(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の新規のパンＣＤＫ阻害剤での乳房腫瘍の処置における、階層化マーカーとしてのＣＣＮＥ２の使用に関する。2014524250.tif 000028
2014524250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2014524250.tif 000027
［式中、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ１はメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基を表し、
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して水素、メチル基またはエチル基を表し、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６−アルキル基またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキル環を表す。］
化合物またはその生理学的に許容される塩、ジアステレオマーまたはエナンチオマーの１つでの乳房腫瘍の処置における、階層化マーカーとしてのＣＣＮＥ２の使用。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、
Ｘが−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ１がメチル基を表し、
Ｒ２がメチル基を表し、
Ｒ３が水素またはメチル基を表し、
Ｒ４がメチル基もしくはエチル基を表すか、またはシクロプロピル環を表す、
化合物またはその生理学的に許容される塩、ジアステレオマーまたはエナンチオマーの１つでの処置における、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
(２Ｒ，３Ｒ)−３−{[２−{[４−(Ｒ−シクロプロピルスルホンイミドイル)フェニル]アミノ}−５−(トリフルオロメチル)ピリミジン−４−イル]オキシ}ブタン−２−オールでの処置における、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
単一治療または組合せ治療における乳房腫瘍の処置における、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
式（Ｉ）の化合物での処置に応答しうる乳房腫瘍患者を選別する方法であって、ＣＣＮＥ２の発現の程度を測定することを特徴とする方法。
【請求項６】
ＣＣＮＥ２の発現の程度を核酸レベルで測定することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＣＮＥ２の発現の程度を蛋白質レベルで測定することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＣＣＮＥ２の発現の程度を、細胞培養由来の試料について測定することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＣＣＮＥ２の発現の程度を、哺乳類生物体由来の試料について測定することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＣＮＥ２の発現の程度を、ヒト患者由来の試料について測定することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＣＮＥ２の発現の程度を、細胞培養由来または実験動物由来の試料について測定することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のパンＣＤＫ阻害剤での乳房腫瘍の処置における、階層化マーカーとしてのＣＣＮＥ２の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の細胞分裂周期では、協調し、調節された一連のイベントを通過することによって、ゲノムが確実に複製され、娘細胞に分配される。細胞周期は、連続的な４つの時期に分けられる: Ｇ１期は、ＤＮＡ複製よりも前の、細胞が増殖している時期を表す。Ｓ期では細胞はＤＮＡを複製し、Ｇ２期では細胞は有糸分裂に入る準備をする。有糸分裂（Ｍ期）の間に、複製したＤＮＡは分離され、細胞分裂が起こる。サイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)は、メンバーがその活性化のための調節サブユニットとしてサイクリン（Ｃｙｃ）の結合を必要とするセリン／スレオニンキナーゼのファミリーであり、細胞周期を通じて細胞を操縦している。細胞周期の異なる期によって、活性であるＣＤＫ／Ｃｙｃの組合せは様々である。例えば、細胞周期の基本的な機能に重要なＣＤＫ／Ｃｙｃの組合せは、ＣＤＫ４（６）／ＣｙｃＤ、ＣＤＫ２／ＣｙｃＥ、ＣＤＫ２／ＣｙｃＡ、ＣＤＫ１／ＣｙｃＡおよびＣＤＫ１／ＣｙｃＢである。したがって、例えば、ＣＤＫ４（６）／ＣｙｃＤおよびＣＤＫ２／ＣｙｃＥ複合体の活性は、細胞が細胞周期に入ることおよび、開始した細胞分裂が終わるまで細胞がさらなる増殖シグナルに依存しないことを示す「Ｒ点 (restriction point)」の通過を促進する。
【０００３】
多数の調節機構により、細胞周期の時期が規則正しく進行し、複製した遺伝物質が正しく娘細胞に分けられることが確実になっている。ＣＤＫは特に阻害蛋白質、例えばｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の影響を受け、サイクリンの発現および分解が調節される。細胞分裂周期の分裂期の間、紡錘体形成チェックポイントの蛋白質により、確実に紡錘体は複製されたクロモソームに正しく接着し、該クロモソームが娘細胞に正しく分配される。紡錘体形成チェックポイントの必須の蛋白質は、ＭＡＤ１、ＭＡＤ２、ＢＵＢ１、ＢＵＢＲ１、ＴＴＫ (Ｍｐｓ−１) およびｃｄｃ２０である。ヒト細胞では、ＭＡＤ２蛋白質には、２つのアイソフォームであるＭＡＤ２Ｌ１およびＭＡＤ２Ｌ２（ＭＡＤ２Ｂ）がある。
【０００４】
サイクリンＥの発現の調節解除およびサイクリンＥのフラグメントが現れることにより、ＣＤＫ２／ＣｙｃＥ複合体が過剰に活性化して細胞分裂周期を刺激することから、腫瘍性のサイクリンＥの過剰発現を示す患者は、ＣＤＫ２を標的とする治療から益をえる可能性が高いという仮説が導きだされた(Hunt, K.K., Keyomarsi, K., Sem. Cancer Biol. 15, 319, 2005)。
【０００５】
Rimkusら(Int. J. Cancer 120, 207, 2006)は、試験したヒト大腸がん１１８試料のうち２５試料で（２１％）において、ＭＡＤ２Ｌ２の発現が少なくとも３倍上昇していることを示している。ＭＡＤ２Ｌ２の発現上昇は、患者の生存期間の低下と相関していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hunt, K.K., Keyomarsi, K., Sem. Cancer Biol. 15, 319, 2005
【非特許文献２】Rimkus et al., Int. J. Cancer 120, 207, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣＤＫ阻害剤は、１０年以上臨床開発されているが、ＣＤＫ阻害剤を用いた治療に対する患者の応答の予測を可能にするようなバイオマーカーはこれまで示されたことがない。該階層化マーカーは、ＣＤＫ阻害剤治療から高い可能性で益を得うる患者を標的化して治療することを可能にするものである。さらに、階層化マーカーは臨床試験の成功の可能性を上昇させる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＷＯ２０１０/０４６０３５は、式（Ｉ）
【化１】
2014524250.tif 000003
［式中、
Ｘは−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ１はメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基を表し、
Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して水素、メチル基またはエチル基を表し、
Ｒ４はＣ１−Ｃ６−アルキル基またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキル環を表す。］
で表される特に効果的なパンＣＤＫ阻害剤およびその塩、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを開示している。
【０００９】
本出願は以下の定義に基づく：
Ｃ１−Ｃ６−アルキル
Ｃ１−Ｃ６−アルキル基は、それぞれの場合において、直鎖または分枝鎖のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチルまたはヘキシル基をさすと理解される。
Ｃ３−Ｃ７−シクロアルキル
Ｃ３−Ｃ７−シクロアルキル環は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチル環をさすと理解される。
【００１０】
一般式（Ｉ）において、Ｘは、−Ｏ−または−ＮＨ−を表しうる。
好ましくは、Ｘは−Ｏ−を表す。
【００１１】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１はメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基を表しうる。
好ましくは、Ｒ１はメチル基を表す。
【００１２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、水素、メチル基またはエチル基を表しうる。
好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して水素またはメチル基を表す。
特に好ましくは、Ｒ２はメチル基を表し、Ｒ３は水素またはメチル基を表す。
【００１３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ４はＣ１−Ｃ６−アルキル基またはＣ３−Ｃ７−シクロアルキル環を表しうる。
好ましくは、Ｒ４はメチル基もしくはエチル基を表すか、またはシクロプロピル環を表す。
【００１４】
特に関心のある化合物の１つは、(２Ｒ，３Ｒ)−３−{[２−{[４−(Ｒ−シクロプロピルスルホンイミドイル)フェニル]アミノ}−５−(トリフルオロメチル)ピリミジン−４−イル]オキシ}ブタン−２−オール (化合物Ａ)である。
【化２】
2014524250.tif 000004
【００１５】
式Ｉのジアステレオマーを分取クロマトグラフィーにより分離した。実験の詳細は、ＷＯ２０１０/０４６０３５Ａ１に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の１つの目的は、ＷＯ２０１０/０４６０３５に記載のパンＣＤＫ阻害剤、特に (２Ｒ，３Ｒ)−３−{[２−{[４−(Ｓ−シクロプロピルスルホンイミドイル)フェニル]アミノ}−５−(トリフルオロメチル) ピリミジン−４−イル]オキシ}ブタン−２−オール (化合物Ａ)についての階層化マーカーを提供することである。
【００１７】
驚くべきことに、ＣＣＮＥ２は、ＷＯ２０１０/０４６０３５に記載の新規のパンＣＤＫ阻害剤での処置、特に化合物Ａでの処置における、ヒト乳房腫瘍細胞の階層化マーカーとして適当であり、感受性の予測を可能にするものであることが明らかになっている。
【００１８】
本発明の方法は、ＣＤＫ阻害剤での処置についての腫瘍細胞または腫瘍の感受性マーカーとしてＣＣＮＥ２の発現を測定することを含む。この目的のためには、定量を行うのが好ましく、ここで、核酸レベルまたは／および蛋白質レベルでのＣＣＮＥ２の発現の程度は腫瘍組織または腫瘍細胞において測定し、これを周囲の正常な組織における発現の程度と比較してもよい。
【００１９】
ＣＣＮＥ２の発現の程度は、標準的な方法により測定しうる。好ましい態様は、核酸レベルでの測定、例えば、転写物の量を決定することである。核酸レベルでのＣＣＮＥ２発現の定量としては例えば、標識化したＣＣＮＥ２特異的なプローブとのハイブリダイゼーション、核酸増幅反応、遺伝子チップハイブリダイゼーションおよび／または転写物配列決定が挙げられる。好ましい測定方法は、定量ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲである。蛋白質レベルでの定量としては、抗ＣＣＮＥ２抗体を用いた免疫学的検出方法、例えばウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡフォーマットでの検出が挙げられる。
【００２０】
ＣＣＮＥ２発現を測定する試料は、例えば、細胞培養または生物体、例えば哺乳類、特にヒト由来であっても、実験動物由来であってもよい。測定は、腫瘍細胞、特にヒトの腫瘍細胞の培養物、または腫瘍患者、特にヒト患者または腫瘍研究用の実験動物由来の試料について行うのが特に好ましい。試料は、腫瘍そのもの由来であっても、剥離した腫瘍細胞、例えば体液、例えば血液より採取した循環している腫瘍細胞由来であってもよい。
【００２１】
好ましい態様において、本発明の方法は、患者、特にヒト患者の処置における、治療方法の過程における治療の選択（治療決定、階層化）に適用しうる。さらに、本発明の方法は、実験動物の処理において、新規の活性化合物の特定および／または特徴付けに役立ちうる。さらに好ましい態様において、本発明の方法は細胞培養、例えばスクリーニングの過程において行いうる。
【００２２】
本発明の方法は、１つ以上の測定を含む。ＣＤＫ阻害剤の最初の投与に先立って、試験細胞培養試料または試験生物体試料におけるＣＣＮＥ２の発現を測定するのが好ましい。
【００２３】
増殖アッセイ
方法１
このアッセイは、以下の細胞株について用いた: MCF 10A、SK-BR-3、MCF7、HCT 116、HT-29、SW480、Caco-2、MIAPaCa-2、DU145、PC3、HeLa、Caki2、786-O、A-375、NCI-H460、NCI-H69、NCI-H1975、A549。
培養したヒト腫瘍細胞(元々はATCCより入手、HeLa-MaTuおよびHeLa-MaTu-ADR、元々はEpo GmbH, Berlinより入手) を、細胞株の増殖速度によって、測定点あたり１０００〜５０００個の細胞数の密度で、増殖培地(DMEM/HAMS F12、２mM Ｌ−グルタミン、１０% ウシ胎児血清) ２００μl中で９６ウェルマルチタイタ−プレートに播種した。２４時間後、１枚のプレートの細胞（ゼロ地点プレート）をクリスタルバイオレット（以下参照）で染色し、他のプレートは培地を、様々な濃度の試験物質(０μMおよび０.０１〜３０μMの範囲; 溶媒のジメチルスルホキシドの最終濃度は０.５%であった)を添加した新鮮な培養培地(２００μl)と交換した。細胞を、試験物質の存在下で４日間インキュベートした。細胞増殖をクリスタルバイオレットによる染色で測定した: １１%の濃度のグルタルアルデヒド溶液を測定点あたり２０μl添加して、室温にて１５分間細胞を固定した。固定した細胞を水で３回洗浄した後、プレートを室温で乾燥させた。０.１%濃度のクリスタルバイオレット溶液(酢酸を添加してｐＨ３に調整)を測定点あたり１００μl添加し、細胞を染色した。染色した細胞を３回水で洗浄した後、プレートを室温で乾燥させた。１０%濃度の酢酸溶液を測定点あたり１００μl添加して色素を溶解させた。吸光度を５９５nmの波長で測光的に測定した。測定値をゼロポイントプレートの吸収値（＝０％）および未処理（０μＭ）細胞の吸収値（＝１００％）に標準化して、細胞増殖の％変化を算出した。測定したデータを０%阻害 (阻害剤なしの細胞増殖) および１００%阻害 (ゼロポイントプレート)に標準化した。４−パラメーターフィットを用いて、プロプライエタリソフトウェアでＩＣ５０値を決定した。
【００２４】
方法２
このアッセイは、以下の細胞株について用いた: KPL-1、MDA-MB-453、Hs 578T、MDA-MB-231、MCF 10A、MDA-MB-468、ZR-75-1、T-47D、MDA-MB-435s、DU-4475、BT-20、BT-474、EVSA-T、BT-549、NCI-H460、NCI-H810、NCI-H441、NCI-H1838、NCI-H69、NCI-H2030、NCI-H358、NCI-H1793、NCI-H1048、SK-MES-1、NCI-H2347、NCI-H1975、A549、NCI-H23、NCI-H2170、NCI-H2228、NCI-H661、NCI-H1703、NCI-H1581、NCI-H226、NCI-H1563、NCI-H522、ChaGo-K-1、NCI-H1437。化合物Ａによる細胞増殖阻害を、InvitrogenのVybrant MTT cell proliferation assayを用いて測定した。
【００２５】
Affymetrix gene chipアッセイ
このアッセイは、用いた腫瘍細胞株における相対的なｍＲＮＡレベルを決定するのに用いた。
培養したヒト腫瘍細胞を、増殖アッセイで用いたのと同じ細胞数／cm2プレート面積で、１０cm細胞培養プレートに播種し、増殖培地中で、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、培地をとり除き、細胞をそれぞれリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）５mlで２回洗浄した。その後細胞を、１% ベータ-メルカプトエタノールを加えたRLT buffer (Qiagen) ６００μlで懸濁した。該懸濁液を、製造者の指示にしたがってQIAShredderを用いてホモジナイズした。続いて、製造者の指示にしたがってRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてＲＮＡ抽出を行った。さらに、製造者の指示にしたがってRNase-free DNase Kit (Qiagen)を用いてＤＮａｓｅ消化を行った。
【００２６】
２６０および２８０nmにおける吸光度を測定して、ＲＮＡの最終濃度を決定した。さらに、Agilent BioanalyzerでＲＮＡの品質を調べた。さらなる解析には、１.０より大きい２８Ｓ／１８Ｓ ｒＲＮＡ比を持つＲＮＡのみを用いた。
【００２７】
該ＲＮＡ試料５μgを、製造者の指示にしたがってＴ７-オリゴ(dT)24 ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの存在下でOne-Cycle cDNA synthesis kit (Affymetrix)を用いた二重鎖のｃＤＮＡの合成に用いた。合成後、該ｃＤＮＡをAffymetrix GeneChip Sample Cleanup Moduleを用いて精製した。その後、精製したｃＤＮＡを、ビオチン標識化したリボヌクレオチドの存在下でGeneChip IVT labelling kit (Affymetrix)を用いてインビトロで転写し、ビオチン標識化ｃＲＮＡを得た。その後、GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix)を用いて標識化ｃＲＮＡを精製した。２６０および２８０nmにおける吸光度を測定することによって該標識化ｃＲＮＡを定量し、Agilent Bioanalyzerで品質チェックを行った。
【００２８】
標識化したｃＲＮＡ３０μgを、GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix)の断片化緩衝液を用いて断片化した。その後、断片化したｃＲＮＡ１０μgを、human U133 Plus 2.0 type (Affymetrix)のマイクロアレイにハイブリダイズした。その後、アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン (SAPE, Molecular Probes)で標識化した。シグナルをビオチン化抗ストレプトアビジンヤギ抗体(Vector Laboratories) を用いて増幅した後、さらにSAPEで標識化した。アレイをGeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix)を用いて標識化した。その後、アレイを共焦点レーザースキャナー (GeneChip-3000 Scanner, Affymetrix) を用いて５７０nmでスキャンし、Affymetrix GeneChip softwareを用いて個々の定量的な値に変換した(各シグナルにつき１つの値、各遺伝子につき４０の個々の値) 。個々の値は、Genedata REFINER（登録商標）のAffymetrix MAS5 algorithmを行って集約し、１つの遺伝子につき１つの値を得た。
【００２９】
各細胞株について、それぞれ３回のマイクロアレイ（再現）で該手法を繰り返す。結果として得られた、全ての遺伝子についての個々の値および再現を、全ての値の平均に標準化した。続いて、各遺伝子についての値および再現を、調和平均を算出することによって集約し、遺伝子および細胞株につき１つの値を得た。この方法で算出したｍＲＮＡ発現値と増殖アッセイより得た上記ＩＣ５０値の間で、全ての細胞株についての全ての場合において遺伝子と試験物質の間のピアソン相関係数を算出した。
【００３０】
化合物Ａは、表に挙げた亜適応症(subindication)の例となっている、表１に示す細胞株において試験した。
【表１】
2014524250.tif 000005
【００３１】
表２には、相関解析に用いた、細胞分裂周期において調節機能を有する蛋白質をコードする６２遺伝子が挙げられている。
【表２−１】
2014524250.tif 000006
【表２−２】
2014524250.tif 000007
【００３２】
表３は、増殖アッセイの結果を示す。
【表３−１】
2014524250.tif 000008
【表３−２】
2014524250.tif 000009
【００３３】
表４は、Affymetrix gene-chip hybridization試験により定量した、試験した５１細胞株における、６２個の細胞周期調節遺伝子の相対的なｍＲＮＡの量を示す。
【表４−１】
2014524250.tif 000010
【表４−２】
2014524250.tif 000011
【表４−３】
2014524250.tif 000012
【表４−４】
2014524250.tif 000013
【表４−５】
2014524250.tif 000014
【表４−６】
2014524250.tif 000015
【表４−７】
2014524250.tif 000016
【表４−８】
2014524250.tif 000017
【表４−９】
2014524250.tif 000018
【表４−１０】
2014524250.tif 000019
【表４−１１】
2014524250.tif 000020
【表４−１２】
2014524250.tif 000021
【表４−１３】
2014524250.tif 000022
【表４−１４】
2014524250.tif 000023
【表４−１５】
2014524250.tif 000024
【表４−１６】
2014524250.tif 000025
【実施例】
【００３４】
実施例
【表５】
2014524250.tif 000026
【００３５】
５１のヒト腫瘍細胞株の化合物Ａについての感受性を、増殖アッセイで決定した。決定したＩＣ５０値は、独立した遺伝子チップハイブリダイゼーション試験(Affymetrix technology)で決定した、６２個の細胞周期調節蛋白質の相対的なｍＲＮＡ量と相関していた。乳房腫瘍細胞株において、統計学的に有意に相関がある(Ｐ＜０．０５)とわかった遺伝子を表５にまとめる。相関係数および有意値は、Microsoft Excel 2003およびSigmaStat 3.0を用いて算出した。
【００３６】
解析した全ての細胞株および肺細胞株の部分群において、ＣＣＮＥ２(ＣｙｃｌｉｎＥ２)またはＭＡＤ２Ｌ２のｍＲＮＡ量と、化合物Ａについての該細胞株のＩＣ５０には相関がない。驚くべきことに、１６種類の乳房腫瘍細胞株の部分群については、ＣＣＮＥ２またはＭＡＤ２Ｌ２遺伝子のｍＲＮＡ量と、ＩＣ５０として決定した、化合物Ａについての細胞の感受性は統計学的に非常に有意に相関を示すことが、相関解析により示される（表５）。
【００３７】
これらのデータから、ＣＣＮＥ２および／またはＭＡＤ２Ｌ２遺伝子の相対的なｍＲＮＡ量は、化合物Ａについてのヒト乳房腫瘍細胞の感受性を示唆しうることを確かめるものである。正の相関係数が見られたＣＣＮＥ２および／またはＭＡＤ２Ｌ２遺伝子の相対的なｍＲＮＡ量が高いことは、ＩＣ５０値が高い、すなわち細胞の化合物Ａに対する感受性が低いことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】増殖アッセイにおいて、ＩＣ５０[nM]として決定した、化合物Ａについてのヒト乳房腫瘍細胞株の感受性を、ＣＣＮＥ２遺伝子の相対的なｍＲＮＡ量に対して統計的に表す。実線は相関直線を表す。
【図１】
2014524250.tif 000029
【国際調査報告】
2014524250.tif 000030
2014524250.tif 000031
2014524250.tif 000032
2014524250.tif 000033
2014524250.tif 000034
2014524250.tif 000035