(57)【要約】  本願はケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドおよびケモカイン−ポリマーコンジュゲートに向けられる。融合ポリペプチドおよびコンジュゲートは、ケモカイン受容体媒介性疾患を治療すること、および炎症、炎症細胞運動性、癌細胞運動性、または癌細胞生存を調節するために使用することができる。【選択図】図１
2014518632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、
ヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL15, CCL16, CCL17, CCL 18, CCL19, CCL20-1, CCL20-2, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-1, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL25-3, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体からなる群から選択されるケモカイン部分；および
ヒトＩｇＧ１の定常領域（ＩｇＧ１Ｆｃ）、ヒトＩｇＧ２の定常領域（ＩｇＧ１Ｆｃ）、ヒトＩｇＧ３の定常領域（ＩｇＧ１Ｆｃ）、ヒトＩｇＧ４の定常領域（ＩｇＧ１Ｆｃ）、およびその機能的変異体からなる群から選択される免疫グロブリン部分を含む前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドがCCL2-IgG1Fc, var-CCL2-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, var-CCL2-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, var-CCL2-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, var-CCL2-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, var-CCL7-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, var-CCL7-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, var-CCL7-IgG3Fc, CCL7-IgG4Fc, var-CCL7-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, var-CCL8-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, var-CCL8-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, var-CCL8-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, var-CCL8-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, var-CCL13-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, var-CCL13-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, var-CCL13-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, var-CCL13-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, var-CCL25-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, var-CCL25-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, var-CCL25-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, var-CCL25-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, var-CXCL11-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, var-CXCL11-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, var-CXCL11-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, var-CXCL11-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, var-CXCL13-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, var-CXCL13-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, var-CXCL13-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, 及び var-CXCL13-IgG4Fcからなる群から選択されることを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドがCCL2-IgG1Fc, CCL2(5-76)-IgG1Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, CCL2(5-76)-IgG2Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, CCL2(5-76)-IgG3Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, CCL2(5-76)-IgG4Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, CCL7(5-76)-IgG1Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, CCL7(5-76)-IgG2Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, CCL7(5-76)-IgG3Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL7-IgG4Fc, CCL7(5-76)-IgG4Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, CCL8(5-76)-IgG1Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, CCL8(5-76)-IgG2Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, CCL8(5-76)-IgG3Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, CCL8(5-76)-IgG4Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, CCL13(5-75)-IgG1Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, CCL13(5-75)-IgG2Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, CCL13(5-75)-IgG3Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, CCL13(5-75)-IgG4Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, CCL25(4-127)-IgG1Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, CCL25(4-127)-IgG2Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, CCL25(4-127)-IgG3Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, CCL25(4-127)-IgG4Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, CXCL11(4-73)-IgG1Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, CXCL11(4-73)-IgG2Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, CXCL11(4-73)-IgG3Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, CXCL11(4-73)-IgG4Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, CXCL13(3-87)-IgG1Fc, CXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, CXCL13(3-87)-IgG2Fc, CXCL13(3-87K/H→A)-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, CXCL13(3-87)-IgG3Fc, CXCL13(3-87K/H→A)-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, CXCL13(3-87)-IgG4Fc, 及び CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fcからなる群から選択されることを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドがペグ化融合ポリペプチドであることを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記ペグ化融合ポリペプチドが少なくとも約５００，０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項４に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、ＰＥＧ分子を含む少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有する前記ペグ化融合ポリペプチドを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項７】
請求項４に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記ペグ化融合ポリペプチドが約１０：１以下のＰＥＧ対融合ポリペプチドモル比を有することを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項４に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記ペグ化融合ポリペプチドが約５：１以下のＰＥＧ対融合ポリペプチドモル比を有することを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項４に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記ペグ化融合ポリペプチドが約２：１以下のＰＥＧ対融合ポリペプチドモル比を有することを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、前記ケモカインの機能的変異体がＮ末端切断を含むことを特徴とする前記分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の前記ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする分離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３に記載の前記ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする分離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
発現ベクターであって：
調節因子；および
前記調節因子と機能的に連鎖するポリヌクレオチドを含み、
前記ポリヌクレオチドが請求項１に記載の前記ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする前記発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の前記発現ベクターであって、前記ベクターがプラスミドベースの発現ベクターであることを特徴とする前記発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の前記発現ベクターであって、前記ベクターがウイルスベースの発現ベクターであることを特徴とする前記発現ベクター。
【請求項１６】
医薬組成物であって：
請求項１に記載の前記ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド；および
医薬品として許容できる担体を含む前記医薬組成物。
【請求項１７】
医薬組成物であって：
請求項１３に記載の前記発現ベクター；および
医薬品として許容できる担体を含む前記医薬組成物。
【請求項１８】
対象におけるケモカイン受容体媒介性障害を治療するための方法であって：
請求項１６に記載の前記医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む前記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記方法であって、前記ケモカイン受容体媒介性障害が白血病、癌腫、黒色腫、肉腫およびリンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項２０】
対象における炎症を調節するための方法であって、
請求項１に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む前記方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の前記方法であって、前記炎症が中枢または末梢神経系の炎症；尿生殖器系の炎症；消化器系の炎症；呼吸器系の炎症；皮膚、外皮および筋骨格系の炎症；心血管系の炎症；自己免疫性障害；ネコひっかき病；眼感染症；ライム病；リンパ節症；リンパ感染症；放射線誘発性炎症；サルコイドーシス；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス；および細菌感染症および炎症性分子によって引き起こされるｉ炎症からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項２２】
対象におけるケモカイン受容体媒介性障害を治療するための方法であって：
前記対象にペグ化ケモカインまたはペグ化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドの有効量を投与することを含み、前記ケモカインがヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL19, CCL21, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の前記方法であって、前記ペグ化ケモカインがCCL2-PEG, var-CCL2-PEG, CCL7-PEG, var-CCL7-PEG, CCL8-PEG, var-CCL8-PEG, CCL13-PEG, var-CCL13-PEG, CCL25-PEG, var-CCL25-PEG, CXCL11-PEG, var-CXCL11-PEG, CXCL13-PEG, var-CXCL13-PEG, CXCL16- PEG, 及び var-CXCL16-PEGからなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の前記方法であって、前記ペグ化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドがCCL2-IgG1Fc, var-CCL2-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, var-CCL2-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, var-CCL2-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, var-CCL2-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, var-CCL7-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, var-CCL7-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, var-CCL7-IgG3Fc, CCL7-IgG4Fc, var-CCL7-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, var-CCL8-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, var-CCL8-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, var-CCL8-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, var-CCL8-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, var-CCL13-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, var-CCL13-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, var-CCL13-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, var-CCL13-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, var-CCL25-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, var-CCL25-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, var-CCL25-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, var-CCL25-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, var-CXCL11-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, var-CXCL11-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, var-CXCL11-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, var-CXCL11-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, var-CXCL13-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, var-CXCL13-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, var-CXCL13-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, 及び var-CXCL13-IgG4Fcからなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年６月１日に出願された米国特許仮出願第６１／４９２，２６０号明細書の優先権を主張する。前述の出願はその全文を本願に参照文献として援用する。
【０００２】
本願は、全般的にケモカイン受容体媒介性疾患を治療すること、および炎症、炎症細胞運動性、癌細胞運動性、または癌細胞生存を調節するために使用することのできる組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ケモカインは、細胞の種類のうちとりわけマクロファージ、ＴおよびＢリンパ球、好酸球、好塩基球および好中球を誘引および活性化するために、幅広い細胞によって分泌される分子量６〜１５ｋＤａの走化性サイトカインである。アミノ酸配列のはじめの２つのシステインが単一のアミノ酸によって隔てられるか（ＣＸＣ）、または隣接するか（ＣＣ）に応じてＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、およびＣＸ３Ｃの４クラスがある。Ｃケモカインは、他のケモカインと異なり、２個のシステインのみ；Ｎ末端に１個および下流に１個を有する。唯一のＣＸ３ＣケモカインであるＣＸ３ＣＬ１は、２つのＮ末端システインの間に３個のアミノ酸を有する。インターロイキン−８（ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８）、好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２／ＣＸＣＬ７）および黒色腫成長刺激タンパク質（ＭＧＳＡ／ＣＸＣＬ１）などのＣＸＣケモカインは主として好中球およびＴリンパ球に対して走化性である一方、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＭＣＰ−２／ＣＣＬ８、ＭＣＰ−３／ＣＣＬ７、ＭＣＰ−４／ＣＣＬ１３、およびＭＣＰ−５／ＣＣＬ１２）およびエオタキシン（−１／ＣＣＬ１１および−２／ＣＣＬ２４）などのＣＣケモカインは、細胞の種類のうちとりわけマクロファージ、Ｔリンパ球、好酸球、樹状細胞、および好塩基球に対して走化性である。主要なケモカインサブファミリーＣＸＣおよびＣＣのいずれにも属さないケモカインであるリンフォタクチン−１／ＸＣＬ１、リンフォタクチン−２／ＸＣＬ２（いずれもＣケモカイン）、およびフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＬ１（ＣＸ３Ｃケモカイン）も存在する。
【０００４】
ケモカインは、「ケモカイン受容体」と命名される、Ｇタンパク質共役７回膜貫通型ドメインタンパク質のファミリーに属する特異的細胞表面受容体と結合する。その同族リガンドと結合した時、ケモカイン受容体は関連する三量体Ｇタンパク質を経て細胞内シグナルを伝達し、これにより反応の中でもとりわけ細胞内カルシウム濃度の急速な上昇、細胞の形状の変化、細胞接着分子の発現の増加、脱顆粒、および細胞遊走の促進がもたらされる。
【０００５】
ケモカイン受容体は、炎症、感染、および癌、喘息およびアレルギー性疾患を含む免疫調節障害および疾患、さらには関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症などの自己免疫病理の重要なメディエーターであると意味づけられてきた。たとえば、ケモカイン受容体ＣＣＲ３はアレルギー性炎症部位に好酸球を誘引し、さらにその後これらの細胞を活性化する際に中心的な役割を果たす。ＣＣＲ３のケモカインリガンドは細胞内カルシウム濃度の急速な上昇、細胞接着分子の発現の増加、細胞脱顆粒化、および好酸球遊走の促進を誘導する。もう１つのケモカイン受容体ＣＣＲ２は癌の進行に寄与し、かつ腫瘍細胞増殖または走化性を誘導しうる。したがって、ケモカイン受容体を調節する物質はこのような障害および疾患に対して有用であろう。
【０００６】
ケモカインは、たとえば腫瘍血管新生および成長などの誘導を含む細胞増殖性障害の病因とも関係している。多くの腫瘍細胞は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、およびＣＣＲ９などのケモカイン受容体を発現することも示され、またしたがって腫瘍細胞は分泌されたケモカインに反応する際にそれ自体の成長、遊走、および／または浸潤を促進することがある。
【０００７】
ケモカインは損傷された組織に白血球を動員する上で重要であり、かつ創傷治癒プロセスにおいて重要な役割を果たす。糖尿病患者における創傷治癒の障害は、初期炎症細胞浸潤の低下を伴いながらも好中球およびマクロファージが残存し、慢性的な非治癒損傷に至る。ケモカインは：成長因子発現、血管新生、細胞外基質形成、および再上皮化の障害を含めた糖尿病性創傷治癒の多くの異なる側面に対し、直接的に、および炎症を媒介して影響を及ぼしうる。創傷における一定のケモカイン受容体の発現は治癒を促進し、かつ手術、慢性潰瘍、および他の病状の文脈において有益となりうる。
【０００８】
したがって、ケモカイン受容体は新規抗炎症および抗腫瘍、さらには抗血管新生、血管新生および創傷治癒剤の開発にとって有望な目標を示す。したがって、ケモカイン受容体の活性を調節することのできる組成物に対するニーズが残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願の１つの態様は、ケモカイン部分および免疫グロブリン部分を有する分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、ケモカイン部分がヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL15, CCL16, CCL17, CCL 18, CCL19, CCL20-1, CCL20-2, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-1, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL25-3, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体からなる群から選択されるケモカインを含むことを特徴とし、かつ免疫グロブリン部分がヒトＩｇＧ１の定常領域、ヒトＩｇＧ２の定常領域、ヒトＩｇＧ３の定常領域、ヒトＩｇＧ４の定常領域、およびその機能的変異体からなる群から選択されるペプチドを含むことを特徴とする分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドに関する。１つの実施形態においては、分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドはペグ化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドである。
【００１０】
１つの具体的実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドはCCL2-IgG1Fc, CCL2(5-76)-IgG1Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL2- IgG4Fc, CCL2(5-76)- IgG4Fc, CCL2(5-76K/H→A)- IgG4Fc, CCL7- IgG1Fc, CCL7(5-76)- IgG1Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL7-IgG4Fc, CCL7(5-76)-IgG4Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, CCL8(5-76)-IgG1Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG1Fc, CCL8-IgG4Fc, CCL8(5-76)-IgG4Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, CCL13(5-75)-IgG1Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc, CCL13-IgG4Fc, CCL13(5-75)-IgG4Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, CCL25(4-127)-IgG1Fc, CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG1Fc, CCL25-IgG4Fc, CCL25(4-127)-IgG4Fc, CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, CXCL11(4-73)-IgG1Fc, CXCL11(4-73K/R→A)-IgG1Fc, CXCL11-IgG4Fc, CXCL11(4-73)-IgG4Fc, CXCL11(4-73K/R→A)-IgG4Fc, CXCL12α-IgG1Fc, CXCL12α(3-67)-IgG1Fc, CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG1Fc, CXCL12α-IgG4Fc, CXCL12α(3-67)-IgG4Fc, CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, CXCL13(3-87)-IgG1Fc, CXCL13(3-87K/R→A)-IgG1Fc, CXCL13-IgG4Fc, CXCL13(3-87)-IgG4Fc, 及び CXCL13(3-87K/R→A)-IgG4Fcからなる群から選択される。
【００１１】
本願の他の態様は、ケモカイン部分および免疫グロブリン部分を有するケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする分離ポリヌクレオチドであって、ケモカイン部分がヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL19, CCL21, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体から選択されるケモカインを含み、かつ免疫グロブリン部分がヒトＩｇＧ１の定常領域（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）、ヒトＩｇＧ２の定常領域（ｈＩｇＧ２Ｆｃ）、ヒトＩｇＧ３）の定常領域（ｈＩｇＧ３Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４の定常領域（ｈＩｇＧ４Ｆｃ）およびその機能的変異体からなる群から選択されるペプチドを含むことを特徴とする分離ポリヌクレオチドに向けられる。
【００１２】
具体的な実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする分離ポリヌクレオチドはCCL2-IgG1Fc, CCL2(5-76)-IgG1Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, CCL2(5-76)-IgG2Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, CCL2(5-76)-IgG3Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, CCL2(5-76)-IgG4Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, CCL7(5-76)-IgG1Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, CCL7(5-76)-IgG2Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, CCL7(5-76)-IgG3Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG3Fc,CCL7-IgG4Fc, CCL7(5-76)-IgG4Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, CCL8(5-76)-IgG1Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG1Fc, CCL8-IgG1Fc, CCL8(5-76)-IgG1Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, CCL8(5-76)-IgG2Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, CCL8(5-76)-IgG3Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, CCL8(5-76)-IgG4Fc, CCL8(5-76K/H/R→A)-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, CCL13(5-75)-IgG1Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, CCL13(5-75)-IgG2Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, CCL13(5-75)-IgG3Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, CCL13(5-75)-IgG4Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, CCL25(4-127)-IgG1Fc, CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, CCL25(4-127)-IgG2Fc, CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, CCL25(4-127)-IgG3Fc, CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, CCL25(4-127)-IgG4Fc, CCL25(4-127K/H/R→A)-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, CXCL11(4-73)-IgG1Fc, CXCL11(4-73K/R→A)-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, CXCL11(4-73)-IgG2Fc, CXCL11(4-73K/R→A)-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, CXCL11(4-73)-IgG3Fc, CXCL11(4-73K/R→A)-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, CXCL11(4-73)-IgG4Fc, CXCL11(4-73K/R→A)-IgG4Fc, CXCL12α-IgG1Fc, CXCL12α(3-67)-IgG1Fc, CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG1Fc, CXCL12α-IgG2Fc, CXCL12α(3-67)-IgG2Fc, CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG2Fc, CXCL12α-IgG3Fc, CXCL12α(3-67)-IgG3Fc, CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG3Fc, CXCL12α-IgG4Fc, CXCL12α(3-67)-IgG4Fc, CXCL12α(3-67K/R→A)-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, CXCL13(3-87)-IgG1Fc, CXCL13(3-87K/R→A)-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, CXCL13(3-87)-IgG2Fc, CXCL13(3-87K/R→A)-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, CXCL13(3-87)-IgG3Fc, CXCL13(3-87K/R→A)-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, CXCL13(3-87)-IgG4Fc, 及び CXCL13(3-87K/R→A)-IgG4Fcからなる群から選択される。
【００１３】
本願のさらなる態様は、（１）本願のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドまたは本願のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする発現ベクター、および（２）医薬品として許容できる担体を含む医薬組成物に向けられる。
【００１４】
本願のさらなる態様は、対象におけるケモカイン受容体媒介性障害を治療するための方法であって、前記対象に本願の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法に向けられる。
【００１５】
本願の他の態様は、対象における炎症を調節するための方法であって、前記対象に本願の医薬組成物の有効量を投与することを含む含む方法に関する。
【００１６】
本願の他の態様は、対象におけるケモカイン受容体媒介性障害を治療するための方法であって、ケモカインがヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL19, CCL21, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体からなる群から選択されることを特徴とするペグ化ケモカインの有効量を前記対象に投与することを含む方法に関する。
【００１７】
さらなる実施形態においては、ペグ化ケモカインはCCL2-PEG, var-CCL2-PEG, CCL7-PEG, var-CCL7-PEG, CCL8-PEG, var-CCL8-PEG, CCL13-PEG, var-CCL13-PEG, CCL25-PEG, var-CCL25-PEG, CXCL11-PEG, var-CXCL11-PEG, CXCL13-PEG, var-CXCL13-PEG, CXCL16- PEG, 及び var-CXCL16-PEGからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａは発現ベクターｐＣＣＬ２．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｆｃ領域はＩｇＧのＨ鎖およびヒンジ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ヒンジはＦｃ−融合タンパク質の２つの部分の間の可動性スペーサーとして働き、分子の各部分が独立して機能することを可能とする。ｈＥＦ１−ＨＴＬＶ  ｐｒｏｍは、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）コアプロモーター１およびヒトＴ細胞白血球ウイルス（ＨＴＬＶ）１型長末端反復２のＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）のＲセグメントおよび一部を含む複合プロモーターである。ＥＦ−１αプロモーターは強力な活性を示しかつ生体内で導入遺伝子の長期持続的発現を得る。Ｒ−Ｕ５’はＥＦ−１αコアプロモーターと共役してＲＮＡの安定性を高める。ＭＣＳ：複数のクローニング部位。ＳＶ４０  ｐＡｎ：サルウイルス４０後期アデニル化シグナル。ｏｒｉ：最小Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点。ＣＭＶ  ｅｎｈ  ／  ｈＦｅｒＬ  ｐｒｏｍ：この複合プロモーターはヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子１エンハンサーおよびヒトフェリチンＬ鎖遺伝子のコアプロモーターを複合する。この遍在性プロモーターは、哺乳類細胞においてゼオシン（登録商標）抵抗性遺伝子の発現を駆動する。ＥＭ２ＫＣは、Ｅ．ｃｏｌｉの抗生物質抵抗性遺伝子の構成的発現を可能とする細菌プロモーターである。ＥＭ２ＫＣはイントロン内に位置し、哺乳類細胞中でスプライシングで切り出される。Ｚｅｏ：ゼオシン（登録商標）に対する抵抗性は、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓに由来するＳｈ  ｂｌｅ遺伝子によってもたらされる同じ抵抗性遺伝子は哺乳類細胞においてもＥ．ｃｏｌｉにおいても選択をもたらす。βＧｌｏ  ｐＡｎ：ヒトβ−グロブリン３’ＵＴＲおよびポリアデニル化配列によって、導入遺伝子転写４の効率的な停止が可能となる。Ｂは発現ベクターｐＣＣＬ２（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図１Ｃ−１】発現ベクターｐＣＣＬ２．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｃ−２】発現ベクターｐＣＣＬ２．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｄ−１】発現ベクターｐＣＣＬ２（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｄ−２】発現ベクターｐＣＣＬ２（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ２（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ２（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図２】Ａは発現ベクターｐＣＣＬ７．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＣＬ７（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図２Ｃ−１】発現ベクターｐＣＣＬ７．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｃ−２】発現ベクターｐＣＣＬ７．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｄ−１】発現ベクターｐＣＣＬ７（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｄ−２】発現ベクターｐＣＣＬ７（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ７（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ７（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図３】Ａは発現ベクターＣＣＬ８．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＣＬ８（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図３Ｃ−１】発現ベクターｐＣＣＬ８．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｃ−２】発現ベクターｐＣＣＬ８．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｄ−１】発現ベクターｐＣＣＬ８（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｄ−２】発現ベクターｐＣＣＬ８（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｅ−１】アラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ８（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｅ−２】アラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ８（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図４】Ａは発現ベクターｐＣＣＬ１３．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＣＬ１３（５−７５）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図４Ｃ−１】発現ベクターｐＣＣＬ１３．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図４Ｃ−２】発現ベクターｐＣＣＬ１３．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図４Ｄ−１】発現ベクターｐＣＣＬ１３（５−７５）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図４Ｄ−２】発現ベクターｐＣＣＬ１３（５−７５）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図４Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ１３（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図４Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ１３（５−７６）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図５】Ａは発現ベクターｐＣＣＬ２５．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＣＬ２５（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図５Ｃ−１】発現ベクターｐＣＣＬ２５．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図５Ｃ−２】発現ベクターｐＣＣＬ２５．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図５Ｄ−１】発現ベクターｐＣＣＬ２５（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図５Ｄ−２】発現ベクターｐＣＣＬ２５（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図５Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ２５（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図５Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＣＬ２５（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図６】Ａは発現ベクターｐＣＸＣＬ１１．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−７３）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図６Ｃ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｃ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｄ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−７３）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｄ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−７３）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図７】Ａは発現ベクターｐＣＸＣＬ１１．ｈＩｇＧ４Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−７３）．ｈＩｇＧ４Ｆｃを描出する。
【図７Ｃ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図７Ｃ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図７Ｄ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−７３）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図７Ｄ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−７３）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図７Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−１２７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図７Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−１２７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図８】Ａは発現ベクターｐＣＸＣＬ１３．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（３−８７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図８Ｃ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｃ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｄ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（４−７３）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｄ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（４−７３）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図８Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（４−１２７）．ｈＩｇＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図９】Ａは発現ベクターｐＣＸＣＬ１３．ｈＩｇＧ４Ｆｃを描出する。Ｂは発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（３−８７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃを描出する。
【図９Ｃ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図９Ｃ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図９Ｄ−１】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（３−８７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図９Ｄ−２】発現ベクターｐＣＸＣＬ１３（３−８７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図９Ｅ−１】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−１２７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図９Ｅ−２】ＧＡＧ結合部位−ｌｙｓおよびｈｉｓの除去のためのアラニン置換を有する発現ベクターｐＣＸＣＬ１１（４−１２７）．ｈＩｇＧ４Ｆｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１０Ａ】発現ベクターｐＣＸＣＬ１６（４７−１１４）．ｈＩｇＧ１Ｆｃを描出する。
【図１１】ＣＸＣＬ１１指示潜在的ペグ化部位の構造のマンガを描出する。
【図１２−１】表１に列挙されたケモカインおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列を示す。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の詳細な説明は、任意の当業者が本発明を作製および使用することを可能とするために提示される。説明を目的として、本発明の完全な理解を提供するために具体的な名称が示される。しかし、これらの具体的な詳細は本発明を実践するために必要とされないことが当業者に明らかとなるであろう。具体的な用途の記述は代表的な実施例としてのみ提供される。本発明は示される実施形態に限定されることを意図しないが、本願に開示される原則および特性と一致する可能な限り幅広い範囲と一致すべきである。
【００２０】
特に定義しない限り、本発明と関連付けて用いられる科学的および技術的用語は当業者が共通して理解する意味を有するものとする。本願に記載されるものと類似するかまたは同等である任意の方法、機器、および材料を本願に開示される主題の実践または試験に用いることができるものの、これよりは代表的な方法、機器および材料が記載される。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含みかつ複数形の用語は単数を含むこととする。
【００２１】
特に示されない限り、明細書および請求項に用いられる成分の量、反応条件などを表現する全ての数字は、全ての場合用語「約」で修飾されると理解すべきである。したがって、逆であると示されない限り、本明細書および付属の請求項に示された数的パラメータは、本願に開示された主題によって得られることを求められる所望の特性に応じて変動しうる近似値である。
【００２２】
本願は、全般的にケモカイン受容体媒介性疾患および調節性炎症を治療するための組成物および方法に関する。具体的には、本願は、免疫、癌の進行、および炎症を調節するため、さらには組織再生、創傷修復、幹細胞恒常性、細胞増殖性障害、および炎症を含むケモカイン受容体媒介性障害を治療するためのケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカイン−ポリマーコンジュゲートおよびその使用に関する。
【００２３】
本願で用いられる用語「約」は、数値または質量、重量、時間、体積、濃度または百分率の量を意味するとき、一部の実施形態においては規定の量より±２０％、一部の実施形態においては±１０％、一部の実施形態においては±５％、一部の実施形態においては±１％、一部の実施形態においては±０．５％、一部の実施形態においては±０．１％の変動が開示された方法を実施するのに適切であるので、そのような変動を包含することを意味する。
【００２４】
本願で用いられる用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、障害および／またはその随伴症状を軽減または抑止する方法を意味する。本願で用いられる用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、対象が障害および／またはその随伴症状を獲得することを防ぐ方法を意味する。一定の実施形態においては、用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、障害および／またはその随伴症状を獲得するリスクを低減する方法を意味する。
【００２５】
薬理学的な意味においては、本発明の文脈において、組成物の「有効な量」は、その治療にとって組成物が有効である障害の予防または治療において有効である量をｅｆｅｒする。「障害」は、組成物を用いた治療により利益を受けるであろう任意の状態である。
【００２６】
治療を目的とした「哺乳類」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの家畜および畜産動物、および動物園、スポーツ、または愛玩動物を含む、哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００２７】
用語「阻害する」は相対的な用語であり、物質の投与後に反応または状態が定量的に減少する場合、または物質の投与後に参照物質と比較して減少する場合、その物質はその反応または状態を阻害する。同様に、用語「予防する」は、反応または状態の少なくとも１つの特性が消失させられる限り、物質が反応または状態を完全に消失させることを必ずしも意味しない。したがって感染、または病的反応などの反応を低減または予防する組成物は、そのような感染または反応を消失させることができるが、たとえば、物質の不在における感染または反応、または参照物質と比較して、その感染または反応が、たとえば少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、またはさらに少なくとも約９０％（すなわち１０％またはそれ以下まで）といった、少なくとも約５０％などのように測定可能に低下する限り必ずしも完全に除去することができない。
【００２８】
（ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド）
ケモカインは、運動性、浸潤、接着、増殖および生存に関与する数多くの細胞機能を媒介することが証明されている。適切なレベルおよび発現において、これらの走化性サイトカインは適切な創傷治癒、血管新生または免疫を促進する。不適切に発現した場合、これらの因子はケロイド形成、血管新生、癌細胞の転移・薬剤耐性、自己免疫、移植片拒絶反応、炎症（例：関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、ＣＯＰＤなど）、糖尿病などの慢性疾患に影響しうる。有益な機能も有害な機能も、クラスＡ、Ｇタンパク質共役受容体であるケモカイン受容体の結合および活性化によって媒介される。
【００２９】
これらの受容体の作用を遮断するために数多くの小分子拮抗物質が構築されている。注目すべきことに、これらの化合物の多くはその標的に対して高い親和性（５〜５０ｎＭ）および特異性を有する。しかし、これらの阻害物質は主として：（ｉ）疎水性および肝残留性／毒性の可能性および（ｉｉ）比較的短い半減期またはバイオアベイラビリティ（＜６時間）という２つの限界を有する。
【００３０】
本願は、臨床使用のための分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇまたはその変異体の定常領域（すなわちＣＨ２およびＣＨ３）と融合された幅広い野生型ヒトケモカインまたはその変異体を含む。ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の特定のケモカイン受容体と特異的に結合し、かつこれにより受容体の１つまたはそれ以上の生物学的活性（例：受容体活性化）を調節することができる。
【００３１】
本発明の１つの態様は、ケモカイン部分および免疫グロブリン部分を有する分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドであって、ケモカイン部分がヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL15, CCL16, CCL17, CCL 18, CCL19, CCL20-1, CCL20-2, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-1, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL25-3, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその変異体からなる群から選択されるケモカインを含むことを特徴とし、かつ免疫グロブリン部分がヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）、ヒトＩｇＧ２の定常領域、ヒトＩｇＧ３の定常領域、ヒトＩｇＧ４の定常領域およびその変異体からなる群から選択されるペプチドを含むことを特徴とする分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドに関する。上記のケモカインおよびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＦｃ領域の完全なアミノ酸配列は、以下の表１に列挙され、かつ図１２に示される。
【００３２】
【表１−１】
2014518632.tif 000003
【表１−２】
2014518632.tif 000004
【表１−３】
2014518632.tif 000005
【００３３】
いかなる具体的な作動原理とも関連付けられることを望まないが、免疫グロブリン領域は融合ポリペプチドの血清半減期またはバイオアベイラビリティを上昇させることができ、かつＦｃ部分の正確なポリペプチド配列は、血清半減期および／またはバイオアベイラビリティを最大化するよう選択することができる。さらに、異なるＩｇＧサブクラス（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に由来するＦｃ領域は異なる免疫活性を示し、かつそのため所望の免疫学的活性に基づいてＩｇＧ  Ｆｃ領域を選択することができる。たとえば、ＩｇＧ１のＦｃ領域は補体を活性化することが可能である一方、ＩｇＧ４のＦｃ領域は補体活性を低下させている。
【００３４】
したがって、各領域が示す所望の免疫学的活性に基づき、特定の用途のために特定のＦｃ領域を選択することができる。一部の具体的な実施形態においては、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域でありえる。このように、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは免疫を促進すること、自己免疫を抑制すること、炎症を抑制すること、および／または増殖性障害細胞の成長／転移を阻害することにおいて有用性を見いだす。本願は、本願に開示されるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする分離ポリヌクレオチドおよび生体内でケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを発現することのできる発現ベクターをさらに提供する。
【００３５】
用語「分離された」は、タンパク質またはポリペプチドに適用されるとき、当該タンパク質またはポリヌクレオチドが、天然状態と関連する他の細胞成分をほとんど含まないことを示す。乾燥状態か、または水溶液でありえるものの、均一な状態でありえる。均一性、および分子が分離されているかは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィなどの分析化学的技術を用いて判定することができる。製剤中に存在する主要な種のタンパク質は相当分離されている。用語「分離された」は、タンパク質またはポリヌクレオチドが１つの電気泳動ゲルにおいてほぼ１つのバンドを生成することを示す。具体的には、タンパク質またはポリヌクレオチドが、一部の実施形態において少なくとも約５０％純粋、一部の実施形態において少なくとも約８５％純粋、かつ一部の実施形態において少なくとも約９９％純粋であることを意味する。
【００３６】
用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖の形態にあるその重合体を意味する。具体的に制限されない限り、当該用語は、参照核酸と類似した結合特性を有しかつ天然に生成する核酸と類似の形態で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸を包含する。特に示さない限り、具体的な核酸配列も保存的に修飾されたその変異体（例：退化コドン置換）および補体配列、さらには明示された配列を暗黙のうちに包含する。具体的には、退化コドン置換は、１つまたはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換される配列を生成することによって達成することができる。用語「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド配列」は、遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に用いることもできる。
【００３７】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は本願において互換的に用いられ、そのサイズまたは機能にかかわらず、２０種類のタンパク質アミノ酸またはアミノ酸類縁体の重合体を意味する。「タンパク質」は相対的に大きなポリペプチドに関して用いられることが多く、かつ「ペプチド」は小さなポリペプチドに用いられることが多いものの、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複しかつ変動する。本願で用いられる用語「ポリペプチド」は、特に注記しない限りペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を意味する。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本願において遺伝子産物を意味するとき互換的に用いられる。したがって、代表的なポリペプチドは遺伝子産物、天然生成タンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変異体、および前述のものの類縁体を含む。
【００３８】
ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドのケモカイン部分は、ケモカイン受容体またはそれが結合特異性を示す受容体に基づいて選択することができる。これは、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを１つまたはそれ以上の特異的ケモカイン受容体に対して選択的に標的化し、これにより受容体の活性化およびその後の生物学的活性を調節することに備える。表１（Ａｌｌｅｎ他（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７８７−８２０より改変）は、本願に開示の主題のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドに組み入れることのできる、１つまたはそれ以上のケモカインによって標的化することのできる受容体の代表的リストを提供する。
【００３９】
表２に開示するように、一定のケモカインは２つ以上のケモカイン受容体と特異的に結合することができる。たとえば、ＣＸＣＬ１１はケモカイン受容体ＣＸＣＲ３−Ａ、ＣＸＣＲ３−Ｂ、ＣＸＣＲ７およびＤＡＲＣ／Ｄｕｆｆｙと特異的に結合することができる。このように、２つ以上のケモカイン受容体を標的とすることが望ましい場合、本願に開示の主題のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドへの組み入れのために、ＣＸＣ１１などの特定のケモカインを選択することができる。本願に開示される主題の一部の実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドはＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３およびその変異体からなる群から選択されるケモカイン部分を含むことができる。ポリペプチドの「突然変異体」は、参照ポリペプチドの変異体およびそのフラグメントを含む。
【００４０】
（表２：ケモカイン受容体およびそのリガンド）
【表２−１】
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【表２−２】
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【００４１】
用語「機能的変異体」は、たとえば１つまたはそれ以上のアミノ酸置換など、参照タンパク質またはポリペプチドと１つまたはそれ以上のアミノ酸が異なるものの、参照タンパク質またはポリペプチドの生物学的機能を相当維持しているタンパク質またはポリペプチドを意味する。本願で用いられるケモカインの機能的変異体は、元のケモカインの受容体結合機能を維持する変異体であり、かつＩｇＧのＦｃ領域の機能的変異体は、元のＦｃ領域のｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｖｌａ活性を維持する変異体である。
【００４２】
ポリペプチドの機能的変異体は元のポリペプチドのフラグメントであってもよい。用語「フラグメント」は、参照ポリペプチドに関して用いるとき、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、通常は残余のアミノ酸配列が参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に発生するか、またはその替わりに両者に発生することもある。典型的には、フラグメントは少なくとも３、５、６、８または１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０または５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、または少なくとも１００、１５０、２００、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【００４３】
用語「機能的変異体」は、保存的に置換された変異体をさらに含む。用語「保存的に置換された変異体」は、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドと異なり、かつ本願に記載される参照ペプチドの活性の一部または全てを維持するアミノ酸残基配列を含むペプチドを意味する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基の機能的に類似した残基による置換である。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの非極性（疎水性）残基の１つともう１つとの置換；アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、トレオニンとセリンなどの荷電または極性（親水性）残基の１つともう１つとの置換；リジンまたはアルギニンなどの塩基性残基の１つともう１つとの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性残基の１つともう１つとの置換；またはフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基の１つともう１つとの置換を含む。語句「保存的に置換された変異体」は、生成するペプチドが本願に記載される参照ペプチドの一部または全ての活性を維持するという前提で、１つの残基が化学的に誘導体化された残基１つで置換されることを特徴とするペプチドも含む。
【００４４】
１部の実施形態においては、本願に開示されるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、グリコサミノグリカン（例：ヘパリン、ラミニン、ＧＡＧ）−結合を消失させるアミノ酸置換を導入し、これによりポリペプチドの血清半減期を延長するためのケモカイン部分の機能的変異体を含む。たとえば一部の実施形態においては、ケモカイン部分のＧＡＧ結合部位内で１つまたはそれ以上のアラニンをリジン、アルギニンおよび／またはヒスチジンで置換することができる。
【００４５】
ケモカイン配列内に１つまたはそれ以上の突然変異を有するケモカイン変異体を含む、本願に開示される具体的なケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、それに従い具体的な突然変異を示すように命名される。たとえばケモカイン名の前の「ｖａｒ−」（例：ｖａｒ−ＣＣＬ２）は、参照ケモカイン配列（例：ＣＣＬ２）と異なるポリペプチド配列をもたらす、操作によるケモカイン部分への突然変異を有する変異体を示す。切断によって生成するフラグメント突然変異は、切断後に残る配列であると記録される。たとえば、７６アミノ酸ＣＣＬ２ケモカインのＮ−末端４アミノ酸の切断は、「ｖａｒ−ＣＣＬ２」または「ＣＣＬ２（５−７６）」と記録される。１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換によって生成する突然変異は、参照ポリペプチド中の（技術上既知である、標準的な１文字アミノ酸コードで示す）アミノ酸Ｘが、特定の残基（＃）かまたはポリペプチド全体、またはたとえばケモカインポリペプチドのＧＡＧ−結合領域などのポリペプチドの特定の領域（Ｘ→Ｙ）においてアミノ酸Ｙで置換されることを特徴とする、「Ｘ＃Ｙ」または「Ｘ→Ｙ」の形態でケモカイン名の後に挿入句として記録されるであろう。一部の実施形態においては、突然変異は参照ケモカインポリペプチドの変異体もフラグメントも含むことができる。これらの突然変異体は、命名されたポリペプチド中にケモカイン名の後に続けて挿入句として示される。たとえば、「ＣＣＬ２（５−７６Ｋ／Ｈ→Ａ）」は、Ｎ末端で切断されて残基１〜４を除去し、かつ突然変異して配列内においてアラニン（Ａ）でリジン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）を置換したＣＣＬ２ポリペプチド突然変異体をケモカイン部分に含む、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを示す。最終的に、命名法に関して、本願に開示のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、共に融合されたケモカイン部分（Ａ）および免疫グロブリン部分（Ｂ）にしたがって命名される（すなわちＡ−Ｂ）。したがって、たとえば、ＣＣＬ２−ＩｇＧＦｃはＩｇＧクラス１免疫グロブリンのＦｃ定常部分と融合された野生型ＣＣＬケモカイン部分を含むケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを意味する。
【００４６】
一部の実施形態においては、本願はヒト免疫グロブリンポリペプチドと融合されたヒトケモカインポリペプチドを提供する。一部の実施形態においては、本願は以下の新規分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを提供する：CCL2-IgG1Fc, var-CCL2-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, var-CCL2-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, var-CCL2-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, var-CCL2-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, var-CCL7-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, var-CCL7-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, var-CCL7-IgG3Fc, CCL7-IgG4Fc, var-CCL7-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, var-CCL8-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, var-CCL8-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, var-CCL8-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, var-CCL8-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, var-CCL13-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, var-CCL13-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, var-CCL13-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, var-CCL13-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, var-CCL25-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, var-CCL25-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, var-CCL25-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, var-CCL25-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, var-CXCL11-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, var-CXCL11-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, var-CXCL11-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, var-CXCL11-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, var-CXCL13-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, var-CXCL13-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, var-CXCL13-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, 及び var-CXCL13-IgG4Fc。
【００４７】
具体的な実施形態においては、本願は以下の新規分離ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを提供する：CCL2-IgG1Fc (SEQ ID NO:52), CCL2(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:53), CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:54), CCL7-IgG1Fc (SEQ ID NO:55), CCL7(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:56), CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:57), CCL8-IgG1Fc (SEQ ID NO:58), CCL8(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:59), CCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:60), CCL13-IgG1Fc (SEQ ID NO:61), CCL13(5-75)-IgG1Fc (SEQ ID NO:62), CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:63), CCL25-IgG1Fc (SEQ ID NO:64), CCL25(4-127)-IgG1Fc (SEQ ID NO:65), CCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:66), CXCL11-IgG1Fc (SEQ ID NO:67), CXCL11(4-73)-IgG1Fc (SEQ ID NO:68), CXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:69), CXCL11-IgG4Fc (SEQ ID NO:70), CXCL11(4-73)-IgG4Fc (SEQ ID NO:71), CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc (SEQ ID NO:72), CXCL13-IgG1Fc (SEQ ID NO:73), CXCL13(3-87)-IgG1Fc (SEQ ID NO:74), CXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:75), CXCL13-IgG4Fc (SEQ ID NO:76), CXCL13(3-87)-IgG4Fc (SEQ ID NO:77), 及び CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fc (SEQ ID NO:78)。
【００４８】
本願に開示される新規ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、技術上周知である多様なペプチド生成技術のいずれかを用いて生成することができる。たとえば、組換え遺伝子技術を利用して本願に開示される融合ポリペプチドを生成することができる。このように、一部の実施形態においては、CCL2-IgG1Fc, var-CCL2-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, var-CCL2-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, var-CCL2-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, var-CCL2-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, var-CCL7-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, var-CCL7-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, var-CCL7-IgG3Fc, CCL7-IgG4Fc, var-CCL7-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, var-CCL8-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, var-CCL8-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, var-CCL8-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, var-CCL8-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, var-CCL13-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, var-CCL13-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, var-CCL13-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, var-CCL13-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, var-CCL25-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, var-CCL25-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, var-CCL25-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, var-CCL25-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, var-CXCL11-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, var-CXCL11-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, var-CXCL11-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, var-CXCL11-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, var-CXCL13-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, var-CXCL13-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, var-CXCL13-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, 及び var-CXCL13-IgG4Fcisからなる群から選択されるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする分離核酸分子が提供される。
【００４９】
具体的な実施形態においては、分離核酸分子はCCL2-IgG1Fc, CCL2(5-76)-IgG1Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL2-IgG2Fc, CCL2(5-76)-IgG2Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL2-IgG3Fc, CCL2(5-76)-IgG3Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL2-IgG4Fc, CCL2(5-76)-IgG4Fc, CCL2(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL7-IgG1Fc, CCL7(5-76)-IgG1Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL7-IgG2Fc, CCL7(5-76)-IgG2Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL7-IgG3Fc, CCL7(5-76)-IgG3Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL7-IgG4Fc, CCL7(5-76)-IgG4Fc, CCL7(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL8-IgG1Fc, CCL8(5-76)-IgG1Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc, CCL8-IgG2Fc, CCL8(5-76)-IgG2Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG2Fc, CCL8-IgG3Fc, CCL8(5-76)-IgG3Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG3Fc, CCL8-IgG4Fc, CCL8(5-76)-IgG4Fc, CCL8(5-76K/H→A)-IgG4Fc, CCL13-IgG1Fc, CCL13(5-75)-IgG1Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc, CCL13-IgG2Fc, CCL13(5-75)-IgG2Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG2Fc, CCL13-IgG3Fc, CCL13(5-75)-IgG3Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG3Fc, CCL13-IgG4Fc, CCL13(5-75)-IgG4Fc, CCL13(5-75K/H→A)-IgG4Fc, CCL25-IgG1Fc, CCL25(4-127)-IgG1Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc, CCL25-IgG2Fc, CCL25(4-127)-IgG2Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG2Fc, CCL25-IgG3Fc, CCL25(4-127)-IgG3Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG3Fc, CCL25-IgG4Fc, CCL25(4-127)-IgG4Fc, CCL25(4-127K/H→A)-IgG4Fc, CXCL11-IgG1Fc, CXCL11(4-73)-IgG1Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc, CXCL11-IgG2Fc, CXCL11(4-73)-IgG2Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG2Fc, CXCL11-IgG3Fc, CXCL11(4-73)-IgG3Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG3Fc, CXCL11-IgG4Fc, CXCL11(4-73)-IgG4Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc, CXCL13-IgG1Fc, CXCL13(3-87)-IgG1Fc, CXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc, CXCL13-IgG2Fc, CXCL13(3-87)-IgG2Fc, CXCL13(3-87K/H→A)-IgG2Fc, CXCL13-IgG3Fc, CXCL13(3-87)-IgG3Fc, CXCL13(3-87K/H→A)-IgG3Fc, CXCL13-IgG4Fc, CXCL13(3-87)-IgG4Fc, 及び CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fcからなる群から選択されるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする。技術上既知であるように、融合ポリペプチド遺伝子産物をコードする異種遺伝子配列を構築するために、組換えクローニング技術を用いることもできる。
【００５０】
（発現ベクター）
本願に開示されるポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターも提供される。特に有用なベクターは、ＤＮＡセグメントのコード部分がプロモーターの調節下に位置するベクターであると意図される。プロモーターは、本願に開示される組成物と関連して、たとえば組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ技術を用いて、コードセグメントまたはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を分離することにより得られるように、たとえば哺乳類組織などにおいて、ケモカインまたは免疫グロブリンと自然に関連するプロモーターの形態にあっても良い。
【００５１】
他の実施形態においては、コードＤＮＡセグメントを組換え、または異種プロモーターの調節下に置くことによって一定の利点が得られることが意図される。本願で用いられる組換えまたは異種プロモーターは、通常はその自然な環境においてケモカインまたは免疫グロブリン遺伝子と関連しないプロモーターを意味することを意図する。そのようなプロモーターは植物、昆虫、細菌、ウイルス、真核、魚類、鳥類または哺乳類細胞から分離されるプロモーターを含みうる。当然ながら、発現のために選択された細胞型において、ＤＮＡセグメントの発現を有効に方向付けるプロモーターを採用することが重要であろう。タンパク質発現のためのプロモーターと細胞型の組み合わせの使用は、分子生物学の当業者にとって周知である。採用されるプロモーターは構成的であってもまたは誘導的であっても良く、かつ組換えタンパク質またはペプチドの大スケール製造において有益となるなどの、導入ＤＮＡセグメントの高レベル発現を方向付けるために適した条件下で用いることができる。
【００５２】
発現ベクターは、一般に転写停止のための配列を含み、かつｍＲＮＡの安定性に好ましく影響する１つまたはそれ以上の要素をさらに含むこともある。発現ベクターは、隣接するタンパク質コード領域間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含んで、感染またはトランスフェクト細胞において共通のｍＲＮＡからの２つまたはそれ以上のタンパク質の発現を促進することもある。加えて、発現ベクターはマーカー生成物をコードする核酸配列をさらに含むこともある。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されているかおよび発現されるか判定するために用いることができる。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【００５３】
一部の実施形態においては、本願の発現ベクターは、生体外環境で本願のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを発現することのできるプラスミド発現ベクターである。発現された融合ポリペプチドは、その後当業者に周知の方法を用いて分離および精製される。
【００５４】
他の実施形態においては、本願の発現ベクターは、生体内環境で本願のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを発現することのできるプラスミド発現ベクターである。これらの発現ベクターは、カチオンリポソーム（例：ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）およびアニオンリポソーム、マイクロカプセル、ナノカプセル、および電気穿孔を含むリポソームなどの送達系を用いて対象に導入することができる。一部の実施形態においては、発現ベクターは抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型に標的化される。「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（目的の細胞への脂質媒介薬剤標的化を含む）、細胞特異的リガンドを経たＤＮＡの受容体媒介標的化、またはたとえばリンパ、上皮または内皮細胞などのウイルスベクター標的化などの媒体。一般に、受容体は構成的またはリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリンコーティング小窩内でクラスタ化し、クラスリンコーティング小胞を介して細胞内に入り、その中で受容体が識別される酸性化リボソームを通過し、さらにその後細胞表面に再生されるか、細胞内に蓄積するか、またはリソソーム内で分解される。インタナリゼーション経路は、栄養素取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の排除、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、および受容体レベル調節などの数多くの機能を果たす。数多くの受容体が、細胞の種類、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの結合価、およびリガンド濃度に応じて２つ以上の細胞内経路に従う。
【００５５】
さらに他の実施形態においては、本願の発現ベクターは、生体内環境で本願のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを発現することのできるウイルスベース発現ベクターである。代表的なウイルスベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルスなどを含んでも、またはこれに由来してもよい。これらのウイルスをベクターとしての使用に適するようにするその特性を共有する任意のウイルス科も好ましい。レトロウイルスは、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ＨＩＶおよび他のレンチウイルスベクターを含む。アデノウイルスベクターは比較的安定かつ取り扱いが容易であり、力価が高く、かつエアロゾル製剤で送達が可能であり、かつ非分裂細胞をトランスフェクトすることが可能である。ポックスウイルスベクターは大きくかつ遺伝子を挿入するための部位が数カ所あり、熱に安定でありかつ室温で保存ができる。ウイルス送達系は、典型的には１つまたはそれ以上の遺伝子が除去されかつ共にかつ外因性遺伝子および／または遺伝子／プロモーターカセットが除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入されるウイルスベクターを利用する。除去された遺伝子の必要な機能は、初期遺伝子の遺伝子産物を途中で発現するよう操作されている細胞株によって提供することができる。
【００５６】
他の実施形態においては、発現ベクターはファージＤＮＡ、酵母プラスミドまたはバキュロウイルスである。
【００５７】
本願に開示されるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む代表的な発現ベクター構造を図１〜１０に示す。これらの発現ベクターはpCCL2-IgG1Fc (SEQ ID NO:79), pCCL2(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:80), pCCL2(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:81), pCCL7-IgG1Fc (SEQ ID NO:82), pCCL7(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:83), pCCL7(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:84), pCCL8-IgG1Fc (SEQ ID NO:85), pCCL8(5-76)-IgG1Fc (SEQ ID NO:86), pCCL8(5-76K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:87), pCCL13-IgG1Fc (SEQ ID NO:88), pCCL13(5-75)-IgG1Fc (SEQ ID NO:89), pCCL13(5-75K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:90), pCCL25-IgG1Fc (SEQ ID NO:91), pCCL25(4-127)-IgG1Fc (SEQ ID NO:92), pCCL25(4-127K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:93), pCXCL11-IgG1Fc (SEQ ID NO:94), pCXCL11(4-73)-IgG1Fc (SEQ ID NO:95), pCXCL11(4-73K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:96), pCXCL11-IgG4Fc (SEQ ID NO:97), pCXCL11(4-73)-IgG4Fc (SEQ ID NO:98), pCXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc (SEQ ID NO:99), pCXCL13-IgG1Fc (SEQ ID NO:100), pCXCL13(3-87)-IgG1Fc (SEQ ID NO:101), pCXCL13(3-87K/H→A)-IgG1Fc (SEQ ID NO:102), pCXCL13-IgG4Fc (SEQ ID NO:103), pCXCL13(3-87)-IgG4Fc (SEQ ID NO:104), 及び CXCL13(3-87K/H→A)-IgG4Fc (SEQ ID NO:105)を含む。当業者であれば理解するように、上記に特に開示したもの以外のベクターと遺伝子の組み合わせは、本願に開示される手段によって意図されることが理解される。
【００５８】
（タンパク質コンジュゲート）
一部の実施形態においては、本願のケモカイン−免疫グロブリン融合タンパク質、さらには一部のケモカインとその変異体は、非タンパク質ポリマーとコンジュゲートされてタンパク質−ポリマーコンジュゲートを形成する。具体的に反対のことが示されない限り、用語「非タンパク質ポリマー」は２つまたはそれ以上の単量体の共有結合によって形成される分子であって、いずれの単量体もアラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）残基からなる群に含まれないことを特徴とする分子と定義される。ポリエチレングリコールなどの血清可溶性非タンパク質ポリマー、およびポリカプロラクトンなどの組織または脂肪可溶性ポリマーをポリペプチドの送達、放出、および／または保持のために用いることができる。１つの実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートはペグ化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体である。
【００５９】
１つの実施形態においては、ｐｒｅｓｅｔｎ出願は、コンジュゲートに対して本願に教示される所望の範囲で見かけ上のサイズを与える、ケモカインまたはそのフラグメントに対するポリマーの任意のモル比を有するコンジュゲートを包含する。コンジュゲートの見かけ上のサイズは、使用するポリマーのサイズおよび形状、使用するケモカインまたはそのフラグメントのサイズおよび形状、ケモカインまたはそのフラグメントに結合するポリマー分子の個数、およびケモカインまたはそのフラグメント上のそのような結合の位置に部分的に依存するであろう。これらのパラメータは容易に同定されかつ最大化して、任意の種類のケモカインまたはそのフラグメント、ポリマー、および結合系について所望の見かけ上のサイズを有するコンジュゲートを得ることができる。
【００６０】
一部の実施形態においては、本願のタンパク質−ポリマーコンジュゲートは少なくとも約５００，０００Ｄ、または少なくとも約８００，０００Ｄ、または少なくとも約９００，０００Ｄ、または少なくとも約１，０００，０００Ｄ、または少なくとも約１，２００，０００Ｄ、または少なくとも約１，４００，０００Ｄ、または少なくとも約１，５００，０００Ｄ、または少なくとも約１，８００，０００Ｄ、または少なくとも約２，０００，０００Ｄ、または少なくとも約２，５００，０００Ｄの有効サイズを有する。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６１】
他の実施形態においては、本願のタンパク質−ポリマーコンジュゲートは５００，０００Ｄまたはその近傍から１０，０００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から８，０００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から５，０００，０００Ｄまたはその近値の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から４，０００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から３，０００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から２，５００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から２，０００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から１，８００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から１，６００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から１，５００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズ、または５００，０００Ｄまたはその近傍から１，０００，０００Ｄまたはその近傍の有効サイズを有する。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６２】
さらなる実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、非コンジュゲート化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体の有効サイズの少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１２倍、または少なくとも約１５倍、または少なくとも約１８倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約２５倍、または少なくとも約２８倍、または少なくとも約３０倍、または少なくとも約４０倍の有効サイズを有する。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６３】
他の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、非コンジュゲート化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体の有効サイズの約８倍から約１００倍であるか、または約８倍から約８０倍であるか、または約８倍から約５０倍であるか、または約８倍から約４０倍であるか、または約８倍から約３０倍であるか、または約８倍から約２８倍であるか、または約８倍から約２５倍であるか、または約８倍から約２０倍であるか、または約８倍から約１８倍であるか、または約８倍から約１５倍である有効サイズを有する。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６４】
他の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、非コンジュゲート化ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体の有効サイズの約２５倍から約１００倍であるか、または約２５倍から約８０倍であるか、または約２５倍から約５０倍であるか、または約２５倍から約４０倍であるか、または約２５倍から約３０倍であるか、または約２５倍から約２８倍である有効サイズを有する。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６５】
他の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは約１０：１以下、または約５：１以下、または約４：１以下、または約３：１以下、または約２：１以下、または約１：１以下のポリマー対タンパク質モル比を有する。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６６】
さらに他の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、少なくとも２０，０００Ｄの実測分子量を有する少なくとも１つのポリマーと共有結合したケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体である。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６７】
さらなる実施形態においては、コンジュゲートは、少なくとも３０，０００Ｄの実測分子量を有する少なくとも１つのポリマーと共有結合したケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体である。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６８】
さらに他の実施形態においては、コンジュゲートは、少なくとも４０，０００Ｄの実測分子量を有する少なくとも１つのポリマーと共有結合したケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体である。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００６９】
他の実施形態においては、コンジュゲートは、２０，０００Ｄまたはその近傍から３００，０００Ｄまたはその近傍である、または３０，０００Ｄまたはその近傍から３００，０００Ｄまたはその近傍である、または４０，０００Ｄまたはその近傍から３００，０００Ｄまたはその近傍値である実測分子量を有する少なくとも１つのポリマーと共有結合するケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体である。１つの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【００７０】
本願のコンジュゲートは、現在既知の、またはケモカインまたはそのフラグメントのポリマーによる誘導体化のために今後開発される任意の適切な技術を用いて作製することができる。本発明はケモカインまたはそのフラグメントとポリマーとのいかなる具体的な種類の結合を利用するコンジュゲートにも限定されないことが認識されるであろう。
【００７１】
本願のコンジュゲートは、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチド、ケモカインまたはその変異体上の単数または複数の非特異的部位にポリマーが共有結合することを特徴とする種を含む（すなわちポリマー結合は、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメント中の特定の領域または特定のアミノ酸残基に標的化されない）。このような実施形態においては、結合化学反応は、たとえば、非コンジュゲート化抗体中のリジン残基の遊離イプシロンアミノ基が無作為にポリマーによって誘導体化されることを特徴とする、そのようなリジン残基アミノ基をポリマーに対する結合部位として利用することができる。
【００７２】
さらに、本発明のコンジュゲートは、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメント上の単数または複数の特異的部位にポリマーが共有結合することを特徴とする種を含む（すなわちポリマー結合は、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメント中の特定の領域または単数または複数の特定のアミノ酸残基に標的化される）。図１１はＣＸＣＬ１１指示潜在的ペグ化部位の構造のマンガを描出する。このような実施形態においては、共役化学反応は、たとえば、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメント中の、ジスルフィド架橋状態にないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用することができる。１つの実施形態においては、単数または複数の特異的結合部位をポリマーに提供することを目的として、１つまたはそれ以上のシステイン残基を操作し、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメント中の選択された単数または複数の部位とする。ポリマーは、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、テシレート、アジリジン、エクシラン、および５−ピリジル官能基などの、非コンジュゲート化抗体上の遊離スルフヒドリルまたはチオール基と特異的に反応することのできる任意の官能基によって活性化することができる。ポリマーは、選択した結合系の化学に適した任意のプロトコルを用いて、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメントと共役することができる。
【００７３】
他の実施形態においては、ポリマー結合は非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメントの受容体結合部位に標的化される。他の実施形態においては、ポリマー結合は、非コンジュゲート化ケモカインまたはそのフラグメントの受容体結合部位以外のケモカインまたはそのフラグメント上の部位に標的化される。
【００７４】
一定の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートのタンパク質部分はヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL15, CCL16, CCL17, CCL 18, CCL19, CCL20-1, CCL20-2, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-1, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL25-3, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体からなる群から選択され、かつタンパク質−ポリマーコンジュゲートのポリマー部分はＰＥＧである。図１１はＣＸＣＬ１１指示潜在的ペグ化部位の構造のマンガを描出する。
【００７５】
他の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートのタンパク質部分は、ケモカイン部分がヒトCCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL15, CCL16, CCL17, CCL 18, CCL19, CCL20-1, CCL20-2, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-1, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL25-3, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, XCL1, XCL2, CX3CL1およびその機能的変異体からなる群から選択されかつ免疫グロブリン部分がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域およびその変異体からなる群から選択されることを特徴とするケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドである。
【００７６】
一部の実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートはCCL2-PEG, var-CCL2-PEG, CCL7-PEG, var-CCL7-PEG, CCL8-PEG, var-CCL8-PEG, CCL13-PEG, var-CCL13-PEG, CCL25- PEG, var-CCL25-PEG, CXCL11-PEG, var-CXCL11-PEG, CXCL13-PEG, var-CXCL13-PEG, CXCL16- PEG, 及び var-CXCL16-PEGからなる群から選択される血清不安定性ポリペプチドである。
【００７７】
具体的な実施形態においては、タンパク質−ポリマーコンジュゲートはCCL2-PEG, CCL2(5-76)-PEG, CCL2(5-76K/H→A)-PEG, CCL7-PEG, CCL7(5-76)-PEG, CCL7(5-76K/H→A)-PEG, CCL8-PEG, CCL8(5-76)-PEG, CCL8(5-76K/H→A)-PEG, CCL13-PEG, CCL13(5-75)-PEG, CCL13(5-75K/H→A)-PEG, CCL25-PEG, CCL25(4-127)-PEG, CCL25(4-127K/H→A)-PEG, CXCL11-PEG, CXCL11(4-73)-PEG, CXCL11(4-73K/H→A)-PEG, CXCL11-IgG4Fc, CXCL11(4-73)-IgG4Fc, CXCL11(4-73K/H→A)-IgG4Fc, CXCL13-PEG, CXCL13(3-87)-PEG, CXCL13(3-87K/H→A)-PEG, CXCL16-PEG, CXCL16(3-87)-PEG, 及び CXCL16(3-87K/H→A)-PEGからなる群から選択される血清不安定性ポリペプチドである。
【００７８】
任意のケモカインまたはそのフラグメントの血清半減期、ＭＲＴおよび／または血清クリアランス速度は、本願に教示するように、ケモカインまたはそのフラグメントをポリマーで誘導体化することによって大きく改善することができると考えられる。好ましい実施形態においては、コンジュゲートはＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２α、ＣＸＣＬ１３およびその突然変異体、変異体およびフラグメントからなる群から選択されるケモカインまたはそのフラグメントを含む。
【００７９】
（ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを生成する方法）
ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドまたはその変異体は、技術上周知の方法を用いて作製することができる。一定の実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドまたはその変異体は化学合成によって生成される。簡単に言うと、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは１つのアミノ酸のカルボキシル基すなわちＣ末端を他のアミノ酸のアミノ基すなわちＮ末端と共役することにより合成しうる。意図しない反応の可能性により、通常は保護基が必要である。化学的ペプチド合成はペプチドのＣ末端より開始しかつＮ末端で終了する。これは、Ｎ末端より開始するタンパク質の生合成とは反対である。
【００８０】
一部の実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは従来の液相または固相合成によって合成しうる。Ｆｍｏｃおよびｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いてペプチドをカルボキシ末端からアミノ末端まで成長させることができる。一定の実施形態においては、反応物に付加される最後の「アミノ酸」がペグ化される。この最後のアミノ酸は、アミンが遮断されて反応より保護され、かつ酸が遊離してあらかじめ反応物に添加されたアミノ酸に由来するアミノ基と反応することによって、カルボキシル−ＰＥＧ−アミン、カルボキシル−ＰＥＯ−アミン、またはアミン−ＰＥＧ−酸と呼ばれる。
【００８１】
他の実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドまたはその変異体は組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。組換えタンパク質の発現および生成のための手順は十分に確立されている。
【００８２】
一定の実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、およびワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、および他の多くのウイルスのようなウイルスベクターｕｓｈｃを用いて発現される。
【００８３】
ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを担持する発現ベクターは、ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、感染、トランスフェクションなどの多様な周知の手順のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。
【００８４】
したがって、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドの発現ベクターを含有する宿主細胞は、本開示の特徴でもある。好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核（すなわち細菌）宿主細胞、さらには真菌（例：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）を含む数多くの真核宿主細胞を含む。適切な発現宿主の例は：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａなどの真菌細胞；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａなどの昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫などの哺乳類細胞；藻類細胞を含む植物細胞などを含む。
【００８５】
宿主細胞は、プロモーターを活性化、形質転換株を選択、または挿入ポリヌクレオチド配列を増幅するために必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度およびｐＨなどの培養条件は、典型的には発現のために選択された宿主細胞で過去に用いられたものであり、当業者におよび本願に引用の参照文献において明らかとなるであろう。ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞内で生成することもできる。細菌系においては、発現される生成物について意図される使用に応じて数多くの発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体の製造のために大量のポリペプチドまたはそのフラグメントが必要とされる場合、好ましくは容易に精製される融合ポリペプチドの高レベル発現を誘導するベクターが使用される。そのようなベクターは、たとえば上に記載される本発明のポリヌクレオチドなどの目的のコード配列を、メチオニンおよびこれに続く７残基のβガラクトシダーゼを開始して酵素的に活性なβガラクトシダーゼ融合ポリペプチドを生成する、アミノ末端翻訳のための配列とインフレームで連結してベクターとすることのできるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−５５０９）；アミノ末端メチオニンがインフレームでヒスチジンタグと連結されるｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）などの多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを含むが、これに限定されない。
【００８６】
同様に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母においては、所望の発現生成物の生成のために、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的または誘導的プロモーターを含む数多くのベクターを用いることができる。哺乳類宿主細胞においては、プラスミド系もウイルスベースの系も含む数多くの発現系を利用することができる。
【００８７】
長期的には、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドの高収率生成、安定な発現系が典型的に用いられる。たとえば、複製のウイルス起源または内因性発現因子および選択的マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞に導入される。ベクターの導入後、選択培地に切り替える前に強化培地内で細胞を１〜２日培養する。選択的マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、またその存在によって導入された配列を良好に発現する細胞の培養および回収が可能となる。たとえば、安定的に形質転換された細胞の抵抗性群またはコロニーは、細胞型に適した組織  培養技術を用いて増殖させることができる。ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドｃをコードする核酸で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのコードタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養してもよい。
【００８８】
適切な宿主細胞株の形質導入および適切な細胞密度への宿主細胞の培養後、選択されたプロモーターを適切な手段（例：温度シフトまたは化学的誘導）で誘導し、かつ細胞をさらなる期間培養する。その後、分泌されたポリペプチド生成物を培地より回収する。代替的に、細胞を遠心分離によって回収し、物理的および化学的な手段で破壊し、また生成した粗抽出物を保持してさらに精製することもできる。タンパク質の発現に用いられる真核細胞または微生物細胞は、当業者に周知である凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用または他の方法を含む任意の簡便な方法によって破壊することができる。
【００８９】
発現されたケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（例：本願に記録したタグ系のうちいずれかを用いて）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含む、技術上周知の数多くの方法のいずれかにより組換え細胞培養から回収および精製することができる。成熟タンパク質の立体配置を完成させる際に、所望のように、タンパク質再フォールディング段階を用いることができる。最後に、最終精製段階において高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることができる。上で注記した参照文献に加えて、数多くの精製法が技術上周知である。
【００９０】
他の実施形態においては、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を昆虫細胞に導入する。昆虫細胞に感染することのできる組換えバキュロウイルスは、ＢＤバイオサイエンスのＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系などの市販のベクター、キット、および／または系を用いて生成することができる。簡単に言うと、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｃＳＧ２伝達ベクターに挿入する。次に、宿主細胞ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）を、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ＡｃＮＰＶ）の線形化ゲノムＤＮＡを含むｐＡｃＳＧ２−チャイマープラスミドおよびＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄでコトランスフェクトする。トランスフェクト後、ｐＡＣＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノム間で相同組み換えが発生して組換えウイルスを生成する。１つの実施例においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドはポリへドリンプロモーターのレギュレーション調節下で発現する。塩基性（Ｂａ）およびｐ１０プロモーターなどの他のプロモーターを用いて同様の伝達ベクターを精製することができる。同様に、Ｓｆ９と密接に関連するＳＦ２１、およびタマナキンウワバガＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来するＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞株など、代替的昆虫細胞も用いることができる。トランスフェクションおよび発現の誘導後（選択されたプロモーターおよび／またはエンハンサーまたは他の調節要素に応じて）、発現されたケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは回収され（例：生成または濃縮され）、さらに再生されて生物学的に活性な立体配置へのフォールディングを確保される。
【００９１】
さらに他の実施形態においては、ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、生体内でプラスミドベクターまたはウイルスベクターによって発現される。
【００９２】
（治療法）
本願は、炎症を調節および／またはケモカイン受容体媒介性障害を治療するために本願に開示されたケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを用いる方法をさらに提供する。一部の実施形態においては、対象におけるケモカイン受容体媒介性障害を治療するための方法が提供される。一部の実施形態においては、方法は、本願に開示のケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドの有効な量を、これを必要とする対象に投与することを含む。
【００９３】
本願に開示される「治療」または「治療すること」は、予防的治療および治療的治療を含むがこれに限定されないケモカイン受容体媒介性障害の任意の治療に関する。このように、用語「治療」または「治療すること」は：ケモカイン受容体媒介性障害またはケモカイン受容体媒介性障害の発症を予防すること；ケモカイン受容体媒介性障害の進行を阻害すること；ケモカイン受容体媒介性障害の発症を停止または予防すること；ケモカイン受容体媒介性障害の重症度を低下させること；ケモカイン受容体媒介性障害に付随する症状を改善または緩和すること；およびケモカイン受容体媒介性障害またはケモカイン受容体媒介性障害に付随する１つまたはそれ以上の症状の後退を引き起こすことを含むがこれに限定されない。
【００９４】
治療的化合物の実施形態は、有効量で投与されるとき、ケモカイン受容体媒介性障害および炎症における活性を示す。本願に開示される組成物の有効量は無毒性であるが、所望の予防的または治療的効果が生成されるような十分な量である。必要とされる組成物の正確な量は、種、年齢、動物の状態、動物における炎症またはケモカイン受容体媒介性障害の重症度、使用する具体的担体またはアジュバント、投与の様式などに応じて、対象ごとに異なる。したがって、本願に開示される任意の個別の治療的組成物の有効量は個別の環境によって異なり、かつ適切な有効量は、それぞれの適用の場合に当業者が常用的実験のみを用いて決定することができる。本願に開示される組成物は、約０．１μｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与することができる。たとえば、投与レジメンは約１μｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重であることも可能であり、かつそのような用量単位は、合計約７μｇから約７００ｍｇの組成物を体重約７０ｋｇの対象に投与するよう用いることも可能である。
【００９５】
投与レジメンは最適な治療反応を提供するよう調節することができ、かつ毎日、週２回、週１回、月２回、月１回、または他の適切な時間間隔で投与することができる。たとえば、本願に開示の組成物は、投与毎に約５〜２５０ｍｇの用量で１日１回から週に１回投与することができる。他の実施例については、数回に分割した用量を毎日投与することができるか、または用量を治療的状況の緊急性によって示されるように比例的に減量することができる。実践上の利点の１つは、化合物を静脈内、腫瘍内、皮下、経皮的、腹腔内または経口的などの簡便な様式で投与することができることである。
【００９６】
一部の実施形態においては、活性組成物を非経口的または腹腔内投与する。グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物中および油中で分散剤を調製することもできる。これらの製剤は、通常の保存および使用条件下で微生物の発育を防止するための保存料を含有する。
【００９７】
注射用途に適した医薬品形態は、無菌水溶液または分散剤および無菌注射液または分散剤の即時調製用の無菌粉末を含む。形態は、無菌でありかつ容易なシリンジ操作性が存在する程度に液状でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。医薬担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油などを含有する溶媒であることも、または分散媒体であることもできる。適切な流動性は、たとえばレクチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合は必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持される。
【００９８】
微生物の作用の予防は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの抗菌剤および抗真菌剤によって実現される。多くの場合、たとえば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤の含有が望ましくなりうる。注射組成物の長時間吸収は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質の組成物における使用によって実現される。
【００９９】
無菌注射液は、必要量の組成物を上に列挙する多様な他の成分を有する適切な溶媒中に組み入れた後で、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、基本分散媒体および上に列挙するものの中で必要とされる他の成分を含有する無菌担体に、多様な無菌有効成分を組み入れることによって調製することができる。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の方法は、有効成分＋任意の所望の追加的成分の粉末をあらかじめ無菌濾過したその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
【０１００】
本願に用いられる「医薬品として許容できる担体」および「医薬担体」は互換的に用いられかつ溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は技術上周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と不適合である範囲を除き、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的活性成分も組成物に組み入れることができる。
【０１０１】
非経口組成物は、投与しやすくしかつ用量を均一とするために用量単位として製剤化することがある。本願で使用される用量単位形態は、治療しようとする対象に対してユニット用量として適した物理的に分離した単位であって、各単位が必要とされる医薬担体と共に所望の治療的効果を生成するよう算出された事前に決定された量の活性物質を含有する単位を意味する。本願の用量単位形態の規格は：（ａ）活性物質に特有の性質および達成しようとする具体的な治療効果、および（ｂ）本願に記載されるように身体健康が障害された状態を有する生体対象の状態の治療のためのそのような活性物質を配合する当技術分野に固有の限界に基づいて選択される。
【０１０２】
有効成分は、本願に記載される用量単位形態で、適切な医薬品として許容できる担体と共に、有効量での簡便かつ有効な投与のために配合することができる。ユニット用量形態は、たとえば、約０．１から約１０００ｍｇ、または他の例については約５から約５００ｍｇの範囲の量で、主要活性化合物を含有することができる。割合で示すと、化合物は一般に約１から約１００ｍｇ／ｍＬ担体で存在する。補助的な活性成分を含有する組成物の場合、用量は成分の通常の用量および投与様式を参照して決定することができる。
【０１０３】
さらに、本願に開示の主題の治療法に関しては、好ましい対象は脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血であり；好ましい温血脊椎動物は哺乳類である。好ましい哺乳類は、最も好ましくはヒトである。本願で用いられる用語「対象」はヒト対象も動物対象も含む。したがって、本願に開示される主題にしたがって動物治療の用途が提供される。
【０１０４】
このように、本願はヒトなどの哺乳類の治療、さらにはシベリアトラなど絶滅が危惧されるために重要な哺乳類；ヒトによる消費のために農場で飼育される動物などの経済的に重要な；および／またはペットとしてまたは動物園で飼育される動物などのヒトにとって社会的に重要な動物の治療も具備する。
【０１０５】
このような動物の例は：ネコおよびイヌなどの肉食動物；ブタ、去勢ブタ、およびイノシシなどのブタ科；ウシ、雄ウシ、ヒツジ、シマウマ、シカ、ヤギ、スイギュウ、およびラクダなどの反芻動物および／または有蹄動物；およびウマを含むが、これに限定されない。絶滅が危惧されかつ／または動物園で飼育される種類の鳥類、さらには、家禽類、より具体的には家畜化された家禽、すなわちシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの家禽の治療もヒトにとって経済的に重要であるので、それらを含む鳥類の治療も提供される。したがって、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）、家禽類などを含むがこれに限定されない家畜の治療も提供される。
【０１０６】
本願に開示された主題の実施形態の一部においては、治療されるケモカイン受容体媒介性障害は腫瘍または癌などの細胞増殖性障害である。本願は、本願に開示される増殖性障害の細胞上に発現される特異的ケモカイン受容体に標的化することのできるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを提供する。癌細胞は、接着、浸潤、および細胞生存を支援するであろう機能的活性ケモカイン受容体を発現する。ケモカインの結合後のケモカイン受容体シグナリングおよび凝集は、細胞の生存および強固な細胞接着を促進するインテグリンのクラスタ化と連関する。理論と結びつけられることは望まないが、本願に開示される新規ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドは、これらの疾患細胞上のケモカイン受容体と結合し、かつ細胞生存、遊走、浸潤、接着、またはその組み合わせを含む細胞事象を阻害し、かつこれにより細胞増殖性障害を治療することができる。表３は、多様な癌および列記された癌の特定のケモカインおよびケモカイン受容体との関連を列記する。
【０１０７】
（表３：ケモカイン、ケモカイン受容体および癌の関連）
（病期に依存）
【表３】
2014518632.tif 000008
【０１０８】
「細胞増殖性障害」は、細胞の異常な増殖によって特徴付けられる障害を意味する。増殖性障害は、細胞増殖速度に関するいかなる制限も意味せず、単に成長および細胞分裂に影響する正常な調節の喪失を示す。したがって、一部の実施形態においては、増殖性障害の細胞は正常細胞と同じ細胞分裂速度を有することがあるものの、そのような増殖を制限するシグナルに応答しない。「細胞増殖性障害」の範囲内には、組織の異常な増殖である新生物または腫瘍がある。「癌」は、周辺組織に浸潤および／または新規定着部位に転移する能力を有する細胞の増殖によって特徴付けられる多様な悪性新生物のいずれかを意味し、かつ白血病、癌腫、黒色腫、および肉腫を含む。癌の例は脳、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、中皮腫、卵巣、前立腺、肉腫、胃、子宮および髄芽腫の癌である。
【０１０９】
「白血病」によって、おおむね血液形成臓器の進行性、悪性疾患が意味され、かつ一般に血液および骨髄における白血球およびその前駆細胞のいびつな増殖および発達によって特徴付けられる。白血病疾患は、たとえば急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病、好塩基急性白血病、胚細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリーセル白血病、血芽球性白血病、血液芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ原性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒細胞性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞性白血病（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞性白血病（ｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病などを含む。
【０１１０】
用語「癌腫」は、周囲組織に浸潤しかつ転移を引き起こす傾向のある上皮細胞からなる悪性の新規成長を意味する。代表的な癌腫は、たとえば細葉細胞癌、小葉癌、腺嚢癌、腺様嚢胞癌、腺癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞上皮癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、細気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌、粘液癌、面皰癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円柱細胞癌、管癌、緻密癌、胎児性癌、脳様癌、ｅｐｉｅｎｎｏｉｄ癌腫、上皮腺癌、外方発育癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌、コロイド膠癌、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌、毛母組織癌、血様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ癌腫、幼児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌、クルチスキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟癌、粘液癌、粘液性癌、粘液細胞性癌、粘膜上皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌、ｎａｓｐｈａｒｙｎｇｅａｌ癌腫、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、軟性癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、回転楕円面細胞癌、紡錘細胞癌、海面様癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張症癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌および絨毛癌などを含む。
【０１１１】
一般的に、用語「肉腫」は、胚性結合組織様の物質からなり、かつ一般的に筋原線維または均一な物質に取り囲まれた密に充填された細胞から構成される腫瘍を意味する。肉腫は、たとえば軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、Ａｂｅｍｅｔｈｙ肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮歯牙肉腫、ブドウ状肉腫、緑色種、絨毛癌、胎芽性肉腫、Ｗｉｌｎ腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫（例：非ホジキンリンパ腫）、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫などを含む。
【０１１２】
用語「黒色腫」は、皮膚および他の臓器のメラニン細胞系から発生する腫瘍を意味するために用いられる。黒色腫は、たとえば、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、ｓｕｂｕｎｇａｌ黒色腫、および表在拡大型黒色腫などを含む。
【０１１３】
その他の癌は、たとえば、ホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ、悪性カルチノイド、前癌性皮膚病変、精巣癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸部癌、子宮内膜癌、および副腎皮質癌などを含む。
【０１１４】
他の実施形態においては、治療されるケモカイン受容体媒介性障害は炎症性障害である。理論と結びつけられることは望まないが、本願に開示される新規ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドはこれらの細胞上のケモカイン受容体と結合し、かつ炎症および炎症性障害をもたらしうる細胞事象を阻害することができる。表４は、多様な代表的炎症性障害および列記された障害の特定のケモカインおよびケモカイン受容体との関連を列記する。列記されたケモカイン受容体の、受容体の特異的リガンドとして作用する本願に開示されるケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドによる標的化は、列記された炎症性障害を治療するために有用となりうる。
【０１１５】
（表４：ケモカイン、ケモカイン受容体および炎症性疾患関連）
（病期に依存）
【表４−１】
2014518632.tif 000009
【表４−２】
2014518632.tif 000010
【表４−３】
2014518632.tif 000011
【０１１６】
本願に用いられる用語「炎症性障害」は、炎症によって少なくとも部分的に引き起こされるか、または悪化し、一般的に血流の増加、浮腫、免疫細胞の活性化（例：増殖、サイトカイン産生、または貪食作用の亢進）、発熱、発赤、腫脹、疼痛、および／または罹患組織または臓器の機能の喪失を特徴とする疾患または障害を含む。炎症の原因は、物理的損傷、化学物質、微生物、組織壊死、細胞増殖性障害、または他の物質のためでありうる。
【０１１７】
炎症性障害は急性炎症性障害、慢性炎症性障害、および再発性炎症性障害を含む。急性炎症性障害は、一般的に比較的短期間のものでありかつ約数分間から約１〜２日持続するものの、数週間続くこともある。急性炎症性障害の特徴は、血流の亢進、体液および血漿タンパク質の浸出（浮腫）および好中球などの白血球の遊出である。慢性炎症性障害は、一般に、たとえば数週間から数ヶ月から数年またはそれ以上などより長期間持続するものであり、かつリンパ球およびマクロファージの存在および血管および結合組織の増殖と組織学的に関連付けられる。再発性炎症性障害は、ある期間後に再発するか、または定期的発現を有する障害を含む。一部の炎症性障害は１つまたはそれ以上のカテゴリーに含まれる。代表的な炎症性障害は、中枢または末端神経系の炎症性障害（例：膿瘍、ＡＩＤＳ関連感染症、アルツハイマー症、慢性疲労症候群、先天性感染症、脳炎、虚血、髄膜炎、多発性硬化症、外傷性脳損傷など）；尿生殖器の炎症性障害（例：子宮内膜症、糸球体硬化症、膣および子宮頸部の感染症、羊水内感染症、骨盤内炎症性疾患、腎臓炎／腎炎、性行為感染症、尿道炎、尿路感染症、カンジダ症など）；消化器系の炎症性障害（例：結腸癌、肝炎、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、潰瘍など）；呼吸器系の炎症性障害（例：慢性肺疾患、喘息、結核、肺炎など）；皮膚、外皮および筋骨格系の炎症性障害（例：ベーチェット病、クローン病、皮膚炎、歯肉炎、痛風、筋肉痛、変形性関節症、歯周炎、乾癬、関節リウマチ、脊椎関節症、皮膚日焼けなど）；心血管系の炎症性障害（例：アテローム性動脈硬化症、心膜炎、心内膜炎、川崎病、心筋炎、リウマチ熱、血管炎）；自己免疫性障害；ネコひっかき病；眼感染症；ライム病；リンパ節症；リンパ感染症；放射線誘発性炎症；サルコイドーシス；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデスおよび関連障害；および微生物および炎症性分子による感染により生じる炎症性障害を含むが、これに限定されない。本願で用いる用語「微生物」は、細菌、ウイルス、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオン、および寄生生物を含むが、これに限定されない微生物の任意の種または種類を意味する。用語微生物は、それ自体においておよびそれ自体が他の生物（例：ヒトおよび植物を含む動物など）に対して病原性である生物も、他の生物に対して病原性の物質を産生する一方で当該生物自体は他の生物に対して病原性または感染性でない生物も包含する。注記したように、炎症性障害は、少なくとも部分的に、血流の増加、浮腫、免疫細胞の活性化（例：増殖、サイトカイン産生、または貪食作用の亢進）、発熱、発赤、腫脹、疼痛、および罹患組織または臓器の機能の喪失を含むこともあるがこれに限定されない炎症性障害の症状および／または発現を特徴とすることもある炎症によって頻繁に引き起こされるか、または悪化する。このように、本願は炎症をモジュレートする方法をさらに提供する。用語「炎症をモジュレートする」は、炎症性障害において発生するように、炎症が病的である炎症の誘発か、または炎症を緩和することを意味する。本願で用いる用語「緩和すること」は、炎症の症状および／または発現または炎症の症状および／または発現の発生を予防すること；炎症の症状および／または発現の進行を阻害すること；炎症の症状および／または発現の発生を停止または予防すること；炎症の症状および／または発現の重症度を低下させること；炎症に関連する症状および／または発現を改善または軽減すること；および／または炎症の症状および／または発現の後退を引き起こすことを意味する。本発明は、制限すると見なすべきでない以下の実施例によってさらに例示される。以下の実施例は、本主題に関係する開発および実験の過程において様々な回数収集されたデータの代表であるデータの編集を含むことがある。
【０１１８】
以下の実施例は、本願に開示された主題の態様を例示するために含まれる。本開示および当技術分野の一般水準に鑑みて、当業者は、以下の実施例は例示とすることのみを意図されかつ数多くの変化、改変、および変更が本願に開示の主題の範囲から離れることなく採用することができることを認識するであろう。
【実施例１】
【０１１９】
（プラスミド発現ベクターの生成）
ケモカイン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを発現することのできる発現ベクターは、標準的な分子生物学手順を用いてインビボジェン（カリフォルニア州サンディエゴ）のｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ１、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ１、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ３−Ｆｃ１およびｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ１ベクターから生成される。発現ベクターの例を図１〜１０に示す。
【実施例２】
【０１２０】
（乳癌細胞株におけるケモカイン受容体の発現）
多様な病期の乳癌組織における、非腫瘍乳房組織におけるＣＸＣＲ７およびＣＸＣＲ３の発現レベルを比較するために実験を実施した。非腫瘍性乳房組織は検出可能レベルのＣＸＣＲ７を発現しない。進行乳癌の組織においては、ＣＸＣＲ７発現は非腫瘍性乳房組織と比較して有意に高い。乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）では、ＣＸＣＲ７およびＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡも正常乳房細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）と比較して上昇する。
【実施例３】
【０１２１】
（ｖａｒ−ＣＸＣＬ１１−ＩｇＧ融合ポリペプチドは乳癌細胞におけるＣＸＣＲ７およびＣＸＣＲ３活性化を阻害する）
アムニスイメージストリーム分析を用いて、我々はＣＸＣＬ１１がＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ７の凝集および迅速な脱感作を刺激し、ＣＸＣＬ１２がわずかなＣＸＣＲ７クラスタ化をモジュレートし、かつアドレノメデュリン（ＡＭ）がＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ７のクラスタ化を刺激することを確認した。ＣＸＣＬ１１−ＩｇＧ融合ペプチドはＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ７を抑制するが、ＣＸＣＲ４と、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２およびＡＭによるクラスタ化および脱感作は抑制しない。
【０１２２】
上の記述は、本発明を実施する方法を当業者に教示することを目的とし、かつ記述を読んだ直後に当業者にとって明らかになるであろうこれら全てのそれの明白な改変および変法を詳述することを意図していない。しかし、全てのこのような明白な変更および変法が、以下の実施形態によって定義される本発明の範囲内に含まれることを意図している。実施形態は、文脈が具体的に反対のことを示さない限り、そこで意図される目的に合致するために有効である任意の順序で、構成要素および段階を対象とすることを意図している。本明細書に引用された全ての参照文献は、その全文を参照文献として本願に援用する。
【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｅ−１】
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【図１Ｅ−２】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図３Ｄ−１】
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【図３Ｄ−２】
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【図３Ｅ−１】
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【図３Ｅ−２】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｅ−１】
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【図４Ｅ−２】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図５Ｄ−１】
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【図５Ｄ−２】
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【図５Ｅ−１】
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【図５Ｅ−２】
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【図６Ｃ−１】
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【図６Ｃ−２】
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【図６Ｄ−１】
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【図６Ｄ−２】
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【図６Ｅ−１】
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【図６Ｅ−２】
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【図７Ｃ−１】
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【図７Ｃ−２】
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【図７Ｄ−１】
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【図７Ｄ−２】
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【図７Ｅ−１】
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【図７Ｅ−２】
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【図８Ｃ−１】
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【図８Ｃ−２】
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【図８Ｄ−１】
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【図８Ｄ−２】
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【図８Ｅ−１】
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【図８Ｅ−２】
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【図９Ｃ−１】
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【図９Ｃ−２】
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【図９Ｄ−１】
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【図９Ｄ−２】
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【図９Ｅ−１】
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【図９Ｅ−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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