(57)【要約】本発明は、不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、高い生産性、高い細胞生存率および増殖速度ならびに高いバッチ間の一貫性を提供し、これらのパラメーターを変更することなくスケールアップすることができる方法に関する。本発明の第２の態様によれば、ヒト不死化ヒト血液細胞における対象とする産物の組換え産生のための方法であって、前記細胞が、対象とする産物をコードする遺伝子を含み、前記細胞が、本発明の第１の態様による方法によって培養される方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、１つまたは複数の以下の特徴を有する方法：
ａ）該懸濁物は、結果として生じる特定の電力入力が、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇとなるように、撹拌される、
ｂ）該懸濁物は、該懸濁物の限定流の気体供給を可能にするのに適した強度で撹拌される、
ｃ）該懸濁物は、結果として生じる剪断力が、少なくとも０．１Ｎ／ｍ２となるように、撹拌される、
ｄ）撹拌機が撹拌のために使用される場合、該懸濁物は、該撹拌機の先端における結果として生じる剪断速度が、少なくとも３００ｓ−１となるように、撹拌される、
ｅ）該細胞に、限定流によって少なくとも１つの気体が供給される、
ｆ）該細胞に、リアクター容積の１リットル当たり多くとも０．０５ｌ／時間の流速で少なくとも１つの気体が供給される、
ｇ）該気体供給が、０．０５ｖｖｍ以下の最大流速を有する。
【請求項２】
前記懸濁物の撹拌のための前記特定の電力入力が、少なくとも０．０１Ｗ／ｋｇであり、前記気体供給が、限定気流によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最大気体流量が、０．０５ｖｖｍ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞、またはそれに由来する細胞における、対象とする産物、好ましくは糖タンパク質の組換え産生のための方法であって、該細胞が、対象とする該産物をコードする遺伝子を含み、該細胞が、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって培養される方法。
【請求項５】
発現された対象とする前記産物が、好ましくは細胞培養培地から対象とする該産物を精製することによって、細胞培養物から得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト骨髄性白血病細胞が、Ｋ５６２細胞またはそれに由来する細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、細胞保持を伴う連続発酵（灌流）によって培養される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
連続遠心分離機が、灌流に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、培養の間に、好ましくはブリーディングによって除去される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養物中の細胞密度が、少なくとも１×１０６／ｍｌに達する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養物中の細胞生存率が、少なくとも７０％である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵が、少なくとも８０μｇ／（ｍｌｄ）、好ましくは少なくとも９０μｇ／（ｍｌｄ）の最大生産性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
撹拌機が、撹拌に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜から成る群から選択されるデバイスが、エアレーションに使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
エアレーションのために、少なくとも１種の気体のパルスが、培養プロセス中に与えられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
エアレーションによって引き起こされる気泡発生が、選ばれるエアレーション方法によって制限され、生成される該気泡が、好ましくは、＞５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍのサイズを有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
エアレーションのために、純酸素が供給される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養物中の酸素値が決定され、酸素のレベルが、所定のレベルより下に下がった場合、酸素および／または酸素を含有する気体もしくは気体混合物が、前記細胞培養培地の中にパルスとして導入される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
所定のレベルのｐＨまたはｐＨ範囲を維持するために、前記培養中に塩基が添加される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
特徴ａ）〜ｆ）のどれも含まない対応する方法に対して、細胞凝集の形成が低減する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞培養培地が、剪断保護剤を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、無血清培地中で培養される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養が、６．５〜８、好ましくは７〜７．５の間のｐＨ範囲、３０％〜５０％、好ましくは３５％〜４５％のｐＯ２、および／または３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で実行される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および／または前記細胞の産生速度が、培養容積によって実質的に影響を受けない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
発酵槽が、少なくとも１ｌ〜１０００ｌ、好ましくは１０ｌ〜２５０ｌの容積を有する細胞培養に使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記電力入力がスケールアップ基準として使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法において使用される前記培養プロセスをアップスケールするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト不死化血液細胞、好ましくは、ヒト骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞を培養するための方法、対象とする産物の組換え産生のための方法、および対象とする産物を産生させるために発酵の容積規模を変更するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特にタンパク質などの対象とする産物を産生させるために、組換え技術が広く適用される。対象とする産物は、適した宿主細胞において発現され、発現された産物は、たとえば細胞および／または細胞培養培地から得られる。
【０００３】
発酵についての基本的な考え方は、多量の所望の産物を産生させるために、様々な規模で、ある期間にわたり、最適条件下で細胞を維持することである。発酵は、原核生物（たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母（たとえばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、および哺乳動物細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０；ＳＰ２／０）などのげっ歯動物細胞系またはヒト細胞系）について共通している。最適化された培養培地に加えて、十分に制御された発酵プロセスは、哺乳動物細胞培養における生産プロセスの基本である。産生細胞系に依存して、細胞は、懸濁培養においてまたは足場依存性細胞培養用のキャリアマトリックス上のいずれかで増殖させる。小規模細胞培養は、相対的に低レベルの器具類を使用して実行される。懸濁培養については、ローラーボトルおよびスピナーフラスコがたとえば適している。小規模細胞培養は、通常、加湿二酸化炭素インキュベーター中で操作される。二酸化炭素インキュベーターにおける気体移動が、受動的な拡散に基づくので、気体移動の限界が生じ得る。薬学的産物の産生のための発酵の技術は、多数の概説、たとえば［ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＲｅｉｌｌｙ  ２００４年］、［ＳｈｕｋｌａおよびＴｈｏｅｍｍｅｓ  ２０１０年］、［Ｍａｒｋｓ  ２００３年］、および［Ｍｏｒｒｏｗ  ２００７年］が利用可能であるように、文献において広範囲に扱われている。細胞培養発酵の操作に関して、文献において記載されている、バイオリアクターについての４つの異なる基本戦略がある：バッチ、フェドバッチ、細胞の保持なしの連続発酵、および細胞保持を伴う連続発酵（灌流）。灌流が細胞の保持を包含するので、培養の間に細胞を除去する唯一のやり方は、ブリード（ｂｌｅｅｄ）（細胞懸濁物の除去）の利用である。
【０００４】
発酵パラメーターは、生産プロセスに特徴的である。それらのパラメーターの変化は、産物収量を増加または減少させ得る。バイオリアクター内部では、温度、溶存酸素、およびｐＨ値は、制御されるべき基本的なパラメーターである。最適化のための戦略は、それらのパラメーターの調整に基づく。最適化に適しているいくつかのパラメーターは、発酵の間に使用される温度、使用される酸素レベル、細胞の保持、および使用される培地の組成を包含するが、これらに限定されない。
【０００５】
その上、選ばれるエアレーション／スパージングもまた、培養プロセスのための重要な特徴になり得る。細胞培養物中で増殖する細胞は、効率的な増殖のために酸素を必要とする。小さな培養容積では、培養培地の表面を介して拡散によって細胞に達する酸素の量は、一般的に十分である。しかしながら、培養容積が増加すると、酸素を特別に追加することが必要になる。これは、スパージングによって普通は達成され、その結果、細胞培養物に供給されることとなる気体（複数可）の気泡が導入される。より大きな容器サイズが必要とされる場合、均質な気体供給はますます重大になる。しかしながら、ほとんどの哺乳動物細胞が気泡によって作り出される剪断力に対して感受性である傾向があるので、気体供給を任意に増加させることはできない。前記気泡は上記表面まで付着細胞を運び、そこで気泡は高い水力学的応力の形成下で破裂し、それによって付着細胞を死滅させる。これらの致死作用は、細胞生存率、その結果、細胞培養物の生産性を低下させ得る。より小さな培養に有用でありうる無気泡気体供給系（たとえば膜）は、スケールアップの間のより大規模な培養に用いるのには実用的ではない。この理由は、たとえば、膜の使用と関連する高コストまたは大きな容器における技術的な限界である。
【０００６】
その上、均質な細胞培養物を達成するために、懸濁物は、通常、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）によって混合される。これは、たとえば、羽根車による撹拌および気体のスパージングによって、達成することができる。撹拌については、通常、撹拌機が使用される。しかしながら、撹拌に対する制限もまたある。細胞は、通常、撹拌、たとえば撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）によって引き起こされる剪断力に対して感受性である傾向がある。そのため、撹拌によって均質性を確実にする可能性は、限られている。
【０００７】
混合に関して、２つの特別な問題がある：（ｉ）基礎溶液（ｂａｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）およびフィード溶液（ｆｅｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の添加ならびに（ｉｉ）二酸化炭素蓄積。基質レベルの濃度変動だけではなく、酸素勾配もまた、生じ得る。それらは、小さな容器よりも、大きな容器においてより共通している。不均等な分布は、容器サイズと共に増加し、ますます決定的になる。混合の主な問題は、不均質性および剪断力の間の兼ね合いである。十分な混合および非傷害性の剪断応力を確実にすることは、興味深い課題である。混合および剪断応力の両方は、異なる手段によって細胞死につながり得る。不十分な混合は、たとえば凝集または酸素制限につながり得るが、一方、剪断応力は、細胞を溶解し得る。
【０００８】
剪断力に基づく水力学的応力は、主要な細胞培養の問題である。一般的に、剪断力による損傷は、大半は、細胞系に依存する。さらに、フェドバッチまたは灌流プロセスの最大細胞密度が、プロセスおよび培地の最適化により増加するので、粘性が増加するとともに、混合がさらに要求される。撹拌タンクバイオリアクター中の水力学的応力は、不均質な現象である。全容積のわずか約１０％しか占めない羽根車領域において、７０％までのエネルギーが消費される。その結果として、剪断力もまた、細胞に対して致死的または非致死的な傷害作用を引き起こし得る羽根車に近い領域においてはるかに高くなる。水力学的応力は、細胞を溶解し得るだけではなく、それはまた、わずかに溶解性の（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）レベルで細胞に影響を与え得るが、これは、現在、十分には理解されていない。
【０００９】
これらの因子は、小規模培養に適しているかもしれない培養条件を大規模培養に容易に移すことができないという事実の一因となる。大規模培養におけるタンパク質産生の成果は、多くの場合、小規模培養のものとはかなり異なる。大規模産生の間に、非常に多くの場合、産生されるタンパク質の生産性および／または品質（たとえば糖タンパク質が組換えで産生される場合のグリコシル化構造）は、低下する。これらすべて、スケールアップは、哺乳動物細胞培養における主要な問題のままである。多くの文献が、スケールアップの概念および考察に関して、スケールアップ手順のために利用可能であるが、スケールアップは、課題のままであり、ある特定の細胞系に適した手順は、非常に多くの場合、異なる細胞系に移すことができない。
【００１０】
たとえば、療法において使用されることになっている抗体などの、対象とするグリコシル化産物を産生する場合、「ヒト」または「ヒト化」グリコシル化構造を得ることが望まれる。いくつかの技術および宿主細胞は、その目的に利用可能である。不死化ヒト血液細胞およびそれに由来する細胞系は、ヒトグリコシル化パターンを有するグリコシル化産物を組換えで産生するのに適していることが分かった。それぞれの細胞系は、たとえば特許文献１において記載されている。産物のグリコシル化は、多くの異なるパラメーターによって影響を及ぼされ得る複雑な翻訳後修飾である。これらのパラメーターは、物理的、化学的、または熱力学的な性質のものであり得る。これらのパラメーターが発酵の間に影響を及ぼされ得るので、一定の、つまり均質なグリコシル化パターンを有する産物を産生することを可能にする発酵プロセスを開発することは非常に重要である。文献において見出されるいくつかの報告がある。たとえば、剪断力、グルコース利用率、酸素飽和度、ｐＨ、温度、および他のプロセス条件がグリコシル化に影響を及ぼし得ることが報告されている非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７。
【００１１】
異なる発酵容積（規模）を使用する場合にも、許容できる収量および良好な品質を有する対象とする産物を産生することを可能にする、細胞、特に不死化ヒト血液細胞を培養するための方法を提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２８６８６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｒｙａｎ  Ｓ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｎ．  Ｋａｒｉｍ  （２００３年）、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ＣＨＯ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，  第１９巻、第４号、ｐ．１１９９−１２０９
【非特許文献２】Ｇｏｄｏｙ−Ｓｉｌｖａ，  Ｒｕｂｅｎ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｓ．  Ａ．  Ｃａｓｎｏｃｈａ，  Ｌ．  Ａ．  Ｂａｓｓ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｍａ  （２００９年）、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  第１０３巻、第６号、ｐ．１１０３−１１１７
【非特許文献３】Ｔａｃｈｉｂａｎａ，  Ｈ．，  Ｋ．  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｙ．  Ｕｓｈｉｏ，  Ｋ．  Ｔｅｒｕｙａ，  Ｋ．  Ｏｓａｄａ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｍｕｒａｋａｍｉ  （１９９４年）、Ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  第１６巻、第３号、ｐ．１５１−１５７
【非特許文献４】Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｄ．  Ｃ．  Ｊａｎ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂｕｔｌｅｒ  （１９９８年）、Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  第６２巻、第１号、ｐ．５５−７１
【非特許文献５】Ｍｕｅｔｈｉｎｇ，  Ｊｏｈａｎｎｅｓ，  Ｓ．  Ｅ．  Ｋｅｍｍｉｎｅｒ，  Ｈ．  Ｓ．  Ｃｏｎｒａｄｔ，  Ｄ．  Ｓａｇｉ，  Ｍ．  Ｎｉｍｔｚ，  Ｕ．  Ｋａｒｓｔ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｐｅｔｅｒ−Ｋａｔａｌｉｎｉｃ  （２００３年）、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐＨ  ｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｎｔｉ−ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒ２４．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  第８３巻、第３号、ｐ．３２１−３３４
【非特許文献６】Ａｈｎ，  Ｗｏｏ  Ｓｕｋ，  Ｊ．−Ｊ．  Ｊｅｏｎ，  Ｙ．−Ｒ．  Ｊｅｏｎｇ，  Ｓ．  Ｊ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｋ．  Ｙｏｏｎ  （２００８年）、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  第１０１巻、第６号、ｐ．１２３４−１２４４
【非特許文献７】Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｌ，  Ｌ．  Ａ．  Ｐａｌｏｍａｒｅｓ，  Ｖ．  Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ，  Ｏ．  Ｔ．  Ｒａｍiｒｅｚ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｓ．  Ｋｏｍｐａｌａ  （２００５年）、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，  第２１巻、第１号、ｐ．４０−４９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、中でも、細胞培養物の撹拌を増加させると、剪断力がそれに伴って増加するにもかかわらず、スケールアップの間にも良好な収量および品質を有する対象とする産物の産生を可能にする、かなり改善された培養条件がもたらされるという、驚くべき発見に基づく。治療用の使用のための糖タンパク質などの、対象とする産物を産生する場合、これは特に重要な利点である。そのような適用に関しては、異なる発酵槽容積を使用する場合の産物の品質における変化は、ＧＭＰプロセスにおいて許容されず、それぞれ、規制当局から承認を得るために必要な労力を増加させる。特に、本発明による培養方法により細胞密度および細胞生存率を改善することができることが分かった。細胞培養培地における栄養素の移送が改善され、エアレーション速度を低下させることができ、これは、気泡発生による細胞の損傷を低下させる。その上、エアレーションにより発生する気泡のサイズおよび／または量が、不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞を培養する場合に最小限に保たれる場合、培養プロセスが改善されることが分かった。
【００１５】
第１の態様によれば、不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、１つまたは複数の以下の特徴を有する方法が提供される：
ａ）前記懸濁物は、結果として生じる特定の電力入力（ｐｏｗｅｒ  ｉｎｐｕｔ）が、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇ、好ましくは少なくとも０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７５、または０．１Ｗ／ｋｇ、より好ましくは０．０１５〜０．０３の範囲、より好ましくは０．０１８〜０．０２５Ｗ／Ｋｇとなるように、撹拌される、
ｂ）前記懸濁物は、前記懸濁物の限定流（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｆｌｏｗ）の気体供給を可能にするのに適した強度で撹拌される、
ｃ）前記懸濁物は、結果として生じる剪断力が、少なくとも０．１Ｎ／ｍ２、好ましくは少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．９、１．０、１．２、１．５、または２．０Ｎ／ｍ２となるように、撹拌される、
ｄ）撹拌機が撹拌のために使用される場合、前記懸濁物は、撹拌機の先端における結果として生じる剪断速度が、少なくとも３００ｓ−１、好ましくは少なくとも５００、７００、９００、１１００、または１３００ｓ−１となるように、撹拌される、
ｅ）前記細胞に、限定流によって少なくとも１つの気体が供給される、
ｆ）前記細胞に、リアクター容積の１リットル当たり多くとも０．０５ｌ／時間、好ましくは多くとも０．０２、０．０１、または０．００５ｌ／時間の流速で少なくとも１つの気体が供給される、
ｇ）気体供給は、０．０５ｖｖｍ以下、好ましくは０．０２、０．０１、または０．００５ｖｖｍ以下の最大流速を有する。
【００１６】
本発明の第２の態様によれば、ヒト不死化ヒト血液細胞における対象とする産物の組換え産生のための方法であって、前記細胞が、対象とする産物をコードする遺伝子を含み、前記細胞が、本発明の第１の態様による方法によって培養される方法が提供される。
【００１７】
その上、本発明はまた、産物の収量および品質を維持しながら、発酵の好結果のスケールアップを可能にする方法およびツールをも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１は、１００ｒｐｍ（０．０００７Ｗ／ｋｇ）、２００ｒｐｍ（０．００６Ｗ／ｋｇ）、および３００ｒｐｍ（０．０２Ｗ／ｋｇ）の異なる電力入力を比較する、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭ（ＰａｎｋｏＭａｂ、抗ＭＵＣ１抗体）についての一組の実験の結果を示す図である。データは、生存細胞濃度（Ａ）、生産性（Ｂ）、および生存率（Ｃ）について示す。
【図１−２】図１は、１００ｒｐｍ（０．０００７Ｗ／ｋｇ）、２００ｒｐｍ（０．００６Ｗ／ｋｇ）、および３００ｒｐｍ（０．０２Ｗ／ｋｇ）の異なる電力入力を比較する、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭ（ＰａｎｋｏＭａｂ、抗ＭＵＣ１抗体）についての一組の実験の結果を示す図である。データは、生存細胞濃度（Ａ）、生産性（Ｂ）、および生存率（Ｃ）について示す。
【図２−１】図２は、連続モードにおけるＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭの細胞の保持についての、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩを使用する２つの同等の灌流操作についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）の比較を示す図である。
【図２−２】図２は、連続モードにおけるＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭの細胞の保持についての、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩを使用する２つの同等の灌流操作についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）の比較を示す図である。
【図２−３】図２は、連続モードにおけるＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭの細胞の保持についての、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩを使用する２つの同等の灌流操作についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）の比較を示す図である。
【図３−１】図３は、１ｌ、１０ｌ、および１００ｌ規模におけるスケールアップ発酵についての例示的なデータを示す図である。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭを使用する同様の条件下での３つの発酵についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）を示す。
【図３−２】図３は、１ｌ、１０ｌ、および１００ｌ規模におけるスケールアップ発酵についての例示的なデータを示す図である。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭを使用する同様の条件下での３つの発酵についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）を示す。
【図３−３】図３は、１ｌ、１０ｌ、および１００ｌ規模におけるスケールアップ発酵についての例示的なデータを示す図である。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭを使用する同様の条件下での３つの発酵についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）を示す。
【図４−１】図４は、同様の１００ｌ灌流操作の比較を示す図である。３回の繰り返しの発酵についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）を示す。
【図４−２】図４は、同様の１００ｌ灌流操作の比較を示す図である。３回の繰り返しの発酵についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）を示す。
【図４−３】図４は、同様の１００ｌ灌流操作の比較を示す図である。３回の繰り返しの発酵についての細胞増殖（Ａ）、比生産性（Ｂ）、生存率（Ｃ）、灌流速度（Ｄ）、およびグルコース濃度（Ｅ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の第１および第２の態様による方法は、１つまたは複数の以下の目標の達成を可能にする：細胞に対する損傷、とりわけ、気体供給、エアレーション、および／または気泡形成によって引き起こされる損傷を最小限にすること、糖タンパク質が発現される場合の、グリコシル化構造の高い安定性および同一性、良好な産生速度、取扱いの容易さ、細胞凝集の数の低下、スケールアップの容易さ、ならびにプロセスパラメーター変動に対する頑健性。
【００２０】
その他に示されない限り、用語「本発明による方法（複数可）」は、本発明の第１の態様による方法および本発明の第２の態様による方法の両方を指す。
【００２１】
本発明による方法は、撹拌の強度（激しさ）がきわめて高い場合に、本発明によって使用される細胞が、特に良好な増殖特性（たとえば生存率）および組換えタンパク質の特に良好な産生を示すという驚くべき発見に一部基づく。細胞が、通常、激しい撹拌によって引き起こされる剪断力によって損傷を受ける傾向があるので、これは予想外であった。驚くべき発見は、本発明によって使用されることとなる細胞が、撹拌によって引き起こされる剪断力および空気の気泡によって引き起こされる剪断力に対して異なる感受性を有するということであった。本発明によって使用される細胞は、撹拌機で引き起こされた剪断力に対して非常に頑健である（たとえば、それらは、たとえば０．９Ｎ／ｍ２の剪断力およびたとえば１０００ｓ−１の剪断速度に対して耐性がある）が、それらは、エアレーションに対してきわめて感受性である。限定流の気体供給または低流速での気体供給もまた、これらの手段が気泡によって引き起こされる剪断力を低下させるので、本発明の利点を達成するために使用されてもよい。本発明によって使用される細胞が、限定流の気体供給の適用を可能にするのに十分に激しい撹拌を可能にする程度まで、撹拌によって引き起こされる剪断力に対してかなり非感受性であるのは予想外であった。激しい撹拌は、すべての細胞についての均質な混合および均質な増殖条件を確実にするという有利な効果を有する。
【００２２】
好ましい実施形態では、細胞懸濁物は、得られた特定の電力入力が、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇとなるように、撹拌される。特定の電力入力は、特に、細胞培養物の質量（たとえばｋｇ）または容積（たとえばｍ３）当たりの撹拌に使用される電力（たとえば、撹拌機を回転させるためのまたは細胞培養物および／もしくは細胞培養容器を回転させる、揺らす、振る、もしくは他の場合には撹拌するための）である。好ましくは、撹拌のための特定の電力入力は、少なくとも０．０１、少なくとも０．０１５、少なくとも０．０２、少なくとも０．０２５、少なくとも０．０３、少なくとも０．０４、少なくとも０．０５、少なくとも０．０７５、または少なくとも０．１Ｗ／ｋｇ、より好ましくは０．０１５〜０．０３Ｗ／ｋｇの範囲、最も好ましくは０．０１８〜０．０２５Ｗ／Ｋｇである。
【００２３】
本発明によって使用されることとなる細胞は、ヒトグリコシル化を有する糖タンパク質の産生を可能にし、これは、一般的に、生物学的利用率および機能性の改善につながる。これは、主に、げっ歯動物起源のものである（たとえばＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞）、現在利用可能な産生系に勝る重要な利点である。その細胞系の主な利点は、他のヒト翻訳後修飾に加えて、ヒトグリコシル化である。
【００２４】
本発明によって使用されることとなる不死化ヒト血液細胞は、好ましくは、ヒト骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞である。好ましくは、細胞は、細胞系から、特に、Ｋ５６２細胞系（たとえばＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２４３として入手可能なＫ５６２細胞系）またはそれに由来する細胞系からのものである。それぞれの細胞、細胞系、および宿主細胞は、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０２８６８６に詳細に記載される。しかしながら、本発明による方法はまた、高い剪断応力に対して耐性のある他の懸濁細胞または細胞系、特に、真核生物懸濁細胞または細胞系、好ましくはヒト懸濁細胞または細胞系にも適している。
【００２５】
不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞、またはそれに由来する細胞における、対象とする産物、好ましくは糖タンパク質の組換え産生のための方法は、異なる培養容積を使用する場合でさえ、また、撹拌によって引き起こされる高い剪断力をかける場合でさえ、良好な収量および均質な品質を有する対象とする産物を産生することを可能にする。宿主細胞は、対象とする産物をコードする遺伝子を含み、前記細胞は、請求項１に記載の方法によって培養される。対象とする産物をコードする前記遺伝子は、好ましくは組換えで導入される。前記組換え技術は、周知であり、したがって、ここで詳細な記載は必要でない。たとえば、対象とする産物をコードする前記遺伝子は、その後安定してまたは一時的に宿主細胞へと導入される発現ベクター中に含むことができる。対象とする産物は、任意の性質のものとすることができる、好ましくは、それは、タンパク質またはポリペプチドである。好ましくは、前記産物は、グリコシル化される。特に、抗体などの薬学的に活性な産物または他の治療上活性なタンパク質の組換え産生は、重要である。それぞれの産物の大規模産生については、異なる培養容積が使用される場合でさえ良好な収量および良好で均質な品質を有する対象とする産物の産生を可能にする発酵方法が必要である。その上、産物の品質および好ましくは収量もまた、好ましくは、種々の生産費用（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｈａｒｇｅ）の間で同等であるべきである。これらの利点は、本発明による方法により達成することができる。
【００２６】
対象とする発現産物は、たとえば、細胞を破壊することによってまたは細胞培養培地から対象とする分泌産物を収集することによって、細胞培養物から得られる。好ましくは、対象とする産物は、細胞培養培地から精製される。本実施形態では、産物は、好ましくは、細胞によって分泌される。
【００２７】
好ましくは、細胞は、細胞保持を伴う連続発酵（灌流）によって培養され、これは特に良好な結果を示す。本発明による方法において使用される細胞は、定常期の間に識別可能な量の組換えタンパク質を産生しない。したがって、灌流は、ほとんどのタンパク質が産生される指数関数（対数）増殖期を延長するように役目を果たし得る。そのため、培養に灌流を使用することは、Ｋ５６２細胞などの不死化ヒト血液細胞またはそれに由来する細胞を培養する場合、有利である。
【００２８】
灌流モードにおいて、新鮮な培地は、好ましくは連続的に供給される。同じやり方において、無細胞上清が、好ましくは、バイオリアクターから採取され、一方、細胞は、好ましくは、発酵槽中に保持される。灌流発酵槽の重要な特徴は、細胞の保持システムである。細胞は、様々な技術を適用して保持することができる。たとえば、ろ過、遠心分離、または沈降を使用することができる。本発明による灌流方法において、細胞の保持は、好ましくは、スピンフィルター、中空繊維、連続遠心分離機、および音波細胞保持システム（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）から成る群から選択されるデバイスによって達成される。
【００２９】
好ましくは、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ連続遠心分離機などの連続遠心分離機が、灌流に使用される。Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ連続遠心分離機を使用する灌流は、０．５ｌ／ｄ〜１２０ｌ／ｄの間の灌流容積に適しており、より大きな細胞培養については、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｃｅｌｌ連続遠心分離機が、使用され得る。この広範囲の容積にわたって、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈは、様々なタイプの操作を使用している。いくつかの連続モード：ポンプモード、バルブモード、およびフィードモードならびにポンプモードの変形である非連続周期性モードがある。非連続モードにおいて、遠心分離機は、待ち時間によって中断される実行時間の間に作動している。待ち時間の間、管系は、無細胞であるべきであり、これは、無細胞上清を使用して、各実行後に系を洗い流すことによって保証される。
【００３０】
灌流は、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈのフィードポンプを設定し、収集ポンプを制御することによって制御される。一実施形態によれば、灌流の速度は、０．５Ｖ／ｄ（１日当たりの細胞培養容積）〜２．５Ｖ／ｄの間に設定される。細胞の必要量に対して灌流速度を適切に調整するために、鍵となるパラメーター（制御パラメーター）が好ましくは選ばれる。理想的には、制御パラメーターは、増殖／産生を制限し、測定するのが容易である。それにもかかわらず、制御パラメーターが増殖を制限する因子ではないことの方が多い。たとえば、グルコースが、制御パラメーターとして設定される。
【００３１】
本発明によって使用される細胞の灌流プロセスは、高密度発酵の間の高い細胞生存率を特徴とする。発酵の間に、主な基質、たとえば酸素、グルコース、グルタミンに関する制限も、タンパク新生アミノ酸の制限のいずれもない。さらに、灌流プロセスは、一定の産物品質およびとりわけ一定のグリコシル化パターンを特徴とする。発酵プロセスは、好ましくは、ｐＨ７．２、４０％のＤＯＴ（溶存酸素圧）、および３７℃の温度に制御される。前記不死化血液細胞を用いる発酵は、細胞が、特に撹拌タンクバイオリアクターにおける高い剪断力に対して耐性があるので、高い電力入力（たとえば０．０２２Ｗ／ｍ３）により実行することができる。
【００３２】
灌流条件下では、細胞濃度は、限界に遭遇するまで、通常増加する。この限界は、栄養素または廃棄物の蓄積のいずれかとすることができる。バッチまたはフェドバッチ発酵と比較して、一定の培地供給および廃棄物洗い流しにより、はるかに高い細胞密度に達することができる。それらのより高い細胞密度に基づいて、優れた空時収量が達成される。
【００３３】
一実施形態によれば、細胞は、培養中に、好ましくはブリーディング（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって除去される。ブリーディングが適用される場合、ある量の細胞（たとえば全容積の１０％）が、発酵槽から採取される。ブリーディングは、細胞がより長い時間、増加した生存率で、増殖期に保たれるという利点を有し、これは、より安定した培養物をもたらす。いくつかのブリーディング戦略は、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｍおよび共同研究者による文献において議論されている［Ｄａｌｍら  ２００４年］、［Ｄａｌｍら  ２００７年］。
【００３４】
対象とするグリコシル化産物の組換え産生にとって重要である、本発明の培養方法の特有の利点は、たとえば糖タンパク質を発現する場合、前記方法が均質で、高度に再現可能な糖構造（ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をもたらすということである。好ましい実施形態では、対象とする産物のグリコシル化構造および／または細胞の産生速度は、培養容積によって実質的に影響を受けない。例として、１ｌリアクターおよび１００ｌリアクターにおける培養物（好ましくは灌流培養物）が比較される場合である。好ましくは、全体的な産物品質は、培養容積によって実質的に影響を受けない。実施例は、本発明による方法がこれらの利点を達成することができることを示す。
【００３５】
一実施形態によれば、細胞培養物中の細胞密度は、少なくとも１×１０６／ｍｌに達する。好ましくは、細胞密度は、一層高く、たとえば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０×１０６細胞／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞培養物中の細胞生存率は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。一実施形態によれば、本発明による方法において、細胞密度は、少なくとも９０％の細胞生存率で、一時点で少なくとも５×１０６／ｍｌに達する。細胞生存率は、特に、試料中のすべての細胞（生細胞および死細胞）の数と比較した生細胞の数のパーセンテージを示す。
【００３６】
好ましい達成可能な最大産生速度は、少なくとも２５μｇ／（ｍｌｄ）（１日当たり細胞培養物１ｍｌ当たり２５μｇ産物）、好ましくは少なくとも５０μｇ／（ｍｌｄ）、少なくとも８０μｇ／（ｍｌｄ）、少なくとも９０μｇ／（ｍｌｄ）、または少なくとも１００μｇ／（ｍｌｄ）である。
【００３７】
本発明による方法では、好ましくは、撹拌機、特に羽根車が、撹拌に使用される。
【００３８】
細胞の培養物は、一般的に、容器中に含有され、これは、たとえば、細胞培養物を含有するためのバッグ、好ましくは使い捨てのバッグ、またはその代わりにバッグ以外の容器、たとえばタンク、コンテナーなどであってもよい。バッグが使用される場合、それは、好ましくは、撹拌に使用される撹拌機と組み合わせられてもよい。好ましくは、発酵槽は、灌流方法に適した、好ましくはよく使用される容器として使用される。
【００３９】
本発明による好ましい方法では、リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜から成る群から選択されるデバイスが、エアレーションに使用される。本発明による方法は、本発明によって使用されることとなる細胞の、空気の気泡に対する高い感受性により、本発明でなければ実現可能ではないであろう、気体供給用のスパージャーの使用を可能にする。
【００４０】
一実施形態によれば、少なくとも１つの気体のパルスが、エアレーションのために培養プロセスの間に与えられる。
【００４１】
一実施形態によれば、エアレーションによって引き起こされる気泡の発生は、選ばれるエアレーション方法によって制限され、生成される気泡は、好ましくは、２ｍｍを超える、好ましくは５ｍｍを超える、より好ましくは１０ｍｍ以上のサイズを有する。上記に議論されるように、２ｍｍよりも大きな、特に１０ｍｍよりも大きな気泡は、より小さな剪断応力をもたらし、したがって、本発明によって使用される細胞に対してそれほど致死的ではない。
【００４２】
上記に議論されるように、一般に気体供給またはエアレーションは、好ましくは、限定気流によって達成される。用語「限定流」は、特に、気体が連続的な様式で供給される定常流とは反対に、非連続的な様式で気体を供給することを指す。用語「エアレーション」は、特に、酸素（たとえば空気、好ましくは純酸素）を含むまたはそれから成る気体の供給を指す。好ましくは、エアレーションは、限定流によって実行される。気体供給（たとえば酸素を含む気体、好ましくはすべての気体）のパルスは、一実施形態によれば、持続時間が多くとも３０秒間（または多くとも１０秒間、３秒間、もしくは１秒間）とすることができる。気体が供給される時間の割合は、少なくとも１時間（または少なくとも２時間もしくは５時間）を超える培養（培養する）時間のうちの多くとも２５％（または多くとも１０％、５％、２．５％、もしくは１％）とすることができる。好ましくは、懸濁物における酸素飽和度を検出するための手段が、使用される。検出された酸素飽和度が、たとえば、１０％、好ましくは２０％、２５％、３０％、またはより好ましくは３５％のｐＯ２またはＤＯＴなどの、あらかじめ定められた閾値よりも低い場合、酸素を含む気体が、好ましくは供給される。好ましくは、エアレーションのために、純酸素が、供給される。
【００４３】
したがって、一実施形態によれば、細胞培養物における酸素値、それぞれ、酸素飽和度は、決定され、酸素および／または酸素を含有する気体もしくは気体混合物は、酸素のレベルが、たとえば上記に定められるような所定のレベルより下に下がった場合、細胞培養培地の中にパルスとして導入される。これは、好都合にも、エアレーション、したがって気泡形成を最小限にする。
【００４４】
好ましい実施形態では、細胞に、リアクター容積の１リットル当たり多くとも０．０５ｌ／時間、好ましくは多くとも０．０２、０．０１、または０．００５ｌ／時間の流速で少なくとも１つの気体が供給される。特に、細胞培養物の全気体供給は、リアクター容積１リットル当たり０．０５ｌ／時間以下、好ましくは、リアクター容積１リットル当たり０．０２、０．０１、または０．００５ｌ／時間以下である。用語「流速」および「気体供給」は、この点で、好ましくは、全培養プロセスにわたる平均の流速か気体供給を指す。それは、気体が周期的な間隔で細胞培養物に導入される限定気流を使用する場合、供給インターバル中の実際の流速は、上記の値よりも速くてもよいことを意味する。しかしながら、平均して、供給インターバルおよび気体が細胞培養物に導入されないインターバルを考慮すると、全体的な流速または気体供給は、好ましくは、上記に定められるように、リアクター容積１リットル当たり多くとも０．０５ｌ／時間である。
【００４５】
気体供給が限定気流によって達成される好ましい実施形態では、供給インターバル中の随時の流速（最大流速）は、０．０５ｖｖｍ（１分当たりのリアクター容積当たりの容積）以下、好ましくは０．０２、０．０１、または０．００５ｖｖｍ以下である。
【００４６】
あるとりわけ好ましい実施形態では、本発明による方法において、
（ｉ）懸濁物の撹拌のための特定の電力入力が、少なくとも０．０１Ｗ／ｋｇであり、かつ
（ｉｉ−１）懸濁物に対する少なくとも１つの気体を用いる気体供給もしくは懸濁物に対する全気体供給が、リアクター容積１リットル当たり０．０５ｌ／時間以下である、または
（ｉｉ−２）気体供給が、限定気流によって達成され、最大流速が０．０５ｖｖｍ以下である。
【００４７】
好ましくは、懸濁物の撹拌のための特定の電力入力が、少なくとも０．０１５Ｗ／ｋｇであり、懸濁物に対する少なくとも１つの気体を用いる気体供給もしくは懸濁物に対する全気体供給が、リアクター容積１リットル当たり０．０２ｌ／時間以下であるまたは気体供給が、限定気流によって達成される場合、最大流速が０．０２ｖｖｍ以下である。これらの実施形態では、懸濁物の撹拌に起因する剪断力が、少なくとも０．１Ｎ／ｍ２、好ましくは０．３Ｎ／ｍ２であるおよび／または撹拌機の先端における剪断速度が、少なくとも３００ｓ−１、好ましくは５００ｓ−１である。
【００４８】
一実施形態によれば、塩基が、所定のレベルのｐＨまたはｐＨ範囲を維持するために培養中に添加される。好ましいｐＨ範囲または値は、５〜９の間、より好ましくは６〜８．５の間、６．５〜８の間、または最も好ましくは７〜７．５の間である。塩基の添加は、通常、たとえば乳酸形成を中和するまたはＣＯ２形成を中和するために必要とされる。先行技術において公知の方法では、塩基の添加により、おそらく塩基によって引き起こされる細胞凝集が生じ、細胞溶解が引き起こされ得る。凝集は、死細胞の集合である。凝集は、特に、より大規模で問題となる。本発明による方法は、おそらくより激しい撹拌により、凝集形成を低下させる。本発明による方法は、細胞凝集の形成を低減する。細胞懸濁物に添加されることとなる塩基は、より迅速に均等に分布し得る。本発明による好ましい方法では、細胞凝集の形成が、特徴ａ）〜ｆ）のどれも含まない対応する方法とは反対に、低減する。
【００４９】
好ましくは、塩基が、撹拌機領域のすぐ近くに添加される。その上、塩基が、好ましくは、細胞懸濁物の中に直接添加される、つまり、添加の部位が、懸濁物の表面の下であり、塩基は、懸濁物に滴下されない。
【００５０】
細胞は、好ましくは、無血清培地、たとえば既知組成（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）ＧＴＭ培地において培養される。
【００５１】
本発明による方法の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、剪断保護剤、たとえば血清、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８を含む。剪断保護剤は、好ましくは、＜０．０１〜３ｇ／ｌの濃度で使用される。好ましくは、細胞培養培地は、無血清である。
【００５２】
一実施形態によれば、細胞培養は、６．５〜８、好ましくは７〜７．５の間のｐＨ範囲、１０％〜９０％、好ましくは３０％〜５０％、より好ましくは３５％〜４５％のｐＯ２、および／または３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で実行される。
【００５３】
好ましい実施形態によれば、対象とする産物のグリコシル化構造および／または細胞の産生速度は、培養容積によって実質的に影響を受けない。
【００５４】
好ましくは、本明細書に開示の好ましい実施形態は、互いに組み合わせられる。特に、以下の好ましい組合せが提供される：
特徴ｅ）と特徴ａ）
特徴ｆ）と特徴ａ）
特徴ｇ）と特徴ａ）
特徴ｅ）および特徴ｇ）と特徴ａ）
特徴ｅ）と特徴ｃ）
特徴ｆ）と特徴ｃ）
特徴ｇ）と特徴ｃ）
特徴ｅ）および特徴ｇ）と特徴ｃ）
特徴ｅ）と特徴ｄ）
特徴ｆ）と特徴ｄ）
特徴ｇ）と特徴ｄ）
特徴ｅ）および特徴ｇ）と特徴ｄ）
特徴ｇ）と特徴ｅ）
特徴ｅ）および特徴ｇ）および特徴ｃ）ならびに／または特徴ｄ）と特徴ａ）。
【００５５】
これらの組合せでは、特に、上記に定められる好ましい値および範囲が、使用されてもよい。ある実施形態では、上記の組合せが、本明細書において定められる１つまたは複数の実施形態、特に特徴ｂ）とさらに組み合わせられる。
【００５６】
一実施形態によれば、発酵槽は、少なくとも１ｌ、好ましくは少なくとも１０ｌ、少なくとも２０ｌ、少なくとも５０ｌ、少なくとも１００ｌ、少なくとも２００ｌ、少なくとも５００ｌ、または少なくとも１０００ｌの容積、特に１ｌ〜１０００ｌ、１ｌ〜５００ｌ、１０ｌ〜２５０ｌ、または２０ｌ〜１００ｌの範囲の容積を有する細胞培養に使用される。上記に議論されるように、驚くべきことに、特に、産物品質だけでなく、生産性もまた、発酵槽のサイズによって影響を受けない。生産プロセスの規模を変更する場合、これは特有の利点である。一実施形態によれば、電力入力は、スケールアップ基準として使用され、よって、特定の電力入力は、異なる発酵槽サイズの間で一定に保たれる（しかしながら、好ましくは、およそ２５％、２０％、１５％、１０％、５％の偏差を許容する）。好ましくは、特定の電力入力は、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇ、好ましくは少なくとも０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７５、または０．１Ｗ／ｋｇ、より好ましくは０．０１５〜０．０３の範囲、より好ましくは０．０１８〜０．０２５Ｗ／Ｋｇである。
【００５７】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明による方法において使用される、培養または生産プロセスをアップスケールするための方法であって、電力入力が、スケールアップ基準として使用される方法に関する。特に、電力入力は、スケールアップの間に、一定に保たれる、すなわち、最初の小規模培養方法のための特定の電力入力は、最終のアップスケールされた大規模培養方法のための特定の電力入力の７５％〜１２５％、好ましくは、８０％〜１２０％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％、または９５％〜１０５％の範囲にある。特に、小規模培養方法および／または大規模培養方法のための特定の電力入力は、少なくとも０．００５Ｗ／ｋｇ、好ましくは少なくとも０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７５、または０．１Ｗ／ｋｇ、より好ましくは０．０１５〜０．０３の範囲、最も好ましくは０．０１８〜０．０２５Ｗ／Ｋｇである。大規模培養は、好ましくは、小規模培養の細胞培養容積よりも少なくとも２５％大きい細胞培養容積を有する。より好ましくは、大規模培養の細胞培養容積は、小規模培養の細胞培養容積よりも少なくとも５０％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも１．５倍大きい、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きい。
【００５８】
特に、本発明は、対象とするタンパク質の組換え産生の規模を変更するための方法であって、以下のステップ：
−細胞を培養するための第１の容器を提供するステップ、
−不死化ヒト血液細胞またはそれに由来する細胞を提供するステップ、
−前記細胞の第１の懸濁物を提供するステップ、
−第１の容器に第１の懸濁物を導入するステップ、
−本発明による培養または産生方法、特に請求項１〜２５のいずれかに記載の方法を実行するステップ、
−必要に応じて、第１の懸濁物中で産生される対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および／または第１の懸濁物の細胞の産生速度を書き留めるステップ、
−第１の容器と異なる内部容積を有する、細胞を培養するための第２の容器を提供するステップ、
−前記細胞の第２の懸濁物を提供するステップ、
−第２の容器に第２の懸濁物を導入するステップ、
−本発明による培養または産生方法、特に請求項１〜２５のいずれかに記載の方法を実行するステップ、
−必要に応じて、第２の懸濁物中で産生される対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および／または第２の懸濁物の細胞の産生速度を書き留めるステップ、
−必要に応じて、両方の懸濁物中で産生される対象とする糖タンパク質のグリコシル化構造および／または両方の懸濁物の細胞の産生速度を比較するステップ、
を含む方法に関する。
【００５９】
用語「規模を変更する」は、好ましくは、アップスケール、つまり、培養容積を増加させることを指す。
【００６０】
本発明による方法（たとえば強い撹拌および少ないエアレーション）は、本発明により使用されることとなる細胞の良好な増殖を可能にする。それらは、容積および形状が均質でない撹拌タンクバイオリアクターならびに本明細書において、総称して、発酵槽とも呼ばれる多くの他の容器（たとえばＴ型フラスコ、スピナー、およびウェーブバイオリアクター）において培養されてもよいことが分かった。撹拌タンクについては、高い生存率＞９５％に加えて約２＊１０６細胞／ｍｌの生存細胞密度を達成することができる。灌流モードにおいて、細胞は、＞９０％の高い生存率に加えて１０７細胞／ｍｌまでの高い細胞密度まで増殖する。良好な比生産性は、たとえば、灌流によって得られてもよい。
【００６１】
本発明による方法はプロセスパラメーター変動に関して頑健であるが、標準的な条件は、ｐＨ７．２、溶存酸素圧（ＤＯＴ）４０％、および温度３７℃である。少ない気体流量およびリングスパージャーの使用は、驚くべきことに、良好な結果を与える。
【００６２】
本発明による方法によって得られる産物品質は、非常に高く、したがって、産生方法に対する選択は、生産性および経済上の考慮に基づいて成すことができる。本発明による方法を使用して抗体を発現した場合、様々な形状比率の１０ｌおよび１００ｌバイオリアクターと比較して１ｌ規模を使用する場合に、グリコシル化パターンが同等であり、したがって不変であることが分かった。本発明により使用される細胞の高い剪断応力の頑健性（ＣＨＯ細胞と比較して少なくとも１０倍の増加）に基づいて、スケールアップは、一定の特定の電力入力で実行され得る。１ｌ、１０ｌ、および１００ｌバイオリアクターの質的および量的性能評価ならびに生化学的特徴付け試験のパネルは、プロセス（方法）および産物の同等性が、スケールアップのプロセスの間に十分に維持されたことを示す。
【００６３】
引用文献
【００６４】
【数１】
2014500032.tif 000002
【００６５】
【数２】
2014500032.tif 000003
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
前培養
前培養物を、細胞培養フラスコ（ＴＰＰ／Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させる。フラスコは、５ｍｌ（Ｔ２５、２５ｃｍ２面積）、３０ｍｌ（Ｔ７５、７５ｃｍ２）、および７５ｍｌ（Ｔ１５０、１５０ｃｍ２）の懸濁容積まで使用する。細胞は、２〜３日毎に分割し、分割の後に０．１５＊１０６細胞／ｍｌに細胞濃度を設定することによって、対数増殖期に維持する。メトトレキサート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびピューロマイシン（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の添加は、様々な濃度で、週単位でまたは持続的に、クローン依存のやり方で行う。細胞は、３７℃、８％二酸化炭素、および９５％相対湿度でインキュベーター（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＢＳ、Ｂｉｏｓａｆｅ  ｐｌｕｓ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄまたはＴｈｅｒｍｏ／Ｈｅｒａｅｕｓ  ＢＢＤ  ６２２０、Ｇｅｒｍａｎｙ）において培養する。
【００６７】
（実施例２）
スピナー培養
容積１２５ｍｌの細胞懸濁物から始めて、スピナー前培養を、スピナーフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＢＳ、Ｃｅｌｌｓｐｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実施する。３つの異なる容積（０．２５ｌ、０．５ｌ、１ｌ）のスピナーフラスコを使用する。３７℃、８％二酸化炭素、および９５％相対湿度でインキュベーター（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＢＳ、Ｂｉｏｓａｆｅ  ｐｌｕｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の内部で系を作動させながら、スピナー速度を６０ｒｐｍに設定する。スピナーフラスコに０．１５＊１０６〜０．３＊１０６細胞／ｍｌを接種する。前培養の目的のために、細胞は、２〜３日毎に懸濁容積を増加させ、分割の後に細胞濃度を０．１５＊１０６細胞／ｍｌに設定することによって、対数増殖期に維持する。
【００６８】
ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  ＡおよびＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ｂ細胞（Ｋ５６２に由来する細胞系の細胞である）について発酵プロセスを確立する前に、増殖をスピナー培養において分析する。Ｔ型フラスコに加えて、スピナーおよび振盪フラスコを前培養の目的のために使用する。Ｔ型フラスコと比較して、スピナーフラスコおよび振盪フラスコの両方は、物質移動（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）特性を改善し、ｋｌａ値の増加をもたらす。
【００６９】
増殖プロファイルは、バッチ実験において、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭ細胞について並行して分析した。細胞は、３つの異なる系すべてにおいて同等に増殖する。Ｔ型フラスコ中の細胞濃度は、スピナー培養および振盪培養と比較してわずかに低い。
【００７０】
Ｔ型フラスコ中の細胞培養物は、より低い細胞密度に達するが、最も高いラクテート濃度を示す。結論付けると、スピナーボトルおよび振盪フラスコは、細胞の培養に等しく十分に適している。両方とも、Ｔ型フラスコと比較して、わずかにより良好な増殖を提供するようであり、そのため、発酵前の前培養に十分に適している。これはまた、培養に関する細胞系の頑健性を暗示する。
【００７１】
（実施例３）
発酵Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵ  ２  ｌ
実験室規模発酵を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵ  ２  ｌ系（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施する。二重壁Ｕｎｉｖｅｓｓｅｌ  ２  ｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）発酵容器は、最小０．８および最大２リットルの、作業容積を有する。一般的に、発酵は、１リットルの作業容積で実行される。発酵槽はすべて、Ｓｙｓｔｅｃ  Ｖ−１５０オートクレーブ（Ｓｙｓｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において滅菌する。気体混合により、４つの異なる気体を維持する：窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。酸素、二酸化炭素、および圧縮空気は、マスフローコントローラーによって操作するが、窒素は、面積式流量計Ｑ−Ｆｌｏｗ（Ｖｏｅｇｔｌｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して制御する。エアレーションもまた、すべての気体について全流量を設定することによって制御することができる。気体供給および排気は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｉｄｉｓａｒｔ  ２０００  ０．２  μｍ  ＰＴＦＥフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してろ過する。溶存酸素濃度は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｒｌｅｄｏ  ＩｎＰｒｏ  ６８００電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してオンラインで測定する。塩基（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）の添加および二酸化炭素の添加は、ｐＨ値を制御するために使用する。ｐＨ値は、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してオンラインで測定する。塩基は、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １００  ＯＥＭポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって添加する。２本の追加のＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １００  ＯＥＭポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）および１本のＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ３１３  ＯＥＭポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を細胞収集、接種、または他の目的のために使用する。フィード培地は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＬＥ１０００１はかり（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および重量式流量コントローラー（ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）を使用してＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １０１Ｕ／Ｒ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって添加する。リアクター重量は、Ｅｃｏｎｏｍｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＥＡ６０ＥＤＥ−１はかり（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。細胞を、１つまたは２つの３枚羽根弓形羽根車１−２  ｌ，ａｄｊｕｓｔ，ｃｏｍｐｌ．，Φ  ５４／１０  Ｈ７（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により撹拌する。アジテーターのシャフトに、Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ  Ｓｅｉｄｅｌ  ６５Ｍ  ２７ＬＬ−４．５００モーター（Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ  Ｓｅｉｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって電力を供給する。リアクター容積に依存して、１つまたは２つの撹拌機を適用する：たとえばＢｉｏｓｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵ  ２  ｌについては、１ｌ作業容積で作業する場合、１つの撹拌機を使用するが、２ｌ発酵のためには２つの撹拌機を使用する。プロセスの冷却は、自律ループ（ａｕｔｏｎｏｍ��ｕｓ  ｌｏｏｐ）およびＦｒｉｇｏｍｉｘ  １０００冷却機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して遂行する。
【００７２】
バッチ発酵
この作業におけるほとんどの発酵は、０．８〜２リットル（好ましい容積は１ｌである）の間の作業容積を有するＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵ系を使用して実行する。その他に示されない限り、発酵は、３７℃、ｐＨ７．２、および４０％ＤＯＴの空気飽和度で０．１５＊１０６〜０．３＊１０６細胞／ｍｌの細胞密度で始める。二酸化炭素気体流量／０．５  ＮａＯＨを、ｐＨを調節するために使用する。ＤＯＴは、圧縮空気または純酸素を使用することによって４０％に保つ。ｐＨおよびＤＯＴの両方をＰＩＤ制御する。電力入力の最適化前に、様々なエアレーションシステムを試験する。これらの発酵は、１．５ｌ作業容積で、５０ｒｐｍ撹拌機速度、３７℃、４０％ＤＯＴ、ｐＨ７．２で実行する。リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜エアレーション（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を並列運転で試験する。
【００７３】
連続発酵
連続発酵は、細胞の保持のために４つの異なる技術を使用して実施する。発酵はすべて、１〜１．５リットルの間の作業容積を有するＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵシステムを使用して実行する。
１．連続遠心分離機：Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩまたはＣｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩＩ（Ｂｅｒｒｙ  Ｗｅｈｒｍｉｌｌｅｒ、Ｃａｒｒ  Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ、ＵＳＡ）
２．内部スピンフィルター：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｐｉｎｆｉｌｔｅｒ  ２ｌ  ２０μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
３．外部中空繊維：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣＦＰ−４Ｅ５Ａ、０．４５μｍ、１２００ｃｍ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）
４．音波細胞保持：Ｂｉｏｓｅｐ  ＡＰＳ  ９９０（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ／Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
【００７４】
プロセス開発の後期段階において、連続発酵はすべて、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩまたはＣｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩＩ（Ｂｅｒｒｙ  Ｗｅｈｒｍｉｌｌｅｒ、Ｃａｒｒ  Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ、ＵＳＡ）連続遠心分離機を使用して実施した。Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈは、様々なサイズのリアクター容積に対して様々な操作モードを提供する。遠心分離は、１ｌ作業容積での実験室規模発酵のために「周期性ポンプモード」を使用して実行する。１０ｌまたは１００ｌ規模の発酵は、連続操作において「ポンプモード」または「フィードモード」を使用する。灌流は、２つのはかりによって制御する。フィードは、重量式流量コントローラーを使用するが、収集は、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ制御パラメーターを変化させることによって設定する。Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩおよびＬａｂ  ＩＩＩ遠心分離機は、ＤＣＵに直接接続しない。１００ｌ規模の灌流は、フィードを制御するレベルセンサーによって制御するが、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈは、連続的に収集する。
【００７５】
（実施例４）
ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターシステム
追加の実験室規模発酵は、ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターシステム（ＤＡＳＧＩＰ、Ｊｕｅｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施する。異なるモジュールから成るので、ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターシステムは、各リアクターについて、独立して、ｐＨ（モジュール  ＰＨ４／ＰＯ４）、ＤＯＴ（モジュール  ＰＨ４／ＰＯ４）、温度（モジュール  ＴＣ４／ＳＣ４）、撹拌（モジュール  ＴＣ４／ＳＣ４）、および液体フィード（モジュール  ＭＰ８）を制御しながら、４つのバイオリアクターを同時に操作することができる。発酵容器（ＤＡＳＧＩＰ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、０．６〜１ｌの作業容積を有する。温度制御は、加熱スリーブを使用して保証される。ＤＡＳＧＩＰシステムは、変速駆動を特徴とする蠕動ポンプを装備している。ポンプ毎の流速は、オンラインデータに基づいて別々の機能によって制御するためにユーザーによりプログラムすることができる。栄養素および代謝物質の両方についての複数の分析の同時フィードバック制御を達成することができる。気体供給は、ＭＸ４／４モジュールを使用して制御する。気体混合により、４つの異なる気体を維持する：マスフローコントローラーによって操作される窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。気体供給および排気は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｉｄｉｓａｒｔ  ２０００  ０．２  μｍ  ＰＴＦＥフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してろ過する。塩基（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）の添加および二酸化炭素の添加は、ｐＨ値を制御するために使用する。ｐＨは、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してオンラインで測定する。発酵槽はすべて、Ｓｙｓｔｅｃ  Ｖ−１５０オートクレーブ（Ｓｙｓｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において滅菌する。細胞は、１つの３枚羽根弓形羽根車（ＤＡＳＧＩＰ、Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）により撹拌する。アジテーターのシャフトには磁気撹拌機によって電力を供給する。
【００７６】
（実施例５）
発酵  １０ｌ実験室規模
実験室規模発酵を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ−ＤＣＵ３  １０  ｌ系（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施する。ステンレス鋼発酵容器は、最小４および最大１０リットルの作業容積で使用する。一般的に、バッチ発酵は、１０ｌ作業容積で実行するが、灌流は、５ｌ作業容積で実施する。１０ｌ  ＣＤＣＵは、２ｌ  Ｂ−ＤＣＵバイオリアクターと同様に構成される。気体混合により、４つの異なる気体を維持する：窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。酸素、二酸化炭素、および圧縮空気は、マスフローコントローラーによって操作するが、窒素は、面積式流量計Ｑ−Ｆｌｏｗ（Ｖｏｅｇｔｌｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して制御する。エアレーションもまた、すべての気体について全流量を設定することによって制御することができる。気体供給および排気は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭｉｎｉまたはＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｊｕｎｉｏｒ  ０．２  μｍ  ＰＴＦＥフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してろ過する。溶存酸素濃度は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｒｌｅｄｏ  ＩｎＰｒｏ  ６１００／１２０／Ｔ／Ｎ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してオンラインで測定する。塩基（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）の添加および二酸化炭素の添加は、ｐＨ値を制御するために使用する。ｐＨ値は、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してオンラインで測定する。塩基は、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １００  ＯＥＭポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって添加する。２本の追加のＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  １００  ＯＥＭポンプ（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を細胞収集、接種、または他の目的のために使用する。フィード培地は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＥＡ１５０ＣＥはかり（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および重量式流量コントローラーを使用してＷａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  ＳＣＩ３２３（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって添加する。細胞を、１つまたは２つの３枚羽根弓形羽根車５−１０  ｌ，ａｄｊｕｓｔ，ｃｏｍｐｌ．，Φ  ５４／１０  Ｈ７（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により撹拌する。アジテーターのシャフトに、Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ  Ｓｅｉｄｅｌ  ６５Ｍ  ５７ＳＬ−３０００モーター（Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ  Ｓｅｉｄｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって電力を供給する。リアクター容積に依存して、１つまたは２つの撹拌機を適用する：たとえば１０ｌ  Ｃ−ＤＣＵについては、５ｌについて１つの撹拌機、１０ｌについて２つの撹拌機。プロセス冷却は、Ｆｒｉｇｏｍｉｘ  １０００冷却機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または水道水による冷却のいずれかと共に、自律ループを使用して遂行する。
【００７７】
（実施例６）
発酵  １００ｌ生産規模
生産規模発酵は、クリーンルーム条件下で実施する。産生操作には、細胞培養用のＡｐｐｌｉｋｏｎ  １００  ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）発酵槽を使用する。ソフトウェアＢｉｏＸｐｅｒｔＸＰをプロセスのモニタリングとデータロギングのために使用する。実験室規模発酵と同様に、気体混合により、４つの異なる気体を維持する：マスフローコントローラーによって操作される窒素、酸素、二酸化炭素、および圧縮空気。ｐＨおよびＤＯＴは、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を測定に使用して制御する。
【００７８】
（実施例７）
発酵−使い捨て
追加の実験室規模発酵をＷａｖｅバイオリアクターにより操作する。温度、揺動速度、および揺動角度は、Ｗａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｓｅ  ２０  ＳＰＳプラットフォーム（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定し、制御する。ＤＯＴ、ｐＨ、およびエアレーションは、Ｗａｖｅｐｏｄ−Ｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）バージョンによって制御する。設定点は、温度３７℃、ｐＨ７．２、揺動速度：１２ｒｐｍ、および角度９°である。最初の細胞濃度は、１．５＊１０５細胞／ｍｌに設定する。灌流は、それぞれ、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩおよびＬａｂ  ＩＩＩ（ＢｅｒｒｙＷｅｈｒｍｉｌｌｅｒ、Ｃａｒｒ  Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を使用して操作した。ウェーブ細胞培養バッグは、ディップチューブを使用して設計した。チューブは、Ｌｕｅｒ−ＬｏｃｋまたはＭＰＣアダプターのいずれかを使用して接続する。接続はすべて、層流（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）下で実行する。
【００７９】
（実施例８）
ＥＬＩＳＡ
抗体濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して一般的に決定する。５０μｌの容積の抗ヒト抗Ｉｇカッパ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を、４℃で、少なくとも１２時間、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで、コーティング抗体として使用する。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により３０分間、ブロッキングする。試料は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈し、５０μｌを１時間インキュベートする。データの定量化は、標準物質としてＥｒｂｉｔｕｘを使用することによって達する。Ｅｒｂｉｔｕｘは、１０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、および０．２５μｇ／ｍｌで使用する。５０μｌのウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＯＤ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｔｅｄ  ｋｉｎｇｄｏｍ）を二次抗体として使用する。インキュベーションは１時間とする。最後に、１００μｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を検出のために適用する。反応は５０μｌ  ２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により停止し、４５０／６３０ｎｍ波長で測定する。
【００８０】
抗原結合ＥＬＩＳＡ
ヒトＰａｎｋｏＭａｂの抗原結合は、抗原ＥＬＩＳＡにおいてグリコシル化および非グリコシル化ＭＵＣ１−ペプチドへの結合によって測定する。グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドは、４℃で、少なくとも１２時間、ＰＢＳ中で等モル濃度でコーティングする。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により３０分間、ブロッキングする。ヒトＰａｎｋｏＭａｂの試料を、０．４μｇ／ｍｌおよび０．８μｇ／ｍｌの濃度まで１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈し、５０μｌを１時間インキュベートする。較正は、細胞培養上清標準物質（希釈：１：１００；１：２００；１：４００）を使用して実行する。５０μｌのウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＯＤ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｔｅｄ  ｋｉｎｇｄｏｍ）を二次抗体として使用する。インキュベーションは１時間とする。最後に、１００μｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を検出のために適用する。反応は５０μｌ  ２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により停止し、４５０／６３０ｎｍ波長で測定する。抗原ＥＬＩＳＡは、上清標準物質に対する回帰を使用して分析する。高い産物品質のための基準は、０．３よりも高い光学密度（ＯＤ）を有するグリコシル化ペプチドへの結合である。さらに、グリコシル化ＭＵＣ１に対する非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドの結合比は、基準を満たすために＜５％でなければならない。
【００８１】
（実施例９）
サイズ排除クロマトグラフィー
単量体抗体のパーセンテージは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用することによって決定する。クロマトグラフィーは、Ａｅｋｔａ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）システムでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）カラムを使用して実行する。試料は、およそ５０〜２００μｇのタンパク質を含有する２５０μｌの試料サイズまでＰＢＳにより希釈する。試料は、２００μｌ試料ループを使用して気泡が発生しないやり方でインジェクトする。分析のためのランニングバッファーは、ＰＢＳであり、流速は、０．５ｍｌ／分に設定する。溶離の後、クロマトグラムピーク面積を単量体、二量体、および多量体含有量に関して分析する。
【００８２】
（実施例１０）
グリカン分析
単糖分析
グリカン単糖分析のために、グリコシル化抗体は、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）により加水分解して、グリカン鎖からの単糖成分の放出をもたらす。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンは、トリフルオロ酢酸の作用を通してグルコサミンおよびガラクトサミンに脱アセチル化する。単糖の混合物は、電流滴定検出を備えた高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）の手段によって分離し、定量化する。
【００８３】
グリコプロファイリング
グリコプロファイリングのために、無傷のＮ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅによるゲル消化でタンパク質コアから放出させる。Ｎ−グリカンをゲルから洗い出し、続いて、蛍光マーカー２−アミノベンズアミドにより標識する。標識Ｎ−グリカンの精製試料は、蛍光検出を備える順相クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）または親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）の手段によって分離する。ＮＰ−ＨＰＬＣは、ほとんどのＮ−グリカンの分離を可能にする。ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣは、ＮＰ−ＨＰＬＣとは対照的に、バイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミンを含有するＮ−グリカン構造の分離を可能にする。保持時間のデータベースとの比較によって、ピークにグリカン構造を割り当てる。さらに、構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法およびエキソグリコシダーゼを用いる酵素的消化のアレイによって確認する。
【００８４】
Ｆｃ／Ｆａｂグリコシル化の分離分析
Ｆｃグリコシル化は、抗体のエフェクター機能に影響力を有するが、Ｆａｂグリコシル化は、抗原との抗体の相互作用に影響を与える。そのため、グリカン分析の基本的な関心は、両方の部分、Ｆｃ、およびＦａｂがグリコシル化されているかどうか、そして、第２に、どの差異が両方の部位のグリコシル化パターンの間で観察されるかを決定することである。パパインによる抗体の完全な切断は、１つのＦｃ断片および２つのＦａｂ断片の生成をもたらす。断片の分離は、プロテインＡ固相上でのアフィニティークロマトグラフィーを用いて実行する。プロテインＡは、Ｆｃ断片および未消化抗体に特異的に結合する。Ｆｃ断片および未消化抗体はプロテインＡに結合するが、Ｆａｂはフロースルー中に見出すことができる。ｐＨ２．２での０．１Ｍシトレート、０．１５Ｍ塩化ナトリウムによる溶離ステップは、未消化抗体に対して、Ｆｃ断片の放出を可能にする。Ｆａｂ部分からのＦｃの分離の後に、各断片のＮ−グリカンは、グリコプロファイリングに適用する。スペクトルの所見に基づいて、対応する構造を以下の特徴に対して分類する：フコースの存在または不在、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃの存在または不在、ガラクトシル化状態の分布、シアリル化レベルの分布（Ｎ０、Ａ１、Ａ２）、および分岐性（ａｎｔｅｎｎａｒｉｔｙ）。
【００８５】
（実施例１１）
産物特徴付け  スピナー培養
ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭ（ヒトＰａｎｋｏＭａｂ）のスピナー培養上清は、プロテインＡカラムを使用して精製する。溶離の後に、精製抗体を特徴付ける。精製抗体は、生物活性抗原ＥＬＩＳＡへの特異的結合を示し、それは基準を満たしており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける明確なバンドは高純度であることを示し、それはまた、高度に単量体の抗体構造（９７％）のものでもある。グリカンプロファイルに関して、産物は、高い値のシアリル化およびガラクトシル化に加えて二分岐構造を示す。グリカンプロファイルは、固定相の抗体から分析する。
【００８６】
異なる増殖期の間の産物品質を分析するために、３つの異なる増殖期を代表する３つの異なる収集を実行する。第１の収集（指数期）は、培養のおよそ４８時間後に採取する。細胞は、指数増殖している（μ＞０）。第２の収集は、定常期における培養のおよそ１４０時間後に集める。この時点で、細胞は著しく増殖しない（μ＝０）が、生存率は高い（およそ９５％）。第３の収集は、およそ２１０時間後の死滅の間に採取する。生存率は著しく下がり（およそ８０％）、生細胞濃度は下降する（μ＜０）。抗体は、収集し、プロテインＡを使用して精製し、異なる段階の増殖について分析する。結果は、重および軽抗体鎖についての明確なバンドを示す。異なる段階の増殖の間に目に見える産物分解はない。結論付けると、スピナー培養は、抗原ＥＬＩＳＡにおいて特異的に結合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて不純物を示さない高度に単量体の産物（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定）を提供する。グリカンプロファイルはまた、定常増殖期についても分析する。さらなるプロセス開発の間、主な目標は、この高い産物品質を維持することである。
【００８７】
（実施例１２）
バッチ発酵
ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ細胞系の増殖がプロセス条件に関して非常に頑健で、撹拌によって引き起こされる剪断力によってほとんど影響を受けないことが分かった。対照的に、細胞は、気泡サイズおよび気体流速に関しエアレーションに対して非常に感受性である。
【００８８】
１２．１  エアレーション
酸素供給が動物細胞にとって不可欠なので、エアレーションは、生物工学プロセスに決定的である。しかし、気泡は、強い剪断力を作り出し得る。Ｔ型フラスコまたはスピナーボトルにおける培養中に、エアレーションは使用されない。一般的にはるかに大きな容積を有する発酵槽では、酸素制限を予防するために酸素または空気を供給しなければならない。さらに、ｐＨ制御は、一般的に、供給する必要がある二酸化炭素の添加により機能する。そのため、３つの異なる種類の気体供給をバイオリアクターにおいて試験する。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭを使用する並行のバッチ発酵を、たとえば異なる前培養に基づく変動を最小限にするように実施する。発酵は、リングスパージャー、マイクロスパージャー、および膜エアレーションを使用して実行する。リングスパージャーは、バイオリアクターにかなり大きな気泡を供給する。これとは対照的に、マイクロスパージャーは、多孔質の気体透過性構造を使用することによってはるかに小さな気泡を作り出す。リングスパージャーおよびマイクロスパージャーは、バイオリアクターへの電力入力によって誘導される対流を使用して細胞に供給する。より高い電力入力では、はるかに良好な物質移動があり、これは、溶存酸素圧（ＤＯＴ）設定点を維持するために必要とされる気体流速を低下させることができる。最後に、膜エアレーションは、気泡を全く作り出さず、拡散のみに基づいて細胞に供給する。そのため、膜エアレーションは、細胞に気体を供給するための最も注意を払う方法である。膜エアレーションを適用する場合、気泡に基づく剪断応力はない。
【００８９】
３つの異なるタイプすべてのエアレーションを、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭのクローンに対して試験する。並行の発酵を、生存細胞濃度、生産性、および生存率に関して分析する。結果は、マイクロスパージャーおよび膜エアレーションの両方について、２＊１０６細胞／ｍｌの最大細胞密度およびおよそ２０〜２５μｇ／ｍｌの抗体濃度までの、同様の増殖を示す。膜エアレーションは、９５％という非常に高い生存率をもたらすが、マイクロスパージャーエアレーションは、約９０％の生存率をもたらす。したがって、リングスパージャーを使用すると、細胞は、０．７＊１０６細胞／ｍｌの最大細胞密度および１０μｇ／ｍｌの産物濃度まで増殖する。リングスパージャーおよびマイクロスパージャーの生存率は、発酵の中および後期段階において下がるが、膜エアレーションは、プロセスの間に非常に高い生存率を確実にする。これは、リングスパージャーまたはマイクロスパージャーにより作業する場合に、気泡が細胞損傷を引き起こすことを示す。最も高度な損傷はリングスパージャー気泡によって引き起こされ、９２％から７４％まで生存率が低下する。マイクロスパージャー生存率は、８４％に低下するが、膜エアレーションは、プロセス全体の間、９５％という非常に高い生存率を保つ。
【００９０】
リングスパージャーを、さらなる開発のために選ぶ。これは、大きな容器の発酵における技術的で、ＧＭＰに関連する制限に基づく。第１に、膜エアレーションは、生産規模において大きな膜面積により非常にコストが高く、たとえば、ＧＭＰの原則により発酵の後毎に膜チューブを交換しなければならない。第２に、必要とされる膜面積は、生産規模においてより一層増加し、これは、流動障害による混合上の問題につながり得る。マイクロスパージャーに関しては、生産規模において大量の起泡の問題につながることが想定され、これは、下流の処理において分解するのが難しい消泡試薬の必要をもたらし得る。その結果として、リングスパージャーにより作業すると、電力入力の増加は、物質移動が増加するにつれ、気体流速の低下をもたらす（たとえば、シャーウッド数は、レイノルズ数の増加と共に増加する）。
【００９１】
１２．２  定常流対限定流
発酵槽においてエアレーションの２つの異なるモードがある。第１は、一定の流速を適用し、細胞の必要量に基づいて４つの気体（空気、酸素、窒素、および二酸化炭素）を混合するものである。第２は、定常気流を混合するのではなく、必要とされる気体のパルスを排他的に与えるものである。限定流システムは、はるかに良好な増殖および生存率を与える。定常流速では、細胞は、流速の増加と共に、より損傷を受ける。０．０１ｌ／時間、０．０５ｌ／時間、および０．１ｌ／時間の流速で実行した一組のバッチ発酵は、リアクター容積１リットル当たり０．０１ｌ／時間を超える流速で生存率の減損を示した。その結果として、限定流システムを、バイオリアクターにおいてＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ細胞の発酵を制御するために選ぶ。さらに、ウェーブバイオリアクター系における発酵は、有望な結果を示した。このタイプのエアレーションを使用すると、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ細胞は、非常によく増殖する。
【００９２】
要約すると、エアレーションは、非常に決定的なパラメーターである。エアレーションによる細胞損傷は、様々な機会に観察されている。損傷を低下させるためにエアレーション速度をできるだけ低く設定しなければならない。下記において、発酵はすべて、定常流での気体混合の代わりに限定流での気体混合により実行する。気泡制限に基づくエアレーションは、開発のすべてのステップの間にきわめて重大である。そのため、発酵は、好ましくは、圧縮空気の代わりに純酸素供給を使用して実行する。
【００９３】
１２．３  電力入力
エアレーションのタイプを設定した後に、最適化における次のステップは異なる電力入力を試験することであった。発酵槽における可能性のある剪断損傷により、第１の発酵を、５０ｒｐｍの非常に低い撹拌機速度で実行する（これは、０．１４ｍ／ｓの先端速度および９＊１０−５Ｗ／ｋｇの電力入力と等しい、下記の表２を参照されたい。エアレーションに関連する実験は、低い電力入力をもたらす１００ｒｐｍの撹拌機速度を使用して行う。とりわけ高い細胞密度でだけでなく、より高度な発酵槽規模で均質性を保つために、より高い電力入力が好ましい。より高い電力入力はまた、エアレーションに必要である気体流速を低下させることも想定され、これは、より少ない気泡に基づく損傷をもたらすはずである。
【００９４】
電力入力を、種々の撹拌機速度を使用し、バッチモードで試験する。実験の最初の組において、１００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、および３００ｒｐｍを試験する。表１は、５０〜４００ｒｐｍの間の異なる撹拌機速度についての撹拌の特徴（電力入力、先端速度、剪断先端速度、およびレイノルズ数）を示す。
【００９５】
【表１】
2014500032.tif 000004
表１：種々の撹拌速度についての２ｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂ−ＤＣＵバイオリアクターにおける撹拌の特徴。データは、１ｌ培養容積および撹拌用の１つの３枚羽根弓形羽根車の利用に基づく。
【００９６】
結果を図１に示す。２００ｒｐｍおよび３００ｒｐｍは、２．５＊１０６細胞／ｍｌまで同様の細胞密度を示すが、撹拌機速度を１００ｒｐｍに設定した場合、細胞は、１＊１０６細胞／ｍｌを上回って増殖しない。力価濃度は、３つの発酵すべてにおいて約２５μｇ／ｍｌという同様のレベルに達する。剪断力の増大にもかかわらず、生存率は、２００ｒｐｍおよび３００ｒｐｍで最も高い。１００ｒｐｍを使用する場合、生存率は、８０％未満まで下がる。その後、１００ｌ規模にスケールアップして作業すると、混合は再び緊急の懸念点になった。２００ｒｐｍおよび４００ｒｐｍの撹拌機速度を使用する発酵は、同等の結果を示す。４００ｒｐｍで作業すると、細胞は、わずかに速く増殖するようであるが、高い生存細胞濃度および生産性に達しない。それにもかかわらず、４００ｒｐｍは、４００ｒｐｍが対数増殖の間に非常に高い生存率（＞９０％）をもたらし、剪断誘導性の損傷を示さないので、発酵に適しているようである。要約すると、２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍの間の撹拌機速度は、同等の増殖を示す。気泡は、撹拌機誘導性の剪断力よりもはるかに否定的に生存率に影響を与える。３００ｒｐｍ（電力入力：０．０２Ｗ／ｋｇ）の撹拌機速度は、２ｌ実験室規模における発酵についての標準的な撹拌速度として設定する。
【００９７】
１２．４  プロセスパラメーターに対する頑健性
バッチ発酵は、リングスパージャーおよび０．０２２Ｗｉｔｈｋｇの電力入力を適用して実行する。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭを使用する合計１６回の実行について分析する。プロセス値は、以下のように設定した：ｐＨ（７．０；７．２；７．４）、ＤＯＴ（２０％；４０％；６０％）、および温度（３６℃、３７℃、３８℃）。バッチ発酵の間に試験した範囲の、プロセスパラメーターｐＨ、ＤＯＴ、および温度を変化させることで、増殖および生産性に関して影響はなかった。これは、プロセスパラメーターを変化させることとその応答に関して相関がないことを意味する。最初の細胞数（約１．２〜１．８＊１０５細胞／ｍｌの間で変動）および最終のバッチ生産性または最大細胞密度の間にいずれも相関はなかった。結果として、接種のプロセスもまた、その結果として、頑健であると見なすことができる。
【００９８】
その他に示されない限り、発酵はすべて、ｐＨ７．２、ＤＯＴ  ４０％空気飽和度、および３７℃の温度の標準的な条件下で実施する。これらの条件はまた、灌流プロセスにも適用する。
【００９９】
１２．５  増殖依存性の産生
細胞がバッチ発酵において増殖するにつれて、生産性および増殖は、細胞が定常増殖期の間に産生しないので、互いに密接に関連付けられることが分かった。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭのバッチ培養物を、それらの増殖および生産性に関して分析した。抗体産生は、細胞増殖に強く依存性であった。発酵における定常期の間に、抗体濃度は、増加しなかった。
【０１００】
統計試験を、作用変数（ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）として細胞濃度を使用し、応答変数として生産性を使用して、適用した。細胞濃度と生産性の間の線形回帰を使用すると、強い相関が見出される（Ｒ２＝０．９９４）。その結果として、産生は、増殖に関連付けられ、細胞は、定常期の間にいかなる抗体をも産生しない。これは、ほとんどの産物が定常増殖期の間に産生されるＣＨＯ細胞のような他の産生系に対して主要な差異を与える。この結果は、プロセス開発にとって非常に重要である。それは、ほとんどのフェドバッチ作業が産物蓄積のための定常期延長であるフェドバッチプロセスの代わりの灌流プロセスの好ましい使用をもたらす。別の結果として、細胞増殖は、灌流およびフェドバッチプロセス開発の両方についての主要な目的であるはずである。
【０１０１】
増殖依存性の生産性のさらなる分析のために、定量的ｍ−ＲＮＡレベルを、対数増殖期および定常増殖期について逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して分析した。結果は、組換え発現タンパク質（ＶＨおよびＶＬ）についての一定のレベルのｍＲＮＡと共に、対数期および定常期の両方において一定のレベルのハウスキーピング遺伝子発現（アクチンおよびＧＡＰＤＨ）を示した。これらの結果は、両方とも対数増殖期および定常増殖期において等しく発現されるということの証拠を与える。定常期において生産性を下降させる理由は、転写後である可能性があるということが結論付けられ得る。
【０１０２】
１２．６  バッチ発酵についての産物品質の確認
バッチ発酵は、産物品質を分析し、かつ結果をスピナー産物の品質と比較するために標準的な条件（ｐＨ７．２、ＤＯＴ  ４０％、３７℃）下で実行した。一般的に、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭの産物品質は、スピナー産生産物（スピナー産物を表１に示す）とほとんど異ならない。バッチ培養物では抗体多量体が約２％という低い量であり、多量体の数はほとんど影響を受けない（スピナー培養産物における３％と比較して）。さらに、生物活性ＥＬＩＳＡは、スピナーおよびバッチ発酵の両方において高度な特異的結合を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥもまた、影響を受けない。グリコシル化プロファイルは、スピナー培養物のグリカンプロファイルと同等である。
【０１０３】
１２．７  結論  バッチ発酵
骨髄性白血病（ｍｙｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）を起源とするヒト細胞は、バッチ発酵において培養することができる。スピナー培養と比較して、バッチ発酵は、わずかに高い生産性（約１０％の増加、データ示さず）と共にわずかに改善された細胞密度をもたらす。細胞が撹拌機誘導性の剪断力に感受性でないので、発酵プロセスは、激しい撹拌で実行することができる。さらに、そのプロセスは、広範囲のｐＨ、ＤＯＴ、および温度設定点についての良好な増殖および生産性を与える発酵プロセス条件に対し高度な頑健性を示す。しかしながら、細胞は、エアレーションに対して感受性であり、よって、気泡は、限定流エアレーションを使用することによって避けられるべきである。そのため、高電力入力の適用は、物質移動が増加するので、有用である。生産性を増加させるために、灌流発酵を、下記に記載されるように実行する。灌流プロセスのために、プロセス条件を、バッチ培養から引き継ぐ。
【０１０４】
（実施例１３）
灌流
細胞保持を伴う連続発酵（灌流）が、良好な比生産性および高度に安定したグリコシル化と共に高い細胞密度で骨髄性白血病を起源とするヒト細胞の発酵を可能にすることが分かった。
【０１０５】
１３．１  結果
Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを使用すると、細胞は非常に高い生存率で増殖し、１０＊１０６細胞／ｍｌを超える細胞密度が達成された。結果（図２を参照）は、高度に再現可能であることが判明し、産物グリコシル化（ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭ）に関する不均質性は、見出さなかった。プロセスは、少なくとも３００時間の培養時間の間実行した。比生産性は、１日当たり２バイオリアクター容積の灌流速度で、最大約１００μｇ／（ｍｌ＊ｄ）に達する。平均の比生産性は、実験室規模発酵規模について約７０μｇ／（ｍｌ＊ｄ）であった。
【０１０６】
好ましい灌流プロセスを表２に示す。
【０１０７】
【表２】
2014500032.tif 000005
表２：好ましい灌流プロセス
１３．２  連続発酵における産物品質の確認
バッチ発酵においてすでに認められたように、産物品質は、顕著に頑健である。産物を生化学的に分析した。多量体に関して、３％の非単量体抗体の構成部分が存在し、これは、バッチ発酵と同等である。抗原ＥＬＩＳＡは、それが高度な特異的結合を示すので、基準内におさまる。さらに、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭのグリコシル化パターンは、２つの独立に実行した灌流操作において同様であるが、スピナー／バッチ産生産物と比較しても同様である。
【０１０８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）において、別々の軽および重抗体鎖についての明確なバンドがあった。重鎖（＝５０ｋＤａ）および軽鎖（＝２５ｋＤａ）は、予想されるようなサイズを示す。
【０１０９】
１３．３  灌流の間のグリコシル化
産物グリコシル化が、たとえば培地、機械的ストレス、または溶存酸素圧の変化によって影響を及ぼされ得るので、発酵の間に、グリコシル化パターンの発生を分析することは非常に重要になる。プロセスの頑健性に関して、産物グリコシル化は、分析されるべき最も重要なパラメーターのうちの１つである。
【０１１０】
ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ細胞系の産物グリコシル化は、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ｂを使用するＧＴ  Ｍ培地を用い、３７℃、４０％ＤＯＴ、ｐＨ７．２で実行する灌流操作について分析した。産物は、灌流プロセスの３日目〜２０日目の間に取得した試料について分析した。いくつかの変化にもかかわらず、グリコシル化パターンは、安定していると見なすことができる。
【０１１１】
結論付けると、プロセスの間のグリコシル化に変動はない。プロセスの頑健性および細胞系の頑健性に関して、発酵は、安定した産物グリコシル化を提供する。ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭの灌流発酵は、高度に純粋な生化学活性産物をもたらす。
【０１１２】
１３．４．結論
ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ細胞系の灌流プロセスは、高密度発酵の間の高い細胞生存率を特徴とする。灌流プロセスは、一定の産物品質およびとりわけ一定のグリコシル化パターンを特徴とする。発酵プロセスは、ｐＨ７．２、ＤＯＴ  ４０％、および３７℃の温度で制御する。細胞が高い剪断力に対して耐性であるので、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ細胞による発酵は、高い電力入力（０．０２２Ｗ／ｍ３）により実行することができる。
【０１１３】
（実施例１４）
種々の産生方法の比較
生化学的産物品質に関して、プロセス（スピナー、バッチ、フェドバッチ（データ示さず）、および灌流）はすべて、同様の高度に単量体の生物活性抗体を提供した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する分析により、多量体抗体が２〜３％の構成部分を占めるという結果が得られた。バッチおよびフェドバッチ発酵産物は、約２％の多量体を示したが、灌流は、なおスピナー産物と同等である約３％の多量体を示した。２〜３％の多量体の部分は、下流の処理（ＤＳＰ）の間に容易に除去することができ、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭについて、多モードの陰イオン交換カラムを適用する。ＤＳＰのこのステップの間に、宿主細胞タンパク質（ｈｃｐ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もまた、除去される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける追加の分析は、すべてのプロセスについての同等のタンパク質純度を示した。産物は、非還元条件下（抗体構造全体）および還元条件下（重および軽鎖の分離）で分析した。抗体鎖の同一性は、ウエスタンブロットを使用して確認した。生物活性に関して、試料はすべて、抗原結合ＥＬＩＳＡにおいて分析する。試料は、グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドに対する高度な結合、および非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドに対する非常にわずかな結合を示し、これは、すべてのプロセスについての基準を満たしていた。
【０１１４】
最も重要な特徴のうちの１つとして、抗体グリコシル化を、スピナー、バッチ、フェドバッチ、および灌流培養物について分析した。グリコシル化パターンは、非常に均質であった。グリコプロファイリングの複雑性により（セクション４．５．４もまた参照されたい）、＋／−４％の標準偏差を測定する。そのため、グリコシル化における変化＞５％のみを、有意であるとみなす
要約すると、グリコシル化パターンは、非常に頑健である。それは、弱い撹拌で、非通気のスピナー培養物と比較して変化がない。さらに、バッチ、フェドバッチ、および灌流プロセスが、それらの特性において異なるので（灌流は、より高い細胞濃度を示し、フェドバッチは、収集時のより低い生存率を示す）、それは、細胞濃度または細胞生存率に対して著しく感受性であるようではない。産物品質がすべてのバッチ、フェドバッチ、および灌流について高いので、焦点がＧＭＰに適したプロセスの開発に置かれるので、生産プロセスに対する選択は、生産性および経済上の考慮に基づいて成すことができる。
【０１１５】
（実施例１５）
スケールアップ
スピナー培養からＧＭＰ生産プロセスへの上流の処理スケールアップ（＞１０００倍）が、産物品質およびとりわけグリコシル化プロファイルを変えることなく、９０ｇまでの精製抗体を提供することが分かった。
【０１１６】
発酵を種々の規模で実行した。最も小さな規模（作業容積０．６ｌ）については、ＤＡＳＧＩＰの並列バイオリアクターシステムを使用した。１ｌおよび１０ｌ作業容積規模における培養を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓガラス製バイオリアクター（Ｂ−ＤＣＵ  ２ｌ、Ｂ−ＤＣＵ  ５ｌ）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓステンレス鋼リアクター（Ｃ−ＤＣＵ  １０ｌ）において実行する。さらに、１０ｌ  Ａｐｐｌｉｋｏｎガラス製バイオリアクターを使用した。最も大きな規模（１００ｌ）は、１００ｌ  Ａｐｐｌｉｋｏｎステンレス鋼発酵槽において実施した。したがって、発酵は、４つの異なる規模においてだけではなく、３つの異なる会社の発酵槽においても行った。係数１６６までの全スケールアップは、以下のステップを使用して行った：１：１．５：１６：１６６。形状特性に関して異なる特徴を示す、異なる会社の発酵槽を発酵に使用するので、エアレーションおよび撹拌、スケールアップは、さらに一層決定的になる。
１５．１  スケールアップ条件
スケールアップを実行する場合、細胞は、剪断力に関してとりわけ頑健でなければならない。２ｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ容器において４００ｒｐｍを使用する場合、細胞が剪断力によって損傷を被らないので、電力入力は、細胞が高度に剪断力抵抗性であるようなので、スケールアップ基準となるように選んだ。その結果として、特定の電力入力（容積当たりの電力入力）は、すべての異なる発酵槽サイズにおいて一定となるように選択する。一旦、電力入力がスケールアップ基準として選ばれたら、約Ｐｓｐｅｃ＝０．０２Ｗ／ｋｇの特定の電力入力を選択する。これは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ２ｌ発酵槽における３００ｒｐｍの撹拌機速度と等しい。この撹拌機速度は、優良な混合および均質化特性を示す。
【０１１７】
形状の類似性は、普通は、スケールアップにとって重要な前提条件であるが、好結果のアップスケールは、非常に多様な容器において実行することができる。表６は、基準として電力入力を使用する、好結果のアップスケールの結果を示す。Ａｐｐｌｉｋｏｎ  １０ｌ発酵槽に加えて、発酵槽はすべて、同様の特定の電力入力を維持することができる。両方のＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵槽が最大の可能性のある撹拌速度（ｒｐｍ）を使用することに注意すべきである。そのため、他の発酵槽と同じ特定の電力入力速度でＡｐｐｌｉｋｏｎ  １０ｌを操作することは可能ではない。
【０１１８】
【表３】
2014500032.tif 000006
表３：用いられる発酵容器の形状特性。最も共通の作業容積についての一定の電力入力に基づく撹拌機の撹拌［ｒｐｍ］。凡例：Ｄｉ：撹拌機直径；Ｄｔ：発酵槽直径；Ｈ：発酵槽高；Ｈｔ：上部の撹拌機の液体表面までの距離；Ｈｉ：撹拌機の間の距離；Ｈｂ：下部の撹拌機より下の距離。
【０１１９】
電力入力が、スケールアップの間に一定に保たれるので（設計の制限のためＡｐｐｌｉｋｏｎ  １０ｌを除いて）、剪断力は、スケールアップの間に増加する。計算した剪断力［Ｎ／ｍ２］を表４に示す。最大剪断力を、撹拌機先端について計算する。なぜなら、この区域が最も高度なエネルギー散逸の領域と見なされるからである。細胞増殖は影響を及ぼされないようであり、生存率はリアクター規模の増加と共に下がらないので、ＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭ細胞は、少なくとも０．９Ｎ／ｍ２の持続的な撹拌機誘導性の剪断応力に対して剪断抵抗性である。これは、０．１Ｎ／ｍ２の剪断速度で損傷を受けるＣＨＯ細胞と比較して、剪断抵抗の少なくとも１０倍増加に等しい［Ｍｏｔｏｂｕら  １９９８年］。
【０１２０】
【表４】
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表４：剪断および混合特性を示す種々の発酵槽についてのスケールアップの結果。計算は、表６に示すとおりバイオリアクター装置について実行する。
【０１２１】
１５．２  種々の規模の比較
灌流発酵のスケールアップは、１リットル、１０リットル、および１００リットルの規模での発酵を使用して実行した。図３は、３７℃、ｐＨ７．２、および４０％のＤＯＴで制御したＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ａ  ｈＰＭの３つの同様の発酵についての例示的な結果を示す。発酵は、図３（Ｄ）において示されるように、同様のフィーディング戦略を適用する灌流で実行する。灌流速度は、グルコース消費に依存して設定する。
【０１２２】
増殖および生産性に関して、実験室規模プロセスおよび１００ｌの生産規模の間にいくつかの差がある。＞１０＊１０６細胞／ｍｌの最大細胞濃度が達成される、より小規模の発酵（１ｌ作業容積）と比較して、細胞は、１０ｌおよび１００ｌ灌流において、６＊１０６細胞／ｍｌを超える高い濃度まで増殖しない。したがって、規模の増加と共にグルコース消費はより少なく、グルコース濃度は、１００ｌ規模について１．５ｇ／ｌ超で保たれる。細胞が通常、より高い濃度まで増殖する小規模発酵において、グルコースは１ｇ／ｌ未満の濃度まで消費される。
【０１２３】
異なる生存率および生存細胞濃度とは対照的に、すべての規模においてほとんど同じレベルの生産性がある。発酵はすべて、＞１００μｇ／（ｍｌｄ）の最大生産性を有し、非常に同等の生産性曲線をも示す。
【０１２４】
要約すると、スケールアップは、大量の産物を産生することができるプロセスを提供する。産物濃度は、すべての規模において同様である。最大の生産性は、＞１００μｇ／（ｍｌｄ）においてである。しかしながら、規模を増加させることで認識されることとなる生存率および最大細胞濃度において有意な減少がある。最大細胞濃度に関して、遠心分離機の細胞の保持は、有意な作用を有する。実験室規模においては＞９９％であるが、それは、生産規模において約９０％まで下がる。これは、最大細胞濃度の低下につながる一定のブリーディングをもたらす。
【０１２５】
１５．３  大規模灌流
大規模灌流操作は、Ａｐｐｌｉｋｏｎ  １００ｌ発酵槽において実施する。灌流を使用して、１００ｌ作業容積で操作する場合、最大で２５０ｌ培地／日を使用する。図４は、ＧＭＰ条件下で実行する３つの同等の１００ｌ灌流操作についての結果を示す。それらの発酵は、高度に再現可能である。発酵はすべて、確立された灌流プロセス条件を使用して実行した（上記を参照されたい）。３つの発酵はすべて、生産性および細胞増殖に関して同様の挙動を示す。最大細胞濃度は、６＊１０６細胞／ｍｌでピークに達し、その後著しく下がる。灌流の後期段階において、約３〜４＊１０６細胞／ｍｌの細胞密度が得られる。その結果として、細胞増殖が生産性と密接に関連付けられるので、比生産性で最大にもなる。比生産性は、約１００μｇ／（ｍｌ＊ｄ）でピークに達する。後期段階の間に、比生産性は、＜４０μｇ／（ｍｌ＊ｄ）まで下がる。生存率に関して、発酵は、＞９０％で始められるが、灌流の開始に際して約８０％まで下がる。
【０１２６】
グリコシル化パターンは測定変動の範囲内で３つの発酵すべてについて一定であった。
【０１２７】
１５．４  結論  スケールアップ
スケールアップは、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ連続遠心分離機を使用する灌流プロセスに適用した。発酵設備は、ある限界、たとえば異なるエアレーション装置を使用する異なるバイオリアクタータイプ、異なる形状特性、撹拌における制限（速度、撹拌機の数）を設ける。細胞が、高度に剪断力抵抗性であることが判明しているので、電力入力をスケールアップ基準として使用する。これは、発酵槽サイズの増加と共に、撹拌機誘導性の剪断力の増加をもたらすが、実験室規模において十分な混合を提供する。それにもかかわらず、スケールアップは、一定の産物グリコシル化を伴う高生存の高密度培養物をもたらした。産物品質（ＳＥＣ、バイオアッセイ、グリコプロファイル（ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌｅ）によって測定される）は、スケールアップによって一般的に不変である。発酵は、９０ｇまでの抗体（下流の処理の前の量）の産生について好結果に実現される。１ｌ、１０ｌ、および１００ｌバイオリアクターの質的および量的性能評価を通して、また、生化学的特徴付け試験のパネルを通して、プロセスおよび産物の同等性は、スケールアップのプロセスの間に十分に維持されたことが実証された。
【０１２８】
（実施例１６）
培養培地
細胞は、異なる培地を使用して、懸濁物中で培養した。主に使用した培地は、ｘ−Ｖｉｖｏ２０（Ｌｏｎｚａ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＧＴＭ−１（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−２（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−３（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−４（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−５（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−６（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−７（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＴＭ−８（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＧＴＭ  Ｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。培地は、追加の栄養素を補充した基礎培地に基づく。ＧＴＭ培地の一般的な命名法を表６に示す。
【０１２９】
【表５】
2014500032.tif 000008
表６：ＧＴＭ培地の概要
上記に議論されるように、電力入力は、好ましくは、スケールアップ基準として使用される。続く等式は、撹拌機速度（Ｎ）、撹拌機直径（ｄｉ）、培地密度（ｐ）、および撹拌機定数（Ｎｅ）に依存性の電力入力（Ｐ）計算の基本的な式を示す。
【０１３０】
【数３】
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理論上、容器直径に対する羽根車直径の比（ｄｉ＝ｄｔ）が一定に保たれる場合、スケールアップの間の撹拌機速度は、一定に保つことができる。それにもかかわらず、これは、バイオリアクター容器寸法によりほとんどの場合、可能ではない。発酵容積に対して電力入力を相関させるために、特定の電力入力（Ｐｓｐｅｃ）を計算することができる。特定の電力入力は、よく使用されるスケールアップ基準である。プロセスにそれを適用するために、細胞は、バイオリアクター容積（Ｖ）と共に増加する剪断力に対してかなり非感受性でなければならない。続く等式は、特定の電力入力の計算を示す。
【０１３１】
【数４】
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先端速度は、撹拌機直径および撹拌速度とともに直線的に増加する。そのため、一定の先端速度（ｖＴｉｐ）は、大きな容器において毎分回転数（ｒｐｍ）の減少をもたらす。これは、大きな容器における、より大きな撹拌機直径に直接依存する。これは、弱い混合または細胞沈降さえもたらし得る十分な電力入力がない可能性がある。その結果として、一定の撹拌機先端剪断速度でのスケールアップは、極度に剪断感受性の細胞に対してのみ適用することができる。続く等式は、撹拌機直径および撹拌機速度に依存性の撹拌機先端速度についての計算を示す。
【０１３２】
【数５】
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バイオリアクターにおいて、最大の剪断力は撹拌機の外側で起こる。そのため、剪断速度は、
【０１３３】
【数６】
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上記の式を使用して、撹拌機先端で計算されるべきである。剪断速度は、撹拌速度（Ｎ）、撹拌機直径（ｄｉ）、および動粘性率（ｖ）に依存性である。この作業において、たとえ高細胞濃度がそれを増加させるかもしれなくても、動粘性率は、一定として仮定される。
【０１３４】
【数７】
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スケールアップ基準として撹拌機先端剪断速度を使用することは、発酵槽サイズの増加と共に撹拌速度（ｒｐｍ）の減少をもたらす。前に述べられるように、弱い混合または細胞沈降さえ生じ得る。その結果として、極度に剪断感受性の細胞では、一定の撹拌機先端剪断速度でのスケールアップが好ましい。本発明により使用される細胞は、剪断抵抗性である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【国際調査報告】
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