(57)【要約】式（Ｉ）（式中：Ｘは、求核置換可能な脱離基である）で示されるリン酸プロドラッグ化ＤＮＡ副溝結合物質が抗体または抗体の抗原結合フラグメントと結合している、免疫コンジュゲート、および該免疫コンジュゲートを製造するために用いられうる化合物、および該免疫コンジュゲートの使用。
2014517842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014517842.tif 000032
[式中：Ｘは、求核置換可能な脱離基である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩が、ペプチジルリンカーを介してその−ＮＨ２基で抗体または該抗体の抗原結合フラグメントと結合している、免疫コンジュゲート。
【請求項２】
式（ＩＩＩａ）：
【化２】
2014517842.tif 000033
［式中：
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択され；
ｍは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｙは、スペーサー部分であり；
ｎは、１、２、３、４または５であり；および
Ａｂは、抗体またはその抗原結合フラグメントを示す］
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３】
式（ＩＩＩａ’）：
【化３】
2014517842.tif 000034
［式中：
ｎは、１、２、３、４または５であり；および
Ａｂは、抗体またはその抗原結合フラグメントを示す］
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４】
該抗体が、ＣＤ７０、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、グリピカン−３、Ｂ７Ｈ４、ＲＧ−１、ＣＤ２２およびＰＴＫ７からなる群より選択されるヒト抗原を認識する、ヒトモノクローナル抗体である、請求項３記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５】
式（ＩＩ）：
【化４】
2014517842.tif 000035
［式中：
Ｘは、求核置換可能な脱離基であり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択され；
ｍは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｙは、スペーサー部分であり；および
Ｚは、抗体と結合しうる反応性官能基である］
で示される構造を有する化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項６】
ＡＡａが、シトルリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、イソロイシン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択され、ｍが、０、１または２である、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｍ−が、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−ＳｅｒおよびＶａｌ−Ｇｌｙからなる群より選択されるジペプチドであり、各ジペプチドがＮ−から−Ｃ方向に示されている、請求項５記載の化合物。
【請求項８】
−Ｚが、−ＯＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、
【化５】
2014517842.tif 000036
である、請求項５記載の化合物。
【請求項９】
Ｙが、
【化６】
2014517842.tif 000037
［式中：下付文字ｑは、それらの各場合について独立して、０または１であり、下付文字ｒは、それらの各場合について独立して、１〜２４である］
およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５記載の化合物。
【請求項１０】
式（ＩＩａ）：
【化７】
2014517842.tif 000038
で示される構造を有する、請求項５記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１１】
式（ＩＩｂ）−（ＩＩｇ）：
【化８】
2014517842.tif 000039
からなる群より選択される構造を有する、請求項５記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１２】
式（Ｉ）：
【化９】
2014517842.tif 000040
［式中：Ｘは、求核置換可能な脱離基である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項１３】
癌に罹患している対象における癌の治療方法であって、該対象に治療上の有効量の請求項３記載の構造を有する免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項１４】
癌が、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、リンパ腫、大腸癌、中皮腫、胃癌、肺癌、前立腺癌、腺癌、肝臓癌、または乳癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
癌が、ヒトＣＤ７０、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、グリピカン−３、Ｂ７Ｈ４、ＲＧ−１、ＣＤ２２、またはＰＴＫ７を発現する癌細胞によって特徴付けられる、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的免疫コンジュゲート、それらを製造するために利用されうる組成物、ならびにかかる組成物および免疫コンジュゲートの製造方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンは、ＤＮＡの副溝に結合する強力な細胞毒性物質である。それらは、副溝内で結合すると誘導される構造変化によって不安定となり、開環アルキル化反応においてＤＮＡアデニン塩基と反応する、縮合シクロプロピル環（以下の構造中の点線のボックス）によって特徴付けられる。ＤＮＡ損傷は修復不可能であり、細胞死を引き起こしうる。
【化１】
2014517842.tif 000003
【０００３】
これらの天然物の可能性は、抗癌剤として有用な類似体の開発を目的とする研究を活発にしている。例えば、Ｃａｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００およびＳｕｃｋｌｉｎｇ  ２００４を参照のこと（第一著者または発明者および年号によって本明細書に引用される参考資料の全ての引用は、本明細書の最後に列挙されている）。類似体は、以下の構造（式中：Ａｒは、典型的にはフェニルまたはピロールである、芳香族環を示し、Ｘは、脱離基、例えばＣｌまたはＢｒを示す）に示される、縮合シクロプロピルのファーマコフォアまたはその開環（ｓｅｃｏ）等価物のいずれかを有する。ｓｅｃｏ形は、インビトロまたはインビボのいずれかで起こりうるプロセスである、ＨＸの除去によってシクロプロピル形に変換可能である。
【化２】
2014517842.tif 000004
【０００４】
他の種類のＤＮＡ副溝結合化合物は公知であるけれども、以下の用語「副溝結合物質」または「ＭＧＢＡ」は、縮合シクロプロピル環またはそのｓｅｃｏ形を有するＣＣ−１０６５／デュオマルマイシン型化合物を表すために用いられる。
【０００５】
免疫コンジュゲートは、抗癌療法に対する現在の関心が高い分野を表している。免疫コンジュゲートでは、薬物部分は、抗原が癌細胞によって特異的に発現されるかまたは過剰発現される（「腫瘍関連抗原」）抗体に結合（共有結合）する。その抗原に対する結合では、抗体は、該薬物部分を特異性が高い癌細胞に輸送するための標的物質として機能する。抗原は、癌細胞の表面上のタンパク質でありうる。抗原に対し抗体が結合すると、薬物部分と抗体の間の共有結合リンカーが開裂される場合、抗原−免疫コンジュゲートの複合体が取り込まれ、最終的に小胞体、例えばリソソーム内のその通路を見出し、その細胞毒性効果を発揮するために薬物部分を遊離する。あるいは、腫瘍関連抗原は、隣接の細胞外空間に腫瘍細胞によって分泌されるものでありうる。
【０００６】
有利なことには、共有結合リンカーは、リソソーム内であるが血漿中ではない部分でよく見られる因子によって開裂されるように設計されている。共有結合リンカーが酸感受性基、例えばヒドラゾンとなるように、ある該因子はより低いリソソームｐＨである。別の該因子は一般的により高い細胞内濃度のグルタチオンであり、それはジスルフィド変換メカニズムによってジスルフィド共有結合リンカーの開裂を可能にする。また別の該因子はリソソーム酵素、例えばカテプシンＢの存在であり、それは好ましい基質になるように設計されたペプチジルリンカーを開裂しうる（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【０００７】
それらの効果は、ＭＧＢＡを免疫コンジュゲートにおける薬物部分の魅力的な候補にする。ＭＧＢＡおよび免疫コンジュゲートにおけるそれらの使用に関する事例的開示には、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８および２０１０；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｇａｎｇｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２，２００６ａ，２００６ｂ，２００９ａ，２００９ｂ，および２０１０；およびＳｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０が含まれる。
【０００８】
免疫コンジュゲートは、まだ全身循環するものであり、標的癌細胞に輸送されていないけれども、共有結合リンカーの付随的開裂の可能性が存在しており、それが、薬物部分の早期放出をもたらし、全身毒性の危険を及ぼす。かかる危険は、薬物部分が非常に強力な細胞毒素、例えばＭＧＢＡである場合に特に懸念される。しかしながら、免疫コンジュゲートがｓｅｃｏ−ＭＧＢＡを利用する場合、該危険は、シクロプロピル形への変換を阻害するためにフェノール性ヒドロキシル基を誘導体化することによって低下しうる。次いで、付随的開裂の場合、放出されるものは、不活性な誘導体化されたｓｅｃｏ−ＭＧＢＡである。リソソーム内で開裂される誘導体を選択することによって、該誘導体は、プロドラッグ化基として機能し、安全因子を提供する：リンカーおよびプロドラッグ化基の２つの開裂は、活性な細胞毒素が放出される前に引き起こさなければならない。
【０００９】
該プロドラッグ化基の１つは、カルバメートであり、それは下記のリソソームおよび／または細胞質カルボキシエステラーゼによって開裂されうる。（ＲａおよびＲｂは、一般的ラジカル基を示す。）。カルバメート基でプロドラッグ化されたｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ免疫コンジュゲートに関する事例的開示については、Ａｒｉｓｔｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８および２０１０；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｇａｎｇｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  １９９４；Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２，２００６ａ，２００６ｂ，２００９ａ，２００９ｂ，および２０１０；Ｓｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；およびＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０を参照のこと。
【化３】
2014517842.tif 000005
【００１０】
ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡと共に用いられうる別のプロドラッグ化基は、ホスフェートであり、その場合の開裂酵素は、リソソーム内および／または細胞質ゾル中で見出された、ホスファターゼである。ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡにおけるホスフェートプロドラッグ化基に関する事例的開示には、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｇｌａｚｉｅｒ  ２００３、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｋｕｔｙａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２ａおよび２００２ｂ、およびＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０が含まれる。
【００１１】
広く研究されているＭＧＢＡ化合物は、構造（Ａ）を有する（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８およびＳｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。それは、カルバメートプロドラッグ化基；カテプシンＢによって開裂されるように設計された、バリン−シトルリン（Ｎ−から−Ｃ方向に示される、すなわち、アミノ（ＮＨ２）末端からカルボキシル（ＣＯ２Ｈ）末端までの、Ｖａｌ−Ｃｉｔ）ジペプチドリンカー（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２００２）；および抗体スルフヒドリル基のマイケル付加による免疫結合のためのマレイミド基を有する。化合物（Ａ）および抗ＣＤ７０抗体の免疫コンジュゲートは、臨床試験を受けている。
【化４】
2014517842.tif 000006
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０２７９８６８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，６９１，９６２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１１３４７６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０２９３８００号明細書
【特許文献５】国際公開第０２／０９６９１０号パンフレット
【特許文献６】米国特許第６，９８９，４５２号明細書
【特許文献７】米国特許第７，１２９，２６１号明細書
【特許文献８】米国特許第７，４９８，３０２号明細書
【特許文献９】米国特許第７，５０７，４２０号明細書
【特許文献１０】米国再発行特許発明第４１，２５２号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１０／０１４５０３６号明細書
【特許文献１２】国際公開第９１／１６３２４号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第７，６５５，６６０号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，５１７，９０３号明細書
【特許文献１５】国際公開第０３／０００２０１号パンフレット
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１１／００２０３２９号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，６５９，０２２号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃａｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ２０００，１０（１２），１８５３−１８７１．
【非特許文献２】Ｓｕｃｋｌｉｎｇ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ２００４，１４（１２），１６９３−１７２４．
【非特許文献３】Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００２，１３，８５５−８６９．
【非特許文献４】Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９９，１５０５−１５０９．
【非特許文献５】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４，５４，２４０４−２４１０．
【非特許文献６】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ  ４５，２８ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，８−１２  Ｊｕｎｅ  ２００２），「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＣＣ−１０６５  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（ａｂｓｔｒａｃｔ）．［２００２ａ］．
【非特許文献７】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ  ＭＥＤＩ  １４７，２２４ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１８−２２  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２），「Ｎｅｗ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＣ−１０６５  ａｎａｌｏｇ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕｔｉｏｎ」（ａｂｓｔｒａｃｔ）［２００２ｂ］．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
（発明の開示）
本発明者らは、ある場合に、カルバメート−プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ免疫コンジュゲート、例えば化合物（Ａ）から生じるものが、所望の強力な抗癌剤ではないことを観測した。本発明者らは、弱い効果がある種の癌細胞内の不十分なカルボキシエステラーゼ活性に起因し、結果として非効率的な脱カルバモイル化をもたらすと仮定している。したがって、活性化のためのカルボキシエステラーゼに依存していないプロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ免疫コンジュゲートを開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一つの態様において、本発明は、抗体（またはその抗原結合フラグメント）およびホスフェート−プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ化合物を含む免疫コンジュゲートを提供する。ホスフェートプロドラッグ化基の除去は、標的細胞内のカルボキシエステラーゼ活性と無関係であり、その結果、上記の欠点を回避する。むしろ、本発明の化合物は、本発明者らの実験が広範なヒト腫瘍細胞にわたって十分なレベルで存在することを示している、ホスファターゼに依存する。一つの実施態様は、式（Ｉ）：
【化５】
2014517842.tif 000007
［式中：Ｘは、求核置換可能な脱離基である］
で示される化合物、またはその医薬的に許容される塩が、抗体または該抗体の抗原結合フラグメントにペプチジルリンカーを介してその−ＮＨ２基で結合する、免疫コンジュゲートである。好ましくは、抗体は、ＣＤ７０、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、グリピカン−３、Ｂ７Ｈ４、ＲＧ−１、ＣＤ２２、およびＰＴＫ７からなる群より選択されるヒト抗原を認識するヒトモノクローナル抗体である。
【００１６】
別の態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントへの結合に適しているホスフェート−プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ化合物が提供される。一般的に、かかる化合物は、ホスフェート−プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ部分、酵素開裂可能なペプチジルリンカー、スペーサー部分および抗体またはその抗原結合フラグメントへの結合のための反応性官能基を含む。一つの実施態様は、式（ＩＩ）：
【化６】
2014517842.tif 000008
［式中： 
Ｘは、求核置換可能な脱離基であり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択され；
ｍは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｙは、スペーサー部分であり；および
Ｚは、抗体に結合可能な反応性官能基である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩で表される。
【００１７】
別の態様において、式（Ｉ）：
【化７】
2014517842.tif 000009
［式中：Ｘは、求核置換可能な脱離基である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩によって具体化される、免疫コンジュゲートを調製するために用いられうるホスフェートプロドラッグ化化合物が提供される。化合物（Ｉ）は、上記のペプチジルリンカー、スペーサーおよび反応性官能基と組み合わせられ、次いで、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合しうる。
【００１８】
さらに別の態様において、癌に罹患している対象、好ましくはヒトにおける、癌の治療方法であって、該対象に治療上の有効量の本発明の免疫コンジュゲートを投与することを含む、方法が提供される。癌は、細胞がＣＤ７０、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、グリピカン−３、Ｂ７Ｈ４、ＲＧ−１、ＣＤ２２、およびＰＴＫ７からなる群より選択される抗原を発現する癌でありうる。そのように治療されうる癌の例として、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、リンパ腫、大腸癌、中皮腫、胃癌、肺癌、前立腺癌、腺癌、肝臓癌、および乳癌が挙げられる。
【００１９】
さらに別の態様において、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の免疫コンジュゲートの使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは組み合わせて、マレイミド反応性官能基を有する、本発明の化合物の合成を示す。
【図２】図２は、本発明の別の化合物の合成を示す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは組み合わせて、本発明のさらに別の化合物の合成を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｒは、３Ｈチミジン取り込み細胞増殖アッセイを用いて、本発明のホスフェートプロドラッグ化免疫コンジュゲートの細胞増殖阻害特性とカルバメートプロドラッグ化免疫コンジュゲートの特性を比較する。試験細胞系には、以下のヒト癌細胞系が含まれていた：７８６−Ｏ（腎臓癌）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＰＡＣ（膵臓癌）、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）、Ｈ２２６（中皮腫）、Ｎ８７（胃癌）、Ｈ２９２（肺粘表皮癌）、Ｈ１６５０（腺癌）、Ｈｅｐ３ｂ（肝細胞癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＨＣＣ−１９５４（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）およびＨ５２０（肺癌）。さらに、メソテリン発現トランスフェクトＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞系が用いられた。
【図５】図５は、ヒト肝臓ミクロソーム酵素によって本発明のホスフェートプロドラッグ化化合物の脱リン酸化を示すクロマトグラフィートレースを図示する。
【図６】図６は、１時間にわたって、ミクロソーム濃度に応じて生成された脱リン酸化生成物の量のプロットである。
【図７】図７は、抗体と結合するアジド反応性官能基を有する、本発明のさらに別の化合物の合成を示す。
【図８】図８は、抗体と結合するヒドロキシルアミン反応性官能基を有する、本発明のさらに別の化合物を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは組み合わせて、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕトリペプチドを有する、本発明の化合物の合成を示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは組み合わせて、Ｌｅｕ−Ｉｌｅジペプチドを有する、本発明の化合物の合成を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは組み合わせて、本発明の別の化合物の合成を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｉは、種々の異種移植研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（定義）
「抗体」は、全抗体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合タンパク質」）またはその一本鎖を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互結合する、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＶｋ）および１つの単一ドメイン、ＣＬを含む軽鎖定常領域を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）が組み込まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分されうる。ＶＨおよびＶＬは、各々、以下の順番でアミノ末端からカルボキシ末端に配列される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。定常領域は、宿主組織または因子（免疫組織の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む）に対する抗体の結合を仲介しうる。抗体が５ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、より好ましくは６ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは３ｘ１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは２ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤで抗原Ｘに結合する場合、抗体は抗原Ｘと「特異的に結合する」とされている。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または好ましくはヒト抗体でありうる。重鎖定常領域は、グリコシル化のタイプもしくは程度に影響を及ぼすか、抗体の半減期を延ばすか、エフェクター細胞もしくは補体系との相互作用を増強もしくは低下させるか、またはある他の特性を調節するように操作されうる。該技術は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または削除によってあるいは別の免疫グロブリンタイプまたは前述の組合せからのドメインでのドメイン置換によって達成されうる。
【００２２】
「抗体フラグメント」または抗体の「抗原結合部」（または単に「抗体部」）は、抗原と特異的に結合する能力を保持する１またはそれ以上の抗体のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメント、例えば、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合する２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の部分を含むＦａｂである、Ｆａｂ’フラグメント（例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２００７を参照のこと）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント，（ｖｉ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域によって実行されうることが示されている。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるけれども、それらは、組換え方法を用いて、一価の分子（単鎖Ｆｖ、またはｓｃＦｖとしても既知）を形成するためにＶＬおよびＶＨ領域が組み合わさる単一タンパク質として作製することを可能にする合成リンカーによって結合されうる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと。かかる単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」なる用語に包含される。
【００２３】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、抗原Ｘと特異的に結合する単離された抗体は、抗原Ｘ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、抗原Ｘと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば、他の種由来の抗原Ｘ分子に対する交差反応性を有しうる。ある実施態様において、単離された抗体は、ヒト抗原Ｘと特異的に結合し、他（非ヒト）の抗原Ｘ抗原と交差反応しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含んでいなくてもよい。
【００２４】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。
【００２５】
「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方（存在すれば、定常領域）がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する抗体を意味する。ヒト抗体は、後の修飾（天然または合成を含む）を含みうる。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビボにおけるランダムまたは部位特異的変異によってまたはインビボにおける体細胞変異によって導入された突然変異体）を含みうる。しかしながら、「ヒト抗体」には、別の哺乳類種、例えば、マウスの生殖細胞系列から得られるＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に導入されている抗体は含まれない。
【００２６】
「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を意味する。一つの実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合するヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって作製される。
【００２７】
特定の立体異性体が（例えば、構造式における関連の立体中心での太字または破線の結合によって、構造式におけるＥまたはＺ配置を有する二重結合の表示によって、または立体化学を指定する命名法の使用によって）具体的に示されていなければ、全ての立体異性体は、純粋な化合物ならびにその混合物として、本発明の範囲内に含まれる。特に明記されない限り、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、ならびにその組合せおよび混合物は全て、本発明に包含される。
【００２８】
化合物が、本明細書にて用いられる構造式に示されるものと同等である、互変異性形態（例えば、ケトおよびエノール形）、共鳴形態、および両性イオン形態を有しうること、そして、構造式がかかる互変異性形態、共鳴形態、または両性イオン形態を包含することは当業者であれば分かるであろう。
【００２９】
「医薬的に許容される塩」は、医薬処方物に適当な化合物の塩を意味する。化合物が１またはそれ以上の塩基性基を有する場合、該塩は、酸付加塩、例えば、硫酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシラート、マレイン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、塩酸塩、乳酸塩、メチル硫酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、ラクトビオン酸塩、スベリン酸塩、トシラートなどでありうる。化合物が１またはそれ以上の酸性基を有する場合、該塩は、塩、例えば、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、４−フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、ナトリウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などでありうる。結晶多形および溶媒和物もまた、本発明の範囲に包含される。リン酸基に関して、医薬的に許容される塩の具体的として、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウム塩が挙げられる。
【００３０】
（組成物）
一つの態様において、本発明の化合物は、式（Ｉ）：
【化８】
2014517842.tif 000010
［式中：Ｘが、求核置換可能な脱離基である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩が、ペプチジルリンカーを介して抗体またはその抗原結合フラグメントに結合する、免疫コンジュゲートである。結合は、好ましくは、その４−ＮＨ２基を仲介する。ペプチジルリンカーは、好ましくは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ｓｅｒ、またはＶａｌ−Ｇｌｙから選択されるジペプチドであり、各ジペプチドは、Ｎ−から−Ｃ方向に示される。
【００３１】
一つの実施態様において、免疫コンジュゲートは、式（ＩＩＩａ）：
【化９】
2014517842.tif 000011
［式中：ＡＡａ、ＡＡｂ、ｍ、およびＹは、上記の式（ＩＩ）に関して定義される通りであり、Ａｂは、抗体または抗体の抗原結合フラグメントを示し、ｎは、１、２、３、４、または５である］
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する。ＡＡａ、ＡＡｂ、ｍ、Ｙ、Ａｂ、およびｎの好ましい実施態様および／または組合せは、以下に記載されている。
【００３２】
式（ＩＩＩａ）で示される好ましい免疫コンジュゲートは、式（ＩＩＩａ’）：
【化１０】
2014517842.tif 000012
［式中：Ａｂおよびｎは、上記に定義される通りである］
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する。したがって、該実施態様は、構造式（ＩＩＩａ’）において、左方向から右方向に読む場合、ジペプチドはＣ−から−Ｎ方向に示されることを当業者の理解の下で、Ｖａｌ−Ｃｉｔジペプチドリンカーを有する。
【００３３】
別の実施態様において、免疫コンジュゲートは、式（ＩＩＩｂ）：
【化１１】
2014517842.tif 000013
［式中：ＡＡａ、ＡＡｂ、ｍ、およびＹは、上記の式（ＩＩ）に関して定義される通りであり、Ａｂは、抗体または抗体の抗原結合フラグメントを示し、ｎは、１、２、３、４、または５である］
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する。ＡＡａ、ＡＡｂ、ｍ、Ｙ、Ａｂ、およびｎの好ましい実施態様および／または組合せは、以下に記載されている。
【００３４】
式（ＩＩＩｂ）で示される好ましい免疫コンジュゲートは、式（ＩＩＩｂ’）：
【化１２】
2014517842.tif 000014
［式中：Ａｂおよびｎは、上記に定義される通りである］
で示される構造または医薬的に許容される塩を有する。
【００３５】
式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩａ’）、（ＩＩＩｂ）、および（ＩＩＩｂ’）における下付文字ｎで示されるように、各抗体は、抗体が結合に利用可能な部位の数および用いられる実験的条件に応じて、１以上のプロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ部分と結合しうる。当業者は、個々の抗体は、各々、整数のプロドラッグ化部分と結合するけれども、免疫コンジュゲート調製物は、統計的平均を示す、１抗体当たりのプロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ部分の非整数比（「置換率」または「ＳＲ」）をアッセイしうることを分かるであろう。ＳＲは、好ましくは１〜５であり、より好ましくは２．５〜３．５である。
【００３６】
本発明の別の態様は、式（ＩＩ）：
【化１３】
2014517842.tif 000015
［式中、ＡＡａ、ＡＡｂ、ｍ、Ｙ、およびＺは、前述に定義されている通りである］
で示される、抗体との結合に適している化合物またはその医薬的に許容される塩である。ＡＡａ、ＡＡｂ、ｍ、Ｙ、およびＺの好ましい実施態様および／または組合せは、以下に記載されている。
【００３７】
式（ＩＩ）で示される好ましい実施態様は、式（ＩＩａ）：
【化１４】
2014517842.tif 000016
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する。
【００３８】
式（ＩＩ）で示される他の好ましい実施態様は、式（ＩＩｂ）−（ＩＩｇ）：
【化１５】
2014517842.tif 000017
で示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する。
【００３９】
式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｘは、求核置換可能な基、好ましくはＣｌ、Ｂｒ、またはトシレート、より好ましくはＣｌである。
【００４０】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）において、ＡＡａおよび各ＡＡｂは、独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン（Ｃｉｔ）、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される。好ましくは、ＡＡａおよびＡＡｂは、アルギニン、アスパラギン酸、シトルリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される。
【００４１】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）における部分−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｍ−は、連続アミノ酸がペプチジル結合によって結合する場合、ペプチジルリンカーを示す。標的細胞に関連する細胞内または細胞外酵素によって開裂されるものが好ましい。酵素は、例えば、カテプシンＢ、カテプシンＥ、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、またはＣＤ１０でありうる。ペプチジルリンカーは、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸からなる。ＡＡａは、好ましくはＣｉｔ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒ、より好ましくはＣｉｔまたはＬｙｓであり、特にｍ＝０、１、または２と組み合わせる。
【００４２】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）における接尾語ｍは、０、１、２、３、４、または５である。好ましくは、ｍは、０、１、または２であり、より好ましくは１である。したがって、−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｍ−は、Ｃ−末端がＡＡａ、そして、Ｎ−末端がＡＡｂである、ｍの値に応じて、単一アミノ酸リンカー、ジペプチドリンカー、トリペプチドリンカーなどを示す。ｍが１である場合、ＡＡａおよびＡＡｂが組み合わせてジペプチドを形成するように、好ましいジペプチドは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ｓｅｒ、およびＶａｌ−Ｇｌｙであり、各ジペプチドは、通常のＮ−から−Ｃ方向に示されている。Ｖａｌ−Ｃｉｔジペプチドリンカーが特に好ましい。ペプチジルリンカーが単一アミノ酸（すなわち、ｍが０である）からなる場合、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０（その開示は本明細書によって引用される）にて教示される、Ｃｉｔ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＳｅｒが好ましい。好ましくは、前記のジペプチドおよび単一ペプチドリンカーは、カテプシンＢによって開裂される。ペプチジルリンカーを開裂するために利用されうる別の酵素は、レグマイン、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎで特異的に開裂するリソソームシステインプロテアーゼである。ペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−ＬｅｕおよびＬｅｕ−Ｉｌｅは、それぞれ、ＣＤ１０およびカテプシンＥによって開裂されるように設計される。
【００４３】
プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡが抗体（またはその抗原結合フラグメント）によって抗原結合を立体的に妨げるかまたは抗体（またはその抗原結合フラグメント）がペプチジルリンカーの開裂を立体的に妨げるといけないから、式（ＩＩ）、（ＩＩＩａ）、および（ＩＩＩｂ）におけるスペーサーＹは、プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡおよび抗体（またはその抗原結合フラグメント）間の空間的境界を提供する。さらに、スペーサーＹは、コンジュゲートに安定性特性の増大または凝集特性の低下をもたらすために用いられうる。スペーサーＹは、１またはそれ以上のモジュール部分を含み、いくつか組み合わせて組み立てられうる。スペーサーＹの適当な部分の例は、
【化１６】
2014517842.tif 000018
［式中：下付文字ｑは、その各場合において独立して、０または１であり、下付文字ｒは、その各場合において独立して、１〜２４、好ましくは２〜４である］
およびそれらの組合せである。これらの部分は、例えば、以下に示されるように組み合わせられうる。
【化１７】
2014517842.tif 000019
【００４４】
スペーサーＹは、それが結合するアミノ酸ＡＡａまたはＡＡｂおよび反応性官能基Ｚ間の、好ましくは５〜２０個の原子、より好ましくは５〜１５個の原子の線形境界を提供する。
【００４５】
別の好ましい実施態様において、スペーサーＹは、場合によっては、ＡＡａまたはＡＡｂのα−アミノ基と直接結合するカルボン酸アシル基以外で、ＡＡａまたはＡＡｂと結合する。好ましくは、スペーサーＹは、場合によっては、スペーサーＹにおけるメチレン基を介して、ＡＡａまたはＡＡｂのα−アミノ基と結合する。
【００４６】
式（ＩＩ）において、Ｚは、抗体に結合可能な反応性官能基である。好ましくは、−Ｚは、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＮＨ２（ヒドロキシルアミン）、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＨ、シクロオクチン、アジド（−Ｎ３）、
【化１８】
2014517842.tif 000020
である。
【００４７】
より好ましくは、−Ｚは、−ＯＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、
【化１９】
2014517842.tif 000021
である。
【００４８】
−ＯＨ基は、抗体における、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸側鎖におけるカルボキシ基とエステル化されうる。
【００４９】
−ＣＯ２Ｈ基は、抗体における、−ＯＨ基とエステル化されうるかまたは（例えば、リジン側鎖における）アミノ基とアミド化されうる。
【００５０】
マレイミド基は、マイケル付加反応において、（例えば、システイン由来のまたはスルフヒドリル官能基を導入するための抗体の化学修飾由来の）抗体における−ＳＨ基と結合しうる。
【００５１】
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基は、機能上、活性化カルボキシル基であり、都合の良いことには、（例えば、リジン由来の）アミノ基との反応によってアミド化されうる。
【００５２】
−ＳＨ基は、上記のものの「鏡像」であるマイケル付加反応において、抗体がそれにマレイミド基を導入するために修飾されている場合の結合に特に有用である。抗体は、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはそのスルホン酸化変種スルホ−ＳＭＣＣ（両方の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である）伴うマレイミド基を有するように修飾されうる。
【００５３】
アジドおよびシクロオクチンは、アジドがシクロオクチンの直鎖アルキン結合に付加して、１，２，３−トリアゾール環を形成する、いわゆる「クリック化学」を介して結合しうる相補的官能基である。アジドは、式（ＩＩ）で示される化合物におけるＺ基になり得、シクロオクチンは、抗体またはその抗原結合フラグメント上に位置しうる、その逆もまたしかりである。シクロオクチン基は、ＤＩＢＯ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎから入手可能）によって提供されうる。
【００５４】
非天然アミノ酸を抗体に導入する技法は、反応性官能基と共に結合のための官能基を提供する非天然アミノ酸をと共に、利用されうる。例えば、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ２００８／０３０６１２  Ａ２（２００８）に教示されるように、非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンは、抗体に組み込まれうる。ｐ−アセチルフェニルアラニン中のケトン基は、ヒドロキシルアミノ反応性官能基を有するオキシムの形成によって結合部位になりうる。他の非天然アミノ酸はまた、Ａｍｂｒｘ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＲｅＣＯＤＥ（商標）技術を用いて組み込まれうる。
【００５５】
前述の免疫コンジュゲートにおいて、抗体は、好ましくは、腫瘍関連抗原に対する抗体であり、免疫コンジュゲートが選択的または特異的に癌細胞を標的とすることを可能にする。かかる抗原の例として、メソテリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ４（Ｏ８Ｅとしても既知）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、グリピカン−３、ＲＧ１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ４４が挙げられる。抗体は、動物（例えば、マウス）、キメラ、ヒト化、または好ましくはヒトでありうる。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、特にモノクローナルヒト抗体である。いくつかの前記抗原に対するヒトモノクローナル抗体の調製は、Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２００９／００７４６６０  Ａ１（Ｂ７Ｈ４）；Ｒａｏ−Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，８，０９７，７０３  Ｂ２（ＣＤ１９）；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２０１０／０１４３３６８  Ａ１（ＣＤ２２）；Ｋｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ７，３８７，７７６  Ｂ２（２００８）（ＣＤ３０）；Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ８，１２４，７３８  Ｂ２（ＣＤ７０）；Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ６，９８４，７２０  Ｂ１（２００６）（ＣＴＬＡ−４）；Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２００９／０２１７４０１  Ａ１（ＰＤ−１）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２００９／０２９７４３８  Ａ１およびＣａｒｄａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ７，８７５，２７８  Ｂ２（ＰＳＭＡ）；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２０１０／００３４８２６  Ａ１（ＰＴＫ７）；Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２０１０／０２０９４３２  （Ａ１）（グリピカン−３）；Ｈａｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ７，３３５，７４８  Ｂ２（２００８）（ＲＧ１）；Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２０１１／０２６２４４８  Ａ１（メソテリン）；およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ２０１０／００９２４８４  Ａ１（ＣＤ４４）に開示されており、それらの開示は本明細書によって引用される。好ましくは、抗体は、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１９、グリピカン−３、Ｂ７Ｈ４、ＲＧ−１、ＣＤ２２、またはＰＴＫ７に対するヒトモノクローナル抗体である。
【００５６】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）：
【化２０】
2014517842.tif 000022
［式中：Ｘは、求核置換可能な脱離基、好ましくはＣｌ、Ｂｒ、またはトシレート、より好ましくはＣｌである］
で示されるプロドラッグ化化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【００５７】
式（Ｉ）で示される化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントと結合し、上記の適当なリンカー、スペーサー、および反応性官能基の利用によって治療上有用な免疫コンジュゲートが作製されうる。ＸがＣｌである式（Ｉ）で示される好ましい実施態様は、式（Ｉａ）：
【化２１】
2014517842.tif 000023
で示される構造に相当する。
【００５８】
（生物活性）
化合物（ＩＩａ）および先行技術の化合物（Ａ）から調製された免疫コンジュゲートの能力を比較する、一連の細胞増殖実験が行われた。各場合において、用いられる技法は３Ｈチミジン取り込みアッセイであり、その製法の詳細については以下の実施例において提供される。
【化２２】
2014517842.tif 000024
【００５９】
免疫コンジュゲートは、プロドラッグ化基−ホスフェート対カルバメート−を除き同一であり、式（ＩＶ）で示される同一薬物がペプチジルリンカーの開裂およびプロドラッグ化基の除去の後に放出されるので、実験は免疫コンジュゲート効力に対するプロドラッグ化基の効果の比較を提供する。これらの比較結果は、予期せぬことには、各場合において、同一の最終的な活性化合物（ＩＶ）が関与していたとしても、式（ＩＩａ）で示される免疫コンジュゲートが化合物（Ａ）のものよりも有意に強力であることを示す。
【化２３】
2014517842.tif 000025
【００６０】
図４Ａは、ＣＤ７０−発現ヒト腎臓癌細胞である、７８６−Ｏ細胞の細胞増殖における２種の免疫コンジュゲートの阻害活性を示す。各場合において、コンジュゲート抗体は、２Ｈ５、抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体であった。化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートは、ＥＣ５０（０．１０００ｎＭ対０．５７２５ｎＭ）が低いのみならず、その阻害曲線の深さ（depth）からも明らかなように、全阻害率も高かった。（抗体２Ｈ５の全配列情報は、Ｃｏｃｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０およびＴｅｒｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２ｂに開示されている；それらの開示は本明細書によって引用される。抗体２Ｈ５のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４、配列番号５、および配列番号６に示される。）
【００６１】
図４Ｂは同様の試験であるが、メソテリン発現ヒト膵臓癌細胞である、ＨＰＡＣ細胞を用いる。各場合において、コンジュゲート抗体は、６Ａ４、抗メソテリンヒトモノクローナル抗体であった。該実験では、１．２５および３の置換率を有する、２種の異なる化合物（ＩＩａ）コンジュゲートが調製された。（Ｘ軸上の細胞毒素濃度は、置換率を反映するように調節される）。図４Ｂは、化合物（Ａ）免疫コンジュゲートは本質的に不活性であるのに対し、化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートはおおよそナノモルＥＣ５０を有していたことを示す。置換率の高い化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートが高い全阻害率（より深い曲線）を示したことはまた注目すべきことである。（抗体６Ａ４の全配列情報は、Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１ｂに開示されており、その開示は本明細書によって引用される。抗体６Ａ４のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２に示される。）
【００６２】
図４Ｃは別の同様の試験であり、今回は、メソテリンを発現するためにトランスフェクトされたチャイニーズハムスターの卵巣細胞である、ＣＨＯ−ｍｅｓｏ細胞を用いる。コンジュゲート抗体はまた、６Ａ４であった。化合物（Ａ）免疫コンジュゲートは本質的に不活性であるのに対し、化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートは約２ｎＭのＥＣ５０を有していた。
【００６３】
図４Ｄはさらに別の同様の試験であり、今回は、メソテリン発現ヒト卵巣癌細胞である、ＯＶＣＡＲ３細胞を用いる。また、コンジュゲート抗体は６Ａ４であった。化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートのＥＣ５０は、化合物（Ａ）免疫コンジュゲートのものより約１０００倍低かった。
【００６４】
図４Ｅはさらに別の同様の試験であり、今回は、ＣＤ１９発現ヒトバーキットリンパ腫細胞である、Ｒａｍｏｓ細胞を用いる。コンジュゲート抗体は、２１Ｄ４、抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体であった。化合物（Ａ）および（ＩＩａ）免疫コンジュゲートの間の不均衡はさらに顕著であり、前者は本質的に不活性であるのに対し、後者はサブナノモルＥＣ５０を有していた。（抗体２１Ｄ４の全配列情報は、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａおよびＲａｏ−Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２に開示されている；それらの開示は本明細書によって引用される。抗体２１Ｄ４のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８に示される。）
【００６５】
図４Ｆはさらに別の同様の試験であり、今回は、メソテリン発現ヒト肺由来中皮腫細胞である、ＮＣＩ−Ｈ２２６（Ｈ２２６）細胞を用いる。コンジュゲート抗体はまた、６Ａ４であった。さらに、アイソタイプ対照として、化合物（ＩＩａ）は、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）に対するヒトモノクローナル抗体である、２Ａ１０とコンジュゲートした。予測したように、Ｈ２２６細胞がＰＳＭＡを発現しないので、ＰＳＭＡ免疫コンジュゲートは、ほんの少しの活性であったかまたは活性がなかった。化合物（Ａ）免疫コンジュゲートは、同様に、低い活性であったかまたは活性がなかった。一方、２種の化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートは、各々、サブナノモルＥＣ５０を有していた。前例に示されるように、置換率の高い免疫コンジュゲートは、高い細胞増殖全阻害率を示した。（抗体２Ａ１０の全配列情報は、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９およびＣａｒｄａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１に開示されている；それらの開示は、本明細書によって引用される。抗体２Ａ１０のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４に示される。）
【００６６】
図４Ｇは、メソテリンを発現する、Ｎ８７ヒト胃癌細胞に対する抗メソテリン抗体６Ａ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの活性を示す。サブナノモルＥＣ５０が観察された。
【００６７】
図４Ｈは、メソテリン発現ヒト肺粘表皮癌細胞である、Ｈ２９２細胞に対する種々の置換率（ＳＲ）の抗体６Ａ４および化合物（ＩＩａ）のコンジュゲートの活性を示す。抗ＰＳＭＡ抗体２Ａ１０および化合物（ＩＩａ）のコンジュゲートは、対照として用いられた。ＥＣ５０値は、以下の表Ｉに示される。それらは、ＳＲが約２ないしはそれ以上まで増加する場合に効力が有意に増加することを示す。
【表１】
2014517842.tif 000026
【００６８】
図４Ｉは、メソテリン発現ヒト腺癌細胞である、Ｈ１６５０細胞に対するが、図４Ｈのものと同様の試験を示す。ＥＣ５０値は、表ＩＩに示される。また、効力の上昇は、約２を超えるＳＲで認められた。
【表２】
2014517842.tif 000027
【００６９】
図４Ｊおよび４Ｋは、２種のヒト肝細胞癌細胞系、Ｈｅｐ  ３ＢおよびＨｅｐ  Ｇ２（両方とも、グリピカン−３を発現する）に対する本発明の免疫コンジュゲートの試験である。抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５および化合物（ＩＩａ）の対照免疫コンジュゲートと一緒に、抗グリピカン−３ヒトモノクローナル抗体４Ａ６単独および化合物（ＩＩａ）とコンジュゲートした場合の効力を比較した。（Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞もＨｅｐ  Ｇ２細胞もＣＤ７０を発現しない）。該結果は、４Ａ６免疫コンジュゲートが、非常に強力、対照ＣＤ７０免疫コンジュゲートより約１０００倍活性であったことを示す。抗グリピカン−３抗体４Ａ６単独では不活性であった。（抗体４Ａ６の配列情報はＴｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ｂに開示されており、その開示は本明細書によって引用される。抗体４Ａ６のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０に示される。）
【００７０】
図４Ｌ、４Ｍ、および４Ｎは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ−１９５４、およびＯＶＣＡＲ３細胞系に対する抗Ｂ７Ｈ４ヒトモノクローナル抗体２Ａ７および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの活性の試験である。最初の２つはヒト乳癌細胞系であるのに対し、三番目のものはヒト卵巣癌細胞系であり、その全ては、Ｂ７Ｈ４を発現するがＣＤ７０を発現しない。抗ＰＳＭＡ抗体２Ａ１０および化合物ＩＩａの免疫コンジュゲートは対照として用いられた。いくつかは乳癌細胞系に対して比活性度があったが、ＯＶＣＡＲ３細胞に対しては比活性度がほとんどまたは全くなかったことが図から見られうる。（抗体２Ａ７の全配列情報は、Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９およびＴｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１ａに開示されている；それらの開示は本明細書によって引用される。抗体２Ａ７のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および３６に示される。）
【００７１】
図４Ｏは、ＰＳＭＡおよびＲＧ−１の両方を発現する、ＬＮＣａｐヒト前立腺癌細胞に対する、抗ＰＳＭＡヒトモノクローナル抗体２Ａ１０および抗ＲＧ−１ヒトモノクローナル抗体１９Ｇ９（各々、化合物（ＩＩａ）とコンジュゲートしている）の免疫コンジュゲートの活性の試験である。対照として、抗メソテリン抗体６Ａ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの比較データが提供される。ＰＳＭＡおよびＲＧ−１のコンジュゲートの両方とも、有効であったことが分かる（各々、サブナノモルＥＣ５０を有する）。（抗体１９Ｇ９の全配列情報は、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１に開示されており、その開示は本明細書によって引用される。抗体１９Ｇ９のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に示される。）
【００７２】
図４Ｐは、ＣＤ１９およびＣＤ２２の両方を発現する、Ｒａｍｏｓ細胞に対する、抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４および抗ＣＤ２２ヒトモノクローナル抗体１２Ｃ５（各々、化合物（ＩＩａ）にコンジュゲートしている）の免疫コンジュゲートの活性の試験である。抗メソテリン抗体６Ａ４および抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの比較データが提供される。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２免疫コンジュゲートの両方とも、非常に強力であった（各々、サブナノモルＥＣ５０を有する）。（抗体１２Ｃ５の全配列情報は、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ｂに開示されており、その開示は本明細書によって引用される。抗体１２Ｃ５のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８に示される。）
【００７３】
図４Ｑは、ヒト大腸癌細胞である、ＨＣＴ１１６細胞に対する抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体４Ｄ５と化合物ＩＩａとの免疫コンジュゲートの活性を示す。免疫コンジュゲートは１．８７ｎＭのＥＣ５０を有するのに対し、抗ＰＳＭＡ抗体２Ａ１０の対照免疫コンジュゲートは、ＥＣ５０が９５１ｎＭであり、かなり弱かった。（抗体４Ｄ５の全配列情報は、Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａおよびＴｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２ａに開示されている；それらの開示は本明細書によって引用される。抗体４Ｄ５のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４に示される。）
【００７４】
図４Ｒは、ヒト肺扁平上皮癌細胞である、Ｈ５２０細胞に対する前述の抗ＰＴＫ７抗体４Ｄ５の免疫コンジュゲートの活性を示す。ＰＴＫ７免疫コンジュゲートは０．２２４ｎＭのＥＣ５０を有するのに対し、対照ＰＳＭＡ免疫コンジュゲートは、ＥＣ５０が６１．６ｎＭであり、かなり弱かった。
【００７５】
前記の結果は、予期せぬことには、プロドラッグ化基−ホスフェート対カルバメート−の特性が、その他が同一である免疫コンジュゲートの効力において重大な役割を果たすことを立証している。理論に束縛されることなく、本発明者らの仮説は、異なるヒト細胞（癌細胞を含む）が異なるレベルのカルボキシエステラーゼを含有し、そして、ほとんどではないにしても多くが、効率的にカルバメートプロドラッグ化基を開裂するために不十分なカルボキシエステラーゼレベルを含有するということである。しかしながら、恐らく、全細胞ではないにしてもほとんどの細胞において、ホスファターゼ活性のレベルは、ホスフェート基を効率的に開裂するのに十分高いので、ホスフェート基でプロドラッグ化された免疫コンジュゲートは、かかる問題に苦しめられていない。
【００７６】
（用途）
本発明の免疫コンジュゲートは、疾患、例えば、限定されるものではないが、過剰増殖性疾患（頭、首、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺の腫瘍、および傍神経節腫を含む頭頸部の癌；肝臓および胆管系の癌、特に肝細胞癌；腸癌、特に結腸直腸癌；卵巣癌；小細胞および非小細胞肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）；乳癌肉腫（breast cancer sarcomas）、例えば、線維肉腫、悪性繊維性組織球腫、胎児性横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、神経線維肉腫、骨肉腫、髄膜肉腫、脂肪肉腫、および胞巣状軟部肉腫；白血病、例えば、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；中枢神経系の新生物、特に脳腫瘍；多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ系大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、およびＴ細胞未分化大細胞リンパ腫を含む）を治療するために用いられうる。臨床的に、本明細書に記載の方法の実施および組成物の使用は、（適用可能な場合）癌性増殖のサイズまたは数の減少および／または関連症状の減少をもたらす。病理学的に、本明細書に記載の方法の実施および組成物の使用は、病理学的に関連のある応答、例えば、癌細胞増殖の阻害、癌または腫瘍のサイズの減少、さらなる転移の阻止、および腫瘍血管新生の阻害をもたらす。かかる疾患の治療方法は、対象に治療上の有効量の本発明の組合せを投与することを含む。該方法は必要に応じて繰り返されうる。特に、癌は、細胞がＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１９、グリピカン−３、Ｂ７Ｈ４、ＲＧ−１、ＣＤ２２、またはＰＴＫ７を発現する癌でありうる。好ましい実施態様において、治療を受ける癌は、腎癌、膵臓癌、卵巣癌、リンパ腫、大腸癌、中皮腫、胃癌、肺癌、前立腺癌、腺癌、肝臓癌、または乳癌である。
【００７７】
本発明の免疫コンジュゲートは、他の治療剤（抗体、アルキル化剤、血管新生阻害剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡクリーバー、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤、エンジイン、熱ショックタンパク質９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、免疫調節剤、微小管安定化剤、ヌクレオシド（プリンまたはピリミジン）類似体、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ（ＩまたはＩＩ）阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤を含む）と組み合わせて投与されうる。特定の治療剤には、アダリムマブ、アンサマイトシンＰ３、アウリスタチン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カリスタチンＡ、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、シタラビン、クリプトフィシン、ダカルバジン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ダイネミシンＡ、エポシロン、エトポシド、フロキシウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、イピリムマブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、インフリキシマブ、インターフェロン、インターロイキン、β−ラパコン、レナリドミド、イリノテカン、メイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、ヒドロキサミン酸サブエロリルアニリド（ＳＡＨＡ）、６−チオグアニジン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、トラスツズマブ、トリコスタチンＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンデシンが含まれる。
【００７８】
本発明の免疫コンジュゲートは、生物学的製剤のための慣習的技法を用いて製剤化および投与されうる。処方物には、賦形剤、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）（その開示は本明細書によって引用される）に教示されるものが含まれうる。賦形剤の例として、限定されるものではないが、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ））、可溶化剤および乳化剤（例えば、ポリソルベート）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、ショ糖、デキストロース、マルトース、トレハロース）、担体（例えば、アルブミン）、アミノ酸およびそれぞれの塩酸塩、クエン酸塩、ソルビトール、デキストラン等が挙げられる。
【００７９】
免疫コンジュゲートは、賦形剤を含むかまたは含まない凍結乾燥散剤として提供され、次いで、さらなる賦形剤を含むかまたは含まない媒体、例えば、注射用滅菌水、注射用塩化ナトリウム溶液、または注射用デキストロース溶液に溶解されうる。
【００８０】
あるいは、免疫コンジュゲートは、所望により賦形剤を含んでいてもよい、濃縮溶液として提供され得、次いで、投与前に所望の濃度に希釈される。別の形態には、分散液、マイクロエマルション、およびリポソームが含まれる。
【００８１】
好ましくは、医薬組成物は、静脈内（「ＩＶ」）、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。語句「非経口投与」は、通常注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、それには、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内，嚢内，眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。好ましい投与方法には、ＩＶ注入、ＩＶボーラス、皮下、および筋肉内が含まれる。
【００８２】
「治療上の有効量」は、好ましくは、病状の重症度の低下、無症状期間の頻度および持続の増加、または疾患苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する対象の治療に関して、「治療上の有効量」は、未治療対象と比べて、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびまたより好ましくは少なくとも約８０％腫瘍成長を阻害する。治療上の有効量の治療化合物は、腫瘍を縮小しうるか、あるいは、典型的にはヒトであるが、別の哺乳類でありうる、対象の症状を改善しうる。
【００８３】
投薬計画は、治療反応をもたらすために調節される。例えば、単回投与量が投与されうるか、いくつかの分割投与量が経時的に投与されうるか、または投与量は、状況の緊急事態で示されるように、比例的に減少もしくは増加されうる。投与を容易にし、そして、投与量を均一にするための投与単位形態における非経口組成物を製剤化することは特に有益である。「投与単位形態」は、治療を受ける対象の単位投与量として適した物理的に不連続な単位を示す；各単位は、所要の医薬担体と一緒になって、所望の治療反応をもたらすために算出された所定量の活性化合物を含有する。デバイス、例えば、プレフィルドシリンジ、２チャンバ型シリンジ、および自己注射器が用いられうる。
【００８４】
投与量は、治療を受ける疾患、患者の特徴、例えば年齢、性別、および遺伝子型、および治療計画の段階によって変化する。典型的には、投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。
【実施例】
【００８５】
（実施例）
本発明の実施化は、以下の実施例を参照することによってさらに理解することができ、その実施例は説明するためのものであって、限定するためのものではない。
【００８６】
実施例１−化合物（ＩＩａ）
該実施例は、本発明の化合物１２（本明細書では、化合物（ＩＩａ）とも称される）の合成について記載している。図１Ａおよび１Ｂは組み合わせて、その合成スキームを示す。
【００８７】
化合物２．トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」，Ｆｉｓｈｅｒ，５ｍＬ）を、化合物１（１ｇ，２．３６ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（「ＤＣＭ」，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温（「ＲＴ」，約２５℃）で３０分間撹拌した。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物を濃縮し、高真空下で終夜乾燥して、緑がかった固形物として１１５ｇの化合物２を得た（ＴＦＡ塩）。
【００８８】
化合物４．無水メタノール（Ａｃｒｏｓ，１００ｍＬ）中二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（「（Ｂｏｃ）２Ｏ」，１０．２４ｇ，４６．９７ｍｍｏｌ）およびパラジウム（Ａｌｄｒｉｃｈ，活性炭担持１０％，４００ｍｇ）を、５−ニトロインドール−２−カルボン酸エチル（化合物３，Ａｃｒｏｓ，１０ｇ，４２．７ｍｍｏｌ）中懸濁液に加えた。反応混合物をＨ２（３０ｐｓｉ）下で８時間水素化した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、高真空下で乾燥し、黄色の固形物として化合物４を得た（１０．５ｇ、８１％）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１１．６８（ｓ，１Ｈ），９．１９（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｍ，２Ｈ），７．０２（ｄ，１Ｈ），４．３０（ｑ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）  １．３３（ｔ，３Ｈ）．
【００８９】
化合物５．ＬｉＯＨ一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の水（１５０ｍＬ，０．５７Ｍ）中溶液を、化合物４（１０．５ｇ，３４．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を４０℃で終夜加熱し、その後、ＨＰＬＣ分析を通じて加水分解が完了した。反応混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、減圧濃縮し、アセトニトリルを除去した。得られた溶液をＥｔＯＡｃ（２ｘ１５０ｍＬ）で抽出し、有機層を廃棄した。１０％ＫＨＳＯ４（Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を加えて、水層をｐＨ４に酸性化した。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃ（３ｘ１５０ｍＬ）で再度抽出した。後の３回の抽出から得た有機層を合わせて、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、褐色の固形物として化合物５を得た（９．７ｇ，８４％）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１２．８４（ｓ，１Ｈ），１１．６５（ｓ，１Ｈ），９．２０（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２９９（Ｍ＋Ｎａ）＋．
【００９０】
化合物６．化合物５（７７９ｍｇ，２．８３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（「ＨＡＴＵ」，Ｏａｋｗｏｏｄ，１．０７ｇ，２．８３ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１０ｍＬ）中溶液を調製した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＰＥＡ」）を加えて、反応溶液のｐＨが８を超えるように調整した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。粗化合物２（１．１５ｇ，推定２．３６ｍｍｏｌ）を加え、次いで、多量のＤＩＰＥＡを加えて、反応混合物のｐＨが８を超えるように調整した。反応混合物を室温で終夜撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応がほぼ終了したことを示した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄し、続けて食塩水で洗浄した。有機相を、２ｇシリカゲルを用いてスラリーになるまで濃縮した。スラリーを、ヘキサン中０〜５０％ＥｔＯＡｃグラジエントを用いて４０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムで精製し、黄色の固形物として化合物６を得た（１．０５ｇ，７６％）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．６１（ｓ，１Ｈ），９．１８（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ），８．１６（ｍ，１Ｈ），７．９５（ｍ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｍ，３Ｈ），７．３３（ｍ，３Ｈ），７．１５（ｓ，１Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），４．８２（ｔ，１Ｈ），４．５９（ｄ，１Ｈ），４．３０（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
【００９１】
化合物７．化合物６（７８０ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１０％，１５０ｍｇ）の無水ＤＣＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１０ｍＬ）および無水メタノール（５ｍＬ）中反応混合物を、水素バルーン下で終夜撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、濾液を濃縮して、わずかに黄色の固形物として化合物７を得（５６２ｍｇ，８６％）、それをさらに精製することなく次の工程で用いた。
【００９２】
化合物９．化合物７（２６０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ジエチルホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，０．５８ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）およびテトラゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，アセトニトリル中０．４５Ｍ，１４ｍＬ）のテトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，２５ｍＬ）中溶液を、室温で２時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、出発物質７が化合物８に完全に変換されたことを示した。化合物８を単離することなく、ｍ−クロロ過安息香酸（「ｍＣＰＢＡ」，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，３６５ｍｇ，２．１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（無水，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物を０．５ｇのシリカゲルを用いて濃縮し、スラリーを形成した。スラリーを、ヘキサン中１０〜５０％ＥｔＯＡｃグラジエントを用いて４ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、高真空下で乾燥し、白色の固形物の化合物９を得た（２１２ｍｇ，５９％）。
【００９３】
化合物１０．ＴＦＡ（Ｆｉｓｈｅｒ，３ｍＬ）を、化合物９（２１２ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物を濃縮し、高真空下で終夜乾燥し、緑がかった固形物として化合物１０を得た（２７１ｍｇ）。ＴＦＡ塩の１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．８１（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，１Ｈ），７．９４（ｄ，１Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｍ，３Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｄ，１Ｈ），４．７８（ｔ，１Ｈ），４．６８（ｄ，１Ｈ），４．３２（ｓ，１Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）．
【００９４】
化合物１２．化合物１１（１７９ｍｇ，Ｓｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０（その開示は本明細書によって引用される）にしたがって調製された、モノＴＦＡ塩と仮定すると０．２５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（Ｏａｋｗｏｏｄ，８４．４ｍｇ，０．２２２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，３ｍＬ）中溶液のｐＨを、ＤＩＰＥＡを加えて８を超えるように調整した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、化合物１１のほとんどが活性化したことを示した。化合物１０（１３０ｍｇ，モノＴＦＡ塩と仮定すると０．２２２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。ＤＩＰＥＡを加えて、ｐＨが８を超えるように調整した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物を、プレパラティブＨＰＬＣに注入し、溶出液として水（０．１％ＴＦＡを含む）中１０〜１００％アセトニトリルグラジエントを用いて精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、白色の固形物として化合物１２を得た（１３８ｍｇ，５５％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１０５５．
【００９５】
当業者であれば、上記の合成ならびに図１Ａおよび１Ｂの合成は、断片ａおよびａ’の前駆体の収束的結合(convergent assembly)を含むことおよび別の合成戦略は、例えば、下記の断片ｂ、ｂ’およびｂ”または断片ｃ、ｃ’およびｃ”の前駆体の結合(assembly)を介して利用されうることを理解するであろう。後者の２つの戦略は、Ｓｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０（その開示は本明細書によって引用される）にて説明されており、適当な変更を加えれば、本発明の化合物の合成に適当でありうる、
【化２４】
2014517842.tif 000028
【００９６】
実施例２−化合物（Ｉａ）
該実施例は、化合物１４（本明細書では、化合物（Ｉａ）とも称される）の合成に関する。合成スキーム図は、図２に示される。
【００９７】
化合物１３．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１７μＬ，０１ｍｍｏｌ）を、化合物１０ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１５．７ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（Ｏａｋｗｏｏｄ，１９．４ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物のｐＨは８を超えた。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、出発物質が完全に活性化したことを示した。化合物１０（３０ｍｇ，モノＴＦＡ塩と仮定すると０．０５１ｍｍｏｌ）を該溶液に加えた。多量のＤＩＰＥＡを加えて、反応混合物のｐＨが８を超えるように調整した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。粗生成物を、溶出液として水中１０〜１００％アセトニトリルグラジエント（０．１容量％ＴＦＡ含有）を用いてプレパラティブＨＰＬＣで精製し、オフホワイト色の固形物として化合物１３を得た（２５ｍｇ，７１％）。
【００９８】
化合物１４．ＴＦＡ（ＶＷＲ，１ｍＬ）を、化合物１３（２５ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物を濃縮し、溶出液として水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１容量％ＴＦＡ含有）を用いてプレパラティブＨＰＬＣで精製し、オフホワイト色の固形物として化合物１４を得た（２１ｍｇ，モノＴＦＡ塩と仮定すると８２％）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．６５（ｓ，１Ｈ），９．６７（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄ，２Ｈ），７．９１（ｍ，２Ｈ），７．６９（ｄ，２Ｈ），７．３５−７．５５（ｍ，４Ｈ），７．１５（ｓ，１Ｈ），６．５７（ｄ，２Ｈ），４．８２（ｔ，１Ｈ），４．５７（ｄ，１Ｈ），４．０３（ｔ，１Ｈ），３．９５４（ｔ，１Ｈ）．３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ−５．９０９（ｓ，１Ｐ），ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５９１．
【００９９】
実施例３−化合物（ＩＩｂ）
図３Ａ〜３Ｄは組み合わせて、化合物２８（本明細書では、化合物（ＩＩｂ）とも称される）の合成を示す。当業者は、本明細書にて利用される一般的戦略は、実施例１における上記のｂ／ｂ’／ｂ”パターンに相当することを理解するであろう。
【０１００】
図３Ａは、第１の中間化合物１８の合成を示す。
【０１０１】
化合物１７．ｔｅｒｔ−ブチル  （２−オキソエチル）カルバメート（化合物１６，Ａｌｄｒｉｃｈ，５ｇ，３１．４ｍｍｏｌ）のメタノール（無水，Ａｃｒｏｓ，１５ｍＬ）中溶液を、（Ｓ）−メチル  ２−アミノ−３−メチルブタノエート（化合物１５，ＢａＣｈｅｍ，ＨＣｌ塩，５．２６ｇ，３１．４ｍｍｏｌ）、ＮａＯＡｃ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１０．３ｇ，８２．０６ｍｍｏｌ）のメタノール（無水，Ａｃｒｏｓ，６５ｍＬ）中溶液に加えた。次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ（Ａｌｄｒｉｃｈ，３．９５ｇ，６２．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２２．５℃で１６時間撹拌し、スラリーになるまで濃縮した。スラリーを水（１００ｍＬ）に溶解し、得られた溶液をＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、食塩水（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、濃縮し、真空下で乾燥して、化合物１７を得た（油状物，粗９．４ｇ）。［Ｍ＋Ｈ］２７５．
【０１０２】
化合物１８．ＬｉＯＨ水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ，２．８８ｇ，６８．６ｍｍｏｌ）の水（４０ｍＬ）中溶液を、粗化合物１７（９．４ｇ）のメタノール（４０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌し、水（４０ｍＬ）で希釈した。得られた溶液をＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出した。水層を分離し、ＫＨＳＯ４溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ，水中２０％）でｐＨ５に酸性化した。懸濁液を濾過し、固形物を高真空下で乾燥し、白色の固形物として化合物１８を得た（４．８５ｇ，化合物１５から６０．２％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］２６１．１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ６．８２（ｔ，１Ｈ），３．０６（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｄ，１Ｈ），２．６２（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｍ  １Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ），０．８６（ｄ，６Ｈ）．
【０１０３】
図３Ｂは、第２の中間化合物２２の合成を示す。
【０１０４】
化合物２１．４−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物１９，Ｆｌｕｋａ，８．７５ｇ，４５．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（「ＥＤＣ」，Ｆｌｕｋａ，８．６８ｇ，４５．３ｍｍｏｌ），無水ＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，１５０ｍＬ）中１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，６．１２ｇ，４５．３ｍｍｏｌ）、およびＣｕＣｌ２（Ａｌｄｒｉｃｈ，６．０８ｇ，４５．３ｍｍｏｌ）を、Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌ−シトルリン（化合物２０，Ｆｌｕｋａ，１５ｇ，３７．７４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）で希釈し、得られた溶液をＮａ２ＣＯ３溶液（５％，２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１ｘ２００ｍＬ）、および食塩水（１ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機相を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、黄色の固形物として粗化合物２１を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．３９（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｑ，４Ｈ），７．６８（ｍ，４Ｈ），７．２８−７．４０（ｍ，５Ｈ），６．０１（ｔ，１Ｈ），５．４２（ｓ，２Ｈ），４．１０−４．２９（ｍ，４Ｈ），２．９０−３．０５（ｍ，２Ｈ），１．３２−１．７０（ｍ，１３Ｈ）；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５７３．
【０１０５】
化合物２２．ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，１４ｍＬ）を、粗化合物２１の無水ＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，１４０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。反応混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）に溶解した。有機相を食塩水（１ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、スラリーになるまでシリカゲルを用いて濃縮した。スラリーを、溶出液としてＤＣＭ中０〜２０％メタノールグラジエントを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、白色の固形物として化合物２２を得た（９．５ｇ，化合物２０から収率７２％）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８２（ｄ，２Ｈ），７．７２（ｄ，２Ｈ），５．９７（ｔ，１Ｈ），５．３８（ｓ，２Ｈ），３．４３（ｍ，１Ｈ），２．９８（ｔ，２Ｈ），１．３０−１．６２（ｍ，１３Ｈ）；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］３５１．
【０１０６】
図３Ｃは、第３の中間化合物２５の合成を示す。
【０１０７】
化合物２３．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、溶液のｐＨが８を超えるように調整するのに十分な量で、化合物１８（１．５ｇ，５．７７ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（「ＢＯＰ」，ＢａＣｈｅｍ，２．８７ｇ，６．５ｍｍｏｌ）および化合物２２（１．８４ｇ，５．２６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，無水，１５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）を反応混合物に加えた。水層をＤＣＭ（２ｘ２５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、スラリーになるまでシリカゲル（８ｇ）を用いて濃縮した。スラリーを、溶出液としてＤＣＭ中０〜１０％メタノールグラジエントを用いて８０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、白色の固形物として化合物２３を得た（２．１ｇ，６８％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５９３．
【０１０８】
化合物２４．ジオキサン中ＨＣｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ，４Ｎ，７ｍＬ）を、化合物２３（１．８ｇ，３．０３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード，Ａｌｄｒｉｃｈ，２０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。生成物を濾過して回収し、高真空下で終夜乾燥し、ほぼ白色の固形物として化合物２４を得た（１．４５ｇ，９４％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］４３７．
【０１０９】
化合物２５．ＤＩＰＥＡを、溶液のｐＨが８を超えるように調整するのに十分な量で、化合物２４（２００ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ，二ＨＣｌ塩と仮定）および（Ｂｏｃ）２Ｏ（９４．２ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（無水，２ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は、反応が終了したことを示した。ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。生成物を半固形物として分離した。溶媒を廃棄し、生成物を高真空下で終夜乾燥し、白色の固形物として化合物２５を得た（１７８ｍｇ，８５％，ＨＣｌ塩）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５３７．１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．５１（ｓ，１Ｈ），８．８５（ｂ，１Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．０３（ｂ，１Ｈ），６．１８（ｄ，１Ｈ），５．４２（ｂ，２Ｈ），４．４８（ｓ，１Ｈ），２．７５−３．１０（ｍ，７Ｈ），２．１８（ｂ，１Ｈ），１．４２−１．７８（ｍ．４Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｍ，６Ｈ）．
【０１１０】
図３Ｄは、化合物２８（本明細書では、化合物（ＩＩｂ）とも称される）の合成の完成を示す。
【０１１１】
化合物２６．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．１４２ｍＬ，０．８１６ｍｍｏｌ）を、化合物２５（３９４ｍｇ，０．７３４ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（Ｏａｋｗｏｏｄ，１８６ｍｇ，０．４８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，無水，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物のｐＨは８を超えていた。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。化合物１０（実施例１，１９２ｍｇ，０．４０７ｍｍｏｌ）を加えた。多量のＤＩＰＥＡを加え、８を超える反応混合物のｐＨを保持した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物をプレパラティブＨＰＬＣに注入し、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、白色の固形物として化合物２６を得た（２０５ｍｇ，５１％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］９９０．
【０１１２】
化合物２７．ＴＦＡ（ＶＷＲ，５ｍＬ）を、化合物２６（２０５ｍｇ，０．２０７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，無水，５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、凍結乾燥して、そのＴＦＡ塩として化合物２７を得た（２１０ｍｇ，１００％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］８９０．
【０１１３】
化合物２８．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．１４７ｍＬ，０．８４２ｍｍｏｌ）を、３−メルカプトプロパン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，５９．６ｍｇ，０．５６２ｍｍｏｌ）、化合物２７（１００ｍｇ，０．１１２ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１２４ｍｇ，０．２８１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，無水，２ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物のｐＨは８を超えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をプレパラティブＨＰＬＣに注入し、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．０１％ＴＦＡ含有）で溶出して精製し、化合物２８（４５ｍｇ，４５．５％）を得た。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］９７８．
【０１１４】
実施例４−免疫コンジュゲートの調製
以下は、リジン  ε−アミノ基と２−イミノチオランとの反応、次いで、マレイミド含有プロドラッグ化部分、例えば化合物（ＩＩａ）との反応による抗体への遊離チオール基の導入に基づく、本発明の免疫コンジュゲートの調製のための一般的製法の説明である。最初に、抗体は、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ジエチレントリアミン五酢酸（「ＤＴＰＡ」）を含有する０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）にバッファー交換され、５〜１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮される。チオール化は、抗体に２−イミノチオランを加えて達成される。２−イミノチオランの添加量は、予備実験によって決定され得、抗体ごとに変化する。予備実験において、２−イミノチオランの増加量を抗体に滴下し、室温（２５℃）で１時間抗体を用いてインキュベートした後に、抗体をＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５カラムを用いて５０ｍＭ  ｐＨ６．０  ＨＥＰＥＳバッファー中に脱塩し、導入されたチオール基の数をジチオジピリジン（「ＤＴＤＰ」）との反応によって速やかに測定する。チオール基とＤＴＤＰとの反応はチオピリジンの遊離をもたらし、それは３２４ｎｍで分光学的にモニターされうる。典型的には、０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の試料を用いる。２８０ｎｍでの吸光度を、試料中のタンパク質濃度を正確に測定するために用いることができ、次いで、各試料のアリコート（０．９ｍＬ）を、室温で１０分間０．１ｍＬ  ＤＴＤＰ（５ｍＭ  エタノール中ストック溶液）を用いてインキュベートする。バッファーのみ＋ＤＴＤＰのブランク試料もまた、並行してインキュベートする。１０分後、３２４ｎｍでの吸光度を測定し、チオール基の数を１９，８００Ｍ−１のチオピリジンの吸光係数を用いて定量化する。
【０１１５】
典型的には、１抗体当たり約３個のチオール基のチオール化レベルが望ましい。例えば、これは、いくつかの抗体と共に、１５倍モル過剰の２−イミノチオランを加え、次いで、室温で１時間インキュベートすることによって達成されうる。次いで、抗体は、所望のモル比で２−イミノチオランを用いてインキュベートされ、次いで、コンジュゲーションバッファー（５０ｍＭ  ｐＨ  ６．０  ＨＥＰＥＳバッファー（５ｍＭ  グリシンおよび２ｍＭ  ＤＴＰＡ含有））中に脱塩される。チオール化物質は氷上で維持されるのに対し、導入されたチオールの数は上記のように定量化される。
【０１１６】
導入されたチオールの数を確認した後、薬物−リンカー部分が、１チオール当たり３倍モル過剰量で加えられる。コンジュゲーション反応は、最終濃度が５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をも含有するコンジュゲーションバッファー、または同様の別の溶媒において進行しうる。一般的に、薬物−リンカーストック溶液は、１００％ＤＭＳＯに溶解される。ストック溶液は、最終濃度を１０％にするために加えられた十分なＤＭＳＯを有するか、または最終濃度が１０％のＤＭＳＯを含有するコンジュゲーションバッファーで前希釈された、チオール化抗体に直接加えられ、次いで、同量のチオール化抗体を加えうる。
【０１１７】
コンジュゲーション反応混合物を、攪拌しながら室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後、コンジュゲーション反応混合物を遠心分離し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。コンジュゲートの精製は、多数の方法を用いてクロマトグラフィーを介して達成されうる。ある方法では、コンジュゲートは、５ｍＭグリシンおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ｐＨ７．２  ＨＥＰＥＳバッファーで予め平衡にしたＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ２００カラムのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する。線流速２８ｃｍ／ｈでクロマトグラフィーを実施する。コンジュゲートを含有するフラクションを改修し、プールし、そして、濃縮する。別法では、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製を達成しうる。条件は、抗体ごとに変化し、各場合において最適化されるべきである。例えば、抗体−薬物コンジュゲート反応混合物は、５ｍＭグリシンを含有する５０ｍＭ  ｐＨ５．５  ＨＥＰＥＳで予め平衡にしたＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムに供給される。抗体コンジュゲートは、ｐＨ５．５で平衡化バッファー中０〜１Ｍ  ＮａＣｌのグラジエントを用いて溶出される。免疫コンジュゲートを含有する関連のあるフラクションは、プールされ、製剤バッファー（５ｍＭグリシンおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ｐＨ７．２  ＨＥＰＥＳバッファー）に対して透析される。
【０１１８】
上記の製法にしたがって、化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートを、抗ＰＳＭＡヒトモノクローナル抗体（２Ａ１０，Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９およびＣａｒｄａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）；抗メソテリンヒトモノクローナル抗体（６Ａ４，Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９ｂ）、抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体（２Ｈ５，Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９ａ）、および抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体（２１Ｄ４，Ｒａｏ−Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２００９）を調製した。同様に、化合物（Ａ）との比較免疫コンジュゲートを調製した。
【０１１９】
当業者は、上記の病態および方法が例示するものであって、限定するものではないこと、そして、コンジュゲーションのアプローチが当該分野にて周知であり、本発明において使用可能であることを理解するであろう。
【０１２０】
実施例５−３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ
該実施例は、一般的に、本発明の免疫コンジュゲートの抗増殖活性をアッセイするために用いられる製法について記載している。ヒト腫瘍細胞系を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡから得、そして、ＡＴＣＣ指示書にしたがって培養した。ＣＨＯ−Ｍｅｓｏ細胞を、ＣＨＯ細胞にヒトメソテリン遺伝子含有ＤＮＡをトランスフェクトし、ヒトメソテリンを発現する安定なクローンを選択することによって作製した。それぞれ３Ｈチミジンアッセイのために３時間９６ウェルプレート中に、細胞を１．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。免疫コンジュゲートの連続希釈物（１：３）をウェルに加えた。プレートを７２時間インキュベートした。プレートは、インキュベーション全期間の最後の２４時間、１．０μＣｉの３Ｈ−チミジン／ウェルでパルスを発し、それを捕獲し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で読み取った。ＥＣ５０値−物質が５０％の最大阻害によって細胞増殖を阻害するかまたは減少させる濃度−を、ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェア，バージョン４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【０１２１】
抗増殖結果は、上記されるように、図４Ａ〜４Ｆに示されている。
【０１２２】
実施例６−細胞溶解物による脱リン酸化
該実施例は、本発明に記載のリン酸プロドラッグ化ｓｅｃｏ−ＭＧＢＡ化合物がヒト腫瘍細胞溶解物によって脱リン酸化されうることを立証している。
【０１２３】
ボルテックス用チューブごとに１０７細胞の推定量を有する冷凍ペレットとしての７８６−Ｏ細胞を再懸濁し、５００μＬの溶解バッファー（２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５Ｍショ糖，０．１％トリトンＸ−１００，ｐＨ５．５）中で均一化した。均一化は、３０秒のボルテックス混合、次いで、１分の氷冷を含んでいた。次いで、細胞試料を、１９ゲージ針中で３回さらにせん断混合した。
【０１２４】
均一化後、細胞溶解物のＤＮＡを、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）ＤＮＡｓｅを用いて加水分解した。最初に、試料を１ｍＭ  ＭｇＳＯ４で育てた。混合後、２μＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）ＤＮＡｓｅ（ニート）を、溶解物の各バイアルに加えた（４μＬ／ｍＬ，ｖ／ｖ，最終濃度）。次いで、試料を１５分間室温で保存し、次いで、氷冷した。該工程について、良好なＤＮＡｓｅ活性を、綿状沈殿物の出現によって明らかにした。次いで、試料を、微小遠心分離機にて最大速度で５分間回転させ、細胞残屑を除去した。上清を、後で用いるために−７０℃で冷凍した。溶解物のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質測定方法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。該試験中の試料が、２．８５ｍｇ／ｍＬタンパク質を含有することを見出した。
【０１２５】
式（Ｉａ）で示される化合物の２０００μＭストック溶液を調製した。溶解物を溶解バッファー中で２．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。反応のために、５μＬの化合物（Ｉａ）ストックを９５μＬの溶解物に加えた。最終濃度は、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する溶解物中１００μＭ化合物（Ｉａ）であった。ｐＨ５．５で緩衝化する、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ショ糖、０．１％トリトンＸ  １００、および１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有するバッファーを提供した。
【０１２６】
ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）ＤＮＡｓｅおよびＭｇＳＯ４も加えられている、細胞溶解物の代わりに溶解バッファーを用いる、陰性対照が用いられた。
【０１２７】
試験試料および対照を、３７℃で熱ブロックセットに加えた。所定の時間間隔（５分、１時間、２時間、４時間および８時間）で、５０μＬアリコートを除去し、１５０μＬ（３ｘ）の冷エタノールを加えて各アリコートにおける反応を停止した。試料を１時間氷上で保存し、遠心分離して、タンパク質を除去した。以下の条件下でＵＰＬＣ分析するために、上清を準備した：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＨＳＳ  Ｔ３  ２．１ｘ５０ｍｍ  Ｃ１８  ＵＰＬＣ
移動相：「Ａ」バッファー：水／０．１％ＴＦＡ；「Ｂ」バッファー：アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
ＨＰＬＣ系：Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ
注入量：４μＬ
溶出：１．８分間で２５〜４０％「Ｂ」
流速：１ｍＬ／分
検出：Ａ３４０
【０１２８】
反応に続いて、それぞれ、脱リン酸化化合物（Ｉａ）のｓｅｃｏ形およびシクロプロピル形である、化合物（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）の製造をモニタリングした。
【化２５】
2014517842.tif 000029
【０１２９】
脱リン酸化は、かなり急速であり、８時間以内に終了することが見出された。反応混合物のｐＨは、リソソーム細胞小器官において見出されたものに近似する、５．５であったので、該結果は、脱リン酸化反応における酸ホスファターゼが関与する。
【０１３０】
Ｈ２２６細胞溶解物を用いて、同様の実験を行った。脱リン酸化は、３時間以内に終了することが見出された。
【０１３１】
実施例７−肝ミクロソームによる脱リン酸化
該実施例は、ヒトおよびマウス肝ミクロソーム酵素による化合物（Ｉａ）の脱リン酸化を立証している。
【０１３２】
プールされている肝臓源（ｌｉｖｅｒ  ｓｏｕｒｃｅ）由来のヒト肝ミクロソームを、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ（Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｈ−０６３０）から得られた。それらは、２０％ショ糖溶液中２０ｍｇ／ｍＬのわずかなタンパク質濃度で供給された。タンパク質含有量を、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒからの試薬を用いてＢＣＡ分析で検証した。
【０１３３】
ヒト肝ミクロソームを、反応バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ０．９％  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で８．４２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈量を、１００μＬ最終反応容量の９５μＬごとに０．８ｍｇを正確に輸送できるように設定した。次いで、ストックを１：１容量対容量で連続希釈して、ストック溶液当たり８〜０．０１５６ｍｇ／ｍＬのミクロソームを輸送する１０個のストック溶液を製造した。
【０１３４】
式（Ｉａ）で示される化合物の２０００μＭストック溶液を調製した。反応のために、９５μＬの各ミクロソームストックを、３７℃の熱ブロック中で平衡化した。次いで、５μＬアリコートの化合物（Ｉａ）ストック溶液を、正確に調整された３０秒間隔で各反応バイアルに加えた。最終化合物（Ｉａ）濃度は、１００μＭであった。試料を温度で１時間反応して、その後、１００μＬの冷エタノールを加えて反応を停止した。各バイアルが正確に１時間反応するように、正確に３０秒間隔で再度停止した。試料を２回調製した。タンパク質は３０分間氷上で沈殿した。遠心分離後に上清を回収した。ＵＰＬＣクロマトグラフィー分析は、前記実施例に記載の同一条件を用いて実施され、化合物（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）の製造を再度モニタリングした。ミクロソーム濃度の関数として化合物（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）への化合物（Ｉａ）の変換を示すクロマトグラフィートレースは、図５に示されている。
【０１３５】
図６は、ミクロソーム濃度の関数として６０分後の化合物（Ｉａ）から製造された化合物（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）の量のプロットである。製造の速度は、基本的には、０．００１５６〜０．０１２５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム濃度に対して線形である。該範囲のデータを用いて、０．００５４μｍｏｌ／分／ｍｇの化合物（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）の製造速度が算出された。
【０１３６】
マウス肝ミクロソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｍ−３０００）を用いること以外は同一製法を利用して、０．００１８μｍｏｌ／分／ｍｇの速度を得た。
【０１３７】
実施例８−化合物（ＩＩｃ）
該実施例および図７は、化合物３０（本明細書では、化合物（ＩＩｃ）とも称される）の合成について記載している。
【０１３８】
化合物３０．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，７．８５μＬ，０．０４５ｍｍｏｌ）を、化合物２７（２０ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）、５−アジドペンタン酸２９（ＢａＣｈｅｍ，６．４３ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１９．８７ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，無水，０．５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物のｐＨは８を超えたままであった。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をプレパラティブＨＰＬＣカラムに注入し、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して精製し、化合物３０を得た（５ｍｇ，２１．９％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１０１５．
【０１３９】
化合物３０（ＩＩｃ）は、「クリック」化学を利用してコンジュゲーションに適当なものにする、アジド反応性官能基を有する。
【０１４０】
実施例９−化合物（ＩＩｄ）
該実施例および図８は、化合物３４（本明細書では、化合物（ＩＩｄ）とも称される）の合成について記載している。
【０１４１】
化合物３２．ジシクロヘキシルカルボジイミド（「ＤＣＣ」，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，２７７ｍｇ，１．０９８ｍｍｏｌ）を、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（Ａｃｒｏｓ，１２６ｍｇ，１．０９８ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸３１（ＴＣＩ，２００ｍｇ，１．０４６ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，２ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、濾液を濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物３２を得た（２７５ｍｇ，９１．２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．６６（ｓ，１Ｈ），４．７８（ｓ，２Ｈ），２．８７（ｓ，４Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．
【０１４２】
化合物３３．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，３６．５μＬ，０．２１ｍｍｏｌ）を、化合物３２（２０ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）および化合物２７（３１ｍｇ，０．０３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）でプレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物３３を得た（２４ｍｇ，６４．５％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１０６３．
【０１４３】
化合物３４．ＴＦＡ（Ａｃｒｏｓ，０．５ｍＬ）を、化合物３３（２４ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，０．５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。反応混合物を、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）を用いてプレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物３４を得た（１０ｍｇ，４５．７％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］９６３．
【０１４４】
化合物３４（ＩＩｄ）は、ケトン基を含有するように改変された抗体とのオキシム形成によって、例えば、非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンの取り込みによって、コンジュゲーションに適当なものにする、ヒドロキシルアミン反応性官能基を有する。
【０１４５】
実施例１０−化合物（ＩＩｅ）
該実施例および図９Ａ〜９Ｂは組み合わせて、化合物４８（本明細書では、化合物（ＩＩｅ）とも称される）の合成について記載している。
【０１４６】
化合物３７．塩化銅（ＩＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，１．２５２ｇ，９．３１ｍｍｏｌ）を、４−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル３６（Ｆｌｕｋａ，１．５ｇ，７．７６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ保護されたロイシン３５（ＢａＣｈｅｍ，２ｇ，５．６６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（Ｆｌｕｋａ，１．７８６ｇ，９．３１ｍｍｏｌ）およびｔ−ブタノール（Ｃｈｅｍ−ｉｍｐｅｘ，１．４２６ｇ，９．３１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）および食塩水（３０ｍＬ）で後処理した。有機相を濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物３７を得た（３．７ｇ）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５２９．
【０１４７】
化合物３８．ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，３ｍＬ）を、粗化合物３７（３．７ｇ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間保持し、次いで、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物３８を得た（１．７ｇ，２工程にわたって７０．８％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］３０７．
【０１４８】
化合物４１．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．９７ｍＬ，５．５ｍｍｏｌ）を、アラニン  ｔ−ブチル  エステル塩酸塩３９（ＢａＣｈｅｍ，０．４ｇ，２．２２ｍｍｏｌ）および化合物４０（Ｂａｃｈｅｍ，１ｇ，２．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，２０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）、水（５０ｍＬ）および食塩水（５０ｍＬ）で後処理した。有機相を濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物４１を得た（１．３ｇ）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］４８１．
【０１４９】
化合物４２．ＴＦＡ（Ａｃｒｏｓ，１０ｍＬ）を、粗化合物４１（１．３ｇ）のＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，無水，１０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間保持し、濃縮し、水中１０〜１００％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物４２を得た（０．６８ｇ，２工程にわたって７２．２％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］４２５．
【０１５０】
化合物４３．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．２４６ｍＬ，１．４１３ｍｍｏｌ）を、化合物３８（２８９ｍｇ，０．８４２ｍｍｏｌ）、化合物４２（２００ｍｇ，０．４７１ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（Ｂａｃｈｅｍ，３１３ｍｇ，０．７０７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）および食塩水（２０ｍＬ）で後処理した。有機相を濃縮し、ヘキサン中０〜６０％ＥｔＯＡｃグラジエントを溶出して、４ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。有機相を組み合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物４３を得た（１２６ｍｇ，３７．５％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］７１３．
【０１５１】
化合物４４．ＴＦＡ（Ａｃｒｏｓ，３ｍＬ）を、化合物４３（１２６ｍｇ）のＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，無水，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で０．５時間保持し、濃縮し，水中１０〜１００％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物４４を得た（８４ｍｇ，７２％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］６５７．
【０１５２】
化合物４５．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，２１μＬ，０．１２２ｍｍｏｌ）を、化合物４４（４０ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（Ｏａｋｗｏｏｄ，１８．５３ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物のｐＨは８を超えた。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。該反応混合物に、化合物１０（３４．５ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）を加え、続けてさらなるＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，２１μＬ，０．１２２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、水中１０〜１００％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物４５を得た（２０ｍｇ，３０％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１１１０．
【０１５３】
化合物４６．ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．２ｍＬ，２．０２ｍｍｏｌ）を、化合物４５（２０ｍｇ）のＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，無水，０．５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間保持した。反応混合物を、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物４６を得た（８ｍｇ，５０％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］８８８．
【０１５４】
化合物４８．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１０μＬ，０．００６ｍｍｏｌ）を、化合物４６（８ｍｇ，０．００９ｍｍｏｌ）およびＮ−スクシンイミジル  ６−マレイミドヘキサノエート４７（ＴＣＩ，５．５５ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｃｒｏｓ，無水，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間保持した。反応混合物を、水中１０〜１００％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物４８を得た（２ｍｇ，２０％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１０８１．
【０１５５】
化合物４８（ＩＩｅ）のＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕトリペプチドは、該化合物と製造されたコンジュゲートをＣＤ１０で開裂しやすくする、酵素ＣＤ１０の基質モチーフである。
【０１５６】
実施例１１−化合物（ＩＩｆ）
該実施例および図１０Ａ〜１０Ｂは組み合わせて、化合物５６（本明細書では、化合物（ＩＩｆ）とも称される）の合成について記載している。
【０１５７】
化合物５０．塩化銅（ＩＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．９１３ｇ，６．７９ｍｍｏｌ）を、４−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル３６（Ｆｌｕｋａ，１．３１２ｇ，６．７９ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ保護されたイソロイシン４９（ＢａＣｈｅｍ，２ｇ，５．６６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（Ｆｌｕｋａ，１．３０２ｇ，６．７９ｍｍｏｌ）およびｔ−ブタノール（Ｃｈｅｍ−ｉｍｐｅｘ，１．０４０ｇ，６．７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，２０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）および食塩水（３０ｍＬ）で後処理した。合わせた有機相を濃縮し、ヘキサン中０〜２０％ＥｔＯＡｃグラジエントで溶出して、４０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物５０を得た（０．８５ｇ，２８．４％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５２９．
【０１５８】
化合物５１．ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．５ｍＬ）を、粗化合物５０（３．７ｇ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間保持した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）、水（１５ｍＬ）および食塩水（１５ｍＬ）で後処理した。有機相を合わせて、濃縮し、ヘキサン中０〜７５％ＥｔＯＡｃグラジエントで溶出して、１２ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物５１を得た（０．３８ｇ，７６．９％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］３０７．
【０１５９】
化合物５２．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．２２８ｍＬ，１．３０５ｍｍｏｌ）を、化合物５１（０．２ｇ，０．６５３ｍｍｏｌ）および化合物４０（Ｂａｃｈｅｍ，２９４ｍｇ，０．６５３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）および食塩水（２０ｍＬ）で後処理した。合わせた有機相を濃縮し、ヘキサン中０〜４０％ＥｔＯＡｃグラジエントで溶出して、４ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。生成物含有フラクションを残渣になるまで濃縮し、それを高真空下で乾燥し、化合物５２を得た（１７８ｍｇ，４２．５％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］６４２．
【０１６０】
化合物５３．ＴＦＡ（Ａｃｒｏｓ，３ｍＬ）を、化合物５２（１７８ｍｇ，０．２７７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，無水，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で０．５時間保持した。反応混合物を濃縮し、凍結乾燥し、化合物５３を得た（１４５ｍｇ，８９．５％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５８６．
【０１６１】
化合物５６（ＩＩｆ）のＬｅｕ−Ｉｌｅジペプチドは、該化合物と製造された免疫コンジュゲートをカテプシンＥで開裂しやすくする、酵素カテプシンＥの基質モチーフである。
【０１６２】
実施例１２−化合物（ＩＩｇ）
該実施例および図１１Ａ〜１１Ｂは組み合わせて、化合物６７（本明細書では、化合物（ＩＩｇ）とも称される）の合成について記載している。
【０１６３】
化合物５７．塩化銅（ＩＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．９１３ｇ，６．７９ｍｍｏｌ）を、４−アミノ安息香酸メチル５６（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．９１３ｇ，６．０５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ保護されたシトルリン２０（ＢａＣｈｅｍ，２ｇ，５．０４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（Ｆｌｕｋａ，１．１６０ｇ，６．０５ｍｍｏｌ）およびｔ−ブタノール（Ｃｈｅｍ−ｉｍｐｅｘ，０．９２６ｇ，６．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，２０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）、水（３０ｍＬ）および食塩水（３０ｍＬ）で後処理した。有機相を濃縮し、ＤＣＭ中０〜２０％メタノールグラジエントで溶出して、４０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物５７を得た（１．８２５ｇ，６８．２％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５３１．
【０１６４】
化合物５８．ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ，０．２ｍＬ）を、化合物５７（１．２５ｇ，３．４３７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，３ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）、水（１５ｍＬ）および食塩水（１５ｍＬ）で後処理した。有機相を合わせて、濃縮し，ＤＣＭ中０〜３０％メタノールグラジエントで溶出して、１２ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物５８を得た（０．７７８ｇ，７３．１％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］３０９．
【０１６５】
化合物５９．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１．０ｍＬ，５．７１ｍｍｏｌ）を、化合物５８（７７８ｍｇ，２．５２ｍｍｏｌ）、化合物１８（６５５ｍｇ，２．５２ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（Ｂａｃｈｅｍ，１．１２ｇ，２．５２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）および食塩水（２０ｍＬ）で後処理した。合わせた有機相を濃縮し、ＤＣＭ中０〜１５％メタノールグラジエントで溶出して、４０ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。有機相を合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物５９（１．０６ｇ，７６％）を得た。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］５５１．
【０１６６】
化合物６０．ＴＦＡ（Ａｃｒｏｓ，５ｍＬ）を、化合物５９（１．０６ｇ，１．９２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，無水，５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、凍結乾燥し、ＴＦＡ塩として化合物６０を得た（１．０９ｇ）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］４５１．
【０１６７】
化合物６２．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，１．０２ｍＬ，５．８３８ｍｍｏｌ）を、化合物６０（５００ｍｇ，１．１０９ｍｍｏｌ）、６−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキサン酸６１（Ｆｌｕｋａ，４５０ｍｇ，１．９４６ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（Ｂａｃｈｅｍ，０．７２０ｇ，１．６２９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）および食塩水（３０ｍＬ）で後処理した。合わせた有機相を濃縮し、ＤＣＭ中０〜２０％メタノールグラジエントで溶出して、１２ｇ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（商標）カラムで精製した。有機相を合わせて、濃縮し、高真空下で乾燥し、化合物６２を得た（４２７ｍｇ，５８％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］６６４．
【０１６８】
化合物６３．ＬｉＯＨ溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ，１０ｍＬ水中１５０ｍｇ）を、化合物６２（０．４２７ｇ，０．６４３ｍｍｏｌ）のアセトン（Ｂａｋｅｒ，１０ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ，氷，０．３ｍＬ）で中和した。反応混合物を、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物６３を得た（３２５ｍｇ，７７．８％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］６５０．
【０１６９】
化合物６４．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，２７μＬ，０．１５３ｍｍｏｌ）を、化合物６３（５９．５ｍｇ，０．０９２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（Ｏａｋｗｏｏｄ，２３．２１ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。これに、化合物１０（３６ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）を加え、続いてさらなるＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，２７μＬ，０．１５３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物６４を得た（３８ｍｇ，５５．７％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１１０３．
【０１７０】
化合物６５．ＴＦＡ（Ａｃｒｏｓ，１ｍＬ）を、化合物６４（３８ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（Ａｃｒｏｓ，無水，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、凍結乾燥し、ＴＦＡ塩として化合物６５を得た（４３ｍｇ）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１００３．
【０１７１】
化合物６６．ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ，２９μＬ，０．１５９ｍｍｏｌ）を、化合物３２（１５．４ｍｇ，０．０５３ｍｍｏｌ）および化合物６５（４３ｍｇ，０．０４３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，無水，１ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物６６を得た（２２ｍｇ，４３．５％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１１７６．
【０１７２】
化合物６７．化合物６６（２２ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）の４Ｎ  ＨＣｌ  １，４−ジオキサン溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ，１０ｍＬ）中溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、水中１０〜６５％アセトニトリルグラジエント（０．１％ＴＦＡ含有）で溶出して、プレパラティブＨＰＬＣで精製した。生成物含有フラクションを合わせて、凍結乾燥し、化合物６７を得た（１２ｍｇ，５８．７％）。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］１０７６．
【０１７３】
実施例１３−インビボ結果
図１２Ａ〜１２Ｉは、種々の癌型に対する、マウスでの異種移植試験における本発明の免疫コンジュゲートのインビボ効果を立証している。
【０１７４】
ＯＶＣＡＲ３細胞試験．０．１ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）＋０．１ｍＬマトリゲル中で再懸濁された、４００万のＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。２３日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された９０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する６匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の２４日後、試験化合物のみをマウスに腹腔内投与した。図１２Ａは、ＯＶＣＡＲ３細胞に対して、抗メソテリン抗体６Ａ４と化合物（ＩＩａ）との免疫コンジュゲートが、特に０．３１４μｍｏｌ／ｋｇの細胞毒素の高投与量で腫瘍成長を抑制したことを示す。抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４の対応する免疫コンジュゲートの比較データはまた、アイソタイプ対照として示される。
【０１７５】
Ｎ８７細胞試験．０．１ｍＬ  ＰＢＳ＋０．１ｍＬ  マトリゲル中で再懸濁された、２５０万人のＮ８７胃腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。１２日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された１１０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する７匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の１４日後、試験化合物のみをマウスに腹腔内投与した。図１２Ｂは、Ｎ８７細胞に対して、抗メソテリン抗体６Ａ４と化合物（ＩＩａ）との免疫コンジュゲートが腫瘍成長を強く阻害することを示す。製剤バッファーのみまたは（アイソタイプ対照としての）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの比較データが示される。
【０１７６】
Ｈ２２６細胞試験．０．１ｍＬ  ＰＢＳ＋０．１ｍＬ  マトリゲル中で再懸濁された、５００万のＨ２２６中皮腫細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。１４日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された１１０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する９匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の１５日後、試験化合物のみをマウスに腹腔内投与した。図１２Ｃは、腫瘍成長に対する抗メソテリン抗体６Ａ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの用量依存的効果を示す。ＳＲは、各場合において、３．６であった。
【０１７７】
Ｈ１６５０細胞試験．０．１ｍＬ  ＰＢＳ＋０．１ｍＬ  マトリゲル中で再懸濁された、２５０万のＨ１６５０肺腫瘍（腺癌）細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。７日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された１１０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する６匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の９日、１４日および２１日後、試験化合物のみをマウスに腹腔内投与した。図１２Ｄは、抗メソテリン抗体６Ａ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートによる腫瘍阻害を示す。ビヒクル対照および（アイソタイプ対照としての）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの比較データが示される。
【０１７８】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞試験．０．１ｍＬ  ＰＢＳ＋０．１ｍＬ  マトリゲル中で再懸濁された、４００万のＨｅｐ３Ｂ肝臓腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。１０日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された９０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する７匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の１１日後、試験化合物のみをマウスに腹腔内投与した。図１２Ｅは、抗グリピカン３抗体４Ａ６および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの用量依存的腫瘍成長阻害効果を示す。最も強力な効果は、０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量で認められた。ビヒクルのみ、抗体４Ａ６のみ、または（アイソタイプ対照としての）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートの比較データもまた示されている。図１２Ｆは、同一試験からのグラフであるが、腫瘍関連悪液質を軽減する抗体４Ａ６−化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートの能力を立証している。抗ＣＤ１９コンジュゲートが、（図１２Ｅによれば）腫瘍成長を減少しているが、（図１２Ｆによれば）悪液質を軽減していないことを示す、抗ＣＤ１９−化合物（ＩＩａ）免疫コンジュゲートのデータもまた示されている。
【０１７９】
ＬＮＣａＰ細胞試験．０．１ｍＬ  ＰＢＳ＋０．１ｍＬ  マトリゲル中で再懸濁された、２５０万のＬＮＣａＰ前立腺腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。３０日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された１５０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する７匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の３１日後、試験化合物のみをマウスに腹腔内投与した。図１２Ｇは、アイソタイプ対照としての処方物バッファーおよび抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４と化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートと比較した、抗ＰＳＭＡ抗体２Ａ１０および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートによる腫瘍成長阻害を示す。各場合において、細胞毒素濃度は０．１μｍｏｌ／ｋｇであった。図１２Ｈは、抗ＲＧ−１抗体１９Ｇ９および化合物（ＩＩａ）の免疫コンジュゲートと、抗ＣＤ１９免疫コンジュゲートのアイソタイプ対照の、同一試験からの別のセットの結果を示す。
【０１８０】
Ｒａｊｉ細胞試験．０．１ｍＬ  ＰＢＳ＋０．１ｍＬ  マトリゲル中で再懸濁された、１０００万のＲａｊｉヒトバーキットリンパ腫細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹部に皮下注入した。６日後、腫瘍測定を開始し、マウスを無作為に腫瘍のＬＷＨ／２で推定された９０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを各々有する８匹のマウスのグループに分けた。腫瘍注入の７日後、試験化合物単独でマウスに腹腔内投与した。図１２Ｉは、抗メソテリン抗体６Ａ４、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４、抗ＣＤ２２抗体１２Ｃ５および抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４それぞれと化合物（ＩＩａ）との免疫コンジュゲートによる腫瘍成長阻害作用を示す。（抗体１Ｆ４の全配列情報は、Ｃｏｃｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０に開示されており、その開示は本明細書によって引用される。抗体１Ｆ４のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０に示される。）
【０１８１】
本発明の前記の詳細な説明には、本発明の特定の部分または態様と主にまたは限定的に関連している一説が含まれる。これは明確にするためであって、便宜のためのものであること、特定の特性は開示されている単なる一説以上に関連がありうること、そして、本明細書の開示には、異なる一説にて見出された情報の適当な組合せが全て含まれることを理解すべきである。同様に、種々の図面および本明細書の記載は本発明の特定の実施態様に関するものであるけれども、特有の特性が特定の図面または実施態様の文脈において開示されている場合、かかる特性はまた、別の特性を組み合わせてまたは一般的な発明における、別の図面または実施態様の文脈において、適当な範囲で、用いられうることを理解すべきである。
【０１８２】
さらに、本発明は特定の好ましい実施態様に関して特に記載されているけれども、本発明はかかる好ましい実施態様に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されている。
【０１８３】
（参考資料）
第一著者（または発明者）および本明細書よりも先の日付によって簡略化された方法で引用される以下の参考資料のすべての引用は以下に提供される。これらの参考資料は、各々、本明細書によって引用される。
【０１８４】
Ａｒｉｓｔｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１６３２４（１９９１）．
【０１８５】
Ｂｅｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９，４８，６５７１−６５８４．
【０１８６】
Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９９，１５０５−１５０９．
【０１８７】
Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２００８／０２７９８６８Ａ１（２００８）．
【０１８８】
Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，６９１，９６２Ｂ２（２０１０）．
【０１８９】
Ｃａｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ２０００，１０（１２），１８５３−１８７１．
【０１９０】
Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，８７５，２７８Ｂ２（２０１１）．
【０１９１】
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，５１７，９０３Ｂ２（２００９）．
【０１９２】
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／０１１３４７６Ａ１（２０１０）．
【０１９３】
Ｃｏｃｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／０１５０９５０Ａ１（２０１０）．
【０１９４】
Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００２，１３，８５５−８６９．
【０１９５】
Ｇａｎｇｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２００８／０２９３８００Ａ１（２００８）．
【０１９６】
Ｇｌａｚｉｅｒ，ＷＯ０３／０００２０１Ａ２（２００３）．
【０１９７】
Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２００９／０２９７４３８Ａ１（２００９）．
【０１９８】
Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／０１０４５０９Ａ１（２０１０）［２０１０ａ］．
【０１９９】
Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／０１４３３６８Ａ１（２０１０）［２０１０ｂ］
【０２００】
Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１１／００２０３２９Ａ１（２０１１）．
【０２０１】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４，５４，２４０４−２４１０．
【０２０２】
Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２００９／００７４６６０Ａ１（２００９）．
【０２０３】
Ｋｕｔｙａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，６５９，０２２（１９９７）．
【０２０４】
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０２／０９６９１０Ａ１（２００２）．
【０２０５】
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，９８９，４５２Ｂ２（２００６）［２００６ａ］．
【０２０６】
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，１２９，２６１Ｂ２（２００６）［２００６ｂ］．
【０２０７】
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，４９８，３０２Ｂ２（２００９）［２００９ａ］．
【０２０８】
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，５０７，４２０Ｂ２（２００９）［２００９ｂ］．
【０２０９】
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ＲＥ４１，２５２Ｅ（２０１０）．
【０２１０】
Ｒａｏ−Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ８，０９７，７０３Ｂ２（２０１２）．
【０２１１】
Ｓｕｃｋｌｉｎｇ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ２００４，１４（１２），１６９３−１７２４．
【０２１２】
Ｓｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／０１４５０３６Ａ１（２０１０）．
【０２１３】
Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／００３４８２６Ａ１（２０１０）［２０１０ａ］．
【０２１４】
Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１０／０２０９４３２Ａ１（２０１０）［２０１０ｂ］．
【０２１５】
Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１１／００８５９７０Ａ１（２０１１）［２０１１ａ］．
【０２１６】
Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１１／０２６２４４８Ａ１（２０１１）［２０１１ｂ］．
【０２１７】
Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１２／００２７７８２Ａ１（２０１２）［２０１２ａ］．
【０２１８】
Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ８，１２４，７３８Ｂ２（２０１２）［２０１２ｂ］．
【０２１９】
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ  ４５，２８ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，８−１２  Ｊｕｎｅ  ２００２），「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＣＣ−１０６５  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（ａｂｓｔｒａｃｔ）．［２００２ａ］．
【０２２０】
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ  ＭＥＤＩ  １４７，２２４ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１８−２２  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２），「Ｎｅｗ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＣ−１０６５  ａｎａｌｏｇ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕｔｉｏｎ」（ａｂｓｔｒａｃｔ）  ［２００２ｂ］．
【０２２１】
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ７，６５５，６６０Ｂ２（２０１０）．
【０２２２】
（配列表）
本明細書に記載の核酸および／またはアミノ酸配列を含む、配列番号１から配列番号６０からなる「ＳＥＱＴ＿１１７７０ＷＯＰＣＴ．ｔｘｔ」名の配列表は、その全体が本明細書によって引用される。配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩテキスト形式で添付して提出されており、その結果、紙とそのコンピューターに読み込み可能な形式の両方を構成する。配列表は、２０１２年４月２４日にＰａｔｅｎｔＩｎ３．５を用いて最初に作成された（サイズは１０ＫＢである）。
【０２２３】
以下の表は、本願に記載の配列の説明を要約している。
【表３−１】
2014517842.tif 000030
【表３−２】
2014517842.tif 000031
【図１Ａ】
2014517842.tif 000041
【図１Ｂ】
2014517842.tif 000042
【図２】
2014517842.tif 000043
【図３Ａ】
2014517842.tif 000044
【図３Ｂ】
2014517842.tif 000045
【図３Ｃ】
2014517842.tif 000046
【図３Ｄ】
2014517842.tif 000047
【図４Ａ】
2014517842.tif 000048
【図４Ｂ】
2014517842.tif 000049
【図４Ｃ】
2014517842.tif 000050
【図４Ｄ】
2014517842.tif 000051
【図４Ｅ】
2014517842.tif 000052
【図４Ｆ】
2014517842.tif 000053
【図４Ｇ】
2014517842.tif 000054
【図４Ｈ】
2014517842.tif 000055
【図４Ｉ】
2014517842.tif 000056
【図４Ｊ】
2014517842.tif 000057
【図４Ｋ】
2014517842.tif 000058
【図４Ｌ】
2014517842.tif 000059
【図４Ｍ】
2014517842.tif 000060
【図４Ｎ】
2014517842.tif 000061
【図４Ｏ】
2014517842.tif 000062
【図４Ｐ】
2014517842.tif 000063
【図４Ｑ】
2014517842.tif 000064
【図４Ｒ】
2014517842.tif 000065
【図５】
2014517842.tif 000066
【図６】
2014517842.tif 000067
【図７】
2014517842.tif 000068
【図８】
2014517842.tif 000069
【図９Ａ】
2014517842.tif 000070
【図９Ｂ】
2014517842.tif 000071
【図１０Ａ】
2014517842.tif 000072
【図１０Ｂ】
2014517842.tif 000073
【図１１Ａ】
2014517842.tif 000074
【図１１Ｂ】
2014517842.tif 000075
【図１２Ａ】
2014517842.tif 000076
【図１２Ｂ】
2014517842.tif 000077
【図１２Ｃ】
2014517842.tif 000078
【図１２Ｄ】
2014517842.tif 000079
【図１２Ｅ】
2014517842.tif 000080
【図１２Ｆ】
2014517842.tif 000081
【図１２Ｇ】
2014517842.tif 000082
【図１２Ｈ】
2014517842.tif 000083
【図１２Ｉ】
2014517842.tif 000084
【配列表】
2014517842000001.app
【国際調査報告】
2014517842.tif 000085
2014517842.tif 000086
2014517842.tif 000087
2014517842.tif 000088