(57)【要約】  本発明は、選択的トリプシン様セリンプロテアーゼ活性依存型プローブ、とりわけウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子活性依存型プローブ、その使用及び上記プローブを使用する選択的なウロキナーゼ活性の検出方法に関する。【選択図】図１
2014518859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2014518859.tif 000018
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、ＯＨ、−ハロ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ７及びＳＯ２−Ｒ８を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、−Ｏ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルを含む群から各々独立して選択され；
Ｒ７及びＲ８は、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、及び−ＮＲ９Ｒ１０を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、−グアニジノであり；
Ａは、直接結合及びＣ１〜６アルキルを含む一覧から選択され；
Ｌは、−ＳＯ２−Ｒ４−アミド−；−ＳＯ２−Ｒ４−スルホンアミド；−ＳＯ２−Ｒ４−トリアゾール−；−ＳＯ２−Ｒ４−尿素−；−ＳＯ２−Ｒ４−アミン；−ＳＯ２−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−アミド−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−カルバメート−；−Ｒ４−アミド−、−Ｒ４−スルホンアミド−；−Ｒ４−トリアゾール−；−Ｒ４−尿素−；−Ｒ４−アミン−；−Ｒ４−カルバメート−を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍ、ｎ及びｏは、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
Ｙは、検出可能な標識を表す）
の化合物、又はその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物。
【請求項２】
前記式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノでり、パラ位にあり；
Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−トリアゾール−であり；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２、３又は４であり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｏは、１、２、３又は４であり；
Ｙは、検出可能な標識を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記検出可能な標識が、磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波、核医学画像法、マルチモーダル画像法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査、質量検出器、波長検出器、燐光画像法、化学発光画像法等を含む一覧から選択される方法によって機器により検出することができる基である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記検出可能な標識が、放射性同位体、蛍光色素分子、ＭＲＩ用造影剤（即ち常磁性金属）、Ｘ線反応剤、及びビオチン標識又はそれらの派生物から選択される、請求項１〜３のいずれかに一項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の調製への式ＩＩ：
【化２】
2014518859.tif 000019
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、ＯＨ、−ハロ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ７及びＳＯ２−Ｒ８を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、−Ｏ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルを含む群から各々独立して選択され；
Ｒ７及びＲ８は、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、及び−ＮＲ９Ｒ１０を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、−グアニジノであり；
Ａは、直接結合及びＣ１〜６アルキルを含む一覧から選択され；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アルキン、又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍ、ｎ及びｏは、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
の中間体。
【請求項６】
前記式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アルキン−、又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２、３又は４であり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｏは、１、２、３又は４である、請求項５に記載の中間体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項８】
トリプシン様セリンプロテアーゼを対象とする活性依存型プローブとして使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼ活性の検出への、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の解析への、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の可視化への、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
ヒト又は動物においてがん細胞の可視化への、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物を、前記ヒト又は動物に投与することと、標識化化合物により発生するシグナルを検出することとを含む、方法。
【請求項１４】
がん細胞がトリプシン様セリンプロテアーゼを発現する、請求項１２に記載の化合物若しくは組成物、又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物を、前記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法。
【請求項１６】
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項７に記載の組成物を種々の時間点（即ち、治療前、治療中及び／又は治療後）に前記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が前記治療が効果的であることを示す、方法。
【請求項１７】
前記種が、タンパク質含有材料、細胞溶解物、細胞、組織溶解物、組織、動物及びヒトを含む一覧から選択される、請求項９に記載の使用、請求項１０若しくは１１に記載の化合物若しくは組成物、又は請求項１５若しくは１６いずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記トリプシン様セリンプロテアーゼがウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）である、請求項９に記載の使用、請求項８、１０若しくは１１に記載の化合物若しくは組成物、請求項１２に記載の化合物、組成物若しくは方法、又は請求項１３若しくは１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）活性依存型プローブ、その使用、並びに上記プローブを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｕＰＡ活性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリプシン様（Ｓ１）ファミリーのセリンプロテアーゼは、消化、血液凝固、及び免疫を含む多くの主要な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。さらに、多くのＳ１セリンプロテアーゼは、がん１〜３、創傷治癒４、５、関節炎６、皮膚疾患、ＡＬＳ７、感染症８等の疾患に関与する。Ｓ１ファミリーの全メンバーは、オキシアニオンホール及びＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐアミノ酸（触媒三残基）からなる触媒部位を含む同様のタンパク質フォールディングを有する。典型的には、このファミリーのメンバーは、深いＳ１ポケットを有し、このポケットの底部にはマイナスに帯電しているＡｒｇ残基がある。
【０００３】
多くの膜固定型セリンプロテアーゼは、ヒトがんにおいて異常発現し、疾患状態のバイオマーカー指標として示唆されてきた９。根拠は、ヒトがんにおける発現研究、そして場合によってはマウス発癌モデルに由来する。これに関する重要なトリプシン様セリンプロテアーゼはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）である。ｕＰＡは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子系（ｕＰＡＳ）のメンバーであり、がん浸潤及びがん転移のプロセスに関与する。ｕＰＡは、単鎖酵素前駆体（ｐｒｏ−ｕＰＡ又はｓｃ−ｕＰＡ）として合成及び分泌され、その受容体（ｕＰＡＲ）に結合した後、Ｌｙｓ１５８−Ｉｌｅ１５９ペプチド結合の開裂を介して、活性な二重鎖形（ｔｃ−ｕＰＡ）へと活性化される。活性化は、プラスミンによって引き起こされる。ｕＰＡがその膜結合受容体（ｕＰＡＲ）に付着した場合、プラスミノーゲンがプラスミンへと活性化する。プラスミンは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の破壊において重要な役割を果たす。それは、直接的に、及び／又は特定のマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性化を介して、一部のＥＣＭ構成成分（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカン及びフィブリン）を分解することができる。さらに、ｔｃ−ｕＰＡ、プラスミン及びＭＭＰは、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）及びＴＧＦ−β（形質転換増殖因子）のような、一部のマイトジェン因子、遊走促進（motogenic）因子及び血管新生増殖因子を放出／活性化することができる。ｕＰＡ／ｕＰＡＲ系の主要な内因性のインヒビターは、ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１）であり、これは、その受容体と関連する活性型ｕＰＡに結合し、複合体の細胞内移行を行う１０〜１２。
【０００４】
がん治療及びがんバイオマーカー１３〜１５の有効な標的とは別に、ｕＰＡは、関節炎１６、アテローム性動脈硬化、黄斑変性１７、創傷治癒１８、ＡＬＳ７及びてんかん１９等が挙げられるがこれらに限定されないその他の疾患に対する標的及びバイオマーカーとしても言及されている。
【０００５】
がんにおけるｕＰＡの重要性を強調する例はわずかである。
【０００６】
原発性乳房腫瘍組織における高レベルのｕＰＡ及び／又はＰＡＩ−１は、腫瘍の悪性度及び患者の予後不良と関連している２０。また、その他のタイプ（例えば、子宮内膜、前立腺、直腸結腸）のがんに関する、ｕＰＡ及びＰＡＩ−１と腫瘍の進行及び患者の予後との関係も示されている。さらに、乳がんに関する腫瘍マーカーの臨床的有用性の格付けにおいて、最も高いＬＯＥ（証拠レベル）が達成された２１。したがって、ｕＰＡは、有効なバイオマーカーであり、ｕＰＡの可視化／標識化は、診断及び／又は治療ガイダンスの強力なツールとなるであろう。
【０００７】
上述の内容について、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ環境において定性的及び定量的な方式でｕＰＡの触媒活性を可視化又は捕捉することができる化学的ツールは、種々の非臨床的適用及び臨床的適用に極めて有用であろうことが認識されている。活性依存型プローブは、機構的に関連するクラスの酵素と反応する特別に設計された化学プローブである２２。プローブは、典型的には２つの要素、即ち、反応基及びタグからなる。加えて、一部のプローブは、選択性を増強する結合基を含み得る。反応基は、通常、活性型酵素の活性部位において求核残基に共有結合する求電子物質を含む。タグは、蛍光色素分子等のレポータータグ又は可視化タグ、ビオチン等の増強手段、又はレポータータグ、可視化タグ又は増強手段を導入するアルキン若しくはアジドであってもよいがこれらに限定されない。そのようなタグ化プローブを得るのに好適なあらゆる化学反応、例えばヒュスゲン１，３−双極性付加環化（クリックケミストリーとも呼ばれる）２３等を使用することができるが、これらに限定されない。
【０００８】
活性依存型プローブ技術の主な利点は、タンパク質又はｍＲＮＡの存在量に限定されず、酵素活性部位の可用性を直接的にモニタリングすることができることである。内因性インヒビターと相互作用することの多いセリンプロテアーゼ、又は非活性型酵素前駆体として存在するセリンプロテアーゼ等の酵素群により、この技術は、活性よりも存在量に頼る従来の技術を上回る価値のある利益を提供する。最も重要なことは、化学プローブを用いた実験から強固な結論を導くため、後者は、或る特定の品質基準を満たさなければならない。Nature Chemical Biology （March 2010）では、化学プローブに関して最近焦点となっている問題について、何人かの著者らがこれらの品質基準について考察している２４、２５。
【０００９】
有効性：化学プローブは、そのタンパク質標的に対して高い親和性を有する必要がある。不可逆的プローブの場合、プローブのその標的（複数の場合もある）への共有結合は、十分に迅速に進行しなければならない。
【００１０】
選択性：これはおそらく最も重要な基準である。標的のプロファイリング及び標的の可視化実験の間、メカニズムに関する確固たる結論を得ることを目的とするのであれば、化学プローブには高い選択性が間違いなく必要不可欠である。化学プロテオミクスは、化学プローブの確実な標的選択性を確定するのに必須となる新たな規律である。
【００１１】
共有結合性バインダー：優良な薬剤と優良な化学プローブの相違は、それらの標的との相互作用の性質にある。製薬業界には、（多くの例がその反対であることを証明しているにも関わらず）不可逆的インヒビターは望ましくない毒性プロファイルを有するという強い先入観が存在する。不可逆的な化学プローブに関して、生物学的標的の長期に亘る化学的ノックダウンは、分子標的と、その標的を調節するより幅広い生物学的結論との関連性を立証するであろう。また、画像化目的及びＭＳに基づく化学プロテオミクスの実験のため、プローブと標的との間の強固な共有結合（covalent link）が有利である。
【００１２】
触媒活性との相関：酵素について、化学プローブは、標的酵素の触媒的に活性な画分のみをモニタリングしなければならない。
【００１３】
細胞透過性：膜透過性は、細胞内標的の前提条件である。
【００１４】
安定性：プローブは、それらが使用される条件（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ）下で十分に長い半減期を有していなければならない。
【００１５】
多用途性：理想的には、同一のプローブを、種々のレポータータグ及び可視化タグにより多目的に誘導体化することができる。
【００１６】
非特異的活性依存型プローブ、ペプチドプローブ、内部消光蛍光基質（internally quenched fluorescent substrates）及び抗体等のタンパク質をモニタリングする既存の技術はいずれも以下の１以上の欠点、即ち、有効性及び選択性の欠如、共有結合を形成せずタンパク質活性と相関がないこと、細胞透過性及び安定性が低いこと、レポータータグ又は画像化タグによる直接的な誘導体化ができないことに悩まされている。
【００１７】
次の段落において、本発明者らは、非特異的活性依存型プローブ（ＡＢＰ）、ペプチド構造を有する活性依存型プローブ、内部消光蛍光基質及び抗体に基づく既存の技術に関連する欠点を更に考察する。
【００１８】
非特異的ＡＢＰは、酵素ファミリー及びスーパーファミリー全体を標的とする２２。例えば、Cravatt他によって開発された、ローダミンでタグ付されたフルオロホスホネートプローブ（ＦＰ−ローダミン）又はビオチンでタグ付されたフルオロホスホネートプローブ（ＦＰ−ビオチン）が挙げられる２６。ＦＰ−ビオチンは、プロテオーム中の代謝的に活性なセリン加水分解酵素の８０％超を標識化可能であることが示されている２７。これらのプローブの主な欠点は選択性が欠如していることである。プローブの選択性は、その自然バックグラウンドにおける或るタンパク質標的の選択的なモニタリング、可視化及び検証の基本原則である。
【００１９】
現行の技術水準は、プロテアーゼを標的とする活性依存型プローブにおいて、通常、理想的にはプロテアーゼの活性部位の内部又は近辺の結合部位によって特異的に認識されるペプチド部分を導入することによって選択性を取得することを教示している２８、２９。しかしながら、これらのペプチド化合物には、ペプチドの欠点、即ち、低い膜透過性及び代謝不安定性がある２３。
【００２０】
プロテアーゼの触媒活性の画像化は、内部消光蛍光基質を用いて行われている。これらのプローブは、互いに近接した一対の蛍光色素分子及び消光単位を含み、蛍光色素分子を検出不可能とする。標的プロテアーゼによって消光基質が開裂した後のみ、そのクエンチャーから蛍光色素分子が放出されて蛍光シグナルを検出することができる３０。Ralph Weissleder他のグループは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍においてプロテアーゼ活性を画像化するこれらの活性化可能なプローブの開発について大規模に研究してきた３１、３２。この技法は、とりわけ、カテプシンＢ及びＭＭＰに対して実証されている。ここでも主な制限は、本質的には上述のペプチド基質の使用に関連するものである。
【００２１】
さらに、画像化は蛍光発光に制限される。おそらく、最大の欠点は、標的との共有結合が形成されず、蛍光色素分子の急速な拡散が生じ、それゆえに高解像度の局在研究における使用に限定されることである。近年、比較研究において、ペプチドＡＢＰが消光基質プローブよりも優れていることが示されている２３。
【００２２】
最後に、生物学的マトリクスにおけるタンパク質標的の存在を示すためにモノクローナル抗体が多く使用される。これらの抗体は、高い有効性と選択性を伴って結合するが、それらは共有結合を形成しない。認識されるエピトープによっては、触媒的に活性でない酵素をも検出される。また、抗体は、上述の巨大な生体分子固有の欠点を有している。
【００２３】
上記考察を鑑みて、本発明者らは、新規な選択的非ペプチドプロテアーゼ結合単位と種々のタイプの可視化タグ又はレポータータグとの有効な組み合わせを可能とし、同一のプロテーゼ結合単位を有しながらも全く異なるタイプのレポータータグ又は可視化タグを有する活性依存型プローブの収集につながる、活性依存型プローブのモジュール的アプローチの開発に努めてきた。そのような収集により、既存の生物学的な課題に適用される種々の画像化／可視化技法の結果を迅速に評価し、又は更にはそれらを組み合わせることができるかもしれない。可視化タグ／レポータータグは、可視領域（例えばローダミン）若しくは近赤外領域（ＮＩＲ）（例えば、ＢＯＤＩＰＹ）由来の種々の蛍光色素分子、金属イオンに対するキレート剤（ＭＲＩにはガドリニウム、又はＳＰＥＣＴには９９ｍＴｃ）、及びＰＥＴに対する１８Ｆ標識化分子であり得る。化学プローブは、生命科学（例えば、画像化、組織学、プロテオミクス等）への種々の適用のみならず、あらゆる産業プロセスでの品質管理に関するツールとして使用され得る。
【００２４】
上記考察より、標的と共有結合を形成する頭部（warhead）と多用途の誘導体化のための手段とを含む選択的に結合する非ペプチドプローブは、科学的及び技術的な技術水準を向上するであろうことが明らかである。本発明者らが知る限り、ｕＰＡを標的とするそのようなプローブは、科学文献及び特許文献に記載されていない。
【００２５】
次の段落において、本発明者らは、トリプシン様ファミリーを標的とするプローブに関する最も近い技術水準、及び本発明者らの新規なプローブと比較した際のそれらの欠点について述べる。
【００２６】
２００８年、Oikonomopoulou他は、捕捉抗体に連結されたペプチド活性依存型プローブを用いたツールを報告している３３。プローブは、カリクレイン６の認識に関与するｐｒｏ−ｌｙｓペプチド断片の周囲に構築されていた。当該分野の専門家らであれば、Oikonomopoulou他によって述べられているプローブに関連する選択性の問題に対処するため、抗体アプローチが必要であることに同意するであろう。このプローブは、Pan他によって以前に説明されていた３４。この論文は、このプローブの非選択性を明確に示した。β−トリプターゼ、トリプシン、トロンビン及びプラスミンに対するＫｉ（ａｐｐ）は、同程度（０．６μＭ〜６μＭ）であった。Pan他は、プロリン残基の組み込みは、単一アミノ酸Ｌｙｓプローブと比較した全体的な反応性を増加するということを明確に述べた。しかしながら、これは、選択性プロファイルの変化を伴わない、わずかな活性の増加にすぎなかった。
【００２７】
Brown他による、より最近の公表論文は、共にトリプシンフォールド（trypsin fold）Ｓ１Ａプロテアーゼのメンバーである、マトリプターゼを標的とするホスホネート−ＡＢＰ、及びトロンビンの合成及び評価を報告している２９。Brown他は、広い特異性を持つホスホネートＡＢＰ及び特異的Ｓ１ＡプロテアーゼＡＢＰの設計には、ペプチド配列が必要であると述べている。加えて、ホスホネートの脱離基、ペプチド配列、ペプチド長及びペプチド安定性は、有効性を高める重要な要素として示されている２９。最も有効なペプチド含有プローブは、マトリプターゼに対するＩＣ５０値０．０６８μＭ及びｋｉ  ４９０Ｍ−１ｓ−１を有し、これはかなり少ない。さらに、提示されているプローブのＩＣ５０値は、長期のプレインキュベーション期間（４時間）の後に取得されており、反応が遅いという特徴を強調している。
【００２８】
２０１１年、特定のプロテアーゼの検出用の特定のジフェニルホスホネートプローブ群に関する特許文献１が、公開された３５。しかしながら、この特定の発明は、Ｐ１における天然アミノ酸ジフェニルホスホネート誘導体（例えば、バリル基、フェニルアラニル基、アルギニル基又はリシル基）を有する具体的分子を開示している。さらに、特許文献１に開示される全ての化合物は、スクシニル部分を含み、これは上記化合物に必須と考えられている。そのようなスクシニル部分は、バイオマーカーの認識、バイオマーカーに対する化合物の選択性、シグナル対ノイズ比の改善、及び化合物の分解耐性に極めて重要かつ必須であることが明らかとなっている。実際、化合物への小さい化学的修飾であっても予想に反して劇的にその活性プロファイル及び選択性プロファイルを変化し得ることから、一般的にペプチジル部分又はスクシニル部分は優れた特徴を有するタグ化ジフェニルホスホネートプローブの製造に必須であると考えられるのは当然である。したがって、ペプチジルリンカー又はスクシニルリンカーが活性依存型プローブを改良することが提言された。したがって、一般的な教示を前提とすると、ペプチジルリンカー又はスクシニルリンカーを使用せずに、タグ化ジフェニルホスホネートプローブが優れた活性依存型特性を有する化合物をもたらすことは予想されていなかった。一般的な教示に鑑みて、なおも驚くべきことに、本発明において開示される化合物は、ペプチジル部分及び／又はスクシニル部分を必要とすることなく、優れた活性依存型特性を有することが見出された。
【００２９】
最も密接に関連する適用は、ｕＰＡに対する内部消光蛍光基質を用いたｕＰＡ活性のｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏ画像化のためのツールである３６。使用されるプローブは高分子量であってペプチドの特徴を有し、蛍光色素を含むペプチド断片を放出する３６。標的酵素の共有結合的標識化は達成されないであろう。上記段落からわかるように、これは、おそらくｕＰＡ活性を可視化又は捕捉するのに最も理想的なプローブではない。
【００３０】
非常に選択的かつ有力な方法でｕＰＡと反応する非ペプチドジフェニルホスホネート不可逆的結合インヒビターを説明する密接に関連する技術水準は、Joossens他によって開示されている３７。記載されるインヒビターは、画像化プローブとしてではなく、有効な薬剤候補として発明されたものである。当業者であれば、可視化タグと組み合わされたリンカーのような大きな置換基を組み込みながらも、同時に有効性及び選択性を維持することは明らかではないことを認識するであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２０１１／０２４００６明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
小さな不可逆的ｕＰＡインヒビターＵＡＭＣ−００１５０３７及びＵＡＭＣ−００２５１３７に基づき、本発明者らは、選択的にｕＰＡを標的とする、反応速度の早い結合パラメーター（fast kinetic binding parameters）を示し、１５分という短時間のインキュベーション期間の後に高いＩＣ５０値を示す、第一の活性依存型プローブを設計した（図１）。前臨床及び臨床の場におけるそれらの使用において、反応の速度は有益となるであろう。凝固及び線維素溶解に関与する４種の密接に関連したセリンプロテアーゼ（ｔＰＡ、トロンビン、プラスミン及びＦＸａ）と選択性を比較した。この選択性プロファイルは、既に言及したトリプシン様セリンプロテアーゼに対する既存のプローブのプロファイルよりも著しく優れており、これらと比較して、本発明者ら自身のプローブは、重要な血液凝固酵素を妨げることがないことから、ｉｎ  ｖｉｖｏの場における使用に好都合であろう。また同様に、ｔＰＡに対するそれらの選択性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適用（例えば、組織学における腫瘍の可視化）においてより明確なプロファイルを示唆することが期待できる。
【００３３】
本発明者らが、ｕＰＡに対して同様の選択性及び活性を保持しながらアルファアミノ（例えば、メチルカルバメート）に結合された小さな基を大きな置換基によって置換することができたという事実は予想外のことであった。リンカー、特にアジド／アルキン−アルカン／ポリエチレンリンカーによるメチルカルバメートの置き換えは、ｕＰＡに対する活性にわずかな影響しか与えない。大きなローダミンがこれらの分子に連結されたとしても、有効性はわずかに低下するのみであり（１０倍）、依然として極めて良好な選択性プロファイルを保持する。これらのプローブは、現在まで、血液凝固及び線維素溶解カスケードのプロテアーゼを妨げない、ｕＰＡを対象とする最も有効で選択的なプローブである。
【００３４】
本発明において提示されるプローブは、密接に関連するBrown他の公表論文２９において提示されるものとは非常に異なるものである。
【００３５】
１）本発明によるプローブは、有効ながんバイオマーカーであるｕＰＡを標的とするものであり、Brown他のものはマトリプターゼ（本発明時点で有効なバイオマーカーではない）に対するものである。
【００３６】
２）本明細書に提示されるプローブは、より速い阻害反応速度を有する。Brown他により取得されたマトリプターゼに対する最も高い二次阻害定数（second
order inhibition constant）は、４９０Ｍ−１ｓ−１であったが、本発明者らのものはｕＰＡに対して１０倍高い（良好な）ものであった（４０００Ｍ−１ｓ−１）。重要な点は、本発明者らのものは、全てのＩＣ５０アッセイにおいて基質を添加する前にプローブ酵素混合物に対して僅か１５分のインキュベーション期間を使用したのに対し、Brown他は４時間であり、結合反応速度が最善のものではないことが反映されている。
【００３７】
２）Brown他によって明確かつはっきりと述べられているように、Brown他の公表論文のプローブはこの有効性を取得するためにペプチドテイルを必要とする。プロテアーゼ結合部分が可視化タグに直接的に結合されたプローブは、二次阻害定数５０Ｍ−１ｓ−１を取得したにすぎない。さらに、トロンビンに対するＩＣ５０値０．０９７μＭは、マトリプターゼに対する選択性を示唆するものではない。加えて、そのドメインにおけるBrown他自身の見解によれば、Brown他は、ジアリールホスホネート活性依存型プローブを用いて一般的に許容され得る結合反応速度を得るためにはペプチドテイルが必須条件であると予想している。本発明者らは、背景技術の項において、ペプチドの特徴は、前臨床及び臨床での使用のためのプローブ設計には不利であると説明した。
【００３８】
３）Brown他のプローブは、トロンビンと比較してマトリプターゼに選択的ではない。これは、凝固及び線維素溶解カスケードの阻害に影響を与える可能性がある。このカスケードのその他の酵素の阻害に関する情報について、全く言及されていない。本発明において提示されるプローブは、プラスミン、ｔＰＡ、トロンビン及びＦＸａに対して少なくとも１００倍の選択性を示す。
【００３９】
４）Brown他によって提示されるプローブは、可視化タグ／レポータータグを変更する可能性について示されなかった。さらに、ビオチンのみが［ストレプトアビジン−蛍光色素分子］複合体の添加を介して標的酵素を示す間接的可視化タグとしてここに提示されている。
【００４０】
一般に、Brown他の論文は、その他の公表論文と一致して、有効で選択的なジフェニルホスホネートプローブを取得するためにはペプチドの特徴が必要であると教示している。本発明において、本発明者らは、最適なプローブ設計のために、全ての特徴（即ち、共有結合性バインダー、非ペプチドの特徴、低分子量及び種々の可視化タグを柔軟に組み込むことができること）を有する非ペプチド型プローブの取得が可能であることを証明した。
【００４１】
Martin他は、２０１１年にジフェニルホスホネートプローブに関する発明を開示した３５。この発明は、必須のスクシニル部分と組み合わせて、Ｐ１においてアルギニル、バリル、フェニルアラニル及びリシルを有する特定のプローブを使用する方法論を記載している。興味深いことに、提示されたプローブの選択性及び有効性に関するデータについては何ら記載されていない。Pan他のデータに基づき３４、本発明者らは、これらのプローブは、おそらく有効ではなく選択的ではないと結論づけることができた。本発明者らの調査より、アルギニル部分は選択的かつ有効なｕＰＡプローブを設計するうえで理想的なＰ１修飾ではないと、本発明者らは理解している３７。記載される発明において、種々の可視化タグの柔軟な組み込みを可能とする手段は予測されていない。
【００４２】
小さな非ペプチド分子との選択的かつ有効なｕＰＡ共有結合に関する最も近い技術水準は、２００７年にJoossens他により発表された３７。しかしながら、これらの近年開示された分子は、画像化プローブとして有用な特性を全く有していない。さらに、大きな置換基を組み込み、最適なプローブの特徴を導く十分な有効性及び選択性を維持することは明らかではない。Ｐ１残基並びにリンカー及び可視化タグに直接的に結合されたジフェニルホスホネート頭部のみを含むほとんどの分子プローブは、特定の標的の非選択的で有効な共有結合性バインダーである３４。
【課題を解決するための手段】
【００４３】
第１の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2014518859.tif 000003
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、ＯＨ、−ハロ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ７及びＳＯ２−Ｒ８を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、−Ｏ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルを含む群から各々独立して選択され；
Ｒ７及びＲ８は、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、及び−ＮＲ９Ｒ１０を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、−グアニジノであり；
Ａは、直接結合及びＣ１〜６アルキルを含む一覧から選択され；
Ｌは、−ＳＯ２−Ｒ４−アミド−；−ＳＯ２−Ｒ４−スルホンアミド；−ＳＯ２−Ｒ４−トリアゾール−；−ＳＯ２−Ｒ４−尿素−；−ＳＯ２−Ｒ４−アミン；−ＳＯ２−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−アミド−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−カルバメート−；−Ｒ４−アミド−、−Ｒ４−スルホンアミド−；−Ｒ４−トリアゾール−；−Ｒ４−尿素−；−Ｒ４−アミン−；−Ｒ４−カルバメート−を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍ、ｎ及びｏは、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
Ｙは、検出可能な標識を表す）
の化合物、又はその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を提供する。
【００４４】
好ましい化合物群は、上記式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−トリアゾール−であり；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２、３又は４であり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｏは、１、２、３又は４であり；
Ｙは、検出可能な標識を表す、式Ｉによる化合物が好ましい。
【００４５】
本発明による検出可能な標識は、磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波、核医学画像法、マルチモーダル画像法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査、質量検出器、波長検出器、燐光画像法、化学発光画像法等を含む一覧から選択される方法によって機器により検出することができる基であることが意図される。
【００４６】
本発明の更なる態様は、式Ｉによる化合物を調整する式ＩＩ：
【化２】
2014518859.tif 000004
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、ＯＨ、−ハロ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ７及びＳＯ２−Ｒ８を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、−Ｏ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルを含む群から各々独立して選択され；
Ｒ７及びＲ８は、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、及び−ＮＲ９Ｒ１０を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、−グアニジノであり；
Ａは、直接結合及びＣ１〜６アルキルを含む一覧から選択され；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アルキン、又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍ、ｎ及びｏは、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
の中間体を提供することである。
【００４７】
好ましい中間体群は、上記式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アルキン、又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２、３又は４であり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｏは、１、２、３又は４である、式ＩＩによる中間体である。
【００４８】
特に、本発明の化合物及び上記化合物を含む組成物は、トリプシン様セリンプロテアーゼを対象とする活性依存型プローブとして非常に有用であり、したがって特に、
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼ活性の検出；
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の解析；
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の可視化；
ヒト又は動物におけるがん細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現するがん細胞の可視化；
ヒト又は動物における細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現する細胞の可視化；
に使用することができる。
【００４９】
本発明の更なる態様は、
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、上記ヒト又は動物に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法；
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、上記種に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法；
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、本発明による化合物又は組成物を種々の時間点（即ち、治療前、治療中及び／又は治療後）に上記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が、上記治療が効果的であることを示す、方法；
を提供することである。
【００５０】
本発明の具体的な好ましい実施態様において、本発明において使用されるトリプシン様セリンプロテアーゼは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】不可逆的インヒビターＵＡＭＣ−００１５０／ＵＡＭＣ−００２５１に基づいたｕＰＡを標的とする活性依存型プローブの略図である。
【図２】クリッカブル（clickable）プローブ及び官能化プローブを取得するための一般的な合成模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
これより、本発明を更に説明する。以下の節では、本発明の種々の態様を更に詳細に規定する。そこで規定された各々の態様は、そうではないことが明確に示されていない限り、他の任意の態様（単数又は複数）と組み合わせてもよい。特に、好適又は有利であると示される任意の特徴を、好適又は有利であると示される他の任意の特徴（単数又は複数）と組み合わせてもよい。
【００５３】
上述のように、第１の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化３】
2014518859.tif 000005
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、ＯＨ、−ハロ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ７及びＳＯ２−Ｒ８を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、−Ｏ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルを含む群から各々独立して選択され；
Ｒ７及びＲ８は、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、及び−ＮＲ９Ｒ１０を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、−グアニジノであり；
Ａは、直接結合及びＣ１〜６アルキルを含む一覧から選択され；
Ｌは、−ＳＯ２−Ｒ４−アミド−；−ＳＯ２−Ｒ４−スルホンアミド；−ＳＯ２−Ｒ４−トリアゾール−；−ＳＯ２−Ｒ４−尿素−；−ＳＯ２−Ｒ４−アミン；−ＳＯ２−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−カルバメート−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−アミド−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−スルホンアミド−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−トリアゾール−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−尿素−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−アミン−；−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−Ｒ４−カルバメート−；−Ｒ４−アミド−、−Ｒ４−スルホンアミド−；−Ｒ４−トリアゾール−；−Ｒ４−尿素−；−Ｒ４−アミン−；−Ｒ４−カルバメート−を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍ、ｎ及びｏは、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
Ｙは、検出可能な標識を表す）
の化合物（その立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を含む）を提供する。
【００５４】
本発明の化合物を説明する場合、使用される用語は、文脈上他に指示がない限り、以下の定義に従って解釈されるものとする：
【００５５】
「アルキル」という用語は、それ自体が又は別の置換基の一部として、式：ＣｘＨ２ｘ＋１（式中、ｘは１以上の数である）の完全に飽和した炭化水素を指す。概して、本発明のアルキル基は１個〜６個の炭素原子を含む。アルキル基は線状であっても、又は分岐状であってもよく、本明細書中で示されるように置換されていてもよい。本明細書中で炭素原子の後に下付き文字が使用されている場合、下付き文字は指定の基が含有し得る炭素原子の数を指す。したがって、例えばＣ１〜４アルキルとは、１個〜４個の炭素原子のアルキルを意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ブチル及びその異性体（例えば、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチル）、ペンチル及びその異性体、ヘキシル及びその異性体、ヘプチル及びその異性体、オクチル及びその異性体、ノニル及びその異性体、デシル及びその異性体が挙げられる。Ｃ１〜６アルキルは、１個〜６個の炭素原子を有する線状、分岐状、又は環状のアルキル基全てを含み、そのためメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ブチル及びその異性体（例えば、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチル）、ペンチル及びその異性体、ヘキシル及びその異性体、シクロペンチル、２−メチルシクロペンチル、３−メチルシクロペンチル、又は４−メチルシクロペンチル、シクロペンチルメチレン、及びシクロヘキシルを含む。
【００５６】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、基又は基の一部として、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードの総称である。
【００５７】
「アミド」という用語は、基又は基の一部として、窒素原子に結合されたカルボニル基−（Ｃ＝Ｏ）−を含む。
【００５８】
「スルホンアミド」という用語は、基又は基の一部として、アミン基に結合されたスルホニル基−Ｓ（＝Ｏ）２−を含み、二価のスルホンアミドは例えば−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ−を表す。
【００５９】
「尿素」という用語は、基又は基の一部として、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）基によってつなぎ合わされた２つのアミン基を含み、二価の尿素は例えば−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を表す。
【００６０】
「カルバメート」という用語は、基又は基の一部として、アミン基に結合されたカルボキシル基−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）を含み、二価のカルバメートは例えば−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を表す。
【００６１】
「トリアゾール」という用語は、基又は基の一部として、式Ｃ２Ｈ３Ｎ３の（即ち、２つの炭素原子及び３つの窒素原子を有する）５員環を指す。特に、本発明において使用されるトリアゾールという用語は、１，２，３−トリアゾールを指し、より具体的にはトリアゾールという用語は以下に示される化学的部分を指す：
【化４】
2014518859.tif 000006
【００６２】
本発明において使用される「グアニジノ」という用語は、以下に示される化学的部分を指す：
【化５】
2014518859.tif 000007
【００６３】
文脈上他に指示がない限り、アスタリスクは、示した一価又は二価のラジカルが、それが関係し、ラジカルが一部を形成する構造に結合する点を示すのに本明細書中で使用される。上記の図形表示は、分子のその他の部分における上記基の実際の配置とは無関係である。
【００６４】
本発明において使用される場合、「本発明の化合物」という用語又は同様の用語は常に、一般式Ｉ又は一般式ＩＩの化合物及びその任意のサブグループを含むと意図される。この用語はまた、その立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を指す。
【００６５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形（singular
forms "a", "an", and "the"）は文脈上他に明白に規定されない限り、複数の指示対象を含む。一例としては、「化合物」とは、１つの化合物又は２つ以上の化合物を意味する。
【００６６】
本発明との関連で使用される「検出可能な標識」は、機器により検出可能なシグナルを発生するシグナル発生基を包含することを意味し、当該技術において既知の好適ないかなる基であってもよい。特に、本発明による検出可能な標識は、磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波、核医学画像法、マルチモーダル画像法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査、質量検出器、波長検出器、燐光画像法、化学発光画像法等を含む一覧から選択される方法によって、機器により検出され得る基を意味する。上記検出可能な標識の存在により、本発明による化合物の可視化及び／又は検出が可能となる。特に、検出可能な標識は、放射性同位体、蛍光色素分子、ＭＲＩ用造影剤（即ち、常磁性金属）、Ｘ線反応剤、及びビオチン標識又はそれらの派生物を含む群から選択されてもよい。
【００６７】
好適な放射性同位体は、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０ｍＢｒ、８２ｍＢｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１４ｍＩｎ、１１７ｍＳｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、２０１Ｔｌ、２０３Ｐｂを含む一覧から選択されてもよい。特定の実施態様において、検出可能な標識は、１１Ｃ、１８Ｆ、１２４Ｉ、又は１２５Ｉ等の小さいサイズの有機ＰＥＴ標識及びＳＰＥＣＴ標識である。また、治療に使用されるようなその他の元素及び放射性同位体を適用してもよい。金属放射性核種は、例えば、当業者に既知の方法による直接的な組み込みによって、キレート剤中に好適に（suitably）組み込まれる。
【００６８】
好適な蛍光色素分子は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、アクリジン、ダンシル、ＮＢＰ、ＢＯＤＩＰＹ、及びローダミンを含む、非限定的な一覧から選択されてもよい。
【００６９】
ＭＲＩ用造影剤は、常磁性イオン又は超常磁性粒子であってもよい。常磁性イオンの例として、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｉ、Ｐａ、Ｌａ、Ｓｃ、Ｖ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｃｅ及びＤｙを含む群から選択されてもよい。
【００７０】
好適なＸ線反応剤としては、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィン（gastrografin）が挙げられるがこれらに限定されず、又は、ヨウ素化合物及び／又は硫酸バリウムで満たされた小胞、リポソーム又はポリマーカプセルを含んでもよい。
【００７１】
本発明による化合物は種々の方法によって合成され得るが、好ましい方法の一つとしてクリックケミストリーの使用が挙げられ、特にアジドとアルキン基との反応を含む付加環化反応が挙げられる。Ｃｕ（Ｉ）塩の存在下で、最終アルキン及びアジドは１，３−双極子付加環化を経て１，４−二置換１，２，３−トリアゾールを形成する。カップリング相手としてアジド及びアルキンを選択することは、銅が存在しなければ本来的に互いに非反応性であり、その他の官能基及び反応条件に対して非常に寛容であることから、特に有益である。当業者に明らかなように、アジドは検出可能な標識に存在してもよく、アルキンは本発明の中間体化合物に存在してもよく、その逆であってもよい。従来の標識化方法に対するクリックケミストリーによるアプローチの利益は、使用される標識が異なるだけで、単一の中間体化合物から開始することが可能であり、また複数の最終化合物の合成を容易に可能とする点である。さらに、このアプローチの選択性により、化合物において予め決定された部位においてのみ結合反応が起こり、単一の予定されていた最終生成物のみが生じる。加えて、標識化反応中に形成されるトリアゾール環は加水分解（hydrolyze）されず、酸化及び還元に対して極めて安定であり、これは最終的な活性依存型プローブがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて非常に安定であることを意味する。
【００７２】
別の実施態様において、中間体及び可視化タグは、リンカー部と可視化タグとの間で共有結合を形成することが可能な予想される全ての末端（end-standing）官能基を用いて設計され得る。１つの例として、アミド結合を生じることが知られている従来的な反応環境下で連結されてアミド結合を形成することが可能な、末端カルボン酸及びアミンが挙げられる。結合形成をもたらすこれらの反応タイプに関する手順は当業者に既知である。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明は式Ｉの化合物を提供し、式中、以下の１つ又は複数の限定が適用される：
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−トリアゾールであり；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２、３又は４であり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｏは、１、２、３又は４であり；
Ｙは、検出可能な標識を表す。
【００７４】
更なる好ましい実施態様において、本発明は式Ｉの化合物を提供し、式中、以下の１つ又は複数の限定が適用される：
Ｒ１及びＲ２は、各々−Ｈであり；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−トリアゾール−であり；
Ｒ４は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）−であり；
ｍは、１、２又は３であり；
Ｙは、検出可能な標識である。
【００７５】
更なる好ましい実施態様において、本発明は式Ｉの化合物を提供し、式中、以下の１つ又は複数の限定が適用される：
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｌは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−トリアゾール−であり；
Ｙは、検出可能な標識を表す。
【００７６】
更なる態様において、本発明は本発明による化合物を調製する式ＩＩ：
【化６】
2014518859.tif 000008
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、ＯＨ、−ハロ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ７及びＳＯ２−Ｒ８を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、−Ｏ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１〜６アルキルを含む群から各々独立して選択され；
Ｒ７及びＲ８は、−ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｓ−Ｃ１〜６アルキル、及び−ＮＲ９Ｒ１０を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、−グアニジノであり；
Ａは、直接結合及びＣ１〜６アルキルを含む一覧から選択され；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アルキン、又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍ、ｎ及びｏは、各々独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
の中間体を提供する。
【００７７】
好ましい中間体群は、式ＩＩの化合物であり、式中、以下の１つ又は複数の限定が適用される：
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−アルキン、又は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−、又は−（Ｃ１〜４アルキル−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｏ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２、３又は４であり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり；
ｏは、１、２、３又は４である。
【００７８】
更に好ましい中間体群は、式ＩＩの化合物であり、式中、以下の１つ又は複数の限定が適用される：
Ｒ１及びＲ２は、各々−Ｈであり；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−アルキン及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ４−Ｎ３を含む一覧から選択され；
Ｒ４は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）−又は−（ＣＨ２）ｎ−を含む一覧から選択され；
ｍは、１、２又は３であり；
ｎは、６である。
【００７９】
更なる好ましい中間体群は、式ＩＩの化合物であり、式中、以下の１つ又は複数の限定が適用される：
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及び−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ３を含む群から各々独立して選択され；
Ｒ３は、グアニジノであり、パラ位にあり；
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ３及び−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−アルキンを含む一覧から選択される。
【００８０】
更なる目的として、本発明は、本発明による化合物を含む組成物を提供する。上記組成物の製剤化は使用される検出可能な標識のタイプに依存することが当業者に明らかである。
【００８１】
例えば、本発明の化合物は、遊離酸若しくは遊離塩基として、及び／又は薬学的に許容可能な酸付加塩及び／又は塩基付加塩（例えば無毒の有機若しくは無機の酸若しくは塩基を用いて得られる）の形態で、水和物、溶媒和物、及び／又は複合体の形態で、及び／又はエステルのようなプロドラッグ又はプレドラッグの形態で使用してもよい。「溶媒和物」という用語は、本明細書中で使用される場合、特に指定しない限りは、本発明の化合物により形成され得る、適切な無機溶媒（例えば水和物）、又はアルコール、ケトン、エステル等（これらに限定されない）のような有機溶媒との任意の組合せを含む。そのような塩、水和物、溶媒和物等、及びそれらの調製物は当業者には明らかであり、例えば米国特許第６，３７２，７７８号、米国特許第６，３６９，０８６号、米国特許第６，３６９，０８７号、及び米国特許第６，３７２，７３３号に記載された塩、水和物、溶媒和物等を参照する。
【００８２】
本発明による化合物の薬学的に許容可能な、すなわち水溶性、脂溶性、又は分散性の産物の形態の塩としては、例えば無機若しくは有機の酸若しくは塩基から形成される、従来の非毒性塩又は第４級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩（glucoheptanoate）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。塩基付加塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩、並びにアルギニン、リジンのようなアミノ酸との塩等が挙げられる。さらに、塩基性窒素含有基は、低級ハロゲン化アルキル、例えば塩化、臭化、及びヨウ化メチル、エチル、プロピル、及びブチル；例えば硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、及び硫酸ジアミルのような硫酸ジアルキル；長鎖ハロゲン化物、例えば塩化、臭化、及びヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリル；臭化ベンジル及び臭化フェネチルのようなハロゲン化アラルキル等のような作用物質を用いて四級化することができる。他の薬学的に許容可能な塩としては、硫酸塩エタノール付加物（sulfate
salt ethanolate）及び硫酸塩が挙げられる。
【００８３】
概して、本発明の化合物は、少なくとも１つの本発明の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤、及び／又はアジュバントとを含む医薬調製物又は医薬組成物として配合することができる。
【００８４】
非限定的な例によると、そのような配合物としては、経口投与、非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、若しくは皮下注射、又は静脈内注入）、局所投与（眼を含む）、吸入、皮膚パッチ、インプラント、坐薬による投与等に適した形態であってもよい。そのような適切な投与形態（投与の様式に応じて固体、半固体、又は液体であってもよい）、並びにその調整に使用される方法、並びに担体、希釈剤、及び賦形剤は、当業者には明らかである。ここでも例えば米国特許第６，３７２，７７８号、米国特許第６，３６９，０８６号、米国特許第６，３６９，０８７号、及び米国特許第６，３７２，７３３号、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版のような標準的なハンドブックを参照する。
【００８５】
かかる調製物の幾つかの好ましいが非限定的な例としては、錠剤、ピル、散剤、ロゼンジ剤、分包剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、軟ゼラチンカプセル剤及び硬ゼラチンカプセル剤、坐薬、点眼剤、無菌注射溶液、及びボーラス投与用及び／又は連続投与用の無菌包装散剤（通常使用前に再構成する）が挙げられ、これらは、それ自身そのような配合に適している担体、賦形剤及び希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、セルロース、（滅菌）水、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩及びプロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、食用油、植物油、及び鉱物油、又はこれらの適切な混合物と共に配合してもよい。配合物は、任意に他の薬学的に活性な物質（本発明の化合物との相乗効果に導いても、又は導かなくてもよい）と、医薬配合物において一般的に用いられる他の物質、例えば滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、保存剤、甘味剤、香味剤、流動調節剤、放出剤等とを含有することができる。組成物もまた、例えばリポソーム又は天然ゲル若しくは合成ポリマーをベースとする親水性ポリマーマトリクスを用いて、それに含有される活性化合物（複数の場合もある）の急速な、持続した又は遅延した放出を提供するように配合してもよい。本発明による医薬組成物の化合物の溶解性及び／又は安定性を増強するために、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン若しくはγ−シクロデキストリン又はそれらの誘導体を用いることに利点があり得る。
【００８６】
さらに、アルコールのような共溶媒によって本化合物の溶解性及び／又は安定性を向上させることができる。水性組成物の調製において、本発明の化合物の塩を添加すれば、それらの水溶性が増加するため、より適しているとされる。
【００８７】
調製物は、それ自体既知の方法で調製してもよく、通常少なくとも１つの本発明による化合物を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、及び必要に応じて他の薬学的に活性な化合物と、必要であれば無菌状態下で混合することを伴う。ここでも米国特許第６，３７２，７７８号、米国特許第６，３６９，０８６号、米国特許第６，３６９，０８７号、及び米国特許第６，３７２，７３３号、並びに上述された更なる従来技術、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版のような標準的なハンドブックを参照する。
【００８８】
本発明の医薬調製物は、好ましくは単位用量形態であることが好ましく、例えば任意に製品情報及び／又は使用に関する指示を含む１つ又は複数の紙片の付いた、箱、ブリスター、バイアル、ビン、サチェット、アンプル又は他のいずれかの適切な単回投与又は複数回投与用のホルダー又は容器（適切なラベルを付けてもよい）の中に適切に入れることができる。一般的にそのような単位用量は、少なくとも１つの本発明の化合物を、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、通常５ｍｇ〜５００ｍｇ含有しており、例えば１単位用量当たり約１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ又は４００ｍｇである。
【００８９】
化合物は、主に使用される具体的な調製物、及び治療又は予防対象の病態に応じて、経口経路、経直腸経路、経眼経路、経皮経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、又は鼻腔内経路を含む様々な経路によって投与することができ、経口投与及び静脈内投与が通常は好ましい。少なくとも１つの本発明の化合物は、一般的に「効果的な量」投与されるが、その意味は、適切な投与を行った場合、投与された個体において所望の治療効果又は予防効果を達成するために十分な式Ｉ〜式ＩＩの化合物の任意の量を意味する。通常予防又は治療対象の病態及び投与経路によって、このような効果的な量は、通常、１日につき患者の体重１ｋｇ当たり、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、より多くの場合０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば１ｍｇ〜２５０ｍｇ、例としては、１日につき患者の体重１ｋｇ当たり、約５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ又は２５０ｍｇであり、毎日１回の服用で、１回若しくは複数回の服用に分けて、又は例えば点滴を用いて本質的に連続的に投与することができる。投与量（複数の場合もある）、投与経路及び更なる治療レジメンは、患者の年齢、性別及び全身状態、並びに治療対象の疾患／症状の性質及び重症度に応じて、治療を行う臨床医によって決定することができる。ここでも米国特許第６，３７２，７７８号、米国特許第６，３６９，０８６号、米国特許第６，３６９，０８７号、及び米国特許第６，３７２，７３３号、並びに上述された更なる従来技術、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版のような標準的なハンドブックを参照する。
【００９０】
本発明の方法に従って、上記医薬組成物は治療中の異なる時間に別々に、又は分けて若しくは単一の混合形態で同時に投与することができる。本発明はそれ故、同時又は交互に全てのそのような治療計画を包含すると理解されるべきであり、「投与する」という用語はそれに従って解釈されるべきである。
【００９１】
経口投与形態については、本発明の組成物は、賦形剤、安定剤又は不活性希釈剤のような適切な添加剤と混合し、通例の方法によって、錠剤、コーティング錠、硬カプセル、水溶液、アルコール溶液又は油性溶液のような適切な投与形態にすることができる。適切な不活性担体としては、アラビアゴム、マグネシア、炭酸マグネシウム、リン酸カリウム、ラクトース、グルコース、又はデンプン、特にコーンスターチが挙げられる。この場合、調製は乾燥又は湿った顆粒の両方で行うことができる。適切な油性の賦形剤又は溶剤は、ひまわり油又はタラ肝油のような植物油又は動物油である。水溶液又はアルコール溶液に適した溶媒は水、エタノール、糖液、又はそれらの混合物である。ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールは、他の投与形態用の更なる補助剤としても有用である。即時型放出錠剤に関しては、これらの組成物は、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース、及び／又は当該技術分野で知られている他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑沢剤を含有してもよい。
【００９２】
経鼻エアロゾル又は吸入によって投与される場合は、これらの組成物は、医薬配合の分野において既知の技法に従って調製することができ、ベンジルアルコール又は他の適切な保存剤、生体内利用性を増強させる吸収促進剤、フッ化炭素類、及び／又は当該技術分野で既知の他の可溶化剤又は分散剤を用いて生理食塩水溶液として調製することができる。エアロゾル又は噴霧剤の形態の投与に適切な医薬配合物は、例えば、薬学的に許容可能な溶媒、例えばエタノール又は水若しくはそのような溶媒の混合液中における本発明の化合物又はそれらの生理学的に許容可能な塩の溶液、懸濁液又は乳濁液である。必要に応じて、配合物はまた、界面活性剤、乳化剤及び安定剤、並びに噴射剤のような他の医薬補助剤を更に含有することができる。
【００９３】
皮下投与に関しては、本発明による化合物を、必要に応じて、溶解剤、乳化剤、又は更なる補助剤のような、それに通常使用される物質と共に溶液、懸濁液、又はエマルションにする。本発明の化合物をまた、凍結乾燥することもでき、得られる凍結乾燥物は、例えば注射又は点滴の調製物の生産に用いることができる。適切な溶媒としては、例えば、水、生理的食塩水、若しくはアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、グリセロール、更にグルコース溶液若しくはマンニトール溶液のような糖溶液、又はその代わりに、言及した種々の溶媒の混合物が挙げられる。注射溶液又は懸濁液は、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンガー液又は等張塩化ナトリウム溶液のような適切な非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤若しくは溶媒を用いて、又は合成モノグリセリド若しくはジグリセリドを含む無菌の無刺激性不揮発油及びオレイン酸を含む脂肪酸のような適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて既知の当該技術分野に従って配合することができる。
【００９４】
坐薬の形態で経直腸投与を行う場合、これらの配合物は、本発明による化合物を、常温では固体であるが、直腸腔で液化及び／又は溶解し薬剤を放出する、ココアバター、合成グリセリドエステル、又はポリエチレングリコールのような適切な無刺激性の賦形剤と混合することにより調製することができる。
【００９５】
本発明は、以下の様々な目的に対して本発明による化合物及び／又は組成物を提供することを目的とするが、これらに限定されない：
種においてトリプシン様プロテアーゼ活性を検出すること。
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性を解析すること。
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性を可視化すること。
ヒト又は動物のがん細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現しているがん細胞を可視化すること。
【００９６】
本発明において使用される「種」という用語は、タンパク質含有材料、細胞溶解物、細胞、組織溶解物、組織、動物及びヒトを包含することを意味する。
【００９７】
本発明において使用される「セリンプロテアーゼ」という用語は、プロテアーゼ（タンパク質におけるペプチド結合を切断する酵素）であって、その酵素の活性部位における少なくとも１つのアミノ酸がセリンであるプロテアーゼを包含することを意味する。一般的に、セリンプロテアーゼは、それらの構造的相同性に基づいてファミリーに分けることができ、更に配列類似性に基づいてサブグループ（例えば（キモ）トリプシン様プロテアーゼグループ）に分けられることが知られている。
【００９８】
好ましい実施態様において、トリプシン様セリンプロテアーゼは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）であり、ウロキナーゼとしても知られている。これは、血液又は細胞外マトリクス等の幾つかの生理学的な場所において発現するプロテアーゼである。その主な基質は、セリンプロテアーゼプラスミンの不活性形である、プラスミノーゲンである。血栓溶解及び細胞外マトリクスの分解におけるその役割により、ｕＰＡは、血管疾患及びがんに関与すると考えられている。したがって、本発明による化合物及び組成物は、ｕＰＡを発現するがん細胞の検出、解析及び可視化に非常に好適である。
【００９９】
本発明の更なる態様は、
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、上記ヒト又は動物に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法；
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、上記種に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法；
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、本発明による化合物又は組成物を種々の時間点（即ち、治療前、治療中及び／又は治療後）に上記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が、上記治療が効果的であることを示す、方法；
を提供することである。
【０１００】
下記実施例において提示される反応模式図に従って、本発明の化合物を調製することができるが、当業者であれば、これらは本発明の一例にすぎず、有機化学分野における当業者によって通常使用される標準的な各合成プロセスのいずれによっても本発明の化合物を調製可能であることが十分理解できるであろう。
【０１０１】
本発明をここで、以下の合成例及び生物学的例を用いて説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１０２】
図２は、クリッカブルプローブ及び官能化プローブを得るのに一般的な合成ストラテジーの概要を説明する。このプローブを合成するための主要な反応は、Ｂｉｒｕｍ−Ｏｌｅｋｓｙｓｚｙｎ反応である。この反応は、アルデヒド、カルバメート、亜リン酸塩及び触媒を必要とする。触媒としてルイス酸を使用する場合、この分子は酸に不安定なＢｏｃ保護基を含んでもよい３８。この反応において種々のカルバメートを使用することにより、ベンジルグアニジン基を保持したまま、種々の側鎖を導入する機会が与えられる。カルバメート系中間体がアジド又はアルキン官能基を含有する場合、得られるプローブ（クリッカブルプローブ）を種々の可視化タグ（例えば、ローダミン、ビオチン）に共役させることができる。これは、ｕＰＡの標識化及び可視化に使用することができる官能化プローブをもたらす。
【０１０３】
模式図１は、試薬としてトリクロロアセチルイソシアネートを使用して、種々のカルバメートの合成を示す。アルコール（中間体４〜６、１０、１３、１７、１８、２３）を対応するカルバメート（中間体７〜９、１１、１４、１９、２０、２４）に変換する。これらのアルコールはそのようにしてもたらされるか、又は求核置換反応を介して商業的に入手可能なエチレングリコール及びハロゲン化アルキルアルコールから作製された。
【０１０４】
デス−マーチンペルヨージナン（periodinane）（模式図２）によって対応するＢｏｃ保護アルコール（中間体２６）から調製されたＢｏｃ保護４−アミノフェニルアセトアルデヒド（中間体２７）を、種々のカルバメートと共にアミドアルキル化反応において使用し、ジアリールホスホネート（中間体２８〜３６）を得た。Ｂｏｃ保護基の酸分解による（acidolytic）除去の後（中間体３７〜４５）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１−グアニルピラゾールを使用して保護グアニジン基を導入した（中間体４６〜５４）。Ｂｏｃ脱保護により中間体５５〜６３が提供された。
【０１０５】
模式図３は、例示的な可視化タグとして使用され、クリッカブルプローブの共役可能性を示す、種々の可視化タグ（ローダミン、ビオチン、ＢＯＤＩＰＹ及び４−フルオロベンズアミド）の合成を示す。
【０１０６】
既知文献の手順３９によって、ピペラジンローダミン（中間体６７）を合成した。その文献の著者らは、仕上げにフラッシュクロマトグラフィーは不要であると言及していたが、本発明者らはフラッシュクロマトグラフィーを用いずに純粋化合物を得ることができなかった。８−アジドオクタン酸（中間体６５）とのカップリングにより、アジド−ローダミン（中間体６８）を得た。
【０１０７】
ビオチンと、ＤＣＣ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によって、活性化されたビオチン−エステル（中間体７１）が２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタンアミンと容易に反応して、アジド−ビオチン（中間体７２）を生じさせることができる。
【０１０８】
２つの２，４−ジメチル−ピロール単位と、アシルクロリド（中間体６９）と、ＢＦ３との縮合は、所望のアジド−ＢＯＤＩＰＹ（中間体７３）を与える。
【０１０９】
５つ目の合成可能な標識はＣｙ５である。合成はJung他によって説明され、アジドリンカーによって更に修飾することができる（Michael E. Jung and Wan-Joong Kim, Bioorganic & Medicinal
Chemistry, 2006, 14, 92-97）。
【０１１０】
【化７】
2014518859.tif 000009
模式図１：カルバメート側鎖の合成
試薬及び条件：（ａ）ＮａＨ、プロパルギルブロミド、ＴＨＦ  （ｂ）ｉ）トリクロロアセチルイソシアネート、ＤＣＭ  ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ  （ｃ）ＮａＮ３、Ｈ２Ｏ、Δ  （ｄ）ＴｓＣｌ、ＴＥＡ、ＤＣＭ  （ｅ）ＮａＮ３、ＣＨ３ＣＮ、Δ
【０１１１】
【化８】
2014518859.tif 000010
模式図２：中間体４６〜５４の合成
試薬及び条件：（ａ）（Ｂｏｃ）２Ｏ、ＴＥＡ、ジオキサン  （ｂ）デス−マーチンペルヨージナン、ＤＣＭ  （ｃ）中間体７〜９；１１；１４；１９；２０；２４、Ｃｕ（ＯＴｆ）２、２８〜３５に対してトリフェニルホスファイト、ＤＣＭ、３６に対してトリパラセタモールホスファイト、ＴＨＦ  （ｄ）ＴＦＡ、ＤＣＭ  （ｅ）ＴＥＡ、ＤＣＭ、５４に対してＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１−グアニルピラゾール  ＤＣＭ／アセトニトリル（１／１）
【０１１２】
【化９】
2014518859.tif 000011
模式図３：種々の可視化標識の合成
試薬及び条件：（ａ）ＮａＮ３、ＤＭＦ、Δ  （ｂ）オキサリルクロリド、ＤＭＦ  （ｃ）Ａｌ（Ｍｅ）３、ピペラジン、ＤＣＭ、Δ  （ｄ）ＴＢＴＵ、ＴＥＡ、中間体６５、ＤＭＦ  （ｅ）ＤＣＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＭＦ  （ｆ）ＴＥＡ、７４、ＤＭＦ  （ｇ）２，４−ジメチル−ピロール、ＢＦ３、ＤＩＰＥＡ  （ｈ）Ｎ−スクシンイミジル−４−フルオロベンゾエート、ＴＥＡ、ＤＣＭ  （ｉ）２−アジドエチルアミン、ＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ
【０１１３】
実験部
Sigma-Aldrich、Acros又はFluorochemより試薬を入手した。全化合物の特徴付けは、１Ｈ  ＮＭＲ及び質量分析法によって実施した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを４００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ｎａｎｏｂａｙスペクトロメーターで記録した。ＥＳ質量スペクトルを、Bruker DaltonicsからのＥｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓイオントラップ質量分析計より取得した。以下のいずれかの方法を用いて純度を確認した：質量検出器又はＵＶ検出器を用いたＨＰＬＣシステム。水（Ａ）及びＣＨ３ＣＮ（Ｂ）を溶離液として使用した。ＭＳ検出器としてのＥｓｑｕｉｒｅ  ３０００ｐｌｕｓと連結されたＡｌｌｔｅｃｈ  Ｐｒｅｖａｉｌ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３μｍ）を用い、０．２ｍＬ／分の流速で５％から１００％のＢ、２０分間の勾配を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムでＬＣ−ＭＳスペクトルを記録した。ギ酸０．１％を溶媒Ａ及び溶媒Ｂに添加した。Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を備えたGilsonの機器で逆相ＨＰＬＣを行った。１ｍＬ／分の流速で１０％から１００％のＢ、３５分間の勾配を用いた。トリフルオロ酢酸０．１％を溶媒Ａ及び溶媒Ｂに添加した。波長は２１４ｎｍを使用した。必要に応じて、Ｆｌａｓｈｍａｓｔｅｒ  ＩＩ（Jones chromatography）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより、生成物を精製した。
【０１１４】
中間体の合成
反応手順Ａ
中間体４：２−（プロパ−２−イニルオキシ）エタノール
０℃にて３０分間に亘り、ＴＨＦ（８０ｍｌ）中の水素化ナトリウム（４５．９ｍｍｏｌ）の溶液にＴＨＦ（１００ｍｌ）中のエタン−１，２−ジオール（１８２ｍｍｏｌ）を滴加した。この溶液を室温で２時間撹拌した。３−ブロモプロパ−１−イン（４１．８ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を一晩還流した後、水（８０ｍｌ）を添加した。溶媒を蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（４×１００ｍｌ）を用いて抽出した。混合された有機層をブラインにより洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮濾過した。得られた混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（１００％ヘキサンからヘキサン中４０％ＥｔＯＡｃ）。
収率：４０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １２３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ１．９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、２．４４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６４（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．７６（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．２０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）
【０１１５】
以下の中間体を同様の方法によって調製した：
中間体５：２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エタノール
収率：３６％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １６７  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．４４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．６９〜３．７７（ｍ，６Ｈ）、４．２２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）
【０１１６】
中間体６：２−（２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エトキシ）エタノール
収率：４１％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２１１．０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、２．４４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２〜３．７５（ｍ，１２Ｈ）、４．２１（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，２Ｈ）
【０１１７】
反応手順Ｂ
中間体７：２−（プロパ−２−イニルオキシ）エチルカルバメート
０℃にて、２，２，２−トリクロロアセチルイソシアネート（isocyanate）（１０．７９ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（５０ｍｌ）中の２−（プロパ−２−イニルオキシ）エタノール（中間体４）（８．９９ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。室温にて１時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、反応混合物をＭｅＯＨ３０ｍｌ及び水３ｍｌ中に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（１５．４６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を一晩撹拌した。ＭｅＯＨを蒸発させ、水（５０ｍｌ）を添加した。この水層を、ＥｔＯＡｃを用いて２度抽出した。有機層を混合し、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。黄色の油性液体を得た。
収率：７９％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １８２  ［Ｍ＋Ｋ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．４５（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．７５（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．２１（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，２Ｈ）、４．２６（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１１８】
以下の中間体を同様の方法によって調製した：
中間体８：２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エチルカルバメート
収率：７４％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２２６  ［Ｍ＋Ｋ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  ２．４０（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６５（ｍ，６Ｈ）、４．２０（ｍ，４Ｈ）、４．９０（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１１９】
中間体９：２−（２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エトキシ）エチルカルバメート
収率：８４％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．４４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６８（ｍ，１０Ｈ）、４．２２（ｍ，４Ｈ）、４．９５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１２０】
中間体１１：ペンタ−４−イニルカルバメート 
収率：６５％
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １．８７（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．９８（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．３（ｄｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ及びＪ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．２３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、１０．８２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１２１】
中間体１４:６−アジドヘキシルカルバメート
収率：６８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２０９．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．３９（ｍ，４Ｈ）、１．６３（ｍ，４Ｈ）、３．２７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．０６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．５９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１２２】
中間体１９：２−（２−アジドエトキシ）エチルカルバメート 
収率：８８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １９７．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ３．３９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．６９（ｍ，４Ｈ）、４．２４（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１２３】
中間体２０：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチルカルバメート 
収率：８０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２４１．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋、２５７．１  ［Ｍ＋Ｋ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ３．４０（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．７０（ｍ，８Ｈ）、４．２３（ｍ，２Ｈ）、４．８２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１２４】
中間体２４：２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチルカルバメート
収率：７０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２８５．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ３．３９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．６７（ｍ，１２Ｈ）、４．２３（ｍ，２Ｈ）、４．８１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）
【０１２５】
反応手順Ｃ
中間体１３：６−アジドヘキサン−１−オール
水（１０ｍｌ）中の６−ブロモヘキサン−１−オール（中間体１２）（５．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウム（２７．６ｍｍｏｌ）を添加し、９０℃にて３時間撹拌した。この混合物を室温まで冷却し、２Ｎ  ＨＣｌで処理した。この水性溶液を、ＥｔＯＡｃ、ブラインを用いて抽出（３回）し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。真空下で溶媒を除去し、淡黄色油を得て、それをそれ以上の精製を行わずに次の工程において使用した。
収率：８１％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．４１（ｍ，６Ｈ）、１．６１（ｍ，４Ｈ）、３．２７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．６５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）
【０１２６】
以下の中間体を同様の方法によって調製した：
中間体１７：２−（２−アジドエトキシ）エタノール
収率：８０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １５４．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．２７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．４１（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．６２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．７０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．７６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）
【０１２７】
中間体１８：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタノール
収率：８２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １９８．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．３６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）、３．４０（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．６２（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．６８（ｍ，６Ｈ）、３．７３（ｍ，２Ｈ）
【０１２８】
反応手順Ｄ
中間体２２：２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート
２，２’−（２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オキシ））ジエタノール（中間体２１）（４０．０ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（２０．００ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍｌ）に溶解した。その後、トシル−Ｃｌ（１．９０７ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた混合物を室温にて１時間撹拌した。この混合物を１Ｍ  ＫＨＳＯ４及び５％ＮａＨＣＯ３を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒の蒸発後、黄色油が形成された。
収率：７２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ３７１．３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．３４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、２．４５（ｓ，３Ｈ）、３．５５〜３．７３（ｍ，１４Ｈ）、４．１７（ｔ，２Ｈ）、７．３３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）
【０１２９】
反応手順Ｅ
中間体２３：２−（２−（２−（２−アジエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタノール
アセトニトリル（１０ｍｌ）中の２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチルメタンスルホネート（中間体２２）（１．８３６ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウム（９．１８ｍｍｏｌ）を添加し、２３時間に亘り還流した。溶媒を蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）及び水（５０ｍｌ）を添加した。有機層を混合し、２Ｎ  ＨＣｌ及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、油性生成物として中間体２３を得た。
収率：７７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２４２．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ２．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．３９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．６１（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．６８（ｍ，１０Ｈ）、３．７３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）
【０１３０】
反応手順Ｆ
中間体２６：ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−ヒドロキシエチル）フェニルカルバメート
ジオキサン１００ｍｌ中の２−（４−アミノフェニル）エタノール（中間体２５）（８７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（８７ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（９６ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を、室温にて一晩撹拌した。その溶液を真空下で濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶解し、２Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインの溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー（１００％ヘキサンから１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製物を取得した。
収率：５０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２６０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋、２７５．９０  ［Ｍ＋Ｋ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．５（ｓ，９Ｈ）、２．８３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．８３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．４（ｓ，１Ｈ）、７．１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）
【０１３１】
反応手順Ｇ
中間体２７：ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−オキソエチル）フェニルカルバメート
ＤＣＭ（５０ｍｌ）中のデス−マーチンペルヨージナン（３１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル４−（２−ヒドロキシエチル）フェニルカルバメート（中間体２６）（２０．６５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を、室温にて４時間撹拌した。得られた溶液を、１時間に亘って、激しく撹拌されている飽和ＮａＨＣＯ３及びＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液（１：１；各１００ｍｌ）へと注いだ。有機層を分離し、ブラインで洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を蒸発させて褐色の油性生成物が形成された。
収率：８９％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２５７．９０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋、２９０  ［Ｍ＋Ｎａ＋ＣＨ３ＯＨ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．５（ｓ，９Ｈ）、３．６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、９．７（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）
【０１３２】
反応手順Ｈ
中間体２８：２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エチル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート
ＤＣＭ（２５ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（２−オキソエチル）フェニルカルバメート（中間体２７）（６．９９ｍｍｏｌ）及び２−（プロパ−２−イニルオキシ）エチルカルバメート（中間体７）（６．９９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスファイト（６．９９ｍｍｏｌ）及びＣｕ（ＯＴｆ）２（０．６９９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を少量のＭｅＯＨに溶解した。−２０℃で溶液を保存することにより沈殿を得た。沈殿を濾別した。
収率：４４％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６１７  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．５（ｓ，９Ｈ）、２．４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．４〜３．５５（ｍ，１Ｈ）、３．３〜３．４（ｍ，１Ｈ）、３．６（ｓ，２Ｈ）、４．１〜４．２（ｍ，４Ｈ）、４．６５〜４．７７（ｍ，１Ｈ）、５．０３〜４．１０（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．４１（ｓ，１Ｈ）、７．１０〜７．３６（ｍ，１４Ｈ）
【０１３３】
以下の中間体を同様の方法によって調製した：
中間体２９：２−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）エチル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート
収率：４３％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６６１．４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．５（ｓ，９Ｈ）、２．４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．９〜３．０５（ｍ，１Ｈ）、３．３〜３．４（ｍ，１Ｈ）、３．５５〜４．１５（ｍ，８Ｈ）、４．２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．６５〜４．７５（ｍ，１Ｈ）、５．１０〜５．１６（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．４７（ｓ，１Ｈ）、７．１０〜７．３５（ｍ，１４Ｈ）
【０１３４】
中間体３０：２−（２−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート
収率：５３％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７０５．３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、２．４３（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．９９（ｍ，１Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．５７〜３．７１（ｍ，１０Ｈ）、４．１２（ｍ，２Ｈ）、４．１９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７２（ｍ，１Ｈ）、５．１８（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．５７（ｓ，１Ｈ）、７．１１〜７．３５（ｍ，１４Ｈ）
【０１３５】
中間体３１：ペンタ−４−イン−１−イル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート（中間体３１）
収率：４９％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６０１．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、１．７２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．９５（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．１５（ｔ，２Ｈ）、２．９７（ｍ，１Ｈ）、３．３５（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｔ，２Ｈ）、４．７１（ｍ，１Ｈ）、４．９８（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、６．４４（ｓ，１Ｈ）、７．１０〜７．３５（ｍ，１４Ｈ）
【０１３６】
中間体３２：６−アジドヘキシル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート
収率：４０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６６０．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．３２（ｍ，４Ｈ）、１．５７（ｍ，１３Ｈ）、２．９８（ｍ，１Ｈ）、３．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．３５（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｍ，２Ｈ）、４．７３（ｍ，１Ｈ）、４．９９（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．４７（ｓ，１Ｈ）、７．１〜７．４（ｍ，１４Ｈ）
【０１３７】
中間体３３：２−（２−アジドエトキシ）エチル（２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート
収率：５１％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６４８．４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、２．９８（ｍ，１Ｈ）、３．３５（ｍ，３Ｈ）、３．５７（ｍ，４Ｈ）、４．１４（ｍ，２Ｈ）、４．７２（ｍ，１Ｈ）、５．１２（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、６．４６（ｓ，１Ｈ）、７．１０〜７．３５（ｍ，１４Ｈ）
【０１３８】
中間体３４：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート
収率：３０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６９２．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、２．９８（ｍ，１Ｈ）、３．３５（ｍ，３Ｈ）、３．６３（ｍ，８Ｈ）、４．１４（ｍ，２Ｈ）、４．７２（ｍ，１Ｈ）、５．１３（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、６．４７（ｓ，１Ｈ）、７．１〜７．４（ｍ，１４Ｈ）
【０１３９】
中間体３５：２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート（中間体３５）
収率：２２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７３６．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、２．９８（ｍ，１Ｈ）、３．３５（ｍ，３Ｈ）、３．６２（ｍ，１２Ｈ）、４．１２（ｍ，２Ｈ）、６．５３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、７．１〜７．４（ｍ，１４Ｈ）
【０１４０】
反応手順Ｉ
中間体３６：ペンタ−４−イン−１−イル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ビス（４−アセトアミドフェノキシ）ホスホリル）エチル）カルバメート
ＴＨＦ（５０ｍｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（２−オキソエチル）フェニルカルバメート（中間体２６）（５．９５ｍｍｏｌ）及び２−（プロパ−２−イニルオキシ）エチルカルバメート（中間体１１）（５．９５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリス（４−アセトアミドフェニル）ホスファイト（５．９５ｍｍｏｌ）及びＣｕ（ＯＴｆ）２（０．５９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨ）で精製した。
収率：５％
ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１５．３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、１．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、２．１４（ｍ，８Ｈ）、２．９７（ｍ，１Ｈ）、３．２８（ｍ，１Ｈ）、４．０５（ｍ，２Ｈ）、４．６６（ｍ，１Ｈ）、５．４８（ｍ，１Ｈ）、６．９〜７．４（ｍ，１２Ｈ）
【０１４１】
反応手順Ｊ
中間体３７：２−（プロパ−２−イニルオキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
ＤＭＣ（２５ｍｌ）中の２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エチル（２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）−１−（ジフェノキシホルフォリル）エチル）カルバメート（中間体２８）（３．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（２５ｍｌ）を添加した。その溶液を１時間撹拌し、その後溶媒を蒸発させた。生成物をエーテルで洗浄した。
収率：８７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４９５  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ３．８３（ｓ，１Ｈ）、３．０３〜３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．３８〜３．４８（ｍ，１Ｈ）、３．５８〜３．６４（ｓ，２Ｈ）、３．９７〜４．１５（ｍ，４Ｈ）、４．５９〜４．６８（ｍ，１Ｈ）、７．１２〜７．５１（ｍ，１４Ｈ）
【０１４２】
以下の中間体を同様の方法によって調製した：
中間体３８：２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート（中間体３８）
収率：９３％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５３９  ［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１４３】
中間体３９：２−（２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エトキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート
収率：９１％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５８３．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  ２．８７（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．１３（ｍ，１Ｈ）、３．４６〜３．６９（ｍ，１０Ｈ）、３．９８〜４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．１８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．６７（ｍ，１Ｈ）、７．１〜８．０（ｍ，１４Ｈ）
【０１４４】
中間体４０：ペンタ−４−イニル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：８２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４７９．１  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  １．７（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．１８（ｄｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ及びＪ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．２３（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．０６（ｍ，１Ｈ）、３．４３（ｍ，１Ｈ）、４．０（ｍ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．１〜７．５（ｍ，１４Ｈ）
【０１４５】
中間体４１：６−アジドヘキシル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：９８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５３８．４  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  １．３４（ｍ，４Ｈ）、１．５５（ｍ，４Ｈ）、３．０７（ｍ，１Ｈ）、３．２４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．９９（ｍ，１Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．１０〜７．５０（ｍ，１４Ｈ）
【０１４６】
中間体４２：２−（２−アジドエトキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート（中間体４２）
収率：９８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５２６．３  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、３．６０（ｍ，４Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、４．１０（ｍ，１Ｈ）、４．６６（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．５５（ｍ，１４Ｈ）
アジドエトキシ側鎖由来の１つのＣＨ２が、ＭｅＯＨピークの後ろに隠れている。
【０１４７】
中間体４３：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：９７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５７０．４  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ３．０９（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、３．６１（ｍ，８Ｈ）、３．９９（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｍ，１Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．０〜７．５４（ｍ，１４）
１つのＣＨ２が、ＭｅＯＨピークの後ろに隠れている。
【０１４８】
中間体４４：２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：９８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６１４．４  ［Ｍ＋Ｈ］＋、６３６．４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０１４９】
中間体４５：ペンタ−４−イニル２−（４−アミノフェニル）−１−（ビス（４−アセトアミドフェノキシ）ホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：８２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５９３．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  １．７０（ｍ，２Ｈ）、２．１１（ｓ，６Ｈ）、２．１７（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．０４（ｍ，１Ｈ）、３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．９６（ｍ，２Ｈ）、４．５９（ｍ，１Ｈ）、７．１１（ｍ，４Ｈ）、７．１８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ）
【０１５０】
中間体５５：２−（プロパ−２−イニルオキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：９５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５３７  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ２．８２（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．０３〜３．１４（ｍ，１Ｈ）、３．３７〜３．４４（ｍ，１Ｈ）、３．６１〜３．６５（ｍ，２Ｈ）、４．０３〜４．１６（ｍ，４Ｈ）、４．５８〜４．６７（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．４５（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １４．３分（９７．４％）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １８．２３分（１００％）
ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）ｔｒ  １８．２３分（１００％）
【０１５１】
中間体５６：２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：９８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５８１  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ２．８４（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．０３〜３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．３６〜３．４５（ｍ，１Ｈ）、３．５３〜４．１８（ｍ，１０Ｈ）、４．５７〜４．６９（ｍ，１Ｈ）、７．１６〜７．９９（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １３．８分（９７．８％）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １８．２９分（１００％）
ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）ｔｒ  １８．３２分（１００％）
【０１５２】
中間体５７：２−（２−（２−（プロパ−２−イニルオキシ）エトキシ）エトキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：７５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６２５  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ２．８２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝Ｊ’＝２．４）、３．０３〜３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．３７〜３．４５（ｍ，１Ｈ）、３．５４〜４．１９（ｍ，１４Ｈ）、４．５８〜４．７０（ｍ，１Ｈ）、７．１６〜７．９７（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １４．０分（９６．５％）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １８．４３分（１００％）
ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）ｔｒ  １８．４２分（１００％）
【０１５３】
中間体５８：ペンタ−４−イニル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：６１％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５２１．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  １．７２（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．２０（ｄｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ及び２．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．２３（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．０７（ｍ，１Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．４５（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １４．３分（９９％）
ＨＰＬＣ（ＵＶ  ２１４ｎｍ）ｔｒ  １９．０７分（９９．１％）
ＨＰＬＣ（ＵＶ  ２５４ｎｍ）ｔｒ  １９．２０分（１００％）
【０１５４】
中間体５９：６−アジドヘキシル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：７５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５８０．３  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  １．３５（ｍ，４Ｈ）、１．５６（ｍ，４Ｈ）、３．１５（ｍ，１Ｈ）、３．２５（ｍ，３Ｈ）、３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．９８（ｍ，２Ｈ）、４．６５（ｍ，１Ｈ）、７．１８〜７．９４（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １１．２分（１００％）
【０１５５】
中間体６０：２−（２−アジドエトキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：４５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５６８．４  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  ３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．６０（ｍ，４Ｈ）、４．０８（ｍ，２Ｈ）、４．６３（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．４５（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ１４．７分（９９．１％）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １９．０１分（９７％）
ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）ｔｒ  １８．９２分（９７％）
【０１５６】
中間体６１：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：６３％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６１２．４  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  ３．１（ｍ，１Ｈ）、３．３１（ｍ，２Ｈ）、３．４２（ｍ，１Ｈ）、３．６２（ｍ，８Ｈ）、４．０４（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｍ，１Ｈ）、４．６３（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．４５（ｍ，１４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １４．６分（９３．３％）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １８．９分（９１．１％）
【０１５７】
中間体６２：２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：７８％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６５６．５  ［Ｍ＋Ｈ］＋
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １８．８分（９５．５％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  ３．０９（ｍ，１Ｈ）、３．３５（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．６３（ｍ，１２Ｈ）、４．０５（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｍ，１Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．４５（ｍ，１４Ｈ）
【０１５８】
中間体６３：ペンタ−４−イニル１−（ビス（４−アセトアミドフェノキシ）ホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート
収率：６７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６３５．３  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  １．７１（ｍ，２Ｈ）、２．１１（ｓ，６Ｈ）、２．１８（ｍ，２Ｈ）、２．２３（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．１２（ｍ，１Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、７．１３（ｍ，４Ｈ）、７．２２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．４０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．５５（ｍ，４Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １１．４（９６．５％）
【０１５９】
反応手順Ｋ
中間体４６：２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エチル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（（２，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート
ＣＨＣｌ３（５０ｍｌ）中の２−（プロパ−２−イニルオキシ）エチル２−（４−アミノフェニル）−１−（ジフェノキシホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート（中間体３７）（１．８９０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｚ）−ｔｅｒｔ−ブチル（１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メタンジイリデンジカルバメート（１．８９０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５．６７ｍｍｏｌ）を添加した。その溶液を、室温にて３日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインの溶液で洗浄した。有機溶媒を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発し、フラッシュクロマトグラフィー（１００％ヘキサンからヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃ）によって精製した。
収率：３２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７３７  ［Ｍ＋１］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．４８（ｓ，９Ｈ）、１．５３（ｓ，９Ｈ）、２．４４（ｓ，１Ｈ）、２．９３〜３．０７（ｍ，１Ｈ）、３．３２〜３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．６３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．１２〜４．２３（ｍ，４Ｈ）、４．６６〜４．８１（ｍ，１Ｈ）、５．０５（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０〜７．３５（ｍ，１４Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、１０．３（ｓ，１Ｈ）、１１．６（ｓ，１Ｈ）
【０１６０】
以下の中間体を同様の方法によって調製した：
中間体４７：２−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）エチル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート
収率：６０％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７８１［Ｍ＋Ｈ］＋，８０３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋、８１９  ［Ｍ＋Ｋ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．５１（ｓ，９Ｈ）、１．５４（ｓ，９Ｈ）、２．４２（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．９４〜３．０７（ｍ，１Ｈ）、３．３３〜３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．５５〜４．２０（ｍ，１０Ｈ）、４．６８〜４．８１（ｍ，１Ｈ）、５．０６（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０〜７．５９（ｍ，１４Ｈ）、１０．３０（ｓ，１Ｈ）、１１．６０（ｓ，１Ｈ）
【０１６１】
中間体４８：２−（２−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジノ）フェニル）エチル）カルバメート
収率：７６％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ８２５  ［Ｍ＋Ｈ］＋，８４７  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．４８（ｓ，９Ｈ）、１．５３（ｓ，９Ｈ）、２．４１（ｔ，１Ｈ）、２．９６〜３．０７（ｍ，１Ｈ）、３．３３〜３．４２（ｍ，１Ｈ）、３．６５〜４．２０（ｍ，１２Ｈ）、４．６８〜４．８１（ｍ，１Ｈ）、５．１〜５．１６（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、７．１１〜７．３５（ｍ，１４Ｈ）、７．５３〜７．５８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）
【０１６２】
中間体４９：ペンタ−４−イン−１−イル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート
収率：６１％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７４３．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：  δ  １．５１（ｄ，１８Ｈ）、１．７３（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．９６（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．１７（ｔ，２Ｈ）、３．０１（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｍ，１Ｈ），４．０８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、４．７６（ｍ，１Ｈ）、４．９６（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．０〜７．６（ｍ，１４Ｈ）、１０．３３（ｓ，１Ｈ）、１１．６３（ｓ，１Ｈ）
【０１６３】
中間体５０：６−アジドヘキシル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート
収率：３５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７８０．６  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：  δ  １．３２（ｍ，４Ｈ）、１．５２（ｍ，２２Ｈ）、３．０２（ｍ，１Ｈ）、３．２２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７７（ｍ，１Ｈ）、４．９３（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．１〜７．６（ｍ，１４Ｈ）、１０．３１（ｓ，１Ｈ）、１１．６１（ｓ，１Ｈ）
【０１６４】
中間体５１：２−（２−アジドエトキシ）エチル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート
収率：３６％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７６８．５  ［Ｍ＋Ｈ］＋、７９０．６  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：  δ１．５３（ｄ，１８Ｈ）、３．０１（ｍ，１Ｈ）、３．３２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．５９（ｍ，４Ｈ）、４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、５．０９（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０〜７．６０（ｍ，１４Ｈ）、１０．３１（ｓ，１Ｈ）、１１．６（ｓ，１Ｈ）
【０１６５】
中間体５２：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジノ）フェニル）エチル）カルバメート
収率：３７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ８１２．５  ［Ｍ＋Ｈ］＋、８３４．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：  δ  １．５３（ｄ，１８Ｈ）、３．０２（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．６３（ｍ，８Ｈ）、４．１３（ｍ，２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、５．１３（ｓ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、７．１〜７．６（ｍ，１４Ｈ）、１０．３（ｓ，１Ｈ）、１１．６（ｓ，１Ｈ）
【０１６６】
中間体５３：２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジノ）フェニル）エチル）カルバメート
収率：２７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ８７８．６  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：  δ  １．５２（ｄ，１８Ｈ）、３．０２（ｍ，１Ｈ）、３．３９（ｍ，３Ｈ）、３．６３（ｍ，１２Ｈ）、４．１４（ｍ，２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、５．１５（ｄ，１Ｈ）、７．１〜７．６（ｍ，１４Ｈ）、１０．３（ｓ，１Ｈ）、１１．６（ｓ，１Ｈ）
【０１６７】
反応手順Ｌ
中間体５４：ペンタ−４−イン−１−イル（１−（ビス（４−アセトアミドフェノキシ）ホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（butoxycarbonyl））グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート
ＤＣＭ（３ｍｌ）及びアセトニトリル（容量：３．００ｍｌ）中のペンタ−４−イニル２−（４−アミノフェニル）−１−（ビス（４−アセトアミドフェノキシ）ホスホリル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート（中間体４５）（０．２８３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−ピラゾールグアニジン（０．５６６ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．８４９ｍｍｏｌ）を添加した。その溶液を５時間撹拌した。追加のＢｏｃ−ピラゾールグアニジン（０．５６６ｍｍｏｌ）を添加し、更に４８時間溶液を撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をＥｔＯＡｃに溶解した。有機層を２Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインの溶液で洗浄した。それをＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中２．５％ＭｅＯＨ）を使用して精製した。
収率：３４％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ８５７．３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ  １．４６（ｓ，９Ｈ）、１．５４（ｓ，９Ｈ）、１．７２（ｍ，２Ｈ）、２．０（ｍ，７Ｈ）、２．１７（ｍ，２Ｈ）、２．８９（ｍ，１Ｈ）、３．２０（ｍ，１Ｈ）、４．０８（ｍ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、６．３８（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ）、６．８〜７．５（ｍ，１２Ｈ）、８．４６（ｓ，１Ｈ）、８．６４（ｓ，１Ｈ）、１０．１９（ｓ，１Ｈ）、１１．６２（ｓ，１Ｈ）
【０１６８】
反応手順Ｍ
中間体６５：８−アジドオクタン酸
ＤＭＦ（５ｍｌ）中の８−ブロモオクタン酸（中間体６４）（２．２４１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アジ化ナトリウム（４．４８ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を８５℃で３時間加熱した。粗反応混合物を、ＤＣＭ（５０ｍｌ）で希釈し、この溶液を０．１Ｎ  ＨＣｌで洗浄した。有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を蒸発させた。黄色の油性生成物が得られた。
収率：７９％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １８４．０  ［Ｍ−Ｈ］−
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：  δ  １．３７（ｍ，６Ｈ）、１．６３（ｍ，４Ｈ）、２．３５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．２５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）
【０１６９】
反応手順Ｎ
中間体６７：Ｎ−（６−（ジエチルアミノ）−９−（２−（ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎエチルエタンアミニウムクロリド
ヘプタン中のトリメチルアルミニウム（４．５２ｍｍｏｌ）の１．０Ｍの溶液を、室温にてＣＨ２Ｃｌ２  ３．５ｍｌ中のピペラジン（９．０４ｍｍｏｌ）溶液に滴加した。添加の間にガス発生が観察された。１時間撹拌した後、白色沈殿が観察された。ＣＨ２Ｃｌ２  ２ｍｌ中のローダミンＢベース（中間体６６）（２．２６ｍｍｏｌ）溶液を、不均一溶液に滴加した。その溶液を４８時間（６５℃）に亘って還流した。ガス発生が終わるまで、０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を滴加した。不均一溶液を濾過し、残留した固体をＣＨ２Ｃｌ２及びＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ溶液（４：１）で濯いだ。混合された濾液を濃縮し、残留物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、濾過して不溶性塩類を除去し、再び濃縮した。その後、得られたガラス質の固体を、低濃度のＮａＨＣＯ３（２％（ｍ／ｖ））水溶液とＥｔＯＡｃとの間で分割した。分離の後、水層を追加のＥｔＯＡｃを３回に分けて洗浄して残留した出発材料を除去した。保持された水層をＮａＣｌで飽和し、１Ｍ  ＨＣｌ水溶液で酸性化し、次いで薄桃色が持続するまでｉＰｒＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（２：１）を用いて複数に分けて抽出した。その後、混合された有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮濾過した。ガラス質の紫色の固体を微量のＭｅＯＨに溶解し、多量のＥｔ２Ｏへ滴加することによって沈殿させた。濾過により、濃い紫色の固体として生成物を採取した。フラッシュクロマトグラフィー（１００％ＤＭＣからＤＣＭ中１５％のＭｅＯＨ）を使用し、更なる精製を行った。
収率：１５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５１１．８０  ［Ｍ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．３２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１２Ｈ）、２．７０（ｂｒ  ｓ，４Ｈ）、３．４１（ｂｒ  ｓ，４Ｈ）、３．７０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ）、６．９７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０８（ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ及びＪ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．２７（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．５１（ｍ，１Ｈ）、７．６８（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｍ，２Ｈ）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  １８．０８分（１００％）
【０１７０】
反応手順Ｏ
中間体６８：Ｎ−（９−（２−（４−（８−アジドオクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−６−（ジエチルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド
ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の８−アジドオクタン酸（中間体６５）（１．８２８ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＢＴＵ（２．０１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５．４８ｍｍｏｌ）を添加した。室温にて１５分間、溶液を撹拌した。Ｎ−（６−（ジエチルアミノ）−９−（２−（ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアルミニウムクロリド（中間体６７）（１．８２８ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を室温にて一晩撹拌した。水２００ｍｌを添加し、水層をＤＣＭで抽出した（２回）。得られた有機層を、２Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインの溶液で抽出した。溶媒をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過して蒸発させた。形成された生成物を、ヘキサン、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１／４）及び２×２０ｍｌ  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１／１）で洗浄した。濃い紫色の固体が形成された。生成物を少量のＤＣＭに溶解し、多量のエーテルに添加した。沈殿が形成された。
収率：８７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６７８．７  ［Ｍ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．３１（ｍ，１８Ｈ）、１．５６（ｍ，４Ｈ）、２．３４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．２７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．３５（ｂｒ  ｓ，８Ｈ）、３．７０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，８Ｈ）、６．９６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０７（ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ及びＪ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．２８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．５２（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｍ，１Ｈ）、７．７７（ｍ，２Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  ２１．５分（１００％）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  ２７．３分（１００％）
ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）ｔｒ  ２７．４分（１００％）
【０１７１】
反応手順Ｐ
中間体６９：８−アジドオクタノイルクロリド
無水トルエン（容量：５０ｍｌ）中の８−アジドオクタン酸（中間体６５）（２ｇ、１０．８０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、オキサリルクロリド（１６．２０ｍｍｏｌ）を添加した。触媒量のＤＭＦ（２滴）を添加し、溶液を室温にて４時間撹拌した。白色沈殿（recipitate）が観察された。真空下での濃縮の後、残留物をトルエンを用いて同時に蒸発させた。赤色生成物が得られ、それ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０１７２】
反応手順Ｑ
中間体７１：２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノエート
Ｄ−ビオチン（０．８１９ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．８１９ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌ容の丸底フラスコ内で撹拌しながら６ｍｌの高温無水ＤＭＦ（７０℃）に溶解した。ＤＣＣ（１．０６４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて一晩撹拌した。形成されたＤＣＵを濾別し、溶液を蒸発乾固させた。残留物を、沸騰したイソプロパノール中に溶解し（taken up）、室温まで溶液を冷却した。目的化合物が折出し、生成物を濾別した。
収率：７９％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ３６４．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．４２〜１．６７（ｍ，６Ｈ）、２．５７〜２．６０（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．６８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．８１〜２．９０（ｍ，５Ｈ）、３．１１（ｍ，１Ｈ）、４．１４〜４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．２９〜４．３５（ｍ，１Ｈ）、６．３７（ｓ，１Ｈ）、６．４２（ｓ，１Ｈ）
【０１７３】
反応手順Ｒ
中間体７２：Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド
ＴＥＡ（０．８７９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ  １５ｍｌ中の２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタンアミン（０．８７９ｍｍｏｌ）溶液に添加した後、ＤＭＦ  １０ｍｌ中のビオチン−ＮＨＳ（中間体７１）（０．８７９ｍｍｏｌ）溶液を添加した。得られた溶液を、室温にて１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ中２０％ＭｅＯＨ）によって精製した。
収率：７７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４６７．３  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．２９〜１．６４（ｍ，６Ｈ）、２．０７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．５９（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．８２（ｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ及びＪ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．０９（ｍ，１Ｈ）、３．１８（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｍ，４Ｈ）、３．５３（ｍ，８Ｈ）、３．６２（ｍ，２Ｈ）、４．１２（ｍ，１Ｈ）、４．３１（ｍ，１Ｈ）、６．３６（ｓ，１Ｈ）、６．４２（ｓ，１Ｈ）、７．８３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）
【０１７４】
反応手順Ｓ
中間体７３：１０−（７−アジドヘプチル）−５，５−ジフルオロ−１，３，７，９−テトラメチル−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド
ＤＣＥ  １０ｍｌ中の８−アジドオクタニルクロリド（中間体６６）（１０．８０ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液を作製し、２，４−ジメチル−ピロール（２２．６８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を６５℃にて２時間撹拌した。室温まで冷却するために置いた後、ボロントリフルオリドエーテル複合体（５４．０ｍｍｏｌ）を滴加し、Ｎ，Ｎ−ジ−イソ−プロピルエチルアミン（４３．２ｍｍｏｌ）を滴加した。その後、Ｎ２ガスを溶液中にバブリングし、反応混合物を常温で一晩撹拌した。Ｈ２Ｏ及びＥｔＯＡｃを添加した。Ｎａ２ＳＯ４上で有機層を乾燥し、溶媒の蒸発の後に粗生成物が得られた。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中７％ＥｔＯＡｃ）を用いた精製により、所望の生成物が生じた。
収率：６％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４１０．１  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  １．３０〜１．７（ｍ，１０Ｈ）、２．４１４（ｓ，６Ｈ）、２．５１４（ｓ，６Ｈ）、２．９４（ｍ，２Ｈ）、３．２６（ｍ，２Ｈ）、６．０５２（ｓ，２Ｈ）
【０１７５】
反応手順Ｔ
中間体７５：Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−４−フルオロベンズアミド
２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタンアミン（中間体７４）（２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ  ２ｍｌ及びＴＥＡ（３．００ｍｍｏｌ）に溶解した。ＤＣＭ  １ｍｌに溶解した２，５−ジオキシピロリジン−１−イル４−フルオロベンゾエート（２．２００ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。得られた混合物を、室温にて４時間撹拌した。その後、粗反応物をＤＣＭで希釈し、１０％クエン酸溶液及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１００％ＤＣＭからＤＣＭ中４％ＭｅＯＨ）により所望の生成物が生じた。
収率：７４％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ  ３．２７（ｍ，２Ｈ）、３．５７（ｍ，１４Ｈ）、６．９０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、７．０２（ｍ，２Ｈ）、７．７６（ｍ，２Ｈ）
【０１７６】
反応手順Ｕ
中間体７７：２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−（６−（（２−アジドエチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム
ＤＭＦ  ４ｍｌ中の（２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム）（中間体７６）（０．１９３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＴＵ（０．２３１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．４２４ｍｍｏｌ）を添加した。室温にて１時間に亘り得られた溶液を撹拌した後、２−アジドエチルアミン＊（０．２６７ｍｍｏｌ）を添加した。この最終溶液を、室温にて一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去した後、フラッシュクロマトグラフィー（１００％ＤＣＭからＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）を行った。
収率：５７％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．４６（ｍ，２Ｈ）、１．６８（ｍ，１４Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、２．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．３０（ｓ，４Ｈ）、３．６１（ｓ，３Ｈ）、４．０９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、６．２５（ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ及びＪ＝１３．６Ｈｚ，２Ｈ）、６．６２（ｔ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．２６（ｍ，４Ｈ）、７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、８．２２（ｔ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，２Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １９．０分（９８．７％）
＊下記参考文献の手順に従って２−アジドエチルアミンを合成した：Benalil, A.;
Carboni, B.; Vaultier, M. Synthesis of 1,2-aminoazides.Conversion to
unsymmetrical vicinal diamines by catalytic hydrogenation or reductive
alkylation with dichloroboranes. Tetrahedron 1991, 47, 8177-8194
【０１７７】
最終化合物の合成
最終化合物の合成のため、Ｂｏｃ保護グアニジン中間体（中間体４６〜５４）、又は非保護グアニジン中間体（中間体５５〜６３）のいずれかを使用することができる。クリックケミストリー（Ｃｕ（Ｉ）触媒ヒュスゲンアジドアルキン付加環化）を用いることにより、種々の視覚化タグ（例えば、ローダミン、ビオチン、ＢＯＤＩＰＹ）を中間体に付加することができる。
【０１７８】
ローダミン最終生成物及びＢＯＤＩＰＹ最終生成物の場合、「クリック」反応が非保護グアニジン中間体に対して実施されたが、ビオチン及び４−フルオレンズアミド（fluorenzamide）は最終工程として脱保護によりｂｏｃ保護グアニジン中間体に連結された。
【０１７９】
ローダミン−アジド（中間体６８）を、アルキンプローブ（中間体５５〜５８及び６３）と連結し、そして、中間体５８／６３のリンカー部を保持する最終化合物が最も速い阻害速度定数を有することが分かった。したがって、種々の視覚化タグの更なる連結は、中間体５８、又はその保護アナログ（中間体４９）に対してのみ行われた。
【０１８０】
ｉｎ  ｓｉｔｕで産生されたＣｕ（Ｉ）触媒（ＣｕＳＯ４／アスコルビン酸ナトリウム）の存在下、水媒体中で室温にて「クリック」反応を行った（模式図４及び模式図５）。
【０１８１】
同様の方法において、Ｃｙ５型可視化リンカーを用いたｕＰＡ活性依存型プローブの合成が可能であった。
【０１８２】
【化１０】
2014518859.tif 000012
中間体
模式図４：最終化合物１〜６を得るための、クリッカブルプローブ（中間体５５〜５８又は中間体６３）におけるローダミン−アジド（中間体６８）又はＢＯＤＩＰＹ−アジド（中間体７３）の連結。
試薬及び条件：（ａ）ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、ｔ−ＢｕＯＨ  （ｂ）ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ
【０１８３】
【化１１】
2014518859.tif 000013
中間体
模式図５：最終化合物７、８及び９をそれぞれ得るための、中間体５８におけるビオチン−アジド（中間体７２）、４−フルオロベンズアミド（中間体７５）、Ｃｙ５−アジド（中間体７７）の連結。
試薬及び条件：（ａ）ｉ）ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、ｔ−ＢｕＯＨ  ｉｉ）ＴＦＡ、ＤＣＭ  （ｂ）ｉ）ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ  ｉｉ）ＴＦＡ、ＤＣＭ
【０１８４】
生化学的評価  ｕＰＡ及びその他の代表的なトリプシン様セリンプロテアーゼに対する中間体５５〜６３及び最終化合物１〜９のＩＣ５０値を判定した。後者は、血液凝固カスケード及び線維素溶解に関与する、ｔＰＡ、プラスミン、トロンビン、及びＦＸａである。
【０１８５】
最終化合物の合成
反応手順Ｖ
最終化合物１：２，２，２−トリフルオロ酢酸、Ｎ−（６−（ジエチルアミノ）−９−（２−（４−（８−（４−（（２−（（（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバモイル）オキシ）エトキシ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド２−（プロパ−２−イ二ルオキシ）エチル１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチルカルバメート２，２，２−トリフルオロアセテート（中間体５５）（０．１５４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（９−（２−（４−（８−アジドオクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−６−（ジエチルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド（中間体６８）（０．１５４ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（０．３６９ｍｍｏｌ）及び硫酸銅（ＩＩ）（０．０９２ｍｍｏｌ）を水（４００μｌ）及びｔ−ＢｕＯＨ（４００μｌ）に溶解した。その溶液を、室温にて５時間撹拌した。ＤＣＭ（４０ｍｌ）及びＨ２Ｏ（４０ｍｌ）を添加した。有機層を分離し、ブライン溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空下で除去した。粗生成物を少量のＤＣＭに溶解し、Ｅｔ２Ｏに添加した。沈殿が形成され、エーテルを除去した。残留した固体をＥｔ２Ｏで数回洗浄した。
収率：２９％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６０７．９  ［Ｍ＋Ｈ］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．３２（ｍ，１８Ｈ）、１．５２（ｍ，２Ｈ）、１．８７（ｍ，２Ｈ）、２．３３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．４１（ｍ，８Ｈ）、３．５０（ｍ，１Ｈ）、３．６３（ｍ，２Ｈ）、３．６９（ｍ，８Ｈ）、４．１１（ｍ，２Ｈ）、４．３７（ｍ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，３Ｈ）、６．９９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．１０（ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ及びＪ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．１７〜７．４４（ｍ，１６Ｈ）、７．５４（ｍ，１Ｈ）、７．７３（ｍ，１Ｈ）、７．８０（ｍ，２Ｈ）、７．９４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １５．５分（９０．８％）
【０１８６】
以下の化合物を同様の方法によって調製した：
最終化合物２：２，２，２−トリフルオロ酢酸、Ｎ−（６−（ジエチルアミノ）−９−（２−（４−（８−（４−（１１−（ジフェノキシホスホリル）−１２−（４−グアニジノフェニル）−９−オキソ−２，５，８−トリオキサ−１０−アザドデシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド
収率：６６％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６２９．９  ［Ｍ＋Ｈ）］２＋
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  ２３．８分（９１．１％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  １．３２（ｍ，１８Ｈ）、１．５３（ｍ，２Ｈ）、１．８９（ｍ，２Ｈ）、２．３３（ｍ，２Ｈ）、３．１２（ｍ，１Ｈ）、３．３９（ｍ，８Ｈ）、３．６２（ｍ，６Ｈ），８．３７（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，８Ｈ）、４．０９（ｍ，２Ｈ）、４．３８（ｍ，２Ｈ）、４．６２（ｍ，２Ｈ）、４．６７（ｍ，１Ｈ）、６．９〜８．０（ｍ，２５Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １６．０分（９６．０％）
【０１８７】
最終化合物３：２，２，２−トリフルオロ酢酸、Ｎ−（６−（ジエチルアミノ）−９−（２−（４−（８−（４−（１４−（ジフェノキシホスホリル）−１５−（４−グアニジノフェニル）−１２−オキソ−２，５，８，１１−テトラオキサ−１３−アザペンタデシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド
追加精製工程：生成物をＤＣＭに溶解し、ＥｔＯＡｃに添加した。沈殿が形成された。この手順を繰り返したが、化合物はヘキサンに添加した。
収率：３７％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６５１．９  ［Ｍ＋Ｈ］２＋１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）＿  １．３０（ｍ，１８Ｈ）、１．５２（ｍ，２Ｈ）、１．８７（ｍ，２Ｈ）、２．３２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．９８（ｍ，８Ｈ）、３．５６〜３．７１，（ｍ，１８Ｈ）、４．０７（ｍ，２Ｈ）、４．３６（ｍ，２Ｈ）、４．６０（ｍ，３Ｈ）、６．９５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０６（ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ及びＪ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．１５〜７．５２（ｍ，１６Ｈ）、７．６９（ｍ，１Ｈ）、７．７７（ｍ，２Ｈ）、７．９０（ｍ，２Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １３．９分（９０．１％）
【０１８８】
最終化合物４：２，２，２−トリフルオロ酢酸、Ｎ−（６−（ジエチルアミノ）−９−（２−（４−（８−（４−（３−（（（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバモイル）オキシ）プロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド
収率：６５％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５９９．８  ［Ｍ＋Ｈ］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  １．３０（ｍ，１８Ｈ）、１．５２（ｍ，２Ｈ）、１．８６（ｍ，４Ｈ）、２．３２（ｍ，２Ｈ）、２．６９（ｍ，２Ｈ）、３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｍ，８Ｈ）、３．６８（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，８Ｈ）、３．９８（ｍ，２Ｈ）、４．３３（ｍ，２Ｈ）、４．６３（ｍ，１Ｈ）、６．９〜７．８（ｍ，２５Ｈ）
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔｒ  ２３．８分（９１．８％）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １６．４分（９７．１％）
【０１８９】
最終化合物５：２，２，２−トリフルオロ酢酸、Ｎ−（９−（２−（４−（８−（４−（３−（（（１−（ビス（４−アセトアミドフェノキシ）ホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバモイル）オキシ）プロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタノイル）ピペラジン−１−カルボニル）フェニル）−６−（ジエチルアミノ）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−Ｎ−エチルエタンアミニウムクロリド
収率：５１％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６５７．２  ［Ｍ＋Ｈ］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）δ  １．３４（ｍ，１８Ｈ）、１．５１（ｍ，２Ｈ）、１．８５（ｍ，４Ｈ）、２．１１（ｓ，６Ｈ）、２．３１（ｔ，２Ｈ）、２．６８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．１３（ｍ，１Ｈ）、３．３６（ｍ，９Ｈ）、３．６５（ｑ，８Ｈ）、３．９５（ｍ，２Ｈ）、４．３０（ｔ，２Ｈ）、４．６０（ｍ，１Ｈ）、６．９４〜７．５５（ｍ，２３Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １４．５分（９１．３％）
【０１９０】
最終化合物６：１０−（７−（４−（３−（（（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバモイル）オキシ）プロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ヘプチル）−５，５−ジフルオロ−１，３，７，９−テトラメチル−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド２，２，２−トリフルオロアセテート
ｔ−ＢｕＯＨに代えてＴＨＦを使用した。精製工程において沈殿はなかった。抽出後、生成物は純粋物であった。
収率：８２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ９０８．５  ［Ｍ＋１］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ，４００ＭＨｚ）：  δ  １．２５〜１．６５（ｍ，８Ｈ）、１．８８（ｍ，４Ｈ）、２．４３（ｓ，６Ｈ）、２．４５（ｓ，６Ｈ）、２．６８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．００（ｍ，２Ｈ）、３．０９（ｍ，１Ｈ）、３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．３４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、６．１３（ｓ，２Ｈ）、７．１５〜７．５０（ｍ，１４Ｈ）、７．６７（ｓ，１Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １７．７分（９５．０％）
【０１９１】
反応手順Ｗ
最終化合物７：３−（１−（１３−オキソ−１７−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−３，６，９−トリオキサ−１２−アザヘプタデシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロピル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバメート２，２，２−トリフルオロアセテートペンタ−４−イン−１−イル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン）フェニル）エチル）カルバメート（中間体４９）（０．１３９ｍｍｏｌ）及びＮ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（中間体７２）（０．１３９ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢｕＯＨ及びＨ２Ｏ（各６００μｌ）の混合物に溶解した後、アスコルビン酸ナトリウム（０．３３３ｍｍｏｌ）及びＣｕＳＯ４（０．０８３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、室温にて４時間撹拌した。水及びＤＣＭを添加し、水層をＤＣＭで更に２回洗浄した。混合された有機層を１Ｎ  ＨＣｌ、飽和重炭酸塩、及びブラインの溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中２０％ＭｅＯＨ）により精製し、３−（１−（１３−オキソ−１７−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−３，６，９−トリオキサ−１２−アザヘプタデシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロピル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−（２，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジノフェニル）エチル）カルバメート２，２，２−トリフルオロアセテートを得た。
収率：６２％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １１８７．８  ［Ｍ＋Ｎａ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  １．４５（ｓ，９Ｈ）、１．５１（ｍ，２Ｈ）、１．５７（ｓ，９Ｈ）、１．６０〜１．７５（ｍ，４Ｈ）、１．８８（ｍ，２Ｈ）、２．１８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．６７（ｍ，３Ｈ）、２．９０（ｄｄ，１Ｈ）、３．０５（ｍ，１Ｈ）、３．１７（ｍ，１Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．５０（ｍ，２Ｈ）、３．５５（ｓ，４Ｈ）、３．５８（ｓ，４Ｈ）、３．８５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．９６（ｄｔ，Ｊ＝１．７Ｈｚ及び６．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．２６（ｍ，１Ｈ）、４．４６（ｍ，１Ｈ）、４．５１（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．１〜７．５５（ｍ，１４Ｈ）、７．７６（ｓ，１Ｈ）
【０１９２】
この得られた「クリック」生成物を、ＤＣＭ  １ｍｌ及びＴＦＡ  １ｍｌ中に溶解することによって脱保護した。この溶液を室温にて２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。低温エーテルを添加し、化合物を洗浄した。
収率：５４％
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ９６５．５  ［Ｍ＋１］＋、４９４．１  ［（Ｍ＋Ｎａ）／２］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ    １．４４（ｍ，２Ｈ）、１．５０〜１．７５（ｍ，４Ｈ）、１．８９（ｍ，２Ｈ）、２．２０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．７０（ｍ，３Ｈ）、２．９２（ｄｄ，１Ｈ）、３．０９（ｍ，１Ｈ）、３．１９（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、３．５１（ｍ，２Ｈ）、３．５８（ｓ，４Ｈ）、３．６１（ｓ，４Ｈ）、３．８９（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、４．００（ｍ，２Ｈ）、４．２９（ｍ，１Ｈ）、４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．５１（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．５０（ｍ，１４Ｈ）、７．７６（ｓ，１Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １２．９分（９８．２％）
【０１９３】
以下の化合物を同様の方法によって調製した：
最終化合物８：３−（１−（１−（４−フルオロフェニル）−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロピル（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバメートヒドロクロリド
ｔ−ＢｕＯＨに代えてＴＨＦを使用した。フラッシュ精製（ＥｔｏＡｃ中１０％ＭｅＯＨ）
「クリック」生成物の脱保護の後、得られた化合物を、エーテル中の１Ｎ  ＨＣｌをＴＦＡ塩に添加することによりＨＣｌ塩に変換した。沈殿が形成された。
収率：９８％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ  １．９５（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．４１（ｍ，１Ｈ）、３．５６（ｍ，１２Ｈ）、３．９０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．９９（ｍ，１Ｈ）、４．０４（ｍ，１Ｈ）、４．６５（ｍ，３Ｈ）、７．２０（ｍ，１０Ｈ）、７．３８（ｍ，４Ｈ）、７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．８８（ｄｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ及びＪ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、８．２１（ｓ，１Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １４．１分（９７．４％）
【０１９４】
最終化合物９：２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−（６−（（２−（４−（３−（（（１−（ジフェノキシホスホリル）−２−（４−グアニジノフェニル）エチル）カルバモイル）オキシ）プロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム
生成物を凍結乾燥した（水／ｔ−ＢｕＯＨ  （３／１）中に溶解）。
収率：８７％
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，４００ＭＨｚ）：  １．４１（ｍ，２Ｈ）、１．６０（ｍ，２Ｈ）、１．７２（ｍ，８Ｈ）、１．７８（ｍ，３Ｈ）、１．８９（ｍ，３Ｈ）、２．１７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．７０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．１１（ｍ，１Ｈ）、３．３７（ｓ，２Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、３．６２（ｓ，４Ｈ）、３．９９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．１１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．４５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．６５（ｍ，１Ｈ）、６．２８（ｄｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ及びＪ＝１７．６Ｈｚ、２Ｈ）、６．６３（ｔ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１５〜７．５２（ｍ，２２Ｈ）、７．７０（ｓ，１Ｈ）、８．０４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ，１Ｈ）、８．２６（ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，２Ｈ）
ＬＣ−ＭＳ  ｔｒ  １７．４分（９２．２％）
【０１９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ｕＰＡ阻害：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価  ８０μＭのＫｍで発色基質Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＣＳ−６１（４４）（ＬｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｙ  Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡ・ＨＣｌ）を用いて、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３４０（Molecular Devices）マイクロタイタープレートリーダーにおいて、３７℃で酵素活性を測定した。
【０１９６】
基質及びヒト酵素は、Nodiaより入手した。４０５ｎｍで反応をモニタリングし、２０分間で０吸光単位〜０．２５吸光単位において初速度を特定した。反応混合物は、最終容量２００μＬにおいて緩衝溶液１４５μＬ中に２５０μＭの基質と約１ｍＵの酵素とを含むものであった。５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．８）を使用した。各インヒビター濃度から５μＬを添加し、総容量０．２ｍＬ中０μＭ〜２５０μＭの最終濃度を得た。定期的に２度に亘って活性測定を行った。基質の添加前に３７℃にて１５分間の酵素とプレインキュベーションした後の酵素活性を５０％に低下させるために必要とされるインヒビターの濃度として、ＩＣ５０値を規定する。Ｇｒａｆｉｔ５を用いた４パラメータロジスティック方程式によりデータをフィッティングすることによってＩＣ５０値を取得した。
【数１】
2014518859.tif 000014
式中、ｓ＝傾斜因子、ｖ＝速度、Ｉ０＝インヒビター濃度、及び範囲＝フィッティングされた非阻害値−バックグラウンドである。方程式は、ｘが増加するとともにｙが低下すると仮定する。
【０１９７】
インヒビターのストック溶液をＤＭＳＯ中に調製し、−２０℃で保存した。本明細書に記載される化合物が擬１次反応速度に従ってｕＰＡを完全に不活性化することから、ＩＣ５０値は不活性化の二次速度定数と逆相関する。単純な擬１次の不活性化プロセスについては、下記方程式に記載されるように、インヒビター（ｖｉ）とインキュベーションを行った後の活性は、インヒビターの濃度（ｉ）により変化する。
【数２】
2014518859.tif 000015
式中、Ｖ０はインヒビターが存在しない場合の活性であり、ｋが不活性化の二次速度定数であり、ｔが時間である。経時的な阻害から不活性化速度定数を決定した。
【０１９８】
基質（最終濃度２５０μＭ）とインヒビターを混合し、酵素を含む緩衝溶液を０時間で添加した。２０分以内に酵素の完全阻害が得られるようにインヒビター濃度を選択した。進行曲線は、時間を関数として生成されるｐ−ニトロアニリドの吸光度を示す。最初はいずれのインヒビターも酵素に結合しておらず、進行曲線（ｄＡ／ｄｔ）に対する接線は遊離酵素の濃度に比例する。上述のように、インヒビターの結合反応速度によって経時的に遊離酵素濃度が低下する。進行曲線は、擬１次条件（［Ｉ］０＞＞［Ｅ］０）において記録され、全時間経過において基質の変換は１０％未満であった。これらの条件において、ｄＡ／ｄｔは時間と共に指数関数的に低下した。擬一次速度定数であるｋｏｂｓ値を得るため、統合速度方程式を用いて進行曲線をフィッティングした。
【数３】
2014518859.tif 000016
式中、Ａｔ＝時間ｔにおける吸光度、Ａ０＝時間０における吸光度、及びｖ０＝非阻害初速度である。
【０１９９】
インヒビター濃度（［Ｉ］０）に対するｋｏｂｓのプロットの直線部分の傾斜から見かけ上の二次速度定数（ｋａｐｐ）を算出した。インヒビターと基質とが競合する場合、酵素の或る特定の画分が酵素基質複合体として存在するため、ｋａｐｐは上述の「真の」二次速度定数ｋよりも小さい。Lambeir他によって説明されるように４０、ｋａｐｐは実験に使用される基質濃度に依存する。ほとんどの最終化合物について、［Ｉ］０に対するｋｏｂｓのプロットは直線ではないが、双曲線関数：ｋｏｂｓ＝ｋ２［Ｉ］０／（Ｋ１＋［Ｉ］０）（二段階機構（two-step mechanism））によりフィッティングすることができた。式中、Ｋ１は可逆的酵素インヒビター複合体の解離定数であり、ｋ２は酵素の不可逆的修飾に関連する一次速度定数である。ｋ２／Ｋ１としてｋａｐｐを算出することができた。
【０２００】
ｕＰＡに対する選択性の決定。プラスミン（ヒト血漿由来、Sigma）、ｔＰＡ（組換え体、Nodia）、トロンビン（ヒト血漿由来、Sigma）及びＦＸａに対するＩＣ５０値は、ｕＰＡに対するものと同様の方法で決定された。ｔＰＡ（Ｋｍ：１ｍＭ）に対してはＢｉｏｐｈｅｎ  ＣＳ−０５（８８）（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮａ・２ＨＣｌ）、プラスミン（Ｋｍ：４００μＭ）及びトロンビン（Ｋｍ：１５０μＭ）に対してはｂｉｏｐｈｅｎ  ＣＳ−２１（６６）（ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ）、そしてＦＸａ（Ｋｍ：１．５ｍＭ）に対してはＢｉｏｐｈｅｎ  ＣＳ−１１（３２）（Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（ａ  Ｐｉｐ）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＨＣｌ）を基質として使用した。トロンビン及びプラスミンに対して基質５８０μＭ、ｔＰＡに対して基質１．２５ｍＭ、ＦＸａに対して基質５２２μＭ、そしてトリプシンに対して基質４２５μＭと、酵素約５ｍＵと、緩衝溶液１４５μＬとが混合物に含まれていた。ｔＰＡ及びトロンビン対してＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．３）を使用し、ＦＸａに対してＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．３）を使用し、プラスミンに対してＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．４）を使用した。結果を表１に示す。
【０２０１】
表１：化合物の選択性
【表１】
2014518859.tif 000017
＊化合物は二段階機構を示し、ｋａｐｐはｋ２／Ｋ１として算出された。
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【０２０２】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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