(57)【要約】混合ワクチン組成物、ならびにそれらの製造法は、比較的少量の抗原および／もしくは比較的少量のアルミニウムを有するが、それらは、それにも拘わらず、比較的多量の抗原および／もしくは比較的多量のアルミニウムを有する混合ワクチンに匹敵する免疫原性を有し得る。アルミニウム非含有混合ワクチン組成物もまた提供される（例えば、水中油型エマルジョンアジュバントが付加された組成物）。患者への投与のための単位用量形態における免疫原性組成物であって、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで該単位用量中のＡｌ＋＋＋の量は、０．２ｍｇ未満である、組成物もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者への投与のための単位用量形態における免疫原性組成物であって、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで該単位用量中のＡｌ＋＋＋の量は、０．２ｍｇ未満である、組成物。
【請求項２】
免疫原性組成物であって、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで該Ａｌ＋＋＋の濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満である、組成物。
【請求項３】
前記組成物は、（ｉ）Ｈｉｂ結合体、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、および／もしくは（ｉｉｉ）不活化ポリオウイルス抗原のうちの１種以上を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ｉ）アルミニウム塩アジュバント、ならびに（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を含む、免疫原性組成物。
【請求項５】
患者への投与のための単位用量形態にある免疫原性組成物であって、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで該単位用量中のＡｌ＋＋＋の量は、０．２ｍｇ未満である、組成物。
【請求項６】
（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで該Ａｌ＋＋＋の濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満である、免疫原性組成物。
【請求項７】
前記組成物は、≦８Ｌｆ／ｍｌ  ジフテリアトキソイドを有する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、≦３．５Ｌｆ／ｍｌ  破傷風トキソイドを有する、請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、≦５μｇ／ｍｌ  百日咳トキソイドを有する無細胞性百日咳抗原を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、Ｈｉｂ結合体の低用量を含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、≦５μｇ／ｍｌ  Ｈｉｂサッカリドを有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、低用量のＨＢｓＡｇを含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、≦５μｇ／ｍｌ  ＨＢｓＡｇを有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、低用量の不活化ポリオウイルスを含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、（ｉ）≦２０ＤＵ／ｍｌ  １型ポリオウイルスおよび／もしくは（ｉｉ）≦４ＤＵ／ｍｌ  ２型ポリオウイルスおよび／もしくは（ｉｉｉ）≦１６ＤＵ／ｍｌ  ３型ポリオウイルスを有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アルミニウム塩アジュバントは、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバントもしくは（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントもしくは（ｉｉｉ）水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントとの混合物である、いずれかの前記請求項に記載の組成物。
【請求項１７】
水酸化アルミニウムアジュバントを含み、該アジュバントに、ＴＬＲアゴニストが吸着されている（例えば、ここで該ＴＬＲ７アゴニストは、「化合物Ｔ」である）、いずれかの前記請求項に記載の組成物。
【請求項１８】
（ｉ）水中油型エマルジョンアジュバント、（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、およびＨｉｂ結合体、（ｉｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原および／もしくは不活化ポリオウイルス抗原を含む、免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、アルミニウム非含有である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水中油型エマルジョンアジュバントは、サブミクロン直径を有する油滴を有する、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記水中油型エマルジョンアジュバントは、スクアレンおよび／もしくはポリソルベート８０を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹのうちの１種以上に由来する結合体化莢膜サッカリドを含む、いずれかの前記請求項に記載の組成物。
【請求項２３】
肺炎球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／もしくは３３Ｆのうちの１種以上に由来する結合体化莢膜サッカリドを含む、いずれかの前記請求項に記載の組成物。
【請求項２４】
（ｉ）髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質抗原および／もしくは（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａのヘパリン結合抗原および／もしくは（ｉｉｉ）髄膜炎菌のＮｈｈＡ抗原および／もしくは（ｉｖ）髄膜炎菌の外膜小胞を含む、いずれかの前記請求項に記載の組成物。
【請求項２５】
患者において免疫応答を惹起するための方法であって、該患者に、いずれかの前記請求項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、混合ワクチン（すなわち、１種より多くの病原体に由来する混合された免疫原を含むワクチン）の投与が１種より多くの病原体に対して被験体を同時に免疫処置し得るようにされている混合ワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００２】
単一用量内に１種より多くの病原性生物に由来する抗原を含むワクチンは、「多価」ワクチンもしくは「混合」ワクチンとして公知である。種々の混合ワクチンが、ＥＵおよびＵＳＡにおいてヒトでの使用のために承認されてきた（ジフテリア、破傷風および百日咳（「ＤＴＰ」ワクチン）から防御するための三価ワクチン、ならびに麻疹、流行性耳下腺炎および風疹から防御するための三価ワクチン（「ＭＭＲ」ワクチン）を含む）。混合ワクチンは、減少した回数の注射を受けるという利点を患者に提供し、このことは、特に、小児ワクチン接種に関する増大したコンプライアンス（例えば、非特許文献１（参考文献１）の第２９章を参照のこと）という臨床的な利点をもたらし得る。
【０００３】
現在の混合ワクチンは、アジュバント（これは、経験的な安全性研究にも拘わらず一部の患者圧力群に懸念を引き起こす）として比較的多量のアルミニウム塩を含み得る［非特許文献２、３（参考文献２、３）］。例えば、既知の混合ワクチンにおけるアルミニウムレベルは、以下のとおりである（以下の表Ａもまた参照のこと）：
【０００４】
【表１Ａ】
2014506916.tif 000002
【０００５】
より低レベルのアルミニウムを有するワクチンは、一部の患者群にとって有用であり、本発明の目的は、このようなワクチンを、理想的には、ワクチン効力の喪失なしに提供することである。
【０００６】
現在のワクチンに伴う別の欠点は、それらが比較的多量の抗原を必要とすることであるのに対して、種々の文書は、防御効果がより少量の抗原で達成され得ることを示す。例えば、非特許文献４（参考文献４）は、Ｈｉｂ抗原の量が、免疫学的応答の喪失なしに、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂワクチンにおいて半減させられ得ることを示し、特許文献１（参考文献５）は、ポリオに対する防御の適切なレベルを維持しながら、低下したＩＰＶ用量が使用され得ることを議論している。本発明の目的は、低下した量の抗原を有する、理想的には、免疫防御効果の喪失がないワクチンをさらに提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２８９５６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（ｅｄｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）．４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０．
【非特許文献２】Ｆｒａｎｃｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  ２４：９５３−６１．
【非特許文献３】Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３）：Ｓ１８−Ｓ２３
【非特許文献４】Ｔａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：１７１５−１９．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、種々の混合ワクチン組成物、ならびにそれらの製造法を提供する。代表的には、上記組成物は、比較的少量の抗原および／もしくは比較的少量のアルミニウムを有するが、それらは、それにも拘わらず、比較的多量の抗原および／もしくは比較的多量のアルミニウムを有する混合ワクチンに匹敵する免疫原性を有し得る。アルミニウム非含有混合ワクチン組成物もまた、提供される（例えば、水中油型エマルジョンアジュバントが付加された組成物）。
【００１０】
第１の実施形態において、本発明は、患者への投与のための単位用量形態にある免疫原性組成物を提供し、上記組成物は、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで上記単位用量中のＡｌ＋＋＋の量は、０．２ｍｇ未満である。
【００１１】
本発明はまた、免疫原性組成物を提供し、上記組成物は、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで上記Ａｌ＋＋＋の濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００１２】
第２の実施形態において、本発明は、（ｉ）アルミニウム塩アジュバント、ならびに（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１３】
第３の実施形態において、本発明は、患者への投与のための単位用量形態にある免疫原性組成物を提供し、上記組成物は、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで上記単位用量中のＡｌ＋＋＋の量は、０．２ｍｇ未満である。
【００１４】
本発明はまた、免疫原性組成物を提供し、上記組成物は、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含み、ここで上記Ａｌ＋＋＋の濃度は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００１５】
第４の実施形態において、本発明は、（ｉ）水中油型エマルジョンアジュバント、（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、およびＨｉｂ結合体、（ｉｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原および／または不活化ポリオウイルス抗原を含む免疫原性組成物を提供する。上記組成物は、理想的には、アルミニウム非含有である。
【００１６】
上記アルミニウム塩アジュバントは、有利には、以下で考察されるように、吸着されたＴＬＲアゴニストを有する。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、ただ１種もしくは２種のＤＴａＰ含有組成物が投与される幼児のための免疫処置スケジュールである。この局面は、以下でさらに詳細に説明される。
【００１８】
（ジフテリアトキソイド）
ジフテリアは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（グラム陽性の非芽胞形成好気性細菌）によって引き起こされる。この生物は、プロファージコードＡＤＰ−リボシル化外毒素（「ジフテリア毒素」）を発現する。上記外毒素は、（例えば、ホルムアルデヒドを使用して）処理されて、もはや毒性ではないが抗原性のままであって、注射後に特異的な抗毒素抗体の生成を刺激し得るトキソイドとなり得る。ジフテリアトキソイドは、参考文献１の第１３章においてより詳細に開示されている。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されるものである。上記ジフテリアトキソイドは、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地、もしくはＬｉｎｇｇｏｕｄ  ＆  Ｆｅｎｔｏｎ培地）（これらには、ウシ抽出物が補充され得る）中で増殖させ、続いて、ホルムアルデヒド処理、限外濾過、および沈殿をすることによって得られ得る。次いで、上記トキソイド化された物質は、滅菌濾過および／もしくは透析を含むプロセスによって処理され得る。
【００１９】
ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）において表され得る。例えば、ＮＩＢＳＣ［６］は、「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １９９９」［７，８］を供給し、これは、１アンプルあたり１６０ＩＵを含む。ＩＵ系の代案として、「Ｌｆ単位」（「凝集単位」、「境界凝集用量（ｌｉｍｅｓ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」、もしくは「凝集の限界」）が、１国際単位の抗毒素と混合した場合に、最適に凝集した混合物を産生するトキソイドの量として定義される［９］。例えば、ＮＩＢＳＣは、１アンプルあたり３００Ｌｆを含む「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ、Ｐｌａｉｎ」［１０］、および１アンプルあたり９００Ｌｆを含む「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［１１］を供給する。組成物中のジフテリア毒素の濃度は、このような参照試薬に対して較正される参照物質との比較によって、凝固アッセイを使用して容易に決定され得る。ＩＵ系とＬｆ系との間の変換は、特定のトキソイド調製物に依存する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、「低用量」のジフテリアトキソイドを含む。このことは、上記組成物中のジフテリアトキソイドの濃度が、≦８Ｌｆ／ｍｌ（例えば、＜７Ｌｆ／ｍｌ、＜６Ｌｆ／ｍｌ、＜５Ｌｆ／ｍｌ、＜４Ｌｆ／ｍｌ、＜３Ｌｆ／ｍｌ、＜２Ｌｆ／ｍｌ、＜１Ｌｆ／ｍｌなど）であることを意味する。従って、代表的な０．５ｍｌの単位用量体積において、ジフテリアトキソイドの量は、４Ｌｆ未満（例えば、＜３Ｌｆ、＜２Ｌｆ、＜１Ｌｆ、＜１／２Ｌｆなど）である。
【００２１】
本発明の組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、上記組成物中のジフテリアトキソイドは、好ましくは、その塩に、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着（より好ましくは、完全に吸着）される。
【００２２】
（破傷風トキソイド）
破傷風は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（グラム陽性の芽胞形成桿菌）によって引き起こされる。この生物は、エンドペプチダーゼ（「破傷風毒素」）を発現する。これは、処理されて、もはや毒性ではないが抗原性のままであって、注射後に特異的な抗毒素抗体の生成を刺激し得るトキソイドを生じ得る。破傷風トキソイドは、参考文献１の２７章においてより詳細に開示される。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されたものである。上記破傷風トキソイドは、Ｃ．ｔｅｔａｎｉを増殖培地（例えば、ウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中で増殖させ、続いて、ホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈澱をすることによって得られ得る。次いで、上記物質は、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスによって処理され得る。
【００２３】
破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表され得る。例えば、ＮＩＢＳＣは、「Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２０００」［１２、１３］を供給し、それは１アンプルあたり４６９ＩＵを含む。ジフテリアトキソイドと同様に、上記「Ｌｆ」単位は、上記ＩＵ系の代案である。ＮＩＢＳＣは、「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［１４］を供給し、それは、１アンプルあたり１０００Ｌｆを含む。組成物中のジフテリア毒素の濃度は、このような参照試薬に対して較正される参照物質との比較によって、凝固アッセイを使用して容易に決定され得る。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、「低用量」の破傷風トキソイドを含む。このことは、上記組成物中の破傷風トキソイドの濃度が、≦３．５Ｌｆ／ｍｌ（例えば、＜３Ｌｆ／ｍｌ、＜２．５Ｌｆ／ｍｌ、＜２Ｌｆ／ｍｌ、＜１．５Ｌｆ／ｍｌ、＜１Ｌｆ／ｍｌ、＜１／２Ｌｆ／ｍｌなど）であることを意味する。従って、代表的な０．５ｍｌの単位用量体積において、破傷風トキソイドの量は、１．７５Ｌｆ未満（例えば、＜１．５Ｌｆ、＜１Ｌｆ、＜１／２Ｌｆ、１／４Ｌｆなど）である。
【００２５】
本発明の組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、上記組成物中の破傷風トキソイドは、好ましくは、その塩に、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着（ときおり、完全に吸着）される。
【００２６】
百日咳トキソイド
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（不活化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形態にある細胞全体；ｗＰ）および無細胞性（「ａＰ」）のいずれかにある。細胞性百日咳抗原の調製は、十分に記録されており（参考文献１の第２１章を参照のこと）、例えば、それは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの第１相培養物の熱不活化によって得られ得る。無細胞性抗原が使用される場合、以下の抗原のうちの１種、２種もしくは（好ましくは）３種が含められる：（１）無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、もしくは「ＰＴ」）；（２）線維状赤血球凝集素（「ＦＨＡ」）；（３）パータクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても公知）。これら３種の抗原は、改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液体培地中で増殖させたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物からの単離によって調製され得る。ＰＴおよびＦＨＡは、発酵ブロスから（例えば、ヒドロキシアパタイトゲルへの吸着によって）単離され得るのに対して、パータクチンは、細胞から、熱処理および凝集（例えば、塩化バリウムを使用して）によって抽出され得る。上記抗原は、逐次的なクロマトグラフィーおよび／もしくは沈澱工程において精製され得る。ＰＴおよびＦＨＡは、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。パータクチンは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、もしくはＩＭＡＣによって、精製され得る。ＦＨＡおよびパータクチンは、本発明に従う使用の前に、ホルムアルデヒドで処理され得る。ＰＴは、好ましくは、ホルムアルデヒドおよび／もしくはグルタルアルデヒドでの処理によって無毒化される。この化学的無毒化手順の代案として、上記ＰＴは、酵素活性が変異誘発によって低下させられた変異対ＰＴ［１５］（例えば、９Ｋ  １２９Ｇ二重変異体［１６］）であり得るが、化学処理による無毒化が好ましい。
【００２７】
本発明は、ＰＴ含有ｗＰ抗原もしくは、好ましくは、ＰＴ含有ａＰ抗原を使用し得る。ａＰ抗原を使用する場合、本発明の組成物は、代表的には、上記ＰＴに加えて、ＦＨＡおよび、必要に応じて、パータクチンを含む。それはまた、必要に応じて、線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）２型および３型を含み得る。
【００２８】
無細胞性百日咳抗原の量は、代表的には、マイクログラムで表され得る。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、「低用量」の百日咳トキソイドを含む。このことは、上記組成物中の百日咳トキソイドの濃度が、≦５μｇ／ｍｌ（例えば、＜４μｇ／ｍｌ、＜３μｇ／ｍｌ、＜２．５μｇ／ｍｌ、＜２μｇ／ｍｌ、＜１μｇ／ｍｌなど）であることを意味する。従って、代表的な０．５ｍｌの単位用量体積において、百日咳トキソイドの量は、２．５μｇ未満（例えば、＜２μｇ、＜１．５μｇ、＜１μｇ、＜０．５μｇなど）である。
【００２９】
本発明の組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、上記組成物中の百日咳トキソイドは、好ましくは、その塩に（好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに）吸着（ときおり、完全に吸着）される。任意のＦＨＡはまた、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着され得る。任意のパータクチンがリン酸アルミニウムアジュバントに吸着され得る。
【００３０】
Ｈｉｂ結合体
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型（「Ｈｉｂ」）は、細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは、代表的には、莢膜サッカリド抗原（例えば、参考文献１の第１４章）に基づく。その調製は、十分に記録されている（例えば、参考文献１７〜２６）。上記Ｈｉｂサッカリドは、その免疫原性を、特に小児において増強するために、キャリアタンパク質に結合体化される。代表的なキャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、および血清群Ｂ髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体である。破傷風トキソイドは、「ＰＲＰ−Ｔ」と一般にいわれる製品において使用される場合、好ましいキャリアである。ＰＲＰ−Ｔは、Ｈｉｂ莢膜ポリサッカリドを、臭化シアンを使用して活性化し、その活性化サッカリドをアジピン酸リンカー（例えば、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、代表的には、塩酸塩）に連結し、次いで、そのリンカー−サッカリド実体と破傷風トキソイドキャリアタンパク質とを反応させることによって、作製され得る。上記結合体のサッカリド部分は、Ｈｉｂ細菌から調製される場合の全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）、および／もしくは全長ＰＲＰのフラグメントを含み得る。サッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわち、過剰タンパク質）〜５：１（すなわち、過剰サッカリド）の間である結合体が、使用され得る（例えば、１：２〜５：１の間の比、および１：１．２５〜１：２．５の間の比）。しかし、好ましいワクチンにおいて、サッカリド  対  キャリアタンパク質の重量比は、１：２．５〜１：３．５の間である。破傷風トキソイドが、抗原としておよびキャリアタンパク質としての両方で存在するワクチンにおいて、上記結合体におけるサッカリド  対  キャリアタンパク質の重量比は、１：０．３〜１：２の間であり得る［２７］。上記Ｈｉｂ結合体の投与は、好ましくは、≧０．１５μｇ／ｍｌ、およびより好ましくは、≧１ｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度を生じ、これらは、標準的な応答閾値である。
【００３１】
Ｈｉｂ抗原の量は、代表的には、μｇ単位で表される。結合体抗原については、この数字は、上記結合体のサッカリド含有量に基づく。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、「低用量」のＨｉｂ結合体を含む。このことは、上記組成物中のＨｉｂサッカリドの濃度が、≦５μｇ／ｍｌ（例えば、＜４、＜３、＜２．５、＜２、＜１など）であることを意味する。従って、代表的な０．５ｍｌの単位用量体積において、Ｈｉｂの量は、２．５μｇ未満（例えば、＜２、＜１．５、＜１、＜０．５など）である。
【００３２】
本発明の組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、Ｈｉｂ結合体は、その塩に吸着されてもよいし、または吸着されなくてもよい。
【００３３】
（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の因子のうちの１つである。ＨＢＶビリオンは、外側タンパク質コートもしくはキャプシドに囲まれた内側のコアからなり、上記ウイルスコアは、ウイルスＤＮＡゲノムを含む。上記キャプシドの主要成分は、ＨＢＶ表面抗原、もしくはより一般には、「ＨＢｓＡｇ」として公知のタンパク質であり、上記表面抗原は、代表的には、分子量約２４ｋＤａを有する、２２６アミノ酸のポリペプチドである。全ての既存のＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含み、この抗原が正常なワクチン接種された個体（ｖａｃｃｉｎｅｅ）に投与される場合、それは、ＨＢＶ感染から防御する抗ＨＢｓＡｇ抗体の生成を刺激する。
【００３４】
ワクチン製造に関して、ＨＢｓＡｇは、２つの方法で作製され得る。第１の方法は、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から粒子状形態において上記抗原を精製することを包含する。なぜなら、ＨＢＶ感染中に多量のＨＢｓＡｇが、肝臓において合成され、血流に放出されるからである。第２の方法は、組換えＤＮＡ法によって上記タンパク質を発現させることを包含する。本発明の方法とともに使用するためのＨＢｓＡｇは、酵母細胞において組換え発現される。適切な酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはＨａｎｅｎｓｕｌａ（例えば、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主が挙げられる。
【００３５】
天然のＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿精製製品におけるような）とは異なり、酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、一般にグリコシル化されておらず、これは、本発明とともに使用するためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。酵母で発現されたＨＢｓＡｇは、非常に免疫原性であり、血液製剤汚染のリスクなしに調製され得る。
【００３６】
上記ＨＢｓＡｇは、一般に、リン脂質を含む脂質マトリクスを含め、実質的に球形の粒子（平均直径約２０ｎｍ）の形態にある。酵母で発現されたＨＢｓＡｇ粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得、これは、天然のＨＢＶビリオンでは見いだされない。上記粒子はまた、免疫系を刺激するために、非毒性量のＬＰＳを含み得る［２８］。上記粒子は、酵母の破壊の間に使用されるとすれば、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）を保持し得る［２９］。
【００３７】
ＨＢｓＡｇ精製にとって好ましい方法は、細胞破壊の後に：限外濾過；サイズ排除クロマトグラフィー；アニオン交換クロマトグラフィー；超遠心分離；脱塩；および滅菌濾過を包含する。溶解産物は、細胞破壊の後に（例えば、ポリエチレングリコールを使用して）沈殿させられ得、ＨＢｓＡｇは溶解したままであり、限外濾過の準備ができる。
【００３８】
精製後に、ＨＢｓＡｇは、透析に供され得（例えば、システインとともに）、これは、ＨＢｓＡｇ調製の間に使用された可能性があるチメロサールのような任意の水銀保存剤を除去するために使用され得る［３０］。チメロサール非含有調製物が、好ましい。
【００３９】
上記ＨＢｓＡｇは、好ましくは、ＨＢＶサブタイプａｄｗ２に由来する。
【００４０】
ＨＢｓＡｇの量は、代表的には、マイクログラム単位で表される。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、「低用量」のＨＢｓＡｇを含む。これは、上記組成物中のＨＢｓＡｇの濃度が、≦５μｇ／ｍｌ（例えば、＜４、＜３、＜２．５、＜２、＜１など）であることを意味する。従って、代表的な０．５ｍｌの単位用量体積において、ＨＢｓＡｇの量は、２．５μｇ未満（例えば、＜２、＜１．５、＜１、＜０．５など）である。
【００４１】
本発明の組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、ＨＢｓＡｇは、その塩に吸着され得る（好ましくは、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着され得る）。
【００４２】
（不活化ポリオウイルス抗原（ＩＰＶ））
灰白髄炎は、３つのタイプのポリオウイルスのうちの１つによって引き起こされ得る。上記３つのタイプは類似であり、同一の症状を引き起こすが、それらは、抗原的には非常に異なっており、１つのタイプによる感染は、他のタイプによる感染を防御しない。参考文献１の第２４章において説明されるように、従って、本発明とともに３つのポリオウイルス抗原（ポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ−１株）、およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株））を使用することは、好ましい。これら株の代替として、１型〜３型のうちのＳａｂｉｎ株が、例えば、参考文献３１および３２において考察されるように、使用され得る。
【００４３】
ポリオウイルスは、細胞培養物中で増殖され得る。好ましい培養物は、Ｖｅｒｏ細胞株を使用し、これは、サル腎臓に由来する継続細胞株である。Ｖｅｒｏ細胞は、都合の良いことには、培養されるマイクロキャリアであり得る。ウイルス感染前およびウイルス感染中のＶｅｒｏ細胞の培養物は、ウシ由来の物質（例えば、仔ウシ血清）およびラクトアルブミン加水分解産物（例えば、ラクトアルブミンの酵素分解によって得られる）の使用を伴い得る。このようなウシ由来物質は、ＢＳＥもしくは他のＴＳＥを含まない供給源から得られるべきである。
【００４４】
増殖の後、ビリオンは、限外濾過、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーなどの技術を使用して、精製され得る。患者への投与の前に、ポリオウイルスは、不活化されなければならず、このことは、上記ウイルスが本発明のプロセスにおいて使用される前に、ホルムアルデヒドでの処理によって達成され得る。
【００４５】
上記ウイルスは、好ましくは、個々に増殖され、精製され、不活化され、次いで、合わされて、本発明とともに使用するためにバルク混合物を与える。
【００４６】
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）の量は、代表的には、「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」［３３］）において表される。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、「低用量」のポリオウイルスを含む。１型ポリオウイルスに関しては、このことは、上記組成物中の上記ウイルスの濃度が、≦２０ＤＵ／ｍｌ（例えば、＜１８、＜１６、＜１４、＜１２、＜１０など）であることを意味する。２型ポリオウイルスに関しては、これは、上記組成物中の上記ウイルスの濃度が、≦４ＤＵ／ｍｌ（例えば、＜３、＜２、＜１、＜０．５など）であることを意味する。３型ポリオウイルスに関しては、これは、上記組成物中の上記ウイルスの濃度が、≦１６ＤＵ／ｍｌ（例えば、＜１４、＜１２、＜１０、＜８、＜６など）であることを意味する。１型、２型および３型の３つ全てのポリオウイルスが存在する場合、上記３つの抗原は、それぞれ、５：１：４のＤＵ比において存在し得るか、または任意の他の適切な比において、例えば、Ｓａｂｉｎ株を使用する場合、１５：３２：４５の比において存在し得る［３１］。Ｓａｂｉｎ株に由来する低用量の抗原は、特に有用である（≦１０ＤＵ  １型、≦２０ＤＵ  ２型、および≦３０ＤＵ  ３型（１単位用量あたりで））。
【００４７】
本発明の組成物が、アルミニウム塩アジュバントを含む場合、ポリオウイルスは、好ましくは、それらが処方される前にはいかなるアジュバントにも吸着されないが、処方された後には、それらは、上記組成物中の任意のアルミニウムアジュバントに吸着した状態になり得る。
【００４８】
（さらなる抗原）
Ｄ抗原、Ｔ抗原、Ｐａ抗原、ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ抗原および／もしくはポリオウイルス抗原を含むのと同様に、本発明の免疫原性組成物は、さらなる病原体に由来する抗原を含み得る。例えば、これら抗原は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／もしくはＹのうちの１種以上）もしくはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来し得る。
【００４９】
（髄膜炎菌サッカリド）
組成物が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリド結合体を含む場合、１種または１種より多くのこのような結合体が存在し得る。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの２種、３種、もしくは４種を含めることは、代表的である（例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど）。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４種全てに由来するサッカリドを含む成分は、ＭＥＮＡＣＴＲＡＴＭ製品およびＭＥＮＶＥＯＴＭ製品におけるように、有用である。１種より多くの血清群に由来する結合体が含まれる場合、それらは、実質的に等しい質量において存在し得、例えば、各血清群のサッカリドの質量は、互いの±１０％以内にある。１血清群あたりの代表的な量は、１μｇ〜２０μｇの間、例えば、１血清群あたり２〜１０μｇの間、または約４μｇもしくは約５μｇもしくは約１０μｇである。実質的に等しい比の代替として、血清群Ａサッカリドの２倍の質量が使用され得る。
【００５０】
結合体の投与は、好ましくは、少なくとも４倍、および好ましくは、少なくとも８倍という関連する血清群についての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）力価の増大を生じる。ＳＢＡ力価は、新生仔ウサギ補体もしくはヒト補体を使用して測定され得る［３４］。
【００５１】
血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜サッカリドは、Ｃ３位およびＣ４位において部分的Ｏ−アセチル化を有する、（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ−３位におけるアセチル化は、７０〜９５％であり得る。上記サッカリドを精製するために使用される条件は、（例えば、塩基性条件下で）脱Ｏ−アセチル化を生じ得るが、このＣ−３位においてＯＡｃを保持することは有用である。いくつかの実施形態において、血清群Ａサッカリドにおけるマンノサミン残基のうちの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）は、Ｃ−３位においてＯ−アセチル化されている。アセチル基は、加水分解を妨げるために保護基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）で置換され得［３５］、このような改変サッカリドは、本発明の意味の範囲内でなお血清群Ａサッカリドである。
【００５２】
血清群Ｃ莢膜サッカリドは、（α２→９）結合シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。上記サッカリド構造は、→９）−Ｎｅｕ  ｐ  ＮＡｃ  ７／８  ＯＡｃ−（ａ２→と記載される。大部分の血清群Ｃ株は、シアル酸残基のＣ−７および／もしくはＣ−８においてＯ−アセチル基を有するが、臨床単離株のうちの約１５％は、これらＯ−アセチル基を欠いている［３６，３７］。ＯＡｃ基の存在もしくは非存在は、特有のエピトープを生成し、上記サッカリドに対する抗体結合の特異性は、Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ−）株および脱Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）株に対するその殺菌活性に影響を及ぼし得る［３８〜４０］。本発明とともに使用される血清群Ｃサッカリドは、ＯＡｃ＋株もしくはＯＡｃ−株のいずれかから調製され得る。認可されたＭｅｎＣ結合体ワクチとしては、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−ＣＴＭ）およびＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥＴＭおよびＭＥＮＧＩＴＥＣＴＭ）サッカリドの両方が挙げられる。いくつかの実施形態において、血清群Ｃ結合体の生成のための株は、ＯＡｃ＋株（例えば、血清タイプ１６、血清サブタイプＰ１．７ａ，ｌなどのもの）である。従って、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，ｌ  ＯＡｃ＋株が、使用され得る。血清サブタイプＰｌ．ｌのＯＡｃ＋株（例えば、Ｃ１１株）もまた、有用である。好ましいＭｅｎＣサッカリドは、ＯＡｃ＋株（例えば、Ｃ１１株）から採取される。
【００５３】
血清群Ｗ１３５サッカリドは、シアル酸−ガラクトースジサッカリドユニットのポリマーである。それは、血清群Ｃサッカリドと同様に、しかし、シアル酸の７位および９位に、変わりやすいＯ−アセチル化を有する［４１］。上記構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→と記載される。
【００５４】
血清群Ｙサッカリドは、ジサッカリド反復ユニットが、ガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清群Ｗ１３５サッカリドに類似する。血清群Ｗ１３５と同様に、それは、シアル酸の７位および９位に変わりやすいＯ−アセチル化を有する［４１］。上記血清群Ｙ構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→と記載される。
【００５５】
本発明に従って使用されるサッカリドは、上記で記載されるように、Ｏ−アセチル化されていてもよい（例えば、天然の莢膜サッカリドにおいて認められるのと同じＯ−アセチル化パターンを有する）か、またはそれらは、上記サッカリド環の１つ以上の位置において部分的にもしくは完全に脱Ｏ−アセチル化されていてもよく、またはそれらは、上記天然の莢膜サッカリドと比較して過剰Ｏ−アセチル化されていてもよい。例えば、参考文献４２は、８０％超が脱Ｏ−アセチル化されている血清群Ｙサッカリドの使用を報告する。
【００５６】
髄膜炎菌の結合体におけるサッカリド部分は、髄膜炎菌から調製されるとおりの全長サッカリドを含んでいてもよいし、そして／または全長サッカリドのフラグメントを含んでいてもよい（すなわち、上記サッカリドは、細菌において認められる天然の莢膜サッカリドより短くてもよい）。上記サッカリドは、従って、解重合されてもよく、解重合は、サッカリド精製の間もしくは後であるが、結合体化の前に起こり得る。解重合は、上記サッカリドの鎖長を減少させ得る。１つの解重合法は、過酸化水素の使用を包含する［４３］。過酸化水素は、サッカリドに（例えば、１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度を与えるように）添加され、上記混合物は、次いで、所望の鎖長の減少が達成されるまでインキュベートされる（例えば、約５５℃において）。別の解重合方法は、酸加水分解を含む［４４］。他の脱重合方法は、当該分野で公知である。本発明に従う使用のための結合体を調製するために使用されるサッカリドは、これら解重合方法のうちのいずれかによって得られ得る。解重合は、免疫原性にとって最適な鎖長を提供するために、および／または上記サッカリドの物理的な処理しやすさのために鎖長を減少させるために、使用され得る。いくつかの実施形態において、サッカリドは、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ）を有する：Ａ＝１０〜２０；Ｃ＝１２〜２２；Ｗ１３５＝１５〜２５；Ｙ＝１５〜２５。Ｄｐではなく、分子量に関して、有用な範囲は、全ての血清群について以下である：＜１００ｋＤａ；５ｋＤａ〜７５ｋＤａ；７ｋＤａ〜５０ｋＤａ；８ｋＤａ〜３５ｋＤａ；１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ；１５ｋＤａ〜２２ｋＤａ。他の実施形態において、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの各々に由来するサッカリドに関する平均分子量は、特に、ＭＡＬＬＳによって決定される場合、５０ｋＤａより大きい可能性があり（例えば、≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａなど）［４５］、およびさらには最大１５００ｋＤａまでであり得る。例えば：ＭｅｎＡサッカリドは、範囲５０〜５００ｋＤａ（例えば、６０〜８０ｋＤａ）にあり得る；ＭｅｎＣサッカリドは、範囲１００〜２１０ｋＤａにあり得る；ＭｅｎＷ１３５サッカリドは、範囲６０〜１９０ｋＤａ（例えば、１２０〜１４０ｋＤａ）にあり得る；そして／またはＭｅｎＹサッカリドは、範囲６０〜１９０ｋＤａ（例えば、ｌ５０〜１６０ｋＤａ）にあり得る。
【００５７】
成分もしくは組成物が、Ｈｉｂ結合体および髄膜炎菌結合体の両方を含む場合、いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、特定の髄膜炎菌血清群サッカリドの質量と実質的に同じであり得る。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、特定の髄膜炎菌血清群サッカリドの質量より大きい（例えば、少なくとも１．５×）。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、特定の髄膜炎菌血清群サッカリドの質量より小さい（例えば、少なくとも１．５×小さい）。
【００５８】
組成物が、１種より多くの髄膜炎菌血清群に由来するサッカリドを含む場合、１血清群あたりの平均サッカリド質量が存在する。実質的に等しい質量の各血清群が使用される場合、上記平均質量は、各個々の質量と同じであり；等しくない質量が使用される場合、平均は異なり（例えば、ＭｅｎＡＣＷＹ混合物に関して１０：５：５：５μｇ量を有する）、平均質量は、１血清群あたり６．２５μｇである。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、１血清群あたりの髄膜炎菌サッカリドの平均質量と実質的に同じである。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、１血清群あたりの髄膜炎菌サッカリドの平均質量より大きい（例えば、少なくとも１．５×）。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、１血清群あたりの髄膜炎菌サッカリドの平均質量より（例えば、少なくとも１．５×）小さい［４６］。
【００５９】
（髄膜炎菌ポリペプチド）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの莢膜サッカリドは、有用なワクチン免疫原ではないので、ポリペプチド抗原が代わりに使用され得る。例えば、参考文献４７においてＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓが報告した「血清群Ｂ髄膜炎菌のユニバーサルワクチン」は、本発明とともに使用され得る。
【００６０】
本発明の組成物は、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）抗原を含み得る。上記ｆＨＢＰ抗原は、詳細に特徴付けられた。それは、タンパク質「７４１」［参考文献４８中、配列番号２５３５および２５３６］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献４９〜５１］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」もしくは「ＯＲＦ２０８６」［５２−５４］としても公知である。それは、天然には、リポタンパク質であり、全ての髄膜炎菌血清群にわたって発現される。上記ｆＨＢＰ抗原は、３つの異なる改変体に分類され［５５］、全ての改変体に関して抗原を含むことが好ましい。
【００６１】
本発明の組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａのヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）を含み得る［５６］。この抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［５７］において、遺伝子ＮＭＢ２１３２として含められた。
【００６２】
本発明の組成物は、ＮａｄＡ抗原を含み得る。上記ＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［５７］において遺伝子ＮＭＢ１９９４として含められた。
【００６３】
本発明の組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含み得る。上記ＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［５７］において遺伝子ＮＭＢ０６６３として含められた。
【００６４】
本発明の組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含み得る。上記ＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［５７］において遺伝子ＮＭＢ０９９２として含められた。
【００６５】
本発明の組成物は、Ａｐｐ抗原を含み得る。上記Ａｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［５７］において遺伝子ＮＭＢ１９８５として含められた。
【００６６】
本発明の組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含み得る。Ｏｍｐ８５は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８の公開されたゲノム配列［５７］において遺伝子ＮＭＢ０１８２として含められた。
【００６７】
本発明の組成物は、髄膜炎菌外膜小胞を含み得る。
【００６８】
（肺炎球菌サッカリド）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、細菌性髄膜炎を引き起こし、既存のワクチンは、莢膜サッカリドに基づく。従って、本発明の組成物は、キャリアタンパク質に結合体化した少なくとも１種の肺炎球菌莢膜サッカリドを含み得る。
【００６９】
本発明は、１種以上の異なる肺炎球菌血清型に由来する莢膜サッカリドを含み得る。組成物が、１種より多くの血清型に由来するサッカリド抗原を含む場合、これらは、好ましくは、別個に調製され、別個に結合体化され、次いで、合わされる。肺炎球菌莢膜サッカリドを精製するための方法は、当該分野で公知であり（例えば、参考文献５８を参照のこと）、２３種の異なる血清型に由来する精製サッカリドに基づくワクチンは、長年にわたって知られてきた。これら方法に対する改善もまた、例えば、血清型３については、参考文献５９に記載されるように、または血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆおよび１９Ａについては、参考文献６０に記載されるように、記載されてきた。
【００７０】
肺炎球菌莢膜サッカリドは、代表的には、以下の血清型から選択される：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／もしくは３３Ｆ。従って、全体で、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３以上の異なる血清型に由来する莢膜サッカリドを含み得る。少なくとも血清型６Ｂサッカリドを含む組成物は、有用である。
【００７１】
血清型の有用な組み合わせは、７価組み合わせ（例えば、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆの各々に由来する莢膜サッカリドを含む）である。別の有用な組み合わせは、９価組み合わせ（例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの各々に由来する莢膜サッカリドを含む）である。別の有用な組み合わせは、１０価組み合わせ（例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの各々に由来する莢膜サッカリドを含む）である。１１価組み合わせは、血清型３に由来するサッカリドをさらに含み得る。１２価組み合わせは、上記１０価混合物に以下を添加し得る：血清型６Ａおよび１９Ａ；６Ａおよび２２Ｆ；１９Ａおよび２２Ｆ；６Ａおよび１５Ｂ；１９Ａおよび１５Ｂ；または２２Ｆおよび１５Ｂ。１３価組み合わせは、上記１１価組み合わせに以下を添加し得る：血清型１９Ａおよび２２Ｆ；８および１２Ｆ；８および１５Ｂ；８および１９Ａ；８および２２Ｆ；１２Ｆおよび１５Ｂ；１２Ｆおよび１９Ａ；１２Ｆおよび２２Ｆ；１５Ｂおよび１９Ａ；１５Ｂおよび２２Ｆ；６Ａおよび１９Ａなど。
【００７２】
従って、有用な１３価組み合わせは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９（もしくは１９Ａ）、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する（例えば、参考文献６１〜６４において開示されるように調製される）莢膜サッカリドを含む。１つのこのような組み合わせは、約８μｇ／ｍｌにおいて血清型６Ｂサッカリド、および約４μｇ／ｍｌ（各々）の濃度において他の１２種のサッカリドを含む。別のこのような組み合わせは、約８μｇ／ｍｌ（各々）において血清型６Ａおよび６Ｂサッカリド、ならびに約４μｇ／ｍｌ（各々）において他の１１種のサッカリドを含む。
【００７３】
結合体に適したキャリアタンパク質としては、細菌毒素（例えば、ジフテリアもしくは破傷風の毒素、またはこれらのトキソイドもしくは変異体）が挙げられる。これらは、結合体ワクチンにおいて一般に使用される。例えば、上記ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体は、有用である［６５］。他の適切なキャリアタンパク質としては、合成ペプチド［６６，６７］、熱ショックタンパク質［６８，６９］、百日咳タンパク質［７０，７１］、サイトカイン［７２］、リンホカイン［７２］、ホルモン［７２］、増殖因子［７２］、種々の病原体由来抗原の複数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ［７３］（例えば、Ｎ１９［７４］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［７５−７７］、ニューモリシン［７８］もしくはその非毒性誘導体［７９］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［８０］、鉄取り込みタンパク質［８１］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡもしくはＢ［８２］、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソタンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ（ｒＥＰＡ）［８３］など）を含む人工タンパク質が挙げられる。
【００７４】
肺炎球菌結合体ワクチンに特に有用なキャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄである。ＣＲＭ１９７は、ＰＲＥＶＮＡＲＴＭにおいて使用される。１３価混合物は、ＣＲＭ１９７を、上記１３種の結合体の各々についてのキャリアタンパク質として使用し得、ＣＲＭ１９７は、約５５〜６０μｇ／ｍｌにおいて存在し得る。
【００７５】
組成物が、１種より多くの肺炎球菌血清型に由来する結合体を含む場合、各別個の結合体に対して同じキャリアタンパク質を使用することか、または異なるキャリアタンパク質を使用することは、可能である。両方の場合において、しかし、異なる結合体の混合物は、通常、各血清型の結合体を別個に調製し、次いで、それらを混合して、別個の結合体の混合物を形成することによって調製される。参考文献８４は、多価肺炎球菌結合体ワクチンにおいて異なるキャリアタンパク質を使用する場合の潜在的な利点を記載しているが、ＰＲＥＶＮＡＲＴＭ製品は、７種の異なる血清型の各々に対して同じキャリアを成功裏に使用する。
【００７６】
キャリアタンパク質は、肺炎球菌サッカリドに対して直接、もしくはリンカーを介して、共有結合的に結合体化され得る。種々のリンカーが公知である。例えば、結合は、カルボニルを介してであり得、これは、改変サッカリドの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応［８５，８６］、続いて、タンパク質と反応して、カルバメート結合を形成することによって、形成され得る。カルボジイミド縮合が使用され得る［８７］。アジピン酸リンカーが使用され得、これは、遊離−ＮＨ２基（例えば、アミノ化によってサッカリドに導入される）とアジピン酸とを（例えば、ジイミド活性化を使用して）カップリングし、次いで、タンパク質を、得られたサッカリド−アジピン酸中間体にカップリング［８８，８９］することによって形成され得る。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［９０］、ニトロフェニル−エチルアミン［９１］、ハロアシルハライド［９２］、グリコシド結合［９３］、６−アミノカプロン酸［９４］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［９５］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［９６］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［９７］などが挙げられる。
【００７７】
還元的アミノ化を介する結合体化が、使用され得る。上記サッカリドは、最初に、アルデヒド基を導入するためにペリオデートで酸化されて、次いで、アルデヒド基は、還元的アミノ化を介して、キャリアタンパク質への（例えば、リジンのε−アミノ基への）直接共有結合を形成する。上記サッカリドが、１分子あたり複数のアルデヒド基を含む場合、この結合技術は、架橋生成物をもたらし得る（ここで複数のアルデヒドは、複数のキャリアアミンと反応する）。この架橋結合体化技術は、少なくとも肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに関して特に有用である。
【００７８】
肺炎球菌サッカリドは、肺炎球菌から調製されるとおりの全長のインタクトなサッカリドを含んでいてもよいし、そして／または全長サッカリドのフラグメントを含んでいてもよい（すなわち、上記サッカリドは、細菌において認められる天然の莢膜サッカリドより短くてもよい）。上記サッカリドは、従って、解重合されてもよく、解重合は、サッカリド精製中もしくはその後であるが、結合体化の前に起こり得る。解重合は、上記サッカリドの鎖長を減少させ得る。解重合は、免疫原性にとって最適な鎖長を提供するために、および／または上記サッカリドの物理的な処理しやすさのために鎖長を減少させるために、使用され得る。１種より多くの肺炎球菌血清型が使用される場合、各血清型に関してインタクトなサッカリドを、各血清型に関してフラグメントを使用すること、またはいくつかの血清型に関してインタクトなサッカリドを、および他の血清型に関してフラグメントを使用することは、可能である。
【００７９】
組成物が、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆのうちのいずれかに由来するサッカリドを含む場合、これらサッカリドは、好ましくは、インタクトである。対照的に、組成物が、血清型１８Ｃに由来するサッカリドを含む場合、このサッカリドは、好ましくは、解重合される。
【００８０】
血清型３サッカリドはまた、解重合され得、例えば、血清型３サッカリドは、解重合のための酸加水分解に供され得る［６１］（例えば、酢酸を使用して）。次いで、得られたフラグメントは、活性化のために酸化され得（例えば、ペリオデート酸化、おそらく二価カチオン（例えば、ＭｇＣｌ２）の存在下で）、キャリア（例えば、ＣＲＭ１９７）に還元条件下で（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して）結合体化され得、次いで、（必要に応じて）上記サッカリド中の任意の反応していないアルデヒドは、（例えば、水素化ホウ素ナトリウムを使用して）キャップされ得る［６１］。結合体化は、例えば、活性化サッカリドおよびキャリアを同時に凍結乾燥した後に、凍結乾燥物質に対して行われ得る。
【００８１】
血清型１サッカリドは、少なくとも部分的に脱Ｏ−アセチル化され得る（例えば、アルカリ性ｐＨの緩衝液処理［６２］によって（例えば、炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液を使用することによって）達成され得る）。このような（部分的に）脱Ｏ−アセチル化されたサッカリドは、活性化（例えば、ペリオデート活性化）のために酸化され得、キャリア（例えば、ＣＲＭ１９７）に還元条件下で（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して）結合体化され得、次いで、（必要に応じて）上記サッカリド中の任意の反応していないアルデヒドは、（例えば、水素化ホウ素ナトリウムを使用して）キャップされ得る［６２］。結合体化は、例えば、活性化サッカリドおよびキャリアを同時に凍結乾燥した後に、凍結乾燥物質に対して行われ得る。
【００８２】
血清型１９Ａサッカリドは、活性化（例えば、ペリオデート活性化）のために酸化され得、ＤＭＳＯ中のキャリア（例えば、ＣＲＭ１９７）に還元条件下で結合体化され得、次いで、（必要に応じて）上記サッカリド中の任意の反応していないアルデヒドは、（例えば、水素化ホウ素ナトリウムを使用して）キャップされ得る［９８］。結合体化は、例えば、活性化サッカリドおよびキャリアを同時に凍結乾燥した後に、凍結乾燥物質に対して行われ得る。
【００８３】
１種以上の肺炎球菌莢膜サッカリド結合体が、凍結乾燥形態において存在し得る。
【００８４】
肺炎球菌結合体は、理想的には、関連するサッカリドに結合する抗莢膜抗体を誘起し得、例えば、抗サッカリド抗体レベル≧０．２０μｇ／ｍＬを誘起し得る［９９］。上記抗体は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および／もしくはオプソニン化貪食作用活性（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＯＰＡ）の測定によって、評価され得る。上記ＥＩＡ法は、広範囲に検証されてきており、抗体濃度とワクチン効力との間には関連性がある。
【００８５】
（アルミニウム塩アジュバント）
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、アルミニウム塩アジュバントを含むが、他の実施形態は、アルミニウムを含まなくてもよい。
【００８６】
現在使用されているアルミニウム塩アジュバントは、代表的には、「水酸化アルミニウム」アジュバントもしくは「リン酸アルミニウム」アジュバントのいずれかで言及される。これらは、便利な名称であるが、いずれも、存在する実際の化合物の正確な記載ではない（例えば、参考文献１００の第９章を参照のこと）。本発明は、アジュバントとして有用な「ヒドロキシド」塩もしくは「ホスフェート」塩のいずれをも使用し得る。ヒドロキシドイオンを含むアルミニウム塩は、本発明とともに使用するための好ましい不溶性金属塩である。なぜなら、これらヒドロキシドイオンは、抗原および／もしくはＴＬＲアゴニストの吸着のために配位子交換を容易に受け得るからである。従って、ＴＬＲアゴニストの吸着に好ましい塩は、水酸化アルミニウムおよび／もしくはヒドロキシリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。これらは、リン含有基（例えば、ホスフェート、ホスホネート）との配位子交換を容易に受けて、安定な吸着を提供し得る表面ヒドロキシル部分を有する。水酸化アルミニウムアジュバントが、最も好ましい。
【００８７】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、アルミニウムオキシヒドロキシド塩（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｓａｌｔ）であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。アルミニウムオキシヒドロキシド（これは、式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得る）は、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび強い３０９０〜３１００ｃｍ−１における強いショルダー（参考文献１００の第９章）の存在によって、他のアルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３）から区別され得る。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶性の程度は、ハーフハイト（ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）における回折バンドの幅（ＷＨＨ）によって反映され、不十分に結晶性の粒子は、より小さな結晶サイズに起因して、より大きな線の拡がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増大するにつれて増大し、より高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、より大きな抗原吸着能力を有することが認められた。線維状の形態（例えば、透過型電子顕微鏡写真において認められるように）は、水酸化アルミニウムアジュバントには代表的である（例えば、直径約２ｎｍを有する針状粒子を有する）。水酸化アルミニウムアジュバントのＰＺＣは、代表的には、約１１である（すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１ｍｇ  Ａｌ＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇの間のタンパク質という吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告された。
【００８８】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、アルミニウムヒドロキシホスフェート（しばしば、少量の硫酸塩もまた含む）である。それらは、沈殿によって得られ得、沈殿の間の反応条件および濃度は、上記塩におけるヒドロキシル基の代わりのホスフェートの置換の程度に影響を及ぼす。ヒドロキシホスフェートは、一般に、０．３〜０．９９の間のＰＯ４／Ａｌ  モル比を有する。ヒドロキシホスフェートは、ヒドロキシル基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ４から区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃へと加熱した場合）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す（参考文献１００の第９章を参照のこと）。
【００８９】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３〜１．２の間、好ましくは、０．８〜１．２の間、およびより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般に、無定形であり、特に、ヒドロキシホスフェート塩に関しては、無定形である。代表的なアジュバントは、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する無定形のアルミニウムヒドロキシホスフェートであり、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌにおいて含まれる。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である。上記粒子の代表的直径は、任意の抗原吸着の後に、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）にある。ｐＨ７．４において１ｍｇ  Ａｌ＋＋＋あたり０．７〜１．５ｍｇの間のタンパク質という吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告された。
【００９０】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルの代わりのホスフェートの置換程度に逆に関連し、この置換程度は、沈殿によって上記塩を調製するために使用される反応条件および反応物の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させることによって（より多くのホスフェート＝より酸性の高いＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液のような緩衝液を添加する（ＰＺＣをより塩基性にする）ことによって、変化する。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般には、４．０〜７．０の間、より好ましくは、５．０〜６．５の間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【００９１】
溶液において、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムアジュバントの両方は、（直径１〜１０μｍの）安定な多孔性凝集体を形成する傾向にある［１０１］。
【００９２】
組成物は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含み得、成分は、これら塩のうちの一方もしくは両方に吸着されてもよい。
【００９３】
本発明の組成物を調製するために使用されるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝液を含み得る（例えば、リン酸緩衝液もしくはヒスチジン緩衝液もしくはＴｒｉｓ緩衝液）が、これは、常に必要であるわけではない。上記リン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、無菌かつ発熱物質非含有である。上記リン酸アルミニウム溶液は、遊離の水性ホスフェートイオン（例えば、１．０〜２０ｍＭの間、好ましくは、５〜１５ｍＭの間、およびより好ましくは、約１０ｍＭの濃度において存在する）を含み得る。上記リン酸アルミニウム溶液はまた、塩化ナトリウムを含み得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）にあり、より好ましくは、約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着の前に、ｐＨの正確な測定を促進する。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、１単位用量あたり０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含む。Ａｌ＋＋＋の量は、これより低いことがある（例えば、＜１５０μｇ、＜１００μｇ、＜７５μｇ、＜５０μｇ、＜２５μｇ、＜１０μｇなど）。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、０．４ｍｇ／ｍｌ未満のＡｌ＋＋＋濃度を有する。Ａｌ＋＋＋の濃度は、これより低いことがある（例えば、＜３００μｇ／ｍｌ、＜２５０μｇ／ｍｌ、＜２００μｇ／ｍｌ、＜１５０μｇ／ｍｌ、＜１００μｇ／ｍｌ、＜７５μｇ／ｍｌ、＜５０μｇ／ｍｌ、＜２０μｇ／ｍｌなど）。
【００９６】
本発明の組成物が、アルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈殿は、貯蔵の間に起こり得る。従って、上記組成物は、患者への投与の前に振盪されるべきである。上記振盪された組成物は、濁った白色懸濁物である。
【００９７】
（Ｔｏｌｌ様レセプターアゴニスト）
本発明の組成物が、アルミニウム塩アジュバントを含む場合、そのアルミニウム塩にＴＬＲアゴニストを吸着させ、それによって、上記アジュバントの免疫強化効果を改善することが可能である［１０２］。これは、より良好な免疫応答をもたらし得、そして／または等しいアジュバント効果を維持しながら、上記組成物中のアルミニウムの量の低下を可能にし得る。
【００９８】
本発明の組成物は、従って、ＴＬＲアゴニスト（好ましくは、ＴＬＲ７アゴニスト、およびより好ましくは、ヒトＴＬＲ７のアゴニスト）が吸着されるアルミニウム塩（好ましくは、水酸化アルミニウム）を含み得る。上記アゴニストおよび上記塩は、上記塩が抗原を吸着させる能力を保持する安定なアジュバント複合体を形成し得る。
【００９９】
吸着特性を有するＴＬＲアゴニストは、代表的には、アルミニウム塩上の表面基との（例えば、表面ヒドロキシド基との）配位子交換を受け得るリン含有部分を含む。従って、有用なＴＬＲアゴニストとしては、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、ホスホナイト（ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｔｅ）、ホスフィナイト（ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｔｅ）、ホスフェートなどが挙げられ得る。好ましいＴＬＲアゴニストは、少なくとも１つのホスフェート基もしくはホスホネート基を含む［１０２］。
【０１００】
有用な吸着性ＴＬＲ２アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストは、参考文献１０２〜１０６において開示されている。目的の具体的な吸着性ＴＬＲ７アゴニストとしては、参考文献１０７の第７９〜８４頁の表Ａ中の化合物１Ａ〜２７Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、上記ＴＬＲ７アゴニストは、以下のうちの１つであり得る：
【０１０１】
【化１】
2014506916.tif 000003
【０１０２】
【化２】
2014506916.tif 000004
【０１０３】
これら化合物は、単純な混合によって、アルミニウム塩アジュバントに吸着され得る。例えば、上記化合物（１ｍｇ／ｍＬ）は、１０ｍＭ  ＮａＯＨ中に溶解され得、最終的なＴＬＲアゴニスト濃度１００μｇ／用量を与えるように、水酸化アルミニウムアジュバント（２ｍｇ／ｍＬ）の懸濁物に添加され得る。好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．０１ｍｇ／ｍＬの上記化合物が、２ｍｇ／ｍＬ  水酸化アルミニウムに添加される。アルミニウム塩  対  ＴＬＲアゴニストの質量比は、２：１〜４００：１の間、好ましくは、２０：１、より好ましくは、２００：１である。１時間にわたって室温においてインキュベートするのは、通常、＞９０％の吸着に十分である。吸着は、ある範囲のｐＨ（例えば、６．５〜９）にわたって起こり得る。好ましい実施形態において、アルミニウム塩およびＴＬＲアゴニストは、ヒスチジン緩衝液（例えば、５〜２０ｍＭの間の（例えば、１０ｍＭ）ヒスチジン緩衝液）中、都合の良いことには、ｐＨ６．５において調製される。水酸化アルミニウム上の最適な抗原吸着のために、そのｐＨは、６．０〜６．５の間の範囲にあるべきである。上記ｐＨはまた、上記抗原の強度および安定性にとって非常に重要であり、タンパク質抗原の場合には、最終的なワクチン処方物中のそれらの適切な折りたたみにとって非常に重要である。
【０１０４】
１つの有用なＴＬＲ７アゴニスト（これは、以下の実施例において使用される）は、「化合物Ｔ」（参考文献１０７の第８０ページの化合物６Ａ）である。それは、水の中で約４ｍｇ／ｍｌの溶解度を有し、水酸化アルミニウムによく吸着する：
【０１０５】
【化３】
2014506916.tif 000005
【０１０６】
一般に、組成物が、ＴＬＲアゴニストおよびアルミニウム塩の両方を含む場合、アゴニスト  対  Ａｌ＋＋＋の重量比は、５：１未満（例えば、４：１未満、３：１未満、２：１未満、もしくは１：１未満）である。従って、例えば、Ａｌ＋＋＋濃度０．５ｍｇ／ｍｌを用いると、ＴＬＲアゴニストの最大濃度は、２．５ｍｇ／ｍｌである。しかし、より高いレベルもしくはより低いレベルが使用され得る。Ａｌ＋＋＋の質量より小さい質量のＴＬＲアゴニストが代表的である（例えば、１用量あたり、１００μｇのＴＬＲアゴニストと０．２ｍｇ  Ａｌ＋＋＋など）。
【０１０７】
単位用量中のＴＬＲアゴニストの量は、慣用的な治験を介して決定され得る比較的広い範囲に入る。１〜１０００μｇ／用量の間の量が使用され得る（例えば、５〜１００μｇ／用量もしくは１０〜１００μｇ／用量、および理想的には、≦３００μｇ／用量（例えば、１用量あたり、約５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、２５μｇ、５０μｇもしくは１００μｇ）。従って、本発明の組成物中のＴＬＲアゴニストの濃度は、２〜２０００μｇ／ｍｌ（例えば、１０〜２００μｇ／ｍｌ、または約５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌもしくは２００μｇ／ｍｌ、および理想的には、≦６００μｇ／ｍｌ）であり得る。
【０１０８】
上記組成物中のアゴニストのうちの少なくとも５０（質量）％が上記金属塩に吸着されることは、好ましい（例えば、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、もしくはさらには１００％）。
【０１０９】
本発明の組成物が、金属塩に吸着されるＴＬＲアゴニストを含み、緩衝液もまた含む場合、上記緩衝液中の任意のホスフェートイオンの濃度が５０ｍＭ未満（例えば、１〜１５ｍＭの間）であるべきであることは、好ましい。なぜなら、高濃度のホスフェートイオンは、脱着を引き起こし得るからである。ヒスチジン緩衝液の使用が好ましい。
【０１１０】
（水中油型エマルジョンアジュバント）
水中油型エマルジョンは、有用なアジュバントであることが公知である（例えば、ＭＦ５９およびＡＳ０３はともに、欧州において認可されたワクチンにおいて存在する）。種々の有用なエマルジョンアジュバントが公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤（上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）および生体適合性である）を含む。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、サブミクロン直径を有し、これら小さいなサイズは、安定なエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。なぜなら、それらは、濾過滅菌に供され得るからである。
【０１１１】
本発明は、動物（例えば、魚類）供給源もしくは植物供給源に由来するもののような油とともに使用され得る。植物性油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。落花生油、大豆油、椰子油、およびオリーブ油（最も普通に入手可能）は、堅果油を例示する。ホホバ油が使用され得、例えば、ホホバの実から得られ得る。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、胡麻種子油などが挙げられる。穀粒のグループの中で、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、他のシリアルの穀粒の油（例えば、小麦、オーツ麦、ライ麦、コメ、テフ、ライコムギなど）もまた、使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中には天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は、代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。分離、精製、鹸化のための手順ならびに動物供給源から純粋な油を得るために必要な他の手段は、当該分野で周知である。大部分の魚類は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、たら肝油、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨蝋）は、本明細書において使用され得る魚油のうちのいくつかを例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレンユニットにおいて生化学的に合成され、一般に、テルペノイドといわれる。サメ肝油は、分枝状の不飽和テルペノイド（スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知））を含み、これは、本明細書において特に好ましい。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）もまた、好ましい油である。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロール（以下を参照のこと）である。油の混合物が、使用され得る。
【０１１２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、およびより好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下が挙げられるが、これらに限定されない界面活性剤とともに使用され得る：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎｓといわれる）、（特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名の下で販売される（例えば、直鎖状のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー））；オクトキシノール（これは、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は、特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン））；ノニルフェノールエトキシレート（例えば、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ  ＮＰシリーズ）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；ならびにソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）。非イオン性界面活性剤は、好ましい。上記エマルジョンに含めるための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート；Ｔｗｅｅｎ  ８０）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１１３】
界面活性剤の混合物が使用され得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０））およびオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））の組み合わせもまた、適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／もしくはオクトキシノールを含む。
【０１１４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリソルベート  ８０）  ０．０１〜１％、特に、約０．１％；オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）  ０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；  ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス  ９）  ０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％および特に、０．１〜１％もしくは約０．５％。
【０１１５】
本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクアレン、ポリソルベート  ８０、およびソルビタントリオレエートのサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの組成は、（体積で）約５％  スクアレン、約０．５％  ポリソルベート  ８０および約０．５％  ソルビタントリオレエートであり得る。重量の観点からは、これらの比は、４．３％  スクアレン、０．５％  ポリソルベート  ８０および０．４８％  ソルビタントリオレエートになる。このアジュバントは、参考文献１００の第１０章および参考文献１１１の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［１０８〜１１０］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、シトレートイオンを含む（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液）。
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート  ８０のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝化食塩水を含み得る。それはまた、ソルビタントリオレエート（例えば、１％において）および／もしくはレシチンを含み得る。これらエマルジョンは、２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  ポリソルベート  ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびポリソルベート  ８０は、約５：２の体積比、もしくは約１１：５の重量比において存在し得る。従って、上記３つの成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート  ８０）は、１０６８：１１８６：４８５もしくは約５５：６１：２５の重量比において存在し得る。１つのこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、ポリソルベート  ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌを、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌ  スクアレンとの）混合物と混合し、その混合物をマイクロフルイダイズすることによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、サブミクロン油滴（例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有する）を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒト用量あたり、０．５〜１０ｍｇ  スクアレン、０．５〜１１ｍｇ  トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ  ポリソルベート  ８０［１１２］を、例えば、上記で考察された比において含み得る。
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（以下を参照のこと）。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート  ８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、これら３種の成分を、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート  ８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）において含み得、これら濃度は、抗原からのこれら成分の任意の寄与を含むべきである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（以下を参照のこと）。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアラン、ポリソルベート  ８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ  Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）中で処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でスレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［１１３］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアラン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート  ８０）。それはまた、「ＡＦ」アジュバント［１１４］（５％  スクアラン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート  ８０）におけるように、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ  ８０」）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または油滴のうちの（体積で）少なくとも９０％は２００ｎｍ未満のサイズを有する［１１５］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；低温保護因子（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース）；および／もしくはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。それはまた、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、化学構造が糖環を含まないもの）を含み得る［１１６］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１１７に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズは、有利である。
・非代謝可能な油（例えば、軽鉱物油）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、ポリソルベート  ８０もしくはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含められ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンをデスアシルサポニンに付加することによって生成されるサポニン−親油性結合体（例えば、ＧＰＩ−０１００（参考文献１１８に記載される）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合されるエマルジョン［１１９］。
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１２０］。
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１２０］。
【０１１６】
本発明とともに使用される好ましい水中油型エマルジョンは、スクアレンおよび／もしくはポリソルベート  ８０を含む。
【０１１７】
上記エマルジョンは、製造の間に抗原と混合されてもよいし、送達時に即時に混合されてもよい。従って、上記アジュバントおよび抗原は、使用時に最終処方の準備ができている、パッケージされたかもしくは分配されたワクチンにおいて別個に保持され得る。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２つの液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための２つの液体の体積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間で）が、一般に、約１：１である。エマルジョンおよび抗原が、複数用量キット（ここから、複数単位用量がとられ得る）において別個に貯蔵される場合、生成物は、アジュバント添加した液体ワクチンを与えるために混合するための、エマルジョンを含むバイアルおよび水性抗原を含むバイアルとして提示され得る。
【０１１８】
ワクチンを処方するにあたって使用される場合、ＭＦ５９は、好ましくは、ＭＦ５９処方物の長期の安定性を保つために、ならびに最終ワクチンにおける生理学的ｐＨおよび容量オスモル濃度の値を保証するために、リン酸緩衝化食塩水中で抗原とともに混合される。この混合は、１：１体積比にあり得る。上記ＰＢＳは、ｐＨ７．２を有し得る。
【０１１９】
組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εもしくはξトコフェロールのうちのいずれでも使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。上記トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、異なる塩および／もしくはアイソマー）を採り得る。塩としては、有機塩（例えば、スクシネート、アセテート、ニコチネートなど）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールが両方とも使用され得る。トコフェロールは、有利には、高齢の患者（例えば、６０歳以上の年齢の）における使用のためのワクチンに含まれる。なぜなら、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対して正の効果を有すると報告されているからである。それらはまた、上記エマルジョンを安定化する助けとなり得る抗酸化特性を有する［１２１］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、スクシネートである。上記スクシネート塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと共同することが見いだされている。
【０１２０】
（免疫原性組成物）
本発明の組成物は、以下を含み得る：（ａ）抗原性成分；および（ｂ）非抗原性成分。上記抗原性成分は、上記で考察された抗原を含み得るか、または上記抗原からなり得る。上記非抗原性成分は、キャリア、アジュバント、賦形剤、緩衝液などを含み得る。これら非抗原性成分は、種々の起源を有し得る。例えば、それらは、上記抗原もしくは製造の間に使用されるアジュバント材料のうちの１つに存在してもよいし、それら成分とは別個に添加されてもよい。
【０１２１】
好ましい本発明の組成物は、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。
【０１２２】
張度を制御するために、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含めることは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。
【０１２３】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。重量オスモル濃度は、ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有しないことが以前に報告されている［１２２］が、それにもかかわらず、容量オスモル濃度をこの範囲内に維持することは、好ましい。
【０１２４】
本発明の組成物は、１種以上の緩衝液を含み得る。代表的な緩衝液としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；もしくはクエン酸緩衝液。緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲に含まれる。
【０１２５】
本発明の組成物は、（いかなるエマルジョンアジュバントとも混合する前に）界面活性剤を実質的に含まなくてもよい。特に、本発明の組成物は、ポリソルベート  ８０を実質的に含まなくてもよい。例えば、それは、０．１μｇ／ｍｌ未満のポリソルベート  ８０を含み、および好ましくは、検出可能なポリソルベート  ８０を含まない。しかし、組成物がＨＢｓＡｇを含む場合、それは、通常、ポリソルベート  ２０を含む（例えば、酵母破壊の間に使用された場合）［２９］。
【０１２６】
本発明の組成物のｐＨは、一般に、６．０〜７．５の間である。製造プロセスは、従って、パッケージングの前に、組成物のｐＨを調節する工程を包含し得る。患者に投与される水性組成物は、５．０〜７．５の間、より代表的には、最適な安定性のために、５．０〜６．０の間のｐＨを有し得る；ジフテリアトキソイドおよび／もしくは破傷風トキソイドが存在する場合、上記ｐＨは、理想的には、６．０〜７．０の間である。
【０１２７】
本発明の組成物は、好ましくは、無菌である。
【０１２８】
本発明の組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１  ＥＵ（エンドトキシンユニット（標準尺度））を含み（１  ＥＵは、０．２ｎｇ  ＦＤＡ参照標準エンドトキシンＥＣ−２「ＲＳＥ」に等しい）、そして好ましくは、＜０．１  ＥＵ／用量を含む）。
【０１２９】
本発明の組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１３０】
抗原の吸着性質に起因して、ワクチン製品は、混濁した外観を有する懸濁物であり得る。この外観は、微生物汚染が容易に見えないことを意味するので、上記ワクチンは、好ましくは、抗菌剤を含む。これは、上記ワクチンが複数容量容器にパッケージされる場合に特に重要である。含めるのに好ましい抗菌剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明のプロセス中に水銀保存剤（例えば、チメロサール）を使用しないことが好ましい。従って、上記プロセスにおいて使用される成分のうちの１種〜全ては、水銀保存剤を実質的に含まないことがある。しかし、微量の存在は、本発明において使用される前に、ある成分がこのような保存剤で処理されたのであれば、不可避であり得る。しかし、安全性のために、最終組成物が約２５ｎｇ／ｍｌ未満の水銀を含むことが好ましい。より好ましくは、最終ワクチン製品は、検出可能なチメロサールを含まない。これは、一般に、上記水銀保存剤を、本発明のプロセスにおいて抗原を添加する前に抗原調製物から除去することによって、または上記組成物を作製するために使用される成分の調製中にチメロサールの使用を回避することによって、達成される。水銀を含まない組成物が好ましい。
【０１３１】
本発明の組成物は、一般に、水性形態にある。
【０１３２】
製造中に所望の最終濃度を与える成分の希釈は、通常、ＷＦＩ（注射用水）で行われる。
【０１３３】
本発明は、個々の用量にパッケージするために適したバルク材料を提供し得る。次いで、バルク材料は、患者への投与のために分配され得る。上記で考察される濃度は、代表的には、最終パッケージされた用量中の濃度であるので、バルクワクチン中の濃度は、より高くてもよい（例えば、希釈によって最終濃度へと低下されてもよい）。
【０１３４】
本発明の組成物は、好ましくは、０．５ｍｌ単位用量において患者に投与される。０．５ｍｌ用量への言及は、標準偏差（ｎｏｒｍａｌ  ｖａｒｉａｎｃｅ）（例えば、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌ）を含むことが理解される。複数用量の状況に関しては、複数用量の量が引き抜かれ、単一の容器（例えば、１０用量の複数用量容器に関しては、５ｍｌ）（もしくは１０％増しで５．５ｍｌ）中に一緒にパッケージされる。
【０１３５】
個々の抗原性成分からの残存材料もまた、本発明のプロセスによって生成される最終ワクチンにおいて微量で存在し得る。例えば、ホルムアルデヒドが、ジフテリア、破傷風および百日咳のトキソイドを調製するために使用される場合、上記最終ワクチン製品は、微量のホルムアルデヒド（例えば、１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは、＜５μｇ／ｍｌ）を保持し得る。媒体もしくは安定化剤は、ポリオウイルス調製中に使用されている可能性があり（例えば、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９）、これらは、上記最終ワクチンへと持ち越され得る。同様に、遊離アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパルテート、システインおよび／もしくはシスチン、グルタメート、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリンおよび／もしくはヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンならびに／またはバリン）、ビタミン（例えば、コリン、アスコルベートなど）、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、カルシウム、グルコース、硫酸アデニン、フェノールレッド、酢酸ナトリウム、塩化カリウムなどは、各々、≦１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、＜１０μｇ／ｍｌにおいて最終ワクチンに保持され得る。抗原調製物に由来する他の成分（例えば、ネオマイシン（例えば、硫酸ネオマイシン）、特に、ポリオウイルス成分に由来する）、ポリミキシンＢ（例えば、ポリミキシンＢスルフェート、特に、ポリオウイルス成分に由来する）など）もまた、１用量あたりナノグラム未満の量において存在し得る。上記抗原調製物に起源がある最終ワクチンのさらに考えられる成分は、抗原の完全未満の精製から生じる。少量のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質および／もしくはゲノムＤＮＡが、従って、存在し得る。これら残った成分の量を最小限にするために、抗原調製物は、好ましくは、抗原が本発明とともに使用される前に、上記残った成分を除去するために処理される。
【０１３６】
ポリオウイルス成分が使用される場合、ポリオウイルスは、一般に、Ｖｅｒｏ細胞で増殖させられている。最終ワクチンは、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは、≦１ｎｇ／ｍｌ、例えば、≦５００ｐｇ／ｍｌもしくは≦５０ｐｇ／ｍｌのＶｅｒｏ細胞ＤＮＡ（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ未満のＶｅｒｏ細胞ＤＮＡ（≧５０塩基対長である））を含む。
【０１３７】
本発明の組成物は、容器中で、使用のために提示される。適切な容器としては、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは、滅菌したもの）が挙げられる。本発明のプロセスは、使用のために、上記ワクチンを容器にパッケージする工程を包含し得る。適切な容器としては、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは、滅菌したもの）が挙げられる。
【０１３８】
本発明の組成物がバイアル中に提示されている場合、バイアルは、好ましくは、ガラスもしくはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物がバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、ラテックス非含有ストッパーで密封され得る。上記バイアルは、単一用量のワクチンを含んでいてもよいし、または１より多くの用量を含んでいてもよい（「複数用量」バイアル）（例えば、１０用量）。複数用量バイアルを使用する場合、各用量は、バイアルの内容物の汚染を回避するように注意を払いながら、滅菌針およびシリンジで、厳密な無菌条件下で引き抜かれるべきである。好ましいバイアルは、無色のガラスで作製される。
【０１３９】
バイアルは、予め充填されたシリンジがキャップへと挿入され得、上記シリンジの内容物が、上記バイアルの中へと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）、そして上記バイアルの内容物が、上記シリンジの中へと取り戻され得るように適合されたキャップ（例えば、ルーアーロック）を有し得る。上記バイアルからのシリンジの除去の後に、次いで、針が取り付けられ得、上記組成物は、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に位置し、その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップがアクセスされ得る前に外されなければならない。
【０１４０】
上記組成物が、シリンジへとパッケージされる場合、上記シリンジは、通常、これに取り付けられる針を有しないが、別個の針が、組み立ておよび使用のために、上記シリンジに供給され得る。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。シリンジは、記録保持を促進するために、ロット番号および内容物の使用期限日が印刷され得る剥離ラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが、吸引中に偶然に外れないようにストッパーを有する。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、針を取り付ける前に先端を密封する先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記シリンジおよび針が別個にパッケージされる場合、上記針は、好ましくは、ブチルゴムシールドにはめられている。灰色のブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で市場に出ているものである。
【０１４１】
ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスではなく、ホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
【０１４２】
組成物を容器にパッケージした後、上記容器は、配送のために、ボックス内に、例えば、厚紙のボックス内部に封入され得、上記ボックスは、ワクチンの詳細（例えば、その商品名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば、「Ｂ型肝炎組換え」など）、提示容器（例えば、「使い捨て充填済みＴｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」もしくは「１０×０．５ｍｌ単一用量バイアル」）、その用量（例えば、「各々、０．５ｍｌの１用量を含む」）、注意事項（例えば、「成人のみの使用用」もしくは「小児のみの使用用」）、使用期限日、適応症、特許番号など）がラベル付けされる。各ボックスは、１個より多くのパッケージされたワクチンを含み得る（例えば、５個もしくは１０個のパッケージされたワクチン（特に、バイアルについて））。
【０１４３】
上記ワクチンは、ワクチンの詳細（例えば、投与のための説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットと一緒にパッケージされ得る（例えば、同じボックスの中に）。上記説明書はまた、注意事項（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に備えてアドレナリンの溶液を容易に入手可能に保持することなど）を含み得る。
【０１４４】
上記パッケージされたワクチンは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それは、凍結されるべきではない。
【０１４５】
ワクチンは、製造後に、完全液体形態において（すなわち、全ての抗原成分が水溶液もしくは懸濁物中にある）提供され得るか、またはそれらは、上記ワクチンが、２つの成分を一緒に混合することによって使用時／使用時点で即時に調製され得る形態において調製され得る。このような２成分実施形態は、液体／液体混合および液体／固体混合（例えば、水性物質と凍結乾燥物質とを混合することによる）を含む。例えば、一実施形態において、ワクチンは、以下を混合することによって作製され得る：（ａ）水性抗原および／もしくはアジュバントを含む第１の成分；ならびに（ｂ）凍結乾燥抗原を含む第２の成分。別の実施形態において、ワクチンは、以下を混合することによって作製され得る：（ａ）水性抗原および／もしくはアジュバントを含む第１の成分；ならびに（ｂ）水性抗原を含む第２の成分。別の実施形態において、ワクチンは、以下を混合することによって作製され得る：（ａ）水性抗原を含む第１の成分；ならびに（ｂ）水性アジュバントを含む第２の成分。上記２つの成分は、好ましくは、別個の容器（例えば、バイアルおよび／もしくはシリンジ）の中にあり、本発明は、成分（ａ）および成分（ｂ）を含むキットを提供する。
【０１４６】
別の有用な液体／凍結乾燥フォーマットは、（ａ）水中油型エマルジョンアジュバント、および（ｂ）１種以上の抗原を含む凍結乾燥成分を含む。患者投与に適したワクチン組成物は、成分（ａ）および（ｂ）を混合することによって得られる。いくつかの実施形態において、成分（ａ）は、抗原非含有であり、その結果、最終ワクチンにおける全ての抗原成分は、成分（ｂ）に由来する；他の実施形態において、成分（ａ）は、１種以上の抗原を含み、その結果、上記最終ワクチン中の抗原成分は、成分（ａ）および（ｂ）の両方に由来する。
【０１４７】
別の有用な液体／凍結乾燥形式は、（ａ）アルミニウム塩およびＴＬＲアゴニストの水性の複合体、ならびに（ｂ）１種以上の抗原を含む凍結乾燥成分を含む。患者への投与に適したワクチン組成物は、成分（ａ）および（ｂ）を混合することによって得られる。いくつかの実施形態において、成分（ａ）は、抗原非含有であり、その結果、上記最終ワクチン中の全ての抗原成分は、成分（ｂ）に由来する；他の実施形態において、成分（ａ）は、１種以上の抗原を含み、その結果、上記最終ワクチン中の抗原成分は、成分（ａ）および（ｂ）の両方に由来する。
【０１４８】
従って、本発明は、混合ワクチンを調製するためのキットを提供し、上記キットは、上記で示されるように、成分（ａ）および（ｂ）を含む。上記キットの構成要素は、代表的には、バイアルもしくはシリンジであり、単一のキットは、バイアルおよびシリンジの両方を含み得る。本発明はまた、このようなキットを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、以下の工程を包含する：（ｉ）上記のように水性成分ワクチンを調製する工程；（ｉｉ）上記水性混合ワクチンを第１の容器（例えば、シリンジ）にパッケージする工程；（ｉｉｉ）抗原含有成分を凍結乾燥形態において調製する工程；（ｉｖ）上記凍結乾燥抗原を第２の容器（例えば、バイアル）にパッケージする工程；ならびに（ｖ）上記第１の容器および第２の容器を、キットの中に一緒にパッケージする工程。上記キットは、医師へ配送され得る。
【０１４９】
液体／凍結乾燥形式は、結合体成分、特に、Ｈｉｂおよび／もしくは髄膜炎菌および／もしくは肺炎球菌の結合体を含むワクチンのために特に有用である。なぜならこれらは、凍結乾燥形態においてより安定であり得るからである。従って、結合体は、本発明とともにそれを使用する前に、凍結乾燥され得る。
【０１５０】
成分が凍結乾燥されている場合、それは、一般に、凍結乾燥工程の前に添加された非活性成分（例えば、安定化剤として）を含む。含めるために好ましい安定化剤は、ラクトース、スクロースおよびマンニトール、ならびにこれらの混合物（例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など）である。上記凍結乾燥物質の水性の再構成によって得られる最終ワクチンは、従って、ラクトースおよび／もしくはスクロースを含み得る。凍結乾燥ワクチンを調製する際に無定形賦形剤および／もしくは無定形緩衝液を使用することが好ましい［１２３］。
【０１５１】
好ましい本発明の組成物は、（１）ジフテリア、破傷風および百日咳のトキソイド、１型、２型および３型の不活化ポリオウイルスと、（２）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原および／もしくはＨｉｂ結合体を含む。これら組成物は、上記特定された抗原からなってもよいし、またはさらなる病原体（例えば、髄膜炎菌）に由来する抗原をさらに含んでいてもよい。従って、上記組成物は、ワクチン自体として、またはさらなるワクチンの成分として、使用され得る。
【０１５２】
組成物が、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドの両方を含む場合、これらは、種々の比において存在し得る。好ましくは、過剰のジフテリアトキソイド（Ｌｆ単位で測定される）（例えば、破傷風トキソイドより２〜４×の間多くのジフテリアトキソイド（例えば、２．５×もしくは３×多い））が存在する。
【０１５３】
（処置方法およびワクチンの投与）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を上記患者に投与する工程を包含する、患者における免疫応答を惹起するための方法を提供する。
【０１５４】
本発明はまた、医薬における使用のための本発明の組成物を提供する。
【０１５５】
本発明はまた、１単位用量あたり０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含む混合ワクチンの製造における、（ｉ）少なくともジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントの使用を提供する。
【０１５６】
本発明はまた、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を含む混合ワクチンの製造における、（ｉ）少なくともジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントの使用を提供する。
【０１５７】
本発明はまた、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を含み、１単位用量あたり０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を有する混合ワクチンの製造における、（ｉ）少なくともジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイド、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントの使用を提供する。
【０１５８】
本発明はまた、混合ワクチンの製造における、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、およびＨｉｂ結合体、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原および／もしくは不活化ポリオウイルス抗原、ならびに（ｉｉｉ）水中油型エマルジョンアジュバントの使用を提供する。
【０１５９】
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、少なくともジフテリア、破傷風、百日咳の予防における使用のためのワクチンである。それらの抗原含有量に依存して、上記ワクチンはまた、細菌性髄膜炎、ポリオ、肝炎などから防御し得る。
【０１６０】
十分な効力を有するために、代表的な一次免疫処置スケジュール（特に、小児用）は、１より多くの用量を投与する工程を包含し得る。例えば、投与は、以下であり得る：０ヶ月および６ヶ月（時間０は、第１の用量である）において；０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月において；０日目、２１日目において、次いで、第３の用量は、６ヶ月〜１２ヶ月の間に；２ヶ月、４ヶ月および６ヶ月において；３ヶ月、４ヶ月、および５ヶ月において；６週、１０週および１４週において；２ヶ月、３ヶ月および４ヶ月において；または０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月および１２ヶ月において。
【０１６１】
組成物はまた、ブースター用量として（例えば、小児については、誕生から２年目において）使用され得る。
【０１６２】
本発明の組成物は、例えば、腕もしくは脚に、筋肉内注射によって投与され得る。
【０１６３】
（より少ない用量での乳児の免疫処置スケジュール）
上述のように、本発明のさらなる局面は、１回もしくは２回のみのＤＴＰ含有組成物が投与される、乳児（すなわち、誕生から１歳齢の間の小児）用の免疫処置スケジュールである。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、現在の通常の３回投与スケジュールと比較してさらに少ない用量を送達するが、免疫防御効果の喪失はない。
【０１６４】
従って、この局面によれば、本発明は、以下を提供する：
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための方法であって、上記方法は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドを含む混合ワクチンの２以下の用量を上記乳児に投与する工程を包含する、方法。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための方法であって、上記方法は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、およびアルミニウム塩アジュバントを含む混合ワクチンの２以下の用量を上記乳児に投与する工程を包含し、ここで上記ワクチンの各用量は、０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含む、方法。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための方法であって、上記方法は、アルミニウム塩アジュバントおよびジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を含む混合ワクチンの２以下の用量を、上記乳児に投与する工程を包含する、方法。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための方法であって、上記方法は、（ｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量、ならびに（ｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含む混合ワクチンの２以下の用量を上記乳児に投与する工程であって；ここで上記ワクチンの各用量は、０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含む、方法。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための方法であって、上記方法は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、および水中油型エマルジョンアジュバントを含むアルミニウム非含有混合ワクチンの２以下の用量を上記乳児に投与する工程を包含する、方法。上記ワクチンは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を有し得る。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳に対して乳児を免疫処置するための混合ワクチンの製造における、少なくともジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの使用であって、ここで上記ワクチンは、２以下の用量によって上記乳児に投与するために調製される、使用。上記ワクチンは、（ｉ）アルミニウム塩アジュバント（この場合、それは、１単位用量あたり０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含み得る）を含み得；そして／または（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を有し得る。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳に対して乳児を免疫処置するためのアルミニウム非含有混合ワクチンの製造における、少なくともジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの使用であって、ここで上記ワクチンは、２以下の用量によって上記乳児に投与するために調製される、使用。上記ワクチンは、製造中に、もしくは使用時のいずれかに、水中油型エマルジョンアジュバントを含み得る。上記ワクチンは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を有し得る。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための、上記混合ワクチンの２以下の用量を上記乳児に投与することによる方法において使用するための、少なくともジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドを含む混合ワクチン。上記ワクチンは、（ｉ）アルミニウム塩アジュバント（この場合、それは、１単位用量あたり０．２ｍｇ未満のＡｌ＋＋＋を含み得る）を含み得；そして／または（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を有し得る。
・少なくともジフテリア、破傷風および百日咳（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ））に対して乳児を免疫処置するための、上記混合ワクチンの２以下の用量を上記乳児に投与することによる方法において使用するための、少なくとも水中油型エマルジョンアジュバント、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドを含むアルミニウム非含有混合ワクチン。上記ワクチンは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳トキソイドの各々の低用量を有し得る。
【０１６５】
この局面によれば、上記ワクチンがアルミニウム塩アジュバントを含む場合、上記で開示されるように、上記ワクチンはまた、そのアルミニウム塩に吸着され得るＴＬＲアゴニストを含み得る。
【０１６６】
この局面によれば、上記混合ワクチンは、百日咳トキソイドを含む。これは、細胞性百日咳抗原内のタンパク質として上記ワクチンに組み込まれ得るが、上記でより詳細に考察されるように、無細胞性百日咳抗原を使用することは好ましい。
【０１６７】
この局面によれば、上記ワクチンの２以下の用量は、上記乳児に与えられる（すなわち、上記乳児は、上記ワクチンの単一の用量もしくは２用量を受けるが、３（以上の）用量を受容しない。しかし、上記乳児は、彼らの人生において後に（すなわち、彼らの１歳の誕生日の後にもしくは彼らの２歳の誕生日の後に）、第３の（およびおそらくさらなる）用量を受け得る。
【０１６８】
１用量もしくは２用量が、好ましくは、（ｉ）１ヶ月齢〜５ヶ月齢の間に、（ｉｉ）２ヶ月齢〜４ヶ月齢の間に、（ｉｉｉ）３ヶ月齢〜５ヶ月齢の間に、（ｉｖ）６週齢〜１６週齢の間に、または（ｖ）０ヶ月齢〜３ヶ月齢の間に、上記乳児に与えられる。例えば、２用量が、（ｉ）１ヶ月齢および２ヶ月齢、（ｉｉ）２ヶ月齢および４ヶ月齢、（ｉｉｉ）３ヶ月齢および４ヶ月齢、（ｉｖ）２ヶ月齢および３ヶ月齢、（ｖ）０ヶ月齢および１ヶ月齢などにおいて与えられ得る。
【０１６９】
（一般）
用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘからもっぱらなってもよいし、またはさらなる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含んでいてもよい。
【０１７０】
語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に非含有の」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」とは、本発明の定義から省略されてもよい。
【０１７１】
用語「約」とは、数値ｘに関して、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１７２】
具体的に示されなければ、２以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、混合のいかなる特定の順番をも必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３成分が存在する場合、２成分が互いに合わされ、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わされるなどであり得る。
【０１７３】
抗原がアジュバントに「吸着される」と記載される場合、その抗原のうちの少なくとも５０（重量）％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％以上）が吸着されることは好ましい。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドがともに完全に吸着される（すなわち、上清中に何も検出可能でない）ことは好ましい。ＨＢｓＡｇの完全な吸着が利用され得る。
【０１７４】
結合体の量は、一般に、キャリアの選択に起因する変動を回避するために、サッカリドの質量に関して与えられる（すなわち、全体としての結合体（キャリア＋サッカリド）の用量は、示される用量より高い）。
【０１７５】
組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、好ましくは、それはまた、水中油型エマルジョンアジュバントを含まない。逆に、組成物が水中油型エマルジョンアジュバントを含む場合、好ましくは、それは同様に、アルミニウム塩アジュバントを含まない。
【０１７６】
本発明とともに使用されるリン含有基は、周辺の環境のｐＨ（例えば、それらが溶解される溶媒のｐＨ）に依存して、多くのプロトン化形態および脱プロトン化形態において存在し得る。従って、特定の形態が本明細書に例示され得るが、別段言及されなければ、これら例示は代表であるに過ぎず、具体的なプロトン化形態にも脱プロトン化形態にも限定しないことが意図される。例えば、ホスフェート基の場合、これは、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２と示されているが、上記定義は、酸性条件下において存在し得るプロトン化形態である−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ２）（ＯＨ）］＋および−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ２）２］２＋、ならびに塩基性条件において存在し得る脱プロトン化形態である−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ）］−および［ＯＰ（Ｏ）（Ｏ）２］２−を包含する。本発明は、全てのこのような形態を包含する。
【０１７７】
ＴＬＲアゴニストは、薬学的に受容可能な塩として存在し得る。従って、上記化合物は、それらの薬学的に受容可能な塩（すなわち、生理学的にもしくは毒物学的に許容可能な塩（これは、適切な場合、薬学的に受容可能な塩基付加塩および薬学的に受容可能な酸付加塩を含む））の形態において使用され得る。
【０１７８】
互変異性形態において（すなわち、ケト形態もしくはエノール形態において）存在し得る、本明細書に示されるＴＬＲアゴニストの場合、上記化合物は、全てのこのような互変異性形態において使用され得る。
【０１７９】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、適切なプロドラッグによって代わりに置換され得る。
【０１８０】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養において使用される場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、および特に、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。
【０１８１】
（図面の簡単な説明）
図面はない。
【発明を実施するための形態】
【０１８２】
（抗原へのアジュバント吸着）
３価（ＤＴａＰ）もしくは６価（ＤＴａＰ−ＨＢｓＡｇ−ＩＰＶ−Ｈｉｂ）ワクチンに、水酸化アルミニウム単独、「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウム、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）微粒子（「ＰＬＧ」）、およびＭＦ５９  水中油型エマルジョンをアジュバント添加した。水酸化アルミニウムおよび「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウムを、ヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）中に調製した。ｐＨ６．５において、水酸化アルミニウムは、正の正味電荷を有するが、大部分のタンパク質は、負の正味電荷を有する。上記ｐＨ値を、試験される抗原の大部分の良好な吸着を提供するために選択した。水酸化アルミニウムもしくは「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウムをアジュバント添加した全ての処方物は、最適なｐＨ（６．５〜６．８±０．１）および容量オスモル濃度値（０．３００±５０ｍＯ）を示した。容量オスモル濃度を、ＮａＣｌで調節した。上記ＭＦ５９をアジュバント添加した処方物の抗原を、ＰＢＳ中で調製した。得られた調製物は、６．２〜７．３の間のｐＨ値および約０．３００±５０ｍＯの容量オスモル濃度値を有した。ＰＬＧ微粒子を含む処方物を、水中で調製した。ＰＬＧ処方物は、最適に及ばない容量オスモル濃度値を示した。上記ＰＬＧ処方物のｐＨは、５．８〜６．５＋０．１の範囲に及んだ。上記ＰＬＧ微粒子を、上記微粒子に負の正味電荷を与えるジオクチルスルホスクシネート（ＤＳＳ）とともに調製した。従って、上記微粒子と上記抗原との相互作用は、上記抗原表面の正電荷によって媒介される。
【０１８３】
水酸化アルミニウム単独、「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウム、およびＰＬＧに関しては、吸着を、遠心分離によって、吸着していない抗原からアジュバント−抗原複合体を分離することによって検出した。０．４％  ＤＯＣを、上記吸着していない抗原を含む上清に添加した。抗原を、６０％  ＴＣＡを添加することによって沈殿させ、遠心分離によって集めた。上記ＴＣＡ沈殿した抗原を含むペレットを、ローディング緩衝液中で再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せた。上記アジュバント−抗原複合体を含むペレットを、脱着緩衝液（４×濃度：０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ、８ｇ  ＳＤＳ、２５ｇ  グリセロール、６．１６ｇ  ＤＴＴおよびプロモフェノール・ブルー）中に再懸濁し、上記水酸化アルミニウムを、遠心分離によって除去し、上記上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに注いだ。上記抗原含有ＭＦ５９水中油型エマルジョンを、遠心分離によって油相と水相とに分離した。吸着していない抗原を含む水相およびＭＦ５９に会合した抗原をおそらく含む油相の両方を、ローディング緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに注いだ。上記サンプルの電気泳動分離の後に、上記ゲルを、クーマシーブルー染色によるかもしくはウェスタンブロッティングによるかのいずれかで分析した。
【０１８４】
濃度２ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム単独を使用すると、クーマシーブルー染色によって検出されたＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡおよび６９Ｋの吸着プロフィールは、上記３価処方物および上記６価処方物についてともに完璧であった。上記ＤＯＣ−ＴＣＡ処理上清においてバンドは検出されなかった。ウェスタンブロット分析から、上記３価処方物および上記６価処方物の両方について、ＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡおよび６９Ｋに関して完全な水酸化アルミニウム吸着が確認された。同様に、他の５つの抗原（ＩＰＶ１、ＩＰＶ２、ＩＰＶ３、ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−ＣＲＭ）は、水酸化アルミニウム吸着処方物のＤＯＣ−ＴＣＡ処理上清においていかなる検出可能なバンドも示さなかった。従って、上記６価処方物に存在する１０種全ての抗原は、水酸化アルミニウムに完全に吸着した。
【０１８５】
「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウムに関しては、抗原吸着は、上記３価処方物と上記６価処方物との間で異なった。４種の異なる「化合物Ｔ」濃度を試験した（０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．００５ｍｇ／ｍｌ）。上記水酸化アルミニウム濃度を、２ｍｇ／ｍｌにおいて一定に維持した。０．１ｍｇ／ｍｌ  「化合物Ｔ」において、上記３価処方物中の全ての抗原は、完全に吸着された。対照的に、上記６価処方物中の６９ＫおよびＰＴは、クーマシーブルー染色によって決定したところ、完全には吸着されなかった。０．０１ｍｇ／ｍｌ  「化合物Ｔ」において、ウェスタンブロット分析から、上記６価処方物中の１０種全ての抗原の吸着が確認された。ＴＴのごく少量が、ウェスタンブロットを使用して、上清中でなお検出可能であった。ＴＴが、ウェスタンブロットによって上清中で検出できたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出できなかったという事実は、おそらく、前者の方法の感度がより高いことに起因する。従って、より高濃度において、「化合物Ｔ」は、上記アジュバントへの結合に関して、上記抗原と競合するようである。これは、なぜ上記効果が、より多数の抗原の存在下において明らかになるに過ぎないのか（すなわち、抗原あたり、より少ない水酸化アルミニウムが利用可能である場合）を説明し得る。
【０１８６】
ＰＬＧ微粒子を使用すると、ＤＴ、ＴＴ、ＩＰＶ１、ＩＰＶ２、ＩＰＶ３、ＦＨＡおよび上記Ｈｉｂ−ＣＲＭ結合体のＣＲＭは、大部分が上清に示され、ごく少量のＤＴ、ＩＰＶ１、ＩＰＶ２およびＦＨＡが、上記抗原−アジュバント複合体を含むペレットにおいてウェスタンブロットによって検出されるに過ぎなかった。６９ＫおよびＰＴは、上清およびペレットにおいて類似の量で提示されるようであった。ＨＢｓＡｇは、上記ＰＬＧ処方物の上清においてもペレットにおいても、いずれでも検出できなかった。水酸化アルミニウムもしくは「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウムを含む調製物を比較すると、ＰＬＧは、有意に少ない抗原を吸着した。さらに、ＰＬＧを使用して得られた上記抗原吸着プロフィールは、他の２種のアジュバントの存在下において認められたものとは反対の傾向を示した。このことは、水酸化アルミニウムもしくは「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウムの正の正味電荷に対して、ＰＬＧの負の正味電荷をおそらく反映する。
【０１８７】
ＭＦ５９は、注射部位における抗原沈着の欠如およびＭＦ５９と上記抗原との独立したクリアランスによって示されるように、上記抗原と物理的に相互作用できないと一般に考えられている送達系である（参考文献１２４および１２５を参照のこと）。１：１、１：３および１：１０の比（ＭＦ５９  対  完全抗原処方物のｖ：ｖ）を試験した。試験した３種全ての比に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析から、試験した１０種の抗原全てが、ＭＦ５９アジュバント添加処方物の水相に存在することが示された。従って、ＭＦ５９アジュバント添加処方物の抗原プロフィールは、アジュバント添加しなかった処方物のプロフィールに対応した。この結果から、ＭＦ５９は、上記試験した抗原のいずれとも相互作用しないことが確認された。
【０１８８】
（アルミニウム塩アジュバントの置換もしくは低下）
ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＩＮＦＡＮＲＩＸ  ＨＥＸＡ製品は、≧３０ＩＵ  ジフテリアトキソイド、≧４０ＩＵ  破傷風トキソイド、無細胞性百日咳成分（２５／２５／８μｇのＰＴ／ＦＨＡ／パータクチン）、１０μｇ  ＨＢｓＡｇ、３価ＩＰＶ成分（４０／８／３２  ＤＵの１型／２型／３型）、および１０μｇ  Ｈｉｂ結合体を含む。上記ワクチンは、上記Ｈｉｂ結合体をその凍結乾燥形態から再構成して、０．９５ｍｇ  水酸化アルミニウムおよび１．４５ｍｇ  リン酸アルミニウムを含むヒト乳児用の０．５ｍｌ水性単位用量を与えるために使用される５価水性ワクチンとして提示される。
【０１８９】
代わりのアジュバント（上記を参照のこと）を調査するために、６価混合物に、以下をアジュバント添加した：水酸化アルミニウム単独（ヒスチジン緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ）、「化合物Ｔ」が予備吸着した水酸化アルミニウム（上記を参照のこと；１ｍｇ／ｍｌ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）微粒子（「ＰＬＧ」、４０ｍｇ／ｍｌにおいて使用）、または上記ＭＦ５９  水中油型エマルジョン（等体積においてリン酸緩衝化食塩水中の抗原と混合）。同じ希釈剤を、以下に示される全てのマウス実験において使用した。上記処方物の容量オスモル濃度を、必要な場合、ＮａＣｌで調節した。アジュバント非含有コントロールもまた、調製した。抗原濃度は、以下のとおりであった（１ｍｌあたり）：
【０１９０】
【表２】
2014506916.tif 000006
【０１９１】
同じアジュバントを、３価Ｄ−Ｔ−Ｐａ混合物（同濃度）でも使用した。
【０１９２】
生理学的受容性を確実にするために、上記成分を合わせた後に、容量オスモル濃度およびｐＨを測定した（および必要であれば、調節した）。全ての３価組成物に関して、ｐＨは、５．９〜７．１の間であり、容量オスモル濃度は、２９０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間であった（＞４００ｍＯｓｍ／ｋｇのものを除く）。全ての６価組成物に関して、ｐＨは、５．５〜６．８の間であり、容量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）は、２６０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間であった（＞５００ｍＯｓｍ／ｋｇのものを除く）。緩衝液コントロールは、ｐＨ７．３および２７６ｍＯｓｍ／ｋｇを有した。
【０１９３】
上記合わせた抗原の完全性および免疫原性もまた、試験した。組み合わせとして処方された後に、抗原はいずれも、変化した分析プロフィールを示さなかった。すなわち、上記抗原およびアジュバントは、ともに物理的に適合性である。
【０１９４】
水酸化アルミニウム単独を用いると、全ての抗原は、上記アジュバントに十分に吸着した。水酸化アルミニウムおよび化合物「Ｔ」（すなわち、安定なアジュバント複合体の形成のために吸着を可能にするように、「化合物Ｔ」と予め混合された水酸化アルミニウム；本明細書中以降「Ａｌ−Ｔ」）を用いると、全ての抗原は、ＴＴ、パータクチンおよびＰＴが部分的に脱着したことを除いて、十分に吸着した。
【０１９５】
上記ＰＬＧアジュバントを用いると、上記ジフテリアおよび破傷風のトキソイドは吸着しなかったが、百日咳トキソイドは吸着した。
【０１９６】
マウス（雌性Ｂａｌｂ／ｃ，  ４週齢）に、０日目および２８日目に、１００μｌの各組成物（すなわち、１／５  ヒト用量の体積）を筋肉内で免疫処置した。血清を、各注射の１４日後に集めた。２回目の免疫処置の後、ＩｇＧ抗体力価は、以下のとおりであった：
【０１９７】
【表３】
2014506916.tif 000007
【０１９８】
従って、これら抗原の全てに関して、アジュバントを含めることにより、ＩｇＧ抗体力価が増大した。最高の力価は、Ａｌ−Ｔを使用する場合に認められた。次に良いものは、ＭＦ５９を用いたものであり、これは、水酸化アルミニウム単独より良好な結果を与えた。Ａｌ−Ｔを使用して得られる力価は、パータクチンを除く全ての抗原について、Ｉｎｆａｎｒｉｘ  Ｈｅｘａで認められたものより、良好であった。
【０１９９】
さらに、データから、上記３価ワクチンで達成される良好な結果が、ＩＰＶ、ＨｉｂおよびＨＢｓＡｇが付加された後ですら維持されることが示される。
【０２００】
ＩｇＧ応答をまた、サブクラスまで調査した。上記６価ワクチンにおける上記抗原の大部分に関して、上記アジュバントは、ＩｇＧ１力価に対してほとんど影響を有しなかったが、それらは、ＩｇＧ２ａ力価およびＩｇＧ２ｂ力価を増大させた。最高のＩｇＧ２ａ力価およびＩｇＧ２ｂ力価が、Ａｌ−Ｔで得られ、次によいものがＭＦ５９で得られた。
【０２０１】
水酸化アルミニウム単独と、またはＩｎｆａｎｒｉｘ  Ｈｅｘａ中で認められるアルミニウム塩の混合物と比較して増大した、Ａｌ−Ｔで認められる力価は、１用量あたりのアルミニウムの総量が、免疫応答の増強を維持しながら低下され得ることを意味する。
【０２０２】
（抗原用量の低下）
実験を、改善されたアジュバントが、１用量あたりの抗原の量を減少させるために使用され得るか否かを調査するために設計した。上記６価抗原組み合わせの１０倍、５０倍および１００倍希釈物（ヒト投与に関して（すなわち、１００μｌ用量あたり１μｇ、０．２μｇもしくは０．１μｇのＨＢｓＡｇを各マウスに送達するために））を、アジュバント濃度を維持しながら作製した。
【０２０３】
希釈後に、容量オスモル濃度およびｐＨを測定した（および必要であれば、調節した）。全ての６価組成物に関して、ｐＨは、６．１〜７．０の間であり、容量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）は、２７５〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間であった。緩衝液コントロールは、ｐＨ７．３および２８５ｍＯｓｍ／ｋｇを有した。
【０２０４】
マウスを、上記で考察したように同じ方法で免疫処置した。２回の免疫処置後の総血清ＩｇＧ力価は、以下のとおりであった：
【０２０５】
【表４】
2014506916.tif 000008
【０２０６】
従って、アジュバントの存在は、アジュバント添加していない抗原に匹敵するかもしくはそれより高いＩｇＧ力価を維持しながら、５倍もしくは１０倍の用量減少を可能にした。ＭＦ５９およびＡｌ−Ｔは、特に、このようにして抗原の用量節約に有用である。
【０２０７】
（アジュバント投与）
１００倍抗原希釈を用いると、アジュバントの量もまた、減少した。上記ＭＦ５９エマルジョンを、抗原と、１：１体積比においてもしくは１：３比において（すなわち、３ｍｌの抗原あたり１ｍｌのエマルジョン、２ｍｌの緩衝液で総体積を維持する）または１：１０比において、混合した。上記Ａｌ−Ｔ複合体を、２ｍｇ／ｍｌ  水酸化アルミニウムと、１用量あたり５μｇ、２５μｇもしくは１００μｇのいずれかの「化合物Ｔ」を有する３種の強度において調製した。比較のために、１：１００抗原用量を、アジュバント添加しない形態において、または水酸化アルミニウム単独で試験した。Ｉｎｆａｎｒｉｘ  Ｈｅｘａの１：１００希釈物もまた、比較のために使用した。
【０２０８】
混合の後に（Ｉｎｆａｎｒｉｘ  Ｈｅｘａを除いて）、容量オスモル濃度およびｐＨを測定した（および、必要であれば、調節した）。全ての６価組成物に関して、ｐＨは、６．２〜７．３の間であり、容量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）は、２７０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間であった。緩衝液コントロールは、ｐＨ７．３および２８０ｍＯｓｍ／ｋｇを有した。
【０２０９】
マウスを、先のように免疫処置した。２回の免疫処置後の総血清ＩｇＧ力価は、以下のとおりであった：
【０２１０】
【表５】
2014506916.tif 000009
【０２１１】
従って、より少量のＭＦ５９およびＡｌ−Ｔは、良好なアジュバント作用（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）をなお保持し、アジュバント添加しない６価抗原処方物によって誘導されるより高いＩｇＧ抗体力価を誘導し得る。免疫学的効力を維持しながらもアジュバントの量を減少させることによって、ワクチンの安全性プロフィールは改善され得る。このことは、小児の状況において特に重要である。
【０２１２】
本発明が、例示によって記載されてきたに過ぎず、改変が、本発明の範囲および趣旨の範囲内に維持されながらなされ得ることは、理解される。
【０２１３】
【表６Ａ】
2014506916.tif 000010
【０２１４】
注意：
（１）Ｐａ用量は、百日咳トキソイド、次に、ＦＨＡ、次に、パータクチンの量（μｇ）を示す。Ｐｅｄｉａｃｅｌ、Ｄａｐｔａｃｅｌ、およびＡｄａｃｅｌのＰａ成分もまた、線毛２型および３型を含む。
（２）Ｈｉｂ用量は、ＰＲＰ莢膜サッカリドの量（μｇ）を示す。
（３）ＩＰＶ用量は、１型、次に、２型、次に、３型の量（ＤＵ単位で測定）を示す。
（４）Ｔｒｉｔａｎｒｉｘ−ＨｅｐＢ、Ｑｕｉｎｖａｘｅｍ、ＴｒｉｐＶａｃ  ＨＢおよびＳＩＩ  Ｑ−Ｖａｃは、完全細胞百日咳抗原を含む。
【０２１５】
参考文献
【０２１６】
【表７−１】
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【０２１７】
【表７−２】
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【０２１８】
【表７−３】
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【国際調査報告】
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