(57)【要約】  本発明は、癌の検出またはその発症リスクの評価に関する。特に、本発明は、被検者における超微細構造マーカーおよび分子マーカーを特定することによりフィールド発癌を検出するための組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者における結腸直腸発癌（ＣＲＣ）、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を検出する方法であって、
（ａ）前記被検者の便サンプルから粘液層結腸細胞を分離することと、
（ｂ）ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を示すフィールド発癌を示すマーカーまたは細胞変化について、粘液層結腸細胞を分析することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記結腸粘膜は、形態学的に生存可能な結腸細胞と、非アポトーシス性結腸細胞のいずれか一方または両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結腸粘膜の分析は、細胞内ナノ構造変化の検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内ナノ構造変化の検出は、細胞内空間屈折率分布または細胞から反射される光の位相シフト分布の変化の検出を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞内ナノ構造変化の検出は、部分波分光法による分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
部分波分光法による細胞内ナノ構造変化の検出は、前記部分波（partial was）分光法のパラメータＬｄの変化の検出を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結腸粘膜の分析は、ｍｉＲＮＡ発現の調節異常を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲＮＡ発現の調節異常は、前記結腸粘膜内部の細胞内の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現の上方および／または下方制御を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−３４ａを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲＮＡ発現の調節異常を検出することは、ｍｉＲＮＡのパネルの発現変化を分析することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を示すマーカーまたは変化の検出は、前記被検者に対する追加検査を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
被検者における癌、前癌、または癌リスク上昇を検出する方法であって、
（ａ）前記被検者の腫瘍以外の器官部位から得たサンプルから上皮細胞を分離することと、
（ｂ）前記上皮細胞を分析して、フィールド発癌を示す超微細構造変化を検出することと、
（ｃ）フィールド発癌を示す癌の分子マーカーについて、前記上皮細胞を分析することと、
（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）に基づき、前記被検者を癌、前癌、または癌リスク上昇と診断することと、
を含む方法。
【請求項１３】
（ｅ）ステップ（ｄ）に基づき、被検者に治療方針を提供すること
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療方針は、外科的治療、医薬品治療、その他の治療、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記上皮細胞は、結腸粘膜細胞、子宮頸部粘膜細胞、および口腔細胞から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記超微細構造変化の検出は、光学的検出、蛍光検出、非光学的検出、画像法、および超解像検出から選ばれる手法で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記超微細構造変化の検出は、光学的検出で行われ、前記光学的検出は部分波分光法を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌の分子マーカーは、ｍｉＲＮＡマーカー、ＤＮＡメチル化マーカー、遺伝子マーカー、およびエピジェネティックマーカーから選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌の分子マーカーは、ｍｉＲＮＡの調節異常を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記上皮細胞は、超微細構造変化を示すが、顕微鏡以上のスケールでは組織学的に正常である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年２月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／４４３，９１２号の利益および優先権を主張するものであり、その全体の開示は、参照によりここに組み込まれる。
政府の利害
本発明は、米国国立衛生研究所の許可番号Ｒ０１ ＣＡ１２８６４１、Ｕ０１ ＣＡ１１１２５７、およびＲ２１ ＣＡ１５６９４４、ならびに全米科学財団の許可番号ＣＢＥＴ−０９３７９８７に基づき、政府支援によりなされたものである。政府は、本発明の一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、癌の検出またはその発症リスクの評価に関する。特に、本発明は、被検者における超微細構造マーカーおよび分子マーカーを特定することによりフィールド発癌を検出するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２００９年の米国における結腸直腸癌（ＣＲＣ）の新症例数は１４６，９７０であり、結果として４９，９２０人が死亡した（Jemal et al. CA Cancer J Clin 59(4), 225-249 (2009)。この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。アメリカ人がＣＲＣを発症する生涯リスクは約５．３％である。無症状集団をスクリーニングすることにより、診断および前駆病変である腺腫性ポリープの除去を通じて、ＣＲＣ全体の６５〜９０％を防止できる。残念なことに、費用、不快感、合併症、困惑、および可用性に関する懸念が原因で、無症状集団の約５０％はスクリーニングを一切受けていない。よって、より効果的なスクリーニング戦略が必要とされている。ＣＲＣスクリーニングの手段には、便、血液、Ｘ線撮影、および内視鏡が含まれる（Lieberman. N Engl J Med 361(12),1179-1187 (2009).、Whitlock et al. Ann Intern Med 149(9), 638658 (2008)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。多グループタスクフォースでは、２種類のＣＲＣ検査、すなわち癌腫のみを標的にした検査（例えば便検査）と、腺腫に対しても感度を有する検査を推奨している。後者の検査は、腺腫−癌腫連鎖の遮断を通じて癌を予防する可能性を有することから、強く提唱されている（Levin et al. Gastroenterology 134(5), 1570-1595 (2008)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。米国予防医療タスクフォース（US Preventive Services Task Force）は、便検査（ＤＮＡでなくＦＯＢＴ）、軟性Ｓ状結腸鏡検査、および大腸内視鏡検査のみを推奨している（"Screening for Colorectal Cancer: U.S. Preventive Services Task Force Recommendation Statement," Ann Intern Med (2008)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。軟性Ｓ状結腸鏡検査（遠位結腸の内視鏡検査）はＣＲＣスクリーニングで強く支持されていたが、近位の新生組織形成（女性で特に重要）を検出できないことから支持を失った（Seeff et al. Gastroenterology 127(6), 1670-1677 (2004).、Mensink et al. Dis Colon Rectum 45(10), 1393-1396 (2002)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。空気注腸造影法については、より高感度で不快感の少ない検査が出現したことから、使用頻度は低い（Rockey et al. Lancet 365(9456), 305-311 (2005)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。血清試験にはプロテオミクス、抗体アレイ、特異タンパク質（ＴＩＭＰ−１、ＣＣＳＡ−３、およびＣＣＳＡ−４）が含まれるが、進行腺腫に対しては感度が乏しい（Duffy et al. Eur J Cancer 39(6),718-727 (2003).、Leman et al. Cancer Res 67(12), 5600-5605 (2007)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。最近行われた多施設試験の報告によれば、著しい新生組織形成（１０ｍｍ超）の場合、仮想大腸内視鏡（ＣＴコログラフィ、ＣＴＣ）の一病変部あたりの感度は、平均のコホート（同属性の集団）が８４％、高リスクのコホートが８０％であった（Johnson et al. N Engl J Med 359(12),1207-1217 (2008).、Regge et al. Jama 301 (23), 2453-2461 (2009)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。しかし、ＣＲＣに関するＣＴＣ誤り率は少なくなかった（約６％）。さらに、費用と患者満足度の問題（ロジスティックの制約上、大腸内視鏡検査のため再訪し腸浄化する必要がある）で、ＣＴＣで特定された病��部に関して、患者全員に大腸内視鏡検査を受けさせるのは現実的でない。しかしながら、潜在的に前癌性の病変部を留置することは、大部分の患者と医師にとって受け入れがたいことである（Shah et al. Am J Med 122(7), 687 e681-689 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。その他の懸念事項として、（ＣＴＣのための腸浄化、および大腸空気注入に起因する）不快感、連続検査からの放射線被曝、ＣＴＣでの腸外発見物の管理が挙げられ、症例の６６％でこれらが発生し、１６％はさらなる調査を要するとみなされている（Brenner & Georgsson. Gastroenterology 129(1), 328-337 (2005).、Kimberly et al. J Gen Intern Med 24(1), 69-73 (2009)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。上記その他の懸念が原因で、メディケア研究センター（Center for Medicare Studies）は、ＣＴＣ費用の払い戻しを行わないことを決定した（Dhruva. et al. N Engl J Med 360(26), 2699-2701 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。最近では、イメージングカプセル（ＰｉｌｉＣａｍ）に大きな関心が寄せられている。ところが、この手段も腸浄化が必要であり、費用を要し、ポリープが確認された場合は再度手技を受ける必要がある。最近の調査では、進行腺腫（感度７３％、特異度７９％）と癌（感度７４％）に対して性能が不十分であることが示された（Van Gossum et al. N Engl J Med 361 (3), 264-270 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。大腸内視鏡が最も正確な検査であり（進行腺腫に対する感度は９８％）、その後の新生組織形成を概算で６５〜９０％低減できることが実証されている（Winawer et al. N Engl J Med 329(27),1977-1981 (1993)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００３】
予測可能な将来においては、大腸内視鏡検査がスクリーニングの「代表的存在」であり続けると見られる。診断能力と治療能力の組み合わせに特に魅力がある。残念ながら、集団全体をスクリーニングする目的で大腸内視鏡検査を利用することは非現実的である。平均的なリスク集団全体（５０歳超の１億人超のアメリカ人）に対して大腸内視鏡検査を実施するには、キャパシティが不足している（Kahi et al. Clin Gastroenterol HepatoI7(7), 770-775、quiz 711 (2009).、Seeff et al. Gastroenterology 127(6), 1661-1669 (2004)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。仮にキャパシティが十分であったとしても、コストが法外に高くなると考えられる（概算で年間最大５００億ドル）。出血や腸穿孔等の生命に関わる問題（特に高齢者）を含め、大腸内視鏡検査に起因する合併症は珍しくない（Rabeneck et al. Gastroenterology 135(6),1899-1906,1906 e1891 (2008).、Warren et al. Ann Intern Med 150(12),849-857, W152 (2009)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。こうした制約と並び、関連の新生組織形成のスクリーニング収率が著しく低い（約５〜７％）という問題がある。したがって、振り返って考えれば、９０％超の大腸内視鏡検査が不要であったとも判断され得る。
【０００４】
ＣＲＣスクリーニングのための便検査は、最も侵襲性の少ない、非常に好ましい選択肢である。侵襲性のスクリーニングが履行されないことが現在のＣＲＣスクリーニングの大きな問題であるため、患者に大いに受け入れられることが主要な利点である。既存の便検査は、出血、腫瘍生成物といった、腫瘍の結果を検出することに依存している。実際、便潜血検査（ＦＯＢＴ）が広く使われているが、ＦＯＢＴは、ＣＲＣスクリーニング活動の標的である進行腺腫を検出できない。実際、グアヤク法や、より精度の高い免疫組織化学法（ＨｅｍｏｃｃｕｌｔおよびＨｅｍｏｃｃｕｌｔ Ｓｅｎｓａ）の感度は１１〜２１％であり、便ＤＮＡパネルは、コストが著しく増加するものの（１検査あたり４００〜７００ドル）、感度は１８〜２０％にしか改善されなかった（４，４８２人の患者を対象にした２００８年の調査）（Imperiale et al. N Engl J Med 351 (26), 2704-2714 (2004).、Ahlquist et al. Ann Intern Med 149(7), 441-450, W481 (2008).、Hewitson et al. Am J Gastroenterol 103(6),1541-1549 (2008)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。よって、より良好な便検査が緊急に必要とされている（Levin et al. Gastroenterology 134(5), 1570-1595 (2008)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
糞便は、アポトーシス性の腸管上皮細胞（３〜７日ごとに裏装全体が脱落する）、細菌、および食物残遺物で構成される。免疫磁気ビーズの精製を通じて、便粘液層から便中結腸細胞を分離することに関心が寄せられている。しかし、この方法は費用を要し、かつ面倒である（Matsushita et al. Gastroenterology 129(6),1918-1927 (2005)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。最近、便の粘液層に、形態学的に生存可能な非アポトーシス性の結腸細胞が含まれていることが示された。典型的な便アッセイが腫瘍細胞を発見しようとしてきた（「骨折り損」という限界）のに対し、粘液層結腸細胞は、正常な結腸細胞に由来している可能性が高い（有形便が粘膜に擦れるとき、上皮から剥脱する）（White et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 18(7), 2006-2013 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。このように、既存の便検査には「骨折り損」の限界があり、特に、早期の治癒可能な病変に対する感度が容認不能なほど低い。ＣＲＣの検出で必要とされる検査とは、早期検出が可能で、出血や腫瘍生成物に依存しない便検査である。
【０００６】
種々の悪性病変（例えば結腸、肺、頭頸部、肝臓等）に共通するテーマは、フィールド発癌（フィールド効果、フィールド異常、傷害領域とも呼ばれる）である。フィールド発癌とは、結腸癌発症をもたらす遺伝／周囲環境が結腸粘膜全体に拡散的に影響するという観察結果である（Kopelovich et al. Clin Cancer Res 5(12),3899-3905 (1999).、Roy et al. Gastroenterology 126(4),1071-1081 (2004).、Bernstein et al. Cancer Lett 260(1-2), 1-10 (2008)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。顕著な特徴は、同時発生の病変部と異時性の病変部が、類似の遺伝的／エピジェネティック（後成的）特性を高頻度で共有するという臨床観察である（Nosho et al. Gastroenterology (2009).、Konishi et al. Cancer Prev Res (Phila Pal 2(9), 814-822 (2009)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００７】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）とは、ｍＲＮＡの結合と分解を介して遺伝子発現を下方制御する、小型で非コード型の、１８〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡである。ｍｉＲＮＡと癌に大きな関心が寄せられている。約７００個のｍｉＲＮＡの調節異常が発癌と関係付けられている（一般に、腫瘍抑制遺伝子／癌原遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを介する）（Valeri et al. Proc Natl Acad Sci USA 107(15), 6982-6987 (2010)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｍｉＲＮＡの約５０％が染色体の脆弱領域（欠失／増幅）に位置するという事実から、発癌初期のｍｉＲＮＡの役割が重視されている（Slaby et al. Mol Cancer 8, 102 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＲＣにおいては、ｍｉＲＮＡは、多くの重要な遺伝経路を調節する（例えばＥＧＦＲ（ＡＫＴ、ＰＩ−３キナーゼ）、ｐ５３、ＩＧＦ−１、ＣＯＸ−２、上皮間葉転換、血管新生、および浸潤）。したがって、ｍｉＲＮＡは、種々のＣＲＣ全体に対して極めて重要である。ｍｉＲＮＡが果たす重要な役割を考えれば、ｍｉＲＮＡは早期発見の標的となり得る（Huang et al. Int J Cancer 127(1), 118-126 (2010)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｍｉＲ−２９ａとｍｉＲ−９２ａを使用した複合ＲＯＣ分析で、ＣＲＣ患者と進行腺腫患者の特定に対するＡＵＣは０．８８、０．７７であることが示された（Hundt et al. Ann Intern Med 150(3), 162-169 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。結腸癌発症の経路は主として２つある。１つはＡＰＣの突然変異によって引き起こされる染色体不安定性（ＣＩＮ）、もう１つはミスマッチ修復（ＭＭＲ）酵素（ｈＭＬＨとｈＭＳＨ２が最も一般的）である。重要なことは、ＡＰＣ、ＭＭＲのどちらの遺伝子発現もｍｉＲ（ｍｉＲ−１３５とｍｉＲ−１５５）が調節している点である（Valeri et al. Proc Natl Acad Sci USA 107(15), 6982-6987 (2010).、Nagel et al. Cancer Res 68(14), 5795-5802 (2008)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＯＭで処置したラットモデルで得られたデータは、フィールド発癌においてｍｉＲＮＡが調節され得ることを示唆している（Davidson et al. Carcinogenesis 30(12),2077-2084 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
上記の背景は結腸直腸癌に最も直接的に該当するが、同一の考察事項および含意事項は他の癌およびスクリーニング方法にも当てはまる。実際、フィールド発癌は、複数の癌種の生物現象として説明されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、癌の検出またはその発症リスクの評価に関する。特に、本発明は、特に好適な細胞型およびマーカーの選択を通じてフィールド発癌を検出するシステムと方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、いくつかの主要な癌種（例えば結腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌等）をスクリーニングする目的でフィールド発癌を利用できる。ある実施形態では、腫瘍性、癌性、または前癌性の病変部を保持または発生するリスクのある器官の一部分（例えば容易にアクセス可能な部分）から（例えば細胞ブラシング採取により）組織検体を取得するか、当該器官の一部ではないが、その器官とフィールド発癌を共有している代理部位から組織サンプルを取得するか、または当該器官の自然の分泌物もしくは刺激性分泌物等の器官機能の副産物（例えば糞便、尿、唾液、分泌物）から組織サンプルを取得する。特定の実施形態では、組織検体中の細胞は腫瘍に由来するものではなく、従来の病理組織基準に従えば組織学的に正常であるように見える。しかし、いくつかの実施形態では、組織検体中の細胞は、フィールド発癌のマーカー（例えば、超微細構造（ナノ構造）マーカー、光学マーカー、および／または分子（マイクロＲＮＡ）マーカー）を示す。いくつかの実施形態では、光学的分析、分子分析、および／または他の分析によりマーカーを同定して、被検者がフィールド発癌を有しているかを特定する。特定の実施形態では、フィールド発癌が検出された場合、このことは、癌、前癌、または、当該器官内に前癌性もしくは癌性の病変部を保持もしくは発生するリスクの上昇を示す。いくつかの実施形態では、本願は、フィールド発癌の診断指標として、（例えば、部分波分光法（ＰＷＳ）およびＰＷＳ顕微鏡法等の光学的手法により）検出される超微細構造（ナノ構造とも呼ばれる）マーカーと、分子マーカー（例えば、マイクロＲＮＡ発現の変化）の組み合わせを提供する。特定の実施形態では、本願は、個々のマーカーよりも正確に診断する相乗的な分析法として、（例えば、部分波分光法（ＰＷＳ）、ＰＷＳ顕微鏡法等の光学的手法により）検出される超微細構造（ナノ構造とも呼ばれる）マーカーと、分子マーカー（例えば、マイクロＲＮＡ発現の変化）の組み合わせを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、超微細構造分析と分子分析の組み合わせは、肺癌リスク評価のため口腔からブラシングにより取得した頬側上皮細胞の分析、卵巣癌リスク評価のための子宮頸部上皮細胞の分析、食道腺癌リスク評価のための上部食道上皮細胞の分析、および膵臓癌リスク分析のための十二指腸上皮細胞の分析等に利用できる。本発明の範囲は、これらの用途に限定されない。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇に関して、出血および腫瘍生成物に依存せずに検出する便検査を提供する。いくつかの実施形態では、糞便中の粘液層結腸細胞を特定して、フィールド発癌のマーカーを検出する。いくつかの実施形態では、フィールド発癌のマーカーにはＰＷＳナノ細胞診断とマイクロＲＮＡ分析が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、結腸上皮細胞の大部分に影響する拡散現象であるフィールド効果を検出することにより、糞便中の異常細胞を検出する確率が著しく上昇し、よって既存検査の検査感度を劇的に改善する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、便中粘液層結腸細胞の分離を提供する。いくつかの実施形態では、便中粘液層結腸細胞を分離することにより、フィールド発癌マーカーの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、便検体中の上皮細胞の過半数はアポトーシス細胞である。いくつかの実施形態では、粘液層結腸細胞は、糞便中の他の上皮細胞と比べて、非腫瘍結腸細胞（例えば、有形便が粘膜に擦れるとき、上皮から剥脱した結腸細胞）に由来している可能性が高い。いくつかの実施形態では、分離した粘液層結腸細胞は非アポトーシス性であるために、フィールド発癌の検出を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、被検者のＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を検出する方法であって、（ａ）被検者の便サンプルから結腸粘膜を分離することと、（ｂ）ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を示すフィールド発癌を示すマーカーまたは細胞変化について、結腸粘膜を分析することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、結腸粘膜は粘液層結腸細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、被検者のＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を検出する方法であって、（ａ）被検者の便サンプルから粘液層結腸細胞を分離することと、（ｂ）ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を示すフィールド発癌を示すマーカーまたは細胞変化について、粘液層結腸細胞を分析することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、粘液層結腸細胞は、形態学的に生存可能な結腸細胞を含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜は、形態学的に生存可能な結腸細胞を含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜は、非アポトーシス性の結腸細胞を含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜を分析することは、粘液層結腸細胞を分析することを含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜を分析することは、細胞内ナノ構造変化の検出を含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜を分析することは、部分波分光法による分析を含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜を分析することは、部分波分光法による細胞内ナノ構造変化の検出を含む。いくつかの実施形態では、部分波分光法による細胞内ナノ構造変化の検出は、部分波分光法のパラメータＬｄの変化の検出を含む。いくつかの実施形態では、（例えば部分波分光法による）細胞内ナノ構造変化の検出は、細胞内空間屈折率分布の変化、または細胞から反射される光の位相シフト分布の変化の検出を含む。いくつかの実施形態では、（例えば部分波分光法による）細胞内ナノ構造変化の検出は、細胞内空間屈折率分布の統計データ、または細胞から反射される光の位相シフト分布の統計データの変化の検出を含む。いくつかの実施形態では、結腸粘膜を分析することは、ｍｉＲＮＡ発現の調節異常を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ発現の調節異常は、結腸粘膜内部の細胞内の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現のアップおよび／または下方制御を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−３４ａを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ発現の調節異常を検出することは、ｍｉＲＮＡのパネルの発現変化を分析することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を示すマーカーまたは変化の検出は、被検者に診断を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を示すマーカーまたは変化の検出は、被検者に対する追加検査を示す。いくつかの実施形態では、追加検査は大腸内視鏡検査を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、被検者のＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇を検出する方法であって、（ａ）被検者の便サンプルから結腸粘膜を分離することと、（ｂ）部分波分光法により結腸粘膜を分析することと、（ｃ）ｍｉＲＮＡの調節異常について結腸を分析することと、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）に基づき、被検者をＣＲＣ、ＣＲＣ前、またはＣＲＣリスク上昇と診断することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）に基づき、被検者にさらなる診断および／または治療方針を提供すること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、さらなる診断および／または治療方針は、大腸内視鏡検査を含む。いくつかの実施形態では、さらなる治療方針は、ＣＲＣの治療（例えば外科的治療、医薬品治療、その他の治療、またはこれらの組み合わせ）を含む。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、被検者の癌、前癌、または癌リスク上昇を検出する方法であって、（ａ）当該被検者のサンプルから（例えば、腫瘍以外の器官部位から）上皮細胞（例えば、粘膜上皮細胞、非粘膜上皮細胞等）を分離することと、（ｂ）上記上皮細胞を分析して、超微細構造変化（例えば、フィールド発癌を示す変化）を検出することと、（ｃ）癌の分子マーカー（例えば、フィールド発癌を示すマーカー）について、上記粘膜上皮細胞を分析することと、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）に基づき、上記被検者を癌、前癌、または癌リスク上昇と診断することと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｄ）に基づき被検者に治療方針を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この治療方針は、外科的治療、医薬品治療、その他の治療、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、粘膜上皮細胞は、（例えば結腸癌を示す）結腸粘膜細胞、（例えば卵巣癌を示す）子宮頸部粘膜細胞、および（例えば肺癌を示す）口腔細胞から選ばれる。いくつかの実施形態では、超微細構造変化の検出は、光学的検出（例えばＰＷＳ）、蛍光検出、非光学的検出（例えば電子顕微鏡法）、画像法、および超解像検出から選ばれる手法で行う。いくつかの実施形態では、超微細構造変化の検出は光学的検出で行われ、この光学的検出は、部分波分光法を含む。いくつかの実施形態では、癌の分子マーカーは、ｍｉＲＮＡマーカー、ＤＮＡメチル化マーカー、遺伝子マーカー、およびエピジェネティックマーカーから選ばれる。いくつかの実施形態では、癌の分子マーカーは、ｍｉＲＮＡの調節異常を含む。いくつかの実施形態では、粘膜上皮細胞は超微細構造変化を示すが、顕微鏡以上のスケールでは組織学的に正常である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ナノ構造変化のＰＷＳ検出を示す。（ａ〜ｃ）：細胞ナノ構造の無秩序強度（disorder strength）（Ｌｄ）は、組織学的に区別不能のＨＴ−２９細胞系（ＥＧＦＲノックダウン、空ベクター対照、ＣＳＫノックダウン）における新生物形成性と相関している。（ｄ）：結腸癌のＭＩＮマウスモデルにおける、組織学的には正常に見える腸細胞間のＬｄ差を示す。（ｅ）：ＡＤＭ処置した結腸癌発生ラットモデルにおいて、未関与の、顕微鏡では正常に見える結腸細胞のＬｄが増加している。（ｆ〜ｉ）：未関与の正常に見える細胞におけるＬｄの増加は、ヒトのフィールド発癌マーカーである。（ｆ）：肺癌の実験（口腔（頬側）粘膜から取得した細胞）。（ｇ）：膵臓癌（十二指腸膨大部周囲の細胞）。（ｈ）：卵巣漿液性癌：ブラシング採取した細胞におけるＬｄ上昇の規模が、同側卵管＞子宮内膜細胞＞子宮頸部細胞の順。（ｉ）：結腸腫瘍から一定程度離れた細胞の内部ナノ構造が、腫瘍細胞と同様に変化している。（ｊ）：ナノスケール構造に対するＰＷＳ感度の実験検証（既知のサイズと屈折率を有する自己組織化したナノ粒子からなるナノ構造モデル）。ＰＷＳで測定したＬｄと予想Ｌｄの間に直線関係があり、また、ナノ粒子サイズＬｃとＬｄの間に直線関係があることから、ＰＷＳ分析の妥当性が確認される。
【図２】（ａ）腺腫患者およびＨＮＰＣＣ患者の組織学的に正常な細胞において、Ｌｄが上昇していることを示す。Ｌｄ上昇の規模はＣＲＣリスクに対応する。（ｂ）人口統計学的要因とリスク要因によってＰＷＳ診断が混乱することはない。（ｃ）ＣＲＣのＡＯＭ処置ラットモデルにおける、便中粘液結腸細胞のＰＷＳ分析を示す。ＡＯＭ処置においてＬｄが上昇し、ＡＤＭ処置後に徐々に進行しており、よって発癌現象の進行に対応している。（ｄ）代表的な便中結腸細胞の顕微鏡画像とＰＷＳ画像を示す。
【図３】対照およびＡＤＭラット便から分離した粘液層便中結腸細胞の画像を示す。
【図４】（ａ）ＡＯＭ処置したラットモデルからのｍｉＲＮＡ発現を示す表、および（ｂ）新生物形成前段階（ＡＯＭ処置から５週間後）のラットにおける、便中結腸細胞から取得したマーカーのＡＤＭ処置識別性能を示す表である。
【図５】口腔細胞から取得した肺癌マーカーである分子（マイクロＲＮＡ）マーカーと超微細構造（光学）マーカーが相乗的であることを示す。
【図６】（ａ）子宮頸部上皮細胞から卵巣フィールド発癌を検出できること、および（ｂ）子宮頸部細胞から取得した卵巣癌マーカーである分子（マイクロＲＮＡ）マーカーと超微細構造（光学）マーカーが相乗的であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、癌（例えば結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌等）の検出、またはその発症リスクの評価に関する。特に、本発明は、フィールド発癌を検出するシステムと方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌について被検者をスクリーニングするための組成物と方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、被検者から得た粘膜物質を検査して、癌、癌リスク、癌の可能性の上昇等の兆候を調べることを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、被検者のサンプルから粘膜細胞（例えば上皮細胞）を抽出および／または分離することを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、生体サンプルから粘液層上皮細胞を抽出および／または分離することを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌スクリーニング（例えば、肺癌スクリーニング、結腸癌スクリーニング、卵巣癌スクリーニング等）のための検査を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する検査は、生体サンプルから分離した粘液層上皮細胞におけるナノ構造（超微細構造ともいう）の変化を検出する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する検査は、生体サンプルから分離した粘液層上皮細胞におけるフィールド発癌の分子マーカーを検出する。いくつかの実施形態では、提供される検査は、癌のスクリーニングと診断のための検査として、上皮細胞におけるナノ構造（超微細構造ともいう）変化とフィールド発癌分子マーカーの両方を検出する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）に関して被検者をスクリーニングするための組成物と方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＣ、ＣＲＣリスク、ＣＲＣの可能性の上昇等の兆候に関して、被検者の糞便を検査することを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、糞便から結腸粘膜を抽出および／または分離することを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、糞便から粘液層結腸細胞を抽出および／または分離することを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、結腸癌スクリーニングのための便検査を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する検査は、便から分離した粘液層上皮細胞におけるナノ構造変化とフィールド発癌の分子マーカーを検出する。いくつかの実施形態では、本発明は、結腸直腸癌のスクリーニングと診断のための検査として、便中結腸細胞におけるフィールド発癌のマーカーの検出を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、代替の癌スクリーニング手法を提供する。例えば、本明細書に記載の結腸癌スクリーニング方法は、集団全体に対して実施する大腸内視鏡検査に代わる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、大腸内視鏡検査の主要標的である進行腺腫を保持している患者の事前選択を提供する。いくつかの実施形態では、大腸内視鏡検査（または任意の適した癌のための別のスクリーニング方法）の患者を事前に選択することにより、限られた資源を、実際に検査の恩恵を受ける患者に集中させることを可能にする。大腸内視鏡検査は、限られた資源で実施される特に侵襲的な手技である。現在のリスク階層化手段（例えば、軟性Ｓ状結腸鏡検査、便潜血検査）は、容認不能なほど低い感度と陽性的中率の問題がある。いくつかの実施形態では、本発明は、現行の癌スクリーニング手法（例えば大腸内視鏡検査）のために患者を事前選択する方法として、より精度の高い方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対費用効果が高く、侵襲性が最小またはゼロであり、容易に耐えられる癌（例えばＣＲＣ）スクリーニングを提供する。いくつかの実施形態では、本発明を用いることにより、追加の癌スクリーニング（例えば大腸内視鏡検査）の恩恵を得ると考えられる患者を選択する。いくつかの実施形態では、本発明は、追加のスクリーニング手法（例えば、標準の癌スクリーニング方法、大腸内視鏡検査等）の補足物である。いくつかの実施形態では、本発明は、従来のスクリーニング手法（例えば、標準の癌スクリーニング方法、大腸内視鏡検査等）の代替物である。いくつかの実施形態では、本発明は、従来のスクリーニング手法（例えば、標準の癌スクリーニング方法、大腸内視鏡検査等）の代替物である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、フィールド発癌の検出に基づくリスク階層化手段を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、フィールド発癌（例えば、結腸癌発生、肺癌発生、卵巣癌発生）をもたらす遺伝／周囲環境の変化の検出［例えば、分子マーカー（例えば遺伝子マーカー、ｍｉＲＮＡ異常、エピジェネティックマーカー、メチル化等）およびナノ構造変化］を提供する。いくつかの実施形態では、フィールド発癌をもたらす遺伝／周囲環境の変化は、粘膜層全体にも拡散的に影響する。いくつかの実施形態では、本発明は、粘膜層（例えば結腸粘膜）の変化［例えば、分子マーカー（例えばｍｉＲＮＡ）およびナノ構造の変化］の検出を提供する。いくつかの実施形態では、リスクの「顕著な特徴」（例えば「繁殖領域」）は、腺腫／腫瘍を含む細胞だけでなく、粘膜層全体に見られる、はるかに多くの細胞に存在する。いくつかの実施形態では、リスクの「顕著な特徴」（「繁殖領域」）は、確率型突然変異により決定される限局的な腫瘍性病変部を含む。いくつかの実施形態では、新生組織形成を保有している患者の組織学的に正常な粘膜において、多くの分子バイオマーカー（ゲノムマーカー、プロテオミックマーカー、エピジェネティックマーカー、生化学マーカーを含む）が変化する。これらのバイオマーカーは、こうした変化と癌、癌リスク、または癌の可能性を示す徴候とを相関させる生物学的妥当性（biological plausibility）を強調するが、ナノ細胞学的分析から得られる追加情報なしに当該変化を分析した場合には、集団スクリーニングに必要な感度／特異度が欠如する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、生体サンプル（例えば便、パップスメア（子宮頸部細胞診）、口腔スワブ等）から取得した上皮細胞（例えば結腸細胞、口腔細胞、子宮頸部上皮細胞等）を評価することにより、フィールド発癌を正確に検出する。いくつかの実施形態では、上記方法は、細胞の構造側面と分子側面の両方を評価する。いくつかの実施形態では、上記方法は、細胞内ナノ構造変化の検出を利用する。いくつかの実施形態では、光学（例えばＰＷＳ）、非光学（例えば電子顕微鏡法）、画像法、蛍光、その他の技術を用いてナノ構造変化を検出する。いくつかの実施形態では、部分波分光（ＰＷＳ）顕微鏡法を用いて細胞内ナノ構造変化を検出する（米国特許第７，８００，７４６号、米国特許第７，６６７，８３２号、Subramanian et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105(51), 20118-20123 (2008).、Subramanian et al. Optics Letters 34(4), 518-520 (2009).、Subramanian et al. Cancer Research 69(13), 5357-5363 (2009)。これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本発明は、分子変化（例えば遺伝子変化、エピジェネティックな変化、マイクロＲＮＡレベル等）の検出を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、（例えば光学手法、非光学手法、ＰＷＳ等による）超微細構造変化の検出と、分子変化（例えば遺伝子の変化、エピジェネティックな変化、マイクロＲＮＡ異常（例えばマイクロＲＮＡレベル）等）の検出の両方を提供する。本発明の実施形態の開発中に実施した実験では、ナノ構造変化（例えばＰＷＳで検出）および分子マーカー異常（例えばマイクロＲＮＡ異常）を検出することにより、他の公知の癌（例えばＣＲＣ）マーカーよりも早期に潜在的な発癌を検出でき、よって他のスクリーニング方法に優る利点を提供できることを実証した。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、さらなる癌スクリーニング（例えば大腸内視鏡検査）の必要性を決定するための初期スクリーニング検査として、ＰＷＳ（例えば便中結腸細胞のＰＷＳ分析）および／または分子マーカー検査（例えばマイクロＲＮＡ検査）を利用した方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌、前癌、および／または癌リスク（例えばＣＲＣ、ＣＲＣ前、および／または患者のＣＲＣリスク）を検出するための正確かつ容易に実行される検査（例えば便検査）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、他の検査（例えば大腸内視鏡検査）を拒絶している患者のための癌スクリーニング（例えばＣＲＣスクリーニング）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、他のスクリーニング（例えば大腸内視鏡検査）が不要な状況で癌スクリーニング（例えばＣＲＣスクリーニング）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、女性の癌による死亡原因の子宮頸癌を１位から１４位に下げることに大きく成功しているパップスメア（子宮頸部細胞診）−コルポスコピーのパラダイムに似たスクリーニングパラダイムを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する癌（例えばＣＲＣ）スクリーニングのシステムおよび方法は、他のスクリーニング手法（例えば大腸内視鏡検査）に取って代わる手段を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、癌（例えばＣＲＣ）またはそのリスクに関して患者をスクリーニングする方法を提供する。この方法では、（１）生体サンプル（例えば便）から粘液層上皮細胞（例えば結腸細胞）を分離して、（２）フィールド発癌のマーカー（例えばナノ構造マーカー、分子マーカー等）を検出する。いくつかの実施形態では、マーカーの検出にはＰＷＳナノ細胞診断とマイクロＲＮＡ分析が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、フィールド発癌が大部分の上皮細胞に影響する拡散現象であるために、より多くの細胞がこれらのマーカーを有し（例えば、癌細胞に限定されない）、検出が単純化される。いくつかの実施形態では、本発明で検出可能なマーカーが広範囲に存在することから、生体サンプル（例えば便）中の異常細胞を検出する確率が著しく上昇し、よって、既存検査の主たる限界である検査感度が劇的に改善される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、粘液層上皮細胞の分離を提供する。いくつかの実施形態では、上皮細胞を、綿棒による採取、ブラシング、その他の物理的な抽出により組織および／または器官の粘膜領域から取得する。いくつかの実施形態では、脱落した上皮細胞を取得する。いくつかの実施形態では、粘液層上皮細胞を含む生体サンプル（例えば便、尿、唾液、血液等）を取得する。フィールド発癌マーカーの検出は、粘液層上皮細胞の分離方法を使用することで可能になる。いくつかの実施形態では、生体サンプル（例えば便サンプル、脱落細胞）中の上皮細胞の過半数はアポトーシス細胞であるが、粘液層上皮細胞は、上皮から剥脱した正常な（例えば、腫瘍でない）上皮細胞に由来する可能性が比較的高い。いくつかの実施形態では、粘液層上皮細胞は非アポトーシス性であり、フィールド発癌を検出するための独特な位置にある。いくつかの実施形態では、本発明は、粘液層上皮細胞の分離および／または精製を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、粘膜上皮細胞の分離および／または精製を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、単なる脱落したアポトーシス細胞でなく、未関与の粘膜から剥脱した細胞を取得する。いくつかの実施形態では、被検者の生体サンプルから粘膜を収集、分離、取得、および／または精製する。いくつかの実施形態では、被検者の生体サンプルから粘液層上皮細胞を収集、分離、取得、および／または精製する。いくつかの実施形態では、粘液層上皮細胞は癌性でも前癌性でもないが、癌、前癌、もしくは癌リスク上昇のマーカー、変化、および／または徴候を保有する。いくつかの実施形態では、本発明の方法で分離した粘膜を調べることにより、癌、前癌、および／または癌リスク上昇の検出または診断が可能になる。いくつかの実施形態では、粘液層上皮細胞を分析することにより、癌性または前癌性細胞の検出に依存するよりも早期の検出が可能になる。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、便中粘液層結腸細胞の分離を提供する。いくつかの実施形態では、便中粘液層結腸細胞の分離方法を用いて、フィールド発癌マーカーの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、便検体中の上皮細胞の過半数はアポトーシス細胞であるが、粘液層結腸細胞は、有形便が粘膜に擦れるときに上皮から剥脱した正常な（例えば、腫瘍でない）結腸細胞に由来する可能性が比較的高い。いくつかの実施形態では、粘液層結腸細胞は非アポトーシス性であり、フィールド発癌を検出するための独特な位置にある。いくつかの実施形態では、本発明は、粘液層結腸細胞の分離および／または精製を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、結腸粘膜の分離および／または精製を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、便流へと脱落した単なるアポトーシス細胞でなく、未関与の結腸粘膜から剥脱した細胞を取得する。いくつかの実施形態では、被検者の便サンプルから結腸粘膜を収集、分離、取得、および／または精製する。いくつかの実施形態では、被検者の便サンプルから粘液層結腸細胞を収集、分離、取得、および／または精製する。いくつかの実施形態では、粘液層結腸細胞は癌性でも前癌性でもないが、ＣＲＣ、ＣＲＣ前、もしくは癌リスク上昇のマーカー、変化、および／または徴候を結腸に保有する。いくつかの実施形態では、本発明の方法で分離した結腸粘膜を調べることにより、ＣＲＣ、ＣＲＣ前、および／またはＣＲＣリスク上昇の検出または診断が可能になる。いくつかの実施形態では、結腸粘膜を分析することにより、癌性または前癌性細胞の検出に依存するよりも早期の検出が可能になる。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明は、癌の検出、前癌の検出、癌もしくは前癌を示す変化の検出、癌保有もしくは癌発症のリスクの評価、のうちの１つ以上に対して、部分波分光顕微鏡法（部分波分光法（ＰＷＳ））とも呼ばれる）の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＣの検出、ＣＲＣ前の検出、ＣＲＣもしくはＣＲＣ前を示す変化の検出、ＣＲＣ保有もしくはＣＲＣ発症のリスクの評価、のうちの１つ以上に対して、部分波分光顕微鏡法の使用を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＷＳは、癌、前癌、および／または癌発症リスクを示し、またはこれらと相関し、またはこれらを診断する細胞内ナノ構造変化の検出を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＷＳは、ＣＲＣ、ＣＲＣ前、および／またはＣＲＣ発症リスクを示し、またはこれらと相関し、またはこれらを診断する細胞内ナノ構造変化の検出を提供する。いくつかの実施形態では、癌（例えばＣＲＣ）、前癌（例えばＣＲＣ前）、および／または癌（例えばＣＲＣ）リスクを有する被検者の粘膜（例えば結腸粘膜、肺粘膜、卵巣粘膜等）、上皮細胞（例えば結腸細胞、肺細胞、卵巣細胞等）、上皮関連細胞（例えば結腸関連細胞）、および／またはフィールド発癌において、ＰＷＳパラメータＬｄが変化する（例えば上昇または下降する）。いくつかの実施形態では、本発明は、顕微鏡レベルでは正常に見える細胞における細胞内ナノ構造変化の検出を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、粘膜（例えば結腸粘膜、肺粘膜、卵巣粘膜等）におけるＬｄの変化（例えば上昇）の検出を提供する。いくつかの実施形態では、粘膜（例えば結腸粘膜）におけるＬｄの変化は、細胞内ナノ構造変化、ならびに／または（例えば結腸および／もしくは腸の）癌性もしくは前癌性の変化を示す。いくつかの実施形態では、他の手段では正常（健常）に見える粘膜層細胞（例えば結腸粘膜、肺粘膜、口腔粘膜、子宮頸部粘膜、卵巣粘膜等）において、Ｌｄの上昇および／または細胞内ナノ構造の変化が発生する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で検出される細胞変化および細胞内変化は、癌性または前癌性細胞だけでなく、非癌性細胞（例えば、結腸領域、肺、口、子宮頸部、卵巣等の非癌性細胞）でも発生する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で検出される細胞変化および細胞内変化は、癌性または前癌性細胞だけでなく、非癌性細胞（例えば、結腸領域、肺、卵巣、口、子宮頸部等の非癌性細胞）でも発生し、よって癌または前癌の早期検出を可能にする。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、粘膜層（例えば結腸粘膜、肺粘膜、卵巣粘膜等）、上皮細胞（例えば肺細胞、卵巣細胞、結腸細胞等）、上皮関連細胞、および／またはフィールド発癌において調節不全の（例えば上方制御または下方制御された）１つ以上の（例えばパネル）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌、前癌、および／または癌リスクを有する被検者において（例えばフィールド発癌および／または粘膜層細胞（例えば結腸粘膜、肺粘膜、卵巣粘膜等）において）上方制御される１つ以上のｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡパネル）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌、前癌、および／または癌リスクを有する被検者（例えばフィールド発癌および／または結腸粘膜）において下方制御される１つ以上のｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡパネル）を提供する。いくつかの実施形態では、パネルは、粘膜（例えば結腸粘膜、肺粘膜、卵巣粘膜等）、上皮細胞（例えば肺細胞、卵巣細胞、結腸細胞等）、上皮関連細胞において調節不全となるｍｉＲＮＡを含み、かつ／または、癌（例えばＣＲＣ）、前癌（例えばＣＲＣ前）、および／または癌リスク（例えばＣＲＣ）を有する被検者のフィールド発癌を示すｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で検出されるｍｉＲＮＡ発現の変化は、癌性または前癌性細胞だけでなく、関心領域（例えば、結腸領域、肺領域、口領域、子宮頸部領域、卵巣領域等）の非癌性細胞でも発生する。
【００２８】
特定の実施形態では、癌、前癌、または癌リスクを示すマーカー（例えば分子マーカー、超微細構造マーカー）に関して、癌検査の対象領域に近接する組織／器官（例えば、肺癌に対する口、卵巣癌に対する子宮頸部、結腸癌に対する結腸）の粘膜層から得た細胞（例えば上皮細胞）を検査する。
【００２９】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で分析するための細胞（例えば上皮細胞）および／または生体サンプルを、被検者の粘膜（ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）または粘膜（ｍｕｃｏｓａ）から取得する。本発明は、粘膜の種類による制限を受けない。細胞または生体サンプルを取得する場所となり得る粘膜の非限定的な例として、頬側粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、鼻粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、気管支粘膜、子宮粘膜、子宮内膜、結腸粘膜、および／または陰茎粘膜が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の範囲は、粘膜由来の細胞に限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて、非粘膜上皮細胞（例えば前立腺上皮細胞、膵臓上皮細胞等）を分析する。いくつかの実施形態では、生体サンプル由来の上皮細胞を、本明細書に記載の方法により取得、分離、および／または分析する。本発明は、上皮細胞の種類による制限を受けない。本発明の実施形態で利用可能な上皮細胞の非限定的な例として、結腸細胞、内胚葉細胞、卵管表皮細胞、口腔上皮細胞、胃上皮細胞、腸上皮細胞、中皮細胞、胚上皮細胞、呼吸器上皮細胞、嗅上皮細胞、尿路上皮細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本発明は上皮細胞に限定されない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞（例えば上皮細胞）および／または生体サンプル（例えば粘膜サンプル、非粘膜サンプル）を分析する（例えば分子マーカーおよび／または超微細構造マーカーを分析する）ことにより、癌、前癌、または癌リスク上昇を検出する方法を提供する。本発明の範囲は、本明細書に記載の方法で検出できる癌の種類による制限を受けない。実際、本発明のいくつかの実施形態で検出される癌（およびその各種前癌）の非限定的な例として、膀胱癌、肺癌、乳癌、メラノーマ、結腸癌、直腸癌、非ホジキンリンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、白血病、甲状腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、咽喉癌等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内の超微細構造変化／異常を検出する方法を提供し、こうした変化／異常を癌、前癌、またはそのリスクと相関させる。本発明の範囲は、細胞ナノ構造および／または細胞ナノ構造内の変化を検出、観察、および／または定量化する方法、手段、および／または手法による制限を受けない。実際、好適な方法の非限定的な例として、光学的方法（例えばＰＷＳ）、非光学的手法（例えば電子顕微鏡法）、画像手法、蛍光手法等が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
〔実施例１〕
実験例
組織学的に正常な、新生物形成前の細胞におけるナノ構造変化のＰＷＳ検出
本発明の実施形態の開発中に実施した実験では、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ−２９において、腫瘍抑制遺伝子であるＣ末端ｓｒｃキナーゼ（ＣＳＫ）、および癌原遺伝子である上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対してＳｈ−ＲＮＡ手段を使用した。ノックダウンの割合は中程度（５０％未満）であった。したがって、この細胞株は顕微鏡では区別不能であった（図１参照）。ところが、ＰＷＳパラメータＬｄは、最も攻撃性の低い細胞（ＥＧＦＲノックダウン）から、中間（空ベクター）、そして最も攻撃性の高い細胞（ＣＳＫノックダウン）へと著しく上昇した（図１ｂ、ｃ参照）。
【００３３】
Ｌｄの上昇は、腫瘍性形質転換を起こしている細胞に共通するテーマである。結腸癌発生の２種類の動物モデル、すなわちＭＩＮマウスモデル（家族性発癌モデル、ＡＰＣ突然変異、６週齢マウス、図１ｄ参照）と、アゾキシメタン（ＡＯＭ）処置ラット（散発性結腸癌発生モデル、ＡＯＭ注入の２週間後、図１ｅ参照）において、新生物形成病変が現れるよりかなり前（ＡＣＦ前および腺腫前段階：腺腫発生には２０週を要し、癌腫発生には３５週を要する）に、正常に見える腸細胞のＬｄが著しく上昇した。フィールド発癌における遺伝的事象およびエピジェネティックな事象は以前に研究されているが、細胞は形態学的に正常であると想定されていた。本発明の実施形態の開発中に実施した実験では、これらの細胞は、マイクロスケールではなく、ナノスケール、高分子構造の長さスケール、および細胞の他の基本的構成単位で、実際に形態学的変化を有していることを示している。
【００３４】
本発明の実施形態の開発中に、結腸のフィールド発癌におけるナノ構造変化を調べる実験を行った（Subramanian, Cancer Research 69(13), 5357-5363 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｌｄが発癌の早期に上昇することから、腫瘍細胞と、フィールド発癌における組織学的に正常な結腸細胞の両方でＬｄが変化するかどうかを評価するための実験を行った。標準プロトコルに従って細胞採取ブラシを用いて細胞をブラシング採取し、ガラススライドに移し、エタノールで固定し、細胞病理学者の判断により組織学的に正常であることを確認した。診断を知らされていない操作者が、各患者の無作為に選択された細胞をＰＷＳで分析した。ＰＷＳにより、各細胞の「ヒートマップ」状のＬｄ画像が作成された（図１ｂを参照）。各細胞のＬｄの平均値を計算した。この平均値の平均から、患者の平均Ｌｄが得られる。
【００３５】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験により、年齢と性別を一致させた正常対照と比べて、腫瘍細胞のＬｄが上昇することが立証された。腫瘍細胞のＬｄが著しく上昇した（図１ｊを参照）が、腫瘍から４ｃｍ離れた、組織学的に正常な細胞（フィールド発癌）もＬｄが上昇した（図１ｊを参照）。したがって、組織学の基準では正常に見えても、これらの細胞はナノ構造変化を有している。
【００３６】
フィールド発癌において、組織学的に正常な細胞のＬｄが上昇する。大腸内視鏡検査を受けている以下の患者：新生組織形成を持たない対照患者、進行していない腺腫を有する患者、進行腺腫を有する患者、およびＨＮＰＣＣ（遺伝性非ポリポーシス大腸癌症候群）を有する患者に対して、内視鏡的にも組織学的にも正常な粘膜から直腸ブラシングを行った。新生組織形成の規模と相関して、直腸Ｌｄが漸進的に上昇した。すなわち、新生組織形成のない患者＜進行していない腺腫を有する患者（大部分は自然消失）＜進行腺腫を有する患者（より攻撃性の高い前癌病変）＜ＨＮＰＣＣ患者（癌に進行するリスクが最も高い）の順でＬｄが上昇した（図２を参照）。全グループに対して効果が有意であった。
【００３７】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験により、新生組織形成の併発に対するＬｄの性能が優れていることが実証された。単一マーカー（Ｌｄ）に対するＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、癌腫が０．９００、進行腺腫が０．８６３、全腺腫が０．７７９であった。人口統計学的要因とリスク要因によるＬｄ上昇の混乱はない。患者の人口統計学的およびリスク要因（例えば年齢、喫煙歴、性別）は、Ｌｄ値、診断結果のどちらにも影響していなかった。共分散分析によるそれぞれのｐ値は、０．６６、０．６０、０．２０である（図２ｂを参照）。相関分析はさらに、人口統計学的要因とＬｄの間に有意な関連性がないことを確認した。最終的に、症例と対照の間で年齢、性別、喫煙歴が一致していた（図２ｂを参照）。
【００３８】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験により、ＰＷＳが遠位腺腫と近位腺腫に対して感度があることが実証された。腺腫は結腸部分間で均一に分布しており（５３％遠位、４７％近位）、近位の新生組織形成を有する患者と遠位の新生組織形成を有する患者の間で、直腸のＬｄに差はなかった。
【００３９】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験により、良性結腸病態の影響がないことが実証された。腺腫のない患者の２２％が良性病変（例えば憩室炎、過形成性ポリープ）を有し、これらの患者のＬｄは変化していなかった（共分散分析）。しかし、Ｌｄの上昇が、将来の新生組織形成に対して感度を有することが示された。新生組織形成のリスクが高い患者、すなわち、非常に高いＣＲＣ生涯リスクの前兆である遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）症候群（遺伝子ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ２の生殖細胞系列変異）を有する患者の組織学的に正常な直腸細胞に対して、ＰＷＳ分析を実施した。これらの患者は腺腫を併発していなかったが、直腸のＬｄが著しく変化した（図２ａを参照）。実際、ＨＮＰＣＣ患者のＬｄは進行腺腫を併発している患者よりも高く、相対的生涯リスク：年間２〜５％に対して６０〜８０％と一致していた。（Lynch and de la Chapelle. N Engl J Med 348(10), 919-932 (2003).、Brenner et al. Gut 56(11), 1585-1589 (2007)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
〔実施例２〕
粘液層便中結腸細胞の分離
便中結腸細胞を分離する手法は、一般に手間がかかり面倒である（Matsushita et al. Gastroenterology 129(6),1918-1927 (2005)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。最近、粘液層に着目した新規アッセイが開発された。このアッセイは実用性の面で有利であり、他方、良好かつ確実な細胞収率を提供する（White et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 18(7), 2006-2013 (2009)。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。粘液層を用いることにより、便流へと脱落した単なるアポトーシス細胞ではなく、未関与の、便通過に関連した結腸粘膜から剥脱した細胞が標的とされる。プロトコルは次の通りである。糞便（例えば、排便から１２時間以内に届けられた冷蔵便）を、ＰＢＳ中で調製された冷却０．５％チオグリコール酸アンモニウム溶液（シグマアルドリッチ）で洗浄し、穏やかに撹拌して、８００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離する。ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液（ホロジック）中にペレットを再懸濁して、４５分間インキュベートする。サンプルを３００μｍフィルターメッシュ（Ｎａｓｃｏ Ｗｈｉｒｌ−Ｐａｋ）に通して大型デブリを除去した後、１２５μｍポリプロピレンメッシュ（スモールパーツ社）に通して濾過する。残った固形物（粘液層結腸細胞を含む）をチオグリコール酸アンモニウムで洗浄し、８００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離して、最上層を抽出する。次に、サンプルを８００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離する。上澄みを除去し、ＰＢＳ中の新しい０．５Ｍ Ｎ−アセチルＬ−システイン（シグマアルドリッチ）を加える。元の便サンプル０．５ｍＵｇに１．５ｍＭのＥＤＴＡを加えて、３７℃、１５０ｒｐｍで１０〜１５分間、サンプルを回転させる。サンプルをＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔで１８〜２０ｍＬに希釈し、ＴｈｉｎＰｒｅｐ ２０００プロセッサ（ホロジック）を用いてガラススライドに細胞を塗布するか、マイクロＲＮＡ分析用にＴＲＩｚｏｌに入れる。
【００４０】
本発明の実施形態の開発中、ＡＯＭ処置ラットモデルを用いて上記プロトコルを試験する実験を行った。特異的なサイトケラチン免疫活性パターンにより、典型的な結腸細胞（図３を参照）を確認した。粘液層結腸細胞の源を明らかにするため、ラットにＢｒｄＵ（腺窩の底部にあり、徐々に上方に移動する増殖細胞を標識）を注入して、２４時間後に屠殺した。屠殺する前に、便中結腸細胞を評価した。データは以下の２点を示した。ｉ）便中結腸細胞の１０〜２０％がＢｒｄＵで標識されたが、腺窩の上半分に進行した細胞（アポトーシスにより脱落するようになる細胞）はまったくなかった。ｉｉ）粘液層便中結腸細胞のいずれも、切断されたカスパーゼ３免疫活性（アポトーシスのマーカー）を示さなかった。このことは、粘液層結腸細胞が、腺窩上部の（一般に便塊の中心に見られる）結腸細胞のアポトーシスを通じて得られたのではなく、有形便通過時の機械的な剥脱により得られた（すなわちフィールド発癌を表す）ことを立証するものである。便中結腸細胞を介してフィールド発癌が検出されたかどうかの問題に対処するため、食塩水で処置したラットとＡＯＭで処置したラットで実験を行い、粘液結腸細胞アッセイでのｍｉＲＮＡ調節異常の効果量（effect size）が、単純な便ホモジネートで見られる効果量の２倍であることを認めた。あるマーカーの効果量とは、マーカーの累積標準偏差で正規化された、症例および対照の平均マーカー値の差と定義される。
〔実施例３〕
ＣＲＣラットモデルにおいて、ＰＷＳが便中結腸細胞のナノ構造変化を検出
ＡＯＭ処置したラットおよび同齢の食塩水処置したラットから取得した糞便を用いて、実験を行った。このモデルでは、ＡＯＭ注入から２０週後に腺腫、３５週後に癌腫が発症する。ＰＷＳ分析のため、ヒトのフィールド発癌状態を再現する時期として、発癌物質の注入後２１８週を選定した。抽出後、便中結腸細胞をサイトカイン溶液（方法に基づく固定液）に入れ、その後、ＴｈｉｎＰｒｅｐ  ２０００機器（サイテック）を使用して細胞スライドを作製した。ＰＷＳで分析可能な細胞の収率は、分注量１ｇあたり細胞１５個であった。患者１名あたり２０〜３０個の細胞で統計的かつ診断的に有意な結果が観察できるので、便中結腸細胞のＰＷＳ分析を実施するには、分注量約２ｇほどの少量で十分である。図２（ｄ）に、食塩水処置したラットとＡＯＭ処置したラットから取得した便中結腸細胞の代表的なＬｄ画像を示す。Ｌｄ値の上昇を認識できる。同齢の対照と比べて、ＡＯＭ処置したラットは５週目にＬｄが上昇し、その後、ラットモデルにおける発癌の進行と平行して、Ｌｄが連続的に上昇した。ＡＯＭ処置後５週間のＡＯＭ処置ラットと食塩水処置ラットのＡＵＣは、無作為に選択した３つの細胞のＬｄ値を平均した場合、０．８７７という良好な値であった。１０週目には、ＡＵＣは０．９２８（感度１００％、特異度７５％）に改善した。
〔実施例４〕
結腸フィールド発癌におけるマイクロＲＮＡプロファイリング
フィッシャー３４４ラットに、食塩水またはＡＯＭ（１５ｍｇ／ｋｇ、シグマ）を２回Ｌｐ注入した。未関与の結腸組織および腫瘍からトータルＲＮＡを分離し、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析用にＲＮＡを処理した（ｍｉＲＮＡ数３００超のアレイ、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ＆ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ｖ７．３．１搭載Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ Ｓｃａｎｎｅｒ）。結腸癌発生中のｍｉＲＮＡ発現差異の比較分析を行った（図３ａ参照：増加は１．５倍超、減少は０．６７倍未満と定義される）。未関与の粘膜において、既定の化学予防剤で処置した結果、１６のマイクロＲＮＡが変化し、初期結腸癌発生（異形成前粘膜）時のマイクロＲＮＡの中心的性質を支持した。これは、ヒトにおいて、２つの予め定義されたＭｅｇａｐｌｅｘ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒプール（ｔａｑ ｍａｎプローブ）遺伝子カード型マイクロアレイ（アプライドバイオシステムズ）の７６０マイクロＲＮＡを用いて、ＣＲＣ患者の顕微鏡的には正常な粘膜に対して実施され、非新生物（主に憩室症）を示す目的で切除されたものと比較したものである。顕微鏡で見ると正常な粘膜において、それぞれ統計的に有意に、２６のマイクロＲＮＡが上方制御され、８８のマイクロＲＮＡが下方制御されていた。
〔実施例５〕
粘液層便中結腸細胞におけるマイクロＲＮＡ調節
上述の通り、粘液層便中結腸細胞はフィールド発癌を表し、ＡＯＭ処置ラットモデルとヒトにおいて、フィールド発癌時にマイクロＲＮＡが調節不全となる。本発明の実施形態の開発中に実施した実験において、（モレキュラーリサーチラボのＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて）便中結腸細胞からマイクロＲＮＡを分離した。観察した６個のマイクロＲＮＡのうち、４個が上方制御されていた。例えば、便中結腸細胞において、ｍｉＲ−３４ａの上方制御で４．４倍の誘発が観察された。これは、組織学的に正常な粘膜での誘発（４．６倍）に相当するが、腫瘍に見られるもの（２８．９倍）よりは少ない。このことは、粘液層便中結腸細胞が剥脱細胞に由来することをさらに示すものである。
〔実施例６〕
ＰＷＳおよび便中結腸細胞由来マイクロＲＮＡの診断性能
発癌物質処置から５週間後（腺腫発生前）に、ＡＯＭ処置ラットから糞便を分離した。分離した便中粘膜結腸細胞に対してＰＷＳを実施して細胞のナノ構造特性を評価し、リアルタイムＰＣＲを実施してｍｉＲ３４ａのレベルを評価した。このような早い時点にもかかわらず、ＡＵＣは顕著であった（図４ｂを参照）。フィールド発癌に対するこの２種類のマーカーから、明確な相乗作用が観察された。これらのデータは、マイクロＲＮＡ＋ＰＷＳが診断上の有力な組み合わせであることを実証している。
〔実施例７〕
ＰＷＳによる複数の癌種の検出
複数の癌種でフィールド発癌が報告されている（Kopelovich et al. Clin Cancer Res 5(12), 3899-3905 (1999).、Dakubo et al. Cancer Cell International 7(2)(2007)。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の実施形態の開発中に実施した実験で、Ｌｄの上昇は発癌時の普遍的現象であることが実証されている。例えば、組織学的に正常な口腔細胞でのＬｄの上昇は、肺癌患者と、新生組織形成を持たない対照（年齢とタバコ曝露を一致させた対照）との区別を可能にした（図１ｆを参照）。年齢、喫煙量によるデータの混乱はなかった。同様に、組織学的に正常な膨大部周囲の十二指腸粘膜から細胞をブラシング採取したとき、膵臓癌を有さない患者と比べて、膵臓癌患者のＬｄが上昇していた（図１ｈを参照）。卵巣癌の最も攻撃性の高い漿液サブタイプ（悪性病変の約８０％）は、最初は卵巣でなく卵管采で発症する。このため、卵管と子宮内膜を評価したところ、新生組織形成を持たない同齢の患者と比べて、漿液性卵巣癌患者の組織学的には正常な上皮において、Ｌｄが著しく上昇していた（図１ｇを参照）。
〔実施例８〕
超微細構造マーカーと分子マーカーの相乗作用
本発明の実施形態の開発中に実施した実験は、超微細構造マーカーと分子マーカーを組み合わせた方が、個々のマーカー単独よりも癌の検出性能が良いことを実証している。
【００４１】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験は、ＰＷＳで測定された無秩序強度の上昇でアッセイした場合に、癌と細胞内ナノ構造変化の間に相関関係があることを実証している。本発明は、ナノ構造変化の検出手段による制限を受けないが、実験の結果、光学分光顕微鏡手法であるＰＷＳは、細胞構造の評価および癌との関連付けに特に有用であることが実証された。１ミクロン未満のスケールで細胞構造を測定または撮像する他の手法（例えば、各種の電子顕微鏡方式）も、本明細書に記載の実施形態で利用できることに注目すべきである。
【００４２】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験は、癌とマイクロＲＮＡの変化の間に相関関係があることを実証している。ただし、本発明は分子マーカーの種類による制限を受けず、超微細構造変化と他の種類の分子マーカーの間の相乗作用は、本発明の範囲に含まれる。超微細構造マーカーと相乗作用し得る分子マーカー候補の例として、メチル化、エピジェネティックマーカー、遺伝子産物等が挙げられる。分子（例えばマイクロＲＮＡ）マーカーと超微細構造（例えば光学）マーカー間の相乗作用は、結腸内フィールド発癌に限定されない。本発明の実施形態の開発中に実施した実験では、むしろ、この相乗作用は、より普遍的な癌現象を示すことが実証されている。本発明の実施形態の開発中、結腸粘膜細胞に対する実験に加えて他の実験も実施し、肺癌および卵巣癌において、この２種類のマーカー間の相乗作用を実証した。
【００４３】
実験により、肺癌のフィールド発癌が口腔（頬側粘膜）で発見できることが実証されている。肺癌患者と非肺癌患者の頬側粘膜から細胞をブラシング採取した。頬側粘膜のＬｄ上昇は、肺癌の診断指標である（図１ｆを参照）。患者の一部の集団において、ブラシング採取した細胞のＰＷＳ分析とマイクロＲＮＡ分析の両方を行った。肺癌患者では、Ｌｄの上昇に加えて、ｍｉＲ−１６（減少）、ｍｉＲ−２１（減少）、ｍｉＲ−３１（減少）、ｍｉＲ−１５ａ（増加）を含むいくつかのマイクロＲＮＡレベルも変化していた。実験データは、肺癌患者のｍｉＲ−１５ａが上方制御されたことを示している（図５を参照）。この患者集団では、頬側細胞の無秩序強度も上昇していた（図５を参照）。ｍｉＲ−１５ａとＬｄのどちらも、癌群と対照群の間の１００％分離を示した。ＬｄとｍｉＲ−１５ａ間の相関係数は０．４５であり、この２つのマーカーが単なる互いの複製物ではなく、実際に相乗作用を及ぼしていることが確認された。
【００４４】
本発明の実施形態の開発中、卵管および子宮内膜のフィールド発癌を検出する実験も行った（図１ｇを参照）。子宮内膜および卵管からブラシング採取した上皮細胞において、Ｌｄが上昇していた。
【００４５】
本発明の実施形態の開発中に実施した実験より前の時点では、子宮頸部細胞内でフィールド発癌を発見できることを実証する研究は行われていない。本発明の実施形態の開発中に実施した実験では、卵巣癌患者と非卵巣癌患者の子宮頸部粘膜から細胞をブラシング採取した。卵巣癌患者の細胞で測定したＬｄは、著しく、かつ有意に上昇していた（図６ａを参照）。卵巣癌マーカーとしての子宮頸部細胞のＬｄ上昇の感度と特異度は、それぞれ８６．１１％、８０．３６％と大変良好であった。このことが示すことは、卵巣癌関連のフィールド発癌が子宮頸部に存在することに加えて、ＰＷＳによるフィールド発癌の検出が可能であり、潜在的に卵巣癌の検出とスクリーニングが可能になるという点である。患者の一部の集団において、ブラシング採取した子宮頸部細胞に対してＰＷＳ分析とマイクロＲＮＡ分析の両方を行った。卵巣癌患者では、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１８７、およびｍｉＲ−１８ａを含むいくつかのマイクロＲＮＡが上方制御されていた。これらの患者では、子宮頸部細胞の無秩序強度も上昇していた。この一部の患者集団において、ＰＷＳの感度と特異性はそれぞれ８７．５％、７５％であったが、ｍｉＲ−１２４７またはｍｉＲ−１８７と組み合わせれば、感度、特異度ともに完全な１００％に診断性能が上昇した。ＬｄとｍｉＲ−１２４７間の相関係数は０．８３であり、この２つのマーカーが単なる互いの複製物ではなく、実際に相乗作用を及ぼしていることが確認された。
〔実施例９〕
代表的な癌スクリーニング手順
いくつかの実施形態では、分子マーカーと超微細構造マーカーの組み合わせにより、癌の診断とスクリーニングに使用可能な相乗効果が得られる。いくつかの実施形態では、分子マーカーと超微細構造マーカーの組み合わせにより、いずれか一方のマーカー単独で検出するよりも高度な癌検出が得られる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いた癌スクリーニングは、以下のプロトコルまたはそのバリエーションに従って実施される。当業者であれば、本手順の適切なバリエーションを認識するであろう。さらに、本発明の範囲は、このような手順の制限を受けない。
【００４６】
分泌物または他の副産物（例えば、結腸癌スクリーニングの場合は便中結腸細胞）から、ブラシング（例えば、肺癌スクリーニングの場合は頬側面のブラシング、卵巣癌スクリーニングの場合は子宮頸部のブラシング等）により、細胞検体を取得する。抽出した細胞の一部分に対して超微細構造分析を実施して、抽出した細胞集団の中から新生組織形成マーカーを特定する。このような分析は、光学的手法（例えばＰＷＳ）または非光学的手法（例えば電子顕微鏡法）を用いて実施できる。抽出した細胞の別の一部分に対して、分子（例えばマイクロＲＮＡ）分析を行う。２種類のマーカーを別個に決定したあと、結果を単一の統合予測規則にまとめる。本発明の実施形態の開発中、結腸癌スクリーニングには便中結腸細胞、肺癌スクリーニングには口腔細胞、卵巣癌スクリーニングには子宮頸部細胞を使用して実施した実験において、超微細構造マーカー（例えば無秩序強度）の値を分子マーカー（例えば特定の診断マイクロＲＮＡのレベル）の値と合計した線形回帰に基づき、共通の予測規則を策定した。この合計が統合マーカーである。あるいは、ツリーベースの予測規則を使用することもできる。この場合、最初にマーカーのいずれか１つ（例えば超微細構造マーカー）の値を比較することにより診断決定を下す。この値が、設定されたカットオフ値より高いか低い場合、分子マーカーを検討して診断をさらに改善する。２種類のマーカー間の相乗作用には、次の２つの側面がある。ｉ）診断性能が改善される。ｉｉ）追加検体を収集する必要なしに、同一検体（例えばブラシング採取した細胞）に基づいて両タイプのマーカーを特定できる。
【００４７】
上記明細書で言及しているすべての出版物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載されている本発明の組成物および方法の種々の修正およびバリエーションは、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者には明らかになるであろう。本発明は、特定の好適な実施形態との関連で記述されているが、請求項に記載の本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解すべきである。実際、当業者にとって自明の、本発明を実施するための上記形態の種々の修正は、本発明の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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