(57)【要約】  ＯＳＢＰに結合する天然化合物であるＯＳＷ−１に構造的に関連する多数の化合物が提供される。また、ＯＳＷ−１類似体を含む医薬組成物、これらのＯＳＷ−１類似体、またはそれらの医薬上許容し得る塩、鏡像異性体または立体異性体の、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病およびＰ２１欠損癌を含む癌の処置における使用方法が提供される。更に、癌細胞を標的とするモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体とＯＳＷ−１類似体の抱合体が提供される。また、これら抱合体を含む医薬組成物、Ｐ２１欠損癌を含む癌の処置におけるこれらの抱合体の使用方法が提供される。
2014515354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014515354.tif 000122
（Ｉ）
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、水素、トリアルキルシリルおよび
【化２】
2014515354.tif 000123
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは、０〜６の整数であり、
Ｒは、置換若しくは無置換の、アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基、およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、水素およびアシルからなる群から選択され、および
Ｒ１０は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
ただし、
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素でありＲ５がアセチルである場合、Ｒ６は水素、ｐａｒａ−メトキシベンゾイル、または３−フェニル−２−プロペノイルではない、
（ｃ）Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない、
（ｄ）Ｒ１が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、または
（ｅ）Ｒ２またはＲ３が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない、
で表される化合物、またはその医薬上許容し得る塩。
【請求項２】
Ｒ４が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ５がアセチルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ６がｐａｒａ‐メトキシベンゾイルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ６が３‐フェニルプロパノイルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ＺがＯである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒがアルキルおよび４−ニトロフェニルからなる群から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ｎが０である、請求項６または７に記載の化合物。
【請求項９】
ＺがＮＨである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒがアミノ基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記アミノ基が、ａｌｌｏｃ−またはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ｎが６である、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ｐａｒａ−アミノアルキルアリール基が、ａｌｌｏｃ−またはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
ｎが１である、請求項１３または１４に記載の化合物。
【請求項１６】
ｎが１であり、かつＲがフェニルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｚが非存在である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒがアミノ基である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記アミノ基が、ａｌｌｏｃ−またはＦｍｏｃ−置換アミノ基である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
ｎが２である、請求項１８または１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒが１−イミダゾリル基である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２２】
ｎが０である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つが、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１およびＲ２の両方が、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】
【化３】
2014515354.tif 000124
【化４】
2014515354.tif 000125
【化５】
2014515354.tif 000126
【化６】
2014515354.tif 000127
【化７】
2014515354.tif 000128
【化８】
2014515354.tif 000129
【化９】
2014515354.tif 000130
【化１０】
2014515354.tif 000131
【化１１】
2014515354.tif 000132
【化１２】
2014515354.tif 000133
【化１３】
2014515354.tif 000134
【化１４】
2014515354.tif 000135
からなる群から選択される化合物。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物および医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
哺乳動物細胞を請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物の有効量に接触させることを含む、哺乳動物細胞を殺傷する方法。
【請求項２９】
前記細胞が癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌細胞がＰ２１を欠損している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）関連疾病または病状を処置する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物の有効量を投与することによって、前記ＯＳＢＰ関連疾病または病状に関連するＯＳＢＰ発現細胞のアポトーシスを増加することを含む、前記方法。
【請求項３２】
前記ＯＳＢＰ関連疾病または病状が癌であり、かつ前記ＯＳＢＰ発現細胞が癌細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が２１欠損である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
【化１５】
2014515354.tif 000136
（ＩＩ）
式中
Ｘは、ＯおよびＮＯＲ２０からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｒ２０、トリアルキルシリルおよび
【化１６】
2014515354.tif 000137
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは、０〜６の整数であり、
Ｒは、置換若しくは無置換であり、アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基、およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＲ２０からなる群から選択され、
Ｒ１０は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２０は、
【化１７】
2014515354.tif 000138
,および
【化１８】
2014515354.tif 000139
からなる群から選択され、
Ｚ′は、ＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、および
ｍは、１〜６の整数である、
ただし、ＸがＯである場合Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つだけがＲ２０であり、ＸがＮＯＲ２０である場合Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれもがＲ２０ではない、で表される化合物、またはその医薬上許容し得る塩。
【請求項３５】
ＸがＯである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が、水素およびＲ２０からなる群から選択される、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
ＸがＮＯＲ２０である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｒ２０が
【化１９】
2014515354.tif 000140
である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ２０が
【化２０】
2014515354.tif 000141
である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ２０が
【化２１】
2014515354.tif 000142
である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４２】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物と共有結合したモノクローナル抗体を含む抱合体。
【請求項４３】
請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の化合物と共有結合したモノクローナル抗体を含む抱合体。
【請求項４４】
前記モノクローナル抗体および前記化合物が、システインチオール−マレイミドマイケル付加反応生成物、バリン−シトルリンｐ−アミノベンジルリンカー、またはバリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバメートリンカーを介して共有結合している、請求項４２または４３に記載の抱合体。
【請求項４５】
前記モノクローナル抗体が、癌細胞上に発現された抗原に特異的に結合する、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の抱合体。
【請求項４６】
前記癌細胞がＰ２１を欠損している、請求項４５に記載の抱合体。
【請求項４７】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の抱合体および医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項４８】
癌細胞を請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の抱合体の有効量と接触させることを含む、癌細胞を殺傷する方法。
【請求項４９】
前記癌細胞がＰ２１を欠損している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の抱合体の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記癌の細胞がＰ２１を欠損している、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年５月１９日に出願された米国特許仮出願ＵＳＳＮ６１／４８８，０２３に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
１９８０年代初期に、コレステロールの合成はオキシステロール結合タンパク質、すなわちオキシステロールに結合する細胞質基質成分を介して調整されるという仮定が提示された。今日、２つのタンパク質ファミリーがオキシステロールに結合することが知られている。それらは、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）と、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）またはＯＳＢＰ関連タンパク質（ＯＲＰ）と呼ばれる細胞質オキシステロール受容体と記載されるタンパク質ファミリーである。
【０００３】
ＯＳＢＰ（オキシステロール結合タンパク質）は、オキシステロール、特に２５−ヒドロキシコレステロール（Ｋｄ＝３７ｎＭ）との高い親和性に基づいて最初に特定された、真核生物に見られるタンパク質である。それは、進化的に保存されたタンパク質のファミリーの最初のメンバーであり、現在哺乳動物では少なくとも１２個が知られており、それらにはＯＳＢＰ（ＯＳＢＰ１とも呼ばれる）、ＯＲＰ１Ｌ、ＯＲＰ１Ｓ、ＯＲＰ２、ＯＲＰ３、ＯＲＰ４Ｌ、ＯＲＰ４Ｓ、ＯＲＰ５、ＯＲＰ６、ＯＲＰ７、ＯＲＰ８、ＯＲＰ９Ｌ、ＯＲＰ９Ｓ、ＯＲＰ１０、ＯＲＰ１１が含まれる。 Lehto et al. (2003) Biochim Biophys Acta 1631:1-11; Yan et al. (2008) Int Rev Cytol 265:253-85; Fairn et al. (2008) Cell Mol Life Sci 65:228-36。ＯＳＢＰ１は、ステロール結合ドメインと、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−脂質相互作用に関与する他のいくつかのドメインとを含む８９ｋＤのタンパク質である。これらのドメインには、タンパク質をホスファチジルイノシトール含有膜に局在化させるプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインと、小胞体（ＥＲ）局在化ドメインであるＦＦＡＴドメインとが含まれる。ＯＳＢＰ１は、酵素活性を示さない。その細胞機能は完全には理解されていないが、過去数年間の研究でＯＳＢＰ１は重要なシグナル経路を制御可能なステロールセンサーであることが解明された。
【０００４】
ＯＳＢＰ１以外にも、哺乳動物は少なくとも他に１１種類のＯＲＰと呼ばれるＯＳＢＰ関連タンパク質を発現する。ＯＳＢＰ１のように、各ＯＲＰはステロール結合ドメインを含有するが、それ以外ではＯＲＰの構成にはかなりの差違がある。ほとんどのＯＲＰはステロール結合ドメインに加えてＰＨドメインを含む。ＯＳＢＰ／ＯＲＰのステロール結合ドメインは、ファミリーの１２のタンパク質間で保存されているが、ＬＸＲ、Ｉｎｓｉｇ、ＮＰＣ−１などの他のタンパク質のステロール結合ドメインとは類似していない。ＯＲＰの特徴はＯＳＢＰ１ほどは知られていないが、脂質代謝、シグナル伝達、小胞輸送、非小胞ステロール輸送と関係付けられている。現在、それらの細胞機能はよく理解されてはいないが、それらは広範に発現され進化的に保存されているので、重要な細胞内役割があると考えられている。それらは、アテローム性動脈硬化症や、おそらく癌と関係付けられている。例えば、ＯＲＰ１Ｌの過剰発現は、マウスにおいて動脈硬化病変を引き起こす。更に、動脈硬化病変部には発現上昇したＯＲＰ８が含まれることが発見されており、ＯＲＰ９は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルを高めるための治療標的として特定されている。ＯＳＢＰ１またはＯＲＰ８のノックダウンは、ＬＸＲ受容体活性化作用においてコレステロール流出のレベルを増加させた。コレステロール流出の上昇は、アテローム性動脈硬化症の処置における治療手段であり、ＯＲＰがアテローム性動脈硬化症の薬剤標的となる可能性を示唆している。酵母においては、７つのＯｓｈタンパク質（ＯＲＰ相同体）がある。興味深いことに、酵母は７つのＯｓｈタンパク質の任意の６つが欠失しても生存可能であるが、７つすべてが欠失すると生存できない。
【０００５】
セファロスタチン１（１）、ＯＳＷ−１（２）、リッテラジンＢ（３）、シュウェインフルチンＡ（４）、（−）−ステレッチンＥ（５）（図１参照）は、最大半量の増殖抑制濃度（ＧＩ５０）が低ナノモル範囲で、特定のヒト癌株化細胞に強毒性がある天然物である。これらの分子は、米国国立癌研究所により評価された６０種類のヒト培養癌細胞株（ＮＣＩ６０）に対して大変類似した毒性パターンを示し、共通の細胞標的を有するか、同様の機構で作用することを強く示唆している。ＣＯＭＰＡＲＥ分析によるピアソン相関係数（ｐ値）が０．６（１．０が完全一致）より大きい化合物同士は、機構的に関連していると考えられる。これらの化合物は以前はＣＲＡＭ（セファロスタチンおよび関連抗増殖性分子）と呼ばれていた。
【０００６】
ＷＯ２０１０／０６８８７７は、ＣＲＡＭおよびそのいくつかの合成類似体が、ＯＳＢＰ１、ＯＲＰ４などのオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）やＯＳＢＰ関連タンパク質（ＯＲＰ）の高親和性配位子であることを開示している。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明の一部は、ＯＳＢＰに結合する天然化合物であるＯＳＷ−１に構造的に関連する多数の化合物に関する。ＯＳＢＰがアテローム性動脈硬化症やアルツハイマー病（ＡＤ）に不可欠であることが示されたので、本発明のある側面は、ＯＳＷ−１類似体またはその医薬上許容し得る塩、鏡像異性体もしくは立体異性体の、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病およびＰ２１欠損癌を含む癌の処置および／または予防における使用に関する。本発明のもう１つの側面は、癌細胞を標的とするモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体と、ＯＳＷ−１類似体との抱合体に関する。本発明の他の側面は、本発明の抱合体を使用した癌の処置方法に関する。本発明のさらに他の側面は、本発明の化合物や抱合体を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な説明
本発明は、以下の図面および説明を参照することでより良く理解されるであろう。図面の成分は、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、本発明の原理を例示する際に強調されることもある。
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、セファロスタチン（１）、ＯＳＷ−１（２）、リッテラジンＢ（３）、シュウェインフルチンＡ（４ａ）、シュウェインフルチンＢ（４ｂ）、ステレッチンＥ（５）、コレステロール（１０）、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨＣ；１１）の化学構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、選択されたＯＳＷ−１類似体を示す。
【００１０】
【図２Ａ】図２Ａは、化合物１〜５とＯＳＷ−１類似体６〜８の、ｐ２１欠損ＨＣＴ−１１６（ヒト結腸直腸がん）細胞に対する選択的増殖抑制効果を示す。ＢＦＡ：ブレフェルジンＡ
【図２Ｂ】図２Ｂは、過剰ＯＳＷ−１の非存在下（左側）および存在下（右側）に６ｂを使用したＨｅＬａ細胞溶解液のクマシー染色ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）クロマトグラフの図である。矢印：ＯＳＢＰ１と特定されたバンド。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｉＴＲＡＱによる定量プロテオミクスにより特定・定量された１２１個のタンパク質を示す散布図である。競合を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）コントロールに対する１０μＭのＯＳＷ−１のｌｏｇ１０倍数変化としてｙ軸に、統計的有意性を示すｐ値をｘ軸にプロットした。Ｐ値は、有意でない単一ペプチド定量を任意に１と設定した。ＶＡＰ−Ａ：小胞結合膜タンパク質結合タンパク質Ａ
【００１１】
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓを過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から作成したＳ１００溶解液中で、化合物１〜４ａに対する［３Ｈ］−２５−ＯＨＣ（２０ｎＭ）の競合結合試験を示すグラフである。ＣＰＭ：１分間当りのカウント。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓを過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から作成したＳ１００溶解液中で、化合物１〜４ａに対する［３Ｈ］−２５−ＯＨＣ（２０ｎＭ）の競合結合試験を示すグラフである。ＣＰＭ：１分間当りのカウント。
【００１２】
【図３Ａ】図３Ａは、ＯＳＢＰ１を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＯＳＢＰ１）または非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＴ）のどちらかを安定に形質移入したＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−細胞におけるノックダウン／用量変化実験を示す一連の４つの帯グラフである。帯は、３つまたは４つの別々の実験の標準偏差を示す。ｓｈＮＴ細胞と比較して、＊Ｐ＝０．０００２（ｎ＝３）；＊＊Ｐ＝０．０００６（ｎ＝４）；＊＊＊Ｐ＝０．０００３（ｎ＝３）（両側スチューデントのｔ検定）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｓｈＮＴ細胞およびｓｈＯＳＢＰ１細胞中のＯＳＢＰ１レベルの定量を示す帯グラフと対応する２つのウェスタンブロットである。７つの別々の実験の平均値±標準偏差。ｓｈＮＴ細胞と比較して、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１（ｎ＝７）（両側スチューデントのｔ検定）。ＷＢ：ウェスタンブロットは、アクチンに基づいて等しいローディング示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｌａｃＺ−ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓを発現するＨｅＬａ細胞溶解液の２つのウェスタンブロットを示す。
【００１３】
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＨｅＬａ細胞における１、２、４ａ、タキソール（登録商標）の増殖抑制活性（４８ｈ）に対するｌａｃＺ、ＯＳＢＰ１、ＯＲＰ４Ｌの過剰発現の効果を示す４つのグラフ群である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓへの結合親和性（Ｋｉ）とＨＣＴ−１１６細胞における増殖抑制（ＧＩ５０）の相関を示すグラフである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓへの結合親和性（Ｋｉ）とＨＣＴ−１１６細胞における増殖抑制（ＧＩ５０）の相関を示すグラフである。
【００１４】
【図４Ａ】図４Ａは、ＨＣＴ−１１６細胞におけるセファロスタチン１（１）（左側）とＯＳＷ−２（２）（右側）の増殖抑制活性（４８ｈ）に対する２５−ヒドロキシコレステロール同時投与の効果を示す２つのグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、増殖培地からのリポタンパク質の除去が、ＣＨＯ−７細胞を２５−ＯＨＣに対して感作するが１、２、４ａに対しては感作しないことを示す棒グラフである。２つの別々の実験の平均値±標準偏差。ＢｒｅｆＡ、ブレフェルジンＡ。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヒトのＯＳＢＰ１ドメインとＯＲＰ４Ｌドメインを模式的に示す図である。ＯＳＢＰ１点変異体Ｍ４４６ＷとＶ５８２Ｍを示す。
【００１５】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＯＳＢＰ、ＯＲＰ４Ｌ、２つのＯＳＢＰ点変異体であるＯＳＢＰ（Ｍ４４６Ｗ）、ＯＳＢＰ（Ｖ５８２Ｍ）に対する３Ｈ−２５−ヒドロキシコレステロールの結合係数（ＫＤ）を示す表である。２０ｎＭ３Ｈ−２５−ヒドロキシコレステロールのＯＳＢＰ、ＯＲＰ４Ｌ、ＯＳＢＰ（Ｍ４４６Ｗ）、ＯＳＢＰ（Ｖ５８２Ｍ）への結合を抑制するセファロスタチン１、ＯＳＷ−１、シュウェインフルチンＡの抑制結合係数（Ｋｉ）値も示した。
【図４Ｅ】図４Ｅは、４８時間後のＨｅＬａ細胞における１、２、４ａ、タキソール（登録商標）の増殖抑制活性に対する、野生型（ＷＴ）ＯＳＢＰ１と点変異体Ｍ４４６Ｗ（上列）およびＶ５８２Ｍ（下列）の過剰発現の効果を示す８つのグラフのパネルである。ＧＩ５０相対値は、２つの別々の実験の平均である。
【図５】図５は、各画像の左下に示す薬剤で処理し、左上に示した抗原用の蛍光標識抗体で染色したＨＣＴ−１１６細胞において、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎ誘発によるＯＳＢＰ１移動を示す１０枚の免疫蛍光顕微鏡写真のパネルである。
【００１６】
【図６Ａ】図６Ａは、表示した濃度の表示した薬剤で処理したＨＣＴ−１１６細胞におけるＯＳＢＰ１タンパク質レベルの時間依存的な減少を示す棒グラフと関連したウェスタンブロットである。媒体処理細胞に対して、＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）；＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ＝３）；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｎ＝３）（両側スチューデントのｔ検定）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、表示した濃度のプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２またはラクタシスチン存在下で（２４時間の時点における）ＯＳＢＰ１タンパク質レベルの減少の抑制を示す棒グラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、表示した濃度のシュウェインフルチンＡ（４ａ）および２５−ＯＨＣが、２４時間処理でＯＳＢＰ１レベルの減少を誘発しないが、ＯＳＷ−１に誘発される減少を阻止可能であることを示す棒グラフである。
【００１７】
【図７】図７は、表示した濃度の表示したＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓによるＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるスフィンゴミエリン生合成の抑制を示すグラフである。挿入図：ネガティブコントロール。すべてのデータは３つの別々の実験の平均値±標準偏差である。媒体処理細胞に対する＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝３）；＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）．＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｎ＝３）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｎ＝３）（両側スチューデントのｔ検定）。ＤＰＭ：毎分崩壊数。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
ヒトＯＳＢＰ１は、前記の特定の構造的および機能的特徴を有する８０７個のアミノ酸からなるタンパク質である。ヒトＯＳＢＰ１の塩基配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号がそれぞれＮＭ＿００２５５６およびＮＰ＿００２５４７として、公表されている。マウスやラットを含む他の多くの種についても、対応する塩基配列およびアミノ酸配列は入手可能である。
【００１９】
ＯＳＢＰ１は、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨＣ）により誘発される、セラミド輸送タンパク質（ＣＥＲＴ）の活性化によるスフィンゴミエリン合成の増加に関与することが知られている。スフィンゴミエリンは、セラミドとホスファチジルコリンから合成される細胞膜のリン脂質成分である。Ｆａｓ配位子などのアポトーシスの誘発因子のいくつかは、スフィンゴミエリン分解酵素を活性化して、スフィンゴミエリンの加水分解や、アポトーシスを引き起こすことが知られているセラミドの産生を引き起こすことにより、アポトーシスを誘発する。２５−ＯＨＣがＯＳＢＰ１へ結合することにより、小胞体から、スフィンゴミエリン合成酵素１が存在するゴルジ体へのセラミドの輸送を間接的に促進する。これは、スフィンゴミエリン合成を増加させる。ＯＳＢＰ１とＣＥＲＴが協働して、細胞内でのコレステロールレベルおよびスフィンゴミエリンレベルを調和させると考えられており、これは適切な膜構造の保持に重要である。重要なことに、ＯＳＢＰ１ノックアウトマウスは胎生致死であることが報告されている。これは、ＯＳＢＰ１が動物の発達のためには必要であるが、株化細胞はＯＳＢＰ１発現を切除しても生存できることを示唆している。
【００２０】
ＯＳＢＰ１の２つ目の活性は、コレステロールを除去したか、あるいは２５−ＯＨＣで処理した原形質膜のカベオラが、ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル制御キナーゼ１、２）の異なるリン酸化状態を引き起こすことを発見した時に明らかとなった。ＯＳＢＰ１は、この事象を仲介するステロール受容体であることがわかった。コレステロールを結合すると、ＯＳＢＰ１は、２つの脱リン酸化酵素であるＰＰ２Ａ（セリン／トレオニン脱リン酸化酵素）およびＨｅＰＴＰ（チロシン脱リン酸化酵素）と共に３元複合体を形成し、この複合体が脱リン酸化によってＥＲＫ１／２を不活性化する。逆に、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨＣ）の添加あるいはコレステロールの除去により、この複合体が解体し、ＥＲＫ１／２の過剰リン酸化をもたらす。ＥＲＫ１／２は、成長因子シグナル伝達を細胞分裂を含む細胞応答と結びつける役割を有する、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル経路の成分である。ＯＳＢＰ１がＥＲＫ１／２活性化をコントロールできるという知見は注目すべきことである。なぜなら、ＯＳＢＰ１がステロール結合を細胞内における重要なシグナル経路と結びつけることができることを示しているからである。
【００２１】
ＯＳＢＰ１が、２５−ＯＨＣおよび７−ケトコレステロールに応答してＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を介してプロフィリン−１の発現増加をコントロールできることも報告されている。しかしながら、これらの効果は、特定の内皮細胞で観察されただけであり、癌細胞におけるＯＳＢＰ１の役割を示すものではないかもしれない。
【００２２】
ＯＳＢＰ２としても知られるヒトＯＲＰ４は、ＯＳＢＰ２遺伝子の２つの異なる転写開始点がある結果、異なるアイソフォームで発現される。具体的には、ヒトにおいて９１６個のアミノ酸の長いバーション（ＯＲＰ４Ｌ）と４６１個のアミノ酸の短いバーション（ＯＲＰ４Ｓ）の特性が明らかになっている。ヒトＯＲＰ４Ｌの塩基配列およびアミノ酸配列は、例えばそれぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５１８５およびＡＡＤ２１６１８として公表されている。ヒトＯＲＰ４Ｓの塩基配列およびアミノ酸配列は、例えばそれぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３０７５８およびＮＰ＿１１０３８５として公表されている。
【００２３】
ＯＳＢＰ／ＯＲＰファミリーは、脂質の輸送や代謝、小胞の輸送や細胞シグナル伝達と関係付けられており、このタンパク質ファミリーには、限定するものではないが、癌、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病などの範囲の疾患の処置に有望な標的が含まれる。
【００２４】
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓ
ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌは、セファロスタチン１（１）、ＯＳＷ−１（２）、リッテラジンＢ（３）、シュウェインフルチンＡ（４ａ）、（−）−ステレッチンＥ（５）の標的である。これらの天然物は、以前はＣＲＡＭ（セファロスタチンおよび関連抗増殖性分子）と呼ばれていたが、ここではＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓと記述する。これらの化合物は、制癌作用を示すことが以前に報告されている。化合物１は、非定型機序を介してアポトーシスを誘発する。化合物２は、それぞれ非形質転換性星状膠細胞やリンパ細胞に比較して、神経膠芽腫細胞や白血病細胞に対して３０〜１５０倍細胞障害性がある。化合物４ａ、５は、それぞれ腫瘍抑制因子である神経線維腫症１（ＮＦ１）、ｐ２１の欠損した腫瘍細胞に対して選択的に増殖を抑制する。ｐ２１発現の抑圧およびＮＦ１の損失は、いくつかの癌の発達に重要であることが知られている。従って、これらの遺伝子変異を有する癌細胞の成長を選択的に抑制する小分子は、癌特異療法の有望な候補である。
【００２５】
癌
癌は哺乳動物における公知の疾患であり、外部シグナルにより制御されない細胞の異常増殖と、すべてではないが多くの場合に組織に浸潤し遠方の部位に転移する能力とにより特徴付けられる。癌は、正常な細胞や組織の機能を破壊することで高い罹患率と死亡率をもたらしている。多くの癌は、体細胞遺伝子突然変異や、分化の損失および／または例えば、ｐ５３、ｐ２１、神経線維腫症１（ＮＦ１）など多くの腫瘍抑制遺伝子のいずれかの異常発現により更に特徴付けられる。ｐ５３および／またはｐ２１の発現の損失は、細胞複製制御の損失をもたらし、しばしば従来の抗癌療法に耐性を示す癌の特徴となっている。
【００２６】
ｐ２１タンパク質は、ｐ２１／ＷＡＦ１タンパク質としてあるいはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤１としても知られ、ここでは単にｐ２１と呼ぶこともあるが、サイクリンＣＤＫ２やサイクリンＣＤＫ４複合体に結合してその活性を阻害し、それによってＧ１での細胞周期進行の制御因子として機能する。通常、この遺伝子の発現は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３により厳密に制御される、それによってこのタンパク質はストレス刺激に応答してｐ５３依存性細胞周期Ｇ１期停止を仲介する。
【００２７】
ｐ２１タンパク質は進行腫瘍ではしばしば発現されず、このことは、もしＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがｐ２１欠損細胞に致死的であるなら、後期の処置が困難な腫瘍患者に優れた治療域を提供するかもしれないことを示唆している。ｐ２１欠損の同質遺伝子株化細胞に対して高い選択性があると報告されている小分子は少ないので、この特徴は、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓが癌の処置に有用であるかもしれない希少な細胞内標的と作用機序を有する化合物であることを示唆している。
【００２８】
アテローム性動脈硬化症
アテローム性動脈硬化症は、高い血清コレステロールレベル（高コレステロール血症）に起因し、動脈壁にコレステロールを蓄積させる。アテローム性動脈硬化症の特徴であるプラークは、血流を抑制し、血栓形成を促進し、最終的には血栓性または虚血性心筋梗塞（心臓発作）および／または脳卒中により死や重度の障害を起すこと可能性がある。
【００２９】
ＯＳＢＰは、アテローム性動脈硬化症の処置に有用であろう。例えば、哺乳動物のオキシステロール結合タンパク質１（ＯＳＢＰ１）は、酸素化コレステロール誘導体に結合し、ステロールやリン脂質合成を仲介することが知られている。更に、哺乳動物のオキシステロール結合タンパク質関連タンパク質８（ＯＲＰ８）は、ＡＢＣＡ１発現やマクロファージコレステロール流出のネガティブ制御因子として作用するが、これによりアテローム性動脈硬化症の発症を調節可能であるかもしれないことが最近示されている。Yan et al. (2008) J Biol Chem 283:332-40。
【００３０】
アルツハイマー病
アルツハイマー病は、一般的な慢性神経変性疾患であり、しばしば認知症や死に至り、それは、記憶の進行性損失や、時として重度の行動異常、更に他の認知機能の障害により特徴付けられる。先進国においては心疾患、癌および脳卒中に次いで４番目に多い死因となっている。アルツハイマー病の発生率は高く、米国では２５０万人〜４００万人の患者が、世界ではおそらく１７００万人〜２５００万人が罹患していると推定されている。更に、人口が高齢化するに連れて患者の数は増加すると予想される。アルツハイマー病の特徴は、患者の脳にアミロイド斑として知られる多数の不溶沈着物が存在することである。死体解剖では、アミロイド斑がほぼすべてのアルツハイマー患者の脳で見られ、アミロイド斑沈着の程度と認知症の程度にしばしば相関が見られたことが示された。アミロイド斑は疾患プロセスの後期の副産物であるという意見も一部にあるが、アミロイド斑および／またはアミロイドペプチドの可溶性凝集物が、アルツハイマー病に本質的におそらく原因として関与しているらしいという意見が大部分である。アルツハイマー病は治癒しないので、疾患の管理には、通常症状をコントロールする薬物と、罹患した人、家族、介護者の苦痛を緩和するよう設計された薬剤以外の多様な方法とが組み合わせて用いられる。残念なことに、すべてのアルツハイマー病患者が現在使用可能な治療法に反応するわけではない。
【００３１】
ＯＳＢＰ１は、アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングと輸送を調節することが示されている。Laitinen et al. (2002) J Lipid Res 43:245-55。これらの結果は、ＯＳＢＰ１がコレステロール代謝を細胞内アミロイド産出に関連付ける役割を果す可能性を示唆しており、ＯＳＢＰ１が、アルツハイマー病やアテローム性動脈硬化症などのヒトの慢性疾患の指向型治療法のための代替的な標的を提供できる可能性を示していることがより重要である。
【００３２】
セファロスタチン１およびリッテラジンＢ
セファロスタチンは、環節動物であるCephalodiscus gilchristiから単離された複合体ステロイド系ピラジンアルカロイドの一群である。ＰＳ株化細胞に対し効果が高い（ＥＤ５０が１０−７〜１０−９μｇ／ｍＬ）細胞毒を示し、抗腫瘍薬である。しかしながら、それらは希少な天然海産物であり、極少量だけ入手可能である。例えば、Cephalodiscus gilchristi（長さ５ｍｍの管状虫）１６６ｋｇから、たった１３９ｍｇのセファロスタチン１と合計２７２ｍｇの他のセファロスタチンが単離可能である。すべてのセファロスタチン（セファロスタチン１、セファロスタチン２、セファロスタチン３、セファロスタチン４、セファロスタチン５、セファロスタチン６、セファロスタチン７、２５’−ｅｐｉ−セファロスタチン７、２０−ｅｐｉ−セファロスタチン７、セファロスタチン８、セファロスタチン９、セファロスタチン１０、セファロスタチン１１、セファロスタチン１２、セファロスタチン１３、セファロスタチン１４、セファロスタチン１５、セファロスタチン１６、セファロスタチン１７、セファロスタチン１８、セファロスタチン１９など）が包含されることを意図している。
【００３３】
セファロスタチン１（１）やおそらくすべてのＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓが、ユニークな細胞内標的および機序を有することは、そのＣＯＭＰＡＲＥプロフィールが珍しいものであることと共に、セファロスタチン１が、ほとんどの細胞障害性抗癌性小分子で起る２つの現象であるアポトソームの形成とミトコンドリアからのシトクロムｃの放出とを起さずにアポトーシスを誘発するという報告によっても示された。Ｊ１６ジャーカット株化細胞をセファロスタチン１で処理することにより、カスパーゼ−４とカスパーゼ−２の活性化と、ミトコンドリアからのＳｍａｃ（第２のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子）の放出を引き起こす。この特定の一連の現象は、小分子誘発アポトーシスではめったに見られないことであり、セファロスタチン１の機序の研究により新規のアポトーシスシグナル伝達機序を発見する可能性を示唆している。従って、セファロスタチン１は、従来の癌療法に耐性ができた腫瘍の処置に有用であろう。
【００３４】
また、セファロスタチン１は、ＰＩＤＤｏｓｏｍｅ（タンパク質ＰＩＤＤ、ＲＡＩＤＤ、カスパーゼ−２からなる）として知られる多タンパク質複合体の形成を誘導することが示された。ＰＩＤＤｏｓｏｍｅの形成を誘発する小分子としては、他にはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡだけが知られている。セファロスタチン１が小胞体ストレス応答を誘発することも示された。
【００３５】
リッテラジンＢとセファロスタチン１の高度に類似した構造およびそられのＣＯＭＰＡＲＥピアソン相関係数がほぼ同一（ｐ＝０．９３）であることは、これらの化合物がおそらく共通の細胞内標的を有することを示唆している。
【００３６】
少数の合成されたセファロスタチン類似体、これらのセファロスタチン類似体を調製するための合成方法、これらの類似体を含む医薬組成物、これらの類似体を医薬利用で活性薬剤として使用する方法が、米国特許第５，７０８，１６４号（Winterfeldt, E. et al.）に記載されている；そこに記載されるセファロスタチン類似体およびその製剤に関してなど、その全体を参照により本明細書に組み込むものである。
【００３７】
ＯＳＷ−１
ＯＳＷ−１（２）は、セファロスタチン１よりも多量に存在し、いくつかの in vivo研究を可能とした。ＯＳＷ−１のＧＩ５０は、ＮＣＩ６０に対する平均として、０．７８ｎＭである。ＯＳＷ−１の in vivo 研究は限らたものであるが、Ｐ３８８腫瘍細胞を皮下に埋め込んだヌードマウスを０．０１ｍｇ／ｋｇのＯＳＷ−１で１回腹腔内（ｉ．ｐ．）で処置したところ寿命が５９％増加することが示された。ＯＳＷ−１は、非悪性細胞に比べて悪性細胞タイプへの選択性も示した。ＯＳＷ−１は、正常リンパ細胞（ＧＩ５０＝１．７３ｎＭ）に比べて白血病細胞（ＨＬ−６０、ＧＩ５０＝０．０４ｎＭ）においてその活性が４０倍以上高く、悪性脳腫瘍細胞においてその選択性は１５０倍増加する（Ｕ８７−ＭＧ、ＧＩ５０＝０．０４７ｎＭ vs 正常な星状膠細胞ＧＩ５０＝７．１３ｎＭ）。最後に、ＣＬＬや他の血液癌の処置で汎用される化学療法薬であるフルダラビン抵抗性の患者から得たＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）細胞は、ＯＳＷ−１に高い感受性を示した（ＧＩ５０＝０．３ｎＭ）。これらの結果は、限定されるものではあるが、ＯＳＷ−１がin vivo でいくつかの腫瘍成長を阻害する高い選択性があることを示している。
【００３８】
膵癌、白血病、結腸癌、悪性神経膠腫、他の脳腫瘍、卵巣癌の処置でのＯＳＷ−１およびその類似体の使用は、米国出願特許公報第２００５／０００４０４４号（Huang, P. et al.）に開示されている；ＯＳＷ−１類似体の調製に関してなどその全体を参照により本明細書に組み込むものである。
【００３９】
シュウェインフルチン
シュウェインフルチンとして知られる天然物ファミリーは、現在、アフリカ原産の植物Macaranga schweinfurthii Paxから単離される４つの化合物を含む。シュウェインフルチンＡ（４ａ）（ＮＣＩ６０に対して平均ＧＩ５０＝３６０ｎＭ）は、セファロスタチン１（１でｐ＝０．５９）や他のＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓと同様の細胞障害性プロフィールを示す。シュウェインフルチンＢ、Ｄは、ＮＣＩ６０株化細胞抗癌試験法においてもＧＩ５０平均値が１μＭ未満の高度の活性を示す。それらの生物活性は、いくつかの中枢神経系（ＣＮＳ）、腎臓および乳癌株化細胞がこれらの化合物にもっとも感受性の高いタイプに含まれるために注目されている。活性スペクトルを調べると、現在使用されているどの薬剤とも相関がなく、これらの化合物が今まで知られていない標的に対してあるいは新規機序により作用している可能性を示唆している。
【００４０】
セファロスタチン１のように、天然の原料から入手できるシュウェインフルチンＡは極少量であるため、in vivo 研究は限定されていた。より多量のシュウェインフルチンサンプルを天然の原料から単離する試みは繰り返されたが、成果は上げられていない。シュウェインフルチンＡの合成はまだ達成されていないが、Wiemer のグループはシュウェインフルチンＢ、Ｅ、Ｆの全合成を達成した。Wiemer, D. et al.の米国特許出願公報第２００８／０２２７８５２号が参照できる；その全体を参照により本明細書に組み込むものである。いくつかの関連するスチルベン誘導体の調製は、Chen, G. et al.の米国特許第７，３２１，０５０号が参照できる；その全体を参照により本明細書に組み込むものである。
【００４１】
シュウェインフルチンＡを使用したマウス異種移植片実験が１つ報告されているが、９．３ｍｇ／ｋｇ（Ｑ２Ｄｘ４）の腹腔内投与により「明白な毒性を示すことなく媒体処理コントロールと比較して腫瘍容積が減少」した。 Beutler et al. (2006) The Schweinfurthins: Issues in development of a plant-derived anticancer lead, In: Bogers RJC, Craker L.E., Lange, D., eds. Medicinal and Aromatic Plantss; Springer, Dordrecht, The Netherlands, p. 301-9。
【００４２】
（−）−ステレッチンＥ
（−）−ステレッチンＥ（５）は海産天然物であり、セファロスタチン１と同様の細胞障害性パターンを有すると報告されている（ｐは報告されていない）。（−）−ステレッチンＥは極少量で単離された感光性化合物であり、詳細な細胞による研究や in vivo 実験を不可能としている。しかしながら、ｐ２１−ＣＤＫＮ１Ａ（ここでは、「ｐ２１」）腫瘍抑制因子を発現しないよう操作されたＨＣＴ−１１６結腸癌株化細胞に対する（−）−ステレッチンＥの細胞障害性が、親のＨＣＴ−１１６株化細胞に比べて１１７倍高いという発見により（ＨＣＴ−１１６ｐ２１-／−中のＧＩ５０＝３９ｎＭに対し、ＨＣＴ−１１６ｐ２１＋／＋中のＧＩ５０＝４．５７μＭ）、この化合物（と類似のＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓ）の細胞内標的をより興味深いものとしている。これらの結果は、（−）−ステレッチンＥ（とおそらくすべてのＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓ）がｐ２１欠損細胞に対して致死性の可能性があることを示唆している。
【００４３】
本発明により、発明者らは、ＯＳＢＰ１およびその最も近いパラログであるＯＲＰ４Ｌが、セファロスタチン１（１）、ＯＳＷ−１（２）、リッテラジンＢ（３）、シュウェインフルチンＡ／Ｂ（４ａ／４ｂ）の高親和性受容体であることを特定した。これらの化合物がＯＳＢＰ１細胞活性のいくつかの側面を変化させることを本明細書で開示しており、大部分が謎であるＯＳＢＰ／ＯＲＰタンパク質の新たな活性を明らかにした。例えば、１はＯＳＢＰ１の原形質膜への部分的局在化を誘発し（図５Ｅ）、１および２はＯＳＢＰ１分解を引き起こし（図６）、研究したすべてのＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓはスフィンゴミエリン生合成の速度の減少を誘発する（図７）。
【００４４】
本発明がなされる前は、ＯＳＢＰ１とそのパラログであるＯＲＰの機能はよく理解されていなかったが、これは、部分的には、細胞におけるこれらのタンパク質の機能を変化できる試薬がなかったことによるものであった。細胞内コレステロールレベルの変化や２５−ＯＨＣの投与がもたらすＯＳＢＰ／ＯＲＰの小分子による摂動は、ＯＳＢＰ／ＯＲＰ以外の多くのタンパク質にも影響を与えるであろう。その使用を更に複雑にしていることは、２５−ＯＨＣが細胞におけるコレステロール生合成の強力な阻害剤であることである。従って、２５−ＯＨＣのＯＳＢＰ１活性に対する効果は、２５−ＯＨＣがＯＳＢＰ１に結合することによるか、または細胞性コレステロールの欠乏によるかのどちらかでありえる。
【００４５】
ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４ＬをＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの標的として特定することで、これらのタンパク質の新たな高親和性小分子プローブが提供される。更に、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは２５−ＯＨＣよりもＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌにより特異的であろう。なぜならここに開示する結果は、２５−ＯＨＣの２つの細胞受容体であるＮＰＣ−１とＩｎｓｉｇのどちらもこれらの化合物の活性に関与していないことを示しているからである。すべてのＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌへの結合に際し２５−ＯＨＣと競合するようである。この知見の最も簡単な説明は、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓが、すべてのＯＳＢＰ／ＯＲＰタンパク質のＣ−末端にある高度に保存された脂質結合ドメインから２５−ＯＨＣを排除しているということである。ＯＳＢＰ１と相同な酵母タンパク質であるＯｓｈ４の結晶構造は、脂質結合ドメインが、部分的なβバレルを有する大型の疎水性キャビティであることを明示した。Im et al. (2005) Nature 437:154-8。かかるキャビティは、おそらくＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓを収納することができるであろう。
【００４６】
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓが同一のタンパク質標的に集合することは、ＮＣＩ６０株化細胞パネルにおける増殖抑制のそれらのパターンが同様であることにより示された、これらの化合物が同一の作用機序を有するであろうという示唆を実証する。しかしながら、ここに開示する知見によれば、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌを標的とする際にそれぞれ異なる活性を有していることは驚くべきことである。例えば、セファロスタチン１（１）およびＯＳＷ−１（２）は、細胞におけるＯＳＢＰ１分解を誘発するが、シュウェインフルチンＡ（４ａ）は誘発しない。免疫蛍光顕微鏡法では、異なるＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１局在化やゴルジ体の構造維持に異なる方法で影響していることを示している。更に、１および２がＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌに結合する親和性は僅かに異なるだけである。しかしながら、シュウェインフルチンＡ（４ａ）はＯＲＰ４Ｌよりも約４０倍高い親和性でＯＳＢＰ１に結合し、ＯＲＰ４ＬとＯＳＢＰ１のタンパク質配列相同性が高いことを考えると、驚くべき結果である。シュウェインフルチンＡ（４ａ）が、ＯＳＢＰ１に比べてＯＲＰ４Ｌへの親和性が低いことは、その細胞障害性が他のＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓと比べて約１００〜３００倍低いことの理由、また４ａがＯＲＰ４Ｌ結合／細胞障害性の相関から脱落していることの理由かもしれない。このようなシュウェインフルチンＡのＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌに対する結合親和性の大きな違いは、ＯＳＢＰ／ＯＲＰスーパーファミリーの個々のメンバーやサブセットと選択的に相互作用する小分子を発見できることを示唆している。
【００４７】
多数の証拠は、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４ＬがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性を仲介することを示している。ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４ＬがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性を仲介することを確認することは、これらのタンパク質の酵素活性の欠如と、それらの機能がよく理解されていないことのために大変困難なことであった。最初に、以下の例では、ＯＳＢＰ１レベルのノックダウンが細胞をＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓに対して感作し（図３Ａ）、一方ＯＳＢＰ１またはＯＲＰ４Ｌのどちらかの過剰発現が細胞をこれらの化合物に対して脱感作した（図３Ｄ）ことが示される。これらの結果は、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌの機能欠如を誘発することと一貫しており、これにより抗増殖効果が観察された。しかしながら、これらの結果は、ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌが「おとりタンパク質」すなわち小分子が抗増殖効果を発揮する実際の有効標的に到達することを妨げる高親和性受容体である可能性を除外するものではなかった。
【００４８】
ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４ＬがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの有効標的であることを共に強く支持する３つの証拠が得られた。第１に、２の４つの類似体と１〜４ａの構造活性相関（ＳＡＲ）がそれらのＯＳＢＰ１への親和性と増殖抑制能力との強い正の相関を示したことがわかった（図３Ｅ）。シュウェインフルチンＡ（４ａ）を除いて、ＯＲＰ４Ｌを使用した同様の分析が同様に強い相関を与えた（図３Ｆ）。更に、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌに結合しないＯＳＷ−１（２）類似体である化合物９は、３つの株化細胞で評価した際に、２に比べて細胞増殖の抑制活性が７００〜２１００倍低かった。これらの結果は、ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌが有効標的であることと一致している。仮にＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌがおとりタンパク質であった場合、ＫｉとＧＩ５０の逆の相関が期待されるであろう。
【００４９】
第２に、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの増殖抑制活性は、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌの高親和性配位子として知られる２５−ＯＨＣの致死量以下と細胞を一緒にインキュベートすることにより著しく抑制された。２５−ＯＨＣが細胞中でＯＳＢＰ１への結合にＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓと競合することの独立した証拠としては、２５−ＯＨＣがＯＳＷ−１（２）により誘発されるＯＳＢＰ１分解を抑制したことを観察したことが挙げられる。仮にＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌがおとり標的である場合、２５−ＯＨＣがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓを排除することで、実際の有効標的と相互作用する化合物をより多く放出するであろう。これによる場合、観察された細胞の脱感作ではなく、細胞がＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓに対して感作されることが期待されるであろう。
【００５０】
最後に、ＯＳＢＰ１の２つの優位な薬剤耐性対立遺伝子が特定された。ＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）の過剰発現は細胞を１、２、４ａに対して脱感作し、ＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）の過剰発現は細胞を１に対して脱感作した。興味深いことに、これらの変異体は、１、２、４ａへの結合の変化を示さなかった。これらのＯＳＢＰ１変異体を過剰発現する細胞の脱感作の可能な説明の１つは、これらの変異がタンパク質−タンパク質相互作用に影響を与え、ＯＳＢＰ１と他のタンパク質の相互作用がＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性に関与しているということである。この可能性の先例としては、甲状腺ホルモンβ受容体の変異体が挙げられ、このタンパク質の公知の変異体が、配位子結合に影響を与えるのではなくむしろタンパク質‐タンパク質相互作用を妨害することによって配位子誘発トランス活性化を抑制している。Collingwood et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94:248-53。ＯＳＢＰ１は、数個の公知の相互作用パートナーを有し、配位子結合依存様式で多タンパク質複合体を形成可能なステロール感受性足場タンパク質として機能することが報告されている。従って、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの活性が、他のタンパク質と相互作用するＯＳＢＰ１に依存し、ＯＳＢＰ１のタンパク質‐タンパク質相互作用を変化させる変異がこれらの化合物の活性を調節できると推測することは妥当である。
【００５１】
全体的にみて、前記の結果は、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌが有効標的であることを強く支持している。しかしながら、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１の機能の損失の原因となっているようであるが、ＯＳＢＰ１ｓｈＲＮＡノックダウンだけでは増殖抑制を引き起こさないことは不思議である。この説明の１つとして、ＯＳＢＰ１発現の完全またはほぼ完全な消失が細胞増殖を抑制することに必要とされ、ＯＳＢＰ１ｓｈＲＮＡノックダウン実験がＯＳＢＰ１レベルを約８５％減少させただけであることである。対照的に、特に小分子エフェクターの能力が高いＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、細胞におけるＯＳＢＰ１の全機能を抑制可能である。これは特に、ＯＳＢＰ１の機能を妨害する２つの手段を有するセファロスタチン１（１）やＯＳＷ−１（２）によく当てはまる。すなわち、両化合物はＯＳＢＰ１の高親和性配位子であり（低ｎＭＫｉ）、両化合物はＯＳＢＰ１の分解を誘発する。
【００５２】
２つ目の説明は、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌの両方の共欠乏が、化合物処理の効果を表現型模写するのに必要とされることである。有効なＯＲＰ４Ｌ抗体がないため、両タンパク質の同時ノックダウンは行われなかった。
【００５３】
３つ目の説明は、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４ＬだけでなくＯＳＢＰ／ＯＲＰスーパーファミリーの多数のメンバーの細胞機能を妨害し、これらの他のＯＳＢＰ／ＯＲＰの抑制がＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性に貢献するということである。酵母における状況を反映するような、多数のＯＳＢＰ／ＯＲＰにより重複して実行される大変重要な細胞機能がある場合、この可能性が高くなる。酵母は７つのＯｓｈタンパク質を有し、それらはＯＳＢＰ／ＯＲＰの酵母相同体である。酵母はこれら７つのＯｓｈタンパク質の任意の６個が損失しても生存できるが７つすべての損失では生存できないと報告されている。更に、ＯＳＢＰ／ＯＲＰは、脂質結合ドメインで重要な配列相同を示し、ほとんどは２５−ＯＨＣを結合することを示した。ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌへの結合で２５−ＯＨＣと競合することを考慮すれば、他のＯＳＢＰ／ＯＲＰもこれらの化合物を結合する可能性がある。２５−ＯＨＣの添加により達成された高度な脱感作（図４Ａ）は、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌに加えて他のＯＲＰからもＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓが排除されることによるのであろう。スーパーファミリー全体のＯＳＢＰ／ＯＲＰの抑制、あるいは細胞生存に必要なこれらタンパク質のサブセットの抑制が、細胞障害性であると報告されているＯＲＰ９Ｓの誘発性発現は例外として、細胞増殖における個々のＯＲＰの役目を明らかにするための遺伝的摂動方法の失敗も説明するであろう。
【００５４】
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓはｐ２１欠損腫瘍細胞の増殖を選択的に抑制し（図２Ａ）、４ａはＮＦ１欠損腫瘍細胞に選択的であるので、ここに開示した結果は、これら腫瘍抑制タンパク質の損失が、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌの摂動に対する細胞の感受性を高めていることを強く示唆するものである。このように、ここで開示した知見は、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌが、ＮＦ１やｐ２１で合成致死性を達成する新たな標的であることを示しており、これにより腫瘍選択的癌治療法が得られる可能性がある。
【００５５】
ＯＲＰ４ＬのｍＲＮＡレベルは、限局性腫瘍と比べて転移性乳癌腫瘍において増加すると報告されており、転移性カスケードの初期段階におけるＯＲＰ４Ｌの役割の可能性を示している。Fournier et al. (1999) Cancer Res. 59:3748-53。従って、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、癌転移におけるＯＲＰ４Ｌの役割を更に探求するために有用な試薬であろう。
【００５６】
セファロスタチン１（１）とＯＳＷ−１（２）がＯＳＢＰ１レベルの高度な減少を誘発するという発見は、この効果を化合物が特定の組織に到達したかどうかの決定に使用することができるので、それらの抗腫瘍活性の研究に有用であろう。更に、化合物１、２は、疾患動物モデルにおけるＯＳＢＰ１タンパク質レベルを低下するために使用可能であろう。
【００５７】
本発明の様々な側面は、ＯＳＷ−１類似体、これらの類似体と形成した抗体抱合体、類似体や抱合体を含む医薬組成物、および特に癌などの、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ１）に関連する疾患や病状の処置における、本発明の類似体、抱合体、医薬組成物の使用に関する。
【００５８】
本発明のある側面は、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
【化１】
2014515354.tif 000003
（Ｉ）
【００５９】
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、水素、トリアルキルシリルおよび
【化２】
2014515354.tif 000004
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは、０〜６の整数であり、
【００６０】
Ｒは、置換若しくは無置換の、アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基、およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、水素およびアシルからなる群から選択され、および
Ｒ１０は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択される、
【００６１】
ただし、
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素でありＲ５がアセチルである場合、Ｒ６は水素、ｐａｒａ−メトキシベンゾイル、または３−フェニル−２−プロペノイルではない、
（ｃ）Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない、
（ｄ）Ｒ１が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、または
（ｅ）Ｒ２またはＲ３が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない。
【００６２】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ４が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ４がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、本発明は、Ｒ４がメチルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、Ｒ５が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ５がアシルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、本発明は、Ｒ５がアセチル（Ａｃ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６３】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ１が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１が
【化３】
2014515354.tif 000005
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６４】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２が
【化４】
2014515354.tif 000006
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６５】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ３が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３が
【化５】
2014515354.tif 000007
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６６】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ６が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ６がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ６が
【化６】
2014515354.tif 000008
である、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、本発明は、Ｒ６がｐａｒａ−メトキシベンゾイルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例の、ある実施態様では、本発明は、Ｒ６が３-フェニルプロパノイルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６７】
ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルケニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がａｌｌｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＦｍｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアリールである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルキル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルケニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６８】
ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつＲがアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつＲが４−ニトロフェニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００６９】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７０】
ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＨである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例の、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＲ１０であり、かつＲ１０がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７１】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７２】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７３】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７４】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、Ｒがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基またはａｌｌｏｃもしくはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基であり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７５】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、Ｒがフェニルであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、ｎがゼロでない場合カルボニル炭素とメチレン基との間に、ｎがゼロ（０）である場合カルボニル炭素とＲの間に結合があるように、Ｚの１つまたは２つ以上の例が非存在である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７６】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲがアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７７】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７８】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲが１−イミダゾリル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、Ｒが１−イミダゾリル基であり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００７９】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１およびＲ２の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【００８０】
本発明のある側面は、  
【００８１】
【化７】
2014515354.tif 000009
【００８２】
【化８】
2014515354.tif 000010
【００８３】
【化９】
2014515354.tif 000011
【００８４】
【化１０】
2014515354.tif 000012
【００８５】
【化１１】
2014515354.tif 000013
【００８６】
【化１２】
2014515354.tif 000014
【００８７】
【化１３】
2014515354.tif 000015
【００８８】
【化１４】
2014515354.tif 000016
【００８９】
【化１５】
2014515354.tif 000017
【００９０】
【化１６】
2014515354.tif 000018
【００９１】
【化１７】
2014515354.tif 000019
【００９２】
【化１８】
2014515354.tif 000020
からなる群から選択される化合物である。
【００９３】
本発明のある側面は、医薬組成物である。前記医薬組成物は、前記化合物のいずれか１つおよび医薬上許容し得る担体を含む。本発明のこの側面による医薬組成物は、前記化合物のいずれか１つの治療有効量および医薬上許容し得る担体を配合する工程を含む方法により調製可能である。もちろん、前記医薬組成物およびその調製方法は、前記化合物を１つより多く含むことが可能である。同様に、前記医薬組成物およびその調製方法は、もちろん、本発明の化合物以外の少なくとも１つの追加の医薬的に活性な剤を任意に含むことが可能である。
【００９４】
本発明の前記化合物の少なくともいくつかは、ＯＳＷ−１フレームワーク構造の特定の位置でＯＳＷ−１類似体を他の分子に結合可能な機能を有するリンカーサブユニットを含むことを指摘すべきであろう。
本発明の１つの側面は、ＯＳＷ−１フレームワーク構造の特定の位置でＯＳＷ−１類似体を他の分子に結合可能な機能を有する特徴的なリンカーサブユニット含む更なるＯＳＷ−１類似体化合物に関する。本発明のこの側面によるＯＳＷ−１類似体は、例えば抗体などのタンパク質と抱合体を形成することに特に好適であろう。
【００９５】
本発明の側面は、式（ＩＩ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩に関する。
【化１９】
2014515354.tif 000021
（ＩＩ）
【００９６】
式中
Ｘは、ＯおよびＮＯＲ２０からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、Ｒ２０、トリアルキルシリルおよび
【化２０】
2014515354.tif 000022
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは、０〜６の整数であり、
【００９７】
Ｒは、置換若しくは無置換であり、アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＲ２０からなる群から選択され、
Ｒ１０は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
【００９８】
Ｒ２０は、
【化２１】
2014515354.tif 000023
，
【化２２】
2014515354.tif 000024
，および
【化２３】
2014515354.tif 000025
からなる群から選択され、
【００９９】
Ｚ′は、ＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、および
ｍは、１〜６の整数である、
【０１００】
ただし、ＸがＯである場合Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つだけがＲ２０であり；ＸがＮＯＲ２０である場合Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれもがＲ２０ではない。いずれの場合でも、前記化合物はただ１つだけＲ２０を含むものである。
【０１０１】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ１が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１が
【化２４】
2014515354.tif 000026
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０２】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２が
【化２５】
2014515354.tif 000027
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０３】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ３が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３が
【化２６】
2014515354.tif 000028
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０４】
ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０５】
ある実施態様では、本発明は、ｎがゼロでない場合カルボニル炭素とメチレン基との間に、ｎがゼロ（０）である場合カルボニル炭素とＲの間に結合があるように、Ｚの１つまたは２つ以上の例が非存在である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０６】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０７】
ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルケニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がａｌｌｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＦｍｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアリールである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルキル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルケニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０８】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ４が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ４がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ４がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、Ｘが酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１０９】
ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素およびＲ２０からなる群から選択される、前記化合物のいずれか１つに関する。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つだけがＲ２０である。例えば、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ１がＲ２０であり、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ２がＲ２０であり、かつＲ１、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ３がＲ２０であり、かつＲ１、Ｒ２およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ４がＲ２０であり、かつＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１０】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、ＸがＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、ＸがＮＲ１０であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１１】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化２７】
2014515354.tif 000029
であり、かつＺ′が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化２８】
2014515354.tif 000030
であり、かつＺ′がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１２】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化２９】
2014515354.tif 000031
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１３】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化３０】
2014515354.tif 000032
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１４】
ある実施態様では、本発明は、ｍが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１５】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化３１】
2014515354.tif 000033
である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｚ′が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｚ′がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１６】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化３２】
2014515354.tif 000034
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１７】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化３３】
2014515354.tif 000035
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１８】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ１０の１つまたは２つ以上の例が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒ１０の１つまたは２つ以上の例がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１１９】
本発明のある側面は、式（ＩＩＩ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩に関する。
【化３４】
2014515354.tif 000036
（ＩＩＩ）
【０１２０】
式中
ＸはＯおよびＮＯＲ２０からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素、Ｒ２０、トリアルキルシリルおよび
【化３５】
2014515354.tif 000037
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは０〜６の整数であり、
【０１２１】
Ｒが、置換若しくは無置換：アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基、およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＲ２０からなる群から選択され、
Ｒ１０は水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
【０１２２】
Ｒ２０は
【化３６】
2014515354.tif 000038
，
【化３７】
2014515354.tif 000039
，および
【化３８】
2014515354.tif 000040
からなる群から選択され、
【０１２３】
Ｒ３０は水素、メチルおよびＣ２〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｚ′はＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、および
ｍは１〜６はの整数である、
ただし、ＸがＯである場合Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つだけがＲ２０であり；ＸがＮＯＲ２０である場合Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれもがＲ２０ではない。いずれの場合でも、前記化合物はただ１つだけＲ２０を含むものである。
【０１２４】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ１が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ１が
【化３９】
2014515354.tif 000041
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１２５】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２が
【化４０】
2014515354.tif 000042
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１２６】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ３が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３が
【化４１】
2014515354.tif 000043
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１２７】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ３０が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３０がメチルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ３０がＣ２〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１２８】
ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１２９】
ある実施態様では、本発明は、ｎがゼロでない場合カルボニル炭素とメチレン基との間に、ｎがゼロ（０）である場合カルボニル炭素とＲの間に結合があるように、Ｚの１つまたは２つ以上の例が非存在である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３０】
ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上の例においてｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３１】
ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルケニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がａｌｌｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＦｍｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアリールである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルキル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルケニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３２】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ４が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ４がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ４がＲ２０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、Ｘが酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３３】
ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素およびＲ２０からなる群から選択される、前記化合物のいずれか１つに関する。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つだけがＲ２０である。例えば、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ１がＲ２０であり、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ２がＲ２０であり、かつＲ１、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ３がＲ２０であり、かつＲ１、Ｒ２およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ４がＲ２０であり、かつＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３４】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、ＸがＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、ＸがＮＲ１０であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３５】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４２】
2014515354.tif 000044
であり、かつＺ′が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４３】
2014515354.tif 000045
であり、かつＺ′がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３６】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４４】
2014515354.tif 000046
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３７】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４５】
2014515354.tif 000047
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３８】
ある実施態様では、本発明は、ｍが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、ｍが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１３９】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４６】
2014515354.tif 000048
である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｚ′が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｚ′がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１４０】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４７】
2014515354.tif 000049
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１４１】
あるいは、ある実施態様では、本発明は、Ｒ２０が
【化４８】
2014515354.tif 000050
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１４２】
ある実施態様では、本発明は、Ｒ１０の１つまたは２つ以上の例が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、本発明は、Ｒ１０の１つまたは２つ以上の例がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１４３】
ある実施態様では、本発明は、ＸがＯであり、Ｒ１が
【化４９】
2014515354.tif 000051
であり、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、本発明は、前記化合物が単一の立体異性体として存在する、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１４４】
本発明のある側面は、前記化合物のいずれか１つに共有結合したモノクローナル抗体を含む抱合体である。ある実施態様では、前記化合物は、ここに記載するＲ２０部分を含む、式（ＩＩ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。ある実施態様では、前記化合物は、ここに記載するＲ２０部分を含む、式（ＩＩＩ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩である。ある実施態様では、前記モノクローナル抗体および前記化合物が、システインチオール−マレイミドマイケル付加反応生成物、バリン−シトルリンｐ−アミノベンジルリンカー、またはバリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバメートリンカーを介して共有結合している。かかる結合化学は、一般に当該分野では公知であり、ここで更なる説明を必要としない。例えば、Senter et al.米国特許第７，６５９，２４１号、Doronina et al.第７，７４５，３９４号、Senter et al.第７，８２９，５３１号、Senter et al.第７，８５１，４３７号が参照でき、その内容の全体を参照により本明細書に組み込むものである。前記モノクローナル抗体は抱合体の一部となっても、同属抗原結合特異性および結合力を保持することが好ましい。前記化合物は抱合体の一部となっても、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎとしてその活性を保持することが好ましい。
【０１４５】
モノクローナル抗体およびその調製方法は当該分野では公知である。モノクローナル抗体としては、全抗体、および例えばモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ′）２フラグメントなどのその抗原結合性フラグメントを含むことができる。様々な実施態様において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体を含むことも可能である。ある実施態様では、モノクローナル抗体は、二重特異性抗体を含むことが可能である。
【０１４６】
ある実施態様では、前記モノクローナル抗体は、癌細胞上に発現される抗原に特異的に結合する。ある実施態様では、かかる抗原は、前記癌細胞により過剰発現されるか、前記癌細胞により特徴的に発現されるか、前記癌細胞により独特に発現されることができる。これらのタイプの抗原は、癌抗原あるいは腫瘍抗原と呼ばれている。これらの抗原のいくつかは、腫瘍特異性抗原あるいは腫瘍結合性抗原であってもよい。「腫瘍特異性抗原」は、正常細胞ではなく腫瘍細胞に特異的に存在する抗原である。腫瘍特異性抗原の例は、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスにより誘発される腫瘍におけるウイルス抗原である。「腫瘍結合性抗原」は、腫瘍細胞と正常細胞の両方に存在するが、腫瘍細胞では異なる量あるいは異なる形態で存在する。かかる抗原の例は、がん胎児性抗原（例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ））、分化抗原（例えば、Ｔ抗原およびＴｎ抗原）、および癌遺伝子産物（例えば、ＨＥＲ／ｎｅｕ）である。
【０１４７】
多数の癌抗原が当該分野で知られており記述されている。本明細書で使用される「癌抗原」は、腫瘍や癌細胞表面に関連したペプチドやタンパク質などの化合物であり、ＭＨＣ分子に関して言えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現される時のように、免疫応答を誘発することが可能である。癌抗原は、例えばCohen et al. (1994) Cancer Res 54:1055に記載されるように、癌細胞の粗抽出物の調製、あるいはその抗原を部分的に精製、組み換え技術、公知の抗原の新規合成のいずれかにより癌細胞から調製可能である。癌抗原には、限定することなく、組み換えにより発現される抗原、腫瘍や癌の免疫原性部分や全体が含まれる。かかる抗原は、組み換え法もしくは当該分野で公知の他の任意の手段により単離または調製可能である。
【０１４８】
ある実施態様では、癌抗原は、ヒト癌抗原、すなわちヒトの癌と関連するまたはそれ由来の癌抗原である。
【０１４９】
限定するものではないが、ヒト癌細胞上に発現される抗原に特異的に結合する市販のモノクローナル抗体の例としては、アレムツズマブ（キャンパス；抗ＣＤ５２）；ベバシズマブ（アバスチン；抗ＶＥＧＦ）；セツキシマブ（アービタックス；抗ＥＧＦＲ）；ゲムツズマブ（マイロターグ；抗ＣＤ３３）；イブリツモマブ（ゼヴァリン；抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（ベクチビックス；抗ＥＧＦＲ）；リツキシマブ（リツキサン；抗ＣＤ２０）；トシツモマブ（ベキサール；抗ＣＤ２０）；トラスツズマブ（ハーセプチン；抗ＥｒｂＢ２）が挙げられる。ヒト癌細胞上に発現される抗原に特異的に結合する他の多くのモノクローナル抗体は、開発中であり、これらの中には規制調査中のものもある。
【０１５０】
ある実施態様では、前記モノクローナル抗体により認識される前記抗原を発現する癌細胞は、ｐ２１の発現が欠損している。このタイプの癌細胞を、ここではＰ２１欠損と呼ぶ。ｐ２１発現のレベルは、例えば、ｐ２１特異性モノクローナル抗体による全細胞または細胞抽出物のどちらかへの結合、適切な配列特異性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行った逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法などを含む任意の適切は方法を使用して評価可能である。モノクローナル抗ｐ２１抗体は、様々な製造業者から入手可能である。ヒトｐ２１／ＷＡＦ１の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ６７３８８として公表されている。
【０１５１】
ある細胞においてｐ２１の発現量が、適切なポジティブコントロール細胞で測定されたｐ２１発現量よりも客観的かつ測定可能に低い場合、その細胞はＰ２１を欠損していると言われる。ある実施態様では、ある細胞においてｐ２１の発現量が、適切なポジティブコントロール細胞で測定されたｐ２１の発現量よりも少なくとも５パーセント低い場合、その細胞はＰ２１を欠損していると言われる。様々な追加のあるいは代わりの実施態様では、ある細胞においてｐ２１の発現量が、適切なポジティブコントロール細胞で測定されたｐ２１の発現量よりも少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５、９９または１００パーセント低い場合、その細胞はＰ２１を欠損していると言われる。
【０１５２】
本発明のある側面は、医薬組成物である。前記医薬組成物は、前記抱合体のいずれか１つおよび医薬上許容し得る担体を含む。本発明のこの側面による医薬組成物は、前記抱合体のいずれか１つの治療有効量および医薬上許容し得る担体を配合する工程を含む方法により調製することが可能である。もちろん、医薬組成物およびその調製方法は、前記抱合体を１つより多く含むことが可能である。同様に、前記医薬組成物およびその調製方法は、もちろん本発明の抱合体以外の少なくとも１つの追加の医薬的に活性な剤を任意に更に含むことが可能である。
【０１５３】
本発明のある側面は、哺乳動物細胞を殺傷する方法である。前記方法は、哺乳動物細胞を本発明の前記化合物のいずれか１つの有効量に接触させる工程を含む。ある実施態様では、前記方法は、式（Ｉ）による化合物またはその医薬上許容し得る塩のいずれか１つに関する。
【化５０】
2014515354.tif 000052
（Ｉ）
【０１５４】
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、水素、トリアルキルシリルおよび
【化５１】
2014515354.tif 000053
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは、０〜６の整数であり、
【０１５５】
Ｒは、置換若しくは無置換の、アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基、およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、水素およびアシルからなる群から選択され、および
Ｒ１０は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択される、
【０１５６】
ただし、
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素でありＲ５がアセチルである場合、Ｒ６は水素、ｐａｒａ−メトキシベンゾイル、または３−フェニル−２−プロペノイルではない、
（ｃ）Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない、
（ｄ）Ｒ１が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、または
（ｅ）Ｒ２またはＲ３が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない。
【０１５７】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ４が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ４がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ４がメチルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１５８】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ５が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ５がアシルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ５がアセチル（Ａｃ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１５９】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１が
【化５２】
2014515354.tif 000054
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６０】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２が
【化５３】
2014515354.tif 000055
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６１】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３が
【化５４】
2014515354.tif 000056
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６２】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６が
【化５５】
2014515354.tif 000057
である、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６がｐａｒａ−メトキシベンゾイルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例の、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６が３-フェニルプロパノイルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６３】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルケニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がａｌｌｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＦｍｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアリールである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルキル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルケニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６４】
ある実施態様では、前記方法は、Ｚの１つまたは２つ以上の例が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつＲがアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつＲが４−ニトロフェニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６５】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６６】
ある実施態様では、前記方法は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＨである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例の、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＲ１０であり、かつＲ１０がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６７】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６８】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１６９】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７０】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、Ｒがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基またはａｌｌｏｃもしくはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基であり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７１】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、Ｒがフェニルであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、前記方法は、ｎがゼロでない場合カルボニル炭素とメチレン基との間に、ｎがゼロ（０）である場合カルボニル炭素とＲの間に結合があるように、Ｚの１つまたは２つ以上の例が非存在である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７２】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲがアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７３】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７４】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲが１−イミダゾリル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、Ｒが１−イミダゾリル基であり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７５】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１およびＲ２の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０１７６】
ある実施態様では、前記方法が、
【化５６】
2014515354.tif 000058
【０１７７】
【化５７】
2014515354.tif 000059
【０１７８】
【化５８】
2014515354.tif 000060
【０１７９】
【化５９】
2014515354.tif 000061
【０１８０】
【化６０】
2014515354.tif 000062
【０１８１】
【化６１】
2014515354.tif 000063
【０１８２】
【化６２】
2014515354.tif 000064
【０１８３】
【化６３】
2014515354.tif 000065
【０１８４】
【化６４】
2014515354.tif 000066
【０１８５】
【化６５】
2014515354.tif 000067
【０１８６】
【化６６】
2014515354.tif 000068
【０１８７】
【化６７】
2014515354.tif 000069
からなる群から選択される化合物に関する。
【０１８８】
更に、本発明のこの方法によれば、ある実施態様では、前記哺乳動物細胞が癌細胞である。ある実施態様では、前記癌細胞がヒト癌細胞である。ある実施態様では、前記癌細胞がＰ２１を欠損している。
【０１８９】
本発明のある側面は、ＯＳＢＰ関連疾病または病状を処置する方法である。前記方法は、それを必要とする対象に本発明の化合物の有効量を投与して、ＯＳＢＰ関連疾病または病状に関連するＯＳＢＰ発現細胞のアポトーシスを増加させる工程を含む。
【０１９０】
本明細書で使用される「ＯＳＢＰ関連疾病または病状」は、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）またはＯＳＢＰ関連タンパク質（ＯＲＰ）が疾病または病状の病変形成に関与していることが示されたあるいは示され得る任意の疾病または病状を意味する。ある実施態様では、ＯＳＢＰ関連疾病または病状は癌である。ある実施態様では、ＯＳＢＰ関連疾病または病状はアテローム性動脈硬化症である。ある実施態様では、ＯＳＢＰ関連疾病または病状はアルツハイマー病である。
【０１９１】
本明細書で使用される「処置する」は、疾病または病状を有する対象における疾病または病状の少なくとも１つの症状または客観的徴候を低減または進行を遅延することを意味する。ある実施態様では、「処置する」は、疾病または病状を有する対象における疾病または病状を除去することを意味する。
【０１９２】
「対象」は、生きている哺乳動物を意味する。ある実施態様では、対象はヒトである。
「有効量」は、所望の結果を達成するに十分な量である。例えば、ＯＳＢＰ発現細胞のアポトーシスを増加させる有効量は、ＯＳＢＰ発現細胞のアポトーシスを増加させるのに十分な量である。
ＯＳＢＰ関連疾病または病状に関連するＯＳＢＰ発現細胞のアポトーシスを増加する方法は、前記ＯＳＢＰ関連疾病または病状に関連する細胞の数（個体数）を減少する。
【０１９３】
アポトーシスは、プログラムされた細胞死を意味する。アポトーシスにおいて、生化学的事象が、細胞形態の特徴的な変化と細胞死をもたらす。これらの変化としては、小疱形成、細胞膜非対称性および接着性の損失、細胞萎縮、核断片化、クロマチン凝縮、染色体ＤＮＡ断片化などが挙げられる。ネクローシスと違って、アポトーシスは、アポトーシス小体と呼ばれる細胞断片を生成し、細胞の内容物が周囲の細胞の上に流出して損傷を与える前に周囲の細胞がそれらを貪食しすばやく除去することができる。
【０１９４】
アポトーシスのプロセスは、細胞外または細胞内を起源とする多種多様な範囲の細胞シグナルにより制御される。細胞外シグナルには、原形質膜を通過するか、シグナルを原形質膜を超えて伝達し応答を引き起こすトキシン、ホルモン、成長因子、一酸化窒素、サイトカインが含まれる。
【０１９５】
細胞は、ストレスに応答して細胞内アポトーシスシグナル伝達を開始し、細胞の自殺を引き起こすことができる。グルココルチコイドによる核内受容体の結合、熱、放射線、栄養欠乏、ウイルス感染症、低酸素、例えば膜の損傷による細胞内カルシウム濃度増加のすべてが、損傷した細胞による細胞内アポトーシスシグナルの放出を引き起こすことが可能である。ポリＡＤＰリボースポリメラーゼなどのいくつかの細胞成分も、アポトーシスを調節する助けをすることができる。
【０１９６】
細胞死の実際のプロセスが酵素により誘発される前に、アポトーシスシグナルが、調節タンパク質にアポトーシス経路を開始させなくてはならない。この工程により、アポトーシスシグナルが細胞死を起させるか、細胞が死ぬ必要がもはや無い場合はプロセスを停止させる。数種のタンパク質が関与するが、主要な２つの調節方法が特定されている：ミトコンドリア機能を標的とするか、シグナルをアダプタータンパク質を介してアポトーシス機構へ直接伝達する。いつくかのトキシンの研究により特定された他の外因性開始経路は、薬剤活性を原因とする細胞内のカルシウム濃度の増加であり、これによっても、カルシウム結合プロテアーゼであるカルパインを介してアポトーシスを引き起こすことが可能である。
【０１９７】
アポトーシス経路は、カスパーゼ依存性か、カスパーゼ非依存性であり得る。カスパーゼは、システインプロテアーゼのファミリーであり、多くの細胞内タンパク質をタンパク質分解して、細胞死プログラムを実行する。
【０１９８】
アポトーシス測定に有用な多数の方法が当該分野で公知である。これらには、カスパーゼ分析法、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）、ＤＮＡ切断化分析法、細胞透過性分析法、アネキシンＶ分析法などが例として含まれる。これらの分析法のいずれも、ＯＳＢＰ関連疾病または病状に関連するＯＳＢＰ発現細胞のアポトーシスの検出に使用可能である。かかる分析法を使用して、アポトーシスの量や程度が、アポトーシスの適切なネガティブコントロール量や程度よりも客観的かつ測定可能に大きい場合、アポトーシスは増加したと言える。例えば、ある実施態様では、アポトーシスが、アポトーシスの適切なネガティブコントロール量や程度よりも少なくとも５パーセント大きい場合、アポトーシスは増加している。他の実施態様では、アポトーシスが、アポトーシスの適切なネガティブコントロール量や程度よりも少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０または１００パーセント大きい場合、アポトーシスは増加している。
【０１９９】
ある実施態様では、本発明は、前記ＯＳＢＰ関連疾病または病状が癌であり、かつ前記ＯＳＢＰ発現細胞が癌細胞である、前記方法のいずれかに関する。ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、腫瘍のいくつかのタイプの臨床的進行の後期にしばしば起る事象である、ｐ２１発現を失った腫瘍に高い選択性を有し得るので、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓは、癌の治療における新たな最後の砦として役割を果すかもしれない。腫瘍は、ｐ２１の損失により標準的治療に耐性となるので、これらの腫瘍は、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓに感受性がより高くなるであろう。従って、ある実施態様では、本発明は、前記癌がＰ２１欠損癌である、すなわち、前記癌細胞がＰ２１を欠損している、前記方法のいずれか１つに関する。
【０２００】
処置できる癌の例としては、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；副腎皮質癌；エイズ関連癌；エイズ関連リンパ腫；肛門癌；星細胞腫、小児小脳；星細胞腫、小児大脳；基底細胞癌；膀胱癌；骨癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍；乳癌；気管支腺腫／カルチノイド；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；原発不明癌；中枢神経系原発リンパ腫；小脳星細胞腫；大脳星細胞腫／悪性神経膠腫；子宮頸癌；小児がん；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫；食道癌；ユーイング腫瘍ファミリー；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；胃腸カルチノイド腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；妊娠性トロホブラスト腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児脳幹神経膠腫；神経膠腫、小児大脳星細胞腫；神経膠腫、小児視経路および視床下部；神経膠腫、視床下部および視経路；ヘアリーセル白血病；頭頚部癌；肝癌、成人（原発性）；肝癌、小児（原発性）；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎癌；喉頭癌；白血病；唇と口腔癌；肝癌、成人（原発性）；肝癌、小児（原発性）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；悪性線維性組織球腫；悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽腫；黒色腫；メルケル細胞癌；中皮腫；中皮腫、成人悪性；原発不明転移性扁平頸部癌；多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ）症候群；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾病；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻副鼻腔癌；上咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；経口癌；口咽頭癌；骨肉腫；骨肉腫／悪性線維性組織球腫；卵巣癌；上皮性卵巣癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵癌；副鼻腔鼻癌；上皮小体癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；軟部肉腫；子宮肉腫；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌（非黒色腫性）；小腸癌；軟部肉腫；有棘細胞癌；原発不明転移性扁平頸部癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；精巣癌；胸腺腫；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺癌；腎盂と尿管の移行上皮癌；妊娠性絨毛性腫瘍；小児にはまれながん；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；視床下部および視経路神経膠腫；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；ウィルムス腫瘍からなる群から選択される癌が挙げられる。
【０２０１】
ある実施態様では、前記方法は、式（Ｉ）による化合物のいずれか１つまたはその医薬上許容し得る塩に関する。
【化６８】
2014515354.tif 000070
（Ｉ）
【０２０２】
式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、水素、トリアルキルシリルおよび
【化６９】
2014515354.tif 000071
からなる群から独立して選択され、
Ｚは、非存在か、またはＯおよびＮＲ１０からなる群から選択され、
ｎは、０〜６の整数であり、
【０２０３】
Ｒは、置換若しくは無置換の、アルキル、アルケニル、アミノ、ａｌｌｏｃで保護されたアミノ、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ、アリール、５〜１３員環のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基、およびＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基からなる群から選択され、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、水素およびアシルからなる群から選択され、および
Ｒ１０は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択される、
【０２０４】
ただし、
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が水素でありＲ５がアセチルである場合、Ｒ６は水素、ｐａｒａ−メトキシベンゾイル、または３−フェニル−２−プロペノイルではない、
（ｃ）Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない、
（ｄ）Ｒ１が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは水素ではない、または
（ｅ）Ｒ２またはＲ３が４−（ａｌｌｏｃ−アミノメチル）ベンジルアミノカルボニルである場合、Ｒ５はアセチルではないか、またはＲ６はｐａｒａ−メトキシベンゾイルではない。
【０２０５】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ４が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ４がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ４がメチルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２０６】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ５が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ５がアシルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ５がアセチル（Ａｃ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２０７】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１が
【化７０】
2014515354.tif 000072
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２０８】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２が
【化７１】
2014515354.tif 000073
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２０９】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３が
【化７２】
2014515354.tif 000074
である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１０】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６が水素である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６がトリアルキルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６が
【化７３】
2014515354.tif 000075
である、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６がｐａｒａ−メトキシベンゾイルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例の、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ６が３-フェニルプロパノイルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１１】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアルケニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がａｌｌｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＦｍｏｃで保護されたアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がアリールである、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルキル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例が５〜１３員環のシクロアルケニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、Ｒの１つまたは２つ以上の例がＮ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜１０員環のヘテロ芳香環基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１２】
ある実施態様では、前記方法は、Ｚの１つまたは２つ以上の例が酸素（Ｏ）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつＲがアルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつＲが４−ニトロフェニルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１３】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。あるいは、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＯであり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１４】
ある実施態様では、前記方法は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＲ１０である、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｚの１つまたは２つ以上の例がＮＨである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例の、ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＲ１０、かつＲ１０がＣ１〜Ｃ６アルキルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１５】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１６】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１７】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１８】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、Ｒがｐａｒａ−アミノアルキルアリール基またはａｌｌｏｃもしくはＦｍｏｃ−Ｎ′置換ｐａｒａ−アミノメチルフェニル基であり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２１９】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺがＮＨであり、Ｒがフェニルであり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
ある実施態様では、前記方法は、ｎがゼロでない場合カルボニル炭素とメチレン基との間に、ｎがゼロ（０）である場合カルボニル炭素とＲの間に結合があるように、Ｚの１つまたは２つ以上の例が非存在である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２２０】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲがアミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲがａｌｌｏｃまたはＦｍｏｃ−Ｎ′置換アミノ基である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２２１】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが２である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが一（１）である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが３である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが４である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが５である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつｎが６である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２２２】
ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、かつＲが１−イミダゾリル基である、前記化合物のいずれか１つに関する。ある実施態様では、前記方法は、１つまたは２つ以上の例においてＺが非存在であり、Ｒが１−イミダゾリル基であり、かつｎがゼロ（０）である、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２２３】
ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。例えば、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ３がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１およびＲ２の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ２およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。さらに他の例として、ある実施態様では、前記方法は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである、前記化合物のいずれか１つに関する。
【０２２４】
ある実施態様では、前記方法は、
【化７４】
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【０２２５】
【化７５】
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【０２２６】
【化７６】
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【０２２７】
【化７７】
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【０２２８】
【化７８】
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【０２２９】
【化７９】
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【０２３０】
【化８０】
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【０２３１】
【化８１】
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【０２３２】
【化８２】
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【０２３３】
【化８３】
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【０２３４】
【化８４】
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【０２３５】
【化８５】
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からなる群から選択される化合物に関する。
【０２３６】
本発明のある側面は、癌細胞を殺傷する方法である。前記方法は、癌細胞を本発明の抱合体の有効量と接触させる工程を含む。ある実施態様では、前記癌細胞がＰ２１を欠損している。
【０２３７】
本発明のある側面は、癌を処置する方法である。前記方法は、それを必要とする対象に本発明の抱合体の有効量を投与する工程を含む。ある実施態様では、前記癌の細胞がＰ２１を欠損している。
【０２３８】
酸性置換基を有する本発明のある化合物は、医薬上許容し得る塩基との塩であってもよい。本発明はかかる塩を含む。かかる塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リジン塩、アルギニン塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法により調製できる。
【０２３９】
本発明のある化合物およびその塩は、２つ以上の結晶体として存在してもよく、本発明は各結晶体とその混合物を含む。
本発明のある化合物およびその塩は、例えば水和物などの溶媒和化合物の形態で存在してもよく、本発明は、各溶媒和化合物およびその混合物を含む。
【０２４０】
本発明のある化合物は、１つ以上のキラル中心を有し、異なる光学活性型で存在してもよい。本発明の化合物が１つのキラル中心を有する場合、前記化合物は２つの鏡像異性型で存在してもよく、本発明には両鏡像異性体、およびラセミ混合物などの鏡像異性体の混合物が含まれる。前記鏡像異性体は、当業者に公知の方法により分割可能であり、例えば結晶化により分離できるジアステレオ異性体塩の形成、例えば結晶化または気液もしくは液体クロマトグラフィにより分離できるジアステレオ異性体の誘導体や複合体の形成、例えば酵素エステル化反応などの、１つの鏡像異性体と鏡像異性体特異性試薬との選択的反応、例えばキラル配位子が結合したシリカなどの、例えばキラル担体やキラル溶媒の存在下などのキラル環境での気液または液体クロマトグラフィが挙げられる。目的の鏡像異性体が前記分離手順の１つにより他の化学物に変換される場合、目的の鏡像異性体を遊離するために更なる工程を使用できることを理解されたい。あるいは、特定の鏡像異性体は、光学活性試薬、基体、触媒もしくは溶媒を使用した不斉合成により、または不斉転換により１つの鏡像異性体を他に変換することにより合成可能である。
【０２４１】
本発明の化合物が２つ以上のキラル中心を有する場合、ジアステレオ異性型で存在するかもしれない。ジアステレオ異性体化合物は、例えばクロマトグラフィまたは結晶化などの当業者に公知の方法により分離可能であり、個々の鏡像異性体は前記のように分離できる。本発明は、本発明の化合物の各ジアステレオ異性体およびその混合物を含む。
本発明のある化合物は、異なる互変異性型や異なる幾何異性体として存在することができ、本発明は本発明の化合物の各互変異性体および／または幾何異性体およびその混合物を含む。
【０２４２】
本発明のある化合物は、分離可能であり得る異なる安定した立体配座型で存在することができる。例えば立体障害や環歪みなどにより、不斉単結合のまわりの回転が制約されていることによるねじれによる非対称は、異なる配座異性体を分離することを可能とする。本発明は、本発明の化合物の各立体配座異性体およびその混合物を含む。
本発明のある化合物は、双性イオン体で存在することができ、本発明は、本発明の化合物の各双性イオン体およびその混合物を含む。
【０２４３】
医薬組成物
本発明の１つまたは２つ以上の化合物は、単独または生物学的に適切な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物の形態で、ここに記載する疾病もしくは病状を処置または改善する用量で対象に投与可能である。これらの化合物の混合物も、単なる混合物としてまたは適切に処方された医薬組成物として対象に投与可能である。治療有効用量は、ここに記載する疾病もしくは病状の予防または減弱をもたらすに十分な化合物の量を意味する。本出願の化合物の製剤および投与の技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition などの当業者に公知である文献が参照できる。
【０２４４】
適切な投与経路としては、例えば、経口、点眼、経直腸、経粘膜、局所、経腸投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、髄内注射を含む非経口送達、さらに髄腔内、直接脳室内、鼻腔内、眼内注射が挙げられる。
【０２４５】
あるいは、例えば、しばしばデポーや持続放出製剤として、例えば腫瘍などの特定の部位へ前記化合物を直接注射することにより前記化合物を全身ではなくむしろ局所に投与することができる。
【０２４６】
更に、例えば、細胞特異性抗体で被覆したリポソーム中での標的薬剤送達システムで、前記薬剤を投与することができる。
【０２４７】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作成、粉末化、乳化、カプセル化、封入化、凍結乾燥法などの手段による公知の方法で製造することができる。
従って、本発明により使用する医薬組成物は、活性化合物を医薬品として使用可能な調製物へ加工することを促進する助剤や賦形剤を含む１つ以上の生理学的に許容された担体を使用して、従来の方法で処方可能である。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。
【０２４８】
注射に関しては、本発明の薬剤を、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、生理食塩水バッファーなどの生理学的に相溶するバッファーに処方可能である。経粘膜投与に関しては、透過すべき障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は当該分野で一般に知られている。
【０２４９】
経口投与に関しては、前記化合物は、前記活性化合物を当該分野公知の医薬上許容し得る担体と配合することにより容易に処方可能である。かかる担体は、本発明の前記化合物を、処置対象の患者により経口摂取される、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして処方することができる。経口使用の医薬調製物は、活性化合物を固形賦形剤と配合し、任意に得られた混合物を粉砕し、錠剤や糖衣錠コアを得るために所望なら適切な助剤を添加した後で顆粒混合物を加工して得ることが可能である。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトールなどの糖類；例えば、コーンスターチ、小麦澱粉、ライススターチ、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸やアルギン酸ナトリウムなどの塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０２５０】
糖衣錠コアは、適切なコーティングが施される。この目的のために、濃縮糖類溶液を使用することができ、それは任意にアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有しても良い。特定のため、あるいは活性化合物用量の異なる配合を特色付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料や顔料を添加することも可能である。
【０２５１】
経口で使用できる医薬調製物としては、ゼラチンから作成した押込嵌め（プッシュフィット）カプセル剤や、グリセロールやソルビトールなどの可塑剤とゼラチンから作成した密封軟カプセル剤などが挙げられる。押込嵌めカプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、澱粉などの結合剤および／またはタルクやステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、任意に安定剤との混和物中に活性成分を含むことが可能である。軟カプセル剤では、前記活性化合物を、脂肪油、流動パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁することができる。更に、安定剤を添加しても良い。経口投与用のすべての製剤は、かかる投与に適切な用量であるべきである。
【０２５２】
頬側投与に関しては、前記組成物は、従来の方法で処方された錠剤やトローチ剤の形態で摂取可能である。
【０２５３】
吸入投与に関しては、本発明による使用のための前記化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素や他の適切な気体などの適切な噴霧剤を使用して、与圧パックや噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達することが便利である。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量した量を送達する弁を提供することで決定できる。吸入器や吹き入れ器で使用するための例えばゼラチンのカプセル剤やカートリッジ剤は、前記化合物とラクトースや澱粉などの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むよう処方することができる。
【０２５４】
前記化合物は、例えば大量瞬時投与や持続点滴などの注射による非経口投与用に処方することが可能である。注射用製剤は、例えばアンプル中に単位用量形態で、または保存剤を添加して多用量容器中に入れて提供できる。前記組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、乳濁液などの形態でもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。
【０２５５】
非経口投与用医薬製剤は、水溶性形態の活性化合物の水性溶液を含む。更に、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射懸濁液として調製できる。好適な親油性溶媒や媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルやトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、リポソームが挙げられる。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる。任意に、前記懸濁液は、適切な安定剤や、化合物の溶解度を高めて高濃度の溶液の調製を可能とする剤を含むこともできる。
あるいは、前記活性成分は粉末形態でもよく、使用前に、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水などの適切な媒体と共に構成される。
【０２５６】
前記化合物は、例えばカカオバターや他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含有する座薬や停留浣腸などの直腸組成物として処方することも可能である。
【０２５７】
前記の製剤以外にも、前記化合物は、デポー製剤としても処方することが可能である。かかる持続型製剤は、移植（例えば皮下もしくは筋肉内にまたは筋肉内注射）により投与できる。このように、例えば、前記化合物は、例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に処方することができる。
【０２５８】
本発明の前記疎水性化合物用医薬担体の例は、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水相を含む共溶媒システムである。この共溶媒システムは、ＶＰＤ共溶媒システムであることができる。ＶＰＤは、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの無極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００を含み、無水エタノールで必要な容積とした溶液である。ＶＰＤ共溶媒システム（ＶＰＤ：５Ｗ）は、ＶＰＤを５％ブドウ糖水溶液で１：１に希薄してなる。この共溶媒システムは疎水性化合物をよく溶解し、それ自身の全身投与での毒性が低い。もちろん、共溶媒システムの比率は、溶解度や毒性特性を低下させることなく、大幅に変化させることができる。更に、共溶媒成分の内容は変更することが可能である。例えば、他の低毒性無極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに使用することができる。ポリエチレングリコールの画分サイズを変えることができる。他の生分解性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに使用できる。他の糖類や多糖類をブドウ糖の代わりに使用できる。
【０２５９】
あるいは、疎水性医薬化合物のための他の送達システムを用いてもよい。リポソームや乳濁液が、疎水性薬剤用の送達媒体や担体の例として公知である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を用いることもできるが、通常は毒性が高くなる可能性がある。更に、前記化合物は、治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放システムを使用して送達できる。様々な徐放材料が確立されており、当業者には公知である。徐放カプセル剤は、それらの化学的性質によるが、前記化合物を数週間から１００日以上までの時間をかけて放出する。治療薬の化学的性質や生物学的安定性によるが、タンパク質安定化のための更なる方策を用いることができる。
【０２６０】
前記医薬組成物は、適切な固体やゲル相の担体や賦形剤を含んでも良い。かかる担体や賦形剤の例としては、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる。
【０２６１】
本発明の化合物の多くは、医薬上適合可能な対イオンとの塩として提供可能である（すなわち、医薬上許容し得る塩）。「医薬上許容し得る塩」は、レシピエントに投与した際、本発明の化合物または化合物のプロドラッグを直接または間接的に提供できる任意の非毒性塩を意味する。「医薬上許容し得る対イオン」は、レシピエントに投与して塩から放出されたとき毒性のない塩のイオン性部分である。医薬上適合可能な塩は、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの多数の酸と形成することができる。塩は、対応する遊離塩基よりも、水性や他のプロトン性溶媒中で溶解性が高い傾向がある。
【０２６２】
医薬上許容し得る塩を形成するために一般に使用される酸としては、二硫化水素、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、パラトルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、ビ酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、蟻酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、パラブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸、関連する無機酸および有機酸が挙げられる。従って、かかる医薬上許容し得る塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノアート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、サクシネート、スベレート、セバケート、フマレート、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホナート、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、乳酸塩、β−ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩および同様の塩が挙げられる。好ましい医薬上許容し得る酸付加塩としては、塩酸や臭化水素酸などの無機酸と形成したものや特にマレイン酸などの有機酸と形成したものが挙げられる。
【０２６３】
酸性官能基と共に医薬上許容し得る塩を形成する好適な塩基としては、限定するものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムや亜鉛などの他の金属の水酸化物；アンモニアや無置換または水酸基置換モノ、ジ、トリアルキルアミンなどの有機アミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ、ビス、トリス（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ、ビス、トリス（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、トリ−（２−ヒドロキシエチル）アミンなどのＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；アルギニン、リジンなどのアミノ酸が挙げられる。
【０２６４】
本発明での使用に適切な医薬組成物としては、活性成分をその目的を達成する有効量で含有する組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量とは、処置対象の既存の症状の発達を予防したり軽減するのに有効な量を意味する。有効量は、当業者の能力で容易に決定される。
【０２６５】
投薬量
本発明の方法で使用される任意の化合物または組成物に関して、前記治療有効用量は最初に細胞試験により推定可能である。例えば、ある用量を、細胞モデルや動物モデルにおいて、細胞試験で決定されるＩＣ５０（すなわち、半数阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するように処方できる。いくつかのケースでは、３〜５％血清アルブミンの存在下でＩＣ５０を決定することが適切である。なぜならそのように決定することは血漿タンパク質の化合物上への結合効果を近似するからである。かかる情報は、ヒトで有用な用量をより正確に決定するために使用可能である。
【０２６６】
「治療有効用量」とは、対象における症状の改善をもたらす前記化合物の量を意味する。かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば最大耐量（ＭＴＤ）やＥＤ５０（最大反応の５０％の有効用量）を決定するための細胞培養物や実験動物での標準的な医薬手順により決定できる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、ＭＴＤとＥＤ５０の比として表される。これらの細胞培養試験や動物実験で得たデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方するのに使用可能である。かかる化合物の投薬量は、毒性が無いかあるいはとても低い、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。投薬量は、使用される投薬形態や投与経路によるが、この範囲内で変化できる。正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の病状を考慮して、個々の医師により選択可能である。（例えば、Fingl et al., 1975, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 p1参照）。急性発症の処置には、急速な反応を得るために、ＭＴＤに近い点滴や大量瞬時投与が必要とされるかもしれない。
【０２６７】
投薬量および投薬間隔は、キナーゼ調節効果、すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な活性成分の血漿中レベルを提供するために、個々のケースで調整可能である。ＭＥＣは各化合物により変化するが、in vitro データから推定することが可能である；例えば、ここに述べた分析法を使用してのプロテインキナーゼの５０〜９０％の抑制を達成するのに必要な濃度である。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬は、個々の特性や投与経路に依存するであろう。しかしながら、ＨＰＬＣ分析法やバイオアッセイの使用により血漿濃度を決定することが可能である。
【０２６８】
投薬間隔も、ＭＥＣ値を使用して決定することが可能である。化合物は、症状の所望の改善が得られるまで、ＭＥＣ以上の血漿レベルを１０〜９０％の時間、好ましくは３０〜９０％の間、より好ましくは５０〜９０％の間保持する投与計画を使用して投与すべきである。局所投与や選択的摂取の場合は、薬剤の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連していない可能性がある。
組成物の投与量は、もちろん、処置対象、対象の体重、病気の重症度、投与方法、処方する医師の判断に依存するであろう。
【０２６９】
前記組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含んでもよいパックかディスペンサー装置で提供できる。パックは、例えばブリスターパックなどの金属やプラスチックホイルを含み得る。パックやディスペンサー装置には、投与説明書を添付してもよい。適合可能な医薬担体に処方された本発明の化合物を含む組成物は、調製し、適切な容器に入れ、処置する病状を表示するためにラベルすることも可能である。
【０２７０】
典型的な製剤
いくつかの製剤では、本発明の化合物を、例えば流体エネルギーミルにより得るような極小サイズの粒子の形態で使用することが有利であろう。
医薬組成物の製造における本発明の化合物の使用を以下に例示する。この説明において、「活性化合物」という用語は、本発明の任意の化合物を意味する。
【０２７１】
活性化合物を含有するカプセル剤が調製可能である。カプセル剤の調製では、１０重量部の活性化合物と２４０重量部のラクトースを脱凝集・混合する。この混合物を硬ゼラチンカプセルに充填する。各カプセル剤は、活性化合物の単位用量または単位用量の一部分を含有する。
【０２７２】
錠剤は、例えば活性化合物（１０重量部）、ラクトース（１９０重量部）、コーンスターチ（２２重量部）、ポリビニルピロリドン（１０重量部）、ステアリン酸マグネシウム（３重量部）から調製される。活性化合物、ラクトース、スターチの一部を脱凝集・混合し、得られた混合物をポリビニルピロリドンのエタノール溶液と一緒に顆粒化する。乾燥した顆粒をステアリン酸マグネシウムおよびスターチの残量と混合する。その後、この混合物を打錠機で圧縮して、それぞれ活性化合物の単位用量または単位用量の一部分を含有する錠剤を得る。
【０２７３】
錠剤は、２０％酢酸フタル酸セルロースと３％フタル酸ジエチルのエタノール：ジクロロメタン（１：１）溶液を使用して従来の方法で腸溶コートしてもよい。
活性化合物を含有する座薬を調製できる。座薬の調製において、例えば、１００重量部の活性化合物を、１３００重量部のトリグリセリド座薬基剤と混合し、その混合物からそれぞれ活性成分の治療有効量を含有する座薬を作成できる。
【０２７４】
本明細書で使用する「アルケニル」という用語は、２つの水素を除去して生成した炭素炭素二重結合を少なくとも１つ含有する、２〜１０個の炭素を有する直鎖または分岐鎖炭化水素を意味する。アルケニルの代表的な例としては、限定するものではないが、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、３−デセニルが挙げられる。
【０２７５】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。アルコキシの代表的な例としては、限定するものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシが挙げられる。
【０２７６】
「アルコキシカルボニル」という用語は、本明細書で定義される-Ｃ（＝Ｏ）-で表されるカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルコキシ基を意味する。アルコキシカルボニルの代表的な例としては、限定するものではないが、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルが挙げられる。
【０２７７】
本明細書で使用する「アルコキシスルホニル」という用語は、本明細書で定義されるスルホニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルコキシ基を意味する。アルコキシスルホニルの代表的な例としては、限定するものではないが、メトキシスルホニル、エトキシスルホニル、プロポキシスルホニルが挙げられる。
【０２７８】
本明細書で使用する「アリールアルコキシ」および「ヘテロアルコキシ」という用語は、本明細書で定義されるアルコキシ基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアリール基またはヘテロアリール基を意味する。アリールアルコキシの代表的な例としては、限定するものではないが、２−クロロフェニルメトキシ、３−トリフルオロメチルエトキシ、２，３−メチルメトキシが挙げられる。
【０２７９】
本明細書で使用する「アリールアルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルコキシ基を意味する。アルコキシアルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、２−エトキシエチル、２−メトキシエチル、メトキシメチルが挙げられる。
【０２８０】
「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられる。
【０２８１】
「アルキレン」という用語は、当該分野で認識されており、本明細書で使用されるように、飽和、部分不飽和または完全不飽和である、脂肪族もしくは脂環式またはその組み合わせであり得る炭化水素化合物の同じ炭素原子２つの水素原子を、または異なる炭素原子の各々の１つずつを除去して得た二座の部分に関する。直鎖飽和Ｃ１−１０アルキレン基の例としては、限定するものではないが、ｎが１〜１０の整数である−（ＣＨ２）ｎ−、例えば、−ＣＨ２−（メチレン）、−ＣＨ２ＣＨ２−（エチレン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（プロピレン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ブチレン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ペンチレン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ヘキシレン）が挙げられる。分岐飽和Ｃ１-１０アルキレン基の例としては、限定するものではないが、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２−が挙げられる。直鎖部分不飽和Ｃ１−１０アルキレン基の例としては、限定するものではないが、−ＣＨ＝ＣＨ−（ビニレン）、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−が挙げられる。分岐部分不飽和Ｃ１−１０アルキレン基の例としては、限定するものではないが、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ-、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−が挙げられる。脂環式飽和Ｃ１-１０アルキレン基の例としては、限定するものではないが、シクロペンチレン（例えば、シクロペンテ−１，３−イレン）、シクロヘキシレン（例えば、シクロヘキシ−１，４−イレン）が挙げられる。脂環式部分不飽和Ｃ１-１０アルキレン基の例としては、限定するものではないが、シクロペンテニレン（例えば、４−シクロペンテン−１，３−イレン）、シクロヘキセニレン（例えば、２−シクロヘキセン−１，４−イレン、３−シクロヘキセン−１，２−イレン、２，５−シクロヘキサジエン−１，４−イレン）が挙げられる。
【０２８２】
本明細書で使用する「アルキルカルボニル」という用語は、本明細書で定義されるカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。アルキルカルボニルの代表的な例としては、限定するものではないが、アセチル、１−オキソプロピル、２，２−ジメチル−１−オキソプロピル、１−オキソブチル、１−オキソペンチルが挙げられる。
【０２８３】
本明細書で使用する「アルキルカルボニルオキシ」および「アリールカルボニルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルキルカルボニルまたはアリールカルボニル基を意味する。アルキルカルボニルオキシの代表的な例としては、限定するものではないが、アセチルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルオキシが挙げられる。アリールカルボニルオキシの代表的な例としては、限定するものではないがフェニルカルボニルオキシが挙げられる。
【０２８４】
本明細書で使用する「アルキルスルホニル」という用語は、本明細書で定義されるスルホニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。アルキルスルホニルの代表的な例としては、限定するものではないが、メチルスルホニル、エチルスルホニルが挙げられる。
【０２８５】
本明細書で使用する「アルキルチオ」という用語は、硫黄原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。アルキルチオの代表的な例としては、限定することなく、メチルチオ、エチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ヘキシルチオが挙げられる。例えば「アリールチオ」、「アルケニルチオ」、「アリールアルキルチオ」という用語は、同様に定義される。
【０２８６】
本明細書で使用する「アルキニル」という用語は、炭素炭素三重結合を少なくとも１つ含有する、２〜１０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味する。アルキニルの代表的な例としては、限定することなく、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニル、１−ブチニルが挙げられる。
【０２８７】
本明細書で使用する「アミド」という用語は、アミド基が窒素原子を介して親分子部分に結合した−ＮＨＣ（＝Ｏ）−を意味する。アミドの例としてはＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−やＣＨ３ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−などのアルキルアミドが挙げられる。
【０２８８】
本明細書で使用する「アミノ」という用語は、窒素原子介して親分子部分に付加した無置換および置換の両アミンのラジカルを意味する。これら２つの基はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルスルホニル、アリールカルボニルまたはホルミルである。代表的な例としては、限定するものではないが、メチルアミノ、アセチルアミノ、アセチルメチルアミノが挙げられる。
【０２８９】
「芳香族」という用語は、ｎを整数の絶対値として、４ｎ＋２個の電子を有する環状に共役した分子部分であること特徴とする平面状または多環の構造を意味する。また、縮合した、すなわち結合した環を有する芳香族分子は、二環式芳香環と呼ばれる。例えば、炭化水素環構造中にヘテロ原子を含有する二環式芳香環は、二環式ヘテロアリール環と呼ばれる。
【０２９０】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、フェニル基またはナフチル基を意味する。本発明のアリール基は、重水素、トリチウム、アルケニル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシスルホニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アミド、アミノ、カルボキシ、シアノ、ホルミル、ハロ、ハロアルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、メルカプト、ニトロ、シリル、シリルオキシからなる群から独立して選択される１、２、３、４、５つの置換基で置換されていてもよい。
【０２９１】
本明細書で使用する「アリールアルキル」または「アラルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアリール基を意味する。アリールアルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、２−ナフチ−２−イルエチルが挙げられる。
【０２９２】
本明細書で使用する「アリールアルコキシ」または「アリールアルキルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアリールアルキル基を意味する。本明細書で使用する「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるヘテロアリールアルキル基を意味する。
【０２９３】
本明細書で使用する「アリールカルボニル」という用語は、本明細書で定義されるカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアリール基を意味する。アリールカルボニルの代表的な例としては、限定するものではないが、ベンゾイル、ナフトイルが挙げられる。
【０２９４】
本明細書で使用する「アリールオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアリール基を意味する。本明細書で使用する「ヘテロアリールオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるヘテロアリール基を意味する。
【０２９５】
本明細書で使用する「カルボニル」という用語は、-Ｃ（＝Ｏ）-基を意味する。
本明細書で使用する「カルボキシ」という用語は、-ＣＯ２Ｈ基を意味する。
【０２９６】
本明細書で使用する「シクロアルキル」という用語は、完全飽和または１つ以上の不飽和結合を有するが芳香族基ではない、３〜１２個の炭素原子を含有する単環または複環（例えば、二環式、三環式など）炭化水素を意味する。シクロアルキル基の例としてはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニルが挙げられる。
【０２９７】
本明細書で使用する「シクロアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるシクロアルキル基を意味する。
本明細書で使用する「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を意味する。
本明細書で使用する「ホルミル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ基を意味する。
【０２９８】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−Ｆを意味する。
本明細書で使用する「ハロアルコキシ」という用語は、本明細書で定義されるアルコキシ基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるハロゲンの少なくとも１つを意味する。ハロアルコキシの代表的な例としては、限定するものではないが、クロロメトキシ、２−フルオロエトキシ、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシが挙げられる。
【０２９９】
「ハロアルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるハロゲンの少なくとも１つを意味する。ハロアルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、２−クロロ−３−フルオロペンチルが挙げられる。
【０３００】
本明細書で使用する「ヘテロシクリル」という用語は、完全に飽和であるか１つまたは２つ以上の不飽和単位を有することができる、誤解を避けるために、不飽和度は芳香環系をもたらさない）、窒素、酸素、硫黄などのヘテロ原子を少なくとも１つ含む３〜１２個の原子を有する、限定するものではないが単環、二環式環、三環式環などの非芳香環系を含むものである。例示の目的であり、本発明の範囲を限定するものではないが、ヘテロシクロ環の例を以下に示す：アゼピン類、アゼチジニル、モルホリニル、オキソピペリジニル、オキソピロリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、キヌクルジニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル。本発明のヘテロシクリル基は、重水素、トリチウム、アルケニル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシスルホニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アミド、アミノ、カルボキシ、シアノ、ホルミル、ハロ、ハロアルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、メルカプト、ニトロ、シリル、シリルオキシから独立して選ばれた０、１、２、３個の置換基で置換される。
【０３０１】
本明細書で使用する「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、硫黄などのヘテロ原子を少なくとも１つ含む３〜１２個の原子を含む、限定するものではないが単環、二環式、三環式環などの芳香環系を含むものである。例示の目的であり、本発明の範囲を限定するものではないが、ヘテロアリールの代表的な例としては：アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、トリアゾリル、トロパニルが挙げられる。本発明のヘテロアリール基は、重水素、トリチウム、アルケニル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルコキシスルホニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アミド、アミノ、カルボキシ、シアノ、ホルミル、ハロ、ハロアルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、メルカプト、ニトロ、シリル、シリルオキシから独立して選ばれた０、１、２、３個の置換基で置換されてもよい。
【０３０２】
本明細書で使用する「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロアラルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるヘテロアリールを意味する。ヘテロアリールアルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、ピリジン−３−イルチル、２−（チエン−２−イル）エチルが挙げられる。
【０３０３】
本明細書で使用する「ヒドロキシ」という用語は、-ＯＨ基を意味する。
本明細書で使用する「ヒドロキシアルキル」という用語は、本明細書で定義される少なくとも１つの水酸基が本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加していることを意味する。ヒドロキシアルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシペンチル、２−エチル−４−ヒドロキシヘプチルが挙げられる。
【０３０４】
本明細書で使用する「メルカプト」という用語は、-ＳＨ基を意味する。
本明細書で使用する「ニトロ」という用語は、-ＮＯ２基を意味する。
本明細書で使用する「プレニル」という用語は、ジメチルアリル、ゲラニル、ネリル、ファルネシル、ゲラニルファルネシル、ならびにその部分飽和均等物。
【０３０５】
「プレニルアリール」または「プレニルヘテロアリール」という用語は、本明細書で定義されるアリールまたはヘテロアリールを介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるプレニルを意味する。ハロアルコキシの代表的な例としては、ゲラニルフェニル、ゲラニルピリジニルが挙げられる。
【０３０６】
本明細書で使用する「シリル」という用語は、シリル（Ｈ３Ｓｉ-）基のヒドロカルビル誘導体（すなわち、（ヒドロカルビル）３Ｓｉ-）を含むものであり、ヒドロカルビル基とは、例えば、エチル、フェニルなど、炭化水素から水素原子を除去してなる一価の基である。ヒドロカルビル基は、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ／ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル（ＳＥＭ）などの、多数のシリル基を提供するために変更できる異なる基の組み合わせでもよい。
【０３０７】
本明細書で使用する「シリルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子に付加した、本明細書で定義されるシリル基を意味する。
【０３０８】
下記の例は、本発明の１つまたは２つ以上の好ましい実施態様を例示するためのものである。以下の例は、本発明の要旨を逸脱しない範囲で多数の変更が可能である。
【０３０９】
例
一般的方法
天然化合物。セファロスタチン１（１）（〜２ｍｇ）は、文献の方法 Fortner et al. (2009) J Am Chem Soc 132:275-80に従って全合成することにより供給した。ＯＳＷ−１（２）は、Ｙ．Ｍｉｍａｋｉ氏と共同研究者により天然物から単離すること、および全合成により得た。ＯＳＷ−１類似体６〜９（図１Ｂ）はＷＯ２０１０／０６８８７７の詳細に従って調製したが、その全体を参照により本明細書に組み込むものである。シュウェインフルチンＡ（４ａ）（約３ｍｇ）とリッテラジンＢ（３）（０．２ｍｇ）はＮＣＩから入手した。
【０３１０】
抗体。ウサギ抗ＯＳＢＰ（Ｎ末端）ポリクローナルは、Ｈ．アライ氏から寄贈された；ウサギ抗ＯＳＢＰ（Ｃ末端）（１１０９６−１−ＡＰ）ポリクローナルは、プロテインテック社から入手した；ウサギ抗アクチンポリクローナルは、シグマ社から入手した；マウス抗チューブリンモノクローナル（ＤＳＨＢＥ７）は、ディベロップメンタル・スタディズ・ハイブリドーマ・バンクから入手した；ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｎ−２６２）ポリクローナルは、サンタクルズ・バイオテクノロジー社から入手した；マウス抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）モノクローナルは、サンタクルズ・バイオテクノロジー社から入手した；ウサギ抗ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ／ＣＥＲＴ（ａｂ７２５３６）ポリクローナルは、アブカム社から入手した；マウス抗Ｐ２３０モノクローナルは、ＢＤバイオサイエンス社から入手した。
【０３１１】
株化細胞。ＨＣＴ−１１６野生型およびＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−株化細胞は、バート・フォルゲルシュタイン研究室（ジョンズ・ホプキンス）により提供された。ＣＨＯ−７細胞は、マイケル・ブラウン氏ジョセフ・ゴールドシュタイン氏（ＵＴ−サウスウェスタン）から寄贈された。Ｍ１２細胞は、ダニエル・オリィ氏（ワシントン大学、セントルイス）から寄贈された。他のすべての株化細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から購入した。
【０３１２】
プラスミド、ベクター、ＯＳＢＰ１ｓｈＲＮＡ。ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓベクターおよびｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓｌａｃＺコントロールベクターは、インビトロジェン社から購入した。ＯＳＢＰ１ｃＤＮＡは、オープン・バイオシステムズ社から購入した。ＯＲＰ４ＬｃＤＮＡは、通常の分子生物学技法を用いてＨｅＬａ全ＲＮＡ抽出物からクローニングした。ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４ＬｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社）へクローン化した。ＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）、ＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）、ＯＲＰ４Ｌ（Ｍ５５０Ｗ）、ＯＲＰ４Ｌ（Ｖ６８６Ｍ）変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩＸＬ部位特異的変異キット（ストラタジーン社）により製品説明書に従って調製した。ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱベクター（ＢＤバイオサイエンス社）中のＯＳＢＰ１ｓｈＲＮＡは、ジュリオ・ロメオ氏（ジョスリン糖尿病センター）から好意により提供された。
【０３１３】
アフィニティクロマトグラフ実験‐ｉＴＲＡＱ。２５ｍｇＨｅＬａ−Ｓ３Ｓ１００溶解液をＤＭＳＯまたは１０μＭＯＳＷ−１と共にプレインキュベートし、その後プルダウン１回につき３０μＬの充填したＯＳＷ−１アフィニティマトリックス６ｂと共に４℃で一晩インキュベートした。樹脂を、Ｍｏｂｉｃｏｌの１ｍＬカラム（Ｂｏｃａサイエンティフィック社）に移した。樹脂はバッファーで十分に洗浄し、結合したタンパク質を、還元条件下でＮｕＰａｇｅ（登録商標）ＬＤＳサンプルローディングバッファー中の変性により溶出し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、ＮｕＰａｇｅ（登録商標）４〜１２％ビストリス濃度勾配ゲル（インビトロジェン社）により分離した。ゲルレーンは、ＬＥＡＰ２ＤｉＤロボットを使用して切断し、トリプシンでゲル内消化し（テカン社ＦｒｅｅｄｏｍＥＶＯ２００）、１レーンに付き８個得られたサンプルをｉＴＲＡＱ（商標）試薬（エービー・サイエックス社）で標識した。サンプルは、Ｐｕｌｓｅｄ−Ｑ解離（ＰＱＤ）モードのサーモＬＴＱ−オービトラップＸＬ質量分析計に連結したエキシジェント・ナノＬＣ１Ｄ＋ＨＰＬＣを使用して混合・分析した。ペプチド／タンパク質の特定・確認、定量データ分析は、ＩＰＩｖ３．５５の前後方向版、マスコットｖ２．２（マトリックスサイエンス社）、トランスプロテオーム・パイプラインｖ３．３スコール（インスティテュート・オブ・システムズ・バイオロジー）ＳｐｏｔｆｉｒｅＤＸＰを組み込んだ自動化ワークフローにより行った。タンパク質倍率変化は、ペプチド倍率変化の中央値として得、ｐ値は、一方向Ｔ検定を使用して計算し、データは今後の分析のためにＳｐｏｔｆｉｒｅＤＸＰを使用して可視化した。
【０３１４】
細胞生存率試験。細胞は、９６ウェルプレートの７５μＬの培地中に播種した。２４時間後、２５μＬの培地と２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）（プロメガ社）をウェルへ添加し、その後３７℃で９０分間インキュベートして、ゼロ時間プレート作成した。投与時の細胞生存率を確立するために、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＧｅｍｉｎｉＸＳを使用して蛍光（５４４ｎｍ励起；５９０ｎｍ発光）を検出した。化合物は培地で連続希釈し、２５μＬの培地中の４倍液として細胞に添加した。４８時間または７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）を添加、前記のようにして蛍光を記録した。未処理細胞に対する増殖を計算し、このデータを、グラフパッドプリズム５を使用して４パラメーター用量反応曲線にフィットさせた。
【０３１５】
野生型および変異型ＯＳＢＰ／ＯＲＰ４Ｌ構築物での過剰発現−生存率試験は、説明書に従ってＰＬＵＳ（商標）試薬入りＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ（インビトロジェン社）を使用して適切なプラスミドをＨｅＬａ細胞に形質移入することで行い、形質移入の８時間後、細胞生存率試験のために前記のようにして細胞を再播種した。発現レベルは、投与時に免疫ブロット法により評価した。
【０３１６】
免疫蛍光顕微法。ＨＣＴ−１１６細胞またはＡ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌）細胞を、６ウェルプレートのカバーガラス上に播種した。７２時間後、培養培地を除去し、化合物または媒体コントロールを含有する培地と交換した。表示した時点で、細胞を３．７％ホルムアルデヒド添加ＰＢＳを使用して１０分間固定した。カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００添加ＰＢＳで５分間透過処理した。ＰＢＳ洗浄後、カバーガラスをＩｍａｇｅ−ｉＴ（商標）ＦＸ（インビトロジェン社）を使用して３０分間ブロックし、ＰＢＳで洗浄し、その後１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）で室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。カバーガラスをその後ＢＳＡ／ＰＢＳ中で一次抗体溶液と共に４℃で一晩インキュベートした。カバーガラスをＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、ＢＳＡ／ＰＢＳ中でＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）を抱合した二次抗体（インビトロジェン社）と共に室温で６０分間インキュベートし、最後の３０分間はヘキスト３３２５８と共にインキュベートした。その後、カバーガラスをＢＳＡ／ＰＢＳ、ＰＢＳ、水で順次洗浄し、最後にＡｑｕａＰｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（ポリサイエンシス社）を使用して顕微鏡用スライドに載置した。画像データは、ツァイス社のＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して得た。
【０３１７】
一般的な合成化学手順。すべての反応は、他に特定しない限り、アルゴン加圧下オーブン乾燥または火炎乾燥したガラス器具中で行った。フラッシュカラムクロマトグラフィは、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社シリカゲル６０（２３０−４００メッシュＡＳＴＭ）を用いて Still et al. (1978) J Org Chem 43:2923-5 に記載されているように行った。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、トルエン、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）は、アルゴンで脱気し、アルミニウムカラムを利用した溶媒精製システム（J.C. Meyer of Glass Contour により設計）を通過させた。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）分析と分取ＴＬＣ（ｐＴＬＣ）精製を、ＥＭサイエンス社（ギブスタウン、ＮＪ）から購入した２５０μｍのシリカゲル６０Ｆ２５４プレートで行った。
【０３１８】
測定機器。赤外線スペクトルは、パーキンエルマー社ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｎｅＦＴ−ＩＲ分光器で記録した。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、バリアン社ＩＮＯＶＡ６００、ＩＮＯＶＡ５００またはＭｅｒｃｕｒｙ４００分光器で記録した。プロトンと炭素の共鳴の化学シフトは、クロロホルム（δ７．２７、プロトン；７７．２３、炭素）、ＣＤ３ＣＮ（δ１．９４、プロトン；１１８．２６、ニトリル炭素）、ピリジン−ｄ５（δ８．７１、Ｃ２−Ｈ、プロトン；１４９．９、Ｃ２、炭素）の残存プロトンまたは特定炭素に対してｐｐｍ（δ）で表した。質量スペクトルは、アジレント社６２１０ＴＯＦＬＣ／ＭＳ機器を使用してハーバード大学のマス・スペクトロメトリー・ラボラトリーから得た。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による精製は、アジレント社１１００で行った。生物学実験法で使用した化合物はすべてＨＰＬＣで精製した。記載した収率は、シリカゲル精製の後、ＨＰＬＣ精製前のものである。セミ分取ＨＰＬＣは、表示したカラムと溶媒条件でダイオードアレイ検出器を使用して行った。
【０３１９】
［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロールのチャコールデキストラン結合試験。ＯＳＢＰ１、ＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）、ＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）、ＯＲＰ４Ｌ、ＯＲＰ４Ｌ（Ｍ５５０Ｗ）、ＯＲＰ４Ｌ（Ｖ６８６Ｍ）、ｌａｃＺを、Ｃ−末端のｍｙｃ−ｈｉｓタグをコードするｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社）にクローン化した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（インビトロジェン社）を使用して、これらのベクターをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質移入し、形質移入の４８時間後に、Ｍ−Ｐｅｒ（登録商標）／ＥＤＴＡ添加ＨＡＬＴ（商標）試薬（サーモサイエンティフィック社）で前記形質移入細胞のプレート上溶解を行い、その後、１００，０００ｇで超遠心分離法を行った。Ｓ１００溶解液を０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、等分し、使用まで−８０℃で保存した。ＨＥＫ−２９３ＴのＯＳＢＰ１溶解液、ＯＲＰ４Ｌ溶解液、ｌａｃＺ−ｍｙｃ−ｈｉｓ溶解液は、９６ウェルプレート中で、［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロールと共に４℃で１６時間インキュベートした。インキュベートの後、チャコール／デキストラン（Ｃ／Ｄ）をウェル添加し、室温で３０分間振盪し、その後１９００ｇで１５分間遠心分離して、Ｃ／Ｄをペレット化した。Ｃ／Ｄを除いた溶解液をＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）２０（パーキンエルマー社）シンチレーション用液体に添加し、残存したタンパク質結合放射標識をＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して定量した。［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロール結合曲線および競合曲線は、少なくとも３回繰り返した。化合物１、２、３、４ａ、６、７、８、９のＫｉ値を得るための競合結合試験は、２０ｎＭの［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロールで行った。
【０３２０】
高処理３Ｈ−２５−ヒドロキシコレステロール（３Ｈ−２５−ＯＨＣ）のチャコールデキストラン結合試験：
試薬：
ＮｏｒｉｔＡ（登録商標）チャコール（ＭＰバイオケミカルズ社、カタログ番号１０２４８９）。デキストラン分子量５００，０００粉末（スペクトラムケミカルズ社、カタログ番号Ｄ１００４）。ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、８０％加水分解（シグマアルドリッチ社、カタログ番号３６０６２７）。１３．２μＭ９７％３Ｈ−２５−ヒドロキシコレステロール（１μＣｉ／μＬ、７７〜８０ｍｍｏｌ／Ｃｉ）エタノール溶液（パーキンエルマー社、カタログ番号ＮＥＴ６７４２５０ＵＣ）。Ｏｐｔｉプレート（商標）９６ウェルプレート（パーキンエルマー社、カタログ番号６００５２９０）。Ｖ型９６ウェルプレート（コスタール社、カタログ番号３８９７）。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）−２０シンチレーション液体（パーキンエルマー社、カタログ番号６０１３６２１）。ＴｏｐＳｅａｌＡフィルム（パーキンエルマー社、カタログ番号６００５１８５）。ＰｌａｔｅＭａｘ、アルミニウムホイルシーリングフィルム（アキシジェン社、カタログ番号ＰＣＲ−ＡＳ−２８）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社、カタログ番号１１６６８）。Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ（登録商標）還元血清培地（インビトロジェン社、カタログ番号１１０５８）。
【０３２１】
結合バッファー：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｘＥＤＴＡ添加ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤（サーモサイエンティフィック社）。
ＯＳＢＰ１、ＯＲＰ４Ｌ、ＬａｃＺｃＤＮＡは、通常の分子生物学方法によりｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社）へクローン化し、配列決定法により確認した。ＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）およびＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）変異体は、製造者の指示通りにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ ＸＬ 部位特異的変異導入キット（ストラタジーン社）で調製し、配列決定法により確認した。
【０３２２】
チャコール／デキストラン（Ｃ／Ｄ）：Ｃ／Ｄは、 Taylorand Kandutsch (1985) Methods Enzymol 110:9-19 に記載に従って調製した。
２０％ＰＶＡ溶液は、５０ｍＬ遠心管で固体ＰＶＡへ水を添加して調製した。ＰＶＡ溶液を、均一になるまで（約１時間）超音波処理やボルテックスを頻繁に行いながら、８０℃の水浴で加熱した。その後、２０％ＰＶＡ溶液は室温（ｒｔ）で保持した。
【０３２３】
手順：
Ａ．結合試験のためのＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓ細胞溶解液またはＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓ細胞溶解液の調製：
この手順は、 http://www.lipidomicnet.org/index.php/Oxysterol_binding_assay に載せられたオンラインプロトコールに基づいている。小ゲージ針を多数回通過させるという細胞溶解条件の使用により、相当量のＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌがタンパク質分解したことが重要である。過剰発現し分解したＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌの存在は、２５−ＯＨＣ結合に重要な影響を及ぼさないが、異なるＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌタンパク質フラグメントは、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓへの結合親和性が大変異なっていた。このため、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌが分解しない細胞溶解条件の開発が求められていた。更に、結合試験は、９６ウェルへの高処理フォーマットに適合させた。
【０３２４】
４ｘ１０６ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍ２ディシュに播種した。２４時間後、細胞は約９０％コンフルエントであり、形質移入の準備ができていた。２４μｇのｐｃＤＮＡ３．１ベクター中ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＯＳＢＰ１−Ｍ４４６Ｗ−ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＯＳＢＰ１−Ｖ５８２Ｍ−ｍｙｃ−ｈｉｓまたはＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓを、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（１０ｃｍ２ディシュにつき６０μＬ）を使用して前記１０ｃｍ２ディシュへ形質移入した。Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ（登録商標）を使用して、プラスミドと形質移入試薬を混合した（各１０ｃｍ２プレートで合計３ｍＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（登録商標））。その後、抗生物質なしのＨＥＫ−２９３Ｔ培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）１２ｍＬを各ディシュに添加した。
【０３２５】
４８時間のインキュベーション後、細胞は室温のＰＢＳで一度洗浄し、その後プレート毎に２ｍＬのＭ−Ｐｅｒ（登録商標）／ＥＤＴＡ添加ＨＡＬＴ（商標）（サーモサイエンティフィック社）細胞溶解試薬を添加した。プレートを室温、２５０ｒｐｍで５分間揺動した。以下のすべての工程は、４℃または氷上の試験管で行った。溶解液を超遠心管に移し、ベックマン・コールター超遠心分離機で７０Ｔｉロータまたは７０．１Ｔｉロータ（ベックマン・コールター社）のどちらかを使用して１００，０００ｇ、４℃で１時間遠心分離した。上澄みのＢＣＡタンパク質決定を行い、溶解液を結合バッファーで０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＨＥＫ−２９３Ｔ中のＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓおよびその変異体の高レベル発現のため、０．２ｍｇ／ｍＬのＳ１００タンパク質溶解液を、非形質移入ＨＥＫ−２９３Ｔの０．２ｍｇ／ｍＬのＳ１００溶解液で１：１に希釈した。０．２ｍｇ／ｍＬのＳ１００のＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓ溶解液は、非形質移入溶解液で希釈しなかった。ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓを形質移入した各１０ｃｍ２ディシュは、結合のための溶解液を約４０ｍＬ生成した。ＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓを形質移入した各１０ｃｍ２ディシュは、結合のための溶解液を約２０ｍＬ生成した。溶解液は等分し、液体Ｎ２中で急冷凍し、使用まで−８０℃で保存した。
【０３２６】
Ｂ．ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓまたはＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓの３Ｈ−２５−ＯＨＣ結合試験
溶解液を、短時間手で温めてから、氷上で解凍した。３Ｈ−２５−ＯＨＣ直接結合試験と３Ｈ−２５−ＯＨＣ競合結合試験の両方において、大量の結合試験用溶解液の原液を用意し、その後７３．５μＬの結合試験用混合物をＶ型９６ウェルプレートへ多チャンネルピペットで分注することで同様に準備した。３Ｈ−２５−ＯＨＣ直接結合試験のためには、１．５μＬの３Ｈ−２５−ＯＨＣおよび３Ｈ−２５−ＯＨＣ／４０ｘ２５−ＯＨＣを、１００％エタノールで希釈してウェルへ添加した。３Ｈ−２５−ＯＨＣ競合結合試験のためには、３Ｈ−２５−ＯＨＣを最終濃度が２０ｎＭとなるように結合試験用溶解液の大量原液へ添加した。その後、この３Ｈ−２５−ＯＨＣ−を含有する結合溶解液を、９６ウェルプレートへ多チャンネルピペットで分注した。その後、１００％エタノール（２５−ＯＨＣ）かＤＭＳＯ（ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓ）のどちらかでの阻害剤の段階希釈液１．５μＬを各ウェルに添加した。
【０３２７】
９６ウェルプレートの各ウェルで使用した結合溶解液は、６０μＬの０．２ｍｇ／ｍＬのＳ１００溶解液、７．５μＬの２０％ＰＶＡ、５．６μＬの２ＭＫＣｌからなるものであった。３Ｈ−２５−ＯＨＣ結合曲線実験のためには、その後０．４μＬのバッファーを添加した（ウェル毎の全容積：７３．５μＬ）。３Ｈ−２５−ＯＨＣ競合阻害試験のためには、０．１１μＬの１３．２μＭ３Ｈ−２５−ＯＨＣと０．２９μＬの結合バッファーを各ウェルに添加した（ウェル毎の全容積：７３．５μＬ）。
【０３２８】
新たな段階希釈液を各実験のために用意した。化合物の希釈は、０．２ｍＬのポリプロピレン９６ウェルプレート（ＶＷＲカタログ番号８２００６−６３６）で行った。すべての２５−ＯＨＣの希釈は、冷エタノールで低温室で行った。ＯＲＰｐｈｉｌｉｎのＤＭＳＯ中の希釈は室温で行った。２５−ＯＨＣに関しては、化合物を低温室で３つのウェルに添加した。ＤＭＳＯ化合物を添加するためには、溶解液を含有するプレートを低温室から短時間取り出した。
【０３２９】
結合試験では、４℃で１６時間放置してインキュベートした。その後、３０μＬの室温Ｃ／Ｄ溶液を、新しいＶ型９６ウェルプレートへ多チャンネルピペットで分注し、その後６０μＬの結合溶解混合物を添加した。プレートを短時間軽くボルテックスし（約１０秒）、その後２５０ｒｐｍ、室温で３０分間揺動した。そして、プレートをソルバル・レジェンドＲＴ遠心分離器でマイクロプレートキャリア（ソルバル社カタログ番号７５００６４４９Ｓ）に設置し、１９００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。Ｃ／Ｄペレットを乱さないように注意深く、３０μＬの上澄みをＯｐｔｉＰｌａｔｅ中の１７０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０に移した。プレートは、トップシールＡフィルムで密封し、激しくボルテックスを行った（最高速度、＞１分）。その後、ウェル中の３Ｈ−２５−ＯＨＣの検出を、トップカウントシンチレーション検出器を使用して各ウェルを２分間測定することで行った。データは、グラフパッドプリズム５を使用してグラフ化・分析し、非線形回帰を使用してＫＤ値とＫＩ値を求めた。
【０３３０】
例１
ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４ＬはＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの受容体である
ＮＣＩ６０の細胞障害性プロフィールが類似していることは、化合物が共通の作用機序を有する可能性を示すだけなので、化合物１〜５が機構的に関連する抗増殖性剤の新たなクラスを形成することを支持する追加の実験を行った。ステレッチンＥ（５）は、ＨＣＴ−１１６野生型（ｗｔ）細胞に比べてＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−細胞に対する増殖抑制が１１７倍高いことが報告されている。 Tasdemir et al. (2002) J Nat Prod 65:210-4。細胞生存率を測定するためにレサズリン酸化還元色素を使用して、４８時間後のＨＣＴ−１１６ｐ２１＋／＋（ｗｔ）細胞およびｐ２１−／−細胞中で化合物のＧＩ５０値を決定した。化合物１〜４ａの増殖抑制活性も、ＨＣＴ−１１６ｗｔ細胞に比べてＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−細胞で著しく増加した（図２Ａ）。化合物１〜５の高いｐ２１−／−選択性は、試験した他の多くの抗増殖性小分子はこの選択性を示さなかったことを考えると、これらの化合物に独特な特徴であった（図２Ａ）。化合物１〜５のｐ２１−／−選択性は、ＮＣＩ６０ＣＯＭＰＡＲＥ分析結果以上に、これらの化合物が機構的に関連していることの証拠を提供した。更に、このｐ２１−／−選択性を、このクラスの化合物を定義する特徴として使用することができ、同様の特徴的な作用機序を共有する１〜５の類似体の特定を可能とするであろう。
【０３３１】
アフィニティ精製を使用して、化合物１〜４ａの推定標的を特定した。ＯＳＷ−１（２）は十分な量が入手可能であるので、ＯＳＷ−１（２）類似体を、２の効力とｐ２１−／−選択性を保持する目的で調製した；これらの同様の類似体は、ＯＳＷ-１アフィニティマトリックスを作成するためにも使用した（図１Ｂ）。キシロシル糖のＣ３−ヒドロキシルとのカルバメートを生成することにより調製されたＡｌｌｏｃ保護アミン６ａが２の抗増殖性効力を保持し、重要なことであるが２に匹敵するｐ２１−／−選択性を示すことがわかった（図２Ａ）。
【０３３２】
その後、類似体６ａを樹脂に充填し、セファロースに結合した試薬６ｂを調製した（図１Ｂ）。アフィニティマトリックスを、ＨｅＬａＳ１００溶解液と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質を変性により溶出した。サンプルをタンパク質ゲル上で分離し、クマシーで染色した。６ｂによるＨｅＬａ−Ｓ３細胞溶解液のアフィニティクロマトグラフィ、その後のタンパク質ゲル電気泳動により、約９０ｋＤに著しく濃縮されたバンドが観察された（図２Ｂの矢印）。矢印で示したバンドをゲルから切断し、その後のトリプシン消化およびマススペクトル分析によりＯＳＢＰ１と特定した。ＨｅＬａ−Ｓ３溶解液を１０μＭのＯＳＷ−１（２）で前処理をすると、このバンドが除外され、このタンパク質がＯＳＷ−１に特異的に結合することを示していることが重要である。ｉＴＲＡＱに基づく定量マススペクトルによるゲルレーン全体の分析で、このバンドがオキシステロール結合タンパク質１に対応することが明らかとなった（ＯＳＢＰ１）。
【０３３３】
１２１個の特定されたタンパク質の中で、ＯＳＢＰ１およびＯＳＢＰ−パラログのＯＲＰ４Ｌが可溶な２による最も顕著な競合を示した（図２Ｃ）。更に、ＶＡＰ−Ａ（小胞結合膜タンパク質結合タンパク質Ａ）は、５０％を超える２による競合を示した。ＶＡＰ−Ａは、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌの両方と相互作用することが知られている。更に、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌは物理的に相互作用すると信じられている。 Wyles et al. (2007) Exp Cell Res 313:1426-37 。従って、これら３つのタンパク質のいずれかが、親和性試薬６ｂの直接結合パートナーとなって、他の２つのタンパク質を同時に精製することができるかもしれない。しかしながら、ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌはオキシステロールの高親和性受容体であり、２はオキシステロール部分を有するので、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌを化合物１〜４の推定上の標的として選択した。
【０３３４】
１〜４がＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌに結合するかどうかを決めるために、両タンパク質の高親和性配位子（ＯＳＢＰ１のＫｄ＝３２±１４ｎＭ；ＯＲＰ４ＬのＫｄ＝５４±２３ｎＭ）である［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨＣ、１１）を使用して、ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓやＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓとの競合結合試験を行った。結合試験は、４℃で１６時間行った。未結合ステロールをデキストラン被覆チャコールで除去し、上澄みに残存したタンパク質結合ステロールをシンチレーションカウンターで定量した。Ｋｉ値は、少なくとも３つの独立した実験からの平均値±標準偏差として求めた。図２Ｄと図２Ｅに示すように、１、２、３、４ａはそれぞれＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓに結合し（それぞれ、Ｋｉ＝３９±１０ｎＭ、２６±９ｎＭ、２８±４ｎＭ、６８±２３ｎＭ）、かつ１、２、３、４ａはＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓにも結合する（それぞれ、Ｋｉ＝７８±１５ｎＭ、５４±１１ｎＭ、＞３６０ｎＭ、２６００±５７０ｎＭ）ことがわかった。化合物４ａは、ＯＲＰ４Ｌへの親和性がＯＳＢＰ１に比べて著しく低く（〜４０倍）、他のＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓと比べると外れた値を示している。
【０３３５】
例２
ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌの細胞レベルがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性に影響を与える
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性が細胞中のＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌレベルに依存するかどうかを確かめるために、ＯＳＢＰ１発現の低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ノックダウンを行い、その後１、２、４ａの増殖抑制活性への効果を測定した。細胞を化合物で７２時間処理し、図２と関連して述べたようにしてＧＩ５０を求めた。ＯＳＢＰ１レベルが８５％減少したことは（図３Ｂ）、ＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−細胞増殖には影響を与えなかったが、細胞を１、２、４ａに対してそれぞれ４倍、６倍、９倍で感作した（図３Ａ）。しかしながら、ＯＳＢＰ１のｓｈＲＮＡノックダウンは、細胞をタキソールに対して感作しなかったので、ＯＳＢＰ１ノックダウンは細胞を細胞障害性の小分子に対して非特異的に感作するのではないことが明らかとなった。同様の結果がＨｅＬａ細胞でも得られた。ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉやＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓを４８時間過剰発現（図３Ｃ）すると、ＨｅＬａ細胞を１、２または４ａの抗増殖活性に対して約２〜５倍脱感作した（図３Ｄ）。しかしながら、タキソール誘発の増殖抑制は、ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓやＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓの過剰発現により影響されなかった（図３Ｄ）。
【０３３６】
例３
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性とＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌへの結合の相関
ＯＳＢＰ１および／またはＯＲＰ４ＬがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性を仲介する場合、それらのＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌへの親和性と抗増殖活性との間に正の相関が存在するはずである。実際、１〜４ａおよび４つのＯＳＷ−１類似体（６ａ、６ｃ、７、８）のＯＳＢＰ１とのＫｉ値をＨＣＴ−１１６でのＧＩ５０値に対してプロットすると、強い正の相関が示された（ｒ＝０．９６４４）（図３Ｅ）。ＯＲＰ４ＬのＫｉ値に関する同様の分析でも、シュウェインフルチンＡ（４ａ）を除外した場合には、強い正の相関（ｒ＝０．９０６９）が示された（図３Ｆ）。同様のＳＡＲ相関の結果が、Ａ５４９およびＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−株化細胞中のＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌの両方に対して得られた。
【０３３７】
ＯＳＢＰ１および／またはＯＲＰ４Ｌへの結合がＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性に必要とされるという関係は、Ｃ３カルビノール上にｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を有するＯＳＷ−１類似体９の活性によりさらに支持される（図１Ｂ）。化合物９は、ＨＣＴ−１１６細胞中の活性がＯＳＷ−１（２）より約１，４００倍少ない（ＧＩ５０＝２３００ｎＭ）。同様に、９は、Ａ５４９細胞中での細胞障害性が２より７００倍少なく、ＨＣＴ−１１６ｐ２１−／−細胞中での細胞障害性が２より２１００倍少ない。特に、化合物９は、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌへの結合では［３Ｈ］−２５−ＯＨＣと競合しなかった。
【０３３８】
例４
２５−ヒドロキシコレステロールはＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性を抑制する
２５−ＯＨＣ（１１）は、ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４Ｌの高親和性配位子であり、１０μＭまでの濃度では細胞障害性がない。例１で、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌとの結合で２５−ＯＨＣと競合することが確立された（図２Ｄ、Ｅ）。従って、ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌがこれらの化合物の生物活性を仲介する場合、２５−ＯＨＣの致死量以下をＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓと同時投与することで、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌへ結合することを抑制して、細胞をＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの細胞障害性の効果に対して脱感作するであろう。
【０３３９】
２５−ＯＨＣの添加は、ＨＣＴ−１１６（図４Ａ）およびＨｅＬａ株化細胞中での１、２、４ａの抗増殖活性の顕著な用量依存的抑制をもたらすことがわかった。１０μＭの２５−ＯＨＣの同時投与は、２５０ｎＭのセファロスタチン１（１）または１０ｎＭのＯＳＷ−１（２）で処理したＨＣＴ−１１６細胞をほぼ完全に脱感作した。これらの１と２の用量は、それだけで７５％を超える増殖抑制を示すものである。２５−ＯＨＣは、１や２に比べて程度が小さいが、シュウェインフルチンＡ（４ａ）に対しても細胞を脱感作する。ここで重要なことは、２５−ＯＨＣがブレフェルジンＡやタキソールの抗増殖活性には影響を与えず、これは２５−ＯＨＣが細胞障害性小分子に対して細胞を非特異的に脱感作するものではないことを示している。
【０３４０】
ＯＳＢＰ１やＯＲＰ４Ｌだけでなく、ＮＰＣ１やＩｎｓｉｇも２５−ＯＨＣの細胞受容体である。ＮＰＣ１は、リソソームからのリポタンパク質由来コレステロールの放出に関与する。ＩｎｓｉｇはＳＲＥＢＰ依存性コレステロールの恒常性の主要な制御因子であり、２５−ＯＨＣは、コレステロール生合成を抑制する能力のほとんどをＩｎｓｉｇに結合することで発揮する。２５−ＯＨＣによるＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの抗増殖活性の抑制が、ＮＰＣ１やＩｎｓｉｇからこれらの化合物を置換することによる可能性を検討した。しかしながら、ｗｔＣＨＯ細胞と比較して、ＮＰＣ１−／−（Ｍ１２）ＣＨＯ細胞中の１、２、４ａの抗増殖活性に変化はみられず、このことは、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの活性がＮＰＣ１に依存しないことを示している。更に、１〜４ａの抗増殖活性を、リポタンパク質欠損培地で増殖するように適応した株化細胞であるＣＨＯ−７株化細胞中で評価した。リポタンパク質欠損培地中では、ＣＨＯ−７細胞は生存するためにＩｎｓｉｇが仲介するコレステロール生合成に依存しており、従って２５−ＯＨＣのＩｎｓｉｇへの結合に感受性がある。２５−ＯＨＣと異なり、ＣＨＯ−７細胞における１、２、４ａの抗増殖活性は、リポタンパク質欠損培地においては増加しなかった。このことは、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがコレステロール生合成に影響を与えず、従ってＩｎｓｉｇの配位子ではないことを示している（図４Ｂ）。
【０３４１】
例５
細胞をＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓに対して脱感作するＯＳＢＰ１の変異対立遺伝子の特定
ＯＳＢＰ１およびＯＲＰ４ＬがＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの標的であることをさらに支持するために、これらのタンパク質の優勢薬剤耐性対立遺伝子を探した。ステロール結合を仲介すると以前に報告されているタンパク質の領域の内側および外側の１５個のＯＳＢＰ１残基を変異した（図４Ｃ）。ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓにより誘発される増殖抑制を、野生型または変異型ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓタンパク質のどちらかを過剰発現するＨｅＬａ細胞中で決定した。ｗｔＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓや変異型ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓの発現は、ウェスタンブロット法で測定するとほぼ同じであった。
【０３４２】
ＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓの２つの変異が、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎ耐性を与えることがわかった。ＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）−ｍｙｃ−ｈｉｓの発現は、ｗｔＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓの発現に比べて、ＧＩ５０レベルでセファロスタチン１（１）の抗増殖活性を１８倍低減させた（図４Ｅ１）。同変異体は、ＯＳＷ−１（２）の抗増殖活性を３．９倍低減し（図４Ｅ２）、シュウェインフルチンＡ（４ａ）の活性を２．７倍低減した（図４Ｅ３）。２つめのＯＳＢＰ１変異体であるＶ５８２Ｍは、ｗｔＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓと比較して、１の抗増殖活性を９．４倍低減したが、この変異体は、２や４ａの抗増殖活性には影響を与えなかった（図４Ｅ５〜７）。タキソールの抗増殖活性は、これら２つのＯＳＢＰ１変異体タンパク質の発現に影響されなかった（図４Ｅ４、４Ｅ８）。
【０３４３】
その後、１、２、４ａのＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）およびＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）変異体への結合親和性を［３Ｈ］−２５−ＯＨＣ競合結合により求めた。２５−ＯＨＣのＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）への結合親和性はｗｔと同一であった。ＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）変異体は、ｗｔと比較してわずかに高い２５−ＯＨＣとのＫＤを有した。誤差の範囲内で、１、２、４ａのこれら２つのＯＳＢＰ１変異体への結合親和性は、ｗｔＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓと変わりなかった（図４Ｄ）。このことは、これら変異がＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓへの耐性を与えるのは、化合物の結合に影響を与えることによるのではなく、ＯＳＢＰ１の細胞機能を変化することによるものであることを示唆している。
【０３４４】
その後、ＯＳＢＰ１とＯＲＰ４Ｌの配列を並置した比較に基づいて、ＯＲＰ４Ｌにおける変異は、ＯＳＢＰ１（Ｍ４４６Ｗ）およびＯＳＢＰ１（Ｖ５８２Ｍ）に相当する位置に作成した。前記２つのＯＳＢＰ１変異体の発現と異なり、ＯＲＰ４Ｌ（Ｍ５５０Ｗ）およびＯＲＰ４Ｌ（Ｖ６８６Ｍ）の発現は、ｗｔＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓと比較して、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓへの細胞感受性を減少させなかった。
【０３４５】
例６
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがＯＳＢＰ１の細胞内局在をかく乱する
ＯＳＢＰ１の機能は完全には解明されてはいないが、いくつかの細胞活性が観察されている。例えば、ＯＳＢＰ１は、２５−ＯＨＣを細胞へ添加すると細胞質部位からトランスゴルジ網（ＴＧＮ）へと移動する。ＨＣＴ−１１６細胞をＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓで短時間（４時間）処理し、ＯＳＢＰ１局在への効果を免疫蛍光顕微法を使用してモニターした。
【０３４６】
ＨＣＴ−１１６細胞において、ＯＳＢＰ１（緑色）およびトランスゴルジタンパク質Ｐ２３０（赤色）を間接免疫蛍光顕微法を使用して可視化した。細胞は、化合物で４時間処理し、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００添加ＰＢＳを使用して透過処理した。タンパク質を、ＯＳＢＰ１とＰ２３０に特異的な一次抗体を使用して４℃で一晩標識化した。細胞を洗浄後、アレクサフルオル４８８とアレクサフルオル５４６二次抗体で室温で１時間処理した。
【０３４７】
２５−ＯＨＣの効果と同様に（図５Ｂ）、シュウェインフルチンＡ（４ａ）の処理により、ＯＳＢＰ１は、トランスゴルジマーカーｐ２３０が高度に共局在する核周囲の位置に蓄積し、これは４ａがＯＳＢＰ１のトランスゴルジ網への移動を引き起こすことを示唆している（図５Ｃ）。ＯＳＷ−１（２）は、ＯＳＢＰ１を、ｐ２３０が共局在しない核周囲の位置に局在化させる（図５Ｄ）。代わりに、ＯＳＷ−１処理は、ｐ２３０マーカーを小さな分散した小胞として出現させ、これはトランスゴルジ切断を示している。２と同様に、セファロスタチン１（１）で処理した細胞でも、分散したｐ２３０マーカーがほとんど共局在しない核周囲の位置をＯＳＢＰ１が占めていた（図５Ｅ）。しかしながら、２５−ＯＨＣ、２、４ａと違って、１はＯＳＢＰ１を原形質膜にも部分的に局在化させた（図５Ｅ）。この効果はリッテラジンＢ（３）でも観察されたが、３ではＯＳＢＰ１とｐ２３０の共局在化が１でよりもより多くみられた。Ａ５４９細胞中でも１、２、４ｂによるＯＳＢＰ１局在化のかく乱が観察された。シュウェインフルチンＢ（４ｂ）での処理は、２５−ＯＨＣと同様の核周囲のＯＳＢＰ１染色をもたらし、一方この株化細胞中で１と２はＯＳＢＰ１の分散または小胞形成を誘発した。
【０３４８】
例７
セファロスタチン１およびＯＳＷ−１がＯＳＢＰ１の細胞レベルを低減する
例６における免疫蛍光試験の過程で、セファロスタチン１（１）およびＯＳＷ−１（２）で８時間以上処理した細胞においてＯＳＢＰ１の蛍光シグナルが著しく低いことが観察された。この観察の説明としては、おそらく１や２での処理がＯＳＢＰ１レベルを減少させたということであろう。媒体（ＤＭＳＯ）や２５−ＯＨＣ（１０μＭ）でＨＣＴ−１１６細胞を処理しても、ウェスタンブロット法により評価したようにＯＳＢＰ１レベルには何ら影響はない（図６Ａ）。しかしながら、１または２で処理することで、ＯＳＢＰ１レベルを時間に依存して大幅に低減した（図６Ａ）。例えば、５０ｎＭの１または１０ｎＭの２は、ＨＣＴ−１１６細胞におけるＯＳＢＰ１タンパク質レベルを２４時間で約７５％低減させ（図６Ａ）、同様の効果がＡ５４９細胞でも記録された。興味深いことに、シュウェインフルチンＡ（４ａ）ではＯＳＢＰ１レベルには影響がなかった（図６Ｃ）。ＯＳＢＰ１レベルは、ＯＳＢＰ１の遠位のＮ末端を認識する抗体（図６）とＯＳＢＰ１のＣ末端を認識する抗体の両方を使用して求めた。両抗体が、１および２により誘発されたＯＳＢＰ１の低減を示したことは、ＯＳＢＰ１の一末端領域のタンパク質分解や修飾ではなく、全タンパク質の分解を意味している。
【０３４９】
１や２での処理に際してのＯＳＢＰ１レベルの低減の可能な説明の１つは、プロテアソーム依存性分解であった。ＯＳＢＰ１の分解がプロテアソームに依存するかどうかを決めるために、プロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２やラクタシスチンを１や２と同時投与した。ＭＧ−１３２やラクタシスチンだけではＯＳＢＰ１レベルに影響しないが、これらの阻害剤は、ＨＣＴ−１１６細胞における１や２によるＯＳＢＰ１の分解を完全に阻止した（図６Ｂ）。同様の結果がＡ５４９細胞においても得られた。
【０３５０】
興味深いことに、既に述べたように、１０μＭの用量の２５−ＯＨＣはＯＳＢＰ１レベルを低減しなかった（図６Ａ、６Ｃ）。２５−ＯＨＣの同時投与がセファロスタチン１（１）およびＯＳＷ−１（２）の抗増殖活性を阻止すると決定されたので（図４Ａ）、１または２での処理により引き起こされたＯＳＢＰ１レベルの低減を２５−ＯＨＣの添加が阻止するかどうかを決めるためのをテストを行った。実際、２５−ＯＨＣ（１０μＭまたは２０μＭ）を２（１ｎＭ）と共に同時投与すると、ＯＳＢＰ１レベルの低減を著しく抑制した（図６Ｃ）。この結果は、２５−ＯＨＣが、ＯＳＢＰ１への結合に関して競合することで、細胞におけるＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓの活性を阻止することができることを更に示している。２５−ＯＨＣが２による抗増殖活性およびＯＳＢＰ１の分解を抑制したので、これらの事象が連結している可能性があることを示唆している。
【０３５１】
最後に、４ａはＯＳＢＰ１レベルの低減を誘発しないので、２によるＯＳＢＰ１レベルの低減を４ａが阻止する可能性をテストした。驚くべきことに、５μＭシュウェインフルチンＡ（４ａ）を１０ｎＭの２で処理した細胞へ添加すると、ＯＳＢＰ１レベルの低減を完全に抑制した（図６Ｃ）。これらの結果は、２および４ａは両方とも細胞中でＯＳＢＰ１に結合しかく乱するが、その活性に対して著しく異なった効果を示すことを明らかにしている。
【０３５２】
例８
ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがスフィンゴミエリン生合成に影響する
スフィンゴミエリンはゴルジ体でセラミドから生合成される。セラミドは主にセラミド輸送タンパク質（ＣＥＲＴ）により小胞体からゴルジへ輸送され、ＣＥＲＴの輸送活性はＯＳＢＰ１およびＶＡＰ−Ａの両方に依存する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、２５−ＯＨＣは、ＯＳＢＰ１に依存する形で、スフィンゴミエリン生合成の増加を誘発することが示されている。ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓがスフィンゴミエリン合成に影響するかどうかを決めるために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞中で［３Ｈ］−セリンでのパルス標識を行い、その後スフィンゴミエリンや他の脂質に取り込まれたトリチウムの量を測定した。細胞を媒体または化合物で６時間処理し、最後の２時間は細胞を１０μＣｉの［３Ｈ］−セリンでパルス処理した。脂質を抽出し、ＴＬＣで単離し、スフィンゴミエリンへの標識の取り込みは、シンチレーションカウンターで測定した。
【０３５３】
報告されているように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２５−ＯＨＣ（５μＭ）で処理すると、スフィンゴミエリン（ＳＭ）の生合成を約４倍増加した（図７）。低用量（ＧＩ１０）のＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓ１〜４（シュウェインフルチンＡ（４ａ）の代わりにシュウェインフルチンＢ（４ｂ））でＣＨＯ−Ｋ１細胞を処理すると、すべての処理で２５−ＯＨＣと同様にけれども異なる程度でＳＭ生合成が増加した。コントロール脂質であるホスファチジルエタノールアミンへの放射標識の取り込みは、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓにより有意にはかく乱されなかった。ＨＣＴ−１１６細胞においては、ＯＳＷ−１（２）の濃度範囲での処理は、セラミド標識に影響を与えなかった。この結果は、ＯＳＢＰ１に結合する２５−ＯＨＣが影響を与えることで知られるプロセスであるセラミドのＳＭへの変換を、ＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓが変化させることと一致している。
【０３５４】
しかしながら、２５−ＯＨＣと異なり、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を高用量（ＧＩ９０）のＯＲＰｐｈｉｌｉｎｓへ暴露することにより、ＳＭの生合成が著しく低減した（図７）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＧＩ９０用量の２５−ＯＨＣ（１５μＭ）で処理すると、１により観察された低減とは反対に、ＳＭ生合成は強く刺激された。ＳＭ生合成の抑制は、細胞をタキソールや小胞体ストレス誘発小分子であるタプシガルギンに暴露した際には起らなかったが、このことは、１、２、４ａが、一般的な細胞障害性や小胞体ストレスの誘発によりＳＭ生合成を抑制するのではないことを示している。
【０３５５】
ＣＥＲＴ発現の抑制は、基礎的なＳＭ生合成を著しく低減させると報告されている。従って、１および２がＣＥＲＴレベル低減を誘発する能力を有するかどうかを、ＯＳＢＰ１レベルに関する１および２の効果と同様にしてテストした。ＨＣＴ−１１６細胞またはＡ５４９細胞を高用量（ＧＩ９０）の１や２で処理しても、ＣＥＲＴタンパク質レベルに影響はなかった。
【０３５６】
例９
ＯＳＷ−１カルバメート１００、１０１、１０２の調製
【化８６】
2014515354.tif 000088
【０３５７】
【化８７】
2014515354.tif 000089
【０３５８】
アルゴン雰囲気下、１．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１．０ｍＬのＣＨ３ＣＮを、モノ−Ｆｍｏｃ−１，６−ジアミノヘキサン塩酸塩（３６ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）に添加し、白色固体物質を含む懸濁液を得た。ＤＩＰＥＡ（３６μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を滴下し反応物を１０分間撹拌したが、溶液は完全に均一となることはなかった。同時に、トリホスゲン（１０．１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を大気中でフラスコに充填し、アルゴンで置換し、その後０．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。モノ−Ｆｍｏｃ−１，６−ジアミノヘキサン溶液を大ゲージ針を通してトリホスゲン溶液へ１５分かけてゆっくり滴下した。反応フラスコの洗浄も含めて、合計２．３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＣＮを使用して、モノ−Ｆｍｏｃ−１，６−ジアミノヘキサンを移した。モノ−Ｆｍｏｃ−１，６−ジアミノヘキサンをトリホスゲンへ添加した際に、溶液はほぼ均一となった。１０分撹拌後、アルゴンを５分間直接反応物に通気し、過剰のホスゲンを除去した。同時に、アルゴン雰囲気下でＯＳＷ−１（９．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。０．３ｍＬ（約０．０１ｍｏｌ、約１ｅｑ．）のイソシアネート溶液をＯＳＷ−１溶液に添加した。約１０時間後、更に０．１５ｍＬのイソシアネート溶液を添加した（約０．００５ｍｍｏｌ、約０．５ｅｑ．）。更に１６時間の後、反応は、ＴＬＣ分析によりかなり進行したことが確認された。
【０３５９】
１．５ｍＬのＭｅＯＨを添加して反応を停止した。１５分間撹拌後、反応物をＣＨＣｌ３で希釈し、ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄した。白色沈殿が形成され、水層に分配された。その後、有機相をＨ２Ｏ、そして食塩水で洗浄した。水相を合わせ、ＣＨＣｌ３で１回逆抽出した。合わせた有機相は、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。反応物は、８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を溶離液として使用したｐＴＬＣで精製し、２つの主要生成物バンドが単離された。上のバンド（Ｒｆ＝０．５２）は、純度が約８５％の１００であった。もう１つのバンドは、１０１と１０２の約２：３混合物（Ｒｆ＝０．４２）であった。ＯＳＷ−１も回収された。１００、１０１、１０２は、９０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの均一濃度溶出で、ＺｏｒｂａｘＣ−１８ＳＢカラム（Ｉ．Ｄ．９．４ｍｍ、３．９ｍＬ／ｍｉｎ）でのセミ分取逆相ＨＰＬＣにより完全に精製した。１００（溶出時間１５．３分）は白色固体として得られた（１．２ｍｇ、９％、２５％ｂｏｒｓｍ）。１０１（溶出時間１７．４ｍｉｎ）は白色固体として得られた（１．４ｍｇ、１１％、２９％ｂｏｒｓｍ）。１０２（溶出時間２０．８ｍｉｎ）は白色固体として得られた（１．８ｍｇ、１４％、３８％ｂｏｒｓｍ）。
【０３６０】
カルバメート １００:  Rf (8% MeOH/CH2Cl2) = 0.52. 1H NMR (500 Hz, D3CN) δ = 8.01 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 2 H), 7.65 (d, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.42 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.37 - 7.30 (m, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.67 - 5.59 (m, 1 H), 5.59 - 5.52 (m, 1 H), 5.31 (d, J = 5.5 Hz, 1 H), 4.97 - 4.90 (m, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.75 (dd, J = 6.0, 7.8 Hz, 1 H), 4.69 (d, J = 6.9 Hz, 1 H), 4.64 - 4.56 (m, 1 H), 4.36 - 4.26 (m, 2 H), 4.25 - 4.17 (m, 2 H), 4.13 - 4.00 (m, 2 H), 3.93 - 3.81 (m, 4 H), 3.81 - 3.72 (m, 2 H), 3.72 - 3.64 (m, 2 H), 3.47 - 3.20 (m, 6 H), 3.12 - 2.99 (m, 4 H), 2.95 - 2.87 (m, 1 H), 2.68 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 2.56 - 2.42 (m, 2 H), 1.85 - 1.76 (m, 2 H), 1.76 - 1.15 (m, 24 H), 1.14 - 0.85 (m, 10 H), 0.94 - 0.84 (m, 2 H), 0.78 (m, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C69H96N3O18 [M+NH4+] = 1254.6683; 実測値: 1254.9
【０３６１】
カルバメート １０１:  Rf (8% MeOH/CH2Cl2) = 0.46. 1H NMR (500 Hz, CD3CN) δ = 7.93 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.83 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.65 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.41 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 6.98 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 5.62 - 5.54 (m, 1 H), 5.51 - 5.45 (m, 1 H), 5.32 - 5.28 (m, 1 H), 4.97 - 4.86 (m, 2 H), 4.75 - 4.66 (m, 3 H), 4.32 (d, J = 6.9 Hz, 1 H), 4.26 - 4.17 (m, 3 H), 4.00 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.95 (dd, J = 5.5, 11.4 Hz, 1 H), 3.91 - 3.70 (m, 8 H), 3.70 - 3.60 (m, 4 H), 3.59 - 3.52 (m, 3 H), 3.46 - 3.24 (m, 7 H), 3.21 - 3.17 (m, 1 H), 3.06 - 2.95 (m, 3 H), 2.95 - 2.72 (m, 6 H), 2.70 - 2.64 (m, 2 H), 2.51 - 2.39 (m, 3 H), 1.85 - 1.75 (m, 2 H), 1.75 - 0.96 (m, 34 H), 0.95 - 0.82 (m, 2 H), 0.83 - 0.71 (m, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C69H96N3O18 [M+NH4+] = 1254.6683; 実測値: 1255.0
【０３６２】
カルバメート１０２:  Rf (8% MeOH/CH2Cl2) = 0.46. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.01 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 2 H), 7.65 (d, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.42 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.33 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 5.69 - 5.61 (m, 1 H), 5.41 - 5.34 (m, 1 H), 5.32 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 4.88 - 4.82 (m, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.73 (dd, J = 6.4, 8.2 Hz, 1 H), 4.61 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 4.36 - 4.26 (m, 3 H), 4.25 - 4.17 (m, 2 H), 4.00 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 3.96 - 3.84 (m, 5 H), 3.77 (dd, J = 4.1, 12.4 Hz, 1 H), 3.72 - 3.64 (m, 2 H), 3.63 - 3.51 (m, 2 H), 3.42 (dd, J = 1.8, 12.4 Hz, 1 H), 3.31 - 3.23 (m, 2 H), 3.12 - 3.00 (m, 4 H), 2.86 (q, J = 7.3 Hz, 1 H), 2.46 (ddd, J = 6.6, 9.0, 18.2 Hz, 1 H), 2.34 - 2.22 (m, 2 H), 1.88 - 1.75 (m, 2 H), 1.67 (s, 4 H), 1.64 - 1.37 (m, 9 H), 1.36 - 1.14 (m, 9 H), 1.12 - 1.05 (m, 4 H), 1.03 - 0.96 (m, 3 H), 0.96 - 0.86 (m, 2 H), 0.79 (d, J = 6.9 Hz, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C69H96N3O18 [M+NH4+] = 1254.6683; 実測値: 1255.0
【０３６３】
例１０
ＯＳＷ−１類似体７、８
【化８８】
2014515354.tif 000090
【０３６４】
ＯＳＷ−１類似体７、８を、前記のようにして調製した。Kubo et al. (1992) Phytochemistry 31(11):3969-73。７のＨＰＬＣ精製：ＺｏｒｂａｘＣ１８ＳＢカラム、均一濃度８２％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ。８のＨＰＬＣ精製：ＥｃｌｉｐｓｅＣ８カラム、均一濃度６０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ。
【０３６５】
例１１
ＯＳＷ−１  Ｏメチルカーボネート１０５の調製
【化８９】
2014515354.tif 000091
【０３６６】
メチルエステル１０５を、モノ−Ｆｍｏｃ−１，６−ジアミノヘキサンイソシアネートとＯＳＷ−１の反応物から単離した。これは、１００〜１０２を製造した反応と同じものである。ＨＰＬＣ精製を使用してこの反応の残りの生成物を精製したときに、１０５がこの反応の少量生成物であることが見つかった。おそらく、１０５は、ＭｅＯＨがＯＳＷ−１の活性化エステル体を攻撃することで生じるのであろう。ＯＳＷ−１の活性化エステルは、ＯＳＷ−１が反応液中でホスゲンと反応して生成したＯＳＷ−１酸塩化物であるかもしれない。この活性化ＯＳＷ−１エステルはその後ｐＴＬＣ精製においてＭｅＯＨと反応したようである。これは反応の微量生成物である（収率＜１０％）。
【０３６７】
ＯＳＷ−１  Ｏメチルカーボネート１０５:  1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.01 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 5.42 - 5.32 (m, 1 H), 4.90 - 4.78 (m, 1 H), 4.73 (dd, J = 6.4, 8.2 Hz, 1 H), 4.61 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.39 - 4.26 (m, 1 H), 4.23 - 4.15 (m, 1 H), 4.01 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 3.95 - 3.80 (m, 5 H), 3.76 (dd, J = 4.6, 12.4 Hz, 1 H), 3.72 - 3.63 (m, 5 H), 3.63 - 3.49 (m, 2 H), 3.47 - 3.35 (m, 2 H), 3.33 - 3.21 (m, 2 H), 2.86 (q, J = 7.3 Hz, 1 H), 1.78 - 1.39 (m, 13 H), 1.40 - 1.16 (m, 10 H), 1.15 - 0.98 (m, 8 H), 0.98 - 0.83 (m, 2 H), 0.83 - 0.72 (m, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C49H70O17 [M+Na+]: 946.4505; 実測値: 946.6
【０３６８】
例１２
ＯＳＷ−１カーボネート１２２の調製
【化９０】
2014515354.tif 000092
【０３６９】
４０ｍｇのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（９７％）を、２．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し試薬原液を作成した。ＯＳＷ−１（５．０ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）を０．１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解したＯＳＷ−１に添加した。このＯＳＷ−１溶液に、０．１ｍＬのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート原液（２．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加し、その後約１μＬのＤＩＰＥＡを添加した。反応物を密封し、約１２時間撹拌した。原料の約６０％が残り、３つの主要生成物のスポットが得られた。更に約１μＬのＤＩＰＥＡを添加し、反応物を更に７時間撹拌した。ＴＬＣは、より複雑になった。その後、３ｍＬのＣＨ３ＣＮを添加し、反応物を減圧下で濃縮した。反応物の精製は、ｐＴＬＣにおいて１つのプレートに２／３を載せ、８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出して行った。大変複雑な生成物の混合物が得られ、その精製および特定は容易ではなかった。特定された唯一の生成物は、環状カーボネート１２２であり、黄みを帯びたフィルム／固体として単離された（＜１ｍｇ、約１５％）．
【０３７０】
環状カーボネート１２２：Rf (8% MeOH/CH2Cl2) = 0.56. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.05 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.35 - 5.25 (m, 2 H), 4.97 (d, J = 3.7 Hz, 1 H), 4.81 - 4.71 (m, 2 H), 4.65 - 4.55 (m, 1 H), 4.38 (dd, J = 5.7, 9.8 Hz, 1 H), 4.16 (s, 1 H), 4.10 (d, J = 5.0 Hz, 1 H), 3.95 - 3.83 (m, 5 H), 3.83 - 3.73 (m, 3 H), 3.72 - 3.64 (m, 2 H), 3.48 - 3.40 (m, 2 H), 3.37 - 3.26 (m, 2 H), 2.98 - 2.90 (m, 1 H), 2.72 - 2.65 (m, 1 H), 2.55 - 2.44 (m, 1 H), 1.89 - 1.65 (m, 7 H), 1.63 - 0.96 (m, 17 H), 0.95 - 0.84 (m, 2 H), 0.83 - 0.72 (m, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C48H66NaO16 [M+Na+]: 921.4243; 実測値: 921.7. 
【０３７１】
例１３
ＯＳＷ−１カーボネート１１５、１２３、１２４、１２７の調製
【化９１】
2014515354.tif 000093
【０３７２】
【化９２】
2014515354.tif 000094
【０３７３】
９１ｍｇのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（９７％）を、０．８６ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し試薬原液を作成した。ＯＳＷ−１（１５．０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を０．１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解したＯＳＷ−１を添加した。このＯＳＷ−１溶液に、約５０μＬのＤＩＰＥＡを添加し、その後０．０５ｍＬのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート原液（５．３ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を密封し、約１６時間撹拌した。その後、３ｍＬのＣＨ３ＣＮを添加し、反応物を減圧下で濃縮した。反応物の精製は、ｐＴＬＣにおいて２つのプレートに載せ、８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出して行った。数個の生成物が単離され、１ＨＮＭＲとＬＲＭＳで特定した。約１〜２ｍｇの＞８０％の１１５、１２３、１２４が生成され（収率約１０％）、１ｍｇ未満の１２７が生成された（収率約１０％）。カーボネート生成物は、ＴＬＣ上でやや不安定であり、かなりの部分が精製の間に分解したことを示唆している。また、おそらく精製が不完全であったため、カーボネート１２３および１２４は互いに混入していたが、これは、ｐ−ニトロフェニルカルボニル基が３’’と４’’キシロシルヒドロキシルの間を転移することで、化合物が溶液中で相互変換できることを示唆している。
【０３７４】
カーボネート１２３:  1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.27 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 8.02 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.43 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.42 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 4.89 - 4.79 (m, 1 H), 4.77 - 4.68 (m, 1 H), 4.65 - 4.57 (m, 1 H), 4.55 - 4.43 (m, 1 H), 4.21 (s, 1 H), 4.09 - 3.97 (m, 2 H), 3.96 - 3.86 (m, 5 H), 3.82 - 3.71 (m, 2 H), 3.72 - 3.64 (m, 2 H), 3.64 - 3.51 (m, 2 H), 3.51 - 3.38 (m, 2 H), 3.36 - 3.14 (m, 2 H), 2.91 - 2.82 (m, 1 H), 2.53 - 2.37 (m, 2 H), 1.67 (s, 5 H), 1.64 - 1.13 (m, 12 H), 1.06 (s, 6 H), 1.03 - 0.83 (m, 3 H), 0.83 - 0.70 (m, 9 H)
カーボネート１２４:  １H NMR (５００ MHz, D３CN)。１２３が混入して著しく純度が低い。
【０３７５】
カーボネート１１５:  1H NMR (600 MHz, CD3CN) δ = 8.29 - 8.26 (m, 2 H), 8.03 - 8.00 (m, 2 H), 7.46 - 7.38 (m, 2 H), 7.06 - 6.98 (m, 2 H), 5.44 - 5.41 (m, 1 H), 4.87 - 4.82 (m, 1 H), 4.75 - 4.71 (m, 1 H), 4.61 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 4.54 - 4.46 (m, 1 H), 4.21 (s, 1 H), 4.01 (d, J = 6.2 Hz, 1 H), 3.96 - 3.84 (m, 6 H), 3.76 (dd, J = 4.0, 12.4 Hz, 1 H), 3.71 - 3.65 (m, 2 H), 3.64 - 3.51 (m, 3 H), 3.47 - 3.38 (m, 2 H), 3.31 - 3.23 (m, 2 H), 2.91 - 2.83 (m, 1 H), 2.52 - 2.41 (m, 3 H), 1.79 - 1.45 (m, 9 H), 1.36 - 1.11 (m, 7 H), 1.10 - 1.03 (m, 6 H), 1.02 - 0.85 (m, 2 H), 0.84 - 0.72 (m, 9 H)
【０３７６】
ＯＳＷ−１ダイマー １２７:  1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 7.99 (d, J = 8.7 Hz, 4 H), 6.99 (d, J = 8.7 Hz, 4 H), 5.28 (d, J = 5.0 Hz, 2 H), 4.85 - 4.80 (m, 2 H), 4.73 - 4.68 (m, 2 H), 4.59 (d, J = 7.8 Hz, 2 H), 4.18 (s, 2 H), 3.98 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.90 (dd, J = 4.6, 11.4 Hz, 2 H), 3.87 - 3.81 (m, 10 H), 3.80 - 3.70 (m, 4 H), 3.69 - 3.49 (m, 12 H), 3.43 - 3.36 (m, 2 H), 3.34 - 3.20 (m, 6 H), 3.06 (q, J = 7.3 Hz, 2 H), 2.89 - 2.79 (m, J = 7.3 Hz, 2 H), 2.73 (d, J = 4.6 Hz, 2 H), 2.48 - 2.38 (m, 2 H), 1.85 - 1.11 (m, 28 H), 1.09 - 1.01 (m, 6 H), 1.01 - 0.93 (m, 8 H), 0.91 - 0.82 (m, 4 H), 0.80 - 0.70 (m, 18 H) LRMS (+TOF): 計算値 C95H136NaO31 [M+2H++Na+]: 1795.8947; 実測値: 1795.6. 
【０３７７】
例１４
カルバメート１２６の調製
【化９３】
2014515354.tif 000095
【０３７８】
方法１：カーボネート１２３を基質として使用：カーボネート１２３（約１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。モノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミンの原液をＣＨ２Ｃｌ２中で調製し、１２３溶液へ添加した（０．６ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）。触媒量のＤＭＡＰ固体を反応物へ添加（＜０．５ｍｇ）し、密封して一晩撹拌した。黄色い溶液を濃縮し、プレートの展開に８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してｐＴＬＣ（１／２プレート）で精製した。２つの生成物が精製された。Ｒｆの高い生成物は環状カーボネート１２２と特定された。Ｒｆの低い生成物は、目的のカルバメート１２６（約０．４ｍｇ、約３５％）であった。
【０３７９】
方法２：カーボネート１２４を基質として使用：方法１と同様にして行った。予想外なことに、いくらかの環状カーボネート１２２の他に、３’’−キシロシル位に目的のカルバメートを得る代わりに、４’’−キシロシルカルバメート１２６（約０．４ｍｇ、約３５％）を得た。この結果は、１）ＤＭＡＰは最初に環状カーボネート１２２の生成を触媒し、その後カルバメート生成物を生成する；あるいは２）ＤＭＡＰは３-キシロースヒドロキシルから４-キシロースへのアシル基転移を触媒し、その後カルバメート生成物を生成するかのどちらかを示唆している。
【０３８０】
カルバメート１２６:  1H NMR (600 MHz, CD3CN) δ = 8.02 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 5.97 - 5.87 (m, 1 H), 5.62 - 5.52 (m, 2 H), 5.34 - 5.29 (m, 1 H), 5.27 (d, J = 17.0 Hz, 1 H), 5.16 (d, J = 10.4 Hz, 1 H), 4.98 - 4.89 (m, 1 H), 4.79 - 4.67 (m, 2 H), 4.65 - 4.54 (m, 1 H), 4.52 - 4.41 (m, 2 H), 4.20 (s, 1 H), 4.08 (dd, J = 5.1, 11.9 Hz, 1 H), 4.04 (d, J = 6.0 Hz, 1 H), 3.92 - 3.85 (m, 5 H), 3.82 - 3.73 (m, 3 H), 3.72 - 3.65 (m, 2 H), 3.46 - 3.22 (m, 6 H), 3.11 - 3.01 (m, 4 H), 2.95 - 2.87 (m, 1 H), 2.71 (d, J = 4.5 Hz, 1 H), 2.57 - 2.45 (m, 1 H), 1.90 - 1.64 (m, 8 H), 1.64 - 1.15 (m, 17 H), 1.08 (d, J = 7.5 Hz, 3 H), 1.05 - 0.97 (m, 4 H), 0.95 - 0.83 (m, 2 H), 0.83 - 0.74 (m, 9 H)
【０３８１】
例１５
カルバメート１０３の調製
【化９４】
2014515354.tif 000096
【０３８２】
方法１：モノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン塩酸塩（シグマアルドリッチ社）（２３．５ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）をベンゼンと共沸し、高い真空に供して溶媒を完全に除去した。その後、０．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、淡黄色の均一溶液を得た。ＤＩＰＥＡ（２２μＬ、０．１２６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を約１５分間撹拌した。一方、３２ｍｇのトリホスゲン（９８％、シグマアルドリッチ社）を大気中で反応フラスコに充填し、アルゴン雰囲気に置換し、０．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。このトリホスゲン原液（１６．０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の０．２５ｍＬをアルゴン雰囲気下シリンジで新しいフラスコに移した。０．２５ｍＬのトリホスゲン溶液に、モノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン溶液をゆっくりと３０分かけて滴下した。添加の後５分間撹拌後、反応物にアルゴンを通気し、過剰のホスゲンを除去した。アルゴン雰囲気下でＯＳＷ−１（８．８ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）を別の反応フラスコに充填し、０．２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解して透明な均一溶液を得た。
【０３８３】
ＯＳＷ−１溶液に、７５μＬのイソシアネート溶液を添加した（約２．４ｍｇイソシアネート、０．０１２ｍｍｏｌ）。５、３５、６０分後のＴＬＣでモニターでは、原料がわずかに変換したが、それが止まっていることを示した。１時間後に、残り全部のイソシアネート溶液を添加した（更に２１．４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）。ＴＬＣは、ＯＳＷ−１の変換が新たに起ったが、６０分後再び止まったことを示した（約４０％ＯＳＷ−１が残存した）。
【０３８４】
反応物を約１５ｍＬのＣＨＣｌ３で希釈し、Ｈ２Ｏで洗浄し、濁った有機層を得た。ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄したところ、有機相は透明となり、その後、Ｈ２Ｏ、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。反応物は、ｐＴＬＣ（２つのプレート８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製し、約９０％の純度で１０３を得た。９０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏでの均一濃度溶出で、ＺｏｒｂａｘＣ−１８ＳＢカラム（Ｉ．Ｄ．９．４ｍｍ、３．９ｍＬ／ｍｉｎ）でのセミ分取ＨＰＬＣにより、純粋な１０３（３．５ｍｇ、３４％、５８％ｂｏｒｓｍ）（８．９分に溶出ピーク）を白色固体として得た。３．７ｍｇのＯＳＷ−１が回収され（４２％）、質量バランスの残りは、他のＯＳＷ−１カルバメート生成物の複雑な混合物であった。 
【０３８５】
方法２：アルゴン雰囲気下で１１５（３−（４−ニトロフェニル）−ＯＳＷ−１カーボネート）（約１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。モノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミンの試薬原液は、４．０ｍｇを０．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解することで調製した。７５μＬの試薬液（０．６ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を密封し、すぐに黄色に変色した。１６時間後、目的物は少ししか形成されず、固体のモノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を反応物へ更に添加した。透明な目的物が形成し始めたが、６時間後に停止したようであった。その後、固体のモノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン（１．６ｍｇ．０．００８ｍｍｏｌ）を更に添加した。そして、反応物を更に１９時間時間撹拌した。ＴＬＣにより、約９０％の原料（ｓｍ）が消費されたように見えたが、ｓｍの加水分解のため、変換をＴＬＣ分析で確かめるのが困難であった。その後、固体のモノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミン（１．６ｍｇ．０．００８ｍｍｏｌ）を更に添加し、反応物を更に２時間撹拌した。その後、鮮やかな黄色反応物を直接減圧下で濃縮した。大過剰のモノ−Ａｌｌｏｃ−１，６−ヘキサンジアミンを除去するために、反応物をＣＨＣｌ３に溶解し、ＮＨ４Ｃｌ水溶液で２回抽出し、その後有機層をＨ２Ｏと食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。反応物は、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２でのｐＴＬＣで精製し、わずかに不純物のある１０３を得た（推定収率約５０〜７０％）。
【０３８６】
カルバメート１０３:  Rf (8% MeOH/CH2Cl2) = 0.30. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.00 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.96 - 5.84 (m, 1 H), 5.60 - 5.47 (m, 1 H), 5.42 - 5.30 (m, 2 H), 5.25 (d, J = 17.4 Hz, 1 H), 5.14 (d, J = 10.1 Hz, 1 H), 4.87 - 4.79 (m, 1 H), 4.76 - 4.68 (m, 1 H), 4.61 - 4.59 (m, 1 H), 4.51 - 4.42 (m, 1 H), 4.35 - 4.25 (m, 1 H), 4.19 (s, 1 H), 4.03 - 3.96 (m, 1 H), 3.85 (s, 5 H), 3.78 - 3.72 (m, 1 H), 3.69 - 3.64 (m, 2 H), 3.61 - 3.49 (m, 2 H), 3.44 - 3.36 (m, 1 H), 3.30 - 3.21 (m, 1 H), 3.09 - 2.99 (m, 4 H), 2.89 - 2.81 (m, 1 H), 2.50 - 2.38 (m, 1 H), 2.33 - 2.17 (m, 3 H), 1.89 -1.64 (m, 10 H), 1.27 (td, J = 3.3, 6.8 Hz, 10 H), 1.11 - 0.95 (m, 8 H), 0.96 - 0.86 (m, 1 H), 0.80 - 0.71 (m, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C58H88N2O18 [M+2H+]: 1100.6021; 実測値: 1100.1; 計算値 C58H87N2NaO18 [M+H++Na+]: 1122.5840; 実測値: 1122.1. 
【０３８７】
例１６
ＯＳＷ−１カルバメート１０４の調製
【化９５】
2014515354.tif 000097
【０３８８】
ＯＳＷ−１カルバメート１０３（６．０ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）を、０．２０ｍＬの４％ＫＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に溶解した。淡黄色溶液を４０分間撹拌した。反応物を１０％ＨＣｌで中性ｐＨまで注意深く中和し、その後ＣＨＣｌ３で希釈した。Ｈ２Ｏで抽出したところ、濁ったよく分離されていない抽出物が得られ、その後飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加した。有機層を分別し、水性画分をＣＨＣｌ３で逆抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。１０４は、５〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２濃度勾配溶離液使用のシリカゲルクロマトグラフィで精製した。１０４は白色固体として得られた（３．３ｍｇ、６８％）。
【０３８９】
ＯＳＷ−１カルバメート１０４:  1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 6.03 - 5.84 (m, 1 H), 5.50 - 5.36 (m, 1 H), 5.29 (d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.17 (d, J = 10.3 Hz, 1 H), 4.57 - 4.45 (m, 3 H), 4.43 - 4.32 (m, 1 H), 4.00 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 3.97 - 3.91 (m, 1 H), 3.91 - 3.79 (m, 3 H), 3.67 - 3.60 (m, 1 H), 3.59 - 3.44 (m, 3 H), 3.25 - 3.16 (m, 2 H), 3.16 - 3.01 (m, 4 H), 2.93 - 2.81 (m, 1 H), 2.77 - 2.64 (m, 1 H), 2.39 - 2.12 (m, 3 H), 2.05 - 1.74 (m, 3 H), 1.72 - 1.27 (m, 21 H), 1.26 - 1.18 (m, 3 H), 1.18 - 1.00 (m, 4 H), 0.90 (s, 9 H). LRMS (+TOF): 計算値 C48H83N3O15 [M+Na++H+]: 941.5818; 実測値: 941.5. 
【０３９０】
例１７
１−（Ｎ−Ａｌｌｏｃ−アミノメチル）−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノメチル）ベンゼンの調製
【化９６】
2014515354.tif 000098
【０３９１】
１−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノメチル）−４−（アミノメチル）ベンゼン（２．０１ｇ、８．４７ｍｍｏｌ）を乾燥した反応フラスコに充填し、ＴＨＦ（３０ｍＬ、０．２８Ｍ）に溶解した。ピリジン（０．６７３ｇ、０．６８６ｍＬ、８．５１ｍｍｏｌ）をシリンジで添加し、その後反応物を−７８℃に冷却した。アリルクロロホルメート（１．０２ｇ、８．５１ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、室温まで放置し、約２．５時間撹拌し、反応させた。１０ｍＬメタノールを添加して反応を停止し、その後減圧下で濃縮した。粗製反応混合物を５％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２混合物と共に直接クロマトグラフにかけ、目的の生成物をオフホワイト色固体として得た（２．１５ｇ、７６％）。
【０３９２】
１−（Ｎ−Ａｌｌｏｃ−アミノメチル）−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノメチル）ベンゼン：1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.25 (m, 4 H), 5.92 (m, 1 H), 5.32 (d, J = 17.0 Hz, 1 H), 5.21 (d, J = 10.8 Hz, 1 H), 5.13 (br s, 1 H), 4.90 (br s, 1 H), 4.59 (d, J = 4.9 Hz, 2 H), 4.35 (d, J = 5.9 Hz, 2 H), 4.29 (d, J = 4.9 Hz, 2 H), 1.46 (s, 9 H)。13C NMR (500 MHz, pyridine-d5): 157.3, 156.9, 139.5, 139.0, 134.2, 128.0, 116.9, 78.3, 65.3, 44.9, 44.6, 28.6。FTIR (film): 3323, 1682, 1530, 1253 cm-1。HRMS (+TOF): C17H24N2NaO4 として計算[M+Na+]: 343.1628; 実測: 343.1648. Δ = 5.8 ppm.
【０３９３】
例１８
１−（Ｎ−Ａｌｌｏｃ−アミノメチル）−４−（アミノメチル）ベンゼンの調製
【化９７】
2014515354.tif 000099
【０３９４】
室温で、１−（Ｎ−Ａｌｌｏｃ−アミノメチル）−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノメチル）ベンゼン（０．３２５ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）中に部分的に溶解した。ＴＦＡ（１．５４ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）をすばやく滴下し、黄色／橙色均一溶液を得た。１時間後、溶液を直接減圧下で濃縮し、高真空ポンプに２時間供した。アミン塩から遊離アミンを分離するために、粗製反応混合物を３０ｍＬのクロロホルムに溶解し、０．２ＭのＮａＯＨ溶液で２回洗浄した。水層をクロロホルムで１回逆抽出し、合わせた有機層を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。得られた粘稠な黄色いオイルは精製しなかった（７６ｍｇ、４３％）。
【０３９５】
１−（Ｎ−Ａｌｌｏｃ−アミノメチル）−４−（アミノメチル）ベンゼン:  1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.28 (m, 4 H), 5.93 (m, 1 H), 5.32 (d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.21 (dd, J = 1.0, 10.4 Hz, 1 H), 4.59 (d, J = 4.6 Hz, 2 H), 4.35 (d, J = 5.7 Hz, 2 H), 3.85 (s, 2 H)。13C NMR (500 MHz, pyridine-d5): 157.7, 143.5, 136.2, 128.3, 128.1, 124.1, 117.2, 65.6, 46.7, 45.4. FTIR (film): 3311, 1692, 1531, 1255 cm-1. HRMS (+TOF): 計算値 C12H17N2O2 [M+H+]: 221.1285; 実測値: 221.1283. ? = -0.90 ppm.
【０３９６】
例１９
Ａｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼンイソシアネートの調製
【化９８】
2014515354.tif 000100
【０３９７】
アルゴン雰囲気下でＡｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼン（１０５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を乾燥したＥｔＯＡｃ（３．３ｍＬ）に溶解した。固体トリホスゲン（７４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を５時間還流条件下で９０℃に加熱したが、反応物は均一となることはなかった。冷却後、溶媒を減圧除去し、反応物を一晩高真空ポンプに供して、黄色固体（１１８ｍｇ、ほぼ定量収率）を生成した。生成物のＩＲ分析は、２２６５ｃｍ−１にイソシアネート生成と一致するピークを明確に示した（予測範囲２２３０〜２２８０ｃｍ−１）。生成物は、精製せずにすぐに使用した。1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.32 - 7.22 (m, 4 H), 6.05 (br s, 1 H), 5.92 (m, 1 H), 5.27 (d, J = 17.0 Hz, 1 H), 5.16 (d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.51 (m, 2 H), 4.41 (d, J = 6.0 Hz, 2 H), 4.23 (m, 2 H)。FTIR (film): 3328, 2940, 2265, 1698, 1516, 1250 cm-1.
【０３９８】
例２０
ＯＳＷ−１カルバメート６ｃ、６ａ、１０９の調製
【化９９】
2014515354.tif 000101
【０３９９】
アルゴン雰囲気下でＯＳＷ−１（２２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解した。窒素グローブバッグ中で、塩化銅（Ｉ）（１０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）とＡｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼンイソシアネート（２５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を乾燥したバイアルに充填し、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解して、試薬原液を作成した。０．５ｍＬの試薬原液（塩化銅（Ｉ）５ｍｇ、（０．０５ｍｍｏｌ）Ａｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼンイソシアネート１２．５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ））を常温でシリンジによりＯＳＷ−１溶液に添加し、５時間撹拌した。反応物を約１５ｍＬのクロロホルムで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で２回洗浄した。青色の水層を１回逆抽出し、合わせた褐色／黄色有機層は食塩水で洗浄した。有機層はＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で還元して残存ＤＭＦ中の黄色い粗製溶液を生成し、それを一晩高真空ポンプで蒸発して粗製固体混合物を得た。ＯＳＷ−１−モノ−カルバメート化合物６ｃと６ａの混合物が、ビス−カルバメート化合物１０９とともに生成した。興味深いことに、１０６はこの反応では特定されなかった。６ｃ、６ａ、１０９は、ｐＴＬＣ（２枚のプレート）により７．５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出して約９０％の純度まで精製した。カルバメート６ｃは白色固体として得られた（６．３ｍｇ、２３％、２７％ｂｏｒｓｍ）。６ａは白色固体として得られた（７．４ｍｇ、２６％、３１％ｂｏｒｓｍ）。ビスカルバメート１０９は白色固体として得られた（６．７ｍｇ、１９％、２４％ｂｏｒｓｍ）。カルバメート６ｃと６ａは両方とも、生物実験のためにＨＰＬＣ（ＥｃｌｉｐｓｅＣ８カラム、均一濃度８３％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）により分析純度まで精製した。
【０４００】
カルバメート６c:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.35. 1H NMR (500 MHz, CD3CN): δ 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.05 - 6.89 (m, 6 H), 6.00 - 5.93 (m, 5 H), 5.32 - 5.17 (m, 3 H), 4.99 - 4.92 (m, 2 H), 4.75 - 4.70 (m, 2 H), 4.56 - 4.52 (m, 2 H), 4.24 - 4.15 (m, 5 H), 4.03 - 3.94 (m, 2 H), 3.91 - 3.86 (m, 4 H), 3.79 - 3.74 (m, 1 H), 3.71 - 3.66 (m, 1 H), 3.64 (m, 1 H), 3.46 - 3.18 (m, 4 H), 2.86 (dd, J = 7.0, 14.3 Hz, 1 H), 2.68 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 2.48 (m, 1 H), 2.25 - 2.15 (m, 5 H), 1.87 - 1.78 (m, 1 H), 1.75 - 1.63 (m, 5 H), 1.62 - 1.16 (m, 9 H), 1.08 - 0.98 (m, 7 H), 0.88 (m, 1 H), 0.94 - 0.75 (m, 9 H). 13C NMR (500 MHz, pyridine-d5): 218.9, 169.2, 165.4, 164.0, 159.3, 157.3, 141.9, 138.7, 134.3, 132.7, 128.0, 127.9, 127.8, 127.6, 121.1, 116.9, 116.8, 114.2, 103.5, 100.9, 88.2, 85.6, 81.5, 77.1, 73.0, 71.9, 71.3, 68.7, 68.5, 66.9, 66.3, 65.3, 55.5, 50.2, 48.5, 46.6, 46.3, 45.0, 44.9, 44.7, 44.2, 43.5, 39.3, 37.8, 36.9, 34.5, 32.7, 32.6, 32.3, 32.1, 27.8, 22.8, 22.5, 20.9, 20.8, 19.6, 13.5, 11.8. FTIR (film, cm-1); HRMS (+TOF): 計算値 C60H86N3O18 [M+NH4+]: 1136.5901; 実測値: 1136.5896. Δ = -0.43 ppm. 
【０４０１】
カルバメート６a:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.28. 1H NMR (600 MHz, CD3CN): δ 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.22 (m, 4 H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.09 - 6.02 (m, 2 H), 5.92 (m, 1 H), 5.32 - 5.25 (m, 2 H), 5.17 (d, J = 10.8 Hz, 1 H), 4.94 (dd, J = 6.7, 8.2 Hz, 1 H), 4.75 (dd, J = 6.0, 8.1 Hz, 1 H), 4.72  (d, J = 6.7 Hz, 1 H), 4.64 (m, 1 H), 4.51 (dt, 1.5, 5.5 Hz, 2 H), 4.29 - 4.16 (m, 5 H), 4.11 (dd, J = 4.7, 11.7 Hz, 1 H), 4.05 (d, J = 6.1 Hz, 1 H), 3.93 - 3.65 (m, 7 H), 3.45 - 3.21 (m, 4 H), 2.91 (m, 1 H), 2.69 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 2.51 (m, 1 H), 2.26 - 2.03 (m, 5 H), 1.85 - 1.78 (m, 1 H), 1.75 - 1.68 (m, 5 H), 1.63 - 1.19 (m, 9 H), 1.09 (d, J = 7.3 Hz, 3 H), 1.06 - 0.98 (m, 5 H), 0.92 - 0.85 (m, 2 H), 0.81 - 0.77 (m, 9 H). 13C NMR (500 MHz, pyridine-d5): 218.9, 169.3, 165.4, 164.0, 157.3, 157.0, 141.9, 138.8, 134.2, 132.5, 128.1, 128.0, 128.0, 127.9, 121.1, 116.9, 114.1, 110.6, 100.8, 88.8, 85.8, 74.0, 72.2, 71.3, 65.3, 55.5, 50.2, 48.5, 46.5, 46.4, 45.0, 44.9, 44.2, 43.5, 39.4, 37.8, 36.9, 34.6, 32.7, 32.3, 32.1, 29.6, 27.8, 22.8, 22.4, 20.9, 19.6, 13.6, 11.9. HRMS (+TOF): 計算値 C60H82N2NaO18 [M+Na+]: 1141.5455; 実測値: 1141.5444. Δ = 0.96 ppm
【０４０２】
ビスカルバメート１０９:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.45. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 7.96 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 7.32 - 7.12 (m, 4 H), 7.09 - 6.85 (m, 6 H), 6.19 - 5.81 (m, 6 H), 5.35 - 5.22 (m, 3 H), 5.17 (d, J = 5.3 Hz, 2 H), 5.07 (dd, J = 7.1, 8.9 Hz, 1 H), 4.89 - 4.67 (m, 3 H), 4.59 - 4.42 (m, 4 H), 4.32 - 4.08 (m, 8 H), 4.08 - 3.96 (m, 2 H), 3.96 - 3.73 (m, 6 H), 3.73 - 3.58 (m, 3 H), 3.55 - 3.39 (m, 3 H), 3.39 - 3.28 (m, 2 H), 3.16 (m, 1 H), 2.49 (br. s., 2 H), 2.37 - 2.15 (m, 4 H), 1.88 - 1.75 (m, 2 H), 1.74 -1.14 (m, 15 H), 1.12 - 0.95 (m, 7 H), 0.95 - 0.84 (m, 2 H), 0.84 - 0.64 (m, 9 H). 
【０４０３】
例２１
ＯＳＷ−１遊離アミン１１２の調製
【化１００】
2014515354.tif 000102
【０４０４】
アルゴン雰囲気下でカルバメート６ａ（５．７ｍｇ、０．００５１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．４ｍＬ）に溶解した。モルホリン（３μＬ、０．０３５ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。反応フラスコを、窒素グローブバッグの中へ移した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（約０．３ｍｇ、５ｍｏｌ％）を固体として反応物へ添加した。淡黄色反応物をアルゴン雰囲気下常温で８０分間撹拌した。水を一滴添加し、反応物を減圧下で濃縮した。ＮＭＲと低分解能マススペクトル分析により、Ａｌｌｏｃ脱保護が完全に行われ１１２が得られたことが示された。遊離アミン化合物（１１２）は、化合物の溶解度が低いために精製せずにセファロース４Ｂ樹脂との結合に使用した。収率は、定量的であったと推定された。
【０４０５】
ＯＳＷ−１アミン１１２:  1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 7.99 - 7.90 (m, 2 H), 7.21 - 7.14 (m, 2 H), 7.07 - 6.94 (m, 4 H), 6.07 - 5.97 (m, 1 H), 5.33 - 5.26 (m, 1 H), 5.01 - 4.89 (m, 2 H), 4.77 - 4.67 (m, 2 H), 4.30 - 4.22 (m, 1 H), 4.22 - 4.13 (m, 3 H), 4.09 - 3.93 (m, 5 H), 3.93 - 3.82 (m, 6 H), 3.81 - 3.72 (m, 2 H), 3.71 - 3.63 (m, 2 H), 3.46 - 3.27 (m, 3 H), 3.13 - 3.05 (m, 2 H), 2.91 - 2.80 (m, 1 H), 2.54 - 2.39 (m, 2 H), 1.85 - 1.76 (m, 1 H), 1.76 - 1.11 (m, 14 H), 1.11 - 0.95 (m, 8 H), 0.92 - 0.82 (m, 2 H), 0.82 - 0.70 (m, 9 H)。HRMS (+TOF): 計算値 C５６H７９N２NaO１６ [M+H+]: １０３５.５４２９; 実測値： １０３５.５４０９. Δ = -１.９ ppm. 
【０４０６】
例２２
ＯＳＷ−１固体相樹脂１１６の調製
【化１０１】
2014515354.tif 000103
【０４０７】
０．３ｍＬのＮＨＳ活性化セファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗ（商標）（１６〜２３μｍｏｌ／ｍＬ水切りした樹脂、ＧＥヘルスケア社）を、広口１０００μＬピペットチップによりＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）管フィルターカップに充填した。樹脂は低速遠心分離により０．３ｍＬのｄ６−ＤＭＳＯで３回洗浄した。その後、アミン化合物１１２を、０．３ｍＬのｄ６−ＤＭＳＯに溶解し、洗浄した樹脂に移した。トリエチルアミン（１１μＬ、０．０７９ｍｍｏｌ、１５．８ｅｑ）を添加し、反応物を常温で振盪インキュベートした。反応は、ＬＣＭＳで０、１、２、約１６時間にモニターし溶解アミン化合物の損失を追跡した。約１６時間後、検出可能は可溶化合物は残っていなかった。反応物を遠心分離して樹脂から溶液を分離した。ｄ６−ＤＭＳＯ通過画分のＮＭＲ分析により、アミン化合物（１１２）がないことを確認した。０．３ｍＬの５％エタノールアミンのＤＭＳＯ溶液を樹脂へ添加し、常温で４時間インキュベートした。その後、樹脂を遠心分離して５％エタノールアミン溶液を除去し、０．５ｍＬのＤＭＳＯで３回洗浄した。樹脂は使用まで−２０℃乾燥下で保存した。
【０４０８】
例２３
ＯＳＷ−１カルバメート１０６、１１８、１１９の調製
【化１０２】
2014515354.tif 000104
【０４０９】
ＯＳＷ−１（５．６ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で０．１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。別の三角フラスコで、１５ｍｇのＡｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼンイソシアネートをベンゼンそしてＣＨＣｌ３と共沸した。その後、０．３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２をイソシアネートに添加し、濁った褐色の試薬原液を得た。アルゴン雰囲気下常温で０．２ｍＬのイソシアネート溶液（１０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をシリンジでＯＳＷ−１に添加した。反応物は、わずかに濁っており黄色であった。反応物を密封し１２時間撹拌、その後２ｍＬのＭｅＯＨを添加した。溶媒を減圧除去し、その後生成混合物をｐＴＬＣ（約２／３プレート）により分離し、７．５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で展開した。３つのカルバメートが約９０％の純度で得られ、ＯＳＷ−１が少量回収された：１１８（１．６ｍｇ、１８％、２４％ｂｏｒｓｍ）；１１９（１．８ｍｇ、２０％、２７％ｂｏｒｓｍ）；１０６（３．３ｍｇ、５０％、６１％ｂｏｒｓｍ）。
【０４１０】
カルバメート１０６:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.17. 1H NMR (500 MHz  CD3CN) δ = 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.23 (s, 4 H), 7.02 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.09 - 5.99 (m, 1 H), 5.99 - 5.84 (m, 2 H), 5.36 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 5.28 (d, J = 17.6 Hz, 1 H), 5.17 (d, J = 11.2 Hz, 1 H), 4.87 - 4.82 (m, 1 H), 4.73 (dd, J = 6.3, 8.3 Hz, 1 H), 4.61 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 4.53 - 4.49 (m, 2 H), 4.39 - 4.30 (m, 1 H), 4.27 - 4.18 (m, 9 H), 4.00 (d, J = 6.3 Hz, 1 H), 3.92 (dd, J = 5.1, 11.5 Hz, 1 H), 3.90 - 3.84 (m, 5 H), 3.76 (dd, J = 4.2, 12.5 Hz, 1 H), 3.70 - 3.64 (m, 2 H), 3.64 - 3.51 (m, 2 H), 3.46 - 3.39 (m, 1 H), 3.30 - 3.23 (m, 2 H), 2.91 - 2.82 (m, 1 H), 2.51 - 2.41 (m, 1 H), 2.35 - 2.18 (m, 2 H), 2.10 - 2.05 (m, 1 H), 1.8 - 1.77 (m, 2 H), 1.76 - 1.40 (m, 10 H), 1.36 - 1.15 (m, 4 H), 1.14 - 1.04 (m, 4 H), 1.04 - 0.97 (m, 3 H), 0.97 - 0.87 (m, 1 H), 0.82 - 0.73 (m, 9 H)
【０４１１】
ビスカルバメート１１８:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.35. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.29 - 7.19 (m, 8 H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.10 - 6.00 (m, 3 H), 6.00 - 5.86 (m, 2 H), 5.36 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 5.28 (d, J = 17.6 Hz, 1 H), 5.17 (d, J = 10.7 Hz, 1 H), 4.93 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 4.78 - 4.70 (m, 2 H), 4.66 - 4.61 (m, 1 H), 4.51 (s, 3 H), 4.38 - 4.31 (m, 1 H), 4.29 - 4.17 (m, 10 H), 4.13 - 4.01 (m, 2 H), 3.92 - 3.83 (m, 3 H), 3.83 - 3.66 (m, 5 H), 3.45 - 3.36 (m, 2 H), 3.26 (s, 1 H), 3.12 (s, 1 H), 2.94 - 2.89 (m, 1 H), 2.53 - 2.48 (m, 1 H), 2.34 - 2.19 (m, 3 H), 2.08 - 1.98 (m, 2 H), 1.88 - 1.75 (m, 2 H), 1.71 (s, 5 H), 1.62 - 1.43 (m, 4 H), 1.38 - 1.18 (m, 7 H), 1.15 - 1.04 (m, 4 H), 1.04 - 0.99 (m, 3 H), 0.99 - 0.84 (m, 1 H), 0.84 - 0.76 (m, 9 H)
【０４１２】
ビスカルバメート１１９:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.28. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.25 - 7.19 (m, 4 H), 7.05 - 6.89 (m, 6 H), 6.04 (br. s., 1 H), 6.00 - 5.85 (m, 4 H), 5.36 (br. s., 1 H), 5.28 (m, 2 H), 5.17 (m, 2 H), 4.99 - 4.92 (m, 2 H), 4.76 - 4.70 (m, 2 H), 4.54 - 4.49 (m, 4 H), 4.38 - 4.31 (m, 1 H), 4.29 - 4.14 (m, 9 H), 4.07 - 3.95 (m, 2 H), 3.91 - 3.82 (m, 4 H), 3.76 (m, 1 H), 3.72 - 3.65 (m, 1 H), 3.62 - 3.56 (m, 1 H), 3.45 - 3.34 (m, 2 H), 3.21 (m, 1 H), 3.11 (s, 1 H), 2.91 - 2.83 (m, 2 H), 2.51 - 2.44 (m, 1 H), 2.30 - 2.14 (m., 2 H), 2.10 - 2.06 (m, 4 H), 1.87 - 1.77 (m, 3 H), 1.72 - 1.17 (m, 14 H), 1.14 - 0.98 (m, 6 H), 0.96 - 0.73 (m, 11 H)
【０４１３】
例２４
ＯＳＷ−１カルバメート２０の調製
【化１０３】
2014515354.tif 000105
【０４１４】
ＯＳＷ−１カルバメート１０６（４．０ｍｇ、０．００３６ｍｍｏｌ）を０．２５ｍＬの４％ＫＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に溶解した。淡黄色溶液を７０分間撹拌した。反応物を１０％ＨＣｌで注意深く中性ｐＨまで中和し、その後ＣＨＣｌ３で希釈した。Ｈ２Ｏで抽出すると、濁ったよく分離されていない抽出物が得られた。その後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加した。有機層を分別し、水性画分をＣＨＣｌ３で逆抽出し、有機相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。２０は、５〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２濃度勾配溶離液を使用したシリカゲルクロマトグラフィで精製した。得られた２０は白色固体であった（２．３ｍｇ、６８％）。
【０４１５】
カルバメート２０:  1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ = 7.31 - 7.17 (m, 4 H), 6.02 - 5.84 (m, 1 H), 5.45 - 5.25 (m, 2 H), 5.18 (d, J = 11.0 Hz, 1 H), 4.54 (d, J = 5.3 Hz, 1 H), 4.48 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 4.44 - 4.35 (m, 1 H), 4.30 - 4.18 (m, 3 H), 4.00 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 3.96 - 3.90 (m, 1 H), 3.89 - 3.79 (m, 2 H), 3.67 - 3.60 (m, 1 H), 3.55 (dd, J = 3.4, 8.9 Hz, 1 H), 3.53 - 3.41 (m, 2 H), 3.25 - 3.13 (m, 2 H), 2.93 - 2.80 (m, 1 H), 2.76 - 2.62 (m, 1 H), 2.40 - 2.28 (m, 2 H), 2.27 - 2.15 (m, 2 H), 2.04 - 1.73 (m, 4 H), 1.73 - 1.46 (m, 8 H), 1.47 - 1.36 (m, 3 H), 1.36 - 1.25 (m, 2 H), 1.21 (d, J = 7.3 Hz, 4 H), 1.18 - 1.08 (m, 2 H), 1.08 - 1.00 (m, 7 H), 1.00 - 0.78 (m, 9 H). 
【０４１６】
例２５
ＯＳＷ−１カルバメート１０７の調製
【化１０４】
2014515354.tif 000106
【０４１７】
ＯＳＷ−１カルバメート６ｃ（５．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を０．３０ｍＬの４％ＫＯＨ／ＥｔＯＨ溶液に溶解した。淡黄色溶液を７０分間撹拌した。反応物を１０％ＨＣｌで注意深く中性ｐＨまで中和し、その後ＣＨＣｌ３で希釈した。Ｈ２Ｏで抽出すると、濁ったよく分離されていない抽出物が得られた。その後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加した。有機層を分別し、水性画分をＣＨＣｌ３で逆抽出し、有機相を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。１０７は、５〜１２％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２濃度勾配溶離液を使用したシリカゲルクロマトグラフィで精製したが、白色固体として目的の純化合物の一部（１．１ｍｇ、２３％）が得られただけであった。残りの１０７は、不純物との混合画分であった（反応物からの生成物の推定全量は５０〜７０％）。
【０４１８】
カルバメート１０７:  1H NMR (500 MHz, cd3od) δ = 7.35 - 7.17 (m, 4 H), 5.99 - 5.86 (m, 1 H), 5.39 - 5.26 (m, 2 H), 5.18 (d, J = 10.3 Hz, 1 H), 4.64 - 4.43 (m, 4 H), 4.37 - 4.19 (m, 3 H), 4.08 - 3.96 (m, 2 H), 3.96 - 3.79 (m, 3 H), 3.69 - 3.37 (m, 5 H), 3.27 - 3.12 (m, 2 H), 2.95 - 2.80 (m, 1 H), 2.77 - 2.61 (m, 1 H), 2.31 - 2.14 (m, 3 H), 2.05 - 1.90 (m, 2 H), 1.90 - 1.73 (m, 3 H), 1.71 - 1.27 (m, 8 H), 1.20 (d, J = 7.3 Hz, 2 H), 1.16 - 1.00 (m, 6 H), 0.99 - 0.84 (m, 9 H). HRMS (+TOF): 計算値 C50H74N2NaO15 [M+Na+]: 965.4981; 実測値: 965.4986. Δ = 0.5 ppm
【０４１９】
例２６
３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ＯＳＷ−１（１０８）の調製
【化１０５】
2014515354.tif 000107
【０４２０】
アルゴン雰囲気下、ＯＳＷ−１（１８ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を０．４ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。溶液を氷浴中で冷却した。２，６−ルチジン（２．５μＬ、０．０２１ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。その後、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸塩（６．５?μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。５分後、氷浴を除き、反応物を常温まで放置して暖めた：全反応時間は１５分であった。反応物をクロロホルムで希釈し、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、その後食塩水で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。最終的な精製はｐＴＬＣで行い、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出し、化合物１２１（２．５ｍｇ、１０％、１２％ｂｏｒｓｍ）および１０８（１２．０ｍｇ、６０％、６５％ｂｏｒｓｍ）を白色固体として得た。この反応で少なくとも他に２つの未特定ＴＢＳ−ＯＳＷ−１生成物が生成されたが、それらはｐＴＬＣでは分離不可能であった。生物テストのために、１０８を９５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの均一濃度溶出でＥｃｌｉｐｓｅＣ８カラム（Ｉ．Ｄ．９．４ｍｍ、３．９ｍＬ／ｍｉｎ）でのセミ分取ＨＰＬＣに供した（８．７分に１０８の溶出ピーク）。
【０４２１】
ビスＴＢＳ保護ＯＳＷ−１１２１:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.93. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.01 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 5.31 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.85 (dd, J = 7.8, 9.2 Hz, 1 H), 4.72 (dd, J = 6.2, 8.2 Hz, 1 H), 4.62 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.20 (s, 1 H), 4.01 (d, J = 6.2 Hz, 1 H), 3.86 (s, 5 H), 3.79 - 3.64 (m, 4 H), 3.30 - 3.22 (m, 2 H), 2.86 (q, J = 7.3 Hz, 1 H), 2.49 - 2.40 (m, 1 H), 2.24 - 2.16 (m, 3 H), 1.84 - 1.76 (m, 2 H), 1.67 (s, 5 H), 1.61 - 1.39 (m, 9 H), 1.35 - 1.15 (m, 7 H), 1.11 - 1.04 (m, 3 H), 1.04 - 1.02 (m, 1 H), 1.00 (s, 4 H), 0.88 (d, J = 2.1 Hz, 18 H), 0.81 - 0.72 (m, 9 H), 0.14 - -0.05 (m, 12 H)
【０４２２】
ＴＢＳ保護ＯＳＷ−１１０８:  Rf (7.5% MeOH/CH2Cl2) = 0.27. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.01 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 9.2 Hz, 2 H), 5.32 (m, 1 H), 4.84 (m, 1 H), 4.73 (dd, J = 1.0 Hz, 1.0 Hz, 1 H), 4.61 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.20 (s, 1 H), 4.00 (d, J  = 6.4 Hz, 2 H), 3.92 (dd, J = 5.0, 11.5 Hz, 1 H), 3.90 - 3.84 (m, 4 H), 3.76 (dd, J = 12.4, 4.1 Hz, 1 H), 3.72 - 3.66 (m, 2 H), 3.63 - 3.51 (m, 2 H), 3.50 - 3.38 (m, 2 H), 3.33 - 3.24 (m, 1 H), 2.86 (m, 1 H), 2.46 (m, 2 H), 2.15 - 2.05 (m, 2 H), 1.85 - 1.75 (m, 3 H), 1.75 - 1.64 (m, 6 H), 1.64 - 1.36 (m, 4 H), 1.36 - 1.15 (m, 5 H), 1.15 - 0.95 (m, 8 H), 0.87 (s, 9 H), 0.84 - 0.69 (m, 9 H), 0.05 (s, 6 H)
【０４２３】
δ １３C NMR (500 MHz, pyridine-d５): 218.9, 169.3, 165.5, 163.9, 141.4, 132.4, 121.5, 114.1, 110.6, 103.7, 100.8, 88.3, 85.7, 81.0, 76.4, 75.1, 72.9, 72.0, 70.7, 67.0, 65.6, 55.5, 50.1, 48.5, 46.5, 46.3, 43.3, 39.3, 37.4, 36.8, 34.6, 32.7, 32.6, 32.3, 32.0, 30.0, 27.7, 26.1, 22.8, 22.5, 20.9, 19.5, 18.3, 13.6, 11.9, -4.4. HRMS (+TOF): 計算値 C53H82NaO15Si [M+Na+]: 1009.5315; 実測値: 1009.5304. Δ = -1.1 ppm
【０４２４】
例２７
ＯＳＷ−１アミン１１１の調製
【化１０６】
2014515354.tif 000108
【０４２５】
ＯＳＷ−１カルバメート１０１（１．３ｍｇ、０．００１１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で０．２ｍＬのＴＨＦに溶解した。ピペリジン（８μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応はＴＬＣでモニターし、脱保護が完了するまで更にピリジンを添加した（ピペリジン合計量約４０μＬ、約１時間を要した）。ピペリジンは、反応物をトルエンとともに２回、その後ＣＨＣｌ３と３回共沸することで除去した。粗製生成物のＮＭＲは、予想通りジベンジルフルベン副生物と共に、目的生成物を示した。生成物は、いくつもの溶媒に難溶であったため、精製は困難であった。生成物は粗製のまま使用した。
ＯＳＷ−１アミン１１１:  LRMS (+TOF): 計算値 C５４H８３O１６ [M+２H+]: 1016.5664; 実測値: 1016.3.
【０４２６】
例２８
ＯＳＷ−１アミン１１３の調製
【化１０７】
2014515354.tif 000109
【０４２７】
アルゴン雰囲気下でカルバメート２０（２．１ｍｇ、０．００２２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．２ｍＬ）に溶解した。モルホリン（１．５μＬ、０．０１８ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。反応フラスコを、窒素グローブバッグの中へ移した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（約１．０ｍｇ、３９ｍｏｌ％）を、固体として反応物に添加した。淡黄色反応物をアルゴン雰囲気下、常温で７５分間撹拌した。水を一滴添加し、反応物を減圧下で濃縮した。化合物はＤＭＳＯに溶解しないので、粗生成物のＮＭＲをピリジン中で測定した。ＮＭＲとＬＣＭＳ分析は、アミン生成物が粗製混合物の主要生成物であることを示した。遊離アミン化合物（１１３）は、化合物の低い溶解度のため精製せずにセファロース４Ｂ樹脂との結合に使用した。収率は、定量的であると推定された。
ＯＳＷ−１アミン１１３：LRMS (-TOF): 計算値 C47H71N2O15 [M+CH2O2-]: 903.4859; 実測値: 903.55。
【０４２８】
例２９
ＯＳＷ−１固体相樹脂１１７の調製
【化１０８】
2014515354.tif 000110
【０４２９】
０．１２ｍＬのＮＨＳ活性化セファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗ（商標）（１６〜２３μｍｏｌ／ｍＬ水切りした樹脂、ＧＥヘルスケア社）を、広口の１０００μＬピペットチップからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）管フィルターカップに充填した。樹脂は、低速遠心分離により０．３ｍＬのｄ５−ピリジンで３回洗浄した。その後、アミン化合物１１７を０．３ｍＬのｄ６−ＤＭＳＯに溶解し、洗浄した樹脂に移した。反応物を、常温で約１６時間振盪しながらインキュベートした。約１６時間後、ＬＣＭＳにより検出可能な可溶化合物は残っていなかった。反応物を遠心分離して溶液を樹脂から分離した。ｄ５−ピリジン通過画分のＮＭＲ分析から、アミン化合物（１１７）がないことが確認された。この樹脂に、０．３ｍＬの５％エタノールアミンのＤＭＳＯ溶液を添加し、常温で４時間インキュベートした。その後、樹脂を遠心分離して５％エタノールアミン溶液を除去し、０．５ｍＬのＤＭＳＯで３回洗浄した。樹脂は使用まで−２０℃の乾燥下で保存した。
【０４３０】
例３０
ＯＳＷ−１アミン１１４の調製
【化１０９】
2014515354.tif 000111
【０４３１】
アルゴン雰囲気下でカルバメート６ｃ（２．４ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．２ｍＬ）に溶解した。モルホリン（２．０μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。反応フラスコを、窒素グローブバッグの中へ移した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（約０．４ｍｇ、１６ｍｏｌ％）を、固体として反応物に添加した。淡黄色反応物をアルゴン雰囲気下、常温で７０分間撹拌した。水を一滴添加し、反応物を減圧下で濃縮した。３〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２濃度勾配でのシリカゲルピペットクロマトグラフィにより、わずかに純度の低い遊離アミン化合物１１４（２．０ｍｇ、約９５％）が白っぽい固体として得られた。
【０４３２】
ＯＳＷ−１アミン１１４:  1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.37 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.29 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.01 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.17 - 6.09 (m, 1 H), 5.39 - 5.27 (m, 2 H), 4.97 - 4.88 (m, J = 7.6, 7.6 Hz, 1 H), 4.81 - 4.67 (m, 2 H), 4.64 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 4.37 - 4.16 (m, 3 H), 4.10 (s, 1 H), 4.07 - 3.97 (m, 2 H), 3.94 - 3.63 (m, 8 H), 3.62 - 3.50 (m, 2 H), 3.49 - 3.26 (m, 3 H), 2.91 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 2.50 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 1.87 - 0.70 (m, 34 H)
【０４３３】
例３１
３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ＯＳＷ−１カルバメート１１０、１２０の調製 
【化１１０】
2014515354.tif 000112
【０４３４】
アルゴン雰囲気下でＯＳＷ−１（５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を窒素グローブバッグへ移した。塩化銅（Ｉ）（約１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）をＯＳＷ−１へ添加し、アルゴン雰囲気下で反応物をＤＭＦ（０．１ｍＬ）に溶解した。Ａｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼンイソシアネート（７ｍｇ）を乾燥したバイアルに入れ、ＤＭＦ（０．２９ｍＬ）に溶解して、試薬原液を調製した。０．１ｍＬのＡｌｌｏｃ−（Ｎ）−ジアミノメチルベンゼンイソシアネート試薬原液（２．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を常温でシリンジによりＯＳＷ−１溶液に添加し１５時間撹拌した。初期反応物は淡緑色であり、イソシアネート添加の約４０分後に黄色いやや不透明な外見となった。反応物を約１０ｍＬのクロロホルムで希釈し、水、その後食塩水で洗浄した。淡褐色の混濁した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。精製前のＴＬＣは数個のスポットが共溶出して不明瞭であった。精製後のＴＬＣは、出発物質と２つの新しい上部Ｒｆスポットの３つの明瞭なスポットに分離した。反応物は、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／２プレート）を使用してｐＴＬＣにより精製した。更に、９５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏで均一濃度溶出で、ＺｏｒｂａｘＣ−１８ＳＢカラム（Ｉ．Ｄ．９．４ｍｍ、３．９ｍＬ／ｍｉｎ）でのセミ分取逆相ＨＰＬＣにより精製を行い、１２０（１．１ｍｇ、１７％、３５％ｂｏｒｓｍ）および１１０（１．１ｍｇ、１７％、３５％ｂｏｒｓｍ）を白色固体として得た。
【０４３５】
３−ＴＢＳ−ＯＳＷ−１カルバメート１２０:  Rf (5% MeOH/CH2Cl2) = 0.39. 1H NMR (600 MHz, CD3CN) δ = 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.98 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 6.91 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 6.00 - 5.90 (m, 3 H), 5.34 - 5.26 (m, 2 H), 5.19 (d, J = 9.1 Hz, 1 H), 5.01 - 4.91 (m, 2 H), 4.77 - 4.68 (m, 2 H), 4.56 - 4.51 (m, 2 H), 4.24 - 4.13 (m, 4 H), 4.01 (d, J = 6.3 Hz, 1 H), 3.97 (dd, J = 5.4, 12.4 Hz, 1 H), 3.93 - 3.85 (m, 4 H), 3.80 - 3.73 (m, 2 H), 3.71 - 3.65 (m, 2 H), 3.61 (d, J = 5.0 Hz, 1 H), 3.52 - 3.33 (m, 4 H), 3.20 (d, J = 5.1 Hz, 1 H), 2.90 - 2.82 (m, 1 H), 2.52 - 2.42 (m, 1 H), 2.08 - 2.02 (m, 2 H), 1.86 - 1.76 (m, 3 H), 1.76 - 1.67 (m, 3 H), 1.67 - 1.62 (m, 3 H), 1.62 - 1.40 (m, 8 H), 1.40 - 1.15 (m, 7 H), 1.11 - 1.05 (m, 3 H), 1.02 - 0.96 (m, 3 H), 0.92 - 0.84 (m, 9 H), 0.82 - 0.72 (m, 9 H), 0.07 - 0.00 (m, 6 H)
【０４３６】
３−ＴＢＳ−ＯＳＷ−１カルバメート１１０：Rf (5% MeOH/CH2Cl2) = 0.32. 1H NMR (600 MHz, CD3CN) δ = 7.95 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 6.98 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 6.91 (d, J = 7.9 Hz, 2 H), 5.99 - 5.93 (m, 2 H), 5.33 - 5.27 (m, 2 H), 5.21 - 5.16 (m, 1 H), 4.99 - 4.92 (m, 2 H), 4.75 - 4.69 (m, 2 H), 4.53 (td, J = 1.6, 5.4 Hz, 2 H), 4.26 - 4.12 (m, 2 H), 4.01 (d, J = 6.3 Hz, 1 H), 3.97 (dd, J = 5.6, 11.9 Hz, 1 H), 3.92 - 3.86 (m, 4 H), 3.80 - 3.73 (m, 1 H), 3.71 - 3.65 (m, 1 H), 3.61 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 3.50 - 3.42 (m, 2 H), 3.37 (dd, J = 10.3, 11.7 Hz, 1 H), 3.20 (d, J = 3.8 Hz, 1 H), 2.89 - 2.83 (m, 1 H), 2.51 - 2.43 (m, 1 H), 1.85 - 1.77 (m, 4 H), 1.76 - 1.67 (m, 3 H), 1.67 - 1.62 (m, 3 H), 1.62 - 1.41 (m, 4 H), 1.38 - 1.15 (m, 4 H), 1.07 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 1.06 - 1.01 (m, 1 H), 1.01 - 0.97 (m, 3 H), 0.91 - 0.84 (m, 9 H), 0.82 - 0.78 (m, 6 H), 0.77 - 0.73 (m, 3 H), 0.06 - 0.02 (m, 6 H)
【０４３７】
例３２
ＯＳＷ−１カルボニル−イミダゾール１２５の調製
【化１１１】
2014515354.tif 000113
【０４３８】
ＯＳＷ−１ニトロフェニルカーボネート１１５（３．０ｍｇ、０．００２９ｍｍｏｌ）をジオキサン：Ｈ２Ｏの９：１混合物に溶解した。触媒量のイミダゾールを添加した。反応物を約１時間を撹拌した。反応物をＣＨＣｌ３で希釈し、Ｈ２Ｏその後食塩水で洗浄し、最後にＮａ２ＳＯ４で乾燥した。ｐＴＬＣ（８％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）。この反応の目的生成物であるＯＳＷ−１の他に、１２５も生成した（約１ｍｇ、約３０％）。
【０４３９】
３−カルボニル-イミダゾリル−ＯＳＷ−１１２５:  1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ = 8.13 - 8.08 (m, 1 H), 8.02 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.46 (t, J = 1.4 Hz, 1 H), 7.02 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 7.01 - 6.99 (m, 1 H), 5.43 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 4.87 - 4.82 (m, 1 H), 4.77 - 4.67 (m, 2 H), 4.61 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.21 (s, 1 H), 4.01 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.92 (dd, J = 5.0, 11.4 Hz, 1 H), 3.90 - 3.85 (m, 5 H), 3.77 (dd, J = 4.1, 12.4 Hz, 1 H), 3.69 - 3.64 (m, 3 H), 3.64 - 3.51 (m, 2 H), 3.47 - 3.38 (m, 2 H), 3.32 - 3.23 (m, 2 H), 2.92 - 2.79 (m, J = 7.8 Hz, 1 H), 2.55 - 2.41 (m, 3 H), 1.86 - 1.65 (m, 6 H), 1.65 - 1.43 (m, 4 H), 1.39 - 1.14 (m, 7 H), 1.13 - 1.02 (m, 7 H), 1.02 - 0.85 (m, 2 H), 0.84 - 0.74 (m, 9 H)
【０４４０】
例３３
１２８、１２９、１３０の調製
【化１１２】
2014515354.tif 000114
【０４４１】
Ｆｍｏｃ−β−アラニン酸塩化物（３．５６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を減圧下で３０分間乾燥した。ＯＳＷ−１（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．１６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の４ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を０℃に冷却した。９を０．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ＯＳＷ−１溶液に注入した。７％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２中のＴＬＣは、反応が完了していないことを示し、更に９の０．８等量を添加した。生成物は、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２中のピペットカラムクロマトグラフィで精製した。溶存シリカゲルのため、収量は１２８が５．４ｍｇ（４０％）、１２９が４．７ｍｇ（３５％）、１３０が６．７ｍｇ（５０％）と実際より多かった。生成物は、８０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏの均一濃度溶出でＺｏｒｂａｘＣ−１８ＳＢカラム（Ｉ．Ｄ．９．４ｍｍ、３．９ｍＬ／ｍｉｎ）でのセミ分取逆相ＨＰＬＣにより更に精製した。
【０４４２】
ＯＳＷ−１エステル１２８:  1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ8.10 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.5, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 8 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.38 (br s, 1H), 5.29 (br s, 1H), 4.93 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.72 (br s, 1H), 4.64 (br s,1H), 4.38 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.17 (m, 4H), 3.88-3.67 (m, 11H), 3.47-3.37 (m, 8H), 2.96 (d, J =5.5 Hz, 1H), 2.70 (q, J = 7.5, 1H), 2.53 (br s, 2H), 2.49 (d, J = 4 Hz, 2H), 2.33 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 2.20 (m, 3H), 2.10-2.07 (m, 2H), 1.88-1.75 (m, 8H), 1.53 (s, 35H), 1.25 (s, 18H), 1.04-1.02 (m, 17H), 0.80-0.75 (m, 23H)
【０４４３】
ＯＳＷ−１エステル１２９:  1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ8.08 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 7 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7 Hz, 2H), 7.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 9 Hz, 2H), 5.33 (d, J = 5 Hz, 2H), 5.02-4.97 (m, 2H), 4.77 (d, J = 6 Hz, 1H), 4.71 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.17 (m, 4H), 3.92-3.68 (m, 9H), 3.54-3.44 (m, 6H), 3.27 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.19 (q, J = 7.5, 1H), 2.77 (q, J = 7 Hz, 1H), 2.58 (br s, 2H), 2.29-2.11 (m, 8H), 1.85-1.82 (m, 5H), 1.06-1.03 (m, 11H), 0.83 (s, 3H), 0.75 (t, J = 6.5 Hz, 7H)
【０４４４】
ＯＳＷ−１エステル１３０:  1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ8.02 (d, J = 4 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.55 (t, J = 7 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 9 Hz, 2H), 5.31 (br s, 1H), 5.23 (br s, 1H), 5.12 (br s, 2H), 4.69 (br s, 2H), 4.34 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.18-4.14 (m, 3H), 3.88-3.30 (m, 15H), 2.72 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 2.46-1.42 (m, 20H), 1.06-0.74 (m, 17H)
【０４４５】
例３４
ＯＳＷ−１カルバメート１３１、１３２の調製
【化１１３】
2014515354.tif 000115
【化１１４】
2014515354.tif 000116
【０４４６】
アルゴン雰囲気下、ＯＳＷ−１（２５ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を乾燥した５ｍＬフラスコに充填した。ベンジルイソシアネート（４．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を別の乾燥フラスコに秤量し、０．５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解した。ピリジン溶液をシリンジでＯＳＷ−１を含有するフラスコに添加し、２０時間撹拌した。１００％ＥｔＯＡｃ中のＴＬＣは複数のスポットを示した。溶媒を減圧除去した。生成物は、ＣＨ２Ｃｌ２中２〜４％ＭｅＯＨの濃度勾配の洗液４ｘ１０ｍＬを使用して、ピペットでカラムクロマトグラフィにより精製した。カラムに３回通して、純粋な生成物を得た。
【０４４７】
カルバメート１３１：1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ=8.08 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.34 - 7.24 (m, 5H), 6.91 (d, J = 9 Hz, 2H), 5.33 (d, J = 5 Hz, 1H), 5.06 - 5.01 (m, 2H), 4.83 (m, 1H), 4.78 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.70 (br s, 1H), 4.36 (br s, 2H), 4.27 (dd, J = 11.5, 4.5 Hz, 1H), 4.20 (s, 2H), 3.92 - 3.8 (m, 6H), 3.77 (t, J = 11 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 6 Hz, 1H), 3.53 - 3.45 (m, 3H), 3.28 (d, J = 8 Hz, 1H), 2.79 (q, J = 8 Hz, 1H), 2.28 - 2.12 (m, 4H), 1.98 (s, 4H), 1.83 (m, 4H), 1.76 - 1.72 (m, 1H), 1.64 - 1.46 (m, 14H), 1.31 - 1.20 (m, 6H), 1.08 - 1.03 (m, 9H), 0.95 (m, 1H), 0.84 (s, 4H), 0.74 (t, J = 6.5 Hz, 7H)
【０４４８】
例３５
水素化物１３３の調製
【化１１５】
2014515354.tif 000117
【化１１６】
2014515354.tif 000118
【０４４９】
ＯＳＷ−３（２．０ｍｇ、０．００２３ｍｍｏｌ）を、０．５ｍＬＭｅＯＨに溶解した。反応物に水素ガスを通気し、その後反応物の雰囲気をアルゴンで置換した。１０％パラジウム炭素（約０．２ｍｇ、約０．０００２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を水素雰囲気下に配置した。反応物を４５分間撹拌した。反応物をセライトパッドでろ過してＰｄ／Ｃを除去し、ＭｅＯＨで洗浄した。反応物を濃縮し、４〜１２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３の濃度勾配でシリカゲルピペットカラムでの精製を行った。１３３（約１．０ｍｇ、約５０％収率）は白色固体として得られた。
【０４５０】
例３６
ＯＳＷ−１類似体の結合
ＯＳＷ−１および例９〜３５で得られたＯＳＷ−１類似体の特性を、それぞれトリチウム標識した２５−ＯＨＣおよびＯＳＢＰ１−ｍｙｃ−ｈｉｓまたはＯＲＰ４Ｌ−ｍｙｃ−ｈｉｓのどちらかを使用して直接および競合結合試験により in vitro で調べた。方法は、前記の一般的方法の欄に記載した。結果を表１に示した。データが得られない項目は、「−−」と記載した。
【０４５１】
【表１】
2014515354.tif 000119
【０４５２】
例３７
ＯＳＷ−１類似体による増殖抑制
ＯＳＷ−１および例９〜３５で得られたＯＳＷ−１類似体の特性を、野生型（ｐ２１＋／＋）およびＰ２１欠損（ｐ２１−／−）ＨＣＴ−１１６細胞を使用して増殖抑制試験により in vitro で調べた。前記一般的方法の欄に述べた方法を用いた。結果を表２に示した。データが得られない項目は、「−−」と記載した。
【０４５３】
【表２】
2014515354.tif 000120
【０４５４】
例３８
ＯＳＷ−１類似体による増殖抑制
ＯＳＷ−１および例９〜３５で得られたＯＳＷ−１類似体の特性を、野生型Ａ５４９細胞を使用した増殖抑制試験で in vitro で調べた。基本的には、ＨＣＴ−１１６細胞を使用した試験法に関して一般的方法の欄に記載したような方法で行った。結果を表３に示した。データが得られない項目は、「−−」と記載した。
【０４５５】
【表３】
2014515354.tif 000121
【０４５６】
均等物
本発明の様々な実施態様を記載したが、本発明の要旨を超えることなく他の実施態様および実装態様が可能であることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は、添付の請求の範囲およびそれらの均等物に鑑みる以外に制限されることはない。
【０４５７】
参照による組み込み
本明細書に特に記載がない限り、本明細書に記載されたすべての特許および特許出願公報はその全体を参照により本明細書に組み込むものである。
【図１Ａ】
2014515354.tif 000143
【図１Ｂ】
2014515354.tif 000144
【図２Ａ】
2014515354.tif 000145
【図２Ｂ】
2014515354.tif 000146
【図２Ｃ】
2014515354.tif 000147
【図２Ｄ】
2014515354.tif 000148
【図２Ｅ】
2014515354.tif 000149
【図３Ａ】
2014515354.tif 000150
【図３Ｂ】
2014515354.tif 000151
【図３Ｃ】
2014515354.tif 000152
【図３Ｄ】
2014515354.tif 000153
【図３Ｅ】
2014515354.tif 000154
【図３Ｆ】
2014515354.tif 000155
【図４Ａ】
2014515354.tif 000156
【図４Ｂ】
2014515354.tif 000157
【図４Ｃ】
2014515354.tif 000158
【図４Ｄ】
2014515354.tif 000159
【図４Ｅ】
2014515354.tif 000160
【図５】
2014515354.tif 000161
【図６Ａ】
2014515354.tif 000162
【図６Ｂ】
2014515354.tif 000163
【図６Ｃ】
2014515354.tif 000164
【図７】
2014515354.tif 000165
【国際調査報告】
2014515354.tif 000166
2014515354.tif 000167
2014515354.tif 000168
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