(57)【要約】本発明は、急性冠動脈症候群を有する被験体において、心不全のリスクを予測するための、ガレクチン−３の使用、材料および方法に関する。本発明は、さらに、急性冠動脈症候群を有する被験体において、心不全のための処置の有効性をモニタリングすることにおけるガレクチン−３の使用に関する。本発明は、被験体において、急性冠動脈症候群後の心不全の発症のリスクを診断する方法を提供し、上記方法は、（ａ）被験体からのサンプル中のガレクチン−３のレベルを測定するステップと、（ｂ）ガレクチン−３のレベルを参照値と比較するステップと、（ｃ）ガレクチン−３のレベルによって、該被験体が心不全を発症する尤度が同定されるか否かを決定するステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、急性冠動脈症候群後の心不全の発症のリスクを診断する方法であって、該方法は、
（ａ）被験体からのサンプル中のガレクチン−３のレベルを測定するステップと、
（ｂ）該ガレクチン−３のレベルを参照値と比較するステップと、
（ｃ）該ガレクチン−３のレベルによって、該被験体が心不全を発症する尤度が同定されるか否かを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ガレクチン−３についての前記参照値は、約１０．０ｎｇ／ｍＬ〜約２５．０ｎｇ／ｍＬの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガレクチン−３についての前記参照値は、約１３．０ｎｇ／ｍＬ〜約１９．２ｎｇ／ｍＬの範囲である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガレクチン−３の値が参照値よりも大きい場合、前記被験体を、心不全を発症する尤度が増大していると同定するステップと、該ガレクチン−３の値が該参照値よりも小さい場合、該被験体を、心不全を発症する尤度が減少していると同定するステップとを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体における心不全を発症する前記尤度に関する情報を、伝送するステップ、表示するステップ、記憶するステップ、もしくは印刷するステップ、またはユーザーインターフェイスデバイス、コンピューター読み取り可能な記録媒体、ローカルコンピューターシステム、もしくはリモートコンピューターシステムに出力するステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
測定される前記ガレクチン−３のレベルは、免疫アッセイ、比色定量アッセイ、濁度測定アッセイ、およびフローサイトメトリーのうちの少なくとも１つによって決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは、血液、血清、または血漿を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体は、ヒト被験体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
心不全を発症するリスクについて、急性冠動脈症候群後に被験体を評価する方法であって、該方法は、該被験体からのサンプル中のガレクチン−３血中濃度を測定して、それにより、心不全を発症するリスクの指標となるガレクチン−３血中濃度の存在または非存在を決定するステップを含む、方法。
【請求項１０】
急性冠動脈症候群後の被験体において心不全の発症または進行をモニタリングする方法であって、該方法は、該被験体からのサンプル中のガレクチン−３血中濃度を測定して、それにより、心疾患の該発症または進行の指標となるガレクチン−３血中濃度の存在または非存在を決定するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、血液、血清、または血漿を含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
急性冠動脈症候群後に患者を処置する方法であって、該方法は、心不全のリスクの指標となる決定されたガレクチン−３血中濃度を有する、急性冠動脈症候群を有する該患者において、心不全治療を開始するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記治療が開始された後に前記患者のガレクチン−３血中濃度をモニタリングするさらなるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者は、標的範囲内であることが決定されたガレクチン−３血中濃度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者は、最小閾値より大きいものであることが決定されたガレクチン−３血中濃度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記最小閾値は、１０ｎｇ／ｍｌ超である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記最小閾値は、１０ｎｇ／ｍｌと１５ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記最小閾値は、１５ｎｇ／ｍｌと２０ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記最小閾値は、２０ｎｇ／ｍｌと２５ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記最小閾値は、２５ｎｇ／ｍｌと３０ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記最小閾値は、３０ｎｇ／ｍｌ超である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者は、最大閾値より小さいものであることが決定されたガレクチン−３血中濃度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記最大閾値は、７０ｎｇ／ｍｌより小さい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記最大閾値は、６０ｎｇ／ｍｌより小さい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記最大閾値は、４０ｎｇ／ｍｌより小さい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記最大閾値は、３０ｎｇ／ｍｌと４０ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記最大閾値は、２５ｎｇ／ｍｌと３０ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記最大閾値は、２０ｎｇ／ｍｌと２５ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記最大閾値は、１５ｎｇ／ｍｌと２０ｎｇ／ｍｌとの間である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年１月３１日に出願された、米国仮特許出願第６１／４３８，２４５号の利益、および上記米国仮特許出願に対する優先権を主張し、その完全な開示は、本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ガレクチン−３は、心臓の線維症およびリモデリングに関与するβ−ガラクトシド結合レクチンであり、不全を起こし易い肥大化した心臓のモデルにおいて上昇しており、心不全（ＨＦ）患者において予後上の価値を有する（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０１９３９５４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を有する患者において、疾患の進行または治療有効性を予測またはモニタリングするために、体液中のヒトタンパク質ガレクチン−３の濃度が使用され得ることが現在発見されている。ＡＣＳ患者のガレクチン−３血中濃度は、心不全を発症するリスクを評価するために決定され得る。さらに、ＡＣＳ患者のガレクチン−３血中濃度は、処置の有効性を決定するために、心不全のための処置の過程にわたって、モニタリングされ得る。
【０００５】
１つの局面において、本発明は、被験体において、急性冠動脈症候群後の心不全の発症のリスクを診断する方法に関する。上記方法は、被験体からのサンプル中のガレクチン−３のレベルを測定することと、ガレクチン−３のレベルを参照値と比較することと、ガレクチン−３のレベルによって、被験体が心不全を発症する尤度が同定されるか否かを決定することとを含み得る。いくつかの実施形態において、ガレクチン−３についての参照値は、約１０．０ｎｇ／ｍＬ〜約２５．０ｎｇ／ｍＬの範囲である。他の実施形態において、ガレクチン−３についての参照値は、約１３．０ｎｇ／ｍＬ〜約１９．２ｎｇ／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態は、ガレクチン−３の値が参照値よりも大きい場合、被験体を、心不全を発症する尤度が増大していると同定することと、ガレクチン−３の値が参照値よりも小さい場合、被験体を、心不全を発症する尤度が減少していると同定することとを含む。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒト被験体である。
【０００６】
上記方法は、被験体における心不全を発症する尤度に関する情報を、伝送するステップ、表示するステップ、記憶するステップ、もしくは印刷するステップ、またはユーザーインターフェイスデバイス、コンピューター読み取り可能な記録媒体、ローカルコンピューターシステム、もしくはリモートコンピューターシステムに出力するステップを含み得る。測定されるガレクチン−３のレベルは、免疫アッセイ、比色定量アッセイ、濁度測定アッセイ、およびフローサイトメトリーのうちの少なくとも１つによって決定され得る。
【０００７】
別の局面において、本発明は、心不全を発症するリスクについて、急性冠動脈症候群後に被験体を評価する方法に関し、上記方法は、被験体からのサンプル中のガレクチン−３血中濃度を測定して、心不全を発症するリスクの指標となるガレクチン−３血中濃度の存在または非存在を決定することを含む。
【０００８】
他の局面において、本発明は、急性冠動脈症候群後の被験体において心不全の発症または進行をモニタリングする方法に関し、上記方法は、被験体からのサンプル中のガレクチン−３血中濃度を測定して、心疾患の発症または進行の指標となるガレクチン−３血中濃度の存在または非存在を決定することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、サンプルは、血液、血清、または血漿を含む。
【００１０】
上記方法は、心不全のリスクの指標となる決定されたガレクチン−３血中濃度を有する患者において、心不全治療を開始することによって、急性冠動脈症候群の患者を処置することを含む。いくつかの実施形態は、治療が開始された後に患者のガレクチン−３血中濃度をモニタリングするさらなるステップを含む。
【００１１】
選択または処置された患者において、ガレクチン−３の血中濃度は、最小閾値より大きいか、最大閾値より小さいか、または最小閾値および最大閾値によって規定される標的範囲内であることが決定され得る。最小閾値は、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ超；１０ｎｇ／ｍｌと１５ｎｇ／ｍｌとの間；１５ｎｇ／ｍｌと２０ｎｇ／ｍｌとの間；２０ｎｇ／ｍｌと２５ｎｇ／ｍｌとの間；２５ｎｇ／ｍｌと３０ｎｇ／ｍｌとの間；または３０ｎｇ／ｍｌ超であり得る。最大閾値は、例えば、７０ｎｇ／ｍｌより小さい；６０ｎｇ／ｍｌより小さい；４０ｎｇ／ｍｌより小さい；３０ｎｇ／ｍｌと４０ｎｇ／ｍｌとの間；２５ｎｇ／ｍｌと３０ｎｇ／ｍｌとの間；２０ｎｇ／ｍｌと２５ｎｇ／ｍｌとの間；または１５ｎｇ／ｍｌと２０ｎｇ／ｍｌとの間であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
用語「心不全」、「ＨＦ」、「うっ血性心不全」、または「ＣＨＦ」は、本明細書中で用いられる場合、心室が血液でいっぱいになるかまたは心室が血液を排出する能力を損なう、複合的な臨床症候群を指す。任意の構造上または機能上の心臓障害が、ＨＦを引き起こし得、ＨＦ患者の大部分は損なわれた左心室（ＬＶ）心筋機能を有する。ＨＦの症状としては、呼吸困難（息切れ）、疲労、および体液貯留が挙げられる。Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＨＡ）は、ＨＦの進行または発症において４つのステージを同定している。ステージＡおよびＢの患者は、明らかな危険因子を示すが、ＨＦをまだ発症していない。ステージＣおよびＤの患者は、ＨＦの症状を現在示しているか、または過去にＨＦの症状を示していた。例えば、ステージＡの患者は、危険因子（例えば、冠状動脈疾患、高血圧症、または糖尿病）を有する患者であり、損なわれた左心室（ＬＶ）機能を示さない患者である。ステージＢの患者は、無症候性であるが、心臓の構造上の異常、またはリモデリング（例えば、損なわれたＬＶ機能、肥大、または幾何学的な心腔（ｃｈａｍｂｅｒ）のゆがみ）を有する。ステージＣの患者は、心臓の異常を有し、症候性である。ステージＤの患者は、最大限の医学処置にもかかわらず症状を示す難治性のＨＦを有する。彼らは、代表的に、繰り返し入院させられるか、または特別な介入なく退院できない。
【００１３】
ガレクチン−３は、多機能β−ガラクトシド結合レクチンのファミリーの構造上独特なメンバーである（Ｇａｂｉｕｓ（２００６）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４３−７９）。ガレクチン−３の発現は、上皮および炎症細胞（マクロファージ、好中球、および肥満細胞が挙げられる）に関連している。ガレクチン−３は、心不全において重要である多様な生物学的プロセス（筋線維芽細胞の増殖、線維形成、組織修復、心臓リモデリング、および炎症が挙げられる）に関与している（Ｌｉｕら（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６（２）：Ｈ４０４−１２；Ｐａｐａｓｐｙｒｉｄｏｎｏｓら（２００８）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２８（３）：４３３−４０；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：５０６０−５０６５；Ｓｈａｒｍａら（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：３１２１−３１２８；Ｓａｎｏら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（４）：２１５６−６４；Ｋｕｗａｂａｒａら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（１０）：３９３９−４４）。
【００１４】
本出願人らは、循環ガレクチン−３タンパク質レベルの使用により、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）後に心不全を発症するリスクを予測することを可能にする方法を開発した。患者のガレクチン−３レベルの知識は、ＡＣＳ後の患者の転帰の情報を提供する。さらに、心不全のリスクがある患者の同定のためのガレクチン−３の検出は、心不全の症状が出現する前に行われ得、それは、処置がより早く行われることを可能にし、より好都合な転帰をもたらし得る。
【００１５】
ガレクチン−３の検出
本発明は、マーカー（例えば、ガレクチン−３）のレベルを、必要に応じて、１つ以上の他のマーカー（例えば、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）と組み合わせて測定することによって、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）後に心不全を発症するリスクを予測するための方法を提供する。目的のタンパク質を検出するための、定量化を伴う、または伴わない、多くの方法は周知であり、本発明の実施において使用され得る。そのようなアッセイの例としては、下に記載され、例えば、免疫アッセイ、クロマトグラフィー法、および質量分析法が挙げられ得る。そのようなアッセイは、とりわけ、血液、血漿、および血清を含む任意の生物学的サンプルにおいて実施され得る。従って、複数のアッセイが、ガレクチン−３を検出するために使用され得、サンプルは、１つ以上の供給源から分析され得る。
【００１６】
マーカーは、１つ以上の分離方法の助けを用いて、サンプルにおいて検出され得るか、または定量され得る。例えば、適切な分離方法としては、質量分析法（例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎは、ゼロよりも大きい整数）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面エンハンス型レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ、または大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎが挙げられ得る。他の質量分析法としては、とりわけ、四重極型、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、およびイオントラップ型が挙げられ得る。また使用され得る分光技術としては、共鳴分光法、および光学分光法が挙げられる。
【００１７】
他の適切な分離方法としては、化学的抽出分配、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動、１次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、もしくは他のクロマトグラフィー技術（例えば、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、または液体クロマトグラフィー）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。１つの実施形態において、アッセイされるべき生物学的サンプルは、分離方法の適用前に分画され得る。
【００１８】
マーカーは、マーカー自体の物理的な分離を必要としない方法によって、検出され得るか、または定量され得る。例えば、分子の複雑な混合物からマーカーのプロフィールを分解するために、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法が使用され得る。腫瘍を分類するためのＮＭＲの類似した使用は、例えば、Ｈａｇｂｅｒｇ（１９９８）ＮＭＲ  Ｂｉｏｍｅｄ．１１：１４８−５６に開示される。
【００１９】
サンプル中のマーカーはまた、例えば、マーカーに特異的に結合することが可能な結合部分とマーカーを合わせることによって、検出され得るか、または定量され得る。結合部分としては、例えば、リガンド−受容体の対（すなわち、特異的な結合相互作用を有することが可能な１対の分子）のメンバーが挙げられ得る。結合部分としては、例えば、特異的な結合対（例えば、抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、タンパク質−核酸、タンパク質−タンパク質、または当該分野において公知である他の特異的な結合対）のメンバーも挙げられ得る。標的に対して高められた親和性を有する結合タンパク質が設計され得る。必要に応じて、結合部分は、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性標識、リン光標識、または着色粒子標識）と結合され得る。標識された複合体は、例えば、視覚的に、または分光光度計もしくは他の検出器の補助で検出され得るか、あるいは定量され得る。
【００２０】
ガレクチン−３のレベルは、免疫アッセイを実施することによって定量され得る。ガレクチン−３免疫アッセイは、ガレクチン−３が存在する場合に免疫特異的結合が起こり得るような条件下で、試験されるべき被験体からのサンプルを適切な抗体と接触させること、および抗体による任意の免疫特異的結合の量を検出するか、または測定することを含む。任意の適切な免疫アッセイが使用され得、その免疫アッセイとしては、限定されることなく、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびプロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合または非競合アッセイシステムが挙げられる。
【００２１】
「サンドイッチ」アッセイにおいて、２つの分子（「結合部分」）（例えば、ガレクチン−３上でオーバーラップしていない部位（エピトープ）に特異的に結合するモノクローナル抗体）が使用される。代表的に、１つの結合部分は、固体表面に固定され、ここで上記１つの結合部分は、ガレクチン−３と結合し、ガレクチン−３を捕捉する。この第１の結合部分は、従って、捕捉結合部分とも称される。第２の結合部分は、例えば、蛍光物質、酵素、または着色粒子を用いて検出可能に標識され、その結果、ガレクチン−３複合体に対する第２の結合部分の結合は、ガレクチン−３が捕捉されたことを示す。シグナルの強度は、サンプル中のガレクチン−３の濃度に比例する。第２の結合部分は、従って、検出結合部分または標識結合部分とも称される。結合部分は、ガレクチン−３のＮ末端の一部分に特異的に結合する限り、任意のタイプの分子であり得る。好ましい実施形態において、使用される結合部分は、モノクローナル抗ガレクチン−３抗体、すなわち、ガレクチン−３の別個の部分に対して産生された、または他の方法でガレクチン−３の別個の部分に結合するよう選択されたモノクローナル抗体である。
【００２２】
そのようなアッセイ手順は、２部位免疫測定アッセイ法（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）、「サンドイッチ」法、または（抗体がバインダーである場合）「サンドイッチ免疫アッセイ」と称され得る。当該分野で公知であるように、捕捉抗体および検出抗体は、同時に、または逐次的に試験サンプルと接触させられ得る。逐次的な方法は、捕捉抗体をサンプルとインキュベートし、その後、標識された検出抗体を所定の時間に加えることによって、達成され得る（時折、「フォワード」法と称される）。あるいは、標識された検出抗体は、最初にサンプルとインキュベートされ、次に、上記サンプルは、捕捉抗体に曝され得る（時折、「リバース」法と称される）。アッセイを完了するために、任意の必要なインキュベーション（複数可）（短い持続期間であり得る）後、標識が測定される。そのようなアッセイは、当業者に公知である多くの特定の形式において実行され得、その形式としては、様々な高スループットの臨床検査分析器の使用を通して、またはケアの地点もしくは家庭用の試験デバイスを用いるものが挙げられる。
【００２３】
１つの実施形態において、ラテラルフローデバイスは、サンドイッチ形式において使用され得、生物学的サンプル中の、ベースラインの感度レベルより上のガレクチン−３の存在は、ラテラルフローアッセイにおける捕捉ゾーンの上流またはラテラルフローアッセイにおける捕捉ゾーンにおいて、サンドイッチ相互作用の形成を可能にする。例えば、米国特許第６，４８５，９８２号を参照のこと。捕捉ゾーンは、ガレクチン−３を捕捉するために適した捕捉結合部分（例えば、抗体分子）、またはビオチン化複合体の捕捉のための固定化アビジンなどを含み得る。例えば、米国特許第６，３１９，６７６号を参照のこと。上記デバイスはまた、捕捉ゾーンにおける捕捉に適した発光標識を組み込み得、ガレクチン−３の濃度は、捕捉部位におけるシグナルの強度に比例する。適切な標識としては、ポリスチレンミクロスフェアに固定された蛍光標識が挙げられる。着色粒子も使用され得る。
【００２４】
本発明の方法で使用され得る他のアッセイ形式としては、フロースルーデバイスが挙げられるが、これに限定されない。例えば、米国特許第４，６３２，９０１号を参照のこと。フロースルーアッセイにおいて、１つの結合部分（例えば、抗体）は、膜表面上の規定された領域に固定される。この膜は、次に、デバイス全体にわたりサンプル体積をくみ上げるために、レザバーとして働く吸収層の上に重ねられる。固定後、膜上に残っているタンパク質結合部位は、非特異的相互作用を最小限にするためにブロックされる。作業中、生物学的サンプルは膜に加えられ、マトリックスに浸透し、サンプル中の、抗体に特異的な任意の検体が、固定された抗体に結合することを可能にする。第２のステップにおいて、捕捉されたマーカーと反応する標識された二次抗体が、サンドイッチを完成するために加えられ得るか、または放出され得る。あるいは、二次抗体は、サンプルと混合され得、単一のステップで加えられ得る。ガレクチン−３が存在する場合、着色スポットが膜の表面上に現れる。
【００２５】
最も一般的な酵素免疫アッセイは、「酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）」である。ＥＬＩＳＡは、標識された（例えば、酵素結合）形態の抗体を用いて、抗原の濃度を検出し、測定するための技術である。異なる形態のＥＬＩＳＡが存在し、それらは当業者に周知である。標準的なＥＬＩＳＡ技術は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ」，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｂｉｇａｚｚｉ，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８０；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４；およびＯｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．（１９８４），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５−９０４に記載される。ガレクチン−３を検出するための好ましい酵素結合免疫吸着アッセイキット（ＥＬＩＳＡ）は、市販されている（ＢＧ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
【００２６】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」において、抗体（例えば、抗ガレクチン−３）は、固相（すなわち、マイクロタイタープレート）に結合され、抗原（例えば、ガレクチン−３）を含む生物学的サンプルに曝される。上記固相は、次に、未結合の抗原を除去するために洗浄される。標識された抗体（例えば、酵素結合）は、次に、結合した抗原（存在する場合）に結合させられ、抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成する。抗体に結合させられ得る酵素の例は、アルカリホスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼである。酵素結合抗体は、基質と反応して着色反応産物を生成し、上記反応産物は測定され得る。本発明のキットおよび方法と一緒に使用するのに適した、本明細書中に記載される免疫アッセイのうちの任意のものも、抗体の代わりに任意の結合部分を使用し得る。
【００２７】
免疫学的アッセイの設計、理論、およびプロトコルの詳細な概説は、当該分野における数多くのテキストにおいて見出され得、それには、Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、およびＨａｒｌｏｗら  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）が挙げられる。
【００２８】
一般に、免疫アッセイの設計の考慮すべきことは、非特異的相互作用の産物から確実に区別され得る複合体を形成するために、標的に対して十分に高い結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体）の調製を含む。本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、結合タンパク質（例えば、抗体）、または免疫グロブリン可変領域様結合ドメインを含み、標的に対する適切な結合親和性および特異性を有する他のタンパク質を意味することが理解される。抗体の結合特異性が高ければ高いほど、検出され得る標的濃度はより低い。本明細書中で用いられる場合、用語「特異的結合」、または「特異的に結合する」は、結合部分（例えば、結合タンパク質）が、約１０５Ｍ−１よりも大きい、標的に対する結合親和性、より好ましくは、約１０７Ｍ−１よりも大きい、標的に対する結合親和性を有することを意味することが理解される。
【００２９】
個体における心不全を検出するためのアッセイにおいて有用である単離された標的マーカーに対する抗体は、当該分野において周知の、記載されている標準的免疫学的手順を用いて産生され得る。例えば、上記Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと。手短に言えば、単離されたマーカーは、異種の宿主（例えば、マウス、ヤギ、または他の適切な哺乳動物）において抗体を産生するために使用される。マーカーは、宿主における抗体産生を高めることが可能である適切なアジュバントと合わせられ、例えば、腹腔内投与によって宿主に注射される。宿主の免疫応答を刺激するために適した任意のアジュバントが使用され得る。一般的に使用されるアジュバントは、フロイント完全アジュバント（死滅かつ乾燥させられた微生物細胞を含むエマルジョンであり、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、またはＧｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能である）である。複数の抗原注射が所望される場合、後の注射は、不完全アジュバント（例えば、細胞を含まないエマルジョン）と組み合わせた抗原を含み得る。ポリクローナル抗体は、目的のタンパク質に対する抗体を含む血清を抽出することによって、抗体産生宿主から単離され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を産生する宿主細胞を単離し、免疫学分野において公知である標準的な手順を用いて、これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させ、標的と特異的に反応し、かつ所望の結合親和性を有するハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）についてスクリーニングすることによって産生され得る。
【００３０】
ガレクチン−３のＮ末端由来の例示的なエピトープとしては、
【００３１】
【化１】
2014505256.tif 000002
が挙げられるが、これらに限定されない。他のガレクチン−３エピトープ（非線状エピトープが挙げられる）も、抗ガレクチン−３抗体による検出のための標的として使用され得る。例示的な抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０１４９５４号において議論され、その内容全体は、本明細書中で参考として援用される。
【００３２】
抗体結合ドメインはまた、生合成により生成され得、結合ドメインのアミノ酸配列は、標的上の好ましいエピトープとの結合親和性を高めるために操作され得る。特異的抗体の方法論は、よく理解されており、文献に記載されている。それらの調製のより詳細な記載は、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記）において見出され得る。
【００３３】
さらに、当該分野においてＢＡＢＳまたはｓＦｖのものとしても公知である遺伝子操作された生合成の抗体結合部位は、サンプルがマーカーを含むか否かを決定するために使用され得る。（ｉ）非共有結合的に結合した、またはジスルフィド結合した、合成ＶＨおよびＶＬ二量体、（ｉｉ）共有結合したＶＨ−ＶＬ単鎖結合部位、（ｉｉｉ）個々のＶＨもしくはＶＬドメイン、または（ｉｖ）単鎖抗体結合部位を含む、ＢＡＢＳを作製および使用する方法が、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；同第４，７０４，６９２号；および同第４，９４６，７７８号に開示される。さらに、マーカーに対して必須な特異性を有するＢＡＢＳは、ファージ抗体クローニングによってコンビナトリアル遺伝子ライブラリーに由来し得る（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照のこと）。手短に言えば、単離されたマーカーまたはその断片によって予め免疫されたマウスに由来する、可変領域遺伝子配列によりコードされた免疫グロブリン可変領域を有するＢＡＢＳを、各々がそれらの外皮表面上で発現するファージが、固定されたマーカーに対する結合活性についてスクリーニングされる。固定されたマーカーに結合するファージは収集され、ＢＡＢＳをコードする遺伝子が、配列を決定される。目的のＢＡＢＳをコードする得られた核酸配列は、次に、従来の発現システムにおいて発現させられて、ＢＡＢＳタンパク質を生成し得る。
【００３４】
診断およびモニタリングの精度を改善するために、マルチマーカー分析が使用され得る。例えば、ガレクチン−３（Ｇａｌ−３）およびＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の血中濃度は、心不全を診断するため、および心不全の長期の転帰を予測するために使用され得る（ｖａｎ  Ｋｉｍｍｅｎａｄｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，４８：１２１７−２４（２００６）；Ｓｈａｒｍａら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：３１２１−２８（２００４）；Ｌｏｋら，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，２８：１４１，Ａｂｓｔｒａｃｔ  １０３５（２００７））。ＢＮＰおよびその切断等価物であるアミノ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）は、心腔の高い充填圧力および心筋線維の伸張の結果として、心不全の間、心筋および血液中で上昇し、ＡＣＳを有する患者における心不全の予測となることが、近年示されている（Ｓｃｉｒｉｃａら，（２００６）「Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｓｔａｔｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ａｆｔｅｒ  ａｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＲＯＶＥ  ＩＴ−ＴＩＭＩ  ２２  Ｓｔｕｄｙ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，４７（１１）：２３２６−２３３１）。心不全を診断するために使用され得る他の二次的なマーカーとしては、非ポリペプチドの心臓マーカー（例えば、スフィンゴ脂質、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−ホスフェート、ジヒドロスフィンゴシン、およびスフィンゴシルホスホリルコリン）が挙げられ得る（米国特許第６，５３４，３２２号を参照のこと）。上記のマーカーのレベルを測定する場合、診断の精度を改善するために、年齢および性についての補正が組み込まれ得る。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ガレクチン−３は、ＡＣＳ後に心不全を発症するリスクに関連する。
【００３６】
Ｔｈｅ  Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ  ｏｒ  Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ−Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ２２（ＰＲＯＶＥ  ＩＴ−ＴＩＭＩ  ２２）研究における、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を有する患者の中でのコホート内症例−対照研究（ｎｅｓｔｅｄ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ）において、新たな心不全または悪化した心不全のために入院を伴った１００症例を同定した。対照（１：１）を年齢、性別、ＡＣＳタイプ、および無作為化処置について対応させた。血清ガレクチン−３（ＢＧ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、ベースラインにおいて測定した（ＡＣＳ後７日目）。さらなる手順の詳細は、Ｃａｎｎｏｎら，（２００４）「Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｍｏｄｅｒａｔｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｔｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ」，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０（１５）：１４９５−１５０４、およびＮ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００６）；３５４：７７８において見出される補正において見出され、その各々は、全ての目的のために、本明細書中で参考として援用される。
【００３７】
心不全を発症した患者は、より高いベースラインのガレクチン−３を有した（メジアン１６．７ｎｇ／ｍｌ（四分位数間範囲（ＩＱＲ）：１４．０〜２０．６）対１４．６（ＩＱＲ：１２．０〜１７．６）、ｐ＝０．００４）。メジアン（１５．６ｎｇ／ｍＬ）より上のベースラインガレクチン−３を有する患者は、２倍程度ＨＦを発症しやすかった（ＯＲ  ２．１（９５％信頼区間（Ｃｌ）：１．２〜３．６）、ｐ＝０．０１）。ガレクチン−３は、心不全のリスクとの段階的な関係を示した（表１）。症例は、高血圧症（ＨＴＮ）、糖尿病（ＤＭ）、および以前の心不全を有する可能性がより高かった；これらの因子について調整後、ガレクチン−３四分位数と心不全とのこの段階的な関係は、有意な調整オッズ比（ａｄｊ−ＯＲ）１．４（９５％ＣＩ  １．１〜１．９；ｐ＝０．０２）のままであった。ガレクチン−３における各標準偏差（ＳＤ）の増加は、心不全の相対的な調整オッズにおける４８％の増加に関連した（ｐ＝０．０４）。これらのデータは、ガレクチン−３がＡＣＳ後に心不全を発症するリスクに関連することを示す。
【００３８】
表１は、急性冠動脈症候群後の患者において、心不全発症の相対的なオッズを示し、相対的なオッズは、ガレクチン−３血清濃度の増加に従って増加する。
【００３９】
表１．  ガレクチン−３濃度カテゴリーによる、心不全発症についてのオッズ比。
【００４０】
【表１】
2014505256.tif 000003
最も低いガレクチン−３カテゴリー（＜１３．０ｎｇ／ｍＬ）は、参照カテゴリーである。カテゴリーにわたって、オッズ比の傾向に関してＰ＝０．００３。
【００４１】
参考としての援用
本明細書中で参照された特許文書および科学論文の各々の開示全体は、全ての目的のために、参考として援用される。
【００４２】
等価物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から外れることなく、他の特定の形態において具体化され得る。前述の実施形態は、従って、全ての局面において、本明細書中に記載された発明に限定するのではなく、例示的であると考えられる。本発明の範囲は、従って、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入れられる全ての変化は、その中に包含されることが意図される。
【配列表】
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【国際調査報告】
2014505256.tif 000004
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