７．
１３．ＤｕＢｏｉｓ  ＧＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ：Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ｉｎ：Ｗａｌｔｅｒｓ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｉｏｎ．ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４５０．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：１９９１：２６１−２７６．
１４．Ｆｕｌｌｅｒ  ＪＬ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｈｅｒｅｄ．１９７４  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；６５（１）：３３−６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：４８４７７４６．
１５．Ｆｕｓｈａｎ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２０１０  Ｓｅｐ；３５（７）：５７９−９２．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｌ  ２１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０６６００５７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９２４４２７．１６．Ｆｕｓｈａｎ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＴＡＳ１Ｒ３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｔａｓｔｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｓｕｃｒｏｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ａｕｇ  １１；１９（１５）：１２８８−９３．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  ２５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９５５９６１８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７４２９１７．
１７．Ｈｅｖｅｚｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｔａｓｔｅ  ｂｕｄｓ  
ｒｅｖｅａｌｓ  ｌｉｎｋｓ  ｔｏ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９  Ｊｕｌ  ２８；４（７）：ｅ６３９５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９６３６３７７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７１２０８０．１８．Ｊｉａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｃｔｉｓｏｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ１Ｒ３  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ａｐｒ  １５；２８０（１５）：１５２３８−４６．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊａｎ  ２４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５６６８２５１．
１９．Ｊｉａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ１Ｒ３  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｎｓｅｌｙ  ｓｗｅｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｏｃｔ  ２２；２７９（４３）：４５０６８−７５．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｕｇ  ６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５２９９０２４．
２０．Ｊｙｏｔａｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｎｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ．２０１０；５７（６）：４６７−７５．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｐｒ  ２３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０４３１２６９．
２１．Ｋｅｓｋｉｔａｌｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｒｅ  ｐａｒｔｌｙ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２００７  Ｊｕｌ；８６（１）：５５−６３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７６１６７６３．
２２．Ｋｉｎｎａｍｏｎ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ  Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｒ．Ｆ．（２００８）Ｔａｓｔｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｅｓ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．Ｅｄ  Ｒ．Ｒ．Ｈｏｙ，Ｇ．Ｍ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ａ．Ｉ．Ｂａｓｂａｕｍ，Ａ．Ｋａｎｅｋｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｗｅｓｔｈｅｉｍｅｒ．Ｖｏｌ．２．
２３．Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１  Ａｐｒ  ２７；２８３（１）：２３６−４２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１３２２７９４．
２４．Ｋｕｍａｚａｗａ  Ｔ，Ｋｕｒｉｈａｒａ  Ｋ．Ｌａｒｇｅ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｓｕｇａｒｓ  ｂｙ  ｓａｌｔｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０  Ｍａｙ；９５（５）：１００７−１８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３６２１８１；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２２１６３４７．
２５．Ｌｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  ｕｍａｍｉ  ｔａｓｔｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２  Ａｐｒ  ２；９９（７）：４６９２−６．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｍａｒ  ２６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１９１７１２５；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１２３７０９．
２６．Ｌｉｕ  ＤＸ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔａｓｔｅ  ｂｕｄｓ．Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．２０１０  Ｊｕｎ  ３０．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０５９８３５６．
２７．Ｍａｘ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｓ１ｒ３，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｉｓ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｗｅｅｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｌｏｃｕｓ  Ｓａｃ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ
．２００１  Ｍａｙ；２８（１）：５８−６３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１３２６２７７．
２８．ＭｃＴａｇｇａｒｔ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｍｅｅｔｓ  ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｓｅｐ  １；５８８（Ｐｔ  １７）：３２０１−９．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｎ  ２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０５１９３１３；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９７６０１５．
２９．Ｍｉｅｒｓｏｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｇａｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｌｉｎｇｕａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｕｇａｒ  ｔａｓｔｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８  Ｊｕｌ；９２（１）：８７−１１１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：３１７１５３６；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２２２８８８８．
３０．Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｓｔｅ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｎｅａｒ  ａ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｌｏｃｕｓ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１  Ｍａｙ；４（５）：４９２−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１３１９５５７．
３１．Ｎｅｌｓｏｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．２００１  Ａｕｇ  １０；１０６（３）：３８１−９０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１５０９１８６．
３２．Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＣＧ．ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｓｅｎｓｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ．２００６  Ｍａｒ  ２３；４４０（７０８３）：４７０−６．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ
ＰＭＩＤ：１６５５４８０７．
３３．Ｐｅｌｚ  ＷＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｃｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ．１９７３  Ｆｅｂ；１０（２）：２６３−５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：４７０８４９６．
３４．Ｑｕｅｓａｄａ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ＫＡＴＰ  ｃｈａｎｎｅｌｓ
ｔｒｉｇｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃａ（２＋）ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２  Ｊｕｌ  ９；９９（１４）：９５４４−９．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｊｕｎ  ２７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１２０８９３２７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１２３１７７．
３５．Ｒｅｅｄ  ＤＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｂｅｈａｖ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ｊｕｌ；２７（４）：３７３−８７．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：９５１９５６３．
３６．Ｓａｉｎｚ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ１Ｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｙ；７７（３）：８９６−９０３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１３３１４１８．
３７．Ｓｃｈｅｅｐｅｒｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ＳＧＬＴ  ａｎｄ  ＧＬＵＴ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＪＰＥＮ
Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ．２００４  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２８（５）：３６４−７１．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５４４９５７８．
３８．Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ  ＳＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｔｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｒ
ｏｓｓ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｅｈａｖ．１９８１  Ｓｅｐ；１５（３）：３７７−８８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：７２９１２４０．
３９．Ｓｃｌａｆａｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｗｅｅｔ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｊ
Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７  Ｍａｙ；２９２（５）：Ｒ１８２８−３３．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｆｅｂ  １．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７２７２６５９；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２３６０４８１．
４０．Ｓｈｉｇｅｍｕｒａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｐｔｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｓｗｅｅｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔａｓｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４  Ｆｅｂ；１４５（２）：８３９−４７．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｏｃｔ  ３０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１４５９２９６４．
４１．Ｓｈｉｎ  ＹＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｓｔｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ＧＬＰ−１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００８  Ｊｕｌ；１０６（１）：４５５−６３．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｊｕｌ  １．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８３９７３６８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２６２９９９６．
４２．Ｓｉｍｏｎ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｌｉｎｇｕａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８９
Ｆｅｂ；２５６（２  Ｐｔ  ２）：Ｒ３９４−４０２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２９１６６９６．
４３．Ｓｉｍｏｎ  ＳＡ．（１９９１）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｗｅｅｔ  Ｔａｓｔｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．４５０，ｐｐ  ２３７−２５０．
４４．Ｕｇａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＮａＣｌ  ａｎｄ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｓｔａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ  １９９２
１７（６）：８１１−８１５．
４５．Ｗｉｎｎｉｇ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｌｉｎｅ  ７３８  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ７３５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｆｔｈ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ
ｒＴａｓ１ｒ３  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｌａｃｔｉｓｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５  Ａｐｒ  ７；６：２２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５８１７１２６；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１０８４３４９．
４６．Ｘｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ
ｏｆ  Ｔ１Ｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００４  Ｓｅｐ  ２８；１０１（３９）：１４２５８−６３．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｓｅｐ  ７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５３５３５９２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５２１１０２．
４７．Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ｊａｎ  １２；１０７（２）：９３５−９．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｄｅｃ  ２２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２００８０７７９；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８１８９２９．
４８．Ｚｈａｏ  ＦＱ，Ｋｅａｔｉｎｇ  ＡＦ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００７  Ａｐｒ；８（２）：１１３−２８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８６６０８４５；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２４３５３５６．
４９．Ｚｈａｏ  ＧＱ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  ｕｍａｍｉ  ｔａｓｔｅ．Ｃｅｌｌ．２００３  Ｏｃｔ
３１；１１５（３）：２５５−６６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１４６３６５５４．
【図１Ａ】
2014506460.tif 000007
【図１Ｂ】
2014506460.tif 000008
【図１Ｃ】
2014506460.tif 000009
【図１Ｄ】
2014506460.tif 000010
【図２Ａ】
2014506460.tif 000011
【図２Ｂ】
2014506460.tif 000012
【配列表】
2014506460000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月25日(2013.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）
（ｉ）試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）およびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ）を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；ならびに
（ｉｉ）接触された細胞若しくは細胞株中のＫＡＴＰチャンネルの電子生理学的若しくは機能的活性を測定することであって；ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株のものと比較した試験分子と接触された細胞若しくは細胞株のＫＡＴＰの電気生理学的若しくは機能的活性の減少若しくは阻害が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定し；または
（ｂ）
（ｉ）試験分子を、糖輸送体を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；および
（ｉｉ）接触された細胞若しくは細胞株による糖輸送体の発現レベル若しくは機能的活性を測定することであって；ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株による糖輸送体の発現若しくは糖輸送体の機能的活性の増大が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定し；または
（ｃ）
（ｉ）試験分子を、スルホニル尿素受容体１（ＳＵＲ１）タンパク質を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；および
（ｉｉ）培養物中のＳＵＲ１タンパク質への試験分子の結合を検出することであって；ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株のものを上回る試験分子と接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１への試験分子の有意の量の結合の存在が、甘味を提供する若しくは高める試験分子を同定し；または
（ｄ）
（ｉ）試験分子を、ＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル（ＫＡＴＰ）を介してスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）およびカリウム内向き整流性チャンネル（Ｋｉｒ）を発現する哺乳動物細胞若しくは細胞株とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下で接触させること；ならびに
（ｉｉ）接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化を測定若しくは検出する
ことであって；ここで、陰性対照細胞若しくは細胞株中のＳＵＲの核局在化に関して接触された細胞若しくは細胞株中のＳＵＲ１の核局在化の変化が、甘味を提供する若しくは調整する試験分子を示し、
を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める分子の同定方法。
【請求項２】
ＳＵＲがＳＵＲ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＫｉｒがＫＩＲ６．１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞若しくは細胞株が、口腔味細胞若しくは口腔味細胞株、味シグナル伝達タンパク質を発現する異種細胞、形質転換細胞若しくは内分泌細胞または細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
電気生理学的活性が、細胞若しくは細胞株の分極若しくは脱分極またはある種のイオン指示薬若しくは流動の変化である、請求項１（ａ）に記載の方法。
【請求項６】
以下すなわち
（ｉｉｉ）試験分子で対スクリーニングアッセイを実施して該試験分子により媒介される非特異的活性若しくは結合を排除すること；および
（ｉｖ）試験分子を、甘さに対する動物の生理学的応答アッセイ、電子生理学的応答アッセイ若しくは行動アッセイ、または単離された味細胞、単離された味蕾若しくは味スライスのカルシウム画像化にかけること
の１つ若しくはそれ以上をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
陰性対照が、口中で甘味を提供しない若しくは高めないことが既知の対照分子により接触されるか；または試験若しくは対照分子により接触されないかのいずれかである同一細胞若しくは細胞株を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
発現レベルが糖輸送体のｍＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルである、請求項１（ｂ）に記載の方法。
【請求項９】
機能的活性が、能動輸送活性、受動的促進輸送活性、グルコースの取り込み若しくは輸送およびナトリウムの取り込み若しくは輸送から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
糖輸送体が、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ３、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ３から選択される、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
結合が試験分子に結合されている標識を使用する結合アッセイにより検出される、請求項１（ｃ）に記載の方法。
【請求項１２】
いずれかの先行する請求項に記載の方法により同定される試験分子を含んでなる、口中で甘味を提供する若しくは高める組成物。
【請求項１３】
スルホニル尿素（ＳＵ）化合物若しくはＳＵ誘導体を含んでなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
哺乳動物味細胞を請求項１２若しくは１３のいずれかに記載の組成物とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含んでなる、口中での甘味の提供若しくは調整方法。
【請求項１５】
前記組成物が、甘味料、食品添加物、飲料若しくは製剤である、請求項１２若しくは１３に記載の組成物。
【国際調査報告】
2014506460.tif 000013
2014506460.tif 000014