(57)【要約】ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するための増幅プライマー、配列決定プライマー、スクリーニングのためのキット、およびスクリーニング法を開示する。そのスクリーニング法には、ＤＮＡの試料をＳＬＣ６Ａ８を有するＤＮＡの領域を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応増幅プライマーで処理して第１、第２、および第３増幅産物を生成し、その第１、第２、および第３増幅産物を配列決定プライマー対を用いて配列決定してその試料中のＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列を提供し、そしてＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列をＳＬＣ６Ａ８の参照ＤＮＡ配列と比較することが含まれる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するためのスクリーニング法であって、該方法が以下の工程：
（ａ）増幅条件下でヒトからのゲノムＤＮＡの試料をＳＬＣ６Ａ８を含むヒトゲノムＤＮＡの複数の領域を増幅するための複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プライマー対を用いて処理し、ここで：
第１の増幅プライマーの対がＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅し、
第２の増幅プライマーの対がＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅し、そして
第３の増幅プライマーの対がＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅し、
前記の処理がＳＬＣ６Ａ８の第１領域を含有する第１増幅産物、ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を含有する第２増幅産物、およびＳＬＣ６Ａ８の第３領域を含有する第３増幅産物を生成し、
（ｂ）該第１増幅産物を配列決定プライマー対の第１セットを用いて配列決定し、該第２増幅産物を配列決定プライマー対の第２セットを用いて配列決定し、そして該第３増幅産物を配列決定プライマー対の第３セットを用いて配列決定し、ここで該第１、第２および第３増幅産物からの配列が整列して該試料中のＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列を提供し、そして
（ｃ）該ＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列をＳＬＣ６Ａ８の参照ＤＮＡ配列と比較し、それにより前記の変異を同定する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
第１の増幅プライマーの対がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の増幅プライマーの対がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第３の増幅プライマーの対がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＳＬＣ６Ａ８の第１領域がエキソン１を含み、ＳＬＣ６Ａ８の第２領域がエキソン２〜４を含み、ＳＬＣ６Ａ８の第３領域がエキソン４〜１３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１領域がＳＬＣ６Ａ８のヌクレオチド位置１−２５〜ｃ．２６２＋２５を含有し、第２領域がＳＬＣ６Ａ８のヌクレオチド位置ｃ．２６３−２５〜ｃ．７７７＋２５を含有し、そして第３領域がＳＬＣ６Ａ８のヌクレオチド位置ｃ．６４５−２５〜ｃ．１９０８＋２５を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
配列決定プライマー対の第１セットがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列決定プライマー対の第２セットがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
配列決定プライマー対の第３セットがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
試料を対象の血液から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
さらに対象におけるクレアチントランスポータータンパク質の機能を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
評価することがＫｍおよびＶｍａｘを含むクレアチントランスポーターの速度論を決定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
評価することが対象からの生物学的試料に対してクレアチントランスポーターアッセイを実施することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列がクレアチントランスポーター欠損症の診断を示す少なくとも１個の変異を含む場合、該方法がさらに以下の工程：
対象におけるクレアチントランスポータータンパク質の機能を評価し；そして
該クレアチントランスポータータンパク質の機能をクレアチントランスポーター欠損症の診断を示す少なくとも１個の変異と関連付ける；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子の第１領域、第２領域、および第３領域を選択的に増幅するための増幅プライマー対のセットであって、該セットが以下：
ＳＬＣ６Ａ８の第１領域を選択的に増幅するための第１の増幅プライマーの対、該第１の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む；
ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を選択的に増幅するための第２の増幅プライマーの対、該第２の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む；ならびに
ＳＬＣ６Ａ８の第３領域を選択的に増幅するための第３の増幅プライマーの対、該第３の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む；
を含む、前記増幅プライマー対のセット。
【請求項１６】
以下：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む配列決定プライマー対の第１セット；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を含む配列決定プライマー対の第２セット；ならびに
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む配列決定プライマー対の第３セット；
を含む、配列決定プライマー対のセット。
【請求項１７】
対象をＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異に関してスクリーニングするためのキットであって、該キットが以下：
以下を含む、増幅プライマー対のセット：
ＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅して第１増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む第１の増幅プライマーの対；
ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅して第２増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む第２の増幅プライマーの対；ならびに
ＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅して第３増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む第３の増幅プライマーの対；ならびに
該第１、第２、および第３増幅産物を配列決定するための配列決定プライマー対のセット、ここで該配列決定プライマー対のセットは以下を含む：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む配列決定プライマー対の第１セット；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を含む配列決定プライマー対の第２セット；ならびに
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む配列決定プライマー対の第３セット；
を含む、前記キット。
【請求項１８】
第１、第２および第３の増幅プライマーの対が前記の増幅条件下で他の既知の遺伝子に実質的にアニーリングしない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
複数の増幅プライマー対が実質的に類似の増幅条件下で複数の領域を増幅する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
方法が多数の試料を同時に高スループットスクリーニングするのに適している、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２０１１年５月２６日に出願された米国仮出願一連番号61/490,192に対する35 U.S.C. §119の下での優先権を主張し、その内容をそのまま本明細書に援用する。
本開示はプライマー、キット、およびスクリーニング法に関し、より具体的にはＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するための増幅および配列決定プライマー、スクリーニングのためのキット、ならびにスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近米国において、および世界中で、自閉症スペクトラム障害の診断が増加してきている。これはいくらかはよりよい診断検査、より多くの公衆認識、およびこのスペクトル中に存在する疾患のいくつかに関する有効な処置の開発によるものである。最近の概算は、１０，０００人あたり６０人もの子供が自閉症の症状を示すことを示唆している。Ｘ連鎖精神遅滞（以下“ＸＬＭＲ”）は問題がＸ染色体内にあるこれらの障害の一群を定義し；既知の遺伝子において広い範囲の変異が存在し、より多くの変異が毎年世界中で発見されている。欧米諸国において、精神遅滞は一般人口の２〜３％を冒している。これらの症例のほとんどに関して、原因はまだ決定されていないが、女性より多い男性の有病率（おおよそ７０％が男性）はＸＬＭＲのこの患者集団への著しい寄与を示している。ＸＬＭＲは全ての精神遅滞（以下“ＭＲ”）の５〜１２％を占めていると考えられている。ＸＬＭＲのおおよそ２．１％はＳＬＣ６Ａ８遺伝子中の変異までたどる（ｔｒａｃｅｄ）ことができ、それはクレアチントランスポータータンパク質をコードしている。
【０００３】
クレアチントランスポーター欠損症（例えば“ＣＴＤ”）は、２００１年にシンシナティ小児病院医療センターにおける患者の群に基づいて最初に記述されたクレアチン代謝のＸ連鎖性先天異常である。この疾患の臨床的特徴には、精神遅滞、表出性言語障害、部分てんかんおよび自閉的特徴が含まれる。これらの症状の重症度は療法計画の早期の実施により低減することができ、早期診断を必須のものにしている。その子供が診断前により年を取っているほど、発達遅延に療法計画により対処することがより困難である。
【０００４】
ＳＬＣ６Ａ８遺伝子は神経伝達物質の輸送を担う溶質キャリヤーファミリーのメンバーである。Ｘｑ２８上に位置するＳＬＣ６Ａ８遺伝子はおおよそ８．４ｋｂに及び、１３個のエキソンからなる。コードされるタンパク質は６３５アミノ酸であり、７０ｋＤａの予想分子量を有する。ＳＬＣ６Ａ８遺伝子は脳、骨格および平滑筋、ならびに腎臓で発現していると考えられている。そのトランスポーターの別の形態が存在し、それは精巣でのみ発現していると考えられている。
【０００５】
クレアチン輸送に影響を及ぼし、結果としてクレアチントランスポーター欠損症をもたらすＳＬＣ６Ａ８遺伝子中の数多くの変異が同定されてきた。従って、クレアチントランスポーター欠損症を引き起こす遺伝子内の変異の同定は、ＳＬＣ６Ａ８遺伝子のコード領域の全ＤＮＡ配列の分析を必要とする。ＳＬＣ６Ａ８遺伝子は溶質キャリヤーファミリーの他のメンバーならびに仮定タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えばＸＰ＿００２３４３５１２）をコードする遺伝子と高度に相同性であり、選択的に増幅および配列決定するのを困難にしている。例えば、その仮定タンパク質はクレアチントランスポーターと約９５％の相同性を共有している。この相同性のため、ＳＬＣ６Ａ８遺伝子中の変異の同定は典型的にはＳＬＣ６Ａ８遺伝子の短い非相同性の区間に向けられたプライマーを用いる多くのより小さい区間におけるその遺伝子の配列決定を必要としてきた。この方法での遺伝子全体の配列決定は現在時間がかかり、面倒で非効率的である。従って、ＳＬＣ６Ａ８遺伝子を変異に関して分析する効率を高めて、ならびにそのための時間を減少させてこの障害に関するスクリーニングの利用可能性を高めるためのプライマーおよび方法が必要とされている。
【０００６】
現在、クレアチントランスポーター欠損症において見られる症状のスペクトルを示す子供を診断する際、まずその子供をミトコンドリア電子伝達系機能障害に関して調べる。何も見つからなかった場合、機能および遺伝子検査のために十分な組織を集めるために皮膚生検（またはますます（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ）、採血）を実施する。得られる皮膚の量は遺伝子、機能、および生化学的分析のために十分ではなく、対象に対する痛みを伴う手順を必要とする。傷害性がはるかに低い方法で試料を収集できること、および遺伝子、機能、および生化学的分析のために十分な組織を収集できることが非常に望ましいであろう。
【０００７】
一度組織が得られたら、それを遺伝子検査のためにＣＬＩＡの承認を有する認定された診断実験所に送る。ＳＬＣ６Ａ８のコード領域全体のＤＮＡに基づく配列分析を実施する実験所は現在世界中に６個しか存在せず、その３個のみが米国にあり、そのいずれもクレアチントランスポーター欠損症のレベルを決定するためのクレアチントランスポーター動態検査を実施していない。このプロセスは、時間がかかり、そして時に傷害性のプロセスであり、早期診断を受けた対象の転帰を向上させることが示されている早期の介入計画の実施のために用いることができたであろう貴重な時間が失われる。
【０００８】
この欠損症に関する年間の診断数は、その検査を実施することができる少数しかない実験所の能力を超えて増大しており、現在用いられている診断法は多数の新生児のスクリーニングを処理するために効率的にスケールアップすることができない。この必要性は、米国臨床遺伝学会が検証されたスクリーニングがないため新生児をその障害に関してスクリーニングすることを推奨しないことを決定したため、特に目立っている。従って、多数の対象をクレアチントランスポーター欠損症に関してスクリーニングするための方法および組成物が必要とされている。
【０００９】
診断能力を有する実験所においてさえも、診断所見に基づいて療法計画を調整する試みは存在しない。簡潔には、科学的かつ専門的能力、および包括的クレアチントランスポーター欠損症スクリーニングを行なうことができるクレアチントランスポーター患者集団、および／または診断所見に基づいてその療法に対してなされたその後の調整を有する機能的プロフィールを有する実験所は、現在米国に存在しない。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、ヒトにおけるＳＬＣ６Ａ８遺伝子の第１、第２および第３領域を選択的に増幅して第１、第２および第３増幅産物を形成する新規の増幅プライマーの発見に基づく。本開示は、その第１、第２および第３増幅産物を配列決定する新規の配列決定プライマー対の発見にも基づく。従って、１態様において、対象においてＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するためのスクリーニング法が開示される。その方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）増幅条件下でヒトからのゲノムＤＮＡの試料をＳＬＣ６Ａ８を含むヒトゲノムＤＮＡの複数の領域を増幅するための複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プライマー対を用いて処理し、前記の処理がＳＬＣ６Ａ８の第１領域を含有する第１増幅産物、ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を含有する第２増幅産物、およびＳＬＣ６Ａ８の第３領域を含有する第３増幅産物を生成し；（ｂ）その第１増幅産物を配列決定プライマー対の第１セットを用いて配列決定し、その第２増幅産物を配列決定プライマー対の第２セットを用いて配列決定し、そしてその第３増幅産物を配列決定プライマー対の第３セットを用いて配列決定し、ここでその第１、第２および第３増幅産物からの配列が整列してその試料中のＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列を提供し；そして（ｃ）そのＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列をＳＬＣ６Ａ８の参照ＤＮＡ配列と比較し、それにより前記の変異を同定する。第１の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅する。第２の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅する。第３の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅する。
【００１１】
別の態様において、ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子の第１領域、第２領域、および第３領域を選択的に増幅するための増幅プライマー対のセットが開示される。その増幅プライマーのセットには、ＳＬＣ６Ａ８の第１領域を選択的に増幅するための第１の増幅プライマーの対（その第１の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する）；ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を選択的に増幅するための第２の増幅プライマーの対（その第２の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する）；およびＳＬＣ６Ａ８の第３領域を選択的に増幅するための第３の増幅プライマーの対（その第３の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有する）が含まれる。
【００１２】
さらに別の態様において、配列決定プライマー対のセットが開示される。その配列決定プライマー対のセットには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する配列決定プライマー対の第１セット；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有する配列決定プライマー対の第２セット；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有する配列決定プライマー対の第３セットが含まれる。
【００１３】
さらになお別の態様において、対象をＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異に関してスクリーニングするためのキットが開示される。そのキットには、増幅プライマー対のセットおよび配列決定プライマー対のセットが含まれる。その増幅プライマー対には、ＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅して第１増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する第１の増幅プライマーの対；ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅して第２増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する第２の増幅プライマーの対；ならびにＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅して第３増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有する第３の増幅プライマーの対が含まれる。その配列決定プライマー対のセットは、その第１、第２、および第３増幅産物を配列決定するためのものである。その配列決定プライマー対のセットには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する配列決定プライマー対の第１セット；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有する配列決定プライマー対の第２セット；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有する配列決定プライマー対の第３セットが含まれる。
【００１４】
本明細書で記述される態様の追加の特徴および利点は続く詳細な記述で述べられると考えられ、部分的にはその記述から当業者に容易に明らかになり、または続く詳細な記述、特許請求の範囲、ならびに添付された図面を含め、本明細書で記述される態様を実施することにより認識されるであろう。
【００１５】
前記の一般的な記述および以下の詳細な記述は両方とも様々な態様を記述しており、特許請求される主題の性質および特徴を理解するための概要または枠組みを提供することを意図していることは理解されるべきである。添付の図面はその様々な態様のさらなる理解を提供するために含まれており、この明細書中に組み込まれ、その一部を構成する。その図面は本明細書で記述される様々な態様を図説しており、その記述と一緒に特許請求される主題の原理および運用を説明する役目を果たしている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は本開示の態様に従うＳＬＣ６Ａ８遺伝子増幅および配列決定計画の図示であり；
【図２】図２にはＳＬＣ６Ａ８遺伝子の図示および本開示の態様に従うその遺伝子の断片の増幅産物の代表的な顕微鏡写真が含まれ；そして
【図３】図３は本開示の態様に従う参照ＤＮＡ配列と比較したＳＬＣ６Ａ８遺伝子の配列決定された部分のスクリーンショットである。
【００１７】
当業者は、その図中の要素は単純さおよび明確さのために図説されており、必ずしも一定の縮尺で描かれていないことを理解している。例えば、その図中の要素のいくつかの寸法は、本発明の様々な態様の理解を向上させるのを助けるために他の要素と比較して誇張されている可能性があり、同様に一般的に用いられる（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）部分が取り除かれている可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の用語が本出願において用いられる：
本明細書で用いられる際、用語“スクリーニング”および“スクリーニングする”は、それによりＳＬＣ６Ａ８遺伝子（すなわちＳＬＣ６Ａ８）中の変異の存在が決定される手順を指す。１つの特定の例において、スクリーニングおよびスクリーニングするは、それによりヒトゲノムＤＮＡ中のＳＬＣ６Ａ８中の変異の存在が決定される手順を指す。
【００１９】
本明細書で用いられる際、用語“変異”は、ＤＮＡ配列における、または染色体構造における、欠陥のない正常または野生型の配列または染色体と考えられる配列または染色体構造からの変化を指す。ＤＮＡ配列の文脈において、変異の例には点変異、挿入、および欠失が含まれる。そのような変異は、例えば遺伝子産物の機能における低下、遺伝子産物における機能の消失、および／または遺伝子産物における新規の機能のような機能的作用を有する可能性がある。
【００２０】
本明細書で用いられる際、用語“処理すること”は、試料に対して化学的および／または生物学的プロセスを施すことを指す。１つの特定の例において、処理することはゲノムＤＮＡの試料に対してポリメラーゼ連鎖反応を施すことを指す。
【００２１】
本明細書で用いられる際、用語“増幅条件”は、その下でＤＮＡの領域（単数および／または複数）を変性、アニーリング、およびＤＮＡ合成のサイクルにより増幅することができる条件を指す。１つの特定の例において、増幅条件という用語は、その下で：１）ＳＬＣ６Ａ８を有する二本鎖ＤＮＡの試料が変性して一本鎖ＤＮＡを形成し；２）第１、第２、および／または第３の増幅プライマーの対がその一本鎖ＤＮＡに、特にＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および／または第３領域にアニーリングし；そして３）そのプライマーがＤＮＡ合成により伸長されてその一本鎖ＤＮＡに相補的な新しいＤＮＡ鎖を形成する条件を指す。増幅条件下で実施されるそのような方法は、ＳＬＣ６Ａ８遺伝子の第１、第２、および／または第３領域を増幅して第１、第２、および／または第３増幅産物を生成する。
【００２２】
本明細書で用いられる際、用語“ゲノムＤＮＡ”は、ある種の完全な遺伝的構成要素を保持しているＤＮＡの集団を指す。１つの特定の例において、ゲノムＤＮＡはヒトの完全な遺伝的構成要素を保持しているＤＮＡの集団を指す。
【００２３】
本明細書で用いられる際、用語“領域”は、ＤＮＡ中の連続したヌクレオチドの配列を指す。ＳＬＣ６Ａ８に関して、領域という用語はＳＬＣ６Ａ８の連続したヌクレオチドの配列を指す。１つの特定の例において、ＳＬＣ６Ａ８には第１、第２、および第３領域が含まれる。
【００２４】
本明細書で用いられる際、用語“増幅産物”は、増幅条件下で実施されたポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの領域を指す。例えば、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および／または第３領域を増幅する文脈において、増幅産物は、変性、第１、第２、および／または第３のプライマーの対へのアニーリング、ならびにＤＮＡ合成の繰り返されるサイクルにより増幅されたＤＮＡの領域を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる際、用語“配列決定”は、ヌクレオチドがＤＮＡ配列中に現れる順序を決定するための手順を指す。例えば、ＳＬＣ６Ａ８に関して、配列決定という用語はヌクレオチドがＳＬＣ６Ａ８および／またはＳＬＣ６Ａ８の領域中に現れる順序を決定するための手順を指す。配列決定技法の例にはサンガー法のようなチェーンターミネーター法が含まれるが、それに限定されるべきではない。
【００２６】
本明細書で用いられる際、用語“整列（ａｌｉｇｎ）”は、ヌクレオチドがＤＮＡの鎖（単数または複数）中で一列に並ぶ（ｌｉｎｅ  ｕｐ）順序を指す。例えば、１つの特定の態様において、整列という用語はＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および／または第３領域から増幅された第１、第２、および／または第３増幅産物中のヌクレオチドの順序を一列に並べることを指す。１態様において、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および／または第３領域は、第１、第２、および第３増幅産物のヌクレオチド配列がその５’および／または３’末端において重複するように重複している。従って、この態様において、その第１、第２、および第３増幅産物の配列は、ＳＬＣ６Ａ８遺伝子のＤＮＡ配列を提供するように整列させることができる。
【００２７】
本明細書で用いられる際、用語“比較すること”は、それによりＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を参照ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序に対して調べて変異を同定することができる手順を指す。そのような手順を実施するために用いられるツールの例には、生物情報学的ツール、例えば国立衛生研究所から入手可能な基本的局所的アラインメント検索ツール（すなわちＢＬＡＳＴ）が含まれるが、それに限定されるべきではない。
【００２８】
本明細書で用いられる際、用語“ＤＮＡ配列”は、それからＤＮＡの分子が構成されるヌクレオチドの順序付け（ｏｒｄｅｒｉｎｇ）を指す。
本明細書で用いられる際、用語“参照ＤＮＡ配列”は、変異を含有しないＤＮＡ配列および／または既知の変異（単数または複数）を含有するＤＮＡ配列を指す。
【００２９】
本明細書で用いられる際、用語“評価すること”は、それにより試料中のタンパク質の機能が決定される手順を指す。１つの特定の例において、評価することという用語は、それにより対象中のクレアチントランスポータータンパク質の機能が決定される手順を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる際、用語“クレアチントランスポーターアッセイ”は、それによりクレアチントランスポータータンパク質の触媒作用が決定される手順を指す。
本明細書で用いられる際、用語“クレアチントランスポーター欠損症”は、クレアチン代謝のＸ連鎖性先天異常を指す。１態様において、クレアチントランスポーター欠損症はＳＬＣ６Ａ８遺伝子中の変異により引き起こされる。
【００３１】
本明細書で用いられる際、用語“関連付けること”は、それによりクレアチントランスポータータンパク質の機能およびクレアチントランスポータータンパク質の変異の間の関係が決定される手順を指す。
【００３２】
本明細書で用いられる際、用語“選択的に”は、ＳＬＣ６Ａ８の領域に、および／またはＳＬＣ６Ａ８の増幅産物にのみアニーリングする増幅プライマーおよび／または配列決定プライマーを指す。言い換えれば、選択的にという用語は他の既知の遺伝子および／または増幅産物に実質的にアニーリングしない増幅および／または配列決定プライマーを指す。
【００３３】
本明細書で用いられる際、用語“高スループットスクリーニング”は、それにより比較的多数の試料におけるＳＬＣ６Ａ８遺伝子（すなわちＳＬＣ６Ａ８）中の変異の存在が決定されるスクリーニング法を指す。１つの特定の例において、高スループットスクリーニングという用語は、それにより比較的多数の試料においてヒトゲノムＤＮＡ中のＳＬＣ６Ａ８中の変異の存在が決定される手順を指す。
【００３４】
本開示の態様は、ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するためのスクリーニング法、増幅プライマー対のセット、配列決定プライマー対のセット、および対象をクレアチントランスポーター遺伝子変異に関してスクリーニングするためのキットに関する。ここで、スクリーニング法の態様を詳細に参照する。
【００３５】
Ｉ．スクリーニング法
１態様において、対象においてＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するためのスクリーニング法が提供される。そのスクリーニング法には以下の工程が含まれる：（ａ）ヒトからのゲノムＤＮＡの試料を、増幅条件下で、ＳＬＣ６Ａ８を含むヒトゲノムＤＮＡの複数の領域を増幅するための複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プライマー対を用いて処理し、前記の処理がＳＬＣ６Ａ８の第１領域を含有する第１増幅産物、ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を含有する第２増幅産物、およびＳＬＣ６Ａ８の第３領域を含有する第３増幅産物を生成し；（ｂ）その第１増幅産物を配列決定プライマー対の第１セットを用いて配列決定し、その第２増幅産物を配列決定プライマー対の第２セットを用いて配列決定し、そしてその第３増幅産物を配列決定プライマー対の第３セットを用いて配列決定し、ここでその第１、第２および第３増幅産物からの配列が整列してその試料中のＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列を提供し；そして（ｃ）そのＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列をＳＬＣ６Ａ８の参照ＤＮＡ配列と比較し、それにより前記の変異を同定する。第１の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅する。第２の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅する。第３の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅する。
【００３６】
一態様において、その方法には、ヒトからのゲノムＤＮＡの試料を、増幅条件下で、ＳＬＣ６Ａ８を有するヒトゲノムＤＮＡの複数の領域を増幅するための複数のポリメラーゼ連鎖反応（すなわちＰＣＲ）増幅プライマー対を用いて処理することが含まれる。その複数のＰＣＲ増幅プライマー対には、ＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅する第１の増幅プライマーの対、ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅する第２の増幅プライマーの対、およびＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅する第３の増幅プライマーの対が含まれる。そのスクリーニング法は、ＳＬＣ６Ａ８を有するヒトゲノムＤＮＡを第１、第２および第３の増幅プライマーの対を用いて３つの領域で増幅する。
【００３７】
図１を参照して、第１、第２および第３の増幅プライマーの対に関して、第１の増幅プライマーの対を用いて短鎖ポリメラーゼ連鎖反応によりＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅することができる。第１の増幅プライマーの対には、下記の表Ｉにおいて示されるように、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が含まれる。
【００３８】
【表１】
2014515269.tif 000003
【００３９】
第２の増幅プライマーの対を用いて長鎖ポリメラーゼ連鎖反応によりＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅することができる。第２の増幅プライマーの対には、下記の表ＩＩにおいて示されるように、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）が含まれる。
【００４０】
【表２】
2014515269.tif 000004
【００４１】
第３の増幅プライマーの対を用いて長鎖ポリメラーゼ連鎖反応によりＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅することができる。第３の増幅プライマーの対には、下記の表ＩＩＩにおいて示されるように、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）が含まれる。
【００４２】
【表３】
2014515269.tif 000005
【００４３】
１態様において、第１の増幅プライマーの対、第２の増幅プライマーの対、および第３の増幅プライマーの対はＳＬＣ６Ａ８に選択的にアニーリングする。言い換えれば、第１の増幅プライマーの対、第２の増幅プライマーの対、および第３の増幅プライマーの対はその増幅条件下で他の既知の遺伝子に実質的にアニーリングしない。
【００４４】
さらに図１を参照して、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および第３領域に関して、ＳＬＣ６Ａ８の第１領域にはエキソン１が含まれる。ＳＬＣ６Ａ８の第２領域にはエキソン２、エキソン３、およびエキソン４が含まれる。ＳＬＣ６Ａ８の第３領域にはエキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、およびエキソン１３が含まれる。第１領域には４２２塩基対が含まれ、第２領域には２１３１塩基対が含まれ、そして第３領域には４７０２塩基対が含まれる。第１領域にはＳＬＣ６Ａ８のｃ．１−２５〜ｃ．２６２＋２５のヌクレオチド位置が含まれる。第２領域にはＳＬＣ６Ａ８のｃ．２６３−２５〜ｃ．７７７＋２５のヌクレオチド位置が含まれる。第３領域にはＳＬＣ６Ａ８のｃ．６４５−２５〜ｃ．１９０８＋２５のヌクレオチド位置が含まれる。略語“ｃ”は本明細書においてＳＬＣ６Ａ８のコード配列を指して用いられる。ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および第３領域はＳＬＣ６Ａ８のコード領域の全部または実質的に全部を構成する。
【００４５】
一態様において、第１、第２および第３の増幅プライマーの対は、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および第３領域を増幅する。増幅条件は、その第１、第２および第３領域の増幅をＤＮＡの変性、プライマーのそのＤＮＡへのアニーリング、およびＤＮＡの合成のサイクルにより実施することができるような条件である。より詳細には、増幅条件はその下で：１）ＳＬＣ６Ａ８を有する二本鎖ＤＮＡの試料が変性して一本鎖ＤＮＡを形成することができ；２）第１、第２、および／または第３の増幅プライマーの対がその一本鎖ＤＮＡに、特にＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および／または第３領域にアニーリングすることができ；そして３）そのプライマーがＤＮＡ合成により伸長されてその一本鎖ＤＮＡに相補的な新しいＤＮＡ鎖を形成することができる条件である。１態様において、その複数の増幅プライマーの対はその複数の領域を実質的に類似の増幅条件下で増幅する。
【００４６】
ＳＬＣ６Ａ８を有する二本鎖ＤＮＡの変性に関して、その二本鎖ＤＮＡを、その二本鎖ＤＮＡが融解して一本鎖ＤＮＡを形成するであろうように、変性温度まで加熱する。１つの特定の例において、その変性温度は約９４℃から約９８℃までである。
【００４７】
第１、第２、および第３の増幅プライマーの対の一本鎖ＤＮＡへの、特にＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および第３領域へのアニーリングに関して、適切なアニーリング条件は以下の条件が含まれる様々なパラメーターに依存する：温度、イオン強度、配列の長さ、相補性、およびグアニン：シトシン塩基対の含有率（以下“Ｇ：Ｃ含有率”）。温度に関して、相補的核酸配列の環境において温度を下げることはアニーリングを促進する。イオン強度に関して、イオン強度または塩濃度は融解温度に影響を及ぼす可能性があり、ここで小さい陽イオンはＤＮＡのホスホジエステル主鎖上の負電荷を打ち消すことにより二本鎖の形成を安定化する可能性がある。最後に、Ｇ：Ｃ含有率に関して、高いＧ：Ｃ含有率および増大した配列の長さは増大した水素結合により二本鎖の形成を安定化する可能性がある。従って、高いＧ：Ｃ含有率およびより長い配列の長さは融解温度を高めることによりアニーリング条件に影響を及ぼす可能性がある。
【００４８】
１つの特定の例において、第１のプライマーの対およびＳＬＣ６Ａ８の第１領域に関するアニーリング温度は約６０℃から約６５℃まで、または約６２℃である。別の特定の例において、第２のプライマーの対およびＳＬＣ６Ａ８の第２領域に関するアニーリング温度は約５８℃から約６８℃までである。さらに別の例において、第３のプライマーの対およびＳＬＣ６Ａ８の第３領域に関するアニーリング温度は約５８℃から約６８℃までである。
【００４９】
ＤＮＡ合成によりプライマーを伸長して一本鎖ＤＮＡに相補的な新しいＤＮＡ鎖を形成することに関して、第１、第２および第３の増幅プライマーの対に加えて、その合成はＳＬＣ６Ａ８を有するゲノムＤＮＡの試料、デオキシヌクレオシド三リン酸、緩衝溶液、二価陽イオン、一価陽イオン、およびＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）を必要とする。１つの特定の例において、その合成はＳＬＣ６Ａ８を有するヒトからのゲノムＤＮＡの試料、デオキシヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼを必要とする。
【００５０】
図１を再度参照して、前に論じたように、ＳＬＣ６Ａ８を有するゲノムＤＮＡの試料を増幅条件下で処理することは、第１増幅産物（すなわちＰ１／アンプリコン１）、第２増幅産物（すなわちＰ２／アンプリコン２）、および第３増幅産物（すなわちＰ３／アンプリコン３）を生成する。１態様において、その第１増幅産物、第２増幅産物、および第３増幅産物は、その増幅産物の配列の整列がＳＬＣ６Ａ８またはその一部の連続した配列を提供するように、５’および／または３’末端において重複している。
【００５１】
その方法には、その第１増幅産物、第２増幅産物、および第３増幅産物を配列決定することも含まれる。その第１、第２、および第３増幅産物はそれぞれ配列決定プライマー対の第１、第２および第３セットを用いて配列決定される。より詳細には、第１増幅産物は配列決定プライマー対の第１セットを用いて配列決定することができる。その配列決定プライマー対の第１セットには、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が含まれる。その配列決定プライマー対の第１セットは、あらゆるエキソン、イントロン、プロモーター、およびエンハンサーを含め、第１領域のＤＮＡ配列全体を配列決定することができる。特にＳＬＣ６Ａ８の第１領域に関して、その配列決定プライマーはエキソン１が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができる。
【００５２】
第２増幅産物は配列決定プライマー対の第２セットを用いて配列決定することができる。その配列決定プライマー対の第２セットには、下記の表ＩＶで示されるように、以下の対が含まれる：センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；ならびにセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。その配列決定プライマー対の第２セットは、あらゆるエキソン、イントロン、プロモーター、およびエンハンサーを含め、第２領域のＤＮＡ配列全体を配列決定することができる。特にＳＬＣ６Ａ８の第２領域に関して、その配列決定プライマーはエキソン２、エキソン３、およびエキソン４が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができる。より具体的には、下記の表ＩＶで示されるように、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）はエキソン２が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）はエキソン３が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；そしてセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）はエキソン４が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができる。
【００５３】
【表４】
2014515269.tif 000006
【００５４】
第３増幅産物は配列決定プライマー対の第３セットを用いて配列決定することができる。その配列決定プライマー対の第３セットには、下記の表Ｖで示されるように、以下の対が含まれる：センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）；ならびにセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）。
【００５５】
その配列決定プライマー対の第３セットは、あらゆるエキソン、イントロン、プロモーター、およびエンハンサーを含め、第３領域のＤＮＡ配列全体を配列決定することができる。特にＳＬＣ６Ａ８の第３領域に関して、その配列決定プライマーはエキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、およびエキソン１３が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができる。より具体的には、下記の表Ｖで示されるように、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）はエキソン５〜６が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）はエキソン５〜６が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）はエキソン５および５〜７が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）はエキソン５〜７が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）はエキソン５が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）はエキソン６〜８が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）はエキソン６〜７が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）はエキソン８、８〜９、および８〜１０が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）はエキソン８〜９、８〜１０、および９〜１０が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）はエキソン８が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）はエキソン８〜９が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）はエキソン９〜１０が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）はエキソン１１が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）はエキソン１１が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）はエキソン１２が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）はエキソン１２が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）はエキソン１３が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができ；アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）はエキソン１３が含まれるそのＤＮＡの一部を配列決定することができる。
【００５６】
【表５】
2014515269.tif 000007
【００５７】
配列決定は当業者に既知の方法に従って実施されてよい。１つの特定の例において、第１増幅産物、第２増幅産物、および第３増幅産物の配列決定は、サンガー法のようなチェーンターミネーター法により実施されてよい。第１、第２、および第３増幅産物の配列が整列してＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列を提供する。より詳細には、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および第３領域の増幅および配列決定により、全てのエキソン、イントロン、プロモーター、およびエンハンサーを含め、ＳＬＣ６Ａ８のコード領域の全部または実質的に全部を配列決定することができる。結果として、ＳＬＣ６Ａ８のコード領域のあらゆる領域中の変異を同定することができる。従って、本明細書で論じられるスクリーニング法は、以前は未知であった新規の変異の同定を可能にする。
【００５８】
当業者は、個々の領域および／またはエキソンを前に論じられた配列決定プライマー対の第１、第２、および第３セットを用いることにより配列決定することができることを理解するであろう。例えば、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および第３領域のそれぞれを配列決定する代わりに、単一の領域または領域の亜集団を表Ｖにおいて列挙された配列決定プライマー対を用いて配列決定することができる。さらなる例として、第３断片中のエキソン５〜１３のそれぞれを配列決定する代わりとして、単一のエキソンまたはエキソンの亜集団を表Ｖにおいて列挙された配列決定プライマー対を用いて配列決定することができる。そのような方法は、関連する変異がＳＬＣ６Ａ８の１つの領域および／またはエキソンの亜集団においてのみ起こっている場合に適用できる可能性がある。
【００５９】
別の態様において、そのスクリーニング法にはＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列をＳＬＣ６Ａ８の参照ＤＮＡ配列と比較して変異を同定することが含まれる。その参照ＤＮＡ配列には、アクセス番号ＮＧ＿０１２０１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）として同定されるＳＬＣ６Ａ８遺伝子のＤＮＡ配列が含まれ得る。そのようなＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）は、欠陥のないＳＬＣ６Ａ８の正常な、または野生型の形態に相当する。加えて、そのようなＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）にはコードおよび非コード領域の両方が含まれる。あるいは、その参照ＤＮＡ配列には変異を含有しないＤＮＡ配列が含まれてよい。そのようなＤＮＡ配列は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20717164において、およびhttps://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/gene.php?gene=SLC6A8において見つけることができる。
【００６０】
別の態様において、その試料は対象の血液から、例えば簡単な採血により得られる。しかし、対象からのゲノムＤＮＡを含有するあらゆる生物学的試料を本明細書で記述される方法において用いることができるであろう。
【００６１】
１つの特定の態様において、ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および第３領域の増幅ならびに第１、第２および第３増幅産物の配列決定は別々に実施することができる。例えば、ＳＬＣ６Ａ８の第１領域の増幅および第１増幅産物の配列決定を第１容器中で実施することができ、ＳＬＣ６Ａ８の第２領域の増幅および第２増幅産物の配列決定を第２容器中で実施することができ、そしてＳＬＣ６Ａ８の第３領域の増幅および第３増幅の配列決定を第３容器中で実施することができる。
【００６２】
別の態様において、その方法にはさらにその対象においてクレアチントランスポータータンパク質の機能を評価することが含まれる。そのような評価には、それによりクレアチントランスポータータンパク質の触媒作用および／または活性が決定される手順が含まれてよい。例えば、そのような評価には、クレアチントランスポーターの速度論および／または細胞中のクレアチンの蓄積を決定することが含まれてよい。クレアチントランスポーターの速度論に関して、そのような分析には当業者に既知の手順によりＫｍおよび／またはＶｍａｘを決定することが含まれてよい。１つの特定の例において、そのような手順にはその対象からの生物学的試料に対してクレアチントランスポーターアッセイを実施することが含まれてよい。
【００６３】
クレアチントランスポータータンパク質の機能を対象からの生物学的試料において評価することができる。その生物学的試料は、クレアチントランスポータータンパク質を発現しているあらゆる細胞から得ることができる。１つの特定の態様において、その生物学的試料は最小限に侵襲的な技法により容易に得られる細胞からのものであってよい。そのような細胞の例には、リンパ球、末梢リンパ芽球、血球、および／または口腔（ｂｕｃｃａｌ）細胞が含まれる。加えて、その生物学的試料には、線維芽細胞が含まれる生検組織試料も含まれてよい。細胞を培養し、および／または前に論じられたアッセイにおいて直接用いて、クレアチントランスポータータンパク質を機能的に特性付けることができる。
【００６４】
本明細書で論じられた方法により決定されるようなＳＬＣ６Ａ８のＤＮＡ配列に少なくとも１個の変異が含まれる１態様において、その方法にはさらに、対象におけるそのクレアチントランスポータータンパク質の機能を評価し、そのクレアチントランスポータータンパク質の機能をその変異と関連付けることが含まれてよい。特定の態様において、関連付けられたその遺伝子の変異およびそのタンパク質の機能は、クレアチントランスポーター欠損症の診断を示している。そのような関連付けは、どのクレアチンおよび／またはクレアチン類似体が最適な処置の結果を提供し得るかのような処置計画を立てる上で臨床医を助けることができる。そのような関連付けは、特定の変異の潜在的な重要度の予測においても臨床医を助けることができる。例えば、いくつかの変異は結果として部分的に機能するトランスポーターをもたらす可能性があり、一方で他の変異は結果として完全にその遺伝子産物の消失をもたらす。クレアチントランスポータータンパク質の触媒作用および／または活性の関連付けは、臨床医にその欠損症をどれだけ積極的に処置するべきかへの洞察を与えることができる。
【００６５】
別の態様において、本明細書で論じられる方法は、多数の試料を同時におよび／または迅速に高スループットスクリーニングするのに適している。
ＩＩ．増幅プライマー対
ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異を同定するためのスクリーニング法の態様が詳細に記述されてきた。増幅プライマー対に向けられたさらなる態様がここで記述されるであろう。
【００６６】
１態様において、ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子の第１領域、第２領域、および第３領域を選択的に増幅するための増幅プライマー対のセットが開示される。その増幅プライマー対のセットにはＳＬＣ６Ａ８の第１領域を選択的に増幅するための第１の増幅プライマーの対が含まれ、その第１の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する。その増幅プライマー対のセットにはＳＬＣ６Ａ８の第２領域を選択的に増幅するための第２の増幅プライマーの対も含まれ、その第２の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する。その増幅プライマー対のセットにはＳＬＣ６Ａ８の第３領域を選択的に増幅するための第３の増幅プライマーの対も含まれ、その第３の対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有する。
【００６７】
ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子の第１領域、第２領域、および第３領域は、より前の節で論じられた通りである。加えて、その増幅プライマー対はより前の節で論じられたように用いることができる。
【００６８】
ＩＩＩ．配列決定プライマー対
増幅プライマー対の態様が詳細に記述されてきた。配列決定プライマー対に向けられたさらなる態様がここで記述されるであろう。
【００６９】
１態様において、配列決定プライマー対のセットが開示される。配列決定プライマー対のセットには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する配列決定プライマー対の第１セット；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有する配列決定プライマー対の第２セット；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有する配列決定プライマー対の第３セットが含まれる。
【００７０】
その配列決定プライマー対は、より前の節で論じられたように用いることができる。
ＩＶ．ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異に関するスクリーニングのためのキット
配列決定プライマー対の態様が詳細に記述されてきた。ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異に関するスクリーニングのためのキットに向けられた更なる態様がここで記述されるであろう。
【００７１】
１態様において、対象をＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子変異に関してスクリーニングするためのキットが開示される。そのキットには、増幅プライマー対のセットおよび配列決定プライマー対のセットが含まれる。その増幅プライマー対には、ＳＬＣ６Ａ８の第１領域を増幅して第１増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する第１の増幅プライマーの対；ＳＬＣ６Ａ８の第２領域を増幅して第２増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有する第２の増幅プライマーの対；ならびにＳＬＣ６Ａ８の第３領域を増幅して第３増幅産物を生成するためのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有する第３の増幅プライマーの対が含まれる。その配列決定プライマー対のセットは、その第１、第２および第３増幅産物を配列決定するためのものである。その配列決定プライマー対のセットには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有する配列決定プライマー対の第１セット；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有する配列決定プライマー対の第２セット；ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有する配列決定プライマー対の第３セットが含まれる。
【００７２】
ＳＬＣ６Ａ８クレアチントランスポーター遺伝子の第１領域、第２領域、および第３領域は、より前の節で論じられた通りである。加えて、その増幅プライマー対および配列決定プライマー対は前の節で論じられたように用いることができる。
【００７３】
そのキットには、その増幅プライマー対ならびに第１、第２、および第３増幅産物を配列決定するための配列決定プライマー対のセットの使用に関する手引きを提供するための説明書が含まれていてよい。例えば、そのキットにはその増幅プライマー対に関して用いるための増幅条件に関する説明書が含まれていてよく、表Ｖにおいて提供されるようなその配列決定プライマー対がＳＬＣ６Ａ８の特定の領域を配列決定する能力に関する説明書も含まれていてよい。その説明書は、より前の節で論じられたような、および／または前に論じられたようなスクリーニング法に関するようなその増幅プライマー対および配列決定プライマー対のセットの使用を伝えるであろうことは理解されている。
【実施例】
【００７４】
以下の限定的でない実施例は、本開示の組成物および方法を説明する。
実施例１：ＳＬＣ６Ａ８遺伝子の第１、第２、および第３領域の増幅、精製、確認、および配列決定
実験プロトコル：ＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および第３領域の増幅、精製、確認、および配列決定を実施した。増幅はポリメラーゼ連鎖反応（以下“ＰＣＲ”）により実施され、ここで水、１０×緩衝液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼを含有するマスター混合物を調製した。第１断片の増幅に関して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液；１．２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌのＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑポリメラーゼ、４μｌの５×ＧＣ緩衝液、１μｌのセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（それぞれ１０μＭ）、ならびに９．９μｌの滅菌水を含有するマスター混合物を調製した。第２および第３領域の増幅に関して、５．０μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ２＋含有）、８μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ）、０．７μｌのＴａＫａＲａＬＡ  Ｔａｑ  ５Ｕ／μｌ、１０μｌの５×ＧＣ緩衝液、４μｌのプライマー混合物（それぞれ１０μＭ）、および１２．３μｌの滅菌水を含有するマスター混合物を調製した。そのプライマー混合物には、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）ならびにセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）が含まれる第２および第３の増幅プライマーの対が含まれていた。
【００７５】
チューブにそれぞれの試料に関する識別名のラベルを貼り、適切なマスター混合物および試料ＤＮＡ（１００〜２５０ｎｇ）をそれぞれのラベルを貼ったチューブの中に分けて入れた（ａｌｉｑｕｏｔｔｅｄ）。第１領域に関する総反応体積は２０μｌであった。第２領域および第３領域に関する総反応体積は５０μｌであった。２個の試料チューブを第３領域に関して用いた。
【００７６】
その試料チューブを密封し、増幅のためにサーマルサイクラーに入れた。第１断片に関して、サーマルサイクラーを以下の反応条件で運転した：１）９４℃で３分間；２）９４℃で３０秒間；３）６２℃で４５秒間；４）７２℃で４０秒間；５）工程２〜４を３４サイクル繰り返す；６）７２℃で５分間；そして７）１２℃で追加の分析のためにサーマルサイクラーから取り出されるまで。第２および第３領域に関して、以下の反応条件がサーマルサイクラーにおいて用いられた：１）９４℃で２分間；２）９８℃で１０秒間；３）６８℃で４５秒間およびサイクルごとに１℃下げる；４）６８℃で５分間；５）工程２〜４を１０サイクル繰り返す；６）９８℃で１０秒間；７）５８℃で４５秒間；８）６８℃で５分間；９）６８℃で１３分間；そして１０）１２℃で追加の分析のためにサーマルサイクラーから取り出されるまで。その第１、第２および第３領域の増幅産物を配列決定の用意ができるまで４℃で保管した。
【００７７】
増幅の後、その第１、第２および第３領域の増幅産物の分子量を決定してその産物がＳＬＣ６Ａ８の第１、第２および第３領域の分子量に相当する分子量を有することを確認した。より具体的には、第１、第２および第３領域の増幅産物の分子量をアガロースゲルを用いて決定した。
【００７８】
確認後、その第１、第２および第３領域の増幅産物を精製した。より具体的には、ＥｘｏＳａｐをそのＰＣＲ産物に添加し、試料チューブを密封し、サーマルサイクラーに入れた。第１領域の増幅産物に関して、２μｌのＥｘｏＳａｐを２０μｌのＰＣＲ産物に添加した。第２および第３領域の増幅産物に関して、４μｌのＥｘｏＳａｐを５０μｌのＰＣＲ産物に添加した。サーマルサイクラーを以下の反応条件で運転した：１）３７℃で３０分間；２）８０℃で１５分間；そして１０）１２℃で追加の分析のためにサーマルサイクラーから取り出されるまで保持した。
【００７９】
精製後、その第１、第２、および第３領域の増幅産物を配列決定した。より具体的には、第１、第２、および第３領域の増幅産物を、１１μｌの水、３μｌの５×配列決定緩衝液、および３μｌの精製されたＰＣＲ産物を含有する配列決定マスター混合物を調製することにより配列決定した。加えて、１μｌの対応する配列決定プライマー対をそれぞれの試料チューブ中に添加した。
【００８０】
より具体的には、第１領域に関して、その配列決定プライマーにはセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が含まれていた。第２領域に関して、その配列決定プライマーにはセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；ならびにセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）が含まれていた。第３領域に関して、その配列決定プライマーにはセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、およびアンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）が含まれていた。
【００８１】
その配列決定マスター混合物を９５℃で３分間変性させ、氷上に２分間置き、次いで２μｌの配列決定混合物を添加して総反応体積を２０μｌにした。その試料チューブを密封してサーマルサイクラーに入れ、以下の条件で運転した：１）９６℃で１分間；２）９６℃で１０秒間；３）５０℃で５秒間；４）６０℃で７５秒間；５）工程２〜４を２４サイクル繰り返す；そして６）４℃でサーマルサイクラーから取り出されるまで。次いでその配列決定された領域をゲルキャピラリー電気泳動を用いて分析したが、他の型にはまった方法も使用に適している。
【００８２】
実験の結果。図２において示したように、第１、第２、および第３断片の増幅産物はＳＬＣ６Ａ８の第１、第２、および第３断片の分子量（すなわちＭｗ）と一致する分子量を有していた。より具体的には、図２において示したように、第１領域の増幅産物（すなわちアンプリコン１）は約４２２塩基対（すなわちｂｐ）の分子量を有し、第２領域の増幅産物（すなわちアンプリコン２）は約２１３１ｂｐのＭｗを有し、そして第３領域の増幅産物（すなわちアンプリコン３）は約４７０２ｂｐのＭｗを有していた。
【００８３】
図３において示したように、ＳＬＣ６Ａ８遺伝子の一部を配列決定した。より詳細には、図３はＳＬＣ６Ａ８の領域を含む二方向性高品質配列トレース（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｃｅｓ）の例を示す。
【００８４】
“好ましくは”、“一般的に”、“一般に”、および“典型的には”のような用語は、本明細書において、特許請求の範囲を限定するため、または特定の特徴が特許請求の範囲の構造もしくは機能に決定的、必須、もしくはさらには重要であることを含意するために利用されているのではないことを特筆する。むしろ、これらの用語は単に本開示の特定の態様において利用されても利用されなくてもよい代わりまたは追加の特徴を強調することを意図している。
【００８５】
別途示さない限り、明細書および特許請求の範囲において用いられている成分、特性、例えば反応条件等の量を表す全ての数は、全ての場合において用語“約”により修飾されているものとして理解されるべきである。従って、そうではないことを示さない限り、この明細書中で示される数値パラメーターは、本明細書で開示される主題により得ようと求められている望まれる特性に応じて変動し得る近似値である。
【００８６】
本開示を記述および定義することを目的として、用語“実質的に”は本明細書においてあらゆる量的な比較、値、測定、または他の表現に帰することができる不確定性の固有の程度を表すために利用されていることを特筆する。用語“実質的に”は、本明細書において、それにより量的表現が結果として問題の主題の基本的な機能における変化をもたらすことなく述べられた参照から変動し得る程度を表すためにも利用されている。
【００８７】
この明細書全体を通して与えられる全ての最大数値限定には、全てのより低い数値限定が、あたかもそのようなより低い数値限定が本明細書において明確に書かれたかのように含まれることは理解されるべきである。この明細書全体を通して与えられる全ての最小数値限定には、全てのより高い数値限定が、あたかもそのようなより高い数値限定が本明細書において明確に書かれたかのように含まれるであろう。この明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲には、そのようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲が、あたかもそのようなより狭い数値範囲が本明細書において全て明確に書かれたかのように含まれるであろう。
【図１】
2014515269.tif 000008
【図２】
2014515269.tif 000009
【図３】
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【配列表】
2014515269000001.app
【国際調査報告】
2014515269.tif 000011