(57)【要約】  本発明は、診断法の分野に関する。具体的には、本発明は、対象において、多発性硬化症を診断する方法、対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうか同定する方法又は多発性硬化症治療が奏功しているかどうか決定する方法を意図する。更に、対象における多発性硬化症の活性状態のリスクを診断又は予測する方法に寄与する。本発明は、診断装置など上述の方法を実施するツールにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、多発性硬化症(MS)を診断する方法であって:
a)対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより多発性硬化症が診断されることになるステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも一種のバイオマーカーが、表1a及び/又は表2aに挙げるバイオマーカーの群から選択され、参照量と比較した前記少なくとも一種のバイオマーカーの増加が、多発性硬化症の指標となる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも一種のバイオマーカーが、表1b及び/又は表2bに挙げるバイオマーカーの群から選択され、参照量と比較した前記少なくとも一種のバイオマーカーの減少が、多発性硬化症の指標となる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
多発性硬化症が、多発性硬化症の初期段階で診断される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記参照量が、見かけ上健康な対象若しくはその群から、又はMSに罹患していないことが既知だがMS症状を示す対象若しくはその群から得られる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうか同定する方法であって、請求項1から5のいずれか一項の方法のステップと、多発性硬化症の治療を必要とする対象を同定する更なるステップとを含む、方法。
【請求項７】
i)多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症に罹患している対象とii)MS症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とを鑑別する方法であって、
a)多発性硬化症の症状を示す対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を少なくとも一種の参照量と比較するステップであり、それによりi)とii)が鑑別されるステップと
を含む、方法。
【請求項８】
多発性硬化症治療が奏功しているかどうか決定する方法であって、
a)対象の第1及び第2サンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを測定するステップであり、前記第1サンプルが、多発性硬化症治療の開始前又は開始時に採取されたものであり、前記第2サンプルが、前記治療の開始後に採取されたものであるステップと、
b)第1サンプル中の前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を第2サンプル中の量と比較するステップであり、それにより第1サンプルと比較した第2サンプルにおいて決定された量の変化が、多発性硬化症治療が奏功している指標となるステップと
を含む、方法。
【請求項９】
i)前記変化が減少であり、前記少なくとも一種のバイオマーカーが、表1a及び/又は表2aに挙げるバイオマーカーから選択される、又は
ii)前記変化が増加であり、前記少なくとも一種のバイオマーカーが、表1b及び/又は表2bに挙げるバイオマーカーから選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療が、インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、アザチオプリン、シクロホスファミド、酢酸ガラティラメル、免疫グロブリンメトトレキセート、ミトキサントロン、ロイスタチン、IVIg、ナタリズマブ、テリフルノミド、スタチン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、スフィンゴシン1リン酸アンタゴニストフィンゴリモド(FTY720)、クラドリビン、フマレート、ラキニモド、B細胞に作用する薬物並びにアンチセンス薬剤及びCD49dに対する薬剤からなる群から選択される少なくとも一種の薬物の投与を含む、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
対象において、多発性硬化症の活性状態を診断する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、表3に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより多発性硬化症が診断されることになるステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
i)前記少なくとも一種のバイオマーカーが、表3aに挙げるバイオマーカーの群から選択され、前記少なくとも一種のバイオマーカーの増加が、多発性硬化症の活性状態の指標となる、又は
ii)前記少なくとも一種のバイオマーカーが、表3bに挙げるバイオマーカーの群から選択され、前記少なくとも一種のバイオマーカーの減少が、多発性硬化症の活性状態の指標となる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照量が、多発性硬化症の安定状態を呈する対象又は対象群から得られる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
対象が、多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうか予測する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより対象が多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうかが予測されるステップとを含む、方法。
【請求項１５】
対象が、多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、表3に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測されるステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断法の分野に関する。具体的には、本発明は、多発性硬化症を診断する方法、対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうか同定する方法又は多発性硬化症治療が奏功しているかどうか決定する方法を意図する。更に、対象における多発性硬化症の活性状態若しくは進行のリスクを診断又は予測する方法に寄与する。本発明は、診断装置など上述の方法を実施するツールにも関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症(MS)は、世界中でおよそ1,000,000人の個体が罹患し、若年成人において長期にわたる高度障害を引き起こす中枢神経系(CNS)の非常に一般的な疾患である。その病因はわかりにくいままであるが、有力な証拠は、脳及び脊髄の白質内にある自己分子に対するT細胞媒介性炎症過程がその病原性の根底にあるという概念を支持している。ミエリン反応性T細胞はMS患者と健康な個体の両方に存在するので、MSにおける原発性免疫異常は、T細胞活性化状態の増強及び厳密でない活性化要件につながる調節機構の機能不全を伴っている可能性が最も高い。従って、発症機序は、脳炎誘発性、すなわちCNS外での自己免疫ミエリン特異的T細胞の活性化、それに続く血液脳関門の開放、T細胞及びマクロファージの浸潤、ミクログリアの活性化、脱髄並びに不可逆性ニューロン損傷を含む(Aktas 2005, Neuron 46, 421〜432頁、Zamvil 2003, Neuron 38:685〜688頁又はZipp 2006, Trends Neurosci. 29, 518〜527頁)。T細胞の脳炎誘発性の原因となる機構についてはかなり知られているが、CNSへの及びCNS中での有害なリンパ球応答を調節する身体の内在性制御機構についてはいまだほとんど知られていない。加えて、T細胞媒介性脱髄に関する莫大な研究にもかかわらず、in vivoにおけるCNS内の損傷過程は十分に理解されていない。
【０００３】
現在、神経画像処理、脳脊髄液分析及び誘発電位などの診断ツールが、MSの診断に使用されている。脳及び脊椎の磁気共鳴画像により、脱髄(病変又は斑)を視覚化することができる。ガドリニウムを造影剤として静脈内投与して活性斑に印をつけ、除去することによって、評価時点では症状と関連していない過去の病変の存在を実証することができる。腰椎穿刺から採取される脳脊髄液の分析から、中枢神経系の慢性炎症の所見が得られる。脳脊髄液は、オリゴクローナルバンドについて分析することができ、オリゴクローナルバンドは、MSの人々の75〜85%に見られる炎症マーカーである(Link 2006, J Neuroimmunol. 180 (1〜2): 17〜28頁)。しかし、上述の技術のいずれも、MSだけに特異的とは限らない。従って、ほとんどの場合生検又は検死からしか、信頼性の高い診断を得られない。
【０００４】
多発性硬化症は、様々な兆候及び症状を示す中枢神経系の慢性脱髄性疾患である。臨床的症状におけるこの多様性は、患者に誤診、不要な専門医紹介及び誤解を招く情報をもたらす可能性がある。MSは、臨床的に不均一性の高い疾患なので、診断を容易にし、個々の患者における疾患の経過、治療の必要性及び治療の種類を予測するには、診断及び予後マーカーが必要である(Bielekova及びMartin 2004、Brain 127: 1463〜1478頁)。現在利用可能な治療に対する応答は、患者によって異なっており、疾患の経過から何の証拠も得られない。マーカーは、利用する薬物の選択を軽減し、更なる薬物が市場に出る場合、それは以後の年にいっそう重要になる。更に、急速に進行している患者は、どちらかといえば良性の疾患経過の患者よりも初めからより積極的に治療されるべきである。組織の損傷、具体的にはニューロン損傷マーカーは、急速な進行及びその後の障害を伴う患者においてだけ発現する又はその患者において高発現する場合がある。一方、潜在的に破壊的な副作用を伴う積極的治療を用いる患者の治療は、治療応答マーカー及び危険管理を必要とする。従って、疾患活性及び治療に対する応答のバイオマーカーは、患者の予後を決定するのに役立ち、治療の個人毎の調整を可能にすることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、MSを確実に診断する及び治療の奏功を評価する手段並びに方法が大いに求められるが、今のところ利用できない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は、対象の多発性硬化症を診断する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を参照量と比較するステップであり、それにより多発性硬化症を診断されることになるステップと
を含む方法に関する。
【０００７】
特に、本発明は、対象の多発性硬化症を診断する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより多発性硬化症を診断するステップと
を含む方法に関する。
【０００８】
本発明に従って規定する方法は、本質的に上述のステップからなる方法又は更なるステップを含む方法を含む。しかし好ましい実施形態において、本方法が、ex vivoで実施される、すなわちヒト又は動物体上で実行されない方法であることは理解されよう。本方法は、好ましくは、自動化によって支援され得る。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で使用される「診断する」という用語は、対象が疾患MSに罹患しているか否かを判定することを指す。当業者に公知であるように、そのような判定は、調査対象の100%に対して正確であることが好ましいが、通常はそうならない。しかしその用語は、対象の統計的に有意な部分を正しく判定でき、すなわち、診断できることを必要とする。ある部分が統計的に有意かどうかは、周知の様々な統計評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、Annova、Mann-Whitney検定などを使用して、当業者によってすぐに決定することができる。詳細は、Dowdy及びWearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見られる。好ましい信頼区間は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%である。p値は、好ましくは、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001である。
【００１０】
この用語は、MS又はその症状の個別診断及び患者の連続的モニタリングを含む。モニタリング、すなわちMS又は様々な時点でのそれに伴う症状の有無を診断するには、MSに罹患していることが既知である患者のモニタリング及びMSを発症するリスクがあることが既知である対象のモニタリングが含まれる。更に、モニタリングを使用して、患者の治療が奏功しているかどうか、又は特定の治療によって少なくともMSの症状を徐々に改善できているかどうか決定することもできる。
【００１１】
本明細書で使用される「MS(多発性硬化症)」という用語は、その対象において長期にわたる高度障害を引き起こす中枢神経系(CNS)の疾患に関する。MSを診断する方法は、当技術分野において周知である。具体的には、MSは、Polmanら(「revised McDonald criteria」, Ann Neurol 2005; 58:840〜846頁)に開示された基準に従って診断でき、その全開示内容に関してその全体を参照により本明細書に組み込む。MSの発症機序は、脳炎誘発性、すなわちCNS外での自己免疫ミエリン特異的T細胞の活性化、それに続く血液脳関門の開放、T細胞及びマクロファージの浸潤、ミクログリア活性化、脱髄及び不可逆性ニューロン損傷を含む。MSには統一された四つのサブタイプの定義がある。以下のそのサブタイプ定義もまた、本発明によって使用される用語に包含される:再発寛解型、二次進行型、一次進行型、及び進行再発型。再発寛解型サブタイプとは、疾患活性の新しい兆候が全くない数ヵ月間から数年間の寛解を伴う、予測不能な再発によって特徴付けられる。発作(活性状態)の間に受ける欠損は、回復する又は後遺症が残る場合がある。これは、MSに罹患している対象の85〜90%の初期の経過を表している。いわゆる良性のMSの場合、欠損は、活性状態の間に常に回復する。二次進行型MSとは、初期の再発寛解型MSを有し、その後、急性発作の間に明確な寛解期なしに進行性の神経減少が始まる。時々の再発及び軽度の寛解が現れる場合がある。疾患発症と再発寛解型から二次進行型MSへの転換との間の平均期間は、約19年である。一次進行型のサブタイプとは、初期のMS症状の後に一度も寛解しない約10〜15%の対象を表す。この型は、発症から、寛解及び好転がない、又は極稀で軽微な障害の進行によって特徴付けられる。一次進行型サブタイプの発症年齢は、他のサブタイプより後である。進行再発型MSとは、発症から、着実な神経減少があるが、明白な混合型発作もある対象を表す。この型は、全てのサブタイプで最も稀である。上述のサブタイプ群に割り当てられない非定型のMSの症例もいくつかある。本明細書で使用される「多発性硬化症」という用語は、臨床分離症候群(clinically isolated syndrome)(しばしば「CIS」とも呼ばれる)も包含する。
【００１２】
MSに関連する症状には、感覚変化(感覚減退及び感覚異常)、筋力低下、筋けいれん、運動困難、協調及びバランス困難(運動失調)、会話(構音障害)又は嚥下問題(嚥下障害)、視覚問題(眼振、視覚神経炎又は複視)、疲労、頭痛、急性又は慢性疼痛、膀胱及び腸困難が含まれる。可変量の認知障害並びにうつ病又は情緒不安定な気分の情動性症状も症状として起こる場合がある。障害の進行及び症状の重症度の主な臨床的尺度は、Expanded Disability Status Scale(EDSS)である。
【００１３】
MSの更なる症状は、当技術分野で周知であり、Stedman又はPschyremblなど医学の標準的な教科書に記載されている。
【００１４】
本発明に関連して実施される研究において、表1及び表2に示すバイオマーカーが、MSの早期診断に特に有用であることが示された。従って、本発明は、特にMSの早期診断方法、従って、MSの初期段階におけるMSの診断に関する。MSの初期段階は、MSの発症後、好ましくは3年、より好ましくは2年、更により好ましくは1年、最も好ましくは6ヵ月の期間を包含する。また好ましくは、MSの初期段階は、MSの初発の急性神経学的事象(発作)からMSの2回目の急性神経学的事象(発作)までの期間を包含する。それは、MSの初発の急性神経学的事象(発作)からMSの3回目の急性神経学的事象(発作)までの期間を更に包含することができる。神経学的事象は、好ましくは脱髄性事象を、より好ましくは炎症性脱髄性事象を指す。好ましくは、MSの初期段階にある対象は、中枢神経系に二つの病変を有する。より好ましくは、前記対象は、中枢神経系に一つの病変を有する。好ましくは、病変は、炎症を起こしている及び/又は脱髄されている中枢神経系の領域である。そのような病変は、例えばMRIによって検出できる。好ましくは、初期段階にある対象は、MSの症状も示す。好ましい症状、具体的には神経学的症状は、本明細書の他の場所に開示される。
【００１５】
本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、この明細書に規定する疾患又は効果に対する指標として機能する分子種のことを指す。前記分子種は、対象のサンプル中に見出される代謝物自体であり得る。更に、バイオマーカーは、前記代謝物から得られる分子種であってもよい。そのような場合、実際の代謝物はサンプル中で又は測定工程の間に化学修飾されることがあり、前記修飾の結果、化学的に異なる分子種、すなわち分析物が決定される分子種になる。そのような場合、分析物は、実際の代謝物を表し、それぞれの病状に対する指標と同じ可能性を有することは理解されよう。
【００１６】
更に、本発明によるバイオマーカーは、必ずしも一種の分子種に対応するわけではない。むしろ、バイオマーカーは、化合物の立体異性体又は光学異性体を含む場合がある。更に、バイオマーカーは、異性体分子の生物学的分類の異性体の合計を表すこともできる。前記異性体は、場合によっては同一の分析特性を呈することがあり、従って、後述する付随の実施例において利用される分析法を含めた様々な分析法によって区別することができない。しかし、その異性体は、少なくとも同一の合計式パラメータを共有し、従って、例えば脂質の場合、同一の鎖長並びに脂肪酸及び/又はスフィンゴ塩基部分に同数の二重結合を共有する。
【００１７】
本発明の方法に関して使用されるバイオマーカーは、好ましくはセラミドである。セラミドは、アミノアルコールで構成され、アミド結合によって単一の脂肪酸に結合している脂質分子である。スフィンゴシン(2-アミノオクタデカ-4-エン-1,3-ジオール)。好ましくは、アミノアルコールは、スフィンゴシン(2-アミノオクタデカ-4-エン-1,3-ジオール)、長鎖脂肪族アミンである。他のアミノアルコールはまた、例えばd16-、d17-又はd20-スフィンゴシンなど異なる鎖長を持つ「長鎖塩基」(LCB)と呼ばれ、また、それぞれの飽和アミノアルコール(ジヒドロスフィンゴシン又はスフィンガニン)を生じることができる。異なるセラミド種を記述するために使用する命名法は、「Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids」; Fahy E., Subramaniam S., Murphy R., Nishijima M., Raetz C., Shimizu T., Spener F., van Meer G., Wakelam M.、及びDennis E., Journal of Lipid Research 50, S9〜S14 (2009)に説明したように、「Lipidmaps」分類体系に従う。
【００１８】
スフィンゴシンに結合した脂肪酸は、様々な鎖長及び異なる飽和/不飽和度を有することができる。好ましいセラミドは、C21-、C22、C23又はC24セラミドである。本発明の方法に関連してバイオマーカーとして使用される特に好ましいセラミドは、本明細書において以下に並びに/又は表1及び/若しくは表2に挙げられる。
【００１９】
従って、本発明の方法に関連するセラミドは、好ましくは、セラミド(d16:1,C22:0)、セラミド(d16:1,C23:0)、セラミド(d16:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C22:0)、セラミド(d17:1,C23:0)、セラミド(d17:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C24:1)、セラミド(d18:1,C21:0)、セラミド(d18:1,C22:0)、セラミド(d18:1,C22:1)、セラミド(d18:1,C23:0)、セラミド(d18:1,C23:1)、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:1,C24:1)、セラミド(d18:2,C22:0)、セラミド(d18:2,C23:0)、セラミド(d18:2,C24:0)及びセラミド(d18:2,C24:1)からなるセラミドの群から選択される。
【００２０】
更に好ましい実施形態において、セラミドは、セラミド(d16:1,C22:0)、セラミド(d16:1,C23:0)、セラミド(d16:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C22:0)、セラミド(d17:1,C23:0)、セラミド(d17:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C24:1)、セラミド(d18:1,C21:0)、セラミド(d18:1,C22:0)、セラミド(d18:1,C22:1)、セラミド(d18:1,C23:0)、セラミド(d18:1,C23:1)、セラミド(d18:2,C22:0)、セラミド(d18:2,C23:0)、セラミド(d18:2,C24:0)及びセラミド(d18:2,C24:1)からなるセラミドの群から選択される。一実施形態において、セラミドは、セラミド(d18:1、C24:0)ではない又はセラミド(d18:1、C24:1)ではない。
【００２１】
セラミドを測定する好ましい方法は、実施例に開示されており、又は当技術分野において公知であり(例えばKasumovら、Analytical Biochemistry 401 (2010) 154〜161頁を参照のこと)、全開示内容に関して参照により本明細書に組み込む。
【００２２】
本発明による方法において、バイオマーカー、すなわち表1及び/又は表2に示すバイオマーカーの上述の群のうち少なくとも一つの代謝物が測定される。しかし、より好ましくは、判定の特異性及び/又は感度を強化するために、バイオマーカーの群を測定することができる。そのような群は、好ましくは、少なくとも二種、少なくとも三種、少なくとも四種、少なくとも五種、少なくとも十種又は最大で表に示した前記バイオマーカーの全てを含む。本明細書に記載の特定のバイオマーカーに加えて、好ましくは、本発明の方法において、他のバイオマーカーが更に測定されてもよい。
【００２３】
本発明の方法との関連で、本発明の方法のステップa)において、表1〜表3、具体的には表1及び表2に挙げる少なくとも一種のバイオマーカーの量に代えて、サンプル中のセラミドの合計量を決定することも想定される。すなわち、合計セラミド含量が決定されるものとする。ステップb)において、セラミドの前記合計量は、参照量と比較されるものとする。好ましくは、C21セラミド、C22セラミド、C23セラミド又はC24セラミドの合計量が決定される。より好ましくは、C21〜C24セラミドの合計量が決定される。好ましくは、参照と比較したセラミドの合計量の増加は、MSの診断、具体的にはMSの初期段階の診断の指標となる。
【００２４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記少なくとも一種のバイオマーカーは、表1a及び/又は表2aに挙げるバイオマーカーの群から選択される。そのようなバイオマーカーの増加は、多発性硬化症、具体的には多発性硬化症の初期段階の指標となる。好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、又は少なくとも50%の増加が、MSの診断の指標となる(高い順に優先)。バイオマーカーがセラミドの場合、同様である。セラミドの合計量がサンプル中で決定される場合も、同様である。
【００２５】
本発明の方法の好ましい別の実施形態において、前記少なくとも一種のバイオマーカーは、表1b及び/又は表2bに挙げるバイオマーカーの群から選択される。そのようなバイオマーカーの減少は、多発性硬化症、具体的には多発性硬化症の初期段階の指標となる。好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%の減少が、MSの診断の指標となる(高い順に優先)。
【００２６】
本発明の方法の好ましい実施形態において、試験しようとする対象がMSの急性期と疑われる場合、表2に示した少なくとも一種のバイオマーカーの量が決定される。MSの急性期と疑われる対象は、好ましくは、MSの急性期の症状を示し、一方、MSの急性期と疑われない対象は、好ましくは、MSの急性期の症状を示さない。
【００２７】
試験しようとする対象がMSの急性期と疑われる場合、好ましくは、少なくとも一種のバイオマーカーは、表2aに挙げるバイオマーカーの群から選択される。そのようなバイオマーカーの増加は、多発性硬化症の指標となる。好ましくは、前記増加は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%の増加(高い順に優先)である。
【００２８】
試験しようとする対象がMSの急性期と疑われる場合、好ましくは、少なくとも一種のバイオマーカーは、表2bに挙げるバイオマーカーの群から選択される。そのようなバイオマーカーの減少は、多発性硬化症の指標となる。
【００２９】
本明細書で使用される代謝物とは、前記特定の代謝物のうちの複数種の分子を上限とする、少なくとも一種の特定の代謝物の分子のことを指す。代謝物の群が複数種の化学的に異なる分子であって、各代謝物について、複数種の分子を上限とする少なくとも一種の分子が存在し得るものを意味することが更に理解されよう。本発明による代謝物は、生物などの生体材料に含まれるものを含めた全てのクラスの有機又は無機化合物を包含する。好ましくは、本発明による代謝物は、小分子化合物である。より好ましくは、複数種の代謝物が想定される場合、前記複数種の代謝物は、メタボローム(すなわち特定の時間及び特定の条件下において生物、器官、組織、体液又は細胞に含まれる代謝物の収集物)を表す。
【００３０】
代謝物とは、代謝経路の酵素基質、そのような経路の中間生成物又は代謝経路によって得られる産物などの小分子化合物である。代謝経路は、当技術分野で周知であり、種間で異なる場合がある。好ましくは、前記経路には、少なくともクエン酸回路、呼吸鎖、解糖系、糖新生、ヘキソース一リン酸経路、酸化的ペントースリン酸経路、脂肪酸の生成及びβ-酸化、尿素回路、アミノ酸生合成経路、タンパク質分解経路(プロテアソーム分解など)、アミノ酸分解経路、脂質、ポリケチド(例えばフラボノイド及びイソフラボノイドを含む)、イソプレノイド(例えば、テルペン、ステロール、ステロイド、カロチノイド、キサントフィルを含む)、炭水化物、フェニルプロパノイド及び誘導体、アルカロイド、ベンゼノイド、インドール、インドール硫黄化合物、ポルフィリン、アントシアニン、ホルモン、ビタミン、補因子(補欠分子族又は電子運搬体など)、リグニン、グルコシノレート、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、ヌクレオチド並びに関連分子(tRNA、マイクロRNA(miRNA)又はmRNAなど)の生合成又は分解経路が挙げられる。従って、小分子化合物代謝物は、好ましくは、次の化合物の種類:アルコール、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、アミン、イミン、アミド、シアン化物、アミノ酸、ペプチド、チオール、チオエステル、リン酸エステル、硫酸エステル、チオエーテル、スルホキシド、エーテル又は上述の化合物の組合せ若しくは誘導体から構成される。代謝物のうちの小分子は、正常な細胞機能、器官機能又は動物の成長、発達若しくは健康に必要な一次代謝産物である場合がある。更に、小分子代謝物には、必須の生態学的機能を有する二次代謝産物、例えば生物がその環境に適応できるようにする代謝物が更に含まれる。更に、代謝物は、前記一次及び二次代謝産物に限定されず、人工的な小分子化合物を更に包含する。前記人工的な小分子化合物は、生物に投与される又は取り込まれる、外生的に提供される小分子に由来するが、上で定義した一次又は二次代謝産物ではない。例えば、人工的な小分子化合物は、動物の代謝経路によって薬物から得られる代謝産物である場合がある。更に、代謝物は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド(RNA又はDNAなど)を更に含む。より好ましくは、代謝物は、50Da(ダルトン)〜30,000Da、最も好ましくは30,000Da未満、20,000Da未満、15,000Da未満、10,000Da未満、8,000Da未満、7,000Da未満、6,000Da未満、5,000Da未満、4,000Da未満、3,000Da未満、2,000Da未満、1,000Da未満、500Da未満、300Da未満、200Da未満、100Da未満の分子量を有する。しかし、好ましくは、代謝物は少なくとも50Daの分子量を有する。最も好ましくは、本発明よる代謝物は、50Da〜最大で1,500Daの分子量を有する。
【００３１】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、体液由来サンプル(好ましくは、血液、血漿、血清、唾液、尿又は脳脊髄液)、又は例えば、生検によって細胞、組織若しくは器官(具体的には脳及び脊椎を含めたCNS)から得られるサンプルのことを指す。より好ましくは、サンプルは、血液、血漿又は血清サンプルであり、最も好ましくは、血清又は血漿サンプルである。生体サンプルは、本明細書の他の場所に指定した対象から得られる。上述の異なる型の生体サンプルを得る技術は、当技術分野で周知である。例えば、血液サンプルは、(例えば生検によって)組織又は器官サンプルを採取するときに採血することによって得られる。
【００３２】
好ましくは、上述のサンプルは、前処理した後に本発明の方法に使用される。後でより詳細に述べるように、前記前処理は、化合物を遊離させる若しくは分離する又は過剰な物質若しくは廃棄物を取り除くのに必要な処理を含むことができる。適当な技法には、遠心分離、抽出、分画、限外濾過、タンパク質沈殿、それに続く濾過及び精製並びに/又は化合物の濃縮が含まれる。更に、化合物分析用として適切な形態又は濃度の化合物を得るために、他の前処理が実施される。例えば、本発明の方法においてガスクロマトグラフィー結合質量分析法が使用される場合、前記ガスクロマトグラフィーの前に化合物を誘導体化する必要がある。適切で必要な前処理は、本発明の方法を実施するのに使用される手段によって決まり、当業者に周知である。前述のように、前処理されたサンプルも、本発明によって使用される「サンプル」という用語に含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物及び好ましくは哺乳動物に関する。より好ましくは、対象は霊長類、最も好ましくはヒトである。好ましくは、対象は、MSに罹患していることが疑われる、すなわち疾患に関連する症状のうち一部又は全てをすでに示している場合がある。
【００３４】
本明細書で使用される「量を決定する」という用語は、本発明の方法によって、サンプル中の測定しようとするバイオマーカーの少なくとも一つの特性を測定することを指す。本発明による特性は、バイオマーカーの生化学的性質を含めた物理的及び/又は化学的性質を特徴付ける特徴である。そのような性質には、例えば、分子量、粘度、密度、電荷、回転、光学活性、色、蛍光、化学発光、元素組成、化学構造、他の化合物との反応能、生物学的リードアウト(read out)系(例えば、リポーター遺伝子の誘導)における応答誘発能などが挙げられる。前記性質の値は、特性として機能する場合があり、当技術分野で周知の技術によって決定できる。更に、本特性は、標準的な操作、例えば、乗算、除算若しくは対数計算など数学的算出によってバイオマーカーの物理的及び/又は化学的性質の値から得られるどんな特徴でもよい。最も好ましくは、少なくとも一つの特性により、前記少なくとも一種のバイオマーカー及びその量の決定並びに/又は化学的同定が可能になる。従って、好ましくは、特性値は、特性値が得られるバイオマーカーの存在量に関する情報も含む。例えば、バイオマーカーの特性値は、質量スペクトルのピークである場合がある。そのようなピークは、バイオマーカーの特質情報、すなわちm/z情報(質量/電荷比又は指数)及びサンプル中の前記バイオマーカーの存在量(すなわちそれの量)に関連する強度値を含む。
【００３５】
前述のように、好ましくは、サンプルに含まれる各バイオマーカーは、本発明によって定量的に又は半定量的に測定できる。定量的測定の場合、バイオマーカーの絶対量又は正確な量のいずれかが決定されることになり、バイオマーカーの相対量は、本明細書において上述した特性(複数可)に対して決定された値に基づいて決定されることになる。バイオマーカーの正確な量が決定できない又は決定できなくなる場合、相対量を決定できる。前記の場合、バイオマーカーの存在量が、前記バイオマーカーを第二の量で含む第二サンプルに対して増大又は減少しているかどうか決定できる。好ましい実施形態において、前記バイオマーカーを含む前記第二サンプルは、本明細書の他の場所に指定した通り算出された参照になる。従って、バイオマーカーの定量的分析には、時折バイオマーカーの半定量分析と称されるものも含まれる。
【００３６】
更に、本発明の方法において使用される測定は、好ましくは、化合物分離ステップの後に、先に規定した分析ステップを使用することを含む。好ましくは、前記化合物分離ステップにより、サンプルに含まれる代謝物の時間分解分離が得られる。従って、本発明によって使用される適当な分離技法には、好ましくは、液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー、サイズ除外又は親和性クロマトグラフィーなど全てのクロマトグラフィー分離技術が含まれる。これらの技術は、当技術分野で周知であり、当業者によってすぐに利用することができる。最も好ましくは、LC及び/又はGCが、本発明の方法によって想定されるクロマトグラフィー技術である。バイオマーカーのそのような決定に好適な装置は、当技術分野で周知である。好ましくは、質量分析法、具体的にはガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)、直接注入質量分析法又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法(FT-ICR-MS)、キャピラリー電気泳動質量分析法(CE-MS)、高速液体クロマトグラフィー結合質量分析法(HPLC-MS)、四重極質量分析法、任意の連結質量分析法(MS-MS又はMS-MS-MSなど)、誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)、熱分解質量分析法(Py-MS)、イオン移動度質量分析法又は飛行時間型質量分析法(TOF)が使用される。最も好ましくは、以下に詳述するように、LC-MS及び/又はGC-MSが使用される。前記技術は、例えば、Nissen 1995, Journal of Chromatography A, 703: 37〜57頁、米国特許第4,540,884号又は米国特許第5,397,894号に開示されており、その開示内容を参照により本明細書に組み込む。変形例として、又は質量分析技術に加えて、化合物測定には次の技術を使用することができる:核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像(MRI)、フーリエ変換赤外分析(FT-IR)、紫外分光法(UV)、屈折率(RI)、蛍光検出、放射化学検出、電気化学的検出、光散乱(LS)、分散型ラマン分光又は炎イオン化検出(FID)。これらの技術は、当業者に周知であり、すぐに利用することが
できる。本発明の方法は、好ましくは、自動化により支援されるものとする。例えば、サンプル処理又は前処理は、ロボット工学によって自動化できる。好ましくは、データ処理及び比較は、適切なコンピュータプログラム及びデータベースによって支援される。本明細書において先に記載した通り、自動化により本発明の方法を高スループット手法で使用することが可能になる。
【００３７】
更に、特定の化学的又は生物学的アッセイによって、少なくとも一種のバイオマーカーを測定することもできる。前記アッセイは、サンプル中の少なくとも一種のバイオマーカーを特異的に検出可能にする手段を含むものとする。好ましくは、前記手段は、バイオマーカーの化学構造を特異的に認識することが可能であり、他の化合物との反応能又は生物学的リードアウト系(例えば、リポーター遺伝子の誘導)における応答誘発能に基づいてバイオマーカーを特異的に同定することが可能である。バイオマーカーの化学構造を特異的に認識することが可能な手段は、好ましくは、受容体若しくは酵素などの化学構造と特異的に相互作用する抗体又は他のタンパク質である。特異的な抗体は、例えば、当技術分野で周知の方法により、バイオマーカーを抗原として使用して得ることができる。本明細書において規定する抗体には、ポリクローナルとモノクロナール抗体の両方、並びにその断片(抗原又はハプテンに結合可能な、Fv、Fab及びF(ab)2断片など)が含まれる。本発明は、所望の抗原特異性を示する非ヒトドナー抗体(donor antibody)のアミノ酸配列をヒトアクセプター抗体(acceptor antibody)の配列と組み合わせたヒト化ハイブリッド抗体も含む。更に、一本鎖抗体が包含される。ドナー配列は通常、少なくとも、ドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むことができるが、他の構造的及び/又は機能的に重要なドナー抗体のアミノ酸残基をも含む場合がある。そのようなハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法によって調製することができる。バイオマーカーを特異的に認識できる好適なタンパク質は、好ましくは、前記バイオマーカーの代謝変換に関与する酵素である。前記酵素は、基質としてバイオマーカーを使用するか、又は基質をバイオマーカーに変換するものでありうる。更に、前記抗体は、バイオマーカーを特異的に認識するオリゴペプチドを生成するための基礎として使用できる。これらのオリゴペプチドは、例えば、前記バイオマーカーに対する酵素の結合ドメイン又はポケットを含むものとする。好適な抗体及び/又は酵素に基づくアッセイには、RIA法(ラジオイムノアッセイ)、ELISA法(酵素結合抗体免疫測定法)、サンドイッチ酵素免疫試験法、電気化学発光サンドイッチ免疫測定法(ECLIA)、解離−増強型ランタニド蛍光イムノアッセイ(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immunoassay; DELFIA)又は固相免疫試験法であり得る。更に、バイオマーカーは、他の化合物と反応する能力(すなわち特異的な化学反応による)に基づいて決定することもできる。更に、バイオマーカーは、生物学的リードアウト系における応答誘発能によってサンプル中で測定することができる。生物学的応答は、サンプルに含まれるバイオマーカーの存在及び/又は量を示すリードアウトとして検出されるものとする。生物学的応答は、例えば、遺伝子発現又は細胞若しくは生物の表現型応答の誘導でありうる。好ましい実施形態において、少なくとも一種のバイオマーカーの測定(determination)は定量的プロセスであり、例えば、サンプル中にある少なくとも一種のバイオマーカーの量の決定も可能になる。
【００３８】
上述の通り、少なくとも一種のバイオマーカーの前記測定には、好ましくは、質量分析法(MS)が含まれ得る。本明細書で使用される質量分析法は、化合物、すなわち本発明によって測定しようとするバイオマーカーに対応する分子量(すなわち質量)又は質量変動の決定を可能にする全ての技術を包含する。好ましくは、本明細書で使用される質量分析法は、GC-MS、LC-MS、直接注入質量分析法、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析法、任意の連結質量分析法(MS-MS又はMS-MS-MSなど)、ICP-MS、Py-MS、TOF又は上述の技術を使用する任意の組合せ手法に関する。これらの技術を利用する方法は、当業者に周知である。更に、好適な装置は市販されている。より好ましくは、本明細書で使用される質量分析法は、LC-MS及び/又はGC-MS、すなわち前にあるクロマトグラフィー分離ステップに作動的に連結された質量分析法に関する。より好ましくは、本明細書で使用される質量分析法は、四重極MSを包含する。最も好ましくは、前記四重極MSは、以下: a)質量分析計の第一分析四重極におけるイオン化によって生じたイオンの質量/電荷指数(m/z)の選択と、b)衝突ガスが充填されており、衝突チャンバとして機能する更なる次の四重極内で加速電圧を印加することによる、ステップa)で選択したイオンのフラグメンテーションと、c)更なる次の四重極において、ステップb)のフラグメンテーションプロセスによって生じたイオンの質量/電荷指数の選択とにより実施され、その際、本方法のステップa)〜c)は少なくとも一回実施され、イオン化プロセスの結果として物質の混合物中に存在する全てのイオンの質量/電荷指数の分析が実施され、その際に、四重極には衝突ガスが充填されるが、分析の際に加速電圧は印加されない。本発明によって使用される前記の最も好ましい質量分析法に関する詳細は、WO03/073464に見られる。
【００３９】
より好ましくは、前記質量分析法は、液体クロマトグラフィー(LC)MS及び/又はガスクロマトグラフィー(GC)MSである。本明細書で使用される液体クロマトグラフィーは、液体又は超臨界相中の化合物(すなわち代謝物)の分離を可能にする全ての技術を指す。液体クロマトグラフィーは、移動相中の化合物が固定相を通過することを特徴とする。各個別の化合物には、固有の保持時間(すなわち化合物が系を通過する所要時間)があるので、化合物が異なる速度で固定相を通過するときに、時間で分離される。本明細書で使用される液体クロマトグラフィーには、HPLCも含まれる。液体クロマトグラフィーの装置は、例えばAgilent Technologies(米国)から市販されている。本発明によって利用されるガスクロマトグラフィーは、原理上、液体クロマトグラフィーと同等に作動する。しかし、固定相を通過する液体移動相中に化合物(すなわち代謝物)を有するのではなく、化合物は気体体積中に存在することになる。化合物は、固定相として固体支持材料を含有できるカラム又は固定相として機能できる若しくはそれで被覆されている壁を通過する。この場合も、各化合物は、カラムを通過するのに必要な固有の時間を有する。更に、ガスクロマトグラフィーの場合、好ましくは化合物を誘導体化した後にガスクロマトグラフィーすることが想定される。誘導体化の好適な技法は、当技術分野で周知である。好ましくは、本発明による誘導体化は、好ましくは、極性化合物のメトキシ化(methoxymation)及びトリメチルシリル化、並びに好ましくは、無極性(すなわち親油性)化合物のメチル基転移、メトキシ化及びトリメチルシリル化に関する。
【００４０】
「参照」という用語は、病状(すなわち疾患の有無)、疾患状態又は本明細書において規定される効果と関連付けられるバイオマーカーの各々の特性値のことを指す。バイオマーカーが、表1a、表2a、又は表3aに示したバイオマーカーから選択される場合、好ましくは、参照はバイオマーカーに対する閾値量であり、調査しようとするサンプル中で閾値より高い又は本質的に同一である量は、病状の存在の指標であり、一方でより低い量は、病状がないことの指標となる。バイオマーカーが、表1b、表2b、又は表3bに示したバイオマーカーから選択される場合、好ましくは、参照はバイオマーカーに対する閾値量であり、調査しようとするサンプル中で閾値より低い又は同一である量は、病状の存在の指標であり、一方でより高い量は、病状がないことの指標となる。
【００４１】
本発明の上述の方法によれば、参照は、好ましくは、MSに罹患していることが既知の対象に由来するサンプルから得られる参照量である。具体的には、参照量は、MSの初期段階にあることが既知の対象に由来するサンプルから得られる。好ましくは、本質的に同一な試験サンプル中にある少なくとも一種のバイオマーカーの量が、疾患の存在の指標となる。
【００４２】
更に、参照は、好ましくはまた、MSに罹患していないことが既知の対象、好ましくは、見かけ上健康な対象に由来する。より好ましくは、参照は、MSに罹患していないことが既知だがMS症状を示す対象(又は、前記対象の群から)から得られる。従って、前記対象は、MS様の症状を示すことがある。前記対象のMS又はMS様症状は、MS以外の神経疾患によって引き起こされることになる。好ましい症状は、本明細書の他の場所に開示される。更に、前記症状は、優先的にMS症状と類似又は同一の症状になり、感覚変化(感覚減退及び感覚異常)、筋力低下、筋けいれん、運動困難、協調及びバランス困難(運動失調)、会話(構音障害)又は嚥下問題(嚥下障害)、視覚問題(眼振、視覚神経炎又は複視)、疲労、頭痛が含まれる。参照量が上述の対象又はその群から得られる場合、参照に対して変化した、試験サンプル中に見出される少なくとも一種のバイオマーカーの量は、疾患の存在の指標となる。好ましくは、前記量は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%変化している。好ましくは、バイオマーカーが、表1a又は表2aに示されるバイオマーカーの群から選択される場合(及びバイオマーカーがセラミドである場合、又はセラミドの合計量が決定される場合)、参照と比較して試験サンプル中で増加しているバイオマーカーの量は、MSの存在の指標となる。好ましくは、バイオマーカーが、表1b又は表2bに示されるバイオマーカーの群から選択される場合、参照と比較して試験サンプル中で減少しているバイオマーカーの量は、MSの存在の指標となる。
【００４３】
算出された参照(最も好ましくは平均値又は中央値)にも、調査対象を含む個体集団の少なくとも一種のバイオマーカーの相対又は絶対量にも、同じことが準用される。本明細書の他の場所に指定した通り、集団のうちの前記個体の少なくとも一種のバイオマーカーの絶対又は相対量を決定することができる。適切な基準値、好ましくは、平均値又は中央値を算出する方法は、当技術分野において周知である。前に規定した対象の集団は、複数の対象、好ましくは、少なくとも5、10、50、100、1,000又は10,000人の対象を含むべきである。本発明の方法によって診断しようとする対象と前記複数の対象のうちの対象とが同生物種であることは理解されよう。
【００４４】
特性値と(定量的測定の場合)強度値が本質的に同一である場合、試験サンプルの量と参照量とは本質的に同一である。本質的に同一とは、二つの量の差異が、好ましくは、有意でないことを意味し、強度値が、少なくとも参照値の1〜99パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、40〜60パーセンタイルの範囲、好ましくは、参照値の50、60、70、80、90又は95パーセンタイルであることを特徴とすることになる。二つの量が本質的に同一かどうか決定するための統計的検定については、当技術分野で周知であり、本明細書の他の場所にも記載されている。
【００４５】
一方で、二つの量に関して観察される差異は、統計的に有意になものである。相対又は絶対量における差異は、好ましくは、参照値の45〜55パーセンタイル、40〜60パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、1〜99パーセンタイルの範囲を有意に外れる。好ましい変化及び倍率調節を、付随の表並びに実施例に記載する。
【００４６】
好ましくは、参照、すなわち少なくとも一種のバイオマーカーの少なくとも一つの特性の値は、データベースなど適切なデータ記憶媒体に保存され、従って、今後の判定にも利用できる。
【００４７】
「比較」という用語は、決定したバイオマーカーの量が、参照と本質的に同一か又は異なるかを決定することを指す。好ましくは、この説明の他の場所に規定した統計的技術によって決定できる観察された差異が統計的に有意な場合、バイオマーカーは参照と異なっているとみなされる。差異が統計的に有意でない場合、そのバイオマーカーの量と参照量とは本質的に同一である。上記の比較に基づいて、対象が、疾患に患っているか否かを判定できる。
【００４８】
この明細書に記載の特定のバイオマーカーにおいて、相対量の変化に関して好ましい値(すなわち調節「倍率」)又は調節の種類(すなわち「上方」若しくは「下方」調節の結果、より高い若しくはより低い相対及び/又は絶対量が得られる)を、以下の表及び実施例において示す。対象において所与のバイオマーカーが「上方調節」されていることが、前記表で示される場合、相対及び/又は絶対量は増加していることになり、「下方調節」されている場合、バイオマーカーの相対及び/又は絶対量は減少していることになる。「上方」調節の場合、中央値の比は1.0を超えることになり、「下方」調節の場合、1.0以下になる。更に、「倍率」変化は増減の程度を示し、例えば、2倍の増加とは、一つの群(例えば、MS群)の中央値が他の群(例えば、参照群)のバイオマーカーの中央値の2倍であることを意味する。従って、調節の方向は、同様に表から得られる。
【００４９】
好ましくは、比較は自動化によって支援される。例えば、二つの異なるデータセット(例えば、特性値(複数可)を含むデータセット)を比較するためのアルゴリズムを含む適切なコンピュータプログラムを使用できる。そのようなコンピュータプログラム及びアルゴリズムは、当技術分野で周知である。上記にもかかわらず、比較は、手作業で実施することもできる。
【００５０】
好都合にも、上記特定のバイオマーカーの量がMSの指標となることが、本発明の基礎的研究において判明した。従って、サンプル中の上で指定した少なくとも一種のバイオマーカーを使用して、原則として、対象がMSかどうか判定できる。これは、疾患の効果的な診断並びにMSの前臨床及び臨床管理の改善、並びに患者の効果的なモニタリングに特に有用である。更に、以下で詳細に記載するように、本発明の基礎的な発見により、MSに対する効果的な薬物療法の開発も容易になる。
【００５１】
上で行った用語の定義及び説明は、本明細書で以下に特に指定したものを除いて、必要な変更を加えて本発明の以下の実施形態に適用される。
【００５２】
更に、本発明は、i)多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症に罹患している対象とii)多発性硬化症の症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とを鑑別する方法であって、前記方法が
a)多発性硬化症の症状を示す対象のサンプルにおいて、少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を少なくとも一種の参照量と比較するステップであり、それによりi)とii)とが鑑別される方法に関する。
【００５３】
具体的には、本発明は、i)多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症に罹患している対象とii)多発性硬化症の症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とを鑑別する方法であって、前記方法が
a)多発性硬化症の症状を示す対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を少なくとも一種の参照量と比較するステップであり、それによりi)とii)とが鑑別されるステップとを含む方法に関する。
【００５４】
本明細書で使用される「鑑別する」という用語は、好ましくは、多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症に罹患している対象と多発性硬化症の症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とを区別することを意味する。従って、上述の方法により、多発性硬化症の症状を示す対象がMSに罹患しているか否かを判定可能になる。当業者に公知であるように、そのような判定は通常、示差的に診断しようとする対象の100%に対して正確であることは意図されない。しかし、その用語は、対象の統計的に有意な部分が正しく診断され得ることを必要とする。診断が正確かどうかは、当技術分野で周知の方法によって確認できる。更に、ある部分が統計的に有意かどうかは、周知の様々な統計評価ツール(例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、Mann-Whitney検定、ANOVAなど)を使用して、当業者によってすぐに決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見られる。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。
【００５５】
上述の方法の好ましい実施形態において、i)多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症の初期段階に罹患している対象とii)多発性硬化症の症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とが鑑別される。
【００５６】
「対象」という用語については、本明細書の他の場所に定義した。上述の方法によれば、好ましくは、対象はMSの症状、具体的にはMSの神経学的症状を示すことになる。MSの症状を示すが、MSに罹患していない対象は、好ましくは、MS以外の神経疾患である。好ましい疾患については、実施例の節に開示する。
【００５７】
MS症状については、本明細書の他の場所に記載した。好ましい症状には、感覚変化(感覚減退及び感覚異常)、筋力低下、筋けいれん、運動困難、協調及びバランス困難(運動失調)、会話(構音障害)又は嚥下問題(嚥下障害)、視覚問題(眼振、視覚神経炎又は複視)、疲労、頭痛が含まれる。好ましくは、MSの症状を示す対象は、頭痛、具体的には片頭痛、知覚減退、知覚異常若しくは髄膜炎又はそれらを併発することがある。
【００５８】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記少なくとも一種バイオマーカーは、表1a及び/又は表2aに挙げるバイオマーカーの群から選択される。参照と比較したそのようなバイオマーカーの増加は、好ましくは、MSの症状を示す対象がMSに罹患していることを示すが、参照と比較したそのようなバイオマーカーの変化がない量又は減少は、好ましくは、MS症状を示す対象がMSに罹患していないことを示している。バイオマーカーがセラミドの場合、同様である。セラミドの合計量がサンプル中で決定される場合も、同様である。好ましい参照は、本明細書の他の場所に開示した。
【００５９】
好ましくは、上述の増加又は減少は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、又は少なくとも50%の増加/減少(高い順に優先)である。
【００６０】
本発明の方法の更に好ましい実施形態において、前記少なくとも一種のバイオマーカーは、表1b及び/又は表2bに挙げるバイオマーカーの群から選択される。参照と比較したそのようなバイオマーカーの減少は、好ましくは、MSの症状を示す対象がMSに罹患していることを示すが、参照と比較したそのようなバイオマーカーの変化がない量又は増加は、好ましくは、MSの症状を示す対象がMSに罹患していないことを示している。好ましい参照は、上に開示した。
【００６１】
試験しようとする対象がMSの急性期と疑われる場合、好ましくは、少なくとも一種のバイオマーカーは、それぞれ、表2、表2a及び表2bに挙げるバイオマーカーの群から選択される。
【００６２】
本発明は、対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうか同定する方法であって、MSを診断する上述した方法のステップと、多発性硬化症と診断される場合に多発性硬化症の治療を必要とする対象を同定する更なるステップとを含む方法にも関する。
【００６３】
本明細書で使用される「多発性硬化症の治療を必要とする」というフレーズは、対象の疾患が、MS若しくはそれに関連する症状を改善又は治療するのに治療的介入が必要か又は有益な状況にあることを意味する。従って、本発明の基礎的な研究の発見により、対象におけるMSの診断が可能になるだけでなく、MS治療によって治療されるべき対象を同定することも可能になる。一旦対象が同定されたら、本方法はMSの治療を勧告するステップを更に含むことができる。
【００６４】
本発明によって使用される多発性硬化症の治療は、好ましくは、インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、アザチオプリン、シクロホスファミド、酢酸ガラティラメル、免疫グロブリンメトトレキセート、ミトキサントロン、ロイスタチン、IVIg、ナタリズマブ、テリフルノミド、スタチン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、スフィンゴシン1リン酸アンタゴニスト(フィンゴリモド(FTY720))、クラドリビン、フマレート(fumarate)、ラキニモド、B細胞に作用する薬物、並びにアンチセンス薬剤及びCD49dに対する薬剤からなる群から選択される少なくとも一種の薬物の投与を含む又はからなる治療に関する。
【００６５】
また、本発明は、多発性硬化症治療が奏功しているかどうか決定する方法であって、
a)対象の第1及び第2サンプルにおいて、少なくとも一種のセラミド又はセラミドの合計量を決定するステップであり、前記第1サンプルが、多発性硬化症治療の開始前又は開始時に採取されたものであり、前記第2サンプルが、前記治療の開始後に採取されたものであるステップと、
b)第1サンプル中の前記少なくとも一種のセラミドの量又はセラミドの合計量を第2サンプル中の量又は合計量と比較するステップとを含む方法を意図している。
【００６６】
上述の方法との関連で、第1サンプルと比較して、第2サンプルにおいて測定された量の減少は、好ましくは、多発性硬化症治療が奏功している指標となる。第1サンプルと比較して、第2サンプルにおいて測定された量の増加は、好ましくは、多発性硬化症治療が奏功していないことを示す。好ましくは、前記増加は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、又は少なくとも50%の増加である(高い順に優先)。
【００６７】
「セラミド」という用語については、本明細書の他の場所に記載した。好ましくは、セラミドは、表1及び/又は表2に挙げるセラミドから選択される。
【００６８】
従って、本発明の方法に関連するセラミドは、好ましくは、セラミド(d16:1,C22:0)、セラミド(d16:1,C23:0)、セラミド(d16:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C22:0)、セラミド(d17:1,C23:0)、セラミド(d17:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C24:1)、セラミド(d18:1,C21:0)、セラミド(d18:1,C22:0)、セラミド(d18:1,C22:1)、セラミド(d18:1,C23:0)、セラミド(d18:1,C23:1)、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:1,C24:1)、セラミド(d18:2,C22:0)、セラミド(d18:2,C23:0)、セラミド(d18:2,C24:0)及びセラミド(d18:2,C24:1)からなるセラミドの群から選択される。
【００６９】
更に好ましい実施形態において、セラミドは、セラミド(d16:1,C22:0)、セラミド(d16:1,C23:0)、セラミド(d16:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C22:0)、セラミド(d17:1,C23:0)、セラミド(d17:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C24:1)、セラミド(d18:1,C21:0)、セラミド(d18:1,C22:0)、セラミド(d18:1,C22:1)、セラミド(d18:1,C23:0)、セラミド(d18:1,C23:1)、セラミド(d18:2,C22:0)、セラミド(d18:2,C23:0)、セラミド(d18:2,C24:0)及びセラミド(d18:2,C24:1)からなるセラミドの群から選択される。一実施形態において、セラミドは、セラミド(d18:1、C24:0)ではない又はセラミド(d18:1、C24:1)ではない。
【００７０】
更に、本発明は、多発性硬化症治療が奏功しているかどうか決定する方法であって、
a)対象の第1及び第2サンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを測定するステップであり、前記第1サンプルが、多発性硬化症治療の開始前又は開始時に採取されたものであり、前記第2サンプルが、前記治療の開始後に採取されたものであるステップと;
b)第1サンプル中の前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を第2サンプル中の量と比較するステップであり、それにより第1サンプルと比較して、第2サンプルにおいて決定された量の変化が、多発性硬化症治療が奏功している指標となるステップとを含む方法を意図する。
【００７１】
未治療の対象と比較して、MS又はその症状の少なくともいくつかを治療又は改善できる場合、MS治療が奏功することは理解されよう。更に、未治療の対象と比較して、疾患の進行を阻止又は少なくとも鈍化できる場合、治療はまた、本明細書における意味で奏功している。
【００７２】
上述の方法の好ましい実施形態において、少なくとも一種のバイオマーカーは、表1a及び/又は表2aに挙げるバイオマーカーから選択される。そのような場合、ステップb)における変化は減少である。従って、減少は、好ましくは、多発性硬化症治療が奏功していることを示す。好ましくは、前記減少は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%の減少である(高い順で優先)。バイオマーカーがセラミドの場合、同様である。セラミドの合計量がサンプル中で決定される場合も、同様である。
【００７３】
上述の方法の更に好ましい別の実施形態において、少なくとも一種のバイオマーカーは、表1b及び/又は表2bに挙げるバイオマーカーから選択される。そのような場合、ステップb)における変化は増加である。従って、増加は、好ましくは、多発性硬化症治療が奏功していることを示す。
【００７４】
本発明は、更に、対象における多発性硬化症の活性状態を診断する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、表3に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより多発性硬化症の活性状態が診断されることになるステップとを含む方法に関する。
【００７５】
上述の方法の好ましい実施形態において、前記少なくとも一種のバイオマーカーは、表3aに挙げるバイオマーカーの群から選択され、前記少なくとも一種のバイオマーカーの増加は、MSの活性状態の指標となる。好ましくは、前記増加は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%の増加である(高い順で優先)。
【００７６】
上述の方法の好ましい別の実施形態において、前記少なくとも一種のバイオマーカーは、表3bに挙げるバイオマーカーの群から選択され、前記少なくとも一種のバイオマーカーの減少は、MSの活性状態の指標となる。好ましくは、前記減少は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%の減少である(高い順で優先)。
【００７７】
好ましくは、対象におけるMSの活性状態を診断する方法は、疾患の進行をモニターするためにも利用できる。具体的には、寛解状態を示さないサンプルで特定の時間ウインドウで採取される全てのサンプルにおいて活性状態の存在を決定する場合、本方法により、疾患の進行、例えば、再発寛解型サブタイプから二次進行型サブタイプへの進行に関する指標も得られる。従って、本発明の方法によって診断できる活性状態の頻度と回数を使用して、MSの悪性度及び進行を更に診断できる。
【００７８】
本発明は、対象が多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうか予測する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を参照量と比較するステップであり、それにより対象が多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうか予測されるステップとを含む方法にも関する。
【００７９】
好ましいセラミドについては、本明細書の他の場所に記載した。好ましくは、セラミドは、表1及び/又は表2に挙げるセラミドから選択される。
【００８０】
従って、本発明の方法に関連するセラミドは、好ましくは、セラミド(d16:1,C22:0)、セラミド(d16:1,C23:0)、セラミド(d16:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C22:0)、セラミド(d17:1,C23:0)、セラミド(d17:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C24:1)、セラミド(d18:1,C21:0)、セラミド(d18:1,C22:0)、セラミド(d18:1,C22:1)、セラミド(d18:1,C23:0)、セラミド(d18:1,C23:1)、セラミド(d18:1,C24:0)、セラミド(d18:1,C24:1)、セラミド(d18:2,C22:0)、セラミド(d18:2,C23:0)、セラミド(d18:2,C24:0)及びセラミド(d18:2,C24:1)からなるセラミドの群から選択される。
【００８１】
更に好ましい実施形態において、セラミドは、セラミド(d16:1,C22:0)、セラミド(d16:1,C23:0)、セラミド(d16:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C22:0)、セラミド(d17:1,C23:0)、セラミド(d17:1,C24:0)、セラミド(d17:1,C24:1)、セラミド(d18:1,C21:0)、セラミド(d18:1,C22:0)、セラミド(d18:1,C22:1)、セラミド(d18:1,C23:0)、セラミド(d18:1,C23:1)、セラミド(d18:2,C22:0)、セラミド(d18:2,C23:0)、セラミド(d18:2,C24:0)及びセラミド(d18:2,C24:1)からなるセラミドの群から選択される。一実施形態において、セラミドは、セラミド(d18:1、C24:0)ではない又はセラミド(d18:1、C24:1)ではない。
【００８２】
更に、本発明は、対象が多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうか予測する方法であって、
a)対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであり、それにより対象が多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうか予測されるステップとを含む方法に関する。
【００８３】
本明細書で使用される「予測する」という用語は、一般に、サンプルを採取した後の特定の時間ウインドウ(すなわち予測ウインドウ)の範囲で病状又はそれに付随する症状を対象が発症する確率を決定することを指す。そのような予測が、調査対象の全員(100%)に対して正確とは限らないことは理解されよう。しかし、本予測は、対象の集団(例えば、コホート研究の対象)のうちの対象の統計的に有意な部分については正確であることが想定される。部分が統計的に有意かどうかは、本明細書の他の場所に記載の統計的技術によって決定できる。
【００８４】
対象が多発性硬化症を発症するリスクがあるかどうか予測する上述の方法の好ましい実施形態において、上述した(第1)サンプルを採取した後に採取した当該対象の一個以上の更なるサンプルに対して本方法を繰り返す。従って、最初の予測が行われた後に予測を数回繰り返すことによって、本方法の予測力を更に高めることができる。
【００８５】
更に、本発明は、対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測する方法に関する。前記方法は、
a)対象のサンプルにおいて、少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のセラミドの量、又はセラミドの合計量を参照量と比較するステップであって、それにより対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測されるステップとを含む。
【００８６】
「セラミド」という用語については、本明細書の他の場所に記載した。上述の方法と関連して、セラミドは、表3に挙げるセラミドから選択されることが特に好ましい。好ましくは、参照量と比較して、少なくとも一種のセラミドの量の増加(又は、セラミドの合計量の増加)は、多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがある対象の指標となる。
【００８７】
対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測する方法も、本発明によって想定される。前記方法は、
a)対象のサンプルにおいて、表3に挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定するステップと、
b)前記少なくとも一種のバイオマーカーの量を参照量と比較するステップであって、それにより対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測されるステップとを含むものとする。
【００８８】
更に、本発明は、対象が多発性硬化症の活性状態に対する治療を必要としているかどうかを同定する方法であって、対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあるかどうか予測するための上述した二つの方法のステップと、対象が多発性硬化症の活性状態を発症するリスクがあると予測される場合に、上記治療を必要とする対象を同定する更なるステップとを含む方法に関する。
【００８９】
本発明は、対象が、MSに罹患しているか否か、又はMSの活性状態に罹患しているか否か、又はMS若しくはその活性状態を発症するリスクがあるかどうかを診断するための補助を確立する方法であって、前記方法が、
a)前記対象のサンプルにおいて、上記の少なくとも一種のバイオマーカーの量を決定し、前記決定が、(i)前記少なくとも一種のバイオマーカーに特異的に結合する検出薬剤とサンプルとを、前記検出薬剤とサンプル由来のバイオマーカーとの複合体を形成させるのに十分な時間接触させること、(ii)形成された複合体の量を測定すること、ここで、形成された複合体の前記量がサンプル中に存在するバイオマーカーの量に比例している、(iii)形成された複合体の量を、サンプル中に存在するバイオマーカーの量を反映するバイオマーカーの量に変換すること、を含むステップと、
b)前記量を参照と比較するステップと、
c)ステップb)で作製した比較結果に基づいて、対象が、MSに罹患しているか否か、又はMSの活性状態に罹患しているか否か、又はMS若しくはその活性状態を発症するリスクがあるか否かを診断するための補助を確立するステップとを含む方法にも関し、及びこれを意図する。
【００９０】
好ましくは、好適な検出薬剤は、本発明の方法によって調査しようとする対象のサンプル中の少なくとも一種のバイオマーカーに特異的に結合する抗体でもよい。好ましくは、利用できる別の検出薬剤は、サンプル中の少なくとも一種のバイオマーカーに特異的に結合するアプタマーでもよい。更に好ましい実施形態において、検出薬剤と少なくとも一種のバイオマーカーとの間で形成された複合体からサンプルを取り除いた後に、形成された複合体の量を測定する。従って、好ましい実施形態において、検出薬剤は、固体支持体上に固定化されてもよい。更に好ましい実施形態において、洗浄溶液を利用することによって、固体支持体上に形成された複合体からサンプルを取り除くことができる。形成された複合体は、サンプル中に存在する少なくとも一種のバイオマーカーの量と比例する。利用される検出薬剤の特異性及び/又は感度が、特異的に結合可能でありサンプル中に含まれる少なくとも一種のバイオマーカーの比率の程度を規定定することは理解されよう。測定を実施できる方法に関する更なる詳細も、本明細書の他の場所にある。形成された複合体の量は、サンプル中に実際に存在する量を反映する少なくとも一種のバイオマーカーの量に変換されることになる。好ましくは、そのような量は、本質的に、サンプル中に存在する量であり得、好ましくは、形成された複合体と元々のサンプル中に存在する量との間の関係から、その一定割合の量であり得る。
【００９１】
上述の方法の更に好ましい実施形態において、ステップa)は、分析ユニット、一態様において、本明細書の他の場所に規定されている分析ユニットによって実施できる。
【００９２】
本発明の方法の好ましい実施形態において、ステップa)において決定される量は、参照と比較される。好ましくは、その参照は、本明細書の他の場所に定義される参照である。更に好ましい別の実施形態において、参照は、測定された複合体の量と元々のサンプル中に存在する量との間の比例関係を考慮する。従って、本発明の方法の好ましい実施形態において利用される参照は、使用された検出薬剤の制限を反映するように採用される人為的な参照である。別の好ましい実施形態において、例えば、決定される量の値と参照値とを実際に比較する前に、決定される量に対して正規化及び/又は補正計算ステップを含めることによって、比較を実施するときに、前記関係も考慮することができる。更にまた、決定される量に対する正規化及び/又は補正計算ステップには、使用された検出薬剤の制限が適切に反映されるような比較ステップを採用する。好ましくは、その比較は、例えば、コンピュータシステムなどによって支援されて自動的に実施される。
【００９３】
一定の確度をもって、MSに罹患している対象の群、又はMSに罹患していない対象の群のいずれかに対象を振り分けることにより、ステップb)において実施される比較に基づいて、診断するための補助が確立される。すでに本明細書の他の場所に述べたように、調査される対象の振り分けは、調査される症例の100%に対して正確なわけではない。更に、調査される対象が振り分けられる対象群は、統計的考察(すなわちそれに基づいて本発明の方法が行われる、予め選択された一定の確度)に基づいて確立される人為的な群である。従って、本方法は、一態様において、他の技術により診断を更に強化することを必要とし得る診断の補助を確立することができる。好ましくは、診断するための補助は、例えばコンピュータシステムなどによって支援されて自動的に確立される。
【００９４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、少なくとも一種のバイオマーカーの測定は、質量分析技術(好ましくはGCMS及び/又はLCMS)、NMR又は本明細書において上述した他の技術によって達成される。そのような場合、好ましくは、分析されるサンプルは、前処理される。好ましくは、前記前処理は、サンプル材料から少なくとも一種のバイオマーカーを得ることを含む(例えば、血漿若しくは血清は全血から得ることができ、又は少なくとも一種のバイオマーカーは更にサンプル材料から特異的に抽出することができる)。更にGCMSの場合、好ましくは、少なくとも一種のバイオマーカーの誘導体化など更なるサンプル前処理を必要とする。更に、好ましくは、前処理はサンプル材料の希釈及びそれに含まれる成分の濃度の調整又は正規化も含む。この目的のために、好ましくは、少なくとも一種のバイオマーカーと参照の量及び/又は分析される異なるサンプル間の量の比較を可能にする予め定めた量で、サンプルに正規化標準を添加することができる。
【００９５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記方法は、ステップc)において確定した診断の補助の結果に従って対象を勧告及び/又は管理するステップを更に含む。そのような勧告は、一態様において、生活環境、本明細書の他の場所に詳細に記載される治療手段の適用、並びに/又は定期的な疾患モニタリングの改善を目標とする生活様式及び栄養などの適応になり得る。
【００９６】
上述の方法の好ましい別の実施形態において、ステップb)及び/又はc)は、本明細書の他の場所に記載される評価ユニットによって実施される。
【００９７】
好ましい別の実施形態において、本方法は、勧告又は診断結果に従って対象を管理又は治療するステップも含む。好ましくは、前記治療は、インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、アザチオプリン、シクロホスファミド、酢酸ガラティラメル、免疫グロブリンメトトレキセート、ミトキサントロン、ロイスタチン、IVIg、ナタリズマブ、テリフルノミド、スタチン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、スフィンゴシン1リン酸アンタゴニスト(フィンゴリモド(FTY720))、クラドリビン、フマレート、ラキニモド、B細胞に作用する薬物並びにアンチセンス薬剤及びCD49dに対する薬剤からなる群から選択される少なくとも一種の薬物を治療上有効な用量で対象に投与することを包含する。
【００９８】
従って、本発明は、MSに罹患している対象においてそれを治療する方法であって、(a)本明細書の上で述べた方法を利用することにより、対象においてMS若しくはMSの活性状態を診断又は予測するステップと、(b)インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、アザチオプリン、シクロホスファミド、酢酸ガラティラメル、免疫グロブリンメトトレキセート、ミトキサントロン、ロイスタチン、IVIg、ナタリズマブ、テリフルノミド、スタチン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、スフィンゴシン1リン酸アンタゴニスト(フィンゴリモド(FTY720))、クラドリビン、フマレート、ラキニモド、B細胞に作用する薬物並びにアンチセンス薬剤及びCD49dに対する薬剤からなる群から選択される少なくとも一種の薬物を治療上有効な量で、MS若しくはMSの活性状態に罹患していると同定される又はMS若しくはMSの活性状態を発症するリスクがある対象に投与するステップとを含む方法も意図する。
【００９９】
少なくとも一種のバイオマーカーを測定する上述の方法は、装置で実行できる。本明細書で使用される装置は少なくとも上述の手段を含む。更に、本装置は、好ましくは、少なくとも一種のバイオマーカーの検出された特性(複数可)及び、好ましくはまた、決定された信号強度を比較並びに評価する手段を更に備える。本装置の手段は、好ましくは、互いに作動的に連結される。動作する方式で手段を連結する方法は、装置に含まれる手段の型によって決まる。例えば、バイオマーカーを自動で定性的又は定量的に決定する手段が利用される場合、前記自動的に動作する手段によって得られるデータは、判定を容易にするために、例えばコンピュータプログラムによって処理できる。そのような場合、好ましくは、その手段は単一装置に含まれる。従って、前記装置は、バイオマーカーに対する分析ユニット及び結果データを処理して判定するためのコンピュータユニットを含むことができる。好ましい装置は、専門臨床医の特別な知識なしに利用できる装置(例えば、サンプルのロードしか必要としない電子装置)である。
【０１００】
別法として、少なくとも一種のバイオマーカーを測定する方法は、好ましくは、互いに作動的に連結された、いくつかの装置を含むシステムにより実行できる。特に、その手段は、上で詳述した本発明の方法を実施可能にする方式で連結されなければならない。従って、本明細書で使用される、作動的に連結したとは、好ましくは、機能的に連結されたことを意味する。本発明のシステムに使用される手段に応じて、前記手段の間でデータ伝送を可能にする手段(例えばグラスファイバーケーブル及び高スループットデータ伝送用の他のケーブル)によって、各手段を他と接続することにより、前記手段を機能的に連結できる。しかも、手段の間での無線データ転送も、本発明によって想定される、例えば、LAN(ワイヤレスLAN、W-LAN)を介する。好ましいシステムは、バイオマーカーを測定する手段を含む。本明細書で使用されるバイオマーカーを測定する手段は、バイオマーカーを分離する手段(クロマトグラフィー装置など)及び代謝物を決定する手段(質量分析装置など)を包含する。好適な装置については上で詳述した。本発明のシステムにおいて使用される化合物を分離するための好ましい手段は、クロマトグラフィー装置、より好ましくは液体クロマトグラフィー、HPLC及び/又はガスクロマトグラフィー装置を含む。化合物測定のための好ましい装置は、質量分析法装置、より好ましくは、GC-MS、LC-MS、直接注入質量分析法、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析法、連結質量分析法(MS-MS又はMS-MS-MSを含める)、ICP-MS、Py-MS又はTOFを含む。分離及び測定手段は、好ましくは、互いに連結される。最も好ましくは、本明細書の他の場所に詳述したように、LC-MS及び/又はGC-MSが、本発明のシステムに使用される。バイオマーカーを測定する手段から得られる結果を比較及び/又は分析する手段も更に含まれるものとする。結果を比較及び/又は分析する手段は、少なくとも一つのデータベース及び結果を比較するために実行されるコンピュータプログラムを備えることができる。上述のシステム及び装置の好ましい実施形態については、以下にも詳述する。
【０１０１】
従って、本発明は、診断装置であって、
a)表1、表1a、表1b、表2、表2a、表2b、表3、表3a、表3bのうちいずれか一つに挙げる少なくとも一種のバイオマーカー用の検出器を備える分析ユニットであり、検出器によって検出される前記バイオマーカーの量を決定するように適合化された前記分析ユニットと、それに作動的に連結される、
b)少なくとも一種のバイオマーカーの決定された量と参照量との比較を実施するために具体的に組み込まれたコンピュータプログラムコードを含むコンピュータ及び前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースを備える評価ユニットとを含み、少なくとも一つの代謝物の比較結果が、表1、表1a、表1b、表2、表2a、表2b、表3、表3a若しくは表3bのうちいずれか一つにある少なくとも一種のバイオマーカーのそれぞれに関して示した調節の種類及び/又は調節倍率と本質的に同一である場合に、対象における多発性硬化症、対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうか若しくは多発性硬化症の奏功が同定され、i)多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症に罹患している対象とii)多発性硬化症の症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とが鑑別される診断装置に関する。
【０１０２】
好ましい実施形態において、本発明は、診断装置であって、
a)表1、表1a、表2、表2a、表3若しくは表3aのうちいずれか一つに挙げる少なくとも一種のセラミド用検出器、又はセラミド用の検出器を備える分析ユニットであり、検出器によって検出される前記少なくとも一種のセラミドの量を決定するように適合された前記分析ユニットと、それに作動的に連結される;
b)少なくとも一種のバイオマーカーの決定された量と参照量との比較を実施するために具体的に組み込まれたコンピュータプログラムコードを含むコンピュータ及び前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースを備える評価ユニットであり、少なくともセラミドの比較結果が、表1、表1a、表2、表2a、表3若しくは表3aのうちいずれか一つにある少なくとも一種のセラミドのそれぞれに関して示した調節の種類及び/又は調節の倍率と本質的に同一である場合に、対象における多発性硬化症、対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうか若しくは多発性硬化症の奏功が同定され、それにより、i)多発性硬化症の症状を示し多発性硬化症に罹患している対象とii)多発性硬化症の症状を示すが多発性硬化症に罹患していない対象とが鑑別される、前記評価ユニットとを含む診断装置に関する。
【０１０３】
好ましい実施形態において、本装置は、表1、表1a、表1b、表2、表2a、表2b、表3、表3a、表3bのうちいずれか一つにある、少なくとも一種のバイオマーカーのそれぞれに関して示した調節の種類及び/又は調節値の倍率を含む更なるデータベースと、決定された調節の種類及び/又は調節値の倍率とデータベースに含まれるそれらとの間の比較を実施するために具体的に組み込まれた更なるコンピュータプログラムコードとを含む。
【０１０４】
更に、本発明は、前述した病状又は効果(すなわち、対象における多発性硬化症の診断、対象が多発性硬化症の治療を必要としているかどうかの同定、又は多発性硬化症治療が奏功しているかどうかの決定)の指標となる少なくとも一種のバイオマーカーの特性値を含むデータコレクションに関する。
【０１０５】
「データコレクション」という用語は、物理的及び/又は論理的に一緒に分類できるデータの収集物のことを指す。従って、データコレクションは、単一のデータ記憶媒体又は互いに作動的に連結されている物理的に分離されたデータ記憶媒体において実装され得る。好ましくは、データコレクションは、データベースを用いて実装される。従って、本明細書で使用されるデータベースは、適切な記憶媒体上へのデータ収集を含む。更に、データベースは、好ましくは、データベース管理システムを更に含む。好ましくは、データベース管理システムは、ネットワーク基盤の、階層的又はオブジェクト指向データベース管理システムである。更に、データベースは、連合又は集積データベースであってもよい。より好ましくは、データベースは、分散(連合)型システム、例えばクライアントサーバシステムとして実装できる。より好ましくは、データベースは、検索アルゴリズムによって試験データセットをデータコレクションに含まれるデータセットと比較できるように構築される。具体的には、そのようなアルゴリズムを使用することにより、前述の病状又は効果の指標となる類似又は同一のデータセットについてデータベースを検索する(例えばクエリー検索)ことができる。従って、同一又は類似のデータセットをデータコレクションの中で同定できる場合、試験データセットは、前記病状又は効果に関連していることになる。結果的に、データコレクションから得られる情報は、例えば、上述の本発明の方法の参照として使用できる。より好ましくは、データコレクションは、上に記載した群のうちいずれか一つに含まれる全ての代謝物の特性値を含む。
【０１０６】
上述の観点から、本発明は、上述のデータコレクションを含むデータ記憶媒体を包含する。
【０１０７】
本明細書で使用される「データ記憶媒体」という用語は、単一の物理的実体(CD、CD-ROM、ハードディスク、光学式記憶媒体又はディスケットなど)に基づくデータ記憶媒体を包含する。更に、その用語は、上述のデータコレクションを提供する方法で、好ましくは、クエリー検索に好適な方法で、互いに作動的に連結された物理的に分離された実体からなるデータ記憶媒体を更に含む。
【０１０８】
本発明は、
(a)サンプルの少なくとも一種のバイオマーカーの特性値を比較するための手段と、それに作動的に連結される、
(b)上述のデータ記憶媒体と、
を含むシステムにも関する。
【０１０９】
本明細書で使用される「システム」という用語は、互いに作動的に連結された異なる手段に関する。前記手段は、単一の装置で実行することができ、又は互いに作動的に連結された物理的に分離された装置であってもよい。バイオマーカーの特性値を比較する手段は、好ましくは、前述した比較用のアルゴリズムに基づく。データ記憶媒体は、好ましくは、上述のデータコレクション又はデータベースを含み、保存されたデータセットの各々は、上記で言及した病状又は効果の指標となる。従って、本発明のシステムは、データ記憶媒体に保存されたデータコレクションに試験データセットが含まれるかどうかを同定することを可能にする。結果的に、本発明の方法は、本発明のシステムによって実行できる。
【０１１０】
本システムの好ましい実施形態において、サンプルのバイオマーカーの特性値を決定する手段が含まれる。好ましくは、「バイオマーカーの特性値を決定するための手段」という用語は、質量分析装置、NMR装置又はバイオマーカーの化学的若しくは生物学的アッセイを実施するための装置など代謝物を測定するための上述の装置に関する。
【０１１１】
更に、本発明は、上記の群のうちいずれか一つから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを測定するための手段を含む診断手段に関する。
【０１１２】
説明の他の場所に詳細に指定した通り、「診断手段」という用語は、好ましくは、診断装置、システム又は生物学的若しくは化学的アッセイに関する。
【０１１３】
「少なくとも一種のバイオマーカーを測定するための手段」という表現は、バイオマーカーを特異的に認識できる装置又は薬剤のことを指す。好適な装置は、質量分析、NMR装置又はバイオマーカーの化学的若しくは生物学的アッセイを実施するための装置などの分光装置であり得る。好適な薬剤は、バイオマーカーを特異的に検出する化合物であり得る。本明細書で使用される検出は、二段階工程であってよく、すなわち化合物は最初に、検出されようとするバイオマーカーに特異的に結合し、その後検出可能な信号(例えば、蛍光信号、化学発光信号、放射性信号など)を生成することができる。検出可能な信号を生成するには、更なる化合物が必要な場合があり、その化合物は、「少なくとも一種のバイオマーカーを測定するための手段」という用語に全て含まれる。バイオマーカーに特異的に結合する化合物については、本明細書の他の場所に詳細に記載しており、好ましくは、酵素、抗体、リガンド、受容体又はバイオマーカーに特異的に結合する他の生体分子若しくは化学物質が含まれる。
【０１１４】
更に、本発明は、上記の群のうちいずれか一つから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを含む診断用組成物に関する。
【０１１５】
上述の群のうちいずれかから選択される少なくとも一種のバイオマーカーは、バイオマーカー、すなわち本明細書の他の場所に記載の対象における病状又は効果に対する指示分子として機能できる。従って、本明細書に記載の手段によって、代謝物分子自身が、好ましくは、可視化又は検出における診断用組成物として機能することができる。従って、本発明によるバイオマーカーの存在を示す診断用組成物は、前記バイオマーカーを物理的に含むこともでき、例えば、抗体と検出されるべき代謝物との複合体は、診断用組成物として機能することができる。従って、この説明の他の場所に指定した通り、診断用組成物は、代謝物の検出手段を更に含むことができる。別法として、検出手段(MS又はNMRに基づく技術など)が使用される場合、リスク状態に対する指示薬として機能する分子種は、調査すべき試験サンプルに含まれる少なくとも一種のバイオマーカーであり得る。従って、本発明によって規定される少なくとも一種のバイオマーカーは、バイオマーカーとして同定されることにより、それ自身が診断用組成物として機能することになる。
【０１１６】
全体的に、本発明は、対象のサンプルにおいて、表1、表2、表1a、表2a、表1b若しくは表2bのうちいずれか一つに挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを多発性硬化症の診断に使用すること、対象のサンプルにおいて、表3、表3a若しくは表3bのうちいずれか一つに挙げるバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを多発性硬化症の活性状態を診断するために使用すること、又は対象のサンプルにおいて、表1及び/又は表2のバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを,多発性硬化症を予測するために使用すること、並びに対象のサンプルにおいて、表3のバイオマーカーから選択される少なくとも一種のバイオマーカーを多発性硬化症の活性状態を予測するために使用することを意図する。
【０１１７】
本明細書における全ての引用文献は、その開示内容全体に関して、又は上述した特定の開示内容に関して、参照によりこれと共に組み込む。
【０１１８】
本発明は、この発明の範囲を限定又は制限することを意図しない以下の実施例によってここに例示される。
【実施例】
【０１１９】
[実施例1]
多発性硬化症(MS)を他の神経学的症状又は疾患と鑑別診断するための研究設計
サンプルの仕様:
症例:MS(n=15)又は臨床分離症候群(clinical isolated syndrome)(CIS)(n=26)がある、新たに診断された未治療患者41名。
【０１２０】
対照:CIS若しくはMSではない異なる神経学的症状又は疾患(例えば頭痛(n=11)、知覚減退(n=10)、知覚異常(n=6))がある患者、髄膜炎患者(n=4)、及び他の症状を持つ患者(n=11)42名。
【０１２１】
他の症状がある患者のうち、1名の患者は外転神経不全麻痺と診断され、1名の患者は脚の痛みを有し、1名の患者は構音障害であり、1名の患者はエルスバーグ症候群であり、1名の患者は特発性顔面神経不全麻痺を示し、1名の患者は頭痛及び感覚減退であり、1名の患者は神経障害であり、1名の患者は偽性脳腫瘍であり、2名の患者はめまいを呈した。
【０１２２】
41名のCIS及びMS患者のうち、18名の患者には兆候又は症状に変化があった(急性発作)が、23名には臨床的変化が無かった(安定期)。
【０１２３】
実施例3において詳細に説明するように、全対象からの追加的な情報(例えば性別、年齢、BMI、サンプル採取日時、疾患状態)が、分析に使用された。
【０１２４】
遠心分離により全サンプルから血清を調製し、測定を実行するまでサンプルを-80℃に保存した。
【０１２５】
[実施例2]
代謝物の測定
ヒト血清サンプルを調製し、以下で説明するように、LC-MS/MS及びGC-MS又はSPE-LC-MS/MS(ホルモン)分析に供した:
血清からの沈殿によってタンパク質を分離した。水、及びエタノールとジクロロメタンとの混合物を添加した後、残りのサンプルを、水性、極性相と有機、親油性相とに分画した。
【０１２６】
脂質抽出物のトランスメタノール溶媒分解のために、クロロホルム140μl、塩酸(水中、HCl 37重量%)37μl、メタノール320μl及びトルエン20μlの混合物を、水分を蒸発させた抽出物に添加した。容器をしっかりと密閉し、振盪しながら100℃で2時間加熱した。その後、溶液を蒸発乾燥させた。残渣を完全に乾燥させた。
【０１２７】
しっかりと密閉した容器内でメトキシアミン塩酸塩と反応(ピリジン中、20mg/ml；100μl、60℃で1.5時間)させることにより、カルボニル基のメトキシ化(methoximation)を実施した。奇数の直鎖脂肪酸の溶液(炭素原子7〜25個の各脂肪酸0.3mg/mL及び炭素原子27、29及び31個の各脂肪酸0.6mg/mLの、3/7(v/v)ピリジン/トルエン溶液)20μlを時間標準として添加した。最後に、N-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(MSTFA)100μlを用いる誘導体化を、再びしっかりと密閉した容器中で、60℃で30分間実施した。GCへ注入する前の最終容量は、220μlであった。
【０１２８】
極性相の場合、誘導体化を以下の方法で実行した:しっかりと密閉した容器内でメトキシアミン塩酸塩と反応(ピリジン中、20mg/ml；50μl、60℃で1.5時間)させることにより、カルボニル基のメトキシ化を実施した。奇数の直鎖脂肪酸溶液(炭素原子7〜25個の各脂肪酸0.3mg/mL及び炭素原子27、29及び31個の各脂肪酸0.6mg/mLの、3/7(v/v)ピリジン/トルエン溶液)10μlを時間標準として添加した。最後に、N-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(MSTFA)50μlを用いる誘導体化を、再びしっかりと密閉した容器中で、60℃で30分間実施した。GCへ注入する前の最終容量は、110μlであった。
【０１２９】
GC-MSシステムは、Agilent 5973 MSDに接続させたAgilent 6890 GCからなる。オートサンプラは、CTC製CompiPal又はGCPalである。
【０１３０】
分析には、分析されたサンプル材料及び相分離ステップからの画分に応じて、0%〜35%までの芳香族部分を含有する異なるポリメチルシロキサン固定相を持つ通常の市販のキャピラリー分離カラム(30m×0.25mm×0.25μm)を使用した(例えば:DB-1ms、HP-5ms、DB-XLB、DB-35ms、Agilent Technologies)。1μL以下の最終容量をスプリットレス注入し、オーブン温度プログラムを、サンプル材料及び相分離ステップからの画分に応じて異なる加熱速度で70℃から始めて340℃で終え、十分な、クロマトグラフィー分離及び各分析物ピーク範囲内でのスキャン数を実現した。更に、分析にはRTL(リテンションタイムロッキング、Agilent Technologies)が使用され、通常のGC-MS標準条件、例えば名目上1〜1.7ml/分の一定流量、移動相ガスとしてヘリウムを使用し、70eVの電子衝撃によりイオン化を行い、m/z範囲15〜600、スキャン速度2.5〜3スキャン/秒及び標準的整調条件でスキャンした。
【０１３１】
HPLC-MSシステムは、API 4000質量分析計(Applied Biosystem/MDS SCIEX、Toronto、Canada)に接続させたAgilent 1100 LCシステム(Agilent Technologies、Waldbronn、Germany)からなる。HPLC分析を、C18固定相を持つ市販の逆相分離カラム上で実行した(例えばGROM ODS 7pH、Thermo Betasil C18)。蒸発させ、再構成させた極性及び親油性相の最終サンプル容量の最大10μLを注入した。200μL/分の流速でメタノール/水/ギ酸又はアセトニトリル/水/ギ酸勾配を使用する勾配溶出で、分離を実行した。
【０１３２】
多重反応モニタリング(MRM)モードを使用して、無極性画分には正モード、極性画分には陰モードでのエレクトロスプレーイオン化法、及び100〜1000amuでのフルスキャンにより質量分析法を実施した。
【０１３３】
ステロイド及びその代謝物は、オンラインSPE-LC-MS(固相抽出-LC-MS)によって測定した。カテコールアミン及びその代謝物は、Yamadaら(J. Anal.Toxicol. (26), 2002, 17〜22頁)に記載のようにして、オンラインSPE-LC-MSによって測定した。カテコールアミンと関連代謝物及びステロイドと関連代謝物両方について、定量化は安定同位体標識した標準を用いて達成され、絶対濃度を算出した。
【０１３４】
血清サンプル中の複合脂質の分析:
クロロホルム/メタノールを使用する液体/液体抽出によって、血清から全脂質を抽出した。
【０１３５】
その後順相液体クロマトグラフィー(NPLC)によって、脂質抽出物を、Christie(Journal of Lipid Research (26), 1985, 507〜512頁)に従い11個の異なる脂質群に分画した。
【０１３６】
脂質分類モノアシルグリセリド(MAG)、トリアシルグリセリド(TAG)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)は、GCで測定した。
【０１３７】
画分を、TMSH(水酸化トリメチルスルホニウム)を用いて誘導体化した後にGC-MSによって分析し、クラス分類された脂質のアシル部分に対応する脂肪酸メチルエステル(FAME)を得た。C14〜C24 FAMEの濃度は、各画分において決定する。
【０１３８】
コレステロールエステル(CE)、スフィンゴミエリン(SM)及びセラミド(CER)それぞれに対する固有の多重反応モニタリング(MRM)遷移を検出しながらエレクトロスプレーイオン化法(ESI)及び大気圧化学物質イオン化法(APCI)を使用するLC-MS/MSによって、画分を分析した。
【０１３９】
Schmidt Hら、Prostaglandins & other Lipid Mediators 81(2006), 162〜170頁に記載のようにして、固有の多重反応モニタリング(MRM)遷移を検出しながらエレクトロスプレーイオン化(ESI)を使用するLC-MS/MSによって、スフィンゴシン及びスフィンゴシン-1-リン酸(SP)を分析した。
【０１４０】
これら画分の一つから得られる表1〜表3及び/又は表1a〜表3a及び/又は表1b〜表3b中の代謝物は、下線で区切られたそれらの名前の前にそれぞれの略語を含む。
【０１４１】
エイコサノイド及び関連代謝物を、オフライン、及びオンラインSPE LC-MS/MS(固相抽出-LC-MS/MS)によって血清から測定した(Masoodi M及びNicolaou A:Rapid Commun Mass Spectrom. 2006 20(20): 3023〜3029頁)。絶対定量を、安定同位体標識した標準を用いて実行した。
【０１４２】
[実施例3]
データ分析及び統計的評価
一定分量の各サンプルから作製されるプールしたサンプル(いわゆる「プール」)を用いるランダム化した分析順序の設計において、血清サンプルを分析した。総合的な分析検証ステップの後に、各分析物の生ピークデータを、工程変動の原因となる分析順序毎にプールの中央値に対して正規化(いわゆる「プール正規化比」)した。利用できる場合には、代謝物の絶対濃度を統計分析に使用した。他の全ての場合において、プール正規化比を使用した。全てのデータを、log10変換して正規分布させた。
【０１４３】
実施例1に記載される研究の場合、年齢(数値)、BMI(数値)、性別(分類)、サンプル調製時間(数値)、並びに診断(全てのCASES(症例)(急性発作有り又は無し)、急性発作があるCASES、急性発作がないCASES及び対照-参照:対照)の因子を含むるよう、固定効果ANOVAモデルを設計した。CASESは、MS患者及びCIS患者を含む。これら因子に影響を受ける代謝物の多さの理由から、年齢、BMI及び性別といった因子の対相互作用(pairwise interaction)を考慮した。統計的有意性は、t統計のp値からリードアウトした。比較しようとする群に対して中央値の比を算出することによってコントラスト推定値を逆変換(「比=10^コントラスト_推定値」)することにより、調節の方向及び強度を比率尺度で得た。調節型は、それぞれの群(例えば急性発作が有り無しのCASES) 対 参照(対照)において増加(比>1)した場合には「上方」とし、参照に対して減少(比<1)した場合には「下方」として、各代謝物について決定した。全ての代謝物の表を、有意差(p値<0.05)で選別した。
【０１４４】
多発性硬化症のバイオマーカーを同定するために、全てのCASES(急性発作有り又は無し) 対 対照参照の比較を診断するリードアウトを検討した(表1)。多発性硬化症疾患の間の診断効果と関連する急性発作の期間をリードアウトするために、急性発作があるCASESを参照対照と比較し(表2)、更に、急性発作があるCASESと急性発作がないCASESの比較を分析した(表3)。
【０１４５】
分析結果を、以下の表にまとめる。本発明の方法によって決定されるバイオマーカーが、以下の表に挙げられる。名称によって正確に定義されないバイオマーカーについては、表4において更に特徴付けられる。
【表１】
2014517300.tif 000002
【表１ａ】
2014517300.tif 000003
【表１ｂ】
2014517300.tif 000004
【表２】
2014517300.tif 000005
【表２ａ】
2014517300.tif 000006
【表２ｂ】
2014517300.tif 000007
【表３】
2014517300.tif 000008
【表３ａ】
2014517300.tif 000009
【表３ｂ】
2014517300.tif 000010
【表４】
2014517300.tif 000011
【国際調査報告】
2014517300.tif 000012
2014517300.tif 000013
2014517300.tif 000014
2014517300.tif 000015
2014517300.tif 000016
2014517300.tif 000017
2014517300.tif 000018
2014517300.tif 000019