(57)【要約】  本発明の主題は、純粋なウシ血清アルブミンモノマー、樹脂カラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とするその製造方法、及び動的光散乱(DLS)を用いるその同定方法に関する。【選択図】図１
2014514343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
12％分離ゲル中でのＳＤＳ/ＰＡＧＥ電気泳動による決定において、分析上純粋なウシ血清アルブミンモノマー。
【請求項２】
ＢＳＡ分子の直径が実質的に７ｎｍであることを特徴とする、請求項１記載の分析上純粋なウシ血清アルブミンモノマー。
【請求項３】
ウシ血清アルブミンモノマーを得る方法であって、
a)BSA調製物のサンプルの調製、
b)緩衝液、好ましくは１％ｎ-ブタノールを含むｐＨ5.65の0.1Ｍ酢酸緩衝液で平衡化した樹脂、好ましくはＨＷ-55による、工程a)で得られたサンプルの、平衡化緩衝液を用いた精製クロマトグラフィー、
を包含する、方法。
【請求項４】
工程a)が疎水性リガンドの除去、好適にはサンプルを炭素に通す工程を含むことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項５】
工程b)における精製が室温で1.2ｍｌ/10分の速度で行われることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。
【請求項６】
アルブミンを同定する方法であって、請求項１の方法を用いて得られたフラクション（分画）において動的光散乱を用いてタンパク分子径を決定することを含み、ここで、フラクションが有するＢＳＡモノマーの分子径が実質的に７ｎｍである、
ことを特徴とする、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は最も安価な市販のタンパク質の１つである。基礎研究[文献1-4]及び多くの実用的用途において、モデルタンパク質として広く用いられている。ＢＳＡの加水分解より得られる遊離アミノ酸混合物は、一般にタンパク質中のアミノ酸の組成を決定するのに用いられる。不純物として糖類が混じる可能性があるが、当該目的用の市販のＢＳＡは十分に純粋である。加水分解の結果として不純物は分解されるので、アミノ酸解析を妨げることはない。アルブミンは循環系において脂肪酸及び他の疎水性の基質の輸送体である。よって、ＢＳＡを研究で使用する前には、活性炭を用いて疎水性の不純物を除去することが重要である。ＢＳＡは評価対象細胞の超高感度画像化を促進するＧＦＰ（Green Fluorescent Protein)の検出に用いられる[6]。量子ドットで表面が共役された修飾ＢＳＡは、金属イオンの分析的検出に用いられてきた[7]。当該タンパク質は、光線力学的治療において、光線感作物質の効果的な担体であることが判明したため、炎症及び悪性新生物の治療において活性成分の輸送体として用いられる[9-12]。さらに、小分子の担体として、ＢＳＡはELISA試験での小分子の検出のために高い抗体感受性及び特異性を獲得することを可能とする、付加化合物の免疫原性を増加させる[13-14]。ＢＳＡはまた、共役ワクチンの構築にも使用される。多糖類抗体と結合後、病原体に対する効果的且つ安全なワクチンが得られる。類似の系において、ＢＳＡはまた悪性新生物の治療に用いられる[15-18]。このような用途においては、ＢＳＡは高純度でなくてはならない。特に炭水化物の不純物をなくすべきである。先の報告は、ＢＳＡの製造において高分子量の誘導体が存在することを示している[19]。高重合度の凝集体は、タンパク質と、反応性のカルボニル化合物との糖化反応の結果のように形成されることができる[20-23]。これらの不純物の凝集形成のリスクは、タンパク質中に還元糖が存在することによる可能性がある。一連の報告は、乾燥条件下及び乾燥粉末形成における熱変形の間に、フルクトース、グルコース、ラクトース及びデキストランによりタンパク質が糖化されることについて開示している[24-27]。Fischerらは、一般に臨床診療で治療用タンパク質を投与するために用いられる輸液バッグ中で、当該タンパク質をデキストロースとともに短期間インキュベーションした後、緩衝液を含む糖類成分の処方の形態で貯蔵期間中の、種々の治療用モノクローナル抗体の糖化生成物を解析した[28]。市販ＢＳＡの天然の糖化が観察された[19]。アルブミンは大部分の一般的な血清タンパクと同様に、インビボで容易に糖化を受ける[29, 30]。乾燥高温条件下での合成でのアルドヘキソースとＢＳＡの反応時にも、凝集が観察されている[31]。進行した糖化生成物は、ＢＳＡと、グルコース及びフルクトースとのインキュベーションに続いて検出された[25, 29, 31, 32]。サッカライドが混入された市販のＢＳＡ製造物のＧＬＣ-ＭＳ解析は、マンノース、グルコース及びガラクトースのモル比が各1:1.6:1の存在比で行われた場合、アルドチオール酢酸（aldothiol acetateｓ）の存在を開示した。ラクトース存在下でのインキュベーション後、ＢＳＡ中でガラクトースが産生することは先の報告で説明されている[26]。タンパク質の単離方���として、タンパク質の分子サイズ[19]、表面電荷[33]、及び与えられた担体に対する親和性[34]を利用する様々な方法が知られている。純粋なアルブミンモノマーを市販のアルブミン調製物から単離する方法は知られていない。アガロースゲル電気泳動により決定された試薬の物性で純度98％と表示されていても、ＳＤＳ/ＰＡＧＥ変性電気泳動[35]は、より高い分子量を伴うタンパク質誘導体の存在を示す。市販調製物ではCohn fraction V (Sigma, A7888, Poland)が高分子量の形態として知られている[19]。ＢＳＡモノマーを高分子タンパク質凝集体から単離する方法としては、デキストランゲルのSephadex G-200(Pharmacia, Sweden)が封入されたカラムに、ＰＢＳ（生理食塩水リン酸緩衝液、phosphate buffer saline ）、0.02％ＮａＮ3含有、室温pH7.5に平衡化させたものにより分画する方法が説明されている[19]。しかし、0.25％のサッカライドの混入が確認された[19]。そのため、Sephadex G-200を分子ふるい（molecular sieve）として用いることは好ましくない。なぜなら、単離されたタンパク質における不純物としてのサッカライドの混入量は、ゲル由来のデキストラン分子の沈殿、タンパク質修飾及び他の反応により増加するためである。先の報告によれば、ＢＳＡはメイラード（Maillard)反応を経由してデキストランにより修飾されることができ、様々の分子量のＢＳＡ-デキストラン共役結合体を形成することができる[36]。市販のＢＳＡ調製物中にサッカライド共役体及び高分子量誘導体が存在することは、それらの分子生物学の基礎研究の使用を妨げる。この理由のため、市販の調製物から、単量体且つサッカライドを含まない状態のＢＳＡを得る単純な方法を設計する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
驚くべきことに、本発明により前記の問題を解決することができた。
【０００３】
本発明の第１の主題は、分析上純粋なウシ血清アルブミンモノマーであって、12％分離ゲルでのＳＤＳ/ＰＡＧＥを介する電気泳動で検出されるサッカライドの混入を含まないものである。分析上純粋であるとは、前記の方法で検出した場合に、サッカライドの混入が存在しないことを意味する。同様に好ましくは、本発明による純粋なウシ血清アルブミンモノマーは分子径が実質的に７ｎｍであることを特徴とする。
【０００４】
本発明の第２の主題は、ウシ血清アルブミンモノマーの単離方法であって、以下：a) ＢＳＡサンプルの調製、b) 緩衝液、好ましくは1％ブタノールを含むｐＨ5.65の0.1Ｍ酢酸緩衝液で平衡化した樹脂、好ましくはＨＷ-55による、工程a)で得られたサンプルの、平衡化緩衝液を用いた精製クロマトグラフィー、を包含する。同様に好ましくは、本発明の方法は、工程a)において疎水性リガンドの除去、好適にはサンプルを炭素に通す工程を含むことを特徴とする。同様に好ましくは、工程b)における精製が室温で1.2ｍｌ/10分の速度で行われることを特徴とする。
【０００５】
本発明の第３の主題は、アルブミンの同定方法であって、本発明の方法を用いて得られたフラクション（分画）において動的光散乱を用いてタンパク分子径を決定することを含み、ここでフラクションが有するＢＳＡモノマーの分子径が実質的に７ｎｍであることを特徴とする。
【０００６】
本発明により得られたＢＳＡモノマー分画の主な利点は、結果物のタンパク質が均一であり且つサッカライドの混入が無いことである。結果物のタンパク質の均一性は従来の変性電気泳動により決定され、さらにＨＷ-55Ｓカラムより動的光散乱（ＤＬＳ）を経て得られた画分中の、タンパク質の分子径を決定することにより確認された[37]。分子径の値は、ＢＳＡの存在を支持するものであり、先行文献のデータとも整合していた[38]。ＤＬＳを介した結果物のＢＳＡモノマーの同定は、結果物のアルブミン画分の均一性（％）を同時に決定可能であるという点で好ましい。最大の利点は従来のＳＤＳ/ＰＡＧＥを経る純度分析と比較して時間が短縮できることである。得られたＢＳＡモノマー画分のサッカライド含有量の総量を決定するために、酸フェノール法[39]を用いることが好ましい。得られた調製物中にサッカライドの混入がないことは、本発明の目的の方法が、実施例に不利な方法として記載した他の２つのウシアルブミンモノマーの単離方法よりも、有利であることの証明となる。加えて、本発明の市販製品からＢＳＡモノマーを単離する方法は、簡素な手順且つ低価格である点で有利である。
【０００７】
本発明の実施態様の例を以下に図示する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は市販ＢＳＡ（Sigma-Aldrich A3294）の溶出プロファイルを示す：A)クロマトグラフィーHW-55S処理後、B)ゲル濾過Sephadex G-200処理後、C)アニオン交換クロマトグラフィーDEAE-Sephadex A-50処理後。
【０００９】
【図２】図２はBSAサンプルの12％分離ゲルにおけるSDS-PAGE分析を示す。レーン1）タンパク質分子量標準マーカー;レーン2）6μｇ市販ＢＳＡサンプル（Sigma-Aldrich A3294）；レーン3）及び4）各々HW-55Sクロマトグラフィーで得られた3μｇ画分A及びB；レーン5）6μｇのHW-55Sカラムから溶出された画分C；レーン6）及び7）各々Sephadex G-200カラム処理後の2μｇ各画分A及びB；レーン8）Sephadex G-200処理後画分より得られた3μｇ画分C；レーン9）、10）及び11）DEAE-Sephadex A-50精製処理後の9-100, 115-123, 及び124-150の2μｇ画分。
【００１０】
【図３】図３はクロマトグラフィーHW-S精製画分のウシアルブミンタンパク質分子径及び純度値の動的光散乱(DLS)分析を示す。A) カラムより溶出されたタンパク質分子の直径：実線と黒塗三角形の折れ線グラフは画分中のタンパク質の含有量としてA280吸収を示し、実線と黒塗正方形の折れ線グラフは分子径を示し、中心の破線はウシアルブミンの参照として直径７nmを示す。B) タンパク質画分の純度値の決定(%)-画分58-60の灰色の棒グラフは参照のウシアルブミン(7nm)及び100％純度を意味する。
【００１１】
【図４】図４はコアオリゴ糖で修飾されたＢＳＡ（37℃、16時間以上、200倍モルの過剰オリゴ糖によるタンパク質修飾）の、12％SDS/PAGEゲルにおける電気泳動を示す。レーン1-タンパク質量標準；レーン2-オリゴ糖とともにインキュベートされた市販ＢＳＡ；レーン3及び4-オリゴ糖の無い理想的な条件下でインキュベートした、市販の及びモノマーのＢＳＡ（ＨＷ55Ｓカラムで精製後に得られたもの）の各対照サンプル；レーン5-オリゴ糖で修飾されたＢＳＡモノマー。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の主題は、ＢＳＡモノマーをSigma-Aldrich製（Cohn fraction V, A3294, 98%以上の純度、アガロースゲル電気泳動を用い製造元により決定）より単離する例に関する実施形態の例に示される。クロマトグラフィーによる分別の前に、可能性のある疎水性リガンド、例えば脂肪酸、を除去するために、市販ＢＳＡサンプルを炭素に通した。単糖類の値はＢＳＡ0.7％において酸フェノール法を用いて測定された（表１）。
【実施例】
【００１３】
実施例１．市販調製物サンプルより、HW-55レジンのカラムを用いた、ＢＳＡモノマーの単離方法
【００１４】
0.1M酢酸緩衝液（pH5.65, 1%n-ブタノール含有）で平衡化されたHW-55Sレジン（Toyopearl, Tosh Bioscience)が充填されたカラム（1.6x100cm）の頂部に、60ｍｇの市販ＢＳＡをロードした。12％SDS/PAGE分析により市販製品の多分散性を決定した：分子量69kDaのアルブミンモノマーに加え、分子量(MW)が200kDa及びそれ以下の分子量の誘導体の凝集の存在を確認した（図2、レーン2）。室温、流速1.2ml/10分で、タンパク質はカラムより平衡化用の緩衝液とともに流出した。ピークD（図1A）におけるカラムからの流出画分において、電気泳動での移動度がアルブミン（分子量69kDa）に相当する相同性タンパク質の存在を確認し、解析は12％SDS/PAGEにおける電気泳動を用いて行った（図2、レーン）。単離したタンパク質は新しい方法、Zeta-seizer NanoZS analyzer (Malvern, GB)による動的光散乱（DLS）を用いてタンパク質の分子径を決定することにより、アルブミンと同定された。HW-55Sカラムで収集された画分53-58において、観察された分子径は7nmであり（図3、実線-黒塗四角形の折れ線グラフ）、これはBSAモノマーの文献データと一致した[39]。
【００１５】
実施例２．市販調製物サンプルより、Sephadex G200 ポリデキストランゲル(Amersham Pharmacia)分子ふるいを用いた、ＢＳＡモノマーの単離方法
【００１６】
PBS（リン酸緩衝液-生理食塩水、pH7.5, 0.02%アジ化ナトリウム含有）で平衡化されたSephadex G200が充填されたカラム頂部に、50ｍｇの市販ＢＳＡをロードした。タンパク質の溶出は平衡化された緩衝液により室温、流速1.2ml/10分で行った。アルブミン画分が３つのタンパク質のピークより流出されたという事実より、市販ＢＳＡとの非相同性が証拠づけられた（図1Ｂ）。SDS/PAGE分析を行った結果、ピークCにおいてＢＳＡを検出した（図2、レーン8）。ロードされた市販調製物の重量の60％を構成した。フェノール法を用いて検出されたサッカライド含有量は、モノマータンパク質中の場合サッカライドの約１％であり、市販サンプル中の場合よりも僅かに高く、デキストランの混入の結果であることを示している。このことは、Sephadex G-gelを通す濾過は純粋なＢＳＡモノマーを得るためには不適切であることの証拠となる。
【００１７】
実施例３．市販調製物サンプルより、DEAE-Sephadex A-50アニオンゲル(Amersham Pharmacia)イオン交換クロマトグラフィーを用いた、ＢＳＡモノマーの単離方法
【００１８】
アニオン性ゲルDEAE-Sephadex A-50を充填され、0.02Mリン酸緩衝液pH8.0にて平衡化されたカラム(3 x 25 cm)に、600mgの市販ＢＳＡを、1mlの緩衝液に溶解させロードした。アルブミンをイオン交換体と混合させ濃度勾配0.02-0.3Ｍのリン酸pH8.0により溶出させた。タンパク質は1ｍｌ/20分の速度で溶出させ、溶出緩衝液が低濃度の範囲のピークA（図1C）は電気泳動上では均一であった（図2、レーン9）。12％SDS/PAGE分析は、市販タンパク質の高い分子量の凝集が、リン酸の高濃度勾配、ピークCにおいて溶出したことを示した（図2、レーン11）。恐らく炭化水素による非酵素的なタンパク質修飾（糖化）により、形成されたタンパク質誘導体は、より陰性の電荷（利用できる塩基性のアミノ酸残基が糖化試薬によりブロックされる）を有し、アニオン性ゲルに対しより強固に結合する。
ピークAの画分におけるサッカライドの総含有量はフェノール法を用いて0.9％と決定された（表１）。このため、DEAE-Sephadexのようなアニオン交換体の利用は、純粋なBSAモノマーを得るのに利用するのに優れているとはいえない。
【００１９】
実施例４．本発明の顕著な効果を示す、赤痢菌（Shigella sonnei PhII)のリポポリ多糖類のオリゴ糖中心との複合糖質形成における、ＢＳＡモノマーの使用例
【００２０】
市販ＢＳＡサンプル及びアルブミンモノマー（HW-55Sによる分離処理後に得られたもの)を細菌性オリゴ糖（オリゴ糖に対するタンパク質のモル比が1:200）の存在下37℃16時間インキュベートした。修飾条件は先の報告[22,23]に基づいて選択し、反応生成物は12%分離ゲル上のSDS/PAGEを用いた電気泳動により分析した。オリゴ糖存在下インキュベートしたＢＳＡモノマーサンプルにおいて複合糖質が確認されたが、一方、オリゴ糖を含まない対照サンプルにおいてそのような生成物は生成しない（図4、各レーン5及び4）。市販ＢＳＡ製造物の修飾結果のように、図4のレーン2に見られる、分子量の範囲が130-150kDaの範囲である複合糖質が得られた。類似の組成物が、強度がより弱いものの、未処理のオリゴ糖対照の市販サンプル中に確認された（図4、レーン3）。実際、市販のＢＳＡをタンパク質修飾の評価におけるモデルタンパク質として使用すると、結果に大きくバイアスがかかるため除外するべきである。純粋なＢＳＡのみでないと、適切な結果を得ることはない。このため、市販製品からの単離にはＨＷ55-Ｓレジンを用いることが好ましい。
【００２１】
【表１】
2014514343.tif 000003
【００２２】
参考文献
【表２】
2014514343.tif 000004
【表３】
2014514343.tif 000005
【表４】
2014514343.tif 000006
【図１】
2014514343.tif 000007
【図２】
2014514343.tif 000008
【図３】
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【図４】
2014514343.tif 000010
【国際調査報告】
2014514343.tif 000011
2014514343.tif 000012
2014514343.tif 000013