(57)【要約】  本開示は、リポタンパク質複合体およびリポタンパク質集団ならびに脂質異常症、障害および／または状態の治療および／または予防におけるそれらの使用に関する。本開示はさらに、アポリポタンパク質の組換え発現、アポリポタンパク質の精製、および熱サイクリングに基づく方法を用いるリポタンパク質複合体の製造に関する。
2014506884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ、脂質画分と、本質的にアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（「ＡｐｏＡ−Ｉ」）からなるアポリポタンパク質画分とを含むリポタンパク質複合体の集団であって、リポタンパク質複合体が、ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより反映されるように、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％均一である、集団。
【請求項２】
下記特徴：
（ａ）リポタンパク質複合体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％が、ゲル浸透クロマトグラフィー（「ＧＰＣ」）または動的光散乱（「ＤＬＳ」）により測定された場合、４ｎｍ〜１５ｎｍのサイズ、６ｎｍ〜１５ｎｍのサイズ、４ｎｍ〜１２ｎｍのサイズ、６ｎｍ〜１２ｎｍのサイズまたは８ｎｍ〜１２ｎｍのサイズの粒子の形態にある；
（ｂ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉに関して少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％または少なくとも９５重量％が成熟形態にある；
（ｃ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉの２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下が未熟形態にある；および
（ｄ）集団中のＡｐｏＡ−Ｉの２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下がトランケートされた形態にある、
のうちの１、２、３または４つをさらに特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
下記特徴：
（ａ）前記集団中の前記ＡｐｏＡ−Ｉ中のメチオニン１１２およびメチオニン１４８のそれぞれの２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、２％以下または１％以下が酸化されている；
（ｂ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉのアミノ酸の１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下が脱アミド化されている；
（ｃ）集団が、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、１ＥＵ以下、０．５ＥＵ以下、０．３ＥＵ以下または０．１ＥＵ以下の内毒素を含有する；
（ｄ）集団が、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、１００ピコグラム以下、５０ピコグラム以下、２５ピコグラム以下、１０ピコグラム以下または５ピコグラム以下の宿主細胞ＤＮＡを含有する；ならびに
（ｅ）集団が、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、５００ナノグラム以下、２００ナノグラム以下、１００ナノグラム以下、５０ナノグラム以下、または２０ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質を含有する、
のうちの１、２、３、４または５つをさらに特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記複合体中の脂質画分中の脂質の１５重量％以下または１０重量％以下、５重量％以下または２重量％以下がコレステロールである、請求項１から３のいずれか一項に記載の集団。
【請求項５】
前記ＡｐｏＡ−ＩがヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項６】
前記ＡｐｏＡ−Ｉが組換えＡｐｏＡ−Ｉである、請求項１から５のいずれか一項に記載の集団。
【請求項７】
前記脂質画分が、本質的に９５〜９９重量％の中性リン脂質と１〜５重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の集団。
【請求項８】
前記脂質画分が、本質的に９６〜９８重量％の中性リン脂質と２〜４重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、請求項７に記載の集団。
【請求項９】
前記脂質画分が、本質的に９７重量％の中性リン脂質と３重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、請求項１から８のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１０】
中性脂質が天然スフィンゴミエリンまたは合成スフィンゴミエリンであり、場合により、脂質が５ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、４ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、３ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、または２ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満の過酸化物価を有する、請求項９に記載の集団。
【請求項１１】
スフィンゴミエリンが卵スフィンゴミエリンである、請求項１０に記載の集団。
【請求項１２】
負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１３】
負に荷電したリン脂質が１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）の塩を含むか、またはそれからなる、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
１：２〜約１：３の範囲のアポリポタンパク質画分：リン脂質画分重量比を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の２、３または４つの集団を含む組成物。
【請求項１６】
組成物中に１５％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下のリポタンパク質を含む前記組成物が非複合体化形態にある、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物中に１５％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下の脂質を含む前記組成物が非複合体化形態にある、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
リポタンパク質複合体あたり２個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含む第１の集団を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
リポタンパク質複合体あたり３もしくは４個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含む第２の集団、および場合により、それぞれ、リポタンパク質複合体あたり４もしくは３個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含む第３の集団を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポタンパク質複合体の集団と、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤とを含むか、または本質的にそれからなる医薬組成物。
【請求項２２】
治療上有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を含む単位剤形。
【請求項２３】
配列番号１の２５〜２６７位に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の複数の哺乳動物宿主細胞を含む哺乳動物細胞培養物。
【請求項２５】
ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質が発現および分泌される条件下で請求項２３に記載の哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含む、成熟した生物学的に活性なＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を製造する方法。
【請求項２６】
リポタンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）脂質成分とタンパク質成分とを含む出発懸濁液を、第１の温度範囲の温度から第２の温度範囲の温度まで冷却するステップであって、前記脂質成分が本質的に脂質の粒子からなり、前記タンパク質成分が本質的に脂質結合ペプチドおよび／または脂質結合タンパク質からなる、ステップ；
（ｂ）冷却された（ａ）の懸濁液を、前記第２の温度範囲の温度から前記第１の温度範囲の温度まで加熱するステップ；
（ｃ）前記の加熱された（ｂ）の懸濁液を、前記第１の温度範囲の温度から前記第２の温度範囲の温度まで冷却するステップ；ならびに
（ｄ）ステップ（ｂ）と（ｃ）を少なくとも１回繰り返すステップ
を含み、それによってリポタンパク質複合体を形成する方法。
【請求項２７】
医薬組成物を作製する方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の方法に従ってリポタンパク質複合体の集団を調製するステップ；および
（ｂ）リポタンパク質複合体の前記集団と、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを合わせるステップ
を含む方法。
【請求項２８】
脂質異常障害を治療する方法であって、治療上有効量の：
（ａ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポタンパク質複合体の集団；
（ｂ）請求項１５から２０のいずれか一項に記載の組成物；
（ｃ）請求項２１に記載の医薬組成物；
（ｄ）請求項２６に記載の方法により作製された治療上有効量のリポタンパク質複合体；
（ｅ）請求項２２に記載の単位剤形；
（ｆ）健康なボランティアへの最大４５ｍｇ／ｋｇの単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｇ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｈ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｉ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｊ）健康なボランティアへの最大２０ｍｇ／ｋｇの単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｋ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｌ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；または
（ｍ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体
を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
脂質異常障害を治療するための方法であって、
（ａ）１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇの初期用量で、
（ｉ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポタンパク質複合体の集団；
（ｉｉ）請求項１５から２０のいずれか一項に記載の組成物；
（ｉｉｉ）請求項２１に記載の医薬組成物；
（ｉｖ）請求項２６に記載の方法により作製された治療上有効量のリポタンパク質複合体；
（ｖ）請求項２２に記載の単位剤形；
（ｖｉ）健康なボランティアへの最大４５ｍｇ／ｋｇの単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｖｉｉ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｖｉｉｉ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｉｘ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｘ）健康なボランティアへの最大２０ｍｇ／ｋｇの単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｘｉ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｘｉｉ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；または
（ｘｉｉｉ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体
を対象に投与するステップ；
（ｂ）対象のトリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドが、前記投与の４、８、１２、２４、４８、７２、１６８、３３６または５０４時間後に２倍を超えて上昇するかどうかを決定するステップ；ならびに
（ｃ）対象のトリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドが投与前のレベルの２倍を超えて上昇する場合、前記投与を繰り返すが、より低い用量で行い、対象のトリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドが投与前のレベルの２倍を超えて上昇しない場合、同等か、もしくはそれより高い用量で前記投与を繰り返すステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願との相互参照
本出願は、２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，３７１号、２０１１年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４５２，６３０号および２０１１年５月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４８７，２６３号（これらの全ての内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益を主張する。
【０００２】
２．技術分野
本開示は、リポタンパク質複合体、該複合体を含む医薬組成物、そのような複合体のためのアポリポタンパク質を製造および精製する方法、該複合体を作製する方法ならびに心血管疾患、障害および／またはそれらと関連する状態を治療または予防するための前記複合体の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
３．１．概説
循環コレステロールは、脂質と、血液中の脂質を輸送するタンパク質組成物との複合体粒子である血漿リポタンパク質により運搬される。４つの主要なクラスのリポタンパク質粒子が血漿中に循環し、脂肪輸送系に関与する：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）。カイロミクロンは、腸脂肪吸収の短命の生成物である。ＶＬＤＬおよび特に、ＬＤＬは、肝臓（コレステロールが合成されるか、または食事起源から得られる）から肝臓外組織、例えば、動脈壁へのコレステロールの送達を担う。対照的に、ＨＤＬは、逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）、特に、肝臓外組織から肝臓へのコレステロール脂質の除去を媒介し、そこで保存、異化、排除または再利用される。ＨＤＬはまた、炎症、酸化された脂質およびインターロイキンの輸送において有益な役割を果たし、次いで血管壁における炎症を減少させることができる。
【０００４】
リポタンパク質粒子は、コレステロール（通常はコレステリルエステルの形態にある）とトリグリセリドとから構成される疎水性コアを有する。このコアは、リン脂質、非エステル化コレステロールおよびアポリポタンパク質を含む表面外被により取り囲まれている。アポリポタンパク質は脂質輸送を媒介し、いくらかは脂質代謝に関与する酵素と相互作用し得る。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＪおよびＡｐｏＨなどの、少なくとも１０種のアポリポタンパク質が同定されている。ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ＣＥＴＰ（コレステリルエステル転移タンパク質）、ＰＬＴＰ（リン脂質転移タンパク質）およびＰＯＮ（パラオキソナーゼ）などの他のタンパク質も、リポタンパク質と関連して見出されている。
【０００５】
冠動脈性心疾患、冠動脈疾患およびアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患は、血清コレステロールレベルの上昇と極めて関連している。例えば、アテローム性動脈硬化症は、動脈壁内でのコレステロールの蓄積を特徴とする、ゆっくりと進行する疾患である。説得力のある証拠が、アテローム性動脈硬化症病変に沈着した脂質が主に血漿ＬＤＬに由来するものであるという理論を支持し、かくして、ＬＤＬが「悪玉」コレステロールとして一般的に知られるようになった。対照的に、ＨＤＬ血清レベルは、冠動脈性心疾患とは逆相関する。実際、ＨＤＬの高い血清レベルは、負の危険因子と見なされている。高レベルの血漿ＨＤＬは冠動脈疾患に対して防御的であるだけでなく、実際にアテローム性動脈硬化プラークの退縮を誘導し得るとの仮説が立てられている（例えば、Badimonら、1992、Circulation 86 (Suppl. Ill): 86-94; DanskyおよびFisher、1999、Circulation 100: 1762-63; Tangiralaら、1999、Circulation 100(17): 1816-22; Fanら、1999、Atherosclerosis 147(l): 139-45; Deckertら、1999、Circulation 100(11): 1230-35; Boisvertら、1999、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. l9(3):525-30; Benoitら、1999、Circulation 99(1): 105-10; Holvoetら、1998、J. Clin. Invest. 102(2):379-85; Duvergerら、1996、Circulation 94(4):713-17; Miyazakiら、1995、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15(11): 1882-88; Mezdourら、1995、Atherosclerosis 113(2):237-46; Liuら、1994、J. Lipid Res. 35(12):2263-67; Plumpら、1994、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91(20):9607-11; Pasztyら、1994、J. Clin. Invest. 94(2):899-903; Sheら、1992、Chin. Med. J. (Engl). 105(5):369-73; Rubinら、1991、Nature 353(6341):265-67; Sheら、1990、Ann. NY Acad. Sci. 598:339-51; Ran、1989, Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih (Zhonghua Bing Li Xue Za Zhiとも翻訳される) 18(4):257-61; Quezadoら、1995、J. Pharmacol. Exp. Ther. 272(2):604-11; Duvergerら、1996、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12): 1424-29; Kopflerら、1994、Circulation; 90(3): 1319-27; Millerら、1985、Nature 314(6006): 109-11; Haら、1992、Biochim. Biophys. Acta 1125(2):223-29; Beitzら、1992、Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 47(2): 149-52を参照されたい)。結果として、ＨＤＬは「善玉」コレステロールとして一般に知られるようになった（例えば、Zhangら、2003 Circulation 108:661-663を参照されたい)。
【０００６】
ＨＤＬの「防御的」役割がいくつかの研究において確認されている（例えば、Millerら、1977、Lancet l(8019):965-68; Whayneら、1981、Atherosclerosis 39:411-19）。これらの研究では、ＬＤＬレベルの上昇は心血管リスクの増加と関連すると考えられるが、高いＨＤＬレベルは心血管防御を付与すると考えられる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究は、ＨＤＬの防御的役割をさらに実証し、ウサギへのＨＤＬ注入がコレステロール誘導性動脈病変の発生を阻害し（Badimonら、1989、Lab. Invest. 60:455-61)および／またはその退縮を誘導し得る（Badimonら、1990、J. Clin. Invest. 85: 1234-41）ことを示した。
【０００７】
３．２．逆コレステロール輸送、ＨＤＬおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）経路は、多くの肝臓外組織からコレステロールを排除するように機能し、体内の多くの細胞の構造および機能の維持にとって重要である。ＲＣＴは主に３つの段階：（ａ）コレステロール流出、すなわち、末梢細胞の様々なプールからのコレステロールの最初の除去；（ｂ）細胞中への流出したコレステロールの再進入を防止する、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によるコレステロールエステル化；および（ｃ）加水分解のための肝臓細胞へのＨＤＬ−コレステロールおよびコレステリルエステルの取込み、次いで、再利用、貯蔵、胆汁中への排出または胆汁酸への異化、からなる。
【０００８】
ＲＣＴにおける鍵となる酵素であるＬＣＡＴは、肝臓により産生され、ＨＤＬ画分と結合して血漿中に循環する。ＬＣＡＴは細胞由来コレステロールをコレステリルエステルに変換し、これらはＨＤＬ中に隔離され、除去を運命付けられる（Jonas 2000、Biochim. Biophys. Acta 1529(l-3):245-56を参照されたい）。コレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）およびリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）は、循環するＨＤＬ集団のさらなる再モデリングに寄与する。ＣＥＴＰはＬＣＡＴにより作られたコレステリルエステルを、他のリポタンパク質、特に、ＡｐｏＢを含むリポタンパク質、例えば、ＶＬＤＬおよびＬＤＬに移動させる。ＰＬＴＰはレシチンをＨＤＬに供給する。ＨＤＬトリグリセリドは細胞外肝臓トリグリセリドリパーゼにより異化され、リポタンパク質コレステロールはいくつかの機構を介して肝臓により除去される。
【０００９】
ＨＤＬ粒子の機能的特徴は、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩなどのそれらの主要なアポリポタンパク質成分によって主に決定される。少量のＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥおよびＡｐｏＪも、ＨＤＬと結合することが観察されている。ＨＤＬは、代謝ＲＣＴカスケードまたは経路の間の再モデリングの状態に応じて、様々な異なるサイズで、および上記の構成要素の異なる混合物中に存在する。
【００１０】
それぞれのＨＤＬ粒子は通常、少なくとも１分子、および通常は２〜４分子のＡｐｏＡ−Ｉを含む。ＨＤＬ粒子はまた、Gerd Assmann教授により記載されたように（例えば、von Eckardsteinら、1994、Curr Opin Lipidol. 5(6):404-16を参照されたい）、コレステロール流出を担うことも知られる、ＡｐｏＥ（γ−ＬｐＥ粒子）のみを含んでもよい。ＡｐｏＡ−Ｉは、肝臓および小腸によりプレプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉとして合成され、プロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｐｒｏＡｐｏＡ−Ｉ）として分泌され、迅速に切断されて、２４３アミノ酸の単一のポリペプチド鎖である血漿型のＡｐｏＡ−Ｉを生成する（Brewerら、1978、Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:623-30）。血流中に実験的に直接注入されたプレプロＡｐｏＡ−Ｉも、血漿型のＡｐｏＡ−Ｉに切断される（Klonら、2000、Biophys. J. 79(3): 1679-85; Segrestら、2000、Curr. Opin. Lipidol. 11(2): 105-15; Segrestら、1999, J. Biol. Chem. 274 (45):31755-58）。
【００１１】
ＡｐｏＡ−Ｉは、６〜８個の異なる２２アミノ酸のα−へリックスまたはプロリンであることが多いリンカー部分により間隔を空けられた機能的反復を含む。この反復単位は、両親媒性らせんコンフォメーションで存在し（Segrestら、1974、FEBS Lett. 38: 247-53）、ＡｐｏＡ−Ｉの主要な生物活性、すなわち、脂質結合およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化を与える。
【００１２】
ＡｐｏＡ−Ｉは、脂質との３つの型の安定な複合体：プレ−β−１  ＨＤＬと呼ばれる、小さい脂質の少ない(lipid-poor)複合体；プレ−β−２  ＨＤＬと呼ばれる、極性脂質（リン脂質およびコレステロール）を含む扁平な円盤状の粒子；ならびに球状または成熟ＨＤＬ（ＨＤＬ３およびＨＤＬ２）と呼ばれる、極性脂質と非極性脂質の両方を含む球状粒子を形成する。循環集団中の多くのＨＤＬは、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−ＩＩの両方（「ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ画分」）を含む。しかしながら、ＡｐｏＡ−Ｉのみを含むＨＤＬの画分（「ＡＩ−ＨＤＬ画分」）が、ＲＣＴにおいてより有効であると考えられる。特定の疫学研究は、ＡｐｏＡ−Ｉ−ＨＤＬ画分が抗動脈硬化的であるという仮説を支持する（Parraら、1992、Arterioscler. Thromb. 12:701-07; Decossinら、1997、Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307）。
【００１３】
ＨＤＬ粒子は、異なるサイズ、脂質組成およびアポリポタンパク質組成を有する粒子のいくつかの集団から作られている。それらは、その水和密度、アポリポタンパク質組成および電荷特性などの特性に従って分離することができる。例えば、プレ−β−ＨＤＬ画分は、成熟α−ＨＤＬよりも低い表面電荷を特徴とする。この電荷の差異のため、プレ−β−ＨＤＬおよび成熟α−ＨＤＬは、アガロースゲル中で異なる電気泳動移動度を有する（Davidら、1994、J. Biol. Chem. 269(12):8959-8965）。
【００１４】
プレ−β−ＨＤＬと成熟α−ＨＤＬの代謝も異なる。プレ−β−ＨＤＬは２つの代謝運命を有する：腎臓による血漿からの除去および異化または肝臓により優先的に分解される中程度のサイズのＨＤＬへの再モデリング（Leeら、2004、J. Lipid Res. 45(4):716-728）。
【００１５】
細胞表面からのコレステロール転移（すなわち、コレステロール流出）の機構は未知であるが、脂質の少ない複合体であるプレ−β−１  ＨＤＬが、ＲＣＴに関与する末梢組織から転移されたコレステロールの好ましい受容器であると考えられる（Davidsonら、1994、J. Biol. Chem. 269:22975-82; Bielickiら、1992、J. Lipid Res. 33: 1699-1709; Rothblatら、1992、J. Lipid Res. 33: 1091-97; およびKawanoら、1993、Biochemistry 32:5025-28; Kawanoら、1997、Biochemistry 36:9816-25を参照されたい）。細胞表面からのコレステロール動員のこのプロセスの間に、プレ−β−１  ＨＤＬはプレ−β−２  ＨＤＬに迅速に変換される。ＰＬＴＰはプレ−β−２  ＨＤＬディスク形成の速度を増加させることができるが、ＲＣＴにおけるＰＬＴＰの役割を示唆するデータはない。ＬＣＡＴは円盤状の小さい（プレ−β）および球状（すなわち、成熟）のＨＤＬと優先的に反応し、レシチンまたは他のリン脂質の２−アシル基を、コレステロールの遊離ヒドロキシル残基に転移させ、コレステリルエステル（ＨＤＬ中に保持される）およびリゾレシチンを生成する。ＬＣＡＴ反応には活性化因子としてＡｐｏＡ−Ｉが必要である、すなわち、ＡｐｏＡ−ＩはＬＣＡＴの天然のコファクターである。ＨＤＬ中に隔離されたコレステロールの、そのエステルへの変換は、コレステロールの細胞中への再進入を防止し、正味の結果は、コレステロールが細胞から除去されるということである。
【００１６】
ＡｐｏＡＩ−ＨＤＬ画分（すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉを含み、ＡｐｏＡ−ＩＩを含まない）中の成熟ＨＤＬ粒子中のコレステリルエステルは肝臓により除去され、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−ＩＩの両方を含むＨＤＬ（ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ画分）から誘導されるものよりも効率的に胆汁中にプロセッシングされる。これは、部分的には、肝細胞膜へのＡｐｏＡＩ−ＨＤＬのより効率的な結合に負うものであり得る。ＨＤＬ受容体の存在が仮定されており、スカベンジャー受容体、クラスＢ、Ｉ型（ＳＲ−ＢＩ）がＨＤＬ受容体として同定されている（Actonら、1996、Science 271 :518-20; Xuら、1997、Lipid Res. 38: 1289-98）。ＳＲ−ＢＩは、ステロイド産生組織（例えば、副腎）および肝臓中で最も豊富に発現される（Landschulzら、1996、J. Clin. Invest. 98:984-95; Rigottiら、1996、J. Biol. Chem. 271 :33545-49）。ＨＤＬ受容体の概説については、Broutinら、1988、Anal. Biol. Chem. 46: 16-23を参照されたい。
【００１７】
ＡＴＰ結合カセット輸送因子ＡＩによる初期の脂質化は、血漿ＨＤＬ形成およびコレステロール流出を生じさせるプレ−β−ＨＤＬ粒子の能力にとって重要であると考えられる（LeeおよびParks、2005、Curr. Opin. Lipidol. 16(1): 19-25）。これらの著者らによれば、この初期の脂質化は、プレ−β−ＨＤＬがコレステロール受容器としてより効率的に機能するのを可能にし、ＡｐｏＡ−Ｉが元々存在する血漿ＨＤＬ粒子と迅速に結合するのを防止し、コレステロール流出のためのプレ−β−ＨＤＬ粒子のより高い利用可能性をもたらす。
【００１８】
ＣＥＴＰは、ＲＣＴにおいても役割を果たし得る。ＣＥＴＰ活性またはその受容器であるＶＬＤＬおよびＬＤＬにおける変化は、ＨＤＬ集団を「再モデリング」するのに役割を果たす。例えば、ＣＥＴＰの非存在下では、ＨＤＬは拡大された粒子になり、消失しない（ＲＣＴおよびＨＤＬの概説については、FieldingおよびFielding、1995、J. Lipid Res. 36:211-28; Barransら、1996、Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85; Hiranoら、1997、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6): 1053-59を参照されたい）。
【００１９】
ＨＤＬはまた、他の脂質および非極性分子の逆輸送において、ならびに解毒、すなわち、異化および排出のための肝臓への細胞、器官および組織からの脂質の輸送において役割を果たす。そのような脂質としては、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、酸化された脂質、およびリゾホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、RobinsおよびFasulo（1997、J. Clin. Invest. 99:380-84）は、ＨＤＬが肝臓による胆汁分泌物への植物ステロールの輸送を刺激することを示した。
【００２０】
ＨＤＬの主要な成分であるＡｐｏＡ−Ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＭと結合し得る。ウシ脳ＳＭ（ＢＢＳＭ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｐｏＡ−Ｉを再構成させた場合、再構成の最大速度は２８℃で起こり、その温度はＢＢＳＭの相転移温度に近い（Swaney、1983、J. Biol. Chem. 258(2)、1254-59）。７．５：１以下（ｗｔ／ｗｔ）のＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉ比では、１個の粒子あたり３個のＡｐｏＡ−Ｉ分子を含み、３６０：１のＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉモル比を有する単一の再構成された均一なＨＤＬ粒子が形成される。それは、電子顕微鏡中では、高い比率のリン脂質／タンパク質でのＡｐｏＡ−Ｉのホスファチジルコリンによる組換えにより得られたものと類似する円盤状複合体として出現する。しかしながら、１５：１（ｗｔ／ｗｔ）のＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉ比では、より高いリン脂質：タンパク質モル比（５３５：１）を有する、より大きい直径の円盤状複合体が形成される。これらの複合体は、ホスファチジルコリンと共に形成されたＡｐｏＡ−Ｉ複合体よりも有意に大きく、より安定であり、変性に対してより耐性が高い。
【００２１】
スフィンゴミエリン（ＳＭ）は早期コレステロール受容器（プレ−β−ＨＤＬおよびγ−移住ＡｐｏＥ含有リポタンパク質）中で上昇し、これはＳＭが、これらの粒子がコレステロール流出を促進する能力を増強することができることを示唆している（DassおよびJessup、2000、J. Pharm. Pharmacol. 52:731-61; Huangら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1834-38; FieldingおよびFielding 1995、J. Lipid Res. 36:211-28）。
【００２２】
３．３．ＨＤＬおよびＡｐｏＡ−Ｉの防御機構
ＨＤＬの防御機構の研究は、ＨＤＬの主成分であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）に焦点を当ててきた。ＡｐｏＡ−Ｉの高い血漿レベルは、冠動脈病変の非存在または減少と関連する（Maciejkoら、1983、N. Engl. J. Med. 309:385-89; Sedlisら、1986、Circulation 73:978-84）。
【００２３】
実験動物におけるＡｐｏＡ−ＩまたはＨＤＬの注入は、有意な生化学的変化を示し、ならびにアテローム性動脈硬化病変の程度および重篤度を低下させる。MaciejkoおよびMao (1982、Arteriosclerosis 2:407a)による初期の報告の後、Badimonら(1989、Lab. Invest. 60:455-61; 1989、J. Clin. Invest. 85: 1234-41)は、ＨＤＬ（ｄ＝１．０６３〜１．３２５ｇ／ｍｌ）を注入することにより、コレステロール給餌ウサギにおいて、アテローム性動脈硬化病変の程度（４５％の減少）およびそのコレステロールエステル含量（５８．５％の減少）を有意に低下させることができることを見出した。彼らはまた、ＨＤＬの注入が確立された病変の５０％に近い退縮をもたらすことも見出した。Esperら（1987、Arteriosclerosis 7:523a）は、ＨＤＬの注入が、初期の動脈病変を生じる遺伝性高コレステロール血症を有するＷａｔａｎａｂｅウサギの血漿リポタンパク質組成を顕著に変化させ得ることを示した。これらのウサギにおいては、ＨＤＬ注入量は、防御的ＨＤＬと動脈硬化性ＬＤＬとの比の２倍を超えるものであってよい。
【００２４】
動物モデルにおける動脈疾患を防止するＨＤＬの能力は、ＡｐｏＡ−Ｉがｉｎ  ｖｉｔｒｏで線維素溶解活性を示し得るという観察によってさらに裏付けられた（Sakuら、1985、Thromb. Res. 39: 1-8）。Ronneberger（1987、Xth Int. Congr. Pharmacol.、Sydney、990）は、ＡｐｏＡ−Ｉがビーグル犬およびカニクイザルにおいて線維素溶解を増加させ得ることを実証した。同様の活性はヒト血漿においてもｉｎ  ｖｉｔｒｏで指摘することができる。Ronnebergerは、ＡｐｏＡ−Ｉで処理された動物における脂質沈着および動脈プラーク形成の減少を確認することができた。
【００２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究は、ＡｐｏＡ−Ｉとレシチンとの複合体が、培養された動脈平滑筋細胞からの遊離コレステロールの流出を促進することができることを示唆している（Steinら、1975、Biochem. Biophys. Acta、380: 106-18）。この機構により、ＨＤＬはこれらの細胞の増殖も低下させることができる（Yoshidaら、1984、Exp. Mol Pathol. 41 :258-66）。
【００２６】
ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉ模倣ペプチドを含むＨＤＬを用いる注入療法もまた、ＡＢＣ１輸送因子による血漿ＨＤＬレベルを調節し、心血管疾患の治療における有効性をもたらすことが示されている（例えば、Brewerら、2004、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24: 1755-1760を参照されたい）。
【００２７】
アルギニン残基がシステインで置換された、ＡｐｏＡ−Ｉの２つの天然のヒト多型が単離されている。アポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）においては、この置換は残基１７３で起こるが、アポリポタンパク質Ａ−ＩＰａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）においては、この置換は残基１５１で起こる（Franceschiniら、1980、J. Clin. Invest. 66:892-900; Weisgraberら、1983、J. Biol. Chem. 258:2508-13; Bruckertら、1997、Atherosclerosis 128: 121-28; Daumら、1999、J. Mol. Med. 77:614-22; Klonら、2000、Biophys. J. 79(3): 1679-85）。さらに、位置１４４でロイシンがアルギニンで置換された、ＡｐｏＡ−Ｉのさらなる天然のヒト多型が単離されている。この多型はアポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｚａｒａｇｏｚａ（ＡｐｏＡ−Ｉｚ）と呼ばれており、重症低αリポタンパク血症および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）逆コレステロール輸送の増強された効果と関連する（Recaldeら、2001、Atherosclerosis 154(3):613-623; Fiddymentら、2011、Protein Expr. Purif. 80(1): 110-116）。
【００２８】
ＡｐｏＡ−ＩＭまたはＡｐｏＡ−ＩＰのジスルフィド結合ホモ二量体を含む再構成されたＨＤＬ粒子は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）乳濁液を消失させる能力およびコレステロール流出を促進する能力において野生型ＡｐｏＡ−Ｉを含む再構成されたＨＤＬ粒子と類似する（Calabresiら、1997b、Biochemistry 36: 12428-33; Franceschiniら、1999、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19: 1257-62; Daumら、1999、J. Mol. Med. 77:614-22）。両突然変異において、ヘテロ接合性個体はＨＤＬのレベルが低下しているが、逆説的であるが、アテローム性動脈硬化症のリスクが低い（Franceschiniら、1980、J. Clin. Invest. 66:892-900; Weisgraberら、1983、J. Biol. Chem. 258:2508-13; Bruckertら、1997、Atherosclerosis 128: 121-28）。いずれかの変異体を含む再構成されたＨＤＬ粒子はＬＣＡＴを活性化することができるが、野生型ＡｐｏＡ−Ｉを含む再構成されたＨＤＬ粒子と比較した場合、その効率は低い（Calabresiら、1997、Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:345-49; Daumら、1999、J. Mol. Med. 77:614-22）。
【００２９】
ＡｐｏＡ−ＩＭ突然変異は常染色体優性形質として伝達される；ファミリー内で８世代のキャリアが同定されている（Gualandriら、1984、Am. J. Hum. Genet. 37: 1083-97）。ＡｐｏＡ−ＩＭキャリア個体の状態は、ＨＤＬコレステロールレベルの顕著な低下を特徴とする。これにもかかわらず、キャリア個体は動脈疾患のいかなる高リスクも見かけ上示さない。実際、家系記録の調査により、これらの対象がアテローム性動脈硬化症から「防御」され得ると考えられる（Sirtoriら、2001、Circulation, 103: 1949-1954; Romaら、1993、J. Clin. Invest. 91(4): 1445-520）。
【００３０】
前記突然変異のキャリアにおけるＡｐｏＡ−ＩＭの可能な防御効果の機構は、１個のα−へリックスの喪失および疎水性残基の露出の増加と共に、ＡｐｏＡ−ＩＭ突然変異体の構造の改変と関連すると考えられる（Franceschiniら、1985、J. Biol. Chem. 260: 1632-35）。複数のα−へリックスの緊密な構造の喪失は、通常のＡｐｏＡ−Ｉと比較して、分子の可撓性の増加をもたらし、より容易に脂質と結合する。さらに、リポタンパク質複合体は、変性をより受けやすく、かくして、この突然変異体の場合、脂質送達も改善されることを示唆している。
【００３１】
Bielickiら（1997、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17 (9): 1637-43）は、ＡｐｏＡ−ＩＭが野生型ＡｐｏＡ−Ｉと比較して膜コレステロールを動員する限られた能力を有することを実証した。さらに、ＡｐｏＡ−ＩＭの膜脂質との結合により形成された新生ＨＤＬは、野生型ＡｐｏＡ−Ｉにより形成されるより大きい９および１１ｎｍの複合体よりもむしろ、主に７．４ｎｍの粒子であった。これらの観察は、ＡｐｏＡ−Ｉ一次配列中のＡｒｇ１７３→Ｃｙｓ１７３置換が、細胞コレステロール動員および新生ＨＤＬ集合の正常なプロセスを阻害したことを示している。この突然変異は、細胞からのコレステロール除去の効率の低下と見かけ上関連する。従って、その抗動脈硬化特性は、ＲＣＴと関連しなくてもよい。
【００３２】
Ａｒｇ１７３→Ｃｙｓ１７３置換に起因する最も著しい構造的変化は、ＡｐｏＡ−ＩＭの二量体化である（Bielickiら、1997、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17 (9): 1637-43）。ＡｐｏＡ−ＩＭは、それ自身とホモ二量体を形成し、ＡｐｏＡ−ＩＩとヘテロ二量体を形成することができる。アポリポタンパク質の混合物を含む血液画分の研究は、循環中の二量体および複合体の存在がアポリポタンパク質の消失半減期の増加の原因となり得ることを示唆している。そのような消失半減期の増加は、前記突然変異のキャリアの臨床研究において観察された（Greggら、1988、NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression、Limone SG）。他の研究は、ＡｐｏＡ−ＩＭ二量体（ＡｐｏＡ−ＩＭ／ＡｐｏＡ−ＩＭ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＤＬ粒子の相互変換における阻害因子として作用することを示唆している（Franceschiniら、1990、J. Biol. Chem. 265: 12224-31）。
【００３３】
３．４．脂質異常症および関連障害のための現在の治療
脂質異常障害は、血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルの上昇ならびに血清ＨＤＬ：ＬＤＬ比の低下と関連する疾患であり、高脂血症、特に、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲の疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患が挙げられる。動脈不全により引き起こされる、一過性虚血発作または間欠性跛行などのアテローム性動脈硬化症と関連する症候群も含まれる。脂質異常障害と関連する上昇した血清コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるためにいくつかの治療が現在利用可能である。しかしながら、有効性、副作用および患者集団の適格性の点で、それぞれはそれ自身の欠点および限界を有する。
【００３４】
胆汁酸結合樹脂は、腸から肝臓への胆汁酸の再利用を遮断する薬剤のクラスである；例えば、コレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ  Ｌｉｇｈｔ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、コレスチポール塩酸塩（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）、Ｔｈｅ  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、およびコレセベラム塩酸塩（Ｗｅｌｃｈｏｌ（登録商標）、Ｄａｉｉｃｈｉ−Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。経口摂取した場合、これらの正に荷電した樹脂は腸において負に荷電した胆汁酸に結合する。この樹脂は腸から吸収されないため、それらはそれらと共に胆汁酸を担持して排出される。しかしながら、そのような樹脂の最良の使用でも、血清コレステロールレベルを約２０％低下させるに過ぎず、便秘および特定のビタミン欠乏などの胃腸副作用を伴う。さらに、前記樹脂は他の薬剤に結合するため、他の経口薬剤は樹脂の摂取の少なくとも１時間前またはその４〜６時間後に摂取しなければならない；かくして、心臓患者の薬剤レジメンを複雑にする。
【００３５】
スタチンは、コレステロール生合成経路に関与する鍵となる酵素であるＨＭＧＣｏＡ還元酵素を阻害することにより、コレステロール合成を遮断するコレステロール低下剤である。スタチン、例えば、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標））、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標））、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標））、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））およびアトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標））は、胆汁酸結合樹脂と共に用いられることがある。スタチンは、血清コレステロールおよびＬＤＬ−血清レベルを有意に低下させ、冠動脈アテローム性動脈硬化症の進行を遅延させる。しかしながら、血清ＨＤＬコレステロールレベルは中程度にのみ増加する。ＬＤＬ低下効果の機構は、ＶＬＤＬ濃度の低下と、ＬＤＬ−受容体の細胞発現の誘導との両方を含み、ＬＤＬの産生の低下および／またはその異化の増加を誘導し得る。肝臓および腎臓の機能障害などの副作用は、これらの薬剤の使用と関連する（The Physicians Desk Reference、第56版、2002、Medical Economics）。
【００３６】
ナイアシン（ニコチン酸）は、栄養補助食品および抗高脂血症剤として用いられる水溶性ビタミンＢ複合体である。ナイアシンはＶＬＤＬの産生を減少させ、ＬＤＬを低下させるのに有効である。いくつかの場合、それは胆汁酸結合樹脂と共に用いられる。ナイアシンは、十分な用量で用いた場合にはＨＤＬを増加させることができるが、そのような高用量で用いた場合、重篤な副作用によってその有用性は限られる。Ｎｉａｓｐａｎ（登録商標）は、純粋なナイアシンよりも副作用の少ない長期放出型のナイアシンである。ナイアシン／ロバスタチン（Ｎｉｃｏｓｔａｔｉｎ（登録商標））は、ナイアシンとロバスタチンの両方を含有する製剤であり、それぞれの薬剤の利益を組み合わせたものである。
【００３７】
フィブラートは、高コレステロール血症とも関連し得る様々な形態の高脂血症（すなわち、血清トリグリセリドの上昇）を治療するために用いられる脂質低下薬のクラスである。フィブラートは、ＶＬＤＬ画分を減少させ、ＨＤＬを穏やかに増加させると考えられるが、血清コレステロールに対するこれらの薬剤の効果は変動する。米国では、クロフィブラート（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（Ｔｒｉｃｏｔ（登録商標））およびベザフィブラート（Ｂｅｚａｌｉｐ（登録商標））などのフィブラートが、抗高脂血症薬としての使用について認可されているが、高コレステロール血症剤としての認可は受けていない。例えば、クロフィブラートは、ＶＬＤＬ画分を減少させることにより血清トリグリセリドを低下させるように作用する（未知の機構を介する）抗高脂血症剤である。特定の患者サブ集団中では血清コレステロールを低下させることができるが、薬剤に対する生化学的応答は変動し、どの患者が好ましい結果を得るかを常に予測できるわけではない。Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標）は、冠動脈心疾患の予防にとって有効であるとは示されていない。化学的および薬学的に関連する薬剤であるゲンフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ（登録商標））は、血清トリグリセリドおよびＶＬＤＬコレステロールを中程度に減少させ、ＨＤＬコレステロール−ＨＤＬ２およびＨＤＬ３サブ画分ならびにＡｐｏＡ−ＩとＡ−ＩＩの両方（すなわち、ＡＩ／ＡＭＴ−ＨＤＬ画分）を中程度に増加させる。しかしながら、脂質応答は、特に異なる患者集団の間では不均一である。さらに、存在する冠動脈心疾患の履歴または症状を有さない４０〜５５歳の男性患者においては、冠動脈心疾患の予防が観察されたが、これらの知見をどの程度他の患者集団（例えば、女性、より高齢者およびより若年者の男性）に外挿することができるかは明らかではない。実際、確立された冠動脈心疾患を有する患者においては、有効性が観察されなかった。悪性腫瘍（特に、胃腸癌）などの毒性、胆嚢疾患および非冠動脈性死亡の発生の増加などの重篤な副作用が、フィブラートの使用と関連する。
【００３８】
経口エストロゲン補充療法が、閉経後の女性における中程度の高コレステロール血症にとって考えられる。しかしながら、ＨＤＬの増加は、トリグリセリドの増加を伴うことがある。エストロゲン治療は勿論、特定の患者集団（閉経後の女性）に限られ、悪性新生物、胆嚢疾患、血栓塞栓症、肝細胞腺腫、血圧上昇、耐糖能異常、および高カルシウム血症の誘導などの重篤な副作用と関連する。
【００３９】
高脂血症の治療にとって有用な他の薬剤としては、コレステロール吸収を遮断または阻害するエゼチミブ（Ｚｅｔｉａ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。しかしながら、エゼチミブの阻害剤は、特定の毒性を示すことが示されている。
【００４０】
ＨＤＬ、およびリン脂質と複合体化した組換え形態のＡｐｏＡ−Ｉは、非極性または両親媒性分子、例えば、コレステロールおよび誘導体（オキシステロール、酸化ステロール、植物ステロールなど）、コレステロールエステル、リン脂質および誘導体（酸化リン脂質）、トリグリセリド、酸化生成物、およびリポ多糖（ＬＰＳ）のためのシンク(sink)／スカベンジャーとして役立ち得る（例えば、Casasら、1995、J. Surg. Res. Nov 59(5):544-52を参照されたい）。ＨＤＬはまた、ＴＮＦ−αおよび他のリンホカインのためのスカベンジャーとしても役立ち得る。ＨＤＬはまた、ヒト血清パラオキソナーゼ、例えば、ＰＯＮ−１、−２、−３のための担体としても役立ち得る。パラオキソナーゼは、ＨＤＬと結合したエステラーゼであり、酸化に対して細胞成分を保護するのに重要である。酸化的ストレスの間に起こるＬＤＬの酸化は、アテローム性動脈硬化症の発症と直接関連すると考えられる（Aviram, 2000、Free Radic. Res. 33 Suppl:S85-97）。パラオキソナーゼは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患に対する罹患性において役割を果たすと考えられる（Aviram、1999、Mol. Med. Today 5(9):381-86）。ヒト血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に結合する。その活性は、アテローム性動脈硬化症と逆相関する。ＰＯＮ−１は有機リン酸エステルを加水分解し、ＨＤＬおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化の阻害によってアテローム性動脈硬化症に対して保護することができる（Aviram、1999、Mol. Med. Today 5(9):381-86）。実験研究は、この保護が酸化されたリポタンパク質中の特定の脂質過酸化物を加水分解するＰＯＮ−１の能力と関連することを示唆している。ＰＯＮ−１活性を保存するか、または増強する介入は、アテローム性動脈硬化症および冠動脈心疾患の開始を遅延させるのに役立ち得る。
【００４１】
ＨＤＬはさらに、抗血栓剤およびフィブリノゲン低下剤として、ならびに出血性ショックにおける薬剤としての役割を有する（Cockerillら、２００１年３月１日に公開されたＷＯ０１／１３９３９）。ＨＤＬ、および特にＡｐｏＡ−Ｉは、敗血症によって産生されたリポ多糖の、ＡｐｏＡ−Ｉを含む脂質粒子への交換を容易にし、リポ多糖の機能的中和をもたらすことが示されている（Wrightら、１９９５年１２月２１日に公開されたＷＯ９５３４２８９; Wrightら、１９９９年７月２７日に発行された米国特許第５，９２８，６２４号; Wrightら、１９９９年８月３日に発行された米国特許第５，９３２，５３６号）。
【００４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリポタンパク質複合体を作製するために利用可能な様々な方法が存在する。米国特許第６，２８７，５９０号および第６，４５５，０８８号は、有機溶媒（または溶媒混合物）中でのアポリポタンパク質と脂質溶液との同時凍結乾燥および凍結乾燥粉末の水和中の荷電リポタンパク質複合体の形成を必要とする方法を開示する。リポタンパク質複合体を、洗剤透析法により形成させることもできる；例えば、脂質、リポタンパク質およびコール酸塩などの洗剤の混合物を透析し、再構成させて複合体を形成させる（例えば、Jonasら、1986、Methods Enzymol. 128:553-82を参照されたい）。米国特許出願公開第２００４／００６７８７３号の実施例１は、ミセルを形成するための条件下で脂質分散物をコール酸塩と合わせ、次いでこれらをアポリポタンパク質溶液と共にインキュベートして複合体を形成させる、コール酸塩分散法を開示する。究極的には、毒性であるコール酸塩は、例えば、透析、限外濾過またはアフィニティビーズもしくは樹脂上への吸着吸収により除去しなければならない。米国特許第６，３０６，４３３号は、タンパク質と脂質との液体混合物を高圧均一化にかけることによるリポタンパク質複合体形成を開示する。しかしながら、高い剪断力に対して感受性が高いタンパク質は、高圧均一化に曝露した場合、活性を喪失し得る。
【００４３】
かくして、現在利用可能な製造方法は、タンパク質分解物などの、出発材料の廃棄物をもたらし、および／または毒性因子の除去などの、得られる生成物の精製を必要とし、かくして、非効率的であり、費用が高い。さらに、リポタンパク質複合体の調製物は不均一であってよく、サイズおよび組成が変化する複合体の混合物を含有する。例えば、米国特許第５，８７６，９６８号を参照されたい。従って、効率的であり、好ましくは高い純度を有するより均一な複合体が得られる、リポタンパク質複合体の新しい製造方法を開発する必要がある。そのようなプロセスは、汚染物質に起因する副作用のリスクがより少ない、より均一な薬学的に許容される生成物を生成しながら、大規模でのより経済的な製造を可能にする。
【００４４】
さらに、しかしながら、全体の製造収率が低いこと、および組換え発現されたタンパク質の培養物においてタンパク質分解が発生することを考慮すれば、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＰおよび他の変異体、ならびに再構成されたＨＤＬの治療的使用は、治療的投与にとって必要とされる大量のアポリポタンパク質により、およびタンパク質の製造費用により現在限られている（例えば、Malloryら、1987、J. Biol. Chem. 262(9):4241-4247; Schmidtら、1997、Protein Expression & Purification 10:226-236を参照されたい）。心血管疾患の治療のためにはその用量範囲は注入１回あたり１．５〜４ｇのタンパク質であることが初期の臨床試験によって提言されている。完全な治療にとって必要とされる注入の回数は知られていない（例えば、Erikssonら、1999、Circulation 100(6):594-98; Carlson、1995、Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 5:85-91; Nanjeeら、2000、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20(9):2148-55; Nanjeeら、1999、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(4):979-89; Nanjeeら、1996、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(9): 1203-14を参照されたい）。
【００４５】
組換えヒトＡｐｏＡ−Ｉが異種宿主中で発現されているが、成熟タンパク質の収率は、特に、収率をさらに低下させ、不純な生成物をもたらす精製方法と対にした場合、大規模な治療適用にとっては不十分である。
【００４６】
Weinbergら、1988、J. Lipid Research 29:819-824は、逆相高速液体クロマトグラフィーによるヒト血漿から精製されたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩおよびＡ−ＩＶならびにそのアイソフォームの分離を記載している。
【００４７】
ＷＯ２００９／０２５７５４は、ヒト血漿からのα−１−抗トリプシンおよびＡｐｏＡ−Ｉのタンパク質分離および精製を記載している。
【００４８】
Hunterら、2009、Biotechnol. Prog. 25(2):446-453は、大腸菌(E.coli)中で組換え発現されたＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏ変異体の大規模精製を記載している。
【００４９】
Caparonら、2009、Biotechnol. And Bioeng. 105(2):239-249は、精製アポリポタンパク質産物中の２つの宿主細胞タンパク質のレベルを低下させるためにこれらのタンパク質を欠失するように遺伝子操作された大腸菌(E.coli)宿主からのＡｐｏＡ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏの発現および精製を記載している。
【００５０】
米国特許第６，０９０，９２１号は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたＡｐｏＡ−Ｉおよびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を含有するヒト血漿の画分からのＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＥの精製を記載している。
【００５１】
Brewerら、1986、Meth. Enzymol. 128:223-246は、クロマトグラフィー技術を用いたヒト血液からのアポリポタンパク質の単離および特性評価を記載している。
【００５２】
Weisweilerら、1987、Clinica Chimica Acta 169:249-254は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いたヒトＨＤＬからのＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩの単離を記載している。
【００５３】
deSilvaら、1990、J. Biol. Chem. 265(24): 14292-14297は、免疫アフィニティクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーによるアポリポタンパク質Ｊの精製を記載している。
【００５４】
リポタンパク質療法の実現可能性を確立する様々なリポタンパク質に基づく薬剤を用いる臨床研究と共に、リポタンパク質およびリポタンパク質複合体が臨床的使用のために現在開発されている（Tardif、2010、Journal of Clinical Lipidology 4:399-404）。ある研究は、自己脱脂質化ＨＤＬを評価した（Waksmanら、2010、J Am. Coll. Cardiol. 55:2727-2735）。別の研究は、組換えＡｐｏＡ−ＩＭとパルミトイル−オレオイル−ＰＣ（ＰＯＰＣ）との複合体であるＥＴＣ−２１６を評価した（Nissenら、2003、JAMA 290:2292-2300）。ＣＳＬ−１１１は、大豆ホスファチジルコリン（ＳＢＰＣ）と複合体化した、血漿から精製された再構成されたヒトＡｐｏＡ−Ｉである（Tardifら、2007、JAMA 297:1675-1682）。現在の探索薬剤は、アテローム性動脈硬化プラークの減少において有効性を示しているが、その効果は、トランスアミナーゼの増加またはＡｐｏＡ−Ｉ抗体の形成などの二次的効果を伴った（Nanjeeら、1999、Arterioscler. Vasc. Throm. Biol. 19:979-89; Nissenら、2003、JAMA 290:2292-2300; Spiekerら、2002、Circulation 105: 1399-1402; Nieuwdorpら、2004、Diabetologia 51 : 1081-4; Drewら、2009、Circulation 119、2103-11; Shawら、2008、Circ. Res. 103: 1084-91; Tardiffら、2007、JAMA 297: 1675-1682; Waksman, 2008、Circulation 118:S 371; Cho、２００７年９月２５日に発行された米国特許第７，２７３，８４９Ｂ２号）。例えば、ＥＲＡＳＥ臨床試験（Tardiffら、2007、JAMA 297: 1675-1682）は、２つの用量のＣＳＬ−１１１：４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉを用いた。８０ｍｇ／ｋｇ用量群は、肝臓毒性のため停止しなければならなかった（重篤なトランスアミナーゼ上昇により示される）。４０ｍｇ／ｋｇ用量群においても、数人の患者はトランスアミナーゼ上昇を経験する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５５】
従って、血清コレステロールの低下、ＨＤＬ血清レベルの増加、脂質異常症ならびに／または脂質異常症と関連する疾患、状態および／もしくは障害の予防および／または治療においてより有効であるより安全な薬剤が必要である。肝臓毒性と関連せず、好ましくは、トリグリセリド、ＬＤＬ−トリグリセリドまたはＶＬＤＬ−トリグリセリドの最少の増加のみを誘導する（または全く誘導しない）リポタンパク質製剤、ならびに商業規模でこれらのリポタンパク質製剤を確実に作製するのに用いることができる着実な製造方法が当技術分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【００５６】
４．概要
本開示は、脂質異常症ならびに脂質異常症と関連する疾患、障害および／または状態を治療および／または予防するのに特に適した、タンパク質画分（例えば、アポリポタンパク質画分）と脂質画分とを含むリポタンパク質複合体、およびその集団を提供する。より高い純度および／もしくは均一性を有し、ならびに／または本明細書に記載のように特定の比率の脂質およびタンパク質を含む複合体の集団が、副作用のリスクの低下と共に、コレステロールを移動させる能力が増加していることが発見された。
【００５７】
リポタンパク質複合体は、タンパク質画分（例えば、アポリポタンパク質画分）および脂質画分（例えば、リン脂質画分）を含む。タンパク質画分は、１つまたは複数の脂質結合タンパク質、例えば、アポリポタンパク質、ペプチド、またはリポタンパク質複合体中に存在する場合にコレステロールを移動させることができるアポリポタンパク質ペプチド類似体もしくは模倣体を含む。そのようなアポリポタンパク質およびアポリポタンパク質ペプチドの非限定例としては、プレプロアポリタンパク質(preproapoliprotein)、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ、プロＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＩ、プロＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＶ、プロＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、プレプロＡｐｏＥ、プロＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＭ、プロＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＭ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＰ、プロＡｐｏＡ−ＩＰ、ＡｐｏＡ−ＩＰ、プレプロＡｐｏＡ−Ｉｚ、プロＡｐｏＡ−ＩｚおよびＡｐｏＡ−Ｉｚが挙げられる。アポリポタンパク質は、単量体、二量体、もしくは三量体、またはその混合物の形態にあってよい。特定の実施形態においては、アポリポタンパク質画分は本質的に、最も好ましくは単一のアイソフォームのＡｐｏＡ−Ｉからなる。リポタンパク質複合体中のＡｐｏＡ−Ｉは、配列番号１のアミノ酸２５〜２６７に対応するタンパク質に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有してもよい。場合により、ＡｐｏＡ−Ｉは、配列番号１のアミノ酸２５（および成熟タンパク質の１位）の完全長ＡｐｏＡ−Ｉに対応する位置にアスパラギン酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のＡｐｏＡ−Ｉが正確にプロセッシングされた成熟タンパク質（すなわち、シグナルおよびプロペプチド配列を欠く）であり、酸化、脱アミド化および／またはトランケートされていない。
【００５８】
本開示はまた、ＡｐｏＡ−Ｉを発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞、ＡｐｏＡ−Ｉを含む細胞培養物、および成熟した生物学的に活性なＡｐｏＡ−Ｉを製造する方法も提供する。未熟なＡｐｏＡ−Ｉ（プロＡｐｏＡ−Ｉ）と、プロテアーゼ分解により生成されたトランケート型のＡｐｏＡ−Ｉとの両方を実質的に含まない大量の成熟ＡｐｏＡ−Ｉを発現するように哺乳動物宿主細胞を遺伝子操作することができることが発見された。これらの結果は驚くべきことである。第１に、タンパク質プロセッシングのための宿主細胞機構は、ＡｐｏＡ−Ｉなどの異種タンパク質の過剰発現によって圧倒され、プロセッシングされていない未熟なタンパク質の産生をもたらすと予想される。第２に、培養培地中に分泌されたＡｐｏＡ−Ｉは、プロテアーゼによる分解を受け、さらに低レベルのトランケートされたＡｐｏＡ−Ｉだけが培養培地中に観察される。哺乳動物宿主細胞、細胞培養物およびＡｐｏＡ−Ｉを製造する方法は、商業的に関連する量の、治療適用において有用な成熟タンパク質の製造に特に適している。
【００５９】
本明細書に提供される通り、哺乳動物宿主細胞は、好ましくは、配列番号１の２５〜２６７位に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）タンパク質を発現するように遺伝子操作される。このタンパク質は、好ましくは、配列番号１の２５位に対応する位置にアスパラギン酸残基を有する。哺乳動物宿主細胞は、場合により、そのようなタンパク質をさらに分泌することができる。いくつかの例においては、前記哺乳動物宿主細胞により発現および／または分泌されたタンパク質は、１８アミノ酸のシグナル配列（ＭＫＡＡＶＬＴＬＡＶＬＦＬＴＧＳＱＡ、配列番号２）および／または６アミノ酸のプロペプチド配列（ＲＨＦＷＱＱ、配列番号３）をさらに含んでもよい。いくつかの例においては、宿主細胞は、配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を発現するように遺伝子操作される。
【００６０】
宿主細胞は、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１もしくはＣＨＯ−Ｓ）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＢＨＫ５７０、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＰＣ１２およびＷ１３８などの任意の哺乳動物細胞系に由来するか、またはミエローマ細胞もしくは細胞系（例えば、マウスミエローマ細胞もしくは細胞系）に由来するものであってよい。
【００６１】
哺乳動物宿主細胞は、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質、例えば、配列番号１の２５〜２６７位を含むか、またはそれからなるタンパク質をコードする複数コピーの核酸をさらに含んでもよい。例えば、哺乳動物宿主細胞は、少なくとも約５、６、７、８以上のコピー、および最大で約１０、１１、１２、１３または１４コピーの核酸を含んでもよい。この核酸をさらに、哺乳動物宿主細胞中で高レベルでタンパク質を発現させることができるプロモーター、例えば、サルサイトメガロウイルスプロモーターまたはより具体的には、極初期サルサイトメガロウイルスプロモーターなどに機能し得る形で連結することができる。
【００６２】
哺乳動物宿主細胞は、好ましくは、培養物中で少なくとも約０．５、１、２もしくは３ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉおよび／または培養物中で最大で約２０ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉ、例えば、培養物中で最大で４、５、６、７、８、９、１０、１２もしくは１５ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉを産生することができる。この培養物は、約１５０ｍＬ〜約５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２５，０００Ｌまたは５０，０００Ｌ以上の範囲の任意の規模のものであってよい。様々な実施形態においては、培養容量は、１０Ｌ〜５０Ｌ、５０Ｌ〜１００Ｌ、１００Ｌ〜１５０Ｌ、１５０Ｌ〜２００Ｌ、２００Ｌ〜３００Ｌ、３００Ｌ〜５００Ｌ、５００Ｌ〜１０００Ｌ、１０００Ｌ〜１５００Ｌ、１５００Ｌ〜２０００Ｌ、２０００Ｌ〜３０００Ｌ、３０００Ｌ〜５０００Ｌ、５０００Ｌ〜７５００Ｌ、７５００Ｌ〜１０，０００Ｌ、１０，０００Ｌ〜２０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ〜４０，０００Ｌ、３０，０００Ｌ〜５０，０００Ｌの範囲であってよい。いくつかの例においては、培養物は大規模培養物、例えば、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、２５，０００Ｌ、最大で５０，０００Ｌ以上である。
【００６３】
本開示の哺乳動物宿主細胞を、培養物中で増殖させることができる。かくして、本開示は、上記の、または以下の第６．１．２節に記載の複数の哺乳動物宿主細胞を含む、哺乳動物細胞培養物をさらに提供する。この細胞培養物は、１または複数の下記特徴を含んでもよい：（ａ）培養物（場合により、少なくとも１０リットル、少なくとも２０リットル、少なくとも３０リットル、少なくとも５０リットル、少なくとも１００リットル、３００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、２５，０００Ｌ、最大で５０，０００Ｌの大規模バッチ式培養物または少なくとも１０リットル、少なくとも２０リットル、少なくとも３０リットル、少なくとも５０リットル、少なくとも１００リットル、３００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、もしくは最大で１０，０００Ｌの連続培養物である）が配列番号１のアミノ酸２５〜２６７に対応するアミノ配列(amino sequence)を含むか、またはそれからなる、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｇ／Ｌ以上の成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を含む；（ｂ）培養培地中の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のタンパク質が、シグナル配列を欠くＡｐｏＡ−Ｉタンパク質である；（ｃ）培養培地中の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のタンパク質が、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠く成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質である；ならびに（ｄ）成熟ＡｐｏＡ−Ｉの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％がトランケート、酸化、または脱アミド化されていない。
【００６４】
本開示はまた、成熟した生物学的に活性なＡｐｏＡ−Ｉを製造する方法も提供する。一般的には、前記方法は、ＡｐｏＡ−Ｉが発現および分泌される条件下で、上記の、または第６．１．２節に記載の哺乳動物宿主細胞のいずれかを培養することを含む。この方法は、成熟した生物学的に活性なＡｐｏＡ−Ｉを、培養された哺乳動物宿主細胞の上清から回収するステップ、および場合により、精製するステップをさらに含んでもよい（以下の第６．１．３節および第６．１．４節に開示される方法によるなど）。
【００６５】
上記の方法により得られた、または得られるＡｐｏＡ−Ｉを、脂質とさらに複合体化させて、本明細書に記載のリポタンパク質複合体を形成させる、および／または治療上有効量の医薬組成物中に組み入れることができる。医薬組成物は、好ましくは、賦形剤としてスクロースおよび／またはマンニトールを含んでもよいリン酸緩衝溶液である。
【００６６】
クロマトグラフィーステップと濾過ステップとの新しい組合せを用いてＡｐｏＡ−Ｉを精製することにより、タンパク質を治療的使用にとって特に好適にする、副作用のリスクの低下および低いか、または全くない毒性などの１つまたは複数の属性を付与するのに十分に低いレベルの宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、内毒素およびトランケート型のタンパク質を含有する大量の純粋なＡｐｏＡ−Ｉを製造することができることをさらに発見した。好ましくは、本明細書に記載の方法により精製されたＡｐｏＡ−Ｉは、哺乳動物細胞中で組換え産生され、増殖培地中に分泌される。従って、本開示は、（ａ）ＡｐｏＡ−Ｉを含有する溶液と、陰イオン交換マトリックスとを、ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合しない条件下で接触させるステップ；（ｂ）ウイルスまたはウイルス粒子を除去するのに十分な孔径を有する膜を通して、ステップ（ａ）で得られたＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液を濾過するステップ；（ｃ）ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合するような条件下で、第１の逆相クロマトグラフィーカラムに、ステップ（ｂ）で得られた濾液を通過させるステップ；（ｄ）増加する濃度勾配の有機溶媒を用いて、第１の逆相クロマトグラフィーマトリックスから、第１のＡｐｏＡ−Ｉ含有逆相溶出液を溶出させるステップ；（ｅ）ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合するような条件下で、第２の逆相クロマトグラフィーカラムに、ステップ（ｄ）に由来する第１のＡｐｏＡ−Ｉ逆相溶出液を通過させるステップ；および（ｆ）増加する濃度勾配の有機溶媒を用いて、第２の逆相クロマトグラフィーマトリックスから、第２のＡｐｏＡ−Ｉ含有逆相溶出液を溶出させるステップを含む、ＡｐｏＡ−Ｉを精製する方法に関する。前記ステップを実施する順序は重要ではなく、例えば、例示的な実施形態においては、ウイルスまたはウイルス粒子を除去するために膜を通して濾過するステップは、ステップ（ａ）の後よりもむしろ、ステップ（ｆ）の後に実施される。
【００６７】
また、ＡｐｏＡ−Ｉの濃度が少なくとも１０ｇ／Ｌである本明細書に記載の精製方法によって得られた、または得られる実質的に純粋なＡｐｏＡ−Ｉ生成物も本明細書に提供される。本明細書に記載の精製方法によって製造された実質的に純粋なＡｐｏＡ−Ｉ生成物は、好ましくは、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ｍｇあたり約１０ｐｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ｍｇあたり約１００ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質、および／またはＡｐｏＡ−Ｉ  １ｍｇあたり０．１ＥＵ未満の内毒素を含む。ＡｐｏＡ−Ｉ生成物は、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋または少なくとも９９％純粋であってよい。
【００６８】
さらに、実質的に純粋なＡｐｏＡ−Ｉ生成物を、ＡｐｏＡ−Ｉを含む本明細書に記載の医薬組成物および／またはリポタンパク質複合体のいずれかに組み入れることができる。
【００６９】
脂質画分は、典型的には、中性の、負に荷電したもの、正に荷電したもの、またはその組合せであってもよい１つまたは複数のリン脂質を含む。リン脂質上の脂肪酸鎖は、好ましくは、１２〜２６個または１６〜２６個の炭素の長さであり、飽和からモノ不飽和まで、飽和度において異なっていてもよい。リン脂質の例としては、低分子アルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロールホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、ミルクスフィンゴミエリン、パルミトイルスフィンゴミエリン、フィトスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテルグリコリピド、およびコレステロールならびにその誘導体が挙げられる。ＳＭおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含むリン脂質画分は場合により、限定されるものではないが、リゾリン脂質、パルミトイルスフィンゴミエリン以外のスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、およびコレステロールならびにその誘導体などの、少量の任意の型の脂質を含んでもよい。
【００７０】
最も好ましくは、脂質画分は、少なくとも１つの中性リン脂質および場合により、１つまたは複数の負に荷電したリン脂質を含有する。中性リン脂質と負に荷電したリン脂質の両方を含むリポタンパク質複合体においては、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質は、同じか、または異なる数の炭素および同じか、または異なる飽和度を有する脂肪酸鎖を有してもよい。いくつかの例においては、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質は、同じアシル尾部、例えば、Ｃ１６：０、またはパルミトイル、アシル鎖を有する。
【００７１】
複合体の脂質成分が中性リン脂質および負に荷電したリン脂質を含むか、またはそれからなる場合、中性リン脂質と負に荷電したリン脂質の重量−重量（ｗｔ：ｗｔ）比は、好ましくは、約９９：１〜約９０：１０、より好ましくは、約９９：１〜約９５：５、および最も好ましくは、約９８：２〜約９６：４の範囲のｗｔ：ｗｔ比にある。一実施形態においては、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質は、約９７：３の中性リン脂質：負に荷電したリン脂質の重量−重量（ｗｔ：ｗｔ）比で存在する。
【００７２】
中性リン脂質は、天然のものであるか、または合成のものであってよい。好ましくは、リン脂質は、場合により、１６〜２６個の炭素原子の鎖長を有する飽和またはモノ不飽和脂肪酸を含む、スフィンゴミエリン（「ＳＭ」）、例えば、パルミトイルスフィンゴミエリン、フィトスフィンゴミエリン、ジフィトスフィンゴミエリン、ホスホスフィンゴ脂質、またはスフィンゴ糖脂質である。ＳＭは任意の供給源に由来するものであってよい。例えば、ＳＭは、ミルク、卵、脳から得るか、または合成的に作製することができる。特定の実施形態においては、ＳＭは鶏卵から得られる（「卵ＳＭ」）。別の特定の実施形態においては、ＳＭはパルミトイルスフィンゴミエリンである。
【００７３】
生理的ｐＨで少なくとも部分的負電荷を担持する任意のリン脂質を、負に荷電したリン脂質として用いることができる。非限定例としては、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジン酸の負に荷電した形態、例えば、塩が挙げられる。特定の実施形態においては、負に荷電したリン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、またはＤＰＰＧ、ホスファチジルグリセロールである。好ましい塩としては、カリウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。
【００７４】
本開示の複合体を製造するのに用いられるリン脂質は、好ましくは少なくとも９５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９９％純粋であり、および／または４ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ以下、より好ましくは３ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ以下（例えば、２ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ以下）の酸化レベルのレベル(levels of oxidation levels)を有する。酸素と脂肪酸との主要な初期反応生成物は、ヒドロペルオキシドである。ヨード還元滴定法を用いれば、試料中の過酸化物の存在をアッセイすることにより酸化レベルを測定することができる。
【００７５】
本開示のリポタンパク質複合体は、好ましくは、以下の実施例に示される通り、より完全で均一な複合体形成をもたらすアポリポタンパク質と脂質との比を有する。リポタンパク質複合体は、１：８０〜１：１２０、１：１００〜１：１１５、または１：１０５〜１：１１０の範囲のアポリポタンパク質画分：脂質画分のモル比を特徴とし、ここでアポリポタンパク質はＡｐｏＡ−Ｉ当量で表される。特定の実施形態においては、アポリポタンパク質画分：脂質画分のモル比は、１：８０〜１：９０（例えば、１：８２、１：８５または１：８７）、１：９０〜１：１００（例えば、１：９５または１：９８）、１：１００〜１：１１０（例えば、１：１０５または１：１０８）である。
【００７６】
特に卵ＳＭが中性脂質として用いられる特定の実施形態においては、アポリポタンパク質画分：脂質画分の重量比は、約１：２．７〜約１：３（例えば、１：２．７）の範囲である。
【００７７】
本開示のリポタンパク質複合体を、疎水性、親油性または非極性活性剤を送達するための担体として用いることもできる。そのような適用のために、脂質画分は、限定されるものではないが、脂肪酸、薬剤、核酸、ビタミンおよび／または栄養素などの１つまたは複数の疎水性、親油性または非極性活性剤をさらに含むか、またはリポタンパク質複合体に、それらのものをロードすることができる。活性剤の特定例は、第６．２節に記載される。
【００７８】
本開示はまた、リポタンパク質複合体の集団も提供する。典型的には、
・集団は、それぞれタンパク質画分と脂質画分とを含む、複数のリポタンパク質複合体を含有する；
・タンパク質画分は、上記の、および第６．１節または第６．５．３節に記載されるリポタンパク質またはリポタンパク質類似体を含有する；最も好ましくは、タンパク質画分は、第６．１．２節に記載の方法により得られたか、もしくは得られる、および／または第６．１．４節に記載の方法により精製されたリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質）を含むか、または本質的にそれからなる；
・脂質画分は、上記の、および第６．２節または第６．５．２節に記載の脂質を含む；
・リポタンパク質複合体は、好ましくは第６．５．４節に記載の熱サイクリング法により製造される。
【００７９】
本出願人は、リポタンパク質複合体集団の効力および安全性プロフィールに個別に、または組合わせて寄与すると考えられるいくつかの特徴を発見した。これらの特徴は、
・多くは４ｎｍ〜１５ｎｍ（例えば、５ｎｍ〜１２ｎｍ、６ｎｍ〜１５ｎｍ、または８ｎｍ〜１０ｎｍ）の範囲である、集団中の複合体のサイズの均一性；
・複合体を作製するのに用いられるアポリポタンパク質の純度（例えば、酸化、脱アミド化、トランケートされた、および／もしくは未熟な形態のアポリポタンパク質の欠如ならびに／または内毒素の欠如ならびに／またはアポリポタンパク質以外のタンパク質（宿主細胞タンパク質など）の欠如、ならびに／または組換え産物中に存在することが多い宿主細胞ＤＮＡ）；
・集団中の複合体自体の純度（複合体を調製するのに用いられる溶媒もしくは洗剤などの汚染物質の欠如；酸化脂質の欠如；脱アミド化、酸化もしくはトランケートされたタンパク質の欠如；ならびに／または少量の非複合体化アポリポタンパク質および／もしくは脂質またはそれらの欠如を特徴とする）
を含む。
【００８０】
これらの特徴のうち、複合体の均一性および複合体中の成熟した非改変アポリポタンパク質の優勢性は、効力を増加させると考えられる。アポリポタンパク質、脂質および複合体の純度は、肝臓酵素（例えば、トランスアミナーゼ）の増加により反映される肝臓損傷などの副作用のリスクを低下させる。さらに、本発明者らは、多くのアポリポタンパク質の複合体中への組込みをもたらす方法によりリポタンパク質複合体の集団を作製することを実現可能にし、非複合体化アポリポタンパク質の量の減少も、それが異種タンパク質の投与により引き起こされ得る被験体における免疫原性応答のリスクを低下させる点で有益である。
【００８１】
従って、本開示は、以下の特徴のうちの１つもしくは複数、またはさらには全部を特徴とするリポタンパク質複合体の集団を提供する：
（ａ）前記集団中のリポタンパク質、典型的には、ＡｐｏＡ−Ｉの少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％が、成熟形態にある；
（ｂ）前記集団中のリポタンパク質、典型的には、ＡｐｏＡ−Ｉの２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下が未熟形態にある；
（ｃ）前記集団が、リポタンパク質、典型的には、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、１００ピコグラム以下、５０ピコグラム以下、２５ピコグラム以下、１０ピコグラム以下または５ピコグラム以下の宿主細胞ＤＮＡを含有する；
（ｄ）前記集団が、リポタンパク質、典型的には、ＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、５００ナノグラム以下、２００ナノグラム以下、１００ナノグラム以下、５０ナノグラム以下、または２０ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質を含有する；
（ｅ）前記集団中のリポタンパク質、典型的には、ＡｐｏＡ−Ｉの２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下がトランケートされた形態にある；
（ｆ）リポタンパク質成分が成熟ＡｐｏＡ−Ｉを含むか、またはそれからなり、前記集団中の前記ＡｐｏＡ−Ｉ中のメチオニン１１２およびメチオニン１４８の各々の２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、２％以下または１％以下が酸化されている；
（ｇ）リポタンパク質複合体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、ゲル浸透クロマトグラフィー（「ＧＰＣ」）または動的光散乱（「ＤＬＳ」）により測定された場合、４ｎｍ〜１５ｎｍのサイズ、例えば、６ｎｍ〜１５ｎｍのサイズ、または８〜１２ｎｍのサイズ、さらにより好ましくは、５ｎｍ〜１２ｎｍのサイズの粒子の形態にある；
（ｉ）前記集団が、リポタンパク質、典型的にはＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、１ＥＵ以下、０．５ＥＵ以下、０．３ＥＵ以下または０．１ＥＵ以下の内毒素を含有する；
（ｊ）前記集団中のリポタンパク質、典型的にはＡｐｏＡ−Ｉ中のアミノ酸の１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下が脱アミド化されている；
（ｋ）前記複合体中の脂質画分中の脂質の１５重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、２重量％以下または０重量％がコレステロールである；
（ｌ）前記集団が２００ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ以下の非水性溶媒を含有する；
（ｍ）前記集団が洗剤（例えば、コール酸塩）を含有しない；
（ｎ）前記集団が、ゲル浸透クロマトグラフィー中の単一のピークにおける集団の百分率により測定された場合、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％均一であってよい；
（ｏ）前記集団が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％のタンパク質が複合体化された形態にある組成物中にある；
（ｐ）前記集団中の脂質の５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下が酸化されている；ならびに
（ｑ）前記集団中のメチオニンおよび／またはトリプトファン残基の１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下が酸化されている。
【００８２】
特定の実施形態においては、前記集団は、下記群から選択される特徴を有する：
Ｉ群：上記の特徴（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；
ＩＩ群：上記の特徴（ｃ）、（ｄ）および（ｉ）；
ＩＩＩ群：上記の特徴（ｆ）、（ｊ）、（ｅ）、（ｐ）および（ｑ）；
ＩＶ群：上記の特徴（ｇ）、（ｎ）および（ｏ）；
Ｖ群：上記の特徴（ｌ）および（ｍ）；ならびに
ＶＩ群：上記の特徴（ｋ）。
【００８３】
特定の態様においては、前記集団は、Ｉ群およびＩＶ群の各々から独立に選択される１または２つの特徴を特徴とする；場合により、前記集団は、Ｉ群およびＩＶ群の各々から独立に選択される３つの特徴を特徴とする。前記集団はさらに、ＩＩ群および／またはＩＩＩ群の各々から独立に選択される１、２または３つの特徴を特徴とする。前記集団はさらに、Ｖ群から独立に選択される１もしくは２つの特徴および／またはＶＩ群から独立に選択される１つの特徴を特徴とする。
【００８４】
特定の脂質およびタンパク質成分は、複数の異なるが均一なリポタンパク質複合体を形成することができる。従って、本開示はまた、異なる量のアポリポタンパク質分子を含むリポタンパク質複合体の２、３または４つの集団を含む組成物も提供する（例えば、２、３または４つのＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量）。例示的な実施形態においては、組成物は２つのリポタンパク質複合体集団を含み、それぞれ、第１の集団はリポタンパク質複合体あたり２個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含み、第２の集団はリポタンパク質複合体あたり３または４個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含み、場合により、第３の集団はリポプロタンパク質複合体あたり４または３個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含む。
【００８５】
リポタンパク質複合体の２つ以上の集団を含む組成物は、好ましくは、低レベルの非複合体化リポタンパク質および／または脂質を有する。従って、好ましくは、組成物中の脂質の１５％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下もしくは１％以下が非複合体化形態にあり、および／または組成物中のリポタンパク質の１５％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下もしくは１％以下が非複合体化形態にある。
【００８６】
本開示は、リポタンパク質複合体を作製するための方法を提供する。この方法は、特に、非複合体化脂質および脂質結合タンパク質またはペプチドを含有する懸濁液を熱サイクリング条件にかけることにより、リポタンパク質複合体が固定温度で成分をインキュベートすることにより製造されるなど、他の方法と比較して有利な結果と共にリポタンパク質複合体の形成が得られるという発見に基づくものである。
【００８７】
本開示は、第６．５．１〜６．５．４節に記載のものなどの、リポタンパク質複合体を調製するための熱サイクリング法を提供する。この方法は、典型的には、脂質粒子（「脂質成分」）および脂質結合タンパク質またはペプチド（「タンパク質成分」）を含む懸濁液を、タンパク質成分のほとんどがリポタンパク質複合体中に組み込まれるまで複数の熱サイクルにかけることを含む。前記方法は一般に、リポタンパク質複合体が形成されるまで、第１の高い方の温度範囲の温度と、第２の低い方の温度範囲の温度との間で懸濁液を循環させることが必要である。熱サイクリングプロセスの高温および低温範囲は、リポタンパク質複合体の脂質およびタンパク質成分の相転移温度に基づく。あるいは、不飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質またはリン脂質の混合物を用いる場合に起こり得るように、脂質成分が規定の、または個別の相転移を示さない場合、熱サイクリングの高温および低温範囲は、少なくとも約２０℃、最大で４０℃またはさらにはそれを超える温度、異なる。例えば、いくつかの実施形態においては、低温および高温範囲は、２０℃〜３０℃、２０℃〜４０℃、２０℃〜５０℃、３０℃〜４０℃、３０℃〜５０℃、２５℃〜４５℃、３５℃〜５５℃異なる。
【００８８】
脂質については、相転移は、ゲル状態として知られる、緊密に固まった規則的構造から、液体状態として知られる、緩く固まった規則性の低い構造への変化を含む。リポタンパク質複合体は、当技術分野では、典型的には用いられる特定の脂質または脂質の混合物の転移温度に近い温度で脂質粒子およびアポリポタンパク質をインキュベートすることにより形成される。脂質成分の相転移温度（熱量測定法により決定することができる）＋／−１２℃、より好ましくは＋／−１０℃は、本開示の方法における「低」温範囲である。特定の実施形態においては、低温範囲は、脂質成分の相転移温度の＋／−３℃、＋／−５℃、または＋／−８℃である。１つの特定の実施形態においては、低温範囲は、脂質成分の相転移温度の、下は５℃以下または１０℃以下から、上は５℃までである。
【００８９】
タンパク質については、相転移温度は、三次構造から二次構造への変化を含む。タンパク質成分の相転移温度＋／−１２℃、より好ましくは＋／−１０℃は、本開示の方法における「高」温範囲である。特定の実施形態においては、高温範囲は、タンパク質成分の相転移温度の＋／−３℃、＋／−５℃、または＋／−８℃である。１つの特定の実施形態においては、低温範囲は、タンパク質成分の相転移温度の、下は１０℃から、上は５℃以下、１０℃以下、または１５℃以下までである。
【００９０】
出発懸濁液の脂質成分、すなわち、熱サイクリング法にまだかけられていない懸濁液は、好ましくは、脂質の粒子を含み、例えば、主に脂質結合タンパク質と複合体化されていない脂質から構成される。脂質成分の作出は、一般的には以下の第６．５．２節に記載される通りである。
【００９１】
出発懸濁液のタンパク質成分は、好ましくは、脂質と複合体化されていない脂質結合ペプチドおよび／またはタンパク質を含有するか、または所望の複合体中でのタンパク質／ペプチドと脂質の比よりも少なくとも５倍高い（例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍高い）タンパク質／ペプチドと脂質の比で脂質と合わせられる。タンパク質成分の作出は、一般的には以下の第６．１節および第６．５．３節に記載される通りである。タンパク質成分は、好ましくは、第６．１．２節に記載の方法に従って作製され、および／または第６．１．３節または６．１．４節に記載の方法に従って精製される。
【００９２】
本開示の方法において、タンパク質成分と脂質成分とを含有する懸濁液は、典型的には、リポタンパク質複合体が形成されるまで、好ましくは高温範囲の温度から出発する、高温範囲と低温範囲との間で熱サイクリングされる。脂質およびタンパク質成分の好適な量を用いて（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００６−０２１７３１２Ａ１号に記載されている）、脂質およびタンパク質成分の実質的に完全な複合体化を、数回のサイクルの後に達成することができる。熱サイクリング法にとって好適なタンパク質および脂質の化学量論のさらなる詳細は、第６．５．４節に記載される。
【００９３】
前記方法により製造される複合体は、典型的には、タンパク質成分が特定の化学量論範囲で、また均一なサイズ分布で脂質成分に物理的に結合したミセル、ベシクル、球状または円盤状粒子として形状化された超分子集合体である。本発明の方法は、有利には、出発懸濁液中での脂質および／またはタンパク質の実質的に完全な複合体化をもたらし、クロマトグラフィーなどの分離方法により観察されるように、遊離脂質および／または遊離タンパク質を実質的に含まない組成物が得られる。かくして、本開示の方法は、精製ステップの非存在下で実施することができる。
【００９４】
出発懸濁液中の脂質成分は、典型的には粒子形態にある。粒子は好ましくは主に、少なくとも４５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも５５ｎｍまたは少なくとも６０ｎｍのサイズであり、最大で６５ｎｍ、最大で７０ｎｍ、最大で７５ｎｍ、最大で８０ｎｍのサイズ、最大で１００ｎｍ、最大で１２０ｎｍ、最大で１５０ｎｍ、最大で２００ｎｍ、最大で２５０ｎｍ、最大で３００ｎｍ、最大で５００ｎｍであり、例えば、４５ｎｍ〜１００ｎｍまたは４５〜２５０ｎｍのサイズ範囲にあり、より好ましくは、５０ｎｍ〜９０ｎｍのサイズ範囲にあり、最も好ましくは、５５ｎｍ〜７５ｎｍのサイズ範囲にある。好ましい実施形態においては、脂質粒子は主に、卵スフィンゴミエリンから構成され、５５〜７５ｎｍのサイズである。別の好ましい実施形態においては、脂質粒子は主に、１または複数の合成スフィンゴミエリン（例えば、パルミトイルスフィンゴミエリンまたはフィトスフィンゴミエリン）から構成され、１７５ｎｍ〜２５０ｎｍのサイズである。さらに別の好ましい実施形態においては、脂質粒子は主に、１または複数の合成脂質（例えば、パルミトイルスフィンゴミエリンまたはフィトスフィンゴミエリン）から構成され、２５０ｎｍ〜１０００ｎｍのサイズである。さらに別の好ましい実施形態においては、脂質粒子は主に、１または複数の合成脂質（例えば、パルミトイルスフィンゴミエリンまたはフィトスフィンゴミエリン）から構成され、１０００ｎｍ〜４０００ｎｍのサイズである。本明細書に記載のサイズは、動的光散乱により決定されるゼータ（Ｚ）平均サイズである。高圧均一化、例えば、マイクロフルイダイゼーションは、好適なサイズの脂質粒子を有利に生成する。粒子を形成させるための他の方法は、以下の第６．５．２節に開示され、均一化の代替方法として用いることができる。そのような方法が好ましいサイズ範囲外の粒子を生成する場合、粒子をサイズ濾過にかけて、好適なサイズの粒子を得ることができる。
【００９５】
本明細書に記載のリポタンパク質複合体を調製する方法は、そのサイズ分布において均一である複合体を有利に生成し、サイズ分画の必要性を回避する。さらに、本開示の方法は、リポタンパク質粒子中への出発タンパク質の実質的に完全な組込み（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）をもたらす。従って、本開示は、リポタンパク質複合体を含み、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて決定された場合、組成物中の脂質結合タンパク質の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が脂質と複合体化された組成物を提供する。特定の実施形態においては、本開示は、４ｎｍ〜２０ｎｍのゼータ平均サイズ、例えば、４ｎｍ〜２０ｎｍのゼータ平均サイズ、４ｎｍ〜１５ｎｍのゼータ平均サイズ、４ｎｍ〜１２ｎｍのゼータ平均サイズ、５ｎｍ〜１５ｎｍのゼータ平均サイズ、５ｎｍ〜１２ｎｍのゼータ平均サイズ、５ｎｍ〜１０ｎｍのゼータ平均サイズ、５ｎｍ〜２０ｎｍのゼータ平均サイズ、６ｎｍ〜１５ｎｍのゼータ平均サイズ、または８ｎｍ〜１２ｎｍのゼータ平均サイズを有し、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて決定された場合、組成物中の脂質結合タンパク質の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が脂質と複合体化されたリポタンパク質複合体を含む組成物を提供する。本明細書に記載の方法に従って脂質粒子をリポタンパク質と共に熱サイクリングにかけることにより、典型的には、４ｎｍ〜１５ｎｍのサイズのリポタンパク質粒子の集団、例えば、６ｎｍ〜１５ｎｍのサイズ、５ｎｍ〜１２ｎｍのサイズ、または８ｎｍ〜１２ｎｍのサイズのリポタンパク質粒子の集団が得られる。熱サイクリングにかけられる脂質粒子のサイズは、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲であってよい。好ましい実施形態においては、脂質粒子は主に、卵スフィンゴミエリンから構成され、５５〜７５ｎｍのサイズである。別の好ましい実施形態においては、脂質粒子は主に、１つまたは複数の合成スフィンゴミエリン（例えば、フィトスフィンゴミエリン）から構成され、１７５ｎｍ〜２５０ｎｍのサイズである。
【００９６】
リポタンパク質複合体を調製する方法における１つまたは複数のステップを、不活性ガス下で実行することができる。そうすることにより、アポリポタンパク質および／または脂質の酸化を低下または防止することができ、それによって肝臓損傷などの副作用のリスクを低下させることができる。好適な不活性ガスとしては、窒素、ヘリウム、およびアルゴンが挙げられる。
【００９７】
上記の方法により得られたか、または得られるリポタンパク質複合体は、複合体が形成された後にさらなる精製ステップが必要ないため、治療的使用に特に適している。
【００９８】
本開示はまた、リポタンパク質複合体の集団、ならびに本明細書に記載のような、リポタンパク質複合体またはその集団を含み、場合により、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含んでもよい医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、投与にとって好適な単位用量中に包装される。例えば、いくつかの実施形態においては、前記組成物は、密閉されたバイアル中に包装された乾燥（例えば、凍結乾燥）されたリポタンパク質複合体の単位用量を含む。そのような組成物は、水、生理的溶液（生理食塩水など）またはバッファーを用いる再構成、および注射による投与にとって好適である。そのような組成物は、場合により、荷電した複合体の再構成を容易にするための１つもしくは複数の凝固防止剤および／または抗凝集剤、または再構成された懸濁液のｐＨ、浸透圧および／もしくは塩分濃度を調整するように設計された１つもしくは複数の緩衝剤、等張剤（例えば、スクロースおよび／もしくはマンニトール）、糖または塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでもよい。リポタンパク質複合体の集団および／または上記の医薬組成物を、酸化を最小化する条件下で製造することによって、酸化生成物により引き起こされる肝臓損傷などの副作用のリスクを低下させることができる。例えば、医薬組成物を、不活性ガス、例えば、窒素、ヘリウム、またはアルゴンの下で製造することができる。
【００９９】
商業的適用のためには、リポタンパク質複合体および医薬組成物の大規模調製物を作製することが有用である。従って、本開示はまた、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、および最大で約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約８ｍｇ／ｍＬ〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲、最も好ましくは、約８ｍｇ／ｍＬの脂質結合タンパク質の濃度を達成するのに十分な量のリポタンパク質複合体を含む少なくとも１Ｌ、２Ｌ、５Ｌまたは１０Ｌおよび最大で１５Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、５０Ｌ以上の調製物（例えば、５Ｌ〜３０Ｌ、１０Ｌ〜１５Ｌまたは３０Ｌ〜５０Ｌの調製物）も提供する。特定の実施形態においては、調製物は１５Ｌ〜２５Ｌの容量を有し、約１００ｇ〜約２５０ｇのＡｐｏＡ−Ｉを含有する。別の特定の実施形態においては、調製物は３０Ｌ〜５０Ｌの容量を有し、約２４０ｇ〜約７８０ｇのＡｐｏＡ−Ｉを含有する。
【０１００】
本明細書に記載のリポタンパク質複合体は、動物、最も好ましくはヒトにおける脂質異常障害を治療するのに有用である。そのような状態としては、限定されるものではないが、高脂血症、および特に高コレステロール血症（ヘテロ接合性およびホモ接合性家族性高コレステロール血症）、およびアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患（アテローム性動脈硬化症の治療および予防を含む）および例えば、脳卒中、虚血性脳卒中、一過性虚血発作、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、間欠性跛行、重症虚血肢、弁狭窄、および心房弁硬化症などのアテローム性動脈硬化症の無数の臨床徴候；再狭窄（例えば、バルーン血管形成術などの医学的手順の結果として生じるアテローム性動脈硬化プラークの予防または治療）；および敗血性ショックをもたらすことが多い内毒素血症などの他の障害が挙げられる。
【０１０１】
本明細書に記載のリポタンパク質複合体および組成物は、現在までの研究において他のリポタンパク質複合体について用いられたものよりも低用量で投与した場合、コレステロール流出を行う、および／または容易にすることがわかった。例えば、１５ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を用いた、Spiekerら、2002、Circulation 105: 1399-1402（８０ｍｇ／ｋｇの用量を用いる）；Nissenら、2003、JAMA 290:2292-2300（１５ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇの用量を用いる）；Tardifら、2007 JAMA 297:1675-1682（４０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇの用量を用いる）を参照されたい。さらに、本明細書に記載のリポタンパク質複合体は、副作用が減少していることがわかった。以下の実施例に示されるように、本開示のリポタンパク質複合体は、２ｍｇ／ｋｇの低い用量でコレステロールを効率的に移動させ、対照的に、ヒト患者に以前に投与されたリポタンパク質複合体は、トリグリセリド、ＶＬＤＬ、およびトランスアミナーゼなどの肝臓酵素のレベルを有意に上昇させないことを発見した（Nanjeeら、1999、Arterioscler. Vasc. Throm. Biol. 19:979-89を参照されたい）。さらに、副作用の減少は、正常な肝臓および／または腎臓機能を有する正常な対象において、最大で約１５ｍｇ／ｋｇ（トリグリセリド上昇の欠如）またはさらには４５ｍｇ／ｋｇ（トランスアミノアーゼ増加の欠如）に増加させた用量でも観察される。かくして、副作用なしに投与される本開示の複合体の能力は、好ましくは、正常な肝機能、正常な腎機能、またはその両方を有する個体において評価される。
【０１０２】
理論によって束縛されるものではないが、本発明者らは、本開示のリポタンパク質複合体の利益が、以前の治療と比較して複合体のより均一なサイズ分布および減少した量の損傷されたタンパク質および／または脂質（例えば、酸化されたタンパク質、脱アミド化されたタンパク質および酸化された脂質）に起因すると考える。さらに、脂質画分を含む負に荷電したリン脂質は、本明細書に記載の複合体および組成物に、従来のリポタンパク質複合体を超える改善された治療特性を付与すると考えられる。腎臓において分解される、小さい円盤状のプレ−βＨＤＬ粒子と、そのコレステロールが貯蔵され、再利用され、代謝され（胆汁酸として）、または排除される（胆汁中に）肝臓によって認識される、大きい円盤状の、および／または球状のＨＤＬとの鍵となる差異の１つは、粒子の電荷である。小さい円盤状のプレ−βＨＤＬ粒子は、負に荷電した大きい円盤状の、および／または球状のＨＤＬ粒子よりも低い負の表面電荷を有する。より高い負の電荷が、肝臓による粒子の認識を誘発し、従って、腎臓による粒子の異化を回避する因子の１つであると考えられる。さらに、腎臓は荷電した粒子を容易に吸収しないことが示されている（Hackerら、2009、Pharmacology: Principles and Practice、183を参照されたい）。かくして、一部、荷電したリン脂質の存在のため、本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体および組成物は、従来のリポタンパク質複合体よりも長く循環中に留まるか、またはその電荷は電荷依存的様式でリポタンパク質の半減期に影響すると考えられる。複合体が負の電荷の結果として凝集し、存在するＨＤＬと融合する速度および／または程度の低下と共に、それらのより長い循環（滞留）時間は、コレステロール移動（コレステロールを蓄積するより多くの時間を複合体に与えることによる）およびエステル化（ＬＣＡＴにエステル化反応を触媒するより多くの時間を提供することによる）を容易にすると予想される。電荷はまた、コレステロール捕捉および／または除去の速度を増加させ、それによって、より大量のコレステロールの除去を容易にすることもできる。結果として、本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体および組成物は、副作用の減少と共に、投与するのに必要な複合体および／または組成物が少なく、頻度も少ないため、従来のリポタンパク質療法を超える治療的利益を提供することが期待される。
【０１０３】
従って、本明細書に提供される方法は一般に、治療上有効量のリポタンパク質複合体、リポタンパク質複合体の集団、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与して、脂質異常障害を治療または予防することを含む。リポタンパク質複合体は、注射１回あたり、約０．２５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量から約４５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量から最大で約１５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与することができる。この用量はさらに、トリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドのレベルの増加を最小化する用量を選択することにより、治療される個体に合わせることができる。特定の実施形態においては、用量は約３ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、または約１２ｍｇ／ｋｇである。
【０１０４】
前記方法は、５〜１４日、または６〜１２日の範囲の間隔、例えば、１または２週間の間隔でリポタンパク質複合体を投与することをさらに含む。前記方法は、上記の任意の間隔で、好ましくは１週間の間隔で、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または最大で５２回、リポタンパク質複合体を投与することをさらに含んでもよい。例えば、一実施形態においては、リポタンパク質複合体は、それぞれの投与の間に１週間の間隔で６回投与される。慢性状態については、５２回を超える投与を実行してもよい。場合により、リポタンパク質複合体をより頻繁に投与する初期の誘導期により前記方法を進行させることができる。
【０１０５】
複合体および／またはその医薬組成物を、非経口的に、例えば、静脈内に投与することができる。静脈内投与は、約１〜約２４時間、または約１〜４時間、約０．５〜２時間、または約１時間の期間にわたる注入として行うことができる。
【０１０６】
以下の実施例は、３０ｍｇ／ｋｇと４５ｍｇ／ｋｇの用量の投与後にトリグリセリドレベルの少しの増加を示し、これは高い程度のコレステロール移動の結果生じるＶＬＤＬおよびＬＤＬの増加により説明される。これらのパラメータは、標準的な脂質パネルを用いて病院の実験室で日常的に測定されるため、治療の間に制御することができる。以下の実施例に基づいて、薬剤に対する患者の反応に応じたトリグリセリドおよびＶＬＤＬ−コレステロールおよびＶＬＤＬ−トリグリセリドのレベルの増加を最小化するように用量の選択を達成することができ、オーダーメイド医療が可能になる。
【０１０７】
複合体および／もしくは組成物を単独で（単剤療法として）投与するか、またはあるいは、脂質異常症および／もしくはその関連する状態、疾患および／もしくは障害を治療および／もしくは予防するのに有用な他の治療剤と共にそれらを補助的に投与することができる。本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体および組成物を補助的に投与することができる治療剤の非限定例としては、胆汁酸結合樹脂、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン）、ナイアシン、樹脂、コレステロール吸収の阻害剤、血小板凝集阻害剤、フィブラート、抗凝固剤、ＣＥＴＰ阻害剤（例えば、アナセトラピブおよびダルセトラピブ）、ならびに／またはＰＣＳＫＧ抗体もしくはリガンドが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
５．図面の簡単な説明
【図１】ヒトプレプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５９５１４．１）のアミノ酸配列を示す図である。太字で示すアミノ酸１〜１８は、ＡｐｏＡ−Ｉのシグナル配列に対応し、下線付きのアミノ酸１９〜２４はプロペプチド配列に対応する。シグナル配列とプロペプチドは両方とも、細胞中で切断されて、完全長成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉ（アミノ酸２５〜２６７）が生成される。
【図２】ＡｐｏＡ−Ｉを発現する組換えＳ−ＣＨＯ細胞の１２日間のフェドバッチ培養におけるＡｐｏＡ−Ｉ力価を示す図である。世代０から世代４３までの連続継代により、細胞を連続的に培養した。逆相ＨＰＬＣにより、世代４、８、１４、１９、２５、２１、３６および４３においてＡｐｏＡ−Ｉ産生をモニターした。培養培地中のＡｐｏＡ−Ｉの量は、１２５９ｍｇ／Ｌから１４００ｍｇ／Ｌまで変化した。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡｐｏＡ−Ｉを発現する組換えＳ−ＣＨＯ細胞の２００Ｌの１３日培養における生細胞密度を示す。生細胞密度は９日目に３３．２０ｘ１０５細胞／ｍＬでピークに達し、９２．５％の生存率であった。図３Ｂは、１３日培養の培養培地中のＡｐｏＡ−Ｉの濃度を示す。培養培地中のＡｐｏＡ−Ｉの濃度は、１２日目に約２ｍｇ／ｍＬでピークに達した。
【図３Ｂ】図３Ａは、ＡｐｏＡ−Ｉを発現する組換えＳ−ＣＨＯ細胞の２００Ｌの１３日培養における生細胞密度を示す。生細胞密度は９日目に３３．２０ｘ１０５細胞／ｍＬでピークに達し、９２．５％の生存率であった。図３Ｂは、１３日培養の培養培地中のＡｐｏＡ−Ｉの濃度を示す。培養培地中のＡｐｏＡ−Ｉの濃度は、１２日目に約２ｍｇ／ｍＬでピークに達した。
【図４】本明細書に記載の方法により精製されたＡｐｏＡ−ＩのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す図である。左手のレーンは分子量マーカーを示す。右手のレーンは、約２８ｋＤの分子量を有する精製されたＡｐｏＡ−Ｉを示す。
【図５Ａ】１：２．５（処方Ａ；図５Ａ）、１：２．７（処方Ｂ；図５Ｂ）、１：３．１（処方Ｃ；図５Ｃ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ複合体、および１：２．７（処方Ｄ；図５Ｄ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｂ】１：２．５（処方Ａ；図５Ａ）、１：２．７（処方Ｂ；図５Ｂ）、１：３．１（処方Ｃ；図５Ｃ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ複合体、および１：２．７（処方Ｄ；図５Ｄ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｃ】１：２．５（処方Ａ；図５Ａ）、１：２．７（処方Ｂ；図５Ｂ）、１：３．１（処方Ｃ；図５Ｃ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ複合体、および１：２．７（処方Ｄ；図５Ｄ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｄ】１：２．５（処方Ａ；図５Ａ）、１：２．７（処方Ｂ；図５Ｂ）、１：３．１（処方Ｃ；図５Ｃ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ複合体、および１：２．７（処方Ｄ；図５Ｄ）のタンパク質：脂質重量比のプロＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図６Ａ】それぞれ、１０、２０、３０および６０分での処方Ｄのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図６Ｂ】それぞれ、１０、２０、３０および６０分での処方Ｄのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図６Ｃ】それぞれ、１０、２０、３０および６０分での処方Ｄのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図６Ｄ】それぞれ、１０、２０、３０および６０分での処方Ｄのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図７Ａ】それぞれ、１０、２０、３０および５０分での処方Ｂのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｂ】それぞれ、１０、２０、３０および５０分での処方Ｂのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｃ】それぞれ、１０、２０、３０および５０分での処方Ｂのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｄ】それぞれ、１０、２０、３０および５０分での処方Ｂのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図８Ａ】それぞれ、２０、４０、６０および１２０分での処方Ｆのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図８Ｂ】それぞれ、２０、４０、６０および１２０分での処方Ｆのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図８Ｃ】それぞれ、２０、４０、６０および１２０分での処方Ｆのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図８Ｄ】それぞれ、２０、４０、６０および１２０分での処方Ｆのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図９】プロＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭ（処方Ｂ）、４８：４８：４のＳＭ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有するプロＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭ、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ（処方Ｆ）、ならびに７３：２３：４のＳＭ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有するプロＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭ、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ（処方Ｇ）を含む、１：２．７のリポタンパク質：全リン脂質ｗｔ：ｗｔ比を有するリポタンパク質複合体の形成を例示する、時間に対するプレ−βＨＤＬ複合体形成を示す図である。
【図１０Ａ】それぞれ、処方Ｅ、Ｈ、ＩおよびＪのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１０Ｂ】それぞれ、処方Ｅ、Ｈ、ＩおよびＪのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１０Ｃ】それぞれ、処方Ｅ、Ｈ、ＩおよびＪのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１０Ｄ】それぞれ、処方Ｅ、Ｈ、ＩおよびＪのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１１】リポタンパク質複合体を作製するための例示的プロセスの概略図である。
【図１２】非商業規模の熱サイクリング実行に用いられる例示的熱サイクリング装置を示す図である。
【図１３Ａ】増加する数の熱サイクルを用いるＳＭ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。成分を、合計３０分間（図１３Ａ）、６０分間（図１３Ｂ）、１２０分間（図１３Ｃ）、１８０分間（図１３Ｄ）または２１０分間（図１３Ｅ）、それぞれの温度で５分間、５７℃と３７℃の間で熱サイクリングにかけた。
【図１３Ｂ】増加する数の熱サイクルを用いるＳＭ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。成分を、合計３０分間（図１３Ａ）、６０分間（図１３Ｂ）、１２０分間（図１３Ｃ）、１８０分間（図１３Ｄ）または２１０分間（図１３Ｅ）、それぞれの温度で５分間、５７℃と３７℃の間で熱サイクリングにかけた。
【図１３Ｃ】増加する数の熱サイクルを用いるＳＭ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。成分を、合計３０分間（図１３Ａ）、６０分間（図１３Ｂ）、１２０分間（図１３Ｃ）、１８０分間（図１３Ｄ）または２１０分間（図１３Ｅ）、それぞれの温度で５分間、５７℃と３７℃の間で熱サイクリングにかけた。
【図１３Ｄ】増加する数の熱サイクルを用いるＳＭ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。成分を、合計３０分間（図１３Ａ）、６０分間（図１３Ｂ）、１２０分間（図１３Ｃ）、１８０分間（図１３Ｄ）または２１０分間（図１３Ｅ）、それぞれの温度で５分間、５７℃と３７℃の間で熱サイクリングにかけた。
【図１３Ｅ】増加する数の熱サイクルを用いるＳＭ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。成分を、合計３０分間（図１３Ａ）、６０分間（図１３Ｂ）、１２０分間（図１３Ｃ）、１８０分間（図１３Ｄ）または２１０分間（図１３Ｅ）、それぞれの温度で５分間、５７℃と３７℃の間で熱サイクリングにかけた。
【図１４】ＳＭ／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図１５】Ｎ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（植物ＳＭまたはフィトスフィンゴミエリンの一形態）／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図１６】合成パルミトイルＳＭ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図１７】フィトスフィンゴミエリン／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉ複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図１８】ＳＭ／ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ／ＡｐｏＡ−Ｉペプチド複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図１９Ａ】Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いる動的光散乱システムによる脂質粒子の特性評価を示す図である。図１９Ａにおいて、Ｚ平均は８４．４９ｎｍである（「８４ｎｍ粒子」）；図１９Ｂにおいて、Ｚ平均は７６．７６ｎｍである（「７７ｎｍ粒子」）；図１９Ｃにおいて、Ｚ平均は６６．２１ｎｍである（「６６ｎｍ粒子」）；および図１９Ｄにおいて、Ｚ平均は５９．５０ｎｍである（「６０ｎｍ粒子」）。
【図１９Ｂ】Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いる動的光散乱システムによる脂質粒子の特性評価を示す図である。図１９Ａにおいて、Ｚ平均は８４．４９ｎｍである（「８４ｎｍ粒子」）；図１９Ｂにおいて、Ｚ平均は７６．７６ｎｍである（「７７ｎｍ粒子」）；図１９Ｃにおいて、Ｚ平均は６６．２１ｎｍである（「６６ｎｍ粒子」）；および図１９Ｄにおいて、Ｚ平均は５９．５０ｎｍである（「６０ｎｍ粒子」）。
【図１９Ｃ】Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いる動的光散乱システムによる脂質粒子の特性評価を示す図である。図１９Ａにおいて、Ｚ平均は８４．４９ｎｍである（「８４ｎｍ粒子」）；図１９Ｂにおいて、Ｚ平均は７６．７６ｎｍである（「７７ｎｍ粒子」）；図１９Ｃにおいて、Ｚ平均は６６．２１ｎｍである（「６６ｎｍ粒子」）；および図１９Ｄにおいて、Ｚ平均は５９．５０ｎｍである（「６０ｎｍ粒子」）。
【図１９Ｄ】Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いる動的光散乱システムによる脂質粒子の特性評価を示す図である。図１９Ａにおいて、Ｚ平均は８４．４９ｎｍである（「８４ｎｍ粒子」）；図１９Ｂにおいて、Ｚ平均は７６．７６ｎｍである（「７７ｎｍ粒子」）；図１９Ｃにおいて、Ｚ平均は６６．２１ｎｍである（「６６ｎｍ粒子」）；および図１９Ｄにおいて、Ｚ平均は５９．５０ｎｍである（「６０ｎｍ粒子」）。
【図２０Ａ】８４ｎｍ（図２０Ａ）、７７ｎｍ（図２０Ｂ）、６６ｎｍ（図２０Ｃ）および６０ｎｍ（図２０Ｄ）の脂質粒子を用いる５回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２０Ｂ】８４ｎｍ（図２０Ａ）、７７ｎｍ（図２０Ｂ）、６６ｎｍ（図２０Ｃ）および６０ｎｍ（図２０Ｄ）の脂質粒子を用いる５回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２０Ｃ】８４ｎｍ（図２０Ａ）、７７ｎｍ（図２０Ｂ）、６６ｎｍ（図２０Ｃ）および６０ｎｍ（図２０Ｄ）の脂質粒子を用いる５回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２０Ｄ】８４ｎｍ（図２０Ａ）、７７ｎｍ（図２０Ｂ）、６６ｎｍ（図２０Ｃ）および６０ｎｍ（図２０Ｄ）の脂質粒子を用いる５回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２１Ａ】４５０ｎｍ（図２１Ａ）および４０ｎｍ（図２１Ｂ）の脂質粒子から出発する６回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２１Ｂ】４５０ｎｍ（図２１Ａ）および４０ｎｍ（図２１Ｂ）の脂質粒子から出発する６回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図である。
【図２２】６５ｎｍの脂質粒子から出発する６回の熱サイクル後の複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す図であり、１回目のサイクルは３７℃の「低温」で開始した。
【図２３】本開示の方法により製造されたリポタンパク質複合体を商業的に有用な医薬組成物に製剤化することを含む、リポタンパク質複合体を含む医薬組成物を作製するための例示的実施形態の概略図である。
【図２４】処方Ｂおよび処方Ｈに従うリポタンパク質複合体の注入後の血漿ＶＬＤＬ−総コレステロールレベルの増加を示す図である。処方Ｈ（■）および処方Ｂ（▼）に従うリポタンパク質複合体を、５ｍｇ／ｋｇの用量で絶食させたウサギに注入した。３つの群に関する０．０３〜０．３ｇ／Ｌの範囲のベースライン値を差し引いて、血漿ＶＬＤＬ−総コレステロールレベルの増加を決定した。
【図２５】処方Ｂおよび処方Ｈに従うリポタンパク質複合体の注入後の血漿トリグリセリドレベルの増加を示す図である。処方Ｈ（■）および処方Ｂ（▲）に従うリポタンパク質複合体を、５ｍｇ／ｋｇの用量で絶食したウサギに注入した。３つの群に関する０．３１〜０．７１ｇ／Ｌの範囲のベースライン値を差し引いて、血漿トリグリセリドレベルの増加を決定した。
【図２６Ａ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの、およびウサギにおいては２０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●、▲）またはＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆、▼）の注入後の血漿総コレステロール（図２６Ａ）、トリグリセリド（図２６Ｂ）、リン脂質（図２６Ｃ）およびＡｐｏＡ−Ｉ（図２６Ｄ）の増加を示す図である。ベースライン値は、測定した様々な血漿脂質について、以下のような範囲であった：血漿コレステロールについては０．２８〜０．４ｇ／Ｌ、血漿トリグリセリドについては０．２３〜０．２９ｇ／Ｌ、および血漿リン脂質については０．４５〜０．６１ｇ／Ｌ。
【図２６Ｂ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの、およびウサギにおいては２０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●、▲）またはＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆、▼）の注入後の血漿総コレステロール（図２６Ａ）、トリグリセリド（図２６Ｂ）、リン脂質（図２６Ｃ）およびＡｐｏＡ−Ｉ（図２６Ｄ）の増加を示す図である。ベースライン値は、測定した様々な血漿脂質について、以下のような範囲であった：血漿コレステロールについては０．２８〜０．４ｇ／Ｌ、血漿トリグリセリドについては０．２３〜０．２９ｇ／Ｌ、および血漿リン脂質については０．４５〜０．６１ｇ／Ｌ。
【図２６Ｃ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの、およびウサギにおいては２０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●、▲）またはＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆、▼）の注入後の血漿総コレステロール（図２６Ａ）、トリグリセリド（図２６Ｂ）、リン脂質（図２６Ｃ）およびＡｐｏＡ−Ｉ（図２６Ｄ）の増加を示す図である。ベースライン値は、測定した様々な血漿脂質について、以下のような範囲であった：血漿コレステロールについては０．２８〜０．４ｇ／Ｌ、血漿トリグリセリドについては０．２３〜０．２９ｇ／Ｌ、および血漿リン脂質については０．４５〜０．６１ｇ／Ｌ。
【図２６Ｄ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの、およびウサギにおいては２０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●、▲）またはＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆、▼）の注入後の血漿総コレステロール（図２６Ａ）、トリグリセリド（図２６Ｂ）、リン脂質（図２６Ｃ）およびＡｐｏＡ−Ｉ（図２６Ｄ）の増加を示す図である。ベースライン値は、測定した様々な血漿脂質について、以下のような範囲であった：血漿コレステロールについては０．２８〜０．４ｇ／Ｌ、血漿トリグリセリドについては０．２３〜０．２９ｇ／Ｌ、および血漿リン脂質については０．４５〜０．６１ｇ／Ｌ。
【図２７Ａ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●）およびＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆）のウサギにおける注入後の血漿ＨＤＬ−総コレステロール（図２７Ａ）、ＬＤＬ−総コレステロール（図２７Ｂ）、およびＶＬＤＬ−総コレステロール（図２７Ｃ）の増加を示す図である。ベースライン値は以下のような範囲であった：血漿ＨＤＬ−総コレステロールについては０．２０〜０．３１ｇ／Ｌ、血漿ＬＤＬ−総コレステロールについては０．０６〜０．０９ｇ／Ｌ、および血漿ＶＬＤＬ−総コレステロールについては０．００７〜０．０１１ｇ／Ｌ。
【図２７Ｂ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●）およびＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆）のウサギにおける注入後の血漿ＨＤＬ−総コレステロール（図２７Ａ）、ＬＤＬ−総コレステロール（図２７Ｂ）、およびＶＬＤＬ−総コレステロール（図２７Ｃ）の増加を示す図である。ベースライン値は以下のような範囲であった：血漿ＨＤＬ−総コレステロールについては０．２０〜０．３１ｇ／Ｌ、血漿ＬＤＬ−総コレステロールについては０．０６〜０．０９ｇ／Ｌ、および血漿ＶＬＤＬ−総コレステロールについては０．００７〜０．０１１ｇ／Ｌ。
【図２７Ｃ】希釈剤（■）と比較した、５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭ複合体（●）およびＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭ複合体（◆）のウサギにおける注入後の血漿ＨＤＬ−総コレステロール（図２７Ａ）、ＬＤＬ−総コレステロール（図２７Ｂ）、およびＶＬＤＬ−総コレステロール（図２７Ｃ）の増加を示す図である。ベースライン値は以下のような範囲であった：血漿ＨＤＬ−総コレステロールについては０．２０〜０．３１ｇ／Ｌ、血漿ＬＤＬ−総コレステロールについては０．０６〜０．０９ｇ／Ｌ、および血漿ＶＬＤＬ−総コレステロールについては０．００７〜０．０１１ｇ／Ｌ。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
６．詳細な説明
本開示は、リポタンパク質複合体を作製する方法と共に、リポタンパク質複合体、その集団を提供する。この複合体、ならびにその集団および組成物（例えば、医薬組成物）は、特に、脂質異常症ならびに／または脂質異常症と関連する疾患、障害および／もしくは状態の治療および／または予防にとって有用である。発明の概要の節で考察された通り、リポタンパク質複合体は、好ましくは、規定の重量比またはモル比の２つの主要な画分、アポリポタンパク質画分およびリン脂質画分を含み、好ましくは、特定の量の中性リン脂質および場合により、１つまたは複数の負に荷電したリン脂質を含む。
【０１１０】
６．１．タンパク質画分
本開示は、タンパク質画分を含むリポタンパク質複合体を提供する。本開示は、リポタンパク質複合体を作製する方法をさらに提供する。リポタンパク質複合体のタンパク質成分は、本発明の方法における成功にとって重要ではない。治療的および／または予防的利益を提供する、実質的に任意の脂質結合タンパク質、例えば、アポリポタンパク質および／またはその誘導体もしくは類似体を、複合体中に含有させることができる。さらに、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉなど）がＬＣＡＴを活性化するか、または脂質と結合した場合に円盤状粒子を形成することができるという点で、その活性を「模倣」する任意のα−へリックスペプチドもしくはペプチド類似体、または任意の他の型の分子を、リポタンパク質複合体中に含有させることができ、用語「脂質結合タンパク質」により包含される。
【０１１１】
６．１．１．脂質結合タンパク質
本開示は、例えば、リポタンパク質複合体を作製するのに用いるための、組換え産生されたタンパク質を精製する方法をさらに提供する。組換え産生されたタンパク質は、最も好適にはアポリポタンパク質である。好適なタンパク質としては、好ましくは成熟形態の、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＶおよびＡｐｏＥが挙げられる。脂質結合タンパク質もまた、活性な多型、アイソフォーム、変異体および突然変異体ならびにトランケートされた形態の前記アポリポタンパク質であり、最も一般的にはアポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＰａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＺａｒａｇｏｚａ（ＡｐｏＡ−ＩＺ）である。システイン残基を含有するアポリポタンパク質突然変異体も公知であり、用いることもできる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８１３７２号を参照されたい）。アポリポタンパク質は、単量体または二量体の形態にあってよく、二量体はホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ（Duvergerら、1996、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12): 1424-29）、ＡｐｏＡ−ＩＭ（Franceschiniら、1985、J. Biol. Chem. 260: 1632-35）、ＡｐｏＡ−ＩＰ（Daumら、1999、J. Mol. Med. 77:614-22）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Shelnessら、1985、J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelnessら、1984、J. Biol. Chem. 259(15):9929-35）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Duvergerら、1991、Euro. J. Biochem. 201(2):373-83）、ＡｐｏＥ（McLeanら、1983、J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000）、ＡｐｏＪおよびＡｐｏＨのホモおよびヘテロ二量体（実現可能である場合）を用いることができる。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が複合体中に含まれた場合にいくらかの生物活性を保持する限り、Ｈｉｓタグなどのその単離を容易にするエレメント、または他の目的のために設計された他のエレメントに対応する残基を含んでもよい。
【０１１２】
そのようなアポリポタンパク質を、動物起源（および特に、ヒト起源）から精製するか、または当技術分野で周知であるように組換え産生することができる。例えば、Chungら、1980、J. Lipid Res. 21(3):284-91；Cheungら、1987、J. Lipid Res. 28(8):913-29を参照されたい。また、米国特許第５，０５９，５２８号、第５，１２８，３１８号、第６，６１７，１３４号；米国特許出願公開第２０００２／０１５６００７号、第２００４／００６７８７３号、第２００４／００７７５４１号、および第２００４／０２６６６６０号；ならびにＰＣＴ出願公開第ＷＯ／２００８／１０４８９０号および第ＷＯ／２００７／０２３４７６号も参照されたい。例えば、以下の第６．１．３節および第６．１．４節に記載のような、他の精製方法も可能である。
【０１１３】
アポリポタンパク質に対応するペプチドおよびペプチド類似体、ならびに本明細書に記載の複合体および組成物中のアポリポタンパク質としての使用にとって好適であるＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶおよびＡｐｏＥの活性を模倣するアゴニストの非限定例は、米国特許第６，００４，９２５号、第６，０３７，３２３号および第６，０４６，１６６号（Dasseuxらに対して発行された）、米国特許第５，８４０，６８８号（Tsoに対して発行された）、米国特許出願公開第２００４／０２６６６７１号、第２００４／０２５４１２０号、第２００３／０１７１２７７号および第２００３／００４５４６０号（Fogelmanに対して）、米国特許出願公開第２００３／００８７８１９号（Bielickiに対して）ならびにＰＣＴ出願公開第ＷＯ／２０１０／０９３９１８号（Dasseuxらに対して）に開示されており、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらのペプチドおよびペプチド類似体は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸またはＬ−およびＤ−アミノ酸の混合物から構成されていてもよい。それらはまた、１つまたは複数の周知のペプチド／アミドイソスターなどの、１つまたは複数の非ペプチドまたはアミド結合を含んでもよい。そのような「ペプチドおよび／またはペプチド模倣性」アポリポタンパク質を、例えば、米国特許第６，００４，９２５号、第６，０３７，３２３号および第６，０４６，１６６号に記載の技術などの、当技術分野で公知のペプチド合成のための任意の技術を用いて合成または製造することができる。
【０１１４】
複合体は、同じか、または異なる種から誘導することができる、単一の型の脂質結合タンパク質、または２つ以上の異なる脂質結合タンパク質の混合物を含んでもよい。必要ではないが、療法に対する免疫応答を誘導するのを回避するために、リポタンパク質複合体は、好ましくは、治療される動物種から誘導されるか、またはアミノ酸配列において治療される動物種に対応する脂質結合タンパク質を含む。かくして、ヒト患者の治療のためには、ヒト起源の脂質結合タンパク質が、本開示の複合体中で好ましく用いられる。ペプチド模倣性アポリポタンパク質の使用もまた、免疫応答を減少させるか、または回避することができる。
【０１１５】
特定の好ましい実施形態においては、脂質結合タンパク質は、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、例えば、配列番号１の２５〜２６７位に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質である。特定の実施形態においては、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、配列番号１の２５〜２６７位に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態においては、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、１位（すなわち、配列番号１の２５位に対応する位置）にアスパラギン酸を有するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、配列番号１の２５〜２６７位に対応するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、哺乳動物宿主細胞、最も好ましくは、以下の小節に記載のチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞中で組換え産生される。
【０１１６】
６．１．２．アポリポタンパク質の組換え発現
本開示は、ＡｐｏＡ−Ｉなどの脂質結合タンパク質を製造するための組換え発現方法、および関連する核酸、哺乳動物宿主細胞、細胞培養物を提供する。得られる組換え脂質結合タンパク質を精製し、および／または本明細書に記載のリポタンパク質複合体中に組み込むことができる。
【０１１７】
一般に、組換え産生のためには、脂質結合タンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、好適な発現ビヒクル、すなわち、挿入されるコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳のための必要なエレメントを含有するベクター中に挿入する。発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスから誘導することができる。次いで、発現ビヒクルを、タンパク質またはペプチドを発現する好適な標的細胞中にトランスフェクトする。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、細菌種、バキュロウイルス系などの哺乳動物または昆虫宿主細胞系（例えば、Luckowら、Bio/Technology、6、47 (1988)を参照されたい）、および確立された細胞系、例えば、２９３、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫなどが挙げられる。次いで、用いられる発現系に応じて、発現されるペプチドを当技術分野でよく確立された手順により単離する。組換えタンパク質およびペプチド産生のための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Sambrookら、1989、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.；およびAusubelら、1989、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１１８】
ＡｐｏＡ−Ｉが脂質結合タンパク質である場合、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質はＡｐｏＡ−Ｉをコードする組換えヌクレオチド配列から発現される。いくつかの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉをコードするヌクレオチド配列はヒトである。ヒトＡｐｏＡ−Ｉヌクレオチド配列の非限定例は、米国特許第５，８７６，９６８号；第５，６４３，７５７号；および第５，９９０，０８１号、ならびにＷＯ９６／３７６０８に開示されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、好ましくは、宿主細胞からのＡｐｏＡ−Ｉの分泌のためのシグナル配列（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１８）および／またはプロタンパク質配列（例えば、配列番号１のアミノ酸１９〜２５）に機能し得る形で連結された、成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列をコードする。ＡｐｏＡ−Ｉの分泌を指令するのに好適な他のシグナル配列は、ＡｐｏＡ−Ｉにとって異種であってもよく、例えば、ヒトアルブミンシグナルペプチドもしくはヒトＩＬ−２シグナルペプチドであってもよく、またはＡｐｏＡ−Ｉと同種であってもよい。
【０１１９】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉポリペプチド、例えば、配列番号１の２５〜２６７位に対応するアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、場合により、そのアミノ酸配列は２５位にアスパラギン酸を含む。好ましい実施形態においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。ヌクレオチド配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００００３０、ＡＡＢ５９５１４、Ｐ０２６４７、ＣＡＡ３０３７７、ＡＡＡ５１７４６またはＡＡＨ０５３８０．１の１つに記載のヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよく、場合により、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の１番目のアミノ酸に対応する位置にアスパラギン酸を含む。
【０１２０】
ＡｐｏＡ−Ｉをコードするポリヌクレオチドを、組換え宿主細胞中での発現のためにコドン最適化することができる。好ましい宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、例えば、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１；ＣＨＯ−Ｓ（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号１１６１９０１２））、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１０３１４）、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３；Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72、1977）、３Ｔ３細胞、ミエローマ細胞（特に、マウス）、ＰＣ１２細胞およびＷ１３８細胞である。特定の実施形態においては、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）などの哺乳動物細胞を、無血清培地中での増殖のために適合させる。さらなる好適な細胞系が当技術分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａなどの公共預託機関から入手可能である。
【０１２１】
ＡｐｏＡ−Ｉの組換え発現のために、ＡｐｏＡ−Ｉをコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の制御配列、例えば、対象の宿主細胞中でのＡｐｏＡ−Ｉの発現を調節するプロモーターまたはターミネーターに機能し得る形で連結する。制御配列は、ＡｐｏＡ−Ｉをコードする配列にとって天然のものであるか、または外来のものであってもよく、また、ＡｐｏＡ−Ｉが発現される宿主細胞にとって天然のものであるか、または外来のものであってよい。制御配列としては、限定されるものではないが、プロモーター、リボソーム結合部位、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。いくつかの実施形態においては、制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。また、制御配列は、制御配列と、ＡｐｏＡ−Ｉをコードするヌクレオチド配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入するための１つまたは複数のリンカーを含んでもよい。
【０１２２】
ＡｐｏＡ−Ｉの組換え発現を駆動するプロモーターは、構成的プロモーター、調節プロモーター、または誘導性プロモーターであってよい。好適なプロモーター配列を、宿主細胞に対して内因性であるか、または異種である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得することができる。様々な強度のプロモーターの単離、同定および操作のための方法が当技術分野で利用可能であるか、または当技術分野から容易に適合させることができる。例えば、Nevoigtら(2006) Appl. Environ. Microbiol. 72:5266-5273（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２３】
１つまたは複数の制御配列を、ウイルス起源から誘導することができる。例えば、特定の態様においては、プロモーターはポリオーマまたはアデノウイルス主要後期プロモーターから誘導される。他の態様においては、プロモーターは、ＳＶ４０のウイルス複製起点も含有する断片として取得することができるサルウイルス４０（ＳＶ４０）（Fiersら、1978、Nature、273: 113-120）、またはサイトメガロウイルスから誘導され、例えば、サルサイトメガロウイルス極初期プロモーターである（米国特許第４，９５６，２８８号を参照されたい）。他の好適なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる（米国特許第４，５７９，８２１号および第４，６０１，９７８号を参照されたい）。
【０１２４】
また、組換えＡｐｏＡ−Ｉ発現ベクターも本明細書で提供される。組換え発現ベクターは、組換え宿主細胞中での異種ＡｐｏＡ−Ｉの発現を容易にするための組換えＤＮＡ技術により操作することができる任意のベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスであってよい。発現ベクターは、組換え宿主細胞の染色体中に組み込むことができ、ＡｐｏＡ−Ｉの産生にとって有用な１つまたは複数の制御配列に機能し得る形で連結された１つまたは複数の異種遺伝子を含む。他の実施形態においては、発現ベクターは、染色体外複製ＤＮＡ分子、例えば、低コピー数（例えば、ゲノム当量あたり約１〜約１０コピー）または高コピー数（例えば、ゲノム当量あたり約１０コピーを超える）のいずれかで見い出される線状または閉環状プラスミドである。様々な実施形態において、発現ベクターは、該ベクターを含む組換え宿主生物に対して抗生物質耐性（例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性）を付与する遺伝子などの、選択可能なマーカーを含む。特定の態様においては、ＤＮＡ構築物、ベクターおよびポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中でのＡｐｏＡ−Ｉの発現にとって好適である。哺乳動物細胞中でのＡｐｏＡ−Ｉの発現のためのベクターは、宿主細胞系と適合する複製起点、プロモーターおよび任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、ならびに転写ターミネーター配列を含んでもよい。いくつかの態様においては、複製起点は宿主細胞に対して異種であり、例えば、ウイルス起源のものである（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）。他の態様においては、複製起点は、宿主細胞染色体複製機構により提供される。
【０１２５】
哺乳動物宿主細胞に外来ＤＮＡを導入するための方法、試薬および道具は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Wiglerら、1978、Cell 14:725; Corsaroら、1981、Somatic Cell Genetics 7:603; Grahamら、1973、Virology 52:456）、エレクトロポレーション（Neumannら、1982、EMBO J. 1 : 841-5）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ausubelら（編）、Short Protocols in Molecular Biology、第３版(John Wiley & Sons 1995)）、およびリポソーム媒介性トランスフェクション（Hawley-Nelsonら、1993、Focus 15:73; Ciccaroneら、1993、Focus 15:80）が挙げられる。
【０１２６】
高収率産生のためには、ＡｐｏＡ−Ｉの安定な発現が好ましい。例えば、宿主細胞に外来ＤＮＡを導入した後、宿主細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞を、好適な発現制御エレメントおよび選択可能なマーカーにより制御されるＡｐｏＡ−Ｉコード配列を含むヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換することができる。ベクター中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体中にベクターを安定に組み込み、増殖巣を形成するように増殖し、次いで、クローニングし、細胞系中で増殖させることができる。いくつかの選択系を用いることができ、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977、Cell 11 : 223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski、1962、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980、Cell 22: 817）遺伝子を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中で用いることができる。また、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、1980、Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567；O'Hareら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapinら、1981、J. Mol. Biol. 150: 1）；および／またはヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇ（Santerreら、1984、Gene 30: 147）を用いることにより、選択の基礎として代謝拮抗物質耐性を用いることができる。
【０１２７】
宿主細胞ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスベクターを用いて、安定な高収率の発現を達成することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６７７９号および第２００４／０２３５１７３号を参照されたい）。あるいは、例えば、ＷＯ１９９４／０１２６５０に記載のような、選択された哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ中の内因性ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子の発現を活性化し、それを増幅することを必要とする、遺伝子活性化方法により、ＡｐｏＡ−Ｉの安定な高収率の発現を達成することができる。ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子（ＡｐｏＡ−Ｉコード配列および１つまたは複数の制御エレメントを含有する）のコピー数の増加は、ＡｐｏＡ−Ｉの高収率発現を容易にすることができる。好ましくは、ＡｐｏＡ−Ｉが発現される哺乳動物宿主細胞は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子コピー指数を有する。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉが発現される哺乳動物宿主細胞は、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子コピー指数を有する。
【０１２８】
特定の実施形態においては、哺乳動物細胞を、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも３．５ｇ／Ｌ、および場合により、最大で４ｇ／Ｌ、最大で４．５ｇ／Ｌ、最大で５ｇ／Ｌ、最大で５．５ｇ／Ｌ、または最大で６ｇ／Ｌの量のＡｐｏＡ−Ｉを産生するように適合させる。哺乳動物宿主細胞は、好ましくは、培養物中に少なくとも約０．５、１、２もしくは３ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉおよび／または培養物中に最大で約２０ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉ、例えば、培養物中に最大で４、５、６、７、８、９、１０、１２または１５ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉを産生することができる。
【０１２９】
特定の実施形態においては、哺乳動物細胞を、無血清培地中での増殖のために適合させる。これらの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは細胞から分泌される。他の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは細胞から分泌されない。
【０１３０】
本明細書で提供される哺乳動物宿主細胞を用いて、ＡｐｏＡ−Ｉを産生させることができる。一般に、前記方法は、ＡｐｏＡ−Ｉが発現される条件下で本明細書に記載の哺乳動物宿主細胞を培養することを含む。さらに、前記方法は、哺乳動物細胞培養物の上清から成熟ＡｐｏＡ−Ｉを回収し、場合により精製することを含んでもよい。
【０１３１】
培養培地、温度、ｐＨなどの培養条件を、培養される哺乳動物宿主細胞および選択される培養の様式（振とうフラスコ、バイオリアクタ、ローラーボトルなど）に適合させることができる。哺乳動物細胞を、大規模バッチ培養、連続または半連続培養中で増殖させることができる。
【０１３２】
また、本明細書に記載の複数のＡｐｏＡ−Ｉを産生する哺乳動物宿主細胞を含む哺乳動物細胞培養物も本明細書に提供される。いくつかの実施形態においては、哺乳動物細胞培養物は、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも３．５ｇ／Ｌ、および場合により、最大で４ｇ／Ｌ、最大で４．５ｇ／Ｌ、最大で５ｇ／Ｌ、最大で５．５ｇ／Ｌ、または最大で６ｇ／ＬのＡｐｏＡ−Ｉを含む。培養物は、約１５０ｍＬ〜約５００ｍＬの範囲、１Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、３５０Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、７５０Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌ、２５００Ｌ、３０００Ｌ、５０００Ｌ、７５００Ｌ、１００００Ｌ、１５０００Ｌ、２００００Ｌ、２５０００Ｌ、５００００Ｌ以上の任意の規模のものであってよい。いくつかの例においては、培養物は、大規模培養物、例えば、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌ、１５０００Ｌ、２００００Ｌ、２５０００Ｌ、最大で５００００Ｌ以上である。
【０１３３】
６．１．３．アポリポタンパク質の精製
本開示は、本明細書に記載のリポタンパク質複合体およびその組成物を作製するのに有用である、高度に精製されたアポリポタンパク質を取得する方法に関する。この方法は、限定されるものではないが、ＡｐｏＡ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩまたは−ＩＶ；ＡｐｏＢ４８およびＡｐｏＢ１００；ＡｐｏＣ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩまたは−ＩＶ；ＡｐｏＤ；ＡｐｏＥ、ＡｐｏＨ；ＡｐｏＪなどの任意のアポリポタンパク質に適用することができる。より具体的には、本開示は、高度に精製されたＡｐｏＡ−Ｉを取得する方法に関する。いくつかの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは、限定されるものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００００３０、ＡＡＢ５９５１４、Ｐ０２６４７、ＣＡＡ３０３７７、ＡＡＡ５１７４６およびＡＡＨ０５３８０．１に記載の配列から選択される配列を有するヒトタンパク質である。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは、第６．１．２節で上記されたヒトタンパク質である。他の実施形態においては、本開示の方法を用いて、非ヒト動物（例えば、米国特許出願公開第２００４／００７７５４１号）、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒヒ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ハリネズミ、アナグマ、マウス、ラット、ネコ、モルモット、ハムスター、アヒル、ニワトリ、サケおよびウナギ（Brouilletteら、2001、Biochim. Biophys. Acta. 1531 :4-46；Yuら、1991、Cell Struct. Funct. 16(4):347-55；ChenおよびAlbers、1983、Biochim Biophys Acta. 753(l):40-6；Luoら、1989、J Lipid Res. 30(11): 1735-46；Blatonら、1977、Biochemistry 16:2157-63；Sparrowら、1995、J Lipid Res. 36(3):485-95；Beaubatieら、1986、J. Lipid Res. 27: 140-49；Januzziら、1992、Genomics 14(4): 1081-8；GoulinetおよびChapman、1993、J. Lipid Res. 34(6):943-59; Colletら、1997、J Lipid Res. 38(4):634-44；ならびにFrankおよびMarcel、2000、J. Lipid Res. 41(6):853-72）から得られるＡｐｏＡ−Ｉを精製することができる。
【０１３４】
本明細書に開示される方法により精製することができるＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の例としては、限定されるものではないが、プレプロアポリポタンパク質形態のＡｐｏＡ−Ｉ、プロおよび成熟形態のＡｐｏＡ−Ｉ、および活性な多型体、アイソフォーム、変異体および突然変異体ならびにトランケートされた形態、例えば、ＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＺ、およびＡｐｏＡ−ＩＰが挙げられる。ＡｐｏＡ−ＩＭは、ＡｐｏＡ−ＩのＲ１７３Ｃ分子変異体である（例えば、Paroliniら、2003、J Biol Chem. 278(7):4740-6；Calabresiら、1999、Biochemistry 38: 16307-14；およびCalabresiら、1997、Biochemistry 36: 12428-33を参照されたい）。ＡｐｏＡ−ＩＰは、ＡｐｏＡ−ＩのＲ１５１Ｃ分子変異体である（例えば、Daumら、1999、J Mol Med. 77(8):614-22を参照されたい)。ＡｐｏＡ−ＩＺは、ＡｐｏＡ−ＩのＬ１４４Ｒ分子変異体である（Recaldeら、2001、Atherosclerosis 154(3):613-623；Fiddymentら、2011、Protein Expr. Purif. 80(1): 110-116を参照されたい）。システイン残基を含有するアポリポタンパク質Ａ−Ｉ突然変異体も公知であり、本明細書に記載の方法により精製することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８１３７２号を参照されたい）。本明細書に記載の方法における使用のためのＡｐｏＡ−Ｉは、単量体、ホモ二量体、またはヘテロ二量体の形態にあってもよい。例えば、調製することができるプロおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉのホモおよびヘテロ二量体としては、特に、ＡｐｏＡ−Ｉ（Duvergerら、1996、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16(12): 1424-29）、ＡｐｏＡ−ＩＭ（Franceschiniら、1985、J Biol Chem. 260: 1632-35）、およびＡｐｏＡ−ＩＰ（Daumら、1999、J Mol Med. 77:614-22）が挙げられる。
【０１３５】
本明細書に記載の精製方法は、当業者にとって都合の良い任意の規模で実施することができる。
【０１３６】
いくつかの態様においては、本明細書に記載の方法により精製することができるＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、配列番号１のアミノ酸２５〜２６７と少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１３７】
アポリポタンパク質は、血漿などの任意の供給源に由来するか、または原核もしくは真核細胞中での組換え発現に由来するものであってよい。特定の実施形態においては、アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉ、例えば、ヒトＡｐｏＡ−Ｉである。いくつかの態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉは、原核または真核宿主細胞の細胞質またはペリプラズム中に発現される。これらの実施形態においては、細胞を破壊して、ＡｐｏＡ−Ｉを上清中に放出した後、ＡｐｏＡ−Ｉを精製する。細胞破壊方法は当技術分野で周知である。細胞を破壊する例示的方法としては、限定されるものではないが、酵素的方法、超音波、洗剤方法、および機械的方法が挙げられる。特定の好ましい態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉは哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞中で発現され、増殖培地中に分泌される。これらの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは清澄化された無細胞培地から精製される。精製方法はヒトＡｐｏＡ−Ｉと関連して本明細書に詳述されるが、当業者によって容易に確認できる特定のタンパク質特性（例えば、分子量、等電点、ストークス半径、疎水性、多量体状態など）に応じて、精製条件を他のアポリポタンパク質、ならびに非ヒトＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉの多型体、アイソフォーム、変異体、突然変異体およびトランケートされた形態または他のアポリポタンパク質に適合させることは当技術分野における技術の範囲内にあることが理解される。
【０１３８】
ＡｐｏＡ−Ｉを血漿から調製する場合、限定されるものではないが、Cohnら、1946、J. Am. Chem. Soc. 68:459-475（「Ｃｏｈｎプロセス」）またはOncleyら、1949、J. Am. Chem. Soc. 71 :541-550（「Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙプロセス」）により記載されたものなどの低温分画プロセスなどの任意の公知の方法により、ＡｐｏＡ−Ｉを血漿から分離することができる。血漿からアポリポタンパク質を単離するための他の方法としては、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎプロセスなどの、ＣｏｈｎおよびＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙプロセスの変法が挙げられる（Nitschmannら、1954、Helv. Chim. Acta 37:866-873；Kistlerら、1962、Vox Sang. 7:414-424を参照されたい）。
【０１３９】
これらの実施形態においては、アポリポタンパク質は、低温アルコール、例えば、エタノールを用いた血漿からの沈降により得られる。血漿の低温分画における使用のための他のアルコールとしては、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝鎖アルコール、例えば、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、およびｔｅｒｔ−ブタノールが挙げられる。様々な実施形態において、タンパク質の溶解度を低下させるアルコール以外の薬剤を用いて、血漿からアポリポタンパク質を沈降させることができる。そのような薬剤としては、限定されるものではないが、エーテル、硫酸アンモニウム、７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン（リバノール）およびポリエチレングリコールが挙げられる。沈降したタンパク質を、限定されるものではないが、沈殿、遠心分離および濾過などの当技術分野で公知の任意の方法により上清から分離することができる。
【０１４０】
タンパク質を含有する血漿のいずれかの画分から、ＡｐｏＡ−Ｉを回収することができる。いくつかの実施形態においては、約８％（ｗ／ｗ）エタノールを用いる沈降によりフィブリノゲンの量を減少させたヒト血漿の血清画分からＡｐｏＡ−Ｉを回収する。他の実施形態においては、約２５％（ｗ／ｗ）エタノールを用いる沈降により他の血清タンパク質（例えば、β−グロブリンおよびγ−ガンマグロブリン）の濃度を低下させたヒト血漿の血清画分からアポリポタンパク質を回収する。さらに他の実施形態においては、エタノール濃度を約３８％（ｗ／ｗ）から約４２％（ｗ／ｗ）まで増加させることにより得られたヒト血清から、沈降物としてアポリポタンパク質を回収する。特定の実施形態においては、エタノール濃度を約４０％（ｗ／ｗ）まで増加させることにより得られたヒト血清から、沈降物としてアポリポタンパク質を回収する（Ｃｏｈｎの画分ＩＶ）。限定されるものではないが、遠心分離および濾過などの当技術分野で公知の任意の方法により、沈降したＡｐｏＡ−Ｉを血清画分から回収することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態においては、アポリポタンパク質が回収される血漿画分の温度は、タンパク質の変性を防止するように十分に低いものである。これらの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ画分の温度は、約−１０℃〜約０℃、例えば、約−８℃〜約−２℃の範囲である。様々な実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉが回収される血漿画分のｐＨは、タンパク質の変性を防止する範囲にある。これらの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉを含有する画分のｐＨは、約５〜約７、例えば、約５．５〜約６．５の範囲である。
【０１４２】
６．１．４．改良されたリポタンパク質精製プロセス
本出願人は、成熟し、無傷であり、汚染物質を実質的に含まないリポタンパク質を生成する、以下に記載され、実施例に例示される改良された精製プロセスをさらに発見した。本明細書に記載の精製方法は、当業者にとって都合の良い任意の規模で実施することができる。
【０１４３】
前記方法は、限定されるものではないが、ＡｐｏＡ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩまたは−ＩＶ；ＡｐｏＢ４８およびＡｐｏＢ１００；ＡｐｏＣ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩまたは−ＩＶ；ＡｐｏＤ；ＡｐｏＥ；ＡｐｏＨ；ＡｐｏＪなどの任意のアポリポタンパク質に適用することができる。より具体的には、本開示は、高度に精製されたＡｐｏＡ−Ｉを取得する方法に関する。いくつかの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは、限定されるものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００００３０、ＡＡＢ５９５１４、Ｐ０２６４７、ＣＡＡ３０３７７、ＡＡＡ５１７４６およびＡＡＨ０５３８０．１に記載の配列から選択される配列を有するヒトタンパク質である。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉは、第６．１．２節で上記されたヒトタンパク質である。他の実施形態においては、本開示の方法を用いて、非ヒト動物（例えば、米国特許出願公開第２００４／００７７５４１号を参照されたい）、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒヒ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ハリネズミ、アナグマ、マウス、ラット、ネコ、モルモット、ハムスター、アヒル、ニワトリ、サケおよびウナギ（Brouilletteら、2001、Biochim. Biophys. Acta. 1531 :4-46；Yuら、1991、Cell Struct. Funct. 16(4):347-55；ChenおよびAlbers、1983、Biochim Biophys Acta. 753(l):40-6；Luoら、1989、J Lipid Res. 30(11): 1735-46；Blatonら、1977、Biochemistry 16:2157-63；Sparrowら、1995、J Lipid Res. 36(3):485-95；Beaubatieら、1986、J. Lipid Res. 27: 140-49；Januzziら、1992、Genomics 14(4): 1081-8；GoulinetおよびChapman、1993、J. Lipid Res. 34(6):943-59; Colletら、1997、J Lipid Res. 38(4):634-44；ならびにFrankおよびMarcel、2000、J. Lipid Res. 41(6):853-72）から得られたＡｐｏＡ−Ｉを精製することができる。
【０１４４】
本明細書に開示される方法により精製することができるＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の例としては、限定されるものではないが、プレプロアポリポタンパク質形態のＡｐｏＡ−Ｉ、プロおよび成熟形態のＡｐｏＡ−Ｉ、および活性な多型体、アイソフォーム、変異体および突然変異体ならびにトランケートされた形態、例えば、ＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＺおよびＡｐｏＡ−ＩＰが挙げられる。システイン残基を含有するアポリポタンパク質Ａ−Ｉ突然変異体も公知であり、本明細書に記載の方法により精製することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８１３７２号を参照されたい）。本明細書に記載の方法における使用のためのＡｐｏＡ−Ｉは、単量体、ホモ二量体、またはヘテロ二量体の形態にあってもよい。例えば、調製することができるプロおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉのホモおよびヘテロ二量体としては、特に、ＡｐｏＡ−Ｉ（Duvergerら、1996、Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16(12): 1424-29)、ＡｐｏＡ−ＩＭ（Franceschiniら、1985、J Biol Chem. 260: 1632-35）、およびＡｐｏＡ−ＩＰ（Daumら、1999、J Mol Med. 77:614-22）が挙げられる。
【０１４５】
いくつかの態様においては、本明細書に記載の方法により精製することができるＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、配列番号１のアミノ酸２５〜２６７と少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または少なくとも１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
アポリポタンパク質は、血漿または原核もしくは真核細胞中での組換え発現などの任意の起源に由来するものであってよい。特定の実施形態においては、アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉ、例えば、ヒトＡｐｏＡ−Ｉである。いくつかの態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉは、原核または真核宿主細胞の細胞質またはペリプラズム中で発現される。これらの実施形態においては、細胞を破壊してＡｐｏＡ−Ｉを上清中に放出させた後、ＡｐｏＡ−Ｉを精製する。細胞破壊方法は当技術分野で周知である。細胞を破壊する例示的方法としては、限定されるものではないが、酵素的方法、超音波、洗剤方法、および機械的方法が挙げられる。特定の好ましい態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉは哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞中で発現され、増殖培地中に分泌される。これらの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉを清澄化された無細胞培地から精製する。精製方法はヒトＡｐｏＡ−Ｉに関連して本明細書で詳細に説明されているが、当業者によって容易に確認できる特定のタンパク質特性（例えば、分子量、等電点、ストークス半径、疎水性、多量体状態など）に応じて、精製条件を他のアポリポタンパク質、ならびに非ヒトＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉの多型体、アイソフォーム、変異体、突然変異体およびトランケートされた形態または他のアポリポタンパク質に適合させることは当技術分野における技術の範囲内にあることが理解される。
【０１４７】
一般に、精製方法は、（ａ）ＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液と、陰イオン交換マトリックスとを、ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合しない条件下で接触させるステップ；（ｂ）ウイルスまたはウイルス粒子を除去するのに十分な孔径を有する膜を通して、ステップ（ａ）で得られたＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液を濾過するステップ；（ｃ）ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合するような条件下で、ステップ（ｂ）で得られた濾液を第１の逆相クロマトグラフィーカラムに通過させるステップ；（ｄ）増加する濃度の有機溶媒の勾配を用いて、第１の逆相クロマトグラフィーマトリックスから、第１のＡｐｏＡ−Ｉ含有逆相溶出液を溶出させるステップ；（ｅ）ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合するような条件下で、ステップ（ｄ）に由来する第１のＡｐｏＡ−Ｉ逆相溶出液を第２の逆相クロマトグラフィーカラムに通過させるステップ；および（ｆ）増加する濃度の有機溶媒の勾配を用いて、第２の逆相クロマトグラフィーマトリックスから、第２のＡｐｏＡ−Ｉ含有逆相溶出液を溶出させるステップを含む。前記ステップを実施する順序は重要ではない。当業者には明らかな通り、前記ステップの順序における様々な順列が可能であり、そのいくつかは以下に記載される。
【０１４８】
特定の態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液は、ステップ（ａ）においてそれを陰イオン交換マトリックスと接触させる前に条件化される。条件化は、タンパク質溶液のｐＨが、ＡｐｏＡ−Ｉがステップ（ａ）において陰イオン交換マトリックスに結合しない範囲になる（すなわち、タンパク質が正味の負の電荷を有さず、ステップ（ａ）がネガティブモードで実行される）ようにそれを調整するために実施される。これらの態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液のｐＨは、約５〜約７、好ましくは、約５．０〜約５．６である。特定の態様においては、ｐＨは約５．１〜約５．５である。さらに他の態様においては、ｐＨは約５．３である。ｐＨの調整は、所望の範囲内のｐＨが得られるまで好適な酸（例えば、塩酸）または塩基（例えば、水酸化ナトリウム）を添加することで実施することができる。いくつかの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液を条件化ステップの前に濾過して、細胞および細胞破片を除去する。他の実施形態においては、条件化ステップが存在しない場合、場合によりＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液をステップ（ａ）の前に濾過して、細胞および細胞破片を除去する。
【０１４９】
いくつかの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液と陰イオン交換マトリックスとを接触させるステップ（ａ）は、タンパク質溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させることにより実施される。これらの実施形態においては、約１０ｃｍ〜約５０ｃｍ、好ましくは約１０ｃｍ〜約３０ｃｍのベッド高(bed height)に、およびより好ましくは約２０ｃｍのベッド高にカラムを充填する。特定の態様においては、１リットルあたり約１０ｇ〜約５０ｇ、例えば、約１０ｇ〜約３０ｇ、例えば、約２５ｇ〜約３５ｇのＡｐｏＡ−Ｉを含むタンパク質溶液を、カラムにロードする。特定の実施形態においては、１リットルあたり最大で約３２ｇのＡｐｏＡ−Ｉを含むタンパク質溶液をカラムにロードする。他の実施形態においては、ステップ（ａ）は、バッチ様式で、すなわち、陰イオン交換マトリックスをフラスコ中のタンパク質溶液に添加し、汚染物質がマトリックスに結合するのに十分な時間にわたって混合した後、例えば、濾過または遠心分離によってタンパク質溶液からマトリックス材料を分離することにより実施される。特定の実施形態においては、タンパク質溶液を濾過して、溶液中の粒子を除去した後、それを陰イオン交換マトリックスと接触させる。
【０１５０】
本明細書に記載の方法のステップ（ａ）における使用のための陰イオン交換マトリックスは、当技術分野で公知の任意の陰イオン交換マトリックスであってよい。好適な陰イオン交換マトリックスとしては、限定されるものではないが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ−Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＤＥＡＥ−ＣｅｌｌｕｌｏｓｅおよびＱ−Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘが挙げられる。特定の実施形態においては、陰イオン交換マトリックスは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。特定の態様においては、ステップ（ａ）におけるタンパク質溶液を陰イオン交換マトリックスと接触させる前に、ＡｐｏＡ−Ｉがマトリックスに結合しないような上記で考察された好ましい範囲内のｐＨを有するバッファー中で、マトリックスを平衡化させる。ステップ（ａ）の前に陰イオン交換マトリックスを平衡化するため、およびステップ（ａ）を実施するために有用なバッファーは、当業者には公知である。特定の実施形態においては、バッファーは、ＴＡＭＰ  Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．３）である。
【０１５１】
様々な実施形態において、ステップ（ａ）は、陰イオン交換マトリックスに結合し、それによって上記のｐＨおよび塩条件下でマトリックスに結合しないＡｐｏＡ−Ｉから分離される、ＡｐｏＡ−Ｉ以外のタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）、宿主細胞ＤＮＡおよび内毒素に関してＡｐｏＡ−Ｉを精製するために用いられる。いくつかの態様においては、出発溶液中のＡｐｏＡ−Ｉの量の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％以上が陰イオン交換ステップから回収される。
【０１５２】
様々な実施形態においては、精製方法は、ウイルスおよびウイルス粒子を捕捉するのに十分である孔径を有するフィルターを用いて、ステップ（ａ）に由来するＡｐｏＡ−Ｉ溶液を濾過するステップ（ｂ）を含む。場合により、ウイルスまたはウイルス粒子を除去するために膜を通して濾過するステップ（ｂ）を、ステップ（ａ）の後よりもむしろ、上記のステップ（ｆ）の後に実施する。特定の態様においては、陰イオン交換マトリックスからの溶出液のｐＨを、水酸化ナトリウムまたは他の好適な塩基の添加により、ウイルス濾過ステップ（ｂ）の前に調整する。ステップ（ａ）からのＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液を、約７．８〜約８．２のｐＨに調整する。特定の態様においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有溶液を、約８．０のｐＨに調整する。ステップ（ｂ）において用いられるフィルターは、ウイルスを捕捉するための好適な孔径、例えば、約１５ｎｍ〜約７５ｎｍの孔径を有する任意のフィルターであってよい。特定の実施形態においては、フィルターの孔径は約２０ｎｍである（例えば、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎ、旭化成メディカル）。当業者であれば、ウイルスフィルターを通過するタンパク質溶液の流速が、溶液の特性（例えば、その粘度、粒子の濃度など）によって決まることを理解できる。ウイルス濾過のための典型的な流速は約１２．５Ｌ／ｈ／ｍ２であるが、流速は１ｂａｒ以下のフィルター圧を維持するためにより高く、またはより低く調整することができる。ステップ（ｂ）からの濾液は、ＡｐｏＡ−Ｉを含有する。特定の態様においては、ウイルス濾過ステップからのＡｐｏＡ−Ｉの回収率は、ステップ（ａ）からの陰イオン交換溶出液中のＡｐｏＡ−Ｉの量の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％以上である。
【０１５３】
特定の実施形態においては、本明細書に記載の精製方法は、ステップ（ｂ）からの濾液を、アポリポタンパク質Ａ−Ｉをマトリックスに結合させるバッファーおよび塩の条件下で第１の逆相クロマトグラフィーカラムに通過させるステップ（ｂ）の後のステップ（ｃ）を含む。これらの実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉを、増加する濃度の有機溶媒の勾配を用いて、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、内毒素およびトランケートされた形態に関して精製する。限定されるものではないが、シリカ、ポリスチレン、またはＣ４〜Ｃ１８疎水性リガンドが移植された架橋アガロースに基づく媒体などの当技術分野で公知の様々なマトリックスの変異体を用いて、逆相クロマトグラフィーを実施することができる。本明細書に記載の方法において有用な市販の疎水性マトリックスとしては、限定されるものではないが、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ、Ｄｉａｎｏｎ  ＨＰ２０ｓｓ、Ｃ１８  ＨｙｐｅｒｓｉｌおよびＳｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣが挙げられる。特定の実施形態においては、ステップ（ｃ）で用いられるマトリックスは、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。特定の態様においては、逆相クロマトグラフィーカラムは、約１０ｃｍ〜約５０ｃｍ、例えば、約１０ｃｍ〜約３０ｃｍのベッド高を有する。特定の態様においては、逆相クロマトグラフィーカラムは、約２５ｃｍのベッド高を有する。
【０１５４】
いくつかの実施形態においては、ウイルス濾過ステップ（ｂ）からのＡｐｏＡ−Ｉ濾液を、１リットルあたり約１〜約２０ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度で、例えば、約１．５ｇ〜約５ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度で、およびより好ましくは約２．５ｇ〜約３．５ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度で逆相カラム上にロードする。特定の態様においては、ステップ（ｂ）からのＡｐｏＡ−Ｉ濾液を、１リットルあたり約３．４ｇの濃度で逆相カラム上にロードする。ＡｐｏＡ−Ｉをロードする前に逆相カラムを平衡化させ、タンパク質がロードの際にカラムに結合することを確実にするために用いることができるバッファー条件は、当業者には容易に確認できる。好ましくは、カラム平衡化バッファーは、カラムのｐＨを約９．５まで低下させることができる強いバッファーである。特定の実施形態においては、平衡化バッファーはＴＡＭＰ  Ｄ（２０ｍＭ炭酸アンモニウム）である。好ましくは、平衡化の後、ステップ（ｂ）からのＡｐｏＡ−Ｉ含有濾液（約８．０のｐＨ）を、１分あたり約０．５ｃｍ〜約５．０ｃｍ、例えば、１分あたり約２．０ｃｍ〜約４．０ｃｍの流速でカラム上にロードする。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有濾液を、１分あたり約２．８ｃｍの流速でカラム上にロードする。
【０１５５】
ステップ（ｃ）においてＡｐｏＡ−Ｉを逆相マトリックスに結合させた後、バッファー中の増加する濃度の有機溶媒の勾配、例えば、ＴＡＭＰ  Ｄバッファー中の約３５％〜約５０％のアセトニトリルへの曝露により、ステップ（ｄ）においてタンパク質を溶出させる。いくつかの態様においては、約６０〜約９０分、例えば、約７０分またはより好ましくは約８０分の時間にわたる約３５％〜約５０％のアセトニトリルの線状勾配を用いて、カラムからＡｐｏＡ−Ｉを溶出させることができる。特定の態様においては、線状勾配の後、５０％のアセトニトリルを用いる約１０分間のアイソクラチック溶出を行う。逆相カラムからＡｐｏＡ−Ｉを溶出させるための正確な条件は、当業者には容易に確認できる。様々な実施形態においては、カラムロード中の約６０％、例えば、約６５％、約７０％、約７５％または約８０％以上のＡｐｏＡ−Ｉが、ステップ（ｄ）におけるカラム溶出液中に存在する。
【０１５６】
特定の態様においては、本明細書に記載の精製方法は、ステップ（ｄ）の後に、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質および完全長タンパク質に由来するトランケートされた形態のＡｐｏＡ−Ｉをさらに除去するために、第２の逆相クロマトグラフィーカラムにステップ（ｄ）からのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ逆相溶出液を通過させるステップ（ｅ）をさらに含む。好ましくは、ステップ（ｄ）からの逆相溶出液を、アポリポタンパク質Ａ−Ｉをマトリックスに結合させる条件下で第２の逆相カラム上にロードする。ステップ（ｅ）における使用のための逆相マトリックスは、ステップ（ｄ）において用いられるものと同じ種類のマトリックスであってもよく、または異なる種類のマトリックスであってもよい。特定の実施形態においては、ステップ（ｅ）において用いられる逆相マトリックスは、Ｃ１８シリカマトリックス、例えば、Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ＳＰ−３００−ＢＩＯ  Ｃ１８マトリックス（３００Å、１０μｍ；ダイソー株式会社）である。ＡｐｏＡ−Ｉをロードする前にＣ１８カラムを平衡化させ、タンパク質がロードの際にカラムに結合することを確実にするために用いることができるバッファー条件は、当業者には容易に確認できる。好ましくは、カラム平衡化バッファーは、カラムのｐＨを約９．５に低下させることができる強いバッファーである。特定の実施形態においては、平衡化バッファーはＴＡＭＰ  Ｅ（１００ｍＭ炭酸アンモニウム）である。様々な実施形態においては、本明細書に記載の精製方法のステップ（ｅ）において用いられる逆相カラムは、約１０ｃｍ〜約５０ｃｍ、例えば、約１０ｃｍ〜約３０ｃｍのベッド高を有する。特定の実施形態においては、ステップ（ｅ）において用いられる逆相カラムは、約２５ｃｍのベッド高を有する。
【０１５７】
様々な実施形態においては、ステップ（ｄ）からのＡｐｏＡ−Ｉ溶出液を、１リットルあたり約０．５ｇ〜約３０ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度で、例えば、約１ｇ〜約１０ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度で、およびより好ましくは約４ｇ〜約５ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度で、Ｃ１８逆相カラム上にロードする。特定の実施形態においては、ステップ（ｄ）からのＡｐｏＡ−Ｉ溶出液を、１リットルあたり約４．７ｇのＡｐｏＡ−Ｉの濃度でＣ１８カラム上にロードする。好ましくは、平衡化後、ステップ（ｄ）からのＡｐｏＡ−Ｉ含有溶出液を、１分あたり約０．５ｃｍ〜約５．０ｃｍ、例えば、１分あたり約１．０ｃｍ〜約３．０ｃｍの流速でカラム上にロードする。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ含有濾液を、１分あたり約２．１ｃｍの流速でカラム上にロードする。
【０１５８】
ステップ（ｅ）においてＡｐｏＡ−Ｉを逆相マトリックスに結合させた後、バッファー中の増加する濃度の有機溶媒の勾配、例えば、ＴＡＭＰ  Ｅバッファー中の約４０％〜約５０％のアセトニトリルを用いて、ステップ（ｆ）においてタンパク質を溶出させる。いくつかの態様においては、約４０％〜約５０％のアセトニトリルの線状勾配を用いて、約４０〜約８０分、例えば、約５０分、約６０分または約７０分の時間にわたってカラムからＡｐｏＡ−Ｉを溶出させる。特定の実施形態においては、約６０分にわたるＴＡＭＰ  Ｅバッファー中の約４０％〜約５０％のアセトニトリルの線状勾配を用いて、逆相マトリックスからＡｐｏＡ−Ｉを溶出させる。特定の態様においては、線状勾配の後、５０％のアセトニトリルを用いる約１５分のアイソクラチック溶出を行う。逆相カラムからＡｐｏＡ−Ｉを溶出させるための正確な条件は、当業者には容易に確認できる。様々な実施形態においては、カラムロード中の約６０％、例えば、約６５％、約７０％、約７５％または約８０％以上のＡｐｏＡ−Ｉが、ステップ（ｆ）においてカラム溶出液中に回収される。
【０１５９】
特定の実施形態においては、有機溶媒を、本明細書に記載の方法のステップ（ｆ）で得られたＡｐｏＡ−Ｉ含有溶出液から除去する。溶媒除去は、限定されるものではないが、ステップ（ｆ）で得られたＡｐｏＡ−Ｉ含有溶出液を濃縮することおよび濃縮液を水性バッファー中に透析濾過することなどの当技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。特定の実施形態においては、ステップ（ｆ）からの溶出液を、ステップ（ｆ）における逆相カラムからの溶出液の容量と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍または約５倍濃縮する。特定の実施形態においては、溶出液を約２．５倍濃縮した後、約１０、１５または２０、好ましくは１５容量の好適な水性バッファーに対して透析濾過する。好適な水性バッファーは、当技術分野で公知である。特に好ましいバッファーは、ＴＡＭＰ  Ｃ（３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）である。
【０１６０】
いくつかの実施形態においては、クロマトグラフィーカラムの順序を逆転させる。
【０１６１】
場合により、濃縮およびバッファー交換の後、水性ＡｐｏＡ−Ｉ溶液をネガティブモード（すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉが陰イオン交換マトリックスに結合しない条件下）での陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製して、残留するＤＮＡおよび他の負に荷電した汚染物質、例えば、宿主細胞タンパク質を除去する（ステップ（ｇ））。いくつかの実施形態においては、陰イオン交換ステップをバッチ様式で実施する。他の実施形態においては、陰イオン交換ステップを、カラムクロマトグラフィーにより実施する。バッチ様式またはカラムクロマトグラフィーにおける使用のための好適な陰イオン交換マトリックスとしては、限定されるものではないが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦまたはステップ（ａ）における使用について上記で考察された陰イオン交換マトリックスのいずれかが挙げられる。特定の態様においては、陰イオン交換膜、例えば、大きい表面積および強い陽イオン電荷を有する膜、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱまたはＭｕｓｔａｎｇ  ＱにＡｐｏＡ−Ｉ溶液を通過させることにより、陰イオン交換ステップを実施する。好ましくは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ陰イオン交換膜（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、陰イオン交換ステップを実施する。特定の態様においては、任意の好適な酸を用いて、この陰イオン交換ステップの前に水性ＡｐｏＡ−Ｉ溶液のｐＨを約５．５、約６．０または約６．５に低下させる。特定の態様においては、希リン酸を用いて水性ＡｐｏＡ−Ｉ溶液のｐＨを約６．０に低下させる。好ましい実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ溶液を、約１２．５Ｌ／ｍ２／ｈでＭｕｓｔａｎｇ  Ｑカートリッジに通過させる。
【０１６２】
いくつかの実施形態においては、陰イオン交換膜濾液を濃縮し、場合により、保存のため、または以下の第６．５．１節に記載のような脂質との複合体化および／もしくは以下の第６．６節に記載のような医薬組成物の製剤化などのＡｐｏＡ−Ｉのさらなるプロセッシングのために好適であるものに溶媒を交換するために透析濾過する。保存のため、またはＡｐｏＡ−Ｉのさらなるプロセッシングのための好適なバッファーは、当業者には容易に確認できる。特定の実施形態においては、精製されたＡｐｏＡ−ＩをＴＡＭＰ  Ｃバッファーに交換する。膜が、バッファーは通過させるが、タンパク質は通過させないように、完全長成熟ＡｐｏＡ−Ｉの分子量より下である分子量カットオフを有する限り、任意の限外濾過膜をこのステップで用いることができる。特定の実施形態においては、１０，０００の名目上の分子量カットオフのポリエーテルスルホン膜（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｏｍｅｇａシリーズ）を用いる。好ましくは、限外濾過後の溶液中のＡｐｏＡ−Ｉ濃度は、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１２ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも２５ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも３５ｇ／Ｌ、少なくとも４０ｇ／Ｌ、少なくとも４５ｇ／Ｌまたは少なくとも５０ｇ／Ｌである。
【０１６３】
６．１．５．アポリポタンパク質生成物
本開示はまた、実質的に純粋な成熟完全長アポリポタンパク質も提供する。本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な」とは、少なくとも９５％純粋であるタンパク質を指す。特定の実施形態においては、実質的に純粋なタンパク質は、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９９％または１００％純粋である。特定の態様においては、本明細書に記載の精製方法により製造された実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、白い背景に対して光源を用いて視覚的に調べた場合、可視粒子を含まない透明からわずかに乳白光を発する無色の溶液である。様々な実施形態においては、上記の第６．１．４節に記載の方法により得られたか、または得られる実質的に純粋なアポリポタンパク質は、以下にさらに詳述するように、少量または検出不可能な量の１つまたは複数の宿主細胞ＤＮＡ、アポリポタンパク質以外のタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）、内毒素、残留溶媒、ならびに低いバイオバーデン(bioburden)（すなわち、試料上または試料中の少数の微生物）を含む。アポリポタンパク質生成物の純度は、限定されるものではないが、Ｎ末端エドマン配列決定、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣおよび／または免疫アッセイなどの当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。
【０１６４】
様々な実施形態においては、本明細書に記載の方法により得られた実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、約２８．１キロダルトンである質量を有する完全長成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉである。生成物中のＡｐｏＡ−Ｉの質量は、限定されるものではないが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳなどの当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。様々な実施形態においては、生成物中のＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が成熟完全長ＡｐｏＡ−Ｉ（例えば、配列番号１のアミノ酸２５〜２６７を含むＡｐｏＡ−Ｉ）である。特定の態様においては、実質的に純粋なＡｐｏＡ−Ｉ生成物は、約１５重量％以下、約１０重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下または約１重量％以下のＮ末端伸長したＡｐｏＡ−Ｉアイソフォーム（例えば、プロＡｐｏＡ−Ｉ）を含む。当業者であれば理解できるように、生成物中の任意のＮ末端伸長したＡｐｏＡ−Ｉは、投与の際に血液中で成熟ＡｐｏＡ−Ｉに迅速に変換される。様々な実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ生成物は、約２５重量％以下、約２０重量％以下、約１５重量％以下、約１０重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、約０．７５重量％以下、約０．５重量％以下、約０．２５重量％以下、または約０．１重量％以下のトランケートされた形態のＡｐｏＡ−Ｉを含む。トランケートされたか、または伸長したＡｐｏＡ−Ｉの量を、例えば、Ｎ末端エドマン配列決定および／もしくはＭＡＬＤＩ−ＭＳならびに／または存在する場合、全てのバンドの総強度に対する精製されたＡｐｏＡ−Ｉバンド領域の強度の比率を決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの泳動および走査により決定することができる。様々な実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ生成物は、約２０重量％以下、約１０重量％以下、約５重量％以下、約４重量％以下、約３重量％以下、約２重量％以下、約１重量％以下、約０．７５重量％以下、約０．５重量％以下、約０．２５重量％以下、または約０．１重量％以下の酸化形態のＡｐｏＡ−Ｉ、特に、Ｍｅｔ１１２位および／またはＭｅｔ１４８位で酸化されたＡｐｏＡ−Ｉを含む。
【０１６５】
特定の実施形態においては、本明細書に記載の方法により製造された実質的に純粋なアポリポタンパク質は、約１００ｐｐｍ（例えば、ｎｇ／ｍｇ）未満、例えば、約７５ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約４０ｐｐｍ未満、約３０ｐｐｍ未満、約２０ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満である量の宿主細胞タンパク質を含む。特定の実施形態においては、実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、約２０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を含む。より好ましくは、アポリポタンパク質生成物は、約１０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を含む。アポリポタンパク質試料中の宿主細胞タンパク質の存在および量は、当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。アポリポタンパク質を、例えば、哺乳動物細胞中で組換え産生させる場合、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｃｙｇｎｕｓ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＫｉｔ  Ｆ０１５）を用いて、宿主細胞タンパク質を検出し、そのレベルを定量することができる。
【０１６６】
いくつかの態様においては、本明細書に記載のように精製された実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、約５０ｐｇ／ｍｇ未満のアポリポタンパク質、例えば、約４０ｐｇ／ｍｇ未満、約３０ｐｇ／ｍｇ未満、約２０ｐｇ／ｍｇ未満、約１０ｐｇ／ｍｇ未満、または約５ｐｇ／ｍｇ未満のアポリポタンパク質である量の宿主細胞ＤＮＡを含む。好ましい実施形態においては、実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、１ｍｇのアポリポタンパク質あたり約１０ｐｇ未満の宿主細胞タンパク質を含む。アポリポタンパク質試料中の宿主細胞ＤＮＡの存在および量は、リアルタイムＰＣＲまたは好ましくは定量的ＰＣＲによる抗ＳＳＢ抗体（Ｇｌｙｃｏｔｙｐｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いる一本鎖結合タンパク質との複合体の検出などの当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。
【０１６７】
特定の実施形態においては、本明細書に記載の方法により製造された実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、アポリポタンパク質１ｍｇあたり、約０．５ＥＵ未満、例えば、約０．４ＥＵ未満、約０．３ＥＵ未満、約０．２ＥＵ未満または約０．１ＥＵ未満である量の内毒素を含む。好ましくは、本明細書に記載の実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、アポリポタンパク質１ｍｇあたり、約０．１ＥＵ未満の内毒素を含む。内毒素の検出および定量を、例えば、グラム陰性細菌内毒素のためのＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）定量試験（Ｃａｍｂｒｅｘ；感度０．１２５ＥＵ／ｍＬ）を用いる当技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。
【０１６８】
本明細書に記載の実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、低いバイオバーデンを有する。用語「バイオバーデン」とは、生成物中の好気性細菌、嫌気性細菌、酵母およびカビのレベルを指す。様々な実施形態において、本明細書に記載のように精製された実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物のバイオバーデンは、１ｍＬあたり、約１ＣＦＵ未満である。バイオバーデン試験は、任意の公知の方法に従って、例えば、European Pharmacopoeia Chapter 2.6.12.B、およびUSB Chapter 61統一方法に従って実施することができる。
【０１６９】
本明細書に記載の実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、少量の残留溶媒を含む。特定の実施形態においては、残留溶媒は、１０ｍｇ／Ｌのアポリポタンパク質について、約５０ｐｐｍ未満、約４５ｐｐｍ未満、約４０ｐｐｍ未満、約３５ｐｐｍ未満、約３０ｐｐｍ未満、約２５ｐｐｍ未満、約２０ｐｐｍ未満、約１５ｐｐｍ未満または約１０ｐｐｍ未満である量で存在する。好ましくは、残留溶媒は、１０ｍｇ／Ｌのアポリポタンパク質について、約４１ｐｐｍ未満である量で存在する。残留溶媒の量は、限定されるものではないが、ＧＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣなどの当技術分野で公知の任意の方法によりアッセイすることができる。
【０１７０】
好ましくは、アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉ（例えば、配列番号１のアミノ酸２５〜２６７を含むＡｐｏＡ−Ｉ）である。いくつかの実施形態においては、成熟ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、１位（すなわち、配列番号１の２５位に対応する位置）にアスパラギン酸を有するアミノ酸配列を有する。
【０１７１】
６．２．脂質画分
本開示のリポタンパク質複合体および組成物は、脂質画分を含む。脂質画分は、１つまたは複数の脂質を含む。様々な実施形態においては、１つまたは複数の脂質は、飽和および／または不飽和および天然または合成の脂質であってよい。脂質画分は、好ましくは少なくとも１つのリン脂質を含む。
【０１７２】
脂質画分中に存在してもよい好適な脂質としては、限定されるものではないが、低分子量アルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン  ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロールホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、パルミトイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、ミルクスフィンゴミエリン、フィトスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテル糖脂質、およびコレステロールならびにその誘導体が挙げられる。合成脂質、例えば、合成パルミトイルスフィンゴミエリンまたはＮ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリンの一形態）を用いて、脂質酸化を最小化することができる。パルミトイルスフィンゴミエリンを含むリン脂質画分は、場合により、限定されるものではないが、リゾリン脂質、パルミトイルスフィンゴミエリン以外のスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、およびコレステロールならびにその誘導体などの少量の任意の種類の脂質を含んでもよい。
【０１７３】
好ましい実施形態においては、脂質画分は、２種類のリン脂質：スフィンゴミエリン（ＳＭ）および負に荷電したリン脂質を含む。ＳＭは、それが生理的ｐＨで約０の正味電荷を有する点で「中性」リン脂質である。用いられるＳＭの同一性は成功にとって重要ではない。かくして、本明細書で用いられる表現「ＳＭ」は、天然の供給源から誘導または取得されたスフィンゴミエリン、ならびに天然のＳＭと同様、ＬＣＡＴによる加水分解に影響されない天然のＳＭの類似体および誘導体を含む。ＳＭは、レシチンと構造的に非常に類似するリン脂質であるが、レシチンと違って、グリセロール骨格を有さず、従って、アシル鎖を結合させるエステル結合を有さない。むしろ、ＳＭはセラミド骨格を有し、アミド結合がアシル鎖を接続する。ＳＭはＬＣＡＴの基質ではなく、一般的にはそれによって加水分解することができない。しかしながら、それはＬＣＡＴの阻害剤として作用するか、または基質であるリン脂質の濃度を希釈することによってＬＣＡＴ活性を低下させることができる。ＳＭは加水分解されないため、それは循環中により長く残存する。この特徴により、本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体はより長い持続時間の生理的効果（コレステロールの移動）を有し、ＳＭを含まないアポリポタンパク質複合体よりも多くの脂質、特に、コレステロールを拾い上げることができると期待される。この効果は、ＳＭを含まないリポタンパク質複合体に必要とされるものよりも治療にとって必要とされる少ない頻度または少ない用量をもたらすことができる。
【０１７４】
ＳＭは、実質的に任意の供給源から取得することができる。例えば、ＳＭはミルク、卵または脳から取得することができる。ＳＭ類似体または誘導体を用いることもできる。有用なＳＭ類似体および誘導体の非限定例としては、限定されるものではないが、パルミトイルスフィンゴミエリン、Ｎ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリンの一形態）、パルミトイルスフィンゴミエリン、ステアロイルスフィンゴミエリン、Ｄ−エリスロ−Ｎ−１６：０−スフィンゴミエリンおよびそのジヒドロ異性体、Ｄ−エリスロ−Ｎ−１６：０−ジヒドロ−スフィンゴミエリンが挙げられる。合成ＳＭ、例えば、合成パルミトイルスフィンゴミエリンまたはＮ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリン）を用いて、動物起源のスフィンゴ脂質よりも少ない汚染物質および／または酸化生成物を含む、より均一な複合体を製造することができる。
【０１７５】
例示的なスフィンゴミエリン、パルミトイルスフィンゴミエリン（palmitoylsphingomyelin）およびフィトスフィンゴミエリン(phytosphingomyelin)を以下に示す。
【０１７６】
【化１】
2014506884.tif 000003
【０１７７】
天然の供給源から単離されたスフィンゴミエリンを、ある特定の飽和または不飽和アシル鎖において人工的に富化することができる。例えば、ミルクスフィンゴミエリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．）は、長い飽和アシル鎖（すなわち、２０個以上の炭素原子を有するアシル鎖）を特徴とする。対照的に、卵スフィンゴミエリンは、短い飽和アシル鎖（すなわち、２０個未満の炭素原子を有するアシル鎖）を特徴とする。例えば、わずかに約２０％のミルクスフィンゴミエリンがＣ１６：０（１６個の炭素、飽和）アシル鎖を含む場合、約８０％の卵スフィンゴミエリンはＣ１６：０アシル鎖を含む。溶媒抽出を用いて、ミルクスフィンゴミエリンの組成を、卵スフィンゴミエリンのものに匹敵するアシル鎖組成を有するように富化させることができ、またはその逆も可能である。
【０１７８】
ＳＭは、それが特定のアシル鎖を有するように半合成であってもよい。例えば、ミルクスフィンゴミエリンを最初にミルクから精製した後、ある特定のアシル鎖、例えば、Ｃ１６：０アシル鎖を切断し、別のアシル鎖により置換することができる。ＳＭはまた、例えば、大規模合成によって全体を合成することもできる。例えば、１９９３年１月１５日に発行された、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎｓ」と題するDongらの米国特許第５，２２０，０４３号；Weis、1999、Chem. Phys. Lipids 102 (l-2):3-12を参照されたい。
【０１７９】
半合成または合成ＳＭを含むアシル鎖の長さおよび飽和レベルを、選択的に変化させることができる。アシル鎖は飽和または不飽和であってもよく、約６〜約２４個の炭素原子を含んでもよい。それぞれの鎖は同じ数の炭素原子を含んでもよく、またはあるいは、それぞれの鎖は異なる数の炭素原子を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、半合成または合成ＳＭは、１つの鎖が飽和であり、１つの鎖が不飽和であるような混合アシル鎖を含む。そのような混合アシル鎖ＳＭでは、鎖の長さは同じであるか、または異なっていてもよい。他の実施形態においては、半合成または合成ＳＭのアシル鎖は、両方とも飽和であるか、または両方とも不飽和である。再度、鎖は同じか、または異なる数の炭素原子を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、半合成または合成ＳＭを含むアシル鎖は両方とも同一である。特定の実施形態においては、鎖は、例えば、オレイン酸、パルミチン酸またはステアリン酸などの天然の脂肪酸のアシル鎖と一致する。別の実施形態においては、飽和または不飽和官能性鎖を有するＳＭが用いられる。別の特定の実施形態においては、アシル鎖は両方とも飽和であり、６〜２４個の炭素原子を含む。半合成および合成ＳＭに含まれ得る一般的に生じる脂肪酸中に存在するアシル鎖の非限定例を、以下の表１に提供する。
【０１８０】
【表１】
2014506884.tif 000004
【０１８１】
好ましい実施形態においては、ＳＭはパルミトイルＳＭ、例えば、Ｃ１６：０アシル鎖を有する合成パルミトイルＳＭであるか、または主成分としてパルミトイルＳＭを含む卵ＳＭである。
【０１８２】
特定の実施形態においては、官能性ＳＭ、例えば、フィトスフィンゴミエリンが用いられる。
【０１８３】
脂質画分は、好ましくは、負に荷電したリン脂質を含む。本明細書で用いられる「負に荷電したリン脂質」は、生理的ｐＨで正味の負の電荷を有するリン脂質である。負に荷電したリン脂質は、単一の種類の負に荷電したリン脂質、または２つ以上の異なる負に荷電したリン脂質の混合物を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、荷電したリン脂質は、負に荷電したグリセロリン脂質である。荷電したリン脂質の同一性は、成功にとって重要ではない。好適な負に荷電したリン脂質の特定例としては、限定されるものではないが、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジン酸が挙げられる。いくつかの実施形態においては、負に荷電したリン脂質は、１つまたは複数のホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよび／またはホスファチジン酸を含む。特定の実施形態においては、負に荷電したリン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、またはＤＰＰＧからなる。
【０１８４】
ＳＭと同様、負に荷電したリン脂質を、天然の供給源から取得するか、または化学的合成により調製することができる。合成の負に荷電したリン脂質を用いる実施形態においては、ＳＭと関連して上記で考察された通り、アシル鎖の同一性を選択的に変化させることができる。本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体のいくつかの実施形態においては、負に荷電したリン脂質上のアシル鎖は両方とも同一である。いくつかの実施形態においては、ＳＭおよび負に荷電したリン脂質上のアシル鎖は全て同一である。特定の実施形態においては、負に荷電したリン脂質、および／またはＳＭは全て、Ｃ１６：０またはＣ１６：１アシル鎖を有する。特定の実施形態においては、ＳＭの脂肪酸部分は主に、Ｃ１６：１パルミトイルである。１つの特定の実施形態においては、荷電したリン脂質および／またはＳＭのアシル鎖は、パルミチン酸のアシル鎖と一致する。
【０１８５】
用いられるリン脂質は、好ましくは少なくとも９５％純粋であり、および／または酸化剤のレベルが低下している。天然の供給源から得られる脂質は、好ましくは、より少ないポリ不飽和脂肪酸部分および／または酸化に影響されにくい脂肪酸部分を有する。試料中の酸化のレベルは、試料１ｋｇあたりの単離されたヨウ素のミリ等価数（ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇと省略される）で表される過酸化物価を提供するヨード還元滴定法を用いて決定することができる。例えば、Gray, J.I.、Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal of the American Oil Chemists Society、Vol. 55、p. 539-545 (1978)；Heaton, F.W.およびUri N.、Improved Iodometric Methods for the Determination of Lipid Peroxides、Journal of the Science of food and Agriculture、vol 9. P, 781-786 (1958)を参照されたい。好ましくは、酸化のレベル、または過酸化物レベルは低い、例えば、５ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、４ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、３ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、または２ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満である。
【０１８６】
ＳＭおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含む脂質画分は、場合により、少量のさらなる脂質を含んでもよい。限定されるものではないが、リゾリン脂質、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、およびコレステロールならびにその誘導体などの実質的に任意の種類の脂質を用いることができる。
【０１８７】
含有される場合、そのような任意選択の脂質は、典型的には脂質画分の約１５ｗｔ％未満を占めるが、いくつかの例においては、より多くの任意選択の脂質が含まれていてもよい。いくつかの実施形態においては、任意選択の脂質は、約１０ｗｔ％未満、約５ｗｔ％未満、または約２ｗｔ％未満を占める。いくつかの実施形態においては、脂質画分は、任意選択の脂質を含まない。
【０１８８】
特定の実施形態においては、リン脂質画分は、９０：１０〜９９：１の範囲、より好ましくは、９５：５〜９８：２の範囲の重量比（ＳＭ：負に荷電したリン脂質）の卵ＳＭまたはパルミトイルＳＭまたはフィトスフィンゴミエリンおよびＤＰＰＧを含有する。一実施形態においては、重量比は９７：３である。
【０１８９】
本開示のリポタンパク質複合体を、様々な治療または診断適用のための疎水性、親油性または非極性活性剤を送達するための担体として用いることもできる。そのような適用のために、脂質画分は、限定されるものではないが、脂肪酸、薬物、核酸、ビタミン、および／または栄養素などの、１つまたは複数の疎水性、親油性または非極性活性剤をさらに含んでもよい。好適な疎水性、親油性または非極性活性剤は、治療的分類によって制限されず、例えば、鎮痛剤、抗炎症剤、駆虫剤(antihelmimthic)、抗不整脈剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、凝固防止剤、抗鬱剤、抗糖尿病剤、抗てんかん剤、抗真菌剤、抗痛風剤、抗高血圧剤、抗マラリア剤、抗片頭痛剤、抗ムスカリン剤、抗新生物剤、勃起障害改善剤、免疫抑制剤、抗原虫剤、抗甲状腺剤、精神安定剤、鎮静剤、睡眠剤、神経弛緩剤、β−遮断剤、強心剤、コルチコステロイド、利尿剤、抗パーキンソン病剤、胃腸剤、ヒスタミン受容体拮抗剤、角質溶解剤、脂質調節剤、抗狭心症剤、ｃｏｘ−２阻害剤、ロイコトリエン阻害剤、マクロライド、筋弛緩剤、栄養剤、核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ）、オピオイド性鎮痛剤、プロテアーゼ阻害剤、性ホルモン、刺激剤、筋弛緩剤、抗骨粗鬆症剤、抗肥満剤、認知機能増強剤、抗尿失禁剤、栄養油、抗良性前立腺肥大剤、必須脂肪酸、非必須脂肪酸、およびその混合物などであってよい。
【０１９０】
好適な疎水性、親油性または非極性活性剤の特定の非限定例は、アセトレチン、アルベンダゾール、アルブテロール、アミノグルテチミド、アミオダロン、アムロジピン、アンフェタミン、アンホテリシンＢ、アトルバスタチン、アトバクオン、アジスロマイシン、バクロフェン、ベクロメタゾン、ベンゼプリル、ベンゾナテート、ベタメタゾン、ビカルタニド、ブデゾニド、ブプロピオン、ブスルファン、ブテナフィン、カルシフェジオール、カルシポトリエン、カルシトリオール、カンプトテシン、カンデサルタン、カプサイシン、カルバメゼピン、カロテン、セレコキシブ、セリバスタチン、セチリジン、クロルフェニラミン、コレカルシフェロール、シロスタゾール、シメチジン、シナリジン、シプロフロキサシン、シサプリド、クラリスロマイシン、クレマスチン、クロミフェン、クロミプラミン、クロピドグレル、コデイン、コエンザイムＱ１０、シクロベンザプリン、シクロスポリン、ダナゾール、ダントロレン、デキスクロルフェニラミン、ジクロフェナク、ジクマロール、ジゴキシン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロエルゴタミン、ジヒドロタキステロール、ジリスロマイシン、ドネゼピル、エファビレンズ、エポサルタン、エルゴカルシフェロール、エルゴタミン、必須脂肪酸源、エトドラク、エトポシド、ファモチジン、フェノフィブラート、フェンタニル、フェキソフェナジン、フィナステリド、フルコナゾール、フルビプロフェン、フルバスタチン、フォスフェニトイン、フロバトリプタン、フラゾリドン、ガバペンチン、ゲンフィブロジル、グリベンクラミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリセオフルビン、ハロファントリン、イブプロフェン、イルベサルタン、イリノテカン、二硝酸イソソルビド、イソトレチノイン、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケトロラック、ラモトリジン、ランソプラゾール、レフルノミド、リシノプリル、ロペラミド、ロラタジン、ロバスタチン、Ｌ−チロキシン、ルテイン、リコペン、メドロキシプロゲステロン、ミフェプリストン、メフロキン、酢酸メゲストロール、メタドン、メトキサレン、メトロニダゾール、ミコナゾール、ミダゾラム、ミグリトール、ミノキシジル、ミトキサントロン、モンテルカスト、ナブメトン、ナルブフィン、ナラトリプタン、ネルフィナビル、ニフェジピン、ニルソリジピン、ニルタニド、ニトロフラントイン、ニザチジン、オメプラゾール、オプレベルキン、エストラジオール、オキサプロジン、パクリタキセル、パラカルシトール、パロキセチン、ペンタゾシン、ピオグリタゾン、ピゾフェチン、プラバスタチン、プレドニゾロン、プロブコール、プロゲステロン、プソイドエフェドリン、ピリドスチグミン、ラベプラゾール、ラロキシフェン、ロフェコキシブ、レパグリニド、リファブチン、リファペンチン、リメキソロン、リタノビル、リザトリプタン、ロシグリタゾン、サキナビル、セルトラリン、シブトラミン、クエン酸シルデナフィル、シンバスタチン、シロリムス、スピロノラクトン、スマトリプタン、タクリン、タクロリムス、タモキシフェン、タムスロシン、タルグレチン、タザロテン、テルミサルタン、テニポシド、テルビナフィン、テラゾシン、テトラヒドロカナビノール、チアガビン、チクロピジン、チロフィブラン、チザニジン、トピラメート、トポテカン、トレミフェン、トラマドール、トレチノイン、トログリタゾン、トロバフロキサシン、ウビデカレノン、バルサルタン、ベンラファキシン、ベルテポルフィン、ビガバトリン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ザフィルルカスト、ジロートン、ゾルミトリプタン、ゾルピデム、およびゾピクロンである。上記薬剤の塩、異性体および誘導体、ならびに混合物を用いることもできる。
【０１９１】
６．３．リポタンパク質複合体
本開示は、それぞれの組成が上記の第６．１節および第６．２節にそれぞれ記載された、タンパク質画分と脂質画分とを含むリポタンパク質複合体を提供する。
【０１９２】
一般に、タンパク質画分は、治療的および／または予防的利益を提供するアポリポタンパク質および／またはその誘導体もしくは類似体などの１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含む。複合体は、単一の種類の脂質結合タンパク質、または同じか、もしくは異なる種から誘導することができる２種以上の異なる脂質結合タンパク質の混合物を含んでもよい。好適な脂質結合タンパク質は、第６．１節に上記されている。必要ではないが、リポタンパク質複合体は、好ましくは、療法に対する免疫応答を誘導することを避けるために、治療される動物種から誘導されたか、またはアミノ酸配列においてそれと一致する脂質結合タンパク質を含む。かくして、ヒト患者の治療のためには、ヒト起源の脂質結合タンパク質が本開示の複合体において好ましく用いられる。ペプチド模倣アポリポタンパク質の使用も、免疫応答を低下させるか、または回避することができる。
【０１９３】
高純度を有する（例えば、成熟し、トランケートされておらず、酸化されておらず、脱アミド化されておらず、内毒素で汚染されておらず、および／または他のタンパク質もしくは核酸で汚染されていない）アポリポタンパク質の使用は、リポタンパク質複合体の治療効力を増強し、および／またはその安全性を増強すると考えられる。従って、タンパク質画分は、場合により、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、もしくは約０％の酸化メチオニン−１１２もしくはメチオニン−１４８、および／または１５％以下、１０％以下、５％以下、または約０％の脱アミノ化アミノ酸を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％成熟した完全長ＡｐｏＡ−Ｉを含んでもよい。アポリポタンパク質は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って精製することができる。好ましくは、アポリポタンパク質を、第６．１．４節に記載のように作製することができる。
【０１９４】
特定の実施形態においては、タンパク質画分は、ＡｐｏＡ−Ｉ、例えば、第６．１．５節に上記された実質的に純粋な成熟した完全長ＡｐｏＡ−Ｉを含むか、または本質的にそれからなる。
【０１９５】
脂質画分は、飽和、不飽和、天然および合成の脂質および／またはリン脂質であってよい１つまたは複数の脂質を含む。好適な脂質としては、限定されるものではないが、低分子アルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン  ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロールホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、ミルクスフィンゴミエリン、フィトスフィンゴミエリン、パルミトイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテル糖脂質、およびコレステロールならびにその誘導体が挙げられる。ＳＭおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含むリン脂質画分は、場合により、限定されるものではないが、リゾリン脂質、パルミトイルスフィンゴミエリン以外のスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、およびコレステロールならびにその誘導体などの少量の任意の種類の脂質を含んでもよい。合成パルミトイルスフィンゴミエリンまたはＮ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリン）などの合成脂質が好ましい。さらなる脂質は、上記の第６．２節に記載されている。好ましくは、リポタンパク質複合体は、スフィンゴミエリンを含む。
【０１９６】
場合により、本開示のリポタンパク質複合体に、様々な治療または診断適用のために、限定されるものではないが、脂肪酸、薬物、核酸、ビタミン、および／または栄養素などの疎水性、親油性または非極性活性剤をロードすることができる。好適な薬剤は、上記の第６．２節に記載されている。
【０１９７】
リポタンパク質複合体を、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて作製することができる。好ましくは、複合体は第６．５．１〜６．５．４節に記載のように作製される。
【０１９８】
本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体の脂質画分とタンパク質画分とのモル比は変化してもよく、他の因子の中でも特に、タンパク質画分を含むアポリポタンパク質の同一性、脂質画分を含む荷電したリン脂質の同一性および量、ならびに荷電したリポタンパク質複合体の所望のサイズに依存する。ＡｐｏＡ−Ｉなどのアポリポタンパク質の生物活性はアポリポタンパク質を含む両親媒性へリックスにより媒介されると考えられるので、脂質：アポリポタンパク質モル比のアポリポタンパク質画分をＡｐｏＡ−Ｉタンパク質当量を用いて表すのが都合が良い。へリックスを算出するのに用いられる方法に応じて、ＡｐｏＡ−Ｉは６〜１０個の両親媒性へリックスを含有することが一般に受け入れられている。他のアポリポタンパク質は、それらが含有する両親媒性へリックスの数に基づくＡｐｏＡ−Ｉ当量を単位として表すことができる。例えば、典型的にはジスルフィド架橋した二量体として存在するＡｐｏＡ−ＩＭは、ＡｐｏＡ−ＩＭの各分子がＡｐｏＡ−Ｉの分子の２倍の両親媒性へリックスを含有するため、２ＡｐｏＡ−Ｉ当量と表すことができる。逆に、単一の両親媒性へリックスを含有するペプチドアポリポタンパク質は、各分子がＡｐｏＡ−Ｉの分子の１／１０〜１／６の両親媒性へリックスを含有するため、１／１０〜１／６ＡｐｏＡ−Ｉ当量と表すことができる。一般に、リポタンパク質複合体の脂質：ＡｐｏＡ−Ｉ当量モル比（本明細書では「Ｒｉ」と定義される）は、約１０５：１〜１１０：１の範囲である。いくつかの実施形態においては、Ｒｉは約１０８：１である。リン脂質については約６５０〜８００のＭＷを用いて重量の比を得ることができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態においては、脂質：ＡｐｏＡ−Ｉ当量のモル比（「ＲＳＭ」）は、約８０：１〜約１１０：１、例えば、約８０：１〜約１００：１の範囲である。特定の例においては、リポタンパク質複合体に関するＲＳＭは、約８２：１であってよい。
【０２００】
負に荷電したリポタンパク質複合体を含む様々なアポリポタンパク質および／またはリン脂質分子を、安定なアイソトープ（例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈなど）；放射性アイソトープ（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉなど）；フルオロフォア；化学発光剤；または酵素マーカーなどの任意の当技術分野で公知の検出可能なマーカーで標識することができる。
【０２０１】
好ましい実施形態においては、リポタンパク質複合体は、好ましくは成熟完全長ＡｐｏＡ−Ｉであるタンパク質画分と、中性リン脂質、スフィンゴミエリン（ＳＭ）および負に荷電したリン脂質を含む脂質画分とを含む負に荷電したリポタンパク質複合体である。
【０２０２】
リポタンパク質複合体の脂質画分を含むＳＭと負に荷電したリン脂質との組成および相対量は、複合体を含む組成物の均一性および安定性に影響することが発見された。実施例の節に例示されるように、脂質画分がＳＭおよび負に荷電したリン脂質から構成される複合体を含む組成物は、脂質画分がＳＭに加えてＤＰＰＣを含む同様の組成物よりも均一であり、安定である。
【０２０３】
かくして、ＳＭおよび負に荷電した脂質を含有する本開示の複合体は、好ましくはその均一性および安定性を改善するためにレシチンの非存在下で形成される。一度、ＳＭおよび負に荷電した脂質を含有する均一な複合体が形成されたら、レシチンなどのさらなる脂質を組み込ませることができる。
【０２０４】
含有される場合、任意選択の脂質は、典型的には、脂質画分の約１５％未満を占めるが、いくつかの例においては、より多くの任意選択の脂質を含有させることができる。いくつかの実施形態においては、任意選択の脂質は、約１０ｗｔ％未満、約５ｗｔ％未満、または約２ｗｔ％未満を占める。いくつかの実施形態においては、負に荷電したリポタンパク質複合体の脂質画分は、任意選択の脂質を含まない。
【０２０５】
特定の実施形態においては、リン脂質画分は、９０：１０〜９９：１の範囲、より好ましくは９５：５〜９８：２の範囲、例えば、９７：３の重量比（ＳＭ：負に荷電したリン脂質）の卵ＳＭまたはパルミトイルＳＭまたはフィトＳＭおよびＤＰＰＧを含有する。
【０２０６】
いくつかのアポリポタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、あるリポタンパク質複合体から別のものに交換される（これはアポリポタンパク質ＡｐｏＡ−Ｉに当てはまる）。そのような交換の過程の間に、アポリポタンパク質は、典型的にはそれと共に１つまたは複数のリン脂質分子を担持する。この特性のため、本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体は、負に荷電したリン脂質を内因性ＨＤＬに「播種」し、それによって、腎臓による排除に対してより耐性であるα粒子にそれらを変換すると予想される。かくして、負に荷電したリポタンパク質複合体および本明細書に記載の組成物の投与は、ＨＤＬの血清レベルを増加させ、および／または内因性ＨＤＬの半減期ならびに内因性ＨＤＬ代謝を変化させると予想される。これはコレステロール代謝および逆脂質輸送の変化をもたらすと予想される。
【０２０７】
実施例の節に例示されるように、ＡｐｏＡ−Ｉ：ＳＭおよびＤＰＰＧリン脂質の重量比が約１：２．７である複合体を含む組成物は、他の重量：重量比を有する同様の組成物よりも均一であり、安定であった。従って、本開示は、タンパク質：脂質重量比が複合体の均一な集団の形成のために最適化されたリポタンパク質組成物を提供する。この重量：重量比は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭおよびＤＰＰＧの複合体について、ならびに同様の分子量の成分の複合体について、１：２．６〜１：３の範囲であり、最適には１：２．７である。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質画分と脂質画分との比は、典型的には約１：２．７〜約１：３の範囲であり、１：２．７が好ましい。これは、約１：９０〜１：１４０の範囲のＡｐｏＡ−Ｉとリン脂質とのモル比に対応する。従って、本開示は、タンパク質と脂質とのモル比が約１：９０〜約１：１２０、約１：１００〜約１：１４０、または約１：９５〜約１：１２５である複合体を提供する。具体的には、この最適化された比では、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質画分とＳＭおよびＤＰＰＧ脂質画分は、それぞれカラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動によりアッセイされた場合、天然のＨＤＬと同じサイズおよび電荷特性を有する実質的に均一な複合体を形成する。
【０２０８】
負に荷電したリポタンパク質複合体のサイズを、Ｒｉを変化させることにより制御することができる。すなわち、Ｒｉが小さくなるほど、ディスクが小さくなる。例えば、大きい円盤状ディスクは、典型的には約２００：１〜１００：１の範囲のＲｉを有するが、小さい円盤状ディスクは、典型的には約１００：１〜３０：１の範囲のＲｉを有する。
【０２０９】
いくつかの特定の実施形態においては、負に荷電したリポタンパク質複合体は、２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量（例えば、２〜４分子のＡｐｏＡ−Ｉ、１〜２分子のＡｐｏＡ−ＩＭ二量体または１２〜４０の単一へリックスペプチド分子）、１分子の負に荷電したリン脂質および４００分子のＳＭを含有する大きい円盤状ディスクである。他の特定の実施形態においては、負に荷電したリポタンパク質複合体は、２〜４ＡｐｏＡ−Ｉ当量；１〜１０、より好ましくは３〜６分子の負に荷電したリン脂質；および９０〜２２５分子、より好ましくは１００〜２１０分子のＳＭを含有する小さい円盤状ディスクである。
【０２１０】
６．３．１．複合体および粒径の測定
リポタンパク質複合体の組成、ならびにそのサイズおよびリポタンパク質複合体の調製において用いられる脂質粒子のものを、当技術分野で公知の様々な技術を用いて決定することができる。
【０２１１】
溶液中のリポタンパク質複合体のタンパク質および脂質濃度を、限定されるものではないが、タンパク質およびリン脂質アッセイ、クロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ、ゲル濾過、質量分析、ＵＶまたはダイオードアレイなどの様々な検出器を備えたＧＣ、蛍光、弾性光散乱など当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。また、脂質およびタンパク質の強度を、同じクロマトグラフィー技術ならびにペプチドマッピング、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動、ＡｐｏＡ−ＩのＮ−およびＣ−末端配列決定、ならびに脂質酸化を決定するための標準的なアッセイにより決定することもできる。
【０２１２】
リポタンパク質複合体ならびにリポタンパク質複合体の調製において用いられる脂質粒子は、本明細書に記載のサイズの範囲であってよい。脂質粒径ならびに／または脂質およびタンパク質複合体サイズを、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。例示的な方法としては、動的光散乱およびゲル浸透クロマトグラフィーが挙げられる。
【０２１３】
光子相関分光法としても知られる動的光散乱（ＤＬＳ）は、ブラウン運動により溶液中で移動する粒子に衝突する光線の波長のシフトを測定する。具体的には、レーザーにより照らされた場合、移動する粒子は光を散乱し、散乱光における得られた強度の変動を用いて、溶液中の球状サイズ分布を算出することができる。Zetasizer Nano Series User Manual, MAN0317 Issue 2.1 (July 2004)を参照されたい。ＤＬＳは、粒子体積および数分布および平均を算出することができることに基づいて、溶液中の粒子の強度分布および平均を決定する。ＤＬＳ技術を用いて、リポタンパク質複合体を作製するのに用いられる脂質粒子のサイズ、ならびにリポタンパク質複合体自体のサイズを決定することができる。好適なＤＬＳ装置は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏである。
【０２１４】
また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、タンパク質を含有する複合体のサイズを決定することもできる。ゲル浸透クロマトグラフィーは、分子サイズに基づいて混合物中の成分を分離するものである。典型的には、補正曲線との比較により、脂質−タンパク質複合体の溶出プロフィールと既知の標準物または参考試料のものとを比較することにより、該複合体のサイズを決定することができる。参考試料は市販されており、タンパク質と、アルブミン、フェリチン、およびビタミンＢ１２などの非タンパク質標準物との両方を含んでもよい。Current Protocols in Molecular Biology (1998)、Section IV、10.9.1-10.9.2。
【０２１５】
本開示のリポタンパク質複合体の調製において有用な脂質粒子は、ＤＬＳによって測定された場合（例えば、強度に基づく測定を用いる）、少なくとも４５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも５５ｎｍ、少なくとも６０ｎｍのサイズであってよい。さらに、脂質粒子は、ＤＬＳにより測定された場合、最大で６５ｎｍ、最大で７０ｎｍ、最大で８０ｎｍ、最大で９０ｎｍ、最大で１００ｎｍ、最大で１２０ｎｍ、最大で１５０ｎｍ、最大で２００ｎｍ、最大で２５０ｎｍ、最大で３００ｎｍ、または最大で５００ｎｍのサイズであってよい。
【０２１６】
本開示のリポタンパク質複合体は、本明細書に記載の技術により測定された場合、４ｎｍ〜１５ｎｍ、６ｎｍ〜１５ｎｍ、４ｎｍ〜１２ｎｍ、５〜１２ｎｍ、６ｎｍ〜１２ｎｍ、８ｎｍ〜１２ｎｍ、または８ｎｍ〜１０ｎｍの範囲のサイズであってよい。
【０２１７】
６．４．リポタンパク質複合体の集団
本開示は、本明細書に記載のリポタンパク質複合体の集団をさらに提供する。集団は、例えば、上記の第６．３節に記載のようなタンパク質画分および脂質画分をそれぞれ含む、本明細書に記載の複数のリポタンパク質複合体を含む。本出願人は、リポタンパク質複合体の集団の効力および安全性プロフィールに個別に、または組み合わせて寄与すると考えられるいくつかの特徴を発見した。リポタンパク質複合体の集団は、本明細書に記載の任意の数の特徴を単独で、または組み合わせて含んでもよい。
【０２１８】
第１に、集団中のリポタンパク質複合体の均一性、すなわち、集団中のリポタンパク質複合体の１つまたは複数の個別のピークにより示されるような、集団中の１つまたは複数の個別のリポタンパク質複合体の優勢性、および成熟した非改変アポリポタンパク質のリポタンパク質複合体における優勢性が、効力を増加させると考えられる。従って、リポタンパク質複合体の集団は、アポリポタンパク質、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉを含むか、または本質的にそれからなるタンパク質画分と、脂質画分とを含んでもよく、その集団は、ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピーク中の集団のパーセントにより測定された場合、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％均一である。
【０２１９】
いくつかの実施形態においては、集団中のリポタンパク質複合体のサイズは、４ｎｍ〜１５ｎｍ、例えば、５ｎｍ〜１２ｎｍ、６ｎｍ〜１５ｎｍ、または８ｎｍ〜１０ｎｍの範囲であってよい。
【０２２０】
集団中のアポリポタンパク質、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉは、成熟した、好ましくは完全長（トランケートされていない）のＡｐｏＡ−Ｉであってよく、集団は少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％の成熟した、好ましくは完全長（トランケートされていない）のＡｐｏＡ−Ｉを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、集団は、２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、もしくは５重量％以下の未熟な、もしくは不完全にプロセッシングされたＡｐｏＡ−Ｉおよび／または２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、もしくは５重量％以下のトランケートされたＡｐｏＡ−Ｉを含む。
【０２２１】
第２に、リポタンパク質複合体の純度とも呼ばれる、複合体中のアポリポタンパク質および脂質の純度ならびにリポタンパク質複合体中の汚染物質の相対的非存在は、肝臓酵素（例えば、トランスアミナーゼ）の増加により反映される、肝臓損傷などの副作用のリスクを低下させると考えられる。アポリポタンパク質の純度を、酸化および／または脱アミド化の相対的欠如により測定することができる。従って、特定の実施形態においては、リポタンパク質複合体の集団は、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下の酸化メチオニン、特に、メチオニン−１１２もしくはメチオニン−１４８、または１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下もしくは１％以下の酸化トリプトファンなどの、少量の酸化アポリポタンパク質を有してもよい。リポタンパク質複合体の集団はまた、低いパーセンテージの脱アミド化アミノ酸、例えば、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の脱アミノ化アミノ酸を有してもよい。
【０２２２】
また、リポタンパク質複合体中の脂質の純度を制御することも望ましい。従って、いくつかの実施形態においては、前記集団中の５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下の脂質が酸化される。
【０２２３】
前記複合体およびその集団の純度の別の尺度は、アポリポタンパク質を製造するか、もしくは精製する方法またはリポタンパク質複合体自体を作製する方法の結果生じる汚染物質の減少、またはその非存在である。従って、アポリポタンパク質が宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞から精製される場合、リポタンパク質複合体の集団は、好ましくは宿主細胞ＤＮＡまたはタンパク質を含まない。特定の実施形態においては、前記集団は、リポタンパク質１ミリグラムあたり、５００ナノグラム以下、２００ナノグラム以下、１００ナノグラム以下、５０ナノグラム以下、もしくは２０ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質、および／またはリポタンパク質、典型的には、ＡｐｏＡ−Ｉの１ミリグラムあたり、１００ピコグラム以下、５０ピコグラム以下、２５ピコグラム以下、１０ピコグラム以下もしくは５ピコグラムの宿主細胞ＤＮＡを含有する。
【０２２４】
生じ得る、および回避すべき他の汚染物質は、特に、細胞培養物および血漿試料中に存在し得る内毒素、ならびにリポタンパク質複合体を作製および／または精製するのに用いられるプロセスに応じて存在し得る溶媒および洗剤である。リポタンパク質複合体の集団は、リポタンパク質、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉの１ミリグラムあたり最大でも約１ＥＵ、約０．５ＥＵ、約０．３ＥＵ、または約０．１ＥＵの内毒素を含有してもよい。また、リポタンパク質複合体の集団は、２００ｐｐｍ以下、２５０ｐｐｍ以下、１００ｐｐｍ以下の非水性溶媒の含有に限定され得る。特定の実施形態においては、集団は、任意の洗剤、例えば、コール酸塩を含有しない。
【０２２５】
さらに、本明細書に開示される方法を用いて、アポリポタンパク質出発材料のほとんどを複合体中に組み込み、集団中に存在する非複合体化アポリポタンパク質の量を制限することができる。非複合体アポリポタンパク質の量の減少は、それが異種タンパク質への曝露に起因する免疫原性応答のリスクを低下させる点で有益である。リポタンパク質複合体の集団は、タンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％がリポタンパク質複合体、すなわち、複合体形態にある組成物にあってもよい。場合により、リポタンパク質複合体の集団は、脂質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％がリポタンパク質複合体にある組成物にあってもよい。
【０２２６】
場合により、前記集団は、脂質画分が脂質重量の１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０％のコレステロールを含む複合体を含んでもよい。
【０２２７】
特定の脂質およびタンパク質成分は、複数の異なるが均一なリポタンパク質複合体を形成してもよい。従って、本開示はまた、異なる量のアポリポタンパク質分子（例えば、２、３もしくは４個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量）を含むリポタンパク質複合体の２、３または４つの集団を含む組成物も提供する。例示的な実施形態においては、組成物は、それぞれ、第１の集団がリポタンパク質複合体あたり２個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含み、第２の集団がリポタンパク質複合体あたり３または４個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含み、場合により、第３の集団がリポプロタンパク質複合体あたり４または３個のＡｐｏＡ−Ｉ分子またはＡｐｏＡ−Ｉ当量を有するリポタンパク質複合体を含む、２つのリポタンパク質複合体集団を含む。
【０２２８】
リポタンパク質複合体の２つ以上の集団を含む組成物は、好ましくは、低レベルの非複合体化リポタンパク質および／または脂質を有する。従って、好ましくは、組成物中の脂質の１５％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、もしくは１％以下が非複合体化形態にあり、および／または組成物中のリポタンパク質の１５％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、もしくは１％以下が非複合体化形態にある。
【０２２９】
また、治療目的のためのリポタンパク質複合体の大規模製造などの、商業適用にとって特に有用である、リポタンパク質複合体、またはその集団の大規模調製物も本明細書に提供される。本明細書で想定される調製物は、本明細書に記載のように、リポタンパク質複合体、例えば、負に荷電したリポタンパク質複合体の集団を含む。
【０２３０】
調製物は、商業規模での、組成物、例えば、医薬組成物および剤形の製造にとって好適なリポタンパク質複合体の容量、量およびその結果得られる濃度で提供される。典型的な調製物の容量は、約５Ｌ〜約５０Ｌ以上、例えば、約１０Ｌ〜約４０Ｌ、約１５Ｌ〜約３５Ｌ、約１５Ｌ〜約３０Ｌ、約２０Ｌ〜約４０Ｌ、約２０Ｌ〜約３０Ｌ、約２５Ｌ〜約４５Ｌ、約２５Ｌ〜約３５Ｌの範囲である。調製物は、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１１Ｌ、約１２Ｌ、約１３Ｌ、約１４Ｌ、約１５Ｌ、約１６Ｌ、約１７Ｌ、約１８Ｌ、約１９Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ、約３０Ｌ、約３５Ｌ、約４０Ｌ、約４５Ｌ、または約５０Ｌの容量を有してもよい。好ましい実施形態においては、調製物は、約２０Ｌの容量を有する。
【０２３１】
調製物はさらに、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、または約８ｍｇ／ｍＬ〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲のアポリポタンパク質のアポリポタンパク質濃度を達成するのに十分な量の、リポタンパク質複合体、またはその集団を含有する。調製物の容量に応じて、量は約２５ｇ〜約３５０ｇの範囲であってよく、調製物中のアポリポタンパク質、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉの量として表される。特定の実施形態においては、調製物は、約８ｍｇ／ｍＬのＡｐｏＡ−Ｉを含有する。
【０２３２】
特定の実施形態においては、調製物は、１５Ｌ〜２５Ｌの容量を有し、約１００ｇ〜約２５０ｇのＡｐｏＡ−Ｉを含有する。別の特定の実施形態においては、調製物は、３０Ｌ〜５０Ｌの容量を有し、約２４０ｇ〜約７８０ｇのＡｐｏＡ−Ｉを含有する。
【０２３３】
６．５．リポタンパク質複合体の作製方法
６．５．１．熱サイクリングに基づくリポタンパク質複合体の作製方法
本明細書に記載のタンパク質および脂質成分の熱サイクリングを用いる方法を用いて、他の方法と比較して利点を有するリポタンパク質複合体を生成することができることが発見された。本明細書に提供される熱サイクリング法においては、タンパク質成分および脂質成分は、タンパク質成分の大部分（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）が脂質成分と複合体化されてリポタンパク質複合体を形成するまで熱サイクリングにかけられる。当業者には明らかなように、リポタンパク質複合体の製造のための他の方法と比較した本発明の方法の利点としては、含まれる副生成物（例えば、非複合体化タンパク質）が少ないか、全くない、または得られる生成物中に存在する製造不純物（例えば、洗剤もしくは界面活性剤、分解されたタンパク質、酸化された成分）を含まない、実質的に均一で純粋な最終生成物をもたらす高い複合体化効率、費用が高く、無駄の多い精製ステップの必要性の回避が挙げられる。かくして、前記方法は効率的であり、出発材料の無駄が皆無かそれに近い。さらに、プロセスはスケールアップが容易であり、装備費用が低い。工業用溶媒を用いずにこれらのプロセスを実行する能力は、それらを環境に優しくもする。
【０２３４】
好ましくは、タンパク質および脂質成分の酸化を最小化するために、複合体形成の１、１を超える、または全てのステップ（脂質成分の均一化など）を、不活性ガス（例えば、窒素、アルゴンまたはヘリウム）ブランケット下で実行する。
【０２３５】
６．５．２．脂質成分
本開示の熱サイクリング法は、上記の第６．２節に記載のように、飽和、不飽和、天然および合成の脂質および／またはリン脂質などの様々な脂質を単独で、または組み合わせて用いることができる。
【０２３６】
多層ベシクル（「ＭＬＶ」）、小単層ベシクル（「ＳＵＶ」）、大単層ベシクル（「ＬＵＶ」）、ミセル、分散物などの脂質粒子を生成する任意の方法を用いて、タンパク質成分を用いる熱サイクリングのために脂質を調製することができる。
【０２３７】
脂質粒子を製造するための様々な技術が公知である。脂質粒子は、様々な種類のベシクルを形成する様々なプロトコルを用いて製造されてきた。本開示の熱サイクリング法において用いられる粒子は、主に４５〜８０ｎｍのサイズ範囲が好ましく、最も好ましくは、５５ｎｍ〜７５ｎｍのサイズ範囲にある。
【０２３８】
高圧均一化、例えば、マイクロフルイダイゼーションは、好適なサイズの脂質粒子を有利に生成する。均一化圧力は、好ましくは、少なくとも１，０００ｂａｒ、少なくとも１，２００ｂａｒ、少なくとも１，４００ｂａｒ、少なくとも１，６００ｂａｒ、少なくとも１，８００ｂａｒであり、最も好ましくは、少なくとも２，０００ｂａｒ、例えば、少なくとも２，２００ｂａｒ、少なくとも２，４００ｂａｒ、少なくとも２，６００ｂａｒ、少なくとも２，８００ｂａｒ、少なくとも３，０００ｂａｒ、少なくとも３，２００ｂａｒ、少なくとも３，４００ｂａｒ、少なくとも３，６００ｂａｒ、少なくとも３，８００ｂａｒ、または少なくとも４，０００ｂａｒである。特定の実施形態においては、均一化圧力は、前記値の任意の対の間の範囲、例えば、１，６００〜３，２００ｂａｒ；１，８００〜２，８００ｂａｒ；１，９００〜２，５００ｂａｒ；２，０００〜２，５００ｂａｒ；２，０００〜３，０００ｂａｒ；２，４００〜３，８００ｂａｒ；２，８００〜３，４００ｂａｒなどである。１ｂａｒは、１００ｋＰａ、１，０００，０００ダイン／平方センチメートル（バーリー）、０．９８７ａｔｍ（気圧）、１４．５０３８ｐｓｉ、２９．５３ｉｎＨｇおよび７５０．０６ｔｏｒｒに等しい。
【０２３９】
１つの好適な均一化方法においては、脂質の乳濁液を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ）の供給容器中に移す。ユニットを浴中に浸して、均一化中のプロセス温度（例えば、５５℃、５８℃、６２℃など）を維持し、使用前にアルゴンなどの不活性ガスでフラッシュする。プライミング後、乳濁液を、相互作用ヘッド(interaction head)にわたって圧力勾配で５〜２０分間、連続的再利用でホモジェナイザーに通過させる。タンパク質成分の非存在下での脂質成分の均一化は、均一化技術において用いられる高剪断によるタンパク質成分の破壊を回避する。
【０２４０】
好適なサイズの粒子を得ることができるという条件で、他の方法を好適に用いることができる。例えば、水性溶液による脂質の水和は、脂質の分散および多層ベシクル（「ＭＬＶ」）の同時形成をもたらし得る。ＭＬＶは、中央の水性コアを取り囲む複数の脂質二重層を有する粒子である。これらの種類の粒子は、小単層ベシクル（ＳＵＶ）よりも大きく、直径３５０〜４００ｎｍであってよい。ＭＬＶは、丸底フラスコ中でクロロホルム中に脂質を可溶化し、脂質がフラスコの壁面上に薄い層を形成するまで、クロロホルムを蒸発させることにより調製することができる。水性溶液を添加し、脂質層を再び水和させる。フラスコで形成されたベシクルを回転させるか、またはボルテックスする。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (Banghamら、1965、J. Mol. Biol. 13:238を引用する）。また、この方法を用いて、単層ベシクルを生成させることもできる。Johnsonら、1971、Biochim. Biophys. Acta 233:820。
【０２４１】
小単層ベシクル（ＳＵＶ）は、水性コアを包み込む単一の脂質二重層を有する粒子である。ＳＵＶを生成するのに用いられる方法に応じて、それらは直径２５〜１１０ｎｍの範囲のサイズであってよい。初めてのＳＵＶは、窒素下でクロロホルム中のリン脂質調製物を乾燥させ、水性層を添加してミリモル範囲の脂質濃度をもたらし、その溶液を４５℃で清澄まで超音波処理することにより調製された。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York。この様式で調製されたＳＵＶは、直径２５〜５０ｎｍの範囲の粒子をもたらす。
【０２４２】
ＳＵＶを作製する別の方法は、エタノール／脂質溶液を、封入しようとする水性溶液中に急速に注入することである。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.)、Marcel Dekker, Inc. New York (Batzriら、1973、Biochim. Biophys. Acta 298: 1015を引用する)。この方法により製造されるＳＵＶは、直径３０〜１１０ｎｍの範囲のサイズである。
【０２４３】
また、多層ベシクルをＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに４回、２０，０００ｐｓｉで通過させることにより、ＳＵＶを製造することもできる。製造されたＳＵＶは、直径３０〜５０ｎｍの範囲のサイズである。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.)、Marcel Dekker, Inc. New York（Barenholzら、1979、FEBS Letters 99:210を引用する）。
【０２４４】
多層および単層リン脂質ベシクルを、小孔径の膜を介する高圧でのリン脂質の水性調製物の押出により形成させることもできる（Hopeら、1996、Chemistry and Physics of Lipids、40:89-107）。
【０２４５】
大単層ベシクルは、それらが中央の水性コアを取り囲む単一の脂質二重層である点でＳＵＶと類似するが、ＬＵＶはＳＵＶよりも非常に大きい。その構成部分およびそれらを調製するのに用いられる方法に応じて、ＬＵＶは直径５０〜１０００ｎｍの範囲のサイズであってよい。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.)、Marcel Dekker, Inc. New York。ＬＵＶは通常、３つの方法：洗剤希釈、逆相蒸発、および注入のうちの１つを用いて調製される。
【０２４６】
洗剤希釈技術においては、コール酸塩、デオキシコール酸塩、オクチルグルコシド、ヘプチルグルコシドおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの洗剤溶液を用いて、脂質調製物からミセルを形成させる。次いで、溶液を透析して、洗剤を除去する。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker、Inc. New York。
【０２４７】
逆相蒸発技術は、水性非極性溶液中に脂質を可溶化し、逆ミセルを形成させる。非極性溶媒を蒸発させると、ミセルは凝集してＬＵＶを形成する。この方法は一般に、大量の脂質を要する。
【０２４８】
注入方法は、非極性溶液中に可溶化された脂質を、封入しようとする水性溶液中に注入する。非極性溶液が蒸発するにつれて、脂質は気体／水性境界面に集まる。気体が水性溶液を通って気泡化する時に、脂質シートはＬＵＶおよびオリゴラメラ(oligolamellar)粒子を形成する。粒子を濾過により区分する。Deamerら、1983、in Liposomes (Ostro, Ed.)、Marcel Dekker, Inc. New York（Deamerら、1976、Biochim. Biophys. Acta 443:629およびSchierenら、1978、Biochim. Biophys. Acta 542: 137を引用する）。
【０２４９】
得られた脂質調製物のアリコートを特性評価して、脂質粒子が本明細書に開示される熱サイクリング法における脂質成分としての使用にとって好適であることを確認することができる。脂質調製物の特性評価は、限定されるものではないが、サイズ排除濾過、ゲル濾過、カラム濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、および非変性ゲル電気泳動などの当技術分野で公知の任意の方法を用いて実施することができる。
【０２５０】
６．５．３．タンパク質成分
リポタンパク質複合体のタンパク質成分は、本発明の熱サイクリング法における成功にとっては重要ではない。実質的に任意の脂質結合タンパク質、例えば、治療的および／または予防的利益を提供するアポリポタンパク質および／またはその誘導体もしくは類似体を、複合体中に含有させることができる。さらに、任意のα−へリックスペプチドもしくはペプチド類似体、またはアポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉなど）がＬＣＡＴを活性化するか、もしくは脂質と結合した場合に円盤状粒子を形成することができるという点で、アポリポタンパク質の活性を「模倣」する任意の他の種類の分子を、リポタンパク質複合体中に含有させることができ、従って、「脂質結合タンパク質」の定義内に含まれる。熱サイクリング法において用いることができる脂質結合タンパク質としては、上記の第６．１節に記載のものが挙げられる。脂質結合タンパク質を、上記の第６．１．２節に記載のように組換え産生することができる。脂質結合タンパク質は、上記の第６．１．３節または第６．１．４節に記載のものなどの、本明細書に記載の方法のいずれかによって精製することができる。
【０２５１】
タンパク質成分を、当技術分野で周知のように、動物起源（および特に、ヒト起源）から精製する、化学的に合成するか、または組換え産生することができ、例えば、Chungら、1980、J. Lipid Res. 21(3):284-91；Cheungら、1987、J. Lipid Res. 28(8):913-29を参照されたい。また、米国特許第５，０５９，５２８号、第５，１２８，３１８号、第６，６１７，１３４号；米国特許出願公開第２０００２／０１５６００７号、第２００４／００６７８７３号、第２００４／００７７５４１号、および第２００４／０２６６６６０号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ／２００８／１０４８９０号および第ＷＯ／２００７／０２３４７６号も参照されたい。
【０２５２】
タンパク質成分は、所望の複合体におけるタンパク質／ペプチドと脂質の比よりも少なくとも５倍高い（例えば、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍高い）タンパク質／ペプチドと脂質の比で脂質を含んでもよい。例えば、所望のタンパク質と脂質の比がモルベースで１：２００であるリポタンパク質複合体を製造するためには、タンパク質成分中のタンパク質を、典型的には、最終複合体中の脂質の小さい画分のみであるものを表す、例えば、１：１０〜１：２０の比で脂質と合わせることができる。いかなる機構も暗示するものではないが、タンパク質と少量の脂質とのこの「予備」複合体化は、所望の複合体が２種以上の脂質を有する場合に有用であり、熱サイクリングにより製造されたリポタンパク質複合体中に少量で存在する（例えば、所望のリポタンパク質複合体中の全脂質の１０重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、または１重量％以下）脂質のより均一な分布が可能になる。
【０２５３】
６．５．４．熱サイクリングによるリポタンパク質複合体の生成
前記方法は一般的に、脂質粒子と脂質結合タンパク質とを含む懸濁液を、リポタンパク質複合体が形成されるまで「高」温範囲と「低」温範囲との間で熱サイクリングすることを必要とする。
【０２５４】
熱サイクリングされる懸濁液は、好ましくは、高温範囲の温度で一緒にされた脂質成分とタンパク質成分とを含有し、「出発」懸濁液を形成した後、熱サイクリングにかけられる。
【０２５５】
出発懸濁液中の脂質とタンパク質との最適比は、製造される最終的なリポタンパク質複合体中の成分の所望の化学量により決定される。当業者によって認識される通り、脂質画分とタンパク質画分とのモル比は、特に他の因子の中でも、タンパク質成分中のタンパク質および／もしくはペプチドの同一性、脂質画分中の脂質の同一性および量、ならびにリポタンパク質複合体の所望のサイズに依存する。リポタンパク質複合体中の好適な脂質とタンパク質との比は、限定されるものではないが、ゲル電気泳動移動度アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＤＬ受容体との相互作用、ＡＴＰ結合カセット輸送因子（ＡＢＣＡ１）による認識、肝臓による取込み、および薬物動態／薬力学などの、任意の数の当技術分野で公知の機能的アッセイを用いて決定することができる。例えば、ゲル電気泳動移動度アッセイを用いて、複合体中の脂質成分とタンパク質成分との最適比を決定することができる。本開示の方法により製造された複合体が脂質成分中へのリン脂質の含有の結果として荷電している場合、天然のプレ−β−ＨＤＬまたはα−ＨＤＬ粒子と類似する電気泳動移動度を示すように複合体を設計することができる。かくして、いくつかの実施形態においては、天然のプレ−β−ＨＤＬまたはα−ＨＤＬ粒子を、複合体の移動度を決定するための標準物として用いることができる。
【０２５６】
好ましい実施形態においては、最終的な複合体は、少なくとも１つのアポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣体（最も好ましくは、それぞれ、成熟ヒトＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−Ｉペプチド）、少なくとも１つの中性脂質、および少なくとも１つの負に荷電した脂質、例えば、ＰＣＴ  ＷＯ２００６／１００５６７（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなどを有する。
【０２５７】
ＡｐｏＡ−Ｉなどのアポリポタンパク質の生物活性は、アポリポタンパク質を含む両親媒性へリックスにより媒介されると考えられるので、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質当量を用いて脂質：アポリポタンパク質モル比のアポリポタンパク質画分を表すのが好都合である。ＡｐｏＡ−Ｉは、へリックスを算出するのに用いられる方法に応じて、６〜１０の両親媒性へリックスを含有することが一般に受け入れられている。他のアポリポタンパク質は、それらが含有する両親媒性へリックスの数に基づいてＡｐｏＡ−Ｉ当量を単位として表すことができる。例えば、ＡｐｏＡ−ＩＭのそれぞれの分子はＡｐｏＡ−Ｉの分子の２倍の両親媒性へリックスを含有するため、典型的にはジスルフィド架橋二量体として存在するＡｐｏＡ−ＩＭを、２ＡｐｏＡ−Ｉ当量と表すことができる。逆に、それぞれの分子はＡｐｏＡ−Ｉの分子の１／１０〜１／６の両親媒性へリックスを含有するため、単一の両親媒性へリックスを含有するペプチドアポリポタンパク質は、１／１０〜１／６ＡｐｏＡ−Ｉ当量と表すことができる。
【０２５８】
一般に、リポタンパク質複合体の脂質：ＡｐｏＡ−Ｉ当量モル比（本明細書では「Ｒｉ」と定義される）は、約２：１〜２００：１の範囲である。いくつかの実施形態においては、Ｒｉは、約５０：１〜１５０：１、または７５：１〜１２５：１、１０：１〜１７５：１である。重量の比は、リン脂質については約６５０〜８００のＭＷを用いて得ることができる。
【０２５９】
特定の実施形態においては、成分のモル比は、２〜６（負に荷電した脂質、例えば、ＤＰＰＧ）：９０〜１２０（中性脂質、例えば、ＳＭ）：１（ＡｐｏＡ−Ｉ当量）である。実施例１に記載される特定の実施形態においては、複合体は、約１０８：１の脂質とタンパク質のモル比でＤＰＰＧ、ＳＭおよびＡｐｏＡ−Ｉを含み、ＤＰＰＧは全脂質の３重量％（＋／−１％）であり、ＳＭは脂質の９７重量％（＋／−５％）である。
【０２６０】
熱サイクリングの開始前の出発懸濁液中の脂質およびタンパク質成分の濃度は、１〜３０ｍｇ／ｍｌ濃度のＡｐｏＡ−Ｉ当量および１〜１００ｍｇ／ｍｌ濃度の脂質の範囲であってよい。特定の実施形態においては、タンパク質成分の濃度は、１〜３０ｍｇ／ｍｌ、２〜２０ｍｇ／ｍｌ、５〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ、５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜２０ｍｇ／ｍｌ、および１０〜２０ｍｇ／ｍｌから選択され、脂質成分の濃度は、１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、１０〜７５ｍｇ／ｍｌ、２５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１０〜７５ｍｇ／ｍｌ、２５〜１００ｍｇ／ｍｌ、２５〜７５ｍｇ／ｍｌ、および１〜７５ｍｇ／ｍｌから独立に選択される。
【０２６１】
熱サイクリングプロセスの高温および低温範囲は、リポタンパク質複合体の脂質およびタンパク質成分の相転移温度に基づく。あるいは、不飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質またはリン脂質の混合物を用いる場合に生じ得るように、脂質成分が規定の、または個別の相転移を示さない場合、熱サイクリングの高温および低温範囲は、少なくとも約２０℃、最大で約４０℃またはそれ以上異なる。例えば、いくつかの実施形態においては、低温および高温範囲は、２０℃〜３０℃、２０℃〜４０℃、２０℃〜５０℃、３０℃〜４０℃、３０℃〜５０℃、２５℃〜４５℃、３５℃〜５５℃異なる。
【０２６２】
脂質については、相転移は、ゲル状態として知られる、緊密に固まった規則的構造から、液体状態として知られる、緩く固まった規則性の低い構造への変化を含む。リポタンパク質複合体は、当技術分野では、典型的には用いられる特定の脂質または脂質の混合物の転移温度に近い温度で脂質粒子およびアポリポタンパク質をインキュベートすることにより形成される。脂質成分の相転移温度（熱量測定法により決定することができる）＋／−５℃〜１０℃が、本開示の方法における「低」温範囲である。
【０２６３】
タンパク質については、相転移温度は、折畳まれた三次元構造から二次元構造への変化を含む。脂質については、相転移は、ゲル状態として知られる、緊密に固まった規則的構造から、液体状態として知られる、緩く固まった規則性の低い構造への変化を含む。リポタンパク質複合体は、当技術分野では、典型的には用いられる特定の脂質または脂質の混合物の転移温度に近い温度で脂質粒子およびアポリポタンパク質をインキュベートすることにより形成される。
【０２６４】
脂質成分の相転移温度（熱量測定法により決定することができる）＋／−１２℃、より好ましくは＋／−１０℃が、本開示の方法における「低」温範囲である。特定の実施形態においては、低温範囲は、脂質成分の相転移温度の＋／−３℃、＋／−５℃、または＋／−８℃である。１つの特定の実施形態においては、低温範囲は、脂質成分の相転移温度の、下は５℃以上または１０℃以上から、上は５℃までである。
【０２６５】
タンパク質については、相転移温度は、三次構造から二次構造への変化を含む。タンパク質成分の相転移温度＋／−１２℃、より好ましくは＋／−１０℃が、本開示の方法における「高」温範囲である。特定の実施形態においては、高温範囲は、タンパク質成分の相転移温度の＋／−３℃、＋／−５℃、または＋／−８℃である。１つの特定の実施形態においては、低温範囲は、タンパク質成分の相転移温度の、下は１０℃から、上は５℃以下、１０℃以下、または１５℃以下までである。
【０２６６】
出発懸濁液は、好ましくは、高温で出発して、出発懸濁液中のタンパク質の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％がリポタンパク質複合体中に組み込まれるまで、高温と低温との間で熱サイクリングにかけられる。好適な化学量論量の脂質およびタンパク質成分を用いて、数サイクル後に脂質およびタンパク質成分の実質的に完全な複合体化を達成することができる。サイクル数は、タンパク質および脂質成分、サイクルの持続期間に依存するが、典型的には、５以上のサイクル、１０以上のサイクル、または１５以上のサイクル（高温および低温の両方で）が、実質的に完全な複合体化に必要である。サイクルは、典型的には、２分〜６０分の範囲である。特定の実施形態においては、サイクルは、それぞれの温度で、５〜３０分、１０〜２０分、５〜２０分、２〜４５分、または５〜４５分の範囲である。
【０２６７】
前記方法により製造される複合体は、典型的には、タンパク質成分が、リン脂質とタンパク質との間で特定の化学量論範囲でリン脂質に物理的に結合し、均一なサイズ分布を有する、ミセル、ベシクル、球状または円盤状粒子として形状化された超分子集合体である。本発明の方法は、有利には、出発懸濁液中での脂質および／またはタンパク質の実質的に完全な複合体化をもたらし、クロマトグラフィーなどの分離方法により観察した場合、実質的に脂質および／またはタンパク質を含まない組成物が得られる。かくして、本開示の方法は、精製ステップの非存在下で実施することができる。
【０２６８】
本開示の方法は、有利には、そのサイズ分布において均一であり、サイズ分画の必要性を回避する複合体を生成する。
【０２６９】
本開示のいくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体は、比較的少量（例えば、脂質成分の１０％未満、５％未満、３％未満または１％未満）の１つまたは複数の脂質を含む２種類以上の脂質を含有する。分散を最適化するために、少量で用いられる脂質は、脂質成分中の脂質粒子に組み込むよりもむしろ、タンパク質成分と予め混合することができる。
【０２７０】
得られるリポタンパク質複合体のアリコートを特性評価して、複合体が所望の特徴、例えば、脂質成分中へのタンパク質成分の実質的に完全な（例えば、＞９０％、＞９５％、＞９７％または＞９８％）組み込みを有することを確認することができる。複合体の特性評価は、限定されるものではないが、サイズ排除濾過、ゲル濾過、カラム濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、および非変性ゲル電気泳動などの当技術分野で公知の任意の方法を用いて実施することができる。
【０２７１】
本明細書に記載のリポタンパク質複合体または組成物の均一性および／または安定性を、限定されるものではないが、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法などの当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、単一のピークまたは限られた数のピークを、安定な複合体と関連させることができる。複合体の安定性は、時間に対して新しいピークの出現をモニターすることにより決定することができる。新しいピークの出現は、粒子の不安定性に起因する複合体間の再編成の兆候である。
【０２７２】
好ましくは、タンパク質および脂質成分の酸化を最小化するために、熱サイクリングを不活性ガス（例えば、窒素、アルゴンまたはヘリウム）ブランケット下で実行する。
【０２７３】
６．５．５．リポタンパク質複合体を作製する他の方法
負に荷電したリポタンパク質複合体などの本明細書に記載のリポタンパク質複合体を、限定されるものではないが、ベシクル、リポソーム、プロテオリポソーム、ミセル、および円盤状粒子などの様々な形態で調製することができる。上記の熱サイクリング法に加えて、当業者には公知の様々な方法を用いて、リポタンパク質複合体を調製することができる。リポソームまたはプロテオリポソームを調製するための様々な技術を用いることができる。例えば、アポリポタンパク質を好適なリン脂質と共に（超音波浴または超音波プローブを用いて）同時超音波処理して、複合体を形成させることができる。あるいは、アポリポタンパク質、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉを、予め形成された脂質ベシクルと合わせて、リポタンパク質複合体の同時形成をもたらすことができる。また、リポタンパク質複合体は、洗剤透析法により；例えば、アポリポタンパク質、荷電したリン脂質およびＳＭおよびコール酸塩などの洗剤の混合物を透析して、洗剤を除去し、再構成させて負に荷電したリポタンパク質複合体を形成させる（例えば、Jonasら、1986、Methods in Enzymol. 128:553-82を参照されたい）、または押出装置を用いることにより、または均一化により形成させることもできる。
【０２７４】
いくつかの実施形態においては、約４０、約５０または約６０分間の高圧（例えば、約３２０００ｐ．ｓ．ｉ．）を用いる均一化により、複合体を調製する。特定の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＮおよびＤＰＰＧを含む複合体を、以下のように調製する。ＡｐｏＡ−Ｉをリン酸バッファーに溶解し、高剪断混合装置を用いて作製されたリン酸バッファー中のＤＰＰＧの分散物と共に５０℃でインキュベートする。次いで、ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ混合物をＳＭの分散物と合わせて、動的光散乱またはゲル浸透クロマトグラフィーによりモニターされた場合、複合体形成が実質的に完了するまで、３０〜５０℃で３０，０００ｐ．ｓ．ｉ．を超える圧力で均一化する。
【０２７５】
いくつかの実施形態においては、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／００６７８７３号の実施例１に記載のコール酸塩分散法により、リポタンパク質複合体を調製することができる。簡単に述べると、乾燥脂質をＮａＨＣＯ３バッファー中で水和した後、ボルテックスし、全ての脂質が分散するまで超音波処理する。コール酸塩溶液を添加し、混合物を、それが脂質コール酸塩ミセルが形成されることを示す透明になるまで、定期的にボルテックスし、超音波処理しながら、３０分間インキュベートする。ＮａＨＣＯ３バッファー中のプロＡｐｏＡ−Ｉを添加し、溶液を約３７℃〜５０℃で１時間インキュベートする。
【０２７６】
コール酸塩を、当技術分野で周知の方法により除去することができる。例えば、コール酸塩を、透析、限外濾過により、または親和性ビーズもしくは樹脂上への吸着吸収によるコール酸塩分子の除去により除去することができる。一実施形態においては、親和性ビーズ、例えば、ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、負に荷電したリポタンパク質複合体およびコール酸塩の調製物に添加して、コール酸塩を吸着させる。別の実施形態においては、調製物、例えば、リポタンパク質複合体およびコール酸塩のミセル調製物を、親和性ビーズを充填したカラム上に通過させる。
【０２７７】
特定の実施形態においては、注射筒内のＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標）上に調製物をロードすることにより、リポタンパク質複合体の調製物からコール酸塩を除去する。次いで、注射筒をバリアフィルムで密閉し、４℃で一晩、振とうしながらインキュベートする。使用前に、ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標）を通して溶液を注入し、そこでビーズにより吸着させることによりコール酸塩を除去する。
【０２７８】
本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体は、複合体がＨＤＬ、特に、プレ−β−１またはプレ−β−２ＨＤＬ集団中のＨＤＬと類似するサイズおよび密度を有する場合、循環中での半減期が増加すると予想される。長い保存可能期間を有する安定な調製物を、凍結乾燥により作製することができる。いくつかの実施形態においては、当技術分野で一般的に公知の同時凍結乾燥法を用いて、ＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体を調製する。簡単に述べると、同時凍結乾燥ステップは、有機溶媒もしくは溶媒混合物中にＡｐｏＡ−Ｉおよび脂質の混合物を可溶化するか、またはＡｐｏＡ−Ｉおよび脂質を別々に可溶化し、それらを一緒に混合することを含む。同時凍結乾燥のための溶媒または溶媒混合物の望ましい特徴としては、（ｉ）疎水性脂質および両親媒性タンパク質を溶解することができる培地相対極性、（ｉｉ）残留有機溶媒に関連する潜在的毒性を回避するためのＦＤＡ溶媒指針（Federal Register、volume 62、No. 247)に従うクラス２またはクラス３溶媒、（ｉｉｉ）凍結乾燥中の溶媒除去の容易性を保証する低沸点、（ｉｖ）より速い凍結、より高い凝縮温度ならびに凍結乾燥機上のより少ない摩耗および裂け目を提供する高融点が挙げられる。いくつかの実施形態においては、氷酢酸を用いる。メタノール、氷酢酸、キシレン、またはシクロヘキサンの組合せを用いることもできる。
【０２７９】
次いで、ＡｐｏＡ−Ｉ−脂質溶液を凍結乾燥して、均一な粉末を得る。凍結乾燥条件を最適化して、凍結乾燥したアポリポタンパク質−脂質粉末中に最少量の残留溶媒を含む溶媒の速い蒸発を得ることができる。凍結乾燥条件の選択は、溶媒の性質、容器の種類および寸法、保持溶液、充填容量、ならびに用いられる凍結乾燥機の特徴に応じて、当業者によって決定することができる。
【０２８０】
凍結乾燥したリポタンパク質複合体を用いて、医薬再製剤化のための大量供給物を調製するか、またはリポタンパク質複合体の溶液もしくは懸濁液を得るために再構成させることができる個々のアリコートもしくは投与単位を調製することができる。再構成のためには、凍結乾燥粉末を、好適な容量（例えば、５ｍｇのポリペプチド／ｍｌ、これは静脈内注射にとって好都合である）まで水性溶液を用いて再水和させる。いくつかの実施形態においては、凍結乾燥粉末を、リン酸緩衝生理食塩水または生理的塩溶液を用いて再水和させる。混合物を撹拌するか、またはボルテックスして、再水和を容易にすることができる。再構成ステップは、複合体の脂質成分の相転移温度に等しいか、またはそれより高い温度で実施することができる。
【０２８１】
ＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体は、好適なｐＨおよび浸透圧の水性媒体を用いる凍結乾燥したアポリポタンパク質−脂質粉末の水和後に自発的に形成し得る。いくつかの実施形態においては、水和媒体は、限定されるものではないが、スクロース、トレハロースおよびグリセリンから選択される安定剤を含有する。いくつかの実施形態においては、複合体を形成させるために、脂質の転移温度より上に溶液を数回加熱する。脂質とタンパク質との比は、１：１〜２００：１（モル／モル）であってよく、好ましくは、３：１〜２：１の脂質：タンパク質（ｗ／ｗ）、より好ましくは、２．７：１〜２．１：１の脂質：タンパク質（ｗ／ｗ）、例えば、２．７：１の脂質：タンパク質（ｗ／ｗ）である。粉末を水和して、タンパク質当量で表される５〜３０ｍｇ／ｍｌの最終複合体濃度を得る。
【０２８２】
様々な実施形態においては、ＮＨ４ＨＣＯ３水性溶液中でポリペプチド溶液を凍結乾燥することにより、ＡｐｏＡ−Ｉ粉末を得ることができる。次いで、脂質粉末およびＡｐｏＡ−Ｉ粉末を氷酢酸中に溶解することにより、ＡｐｏＡ−Ｉおよび脂質（例えば、スフィンゴミエリン）の均一な溶液を形成させる。次いで、この溶液を凍結乾燥し、水性媒体中での得られる粉末の水和により、ＨＤＬ様アポリポタンパク質−脂質複合体を形成させる。
【０２８３】
いくつかの実施形態においては、リン脂質とタンパク質溶液または懸濁液との同時凍結乾燥により、ＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体を形成させる。有機溶媒または有機溶媒混合物中のＡｐｏＡ−Ｉおよび脂質（例えば、リン脂質）の均一な溶液を凍結乾燥した後、水性バッファー中での凍結乾燥粉末の水和により、ＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体を自発的に形成させる。本発明の方法における使用のための有機溶媒および溶媒混合物の例としては、限定されるものではないが、酢酸、酢酸／キシレン混合物、酢酸／シクロヘキサン混合物、およびメタノール／キシレン混合物が挙げられる。
【０２８４】
得られる再構成された調製物のアリコートを特性評価して、複合体が所望のサイズ分布、例えば、ＨＤＬのサイズ分布を有することを確認することができる。サイズを特性評価するための例示的方法は、ゲル濾過クロマトグラフィーである。既知の分子量およびストークス直径の一連のタンパク質、ならびにヒトＨＤＬを、カラムを補正するための標準物として用いることができる。
【０２８５】
他の実施形態においては、ＡｐｏＡ−Ｉと、米国特許出願公開第２００６／０２１７３１２号および国際特許出願公開第ＷＯ２００６／１００５６７号（ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００６３５）（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示された脂質とを複合体化させることにより、組換えＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体を作製する。
【０２８６】
米国特許第６，００４，９２５号、第６，０３７，３２３号、第６，０４６，１６６号および第６，２８７，５９０号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ＨＤＬと類似する特徴を有する負に荷電したリポタンパク質複合体を調製するための単純な方法を開示する。有機溶媒（または溶媒混合物）中でのアポリポタンパク質と脂質溶液との同時凍結乾燥および凍結乾燥粉末の水和中の負に荷電したリポタンパク質複合体の形成を含むこの方法は、以下の利点を有する：（１）この方法は非常に少ないステップを要する；（２）この方法は安価な溶媒を用いる；（３）ほとんどの、または全ての含まれる成分が設計される複合体を形成させるために使用され、かくして、他の方法には一般的である出発材料の廃棄を回避する；（４）保存の間に非常に安定である凍結乾燥した複合体が形成され、得られた複合体を使用の直前に再構成することができる；（５）得られる複合体を、通常は形成後および使用前にさらに精製する必要がない；（６）コール酸塩などの洗剤を含む毒性化合物が回避される；および（７）製造方法を容易にスケールアップすることができ、これはＧＭＰ製造（すなわち、内毒素を含まない環境における）にとって好適である。
【０２８７】
他の好適な方法は、米国特許出願公開第２００６／０２１７３１２号および国際特許出願公開第ＷＯ２００６／１００５６７号（ＰＣＴ／ＩＢ２００６／０００６３５）に記載されており、これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８８】
好ましくは、タンパク質および脂質成分の酸化を最小化するために、複合体形成の１、２以上または全てのステップを、不活性ガス（例えば、窒素、アルゴンまたはヘリウム）ブランケット下で実行する。
【０２８９】
溶液中のアポリポタンパク質−脂質粒子のタンパク質および脂質濃度は、限定されるものではないが、タンパク質およびリン脂質アッセイ、クロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ、ゲル濾過、質量分析、ＵＶまたはダイオードアレイなどの様々な検出器を備えたＧＣ、蛍光、弾性光散乱など当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。また、脂質およびタンパク質の完全性を、同じクロマトグラフィー技術により、ならびにペプチドマッピング、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動、ＡｐｏＡ−ＩのＮ−およびＣ−末端配列決定、および脂質酸化を決定するための標準的アッセイにより決定することもできる。
【０２９０】
６．６．医薬組成物
本開示により想定される医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与および送達にとって好適な薬学的に許容される担体中に活性成分として負に荷電したリポタンパク質複合体を含む。ペプチドは酸性および／または塩基性末端および／または側鎖を含んでもよいため、ペプチド模倣性アポリポタンパク質を、遊離酸もしくは塩基の形態で、または薬学的に許容される塩の形態で組成物中に含有させることができる。アミド化、アシル化、アセチル化またはペグ化されたタンパク質などの改変タンパク質を用いることもできる。場合により、医薬組成物は、上記の第６．２節および第６．３節に記載のように、１つまたは複数の疎水性、親油性、または非極性活性剤をロードしたリポタンパク質複合体を含んでもよい。
【０２９１】
注射用組成物は、水性または油性ビヒクル中の活性成分の滅菌懸濁液、溶液または乳濁液を含む。組成物はまた、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、注射用組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ８．２）中に負に荷電したリポタンパク質複合体を含む。注射用の組成物を、単位剤形中で、例えば、アンプルまたは複数用量容器中で提供することができ、添加された保存剤を含んでもよい。注入のために、エチレンビニル酢酸または当技術分野で公知の任意の他の適合性材料などの、負に荷電したリポタンパク質複合体と適合する材料で作られた輸液バッグ中に組成物を供給することができる。
【０２９２】
好適な剤形は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬのリポタンパク質の最終濃度で負に荷電したリポタンパク質複合体を含む。特定の実施形態においては、剤形は、約８ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、好ましくは、約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度で負に荷電したリポタンパク質複合体を含む。
【０２９３】
好ましくは、タンパク質および脂質成分の酸化を最小化するために、医薬組成物を不活性ガス（例えば、窒素、アルゴンまたはヘリウム）ブランケット下で製剤化および／または充填する。
【０２９４】
６．７．治療方法
本明細書に記載のリポタンパク質複合体、例えば、負に荷電したリポタンパク質複合体、および組成物を、有用であることが示された実質的に全ての目的のリポタンパク質複合体のために用いることができる。負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体は、現在利用可能な治療レジメンにより必要とされるアポリポタンパク質の量（２〜５日毎に投与１回あたり２０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、平均的なサイズのヒト１人あたり１．４ｇ〜８ｇ）よりも有意に低い用量で投与された場合でも、コレステロールを移動させるのに有効である。
【０２９５】
その結果、本開示の複合体および組成物は、心血管疾患、障害および／または関連状態を治療または予防するのに特に有用である。対象における心血管疾患、障害および／または関連状態を治療または予防する方法は、一般的には、対象に、低い（＜１５ｍｇ／ｋｇ）用量または量の本明細書に記載のリポタンパク質複合体または医薬組成物を、特定の適応症を治療または予防するのに有効なレジメンに従って投与することを含む。
【０２９６】
治療的利益を提供するのに十分または有効な量のリポタンパク質複合体を投与する。心血管疾患、障害および／または関連状態を治療する状況においては、治療的利益は、以下の１つまたは複数が起こる場合に推測することができる：ベースラインと比較したコレステロール移動の増加、アテローム性動脈硬化プラーク体積の減少、平均血漿トリグリセリド濃度の増加または肝臓トランスアミナーゼ（もしくはアラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルの正常範囲を超える増加を伴わない、ベースラインレベルと比較した遊離コレステロールの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）画分の増加。完全な治癒は、望ましいが、治療的利益の存在にとって必要ではない。
【０２９７】
いくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体を、注射１回あたり約２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏａ−Ｉ当量〜約１２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与する。いくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体を、約３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与する。いくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体を、約６ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与する。いくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体を、約１２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与する。
【０２９８】
治療される対象は、心血管疾患、障害および／または関連状態に罹患する個体である。本明細書に記載のリポタンパク質複合体および組成物を用いて治療または予防することができるそのような心血管疾患、障害および／または関連状態の非限定例としては、末梢血管疾患、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、ならびに、例えば、脳卒中、虚血性脳卒中、一過性虚血性発作、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、間欠性跛行、重症虚血肢、弁狭窄、および心房弁硬化症などのアテローム性動脈硬化症の多種多様な臨床徴候が挙げられる。対象は、心筋梗塞（ＳＴ上昇を有するか、もしくは有さない）または不安定狭心症などの急性冠動脈症候群を以前に発症した個体であってよい。治療される対象は、任意の動物、例えば、哺乳動物、特に、ヒトであってよい。
【０２９９】
一実施形態においては、前記方法は、投与後に患者のベースラインＡｐｏａ−Ｉを変化させない量の本明細書に記載の荷電したリポタンパク質複合体または組成物を対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を包含する。
【０３００】
他の実施形態においては、前記方法は、投与前のベースライン（初期）レベルよりも、投与の約２時間後に約５ｍｇ／ｄＬ〜１００ｍｇ／ｄＬまたは投与の約２４時間後に約５ｍｇ／ｄＬ〜２０ｍｇ／ｄＬ高い遊離または複合体化アポリポタンパク質の血清レベルを達成するのに有効である量の本明細書に記載のリポタンパク質複合体（例えば、荷電した複合体）または組成物を対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を包含する。
【０３０１】
別の実施形態においては、前記方法は、投与前の初期ＨＤＬ−コレステロール画分よりも少なくとも約１０％高い、投与の少なくとも１日後のＨＤＬ−コレステロール画分の循環血漿濃度を達成するのに有効な量の本明細書に記載のリポタンパク質複合体（例えば、荷電した複合体）または組成物を対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を包含する。
【０３０２】
別の実施形態においては、前記方法は、投与後５分〜１日の間に３０〜３００ｍｇ／ｄＬであるＨＤＬ−コレステロール画分の循環血漿濃度を達成するのに有効な量の本明細書に記載のリポタンパク質複合体（例えば、荷電した複合体）または組成物を対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を包含する。
【０３０３】
別の実施形態においては、前記方法は、投与後５分〜１日の間に３０〜３００ｍｇ／ｄＬであるコレステリルエステルの循環血漿濃度を達成するのに有効な量の本明細書に記載のリポタンパク質複合体（例えば、荷電した複合体）または組成物を対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を包含する。
【０３０４】
さらに別の実施形態においては、前記方法は、投与前のベースライン（初期）レベルの少なくとも約１０％上である投与の少なくとも１日後の糞便コレステロール排出の増加を達成するのに有効な量の本明細書に記載のリポタンパク質複合体（例えば、荷電した複合体）または組成物を対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または保護する方法を包含する。
【０３０５】
本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体、または組成物を、単独で、または前記状態を治療もしくは予防するのに用いられる他の薬剤との組合せ療法において用いることができる。そのような療法としては、限定されるものではないが、含まれる薬剤の同時的または連続的投与が挙げられる。例えば、家族性高コレステロール血症（同型もしくは異型）などの高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の治療においては、荷電したリポタンパク質製剤を、現在用いられている任意の１つまたは複数のコレステロール低下療法；例えば、胆汁酸樹脂、ナイアシン、スタチン、コレステロール吸収の阻害剤および／またはフィブラートと共に投与することができる。そのような組合せレジメンは、それぞれの薬剤がコレステロール合成および輸送における異なる標的に作用するため、特に有益な治療効果をもたらし得る；すなわち、胆汁酸樹脂は、コレステロール再利用、カイロミクロンおよびＬＤＬ集団に影響する；ナイアシンはＶＬＤＬおよびＬＤＬ集団に主に影響する；スタチンはコレステロール合成を阻害し、ＬＤＬ集団を減少させる（およびおそらく、ＬＤＬ受容体発現を増加させる）；その一方、本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体は、ＲＣＴに影響し、ＨＤＬを増加させ、コレステロール流出を促進する。
【０３０６】
別の実施形態においては、本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体、または組成物を、フィブラートと一緒に用いて、冠動脈性心疾患；冠動脈疾患；心血管疾患、再狭窄、血管または血管周囲疾患；アテローム性動脈硬化症を治療または予防することができる（アテローム性動脈硬化症の治療および予防を含む）。例示的な製剤および治療レジメンは、以下に記載される。
【０３０７】
本明細書に記載の負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体、または組成物を、小さいＨＤＬ画分、例えば、プレ−β、プレ−γおよびプレ−β様ＨＤＬ画分、αＨＤＬ画分、ＨＤＬ３ならびに／またはＨＤＬ２画分を増加させる用量で投与することができる。いくつかの実施形態においては、その用量は、例えば、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）または血管内超音波法（ＩＶＵＳ）などの画像化技術により測定された場合、アテローム性動脈硬化プラークの減少を達成するのに有効である。ＩＶＵＳにより追跡するパラメータとしては、限定されるものではないが、ベースラインからのアテローム体積率の変化および総アテローム体積の変化が挙げられる。ＭＲＩにより追跡するパラメータは、限定されるものではないが、ＩＶＵＳに関するものならびにプラークの脂質組成および石灰化が挙げられる。
【０３０８】
プラークの退縮を、その自身の対照としての患者を用いて測定することができる（時間０に対する、最後の注入の終わりの、または最後の注入の数週間以内の、または療法の開始後３カ月、６カ月、もしくは１年以内の時間ｔ）。
【０３０９】
静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、および腹腔内（ＩＰ）注射などの非経口投与経路により、投与を最良に達成することができる。特定の実施形態においては、投与は、パーフューザ(perfusor)、インフィルトレータ(infiltrator)またはカテーテルによる。いくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体、例えば、負に荷電したリポタンパク質複合体を、非経口投与により得られるものと同等の循環血清濃度を達成する量で、注射により、皮下に埋込み可能なポンプにより、またはデポー調製物により投与する。また、複合体を、例えば、ステントまたは他のデバイス中に吸収させることもできる。
【０３１０】
投与は、様々な異なる治療レジメンを通じて達成することができる。例えば、数回の静脈内注射を、注射の累積総量が１日中毒用量に達しないように１日の間に定期的に投与することができる。この方法は、６、７、８、９、１０、１１または１２日の間隔でリポタンパク質複合体を投与することを含む。いくつかの実施形態においては、リポタンパク質複合体は、１週間の間隔で投与される。
【０３１１】
前記方法は、上記の間隔のいずれかで４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２回、リポタンパク質複合体を投与することをさらに含んでもよい。例えば、一実施形態においては、リポタンパク質複合体を、それぞれの投与の間に１週間の間隔で６回投与する。いくつかの実施形態においては、投与は、一連の注射として行った後、６カ月〜１年間停止し、次いで、別の一連の注射を開始することができる。次いで、一連の注射の維持を、毎年または３〜５年毎に投与することができる。一連の注射を１日（複合体の特定の血漿レベルを維持するためのかん流）、数日（例えば、８日間にわたって４回の注射）または数週間（例えば、４週間にわたって４回の注射）にわたって行った後、６カ月〜１年後に再開することができる。慢性状態については、投与を継続的に実行することができる。場合により、前記方法の前に、リポタンパク質複合体をより頻繁に投与する場合、誘導期を行うことができる。
【０３１２】
さらに別の選択肢においては、投与１回あたり（５０〜２００ｍｇ）の用量で約１〜５用量から出発した後、投与１回あたり２００ｍｇ〜１ｇの反復用量の高用量を投与することができる。患者の必要性に応じて、投与は、１時間より長い時間のゆっくりした注入、１時間以下の急速な注入、または単回ボーラス注射によるものであってよい。
【０３１３】
様々なリポタンパク質複合体の毒性および治療有効性を、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順を用いて決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、それをＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体が好ましい。追跡することができるパラメータの非限定例としては、肝機能トランスアミナーゼ（正常ベースラインレベルの２倍以下）が挙げられる。これは、多すぎるコレステロールが肝臓にもたらされ、そのような量を同化することができないことを示すものである。赤血球からのコレステロールの移動は、赤血球を脆くするか、またはその形状に影響するため、赤血球に対する効果をモニターすることもできる。
【０３１４】
医療行為（例えば、予防的治療）の前、または医療行為の間もしくは後に、数日から数週間、患者を治療することができる。投与は、血管形成術、頸動脈切断(carotid ablation)、ロトブレーダー(rotoblader)または臓器移植（例えば、心臓、腎臓、肝臓など）などの別の侵襲的療法に付随的なものであるか、またはそれと同時的なものであってよい。
【０３１５】
特定の実施形態においては、負に荷電したリポタンパク質複合体は、コレステロール合成がスタチンまたはコレステロール合成阻害剤によって制御されている患者に投与される。他の実施形態においては、負に荷電したリポタンパク質複合体は、胆汁酸塩およびコレステロールを捕らえるために、胆汁酸排出を増加させ、血中コレステロール濃度を低下させるために、結合樹脂、例えば、半合成樹脂、例えば、コレスチルアミンで、または繊維、例えば、植物性繊維を用いる治療を受けている患者に投与される。
【０３１６】
６．８．他の使用
本明細書中に記載のリポタンパク質複合体、例えば、負に荷電したリポタンパク質複合体、および組成物は、例えば、診断目的で、血清ＨＤＬを測定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイにおいて用いることができる。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩおよびＡｐｏペプチドは、血清のＨＤＬ成分と結合するので、負に荷電したリポタンパク質複合体を、ＨＤＬ集団、ならびにプレ−β１およびプレ−β２  ＨＤＬ集団の「マーカー」として用いることができる。さらに、負に荷電したリポタンパク質複合体を、ＲＣＴにおいて有効なＨＤＬのサブ集団のマーカーとして用いることができる。この目的のために、負に荷電したリポタンパク質複合体を、患者血清試料に添加するか、または患者血清試料と混合することができる；適切なインキュベーション時間の後に、組み込まれた負に荷電したリポタンパク質複合体を検出することによって、ＨＤＬ成分をアッセイすることができる。これは、標識された負に荷電したリポタンパク質複合体（例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、染料など）を使用して、または負に荷電したリポタンパク質複合体に対して特異的な抗体（もしくは抗体断片）を使用する免疫アッセイによって、達成することができる。
【０３１７】
あるいは、標識された負に荷電したリポタンパク質複合体は、循環系を可視化するために、またはＲＣＴをモニターするために、またはＨＤＬがコレステロール流出において活性であるはずである脂肪線条(fatty streak)、アテローム性動脈硬化症病変などにおけるＨＤＬの蓄積を可視化するために、画像化手順（例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン）において用いることができる。
【０３１８】
特定のプロＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体の調製および特性評価に関連する例およびデータは、米国特許出願公開第２００４／００６７８７３号（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３１９】
特定のプロＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体を用いて動物モデル系において得られたデータは、米国特許出願公開第２００４／００６７８７３号（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【実施例１】
【０３２０】
７．実施例１：ＡｐｏＡ−Ｉ発現系の開発
７．１．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのヒトＡｐｏＡ−Ｉのクローニングおよび発現
７．１．１．ＡｐｏＡ−Ｉ発現ベクターの調製
プレプロＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子配列はＮＣＢＩ（Ｐ０２６４７）から取得し、クローニングを容易にし、発現を改善するためにフランキング配列を付加した。フランキング配列を含むプレプロＡｐｏＡ−ＩコードＤＮＡを合成し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター中にクローニングした。５’フランキング配列は、最適化されたＫｏｚａｋ翻訳配列を含んでいた。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクターから、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ挿入物を切り出した。この断片をゲル精製し、以下の遺伝子エレメント：Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓａｒｃｏｍａウイルス５’ＬＴＲに融合されたヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ／ＳＶパッケージング領域、極初期サルサイトメガロウイルスプロモーター、マルチクローニング部位、ＭｏＭｕＬＶ由来３’ＬＴＲ、ならびに細菌の複製起点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を担持するレトロウイルス発現ベクター中にライゲーションした。得られた構築物のクローンを、遺伝子およびフランキング領域を通じて配列決定した。最終的なクローン（クローン＃１７）を、予測されるＤＮＡ配列との一致に基づいて選択した。次いで、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓエンベロープ糖タンパク質のための発現プラスミドで同時トランスフェクトした２９３ＧＰ細胞を用いる形質導入のために、レトロベクターを調製した。同時トランスフェクトされた細胞から回収され、濃縮された上清を、以下の第７．１．２節に記載のＣＨＯ−Ｓ形質導入ステップに用いた。
【０３２１】
７．１．２．ＡｐｏＡ−Ｉの発現のための哺乳動物細胞系の製造
無血清培地中での増殖のために適合させたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ）を、上記の第７．１．１節に記載のレトロウイルスベクターを用いる３ラウンドの形質導入（１Ｘ、２Ｘおよび３Ｘ）にかけた。それぞれの形質導入後の低温保存のために、プールされた集団を拡張し、細胞の試料を遺伝子コピー分析に提出した。遺伝子コピー指数を以下の表２に示す。３Ｘ形質導入細胞系を、１２５ｍＬフラスコ中で２回、１６日のフェドバッチ試験における生産性について分析した。その結果を表３に示す。
【０３２２】
【表２】
2014506884.tif 000005
【０３２３】
【表３】
2014506884.tif 000006
【０３２４】
７．１．３．ＡｐｏＡ−Ｉを発現する細胞系の安定性
ＡｐｏＡ−Ｉを産生するマスター細胞バンクであるＣＨＯ−Ｓ−ＡｐｏＡ−Ｉ−Ｒ（３Ｘ）クローン１７に対して、その生存能力の安定性、増殖速度、遺伝子挿入物の保護、および長期培養中の一貫した生成物分泌を評価するために、非ＧＭＰ特性評価試験を行った。
【０３２５】
細胞系をマスター細胞バンクから解凍し、ＰＦ  ＣＨＯ  ＬＳ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）を用いて１２５ｍＬ振とうフラスコ中で培養した。細胞を、世代０から世代４３までの連続継代により、連続的に培養した。世代４、８、１４、１９、２５、３１、３６および４３で、細胞の試料を凍結した。培養の終わりに、全世代に由来する細胞の試料を解凍し、これを用いて、同じ実験における異なる世代での細胞系のＡｐｏＡ−Ｉタンパク質産生を比較するための最後の培養実行を行った。それぞれの試料から得られた上清を、逆相ＨＰＬＣ分析を用いて１２日目に試験して、ＡｐｏＡ−Ｉ産生のレベルを決定した。ＡｐｏＡ−Ｉ濃度は、様々な試料について１２５９ｍｇ／Ｌから１４００ｍｇ／Ｌまで変化することがわかった（図２）。
【０３２６】
遺伝子挿入物の安定性を比較するために、世代０、４、１４、２５、３６および４３でのＣＨＯ細胞の試料を、ＤＮＡ単離のために用いた。それぞれの試料の遺伝子挿入物の数を、ゲノムＤＮＡ上でのリアルタイムＰＣＲを用いて決定した。表３に示された通り、コピー数のＰＣＲに基づく指数は、世代０と世代４３との間の重複する標準偏差に基づけば有意に異なっていた。マスター細胞バンク細胞系からのＡｐｏＡ−Ｉの産生および遺伝子コピー指数値は、試験した４３世代にわたって安定であることがわかった。
【０３２７】
【表４】
2014506884.tif 000007
【０３２８】
７．２．ＡｐｏＡ−Ｉの細胞増殖および収穫
７．２．１．接種材料および２００Ｌバイオリアクター製造へのスケールアップ
マスター細胞バンクからのヒトＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子を安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞のバイアルを３７℃水浴中で解凍し、３５ｍＬのＨｙＱ  ＰＦ−ＣＨＯ  ＬＳ細胞培養培地を含有する単一の振とうフラスコ（２５０ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。血球計を用いて決定された初期細胞計数は、２．４８ｘ１０５細胞／ｍＬであり、９３．８％の生存率であった。次いで、培養物を、加湿された５％ＣＯ２環境中、３７℃で維持したインキュベータ内のＯｒｂｉｔ振とう器（９０ｒｐｍ）上に置いた。継代培養ステップは、約１．６ｘ１０５細胞／ｍＬの接種密度を目標とした。フラスコ中の４日目の細胞計数および生存率は、１５．０１ｘ１０５細胞／ｍＬおよび９３．９％の生存率であった。２５０ｍＬのフラスコを１Ｌのフラスコに継代培養した。１Ｌフラスコからの３日目の平均生細胞計数は、１３．５６ｘ１０５細胞／ｍＬであり、９５．３％の生存率であった。この１Ｌフラスコを、それぞれ、１０００ｍＬおよび１．７５ｘ１０５細胞／ｍＬの初期培養容量および初期標的細胞密度で１０Ｌの使い捨てＷａｖｅ  Ｂａｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｒｐ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）を含むＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２０ＥＨに継代培養した。Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ運転設定は、３７℃のインキュベーション温度、１５．０ｃｐｍの振とう速度、１０．９°の振とう角度、および０．２５Ｌ／分のガス流速を用いる通気ガス中、５．０％のＣＯ２濃度であった。培養の３日後、Ｗａｖｅ  Ｂａｇ中の生細胞密度は１０．７３ｘ１０５細胞／ｍＬであり、新鮮なＨｙＱ  ＰＦ−ＣＨＯ  ＬＳを添加し、培養容量を５０００ｍＬにした。さらに３日後、生細胞密度は１３．２５ｘ１０５細胞／ｍＬであり、Ｗａｖｅ  Ｂａｇ中の容量を３０Ｌバイオリアクターに移した。温度、ｐＨ、溶解酸素、圧力、および撹拌速度に関する３０Ｌバイオリアクターにおける運転設定点は、それぞれ、３７℃、ｐＨ７．０、４０％空気飽和、１ｐｓｉｇ圧力、および５０ｒｐｍ撹拌速度であった。
【０３２９】
３０Ｌバイオリアクター中の生細胞密度は、培養の３日目に１０．８０ｘ１０５細胞／ｍＬであり、これは２．４０ｘ１０５細胞／ｍＬの初期標的密度で２００Ｌバイオリアクターに接種するのに十分なものであった。３０Ｌの全内容物を移したところ、接種後の重量、細胞密度および生存率は、それぞれ、１３４．５Ｋｇ、２．３７ｘ１０５細胞／ｍＬおよび９０．９％であった。温度、ｐＨ、溶解酸素、圧力、および撹拌速度に関する２００Ｌバイオリアクターにおける運転設定点は、それぞれ、３７℃、ｐＨ７．０、４０％空気飽和、１ｐｓｉｇ圧力、および３５ｒｐｍ撹拌速度であった。３日目に、細胞密度は１５．７１ｘ１０５細胞／ｍＬであり、これは、バイオリアクターに６０Ｌ（ｖ／ｖ）の完全培地（ＡＧＴ  ＣＤ  ＣＨＯ  ５Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２００ｍＭのＬ−グルタミン（最終濃度１０ｍＭ）溶液を添加するのに十分なものであった。８および１２日目に、グルコースレベルは５ｇ／Ｌ以下まで低下し、これは３ｇ／Ｌのグルコース（２０％）溶液の添加を誘発した。９日目に生細胞密度は３３．２０ｘ１０５細胞／ｍＬでピークに達し、９２．５％の生存率であった。７８．５％の細胞密度で１３日目にバイオリアクターを収穫した。培養期間を通じた培養物の細胞計数および生存率を図３Ａに示し、培養期間を通じた培養培地中のＡｐｏＡ−Ｉ濃度を図３Ｂに示す。
【０３３０】
７．２．２．細胞の収穫、細胞分離および保存
バイオリアクターの内容物を２つのＣｕｎｏ（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）６０Ｍ０２  Ｍａｘｉｍｉｚｅｒフィルター、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．２２μｍ  Ｏｐｔｉｃａｐ（Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ、ＭＡ、ＵＳＡ）に通過させることにより、バイオリアクターからの培地を２００Ｌの袋に収穫した。次いで、清澄化された培地を、分散操作まで２〜８℃で保存した。清澄化された培地を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．２２μｍフィルター（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を通して濾過し、２Ｌの滅菌ＰＥＴＧボトル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ、ＵＳＡ）中に分注した後、出荷されるまで−２０℃で凍結した。
【実施例２】
【０３３１】
８．実施例２：ＡｐｏＡ−Ｉ精製システムの開発
８．１．材料および方法
発現、一次分離および条件化。実施例１に記載のように得られたＡｐｏＡ−Ｉ清澄化細胞増殖培地（約１．８Ｌ）を、周囲温度での保存により解凍した。解凍された培地を、１Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ５．３±０．２に低下させることにより、陰イオン交換クロマトグラフィーのために条件化した。
【０３３２】
ＡｐｏＡ−Ｉの精製。２０ｃｍのベッド高に充填したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）陰イオン交換カラムを、ＴＡＭＰ  Ａバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．３）を用いて平衡化させた。カラム流出液のｐＨが約５．５であった場合に平衡化が完了したと判定した。条件化された濾液を、３．７ｃｍ／ｍｉｎの流速で２５〜３５ｇのＡｐｏＡ−Ｉ／陰イオン交換樹脂１Ｌでカラム上にロードした。ＴＡＭＰ  Ａ流出物中、カラムを通してＡｐｏＡ−Ｉを洗浄し、これを回収した。
【０３３３】
陰イオン交換カラムからのＡｐｏＡ−Ｉを含有する流出物を、１Ｍ  ＮａＯＨを用いて８．０±０．２にｐＨ調整した。次いで、溶液を、約１２．５Ｌ／ｈ／ｍ２の流速で０．２μｍのＰｌａｎｏｖａ  ２０Ｎフィルター（旭化成メディカル）を通して濾過して、ウイルスおよびウイルス粒子を除去した。
【０３３４】
２５ｃｍのベッド高を有するＳｏｕｒｃｅ  ３０逆相クロマトグラフィーカラムを、カラム流出液がｐＨ９．５に達した場合に平衡化されるまで、ＴＡＭＰ  Ｄバッファー（２０ｍＭ炭酸アンモニウム、ｐＨ９．５）で洗浄した。ウイルス濾過ステップからのＡｐｏＡ−Ｉを含有する濾液を、２．８ｃｍ／ｍｉｎの流速でカラム上にロードした。試料中のＡｐｏＡ−Ｉをマトリックスに吸着させ、ＴＡＭＰ  Ｄバッファー中の３５〜５０％アセトニトリルの勾配を用いて溶出させた。
【０３３５】
２５ｃｍのベッド高に充填した逆相シリカＣ１８カラム（３００Å  １０μｍ）を、カラム流出液がｐＨ９．５に達した場合に平衡化されるまで、ＴＡＭＰ  Ｅバッファー（１００ｍＭ炭酸アンモニウム、ｐＨ９．５）中で洗浄した。次いで、Ｃ１８カラムを、４．７ｇのＡｐｏＡ−Ｉ／マトリックス１Ｌでロードした。カラムマトリックスに吸着されたＡｐｏＡ−Ｉを、ＴＡＭＰ  Ｅバッファー中の４０〜５０％アセトニトリル勾配中で溶出させた。
【０３３６】
画分を約２．５倍にプール、濃縮した後、１５容量のＴＡＭＰ  Ｃバッファー（３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８）に対して濃縮液を透析濾過することにより、Ｃ１８カラムから溶出したＡｐｏＡ−Ｉ含有画分からアセトニトリルを除去した。透析濾過されたＡｐｏＡ−Ｉ溶液のｐＨを、希リン酸を用いて約６．０に低下させた後、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ陰イオン交換膜（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通して濾過して、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質を除去した。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑの濾液を、５容量のＴＡＭＰ  Ｃバッファーに対して透析濾過した。
【０３３７】
次いで、透析濾過された濾液を、膜が２８，０００ダルトンのＡｐｏＡ−Ｉを保持するように１０，０００ダルトン分子量カットオフを有するポリエーテルスルホン膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｏｍｅｇａシリーズ）を用いて最後の限外濾過にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査し、精製されたＡｐｏＡ−Ｉバンド領域の強度と全バンドの総強度との比率を測定することにより決定された場合、タンパク質溶液は７．８〜１７ｇ／Ｌの純粋なＡｐｏＡ−Ｉを含有していた。
【０３３８】
８．２．結果
ＡｐｏＡ−Ｉの特性評価。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＡｐｏＡ−Ｉ生成物の純度をアッセイしたところ、９９％以上純粋であり、低レベルのＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質を含み、トランケートされたＡｐｏＡ−Ｉの量は検出不可能であった。図４を参照されたい。
【実施例３】
【０３３９】
９．実施例３：リポタンパク質複合体成分の最適化
９．１．アポリポタンパク質およびリン脂質成分の調製
プロＡｐｏＡ−Ｉ：タンパク質プロＡｐｏＡ−Ｉは、約９０ｍｇのタンパク質を含有する凍結乾燥された個々の１００ｍＬフラスコ中で、Ｕｎｉｔｅ  ｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｍｅｕｒｉｃｅ、Ｈｔｅ  Ｅｃｏｌｅ  Ｌｕｃｉａ  Ｄｅ  Ｂｒｏｕｃｋｅｒｅ、１  Ａｖｅｎｕｅ  Ｅｍｉｌｅ  Ｇｒｙｚｏｎ、Ｂ−１０７０  Ａｎｄｅｒｌｅｃｈｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍにより供給されたものであった。バッチ番号は２００６０２０２であった。タンパク質を使用まで約４℃で保持した。凍結乾燥前に、プロＡｐｏＡ−Ｉの含量は３．２２５ｍｇ／ｍＬであり、尿素含量は約０．０１１ｍｇ／ｍＬであった。約６３０ｍｇのプロＡｐｏＡ−Ｉを２５．６ｍＬの酢酸／水５％中に溶解することにより、プロＡｐｏＡ−Ｉの溶液を作製した。溶液の最終濃度は２５ｍｇ／ｍＬであった。
【０３４０】
ＡｐｏＡ−Ｉ：ＡｐｏＡ−Ｉを、上記の実施例１に記載のように調製した。
【０３４１】
スフィンゴミエリン：卵由来スフィンゴミエリン（Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＮＭ−１０）は、日油株式会社、１−５６、Ｏｏｈａｍａ−Ｃｈｏ、Ａｍａｇａｓａｋｉ−Ｓｈｉ、６６０−００９５、Ｊａｐａｎにより供給されたものであった。バッチ番号は０５０２ＥＳ１であった。スフィンゴミエリンを、使用まで約−２０℃で保持した。スフィンゴミエリンの純度は９９．１％であった。７９９．４ｍｇの精製スフィンゴミエリンを１６ｍＬの酢酸／水５％中に溶解し、５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得ることにより、スフィンゴミエリンの溶液を作製した。
【０３４２】
ホスファチジルグリセロール：ナトリウム塩としての１，２−ジパルミトイル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ−Ｎａ、Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＭＧ−６０６０ＬＳ）は、日油株式会社、１−５６、Ｏｏｈａｍａ−Ｃｈｏ、Ａｍａｇａｓａｋｉ−Ｓｈｉ、６６０−００９５、Ｊａｐａｎにより供給されたものであった。バッチ番号は０３０９６５１Ｌであった。ＤＰＰＧ−Ｎａを、使用まで約−２０℃で保持した。ＤＰＰＧ−Ｎａの純度は９９．２％であった。４９．１ｍｇのＤＰＰＧ−Ｎａを１ｍＬの酢酸／水５％に溶解し、５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得ることにより、ＤＰＰＧ−Ｎａの溶液を作製した。
【０３４３】
ホスファチジルコリン：ジ−パルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を、商業的供給源から取得した。
【０３４４】
９．２．リポタンパク質複合体の調製
以下のリポタンパク質複合体を調製した：
（ａ）中性リポタンパク質複合体：
ａ．処方Ａ：タンパク質中のプロＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭ：リン脂質重量比１：２．５；
ｂ．処方Ｂ：タンパク質中のプロＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭ：リン脂質重量比１：２．７；
ｃ．処方Ｃ：タンパク質中のプロＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭ：リン脂質重量比１：３．１；
ｄ．処方Ｄ：５０：５０のＳＭ：ＤＰＰＣ  ｗｔ比を有する、１：２．７のリポタンパク質ｗｔ：総リン脂質ｗｔ比中のプロＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭおよびＤＰＰＣ；
ｅ．処方Ｅ：タンパク質中のプロＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭ：リン脂質重量比１：２．７。
（ｂ）負に荷電したリポタンパク質複合体：
ａ．処方Ｆ：４８：４８：４のＳＭ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有する、１：２．７のリポタンパク質ｗｔ：総リン脂質ｗｔ比中のプロＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭ、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ；
ｂ．処方Ｇ：７３：２３：４のＳＭ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有する、１：２．７のリポタンパク質ｗｔ：総リン脂質ｗｔ比中のプロＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭ、ＤＰＰＣおよびＤＰＰＧ；
ｃ．処方Ｈ：９７：３のＳＭ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有する、１：２．７のリポタンパク質ｗｔ：総リン脂質ｗｔ比中のＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭおよびＤＰＰＧ；
ｄ．処方Ｉ：９７：３のＳＭ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有する、１：３．０のリポタンパク質ｗｔ：総リン脂質ｗｔ比中のＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭおよびＤＰＰＧ；
ｅ．処方Ｊ：９７：３のＳＭ：ＤＰＰＧ  ｗｔ：ｗｔ比を有する、１：３．３のリポタンパク質ｗｔ：総リン脂質ｗｔ比中のＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭおよびＤＰＰＧ。
【０３４５】
９．３．リポタンパク質複合体の形成速度および均一性
試料をＨＰＬＣ系に注入し、リポタンパク質複合体のサイズおよび分布について検査することにより、処方ＡからＪまでのリポタンパク質複合体の形成を試験した。同時均一化により複合体を製造し、指示された時間にサンプリングした。
【０３４６】
図５は、異なるリポタンパク質：ＳＭ  ｗｔ：ｗｔ比を含む処方Ａから処方Ｃまで、ならびに中性リン脂質が５０：５０のＳＭ：ＤＰＰＣである１：２．７の比のリポタンパク質および中性リン脂質を含む処方Ｄに従う中性リポタンパク質複合体に関する例示的ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。１：２．７のリポタンパク質：ＳＭ  ｗｔ：ｗｔ比が最適であった。ＳＭとＤＰＰＣの混合物を含む処方Ｄは、少ない複合体形成を示した。
【０３４７】
第２の中性リン脂質としてホスファチジルコリンを添加したところ、ゆっくりとした不完全な複合体形成が得られた。図６は、１０、２０、３０および６０分での処方Ｄのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。対照的に、図７に示される通り、処方Ｂは急速に複合体を形成した。
【０３４８】
負に荷電したリン脂質、ＤＰＰＧのＳＭおよびＤＰＰＣへの添加は、図８の２０、４０、６０および１２０分での処方Ｆのリポタンパク質複合体のＨＰＬＣクロマトグラムに示される通り、さらに少ない複合体形成をもたらした。
【０３４９】
図９に示される通り、１：２．７のタンパク質：脂質重量比で、リン脂質としてＳＭのみを含有するリポタンパク質複合体は、より多くのプレ−Ｂ  ＨＤＬ複合体を形成し、同じタンパク質：脂質重量比を有するが、ＤＰＰＣおよび／またはＤＰＰＧを含有するリポタンパク質複合体よりもそうするのが速い。従って、中性脂質としてＳＭのみを含むリポタンパク質複合体は、ＳＭに加えてＤＰＰＣを含み、ＤＰＰＧを添加した、または添加しない複合体よりも速い速度でより均一なリポタンパク質複合体を形成する。
【０３５０】
最後に、リン脂質画分が９７：３の重量比のＳＭおよびＤＰＰＧを含有する、１：２．７〜１：３のアポリポタンパク質：リン脂質重量比を含む負に荷電したリポタンパク質複合体は、１：３．３のアポリポタンパク質：リン脂質重量比を含む複合体および非荷電リポタンパク質複合体と比較して、最適な均一性を示し、遊離脂質ピークを示さなかった。処方Ｅ、Ｈ、ＩおよびＪに関するＨＰＬＣクロマトグラムを示す図１０を参照されたい。動物におけるさらなる試験（実施例６）のために、処方ＢおよびＨに従うリポタンパク質複合体を選択し、その動物試験の結果に基づいて、ヒト患者における臨床評価（実施例６および８）のために、処方Ｈのリポタンパク質複合体を選択した。
【実施例４】
【０３５１】
１０．実施例４：熱サイクリングに基づく方法を用いるリポタンパク質複合体の形成
１０．１．ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／スフィンゴミエリン複合体を作製するための手順の概説
１〜３０ｍｇ／ｍｌ、典型的には５〜２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度のリン酸バッファー（ｐＨ７〜９）中の凍結ＡｐｏＡ−Ｉ溶液を、２〜８℃で約２４〜９６ｈ解凍することにより調製し、秤量する。リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素ナトリウムをＡｐｏＡ−Ｉ溶液に添加して、ｐＨ７．４のバッファー中１０ｍＭの最終ペプチド濃度を得る。
【０３５２】
ＤＰＰＧ溶液を、リン酸バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を５０℃を目標に温めることにより調製する。ＤＰＰＧ粉末（日油株式会社）を少なくとも１．５ｈ、周囲温度で解凍した後、秤量し、バッファー容器に添加する。次いで、ＤＰＰＧを、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）高性能ディスペンサ（ＩＫＡ（登録商標）Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）を用いて５０℃の温度で分散させる。分散後、ＤＰＰＧ懸濁液およびＡｐｏＡ−Ｉ溶液を５７℃に加熱する。それらを合わせ、窒素下で３０分間、５７℃で加熱する。このプレ複合体溶液を室温に冷却する。
【０３５３】
スフィンゴミエリン（ＳＭ）粉末（日油株式会社）を周囲温度で解凍した後、ガラスタンク中に秤量する。リン酸リン酸(phosphate phosphate)バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を５０℃に加熱し、ＳＭ粉末と合わせて２２０ｍｇ／ｍｌのＳＭ濃度にする。ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）を用いてＳＭ粉末を懸濁液中に分散させ、分散物を４℃に冷却した後、ホモジェナイザーに通過させる。動的光散乱（ＤＬＳ）により５５〜７０ｎｍゼータ（Ｚ）平均サイズ（強度測定を用いる）までＳＭ粒子をモニターする。これを、例えば、３２０００＋／−３０００ｂａｒで、１０〜１８℃の入力温度および好ましくは３０〜４０℃（および５９℃を超えない）の出力温度でＮａｎｏ  ＤｅＢｅｅホモジェナイザーを用いて達成し、５８ｎｍのＺ平均サイズを有する粒子を得ることができる。
【０３５４】
複合体化のために、ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ混合物およびＳＭ分散物を別々に５７℃に温める。温められたＳＭ分散物を、５７℃の初期温度設定点でＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ混合物に添加する。合わせるために撹拌した後、溶液を３７℃に冷却し、次いで、一連の熱サイクル（５７℃〜３７℃）を実行して、ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体を形成させる。この加熱−冷却プロセスを、５分〜３０分の温度間の接触時間で継続する。加熱−冷却サイクルを、タンパク質成分の大部分がリポタンパク質複合体中に組み込まれるまで繰り返す。熱サイクリングの間の複合体のサイズおよび分布を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によりモニターする。
【０３５５】
ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体を、上記の（および図１１に例示された）手順に従って作製した。ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、図１に記載の配列の２５〜２６７位に一致するアミノ酸配列を有していた。複合体は、９７：３の重量比のスフィンゴミエリン（ＳＭ）および１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ジパルミトイルホスファチジルグリセロールまたはＤＰＰＧ）を含有する。ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質と総脂質との比は１：２．７重量／重量（ｗ／ｗ）であり、これは１：１０８のモル比と等価である。左側にＬａｕｄａ  Ｅｃｏｌｉｎｅ  Ｓｔａｒ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ  ２６ＬＥ水浴（その中で試料が熱サイクリングされる）を含み、右側に１８ｍｌの保持容量を有するｓｈｅｌｌ  ＆  ｔｕｂｅ熱交換器（モデルＥＦ−Ｃ５０−ＨＥ）を含み、蠕動ポンプにより接続された、図５に記載のように配置された熱交換器を用いて、各温度で５分間、５７℃と３７℃の間で、合わせた脂質およびタンパク質成分をサイクルにかけた。
【０３５６】
１８０ｍｇのＤＰＰＧを、２．８２グラムの１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０に添加した。５０℃で１０分間、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ディスペンサを用いて、懸濁液を分散させた。２２グラムのＳＭ粉末を、７８グラムの１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０と合わせた。５０℃で２０〜４０分間、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ディスペンサを用いて、懸濁液を分散させた。６０ｎｍの平均粒径に設定されたＮａｎｏＢＥＥを用いて、ＳＭを均一化させた。ＤＰＰＧ、ＳＭおよびタンパク質を５７℃にした。１８ｍｇ（０．３ｍｌ）のＤＰＰＧを、５７℃で１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４中の２１４ｍｇのＡｐｏＡ−Ｉタンパク質に添加した。５７℃で３０分後、５５９ｍｇのＳＭ粒子（２．５４ｍｌ）を添加した。次いで、この溶液を熱サイクリングにかけて複合体を形成させた。
【０３５７】
３０分、６０分、１２０分、１８０分および２１０分の熱サイクリング後のＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体形成を示すゲル浸透クロマトグラフィーを、それぞれ図１３Ａ〜１３Ｅに示す。主要なＧＰＣピークの鋭さの増加により示される通り、サイクル時間の増加と共により小型の複合体が製造される。非複合体化タンパク質に対応するピークも時間と共に消失する。
【０３５８】
１０．２．ＡｐｏＡ−Ｉ／スフィンゴミエリン複合体の形成
上記の手順に従うが、ＡｐｏＡ−ＩをＤＰＰＧとプレ複合体化せずに、ＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ複合体を作製した。タンパク質成分は８．９ｍｇ／ｍｌの濃度の５ｍｌのＡｐｏＡ−Ｉであり、脂質成分は１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０中に懸濁し、均一化して６０ｎｍの脂質粒子を形成させた０．５ｍｌの卵スフィンゴミエリン（２２０ｍｇ／ｍｌ）であった。タンパク質および脂質成分を５０℃で１：２．５ｗｔ：ｗｔの比で混合した。得られた懸濁液を、図５に記載の熱サイクリング装置を用いて１８時間（１０８サイクルおよび１０分のサイクリング時間）、熱サイクリングにかけた。ゲル浸透クロマトグラフィーは、形成されたタンパク質／脂質複合体が本質的に均一であることを示す（図１４のＧＰＣクロマトグラムを参照されたい）。
【０３５９】
１０．３．ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／Ｎ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリン）複合体の形成
ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／フィトスフィンゴミエリン複合体を、上記の手順に従って作製した。フィトスフィンゴミエリン粒子を約１８３ｎｍのサイズ（ＤＬＳにより測定）まで均一化し、７．８ｇ／Ｌのタンパク質：ＤＰＰＧ混合物に添加して、１：２．７の最終タンパク質：脂質（ＳＭおよびＤＰＰＧ）比を達成した。Ｎ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィト−スフィンゴミエリン）およびタンパク質：ＤＰＰＧ成分を含有する懸濁液を、合計２時間にわたって、３７℃で１０分間および５７℃で１０分間の６サイクルにわたって熱サイクリングした。ゲル浸透クロマトグラフィーは、形成されたタンパク質／脂質複合体が本質的に均一であることを示す（図１５のＧＰＣクロマトグラムを参照されたい）。
【０３６０】
１０．４．ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／合成パルミトイルスフィンゴミエリンの形成
ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／合成パルミトイルスフィンゴミエリン複合体を、以下のように作製した。１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４中の合成パルミトイルスフィンゴミエリン（２２０ｍｇ／ｍｌ）の８．８ｍＬの溶液を、３３００ｎｍの粒径に達するまで混合した。ＡｐｏＡ−Ｉ（１４ｍｇ／ｍｌで９４５ｍｇ）を、０．０３重量％のＤＰＰＧ（６０ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、５０℃で３０分間加熱した。合成パルミトイルスフィンゴミエリンミセルを、１：２．７のアポリポタンパク質：リン脂質重量比でタンパク質／ＤＰＰＧ複合体と合わせた。タンパク質および脂質の懸濁液を、合計２４０分間、または好適な粒径分布に達するまで、１０分毎に３７℃と５７℃を交互にする加熱−冷却サイクルを用いて熱サイクリングした。熱サイクリングの間の複合体のサイズおよび分布を、ＧＰＣによりモニターした。複合体化後、濃度を８．０ｍｇのＡｐｏＡ−Ｉ／ｍｌにした後、等張性のためにスクロース（４０ｍｇ／ｍｌ）およびマンニトール（２０ｍｇ／ｍｌ）を複合体に添加した。リポタンパク質複合体をＧＰＣによりアッセイしたところ、本質的に均一であることがわかった（図１６のＧＰＣクロマトグラムを参照されたい）。
【０３６１】
１０．５．ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／フィトスフィンゴミエリンの形成
ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／フィトスフィンゴミエリン複合体を、以下のように作製した。１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４中のフィトスフィンゴミエリン（２２０ｍｇ／ｍｌ）の２．０ｍＬの溶液を、９９０ｎｍの粒径に達するまで５０℃で４０分間、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）中で分散させた。ＡｐｏＡ−Ｉ（７．８ｍｇ／ｍｌの濃度で１５．６ｍｇ）を、０．０３重量％のＤＰＰＧ（６０ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、５７℃で３０分間加熱した。フィトスフィンゴミエリン溶液を、１：２．７のアポリポタンパク質：リン脂質重量比でタンパク質／ＤＰＰＧ混合物と合わせた。次いで、タンパク質および脂質の懸濁液を、合計２４０分間、または好適な粒径分布に達するまで、１０分毎に３７℃と５７℃を交互にする加熱−冷却サイクルを用いて熱サイクリングした。リポタンパク質複合体の集団をＧＰＣにより測定したところ、約９２．６％均一であることがわかった（図１７のＧＰＣクロマトグラムを参照されたい）。
【０３６２】
１０．６．ＡｐｏＡ−Ｉペプチドとの複合体形成
ＡｐｏＡ−Ｉペプチド（Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ５−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ１０−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ１５−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ２０−Ｖａｌ−Ｉｎｐ２２−ＯＨ；配列番号４）溶液を用いて、上記のように（第１０．１節を参照されたい）、ＡｐｏＡ−Ｉペプチド、ＤＰＰＧおよびスフィンゴミエリンの複合体を生成させた。リン脂質成分は、４８．５：４８．５：３の重量比の卵スフィンゴミエリン（ＳＭ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ジパルミトイルホスファチジル−グリセロール、ＤＰＰＧ）からなる。ペプチドと総リン脂質複合体との比率は、１：２．５（ｗ／ｗ）である。薬剤複合体は、リン酸緩衝生理食塩水（１２ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．２）中のＣＥＲ−５２２複合体の溶液である。出発溶液を２時間、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で５０℃と３７℃の間で熱サイクリングにかけることにより、複合体を形成させた。
【０３６３】
ゲル浸透クロマトグラフィーは、形成されたタンパク質／脂質複合体が本質的に均一であり、タンパク質の大部分がリポタンパク質複合体中に組み込まれていることを示す（図１８のＧＰＣクロマトグラムを参照されたい）。
【０３６４】
１０．７．複合体形成に対する脂質粒径および熱サイクル数の効果
粒径に対する脂質粒径および熱サイクル数の効果を試験した。４つの異なる出発脂質粒径（８５ｎｍ、７７ｎｍ、６６ｎｍおよび６０ｎｍのゼータ平均を有する）の調製物（それぞれ、図１９Ａ〜１９Ｄ）を、１回の通過でＮａｎｏＢＥＥにＳＭ溶液を通すことにより生成させた。それぞれの通過物をそのゼータ平均について分析した。脂質粒径はそれぞれの通過と共に低下し、所望のサイズが達成されるまで脂質粒子を収集した。４つの異なる脂質粒径を、３７℃で３分間および５７℃で１０分間の５または７サイクルにわたって、第１０．１節の複合体形成法において試験した。
【０３６５】
脂質成分をタンパク質成分と混合した場合、得られる懸濁液は濁っている。複合体が形成されるにつれて、この濁りは減少し、溶液はより透明になる。
【０３６６】
５サイクルの後、６０ｎｍの脂質粒子から製造された複合体の懸濁液が最も透明であった。ＧＰＣクロマトグラム（図２０Ａ〜２０Ｄ）は、主要なピークの均一性により証明される通り、全試料において完全な、またはほぼ完全な複合体化を示した。６６ｎｍの脂質粒子から出発した場合、リポタンパク質複合体の得られた懸濁液中にＧＰＣによって検出可能な非複合体化タンパク質はなかったが、これは全てのタンパク質が５サイクル後に脂質と複合体化されたことを示唆し、得られた複合体は９８％純粋であった。７サイクルの後、４つ全ての懸濁液がより透明になり、これはさらにより高い程度の複合体化を示す。６０ｎｍの脂質粒子を用いて作製された懸濁液は、最も透明に見えた。
【０３６７】
別の試験において、４５０ｎｍと４０ｎｍのＳＭ粒子を、第１０．１節に記載の方法を用いてＡｐｏＡ−ＩおよびＤＰＰＧと複合体化した。図２１ＡのＧＰＣクロマトグラムに示されるように（９．８分のピーク）、脂質成分として４５０ｎｍのＳＭ粒子を用いた場合、全てではないが、ほとんどのＡｐｏＡ−Ｉがリポタンパク質複合体中に組み込まれた。図２１ＢのＧＰＣクロマトグラムに示されるように（９．５５１分のピーク）、脂質成分として４０ｎｍのＳＭ粒子を用いた場合、はるかに少量のＡｐｏＡ−Ｉ画分がリポタンパク質複合体中に組み込まれた。
【０３６８】
１０．８．複合体形成に対する出発温度の効果
複合体形成に対する初期熱サイクリング温度の効果を試験した。脂質成分およびタンパク質成分を、５７℃の代わりに３７℃に加熱し、合わせた以外は第１０．１節に記載のようにＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体を生成させた。得られた複合体のＧＰＣクロマトグラムを図２２に示す。比較的大きいタンパク質ピーク（図２２で９．４５５分に溶出する）により示されるように、熱サイクリングを５７℃で開始した場合よりも実質的に少ないタンパク質成分がリポタンパク質複合体中に組み込まれた。
【０３６９】
１０．９．熱サイクリング法を用いるリポタンパク質複合体の商業生産
大規模商業製造のために、本開示の方法をスケールアップし、場合により製剤化ステップと組み合わせた。商業的実施形態を図２３に示す。この実施形態では、熱サイクリングステップの後に、リポタンパク質複合体を希釈し、１つまたは複数の等張剤（例えば、スクロースおよび／またはマンニトール）と混合し、濾過し、バイアル中にアリコートする。バイアルの内容物を凍結乾燥して、得られる製剤の貯蔵期間を延長することができる。
【０３７０】
第１０．１節に記載のＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体を、ＤａＢＥＥ２０００を用いて２０リットルスケールで製造した。この複合体をリン酸バッファー（ｐＨ７〜８）で希釈し、スクロースおよびマンニトールと混合し、リン酸バッファー１０ｍＭ  ｐＨ７．４、８ｍｇ／ｍｌのＡｐｏＡ−Ｉ、４％（ｗ／ｗ）のスクロースおよび２％（ｗ／ｗ）のマンニトールを含有する最終製剤を得た。
【０３７１】
１０．１０．熱サイクリング対同時均一化により作製されたリポタンパク質複合体の比較
本明細書に開示される熱サイクリング法により作製されたＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体を、脂質およびタンパク質成分の同時均一化により作製された複合体と比較した。熱サイクリングにより作製された複合体の純度は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定した場合、同時均一化と比較して９７％に改善された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた場合、熱サイクリングにより作製された複合体は、同時均一化された複合体と比較して、９８％の増加した主バンド純度を有し、あまりトランケートされていないタンパク質バンドが存在する。
【０３７２】
また、ＡｐｏＡ−Ｉの酸化も、同時均一化と比較して熱サイクリングプロセスによって減少する。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）は、同時均一化された複合体においてはＲＴ０．９３と０．９９に２つの酸化ピークを示し、これは熱サイクリングプロセスでは存在しない。また、ペプチドマップは、同時均一化により製造された複合体と比較して、熱サイクリングにより製造された複合体においてＭｅｔ１１２およびＭｅｔ１４８でのＡｐｏＡ−Ｉのメチオニンの酸化の減少を示す。
【０３７３】
データの概要を以下の表５に提示する。
【０３７４】
【表５】
2014506884.tif 000008
【０３７５】
１０．１１．製造方法における不活性ガスの使用
ＡｐｏＡ−Ｉは、化学的に不安定になりやすい（例えば、酸化）繊細なタンパク質である。ＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ含有医薬組成物中のＡｐｏＡ−Ｉの安定性を増強するために、不活性ガスである窒素の雰囲気下で医薬組成物を調製した（熱サイクリング、充填および最終ステップを含む）。以下は、窒素下での同時均一化により作製されたＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ複合体と、熱サイクリングにより作製されたＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＣ複合体とを比較する試験の結果である。
【０３７６】
【表６】
2014506884.tif 000009
【実施例５】
【０３７７】
１１．実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコレステロール流出試験
ＡｐｏＡ−Ｉ−脂質複合体の生物活性を、Ｆｕ５ＡＨラットヘパトーマ細胞において試験し、ＡＢＣＡ１媒介性コレステロール流出を測定した。
【０３７８】
Ｆｕ５ＡＨラットヘパトーマ細胞は、細胞と成熟ＨＤＬとの間のコレステロールの二方向流動を容易にするＩ型スカベンジャー受容体クラスＢ（ＳＲＢ１）を高度に発現する。このモデルは、ＨＤＬ媒介性コレステロール流出活性に関する特異的アッセイを提供する。このアッセイを、Mwevaら、2006、「Comparison of different cellular models measuring in vitro the whole human serum cholesterol efflux capacity」、Eur. J. Clin. Invest. 36、552-559により記載された方法を用いて実施した。Ｆｕ５ＡＨ細胞を、３Ｈ−コレステロールで２４時間標識した。流出のための受容培地を、それぞれの試験試料（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳで緩衝化されたＭＥＭで希釈された、３０、２０および１０μｇ／ｍｌのＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／パルミトイルＳＭ、ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／卵ＳＭ、またはＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／フィトＳＭ）のため、および対照試料（ヒト血漿から精製されたＡｐｏＡ−Ｉ（２０μｇ／ｍＬ）、ＨＤＬ３、２％ヒト血清、培地のみ）のために調製した。試験または対照試料を含有する受容培地を、４時間にわたって細胞に添加し、流出培地および細胞単層中でコレステロールを測定して、Ｆｕ５ＡＨ細胞から放出されたコレステロールの百分率を決定した。試験試料の生物活性を算出し、正の実験対照として役立つ試験試料中のリポタンパク質複合体と同じ濃度の上記の処方Ｈの参考標準に対するコレステロール流出の百分率として表す。結果を以下の表７に示し、これは試験したリポタンパク質複合体がコレステロール流出アッセイにおいて測定された場合、有意な生物活性を有することを実証している。
【０３７９】
【表７】
2014506884.tif 000010
【実施例６】
【０３８０】
１２．実施例６：ウサギにおける処方Ｂおよび処方Ｈの複合体の単回低用量投与の薬力学的試験
正常なウサギに、（ａ）５ｍｇ／ｋｇ用量の処方Ｂの調製物（１：２．７のアポリポタンパク質：リン脂質重量比でＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭを含有する中性リポタンパク質複合体）；（ｂ）５ｍｇ／ｋｇ用量の処方Ｈの調製物（１：２．７のアポリポタンパク質：リン脂質重量比および９７：３のＳＭ：ＤＰＰＧ重量比でＡｐｏＡ−Ｉ、ＳＭおよびＤＰＰＧを含有する負に荷電したリポタンパク質複合体）；または（ｃ）リポタンパク質複合体調製物のための希釈剤を含有する対照調製物を単回注射した。４匹のウサギを、処方Ｂ、処方Ｈおよび対照の各々について試験した。
【０３８１】
経時的な、ＶＬＤＬ総コレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルを、図２４および２５に示す。血漿ＶＬＤＬ総コレステロールレベルは、処方Ｂ（ＡｐｏＡ−ＩおよびＳＭのリポタンパク質複合体）で処理した動物におけるレベルよりも、処方Ｈ（ＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体）（ｂ）で処理した動物において、あまり増加せず、より速くベースラインに戻った。同様の効果がトリグリセリドレベルについても認められた。この試験は、これらのレベルの一過的上昇が、中性リポタンパク質複合体よりもＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体複合体についてより短い持続期間のものであることを示していた。この結果は、ヒト対象における処方Ｈのリポタンパク質複合体の第Ｉ相試験の結果と一致する（以下の実施例８に記載される）。
【実施例７】
【０３８２】
１３．実施例７：卵ＳＭおよび合成パルミトイルＳＭの比較薬力学的試験
ウサギに静脈内注射されたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）／卵ＳＭおよびＡｐｏＡ−Ｉ／合成パルミトイルＳＭリポタンパク質複合体の薬力学的効果を試験した。リポタンパク質複合体の注射後、血漿脂質およびリポタンパク質レベルの変化を測定した。
【０３８３】
ＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭまたはＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭのいずれかのリポタンパク質複合体を、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で、耳静脈への静脈内注入により５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの用量でウサギに投与した。１群あたり４匹の動物を試験した。投与前、注入の終了直後、ならびに注入の開始の３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１０ｈおよび３０ｈ後に、血漿試料を採取した。次いで、市販の酵素キットを用いて、総コレステロール、非エステル化コレステロール、リン脂質および総トリグリセリドについて血漿試料を分析した。市販のＥＬＩＳＡキットを用いて血漿試料中でＡｐｏＡ１をアッセイした。血漿試料をＧＰＣにより分析して、総コレステロールおよび非エステル化コレステロールのプロフィールを決定した。５ｍｇ／ｋｇ用量での処理について、クロマトグラムトレースの曲線下総面積の百分率に基づいて、結果を定量した。
【０３８４】
図２６Ａ〜２６Ｄは、５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭまたはＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭのいずれかを注入したウサギにおける、経時的な、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質およびＡｐｏＡ−Ｉの血漿レベルを示す。投与した両用量で、注入の開始後３０分以内に急速で有意なコレステロール移動が観察された：コレステロール移動は５ｍｇ／ｋｇ用量については投与の３０分後にピークに達し、２０ｍｇ／ｋｇ用量ではコレステロール移動の大きな増加が観察された。試験した各用量で、両方の製剤は、血漿トリグリセリド、血漿リン脂質および血漿組換えヒトＡｐｏＡ−Ｉについて類似するプロフィールを有していた。
【０３８５】
図２７Ａ〜２７Ｃは、血漿ＨＤＬ−総コレステロールレベル、血漿ＬＤＬ−総コレステロールレベル、および血漿ＶＬＤＬ−総コレステロールレベルを示す。ＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭおよびＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭに関するＨＤＬ−総コレステロールの増加は類似していた（図２７Ａ）。血漿ＬＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃレベルにおいては変動はほとんどなく、そのレベルはいずれかの製剤のリポタンパク質複合体の注射によって実質的に変化しなかった（図２７Ｂ〜２７Ｃ）。
【０３８６】
この試験の結果は、ＡｐｏＡ−Ｉ／卵ＳＭおよびＡｐｏＡ−Ｉ／合成ＳＭリポタンパク質複合体がｉｎ  ｖｉｖｏで類似する応答を惹起することを示している。
【実施例８】
【０３８７】
１４．実施例８：健康な脂質異常症対象におけるＡｐｏＡ−Ｉ／ＤＰＰＧ／ＳＭ複合体の第Ｉ相試験
１４．１．材料および方法
３．０を超えるＬＤＬ／ＨＤＬ比を有する健康なボランティアにおいて、無作為化二重盲検プラセボ対照交差単回上昇用量試験として処方Ｈのリポタンパク質複合体を用いて、第Ｉ相臨床試験を行った。この第Ｉ相試験の目的は、単回用量として投与された場合の負に荷電したリポタンパク質複合体の安全性、許容性、薬物動態および薬力学を評価することであった。０．２５、０．７５、２．０、５．０、１０．０、１５．０、３０．０および４５．０ｍｇ／ｋｇの上昇用量を試験した。対象は、注入により、タンパク質および脂質成分の同時均一化により作製されたＡｐｏＡ−Ｉ（実施例１に記載のように調製されたもの）、ＳＭおよびＤＰＰＧ（１：２．７のタンパク質：脂質重量比および９７％ＳＭ／３％ＤＰＰＧ（ｗ／ｗ）の脂質組成）のリポタンパク質複合体を含有する滅菌溶液を受けた。この滅菌溶液は、リポタンパク質複合体に加えて、マンニトールおよびスクロース（４％（ｗ／ｗ）スクロース、２％（ｗ／ｗ）マンニトール）を含有するｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水であった。
【０３８８】
１４．２．結果
以下に、この第Ｉ相試験からの臨床知見をまとめる。
【０３８９】
総コレステロール：各時点での平均血漿総コレステロール濃度を、以下の表８に提示する。
【０３９０】
【表８】
2014506884.tif 000011
【０３９１】
総コレステロール中のＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ：総コレステロール中のＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの平均値を、以下の表９〜１１に時点および用量別にまとめる。
【０３９２】
【表９】
2014506884.tif 000012
【０３９３】
【表１０】
2014506884.tif 000013
【０３９４】
【表１１】
2014506884.tif 000014
【０３９５】
非エステル化（遊離）コレステロール：各時点での平均血漿遊離（非エステル化）コレステロール濃度を、以下の表１２に提示する。
【０３９６】
【表１２】
2014506884.tif 000015
【０３９７】
遊離コレステロール中のＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ：遊離コレステロール中のＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの平均値を、以下の表１３〜１５に時点および用量別にまとめる。
【０３９８】
【表１３】
2014506884.tif 000016
【０３９９】
【表１４】
2014506884.tif 000017
【０４００】
【表１５】
2014506884.tif 000018
【０４０１】
トリグリセリド：各時点での平均血漿トリグリセリド濃度を、以下の表１６に提示する。
【０４０２】
【表１６】
2014506884.tif 000019
【０４０３】
ＡｐｏＡ−Ｉ：対象の基準ＡｐｏＡ−Ｉの経時的変化（ｍｇ／ｄＬ）を、以下の表１７に示す。各用量について血漿ＡｐｏＡ−Ｉの最大変化を太字で示す。
【０４０４】
【表１７】
2014506884.tif 000020
【０４０５】
トランスアミナーゼ：毒性と相関する、肝臓アラニンアミノトランスフェラーゼ、またはトランスアミナーゼのレベルの平均値を、以下の表１８に提示する。アラニンアミノトランスフェラーゼの正常範囲は９〜６０ＩＵ／Ｌである。
【０４０６】
【表１８】
2014506884.tif 000021
【０４０７】
有害事象：合計７人（２２％）の対象が有害事象を有した。試験薬剤と少なくともおそらく関連すると調査員によって考えられた有害事象を有した対象はいなかった。有害事象の出現率に用量に関連する傾向はないと考えられる。重篤な有害事象を有した対象はなく、有害事象のために試験を取りやめた対象もいなかった。以下の表１９は、身体系別の有害事象の概要を提供する。
【０４０８】
【表１９】
2014506884.tif 000022
【０４０９】
１４．３．結論
０．２５、０．７５、２．０、５．０、１０．０、１５．０、３０．０および４５．０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量で処方Ｈの負に荷電したリポタンパク質複合体を含む滅菌溶液の調製物を投与したこの第Ｉ相試験から、以下の結論が得られた。
【０４１０】
前記調製物は、全ての対象において全用量で良好に許容され、有害事象プロフィールはプラセボについて観察されたものと同様であった。複合体は、プラセボと違って臨床化学、血液学または凝固パラメータに影響しないと考えられる。ＥＣＧに対する有害効果は観察されなかった。単回用量投与後にＡｐｏＡ−Ｉに対する抗体は検出されなかった。
【０４１１】
ＡｐｏＡ−Ｉおよびスフィンゴミエリンの血漿濃度は、用量と共に増加した：ＡｐｏＡ−Ｉレベルは、１０ｍｇ／ｋｇまでの用量については投与の２４時間後まで、および１０ｍｇ／ｋｇを超える用量については投与の７２時間後までにベースラインに戻った。スフィンゴミエリンレベルは、５ｍｇ／ｋｇまでの用量については投与の２４時間後まで、１０〜３０ｍｇ／ｋｇの用量については投与の７２時間後まで、および４５ｍｇ／ｋｇを投与された対象については投与の７日後までに、ベースラインに戻った。
【０４１２】
コレステロール移動は、用量の増加と共に増加した：遊離コレステロールのＨＤＬ画分における移動は、２．０ｍｇ／ｋｇの低さの用量でも認められ（ベースラインからの平均２３％の増加）、用量と共に増加した。トリグリセリドレベルは、１５ｍｇ／ｋｇおよびそれを超える用量で、プラセボについて認められたレベルを超えて一過的に増加した。
【０４１３】
さらに、複合体の投与は、肝臓トランスアミナーゼレベルを有意に上昇させず、全ての事例において、そのレベルは正常範囲内に良好に残った。これは、大豆ホスファチジルコリンと複合体化した血漿に由来する再構成された精製ヒトＡｐｏＡ−ＩであるＣＳＬ−１１１とは対照的であり、これは８０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で投与した場合、いくらかの患者において正常値上限の最大で１００倍を超えるアラニンアミノトランスフェラーゼレベルまで上昇することが認められた。Tardifら、2007、JAMA 297:1675-1682。
【０４１４】
かくして、本開示の複合体を、ＨＤＬを模倣し、さらに有害な副作用なしに脂質パラメータの臨床的に意義のある改善を達成する他の調製物について報告されたものよりも低い用量で投与することができる。
【実施例９】
【０４１５】
１５．実施例９：急性冠動脈症候群を有する対象の治療におけるＡｐｏＡ−Ｉ／ＳＭ／ＤＰＰＧ複合体の第ＩＩ相臨床試験
心血管疾患の治療における、低用量の処方Ｈ（１：２．７のアポリポタンパク質：リン脂質重量比で、９７：３の卵ＳＭ：ＤＰＰＧ重量比のＡｐｏＡ−Ｉ、卵スフィンゴミエリン（卵ＳＭ）およびＤＰＰＧ）の負に荷電したリポタンパク質複合体の治療的利益をさらに確認するために、臨床試験を行う。ＡｐｏＡ−Ｉを上記の実施例１に記載のようにＣＨＯ細胞中での発現により調製し、複合体を実施例４の熱サイクリング法により生成する。
【０４１６】
ＡＣＳの症状を示す対象がこの試験にとってスクリーニングするのにふさわしい。ベースラインカテーテル挿入の時点で、対象は、以前の、または現在のＰＣＩにより影響されない血管内超音波（ＩＶＵＳ）のために１つの「標的」動脈の十分なＩＶＵＳ評価を行う必要があり、標的動脈の近位４ｃｍは、視覚的血管造影評価による０〜５０％の直径狭窄を有し、参考直径≧２．５ｍｍであり、血栓を示唆する欠陥を含まないべきである。一度、ベースラインＩＶＵＳが全体の品質、好適な標的血管の存在およびＩＶＵＳ画像の正確な読み取りを不可能にし得る技術的因子の非存在についてＩＶＵＳ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって評価されたら、対象を無作為化して、１時間にわたって投与される、プラセボまたは複合体の３つの用量のうちの１つ（３、６もしくは１２ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入を受けさせる。無作為化された対象は、５回のさらなる注入について毎週の間隔（すなわち、７〜１１日毎）に戻す。最後の注入の１週間後（５〜９日）に、治療終了実験の結果を出す。最後の注入の約３週間後（１４〜３５日）に、追跡ＩＶＵＳを行う。最後の注入の約６カ月後（＋／−２週）に追跡訪問を行って、試験する抗ＡｐｏＡ１抗体について試料を採取し、主要有害心事象（ＭＡＣＥ）評価項目についてモニターする。
【０４１７】
主要評価項目は、三次元ＩＶＵＳにより評価された標的冠動脈の３０ｍｍ断片における総プラーク体積の数値的変化である。他の有効性測定値は、プラーク体積の変化率（％）、標的３０ｍｍ断片中のアテローム体積率（％）の変化、標的３０ｍｍ断片中の総血管体積の変化、ならびにベースラインでの最も小さいプラーク断面積(plaque burden)および三次元ＩＶＵＳ上のベースラインでの最も大きいプラーク断面積を有する部位を中心とする解剖学的に比較可能な５ｍｍ断片におけるベースラインから追跡までのプラーク、内腔および総血管体積の変化である。プラーク体積の変化率（％）は、数値的変化をベースラインで割って１００を掛けたものとして算出される。アテローム（閉塞）体積率（％）は、プラーク体積を弾性外膜（ＥＥＭ）体積で割った後、１００を掛けることにより計算される。
【０４１８】
１６．特定の実施形態、参考文献の引用
本開示の様々な態様が、以下の番号付きの段落に記載の実施形態で説明される。
１．アポリポタンパク質画分と脂質画分とを含むリポタンパク質複合体であって、前記脂質画分が本質的に９５〜９９重量％の中性リン脂質と１〜５重量％の負に荷電したリン脂質とからなり、アポリポタンパク質画分とリン脂質画分との比が、重量比で約１：２．７〜約１：３の範囲にある、リポタンパク質複合体。
２．アポリポタンパク質が、プレプロアポリタンパク質(preproapoliprotein)、プレプロＡｐｏＡ−Ｉ、プロＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＩ、プロＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＶ、プロＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、プレプロＡｐｏＥ、プロＡｐｏＥ、ＡｐｏＥ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、プロＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、プレプロＡｐｏＡ−ＩＰａｒｉｓ、プロＡｐｏＡ−ＩＰａｒｉｓ、およびＡｐｏＡ−ＩＰａｒｉｓならびにその混合物から選択される、実施形態１に記載のリポタンパク質複合体。
３．アポリポタンパク質が本質的に配列番号１のアミノ酸２５〜２６７に対応するタンパク質に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するＡｐｏＡ−Ｉからなる、実施形態２に記載のリポタンパク質複合体。
４．アポリポタンパク質が単量体、二量体および／または四量体を含む、実施形態３に記載のリポタンパク質複合体。
５．アポリポタンパク質がＡｐｏＡ−Ｉペプチド模倣体を含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体。
６．アポリポタンパク質画分とリン脂質画分との比が、重量比で１：２．７である、実施形態１から５のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体。
７．脂質：アポリポタンパク質モル比が約１：１０５〜約１１０の範囲であり、アポリポタンパク質の値がＡｐｏＡ−Ｉ当量で表される、実施形態１から６のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体。
８．脂質：アポリポタンパク質モル比が１：１０８である、実施形態７に記載のリポタンパク質複合体。
９．中性脂質が天然スフィンゴミエリンまたは合成スフィンゴミエリンである、実施形態１から８のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体。
１０．スフィンゴミエリンが卵スフィンゴミエリンである、実施形態９に記載のリポタンパク質複合体。
１１．少なくとも９５％純粋であるスフィンゴミエリンから作製される実施形態９に記載のリポタンパク質複合体。
１２．前記脂質画分が本質的に９６〜９８重量％の中性リン脂質と２〜４重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態１から１１のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体。
１３．前記脂質画分が本質的に９７重量％の中性リン脂質と３重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態１２に記載のリポタンパク質複合体。
１４．負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含む、実施形態１３に記載のリポタンパク質複合体。
１５．負に荷電したリン脂質が１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）の塩を含むか、またはそれからなる、実施形態１４に記載のリポタンパク質複合体。
１６．塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、実施形態１５に記載のリポタンパク質複合体。
１７．中性および／または負に荷電したリン脂質のアシル鎖がそれぞれ互いに独立に、１２〜２６、１４〜２６、または１６〜２６個の炭素原子を含有する飽和またはモノ不飽和炭化水素から選択される、実施形態１から１６のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体。
１８．中性および／または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が同じである、実施形態１７に記載のリポタンパク質複合体。
１９．中性および／または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が異なる、実施形態１７に記載のリポタンパク質複合体。
２０．中性および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が同じ数の炭素原子を含有する、実施形態１７に記載のリポタンパク質複合体。
２１．中性および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が異なる飽和度を有する、実施形態１７に記載のリポタンパク質複合体。
２２．中性および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が１６個の炭素原子を含有する、実施形態１７に記載のリポタンパク質複合体。
２３．実施形態１から２２のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体の集団。
２４．脂質画分と、本質的にアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（「ＡｐｏＡ−Ｉ」）からなるアポリポタンパク質画分とをそれぞれ含むリポタンパク質複合体の集団であって、下記特徴：
（ａ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉに関して少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％が成熟形態にある；
（ｂ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉの２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下が未熟形態にある；
（ｃ）前記集団がＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、１００ピコグラム以下、５０ピコグラム以下、２５ピコグラム以下、１０ピコグラム以下または５ピコグラム以下の宿主細胞ＤＮＡを含有する；
（ｄ）前記集団がＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、５００ナノグラム以下、２００ナノグラム以下、１００ナノグラム以下、５０ナノグラム以下、または２０ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質を含有する；
（ｅ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉの２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下または５重量％以下がトランケートされた形態にある；
（ｆ）前記集団中の前記ＡｐｏＡ−Ｉ中のメチオニン１１２およびメチオニン１４８のそれぞれの２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、２％以下または１％以下が酸化されている；
（ｇ）リポタンパク質複合体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９０％が、ゲル浸透クロマトグラフィー（「ＧＰＣ」）または動的光散乱（「ＤＬＳ」）により測定された場合、４ｎｍ〜１５ｎｍまたは６ｎｍ〜１５ｎｍのサイズの粒子の形態にある；
（ｈ）前記集団がＡｐｏＡ−Ｉ  １ミリグラムあたり、１ＥＵ以下、０．５ＥＵ以下、０．３ＥＵ以下または０．１ＥＵ以下の内毒素を含有する；ならびに
（ｉ）前記集団中のＡｐｏＡ−Ｉ中のアミノ酸の１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下が脱アミド化されている
のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個全部を特徴とする、集団。
２５．前記複合体中の脂質画分中の脂質の１５重量％以下、または１０重量％以下、５重量％以下または２重量％以下がコレステロールである、実施形態２４に記載の集団。
２６．コレステロールを含有しない、実施形態２５に記載の集団。
２７．タンパク質の少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質である、実施形態２４から２６のいずれか１つに記載の集団。
２８．タンパク質の１５％未満、１０％未満、または１０％未満が酸化、脱アミド化、および／またはトランケートされた種である、実施形態２７に記載の集団。
２９．リポタンパク質複合体が少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％または少なくとも９８％純粋である、実施形態２４から２８のいずれか１つに記載の集団。
３０．リポタンパク質複合体が、ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより反映されるように、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％均一である、実施形態２４から２９のいずれか１つに記載の集団。
３１．リポタンパク質複合体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、ＧＰＣまたはＤＬＳにより測定された場合、４ｎｍ〜１２ｎｍの範囲のサイズ、６ｎｍ〜１２ｎｍの範囲のサイズ、または８ｎｍ〜１２ｎｍの範囲のサイズである、実施形態３０に記載の集団。
３２．タンパク質の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が複合体中にある、実施形態２４から３１のいずれか１つに記載の集団。
３３．コール酸塩を含有しない、実施形態２４から３２のいずれか１つに記載の集団。
３４．洗剤を含有しない、実施形態２４から３３のいずれか１つに記載の集団。
３５．２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満または５０ｐｐｍ未満の非水性溶媒を含有する、実施形態２４から３４のいずれか１つに記載の集団。
３６．前記ＡｐｏＡ−ＩがヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質である、実施形態２４から３５のいずれか１つに記載の集団。
３７．前記ＡｐｏＡ−Ｉが組換えＡｐｏＡ−Ｉである、実施形態２４から３６のいずれか１つに記載の集団。
３８．ＡｐｏＡ−Ｉが配列番号１のアミノ酸２５〜２６７に対応するタンパク質に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２４から３７のいずれか１つに記載の集団。
３９．前記脂質画分が本質的に９５〜９９重量％の中性リン脂質と１〜５重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態２４から３８のいずれか１つに記載の集団。
４０．前記脂質画分が本質的に９６〜９８重量％の中性リン脂質と２〜４重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態３９に記載の集団。
４１．前記脂質画分が本質的に９７重量％の中性リン脂質と３重量％の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態２４から４０のいずれか１つに記載の集団。
４２．中性脂質が天然スフィンゴミエリンまたは合成スフィンゴミエリンであり、場合により、脂質が５ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、４ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、３ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満、または２ｍｅｑ  Ｏ／ｋｇ未満の過酸化物価を有する、実施形態４１に記載の集団。
４３．スフィンゴミエリンが卵スフィンゴミエリンである、実施形態４２に記載の集団。
４４．少なくとも９５％純粋であるスフィンゴミエリンから作られる実施形態４２に記載の集団。
４５．負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含む、実施形態４１から４４のいずれか１つに記載の集団。
４６．負に荷電したリン脂質が１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）の塩を含むか、またはそれからなる、実施形態４５に記載の集団。
４７．塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、実施形態４６に記載の集団。
４８．中性リン脂質および／または負に荷電したリン脂質のアシル鎖がそれぞれ互いに独立に、１２〜２６、１４〜２６、または１６〜２６個の炭素原子を含有する飽和またはモノ不飽和炭化水素から選択される、実施形態２４から４７のいずれか１つに記載の集団。
４９．中性リン脂質および／または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が同じである、実施形態４８に記載の集団。
５０．中性リン脂質および／または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が異なる、実施形態４８に記載の集団。
５１．中性リン脂質および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が同じ数の炭素原子を含有する、実施形態４８に記載の集団。
５２．中性リン脂質および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が異なる飽和度を有する、実施形態４８に記載の集団。
５３．中性リン脂質および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が１６個の炭素原子を含有する、実施形態４８に記載の集団。
５４．１：８０〜１２０、１：８５〜１：１１０、または１：１００〜１：１１５の範囲のアポリポタンパク質画分：脂質画分モル比を有し、アポリポタンパク質の値がＡｐｏＡ−Ｉ当量で表される、実施形態２４から４１のいずれか１つに記載の集団。
５５．１：８０〜１：９０、１：９０〜１：１００、１：１００〜１：１１０または１：１０５〜１：１１０の範囲のアポリポタンパク質画分：脂質画分モル比を有し、アポリポタンパク質の値がＡｐｏＡ−Ｉ当量で表される、実施形態５４に記載の集団。
５６．１：２〜約１：３の範囲のアポリポタンパク質画分：リン脂質画分重量比を有する、実施形態２４から５５のいずれか１つに記載の集団。
５７．アポリポタンパク質画分：リン脂質画分の重量比が１：２．１〜１：２．７である、実施形態２４から４０のいずれか１つに記載の集団。
５８．アポリポタンパク質画分：リン脂質画分の重量比が１：２．７である、実施形態５７に記載の集団。
５９．実施形態１から２２のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体または実施形態２３から５８のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体の集団、ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含むか、または本質的にそれからなる医薬組成物。
６０．配列番号１の２５〜２６７位に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞。
６１．宿主細胞が培養される培地中に前記タンパク質が分泌される、実施形態６０に記載の哺乳動物宿主細胞。
６２．前記タンパク質がシグナル配列ＭＫＡＡＶＬＴＬＡＶＬＦＬＴＧＳＱＡをさらに含む、実施形態６０または６１に記載の哺乳動物宿主細胞。
６３．前記タンパク質がプロペプチド配列ＲＨＦＷＱＱをさらに含む、実施形態６０から６２のいずれか１つに記載の哺乳動物宿主細胞。
６４．チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＢＨＫ５７０、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ細胞、２９３、３Ｔ３、ミエローマ、ＰＣ１２およびＷ１３８である、実施形態６０から６３のいずれか１つに記載の哺乳動物宿主細胞。
６５．ＣＨＯ細胞である、実施形態６４に記載の哺乳動物宿主細胞。
６６．ＣＨＯ−Ｓ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞である、実施形態６５に記載の哺乳動物宿主細胞。
６７．培養物中で少なくとも０．５、１、２、３または４ｇ／Ｌの前記ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を産生することができる、実施形態６０から６６のいずれか１つに記載の哺乳動物宿主細胞。
６８．培養物中で最大で４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０ｇ／Ｌの前記ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を産生することができる、実施形態６７に記載の哺乳動物宿主細胞。
６９．培養物が大規模培養物である、実施形態６７または６８に記載の哺乳動物宿主細胞。
７０．前記大規模培養物が少なくとも１５リットル、少なくとも２０リットル、少なくとも２５リットル、または少なくとも３０リットルである、実施形態６９に記載の哺乳動物宿主細胞。
７１．前記大規模培養物が約５０リットル、約１００リットル、約２００リットルまたは約３００リットルである、実施形態７０に記載の哺乳動物宿主細胞。
７２．少なくとも約５コピーの、前記ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態６０から７１のいずれか１つに記載の哺乳動物宿主細胞。
７３．それぞれのヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得る形で連結される、実施形態７２に記載の哺乳動物宿主細胞。
７４．プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態７３に記載の哺乳動物宿主細胞。
７５．プロモーターが極初期サルサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態７４に記載の哺乳動物宿主細胞。
７６．配列番号１のアミノ酸２５〜２６７に対応するアミノアミノ配列を含むか、またはそれからなる成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を分泌する、実施形態６０から７５のいずれか１つに記載の哺乳動物宿主細胞。
７７．実施形態６０から７６のいずれか１つに記載の複数の哺乳動物宿主細胞を含む哺乳動物細胞培養物。
７８．配列番号１のアミノ酸２５〜２６７に対応するアミノアミノ配列を含むか、またはそれからなる少なくとも約０．５ｇ／Ｌの成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を含む、実施形態７７に記載の哺乳動物細胞培養物。
７９．前記成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％がシグナル配列を欠く、実施形態７８に記載の哺乳動物細胞培養物。
８０．前記成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％がシグナル配列およびプロペプチド配列を欠く、実施形態７８に記載の哺乳動物細胞培養物。
８１．前記成熟ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％がトランケート、酸化または脱アミド化されていない、実施形態７８から８０のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞培養物。
８２．ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質が発現および分泌される条件下で実施形態６０から７６のいずれか１つに記載の哺乳動物宿主細胞を培養することを含む、成熟した生物学的に活性なＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を製造する方法。
８３．前記培養哺乳動物宿主細胞の上清から、前記成熟した生物学的に活性なＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を回収することをさらに含む、実施形態８２に記載の方法。
８４．ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を精製することをさらに含む、実施形態８２または８３に記載の方法。
８５．実施形態８４に記載の方法により得られたか、または得られる治療上有効量のＡｐｏＡ−Ｉタンパク質を含む医薬組成物。
８６．ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質が脂質と複合体化される、実施形態８５に記載の医薬組成物。
８７．不活性ガス下で前記医薬組成物を製造することを含む、ＡｐｏＡ−Ｉを含む医薬組成物中の酸化生成物を最小化する方法。
８８．不活性ガスが窒素、ヘリウムまたはアルゴンである、実施形態８７に記載の方法。
８９．医薬組成物がＡｐｏＡ−Ｉを含むリポタンパク質複合体の医薬組成物である、実施形態８７または８８に記載の方法。
９０．リポタンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）脂質成分とタンパク質成分とを含む出発懸濁液を、第１の温度範囲の温度から第２の温度範囲の温度まで冷却するステップであって、前記脂質成分が本質的に脂質の粒子からなり、前記タンパク質成分が本質的に脂質結合ペプチドおよび／または脂質結合タンパク質からなる、ステップ；
（ｂ）冷却された（ａ）の懸濁液を、前記第２の温度範囲の温度から前記第１の温度範囲の温度まで加熱するステップ；
（ｃ）前記の加熱された（ｂ）の懸濁液を、前記第１の温度範囲の温度から前記第２の温度範囲の温度まで冷却するステップ；ならびに
（ｄ）ステップ（ｂ）と（ｃ）を少なくとも１回繰り返すステップ
を含み、それによってリポタンパク質複合体を形成する方法。
９１．ステップ（ｃ）が、前記脂質成分および／または前記タンパク質成分の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が複合体化形態になるまで、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すことを含む、実施形態９０に記載の方法。
９２．ステップ（ｃ）が、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の均一性のリポタンパク質複合体が得られるまで、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すことを含む、実施形態９０または９１に記載の方法。
９３．ステップ（ｄ）が、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回、ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことを含む、実施形態９０から９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．ステップ（ｃ）が、最大６回、最大８回または最大１０回、ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことを含む、実施形態９０から９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．ステップ（ａ）の後、懸濁液が、前記加熱ステップ（ｂ）の前に少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分または少なくとも５分、第２の温度範囲で維持される、実施形態９０から９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．ステップ（ａ）の後、懸濁液が、前記加熱ステップ（ｂ）の前に、最大で６分、最大で８分、最大で１０分、最大で２０分、最大で３０分または最大で１時間、第２の温度範囲内で維持される、実施形態９０から９５のいずれか１つに記載の方法。
９７．ステップ（ｂ）の後、懸濁液が、前記冷却ステップ（ｃ）の前に少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分または少なくとも５分、第１の温度範囲内で維持される、実施形態９０から９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．ステップ（ｂ）の後、懸濁液が、前記冷却ステップ（ｃ）の前に最大で６分、最大で８分、最大で１０分、最大で２０分、最大で３０分または最大で１時間、第１の温度範囲内で維持される、実施形態９０から９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．得られるリポタンパク質複合体が遠心分離にかけられない、実施形態９０から９８のいずれか１つに記載の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１００．脂質成分およびタンパク質成分が、ステップ（ａ）の前記出発懸濁液中で、それぞれ、脂質およびタンパク質およびペプチドの大部分に相当する、実施形態９０から９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．脂質成分が、ステップ（ａ）の前記出発懸濁液中の脂質の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に相当する、実施形態９０から１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．タンパク質成分が、ステップ（ａ）の前記出発懸濁液中のタンパク質およびペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に相当する、実施形態９０から１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０３．前記懸濁液中の脂質の最大で５％、最大で１０％、最大で１５％または最大で２０％が、ステップ（ａ）の出発懸濁液中でタンパク質成分と予め複合体化される、実施形態９０から１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．前記第１の温度範囲が、前記タンパク質成分の転移温度の、下は１０℃以上および上は１５℃以下、１０℃以下または５℃以下の温度を含む、実施形態９０から１０３のいずれか１つに記載の方法。
１０５．前記第２の温度範囲が、前記脂質成分の転移温度の、下は５℃以上または１０℃以上および上は５℃以下の温度を含む、実施形態９０から１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．前記第１の温度範囲が、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、７℃または１０℃以下である、実施形態９０から１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．前記第２の温度範囲が、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、７℃または１０℃以下である、実施形態９０から１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．前記出発懸濁液を形成させるステップをさらに含む、実施形態９０から１０７のいずれか１つに記載の方法。
１０９．前記懸濁液の形成が、それぞれ前記第１の範囲の温度に予め加熱された、脂質粒子の懸濁液と、前記脂質結合ペプチドおよび／または脂質結合タンパク質の溶液とを合わせるステップを含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．前記懸濁液の形成が、それぞれ前記第１の範囲の温度に予め加熱された、脂質粒子の集団と、脂質と予め複合体化された前記脂質結合ペプチドおよび／または脂質結合タンパク質とを混合するステップを含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１１．脂質結合ペプチドおよび／または脂質結合タンパク質と予め複合体化された脂質が、前記出発懸濁液中の総脂質の５％以下、１０％以下、１５％以下または２０％以下である、実施形態１１０に記載の方法。
１１２．脂質の溶液が均一化された脂質の溶液である、実施形態１０９から１１１のいずれか１つに記載の方法。
１１３．前記合わせるステップの前に、高圧均一化を用いて均一化された脂質の溶液を形成させるステップをさらに含む、実施形態１１２に記載の方法。
１１４．前記高圧均一化が、１５００ｂａｒを超える、１８００ｂａｒを超える、または２０００ｂａｒを超える圧力である、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．前記高圧均一化が、１９００〜２５００ｂａｒの圧力で実施される、実施形態１１４に記載の方法。
１１６．脂質成分が本質的に脂質粒子からなり、前記脂質粒子が、
（ｉ）ＤＬＳにより測定された場合、少なくとも４５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも５５ｎｍまたは少なくとも６０ｎｍのサイズである；および
（ｉｉ）ＤＬＳにより測定された場合、最大で６５ｎｍ、最大で７０ｎｍ、最大で７５ｎｍ、最大で８０ｎｍのサイズ、最大で１００ｎｍ、最大で１２０ｎｍ、最大で１５０ｎｍ、最大で２００ｎｍ、最大で２５０ｎｍ、最大で３００ｎｍ、最大で５００ｎｍのサイズである、実施形態９０から１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前記脂質粒子が、ＤＬＳにより測定された場合、最大で６５ｎｍ、最大で７０ｎｍ、最大で７５ｎｍ、または最大で８０ｎｍのサイズである、実施形態１１６に記載の方法。
１１８．前記脂質粒子が、ＤＬＳにより測定された場合、最大で１００ｎｍ、最大で１２０ｎｍ、最大で１５０ｎｍ、最大で２００ｎｍ、最大で２５０ｎｍ、最大で３００ｎｍ、最大で５００ｎｍのサイズである、実施形態１１６に記載の方法。
１１９．ステップ（ｂ）および（ｃ）が、４ｎｍ〜１５ｎｍ、５ｎｍ〜１５ｎｍ、６ｎｍ〜１５ｎｍ、または８ｎｍ〜１５ｎｍのリポタンパク質複合体が得られるまで繰り返される、実施形態９０から１１６のいずれか１つに記載の方法。
１２０．ステップ（ｂ）および（ｃ）が、５ｎｍ〜１２ｎｍ、６ｎｍ〜１２ｎｍ、または８ｎｍ〜１２ｎｍのサイズのリポタンパク質複合体が得られるまで繰り返される、実施形態９０から１１６のいずれか１つに記載の方法。
１２１．１、１を超える、または全てのステップが不活性ガス下で実行される、実施形態９０から１２０のいずれか１つに記載の方法。
１２２．不活性ガスが窒素である、実施形態１２１に記載の方法。
１２３．前記タンパク質成分が脂質結合タンパク質を含むか、またはそれからなる、実施形態９０から１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．前記脂質結合タンパク質がＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＥまたはその混合物である、実施形態１２３に記載の方法。
１２５．前記タンパク質成分が脂質結合ペプチドを含むか、またはそれからなる、実施形態９０から１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２６．前記脂質結合ペプチドがＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＥの類似体またはその混合物である、実施形態１２５に記載の方法。
１２７．前記脂質成分が天然脂質、合成脂質、またはその混合物を含むか、またはそれからなる、実施形態９０から１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８．前記脂質成分が、エーテルリン脂質、短鎖リン脂質、コレステロール、コレステロール誘導体、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、ホスファチジルグリセロール、ガングリオシド、および／またはセレブロシドを含むか、またはそれからなる、実施形態１２７に記載の方法。
１２９．前記脂質成分が、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、および／または３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテル糖脂質を含むか、またはそれからなる、実施形態１２８に記載の方法。
１３０．前記脂質成分が中性脂質を含む、実施形態９０から１２６のいずれか１つに記載の方法。
１３１．前記脂質成分が主に中性脂質である、実施形態１３０に記載の方法。
１３２．前記中性脂質がスフィンゴミエリンを含む、実施形態１３０または１３１に記載の方法。
１３３．前記中性脂質が主にスフィンゴミエリンである、実施形態１３２に記載の方法。
１３４．スフィンゴミエリンがＤ−エリスロース−スフィンゴミエリンおよび／またはＤ−エリスロースジヒドロスフィンゴミエリンを含むか、またはそれからなる、実施形態１３２または１３３に記載の方法。
１３５．前記出発懸濁液が負に荷電したリン脂質をさらに含む、実施形態１３０から１３５のいずれか１つに記載の方法。
１３６．前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含むか、またはそれからなる、実施形態１３５に記載の方法。
１３７．前記ホスファチジルグリセロールがＣ１６：０アシル鎖を有する、実施形態１３６に記載の方法。
１３８．前記ホスファチジルグリセロールが、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）の塩を含むか、またはそれからなる、実施形態１３６または１３７に記載の方法。
１３９．前記塩がナトリウム塩である、実施形態１３８に記載の方法。
１４０．前記出発懸濁液中の脂質：タンパク質モル比が約２：１〜約２００：１である、実施形態９０から１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．前記出発懸濁液中の脂質：タンパク質モル比が約１０：１〜約１２５：１である、実施形態１４０に記載の方法。
１４２．前記出発懸濁液中の脂質：タンパク質モル比が約１０：１〜約１５０：１である、実施形態１４０に記載の方法。
１４３．前記出発懸濁液中の脂質：タンパク質モル比が約７５：１〜１２５：１である、実施形態１４０に記載の方法。
１４４．出発懸濁液が、２〜６（負に荷電した脂質）：９０〜１２０（中性脂質）：１（脂質結合ペプチド、脂質結合タンパク質またはその混合物）の範囲のモル比で負に荷電した脂質、中性脂質および脂質結合ペプチドを含有する、実施形態９０から１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．前記第１の温度範囲が５５℃〜６０℃である、実施形態９０から１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．前記第２の温度範囲が３５℃と４０℃の間である、実施形態９０から１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．得られたリポタンパク質複合体を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態９０から１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．凍結乾燥の前に等張剤を添加するステップをさらに含む、実施形態１４７に記載の方法。
１４９．リポタンパク質複合体の集団を含む医薬組成物であって、前記リポタンパク質複合体が、
（ａ）ＧＰＣまたはＤＬＳにより測定された場合、４ｎｍ〜１５ｎｍのサイズまたは６ｎｍ〜１５ｎｍのサイズ、または５ｎｍと１２ｎｍとの間のサイズ、または８ｎｍと１０ｎｍとの間のサイズである；および
（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより反映されるように、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％均一である、
医薬組成物。
１５０．医薬組成物を作製する方法であって、
（ａ）実施形態９０から１４６のいずれか１つに記載の方法に従ってリポタンパク質複合体の集団を調製するステップ；および
（ｂ）リポタンパク質複合体の前記集団と、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを合わせるステップ
を含む、方法。
１５１．医薬組成物が不活性ガス下で調製される、実施形態１５０に記載の方法。
１５２．不活性ガスが窒素、ヘリウムまたはアルゴンである、実施形態１５１に記載の方法。
１５３．医薬組成物を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態１５０から１５２のいずれか１つに記載の方法。
１５４．個々の単位用量中に医薬組成物をアリコートするステップをさらに含む、実施形態１５０から１５２のいずれか１つに記載の方法。
１５５．個々の単位用量を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態１５４に記載の方法。
１５６．実施形態１４７に記載の方法に従う、または実施形態１５３もしくは１５５に記載の方法により作製されたリポタンパク質複合体の凍結乾燥調製物を再構成させるステップを含む、医薬組成物を作製する方法。
１５７．再構成されたリポタンパク質複合体と、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを合わせるステップをさらに含む、実施形態１５６に記載の方法。
１５８．個々の単位用量中に医薬組成物をアリコートするステップをさらに含む、実施形態１５６または１５７に記載の方法。
１５９．実施形態１５０または１５６に記載の方法により作製された液体医薬組成物。
１６０．実施形態１５３に記載の方法により作製された凍結乾燥された医薬組成物。
１６１．実施形態１５８に記載の方法により作製された液体単位剤形。
１６２．治療上有効量の実施形態１４９に記載の医薬組成物を含む液体単位剤形。
１６３．実施形態１５５に記載の方法により作製された乾燥単位剤形。
１６４．脂質異常障害を治療するための方法であって、治療上有効量の：
（ａ）実施形態１から２２のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体；
（ｂ）実施形態２３から５８のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体の集団；
（ｃ）実施形態５９、１４９、および１５９のいずれか１つに記載の医薬組成物；
（ｄ）実施形態９０から１４８のいずれか１つに記載の方法により作製された治療上有効量のリポタンパク質複合体；
（ｅ）実施形態１６１または１６２に記載の単位剤形；
（ｆ）健康なボランティアへの最大４５ｍｇ／ｋｇの単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｇ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｈ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｉ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｊ）健康なボランティアへの最大２０ｍｇ／ｋｇの単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｋ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｌ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；または
（ｍ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体
を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
１６５．前記投与を繰り返すステップをさらに含む、実施形態１６４に記載の方法。
１６６．投与が６日〜１２日の間隔で繰り返される、実施形態１６５に記載の方法。
１６７．投与が毎週である、実施形態１６６に記載の方法。
１６８．投与が１カ月、５週間、６週間、２カ月、３カ月、６カ月、１年、２年、３年、またはそれ以上の期間にわたって行われる、実施形態１６５から１６７のいずれか１つに記載の方法。
１６９．投与が１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回行われる、実施形態１６５から１６７のいずれか１つに記載の方法。
１７０．投与が静脈内である、実施形態１６４から１６９のいずれか１つに記載の方法。
１７１．投与が注入による、実施形態１７０に記載の方法。
１７２．注入が１〜４時間にわたって行われる、実施形態１７１に記載の方法。
１７３．注入が最大で２４時間にわたって行われる、実施形態１７１に記載の方法。
１７４．リポタンパク質複合体の量が、１回の投与あたり約０．２５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量から約３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量までの範囲である、実施形態１７０から１７３のいずれか１つに記載の方法。
１７５．リポタンパク質複合体の量が、１回の投与あたり約１ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量から約１５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量までの範囲である、実施形態１７４に記載の方法。
１７６．リポタンパク質複合体の量が、１回の投与あたり約２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量から約１２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量までの範囲である、実施形態１７５に記載の方法。
１７７．リポタンパク質複合体の量が、１回の投与あたり約３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量である、実施形態１７６に記載の方法。
１７８．リポタンパク質複合体の量が、１回の投与あたり約６ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量である、実施形態１７６に記載の方法。
１７９．リポタンパク質複合体の量が、１回の投与あたり約１２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量である、実施形態１７６に記載の方法。
１８０．脂質異常障害を治療するための方法であって、
（ａ）１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇの初期用量で、
（ｉ）実施形態１から２２のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体；
（ｉｉ）実施形態２３から５８のいずれか１つに記載のリポタンパク質複合体の集団；
（ｉｉｉ）実施形態５９、１４９、および１５９のいずれか１つに記載の医薬組成物；
（ｉｖ）実施形態９０から１４８のいずれか１つに記載の方法により作製された治療上有効量のリポタンパク質複合体；
（ｖ）実施形態１６１または１６２に記載の単位剤形；
（ｖｉ）健康なボランティアへの最大４５ｍｇ／ｋｇの単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｖｉｉ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｖｉｉｉ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｉｘ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｘ）健康なボランティアへの最大２０ｍｇ／ｋｇの単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｘｉ）ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；
（ｘｉｉ）１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でのヒト対象への単回投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体；または
（ｘｉｉｉ）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量での、ヒト対象への２、３、４、５または６回の投与後に２倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体
を対象に投与するステップ；
（ｂ）対象のトリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドが、前記投与の４、８、１２、２４、４８、７２、１６８、３３６または５０４時間後に２倍を超えて上昇するかどうかを決定するステップ；ならびに
（ｃ）対象のトリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドが投与前のレベルの２倍を超えて上昇する場合、前記投与を繰り返すが、より低い用量で行い、対象のトリグリセリド、ＶＬＤＬ−コレステロールおよび／またはＶＬＤＬ−トリグリセリドが投与前のレベルの２倍を超えて上昇しない場合、同等か、もしくはそれより高い用量で前記投与を繰り返すステップ
を含む、方法。
１８１．前記対象が高脂血症または心血管を有するか、またはそれに罹りやすい、実施形態１６５から１８０のいずれか１つに記載の方法。
１８２．患者が高脂血症を有するか、またはそれに罹りやすく、前記高脂血症が高コレステロール血症である、実施形態１８１に記載の方法。
１８３．患者が心血管疾患を有するか、またはそれに罹りやすく、心血管疾患がアテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、間欠性跛行、重症虚血肢、心房弁硬化症または再狭窄である、実施形態１８１に記載の方法。
１８４．胆汁酸樹脂、ナイアシン、抗炎症剤、スタチン、フィブラート、ＣＥＴＰ阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ＰＣＳＫ９のアゴニストおよび／またはコレステロール吸収の阻害剤を補助的に投与するステップをさらに含む、実施形態１６５から１８３のいずれか１つに記載の方法。
１８５．アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチンまたはロバスタチンから選択されるスタチンを投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１８６．フィブラートであるフェノフィブラートを投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１８７．コレステロール吸収阻害剤であるゼチアを投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１８８．アナセトラピブおよびダルセトラピブから選択されるＣＥＴＰ阻害剤を投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１８９．ＰＣＳＫ９の抗体アゴニストまたはＰＣＳＫ９のリガンドアゴニストを投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１９０．コレステロール吸収阻害剤であるクロピドグレル二硫酸塩を投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１９１．抗凝固剤であるワーファリンを投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１９２．抗炎症剤であるアスピリンを投与するステップをさらに含む、実施形態１８１に記載の方法。
１９３．リポタンパク質複合体の１、２または３つの均一な集団を含む組成物。
１９４．少なくとも１つの均一な集団中のリポタンパク質複合体が、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の複合体の特徴を有する、実施形態１９３に記載の組成物。
１９５．前記集団の少なくとも１、２または３つが、実施形態２３から５８のいずれか１つに記載の集団の特徴を有する、実施形態１９３または１９４に記載の組成物。
【０４１９】
全ての引用文献は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的および個別にあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれたのと同程度まで、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２０】
当業者には明らかであるように、本発明の多くの改変および変更を、その精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。記載された特定の実施形態は、例のために提供されるに過ぎず、本発明は添付の特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の完全な範囲と共にそのような特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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