(57)【要約】  本発明は、ＮｉｃｋＦｅｃｔという名の細胞内カーゴ送達のためのシステムであって、細胞透過性ペプチドＢ及び／又はペプチド性若しくは非ペプチド性構築物Ｃに共有結合した少なくとも１種の成分Ａを含むシステムに関連する。該送達システムＮｉｃｋＦｅｃｔは、効率的細胞のために非共有結合的又は共有結合的にカーゴと複合化した化学的に改変された新規細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に関連する。【選択図】  １Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内へのカーゴ送達のための、細胞透過性ペプチドＢで構成されるシステムであって、
該細胞透過性ペプチドＢが、共有結合した成分Ａ、及び、細胞内へカーゴを送達するための標的部分としての共有結合的又は非共有結合的に結合したペプチド性又は非ペプチド性構築物Ｃを含んでもよいことを特徴とする、システム。
【請求項２】
ペプチドＢが、主鎖に共有結合した脂肪酸（例えばステアリン酸）を有する細胞透過性ペプチドＴＰ１０の化学的改変物を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
３位のＴｙｒが、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又は、Ｇｌｕで置換される、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
８位のＩｌｅが、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又は、他の親水性アミノ酸で置換される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
少なくとも１つのＬｅｕが、ロイシンの異性体及び／又は類似体（例えばノルロイシン）で置換される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
少なくとも１つのリシンが、リシンの異性体及び／又は類似体（例えばオルニチン）で置換される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
ペプチドＢが、リシン又はその類似体のα、β、γ、δ、ε−アミノ基を介して、両親媒性若しくは／及びα−ヘリックス性のペプチド又は／並びにペプチド部分（例えばＮＰＹ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、（Ａｌａ−Ｌｅｕ）nのようなモデル配列、ＴＰ１０、ガラニン、マストパラン）に結合された、脂肪酸改変ＴＰ１０ペプチド又は／及びその部分（例えばガラニン、マストパラン）から成る分岐ペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
１種又はそれ以上の成分Ａが、直接的又はスペーサーを介してペプチドＢと共役する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の送達システム。
【請求項９】
結合した複数の成分Ａが、異なってもよい、請求項１〜８のいずれか１項に記載の送達システム。
【請求項１０】
成分Ａが、リン酸基（ＰＯ3）若しくは（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、炭水化物から成るがこれらに限定されるわけではない群から選択される）負電荷を有する部分を含むか、又は、全体として負電荷を有するペプチド配列でさえあり得る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
標的部分である少なくとも１種の成分Ｃを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記標的部分が、細胞若しくは腫瘍ホーミングペプチド、アプタマー、受容体リガンド、不活性化ペプチドに結合した開裂可能部位を含むスペーサー、ペプチドリガンド、細胞障害性ペプチド、公知若しくは非公知の受容体に対する生物活性ペプチドリガンド、特定の組織若しくは細胞型に選択的に結合するペプチド配列、又は、核局在配列（ＮＬＳ）である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
さらにカーゴを含み、１種又は数種のカーゴが共有結合的又は／及び非共有結合的に成分Ｂと結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
１種又はそれ以上の成分Ａ、１種又はそれ以上の成分Ｃ、及び、１種又はそれ以上のカーゴが、ペプチドＢに取り付けられる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
２種以上のペプチドＢを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
成分Ｃ及びカーゴの少なくとも１種が、スペーサーアームに取り付けられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記カーゴが、一本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びそれらの類似体）、二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、デコイＤＮＡ）、プラスミド、及び、他のそれらのさまざまな合成ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド及びその改変型から成るがこれらに限定されるわけではない群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記カーゴが、細胞若しくは腫瘍ホーミングペプチド、アプタマー、受容体リガンド、不活性化ペプチドに結合した開裂可能部位を含むスペーサー、ペプチドリガンド、細胞障害性ペプチド、生物活性ペプチド、抗体、診断剤、タンパク質、例えば抗癌剤である薬剤、又は、抗生物質から成る群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
さらに少なくとも１種の造影剤及び／又は標識分子を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
ＰＥＧのような循環クリアランス調整剤を組み合わせて含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
形成されたペプチドＢ及びカーゴナノ粒子の全表面電荷が負である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の送達システムを２種以上含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のシステムの、疾患の診断における、研究ツールとしての、標的化システムとしての、及び、医薬組成物としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮｉｃｋＦｅｃｔという名の細胞内カーゴ（ｃａｒｇｏ）送達のためのシステムであって、細胞透過性ペプチドＢ及び／又はペプチド性若しくは非ペプチド性構築物Ｃに共有結合した少なくとも１種の成分Ａを含むシステムに関連する。該送達システムＮｉｃｋＦｅｃｔは、効率的細胞のために非共有結合的又は共有結合的にカーゴと複合化した化学的に改変された新規細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に関連する。より正確には、本発明は、安定性が高くエンドソーム−リソソーム区画から逃れるのにより有力な、非毒性ペプチド送達ベクターを含む構築物に関連し、血清の存在下でも原形を保つカーゴと安定な複合体を形成することができる。
【０００２】
本発明は、全体として負電荷の、オリゴヌクレオチド送達のために形成されたナノ粒子を有する送達システムに関連する。
本発明はまた、分岐ＣＰＰを含む送達システムであって、脂肪酸改変ＴＰ１０又はその部分が、リシン又はその類似体のα、β、γ、ε−アミノ基を介して、両親媒性若しくは／及びα−ヘリックス性のペプチド又はペプチド部分に結合する、送達システムに関連する。
【０００３】
さらに、本発明は、インビトロ又はインビボで標的細胞の細胞質又は核内へカーゴ（ＲＮＡ、ＤＮＡ、薬物、プラスミド、ミニサークルなど）を送達する方法に関連する。それはまた、前記システムの疾患の診断における、研究ツールとしての、及び、標的化システムとしての使用、前記システムを含む組成物、特に医薬組成物、前記システムで覆われた材料、並びに、材料内への送達システムを有する材料に関連する。最後に、それはまた、新規細胞透過性ペプチドに関連する。
【背景技術】
【０００４】
疎水性の細胞膜は、細胞内容物を包み込む脂質二重膜である。通常は小さい及び／又は疎水性の分子しか越えられない障壁として機能し、裸のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質のような他の高分子が細胞の内面に接近するのを防ぐ。この１０年間では、この問題を解決することを目的とした戦略はほとんどなかったが、形質膜を越えられないことは、依然として現在の薬物研究開発（Ｒ＆Ｄ）の成功のために克服すべき主要な障害の１つである。
【０００５】
過去４０年間は、いくつかのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）−ベースの方法が、遺伝子発現を制御する目的で開発された。この方法の効率性は、数ある要因のうちで、細胞内へのＯＮの効率的な取り込み及びそれに続くエンドソームの回避に依存している。遺伝子制御のための他の最も基本的な方法は、目的の遺伝子を発現するための細菌ベクターの使用を含む。種々の遺伝子の機能的側面の評価に加えて、これは臨床の場、すなわち遺伝子治療において利用するための高度に魅力的な戦略である。もともと遺伝子治療は、例えばスプライス修正用（ｓｐｌｉｃｅ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ）オリゴヌクレオチドによる、遺伝性遺伝子疾患のための矯正治療として役立つと考えられていた。しかしながら、他の後天性疾患もまた研究されているけれども、過去１５年間にわたって、癌疾患のための実験的遺伝子治療が最もよくある応用となった［１］。
【０００６】
より短いＯＮ配列を利用して遺伝子発現を妨げる他の汎用的戦略が出現した。遺伝子サイレンシングをもたらすために利用される２０〜２５ヌクレオチドの長さの干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である二本鎖ＲＮＡ分子、又は、スプライシングパターンの操作のために適用されるスプライス修正用ＯＮ（ＳＣＯ）に基づいたアンチセンスアプローチが、最近厳密に利用されている［２、３］。遺伝子発現を制御するのに有効な生体分子ではあるけれども、それらの親水性及び大きさ（プラスミドの場合１ＭＤａ以上の大きさ）が、細胞内在化を妨げている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、現在の遺伝子治療を進展させるために、細胞内に種々の分子を輸送するためのさまざまな細胞送達システムが求められているが、それらの多くは、高い細胞毒性、特有の免疫原性、低いトランスフェクション効率などのようないくつかの欠点を有している（表１）。
【０００８】
表１：送達ベクター
【表１】
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【０００９】
したがって、細胞透過性ペプチドは、インビトロ及びインビボの送達ベクターとして大きな可能性を持っており望みがあるので、それらは研究及び医薬分野で用いられ得る。タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤｓ）とも呼ばれる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ここ数十年において、広範なカーゴの送達のための非毒性担体として多くの注目を集めているペプチドの種類である。これらのペプチドは、長さが３０アミノ酸（ａａ）未満で、正味の正電荷及び／又は両親媒性を有し、インビトロ及びインビボの両方で細胞膜を越えて積載物を送達することができる［５］。今日では、何百ものＣＰＰが知られている。細胞内送達を促進するために、ＣＰＰは、共有結合的又は非共有結合的な方法でカーゴ（オリゴヌクレオチド、プラスミド、ミニサークルなど）と結合すべきだろう。ペプチドをＯＮ又は他の生体分子へ共有結合することは骨の折れる手順であり、意味のある生物学的反応を得るためには、通常は高濃度のペプチド共役体が必要とされる。非共有結合複合体の場合には、効率的な濃度はナノモル範囲であり、非共有結合複合体の形成は、１時間水中でペプチド及び生体分子溶液を一緒に混合することで達成され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、毒性に加えて低調で不均一な送達という非共有結合的遺伝子送達の欠点を克服する新シリーズの細胞透過性ペプチドを含む、細胞内カーゴ送達のためのシステムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】改変ルシフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体。ヌクレオチド７０５番に点突然変異を有するＢ−グロビン遺伝子由来のイントロン２を、ルシフェラーゼ遺伝子内に挿入する。ＳＣＯでこの部位を遮断すると、機能的なｍＲＮＡにスプライシングが切り替わる。
【図１Ｂ】ＮｉｃｋＦｅｃｔ送達システムの一般的な構造図であり、実線は共有結合を示し、点線は非共有結合である。
【図１Ｃ】ＮｉｃｋＦｅｃｔ送達システムの一般的な構造図であり、実線は共有結合を示し、点線は非共有結合である。
【図２】２００ｎＭのＳＣＯと組み合わせたリン酸化ＣＰＰ（ＮＦ１、ＮＦ５）又はステアリル−ＴＰ１０及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００による処理後のスプライス修正（ｓｐｌｉｃｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）。  Ｈｅｌａ ｐＬｕｃ ７０５細胞を、４時間無血清ＤＭＥＭ中で種々のモル比（５：１、７：１、１０：１）でのペプチド：２’−ＯＭｅ ＯＮ複合体により処理し、その後培地を完全増殖培地と置換して、さらに２０時間インキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は、製品プロトコールに従って使用した。結果は、スプライス修正効率を上げるためには、リン酸化に加えて該ペプチドの主鎖の改変が必要であることを明らかに示している。
【図３】ＮｉｃｋＦｅｃｔは、低いペプチド：ＯＮモル比における効率的なトランスフェクションベクターである。複合体を、１：１、３：１、５：１、７：１、１０：１、１５：１のモル比で、ＳＦＭ中（Ａ）及びＦＭ中（Ｂ）のＨｅｌａ ｐＬｕｃ ７０５細胞に対して、２００ｎＭのＯＮ濃度で適用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は、製品プロトコールに従って使用した。ＮｉｃｋＦｅｃｔ１はスプライス修正の劇的な増加を誘導したが、生物学的反応を引き起こすために必要なペプチドは非常に少量である。
【図４】化学的改変ステアリル−ＴＰ１０類似体（ＮＦ１１）のチロシン又はトレオニン部分におけるリン酸基の導入の、スプライス修正活性に対する影響。複合体を、３：１、５：１、７：１のモル比で、ＳＦＭ中（Ａ）及びＦＭ中（Ｂ）のＨｅｌａ ｐＬｕｃ ７０５細胞に対して、２００ｎＭのＯＮ濃度で適用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は、製品プロトコールに従って使用した。新規リン酸化ＣＰＰはスプライス修正の劇的な増加を誘導したが、生物学的反応を引き起こすために必要なペプチド及びＯＮは非常に少量である。ＮＦ１は、ＮＦ２と比較して、完全培地中でより有効に作用した。
【図５】リソソーム指向性（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ）試薬であるクロロキンの、スプライス修正活性に対する影響。クロロキンの存在下又は不存在下で、ＳＦＭ中のペプチド−ＯＮ複合体であるＮＦ１、ＮＦ２及びステアリル−ＴＰ１０を、最も効率的なモル比（７：１）で細胞に対して２００ｎＭのＯＮ濃度で適用した。
【図６】ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００と比較した、オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体のＨｅｌａ細胞の生存率に対する影響。細胞生存率は、ペプチド：２’−ＯＭｅ ＯＮ複合体を種々のモル比で添加した後の２４時間後に、ＭＴＳアッセイによって測定した。適用されたＯＮは、２００ｎＭの濃度だった。ＮＦ１及びＮＦ２は、最も有効な濃度において有毒ではなかった。
【図７】ＮＦ１、ＮＦ２は、ＧＦＰタンパク質を安定に発現しているＥＧＦＰ−ＣＨＯ細胞内へのｓｉＲＮＡ送達を仲介した。細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地中のＭＲ２０、ＭＲ２５、ＭＲ３０、ＭＲ４０によるｓｉＲＮＡ：ペプチド複合体で４時間処理し、ＨＡＭ完全培地で２０時間処理した。その後細胞を洗浄し、トリプシン処理して、フローサイトメトリーにより解析した。
【図８】ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＧＬ３プラスミドのトランスフェクションのための送達ベクターとしてのＮＦ５１、ＮＦ５２、ＮＦ５３及びＮＦ６１。
【図９】ＣＨＯ細胞におけるｐＧＬ３プラスミドのトランスフェクションのための送達ベクターとしてのＮＦ５１、ＮＦ５２、ＮＦ５３及びＮＦ６１。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＴＰ１０配列（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ2）に基づいた、非共有結合的又は共有結合的アプローチを用いたインビトロ又はインビボにおける標的細胞の細胞質及び／又は核内への種々のカーゴ（ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、ミニサークル、薬物など）の効率的な送達に利用され得る、新規の化学的改変送達ベクター、ＮｉｃｋＦｅｃｔのシリーズを提供する。該新規送達システム、ＮｉｃｋＦｅｃｔは、安定で、密に詰まった、均一で、球状の、カーゴを含むナノ粒子を形成することができる。形成されたナノ粒子は、血漿及び／又は核膜とのより良い相互作用特性を有しており、より効率的に細胞内に内在化することができる。
【００１３】
上述のＮｉｃｋＦｅｃｔは、疾患の診断において、遺伝子治療において、腫瘍の治療において、及び、他の薬学的用途のために、研究ツールとして及び標的化システムとして用いられ得る。
より正確には、本発明は、非毒性であり、安定性が高くエンドソーム−リソソーム区画から逃れるのにより有力であって、血清の存在下でも原形を保つカーゴとの安定な複合体を形成することができる構築物に関連する。
【００１４】
ＮｉｃｋＦｅｃｔ送達ベクターは、細胞の内側へ種々のＯＮ及びプラスミドを運搬するのに、市販のトランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００よりも効果的であるが、毒性は低い。ＮｉｃｋＦｅｃｔの毒性が低いことで、それは敏感な細胞及びインビトロにおけるトランスフェクションに適したものとなるが、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００は、必要な濃度で毒性が高いためインビトロでしか使用できない。
ＮｉｃｋＦｅｃｔは、細胞集団の１００％にトランスフェクトするが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅは、細胞株によるが最適化工程後でも６０〜８０％にしかトランスフェクトしない。
ＮｉｃｋＦｅｃｔは、粉末として長期間保存できるが、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００の安定性について、製造者は＋４℃でたった６月の間しか保証しない。
さらに、ＮｉｃｋＦｅｃｔ送達ベクターは、ＲＮＡ及びＤＮＡの細胞送達のために従来使用されたＣＰＰよりも強力である。最も重要なことには、生物学的反応を得るために非常に少量のペプチド及びＯＮしか必要とされない。
【００１５】
ＮｉｃｋＦｅｃｔは、細胞の核内で作用するＯＮ化合物を輸送するために機能するだけでなく、細胞質で作用するｓｉＲＮＡなどのＯＮの送達のためにも有効に利用される。ＮＦ１は、細胞内へのｓｉＲＮＡの送達のためには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と同程度に機能する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ｓｉＲＮＡ複合体が、いかなるｓｉＲＮＡ濃度においても８０％より大きい遺伝子発現の下方制御を生み出すことはめったにないが、ｓｉＲＮＡと複合体化したＮｉｃｋＦｅｃｔ１は、低いｓｉＲＮＡ濃度でほぼ完全なＲＮＡｉを与える。
【００１６】
本発明は、ＮｉｃｋＦｅｃｔという名の細胞内カーゴ送達のためのシステムであって、ある場合には共有結合した成分Ａ及び／又は標的部分であるペプチド性若しくは非ペプチド性構築物Ｃを含む少なくとも１種の細胞透過性ペプチドＢを含むシステムに関連する。該送達システムＮｉｃｋＦｅｃｔは、共有又は非共有結合によってカーゴを送達することができる（図１Ｂ）。
該細胞送達システムは、カーゴなしに任意の順序で連結した、２種以上のペプチドＢ、２種以上の成分Ａ、及び、２種以上の標的用成分Ｃを含んでもよい。
上述の送達システムは、細胞、組織内へ、又は、細胞層を越えて送達されてもよい１種又はそれ以上のカーゴに連結されてもよい。
【００１７】
本発明はまた、ＮｉｃｋＦｅｃｔ構築物の製造方法だけでなく、新規の細胞透過性ペプチドにも関連する。
標的部分としての成分Ｃは、目的の特定の細胞又は組織に到達することができる。該標的部分は、アプタマー又はホーミングペプチド若しくは受容体リガンドなどの標的ペプチドであってもよい。
天然アミノ酸の非天然アミノ酸（例えばオルニチン）による置換、及び、ペプチド結合形成のために非α−アミノ基を用いることによるその二次構造の変形が、ＣＰＰを安定化し、ＮｉｃｋＦｅｃｔをプラスミドの効率的細胞内送達のための非常に強力なベクターにすることが示された。
【００１８】
成分Ａ
成分Ａは、リン酸基（ＰＯ3）又は負に荷電した部分（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、炭水化物など）を含む。成分Ａは、全体として負の電荷を有するペプチド配列でさえあり得る。１種の直鎖脂肪族成分ＡがペプチドＢと結合されてもよく、又は、類似の若しくは異なった２種の成分Ａがリシン分岐スペーサーを介してペプチドＢと結合されてもよい。
細胞透過性ペプチドは正味の正電荷を有していることが知られているので、１種又は数種の負に荷電した部分を挿入することは新しい方針である。
【００１９】
ペプチドＢ
ペプチドＢは、ペプチド主鎖に共有結合した脂肪酸（例えばステアリン酸）を有する細胞透過性ペプチドＴＰ１０の化学的改変物を含む。
ペプチドＢはまた、細胞透過性ペプチドである脂肪酸改変ＴＰ１０であって、その３位において、Ｔｙｒを、負に荷電した分子又は官能基を後で追加するためにＬｙｓ、Ｏｒｎによって、チロシン類似体として使用するためにＴｈｒ、Ｓｅｒによって、及び、ペプチド主鎖にカルボキシル基を挿入するためにＡｓｐ又はＧｌｕによって置換したものを含む。
ペプチドＢはまた、細胞透過性ペプチドである脂肪酸改変ＴＰ１０であって、その８位において、Ｉｌｅを、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓ、Ｇｌｕ、又は、他の親水性アミノ酸で置換し、α−ヘリックスの親水特性を向上させたものを含む。
ペプチドＢはまた、脂肪酸改変ＴＰ１０であって、少なくとも１つのロイシンを、ロイシン異性体及び／又は類似体（例えばノルロイシン）で置換したものであってもよい。
ペプチドＢはまた、脂肪酸改変ＴＰ１０であって、少なくとも１つのリシンをリシン異性体及び／若しくは誘導体、又は、オルニチン異性体若しくは／及び類似体で置換したものあってもよい。
天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換すると、ペプチドが血清プロテアーゼに対してより安定になる。
ペプチドＢは、リシン又はその類似体のα、β、γ、δ、ε−アミノ基を介して、両親媒性若しくは／及びα−ヘリックス性のペプチド又は／及びペプチド部分（例えばＮＰＹ、サブスタンスＰ、ブラジキニン、（Ａｌａ−Ｌｅｕ）nのようなモデル配列、ＴＰ１０、ガラニン、マストパラン）に結合した脂肪酸改変ＴＰ１０ペプチド又は／及びその部分（例えばガラニン、マストパラン）から成る分岐ペプチドであってもよい（図１Ｃ）。
これらの改変のいくつかを、同時に行うこともできる。
【００２０】
構築物Ｃ
ペプチド性又は非ペプチド性構築物Ｃは、共有結合的又は非共有結合的にペプチドＢと結合した、目的の特定の細胞又は組織に到達することができる標的成分を含む。
構築物Ｃは、細胞又は腫瘍ホーミングペプチド、アプタマー、受容体リガンド、不活性化ペプチドに結合した開裂可能部位を含むスペーサー、ペプチドリガンド、細胞障害性ペプチド、公知若しくは非公知の受容体に対する生物活性ペプチドリガンド、特定の組織若しくは細胞型に選択的に結合するペプチド配列、又は、核局在配列（ＮＬＳ）である。
【００２１】
スペーサー
スペーサーは、成分Ａ、Ｃ及びカーゴを成分Ｂに取り付けるために使用してもよい。
該スペーサーは、１種又は数種のリシン及び／又はオルニチン残基から成る直鎖又は分岐部分であってもよい。
【００２２】
カーゴ
カーゴは、共有結合アセンブリ又は複合体形成によって、前記送達システムに取り付けられる。
該カーゴは、オリゴヌクレオチド及びその改変型、一本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及び合成オリゴヌクレオチド）、二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、デコイｄｓＤＮＡなど）、プラスミド、ミニサークル及びそれらの他の型、ウイルス複製の阻害の目的又は抗ウイルスＯＮのための合成ヌクレオチド類似体から成る群から選択されてもよい。
該カーゴは、検出マーカー、造影剤、標識分子、蛍光マーカー、アプタマー、受容体リガンド、不活性化ペプチドに結合した開裂可能部位を含むスペーサー、ペプチドリガンド、細胞障害性ペプチド、生物活性ペプチド、抗体、診断剤、タンパク質、例えば抗癌剤である薬剤、又は、抗生物質であってもよい。
カーゴとしての抗癌剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、及び、細胞障害性抗生剤から選択されてもよい。
【００２３】
本発明のさらなる局面では、本発明に係る構築物は、疾患の診断において、遺伝子治療において、研究ツールとして、標的化システムとして、及び、医薬組成物として使用されてもよい。
本発明は次に、図面の簡潔な説明、材料及び方法、見本の配列だけでなく図表及び図表の説明文を含む実施例によって、さらに説明されるが、本発明の範囲は具体的に述べられる態様又は詳細のいずれにも限定されないことが理解されるべきである。
【００２４】
表２：ＮｉｃｋＦｅｃｔの見本配列（ＮＦ−ｓ）
【表２】
2014508521.tif 000004
2014508521.tif 000005
【００２５】
実施例及び実験
以下本発明は、ＮｉｃｋＦｅｃｔ及びＰｅｐＦｅｃｔシステム、並びに、陽性対照として今日の市場をリードするインビトロ用トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いた、実施例及び比較例によって説明される。まず、送達ベクターの改善及び改造が説明される。そして、ＮｉｃｋＦｅｃｔｓがスプライス修正用オリゴヌクレオチド、プラスミド及びｓｉＲＮＡの送達にどれだけ汎用性があるかを示す種々の方法が説明される。加えて、メーカーのプロトコールに従って適用されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と比較した、ＮｉｃｋＦｅｃｔペプチドの全体的な改善は、より低い細胞毒性で、均一で、効率的なトランスフェクションによって示される。すべての実験は、２種以上の細胞型について行われ、多くの場合には血清存在下で行われた。
【００２６】
材料及び方法
ペプチドの合成
固相としてＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ（メチルベンジルヒドリルアミン（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ））樹脂（Ｆｌｕｋａ）を用いたＦｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）固相ペプチド合成法（Ｆｉｅｌｄｓ及びＮｏｂｌｅ、１９９０）を利用して、自動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＢＩ４３３Ａ、ＵＳＡ）によって、ペプチドを０．１ｍｍｏｌ規模の段階的なやり方で合成し、Ｃ末端がアミド化されたペプチドを取得した。室温で一晩、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（１：１）中において、５当量のステアリン酸（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、３当量のＨＯＢｔ及び３当量のＨＢＴＵ（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ、ドイツ）、６当量のＤＩＥＡ（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）でペプチジル樹脂を処理することによって、ステアリン酸を該ペプチドのＮ末端に手動で結合した。リン酸化ペプチドの合成のためには、ホスホトレオニンＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ（Ｆｌｕｋａ、ドイツ）及びホスホチロシンＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）単量体を使用し、収率を上げるために、ＤＣＭ／ＤＭＦ／ＮＭＰ／ＤＭＳＯ（３：３：３：１；ｖ：ｖ：ｖ：ｖ）混合物中において、室温で３時間、３当量のホスホ単量体、３当量のＨＯＢｔ及び３当量のＨＢＴＵ、６当量のＤＩＥＡでペプチジル樹脂を処理することによって、手動で結合を行った。最後の切断は、標準的なプロトコール（９５％ＴＦＡ／２．５％ＴＩＳ／２．５％Ｈ2Ｏ）を利用して行った。０．１％のＴＦＡを含む２０−８０％の勾配のアセトニトリル／水を用いたＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４、５μｍ、３００Ａ、２５０ｘ１０ｍｍ）を利用した逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドを精製した。ペプチドの同定は、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたポジティブリニアモードでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥTM ＰＲＯ ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙTMシステム）によって解析された。該ペプチドのモル濃度は、正確に秤量された物質の希釈に基づいて決定した。該ペプチドの配列を表１に示す。
Ｃｙ５標識及び未標識のホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＣＣＵ ＣＵＵ ＡＣＣ ＵＣＡ ＧＵＵ ＡＣＡ）は、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、スイスから購入した。
【００２７】
細胞培養
Ｒ．Ｋｏｌｅ及びＢ．Ｌｅｂｌｕｅからご提供いただいたＨｅＬａ ｐＬｕｃ ７０５細胞、及び、ＨＥＫ２９３細胞は、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したグルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。ＣＨＯ細胞は、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したグルタマックスを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で培養した。細胞は、５％ＣＯ2雰囲気において３７℃で培養した。すべての培地及び化学物質は、ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ（ドイツ）から購入した。
【００２８】
複合体形成
ＳＣＯ／ＣＰＰ複合体の形成：ホスホロチオエート２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチドを、最終処理容量の１０％（すなわち５０μｌ）のｄｄＨ2Ｏ中で、ＣＰＰと種々のモル比（１：０−１：２０）で混合した。室温１時間で複合体を形成し、その一方で、２４ウェルプレート中で細胞培地を新鮮な無血清ＤＭＥＭ（４５０μｌ）と交換した。その後、複合体を各ウェルへ添加した。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用した場合には、複合体はＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中でメーカーのプロトコールに従って調製した。
プラスミド／ＣＰＰ複合体の形成：０．５μｇのｐＧＬ３ルシフェラーゼ発現ｐｌａｓｍｉｄ又はｐＥＧＦＰ緑色蛍光タンパク質発現ベクターを、最終処理容量の１／１０（５０μｌ）のｄｄＨ2Ｏ中で、ＣＰＰと種々の電荷比（１：１−１：５）で混合した。１時間後、複合体を４５０μｌの新鮮な無血清培地中で培養した細胞に添加した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用した場合には、複合体はメーカーのプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に従って調製した。
【００２９】
ゲル遅延度アッセイ
オリゴヌクレオチド／ＣＰＰ複合体の形成は、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液の２％アガロースゲルで複合体を１００Ｖで３０分間電気泳動した後に、Ｃｙ５標識ＯＮを利用してＴｙｐｈｏｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン）によって解析した。
プラスミド／ＣＰＰ複合体は、エチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）を含むＴＡＥ緩衝液の２％アガロースゲルにおける１００Ｖで１時間の電気泳動で解析した。
【００３０】
スプライス修正アッセイ
細胞（５０，０００）を実験の２４時間前に２４ウェルプレート内に播いて、播種後１日で約６０％集密状態にした。細胞を、５００μｌの無血清又は血清含有培地中、２００ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度で、６通りのモル比（１：１、３：１、５：１、７：１、１０：１、１５：１）でのペプチド：２’−ＯＭｅ ＯＮ複合体により４時間処理した後、１ｍｌの１０％血清含有培地を添加して、さらに２０時間インキュベートした。その後、該細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌのＨＥＰＥＳ−クレブス−リンガー（ＨＫＲ）緩衝液中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて４℃で３０分間溶解した。ルシフェラーゼ活性は、メーカーによる提案に従って、ＧＬＯＭＡＸTM９６マイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ、スウェーデン）のプロメガのルシフェラーゼアッセイシステムを利用して測定し、タンパク質濃度測定のためにＤＣタンパク質決定アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用することによって、タンパク質含量で規格化した。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００をトランスフェクション効率の測定における陽性対照として使用し、裸のオリゴヌクレオチドを陰性対照として使用した。
【００３１】
１−ナフチルリン酸ナトリウム一水和物−Ｎ７０００（最終濃度２００μＭ）での実験においては、阻害剤を、ペプチド：２’−ＯＭｅ ＯＮ複合体による細胞の処理の３０分前に培地に添加した。細胞へ該複合体を添加して２時間後、阻害剤の有毒な効果を避けるために、培地を除去して新鮮な培地と交換した。クロロキンを用いた実験では、エンドソームの回避を促すために、クロロキン（最終濃度１００μＭ）をペプチド：２’−ＯＭｅ ＯＮ複合体と一緒に細胞に添加した。細胞に該複合体及びクロロキンを添加して４時間後、クロロキンの有毒な効果を避けるために、培地を除去して新鮮な培地と交換した。
【００３２】
プラスミドのトランスフェクション
５００００個のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）又はＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓２９３細胞）細胞を、実験の２４時間前に２４ウェルプレート内に播いた。細胞は、無血清又は完全培地中で４時間、種々の電荷比（１：１、１：２、１：３、１：５）でのプラスミド：ＣＰＰ複合体により処理した。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、スウェーデン）はメーカーのプロトコールに従って使用した。
４時間の処理後、５００μｌの完全成長培地を添加して、さらに２０時間インキュベートした。その後、細胞をＨＫＲで２回洗浄して、１００μｌのＨＫＲ緩衝液中０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間溶解した。ｐＧＬ３プラスミドの場合には、ルシフェラーゼ活性はＧＬＯＭＡＸTM９６マイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ、スウェーデン）のプロメガのルシフェラーゼアッセイシステムを利用して測定し、ｐＥＧＦＰベクターの場合には、フルオレセイン測定はＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｘモノクロメーターに基づくマルチモードマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で行った。データは、ＤＣタンパク質決定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて測定したタンパク質含量で規格化した。
【００３３】
ＦＡＣＳ（ｓｉＲＮＡ下方制御）
ＥＧＦＰ−ＣＨＯ細胞（１００００）を、実験の２４時間前に９６ウェルプレートに播いて、実験当日に６０％集密状態にした。複合体形成においては、ペプチド（１００μＭのストック溶液）を最終処理容量の１／１０（すなわち１０μｌ）のＭＱ水中でｓｉＲＮＡ（１０μＭのストック溶液）と混合した。無血清ＤＭＥＭ中最終濃度１００ｎＭのｓｉＲＮＡ、ＭＲ２０、ＭＲ２５、ＭＲ３０、ＭＲ４０を使用した。
複合体を室温６０分間で形成して、１００μｌの成長培地中の細胞に添加した。４時間後、１００μｌの新鮮培地をウェルに添加して、細胞をさらに２０時間インキュベートした。ＬＦ２０００での処理は、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨に従って行った。２４時間後、培地を除去した。細胞をＰＢＳでリンスし、３７℃分間のＰＢＳ中トリプシン／ＥＤＴＡを利用してプレートからはがした。細胞は５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで懸濁した。
フローサイトメトリー解析は、ＢＤ ＦａｃｓＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。生細胞集団を、散布図すなわち前方散乱光（ＦＳＣ）対側方散乱光（ＳＳＣ）のプロットから決定した。１試料あたり生細胞集団からの最低１０，０００イベントを解析した。
【００３４】
毒性測定
細胞増殖を、メーカーの使用説明書に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（Ｒ）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）で調査した。簡単に言うと、１ウェルあたり１００００個のＨｅｌａ ｐＬｕｃ ７０５細胞を、実験の１日前に完全ＤＭＥＭで９６ウェルプレート上に播いた。細胞を、無血清培地中で４時間、４通りのモル比（５：１、７：１、１０：１及び２０：１）でのペプチド：２’−ＯＭｅ ＯＮ複合体により処理した後、１０％血清含有培地を添加し、さらに２０時間インキュベートした。ＭＴＳをメーカーの一般的なプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、スウェーデン）に従って添加した。ＭＴＳの水性の可溶性ホルマザンへの変換は、代謝的に活性な細胞中に見られる脱水素酵素によって達成される。ホルマザン生成物の吸光度を４９０ｎｍで測定したが、これは培養中の生細胞数に直接比例する。吸光度はＴｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレート吸光度リーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、スイス）で測定し、生細胞の比率はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア５．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して決定した。
【００３５】
参考文献
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１Ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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