(57)【要約】  本発明は、既知のＤＮＡ配列の側部に位置する未知のＤＮＡ配列を同定する方法である。本発明は、既知のＤＮＡ配列の側部に位置する未知のＤＮＡ配列を決定するために、正確さ、感度および再現性を向上させる。この請求される方法は、トランスジーンの側部に位置する植物ゲノム染色体配列を迅速かつ効率的に同定するための高スループット法として実施することができる。これら未知の配列のさらなる分析法を用いて、トランスジーンの組込みに起因する再配置、挿入および欠失の同定のために、トランスジーン挿入部位を特徴付けることができる。また、染色体フランキング配列の分析法を用いて、染色体上のトランスジーンの位置を同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＤＮＡ中の既知のポリヌクレオチド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列を見出す方法であって、
ａ）既知のポリヌクレオチド配列の一部または全て、および隣接する未知のポリヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡを、１つまたは複数の適切な制限酵素で消化して、複数の消化されたポリヌクレオチド制限断片を生じさせるステップ；
ｂ）５’末端に結合性化学物質が結合したオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、前記消化されたポリヌクレオチド制限断片の相補鎖を合成するステップ；
ｃ）前記結合性化学物質を適切な単離マトリックスに結合させた後、前記消化されたポリヌクレオチド制限断片の前記相補鎖を変性させることによって、前記相補鎖を単離するステップ；
ｄ）前記単離マトリックスに結合した前記単離相補鎖に一本鎖アダプターを連結して、連結された単離相補鎖を生じさせるステップ；
ｅ）前記既知のポリヌクレオチド配列に結合するように設計した第１のＰＣＲプライマーと、前記一本鎖アダプターに結合するように設計した第２のＰＣＲプライマーとを用いて、前記連結された単離相補鎖の第１のＰＣＲ増幅を実行し、第１のＰＣＲアンプリコンを生じさせるステップ；
ｆ）前記第１のＰＣＲアンプリコンの第２のＰＣＲ増幅であって、前記第１のＰＣＲアンプリコンの内部配列を増幅する第２のＰＣＲ増幅を実行して、第２のＰＣＲアンプリコンを生じさせるステップ；ならびに
ｇ）前記第２のＰＣＲアンプリコンを配列決定して、前記未知のポリヌクレオチド配列の配列を確かめるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記単離ＤＮＡが植物ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記未知のポリヌクレオチド配列がトランスジーン境界配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記未知のポリヌクレオチド配列が、既知のポリヌクレオチド配列の側部に位置する染色体配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記未知のポリヌクレオチド配列が、形質をコードする天然の遺伝子配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記既知のポリヌクレオチド配列が、既知のウイルスポリヌクレオチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記既知のポリヌクレオチド配列が、既知のトランスジーンポリヌクレオチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記既知のポリヌクレオチド配列が、既知のトランスポゾンポリヌクレオチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記既知のポリヌクレオチド配列が、形質をコードする遺伝子配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
挿入突然変異生成により単離植物ＤＮＡ内に挿入された既知のポリヌクレオチド配列の染色体位置を同定するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記挿入突然変異生成が、トランスポゾン突然変異生成またはＴ鎖組込み突然変異生成からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
既知のポリヌクレオチド配列の側部に位置する染色体配列からなる未知のポリヌクレオチド配列を特徴付けるために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
トランスジーン挿入部位の前記特徴付けが、染色体配列からなる前記未知のポリヌクレオチド配列内の再配置、挿入、欠失または逆位からなるポリヌクレオチド配列を同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トランスジーンコピー数を決定するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
トランスジェニック植物系統を同定するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
分子マーカーシステムを開発するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
育種戦略を促進するために用いられる、請求項１７に記載の分子メーカーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に植物の分子生物学および生化学の分野に関するものである。本発明は、トランスジーン境界を分析し、かつトランスジーンの側部に位置する染色体配列を決定するための改良されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
挿入されたトランスジーンのゲノム位置および当該トランスジーンに隣接する染色体フランキング配列を決定することは、技術的に難しいものである。既知のＤＮＡ配列の側部に位置する未知のＤＮＡ配列を同定する限界を克服するための種々の方法が開発されている。しかしながら、既知のトランスジーンの側部に位置するゲノム染色体配列を同定するためのこれら従来のＰＣＲ法（ＬＭ−ＰＣＲ（ゲノムウォーキングとも記載される）、ならびに逆ＰＣＲ（ｉ−ＰＣＲ）、熱非対称インタレースＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）、アンカードＰＣＲ（ａ−ＰＣＲ）およびランダムリープライムド（randomly primed）ＰＣＲ（ｒｍ−ＰＣＲ）を含む他の方法等）は、調製中のＤＮＡ損失による検出感度の低さ（大量の鋳型ＤＮＡを必要とする）または特異性の低さが障害となっている。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一般的に使用されている分子生物学的方法である。この方法は、二本鎖鋳型ＤＮＡを変性させ、オリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ鋳型にアニールさせ、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖を伸長させることによって実行される。オリゴヌクレオチドプライマーは、対向する側のＤＮＡ鎖にアニールするように設計され、ＤＮＡポリメラーゼによって生成されるＤＮＡ鎖が、他方のプライマーに対する鋳型鎖となるように配置される。各サイクルが繰り返されて、ＤＮＡ断片が指数関数的に増幅する（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，８００，１５９号）。当業者によるＰＣＲの使用は、ＤＮＡ断片をその後の分析用に増幅および単離するために基本となるものである。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ鋳型を単離および分析するには、フランキングＤＮＡ配列が知られている必要がある。残念ながら、この必要条件により、ＰＣＲ増幅は既知のＤＮＡ配列の領域に制限される。ゲノム内のトランスジーン位置を同定するためにＰＣＲ法を使用するには、生物のゲノム内の未知の染色体位置内にトランスジーンがランダムに挿入されることが障害となる。生物の染色体内におけるトランスジーン位置を同定するには、既知のＤＮＡ配列に隣接して位置する未知のＤＮＡ配列を同定する方法が不可欠である。また、このような方法は、新規な遺伝子配列を同定して新たな形質を同定するために、生物のゲノム内に挿入されたトランスポゾン配列もしくはウイルス配列のゲノム位置を決定するために、または挿入突然変異生成によりゲノム内に挿入されたポリヌクレオチド配列の染色体位置を同定するために、用いることができる。
【０００５】
既知のＤＮＡ配列の側部に位置する未知のＤＮＡ配列による限界を克服するために、種々の方法が開発されている。ゲノムライブラリーを作製し、ＰＣＲ増幅のためにアダプターをＤＮＡ断片にアニールさせる連結媒介（Ligation Mediated）ＰＣＲ（ＬＭ  ＰＣＲ）法が、ＧＥＮＯＭＥ  ＷＡＬＫＥＲ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＫＩＴ（商標）（米国特許第５，５６５，３４０号および米国特許第５，７５９，８２２号参照）として市販されている。別の一般的に用いられている方法が、ＤＮＡを制限酵素により消化し、自己連結させて連続した環とする逆ＰＣＲ反応（SilverおよびKeerikatte (1989), J. Virol., 63:1924-1928参照）である。既知の配列に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、未知のフランキング配列を増幅し解明できる。しかしながら、これらの方法は非効率であり、時間を浪費するという問題がある。これらの方法および他の従来のＰＣＲ法（熱非対称インタレースＰＣＲ［ＴＡＩＬ−ＰＣＲ］、アンカードＰＣＲ［ａ−ＰＣＲ］およびランダムリープライムドＰＣＲ［ｒｍ−ＰＣＲ］が挙げられる）は、調製中のＤＮＡ損失による検出感度の低さ（大量の鋳型ＤＮＡを必要とする）または特異性の低さが障害となっている。
【０００６】
既知のＤＮＡ配列および未知のＤＮＡ配列の双方を含む染色体ＤＮＡ断片を精製することによって検出感度を高めることができる方法を開発することにより、既知のＤＮＡ配列に隣接して位置する未知のＤＮＡ領域を検出し特徴付ける高感度の方法を得ることができる。線形増幅媒介（Linear Amplification Mediated）ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＭ  ＰＣＲ）法の開発により、これらの目的が達成される（米国特許第６，５１４，７０６号参照）。ＬＡＭ  ＰＣＲ法は、配列が部分的に知られているだけであるＤＮＡ断片を増幅および分析するのに特に適している。
【０００７】
既知のＤＮＡ配列および未知のＤＮＡ配列の双方を含む染色体ＤＮＡ断片を精製することによって検出感度を高めることができる方法を開発することにより、既知のＤＮＡ配列に隣接して位置する未知のＤＮＡ領域を検出し特徴付ける高感度の方法を得ることができる。ＬＡＭ  ＰＣＲ法の開発により、これらの目的が達成される。ＬＡＭ  ＰＣＲは、既知のＤＮＡ配列に隣接して位置する未知の染色体フランキング配列を分析するために用いられる改良されたＰＣＲ法である。ＬＡＭ  ＰＣＲ法は、既知のＤＮＡ領域またはＲＮＡ領域の側部に位置する未知のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を同定および／または配列決定するために用いることができる。
【０００８】
ＬＡＭ  ＰＣＲ法は、以下のステップからなる。プライマー伸長反応が、鋳型としての染色体ＤＮＡ、および染色体ＤＮＡ内の既知のＤＮＡ配列に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実行される。オリゴヌクレオチドプライマーは、レトロウイルスに特有の配列である長末端反復（ＬＴＲ）配列と相補的であり、オリゴヌクレオチドプライマーの末端はビオチンで標識されている。線形ＰＣＲの一本鎖ＤＮＡ産物を、ストレプトアビジンを固定した磁気ビーズに結合させる。このステップにより、染色体に由来する既知のＬＴＲ配列および未知の配列を含む一本鎖の増幅ＤＮＡ断片が単離される。一本鎖ＤＮＡは、相補鎖を合成することによって二本鎖ＤＮＡに変換される。二本鎖ＤＮＡは、ある配列を認識してその配列にて二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素によって切断される。リンカーカセットと呼ばれる二本鎖ＤＮＡが末端に連結される。続いて、このようにして得た連結産物を鋳型として、ＬＴＲと相補的なプライマーおよびリンカーカセットと相補的なプライマーを共に用いてＰＣＲ反応が行われる。ＬＴＲおよびＬＴＲに隣接する染色体ＤＮＡフランキング配列を含むＤＮＡ断片が増幅される。結果として、今まで知られていなかったレトロウイルス組込み部位を決定することができる。
【０００９】
ＬＡＭ  ＰＣＲ法は現在、既知のＤＮＡ配列に隣接する未知のＤＮＡ配列を分析するのに有効なシステムであると考えられている。ＬＡＭ  ＰＣＲ法の改良および改善が、当技術分野において記載されている（米国特許出願公開第２００７／００３７１３９号およびHarkeyら (2007) Stem Cells Dev., 6月; 16(3): 381-392参照）。
【００１０】
ＬＡＭ  ＰＣＲ法は、米国特許出願公開第２００７／００３７１３９号において改良されて、レトロウイルスを種々の部位に組み込んだ生体サンプルの検出を向上させた。従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法の反応条件で生じた結果は、サンプルの細胞集団中に存在するクローンの実際の状態を反映しなかった。特定のクローンから増幅される断片に偏ることのない、より多くの組込み断片がＰＣＲ増幅される改良法が開発された。このＬＡＭ  ＰＣＲ法の改良により、研究者は、集団における組込み遺伝子を有する細胞の広がりを決定することができ、かつ集団における特定細胞の比率を決定することができた。
【００１１】
また、Harkeyら (2007)は、ＬＡＭ  ＰＣＲ法を最適化したマルチアーム高スループット改良法を記載しており、その検出能力は包括的サンプリングの９０％にまで向上した。改良プロトコルにより総プールサイズを正確に推定できるようになったことから、ベクターを組み込むのに好ましいゲノム位置の大きな挿入部位データを得るための迅速かつ対費用効果の高いアプローチが提供された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、さらに大幅な改良を記載しており、二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせてから、この二本鎖ＤＮＡ断片を消化し、二本鎖ＤＮＡ断片を変性させるステップを省略することによって、従来のＬＡＭ−ＰＣＲのいくつかの課題を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、単離植物ＤＮＡ中の既知のポリヌクレオチド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列を見出す方法であって、既知のポリヌクレオチド配列の一部または全て、および隣接する未知のポリヌクレオチド配列を含む単離植物ＤＮＡを、１つまたは複数の適切な制限酵素で消化して、複数の消化されたポリヌクレオチド制限断片を生じさせるステップ；５’末端に結合性化学物質が結合したオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、消化されたポリヌクレオチド制限断片の相補鎖を合成するステップ；結合性化学物質を適切な単離マトリックスに結合させた後、消化されたポリヌクレオチド制限断片の相補鎖を変性させることによって、相補鎖を単離するステップ；単離マトリックスに結合した単離相補鎖に一本鎖アダプターを連結して、連結された単離相補鎖を生じさせるステップ；既知のポリヌクレオチド配列に結合するように設計した第１のＰＣＲプライマーと、一本鎖アダプターに結合するように設計した第２のＰＣＲプライマーとを用いて、連結された単離相補鎖の第１のＰＣＲ増幅を実行し、第１のＰＣＲアンプリコンを生じさせるステップ；前記第１のＰＣＲアンプリコンの第２のＰＣＲ増幅であって、前記第１のＰＣＲアンプリコンの内部配列を増幅する第２のＰＣＲ増幅を実行して、第２のＰＣＲアンプリコンを生じさせるステップ；ならびに第２のＰＣＲアンプリコンを配列決定して、未知のポリヌクレオチド配列の配列を確かめるステップを含む方法を提供する。
【００１４】
本明細書において開示される本発明の実施形態は、トランスジーン境界配列の単離および同定のための方法である。本発明の実施形態は、ゲノム挿入部位のトランスジーンコピー数および染色体位置を決定するための高スループット用途に容易に適用できる方法である。また、本発明は、１つの反応での複数の挿入部位の同時検出に用いることができる。本発明は、既知のポリヌクレオチド断片の側部に位置する未知のポリヌクレオチド断片の検出について感度および特異性を高めた方法を開示する。さらに、本発明は、任意の標的配列（ウイルス配列、およびトランスポゾン突然変異生成またはＴ鎖組込みにより生じる突然変異生成によりもたらされる挿入突然変異生成部位が挙げられる）に隣接して位置する未知のＤＮＡ配列を検出するために実施することができる。
【００１５】
本発明の実施形態は、部分的に、そのようなフランキング配列、接合配列および挿入配列を用いたトランスジェニックイベントの同定に関するものである。本発明によれば、挿入されたトランスジーンＤＮＡおよびその境界に及ぶアンプリコンを用いる、改良されたＰＣＲ分析法およびＤＮＡ配列決定分析法を用いて、独占所有権のあるトランスジェニック植物系統に由来する、市販されているトランスジェニック植物の品種または系統を検出または同定することができる。
【００１６】
本発明のトランスジーン境界配列および隣接する染色体フランキング配列は、トランスジェニックイベントの診断に役立つものである。これらの配列に基づいて、トランスジェニック植物系統を、染色体フランキング配列およびトランスジーン配列の分析によって、様々な植物遺伝子型で同定することができる。このように、本発明の実施形態は、トランスジェニック植物系統を同定するために用いることができる方法を記載する。
【００１７】
本発明の染色体フランキング配列は、特に、植物育種と関連して、１つまたは複数の注目するさらなる形質を後代に与える目的で、注目するイベントを具える親植物が別の植物系統と交配された後、どの後代植物が与えられたイベントを具えているかを決定するのに有用である。本発明の実施形態は、染色体フランキング配列／接合配列の決定法であり、特に市販されているトランスジェニック植物系統の、育種計画および品質管理に有益である。
【００１８】
さらに、染色体フランキング配列の同定法を用いて、各トランスジェニック挿入体のゲノム位置を具体的に同定することができる。この情報を用いて、各イベントに特異的な分子マーカーシステムを開発することができる。この分子マーカーシステムは、育種戦略を促進するために、そして連鎖データを確立するために、用いることができる。本発明の実施形態は、分子マーカーシステムである。
【００１９】
またさらに、染色体フランキング配列情報を用いて、トランスジーン組込みプロセス、ゲノム組込み部位特性、イベント分類、トランスジーンおよびそのフランキング配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に、ジーンサイレンシング、トランスジーンメチル化パターン、位置効果および能力発現関連要素（例えばＭＡＲＳ（マトリックス付着領域））等に関連するもの）を研究し、特徴付けることができる。
【００２０】
本発明の方法を用いて、トランスジェニック生物から未知のポリヌクレオチドの配列を得て、確かめることができる。本発明の任意の方法において、サンプルはゲノムＤＮＡであってよく、トランスジェニック生物はトランスジェニック植物であってよい。本発明の任意の方法によって分析されるトランスジェニック植物は、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、ソルガム、芝草、サトウキビ、コムギ、アルファルファ、バナナ、ブロッコリ、マメ類、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、カンキツ類、ワタ、ウリ類、ユーカリノキ、アマ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ライムギ、イネ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サツマイモ、タバコ、トマト、観賞植物、潅木、ナッツ、雑穀および牧草からなる植物から選択されてよい。
【００２１】
本発明の方法を用いて、非トランスジェニック生物から未知のポリヌクレオチドの配列を得て、確かめることができる。本発明の任意の方法において、サンプルはゲノムＤＮＡであってよく、非トランスジェニック生物は植物であってよい。本発明の任意の方法によって分析される植物は、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、ソルガム、芝草、サトウキビ、コムギ、アルファルファ、バナナ、ブロッコリ、マメ類、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、カンキツ類、ワタ、ウリ類、ユーカリノキ、アマ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ライムギ、イネ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、テンサイ、サツマイモ、タバコ、トマト、観賞植物、潅木、ナッツ、雑穀および牧草からなる植物から選択されてよい。本発明の任意の方法において、既知のポリヌクレオチド配列に隣接する未知のポリヌクレオチド配列は、農学的に注目する天然のポリヌクレオチドであってよい。
【配列表フリーテキスト】
【００２２】
配列番号１は、４４６８−３ＰＡ０１−２Ｂｔｎと表記される５’ビオチン化プライマーを示す。
配列番号２は、ＺＣ−Ａｄｐ−０１と表記される５’リン酸化アダプターを示す。
配列番号３は、ＰＡＴ−ＩｎｖＰｒｉＦと表記されるプライマーを示す。
配列番号４は、Ｚｎ＿Ａｄｔ＿ＰＣＲ＿０１と表記されるプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において使用される場合、用語「含む」、「含んでいる」、「具える」、「具えている」、「有する」、「有している」、「包含する」もしくは「包含している」、またはそれらの他の任意の変形は、非排他的である、または非限定的であることを意図している。例えば、構成要素の記載を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置は、それらの要素にのみ必ずしも限定されるというわけではなく、明示的に記載されていない他の構成要素、あるいはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置に固有のものでもない他の構成要素を含んでもよい。さらに、反対の意味で明記されない限り、「または（もしくは）」は包含的なまたは（もしくは）であることを指すのであって、排他的なまたは（もしくは）であることを指すのではない。例えば、条件ＡまたはＢが満たされるのは、Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの双方が真である（または存在する）、のいずれか１つによってである。
【００２４】
また、本発明の構成要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要素または成分の事例（すなわち、存在）の数に関して非限定的であることを意図している。従って、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むと読まれるべきであり、構成要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数であることを意図していない限り、複数も包含する。
【００２５】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇ等、または天然に存在するヌクレオチド類似体もしくは人工ヌクレオチド類似体）のポリマー（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの表現（例えば文字列等））を指すために用いられ、関連する前後関係に応じて決まるものである。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、特に明記されない限り、または前後関係によって明らかに否定されない限り、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは本発明の他の新規な核酸分子に関して用いられる。所定のポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオチドは、任意の特定のヌクレオチド配列から決定することができる。核酸は、一本鎖の形態であっても二本鎖の形態であってもよい。
【００２６】
用語「単離された」は、核酸またはタンパク質等の物質であって、（１）天然に存在する環境において見出されるような物質に通常は付随している成分を、またはそのような物質と通常は相互作用している成分を実質的または本質的に含まない物質、あるいは（２）自然環境中にある場合に、人間の意図的な介入によって組成物に改変された、かつ／または本来の場所ではなく、細胞内の場所に置かれた物質、を指す。
【００２７】
用語「植物」は、葉、幹、根、花、花粉および種子等の植物細胞および植物組織を含むが、これらに限定されない植物体または植物の部分を含むものである。本発明で用いることができる植物の綱は、突然変異生成を受け入れやすい、高等植物から下等植物の綱（被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ類および多細胞藻類を含む）とほぼ同程度に広いものである。
【００２８】
用語「プロモーター」は、一般にＲＮＡを生じさせるために構造遺伝子を転写させるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモーターは、遺伝子の５００塩基対上流の領域に、転写開始部位に近接して配置されている。プロモーターが誘導プロモーターであれば、外因性の誘発剤または内因性の誘発剤に応答して転写速度が上昇または低下する。対照的に、プロモーターが構成プロモーターであれば、転写速度は誘発剤によってより低い程度に調節される。
【００２９】
用語「トランスジェニック植物」は、形質転換された植物細胞またはプロトプラストに由来する植物またはその後代であって、植物ＤＮＡが、天然の同種の非トランスジェニック植物に本来存在しない、導入された外因性ＤＮＡ分子を含む、植物またはその後代を指す。
【００３０】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、形質転換（すなわち、異種ＤＮＡの宿主細胞内への導入）の目的で用いることができる任意の組換えポリヌクレオチド構築体を指す。
【００３１】
用語「相補鎖」は、ある分子中の各塩基が他の鎖中の相補的塩基と対になって、安定したらせん形の二本鎖分子を形成する核酸配列または分子を説明する。それぞれの鎖は相補鎖と呼ばれる。
【００３２】
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、増幅されるヌクレオチド配列の５’側または３’側と相補的である、約１０から約５０ヌクレオチド長の線形オリゴヌクレオチドの配列である。一対のオリゴヌクレオチドプライマー（一方のプライマーは、増幅されるポリヌクレオチド断片の５’側のヌクレオチド配列と相補的であり、他方のプライマーは、増幅されるポリヌクレオチド断片の３’側の位置のヌクレオチド配列と相補的である）を用いて、ポリヌクレオチド配列を増幅することができる。当業者であれば、一対のオリゴヌクレオチドプライマーが、核酸の対向する鎖と相補的であり、かつ増幅されるポリヌクレオチド配列の側部に位置する、２つのオリゴヌクレオチドを意味することを理解する。
【００３３】
用語「アダプター」は、ポリヌクレオチド分子と平滑末端または粘着末端のいずれかで結合され得る短いオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドセグメントを説明する。アダプターは、ポリヌクレオチド断片内に制限酵素認識配列を含んでよい。アダプターの大きさは、約１０から約１５０ヌクレオチド長の間で変化してよい。アダプターは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００３４】
用語「連結された単離相補鎖」は、連結反応により、既知のポリヌクレオチド配列および隣接する未知のポリヌクレオチド配列の一部または全てを含む第２のＤＮＡ断片に結合されたアダプターを含むポリヌクレオチド断片を指す。「連結された単離相補鎖」は、一方の末端ではアダプターが、他方の末端では既知のポリヌクレオチド配列が、側部に位置している。
【００３５】
連結反応は、酵素（一般に、ＤＮＡの隣接する３’−ＯＨ末端と５’−Ｐ末端との間でホスホジエステル結合の形成を触媒するリガーゼと呼ばれる）によって完了する。
【００３６】
植物ＤＮＡの単離は、当技術分野において知られている方法によって達成することができる。一般に、植物ＤＮＡの単離により、脂質、タンパク質およびその他の細胞残屑を含まない精製された植物ＤＮＡを得ることになる。好ましい植物ＤＮＡ単離法は、溶解、加熱、アルコール沈殿、塩析沈殿、有機抽出、固相抽出、シリカゲル膜抽出、ＣｓＣｌ勾配精製、およびそれらの任意の組合せ、を含む。より好ましい植物ＤＮＡ単離法は、ＤＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）として市販されるシリカゲル膜技術またはセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）ＤＮＡ単離プロトコルである。
【００３７】
制限酵素消化（制限エンドヌクレアーゼ消化とも呼ばれる）は、ヌクレアーゼ酵素を用いてポリヌクレオチド配列を切断する場合に実行される。当業者が利用できる数多くの制限酵素がある。www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/overview.aspに記載されるように、４つの分類を用いて制限酵素が特徴付けられている。これらの分類は、サブユニット組成、切断位置、配列特異性および補因子要件に基づいてなされる。
【００３８】
Ｉ型酵素は、認識／結合配列から距離を置いた（＞１，０００ｂｐ離れている）位置でＤＮＡをランダムに切断する。Ｉ型酵素によって結合される認識部位は、非対称的である。結果として、これらの酵素は、離散的な制限断片および明確なゲルバンドパターンをもたらさないため、遺伝子クローニングには用いられない。Ｉ型酵素は多機能的であり、Ｉ型制限酵素を構成する様々なサブユニットは様々な活性に関与している（すなわち、サブユニットＨｓｄＲは制限をコードし、サブユニットＨｓｄＭはＤＮＡのメチル化をコードし、サブユニットＨｓｄＳは認識配列の特異性をコードしている）。
【００３９】
ＩＩ型酵素は、認識配列付近の位置で、ＤＮＡを消化する。この酵素は二量体として機能し、サブユニットはセンス鎖に結合し、サブユニットの第２コピーは、通常４から８のヌクレオチド長であるパリンドローム配列にてアンチセンス鎖に結合する。ＤＮＡに結合するＩＩ型二量体は、対称的なＤＮＡ配列に結合するホモ二量体、または非対称的なＤＮＡ配列に結合するヘテロ二量体のいずれであってもよい。酵素は、連続した配列または不連続な配列のいずれであっても認識することができる。ＩＩ型酵素は市販されており、一般的にＤＮＡ分析および遺伝子クローニングに用いられている。この酵素の広範な使用を受けて異なる制限断片が生成し、アガロースゲル上で分離することができる。
【００４０】
ＩＩ型酵素は、アミノ酸配列の類似性が高度に異なっている関連のないタンパク質の集合である。ＩＩ型酵素は、サフィックス付の文字を用いて表されるサブカテゴリに分けられている。ＩＩＢ型制限酵素は、複数のサブユニットを含む多量体である。この酵素は、認識配列の両側部を切断することによって認識配列を取り出すものである。ＩＩＥ型制限酵素およびＩＩＦ型制限酵素は、それらのコピーの認識配列と相互作用した後、ＤＮＡを切断するものである。ＩＩＧ型制限酵素は、１つのサブユニットから構成されるものである。この酵素のＮ末端部分は、ＤＮＡ切断ドメインおよびＤＮＡ修飾ドメインを有する。この酵素のＣ末端部分は、ＤＮＡ配列結合ドメインを有する。この酵素は、認識配列の外側を切断する。ＩＩＭ型制限酵素は、メチル化されたＤＮＡを認識して切断するものである。ＩＩＳ型制限酵素は二量体として機能し、非パリンドロームの非対称な認識部位の外側の位置にてＤＮＡを切断するものである。この酵素は、２つの異なるドメイン（一方がＤＮＡ結合用で他方がＤＮＡ切断用）から構成される。
【００４１】
ＩＩＩ型酵素は、制限−修飾組合せ型酵素である。この酵素は２つの別々の非パリンドローム配列を認識し、認識配列の外側を切断する。ＩＩＩ型酵素は、切断を達成するために、同じＤＮＡ分子内に逆向きの２つの認識配列を必要とする。
【００４２】
ＩＶ型酵素は、メチル化されたＤＮＡを認識するものである。例として、大腸菌（E. coli）のＭｃｒＢＣ系およびＭｒｒ系が挙げられる。
【００４３】
当技術分野において、制限酵素によりポリヌクレオチドを消化する代わりに用いることができる、ポリヌクレオチドを切断するための他の方法が知られており、溶解、配列特異的な切断剤、非配列特異的な切断剤、音波処理、せん断応力、フレンチプレス、ＵＶ照射、イオン化放射およびＤＮａｓｅからなる群のいずれかである。また、前述した制限酵素に対し、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはフラップエンドヌクレアーゼまたはこれら酵素の任意の組合せを用いて、単離ＤＮＡを消化することができる。単離した植物ＤＮＡを消化するための好ましい方法は、植物内に形質転換されたトランスジーン配列の外側を切断することがわかっているＩＩ型制限酵素の使用である。単離した植物ＤＮＡを消化するための別の好ましい方法は、トランスジーン配列の末端付近の部位にて切断することがわかっているＩＩ型制限酵素の使用である。
【００４４】
プライマー伸長反応を用いて、既知のポリヌクレオチド配列および隣接する未知のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖が生成される。プライマー伸長法によれば、未知のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖が生成されることになる。ＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖は、ポリメラーゼがＤＮＡまたはＲＮＡの既知の鋳型鎖と結合したオリゴヌクレオチドプライマーと複合した後にポリメラーゼによって生成され、ＤＮＡまたはＲＮＡの鋳型鎖に沿って伸長する。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡの鋳型鎖内の既知のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列と特異的に結合するように設計されている。伸長反応用の多種類のポリメラーゼが市販されている。Ｔ４ポリメラーゼ、ＴＡＱポリメラーゼ、ＰＦＵポリメラーゼまたは逆トランスクリプターゼは、一般的に用いられるポリメラーゼのいくつかの非限定的な例である。各ポリメラーゼは、最適な反応条件について、特別なバッファ要件があり、特定温度にて機能する。好ましいプライマー伸長反応は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑキットとして市販されているＴＡＱポリメラーゼを使用するものである。
【００４５】
単離マトリックス（磁気ビーズベースのシステム等）に付着する結合性化学物質が、プライマー伸長反応による一本鎖ＤＮＡ産物を単離するために用いられる。プライマー増幅反応によって生成されたＤＮＡ鎖を、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用によりゲノムＤＮＡから精製することができる。ビオチン化は、生体分子の単離、分離、濃縮およびさらなる下流プロセスならびに分析を可能にするために広く使われている（例えば、米国特許第５，９４８，６２４号、米国特許第５，９７２，６９３号および米国特許第５，５１２，４３９号に方法が記載されている）。第一級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、炭水化物、チロシンおよびヒスチジン側鎖ならびにシアニジンおよびシトシン塩基のような様々な官能基を標的とする、種々の市販のビオチン化試薬がある。以後の分析のためにゲノムから特定のＤＮＡ配列を分離するための、ビオチン（または等価物（例えばジゴキシゲニン））で官能化された短い、配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、および磁気ビーズの使用は、多様な使い方がある。ビーズベースの方法を用いた単離により、特定の配列についてＤＮＡ集団のエンリッチメントが可能となり、全ゲノム相補ＤＮＡの存在下では行うことができなかった以後の分析を実行することができる。このようなビーズベースの方法は、高スループットを自動化するのに適している。
【００４６】
ビオチン−ストレプトアビジン相互作用が最もよく記載されている結合対であるが、互いに強い親和性のある他の分子が知られている。オリゴヌクレオチドプライマーに含まれてもよい結合性化学物質として、以下が挙げられる：ＡＣＲＹＤＩＴＥ（商標）（アクリルホスホラミダイトに基づく結合性化学物質であり、オリゴヌクレオチドに５’−修飾体として加えることができ、チオール修飾された表面と共有結合反応する）；アルキン修飾体（アジド標識された官能基と反応して、アジドとアルキンのヒュスゲン付加環化反応（クリック反応とも呼ばれる）による安定した結合が形成される）；およびチオール修飾体（対応するリガンドまたは表面（金表面等）と高い親和性をもって結合および相互作用することができる）。これらの分子は、ＤＮＡ配列の精製またはエンリッチメントのために用いることができる。ここで、プライマーを第１の分子で標識し、第２の分子をマトリックス（例えば磁気ビーズ）に結合させて、第１の分子を固定することができる。第１の分子で標識されているプライマーから生じたＤＮＡ鎖は、第２の分子で標識されている固定化マトリックス（例えば磁気ビーズ）を含むカラムにＤＮＡをかけることによって、単離することができる。第２の分子との親和性の結果、第１の分子で標識されているプライマーを含む増幅ＤＮＡ配列が単離される。好ましい結合性化学物質として、アクリル−チオール相互作用、アルキン−アジド相互作用、およびチオール−リガンド相互作用が挙げられる。より好ましい結合性化学物質は、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用である。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語単離マトリックスは、任意の種類の分子が付着され得る表面を指す。好ましくは、単離マトリックスは、反応中に他の成分からすぐに分離し得るように分子が付着することができる不溶性物質である。好ましい単離マトリックスとして、フィルタ、クロマトグラフィー樹脂、ビーズ、磁気粒子、あるいはガラス、プラスチック、金属、１つまたは複数のポリマーおよびそれらの組合せを含む組成物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。より好ましい単離マトリックスは、磁気ビーズベースのシステムである。
【００４８】
アダプターは、一本鎖リガーゼにより固定化一本鎖ＤＮＡと連結することができる。従来から、市販のリガーゼは、二本鎖ＤＮＡ断片を結合することにしか利用できなかった。近年、ＲＮＡリガーゼを用いて一本鎖ＤＮＡ断片を連結することができることが示された（Zhang and Chiang (1995) Nucleic Acids Research, 24(5); 990-991）。好ましい一本鎖リガーゼは、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ１およびＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）ならびにＳｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）として市販されている。より好ましい一本鎖ＤＮＡリガーゼは、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＴＲＬ）である。
【００４９】
Brautigmaら、2010によって記載されるように、ＤＮＡ配列分析法を用いて、単離および増幅された断片のヌクレオチド配列を決定することができる。増幅された断片について、単離し、ベクター内にサブクローニングし、そしてチェーンターミネーター法（サンガー配列決定法とも呼ばれる）または色素ターミネーター配列決定法を用いて配列決定することができる。また、アンプリコンは、次世代シーケンシング（Next Generation Sequencing）で配列決定することができる。ＮＧＳ技術はサブクローニングステップを必要とせず、複数の配列決定リードを単一反応で完了することができる。３つのＮＧＳプラットホーム（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＲｏｃｈｅのＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ、ＳｏｌｅｘａのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」の頭字語））が市販されている。また、現在開発されている２つの単一分子配列決定法がある。これらには、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）、およびＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳＭＲＴ）が含まれる。
【００５０】
４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅにより市販されているＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＦＬＸはロングリードＮＧＳであり、エマルジョンＰＣＲおよびパイロシーケンシングを用いて配列決定リードをもたらすものである。３００から８００ｂｐのＤＮＡ断片、または３から２０ｋｂｐの断片を含むライブラリを用いることができる。反応により、１回につき１００万を超える約２５０から４００塩基のリードがもたらされ、総収率を２５０から４００メガ塩基とすることができる。この技術によれば最長のリードがもたらされるが、１回あたりの総配列出力は他のＮＧＳ技術と比較して低い。
【００５１】
Ｓｏｌｅｘａによって市販されているＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＡｎａｌｙｓｅｒはショートリードＮＧＳであり、蛍光色素で標識された可逆性ターミネーターヌクレオチドでの合成アプローチによる配列決定法を用い、固相ブリッジＰＣＲに基づくものである。最長１０ｋｂのＤＮＡ断片を含むペアードエンド配列決定ライブラリの構築を用いることができる。反応により、１億を超える３５から７６塩基長のショートリードがもたらされる。このデータから、１回につき３から６ギガ塩基をもたらすことができる。
【００５２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販されているＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システムは、ショートリード技術である。このＮＧＳ技術は、最長１０ｋｂｐの断片化二本鎖ＤＮＡを用いる。このシステムは、色素が標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの連結およびエマルジョンＰＣＲによる配列決定法を用いて、１０億のショートリードをもたらし、１回あたりの総配列出力は最長３０ギガ塩基となる。
【００５３】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｔＳＭＳおよびＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴは、シーケンス反応にシングルＤＮＡ分子を用いる、異なるアプローチを適用している。ｔＳＭＳ  Ｈｅｌｉｃｏｓシステムでは最長８億のショートリードをもたらし、１回あたり２１ギガ塩基となる。これらの反応は、蛍光色素で標識されたバーチャルターミネーターヌクレオチドを用いて完了する（「合成による配列決定」アプローチと記載されている）。
【００５４】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販されているＳＭＲＴ次世代シーケンシングシステムは、合成によるリアルタイム配列決定法を用いている。この技術により、可逆性ターミネーターによって制限されない結果として、最長１０００ｂｐのリードをもたらすことができる。この技術を用いることで、１日あたり、２倍体ヒトゲノムの１ｘカバレッジに等しい未処理のリードスループットをもたらすことができる。
【００５５】
以下の例は、トランスジーン挿入体のゲノムフランキング配列を単離および同定するために開発された方法を記載する。また、この方法は、トランスジェニックイベントについて、トランスジーンコピー数およびトランスジーンのゲノム位置を決定するために用いることができる。
【００５６】
本発明の実施形態は、以下の例においてさらに明確に述べられている。これらの例は、実例としてのみ与えられているだけであることを理解すべきである。前述の議論およびこれらの例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱しない範囲で、本発明の実施形態に種々の変形および変更をして、これを種々の使用および条件に適応させることができる。このため、本発明の実施形態の種々の変更が、本明細書において示され記載されているものに加えて、前述の記載から当業者にとって明らかである。そのような変更もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。本明細書において示されている各引用の開示は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
（実施例）
【実施例１】
【００５７】
注目する遺伝子の発現カセットおよび選択可能マーカ遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いて、Ｂｉｏｒａｄ遺伝子銃によってトウモロコシ（Zea mays）ｃｖ  Ｈｉ−ＩＩの植物組織を形質転換した。遺伝子を衝撃導入したＩＩ型カルス由来のトランスジェニックトウモロコシの生産：金の粒径およびカルス形態が形質転換率に及ぼす影響（In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant. 36:21-29）。プロトコルを変更した：培地成分、選択薬剤およびタイミングを、形質転換プロセスの効率が向上するように最適化した。プラスミドのＦｓｐ  Ｉ線形化断片を形質転換に用いた。生じた形質転換体は、植物の選択可能マーカ遺伝子発現カセットと連鎖した、注目する遺伝子の発現カセットを含むトランスジェニックトウモロコシ（maize）植物体を生産した。
【実施例２】
【００５８】
ゲノムＤＮＡを、３つの相異するトウモロコシ（maize）イベント（３）−００１、（３）−００８および（３）−００９、ならびに形質転換していないトウモロコシ（maize）対照群から単離した。いくつかの方法（ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）または従来のＣＴＡＢ  ＤＮＡ単離プロトコル等）を用いて、ｇＤＮＡを単離した。ＤＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて決定した。合計２５０ｎｇのｇＤＮＡを、ＴａｑＩ制限酵素で消化した。消化反応物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてさらに精製した。
【実施例３】
【００５９】
単離および精製したｇＤＮＡを用いてプライマー伸長反応を完了した。二重ビオチン標識プライマーを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）で合成し、反応に用いた（配列番号１（４４６８−３ＰＡ０１−２Ｂｔｎ）５’−＼二重ビオチン＼−ＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡ−３’）。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、プライマー伸長によりＤＮＡ鎖を合成した。以下の試薬：２μＬの１０×ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＱバッファ；１．２５μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．８μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ；０．１μＬの１０μＭ  ４４６８−３ＰＡ０１−２Ｂｔｎ；０．１μＬのＰａｔｉｎｕｍ  ＴＡＱ；１４．７５μＬのＨ２Ｏ；１μＬのｇＤＮＡをチューブ内で混合した。増幅を以下の反応条件を用いて完了した：１）９４℃３分；２）９８℃１０秒；３）６３℃１分；４）７２℃５分；５）ステップ２から４を１５回繰り返す；６）７２℃３分；７）４℃にて維持。
【実施例４】
【００６０】
捕獲反応は、２．５μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で完了した。ビーズを、磁石上にてＰＢＳＴバッファ（リン酸緩衝食塩水およびｔｗｅｅｎ  ２０）で１回、およびＰＢＳバッファ（リン酸緩衝食塩水）で２回、洗浄した。上澄みを磁石から除去した後、２０μＬのＰＢＳをビーズに加えて、ビーズを混合し、再懸濁した。この溶液を１：１の濃度で単一プライマー伸長反応液に加え、２０μＬのビーズを２０μＬのプライマー伸長反応液と混合した。生じた溶液を、室温で穏やかにピペッティングしながら１時間インキュベートした。その後、ビーズを、磁石上にてＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで２回、およびＨ２Ｏで１回、洗浄した。全ての洗浄溶液をビーズから除去した。
【実施例５】
【００６１】
一本鎖アダプターを、イベント（３）−００１、（３）−００８および（３）−００９由来の捕獲した標的一本鎖ｇＤＮＡに連結した。一本鎖アダプター（配列番号２（ＺＣ−Ａｄｐ−０１）５’−／５Ｐｈｏｓ／ＡＴＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＧＧＴＣＧＧＡＣＧＣ／３６−ＦＡＭ／−３’）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）にて合成）を、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＴＲＬ）により連結した。以下の反応液を用いて、アダプターを一本鎖ＤＮＡに連結した：０．１２５μＬの１００μＭ  ＺＣ−Ａｄｐ−０１；５．０μＬの５０％  ＰＥＧ  ８０００（Ｈ２Ｏ中のＷ／Ｖ）；１．０μＬのＤＭＳＯ；および１．８７５μＬのＨ２Ｏ。反応混液を混合し、サーマルサイクラーにて９４℃で５分間変性し、その後室温にまで冷却した。続いて、１μＬの１０×ＴＲＬバッファ、０．５μＬの１ｍＭ  ＡＴＰ、および０．５μＬのＴＲＬを溶液に加えて混合した。生じた溶液を、捕獲反応由来の洗浄ビーズに加え、サーマルサイクラーにて６０℃で１時間、その後４℃でインキュベートした。ビーズを磁石上にて０．１×ＴＥバッファで数回洗浄し、全ての液体をビーズから除去した。
【実施例６】
【００６２】
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  ＴＡＱ  ＨＳ  ＰＣＲキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａ）を用いて完了した。以下のプライマーを用いて、イベントおよびフランキング配列を増幅した：トランスジーン特異的プライマー、配列番号３（ＰＡＴ−ＩｎｖＰｒｉＦ）５’−ＣＧＣＴＴＡＣＧＡＴＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧ−３’）、およびアダプタープライマー、配列番号４（Ｚｎ＿Ａｄｔ＿ＰＣＲ＿０１）５’−ＧＴＣＣＧＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＡＴ−３’）。以下の試薬を用いてＰＣＲ反応を行った：５μＬの１０×ＬＡ  ＴＡＱ  ＨＳバッファ；８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭトランスジーン特異的プライマー；１μＬの１０μＭアダプター特異的プライマー；０．５μＬのＬＡ  Ｔａｑ  ＨＳポリメラーゼ；および３４．５μＬのＨ２Ｏ。反応混液を、連結反応由来の洗浄ビーズに加え、表１の以下の条件を用いて増幅した。
【００６３】
【表１】
2014511695.tif 000002
【実施例７】
【００６４】
生じたＰＣＲ産物（大きさが約８５０ｂｐを超える）をプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）内にクローニングした。コロニーを単離し、ｐＣＲ２．１プラスミドがＰＣＲアンプリコンを含むことを確かめた。ベクターは、Ｍ１３フォワードプライマーおよびＭ１３リバースプライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、プラスミドに存在する遺伝的要素に加えて、トウモロコシ（maize）３’ゲノムフランキング配列のヌクレオチド配列も含むと予想された。イベント（３）−００１クローン＃４、（３）−００８クローン＃１０、（３）−００８クローン＃１３および（３）−００９の３’トランスジーン挿入体およびトウモロコシ（maize）ゲノムフランキング配列を、前述の技術を用いて単離および同定した。
【００６５】
ゲノム挿入体の特性評価によれば、イベント（３）−００１がトランスジーンの複数のコピーを含んでいることが示された。いくつかの特有の挿入体が、このイベント内で同定された。イベント（３）−００１クローン＃４は特有のフランキング領域を有しており、さらに、再配置された第２挿入体および第３挿入体のフランキング配列が単離された（データは開示せず）。特有のフランキング領域により、３コピーのトランスジーンがトウモロコシ（Zea mays）ゲノムの特有の位置に挿入されたことが示される。
【００６６】
イベント（３）−００８は、２コピーのトランスジーンを含む。イベント（３）−００８クローン＃１０および（３）−００８クローン＃１３のフランキング配列は、特有であり似ておらず、これによって、２コピーのトランスジーンがトウモロコシ（Zea mays）ゲノムの特有の位置に挿入されたことが示される。
【００６７】
イベント（３）−００９だけが、１コピーのトランスジーンを含んでいる。単離したフランキング領域を用いて、トウモロコシ（Zea mays）ゲノム内のトランスジーン挿入体の染色体位置を同定した。
【００６８】
同定されたトウモロコシ（maize）ゲノムフランキング配列を、Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、トウモロコシ（Zea mays）Ｂ７３ゲノムデータベース（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ）に対してＢＬＡＳＴ検索して、トランスジーン挿入体の染色体位置を同定した。イベント（３）−００８クローン＃１３のフランキング配列は、第５染色体にマップされた。イベント（３）−００９のフランキング配列は、第３染色体にマップされた。
【配列表】
2014511695000001.app
【国際調査報告】
2014511695.tif 000003