(57)【要約】植え込み式除細動器に関する対象の必要性を決定する、心臓性突然死（ＳＣＤ）、不整脈または心不全に関する対象のリスクを決定する、抗不整脈剤、例えば、ナトリウムチャネル遮断薬に関する対象の必要性を決定する方法ならびに対象におけるＳＣＤのリスクを低下させる方法が開示されている。これら方法のそれぞれは、対象から得られる生体試料における切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料における完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）生体試料における全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含むことができる。システム、コンピュータ可読媒体およびコンピュータにおいてプロセッサにより実施される方法がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＣＤに関する対象の必要性を決定する方法であって、
対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、
（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル
と比較する比率ＲＳを決定するステップを含む、方法。
【請求項２】
ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、前記対象がＩＣＤを必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＴが、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、
（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル
と比較する比率であり、
前記対照対象が、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対象である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＴ＝μ＋４．０σであり、
式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、
前記セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、
（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル
と比較する比率を表し、
前記対照対象は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対象であり、σは、前記データ値のガウス分布の標準偏差である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＲＴが、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、
（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル
と比較する比率であり、前記対照対象が、前記対照対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＲＴ＝μ＋Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、前記セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、
（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは
（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル
と比較する比率を表し、前記対照対象は、前記対照対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象であり、σは、前記データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、前記セットの各データ値は、比率を表し、前記対照対象は、前記対照対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象であり、前記対照対象は、前記対照対象にショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象であり、σは、前記データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
Ｘが、約０．７〜約１．０の間の数である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｘが、約２．０〜約４．０の間の数である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘが、約２．３２６〜約４．０の間の数である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（Ａ）ＲＳが決定されるとき、前記対象から得られる（ｉ）前記生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルが、前記対象から得られる前記生体試料のハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化される、
（Ｂ）ＲＴが決定されるとき、前記対象から得られる（ｉ）前記生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルが、前記対照対象から得られる前記生体試料のハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化される、あるいは
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）との両方である、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）またはβ−アクチンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＳが、
【数２０】
2014508514.tif 000040
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＳが、
【数２１】
2014508514.tif 000041
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＴ＝μ＋Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の前記比率＝
【数２２】
2014508514.tif 000042
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（−）ショック」は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいは、ＲＴ＝μ＋Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の前記比率＝
【数２３】
2014508514.tif 000043
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（−）ショック」は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項６および１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の前記比率が、
【数２４】
2014508514.tif 000044
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（＋）ショック」は、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＴ＝μ−Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の前記比率が、
【数２５】
2014508514.tif 000045
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（＋）ショック」は、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
各ｍＲＮＡレベルが、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、ＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルまたはＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルである、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄのレベルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、（ｉ）ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）Ｅ２８Ａ−Ｓのレベルまたは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との組み合わせと比較される、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てのレベルと比較される、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、（Ａ）および（Ｂ）のレベルと比較され、
（Ａ）が、（ｉ）ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）Ｅ２８Ａ−Ｓのレベルまたは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との組み合わせのうちの１つであり、
（Ｂ）が、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄのうち１または複数である、
先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物が、Ｅ２８Ｃである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＳ＝ＲＥ２８Ｃ＝
【数２６】
2014508514.tif 000046
であり、式中、
Ｅ２８Ｃ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｃ＝（［対象試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＥ２８Ｃ＝
【数２７】
2014508514.tif 000047
であり、式中、
Ｅ２８Ｃ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｃ＝（［対象試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物が、Ｅ２８Ｄである、請求項１９または２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＳ＝ＲＥ２８Ｄ＝
【数２８】
2014508514.tif 000048
であり、式中、
Ｅ２８Ｄ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｄ＝（［対象試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＥ２８Ｄ＝
【数２９】
2014508514.tif 000049
であり、式中、
Ｅ２８Ｄ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｄ＝（［対象試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第一のＲＳおよび第二のＲＳを決定するステップを含み、ここで前記第一のＲＳが、Ｅ２８Ｃのレベルを全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルと比較し、前記第二のＲＳが、Ｅ２８Ｄのレベルを全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルと比較する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一のＲＳが、ＲＥ２８Ｃであり、前記第二のＲＳが、Ｅ２８Ｄである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
植え込み式除細動器（ＩＣＤ）に関する対象の必要性を決定する方法であって、
（Ａ）対象の生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、
（Ｂ）（Ａ）において決定されたＲＳを閾値比率ＲＴと比較するステップであって、請求項９７〜１０８のいずれか一項に記載のシステムによりＲＴが決定されるステップと、
を含む、方法。
【請求項２９】
Ｒｓが前記ＲＴ以上である場合、前記対象がＩＣＤを必要とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
臓性突然死（ＳＣＤ）に関する対象のリスクを決定する方法であって、
対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む、方法。
【請求項３１】
Ｒｓが閾値比率ＲＴ以上である場合、前記対象にＳＣＤのリスクがある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗不整脈療法に関する対象の必要性を決定する方法であって、
対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む、方法。
【請求項３３】
Ｒｓが閾値比率ＲＴ以上である場合、前記対象が抗不整脈療法を必要とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗不整脈剤が、Ｓｉｎｇｈ  Ｖａｕｇｈａｎ  ＷｉｌｌｉａｍｓクラスＩＡ、ＩＢ、ＩＣまたはＩＩＩ抗不整脈剤である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｓｉｎｇｈ  Ｖａｕｇｈａｎ  ＷｉｌｌｉａｍｓクラスＩＡ抗不整脈剤が、キニジン、プロカインアミドまたはジソピラミドである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｓｉｎｇｈ  Ｖａｕｇｈａｎ  ＷｉｌｌｉａｍｓクラスＩＢ抗不整脈剤が、リドカイン、フェニトイン、メキシレチンまたはトカイニドである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｓｉｎｇｈ  Ｖａｕｇｈａｎ  ＷｉｌｌｉａｍｓクラスＩＣ抗不整脈剤が、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジンまたはエンカイニドである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｓｉｎｇｈ  Ｖａｕｇｈａｎ  ＷｉｌｌｉａｍｓクラスＩＩＩ抗不整脈剤が、ドロネダロン、アミオダロンまたはイブチリドである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗不整脈剤が、ＮＡＤ＋またはｍｉｔｏＴＥＭＰＯである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項４０】
対象における心臓性突然死（ＳＣＤ）のリスクを低下させる方法であって、
（ａ）対象から得られる生体試料の、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、
（ｂ）Ｒｓが閾値比率ＲＴと比べて増加している場合、前記対象にＩＣＤを植え込むステップと、
のうちのステップを含む、方法。
【請求項４１】
ＲＴが、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率であり、前記対照対象が、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である、請求項３１および３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＴ＝μ＋４．０σであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、前記セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、前記対照対象は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象であり、σは、前記データ値のガウス分布の標準偏差である、請求項３１および３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＴが、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率であり、前記対照対象が、前記対照対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である、請求項３１および３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＲＴ＝μ＋Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、前記セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記対照対象から得られる前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、前記対照対象は、前記対照対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象であり、σは、前記データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、請求項３１および３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、前記セットの各データ値は、比率を表し、前記対照対象は、前記対照対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象であり、前記対照対象は、前記対照対象にショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象であり、σは、前記データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、請求項３１および３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
Ｘが、約０．７〜約１．０の間の数である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｘが、約２．０〜約４．０の間の数である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
Ｘが、約２．３２６〜約４．０の間の数である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
（Ａ）ＲＳが決定されるとき、前記対象から得られる（ｉ）前記生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルが、前記対象から得られる前記生体試料のハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化される、
（Ｂ）ＲＴが決定されるとき、前記対象から得られる（ｉ）前記生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルが、前記対照対象から得られる前記生体試料のハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化される、あるいは
（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）の両方である、
請求項３０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）またはβ−アクチンである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＲＳが、
【数３０】
2014508514.tif 000050
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＳが、
【数３１】
2014508514.tif 000051
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項２８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ＲＴ＝μ＋Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の比率＝
【数３２】
2014508514.tif 000052
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（−）ショック」は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいは、ＲＴ＝μ＋Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の比率＝
【数３３】
2014508514.tif 000053
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（−）ショック」は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項４４および４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の比率が、
【数３４】
2014508514.tif 000054
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（＋）ショック」は、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＴ＝μ−Ｘσである場合、前記対照対象から得られる前記生体試料の比率が、
【数３５】
2014508514.tif 000055
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（＋）ショック」は、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
各レベルが、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定される、請求項２８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、ＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルまたはＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルである、請求項２８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄのレベルである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、（ｉ）ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）Ｅ２８Ａ−Ｓのレベルまたは（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせと比較される、請求項２８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てのレベルと比較される、請求項２８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルが、（Ａ）および（Ｂ）のレベルと比較され、
（Ａ）が、（ｉ）ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）Ｅ２８Ａ−Ｓのレベルまたは（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせのうちの１つであり、
（Ｂ）が、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄのうち１または複数である、
請求項２８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物が、Ｅ２８Ｃである、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６１】
ＲＳ＝ＲＥ２８Ｃ＝
【数３６】
2014508514.tif 000056
であり、式中、
Ｅ２８Ｃ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｃ＝（［対象試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＥ２８Ｃ＝
【数３７】
2014508514.tif 000057
であり、式中、
Ｅ２８Ｃ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｃ＝（［対象試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物が、Ｅ２８Ｄである、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６３】
ＲＳ＝ＲＥ２８Ｄ＝
【数３８】
2014508514.tif 000058
であり、式中、
Ｅ２８Ｄ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｄ＝（［対象試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す、
あるいはＲＥ２８Ｄ＝
【数３９】
2014508514.tif 000059
であり、式中、
Ｅ２８Ｄ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｄ＝（［対象試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、前記対象から得られる生体試料であり、
「対照試料」は、
（ｉ）ＩＣＤを有していない、
（ｉｉ）心臓病ではない、
（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、
（ｉｖ）拡張機能障害がない、または
（ｖ）これらの組み合わせ
であることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、
「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す、
請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
第一のＲＳおよび第二のＲＳを決定するステップを含み、ここで、前記第一のＲＳが、Ｅ２８Ｃのレベルを全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルと比較し、前記第二のＲＳが、Ｅ２８Ｄのレベルを全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の前記レベルと比較する、請求項２８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記第一のＲＳが、ＲＥ２８Ｃであり、前記第二のＲＳが、Ｅ２８Ｄである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
不整脈に関する対象のリスクを決定する方法であって、
対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む、方法。
【請求項６７】
Ｒｓが閾値比率ＲＴ以上である場合、前記対象に不整脈のリスクがある、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記不整脈が、心房性不整脈、場合により、心房細動である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
心不全に関する対象のリスクを決定する方法であって、
対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む、方法。
【請求項７０】
Ｒｓが閾値比率ＲＴ以上である場合、前記対象に心不全のリスクがある、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象から得られる生体試料の（ｉ）完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）切断型ＳＣＮ５Ａ転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するステップを含む、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記測定するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応、場合によりリアルタイムＰＣＲを行うステップを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
（Ａ）前記対象から得られる生体試料の（ｉ）完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）切断型ＳＣＮ５Ａ転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するステップと、
（Ｂ）前記対象の医療記録から、（ｉ）完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、（ｉｉ）切断型ＳＣＮ５Ａ転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを得るステップと、
を含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象に抗不整脈療法を与えるステップを含む、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ＩＣＤを植え込む必要があると決定された対象にＩＣＤを植え込むステップを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象に抗不整脈剤を投与するステップを含む、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗不整脈剤が、ナトリウムチャネル遮断剤である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
（ｉ）６〜１２カ月毎に前記対象から生体試料を得るステップと、（ｉｉ）得られた各生体試料のＲＳを決定するステップとを含む、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記試料におけるＳＣＮ５Ａスプライシング因子もしくはＵＰＲタンパク質、またはシャペロンタンパク質のレベルを決定するステップを含む、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
ｈＬｕｃ７Ａ、ＲＢＭ２５またはＰＥＲＫのレベルを決定するステップを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記シャペロンタンパク質が、ＣＨＯＰまたはカルネキシンである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記生体試料が、前記対象由来の白血球、心臓細胞または筋肉細胞を含む、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記生体試料が、前記対象由来の血液である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が、５０％未満または約５０％の慢性左心室駆出率を患う、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記対象が、４０％未満または約４０％の慢性左心室駆出率を患う、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記対象が、３５％未満または約３５％の慢性左心室駆出率を患う、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記対象が、（ｉ）心筋梗塞後少なくとも４０日で非虚血性拡張型心筋症または虚血性心疾患を患う、（ｉｉ）慢性的に医学療法を受けていながらも、ＮＹＨＡ機能的クラスＩＩまたはＩＩＩ対象として分類される、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象が、構造的心疾患を有する、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記対象が、ＩＣＤを有する、請求項３０〜４４および４６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象が、ＨＦと診断されている、先行する請求項のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
キットであって、
（ａ）Ｅ２８Ｃ結合剤および／またはＥ２８Ｄ結合剤、
（ｂ）ＷＴ  ＳＣＮ５Ａ結合剤および／またはＥ２８Ａ−Ｓ結合剤、ならびに
使用のための説明書
を含むキット。
【請求項９２】
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄに対する結合剤をさらに含む、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
前記結合剤が、核酸である、請求項９１または９２に記載のキット。
【請求項９４】
キットであって、
（Ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、前記比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第一の集団の各対象が、ショックを与えたＩＣＤを有することが既知の対象である、複数のデータ値、
（ＩＩ）前記複数のデータ値のガウス分布、
（ＩＶ）前記ガウス分布の平均値および標準偏差または
（Ｖ）前記複数のデータ値の前記ガウス分布の平均値および標準偏差に基づく閾値比率ＲＴ
を記憶したコンピュータ可読記憶媒体、あるいは
（Ｉ）〜（Ｖ）のうちいずれか１もしくは複数へのアクセス
を含むキット。
【請求項９５】
キットであって、
（Ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、前記比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第一の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である、複数のデータ値、
（ＩＩ）前記複数のデータ値のガウス分布、
（ＩＶ）前記ガウス分布の平均値および標準偏差または
（Ｖ）前記複数のデータ値の前記ガウス分布の前記平均値および前記標準偏差に基づく閾値比率ＲＴ
を記憶したコンピュータ可読記憶媒体、あるいは
（Ｉ）〜（Ｖ）のうちいずれか１もしくは複数へのアクセス
を含むキット。
【請求項９６】
キットであって、
（Ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、前記比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第一の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である、複数のデータ値、
（ＩＩ）前記複数のデータ値のガウス分布、
（ＩＶ）前記ガウス分布の平均値および標準偏差または
（Ｖ）前記複数のデータ値の前記ガウス分布の前記平均値および前記標準偏差に基づく閾値比率ＲＴ
を記憶したコンピュータ可読記憶媒体、あるいは
（Ｉ）〜（Ｖ）のうちいずれか１もしくは複数へのアクセス
を含むキット。
【請求項９７】
システムであって、
プロセッサと、
前記プロセッサに連結したメモリデバイスであって、前記メモリデバイスは、前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、
（ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσに設定させ、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、
機械可読命令を記憶する、メモリデバイスと、
を含むシステム。
【請求項９８】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項９７に記載のシステム。
【請求項９９】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項９７に記載のシステム。
【請求項１００】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０１】
前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、インプットとしてＲｓを受け取らせ、ＲｓをＲＴと比較させる機械可読命令を含む、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０２】
前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、ＲｓとＲＴとの間の関係性を表示するアウトプットを提示させる機械可読命令を含む、請求項１０１に記載のシステム。
【請求項１０３】
前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、
（ｉ）第二の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第二の複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第二の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である第二の複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記第二の複数のデータ値を第二のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記第二のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第二の閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσに設定させ、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、
機械可読命令を含む、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０４】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１０３に記載のシステム。
【請求項１０５】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１０３に記載のシステム。
【請求項１０６】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１０５に記載のシステム。
【請求項１０７】
前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、
（ｉ）第三の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第三の複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第三の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である第三の複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記第三の複数のデータ値を第三のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記第三のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第三の閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定させる、
機械可読命令を含む、請求項９７〜１０６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０８】
前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、前記第一のガウス分布の曲線下面積が最大化され、前記第二のガウス分布の曲線下面積が最小化される点に、組み合わせた閾値比率ＲＴ組み合わせを設定させる機械可読命令を含む、請求項１０３〜１０７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０９】
システムであって、
プロセッサと、
前記プロセッサに連結したメモリデバイスであって、前記メモリデバイスは、前記プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、
（ｉ）複数のデータ値の各データ値が、集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記複数のデータ値をガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記ガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσに設定させ、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、
機械可読命令を記憶するメモリデバイスと、
を含むシステム。
【請求項１１０】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１１】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１２】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１１１に記載のシステム。
【請求項１１３】
システムであって、
プロセッサにより実行されると、前記プロセッサに、
（ｉ）複数のデータ値の各データ値が、集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記複数のデータ値をガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記ガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定させる、
機械可読命令を含むシステム。
【請求項１１４】
プロセッサにより実行可能な機械可読命令を記憶したコンピュータ可読記憶媒体であって、
（ｉ）前記プロセッサに複数のデータ値を受け取らせるための命令であって、各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である、命令と、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させるための命令と、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させるための命令と、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσに設定させるための命令であって、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、命令と、
を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１５】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１１４に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１６】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１１４に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１７】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１１６に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１８】
前記プロセッサに、インプットとしてＲｓを受け取らせ、ＲｓをＲＴと比較させるための命令を含む、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１９】
前記プロセッサに、ＲｓとＲＴとの間の関係性を示すアウトプットを提示させるための命令を含む、請求項１１８に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２０】
前記プロセッサに、
（ｉ）第二の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第二の複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第二の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である第二の複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記第二の複数のデータ値を第二のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記第二のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第二の閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσに設定させ、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、
ための命令を含む、請求項１１４〜１１９のいずれか一項に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２１】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１２０に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２２】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１２０に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２３】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１２２に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２４】
前記プロセッサに、
（ｉ）第三の複数のデータ値の各データ値が第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第三の複数のデータ値であって、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第三の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である第三の複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）前記第三の複数のデータ値を第三のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）前記第三のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第三の閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定させる
ための命令を含む、請求項１１４〜１２３のいずれか一項に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２５】
前記プロセッサに、前記第一のガウス分布の曲線下面積が最大化され、前記第二のガウス分布の曲線下面積が最小化される点において、組み合わせた閾値比率ＲＴ組み合わせを設定させるための命令を含む、請求項１２０〜１２４のいずれか一項に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２６】
プロセッサにより実行可能な機械可読命令を記憶したコンピュータ可読記憶媒体であって、
（ｉ）前記プロセッサに複数のデータ値を受け取らせるための命令であって、前記複数のデータ値の各データ値が、集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である、命令と、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数のデータ値をガウス分布に適合させるための命令と、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、前記ガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させるための命令と、
（ｉｖ）前記プロセッサに、閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσに設定させるための命令であって、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、命令と、
を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２７】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１２６に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２８】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１２６に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２９】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１２８に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１３０】
プロセッサにより実行可能な機械可読命令を記憶したコンピュータ可読記憶媒体であって、
（ｉ）前記プロセッサに複数のデータ値を受け取らせるための命令であって、前記複数のデータ値の各データ値が、集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である、命令と、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数のデータ値をガウス分布に適合させるための命令と、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、前記ガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させるための命令と、
（ｉｖ）前記プロセッサに、閾値比率ＲＴ３をμ＋４．０σに設定させるための命令と、
を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１３１】
コンピュータにおいてプロセッサにより実施される方法であって、
（ｉ）複数のデータ値を受け取るステップであって、各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である、ステップと、
（ｉｉ）前記複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉ）前記第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｉｉ）第一の閾値比率ＲＴをμ−Ｘσに設定するステップであって、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、ステップと、
を含む、方法。
【請求項１３２】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
インプットとしてＲｓを受け取り、ＲｓをＲＴと比較するステップを含む、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
ＲｓとＲＴとの間の関係性を示すアウトプットを提示するステップを含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
（ｉ）第二の複数のデータ値を受け取るステップであって、前記第二の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第二の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である、ステップと、
（ｉｉ）前記第二の複数のデータ値を第二のガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記第二のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｖ）第二の閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσに設定するステップであって、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、ステップと、
を含む、請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
（ｉ）第三の複数のデータ値を受け取るステップであって、前記第三の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記第三の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である、ステップと、
（ｉｉ）前記第三の複数のデータ値を第三のガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記第三のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｖ）第三の閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定するステップと、
を含む、請求項１３１〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第一のガウス分布の曲線下面積が最大化され、前記第二のガウス分布の曲線下面積が最小化される点に、組み合わせた閾値比率ＲＴ組み合わせを設定するステップを含む、請求項１３７〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
コンピュータにおいてプロセッサにより実施される方法であって、
（ｉ）複数のデータ値を受け取るステップであって、前記複数のデータ値の各データ値が、集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である、ステップと、
（ｉｉ）前記複数のデータ値をガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記ガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｖ）閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσに設定するステップであって、式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である、ステップと、
を含む、方法。
【請求項１４４】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、０．７〜１．０の間の数である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４５】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．０〜４．０の間の数である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４６】
ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘが、２．３２６〜４．０の間の数である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
コンピュータにおいてプロセッサにより実施される方法であって、
（ｉ）複数のデータ値を受け取るステップであって、前記複数のデータ値の各データ値が、集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、前記比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）前記生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）前記生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、前記集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である、ステップと、
（ｉｉ）前記複数のデータ値をガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記ガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｖ）閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１１年１月６日に出願された米国仮特許出願第６１／４３０，４６２号、２０１１年８月２６日に出願された米国仮出願第６１／５２７，８９０号、２０１１年８月２６日に出願された米国仮出願第６１／５２７，９１６号および２０１１年１１月８日に出願された米国仮出願第６１／５５７，２０３号に対する優先権を主張する。これらの出願の各々の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
米国政府の利益に関する記述
本発明は、米国政府の支援により、国立衛生研究所（ＮＩＨ）国立心臓肺血液研究所（National  Heart,  Lung  and  Blood  Institute）（ＮＨＬＢＩ）助成番号（Grant  No.）Ｒ０１  ＨＬ１０２４０２５−０１Ａ１およびＮＩＨ中小企業技術移転（Small  Business  Technology  Transfer）（ＳＴＴＲ）助成番号１Ｒ４１ＨＬ１１２３５５−０１Ａ１の下に為されたものである。米国政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
【０００３】
電子提出された資料の参照による援用
２０１２年１月６日に作成された「４６４６３Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と命名された２メガバイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして同定される、本明細書と同時に提出したコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全体が参照により援用される。
【背景技術】
【０００４】
心不全（ＨＦ）は、米国における主要な医療上の懸案事項を表す。米国におけるおよそ５百万人の患者がＨＦであり、毎年、さらに５５０，０００名がこの疾患と診断されると推定された（非特許文献１）。当然ながら、ＨＦは、入院において最も多く見られる診断である。
【０００５】
ＨＦ患者は、非ＨＦ患者よりも６〜９倍高い心臓性突然死（ＳＣＤ）のリスクを有し、心不整脈は、ＨＦ患者における主な死亡原因である（非特許文献２；非特許文献３）。ＳＣＤを予防するための「最も信頼できる標準（gold  standard）」は、植え込み式除細動器（implanted  cardiac  defibrillator）（ＩＣＤ）の植え込みである。広範な臨床治験は、ＩＣＤの植え込みが寿命を延ばすことを支持する。
【０００６】
現在、ＩＣＤは、３５％未満の慢性左心室駆出率（ＥＦ）を有するあらゆる患者に適応される（非特許文献４）。心筋梗塞後少なくとも４０日で非虚血性拡張型心筋症または虚血性心疾患を有し、３５％以下のＥＦを有し、慢性的に最適な医学療法を受けていながらニューヨーク心臓協会（New  York  Heart  Association）（ＮＹＨＡ）機能的クラスＩＩまたはＩＩＩ症状があり、１年間を超えて良好な機能状態で妥当な生存期待値を有する患者における全死亡率を低下させるために、米国心臓病学会（American  College  of  Cardiology）と米国心臓協会（American  Heart  Association）は両者共に、心臓性突然死一次予防のために植え込み式除細動器（ＩＣＤ）の設置を推奨する（Level  of  Evidence：A；非特許文献４）。
【０００７】
これらの指針が広く受け入れられ実施されているにもかかわらず、ＩＣＤを有する患者の６０％超は、その必要がないためＩＣＤからのショックを経験していない（非特許文献５）。このように、ＩＣＤを不必要に受け入れた患者が多く存在する。
【０００８】
平均すると、ＩＣＤは、手術、経過観察および合併症にかかる費用を除いて＄２０，０００〜＄５０，０００の間の費用がかかる。また、植え込み外科手術それ自体が、大量出血、気胸、心臓の穿孔、不整脈誘導、脳卒中、心発作、緊急心臓外科手術の必要および死亡等、合併症のさらなる患者リスクをもたらす。
【０００９】
ＳＣＤリスク層別化および患者におけるＩＣＤ設置の必要性を決定するための現在の方法は、この目標を達成するための単純かつ対費用効果の高い方法を提供することができていない。その方法は、基本的に駆出分画率（ＥＦ）のみを査定するものでＳＣＤリスク層別化の複雑さを過度に単純化しているか、またはその方法は、過度に複雑であるか、観血的であるか、もしくは費用がかかる。ＥＦに注目する方法は、恐らくは催不整脈性病態生理学的過程を直接的に反映しないことが原因で、低リスク患者と高リスク患者との間を十分に識別せず、一方、他のＦＤＡに認可された技法、例えば、平均加算心電図（ＳＡＥＣＧ）およびＴ波交互脈は、これらを実施するための設備費および人件費が高すぎるため広く利用されていない。また、一部の研究は、それらが有用性を欠くことを実証した（８〜１０）。加えて、同様の理由により、観血的電気生理学的検査の大部分も放棄された。リスクは時間と共に変化し得るため、これらの多くを要する技法は、仮に用いるとしても、多くの場合、患者１名当たり単一の査定に制限される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Huntら、Circulation  １１２巻：ｅ１５４〜Ｅ２３５頁（２００５年）
【非特許文献２】Rogerら、Circulation  １２１巻（７号）：ｅ４６〜ｅ２１５頁（２０１０年）
【非特許文献３】Kannelら、Am  Heart  J  １１５巻：８６９〜８７５頁（１９８８年）
【非特許文献４】Huntら、Circulation  １１９巻：ｅ３９１〜Ｅ４７９頁（２００９年）
【非特許文献５】Bardyら、N  Eng  J  Med  ３５２巻：２２５〜２３７頁（２００５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述に鑑み、本技術分野において、ＳＣＤリスクを決定し、ＩＣＤインプラントに関する患者の必要性を決定するための単純かつ安価な血液検査が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書に提供されている本発明は、患者にショックを与える植え込み式除細動器（ＩＣＤ）を備える患者が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアント転写産物のレベルの増加を示し、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルの低下を示すことを実証するデータに一部に基づく。
【００１３】
従って、本発明は、植え込み式除細動器（ＩＣＤ）に関する対象の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを決定するステップを含む。例示的な実施形態において、方法は、野生型（ＷＴ）エクソン２８転写産物、Ｅ２８Ａ転写産物、Ｅ２８Ｂ転写産物、Ｅ２８Ｃ転写産物およびＥ２８Ｄ転写産物の全てを包含する全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを決定するステップを含む。
【００１４】
例示的な実施形態において、ＩＣＤに関する対象の必要性を決定する方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００１５】
本発明はまた、（Ａ）対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、（Ｂ）（Ａ）において決定されたＲｓを、システムにより決定された閾値比率ＲＴと比較するステップとを含む、ＩＣＤに関する対象の必要性を決定する方法を提供する。例示的な態様において、システムは、プロセッサと、プロセッサに連結したメモリデバイスとを含み、メモリデバイスは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ａ）完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｂ）全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である、複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる、
機械可読命令を記憶する。
【００１６】
本システムは、他の関連システム、プロセッサにより実行可能な機械可読命令を記憶した関連コンピュータ可読記憶媒体およびコンピュータにおいてプロセッサにより実施される関連方法と共に、本明細書において提供される。
【００１７】
ＩＣＤからショックを受ける患者は、心臓性突然死のリスクが高い。よって、本発明は、心臓性突然死に関する対象のリスクを決定する方法をさらに提供する。例示的な態様において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００１８】
心臓性突然死のリスクがある患者は、抗不整脈療法の一形態を処方される。このように、本発明は、抗不整脈療法に関する対象の必要性を決定する方法を追加的に提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００１９】
本発明は、対象における心臓性突然死（ＳＣＤ）のリスクを低下させる方法をさらに提供する。例示的な実施形態において、方法は、（Ａ）対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、（Ｂ）ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象にＩＣＤまたは抗不整脈剤を投与するステップとを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００２０】
本発明は、対象への抗不整脈療法の投与が安全となるか決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００２１】
不整脈に関する対象のリスクを決定する方法もまた提供される。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００２２】
本発明は、心不全に関する対象のリスクを決定する方法をその上さらに提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＤ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）の合計レベルと比較する。例示的な態様において、Ｒｓは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの合計レベルと比較する。
【００２３】
本明細書において、ＩＣＤもしくは抗不整脈剤に関する対象の必要性を決定するため、ＳＣＤ、心不全もしくは不整脈に関する対象のリスクを決定するため、または対象への抗不整脈剤の投与が安全となるか決定するために有用なキットがその上さらに提供される。例示的な態様において、キットは、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するための試薬と、（ｉｉ）生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するための試薬とを含む。例示的な態様において、キットは、使用のための説明書またはそれへのアクセスを含む。例示的な態様において、本明細書においてさらに記載する通り、キットは、システムまたはプロセッサにより実行可能な機械可読命令を記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ヒトＳＣＮ５Ａ遺伝子の５’端において同定されたスプライスバリアントの略図である。マップは、非翻訳（白いバー）または翻訳（黒いバー（closed  bar））転写配列および非転写配列（線）を備えるＳＣＮ５Ａのゲノム構造を示す。３種のエクソン１アイソフォームそれぞれのスプライシングパターンが同定される。
【図２】図２は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ１、Ｅ１Ｂ２、Ｅ１Ｂ３、Ｅ１Ｂ４、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ１およびＥ２Ｂ２のｃＤＮＡ配列を示す。
【図３】図３は、ヒトＳＣＮ５Ａ遺伝子の３’端において同定されたスプライスバリアントの略図である。マップの上に、非翻訳（白いバー）または翻訳（黒いバー）転写配列および非転写配列（線）を備えるＳＣＮ５Ａのゲノム構造を示す。４種のエクソン２８アイソフォームそれぞれのスプライシングパターンが同定される。
【図４Ａ】図４は、Ｅ２８Ａ（図４Ａおよび４Ｂ）、Ｅ２８Ｂ（図４Ｃ）、Ｅ２８Ｃ（図４Ｄ）およびＥ２８Ｄ（図４Ｅ）のｃＤＮＡ配列を示す。
【図４Ｂ】図４は、Ｅ２８Ａ（図４Ａおよび４Ｂ）、Ｅ２８Ｂ（図４Ｃ）、Ｅ２８Ｃ（図４Ｄ）およびＥ２８Ｄ（図４Ｅ）のｃＤＮＡ配列を示す。
【図４Ｃ】図４は、Ｅ２８Ａ（図４Ａおよび４Ｂ）、Ｅ２８Ｂ（図４Ｃ）、Ｅ２８Ｃ（図４Ｄ）およびＥ２８Ｄ（図４Ｅ）のｃＤＮＡ配列を示す。
【図４Ｄ】図４は、Ｅ２８Ａ（図４Ａおよび４Ｂ）、Ｅ２８Ｂ（図４Ｃ）、Ｅ２８Ｃ（図４Ｄ）およびＥ２８Ｄ（図４Ｅ）のｃＤＮＡ配列を示す。
【図４Ｅ】図４は、Ｅ２８Ａ（図４Ａおよび４Ｂ）、Ｅ２８Ｂ（図４Ｃ）、Ｅ２８Ｃ（図４Ｄ）およびＥ２８Ｄ（図４Ｅ）のｃＤＮＡ配列を示す。
【図５】図５は、転写開始点（ＴＳＳ）、ヒト心臓性ＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン１バリアントを検出するためのＰＣＲ結果を示すゲル写真である。胎児および成人心臓由来の全ＲＮＡを用いて、ＳＣＮ５Ａ特異的プライマーによりＴＳＳおよびエクソン１アイソフォームを確定した。ＲＡＣＥ−ＰＣＲ結果は、胎児心臓（ＦＨ）および成人心臓（ＡＨ）の両方における総計３本のバンド（hand）（３８０、２００および１００ｂｐ）が、心臓性特異的Ｎａ＋チャネル配列を含有したことを示す。第一のバンド３８０ｂｐは、以前に報告されたエクソン１Ａに対応する。第二のバンド２００ｂｐは、複数のＴＳＳを備えるエクソン１Ｂ（Ｅ１Ｂ）と称する（referred  as  to）新規のエクソン１アイソフォームであり、一方、第三の１００ｂｐバンドは、複数のＴＳＳを備えるエクソン２Ｂ（Ｅ２Ｂ）と称するエクソン１アイソフォームである。
【図６】図６は、ヒト心臓性ＳＣＮ５Ａ遺伝子の３’ＵＴＲアイソフォームを検出するためのＲＡＣＥ−ＰＣＲ結果を示すゲル写真である。ヒト胎児および成人心臓由来の全ＲＮＡを用いて、ＳＣＮ５Ａ遺伝子特異的プライマーＧＳＰ３’により３’ＵＴＲを確定した。最初の２レーン（line）は、ＲＡＣＥ産物の１回目のＰＣＲであり、最後の２バンドは、２回目のＲＡＣＥ−ＰＣＲ結果であり、胎児心臓レーン（ＦＨ）は、３本のバンドを示し、その内より大きい目に見えるバンドが、ヒト心臓性Ｎａ＋チャネル配列の８３４ｂｐの短い３’ＵＴＲに対応することを示す。第二のバンド（約１．４ｋｂ）は、胎児心臓（ＦＨ）のみに見られ、一方、第三のバンドは、０．２５および０．３ｋｂバンドとして胎児および成人心臓の両方に見られる。最後のバンドは０．２ｋｂであり、これは成人心臓にのみ検出された。４種のエクソン２８アイソフォームの存在を配列決定により確認した。
【図７】図７は、４種のＳＣＮ５Ａ転写アイソフォームのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（一文字表記）のアライメントを示す図表である。アイソフォーム名および最初のＡＵＧコドンから開始されるヌクレオチド塩基対ナンバリングを左に示す。配列は、エクソン２７（影付き）から開始し、ポリＡテールへと続く。イントロンは、点線として示す。エクソンＢ、ＣおよびＤのスプライシングは、フレームシフトおよび未成熟終止コドンを生じる。アミノ酸１６５２におけるメチオニンを太字で示し、遺伝子標的化マウスにおける終止コドンの導入部位を示す。
【図８】図８は、心臓性Ｎａ＋チャネルの推定二次構造を示す図面である。
【図９】図９は、ヒトＳＣＮ５Ａエクソン２８アイソフォームの発生制御を示す１セットのグラフである。胎児（ＦＨ、白いバー）および成人心臓（ＡＨ、黒いバー）における４種のアイソフォームの相対存在量を図９Ａに示す。図９Ｂは、各アイソフォームの存在量を総ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡのパーセンテージとして示す。いずれの場合においても、完全長転写産物（Ｅ２８Ａ）が、最も多く見られた。エクソン２８Ｄ（Ｅ２８Ｄ）は、次に豊富であった。エクソン２８Ｂ（Ｅ２８Ｂ）は、胎児心臓において最も少量であり、エクソン２８Ｃ（Ｅ２８Ｃ）は、成人心臓において最も少量であった。Ｅ２８ＢおよびＥ２８Ｄは、胎児心臓と比較して、成人心臓において増加した。＊ｐ＜０．０５、ＦＨをＡＨと比較した場合。
【図１０】図１０は、Ｃ末端アイソフォームｍＲＮＡ存在量が、対照および罹患心臓の間で変動することを示す１セットのグラフである。リアルタイムＰＣＲ結果は、各試料における総ｍＲＮＡ存在量に対するアイソフォーム存在量を示す。総心室（図１０Ａ）、左心室（図１０Ｂ）および右心室（図１０Ｃ）毎に、対照（黒バー）およびＨＦ（白いバー）患者における４種のエクソン２８バリアントの変化を決定した。それぞれ図１０Ｂおよび図１０Ｃにおける左および右心室を比較すると、アイソフォーム存在量変化が、左心室においてより顕著であることが示される。全事例において参照としてベータ−アクチンを用いた。ｍＲＮＡ存在量は全て、正常ヒト心室エクソン２８Ｄ  ｍＲＮＡ存在量の１種に対して正規化した。＊ｐ＜０．０５、対照をＨＦ心臓と比較した場合。
【図１１】図１１は、ヒトＳＣＮ５Ａエクソン２８アイソフォームの組織特異的発現を示す１セットのゲル写真である。ＲＴ−ＰＣＲ結果は、アイソフォームＥ２８ＡおよびＤが、ヒト心臓のみならず骨格筋（ＳＫＭ）においても発現したことを示す。全４種のアイソフォームは、リンパ芽球に見出された。内部参照としてベータ−アクチンを用いた。
【図１２】図１２は、心臓性Ｎａ＋チャネル電流を低下させるモデル切断を示す１セットのグラフである。スプライス変種の生理学的役割を検査するため、ジーンターゲティングによりモデル切断をマウスＥＳ細胞の単一アレルに導入した。図１２Ａは、アレル変化ありまたはなしの心筋細胞を電気生理学的に試験したことを示す。野生型（黒四角）および切断型（白い四角）のＮａ＋チャネル電流−電圧曲線を示す。図１２Ｂは、２細胞型間のピーク電流の比較を示す。ｍＲＮＡスプライス変種の領域における切断の導入は、ピークＮａ＋電流の相当な低下をもたらした。図１２Ｃは、自発的に拍動する野生型（灰色の線）および変異体ＣＭ（黒線）の、電流固定モードで記録された活動電位（ＡＰ）を示す。図１２Ｄは、２種のＣＭ間の拍動数、ＡＰ振幅およびＡＰ立ち上がり速度を比較する。切断変異体は、拍動数（１秒当たりの拍動）、ＡＰ振幅（ｍＶ／１０）および最大ＡＰ立ち上がり速度（ｍＶ／ｍｓ）の低下を示し、これはＮａ＋電流低下と一致する。＊、ｐ＜０．０５。
【図１３−１】図１３は、モデル切断の導入ありおよびなしの分化ＣＭの多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を示す１セットのグラフである。図１３Ａは、単一ＭＥＡ電極から記録されたシンシチウム野生型および切断型含有ＣＭの代表的なフィールド電位（ＦＰ）を図解する。図１３Ｂは、１９日目に記録されたフィールド電位最小（ＦＰｍｉｎ）を比較する。ＦＰｍｉｎは、切断の導入により有意に減少した。図１３Ｃは、ＦＰｍｉｎまでの時間（即ち、フィールド電位上昇時間、ＦＰ上昇）が、野生型と比較して切断型ＣＭにおいて遅くなったことを示す。伝導速度は、切断型心筋細胞（図１３Ｄ）において大幅に減少した。あらゆる変化は、Ｎａ＋電流低下と一致する。＊ｐ＜０．０５、野生型および切断型の間。
【図１３−２】図１３は、モデル切断の導入ありおよびなしの分化ＣＭの多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を示す１セットのグラフである。図１３Ａは、単一ＭＥＡ電極から記録されたシンシチウム野生型および切断型含有ＣＭの代表的なフィールド電位（ＦＰ）を図解する。図１３Ｂは、１９日目に記録されたフィールド電位最小（ＦＰｍｉｎ）を比較する。ＦＰｍｉｎは、切断の導入により有意に減少した。図１３Ｃは、ＦＰｍｉｎまでの時間（即ち、フィールド電位上昇時間、ＦＰ上昇）が、野生型と比較して切断型ＣＭにおいて遅くなったことを示す。伝導速度は、切断型心筋細胞（図１３Ｄ）において大幅に減少した。あらゆる変化は、Ｎａ＋電流低下と一致する。＊ｐ＜０．０５、野生型および切断型の間。
【図１４】図１４は、細胞生存率検査を示す１セットのグラフである。図１４Ａ：アンジオテンシンＩＩ濃度に応じた４８時間目のＨ９ｃ２心筋細胞生存率。図１４Ｂ：Ｈ２Ｏ２に応じた４８時間目のＨ９ｃ２心筋細胞生存率。＊、Ｐ＜０．０５、１０．ｍｕ．ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２Ｏ２と比較した場合。
【図１５】図１５は、ＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２による心臓性Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡの下方制御を示す１セットのグラフである。無血清培地（ＳＦＭ）において培養した、あるいはＡｎｇＩＩ（１００ｎＭもしくは２ｎＭ）、Ｈ２Ｏ２（２０．ｍｕ．Ｍもしくは４０ｎＭ）またはＡｎｇＩＩ（１００ｎＭもしくは２ｎＭ）とＰＥＧ−カタラーゼ（２５０Ｕ／ｍＬ）に４８時間曝露したＨ９ｃ２または急性摘出した新生児心筋細胞。ＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２は、Ｈ９ｃ２（図１５Ａ）および新生児心筋細胞（図１５Ｂ）の両方におけるＮａ＋チャネルｍＲＮＡ存在量の低下を生じた。どちらの場合においても、ＡｎｇＩＩ効果は、ＰＥＧ−カタラーゼにより防止できた（ＡｎｇＩＩ＋ＣＡＴ）。＊、Ｐ＜０．０５。
【図１６】図１６は、心臓性Ｎａ＋チャネル電流が、Ｈ２Ｏ２により下方制御されることを示す１セットのグラフである。図１６Ａは、４８時間のＨ２Ｏ２曝露前後の−１０ｍＶまでの電圧ステップにより、Ｈ９ｃ２  ＣＭから記録される代表的なＮａ＋電流を示す。図１６Ｂは、Ｈ２Ｏ２曝露（２０．ｍｕ．Ｍ、４８時間）が、ピークＮａ＋電流の４６％（．＋−．２．９％、ｐ＝０．０１）低下をもたらしたことを示す。＊、Ｐ＜０．０５。
【図１７】図１７は、Ｎａ＋チャネルプロモーターにおけるＮＦ−カッパーＢ結合部位の変異が、ＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２の効果を排除することを示す。図１７Ａは、マウスｓｃｎ５ａプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ７６９９８１）に用いたプロモーター−レポーター断片の関係性を示す。上の線は、ｓｃｎ５ａプロモーター（３．０ｋｂ）のこの領域の構造機構を示す。非翻訳エクソン１Ｃと、翻訳開始点を含有するエクソン２の一部の存在に留意されたい。ヌクレオチドナンバリングは、タンパク質翻訳開始点に対応する＋１から始まる。ＮＦ−カッパーＢ部位（菱形−中実）を含有する構築物ＡＰＳ３は、１００ｎＭ  ＡｎｇＩＩまたは２０．ｍｕ．Ｍ  Ｈ２Ｏ２への４８時間の曝露後に活性低下を示した。ＮＦ−カッパーＢ結合部位の変異は、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２効果を防止した（図１７Ｂ）。データは、平均値．＋−．Ｓ．Ｅ．Ｍとして提示され、両群における４回の別個の実験に基づく。
【図１８】図１８は、ＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２が、ｓｃｎ５ａプロモーターへのＮＦ−カッパーＢ結合を誘導することを示すゲルの１セットの写真である。図１８Ａは、Ｈ９ｃ２心筋細胞の核抽出物による電気泳動移動度シフトアッセイが、基本条件（ＳＦＭ）下において、ｓｃｎ５ａプロモーターへのＮＦ−カッパーＢの結合はほとんど見られなかったことを示したことを示す。Ｈ２Ｏ２またはＡｎｇＩＩ曝露は、プロモーターへのＮＦ−カッパーＢ結合をもたらした。ＴＮＦ−アルファ活性化Ｈ９ｃ２細胞核抽出物（５．ｍｕ．ｇ）を陽性対照として用いた。ＮＦ−カッパーＢ阻害剤であるＣＡＰＥ（コーヒー酸フェネチルエステル）は、Ｈ２Ｏ２に応答した結合を防止した。ＡｎｇＩＩ誘導性のＮＦ−カッパーＢ結合は、非標識プローブにより阻害されたが、変異体非標識プローブによっては阻害されなかった。図１８Ｂは、ＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２が、心臓性Ｎａ＋チャネルプロモーターへのＮＦ−カッパーＢのｐ５０サブユニットの結合を促進することを示す。ｓｃｎ５ａプロモーターに特異的なプライマーを用いた染色体免疫沈降アッセイは、ＮＦ−カッパーＢのｐ６５サブユニットが、チャネルプロモーターに構成的に結合していると考えられるが、ｐ５０サブユニットは、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２に応答して結合することを示す。ＣＡＰＥおよびＮＦ−カッパーＢの阻害剤は、チャネルプロモーターへの両方のサブユニットの結合（biding）を防止することができた。レーン１および２は、それぞれ陽性および陰性対照である。インプットＤＮＡを１：１０で希釈した。
【図１９】図１９は、ｐ５０  ＮＦ−カッパーＢサブユニットの過剰発現が、Ｎａ＋チャネル転写下方制御をもたらすことを示す。パネルＡは、ｐ５０、ｐ６５またはその両方をコードするベクターを安定的にトランスフェクトしたＨ９ｃ２細胞におけるｐ５０またはｐ６５  ＮＦ−カッパーＢサブユニットＲＮＡの存在を示す。Ｃｏｎは、対照細胞を表す。パネルＢ：定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果は、相対ｓｃｎ５ａ  ｍＲＮＡ存在量が、対照（Ｃｏｎ）と比較してｐ５０サブユニットを発現する細胞株において減少したことを示す。＊ｐ＜０．０５、ｖｓ．対照。
【図２０】図２０は、年齢に応じたＳＣＮ５Ａスプライスバリアントの存在量の比較を示すグラフである。３種の年齢群、４０〜４９（４０代）、５０〜５９（５０代）および６０〜６９（６０代）に対象を分けた後、スプライスバリアントの相対ｍＲＮＡ存在量を比較すると、スプライスバリアント存在量が、年齢の関数であるとは考えられないことが示される。
【図２１】図２１は、マウスＳＣＮ５Ａ切断モデルを作製するための標的化戦略を示す１セットの線図である。図２１Ａ：標的化ベクターｐＢＳＫ．ＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐを未変性ＳＣＮ５Ａエクソン２８領域（ＷＴ  ＳＣＮ５Ａアレル）にマッピングした。図２１Ｂ：ＷＴアレルへの標的化ベクターの取り込みを示すマップ。図２１Ｃ：ネオマイシン抵抗性カセットをＣｒｅ介在性切除してＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐを作製した後に、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａアレルに導入された切断変異のマップ。遺伝子型判定のための制限消化、ＰＣＲプライマーならびにハイブリダイゼーションプローブＡ（３．１ｋｂのＰｖｕＩＩ断片）およびＢ（３．７１ｋｂのＰｖｕＩＩ断片）を表示する。
【図２２−１】図２２は、ＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐの相同組換えの遺伝子型判定を示す１セットのゲル写真である。図２２Ａ：アッパー（upper）およびロウワー（lower）ＰＣＲアンプリコンを用いたＰＣＲ解析（方法および図Ｓ２を参照）は、ヘテロ接合（．＋−．）では適切な組換えがあり、野生型（ＷＴ）マウス（＋／＋）ではないことを実証している。図２２Ｂおよび２２Ｃ：標的ＥＳ細胞の単一アレルにおける切断ベクターの適切な取り込み（．＋−．）を示す、外部プローブＡおよびＢによるサザンブロット解析。図２２Ｄ：ネオマイシン抵抗性カセットの切除が成功する前（ｎｅｏ＋）および後（ｎｅｏ−）における、適切に標的化されたＥＳ細胞クローンのＰＣＲ結果。標的化ベクターを対照として用いた。図２２Ｅ：標的化ベクターの取り込みを実証するためのＢｓｐＨＩ制限消化。コーディング変異の導入は、ＢｓｐＨＩ制限部位の排除をもたらした。よって、適切な標的化のアレルは、この領域にまたがるＰＣＲアンプリコンのＢｓｐＨＩ消化を行った場合、未変性配列（野生型、ＷＴ）から生じる３９５ｂｐおよび１５０ｂｐ断片と比較して、標的化されたアレル（ヘテロ接合、．＋−．）を表す追加的な５４５ｂｐ断片を呈示した。
【図２２−２】図２２は、ＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐの相同組換えの遺伝子型判定を示す１セットのゲル写真である。図２２Ａ：アッパー（upper）およびロウワー（lower）ＰＣＲアンプリコンを用いたＰＣＲ解析（方法および図Ｓ２を参照）は、ヘテロ接合（．＋−．）では適切な組換えがあり、野生型（ＷＴ）マウス（＋／＋）ではないことを実証している。図２２Ｂおよび２２Ｃ：標的ＥＳ細胞の単一アレルにおける切断ベクターの適切な取り込み（．＋−．）を示す、外部プローブＡおよびＢによるサザンブロット解析。図２２Ｄ：ネオマイシン抵抗性カセットの切除が成功する前（ｎｅｏ＋）および後（ｎｅｏ−）における、適切に標的化されたＥＳ細胞クローンのＰＣＲ結果。標的化ベクターを対照として用いた。図２２Ｅ：標的化ベクターの取り込みを実証するためのＢｓｐＨＩ制限消化。コーディング変異の導入は、ＢｓｐＨＩ制限部位の排除をもたらした。よって、適切な標的化のアレルは、この領域にまたがるＰＣＲアンプリコンのＢｓｐＨＩ消化を行った場合、未変性配列（野生型、ＷＴ）から生じる３９５ｂｐおよび１５０ｂｐ断片と比較して、標的化されたアレル（ヘテロ接合、．＋−．）を表す追加的な５４５ｂｐ断片を呈示した。
【図２３】図２３は、ヒトＨＦ組織におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現の効果を実証する。（Ａ）ｑＰＣＲは、ヒトＨＦ組織におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の上方制御を実証する。正常対照（白バー）および不全の心臓組織（黒バー）の両方におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の相対発現変化を示す。ｍＲＮＡ存在量は全て、β−アクチンにより正規化される。＊Ｐ＜０．０５、対照と比較した場合。（Ｂ）ウエスタンブロットの定量化は、ヒトＨＦ組織におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の上方制御を確認する。対照は、４種の正常ヒト心臓組織試料の混合物を表す。ＨＦ１、ＨＦ２、ＨＦ３およびＨＦ４は、それぞれＨＦ組織試料１、試料２、試料３および試料４を表す。定量化は、試料毎の３回複製に基づく。タンパク質レベルは全て、ＧＡＰＤＨにより正規化される。＊Ｐ＜０．０５、対照と比較した場合。
【図２４】図２４は、ＳＣＮ５ＡならびにバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８ＤのＣ末端構造の図解を提供する。（Ａ）＊は、エクソン２８におけるＲＢＭ２５結合部位ＣＧＧＧＣＡ（９８２ｂｐ〜９８７ｂｐ）を示す。ビオチン化野生型（ＷＴ）プローブ（Ｂ）または変異体（Ｍｕ）プローブ（Ｃ）および精製ＲＢＭ２５タンパク質を用いてゲル移動度シフトアッセイを行った。左から右に試料をロードする毎に、各結合反応におけるＲＢＭ２５の量は倍数的に増加する。競合アッセイ（Ｄ）のため、０、１、５または２０倍モル過剰の非標識ＷＴまたはＭｕプローブが各結合反応において添加される。
【図２５】図２５は、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３が、ジャーカット（Jurkat）細胞におけるＳＣＮ５Ａ制御に関与することを実証する。（Ａ）ｑＰＣＲは、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の上方制御を実証する。低酸素処理（影付きバー）およびＡｎｇＩＩ処理（黒バー）ｖｓ．正常対照ジャーカット細胞（白バー）における４８時間目におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現変化を示す。ＨＩＦ−１αは、低酸素の指標である。ｍＲＮＡ存在量は、β−アクチンにより正規化する。＊Ｐ＜０．０５、対照（Ｎ＝６）と比較した場合。（Ｂ）ウエスタンブロット定量化は、ジャーカット細胞におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の上方制御を確認する。ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現は、経時的に解析されている。＊Ｐ＜０．０５、対照（Ｎ＝６）と比較した場合。（Ｃ）低酸素処理（影付きバー）およびＡｎｇＩＩ処理（黒バー）ｖｓ．未処理ジャーカット細胞（白バー）における４８時間目におけるＳＣＮ５ＡならびにバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現変化を示す。＊Ｐ＜０．０５、対照（Ｎ＝６）と比較した場合。ウエスタンブロットは、ＡｎｇＩＩまたは低酸素処理のジャーカット細胞におけるＳＣＮ５Ａの下方制御を示す。（Ｄ）ｑＰＣＲは、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３  ｓｉＲＮＡが、バリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄにおける低酸素の誘導を遮断することができたことを実証する。２４時間目における代表的な結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、対照（Ｎ＝６）と比較した場合。（Ｅ）ｑＰＣＲは、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３  ｓｉＲＮＡが、ＡｎｇＩＩによるバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの誘導を遮断することができたことを実証する。４８時間目における代表的な結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、対照（Ｎ＝６）と比較した場合。スクランブルされたｓｉＲＮＡは、ＡｎｇＩＩによる誘導において効果がなかった（データ図示せず）。ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３  ｓｉＲＮＡのノックダウン効率は、ウエスタンブロットにより評価し、対照およびスクランブルしたＲＮＡと比較する。（Ｆ）ｑＰＣＲは、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３過剰発現が、４８時間目において完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物を減少させ、バリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄを増加させることを実証する。＊Ｐ＜０．０５、対照（Ｎ＝６）と比較した場合。外因的に発現されたＲＢＭ２５−ＧＦＰおよびＬＵＣ７Ｌ３−ＧＦＰは、ジャーカット細胞におけるトランスフェクション後４８時間目に、抗ＧＦＰを用いたウエスタンブロット解析により検出される。代表的なウエスタンブロットは、対照群と比較して、外因的に発現されたＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３を備えるジャーカット細胞における完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物の下方制御を示す。完全長ＳＣＮ５Ａ  ＲＮＡは、ＧＦＰ発現単独により変化しない。
【図２６】図２６は、ＡｎｇＩＩ処理ｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＳＣＮ５ＡならびにバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現におけるＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡの効果を実証する。（Ａ）感染３日目に全実験群にＡｎｇＩＩ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）処理を行った。ＡｎｇＩＩ処理後２４時間目にＲＴ−ＰＣＲ測定を行い、β−アクチンにより正規化する。２４時間目におけるＲＢＭ２５  ｐＬＫＯ．１  ｓｈＲＮＡにより前感染（影付きバー）およびスクランブルされたｓｈＲＮＡにより前感染（黒バー）したＡｎｇＩＩ処理心筋細胞ｖｓ．正常ＡｎｇＩＩ処理心筋細胞（白バー）におけるＳＣＮ５ＡならびにバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現変化を示す。＊Ｐ＜０．０５、正常ＡｎｇＩＩ処理心筋細胞（Ｎ＝６）と比較。（Ｂ）共焦点顕微鏡は、ｈＥＳＣ−ＣＭを示す。ＧＦＰ蛍光は、ｐＧＩＰＺレンチウイルスｓｈＲＮＡｍｉｒによる感染を示す。ＲＢＭ２５ノックダウン効率は、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロット（Ｎ＝６）により評価する。スクランブルされたｓｈＲＮＡは、ＲＢＭ２５に効果がなかった。
【図２７】図２７は、処理後２４時間目のｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＮａ＋電流におけるＡｎｇＩＩ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）の効果を実証する。対照（Ａ）、ＡｎｇＩＩ処理（Ｂ）、ＡｎｇＩＩ処理、ＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡの前感染あり（Ｃ）およびＴＴＸ処理群（Ｄ）における代表的な電流トレースを示す。Ｉ−Ｖ曲線において３種の実験群のピーク電流統計学を示し（Ｅ）、図中、対照群（ｎ＝３）は黒塗りの四角で、ＡｎｇＩＩ処理群（ｎ＝３）は黒塗りの丸で、ＡｎｇＩＩ処理群、ＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡの前感染あり（ｎ＝３）は白い三角形で表される。データは、平均値±ＳＥＭとして表される。ピーク電流は、対照群と比較してＡｎｇＩＩ処理群において−４０から＋３０ｍＶに有意に低下し（Ｐ＜０．０５）、最大低下は−３０ｍＶにおける９１．１±９．３％であった。ＡｎｇＩＩ処理群、ＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡの前感染ありと対照群との間に差は観察されない（Ｅ）。群Ｄにおいて、ＴＴＸ（特異的ナトリウムチャネル遮断薬）によりナトリウムチャネル電流の特異性を検査する。スクランブルしたｓｈＲＮＡは、ＡｎｇＩＩ単独と比較してＩ−Ｖ関係性において効果がなかった（データ図示せず）。
【図２８】図２８は、対照患者、心不全（ＨＦ）患者、ショックを与えたことのないＩＣＤを備える患者（ＩＣＤ（−）ショック）およびショックを与えたことのあるＩＣＤを備える患者（ＩＣＤ（＋）ショック）のバリアントＥ２８Ｃ（「ＶＣ」）またはＥ２８Ｄ（「ＶＤ」）の相対比の棒グラフである。
【図２９】図２９は、総ＳＣＮ５Ａ発現に対し正規化されたＳＣＮ５Ａスプライスバリアントの心臓性組織および血液存在量の相関を実証する２個のグラフを表す。左パネル：バリアントＥ２８Ｃ（ＶＣ）の相関。右パネル：バリアントＥ２８Ｄ（ＶＤ）の相関。
【図３０】図３０は、対照患者、患者にショックを与えるＩＣＤを備える患者および患者にショックを与えないＩＣＤを備える患者におけるＳＣＮ５Ａスプライスバリアントの存在量のガウス分布の２個のグラフを表す。左パネル：バリアントＥ２８Ｃ（ＶＣ）の分布。右パネル：バリアントＥ２８Ｄ（ＶＤ）の分布。
【図３１】図３１は、妥当なＩＣＤ放電の予測因子としてのＳＣＮ５ａバリアントＤの受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。同一性の線を示す。
【図３２】図３２は、それぞれ患者のＶＣが高くなる、ＶＤが高くなる、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶ心不全である、ＡＣＥ阻害剤を服用している、抗不整脈薬を受けている、あるいは３０％未満のＥＦを有する、あるいは１２０ｍｓを超えて広がるＱＲＳ持続期間を有する場合の、突然死の単変量オッズ比のグラフを表す。
【図３３】図３３は、対照患者、患者にショックを与えるＩＣＤを備える患者および患者にショックを与えないＩＣＤを備える患者におけるＳＣＮ５Ａスプライスバリアントの存在量のガウス分布の２個のグラフを表し、図中、存在量は、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化されてもいなければ、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物のレベルに対し相対的でもない。左パネル：バリアントＥ２８Ｃ（ＶＣ）の分布。右パネル：バリアントＥ２８Ｄ（ＶＤ）の分布。
【図３４】図３４は、植え込み式除細動器（ＩＣＤ）に関する対象の必要性を査定するためのシステム１００の例示的な実施形態１０１の図表である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ＳＣＮ５Ａ転写産物
本明細書および本技術分野（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２１２７２３（Ａ１）号明細書）において記載されている通り、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のプロモーターならびに５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内またはその近傍の解析は、複数の特異的５’および３’ｍＲＮＡスプライスバリアントの同定をもたらした。図１〜４に示す通り、スプライスバリアントは、エクソン１スプライスバリアント：Ｅ１Ｂ１（配列番号１）、Ｅ１Ｂ２（配列番号２）、Ｅ１Ｂ３（配列番号３）およびＥ１Ｂ４（配列番号４）を包含し、エクソン２スプライスバリアント：Ｅ２Ｂ１（配列番号５）、Ｅ２Ｂ２（配列番号６）も包含し、その上さらに、エクソン２８スプライスバリアントＥ２８Ｂ（配列番号７）、Ｅ２８Ｃ（配列番号８）またはＥ２８Ｄ（配列番号９）も包含する。
【００２６】
Ｅ１Ｂ１、Ｅ１Ｂ２、Ｅ１Ｂ３、Ｅ１Ｂ４、Ｅ２Ｂ１およびＥ２Ｂ２スプライスバリアントは、５’領域に由来し、ＳＣＮ５Ａ遺伝子およびｍＲＮＡにおけるその位置は、図１に描写されている。Ｅ１Ｂ１、Ｅ１Ｂ２、Ｅ１Ｂ３、Ｅ１Ｂ４、Ｅ２Ｂ１およびＥ２Ｂ２の核酸配列は、図２に示す。Ｅ１Ａ（配列番号１０）は、エクソン１の５’ＵＴＲの内および／またはその近傍における野生型（または完全長）アイソフォームであり、一方、Ｅ１Ｂ１、Ｅ１Ｂ２、Ｅ１Ｂ３、Ｅ１Ｂ４は、その様々なスプライス型（または切断型）バリアントである。同様に、Ｅ２Ａ（配列番号１１）は、エクソン２の５’ＵＴＲの内および／またはその近傍における野生型（完全長）アイソフォームであり、一方、Ｅ２Ｂ１およびＥ２Ｂ２は、その様々なバリアントである。
【００２７】
Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣまたはＥ２８Ｄスプライスバリアントは、３’非翻訳領域またはその近傍に由来し、ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡにおけるその位置は、図３に描写されている。Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの核酸配列は、それぞれ配列番号７〜９に表記されている。Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄのそれぞれは、短縮型、機能障害性チャネルをコードする切断型スプライスバリアントである。Ｅ２８ＢおよびＥ２８Ｃは両者共に、非翻訳および翻訳領域を含有するが、Ｅ２８Ｄは、エクソン２８の翻訳領域のみを含有する。Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄスプライスバリアントの生理学的意義は、２個のＳＣＮ５Ａアレルのうち一方のエクソン２８における未成熟終止コドンによって支持され、これは、Ｎａ＋電流の８６％低下を生じる（Shangら、Circ.  Res.、１０１巻：１１４６〜１１５４頁、２００７年）。
【００２８】
Ｅ２８Ａスプライスバリアントは、ＳＣＮ５Ａエクソン２８の３’領域の別のアイソフォームである。Ｅ２８Ａには２種のアイソフォームが存在する。Ｅ２８Ａ−短（short）（Ｅ２８Ａ−Ｓ）（配列番号１２）およびＥ２８Ａ−長（long）（Ｅ２８Ａ−Ｌ）（配列番号１３）である。Ｅ２８Ａのどちらのアイソフォームも、翻訳領域における１２３９塩基対を含有する。Ｅ２８−ＬとＥ２８−Ｓとの間の差は、ＵＴＲにあり、Ｅ２８Ａ−Ｌは、３’ＵＴＲの２２９５塩基対を含有し、一方、Ｅ２８Ａ−Ｓは、３’ＵＴＲの８３４塩基対を含有する。Ｅ２８Ａ−Ｓは、３’ＵＴＲの最初の８３４塩基対のみを含有する。Ｅ２８Ａ−Ｌは、野生型（ＷＴ）アイソフォームを表す。本明細書における目的のため、この段落外では、「Ｅ２８Ａ」の記述はＥ２８Ａ−Ｓを指し、Ｅ２８Ａ−Ｌは野生型またはＷＴと称されることになる。
【００２９】
本明細書において、用語「切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン２８の短縮型または切断型翻訳領域を含む転写産物を指す。例示的な態様において、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、本明細書においてそれぞれ「Ｅ２８Ｂ」、「Ｅ２８Ｃ」および「Ｅ２８Ｄ」と称され得るＥ２８Ｂ転写産物、Ｅ２８Ｃ転写産物またはＥ２８Ｄ転写産物を含む転写産物である。例示的な態様において、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、Ｅ２８Ｃ転写産物またはＥ２８Ｄ転写産物の一方を含む転写産物である。
【００３０】
本明細書において、用語「完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン２８の完全長翻訳領域を含む転写産物を指す。例示的な態様において、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物である。例示的な態様において、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物と比較して短縮型または切断型であるスプライスされた転写産物であるが、このスプライスされた転写産物は、ＳＣＮ５Ａエクソン２８の完全長翻訳領域を依然として含む。例示的な態様において、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、Ｅ２８Ａ転写産物（Ｅ２８Ａ−Ｓ）を含む転写産物である。
【００３１】
植え込み式除細動器
本明細書において、用語「植え込み式除細動器」または「ＩＣＤ」は、「植え込み型除細動器（implantable  cardiac  defibrillator）」または「植え込み式心臓デバイス（implanted  cardiac  device）」または「植え込み型心臓デバイス（implantable  cardiac  device）」または「植え込み型心除細動デバイス（implantable  cardioverter-defibrillator  device）」の同義語であり、心不整脈が検出されると電気の衝撃を送達するようプログラムされた小型のバッテリ電源式電気インパルス発生器を指す。ＩＣＤは、心室細動および心室頻拍による心臓性突然死のリスクのある患者に植え込まれる。ＩＣＤを必要としている患者の同定に用いられる現行標準（Huntら、Circulation  １１９巻：ｅ３９１〜ｅ４７９頁（２００９年）およびEpsteinら、J  Am  Coll  Cardol  ５１巻：ｅ１〜ｅ６２巻（２００８年）において概説される）において、ＩＣＤを受け入れた患者のおよそ６０％は、恐らく患者が心不整脈（arrythmia）を示さないため、ＩＣＤからショックを受けない。よって、ＩＣＤを受け入れた患者のおよそ６０％は、実際にはＩＣＤを必要としない。
【００３２】
本明細書に記されているデータは、患者にショックを与えるＩＣＤを備える患者が、患者にショックを与えないＩＣＤを備える患者のＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルのプロファイルとは異なるＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルのプロファイルを示すことを実証する。データは、患者にショックを与えるＩＣＤを備える患者が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアント転写産物のレベルの増加を示し、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルの低下を示すことを実証する。このように、これらのデータは、２種の患者集団（ＩＣＤを本当に必要とする患者ｖｓ．ＩＣＤを必要としない患者）を識別することができる基盤を示唆する。
【００３３】
従って、本発明は、ＩＣＤに関する対象の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを決定するステップを含む。例示的な実施形態において、方法は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄを包含する全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを決定するステップを含む。例示的な態様において、本明細書においてさらに記載されている通り、本明細書における方法に言及されているＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、参照遺伝子、例えば、ハウスキーピング遺伝子の転写産物のレベルに対して正規化される。
【００３４】
例示的な態様において、ＩＣＤに関する対象の必要性を決定する方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率ＲＳを決定するステップを含む。例示的な態様において、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象は、ＩＣＤを必要としていると決定される。これらの比率それぞれのさらなる記載については、後述を参照されたい。
【００３５】
比率ＲＳ
例示的な態様において、本発明の方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率ＲＳを決定するステップを含む。
【００３６】
従って、一部の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物］の比率である。本明細書に記載されている通り、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物またはＥ２８Ａ−Ｓのいずれかを指す。従って、特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［生体試料のＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］比率である、あるいはＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［生体試料のＥ２８Ａ（Ｅ２８Ａ−Ｓ）のレベル］の比率である。
【００３７】
他の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄのレベル］である。よってＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［生体試料の（ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８＋Ｅ２８Ａ（Ｅ２８Ａ−Ｓ）＋Ｅ２８Ｂ＋Ｅ２８Ｃ＋Ｅ２８Ｄ）のレベル］の比率となり得る。
【００３８】
例示的な態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１または複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８および、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄのうち１種、２種または全種のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８および、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの全種のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８および、（Ｅ２８ＢおよびＥ２８Ｃ）のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８および、（Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ）のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８および、（Ｅ２８ＢおよびＥ２８Ｄ）のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［Ｅ２８Ａ（Ｅ２８Ａ−Ｓ）および、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８Ｃ、Ｅ２８Ｄの全種のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［Ｅ２８Ａ（Ｅ２８Ａ−Ｓ）および、（Ｅ２８ＢおよびＥ２８Ｃ）のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［Ｅ２８Ａ（Ｅ２８Ａ−Ｓ）および、（Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ）のレベル］の比率である。特定の態様において、ＲＳは、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［Ｅ２８Ａ（Ｅ２８Ａ−Ｓ）および、（Ｅ２８ＢおよびＥ２８Ｄ）のレベル］の比率である。
【００３９】
例示的な態様において、ＲＳのＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の各レベルは、レベルが参照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子のレベルに対して正規化または較正された較正レベル（較正存在量）である。適したハウスキーピング遺伝子は、本技術分野において公知のものであり、その一部は、本明細書においてさらに記載されている。
【００４０】
例示的な態様において、ＲＳのＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の各レベルは、対照正規化レベルである。例示的な態様における対照正規化レベルは、対象のレベルと対照対象のレベルとの間の差であるレベルである。対照対象は、本明細書においてさらに記載されている。例示的な態様において、対照対象は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である。
【００４１】
例示的な態様において、ＲＳを決定するステップは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）から得られた値を計算するステップを含む。例示的な態様において、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正レベル（較正存在量）＝２の、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の−ΔΔＣｔ乗（２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物とも表現される）（式中、ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子である）となるように、リアルタイムＰＣＲのデータ解析のΔΔＣｔ数理モデルが適用される（Livakら、Methods  ２５巻：４０２〜４０８頁（２００１年）およびYuanら、BMC  Bioinformatics  ７巻：８５頁（２００６年））。例示的な態様において、ΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物は、（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］マイナス［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］であり、ΔＣｔハウスキーピング遺伝子は、（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］マイナス［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］である。例示的な態様において、対照試料は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料である。
【００４２】
従って、例示的な態様において、ＲＳ＝
【００４３】
【数１】
2014508514.tif 000002
【００４４】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【００４５】
また、例示的な態様において、ＲＳ＝
【００４６】
【数２】
2014508514.tif 000003
【００４７】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【００４８】
例示的な態様において、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、生体試料のＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｃ）のレベルを含む。例示的な態様において、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、ＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＣ（Ｅ２８Ｄ）のレベルを含む。例示的な態様において、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、生体試料のＥ２８Ｃのレベルおよび生体試料のＥ２８Ｄのレベルである。
【００４９】
例示的な態様において、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルである。例示的な態様において、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］＋［ＳＣＮ５Ａエクソン２８スプライスバリアントＡ（Ｅ２８Ａ）のレベル］の合計レベルである。例示的な態様において、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、Ｅ２８Ａ（Ｅ２８−Ｓ）のレベルである。代替的な態様において、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］＋［Ｅ２８Ａのレベル］＋［Ｅ２８Ｂのレベル］＋［Ｅ２８Ｃのレベル］＋［Ｅ２８Ｄのレベル］の合計レベルである。
【００５０】
例示的な態様において、ＲＳは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、（ｉ）［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］＋［Ｅ２８Ａ−Ｓのレベル］の合計レベルまたは（ｉｉ）Ｅ２８Ａ−Ｓのレベルまたは（ｉｉｉ）ＷＴのレベルと比較する。例示的な態様において、ＲＳ＝ＲＥ２８Ｃ＝
【００５１】
【数３】
2014508514.tif 000004
【００５２】
であり、式中、
Ｅ２８Ｃ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｃ＝（［対象試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【００５３】
例示的な態様において、ＲＳは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｃのレベルを、［全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄのレベルと比較する。例示的な態様において、ＲＳ＝ＲＥ２８Ｃ＝
【００５４】
【数４】
2014508514.tif 000005
【００５５】
であり、式中、
Ｅ２８Ｃ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｃ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｃ＝（［対象試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｃ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【００５６】
例示的な態様において、ＲＳは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、（ｉ）［ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］＋［Ｅ２８Ａ−Ｓのレベル］の合計レベルまたは（ｉｉ）Ｅ２８Ａ−Ｓのレベルまたは（ｉｉｉ）ＷＴのレベルと比較する。例示的な態様において、ＲＳ＝ＲＥ２８Ｄ＝
【００５７】
【数５】
2014508514.tif 000006
【００５８】
であり、式中、
Ｅ２８Ｄ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｄ＝（［対象試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【００５９】
例示的な態様において、ＲＳは、対象から得られる生体試料のＥ２８Ｄのレベルを、［全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ］のレベルと比較する。例示的な態様において、ＲＳ＝ＲＥ２８Ｄ＝
【００６０】
【数６】
2014508514.tif 000007
【００６１】
であり、式中、
Ｅ２８Ｄ転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物＝ΔＣｔＥ２８Ｄ転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔＥ２８Ｄ＝（［対象試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］−［対照試料のＥ２８Ｄ転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【００６２】
例示的な態様において、方法は、第一のＲＳおよび第二のＲＳを決定するステップを含み、第一のＲＳは、Ｅ２８Ｃのレベルを全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第二のＲＳは、Ｅ２８Ｄのレベルを全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する。例示的な態様において、上に記す通り、第一のＲＳは、ＲＥ２８Ｃであり、第二のＲＳは、ＲＥ２８Ｄである。
【００６３】
閾値比率ＲＴ
本明細書に記載されている通り、本発明の方法は、比率ＲＳに関与し、例示的な実施形態において、ＲＳの解釈は、閾値比率ＲＴに対するその比較によりなされる。例えば、さらに本明細書に記載されている通り、ＲＳがＲＴ以上である場合、対象はＩＣＤを必要としている。ＲＴに対するＲＳのさらなる解釈は、本明細書に記載されている。
【００６４】
例示的な実施形態において、ＲＴは、ＲＳの直接的な基準点としての機能を果たし、ＲＴは、ＲＳにマッチさせられる。例えば、ＲＳが、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［対象から得られる生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］の比率である場合、ＲＴは、マッチさせられた比率、例えば、［対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［対照対象から得られる生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］の比率である。また、例えば、ＲＳが、［対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［対象から得られる生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物］である場合、ＲＴは、［対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル］対［対照対象から得られる生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物］である。
【００６５】
また、ＲＳと同様に、例示的な態様において、ＲＴの各レベルは、レベルが参照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化または較正された較正レベル（較正存在量）である。適したハウスキーピング遺伝子は、本技術分野において公知のものであり、その一部は、本明細書においてさらに記載されている。
【００６６】
また、ＲＳと同様に、例示的な態様において、ＲＴの各レベルは、対照正規化レベルである。例示的な態様における対照正規化レベルは、対象のレベルと対照対象のレベルとの間の差であるレベルである。対照対象は、本明細書においてさらに記載されている。例示的な態様において、対照対象は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である。
【００６７】
ＲＴは、要因に応じて種々の様式の１種で定義することができ、その例として、ＲＳおよびＲＴの間の比較の適用（例えば、ＩＣＤに関する対象の必要性の決定ｖｓ．ＳＣＤに関する対象のリスクの決定ｖｓ．抗不整脈剤の必要性の決定における使用）、本発明の方法が実施される領域の規制機関（例えば、食品医薬品局または同様の機関）により設定された指針、要件または方針、本発明の方法が実施される領域の現在の標準医療行為、その他等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
例示的な態様において、ＲＴは、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率であり、生体試料は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる。
【００６９】
代替的な態様において、ＲＴ＝μ＋４．０σであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差である。例示的な態様において、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象から得られる生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率は、これと比較されているＲＳとマッチさせられる。
【００７０】
他の代替的な態様において、ＲＴは、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対照対象から得られる切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率である。
【００７１】
例示的な態様において、ＲＴは、リアルタイムＰＣＲにより決定される。例示的な態様において、ＲＴは、次の通りのものである。
【００７２】
【数７】
2014508514.tif 000008
【００７３】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［対象試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【００７４】
また、例示的な態様において、ＲＴ＝
【００７５】
【数８】
2014508514.tif 000009
【００７６】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［対象試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［対象試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［対象試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「対象試料」は、対象にショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【００７７】
さらになお他の態様において、ＲＴ＝μ＋Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、約０．７〜約４．０の間の数（例えば、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０）である。
【００７８】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ＋Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率＝
【００７９】
【数９】
2014508514.tif 000010
【００８０】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（−）ショック」は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【００８１】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ＋Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率＝
【００８２】
【数１０】
2014508514.tif 000011
【００８３】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（−）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（−）ショック」は、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全種を指す。
【００８４】
あるいは、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、対照対象にショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、約０．７〜約４．０の間の数（例えば、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０）である。例示的な態様において、Ｘは、約０．７〜約１．０の間の数または約２．０〜約４．０の間の数または約２．３〜約４．０の間の数である。例示的な態様において、Ｘは、２．３２６である。
【００８５】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率＝
【００８６】
【数１１】
2014508514.tif 000012
【００８７】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（＋）ショック」は、ショックを与えたＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【００８８】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率は、
【００８９】
【数１２】
2014508514.tif 000013
【００９０】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックの切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［ＩＣＤ患者（＋）ショックのハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「ＩＣＤ患者（＋）ショック」は、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【００９１】
例示的な態様において、ＲＴは、システムにより決定される。例示的な態様において、システムは、プロセッサと、プロセッサに連結したメモリデバイスとを含み、メモリデバイスは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である、複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる
機械可読命令を記憶する。
【００９２】
ＲＴの決定に用いることのできる適したシステムのさらなる記述について、本明細書において後述する。
【００９３】
心臓性突然死およびそれに関係する方法
心臓性突然死（ＳＣＤ）は、米国における年間およそ３２５，０００名の死亡原因であり、この数は、肺癌、乳癌または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に起因する死亡数よりも多い。ＳＣＤは、心不全による死亡の約５０％の原因であり、多くの場合、冠疾患の第一の発現である。Sovariら、「Sudden  Cardiac  Death」、e-medicine  Cardiology、article  １５１９０７、２０１０年１１月４日に更新；およびZhengら、Circulation  １０４巻：２１５８〜２１６３頁（２００１年）を参照されたい。ＳＣＤの共通原因は、例えば、安静時心拍数が正常よりも速い心室頻拍（ＶＴ）、心臓における心室の心筋の非協調的収縮が起こり、適切な収縮ではなく筋肉を震えさせる心室細動（ＶＦ）またはＶＴおよびＶＦの両方が存在する不整脈状態等、心室性不整脈である。Wedro,  B.、「Sudden  Cardiac  Arrest  (Sudden  Cardiac  Death)」、medicine.net、KulickおよびSoppler編、を参照されたい。心室細動を処置する現在の方法は、電気的除細動器または前胸部殴打（thump）による除細動を包含する。抗不整脈療法は、心室性不整脈を処置または予防し、これによりＳＣＤを予防することを目的とする。抗不整脈療法の１種は、患者へのＩＣＤの植え込みを包含する。ＩＣＤは、本明細書においてさらに記載されている。
【００９４】
記述されている通り、本明細書に提供されているデータは、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物レベルのレベルに基づき、ＩＣＤからショックを受ける患者を同定することができる手段を支持する。ＩＣＤからショックを受ける患者は、心臓性突然死（ＳＣＤ）のリスクが高いため、本明細書に提供されているデータは、一部には、ＳＣＤのリスクがある患者を同定することができる手段も支持する。従って、本発明は、心臓性突然死のリスクがある患者を同定する方法を提供する。代替的な仕方で述べると、本発明は、心臓性突然死（ＳＣＤ）に関する対象のリスクを決定する方法も提供する。例示的な実施形態において、このような方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、対象は、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、ＳＣＤのリスクがあると決定される。
【００９５】
本明細書に提供されている心臓性突然死に関する対象のリスクを決定する方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、本明細書に記載されているＲＴ（例えば、標題、「閾値比率ＲＴ」のセクションにおける上述のＲＴ）のいずれか１つと同一である。
【００９６】
心臓性突然死のリスクをモニターする方法
例示的な態様において、比率Ｒｓを決定するステップは、少なくとも１回、さもなくば、２回以上反復される。例示的な態様において、比率Ｒｓは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上決定される。このような場合、方法は、ＳＣＤに関する対象のリスクをモニターする方法として考慮することができる。例示的な態様において、比率Ｒｓは、６〜１２カ月毎（例えば、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎）に決定され、毎回、Ｒｓは、同一対象から得られる異なる生体試料に基づく。
【００９７】
抗不整脈療法に関する必要性を決定する方法
一部の事例において、ＳＣＤのリスクがあると決定されたことのある患者は、抗不整脈療法が与えられる。本発明の方法は、ＳＣＤに関する対象のリスクを決定する手段を提供するため、本発明の方法は、抗不整脈療法に関する対象の必要性を決定する手段も提供する。従って、本発明は、抗不整脈療法に関する対象の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象は、抗不整脈療法を必要とすると決定される。
【００９８】
本明細書に提供されている抗不整脈療法に関する対象の必要性を決定する方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、本明細書に記載されているＲＴ（例えば、標題、「閾値比率ＲＴ」のセクションにおける上述のＲＴ）のいずれか１つと同一である。
【００９９】
例示的な態様において、抗不整脈療法は、ＩＣＤまたは関連デバイスの植え込みである。例示的な態様において、抗不整脈療法は、抗不整脈剤の投与である。
【０１００】
抗不整脈剤
本明細書における目的のため、抗不整脈剤は、心房細動、心房粗動、心室頻拍および心室細動等、心臓の異常調律（心不整脈）の抑制に用いられる医薬品の群のうちいずれか１種である。例示的な態様において、抗不整脈剤は、Ｓｉｎｇｈ  Ｖａｕｇｈａｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ＳＶＷ）クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ抗不整脈剤である。例示的な態様において、抗不整脈剤は、ＳＶＷクラスＩＡ、ＩＢ、ＩＣまたはＩＩＩ抗不整脈剤である。抗不整脈剤は、速効（fast）チャネル遮断薬、ベータ遮断薬、遅効（slow）チャネル遮断薬、ナトリウムチャネル遮断剤、カリウムチャネル遮断剤またはカルシウムチャネル遮断剤となり得る。一部の態様における抗不整脈剤は、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、トカイニド、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシンまたは硫酸マグネシウムのうちの１つである。一部の態様において、ＳＶＷクラスＩＡは、キニジン、プロカインアミドまたはジソピラミドである。一部の態様において、ＳＶＷクラスＩＢ抗不整脈剤は、リドカイン、フェニトイン、メキシレチンまたはトカイニドである。一部の態様において、ＳＶＷクラスＩＣ抗不整脈剤は、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジンまたはエンカイニドである。一部の態様において、ＳＶＷクラスＩＩＩ抗不整脈剤は、ドロネダロン、アミオダロンまたはイブチリドである。一部の態様において、抗不整脈剤は、ＮＡＤ＋またはｍｉｔｏＴＥＭＰＯである。
【０１０１】
心臓性突然死のリスクを低下させる方法
本発明は、対象におけるＳＣＤのリスクを低下させる方法を追加的に提供する。方法は、ＳＣＤに関する対象のリスクを決定するステップと、対象がＳＣＤのリスクがあると決定された場合、対象を処置するステップとを含む。例示的な実施形態において、本明細書に提供されている対象におけるＳＣＤのリスクを低下させる方法は、（Ａ）対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、（Ｂ）ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象に療法を与えるステップとを含む。
【０１０２】
本明細書に提供されているＳＣＤのリスクを低下させる方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、本明細書に記載されているＲＴ（例えば、標題、「閾値比率ＲＴ」のセクションにおける上述のＲＴ）のいずれか１つと同一である。
【０１０３】
例示的な態様において、対象に与えられる療法は、抗不整脈療法である。例示的な態様において、療法は、ＩＣＤの植え込みである。従って、本明細書に提供されているＳＣＤのリスクを低下させる方法は、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、ＩＣＤを植え込むステップを含むことができる。例示的な態様において、療法は、抗不整脈剤の投与である。適した抗不整脈剤は、本技術分野において公知のものであり、本明細書において「抗不整脈剤」と題するセクションに記載されている。例示的な態様において、療法は、アンジオテンシン遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、ナトリウムチャネル阻害剤、ＮＡＤ＋、ミトコンドリア標的化抗酸化剤、ｍｉｔｏＱ、ｍｉｄＴＥＭＰＯ、プロテインキナーゼＡのアクチベーター、フォルスコリン、ＢＨ４またはＳｒｃ阻害剤である。
【０１０４】
心不全およびそれに関係する方法
心不全（ＨＦ）は、身体の必要に見合う十分な血流を供給する心臓の能力として定義される。一部の実施形態において、心不全の徴候および症状として、呼吸困難（例えば、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難）、咳、心臓性喘息、喘鳴、眩暈、錯乱、安静時の冷たい四肢、慢性静脈性うっ血、くるぶし腫脹、末梢性浮腫もしくは全身浮腫、夜間多尿、腹水、肝腫大（heptomegaly）、黄疸、凝固障害、疲労、運動不耐性、頸静脈性膨満（jugular  venous  distension）、肺ラ音、末梢性浮腫、肺血管再分布、間質性浮腫、胸水またはこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、心不全の症状は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）に従った心不全の分類基盤を提供する次表に列挙されている症状のうちの１つである。
【０１０５】
【表１Ａ】
2014508514.tif 000014
【０１０６】
例示的な態様において、心不全は、収縮期機能障害が原因のまたはこれに特徴付けられる心不全である収縮期心不全である。簡単に言えば、収縮期機能障害は、心臓のポンプ機能または収縮（即ち、収縮期）が失敗した状態である。収縮期機能障害は、駆出分画率の減少または低下、例えば、４５％未満の駆出分画率と、心室拡張終期圧および容積の増加により特徴付けることができる。一部の態様において、心室収縮の強さが弱まり、妥当な一回拍出量を生じるのに不十分となり、より少ない心拍出量をもたらす。一部の態様において、収縮期心不全は、虚血性心不全である。代替的な態様において、収縮期心不全は、非虚血性心不全である。
【０１０７】
本明細書に記されている通り、心不全患者は、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルの増加および完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルの増加を提示した。このような知見は、心不全患者を同定することができる手段を支持する。従って、本発明は、心不全のリスクがある患者を同定する方法を提供する。代替的な仕方で述べると、本発明は、心不全に関する対象のリスクを決定する方法も提供する。例示的な実施形態において、このような方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象は、ＨＦのリスクがあると決定される。
【０１０８】
本明細書に提供されているＨＦに関する対象のリスクを決定する方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。一部の事例において、対照試料または対照対象または対象が当該セクションに記載されているものとは異なる以外は、閾値比率ＲＴは、本明細書に記載されているＲＴ（例えば、標題、「閾値比率ＲＴ」のセクションにおける上述のＲＴ）と基本的に同一である。例えば、本明細書に提供されているＨＦに関する対象のリスクを決定する方法に関して、例示的な態様におけるＲＴは、生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率であり、生体試料は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、心不全ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる。
【０１０９】
代替的な態様において、ＲＴ＝μ＋４．０σであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、心不全ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差である。例示的な態様において、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象から得られる生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率は、これと比較されているＲＳとマッチさせられる。
【０１１０】
あるいは、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、心不全を有することが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、約０．７〜約４．０の間の数（例えば、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０）である。例示的な態様において、Ｘは、約０．７〜約１．０の間の数または約２．０〜約４．０の間の数または約２．３〜約４．０の間の数である。例示的な態様において、Ｘは、２．３２６である。
【０１１１】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率は、
【０１１２】
【数１３】
2014508514.tif 000015
【０１１３】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［心不全患者試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［心不全患者試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［心不全患者試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「心不全患者試料」は、心不全であることが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、心不全ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【０１１４】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率は、
【０１１５】
【数１４】
2014508514.tif 000016
【０１１６】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［心不全患者試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［心不全患者試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［心不全患者試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「心不全患者試料」は、心不全であることが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、心不全ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【０１１７】
例示的な態様において、ＲＴは、システムにより決定される。例示的な態様において、システムは、プロセッサと、プロセッサに連結したメモリデバイスとを含み、メモリデバイスは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、心不全を有することが既知の対象である、複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる
機械可読命令を記憶する。
【０１１８】
ＲＴの決定に用いることのできる適したシステムのさらなる記述について、本明細書において後述する。
【０１１９】
ＨＦのリスクをモニターする方法
例示的な態様において、比率Ｒｓを決定するステップは、少なくとも１回、さもなくば２回以上反復される。例示的な態様において、比率Ｒｓは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上決定される。このような事例において、方法は、ＨＦに関する対象のリスクをモニターする方法として考慮することができる。例示的な態様において、比率Ｒｓは、６〜１２カ月毎（例えば、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎）に決定され、各回において、Ｒｓは、同一対象から得られる異なる生体試料に基づく。
【０１２０】
抗ＨＦ療法に関する必要性を決定する方法
本発明は、ＨＦの療法または予防法に関する対象の必要性を決定する方法も提供する。例示的な実施形態において、方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象は、療法を必要とすると決定される。
【０１２１】
本明細書に提供されている抗ＨＦ療法に関する対象の必要性を決定する方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、標題、「心不全およびそれに関係する方法」のセクションにおける、本明細書に記載されているＲＴのいずれか１つと同一である。
【０１２２】
ＨＦのリスクを低下させる方法
本発明は、対象におけるＨＦのリスクを低下させる方法を追加的に提供する。方法は、ＨＦに関する対象のリスクを決定するステップと、対象がＨＦのリスクがあると決定された場合、対象を処置するステップとを含む。例示的な実施形態において、本明細書に提供されている対象におけるＨＦのリスクを低下させる方法は、（Ａ）対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、（Ｂ）ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象に療法を与えるステップとを含む。
【０１２３】
本明細書に提供されているＨＦに関する対象のリスクを低下させる方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、標題、「心不全およびそれに関係する方法」のセクションにおける本明細書に記載されているＲＴのいずれか１つと同一である。
【０１２４】
心不全の療法
抗ＨＦ療法は、本技術分野において公知のものである。例えば、AbrahamおよびKrum、「Heart  Failure:  A  Practical  Approach  to  Treatment」、McGraw  Hill  Professional、２００７年を参照されたい。例示的な態様における抗ＨＦ療法は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）、ベータ−遮断薬、ジゴキシン、利尿薬、血管拡張薬、カリウムまたはマグネシウム、アルダクトン阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬および心臓ポンプ薬物療法のうち１または複数の投与を包含する。例示的な態様において、抗ＨＦ療法は、バイパス術、左心補助循環装置、心臓弁外科手術、梗塞除去外科手術、心臓移植等が挙げられるがこれらに限定されない、１または複数の外科手技を包含する。
【０１２５】
不整脈およびそれに関係する方法
不整脈
その上本発明は、不整脈に関する対象のリスクを決定する方法を提供する。本明細書において、用語「不整脈」は、「心臓性リズム障害」または「心不整脈」の同義語であり、心臓に異常電気活性が存在するいずれかの状態を指す。例示的な実施形態において、心不整脈は、心室細動、心室頻拍または心室細動と心室頻拍の両方が存在する不整脈状態等、心室性不整脈である。例示的な実施形態において、心不整脈は、心房性不整脈、例えば、心房細動、心房頻拍または心房細動と心房頻拍の両方が存在する不整脈状態である。他の種類の心不整脈については後述する。
【０１２６】
例示的な態様において、心不整脈は、異常心拍数により特徴付けられる。例示的な態様において、心不整脈は、徐脈または頻拍により特徴付けられる。
【０１２７】
徐脈
例示的な態様において、心不整脈は、安静時心拍数が正常よりも遅い徐脈である。例示的な態様において、徐脈は、成人における毎分６０拍動よりも遅い安静時心拍数により特徴付けられる。例示的な態様において、徐脈は、洞性徐脈である。例示的な態様において、徐脈は、洞停止またはＡＶブロックまたは心ブロックが原因である。例示的な態様において、徐脈は、心臓における電気伝導の遅延が原因である。例示的な態様において、徐脈は、運動選手またはスポーツマンの正常に機能する心臓により提示される徐脈ではない。
【０１２８】
頻拍
例示的な態様において、心不整脈は、安静時心拍数が正常よりも速い頻拍である。例示的な態様において、頻拍は、成人における毎分１００拍動よりも速い安静時心拍数により特徴付けられる。例示的な態様において、頻拍は、洞性頻拍である。例示的な態様において、洞性頻拍は、肉体的運動、情動ストレス、甲状腺機能亢進、カフェインまたはアンフェタミン等、物質の摂取または注射が原因ではない。例示的な態様において、頻拍は、洞性頻拍ではなく、例えば、自動能、リエントリー（例えば、細動）または撃発活動に起因する頻拍である。例示的な態様において、頻拍は、心臓における電気伝導の遅延が原因である。例示的な態様において、頻拍は、異所性病巣（focus）が原因である。例示的な態様において、頻拍は、異常調律と組み合わされる。
【０１２９】
例示的な態様において、心不整脈は、それが生じる機序により特徴付けられる。例示的な態様において、心不整脈は、自動能、リエントリーまたは細動が原因である。
【０１３０】
自動能
例示的な態様において、心不整脈は、伝導系の心筋以外の心筋細胞が独自のインパルスを発する状態である自動能が原因の異常調律または頻拍である。例示的な態様において、心不整脈は、独自のインパルスを発する洞房（ＳＡ）結節、房室（ＡＶ）結節、Ｈｉｓ束またはプルキンエ線維の細胞以外の筋肉細胞が原因である。
【０１３１】
リエントリー
例示的な態様において、心不整脈は、心臓の一端から他端へと移動してそこで終わるのではなく、心臓内を循環して電気インパルスが回帰的に伝わる、リエントリー不整脈である。例示的な態様において、心不整脈は、心臓性粗動、発作性上室性頻拍または心室頻拍である。
【０１３２】
細動
例示的な態様において、心不整脈は、細動である。例示的な態様において、細動は、心房細動である。例示的な態様において、細動は、心室細動である。
【０１３３】
撃発拍動（Triggered  beat）
例示的な態様において、心不整脈は、心臓細胞におけるイオンチャネルが機能不全となり、電気活性の異常伝播と、場合により異常調律をもたらす場合に生じる、撃発拍動である。
【０１３４】
例示的な実施形態において、心不整脈は、起源部位により分類される。例示的な態様において、心不整脈は、心房性不整脈（例えば、心房性期外収縮、遊走（wandering）心房ペースメーカ、多源性心房頻拍、心房粗動、心房細動）である。例示的な態様において、心不整脈は、接合部不整脈（例えば、上室性頻拍、ＡＶ結節リエントリー性頻拍、発作性上室性頻拍、接合部調律、接合部頻拍、接合部期外複合（premature  junctional  complex））である。例示的な態様において、心不整脈は、房室不整脈（例えば、ＡＶリエントリー性頻拍）である。例示的な態様において、心不整脈は、心室性不整脈（例えば、心室性期外収縮または心室性多（extra）拍動、促進型心室固有調律、単形性心室頻拍、多形性心室頻拍、心室細動）である。例示的な態様において、心不整脈は、心ブロック（例えば、第１度心ブロック、Ｉ型第２度心ブロック、２型第２度心ブロック、第３度心（heat）ブロック）である。例示的な態様において、心不整脈は、期外収縮である。
【０１３５】
例示的な態様において、心不整脈は、２種以上の心不整脈が存在する状態である。例示的な態様において、心不整脈は、心室頻拍と心室細動の両方が存在する状態である。例示的な態様において、心不整脈は、徐脈が存在しない状態である。
【０１３６】
例示的な態様において、不整脈に関する対象のリスクを決定する方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップを含む。例示的な態様において、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象は、不整脈のリスクがあると決定される。
【０１３７】
本明細書に提供されている不整脈に関する対象のリスクを決定する方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。一部の事例において、対照試料または対照対象または対象が当該セクションに記載されているものとは異なる以外は、閾値比率ＲＴは、本明細書に記載されているＲＴ（例えば、標題、「閾値比率ＲＴ」のセクションにおける上述のＲＴ）と基本的に同一である。例えば、本明細書に提供されているＨＦに関する対象のリスクを決定する方法に関して、例示的な態様におけるＲＴは、生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率であり、生体試料は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、心不全ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる。
【０１３８】
代替的な態様において、ＲＴ＝μ＋４．０σであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、心不全ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差である。例示的な態様において、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象から得られる生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率は、これと比較されているＲＳとマッチさせられる。
【０１３９】
あるいは、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、式中、μ＝は、１セットのデータ値のガウス分布の平均値であり、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、対照対象は、不整脈を有することが既知の対象であり、σは、データ値のガウス分布の標準偏差であり、Ｘは、約０．７〜約４．０の間の数（例えば、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０）である。例示的な態様において、Ｘは、約０．７〜約１．０の間の数または約２．０〜約４．０の間の数または約２．３〜約４．０の間の数である。例示的な態様において、Ｘは、２．３２６である。
【０１４０】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率は、
【０１４１】
【数１５】
2014508514.tif 000017
【０１４２】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ完全長−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ完全長＝（［不整脈患者試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［不整脈患者試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［不整脈患者試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「不整脈患者試料」は、不整脈であることが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、不整脈ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「完全長」は、ＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物もしくはＥ２８Ａ−Ｓ転写産物またはＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物およびＥ２８Ａ−Ｓ転写産物の両方を指す。
【０１４３】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσである場合、セットの各データ値は、対照対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）対照対象の生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する比率を表し、比率は、
【０１４４】
【数１６】
2014508514.tif 000018
【０１４５】
であり、式中、
切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の較正存在量＝２−ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物
ΔΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔΔＣｔ切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝ΔＣｔ切断型−ΔＣｔハウスキーピング遺伝子
ΔＣｔ全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物＝（［不整脈患者試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔ切断型＝（［不整脈患者試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］−［対照試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のＣｔ］）
ΔＣｔハウスキーピング遺伝子＝（［不整脈患者試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］−［対照試料のハウスキーピング遺伝子のＣｔ］）であり、
「不整脈患者試料」は、心不全であることが既知の対象から得られる生体試料であり、「対照試料」は、（ｉ）ＩＣＤを有していない、（ｉｉ）心臓病、例えば、不整脈ではない、（ｉｉｉ）正常な左心室機能を有する、（ｉｖ）拡張機能障害がない、または（ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対照対象から得られる生体試料であり、「全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物」は、ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの全てを指す。
【０１４６】
例示的な態様において、ＲＴは、システムにより決定される。例示的な態様において、システムは、プロセッサと、プロセッサに連結したメモリデバイスとを含み、メモリデバイスは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、不整脈を有することが既知の対象である、複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる
機械可読命令を記憶する。
【０１４７】
ＲＴの決定に用いることのできる適したシステムのさらなる記述について、本明細書において後述する。
【０１４８】
不整脈のリスクをモニターする方法
例示的な態様において、比率Ｒｓを決定するステップは、少なくとも１回、さもなくば２回以上反復される。例示的な態様において、比率Ｒｓは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上決定される。このような事例において、方法は、不整脈に関する対象のリスクをモニターする方法として考慮することができる。例示的な態様において、比率Ｒｓは、６〜１２カ月毎（例えば、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎）に決定され、各回において、Ｒｓは、同一対象から得られる異なる生体試料に基づく。
【０１４９】
不整脈のリスクを低下させる方法
本発明は、対象における不整脈のリスクを低下させる方法を追加的に提供する。方法は、不整脈に関する対象のリスクを決定するステップと、対象が不整脈のリスクがあると決定された場合、対象を処置するステップとを含む。例示的な実施形態において、本明細書に提供されている対象における不整脈のリスクを低下させる方法は、（Ａ）対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率Ｒｓを決定するステップと、（Ｂ）ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象に抗不整脈療法を与えるステップとを含む。
【０１５０】
本明細書に提供されている不整脈に関する対象のリスクを低下させる方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、標題、「不整脈およびそれに関係する方法」のセクションにおける本明細書に記載されているＲＴのいずれか１つと同一である。不整脈のリスクを低下させる方法に提供されている抗不整脈療法は、本技術分野において公知のいずれかの適した抗不整脈療法となることができ、その一部は、本明細書に記載されている。
【０１５１】
療法の安全な使用を決定する方法
本発明は、対象への抗不整脈剤の投与が安全であるか決定する方法をその上さらに提供する。方法は、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較する、比率ＲＳを決定するステップを含む。例示的な態様において、ＲＳが閾値比率ＲＴ以上である場合、対象への抗不整脈剤の投与は安全である。
【０１５２】
本明細書に提供されている対象への抗不整脈剤の投与が安全であるか決定する方法に関して、ＲＳは、例示的な態様において、本明細書に記載されているＲＳ（例えば、標題：「比率ＲＳ」のサブセクションにおける上述のＲＳ）のいずれか１つと同一である。また、例示的な態様において、閾値比率ＲＴは、標題、「閾値比率ＲＴ」のセクションにおける本明細書に記載されているＲＴのいずれか１つと同一である。不整脈のリスクを低下させる方法に提供されている抗不整脈剤は、本技術分野において公知のいずれかの適した抗不整脈剤となることができ、その一部は、本明細書に記載されている。例示的な態様において、抗不整脈剤は、ナトリウムチャネル遮断剤、例えば、ＮＡＤ＋、ｍｉｔｏＴＥＭＰＯである。
【０１５３】
ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル
本明細書に記載されている方法は、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の１または複数のレベルを参照する。方法は、例えば、生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルに関連する比率を決定するステップを包含する。ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルは、いずれかの適した手段により決定または得ることができる。例示的な態様において、レベルは、生体試料からレベルを測定することにより決定される。例えば、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の完全長転写産物のレベルおよび切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルのいずれかは、本技術分野において公知の転写産物を測定するのに適した技法を用いて測定することができる。これらのレベルの測定は、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の直接的測定となり得る。このような方法は、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の発現レベルの測定に関与するものとして考慮することができる。例示的な態様において、測定されるレベルは、ｍＲＮＡ転写産物レベルまたはｍＲＮＡ転写産物にコードされる産物のレベル、例えば、タンパク質もしくはペプチド発現レベルである。タンパク質の発現レベルを決定するのに適した方法は、本技術分野において公知のものであり、イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学的アッセイ）を包含する。核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現レベルを決定するのに適した方法は、本技術分野において公知のものであり、リアルタイムＰＣＲ等が挙げられるがこれらに限定されない定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティングおよびサザンブロッティングを包含する。
【０１５４】
代替的な態様において、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の測定は、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物以外のものが測定される間接的測定となり得る。例えば、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物レベルは、関連タンパク質、例えば、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物の上流または下流において作用するタンパク質の発現レベルまたは生物活性レベルを測定することにより決定することができる。例えば、本明細書に提供されているデータは、スプライシング因子ｈＬｕｃ７ＡおよびＲＢＭ２５ならびに小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）のトランスデューサー、ＰＥＲＫが、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の異常スプライシングに関連することを証明する。従って、レベルは、スプライシング因子ｈＬｕｃ７ａ、スプライシング因子ＲＢＭ２５および／またはＰＥＲＫの発現レベルを測定することにより決定することができる。スプライシング因子ｈＬｕｃ７ａ、スプライシング因子ＲＢＭ２５および／またはＰＥＲＫの発現レベルは、遺伝子発現または遺伝子産物の発現（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）の測定により測定することができる。従って、例示的な態様において、本明細書に記載されている方法は、スプライシング因子ｈＬｕｃ７ａタンパク質、スプライシング因子ＲＢＭ２５タンパク質および／またはＰＥＲＫタンパク質、あるいはスプライシング因子ｈＬｕｃ７ａ  ｍＲＮＡ、スプライシング因子ＲＢＭ２５  ｍＲＮＡおよび／またはＰＥＲＫ  ｍＲＮＡのレベルを測定するステップを含むことができる。
【０１５５】
Ｌｕｃ７Ａ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５１７４７）は、ＬＵＣ７Ｌ３；ＬＵＣ７様３；ＣＲＡ；ＣＲＯＰ；ＬＵＣ７Ａ；ｈＬｕｃ７Ａ；ＣＲＥＡＰ−１；およびＯＡ４８−１８としても公知である。ｈＬｕｃ７Ａの例示的なｍＲＮＡ配列は、本明細書において、配列番号３４および３５として表記されているが、ＮＣＢＩのヌクレオチドデータベースにおいては、受託番号ＮＭ＿００６１０７．３および受託番号ＮＭ＿０１６４２４．４として見出すこともできる。ｈＬｕｃ７Ａの例示的なアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号３６および３７として表記されているが、ＮＣＢＩのタンパク質データベースにおいては、受託番号ＮＰ＿００６０９８．２および受託番号ＮＰ＿０５７５０８．２として見出すこともできる。ＲＢＭ２５（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５８５１７）は、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質２５；Ｓ１６４；ＮＥＴ５２；ＲＮＰＣ７；Ｓｎｕ７１；ＲＥＤ１２０；ｆＳＡＰ９４；ＭＧＣ１０５０８８；およびＭＧＣ１１７１６８としても公知である。ＲＢＭ２５の例示的なｍＲＮＡ配列は、本明細書において、配列番号３８として表記されているが、ＮＣＢＩのヌクレオチドデータベースにおいては、受託番号ＮＭ＿０２１２３９．２として見出すことができる。ＲＢＭ２５の例示的なアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号３９として表記されているが、ＮＣＢＩのタンパク質データベースにおいては、受託番号ＮＰ＿０６７０６２．１として見出すことができる。ＰＥＲＫ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号９４５１）は、真核生物翻訳開始因子２−アルファキナーゼ３、ＥＩＦ２ＡＫ３、プロテインキナーゼＲ様小胞体キナーゼ、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ；ＰＥＫ；ＷＲＳ；およびＤＫＦＺｐ７８１Ｈ１９２５としても公知である。ＰＥＲＫの例示的なｍＲＮＡ配列は、本明細書において、配列番号４０として表記されているが、ＮＣＢＩのヌクレオチドデータベースにおいては、受託番号ＮＭ＿００４８３６．５として見出すこともできる。ＰＥＲＫの例示的なアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号４１として表記されているが、ＮＣＢＩのタンパク質データベースにおいては、受託番号ＮＰ＿００４８２７．４として見出すこともできる。
【０１５６】
また、例えば、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物レベルは、シャペロンタンパク質（例えば、カルネキシン、ＣＨＯＰ）の発現レベルまたは生物活性レベルを測定することにより決定することができるが、その理由として、これらのタンパク質は、ＵＰＲがＰＥＲＫにより活性化されると上方制御され、そのＰＥＲＫは、特定の切断型ＳＣＮ５Ａ転写産物により活性化されるからである。従って、例示的な態様において、本明細書に記載されている方法は、生体試料におけるシャペロンタンパク質のレベルを測定するステップを含むことができる。例示的な実施形態において、シャペロンタンパク質は、ＣＨＯＰまたはカルネキシンである。
【０１５７】
例示的な態様において、シャペロンタンパク質は、ＣＨＯＰである。ＣＨＯＰ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１６４９）は、ＤＤＩＴ３、ＤＮＡ損傷誘導性転写産物３、ＣＥＢＰＺ；ＣＨＯＰ１０；ＣＨＯＰ−１０；ＧＡＤＤ１５３；ＭＧＣ４１５４としても公知である。ＣＨＯＰの例示的なアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号４２〜４７として表記されているが、ＮＣＢＩのタンパク質データベースにおいては、受託番号ＮＰ＿００１１８１９８２．１、ＮＰ＿００１１８１９８３．１、ＮＰ＿００１１８１９８４．１、ＮＰ＿００１１８１９８５．１、ＮＰ＿００１１８１９８６．１、ＮＰ＿００４０７４．２として見出すこともできる。ＣＨＯＰの例示的なヌクレオチド配列は、本明細書において、配列番号４８〜５３として表記されているが、ＮＣＢＩのヌクレオチドデータベースにおいては、受託番号ＮＭ＿００１１９５０５３．１、ＮＭ＿００１１９５０５４．１、ＮＭ＿００１１９５０５５．１、ＮＭ＿００１１９５０５６．１、ＮＭ＿００１１９５０５７．１およびＮＭ＿００４０８３．５として見出すこともできる。
【０１５８】
例示的な態様において、シャペロンタンパク質は、カルネキシンである。カルネキシン（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号８２１）は、ＣＡＮＸ；ＣＮＸ；Ｐ９０；ＩＰ９０；ＦＬＪ２６５７０としても公知である。カルネキシンの例示的なアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号５４および５５として表記されているが、ＮＣＢＩのタンパク質データベースにおいては、受託番号ＮＰ＿００１０１９８２０．１およびＮＰ＿００１７３７．１として見出すこともできる。カルネキシンの例示的なヌクレオチド配列は、本明細書において、配列番号５６および５７として表記されているが、ＮＣＢＩのヌクレオチドデータベースにおいては、受託番号ＮＭ＿００１０２４６４９．１およびＮＭ＿００１７４６．３として見出すこともできる。
【０１５９】
スプライシング因子ｈＬｕｃ７ａ、スプライシング因子ＲＢＭ２５、ＰＥＲＫおよび／またはシャペロンタンパク質のレベルが測定される方法において、レベルは、スプライシング因子ｈＬｕｃ７ａ、スプライシング因子ＲＢＭ２５、ＰＥＲＫまたはシャペロンタンパク質の発現レベル（例えば、タンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、遺伝子発現レベル）となり得る。あるいは、レベルは、酵素活性レベルまたは結合活性レベル等、生物活性レベルとなり得る。例示的な態様において、測定は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子または遺伝子転写産物と結合しているＲＢＭ２５の量を測定することにより行うことができる。
【０１６０】
医療記録
例示的な態様において、レベルは、医療記録からレベルを得ることにより決定される。例えば、レベルは、本発明の方法のステップが行われるよりも前、例えば、ＲＳが決定されるよりも前の時点に測定され、記録されていてもよい。例示的な態様において、レベルは、本発明の方法のステップが行われる時点以前の６カ月以内に測定され、記録されたレベルを含有する対象の医療記録から得られる。例示的な態様において、レベルは、本発明の方法のステップが行われる時点以前の５カ月または４カ月または３カ月または２カ月以内に測定され、記録されたレベルを含有する対象の医療記録から得られる。例示的な態様において、レベルは、本発明の方法のステップが行われる時点以前の１カ月または３週間または２週間または１週間以内に測定され、記録されたレベルを含有する対象の医療記録から得られる。
【０１６１】
例示的な態様において、レベルの一部は、医療記録からレベルを得ることにより決定され、一部は、測定される。例示的な態様において、方法は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の完全長転写産物のレベルを測定するステップと、対象の医療記録から、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン２８内の選択的（alternative）スプライシングから産生されたＳＮＣ５Ａスプライスバリアントのレベルを得るステップとを含む。あるいは、方法は、対象の医療記録から、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の完全長転写産物のレベルを得るステップと、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン２８内の選択的スプライシングから産生されたＳＮＣ５Ａスプライスバリアントのレベルを測定するステップとを含む。
【０１６２】
追加的なステップ
本発明の方法に関して、方法は、追加的なステップを包含することができる。例えば、方法は、方法の記述されているステップ（複数可）のうち１または複数を反復するステップを包含することができる。従って、例示的な態様において、方法は、比率ＲＳを再決定するステップを含む。例示的な態様において、方法は、６〜１２カ月毎に比率ＲＳを再決定するステップを含み、各ＲＳの決定は、同一対象から得られる異なる生体試料に基づく。一部の態様において、方法は、６〜１２カ月毎に対象から生体試料を得るステップと、得られた各生体試料のＲＳを決定するステップとを含む。
【０１６３】
例示的な態様において、方法は、その必要性またはリスクが決定されると、治療用の薬剤またはデバイスを投与するステップを含む。例えば、本明細書に記載されている方法は、その必要性があると決定された対象に、妥当な療法を与えるステップ（医薬品製剤を投与するステップまたはケア標準を実施するステップ）を場合により含むことができる。例示的な態様において、本発明の方法は、妥当な療法の提供に関係する１または複数のステップを含む。方法は、例えば、対象にＩＣＤを植え込むステップまたは対象に抗不整脈剤を投与するステップを含むことができる。抗不整脈剤は、本技術分野において公知のいずれかとなることができ、その一部は、本明細書に記載されている。抗不整脈剤は、本技術分野において公知のいずれかの適した投与経路により対象に投与することができ、その一部の経路は、本明細書において後述されている。
【０１６４】
例示的な態様において、方法は、２以上の仕方でＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを決定するステップを含む。例示的な態様において、方法は、（ｉ）対象から得られる生体試料からＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するステップと、（ｉｉ）対象の医療記録からＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを得るステップとを含む。例示的な態様において、方法は、ＳＣＮ５Ａエクソン２８  ｍＲＮＡ転写産物の測定およびＳＣＮ５Ａエクソン２８  ｍＲＮＡ転写産物にコードされるタンパク質産物の測定により、ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するステップを含む。例示的な態様において、方法は、次のうち２、３、４、５、６、７、８種または全てのレベルを測定するステップを含む。（ｉ）ＳＣＮ５Ａエクソン２８  ｍＲＮＡ転写産物、（ｉｉ）ＳＣＮ５Ａエクソン２８タンパク質、（ｉｉｉ）ｈＬｕｃ７Ａの発現レベル、（ｉｖ）ＲＢＭ２５の発現レベル、（ｖ）ＳＣＮ５Ａ遺伝子または遺伝子転写産物に対するＲＢＭ２５の結合レベル、（ｖｉ）ＰＥＲＫの発現レベル、（ｖｉｉ）ＰＥＲＫの生物活性レベル、（ｖｉｉｉ）シャペロンタンパク質の発現レベル、（ｉｘ）シャペロンタンパク質の生物活性レベル。例示的な態様において、方法は、２種以上の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを測定するステップを含む、例えば、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ両方のレベルを測定するステップを含む。
【０１６５】
例示的な態様において、方法は、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のうち２種類以上（例えば、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ）および／または完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のうち２種類以上（例えば、Ｅ２８Ａ−ＳおよびＷＴ  ＳＣＮ５Ａエクソン２８）のレベルを決定するステップを含む。
【０１６６】
本発明の方法の目的のため、本明細書に記載されているステップのありとあらゆる可能な組み合わせが企図される。
【０１６７】
生体試料
本明細書に開示されている方法に関して、一部の実施形態において、試料は、体液を含み、体液として、対象から得られる血液、血漿、血清、リンパ液、母乳、唾液、粘液、精液、膣分泌物、細胞抽出物、炎症液、脳脊髄液、糞便、硝子体液または尿等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の態様において、試料は、先述の試料のうち少なくとも２種の複合性パネルである。一部の態様において、試料は、血液試料、血漿試料、血清試料および尿試料のうち少なくとも２種の複合性パネルである。例示的な態様において、試料は、血液またはその画分（例えば、血漿、血清、白血球フェレーシスにより得られる画分）を含む。例示的な態様において、試料は、対象から得られる白血球を含む。例示的な態様において、試料は、白血球のみを含む。例示的な態様において、試料は、筋肉組織（例えば、骨格筋組織）である。例示的な態様において、試料は、心臓性組織（例えば、心筋組織）である。
【０１６８】
対象
本明細書に開示されている方法に関して、例示的な態様における対象は、哺乳動物である。哺乳動物として、マウスおよびハムスター等、齧歯目（Rodentia）の哺乳動物、ウサギ等、ウサギ目（Logomorpha）の哺乳動物、Ｆｅｌｉｎｅ（ネコ）およびＣａｎｉｎｅ（イヌ）を包含する食肉目（Carnivora）由来の哺乳動物、Ｂｏｖｉｎｅ（ウシ）およびＳｗｉｎｅ（ブタ）を包含する偶蹄目（Artiodactyla）またはＥｑｕｉｎｅ（ウマ）を包含する奇蹄目（Perssodactyla）由来の哺乳動物等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の態様において、哺乳動物は、霊長目（Primates）の哺乳動物、ＣｅｂｏｉｄまたはＳｉｍｏｉｄ（サル）または真猿亜目（Anthropoids）の哺乳動物（ヒトおよび類人猿）である。一部の態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【０１６９】
対照
本明細書に記載されている方法において、決定されるレベルは、対照レベルまたはカットオフレベルまたは閾値レベルと同一であっても、あるいは対照レベルまたはカットオフレベルまたは閾値レベルと比べて増加または減少してもよい。一部の態様において、対照対象は、同一の生物種、性別、民族、年齢群、喫煙状況、ＢＭＩ、現在の療法レジメン状況、病歴またはこれらの組み合わせがマッチされた対照であるが、対照が、問題になっている疾患を患っていないあるいは疾患のリスクがないという点において、診断されている対象とは異なっている。
【０１７０】
決定されるレベルは、対照レベルと比べて増加したレベルとなり得る。本明細書において、レベル（例えば、発現レベル、生物活性レベル）に関する用語「増加した」は、対照レベルを上回る任意の％増加を指す。増加したレベルは、対照レベルと比べて、少なくともまたは約５％増加、少なくともまたは約１０％増加、少なくともまたは約１５％増加、少なくともまたは約２０％増加、少なくともまたは約２５％増加、少なくともまたは約３０％増加、少なくともまたは約３５％増加、少なくともまたは約４０％増加、少なくともまたは約４５％増加、少なくともまたは約５０％増加、少なくともまたは約５５％増加、少なくともまたは約６０％増加、少なくともまたは約６５％増加、少なくともまたは約７０％増加、少なくともまたは約７５％増加、少なくともまたは約８０％増加、少なくともまたは約８５％増加、少なくともまたは約９０％増加、少なくともまたは約９５％増加となり得る。
【０１７１】
決定されるレベルは、対照レベルと比べて減少したレベルとなり得る。本明細書において、レベル（例えば、発現レベル、生物活性レベル）に関する用語「減少した」は、対照レベルを下回る任意の％減少を指す。減少したレベルは、対照レベルと比べて、少なくともまたは約５％減少、少なくともまたは約１０％減少、少なくともまたは約１５％減少、少なくともまたは約２０％減少、少なくともまたは約２５％減少、少なくともまたは約３０％減少、少なくともまたは約３５％減少、少なくともまたは約４０％減少、少なくともまたは約４５％減少、少なくともまたは約５０％減少、少なくともまたは約５５％減少、少なくともまたは約６０％減少、少なくともまたは約６５％減少、少なくともまたは約７０％減少、少なくともまたは約７５％減少、少なくともまたは約８０％減少、少なくともまたは約８５％減少、少なくともまたは約９０％減少、少なくともまたは約９５％減少となり得る。
【０１７２】
ハウスキーピング遺伝子
本明細書における目的のため、ＳＣＮ５Ａ転写産物のレベルは、決定され（得られまたは測定され）、レベルは、ハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化または較正される。一部の態様におけるハウスキーピング遺伝子は、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨである。例示的な態様において、ハウスキーピング遺伝子は、配列表において配列番号６１〜６３５として表記される遺伝子のうちいずれか１つ、あるいは下の表１に表記される遺伝子のうちいずれか１つである。
【０１７３】
【表１Ｂ−１】
2014508514.tif 000019
【０１７４】
【表１Ｂ−２】
2014508514.tif 000020
【０１７５】
【表１Ｂ−３】
2014508514.tif 000021
【０１７６】
【表１Ｂ−４】
2014508514.tif 000022
【０１７７】
【表１Ｂ−５】
2014508514.tif 000023
【０１７８】
【表１Ｂ−６】
2014508514.tif 000024
【０１７９】
【表１Ｂ−７】
2014508514.tif 000025
【０１８０】
【表１Ｂ−８】
2014508514.tif 000026
【０１８１】
【表１Ｂ−９】
2014508514.tif 000027
【０１８２】
【表１Ｂ−１０】
2014508514.tif 000028
【０１８３】
【表１Ｂ−１１】
2014508514.tif 000029
【０１８４】
【表１Ｂ−１２】
2014508514.tif 000030
【０１８５】
【表１Ｂ−１３】
2014508514.tif 000031
【０１８６】
【表１Ｂ−１４】
2014508514.tif 000032
【０１８７】
投与経路
投与経路に関する次の記述は、単に例示的な実施形態を図解するために提供されており、決してその範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【０１８８】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水またはオレンジジュース等の希釈液に溶解した有効量の本開示のアナログ等、液体の溶液、（ｂ）それぞれ所定量の有効成分を固体または顆粒として含有するカプセル、小袋（sachet）、錠剤、薬用キャンディー（lozenge）およびトローチ、（ｃ）粉末、（ｄ）妥当な液体における懸濁液ならびに（ｅ）適したエマルジョンからなることができる。液体製剤は、薬学的に許容されるサーファクタントを添加したまたは添加しない、水ならびにアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコール等、希釈液を包含することができる。カプセル形態は、例えば、サーファクタント、潤滑剤ならびにラクトース、スクロース、リン酸カルシウムおよびコーンスターチ等、不活性フィラーを含有する、通常の堅いまたは柔らかい殻のゼラチン型のカプセルとなり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アラビアゴム（acacia）、ゼラチン、グアーガム、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸および他の賦形剤、着色料、希釈液、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤（moistening  agent）、保存料、香味料ならびに他の薬理学的に適合性の賦形剤のうち１または複数を包含することができる。薬用キャンディー形態は、香味、通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガント中に本開示のアナログを含むことができ、芳香錠（pastille）は、本技術分野において公知の賦形剤をその上含有する、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム、エマルジョン、ゲルその他等、不活性基剤（base）中に本開示のアナログを含む。
【０１８９】
本開示のアナログは、単独で、あるいは他の適した構成成分と組み合わせて、経肺投与により送達することができ、吸入により投与するためのエアロゾル製剤へと作製することができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素その他等、加圧された許容される噴霧剤中に置くことができる。これは、ネブライザまたはアトマイザにおける調製物等、非加圧型調製物のための医薬品として処方することもできる。このようなスプレー製剤は、粘膜のスプレーに用いてもよい。一部の実施形態において、アナログは、粉末ブレンドへとまたはマイクロ粒子もしくはナノ粒子へと処方される。適した経肺製剤は、本技術分野において公知のものである。例えば、Qianら、Int  J  Pharm  ３６６巻：２１８〜２２０頁（２００９年）；AdjeiおよびGarren、Pharmaceutical  Research、７巻（６号）：５６５〜５６９頁（１９９０年）；Kawashimaら、J  Controlled  Release  ６２巻（１〜２号）：２７９〜２８７頁（１９９９年）；Liuら、Pharm  Res  １０巻（２号）：２２８〜２３２頁（１９９３年）；国際特許出願公開の国際公開第２００７／１３３７４７号パンフレットおよび国際公開第２００７／１４１４１１号パンフレットを参照されたい。
【０１９０】
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および目的とするレシピエントの血液との等張性を製剤に付与する溶質を含有し得る水性および非水性、等張性無菌注射溶液ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤および保存料を包含し得る水性および非水性無菌懸濁液を包含する。用語「非経口」は、消化管を経由せず、皮下、筋肉内、脊髄内または静脈内等、その他の経路によることを意味する。本開示のアナログは、せっけん（soap）もしくは洗剤（detergent）等の薬学的に許容されるサーファクタント、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース等の懸濁剤または乳化剤その他の医薬品アジュバントを添加したまたは添加しない、水、生理食塩水、デキストロース水および関連する糖溶液、エタノールもしくはヘキサデシルアルコール等のアルコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール等のケタール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリドもしくはアセチル化脂肪酸グリセリドを包含する、無菌液体または液体混合物等、医薬品担体における生理的に許容される希釈液と共に投与することができる。
【０１９１】
非経口製剤において用いることのできる油として、石油、動物性油、植物性油または合成油が挙げられる。油の具体的な例として、ピーナッツ、ダイズ、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリンおよび鉱物が挙げられる。非経口製剤における使用に適した脂肪酸として、オレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適した脂肪酸エステルの例である。
【０１９２】
非経口製剤における使用に適したせっけんとして、脂肪族（fatty）アルカリ金属、アンモニウムおよびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適した洗剤として、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライドおよびアルキルピリジニウムハライド等、陽イオン性洗剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホネート（sulfonate）、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドサルフェートならびにスルホサクシネート等、陰イオン性洗剤、（ｃ）例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等、非イオン性洗剤、（ｄ）例えば、アルキル−β−アミノプロピオネートおよび２−アルキル−イミダゾリン四級アンモニウム塩等、両性洗剤ならびに（ｅ）これらの混合物が挙げられる。
【０１９３】
非経口製剤は、通例、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の本開示のアナログを含有するであろう。保存料およびバッファーを用いてもよい。注射部位における刺激作用を最小化または排除するため、このような組成物は、約１２〜約１７の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１または複数の非イオン性サーファクタントを含有することができる。このような製剤におけるサーファクタントの含量は、通例、約５重量％〜約１５重量％に及ぶであろう。適したサーファクタントは、ソルビタンモノオレエート等、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステルおよびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により生成された疎水性塩基とエチレンオキシドの高分子量付加物を包含する。非経口製剤は、アンプルおよびバイアル等、単位用量または複数用量の密封容器中に提示することができ、使用直前に注射用の無菌液体賦形剤、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０１９４】
注射用製剤は、本発明に合致している。注射用組成物のための有効な医薬品担体の要件は、当業者にとって周知のものである（例えば、Pharmaceutics  and  Pharmacy  Practice、J.  B.  Lippincott  Company、ペンシルベニア州フィラデルフィア、BankerおよびChalmers編、２３８〜２５０頁（１９８２年）およびASHP  Handbook  on  Injectable  Drugs,  Toissel、第４版、６２２〜６３０頁（１９８６年）を参照）。
【０１９５】
その上、本開示のアナログは、乳化基剤または水溶性基剤等、種々の基剤と混合することにより、直腸投与のための坐薬へと作製することができる。膣内投与に適した製剤は、有効成分に加えて、本技術分野において妥当であることが公知の担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー処方として提示することができる。
【０１９６】
当業者であれば、上述の医薬組成物に加えて、本開示のアナログが、シクロデキストリン封入複合体またはリポソーム等、封入複合体として処方することができると認められよう。
【０１９７】
処置および予防
用語「処置」および「予防」は、それらから派生（stemming）する語句と共に、本明細書において、必ずしも１００％または完全な処置または予防を暗示しない。むしろ、潜在的な利益または療法効果を有すると当業者が認識する、その処置または予防の変動的な程度が存在する。この点において、本発明の方法は、哺乳動物における任意の量の任意のレベルの処置または予防を提供することができる。その上さらに、処置または予防は、処置または予防されている疾患の１または複数の状態または症状の処置または予防を包含することができる。また、本明細書における目的のため、「予防」は、疾患またはその症状もしくは状態の発病の遅延を網羅することができる。
【０１９８】
システム、コンピュータ可読記憶媒体およびコンピュータプロセッサにより実施される方法
図３４は、植え込み式除細動器（ＩＣＤ）に関する対象の必要性を査定するためのシステム１００の例示的な実施形態１０１を図解する。一般に、システム１００は、１または複数のクライアントデバイス１０２と、ネットワーク１０４と、データベース１０８とを包含することができる。例えば、ＩＥＥＥ８０２．１１規格（「Ｗｉ−Ｆｉ」）、イーサネット（登録商標）（Ethernet（登録商標））規格または任意の他の適切なネットワーク接続のうちの１つなどの規格に準拠する接続となり得る１または複数の有線または無線ネットワーク接続１１２により、各クライアントデバイス１０２は、ネットワーク１０４に通信可能に連結され得る。同様に、データベース１０８は、１または複数の接続１１４を介してネットワーク１０４に通信可能に連結され得る。（当然ながら、データベースは、クライアントデバイス１０２の１または複数に対し代替的に内部のものであってもよい。）データベース１０８は、ＩＣＤに関する対象の必要性の決定に関係するデータを記憶することができる。このようなデータとして、対象から得られる生体試料のデータ、対照または検査集団から得られる生体試料のデータ、生体試料のデータに関連するガウス分布のデータ、生体試料（複数可）および／またはガウス分布のデータに関連する１または複数の閾値のデータ等が挙げられるがこれらに限定されない。より詳細に後述する通り、生体試料のデータは、例えば、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル、複数のＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベル等のうち１または複数に関係し得る。
【０１９９】
理解されるように、ネットワーク１０４は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）となり得る。即ち、ネットワーク１０４は、ローカル（例えば、組織団体内（intra-organization））接続のみを包含してもよいし、あるいはネットワーク１０４は、組織団体を越えて１または複数の公衆のネットワーク（例えば、インターネット）に伸びる接続を包含してもよい。一部の実施形態において、例えば、クライアントデバイス１０２およびデータベース１０８は、一社（会社Ａ）によって運営されるネットワーク内に存在してもよい。他の実施形態において、例えば、クライアントデバイス（複数可）１０２は、会社Ａにより運営されるネットワークに存在し得るが、データベース１０８は、第二の会社（会社Ｂ）により運営されるネットワークに存在してよく、会社Ａおよび会社Ｂのネットワークは、例えば、インターネット等、第三のネットワークにより連結されてよい。
【０２００】
さらに図３４を参照すると、クライアントデバイス１０２は、プロセッサ１２８（ＣＰＵ）と、ＲＡＭ１３０と、不揮発性メモリ１３２とを包含する。不揮発性メモリ１３２は、例として、磁気ディスク（例えば、ハードディスクドライブ）、半導体（solid  state）ドライブ（例えば、フラッシュメモリ）等が挙げられるがこれらに限定されない任意の妥当なメモリデバイスとなり得る。その上、少なくとも図３４に関して、データベース１０８は、クライアントデバイス１０２と別個のものである必要はないことが理解されよう。その代わりに、一部の実施形態において、データベース１０８は、不揮発性メモリ１３２の一部であり、データ１２２、１２４、１２６は、メモリ１３２内のデータとして記憶され得る。例えば、データ１２２は、データベース１０８におけるデータとしてではなく、メモリ１３２に記憶されるスプレッドシートファイルにおけるデータとして包含され得る。データベース１０８（一部の実施形態において）の記録の記憶に加えて、メモリ１３２は、１または複数の試料および／または対照集団のデータの解析、データのガウス適合の決定、対象のデータが比較され得る閾値の決定および／またはＩＣＤに関する対象の必要性の決定に必要なプログラムデータおよび他のデータを記憶する。例えば、一実施形態において、メモリ１３２は、第一のルーティン１３４、第二のルーティン１３６および第三のルーティン１３８を記憶する。第一のルーティン１３４は、１または複数の試料および／または対照集団に関係するデータ値を受け取ることができ、ルーティン１３４により受け取ったデータ値をガウス分布に適合させることができる。第二のルーティン１３６は、ガウス分布の平均値、標準偏差値等の決定等、第一のルーティン１３４により収集されたデータの１または複数の統計パラメータをコンピュータ計算することができる。その上および／またはあるいは、第二のルーティン１３６は、各対象がＩＣＤを受け入れるべきか決定するために１または複数の対象のデータと比較され得る第一の閾値を設定することができる。第三のルーティン１３８は、例えば、１または複数の対象のデータを受け取り、１または複数の対象のデータを第二のルーティン１３６により決定された閾値（複数可）と比較し、および／または対象のデータと閾値との比較に従って各対象がＩＣＤを受け入れるべきか決定することができる。そうであるにもかかわらず、ルーティンのそれぞれは、プロセッサ１２８により実行可能であり、メモリ１３２に記憶された一連のコンパイルされたまたはコンパイル可能な機械可読命令を含む。その上、メモリ１３２は、ルーティン１３４または１３６の一方によりアウトプットされたデータの作成された報告または記録を記憶することができる。あるいは、報告または記録は、データベース１０８にアウトプットされてよい。一般に公知の通り、１または複数のディスプレイ／アウトプットデバイス１４０（例えば、プリンタ、ディスプレイ等）および１または複数のインプットデバイス１４２（例えば、マウス、キーボード、タブレット、タッチセンサ式インターフェース等）が、クライアントデバイス１０２に連結されてもよい。
【０２０１】
理解されるように、１または複数の方法の個々の操作は、別個の操作として説明および記載されているが、個々の操作の１または複数は同時に行われてよく、説明されている順序で操作が行われる必要ない。具体例の構成において別個の構成成分として提示されている構造および機能性は、組み合わせた構造または構成成分として実施することができる。同様に、単一の構成成分として提示されている構造および機能性は、別個の構成成分として実施することができる。上述および他の変更、修正、追加および改善は、本明細書における対象物の範囲内に収まる。
【０２０２】
例えば、ネットワーク１０４として、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮ、モバイル、有線もしくは無線ネットワーク、プライベートネットワークまたは仮想プライベートネットワークのいずれかの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。その上、説明を単純化および明確化するために、２個のクライアント１０２のみが図３４に図解されているが、任意の数のクライアントコンピュータが支持され、１または複数のサーバ（図示せず）と連絡することができることが理解できる。
【０２０３】
その上、特定の実施形態が、ロジックまたは数多くのルーティンを包含するものとして本明細書に記載されている。ルーティンは、ソフトウェアルーティン（例えば、機械可読媒体もしくは伝送シグナルに具現化されたコード）またはハードウェアルーティンのいずれかを構成することができる。ハードウェアルーティンは、特定の操作を行うことのできる有形ユニットであり、特定の形式で構成または配置され得る。具体例としての実施形態において、１または複数のコンピュータシステム（例えば、スタンドアロン、クライアントもしくはサーバコンピュータシステム）またはコンピュータシステムの１もしくは複数のハードウェアルーティン（例えば、プロセッサもしくはプロセッサ群）は、ソフトウェア（例えば、アプリケーションまたはアプリケーション割り当て（portion））により、本明細書に記載されている特定の操作を行うよう操作するハードウェアルーティンとして構成され得る。
【０２０４】
同様に、本明細書に記載されている方法またはルーティンは、少なくとも部分的にプロセッサ実施され得る。例えば、方法の少なくとも一部の操作は、１もしくは複数のプロセッサまたはプロセッサ実施ハードウェアモジュールにより行うことができる。特定の操作のパフォーマンスは、１または複数のプロセッサ中に分布することができ、単一のマシン内に存するだけではなく、数多くのマシンにわたり展開される。一部の具体例としての実施形態において、プロセッサ（単数または複数）は、単一の位置（例えば、家庭環境、職場環境内にまたはサーバファームとして）に位置づけることができるが、他の実施形態において、プロセッサは、数多くの位置に分布することができる。
【０２０５】
特定の操作のパフォーマンスは、１または複数のプロセッサ中に分布することができ、単一のマシン内に存するだけではなく、数多くのマシンにわたり展開される。一部の具体例としての実施形態において、１または複数のプロセッサまたはプロセッサ実施モジュールは、単一の地理的位置（例えば、家庭環境、職場環境またはサーバファーム内）に位置づけることができる。他の具体例としての実施形態において、１または複数のプロセッサまたはプロセッサ実施モジュールは、数多くの地理的位置に分布することができる。
【０２０６】
一部の実施形態は、表現「連結された」および「接続された」ならびにこれらの派生語を用いて記載することができる。例えば、一部の実施形態は、２個以上の構成要素が、直接的に物理的または電気的接触していることを示すために、用語「連結された」を用いて記載することができる。しかし、用語「連結された」は、２個以上の構成要素が、互いに直接的に接触していないが、依然として互いに協働または相互作用していることを意味することもできる。実施形態は、この文脈に限定されない。
【０２０７】
本明細書において、用語「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」、「有している」またはこれらの任意の他の変種は、非排他的包括をカバーすることを目的とする。例えば、構成要素のリストを含むプロセス、方法、物品または器具は、これらの構成要素のみに必ずしも限定されないが、明確に列挙されていない構成要素またはこのようなプロセス、方法、物品もしくは器具に固有の他の構成要素を包含し得る。さらに、それとは反対のことが明確に記述されていなければ、「または」は、包括性または非排他性を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、次のうちいずれか１つにより要件が満たされる。Ａは真であり（または存在し）かつＢは偽である（または存在しない）；Ａは偽であり（または存在せず）かつＢは真である（または存在する）；ならびにＡおよびＢは共に真である（または存在する）。
【０２０８】
加えて、単数形（「ａ」または「ａｎ」）の使用は、本明細書における実施形態の構成要素および構成成分の記載に利用される。これは、単に便宜上なされており、記載の一般感覚を与えるためのものである。この記載は、１個または少なくとも１個を包含するものと読み取るべきであり、それ以外を意味することが明らかでない限り、単数形は複数形も包含する。
【０２０９】
さらにまた、図面は、単に説明目的のため、マップエディタシステム（map  editor  system）の好ましい実施形態を描写する。当業者であれば、次の記述から、本明細書において説明されている構造および方法の代替的な実施形態が、本明細書に記載されている原則から逸脱することなく用いられ得ることを容易に認識するであろう。
【０２１０】
本開示を読めば、当業者であれば、本明細書に開示されている原則により、末端道路区分（terminal  road  segment）を同定するためのシステムおよびプロセスのさらに追加的な代替的な構造的および機能的デザインを認められよう。このように、特定の実施形態および適用を説明および記載してきたが、開示されている実施形態が、本明細書に開示されている正確な構築および構成成分に限定されないことを理解されたい。本明細書に開示されている方法および器具の配置、操作および詳細において、添付の特許請求の範囲において定義されている精神および範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかな様々な修正、変化および変更がなされ得る。
【０２１１】
本発明は、プロセッサと、該プロセッサに連結したメモリデバイスと、該メモリデバイスに記憶された機械可読命令とを含むシステムを提供する。例示的な実施形態において、機械可読命令は、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる。
【０２１２】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘは、０．７〜１．０の間の数、２．０〜４．０の間の数または２．３２６〜４．０の間の数である。例示的な態様において、システムは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、インプットとしてＲＳを受け取らせ、ＲＳをＲＴと比較させる機械可読命令を含む。例示的な態様において、機械可読命令は、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、ＲＳとＲＴとの間の関係性を示すアウトプットを提示させる。
【０２１３】
代替的なまたは追加的な態様において、本発明のシステムは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）第二の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第二の複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第二の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である第二の複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）第二の複数のデータ値を第二のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第二のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第二の閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる、
機械可読命令を含む。
【０２１４】
例示的な態様において、ＲＴ２＝μ＋Ｘσであり、Ｘは、０．７〜１．０の間の数または２．０〜４．０の間の数または２．３２６〜４．０の間の数である。
【０２１５】
代替的なまたは追加的な態様において、本発明のシステムは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、
（ｉ）第三の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第三の複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第三の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である第三の複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）第三の複数のデータ値を第三のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第三のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第三の閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定させる、
機械可読命令を含む。
【０２１６】
これらのシステムのいずれかに関して、一部の態様において、システムは、プロセッサにより実行されると、プロセッサに、第一のガウス分布の曲線下面積が最大化され、第二のガウス分布の曲線下面積が最小化される点において、組み合わせた閾値比率ＲＴ組み合わせを設定させる機械可読命令を含む。
【０２１７】
プロセッサにより実行可能な機械可読命令を記憶したコンピュータ可読記憶媒体もまた本明細書に提供されている。例示的な実施形態において、命令は、
（ｉ）プロセッサに複数のデータ値を受け取らせるための命令であって、各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である、命令と、
（ｉｉ）プロセッサに、複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させるための命令と、
（ｉｉ）プロセッサに、第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させるための命令と、
（ｉｉｉ）プロセッサに、第一の閾値比率ＲＴを、μ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させるための命令と、
を含む。
【０２１８】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘは、０．７〜１．０の間または２．０〜４．０の間または２．３２６〜４．０の間の数である。例示的な態様において、コンピュータ可読記憶媒体は、プロセッサに、インプットとしてＲｓを受け取らせ、ＲｓをＲＴと比較させるための命令を含む。例示的な態様において、コンピュータ可読記憶媒体は、プロセッサに、ＲｓとＲＴとの間の関係性を示すアウトプットを提示させるための命令を含む。
【０２１９】
代替的なまたは追加的な実施形態において、本発明のコンピュータ可読記憶媒体は、プロセッサに、
（ｉ）第二の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第二の複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第二の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）第二の複数のデータ値を第二のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第二のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第二の閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定させる、
ための命令を含む。
【０２２０】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘは、０．７〜１．０の間または２．０〜４．０の間または２．３２６〜４．０の間の数である。
【０２２１】
代替的なまたは追加的な実施形態において、コンピュータ可読記憶媒体は、プロセッサに、
（ｉ）第三の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第三の複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第三の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である複数のデータ値を受け取らせ、
（ｉｉ）第三の複数のデータ値を第三のガウス分布に適合させ、
（ｉｉｉ）第三のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定させ、
（ｉｖ）第三の閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定させる、
ための命令を含む。
【０２２２】
コンピュータ可読記憶媒体は、例示的な態様において、プロセッサに、第一のガウス分布の曲線下面積が最大化され、第二のガウス分布の曲線下面積が最小化される点において、組み合わせ閾値比率ＲＴ組み合わせを設定させるための命令を含む。
【０２２３】
コンピュータにおいてプロセッサにより実施される方法が、さらに本明細書に提供されている。例示的な実施形態において、方法は、
（ｉ）複数のデータ値を受け取るステップであって、各データ値が、第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率であり、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である、ステップと、
（ｉｉ）複数のデータ値を第一のガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉ）第一のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｉｉ）第一の閾値比率ＲＴをμ−Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定するステップと、
ステップを含む。
【０２２４】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘは、０．７〜１．０の間または２．０〜４．０の間または２．３２６〜４．０の間の数である。例示的な態様において、方法は、インプットとしてＲｓを受け取るステップと、ＲｓをＲＴと比較するステップとを含む。例示的な態様において、方法は、ＲｓとＲＴとの間の関係性を示すアウトプットを提示するステップを含む。
【０２２５】
代替的なまたは例示的な実施形態において、方法は、
（ｉ）第二の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第二の複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第二の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である第二の複数のデータ値を受け取るステップと、
（ｉｉ）第二の複数のデータ値を第二のガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉｉ）第二のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｖ）第二の閾値比率ＲＴ２を、μ＋Ｘσ（式中、Ｘは、０．７〜４．０の間の数である）に設定するステップと、
ステップを含む。
【０２２６】
例示的な態様において、ＲＴ＝μ−Ｘσであり、Ｘは、０．７〜１．０の間または２．０〜４．０の間または２．３２６〜４．０の間の数である。
【０２２７】
代替的なまたは例示的な態様において、方法は、
（ｉ）第三の複数のデータ値の各データ値が、第二の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である第三の複数のデータ値であって、比率が、対象から得られる生体試料の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（Ａ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｂ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（Ｃ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第三の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である第三の複数のデータ値を受け取るステップと、
（ｉｉ）第三の複数のデータ値を第三のガウス分布に適合させるステップと、
（ｉｉｉ）第三のガウス分布の平均値μおよび標準偏差σを決定するステップと、
（ｉｖ）第三の閾値比率ＲＴ３を、μ＋４．０σに設定するステップと、
ステップを含む。
【０２２８】
例示的な態様において、方法は、第一のガウス分布の曲線下面積が最大化され、第二のガウス分布の曲線下面積が最小化される点において、組み合わせた閾値比率ＲＴ組み合わせを設定するステップを含む。
【０２２９】
本セクションに記載されているシステム、媒体および方法の代替的な実施形態において、本発明は、第一の集団の各対象が、心不全または不整脈であることが既知の対象である、システム、媒体および方法をさらに提供する。例示的な態様において、システム、媒体または方法は、第三の複数のデータ値の受け取りに関係する命令をさらに含み、第三の複数のデータ値の各データ値は、第三の集団の対象から得られる生体試料から決定される比率であり、第三の集団の各対象は、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病、例えば、心不全または不整脈ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である。
【０２３０】
キット
キット、例えば、本明細書に表記されている方法を踏まえて、リスクの診断または決定に用いることのできる診断キットが本明細書に提供されている。例示的な実施形態において、キットは、（ａ）Ｅ２８Ｃ結合剤および／またはＥ２８Ｄ結合剤、（ｂ）ＷＴ  ＳＣＮ５Ａ結合剤および／またはＥ２８Ａ−Ｓ結合剤ならびに使用のための説明書を含む。例示的な態様において、キットは、全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物：ＷＴ、Ｅ２８Ａ−Ｓ、Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄに対する結合剤をさらに含む。
【０２３１】
追加的なまたは代替的な実施形態において、キットは、（Ｉ）各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことのあるＩＣＤを有することが既知の対象である複数のデータ値、（ＩＩ）複数のデータ値のガウス分布、（ＩＶ）ガウス分布の平均値および標準偏差または（Ｖ）複数のデータ値のガウス分布の平均値および標準偏差に基づく閾値比率ＲＴを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含む。例示的な実施形態において、キットは、コンピュータ可読記憶媒体へのアクセスを含む。例示的な実施形態において、キットは、（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれか１または複数へのアクセスを含む。
【０２３２】
追加的なまたは代替的な実施形態において、キットは、（Ｉ）各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、ショックを与えたことがないＩＣＤを有することが既知の対象である複数のデータ値、（ＩＩ）複数のデータ値のガウス分布、（ＩＶ）ガウス分布の平均値および標準偏差または（Ｖ）複数のデータ値のガウス分布の平均値および標準偏差に基づく閾値比率ＲＴを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含む。例示的な実施形態において、キットは、コンピュータ可読記憶媒体へのアクセスを含む。例示的な実施形態において、キットは、（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれか１または複数へのアクセスを含む。
【０２３３】
追加的なまたは代替的な実施形態において、キットは、（Ｉ）各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、（Ｉ）ＩＣＤを有していない、（ＩＩ）心臓病ではない、（ＩＩＩ）正常な左心室機能を有する、（ＩＶ）拡張機能障害がない、または（Ｖ）これらの組み合わせであることが既知の対象である複数のデータ値、（ＩＩ）複数のデータ値のガウス分布、（ＩＶ）ガウス分布の平均値および標準偏差または（Ｖ）複数のデータ値のガウス分布の平均値および標準偏差に基づく閾値比率ＲＴを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含む。例示的な実施形態において、キットは、（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれか１または複数へのアクセスを含む。
【０２３４】
追加的なまたは代替的な実施形態において、キットは、（Ｉ）各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、心不全またはそのリスクがあることが既知の対象である複数のデータ値、（ＩＩ）複数のデータ値のガウス分布、（ＩＶ）ガウス分布の平均値および標準偏差または（Ｖ）複数のデータ値のガウス分布の平均値および標準偏差に基づく閾値比率ＲＴを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含む。例示的な実施形態において、キットは、コンピュータ可読記憶媒体へのアクセスを含む。例示的な実施形態において、キットは、（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれか１または複数へのアクセスを含む。
【０２３５】
追加的なまたは代替的な実施形態において、キットは、（Ｉ）各データ値が第一の集団の対象から得られる生体試料から決定された比率である複数のデータ値であって、比率が、切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルを、（ｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉ）生体試料の全ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルまたは（ｉｉｉ）生体試料の完全長ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルおよび１もしくは複数の切断型ＳＣＮ５Ａエクソン２８転写産物のレベルと比較し、第一の集団の各対象が、不整脈またはそのリスクがあることが既知の対象である複数のデータ値、（ＩＩ）複数のデータ値のガウス分布、（ＩＶ）ガウス分布の平均値および標準偏差または（Ｖ）複数のデータ値のガウス分布の平均値および標準偏差に基づく閾値比率ＲＴを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含む。例示的な実施形態において、キットは、コンピュータ可読記憶媒体へのアクセスを含む。例示的な実施形態において、キットは、（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれか１または複数へのアクセスを含む。
【０２３６】
例示的な実施形態において、キットは、ｈＬｕｃ７ａ結合剤、ＲＢＭ２５結合剤、ＰＥＲＫ結合剤および／またはシャペロンタンパク質結合剤、例えば、ＣＨＯＰ結合剤、カルネキシン結合剤を含む。
【０２３７】
本明細書において、用語「結合剤」は、対象とするマーカー（ｈＬｕｃ７Ａ、ＲＢＭ２５、ＰＥＲＫ、ＣＨＯＰ、カルネキシンその他）と特異的に結合する任意の化合物を指す。
【０２３８】
先述に関して、一部の態様における結合剤は、抗体、抗原結合断片、アプタマー、タンパク質もしくはペプチド基質または核酸プローブである。このような結合剤は、本技術分野において公知のものである。一部の態様において、キットは、結合剤のコレクション、例えば、抗体のコレクション、その各結合剤がマーカーをコードする遺伝子または核酸と特異的に結合する核酸プローブのコレクションを含む。一部の態様において、核酸プローブのコレクションは、固体支持体、例えば、遺伝子チップ上のアレイにフォーマットされる。一部の態様において、キットは、マーカーと特異的に結合する抗体のコレクションを含む。一部の態様において、キットは、各ウェルが他のウェルの抗体に独特の特異性を有する抗体を含む、マルチウェル（multi-well）マイクロタイタープレートを含む。一部の態様において、キットは、マーカーと特異的に反応する基質のコレクションを含む。一部の態様において、キットは、各ウェルが他のウェルの基質に独特の特異性を有する基質を含む、マルチウェルマイクロタイタープレートを含む。
【０２３９】
一部の態様において、キットは、使用のための説明書をさらに含む。一部の態様において、説明書は、紙のコピーの説明書、電子コピーの説明書、例えば、コンパクトディスク、フラッシュドライブ（flash  drive）または他の電子媒体として提供される。一部の態様において、説明書は、ユーザーが説明書にアクセスできるインターネットサイトへの案内を与えるために提供される。
【０２４０】
一部の態様において、キットは、対象の生体試料、例えば、本明細書に記載されている試料のいずれかを収集するためのユニットをさらに含む。一部の態様において、試料を収集するためのユニットは、バイアル、ビーカー、チューブ、マイクロタイタープレート、ペトリ皿その他である。
【０２４１】
本発明を説明するため、あるいは本発明に関係する背景情報を提供するためのみに、次の実施例を記載する。次の実施例は、決して本発明の範囲の限定を目的としない。
【実施例】
【０２４２】
（実施例１）
本実施例は、米国特許出願公開第２００７／０２１２７２３号明細書に示す通り、ヒトＳＣＮ５ＡのＮ末端およびＣ末端ｍＲＮＡスプライシングバリアントの検出を実証する。
【０２４３】
最初のヒトＳＣＮ５Ａ  ｃＤＮＡ（Shengら（DNA  and  Cell  Biology  １３巻：９〜２３頁（１９９４年））により報告、Zhangら、Gene  Expression  ８巻：８５〜１０３頁（１９９９年）も参照されたい）（受託番号Ｍ７７２３５）は、ＡＴＧコドンの１５０ｂｐ上流まで５’端が伸長し、２２９３ｂｐの３’ＵＴＲを有する８．５〜９．０ｋｂであり、これは、ポリアデニル化（polyadenylylation）シグナル配列とポリＡ領域のいずれも含有していなかった。マウスｓｃｎ５ａ遺伝子は、複雑な５’および３’ＵＴＲを有し、５’および３’ＵＴＲスプライスバリアントは、発生的に制御される（Shang,  L.  L.  &  Dudley,  S.  C.,  Jr、J.  Biol.  Chem.２８０巻：９３３〜９４０頁（２００５年））。よって、本出願人らは、以前に報告されたヒトＵＴＲ配列が、ｃＤＮＡアイソフォームの全範疇を表すか評価するよう努めた。それぞれ開始コドン上流および終止コドン下流の５’および３’ｍＲＮＡ端の解析のため、ＲＡＣＥ手順を利用した。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、ゲル電気泳動において数本の明確なバンドが得られた。その後のネステッドＰＣＲ増幅により、胎児心臓ＲＮＡおよび成人心臓ＲＮＡの両方において３本のバンド（３８０ｂｐ、２００ｂｐおよび１００ｂｐ）が得られた（図５）。これらのバンドの配列は、３本のバンドが全てＳＣＮ５Ａ遺伝子特異的であることを示した。５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物とゲノム配列との間の比較は、報告されたデータから、２種の異なるエクソン１アイソフォームが存在し、そのうち公知の一方は１６０ｂｐであり、エクソン２の１６．０ｋｂ上流に位置づけられることを示した。新規アイソフォームは、８５ｂｐであり、これはエクソン２から１２．３ｋｂ離間していた。別の新しいスプライシングエクソン１は、エクソン２において見出され、これは、エクソン１スプライスが存在しないことを意味する。ＲＮＡは、エクソン２から直接的に転写されたが、ＴＳＳは、正常エクソン２と比較して短い１３ｂｐであった。ＲＡＣＥ手順から、本出願人らは、以前に報告された（Shang,  L.  J.  &  Dudley,  S.  C.、Biophysical  Journal  ８６巻、４２４Ａ（２００４年））エクソン１アイソフォームを得ることができず、この結果は、総計３種のエクソン１スプライスバリアントが存在することを示唆した。そして、複数のＴＳＳが、全スプライシングアイソフォームに存在していた。本出願人らは、これらの非翻訳ｃＤＮＡ断片を、それぞれエクソン１Ａ（１６０ｂｐ）、エクソン１Ｂ（８５ｂｐ）およびエクソン２Ｂ（３１３ｂｐ）と命名した。プライマー伸長およびＲＮａｓｅ保護により同定されたエクソン１Ａが、９７〜１７６ｂｐにわたる長さでヒトおよびラットにおいて以前に報告されている（Yangら、Cardiovascular  Research  ６１巻：５６〜６５頁（２００４年））。ＳＣＮ５Ａ  ５’ＵＴＲの全アイソフォームを図１および３にまとめ、配列を図２および４に描写した。
【０２４４】
３’ＵＴＲの解析は、胎児および成人心臓におけるスプライス変種のエビデンスを示した。ＧＳＰ３’およびオリゴｄＴプライマーを用いたＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、本出願人らは、６種の代替的な３’ＵＴＲを同定した（図６）。ゲノムおよびｃＤＮＡ配列の比較は、３’ＵＴＲが、６種の異なるポリＡスプライシングバリアントを有することを示した。そのうち１種は、終止コドン後に長い２２９５ｂｐがあり、Ｇｅｎｅｂａｎｋには見出されなかったが、公表されているマウスｓｃｎ５ａ  ｃＤＮＡ（受託番号ＡＪ２７１４７７）と一致する。その上、ヒトｓｃｎ５ａ  ｃＤＮＡ  ５’ＵＴＲ（受託番号Ｍ７７２３５）と対応する８２４ｂｐの第二の短いバリアントが存在した。これらの２種のアイソフォームは、Ｅ２８Ａと称される同一スプライスによるエクソン２８を有する。３’ＵＴＲにおいて、３種のエクソン２８スプライスバリアント、Ｅ２８Ｂ（２７ｂｐ）、Ｅ２８Ｃ（３９ｂｐ）およびＥ２８Ｄ（１１４ｂｐ）を検出した。Ｅ２８Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄの配列は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＦ０９２２９２、ＥＦ０９２２９３およびＥＦ０９２２９４と表記され、本明細書においては、それぞれ配列番号６３６〜６３８と表記される。Ｅ２８Ｂは胎児特異的であり、Ｅ２８Ｄは成人特異的であり、一方、Ｅ２８Ｃは、胎児およびヒト心臓の両方において発現した。完全長Ｅ２８Ａバリアントと比較すると、全３種のバリアントはそれよりも短く、Ｃ末端にドメインＩＶ、Ｓ３またはＳ４由来のセグメントを欠損する未成熟切断されたＮａ＋チャネルタンパク質を生じた（Georgeら、Cytogenet  Cell  Genet  ６８巻：６７〜７０頁（１９９５年））。３’ＵＴＲの知見の概要を図３に示す。ＳＣＮ５Ａ  ３’ＵＴＲの全アイソフォームの配列を図４にプレフォーマットした。
【０２４５】
本実施例において用いた方法を次に示す。
【０２４６】
胎児および成人由来のヒト心臓組織をホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いてメーカーの説明書（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）に従って全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ端のＲＮＡリガーゼを介した急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）方法を用いて、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）によりヒトＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡの５’および３’端を特徴付けた。即ち、１．ｍｕ．ｇの全ＲＮＡをウシ腸ホスファターゼで処理して、全ＲＮＡ中の切断型ｍＲＮＡおよび非ｍＲＮＡ形態の５’リン酸を除去した。タバコ酸性ピロホスファターゼ（acid  pyrophosphatase）を用いて、インタクトな完全長ｍＲＮＡから５’キャップ構造を除去し、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、ｍＲＮＡの５’端にＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏを付加した。それぞれ５’および３’端におけるヒトＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン３に相補的なリバース遺伝子特異的プライマーＧＳＰ５’（５’ＣＡＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ３’（配列番号６４０））およびＧｅｎｅＲａｃｅｒオリゴｄＴプライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成した。５’端断片を増幅するために１０．ｍｕ．ＭのＧＳＰ５’およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマーを用いて、また、３’端を得るためにヒトＳＣＮ５Ａのエクソン２７に相補的な１０．ｍｕ．ＭのフォワードＧＳＰ３’（５’ＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣ３’（配列番号６４１））およびＧｅｎｅＲａｃｅｒオリゴｄＴプライマーを用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼにより５’および３’端ＰＣＲ反応を行った。ネステッドプライマーによる追加的なＰＣＲ反応を行った。ネステッドＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングし、配列決定してＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物がヒトＳＣＮ５Ａ  ｃＤＮＡ由来であることを確認した。
【０２４７】
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ７ソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ、メリーランド州フレデリック）により、一次ＤＮＡ配列解析を行った。配列を、ＧｅｎｅｂａｎｋデータベースにおけるヒトゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列と整列して、転写開始点（ＴＳＳ）および３’ポリアデニル化（polyadenylylation）部位を同定した。
【０２４８】
（実施例２）
Shangら、Circulation  Research  １０１巻：１１４６〜１１５４頁（２００７年）および米国特許出願公開第２００７／０２１２７２３号明細書のうち１または複数に示す通り、本実施例は、ヒト心不全が、心臓性ナトリウムチャネルにおける異常Ｃ末端スプライシングバリアントに関連することを示唆するデータを示す。
【０２４９】
３種の新規ヒトＳＣＮ５Ａ  Ｃ末端ｍＲＮＡスプライシングバリアントの検出
コード配列が変わらない、ポリＡテールの長さが異なる２種のＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡバリアントが、マウス心臓から以前に報告されている（Gellensら、１９９２年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.８９巻：５５４〜５５８頁；およびShang,  L.  L.、およびDudley,  S.  C.,  Jr.、２００５年、J.  Biol.  Chem.２８０巻：９３３〜９４０頁）。ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、本出願人らは、ヒト心臓における類似のナトリウムチャネルｍＲＮＡアイソフォームを見出した（図６）。これらのバンドに加えて、ネステッドＲＴ−ＰＣＲは、胎児および成人両方のヒト心臓において、より短いバンドを明らかにした。バンドの配列解析は、上に記す通り３種の新しいｍＲＮＡスプライスバリアントを明らかにし、これらをエクソンＥ２８Ｂ（２７ｂｐ）、Ｅ２８Ｃ（３９ｂｐ）およびＥ２８Ｄ（１１４ｂｐ）（それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＦ０９２２９２、ＥＦ０９２２９３およびＥＦ０９２２９４）と命名した。これらの新規エクソンを産生する選択的スプライシングを図３にまとめる。完全長Ｅ２８Ａアイソフォームと比較すると、３種の新しいアイソフォームは全て、より短く、Ｃ末端にドメインＩＶ、Ｓ３またはＳ４由来のセグメントを欠損する未成熟切断されたナトリウムチャネルタンパク質を生じることが予見された。
【０２５０】
ＳＣＮ５Ａアイソフォームの相対存在量は発生的に制御される
Ｃ末端におけるＮａｖ１．５のスプライスバリアントは、発生において変動することが公知である。よって、本出願人らは、本出願人らの新規３’アイソフォームが、同様の挙動を示すか調査した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、アイソフォームそれぞれの相対存在量が、胎児から成人心臓へと、それぞれＥ２８Ａ、Ｅ２７Ｂ、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄに関して４１．６％（ｐ＜０．００１）、５．１倍（ｐ＜０．０１）、１．１倍（ｐ＜０．０１）および４．８倍（ｐ＜０．００１）増加することを示した（図９Ａ）。図９Ｂは、総転写産物のパーセンテージとして、Ｅ２８Ａが、胎児および成人心臓両方において最も豊富であったことを示す。Ｅ２８Ｂは、胎児心臓において最も少量であったが、発生に伴い最も増加し、１．７．＋−．０．２倍変化した。総ｍＲＮＡのパーセンテージとして、発生において、代替的なスプライスバリアントＥ２８ＢおよびＥ２８Ｄは有意に増加し、完全長Ｅ２８Ａは減少し、Ｅ２８Ｃ存在量は未変化であった。
【０２５１】
心不全はナトリウムチャネルＣ末端スプライスバリアントのうち２種を増加させた
ＨＦのための心臓移植においてその心臓が除去された１２名の患者（表１）と、心臓病ではないことが既知の３名の対照患者から得られた心室の間でスプライスバリアントの存在を比較した。
【０２５２】
【表１Ｃ】
2014508514.tif 000033
【０２５３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果は、Ｅ２８Ａ完全長アイソフォームの相対ｍＲＮＡ存在量が、対照と比較してＨＦ患者において２４．７％減少した（ｐ＜０．００１）ことを示した。しかし、切断型アイソフォームのうち２種は、対照と比較してＨＦ患者において増加した（図１０Ａ）。Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ  ｍＲＮＡ存在量は、対照をＨＦ患者と比較してそれぞれ１４．２倍（ｐ＜０．００１）および３．８倍（ｐ＜０．００１）増加した（図１０Ａ）。他方では、最も少量のアイソフォーム、Ｅ２８Ｂは、ＨＦ患者において７３．８％（ｐ＜０．０１）減少した。総転写産物存在量のパーセンテージとして、Ｅ２８ＡおよびＢは、対照における８７．５％（．＋−．５．１）および２．４％（．＋−．０．４）から、ＨＦ患者における４５．１％（．＋−．４．５）および０．５％（．＋−．０．２）へと有意に減少した。Ｅ２８ＣおよびＤバリアントは、対照における３．９％（．＋−．０．６）および６．２％（．＋−．４．６）から、ＨＦ患者における３４．３％（．＋−．３．１）および２０．２％（．＋−．３．３）へと増加した（図１０Ａ）。短いアイソフォームバリアントの総パーセンテージは、対照対象における総ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡの１２．５％（．＋−．５．１）から、ＨＦ患者における５４．９％（．＋−．４．５）となった。
【０２５４】
チャネル発現の不均質性は、不整脈性リスクに寄与すると考えられるため、対照およびＨＦ患者における左心室（ＬＶ、図１０Ｂ）および右心室（ＲＶ、図１０Ｃ）におけるＳＣＮ５Ａアイソフォームの相対ＲＮＡ存在量を比較した。総ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡに対し正規化されると、Ｅ２８Ａ存在量は、ＬＶおよびＲＶの両方において減少した。切断バリアントの変化のパターンは、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄが増加し、両方の心室において同様であった。切断型ｍＲＮＡのパーセンテージは、ＲＶと比較すると、ＬＶにおいてより増加した（ｐ＝０．０００３）。
【０２５５】
切断型アイソフォームはナトリウムチャネル機能を低下させる
同定された３種の新規ＳＣＮ５Ａスプライス変種は、未成熟切断された非機能性ナトリウムチャネルを生じることが予見された。本出願人らは、エクソン２８にナンセンス変異を有する遺伝子標的化されたマウスモデルを作製することにより、この考えを検査した（１６５２ｓｔｏｐ、図７）。配列決定、制限部位解析およびサザンブロッティングにより、胚性幹細胞における適切な相同組換えを確認した（補足資料を参照）。胚性幹（ＥＳ）細胞を胚盤胞に首尾よく注射し、キメラ動物を作出した。ところが、これらの動物の繁殖を試みたところ、この変異は胚性致死であった。しかし、ＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐがヘテロ接合である未分化マウスＥＳ細胞は、正常な成長特徴を有し、自発的に拍動する心筋細胞（ＣＭ）へと分化することができた。
【０２５６】
切断が存在することの電気生理学的効果を査定するため、変異がヘテロ接合であるＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＭへと分化させ、電気生理学的に試験した。１９日目に酵素により単離した１個ずつのＣＭの電流および活動電位（ＡＰ）を比較した。個々のＥＳ細胞株に由来する野生型および切断胚性体（embryonic  bodies）から単離した収縮するＣＭのナトリウムチャネル電流−電圧関係性を図５Ａに示す。ＷＴのＣＭ（７６．４．＋−．９．５ｐＡ／ｐＦから１０．６．＋−．０．９ｐＡ／ｐＦ；図５Ｂ）と比較すると、ピークＩＮａは、切断を含有する分化ＣＭにおいて８６．１％（．＋−．５．２、ｎ＝８、ｐ＝０．０００２）減少した。電流固定モードで記録された自発的に拍動するＣＭの活動電位は、野生型における１秒当たり２．９．＋−．０．４拍動（ｂｐｓ）から、切断変異体における１．３ｂｐｓ．＋−．０．１（ｐ＝０．０２、ｎ＝１１）へと、拍動頻度の有意な緩徐化を示した。活動電位は、切断変異において、４．１．＋−．０．３ｍＶ／ｍｓから１．４．＋−．０．１ｍＶ／ｍｓ（ｐ＜０．０１、ｎ＝１１）へのＡＰ上昇の最大率の有意な低下と、野生型（ＷＴ）と比較して７６．＋−．１．４ｍＶから５２．＋−．０．６ｍＶ（ｐ．ｌｔｏｒｅｑ．０．０１、ｎ＝１１）への振幅低下も示した（図１２ＣおよびＤ）。これらの変化は、ナトリウムチャネル機能低下と一致する。
【０２５７】
胚様体からＣＭの部分を解剖し、これを平面状多電極アレイ（ＭＥＡ）上端に置くことにより、切断変異を含有するＣＭのシンシチウム特性を試験した（Caspi、およびGepstein、２００４年、Potential  applications  of  human  embryonic  stem  cell-derived  cardiomyocytes.  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.、１０１５巻：２８５〜２９８頁；およびKehatら、２００２年、High-resolution  electrophysiological  assessment  of  human  embryonic  stem  cell-derived  cardiomyocytes:  a  novel  in  vitro  model  for  the  study  of  conduction.、Circ.  Res.９１巻：６５９〜６６１頁）。ＷＴおよび変異ＥＳ細胞の双極性細胞外電位図の特徴を比較した。双極性フィールド電位（ＦＰ）の初期減退の時間、最小ＦＰ振幅および伝導速度は、ナトリウムチャネル活性を反映することが公知である。切断型ｍＲＮＡの結果生じるナトリウム電流の生理的に有意な低下と一致して、切断変異を有するＣＭのＭＥＡ記録は、ＷＴにおける−１１２６．＋−．３１４．ｍｕ．Ｖ（ｎ＝６）から、切断における−３３２．＋−．１７４．ｍｕ．Ｖ（ｎ＝７）へと、７０．５％（ｐ＜０．０５）減少した最小ＦＰを示した（図１３ＡおよびＢ）。ＦＰ上昇は、それぞれＷＴおよび変異体における２２．＋−．４ｍｓ（ｎ＝６）から３２．＋−．２ｍｓ（ｎ＝７）へと、４５．５％（ｐ＜０．０５）遅くなった（図１３ＡおよびＣ）。伝導速度は、ＷＴにおける５．３．＋−．１．２ｃｍ／ｓ（ｎ＝６）から、切断における１．９．＋−．０．４ｃｍ／ｓ（ｎ＝７）へと、６４．２％（ｐ＝０．０３）減少した（図１３Ｄ）。
【０２５８】
本実施例において用いた方法を次に示す。
【０２５９】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲによるヒトＳＣＮ５Ａ  ３’ＵＴＲアイソフォームの検出
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州マウンテンビュー）から、正常胎児および成人の心臓全体由来のヒト全ＲＮＡを購入した。ｃＤＮＡ端のＲＮＡリガーゼを介した急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）方法を用いて、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）によりヒトＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡの３’端を特徴付けた。即ち、１μｇの全ＲＮＡを用いて、３’端におけるＧｅｎｅＲａｃｅｒオリゴｄＴプライマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ヒトＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン２６に相補的な１０．ｍｕ．Ｍのフォワード遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）ＨＥ２６Ｆ（５’ＣＡＴＣＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＡ３’（配列番号６４２））および３’端断片を増幅するためのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’プライマーを用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼにより３’端ＰＣＲ反応を行った。ヒトＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソン２７に対応するネステッドＧＳＰプライマーＨＥ２７Ｆ（５’ＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡ３’（配列番号６４３））およびネステッドＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’プライマーによる追加的なＰＣＲ反応を行った。ネステッドＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングして、配列決定した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ７ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、得られた配列をＳＣＮ５Ａの配列と比較した。
【０２６０】
リンパ芽球の単離および培養
アトランタ退役軍人局医療センター（Atlanta  Veterans  Administration  Medical  Center）（ＡＶＡＭＣ）の心臓カテーテル法研究室に付託された、正常心臓性機能を備える志願者の末梢血単核細胞からヒトリンパ芽球細胞株を発生させた。手順および同意書は、エモリー治験審査委員会（Emory  Institutional  Review  Board）およびＡＶＡＭＣの研究開発委員会（Research  &  Development  Committee）により認可された。不死化リンパ芽球細胞株を惹起するため、フィコールハイパック遠心分離により末梢血を分画して、単核細胞をエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）Ｂ９５−８株に感染させた。ＥＢＶ形質転換の後、１０％熱失活ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地において、セ氏３７度、５％ＣＯ２、高湿度の雰囲気下でリンパ芽球を培養した。週に２回培地を交換した。トリパンブルー染色および蛍光顕微鏡により、細胞数および生存率を査定した。およそ５．０×１０７個のリンパ芽球を遠心分離により収集し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーのマニュアルに記載されている通りにＲＮＡを単離した。
【０２６１】
ＳＣＮ５Ａ転写産物アイソフォームのリアルタイムＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ定量化
エモリー大学病院（Emory  University  Hospital）において、エモリー治験審査委員会（Emory  Institutional  Review  Board）により認可されたプロトコールの下、心臓移植の際に除去された心臓の心室組織をホモジナイズし、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、メーカーの説明書に従って全ＲＮＡを単離した。正常成人の心室および骨格筋の全ＲＮＡは、それぞれＡｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）およびＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。バリアントエクソン２８（Ｅ２８）アイソフォームを保有する異なる心臓性ｍＲＮＡの存在量を決定するため、正常および患者両方の左および右心室の全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、メーカーの説明書に従った逆転写によるｃＤＮＡの合成に用いた。第一鎖ｃＤＮＡを、その後のＰＣＲの鋳型として用いた。各ＰＣＲ反応液は、２５．ｍｕ．Ｌの総反応容量中に、１２．５．ｍｕ．ＬのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキットマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）および２００ｎＭのプライマー対を含有した。エクソン２８バリアントのリバースプライマーは、それぞれＨＳＣＮ５ＡＥ２８Ａ／Ｒ（５’ＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡ３’（配列番号２１）、Ｅ２８Ａおよび２８Ｄ）、ＨＳＣＮ５ＡＥ２８Ｂ／Ｒ（５’ＡＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣ３’（配列番号６４４）、Ｅ２８Ｂ）、ＨＳＣＮ５ＡＥ２８Ｃ／Ｒ（５’ＴＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣ３’（配列番号６４５）、Ｅ２８Ｃ）およびＨＳＣＮ５ＡＥ２８Ｄ／Ｒ（５’ＴＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＴ３’（配列番号６４６）、Ｅ２８Ａのみ）であった。フォワードプライマー、ＨＥ２７Ｆは、各事例において不変であった。反応は、それぞれ１２４ｂｐ、１７０ｂｐおよび１４３ｂｐおよび２１１ｂｐのＰＣＲ産物を生じた。プライマーＨＥ２７ＦおよびＨＳＣＮ５ＡＥ２８Ｄ／Ｒによる増幅は、完全長アイソフォーム、Ｅ２８Ａを作製した。ＨＥ２７ＦおよびＨＳＣＮ５ＡＥ２８Ａ／Ｒによる増幅は、アイソフォームＥ２８ＡおよびＥ２８Ｄで構成された産物を作製した。これら２回の反応の産物の引き算により、Ｅ２８Ｄの量を計算した。増幅は全て、３回複製して行い、ＢｉｏＲｅｄサーマルサイクラー（thermocycler）ｉＣｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）における４０サイクルの３０秒９４℃、３０秒６５℃および１分７２℃からなるものであった。１．５％アガロースゲルにおける電気泳動によりＰＣＲ産物を解析した。定量的比較を行う場合、内部参照としてベータ−アクチンを用いた。
【０２６２】
切断型Ｓｃｎ５ａマウスモデルの作製
公知のマウスＳＣＮ５Ａエクソン２８配列（４０）に対応するプライマーＲＨＩ２８Ｆ／Ｒ（１１）を用いたＰＣＲ増幅により、１２９Ｓｖ／ＪマウスゲノムＤＮＡの４．０ｋｂ断片をマウスＥＳ細胞ゲノムライブラリーからクローニングした。１個のＰＣＲ陽性クローンを用いて、４．０ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩゲノム断片のサブクローニングによりｓｃｎ５ａ切断標的化ベクターｐＢＳＫ．ＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐを構築した。２つのｌｏｘＰによって挟まれた（floxed）ＰＧＫ−ネオマイシンカセットを、ＡａｔＩＩ部位に挿入した（図Ｓ２）。このコドンにおいてアデノシン（Ａ）が欠失された。この欠失は、それ以前はメチオニンをコードしていた１６５２コドンを終止コドンに変える（ＴＧＡ；ＮＣＢＩ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＰ−−９３２１７３；図７）フレームシフトを生じ、これは、未成熟ナトリウムチャネル切断の原因となると予見された。ネオマイシン抵抗性カセットにより離間した標的化ベクターの５’および３’腕（arm）は、それぞれ１，７６７および２，２１４ｂｐであり、変異の５’側に９４２ｂｐ相同断片を維持していた（図Ｓ２）。２０．ｍｕ．ｇのＫｐｎＩ直線化した標的化構築物をマウス胚性幹細胞（Ｒ１）にエレクトロポレーションした後、標的化したクローンをスクリーニングして、５’および３’端におけるプライマーＰ１／ｎｅｏＲ（Ｐ１：５’ＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＣ３’（配列番号６４７））；ｎｅｏｒＲ：５’ＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧ３’（配列番号６４８））ｎｅｏＦ／Ｐ２（ｎｅｏｒＦ：５’ＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧ３’（配列番号６４９）；Ｐ２：５’ＡＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧ３’（配列番号６５０））ならびにｎｅｏ−カセット（図２１Ｂおよび２２Ａ）を用いた、また、変異部位前後のプライマーＰ３／Ｐ４（Ｐ３：５’ＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＴＣ３’（配列番号６５１）；Ｐ４：５’ＧＣＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧ３’（配列番号６５２））（図２１および２２Ｅ）を用いたＰＣＲにより同定した。外部プローブＡおよびＢによる５’および３’端のサザンブロッティングを用いて、ＰＣＲ結果を確認した（図２１、２２Ｂおよび２２Ｃ）。ｎｅｏｒＦ／Ｒを用いたＰＣＲにより確認した、正確に標的化されたクローンにおけるトランスフェクトされたＣｒｅリコンビナーゼを発現させることにより、２つのｌｏｘＰによって挟まれたネオマイシンカセットを切除した（図２１Ｄ）。ＢｓｐＨＩ消化ありまたはなしのＰ３−Ｐ４  ＰＣＲ産物により、ヘテロ接合性を確認した（図２１Ｅ）。ナトリウムチャネルの一方のアレルの標的化が成功したＥＳ細胞株において実験的試験を行った。
【０２６３】
ＥＳ細胞の心筋細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化
変異ありまたはなしのＲ１マウスＥＳ細胞を、サプリメントを含む高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）を用いて未分化状態で維持し、以前に記載された通りに（Zhang,  Y.  M.、Shang,  L.、Hartzell,  C.、Narlow,  M.、Cribbs,  L.、およびDudley,  S.  C.,  Jr.、２００３年、Characterization  and  regulation  of  T-type  Ca2+  channels  in  embryonic  stem  cell-derived  cardiomyocytes.、Am.  J.  Physiol  Heart  Circ.  Physiol  ２８５巻：Ｈ２７７０〜Ｈ２７７９頁）分化させた。パッチクランプ実験のため、１９日齢の胚様体から拍動するＣＭの部分を機械的に解剖し、解剖された部分の酵素消化により１個ずつのＣＭを得た（Shangら、２００６年、Analysis  of  arrhythmic  potential  of  embryonic  stem  cell-derived  cardiomyocytes、Methods  Mol.  Biol.３３０巻：２２１〜２３１頁）。ＭＥＡ実験のため、１７日齢の胚様体から拍動するＣＭの部分を機械的に解剖して、ＭＥＡ上端に置き、記録する前にさらに２日間培養した。
【０２６４】
ＥＳ由来心筋細胞のナトリウム電流の記録
細胞単離後１〜５日目にパッチクランプ実験を行った。試験において、一律的な収縮および拍動数を有する心筋細胞を用いた。２〜５Ｍオメガの抵抗性までパッチピペット（Patch  pipette）を引いた。ＮａＣｌ（１４０）、ＫＣｌ（５．４）、ＣａＣｌ２（１．８）、ＭｇＣｌ２（１）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびグルコース（１０）（単位はｍＭ）（ＮａＯＨによりｐＨ７．４）からなる溶液において、電流固定実験を行った。細胞内溶液は、ＫＣｌ（１２０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＭＧＡＴＰ（３）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびＥＧＴＡ（１０）（単位はｍＭ）（ＫＯＨによりｐＨ７．２）を含有した。電圧固定実験のため、ガラスピペットに、ＣｓＣｌ（６０）、アスパラギン酸セシウム（Cesium  aspartate）（８０）、ＥＧＴＡ（１１）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびＮａ２ＡＴＰ（５）（単位はｍＭ）の溶液（ＣｓＯＨによりｐＨ７．２）を充填した。浴（bath）溶液は、ＮａＣｌ（３０）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）Ｃｌ（１００）、ＣｓＣｌ（５）、ＣａＣｌ２（２）、ＭｇＣｌ２（１．２）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびグルコース（５）（単位はｍＭ）（ＨＣｌによりｐＨ７．４）からなった。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器およびｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により、パッチクランプデータを収集した。データを１０ｋＨｚでデジタル化して、解析のために１ｋＨｚにおいてフィルタリングした。３７℃で実験を行った。
【０２６５】
多電極アレイ記録による切断変異体の機能的査定
ＭＥＡデータ取得システム（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ、ロイトリンゲン）を用いて、ＥＳ細胞に由来するＷＴおよび切断シンシチウムＣＭの細胞外記録を行った。ＭＥＡは、電極間距離２００μｍの８×８レイアウトグリッドにおける、６０本の窒化チタンコーティングした金電極（３０μｍ直径）のマトリックスからなる。増幅器システムにおいてＭＥＡを挿入した。１０ｋＨｚのサンプリング周波数で３７℃にて全電極の双極性細胞外ＦＰの同時記録を行った。アレイの境界における１本の電極を接地（ground）して、参照電極として用いた。Jiaoら（２００６年、A  possible  mechanism  of  halocarbon-induced  cardiac  sensitization  arrhythmias.、J.  Mol.  Cell  Cardiol.４１巻：６９８〜７０５頁）により以前に記載された通り、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、マサチューセッツ州ネイティック）のためにプログラムされたカスタマイズされたツールボックスによりオフラインでデータを解析した。伝導速度（ＣＶ）を測定するため、本出願人らは、閾値−交差（crossing）アルゴリズムを用いて各点における活性化時間を計算して、等時線マップを形成した。均一の平行な等時線を有する範囲の３個の非共線性（non  co-linear）点を選んで、直交する２方向（例えば、ｖｘおよびｖｙ）におけるＣＶを計算した。ｖ＝（（１／ｖｘ）２＋（１／ｖｙ）２）−１／２として、最終ＣＶを計算した。
【０２６６】
統計的評価
全データは、平均．＋−．Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。複数の比較のためのｈｏｃ後（post-hoc）補正による独立ｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、平均値の統計的解析を行った。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考慮した。
【０２６７】
最後に、対照対象は、ＨＦ患者よりも若かったが、本出願人らは、年齢に伴うスプライス変種の変化のエビデンスを見出すことはできなかった（図２０）。
【０２６８】
結論として、本出願人らは、ヒト心臓においてＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡの数種の代替的な切断型が存在することを実証する。ＨＦの際に、これらの代替的なスプライスされたｍＲＮＡアイソフォームは、単独でまたは他の誘因と組み合わせて、不整脈性リスクに寄与し得るレベルまでナトリウム電流を低下させる可能性が高い。
【０２６９】
（実施例３）
本実施例は、米国特許出願公開第２００７／０２１２７２３号明細書およびShangら、Am  J  Physiol  Cell  Physiol  ２９４巻：Ｃ３７２〜Ｃ３７９頁のうち１または複数に示す通り、アンジオテンシンＩＩによる心臓性ＳＣＮ５ＡナトリウムチャネルのＮＦκＢ依存性転写制御を実証するデータを提供する。
【０２７０】
Ｈ９ｃ２細胞におけるＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２用量範囲決定（Dose  Ranging）
さらなる（future）実験においてこれら薬剤の妥当な濃度を決定するため、ラットＨ９ｃ２心筋細胞を、増大する濃度のＡｎｇＩＩおよびＨ２Ｏ２で処理し、用量依存性細胞生存率を決定した。Ｈ９ｃ２心筋細胞は、無血清培地における１〜５００ｎＭの広範囲のＡｎｇＩＩ濃度に耐性があった（図１４Ａ）。他方では、より高用量のＨ２Ｏ２は、５０μＭの濃度から始まる細胞死を誘導した（図１４Ｂ）。よって、本出願人らは、さらなる実験を、本出願人らの実験の時間経過における統計的に有意な細胞死増加が見られない濃度である２０μＭ  Ｈ２Ｏ２に制限した。Ｎａ＋電流における転写効果に十分な時間を与えるための、４８時間の曝露を用いた。
【０２７１】
ＡｎｇＩＩによりＳｃｎ５ａ  ｍＲＮＡ存在量は下方制御された
１００ｎＭ  ＡｎｇＩＩで４８時間処理したＨ９ｃ２細胞は、ｓｃｎ５ａ  ｍＲＮＡ存在量における４７．３％（．＋−．５．３％、ｎ＝７、Ｐ＜０．０１）低下を示した（図１５Ａ）。Ｈ９ｃ２細胞は、一般に、高用量のＡｎｇＩＩのみに対して応答性であるため（Tranら、（１９９５年）Biochim.  Biophys.  Acta  １２５９巻、２８３〜２９０頁；およびLaufsら、（２００２年）Cardiovasc.  Res.  ５３巻、９１１〜９２０頁）、急性摘出されたラット新生児細胞およびより生理的濃度のＡｎｇＩＩを用いて実験を反復した。新生児心筋細胞において、２ｎＭ  ＡｎｇＩＩへの４８時間の曝露は、新生児心筋細胞におけるｓｃｎ５ａ  ｍＲＮＡ存在量における４９．０％（．＋−．５．２％、ｎ＝１０、Ｐ＜０．０１）低下をもたらし、この結果は、単離された筋細胞が、より高い感受性を有し、効果がＨ９ｃ２系に限定されないことを示唆する（図１５Ｂ）。
【０２７２】
Ｈ２Ｏ２により心臓性Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡおよび電流の両方が下方制御された
ＡｎｇＩＩは、Ｈ２Ｏ２へと不均化（dismutate）されるスーパーオキシドを生成するＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化することが公知であるため、本出願人らは、Ｈ２Ｏ２がＡｎｇＩＩ結果を再現するか検査した。２０μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２Ｏ２へとＨ９ｃ２細胞を４８時間曝露すると、Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡが同様に低下した（４６．９％．＋−．３．６％、ｎ＝９、ｐ＜０．０１；図１５Ａ）。単離された新生児ラット筋細胞において、また、ＡｎｇＩＩに対するその感受性増加と一致して、低下した濃度のＨ２Ｏ２に対し４８時間で類似の応答が見られた（４０ｎＭ；４５．４％．＋−．７．５％、ｎ＝９、ｐ＜０．０１；図１５Ｂ）。どちらの種類の筋細胞においても、Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡのＡｎｇＩＩ介在性下方制御は、カタラーゼによる細胞の前処理により防止することができ、この結果は、ＡｎｇＩＩが、Ｈ２Ｏ２生成を介して作用するとの考えと一致する。図１６は、４８時間の２０μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２Ｏ２曝露が、Ｎａ＋電流の４６．０％（．＋−．２．９％）減少をもたらし、これがｍＲＮＡ存在量の低下と釣り合う（対照ｎ＝７、処理群ｎ＝９、Ｐ＝０．０１）ことを示す。
【０２７３】
心臓性Ｎａ＋チャネルのＮＦ−κＢ制御のエビデンス
ＮＦ−κＢは、公知のレドックス（redox）感受性転写因子である（Zhouら、（２００１年）Free  Radic.  Biol.  Med.３１巻、１４０５〜１４１６頁）。本出願人らは以前に、心臓性Ｎａ＋チャネルのプロモーター領域が、１個のＮＦ−κＢコンセンサス結合配列を含有することを示した（Shang,  L.  L.  &  Dudley,  S.  C.,  Jr.（２００５年）J.  Biol.  Chem.２８０巻、９３３〜９４０頁）。よって、本出願人らは、ＮＦ−κＢが、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２介在性Ｎａ＋チャネル転写制御に関与し得るか調査した。この考えを検査するため、本出願人らは、ＮＦ−κＢ結合部位が変容したｓｃｎ５ａプロモーターの変異型、ＡＰＳ３−ＮＦ−κＢｍを構築した（図１７Ａ）。インタクトなＮＦ−κＢ結合部位を含有するプロモーター−レポーター構築物は、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２に応答した活性の低下を示した（図１７Ｂ）。ＡＰＳ３構築物によりトランスフェクトした心筋細胞をＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２曝露ありおよびなしで比較した場合、ｓｃｎ５ａ  Ｎａ＋チャネルプロモーター活性は、Ｈ９ｃ２細胞においてそれぞれ３３．０％（．＋−．２．６％、ｎ＝４、Ｐ＜０．００１）および４２．３％（．＋−．４．５％、ｎ＝４、Ｐ＜０．００１）抑圧された。他方では、変異したＮＦ−κＢ結合部位を有する構築物は、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２の存在における活性の有意な変化を示さなかった。
【０２７４】
ＮＦ−カッパーＢが、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２曝露に応答してｓｃｎ５ａプロモーターと結合していることを確認するため、本出願人らは、電気泳動移動度シフトおよびクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを利用した。ＮＦ−κＢ部位を有するｓｃｎ５ａプロモーターの３５ｂｐ断片をプローブとして用いた（図１８Ａ）。ＮＦ−κＢ結合活性は、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２処理の存在で増加した。ＮＦ−κＢ阻害剤であるコーヒー酸フェネチルエステルにより、ＮＦ−κＢ  Ｂ結合を遮断した（Natarajanら、（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.９３巻、９０９０〜９０９５頁；Watabeら、（２００４年）J.  Biol.  Chem.２７９巻、６０１７〜６０２６頁）。ＣｈＩＰアッセイは、ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２処理に応答して、心臓性Ｎａ＋チャネルプロモーターにおいて完全なｐ５０−ｐ６５  ＮＦ−κＢヘテロダイマーが生成されたことを示した（図１８Ｂ）。
【０２７５】
Ｈ９ｃ２細胞におけるＮＦ−κＢサブユニットの過剰発現は、Ｎａ＋チャネル下方制御におけるｐ５０サブユニットの必要を確認した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果は、ｐ５０のみまたはｐ５０およびｐ６５の組み合わせを発現する細胞株において相対ｓｃｎ５ａ  ｍＲＮＡ存在量が、それぞれ７７．３％（．＋−．７．３、ｎ＝４）および８８．６％（．＋−．４．８、ｎ＝４）減少したことを示した。しかし、ｐ６５過剰発現単独の存在により、Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡにおける有意な変化は見られなかった（図１９）。
【０２７６】
本実施例において次の方法を用いた。
【０２７７】
細胞培養および細胞生存率アッセイ
ラット胚性心筋細胞細胞株、Ｈ９ｃ２（ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃ＣＲＬ−１４４６）または急性摘出した新生児ラット心臓の心筋細胞を用いた。３日齢のスプラーグドーリーラット（Sprague-Dawley  rat）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）から、キットを用いてメーカー（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州レイクウッド）の説明書に従ってラット新生児心室細胞を単離した。１０％ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）において、標準組織培養条件下において３７℃で７０〜８０％コンフルエンスとなるまで培養した細胞を、２４ウェルプレートにて３回複製するよう、無血清培養培地（ＳＦＭ）においてＡｎｇＩＩ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）またはＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）に総計４８時間曝露した。実験を３回反復した。０．１２５％トリプシン−ＥＤＴＡにより解離した後、各ウェルに２０μＬの０．４％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を添加して、トリパンブルー排除生存率アッセイを行った。ラットの使用は、米国国立衛生研究所により刊行された実験動物の管理と使用に関する指針（Guide  for  the  Care  and  Use  of  Laboratory  Animals）（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８５〜２３、１９９６年改訂）を順守する。
【０２７８】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによるｓｃｎ５ａ転写産物の定量化
様々な条件下で心臓性ナトリウムチャネル（ｓｃｎ５ａ）ｍＲＮＡの存在量を決定するため、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ  Ｉを添加して未処理および有処理心筋細胞から全ＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、１ｐｇの全ＲＮＡおよび４．ｍｕ．Ｌの５×ｉＳｃｒｉｐｔ反応ミックスにより、メーカーの説明書に従って４２℃で３０分間逆転写を行った。第一鎖ｃＤＮＡは、２５μＬの総反応容量におけるＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および２．５μＭプライマー対と共に（as）用いた。フォワードプライマー、ｒｔＰＣＲｓｃｎ５ａＦ（５’ＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＡ３’（配列番号６５３））は、エクソン２６由来の配列を認識した。リバースプライマー、ｒｔＰＣＲｓｃｎ５ａＲ（５’ＣＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＣ３’（配列番号６５４））は、ｓｃｎ５ａ  ｃＤＮＡのエクソン２７に相補的であった。反応は、１０１ｂｐのＰＣＲ産物を生じた。全増幅は、３回複製して行い、ＢｉｏＲａｄサーマルサイクラーｉｃｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）における４０サイクルの３０秒９５℃、３０秒６０℃および３０秒７２℃からなった。相対標準曲線方法によりＰＣＲ産物を解析した。定量的比較を行う場合、参照としてβ−アクチンを用いた。
【０２７９】
Ｎａ＋電流の電気生理学的決定
パッチクランプ実験の開始３時間前に、Ｈ９ｃ２細胞をトリプシン処理して、処理済プラスチックカバーガラス上にプレーティングした。示されている通り、Ｈ２Ｏ２ありまたはなしでＨ９ｃ２細胞を処理した。０．５〜１．５ＭΩの抵抗性までＳｕｔｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｐ−９７水平プラー（puller）においてガラスピペットを引いた。ＣｓＣｌ（６０）、アスパラギン酸セシウム（８０）、ＥＧＴＡナトリウム（１１）、ＨＥＰＥＳ（１０）、Ｎａ２ＡＴＰ（５）（単位はｍＭ）の溶液、ＣｓＯＨによりｐＨ７．２をガラスピペットに充填した。浴溶液は、Ｎａ（３０）、Ｎ−メチル−Ｄ−塩化グルタミン酸（glutamate  chloride）（１００）、ＣｓＣｌ（５）、ＣａＣｌ２（２）、ＭｇＣｌ２（１．２）、ＨＥＰＥＳ（１０）、グルコース（５）（単位はｍＭ）からなり、ＮａＯＨによりｐＨ７．４とした。密封を確立したら、少量の吸引を加えて、ホールセル構成を得た。−１００ｍＶの保持電位から、−１０ｍＶで得られたピーク電流を比較に用いた。２５℃で細胞を検査した。データを１０ｋＨｚにおいてサンプリングし、その後解析のために５ｋＨｚにおいてフィルタリングした。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器、Ａｘｏｎ  Ｄｉｇｉｄａｔａ  １２３０Ａ  Ａ／Ｄ変換器およびｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サニーベール）により電流を記録、解析した。
【０２８０】
プロモーター−レポーター構築物および一過性トランスフェクション
ｓｃｎ５ａプロモーター領域は、以前に定義されている（Shang,  L.  L.  &  Dudley,  S.  C.,  Jr.（２００５年）J.  Biol.  Chem.２８０巻、９３３〜９４０頁）。これらの実験のため、ＮＦ−κＢコンセンサス結合部位を含有した新しいプロモーター構築物を用いて、処理のｓｃｎ５ａ転写における効果を検査した。この構築物、ｐＧＬ３−ＡＰＳ３は、エクソン１Ｃから始まり、マウスｓｃｎ５ａ遺伝子のエクソン２に位置づけられた開始コドンに対し＋３２塩基対までとなる９３７ｂｐ断片からなった。
【０２８１】
２４ウェルプレートの各ウェルに、最終容量１ｍＬの培養培地において２．５×１０４細胞の密度となるよう、Ｈ９ｃ２心筋細胞をプレーティングし、一晩付着させ、７０％〜８０％コンフルエンスとなるまで増やした。プロモーター−レポーター構築物（０．３μｇ）および合成ウミシイタケルシフェラーゼの発現を駆動する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターを含有するプラスミド（ｐｈＲＬ−ＴＫ；Ｐｒｏｍｅｇａ、カリフォルニア州マディソン）（０．０１３μｇ）のトランスフェクションを、０．９μＬのＦｕｇｅｎｅ６化学トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）により、メーカーの説明書に従って行った。ＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２ありまたはなしの無血清ＤＭＥＭ培養培地を２４時間毎に交換した。４８時間培養した後、受動的（passive）溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、カリフォルニア州マディソン）で細胞を処理し、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カリフォルニア州マディソン）の１００．ｍｕ．Ｌのルシフェラーゼアッセイ基質および１００．ｍｕ．ＬのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬を用いたホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性の解析のために、細胞抽出物を収集した。Ｖｅｒｉｔａｓマイクロプレートルミノメーターにおいて、Ｖｅｒｉｔａｓバージョン１．４．０ソフトウェア（Ｔｕｅｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて、発光を定量化した。レポーター構築物のトランスフェクション効率は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性との比較により照合した。ｐｈＲＬ−ＴＫベクターは、潜在的な転写因子結合部位の大部分を除去するよう遺伝子操作されているため、実験条件によるウミシイタケルシフェラーゼ発現のいかなるモジュレーションも最小化した。全プロモーター−構築物のルシフェラーゼ活性を、同時にトランスフェクトしたｐＧＬ３−ベーシックプロモーターレス対照に対し正規化した。４種の別個のトランスフェクションセッションを解析し、各セッションにおいて、トランスフェクションを３回複製して行った。トランスフェクション実験毎に３回の二重ルシフェラーゼ読み取りを行った。
【０２８２】
ＮＦ−κＢ結合部位の部位特異的（site-directed）変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キットを用いて、メーカーの説明書に従って（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）ＮＦ−カッパーＢ結合部位の破壊を行った。即ち、ＰＣＲのため、１０ｎｇのｐＧＬ３−ＡＰＳ３を鋳型として用い、列挙されているヌクレオチドプライマーを用いて、ｐＧＬ３−ＡＰＳ３のＮＦ−κＢ結合部位（太字は野生型、下線は変異体）を変異させた。ＮＦκＢ−ｍｕｔＣＦ：５’ＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＣ３’（配列番号６５５）およびＮＦκＢ−ｍｕｔＣＲ：５’ＧＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣ３’（配列番号６５６）。ＤｐｎＩで消化した後、２μＬのＰＣＲ産物を用いて、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテント細胞を形質転換した。配列決定により、妥当なクローンを同定した。
【０２８３】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ／ゲルシフト）
Ｈ９ｃ２細胞を、プレーティング２４時間後から、ＣＡＰＥ（コーヒー酸フェネチルエステル、ＮＦ−κＢ阻害剤、１０μＭ）ありまたはなしでＡｎｇＩＩまたはＨ２Ｏ２で４８時間処理した。核抽出キット（Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ、カリフォルニア州カールスバッド）による核タンパク質抽出のため、およそ５×１０６細胞を掻き取った。ｓｃｎ５ａプロモーター由来のＮＦ−κＢのコンセンサス結合配列（太字）（５’ＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＣ３’（配列番号６５７））およびＮＦ−κＢ変異体配列（５’ＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＣ３’（配列番号６５８））を含有する二重鎖オリゴヌクレオチドを、核抽出物の結合活性のアッセイのためのプローブとして用いた。相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングにより調製したビオチン末端標識二重鎖ＤＮＡプローブを用いて、タンパク質−ＤＮＡ複合体を検出した。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼおよびビオチン−Ｎ４−ＣＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を用いた反応において、ビオチン３’端ＤＮＡ標識キットマニュアルに従ってオリゴヌクレオチドを標識した。ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて結合反応を行った。即ち、２０μＬの容量において３０μｇの核抽出物および結合バッファーを氷上で５分間インキュベートし、次に、標識プローブ（２０ｆｍｏｌ）を添加し、反応を行わせてさらに２５分間インキュベートした。電気泳動後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を、ナイロン膜に移行させ（transferred）、化学発光を用いて検出した。ＴＮＦ−α活性化Ｈ９ｃ２細胞核抽出物（５μｇ）を陽性対照として用いた。６％遅延ゲルにおいて反応産物を分離した。２００倍過剰の非標識プローブの添加により、特異性を確認した。
【０２８４】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
製造元のマニュアル（ＣｈＩＰ−ＩＴ（商標）キット、Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ）に記載されている通り、ホルムアルデヒド架橋およびクロマチン免疫沈降を行った。即ち、処理ありまたはなしのＨ９ｃ２細胞において、１％ホルムアルデヒドを用いてタンパク質をクロマチンと架橋した。その後、溶解バッファー中で細胞を超音波処理し、ライセートのアリコートをＰＣＲ反応に用いた。残りのライセートをプロテインＧビーズにより清澄化した。清澄化したライセートの半分をｐ５０またはｐ６５抗体と共にインキュベートし、一方、残りの半分を抗体なしの陰性対照として用いた。架橋を解除した後、免疫複合体をプロテイナーゼＫで消化し、ＤＮＡを精製した。ＰｉｃｏＭａｘポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）およびＡＰＳ３プロモーター領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによりＤＮＡを解析した。
【０２８５】
安定的Ｈ９ｃ２細胞株はＮＦ−κＢサブユニットｐ５０およびｐ６５を過剰発現した
Ｈ９ｃ２細胞を、ヒトＮＦ−カッパーＢサブユニットｐ５０および／またはｐ６５を保持する発現ベクター（Lindholmら、（２００３年）J.  Hypertens.２１巻、１５６３〜１５７４頁）ならびにマーカーとして赤色蛍光タンパク質を保持するｐＤｓＲｅｄ発現Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）で同時トランスフェクトし、少なくとも４週間、４００．ｍｕ．ｇ／ｍＬジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により選択した。この時点において、９０％超の細胞が赤色蛍光を示した。トランスフェクションは、ヒトｐ５０またはｐ６５特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ＳＹＢＲ定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｎａ＋チャネル発現をアッセイした。
【０２８６】
統計的評価
全データは、平均値．＋−．Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。スチューデント対応（paired）または独立（unpaired）ｔ検定を用いて、平均値の統計的解析を行った。複数の平均値間の分散の比較のためにＡＮＯＶＡを用いた。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考慮される。
【０２８７】
（実施例４）
次の記載は、本明細書に提供されているデータに関係する。
【０２８８】
心不全はＮａ＋チャネルＣ末端スプライスバリアントのうち２種を増加する
外植された心室と既知の心臓病がない対照患者との間でスプライスバリアントの存在を比較した。ＲＴ−ＰＣＲ結果は、Ｅ２８Ａ完全長バリアントの相対ｍＲＮＡ存在量が、対照と比較してＨＦ患者において２４．７％減少した（ｐ＜０．００１）ことを示した。Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ  ｍＲＮＡ存在量は、対照をＨＦ患者と比較して、それぞれ１４．２倍（ｐ＜０．００１）および３．８倍（ｐ＜０．００１）増加した。総ＳＣＮ５Ａ転写産物のパーセンテージとして、Ｅ２８ＡおよびＢは、対照における８７．５％（±５．１）および２．４％（±０．４）から、ＨＦ患者における４５．１％（±４．５）および０．５％（±０．２）へと有意に減少した。Ｅ２８ＣおよびＤバリアントは、対照における３．９％（±０．６）および６．２％（±４．６）から、ＨＦ患者における３４．３％（±３．１）および２０．２％（±３．３）へと増加した。短いバリアントの総パーセンテージは、対照対象における総ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡの１２．５％（±５．１）から、ＨＦ患者における５４．９％（±４．５）となった。同様の量の切断型チャネルバリアントは、ブルガダ症候群の原因であることが公知である（Chenら、Nature  ３９２巻：２９３〜２９６頁（１９９８年）；Makiyamaら、J  Am  Coll  Cardiol  ４６巻：２１００〜２１０６頁（２００５年）；Prioriら、Circulation  １０５巻：１３４２〜１３４７頁（２００２年）；Schulze-Bahrら、Hum  Mutat  ２１巻：６５１〜６５２頁（２００３年）；Smitsら、J  Am  Coll  Cardiol  ４０巻：３５０〜３５６頁（２００２年））。切断バリアントの変化のパターンは、両方の心室において同様であり、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄが増加した。ＲＮＡ効果に対応して、ヒト対照および心不全組織のウエスタン解析は、正常心臓と比較してＨＦにおける６２．８％（±９．７、ｎ＝３、ｐ＜０．０１）のタンパク質低下を明らかにした。切断バリアントに対応し得るバンドは、正常および不全の心臓において観察されなかった。
【０２８９】
切断バリアントはＮａ＋チャネルタンパク質および電流を低下させる
バリアントｃＤＮＡを、完全長Ｅ２８Ａチャネルを安定的に発現するヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）−ＳＣＮ５Ａ細胞株において発現させた。Ｅ２８Ｄの発現は、Ｅ２８ＡバリアントｍＲＮＡ存在量を低下させた。Ｅ２８Ｄをコードするベクターを増加比率で用いると、完全長転写産物ｍＲＮＡ存在量が漸進的に低下した。Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄバリアントは、ＨＥＫ細胞に単独でトランスフェクトした場合、どちらも電流を発生せず、完全長Ｎａ＋チャネルを安定的に発現するＨＥＫ−ＳＣＮ５Ａ細胞株にトランスフェクトした場合、どちらのバリアントも、Ｎａ＋電流を低下させた。ＣまたはＤバリアントの存在は、未変性単独の結果と比較すると、それぞれピーク電流の５４．６％（±８．５、ｐ＜０．０１、ｎ＝１４）および５６．０％（±８．９、ｐ＜０．０１、ｎ＝１０）低下をもたらした。電流の低下は、用いたバリアント対完全長ベクターの比率に依存した。Ｎａ＋チャネルＣ末端標識バリアントをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の蛍光顕微鏡像は、等量の完全長Ｅ２８Ａバリアントと比較した場合の、ＣまたはＤバリアントＮａ＋チャネルタンパク質量の著しい低下を実証した。
【０２９０】
ＳＣＮ５Ａ切断バリアントの生理学的意義
ＣおよびＤバリアントに起因する切断の間でエクソン２８にナンセンス変異を有する遺伝子標的化マウスモデルを作製することにより、ＳＣＮ５Ａエクソン２８における切断の生理学的意義を検査した。この変異は、胚性致死であった。ＳＣＮ５Ａ１６５２ｓｔｏｐがヘテロ接合である未分化マウス胚性幹細胞は、正常な成長特徴を有し、自発的に拍動する心筋細胞（ＣＭ）に分化することができた。ピークＩＮａは、ＷＴのＣＭと比較して、切断を含有する分化ＣＭにおいて８６．１％（±５．２、ｎ＝８、ｐ＝０．０００２）減少し、野生型チャネルにおける切断のドミナントネガティブ効果を示した。自発的に拍動するＣＭから電流固定モードで記録された活動電位は、野生型と比較して、拍動頻度の有意な緩徐化（ｐ＝０．０２、ｎ＝１１）、切断変異における活動電位上昇の最大率の有意な低下（ｐ＜０．０１、ｎ＝１１）および振幅低下（００．０１、ｎ＝１１）を示した。これらの変化は、Ｎａ＋チャネル機能低下と一致する（Smitsら、J  Mol  Cell  Cardiol  ３８巻：９６９〜９８１頁（２００５年）；Tanら、Nature  ４０９巻：１０４３〜１０４７頁（２００１年）；Leiら、J  Physiol  ５６７巻：３８７〜４００頁（２００５年））。多電極アレイ（ＭＥＡ）を用いてこれらＣＭのシンシチウム特性を試験した（Caspiら、Ann  NY  Acad  Sci  １０１５巻：２８５〜２９８頁（２００４年）；Kehatら、Circ  Res  ９１巻：６５９〜６６１頁（２００２年））。切断型ｍＲＮＡの結果生じるＮａ＋電流の生理的に有意な低下と一致して、切断変異を有するＣＭのＭＥＡ記録は、伝導速度が、野生型と比較して６４．２％（ｐ＜０．０３）減少したことを示した（Halbachら、Cell  Physiol  Biochem  １３巻：２７１〜２８４頁（２００３年））。
【０２９１】
（実施例５）
本実施例は、Gaoら、Circulation、１２４巻（１０号）：１１２４〜３１頁（２０１１年８月２２日にオンライン発表）および国際公開第２０１０／１２９９６４号パンフレットの一方または両方に示す通り、スプライシング因子ｈＬｕｃ７ＡおよびＲＢＭ２５が、ＳＣＮ５Ａの異常スプライシングに関連することを実証する。
【０２９２】
次の段落は、実施例５および６において用いる方法について記載する。
【０２９３】
細胞培養
１０％熱失活ウシ胎仔血清、４ｍＭグルタミン、７５ユニット／ｍＬストレプトマイシンおよび１００ユニット／ｍＬペニシリンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地において、ジャーカットＴ細胞クローンＥ６．１（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）を培養した。
【０２９４】
以前に記載された通り、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）においてヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を維持した。１４。効率的な心発生のための限定培地（defined  media）における定方向分化アプローチを用いて、ＷＡ０９（Ｈ９）ＥＳ細胞から心筋細胞を分化させた。分化３０日後、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（ｈＥＳＣ−ＣＭ）を本試験に用いた。
【０２９５】
リアルタイムＰＣＲ定量化
それぞれＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔおよびＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、培養細胞およびヒト心室組織から全ＲＮＡを単離した。ヒト心臓組織は、アドボケートキリスト心臓手術臨床研究センター（Advocate  Christ  Cardiac  Surgery  Clinical  Research  Center）に維持されている組織バンクから得た。
【０２９６】
トランスフェクションおよび感染アッセイ
Ｒｏｃｈｅ（ウィスコンシン州マディソン）製のＦｕｇｅｎｅ６試薬を、メーカーの説明書に従ってトランスフェクションアッセイに用いた。ＬＵＣ７Ｌ３およびＲＢＭ２５の低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入した。ヒトｐＧＩＰＺレンチウイルス低分子ヘアピン型ＲＮＡｍｉｒ粒子は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アラバマ州ハンツビル）から購入した。ヒト心筋細胞を、２００，０００／ウェルの密度で２４ウェルプレートに置いた。ＲＢＭ２５低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；各ウェル５μＬ、プレタイター（pre-titer）結果に基づく）を、最終濃度８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）と共に１時間プレインキュベートし、各ウェルに分注した。スクランブルしたｓｈＲＮＡ群は、同一プロトコールに従った。５時間後に培地を通常の培養培地に置き換えた。それぞれ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ、オーバーコッヘン）およびｑＰＣＲにより、２日目および３日目に感染率およびＲＢＭ２５ノックダウン率を評価した。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＬＵＣ７３およびＲＢＭ２５の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付きオープンリーディングフレームクローンは、ＯＲＩＧＥＮＥ（メリーランド州ロックビル）から購入した。トランスフェクションアッセイは、メーカーの説明書に従った。
【０２９７】
電気生理学
ｈＥＳＣ−ＣＭを１０分間トリプシン処理（２．５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）し、実験前日に３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ、マサチューセッツ州アシュランド）に４０，０００細胞／皿の細胞密度でプレーティングした。電圧固定構成で室温にてホールセルパッチクランプ技法を用いることにより、Ｎａ＋チャネル電流を測定した。Ｎａ＋チャネル電流を測定するため、ピペット（３〜４ＭΩ）に、ＣｓＣｌ（８０）、セシウムアスパラギン酸（８０）、ＥＧＴＡ（１１）、ＭｇＣｌ２（１）、ＣａＣｌ２（１）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびＮａ２ＡＴＰ（５）（単位はｍｍｏｌ／Ｌ）（ＣｓＯＨによりｐＨ７．４に調整）を含有するピペット溶液を充填した。浴溶液は、ＮａＣｌ（１３０）、ＣｓＣｌ（５）、ＣａＣｌ２（２）、ＭｇＣｌ２（１．２）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびグルコース（５）（単位はｍｍｏｌ／Ｌ）（ＣｓＯＨによりｐＨ７．４に調整）からなった。１５。保持電位は−１００ｍＶであった。１０ｍＶステップによる−８０〜＋７０ｍＶの範囲に及ぶ電圧ステッププロトコールを適用して、Ｎａ＋チャネル電流の存在を確立した。ピーク電流密度を用いて、電流−電圧（Ｉ−Ｖ）曲線をプロットした。浴溶液にニフェジピン（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加して、Ｌ型Ｃａ＋チャネル電流を遮断した。
【０２９８】
ゲル移動度シフトアッセイ
ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）キット（Ｐｉｅｒｃｅ、ウィスコンシン州アップルトン）を用いることにより、ＲＮＡゲル移動度シフトアッセイを行った。要約すると、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって、ビオチン化野生型（ＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵ）および変異体（ＣＡＧＣＡＧＧＵＵＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＵ）ＲＮＡ基質が合成された。ＲＢＭ２５へのビオチン化ＲＮＡの結合は、２０μＬの結合バッファーにおける０．２ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡおよび可変量のタンパク質の３０分間４℃のインキュベートにより達成された。競合アッセイのため、様々な倍数的レベルのモル過剰の非標識競合体ＲＮＡを、プレインキュベートした反応混合物に添加した。未変性５％ポリアクリルアミドゲルにおいて試料を分画し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ｐｉｅｒｃｅ、ウィスコンシン州アップルトン）へと移行させた。ストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートおよび化学発光基質を用いて、ビオチン標識ＲＮＡを検出した。１２。
【０２９９】
ウエスタンブロットアッセイ
ＢｉｏＲａｄ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）製のＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）Ｔｅｔｒａ電気泳動システムを、ウエスタンブロット解析に用いた。抗ＲＢＭ２５抗体は、Ｓｈｕ−Ｃｈｉｎｇ  Ｈｕａｎｇ博士（ダナ−ファーバー癌研究所（Dana-Farber  Cancer  Institute））より提供された。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ビルリカ）から抗ＬＵＣ７Ｌ３抗体を購入した。ＯＲＩＧＥＮＥ（メリーランド州ロックビル）から抗ＧＦＰを購入した。
【０３００】
統計学
データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。独立スチューデントｔ検定または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて平均値を比較した。確率値Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考慮した。
【０３０１】
臨床標本
マイクロアレイ試験試料は、末期心筋症心臓（ｎ＝１０）および不全ではない対照心臓（ｎ＝６）で構成された。１。左心補助循環装置（ＬＶＡＤ）設置または心臓移植の際に、末期心筋症心臓試料を得た。末期心筋症の対象は、駆出分画率の重度低下、左心室拡張、肺動脈および楔入圧上昇ならびに心臓指数低下を示した。対照対象は、より若く（年齢中位数４２歳、四分位範囲２４〜５０歳）、主として男性であった。
【０３０２】
データ解析方法
ＧｅｎｅＳｉｆｔｅｒ遺伝子発現マイクロアレイデータ解析システムを用いて、ヒト（ＧＥＯ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＧＳＥ１８６９）１心不全組織由来遺伝子発現データから有意にディファレンシャル発現する遺伝子を同定および比較した。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブＩＤ使用オプションのＢａｔｃｈ  Ｕｐｌｏａｄにより、ＧｅｎｅＳｉｆｔｅｒにデータをアップロードした。いずれのファイルからもデータ点は欠損していなかった。正規分布と比較した観察遺伝子の有意性の尺度としてｚスコアを用いた。ｚスコアは、＞２または＜−２である場合、有意であると考慮し、これは、遺伝子が有意に過剰提示（over-represented）または過小提示（under-represented）されたことを暗示する。独立スチューデントｔ検定、ｐ値＜０．０５および５％Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ＦＤＲ）補正を用いて、統計的に有意な遺伝子変化を同定した。これらの設定は、Ｋｉｔｔｌｅｓｏｎらに用いられたものと同様である。１。倍数的変化カットオフの範囲を用いた。機能的解析のため、Donigerらの方法に従い、遺伝子オントロジー（ＧＯ）報告を作成した。２。ＲＮＡスプライシングに関連する遺伝子は、生物学的過程ＧＯ項「ＧＯ：０００８３８０  ＲＮＡスプライシング」の下に見出された。上方制御されたスプライシング因子を表１に列挙する。スプライシング因子の有意な下方制御は、観察されなかった。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（フレッドハッチンソン癌研究センター（Fred  Hutchinson  Cancer  Research  Center））による平均相関アプローチを用いて、試料全体におけるこれら遺伝子の階層的クラスタリングを行った。ヒートマップ（図１）は、遺伝子および試料の相互の関係性を表し、緑色は各遺伝子の平均発現値と比べた遺伝子の下方制御を表し、赤色は上方制御を表す。
【０３０３】
ヒトＨＦ組織におけるスプライシング因子のｍＲＮＡプロファイルの変容
ｍＲＮＡマイクロアレイ解析を用いて、正常およびヒトＨＦ組織両方におけるスプライシング因子を同定および比較した。解析した１８１種の公知のヒトスプライシング因子のうち、１７種はＨＦにおいて上方制御された。これらのスプライシング因子を、ＨＦに関与する低酸素、炎症、壁張力またはホルモン因子等、公知の病原性制御因子に応じてグループ分けした（表１）。
【０３０４】
【表１Ｄ】
2014508514.tif 000034
【０３０５】
ヒトＨＦ組織におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の上方制御
スプライシング因子ＲＢＭ２５のシスエレメント、ＣＧＧＧＣＡは、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄのスプライシング部位近傍に見出された。ＲＢＭ２５は、スプライシング制御におけるＬＵＣ７Ｌ３の活性を必要とするため、ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライシング制御における役割に関してＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の両方をさらに評価した。上方制御される他の４５種のスプライシング因子のうち、公知のシスエレメント配列に基づき、結合することが公知のものも、ＳＣＮ５Ａに存在する模範的結合配列を有するものもない。
【０３０６】
ｑＰＣＲにより、ヒトＨＦ組織におけるスプライシング因子ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の上方制御を確認した。正常ヒト心臓組織と比較すると、結果は、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の相対存在量が、ＨＦ組織においてそれぞれ１．１倍および０．６倍増加したことを示した（Ｐ＜０．０５、図２３Ａ）。完全長ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡは、ＨＦ組織において０．６倍低下し（Ｐ＜０．０５、図２３Ａ）、これは、本出願人らの以前の報告と同様の結果であった。８。ｍＲＮＡの知見は、ウエスタンブロットによるタンパク質発現と相関した。代表的なウエスタンブロットを図２３Ｂに示す。対照群（４種の正常ヒト心臓組織試料の混合物）と比較すると、ウエスタンブロット定量化は、ＲＢＭ２５が、それぞれＨＦ組織試料１〜４において０．５〜０．６倍増加したことを示した（Ｐ＜０．０５、試料毎に３複製）。ＬＵＣ７Ｌ３のゲル密度は、同一ＨＦ組織試料において０．６〜０．７倍増加した（Ｐ＜０．０５、試料毎に３複製）。
【０３０７】
ＲＢＭ２５はＳＣＮ５Ａに関連し、ＣＧＧＧＣＡに相互作用する
ゲル移動度シフトアッセイは、ＲＭＢ２５が、ＳＣＮ５Ａエクソン２８における模範的配列、ＣＧＧＧＣＡと結合したことを示した（図２４）。ＳＣＮ５Ａ  ＲＮＡ配列全体のスキャンは、ＳＣＮ５Ａスプライシングバリアントが検出された位置におけるＲＢＭ２５の単一の結合部位のみを明らかにした（図２Ａ）。図２Ｂ〜Ｄにおいて、ＲＢＭ２５とビオチン化野生型（ＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵ）ＲＮＡとの結合を観察した。この結果は、ＲＢＭ２５結合が、配列ＣＧＧＧＣＡに特異的であることを説明した。ＲＢＭ２５は、濃度依存的様式で野生型ＳＣＮ５Ａ配列に結合していた（図２４Ｂ）。競合アッセイのため、様々な倍数的レベルのモル過剰の非標識競合体ＲＮＡを、プレインキュベートした反応混合物に添加した（図２Ｄ）。変異した模範的結合配列との結合を欠くこと（図２４Ｃ）およびＲＢＭ２５結合に対し非標識プローブが標識プローブと競合できないこと（図２４Ｄ）を示すことにより、特異性を確認した。
【０３０８】
（実施例６）
本実施例は、Gaoら、Circulation、１２４巻（１０号）：１１２４〜３１頁（２０１１年８月２２日にオンライン発表）および国際公開第２０１０／１２９９６４号パンフレットの一方または両方に示す通り、Ａｎｇ−ＩＩおよび低酸素が、ＲＢＭ２５、ｈＬｕｃ７ＡおよびＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライシングを制御することを実証する。
【０３０９】
ＡｎｇＩＩおよび低酸素は、ＲＢＭ２５、ＬＵＣ７Ｌ３発現と共にＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライシングを制御した
ＡｎｇＩＩおよび低酸素は、ＨＦにおける共通病原性因子であり、マイクロアレイ解析において、ｍＲＮＡスプライシング因子の変化の原因である潜在的な上流刺激として同定された（表１）。ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡは、骨格筋および白血球において転写されることが公知である。本出願人らは、白血球が、心臓と同様のｍＲＮＡスプライシングパターンを有することを報告した。その上、ＨＦ患者由来の循環白血球は、ＡｎｇＩＩ  １型受容体の４倍増加を示した（データ図示せず）。よって、ＳＣＮ５Ａ制御機序を試験する初期モデルとして、ＳＣＮ５Ａを顕著に発現するＴリンパ球細胞の不死化系統であるジャーカット細胞を選んだ。
【０３１０】
ジャーカット細胞を、３種の実験群：未処理対照、低酸素処理（１％Ｏ２）およびＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）に分けた。４つの時点（３０分間、２４時間、４８時間および７２時間）において、各実験群から細胞を回収し、総ｍＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲによりＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現を調べ、４８時間目の結果を図２５Ａに示す。細胞の低酸素ストレスの指標としてＨＩＦ−１αを用いた。低酸素処理条件下において、ジャーカット細胞におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現は、それぞれ２．４倍および４．９倍増加した（Ｐ＜０．０５）。ＡｎｇＩＩ処理条件下において、ジャーカット細胞におけるＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現は、それぞれ２．１倍および１．９倍増加した（Ｐ＜０．０５）。低酸素処理群は３つの時点（１２時間、２４時間および４８時間）において、ＡｎｇＩＩ処理群は４つの時点（２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）において、ウエスタンブロットによりＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の発現を解析した。ウエスタンブロット定量化は、ＲＢＭ２５が、低酸素処理群において、それぞれ１２時間、２４時間および４８時間の時点において１．９、２．０および１．５倍増加し、ＡｎｇＩＩ処理群においては、それぞれ２４時間、４８時間、７２時間および９６時間目に２．１、２．１、１．９および２．０倍増加したことを示した（Ｐ＜０．０５）。ＬＵＣ７Ｌ３のゲル密度は、低酸素処理群においては、それぞれ１２時間、２４時間および４８時間の時点において２．４、２．４および２．７倍増加し、ＡｎｇＩＩ処理群においては、それぞれ２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の時点において２．６、２．５、２．８および２．８倍増加した（Ｐ＜０．０５）。代表的なウエスタンブロットおよび定量化（各群３複製に基づく）を図２５Ｂに示す。
【０３１１】
ＳＣＮ５ＡバリアントをＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３存在量と相関させるために、ジャーカット細胞におけるＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄにおける低酸素およびＡｎｇＩＩの効果も試験した。４８時間目の完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物ならびにＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現を図２５Ｃに示す。低酸素により、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現は、それぞれ３．７倍および６．４倍増加し（Ｐ＜０．０５）、一方、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物の発現は、０．７倍減少した（Ｐ＜０．０５）。ＡｎｇＩＩにより、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現は、それぞれ２．９倍および４．３倍増加し（Ｐ＜０．０５）、一方、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物（transcipt）の発現は、０．８倍減少した（Ｐ＜０．０５）。
【０３１２】
これら２種のスプライシング因子のｓｉＲＮＡは、４８時間目の低酸素またはＡｎｇＩＩ誘導性ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの増加を部分的に遮断することが判明した（図２５Ｄ〜Ｅ）。異常スプライシングの低下における部分効果は、ｓｉＲＮＡノックダウン効率が、それぞれＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３に関して、ｑＰＣＲによる推定では６０±５％および７０±５％であり、ウエスタンブロットでは６３±７％および６９±６％であることが原因である可能性がある。
【０３１３】
ジャーカット細胞における２種のスプライシング因子の下方制御は、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄを低下させるが、ＲＢＭ２５およびＬＵＣ７Ｌ３の過剰発現は、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄを増加させ、完全長ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡ存在量減少させた。４８時間目の完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物ならびにＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現を図２５Ｆに示す。ＲＢＭ２５の過剰発現により、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現は、それぞれ１．６倍および２．５倍増加し（Ｐ＜０．０５）、一方、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物の発現は、０．６倍減少した（Ｐ＜０．０５）。ＬＵＣ７Ｌ３の過剰発現により、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現は、それぞれ１．１倍および１．９倍増加し（Ｐ＜０．０５）、一方、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物の発現は、０．７倍減少した（Ｐ＜０．０５）。
【０３１４】
ｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＮａ＋チャネルにおけるＡｎｇＩＩの効果
ｈＥＳＣ−ＣＭにおける心臓性Ｎａ＋チャネルにおけるＡｎｇＩＩの効果を調査した。分化３０日目に、２４ウェル培養プレートにｈＥＳＣ−ＣＭをプレーティングした。細胞を、３種の実験群：ＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）およびｐＧＩＰＺレンチウイルスＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡｍｉｒによる前感染ならびにＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）およびスクランブルしたｓｈＲＮＡによる前感染に分けた。ＡｎｇＩＩ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）処理は、全実験群で感染３日目に行った。ＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡにより細胞を前感染した場合、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物の発現は、０．４倍増加し、一方、ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの発現は、それぞれ０．４倍および０．５倍減少した（Ｐ＜０．０５）。各実験群においてＡｎｇＩＩ処理後２４時間目にｑＰＣＲ測定を行い、β−アクチンにより正規化した。しかし、スクランブルしたｓｈＲＮＡにより細胞を前感染した場合、変化は観察されなかった。結果は、ＡｎｇＩＩ介在性ＳＣＮ５Ａ下方制御が、スプライシング因子ＲＢＭ２５に依存することを示した（図２６Ａ）。ＧＦＰ陽性細胞（ｐＧＩＰＺレンチウイルス感染細胞）対、総細胞の比率により評価したところ、感染率は９０±６％であった。ｑＰＣＲおよびウエスタンブロット両方により評価したところ、ＲＢＭ２５ノックダウン効率は７０±５％であった（図２６Ｂ）。
【０３１５】
異常Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡプロセシングはＮａ＋チャネル電流を変えた
ｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＮａ＋電流をホールセル電圧固定技法により測定することにより、Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡプロセシングの変化が意味するところを検査した。適した動物モデルが検証されていないため、ｈＥＳＣ−ＣＭを、最も的確に模倣的な（mimic）臨床状態に用いた。細胞を４種の実験群：対照、ＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）とＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡによる前感染およびＡｎｇＩＩ処理（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）とスクランブルしたｓｈＲＮＡによる前感染に分けた。ＲＢＭ２５が、ＬＵＣ７Ｌ３をリクルートすることによりプレｍＲＮＡ選択的スプライシングを制御すると仮定し、レンチウイルスｓｈＲＮＡによるＲＢＭ２５の１２機能喪失型を排他的に用いて、異常チャネルスプライシングを抑制した。各実験群における巨視的Ｎａ＋チャネル電流を測定した。ＡｎｇＩＩ処理後２４時間目の最初の３種の実験群の結果を図２７に示す。−４０〜＋３０ｍＶに及ぶ膜電位における対照細胞とＡｎｇＩＩ処理細胞との間のピーク電流に有意差が存在した（Ｐ＜０．０５）。ＡｎｇＩＩ処理前にＲＢＭ２５  ｓｈＲＮＡにより細胞を前感染した場合、ピーク電流におけるＡｎｇＩＩの効果は観察されなかった。ＡｎｇＩＩ単独と比較してＩ−Ｖ関係性に効果がない、スクランブルしたｓｈＲＮＡにより前感染した細胞と比較することにより、レンチウイルスの非特異的効果を除外した（データ図示せず）。結果は、ＡｎｇＩＩが、ｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＮａ＋チャネル電流を下方制御することができ、この下方制御が、スプライシング因子ＲＢＭ２５に依存したことを示した。
【０３１６】
（実施例７）
本実施例は、国際公開第２０１０／１２９９６４号パンフレットに示す通り、ＳＣＮ５Ａバリアントが、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を活性化することを実証する。
【０３１７】
以前に、本出願人らは、ＳＣＮ５Ａスプライシングバリアントが、Ｎａ＋電流におけるドミナントネガティブ効果を有することを示した（Shangら、Circ.  Res.、１０１巻：１１４６〜１１５４頁（２００７年））。Ｎａ＋チャネルは、単一のｍＲＮＡにコードされるため、切断型が、どのようにして完全長チャネル産生におけるドミナントネガティブ効果を有することができたかは明らかではない。次の実施例は、切断型ＳＣＮ５Ａバリアントが、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路を活性化するか調査した。
【０３１８】
低酸素およびＡｎｇＩＩを用いて、異常ＳＣＮ５Ａスプライシングを増加させた。ＲＴ−ＰＣＲによりＰＥＲＫおよびｓＸＢＰ１の発現を測定した。ＰＥＲＫの発現は、それぞれ低酸素処理およびＡｎｇＩＩ処理条件下において、４８時間目に１８．６±０．８倍（ｐ＜０．０５）および１４．２±０．６倍（ｐ＜０．０５）増加したが、ｓＸＢＰ１の発現上方制御は観察されなかった。ＵＰＲの一方の腕のこのような上方制御が、ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡバリアントにより媒介されるか検査するため、外因的なＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄを導入した。ジャーカット細胞を、４種の実験群：正常対照、空ベクター対照、バリアントＥ２８Ｃ過剰発現細胞およびバリアントＥ２８Ｄ過剰発現細胞に分けた。各群において、４８時間の時点でＲＴ−ＰＣＲによりＰＥＲＫの発現を測定した。結果は、バリアントＥ２８ＣまたはＥ２８Ｄを過剰発現させた場合、ＰＥＲＫの発現が、６．３±０．４（ｐ＜０．０５）倍および７．９±０．５倍（ｐ＜０．０５）増加したことを示した。ジャーカット細胞におけるＰＥＲＫの上方制御を、ウエスタンブロットによりさらに確認した。対照群と比較したとこと、ウエスタンブロット解析は、ＰＥＲＫの密度が、それぞれ低酸素処理およびＡｎｇＩＩ処理条件下において４３７．９±１１．２％、３８３．２±１０．７％増加し（ｐ＜０．０５）、それぞれバリアントＥ２８ＣまたはＥ２８Ｄを過剰発現する細胞において２６２．６±９．６％および３５９．５±１０．１％増加した（ｐ＜０．０５）ことを示した。その上さらに、ＰＥＲＫに対するｓｉＲＮＡは、低酸素またはＡｎｇＩＩ処理後に完全長ＳＣＮ５Ａ発現の下方制御を部分的に逆行させた。ｓｉＲＮＡノックダウン効率は５０％以上。
【０３１９】
（実施例８）
本実施例は、以前に記載された通り、ヒト心不全における心臓性ナトリウムチャネルの制御におけるＰＥＲＫ介在性小胞体ストレス応答経路の役割を実証する。
【０３２０】
小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）は、小胞体（ＥＲ）が、過剰分泌性負荷を経験、ミスファイル（misfile）したタンパク質を蓄積または他の病的状態に付されたときに生じる、一連の互いに関連するシグナル伝達経路である。ＵＰＲは、全般的なタンパク質合成を減弱するよう作用し、ＥＲシャペロンタンパク質の発現を誘導し、ミスファイルしたタンパク質の分解を増強する。公表された研究において、本出願人らは、心不全（ＨＦ）が、ＳＣＮ５Ａ遺伝子（心臓性ナトリウムチャネルをコード）の選択的スプライシングを増加させ、切断型の非機能性ナトリウムチャネルをコードするｍＲＮＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄを産生することを示した。これらバリアントの存在は、催不整脈性（arrthmogenic）となるのに十分な程度まで、野生型ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡおよびナトリウム電流のドミナントネガティブ下方制御をもたらす。本出願人らは、ＨＦにおいて切断型ナトリウムチャネルｍＲＮＡバリアントが存在する場合、ＰＥＲＫ介在性ＵＰＲが、Ｎａ＋電流におけるドミナントネガティブ効果に寄与するか検査した。
【０３２１】
発現の相関は、ＰＥＲＫ、主要ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（ｈＥＳＣ−ＣＭ）の間で変化する。低酸素およびＡｎｇＩＩは、ＨＦの病理学的因果関係の一部を媒介することを示したため、異常スプライシングの誘導因子（induces  or）として用いた。ｈＥＳＣ−ＣＭを、６種の実験群：正常酸素圧、１％Ｏ２低酸素処理、１００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＡｎｇＩＩ処理、Ｅ２８Ｃ過剰発現、Ｅ２８Ｄ過剰発現および空ベクター対照に分けた。切断型タンパク質を過剰発現させるために、Ｅ２８ＣおよびＥ２８Ｄ構築物を形質導入した。
【０３２２】
主要ＵＰＲ構成成分（ＰＥＲＫ、カルネキシン、ＣＨＯＰ）の発現は、ＨＦ組織において増加し、心臓性Ｎａ＋チャネルが下方制御された。ｈＥＳＣ−ＣＭにおいて、ＡｎｇＩＩまたは低酸素によるＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの誘導は、外因的バリアントの発現と共に、主要ＵＰＲ構成成分（ＰＥＲＫ、カルネキシン、ＣＨＯＰ）を誘導することができた。最後に、ＰＥＲＫの下方制御（downregualtion）は、これらの刺激による完全長ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡ存在量の損失を防止した。
【０３２３】
ＳＣＮ５Ａバリアントは、主要ＵＰＲ構成成分の発現を誘導することができ、ＰＥＲＫ介在性Ｎａ＋チャネル（channed）の下方制御を誘導することができた。結果は、ＵＰＲが、ヒトＨＦにおけるＮａ＋チャネルの下方制御に寄与することを示す。
【０３２４】
（実施例９）
本出願人らは、心臓性Ｎａ＋チャネルのα−サブユニットをコードする遺伝子であるＳＣＮ５Ａが、ヒト心不全（ＨＦ）において上方制御される２種のｍＲＮＡ選択的スプライシングバリアントを有すると報告した。これらのスプライシングバリアントは、機能性チャネルを形成せず、これらの存在は、心筋細胞間の伝導速度を低下させる。よって、異常Ｎａ＋チャネルスプライシングは、ＨＦにおける不整脈性リスクに寄与し得る。さらなる試験は、スプライシング因子ＲＢＭ２５およびｈＬｕｃ７Ａが、異常ｍＲＮＡプロセシングを導くことを示した。本出願人らのデータは、不死化Ｂ細胞が、心臓組織と同じ様に心臓性Ｎａ＋チャネルバリアントを発現し、異常心臓性スプライシングの代用として機能し得ることも示す。
【０３２５】
本出願人らは、白血球（ＷＢＣ）Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡスプライシングが、ＨＦの有無に応じて変動するか検査した。
方法：１８０名の成人患者を本試験にリクルートし、そのうち４５名はＨＦなしの対照（駆出分画率（ＥＦ）＞６０％）、１３５名はＨＦあり（ＥＦ＜３５％）であった。先天性心疾患、感染症および炎症性状態の患者は除外した。ＷＢＣから全ＲＮＡを抽出した。ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ５Ａバリアントならびにスプライシング因子ＲＢＭ２５およびｈＬｕｃ７ａのｍＲＮＡ存在量をリアルタイムＰＣＲにより決定した。
結果：ＷＢＣ  ＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣまたはＥ２８Ｄの、完全長ＳＣＮ５Ａ転写産物に対する比率は、対照群と比較してＨＦ患者において増加した。平均倍数的誘導は、それぞれＳＣＮ５ＡバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄに関して５．０±２．７および７．０±３．５であった（ｐ＜０．０５）。これらの変化は、心臓性組織において観察される変化よりも大きかった。ＲＢＭ２５およびｈＬｕｃ７ａのＷＢＣ  ｍＲＮＡ存在量もＨＦにおいて増加した。ＲＢＭ２５およびｈＬｕｃ７Ａの平均増加は、それぞれ６７．０±７．８％および７３．０±９．３％であった（ｐ＜０．０５）。これらの変化は、本出願人らが前に報告した心臓組織と同様のものであった。結論：病原性スプライシング因子増加および異常Ｎａ＋チャネルスプライシングの明瞭なパターンが、ＨＦ患者の循環ＷＢＣに存在し、これは、ＷＢＣ  ｍＲＮＡスプライシングが、心臓において起こる同一過程に影響され得ること、ＷＢＣ  ｍＲＮＡスプライシングが、心臓におけるＮａ＋チャネル下方制御に関係する不整脈性リスクの代用として機能し得ることを示唆した。
【０３２６】
（実施例１０）
本実施例は、現在進行中の臨床治験である、ＳＯＣＳ−ＨＥＦＴ（心不全におけるナトリウムチャネルスプライシング治験（Sodium  Channel  Splicing  in  Heart  Failure  Trial）、ＮＣＴ０１１８５５８７）として公知のヒト臨床治験の説明を提供する。
【０３２７】
本出願人らは、（１）左心室駆出分画率が低下した患者は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の切断型ｍＲＮＡスプライスバリアントの存在量が増加し、この状態は、ナトリウムチャネル機能障害および心臓性突然死リスク増加の前兆になり、（２）ショック療法を経験したことのある、植え込み型心除細動デバイス（ＩＣＤ）を備える患者は、ショック療法を経験したことがない同様のうっ血性心不全患者と比較して、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の切断型ｍＲＮＡスプライスバリアントの存在量が増加すると仮定した。
【０３２８】
これらの仮説を検査するため、本出願人らは、基本的に次に記す通りにＳＯＣＳ−ＨＥＦＴ治験を開始した。
【０３２９】
本試験の具体的な目標および目的は、（ｉ）慢性心不全（ＣＨＦ）である、３５％未満のベースライン駆出分画率の患者、対、同様の年齢群の正常対照におけるＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライスバリアントの存在量を決定し、（ｉｉ）ＩＣＤデバイスを備える患者における、ＩＣＤショック療法を経験した患者としていない患者におけるＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライスバリアントの存在量を比較することである。心不全ありまたはなしの患者における白血球（white）細胞Ｎａ＋チャネルスプライスバリアントの量が駆出分画率と相関するよう、また、ＩＣＤを適所に備える患者における白血球Ｎａ＋チャネルスプライスバリアントの量が、妥当なＩＣＤショックの数と相関するように試験を設計した。
【０３３０】
試験参加者は、いずれかの原因によりＩＣＤデバイスを備えるあるいは備えない、後天性心不全（先天性心疾患の続発ではない）である主に成人患者であった。正常な左心室機能を有し、心エコー査定による拡張機能障害のエビデンスがない患者も、本試験に対照患者として包含した。これらの患者は、心臓病ではなく、ＩＣＤデバイスも備えない。
【０３３１】
試験参加者を選択する際に、次の適格性判断基準を用いた。
１．全患者は、１８歳を超えていなければならない。
２．左心室機能が低下した患者（即ち、心不全患者）は、この２年間においていずれかの方法論により実証された後天性心不全および３５％未満の駆出分画率でなければなない。
３．対照集団患者は、試験登録１年以内にいずれかの方法論により実証された心不全症状、拡張機能障害および左心室収縮期機能障害であってはならない。
４．１年間を超えてＩＣＤを適所に備え、ＩＣＤイベントのエビデンスがある患者。
５．１年間を超えてＩＣＤを適所に備え、ＩＣＤイベントのエビデンスがない患者。
６．全患者は、インフォームドコンセントを与えることができなければならない。
【０３３２】
試験参加者を除外する際に、次の不適格性判断基準を用いた。
１．１８歳未満の患者。
２．左心室機能欠損が原因の先天性心疾患の病歴。
３．左心室収縮期機能が欠損したまたは拡張機能障害が存在する対照患者。
４．ＱＴ延長症候群またはブルガダ病等の先天性電気生理学的障害の病歴を有する対照または試験群患者は包含されない。
５．Ｖａｕｇｈｎ−ＷｉｌｌｉａｍｓクラスＩＩおよびＩＶ薬剤以外の抗不整脈薬を必要とする対照または試験群患者。
６．試験登録１２カ月以内に心機能を損ないかねない重大な疾病の病歴を有する対照患者。このような状態として、心筋梗塞、心臓による入院加療、心不整脈、感染症または癌が挙げられる。
７．その他の末期的（terminal）または慢性炎症性疾病を患うＩＣＤ患者。
８．白血球ｍＲＮＡ発現を変える可能性のある、免疫抑制性薬物療法を受けている、慢性感染症、あるいは急性または慢性炎症性疾病の患者。
９．登録１８カ月以内の死亡が予想されるいずれかの疾病の患者。
１０．白血球悪液質または癌の患者。
１１．現在、不正薬物を使用している。
１２．インフォームドコンセントを与えることができない。
【０３３３】
試験参加候補者に次の登録前評価を行った。
１．病歴および身体検査。
２．アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、スタチン、抗不整脈薬およびアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）等が挙げられるがこれらに限定されない現在の薬物療法の記録。
３．ＩＣＤデバイスを備える患者は、そのデバイスを照合してショックの存在に関して再調査する。
【０３３４】
対象参加の持続期間は、次の通りに決定した。登録時に一回の採血が要求され、ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライスバリアントのレベルが解析された。ＩＣＤ照合記録、ＥＣＧ、エコー法実験結果等、心臓特異的な情報に関する患者の医療記録を登録日から遡及的に調べた。本試験は、ケア標準の変更を必要としなかった。全試験参加者を、登録時に静脈切開術に付した。本試験におけるモニタリングパラメータは存在しなかった。患者は、随意、任意の時点で試験を中止することができた。
【０３３５】
成績査定は次の通りであった。初期評価において、人口統計および過去の病歴データを記録した。この情報は、年齢、人種、性別、肥満度指数、血圧、ニューヨーク心臓協会クラス、心筋梗塞および高血圧の病歴、糖尿病の状況、煙草およびアルコール摂取、ペースメーカデバイスの存在および種類を包含した。心不全診断時の年齢を記録した。その上、以前の心臓検査の概説を記録した。再調査した検査の種類は、心電図、断層心エコー図、冠血管造影図および心臓核試験結果を包含した。ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライスバリアントのレベルを査定するため、各試験参加者の血液試料を採取した。本出願人らは近年、ＡｎｇＩＩおよび低酸素が、異常ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライシングの上流シグナルであることを示したため、本出願人らは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）レベルおよび活性、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）ならびに低酸素誘導性因子（ＨＩＦ−１α）ｍＲＮＡにも着目したい。
【０３３６】
本試験の試料収集および加工は、次の通り行った。静脈切開術および試験参加のインフォームドコンセントを与えたＵＩＣまたはＪＢＶＡＭＣの試験参加者から約１５ｍｌの血液を採血した。収集２時間以内に加工するため、試験スタッフにより試料を直ちに配送した。ｍＲＮＡのレベルを測定し、加工した試料の一部を同一研究室の−８０°Ｆフリーザー内に最大７年間保存した。ＪＢＶＡＭＣまたはその他の施設では、試料を保存または加工しなかった。
【０３３７】
試験の統計的考察は、次の通りである。心不全ありおよびなしの対象ならびにＩＣＤイベントありおよびなしの対象において、Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡバリアント存在量の関係性を比較した。主要エンドポイントは、ｍＲＮＡバリアント存在量の比較であった。従属変数は、心不全およびショック数を包含した。検定の分散、予想される平均差および回帰解析における解析に必要な共変数の検討により、本試験のゴールに必要とされる患者数を決定した。以前に、本出願人らは、最も低い感度尺度は、Ｅ２８Ａ存在量の２４％低下であることを示した。本出願人らが、同一パーセンテージ低下が、ゴール１および２において起こると想定する場合、この差を検出するための９０％の検出力を有するために各群約４５名の患者を必要し、アッセイにおける技術的誤差による１０％損失率を想定する。よって、本出願人らは、総治験のため、心不全４５名、対照４５名、イベントありＩＣＤ患者４５名およびイベントなし患者４５名の、総計１８０名の患者を必要とした。
【０３３８】
ベースラインデータは、連続型変数の平均値±ＳＤおよびカテゴリー変数の度数として表した。群の間のベースライン特徴における差は、それぞれカテゴリーおよび連続型変数のためフィッシャー直接およびマンホイットニーの検定の使用により調べる。記録されているＩＣＤイベントの数は、観察時間の関数であるため、ポアソン回帰を用いて、任意の関係性をモデル化した。このモデルにおいて、観察されたＩＣＤイベント数は、ポアソン分布に従って分布すると想定される。即ち、所定の期間、一定数のイベントが起こった確率は、観察期間を乗じたイベント率の関数である。イベント発生率におけるｍＲＮＡバリアントの効果を推定するため、イベント率が、対象とする予測因子に関して線形の対数であると想定された。この方程式を解くと、ＩＣＤイベントありおよびなしの対象におけるイベント発生率を比較する比率が得られる。各バリアントそれぞれの相対存在量、総Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡに応じた個々のバリアントの存在量および切断対完全長Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡの比率等、ｍＲＮＡバリアント存在量の複数の表現が考慮された。回帰係数は、従属変数、ＩＣＤイベントおよび比率推定の対数としての独立変数の間の関係性に対して推定した。尤度比検定を用いることにより、統計的有意性を決定した。０．０５以下のｐ値は、統計的に有意であると解釈した。結果をリスク比およびその関連する９５％信頼区間として報告した。このモデルに包含すべき変数を選択するため、本出願人らは、ｐ＜０．２０にて２群間で異なる分布を有する変数を保存的に検討した。多重共直線性（multicolinearity）の可能性を評価した。線形および非線形項を検討した。正規確率プロットおよびシャピロ−ウイルク検定により変数分布の正規性を検定した。回帰は、この点における侵害に相当に耐性があるが、変換を適宜調査した。残渣対予測値のプロットにより、等分散性を評価した。モデルの弁別を総合Ｃ指数により評価し、ブートストラップ方法により検証した。
【０３３９】
安全性モニタリングおよび本試験の査定は、次の通りである。これは、患者に対し最小のリスクがある断面（cross-sectional）コホート比較治験である。データ安全性モニタリング委員会は存在しなかった。あらゆるデータは、現行法および規制を遵守して収集した。データを特定不能（de-identified）様式で管理されたアクセス位置に保存した。本出願人らは、血液試料取得、ｍＲＮＡバリアント解析または統計学実行によるいかなる複雑化要素（complication）も予測しない。そうであるにもかかわらず、本治験にとっての主要な制限は、その後向き性質である。そうであるにもかかわらず、本データは、将来的な前向き治験の設計において有用となるであろう。
【０３４０】
次の参考文献は、本実施例において考察された。
【０３４１】
【表２−１】
2014508514.tif 000035
【０３４２】
【表２−２】
2014508514.tif 000036
【０３４３】
（実施例１１）
本実施例は、白血球（ＷＢＣ）ＳＣＮ５Ａ選択的スプライシングが、心臓性ＳＣＮ５Ａスプライシングと相関することを実証する。
【０３４４】
ＳＯＣＳ−ＨＥＦＴからのデータに基づき、本出願人らは、ＷＢＣおよび左心室ＳＣＮ５Ａスプライシングバリアント存在量が、高度に相関的であることを確立した。左心補助循環装置コア試料および同時に得た血液試料を用いて、本出願人らは、心臓および血液における正規化バリアントレベルの間に有意な程度の相関が存在することを示した（図２９）。これらのデータは、バリアントの血液検査が、心臓における変化を反映する可能性が高いことを示唆する。
【０３４５】
（実施例１２）
本実施例は、ＷＢＣスプライシングバリアントの増加が、妥当なＩＣＤ放電を予測することを実証する。
【０３４６】
ＳＯＣＳ−ＨＥＦＴ治験からのデータに基づき、本出願人らは、バリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの両方が、対照と比較してＩＣＤ患者の血液において増加したことを示すことができた。加えて、バリアントレベルは、試料取得に先立つ１２カ月以内の期間に心室頻拍または細動のために妥当なＩＣＤ放電を有する患者において相当に高くなり、群の間のバリアント存在量の分布における重複はほとんど見られなかった（図３０）。現在の治験登録は、２８名の対照、３４名の放電なしのＩＣＤ患者および１５名の妥当な放電ありの患者（突然死の妥当な代用）である。後向きであり、数が少ないが、ＩＣＤを備える患者におけるショックリスクを予見するためのＳＣＮ５Ａバリアントの使用には、治験結果は、既に統計的に有意である。
【０３４７】
その上、Ｅ２８Ｃに対し４．０またはＥ２８Ｄに対し２．８のカットオフを用いると、ショックリスクの予見に関する感度および特異性は、それぞれ１００％および８５％であり、曲線下面積（ＡＵＣ）は、Ｅ２８Ｃが０．９６±０．０３、Ｅ２８Ｄが０．９５±０．０３である（ｐ＜０．００１、図３０）。この結果は、提案された血液検査が、突然死の予見に利用できる任意の検査の最高のＡＵＣを有することを暗示する。
【０３４８】
次の記載は、図３０のガウス分布曲線に基づきどのように計算がなされるかを示す。
【０３４９】
確率理論において、ガウス分布は、ガウス関数として公知のベル型（bell-shaped）確率密度関数を有する連続的確率分布である。
【０３５０】
【数１７】
2014508514.tif 000037
（式中、パラメータμは、平均値または期待値（ピークの位置）であり、σは、標準偏差である。）
【０３５１】
対照およびＩＣＤ患者（ショックありまたはなし）におけるＥ２８Ｃ／ＳＣＮ５ａ（ＳＣＮ５ａスプライスバリアントＥ２８Ｃ対ＳＣＮ５ａの存在量比率）およびＥ２８Ｄ／ＳＣＮ５ａ（ＳＣＮ５ａスプライスバリアントＥ２８Ｄ対ＳＣＮ５ａの存在量比率）の分布は、ガウス分布に従う。対照のガウス分布は、非常に狭いベル型確率分布に対応して、より小さい平均値およびより小さい標準偏差を有する。ショックなしのＩＣＤ患者のガウス分布は、より広いベル型確率分布に対応して、より大きい平均値およびより大きい標準偏差を有する。ショックありのＩＣＤ患者のガウス分布は、縦座標から最も遠い最も広いベル型確率分布に対応して、最大の平均値および最大の標準偏差を有する。
【０３５２】
通常、ＶＣ／ＳＣＮ５ａおよびＶＤ／ＳＣＮ５ａの計算の前に、ＩＣＤ患者におけるＳＣＮ５ａならびにそのスプライスバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの存在量が、ある種のアルゴリズムにより較正される。次に一例を示す。第一に、β−アクチン、ＳＣＮ５ａならびにそのスプライスバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄに関して、ＩＣＤ患者と対照との間の存在量差ΔＣｔを計算する。第二に、ΔΔＣｔＳＣＮ５ａ＝ΔＣｔＳＣＮ５ａ−ΔＣｔβ−アクチン、ΔΔＣｔＥ２８Ｃ＝ΔＣｔＥ２８Ｃ−ΔＣｔβ−アクチンおよびΔΔＣｔＥ２８Ｄ＝ΔＣｔＥ２８Ｄ−ΔＣｔβ−アクチンを計算する。次に、次式により、ＩＣＤ患者におけるＳＣＮ５ａならびにそのスプライスバリアントＥ２８ＣおよびＥ２８Ｄの較正存在量を得る：２の、それぞれマイナスΔΔＣｔＳＣＮ５ａ乗、マイナスΔΔＣｔＥ２８Ｃ乗およびマイナスΔΔＣｔＥ２８Ｄ乗。最後に、ＶＣ／ＳＣＮ５ａ（較正したバリアントＥ２８Ｃ存在量、対、較正したＳＣＮ５ａ存在量の比率）およびＶＤ／ＳＣＮ５ａ（較正したバリアントＥ２８Ｄ存在量、対、較正したＳＣＮ５ａ存在量の比率）の値を用いて、ＩＣＤ患者におけるガウス分布を適合させた。
【０３５３】
ガウス分布を適合させるため、ＶＣ／ＳＣＮ５ａおよびＶＤ／ＳＣＮ５ａのそのままの値（raw  value）を瓶に入れて（binned）、各瓶内の値の分布の分散を最大化することができる。例えば、ＶＣ／ＳＣＮ５ａまたはＶＤ／ＳＣＮ５ａが、５．５以上かつ６．５より小さい場合、関連値は全て、瓶幅１．０を有する同一瓶中心値６．０にグループ分けすることができる。ガウス分布適合結果は、瓶幅の値にある程度依存する。
【０３５４】
ガウス分布の適合は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ等、ソフトウェアにより行うことができる。度数分布は、度数がＹ値、ＶＣ／ＳＣＮ５ａまたはＶＤ／ＳＣＮ５ａ瓶中心がＸ値である、ＸＹプロットとしてプロットされるよう指定される。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いる場合、ＸＹ値インプット後に分析関数がクリックされる。続いて、非線形回帰、方程式のガウスファミリーおよびガウスモデルを選び、次に、ガウス型度数分布を作成する。
【０３５５】
４．１のＶＣ／ＳＣＮ５ａ値および２．６のＶＤ／ＳＣＮ５ａ値を、ＩＣＤ患者がショックを有し得る可能性を予見するための判断基準として選ぶことができる。既存の臨床データによると、ショックありＩＣＤ患者の９９％は、４．１を超えるＶＣ／ＳＣＮ５ａ値および２．６を超えるＶＤ／ＳＣＮ５ａ値を有するが、ショックなしのＩＣＤ患者の８％は、４．１を超えるＶＣ／ＳＣＮ５ａ値を有し、ショックなしのＩＣＤ患者の１６％は、２．６を超えるＶＤ／ＳＣＮ５ａ値を有する。ショックありのＩＣＤ患者の９６％は、４．７を超えるＶＣ／ＳＣＮ５ａ値および３．５を超えるＶＤ／ＳＣＮ５ａ値を有するが、ショックなしのＩＣＤ患者の３％は、４．７を超えるＶＣ／ＳＣＮ５ａ値および３．５を超えるＶＤ／ＳＣＮ５ａ値を有する。
【０３５６】
次に、ＶＣ／ＳＣＮ５ａおよびＶＤ／ＳＣＮ５ａの得られた値を、ＩＣＤ患者がショックを有し得る可能性を予見するための判断基準として選ばれたカットオフ値と比較する。カットオフ値は、９９％前後の陰性適中率を有するよう指定することができる。
【０３５７】
ガウス分布値表に基づくと、９９％のデータ値は、次式により計算される判断基準値よりも大きい：μ−２．３３σ（式中、μは、平均値または期待値（ピークの位置）であり、σは、標準偏差である）。
【０３５８】
平均値μは、次式により計算することができる。
【０３５９】
【数１８】
2014508514.tif 000038
（式中、Ｎは、データ値の総数であり、各データ値は、ｘｉ（ｉ＝１、…、Ｎ）により示される。）
【０３６０】
標準偏差σは、次式により計算することができる。
【０３６１】
【数１９】
2014508514.tif 000039
【０３６２】
既存の臨床データによると、ショックありのＩＣＤ患者のガウス分布は、ＶＣ／ＳＣＮ５ａに関して７．２の平均値μおよび１．３の標準偏差σを有し、ＶＤ／ＳＣＮ５ａに関して６．４の平均値μおよび１．６の標準偏差σを有する。よって、ＶＣ／ＳＣＮ５ａに関してμ−２．３３σ＝４．１であり、ＶＤ／ＳＣＮ５ａに関してμ−２．３３σ＝２．６である。４．１のＶＣ／ＳＣＮ５ａ値および２．６のＶＤ／ＳＣＮ５ａ値は、判断基準として選ばれるため、ショックありのＩＣＤ患者の９９％は、陽性として同定することができる、即ち、そのＶＣ／ＳＣＮ５ａ＞４．１およびＶＤ／ＳＣＮ５ａ＞２．６。４．１のＶＣ／ＳＣＮ５ａ値のみが判断基準として選ばれる場合、対応する感度および特異性は、それぞれ９１．７％および９１．１％であり、対応する陽性および陰性適中率は、それぞれ９２．５％および９８．９％である。２．６のＶＤ／ＳＣＮ５ａ値のみが判断基準として選ばれる場合、対応する感度および特異性は、それぞれ８５．３％および８３．２％であり、対応する陽性および陰性適中率は、それぞれ８６．１％および９８．８％である。
【０３６３】
次に、感度、特異性、陽性適中率および陰性適中率を計算するための式を記す。
【０３６４】
感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＦＮ）
特異性＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）
陽性適中率＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）
陰性適中率＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）
（式中、ＴＰは、真陽性を示し、ＴＮは、真陰性を示し、ＦＰは、偽陽性を示し、ＦＮは、偽陰性を示す。）例えば、閾値が決定されると、ＴＮは、カットオフ左のショックなし群におけるデータ値である。ＦＮは、カットオフ左のＩＣＤショック群におけるデータ値である。ＴＰおよびＦＰは、それぞれカットオフ右のショック群およびショックなし群である。
【０３６５】
（実施例１３）
本実施例は、ＨＦ患者においてＷＢＣスプライシングバリアントが増加することを実証する。
【０３６６】
同ＳＯＣＳ−ＨＥＦＴ治験において、本出願人らは、両バリアントが、対照と比較してＨＦ患者の血液において増加したことを示すことができた（図３０）。現在の治験登録は、男性４２名および女性１４名である。この結果は、ＷＢＣ  ＳＣＮ５Ａ  ｍＲＮＡスプライシングが、ＨＦに応じて変動することを示唆し、ＨＦは不整脈性リスクに関連するため、ＷＢＣ  ｍＲＮＡバリアントが突然死リスクを予見し得るとの考えは理にかなう。
【０３６７】
（実施例１４）
本実施例は、心室性不整脈のためのＩＣＤ療法ありおよびなしの患者を比較する断面、コホート試験を示す。
【０３６８】
本試験の各患者は、ＩＣＤを有するであろう。潜在的な対象は、３施設のイリノイ大学シカゴ校（University  of  Illinois  at  Chicago）教育病院に従った数千名の患者コホートから来るであろう。悪性心室頻拍（即ち、ＩＣＤイベント）のために審査されたＩＣＤ療法による患者は、同一データベースから同定されランダムに選ばれたＩＣＤイベントなしの同数の対象と共に、ＷＢＣ  Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡスプライスバリアント存在量の解析のためにさらに血液試料を提供するよう依頼される。次に、これらの存在量は、下に記す共変数の補正後に、ＩＣＤイベントの存在と相関付けられる。適格性判断基準は、（１）１８歳を超えていること、（２）妥当な期間にわたり遡及的リスクを評価できるよう、１年間を超えてＩＣＤを配備していることを包含する。不適格性判断基準は、ヒト対象セクションに列挙するが、これは、先天性心疾患、先天性不整脈性障害の病歴、白血球ｍＲＮＡ発現を変え得る免疫抑制性薬物療法を受けている、慢性感染症の患者、白血球悪液質または癌患者を包含する。登録された全患者は、書面による同意を提出する。
【０３６９】
データは、対象問診ならびに病院およびクリニックカルテの再検討から収集される。得られた人口統計データは、年齢、人種、肥満度指数、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能的クラスおよび以前の心筋梗塞、高血圧、糖尿病の病歴、喫煙またはアルコール摂取を包含する。その上、登録時に受けているあらゆる薬物療法ならびにＥＦ決定の日付および方法が記録される。
【０３７０】
登録時に１回の採血が行われる。全ＲＮＡをＷＢＣから直ぐに（acutely）単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて様々な形態のＮａ＋チャネルスプライス変種を解析する。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）をメーカーの説明書に従って用いた逆転写によりｃＤＮＡを合成するために、全ＲＮＡを用いる。全増幅は２回複製して行い、ＢｉｏＲａｄサーマルサイクラーｉＣｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）における４０サイクルの３０秒９４℃、３０秒６５℃および１分間７２℃からなる。１．５％アガロースゲルにおける電気泳動によりＰＣＲ産物を解析する。定量的比較を行う場合、ベータ−アクチンおよびＧＡＰＤＨを内部参照として用いる。
【０３７１】
ＨＦおよび対照患者間の上に記すｍＲＮＡアイソフォーム存在量における最小変化は、２５％低下した完全長転写産物であった。この最小変化を検出力解析の基盤として用いると、各群３７名の対象の登録が、０．０５の両側（two-tailed）アルファレベルを用いてこの差を検出するための９０％検出力をもたらすことになる。これに基づき、また、共変数の補正に十分な対象を得る必要から、本出願人らは、各群５０名の対象を登録する。
【０３７２】
本出願人らは、異常ＳＣＮ５Ａスプライシングパターンが、ＩＣＤイベントに関連することを予測する。Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡバリアント存在量およびパターンの関係性は、ＩＣＤイベントありおよびなしの対象において比較される。上述の通り、様々なｍＲＮＡアイソフォームレベルは、相対ｍＲＮＡ存在量および総Ｎａ４チャネルｍＲＮＡのパーセントとして表される。ベースラインデータは、連続型変数の平均値±ＳＤおよびカテゴリー変数の度数として表される。群の間のベースライン特徴における差は、それぞれカテゴリーおよび連続型変数のフィッシャー直接およびマンホイットニー検定の使用により調べる。記録されたＩＣＤイベント数は、観察時間の関数であるため、ポアソン回帰を用いて、任意の関係性をモデル化する。このモデルにおいて、観察されたＩＣＤイベント数は、ポアソン分布に従って分布すると想定される。即ち、所定の期間、一定数のイベントが起こった確率は、観察期間を乗じたイベント率の関数である。イベント発生率におけるｍＲＮＡバリアントの効果を推定するため、イベント率が、対象とする予測因子に関して線形の対数であることが想定される。この方程式を解くと、ＩＣＤイベントありおよびなしの対象におけるイベント発生率を比較する比率が得られる。各バリアントそれぞれの相対存在量、総Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡに応じた個々のバリアントの存在量および切断対完全長Ｎａ＋チャネルｍＲＮＡの比率等、ｍＲＮＡバリアント存在量の複数の表現が考慮される。回帰係数は、従属変数、ＩＣＤイベントおよび比率推定の対数としての独立変数の間の関係性に対して推定される。統計的有意性は、尤度比検定を用いることにより決定される。０．０５以下のｐ値は、統計的に有意であると解釈される。結果は、リスク比およびその関連する９５％信頼区間として報告される。このモデルに包含される変数を選択するため、本出願人らは、ｐ＜０．２０において２群間で異なる分布を有する変数を保存的に検討する。多重共直線性の可能性が評価される。線形および非線形項が検討される。変数分布の正規性が、正規確率プロットおよびシャピロ−ウイルク検定により検定される。回帰は、この点における侵害に相当に耐性があるが、適宜変換が調査される。等分散性は、残渣対予測値のプロットにより評価される。モデルの弁別は、総合Ｃ指数により評価され、ブートストラップ方法により検証される。データ解析は、生物統計学コアを維持する、国立研究資源センター（National  Center  for  Research  Resources）、ＮＩＨ、Ａｗａｒｄ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＵＬ  １ＲＲ０２９８７９により近年出資された、臨床解釈科学のためのＵＩＣセンター（UIC  Center  for  Clinical  Translational  Science）と協力して行われる。
【０３７３】
本出願人らは、近年の中間（interim）ＧＲＡＤＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ５５または本出願人らによる、心房細動予防のためのスタチン治験（Statins  for  the  Prevention  of  Atrial  fibrillation  trial）（ＳｔｏＰ−ＡＦ、ＮＣＴ００２５２９６７）（５６）において用いられたものと同様の、血液試料の取得、ｍＲＮＡバリアントの解析または統計学の実行によるいかなる複雑化要素も予測しない。ところが、本出願人らは、ＡｎｇＩＩおよび低酸素が、スプライス変種存在量に影響を及ぼすことを示したが、潜在的複雑化要素の１つは、ＨＦに関係するものは別としてＮａ＋チャネルスプライシングに影響する他の状態が存在し得ることである。試料サイズは、他の要因の統計的補正に十分な程大きくなるべきであり、このような要因の同定は、リスク緩和戦略をもたらし得る。例えば、スプライシングが、心筋症の型、人種、性別またはＥＦに影響されることが可能であり、これについては調査されるであろう。本出願人らの予備的データは、年齢が、Ｆ−ＩＦ患者における変種存在量に影響を及ぼさないことを示す（データ図示せず）。その上、この後向き治験が陽性であったとしても、ＩＣＤイベントの予見におけるＮａ＋チャネルバリアントの有用性を堅固に確立するには、前向き、多施設治験が必要とされることが認識される。
【０３７４】
（実施例１５）
本実施例は、抗不整脈薬の投与が安全となる患者を同定するための試験を示す。
【０３７５】
ＩＣＤを備え、抗不整脈薬を服用している患者が、本試験に登録される。これにより、薬物の任意の有害不整脈誘発イベントから患者を保護する。ナトリウムチャネルバリアント、ナトリウムチャネルスプライシング因子および／または小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）のレベルは、抗不整脈薬投与レジメン開始前に査定される。心室性不整脈安全性および効力または心房性不整脈の発病／再発の場合、患者に薬物を開始した後、患者をその妥当なショックリスクに関してモニターする。心房性不整脈におけるこれら薬物の使用はより一般的であり、より大きな市場を表す。
【０３７６】
比例ハザード回帰、不整脈までの中位時間の推定および比例エンドポイントフリー（endpoint-free）を用いて、関連不整脈発病までの時間の差を解析する。コックス比例ハザード回帰を用いて、年齢、性別、肥満度指数、血圧、ＮＹＨＡ分類、高血圧、喫煙、以前のＣＶ数、ＬＡ寸法、推定ＬＶ駆出分画率およびＬＶ壁厚を包含する成績に影響し得る変数の調整後に、試験エンドポイントのハザード比を導く。解析において、関連不整脈の発病までの時間は、従属変数であり、ベースラインマーカーレベル、人口統計および臨床変数が、独立変数として機能する。このアプローチは、処置成績がマーカーレベルにより予見されるか検定する。モデル化は、スタチン、ＡＣＥ阻害剤／ＡＲＢ、ナイトレートおよび他の薬物が、これら処置のダミー指標変数を包含することにより、本出願人らのマーカーに影響を及ぼし得ることを考慮に入れる。モデルの弁別は、総合Ｃ指数により評価され、ブートストラップ方法により検証され、予見されるイベントの範囲にわたり予見および観察される再発不整脈の間の関係性を調べることにより適合させる。比例ハザード仮定は、様々な方法によりチェックされる（対数−対数プロットの検討、ショーンフェルド（Schoenfeld）残渣の検定、各独立変数および時間の間の時間依存性相互作用を表す項の包含）。結果は、ハザード比およびその関連する９５％信頼区間として報告される。このハザード比の有意性は、尤度比検定により検定される。仮説が真である場合、療法は、ＡＦまたはＡＦｌｕｔ再発のハザード比を低下させ、酸化ストレスのマーカーを低下させる筈である。３０日目に酸化ストレスを減少させる介入能力の二次エンドポイントは、対応ｔ検定および共変数を調整するための複数の回帰技法により解析される。
【０３７７】
総合的な、調整されたＲ２は、適合度の尺度として解釈される。問題となっている独立変数の係数がゼロに等しい帰無仮説のため、ｐ＝０．０５の値を上回る変数を除外して、段階的後方手順を用いて精緻化されたモデルを用いる。項の線形性等、解析における仮定は、残渣検討および従属変数に関する独立変数の散布図を調査する。非線形性が検出される場合、変数の変換または非線形モデル適合を試み、そのモデル改善に関して項を評価する。変数分布の正規性は、正規確率プロットおよびシャピロ−ウイルク検定により検定される。回帰は、この点における侵害に相当に耐性があるが、変換は適宜調査される。等分散性は、残渣対予測値のプロットにより評価される。仮定が侵害されていると思われる場合、本出願人らは、非パラメトリック方法（例えば、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を検討することになる。
【０３７８】
本明細書に引用されている刊行物、特許出願および特許を包含するあらゆる参考文献は、これにより、あたかも各参考文献が参照により援用されていると個々にかつ特に示されており、本明細書においてその全体が表記されているのと同じ程度まで、参照により援用される。
【０３７９】
本発明を説明する文脈における（特に、次の特許請求の範囲の文脈における）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において他の事柄が示されていない限り、あるいは文脈により明らかに矛盾が生じない限り、単数形および複数形の両方を網羅するものと解釈されたい。用語「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」は、他に断りがなければ、オープンエンド（open-ended）な用語（即ち、「等が挙げられるがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されたい。
【０３８０】
本明細書における値の範囲の記述は、本明細書において他の事柄が示されていない限り、単に、範囲内に収まるそれぞれ別個の値および各エンドポイントを個々に指し示す手短な方法としての役割を目的とし、それぞれ別個の値およびエンドポイントは、本明細書に個々に記述されているかの如く本明細書に組み込まれる。
【０３８１】
本明細書に記載されているあらゆる方法は、本明細書において他の事柄が示されていない限り、あるいは文脈により明らかに矛盾する他の事柄が生じない限り、任意の適した順序で行うことができる。本明細書に提供されているありとあらゆる具体例または例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、単に本発明に十分に光を当てることを目的とし、他に主張されていない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の請求されていない構成要素を本発明の実施に必要不可欠なものとして示すものと解釈するべきではない。
【０３８２】
本発明を実施するための発明者に公知の最良の形態等、本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載されている。当業者であれば、好ましい実施形態の変種は、先述の記載を読むことにより明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が、このような変種を適宜利用することを予想し、本発明者らは、本明細書に特に記載されている以外の仕方で本発明が実施されることを企図する。従って、本発明は、適用法により認められる通り、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記述されている対象物のあらゆる修正および均等物を包含する。その上、本明細書において他の事柄が示されていない限り、あるいは文脈により明らかに矛盾する他の事柄が生じない限り、そのあらゆる可能な変種における上述の構成要素のいかなる組み合わせも本発明により網羅される。
【図１】
2014508514.tif 000060
【図２】
2014508514.tif 000061
【図３】
2014508514.tif 000062
【図４Ａ】
2014508514.tif 000063
【図４Ｂ】
2014508514.tif 000064
【図４Ｃ】
2014508514.tif 000065
【図４Ｄ】
2014508514.tif 000066
【図４Ｅ】
2014508514.tif 000067
【図８】
2014508514.tif 000068
【図９】
2014508514.tif 000069
【図１３−１】
2014508514.tif 000070
【図１３−２】
2014508514.tif 000071
【図１４】
2014508514.tif 000072
【図１５】
2014508514.tif 000073
【図１６】
2014508514.tif 000074
【図２１】
2014508514.tif 000075
【図２８】
2014508514.tif 000076
【図２９】
2014508514.tif 000077
【図３２】
2014508514.tif 000078
【図３４】
2014508514.tif 000079
【図５】
2014508514.tif 000080
【図６】
2014508514.tif 000081
【図７】
2014508514.tif 000082
【図１０】
2014508514.tif 000083
【図１１】
2014508514.tif 000084
【図１２】
2014508514.tif 000085
【図１７】
2014508514.tif 000086
【図１８】
2014508514.tif 000087
【図１９】
2014508514.tif 000088
【図２０】
2014508514.tif 000089
【図２２−１】
2014508514.tif 000090
【図２２−２】
2014508514.tif 000091
【図２３】
2014508514.tif 000092
【図２４】
2014508514.tif 000093
【図２５】
2014508514.tif 000094
【図２６】
2014508514.tif 000095
【図２７】
2014508514.tif 000096
【図３０】
2014508514.tif 000097
【図３１】
2014508514.tif 000098
【図３３】
2014508514.tif 000099
【配列表】
2014508514000001.app
【国際調査報告】
2014508514.tif 000100
2014508514.tif 000101
2014508514.tif 000102