(57)【要約】  本発明は、Ｍｓｐの変異型に関する。本発明は、Ｍｓｐを使用する核酸の特徴付けにも関する。
2014506575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体Ｍｓｐモノマーであって、前記バリアントが以下の変異：
（ａ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｂ）９０位にセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはチロシン（Ｙ）；
（ｃ）１０５位にロイシン（Ｌ）またはセリン（Ｓ）；
（ｄ）１２６位にアルギニン（Ｒ）；
（ｅ）７５位にセリン（Ｓ）；
（ｆ）７７位にセリン（Ｓ）；
（ｇ）５９位にアルギニン（Ｒ）；
（ｈ）７５位にグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｉ）７７位にグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｊ）７８位にロイシン（Ｌ）；
（ｋ）８１位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｌ）８３位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｍ）８６位にセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｎ）８７位にフェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）；
（ｏ）８８位にチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｐ）８９位にフェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）；
（ｑ）９０位にロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｒ）９１位にセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｓ）９２位にアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）；
（ｔ）９３位にセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）；
（ｕ）９４位にロイシン（Ｌ）；
（ｖ）９５位にバリン（Ｖ）；
（ｗ）９６位にアルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｘ）９７位にセリン（Ｓ）；
（ｙ）９８位にセリン（Ｓ）；
（ｚ）９９位にセリン（Ｓ）；
（ａａ）１００位にセリン（Ｓ）；
（ｂｂ）１０１位にフェニルアラニン（Ｆ）；
（ｃｃ）１０２位にリシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｄｄ）１０３位にアラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｅｅ）１０４位にイソロイシン；
（ｆｆ）１０５位にチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｇｇ）１０６位にフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）；
（ｈｈ）１０８位にプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）；
（ｉｉ）１１８位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｊｊ）１０３位にセリン（Ｓ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｋｋ）１０〜１５、５１〜６０、１３６〜１３９および１６８〜１７２位のうちの１つまたは複数にシステイン
の少なくとも１つを含む、変異体。
【請求項２】
前記バリアントが、次の置換：
（ａ）（ｉ）７５位にセリン（Ｓ）、（ｉｉ）７７位にセリン（Ｓ）、（ｉｉｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、（ｉｖ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｖ）１２６位にアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数；
（ｂ）（ｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉ）１２６位にアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数；
（ｃ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）１２６位にアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数；
（ｄ）（ｉ）８８位にセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）の１つまたは複数；
（ｅ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）の１つまたは複数；
（ｆ）（ｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉ）１０５位にアラニン（Ａ）の１つまたは複数；
（ｇ）（ｉ）９０位にセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９２位にセリン（Ｓ）の１つまたは複数；
（ｈ）（ｉ）８８位にトレオニン（Ｔ）および（ｉｉ）９０位にセリン（Ｓ）の１つまたは複数；
（ｉ）（ｉ）８７位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉ）９０位にセリン（Ｓ）の１つまたは複数；
（ｊ）（ｉ）８９位にチロシン（Ｙ）および（ｉｉ）９０位にセリン（Ｓ）の１つまたは複数；
（ｋ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）８９位にフェニルアラニン（Ｆ）の１つまたは複数；
（ｌ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）８９位にチロシン（Ｙ）の１つまたは複数；
（ｍ）（ｉ）９０位にセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９２位にアラニン（Ａ）の１つまたは複数；
（ｎ）（ｉ）９０位にセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９４位にアスパラギン（Ｎ）の１つまたは複数；
（ｏ）（ｉ）９０位にセリン（Ｓ）および（ｉｉ）１０４位にイソロイシン（Ｉ）の１つまたは複数；
（ｐ）（ｉ）８８位にアスパラギン酸（Ｄ）および（ｉｉ）１０５位にリシン（Ｋ）の１つまたは複数；
（ｑ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）１２６位にアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数；
（ｒ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）９１位にアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数；
（ｓ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）９１位にセリン（Ｓ）の１つまたは複数；
（ｔ）（ｉ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）１０５位にバリン（Ｖ）の１つまたは複数；
（ｕ）（ｉ）９０位にグルタミン（Ｑ）、（ｉｉ）９３位にセリン（Ｓ）および（ｉｉｉ）１０５位にアラニン（Ａ）の１つまたは複数；
（ｖ）（ｉ）９０位にフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）９１位にフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）および（ｉｉｉ）１０５位にフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）の１つまたは複数；
（ｗ）（ｉ）９０位にセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）、（ｉｉ）９１位にセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）および（ｉｉｉ）１０５位にセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）の１つまたは複数；
（ｘ）９０位にセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）および／または９１位にセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）；
（ｙ）９０位にセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）および／または９１位にセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）；ならびに
（ｚ）９０、９１および１０３位の１つまたは複数にシステイン
の１つまたは複数を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記バリアントが、次の置換（複数可）：
2014506575.tif 000025
2014506575.tif 000026
の少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
化学修飾されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
１つもしくは複数のシステインへの分子の付着、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって化学修飾されている、請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
前記１つまたは複数のシステインが、置換により前記変異体に導入されている、請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
前記分子が、（ａ）前記モノマーを含む細孔と標的ヌクレオチドもしくは標的核酸配列との相互作用を促進する分子アダプターまたは（ｂ）核酸結合タンパク質である、請求項５または６に記載の変異体。
【請求項８】
前記付着がリンカーを介している、請求項５から７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記分子が、配列番号２の９０、９１および１０３位の１つまたは複数に付着している、請求項５から８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
Ｍｓｐから得られる共有結合したモノマーを２個以上含む構築物。
【請求項１１】
前記２個以上のモノマーが、同じまたは異なっている、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
少なくとも１つのモノマーが、配列番号２に示される配列を含む、請求項１０または１１に記載の構築物。
【請求項１３】
前記モノマーの少なくとも１つが、請求項１から８のいずれか一項に記載の変異体モノマーである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１４】
２個のモノマーを含み、前記モノマーの少なくとも１つが、請求項１から８のいずれか一項に記載の変異体である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１５】
前記モノマーが遺伝学的に融合されている、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１６】
前記モノマーがリンカーを介して付着している、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１７】
請求項１から３のいずれか一項に記載の変異体または請求項１５に記載の構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１から３のいずれか一項に記載の同一の変異体モノマーを含むＭｓｐから得られる、ホモオリゴマー細孔。
【請求項１９】
前記細孔が、請求項１から３のいずれか一項に記載の同一の変異体モノマー８個を含む、請求項１８に記載のホモオリゴマー細孔。
【請求項２０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の変異体モノマーを少なくとも１つ含み、全８個のモノマーのうち少なくとも１つが他と異なっている、Ｍｓｐから得られるヘテロオリゴマー細孔。
【請求項２１】
前記細孔が、請求項１に記載の変異体モノマー８個を含み、そのうちの少なくとも１つが他と異なっている、請求項２０に記載のヘテロオリゴマー細孔。
【請求項２２】
前記細孔が、配列番号２に示される配列を含む少なくとも１つのモノマーを含む、請求項２１に記載のヘテロオリゴマー細孔。
【請求項２３】
前記細孔が、（ａ）１個の変異体モノマーおよび（ｂ）７個の同一のモノマーを含み、（ａ）の前記変異体モノマーが（ｂ）の前記同一のモノマーとは異なっている、請求項２１または２２に記載のヘテロオリゴマー細孔。
【請求項２４】
前記細孔が、
（ａ）配列番号２に示される配列を含むモノマー７個および置換Ｎ９０Ｒ、Ｎ９０Ｋ、Ｎ９０Ｙ、Ｎ９０Ｑ、Ｎ９０ＷもしくはＮ９０Ｃを含む変異体モノマー１個；
（ｂ）配列番号２に示される配列を含むモノマー７個および置換Ｎ９１Ｒ、Ｎ９１Ｋ、Ｎ９１Ｙ、Ｎ９１Ｑ、Ｎ９１ＷもしくはＮ９１Ｃを含む変異体モノマー１個；または、
（ｃ）配列番号２に示される配列を含むモノマー７個および置換Ｌ８８Ｃ、Ｓ１０３ＣもしくはＩ１０５Ｃを含む変異体モノマー１個
を含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載のヘテロオリゴマー細孔。
【請求項２５】
前記変異体モノマーの少なくとも１つが、請求項４から９に記載のとおり化学修飾されている、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の細孔。
【請求項２６】
請求項１０から１６に記載の構築物を少なくとも１つ含む細孔。
【請求項２７】
（ａ）請求項１３に記載の構築物１個と、（ｂ）（ｉ）配列番号２に示される配列または（ｉｉ）請求項１もしくは２に記載の配列番号２のバリアントを各々含むモノマー６個とを含む、請求項２６に記載の細孔。
【請求項２８】
請求項１４に記載の構築物４個を含む、請求項２６に記載の細孔。
【請求項２９】
前記構築物の少なくとも１つが、請求項４から９に記載のとおり化学修飾されている、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の細孔。
【請求項３０】
標的核酸配列を特徴付ける方法であって、
（ａ）核酸結合タンパク質が、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の細孔を通る前記標的配列の移動を制御し、前記標的配列中のヌクレオチドの一部が前記細孔と相互作用できるように、前記標的配列を前記細孔および前記タンパク質と接触させるステップと；
（ｂ）各相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによって前記標的配列を特徴付けるステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記標的核酸配列を特徴付けるステップが、前記標的核酸配列の配列を推定するステップまたは配列決定するステップを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）請求項１８から２９のいずれか一項に記載の細孔および（ｂ）核酸ハンドリング酵素を含む、標的核酸配列を特徴付けるためのキット。
【請求項３３】
サンプル中の標的核酸配列を特徴付けるための装置であって、（ａ）請求項１８から２９に記載の複数の細孔および（ｂ）複数の核酸ハンドリング酵素を含む装置。
【請求項３４】
前記複数の細孔を支持することができ、前記細孔および酵素を使用して核酸の特徴付けを行うように操作できるセンサーデバイスと；
前記特徴付けを行うための材料保持用の少なくとも１つの貯蔵部と；
前記少なくとも１つの貯蔵部から前記センサーデバイスへと制御可能に材料を供給するよう構成された流体系と；
それぞれのサンプルを受けるための複数の容器とを含み、前記流体系が、前記容器から前記センサーデバイスへと選択的に前記サンプルを供給するよう構成されている、請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
標的核酸配列を特徴付ける方法であって、
（ａ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼがＭｓｐから得られる細孔を通る標的配列の移動を制御し、前記標的配列中のヌクレオチドの一部が前記細孔と相互作用するように、前記標的配列を前記細孔および前記ポリメラーゼと接触させるステップと；
（ｂ）各相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによって前記標的配列を特徴付けるステップとを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）が前記細孔に印加される電圧により実施される、方法。
【請求項３６】
前記標的核酸配列を特徴付けるステップが、前記標的核酸配列の配列を推定するステップまたは配列決定するステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリメラーゼが印加電圧により生じる電場とは反対方向に前記細孔を通して前記標的配列を移動させるように、ステップ（ａ）および（ｂ）が、遊離ヌクレオチドと酵素補因子の存在下で実施される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ｃ）前記ポリメラーゼが、ステップ（ａ）および（ｂ）における方向とは反対方向に前記細孔を通して前記標的配列を移動させ、前記標的配列中のヌクレオチドの一部が前記細孔と相互作用するように、前記遊離ヌクレオチドを取り除くステップと；
（ｄ）各相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｂ）において得られた前記標的配列の配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）もまた、前記細孔に印加される電圧により実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリメラーゼが前記印加電圧により生じる電場に伴って前記細孔を通して前記標的配列を移動させるように、ステップ（ａ）および（ｂ）が、遊離ヌクレオチドの非存在下および酵素補因子の存在下で実施される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４０】
（ｃ）前記ポリメラーゼが、ステップ（ａ）および（ｂ）における方向とは反対方向に前記細孔を通して前記標的配列を移動させ、前記標的配列中のヌクレオチドの一部が前記細孔と相互作用するように、遊離ヌクレオチドを添加するステップと；
（ｄ）各相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｂ）において得られた前記標的配列の配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）もまた、前記細孔に印加される電圧により実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリメラーゼが、前記印加電圧により生じる電場に伴って前記細孔を通る前記標的配列の移動を制御するように、ステップ（ａ）および（ｂ）が、遊離ヌクレオチドの非存在下および酵素補因子の非存在下で実施される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４２】
（ｃ）前記標的配列が、ステップ（ａ）および（ｂ）における方向とは反対方向に前記細孔を通って移動し、前記標的配列中のヌクレオチドの一部が前記細孔と相互作用するように、前記細孔に印加される前記電圧を下げるステップと；
（ｄ）各相互作用の間に前記細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｂ）において得られた前記標的配列の配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）もまた、前記細孔に印加される電圧により実施される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
標的核酸配列を特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、
（ａ）前記標的核酸配列の存在下でＭｓｐから得られる細孔をＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップと；
（ｂ）前記細孔に電圧を印加して、前記細孔と前記ポリメラーゼとの複合体を形成させるステップと
を含み、それによって前記標的核酸配列を特徴付けるためのセンサーを形成する、方法。
【請求項４４】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高める方法であって、
（ａ）核酸配列の存在下で前記Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをＭｓｐから得られる細孔と接触させるステップと；
（ｂ）前記細孔に電圧を印加して、前記細孔と前記ポリメラーゼとの複合体を形成させるステップと
を含み、それによってＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高める、方法。
【請求項４５】
前記細孔への印加電圧を増加させて、前記Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高めるステップをさらに含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸配列の少なくとも一部が二本鎖である、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細孔が、請求項１８から２９のいずれか一項に記載のとおりである、請求項３５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細孔が、配列番号２に示される配列またはそのバリアントを含むモノマー８個を含む、請求項３５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号４に示される配列、または全配列にわたるアミノ酸同一性に基づいて、配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有するそのバリアントを含み、酵素活性を保持している、請求項３５から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）Ｍｓｐから得られる細孔および（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む、標的核酸配列を特徴付けるためのキット。
【請求項５１】
サンプル中の標的核酸配列を特徴付けるための装置であって、Ｍｓｐから得られる複数の細孔および複数のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む装置。
【請求項５２】
請求項３４に記載のとおりである、請求項５１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｓｐの変異型に関する。本発明は、Ｍｓｐを使用する核酸の特徴付けにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ細孔検出は、分析物分子と受容体との個々の結合事象の観察を利用する検出手法である。ナノ細孔センサーは、絶縁膜中にナノメートル規模の単一細孔を配置し、分析物分子の存在下で、細孔を通り抜ける電圧で駆動されるイオン輸送を測定することによって創出できる。分析物の同一性は、特徴的な電流識別特性、特に電流を遮断する持続時間および程度ならびに電流レベルの変動によって明らかになる。
【０００３】
現在、広範な用途にわたって迅速かつ安価に核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を配列決定する技術の必要性がある。既存の技術は、主に大量の核酸を作製するために増幅技術を利用し、シグナル検出用として多量の専用の蛍光化学物質を必要とするので、時間と費用がかかる。ナノ細孔検出は、必要とするヌクレオチドと試薬の量を減らすことによって迅速で安価な核酸の配列決定を提供する可能性がある。
【０００４】
ナノ細孔検出を使用する核酸の配列決定の２つの重要な成分は、（１）細孔を通る核酸の移動を制御することおよび（２）細孔を通して核酸ポリマーを移動させながらヌクレオチドを識別することである。これまで、ヌクレオチドを識別するには、核酸は溶血素変異体を通されていた。これは、配列依存的であることが示されている電流識別特性を備えている。多くのヌクレオチドが観察される電流に関与しており、観察される電流と核酸配列の間に直接的な関係を作ることを難しくしていることも示されている。
【０００５】
ヌクレオチドを識別するための電流範囲は、溶血素細孔の変異によって改善されたが、ヌクレオチド間の電流差をさらに改善できるならば、配列決定システムはより高性能になるはずである。加えて、核酸が細孔を通って移動するとき、いくつかの電流状態が大きい変動を示すことが観察された。いくつかの変異体溶血素細孔が他より大きな変動を表すことも示されている。これら状態の変動は、配列特異的な情報を内包する可能性があるが、システムを単純化するには、変動の小さい細孔を作製することが望ましい。観察される電流に関与するヌクレオチド数を減らすことも望ましい。
【０００６】
Ｍｓｐの異なる形態は、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）由来のポーリンである。ＭｓｐＡは、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）由来の１５７ｋＤａの八量体ポーリンである。ＭｓｐＡの構造は、研究者によってよく立証されている（Gundlach、Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Sep 14； 107(37)：16060〜5頁、Epub 2010 Aug 26）。いくつかの重要な残基が同定され、変形されて細孔の特性が増強されてきた。これらの変異は、ＤＮＡがＭｓｐＡ細孔を通って推移できるように施された。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤもＭｓｐの公知の形態である。
【発明の概要】
【０００７】
驚くべきことに、本発明者は、Ｍｓｐの新規な変異体が核酸配列などの特徴を推定する特性を改善することを実証した。驚くべきことに変異体は、ヌクレオチドの識別を改善する。具体的には、驚くべきことに変異体は、異なるヌクレオチドの識別を容易にする電流範囲を増加させ、シグナル対ノイズ比を高める状態変動を減少させる。加えて、細孔を通って核酸が移動するにつれて電流に関与するヌクレオチドの数は減少する。これにより、核酸が細孔を通って移動する際に観察される電流と核酸配列との直接的な関係を同定することがさらに容易になる。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者は、細孔を通る核酸の移動がＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによって制御されているとき、Ｍｓｐが配列決定特性を改善することも示した。具体的には、ＭｓｐとＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼとの結合により、予想外の利点が３つもたらされる。第１に、商業的に実現可能でありなおかつ有効な配列決定を可能にする速度で、核酸が細孔を通って移動する。第２に、核酸が細孔を通って移動する際に電流範囲の増加が観察され、それにより容易に配列を決定できるようになる。第３に、電流変動の減少が観察され、それによってシグナル対ノイズ比が高まる。
【０００９】
したがって、本発明は、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体Ｍｓｐモノマーであって、バリアントが以下の変異：
（ａ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｂ）９０位にセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはチロシン（Ｙ）；
（ｃ）１０５位にロイシン（Ｌ）またはセリン（Ｓ）；
（ｄ）１２６位にアルギニン（Ｒ）；
（ｅ）７５位にセリン（Ｓ）；
（ｆ）７７位にセリン（Ｓ）；
（ｇ）５９位にアルギニン（Ｒ）；
（ｈ）７５位にグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｉ）７７位にグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｊ）７８位にロイシン（Ｌ）；
（ｋ）８１位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｌ）８３位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｍ）８６位にセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｎ）８７位にフェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）；
（ｏ）８８位にチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｐ）８９位にフェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）；
（ｑ）９０位にロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｒ）９１位にセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｓ）９２位にアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）；
（ｔ）９３位にセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）；
（ｕ）９４位にロイシン（Ｌ）；
（ｖ）９５位にバリン（Ｖ）；
（ｗ）９６位にアルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｘ）９７位にセリン（Ｓ）；
（ｙ）９８位にセリン（Ｓ）；
（ｚ）９９位にセリン（Ｓ）；
（ａａ）１００位にセリン（Ｓ）；
（ｂｂ）１０１位にフェニルアラニン（Ｆ）；
（ｃｃ）１０２位にリシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｄｄ）１０３位にアラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｅｅ）１０４位にイソロイシン；
（ｆｆ）１０５位にチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｇｇ）１０６位にフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）；
（ｈｈ）１０８位にプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）；
（ｉｉ）１１８位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｊｊ）１０３位にセリン（Ｓ）またはシステイン（Ｃ）；、
（ｋｋ）１０〜１５、５１〜６０、１３６〜１３９および１６８〜１７２位のうちの１つまたは複数におけるシステイン
の少なくとも１つを含む、変異体を提供する。
【００１０】
本発明は、
−  Ｍｓｐから得られる共有結合したモノマーを２個以上含む構築物；
−  本発明の変異体または本発明の構築物をコードするポリヌクレオチド；
−  本発明の同一の変異体モノマーを含む、Ｍｓｐから得られるホモオリゴマー細孔；
−  本発明の変異体モノマーを少なくとも１つ含み、全８個のモノマーのうちの少なくとも１つが他と異なっている、Ｍｓｐから得られるヘテロオリゴマー細孔；
−  標的核酸配列を特徴付ける方法であって、
（ａ）核酸結合タンパク質が、本発明の細孔を通る標的配列の移動を制御し、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用できるように、標的配列を細孔およびタンパク質と接触させるステップと；
（ｂ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって標的配列を特徴付けるステップと
を含む方法；
−  （ａ）本発明の細孔および（ｂ）核酸ハンドリング酵素を含む、標的核酸配列を配列決定するためのキット；
−  サンプル中の標的核酸配列を配列決定するための装置であって、（ａ）本発明の複数の細孔および（ｂ）複数の核酸ハンドリング酵素を含む装置；
−  標的核酸配列を特徴付ける方法であって、
（ａ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが、Ｍｓｐから得られる細孔を通る標的配列の移動を制御し、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、標的配列を細孔およびポリメラーゼと接触させるステップと；
（ｂ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって標的配列を特徴付けるステップとを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）が細孔に印加される電圧により実施される、方法；
−  標的核酸配列を特徴付けるためのセンサーを形成する方法であって、
（ａ）標的核酸配列の存在下でＭｓｐから得られる細孔をＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップと；
（ｂ）細孔に電圧を印加して、細孔とポリメラーゼとの複合体を形成させるステップと
を含み、それによって標的核酸配列を特徴付けるためのセンサーを形成する、方法；
−  Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高める方法であって、
（ａ）核酸配列の存在下でＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをＭｓｐから得られる細孔と接触させるステップと；
（ｂ）細孔に電圧を印加して、細孔とポリメラーゼとの複合体を形成させるステップと
を含み、それによってＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高める、方法；
−  （ａ）Ｍｓｐから得られる細孔および（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む、標的核酸配列を特徴付けるためのキット；ならびに
−  サンプル中の標的核酸配列を特徴付けるための装置であって、Ｍｓｐから得られる複数の細孔および複数のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む装置、も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一本鎖ＤＮＡがナノ細孔を移行する際の、個々の電流レベルの平均滞留時間を示す図である。データは、いくつかの単一分子と照合され、電流レベルによって四分位値に分割される。
【図２】アンジッピングモード（Unzipping mode）でＰｈｉ２９を使用してＭＳ−（ＮＮＮＲＲＫ）８ナノ細孔を通してＤＮＡ鎖（配列番号１５）を移動させることから得られる電流レベルおよび変動を示す図である。
【図３】アンジッピングモードでＰｈｉ２９を使用してＨＬ−（変異体）７ナノ細孔を通してＤＮＡ鎖（配列番号１５）を移動させることから得られる電流レベルおよび変動を示す図である。
【図４】印加電位の範囲（−２００ｍＶ〜２００ｍＶ）で記録した単一ＭｓｐＡチャネルに対する電流レベルを示す図である。
【図５】ベースラインＭｓｐＡ変異体、ＭＳ−（Ｂ１）８に対する開孔レベルのＩ−Ｖ曲線を示す図である。各線は、単一細孔を表している。
【図６】ＭｓｐＡ変異体、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｙ）８に対する開孔レベルのＩ−Ｖ曲線を示す図である。各線は、単一細孔を表している。
【図７】ＭｓｐＡ変異体、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｎ）８に対する開孔レベルのＩ−Ｖ曲線を示す図である。各線は、単一細孔を表している。
【図８】１８０ｍＶにおけるＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ａ）８細孔に対する高伝導性状態（２７５ｐＡ）と低伝導性状態（１５０ｐＡ）の間の電流の変化を示す図である。
【図９】ＤＮＡがベースラインＭＳ−（Ｂ１）８細孔を通ってほどかれるときに生じる電流レベルを示す図である。これらの事象に対する電流範囲は、３０ｐＡ以下である。
【図１０】ＤＮＡがベースラインＭＳ−（Ｂ１ーＩ１０５Ａ）８細孔を通ってほどかれるときに生じる電流レベルを示す図である。これらの事象に対する電流範囲は、４０ｐＡ以下である。
【図１１】実施例９および１２および１５において使用されるＤＮＡ基質設計を示す図である。
【図１２】実施例１０および１１において使用されるＤＮＡ基質設計を示す図である。
【図１３】点突然変異が、ＭｓｐＡモノマー配列中に作られるとき、同じＤＮＡ配列に対して、配列決定プロファイルがどのように変化するかを示す図である。これらの図表は、複数のポリヌクレオチドから得られるレベルのプロファイルの平均を示している。Ａ）ＭＳ−（Ｂ１）８細孔の配列決定プロファイルを示すグラフである。Ｂ）ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９３Ｓ−Ｉ１０５Ａ）８細孔の配列決定プロファイルを示すグラフである。Ｃ）ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｑ１２６Ｒ）８細孔の配列決定プロファイルを示すグラフである。Ｄ）ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｍ）８細孔の配列決定プロファイルを示すグラフである。Ｅ）ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｓ）８細孔の配列決定プロファイルを示すグラフである。Ｆ）ＭＳ−（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８細孔の配列決定プロファイルを示すグラフである。
【図１４】実施例１３において使用されるＤＮＡ基質設計を示す図である。
【図１５】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによって媒介され、ＭｓｐＡ変異体細孔ＭＳ−（Ｂ１）８を通るＲＮＡの移行の制御に関する事象追跡例を示す図である。上の追跡において強調されている領域の拡大図を下に示している。
【図１６】脂質二重層への細孔の挿入を示す図である。Ａ）モノマーからオリゴマー化したＭＳ−（Ｂ１）８の細孔の挿入を示す図である。Ｂ）ダイマーからオリゴマー化したＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４の細孔の挿入を示す図である。
【図１７】ヘリカーゼによって媒介され、モノマーのオリゴマー化によって作製されたＭＳ−（Ｂ１）８変異体細孔を通るＤＮＡの移行の制御に関する事象追跡例を示す図である。上の追跡において強調されている領域の拡大図を下に示している。
【図１８】ヘリカーゼによって媒介され、ダイマーのオリゴマー化によって作製されたＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４変異体細孔を通るＤＮＡの移行の制御に関する事象追跡例を示す図である。上の追跡において強調されている領域の拡大図を下に示している。
【図１９】実施例１６において使用されるＤＮＡ基質設計を示す図である。
【図２０】ヘリカーゼによって媒介され、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８変異体細孔を通るシトシンおよび５−メチルシトシンの両方を含有するＤＮＡの移行の制御に関する事象追跡例を示す図である。上の追跡において強調されている領域の拡大図を下に示している。
【００１２】
配列表の説明
配列番号１は、ＮＮＮ−ＲＲＫ変異体ＭｓｐＡモノマーをコードしているポリヌクレオチド配列を示している。
【００１３】
配列番号２（「Ｂ１」とも呼ばれる）は、ＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示している。変異体は、シグナル配列およびアミノ末端メチオニン（スタートコドンによってコードされる）を欠いており、以下の変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。これらの変異により、ＤＮＡはＭｓｐＡ細孔を通って推移できる。
【００１４】
配列番号３は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を示している。
【００１５】
配列番号４は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１６】
配列番号５は、大腸菌（E. coli）由来のｓｂｃＢ遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏＩ）をコードしている。
【００１７】
配列番号６は、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏＩ）のアミノ酸配列を示している。
【００１８】
配列番号７は、大腸菌（E. coli）由来のｘｔｈＡ遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードしている。
【００１９】
配列番号８は、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示している。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖から３’−５’方向に、５’モノリン酸ヌクレオシドの分配消化を行う。鎖上における酵素開始にはおよそ４ヌクレオチドの５’突出が必要である。
【００２０】
配列番号９は、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のｒｅｃＪ遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードしている。
【００２１】
配列番号１０は、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示している。この酵素は、ｓｓＤＮＡから５’−３’方向に、５’モノリン酸ヌクレオシドの前進性消化を行う。鎖上における酵素開始には少なくとも４ヌクレオチドが必要である。
【００２２】
配列番号１１は、バクテリオファージλｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子から得られるコドンを最適化したポリヌクレオチド配列を示している。これは、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼをコードしている。
【００２３】
配列番号１２は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示している。この配列は、三量体へと組織化する３つの同一サブユニットの１つである。この酵素は、ｄｓＤＮＡの一方の鎖から５’−３’方向に、ヌクレオチドの高前進性消化を行う（http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp）。鎖上における酵素開始には、選択的に５’リン酸を持つおよそ４ヌクレオチドの５’突出が必要である。
【００２４】
配列番号１３〜１５は、実施例２において使用した配列を示している。
【００２５】
配列番号１６〜１８は、それぞれＭｓｐＢ、ＣおよびＤ変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示している。成熟形態は、シグナル配列を欠いている。
【００２６】
配列番号１９および２０は、実施例９、１２および１５において使用した配列を示している。
【００２７】
配列番号２１〜２３は、実施例１０および１１において使用した配列を示している。
【００２８】
配列番号２４〜２７は、実施例１３において使用した配列を示している。
【００２９】
配列番号２８は、実施例１４において使用したＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体の成熟形態のダイマーのＤＮＡ配列を示している。
【００３０】
配列番号２９は、実施例１４において使用したＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体の成熟形態のダイマーのタンパク質配列を示している。
【００３１】
配列番号３０、３１および３２は、実施例１６において使用した配列を示している。
【００３２】
配列番号３３は、配列番号２９に示した構築物において使用した示されるリンカー配列を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
開示された産物および方法の異なる適用が、当技術分野における特定の必要性に合わせられることは理解されよう。本明細書において使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を記載するためだけのものであり、制限することを意図しないことも理解されよう。
【００３４】
加えて、この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されているように、文脈に別段の明確な指図がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「変異体」への言及は「変異体（複数）」を含み、「置換」への言及はそのような置換を２個以上含み、「細孔」への言及はそのような細孔を２個以上含み、「核酸配列」への言及はそのような配列を２個以上含む、などである。
【００３５】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前後を問わず、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００３６】
変異体Ｍｓｐモノマー
本発明は、変異体Ｍｓｐモノマーを提供する。変異体Ｍｓｐモノマーを使用して、本発明の細孔を形成することができる。変異体Ｍｓｐモノマーとは、その配列が野生型Ｍｓｐモノマーと異なるが、細孔形成能を保持しているモノマーである。変異体モノマーが細孔を形成する能力を確認する方法は、当技術分野において周知であり、以下に詳述されている。
【００３７】
変異体モノマーは、ヌクレオチド読み取り特性が改善されており、すなわちヌクレオチドの捕捉および識別が改善されている。具体的には、変異体モノマーから構築された細孔は、野生型より容易にヌクレオチドおよび核酸を捕捉する。加えて、変異体モノマーから構築された細孔は、異なるヌクレオチドの識別を容易にする電流範囲を増加させ、シグナル対ノイズ比を高める状態変動を減少させる。加えて、変異体から構築した細孔を通って核酸が移動するにつれて電流に関与するヌクレオチドの数は減少する。これにより、核酸が細孔を通って移動する際に観察される電流と核酸配列との直接的な関係を同定することがさらに容易になる。変異体のヌクレオチド読み取り特性の改善は５つの主な機序、すなわち：
−  立体性（アミノ酸残基のサイズを増減する）；
−  電荷（例えば＋ｖｅ電荷を導入して核酸配列と相互作用させる）；
−  水素結合（例えば塩基対と水素結合できるアミノ酸を導入する）；
−  πスタッキング（例えば非局在化π電子系によって相互作用するアミノ酸を導入する）；および／または
−  細孔の構造の改変（例えば入口部および／または狭窄部のサイズを増大させるアミノ酸を導入する）、の変化によって得られる。
【００３８】
これらの５つの機序のいずれか１つまたは複数が、本発明の細孔の特性の改善に関与している可能性がある。例えば、立体性の改変、水素結合の改変および構造の改変により、本発明の細孔は、ヌクレオチド読み取り特性を改善することができる。
【００３９】
フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）など嵩高い残基の導入は、細孔の立体性を増加させる。フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）などの芳香族残基の導入は、細孔内のπステーキング（staking）も高める。嵩高い残基または芳香族残基の導入は、例えば細孔を広げ、入口部および／または狭窄部のサイズを増大させることによって、細孔の構造も改変する。これについては、以下に詳しく記載されている。
【００４０】
本発明の変異体モノマーは、配列番号２に示される配列のバリアントを含む。配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体である。これは、以下の変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。配列番号２のバリアントは、配列番号２と異なるアミノ酸配列を有するが、細孔形成能を保持しているポリペプチドである。
【００４１】
バリアントは以下の変異：
（ａ）８８位にアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｂ）９０位にセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはチロシン（Ｙ）；
（ｃ）１０５位にロイシン（Ｌ）またはセリン（Ｓ）；
（ｄ）１２６位にアルギニン（Ｒ）；
（ｅ）７５位にセリン（Ｓ）；
（ｆ）７７位にセリン（Ｓ）；
（ｇ）５９位にアルギニン（Ｒ）；
（ｈ）７５位にグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｉ）７７位にグルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｊ）７８位にロイシン（Ｌ）；
（ｋ）８１位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｌ）８３位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｍ）８６位にセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｎ）８７位にフェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）；
（ｏ）８８位にチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｐ）８９位にフェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）；
（ｑ）９０位にロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｒ）９１位にセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｓ）９２位にアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）；
（ｔ）９３位にセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）；
（ｕ）９４位にロイシン（Ｌ）；
（ｖ）９５位にバリン（Ｖ）；
（ｗ）９６位にアルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｘ）９７位にセリン（Ｓ）；
（ｙ）９８位にセリン（Ｓ）；
（ｚ）９９位にセリン（Ｓ）；
（ａａ）１００位にセリン（Ｓ）；
（ｂｂ）１０１位にフェニルアラニン（Ｆ）；
（ｃｃ）１０２位にリシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｄｄ）１０３位にアラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）；
（ｅｅ）１０４位にイソロイシン；
（ｆｆ）１０５位にチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）またはシステイン（Ｃ）；
（ｇｇ）１０６位にフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）またはセリン（Ｓ）；
（ｈｈ）１０８位にプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）；
（ｉｉ）１１８位にアスパラギン（Ｎ）；
（ｊｊ）１０３位にセリン（Ｓ）またはシステイン（Ｃ）；、
（ｋｋ）１０〜１５、５１〜６０、１３６〜１３９および１６８〜１７２位のうちの１つまたは複数にシステイン
の少なくとも１つを含む。
【００４２】
野生型ＭｓｐＡにおいて、各モノマーの残基８８および１０５は、細孔の内部狭窄部に疎水性の環を形成している。Ｌ８８およびＩ１０５位の疎水性残基は、細孔の主な狭搾部の真上に位置し、水性チャネルに面している。これら残基の変異は、ベースライン（配列番号２）に対して著しく高い開孔電流を有する細孔をもたらす。これらの位置に変異が作られるときに観察される電流差は、単一変異を作ることから予想される差より著しく高くなる。この驚くべき結果は、これらの位置における変異が、これら残基の局所的な環境だけでなくチャネル構造に対する効果も有する可能性があることを意味している。配列番号２ベースラインは広範な細孔伝導性を表すと報告されているが、その理由は十分に分かっていない。Ｌ８８およびＩ１０５位に対する変異は、支配的な細孔電流レベルをベースライン細孔より著しく高める。加えて、この高い伝導性状態は、変異体の支配的な立体構造であり、広い電流範囲およびシグナル対ノイズの増加にとって望ましい。
【００４３】
８８位へのＮ、Ｓ、ＱまたはＴの導入（すなわち上記の変異（ａ））は、核酸中のヌクレオチドと水素結合できるアミノ酸を細孔の内部狭搾部に導入する。
【００４４】
各モノマー中の残基９０および９１も、細孔の内部狭搾部の部分を形成している。各モノマー中の残基１１８は、細孔の入口部の中に存在している。各モノマー中の残基１３４は、細孔への入口部分である。
【００４５】
９０位へのＳ、ＱまたはＹの導入（すなわち上記の変異（ｂ））は、核酸中のヌクレオチドと水素結合できるアミノ酸を細孔の内部狭搾部に導入する。
【００４６】
バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の変異など、任意の数の変異（ａ）〜（ｋｋ）を含むことができる。変異の好ましい組合せについては後述する。バリアントに導入されるアミノ酸は、天然に存在するまたはそれの天然に存在しない誘導体であってよい。バリアントに導入されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であってよい。
【００４７】
任意の数のシステインが、バリアントに導入されてよい。好ましくは、システインは、９０、９１および１０３位のうちの２つまたは全てなど、１つまたは複数の位置に導入される。これらの位置は、以下で詳述するように、分子アダプターの化学的付着に有用となる場合がある。任意の数のシステイン（例えば２、３、４、５、６個以上のシステイン）が、１０〜１５、５１〜６０、１３６〜１３９および１６８〜１７２位に導入されてよい。これらの位置は細孔の非保存的ループ領域に存在しており、以下で詳述するように、核酸結合タンパク質を細孔に化学的に付着させるのに有用である。
【００４８】
好ましい実施形態において、バリアントは以下の（Ａ）〜（Ｚ）に示される１つまたは複数の置換を含む。バリアントは、Ａ〜Ｚにある置換を任意の数（例えば１、２、３、４または５個など）含むことができる。
【００４９】
（Ａ）（ｉ）７５位へのセリン（Ｓ）、（ｉｉ）７７位へのセリン（Ｓ）、（ｉｉｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）、（ｉｖ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｖ）１２６位へのアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２、３、４または５個含むことができる。各モノマー中に４つ全ての置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表３に示す。
【００５０】
（Ｂ）（ｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉ）１２６位へのアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表３に示す。
【００５１】
（Ｃ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）１２６位へのアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。各モノマー中に３つ全てのこれら置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表３に示す。
【００５２】
（Ｄ）（ｉ）８８位へのセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表３に示す。
【００５３】
（Ｅ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表３に示す。
【００５４】
（Ｆ）（ｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉ）１０５位へのアラニン（Ａ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００５５】
（Ｇ）（ｉ）９０位へのセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９２位へのセリン（Ｓ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００５６】
（Ｈ）（ｉ）８８位へのトレオニン（Ｔ）および（ｉｉ）９０位へのセリン（Ｓ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００５７】
（Ｉ）（ｉ）８７位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉ）９０位へのセリン（Ｓ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００５８】
（Ｊ）（ｉ）８９位へのチロシン（Ｙ）および（ｉｉ）９０位へのセリン（Ｓ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００５９】
（Ｋ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）８９位へのフェニルアラニン（Ｆ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６０】
（Ｌ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）８９位へのチロシン（Ｙ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６１】
（Ｍ）（ｉ）９０位へのセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９２位へのアラニン（Ａ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６２】
（Ｎ）（ｉ）９０位へのセリン（Ｓ）および（ｉｉ）９４位へのアスパラギン（Ｎ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６３】
（Ｏ）（ｉ）９０位へのセリン（Ｓ）および（ｉｉ）１０４位へのイソロイシン（Ｉ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６４】
（Ｐ）（ｉ）８８位へのアスパラギン酸（Ｄ）および（ｉｉ）１０５位へのリシン（Ｋ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６５】
（Ｑ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）および（ｉｉ）１２６位へのアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１または２個含むことができる。各モノマー中に両方の置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６６】
（Ｒ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）９１位へのアルギニン（Ｒ）の１つまたは複数。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。各モノマー中に３つ全てのこれら置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６７】
（Ｓ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）９１位へのセリン（Ｓ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。各モノマー中に３つ全てのこれら置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６８】
（Ｔ）（ｉ）８８位へのアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）および（ｉｉｉ）１０５位へのバリン（Ｖ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。各モノマー中に３つ全てのこれら置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００６９】
（Ｕ）（ｉ）９０位へのグルタミン（Ｑ）、（ｉｉ）９３位へのセリン（Ｓ）および（ｉｉｉ）１０５位へのアライン（alaine）（Ａ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。各モノマー中に３つ全てのこれら置換を含むホモ八量体の細孔の利点を以下の表２に示す。
【００７０】
（Ｖ）（ｉ）９０位へのフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）９１位へのフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）および（ｉｉｉ）１０５位へのフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。これらの嵩高い芳香族残基の導入は、細孔の入口部および／または狭搾部における立体性およびπスタッキングを増大させる。それらは、入口部および／または狭搾部のサイズも増大させる（すなわち、細孔を広げる）。
【００７１】
（Ｗ）（ｉ）９０位へのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）もしくはバリン（Ｖ）、（ｉｉ）９１位へのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）もしくはバリン（Ｖ）および（ｉｉｉ）１０５位へのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）もしくはバリン（Ｖ）の１つまたは複数の導入。バリアントは、これら置換を１、２または３個含むことができる。小さい残基の導入は、細孔の入口部および／または狭搾部における立体性を減少させる。
【００７２】
（Ｘ）９０位へのセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）もしくはヒスチジン（Ｈ）および／または９１位へのセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）もしくはヒスチジン（Ｈ）の導入。陽性電荷残基（Ｒ、ＫまたはＨ）の導入は、細孔の狭搾部と核酸配列との相互作用を高める。
【００７３】
（Ｙ）９０位へのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）および／または９１位へのセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）の導入。これら残基の導入は、細孔の狭搾部と核酸配列との間で起こる水素結合を強める。それらは、入口部および／または狭搾部のサイズも増大させる（すなわち、細孔を広げる）。
【００７４】
（Ｚ）９０、９１および１０３位の１つまたは複数へのシステインの導入。これにより、化学基はシステイン結合を介して細孔に付着できるようになる。これについては、上および下に詳述されている。
【００７５】
好ましいバリアントには、それだけには限らないが、以下の置換（複数可）の少なくとも１つを含むものがある。Ｌ８８Ｎ；Ｌ８８Ｓ；Ｌ８８Ｑ；Ｌ８８Ｔ；Ｄ９０Ｓ；Ｄ９０Ｑ；Ｄ９０Ｙ；Ｉ１０５Ｌ；Ｉ１０５Ｓ；Ｑ１２６Ｒ；Ｇ７５Ｓ；Ｇ７７Ｓ；Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ｌ８８ＮおよびＱ１２６Ｒ；Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８ＳおよびＤ９０Ｑ；Ｌ８８ＮおよびＤ９０Ｑ；Ｅ５９Ｒ；Ｇ７５Ｑ；Ｇ７５Ｎ；Ｇ７５Ｓ；Ｇ７５Ｔ；Ｇ７７Ｑ；Ｇ７７Ｎ；Ｇ７７Ｓ；Ｇ７７Ｔ；Ｉ７８Ｌ；Ｓ８１Ｎ；Ｔ８３Ｎ；Ｎ８６Ｓ；Ｎ８６Ｔ；Ｉ８７Ｆ；Ｉ８７Ｖ；Ｉ８７Ｌ；Ｌ８８Ｎ；Ｌ８８Ｓ；Ｌ８８Ｙ；Ｌ８８Ｆ；Ｌ８８Ｖ；Ｌ８８Ｑ；Ｌ８８Ｔ；Ｉ８９Ｆ；Ｉ８９Ｖ；Ｉ８９Ｌ；Ｎ９０Ｓ；Ｎ９０Ｑ；Ｎ９０Ｌ；Ｎ９０Ｙ；Ｎ９１Ｓ；Ｎ９１Ｑ；Ｎ９１Ｌ；Ｎ９１Ｍ；Ｎ９１Ｉ；Ｎ９１Ａ；Ｎ９１Ｖ；Ｎ９１Ｇ；Ｇ９２Ａ；Ｇ９２Ｓ；Ｎ９３Ｓ；Ｎ９３Ａ；Ｎ９３Ｔ；Ｉ９４Ｌ；Ｔ９５Ｖ；Ａ９６Ｒ；Ａ９６Ｄ；Ａ９６Ｖ；Ａ９６Ｎ；Ａ９６Ｓ；Ａ９６Ｔ；Ｐ９７Ｓ；Ｐ９８Ｓ；Ｆ９９Ｓ；Ｇ１００Ｓ；Ｌ１０１Ｆ；Ｎ１０２Ｋ；Ｎ１０２Ｓ；Ｎ１０２Ｔ；Ｓ１０３Ａ；Ｓ１０３Ｑ；Ｓ１０３Ｎ；Ｓ１０３Ｇ；Ｓ１０３Ｔ；Ｖ１０４Ｉ；Ｉ１０５Ｙ；Ｉ１０５Ｌ；Ｉ１０５Ａ；Ｉ１０５Ｑ；Ｉ１０５Ｎ；Ｉ１０５Ｓ；Ｉ１０５Ｔ；Ｔ１０６Ｆ；Ｔ１０６Ｉ；Ｔ１０６Ｖ；Ｔ１０６Ｓ；Ｎ１０８Ｐ；Ｎ１０８Ｓ；Ｄ９０ＱおよびＩ１０５Ａ；Ｄ９０ＳおよびＧ９２Ｓ；Ｌ８８ＴおよびＤ９０Ｓ；Ｉ８７ＱおよびＤ９０Ｓ；Ｉ８９ＹおよびＤ９０Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ８９Ｆ；Ｌ８８ＮおよびＩ８９Ｙ；Ｄ９０ＳおよびＧ９２Ａ；Ｄ９０ＳおよびＩ９４Ｎ；Ｄ９０ＳおよびＶ１０４Ｉ；Ｌ８８ＤおよびＩ１０５Ｋ；Ｌ８８ＮおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＤ９１Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＤ９１Ｓ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＩ１０５Ｖ；Ｄ９０Ｑ、Ｄ９３ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９１Ｙ；Ｎ９０ＹおよびＮ９１Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｙ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｇ；Ｉ０５Ｇ；Ｎ９０Ｒ；Ｎ９１Ｒ；Ｎ９０ＲおよびＮ９１Ｒ；Ｎ９０Ｋ；Ｎ９１Ｋ；Ｎ９０ＫおよびＮ９１Ｋ；Ｎ９０ＱおよびＮ９１Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｑ；Ｎ９０ＱおよびＮ９１Ｑ；Ｒ１１８Ｎ；Ｎ９１Ｃ；Ｎ９０Ｃ；Ｎ９０Ｗ；Ｎ９１Ｗ；Ｎ９０Ｋ；Ｎ９１Ｋ；Ｎ９０Ｒ；Ｎ９１Ｒ；Ｎ９０ＳおよびＮ９１Ｓ；Ｎ９０ＹおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＧおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＱおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＡおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＳおよびＩ１０５Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ１０５Ｎ；Ｎ９０ＧおよびＮ９３Ｇ；Ｎ９０Ｇ；Ｎ９３Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ａ；Ｉ１０５Ｋ；Ｉ１０５Ｒ；Ｉ１０５Ｖ；Ｉ１０５Ｐ；Ｉ１０５Ｗ；Ｌ８８Ｒ；Ｌ８８Ａ；Ｌ８８Ｇ；Ｌ８８Ｎ；Ｎ９０ＲおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＡおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＳおよびＩ１０５Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ１０５Ｎ；Ｌ８８Ｃ；Ｓ１０３Ｃ；およびＩ１０５Ｃ．．
【００７６】
特に好ましいバリアントは、Ｉ１０５Ｎを含む。Ｉ１０５Ｎを含む変異体モノマーから構築される細孔は、およそ８０％に上昇する残留電流を有する。異なるヌクレオチドに関連する電流の変化も増大する。これは、Ｉ１０５Ｎを含む変異体モノマーから構築される細孔の構造変化を反映している。したがってそのような細孔は、ヌクレオチドを識別する能力が改善されている。
【００７７】
ホモ八量体の細孔において使用される際に好ましい単一変異体およびそれらの利点を以下の表１に示す。
【００７８】
【表１】
2014506575.tif 000003
【表１−２】
2014506575.tif 000004
表１の続き  
【００７９】
ホモ八量体の細孔において使用される際に好ましい多重変異体およびそれらの利点を以下の表２に示す。
【００８０】
【表２】
2014506575.tif 000005
【００８１】
ホモ八量体の細孔において使用される際に最も好ましい変異体およびそれらの利点を以下の表３に示す。
【００８２】
【表３】
2014506575.tif 000006
【００８３】
上述した特定の変異に加えて、バリアントは他の変異を含むことができる。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同になる。より好ましくは、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、全配列にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。１００以上（例えば１２５、１５０、１７５または２００以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性（hard homology）」）。
【００８４】
当技術分野において標準的な方法を使用して相同性を決定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供しており、これを使用して（例えば初期設定で使用して）相同性を算出できる（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387〜395頁）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36：290〜300頁；Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215：403〜10頁に記載のとおり、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を算出するまたは配列を整列させる（例えば等価な残基もしくは対応する配列を（通常は初期設定で）同定する）ことができる。
【００８５】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって一般公開されている。このアルゴリズムは、最初にデータベース配列中の同じ長さのワードと整列したときに、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するまたはそれを満たすクエリー配列中にある長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）の同定を行う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれている（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌら）。これら最初の近傍ワードヒットは、それを含有するＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積整列化スコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に広げられる。ワードヒットの各方向への拡張は、次の場合に停止する：累積整列化スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下する場合；１つもしくは複数の負にスコアされる残基の整列化が蓄積することにより累積スコアが０以下になる場合、または配列のいずれかの末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸにより、整列化の感度および速度が決まる。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定としてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89： 10915〜10919頁を参照のこと）、整列化（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００８６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 5873〜5787頁を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の１つの基準は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのアミノ酸配列の一致が偶然に起こり得る確率の指標が得られる。例えば第１配列と第２配列との比較において、最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満および最も好ましくは約０．００１未満である場合、ある配列は別の配列に類似していると見なされる。
【００８７】
配列番号２は、ＭｓｐＡモノマーのＮＮＮ−ＲＲＫ変異体である。バリアントは、ＭｓｐＡと比較して、ＭｓｐＢ、ＣまたはＤモノマー中にどんな変異も含むことができる。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態を、配列番号１６〜１８に示す。具体的には、バリアントは、ＭｓｐＢに存在する以下の置換を含むことができる：Ａ１３８Ｐ。バリアントは、ＭｓｐＣに存在する以下の置換の１つまたは複数を含むことができる：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐ。バリアントは、ＭｓｐＤに存在する以下の変異の１つまたは複数を含むことができる：Ｇ１、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの欠失。バリアントは、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤに由来する１つまたは複数の変異と置換の組合せを含むことができる。
【００８８】
上述のものに加えて、配列番号２のアミノ酸配列に対して、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までアミノ酸置換を行うことができる。保存的置換は、アミノ酸を類似の化学的構造、類似の化学的特性または類似の側鎖容積の他のアミノ酸と置きかえる。導入されるアミノ酸は、それと置きかわるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有することができる。あるいは、保存的置換は、予め芳香族または脂肪族アミノ酸が存在している場所に芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することができる。保存的なアミノ酸変化は当技術分野において周知であり、以下の表４で定義される２０種の主要なアミノ酸の特性に従って選択できる。アミノ酸が類似の極性を有する場合、表５にあるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシー尺度を参照することによって、これを決定することもできる。
【００８９】
【表４】
2014506575.tif 000007
【００９０】
【表５】
2014506575.tif 000008
【００９１】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基を、上記のポリペプチドからさらに欠失させることができる。１、２、３、４、５、１０、２０または３０個までの残基を欠失させることができ、それ以上でもよい。
【００９２】
バリアントは、配列番号２の断片を含むことができる。そのような断片は、細孔形成活性を保持している。断片は、少なくとも長さ５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片を使用して、本発明の細孔を作製することができる。断片は、好ましくは配列番号２の細孔形成ドメインを含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４のうちの１つを含まなければならない。通常、断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【００９３】
あるいはまたはさらに、１つまたは複数のアミノ酸を、上記のポリペプチドに付加することができる。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもしくは断片のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に形成され得る。伸長は、例えば長さ１〜１０アミノ酸と非常に短くてよい。あるいは、伸長は、例えば５０または１００アミノ酸まで長くてもよい。本発明によるアミノ酸配列に担体タンパク質を融合させてもよい。他の融合タンパク質については、以下で詳述している。バリアントは、配列番号２のアミノ末端にメチオニンを有する場合がある。
【００９４】
上述のとおり、バリアントは、配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有するが、細孔形成能を保持しているポリペプチドである。バリアントは通常、細孔形成に関与する配列番号２の領域を含有する。Ｍｓｐ（β−バレルを含有する）の細孔形成能は、各サブユニット中にあるβ−シートによってもたらされる。配列番号２のバリアントは通常、β−シートを形成する配列番号２の領域を含む。得られたバリアントが細孔形成能を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に１つまたは複数の修飾を作ることができる。配列番号２のバリアントは、そのα−へリックスおよび／またはループ領域内に、好ましくは１つまたは複数の修飾（置換、付加または欠失など）を含む。
【００９５】
変異体モノマーを修飾して、例えばヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（Ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラグタグを付加することによって、またはポリペプチドがシグナル配列を天然に内包しない場合には、細胞からの分泌を促進するためにそのような配列を付加することによって、変異体モノマーの同定または精製を補助することができる。遺伝学的タグを導入するための別の手段は、細孔上の天然のまたは工作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、細孔の外側に工作されたシステインに対してゲルシフト試薬を反応させることである。これは、溶血素ヘテロオリゴマーを分離する方法として実証されている（Chem Biol. 1997 Jul；4(7)：497〜505頁）。
【００９６】
変異体モノマーを、明示用標識で標識することができる。明示用標識は、細孔を検出できるようにするどんな適切な標識であってもよい。適切な標識には、それだけには限らないが、蛍光分子、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ、３５Ｓ）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドがある。
【００９７】
変異体モノマーは、合成または組換え手段によって作成され得る。例えば、細孔は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。変異体モノマーのアミノ酸配列を修飾して、非天然アミノ酸を含めるまたはモノマーの安定性を高めることができる。変異体モノマーを合成手段によって作製する場合、作製する間にそのようなアミノ酸を導入することができる。変異体モノマーは、合成または組換え作製の後に改変されてもよい。
【００９８】
変異体モノマーは、Ｄ−アミノ酸を使用して作製されてもよい。例えば、変異体モノマーは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含んでもよい。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを作製する際に当技術分野で常用されている。
【００９９】
変異体モノマーは、ヌクレオチドの識別を促進するために１つまたは複数の特定の修飾を含有する。変異体モノマーは、細孔形成を妨げない限り、他の非特異的な修飾を含有してもよい。いくつかの非特異的な側鎖修飾が、当技術分野において公知であり、変異体モノマーの側鎖に作ることができる。そのような修飾には、例えば、アルデヒドと反応させ続いてＮａＢＨ４を用いて還元することによるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデートを用いるアミジン化または無水酢酸を用いるアシル化がある。
【０１００】
変異体モノマーは、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して作製することができる。変異体モノマーをコードしているポリヌクレオチド配列は、当技術分野において標準的な方法を使用して生成し、複製できる。そのような配列については、以下に詳述する。変異体モノマーをコードしているポリヌクレオチド配列は、当技術分野において標準的な技術を使用して、細菌宿主細胞中で発現させることができる。変異体モノマーは、組換え発現ベクターからポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕ発現させることによって細胞中で作製できる。発現ベクターは場合によっては、ポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモータを持っている。
【０１０１】
細孔を生成する生物から任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによって精製した後に、または後述するように組換え発現した後に、変異体モノマーを大規模に作製することができる。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムがある。次いで変異体モノマーを、本発明に従って使用する天然に存在するまたは人工的な膜へと挿入することができる。膜に細孔を挿入する方法については後述する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、変異体モノマーは化学修飾されている。変異体モノマーは、任意の方法で任意の部位で化学修飾できる。好ましくは、変異体モノマーは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン結合）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって化学修飾されている。そのような修飾を実施する適切な方法は、当技術分野において周知である。変異体モノマーは、任意の分子の付着によって化学修飾され得る。例えば、変異体モノマーは、色素または発蛍光団の付着によって化学修飾することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、変異体モノマーは、モノマーを含む細孔と標的ヌクレオチドまたは標的核酸配列との相互作用を促進する分子アダプターで化学修飾されている。アダプターが存在することにより、細孔とヌクレオチドまたは核酸配列とのホスト−ゲスト化学が改善され、それによって変異体モノマーから形成される細孔の配列決定能が改善される。ホスト−ゲスト化学の原理は、当技術分野において周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたは核酸配列との相互作用を改善する、細孔の物理的もしくは化学的特性に対して効果がある。アダプターは、細孔のバレルもしくはチャネルの電荷を改変することができ、またはヌクレオチドもしくは核酸配列と特異的に相互作用するもしくは結合することができ、それによって細孔との相互作用が促進される。
【０１０４】
好ましくは、分子アダプターは、環状分子、シクロデキストリン、ハイブリダイゼーションできる種、ＤＮＡ結合剤もしくは相互キレート剤（interchelator）、ペプチドもしくはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正電荷小分子または水素結合が可能な小分子である。
【０１０５】
アダプターは環状であってよい。好ましくは、環状アダプターは細孔と同じ対称性を有する。通常Ｍｓｐは中心軸の周りに８個のサブユニットを有するので、アダプターは、好ましくは８倍の対称性を有する。これについては、以下で詳述する。
【０１０６】
アダプターは通常、ホスト−ゲスト化学によってヌクレオチドまたは核酸配列と相互作用する。アダプターは通常、ヌクレオチドまたは核酸配列と相互作用できる。アダプターは、ヌクレオチドまたは核酸配列と相互作用できる１つまたは複数の化学基を含む。好ましくは、１つまたは複数の化学基は、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−陽イオン相互作用および／または静電力など非共有結合性相互作用によってヌクレオチドもしくは核酸配列と相互作用する。好ましくは、ヌクレオチドまたは核酸配列と相互作用できる１つまたは複数の化学基は正に荷電している。より好ましくは、ヌクレオチドまたは核酸配列と相互作用できる１つまたは複数の化学基はアミノ基を含む。アミノ基は、第一、第二または第三炭素原子に付着することができる。さらにより好ましくは、アダプターは、６、７または８アミノ基の環などのアミノ基の環を含む。最も好ましくは、アダプターは、８アミノ基の環を含む。プロトン化したアミノ基の環は、ヌクレオチドまたは核酸配列中にある負に荷電したリン酸基と相互作用することができる。
【０１０７】
細孔内部におけるアダプターの正しい位置決めは、アダプターと変異体モノマーを含む細孔とのホスト−ゲスト化学によって促進され得る。好ましくは、アダプターは、細孔中にある１つまたは複数のアミノ酸と相互作用可能な１つまたは複数の化学基を含む。より好ましくは、アダプターは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−陽イオン相互作用および／または静電力など非共有結合性相互作用によって細孔中にある１つまたは複数のアミノ酸と相互作用可能な１つまたは複数の化学基を含む。細孔中にある１つまたは複数のアミノ酸と相互作用可能な化学基は、通常、ヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基は、第一、第二または第三炭素原子に付着することができる。ヒドロキシル基は、細孔中の荷電していないアミノ酸と水素結合を形成することができる。細孔とヌクレオチドまたは核酸配列との相互作用を促進するどんなアダプターも使用することができる。
【０１０８】
適切なアダプターには、それだけには限らないが、シクロデキストリン、環状ペプチドおよびククルビツリルがある。好ましくは、アダプターは、シクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081〜6088頁に開示されているもののいずれかである。より好ましくは、アダプターは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤ中のグアニジノ基は、ａｍ７−βＣＤ中の１級アミンよりかなり高いｐＫａを有し、したがってより強く正に荷電している。このｇｕ７−βＣＤアダプターを使用して、細孔中にあるヌクレオチドの滞留時間を高め、測定される残留電流の精度を高め、高温または低いデータ収集速度における塩基検出速度を高めることができる。
【０１０９】
スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）架橋剤を以下に詳述するように使用する場合、好ましくは、アダプターはヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
【０１１０】
より適切なアダプターは、８個の糖単位を含むγ−シクロデキストリンを含む（したがって、８倍の対称性を有する）。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含有することができ、または修飾されて、上記のβ−シクロデキストリンの例において使用した修飾された糖単位を全てもしくはそれ以上に含むことができる。
【０１１１】
好ましくは、分子アダプターは、変異体モノマーに共有結合している。アダプターは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細孔に共有結合できる。アダプターは通常、化学的結合によって付着している。分子アダプターがシステイン結合によって付着している場合、好ましくは、１つまたは複数のシステインが置換によって変異体に導入されている。本発明の変異体モノマーは当然ながら、８８、９０、９１、１０３および１０５位の１つまたは複数にシステイン残基を含むことができる。変異体モノマーは、１つまたは複数（２、３、４もしくは５個など）のこれらシステインに分子アダプターを付着させることによって化学修飾できる。あるいは、変異体モノマーは、他の位置に導入した１つまたは複数のシステインに対する分子の付着によって化学修飾されてもよい。好ましくは、分子アダプターは、配列番号２の９０、９１および１０３位の１つまたは複数に付着している。
【０１１２】
システイン残基の反応性は、付近の残基を修飾することによって増強できる。例えば、隣接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性の高いＳ−基に変化させることがある。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護できる。これらを、変異体モノマーの１つまたは複数のシステイン残基と反応させて、その後にリンカーを付着させることができる。分子は、変異体モノマーに直接付着することができる。好ましくは、分子は、化学的架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体モノマーに付着する。
【０１１３】
適切な化学的架橋剤は、当技術分野において周知である。好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタナノエート（octananoate）がある。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）である。通常は、分子を二官能性架橋剤に共有結合させた後に分子／架橋剤複合体を変異体モノマーに共有結合させるが、モノマーに二官能性架橋剤を共有結合させた後に二官能性架橋剤／モノマー複合体を分子に付着させることも可能である。
【０１１４】
好ましくは、リンカーはジチオスレイトール（ＤＴＴ）に耐性がある。適切なリンカーには、それだけには限らないが、ヨードアセトアミド系およびマレイミド系リンカーがある。
【０１１５】
他の実施形態において、モノマーは、核酸結合タンパク質に付着することができる。これは、本発明の配列決定法において使用できるモジュラ配列決定システムを形成する。核酸結合タンパク質については、以下に記載する。
【０１１６】
好ましくは、核酸結合タンパク質は、変異体モノマーに共有結合している。タンパク質は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細孔に共有結合され得る。モノマーとタンパク質は、化学的に融合されるかまたは遺伝学的に融合され得る。構築物全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマーとタンパク質は遺伝学的に融合されている。核酸結合タンパク質と細孔との遺伝子融合については、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）に記述されている。
【０１１７】
核酸結合タンパク質が、システイン結合によって付着している場合、好ましくは１つまたは複数のシステインが置換によって変異体に導入されている。本発明の変異体モノマーは当然ながら、１０〜１５、５１〜６０、１３６〜１３９および１６８〜１７２位の１つまたは複数にシステイン残基を含むことができる。これらの位置は、相同物の間で保存性が低いループ領域に存在しており、変異または挿入を許容できることを示している。したがってそれらは、核酸結合タンパク質を付着するには適している。システイン残基の反応性は、上述のような修飾によって増強できる。
【０１１８】
核酸結合タンパク質は、変異体モノマーに直接、または１つまたは複数のリンカーを介して付着することができる。分子は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されているハイブリダイゼーションリンカーを使用して、変異体モノマーに付着させることができる。あるいは、ペプチドリンカーが使用されてよい。ペプチドリンカーは、アミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、柔軟性および親水性は通常、モノマーおよび分子の機能を妨げないように設計される。好ましい柔軟性があるペプチドリンカーは、２〜２０個（例えば４、６、８、１０または１６個）の一続きのセリンおよび／またはグリシンアミノ酸である。より好ましい柔軟性があるリンカーには（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５および（ＳＧ）８があり、ここでＳはセリン、Ｇはグリシンである。好ましい剛直なリンカーは、２〜３０個（例えば４、６、８、１６または２４個）の一続きのプロリンアミノ酸である。より好ましい剛直なリンカーには、（Ｐ）１２があり、ここでＰはプロリンである。
【０１１９】
変異体モノマーは、分子アダプターおよび核酸結合タンパク質を用いて化学修飾されてよい。
【０１２０】
構築物
本発明は、Ｍｓｐから得られる共有結合したモノマーを２個以上含む構築物も提供する。本発明の構築物は、細孔形成能を保持している。本発明の１つまたは複数の構築物を使用して、配列決定など、核酸配列を特徴付けるための細孔を形成することができる。構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のモノマーを含むことができる。２個以上のモノマーは、同じでも異なっていてもよい。
【０１２１】
モノマーは、本発明の変異体モノマーである必要はない。例えば、少なくとも１つのモノマーが、配列番号２に示される配列を含んでいてもよい。あるいは、少なくとも１つのモノマーは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号２と全配列にわたって少なくとも５０％相同である配列番号２のバリアントを含むことができるが、本発明の変異体モノマーに必要とされるいずれの特定の変異も含まない。より好ましくは、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号２のアミノ酸配列と全配列にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。好ましい実施形態において、構築物中の少なくとも１つのモノマーは、本発明の変異体モノマーである。構築物中のモノマーの全てが、本発明の変異体モノマーであってもよい。変異体モノマーは、同じでも異なっていてもよい。より好ましい実施形態において、構築物は２つのモノマーを含み、そのモノマーのうち少なくとも１つは本発明の変異体モノマーである。
【０１２２】
好ましくは、モノマーは遺伝学的に融合されている。構築物全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマーは遺伝学的に融合されている。モノマーのコード配列を任意の方法で結合して、構築物をコードしている単一のポリヌクレオチド配列を形成することができる。
【０１２３】
モノマーは、任意の構成で遺伝学的に融合されてよい。モノマーは、その末端アミノ酸によって融合されてよい。例えば、１個のモノマーのアミノ末端を、別のモノマーのカルボキシ末端に融合することができる。構築物が、配列番号２に示す配列またはそのバリアントを各々含む２個以上のモノマーの遺伝子融合から形成される場合、構築物中で２番目のおよび（アミノからカルボキシの方向で）その後にあるモノマーは、そのアミノ末端にメチオニンを含むことができる（各アミノ末端は前にあるモノマーのカルボキシ末端に融合される）。例えば、Ｍが（アミノ末端メチオニンを持たない）配列番号２に示される配列またはバリアントを含むモノマーであり、ｍＭがアミノ末端メチオニンを持つ配列番号２に示される配列またはバリアントを含むモノマーである場合、その構築物は配列Ｍ−ｍＭ、Ｍ−ｍＭ−ｍＭまたはＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭを含むことができる。これらのメチオニンの存在は通常、構築物全体をコードしているポリヌクレオチド中で２番目またはその後のモノマーをコードしているポリヌクレオチドの５’末端におけるスタートコドン（すなわちＡＴＧ）の発現に由来している。構築物中の１番目のモノマー（アミノからカルボキシの方向で）が、メチオニンを含んでもよい（例えばｍＭ−ｍＭ、ｍＭ−ｍＭ−ｍＭまたはｍＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ）。
【０１２４】
２個以上のモノマーが、直接一緒に遺伝学的に融合されてよい。好ましくは、モノマーは、リンカーを使用して遺伝学的に融合される。リンカーは、モノマーの可動性を限定するように設計することができる。好ましいリンカーは、アミノ酸配列（すなわちペプチドリンカー）である。上述したペプチドリンカーのいずれかが使用される。好ましくは、構築物は、配列番号２９で示される配列またはそのバリアントを含む。配列番号２９中の各モノマーは、配列番号２に示す配列またはそのバリアントを含む。２番目のモノマーも、上記のとおり、そのアミノ末端にメチオニンを含む。２個のモノマーは、ペプチドリンカーによって連結されている。配列番号２９のバリアントは、配列番号２のバリアントを参照して、上述した方法のいずれかで、配列番号２９と異なることができる。リンカーは、修飾することもまたは上述のペプチドリンカーと置きかえることもできる。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、モノマーは化学的に融合される。２つの部分が化学的に、例えば化学的架橋剤によって付着している場合、サブユニットは酵素に化学的に融合される。上述の化学的架橋剤のいずれかを使用することができる。リンカーは、本発明の変異体モノマーに導入された１つまたは複数のシステイン残基に付着することができる。あるいは、リンカーは、構築物中のモノマーのうちの一方の末端に付着することができる。
【０１２６】
構築物が異なるモノマーを含有する場合、リンカー濃度をモノマーより大過剰に保つことによって、モノマーとそれ自身との架橋反応を防止することができる。あるいは、２つのリンカーが使用される「鍵−鍵穴」構成を使用することができる。各リンカーの一方の端だけが一緒に反応して長いリンカーを形成することができ、リンカーの他方の端は各々異なるモノマーと反応する。そのようなリンカーは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されている。
【０１２７】
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。変異体モノマーは、上述したもののいずれであってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド同一性に基づいて、配列番号１の配列と全配列にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％相同である配列を含む。３００以上（例えば３７５、４５０、５２５または６００以上）の連続するヌクレオチド区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のヌクレオチド同一性が存在し得る（「厳密な相同性」）。相同性は、上記のとおり算出され得る。ポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に基づいて配列番号１と異なる配列を含むことができる。
【０１２８】
本発明は、本発明の遺伝学的に融合された構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、上記のとおり配列番号１で示される配列またはそのバリアントを２個以上含む。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２８を含む、またはヌクレオチド同一性に基づいて、配列番号２８の配列と全配列にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％相同である配列を含む。６００以上（例えば７５０、９００、１０５０または１２００以上）の連続するヌクレオチド区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のヌクレオチド同一性が存在し得る（「厳密な相同性」）。相同性は、上記のとおりに算出され得る。ポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に基づいて配列番号２８と異なる配列を含むことができる。
【０１２９】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野において標準的な方法を使用して生成され、複製されることができる。野生型Ｍｓｐをコードしている染色体ＤＮＡは、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）など、細孔を生成する生物から抽出できる。細孔サブユニットをコードしている遺伝子は、特異的なプライマーを含むＰＣＲを使用して増幅できる。次いで、増幅した配列は部位特異的突然変異誘発を受けることができる。部位特異的突然変異誘発の適切な方法は、当技術分野において公知であり、例えば、組合せ連鎖反応（combine chain reaction）を含む。本発明の構築物をコードしているポリヌクレオチドは、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載の技術など、周知の技術を使用して作成できる。
【０１３０】
次いで、得られたポリヌクレオチド配列を、クローニングベクターなど組換え複製可能なベクターに組み込むことができる。そのベクターを使用して、適合宿主細胞の中でポリヌクレオチドを複製することができる。したがって、ポリヌクレオチド配列は、複製可能なベクターにポリヌクレオチドを導入し、適合宿主細胞にベクターを導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、作ることができる。ベクターは、宿主細胞から回収できる。ポリヌクレオチドのクローニングに適切な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、以下で詳しく記載する。
【０１３１】
ポリヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は通常、宿主細胞によるコード配列の発現を得ることができる制御配列に作動的に連結されている。そのような発現ベクターを使用して、細孔サブユニットを発現させることができる。
【０１３２】
用語「作動的に連結された」は、並置を意味しており、記述した成分が意図する方式で機能できるような関係である。コード配列に対して「作動的に連結された」制御配列は、制御配列に適合する条件のもとでコード配列の発現が得られるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なっているポリヌクレオチド配列の複数のコピーを、ベクターに導入することができる。
【０１３３】
発現ベクターは次いで、適切な宿主細胞に導入され得る。したがって、本発明の変異体モノマーまたは構築物は、発現ベクターにポリヌクレオチド配列を挿入し、適合細菌宿主細胞にベクターを導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製できる。組換え発現させたモノマーまたは構築物は、宿主細胞膜の中で細孔へと自己組織化することができる。あるいは、この方式で作製した組換え細孔を宿主細胞から取り出し、別の膜に挿入することもできる。少なくとも２つの異なるサブユニットを含む細孔を作製する場合、上記のとおり異なるサブユニットを異なる宿主細胞中で別々に発現させ、宿主細胞から取り出し、ウサギ細胞膜など別の膜の中で細孔へと組織化することができる。
【０１３４】
ベクターは例えば、複製起点、場合によっては前記ポリヌクレオチド配列を発現するためのプロモータおよび場合によってはプロモータの調節因子を備えているプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子（例えばテトラサイクリン耐性遺伝子）を含有することができる。プロモータおよび他の発現調節シグナルは宿主細胞と適合するように選択され、それ用として発現ベクターを設計することができる。通常、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモータが使用される。
【０１３５】
宿主細胞は通常、細孔サブユニットを高レベルで発現する。ポリヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用した発現ベクターに適合するように選ばれることになる。宿主細胞は、通常は細菌であり、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）である。λＤＥ３溶原菌を持つ任意の細胞、例えばＣ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉＢが、Ｔ７プロモータを含むベクターを発現することができる。上に列挙した条件に加えて、Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 30；105(52)：20647〜52頁に引用されている方法のいずれかを使用して、Ｍｓｐタンパク質を発現することができる。
【０１３６】
細孔
本発明は、様々な細孔も提供する。本発明の細孔は、異なるヌクレオチドを高感度で識別することができるので、配列決定など、核酸配列を特徴付けるには理想的である。驚くべきことに、細孔は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の４種のヌクレオチドを区別することができる。本発明の細孔は、メチル化および非メチル化ヌクレオチドを区別することさえ可能である。本発明の細孔の塩基分解能は驚くほど高い。細孔は、４種のＤＮＡヌクレオチド全てをほぼ完全に分離する。さらに、細孔は、細孔中での滞留時間および細孔を通る電流の流れに基づいて、デオキシシチジンモノリン酸（ｄＣＭＰ）とメチルｄＣＭＰとを識別する。
【０１３７】
本発明の細孔は、様々な条件下で異なるヌクレオチドを識別することもできる。具体的には、細孔は、配列決定など、核酸の特徴付けに有利な条件下でヌクレオチドを識別することができる。印加電位、塩濃度、緩衝液、温度および添加物（尿素、ベタインおよびＤＴＴなど）の存在を変更することによって、本発明の細孔が異なるヌクレオチドを識別できる程度を制御することができる。これによって、特に配列決定のときに、細孔の機能を微調整できるようになる。これについては、以下で詳述する。本発明の細孔を使用して、ヌクレオチド塩基毎ではなく、１つまたは複数のモノマーとの相互作用から核酸ポリマーを同定することもできる。
【０１３８】
本発明の細孔は、単離される、実質的に単離される、精製されるまたは実質的に精製されることができる。本発明の細孔が、脂質または他の細孔など他のいかなる成分も全く含まない場合、それは単離または精製されている。細孔が、意図する使用法に干渉することのない担体または希釈剤と混合されている場合、それは実質的に単離されている。例えば、細孔が、脂質もしくは他の細孔など他の成分を１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満含む形態で存在している場合、それは実質的に単離または実質的に精製されている。あるいは、本発明の細孔は、脂質二重層中に存在することができる。
【０１３９】
本発明の細孔は、個別のまたは単一の細孔として存在することができる。あるいは、本発明の細孔は、２個以上の細孔の同種または異種集団で存在することができる。
【０１４０】
ホモオリゴマー細孔
本発明は、本発明の同一の変異体モノマーを含むＭｓｐから得られるホモオリゴマー細孔も提供する。好ましくは、ホモオリゴマー細孔は、表１、２および３に示した変異体の１つを含む。本発明のホモオリゴマー細孔は、配列決定など、核酸を特徴付けるには理想的である。本発明のホモオリゴマー細孔は、上述した利点のいずれかを有することができる。本発明の特異的なホモオリゴマー細孔の利点を、表１、２および３に示す。
【０１４１】
ホモオリゴマー細孔は、任意の数の変異体モノマーを含有することができる。細孔は通常、７、８、９または１０個の同一の変異体モノマーを含む。好ましくは、細孔は、８個の同一の変異体モノマーを含む。好ましくは、１つまたは複数（例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）の変異体モノマーが、上述のとおり化学修飾されている。
【０１４２】
細孔を作る方法については、以下で詳述する。
【０１４３】
ヘテロオリゴマー細孔
本発明は、本発明の変異体モノマーを少なくとも１つ含み、全８個のモノマーのうちの少なくとも１つが他と異なっている、Ｍｓｐから得られるヘテロオリゴマー細孔も提供する。本発明のヘテロオリゴマー細孔は、配列決定など、核酸を特徴付けるには理想的である。ヘテロオリゴマー細孔は、当技術分野において公知の方法（例えばProtein Sci. 2002 Jul；11(7)：1813〜24頁）を使用して作成できる。
【０１４４】
ヘテロオリゴマー細孔は、細孔を形成するのに十分なモノマーを含有する。モノマーは、どんなタイプであってもよい。細孔は通常、７、８、９または１０個のモノマーを含む。好ましくは、細孔は、８個のモノマーを含む。
【０１４５】
細孔は、（ａ）配列番号２に示される配列または（ｂ）本発明の変異体モノマーに必要とされる変異を持たないそのバリアント、を含めた少なくとも１つのモノマーを含むことができる。適切なバリアントについては上述している。この実施形態において、好ましくは、残りのモノマーは本発明の変異体モノマーである。したがって、細孔は、本発明の変異体モノマーを９、８、７、６、５、４、３、２または１個含むことができる。
【０１４６】
好ましい実施形態において、細孔は（ａ）１個の変異体モノマーおよび（ｂ）７個の同一のモノマーを含み、（ａ）の変異体モノマーは、（ｂ）の同一のモノマーとは異なっている。好ましくは、（ｂ）の同一のモノマーは、（ｉ）配列番号２に示される配列または（ｉｉ）本発明の変異体モノマーに存在する変異を持たないそのバリアントを含む。
【０１４７】
好ましい細孔は、それだけには限らないが、以下のいずれかを含む：
（ａ）配列番号２に示される配列を含むモノマー７個および置換Ｎ９０Ｒ、Ｎ９０Ｋ、Ｎ９０Ｙ、Ｎ９０Ｑ、Ｎ９０ＷまたはＮ９０Ｃを含む変異体モノマー１個。これらの細孔は、内部の狭搾部に導入された単一の立体性アミノ酸（ＹもしくはＷ）、単一の荷電アミノ酸（ＫもしくはＲ）または単一の反応性アミノ酸（Ｃ）を有する。
（ｂ）配列番号２に示される配列を含むモノマー７個および置換Ｎ９１Ｒ、Ｎ９１Ｋ、Ｎ９１Ｙ、Ｎ９１Ｑ、Ｎ９１ＷまたはＮ９１Ｃを含む変異体モノマー１個。これらの細孔は、内部の狭搾部に導入された単一の立体性アミノ酸（ＹもしくはＷ）、単一の荷電アミノ酸（ＫもしくはＲ）または単一の反応性アミノ酸（Ｃ）を有する。
（ｃ）配列番号２に示される配列を含むモノマー７個および置換Ｌ８８Ｃ、Ｓ１０３ＣまたはＩ１０５Ｃを含む変異体モノマー１個。これらの細孔は、細孔に導入された反応性アミノ酸を有する。
【０１４８】
別の好ましい実施形態において、モノマーの全て（すなわち１０、９、８または７個のモノマー）が、本発明の変異体モノマーであり、それらのうちの少なくとも１つが他と異なっている。より好ましい実施形態において、細孔は、８個の本発明の変異体モノマーを含み、それらのうちの少なくとも１つが他と異なっている。
【０１４９】
上述の実施形態の全てにおいて、好ましくは、１つまたは複数（例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）の変異体モノマーが、上述のとおり化学修飾されている。好ましくは、上記の好ましい細孔（ａ）〜（ｃ）は、１つまたは複数の導入されたシステインに対して分子が付着することによって化学修飾されている。
【０１５０】
細孔を作る方法については、以下で詳述する。
【０１５１】
構築物を含む細孔
本発明は、本発明の構築物を少なくとも１つ含む細孔も提供する。本発明の構築物は、Ｍｓｐから得られる共有結合したモノマーを２個以上含む。換言すれば、構築物は、２個以上のモノマーを含有しなければならない。細孔は、細孔を形成するのに十分な構築物および、必要に応じて、モノマーを含有する。例えば、八量体の細孔は、（ａ）４個のモノマーを各々含む２個の構築物または（ｂ）２個のモノマーおよび構築物の部分を形成しない６個のモノマーを含む１個の構築物を含むことができる。細孔中のモノマーの少なくとも２つは、本発明の構築物の形態をしている。モノマーは、どんなタイプであってもよい。細孔は通常、合計で７、８、９または１０個のモノマーを含む（そのうちの少なくとも２つは構築物中になければならない）。好ましくは、細孔は、８個のモノマーを含む（そのうちの少なくとも２つは構築物中になければならない）。
【０１５２】
細孔は通常、（ａ）２個のモノマーを含む１個の構築物と（ｂ）５、６、７または８個のモノマーとを含む。構築物は、上述したもののいずれであってもよい。モノマーは、本発明の変異体モノマーを含めて、上述したもののいずれであってもよい。
【０１５３】
別の典型的な細孔は、本発明の構築物を２個以上（２、３または４個の本発明の構築物）含む。そのような細孔は、細孔を形成するのに十分なモノマーをさらに含む。モノマーは、上述したもののいずれであってもよい。本発明のさらなる細孔は、２個のモノマーを含む構築物だけを含み、例えば細孔は、２個のモノマーを含む４、５、６、７または８個の構築物から構成されてよい。本発明に記載の特定の細孔は、２個のモノマーを各々含む４個の構築物を含む。構築物は、１個の構築物のうちの１個のモノマーしか細孔のバレルまたは入口部に関与しないような構造を持つ細孔へとオリゴマー化することができる。通常、その構築物の他のモノマーは、細孔のバレルまたは入口部の外側になる。例えば、本発明の細孔は、２個のモノマーを含む５、６、７または８個の構築物を含むことができ、これらの構築物ではバレルまたは入口部は８個のモノマーを含む。
【０１５４】
上記のように、変異を構築物に導入することができる。変異は互い違いになっていてもよく、すなわち２個のモノマーを含む構築物の中でモノマー毎に変異が異なっており、その構築物がホモオリゴマーとなって組織化され、その結果互い違いの修飾になる。換言すれば、ＭｕｔＡとＭｕｔＢを含むモノマーが融合され、組織化されてＡ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ細孔が形成される。あるいは、変異は隣接していてもよく、すなわち同一の変異が構築物中の２個のモノマーに導入され、次いでこれが異なる変異体モノマーとオリゴマー化される。換言すれば、ＭｕｔＡを含むモノマーが融合され、続いてＭｕｔＢ含有モノマーとオリゴマー化されることによって、Ａ−Ａ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂが形成される。
【０１５５】
構築物を含有する細孔中の１つまたは複数の本発明のモノマーは、上述のように化学修飾されてよい。
【０１５６】
個々のヌクレオチドを同定する方法
本発明は、個々のヌクレオチドを特徴付ける方法も提供する。本方法は、ヌクレオチドが細孔と相互作用できるようにヌクレオチドを本発明の細孔と接触させるステップと、相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってヌクレオチドを特徴付けるステップとを含む。したがって本発明は、個々のヌクレオチドのナノ細孔検出を含む。本発明は、相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってヌクレオチドの同一性を決定するステップを含む、個々のヌクレオチドを同定する方法も提供する。本発明のいずれの細孔も使用することができる。好ましくは本発明の細孔は、上述の分子アダプターで化学修飾されている。
【０１５７】
電流が、ヌクレオチドに特異的な形で細孔を通って流れる場合（すなわちヌクレオチドと関連した特徴的な電流が、細孔を通って流れているのが検出される場合）、ヌクレオチドは存在している。電流が、ヌクレオチドに特異的な形で細孔を通って流れない場合、ヌクレオチドは存在しない。
【０１５８】
本発明を使用して、細孔を通る電流に影響する異なる効果に基づいて、類似構造のヌクレオチドを区別することができる。ヌクレオチドが細孔と相互作用するときの電流振幅から、個々のヌクレオチドを単一分子レベルで同定することができる。本発明を使用して、特定のヌクレオチドがサンプル中に存在するか否かを決定することもできる。本発明を使用して、サンプル中の特定のヌクレオチドの濃度を測定することもできる。
【０１５９】
本方法は、本発明の細孔が膜に挿入されている任意の適切な膜／細孔系を使用して実施することができる。本方法は通常、（ｉ）本発明の細孔を含む人工膜、（ｉｉ）本発明の細孔を含む単離された天然に存在する膜、または（ｉｉｉ）本発明に従って修飾された細孔を発現している細胞を使用して実施される。好ましくは、本方法は人工膜を使用して実施される。膜は、本発明の細孔に加えて、他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含むことができる。
【０１６０】
膜は、イオン、ヌクレオチドおよび核酸のフローに対する障壁を形成する。本発明に従って任意の膜を使用することができる。適切な膜は当技術分野において周知である。好ましくは、膜は両親媒性層である。両親媒性層とは、両親媒性分子（リン脂質など）から形成される層であり、親水性と親油性の両方の特性を有する。両親媒性物質は、合成または天然であってよい。両親媒性層は、単分子層または二重層であってよい。非天然の両親媒性物質および単分子層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えばブロックコポリマーがある（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447〜10450頁）。
【０１６１】
膜は、脂質二重層であってよい。本発明に従った使用に適している脂質二重層は、当技術分野において公知の方法を使用して作ることができる。例えば、脂質二重層膜は、Montal and Mueller (1972)の方法を使用して形成することができる。脂質二重層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３に記載の方法を使用して形成することもできる。
【０１６２】
本発明の方法は、リン脂質、糖脂質、コレステロール、ミコール酸およびそれらの混合物を含むがこれに限らない任意の膜脂質から形成される脂質二重層を使用して実施できる。国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３に記載のいずれの脂質も使用できる。
【０１６３】
別の好ましい実施形態において、膜は固体層である。固体層は、生物起源ではないものである。換言すれば、固体層は、生物もしくは細胞などの生物学的環境、または生物学的に利用可能な構造を合成的に製造した変形からは得られず、単離されない。固体層は、マイクロエレクトロニクス材料、絶縁材料（Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなど）、有機および無機ポリマー（例えば、ポリアミド、テフロン（登録商標）などのプラスチックまたは２成分付加硬化シリコーンゴムなどのエラストマ）、ならびにガラスを含むがこれに限らない有機および無機材料から形成することができる。固体層は、グラフェンなどの単原子層またはほんの数原子の厚さしかない層から形成することができる。適切なグラフェン層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。両親媒性層は、固体細孔を横切って形成できる。これは、混成細孔形成として当技術分野に記載され得る（Hall et al., Nat Nanotechnol., 2010, 5, 874〜877頁）。
【０１６４】
脂質二重層などの膜に細孔を挿入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、細孔が脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合し機能状態へと組織化することによって挿入されるように、細孔を、脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁することができる。あるいは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am Chem. Soc. 2005, 127, 6502〜6503頁および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を使用して、細孔を膜に直接挿入することができる。
【０１６５】
本発明の方法は通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１６６】
個々のヌクレオチド
個々のヌクレオチドは単一ヌクレオチドである。個々のヌクレオチドとは、ヌクレオチド結合によって別のヌクレオチドまたは核酸に結合していないものである。ヌクレオチド結合は、別のヌクレオチドの糖類に結合しているヌクレオチドのリン酸基のうちの１つを含む。個々のヌクレオチドとは、通常、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００ヌクレオチドの別の核酸配列に、ヌクレオチド結合によって結合していないものである。例えば、個々のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖など標的ポリヌクレオチド配列から消化されている。
【０１６７】
本発明の方法を使用して、任意のヌクレオチドを同定することができる。ヌクレオチドは、天然または人工であってよい。ヌクレオチドは通常、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は通常複素環である。適切な核酸塩基には、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンがある。糖は通常、ペントース糖である。適切な糖には、それだけには限らないが、リボースおよびデオキシリボースがある。ヌクレオチドは通常、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは通常、一リン酸塩、二リン酸塩または三リン酸塩を含有する。
【０１６８】
適切なヌクレオチドには、それだけには限らないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）がある。好ましくは、ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰである。
【０１６９】
ヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸などの核酸配列の消化から得ることができる。核酸配列は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して消化できる。適切な方法には、それだけには限らないが、酵素または触媒を使用する方法がある。核酸の触媒消化については、Deck et al., Inorg. Chem., 2002； 41： 669〜677頁に開示されている。
【０１７０】
単一の核酸配列に由来する個々のヌクレオチドを、連続して細孔と接触させて、その核酸の全部または一部を配列決定することができる。核酸配列決定については、以下で詳述する。
【０１７１】
ヌクレオチドが核酸配列の消化から得られる場合、ヌクレオチドは通常修飾されていない。あるいは、ヌクレオチドが修飾または損傷を受けている場合がある。ヌクレオチドは通常、メチル化または酸化されている。ヌクレオチドを、明示用標識で標識することができる。明示用標識は、ヌクレオチドを検出できるようにするどんな適切な標識であってもよい。適切な標識には、蛍光分子、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ、３５Ｓ）およびビオチンなどのリンカーがある。
【０１７２】
ヌクレオチドは通常、任意の適切な生体サンプル中に存在している。適切な生体サンプルについては、上述している。
【０１７３】
細孔とヌクレオチドとの相互作用
膜のいずれかの面で、ヌクレオチドを細孔と接触させることができる。膜のいずれかの面で、ヌクレオチドを細孔に導入することができる。ヌクレオチドが膜の反対の面へと細孔を通れる膜の面と、ヌクレオチドを接触させることができる。例えば、ヌクレオチドを細孔の端部と接触させると、それによりその自然環境において、イオンもしくは小分子（ヌクレオチドなど）は、ヌクレオチドが細孔を通れるような細孔のバレルまたはチャネルへと侵入できるようになる。そのような場合、ヌクレオチドは、細孔のバレルまたはチャネルを通って膜を通るときに、細孔および／またはアダプターと相互作用する。あるいは、ヌクレオチドを、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔と相互作用させ、細孔から解離させ、膜の同じ面に留まらせる膜の面とヌクレオチドとを接触させることができる。本発明は、アダプターの位置が固定されている細孔を提供する。結果として、好ましくは、ヌクレオチドは、アダプターがヌクレオチドと相互作用できるように細孔の端部と接触することになる。
【０１７４】
ヌクレオチドは、任意の様式でおよび任意の部位で細孔と相互作用することができる。上述のとおり、好ましくは、ヌクレオチドは、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔に可逆的に結合する。最も好ましくは、ヌクレオチドは、膜を横切って細孔を通るときに、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔に可逆的に結合する。ヌクレオチドは、膜を横切って細孔を通るときに、アダプターを介してまたはアダプターと共に細孔のバレルまたはチャネルに可逆的に結合することもできる。
【０１７５】
ヌクレオチドと細孔とが相互作用している間に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドに特異的な形で、細孔を通る電流の流れに影響を及ぼす。例えば、特定のヌクレオチドは、特定の平均時間および特定の範囲で細孔を通る電流の流れを減少させることになる。換言すれば、細孔を通る電流の流れは、特定のヌクレオチドに対して特徴的である。対照実験を実施して、特定のヌクレオチドが細孔を通る電流の流れに及ぼす影響を決定することができる。試験サンプルにおいて本発明の方法を実施した結果を、次いでその対照実験から得られた結果と比較して、サンプル中にある特定のヌクレオチドを同定するまたはサンプル中に特定のヌクレオチドが存在するか否かを決定することができる。細孔を通って流れる電流が特定のヌクレオチドを示す形で影響を受ける頻度を使用して、サンプル中にあるヌクレオチドの濃度を決定することができる。サンプル中の異なるヌクレオチドの比率も算出できる。例えば、メチルｄＣＭＰに対するｄＣＭＰの比率を算出できる。
【０１７６】
装置
本方法は、本発明の細孔が膜に挿入されている膜／細孔系を調査するのに適切ないずれかの装置を使用して実施することができる。本方法は、ナノ細孔検出に適切ないずれかの装置を使用して実施することができる。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバおよびチャンバを２つのセクションに分離する障壁を含む。障壁は、細孔を含有する膜が形成される開口部を有する。ヌクレオチドは、チャンバにヌクレオチドを導入することによって細孔と接触できる。ヌクレオチドは、チャンバの２つのセクションのいずれかに導入することができる。
【０１７７】
本方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２に記載の装置を使用して実施できる。
【０１７８】
本発明の方法は、ヌクレオチドと相互作用している間に、細孔を通る電流を測定することを含む。したがって、装置は、電位を印加し、膜および細孔の電気シグナルを測定可能な電気回路も含む。本方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施することができる。好ましくは、本方法は電圧クランプの使用を含む。
【０１７９】
サンプル
ヌクレオチドは、任意の適切なサンプル中に存在する。本発明は通常、ヌクレオチドを含有することが既知であるまたは含有することが疑われるサンプルに対して実施される。本発明は、同一性が未知の１つまたは複数のヌクレオチドを含有するサンプルに対して実施できる。あるいは、本発明をサンプルに対して実施して、サンプル中の存在が既知であるまたは予想される１つまたは複数のヌクレオチドの同一性を確認することができる。
【０１８０】
サンプルは、生体サンプルであってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得たまたは抽出したサンプルに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。生物または微生物は通常、原核生物または真核生物であり、通常は５界（植物界、動物界、真菌、モネラ界および原生生物界）のうちの１つに属している。本発明は、任意のウイルスから得たまたは抽出したサンプルに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。好ましくは、サンプルは液体サンプルである。サンプルは通常、患者の体液を含む。サンプルは、尿、リンパ、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。通常、サンプルはヒト起源であるが、あるいは例えばウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育された動物由来など別の哺乳動物由来でもよく、あるいはネコまたはイヌなどのペットでもよい。あるいは、植物起源のサンプルは通常、穀物、豆類、果物または野菜、例えば小麦、大麦、オート麦、カノーラ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、インゲン豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿、茶、コーヒーなどの商品作物から得られる。
【０１８１】
サンプルは、非生体サンプルであってもよい。好ましくは、非生体サンプルは、液体サンプルである。非生体サンプルの例には、外科輸液、水（飲料水、海水または河川水など）、および実験室試験用の試薬がある。
【０１８２】
サンプルは通常、アッセイされる前に、例えば遠心分離によってまたは不要な分子もしくは細胞（赤血球など）を除去する膜を通すことによって処理される。サンプルは、採取されると同時に直ちに測定されてもよい。サンプルは通常、アッセイ前に、好ましくは−７０℃より低い温度に貯蔵されてもよい。
【０１８３】
条件
本発明の方法は、ヌクレオチドと相互作用している間に、細孔を通る電流を測定することを含む。膜貫通タンパク質細孔を通るイオン電流を測定するための適切な条件は、当技術分野において公知であり、実施例において開示されている。本方法は、膜および細孔に印加される電圧により実施される。使用される電圧は通常、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。好ましくは、使用される電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値、ならびに＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶからそれぞれ独立に選択される上限値の範囲にある。より好ましくは、使用される電圧は、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にある。印加電位を高めて使用することにより、本発明の細孔による異なるヌクレオチドの識別を高めることが可能である。
【０１８４】
本方法は通常、任意のアルカリ金属塩化物塩の存在下で実施される。上述した例示的な装置において、塩は、チャンバ内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が、通常使用される。好ましくはＫＣｌである。塩濃度は通常、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。好ましくは、塩濃度は、１５０ｍＭ〜１Ｍである。高塩濃度は高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を、正常電流のバックグラウンド変動に対して同定することが可能になる。ヌクレオチドの検出が、核酸を配列決定するときなど酵素の存在下で実施される場合、低塩濃度を使用できる。これについては、以下で詳述する。
【０１８５】
本方法は通常、緩衝液の存在下で実施される。上述した例示的な装置において、緩衝液は、チャンバ内の水溶液中に存在する。本発明の方法において、どんな緩衝液も使用することができる。１つの適切な緩衝液は、トリス−ＨＣｌ緩衝液である。本方法は通常、ｐＨ４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７または７．０〜８．８もしくは７．５〜８．５で実施される。好ましくは、使用されるｐＨは約７．５である。
【０１８６】
本方法は通常、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃または２０℃〜６０℃で実施される。本方法は、室温で実施されてよい。好ましくは、方法は、約３７℃など酵素機能を補助する温度で実施される。
【０１８７】
核酸を特徴付ける方法
本発明は、標的核酸配列を特徴付ける方法も提供する。標的核酸配列の１つまたは複数の特徴を決定することができる。本方法は、標的核酸配列の２、３、４または５つ以上の特徴の測定を含むことができる。好ましくは、１つまたは複数の特徴が、（ｉ）標的核酸配列の長さ、（ｉｉ）標的核酸配列の同一性、（ｉｉｉ）標的核酸配列の配列、（ｉｖ）標的核酸配列の二次構造および（ｖ）標的核酸配列が修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）〜（ｖ）の任意の組合せを、本発明に従って決定することができる。
【０１８８】
（ｉ）に関して、核酸配列の長さは、標的核酸配列と細孔との相互作用の数を使用して測定できる。
【０１８９】
（ｉｉ）に関して、核酸配列の同一性はいくつかの方法で測定できる。核酸配列の同一性は、標的核酸配列の配列測定と併せてまたは標的核酸配列の配列測定なしに測定できる。前者は直接的であり；核酸が配列決定され、それによって同定される。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、核酸配列中の特定のモチーフの存在を、（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定することなく）測定できる。あるいは、本方法における特定の電気シグナルの測定により、特定の起源に由来する標的核酸配列を同定することができる。
【０１９０】
（ｉｉｉ）に関して、核酸配列の配列は、前記のとおり決定できる。適切な配列決定方法、特に電気的な測定を使用する方法は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12；106(19)：7702〜7頁、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010；132(50)：17961〜72頁および国際出願第ＷＯ  ２０００／２８３１２に記載されている。
【０１９１】
（ｉｖ）に関して、二次構造は多様な方法で測定できる。例えば、二次構造は、滞留時間の変化または細孔を通る電流の流れの変化を使用して測定できる。
【０１９２】
本発明は、標的核酸配列の配列を推定する方法も提供する。本発明はさらに、標的核酸配列を配列決定する方法を提供する。
【０１９３】
核酸は、ヌクレオチドを２個以上含む高分子である。ヌクレオチドは、上述したそれのいずれであってもよい。
【０１９４】
一実施形態において、本方法は、（ａ）核酸結合タンパク質が、本発明の細孔を通る標的配列の移動を制御し、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用できるように、標的配列を細孔およびタンパク質と接触させるステップと；（ｂ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって標的配列の配列を推定するまたは配列決定するなど標的配列を特徴付けるステップとを含む。したがって、本方法は、ヌクレオチドがバレルまたはチャネルを通る際に標的核酸配列中のヌクレオチドの一部をナノ細孔検出して、配列決定など、標的配列を特徴付けることを含む。
【０１９５】
別の実施形態において、本方法は、（ａ）エキソヌクレアーゼが標的配列の一方の末端から個々のヌクレオチドを消化するように、標的配列を本発明の細孔およびエキソヌクレアーゼと接触させるステップと；（ｂ）ヌクレオチドがアダプターと相互作用できるようにヌクレオチドを細孔と接触させるステップと；（ｃ）相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってヌクレオチドを特徴付けるステップと；（ｄ）標的配列の同じ末端でステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返し、それによって標的配列を特徴付けるステップとを含む。したがって、本方法は、標的核酸配列中のヌクレオチドの一部を連続してナノ細孔検出して、標的配列を特徴付けることを含む。好ましい実施形態において、本方法は、標的核酸配列を配列決定することに関し、ステップ（ａ）はヌクレオチドの同一性を決定することを含む。個々のヌクレオチドについては、上に記している。
【０１９６】
本発明の細孔は、ヌクレオチドの識別が改善されているので、これらの方法に特に適している。具体的には、それらは、電流範囲を増加させ（異なるヌクレオチドの識別が容易になる）、状態変動を減少させる（シグナル対ノイズ比が高まる）。加えて、前の実施形態に関連して、細孔を通って核酸が移動するにつれて電流に関与するヌクレオチドの数は減少する。これにより、核酸が細孔を通って移動する際に観察される電流と核酸配列との直接的な関係を同定することがさらに容易になる。好ましくは、本発明の細孔は、上記のように（１）分子アダプターおよび／または（２）核酸結合タンパク質もしくはエキソヌクレアーゼで化学修飾されている。
【０１９７】
この方法を使用して、標的核酸配列の全部または部分だけを、配列決定など、特徴付けることができる。核酸配列は、任意の長さであってよい。例えば、核酸配列は、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または、少なくとも５００ヌクレオチドであってよい。核酸配列は、長さ１０００ヌクレオチド以上または５０００ヌクレオチド以上であってよい。核酸配列は、天然または人工であってよい。例えば、本方法を使用して、製造したオリゴヌクレオチドの配列を検証することができる。本方法は通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１９８】
本方法は、細孔が膜に挿入されている任意の適切な膜／細孔系を使用して実施することができる。本方法は通常、上で開示したシステム、装置または条件のいずれかを使用して実施することができる。
【０１９９】
上述のとおり、温度が上昇した場合、低塩濃度で、優れたヌクレオチド識別を得ることができる。溶液温度を上げることに加えて、酵素活性にとって適切な条件を維持しながら、溶液の伝導性を高めるために採用できるいくつかの他の戦略がある。そのような戦略の１つは、脂質二重層を使用して、塩溶液を異なる２つの濃度に分けることである（酵素側に低塩濃度、反対側に高濃度の塩）。この手法の１つの例は、膜のシス側に２００ｍＭのＫＣｌおよびトランスチャンバ中に５００ｍＭのＫＣｌを使用することである。これら条件において、細孔を通る伝導性は、通常の条件下で４００ｍＭのＫＣｌとおおよそ同等であると予想され、酵素は、シス側に配置された場合、２００ｍＭの影響しか受けない。非対称の塩条件を使用する別の考えられる利益は、細孔を横切って誘導される浸透圧勾配である。この正味の水の流れを使用して、検出用の細孔へとヌクレオチドを引き込める可能性がある。類似の効果は、スクロース、グリセリンまたはＰＥＧなど中性浸透圧調節物質を使用して得ることができる。別の可能性は、比較的低レベルのＫＣｌを含む溶液を使用し、酵素活性に対して破壊的でない追加的な電荷を担持している種を利用することである。
【０２００】
分析される標的配列は、公知の保護化学物質と合わせて、バルク溶液中にある間に結合タンパク質またはエキソヌクレアーゼによって受ける作用から配列を保護することができる。次いで細孔を使用して、保護化学物質を取り除くことができる。これは、印加電位のもとで細孔、結合タンパク質もしくは酵素にハイブリダイズされない保護基を使用することによって（ＷＯ２００８／１２４１０７）、または細孔に対して近接近に保持されているときに、結合タンパク質もしくは酵素によって取り除かれる保護化学物質を使用することによって得ることができる（J Am Chem Soc. 2010 Dec 22；132(50)：17961〜72頁）。
【０２０１】
鎖配列決定
鎖配列決定は、細孔を通る核酸ポリマーの段階的な移行の制御を含む。本発明の細孔は、鎖配列決定に使用できる。本発明の１つの方法は、細孔を通る標的配列の移動を制御するために核酸結合タンパク質を使用する。そのようなタンパク質の例には、それだけには限らないが、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼおよびヘリカーゼなどの核酸ハンドリング酵素ならびにＳＣＯＰ（タンパク質の立体構造分類）によって核酸結合タンパク質スーパーファミリー（５０２４９）に分類されているものなどの非触媒的結合タンパク質がある。結合タンパク質は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）であってよい。
【０２０２】
核酸は、ヌクレオチドを２個以上含む高分子である。タンパク質に結合される核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含むことができる。ヌクレオチドは、上述したそれらいずれであってもよい。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であってよい。核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセリン核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を持つ他の合成ポリマーなど当技術分野において公知の任意の合成核酸であってもよい。タンパク質に結合される核酸は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡもしくはＬＮＡなどの一本鎖、またはＤＮＡなどの二本鎖であってよい。二本鎖ＤＮＡが、タンパク質に結合される前に一本鎖へと解離していれば、一本鎖核酸に結合するタンパク質を使用して、二本鎖ＤＮＡを配列決定することができる。
【０２０３】
好ましくは、核酸結合タンパク質は核酸ハンドリング酵素である。核酸ハンドリング酵素は、核酸と相互作用でき、核酸の少なくとも１つの特性を修飾できるポリペプチドである。酵素は、核酸を切断することによってこれを修飾し、個々のヌクレオチドまたは短いヌクレオチド鎖（ジ−もしくはトリヌクレオチドなど）を形成することができる。酵素は、核酸を正しい向きに配向させるまたは特定の位置に移動させることによってこれを修飾できる。核酸ハンドリング酵素は、標的配列に結合する能力および細孔を通る移動を制御する能力がありさえすれば、酵素活性を示す必要はない。例えば、酵素は、修飾して酵素活性を取り除かれてもよく、または酵素として作用できない条件で使用されてもよい。そのような条件については、以下で詳述する。
【０２０４】
好ましくは、核酸ハンドリング酵素は、核酸分解酵素から得られる。より好ましくは、酵素構築物において使用される核酸ハンドリング酵素は、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバーから得られる。酵素は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（ＷＯ  ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されているそれらのいずれかであってよい。
【０２０５】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびトポイソメラーゼ（ジャイレースなど）である。適切な酵素には、それだけには限らないが、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号８）、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来のＲｅｃＪ（配列番号１０）およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号１２）ならびにそれらのバリアントがある。配列番号１０に示される配列またはそのバリアントを含む３つのサブユニットが相互作用して、三量体エキソヌクレアーゼを形成する。好ましくは、酵素はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）に基づく。
【０２０６】
配列番号４、６、８、１０または１２のバリアントは、配列番号４、６、８、１０または１２とは異なるアミノ酸配列を有するが、核酸結合能を保持している酵素である。バリアントは、核酸の結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含むことができる。
【０２０７】
好ましくは、バリアントは、配列番号４、６、８、１０または１２のアミノ酸配列の全長にわたってアミノ酸同一性に基づいて、その配列と少なくとも５０％相同になる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号４、６、８、１０もしくは１２のアミノ酸配列と全配列にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００以上（例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性」）。相同性は、上述のとおりに決定される。バリアントは、配列番号２を参照して、上述した方法のいずれかで、野生型配列と異なることができる。酵素は、上述のとおり細孔に共有結合されてよい。
【０２０８】
ヌクレオチドが細孔の検出部分に達する系列において障害の可能性が全くないので、酵素は、個々のヌクレオチド配列決定の場合ほど細孔内腔に近接近する必要がない。
【０２０９】
一本鎖ＤＮＡ配列決定のための２つの戦略は、ナノ細孔を通してＤＮＡをシスからトランスへ、およびトランスからシスへと印加電位に伴ってまたは反対に移行させることである。鎖配列決定に最も有利な機序は、印加電位の下でナノ細孔を通る一本鎖ＤＮＡの移行を制御することである。二本鎖ＤＮＡ上で漸進的または進行的に作用するエキソヌクレアーゼを細孔のシス側で使用して、残った一本鎖を印加電位の下で送り込むことができ、またはトランス側で使用して、逆電位の下で送り込むことができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、類似の方式で使用できる。印加電位とは反対への鎖の移行を必要とする配列決定応用の可能性もあるが、ＤＮＡは最初に逆電位または無電位の下で酵素に「捕われ」なければならない。次いで結合した後に電位を切り替えて、鎖は細孔を通ってシスからトランスへと通過し、電流の流れによって伸びた立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存的ポリメラーゼが分子モーターとして作用して、移行したばかりの一本鎖を段階的に制御する方式で、印加電位とは反対方向にトランスからシスへと細孔を通して引き戻すことができる。
【０２１０】
エキソヌクレアーゼに基づく方法
一実施形態において、標的核酸配列を特徴付ける方法は、標的配列をエキソヌクレアーゼ酵素と接触させるステップを含む。上述したエキソヌクレアーゼ酵素のいずれも、本方法で使用できる。エキソヌクレアーゼは、標的配列の一方の端から個々のヌクレオチドを遊離させる。酵素は、上述のとおり細孔に共有結合されてよい。
【０２１１】
エキソヌクレアーゼは、通常核酸配列の一方の末端を掴み、その末端から一度に１ヌクレオチドずつ配列を消化する酵素である。エキソヌクレアーゼは、５’から３’方向にまたは３’から５’方向に核酸を消化することができる。エキソヌクレアーゼが結合する核酸の末端は通常、使用される酵素の選択によっておよび／または当技術分野において公知の方法を使用して決定される。通常、核酸配列のいずれかの末端にあるヒドロキシル基またはキャップ構造を使用して、核酸配列の特定の末端に対するエキソヌクレアーゼの結合を防止するまたは促進する。
【０２１２】
上述のとおり、本方法は、ヌクレオチドの一部を特徴付けまたは同定できる速度でヌクレオチドが核酸の末端から消化されるように、核酸配列をエキソヌクレアーゼと接触させるステップを含む。これを行う方法は、当技術分野で周知である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して同定できるように、エドマン分解を使用してポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を連続的に消化する。本発明において相同な方法を使用することができる。
【０２１３】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は通常、野生型エキソヌクレアーゼの最適な速度より遅い。本発明の方法におけるエキソヌクレアーゼの活性の適切な速度は、１秒につき０．５〜１０００ヌクレオチド、１秒につき０．６〜５００ヌクレオチド、１秒につき０．７〜２００ヌクレオチド、１秒につき０．８〜１００ヌクレオチド、１秒につき０．９〜５０ヌクレオチド、または１秒につき１〜２０もしくは１０ヌクレオチドの消化を含む。好ましくは、速度は１秒につき１、１０、１００、５００または１０００ヌクレオチドである。エキソヌクレアーゼ活性の適切な速度は、様々な方法で得ることができる。例えば、活性の最適速度が低下したバリアントエキソヌクレアーゼを、本発明に従って使用できる。
【０２１４】
ＭｓｐおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ
好ましい実施形態において、鎖配列決定などの特徴付けは、Ｍｓｐから得られる細孔およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。本方法は、（ａ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼがＭｓｐから得られる細孔を通る標的配列の移動を制御し、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、標的配列を細孔およびポリメラーゼと接触させるステップと、（ｂ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによって配列を決定するなど、標的配列を特徴付けるステップとを含み、ステップ（ａ）および（ｂ）は細孔に印加される電圧により実施される。標的配列がＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｓｐから得られる細孔と接触されるとき、標的配列は最初にＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成する。電圧が細孔に印加されるとき、標的配列／Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ複合体は細孔と複合体を形成し、細孔を通る標的配列の移動を制御する。
【０２１５】
この実施形態には、予想外の利点が３つある。第１に、商業的に実現可能でありなおかつ有効な配列決定を可能にする速度で、標的配列が細孔を通って移動する。標的配列は、溶血素細孔を通って移動するより速くＭｓｐ細孔を通って移動する。第２に、核酸が細孔を通って移動する際に、電流範囲の増加が観察され、より容易に配列を決定できるようになる。第３に、特異的細孔とポリメラーゼを一緒に使用する場合、電流変動の減少が観察され、それによってシグナル対ノイズ比が高まる。
【０２１６】
上述した任意の核酸配列を、特徴付けまたは配列決定することができる。好ましくは、核酸配列の少なくとも一部は二本鎖である。
【０２１７】
細孔は、上述した細孔のいずれであってもよい。好ましくは、細孔は本発明の細孔である。細孔は、配列番号２、１６、１７または１８で示される配列またはそのバリアントを含む８個のモノマーを含むことができる。細孔は、本発明の変異のどれも含む必要はない。
【０２１８】
野生型Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を有する。これは、適当な条件下で二本鎖核酸をほどくこともできる。したがって、本酵素は３つのモードで作動できる。これについては、以下で詳述する。
【０２１９】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４に示される配列またはそのバリアントを含むことができる。配列番号４のバリアントは、配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有するが、核酸結合活性を保持している酵素である。バリアントは、後述する３つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、バリアントは３つ全てのモードで作動する。バリアントは、核酸の処理を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含むことができる。
【０２２０】
好ましくは、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号４のアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも４０％相同になる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、配列番号４のアミノ酸配列と全配列にわたって少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。２００以上（例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上）の連続するアミノ酸区間にわたって、少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％または９５％）のアミノ酸同一性が存在し得る（「厳密な相同性」）。相同性は、上述のとおりに決定される。バリアントは、配列番号２を参照して、上述した方法のいずれかで、野生型配列と異なることができる。酵素は、上述のように細孔に共有結合されてよい。
【０２２１】
上述したシステム、装置または条件のいずれかを、この好ましい実施形態に従って使用できる。塩濃度は通常０．１５Ｍ〜０．６Ｍである。好ましくは、塩はＫＣｌである。
【０２２２】
本方法は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの３つのモードに基づいて、３つの好ましい方法の１つで実施され得る。各方法は、配列を校正する方法を含む。第１に、好ましくは、本方法はポリメラーゼとしてＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。この実施形態において、ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場とは反対方向に細孔を通して標的配列を移動させるように、ステップ（ａ）および（ｂ）が遊離ヌクレオチドと酵素補因子の存在下で実施される。標的配列は、５’から３’の方向で移動する。遊離ヌクレオチドは、上述した個々のヌクレオチドのいずれか１つまたは複数であってよい。酵素補因子は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼがポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼとして機能できるようにする因子である。好ましくは、酵素補因子は二価金属陽イオンである。好ましくは、二価金属陽イオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。最も好ましくは、酵素補因子はＭｇ２＋である。好ましくは、本方法は（ｃ）ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場に伴って（すなわち３’から５’方向に）細孔を通して標的配列を移動させ、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、遊離ヌクレオチドを取り除くステップと、（ｄ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｂ）において得られた標的配列の配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）もまた細孔に印加される電圧により実施される。
【０２２３】
第２に、好ましくは、本方法はエキソヌクレアーゼとしてＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。この実施形態において、ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場に伴って細孔を通して標的配列を移動させるように、ステップ（ａ）および（ｂ）が、遊離ヌクレオチドの非存在下および酵素補因子の存在下で実施される。標的配列は、３’から５’の方向に移動する。好ましくは、本方法は、（ｃ）ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場と反対方向に（すなわち５’から３’方向に）細孔を通して標的配列を移動させ、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、遊離ヌクレオチドを添加するステップと、（ｄ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｂ）において得られた標的配列の配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）もまた細孔に印加される電圧により実施される。
【０２２４】
第３に、好ましくは、本方法は、アンジッピングモードでＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。この実施形態において、ポリメラーゼが、印加電圧により生じる電場と共に細孔を通る標的配列の移動を制御するように（ほどかれるように）、ステップ（ａ）および（ｂ）が、遊離ヌクレオチドの非存在下および酵素補因子の非存在下で実施される。この実施形態において、ポリメラーゼは、印加電圧の影響下で標的配列があまりに速く細孔を通って移動することを防止する制動装置のように作用する。好ましくは、本方法は、（ｃ）標的配列がステップ（ａ）および（ｂ）における方向とは反対方向に細孔を通って移動し（すなわち、再アニールし）、標的配列中のヌクレオチドの一部が細孔と相互作用するように、細孔に印加される電圧を下げるステップと、（ｄ）各相互作用の間に細孔を通る電流を測定し、それによってステップ（ｂ）において得られた標的配列の配列を校正するステップとをさらに含み、ステップ（ｃ）および（ｄ）もまた細孔に印加される電圧により実施される。
【０２２５】
本発明は、標的核酸配列を配列決定するためのセンサーを形成する方法であって、（ａ）標的核酸配列の存在下でＭｓｐから得られる細孔をＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップと、（ｂ）細孔に電圧を印加して、細孔とポリメラーゼとの複合体を形成させるステップとを含み、それによって標的核酸配列を配列決定するためのセンサーを形成する方法も提供する。本発明は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高める方法であって、核酸配列の存在下でＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをＭｓｐから得られる細孔と接触させるステップと、細孔に電圧を印加して細孔とポリメラーゼとの複合体を形成させるステップとを含み、それによって、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性速度を高める方法をさらに提供する
【０２２６】
キット
本発明は、配列決定など、標的核酸配列を特徴付けるためのキットも提供する。１つのキットは、（ａ）本発明の細孔および（ｂ）核酸ハンドリング酵素を含む。別のキットは、（ａ）Ｍｓｐから得られる細孔および（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明の方法を参照して上述したどの実施形態も本発明のキットに同程度に適用できる。
【０２２７】
本発明のキットは、前述の実施形態のいずれかを実施可能にする１つまたは複数の他の試薬または機器を追加的に含むことができる。そのような試薬または機器には、以下の１つまたは複数が含まれる：適切な緩衝液（複数可）（水溶液）、対象からサンプルを採取する手段（注射針を備える容器または機器など）、ポリヌクレオチド配列を増幅および／または発現させる手段、上で定義した膜または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、液体サンプルで試薬を再懸濁するような乾燥状態でキット中に存在することができる。場合によっては、キットは、本発明の方法でキットを使用することが可能になる説明書、または本方法を使用できる患者に関する詳細を含むこともできる。キットは、場合によってはヌクレオチドを含むことができる。
【０２２８】
装置
本発明は、配列決定など、サンプル中の標的核酸配列を特徴付けるための装置も提供する。装置は、（ａ）本発明の複数の細孔および（ｂ）複数の核酸ハンドリング酵素を含むことができる。あるいは、本発明は、Ｍｓｐから得られる複数の細孔および複数のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。装置は、アレイまたはチップなど分析物分析用のどんな通常装置であってもよい。
【０２２９】
好ましくは、装置は、
複数の細孔を支持することができ、細孔および酵素を使用して核酸の特徴付けまたは配列決定を行うように操作できるセンサーデバイスと；
−  特徴付けまたは配列決定を行うための材料保持用の少なくとも１つの貯蔵部と；
−  少なくとも１つの貯蔵部からセンサーデバイスへと制御可能に材料を供給するよう構成された流体系と；
−  それぞれのサンプルを受けるための複数の容器とを含み、流体系は、容器からセンサーデバイスへと選択的にサンプルを供給するよう構成されている。
装置は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９（ＷＯ  ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６（未公開）または国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９（ＷＯ  ００／２８３１２として公開）に記載される装置のいずれかであってよい。
【０２３０】
以下の実施例は、本発明を例示している：
【実施例１】
【０２３１】
ホモオリゴマーは細孔であって、全てのモノマー単位が同一である。モノマー単位が自己組織化しようとするとき、これらは最も単純な構築物を作製することになる。塩基読み取り特性を改善するための戦略は、種類分けできる：
・立体性（アミノ酸残基のサイズを増減する）
・電荷（＋ｖｅ電荷を導入してＤＮＡと相互作用させる）
・水素結合（塩基対と水素結合できる残基）
・πスタッキング（非局在化π電子系によって相互作用するアミノ酸）
立体性／πスタッキングの増大（全ＮＮＮ−ＲＲＫバックグラウンド）：
立体性−残基をバルク（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン）と置換
πスタッキング−芳香族残基（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン）を置換
以下の全ての表（６〜１１）に、配列番号２に作られた変異が示されている。Ｂ１＝配列番号２。
【０２３２】
【表６】
2014506575.tif 000009
立体性の減少−残基をより小さいサイズ（例えばセリン、トレオニン、グリシン、アラニン、バリン）と置換
【０２３３】
【表７】
2014506575.tif 000010
電荷−残基を陽電荷（例えばアルギニン、リシン、ヒスチジン）と置換
【０２３４】
【表８】
2014506575.tif 000011
水素結合−残基を結合能力（例えばアスパラギン、グルタミン、チロシン、ヒスチジン）と置換
【０２３５】
【表９】
2014506575.tif 000012
【０２３６】
【表１０】
2014506575.tif 000013
【０２３７】
ホモオリゴマーを修飾して反応性基を含めることができ、次いで化学修飾することができる。
【０２３８】
【表１１】
2014506575.tif 000014
【実施例２】
【０２３９】
異なるモノマー単位を結合させて、新規なオリゴマー細孔を創出することができる。オリゴマーが２個以上の異なるサブユニットを含有する場合（例えばＭＳ−（ＭｕｔＡ）６（ＭｕｔＢ）１（ＭｕｔＣ）１）、細孔はヘテロオリゴマーである。ヘテロオリゴマーは通常、１つの単位（例えばＭＳ−（ＭｕｔＡ）７（ＭｕｔＢ）１）しか修飾されていない。他の割合のヘテロオリゴマーが形成される可能性もある（例えばＭＳ−（ＭｕｔＡ）６（ＭｕｔＢ）２）。サブユニットは、配列番号２を含むこともできる。
【０２４０】
ヘテロオリゴマーの利点は、細孔に（あらゆるモノマー単位に変化を導入するのではなく）単一の化学変化を作れるということである。これは、ホモオリゴマーと比べると構造についてはそれほど大幅な変化ではなく、これによりホモオリゴマーでは有効でなかった位置で残基を細孔の中に導入できる可能性がある。ＤＮＡと相互作用する単一の残基が、複数の単位と比較して有益な場合がある（例えば、八量体上の８個のＡｒｇと比較したヘテロ八量体上の単一のＡｒｇ）。変異体を組み合わせて、同じ残基で異なる効果を作製することもでき、この例は７個の単位のサイズを減少させ、一方で１つのサイズを増加させることである（例えばＭＳ−（Ｄ９０Ｇ）８（Ｄ９０Ｙ）１）。
【０２４１】
変異体設計の法則は、ホモオリゴマーについて上で提示したそれと類似することになる。
【０２４２】
単一の立体性残基の導入
【０２４３】
【表１２】
2014506575.tif 000015
【０２４４】
単一の荷電残基の導入
【０２４５】
【表１３】
2014506575.tif 000016
【０２４６】
単一の反応性残基の導入
【０２４７】
【表１４】
2014506575.tif 000017
【実施例３】
【０２４８】
化学修飾用としての単一の反応性残基の導入。
【０２４９】
【表１５】
2014506575.tif 000018
【実施例４】
【０２５０】
以下の表は、本発明の変異体細孔の要約である。１つ目はホモオリゴマーに関し、２つ目はヘテロオリゴマーに関する。
【０２５１】
【表１６】
2014506575.tif 000019
【表１６−２】
2014506575.tif 000020
表１６の続き  
【０２５２】
【表１７】
2014506575.tif 000021
【実施例５】
【０２５３】
ＨＬと比較したＭｓｐＡ
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）を分子モーターとして、変異体ＭｓｐＡナノ細孔と結合させて、細孔を通るＤＮＡ鎖の移動を制御することを可能にした。電圧は細孔に印加され、ナノ細孔の両側にある塩溶液中のイオンの移動により、電流が生成された。細孔を通ってＤＮＡが移動するとき、細孔を通るイオン流はＤＮＡに関連して変化する。この情報は、配列依存的であることが示されている。
【０２５４】
溶血素の変異型をＭｓｐＡ、具体的にはＭＳ−（Ｂ１）８と比較した。ＭｓｐＡの電流範囲は溶血素（ＨＬ）と比較して高い。加えて、ＤＮＡの鎖を細孔に通すとき、ＭｓｐＡの電流範囲もまた大きくなる。
【０２５５】
ＭｓｐＡとＰｈｉ２９ＤＮＡＰを一緒にすることによって、ＭｓｐＡについて予想していなかったいくつかの驚くべき特徴があることが示された。主な違いは、以下のとおりである：
１．ＨＬと比較して速い鎖の移動（アンジッピングモード）。
２．細孔を通して鎖を移動させるときの電流範囲の増加。
３．ＨＬ変異体と比較した電流レベルの変動の減少。
【０２５６】
より速い鎖移動
１３４マーのｓｓＤＮＡ鋳型（配列番号１３）を８４マーのｓｓＤＮＡ（配列番号１４）にハイブリダイズさせて、５０マーのｓｓＤＮＡ５’突出を持つ８４マーのｄｓＤＮＡ鋳型を形成した。この鎖は、アンジッピングモードでＰｈｉ２９ＤＮＡＰを使用して、ＭＳ−（Ｂ１）８ＭｓｐＡ変異体および溶血素変異体を通って移動する。２回の実験を行った；全て室温で、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴを含む、一方は４００ｍＭ  ＫＣｌ、他方は６００ｍＭ  ＫＣｌ。印加電位は、変異体構築物毎に最適化した；ＨＬは２２０ｍＶで、ＭｓｐＡは１８０ｍＶで行った。
【０２５７】
電流レベルが、酵素に結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出され、これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された。
【０２５８】
全てのほどく実験について、ほどける速度は、鎖を通して一貫しているというわけではなかった。これは、事象継続時間の平均を算出することによって示され、事象索引を４分の１に分割することができる（図１）。第１四分位値は、次の四分位値よりもかなり長い継続時間を有する事象を提供し、これはＨＬおよびＭｓｐＡ両方に当てはまった。第１四分位値の場合、平均事象長は、ＭｓｐＡでは４００ｍＭ  ＫＣｌで最短であり、ＨＬでは６００ｍＭで最短であった。しかしＱ２、Ｑ３およびＱ４において、ＭｓｐＡは、両方の塩条件に関してより短い事象を生じた。シグナル対ノイズ比が十分な場合、細孔を通るＤＮＡ鎖が速い移動を示す際には短い事象が望ましく、したがって実験の処理量が増加する。
【０２５９】
電流範囲の増加および変動の減少
ここで記載のナノ細孔実験において、電流レベルは、主に塩濃度、印加電圧および温度に依存的である。ＨＬとＭＳ−（Ｂ１）８ＭｓｐＡ変異体とを、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して、アンジッピングモードで６００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０、＋２２０ｍＶに設定した物理的条件で比較した。この実験において使用したＤＮＡは、３４マーの一本鎖５’突出を持つ１００マーのヘアピンであった（配列番号１５）。実験は、室温で実行された。
【０２６０】
電流レベルが、酵素結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出され、これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された（図２および３）。
【０２６１】
電流範囲がおよそ２０ｐＡであるＨＬ変異体と比較して、ＭｓｐＡ変異体がおよそ５０ｐＡという著しく大きな範囲を与えることは、これらの実験から明白である（図２および３）。大きな電流範囲は、大きなシグナル対ノイズ比を提供し、異なる電流状態の区別を容易にするので有利である。Ｎ塩基が電流シグナルに関与する可能性があるとき、これは配列決定用途に特別な利点があり、４Ｎに可能な電流状態をもたらす。
【０２６２】
ＭｓｐＡ変異体の状態の変動はまた、ＨＬと比較して減少する。これは、上記痕跡における事象の標準偏差によって示される（図２および３）。上記の鎖の場合、ＭｓｐＡ鎖の全ての事象にわたる標準偏差の平均は、ＨＬの４．５と比較して３．６であった。状態の小さい変動は、事象電流レベルの正確な評価を可能にするには望ましい。
【実施例６】
【０２６３】
ＭＳ−（Ｂ１）８ベースラインとＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５）８変異体との開孔電流比較
ＭｓｐＡ細孔の電流レベルは、タンパク質中のＩ１０５位を変異させることによって制御できる。ＭｓｐＡモノマーに単一の変異を作ることにより、開孔電流を８０％超増加できることを実証する。
【０２６４】
次の条件下で、単一のチャネルを脂質膜に挿入した：４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、室温。開孔電流レベルを、−２００ｍＶ〜２００ｍＶの印加電位の範囲にわたって記録して、Ｉ−Ｖ曲線を作製した。いくつかの細孔について実験を繰り返して、サンプルの分布を算定した。Ｉ−Ｖ曲線実験に由来するデータの例が、見られる（図４）。
【０２６５】
実験において、ベースラインＭＳ−（Ｂ１）８変異体は、＋１６０ｍＶでおよそ１５０ｐＡの開孔電流を有する細孔を生成する（図５）。
【０２６６】
高い残留電流を伴う多くの細孔を表すＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｙ）８変異体を用いて実験を繰り返した。これらチャネルの場合、開孔電流は＋１６０ｍＶでおよそ２００ｐＡであった（図６）。
【０２６７】
電流レベルの２つの主な分布を表すＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｎ）８変異体を用いて実験を繰り返した。１６個の細孔のうち１０個は、密な分布で高い残留電流を生じた。これらチャネルの場合、開孔電流は、＋１６０ｍＶでおよそ２８０ｐＡであった（図７）。
【実施例７】
【０２６８】
自発的に伝導性を変化させるＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ａ）８細孔
ＭｓｐＡ変異体細孔が、電気的記録実験の間に自発的に伝導性を変化させることが観察された。
【０２６９】
電気的な測定は、実施例６において説明したように、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ａ）８変異体細孔を使用して得られた。
【０２７０】
単一のＭｓｐＡ変異体細孔は、高低の伝導性状態の間で自発的に入れ替ることが可能である（図８）。これは、ＭｓｐＡに対する変異により、ベースラインＭＳ−（Ｂ１）８細孔においてまれに観察される立体構造変化が起こり得ることを示唆している。Ｉ１０５位における変異は、細孔の高い伝導性状態を安定させる可能性がある。
【実施例８】
【０２７１】
ベースラインＭＳ−（Ｂ１）８細孔を通るＤＮＡの移動を、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ａ）８細孔と比較したときのＤＮＡ電流の比較
ＭＳ−（Ｂ１）８細孔とＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｎ）８細孔とを、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して、アンジッピングモードで４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０、＋１８０ｍＶに設定した物理的条件で比較した。この実験において使用したＤＮＡは、３４マーの一本鎖５’突出を持つ１００マーのヘアピンであった（配列番号１５）。実験は、室温で実行された。
【０２７２】
電流レベルが、酵素結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出され、これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された。
【０２７３】
ＭＳ−（Ｂ１）８変異体を通って移動するＤＮＡ鎖に由来する電流レベルの広がりは、これらの条件下で３０ｐＡ以下であった（図９）。ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ａ）８変異体を使用して同じ実験が繰り返され、電流レベルは同じＤＮＡ鎖について４０ｐＡ以下の範囲を表した（図１０）。ナノ細孔内のヌクレオチドの組合せを識別するためには、ＭＳ−（Ｉ１０５Ａ）８変異体のより大きな電流範囲が望ましい。
【実施例９】
【０２７４】
ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８変異体とＭＳ−（Ｂ１）８ベースラインとのシグナルノイズ比較
ＭｓｐＡ細孔のノイズレベルは、ＭｓｐＡモノマー配列中のＬ８８位を変異させることによって制御できる。ＭｓｐＡモノマーに単一の変異を作ることにより、ノイズレベルを１９％減らせることが実証された。
【０２７５】
この実施例は、ヘリカーゼを使用してナノ細孔を通る完全なＤＮＡ鎖の移動を制御することにより、移行モードでＭＳ−（Ｂ１）８細孔とＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８細孔とを比較する。
【０２７６】
材料
プライマーは、ＰｈｉＸ１７４の４００ｂｐ以下の断片を増幅するように設計された。これらプライマーの５’−末端の各々は、５０ヌクレオチドの非賞賛（complimentary）の領域（ホモポリマー範囲または１０ヌクレオチドホモポリマーセクションの繰り返し単位）を含んだ。これらは、ナノ細孔を通る鎖の移行を制御するための識別子として役立ち、ならびに移行の方向性を決定している。加えて、フォワードプライマーの５’−末端は「キャップ化」されて、４つの２’−Ｏ−メチルウラシル（ｍＵ）ヌクレオチドを含み、リバースプライマーの５’−末端は化学的にリン酸化された。次いで、これらのプライマー修飾により、ラムダエキソヌクレアーゼを使用すると、主にアンチセンス鎖だけを消化する制御が可能になる。ｍＵキャッピングはヌクレアーゼ消化からセンス鎖を保護するが、アンチセンス鎖の５’のＰＯ４は消化を進める。したがって、ラムダエキソヌクレアーゼとインキュベーションした後には、二本鎖のセンス鎖だけが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として無傷で残る。次いで、生成したｓｓＤＮＡを、前述のとおりＰＡＧＥ精製した。
【０２７７】
この実験に使用したＤＮＡ基質の設計を、図１１に示す（配列番号１９および２０（以下に配列およびタグを提示する））。ＤＮＡ基質は、ナノ細孔による捕捉を補助するための５０個のＴの５’−リーダーを持つＰｈｉＸに由来するｓｓＤＮＡの４００塩基のセクションを含む。二重層の表面にＤＮＡを濃縮し、したがって捕捉効率を改善するために、３’コレステロールタグ（３’コレステリル−ＴＥＧ）を含有するプライマーを、この鎖の５０Ｔリーダー直後にアニールする。
【０２７８】
配列番号１９
ｍＵｍＵｍＵｍＵＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＣＣＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＧＧＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＡＣＣＣＴＣＣＣＧＡＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＴＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＴＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＣＴＡＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＣＧＧＡＴＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＡＡＧＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＧＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＣ
【０２７９】
配列番号２０（プラス３’コレステリル−ＴＥＧタグ）ＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／３ＣｈｏｌＴＥＧ／
【０２８０】
実験方法
緩衝溶液：４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノ細孔：ＭＳ（Ｂ１）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ
酵素：ヘリカーゼ
電気的な測定は、１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノ細孔から得られた。２つの１ｍＬ緩衝液に分離している（特注のデルリンチャンバ内の）厚さ２０μｍのＰＴＦＥ薄膜にある直径１００μｍ以下の開口部を横切って、Ｍｏｎｔａｌ−Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により、二重層が形成された。全ての実験は、記載の緩衝液で実施された。単一チャネルの電流を、１４４０Ａデジタイザを備えているＡｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。シス区画（ナノ細孔と酵素／ＤＮＡ両方が添加されている）をＡｘｏｐａｔｃｈヘッドステージのアースに接続し、トランス区画をヘッドステージの活性電極に接続できるように、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を緩衝液に接続した。
【０２８１】
二重層中にＭＳ（Ｂ１）８またはＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８の単一細孔を得た後に、ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号１９および２０）ならびにヘリカーゼを緩衝液１００μＬに添加し、５分間プレインキュベートした（ＤＮＡ＝１．５ｎＭ、酵素＝１μＭ）。電気生理学チャンバのシス区画内の緩衝液９００μＬにこのプレインキュベーション混合物を添加して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ、酵素＝０．１μＭを得る）。ヘリカーゼＡＴＰアーゼ活性は、シス区画に二価金属（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）およびＮＴＰ（１ｍＭ  ＡＴＰ）を添加することによって、必要に応じて開始された。実験は、＋１４０ｍＶの定電位で実施された。電流レベルが、酵素結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出され、これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された。
【０２８２】
ＭｓｐＡ細孔ＭＳ−（Ｂ１）８を使用した場合、検出された事象の３１．０８％は、＋１４０ｍＶの印加電位で標準偏差＞２．０であった（追加的なデータを表１８にまとめた）。ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８変異体を用いて実験を繰り返し、検出された事象のわずか１２．３８％が、＋１４０ｍＶの印加電位で２．０より大きい標準偏差を表した（追加的なデータを表１８にまとめた）。したがって、ＭｓｐＡモノマー配列中のＬ８８における点突然変異は、観察されるノイズ範囲を１９％減少させた。
【０２８３】
【表１８】
2014506575.tif 000022
【実施例１０】
【０２８４】
ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｓ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｑ）８変異体とＭＳ−（Ｂ１）８ベースラインとのシグナルノイズ比較
ＭｓｐＡ細孔のノイズレベルは、タンパク質中のＬ８８位を変異させることによって改変できる。ＭｓｐＡモノマーに単一の変異を作ることにより、ノイズレベルを減少させられることが実証された。
【０２８５】
この実施例は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用してナノ細孔を通る完全なＤＮＡ鎖の移動を制御することにより、アンジッピングモードでＭＳ−（Ｂ１）８細孔とＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｓ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｑ）８細孔とを比較する。この実施例に記載されている全ての実験に使用したＤＮＡ基質の設計を、図１２に示す（配列番号２１、２２および２３）。以下に示すように、配列番号２３はＩＤＴ  Ｉｎｔ  Ｓｐａｃｅｒ９（ｉＳｐ９）および３’コレステリル−ＴＥＧ（３ＣｈｏｌＴＥＧ）を用いてタグ付けされた。実験は、室温で、＋１８０ｍＶの印加電位で実行された。
【０２８６】
配列番号２３：
ＣＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣ／ｉＳｐ９／／３ＣｈｏｌＴＥＧ／
【０２８７】
実験方法
緩衝液：４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ
細孔：ＭＳ（Ｂ１）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｓ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｑ）８ＭｓｐＡ；
酵素：Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ配列番号４
電気的な測定は、実施例９に記載のとおり得られた。二重層中にＭＳ（Ｂ１）８、ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８、ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｓ）８またはＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｑ）８の単一細孔を得た後に、ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号２１、２２および２３）ならびにＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを緩衝液１００μＬに添加し、５分間プレインキュベートした。電気生理学チャンバのシス区画内の緩衝液９００μＬにこのプレインキュベーション混合物を添加して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝０．５ｎＭ、酵素＝０．１μＭを得る）。実験は、＋１８０ｍＶの定電位で実施された。ＤＮＡが酵素に結合している状態にあるとき、観察された電流レベルが索引付けされ、電流レベル、その継続時間および変動が記録された。
【０２８８】
実験において、ベースラインＭＳ−（Ｂ１）８変異体は、＋１８０ｍＶで高レベルのノイズ（７６．１５％が標準偏差＞２．０、表１９を参照のこと）を表した。試験した他の３つの変異体、Ｌ８８位に単一点突然変異を有する（ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｓ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｑ）８）の全てが、同じＤＮＡ鎖配列に対してベースライン細孔より低いノイズレベル（表１９を参照のこと）が観察された。したがって、ＭｓｐＡモノマー配列中のＬ８８位に点突然変異を適用することによってシグナルノイズを減らすことが可能になった。
【０２８９】
【表１９】
2014506575.tif 000023
【実施例１１】
【０２９０】
他のＭｓｐＡ変異体とＭＳ−（Ｂ１）８ベースラインとの全シグナル範囲の比較
ＭｓｐＡ細孔のシグナル範囲は、ＭｓｐＡタンパク質モノマー配列中の様々な位置を変異させることによって増加させることができる。
【０２９１】
この実施例は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用してナノ細孔を通る完全なＤＮＡ鎖の移動を制御することにより、アンジッピングモードでＭＳ−（Ｂ１）８細孔と次の細孔−ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｌ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｙ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ８９Ｙ−Ｄ９０Ｓ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｎ８６Ｔ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｓ１０３Ｇ）８−細孔とを比較する。この実施例に記載されている全ての実験に使用したＤＮＡ基質の設計を、図１２に示す（配列番号２１、２２および２３）。ｉＳｐ９および３ＣｈｏｌＴＥＧでタグ付けされた配列番号２３を上に示す。実験は、室温で、＋１８０ｍＶの印加電位で実行された。ＤＮＡが酵素に結合している状態にあるとき、観察された電流レベルが索引付けされ、電流レベル、その継続時間および変動が記録された。
【０２９２】
実験方法
緩衝液：４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノ細孔：ＭＳ（Ｂ１）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｌ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｙ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ８９Ｙ−Ｄ９０Ｓ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ−（Ｂ１−Ｎ８６Ｔ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ−（Ｂ１−Ｓ１０３Ｇ）８ＭｓｐＡ；
酵素：Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ配列番号４
電気的な測定は、実施例１０に記載のとおり得られた。二重層中にＭＳ（Ｂ１）８、ＭＳ（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ）８、ＭＳ（Ｂ１−Ｉ１０５Ｌ）８、ＭＳ（Ｂ１−Ｉ１０５Ｙ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１８９Ｙ−Ｄ９０Ｓ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｎ８６Ｔ）８またはＭＳ−（Ｂ１−Ｓ１０３Ｇ）８の単一細孔を得た後に、ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号２１、２２および２３）ならびにＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを緩衝液１００μＬに添加し、５分間プレインキュベートした。電気生理学チャンバのシス区画内の緩衝液９００μＬにこのプレインキュベーション混合物を添加して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝０．５ｎＭ、酵素＝０．１μＭを得る）。実験は、＋１８０ｍＶの定電位で実施された。ＤＮＡが酵素に結合している状態にあるとき、観察された電流レベルが索引付けされ、電流レベル、その継続時間および変動が記録された。
【０２９３】
実験において、ベースラインＭＳ−（Ｂ１）８変異体は、＋１８０ｍＶで３５ｐＡの最大範囲を表した（表２０）。試験した他の６つの変異体、ＭＳ（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｌ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ１０５Ｙ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｉ８９Ｙ−Ｄ９０Ｓ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｎ８６Ｔ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｓ１０３Ｇ）８の全てで、同じＤＮＡ鎖配列に対してベースライン細孔より大きな最大範囲（表２０を参照のこと）が観察された。したがって、ＭｓｐＡモノマー配列中の様々な位置に点突然変異を適用することによってシグナル範囲を増やすことが可能になった。
【０２９４】
【表２０】
2014506575.tif 000024
【実施例１２】
【０２９５】
他のＭｓｐＡ変異体とＭＳ−（Ｂ１）８ベースラインとの全配列決定プロファイルの比較
ＭｓｐＡ細孔の配列決定プロファイルは、ＭｓｐＡタンパク質モノマー配列中の多様な位置を変異させることによって制御することができる。
【０２９６】
この実施例は、ヘリカーゼを使用してナノ細孔を通る完全なＤＮＡ鎖の移動を制御することにより、移行モードでＭＳ−（Ｂ１）８細孔をＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９３Ｓ−Ｉ１０５Ａ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｑ１２６Ｒ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｍ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｓ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８細孔と比較する。
【０２９７】
実験方法
緩衝液：４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノ細孔：ＭＳ（Ｂ１）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９３Ｓ−Ｉ１０５Ａ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１ーＬ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｍ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｓ）８ＭｓｐＡ；
ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ；
酵素：ヘリカーゼ
実験の組み立ては、実施例９に記載のとおり実施された。二重層中にＭＳ−（Ｂ１）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９３Ｓ−Ｉ１０５Ａ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｑ１２６Ｒ）、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｍ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｓ）８またはＭＳ−（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８の単一細孔を得た後に、ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号１９および２０（配列およびタグを上に示した））ならびにヘリカーゼを緩衝液１００μＬに添加し、５分間プレインキュベートした（ＤＮＡ＝１．５ｎＭ、酵素＝１μＭ）。電気生理学チャンバのシス区画内の緩衝液９００μＬにこのプレインキュベーション混合物を添加して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ、酵素＝０．１μＭを得る）。ヘリカーゼＡＴＰアーゼ活性は、シス区画に二価金属（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）およびＮＴＰ（１ｍＭＡＴＰ）を添加することによって、必要に応じて開始された。実験は、＋１４０ｍＶの定電位で実施された。ＤＮＡが酵素に結合している状態にあるとき、観察された電流レベルが索引付けされ、電流レベル、その継続時間および変動が記録された。
【０２９８】
実験において、ベースラインＭＳ−（Ｂ１）８変異体は、図１３ａに示す配列決定プロファイルを作製した。多様な異なる配列決定プロファイルを表す次の変異体ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９３Ｓ−Ｉ１０５Ａ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｄ９０Ｑ−Ｑ１２６Ｒ）、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｍ）８、ＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ−Ｄ９０Ｑ−Ｄ９１Ｓ）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８を用いて実験を繰り返した、（図１３ｂ〜ｆを参照のこと）。したがって、ＭｓｐＡモノマー配列中の多様な位置に点突然変異を作ることによって、検出される配列決定プロファイルを改変することが可能になる。
【実施例１３】
【０２９９】
ＭＳ−（Ｂ１）８ベースライン細孔を使用するＲＮＡ鎖配列の分析
この実施例は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと合わせたＭｓｐＡベースライン細孔ＭＳ−（Ｂ１）８を使用して、ＲＮＡ鎖を配列決定できる方法について記載している。
【０３００】
この実施例は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用してナノ細孔を通る完全なＲＮＡ鎖の移動を制御することにより、アンジッピングモードでＭＳ−（Ｂ１）８細孔を使用する。この実験に使用したＲＮＡ／ＤＮＡ混成基質の設計を、図１４（配列番号２４および２５）に示す。配列番号２４および２５を以下に提示している（ＲＮＡは太字）。実験は、室温で、＋１８０ｍＶの印加電位で実行された。
【０３０１】
配列番号２４：
５’ＯＨ−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＵＡＵＵＣＵＧＵＵＵＡＵＧＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＧＵ−３’ＯＨ
【０３０２】
配列番号２５（プラスコレステロールタグ）：
５’Ｐｈｏｓ−ＵＡＵＵＣＵＧＵＵＵＡＵＧＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＧＵＵＡＧＣＣＣＣＣＵＵＵＧＡＵＡＡＧＡＣＡＡＡＵＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡ−３’Ｃｈｏｌ
【０３０３】
材料
ＲＮＡ／ＤＮＡ混成鎖（長さ１２０マー）を合成するには、配列番号２４と２５を一緒にライゲーションする必要があった。これは、相補的なＤＮＡアダプター鎖配列番号２６を使用して、２本の鎖を近接近させることにより得られ、その後、それらを一緒にライゲーションし、１２０マーのＤＮＡ／ＲＮＡ混成物、配列番号２７を形成する。
【０３０４】
配列番号２７（プラスコレステロールタグ；ＲＮＡは太字）：
５’ＯＨ−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＵＡＵＵＣＵＧＵＵＵＡＵＧＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＧＵＵＡＵＵＣＵＧＵＵＵＡＵＧＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＧＵＵＡＧＣＣＣＣＣＵＵＵＧＡＵＡＡＧＡＣＡＡＡＵＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡ−３’Ｃｈｏｌ
【０３０５】
実験方法
緩衝液：４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノ細孔：ＭＳ（Ｂ１）８ＭｓｐＡ；
酵素：Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ配列番号４
電気的な測定は、実施例１０に記載のとおり得られた。二重層中にＭＳ（Ｂ１）８の単一細孔を得た後に、ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号２４および２５）ならびにＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを緩衝液１００μＬに添加し、５分間プレインキュベートした。電気生理学チャンバのシス区画内の緩衝液９００μＬにこのプレインキュベーション混合物を添加して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝０．２ｎＭ、酵素＝０．２μＭを得る）。実験は、＋１８０ｍＶの定電位で実施された。電流レベルが、酵素結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出され、これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された。
【０３０６】
実験において、分子モーターとしてのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと合わせたベースラインＭＳ−（Ｂ１）８変異体を観察して、ＲＮＡ鎖が細孔に通されるときの異なる電流レベルを検出した。次いで、これらの電流シグナルを使用して、標的の配列を決定した。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼアンジッピングモードにおける典型的なＲＮＡ移行事象を、図１５に示す。
【実施例１４】
【０３０７】
細孔形成のためのＭｓｐＡダイマーおよびオリゴマー化
この実施例は、ＭｓｐＡダイマーの調製およびオリゴマー化について記載している。
【０３０８】
ダイマーの調製
ＭｓｐＡ  ＮＮＮＲＲＫ単量体タンパク質は、１８４アミノ酸残基からなる。ＭｓｐＡ−ＮＮＮＲＲＫタンパク質のダイマー版を作るために、単一のポリペプチドが設計された。
【０３０９】
１８４残基ＭｓｐＡ−ＮＮＮＲＲＫポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列が、短いＤＮＡリンカー配列を介して、同一のポリペプチド鎖をコードしている第２のＤＮＡ配列と連結された。リンカーＤＮＡ配列は、ＳＧＳＧＳＧＤＤＤＤＤＤＤＤＳＧＳＧＳＳ（配列番号３３；−（ＳＧ）３−Ｄ８−（ＳＧ）２（ＳＳ）−と示す）をコードしている。第１塩基の直前に開始コドン（ＡＴＧ）を付け加え、２つの停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードしているＤＮＡを最後の塩基の後に付け加えた。これにより、ＭｓｐＡ−ＮＮＮＲＲＫ−（ＳＧ）３−Ｄ８−（ＳＧ）２（ＳＳ）−ＭｓｐＡ−ＮＮＮＲＲＫをコードしている全長ＤＮＡ配列を、配列番号２８に示す。
【０３１０】
ＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃで合成し、発現目的用のｐＴ７ベクターにクローニングした。
【０３１１】
環状ＤＮＡ用として大腸菌（E. coli）Ｔ７−Ｓ３０抽出物システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写と翻訳を連動させた（ＩＶＴＴ）によってタンパク質を生成した。
【０３１２】
システインなしの完全な１ｍＭアミノ酸混合物とメチオニンなしの完全な１ｍＭアミノ酸混合物とを等容量で混合して、高濃度のタンパク質を生成するのに必要な作業用アミノ酸溶液を得た。アミノ酸混合物（２．５．０μＬ）、予混合溶液（１０μＬ）、［３５Ｓ］Ｌ−メチオニン（０．５μＬ）およびリファンピシン（２μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）を、プラスミドＤＮＡ（４μＬ、４００ｎｇ／ｍＬ）およびＴ７Ｓ３０抽出物（７．５μＬ）と混合した。合成を、３７℃で９０分間実施して、ＭｓｐＡ−ＮＮＮＲＲＫモノマーおよびダイマーのＩＶＴＴタンパク質２５μＬを生成した。反応後に、サンプルを２５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を破棄した。ペレットをＭＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１００μＬで洗浄し、薄膜サンプル緩衝液２５μＬに再懸濁した。サンプルを、１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを、８０℃で４５分間乾燥させ、Ｘ線フィルムに２時間感光させた。ゲルは２本の異なるバンドを示し、１つがＭｓｐＡダイマーにおよび１つがＭｓｐＡモノマーに相当した。
【０３１３】
モノマーおよびダイマーのオリゴマー化
ダイマーおよび、それとは別にモノマーの発現を、合成脂質小胞の存在下で実施して、オリゴマー化を促進させた。５成分の脂質混合物を使用した（ＰＳ：ＳＭ：ＰＥ：ＰＣ：コレステロールを１０：１０：２０：３０：３０の比率で、２５ｍｇ／ｍＬ）。脂質混合物５０μＬを、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中で、２５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を破棄した。システインなしの完全な１ｍＭアミノ酸混合物とメチオニンなしの完全な１ｍＭアミノ酸混合物とを等容量で混合して、高濃度のタンパク質を生成するのに必要な作業用アミノ酸溶液を得た。膜ペレットを、アミノ酸混合物（１０．０μＬ）、予混合溶液（４０μＬ）、［３５Ｓ］Ｌ−メチオニンおよびリファンピシン（２μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）で再懸濁した。プラスミドＤＮＡ（１６μＬ，４００ｎｇ／ｍＬ）およびＴ７  Ｓ３０抽出物（３０．０μＬ）を添加して、合成を開始した。合成を、３７℃で９０分間実施して、ＩＶＴＴタンパク質１００μＬを生成した。ＩＶＴＴ反応サンプルを遠心分離（２５，０００ｇ、１０分間）し、得られた膜ペレットをＭＢＳＡで洗浄し、７．５％ゲルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルを、ワットマン３Ｍ紙上で、５０℃で３時間乾燥させ、Ｘ線フィルムに２時間感光させた。ゲルは、オリゴマー化したＭｓｐＡダイマーに対する８本の異なるバンドを示し、その全てが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいてオリゴマー化したモノマーより遅く移動した。
【０３１４】
二重層に対するタンパク質精製実験
ダイマーオリゴマー化実験に由来する３本のタンパク質バンドをゲルから切り出し、精製した。オートラジオグラムを型として使用して、バンドを切り出し、緩衝液（２５ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０  １５０〜２００μＬ）に再水和した。紙を取り除き、乳棒を使用してゲル片を破砕した。スラリーを、２５，０００ｘｇで１０分間遠心分離することにより、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を通して濾過した。次いで、モノマーレベルの第３のバンドから得られたタンパク質を、実施例１５に記載の電気生理学実験に使用した。
【実施例１５】
【０３１５】
モノマーからオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１）８とダイマーからオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４との比較
この実施例は、ヘリカーゼを使用してナノ細孔を通る完全なＤＮＡ鎖（配列番号１９および２０（配列およびタグを上に示す））の移動を制御することにより、移行モードでモノマー（配列番号２）からオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１）８細孔とダイマー（配列番号２９）からオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４細孔とを比較する。
【０３１６】
実験方法
緩衝液：４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノ細孔：ＭＳ−（Ｂ１）８；
ＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４
酵素：ヘリカーゼ
電気的な測定は、銀メッキされた１２８ウェルシリコンチップ（形式、直径７５μｍ、深さ２０μｍ、間隔２５０μｍ）を使用して得られた（ＷＯ  ２００９／０７７７３４）。最初に、チップを２０ｍＬエタノール、次いで２０ｍＬ  ｄＨ２Ｏ、そして２０ｍＬエタノールで洗浄した後にＣＦ４プラズマ処理した。次いで、使用されるチップを浸漬被覆によって前処理し、真空密閉し、４℃で貯蔵した。使用前に、チップを最低２０分間、室温で暖めた。
【０３１７】
１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５に溶解した３．６ｍｇ／ｍＬ  １，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（ＤＰｈＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＡＬ、ＵＳＡ）を含む一連のスラグを、チップ全面に０．４５μＬ／秒で通すことによって二重層を形成した。最初に、脂質スラグ（２５０μＬ）をチップ全面に流し、その後空気スラグ１００μＬを流した。次いで、スラグ１５５μＬと脂質溶液１５０μＬをさらに２回、各々を空気スラグ１００μＬで区切って、チップ全体に通した。二重層を形成した後に、チャンバを、流速３μＬ／秒で緩衝液３ｍＬを用いて洗浄した。二重層形成の電気的な記録を、集積キャパシタンス１．０ｐＦで、１０ｋＨｚで実施した。
【０３１８】
モノマーからオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１）８細孔またはダイマーからオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４細孔を使用して、１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に生物学的ナノ細孔の溶液を調製した。＋１８０ｍＶの保持電位を印加し、溶液をチップ表面に流し、細孔に二重層を侵入させた。次いで、サンプリング率と集積キャパシタンスをそれぞれ１０ｋＨｚおよび１．０ｐＦに維持し、印加電位を０まで下げた。
【０３１９】
＋１８０ｍＶの保持電位を印加する制御プログラムを実行した。ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号１９および２０）とヘリカーゼを、５分間プレインキュベーションした。次いで、このプレインキュベーション混合物（ＭｇＣｌ２とＡＴＰを含む）をチップ表面に流して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝１．５ｎＭ、酵素＝１０ｎＭを得る）。実験は、＋１８０ｍＶの定電位で実施された。電流レベルが、酵素結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出された。これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された。
【０３２０】
実験において、ダイマーのオリゴマー化により形成されたベースラインＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４変異体細孔は、モノマーのオリゴマー化により形成されたＭＳ（Ｂ１）８細孔と同程度に効果的に脂質二重層に挿入された（ＭＳ（Ｂ１）８およびＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４の細孔挿入を示す図１６を参照のこと）。モノマーおよびダイマーがオリゴマー化した細孔が、分子モーターとしてのヘリカーゼと合わされる場合、ＤＮＡ鎖が細孔に通されるときに異なる電流レベルを検出することができた。ヘリカーゼ移行モードでの典型的なＤＮＡ移行事象を、モノマーのオリゴマー化により形成されるＭＳ−（Ｂ１）８細孔については図１７に、ダイマーからのオリゴマー化により形成されるＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４細孔については図１８に示す。したがって、ダイマー単位からオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１−Ｂ１）４細孔変異体が、モノマー単位からオリゴマー化されたＭＳ−（Ｂ１）８細孔変異体と同程度に優れた細孔になることが判明した。
【実施例１６】
【０３２１】
５−メチルシトシンとシトシンとを区別するためのＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８変異体ＭｓｐＡ細孔の使用
この実施例は、ＭｓｐＡのＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８変異体細孔を使用して、シトシンとその後成的に修飾された塩基である５−メチルシトシンとを区別できる方法について記載している。この実験に使用したＤＮＡ基質設計を、図１９に示し、次の配列を有する：ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｉｄＳｐ／ＴＴＴＴＴＴＴＴｍＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴｍＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴ（９個のＴヌクレオチドおよび５’末端にＩＤＴ  Ｉｎｔ  ｄスペーサ（ｉｄＳｐ）を持つ配列番号３０である）。ｍＣは、５−メチルシトシンＧＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡ（配列番号３１）および５ＣｈｏｌＴＥＧ／ＴＴＧＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＴＣ（５’コレステリルＴＥＧタグを持つ配列番号３２）を表している。
【０３２２】
材料
図１９に示したＤＮＡ鎖構築物を形成するには、配列番号３０、３１および３２を同時にハイブリダイズさせる必要があった。これは、３つ全ての鎖を同時にプレインキュベートすることによって実施された。
【０３２３】
実験方法
緩衝液：１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ
ナノ細孔：ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ
酵素：ヘリカーゼ
実験の組み立ては、実施例９に記載のとおり実施された。二重層中にＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８の単一細孔を得た後に、ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号３０、３１および３２）ならびにヘリカーゼを緩衝液５０μＬに添加し、５分間プレインキュベートした（ＤＮＡ＝５ｎＭ、酵素＝１００ｎＭ）。電気生理学チャンバのシス区画内の緩衝液９５０μＬにこのプレインキュベーション混合物を添加して、ＭｓｐＡナノ細孔中におけるヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始した（最終濃度ＤＮＡ＝５ｎＭ、酵素＝１００ｎＭを得る）。ヘリカーゼＡＴＰアーゼ活性は、シス区画に二価金属（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）およびＮＴＰ（１ｍＭ  ＡＴＰ）を添加することによって、必要に応じて開始された。実験は、＋１２０ｍＶの定電位で実施された。電流レベルが、酵素結合している状態のＤＮＡに由来する事象として抽出された。これらの事象が索引付けされ、電流レベル、継続時間および事象の変動が記録された。
【０３２４】
実験において、シトシンおよび５−メチルシトシンが、ヘリカーゼの制御下でＭＳ−（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８細孔を通って移行するときに、異なる電流レベルを発生することが観察された（図２０を参照のこと）。したがって、ＭｓｐＡのこのバリアントを使用すれば、シトシンとその後成的に修飾された塩基である５−メチルシトシンとを区別することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2014506575.tif 000043
【図１８】
2014506575.tif 000044
【図１９】
2014506575.tif 000045
【図２０】
2014506575.tif 000046
【配列表】
2014506575000001.app
【国際調査報告】
2014506575.tif 000047
2014506575.tif 000048
2014506575.tif 000049
2014506575.tif 000050
2014506575.tif 000051