(57)【要約】  Ｂ細胞仲介性自己免疫疾患の治療または防止に使用するための、細胞死受容体に対する一価結合部位およびＢ細胞上に発現される細胞表面抗原に対する少なくとも１つの結合部位を含む、活性Ｆｃ部分を欠く、二重特異性抗体形式。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己反応性Ｂ細胞障害の治療または防止に使用するための、細胞死受容体に対する一価結合部位およびＢ細胞上に発現される細胞表面抗原に対する少なくとも１つの結合部位を含む、活性Ｆｃ部分を欠く、二重特異性抗体形式。
【請求項２】
細胞死受容体が、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ受容体およびＴＮＦ受容体からなる群より選択される、好ましくはＣＤ９５である、請求項１にしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項３】
細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０からなる群より選択される、好ましくはＣＤ２０である、請求項１または２にしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項４】
ＣＤ９５に特異的に結合する一価結合部位、およびＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ４０に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位を含む、請求項１〜３のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項５】
自己反応性Ｂ細胞障害が、異常な、過剰なまたは望ましくない免疫反応によって引き起こされ、好ましくはこれが癌ではない、請求項１〜４のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項６】
自己反応性Ｂ細胞障害が、好ましくは、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、移植片対宿主病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、好ましくは再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、抗リン脂質症候群、ナルコレプシー、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫障害である、請求項１〜５のいずれかにしたがって使用するための二重特異性抗体形式。
【請求項７】
少なくとも２つの抗体ドメイン、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７または８の抗体ドメイン、および場合によってヒンジ領域を含む組換え分子である、請求項１〜６のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項８】
抗体ドメインが、ヒト起源であるか、またはヒト以外の哺乳動物起源のヒト化抗体ドメインであり、好ましくはヒト化ネズミまたはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）起源である、請求項１〜７のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項９】
相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくはＶＨおよびＶＨ／ＶＬドメイン対からなる群より選択される抗体ドメイン由来のＣＤＲ、好ましくは少なくとも１つまたは２つのＶＨドメインおよび／または少なくとも１つまたは２つのＶＨ／ＶＬドメイン対によって形成される少なくとも２つの結合部位を含む、請求項１〜８のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１０】
少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ結合部位および／またはｓｃＦｖ結合部位、ならびに場合によって、少なくとも１つのＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜９のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１１】
Ｆｃ部分を欠くか、あるいは、好ましくはＦｃ部分における１またはそれより多い突然変異によって、Ｆｃエフェクター機能を不活性化させるかまたは減少させるように操作されたＦｃ部分を含む、請求項１〜１０のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１２】
ｓｃＦｖ、１またはそれより多い抗体可変ドメインを含むＦａｂ断片の組み合わせ、Ｆ（ａｂ’）２、および好ましくはリンカーとして少なくとも１つの抗体定常ドメインを使用するその組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１３】
−第一の抗原に対する第一の結合部位を含む、Ｆａｂ断片；
−第二の抗原に対する第二の結合部位を含む、ｓｃＦｖ断片；および
−Ｆａｂ断片およびｓｃＦｖ断片がＣＨ２ドメインを通じて連結されている、ＣＨ２ドメインであって、
ａ）第一の抗原がＣＤ９５であり、そして第二の抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０より選択され、好ましくはＣＤ２０であるか；または
ｂ）第一の抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０より選択され、好ましくはＣＤ２０であり、そして第二の抗原がＣＤ９５である
前記ＣＨ２ドメイン
を含む、請求項１〜１２のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１４】
ＣＤ２０に結合する結合部位が、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含み、
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）を含むか；
または
Ｂ）機能的に活性であるその変異体であって、以下のうち少なくとも１つである
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして／または
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
請求項１〜１３のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１５】
配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、請求項１〜１４のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１６】
変異体が、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、ヒト化変異体である、請求項１５にしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１７】
ＣＤ９５に結合する結合部位が、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含み、
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）を含むか；
または
Ｂ）機能的に活性であるその変異体であって、以下のうち少なくとも１つである
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして／または
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
請求項１〜１６のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１８】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、請求項１〜１７のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項１９】
変異体が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、ヒト化変異体である、請求項１８にしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項２０】
配列番号２１の軽鎖配列および配列番号２２の重鎖配列、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、請求項１〜１９のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項２１】
変異体が、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、ヒト化変異体である、請求項２０にしたがった、二重特異性抗体形式。
【請求項２２】
ネズミ、キメラおよび／またはヒト化配列を含む、請求項１〜２１のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項２３】
Ｋｄ＜１０−８ＭでＣＤ２０に結合し、そして／またはＫｄ＜１０−８ＭでＣＤ９５に結合する、請求項１〜２２のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項２４】
自己反応性Ｂ細胞障害の他の治療との組み合わせ療法で、好ましくはサイトカイン治療、あるいは他の抗体形式または剤での治療と組み合わせて、請求項１〜２３のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項２５】
抗体形式を、治療が必要な被験体に、療法的有効量で投与する、請求項１〜２４のいずれかにしたがって使用するための、二重特異性抗体形式。
【請求項２６】
自己反応性Ｂ細胞障害の治療または防止のための方法であって、細胞死受容体に対する一価結合部位およびＢ細胞上に発現される細胞表面抗原に対する少なくとも１つの結合部位を含む、活性Ｆｃ部分を欠く、二重特異性抗体形式の療法的有効量を、治療が必要な被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２７】
自己反応性Ｂ細胞を治療するための方法であって、請求項１〜２３のいずれかに定義するような二重特異性抗体形式を含む組成物と、前記細胞を接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
細胞死受容体および前記細胞によって発現される細胞表面抗原が、二重特異性抗体形式によってターゲティングされ、それによって、前記細胞によるＩｇＧ産生が阻害される、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃ部分を持たないかまたはＦｃ部分が損なわれており、そして細胞死受容体に対する一価結合部位およびＢ細胞上に発現される細胞表面抗原に対する少なくとも１つの結合部位を有する二重特異性抗体の、Ｂ細胞依存性自己免疫疾患に関する、新規医学的使用に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９５／Ｆａｓ／Ａｐｏ−１は、ヒト細胞のアポトーシス死を誘導可能な細胞表面受容体である。この受容体の生理学的リガンド、ＣＤ９５Ｌと同様、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体は、ＣＤ９５への結合が多量体形式で、例えば五量体ＩｇＭまたは自己凝集性ＩｇＧ３として生じた場合、アポトーシスを誘導可能である。あるいは、抗ＣＤ９５抗体は、隣接する細胞上のＦｃ受容体によって、またはアゴニスト性活性を達成する二次抗体によって、架橋されてもよい。
【０００３】
多くの腫瘍細胞はＣＤ９５を発現するため、腫瘍療法のためのアゴニスト性抗ＣＤ９５抗体の使用は、プロトタイプＣＤ９５抗体の最初の性質決定後、熱心に追求されてきている。しかし、少なくとも、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体または組換えＣＤ９５Ｌを患者に適用する最も単純な型であっても、このアプローチは、多くの正常細胞タイプが機能性ＣＤ９５を発現し、そしてアゴニスト性抗体によって殺される可能性もあるため、失敗することが、まもなく明らかになった。
【０００４】
ＣＤ２０は、多くのリンパ腫および自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関与するＢ細胞マーカーである。
【０００５】
Ｂ細胞会合ＣＤ２０表面抗原に対して向けられる抗体は、正常ならびに悪性Ｂ細胞をターゲットとしうる。これらはそれぞれ、Ｂ細胞由来白血病およびリンパ腫および抗体仲介性自己免疫疾患の治療に成功裡に使用されている。リツキシマブ（商標名リツキサンおよびマブテラ）は、タンパク質ＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブはＢ細胞を破壊し、そしてしたがって、過剰な数のＢ細胞、過剰活性Ｂ細胞、または機能不全Ｂ細胞によって特徴付けられる疾患を治療するために用いられる。これには、多くのリンパ腫、白血病、移植拒絶、およびいくつかの自己免疫障害が含まれる。
【０００６】
しかし、リツキシマブはＣＤ２０陽性細胞を非特異的に殺し、そしてＭＳにおいて臨床的に有効であることが示されたが、副作用（例えば進行性多巣性白質脳症、ＰＭＬ）によって損なわれる。
【０００７】
以前、ＣＤ９５、ならびにリンパ腫細胞上の異なるターゲット抗原、例えばＣＤ２０およびＣＤ４０に対する特異性を持つ二重特異性Ｆ（ａｂ’）２断片（ｂｓ−Ｆ（ａｂ’）２）が、ＣＤ９５およびそれぞれのターゲット抗原に対して陽性である細胞のアポトーシスを誘導することが示された。ＣＤ９５を発現するが、ターゲット抗原を発現しないリンパ腫細胞は、殺されなかった（Ｊｕｎｇら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，  １８４６−１８４８（２００１））。
【０００８】
Ｈｅｒｒｍａｎｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８  （４）：  １２２１−７（２００８））は、腫瘍細胞における選択的ＣＤ９５仲介性アポトーシスに対する抗体形式およびターゲット抗原の性質の影響を評価した。
【０００９】
ＵＳ２００３／０２３２０４９Ａ１は、細胞表面受容体を選択的に刺激するための多重特異性試薬を記載する。細胞表面受容体、例えば細胞死受容体、例えばＣＤ９５に対する第一の結合部位、および同じ細胞のターゲット抗原、例えばＣＤ２０またはＣＤ４０に対する第二の結合部位を持つ、抗原結合性抗体断片からなる二重特異性抗体は、癌細胞を殺すと記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ２００３／０２３２０４９Ａ１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｕｎｇら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，  １８４６−１８４８（２００１））
【非特許文献２】Ｈｅｒｒｍａｎｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８  （４）：  １２２１−７（２００８））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、特に自己免疫疾患において、Ｂ細胞関連疾患または障害の選択的免疫療法を提供することである。
【００１３】
この目的は、請求するような主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明にしたがって、自己反応性Ｂ細胞障害の治療または防止に使用するための、細胞死受容体に対する一価結合部位およびＢ細胞上に発現される細胞表面抗原に対する少なくとも１つの結合部位を含む、活性Ｆｃ部分を欠く、二重特異性抗体形式を提供する。
【００１５】
具体的には、抗体形式は、図１Ａまたは図１Ｂに示すような構造を含む。
【００１６】
具体的には、細胞死受容体は、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ受容体およびＴＮＦ受容体からなる群より選択され、好ましくはＣＤ９５である。
【００１７】
具体的には、細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０からなる群より選択され、好ましくはＣＤ２０である。
【００１８】
特定の態様にしたがって、形式は、ＣＤ９５に特異的に結合する一価結合部位、およびＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ４０に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位を含む。
【００１９】
特定の側面にしたがって、自己反応性Ｂ細胞障害が、異常な、過剰なまたは望ましくない免疫反応によって引き起こされる、本発明にしたがって使用するための、二重特異性抗体形式を提供する。具体的には、治療されるべき疾患は、悪性Ｂ細胞でなく、正常で活性化されたＢ細胞によって引き起こされる。
【００２０】
本発明は、具体的には、自己反応性Ｂ細胞との闘いに、そしてそれに関連する疾患状態の治療または防止に関連する。Ｂ細胞由来白血病およびリンパ腫は、他の任意の癌同様、Ｂ細胞の特異性または反応性に関わらず、過剰なＢ細胞産生および関連疾患状態に関連する。したがって、こうした白血病、リンパ腫または癌の防止および治療は、本発明にしたがった疾患治療からは特に排除される。
【００２１】
具体的には、自己反応性Ｂ細胞障害は、好ましくは、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、移植片対宿主病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、好ましくは再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、抗リン脂質症候群、ナルコレプシー、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫障害である。
【００２２】
本発明の特定の側面にしたがって、二重特異性抗体形式は、少なくとも２つの抗体ドメイン、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７または８の抗体ドメイン、および場合によってヒンジ領域を含む組換え分子である。好ましい組換え二重特異性抗体形式を図１Ｂに示す。抗体または抗体断片は、こうした抗体ドメインおよびヒンジ領域、好ましくはモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片または他のモノクローナル抗体形式を含むかまたはこれらからなることも可能であり、天然アミノ酸配列を含むか、あるいは例えば、ターゲットへの結合の特異性、アフィニティおよび／またはアビディティを改善するため、または形式の安定性を改善するため、または組換え分子の生産性を増加させるため、アミノ酸配列、三次構造および場合によってグリコシル化の１またはそれより多い突然変異を含んでもいずれでもよい。
【００２３】
具体的には、抗体ドメインは、哺乳動物起源、例えば齧歯類、例えばネズミ起源であるか、またはヒト起源であるか、あるいは、キメラまたはヒト以外の哺乳動物起源のヒト化抗体ドメインであり、例えば、ヒト化ネズミまたはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体ドメインである。
【００２４】
二重特異性抗体形式は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくはＶＨおよびＶＨ／ＶＬドメイン対からなる群より選択される抗体ドメイン由来のＣＤＲ、好ましくは少なくとも１つまたは２つのＶＨドメインおよび／または少なくとも１つまたは２つのＶＨ／ＶＬドメイン対によって形成される少なくとも２つの結合部位を含む。具体的には、二重特異性抗体形式は、Ｊｕｎｇら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２４３１，  １９９１に記載されるような、異なる特異性を持つ２つのＦａｂ断片の化学的ハイブリダイゼーションによって得られる。二重特異性抗体形式はまた、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術によって、または組換え抗体技術によっても得られうる。
【００２５】
具体的には、形式は、少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ結合部位および／またはｓｃＦｖ結合部位、ならびに場合によって、抗体定常ドメインの少なくとも１つ、具体的にはＣＨ１、ＣＬ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含む。
【００２６】
好ましい態様にしたがって、形式は、少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ抗体ドメイン対および少なくとも１つのｓｃＦｖ結合部位を含み、場合によって、好ましくは、特異的結合部位を取り込む可変ドメイン間のリンカーとして用いられる、具体的にはＣＨ２、ＣＨ１およびＣＬドメインを含む、任意の定常ドメインを伴う。
【００２７】
別の好ましい態様にしたがって、形式は、少なくとも２つの単一ＶＨ抗体ドメイン、好ましくは単一ＶＨＨドメインを含む。
【００２８】
具体的には、形式は、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）断片と１またはそれより多い抗体可変ドメインの組み合わせ、Ｆ（ａｂ’）２、および好ましくはリンカーとして少なくとも１つの抗体定常ドメインを使用するその組み合わせからなる群より選択される。
【００２９】
特定の態様にしたがって、形式は、
ａ）ＶＬ／ＶＨドメイン対およびＣＬ／ＣＨ１ドメイン対からなるＦａｂ断片であって、第一の結合部位を含む、前記Ｆａｂ断片；
ｂ）互いに連結されたＶＨ／ＶＬドメインからなるｓｃＦｖ；および
ｃ）ａ）のＦａｂ断片をｂ）のｓｃＦｖのＶＨドメインに連結するＣＨ２ドメイン
を含むかまたはこれらからなる構築物である。
【００３０】
さらなる特定の態様にしたがって：
−第一の抗原に対する第一の結合部位を含む、Ｆａｂ断片；
−第二の抗原に対する第二の結合部位を含む、ｓｃＦｖ断片；および
−Ｆａｂ断片およびｓｃＦｖ断片がＣＨ２ドメインを通じて連結されている、ＣＨ２ドメインであって、
ａ）第一の抗原がＣＤ９５であり、そして第二の抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０より選択され、好ましくはＣＤ２０であるか；または
ｂ）第一の抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０より選択され、好ましくはＣＤ２０であり、そして第二の抗原がＣＤ９５である
前記ＣＨ２ドメイン
を含むかまたはこれらからなる、本発明にしたがって使用するための、二重特異性抗体形式を提供する。
【００３１】
具体的には、ＣＤ２０に結合する結合部位は、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含み、
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）を含むか；
または
Ｂ）機能的に活性であるその変異体であって、以下のうち少なくとも１つである
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして／または
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明は、具体的には、上記の配列Ａ  ｉ）〜ｖｉ）由来のＣＤ２０結合部位、例えば軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または重鎖可変領域のＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列を含む任意の抗体形式の使用を意図し、これには、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の組み合わせ、あるいはＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の組み合わせのいずれかを含む単一可変ドメイン、あるいはこうした単一可変ドメインの対、例えばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＨ／ＶＬドメイン対を含む、構築物が含まれる。
【００３３】
特定の態様は、ＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む、抗体形式を指す。
【００３４】
さらに特定の態様は、ＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む、抗体形式を指す。
【００３５】
特定の態様は、Ａ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）の配列のＣＤＲ２、およびＡ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＡ  ｉｖ）またはＢ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）またはＢ  ｖ）のＣＤＲ５配列およびＡ  ｖｉ）またはＢ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域の使用を指し、ここで、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の少なくとも１つは、Ｂの機能的に活性である変異体を含む。
【００３６】
さらに特定の態様は、Ａ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）の配列のＣＤＲ５、およびＡ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域、ならびにＡ  ｉ）またはＢ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）またはＢ  ｉｉ）のＣＤＲ２配列およびＡ  ｉｉｉ）またはＢ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の使用を指し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、Ｂの機能的に活性である変異体を含む。
【００３７】
Ｂの変異体は、場合によって、列挙するような特異的ＣＤＲ配列を含み、これは、例えばアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または化学的誘導体化による、１、２または３の点突然変異を含有する。
【００３８】
ＣＤ２０結合因子の変異体は、ＣＤ２０、特にヒトＣＤ２０に、特に高アフィニティで、例えばＫｄ＜１０−８Ｍで、結合する場合、機能的に活性である変異体と見なされる。
【００３９】
さらに機能的に活性である変異体は、実施例に記載するような試験において決定されるような、活性化Ｂ細胞をターゲットとする機能的活性、例えばアポトーシス活性を有する。
【００４０】
特定の態様にしたがって、抗体形式は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む。
【００４１】
具体的には、変異体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、ヒト化変異体である。
【００４２】
具体的には、ＣＤ９５に結合する結合部位は、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含み、
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）を含むか；
または
Ｂ）機能的に活性であるその変異体であって、以下のうち少なくとも１つである
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして／または
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４３】
本発明は、具体的には、上記の配列Ａ  ｉ）〜ｖｉ）由来のＣＤ９５結合部位、例えば軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／または重鎖可変領域のＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列を含む任意の抗体形式の使用を意図し、これには、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の組み合わせ、あるいはＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の組み合わせのいずれかを含む単一可変ドメイン、あるいはこうした単一可変ドメインの対、例えばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＨ／ＶＬドメイン対を含む、構築物が含まれる。
【００４４】
特定の態様は、ＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む、抗体形式を指す。
【００４５】
さらに特定の態様は、ＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む、抗体形式を指す。
【００４６】
特定の態様は、Ａ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）の配列のＣＤＲ２、およびＡ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＡ  ｉｖ）またはＢ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）またはＢ  ｖ）のＣＤＲ５配列およびＡ  ｖｉ）またはＢ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域の使用を指し、ここで、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の少なくとも１つは、Ｂの機能的に活性である変異体を含む。
【００４７】
さらに特定の態様は、Ａ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）の配列のＣＤＲ５、およびＡ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域、ならびにＡ  ｉ）またはＢ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）またはＢ  ｉｉ）のＣＤＲ２配列およびＡ  ｉｉｉ）またはＢ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の使用を指し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、Ｂの機能的に活性である変異体を含む。
【００４８】
Ｂの変異体は、場合によって、列挙するような特異的ＣＤＲ配列を含み、これは、例えばアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または化学的誘導体化による、１、２または３の点突然変異を含有する。
【００４９】
ＣＤ９５結合因子の変異体は、ＣＤ９５、特にヒトＣＤ９５に、特に高アフィニティで、例えばＫｄ＜１０−８Ｍで、結合する場合、機能的に活性である変異体と見なされる。
【００５０】
さらに機能的に活性である変異体は、実施例に記載するような試験において決定されるような、活性化Ｂ細胞をターゲットとする機能的活性、例えばアポトーシス活性を有する。
【００５１】
特定の態様にしたがって、抗体形式は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む。
【００５２】
具体的には、変異体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、ヒト化変異体である。
【００５３】
特定の態様にしたがって、抗体形式は配列番号２１の軽鎖配列および配列番号２２の重鎖配列、または機能的に活性であるその変異体を含むかまたはこれらからなる。
【００５４】
具体的には、変異体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、あるいは機能的に活性であるその変異体を含む、ヒト化変異体である。
【００５５】
本発明にしたがった二重特異性抗体形式は、具体的には、ネズミ、キメラ、ヒト化および／またはヒト配列を含む。
【００５６】
好ましくは、二重特異性抗体形式は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０より選択される抗原、好ましくはＣＤ２０に、Ｋｄ＜１０−８Ｍで結合し、そして／またはＫｄ＜１０−８ＭでＣＤ９５に結合する。
【００５７】
例示的な構築物は、図１Ｂに模式的に記載するＣＤ２０ＸＣＤ９５特異性を持つ組換え二重特異性Ｆａｂ−一本鎖（ｂｓＦａｂＸｓｃ）である。これはＮＡ−Ｃ２０と称される。
【００５８】
具体的には、形式は、Ｆｃ部分を欠くか、あるいは、好ましくはＦｃ部分における１またはそれより多い突然変異によって、Ｆｃエフェクター機能を不活性化させるかまたは減少させるように操作されたＦｃ部分を含む。Ｆｃエフェクター機能を減少させるための例示的な突然変異は、抗体Ｆｃ断片のＦｃガンマ受容体結合領域中に、好ましくはＮ末端ＣＨ２領域中にある。分子操作および／または化学的操作による突然変異が実行可能である。好ましい突然変異は、アミノ酸配列中の点突然変異、例えば挿入および／または欠失および／または置換である。さらに好ましい突然変異は、アミノ酸の化学的誘導体化による。
【００５９】
Ｆｃエフェクター機能の不活性化または減少は、抗体形式のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を決定するのに適したアッセイによって決定可能である。結果を、対応する野生型分子の活性に比較する。
【００６０】
具体的には、形式は、ＩｇＧクラスの抗体、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブクラスのいずれか、特にヒトＩｇＧ抗体由来の配列を含むものに由来することも可能である。
【００６１】
具体的には、形式は、ヒトＩｇＧ抗体由来であってもよい。
【００６２】
特定の態様にしたがって、自己反応性Ｂ細胞障害の他の治療との組み合わせ療法で、好ましくはサイトカイン治療、例えばインターフェロン、特にインターフェロン−ベータとの組み合わせで、あるいは他の抗体形式または剤との治療で、本発明にしたがって使用するために、二重特異性抗体形式を提供する。
【００６３】
具体的には、本発明にしたがって使用するための二重特異性抗体形式を、治療の必要がある被験体に、好ましくは非経口使用のための配合物、例えば静脈内または皮下配合物中で、特に抗体形式および場合によって薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む薬学的調製物中で、療法的有効量で、提供する。
【００６４】
特定の側面にしたがって、本発明は、自己反応性Ｂ細胞障害の治療または防止のための方法であって、細胞死受容体に対する一価結合部位およびＢ細胞上に発現される細胞表面抗原に対する少なくとも１つの結合部位を含む、活性Ｆｃ部分を欠く、二重特異性抗体形式の療法的有効量を、治療が必要な被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００６５】
具体的には、自己反応性Ｂ細胞障害の治療または防止のためのこうした方法は、本明細書に記載するような、医学的使用に関連する態様によって特徴付けられる。
【００６６】
本発明の別の側面にしたがって、自己反応性Ｂ細胞を治療するための方法であって、本発明の二重特異性抗体形式を含む組成物と、前記細胞を接触させる工程を含む、前記方法を提供する。こうした治療法はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであることも可能である。
【００６７】
具体的には、細胞死受容体および前記細胞によって発現される細胞表面抗原が、二重特異性抗体形式によってターゲティングされ、それによって、前記細胞によるＩｇＧ産生が阻害され、そして場合によって、前記細胞のアポトーシスが達成される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】２つの例示的な抗体形式の模式的説明：ＣＤ２０およびＣＤ９５の両方を発現している正常、活性化または悪性Ｂ細胞の表面上の細胞死受容体ＣＤ９５の選択的刺激のための二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体の２つの異なる形式。  図１Ａ：化学的にハイブリダイズした二重特異性（Ｆａｂ’）２断片（本明細書において、ｂｓＦａｂ２とも称される）。二重特異性Ｆａｂ２断片を、Ｊｕｎｇら  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１：２４３１，  １９９１に記載されるように調製した。化学的ハイブリダイゼーションに用いた親抗体は、Ｂ細胞由来悪性リンパ腫の治療のために認可された抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）、および培養ハイブリドーマ細胞の上清から精製された抗ＣＤ９５抗体Ａｐｏ−１であった。あるいは、Ａｐｏ−１抗体を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１より、精製型（ＢＭＳ１５１）で購入してもよい。  図１Ｂ：組換え二重特異性Ｆａｂ−一本鎖（本明細書において、ｂｓＦａｂＸｓｃまたはＮＡ−Ｃ２０と称される）。ＮＡ−Ｃ２０は、リンカーとして単量体ＣＨ２ドメインを用いて、ｓｃＦｖに連結されているＦａｂを含有する。  この抗体形式の配列を、ＣＤ２０（２Ｈ７、ネズミおよびヒト化）およびＣＤ９５抗体（ネズミおよびヒト化）のものを含めて、図９Ｅに提供する。標準的技術を用いて、抗体をコードする遺伝子構築物をＳｐ２／０細胞に安定的にトランスフェクションした。ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ・フライブルグから購入したカッパ選択を伴うアフィニティクロマトグラフィを用いて、トランスフェクション細胞の上清からタンパク質を精製した。
【図２】１μｇ／ｍＬ  ＰＷＭで活性化されたヒトＢ細胞上のＣＤ９５の発現。  密度勾配遠心分離によって単離された、正常で健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・タウフキルヘン）と６日間インキュベーションし、そして洗浄した。示す時点で、細胞を培養フラスコから取り除き、そしてフローサイトメトリーによって分析した。この目的のため、細胞を、パシフィックブルーにカップリングしたＣＤ１９抗体またはアイソタイプ対照抗体、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）にカップリングしたＣＤ９５抗体、および生存細胞を明らかに同定するための７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色した。生存ＣＤ１９陽性細胞をゲート処理し、そして分析した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１から抗体を購入した。アイソタイプ対照で明るいプロファイルを得て、ＣＤ９５抗体で暗いプロファイルを得た。  結論：ＣＤ９５は、休止Ｂ細胞上で検出不能であるが、その発現は、ＰＷＭ刺激の１日後に生じ、第３日で最大に到達し、そして第６日に細胞を洗浄しても、第１０日まで高いままである。
【図３】ＰＷＭ活性化Ｂ細胞によるＩｇＧ産生の動力学。  正常ＰＢＭＣをＰＷＭ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。多様な時間後、培養上清のアリコットを取り除き、そしてヒトＩｇＧ含量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。ＰＷＭでのＰＢＭＣの刺激（黒塗りの円）は、ヒトＩｇＧの産生を誘導する。抗体産生は、第４日で検出可能となり、そして最長第１０日まで連続して上昇する。未刺激ＰＢＭＣの抗体産生の測定（白抜きの円）は、対照として働く。  結論：ＩｇＧ産生は、ＰＷＭ刺激５日後に検出可能となり、そして最長第１０日まで連続して上昇する。
【図４】未刺激ＰＢＭＣからのＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ４／ＣＤ８＋  Ｔ−ヘルパー／キラー細胞の枯渇  未刺激ＰＢＭＣを、示す抗体（１μｇ／ｍｌ）と４日間インキュベーションし、洗浄し、そしてパシフィックブルーにカップリングしたＣＤ１９抗体、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にカップリングしたＣＤ４抗体、ＡＰＣにカップリングしたＣＤ８抗体、および生存性色素７−ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。ＮＡ−Ｃ２０は、図１Ｂに示す組換え二重特異性抗体である。  結論：示す抗体のいずれも、未刺激ＰＢＭＣ培養において、Ｔ細胞またはＢ細胞に影響を及ぼさない。
【図５】刺激ＰＢＭＣからのＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ４／ＣＤ８＋  Ｔ−ヘルパー／キラー細胞の枯渇。  ＰＢＭＣを、ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１μｇ／ｍｌ）で６日間刺激し、洗浄し、そして示す抗体（１μｇ／ｍｌ）と４日間インキュベーションした。図４に記載するように、第１０日でフローサイトメトリーによって細胞を分析した。ＮＡ−Ｃ２０は、図１Ｂに示す、ｂｓＦａｂＸｓｃ形式の組換え二重特異性抗体である。  結論：２つの二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体は、ＰＷＭ刺激ＰＢＭＣにおいて、Ｂ細胞の枯渇を誘導する。Ｔ細胞には影響を及ぼさない。ＭｙｃＸＣＤ９５特異性を持つ、化学的にハイブリダイズした対照抗体は無効である。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体産生の抑制：  ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した血液から単離し、６ウェルプレート中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで植え付け、そしてレクチン・ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。第６日、細胞を洗浄し、そして示した抗体を添加した。第１０日、上清中のヒトＩｇＧの量をＥＬＩＳＡによって測定した。ＮＡ−Ｃ２０は図１Ｂに示すｂｓＦａｂＸｓｃ形式の組換え二重特異性抗体である。  結論：どちらの二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５も、刺激されたヒトＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を抑制する。ＭｙｃＸＣＤ９５特異性を持つ化学的にハイブリダイズした対照抗体は抑制しない。
【図７Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＷＭ誘導性ＩｇＧ合成の二重特異性抗体が仲介する抑制。３つの異なる健康なドナー（７Ａ〜７Ｃ）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した血液から単離し、６ウェルプレート中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで植え付け、そしてレクチン・ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。第６日、細胞を洗浄し、そして二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）を添加した。第１０日、上清中のヒトＩｇＧの量をＥＬＩＳＡによって測定した。試験した二重特異性抗体は、ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５（黒塗りの円）またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５（三角形）のいずれかを特異的にターゲティングした。比較のため、細胞内ｍｙｃタンパク質に特異的に向けられる非関連ターゲット特異性（ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５）を持つ二重特異性抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）（白抜きの円）を平行して試験した。  結論：  ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ二重特異性Ｆａｂ２抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生を抑制し、Ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ抗体は抑制しない。
【図７Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＷＭ誘導性ＩｇＧ合成の二重特異性抗体が仲介する抑制。３つの異なる健康なドナー（７Ａ〜７Ｃ）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した血液から単離し、６ウェルプレート中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで植え付け、そしてレクチン・ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。第６日、細胞を洗浄し、そして二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）を添加した。第１０日、上清中のヒトＩｇＧの量をＥＬＩＳＡによって測定した。試験した二重特異性抗体は、ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５（黒塗りの円）またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５（三角形）のいずれかを特異的にターゲティングした。比較のため、細胞内ｍｙｃタンパク質に特異的に向けられる非関連ターゲット特異性（ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５）を持つ二重特異性抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）（白抜きの円）を平行して試験した。  結論：  ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ二重特異性Ｆａｂ２抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生を抑制し、Ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ抗体は抑制しない。
【図７Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＷＭ誘導性ＩｇＧ合成の二重特異性抗体が仲介する抑制。３つの異なる健康なドナー（７Ａ〜７Ｃ）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した血液から単離し、６ウェルプレート中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで植え付け、そしてレクチン・ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。第６日、細胞を洗浄し、そして二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）を添加した。第１０日、上清中のヒトＩｇＧの量をＥＬＩＳＡによって測定した。試験した二重特異性抗体は、ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５（黒塗りの円）またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５（三角形）のいずれかを特異的にターゲティングした。比較のため、細胞内ｍｙｃタンパク質に特異的に向けられる非関連ターゲット特異性（ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５）を持つ二重特異性抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）（白抜きの円）を平行して試験した。  結論：  ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ二重特異性Ｆａｂ２抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生を抑制し、Ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ抗体は抑制しない。
【図８】破傷風トキソイド特異的ＩｇＧ産生の抑制  破傷風トキソイドを新鮮にワクチン接種されたドナーのＰＢＭＣを、破傷風トキソイド（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で４日間刺激し、洗浄し、そして示す抗体（１μｇ／ｍｌ）と８日間インキュベーションした。第１２日、特異的抗破傷風抗体の量をＥＬＩＳＡによって決定した。ＮＡ−Ｃ２０は、図１Ｂに示す、ｂｓＦａｂＸｓｃ形式の組換え二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体である。  結論：組換え二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体ＮＡ−Ｃ２０および単一特異性抗ＣＤ２０抗体リツキサンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的抗破傷風トキソイド抗体の産生を抑制する。ＥＧＦ受容体に対して向けられる非関連ターゲット特異性を持つ対応する抗体（エルビタックス）および黒色腫関連プロテオグリカン（ＮＡ−ＣＭｅｌ）は、それぞれ、無効である。
【図９Ａ】実施例に言及されるような例示的抗体形式の配列。ＣＤ９５に対して向けられる結合部位を持つ抗体形式のマウスＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号１および５）、ＣＤＲ配列を下線で示す（ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号２〜４；ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号６〜８）。
【図９Ｂ】実施例に言及されるような例示的抗体形式の配列。ＣＤ９５に対して向けられる結合部位を持つ抗体形式のＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号９および１０）（ヒト化）、ＣＤＲ配列を下線で示す。
【図９Ｃ】実施例に言及されるような例示的抗体形式の配列。ＣＤ２０に対して向けられる結合部位を持つ抗体形式のＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号１１および１５）（ネズミ、Ｌｉｕら  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３９，  ３５２１−３５２６（１９８７）、ＮＣＢＩ寄託番号Ｍ１７９５３およびＭ１７９５４に記載されるような抗体２Ｈ７由来）、ＣＤＲ配列を下線で示す（ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号１２〜１４；ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号１６〜１８）。
【図９Ｄ】実施例に言及されるような例示的抗体形式の配列。ＣＤ２０に対して向けられる結合部位を持つ抗体形式のＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号１９および２０）（ヒト化、抗体２Ｈ７由来）、ＣＤＲ配列を下線で示す。
【図９Ｅ−１】実施例に言及されるような例示的抗体形式の配列。例示的な二重特異性抗体形式ＣＤ９５ｘＣＤ２０、キメラおよびヒト化型：配列番号２１：キメラ型、軽鎖；配列番号２２：キメラ型重鎖；配列番号２３：リンカー配列；配列番号２４：ヒト化型軽鎖；配列番号２５：ヒト化型重鎖。
【図９Ｅ−２】実施例に言及されるような例示的抗体形式の配列。例示的な二重特異性抗体形式ＣＤ９５ｘＣＤ２０、キメラおよびヒト化型：配列番号２１：キメラ型、軽鎖；配列番号２２：キメラ型重鎖；配列番号２３：リンカー配列；配列番号２４：ヒト化型軽鎖；配列番号２５：ヒト化型重鎖。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
用語「抗体形式」は、本明細書において、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインと理解される抗体ドメインからなるかまたはこれらを含むポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。この定義は、具体的には、可変領域の重鎖および軽鎖のドメイン（例えばｄＡｂ、Ｆｄ、ＶＬ、Ｖｋ、ＶＨ、ＶＨＨ）および損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体の定常領域または個々のドメイン、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、ＣｌおよびＣｋを指す。ＶｋまたはＶｌは、ＶＬ、軽鎖の可変ドメイン、カッパまたはラムダと理解され；同様に、ＣｌまたはＣｋは、ＣＬドメインカッパまたはラムダと理解される。本明細書において、抗体ドメインへの言及は、こうした抗体ドメインの任意のタイプまたは変異体を指すよう理解されることが明らかに理解される。したがって、本明細書において、ＶＨドメインへのいかなる言及も、ＶＨＨを含む、ＶＨドメインのいかなるタイプも含むよう理解される。
【００７０】
抗体ドメインは、天然構造であってもよいし、あるいは例えば抗原結合特性または任意の他の特性、例えば安定性または機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合を修飾するため、突然変異誘発または誘導体化によって修飾されてもよい。ポリペプチド配列は、ループ配列によって連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインであると見なされる。
【００７１】
用語「抗体形式」は、特に、例えば抗原、エフェクター分子、あるいは病原体起源またはヒト構造のいずれかの構造、細胞会合タンパク質または血清タンパク質を含む同様の自己抗原のエピトープに対して、単一または二重または多重特異性、あるいは一価、二価または多価結合特性、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも３の特異的結合部位を示しうる、ポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。用語、抗体形式には、本明細書において、全長抗体または抗体の機能的断片、例えばＦａｂ（本明細書において、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）を含むと理解される）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖまたは他の一本鎖二量体、例えばＣＨ１／ＣＬ（カッパまたはラムダ）ドメイン、Ｆｖ、ＶＨ／ＶＬ、ＣＨ１／ＣＬ、ＣＨ２／ＣＨ２、ＣＨ３／ＣＨ３のような二量体、あるいは他の誘導体またはその組み合わせ、例えば抗体ドメイン対の一本鎖またはリンカーもしくはヒンジ領域によって互いに連結された抗体ドメインの鎖、特に、図１Ａまたは１Ｂに示すような抗体形式が含まれる。
【００７２】
パパインによって消化された抗体は、３つの断片：２つのＦａｂ断片および１つのＦｃ断片を生じる。用語「Ｆａｂ」は、本明細書において、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）を含むよう理解され、これはヒンジ領域を含んでもまたは含まなくてもよい。ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）断片は、なお抗原に結合するが、Ｆｃ部分を持たず一価である、抗体構造である。本発明の好ましい態様の１つは、ＶＨ／ＶＬドメイン対およびさらに２つの抗体定常ドメイン、例えばＣＬおよびＣＨ１を含む、Ｆａｂ断片を含む抗体形式に向けられる。
【００７３】
Ｆ（ａｂ’）２断片抗体は、全ＩｇＧ抗体のペプシン消化によって、ヒンジ領域のある程度を損なわれないまま残しつつ、Ｆｃ領域の大部分を取り除いて生成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ともに連結された２つの抗原結合Ｆ（ａｂ’）部分を有し、そしてしたがって二価である。
【００７４】
本発明の抗体形式が、少なくとも２つの特異的結合部位（単数または複数）を提供する、少なくとも可変ドメイン；および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、または少なくとも３つの定常ドメインを含むことが好ましい。
【００７５】
用語「抗体形式」には、具体的には、単離抗体形式が含まれるものとし、本明細書において、異なるターゲット抗原に対して向けられる他の抗体形式を実質的に含まず、または抗体ドメインの異なる構造配置を含むと理解される。なお、本発明にしたがって用いられるような単離抗体形式は、組み合わせ調製物中に含まれてもよく、単離抗体形式と、例えば少なくとも１つの他の抗体形式、例えば異なる特異性を持つモノクローナル抗体または単離抗体形式の組み合わせを含有してもよい。
【００７６】
抗体形式は、本明細書において、組換え二重特異性抗体形式であってもよく、この用語には、組換え手段によって調製され、発現され、生成されまたは単離された、すべての抗体形式が含まれ、例えば異なる起源由来の遺伝子または配列を含む、動物、例えばヒトを含む哺乳動物から生じる抗体、例えばヒト化抗体、あるいはハイブリドーマ由来抗体が含まれる。さらなる例は、抗体形式を発現するように形質転換させた宿主細胞から単離される抗体形式、あるいは抗体または抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体形式、あるいは抗体遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングする工程を伴う任意の他の手段によって調製され、発現され、生成されまたは単離される抗体形式を指す。
【００７７】
用語「抗体形式」にはその誘導体が含まれることが理解される。誘導体は、本発明の１またはそれより多い抗体ドメインまたは抗体形式の任意の組み合わせであり、そしてまたは本発明の抗体形式の任意のドメインが、１またはそれより多い他のタンパク質、例えば他の抗体または抗体形式、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドの任意の部分であるが、またリガンド、骨格タンパク質、酵素、毒素等に融合していてもよい融合タンパク質である。本発明のモジュラー抗体の誘導体はまた、共有カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等の多様な化学的技術による、他の物質への会合または結合によっても得られうる。免疫グロブリンに結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはその任意の組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグまたは薬剤）であってもよい。用語、誘導体にはまた、機能性であり、そして機能的同等物として働くことも可能であり、例えば特異的ターゲットに結合し、そして機能特性、例えばＩｇＧ阻害活性またはアポトーシス活性を持つ、抗体形式の断片、変異体、類似体または相同体も含まれる。好ましい誘導体は、なお、抗原結合、アポトーシス活性および／または自己反応性Ｂ細胞によるＩｇＧ産生を阻害する活性に関して機能性である。
【００７８】
用語「活性Ｆｃ部分」は、本明細書において、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの定常抗体ドメイン、例えばＣＨ２およびＣＨ３抗体ドメイン、あるいは、Ｆｃエフェクター機能によってなお機能性である、定常抗体ドメインの修飾、誘導体、組み合わせまたは一部を指すものとする。Ｆｃエフェクター機能は、以下の方式で理解される。活性Ｆｃ部分を含む抗体は、典型的には細胞傷害活性を与える。抗原に結合した際、Ｆｃ部分は、細胞傷害性Ｔ細胞あるいはＡＤＣＣまたはＣＤＣを仲介する細胞の活性化を生じる、エフェクター細胞に対する活性によって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を仲介する。したがって、機能的に活性であるＦｃ部分は、Ｆｃガンマ受容体（ＦＣＧＲ）結合部位を通じて、エフェクター細胞に結合する。
【００７９】
本発明記載の抗体形式は、活性Ｆｃ部分を欠き、したがって、ＦＣＧＲ結合部位を持たず、特にＣＨ２およびＣＨ３ドメインの鎖を欠く任意の抗体形式を含む抗体ドメインで構成されるか、または例えば特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を抑制するかまたは減少させる修飾によって、Ｆｃエフェクター機能を欠くＦｃ部分を含むかいずれかである。こうした修飾は、突然変異誘発、例えばＦＣＧＲ結合部位における突然変異によって、あるいは抗体形式のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性に干渉し、したがってＦｃエフェクター機能の減少またはＦｃエフェクター機能の欠如を達成する、誘導体または剤によって、達成可能であり、これは典型的にはＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって測定した際、非修飾（野生型）形式の１０％未満、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を指すよう理解される。特定の例は、例えばＦｃエフェクター機能を仲介する原因となるＦｃ領域中に位置するアミノ酸残基の１またはそれより多くの置換、例えばＣＨ２ドメインのＮ末端領域における突然変異によって、抗体の機能的特性または薬物動態学的特性を変化させるために、１またはそれより多い改変が行われているＦｃ領域を含む、抗体形式を指す。
【００８０】
用語「自己反応性Ｂ細胞」および「自己反応性Ｂ細胞障害」は、本明細書において、以下の方式で理解される。自己反応性Ｂ細胞は、未刺激（ｎａｉｖｅ）Ｂ細胞レパートリーの一部であり、そして自己抗体を産生することによるだけでなく、サイトカインを分泌することによって、そして自己抗原を提示することによってもまた、自己免疫疾患の病因の中枢となる。自己反応性Ｂ細胞障害は、本発明の抗体形式を含む薬学的組成物の投与によって寛解可能な疾患条件を指すよう意味される。Ｂ細胞仲介性自己免疫疾患のような、自己反応性Ｂ細胞障害と関連する疾患において、典型的には、異常な負の選択および自己反応性Ｂ細胞の活性化がある。
【００８１】
自己免疫疾患は、具体的には、被験体の自己の組織または臓器に対して向けられる反応、典型的には自己抗原との抗体反応から生じる障害と理解される。自己免疫疾患を示す多様な臨床的および実験室マーカーの中で、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原−抗体複合体デポジット、コルチコステロイドまたは免疫抑制治療からの臨床的利点、および罹患組織におけるリンパ球凝集がある。
【００８２】
本発明記載の抗体形式は、Ｂ細胞レパートリーを調節して、Ｂ細胞の自己反応性を減少させることを可能にする。調節は、単一特異性抗体によって達成されるよりも、より特異的であり、これは、活性化されたＢ細胞のみがＣＤ９５を発現し、そしてＣＤ９５を欠く休止Ｂ細胞は影響を受けないためである。本発明にしたがった抗体形式は活性化Ｂ細胞のアポトーシスを誘導し、そしてさらに活性化誘導性ＩｇＧ産生を抑制し、そして活性化Ｂ細胞のＩｇＧ合成を阻害することを示すことも可能であった。したがって、自己免疫ターゲット、例えば自己抗原に対して向けられるＩｇＧ抗体を産生する自己反応性Ｂ細胞を、有効に減少させることも可能である。
【００８３】
本発明の二重特異性抗体形式、具体的にはＣＤ２０  ｘ  ＣＤ９５二重特異性抗体形式によって、悪性Ｂ細胞だけでなく、ＣＤ９５細胞死受容体を発現する活性化正常（良性）Ｂ細胞をターゲティングし、そして枯渇させることも可能である。対照的に、休止Ｂ細胞は、ターゲティングされず、こうした正常Ｂ細胞にはいかなる影響も見られなかった。これは、活性化Ｂ細胞が、ＣＤ９５感受性であり、記載する種類の二重特異性ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５抗体とインキュベーションした後、アポトーシス性細胞死を経ることを示す。
【００８４】
活性化Ｂ細胞の枯渇は、抗体産生を抑制する。これは、最終的に分化した抗体産生細胞、すなわち形質細胞がＣＤ２０を発現しないため、驚くべきことであった。活性化前駆体Ｂ細胞の抑制は、明らかに、抗体産生を抑制するのに十分である。
【００８５】
本発明の二重特異性抗体形式による抗体産生の抑制は、正常または休止Ｂ細胞から自己反応性または活性化Ｂ細胞を区別することなく、すべてのＣＤ２０発現Ｂ細胞を枯渇させる、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））のような、確立された単一特異性ＣＤ２０抗体の使用より好ましい。
【００８６】
用語「結合部位」は、本明細書において、本発明記載の抗体または抗体形式に関して、抗原との結合性相互作用が可能な分子構造を指す。典型的には、結合部位は、本明細書において、「ＣＤＲ結合部位」とも称される、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置し、これは多様な抗原に対する結合機能を与える多様な構造を持つ、特異的領域である。多様な構造は、抗体の天然レパートリー、例えばネズミまたはヒトレパートリーから得られてもよいし、あるいは例えば突然変異誘発によって、そして特にランダム化技術によって、組換え的または合成的に産生されてもよい。これらには、突然変異誘発ＣＤＲ領域、可変抗体ドメインのループ領域、特に抗体のＣＤＲループ、例えば任意のＶＬおよび／またはＶＨ抗体ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループが含まれる。本発明にしたがって用いられる抗体形式は、典型的には、各々、抗原に特異的な、１またはそれより多いＣＤＲ結合部位を含む。
【００８７】
用語「特異的」または「二重特異性」は、本明細書において、分子の異種集団において、関心対象の同族リガンドの決定要因である、結合反応を指すものとする。したがって、指定した条件下で、例えばイムノアッセイ条件下で、特定のターゲットに特異的に結合する抗体形式は、試料中に存在する他の分子には、有意な量では結合しない。
【００８８】
特異的結合部位は、典型的には、他のターゲットと交差反応性ではない。なお、特異的結合部位は、ターゲットの１またはそれより多いエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合することも可能であるし、あるいは他の関連ターゲット抗原、例えば相同体または類似体に対して交差反応性であってもよい。
【００８９】
特異的結合は、結合が、選択に応じて、ターゲット同一性、高い、中程度のまたは低い結合アフィニティまたはアビディティに関して選択性であることを意味する。選択的結合は、通常、結合定数または結合動力学が、少なくとも１０倍異なる場合に達成され、好ましくは相違は少なくとも１００倍、そしてより好ましくは少なくとも１０００倍である。
【００９０】
本発明の二重特異性抗体形式は、具体的には、２またはそれより多い結合部位、おそらく特定の結合特性を持つ３または４の結合部位を含み、ここで少なくとも２つの異なるターゲット抗原が、抗体形式によって認識される。したがって、例示的な二重特異性抗体形式は、２つの結合部位を含むことも可能であり、ここで、結合部位の各々は、異なる抗原、例えば細胞死受容体およびＢ細胞の細胞表面抗原に特異的に結合することが可能である。二重特異性抗体形式が、２より多い結合部位を含む場合、２より多い異なるターゲット抗原に対して向けられることも可能であり、そして／またはターゲット抗原の単一または同じタイプに特異的に結合する１より多い結合価を含む。
【００９１】
用語「一価」は、本明細書において、抗体または抗体形式の結合部位に関して、ターゲット抗原に対して向けられる１つの結合部位のみを含む分子を指すものとする。用語「結合価」は、したがって、抗原の同じかまたは異なるかいずれかであるエピトープに特異的に結合する、同じターゲット抗原に対して向けられる結合部位の数と理解される。本発明にしたがって用いられるような抗体または抗体形式は、同じターゲット抗原に対する２またはそれより多い結合部位、例えば、２、３または４つの結合部位を含み、特に、抗原の同じまたは異なるエピトープに対して向けられている場合、これは二価性または多価性と呼ばれる。
【００９２】
本発明にしたがって用いられるような抗体形式は、細胞死受容体ターゲットに特異的に結合する一価結合部位、およびＢ細胞、特に自己反応性Ｂ細胞上に発現される細胞表面抗原に特異的に結合する、少なくとも１つのさらなる結合部位を含むと理解される。したがって、細胞死受容体結合に関しては一価であり、そして細胞表面抗原結合に関しては、一価、二価または多価であると理解される。
【００９３】
用語「抗原」は、本明細書において、用語「ターゲット」または「ターゲット抗原」と交換可能に用いられ、抗体結合部位によって認識される全ターゲット分子またはこうした分子の断片を指すものとする。具体的には、抗原の下位構造、例えばポリペプチドまたは炭水化物構造は、一般的に、「エピトープ」、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと称され、これは免疫学的に適切であり、こうした結合部位によって認識されうる。用語「エピトープ」は、本明細書において、特に、本発明の抗体形式の結合部位に対して、特異的結合パートナーを完全に構成可能であるかまたは特異的結合パートナーの一部でありうる、分子構造を指す。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物質、生化学物質または無機物質またはその誘導体および任意のその組み合わせのいずれかで構成されてもよい。エピトープがペプチド構造、例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合、通常、少なくとも３アミノ酸、好ましくは５〜４０アミノ酸、そしてより好ましくは約１０〜２０アミノ酸が含まれる。エピトープは、直鎖またはコンホメーションエピトープであってもいずれでもよい。直鎖エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一のセグメントで構成される。直鎖エピトープは連続性または重複性であってもよい。コンホメーションエピトープはポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによって、一緒にされたアミノ酸または炭水化物で構成され、そしてアミノ酸は、直鎖配列においては、互いに必ずしも隣接しない。
【００９４】
用語「細胞表面抗原」は、Ｂ細胞に関して本明細書で用いられる際、Ｂ細胞、好ましくは成熟、活性化または自己反応性Ｂ細胞表面上に発現される抗原を指すものとし、これは該分子に結合するアンタゴニストを用いてターゲティング可能である。例示的なＢ細胞表面マーカーには、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０が含まれる。
【００９５】
特定の関心対象のＢ細胞表面抗原は、自己反応性Ｂ細胞表面上に、優先的に高発現され、優先的には、細胞あたり１０，０００分子を超えて発現される。
【００９６】
ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４０より選択される抗原に特異的に結合する結合部位は、抗原に対して向けられる商業的に入手可能なモノクローナル抗体、例えばＣＤ２０に対して向けられるリツキシマブまたはオクレリズマブに由来することも可能である。具体的には、図９に例示するような抗ＣＤ２０抗体形式のいずれかに由来する結合部位を用いてもよい。
【００９７】
用語「ＣＤ１９」には、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ１９遺伝子でトランスフェクションされた細胞上に発現される、ヒトＣＤ１９の任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。
【００９８】
用語「ＣＤ２０」には、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ２０遺伝子でトランスフェクションされた細胞上に発現される、ヒトＣＤ２０の任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。
【００９９】
用語「ＣＤ４０」には、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ４０遺伝子でトランスフェクションされた細胞上に発現される、ヒトＣＤ４０の任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。
【０１００】
用語「細胞死受容体」は、本明細書で用いられるＢ細胞に関して、１またはそれより多いアポトーシス経路によるプログラム細胞死を導く、細胞表面上の受容体に由来する抗原を指すものとする。例示的な細胞死受容体は、活性化Ｂ細胞上に発現され、そしてこれには、例えば、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ受容体、例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ１またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２、およびＴＮＦ受容体が含まれる。活性化Ｂ細胞とは対照的に、ＣＤ９５は、正常休止Ｂ細胞上では発現されない。
【０１０１】
ＣＤ９５はまた、ＦａｓまたはＡｐｏ−１としても知られ、そして腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーである。ＣＤ９５に特異的に結合する結合部位は、ＣＤ９５に対して向けられる抗体、例えば、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ドイツ・ヘルフォルトが流通させているクローンＡＰＯ−１またはＬＴ９５およびＤＸ２に由来してもよい。具体的には、図９に例示されるような任意の抗ＣＤ９５抗体形式由来の結合部位を用いてもよい。
【０１０２】
用語「ＣＤ９５」には、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ９５遺伝子でトランスフェクションされた細胞上に発現される、ヒトＣＤ９５の任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。
【０１０３】
用語「変異体」は、例えば部位特異的突然変異誘発法によって得られ、特に、アミノ酸配列を欠失させ、交換し、特異的抗体領域内に挿入物を導入するか、または化学的に誘導体化して、定常ドメインにおいて抗体エフェクター機能または半減期を操作するか、あるいは可変ドメインにおいて、例えばアフィニティ成熟技術によって抗原結合特性を改善する。望ましい位での点突然変異を含む、任意の既知の突然変異誘発法を使用してもよく、例えばランダム化技術によって得られるものであってもよい。いくつかの場合、例えば抗体配列をランダム化するための任意のありうるアミノ酸または好ましいアミノ酸の選択肢のいずれかを用いて、位をランダムに選択する。用語「変異体」は、具体的には、機能的に活性である変異体を含むものとする。
【０１０４】
用語、分子、例えば抗体の「機能的に活性である変異体」は、本明細書において、この配列（親配列）の、１またはそれより多いアミノ酸の挿入、欠失または置換、あるいは１またはそれより多いアミノ酸残基、または配列内もしくは配列の遠位端のいずれかもしくは両方でのヌクレオチドの化学的誘導体化により、そしてこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に損なわない）、修飾から生じる配列を指す。選択したターゲット抗原に対する特異性を有する結合部位の場合、分子の機能的に活性である変異体は、なお、あらかじめ決定された結合特異性を有するであろうが、これは変化してもよく、例えば特定のエピトープに対する細かい特異性、アフィニティ、アビディティ、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度等が変化してもよい。
【０１０５】
機能的に活性である変異体は、親抗体形式の配列、例えば図９の任意の配列、例えば図９Ｅ  ｉ）またはｉｉ）のＮＡ−Ｃ２０配列を変化させることによって得られてもよく、そしてＣＤ２０および／またはＣＤ９５に結合する能力あるいは活性化されたＢ細胞または自己反応性Ｂ細胞をターゲティングする能力を含めて、それぞれの配列によって示されるものと類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられる。
【０１０６】
抗体形式の機能的に活性である変異体は、好ましくは、活性化されたＢ細胞または自己反応性Ｂ細胞をターゲティングする特異的結合アッセイまたは機能性試験によって決定した際、実質的に同じ生物学的活性を有する。用語「実質的に同じ生物学的活性」は、本明細書において、親抗体形式、例えば図９Ｂの組換え二重特異性抗体形式ＮＡ−Ｃ２０に関して決定されるような活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、例えば最大２００％である、実質的に同じ活性によって示されるような活性を指す。
【０１０７】
好ましい態様において、機能的に活性である変異体は
ａ）分子の生物学的に活性である断片であって、分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含む、前記断片であり；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって分子から得られ、ここで、機能的活性変異体は、少なくとも５０％配列同一性で、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％同一性の抗体など、分子または分子の一部に配列同一性を有し；そして／または
ｃ）分子または機能的に活性であるその変異体、およびさらにポリペプチドまたはヌクレオチド配列に異種性である少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドからなり、好ましくは、ここで、機能的に活性である変異体は、天然存在または組換え抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０および／または抗ＣＤ９５抗体のいずれかに由来する。
【０１０８】
本発明の１つの好ましい態様において、本発明記載の抗体の機能的に活性である変異体は、上記の変異体に本質的に同一であるが、異なる種の相同配列に由来する点で、それぞれそのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とは異なる。これらは、天然存在変異体と称される。
【０１０９】
本発明は、具体的には、キメラ、ヒト化またはヒト配列、およびこうしたキメラ、ヒト化またはヒト配列を含む親抗体形式の機能的に活性である変異体を提供する。
【０１１０】
用語「キメラ」は、本発明の抗体形式に関して用いた際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列各々の１つの部分が、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体において、対応する配列に相同である一方、鎖の残りのセグメントが、別の種またはクラスにおける対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方、定常部分は、別の種由来の抗体の配列に相同である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物から得られる定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いて、現在知られる供給源に由来してもよい。
【０１１１】
用語「ヒト化」は、本発明の抗体形式に関して用いられた際、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全可変ドメイン、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型であっても、あるいは例えば、１またはそれより多いアミノ酸置換によって修飾されてもよく、好ましくはより緊密にヒト免疫グロブリンに似るように修飾されてもよい。ヒト化抗体のいくつかの型は、すべてのＣＤＲ配列を保持する（例えばマウス抗体由来の６つのＣＤＲすべてを含有するヒト化マウス抗体）。他の型は、元来の抗体に関して改変されている１またはそれより多いＣＤＲを有する。
【０１１２】
用語「ヒト」は、本発明の抗体形式に関して用いられる際、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むよう理解される。本発明のヒト抗体形式には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えばランダムまたは部位特異的突然変異誘発によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは体細胞突然変異によってｉｎ  ｖｉｖｏで、導入される突然変異）によってコードされないアミノ酸残基が、例えばＣＤＲ中に含まれてもよい。本発明のヒト抗体形式には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１またはそれより多いヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から、単離された抗体が含まれる。
【０１１３】
用語「機能的に活性である変異体」にはまた、天然存在アレル変異体、ならびに突然変異体または任意の他の非天然存在変異体も含まれる。当該技術分野に知られるように、アレル変異体は、本質的にポリペプチドの生物学的機能を改変しない、１またはそれより多いアミノ酸の置換、欠失、または付加を有すると特徴付けられる、（ポリ）ペプチドの代替型である。
【０１１４】
機能的に活性である変異体は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列中の配列改変によって、例えば１またはそれより多い点突然変異によって得られることも可能であり、ここで、配列改変は、本発明と組み合わせて用いた際、非改変ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持する。こうした配列改変には、限定されるわけではないが、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入が含まれることも可能である。
【０１１５】
ＣＤＲ変異体には、少なくとも１つのアミノ酸によって修飾されたアミノ酸配列が含まれ、ここで前記修飾は、アミノ酸配列の化学的または部分的改変であってもよく、修飾は、変異体が、非修飾配列の生物学的特性を保持することを可能にする。例えば、変異体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０またはＣＤ９５に結合する機能的変異体である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的改変は、１〜数アミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の欠失または置換によって、あるいは１〜数アミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の付加または挿入によって、あるいは１〜数アミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の化学的誘導体化によってもよく、あるいはその組み合わせであってもよい。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、例えば１つの疎水性アミノ酸に関する別の疎水性アミノ酸の置換であってもよい。
【０１１６】
保存的置換は、側鎖および化学的特性に関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖を持つアミノ酸、酸性側鎖を持つアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を持つアミノ酸、非極性芳香族側鎖を持つアミノ酸、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸、小分子側鎖を持つアミノ酸、大分子側鎖を持つアミノ酸等である。
【０１１７】
点突然変異は、異なるアミノ酸に関する、アミノ酸の１またはそれより多い単一（非保存的）または２つ組の置換または交換、欠失または挿入における、非操作アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現を生じるポリヌクレオチドの操作と理解される。
【０１１８】
好ましい点突然変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関連して、アミノ酸は、６４の３つ組コドンによってコードされる、２０の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０のアミノ酸は、中性電荷、陽性電荷、および陰性電荷を有するものに分けられうる：
「中性」アミノ酸を、それぞれの３文字および１文字コードおよび極性とともに、以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、陽性（１０％）中性（９０％）。
【０１１９】
「陽性」荷電アミノ酸は：
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）極性、陽性；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、陽性
である。
【０１２０】
「陰性」荷電アミノ酸は：
アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）極性、陰性；および
グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、陰性
である。
【０１２１】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、本明細書に同定するポリペプチド配列に関して、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。当業者は、比較される配列の全長に渡って、最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列を測定するための適切なパラメータを決定可能である。
【０１２２】
用語「被験体」は、本明細書において、温血哺乳動物、特にヒトを指すものとする。特に自己反応性Ｂ細胞障害の予防または治療の必要がある被験体は、初期または後期疾患を患う患者、あるいは例えば遺伝的素因によってこうした疾患の素因がある被験体であってもよい。
【０１２３】
したがって、本発明の主題は、例示的な二重特異性抗体構築物、特に活性化Ｂ細胞の表面上のＣＤ９５およびＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ４０への結合が、具体的にＩｇＧ産生を抑制し、そしてＩｇＧ合成を阻害し、それによって、被験体におけるＩｇＧレベル生成を減少させ、そして被験体における自己免疫反応を減少させるという驚くべき知見に基づく。本発明に記載し、そして図１Ｂに示す組換え二重特異性抗体ＮＡ−Ｃ２０に関しては、該分子が、ポリクローナル的に活性化されたＢ細胞による抗体産生だけでなく、破傷風トキソイドに対する特異的抗体を産生する、より特異的に活性化されたＢ細胞による抗体産生も抑制することが立証されている。
【０１２４】
先に、ＣＤ２０および細胞死受容体ＣＤ９５に対する特異性を持つ二重特異性抗体は、ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞において、ＣＤ９５仲介性アポトーシスを誘導することが可能であると記載された。驚くべきことに、本発明のＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５ハイブリッド抗体は、ＣＤ９５を発現しているヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ）活性化Ｂ細胞においてアポトーシスを誘導するが、該分子を欠く休止細胞においては誘導しないことがわかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＷＭによって誘導される抗体産生は、顕著に阻害される。これらの結果は、本発明の二重特異性ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５抗体が抗体仲介性自己免疫疾患の治療に使用可能であることを示す。単一特異性ＣＤ２０抗体と比較して、これらの試薬は、新規エフェクター原理を提供し、そして休止Ｂ細胞よりも活性化細胞に関する特異性を提供する。
【０１２５】
さらに、本発明の二重特異性ＣＤ２０  ｘ  ＣＤ９５抗体および特定の抗体形式が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化ヒトＢ細胞を殺す能力を決定し、そして抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと比較した。
【０１２６】
本発明記載の例示的な二重特異性抗体形式は、ＣＤ２０およびＣＤ９５を所持する細胞をターゲティングし、ＣＤ９５細胞死受容体を誘発することが可能であった。ＣＤ２０／ＣＤ９５陽性活性化Ｂ細胞の存在の増加は、通常、ループスおよび関節リウマチにおける発赤と関連づけられる。多発性硬化症（ＭＳ）における活性化Ｂ細胞の関与はまた、これらが、例えばＴ細胞補充および活性化、サイトカイン放出および抗体産生に関与するため、次第に認められてきている。
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、本発明の例示的二重特異性抗体形式が、活性化ヒトＢ細胞による免疫グロブリンの産生を下方制御可能であることが示されてきている。これは、非常に選択的であり、それによって、非特異的反応を減少させることにより、副作用が回避されることが見出された。
【０１２８】
本発明記載の抗体形式による、活性化Ｂ細胞によるＩｇＧ産生の抑制およびＩｇＧ合成の阻害は、「ＩｇＧ阻害活性」と理解される。こうしたＩｇＧ阻害活性は、活性化Ｂ細胞に、特に自己反応性Ｂ細胞に向けられ、そして本発明の抗体形式と接触していない、同じ細胞のＩｇＧ産生に比較した際のＩｇＧレベルにおけるいかなる測定可能な減少も、特に自己免疫抗体産生の減少も、例えば活性化Ｂ細胞を使用した試験系における、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％のＩｇＧ減少も含むよう意図される。
【０１２９】
特定の態様にしたがって、本発明の抗体形式は、アポトーシス活性、すなわち免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞と独立にターゲットＢ細胞に対する直接細胞傷害活性を有する。具体的には、本発明の抗体形式は、標準的アポトーシスアッセイにおいて測定した際、例えば標準的ＤＮＡ断片化アッセイにおいて測定した際、アポトーシス活性を有する。
【０１３０】
アポトーシス活性は、好ましくは、細胞の死亡および／または死細胞を決定する標準法を用いて測定される。アポトーシスを測定するため、細胞傷害性アッセイを使用してもよい。これらのアッセイは、死につつある細胞は漏出性であるため、形質膜浸透性の増加を測定する放射性および非放射性アッセイであってもよく、またはミトコンドリアの代謝活性の減少を測定する比色分析アッセイであってもよい。死細胞中のミトコンドリアは、色素を代謝することができず、一方、生存細胞中のミトコンドリアは代謝可能である。
【０１３１】
細胞表面の外側のホスファチジルセリンの存在を生じる膜非対称性の改変などのアポトーシスの初期指標もまた測定してもよい（アネキシンＶに基づくアッセイ）。あるいは、アポトーシスのより後期の段階、例えばカスパーゼの活性化を細胞集団において、または個々の細胞において、測定してもよい。さらに、ミトコンドリアによるチトクロムＣおよびＡＩＦの細胞質への放出の測定、あるいは染色体ＤＮＡの断片化を決定してもよい。
【０１３２】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）は、アポトーシス性シグナル伝達カスケードから生じるＤＮＡ断片化を検出するための一般的方法である。該アッセイは、ＤＮＡにおけるニックの存在に頼り、これは、特異的標識抗体で二次的に検出される、ブロモール化（ｂｒｏｍｏｌａｔｅｄ）ｄＵＴＰの付加を触媒するであろう酵素である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって同定可能である。
【０１３３】
本発明記載の抗体形式の好ましいアポトーシス活性は、それぞれのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞殺傷アッセイにおいて測定するように；例えばフローサイトメトリーによる二重特異性抗体とのインキュベーション後のＢ細胞の生存を測定して、細胞溶解の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％に達する。
【０１３４】
Ｆｃエフェクター機能を欠くため、本発明の抗体形式は、具体的には、例えば細胞表面上の受容体ターゲットを発現している細胞を使用する、標準的ＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイにおいて測定した際、免疫エフェクター細胞の存在において、有意な細胞傷害活性を持たないであろう。
【０１３５】
対照に比較した際、細胞溶解の割合の有意な増加がない場合、ＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイのいずれかによって決定されるような低い細胞傷害活性が、本発明の任意の抗体形式に関して示されうる。ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の絶対パーセント増加によって測定されるような細胞傷害活性が、好ましくは１０％より低く、好ましくは５％より低く、より好ましくは３％より低い場合、典型的には、Ｆｃエフェクター機能の欠如が決定される。
【０１３６】
好ましくは、高アフィニティで、特に高いオンおよび／または低いオフ速度で、あるいは高い結合アビディティで、ターゲット抗原の一方または両方に結合する抗体形式を用いる。抗体の結合アフィニティは、通常、抗原結合部位の半分が占有される抗体の濃度に関して性質決定され、これは解離定数（Ｋｄ、またはＫＤ）として知られる。通常、結合因子は、Ｋｄ＜１０−８Ｍで、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍで、さらにより好ましくは、Ｋｄ＜１０−１０Ｍで、高アフィニティ結合因子と見なされる。
【０１３７】
それにもかかわらず、別の好ましい態様において、個々の抗原結合アフィニティは、中程度のアフィニティであり、例えば少なくとも２つの抗原に結合した際、例えば１０−６Ｍ未満および最大１０−８ＭのＫｄである。
【０１３８】
本発明の二重特異性モノクローナル抗体形式は、多様な技術によって産生可能であり、これには、二重特異性Ｆａｂ２断片（（Ｆａｂ’）２、ｂｓＦａｂ２）を生じる２つのＦａｂ断片の化学的ハイブリダイゼーションおよび組換え抗体技術が含まれ、場合によって、ハイブリドーマまたはヒト抗体配列のライブラリーを使用する。実施例に提供するデータは、図１Ｂに示されるｂｓＦａｂ２断片（（Ｆａｂ’）２）または組換えｂｓＦａｂＸｓｃ形式で得られた。組換え抗体技術は、トランスフェクション細胞による再現可能な産生および単純化された精製を可能にするため、好ましい。
【０１３９】
本発明の抗体形式は、好ましくは、薬学的組成物中で用いられる。本発明の抗体形式および１またはそれより多い療法的活性剤が配合された薬学的組成物が意図される。所望の度合いの純度を有する抗体形式を、場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤または安定化剤と、凍結乾燥配合物、水溶液または水中油エマルジョンの形で混合することによって、貯蔵のため、本発明の抗体形式の安定配合物を調製する。
【０１４０】
典型的には、こうした組成物は、許容されうる薬学的実施によって知られ、そして要求されるような、薬学的に許容されうるキャリアーを含み、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版（１９８０）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．を参照されたい。こうしたキャリアーの例には、無菌キャリアー、例えば場合によって適切な緩衝剤で、５〜８の範囲内のｐＨに緩衝された、生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される配合物は、無菌でなければならないであろう。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって、または他の適切な方法によって、容易に達成される。
【０１４２】
本発明の抗体形式を含む薬学的組成物の投与は、全身または非経口投与を含む多様な方式で、好ましくは無菌水溶液の形で、例えば静脈内、筋内または皮下経路によって、しかしまた、経口、鼻内、皮質内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）、経皮、粘膜、局所（例えばジェル、軟膏、ローション、クリーム等）、腹腔内、筋内、肺内、膣、非経口、直腸または眼内によって、行われてもよい。したがって、本発明は、こうした使用に適したそれぞれの配合物で、抗体形式を提供する。
【０１４３】
本発明には、療法的有効量の本発明の抗体形式を活性物質として含有する薬学的調製物での治療が含まれる。特に、抗体形式の薬学的に許容されうる配合物は、治療の必要がある被験体の治療と適合する。
【０１４４】
用語「療法的有効量」は、本明細書において、用語、本発明の抗体形式の「有効量」または「十分な量」のいずれとも交換可能に用いられ、被験体に投与された際に、臨床的結果を含む、有益なまたは望ましい結果を達成するのに十分な量または活性であり、そしてこうしたものとして、有効量またはその同義語は、適用される背景に依存する。例えば、ＩｇＧ産生または合成阻害の背景において、化合物の投与を伴わずに得られる反応と比較して、それぞれのＩｇＧレベルによって決定されるような自己抗体の増加の阻害を達成するのに十分な化合物の量である。疾患の背景において、療法的に有効な量の抗体形式は、自己免疫反応、例えば自己反応性Ｂ細胞障害と関連する急性または慢性炎症性疾患の阻害から利益を得る疾患または状態を治療し、調節し、減弱させ、逆転させ、または影響を及ぼすのに用いられる。有効量は、こうした疾患または障害を治療するか、防止するかまたは阻害するのに十分な化合物の量を意味するよう意図される。こうした量に対応するであろう抗体形式の量は、多様な要因、例えば所定の薬剤または化合物、薬学的配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、治療される被験体または宿主の同一性等に応じて多様であろうが、にもかかわらず、当業者によってルーチンに決定可能である。
【０１４５】
治療の必要があるヒト患者に提供されるような療法的有効量は、具体的には、０．５〜５００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇ、さらにより好ましくは最大３００ｍｇ、最大２００ｍｇ、最大１００ｍｇまたは最大１０ｍｇであってもよいが、より高い用量が、例えば急性疾患状態を治療するために示される可能性もある。
【０１４６】
さらに、療法的有効量の本発明の抗体形式での被験体の治療または防止計画は、単一投与からなることも可能であるし、または一連の適用を含むことも可能である。例えば、抗体形式を少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回または少なくとも１ヶ月に１回、投与してもよい。しかし、別の態様において、抗体形式を、所定の治療のために週あたり約１回からほぼ毎日投与で、被験体に投与してもよい。治療期間の長さは、多様な要因、例えば疾患の重症度、急性または慢性疾患いずれか、患者の年齢、抗体形式の濃度および活性に応じる。治療または予防のために用いられる有効投薬量は、特定の治療または予防計画の経過に渡って、増加または減少する可能性もあることもまた認識されるであろう。投薬量の変化が生じ、そしてこれは当該技術分野に知られる標準的診断アッセイによって明らかになりうる。いくつかの例において、長期投与が必要である可能性もある。
【０１４７】
非経口投与に用いられるような例示的な配合物には、皮下、筋内または静脈内注射に、例えば無菌溶液または懸濁物として適切なものが含まれる。
【０１４８】
本発明の抗体形式は、典型的には、自己免疫反応の症状を減少させる、例えば再発寛解ＭＳ（ＲＲＭＳ）における年間再発率を、例えば５０％未満、好ましくは４０％未満または３０％未満に減少させるために用いられる。他の例は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の症例における２倍よりも大きい血小板数の上昇、または自己免疫溶血性貧血の症例における２ｍｇ／ｄｌより多いヘモグロビン濃度の上昇である。
【０１４９】
１つの態様において、本発明記載の抗体形式は、疾患修飾単一療法として、患者に投与される唯一の療法的活性剤である。
【０１５０】
あるいは、本発明記載の抗体形式を、限定されるわけではないが、標準的治療、例えばＭＳの場合、インターフェロン−ベータまたはステロイド、あるいはＩＴＰの場合、高用量免疫グロブリンを含む、１またはそれより多い他の療法剤と組み合わせて投与する。
【０１５１】
組み合わせ療法は、特に、例えばＲＲＭＳを治療するために用いられるような、標準的治療計画を使用する。これには、インターフェロン−ベータまたはステロイドが含まれてもよい。
【０１５２】
組み合わせ療法において、抗体形式を混合物として、あるいは１またはそれより多い他の療法計画に付随して、例えば付随療法の前に、同時にまたはその後に、投与してもよい。
【０１５３】
本発明記載の抗体形式の生物学的特性は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞、組織、および全生物実験において、特徴付けられることも可能である。当該技術分野に知られるように、疾患または疾患モデルに対する治療に関する薬剤有効性を測定するため、または薬剤の薬物動態学、薬力学、毒性、および他の特性を測定するため、薬剤の有効性を測定するため、薬剤は、しばしば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含む動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。動物は、疾患モデルと称されてもよい。療法剤は、しばしば、限定されるわけではないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むマウスにおいて試験される。こうした実験は、適切な半減期、エフェクター機能、アポトーシス活性およびＩｇＧ阻害活性を持つ療法剤として用いられる抗体形式の潜在能力の決定のために、意味があるデータを提供しうる。任意の生物、好ましくは哺乳動物を試験に用いてもよい。例えば、ヒトに遺伝的に類似であることから、霊長類、サルは適切な療法的モデルである可能性もあり、そしてしたがって、これらを用いて、本発明記載の抗体形式の有効性、毒性、薬物動態学、薬力学、半減期、または他の特性を試験することも可能である。ヒトにおける物質の試験は、薬剤としての認可に最終的に必要であり、そしてこれらの実験が本明細書に意図される。したがって、本発明の抗体形式を、動物モデルまたはヒトにおいて試験して、その療法的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態学、および／または他の臨床特性を決定することも可能である。
【０１５４】
前述の説明は、以下の実施例を参照するとより完全に理解されるであろう。こうした実施例は、しかし、本発明の１またはそれより多い態様を実施する方法の代表にすぎず、そして本発明の範囲を限定すると読み取ってはならない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１Ａ：
Ｆａｂ断片の化学的ハイブリダイゼーションによる例示的抗体形式の産生：
図１Ａに上述するような二重特異性（Ｆａｂ’）２抗体を調製し、これはＪｕｎｇら  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１：２４３１，  １９９１に記載されるとおりであった。簡潔には、ＣＤ２０抗体リツキシマブをＲｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ（ドイツ）より購入し、ＣＤ９５抗体（Ａｐｏ−１抗体）をハイブリドーマ培養上清から精製した。Ａｐｏ−１抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１より精製型（ＢＭＳ１５１）で購入してもよい。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを用いて抗体を精製し、そしてハイブリドーマクローン、クローン９Ｅ１０（ＣＲＬ−１７２９、ＡＴＣＣ  米国バージニア州マナサス）の上清から、ｍｙｃ抗体を得た。両方の抗体をペプシンによって消化し、修飾し、そしてハイブリダイズさせて、上に言及する論文に記載されるような二重特異性Ｆａｂ２断片（ｂｓＦａｂ２）を得た。その結果、ＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５特異性およびｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ二重特異性抗体を産生した。ＣＤ４０およびｍｙｃタンパク質に対して向けられる親抗体を、ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス）の培養上清から精製した。
【０１５６】
一般的な方式で、一価Ｆ（ａｂ’）断片を酸化して、（Ｆａｂ’）２断片を得ることによって、二重特異性（Ｆａｂ’）２抗体を調製した。
【０１５７】
あるいは、２つのハイブリドーマ細胞株を融合させて、クアドローマ細胞を生じることによって、または組換え抗体技術によって、二重特異性（Ｆａｂ’）２抗体を産生してもよい。
【０１５８】
実施例１Ｂ：  組換え操作による例示的な抗体形式の産生、組換え二重特異性Ｆａｂ−一本鎖（本明細書において、またｂｓＦａｂＸｓｃまたはＮＡ−Ｃ２０とも称される）：
図１Ｂにおいて上述するような二重特異性ＮＡ−Ｃ２０抗体を調製し、そして該抗体は図９に記載するような配列を使用した。標準的技術を用いて、抗体をコードする遺伝子構築物をＳｐ２／０細胞に安定トランスフェクションした。ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ・フライブルグから購入した、カッパ選択のアフィニティクロマトグラフィを用いて、トランスフェクションした細胞の上清からタンパク質を精製した。
【０１５９】
実施例２：  １μｇ／ｍＬ  ＰＷＭで活性化されたヒトＢ細胞上のＣＤ９５の発現：
密度勾配遠心分離によって単離された、正常な健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・タウフキルヘン）と６日間インキュベーションし、そして洗浄した。示す時点で、培養フラスコから細胞を取り除き、そしてフローサイトメトリーによって分析した。この目的に向けて、細胞を、パシフィックブルーにカップリングしたＣＤ１９抗体またはアイソタイプ対照抗体、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）にカップリングしたＣＤ９５抗体、および生存細胞を明らかに同定するための７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色した。生存ＣＤ１９陽性細胞をゲート処理し、そして分析した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１から抗体を購入した。アイソタイプ対照で明るいプロファイルを得て、ＣＤ９５抗体で暗いプロファイルを得た。
【０１６０】
結論：ＣＤ９５は、休止Ｂ細胞上で検出不能であるが、その発現は、ＰＷＭ刺激の１日後に生じ、第３日で最大に到達し、そして第６日に細胞を洗浄しても、第１０日まで高いままである。
【０１６１】
実施例３：  ＰＷＭ活性化Ｂ細胞によるＩｇＧ産生の動力学：
正常ＰＢＭＣをＰＷＭ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。多様な時間後、培養上清のアリコットを取り除き、そしてヒトＩｇＧ含量に関してＥＬＩＳＡによって分析した。結果を図３に提供する。ＰＷＭでのＰＢＭＣの刺激（黒塗りの円）は、ヒトＩｇＧの産生を誘導する。抗体産生は、第４日で検出可能となり、そして最長第１０日まで連続して上昇する。未刺激ＰＢＭＣの抗体産生の測定（白抜きの円）は、対照として働く。
【０１６２】
結論：ＩｇＧ産生は、ＰＷＭ刺激５日後に検出可能となり、そして最長第１０日まで連続して上昇する。
【０１６３】
実施例４：  未刺激ＰＢＭＣからのＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ４／ＣＤ８＋  Ｔヘルパー／キラー細胞の枯渇：
未刺激ＰＢＭＣを、示す抗体（１μｇ／ｍｌ）と４日間インキュベーションし、洗浄し、そしてパシフィックブルーにカップリングしたＣＤ１９抗体、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にカップリングしたＣＤ４抗体、ＡＰＣにカップリングしたＣＤ８抗体、および生存性色素７−ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。ＮＡ−Ｃ２０は、図１Ｂに示す組換え二重特異性抗体である。結果を図４に提供する。
【０１６４】
結論：示す抗体のいずれも、未刺激ＰＢＭＣ培養において、Ｔ細胞またはＢ細胞に影響を及ぼさない。
【０１６５】
実施例５：  刺激ＰＢＭＣからのＣＤ１９＋  Ｂ細胞およびＣＤ４／ＣＤ８＋  Ｔ−ヘルパー／キラー細胞の枯渇：
ＰＢＭＣを、ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１μｇ／ｍｌ）で６日間刺激し、洗浄し、そして示す抗体（１μｇ／ｍｌ）と４日間インキュベーションした。図４に記載するように、第１０日でフローサイトメトリーによって細胞を分析した。結果を図５に示す。ＮＡ−Ｃ２０は、図１Ｂに示す、ｂｓＦａｂＸｓｃ形式の組換え二重特異性抗体である。
【０１６６】
結論：２つの二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体は、ＰＷＭ刺激ＰＢＭＣにおいて、Ｂ細胞の枯渇を誘導する。Ｔ細胞には影響を及ぼさない。ＭｙｃＸＣＤ９５特異性を持つ、化学的にハイブリダイズした対照抗体は無効である。
【０１６７】
実施例６：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体産生の抑制：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した血液から単離し、６ウェルプレート中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで植え付け、そしてレクチン・ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。第６日、細胞を洗浄し、そして示した抗体を添加した。第１０日、上清中のヒトＩｇＧの量をＥＬＩＳＡによって測定した。ＮＡ−Ｃ２０は図１Ｂに示すｂｓＦａｂＸｓｃ形式における組換え二重特異性抗体である。結果を図６に提供する。
【０１６８】
結論：どちらの二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体も、刺激されたヒトＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を抑制する。ＭｙｃＸＣＤ９５特異性を持つ化学的にハイブリダイズした対照抗体は抑制しない。
【０１６９】
実施例７：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＷＭ誘導性ＩｇＧ合成の二重特異性抗体が仲介する抑制：
３つの異なる健康なドナー（図７Ａ〜７Ｃ）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって、ヘパリン処理した血液から単離し、６ウェルプレート中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで植え付け、そしてレクチン・ヨウシュヤマゴボウ・マイトジェン（ＰＷＭ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。第６日、細胞を洗浄し、そして二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）を添加した。第１０日、上清中のヒトＩｇＧの量をＥＬＩＳＡによって測定した。試験した二重特異性抗体は、ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５（黒塗りの円）またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５（三角形）のいずれかを特異的にターゲティングした。比較のため、細胞内ｍｙｃタンパク質に特異的に向けられる非関連ターゲット特異性（ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５）を持つ二重特異性抗体（すなわちＦ（ａｂ’）２抗体形式）（白抜きの円）を平行して試験した。
【０１７０】
結論：
ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５またはＣＤ４０  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ二重特異性Ｆａｂ２抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生を抑制し、Ｍｙｃ  Ｘ  ＣＤ９５特異性を持つ抗体は抑制しない。
【０１７１】
実施例８：  破傷風トキソイド特異的ＩｇＧ産生の抑制：
破傷風トキソイドを新鮮にワクチン接種されたドナーのＰＢＭＣを、破傷風トキソイド（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）で４日間刺激し、洗浄し、そして示す抗体（１μｇ／ｍｌ）と８日間インキュベーションした。第１２日、特異的抗破傷風抗体をＥＬＩＳＡによって決定した。ＮＡ−Ｃ２０は、図１Ｂに示す、ｂｓＦａｂＸｓｃ形式の組換え二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体である。結果を図８に提供する。
【０１７２】
結論：組換え二重特異性ＣＤ２０ＸＣＤ９５抗体ＮＡ−Ｃ２０および単一特異性抗ＣＤ２０抗体リツキサンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的抗破傷風トキソイド抗体の産生を抑制する。ＥＧＦ受容体に対して向けられる（エルビタックス）かまたはＣＤ９５および黒色腫関連プロテオグリカン（ＮＡ−ＣＭｅｌ）に対して向けられるかいずれかの非関連ターゲット特異性を持つ、対応する単一および二重特異性抗体は、それぞれ、無効である。ＮＡ−ＣＭｅｌはＮＡ−Ｃ２０と同じ形式の組換え二重特異性抗体である。
【図２】
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【図３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ−１】
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【図９Ｅ−２】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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