(57)【要約】本発明は生物技術に属し、具体的にはアネキシンＶ変異体の設計、調製方法及び応用を開示する。前記アネキシンＶ変異体は配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列に１個または複数個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を行い、且つ配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同様な活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質から誘導された蛋白質である。前記アネキシンＶ変異体の調製方法によって生産されたアネキシンＶ変異体は純度がよく、収率が高く、標識が簡単で、及び標識効率と安定性が高く且つアネキシンＶ変異体の生物学機能を影響せず、工業化生産に適用し、アネキシンＶ変異体及びその細胞アポトーシス観察試薬、病気観察薬物などの方面における応用の更なる研究のために基盤を築いた。
2014511831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンＶ変異体の一種であり、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を有し、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列に１個または複数個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加し、且つ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同様な活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の誘導体である、ことを特徴とするアネキシンＶ変異体。
【請求項２】
前記アネキシンＶのＣ末端に、柔軟性構造を有し、側鎖アミノ酸を含まない一つのショートペプチドを付加し、ショートペプチドが１〜２５個のアミノ酸残基であり、主にグリシン、アラニン、セリンなどの、側鎖を含まないアミノ酸によって構成され、且つ１〜３個のシステインを含有する、ことを特徴とする請求項１に記載のアネキシンＶ変異体。
【請求項３】
前記アネキシンＶのＣ末端に１個のシステインを付加する、ことを特徴とする請求項１に記載のアネキシンＶ変異体。
【請求項４】
アネキシンＶ変異体の調製方法において、
コンピュータ支援分子設計を使用して、アネキシンＶ結晶構造に基づいて、アネキシンＶのＣ末端に対してアミノ酸配列を付加して分子モデリング及び設計を行うステップａと、
アネキシンＶ蛋白質をコードする塩基配列を有するプライマーセットを設計し、アネキシンＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲ増幅を行うステップｂと、
ＰＣＲ電気泳動回収生成物とクローニングベクターを結合し、大腸菌コンピテントセルＴｏｐ１０に導入して培養を行うステップｃと、
制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを使用して、前記ステップＣの回収生成物及び発現ベクターｐＥＴ２８ａをそれぞれ双酵素切断し、得た２つの標的遺伝子の断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、大腸菌コンピテントセルＴｏｐ１０に導入して培養を行い、組換え発現プラスミドをスクリーニング・抽出するステップｄと、
前記組換え発現プラスミドを大腸菌の発現宿主菌に導入し、菌株を培養して菌液を得、ＩＰＴＧを使用して菌液を誘導し、菌種を収集するステップｅと、
前記ステップｅで得た菌種を拡大培養し、菌体を収集するステップｆと、
菌体を破砕し、分裂分解し、純化し、純化された後の蛋白質を収集するステップｇと、を含む、ことを特徴とするアネキシンＶ変異体の調製方法。
【請求項５】
前記プライマーセットの塩基配列が、
上流プライマーが、5’-gtt cca tgg gcg cac agg ttc tca gag gca-3’であり、
下流プライマーが、5’-tcc gct cga gtt agc agt cat ctt ctc cac aga gca-3’である、ことを特徴とする請求項４に記載のアネキシンＶ変異体の調製方法。
【請求項６】
前記ステップｇにおける純化のステップは順に、沈殿吸着、硫酸アンモニウム分画沈殿、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィー及びＳＰクロマトグラフィーである、ことを特徴とする請求項４に記載のアネキシンＶ変異体の調製方法。
【請求項７】
蛍光化学標識または核種標識を行う、ことを特徴とする細胞アポトーシスプローブとしての請求項４に記載のアネキシンＶ変異体の調製方法。
【請求項８】
細胞アポトーシス観察試薬、病気観察薬物の調製における応用である、ことを特徴とする請求項７に記載のアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスプローブとしての応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工程生物技術分野に属し、アネキシンＶ変異体と前記アネキシンＶ変異体の試薬調製及び薬学的な用途に係る。
【背景技術】
【０００２】
アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）はアネキシンＶファミリーに属し、該ファミリーは進化には高度に保守的であり、Ｃａ2+とリン脂質との結合特性を有する蛋白質である。これらは構造において同族性を有し、Ｃａ2+に調節される膜結合成分と考えられる。アネキシンファミリーの機能上の相同点は、Ｃａ2+が存在する時に、酸性リン脂質分子に対して高親和力を有することにある。ヒトを含む高等真核生物及び下等真核生物のいずれにもアネキシンファミリーのメンバーが存在していることが発見された。アネキシンメンバーが非常に多くの異なる細胞類型に存在しており、それらの生物化学作用が免疫性質と密に関係し、抗凝固、抗炎症過程、特に細胞複製、分化及び開口放出に関与する（非特許文献１、非特許文献２）。該ファミリーメンバーの生物学機能に対する更なる研究が必要である。メンバーの体内機能についてはまだ解明されていないが、アネキシンとリン脂質との結合の活性がアネキシンファミリーの体外活性の基礎であり、且つそれらの生理性質と緊密に関すると一般的に考えられている。
【０００３】
現在、アネキシンＶの応用は主にアポトーシスの検出に集中している。細胞アポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）はまた、プログラム細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，ＰＣＤ）とも呼ばれ、細胞生命周期における重要な組成部分であり、壊死及び意外死亡と違い、遺伝子によって調製制御されている能動的細胞死過程である（非特許文献３）。細胞アポトーシスは生物体が体の相対バランスを調節及び維持する重要な方式であり、複数種の病気の病理過程にも密に関わり、腫瘍の発生発展及び放射化学治療、脳と心筋細胞虚血再潅流損傷及び器官移植における拒絶反応などの過程において、細胞アポトーシス現象及びその変化が共に発見される。細胞アポトーシスは細胞が能動的に関与する自身のプログラム死亡過程であり、一連の生物分子及び細胞形態学の変化に関係し、細胞がアポトーシスを発生する時に、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が外側に反転して細胞膜外に露出する（非特許文献４）。これは細胞アポトーシスにおける早期の出来事であり、アポトーシス細胞形態学の変化の前に発生し（非特許文献５）、アポトーシスカスケードの初期事件でもあり、アポトーシス細胞の、食細胞により識別される標識であり、それによってさらに細胞質の萎縮、染色体の凝縮及び核内ＤＮＡ分解などを引き起こす。そのため、外側に反転したＰＳが現在最も多く研究され、且つ最も希望及び応用の見通しを有するアポトーシス検出ターゲットであり、アポトーシスを早期に検出でき、比較的高い時効性を有している（非特許文献６）。国内外は一般的に、ＰＳと特異的に結合する薬物を利用して、細胞アポトーシスの検出を行っている。
【０００４】
ＰＳに対して特異的な親和性を有し（非特許文献７）、アネキシンＶがアポトーシス過程になっている細胞表面に特異的に結合できるため、このように、アネキシンＶが蛍光蛋白質または放射性物質で標識した後に、アポトーシス細胞の検出に用いることができる。この方法は細胞分子生物学及び免疫学の研究に汎用されている（非特許文献８〜１２）。アネキシンＶをフルオレセイン（例えばＦＩＴＣ，ＰＥなど）またはビオチンで標識してプローブとし、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を使用して細胞アポトーシス現象を検査することは、感度の高い、効率の高い、成熟的な実験室測定方法である。但し、臨床標本に対して、血液以外に、さらに組織生検を行う必要があり、外傷性を有し、且つ操作過程においてもアポトーシスが発生しやすく、それによって、分析の結果に影響を与える。そのため、体内細胞アポトーシスの測定は新しい方法の検討が必要である。例えば、体内のアポトーシスをリアルタイムに観察するように、放射性核種を使用してアネキシンＶを標識し、体内アポトーシス現像を行い、細胞アポトーシスの生体無侵襲現像を実現し、このようなアポトーシス現像は生体細胞アポトーシスを観察する分野において大きな発展を得た。現在、放射性物質標識のアネキシンＶの、虚血性損傷の評価、同種移植後拒絶反応、及び化学治療薬物の腫瘍に対する治療効果の評価などの方面における応用は臨床試験段階に入っている（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００５】
放射性ヨウ素（*Ｉ）で蛋白質ポリペプチド類を標識することは、方法が簡便、成熟で、その元の生物活性を維持できるが、体内現像に適する123Ｉ及び124Ｉの供給が困難である。現在、99mＴｃでアネキシンＶを標識する報道が最も多い。99mＴｃの長所は半減期が６時間で、タイムリーに現像を行うことができ、患者の投与された量を小さくし、且つＭｏ／Ｔｃ発生装置によって簡易に得ることができることである。但し、99mＴｃでアネキシンＶを直接標識することは比較的難しく、標識率が低く、且つ標識の過程において一部の変性蛋白質を生成して体内におけるその放射性分布に影響を与える可能性がある（非特許文献１５）。そのため、アネキシンＶの99mＴｃ標識は間接標識をメインとし、常用の二官能性キレート剤はＮ−１−イミノ基−４−スルフヒドリル基ブチル（Ｉｍｉｎｏ）（非特許文献１６）、エチレンジアミン・システイン（ＥＣ）（非特許文献１７）、二硫化二窒素（Ｎ2Ｓ2、ＢＴＡＰとも呼ばれる）（非特許文献１８）などが例として挙げられ、ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が最も多く使用され、且つすでに臨床において試用されている（非特許文献１９〜２２）。異なる二官能性キレート剤を使用して調製した標識物の、体内における生物行為が大きく異なっており、Ｉｍｉｎｏで99mＴｃと結合して作った標識物は肝臓、腎臓及び脾臓において高い摂取を有し、且つ体内における生物半減期が比較的長く、Ｎ2Ｓ2（ＢＴＡＰ）で作った標識物は肝臓、腎臓、脾臓及び下腹において共に高い摂取を有し、ＨＹＮＩＣで作った標識物は腸管の代わりに腎臓を経由して代謝するが、腎臓及び肝臓において比較的高い放射性摂取を有し、且つ体内におけるその生物半減期が比較的長い（非特許文献２３）。また、これらの間接標識法が複雑で、生成物は純化する必要があり、試薬キットを製作しにくく、臨床での使用はある程度に制限されている。
【０００６】
最近の研究で、アネキシンＶは遺伝子組み換え発現において構造修飾された後99mＴｃで直接標識することに有利であることが示されている。例えば、張麗娜等がアネキシンＶ蛋白質のＮ末端に１０個のヒスチジンを付加した（非特許文献２４）。１０個のヒスチジンを付加したアネキシンＶ蛋白質は非常によく発現し、且つ体内外細胞アポトーシスを検出するのに比較的よい活性を有している（非特許文献２５〜２９）。Ｔａｉｔ ＪＦ等がＮ端に７個のアミノ酸を付加し、そのうち１〜２個のシステイン残基を含み、得た３種の突然変異体がそれぞれアネキシンＶ−１１６、アネキシンＶ−１１７及びアネキシンＶ−１１８と命名し（非特許文献３０、非特許文献３１）、膜と結合するそれらの活性が天然のアネキシンＶと一致しており、且つ99mＴｃ−ＨＹＮＩＣ−アネキシンＶと比較的類似する生物分布を有する（特許文献１）。３種のアネキシンＶ変異体は共に大腸菌細胞質において発現及び分離純化されることができ、生成物の収率が１０ｍｇ／Ｌである（非特許文献３２、非特許文献３３、特許文献１）。但し、組換えアネキシンＶは使用するにあたり以下の問題がある。
【０００７】
１．現在、放射線物質標識の組換えアネキシンＶは、標識効率が低いという欠点がある。同時に、標識率が低く、且つ標識過程において一部の変性蛋白質を生成することによって、体内におけるアネキシンＶの放射性分布に影響を与える。臨床実験でもアネキシンＶが主に腎臓、肝臓及び脾臓に分布することが明らかになっている（非特許文献３４）。
【０００８】
２．組換えアネキシンＶの生産方法の仕上がり量が低く、実際の使用ニーズに適しない。組換えアネキシンＶが大腸菌において発現する時に、常に封入体の形で存在するため、国外の学者は酵母で組換えアネキシンＶを発現することによってその大腸菌において発現するときに封入体を形成しやすい技術的課題を解決するように研究を行っている。たとえ国際的なアネキシンＶの研究権威である米国のＴａｉｔ ＪＦ教授の研究グループが最新の研究内容及び特許を用いてＮ末端に７つのアミノ酸を増加した３種の組換えアネキシンＶ変異体を大腸菌で発現し、純化を行ったとしても、その仕上がり率は１０ｍｇ／Ｌしかなく、実際の使用ニーズを満たすことができない。その純化過程は超音波破砕、細胞膜吸着及び解離、Ｍｏｎｏ Ｑイオン交換クロマトグラフィー（溶出溶液濃度：０．２２Ｍ ＮａＣｌ）、超ろ過及び透析を含む。一方、本発明者は１０年前の前記研究において１０個のヒスチジンを付加した１つのアネキシンＶを構築し、その標識率が顕著に向上され、且つ標識方法が簡易であった。しかし、最終仕上がり率が７．４ｍｇ／Ｌ（非特許文献３５）しかなく、発現レベル及び収率は、米国Ｔａｉｔ ＪＦ教授の研究グループが最近構築した、Ｎ末端に７個のアミノ酸を増加した３種の組換えアネキシンＶ変異体の収率と近いことから、組換えアネキシンＶの生産には厳重なボトルネックが存在していると示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，２０４，９７２号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Iwasaki A , Suda M , Nakao H , et al. Biochem, 1987, 10, p.1261
【非特許文献２】Pollard H B, Haigler HT. Biol Chem, 1990, 265, p.21207
【非特許文献３】Cohen JJ,Immunol Today, 1993, 14(3), p.126-130
【非特許文献４】Fadok VA, Voelker DR, Campbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. J Immunol, 1992, 148(7), p.2207-2216
【非特許文献５】Narula J, Strauss HW, 2003, J Nucl Med, 44(3), p.397-399
【非特許文献６】Bold RJ, Termuhlen PM, McConkey DJ, Surg Oncol, 1997, 6(3), p.133-142
【非特許文献７】Meers P, Mealy T. Biochemistry, 1993, 32(43), p.11711-11721
【非特許文献８】Koopman G, Reutelingsperger C, Kuijten GA, et al. Blood, 1994, 84(5), p.1415-1420
【非特許文献９】Vermes I, Haanen C, SteVens-Nakken H, et al. J Immunol Methods, 1995, 184(1), p.39-510
【非特許文献１０】Zhang G, Gurtu V, Kain SR, et al. Biotechniques, 1997, 23(3), p.525-531
【非特許文献１１】Vriens PW, Blankenberg FG, Stoot JH, et al. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 116(5), p.844-853
【非特許文献１２】Boldt A, Barten MJ, Weiss C, et al. Cytometry A, 2006, 69(3), p.158-160
【非特許文献１３】Watanabe H, Murata Y, Miura M, et al. Nucl Med Commun, 2006, 27(1), p.81-89
【非特許文献１４】Blankenberg FG, Kalinyak J, Liu L, et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006, 14, p.1-9
【非特許文献１５】Takei T, Kuge Y, Zhao S,et al. J Nucl Med, 2004, 45(12), p.2083-2087
【非特許文献１６】Kemerink GJ, Liem IH, Hofstra L,et al. J Nucl Med, 2001, 42(2), p.382-387
【非特許文献１７】Yang DJ, Azhdarinia A, Wu P,et al. Cancer Biother Radiopharm, 2001, 16(1), p.73-83
【非特許文献１８】Kemerink GJ, Boersma HH, Thimister PW,et al. Eur J Nucl Med, 2001, 28(9), p.1373-1378
【非特許文献１９】Penn DL, Kim C, Zhang K,et al. Nucl Med Biol, 37(1), p.29-34
【非特許文献２０】Rottey S, Slegers G, Van Belle S, et al. J Nucl Med, 2006, 47(11), p.1813-1818
【非特許文献２１】Kartachova M, Haas RL, Olmos RA, et al. Radiother Oncol, 2004, 72(3), p.333-339
【非特許文献２２】Kemerink GJ, Liu X, Kieffer D, et al. J Nucl Med, 2003, 44(6), p.947-952
【非特許文献２３】Boersma HH, Kietselaer BL, Stolk LM, et al. J Nucl Med, 2005, 46(12), p.2035-2050
【非特許文献２４】Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2000, 30(4), p.305-312
【非特許文献２５】Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2000, 30(4), p.305-312
【非特許文献２６】Ye F, Fang W, Wang F, et al. Nuclear Medicine and Biology, doi: 10. 1016 /j. nucmedbio. 2010. 11. 002
【非特許文献２７】鄭玉民、王自正、顔▲玉▼等、中華核医学雑誌，２００８，２８（６），ｐ．３７８−３８２
【非特許文献２８】宋麗萍、華子春、張欣等、中国臨床医学影像雑誌，２０１０，２１（１），ｐ．５３−５５
【非特許文献２９】宋麗萍、華子春、張欣等、中国臨床医学影像雑誌，２０１０，２１（５），ｐ．３５８−３６０
【非特許文献３０】Tait JF, Brown DS, Gibson DF, et al. Bioconjug Chem, 2000, 11(6), p.918-925
【非特許文献３１】Tait JF, Smith C, Gibson DF, Bioconjug Chem, 2002, 13(5), p.1119-1123
【非特許文献３２】Tait JF, Brown DS, Gibson DF, et al. Bioconjug Chem, 2000, 11(6), p.918-925
【非特許文献３３】Tait JF, Smith C, Gibson DF, Bioconjug Chem, 2002, 13(5), p.1119-1123
【非特許文献３４】Rottey S, Van den Bossche B, Slegers G, Van Belle S, van de Wiele C, Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2009, 53(2), p.127-32
【非特許文献３５】Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2000, 30(4), p.305-312
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在アネキシンＶ蛋白とその変異体が存在する生産及び標識の２つの方面の技術的課題を克服するため、本発明の目的はアネキシンＶ変異体とその高レベルに、量産に生産する調製方法、及び体内外細胞アポトーシス検出のプローブまたは診断薬物の調製における応用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達するため、本発明は以下の技術的解決手段によって実現される。
アネキシンＶ変異体の一種であり、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を有し、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列に１個または複数個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加し、且つ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同様な活性を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の誘導体である。
【００１３】
前記アネキシンＶ変異体は、アネキシンＶのＣ末端に、柔軟性構造を有し、側鎖アミノ酸を含まない一つのショートペプチドを付加し、ショートペプチドが１〜２５個のアミノ酸残基であり、主にグリシン、アラニン、セリンなどの、側鎖を含まないアミノ酸によって構成され、且つ１〜３個のシステインを含有するものである。
【００１４】
前記アネキシンＶ変異体は、アネキシンＶのＣ末端に１個のシステインを付加することができる。
【００１５】
前記アネキシンＶ変異体の調製方法は、
コンピュータ支援分子設計を使用して、アネキシンＶ結晶構造に基づいて、アネキシンＶのＣ末端に対してアミノ酸配列を付加して分子モデリング及び設計を行うステップａと、
アネキシンＶ蛋白質をコードする塩基配列を有するプライマーセットを設計し、アネキシンＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲ増幅を行うステップｂと、
ＰＣＲ電気泳動回収生成物とクローニングベクターを結合し、大腸菌コンピテントセルＴｏｐ１０に導入して培養を行うステップｃと、
制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを使用して、前記ステップｃの回収生成物及び発現ベクターｐＥＴ２８ａをそれぞれ双酵素切断し、得た２つの標的遺伝子の断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、大腸菌コンピテントセルＴｏｐ１０に導入して培養を行い、組換え発現プラスミドをスクリーニング・抽出するステップｄと、
前記組換え発現プラスミドを大腸菌の発現宿主菌に導入し、菌株を培養して菌液を得、ＩＰＴＧを使用して菌液を誘導し、菌種を収集するステップｅと、
前記ステップｅで得た菌種を拡大培養し、菌体を収集するステップｆと、
菌体を破砕し、分裂分解し、純化し、純化された後の蛋白質を収集するステップｇと、を含む。
【００１６】
前記アネキシンＶ変異体の調製方法は、前記プライマーセットの塩基配列が、
上流プライマー：5’-gtt cca tgg gcg cac agg ttc tca gag gca-3’であり、
下流プライマー：5’-tcc gct cga gtt agc agt cat ctt ctc cac aga gca-3’である。
【００１７】
前記アネキシンＶ変異体の調製方法は、前記ステップｇにおける純化のステップは順に、沈殿吸着、硫酸アンモニウム分画沈殿、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィー及びＳＰクロマトグラフィーである。
【００１８】
細胞アポトーシスプローブとしての前記アネキシンＶ変異体の調製方法は、蛍光化学標識または核種標識を行うことである。
【００１９】
前記アネキシンＶ変異体の細胞アポトーシスプローブとしての応用は、細胞アポトーシス観察試薬、病気観察薬物の調製における応用である。
【００２０】
調製方法は、コンピュータ支援分子設計を使用して、アネキシンＶ変異体を構築し、アネキシンＶのＣ末端に、１個または１個以上のシステインを含有する、１〜２５個のアミノ酸を結合したショートペプチドを付加するステップと、設計したアネキシンＶ変異体の遺伝子を取得するステップと、組換えプラスミドを構築するステップと、相応する組換え遺伝子工程を発現するステップと、アネキシンＶ変異体を分離純化して得るステップと、を含む。
【００２１】
本発明により開示された、体内外細胞アポトーシス検出のプローブまたは診断薬物を調製することにおけるアネキシンＶ変異体の応用は以下の技術的解決手段によってさらに実現される。得たアネキシンＶ変異体を、蛍光化学標識または核種標識を簡単に行い、それによって、体内外細胞アポトーシス検出のプローブまたは診断薬物の調製に応用する。
【００２２】
アネキシンＶ変異体のコンピュータ支援分子設計において、本発明者らはアネキシンＶ変異体に対して構造模擬及び分子設計を行ったことを利用して、アネキシンＶ変異体の結晶構造に基づいて、アネキシンＶ変異体のＣ末端にアミノ酸を付加して分子モデル構築及び分子設計を行い、Ｃ末端に付加できるアミノ酸の長さを確定する。アネキシンＶ変異体のＣ末端にシステイン残基を付加する目的はシステイン残基がカップリング反応に関与しやすく、金属イオンに対する親和性を有する特徴を利用して、組換えアネキシンＶの標識効率を向上することにある。結果、コンピュータ分子設計時に計算された２５個のアミノ酸が結合したショートペプチド内に、ショートペプチドが側鎖を含まず、柔軟性の比較的大きいアミノ酸残基、例えばグリシン、アラニン、セリンなどから構成され、且つそのうちに含有されるシステインの数量が３個より多くなければ、共にアネキシンＶの構造に対していずれの影響もしないことを発見した。且つ分子動力学により計算された側鎖を含まず、柔軟性の比較的大きい２５個のアミノ酸が結合したショートペプチド内に、ショートペプチドの長さが長いほど、アネキシンＶの構造に対する干渉が小さく、相対に言うと、長さが短すぎれば、アネキシンＶ蛋白質の構造に対してある程度の影響を与える可能性がある。それによって、アネキシンＶの、細胞アポトーシスのプローブとしてアポトーシス細胞を識別する機能に影響を与える可能性もあり、且つシステインの増加がアネキシンＶの、蛍光グループまたは核種標識を行うことに有利であるが、分子設計の結果は、システインの数量が１〜３個の範囲内に制御すべきであり、そうしないと蛋白質が重合する恐れがある。
【００２３】
前記分子設計に基づいて、本発明者らはまずアネキシンＶのＣ末端に１つのシステイン残基のみを付加する設計案を選択した。その理由は、コンピュータシミュレーションから、前記案はアネキシンＶの（蛍光または核種）化学標識に対する影響が最も大きく、または蛍光／核種化学標識後アネキシンＶの構造及びアポトーシス細胞を識別するその機能に対する影響の可能性が最も大きいからである。その他の設計案は共にアネキシンＶの分子表面とある程度の距離を有するため、比べればこの干渉及び影響が非常に小さい。
【００２４】
本発明者らは同時に、アネキシンＶのＣ末端に、アラニン−グリシン−グリシン−セリン−セリン−グリシン−グリシン−システインを含有するショートペプチドを付加したアネキシンＶ変異体、及び以上の３つの重複を含有する、グリシン−（アラニン−グリシン−グリシン−セリン−セリン−グリシン−グリシン−システイン）３、２５個のアミノ酸残基のアネキシンＶ変異体の発現を試してみて、共に類似な結果を得たため、コンピュータ分子設計の正確性を証明した。比較すれば、１個のシステインのみを付加したアネキシンＶ変異体の発現レベルが最も高く、その他の変異体の発現レベルがやや低いが、共に約６０ｍｇ／Ｌのレベルであった。
【００２５】
前記アネキシンＶ変異体の発現方法におけるＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。９４℃で５分間事前に熱変性した後、９４℃で３０秒熱変性を行い、５８℃で３０秒アニーリングし、７２℃で３０秒伸長反応させることを３０サイクル行い、７２℃で７分間伸長反応した後４℃で保存する。
【００２６】
さらに、アネキシンＶ変異体の発現方法において、組換え発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の宿主菌に導入した後、単クローンを取って３７℃で一晩振盪培養し、その後１：１００の体積でＬＢ培地に接種し、３７℃４時間誘導発現し、菌体を収集し、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析を行う。１０〜４０℃の範囲内にアネキシンＶ変異体の発現レベル及び仕上がり率は共に顕著な変化が認められなかった。
【００２７】
さらに、アネキシンＶ変異体の、前ステップにより得た菌体を、５ｍＬ緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０）に１ｇの湿潤菌体を浮遊する割合で菌体を再び浮遊させ、リゾチームを加えて菌体を処理し、１時間反応させた後濃度が６０％となるまでサッカロースを加え、その後２０倍体積（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，２０ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ９．０）の緩衝液に希釈し、遠心して上澄み液を廃棄し、沈殿を保留する。沈殿物を、５ｍＬ分解吸着液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で１ｇの沈殿を再び浮遊する割合で、沈殿を再び浮遊させ、遠心して上澄み液を取る。さらに前記得た上澄み液を硫酸アンモニア分画沈殿し、４０％〜７０％部分の沈殿を収集し、再度溶解した後透析を行い、ろ過して不溶解物を除去する。その後、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーで分離を行う。これは、初期緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０）でＳｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーカラム（日本ＴＯＳＯＨ社）を平衡化し、溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０，２００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出を行い、溶出ピークを収集する。溶出ピークを続けてＳＰクロマトグラフィーで分離する。これは、初期緩衝液（２０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，８０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ９．０）でＳＰクロマトグラフィーカラムを平衡化し、溶出緩衝液（２０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ９．０）で溶出を行い、溶出ピークを収集する。前記分離純化方法は仕上がり率を１１０ｍｇ／Ｌに達させることができ、その純度が９７％以上にも達する。
【００２８】
純化過程において、実験結果は、ＳＰカラム純化時、アネキシンＶに対して、アネキシンＶ変異体とＳＰカラムとの結合がより堅固であり、より高いイオン強度が無ければ溶出されることができないことを示した。これは１つの側面から、アネキシンＶ変異体がアネキシンＶと比べより強い金属イオン結合能力を有することを説明した。アネキシンＶ変異体がより多くのカリウムイオンと結合するためそれとＳＰカラムとの結合をより堅固にし、これは本発明者らが設計したアネキシンＶ変異体の有効性を１つの側面から証明した。
【００２９】
さらに、アネキシンＶ変異体に対して蛍光化学標識または核種標識を行った。得た標識されたアネキシンＶ変異体が体内外細胞アポトーシスの観察に用いられることができる。
【００３０】
本発明者らはアネキシンＶ及びアネキシンＶ変異体をそれぞれＦＩＴＣ蛍光標識を行い、その後細胞アポトーシスの検出に用い、結果は、ＦＩＴＣ−アネキシンＶ変異体（図３Ａ）及びＦＩＴＣ−アネキシンＶ（図３Ｂ）は共にアポトーシス細胞を識別でき、用量依存性を有するが、ＦＩＴＣ−アネキシンＶと比べ、同用量のＦＩＴＣ−アネキシンＶ変異体の信号がより強く、これは、アネキシンＶ変異体はＦＩＴＣを標識する効率がより高く、プローブ分子数が同一である場合、より高い蛍光信号を形成させることをはっきりと示した。
【００３１】
本発明者らはそれぞれ核種標識99mＴｃ−アネキシンＶ及び標識99mＴｃ−アネキシンＶ変異体を用いて、いずれの蛋白質の標識も３回重複し、アネキシンＶ変異体の標識効率が非常に安定であるが、アネキシンＶの標識効率が非常に大きく変動するため、アネキシンＶ変異体がより標識しやすい。また、99mＴｃ−アネキシンＶが３時間放置した後、比放射能が９５％で、２４時間放置した後、比放射能が６５％であるが、99mＴｃ−アネキシンＶ変異体が３時間放置した後、比放射能が９８％で、２４時間放置した後、比放射能射能が依然９０％より大きい。そのため、アネキシンＶ変異体は核種標識する時によりよい安定性を有する。本発明者らは核種標識99mＴｃ−アネキシンＶ及び標識99mＴｃ−アネキシンＶ変異体を動物体内に注射し、それらは同様な組織分布及び代謝特性を表したため、共に体内の現像検出に用いられることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の有益な効果は以下の通りである。（１）従来のアネキシンＶの基礎上にＣ末端アミノ酸配列の設計を行い、少なくとも１個のシステインを含有するショートペプチドを増加する配列変異体の設計によって、アネキシンＶのＮ末端にアミノ酸配列を付加する従来の方法と比べ、その生物学機能活性に影響しないことを基礎にして標識効率を向上することができ、同時に先進の沈殿吸着、硫酸アンモニウム分画沈殿、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィー及びＳＰクロマトグラフィーのステップを使用して蛋白質の分離純化を行い、蛋白質の仕上がり量を大幅に向上し、仕上がり量が従来の方法の１０倍以上である。（２）アネキシンＶ変異体蛋白の純度がよく、仕上がり率が高く、標識効率及び安定性が高く且つアネキシンＶ変異体の生物学機能に影響せず、工業化の生産に適し、アネキシンＶ変異体とその、細胞アポトーシス観察試薬、病気観察薬物などの方面における応用の更なる研究に基盤を築いた。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明における実施例のアネキシンＶ変異体組換え発現菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。１は、誘導発現した後の菌体総蛋白質であり、２は、菌体破砕後の発現上澄み液であり、３は、菌体破砕後の発現沈殿である。
【図２】本発明における実施例のアネキシンＶ変異体の分離純化過程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。１は、分子量標準品（上から下へそれぞれ：１１６．０、６６．２、４５．０、３５．０、２５．０、１８．４、１４．４ｋＤａ）、２は、吸着生成物であり、３と４は、硫酸アンモニウム分画沈殿生成物であり、５は、ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍクロマトグラフィー純化サンプルであり、６は、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーの通過ピークであり、７は、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーの溶出ピークであり、８は、ＳＰクロマトグラフィーの純化サンプルであり、９は、ＳＰクロマトグラフィーの通過ピークであり、１０は、ＳＰクロマトグラフィーの溶出ピークである。
【図３Ａ】本発明における実施例の組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスの検出の生物活性を比較した図であって、異なる濃度（緑：０．３６ ｎＭ；ピンク：０．１２ ｎＭ；青：０．０３６ｎＭ）の組換えアネキシンＶ変異体の細胞アポトーシスを検出したものである。
【図３Ｂ】本発明における実施例の組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスの検出の生物活性を比較した図であって、異なる濃度（緑：０．３６ ｎＭ；ピンク：０．１２ ｎＭ；青：０．０３６ｎＭ）の組換えアネキシンＶ変異体の細胞アポトーシスを検出したものである。
【図３Ｃ】本発明における実施例の組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスの検出の生物活性を比較した図であって、異なる濃度の組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体との細胞アポトーシスを検出する生物活性の比較（緑：０．３６ｎＭ；ピンク：０．１２ ｎＭ；青：０．０３６ｎＭ）をしたものである。図３Ｃ中、同じ色で、ピークの高いプローブがＦＩＴＣ−アネキシンＶ変異体である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３４】
ａ．アネキシンＶ変異体の構造模擬及び分子設計
ＳＧＩコンピュータワークステーションにおいて、ＭＳＩ社の分子設計ソフト（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒおよびその他のモジュール）を使用して、アネキシンＶの結晶構造を元に、アネキシンＶのＣ末端に対してアミノ酸を付加して分子モデル構築及び分子設計を行い、Ｃ末端に付加できるアミノ酸の長さを確定し、且つアネキシンＶのＣ末端に１個のシステインを付加したアネキシンＶ変異体を選択して次のステップを実施する基礎とする。
【００３５】
ｂ．アネキシンＶ変異体蛋白質原核生物の発現ベクターの構築
すでに公開されているアネキシンＶの遺伝子配列に基づいて上下流プライマーを設計及び化学合成し、本発明者らの実験室に保存されたヒトアネキシンＶ遺伝子を鋳型とし、ＰＣＲ法で増幅してアネキシンＶ変異体をコードするＤＮＡ配列を得た。プライマーセットの塩基配列は以下の通りである。
上流プライマーは、5’-gttccatgggcgcacaggttctcagaggca-3’であり、
下流プライマーは、5’-tccgctcgagttagcagtcatcttctccacagagca-3’である。
【００３６】
ＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
９４℃で５分間事前に熱変性した後、９４℃で３０秒熱変性し、５８℃で３０秒アニーリングし、７２℃で３０秒伸長反応させることを３０サイクル行い、７２℃で７分間伸長反応した後４℃で保存する。
【００３７】
ｃ．ＰＣＲ電気泳動回収生成物をクローニングベクターと結合し、大腸菌コンピテントセルＴｏｐ１０に導入して培養を行い、
ｄ．制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを使用して、ステップｃの回収生成物及び発現ベクターｐＥＴ２８ａをそれぞれ双酵素切断し、回収後に得たｐＥＴ２８ａベクター断片とヒトアネキシンＶ変異体ＤＮＡ断片とを１：２０の割合で混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテント菌を形質転換し、陽性クローンをスクリーニングして酵素切断確認及びＤＮＡシーケンス解析を行い、そのコードされている配列の正確性を検証する。
【００３８】
ｅ．抽出した組換え発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の発現宿主菌内に導入し、単クローンを取って３７℃で一晩振盪培養する。その後１：１００の体積でＬＢ培地に接種し、ＯＤ600が約０．６となるまで３７℃で２時間培養し、濃度が０．５ｍＭに達するまでＩＰＴＧを加え、３７℃で４時間誘導発現し、菌体を収集して１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析を行う。分析結果は図１に示される通りである。１は、誘導発現後の菌体総蛋白質であり、２は、菌体破砕後の発現上澄み液であり、３は、菌体破砕後の発現沈殿である。アネキシンＶ変異体の発現レベルが菌体総蛋白の３５．４％を占め、大部分が可溶性の形で存在する。
【００３９】
ｆ．プラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｈｉｓ−ＦＡＤＤとプラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｈｉｓ−ＦＡＤＤ（Ｆ２５Ｙ）を宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にそれぞれ導入し、発現させ、カナマイシン含有のＬＢ寒天培地に培養し、３７℃で１６時間培養する。しかる後、単クローンを取って新鮮なＬＢ液体培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシン含有）に接種し、３７℃で振盪機にて振盪培養し、培養液のＯＤ600値が約０．６に達した後、振盪機の温度を２５℃まで下げる。そして、引き続き０．５時間培養し、最終濃度が０．４ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えて目標蛋白質の発現を誘導する。２５℃で引き続き振盪培養を５時間行い、遠心して菌体を収集する。
【００４０】
ｇ．ステップｆにより得た菌液を、５ｍＬ緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０）を用いて１ｇの湿潤菌体を浮遊する割合で菌体を再び浮遊させ、リゾチームを加えて菌体を処理し、１時間反応させる。しかる後、濃度が６０％となるまでサッカロースを加え、その後２０倍体積（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，２０ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ９．０）の緩衝液に希釈し、遠心して上澄み液を廃棄し、沈殿を保留する。沈殿物を、５ｍＬ分解吸着液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で１ｇの沈殿を再び浮遊する割合で、沈殿を再び浮遊させ、遠心して上澄み液を取る。さらに前記得た上澄み液を硫酸アンモニア分画沈殿し、４０％〜７０％部分の沈殿を収集し、再度溶解した後透析を行い、ろ過して不溶解物を除去する。初期緩衝液（５０ ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０）でＳｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーカラム（日本ＴＯＳＯＨ社）を平衡化し、溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，ｐＨ９．０，２００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出を行い、溶出ピークを収集する。次いで、初期緩衝液（２０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，８０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ９．０）でＳＰクロマトグラフィーカラムを平衡化し、溶出緩衝液（２０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ９．０）で溶出を行い、溶出ピークを収集する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで各の収集液を分析する。その結果が図２に示される通りである。１は、分子量標準品（上から下へそれぞれ：１１６．０、６６．２、４５．０、３５．０、２５．０、１８．４、１４．４ ｋＤａ）であり、２は、吸着生成物であり、３と４は、硫酸アンモニウム分画沈殿生成物であり、５は、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィー純化サンプルであり、６は、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーの通過ピークであり、７は、Ｓｕｐｅｒ Ｑ−６５０Ｍクロマトグラフィーの溶出ピークであり、８は、ＳＰクロマトグラフィーの純化サンプルであり、９は、ＳＰクロマトグラフィーの通過ピークであり、１０は、ＳＰクロマトグラフィーの溶出ピークである。
【００４１】
前記純化方法を通じて９７％よりも高い純度のアネキシンＶ変異体を得、１リットルごとの発酵液を純化すると１１０ｍｇ以上のアネキシンＶ変異体を得ることができる。アネキシンＶ変異体がＳｕｐｅｒ Ｑカラム及びＳＰカラムという２種の相補性の非常に強い純化方式を通じて、不純蛋白質をほぼ全部除去でき、実験結果は、前記２ステップの純化によって、蛋白質の濃度がすでに９７％よりも高いことを示した。
【００４２】
ｈ．アネキシンＶ及びアネキシンＶ変異体のＦＩＴＣ蛍光標識
３ｍｇのアネキシンＶ及びアネキシンＶ変異体を含有する溶液を、分画分子量が１０ｋＤａであるスーパーフィルター・チューブに入れ、ｐＨ９．０の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムを使用して超ろ過を行い、遠心して上澄み液を廃棄し、さらに炭酸水素ナトリウムを加え、３回繰り返し、蛋白質濃度を測定すると、最終濃度は約５ｍｇ／ｍＬとなる。反応前に２００μＬを取り出して細胞冷凍保存チューブに入れ、撹拌する。
【００４３】
１ｍＬの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．０）を使用して２ｍｇのＦＩＴＣを溶解し、室温下で迅速に撹拌し、適量のＦＩＴＣ溶液を取り出して（ＦＩＴＣと蛋白質とのモル比を６０〜１００：１にする）、反応最終体積が２５０μＬを超えないよう、蛋白質溶液に徐々に滴下する。室温下で光を避けて２時間撹拌反応する。反応液はスーパーフィルター・チューブを用いて、ろ過液に浅緑色のＦＩＴＣ分子が認められないまでに、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液に対して超ろ過を行うと、生成物は黄橙色の透明溶液となる。得た複合体をすず箔で包装して、−２０℃の冷蔵庫に入れて保存する。
【００４４】
ｉ．組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスを検出する生物活性の比較
ヒト肺癌Ａ５４９（１．５×１０5）細胞を１００ｎｇ／ｍＬ最終濃度の組換えヒトＴＲＡＩＬによって６時間処理した後、トリプシンで酵素消化し、４℃で５分間８００ｒｐｍ遠心して細胞を収集し、各サンプルにそれぞれ４００μＬの、０．３６ ｎＭ、０．１２ ｎＭ、０．０３６ ｎＭのＦＩＴＣ標識を含有する組換えアネキシンＶまたは組換えアネキシンＶ変異体を加え、フローサイトメトリーによって細胞アポトーシスを検出する。各組換えアネキシンＶまたは組換えアネキシンＶ変異体濃度にて３回繰り返して実験を行い、標識されなかった細胞サンプルを対照とした。生物活性の対比結果は図３に示されるとおりである。図３Ａは、異なる濃度（緑：０．３６ｎＭ；ピンク：０．１２ｎＭ；青：０．０３６ｎＭ）の組換えアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスの検出を示し、図３Ｂは、異なる濃度（緑：０．３６ｎＭ；ピンク：０．１２ｎＭ；青：０．０３６ｎＭ）の組換えアネキシンＶ変異体の、細胞アポトーシスの検出を示し、図３Ｃは、異なる濃度の組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体との、細胞アポトーシスを検出する生物活性の比較（緑：０．３６ｎＭ；ピンク：０．１２ｎＭ；青：０．０３６ｎＭ）を示す。同じ色で、ピークの高いプローブがＦＩＴＣ−アネキシンＶ変異体である。
【００４５】
ｊ．アネキシンＶ及びアネキシンＶ変異体の核種標識
ＳｎＣｌ2を３．５ｍｇ取って１０ｍＬ ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液に溶解して０．３５μｇ／ｍＬのＳｎＣｌ2溶液を調製し、準備しておく。室温下で１００μＬ（３５μｇ）ＳｎＣｌ2を取り、それに対して０．６μｇ／μＬのアネキシンＶ及びアネキシンＶ変異体２０μＬをそれぞれ加え、軽く５分間振り混ぜる。それに０．１ｍＬより少ない体積の、放射量約５ｍＣｉの99mＴｃＯ4-溶液を加え、その後１０μＬ Ｖｃを滴下し、室温で３０分間静置し、標識蛋白質の放射化学純度をＨＰＬＣで測定し、９５％より高ければ使用することができる。
【００４６】
ｋ．核種標識の組換えアネキシンＶと組換えアネキシンＶ変異体の、体外安定性の測定
99mＴｃ−アネキシンＶ、99mＴｃ−アネキシンＶ変異体を室温下でそれぞれ１時間、２時間、３時間放置し、その後放射化学純度を測定した。そのほか、99mＴｃ−アネキシンＶを３時間放置した後の比放射能は９５％であり、２４時間放置した後の比放射能は６５％であるが、99mＴｃ−アネキシンＶ変異体を３時間放置した後の比放射能は９８％であり、２４時間放置した後の比放射能は依然９０％より大きい。そのため、アネキシンＶ変異体は核種標識する時によりよい安定性を有する。本発明者らは核種標識99mＴｃ−アネキシンＶ及び標識99mＴｃ−アネキシンＶ変異体を動物体内に注射し、それらは同様な組織分布及び代謝特性を表したため、共に体内の現像検出に用いられることができる。
【００４７】
以上に説明した具体的な実施例は、本発明の目的、技術的解決手段及び有益な効果に対して詳細に説明をしたが、理解すべきなのは、以上に説明したのは本発明の具体的な実施例のみであり、本発明を制限することに用いられるものではなく、本発明の主旨及び原則内に行った全ての修正、等価な取替え、改善などは、共に本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
【図１】
2014511831.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
2014511831.tif 000005
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2014511831.tif 000007
【配列表】
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【国際調査報告】
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