(57)【要約】  本発明は、全般的に、改変インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質ならびにそれらの作製方法および使用に関し、インフルエンザ感染の治療および／または予防のためのワクチンなどの免疫原性組成物におけるそれらの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＨＡタンパク質が、前記ＨＡタンパク質から１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する１つまたは複数のアミノ酸変異を含むＶＬＰ。
【請求項２】
前記ＨＡタンパク質がトリインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項３】
前記トリインフルエンザウイルス株がＨ５Ｎ１である、請求項２に記載のＶＬＰ。
【請求項４】
前記トリインフルエンザウイルス株がＨ９Ｎ２である、請求項２に記載のＶＬＰ。
【請求項５】
前記ＨＡタンパク質がブタインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項６】
前記ブタインフルエンザウイルス株がＨ１Ｎ１である、請求項５に記載のＶＬＰ。
【請求項７】
前記ＨＡタンパク質が季節性インフルエンザウイルス株に由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項８】
前記季節性インフルエンザウイルス株がＡ型インフルエンザウイルス株である、請求項７に記載のＶＬＰ。
【請求項９】
前記季節性インフルエンザウイルス株がＢ型インフルエンザウイルス株である、請求項７に記載のＶＬＰ。
【請求項１０】
前記ＨＡタンパク質がパンデミックインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項１１】
前記ＨＡタンパク質がプレパンデミックインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１に記載のＶＬＰ。
【請求項１２】
前記ＨＡタンパク質がヘマグルチニン活性を示す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項１３】
前記ＨＡタンパク質がキメラタンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のアミノ酸変異が、前記ＨＡタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に生じる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のアミノ酸変異が、前記ＨＡタンパク質中のＮＸ（Ｔ／Ｓ）（配列番号１）配列を変化させるものであり、Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｔ／Ｓがスレオニンまたはセリン残基である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項１６】
前記アミノ酸変異が、配列番号２の１７０〜１７２および１８１〜１８３から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する、請求項１５に記載のＶＬＰ。
【請求項１７】
前記ＶＬＰがインフルエンザマトリックス（Ｍ１）タンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項１８】
前記Ｍ１タンパク質がトリインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１７に記載のＶＬＰ。
【請求項１９】
前記トリインフルエンザウイルス株がＨ９Ｎ２である、請求項１８に記載のＶＬＰ。
【請求項２０】
前記トリインフルエンザウイルス株がＨ５Ｎ１である、請求項１８に記載のＶＬＰ。
【請求項２１】
前記トリインフルエンザウイルス株がA/Indonesia/5/05である、請求項２０に記載のＶＬＰ。
【請求項２２】
A/Indonesia/5/05由来の前記Ｍ１タンパク質が配列番号３を含む、請求項２１に記載のＶＬＰ。
【請求項２３】
前記Ｍ１タンパク質がブタインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１７に記載のＶＬＰ。
【請求項２４】
前記ブタインフルエンザウイルス株がＨ１Ｎ１である、請求項２３に記載のＶＬＰ。
【請求項２５】
前記Ｍ１タンパク質が配列番号３の１００〜１０３位に対応するアミノ酸位にアミノ酸残基ＹＫＫＬを含む、請求項１７に記載のＶＬＰ。
【請求項２６】
前記ＶＬＰがインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項２７】
前記ＮＡタンパク質がノイラミニダーゼ活性を示す、請求項２６に記載のＶＬＰ。
【請求項２８】
前記ＶＬＰが、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように変異していないＨＡタンパク質を含む親ＶＬＰよりも、哺乳動物に強力な免疫応答を誘導する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のＶＬＰを含むワクチンであって、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物に、インフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチン。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む、少なくとも１つの有効用量のワクチンを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチンを製剤化する方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のＶＬＰの有効用量を前記製剤に加えることを含み、前記ワクチンが、前記哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法。
【請求項３４】
ＶＬＰを作製する方法であって、
ａ）組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスコンストラクトを構築する工程であって、前記ＨＡタンパク質が、前記ＨＡタンパク質から１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する１つまたは複数のアミノ酸変異を含む工程と、
ｂ）前記組換えバキュロウイルスにより適切な宿主細胞をトランスフェクション、感染、または形質転換し、前記ＨＡタンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）前記宿主細胞においてＶＬＰの形成を可能にする工程と、
ｄ）前記ＶＬＰを含有する感染細胞培地を回収する工程と、
ｅ）前記ＶＬＰを精製する工程と
を含む方法。
【請求項３５】
前記ＨＡタンパク質がトリインフルエンザウイルスに由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記トリインフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記トリインフルエンザウイルスがＨ９Ｎ２である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＨＡタンパク質がブタインフルエンザウイルスに由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記ブタインフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＨＡタンパク質が季節性インフルエンザウイルスに由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記季節性インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記季節性インフルエンザウイルスがＢ型インフルエンザウイルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＨＡタンパク質がキメラタンパク質である、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数のアミノ酸変異が、前記ＨＡタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に生じる、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記アミノ酸変異が、前記ＨＡタンパク質中のＮＸ（Ｔ／Ｓ）（配列番号１）配列を変化させるものであり、Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｔ／Ｓがスレオニンまたはセリン残基である、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記アミノ酸変異が、配列番号２の１７０〜１７２および１８１〜１８３から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１０年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／４２６，３９０号の優先権を主張するものであり、あらゆる目的のためにその内容全体が参照によって本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、改変インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質ならびにそれらの作製方法および使用方法に関し、インフルエンザ感染の治療および／または予防のためのワクチンなどの免疫原性組成物におけるそれらの使用を含む。
【０００３】
電子的に提出された文書ファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出された文書ファイルの内容は、それら全体が参照によって本明細書に援用されるものとする：配列表のコンピュータ読取り可能なフォーマットコピー（ファイル名：NOVV_046_00US_SeqList_ST25.txt、記録した日付：２０１０年１０月２９日、ファイルサイズ：１０キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）ファミリーのメンバーであり、分節されたネガティブセンスＲＮＡゲノムを含有する。インフルエンザビリオンは以下のタンパク質を含む：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス（Ｍ１）、プロトンイオン−チャネルタンパク質（Ｍ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、および非構造タンパク質２（ＮＳ２）。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、およびＭ２タンパク質は、膜結合型であり、一方、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＳ２は、ヌクレオカプシドに結合している。ＨＡタンパク質は、宿主細胞へのウイルス付着の原因となるエンベロープ糖タンパク質であり、ウイルス中和反応および防御免疫のための免疫優勢エピトープの主要な供給源である。したがって、ＨＡタンパク質は、その比較的強固な免疫原性により、予防的なインフルエンザワクチンのための重要な成分と考えられる。
【０００５】
現在認可されている、ＨＡを組み込んだワクチンには、不活化インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスワクチンが含まれる（例えば、非経口投与用の３価ワクチン）。市販のインフルエンザワクチンは、ウイルス全体（ＷＶ）またはサブビリオン（ＳＶ）のウイルスワクチンである。ＷＶワクチンは、無傷の不活化ビリオンを含有し、一方、ＳＶワクチンは、溶媒で処理され、ウイルスの構造タンパク質のほぼすべておよびウイルスエンベロープの一部を含有する。さらに、ＳＶウイルスは、界面活性剤で処理され、さらに精製された場合には、ＨＡ、ＮＡ、およびＮＰタンパク質の凝集物を主として含有する。
【０００６】
ＨＡを含む、弱毒化されたＷＶまたはＳＶインフルエンザワクチンに加えて、いくつかの組換えＨＡ生成物がワクチン候補として開発されている。これらの手法は、インフルエンザＨＡタンパク質の発現、産生、および精製に焦点を当てるものであり、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞を使用する、これらのタンパク質の発現を含む。
【０００７】
最近では、より効果的なワクチンを製造する試みとして、１つまたは複数のさらなるウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザＭ１および／またはＮＡ）と組み合わせてＨＡを発現させ、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質巨大分子粒子を形成させることに注目が集まっている（Pushko et al, 2005, Vaccine 23: 5751-9）。ＶＬＰは、潜在的に感染性がある材料の含有を必要とせずに、ウイルス粒子の全体構造を模倣する。ＶＬＰはウイルスＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを欠損するが、本物のウイルスの３次元構造を保持する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在使用されているＨＡ含有インフルエンザＶＬＰは、予防的な投与の後の忍容性は良好であるが、特定の集団、特に若年者、高齢者、および慢性的な病気に罹患した個体において効力が疑わしいことが示されている。したがって、これらの高度に感染しやすい患者集団での使用のために、インフルエンザＶＬＰワクチンを改良する必要性がある。本発明者らは、特にインフルエンザＶＬＰの文脈の中で発現される場合に、免疫原性の増強を誘導するインフルエンザＨＡタンパク質を開発することにより、この必要性に取り組んだ。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質から１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去すると、驚くべきことに、免疫応答を誘導するＨＡタンパク質の能力が改善されることを観察した。さらに、本発明者らは、改変されて１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去されたＨＡタンパク質が依然としてその高次構造を維持し、かつ予想外のことには、インフルエンザＶＬＰの文脈の中で発現される場合に、Ｍ１およびＮＡなどの他のインフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する能力を保持していることを観察した。したがって、適切な発現系で産生される場合、そのような糖鎖付加部位の改変は、ＨＡベースのインフルエンザワクチン（例えば、インフルエンザＶＬＰワクチン）の免疫原性を全般的に改善することになる。このようにして、この発見によりさらに、ワクチンの１用量当たりに使用されるウイルス抗原の必要量が低減され、同時に、製造されたワクチンの１バッチ当たりのワクチン収率の増加がもたらされる。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質上の位置（すなわち、糖鎖付加部位）から１つまたは複数のグリカンを除去するように改変されたＨＡタンパク質を提供する。このような改変ＨＡタンパク質は、その未改変対応物よりも強力な免疫応答をインフルエンザウイルスによる感染に対して誘導すると期待することができる。除去のために選択されるグリカンは、ＨＡタンパク質のステム領域または球状頭部のいずれかに見出すことができる。特定の実施形態では、除去の標的となる１つまたは複数のグルカンが球状頭部の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に見出される。本明細書に記載の種々の実施形態では、除去されるグリカンはＮ−結合グリカンである（すなわち、アスパラギンまたはアルギニンの側鎖の窒素に結合したグリカン）。
【００１１】
一実施形態では、ＨＡタンパク質は、前記ＨＡタンパク質から１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する１つまたは複数のアミノ酸変異を保有するようにＨＡタンパク質を操作することにより改変される。ＨＡタンパク質から１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する１つまたは複数のアミノ酸変異は、一実施形態では、１アミノ酸変異、または２アミノ酸変異、または３アミノ酸変異、または４アミノ酸変異、または５アミノ酸変異である。一実施形態では、アミノ酸変異は、ステム領域で作製される。別の実施形態では、アミノ酸変異は、球状頭部で作製される。さらに別の実施形態では、アミノ酸変異は、ステム領域および球状頭部領域の両方で作製される。一実施形態では、アミノ酸変異の１つまたは複数は、改変ＨＡタンパク質の球状頭部内の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に生じる。さらなる実施形態では、アミノ酸変異はすべて、改変ＨＡタンパク質の球状頭部内のＲＢＤに生じる。特定の実施形態では、アミノ酸変異の１つまたは複数は、ＨＡタンパク質中のＮＸ（Ｔ／Ｓ）（配列番号１）糖鎖付加コンセンサス配列を変化させることにより作製される。配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｔ／Ｓはスレオニン残基またはセリン残基である。典型的な実施形態では、アミノ酸変異は、配列番号２の１７０〜１７２および１８１〜１８３から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する。
【００１２】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、酵素的処理を介して１つまたは複数のグリカンを除去するように改変される。一実施形態では、ＨＡタンパク質は、エンドグリコシダーゼによる処理を介して１つまたは複数のグリカンを除去するように改変される。他の実施形態では、ＨＡタンパク質は、化学処理を介して１つまたは複数のグリカンを除去するように改変される。特定の実施形態では、１つまたは複数のグリカンは、ヒドラジン様化学反応により化学的に除去される。
【００１３】
本発明の改変インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、インターパンデミック（例えば、通年性または季節性）インフルエンザ株に由来してもよく、あるいはＨＡタンパク質は、パンデミック発生を引き起こす可能性がある株に由来してもよい（すなわち、現在広まっている株のヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、または鳥類被験体に病原性があり、ヒト集団の中に水平感染する可能性があるインフルエンザ株もしくはヒトに病原性のあるインフルエンザ株）。特定の季節およびワクチンに含まれるＨＡ抗原の性質に依存して、インフルエンザウイルスＨＡは、以下の亜型の１つまたは複数に由来することがある：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６。典型的な実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９亜型に由来する。
【００１４】
本明細書に記載の種々の実施形態では、ＨＡタンパク質はトリインフルエンザウイルス株に由来してもよい。一実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はＨ５Ｎ１である。別の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はＨ９Ｎ２である。さらに別の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はＨ７Ｎ３である。さらに別の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はＨ７Ｎ７である。
【００１５】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質はブタインフルエンザウイルス株に由来してもよい。一実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株はＨ１Ｎ１である。別の実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株はＨ１Ｎ２である。さらに別の実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株はＨ３Ｎ２である。
【００１６】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質はヒトインフルエンザウイルス株に由来してもよい。一実施形態では、ヒトインフルエンザウイルス株はＨ１Ｎ１である。別の実施形態では、ヒトインフルエンザウイルス株はＢ株である。
【００１７】
さらなる実施形態では、免疫原性組成物は２つ以上の改変ＨＡタンパク質を含んでもよい。例えば、免疫原性組成物は、トリインフルエンザウイルス株由来の改変ＨＡタンパク質およびブタインフルエンザウイルス株由来の改変ＨＡタンパク質を含むことができる。
【００１８】
一実施形態では、改変ＨＡタンパク質はヘマグルチニン活性を示す。そのような改変ＨＡタンパク質は、赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））に結合し凝集させる能力を保持する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の改変インフルエンザＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。改変インフルエンザＨＡタンパク質を含むそのようなＶＬＰは、未改変インフルエンザＨＡタンパク質を含むそれらのＶＬＰ対応物よりも、インフルエンザウイルスに対して、より強力な免疫応答を誘導すると予測することができる。一実施形態では、改変ＨＡタンパク質は、前記ＨＡタンパク質から１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。さらなる実施形態では、アミノ酸変異の１つまたは複数は、改変ＨＡタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内に生じる。特定の実施形態では、アミノ酸変異の１つまたは複数は、ＨＡタンパク質中のＮＸ（Ｔ／Ｓ）（配列番号１）糖鎖付加コンセンサス配列を変化させることにより作製される。配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｔ／Ｓはスレオニン残基またはセリン残基である。典型的な実施形態では、アミノ酸変異は、配列番号２の１７０〜１７２および１８１〜１８３から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する。
【００２０】
本明細書に記載の種々の実施形態では、本発明のＶＬＰは、限定しないが、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＳ２を含む、さらなるインフルエンザタンパク質を含んでもよい。典型的な実施形態では、本発明のＶＬＰはＭ１、ＮＡ、および改変ＨＡタンパク質を含む。一実施形態では、Ｍ１タンパク質は、配列番号３の１００〜１０３位に対応するアミノ酸位にアミノ酸残基ＹＫＫＬを含む。別の実施形態では、Ｍ１タンパク質はトリインフルエンザウイルス株に由来する。さらに別の実施形態では、Ｍ１タンパク質は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ７Ｎ７から選択されるトリインフルエンザウイルス株に由来する。特定の実施形態では、Ｍ１タンパク質は、トリインフルエンザウイルス株A/Indonesia/5/05（Ｈ５Ｎ１）に由来する。さらに特定の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株A/Indonesia/5/05（Ｈ５Ｎ１）由来のＭ１タンパク質は、配列番号３を含む。別の実施形態では、Ｍ１タンパク質はブタインフルエンザウイルス株に由来する。さらに別の実施形態では、Ｍ１タンパク質は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２から選択されるブタインフルエンザウイルス株に由来する。特定の実施形態では、Ｍ１タンパク質は、ブタインフルエンザウイルス株A/California/04/09（Ｈ１Ｎ１）に由来する。さらに特定の実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株A/California/04/09（Ｈ１Ｎ１）由来のＭ１タンパク質は、配列番号４を含む。
【００２１】
本発明はまた、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物に、インフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法であって、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された１つまたは複数のＨＡタンパク質を含む少なくとも１つの有効用量のワクチンを投与することを含む方法を提供する。典型的な実施形態では、本発明は、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物に、インフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法であって、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された１つまたは複数のＨＡタンパク質を含むインフルエンザＶＬＰを含む少なくとも１つの有効用量のワクチンを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、前記方法は、動物に前記ワクチンを、経口的に、非経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内で、静脈内に、または皮下に投与することを含む。
【００２２】
本発明はまた、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチンを製剤化する方法であって、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された１つまたは複数のＨＡタンパク質を含む有効用量のワクチンを、前記製剤に加えることを含む方法を提供する。典型的な実施形態では、本発明は、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチンを製剤化する方法であって、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された１つまたは複数のＨＡタンパク質を含むインフルエンザＶＬＰを含む有効用量のワクチンを、前記製剤に加えることを含む方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つのさらなる構造タンパク質をコードする１つまたは複数の組換えコンストラクトを構築することにより、インフルエンザ由来のＶＬＰを作製する方法を提供する。典型的な実施形態では、ＶＬＰは、Ｍ１、ＮＡ、および１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質を含む。一実施形態では、１つまたは複数の組換えコンストラクトは、適切な宿主細胞をトランスフェクション、感染、または形質転換させるために使用される。典型的な実施形態では、組換えコンストラクトはバキュロウイルスコンストラクトである。宿主細胞は、改変ＨＡタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、ＶＬＰが宿主細胞の中に形成される。インフルエンザＶＬＰを含有する感染細胞培地が回収され、ＶＬＰが精製される。本明細書に記載の種々の実施形態では、宿主細胞は真核細胞であってよく、典型的な実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。
【００２４】
本発明はまた、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された１つまたは複数のＨＡタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つのさらなる構造タンパク質を含むインフルエンザＶＬＰを含有する原体を製剤化する方法を特色とする。一実施形態では、改変ＨＡタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つの構造タンパク質をコードする１つまたは複数の組換えコンストラクトは、適切な宿主細胞をトランスフェクション、感染、または形質転換させるために使用される。典型的な実施形態では、組換えコンストラクトはバキュロウイルスコンストラクトである。宿主細胞は、改変ＨＡタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも１つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、ＶＬＰが宿主細胞の中に形成される。インフルエンザＶＬＰは単離および精製され、原体はこのインフルエンザＶＬＰを含有して製剤化される。原体はさらにアジュバントを含んでもよい。加えて、本発明は、インフルエンザＶＬＰを含有するそのような原体を脂質小胞、すなわち、非イオン性脂質小胞と混合することにより、薬物製品を製剤化する方法を提供する。したがって、インフルエンザＶＬＰは、感染細胞から被包粒子として出芽することができる。出芽したインフルエンザＶＬＰは、原体として、超遠心分離またはカラムクロマトグラフイーにより単離および精製し、ワクチンなどの薬物製品として、単独でまたはNovavax, Inc.製品であるNovasomes(登録商標)などのアジュバントと共に製剤化することができる。免疫学的効果を増強するNovasomes（登録商標）は、米国特許第４，９１１，９２８号にさらに詳細に記載されており、これは参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】A/Indonesia/G5/2005（Ｈ５Ｎ１）ＨＡ１配列の配列を示す図である。アミノ酸残基１７０〜１７２および１８１〜１８３のグリカン位置を図示する。
【図２】アミノ酸位１７０〜１７２（レーン４〜６）、アミノ酸位１８１〜１８３（レーン２）、またはアミノ酸位１７０〜１７２および１８１〜１８３の両方（レーン３）で、糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質を含むA/Indonesia/05/2005（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
定義：
本明細書で使用される用語「抗原製剤」または「抗原組成物」は、脊椎動物、特に鳥類または哺乳動物に投与された場合、免疫応答を誘導する調製物を指す。
【００２７】
本明細書で使用される用語「アジュバント」は、製剤において特定の免疫原（例えば、ＶＬＰ）と組み合わせて使用された場合、結果として生ずる免疫応答を増強、またはそうでなければ改変もしくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾には、抗体および細胞性免疫応答のいずれかまたはその両方の強化またはその特異性の拡大が含まれる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低減または抑制を意味することもある。
【００２８】
本明細書で使用される用語「トリインフルエンザウイルス」は、主として鳥類に見出されるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、トリインフルエンザウイルスは、ヒトからヒトに感染または伝染することがある。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザパンデミック、すなわちヒトの罹患および／または死亡を引き起こす可能性がある。パンデミックは、インフルエンザウイルスの新株（ヒトが自然免疫を有していないウイルス）が出現し、個々の場所を越えて、おそらく地球全体に伝播し、一度に多くのヒトに感染した場合に起こる。
【００２９】
本明細書で使用される用語「キメラタンパク質」は、単一高分子（例えば、融合タンパク質）に少なくとも２つの異種タンパク質が連結しているコンストラクトを指す。
【００３０】
本明細書で使用される「有効用量」は、概して、免疫の誘導、インフルエンザウイルス感染の予防および／もしくは寛解、またはインフルエンザ感染の少なくとも１つの症状の軽減、ならびに／またはさらなる用量のＶＬＰ効力の増強に十分な本発明のＶＬＰ量を指す。有効用量は、インフルエンザ感染の発症を遅延または最小限にするのに十分なＶＬＰ量を指すこともある。有効用量はまた、インフルエンザ感染の治療または管理において治療的有益性を提供するＶＬＰ量を指すこともある。さらに、有効用量は、単独でまたは他の療法と組み合わせて、インフルエンザ感染の治療または管理において治療的有益性を提供する本発明のＶＬＰに関する量である。有効用量はまた、インフルエンザウイルスへのその後の曝露に対する、被験体（例えば、ヒト）自体の免疫応答を増強するのに十分な量であってもよい。免疫のレベルは、例えば、中和分泌および／または血清抗体の量の測定、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着、またはマイクロ中和実験アッセイによりモニターすることができる。ワクチンの場合には、「有効用量」は、疾患を予防するかまたは症状の重症度を軽減する量である。
【００３１】
本明細書で使用される用語「インフルエンザＶＬＰ」は、少なくとも１つのインフルエンザタンパク質を含むＶＬＰを指す。前記ＶＬＰは、さらなるインフルエンザタンパク質および／または非インフルエンザタンパク質を含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「ヘマグルチニン」（または「ＨＡ」または「ＨＡタンパク質」または「ヘマグルチニンタンパク質」）は、そのアミノ酸配列がＨＡの少なくとも１つの特有な配列を含むポリペプチドを指す。インフルエンザ単離物に由来する、多種多様のＨＡ配列が当技術分野で公知である；実際、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）は、本願出願時に９０００を超えるＨＡ配列を含んだデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/flu.html）を保持している。当業者は、このデータベースを参照しながら、ＨＡポリペプチド全般、および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６ポリペプチド；または特定の宿主、例えばトリ、ラクダ、イヌ、ネコ、シベット、エンバイロンメント（environment）、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、イワツバメ、ブタ、トラ、クジラ等の感染を媒介するＨＡ）に特有な配列を容易に同定することができる。
【００３３】
本明細書で使用される用語「ヘマグルチニン活性」は、ＨＡを含有するタンパク質、ＶＬＰ、またはそれらの一部が赤血球(red blood cell)（赤血球((erythrocyte)）に結合し凝集させる能力を指す。
【００３４】
本明細書で使用される用語「Ｎ−結合グリカン」および「Ｎ−結合オリゴ糖」は、Ｎ−グリコシド結合によりコンジュゲート（例えば、ＨＡ）に共有結合するオリゴ糖を指す。
【００３５】
本明細書で使用される用語「ノイラミニダーゼ活性」は、ＮＡを含有するタンパク質、ＶＬＰ、またはそれらの一部が、フェチュインなどのタンパク質を含めた基質からシアル酸残基を切断する酵素活性を指す。
【００３６】
本明細書で使用される用語「感染因子」は、脊椎動物に感染を引き起こす微生物を指す。通常、この生物はウイルス、細菌、寄生生物、および／または真菌類である。この用語はまた、同じ感染因子の異なる抗原変異体を指す。
【００３７】
本明細書で使用される用語「免疫刺激物質」は、生体自体の化学伝達物質（サイトカイン）を介して免疫応答を増強する化合物を指す。これらの分子は、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；およびマクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等の他の免疫刺激分子など、免疫刺激性、免疫増強性、および炎症促進性の活性を有する種々のサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインを含む。免疫刺激分子は、インフルエンザＶＬＰと同じ製剤で投与することも、別個に投与することもできる。このタンパク質またはこのタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを免疫刺激効果をもたらすために投与することができる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「免疫」は、脊椎動物の免疫系の誘導を指し、前記誘導により、前記脊椎動物の少なくとも１つの感染症状の予防、寛解、および／または軽減が得られる。免疫はまた、本発明のＶＬＰが脊椎動物に投与され、前記ＶＬＰがインフルエンザウイルスのＨＡに対する免疫応答を誘導した場合における、４０以上の赤血球凝集阻止（ＨＩ）力価を指すこともある。
【００３９】
本明細書で使用される用語「受容体結合ドメイン」（または「ＲＢＤ」）は、ＨＡのシアル酸結合部位を含む約１４８個のアミノ酸ドメインを指す。ＨＡ受容体結合ドメインのサブ領域は、ＲＢＤ−Ａ（「頭頂」）ドメインとして知られており、インフルエンザ株A/South Carolina/1/1918由来のＨＡに対して確立された番号付けに基づくと、アミノ酸１３１〜１４３、１７０〜１８２、２０５〜２１５、および２５７〜２６２内に含有される(Chih-Jen Wei et al, 2010, Set Transl Med 2: 24ra21)。
【００４０】
本明細書で使用される用語「季節性インフルエンザウイルス」は、世界の国立インフルエンザセンター（National Influenza Centers）が実施した疫学調査に基づいて、所与のインフルエンザ季節の間、ヒト集団内に蔓延していると判断されたインフルエンザウイルス株を指す。これらの疫学的調査および単離されたインフルエンザウイルスの一部は、４つの世界保健機構（World Health Organization）（ＷＨＯ）の参考検査室（その１つはアトランタ（Atlanta）の疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）（ＣＤＣ）にある）の１つに詳細な試験のために送られる。これらの検査室では、現在のワクチンに対して作られた抗体が、広まっているウイルスおよび新規のインフルエンザウイルスにどの程度良好に反応するかを試験する。この情報は、インフルエンザ活性に関する情報と共にまとめられ、米国食品医薬品局（Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）の諮問委員会およびＷＨＯの会議に提示される。これらの会議により、次の秋および冬のためのインフルエンザワクチンに入れる３種のウイルス（インフルエンザＡ型ウイルスの２つの亜型および１つのインフルエンザＢ型ウイルス）が選択される。この選択は、北半球に対しては２月に、南半球に対しては９月に行われる。通常、ワクチンの中の３種のウイルス株の１つまたは２つが毎年変更される。
【００４１】
本明細書で使用される用語「ブタインフルエンザウイルス」は、主としてブタで見出されるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、ブタインフルエンザウイルスは、ヒトからヒトに感染または伝染することがある。ヒトに感染するブタインフルエンザウイルスは、インフルエンザパンデミック、すなわちヒトの罹患および／または死亡を引き起こす可能性がある。パンデミックは、インフルエンザウイルスの新株（ヒトが自然免疫を有していないウイルス）が出現し、個々の場所を越えて、おそらく地球全体に伝播し、一度に多くのヒトに感染した場合に起こる。
【００４２】
本明細書で使用される用語「ワクチン」は、死んだ病原体もしくは弱体化した病原体の調製物、またはその病原体に対する抗体形成もしくは免疫を誘導するために使用される誘導抗原決定基の調製物を指す。ワクチンは、疾患、例えばインフルエンザウイルスが原因のインフルエンザに対する免疫を備えさせるために投与される。加えて、用語「ワクチン」は、防御免疫、すなわち、感染に付随した疾患の重症度を防止または軽減する免疫をもたらすために脊椎動物に投与される免疫原（例えば、ＶＬＰ）の懸濁液または溶液も指す。本発明は、免疫原性があり、感染に付随した疾患に対する防御作用を提供しうるワクチン組成物を提供する。
【００４３】
本明細書で使用される用語「脊椎動物」または「被験体」または「患者」は、限定しないが、ヒトならびにチンパンジーなどの非ヒト霊長類および他の類人猿およびサル類を含む他の霊長類を含めた、脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどのペット哺乳動物；マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなど、ペット鳥類、野生鳥類、および狩猟鳥類を含む鳥類等もまた非限定例である。用語「哺乳動物」および「動物」はこの定義に含まれる。成熟個体および新生個体の両方が包含されるように意図される。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの性状でウイルスに類似しているが、感染性があると実証されていない構造を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保持しない。一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠損し、そのため非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は、多くの場合、異種発現により多量に産生することができ、かつ容易に精製することができる。
【００４５】
インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）：
インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子（particular）の膜に埋め込まれた、２種の糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する脂質膜エンベロープを特徴とするＲＮＡウイルスである。１６種の公知ＨＡ亜型および９種のＮＡ亜型があり、種々のインフルエンザ株は、その株のＨＡ亜型およびＮＡ亜型の数に基づいて命名される。アミノ酸配列同一性および結晶構造の比較に基づいて、ＨＡ亜型は２つのメイングループと４つのより小さなクレードに分類された。異なるＨＡ亜型は、必ずしも強固なアミノ酸配列同一性を共有していないが、異なるＨＡ亜型の全体的な３次元構造は互いに類似しており、分類目的に使用することができるいくつかの微妙な差異がある。例えば、中央のα−ヘリックスに対する膜遠位サブドメインの特定の配向は、ＨＡ亜型を決定するために一般に使用される構造特性の１つである（Russell et al., Virology, 325 :287, 2004）。
【００４６】
ＨＡはホモ三量体の内在性膜糖タンパク質である。ＨＡは円柱形状であり、球状頭部とステム領域から構成された外部ドメインを含有する。ＨＡの球状頭部およびステム領域は両方とも、このタンパク質の機能特性に影響を及ぼしうるＮ−結合オリゴ糖を保持する。例えば、１つまたは複数のステムオリゴ糖を欠損するＨＡ変異体は細胞融合能の低下を示し、これによって、ステム領域のオリゴ糖が細胞融合に必要なＨＡの準安定形態を維持するという結論が得られた（Ohuchi et al., 1997, J. Virology 71: 3719-25）。さらに、ＨＡのタンパク質分解活性部位の近傍にグリカンが存在すると、切断が調節され、インフルエンザウイルスの病原性が影響を受けることが示されている（Deshpande et al, 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84: 36-40）。さらに、インフルエンザウイルスＨＡの糖鎖付加は、タンパク質分解から保護するために重要である（Schwartz et al., 1976, J. Virology 19: 782-91）。
【００４７】
グリカンの構造および組成がどのようにＨＡ活性に影響を及ぼすかに関してはほとんど知られていないが、ＨＡのコンフォメーションの安定化に及ぼすグリカンの役割、およびＨＡが他のインフルエンザタンパク質と相互作用する能力に対するグリカンの影響が示唆されている（Wilson et al, 1981, Nature 289: 373-8）。実際に、球状頭部領域から１つまたは複数のグリカンが欠損しているウイルスの成長が、ＭＤＣＫ細胞および有胚鶏卵では損なわれていることが見出された（Wagner et al, 2001, Intl Cong Series 1219: 375-82）。これは、変異ＨＡの受容体親和性が増強された結果、宿主細胞由来の子ウイルスの放出が制限されたことに主に起因する。Ｉｄ。さらに、グリカンがＨＡステムから除去された場合には、得られるウイルスは細胞培養および鶏卵においてテンペレート感受性な成長を示した。これらのウイルスはｐＨ安定性が低下しており、これによって適切なコンフォメーションにＨＡタンパク質を維持するためにグルカンが重要であることが指摘される。
【００４８】
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質：
本発明者らは、１つまたは複数のグリカンが欠失しているＨＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）が作製可能であり、しかも驚くべきことに、ＨＡおよびＮＡの活性および効力を保持することを見出した。ＨＡのコンフォメーションおよび安定性の維持におけるグリカンの主張される役割が具体的に想定される場合、このような結果は予想外である。さらに、改変ＨＡタンパク質は、単独でまたはインフルエンザＶＬＰの文脈の中で発現される場合、それらの未改変対応物と比較して、免疫原性が増強されている。したがって、一態様では、本出願は、改良ワクチンの作製を容易にしうる、免疫原性が増大した改変ＨＡタンパク質の生成について記載する。
【００４９】
本発明によると、ＨＡタンパク質上の位置（すなわち、糖鎖付加部位）からグリカンを除去する、任意の数の改変をＨＡタンパク質に施すことができ、一実施形態では、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力を増大させるために、複数のグリカン（例えば、２、３、４、５、または６個のグリカン）を除去することができる。典型的な実施形態では、除去のために選択される１つまたは複数のグリカンはＮ−結合グリカンである。さらなる実施形態では、Ｎ−結合グリカンのみが除去される。このような改変は、操作された点変異、フレームシフト変異、欠失、または挿入の結果として起こりうるものであり、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７以上）の点変異が好ましい。別の実施形態では、１つまたは複数のグリカンは、酵素的または化学的処理を介して除去することができる。例えば、ＨＡタンパク質は、エンドグリコシダーゼ処理を介して１つまたは複数のＮ−結合グリカンを除去するように改変することができる。他の実施形態では、Ｎ−結合グリカンは、ヒドラジン様化学反応により化学的に除去することができる。
【００５０】
一態様では、１つまたは複数の糖鎖付加部位は、ＨＡタンパク質をコードする核酸配列を変異させることにより、前記ＨＡタンパク質から除去することができる。１つまたは複数のグリカンを除去するための変異は、当業者に公知の任意の方法論も使用して、本発明のＨＡタンパク質に導入することができる。例えば、コード化ＤＮＡ分子に沿って、任意の決定部位におけるあらゆる可能な種類の塩基対変化を可能にするオリゴヌクレオチド定方向変異を使用して、改変ＨＡタンパク質を作製することができる。一般に、この手法には、目的のＨＡタンパク質をコードする一本鎖ヌクレオチド配列に相補的な（１つまたは複数のミスマッチを除いて）オリゴヌクレオチドをアニールすることが含まれる。次いで、このミスマッチオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、一方の鎖の配列に所望の変化を含有する二本鎖ＤＮＡ分子が生成する。例えば、配列中のこの変化により、アミノ酸の欠失、置換、または挿入を得ることができる。次いで、二本鎖ポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに挿入することができ、したがって変異または改変ポリペプチドを産生することができる。上記オリゴヌクレオチド定方向変異は、例えばＰＣＲを介して実行することができる。
【００５１】
本発明の組成物および方法で使用されるＨＡタンパク質には、インフルエンザウイルス感染に対する免疫原性応答を刺激する能力を有する任意のＨＡタンパク質が含まれる。このようなＨＡタンパク質としては、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６が挙げられる。当業者が理解するように、糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質は、当技術分野でルーチン的で周知の組換え技術または遺伝子工学技術により得ることができる。改変ＨＡタンパク質は、例えば、部位特異的またはランダム変異誘発により目的のＨＡタンパク質をコードする遺伝子を変異させて得ることができる。そのような変異としては、点変異、欠失変異、および挿入変異を挙げることができる。例えば、１つまたは複数の点変異（例えば、１つまたは複数の異なるアミノ酸による、１つまたは複数のアミノ酸の置換）を使用して、本発明の改変ＨＡタンパク質を構築することができる。
【００５２】
本発明は、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変され、インフルエンザに対する免疫応答を刺激する能力が増大したことを示す、野生型ＨＡタンパク質とアミノ酸レベルで５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である相同ＨＡタンパク質をさらに含む。本発明はまた、上記に記載のＨＡタンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００５３】
本発明はまた、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のアミノ酸残基を含み、かつ改変ＨＡタンパク質に付随した１つまたは複数の活性を保持する改変ＨＡタンパク質の断片を含む。このような断片は、当技術分野でルーチン的で周知の組換え手法を使用する欠失変異により、またはいくつかの周知のタンパク質分解酵素のいずれかを使用して目的のＨＡタンパク質を酵素消化することにより得ることができる。本発明は、上記に記載の改変ＨＡタンパク質およびＨＡタンパク質断片をコードする核酸分子をさらに含む。
【００５４】
一態様では、標的アミノ酸置換は、目的のＨＡタンパク質の１つまたは複数の糖鎖付加部位で行われる。この態様に従う一実施形態では、ＮＸ（Ｔ／Ｓ）のＮ−結合糖鎖付加コンセンサス配列における１つまたは複数のアミノ酸を変異させて、糖鎖付加シグナル配列を消失させる。このような変異により、Ｎ−結合糖鎖付加が全般的に防止され、前記ＨＡタンパク質の免疫原性が改善されることになる。
【００５５】
目的のＨＡタンパク質のＮ−結合糖鎖付加部位を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、NetNGlyc 1.0サーバー（デンマーク工科大学（Technical University of Denmark））を使用して、ＮＡのＮ−結合糖鎖付加部位を予測することができる。このソフトウェアは、マッチさせる配列を公知のＮ−結合糖鎖付加部位のデータベースと比較し、糖鎖付加可能スコアを提示する。０．５を超えるスコアが糖鎖付加の可能性がある部位を示し、０．５未満が可能性の低い部位を示す。次いで、NetNGlyc 1.0ソフトウェアを使用して同定された推定上の糖鎖付加部位について、天然のインフルエンザウイルス中のマッチさせる配列を対象として、ＢＬＡＳＴを使用してＮＣＢＩタンパク質データベースを検索することができる。
【００５６】
一実施形態では、１つまたは複数の糖鎖付加部位が球状頭部領域から除去される。別の実施形態では、１つまたは複数の糖鎖付加部位がステム領域から除去される。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の糖鎖付加部位が球状頭部領域およびステム領域の両方から除去される。典型的な実施形態では、シアル酸結合部位を保有する約１４８個のアミノ酸ドメインである受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）として知られる領域にある、球状頭部の上部から１つまたは複数の糖鎖付加部位が除去される。受容体結合部位（ＲＢＳ）としても知られるＲＢＤは、各ＨＡモノマーの膜遠位末端にあり、シアル酸に対するその特異性および隣接ガラクトース残基へのその結合の性質が、宿主域制限を決定する。特定の実施形態では、１つまたは複数の糖鎖付加部位がＲＢＤ−Ａとして知られるＲＢＤのサブ領域から除去される。ＲＢＤ−Ａ（「頭頂」ドメイン）は、インフルエンザ株A/South Carolina/1/1918由来のＨＡに対して確立された番号付けに基づくと、アミノ酸１３１〜１４３、１７０〜１８２、２０５〜２１５、および２５７〜２６２内に含有される（GenBank受託番号AF117241）（Chih-Jen Wei et aL., 2010, Sci. Transl Med 2: 24ra21）。
【００５７】
一実施形態では、アミノ酸置換は、ＲＢＤ中の１つまたは複数のＮＸ（Ｔ／Ｓ）のＮ−結合糖鎖付加コンセンサス配列で行われる。配列中、Ｘは任意のアミノ酸であり、（Ｔ／Ｓ）はスレオニン残基またはセリン残基のいずれかである。典型的な実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、A/Indonesia/5/05のＨＡタンパク質（配列番号２）の１７０〜１７２および１８１〜１８３から選択されるアミノ酸残基に対応する位置で行われる。したがって、これらの位置にある天然アミノ酸の１つまたは複数は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む任意の他のアミノ酸で置換することができる。インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力が増大したことを示すＨＡタンパク質の具体例は、（１）１７２位のスレオニンがアラニンで置換され、かつ／または（２）１８３位のスレオニンがアラニンで置換されたＨＡタンパク質である。本出願の開示を習得した当業者ならば理解するように、A/Indonesia/5/05のＨＡタンパク質（配列番号２）のアスパラギン残基１７０および／または１８１に対応する位置でアミノ酸変異を行うと、同様の結果を得ることができる。
【００５８】
本発明によると、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激するＨＡタンパク質の能力を増大させるために、１つまたは複数の変異を目的の任意のＨＡタンパク質の中に行うことができる。そのような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および、挿入が含まれる。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を生じる１つまたは複数の点変異が、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力が増大したＨＡタンパク質を産生するために使用される。本発明の典型的な実施形態では、目的の他のＨＡタンパク質に所望の結果をもたらすために、A/Indonesia/5/05（配列番号２）のＨＡタンパク質のＮ１７０位（例えば、Ｎ１７０Ｄ）、Ｔ１７２位（例えば、Ｔ１７２Ａ）、Ｎ１８１位（例えば、Ｎ１８１Ｄ）、および／またはＴ１８３位（例えば、Ｔ１８３Ａ）と同等または対応する位置に１つまたは複数の変異を行うことができる。
【００５９】
本明細書で同定されたＨＡタンパク質（例えば、配列番号２のA/Indonesia/5/05のＨＡ）の対応する位置は、当業者によって他のＨＡタンパク質について容易に同定することができる。したがって、本出願に記載の指定領域およびアッセイが与えられれば、目的の任意のＨＡタンパク質において、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力を増大させるであろう１つまたはいくつかの改変を当業者は行うことができる。
【００６０】
好ましい実施形態では、改変ＨＡタンパク質は、野生型のＨＡタンパク質と比較して、Ｎ１７０、Ｔ１７２、Ｎ１８１、および／またはＴ１８３に対応する位置から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、改変ＨＡタンパク質は、それぞれの野生型ＨＡタンパク質と比較して、他の位置でさらなるアミノ酸置換を有する。したがって、改変ＨＡタンパク質は、それぞれの野生型ＨＡと比較して、他の位置に少なくとも約２、３、４、５、６、７以上の異なる残基を有することがある。当業者が認識するように、アミノ酸置換を有しうるさらなる位置の数は、変異体を生成するために使用される野生型ＨＡタンパク質に依存することになる。例えば、Ｘ３１インフルエンザ株由来のＨＡは、７つのＮ−結合糖鎖付加部位を示す（Ermonval et al, 2000, Glycobiology 10: 77-87）。したがって、場合によっては、７以上ほどの異なるＮ−グリカンが標的アミノ酸置換を介して除去されうる。
【００６１】
上記のように、別の実施形態では、１つまたは複数のグリカンを酵素的処理によって除去することができる。例えば、エンドグリコシダーゼによる処理を介して１つまたは複数のＮ−結合グリカンを除去するように、ＨＡタンパク質を改変することができる。本明細書で使用される場合、「エンドグリコシダーゼ」は、オリゴ糖を含む基質から糖成分を顕著に切断することができる酵素またはその機能性部分、誘導体および／もしくはアナログを指すために使用される。糖タンパク質（例えば、ＨＡ）または糖脂質からオリゴ糖を放出させるそのような酵素の使用は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第７，６３２，６５４号に記載されている。Ｎ−グリカンの除去に適したエンドグリコシダーゼの例としては、エンドグリコシダーゼＤ、Ｆ、Ｆ１、Ｆ２、およびＨが挙げられる。
【００６２】
他の実施形態では、１つまたは複数のＮ−結合グリカンは化学的に除去することができる。一実施形態では、化学反応は１つまたは複数のヒドラジン様試薬により媒介される。ヒドラジンおよびヒドラジン様試薬を使用する、Ｎ−結合グリカン放出のための方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第５，５３９，０９０号に見出される。手短に言えば、ヒドラジン試薬の作用（すなわち、ヒドラジン分解）にＨＡを供する前に、好ましくは、ＨＡタンパク質およびヒドラジン試薬を以下のように調製する。複合糖質は、例えば、適切なシステムでの透析、ゲル濾過、またはクロマトグラフィーにより、基本的に無塩にする。いったん無塩にしたならば、ＨＡは、例えば凍結乾燥により基本的に無水にし、少なくとも、２５℃で２５ミリバールの凍結乾燥条件下で平衡に達成するまで水分を減少させる。ヒドラジン試薬の水分も同様に重要であり、４％ｖ／ｖを超えるべきでない。したがって、ヒドラジン試薬の乾燥は、数多くの報告された方法の１つによって達成することができるが、無水ヒドラジン試薬のほとんどの商品は適切である。次いで、適切なヒドラジン試薬を気密容器中の適切に調製された試料に加える。ＨＡとヒドラジン試薬との間の反応は、例えば温度上昇によるエネルギー投入により微視的または巨視的に開始させることができる。エネルギー投入のいずれの方法についても、反応の最適条件は種々の実験的手法から推定することができる。本開示では、反応開始の好ましい方法は、定常状態への温度の上昇によるものである。
【００６３】
さらに他の実施形態では、Ｎ−結合グリカンを除去するためにアルカリ性溶液を使用することができる。Ｎ−グリカンをコンジュゲートに結合させるＮ−グリコシド結合は、アルカリ性で不安定であり、したがって、Ｎ−グリカン放出のためにアルカリ性溶液を使用することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第５，５３９，０９０号明細書に記載のように、１００℃で４時間の１Ｍ  ＮａＯＨとのインキュベーションの使用が成功している。
【００６４】
本明細書に記載の方法および組成物で使用するのに適したＨＡタンパク質をコードする遺伝物質の「供給源」として種々のインフルエンザウイルス株が利用できることが理解される。本明細書に記載の種々の実施形態では、本発明の改変ＨＡタンパク質は、当技術分野で公知のインフルエンザ単離物に由来する公知のＨＡ配列の任意のものから誘導することができる。例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology information）（ＮＣＢＩ）は、公知のＨＡ配列のデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/gmomes/FLU/flu.html）を維持している。加えて、インフルエンザＨＡ野生型配列またはＭＤＣＫ細胞および鶏卵に継代の配列についてのデータベースが、Global Initiative on Sharing All Influenza Database (GISAID) EpiFluデータベースから入手可能である。当業者は、これらのデータベースを参照しながら、ＨＡポリペプチド全般、および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６ポリペプチド）；または特定の宿主（例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ブタ、トラ、クジラ等）の感染を媒介するＨＡに特有な配列を容易に同定することができる。本明細書に記載の方法により改変可能なそのようなＨＡタンパク質を含む亜型の例としては、限定しないが、A/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）、A/Indonesia/5/05（Ｈ５Ｎ１）、A/chicken/New York/1995、A/herring gull/DE/677/88（Ｈ２Ｎ８）、A/Texas/32/2003、A/mallard/MN/33/00、A/duck/Shanghai/1/2000、A/northern pintail/TX/828189/02、A/Turkey/Ontario/6118/68（Ｈ８Ｎ４）、A/shoveler/Iran/G54/03、A/chicken/Germany/N/1949 （Ｈ１０Ｎ７）、A/duck/England/56（Ｈ１１Ｎ６）、A/duck/Alberta/60/76（Ｈ１２Ｎ５）、A/Gull/Maryland/704/77（Ｈ１３Ｎ６）、A/Mallard/Gurjev/263/82、A/duck/Australia/341/83（Ｈ１５Ｎ８）、A/black-headed gull/Sweden/5/99（Ｈ１６Ｎ３）、B/Lee/40、C/Johannesburg/66、A/PuertoRico/8/34（Ｈ１Ｎ１）、A/Brisbane/59/2007（Ｈ１Ｎ１）、A/Solomon Islands 3/2006（Ｈ１Ｎ１）、A/Brisbane 10/2007（Ｈ３Ｎ２）、A/Wisconsin/67/2005（Ｈ３Ｎ２）、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/4/2006、A/Singapore/1/57（Ｈ２Ｎ２）、A/Anhui/1/2005（Ｈ５Ｎ１）、A/Vietnam/1194/2004（Ｈ５Ｎ１）、A/Teal/HongKong/W312/97（Ｈ６Ｎ１）、A/Equine/Prague/56（Ｈ７Ｎ７）、A/HongKong/1073/99（Ｈ９Ｎ２）が挙げられる。本発明の方法により改変可能なＨＡタンパク質の典型的なリストを、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０２３９６１０号に見出すことができる。一実施形態では、目的の改変のために選択されるＨＡ配列は、鶏卵に適合したＨＡ配列である。鶏卵に適合したＨＡ配列を入手および同定する方法は当技術分野で公知である（Robertson et al, 1991, J. Gen. Virology 72: 2671-7）。
【００６５】
さらに、感染体由来のタンパク質に融合した改変インフルエンザＨＡタンパク質の膜貫通ドメインおよび／または細胞質尾部を含むキメラＨＡタンパク質が本発明の範囲内に包含される。別の実施形態では、改変インフルエンザＨＡタンパク質の膜貫通ドメインおよび／または細胞質尾部は、膜貫通ドメインを通過して約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０から約５０アミノ酸までＮ末端またはＣ末端から伸長し、他の感染因子由来の前記タンパク質に融合する。感染因子はウイルス、細菌、真菌類、および／または寄生生物であってもよい。前記感染因子タンパク質が由来しうるウイルスの非限定例としては、以下のものがある：コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳを引き起こす因子）、肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ３、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス１、２、６、および７、サイトメガロウイルス、帯状疱疹、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コクサッキーウイルス、ピコマ（picoma）ウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス（複数の型）、アデノウイルス（複数の型）、パラインフルエンザウイルス（複数の型）、トリインフルエンザ（種々の型）、船積み熱ウイルス、西部および東部ウマ脳脊髄炎（Western and Eastern equine encephalomyelitis）、日本脳脊髄炎(Japanese encephalomyelitis)、鶏痘、狂犬病ウイルス、遅延型脳ウイルス（slow brain virus）、ラウス肉腫ウイルス、パポバウイルス科(Papovaviridae)、パルボウイルス科(Parvoviridae)、ピコマウイルス科（Picomaviridae）、ポックスウイルス科(Poxviridae)（痘瘡またはワクチニアなど）、レオウイルス科(Reoviridae)（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科(Retroviridae)（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、トガウイルス科(Togaviridae)（例えば、ルビウイルス）、ニューカッスル病ウイルス、ウェストナイル熱ウイルス、ダニ媒介脳炎(Tick borne encephalitis)、黄熱病、チクングニアウイルス、およびデング熱ウイルス（すべての血清型）。
【００６６】
改変ＨＡタンパク質を含むワクチン：
本出願は、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたインフルエンザＨＡタンパク質を提供する。本明細書に記載の種々の態様では、本発明の改変ＨＡタンパク質は、インフルエンザ感染の治療および／または予防のためのワクチンなどの免疫原性組成物において有用性がある。
【００６７】
脊椎動物に中和抗体を与えることによりインフルエンザ感染を予防することができるので、改変インフルエンザＨＡタンパク質を含むワクチンは、脊椎動物に投与した場合に、インビボで中和抗体を誘導することができる。改変インフルエンザＨＡタンパク質は、インフルエンザ感染の予防および／または治療に好ましくは使用される。したがって、この開示の別の態様は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発するための方法に関する。この方法は、改変インフルエンザＨＡタンパク質を含有する組成物の免疫学的に有効な量を被験体（ヒトまたは動物の被験体など）に投与することを含む。免疫学的に有効な量の組成物を投与すると、改変インフルエンザＨＡタンパク質上に存在するエピトープに特異的な免疫応答が誘発される。このような免疫応答としては、Ｂ細胞応答（例えば、中和抗体の産生）および／またはＴ細胞応答（例えば、サイトカインの産生）を挙げることができる。好ましくは、改変インフルエンザＨＡタンパク質により誘発された免疫応答は、改変インフルエンザＨＡタンパク質上に存在する少なくとも１つの立体エピトープに特異的な要素を含む。
【００６８】
本発明の範囲内の改変ＨＡタンパク質を含むワクチンには、不活化インフルエンザワクチン、弱毒化生ウイルスワクチン、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれる。
【００６９】
以下の３つの型の不活化インフルエンザワクチンが現在世界で使用されている：全ウイルスワクチン、スプリット産物（split product）ワクチン、および表面抗原または「サブユニット」ワクチン。これらのワクチンはすべて、来たる季節にヒト集団の中に広まると予想されるインフルエンザウイルス株の表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）、およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する。ワクチンに組み込まれるこれらの株を、雌鶏の有胚鶏卵の中で成長させ、次いでウイルス粒子を精製してさらなる処理を行う。一実施形態では、既存のインフルエンザワクチンの免疫原性を改善するために、１つまたは複数の糖鎖付加部位を既存の鶏卵に適合したＨＡ配列から除去する。鶏卵に適合したＨＡ配列を調製するための方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第５，１６２，１１２号に記載されている。
【００７０】
さらに、改変ＨＡタンパク質は、インフルエンザの多価ワクチン（例えば、１価、２価、または３価）の１つまたは複数から誘導することができる。一態様では、改変ＨＡタンパク質は、インフルエンザに対する３価不活化ワクチン（ＴＩＶ）の１つから誘導することができる。ＴＩＶの標準成分には、インフルエンザウイルスの３つの異なる株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼが含まれる。使用することができるＴＩＶの例としては、限定しないが、Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac、およびFluvaxが挙げられる。
【００７１】
一態様では、本発明は、免疫系に提示され、個体に免疫応答を誘導することができる改変ＨＡタンパク質の組成物を含むワクチンを提供する。一部の実施形態では、この組成物はアジュバントまたは担体をさらに含む。別の実施形態では、本明細書に記載の改変ＨＡタンパク質は、少なくとも１つの３価不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の１つまたは複数の成分を含む。一部の実施形態では、ＴＩＶは、Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac、およびFluvaxからなる群から選択される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の改変ＨＡタンパク質は、Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac、およびFluvaxからなる群から選択されるＴＩＶと併せて投与することができる。
【００７２】
改変ＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子：
本発明はまた、インフルエンザ感染またはその少なくとも１つの疾患症状から脊椎動物（例えば、ヒト）を防御するためのワクチンまたは抗原製剤に製剤化することができる、改変ＨＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を包含する。ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６、またはそれらの断片もしくは一部を含む、１つまたは２つ以上の亜型に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことができる。このようなＨＡタンパク質を含む亜型の例としては、A/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１） A/Indonesia/5/05（Ｈ５Ｎ１）、A/chicken/New York/1995、A/herring gull/DE/677/88（Ｈ２Ｎ８）、A/Texas/32/2003、A/mallard/MN/33/00、A/duck/Shanghai/1/2000、A/northern pintail/TX/828189/02、A/Turkey/Ontario/6118/68（Ｈ８Ｎ４）、A/shoveler/Iran/G54/03、A/chicken/Germany/N/1949（Ｈ１０Ｎ７）、A/duck/England/56（Ｈ１１Ｎ６）、A/duck/Alberta/60/76（Ｈ１２Ｎ５）、A/Gull/Maryland/704/77（Ｈ１３Ｎ６）、A/Mallard/Gurjev/263/82、A/duck/Australia/341/83（Ｈ１５Ｎ８）、A/black-headed gull/Sweden/5/99（Ｈ１６Ｎ３）、B/Lee/40、C/Johannesburg/66、A/PuertoRico/8/34（Ｈ１Ｎ１）、A/Brisbane/59/2007（Ｈ１Ｎ１）、A/Solomon Islands 3/2006（Ｈ１Ｎ１）、A/Brisbane 10/2007（Ｈ３Ｎ２）、A/Wisconsin/67/2005（Ｈ３Ｎ２）、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/4/2006、A/Singapore/1/57（Ｈ２Ｎ２）、A/Anhui/1/2005（Ｈ５Ｎ１）、A/Vietnam/1194/2004（Ｈ５Ｎ１）、A/Teal/HongKong/W312/97（Ｈ６Ｎ１）、A/Equine/Prague/56（Ｈ７Ｎ７）、A/HongKong/1073/99（Ｈ９Ｎ２）が挙げられる。
【００７３】
本発明の態様では、ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、またはＨ９亜型であってもよい。別の態様では、Ｈ１タンパク質は、A/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）株、A/PuertoRico/8/34（Ｈ１Ｎ１）株、A/Brisbane/59/2007（Ｈ１Ｎ１）株、またはA/Solomon Islands 3/2006（Ｈ１Ｎ１）株に由来するものであってもよい。さらに、Ｈ３タンパク質は、A/Brisbane 10/2007（Ｈ３Ｎ２）株またはA/Wisconsin/67/2005（Ｈ３Ｎ２）株に由来するものであってもよい。本発明のさらなる態様では、Ｈ２タンパク質は、A/Singapore/1/57（Ｈ２Ｎ２）株に由来するものであってよい。Ｈ５タンパク質は、A/Anhui/1/2005（Ｈ５Ｎ１）株、A/Vietnam/1194/2004（Ｈ５Ｎ１）株、またはA/Indonesia/5/2005株に由来するものであってもよい。本発明の態様では、Ｈ６タンパク質は、A/Teal/HongKong/W312/97（Ｈ６Ｎ１）株に由来するものであってよい。Ｈ７タンパク質は、A/Equine/Prague/56（Ｈ７Ｎ７）株に由来するものであってよい。本発明の態様では、Ｈ９タンパク質は、A/HongKong/l073/99（Ｈ９Ｎ２）株に由来するものであってよい。本発明のさらなる態様では、ＨＡタンパク質は、B/Malaysia/2506/2004またはB/Florida/4/2006を含む、Ｂ型ウイルスでありうるインフルエンザウイルスに由来するものであってよい。
【００７４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変インフルエンザＨＡタンパク質を含むＶＬＰは、Ｍ１、ＮＡ、Ｍ２、およびＮＰなどのさらなるインフルエンザタンパク質をさらに含む。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、およびＮＰタンパク質は、パンデミック株および季節性株を含むインフルエンザウイルスのいずれの株に由来するものでもよい。
【００７５】
本発明のＶＬＰは、トリインフルエンザＭ１タンパク質を含むことができる。一実施形態では、トリインフルエンザＭ１タンパク質は、Ｈ９Ｎ２インフルエンザ株に由来する。本明細書に記載の種々の実施形態では、インフルエンザＭ１は、A/quail/Hong Kong/Gl/97、A/Hong Kong/1073/99、A/Hong Kong/2108/03、Duck/HK/Y280/97、CK/HK/G9/97、Gf/HK/SSP607/03、Ph/HK/CSW1323/03、WDk/ST/4808/01、CK/HK/NT142/03、CK/HK/WF126/03、SCk/HK/WF285/03、CK/HK/YU463/03、CK/HK/YU577/03、SCk/HK/YU663/03、Ck/HK/CSWl61/03、およびGF/HK/NTl01/03からなる群から選択されるＨ９Ｎ２インフルエンザウイルスの任意の１つから単離することができる。典型的な実施形態では、Ｈ９Ｎ２インフルエンザ株はA/Hong Kong/1073/99である。別の実施形態では、トリインフルエンザＭ１タンパク質はＨ５Ｎ１インフルエンザ株に由来する。本明細書に記載の種々の実施形態では、インフルエンザＭ１は、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/1203/04、A/Hongkong/213/03、A/Indonesia/2/2005、A/Bar headed goose/Quinghai/1A/2005、A/Anhui/1/2005、およびA/Indonesia/5/05からなる群から選択されるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの任意の１つから単離することができる。典型的な実施形態では、Ｈ５Ｎ１株はA/Indonesia/5/05である。
【００７６】
別の実施形態では、本発明のＶＬＰは、ブタ起源のΗ１Ν１株からのものなど、非トリ供給源に由来するインフルエンザＭ１タンパク質を含むことができる。一実施形態では、Ｍ１タンパク質はインフルエンザA/California/04/09に由来する。他の実施形態では、Ｍ１タンパク質は、インフルエンザA/California/08/09またはインフルエンザA/Mexico/4108/09に由来するものであってよい。
【００７７】
本発明者らは、配列番号３の残基１００〜１０３に対応するアミノ酸位にＹＫＫＬ  Ｌ−ドメイン配列を含むインフルエンザＭ１タンパク質を使用すると、インフルエンザＶＬＰ産生の効率が増大することを見出した。したがって、本明細書に記載の典型的な実施形態では、本発明のＶＬＰは、ＹＫＫＬ  Ｌ−ドメイン配列を含有するインフルエンザＭ１タンパク質を含む。一実施形態では、配列番号３の残基１００〜１０３に対応するアミノ酸位にＹＫＫＬ  Ｌドメイン配列を含むインフルエンザＭ１タンパク質は、トリインフルエンザＭ１タンパク質である。別の実施形態では、配列番号３の残基１００〜１０３に対応するアミノ酸位にＹＫＫＬ  Ｌドメイン配列を含むインフルエンザＭ１タンパク質は、非トリインフルエンザＭ１タンパク質である。さらなる実施形態では、非トリインフルエンザＭ１タンパク質はブタインフルエンザＭ１タンパク質である。さらなる実施形態では、ブタインフルエンザＭ１タンパク質はインフルエンザ株A/California/04/09に由来する。典型的な実施形態では、A/California/04/09に由来するＭ１タンパク質は、配列番号４から構成される。推定上のＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインを保有するＭ１タンパク質を利用するＶＬＰを作製する方法は、共同所有される同時係属中の米国特許出願第１２／８３２，６５７号に記載されている。
【００７８】
本明細書で同定されたインフルエンザＭ１タンパク質の対応する位置（例えば、配列番号３および４の残基１００〜１０３に対応する位置にあるＹＫＫＬアミノ酸）は、他のインフルエンザＭ１タンパク質において当業者が容易に同定することができる。したがって、本出願に記載の指定領域およびアッセイ法が与えられれば、当業者は、ＶＬＰ形成を媒介する能力が増大したことを示す、天然のインフルエンザＭ１タンパク質を同定することができる。同様に、本出願の開示があれば、当業者は、目的の任意のインフルエンザＭ１タンパク質において、ＶＬＰ形成を媒介する能力を増大させる、１つまたは複数の改変を行うことができよう。したがって、配列番号３および４の残基１００〜１０３に対応する位置にＹＫＫＬアミノ酸を有する天然のインフルエンザＭ１タンパク質、ならびに配列番号３および４の残基１００〜１０３に対応する位置にＹＫＫＬ  Ｌ−ドメインを含有するように、天然にまたは遺伝子工学によって変異させられたインフルエンザＭ１タンパク質は本発明の範囲内にある。
【００７９】
一実施形態では、ＶＬＰは、少なくとも２つの異なるインフルエンザウイルスに由来するタンパク質を含むことができる。例えば、ＶＬＰは、トリインフルエンザウイルス由来の改変ＨＡ（すなわち、Η５Ν１）およびブタインフルエンザウイルス（すなわち、Ｈ１Ｎ１）由来のＮＡを含むことができる。別の実施形態では、ＶＬＰは、２つ以上の型のインフルエンザウイルス（すなわち、Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１）に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことができる。これらの実施形態では、前記ＶＬＰは、いくつかのタンパク質に対して、したがって、インフルエンザウイルスのいくつかの株に対して免疫応答を誘導することができる多価ＶＬＰである。別の実施形態では、前記多価ＶＬＰはインフルエンザＭ１タンパク質を含む。一実施形態では、Ｍ１タンパク質は、配列番号３の残基１００〜１０３に対応するアミノ酸位にＹＫＫＬを含むＬ−ドメイン配列含む。別の実施形態では、Ｍ１タンパク質はブタインフルエンザＭ１タンパク質である。さらなる実施形態では、ブタインフルエンザＭ１タンパク質はインフルエンザ株A/California/04/09に由来する。典型的な実施形態では、A/California/04/09由来のＭ１タンパク質は、配列番号４から構成される。さらに別の実施形態では、Ｍ１タンパク質はトリインフルエンザＭ１タンパク質である。さらなる実施形態では、トリインフルエンザＭ１タンパク質は、インフルエンザ株A/Indonesia/5/05に由来する。典型的な実施形態では、インフルエンザ株A/Indonesia/5/05由来のＭ１タンパク質は、配列番号３から構成される。
【００８０】
本発明はまた、本発明のＶＬＰの上または中に発現される前記タンパク質の変異体を包含する。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列の変化を含有することができる。タンパク質に関する用語「変異体」は、参照配列に対して１つまたは複数のアミノ酸が変化したアミノ酸配列を指す。変異体は「保存的」変化を有することができ、そこでは置換アミノ酸は類似の構造または化学的性質を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換）。あるいは、変異体は「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンへの置換）を有することができる。類似した少数の変異体は、さらにアミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方を含むことができる。生物学的または免疫学的活性を消失させることなく、いずれのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失可能であるかを判定する指針を、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAソフトウェアを使用して見出すことができる。
【００８１】
天然変異体はタンパク質中の変異により生じうる。これらの変異は、感染因子、例えばインフルエンザのそれぞれのグループ内に抗原多様性をもたらすことができる。したがって、インフルエンザ株に感染した人は、新しいウイルス株が出現すると、そのウイルスに対する抗体を発現し、古い株に対する抗体はもはや新しいウイルスを認識せず、再感染が起こりうる。本発明は、ＶＬＰを作製するための、感染因子に由来するタンパク質のすべての抗原および遺伝的多様性を包含する。
【００８２】
クローニング、変異、細胞培養等の本発明に適用可能な分子生物手法を記載する一般的な教科書としては、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (“Berger”); Sambrook et al, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (“Sambrook”)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (“Ausubel”)が挙げられる。これらの教科書は、例えばＨＡ、ＮＡ、および／またはＭ１のクローニングおよび変異に関連する変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、および多くの他の関連トピックについて記載している。したがって、本発明はまた、本発明のＶＬＰの上または中に発現されるタンパク質の特性を改善または改変するためのタンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用することを包含する。タンパク質分子をコードする変異体核酸を生成および／または単離するために、かつ／または本発明のＶＬＰの中または上のタンパク質をさらに改変／変異させるために、種々のタイプの変異誘発を使用することができる。これらの方法としては、限定しないが、部位特異的、ランダム点変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド定方向変異誘発、およびホスホロチオアート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップのある二本鎖ＤＮＡを使用する変異誘発等が挙げられる。さらなる適切な方法としては、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラコンストラクトが関与する変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、天然分子または改変または変異を受けた天然分子についての公知の情報、例えば配列、配列比較、物理的性質、結晶構造等を指針とすることができる。
【００８３】
本発明は、実質的な生物活性を示す、例えば、本発明のＶＬＰの上または中に発現されると、効果的な抗体産生応答を誘発することができるタンパク質変異体をさらに含む。このような変異体は、活性にほとんど影響を及ぼさないように、当技術分野で公知の一般規則に従って選択された欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含む。
【００８４】
前記タンパク質をクローニングする方法は当技術分野で公知である。例えば、特定のウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、ウイルス（ＤＮＡまたはＲＮＡウイルス）に感染した細胞から抽出されたポリアデニル化ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、またはＤＮＡウイルスに感染した細胞でのＰＣＲにより単離することができる。得られる産物遺伝子は、ベクターの中にＤＮＡ挿入断片としてクローニングすることができる。用語「ベクター」は、生物間、細胞間、または細胞成分間で核酸を伝搬および／または移動させることができる手段を指す。ベクターとしては、自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体の中に組み込まれうるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等が挙げられる。ベクターはまた、自律的に複製しない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内にあるＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリジン結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡ等であってもよい。すべてではないが多くの一般的な実施形態では、本発明のベクターはプラスミドまたはバクミドである。
【００８５】
したがって、本発明は、本発明のＶＬＰの形成を誘導する細胞の中で発現することができる発現ベクターにクローニングされたタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、そこに挿入される核酸の発現および複製を促進することができるプラスミドなどのベクターである。典型的には、発現される核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「機能的に連結」されており、プロモーターおよび／またはエンハンサーにより転写調節制御を受けている。一実施形態では、ベクターは、Ｍ１、ＮＡ、および改変ＨＡをコードするヌクレオチドを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、サイレントな置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされたタンパク質の特性および活性も、そのタンパク質の作製方法も変化させない改変を含有する変異を、前記タンパク質は含むことができる。ヌクレオチド変異体は、種々の理由で、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために作製することがある（ヒトｍＲＮＡのコドンをＳｆ９細胞などの昆虫細胞にとって好ましいコドンに変更する）。あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０１１８１９１号を参照されたい。
【００８７】
加えて、ヌクレオチドを配列決定して、適正なコード領域をクローニングし、望ましくない変異が少しも含有されていないことを確認することができる。ヌクレオチドは、任意の細胞での発現のために、発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）にサブクローニングすることができる。上記のものは、インフルエンザタンパク質をクローニングすることができる方法の一例にすぎない。当業者は、さらに他の方法が利用可能であり、実行可能であると理解している。
【００８８】
本発明はまた、上記のインフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドを含むコンストラクトおよび／またはベクターを提供する。インフルエンザタンパク質を含むコンストラクトおよび／またはベクターは、非限定例であるＡｃＭＮＰＶポリへドリンプロモーター（または他のバキュロウイルス）、λファージＰＬプロモーター、大腸菌（E. coli）ｌａｃ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターに機能的に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、所望の宿主細胞および／または発現率に応じて、当業者には公知であろう。発現コンストラクトは、転写の開始部位、終結部位、および転写領域では翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することになる。コンストラクトにより発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始点の翻訳開始コドンおよび終点に適正に位置する終止コドンを含むことになる。
【００８９】
発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択可能マーカーを含むことになる。そのようなマーカーとしては、真核細胞の培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、及び大腸菌（E. coli）および他の細菌における培養については、テトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。中でも好ましいベクターには、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーンポックスウイルス、豚痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスベクターがある。本発明で使用することができる他のベクターは、細菌で使用されるベクターを含み、これらは、pQE70、pQE60およびpQE-9、pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5を含む。中でも好ましい真核生物ベクターは、pFastBac1 pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLである。他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。
【００９０】
次に、上述の組換えコンストラクトは、トランスフェクション、感染、または形質転換のために使用することができ、真核細胞および／または原核細胞の中へインフルエンザタンパク質を発現させることができる。したがって、本発明は、インフルエンザタンパク質をコードする核酸を含有するベクターを含む宿主細胞を提供し、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で、前記宿主細胞中での前記コンストラクトの発現を可能にする。
【００９１】
真核生物宿主細胞の中には、酵母、昆虫、鳥類、植物、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（または、線虫）、および哺乳動物宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定例は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）細胞、例えばHigh Five細胞、およびショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）（Ｋ．ラクチス（K. lactis））、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）およびＣ．グラブラタ（C. glabrata）を含むカンジダ（Candida）種、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（Ｓ．ポンベ（S. pombe））、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ならびにヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）である。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、およびアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ、およびＨｅｐ−２細胞である。アフリカツメガエル卵母細胞、または両生類起源の他の細胞も使用することができる。原核生物宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、大腸菌（E. coli）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、およびミコバクテリアが挙げられる。
【００９２】
ベクター、例えば、インフルエンザタンパク質のポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で周知の方法に従って宿主細胞をトランスフェクションすることができる。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによって行うことができる。一実施形態では、前記ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、前記組換えバキュロウイルスは真核細胞にトランスフェクションされる。好ましい実施形態では、前記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態では、前記昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００９３】
別の実施形態では、前記ベクターおよび／または宿主細胞は、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質ならびにＭ１、ＮＡ、Ｍ２、およびＮＰから選択される１つまたは複数のさらなるインフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。典型的な実施形態では、ベクターおよび／または宿主細胞は、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質ならびにＭ１および／またはＮＡタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。別の実施形態では、前記ベクターおよび／または宿主細胞は、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質ならびにＭ１および／またはＮＡタンパク質から本質的になる。さらなる実施形態では、前記ベクターおよび／または宿主細胞は、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質ならびにＭ１および／またはＮＡタンパク質からなる。これらのベクターおよび／または宿主細胞は、複製起点、選択マーカー等のさらなるマーカーを含有することができる。
【００９４】
本発明はまた、ＶＬＰ産生の効率をさらに増大させることになるコンストラクトおよび方法を提供する。例えば、Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡタンパク質にリーダー配列を付加すると、細胞内でのタンパク質輸送の効率を改善することができる。例えば、異種のシグナル配列を、Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡに融合させることができる。一実施形態では、シグナル配列を、昆虫前駆体タンパク質の遺伝子から取り出し、Ｍ１、ＨＡ、および／またはＮＡに融合させることができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、キチナーゼシグナル配列であり、これはバキュロウイルス発現系で効率的に機能する。
【００９５】
本発明はまた、本発明のＶＬＰを産生する方法であって、細胞培養発現系において、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質とＭ１、ＮＡ、Ｍ２、およびＮＰから選択される１つまたは複数のさらなるインフルエンザタンパク質とをコードする核酸を発現すること、ならびに細胞培養上清から前記ＶＬＰを精製することを含む方法を提供する。
【００９６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質ならびにＭ１および／またはＮＡタンパク質をコードする核酸を、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で、真核細胞中で発現させる。一実施形態では、発現のために利用する真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物細胞からなる群から選択される。典型的な実施形態では、真核細胞は昆虫細胞である。一実施形態では、細胞培養発現系はバキュロウイルス発現系である。
【００９７】
選択された発現系および宿主細胞に応じて、ＶＬＰは、組換えタンパク質が発現され、ＶＬＰが形成される条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。適切な成長条件の選択は、当技術分野の技術または技術者の範囲内である。
【００９８】
本発明のＶＬＰを産生するように操作された細胞を成長させる方法としては、限定しないが、バッチ、バッチ−フェド、連続、および灌流細胞培養技法が挙げられる。細胞培養とは、細胞が増殖して、精製および単離のためのタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現するバイオリアクター（発酵チャンバー）内での細胞の成長および増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクター内で、無菌、制御された温度および大気条件の下で行なわれる。バイオリアクターは、温度、大気、攪拌、および／またはｐＨなどの環境条件をモニターすることができる、培養細胞に使用されるチャンバーである。一実施形態では、前記バイオリアクターはステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、前記バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチック袋（例えば、Cellbag(登録商標), Wave Biotech, Bridgewater, NJ）である。他の実施形態では、前記予め滅菌されたプラスチック袋は、約５０Ｌ〜１０００Ｌである。
【００９９】
次いで、ＶＬＰは、例えば塩化セシウム、スクロース、イオジキサノールの勾配遠心分離ならびに例えばイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含む標準精製手法など、その完全性を保持する方法を使用して単離される。
【０１００】
以下は、本発明のＶＬＰを作製、単離、および精製する方法の例である。通常、ＶＬＰは、ＶＬＰを形成するように操作された組換え細胞株から、前記細胞が細胞培養で成長すると産生される（上記参照のこと）。当業者ならば、本発明のＶＬＰを作製および精製するために利用することができるさらなる方法があり、したがって、本発明は記載の方法に限定されないことを理解するであろう。
【０１０１】
本発明のＶＬＰの産生は、Ｓｆ９細胞（非感染）を振盪フラスコに播種し、細胞が拡大することを可能にし、細胞の成長および増加に伴いスケールアップする（例えば、１２５ｍｌフラスコから５０Ｌウェーブ袋（Wave bag）に）ことにより開始することができる。細胞を成長させるために使用する培地は、適切な細胞株のために調製されたものである（好ましくは無血清培地、例えば昆虫培地ExCe11-420、JRH）。次に、前記細胞を最も効率的な感染多重度（例えば、細胞当たり約１〜約３のプラーク形成単位）で組換えバキュロウイルスにより感染させる。いったん感染が起こると、トリインフルエンザＭ１などのＭ１および少なくとも１つのインフルエンザ異種タンパク質（すなわち、本発明の改変ＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質）がウイルススゲノムから発現し、ＶＬＰに自己組織化し、感染の約２４〜７２時間後に細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が対数増殖期中期にあるとき最も効率的であり（４〜８×１０６細胞／ｍｌ）、少なくとも約９０％が生存可能である。
【０１０２】
本発明のＶＬＰは、感染の約４８〜９６時間後、細胞培養培地中のＶＬＰレベルがほぼ最大になっているが、広範な細胞溶解が起こる前に回収することができる。回収時点でのＳｆ９細胞の密度及び生存率は、色素排除アッセイにより示される場合、約０．５×１０６細胞／ｍｌ〜約１．５×１０６細胞／ｍｌで、少なくとも２０％の生存率となりうる。次に、培地を取り出し、清澄にする。培地にＮａＣｌを約０．４〜約１．０Ｍ、好ましくは約０．５Ｍの濃度まで添加して、ＶＬＰの凝集を回避することができる。本発明のＶＬＰを含有する細胞培養培地からの細胞及び細胞デブリの除去は、使い捨ての予め滅菌された中空繊維０．５または１．００μｍフィルターカートリッジまたは同様の装置による接線流ろ過（ＴＦＦ）により達成することができる。
【０１０３】
次に、清澄化した培養培地中のＶＬＰを、使い捨ての予め滅菌された５００，０００分子量カットオフ中空繊維カートリッジを使用する限外ろ過により濃縮することができる。濃縮したＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含有する、ｐＨ７．０〜８．０の１０容量リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対しダイアフィルトレーションを行い、残留培地成分を除去することができる。
【０１０４】
濃縮し、ダイアフィルトレーションしたＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中の２０％〜６０％不連続スクロース勾配上で、約４℃〜約１０℃において６，５００×ｇで１８時間遠心することによりさらに精製することができる。通常、ＶＬＰは、約３０％〜約４０％のスクロースの間に、または界面に（２０％および６０％ステップ勾配において）明確な目に見えるバンドを形成するが、これを勾配から回収して保存することができる。この生成物は、精製法の次の工程のために、調製物中に２００ｍＭのＮａＣｌを含むように希釈することができる。この生成物はＶＬＰを含有することに加え、無傷のバキュロウイルス粒子を含有することがある。
【０１０５】
ＶＬＰのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、または４４％等密度スクロースクッション遠心分離により達成することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配（上記参照のこと）からの試料を、陰イオンを含む媒体（例えば、Matrix Fractogel EMD TMAE）で充填されたカラムに負荷し、ＶＬＰを他の混入物（例えば、バキュロウイルス及びＤＮＡ／ＲＮＡ）から分離することができる塩勾配（約０．２Ｍ〜約１．０ＭのＮａＣｌ）を介して溶出する。スクロースクッション法では、ＶＬＰを含む試料を４４％スクロースクッションに添加し、３０，０００ｇで約１８時間遠心する。ＶＬＰは、４４％スクロースの最上部にバンドを形成し、一方バキュロウイルスは底に沈殿し、他の混入タンパク質は最上部の０％スクロース層に留まる。ＶＬＰピークまたはバンドを回収する。
【０１０６】
必要に応じて、無傷のバキュロウイルスを不活性化することができる。不活性化は、化学的な方法、例えばホルマリンまたはβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）により達成することができる。無傷のバキュロウイルスの除去および／または不活性化は、上記に例示されるように、当該技術分野で公知の選択的沈殿法およびクロマトグラフ法を使用することによっても、大部分は達成することができる。不活性化の方法は、ＶＬＰを含有する試料を０．２％のＢＰＬ中で３時間、約２５℃〜約２７℃でインキュベートすることを含む。バキュロウイルスはまた、ＶＬＰを含有する試料を０．０５％ＢＰＬにおいて４℃で３日間、次に３７℃で１時間インキュベートすることにより不活性化することができる。
【０１０７】
不活性化／除去工程の後、ＶＬＰを含む生成物を別のダイアフィルトレーション工程に通して不活性化工程からのいかなる試薬もおよび／またはいかなる残留スクロースも除去し、ＶＬＰを所望の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中に入れることができる。ＶＬＰを含む溶液は、当技術分野において公知の方法により滅菌し（例えば、ろ過滅菌）、冷蔵庫または冷凍庫に保存することができる。
【０１０８】
上記の技法は、種々の規模にわたって実施することができる。例えば、Ｔ型フラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリアクターに至るまで可能である。バイオリアクターは、ステンレス鋼タンクまたは予め滅菌されたプラスチック袋（例えば、Wave Biotech、Bridgewater、NJにより販売されるシステム）のいずれかを含むことができる。当業者は、その目的にとって最も望ましいものを知っているであろう。
【０１０９】
バキュロウイルス発現ベクターの増幅および産生ならびに細胞の組換えバキュロウイルス感染による組換えインフルエンザＶＬＰの産生は、前述のように、昆虫細胞、例えばＳｆ９昆虫細胞で達成することができる。好ましい実施形態では、細胞は、本発明のＶＬＰを産生するように操作された組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９である。
【０１１０】
医薬製剤またはワクチン製剤および投与：
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含む抗原製剤を提供する。ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６、またはそれらの断片もしくは一部を含む、１つまたは２つ以上の亜型に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことができる。一実施形態では、ＶＬＰは、限定しないが、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ、およびＮＰを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変ＨＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、およびＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含む抗原製剤を含む。一実施形態では、本発明の製剤は、１つまたは複数の精製または部分精製された改変ＨＡ抗原と組み合わせた、またはそれらと一緒に製剤化された、本明細書に記載の１つまたは複数のＶＬＰを含むことができる。例えば、一実施形態では、製剤は、インフルエンザA/California/04/09由来の改変ＨＡタンパク質を、同じウイルス由来の精製された改変ＨＡタンパク質と組み合わせて含むＶＬＰを含む。別の製剤では、ＶＬＰを同種または異種のＨＡまたはＮＡと組み合わせる。別の実施形態では、少なくとも１つのＶＬＰおよび少なくとも１つのＨＡまたはＮＡについて別々の製剤を作製し、患者または被験体に同時にまたは別々に投与する。一部の実施形態では、ＨＡ抗体価または他の尺度により測定される抗体産生量は、ＶＬＰおよびＨＡを単一製剤または別々の製剤で同じ患者または被験体（または動物）に投与した場合に優れている。
【０１１１】
本発明の前記製剤は、本発明のＶＬＰおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。薬学的に許容可能な担体としては、限定しないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張緩衝水溶液、およびそれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および他の賦形剤ついての詳細な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. current edition)の中に提示されている。製剤は、投与方法に適合するものにすべきである。別の実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適したものであり、好ましくは無菌、非微粒子、および／または非発熱性である。
【０１１２】
本明細書で有用な医薬組成物は、組成物を投与された脊椎動物に有害な免疫応答の生成をそれ自体は誘導しない任意の医薬品を含み、かつ過度の毒性なしに投与することができる、任意の適切な希釈剤または賦形剤を含めた薬学的に許容可能な担体、および本発明のＶＬＰを含有する。本明細書で使用する用語「薬学的に許容可能な」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または哺乳動物およびより具体的にはヒトにおける使用について、米国薬局方、欧州薬局方、もしくはその他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチンおよび／または抗原組成物として有用となりうる。
【０１１３】
組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は、再構成するのに適した凍結乾燥粉末などの固形形態、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤、または粉末であってもよい。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。
【０１１４】
本発明はまた、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含むワクチンを含む。ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６、またはそれらの断片もしくは一部を含む、１つまたは２つ以上の亜型に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことができる。一実施形態では、ＶＬＰは、限定しないが、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ、およびＮＰを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変ＨＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、およびＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含むワクチンを含む。
【０１１５】
本発明はまた、本発明のワクチン製剤の成分の１つまたは複数で充填された１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。一実施形態では、キットは、２つの容器を含み、一方はＶＬＰを含有し、他方はアジュバントを含有する。別の実施形態では、キットは、２つの容器を含み、一方は凍結乾燥ＶＬＰを含有し、他方は前記ＶＬＰを再懸濁するための溶液を含有する。このような容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形式の通知を添付することができ、この通知は機関によるヒト投与に対する製造、使用、または販売の承認を反映するものである。
【０１１６】
本発明はまた、ＶＬＰ製剤が組成物の分量を示すアンプルまたはサシェットなどの密封容器にパッケージされることを提供する。一実施形態では、ＶＬＰ組成物は液体として、別の実施形態では、乾燥滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密封容器に供給され、例えば水または生理食塩水により、被験体への投与に適した濃度に再構成することができる。一実施形態では、前記容器は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌの本発明のＶＬＰ付随抗原を含む。
【０１１７】
別の実施形態では、ＶＬＰ組成物は、ＶＬＰ組成物の分量および濃度を示す密封容器の中に液体形態で供給される。ＶＬＰ組成物の液体形態は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌの本発明のＶＬＰ付随抗原で、密封容器の中に供給される。
【０１１８】
一般に、本発明のＶＬＰは、１つまたは複数の感染因子に対する免疫応答を刺激するのに十分な有効量または有効分量（上記に定義のとおり）で投与される。好ましくは、本発明のＶＬＰの投与は、感染因子に対する免疫を誘発する。典型的には、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床的要因に基づき、この範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば、注射針および注射器または無針注射器具を使用する皮下または筋肉内注射により全身投与される。あるいは、ワクチン製剤は、点鼻液、大型粒子エアロゾル（約１０ミクロン超）、または上気道への噴霧のいずれかにより鼻腔内投与される。上記の送達経路のいずれも免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、インフルエンザを含む多くのウイルスの侵入部位で粘膜免疫を誘発するさらなる有益性を付与する。
【０１１９】
したがって、本発明はまた、感染またはその少なくとも１つの症状に対する免疫を哺乳動物に誘導するワクチンまたは抗原組成物を製剤化する方法であって、本発明のＶＬＰの有効用量を前記製剤に加えることを含む方法を含む。
【０１２０】
ＶＬＰ（ワクチンおよび／または抗原製剤）を含む組成物の投与方法としては、限定しないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、および皮下）、硬膜外麻酔、粘膜（例えば、鼻腔内および経口もしくは経肺経路、または坐剤による）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、または皮内に投与される。組成物は、任意の従来の経路により、例えば点滴またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、口腔咽頭、腟、尿道、膀胱、および腸粘膜等）を介する吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。一部の実施形態では、本発明のＶＬＰを含む組成物の鼻腔内または他の粘膜投与経路は、他の投与経路より実質的に高度な抗体または他の免疫応答を誘導することができる。別の実施形態では、本発明のＶＬＰを含む組成物の鼻腔内または他の粘膜投与経路は、感染を引き起こす他の株または生物に対する交差防御を誘導する抗体または他の免疫応答を誘導することができる。例えば、インフルエンザタンパク質を含むＶＬＰは、脊椎動物に投与された場合、いくつかのインフルエンザ株に対して交差防御を誘導することができる。投与は全身的であっても局所的であってもよい。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、ワクチンおよび／または抗原製剤は、免疫部位で免疫応答を誘発するために、粘膜組織を標的にするような方法で投与される。例えば、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）などの粘膜組織は、特定粘膜標的特性を有するアジュバントを含有する組成物の経口投与を使用することにより、免疫の標的にすることができる。鼻咽頭リンパ組織（ＮＡＬＴ）および気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）などのさらなる粘膜組織もまた、標的にすることができる。
【０１２２】
本発明のワクチンおよび／または抗原製剤はまた、例えば、ワクチン組成物の初回投与とそれに続く追加免疫投与の投与スケジュールで投与することができる。特定の実施形態では、組成物の第２の用量は、初回投与の大体２週間〜１年後、好ましくは約１、約２、約３、約４、約５ヶ月〜約６ヶ月後に投与される。さらに、第３の用量は、第２の用量後でかつ初回投与の約３ヶ月〜約２年後またはそれを超えた後でも、好ましくは約４，約５、または約６ヶ月もしくは約７ヶ月〜約１年後に投与することができる。第３の用量は、第２の用量後、特定の免疫グロブリンが被験体の血清および／または尿または粘液分泌物の中に検出されないかまたは低レベルで検出される場合、任意選択で投与することができる。好ましい実施形態では、第２の用量は、初回投与の約１ヶ月後に投与され、第３の用量は、初回投与の約６ヶ月後に投与される。別の実施形態では、第２の用量は、初回投与の約６か月後に投与される。別の実施形態では、本発明の前記ＶＬＰは、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明のＶＬＰは、他の免疫原性組成物、抗ウイルス剤、および／または抗生物質と共に製剤化することができる。
【０１２３】
医薬製剤の投薬量は、例えば、予防的または治療的免疫応答を誘発するのに効果的な用量を、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価の測定により、または血清試料、尿試料、または粘膜分泌物の中の抗体の阻害率の測定により、最初に特定することによって、当業者が容易に決定することができる。前記投薬量は、動物試験から決定することができる。ワクチンの効力を試験するために使用される動物の非限定的リストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス、およびコトンラットが含まれる。ほとんどの動物は、感染因子の自然宿主でないが、その疾患の種々の様相に関する試験にはなお有用となりうる。例えば、上記のいずれの動物においても、ワクチン候補、例えば本発明のＶＬＰを投薬して、誘導される免疫応答を部分的に特徴づけること、および／またはいずれの中和抗体が産生されるかを判定することができる。例えば、マウスは小型であり、その低コストのため、研究者が試験を大規模に実施することが可能になるので、多くの試験がマウスモデルで実施されている。
【０１２４】
加えて、ヒト臨床試験を実施して、当業者がヒトに対する好ましい有効用量を決定することができる。そのような臨床試験は当技術分野ではルーチン的で周知である。使用される正確な用量は、投与ルートにも依存することになる。有効用量は、インビトロまたは動物の実験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。
【０１２５】
さらに、当技術分野で周知のように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的な刺激物質の使用により増強することができる。アジュバントは未知の抗原に対する免疫の全般的な増大を促進するために実験的に使用されている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。長年、免疫プロトコールでは応答を刺激するためにアジュバントが使用されており、そのためアジュバントは、当業者には周知である。アジュバントの一部は、抗原提示の様式に影響を及ぼす。例えば、タンパク質抗原をミョウバンにより沈殿させると、免疫応答が増大する。また、抗原を乳化すると、抗原提示の期間が延長される。あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される、Vogel et al., “A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)”に記載されるいずれのアジュバントも包含されることが、本発明の範囲内に想定される。
【０１２６】
典型的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅したマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）を含有する非特異的な免疫応答刺激物質）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰとＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が含まれる。細菌から抽出される３つの成分であるＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を、２％スクアレン／Tween 80乳剤中に含有するRIBIもまた考慮される。MF-59、Novasomes（登録商標）、ＭＨＣ抗原もまた使用することができる。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、アジュバントは、脂質二重層を含まない大きな無定形の中心腔を取り囲む、水層により分離された、実質的に球状のシェル形態で配置された約２〜１０の二重層を有する少重層膜（paucilamellar）脂質小胞である。少重層膜脂質小胞は、非特異的刺激物質として、抗原用の担体として、さらなるアジュバントの担体として、およびそれらの組合せとして、いくつかの様式で免疫応答を刺激するように作用することができる。例えば、抗原が小胞に対して細胞外に留まるように、予め形成した小胞と抗原を混ぜ合わせてワクチンを調製すると、少重層膜脂質小胞は非特異的免疫刺激物質として作用する。抗原を小胞の中心腔内に封入することにより、小胞は免疫刺激物質および抗原用担体の両方として作用する。別の実施形態では、小胞は主に非リン脂質小胞から作製される。他の実施形態において、小胞はNovasomes（登録商標）である。Novasomes（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の少重層膜非リン脂質小胞である。これは、Brij 72、コレステロール、オレイン酸、およびスクアレンを含む。Novasomes（登録商標）は、インフルエンザ抗原に対して有効なアジュバントであることが示されている（あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、および同第４，９１１，９２８号を参照のこと）。
【０１２８】
免疫応答を誘導する別の方法は、「免疫刺激物質」と共に本発明のＶＬＰを製剤化することにより達成することができる。これらは、免疫系の応答を増大させる、生体自体の化学伝達物質（サイトカイン）である。免疫刺激物質としては、限定しないが、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；およびマクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等の他の免疫刺激分子など、免疫刺激性、免疫増強性、および炎症促進性の活性を有する種々のサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインが挙げられる。免疫刺激分子は、ＲＳＶ  ＶＬＰと同じ製剤で投与しても、別個に投与してもよい。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。したがって、一実施形態では、本発明は、アジュバントおよび／または免疫刺激物質を含む抗原製剤およびワクチン製剤を含む。
【０１２９】
したがって、本発明の一実施形態は、ＶＬＰならびにアジュバントおよび／または免疫刺激物質を含む製剤を含む。別の実施形態では、前記アジュバントはNovasomes（登録商標）である。別の実施形態では、前記製剤はヒト投与に適している。別の実施形態では、製剤は、脊椎動物に対して、経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される。別の実施形態では、異なるＶＬＰを一緒にブレンドして多価製剤を作製する。これらのＶＬＰは、異なるインフルエンザウイルス株に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことがある。
【０１３０】
単回用量による免疫の刺激が好ましいが、所望の効果を達成するために、同じかまたは異なる経路によりさらなる投薬量を投与することができる。新生児および幼児では、例えば、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回投与が要求されることがある。感染からの防御を十分なレベルで維持するために必要ならば、幼年期を通してある間隔で投与を継続することができる。同様に、例えば医療従事者、デイケア従事者、年少児の家族、高齢者、および心肺機能が損なわれている個体など、反復感染または重篤感染を特に受けやすい成人は、防御免疫応答の確立および／または維持のために複数回の免疫付与を必要とすることがある。誘導免疫のレベルは、中和分泌および血清抗体の量を測定することによりモニターすることができ、所望の防御レベルを誘発または維持するために、必要に応じて、投薬量を調製するかまたはワクチン接種を反復することができる。
【０１３１】
免疫応答を刺激する方法：
上述のように、本発明のＶＬＰは、感染因子に対する免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫および細胞性免疫は両方とも、感染因子および疾患に対する免疫に寄与することができる。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主要な因子である。分泌性免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）は上気道の防御に関与し、血清ＩｇＧは下気道の防御に関与する。感染により誘導される免疫応答は、同じウイルスまたは抗原的に同様のウイルス株による再感染を防御する。例えば、インフルエンザは頻繁かつ予測不能の変化を受ける；したがって、自然感染後、宿主の免疫により提供される防御の有効期間は、その地域で広まるウイルスの新株に対して数年のみである場合がある。
【０１３２】
本発明のＶＬＰは、脊椎動物（例えば、ヒト）に投与されると、前記脊椎動物に免疫を誘導することができる。免疫は、前記脊椎動物において、感染を防御するかもしくは寛解する、または少なくとも感染の症状を軽減する、本発明のＶＬＰに対する免疫応答から生じる。場合によっては、前記脊椎動物が感染すると、前記感染は無症候性になる。応答は、完全防御応答ではないこともある。この場合、前記脊椎動物が感染因子に感染すると、この脊椎動物は、非免疫脊椎動物と比較して、症状の軽減または短い症状期間を経験することになる。
【０１３３】
本発明は、脊椎動物に免疫を誘導する方法であって、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質を含むＶＬＰを、前記脊椎動物に投与することを含む方法を含む。ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６、またはそれらの断片もしくは一部を含む、１つまたは２つ以上の亜型に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことができる。一実施形態では、ＶＬＰは、限定しないが、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ、およびＮＰを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変ＨＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、およびＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含むワクチンを含む。一実施形態では、誘導される免疫応答は体液性免疫応答である。別の実施形態では、誘導される免疫応答は細胞性免疫応答である。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的または部分的にコードされた１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順にそれぞれ、免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、２つの同一ポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識の主たる役割を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによる消化により生成したいくつかの十分特徴づけられた断片として存在する。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明は、被験体において感染またはその少なくとも１つの症状に対して防御細胞応答を誘導する方法であって、１つまたは複数の改変ＨＡタンパク質を含む本発明の前記ＶＬＰの少なくとも１つの有効用量を投与することを含む方法を含む。ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１Ｏ、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６、またはそれらの断片もしくは一部を含む、１つまたは２つ以上の亜型に由来する改変ＨＡタンパク質を含むことができる。一実施形態では、ＶＬＰは、限定しないが、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ、およびＮＰを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変ＨＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、およびＮＡタンパク質を含むＶＬＰを含むワクチンを含む。
【０１３６】
上述のように、本発明のＶＬＰは、被験体に投与された場合、前記被験体におけるインフルエンザの少なくとも１つの症状を予防または軽減することができる。インフルエンザのほとんどの症状は当技術分野で周知である。したがって、本発明の方法は、インフルエンザに付随した少なくとも１つの症状の予防または軽減を含む。症状の軽減は、例えば、被験体による自己評価により、臨床医の評価により、または適切なアッセイまたは測定（例えば、体温）の実施により、主観的または客観的に判定することができ、これには、例えば、生活の質の評価、感染もしくはさらなる症状の進行の遅延、症状の重症度の軽減、または適切なアッセイ（例えば、抗体価および／またはＴ細胞活性化アッセイ）が含まれる。客観的な評価は、動物およびヒトの評価の両方を含む。
【０１３７】
本発明は、インフルエンザによる感染またはその症状を予防および／または軽減する方法であって、本発明のＶＬＰを前記脊椎動物に投与することを含む方法を含む。
【０１３８】
集団発生（例えば、インフルエンザ）中に感染症を制御するための戦略は、小児を含む健常個体に遍くワクチン接種することである。例えば、流通しているインフルエンザワクチンを地域の生徒の約８０％にワクチン接種すると、成人における呼吸器疾患および高齢者における過剰死亡が減少した（Reichert et al., 2001）。この概念は地域免疫または「集団免疫」として知られており、疾患から地域を防御する重要な役割を果たすと思われている。ワクチン接種を受けた人は、感染因子、例えばインフルエンザウイルスを中和する抗体を有するので、その人が他の人に前記因子を伝染させる可能性は極めて低い。したがって、ワクチン接種を受けていない人（およびワクチン接種の効力が弱くなっている人またはワクチンが十分効力を発揮してない人）は、彼らのまわりのワクチンを受けた人々が病気になっていないので、多くの場合、集団免疫により保護することができる。ワクチン接種を受けた人の割合が上昇するほど、集団免疫はより効果的になる。集団免疫を達成するためには、地域の人々の約９５％がワクチンにより防御されなければならないと考えられる。免疫されていない人々によって、彼らおよび他の人々がその疾患になる可能性が高まる。
【０１３９】
したがって、本発明はまた、集団におけるインフルエンザの重症度を軽減する方法であって、前記集団中の十分な個体に本発明のＶＬＰを投与して、前記集団中の他の個体に伝染する可能性を防止または低減することを含む方法を含む。本発明はまた、免疫無防備状態の個体またはワクチン接種を受けなかった個体の間での感染の発生率を低減するために、地域の集団に本発明のＶＬＰを投与することによって、集団または地域にインフルエンザウイルスに対する免疫を誘導する方法を包含する。一実施形態では、本発明のＶＬＰの投与によりほとんどの学齢期児童を免疫にする。別の実施形態では、本発明のＶＬＰの投与により地域のほとんどの健常個体を免疫にする。別の実施形態では、本発明のＶＬＰは、「動的ワクチン接種法（dynamic vaccination）」戦略の一部である。動的ワクチン接種法は、出現するパンデミック株に関連するが、抗原連続変異により、哺乳動物に完全な防御を提供することができない効力の低いワクチンの安定した生成である（Germann et al., 2006を参照のこと）。
【０１４０】
限定として解釈されるべきではない以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明する。本出願全体を通して引用されたすべての参考文献、特許、および公開済み特許出願の内容ならびに図および配列表は、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４１】
実施例１
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成
この実施例は、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質と共に作製されるインフルエンザＨ５Ｎ１  ＶＬＰの産生について記載する。改変ＨＡタンパク質を構築するために、A/Indonesia/05/2005（Ｈ５Ｎ１）ＨＡ１（配列番号２）タンパク質のアミノ酸位１７０〜１７２および１８１〜１８３にあるＮＸ（Ｔ／Ｓ）配列の１つまたは両方を変異させた（図１）。具体的には、ＨＡ１タンパク質の１７２および／または１８３位においてスレオニンからアラニンへの変異を作製した。
【０１４２】
ＨＡ遺伝子を改変した後、改変ＨＡ遺伝子を、A/Indonesia/5/2005（Ｈ５Ｎ１）由来のＮＡおよびＭ１遺伝子と共発現させた。ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１遺伝子を、バキュロウイルス発現系を使用して、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Ｓｆ９昆虫細胞の中で発現させた。感染したＳｆ９細胞の発現産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により特徴づけた。図２に示すように、予測分子量のＨＡ、ＮＡ、およびＭ１タンパク質（それぞれ、６４ｋｄ、６０ｋｄ、および３１ｋｄ）が検出された。同じレーン中のＭ１およびＨＡのバンドの存在は、ＶＬＰ形成の証明となるＭ１会合体と会合するＨＡを示している。アミノ酸位１７０〜１７２（レーン４〜６）、アミノ酸位１８１〜１８３（レーン２）、またはアミノ酸位１７０〜１７２および１８１〜１８３の両方（レーン３）の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質を含むＶＬＰは正常に形成した。これらのデータは、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡを含むインフルエンザＶＬＰを作製することが可能であるという証拠を提供し、これは、糖鎖付加パターンの改変に続いて生じるタンパク質コンフォメーションの変化の報告を考えると驚くべき結果である。
【０１４３】
実施例２
改変ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含むインフルエンザＶＬＰは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性を保持する
この実施例では、野生型A/Indonesia/05/2005（Ｈ５Ｎ１）ＶＬＰにおけるＨＡおよびＮＡタンパク質のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性をそれぞれ、A/Indonesia/05/2005 ＨＡタンパク質（配列番号２）の１７０〜１７２および１８１〜１８３位にある１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質を含むＨ５Ｎ１  ＶＬＰからの同じ活性と比較した。
【０１４４】
インフルエンザＶＬＰの赤血球凝集活性を測定するために、野生型インフルエンザＶＬＰまたは改変ＨＡタンパク質含有インフルエンザＶＬＰを含有するショ糖勾配画分の２倍希釈系列を調製した。次に、これらのＶＬＰをモルモット赤血球とＰＢＳ中で混合し、４℃で１〜１６時間インキュベートした。赤血球凝集の程度を視覚的に判定し、モルモット赤血球を凝集させることができる最も高い稀釈度を決定した。野生型インフルエンザＶＬＰについて観察された最も高い赤血球凝集価は、１：４０９６であった。それに比較して、単一Ｔ１７２Ａ糖鎖付加部位改変のＨＡタンパク質を含むインフルエンザＶＬＰは、１：２０４８の赤血球凝集価を示し、一方、Ｔ１７２ＡおよびＴ１８３Ａ糖鎖付加部位改変のＨＡタンパク質を含むインフルエンザＶＬＰは、１：１０２４の赤血球凝集価を示した。これらの結果より、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質を含むＨ５Ｎ１  ＶＬＰが赤血球凝集活性を保持することが実証される。
【０１４５】
加えて、インフルエンザＶＬＰ含有ショ糖勾配画分中のノイラミニダーゼ活性量は、ＮＡタンパク質が基質フェチュインに作用してシアル酸を放出するノイラミニダーゼアッセイを使用して測定した。遊離シアル酸量に比例してピンク色を産生するチオバルビツール酸を用いて、遊離されたシアル酸量を化学的に判定し、発色団の量は波長５９４ｎｍで分光光度計を使用して測定する。ノイラミニダーゼ活性は、野生型インフルエンザＶＬＰ、単一Ｔ１７２Ａ糖鎖付加部位改変のＨＡタンパク質を含むＶＬＰ、ならびにＴ１７２ＡおよびＴ１８３Ａ糖鎖付加部位改変のＨＡタンパク質を含むインフルエンザＶＬＰにおいて検出され、１つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたＨＡタンパク質を含むＨ５Ｎ１  ＶＬＰが赤血球凝集活性を保持することが示された。
【０１４６】
実施例３
NetNGlyc 1.0ソフトウェアを使用する、Ｎ−結合糖鎖付加部位の同定
この実施例では、NetNGlyc予測分析ソフトウェアを使用して、３つの季節性インフルエンザ株における球状頭部上部のＮ−結合糖鎖付加部位を同定した。
【０１４７】
この実施例における第１の分析株は、A/California/07/2009（Ｈ１Ｎ１）であった。NetNGlyc予測ソフトウェアにより、２８位（付随するアミノ酸配列「ＮＳＴＤ」と共に）、４０位（ＮＶＴＶ）、３０４位（ＮＴＳＬ）、および５５７位（ＮＧＳＬ）に糖鎖付加部位を同定した。これらの部位の中に、「頭頂」領域に位置するものはない。したがって、パンデミックA/California/07/2009（Ｈ１Ｎ１）由来のＨＡは、ＨＡ球状頭部の上部近傍領域に糖鎖付加部位を保有しない。
【０１４８】
この実施例における第２の分析株は、A/Perth/16/2009（Ｈ３Ｎ２）であった。NetNGlyc予測ソフトウェアは、２４位（ＮＳＴＡ）、３８位（ＮＧＴＩ）、７９位（ＮＣＴＬ）、１４２位（ＮＷＴＧ）、１４９位（ＮＧＴＳ）、１８１位（ＮＶＴＭ）、２６２位（ＮＳＴＧ）、および３０１位（ＮＧＳＩ）に糖鎖付加部位を同定した。これらの部位のうち、以下の４部位が「頭頂」領域に位置する：１４２、１４９、１８１、および２６２。これらの結果に基づいて、以下の４つの提案された変異部位が示唆された：Ｎ１４２Ｄ、Ｔ１５１Ａ、Ｔ１８３Ａ、およびＮ２６２Ｄ。これらの４つの提案された変異のうち、Ｎ１４２Ｄ、Ｔ１５１Ａ、およびＮ２６２Ｄは天然に存在する。これに対して、Ｔ１８３Ａ変異は天然には存在せず、この糖鎖付加部位が極めて保存的であることが示唆される。
【０１４９】
この実施例における第３の分析株は、B/Brisbane/60/2008であった。NetNGlyc予測ソフトウェアは、４０位（ＮＶＴＧ）、７４位（ＮＣＴＤ）、１６０位（ＮＩＴＮ）、１８１位（ＮＫＴＡ）、２１２位（ＮＥＴＱ）、２４８位（ＮＱＴＥ）、３１９位（ＮＫＳＫ）、３４８位（ＮＧＴＫ）、および５７８位（ＮＶＳＣ）に糖鎖付加部位を同定した。これらの部位のうち、以下の４部位が「頭頂」領域に位置する：１６０、１８１、２１２、および２４８。これらの結果に基づいて、以下の４つの提案された変異部位が示唆された：Ｔ１６２Ａ、Ｔ１８３Ａ、Ｔ２１４Ａ（鶏卵をベースとした変異）、およびＮ２４８Ｄ。これらの４つの提案された変異のうち、Ｔ２１４ＡおよびＮ２４８Ｄは天然に存在する。これに対して、Ｔ１６２ＡおよびＴ１８３Ａ変異は天然には存在せず、この糖鎖付加部位が極めて保存的であることが示唆される。
【０１５０】
前述の詳細な説明は、理解を明瞭にするためにのみ提示されたものであり、当業者には変更形態が明らかであるため、そこから不必要な限定があると理解されるべきではない。本明細書に提供される情報はいずれも、ここに特許請求される発明の従来技術もしくは関連技術であると認めるものではなく、具体的にもしくは黙示的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であると認めるものではない。
【０１５１】
他に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
【０１５２】
本出願は、読者の注意を具体的な実施形態に向けるようにセクションに分割されているが、そのようなセクションが実施形態間の区分であると解釈されるべきではない。各セクションの教示及びそこに記載の実施形態は、他のセクションに適用可能である。
【０１５３】
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更形態が可能であり、本出願が、概して本発明の原理に従い、かつ本発明が関する技術分野の範囲内の公知または通例の実施範囲内に含まれるような、また、以上に示され、添付の特許請求の範囲に従う本質的な特徴が適用されうるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形形態、使用、または適合形態を網羅するように意図されることは理解されるであろう。
【図１】
2014505681.tif 000002
【図２】
2014505681.tif 000003
【配列表】
2014505681000001.app
【国際調査報告】
2014505681.tif 000004
2014505681.tif 000005