(57)【要約】  本発明は、骨軟骨組織の修復又は再生のための方法及び組成物を供する。当該方法及び組成物は、骨軟骨組織の再生又は修復に十分である単離された分化可能なヒト極小胚様幹細胞（hVSELs）の有効量を供する。当該組成物は、上記組織へ直接投与又は全身性に投与可能である。
2014511864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において骨軟骨組織に対する損傷又は傷害を治療するための方法であって、極小胚様幹細胞（VSELs）を含んで成る組成物の有効量を該対象へ投与する工程を含んで成り、該VSELsが分化し骨軟骨組織を治療する、方法。
【請求項２】
前記VSELsが、骨芽細胞へ分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記VSELsが、軟骨細胞へ分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記VSELsが、前記組織へ直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記VSELsが、全身に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、１mm3当たり約20〜約5 x 105 VSELsを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、１mm3当たり約40〜約4,000 VSELsを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、１mm2当たり約10〜約1 x 105 VSELsを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、１mm2当たり約25〜約500 VSELsを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、適したマトリックスを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記マトリックスが、生分解性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、１又は２以上の骨形成タンパク質（BMPs）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨軟骨組織が骨である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨軟骨組織が軟骨である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨軟骨組織が関節軟骨である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、少なくとも約50% VSELsである細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、少なくとも約70% VSELsである細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、少なくとも約90% VSELsである細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記VSELsが、自己VSELsである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記VSELsが、同種VSELsである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記VSELsが、ヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、骨形成不全症を治療するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、変形性関節症を治療するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、骨粗しょう症を治療するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
骨軟骨組織の再生又は修復に十分なVSELsの有効量を含んで成る、幹細胞組成物。
【請求項２６】
１mm3当たり約20〜約5 x 105 VSELsを含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項２７】
１mm3当たり約40〜約4,000 VSELsを含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項２８】
１mm2当たり約10〜約1 x 105 VSELsを含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項２９】
１mm2当たり約25〜約500 VSELsを含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３０】
適したマトリックスを含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３１】
前記マトリックスが生分解性である、請求項３０に記載の幹細胞組成物。
【請求項３２】
１又は２以上の骨形成タンパク質（BMPs）を含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３３】
骨芽細胞に分化可能である、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３４】
軟骨細胞に分化可能である、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３５】
少なくとも約50% VSELsである細胞を含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３６】
少なくとも約70% VSELsである細胞を含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【請求項３７】
少なくとも約90% VSELsである細胞を含んでなる、請求項２５に記載の幹細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の資金提供の報告
本発明は、国立衛生研究所により認可された認可番号AR056893及びDK082481の政府援助により行われた。政府は、発明において一部の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許出願番号第６１／４７３，４２０号、出願日２０１１年４月８日の優先権を主張し、斯かる出願は本願全体におい参照により組み込まれる。
【０００３】
発明分野
本発明は、極小胚様（VSEL）幹細胞を含んで成る組成物、及びヒトにおける骨及び軟骨疾患を治療するための組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
成人のヒトVSELsは、組織の通常の代謝回転及び再生に関与する骨髄中の小さな多能性幹細胞の常在群である。hVSELsは、典型的にはSSEA-4+/Oct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-であり、多能性マーカー（Oct-4及びNanog）を発現し、インビボ（in vivo）であらゆる三胚葉系列から骨芽細胞様細胞を含む細胞へ分化する能力を有する。
【０００５】
それらの循環レベルは傷害及びストレスに応答して非常に増大することが、心筋梗塞の動物モデル及びヒト心筋梗塞及び脳卒中患者で示されている。VSELsはまた、インビボ（in vivo）で心組織を修復することに有効であることが示されている。さらに、VSELsは放射線被曝後の免疫系を補助することが分かった。これは、ストレスがBMからのVSELsの放出を促進し、これらの細胞を傷害部位へ輸送することができ、細胞は損傷組織を再生することにより損傷した組織の回復を促進できることを示唆している。
【０００６】
他の成体幹細胞（MSCs、iPSCs）と異なり、ヒトVSELs（hVSELs）は、その多能性のため、広範囲の治療上の適用に使用することができる。
【０００７】
骨は、ミネラル化基底質及びコラーゲン線維のマトリックス中に組み込まれた細胞から成る硬い結合組織である。斯かる線維は、ヒドロキシアパタイトと同様のリン酸カルシウムの形態で含浸され、炭酸、クエン酸ナトリウム、及びマグネシウムの実質量を有し、重量で、75%無機物及び25%有機物から構成される。骨修復及び再生過程における異常は、一部のヒト疾病及び疾患、例えば、骨粗しょう症及び骨形成不全症の進行へリンクする。骨修復機構不全はまた、臨床整形外科治療における顕著な合併症、例えば、骨折後の線維性偽関節、移植片インターフェース不全及び大規模の移植臓器不全に関係する。骨再構築の技術は、例えば、外傷、癌手術又は発達過程におけるエラーの結果として生じる異常を再構築する等のために使用され、また骨修復を促進する新規方法によって改善されるであろう。現在利用される再建方法、例えば、自己骨移植片、又は付着した軟組織及び血管を有する骨移植片を使用すること等は、費用及び困難性双方に顕著な欠点が付随する。例えば、自己骨の有用量を収集することは、容易に達成することが不可能であり、自己移植片でさえ度々感染する又は再吸収に苦しむ。
【０００８】
副甲状腺ホルモン（PTH）は、成長板伸長及び骨折カルス形成に利用可能である間葉系幹細胞（MSC）のプールを増加することによって、正常な骨及び骨創傷及び骨折の部位において新たな骨芽細胞を刺激する。重要なことに、PTHは加齢中に骨密度を維持するために骨芽細胞前駆細胞を刺激可能であり、動物実験では、骨芽細胞形成において誘発される増大が若い動物よりも老齢動物において大きいことが示されている。PTH 1-84及びPTH 1-34は共に、他の確立された治療にわたって、様々な動物モデル及びヒトにおいて骨上で強力な同化効果を有することが示されている。PTHの効果は、骨中でMSCのプールを増大し、新たな骨芽細胞形成を刺激し、骨密度を増大するその能力に起因し、よって幹細胞治療は、高カルシウム血症の進行なくPTHより短時間に新たな骨形成を刺激することにおいてより効果的となり得る。
【０００９】
骨芽細胞に分化し骨損傷を修復する極小胚様（「VSEL」）幹細胞の可能性は、非常に興味深い。重症複合免疫不全症（SCID）マウスにおける頭蓋冠骨欠損の骨形成を促進するhVSELsの能力を試験するために研究を行った。これらの研究は、ヒトVSELs（「hVSELs」）は、インビボ（in vivo）で骨芽細胞に分化し、骨組織を再生することができることを示した。ヒトにおけるhVSELsのインビボ（in vivo）での効果及び安全性を試験し、骨欠損及び喪失を治療するこれらの多能性幹細胞のさらなる発展のための基礎を供する、ヒト頭蓋顔面の骨格において骨リモデリングを促進する自己VSELsの能力を試験するための研究が記載される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一態様によれば、記載の発明は、骨軟骨組織に対する損傷又は傷害を治療するための方法を供し、当該方法は自己極小胚様幹細胞（VSELs）を含んで成る組成物の有効量を組織へ投与することを含んで成り、VSELsは分化し骨軟骨組織を修復又は再生する。
【００１１】
本発明によれば、骨軟骨組織、特に骨及び軟骨を修復又は再生するためにVSELsはヒト組織と結合される。VSELsの動員、採取、及び精製方法が記載される。一部の実施形態において、それによって得られたVSELは、直接治療される骨軟骨組織に投与される。他の実施形態において、VSELsは生分解性であるマトリックス、又は足場に取り込まれる。一部の実施形態において、マトリックスは所望の組織型の方へのVSELsの分化を誘発するために選択される。一部の実施形態において、VSELsは、所望の組織型への分化を促進する薬剤又は成長因子と共に投与される。一部の実施形態において、成長因子は骨形成タンパク質（BMP）である。
【００１２】
一部の実施形態において、方法は骨軟骨組織における欠損を充填する又は覆うために使用される組成物中にVSELsを供する工程を含む。使用される組成物中のVSELsの数は、欠損の体積又は表面積と関係づけることができる。発明の実施形態において、組成物は１mm3当たり約20〜約500,000 VSELsを含んでなる。他の実施形態において、組成物は１mm3当たり約40〜約4,000 VSELsを含んでなる。発明の実施形態において、組成物は１mm2当たり約10〜約100,000 VSELsを含んでなる。他の実施形態において、組成物は１mm2当たり約25〜約500 VSELsを含んでなる。
【００１３】
一部の実施形態において、VSELsは他の有核細胞を含んでなる組成物中に供される。一部のこのような実施形態において、組成物の細胞は少なくとも約50% VSELsである。他の実施形態において、少なくとも組成物の細胞の約70%がVSELsである。さらなる実施形態において、少なくとも組成物の細胞の約90%又は少なくとも約95%がVSELsである。
【００１４】
VSELsは、自己、同種、又は遺伝子操作性とすることができる。発明の実施形態において、方法は、物理的損傷を治療又は修復するために使用され、骨折の回復、軟骨断裂の修復等を含むがそれらに限定されない。他の実施形態において、発明は新たな組織組織を再生又は産生するために使用される。非限定的実施例は、関節炎又は通常の摩耗により損傷された軟骨の回復、及び例えば、脊髄又は頭蓋損傷を修復するための、インサイツ（in situ）での骨の創生を含む。一部の実施形態において、本願の方法は、人工関節の骨格の骨への固着を促進するために使用される。方法は、変形性関節症、骨粗しょう症、又は骨形成不全症を治療するために使用することができる。
【００１５】
発明はまた、骨軟骨組織の再生又は修復に十分なVSELsの有効量を含んで成る組成物を供する。一部の実施形態において、幹細胞組成物は１mm3当たり約20〜約500,000 VSELs、又は１mm3当たり約40〜約4,000 VSELsを含んでなる。一部の実施形態において、幹細胞組成物は、１mm2当たり約10〜約100,000 VSELs、又は１mm2当たり約15〜約500 VSELsを含んでなる。幹細胞組成物は、他の有核細胞を含むことができる。一部の実施形態において、VSELsの細胞の割合は、少なくとも約50%、又は少なくとも約70%、又は少なくとも約90%、又は少なくとも約95%である。
【００１６】
本発明によれば、VSELsを含んで成る組成物はさらに、生分解性とすることができる、マトリックス、又は足場を含むことができる。一部の実施形態において、マトリックスは、VSELsの分化を促進するために選択される。一部の実施形態において、組成物は、分化を促進する１又は２以上の薬剤又は成長因子を含み、骨形成タンパク質（BMPs）を含むがそれに限定されない。
【００１７】
一実施形態において、組成物のVSELsは骨芽細胞に分化可能である。他の実施形態において、組成物のVSELsは軟骨細胞に分化可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、危機的サイズの欠損中へのヒトVSEL細胞移植に由来するμCT及び骨量画分を示す。SCIDマウスにおけるヒトVSELsにより産生された組織のμCT分析。（A）コラーゲンベースのGelfoamスポンジ又はヒトVSELsの移植後のμCT骨形成の代表的なイメージ（矢印）。（B）３人のドナーの１人由来のn=10移植片から得られた骨量画分の定量化。細胞対照（ヒト末梢血CD34+ 単核細胞（ドナー3）対照（担体単独-不の対照）と比較して増強された骨形成が観察された。p<0.01である、対照との顕著な相違（*）。
【図２】図２は、頭蓋冠欠損において骨を形成するヒトVSEL細胞能力の組織学試験を示す。マウス頭蓋冠欠損に、媒体（A、E）、ヒトCD34+ 細胞（B、F）又はヒトVSEL細胞（C、G - ドナー1、又はD -ドナー2）を含むGelfoam担体を充填した。3月後に、頭蓋冠欠損を収集し、脱灰し、ヘマトキシリンエオシン染色を行った。データは、ヒトVSEL細胞がヒト起源の頭蓋冠欠損内に骨組織を産生したことを示す（図4）。バー = 100ミクロン。
【図３】図３は、hVSELsが頭蓋冠欠損のミネラル化を誘発することを示しているマッソントリクローム染色を示す。VSELsで処置したマウス由来の頭蓋冠欠損の分析を示す。生じる骨組織のミネラル化。骨コラーゲンは青く染色され、ミネラル化されていない骨中の有機マトリックス成分又は「類骨」は赤く染色されている。
【図４】図４は、ヒトVSEL細胞の局所移植後の、SCIDマウスにおいて形成された骨におけるヒトHLAに関する免疫組織化学を示す。インキュベーション後に骨／骨髄干渉を、汎ヒトHLA抗体（D、E、F）又はアイソタイプマッチド対照（A、B、C）でイメージ化し、DAPIで対比染色し、核を識別した。骨／骨髄干渉（A、D）の微分干渉（DIC）イメージング、ヒトHLAの検出に関する免疫蛍光（IF）（B、E）及びDIC及び免疫組織化学の多層イメージ。白色の矢印は、骨芽細胞を示す。バー= 5ミクロン。
【図５】図５は、VSEL産生の骨組織中の内皮細胞がヒト起源であることを示す。ヒト特異的HLAマーカーと共局在化された、内皮特異的マーカーCD31へのヒト特異的抗体は、ヒトVSEL細胞が内皮細胞を、負の対照（A、B、C）ではなく、hVSEL移植片（D、E、F）において、管状構造中に産生したことを示した。骨の微分干渉（DIC）イメージング（A、D）、ヒトCD31の検出のための免疫蛍光（IF）（B、E）及びDICと免疫組織化学との多層イメージ。白色の矢印は、骨芽細胞を示す。バー = 5ミクロン。
【図６】図６は、免疫欠損マウスにおいてhVSEL細胞により産生されたミネラル含有量を示す。（A）hVSEL細胞を、用量範囲2,000-500,000細胞／欠損で頭蓋冠欠損に移植した。３月後に、各欠損内の組織ミネラル含有量値を動物群に関して平均した。正の対照は、BMP2を発現しているマウス骨髄ストロマ細胞を含み、負の対照はコラーゲン担体のみから構成された。（B）ドナーの2,000 hVSELによって頭蓋冠欠損内に形成された組織ミネラル含有量の平均値。*P<0.05。
【図７】図７は、頭蓋冠欠損内にhVSEL細胞により産生された組織の組織学評価を示す。代表的なスライドを、H&E（上列）及びマッソントリクローム（下列）で染色し、コラーゲン及び骨は青く見える。正の対照はBMP2を発現しているマウス骨髄ストロマ細胞を含み（図示なし）、負の対照（負の対照）はコラーゲン担体のみから構成された。組織診断は、20X（挿入）及び40x拡大率で提示した。負の対照群におけるコラーゲン担体マトリックスの残留及び炎症性細胞浸潤物の不存在に留意されたい。2,000 hVSEL群において、骨髄空間を含む層状骨が示される（矢印）。バー= 100ミクロン。
【図８】図８は、hVSEL細胞により産生された組織がヒト細胞に由来することを示す。頭蓋冠欠損中にhVSEL細胞により形成された組織を、蛍光ヒト特異的汎ヒト白血球抗原（HLA）で免疫染色し、抗核染色（DAPI）のイメージ及び微分干渉（DIC）イメージと組み合わせた。（A）負の対照は、媒体のみ移植したマウスにおける血管の縦切片であり、ヒトHLAの染色の欠如を示している。（B-D）ヒトVSEL細胞を注射したマウスにおける血管の縦切片は、細胞質ヒトHLAの染色を示している。組織学イメージは、40 X、バー= 100ミクロンで提示する。
【図９】図９は、マウス血清に存在するヒトオステオカルシンを示す。何も移植していない（負の対照）、担体のみ移植（スポンジのみ）、BMPを発現しているマウス骨髄ストロマ細胞を移植、又は2,000-500,000のhVSEL細胞／欠損を移植した動物の血清（3月）中に存在するインタクトのヒトオステオカルシンの循環レベル。オステオカルシンレベルを、総血清タンパク質に対して規準化した全動物／移植群の平均値及び標準偏差で表す。負の対照との比較の、*P<0.05。
【図１０】図１０は、実験動物の血液中にヒト細胞が見られることを示す。ヒト特異的Aluに関する定量的リアルタイムPCRを、選択マウス組織（脾臓、大腿、肝臓の右葉及び全血）内のヒト細胞の存在を測定するために使用した。純粋なマウス骨髄は負の対照として機能し、ヒト骨髄有核細胞は正の対照として機能した。ヒトDNAは、2,000 hVSEL細胞を移植した動物のいずれの脾臓、大腿又は肝臓中でも観察されなかった。ヒト特異的Aluは、動物の末梢血中に検出された。負の対照との比較の、*P<0.05。
【図１１】図１１は、hVSEL細胞により産生された軟骨組織がヒト細胞に由来することを示す。hVSEL細胞により形成された組織を、蛍光ヒト特異的汎ヒト白血球抗原（HLA）で免疫染色し、コラーゲンII型（Co II）のイメージ及び微分干渉（DIC）イメージと組み合わせた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細な説明
本発明は、対象において骨軟骨組織を治療又は再生するための方法を供する。方法は、自己の極小胚様幹（VSELs）細胞集団を得る工程及び細胞を投与し骨軟骨組織を治療又は再生する又は新たな組織を産生する工程を含んでなる。VSELs細胞は、骨髄から得る、又は血液から動員及び収集することができる。投与に先立ち、VSELsは、濃縮又は精製によって通常調製され、支持マトリックスに取り込まれることができる。一部の実施形態において、発明のVSEL調製は、さらに１又は２以上の成長因子を含み、骨形態形成因子又はタンパク質（BMPs）を含むがそれらに限定されない。
【００２０】
本発明によれば、VSELsの調製は、骨及び軟骨を含む結合組織を治療又は再生するために使用することができる。軟骨は、弾性軟骨、硝子軟骨、又は線維軟骨とすることができる。一部の実施形態において、VSELsは修復関節軟骨（例えば、変形性関節症に起因）へ使用される。他の実施形態において、VSELsは、変性椎間板疾患を治療するために使用される。発明のVSEL調製は、新たな骨及び軟骨組織を産生することにも有用であり、例えば、顔の再構築において使用される。
【００２１】
本明細書中に供される実験結果は、ヒトVSEL細胞が頭蓋冠欠損において骨構造を産生する能力があることを示す。産生された骨は、収集時（3月）に大部分が休止又はライニング細胞表現型であった、ヒト骨芽細胞で囲まれた厚い皮質構造をもたらした。大量の骨細胞が皮質構造中に取り込まれて見られ、マッソントリクローム染色において皮質組織の厚い積層が観察された。形成された組織がヒトVSEL細胞に由来することを確認するために、ヒト特異的汎ヒト白血球抗原抗体での組織の染色を行った。ヒトVSEL細胞が移植された動物から単離された組織のみ、ヒトドナー細胞に由来する細胞を示している骨髄染色を示した。精製され、濃縮されたhVSEL移植片由来の組織部分を、ヒトオステオカルシンに特異的な抗体（特異的成熟造骨細胞マーカー）でもまた染色した。
【００２２】
移植片あたり200、2,000、10,000 VSEL細胞の移植により、顕著に骨が充填された。特に、移植片あたりより多くのVSEL細胞であっても、必ずしもより速い、又はより完全な再生に繋がらなかった。例えば、10,000又は30,000 VSEL細胞が移植された欠損と比較して、2,000 細胞／欠損が移植された動物でより多くの骨組織が産生された。
【００２３】
本明細書中で用語「投与する」及びその様々な文法上の形態は、供与又は適用することを意味する。本明細書中で用語「投与すること」とは、インビボ（in vivo）で投与すること、及びエクスビボ（ex vivo）で組織へ直接投与することを含む。通常、組成物は従来の無毒の医薬的に許容される担体、アジュバント、及び所望の媒体を含む用量単位製剤で全身に非経口で又は局所的に投与することができる、又は注射、移植、移植（grafting）、局所投与、又は非経口投与等であるがこれらに限定されない手段によって局所的に投与することができる。本明細書中で用語「非経口」又は「非経口で」は、注射手段（すなわち、注射による投与）によって体内へ導入することを意味し、点滴技術を含むが、これに限定されない。
【００２４】
本明細書中で用語「自己」は、同一の個体由来であることを意味する。
【００２５】
用語「細胞分化」は、特定化されていない状態から成熟又は特定化された細胞型へ発展する場合の、細胞において生じている形態学及び生理学上の質的変化を意味する。
【００２６】
本明細書中で用語「損傷」は、あるものの価値、有用性又は正常な機能を損傷するようにそれに生じた物理的損害を意味する。
【００２７】
本明細書中で用語「分化可能」は、細胞分化を起こす能力を意味する。
【００２８】
用語「傷害」は、薬剤又は物理的又は化学的な力によって生じた対象の体の構造又は機能に生じた損傷又は損害を意味する。
【００２９】
用語「単離」は、例えば、（1）その自然に生じている環境において見られるような通常伴う又は相互作用する成分が実質的に又は本質的に存在しない、細胞、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質等であるがこれらに限定されない物質を意味するために本明細書中で使用される。本明細書中で使用される用語「実質的に存在しない」又は「本質的に存在しない」とは、相当又は顕著に存在しない、又は約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は約99%以上存在しないことを意味する。単離された物質は、任意にはその天然の環境においてその物質と共に見られない物質を含んでなる、又は（2）物質がその天然の環境中の場合、物質は慎重なヒトの介入により合成的に（非自然に）、その環境で見られる物質に由来しない組成物へ変更されている。合成物質を得るための変更は、その天然の状態内、又はその状態から除去された物質上で行うことができる。
【００３０】
本明細書中で用語「多能性」は、複数の異なる細胞型となる細胞の能力を意味する。
【００３１】
本明細書中で用語「骨芽細胞」は、全骨表面近くに及び骨髄中に位置する骨細胞前駆細胞又は間葉系細胞が成長因子の影響下で分化する場合に、生じる細胞を意味する。骨マトリックス合成に関与する骨芽細胞は、ヒドロキシアパタイト及び他の結晶の後のミネラル化に必須のコラーゲンリッチな基底質を分泌する。コラーゲンストランドは、類骨、骨マトリックスのらせん状線維を形成する。骨芽細胞は、カルシウム塩及びリンを生じ、血液から沈殿し、新たに形成された類骨と結合し、骨組織をミネラル化する。一旦骨芽細胞がそれらが分泌するマトリックスに捕捉されると、骨細胞となる。分化の程度から、骨細胞分化系列は、（i）コロニー形成線維芽細胞（CFU-F）、（ii）間葉系幹細胞／骨髄ストロマ細胞（MSC）、（3）骨芽細胞、（4）骨細胞である。
【００３２】
用語「骨形成」は、骨形成又は骨コンピテント（osteocompetent）細胞からの新たな骨の形成を意味する。
【００３３】
骨形成不全症（OI）は、骨及び軟結合組織脆弱性を特徴とする遺伝性結合組織疾病のグループを意味する（Byers & Steiner（1992）Annu. Rev. Med. 43: 269 289; Prockop（1990）J. Biol. Chem. 265: 15349-15352）。男女が同等に発症し、総発症率は5,000-14,000 出生あたり1人と現在推定されている。難聴、象牙質形成不全症、呼吸不全、重度の脊柱側弯症及び肺気腫は、１又は２以上のOIの型と関係する症状のまさに一部である。
【００３４】
用語骨粗しょう症は、減少された骨量及び骨折を特徴とする疾患の不均一なグループを意味する。臨床的に、骨粗しょう症は、I型及びII型に分けられる。I型骨粗しょう症は、主に中年女性で生じ、閉経期のエストロゲン喪失と関係し、一方骨粗しょう症II型は老化と関係する。
【００３５】
本明細書中で用語「多能性」は、体内で各細胞型となる細胞の能力を意味する。
【００３６】
用語「幹細胞」は、自己再生する能力を備えた高増殖能を有する未分化細胞を意味し、１以上の別個の細胞表現型への末端分化を起こし得る娘細胞を産生できる。
【００３７】
一部の実施形態において、記載の発明の進行性組成物は、賦形剤、担体又は溶媒を含むがそれらに限定されない媒体で製剤可能である。本明細書中で用語「賦形剤」「担体」又は「媒体」は、本明細書中に記載される自己幹細胞生成物の製剤化及び投与に適した担体物質を意味する。有用な担体及び媒体は、無毒且つ他の成分と相互作用しない当技術分野で周知の任意の物質を含む。本明細書中で、用語「医薬的に許容される担体」は、記載の発明の自己幹細胞生成物が安定及び生物学的に利用可能なままとなる、任意の実質的に記載の発明の組成物の製剤化及び投与に使用可能な無毒担体を意味する。医薬的に許容される担体は、治療される哺乳類への投与に適する、十分に高純度及び十分に低毒性でなければならない。さらに活性薬剤の安定性及び生物学的利用率を維持すべきである。医薬的に許容される担体は、液体又は固体とすることができ、活性薬剤及び所定の組成物の他の成分と組み合わせる場合に、所望の容積、堅さ等を提供するように計画された投与方法と共に選択される。
【００３８】
本明細書中で用語「再生」は、喪失又は損傷した部分の再生産又は再構成を意味する。
【００３９】
本明細書中で用語「修復」は、治癒過程により自然に又は人工的に疾病組織又は損傷した組織の回復を意味する。
【００４０】
本明細書中で用語「治療効果のある」は、対象への投与後に治療又は有益な効果を生じるヒト極小胚様幹細胞（VSELs）を含んで成る、自己幹細胞生成物の量を意味する。治療効果は、疾病又は疾患の治癒、最小化、阻止又は寛解とすることができ、また任意の他の有益な効果を有することができる。物質の濃度は、治療効果を発揮するように選択されるが、顕著な副作用を回避するために、その範囲内且つ医師の適切な判断内で十分に低い。自己幹細胞生成物の有効量は、治療される生体被験者の年齢及び健康状態、疾患の重症度、治療期間、併用療法の性質、点滴のタイミング、特異的化合物、使用される組成物又は他の活性成分、利用される特定の担体、及び同様の因子に伴って変更することができる。
【００４１】
当業者は、ヒト極小胚様幹細胞（VSELs）を含んで成る自己幹細胞生成物の医薬的有効量を、所定の効果強度を誘発する用量単位（使用単位を意味する）中の用量（以下、「単位用量」と呼ぶ）を決定することによって決定できる。用語「用量強度相関」は、個体レシピエントにおける効果の強度が用量に関係する態様を意味する。指定される効果の強度は通常、最大強度の50%である。対応する用量は、50%有効量又は個体ED50と呼ばれる。用語「個々」の使用は、半有効量と、本明細書中で使用される効果の強度に基づくED50を区別し、集団における応答データの頻度から決定される簡易ED50もまた区別する。本明細書中で「効果」は、所望の応答を達成する記載の発明の組成物の特性を意味し、「最大効果」は、最大達成可能な効果を意味する。特定の疾患又は疾病の治療において効果的となり得る自己幹細胞生成物の量は、疾患又は疾病の性質に依存的であろうし、標準的な臨床技術（例えば、Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Joel G. Harman, Lee E. Limbird, Eds.; McGraw Hill, New York, 2001: THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J., 1995; 及びDRUG FACTS AND COMPARISONS, FACTS AND COMPARISONS, INC., St. Louis, Mo., 1993）によって決定できる。これらの各々の技術は、参照により本明細書中に組み込まれる。記載の発明の製剤において使用される正確な用量もまた、投与経路及び疾病又は疾患の重篤度に依存的であろうし、施術者の判断及び各対象の状況によって決定されるべきである。
【００４２】
本明細書中で用語「治療」又は「治療すること」は、疾病の進行を抑止すること、実質的に阻害すること、減速すること又は逆行する、実質的に疾病の臨床又は審美的症状を寛解する、実質的に疾病の臨床又は審美的症状の出現を阻止する、及び有害な又は厄介な刺激から保護することを含むよう互換的に使用される。治療することはさらに、以下の１又は２以上を達成することを意味する。（a）疾患の重症度の減少、（b）治療される疾患症状の特徴の進行の制限、（c）治療される疾患の症状の特徴の悪化の制限、（d）以前に疾患を患った患者における疾患の再発の制限、及び（e）以前に疾患が無症状であった患者における症状の再発の制限。
【００４３】
用語「極小胚様幹細胞」は、「VSEL幹細胞」又は「VSEL」もまた意味し、多能性である一部の幹細胞を意味する。一部の実施形態において、VSEL幹細胞（「VSELs」）は、ヒトVSELsであり、lin-、CD45-、及びCD34+が特徴となり得る。一部の実施形態において、VSELsはヒトVSELsであり、lin-、CD45-、及びCD133+が特徴となり得る。一部の実施形態において、VSELsは、ヒトVSELsであり、lin-、CD45-、及びCXCR4+が特徴となり得る。一部の実施形態において、VSELsはヒトVSELsであり、lin-、CD45-、CXCR4+、CD133+、及びCD34+が特徴となり得る。一部の実施形態において、ヒトVSELsは、少なくとも１つのSSEA-4、Oct-4、Rex-1、及びNanogを発現する。VSELsは、細胞質の狭い縁で囲まれた大きな核を有すること、胚型の未組織化クロマチンを含むこともまた特徴となり得る。一部の実施形態において、VSELsは高テロメラーゼ活性を有する。一部の実施形態において、ヒトVSELsはlin-、CD45-、CXCR4+、CD133+、Oct 4+、SSEA4+、及びCD34+が特徴となり得る。一部の実施形態において、ヒトVSELsは、原始性がより少ないものとすることができ、lin-、CD45-、CXCR4+、CD133-、及びCD34+が特徴となり得る。一部の実施形態において、ヒトVSELsは多能性胚性転写因子、例えば、Oct-4、Sox2、及びNanogに関して濃縮することができる。一部の実施形態において、ヒトVSELsは、直径4-5 μm、4-6 μm、4-7 μm、5-6 μm、5-8 μm、6-9 μm、又は7-10 μmを有することができる。本発明の投与されるVSELsは、収集及び濃縮又は精製し、直接使用する、又は後の使用のために凍結することができる。本発明の自己又は同種VSELsは、投与可能である。さらに、VSELsは遺伝子操作することができる。
【００４４】
VSELsは、任意の方法によって収集及び精製することができる。国際公開第2011/069117号には、サイズベースの分離を使用した、末梢血からの幹細胞集団の単離方法が記載される。フレッシュな分離された（apheresed）細胞は、約1:10（vol/vol）の割合の1X BD Pharm Lyse 緩衝液で溶解され、赤血球が除去される。洗浄後、細胞をカウントし、合計2-2.5 X 1010の有核細胞をELUTRA（登録商標）細胞分離システム（CaridianBCT）に濃度1 X 108 細胞/mlで負荷する。細胞を続いて各バッグの900 ml PBS + 0.5% HSA媒体に、異なる流速で収集する。典型的には、６つの画分を遠心分離速度2400 rpmで収集する。最終的に、全画分由来の細胞を、チューブに移し、600 x gで15分間沈降させる。画分のサイズ特性は、SSC及びFSCを評価することによって確認される。本明細書で開示されるように、画分2（50 mL/min）はVSELsが豊富であり、臨床適用のためのVSELsの群を供するために使用することができる。手順は、他の装置に適合させることができる。集団は、FACSによってさらに精製することができる。
【００４５】
骨傷害部位において骨芽細胞を形成し骨損傷の治癒を促進するヒトVSELsの有用性を試験するために、VSELsをヒトボランティアからアフェレシス及び単離手順を使用して単離し、続いて頭蓋冠欠損モデルのSCIDマウスにおいて骨を治癒するhVSELsの再生特性を試験した。
【００４６】
hVSELsは、Gelfoam（登録商標）、FDA認可された足場（又はマトリックス）を使用して骨に適用され、骨傷害部位において骨芽細胞を形成し、SCIDマウスの頭頂骨欠損において骨損傷の治癒を促進した。３つの異なるヒトドナーからアフェレシスを介して得られ、FACSによって単離されたVSELsは、損傷した部位に適用された場合に、密度を測定するめのμCTスキャンによって評価された新たな骨を形成した。組織学的解析は、hVSELsが骨形成、顕著な新たな骨形成、インタクトの皮質様構造、骨梁の密度の高い肥厚及び骨髄形成を示すことを証明した。最も重要なことに、骨組織の免疫組織化学を使用したヒト特異的HLA抗体は骨髄及びミネラル化マトリックスに隣接した骨芽細胞様細胞の大量のヒトHLA標識化を示したので、新たな骨組織はhVSELに由来した。以下に記載される研究は、インビボ（in vivo）で骨芽細胞に分化し新たな骨組織を産生し、骨損傷を修復し骨粗しょう症を治療する可能性を有する、hVSELsの能力の最初の証拠を供する。これらはまた、ヒト頭蓋顔面骨格及び骨粗しょう症において骨リモデリングを促進する自己ヒトVSELsの能力を初めての試験し、ヒトにおける研究の基礎を供する。
【００４７】
本発明によれば、VSELsは、治療上有効量で投与される。一部の実施形態において、移植されるVSELsの数は、投与される組成物の体積次第である。例証されるように、3x3 mmコラーゲンスポンジ中の200 to 500,000 VSELsの範囲の細胞数を、3 mm直径の頭蓋冠欠損（約体積 = 1.0 - 5.0 mm3）に移植し、ミネラル化組織が産生された。一部の実施形態において、発明の組成物中のインサイツ（in situ）で投与されたVSELsの数は、単位体積あたりの細胞の単位で表すことができる。発明の実施形態において、少なくとも１mm3当たり約20 VSELsが投与される。他の実施形態において、１mm3当たり少なくとも40、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも400、少なくとも1000、少なくとも2000、少なくとも5000、少なくとも10,000、少なくとも50,000、少なくとも100,000、又はより多くのVSELsが投与される。発明の一部の実施形態において、VSELsの範囲は、１mm3当たり約20〜約500,000又は約40〜約4000、又は約20〜約100又は約100〜約400、又は約400〜約1000、又は約1,000〜約5,000、又は約5,000〜約50,000 VSELsである。
【００４８】
一部の実施形態において、発明の組成物にインサイツ（インサイツ）で投与されるVSELsの数は、単位面積あたりの細胞数の単位で表すことができる。発明の実施形態において、少なくとも１mm2当たり約15 VSELsが投与される。他の実施形態において、１mm2当たり少なくとも25、少なくとも100、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2000、少なくとも5000、少なくとも10,000、又は少なくとも50,000 VSELsが投与される。一部の実施形態において、１mm2当たりのVSELsの範囲は、約10〜約100,000、又は約25〜約500、又は約10〜約40、又は約40〜約100又は約100〜約500、又は約500〜約2,500、又は約2,500〜約10,000、又は約10,000〜約100,000である。
【００４９】
発明の一部の実施形態において、骨軟骨欠損へ投与されるVSELsの数は、約200〜約1000である。一部の実施形態において、投与されるVSELsの数は、約1,000〜約5,000である。一部の実施形態において、投与されるVSELsの数は、約5,000〜約20,000である。
【００５０】
移植可能な組成物は、様々な純度のVSELsを含むことができる。一実施形態において、VSELsは少なくとも50%の純度である（すなわち、有核細胞の少なくとも50%を示す）。他の実施形態において、VSELSは、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の純度である。他の実施形態において、VSELsは、50%〜80%、又は80%〜90%、又は90%〜95%、又は95%〜99%の純度である。
【００５１】
一部の実施形態において、発明の方法及び組成物は、骨形成又は軟骨形成の成長に適したマトリックスを含む。骨において、細胞外マトリックス（ECM）は、主に骨量約 20%を構成する類骨として周知の有機相、及び無機相から成る。骨の有機画分は、90%以上のI型コラーゲン、他の微量コラーゲン、例えば、III型及びV型等、並びに5%の非コラーゲンタンパク質から成る。骨中の非コラーゲンタンパク質は、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、接着タンパク質、例えば、フィブロネクチン及びビトロネクチン等及びプロテオグリカン、例えば、バーシカン等、デコリン及びヒアルロナンを含む。骨の無機相は、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム化合物から構成される。骨マトリックスはまた、可溶性誘導シグナルのためのリザーバーとして機能している成長因子、例えば、骨形成タンパク質（BMP）等を捕捉する。
【００５２】
発明の実施形態において、使用されるマトリックスは、その表面内または上に分散されたVSELsを含んで成る。マトリックスは任意には、レシピエント器官の表面上の位置において細胞を保持する接着物を含む。一部の実施形態において、マトリックスはスプレー可能である、塗ることができる、又は積層可能なフィブリン糊（又はフィブリン組織接着剤）であり、フィブリノーゲン及びトロンビンを含んで成る。２つの例は、Tisseel及びDuraSealである。斯かる接着剤又はシーラントは、その密度及び分解特性に適合させるために修飾することができる。
【００５３】
一部の実施形態において、マトリックスは、ポリマーから構成される構造であり、生分解性とすることができる。一部の実施形態において、マトリックスはポリマーフィルムであり、担体上で独立している又は覆われることができる。一実施形態において、ポリマーは、ポリ（D, L-乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）である。一部の実施形態において、乳酸グリコール酸比は、50:50、65:35、又は75:25である。他の実施形態において、ポリマーはポリ乳酸（PLA）である。他の有用なポリマーは、キトサン、キチン、ヒアルロナン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、及びグリコサミノグリカンを含むがこれらに限定されない。
【００５４】
ECMタンパク質は、骨欠損の治癒及び移植片組込みのための足場として有用であり、コラーゲン（例えば、Gelfoam（登録商標）等）、フィブリン、脱細胞化マトリックス、及び骨シアロタンパク質を含む。人工マトリックスは、例えば、覆う又は繋留することによりこれらのタンパク質で機能させることができる。ECM移植片の有用な形態は、架橋形成された膜、スポンジ、ゲル、脱ミネラル化骨粒子又は小さな腸粘膜下組織切断片を含む。一部の非限定的例は、コラーゲン、フィブリン、DCM、及びRGDペプチドである。RGDは、フィブロネクチン、ビトロネクチン、骨シアロタンパク質及びオステオポンチンを含む多くのECM分子において見られるペプチド配列であり、複数のインテグリン、αvβ3、αvβ1、α8β1、αvβ8、αvβ6、αvβ5及びαIIbβ3等に結合できる（例えば、Shekeran et al.、201, J Biomed Mater Res A. 96（1）: 261-72）。一部の臨床的に利用できる骨移植片物質は、合成ケイ酸置換多孔性ヒドロキシアパタイト（Actifuse ABX）、合成アルファ-TCP（Biobase）、合成ベータ-TCP（Vitoss）、合成ベータ-TCP（Chronos）、加工ヒト海綿状同種移植片（Tutoplast）及び加工ウシヒドロキシアパタイトセラミックス（Cerabone）である。
【００５５】
一部の実施形態において、方法及び組成物は、さらに骨形成又は軟骨形成成長因子を含む。斯かる因子は、米国特許第5,108,922号、5,013,649号、5,116,738号、5,106,748号、5,187,076号、及び5,141,905号に開示される、BMP-2（BMB-2a）、BMP-3（osteogenin）、BMP-4（BMP-2B）、BMP-5、BMP-6（Vgr-1）、BMP-7（OP-1）、BMP-8（OP-2）、BMP-9（GDF-2）、BMP-10、BMP-11、BMP-12（GDF-11、CDMP-3）、BMP-13（GDF-6、CDMP-2）、BMP-14（GDF-5、CDMP-1）、BMP-15（GDF-9B）、BMP-16、BMP-17、BMP-18、及びVgr-2（GDF-3）を含むが、それらに限定されない。BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6及びBMP-7BMP-8は、PCT出願国際公開第91/18098号に開示され、BMP-9は、PCT出願国際公開第93/00432に開示される。BMP-10は、米国特許第5,637,480号に開示され、BMP-11は米国特許第5,639,638号に開示される。BMP-12及びBMP-13は、米国特許第5,658,882号に開示される。BMP-15は、米国特許第5,635,372号に開示され、BMP-16は米国特許第5,965,403号に開示される。BMP-17及びBMP-18は、米国特許第6,027,917号に開示される。さらなる因子は、FGF-1、FGF-2、IFG-1、IGF-2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、及びVEGFを含む。一部の実施形態において、１又は２以上のビスホスホネート（例えば、エチドロネート、クロドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、リスドロネート、ゾレドロネート）を含む。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明のVSEL組成物は、１又は２以上の血液成分を含み、赤血球、白血球、単球、血小板、または血小板リッチな血漿を含むがそれらに限定されない。
【００５７】
マトリックスの構造は、どのような形状及び寸法でも、VSELsを傷害又は欠損と接触して又はそれらに接近して置くことに最も適するように修飾することができる。VSELsを含んで成るマトリックスは、パッチ、ラップ、又は導管形態とすることができ、傷害又は欠損の輪郭及び寸法にフィットするように形成することができる。一部の実施形態において、VSELsが播種されたマトリックスは、大部分のVSELsが欠損に直接接触するように配置される。他の実施形態において、VSELsは傷害又は異常に近接して配置される。
【００５８】
本発明は、VSELsを含んで成る組成物を投与することによって、骨又は軟骨欠損を有するヒト又は他の哺乳類を治療する方法を供する。組織欠損は、先天性異常、疾病又は外傷の結果又は症状、或いは外科又は他の医学的手法に起因するものを含むが、それらに限定されない。
【００５９】
骨折は、骨が亀裂された、切断された、又は細断された損傷を含む。骨治癒は、大抵の対象において自然に生じる。骨折は、通常、出血及び凝固、線維芽細胞によるコラーゲン生成及びコラーゲンマトリックスのミネラル化が続く。時間と共に、生じる未成熟骨は、リモデリングを起こし、成熟層板骨を生成する。しかしながら、骨折修復（偽関節）の不全は、全骨折の10%で生じる。VSEL組成物及び方法は、正常な骨治癒及びリモデリングを促進し、偽関節の発生を減少する。
【００６０】
VSEL組成物及び方法はまた、所望の位置で新たな骨の形成を促進するために使用される。非限定的例は、移植されるアプライアンス及びプロステーシスを含む。本発明によれば、移植アプライアンス又はプロステーシスは、VSELsが含浸され物質から形成される又はそれで覆われる。「含浸」とは、その表面及び／又は内部にVSELsを含んでなる物質を意味する。
【００６１】
よって、開示されるVSEL組成物は、骨の修復、再生、及び成長に有用である。非限定的適用としては、関節交換手術を含み、例えば、癌等の疾病による骨損失の人工股関節置換術、膝の代替手術、人工肩関節置換術、及び足関節置換術、脊髄融合、関節融合、手首、指、つま先、及び脊椎を含む骨融合、頭蓋形成、歯科骨移植片及び移植片置換術、及び再構築又は置換に限定されない。
【００６２】
本発明のVSEL組成物は、骨粗しょう症を治療することに有用である。本発明の一部の実施形態において、VSELs細胞が全骨格構造にアクセスするように、VSELsは全身性に（例えば、静脈内に）投与される。例えば、VSELsはCXCR4を発現し、CXCL12（SDF-1）勾配に反応し、CXCL12及び他の化学誘引物質は骨髄ストロマ細胞によって分泌される。本発明の一部の実施形態において、少なくとも5 x 103、又は少なくとも104、又は少なくとも5 x 104、又は少なくとも105又は少なくとも5 x 105、又は少なくとも106 VSELsが投与される。一部の実施形態において、投与されるVSELsの範囲は、約103〜約104、又は約104〜約105、又は約105〜約106である。
【００６３】
発明の実施形態において、VSELsの骨組織へのホーミング及び／又は固着を促進する薬剤が使用される。斯かる薬剤の１つは、VSELsに結合する第一の部分及び骨組織に結合する第二の部分を含んでなる。VSELsに結合する薬剤は、VSELマーカー（例えば、CXCR4、CD133）に特異的な抗体を含むが、それらに限定されない。骨に結合する薬剤は、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）を含むが、それらに限定されず、それは骨へのタンパク質及びMSCsを標的化するためにも使用されている。一部の実施形態において、第一の部分は、VSELs及び他の細胞上に発現されるマーカーに特異的とすることができる。斯かる場合、投与に先立ち薬剤を精製VSELsでインキュベートすることが好ましいとすることができる。本発明の他の実施形態において、骨組織に結合する薬剤はVSELへ共有結合させることができる。斯かる場合、投与に先立ち薬剤は任意のVSEL成分に結合させることができる。発明の実施形態において、骨粗しょう症に罹患する対象は、VSEL動員薬剤及び骨組織へのVSELsのホーミング及び／又は固着を促進する薬剤で治療される。
【００６４】
関節軟骨は、自発運動の力を基礎骨構造へ分配するために可動関節における骨末端をカバーする一方、同時にほとんど摩擦のない関節干渉を供する。これらの特性は、コラーゲンII型及び他の微量コラーゲン成分及び高含有量のプロテオグリカンアグリカンから構成された細胞外マトリックスによって装備される。低摩擦特性は、関節表面及び滑液の特別な分子組成物並びに関節表面上への負荷中の間質液の滲出の結果である。関節軟骨は、主に血管化（vascularisation）の欠如及び高密度プロテオグリカンリッチな細胞外マトリックスの存在に起因して、成体において傷害への制限された応答を有する。
【００６５】
本発明は、軟骨組織の修復、再生、再構築又はバルキングにおける使用のためのVSEL組成物及び方法を供する。好ましくは、組成物は、軟骨組織に接着し、その中に導入されVSEL分化及び軟骨を修復するための増殖をサポートする。一実施形態において、組成物は、VSELs及び任意の他の望ましい成分と混合される場合に、非液体（例えば、ゲル）となるポリマー組成物を含んでなり、これにより組成物は導入部位に保持され且つ接着される。ポリマーは、修飾又は天然の多糖、例えば、キトサン、キチン、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、又はヘパリン硫酸等とすることができる。一部の場合、導入部位の軟骨は、穴をあけること、研磨、又はドリルで穴を開けることによって準備され、VSEL組成物の空隙又は位置を提供し且つ／又はVSELsの生着を促進する。本発明の方法及び組成物は、軟骨への損傷、部分的な深さ（骨までの一部）又は全ての深さ（骨まで全て）の損傷及び半月板断裂を治療することに適するが、それらに限定されない。治療することができる軟骨の変性を含む疾病は、変形性関節症、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、ループス、痛風、及びライム疾病を含むが、それらに限定されない。
【００６６】
一部の実施形態において、同種VSELsは、損傷又は損傷した骨軟骨組織を治療するために使用される。同種VSELsは、遺伝的原因を有する骨格疾病を治療するために好ましい。例えば、発明の実施形態において、同種VSELsは骨形成不全症を治療するために対象へ投与される。斯かる疾病は、度々非常に少ないI型コラーゲン又は質の悪いI型コラーゲンを特徴とし、これはI型コラーゲン遺伝子の１つにおける突然変異に起因する。あるいは、分化においてI型コラーゲンを発現するために遺伝子操作された対象のVSELsを、使用することができる。
【００６７】
値の範囲を供する場合、文脈で他に明確に記載しない限り、その範囲の上限と下限との間に存在し、下限の単位の１０分の１までの各値、及び当該規定範囲内の任意の他の規定値又は存在する値は、本発明に含まれると理解すべきである。記載される範囲において特異的に排除される任意の限度に従って、これらのより狭い範囲に独立して含むことができるより狭い範囲の上下限もまた、本発明に含まれる。記載の範囲が１つ又は両方の限度を含む場合、含まれる限度の一方又はそれらの双方を除いた範囲もまた、本発明に含まれる。
【００６８】
他に定義しない限り、本明細書で使用される全技術及び科学用語は、本発明の属する当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び物質もまた本発明の実施又は試験で使用できるが、好ましい方法及び物質は今回記載するものである。本明細書中で言及される全公表文献は、斯かる公表文献に列記される方法及び／又は物質に関連した方法及び／又は物質を開示及び記載するために本明細書中に参照により組み込まれる。
【００６９】
本明細書中及び添付の請求項において、文脈で他に明確に記載しない限り、単数形「a」、「及び」及び「the」は、複数の言及を含むことに留意されたい。
【００７０】
本明細書中で考察される公表文献は、単に本願の出願日に先立つそれらの開示のために供され、各々は全体が本明細書中に組み込まれる。本明細書中には、先行発明のために本発明が斯かる公表文献に先行することは認められないと解釈すべき理由はない。さらに、供される公開日は実際の公開日とは異なり得るものであり、単独で確認する必要もあろう。
【００７１】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明をどう実施し使用するかの完全な開示及び記載を供するものであり、発明者が発明として見なすものの範囲を限定するものではなく、また以下の実験が行った全てである又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用した数値（例えば、量、温度、等）に関して正確性を保証するために努力したが、一部に実験エラー及び偏差が、存在するかもしれない。他に表示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は近大気圧である。
【００７２】
実施例1.  VSELsは、インビボ（in vivo）で骨芽細胞様細胞に分化できる。
【００７３】
最初の研究は、骨芽細胞、骨形成に関与する重大な細胞型に分化するマウスVSELsの能力の証明に焦点を絞った。Dr. Taichman及び彼のグループは、幹細胞様活性を有する細胞を識別するために使用可能である、インビボ（in vivo）でのアッセイを近年記載した。彼らは、今回、インビボ（in vivo）で5-フルオロウラシル（5-FU）に耐性があり、CXCR4 [46,47]を発現した、MSC様活性を有する細胞がマウスBMにおいて低密度で存在することを発見した。これらの細胞は、FACSを特徴とし、その後VSELs [3-5]と同一の特性を有するLin- Sca-1+ CD45-細胞であることが分かった。
【００７４】
多系列の分化を起こすマウスVSELsの可能性を評価するために、骨髄移植研究を行った。まず、MSCsをCol2.3Δ TKマウスから収集し、培養下で増殖させ、SCIDマウスに移植し、レシピエント部位を生じさせ、そこではチミジンキナーゼ組織が確立された。斯かるストラテジーを使用するための原理は、分化の進行を起こすためのGFP標識細胞の注射用空きスペースのために、生じる移植片の骨髄において骨芽細胞を除去することが可能であったことに違いない。対照として、フレッシュに単離されたVSELs由来のmRNAを、骨芽細胞特異的マーカーRunx-2及び脂肪細胞マーカーPPARγの発現に関して評価した。造骨細胞系統MC3T3-E及び1 x 10-6 Mデキサメタゾンで処理した骨髄ストロマ細胞と比較して、Runx-2及びPPARγ [47]のmRNAが存在する場合、VSELsはほとんど発現しなかった。1.5月において、小骨を外科的に曝露させ、GFPマウスから単離されたVSELsを注射した。さらに1.5月後、移植片を収集し、注入したGFP細胞の分化を細胞表面マーカー及び共焦点顕微鏡で測定した。骨芽細胞特異的マーカーRunx-2及び脂肪細胞マーカーPPARγへの抗体でのGFP発現細胞の共局在化を行った。Runx-2発現細胞の約半分が、GFPを発現した。同様に、ほぼ半数のPPARγ発現細胞がGFPで標識された。これらのデータは、少なくともVSELs由来の２つの系統で分化系列の進行低下がインビボ（in vivo）で生じたことを示す。最も重要なことは、VSELsはインビボ（in vivo）で骨芽細胞様細胞に分化することができたことである。
【００７５】
実施例2.  頭頂骨欠損モデルにおいてヒトVSELsが骨を再生することができる。
【００７６】
これらの最初の研究は、頭頂骨欠損モデルにおいて骨を形成するヒトVSELsの効果を試験するための研究の基礎を供する。これらの研究に関して、NeoStemは健康なヒトボランティアからVSELsを単離した。個体を、3日間コースに亘ってG-CSF（480 ug／日）で処置し、200 mlの血液試料を採取し、アフェレシス及びFACSに供しVSELsを単離した。〜70%又は〜90%純度のVSELsを、負の細胞対照として使用したCD34+ 細胞（VSELsはCD34-である）と共に単離し、不活性担体としてのコラーゲンGelfoam（登録商標）無菌スポンジ上に負荷した。
【００７７】
５週齢のメスSCIDマウス（N:NIH-bg-nu-xid; Charles River Labs）を、それぞれ１０匹から成る群にランダムに分けた。頭蓋冠欠損を産生するために、線状頭皮切開を行い、両側の全層フラップを持ち上げた。頭蓋冠骨を覆っている骨膜を切除し、水スプレーを備えたトレフィンバーを5-mm 開頭欠損を作成するために使用した。頭蓋冠ディスクの除去後に、VSEL細胞又は対照（負のGelfoamのみ又はCD34+ 細胞）を欠損中に置いた。4-0 Chromic Gut縫合（Ethicon／Johnson & Johnson, NJ）で切開を閉塞し、マウスを戻した。手術の3 月後に全マウスを屠殺した。頭蓋冠を収集し、直ちに10%中性緩衝ホルマリン中で48時間固定し、続いてμCT分析に関してスキャンし、その後10% EDTA溶液で2-3週間脱灰させ、勾配アルコールで脱水し、組織診断用にパラフィン中に取り込んだ。
【００７８】
8.93 μm ボクセル解像度でEVS Corp., μCTスキャナー（London, Ontario, Canada）上で、１スキャンあたり合計667スライスで検体をスキャンした。GEMS Micro View（登録商標）ソフトウェアを、スキャンのセットから3D再構成のために使用した。固定閾値（1,000）を、ミネラル化骨相、骨量画分（BVF）、骨密度（BMD）及び骨梁数（Th.N.）を抽出するために使用した。骨量画分の代表的なイメージ及び定量化を、図1A、B中に供する。データは、担体（対照）又はCD34+ 細胞のみ移植した動物は、全く骨組織を産生しないことを示す（図1A、パネル1及びパネル3及び4、右側の欠損及び1B）。健康なドナー 1由来の10,000の精製VSEL細胞の移植は、共に骨形成を刺激した（図1A、左から2番目のパネル）。ドナー1由来のVSELsの効果は、用量依存的のようであり、骨を産生するが、この違いは、統計レベルに達しない（図1B）。ボランティア2及び3由来のVSELsにより産生された骨（図1A、左から第３及び４パネル）は、ドナー1由来のVSELsと比較してより大きな骨の充填を供し、より少量の細胞を使用した場合でさえ、骨形成を促進するVSELs能力における個体相違の可能性を示した。
【００７９】
細胞を含まない移植した対照Gelfoamスポンジの組織学試験は、低レベルの好中球及び成長中の結合組織のみもたらした（図2 A、E）。2 x 104 CD34+ 細胞の移植はまた、特異的組織再生を示すことができず、緩く構築された結合組織及び残留コラーゲン足場物質から構成された（図2B、F）。全３人のドナー由来の2,000 ヒトVSELsの移植は、骨様組織に似た肥大性細胞の小さな局所領域を生じた（図2C、D）。より高拡大率において、VSEL処理群は顕著な新たな骨形成、脂肪細胞及び造血骨髄の漸増を示した。骨形成の程度は、2,000 VSEL細胞で播種した細胞の数に反比例的に依存しているように思われ、よりインタクトの皮質様構造、より高密度の骨梁及び10,000 細胞より多くの骨髄が、幹細胞と可能性のある担体又はアクセサリー細胞との間及びそれらの中で生じている複合体相互作用と一致していることを再度示している。細胞を有しない移植片は、低レベルの好中球及び成長中の結合組織のみもたらした（図2A、E）。2 x 104 CD34+ 細胞の移植はまた、特異的組織再生を示すことができず、緩く構築された結合組織及び残留コラーゲン足場物質から構成された（図2B、F）。全３人のドナー由来の2,000 ヒトVSELsの移植は、骨様組織に似た肥大性細胞の小さな局所領域を生じた（図2C、D）。より高拡大率で、VSEL処理群は、顕著な新たな骨形成、脂肪細胞及び造血骨髄の漸増を示した。
【００８０】
VSELsが骨のミネラル化を生じたという証拠は、マッソントリクローム染色において示される（図3）。青色染色はコラーゲンを示し、VSEL治療は、ミネラル化されていない領域（赤色染色）と比較して、頭蓋冠欠損において非常にコラーゲン蓄積を増大することを示す。実際、ほとんどの欠損は、新たに形成された骨組織によって充填される。
【００８１】
骨組織がヒト又はマウス起源に由来するかを決定するために、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（MHC）であるヒト白血球抗原（HLA）、又はアイソタイプ対照に特異的な抗体で切片を染色した（図4）。
【００８２】
ヒトHLAに関する免疫組織化学は、大量の骨髄染色を同定した。ミネラル化マトリックスに隣接した骨芽細胞様細胞は、ヒトHLAに関して特に強く染色され、他方でヒト細胞を含む隣接部分は、IgG対照染色の存在を染色できなかった。これらのデータは、移植ヒトVSEL細胞が新たな骨組織を産生することに寄与したことを示す。
【００８３】
内皮細胞は、骨形成に重要である。我々はさらに、骨組織内で内皮細胞が形成されたかを評価した。ヒト特異的HLAマーカーと共局在化された、内皮特異的マーカーCD31へのヒト特異的抗体の使用は、実際、管状構造中にヒト内皮細胞が、負の対照ではなくhVSEL移植片で生じることを示した（図5）。
【００８４】
結果は、VSELsがヒトボランティアから十分な量（200 ml TNC アフェレシスあたり約 17,000,000細胞）で単離することができ、再生医療に使用することができることを証明する。ヒト血液からVSELsを単離する手段を確立している研究は、公開されており[28]、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
さらに、マウスモデルで骨は2000 ヒトVSELsで形成することがができた（図1）という事実は、一旦単離した細胞の伸長、分化誘導、又は任意の他の細胞操作が必須でないことを示す。実際、骨再生の研究は、フレッシュに単離したヒトVSELsで全て行われている。ホスト骨髄中に移植した場合のRunx-2の発現によって示されるように、我々は、VSELsがインビボ（in vivo）で骨芽細胞様細胞に分化し得ることを示した（Taichman、2010）。
【００８６】
最も重要なことは、我々はhVSELsが、損傷骨において新たな骨を産生し得ることを示したことである（図3〜6）。これらは、hVSEL分化の最初のインビボ（in vivo）での研究であり、その再生能力の最初の証拠である。この結果は、それらを再生医療において、特定に骨修復において、使用できることを裏付けている。
【００８７】
最後に、我々の研究は、骨を再生するためにhVSELsを投与することがどれほど最良であるかの情報を供する。最初に、Gelfoamは、細胞を骨創傷に適用するのに有用な足場のようである。Gelfoamは、創傷及び体内器官傷害の治療における使用でFDA認可されており、ヒトの研究において広範囲に使用されている。よって、GelfoamはhVSELをヒト骨へ適用し、損傷及び骨欠損を治療する足場として使用可能に違いない。
【００８８】
実施例3.  ヒトVSELsは、頭頂骨欠損モデルにおいて骨を再生できる。
【００８９】
健康なコーカサス人男性及び女性をVSEL細胞ドナーとして採用し、周知の疾病、薬物及びタバコの使用及び肥満に関してスクリーニングした。アフェレシスの２日前に、各ドナーに毎日皮下にG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子（Neupogen（登録商標）、Amgen Inc., Thousand Oaks, CA））（480μg／日）を注射し、骨髄においてその後血流に放出されるVSEL細胞の動員を促進させた。2〜3時間のコースに亘って有資格のスタッフ専門家によって、アフェレシスを実施した。続いて、ヒトVSEL細胞をElutriation（CaridianBCT）で濃縮し、続いてCD34／CD133 Microbeads（Miltenyi Biotec）正の選択を行い、生Lin-CD45-CD34+CD133+ VSEL細胞をMoflo XDP 高速細胞選別機（Beckman Coulter）を使用して流動選別した。高精製のVSEL細胞を最終的にPBS-5% HSA中に凍結させ、翌日配達便で人口情報なくMichigan大学に輸送した。
【００９０】
５週齢のメスSCIDマウス（N:NIH-bg-nu-xid; Charles River Laboratories, Raleigh, NC）をn=10-13匹の動物から成るn= 5群にランダムに分けた。動物にイソフルラン吸入で麻酔し、鼻骨から後頭まで線状頭皮切開を行い、全層フラップを持ち上げた。ハンクス平衡塩類溶液で継続的に灌注しながら、トレフィンを各頭頂骨の中央に置かれる3-mm開頭欠損を作成するために使用した。下部の硬膜及び脳組織の損傷を回避するために、頭蓋冠ディスクを除去した。止血後、足場が全欠損を充填し、その周辺で骨縁に結合するように、媒体又はhVSEL細胞を予め負荷した足場（Gelfoam（登録商標）、Pharmacia & Upjohn、Kalamazoo、MI）を欠損中に慎重に置いた。切開を4-0 Chromic Gut縫合（Ethicon／Johnson & Johnson、Somerville、NJ）で閉塞し、加温パッド上でマウスを麻酔から回復させた。移植16週間後に、全マウスを屠殺した。血清を回収するために、麻酔下で心臓内穿刺で屠殺し、吸引を行った。
【００９１】
C57BL／6マウス（Jackson Laboratory）の大腿、脛骨及び上腕骨を、DMEN + 10% FBS（Invitrogen、Grand Island、NY）でフラッシングすることにより骨髄を単離した。調整Dexter培地（IMDM培地、10% FBS、10% ウマ血清、1 μMヒドロコルチゾン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies、Grand Island NY））中で37℃で可塑的固着を行った。オーバーナイト固着後、非接着細胞を除去し、フレッシュな培地に交換した。第１及び第２継代細胞（P1又はP2）を産生しながら、３週間のコースに亘って培養物をトリプシン処理で２度広げた。80-90%コンフルエンスのP1又はP2由来のBMSCsを、感染の多重度（MOI）500での移植の24時間前に、エクスビボ（ex vivo）でAdCMVBMP-7と変換させた。以前に記載されるように（Franchesi et al.、2000, J. Cell. Biochem 78:476-86）、AdCMVBMP-7をCre-lox組換えで構築し、Michigan大学のVector Coreで生成した。
【００９２】
マウスの５つの群を確立し、頭蓋顔面の欠損を再生するヒトVSEL細胞の能力を評価した。第一の群は、媒体及びGelfoam（登録商標）のみ欠損に置いた負の対照として機能した。第二の群は、huBMP-7を発現するようにデザインされたAdCMVBMP-7に感染したP1又はP2マウス骨髄ストロマ細胞から構成され、正の対照として機能した。Gelfoam（登録商標）中の20、200又は2000 VSEL細胞から構成された試験群は、３つの異なる個体から単離された。細胞用量は、（i）骨髄に存在すると報告されているこれらの骨髄ヒトMSCsの発生頻度（1／10,000〜1／100,000骨髄単核細胞の範囲）の推定、及び〜2x106 ヒト骨髄接着細胞がマウスにおける3 mmの頭蓋欠損の治癒に必要であるという所見によって、到達させた。移植した細胞の10%だけが創傷修復に関与できるとすれば、2000 VSEL細胞用量の取り込みは、VSEL細胞応答を観察する我々の能力を保証できた。
【００９３】
マイクロコンピュータ断層撮影（μCT）
頭蓋冠を収集し、10%中性緩衝ホルマリン中に直ちに48時間固定した。骨検体を続いて8.93 μm ボクセル解像度でEVS Corp.、microCTスキャナー（London、Ontario、Canada）上で、１スキャンあたり合計667スライスでスキャンした。GEMS MicroView（登録商標）ソフトウェアを、斯かるセットからの3D再構築のために使用した。目的の領域（ROI）に関して各欠損を個体評価し、骨分析をミネラル化骨相を引き出すために使用される固定閾値（600）で行い、骨量画分（BVF）、骨密度（BMD）及び骨梁数（Th.N.）を算出した。
【００９４】
組織学試験
μCT分析後に、骨を10% EDTA（pH 7.4）に10日間脱灰させ、パラフィン中に取り込んだ。頭蓋冠の縦切片をカットし、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）で又はマッソントリクローム染色を使用することによって染色し、光学顕微鏡で分析した。一部の場合、製造者のプロトコール（R&D Systems）に従って、スライドをヒトHLA抗原への抗体（抗HLA-ABC抗体（BioLegend、San Diego、CA））で又はHRPAEC染色系キットと併せてIgG対照（Sigma）で染色し、ヒト細胞を識別した。
【００９５】
血清オステオカルシンレベル
サンドイッチMid-TactオステオカルシンEIA（Biomedical Technologies、Stoughton、MA）及びヒト組換え型オステオカルシン（Biomedical Technologies）を標準として使用することによって、ヒトオステオカルシンレベルを測定した。斯かるサンドイッチEIAは、インタクトのヒトオステオカルシン及び主要な（1-43）断片双方に非常に特異的である。血清中の生じるオステオカルシンレベルを規準化するために、ウシ血清アルブミン標準に対するRC-DCタンパク質アッセイキット（BioRad Laboratories）を使用することによって総タンパク質を測定した。
【００９６】
ヒトVESLに関するリアルタイムPCR評価
【００９７】
DNA単離キットを、指定組織からゲノムDNAを調製するために使用した（DNeasy Blood and Tissue Kit（Cat. no. 69506）; Qiagen, Inc., Valencia, CA）。偽陽性結果を排除するために、各反応で全試料濃度を標準化した。総体積30 μl中、15.0 μlのTaqMan PCR Master Mix（Applied Biosystems, Foster City, CA）及び100 nMのヒトAlu TaqManプローブ（前方- 5′- CATGGTGAAACCCCGTCTCTA-3′、逆- 5′-GCCTCAGCCTCCCGAGTAG-3′、TaqManプローブ- 5′-FAM-ATTAGCCGGGCGTGGTGGCG-TAMRA-3′）、（Applied Biosystems）及び1μgの単離された組織DNAを使用して、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行った。温熱条件は、50°Cで2分間、95°Cで10分間、続いて95°Cで15秒間を40サイクル、並びに60°Cで1分であった。発現レベルを、配列検出システム（ABI PRISM 7700; Applied Biosystems）を使用して蛍光中の増大として検出した。DNAレベルをマウスβ-アクチン（Cat. no. 4331182; Applied Biosystems）に対して規準化した相対的複製（%対照）として表し、精製Luc／Alu cDNA断片の段階希釈から構築した標準曲線を、典型的なPCRによってクローン化した。数的データを、ヒトVSELの対数倍希釈を含む、マウス骨髄を使用して確立した標準的な曲線に対して測定した。正及び負の対照は、非VSEL注入マウスから得られる組織又はVSELから直接得られるDNAを含んだ。
【００９８】
統計分析
数的データを平均値± 標準偏差として表わす。統計分析をKruskal-Wallisの一方向分散分析によって、GraphPad Instat統計プログラム（GraphPad Software、San Diego, CA）を使用して行った。特異的な相違をMann-Whitney U検定によって測定した。有意性レベルをP < 0.05に設定する。
【００９９】
マイクロコンピュータ断層撮影による骨形成評価
【０１００】
ヒトVSELを、マウス頭蓋冠欠損における骨を形成する能力に関して評価した。VSEL細胞を、正常な健康なドナーのG-CSF動員後に単離し、直径3mmの左頭頂骨にもうけた頭蓋冠欠損に置いた。移植した細胞（2,000-500,000 細胞の範囲）を、3x3 mmのCollagraft（登録商標）コラーゲンスポンジ中の欠損へ送達した。負の細胞対照は、スポンジのみから構成した。正の対照は、hBMP7の過剰発現のために遺伝子操作したマウス骨髄ストロマ細胞を組み込んだ。3月後、全検体をμCTで評価した。データは、担体のみを移植した動物（負の対照）は、正の対照におけるミネラル化組織形成と比較して骨組織を全く産生しなかったことを示した。試験ドナーの全３人由来の2,000-500,000 VSEL細胞の移植は全て、骨形成を刺激した。ミネラル化の試験は、欠損は全て不完全な閉鎖を示した。それにもかかわらず、強固な骨形成が、2,000〜10,000 細胞／移植群が産生された試料において観察された。興味深いことに、30,000 細胞／移植片で治療した動物で形成された骨は、2,000 細胞／移植で治療より顕著に多くの骨組織は生じなかったが、500,000 細胞／移植片は30,000及び2,000 細胞／移植群より大きな骨構造を生じた。
【０１０１】
GEMS MicroView（登録商標）ソフトウェアを使用して、ミネラル含量について各試料を試験した。ミネラル化マトリックスを産生する細胞の効果は、利用される細胞の用量に関して反比例するように思われたが、この違いは統計レベルに達しなかった（図6A）。例えば、2,000 ヒトVSELsを移植した欠損は、10,000又は30,000 細胞を移植した欠損よりもミネラル化された組織を生じた。興味深いことに、30,000 hVSELsを有する移植片は、最も低いミネラル化の組織を生じた。頭蓋冠欠損に500,000 細胞を移植する場合、ミネラル化組織の形成は最大となったが、統計的に顕著な量でなかった。
【０１０２】
上述のように、hVSEL単離は、３人の別々のドナーから収集した。ドナー間の骨形成の効果における任意の相違をアッセイするために、個体ドナー由来の移植片を同一細胞用量で評価した。2,000 hVSEL 細胞／移植片で生じた骨をドナー1及び3と比較したところ、これらの群で平等に行ったが、結果は、共にドナー2よりミネラル化された組織が産生されたことを示した（図6B）。しかし、ドナー 1は顕著に他の２つのドナーより多くのhVSEL細胞を産生した。産生された総VSEL細胞は、ドナー 1、2及び3に関して各々、312K、19K及び11Kであった。さらに、ドナー2の2,000 hVSEL 細胞／移植片と比較して、細胞／移植片が少なければ少ないほど、骨がより形成され、このことはhVSEL細胞機能における個体相違の可能性を示唆している。
【０１０３】
組織学的解析による骨形成の評価
脱灰後に、組織学評価の準備において各欠損を介して連続切片を作成した。移植片物質は、高度の生体適合性を示し、非常に低レベルの炎症及び異物応答の証拠がないことが特徴であった。対照群において、コラーゲンGelfoam担体マトリックスは存続し、H&E又はマッソントリクローム染色で類骨又は成熟層状骨は観察できなかった（図7）。2,000-30,000 hVSEL 細胞を移植した実験群において、頭蓋冠欠損内に骨髄空間を含む層状骨が観察された（図7B-D）。担体マトリックスは大部分が欠損部位から再吸収され、層板骨を覆っている線維性結合組織内に包埋された残存小片はほとんどなかった。生じた骨は、主に成熟層状骨を含んだ（図7B-D）。
【０１０４】
hVSEL細胞が骨を形成したことの証明
形成された骨が実際に移植されたヒト細胞によって産生されたことを確認するために、２つの独立した方法で評価した。まず、切片を汎ヒト特異的白血球抗原（HLA）抗体で染色した。媒体のみを移植しヒトVSELsを含まないたマウスは、ヒトHLAに交差反応を全く示さなかった（図8A）。ヒトVSEL細胞を移植したマウスは、骨芽細胞上及び骨細胞中に特異的に顕著なヒトHLA染色を示した（図8B-D）。
【０１０５】
hVSEL細胞が骨を産生したことをさらに説明するために、屠殺時（3月）に動物から採取された血清を、ヒト特異的オステオカルシンの存在に関して評価した。移植片に全くhVSEL細胞を受けなかった動物は、全くヒトオステオカルシンを血清中に示さなかった（図9）。hVSEL細胞を移植した動物は、血清内に存在する循環ヒトオステオカルシンを有した。オステオカルシンのレベルはおおよそ骨形成の量に相当し、500,000 細胞／移植片を受けた動物は血清中に最も高濃度のオステオカルシンを有し、より少ないVSEL細胞を移植した動物はより少ない血液オステオカルシンを示す。
【０１０６】
骨欠損へのヒト細胞の局在性
ヒトVSELsの移植部位から周辺への遊走を、定量的リアルタイムPCRを使用して、ヒト特異的Alu 配列に関して評価した。ヒトDNAの存在を、脾臓、大腿、肝臓の右葉及び全血由来の、代表的な組織試料から評価した。ヒト細胞移植していない動物及びマウス骨髄を移植した動物は、負の対照として機能した。マウス骨髄と混合（1:1,000）のヒト前立腺癌細胞系統（PC-3）は、正の対照として機能した。ヒト特異的Alu発現を、ヒトVSEL細胞を移植したレシピエント動物の血液で低レベルで同定した（図10）。ヒトDNAの証拠は、ヒトVSEL細胞を移植した動物の脾臓、大腿又は肝臓で見られなかったことは、欠損外に遊走したVSEL細胞のレベルが相対的に低かったことを示唆している。
【０１０７】
実施例4.  ヒトVSELsは軟骨を再生できる。
【０１０８】
軟骨へのヒト細胞の局在性
一部の切片における組織学試験は、軟骨におけるヒトVSELsの存在を示した。一部の切片において、軟骨中に取り込まれた軟骨細胞を暗示する組織と共に織り込まれた骨が観察された。この細胞型が軟骨形成を示し得るコラーゲンII型を生じたかを決定するためにさらなる分析を行った。hVSEL細胞により形成された組織を、蛍光ヒト特異的汎ヒト白血球抗原（HLA）で免疫染色し、コラーゲンII型（Co II）を染色した。図11は、混合HLA、CO II、及び微分干渉（DIC）のイメージを示す。
【０１０９】
本発明は特定の実施形態に関して記載されるが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であり等価物と置換することができることを当業者は理解すべきである。さらに、特定の状況、物質、物質の組成、方法、工程段階に合わせて、本発明に多くの変更が可能である。斯かる変更は全て、添付の請求項の範囲内であることを意図する。
【０１１０】
参考文献
1. Rodgerson, D.O. and Harris, A. (2011) A Comparison of Stem Cells for Therapeutic Use. Stem Cell Rev and Rep. Pub. on line DOI 10.1007/s12015-011-9241
2. Taichman, R.S., Wang, Z., Shiozawa, Y., Jung, Y., Song, J., Balduino, A., Wang, J., Patel, L.R., Havens, A., Kucia, M., Ratajczak, M., Krebsbach, P.H.  Prospective Identification and Skeletal Localization of Cells Capable of Multi-Lineage Differentiation In Vivo. Stem Cells Dev. 2010.
3. Kucia, M., Wu, W., Ratajczak, M.Z. Bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells: Their developmental origin and biological significance. Dev. Dyn. 2007.
4. Kucia, M., Zuba-Surma, E.K., Wysoczynski, M., Wu, W., Ratajczak, J., Machalinski, B., Ratajczak, M.Z. Adult marrow-derived very small embryonic-like stem cells and tissue engineering. [Review] [104 refs]. Expert Opinion on Biological Therapy 7(10):1499-514, 2007.
5. Kucia, M., Reca, R., Campbell, F.R., Zuba-Sunna, E., Majka, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M.Z. A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia 1920;857-869.
【図２Ａ】
2014511864.tif 000003
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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