(57)【要約】医薬組成物は、治療上の有効成分として、固体溶液または分散液として脂質ナノ粒子に取り込まれた、コルチコステロイドおよび／またはビタミンＤ誘導体を含み、該脂質ナノ粒子は環境温度で固体であり、融点が体温より高い第一の脂質を含み、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルモノ−、ジ−もしくはトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、該脂質ナノ粒子は、環境温度で油であり第一の脂質と混和性である第二の脂質を含んでよく、そして、薬学的に許容される界面活性剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上の有効成分として、固体溶液または分散液として、脂質ナノ粒子に取り込まれたコルチコステロイドを含む医薬組成物であって、該脂質ナノ粒子は環境温度で固体であり、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含み、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルモノ−、ジ−、もしくはトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、該脂質ナノ粒子はさらに約２〜２５重量％の薬学的に許容される界面活性剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
第一の脂質を脂質ナノ粒子の約６５〜９２重量％または約７０〜９０重量％または約７５〜８５重量％または約８０重量％含み、界面活性剤を組成物の約８〜２２重量％、例えば約１０〜２０重量％含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第一の脂質が、パルミチン酸セチル、蜜蝋、パルミチン酸ステアリル、ベヘン酸ステアリル、モノステアリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジベヘン酸グリセロール、トリミリスチン酸グリセリロール、トリパルミチン酸グリセロール、トリステアリン酸グリセロール、ベヘノール、ステアリン酸、水添パーム油、水添ココグリセリル、水素化ヒマシ油およびセトステアリルアルコールからなる群から選択される、
請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
界面活性剤が、ポロキサマー、ポリソルベート、糖エステル、エトキシル化した脂肪アルコールまたはリン脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
環境温度で油であり、第一の脂質と混和性である、第二の脂質または親油性の乳化剤もしくは皮膚軟化薬を、脂質ナノ粒子の約１〜４０％、例えば約１０〜３０重量％または約１５〜２５重量％または約２０重量％さらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
第二の脂質が、Ｃ６〜１０モノグリセリド、Ｃ６〜１０ジグリセリド、ミリスチン酸イソプロピルもしくはパルミチン酸イソプロピル、中鎖トリグリセリド、例えばトリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリル、または、植物油、例えばヒマシ油、ヒマワリ油、サフラワー油、メマツヨイグサ油、ボラージオイル、ゴマ油、トウモロコシ油、パーム核油、オリーブ油、アボカド油、なたね油、ココナッツ油、綿実油、ピーナツ油、大豆油、麦芽油、ブドウ種子油またはホホバ油を含む長鎖トリグリセリドからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第一の脂質を脂質ナノ粒子の約７５〜８５重量％、第二の脂質を脂質ナノ粒子の約１５〜２５重量％および、界面活性剤を脂質ナノ粒子の約２〜５重量％含む、
請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
コルチコステロイドがアムシノニド、ベタメタゾン、ブデノシド、クロベタゾール、クロベタゾン、コルチゾン、デソニド、デスオキシコルチゾン、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフルコルトロン、ジフロラゾン、フルコルチゾン、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノニド、フルオシノロン、フルオロメトロン、フルプレドニソロン、フルランドレノリド、フルチカゾン、ハルシノニド、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾン、モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾン、プレドニゾロンおよびトリアムシノロンからなる群から選択されるか、またはその薬学的に許容されるエステルもしくはアセトニドである、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
コルチコステロイドが、１７-吉草酸ベタメタゾンまたは１７,２１-ジプロピオン酸ベタメタゾンのような、ベタメタゾンまたはそのエステルである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
脂質ナノ粒子が平均粒子サイズ／直径が約１０〜８００nm、特に約５０〜６００nm、例えば１００〜５００nmの範囲内である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
脂質ナノ粒子が組成物の約１〜４０重量％、例えば約５〜３０重量％、または約１０〜２０重量％の量で存在する、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
さらに水相を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
水相が増粘剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
増粘剤が、カルボマー、セルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストランからなる群から選択されるか、またはその誘導体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
増粘剤が、組成物の約０.１〜５重量％、例えば約０.５重量％の量で存在する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
（a）コルチコステロイドを、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含む脂質相に、溶解または分散させ、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルジ−またはトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、かかる第一の脂質は溶解した状態であり、該脂質相は、約１〜４０重量％の、環境温度で油であり第一の脂質と混和性である、第二の脂質、または親油性の乳化剤もしくは皮膚軟化薬を含んでよく;
（b）工程（a）で得られた脂質相を、ポロキサマー、ポリソルベート、糖エステルまたはエトキシル化した脂肪アルコールからなる群から選択される、薬学的に許容される界面活性剤を０.２〜１０重量％含む水相に分散させ、乳化剤を形成させ、
（c）工程（b）で得られた乳化剤を、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、コルチコステロイドを含む脂質相のナノ粒子を形成させ、そして
（d）工程（c）で得られた、ホモジナイズした乳化剤を冷却し、ナノ粒子を凝固させる、
工程を含む、製造方法。
【請求項１７】
炎症性または過剰増殖性の皮膚疾患、例えば乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、皮膚老化、光老化、ざ瘡、蕁麻疹またはそう痒症を予防または処置するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
治療上の有効成分として、脂質ナノ粒子に固体溶液または分散液として取り込まれたビタミンＤ誘導体を含む、局所用医薬組成物であって、該脂質ナノ粒子は環境温度で固体であり、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含み、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、酸価０.１以下のＣ１２〜２４脂肪酸のグリセリルトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、該脂質ナノ粒子はさらにポロキサマーおよびエトキシル化した脂肪アルコールから選択される、薬学的に許容される界面活性剤を約２〜２２重量％含む、医薬組成物。
【請求項１９】
第一の脂質を、脂質ナノ粒子の約６５〜９０重量％、または約７０〜８５重量％、または約７５〜８０重量％含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
かかる第一の脂質が、パルミチン酸セチル、Ｃ１４〜２８脂肪アルコール、水添パーム油および酸価０.１以下のトリグリセリドからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
環境温度で油であり、第一の脂質と混和性である、第二の脂質を、脂質ナノ粒子の約１〜４０重量％、または約１０〜３５重量％、または約１５〜３０重量％、または約２０〜２５重量％さらに含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
かかる第二の脂質が、ミリスチン酸イソプロピルまたはパルミチン酸イソプロピル、中鎖トリグリセリド、例えばトリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリル、または長鎖トリグリセリド、例えばヒマシ油からなる群から選択される、請求項１８〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
脂質ナノ粒子が、該脂質ナノ粒子の約８０〜８５重量％の第一の脂質、１５〜２０重量％のかかる第二の脂質、および約２〜５％の界面活性剤を含む、請求項１８〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
かかる第一の脂質がパルミチン酸セチルであり、かかる第二の脂質がトリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリルである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ビタミンＤ誘導体がカルシポトリオール、カルシトリオール、マキサカルシトールまたはタカルシトールから選択される、請求項１８〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
ビタミンＤ誘導体がルシポトリオールまたはカルシポトリオール一水和物である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
脂質ナノ粒子の平均粒子サイズ／直径が約１０〜８００nm、具体的には約５０〜６００nm、例えば約１００〜５００nmの範囲内である、請求項１８〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
脂質ナノ粒子が組成物の１〜４０重量％、例えば約５〜３０重量％または約１０〜２０重量％の量で存在する、請求項１８〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
さらに、組成物のｐＨが７．５以上になるようにアルカリ性緩衝剤を含む、請求項１８〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
該アルカリ性緩衝剤が脂質アンカーを含むアミンである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３１】
該アミンが、トリエタノールアミン、トロメタモール、モノエタノールアミンまたはジエタノールアミンから選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
さらに水相を含む、請求項１８〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
水相がさらに、シリコーン油、流動パラフィンまたはコレステロールのような皮膚軟化薬を含む、請求項１２〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
該皮膚軟化薬が、組成物の約１０〜５０重量％、または約２０〜４０重量％、または約３０重量％の量で含まれる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
増粘剤をさらに含む、請求項１８〜３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
該増粘剤が、カルボマーまたはセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
増粘剤が、組成物の０.１〜５重量％、具体的に約０.５重量％である、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１８〜３７のいずれかに記載の組成物の製造方法であって、
（a）ビタミンＤ誘導体を、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含む脂質相に、融解または分散させ、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、酸価０.１以下の、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコール、およびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、環境温度で油であり第一の脂質と混和性である、第二の脂質を約１〜４０重量％含んでよく、かかる第一の脂質は融解した状態であり、
（b）工程（a）で得られた脂質相を、ポロキサマーまたはエトキシル化した脂肪アルコールから選択される、薬学的に許容される界面活性剤を０.２〜１０重量％含む水相に分散させ、
（c）工程（b）で得られた乳化剤を、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズして、ビタミンＤ誘導体を含む脂質相のナノ粒子を形成させ、そして、
（d）工程（c）で得られた、ホモジナイズした乳化剤を冷却して、ナノ粒子を凝固させる、
工程を含む、方法。
【請求項３９】
炎症性または過剰増殖性の皮膚症状、例えば、乾癬、脂漏性乾癬（sebopsoriasis）、手掌足底膿疱症、皮膚炎、魚鱗癬、酒さ、ざ瘡または日光角化症の予防または処置のための、請求項１８〜３７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
ビタミンＤ誘導体の標的を毛包の脂腺とする方法であって、かかる処置を必要としている患者の皮膚領域に、請求項１８〜３７のいずれかに記載の脂質ナノ粒子組成物を治療上有効量適用することを含む、方法。
【請求項４１】
処置を必要としている患者の皮膚領域が、ざ瘡または酒さに伴う、面皰、膿疱、丘疹または嚢胞を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ビタミンＤ誘導体が、カルシポトリオールまたはカルシポトリオール一水和物である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜１７および１８〜３７のいずれかに記載の脂質ナノ粒子の、薬学的に許容される水性媒体中の混合物を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
抗酸化剤をさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
該抗酸化剤が、ＢＨＡおよびＢＨＴの群から選択されるか、ＢＨＡとＢＨＴの混合物である、請求項４４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質ナノ粒子と、有効成分としてコルチコステロイドおよび／またはビタミンＤ類似体を含む組成物、該脂質ナノ粒子を製造する方法、および該組成物の、皮膚疾患および症状の処置における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、全ての子供の１０〜２０％で発症する、乳児期で罹患率の高い、慢性的に再発性の炎症性皮膚疾患である（非特許文献１）。該疾患は、そう痒、紅斑、苔癬化、丘疹および上皮バリアの損傷を伴う皮膚乾燥および、皮膚感染のおこりやすさを特徴とする（非特許文献２）。ＡＤの病因は、多くは免疫異常によるとされている。しかしながら、近年のいくつかの研究結果から、ＡＤにおいて、皮膚バリアの欠損が、炎症プロセスならびに、皮膚内の免疫細胞に、抗原が近づくのを引き起こすのに重要であることが示されている。ＡＤと遺伝的なフィラグリンの欠損は有意に関係があり、皮膚バリアの破損はＡＤの発病に決定的なものであることが示されている（非特許文献３）。
【０００３】
現在、第一に選択されるＡＤの処置は、保湿剤との組み合わせで、広い抗炎症作用および免疫抑制作用を示す、コルチコステロイドの局所適用であり、この処置は、皮膚乾燥を軽減し、バリアを回復するのを助けることができる（非特許文献２）。油の含有量が高い軟膏剤またはクリーム剤は、皮膚を水分補給した状態に保つのにより効果的であり、適用する薬剤物質の浸透を促進しうるため、皮膚科医に好まれることがしばしばである（非特許文献４；非特許文献２）。しかし、これらのタイプの製剤は美容面であまり受け入れられておらず、ＡＤ患者におけるコンプライアンスの低さはこれを反映している（非特許文献５）。さらに、軟膏剤やクリーム剤といった慣用の媒体からの薬剤物質の放出や、その後の皮膚浸透は、きわめて限られており、非特異的な送達を含み、例えば、ある患者では、薬剤レベルが治療効果を誘発できない程に低い一方で、別の患者では、副作用を誘発するか、全身に浸透するようなことがありうる（非特許文献６）。ＡＤにおいて、皮膚バリアが損傷していることによって、薬剤を皮膚に標的化して送達することがさらに困難になっているが、これはバリアの状態が、皮膚内に浸透し、皮膚を通って透過する薬剤物質の量にとって重要であるためである（非特許文献７;非特許文献８;非特許文献９;非特許文献１０）。
【０００４】
皮膚の薬剤送達を最適化する方法の一は、ナノ粒子担体を用いることである。特に、脂質からなる粒子性の担体（脂質ナノ粒子、リポソーム、マイクロおよびナノ乳化剤）は、遮蔽性の性質、皮膚浸透促進および標的化の性質を有しうるために有望である（非特許文献６）。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、４０〜１０００nmで、原則的にｏ／ｗ型乳化剤に匹敵するが、液体油は融点が体温よりも上である脂質に置きかえられている（非特許文献１１）。ＳＬＮは、固体状態であり、サイズが小さいため、強い接着性を持ち、これは、皮膚への適用時に遮蔽性を誘発しうるものであり、また、美容的に、軟膏剤より受け入れられる（非特許文献１２;非特許文献１３;非特許文献１４）。遮蔽性は、ＡＤのような皮膚疾患において、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）を減少させ、また、皮膚バリアを物理的に回復するのに有用でありうる（非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Katoh, J. Dermatol. 36, 2009, pp. 367-376
【非特許文献２】Reitamo et al., Textbook of Atopic Dermatitis, １st Ed., Informa Healthcare, London, 2008
【非特許文献３】Palmer et al., Nat. Genet. 38, 2006, pp. 441-446; Weidinger et al., J. Allergy Clin. Immunol. 118, 2006, pp. 214-219
【非特許文献４】Wiedersberg et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 68, 2008, pp. 453-466
【非特許文献５】Yentzer et al., J. Drugs Dermatol. 9, 2010, pp. 324-329
【非特許文献６】Korting and Schaefer-Korting, Handbook Exp. Pharmacol., 2010, 435-468
【非特許文献７】Bronaugh and Stewart, J. Pharm. Sci. 74, 1985, pp. 1062-1066
【非特許文献８】Moon and Maibach, Exogenous Dermatoses. Environmental Dermatitis（Menne and Maibach, Eds.）, CRC, Boca Raton, 1991, pp. 217-226
【非特許文献９】Simonsen and Fullerton, Skin Pharmacol. Physiol. 20,  2007, pp. 230-236
【非特許文献１０】Wilhelm et al., J. Invest. Dermatol. 97, 1991, pp. 927-932
【非特許文献１１】Muller et al., Adv. Drug Del. Review 54, Suppl. 1, 2002, S131-S155
【非特許文献１２】Jenning et al., Int. J. Pharm. 199, 2000, pp. 167-177
【非特許文献１３】Santos et al., J. Drug Target., 2002, pp. 489-495
【非特許文献１４】Wissing and Muller, Eur. J. Pharm. Biophar. 56, 2003, pp. 67-72
【非特許文献１５】Keck and Schwabe, J. Biomed. Nanotechnol. 5, 2009, pp. 428-436
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
乾癬は、過角化症に起因する紅斑状の乾燥した鱗屑斑として顕在化する、慢性の炎症性皮膚疾患である。鱗屑斑は肘、膝および頭皮に最もよく見られるが、身体の他の部位、特に腰仙部に、より広範囲な病変が現れうる。軽度から中程度の乾癬の最も一般的な処置は、有効成分としてコルチコステロイドを含む組成物の局所適用を含む。コルチコステロイドの適用は、有効ではあるが、皮膚萎縮、皮膚線条、ざ瘡様発疹、口囲皮膚炎、皮膚真菌および細菌の過成長、有色皮膚の色素脱落および酒さのような多くの副作用があるという不利益がある。
【０００７】
しかしながら、長年、乾癬の有利な非ステロイド性処置には、カルシポトリオールが溶液中に存在する軟膏組成物（LEO PharmaのDaivonex（登録商標）またはDovonex（登録商標）軟膏として販売）またはクリーム組成物（LEO PharmaのDaivonex（登録商標）またはDovonex（登録商標）クリームとして販売）として製剤された、ビタミンＤ類似体化合物であるカルシポトリオールでの局所処置があった。軟膏組成物の溶媒は、皮膚への有効成分の浸透性を高め、効果の増強をもたらすとの利点を有するが、また皮膚刺激物としても作用することが知られているプロピレングリコールである。それ故に、局所製剤において、プロピレングリコールの含有は、頻繁に患者に接触性皮膚炎を起こし（ある研究により、１２.５％のプロピレングリコールに対する、多くの刺激反応が報告された、M. Hannuksela et al., Contact Dermatitis 1, 1975, pp. 112-116参照）、プロピレングリコールを高濃度で使用した場合、刺激反応の数は増加する（J. Catanzaro and J. Graham Smith, J. Am. Acad. Dermatol. 24, 1991, pp. 90-95により概説）ことが報告されている。とりわけプロピレングリコールの存在により生じる、カルシポトリオールの皮膚への浸透が上昇しているために、Daivonex（登録商標）軟膏は、Daivonex（登録商標）クリームよりも乾癬病変の処置に有効であることはわかっているが、また相当な割合の乾癬患者に、皮膚刺激をももたらす。
【０００８】
ヒトの皮膚、特に外層である角質層は、微生物の病原体および有毒化学物質の浸透に対する有効なバリアを提供する。皮膚のこの特性は一般に有益であるが、皮膚疾患を有する患者の皮膚に適用した有効成分が、大部分ではないにしても、相当量が、活性を発揮する場所である、皮膚の生きた層(viable layers of the skin)に浸透しえない点で、医薬の経皮投与を複雑にしている。真皮および表皮への有効成分が適切に浸透することを確実にするために、典型的にアルコール、例えばエタノールまたはジオール、例えばプロピレングリコールの形の溶媒の存在下で、有効成分を溶解された状態で含むことが一般的には好ましい。上述したように、プロピレングリコールはよく知られた浸透促進剤、すなわち、角質層に浸透することができ、媒体中の治療有効成分のような低分子成分を、表皮中へ「引き込む」物質である。プロピレングリコールは、それ自体が顕著な皮膚刺激を起こす可能性があり、また、媒体中の低分子で刺激物である可能性のある成分を表皮に「引き込む」ことができ、プロピレングリコールを含む慣用の媒体の、全体的な刺激作用を誘発する。このため、炎症性皮膚疾患の処置を意図した組成物中に、溶媒としてプロピレングリコールが含まれていると、炎症反応を悪化させることがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、皮膚への浸透が改善され、局所用の組成物に有効成分として含まれるコルチコステロイドまたはビタミンＤ類似体の生物学的活性が、例えば、潜在的な刺激物質である、プロピレングリコールや他の賦形剤といった慣用的な浸透促進剤の非存在下で、市販の軟膏剤に比べて改善されている組成物を提供することである。他の目的は、遮蔽性を有するが、美容的な性質は改善されている、すなわち、軟膏よりも脂っこさが少なく、より受け入れやすい「皮膚感触」を有している組成物を提供することである。
【００１０】
ざ瘡は、毛嚢脂腺濾胞に発症する、多因子性の疾患であって、皮脂産生と、皮脂腺からの皮脂の放出の増加、面皰（濾胞管中の固体化した皮脂プラグ）の形成につながる、毛嚢脂腺濾胞管における過剰量の皮脂が存在することを特徴とする、皮膚の症状である。さらに、管を閉じることにより、膿疱、丘疹または嚢胞が形成されるが、これらはしばしばバクテリア、特にざ瘡菌（Propionibacterium acnes）のコロニー形成および、局在化した炎症にさらされる。尋常性ざ瘡は１０代の間で最も共通の皮膚障害であるが、２０〜４０歳のかなりの数の大人も、ざ瘡を発症している。ざ瘡の処置のための、現在入手可能な薬剤は、過酸化ベンゾイル、アゼライン酸、局所用および全身用の抗生物質、例えばFucidin（登録商標）、クリンダマイシン、エリスロマイシンおよびテトラサイクリン、レチノイド、例えばアダパレン、トレチノイン、イソトレチノインおよびホルモン、例えばエストロゲンを含む。しかし、これらの薬物療法には、催奇性、皮膚刺激、光感作などの深刻な弱点がある。
【００１１】
発症した個人の心理社会面における否定的な結果および、ざ瘡の局所処置用の、入手可能な薬剤の数が比較的限られていること、ならびにこれらの薬剤について知られている副作用が重度のものであることから、ざ瘡の適切な治療のための新しい薬剤を提供することは非常に重要なことである。
【００１２】
したがって、組成物中に含有される有効成分を皮膚中の毛包に標的化することができる組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。ざ瘡および、酒さのような関連する障害の処置を意図している組成物の場合、濾胞に標的化することは特に興味深いことである。作用部位を有効成分の直接の標的とすることは、現在市販されている処置用の選択肢よりも、より許容性を示す、ざ瘡の治療を提供するために、皮膚刺激のような、副作用を減少させるという利点を加えうる。
【００１３】
皮膚で局所的に用いることを意図した薬剤物質の皮膚浸透は、主に３つの、以下の工程：１）該物質の媒体からの放出、２）角質層への浸透、および３）角質層から、生表皮および真皮中の標的部位への分配、を含む複雑な過程である。第一の過程は、薬剤と媒体の物理化学的な性質に依存するが、これは加工により最適化されうる。第二および第三の過程はより複雑である。薬剤物質の物理化学的な性質および媒体中の薬剤の飽和度はまた、媒体と皮膚間の、薬剤物質の分配に重要であり、媒体の最適化によって影響を受けうる。しかし、さらに、皮膚への浸透の主な生物学的バリア−角質層の状態は、皮膚疾患により影響を受ける。本発明に至る研究において、バリア損傷皮膚への局所的薬剤送達システムとしての性質について、脂質ナノ粒子を評価した。脂質ナノ粒子を、親油性化合物の皮膚への送達に適しており、遮蔽性を有する慣用的な軟膏製剤と比較した。
【００１４】
近年、バリア損傷皮膚を用いた試験管内試験により、ＳＬＮは軟膏剤と比較して、皮膚中に有意に高いレベルのコルチコステロイドを維持できるということが示された。この貯蔵効果は試験管内において、無傷の皮膚（intact skin）およびバリア損傷皮膚の両方で見られ、薬剤は角質層に特徴的に局在した。薬剤含有ＳＬＮの適用後における、薬剤物質の皮膚上層への特異的な局在、皮膚での貯蔵効果と、皮膚に適用した薬剤の治療上の効果の相関は十分に示されていない。脂質ナノ粒子が皮膚を遮蔽し、バリア損傷皮膚との相互作用を上昇させうることによって、薬剤の有効性が上昇した組成物を提供することは、本発明の目的である。
【００１５】
したがって、本発明は、固体溶液もしくは分散液として脂質ナノ粒子内に取り込まれたコルチコステロイドを治療上の有効成分として含む、局所用の医薬組成物であって、該脂質ナノ粒子は環境温度で固体であり、融点が体温より高い、第一の脂質を約６０〜９２重量％含み、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルモノ−、ジ−またはトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコール、およびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、該脂質ナノ粒子はさらに、薬学的に許容される界面活性剤を約２〜２５重量％含む、
医薬組成物に関する。
【００１６】
他の局面において、本発明は、固体溶液もしくは分散液として脂質ナノ粒子に取り込まれたビタミンＤ誘導体を治療上の有効成分として含む局所用医薬組成物であって、該脂質ナノ粒子は環境温度で固体であり、融点が体温より高い第一の脂質を、約６０〜９２重量％含み、かかる第一の脂質はＣ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、酸価が０．１以下であるＣ１２〜２４脂肪酸のグリセリルモノ−、ジ−またはトリエステルと、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、該脂質ナノ粒子はさらに、ポロキサマーまたはエトキシル化脂肪アルコールからなる群から選択される、薬学的に許容される界面活性剤を約２〜２５重量％含む、
医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明はさらに、付加した図面に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】無傷の皮膚に、軟膏剤および３つの異なるＳＬＮで、それぞれＢＭＶを２４時間適用した後の、皮膚の異なる層に浸透している、３Ｈ ＢＭＶの相対量を示す。結果は回収したＢＭＶの総量に対する相対量である。平均±ＳＤ（ｎ＝８）。
【図１ｂ】バリア損傷皮膚に、軟膏剤および３つの異なるＳＬＮで、それぞれＢＭＶを２４時間適用した後の、皮膚の異なる層に浸透している、３Ｈ ＢＭＶの相対量を示す。結果は回収したＢＭＶの総量に対する相対量である。平均±ＳＤ（ｎ＝８）。
【図２ａ】無傷の皮膚に、軟膏剤およびジステアレートＳＬＮ中で、それぞれＢＭＶを６、１６または２４時間適用した後の、皮膚およびレセプター媒体へ浸透した３Ｈ ＢＭＶの相対量を示す。結果は回収したＢＭＶの総量に対する相対量である。平均±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図２ｂ】バリア損傷皮膚に、軟膏剤およびジステアレートＳＬＮ中で、それぞれＢＭＶを６、１６または２４時間適用した後の、皮膚およびレセプター媒体へ浸透した３Ｈ ＢＭＶの相対量を示す。結果は回収したＢＭＶの総量に対する相対量である。平均±ＳＤ（ｎ＝６）。
【図３ａ】ジステアレートと軟膏剤でそれぞれ、２４時間適用した後の、皮膚中の３Ｈ ＢＭＶの相対量を示す。ＳＬＮを曝露した皮膚はいくつかの場合には、ＳＬＮの適用後に遮蔽した。結果は回収した３Ｈ ＢＭＶの総量に対する相対量である。平均±ＳＤ（ｎ＝８）。
【図３ｂ】ジステアレートと軟膏剤でそれぞれ、２４時間適用した後の、レセプター媒体中の３Ｈ ＢＭＶの相対量を示す。ＳＬＮを曝露した皮膚はいくつかの場合には、ＳＬＮの適用後に遮蔽した。結果は回収した３Ｈ ＢＭＶの総量に対する相対量である。平均±ＳＤ（ｎ＝８）。
【図４】ジステアリン酸グリセロールからなるＳＬＮ中のＢＤＰで処理した無毛ラットの皮膚における、ＢＤＰの皮膚濃度を軟膏剤中のＢＤＰ処理と比較して示す。ＳＬＮの組成は実施例１に示す。
【図５ａ】ＳＬＮ中で投与したＢＭＶの効果を、軟膏剤中のＢＭＶと比較した試験における、耳の厚みのＡＵＣを示す。平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）。全ての動物は、ＡＤ表現型を誘導するために、実施例３に記載した処理スキームにしたがって、オキサゾロンで処理した。
【図５ｂ】用量設定試験における、耳の厚みのＡＵＣを示す。平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）。全ての動物は、ＡＤ表現型を誘導するために、実施例３に記載した処理スキームにしたがって、オキサゾロンで処理した。
【図６ａ】感作させたマウスにおけるＩＬ−４のレベルを示す。全ての動物は、ＡＤ表現型を誘導するために、実施例３に記載した処理スキームにしたがって、オキサゾロンで処理した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）。
【図６ｂ】感作させたマウスにおけるＩＬ−１βのレベルを示す。全ての動物は、ＡＤ表現型を誘導するために、実施例３に記載した処理スキームにしたがって、オキサゾロンで処理した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）。
【図７ａ】ＢＭＶ含有脂質ナノ粒子を、オキサゾロン処理マウスの耳に適用したことにより、ＢＭＶ含有軟膏剤の適用に比べて、経皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）が減少したことを示すグラフ。軟膏剤との比較を示す。
【図７ｂ】ＢＭＶ含有脂質ナノ粒子を、オキサゾロン処理マウスの耳に適用したことにより、ＢＭＶ含有軟膏剤の適用に比べて、経皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）が減少したことを示すグラフ。用量設定試験によるＴＥＷＬの値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
用語「脂質ナノ粒子」は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）またはナノ構造の脂質担体（ＮＬＣ）のいずれかをさすことを意図している。ＳＬＮは環境温度で固体である脂質（例えば、長鎖トリグリセリド、脂肪酸およびワックス）および界面活性剤から製造されるナノ径の粒子であり、ここに、有効成分が溶解または分散していてよい。ＮＬＣは、環境温度で固体である脂質と、環境温度で液体である脂質（油）および界面活性剤から製造されるナノ径の粒子であり、ここに有効成分は溶解または分散していてよい。脂質ナノ粒子の、粒子の大きさは、約１０〜８００nm、例えば５０〜６００nmまたは１００〜５００nmであってよい。
【００２０】
用語「有効成分」は、ビタミンＤ誘導体または類似体と、コルチコステロイドから選択される治療上有効な薬剤物質をさすことを意図している。
【００２１】
用語「ビタミンＤ誘導体」は、カルシトリオールのような、ビタミンＤ３の生物学的に活性な代謝物またはアルファカルシドールのような、かかる代謝物質の前駆体を示すことが意図される。
【００２２】
用語「ビタミンＤ類似体」は、側鎖修飾および／または骨格自体の修飾を有するビタミンＤ骨格を含む合成化合物を示すことが意図される。該類似体は、ビタミンＤレセプターに対して、天然に存在するビタミンＤ化合物に匹敵する生物活性を示す。
【００２３】
「カルシポトリオール」は、式
【化１】
2014508796.tif 000002
で表される、ビタミンＤ類似体である。
【００２４】
カルシポトリオールは、２つの結晶形態、すなわち無水物および一水和物で存在することが判明している。カルシポトリオール一水和物およびその製造はＷＯ９４／１５９１２に開示されている。
【００２５】
用語「コルチコステロイド」は、コレステロールまたはその誘導体、具体的には抗炎症効果を発揮するような誘導体から、副腎皮質において合成されるステロイド化合物をさすことを意図している。コルチコステロイドの例は、アムシノニド、ベタメタゾン、ブデノシド、クロベタゾール、クロベタゾン、コルチゾン、デソニド、デスオキシコルチゾン、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフルコルトロン、ジフロラゾン、フルコルチゾン、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノニド、フルオシノロン、フルオロメトロン、フルプレドニソロン、フルランドレノリド、フルチカゾン、ハルシノニド、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾン、モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾン、プレドニゾロンおよびトリアムシノロンまたはその薬学的に許容されるエステルまたはアセトニドであるが、これらに限定されない。現在好まれるコルチコステロイドの例は、ベタメタゾンおよびそのエステル、例えば１７-バレレートまたは１７,２１−ジプロピオネート、または１７−プロピオン酸クロベタゾールである。
【００２６】
用語「貯蔵安定性」または「貯蔵が安定である」は、組成物が、少なくとも１２ヶ月、特に少なくとも１８ヶ月および好ましくは少なくとも２年といったような、該組成物に商業的価値があるとするに十分な期間、冷蔵で、好ましくは室温で組成物の貯蔵を可能にする化学的および物理的安定性特性を表すことを示すことが意図される。
【００２７】
用語「化学的安定性」または「化学的に安定している」は、典型的に２年の製品の貯蔵寿命中に分解される有効成分が、１０％以下、好ましくは６％以下であることを意味することが意図される。室温での化学的安定性の近似値は、組成物を４０℃で加速安定性試験に付することにより得られる。該試験では、組成物を４０℃の加熱棚に置き、１ヶ月および３ヶ月時点で試料を採取し、ＨＰＬＣによって、分解産物が存在するかどうか試験する。４０℃で３ヶ月時点での分解が、該物質の約１０％未満であるとき、これは通常、室温で２年の貯蔵寿命に対応すると解釈される。該組成物に含まれる有効成分がカルシポトリオールである場合、「化学的安定性」は通常、カルシポトリオールが、最終医薬品において２４−エピカルシポトリオールまたは他の分解産物に経時的に有意に分解しないことを示すことを意図する。
【００２８】
用語「物理的安定性」または「物理的に安定である」は、有効成分が、噴霧剤または媒体相から、該組成物の貯蔵寿命を通じて沈殿しないことを意味することを意図している。
【００２９】
用語「実質的に無水である」は、軟膏組成物中の遊離の水の含有量が該組成物の約２重量％を超えない、好ましくは約１重量％を超えないことを意味することを意図している。
【００３０】
用語「中鎖トリグリセリド」は、６〜１２個の炭素原子の鎖長の脂肪酸のトリグリセリドエステルを示すのに用いられる。かかる中鎖トリグリセリドの現在好ましい例は、例えば、商品名Miglyol 812ので入手可能なカプリル酸（Ｃ８）およびカプリン酸（Ｃ１０）トリグリセリドの混合物である。
【００３１】
用語「半固体」は、粘弾性の挙動を示し、非ニュートン性である、すなわち、低い剪断応力下では流れないが、高剪断応力下では、室温で、可塑性、擬塑性または揺変性の流動を示す組成物または賦形剤を意味するのに用いられる。半固体組成物の典型例は、軟膏剤およびクリーム剤である。
【００３２】
用語「遮蔽性」は、皮膚の表面に、経表皮水分喪失を減少させ、皮膚の水分補給を引き起こすのに十分な水分補給バリアを形成する、脂質層を提供することをさすことを意図している。
【００３３】
用語「皮膚浸透」は、種々の皮膚の層、すなわち角質層、表皮、真皮への有効成分の拡散を意味することを意図している。
【００３４】
用語「皮膚透過」は、皮膚を介する全身循環へ、または下の実施例２に記載する試験管内試験の場合には、実験で用いるフランツセル装置のレセプター液への、有効成分の流動を意味することが意図される。
【００３５】
態様
本発明の組成物において、第一の脂質は脂質ナノ粒子の約６５〜９２重量％、もしくは約７０〜９０重量％、もしくは約７５〜８５重量％、もしくは約８０重量％、界面活性剤は、脂質ナノ粒子の約８〜２２重量％、例えば約１０〜２０重量％含んでいてよい。第一の脂質は、好ましくは、パルミチン酸セチル、蜜蝋、パルミチン酸ステアリル、ベヘン酸ステアリル、モノステアリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジベヘン酸グリセロール、トリミリスチン酸グリセロール、トリパルミチン酸グリセロール、トリステアリン酸グリセロール、ベヘノール（behenol）、ステアリン酸、水添パーム油、水添ココグリセリド、水素化ヒマシ油またはセトステアリルアルコールから選択されてよい。
【００３６】
本発明の組成物において、界面活性剤は、親水性界面活性剤であってよく、好ましくはポロキサマー、例えばポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０、糖エステル（例えばステアリン酸スクロースまたはパルミチン酸スクロース）、エトキシル化脂肪アルコール、例えばポリオキシエチレンヒマシ油誘導体から選択されてよいか、または、リン脂質、例えば大豆ホスファチジルコリンまたは卵レシチンのような親油性界面活性剤であってよい。
【００３７】
さらに、脂質ナノ粒子は、約１〜４０％、例えば約１０〜３０重量％または約１５〜１５重量％または約２０重量％の、環境温度で油であり第一の脂質と混和性である、第二の脂質または親油性の乳化剤（例えばポリオキシプロピレン脂肪アシルエーテル）もしくは皮膚軟化薬を含んでよい。かかる第二の脂質は、Ｃ６〜１０モノグリセリド、Ｃ６〜１０ジグリセリド、ミリスチン酸イソプロピルもしくはパルミチン酸イソプロピル、中鎖トリグリセリドまたは、植物油、例えば、ヒマシ油、ヒマワリ油、サフラワー油、メマツヨイグサ油、ボラージオイル、ゴマ油、トウモロコシ油、パーム核油、オリーブ油、アボカド油、アーモンド油、なたね油、ココナッツ油、綿実油、落花生油、大豆油、麦芽油、ブドウ核油またはホホバ油を含む、長鎖トリグリセリドから選択されてよい。
【００３８】
本発明の組成物は、クリーム剤（水中油型の乳化剤）、ローション剤、噴霧可能な製剤または水性ゲルであってよく、ここで、脂質ナノ粒子は典型的に、組成物の約１〜４０重量％、例えば５〜３０重量％または約１０〜２０重量％存在する。該組成物はさらに水相を含み、ここで、脂質は、特定の環境下において、組成物のゲル化を引き起こすために網状物を形成するか、または、増粘剤をここに含んでいてよい。増粘剤は、カルボマー、セルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストランまたはその誘導体から選択されてよい。増粘剤は、典型的に、該組成物の約０．１〜５重量％、例えば、約０．５重量％存在している。該組成物はさらに、シリコーン油、流動パラフィンおよびコレステロールまたはグリセリン、アラントイン、パンテノール、ポリグリセリンまたはポリグリセリンエステルからなる群から選択されてよい、皮膚軟化薬を含んでいてよい。該皮膚軟化薬は、組成物の約１０〜５０重量％、または約２０〜４０重量％、約３０重量％の量で含まれていてよい。
【００３９】
有効成分は、組成物中に様々な形態で存在していてよい、すなわち、水相に溶解もしくは分散、表層の脂質／水相に溶解もしくは分散、または脂質ナノ粒子の、表面かコアのいずれかに、溶解もしくは分散していてよい。有効成分は脂質表面と最も結合しやすく、コアには効率良くは取り込まれないために、６時間後での、ゼロ次の放出プロファイルおよび特異的な皮膚標的化の欠損が引き起こされることが以前にわかっている [L.B. Jensen et al., Int. J. Pharm. 390（1）, 2010, pp. 53-60]。これは、有効成分の大部分が、脂質表面に取り込まれるか、または結合する一方で、少なくともパルミチン酸セチルおよびトリパルミテート脂質ナノ粒子において、有効成分のうちのいくらかが水相に溶解もしくは分散しているという本発明の知見と一致している。脂質組成物における高い溶解度および有効成分のより効率的なカプセル化は、極性の少ない脂質に比べ、より極性を持つ脂質により達成されうると、一般的に考えられている［J. Zhangおよび E. Smith, J. Pharm. Sci. DOI 10.1002/jps.22329, 2010］。したがって、吉草酸ベタメタゾン（ＢＭＶ、モデル有効成分）の融解脂質中での溶解度試験により、脂質の極性と媒体中の溶解度との相関が示されているが、これは様々な量のモノグリセリドを含有する脂質についての、以前の知見に相当する[L.B. Jensen et al., 上記; V.V. Kumar et al., Int. J. Pharm. 335（1-2）, 2007, pp. 167-175]。様々な極性を持つ異なる脂質を用いて行った、試験管内放出試験において、脂質の極性はＢＭＶの放出を調節することが示された[L.B. Jensen et al.、上記]。
【００４０】
脂質の極性による効果は、脂質ナノ粒子中に製剤した有効成分の皮膚浸透にも関連があってよく、これは、脂質ナノ粒子と皮膚脂質の相互作用が変化した結果でありうる。皮膚に近い溶解パラメーターを有する構成要素は、皮膚とよく混和する性質を持ち得、脂質溶解パラメーターを変えることは、有効成分の脂質ナノ粒子からの放出を調節し、皮膚内に分配する方法でありうる[K.B. Sloan et al., J. Invest. Dermatol. 87（2）, 986 pp. 244-252]。例として、ＢＭＶの溶解パラメーターは１２であり[L.B. Jensen et al., 上記]、ブタの皮膚については約１０である[Z. Liron and S. Cohen, J. Pharm. Sci. 73（4）, 1984, pp. 538-542]と評価されている。用いた脂質は８.７〜９.５の溶解パラメーターを有していた。皮膚に最も近い、９.５の溶解パラメーターを持つ、ジステアレートからなる脂質ナノ粒子は、それ故、トリパルミテートおよびパルミチン酸セチルの脂質ナノ粒子よりも皮膚脂質とより混和する性質を持つことが期待される。ＢＭＶはこの脂質に可溶であり、ジステアレート脂質ナノ粒子は、適用したその他の脂質ナノ粒子よりもサイズが小さく;直径が１５０.９±０.１２nmであった。このことにより、ＢＭＶをジステアレート脂質ナノ粒子で適用した後では、トリパルミテートおよびパルミチン酸セチル脂質ナノ粒子に比べて、皮膚中、および特に角質層におけるＢＭＶの量が多いことを説明しうる（参考 実施例２）。
【００４１】
大きさの違いにより生じる浸透プロファイルの違いをいずれも最小化するため、脂質粒子はその平均直径において有意に異なるべきではないと意図された。平均直径は、粒子の表面面積と相関し、脂質ナノ粒子の皮膚との相互作用および皮膚への浸透ならびに遮蔽性について重要なパラメーターであると考えられる[S. Wissing et al., J. Cosmet. Sci. 52（5）, 2001, pp. 313-324; R.H. Muller et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54, Suppl. 1, 2002, S131-S155]。したがって、本発明の組成物において、脂質ナノ粒子は、１０〜８００nm、具体的には約５０〜６００nm、例えば１００〜５００nmの範囲の平均直径を有してよい。例示したＢＭＶ脂質ナノ粒子（参照：実施例１）の平均直径は１５０〜２１２nmの範囲内であり、ＰｄＩは０.２４より小さかった。１０nmを超える粒子は、無傷の皮膚には浸透しないが、疾患にかかった皮膚は、バリアが損傷しているため、より大きなサイズの粒子（直径５００〜７００nm）でも浸透しうると一般的に考えられている。粒子サイズの測定により、バリアが損傷した皮膚は粒子を浸透させやすいが、該粒子は無傷の皮膚には浸透できないことを示唆している。パルミチン酸セチルから作った脂質ナノ粒子は、他のタイプの脂質よりも、単分散性であったが、これはパルミチン酸セチルが異なる結晶構造を持つワックスタイプの脂質であるためでありうる。このタイプの脂質は、物理的に優れた安定性を持つ、均一でサイズの小さな粒子をもたらすことが以前示されている [V. Jenning and S. Gohla, Int. J. Pharm. 196（2）, 2000, pp. 219-222]。
【００４２】
ＳＬＮは無傷の皮膚に浸透することはできないが、バリア損傷皮膚については、粒子の浸透は可能であることが、サイズの測定によって示唆された。後述する実施例２で論じる、１４Ｃ−標識した脂質粒子および３Ｈ−標識したＢＭＶを用いた試験により、ＢＭＶ/脂質の比は、皮膚の深層で増加し、レセプター媒体中で最大に達した。この理由により、ＢＭＶは皮膚の深層部中の標的細胞には脂質ナノ粒子によっては送達されず、該脂質ナノ粒子はむしろ、皮膚の上層で薬剤物質の薬剤貯蔵部として働いていると結論づけられた。脂質の１４Ｃ-標識により、脂質粒子は、無傷の皮膚およびバリア損傷皮膚の両方で、主に皮膚表面および角質にとどまることが示された。したがって、有効成分は粒子から放出されて、さらに皮膚内に拡散し、生表皮および真皮内の標的細胞に達しなければならない。
【００４３】
本明細書中で、テープストリップした皮膚で示すように、バリアが強く損傷していても、脂質ナノ粒子が皮膚を透過できないのは、利点のあることであると考えられる。脂質粒子が皮膚の表面にとどまることによって、脂質ナノ粒子が皮膚の水分補給を改善するとともに、物理的にバリアを強化しうる可能性が高くなる。これは、ＡＤのような皮膚疾患の処置に関連性の高い性質であり、ここで、皮膚バリアの物理的な状態は、ＡＤの病因と関連性が高いが、これは、免疫性の皮膚バリアと相互作用するためである。
【００４４】
脂質ナノ粒子は、皮膚中の多量の薬剤物質を達成できるという点で軟膏剤よりも優れていた。これは、図３の結果より明らかに見ることができる。有効成分の大部分は、無傷の皮膚およびバリア損傷皮膚の上層に見られたが、これは、脂質ナノ粒子の表面積が大きいことおよび接着性の性質によく相関がありそうなことである。さらに、該脂質ナノ粒子および有効成分は、それらがそこから薬剤貯蔵物質として作用しうる場所である、毛包および皮膚小溝に浸透しうる。トリパルミテートおよびパルミチン酸セチルに比べて、ジステアレート脂質ナノ粒子を無傷の皮膚およびバリア損傷皮膚に適用した後では、角質層および表皮に、より多量の有効成分が存在したが、これは脂質の極性および粒子のサイズに関連していると考えられる（図１）。したがって、皮膚との密接な相互作用、皮膚脂質との融合および薬剤物質の制御された形での放出は、前に見られた脂質ナノ粒子の遮蔽効果に加え、浸透−促進性の性質の機構でありうる[上記R.H. Muller et al.]。
【００４５】
パルミチン酸セチルＳＬＮの適用時に、無傷の皮膚の表皮ならびに、無傷の皮膚およびバリア損傷皮膚のレセプター媒体に、ＢＭＶが多量存在するということは、脂質の構造が異なること、極性が低いことおよびＢＭＶ溶解度が低いことに起因しうる [上記J. Zhang and E. Smith.、上記V. Jenning and S. Gohla.]。このことにより、ＢＭＶはＳＬＮ媒体からより容易に離れ、皮膚に分配しうる。
【００４６】
ＢＭＶはバリアが無傷のとき、非常に効率よく皮膚中に維持される（図１ａ）が、バリアが損傷すると、軟膏剤と同様に透過する（図１ｂ）。しかしながら、軟膏剤に比べて、バリアが損傷した皮膚中に、有効成分が多量存在することがわかった。被験脂質ナノ粒子（参照、実施例２）の最も好ましい浸透プロファイルは、ジステアレート脂質ナノ粒子により得られ、かかる脂質ナノ粒子は、最も高い有効成分の溶解度をもたらし、皮膚中に多量の、レセプター媒体に少量の有効成分を維持する上で優れていた。皮膚中の有効成分のレベルは、無傷の皮膚とバリア損傷皮膚で同等であり、このことは、かかる脂質ナノ粒子が無傷の皮膚の表面に、バリア損傷皮膚と同様に効率的に接着していたことを示唆している。
【００４７】
ジステアレートＳＬＮを適用した６、１６および２４時間の間、軟膏剤に比べて、多量の有効成分が、無傷の皮膚ならびに損傷した皮膚で、皮膚内に維持される、ということがわかった（図２）。２４時間の間で、レセプター媒体における増加が最も小さかったことは、製剤、すなわち、皮膚内への浸透に用いうる有効成分の量が表面で枯渇していたことによって説明しうる。該有効成分は、一部は粒子内に、一部は粒子の表層に取り込まれると考えられている。この構造は、突発的な放出の後に、制御された放出が見られることに反映されていることが以前示された[E.B. Souto et al., Int. J. Pharm 278（1）, 2004, pp. 71-77; V. Jenning et al., J. Control. Release 66（2-3）, 2000, pp. 115-126]。突発的な放出によって表層が枯渇すると、粒子から皮膚へと拡散しうる有効成分の量は減少し、放出速度は低下する。かかるプロファイルが見られるもう一つの理由は、皮膚または毛包が、特にＳＬＮに取り込まれたＢＭＶまたは任意のＢＭＶ結晶のいずれかにより飽和するためであり、これらはそれぞれ、パルミチン酸セチルおよびトリパルミテートからなるＳＬＮ内に存在していた。毛包および汗管を通った、一過的な短絡拡散が最初に見られた後、ＳＣを通って、定常状態で拡散しうる（R. J. Scheuplein, Mechanism of percutaneous absorption. II. Transient diffusion and the relative importance of various routes of skin penetration, J Invest Dermatol 48（1）（1967）79-88）。この効果は、これらの研究で見られるＢＭＶのレベルが一定で有ることに相当しうる。したがって、該脂質ナノ粒子は、皮膚内ならびに毛包内で、貯蔵部を形成し、吸収に使用しうる有効成分を一定量維持するのに用いうる。しかし、粒子と皮膚の間の交換速度は、薬剤の取り込みのため、適用する時間により変化しうる。時間プロファイルおよびレセプター媒体中の薬剤物質の量は、薬剤物質が粒子の表層に見られることを示唆している。したがって、皮膚に適用した場合、脂質ナノ粒子は有効成分を二層性に送達する能力を有する、−すなわち、粒子の表面および水相からの突発的な放出によってはじまり、その後、脂質粒子により密接に結合する薬剤物質の角質層での貯蔵効果が見られる。
【００４８】
バリア損傷皮膚の遮蔽に伴って、ＢＭＶの浸透が有意に増加するのには、様々な理由があってよい。第一に、遮蔽により、角質層の水分含有量が増加することおよび脂質バリアの妨害によって、拡散係数が上昇するため、ほとんど常に皮膚に吸収される薬剤物質の量がほとんど常に増加している[J.A. Bouwstra et al., J. Recept. Signal Transduct. Res. 21（2-3）, 2001, pp. 259-286]。さらに、遮蔽によって、脂質ナノ粒子中に存在する界面活性剤の、皮膚バリアへの浸透増大効果が促進しうる。遮蔽により、適用後に水が蒸発しないため、組成物と皮膚の間の薬剤の交換が影響を受けうる。バリア損傷皮膚では、遮蔽時にレセプター媒体に透過する薬剤の量が非常に多いため、これらの結果はまた、有効成分が固体粒子のコアにカプセル化されているよりも、粒子表面により結合しているということを支持している。
【００４９】
別の試験において、ＳＬＮ中に取り込まれたジプロピオン酸ベタメタゾン（ＢＤＰ）を無毛ラットの皮膚に適用し、ＳＬＮがコルチコステロイドの皮膚への維持能を有することが示された。軟膏剤と比較すると、製剤の適用から１日後と３日後ではそれぞれ、有意に多量のＢＤＰが皮膚内に存在し、７日後では、薬剤物質は、軟膏剤で投与した場合は全く検出できなかったが、ＳＬＮで投与した場合はまだ検出が可能であった。
【００５０】
上述したかかる型の脂質ナノ粒子は、
（a）コルチコステロイドを、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含む脂質相に、融解または分散させ、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルジ−もしくはトリ−エステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、かかる第一の脂質は融解した状態であり、該脂質相は、約１〜４０重量％の、環境温度で油であり第一の脂質と混合しうる、第二の脂質または親油性の乳化剤もしくは皮膚軟化薬を含んでよく;
（b）工程（a）で得られた脂質相を、ポロキサマー、ポリソルベートおよびエトキシル化した脂肪アルコールからなる群から選択される、薬学的に許容される界面活性剤を０.２〜１０重量％含む水相に分散させ、乳化剤を形成させ；
（c）工程（b）で得られた乳化剤を、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、コルチコステロイドを含む脂質相のナノ粒子を形成させ；そして
（d）工程（ｃ）で得られた、ホモジナイズした乳化剤を冷却し、ナノ粒子を凝固させる、
工程を含む方法によって製造しうる。
【００５１】
この方法により製造した脂質ナノ粒子は、約１００〜５００nmの範囲内と測定された。
【００５２】
あるいは、脂質ナノ粒子は、
（a）コルチコステロイドを、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含む脂質相に、溶解または分散させ、かかる第一の脂質はＣ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜２４脂肪酸のグリセリルジ−もしくはトリ−エステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールからなる群から選択されるワックスであり、かかる第一の脂質は融解した状態であり、該脂質相は、約１〜４０重量％の、環境温度で油であり、第一の脂質と混合できる第二の脂質または親油性の乳化剤もしくは皮膚軟化薬を含んでよく;
（b）工程（a）で得られた脂質相を、液体窒素内もしくはドライアイス上で凝固させ;
（c）凝固させた脂質相を、約５０〜１００μmの粒子サイズに製粉し;
（d）工程（c）で得られた粉末を、界面活性剤を約０.２〜１０重量％含有する、冷却した水相内に分散させ；そして
（e）工程（d）で得られた該分散液を、高圧ホモジナイザーを用いて室温あるいは室温よりも下の温度でホモジナイズし、脂質ナノ粒子を得る、
工程を含む方法により製造されうる。
【００５３】
コルチコステロイドを含む脂質ナノ粒子組成物は、好ましくは、炎症性皮膚疾患または障害、例えば、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚老化、光老化、ざ瘡、蕁麻疹またはそう痒症の処置に用いうる。
【００５４】
他の態様において、脂質ナノ粒子はさらに、環境温度で油であり、第一の脂質と混和性である、第二の脂質または、親油性の乳化剤もしくは皮膚軟化薬を含む。第二の脂質の量は脂質ナノ粒子の約１〜４０重量％、例えば約１０〜３５重量％、または約１５〜３０重量％、または約２０〜２５重量％である。より具体的には、脂質ナノ粒子は、約８０〜８５重量％の第一の脂質と約１５〜２０重量％の第二の脂質を含んでよい。
【００５５】
この態様において、第二の脂質は、Ｃ６〜１０モノグリセリド、Ｃ６〜１０ジグリセリド、中鎖トリグリセリド、例えばトリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリル、長鎖トリグリセリド、例えばヒマシ油、ミリスチン酸イソプロピルまたはパルミチン酸イソプロピルからなる群から有利に選択されてよい。
【００５６】
ビタミンＤ誘導体もしくは類似体を有効成分として含む態様の一において、かかる第一の脂質は、好ましくは、パルミチン酸セチル、Ｃ１４〜２８脂肪アルコール、水添パーム油および、酸価０.１以下のトリグリセリドからなる群から選択されてよく、このことは、ビタミンＤ誘導体が酸感受性であることがよく知られているため、ビタミンＤ誘導体の化学的安定性に対して有害な、遊離の脂肪酸の含有量が低いことを示唆している。該態様において、第一の脂質および第二の脂質を含む脂質ナノ粒子は、組成物の水相内の有害成分による分解に、薬剤化合物がさらされにくい脂質ナノ粒子に、薬剤化合物を取り込ませるため、ビタミンＤ誘導体の製剤化に特に好ましいことがわかっている。第一および第二の脂質を用いることで、脂質ナノ粒子に充填される薬剤が増加し、有効成分が水相に存在するのを防ぐことができる。さらに、脂質ナノ粒子が、貯蔵の間に多形変換をおこし、その結果、薬剤の排出および水相への分配を引き起こしがちでない構造を有する場合、安定性はさらに上昇する。第二の脂質は、好ましくは、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、中鎖トリグリセリド、例えばトリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリル、または長鎖トリグリセリド、例えば、ヒマシ油から選択されうる。現在好ましい態様において、かかる第一の脂質はパルミチン酸セチルであり、かかる第二の脂質はトリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリルである。ビタミンＤ誘導体は、カルシポトリオール、カルシトリオール、マキサカルシトール、タカルシトールから選択されてよく、これら全ては皮膚適用についてよく知られている。
【００５７】
毛包を標的とすることを意図した、薬剤含有脂質ナノ粒子を含む組成物は、毛包の毛嚢脂腺に存在する皮脂に近い溶解パラメーターを有する脂質を有利に含んでよい。したがって、脂質ナノ粒子内に存在する第一および／または第二の脂質の、皮脂の豊富な領域、例えば毛包への有効成分の送達に対する影響は、Hildebrand溶解係数によって決定される、賦形剤の溶解性によって説明できると考えられる（JH Hildebrand and RL Scott, The Solubility of Non-Electrolytes, Reinhold, New York, 1949）。モデル皮脂組成物についてのHildebrand係数（溶解パラメーターδ）は、皮質が、約７.５〜８（cal/cm３）１／２のHildebrand係数を有する、全体的に無極性な、油性の物質であることを示している（参照 Topical Drug Delivery Formulations, Vol. 42, 1990（Drugs and the Pharmaceutical Science）中の、DW Osborne et al., 「The Influence of Skin Surface Lipids on Topical Formulations」）。皮質のHildebrand係数の、±２単位の範囲内のHildebrand係数を有する脂質は、皮質と混和性であり、それゆえに、毛嚢脂腺ユニットへ送達するために、有効成分を可溶化するという目的に適していることがわかっている。他の影響要因は、脂質の融点であるが、これは、薬剤物質の放出が、溶解ならびに、皮脂と皮膚の脂質の融合によって開始しうるためである。皮脂に近い溶解パラメーターを有する脂質は、パルミチン酸セチル、パルミチン酸ステアリルおよびベヘン酸ステアリルを含んでよい。
【００５８】
カルシポトリオールは、カルシポトリオールの急速分解に関与する酸性条件（水性組成物において約７.０より下のｐＨ、または非水性の組成物において酸性の反応物質の存在下）に極めて感受性を示す物質であることが知られている。組成物の貯蔵寿命を通して物質の適切な化学的安定性を保証するために、組成物の賦形剤の１つ以上に存在し得、カルシポトリオールの化学的安定性に有害な酸性不純物を中和することができる、化合物を加えておくことが望ましいことがある。酸を中和する化合物は、好ましくはリン酸緩衝液のような緩衝剤であって、該組成物のｐＨが７．５以上になるように、組成物の約０.０２５〜０.１重量％の量で含まれうる緩衝剤から選択されてよい。酸中和化合物は、また、脂質アンカー、すなわち、水相と脂質ナノ粒子の界面に係留される長鎖脂質鎖を有するアミンである。かかるアミンの例は、例えば、トリエタノールアミン、トロメタモール、モノエタノールアミンまたはジエタノールアミンのような第三級アミンであり、組成物中に約０.１〜２重量％の量で含まれうる。
【００５９】
本発明の組成物のこの態様において、脂質ナノ粒子は、組成物の約１〜４０重量％、例えば約５〜３０重量％または約１０〜２０重量％の量で存在してよい。かかる組成物は、クリーム剤（水中油型）、ローション剤、スプレー可能な製剤または水性ゲルであってよく、該組成物はさらに水相を含む。かかる水相は、さらに脂質、例えば、シリコーン油、流動パラフィンまたはコレステロールおよび／または増粘剤を含んでよい。かかる増粘剤は、カルボマーまたはセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースから選択されてよい。該増粘剤は、典型的には、該組成物の０.１〜５重量％、具体的には０.５重量％の量で存在する。該組成物は、さらに、シリコーン油、流動パラフィンおよびコレステロールからなる群から選択されてよい、皮膚軟化薬を含んでよい。かかる皮膚軟化薬は、該組成物の約１０〜５０重量％、または約２０〜４０重量％、または約３０重量％の量で含まれてよい。
【００６０】
この態様の組成物は、
（a）ビタミンＤ誘導体を、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含む脂質相に、溶解または分散させ、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、酸価０.１以下のＣ１２〜２４脂肪酸のグリセリルトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールから選択されるワックスであり、室温で油であり第一の脂質と混和性である、第二の脂質を約１〜４０重量％含んでよく、該第一の脂質は融解した状態であり、
（b）工程（a）で得られた脂質相を、ポロキサマーまたはエトキシル化した脂肪アルコールから選択される、薬学的に許容される界面活性剤を約０.２〜１０重量％含む水相に分散させ、
（c）工程（b）で得られた乳化剤を、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、ビタミンＤ誘導体を含む脂質相のナノ粒子を形成し、そして
（d）工程（c）で得られた、ホモジナイズした乳化剤を冷却して、ナノ粒子を凝固させる、
工程を含む方法によって製造されうる。
【００６１】
この方法で製造した脂質ナノ粒子の粒子サイズは、約１００〜５００nmの範囲内と測定された。
【００６２】
あるいは、該組成物は、
（a）ビタミンＤ誘導体を、融点が体温より高い第一の脂質を約６０〜９２重量％含む脂質相に、溶解または分散させ、かかる第一の脂質は、Ｃ１２〜２４アルコールとＣ１２〜２４脂肪酸のエステル、酸価０.１以下のＣ１２〜２４脂肪酸のグリセリルトリエステル、Ｃ１２〜２４脂肪アルコールおよびコレステロールから選択されるワックスであり、室温で油であり第一の脂質と混和性である、第二の脂質を約１〜４０重量％含んでよく、かかる第一の脂質は融解した状態であり、
（b）工程（a）で得られた脂質相を、液体窒素内またはドライアイス上で凝固させ;
（c）凝固した脂質相を約５０〜１００μmの粒子サイズに製粉し;
（d）工程（c）で得られた粉末を、界面活性剤を約０.２〜１０重量％含む、冷却した水相に分散させ、そして
（e）工程（d）で得られた分散液を、高圧ホモジナイザーを用いて、室温でもしくは室温より低い温度で、ホモジナイズして、脂質ナノ粒子を得る、
工程を含む方法により製造されうる。
【００６３】
ビタミンＤ誘導体または類似体を含む脂質ナノ粒子組成物は、炎症性または過剰増殖性の皮膚の症状、例えば、乾癬、脂漏性乾癬（sebopsoriasis）、手掌足底膿疱症、皮膚炎、魚鱗癬（ichtyosis）、酒さ、ざ瘡または日光角化症の予防または処置に使用しうる。
【００６４】
文献では、脂腺細胞がビタミンＤ受容体（VDR）を発現すること、ならびに、VDRの発現は生物学的に活性なビタミンＤ代謝物である１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）処理によって誘導されることが記載されている。参考： C. Kramer et al, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 113, 2009, pp. 9-16。培養脂腺細胞をカルシトリオールとともにインキュベートした結果、炎症促進性のサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌が減少した。したがって、毛包を標的とすれば、ビタミンＤ誘導体は、ざ瘡のような脂腺の障害に治療上の効果を及ぼしうると仮定できる。さらに、ビタミンＤ誘導体は、ケラチノサイトの過剰増殖を減少させることが知られており、濾胞管（follicular duct）のケラチノサイトにも同様に効果をもたらすことが期待されうる。
【００６５】
カルシポトリオールのようなビタミンＤ類似体は、ざ瘡の処置に用いうることが以前から提唱されてきたが（参考、ＷＯ９１/１２８０７）、該先行文献に記載されている組成物は、かかる処置には有効でないことが続いて示されていた。先行技術の組成物に有効性が見られないのは、有効成分が作用部位を標的としていないことによると考えられており、そして、現在では、ビタミンＤ類似体が毛包を標的とした場合、ざ瘡の処置における効力は改善されうると考えられている。
【００６６】
したがって、本発明はさらに、カルシポトリオールのようなビタミンＤ誘導体の標的を、毛包の脂腺とする方法であって、かかる処置を必要とする患者の皮膚領域に、上述のナノ粒子組成物を治療上有効量適用することを含む、方法に関する。より具体的には、処置を必要とする皮膚領域は、ざ瘡もしくは、関連疾患、例えば酒さに伴う面皰、膿疱、丘疹または嚢胞を含む。ビタミンＤ誘導体は、好ましくは、カルシポトリオールまたはカルシポトリオール一水和物である。
【００６７】
さらに、コルチコステロイドとビタミンＤ誘導体もしくは類似体の両方を有効成分として、薬学的に許容される水性媒体内に含む、脂質ナノ粒子組成物を製剤することも期待されている。この態様において、かかる組成物は、ＢＨＡおよびＢＨＴの群から選択されるか、ＢＨＡとＢＨＴの混合物であってよい、抗酸化剤を添加することにより安定化しうる。
【実施例】
【００６８】
実施例１
本発明の組成物
【表１】
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【表２】
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【００６９】
カルシポトリオール一水和物を含有する脂質ナノ粒子
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００７０】
【表８】
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【表９】
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【００７１】
カルシポトリオール一水和物とジプロピオン酸ベタメタゾンを含有する脂質ナノ粒子
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【００７２】
脂質ナノ粒子に取り込まれたカルシポトリオール（組成物Ｈ〜Ｌ）は、４０℃で３ヶ月間保存した後で、化学的に安定である（＞９０％）と測定された。
脂質ナノ粒子に取り込まれたカルシポトリオール（組生物Ｈ〜Ｍ）は２５℃で１８ヶ月間保存した後で、化学的に安定である（＞９０％）と測定された。
ジプロピオン酸ベタメタゾンは、２５℃で６ヶ月間保存した組成物Ｇにおいて、化学的に安定である（＞９０％）と測定された。
組成物Ｎの、２５℃での安定性評価は現在進行中である。
脂質ナノ粒子に取り込まれたカルシポトリオールおよびジプロピオン酸ベタメタゾン（組成物Ｏ〜Ｑ）は、２５℃で６ヶ月間保存したＳＬＮ中で、化学的に安定である（＞９０％）と測定された。
【００７３】
製剤の調製
ＳＬＮの調製は、ＥＰ６０５４９７に記載されているように、高熱高圧ホモジナイズによりおこなった。
端的には、ＢＭＶおよびＢＤＰを含むＳＬＮについて、脂質を８０℃で融解し、ＢＭＶまたはＢＤＰを、融解した脂質に、撹拌しながら溶解した。同じ温度のポリソルベート ８０水溶液を該脂質混合物に添加し、該混合物を、Silverson Machines Ltd.（Chesham, United Kingdom）のSilverson High Speed Mixer L4RTを用いて、６０００rpmで２分間おだやかにホモジナイズし、粗製乳化剤を製造した。該乳化剤をAvestin Inc.（Ottawa, ON, Canada）のEmulsiFlex C5を用いて、該ホモジナイザーをJulabo TW 20ウォーターバス（Seelbach, Germany）内に置いて温度を８０℃に保ちながら、高圧ホモジナイズした。ホモジナイズサイクルを、４サイクル適用して、該粗製乳化剤を６００barで加工した。これらの加工パラメーターは、平均粒子サイズが小さく（≦２００nm）、多分散性が低いＳＬＮをもたらした、予備試験から選択した。ＳＬＮ分散液を光から保護しながら室温で冷却し、次に、ｐＨを５．０に調整した。
ＢＭＶを含む軟膏剤は、９９％（ｗ／ｗ）の白色ワセリンと１％（ｗ／ｗ）の流動パラフィンからなり、乳鉢を用いて、ＢＭＶ結晶を軟膏剤に懸濁することにより調製した。ＢＭＶを含む全ての製剤は、使用時まで光から保護しながら、５℃で保存した。
【００７４】
カルシポトリオールを含む固体脂質ナノ粒子および、ナノ構造脂質担体の製造を、同様の方法で行った。カルシポトリオールを、高温の油の中に溶解し（ＮＬＣの場合）、該混合物を、融解した脂質に添加した。ＳＬＮについては、カルシポトリオールを融解した脂質に溶解し、撹拌しながら温度を８０℃に保った。ポロキサマー/水の溶液をｐＨ８．０に調整し、温度を８０℃に加熱し、融解した脂質−薬剤混合物に添加した。プレ−乳化剤をSilverson Machines Ltd.（Chesham, United Kingdom）のSilverson High Speed Mixer L4RTを用いて調製した。次に、Avestin Inc.（Ottawa, ON, Canada）のEmulsiFlex C5を用いて、該ホモジナイザーをJulabo TW 20ウォーターバス（Seelbach, Germany）内に置いて温度を８０℃に保ちながら、５００〜８００barにて高圧ホモジナイズを３サイクル行うことによって、ＳＬＮ分散液を製造した。冷却しながら、ＳＬＮを緩衝剤、保存剤および安定剤と混合し、ｐＨを８.０または８.５に調整した。製剤をカルボマーで増粘した場合は、冷却しながら、Silverson Machines Ltd.（Chesham, United Kingdom）のSilverson High Speed Mixer L4RTを用いて、段階的にカルボマーを添加することによって行い、その後、最終工程としてｐＨを調整した。
【００７５】
製剤の性質決定
性質決定は、製造日から０〜３日後に行い、生体内試験は製造後から１週間内に開始した。
【００７６】
動的光散乱法（ＤＬＳ）
ＳＬＮの粒子サイズの分析は、６３３nmレーザーおよび１７３°検出オプティクスを備えた、Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK）を用いて、ＤＬＳによって行った。測定は、測定前に、精製水で適切に希釈したサンプル（ｎ＝３）について、２５℃で行った。すなわち、水の粘度を測定に用いた。データの取得および分析には、Malvern DTS v5.10ソフトウェアを適用した。粒子サイズの分布は、多分散指数（ＰｄＩ）および平均流体力学的径（Ｚ−平均）によって記載した。
【００７７】
顕微鏡観察
ＢＭＶの脂質への溶解度ならびに最終製剤の外見を、ＳＬＮおよび軟膏剤の両方について、どちらもDFA Instruments（Glostrup, Denmark）の、Linkam PE94ヒーターを備えた、Nikon Eclipse 80i顕微鏡を用いて、顕微鏡的に評価した。データ取得に用いたソフトウェアは、Image Pro Plus（登録商標）である。
【００７８】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
ＳＬＮおよび軟膏剤を、ＢＭＶ、ＢＤＰおよびカルシポトリオールの含有量について、それぞれＨＰＬＣによって定量的に分析した。
【００７９】
ＳＬＮおよび軟膏剤の性質決定
ＤＬＳ分析によって、用量設定試験で試験した、４つの異なるＳＬＮ（ＢＭＶの含有量においてのみ異なる）の平均直径は、１７９.９〜１９３.６nmで、ＰｄＩが０.１７９〜０.２１６であることが示された。小さい平均粒子サイズおよび低いＰｄＩを保ちながら皮膚刺激性を低下させるために、界面活性剤と脂質の濃度を最適化することは、２.５％（w/w）ジアステレートおよび０.４％（ｗ／ｗ）ポリソルベート ８０の組成物で可能であることが示された。この組成のＳＬＮのＺ−平均は、２０５.４nmでＰｄＩは０.２２８であった。Z-平均およびＰｄＩの値はいずれも、界面活性剤と脂質の濃度に依存していた。どちらの脂質濃度についても、界面活性剤の濃度を上昇させることにより、界面活性剤が一定のレベルになるまではＺ−平均およびＰｄＩは低下したが、それ以降、粒子サイズがさらに低下することはなかった。
最終製剤では、ＢＭＶはＳＬＮ中の脂質中に溶解しており、薬剤結晶は顕微鏡観察では全く検出されなかった。軟膏剤では、ＢＭＶ結晶（＜２５μm）が、媒体を通じて均一に分布していた。ＨＰＬＣ分析によって、ＳＬＮ中および軟膏中のＢＭＶの濃度が、相対標準偏差が１．４％よりも小さい、期待値であることが示された（相対標準偏差が１０.３％であった、０.００３mg/g ＳＬＮは除く）。このことは、ＢＭＶが両方の型の製剤において均一に分布しており、化学的に安定であることを示している。
【００８０】
実施例２
皮膚浸透試験
皮膚試料の準備
ブタの耳を、Danish Meat Trade College（Roskilde, Denmark）から、新しく屠殺したブタより得た。耳を−２０℃で保存し、ゆっくりと４℃で融解させ、剪毛し、メスを用いて耳の後ろから全層の皮膚を取り除いた。皮下組織を注意深くメスで取り除き、皮膚を適当な小片に切り、使用するまで−２０℃で冷凍した（１４日以内）。それぞれの耳から、２つの皮膚小片を得、無傷の皮膚およびバリア損傷皮膚について、これらを比較した。
【００８１】
皮膚バリアの損傷は、D-Squame（登録商標） tape disc（Cuderm Corp., Dallas, USA）を適用して、テープストリッピングを連続して２５回行うことにより誘導した。D-Squame（登録商標）テープ貼り付け装置（Cuderm Corp., Dallas, USA）を用いて、テープに２２５g/cm２の圧力を５秒間かけた。皮膚をコルク板の上に小さいピンを用いてのせ、テープストリッピングを行うときに皮膚小溝の問題を克服できるように、伸ばした。この方法は、ＡＤの皮膚のバリアの性質をシミュレートする皮膚モデルを作った、Simonsenらの方法から適用したものである[L. Simonsen and A Fullerton, Skin Pharmacol. Physiol. 20（5）, 2007, pp. 230-236]。最初の試験で、新鮮な皮膚と融解した皮膚（ｎ＝６）を、テープストリッピングを０、５、１５、２５および４０回行って比較することで、新鮮な皮膚と、凍結融解した皮膚でのテープストリッピングの効果を評価した。パンチ生検を採取し、１０％（ｗ／ｗ）ホルマリンで固定し、次に、ヘマトキシリン−エオシンで染色した後、顕微鏡試験を行った。
【００８２】
皮膚浸透および透過試験
ＢＭＶおよび脂質の浸透プロファイルを評価した。３Ｈ−標識したＢＭＶおよび１４Ｃ-標識した脂質を、ＢＭＶおよび脂質粒子（ジアステレートおよびトリパルミテート）の無傷およびバリア損傷皮膚への浸透を試験するのに用いた。
【００８３】
フランツ型拡散セルに、真皮側がレセプター媒体（拡散面積３.１４cm２、レシピエント体積１０ml、常に撹拌しており、温度は３２℃に維持）に面するように皮膚をのせた。等張酢酸塩緩衝液（ｐＨ５.５、１５mM 酢酸ナトリウム、１００mM塩化ナトリウム）中のメチル−β−シクロデキストリンの１％（ｗ／ｗ）溶液をレセプター媒体として用いた。皮膚を等張塩化ナトリウム溶液で３０分間、レセプター媒体で６０分間平衡化した後、レセプター媒体を新しくし、スパチュラを用いて、製剤２０mg（６.４mg製剤/cm２）を皮膚表面に均等に適用した。適用した製剤の正確な量は、スパチュラの重さを適用の前後で量ることによって測定した。インキュベートが完了した後、皮膚を分離して分析した。全ての試験を、無傷の皮膚またはバリア損傷皮膚について行い、製剤の適用時間は、６、１６および２４時間の間で変わった。遮蔽状態が完全なものであることを確認するために、ガラスプラグを皮膚の上にのせることで遮蔽状態を作った。適用時間が終わった後、綿パッドで皮膚をぬぐうことで、余剰の製剤を取り除いた。綿パッドおよびドナーコンパートメントの蓋から、ＢＭＶおよび脂質を抽出するのに、酢酸エチル１０mlを用いた。軟膏剤からＢＭＶを抽出するのには、ヘプタン：エタノール（３０:７０）を用いた。D-Squame（登録商標）tape discs（Cuderm Corp., Dallas, USA）を用いて、皮膚損傷を誘導する場合と同じ方法で、テープストリッピングを無傷の皮膚には最大で１５回行うことにより、角質層を除去した。バリア損傷皮膚については、テープストリッピングを最大で３回のみ行った。いずれの場合も、１回目のテープストリッピングは、余剰の製剤に含んだ。角質層を除去する方法は、様々な製剤を用いた予備試験および製剤への曝露から２４時間後における、様々な回数のテープストリッピングを用いた試験結果により確立した。しかし、それぞれ１５回もしくは３回よりも少ないテープストリッピングで表皮がほぐれはじめた場合、テープストリッピングをやめ、最後の１回を表皮のカウントに含んだ。表皮と真皮を熱（６０℃、高湿度で５分間インキュベート）により分離した。適用領域の周辺の皮膚（非適用皮膚とよぶ）を小片に切り分け、同様に、側方浸透を含んでいるか、ならびに完全な回収率を達成しているか調べるために分析した。Soluene（登録商標）350をテープストリップおよび皮膚試料に添加し、組織を可溶化し、薬剤物質および脂質を抽出した。５０℃で２４時間インキュベートした後、Hionic-Fluor１０mlをSoluene（登録商標） 350試料に添加し、Packard Instrument Company（Meriden, USA）のTri-Carb 2100 TR Liquid Scintillation Analyzerで、液体シンチレーションにより分析した。蓋および綿パッドからの抽出物およびレセプター媒体の内容物は、そのうちの１mlをHionic-Fluor１０mlに混合し、シンチレーション計測を行うことによって分析した。適当な液体（すなわち、Hionic-Fluorと混合した、酢酸エチル、レセプター媒体、ヘプタン：エタノール（３０:７０）およびSoluene（登録商標） 350）を測定のバックグラウンドとして用いた。
【００８４】
６、１６および２４時間で比較する場合、２４時間の間に皮膚構造が変化することを考慮にいれて、様々な皮膚層内のＢＭＶの量をプールした。そのため、分離方法の効率もまた変わりうる。
【００８５】
試験管内浸透試験は、無傷およびバリア損傷したブタの皮膚について、フランツ型拡散セル内で、ＳＬＮがどのように薬剤物質の皮膚内および皮膚を通過しての浸透プロファイルに影響を及ぼすかを評価するため、ＳＬＮ脂質組成、適用時間、遮蔽状態の有無を変化させて行った。
【００８６】
ＢＭＶ：ジステアレートの比は、皮膚の深さに伴って上昇する、すなわち、ＢＭＶは脂質よりも多くの量が皮膚に浸透することが明らかになった。余剰の製剤中のかかる比は、約１であった。角質層では、かかる比は低下して１より小さくなり、続いて、表皮および真皮を通過すると上昇して、レセプター媒体では３．６の比に到達した。ジステアレートと比較すると、トリパルミテートのプロファイルはわずかに異なっており、真皮内で、脂質に対するＢＭＶの比の減少が見られており、レセプター媒体中での比は２．７であり、ジステアレートの比よりも低かった。ＢＭＶ／脂質の比が皮膚の深さとともに上昇することは、脂質粒子が主に皮膚の表面または上層にとどまり、ＢＭＶが粒子から放出されて皮膚内に浸透したことを示唆している。表３では、皮膚の様々な層およびレセプター媒体への、脂質の浸透データを示している。無傷の皮膚およびバリア損傷皮膚の両方において、ジアステレートの方が、トリパルミテートよりも多く表皮に到達するという傾向が見られた。皮膚がテープストリッピングによってバリアを損傷していた場合、表皮、真皮およびレセプター媒体に到達する脂質の量に増加が見られた。脂質浸透の増加（〜３から７倍）は、ＢＭＶの浸透の増加（〜３から６０倍）に比べると非常に低く、ＢＭＶがナノ粒子から放出され、皮膚を通って個々に分散していることを強調していた。
【００８７】
皮膚適用後２４時間時点で、ＳＬＮと軟膏剤の間で見られる主な違いは、ＳＬＮは、無傷およびバリア損傷皮膚の両方において、有意に高い量のＢＭＶの、皮膚中の残存を引き起こしたということである（図１）。バリアが無傷の場合、ＳＬＮ中で投与したＢＭＶの大部分は、角質層に見られ、レセプター媒体内には少なかった（図１ａ）。ＳＬＮは、ＢＭＶを皮膚の上層に高程度で局在させ、そこからＢＭＶを皮膚深層に分散させることができ、そして、ＳＬＮは、軟膏剤と比べて、無傷の皮膚の角質層中のより深くに、有意に多くのＢＭＶを浸透させたと考えられる（ｐ＜０．０５）。パルミチン酸セチルＳＬＮでは、より多くのＢＭＶが表皮に到達していた。ＳＬＮを無傷の皮膚に適用すると、無視できる量のＢＭＶ（＜０.９％）しかレセプター媒体に透過していなかったのに対し、軟膏剤を使った後では、有意に多くの（８.４±４.０％）ＢＭＶが無傷の皮膚を透過していた（図１ａ）。ＳＬＮまたは軟膏剤の適用の前に皮膚をテープストリッピングするのに伴って、全ての製剤から、レセプター媒体へのＢＭＶの透過が大きく上昇した（１３.８〜２１.８％）（図３ｂ）。軟膏剤と比較すると、ＳＬＮの適用時には、有意に多くのＢＭＶがバリア損傷皮膚に残っていたが（ｐ＜０.０５）、レセプター媒体に透過したＢＭＶの量は同じぐらいであった（図１ｂ）。ジステアレートＳＬＮ中でＢＭＶを投与した後では、トリパルミテートＳＬＮおよびパルミチン酸セチルＳＬＮと比較して、無傷およびバリア損傷皮膚の両方において、より多くのＢＭＶが、角質層に残存しているという傾向が見られた（図１）。
【００８８】
適用後２４時間で得られた結果をよりよく理解するために、さらに２つのタイムポイントを試験に含めた、すなわち、６時間、１６時間の時点である。これらの試験には、ＢＭＶの溶解度が高いことから、ジステアレートを選択した。適用後それぞれ６、１６および２４時間後で、軟膏剤を使った場合は、全てのタイムポイントにおいて、皮膚中に存在するＢＭＶの量が有意に低く（図２）、ジステアレートＳＬＮの適用により、皮膚中のＢＭＶの量が恒常的および有意に増加したことが示された。バリア損傷皮膚について、レセプター媒体に透過するＢＭＶの量はＳＬＮで投与した場合は、２４時間でごく低い程度でしか増加しなかった（図２ｂ）。
【００８９】
皮膚がＳＬＮの適用後すぐに、２４時間遮蔽状態にされた場合、遮蔽状態にしなかった場合に比べて、レセプター媒体に透過したＢＭＶの量は有意に上昇し、皮膚中の量は減少した（図３）。バリア損傷皮膚については、遮蔽に伴って、無傷の皮膚とは対照的に、レセプター媒体に透過したＢＭＶの増加はきわめて高かった；ジステアレートＳＬＮを適用した場合、６５.６±１５.２％（図３ｂ）。
【００９０】
無毛ラットにおけるジプロピオン酸ベタメタゾンの生体内経皮送達
イソフルラン麻酔下で、製剤１００μlをラットの背中の面積４x３cmに適用した。ラットを２分間そのままにし（製剤を乾燥させるため）、「バイオフィルム」として、Optiskinフィルム（５.３x７.２cm、URGO laboratories, France）をその領域の上に適用し、その上にFixomull strech（BSN medical, Germany）を貼った。
【００９１】
ラットを、投与後様々な時間間隔で死なせ、その時点で皮膚生検および血液試料を採取した。舌下の血液試料は、死なせる前に各動物から回収した。ラットはＣＯ２で安楽死させた。皮膚生検は適用した皮膚領域から採取した。該皮膚は、９９.９％エタノールに浸したティッシュペーパーで優しく洗浄した。生検材料は重さを量り、定量分析を行うまで−８０℃で保存した。定量分析はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって行った。
【００９２】
図４は、無毛ラットにＳＬＮによって投与すると、軟膏剤に比べて、皮膚中で、高いレベルのジプロピオン酸ベタメタゾン（ＢＤＰ）およびその代謝物のベタメタゾン（ＢＯＰ）ならびにモノプロピオン酸ベタメタゾン（ＢＭＰ）が、より長期間にわたって得られるということを示している。３日目には、皮膚中の薬剤物質のレベルが安定して高く、７日目には、軟膏剤で投与した場合には検出されなかったのに対し、薬剤物質が未だ皮膚中にある程度維持されていた。これらのデータより、ＳＬＮ中でコルチコステロイドＢＭＶを無傷およびバリア損傷したブタの皮膚に適用した場合、試験管内で見られた貯蔵効果があることが確実になった。
【００９３】
実施例３
マウスアトピー性皮膚炎モデルにおける皮膚送達システムとしての、ＢＭＶ含有脂質ナノ粒子の評価
ＡＤ誘導
ＡＤの表現型は、オキサゾロンに繰り返し曝露させることによって誘導した（Man et al., J. Invest. Dermatol. 128, 2008, pp. 79-86）。右耳の片側に０.８％（ｗ／ｖ）アセトン中オキサゾロン１０μlを適用することで、マウスを感作させた（−７日目とする）。対照群は、右耳と左耳の両側をアセトン１０μlで処理した。感作から７日後（０日目とする）、マウスを１回目の０.４％（ｗ／ｖ）アセトン中オキサゾロンに曝露した。より具体的には、マウスの右耳の片側に、０日目から２１日目まで１日おきに、０.４％（ｗ／ｖ）オキサゾロンを１０μl投与した。オキサゾロンを適用したのと同じ日に、対照群のマウスには、左耳および右耳の片側のみに、それぞれアセトン１０μlを投与した。１日に一度処置するスキームを含む処理は、１０日目にはじまり、試験が２１日目に終わるまで続いた。以下の情報；耳の厚み、ＴＥＷＬ、サイトカイン分析、耳の皮膚の組織評価、耳組織および血清中のＢＭＶの定量分析を測定した。
【００９４】
ＳＬＮ中で投与されるＢＭＶの用量設定
ＳＬＮ中のＢＭＶについての用量応答関係を明らかにし、ＳＬＮの効果を軟膏剤と比較する場合に用いる用量を確立するための最初の試験を行った。この試験では、３つの異なる濃度の、ＳＬＮ中のＢＭＶを適用した。マウス（全体で５２匹）を、４〜８匹の動物からなる８つの群に分け、その中に、ＡＤを誘導せず、１日に１度、右耳および左耳の片側にアセトン１０μlか、または、１日に１度、右耳の片側にプラシーボＳＬＮ５μlのいずれかで処理する、アセトン対照のマウス群（ｎ＝４）２つを含む。その他の群は、オキサゾロンでＡＤを誘導し、１日に１度右耳の片側を、アセトン１０μl（ｎ＝７）か、３.０μg／耳／日のアセトン中ＢＭＶ１０μl（ｎ＝６）、プラシーボＳＬＮ５μl（ｎ＝７）、０.０３０μg／耳／日のＳＬＮ中ＢＭＶ５μl（ｎ＝８）、１.２０μg／耳／日のＳＬＮ中のＢＭＶ５μl（ｎ＝８）および１２.０μg／耳／日のＳＬＮ中ＢＭＶ５μl（ｎ＝８）のいずれかで処理した。左耳は処理を受けなかった。
【００９５】
ＳＬＮおよび軟膏剤の刺激および効果
ＳＬＮの組成は、ＳＬＮ媒体の、マウスの耳の皮膚への刺激作用を評価した試験において、最適化した。具体的には、界面活性剤であるポリソルベート ８０を評価した。様々なプラシーボ製剤を製造し、約２００nmの平均粒子サイズと低い粒子多分散性（＜０.２５）をもたらすような至適な界面活性剤と脂質のレベルを明らかにした。さらには、この組成物の粒子は健康なマウスの耳の皮膚において何ら刺激作用をもたらすべきでなく、脂質混合物中で、十分なＢＭＶ溶解度（＞０.０１２％（ｗ／ｗ））を提供するべきである。これらの判断基準を満たすＳＬＮ媒体の組成は、脂質２.５％（ｗ／ｗ）とポリソルベート ８０ ０.４％（ｗ／ｗ）であるとわかった（表１）。このＳＬＮ組成物の効果を慣用的なパラフィン軟膏と比較し、健康なマウスの耳の皮膚にとって全く刺激性でないことも示された。
【００９６】
ＢＭＶの送達についてＳＬＮを軟膏剤と比較するために、６９匹のマウスを４〜１０匹の動物からなる８の群に分け、そのうちの１つの群はＡＤを誘導していないアセトン対照群であった（ｎ＝４）。その他の群のマウスは、全てオキサゾロンでＡＤを誘導しており、１日に１度右耳の片側を、アセトン１０μl（ｎ＝８）、３.０μg／耳／日のアセトン中ＢＭＶ１０μl（ｎ＝８）、１.２０μg／耳／日のアセトン中ＢＭＶ１０μl（ｎ＝１０）、１.２０μg／耳／日のＳＬＮ中ＢＭＶ５μl（ｎ＝１０）、１.２０μg／耳／日の軟膏剤中ＢＭＶ６μg（ｎ＝１０）、プラシーボＳＬＮ５μl（ｎ＝１０）およびプラシーボ軟膏剤６μg（ｎ＝９）で処理した。処理のスキームは、それ以外の点では、用量設定試験と同様のものだった。ＳＬＮはピペットで適用し、軟膏剤は、粘性が高いためスパチュラを用いた。被験製剤の組成は、表１に示す通りである。
【００９７】
耳の厚み
皮膚炎症の程度をはかる尺度として右耳および左耳の厚みを、未処理の耳の厚みを内部対照として、Mitutoyo Americ Co.（Aurora, IL, USA）のデジタルマイクロメーターを用いて測定した。全ての測定は、個人による測定の変わりやすさを最小限にするために、試験を通じて同じ人物が行った。１０、１２、１４、１７、１９および２１日目では、処理を適用する前に測定を行った。
【００９８】
経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）
ＴＥＷＬはDelfin Technologies Ltd.（Kuopio, Finland）のVapometerを用いて、皮膚バリア状態の指標として用いた。ＴＥＷＬは、直径４.５mmのネイルアダプターを用いて、マウスの右耳で、２０秒間で測定した（マウス１匹につき１回）。測定は、用量設定試験では、−７、１０、１４および２０日目に、ＳＬＮを軟膏剤と比較した試験では、−７、１０、１３、１７および２０日目に、処理を適用する前に行った。研究室内の環境相対湿度および温度は、各ＴＥＷＬ測定時に測定した。
【００９９】
エンドポイントでのサンプリング
２１日目、最後の製剤適用から２時間後に、血液および右耳を全ての動物から採取した。アセトン対照の群では、両方の耳を採取した。動物はイソフルランで安楽死させ、毛細管チューブを用いて、眼から血液を採取した。血液を２.５mlのVacutainer（登録商標）バイアル内に満たし、室温で３０分間静置し、その後、４℃、１０００Gで１０分間遠心した。上清を１.４mlの非標識ｕ−底バルクMicronics tubeに移し、定量薬剤分析を行うまで、−８０℃で保存した。血液を採取した後、動物を屠殺し、メスを用いて右耳を切り取った。Stiefel（登録商標）biopsy punch（Offenbach am Main, Germany）を用いて、耳の真ん中から、組織分析のために８mmの生検試料を単離し、ここから３mmの生検試料を採り、１０％（ｖ／ｖ）の中性に緩衝したホルムアルデヒド中に保存した。８mmの生検試料をそこから取って、残っている耳組織を半分に切り、片方をテープストリッピングして薬剤濃度を分析し、もう片方はサイトカイン分析に用いた。これら両方を液体窒素で急冷し、分析を行うまで−８０℃で保存した。
【０１００】
耳組織内のサイトカインレベル
耳組織を、Bertin Technologies（Montigny-le-Bretonneux, France）の、Cryolys冷却ユニットを備えたPrecellys（登録商標）24 tissue homogenizerを用いて、可溶化バッファー２００μl中でホモジナイズした。該可溶化バッファーは、１mM Ｎａ３ＶＯ４、０.４％（ｖ／ｖ）ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）およびRoche Diagnostics（Mannheim, Germany）のプロテアーゼ阻害剤CompleteTMをＰＢＳに溶解したものからなる。ホモジナイズの後、試料を氷上に１５〜３０分間静置し、その後、Ole Dich Instrument makers（Hvidovre, Denmark）のMicrocentrifuge 157 MPを用いて、４℃、１５０００Gで１５分間遠心した。上清をMSD（登録商標）サイトカインアッセイを行うまで−８０℃で保存した。サイトカインの定量を行う前に、試料濃度を標準化するため、全蛋白質濃度を定量した。この定量は、Pierce Biotechnology（Rockford, IL, USA）のPierce（登録商標） BCA Protein Assay kitを用いて行った。プレートは、Perkin Elmer（Skovlunde, Danmark）のVICTORTM X3 Multilabel Plate Readerを用いて読み取った。サイトカイン ＩＦＮ-γ、ＩＬ−１-β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２全量および耳組織内のTNF-αのレベルを特異的にMSD（登録商標） mouse TH1/TH2 9-plexのmulti-spot（登録商標）96-well 10 spot plateで、MSD（登録商標）Sector Imager 6000（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA）を用いて測定した。MSD（登録商標）アッセイは組織での使用に最適化した。したがって、プレートを１時間、MSD calibrator blend１５０μlでブロックし、その後、０.０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート ２０ １５０μlで３回洗浄した。希釈した組織上清試料２５μlをプレートに添加した後、室温で２時間振盪した。その後、SULFO-TAGTM検出抗体溶液（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA）２５μlを添加し、室温で２時間インキュベートした。０.０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート ２０での洗浄を３回繰り返し、最後に、MilliQ水で１:２に希釈したリードバッファー１５０μlを添加し、プレートをMSD（登録商標） Sector Imager 6000で読みとった。
【０１０１】
耳組織および血清中のＢＭＶの定量分析
血清および組織中のＢＭＶの定量分析を質量分析（ＭＳ）によって行った。５mg/ml プロテイナーゼＫ溶液３００μlおよび消化緩衝液ｐＨ８.５（１.５８％ トリス塩酸（trizma hydrochloride）、０.０２９％ ＥＤＴＡ、０.２０％ ドデシル硫酸ナトリウム、０.１１７％ 塩化ナトリウム）１７００μlを、耳組織試料に添加し、その後、試料を２０分間超音波処理して、ホモジナイズした。試料の５０μLをディープウェルプレートに移し、内部標準 EO1271（２０nM）を含有するメタノール１５０μLを添加して、沈殿化を誘導した。４０００rpm、１０℃で３０分間遠心した後、試料を分析した。血清試料内で蛋白質を沈殿化させるため、アセトニトリル中の内部標準１００μlを添加した。試料および標準をそれぞれ２０μl、ディープウェルプレートに移した。優しく振盪した後、プレートを１０℃にて、４０００rpmで３０分間遠心した。試料を Waters（Milsford MA, USA）のUPLCおよびApplied Biosystems（Carlsbad, CA, USA）のAPI5000 Mass Spectrometerを用いてLC-MS/MS系で分析した。Analyst（API５０００）およびWaters Acquity softwareをデータ取得および分析のために用いた。温度は６０℃で、流速は０.５ml/分であった。２.３分の間に移動相をメタノール:１M 酢酸アンモニウム:ギ酸:水（９００:２:０.７５５:１００）およびメタノール:１M 酢酸アンモニウム:ギ酸:水（５０:２:０.７５５:９５０）を０〜１００％で変化させて、流速勾配法を用いた。検出の限界は、皮膚試料については１１.１１ng/mg、血清試料については０.００１ng/mlと測定された。
【０１０２】
データ分析
全てのデータはMicrosoft ExcelまたはGraph Pad Prism 5.0でプロットした。統計分析はGraph Pad Prism 5.0で行った。一元配置分散分析（ｐ＜０.０５）の後、ニューマンケウルスもしくはダネット多重比較試験により、平均値の比較を行った。
【０１０３】
ＡＤモデル検証
慢性オキサゾロンモデルはＡＤについての、よく検証され、許容されているモデルである（Man et al., 上記）。実際、我々の動物実験においても、ＡＤ表現型がよく誘導されていた。アセトンのみで処理した耳については、厚みに何の変化も見られなかった一方、オキサゾロンで処理した耳では、耳の厚みは増加した。予期した通り、アセトン中のＢＭＶで処理したことにより、オキサゾロンで感作したマウスの耳の厚みは有意に減少した。さらに、ＴＥＷＬ値は耳の厚みと相関しており、皮膚炎症およびバリア損傷があることが確認された。したがって、ＴＥＷＬ値は、オキサゾロン処理の１０日の間に、１０g/m２＊時間から、３０〜３５g/m２＊時間に上昇した。サイトカイン発現は、オキサゾロンで感作した群では上昇したが、その一方、アセトンのみで処理したマウスでは影響が見られなかった。オキサゾロンで感作したマウスでは、アセトン中のＢＭＶの処理によってサイトカインレベルが低下し、このことにより、コルチコステロイドの局所処置の効果が確認された。オキサゾロンで感作したマウスでは、組織評価によっても、耳組織で顕著な炎症反応を示した。これは、アセトンのみで処理したマウスからの皮膚試料では、炎症反応の徴候を全く示さなかったのと対照的であり、またその一方で、ＢＭＶで処理したマウスは軽度の炎症の徴候のみを示したが、これは薬剤処理の有効性に相関している（データは示さない）。
【０１０４】
ＳＬＮおよび軟膏剤中のＢＭＶによる、耳の厚みの同様の減少
耳の厚みは、皮膚炎症の程度を測る尺度としても用いられうるため、エンドポイントの１つとして選択した（Patrick et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 81, 1985, pp. 476-490; Young et al., J. Invest. Dermatol. 82, 1984, pp. 367-371）。
耳の厚みの計測結果から、ＢＭＶを含むＳＬＮと軟膏剤は、耳の厚みについて同様の有意な減少を示し（Ｐ＜０.０５）、その効果は、アセトン中のＢＭＶ対照の１.２０μg／耳／日と同じ範囲内であることが示された（図５ａ）。このことは、ＢＭＶがＳＬＮ媒体から放出され、皮膚内に浸透し、軟膏剤およびアセトン中で投与したＢＭＶに匹敵する効果をもたらす量で、標的細胞に到達することを強く示唆している。試験管内では、ＳＬＮ中のＢＭＶをブタの皮膚に適用すると、皮膚中、特に角質層に残存している薬剤物質の総量は、ＢＭＶを軟膏剤で投与した場合に比べて有意に高いことが、前に示された（参照；実施例２）。しかしながら、薬剤物質は、効果を発揮するためには、ＳＬＮから放出され、角質層に浸透することが必須であり、このことは、本明細書中の生体内試験において確認されている。
【０１０５】
用量設定試験において、耳の厚みには、顕著な用量応答効果がみられ、これは、ＢＭＶを含むＳＬＮを、１.２０μg／耳／日および、１２.０μg／耳／日で適用すると、未処理の動物ならびにＳＬＮプラシーボ群と比較して、耳の厚みが有意に減少している（Ｐ＜０．０５）という形で反映された（図５ｂ）。ＢＭＶを、ＳＬＮ中、０.０３μg／耳／日で処理した場合には、何の効果も見られなかった。
【０１０６】
サイトカインレベルは、ＳＬＮおよび軟膏剤中のＢＭＶにおいて同様の効果を示す
オキサゾロンへの複数回の曝露により、皮膚炎症の、Ｔｈ１優位な応答から、Ｔｈ２優位な応答へのシフトが引き起こされたことが、サイトカインの発現に反映されており、これは、ヒトＡＤにおいて一般的に見られることである（Kitagaki et al., J. Invest. Dermatol. 105, 1995, pp. 749-755; Kitagaki et al., J. Immunol. 159, 1997, pp. 2484-2491; Matsumoto et al., Skin Res. Technol. 10, 2004, pp. 122-129）。
【０１０７】
サイトカインを産生するＴｈ１およびＴｈ２を、ともにこの試験で評価した。用量設定試験において、ＳＬＮ中のＢＭＶには、明確な用量応答効果が見られた、すなわち、ＳＬＮ中で適用したＢＭＶの用量に比例して、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のレベルは低下した（データは示さない）。不運なことに、ＩＬ−５およびＴＮＦ-αの濃度は、ＢＭＶ処理時に、検出できる限界を下回っていたため、これらをデータ分析に含めることはできない。オキサゾロンで感作させていないマウスにプラシーボＳＬＮを適用すると、その後、アセトン対照と比較して、ＩＬ−８およびＩＬ−１２レベルが有意に上昇したが、これは、ＳＬＮ媒体から刺激があることを示唆している。
【０１０８】
ＳＬＮ中のＢＭＶと、軟膏剤中のＢＭＶを比較すると、どちらの製剤においても、ＢＭＶは、用量設定試験でも見られたように、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のレベルを低下させた。このことは、サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１βの低下を示している、図６ａおよび６ｂに例示されている。サイトカインの調節に関しては、製剤による有意な違いはなく、このことは、２つの製剤が、この点については同様に効果的であったことを示している。しかしながら、プラシーボ軟膏剤の適用後では、プラシーボＳＬＮの適用後よりも、サイトカインのレベルが一般的に高かったことは注目すべきことであり、このことは、軟膏剤の媒体は、ＳＬＮよりも刺激が大きかったことを示唆している。
【０１０９】
ＴＥＷＬはＳＬＮまたは軟膏剤中のＢＭＶの投与により低下する
ＴＥＷＬは、皮膚バリアの性質の指標として（Levin and Maibach, J. Contr.Rel. 103, 2005, pp. 291-299; Proksch et al., J. Dermatol. Sci. 43, 2006, pp. 159-169; Werner and Lindberg, Acta Derm. Venereol. 65, 1985, pp. 102-105）、また、皮膚に適用した媒体の遮蔽性を評価するのに（Loden, Acta Derm. Venereol. 72, 1992, pp. 327-330）、用いることができる。１.２０μg ＢＭＶ／耳／日を適用して、ＳＬＮを軟膏剤と比較すると、いずれの製剤で処理しても、ＴＥＷＬ値は、対照と比較できるレベルに低下することが示された（図７ａ）。用量設定試験では、１.２μg／耳／日の、ＳＬＮ中のＢＭＶのみの処理により、ＴＥＷＬ値の有意な低下が引き起こされた（Ｐ＜０.０５）（図７ｂ）。皮膚にＳＬＮを適用した以前の結果と対照的に（Jenning et al., Int. J. Pharm. 199, 2000, pp. 167-177; Santos et al., J. Drug Target. 10, 2002, pp. 489-495; Wissing and Muller, Eur. J. Pharm. Biopharm. 56, 2003, pp. 67-72）、ＴＥＷＬは、プラシーボＳＬＮまたはプラシーボ軟膏剤のいずれからも、遮蔽性の効果が見られることは何ら示唆しなかった。ＴＥＷＬは、ＢＭＶを含む製剤によってのみ低下した。遮蔽効果が現れなかったのは、測定を、製剤を適用した次の日に行ったためとも考えられる。とりわけ、マウスは連続して耳にひっかき傷をつくり、洗浄していたために、このときまでに、製剤が、遮蔽性を誘導できるだけの量で皮膚中に存在しなくなっていた可能性がある。したがって、ＢＭＶを含有する製剤の投与後で、ＴＥＷＬが低下したのは、ＢＭＶの治療上の効果、特に、皮膚表面からの水分の蒸発を減少させうる血管収縮性の効果に関連していると考えられる（Kolbe et al., Skin Re. Technol. 7, 2001, pp. 73-77）。
【０１１０】
ＳＬＮは皮膚中のＢＭＶの量を増加させる
２１日目の最後の適用から２時間後に、皮膚および血清中のＢＭＶの濃度を分析した。ＳＬＮと軟膏剤の比較から、ＳＬＮの適用後では、軟膏中のＢＭＶの適用後よりも、ＢＭＶの皮膚濃度は有意に高かった（５倍）。血清中のＢＭＶの濃度は、１.２０μg／耳／日でのＳＬＮ、軟膏剤およびアセトン対照について同じぐらいであった（図８）。用量設定試験により、血清中のＢＭＶのレベルは、１２.０μg／耳／日での、ＢＭＶ含有ＳＬＮと、３.０μg／耳／日でのアセトン中のＢＭＶの適用で、同等のものであった（図８）。しかしながら、皮膚中のレベルは、１２μg／耳／日のＢＭＶ含有ＳＬＮが、３.０μg／耳／日のアセトン中のＢＭＶよりも高かった。０.０３μg／耳／日のＳＬＮでは、血清中で測定ができず、皮膚中には非常に低いレベルのＢＭＶが存在していた。このことにより、この製剤ではどちらにも何の効果もなかったことが説明される。
【０１１１】
耳の厚み、ＴＥＷＬおよび耳組織のサイトカインレベルは、対照を含む、適用した様々な製剤により達成される皮膚濃度とともに、ＢＭＶが経皮的に浸透し、局所的に効果を発揮したことを示唆している。しかしながら、血清濃度を解釈する際に、マウスの耳にひっかき傷をつくり、洗浄している際に、マウスがＢＭＶを経口で摂取しているという可能性を除外することはできない。
ＳＬＮの適用後に、皮膚中により多くのＢＭＶが見られたことは、ＳＬＮが軟膏剤に比べてより強力に皮膚に接着し、皮膚貯蔵部をつくりだすことができることを示唆しうる。この効果は、試験管内においても、ＢＭＶ含有ＳＬＮを軟膏剤と比較した際に見られた（参考：実施例２）。本試験では、残っている角質層および／または生表皮に残存している薬剤物質の量の増加を引き起こすのに加え、薬剤物質が、ＳＬＮから、慣用的な製剤およびアセトン対照と同様の効果をもたらす程度で、標的部位に到達したことも示された。マウスＡＤモデルにおいて、シクロスポリンＡをＳＬＮまたは油のどちらかで適用して効果を比較した、別の生体内試験においても、同様の結果が見られた。ＳＬＮ中のシクロスポリンＡは、油よりも効果的であったこと、ならびに、皮膚の角質層中の薬剤物質の量がＳＬＮの使用によって有意に増加したことが示された（Kim et al., Pharmazie 64, 2009, pp. 510-514）。湿疹患者で行われた別の試験によって、ＳＬＮ内に取り込まれたプロピオン酸クロベタゾールは、皮膚貯蔵効果をもたらし、市販のクリーム剤に比べて効力が優れていることが示された（Kalariya et al., Indian J. Exp. Biol., 2005, pp. 233-240）。
【０１１２】
実施例４
ブタの耳の皮膚は無傷のもののみを用いたこと、ならびに、レセプター媒体を４％ＢＳＡで置きかえたこと以外は、実施例２に記載したように組成物Ｈ、Ｌ、Ｊ、Ｍ、Ｎを用いて、皮膚浸透および透過試験を行った。これらの試験から得られた結果により、脂質ナノ粒子は、クリーム剤と比較して、角質層および、特に生皮膚（viable skin）中に維持されることが示された。さらに、脂質ナノ粒子を適用した場合、皮膚を通ってレセプター媒体まで透過した薬剤物質はごく少量であった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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