(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）2014524923.tif 000048の新規な化合物、このような化合物を含む医薬組成物および生物学的研究のための手段としてまたはそれらが単独で使用されるかまたは他の治療法と併用されるかにかかわらず、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患などの療法のための作用物質または薬剤としてこのような化合物を使用するための方法を提供する。
2014524923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の式（Ｉ）：
【化１】
2014524923.tif 000042
（式中、
Ｒ１が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、または−Ｃ（Ｏ）Ｒ８であり；ここで、
Ｒ８が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１つ以上の置換基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、前記フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；または
Ｒ１が、それが結合される窒素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成し；
Ｒ２が、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基であり、ここで、前記Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される１つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または前記環式基または複素環式基が、任意に置換される芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；
Ｒ３が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合されたピペリジンを形成し；
ここで、前記フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環あるいはピペリジンと縮合された前記芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく；または前記ピペリジンと縮合された前記芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環式基とさらに縮合され；
Ｒ６が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環であり；または
組み合わされたＲ６およびＲ７が、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるＣ５〜Ｃ８芳香族または脂肪族環式基または複素環式基を形成し；
Ｒ１２が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）によって表されるＰＡＲ２拮抗薬；および
その塩を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の式（Ｉ）：
【化２】
2014524923.tif 000043
（式中、
Ｒ１が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、または−Ｃ（Ｏ）Ｒ８であり；ここで、
Ｒ８が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１つ以上の置換基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、前記フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；または
Ｒ１が、それが結合される窒素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成し；
Ｒ２が、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基であり、ここで、前記Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される１つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または前記環式基または複素環式基が、任意に置換される芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；
Ｒ３が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合されたピペリジンを形成し；
ここで、前記フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環あるいはピペリジンと縮合された前記芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく；または前記ピペリジンと縮合された前記芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環式基とさらに縮合され；
Ｒ６が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環であり；または
組み合わされたＲ６およびＲ７が、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるＣ５〜Ｃ８芳香族または脂肪族環式基または複素環式基を形成し；
Ｒ１２が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）によって表されるＰＡＲ２拮抗薬；および
その塩を投与する工程を含み；
ただし、前記化合物が、５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］、５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インダン−１，４’−ピペリジン］、５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１，４’−ピペリジン］または５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンでない方法。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物；およびその塩について、
Ｒ１が、水素または−Ｃ（Ｏ）Ｒ８であり；ここで、
Ｒ８が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１つ以上の置換基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；
Ｒ６が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）の前記化合物が、式（Ｉａ）：
【化３】
2014524923.tif 000044
（式中、
Ｒ１１が、アルキル、アミノ、またはフェニルから選択される１つ以上の基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の不飽和複素環であり、ここで、前記フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で置換されるベンジル基であり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；ここで、前記フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく；または前記縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環式基と縮合される）；および
その塩によって表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）の前記化合物が、式（Ｉｂ）：
【化４】
2014524923.tif 000045
（式中、
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；ここで、前記フェニル、ベンジル、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルオキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルキルオキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよい）；および
その塩によって表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）の前記化合物が、式（Ｉｃ）：
【化５】
2014524923.tif 000046
（式中、
Ｒａ、ＲｂおよびＲｃが、個々に、水素、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基を表し；または
組み合わされたＲａおよびＲｂまたはＲｂおよびＲｃがジオキサランを形成する）；および
その塩によって表される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）の前記化合物が、式（Ｉｄ）：
【化６】
2014524923.tif 000047
（式中、
Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆが、独立して、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキル、アミノアリールまたは複素環から選択される基を表し、または組み合わされたＲｄおよびＲｅまたはＲｅおよびＲｆが、縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基を形成し；ここで、前記フェニル、ベンジル、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよい）；および
その塩によって表される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
式（Ｉ）の前記化合物が：
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メチル）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−エトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−プロポキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−イソプロポキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−ブトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−イソブトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−トリフルオロメチル）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３−トリフルオロメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−トリフルオロメチル）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（１，３−ジオキサラン）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，４−ジクロロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，５−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，３−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，３，４−トリメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，６−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メトキシ−５−トリフルオロメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，５−ビス（トリフルオロメチル））フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−フェニル）ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−メトキシ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−クロロ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｏ−トリフルオロメチル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｏ−フェニル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｍ−フェニル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−フェニル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−フェノキシ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（２，５−ジメトキシ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−ベンジル）ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−２Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブチルアミド）ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（４−アセトアミド）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｏ−フルオロ）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｍ−フルオロ）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｐ−フルオロ）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｏ−トリフルオロメチル）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｍ−トリフルオロメチル）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｐ−トリフルオロメチル）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロクロマン−２，４’−ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−［（Ｓ）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）］ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノジメチル−（２−メトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インダン−１，４’−ピペリジン］；または
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１，４’−ピペリジン］
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）の前記化合物が：
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−ベンズイミダゾール；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−２−ビフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−３−ビフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−４−ビフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−２−ナフタレン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル；
Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−（３−アミノ−イソオキサゾリル）−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；または
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インダン−１，４’−ピペリジン］；または
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１，４’−ピペリジン］
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１１】
メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防に使用するための、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、プロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）を調節することが可能な化合物、およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、ＰＡＲ２の調節剤、それらの調製、および生物学的研究のための手段としてまたはそれらが単独で使用されるかまたは他の治療法と併用されるかにかかわらず、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患などの療法のための作用物質または薬剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ活性化受容体−２（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２：ＰＡＲ２）は、公知の内因性細胞外配位子を有さず、トリプシン、トリプターゼ、およびカテプシンＧなどの多くのセリンプロテアーゼを含むプロテアーゼによって活性化される点で一意のＧタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）である。セリンプロテアーゼは、膜結合受容体の細胞外Ｎ末端の一部を開裂させて、受容体に結合し、活性化を引き起こすことによって連結配位子として働く新たな配列を露出させる。
【０００３】
ＰＡＲ２は、全身に広まると、関節炎、炎症性腸疾患、膵炎、および心血管疾患を含む急性および慢性炎症性疾患における炎症誘発性メディエータとして関与している。ＰＡＲ２はまた、胃潰瘍、結腸炎、喘息、および肝線維症などの病態において抗炎症性および保護性があると報告されているが、これについてはまだ議論が分かれている。ＰＡＲ２の活性化は、胃、結腸、乳房および膵臓の癌を含む多くの癌の増殖、転移および血管新生に関連付けられてきた。これに関連して、ＰＡＲ２の小分子調節剤は、抗炎症性、炎症誘発性、抗増殖性または増殖性の作用物質の新たな種類として潜在的な関心を集めている。
【０００４】
最近、様々な血栓形成促進性分子（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、組織因子など）および他のシステイン／セリンプロテアーゼ（カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トリプシン様セリンプロテアーゼなど）の循環の増加が食餌性肥満およびメタボリック・シンドロームに関与していることが確認された後、これらの疾患のための新規な治療標的としての炎症性ＧＰＣＲに対する関心が集まっている。
【０００５】
飽和脂肪および炭水化物をますます多く含む人の食事は、代謝系および免疫系に過負荷を掛け、肥満、代謝機能不全および免疫障害を引き起こすものと考えられる。この栄養素の過剰摂取は、脂肪組織の慢性炎症状態を引き起こし、肥満を促進し、脂肪細胞機能および免疫細胞分布を変更し、これらは両方とも代謝機能不全を引き起こすようである。慢性代謝機能不全は、肥満、ＩＩ型糖尿病および心血管疾患につながることがあり、それらの治療は、世界中の医療システムにとっての大きな課題である（非特許文献１）（非特許文献２）。過剰なカロリー摂取に加えて、現代の座りがちなライフスタイルは、肥満ならびに関連する代謝性疾患および心血管疾患（現在まとめて「メタボリック・シンドローム」と呼ばれる）を引き起こす重要な因子である（非特許文献３）（非特許文献４）。
【０００６】
メタボリック・シンドロームには、過剰な内臓脂肪沈着、高血圧症、グルコースおよびインスリン恒常性異常、インスリン抵抗性、内皮障害、心血管肥大、炎症、血管炎症、アテローム性動脈硬化症、心室収縮機能不全、線維症および脂肪肝疾患などの合併症が伴う。この多因子症候群を処置するための有効な治療および予防の選択肢の特定は、非常に困難であることが分かっており、肥満およびメタボリック・シンドロームの発生および進行の両方に大きな役割を果たすことが示されている、慢性炎症としての脂肪症、代謝および心血管機能不全に対処し得る抗炎症薬の開発に対して新たに注目が集まっている。
【０００７】
脂肪組織の動的成分の中には、脂肪細胞ならびに、脂肪細胞機能に間接的に寄与する、マクロファージ、単球、Ｔ細胞および肥満細胞などの多くの様々な免疫細胞がある。肥満の発生の際に初期に脂肪組織中にある免疫細胞（特に、マクロファージ）の数の変化は、脂肪症および代謝機能不全を引き起こす酸化および炎症カスケードを伝播するものと現在考えられている。脂肪組織におけるマクロファージ活性化を引き起こすシグナルは分かっていない。相次ぐエビデンスが、脂肪細胞および／またはマクロファージによって局所的に生成される飽和脂肪酸および脂質メディエータが、炎症細胞活性化、脂肪細胞の増殖、発達および機能不全に少なくとも部分的に関与し、したがって、肥満および代謝障害に寄与し得ることを示唆している。様々な炎症性脂質誘発性Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が、肥満、脂肪組織免疫細胞依存性炎症、インスリン分泌および心血管恒常性の調節に寄与する細胞内タンパク質をシグナル伝達するものと考えられる。
【０００８】
トリプシンは、膵臓トリプシンが見られる消化管、ならびにトリプシノーゲンの発現が実証されている結腸、気道上皮、神経および血管内皮細胞、皮膚、腸、腎臓および膵臓におけるＰＡＲ２の強力な活性剤である。肥満細胞トリプターゼは、ＰＡＲ２の重要な活性剤でもあり、肥満細胞において高度に発現され、多くの炎症性疾患、内分泌疾患および他の疾病と強く関連している。組織因子ＶＩＩａなどの血栓形成促進性因子は、ＰＡＲ２の切断、Ｎ末端内でコードされた受容体活性化配列の露出、それによって、脂肪組織およびマクロファージにおけるＰＡＲ２シグナル伝達の活性化にも関与している。より低い効力（ｎＭの濃度の代わりにμＭ）ではあるが、連結配位子のヒトおよびマウスの配列にそれぞれ対応するヘキサペプチドＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ２およびＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２が、セリンプロテアーゼの代わりにヒトＰＡＲ２を活性化し得る。
【０００９】
より強力なペプチド作動薬が、ＰＡＲ２向けに作製された。ヘキサペプチド類似体、２−フロイル−ＬＩＧＲＬ−ＮＨ２は、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２より約２０倍高い作動薬効力を有し、ＰＡＲ１よりＰＡＲ２に対して選択的である。セリンを他の複素環に置き換えると、等しい効力のＰＡＲ２作動薬が得られ、Ｃ末端ロイシンの代わりの大きい芳香族基は、ＰＡＲ２作動薬効力に同様の向上を与える（非特許文献５）（非特許文献６）（非特許文献７）（非特許文献８）（非特許文献９）。２５０，０００種の薬剤様の（ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ）化合物のスクリーニングにより、２−フロイル−ＬＩＧＲＬ−ＮＨ２と同様の作動薬効力、ＰＡＲ２に対するいくらかの選択性および生体内での代謝的安定性を有するＰＡＲ２の２つの小分子作動薬が生成された（非特許文献１０）。
【００１０】
ＰＡＲ２の第１の公知の拮抗薬は、わずかミリモル濃度で受容体に対する親和性を有し、非ＰＡＲ受容体を上回るＰＡＲ２に対する選択性が最もなさそうである（非特許文献１１）。ＰＡＲ２について報告される第２の拮抗薬は、μＭの濃度で活性であるが、トリプシン、トリプターゼおよび他のプロテアーゼのような内因性のＰＡＲ２活性剤に対して完全に不活性であるか（非特許文献１２）または部分作動薬の作用または可能な作動薬に誘発されるシグナル伝達のいずれかにより、拮抗薬および作動薬としての二重の機能を有する（非特許文献１３）。より最近になって、低いマイクロモル濃度で活性を有するＰＡＲ２拮抗薬が報告されており、他のＰＡＲよりＰＡＲ２に対して選択的であり、プロテアーゼおよび合成ＰＡＲ２作動薬による受容体活性化を可逆的に阻害することが分かった（非特許文献１４）。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、低いマイクロモルまたはサブマイクロモル濃度で使用される場合、ＰＡＲ２を選択的に調節することができる新規な種類の化合物を提供するのが有利である。構造的特性、および調べられる細胞内経路に応じて、これらの新規な化合物は、作動薬または拮抗薬のいずれかとして作用することができ、生物学的研究のための手段としてまたは抗炎症性、炎症誘発性、抗増殖性または増殖性の療法のための作用物質として有用であり得る。
【００１２】
肥満に対する現在の治療は、食欲、代謝またはカロリーおよび食物からの栄養素の吸収を変えることによって、患者の体重を減少または制御することによって機能し、例えば、オルリスタット（Ｘｅｎｉｃａｌ）は、長期使用がＦＤＡによって現在承認されている。オルリスタットは、膵臓リパーゼを阻害することによって、腸内の脂肪吸収を減少させる。第２の薬剤である、リモナバント（Ａｃｏｍｐｌｉａ）は、内在性カンナビノイド系の特異的な阻害によって作用する。ＦＤＡに承認された複合薬Ｑｓｙｍｉａは、食欲を抑制する刺激剤であるフェンテルミンと、抗けいれん剤であるトピラマートとを含む。しかしながら、これまで、メタボリック・シンドロームの症状の改善または緩和におけるＰＡＲ２の阻害剤の役割は、報告されていない。
【００１３】
意外なことに、ＰＡＲ２の特定の拮抗薬が、肥満、メタボリック・シンドロームならびに脂肪炎症、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患を含むその関連する疾病および疾患を改善し、予防し、または緩和することができることがここで分かった。
【００１４】
したがって、別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、脂肪炎症、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患の治療および／または予防におけるＰＡＲ２拮抗薬の使用を有利に提供する。本発明の態様は、ＰＡＲ２拮抗作用が、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病に特徴的なインスリンおよびグルコース不耐性、心血管疾患に特徴的な心血管の異常（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ）、およびコラーゲン沈着によって定義される線維症の治療および／または予防に有効であるという事実に基づくものである。
【００１５】
クローン病および潰瘍性大腸炎は、共通の病理を有する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の一般的な形態である。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸を侵し、クローン病は、結腸および回腸の複数の領域を侵し、それぞれの病態は、特徴的な模様の粘膜の潰瘍（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａ）を有する。意外なことに、ＰＡＲ２の拮抗薬が、現在の治療と比較して改良された効力で、炎症性腸疾患を予防または緩和することができることがここで分かった。したがって、別の態様において、本発明は、炎症性腸疾患の治療および／または予防におけるＰＡＲ２拮抗薬の使用を有利に提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｉｙｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００９，６，７１−８２
【非特許文献２】Ｉｙｅｒ，Ａ．＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ２０１１
【非特許文献３】Ｐｏｔｅｎｚａ，Ｍ．Ｖ．＆  Ｍｅｃｈａｎｉｃｋ，Ｊ．Ｉ．，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２００９，２４，５６０−７７
【非特許文献４】Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２０１０，５３，６００−５
【非特許文献５】ＭｃＧｕｉｒｅ，  Ｊ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００４，  ３０９，  １１２４−３１
【非特許文献６】Ｂａｒｒｙ  Ｇ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００７，  ２７，  ５５５２−７
【非特許文献７】Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｍ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００８，  ３２６，  ４５３−６２
【非特許文献８】Ｂｏｉｔａｎｏ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１１，  ５４，  １３０８−１３
【非特許文献９】Ｆｌｙｎｎ，  Ａ．  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１１，  ２８６，  １９０７６−８８
【非特許文献１０】Ｓｅｉｔｚｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８，  ５１，  ５４９０−３）
【非特許文献１１】Ｋｅｌｓｏ，Ｅ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ＥｘｐＴｈｅｒ  ２００６，３１６，１０１７−２４
【非特許文献１２】Ｋａｎｋｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００９，１５８，３６１−３７１
【非特許文献１３】Ｇｏｈ，Ｆ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００９，１５８，１６９５−１７０４
【非特許文献１４】Ｂａｒｒｙ  Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，７４２８−４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2014524923.tif 000003
（式中、
Ｒ１が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、または−Ｃ（Ｏ）Ｒ８であり；ここで、
Ｒ８が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１つ以上の置換基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；または
Ｒ１が、それが結合される窒素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成し；
Ｒ２が、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基であり、ここで、Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される１つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または環式基または複素環式基が、任意に置換される芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；
Ｒ３が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン（ｄｉｏｘａｌａｎｅ）、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合されたピペリジンを形成し；
ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環あるいはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく；またはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環式基とさらに縮合され；
Ｒ６が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環であり；または
組み合わされたＲ６およびＲ７が、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるＣ５〜Ｃ８芳香族または脂肪族環式基または複素環式基を形成し；
Ｒ１２が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）
の化合物；および
その塩であって；
ただし、化合物が、５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］、５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インダン−１，４’−ピペリジン］、５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１，４’−ピペリジン］または５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンでない化合物またはその塩を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、式（Ｉａ）：
【化２】
2014524923.tif 000004
（式中、
Ｒ１１が、アルキル、アミノ、またはフェニルから選択される１つ以上の基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；ここで、フェニル、ベンジルまたは複素環が、アルキル、アルキルオキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよい）によって表される式（Ｉ）の化合物；および
その塩を提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物、またはその塩に受容体を曝露する工程を含む、ＰＡＲ２の活性を調節する方法を提供する。
【００２０】
一態様において、本発明の化合物はＰＡＲ２拮抗薬である。
【００２１】
さらなる態様において、本発明の化合物はＰＡＲ２作動薬である。
【００２２】
さらなる態様において、本発明の化合物は、ＰＡＲ２によって媒介される特定の細胞内シグナル伝達経路のための「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」配位子に応じて、所与のアッセイではＰＡＲ２拮抗薬であり得るが、異なるアッセイではＰＡＲ２作動薬であり得る。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物、またはその塩を、好ましくは、薬学的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤および／または補助剤とともに含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
さらに他の態様において、本発明は、本発明に係る化合物、またはその塩を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体を処置する予防または治療方法を提供する。好ましくは、疾病または疾患は、炎症性の疾病または疾患、または増殖性の疾病または疾患である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＰＡＲ２拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の式（Ｉ）：
【化３】
2014524923.tif 000005
（式中、
Ｒ１が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、または−Ｃ（Ｏ）Ｒ８であり；ここで、
Ｒ８が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１つ以上の置換基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の飽和または不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；または
Ｒ１が、それが結合される窒素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成し；
Ｒ２が、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基であり、ここで、Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される１つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または環式基または複素環式基が、任意に置換される芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；
Ｒ３が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合されたピペリジンを形成し；
ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環あるいはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく；またはピペリジンと縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環式基とさらに縮合され；
Ｒ６が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ７が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環であり；または
組み合わされたＲ６およびＲ７が、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるＣ５〜Ｃ８芳香族または脂肪族環式基または複素環式基を形成し；
Ｒ１２が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）によって表されるＰＡＲ２拮抗薬；および
その塩を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、炎症性腸疾患を治療する方法であって、本発明に係る式（Ｉ）の化合物、またはその塩を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２８】
さらに他の態様において、本発明は、望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体の予防または治療処置への、式（Ｉ）の化合物、またはその塩の使用を提供する。好ましくは、疾病または疾患は、炎症性の疾病または疾患、または増殖性の疾病または疾患である。
【００２９】
別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のためのＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。
【００３１】
さらに他の態様において、本発明は、望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体の予防または治療処置のための薬剤の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその塩の使用を提供する。好ましくは、疾病または疾患は、炎症性の疾病または疾患、または増殖性の疾病または疾患である。
【００３２】
別の態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造のためのＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＨＴ２９細胞におけるＰＡＲ２作動薬６についての３点濃度の棒グラフのグラフ表示。
【図２】ＰＡＲ２拮抗薬１８によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図３】ＰＡＲ２拮抗薬２４によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図４】ＰＡＲ２拮抗薬２６によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図５】ＰＡＲ２拮抗薬２７によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図６】ＰＡＲ２拮抗薬３０によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図７】ＰＡＲ２拮抗薬３９によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図８】ＰＡＲ２拮抗薬４２によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の濃度依存性阻害のグラフ表示。
【図９】ＰＡＲ２拮抗薬１８、３０、４２、４４が実験の足浮腫を緩和する能力のグラフ表示。拮抗薬１８、３０、４２または４４（オリーブ油中１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．）、ｎ＝３）により、２−ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２（足当たり３５０μｇ、拮抗薬の経口投与の２時間後）によって誘発される足浮腫が軽減された。
【図１０】ラット血漿（薬剤を投与していないＷｉｓｔａｒラットに由来する）中の公知のペプチド作動薬ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２および２−ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２と比較したＰＡＲ２拮抗薬（１８、３０、４０、４２および４４）の安定性のグラフ表示。
【図１１】ラットの肝臓のホモジネート（薬剤を投与していないＷｉｓｔａｒラットに由来する）中の公知のペプチド作動薬ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２および２−ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２と比較したＰＡＲ２拮抗薬（１８、３０、４０、４２および４４）の安定性のグラフ表示。
【図１２】ヒト初代単球由来マクロファージに対するパルミチン酸の影響のグラフ表示。
【図１３】食餌性肥満ラットにおけるＰＡＲ２拮抗薬５２による肥満および脂肪組織免疫炎症性細胞浸潤の調節のグラフ表示。
【図１４】ＰＡＲ２  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ遺伝子定量のグラフ表示。
【図１５】脂肪組織炎症におけるＰＡＲ２拮抗薬５２の調節のグラフ表示。
【図１６】食餌誘発性ラットにおけるＰＡＲ２拮抗薬５２による代謝パラメータの調節のグラフ表示。
【図１７】ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置されたラットにおける肝臓、骨格筋および膵臓中の脂肪酸酸化の影響のグラフ表示。
【図１８】食餌性肥満ラットにおけるＰＡＲ２拮抗薬５２による心血管の構造および機能の調節のグラフ表示。
【図１９】ＰＡＲ２拮抗薬５２によるラットにおける実験の足浮腫の緩和のグラフ表示。
【図２０】ＰＡＲ２拮抗薬５２によるコラーゲン誘発性関節炎の病態生理の予防的改善のグラフ表示。
【図２１】染色した足関節切片の顕微鏡写真とともに、ＰＡＲ２拮抗薬５２の予防的投与による関節炎発症（ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の際の組織病理学的変化の緩和のグラフ表示。
【図２２】ＰＡＲ２拮抗薬５２による病変関節における関節炎様のコラーゲン損失、肥満細胞脱顆粒およびマクロファージ集積の減少を示す、グラフ表示および染色した足関節切片の顕微鏡写真。
【図２３】ラットのＴＮＢＳ誘発性慢性大腸炎モデルのＴＮＢＳ誘発性病様症状ならびにスルファサラジンおよび化合物５２によるその緩和のグラフ表示。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
上記の病態生理学におけるその明らかな役割の証拠にもかかわらず、ＰＡＲ２の生物学的機能は、特に生体内レベルにおいて、依然としてよく理解されていない。このように実質的な進展がないことの原因は、主に、さらなる研究のためのＰＡＲ２の強力でかつ選択的な、生物学的に利用可能な作動薬および拮抗薬がないことにある。
【００３６】
構造活性関係研究は、ヘキサペプチド作動薬ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ２およびＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２から出発して、これらのペプチド配位子がＰＡＲ２に結合しそれを活性化するのに必要な特定の側鎖官能基を決定できるようにした。この情報を用いることによって、初めて、強力で、選択的でかつ経口で有効な、受容体の非ペプチド性の調節剤を合理的に設計し、開発することができた。この過程において、新規な化合物における、受容体認識に必要な断片および作動薬または拮抗薬の機能性を与える領域を決定することができた。ある実施形態において、これらの新規な化合物は、異常なＰＡＲ２発現および／または活性に関連する疾病または疾患を治療または予防する手段を提供する。
【００３７】
本明細書において、当業者に周知のいくつかの用語が使用される。それにもかかわらず、明瞭にするために、いくつかの用語が定義される。
【００３８】
本明細書に使用される際の「非置換」という用語は、置換基が存在せず、または唯一の置換基が水素であることを意味する。
【００３９】
本明細書において、特に定義されない限り、「任意に置換される」という用語は、基が、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、アルキニルオキシ、アミノ、アミノアシル、チオ、アリールアルキル、アリールアルコキシ、アリール、アリールオキシ、アシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、スルホ、ホスホノ、ホスホリルアミノ、ホスフィニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロキシ、オキシアシル、オキシム、オキシムエーテル、ヒドラゾン、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、オキシアシルアミノ、オキシスルホニルアミノ、アミノアシルオキシ、トリハロメチル、トリアルキルシリル、ペンタフルオロエチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメタンチオ、トリフルオロエテニル、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロシクリル、アミノ、ならびにアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルから選択される異なる置換基を有する非対称二置換アミンから選択される１つ以上の基でさらに置換されるかまたは（縮合された多環式基を形成するように）縮合されても、またはされなくてもよいことを意味するものと解釈される。
【００４０】
特定の実施形態において、好ましい置換基は、アルキル、フェニル、アルコキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、トリハロアルキルオキシまたは式−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ５Ｒ６（式中、Ｒ５が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ６がＣ２〜Ｃ５アルキルアミンである）の基から独立して選択される１つ以上の基である。
【００４１】
基または基の一部としての「アルキル」は、特に断りのない限り、直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素基、好ましくはＣ１〜Ｃ１０アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキル、最も好ましくはＣ１〜Ｃ６を指す。好適な直鎖状または分枝鎖状のＣ１〜Ｃ６アルキル置換基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００４２】
本明細書における「アミノ」という用語は、水素、アルキル、アリールまたはそれらの組合せで置換される窒素ラジカルを指す。
【００４３】
本明細書において、正式名称、一般的な三文字表記（例えばＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＶａｌまたはＣｈａ）または一文字表記（例えばＳ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｒ、ＫまたはＶ）のいずれかによる、セリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、リジンまたはバリンなどの天然アミノ酸、あるいはシクロヘキシルアラニンなどの非天然アミノ酸を含むアミノ酸への言及は、特に規定されない限り、Ｌ−異性体を意味するものと解釈される。
【００４４】
「アルキルアミン」という用語は、本明細書に定義されるアルキル基にさらに結合されるアミンを指し、規定されない限り、モノ−およびジ−アルキルアミンの両方を含む。アルキル基は、好ましくはＣ１〜Ｃ１０アルキル基である。この基は、窒素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００４５】
「アルキルアミド」という用語は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２（式中、Ｒ置換基の少なくとも１つが、本明細書において定義されるアルキル基を表す）の基を指す。アルキルアミドは、規定されない限り、モノ−およびジ−アルキルアミドの両方を含む。当業者は、モノ−アルキルアミドの場合、残りのＲ置換基が水素を表すことを認識するであろう。アルキル基は、好ましくはＣ１〜Ｃ１０アルキル基である。この基は、窒素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００４６】
「アミノアルキル」という用語は、少なくとも１つのアミンでさらに置換される、本明細書において定義されるアルキル基を指す。好ましいアミノアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１０アミノアルキル基である。アミノアルキル基の例としては、以下に限定はされないが、モノ−またはジ−アミノメチル、１−アミノエチル、１，１−ジアミノエチル、１，２−ジアミノエチルおよび−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）が挙げられる。この基は、アルキル炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００４７】
「アミドアルキル」という用語は、少なくとも１つのアミド基でさらに置換される、本明細書において定義されるアルキル基、すなわち式アルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の基を指す。好ましいアミドアルキル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アミドアルキル基である。この基は、アルキル炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００４８】
基または基の一部としての「アリール」は、好ましくは環当たり５〜１２個の原子を有する、任意に置換される単環式、または縮合された多環式の、芳香族炭素環（全て炭素である環原子を有する環構造）を表す。アリール基の例としては、フェニルなどの単環式基、ナフチルなどの縮合された多環式基などが挙げられる。典型的に、アリール基が、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基である。
【００４９】
二環式または多環式基に言及して使用される際の「縮合」という用語は、オルト−またはペリ−縮合された二環式または多環式環系などの、環の少なくとも２つが共通のＣ−Ｃ結合を共有する二環式または多環式環系を指す。「縮合」という用語は、二環式または多環式スピロ環系などの、１つのみの共通のＣ原子を共有する二環式または多環式環系も含む。
【００５０】
「アリールアミン」という用語は、本明細書において定義されるアリール基にさらに結合されるアミンを指し、規定されない限り、モノ−およびジ−アリールアミンの両方を含む。アリール基は、好ましくはＣ６〜Ｃ１０アリール基である。この基は、窒素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００５１】
「アミノアリール」という用語は、少なくとも１つのアミンでさらに置換される、本明細書において定義されるアリール基を指す。好ましいアミノアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１０アミノアリール基である。この基は、アリール炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００５２】
基または基の一部としての「アルコキシ」という用語は、アルキルが本明細書において定義されるとおりであるアルキル−Ｏ−基を指す。好ましくは、アルコキシは、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシである。例としては、以下に限定はされないが、メトキシおよびエトキシが挙げられる。
【００５３】
「環」または「環式基」という用語は、好ましくは環当たり３〜１０個の炭素を含有する、飽和、部分不飽和または完全不飽和の単環式または縮合またはスピロ多環式環系を指す。
【００５４】
本明細書において使用される「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。
【００５５】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、少なくとも１つの−ＯＨ基でさらに置換される、本明細書において定義されるアルキル基を指す。好ましいヒドロキシアルキル基は、Ｃ２〜Ｃ１０ヒドロキシアルキル基である。この基は、アルキル炭素原子を介して分子の残りの部分に結合される。
【００５６】
「複素環」または「複素環基」という用語は、環原子として窒素、硫黄および酸素からなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する飽和、部分不飽和または完全不飽和の単環式、二環式または縮合された多環式またはスピロ多環式環系を指す。各環は、好ましくは３〜１０員、より好ましくは４〜７員である。好適な複素環置換基の例としては、以下に限定はされないが、それぞれ１〜３つの置換基でさらに置換され得る、ピロール、フラン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、トリアゾール、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、フラザン、オキサジアゾール、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジンおよびピラジンが挙げられる。
【００５７】
本発明のある好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）に関して、以下の定義の１つ以上が当てはまる：
ａ）Ｒ１が、それぞれがアルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１つ以上の置換基でさらに任意に置換され得る、ピロール、ピリジン、ピラジン、フラン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、トリアゾール、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、フラザン、またはオキサジアゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ｂ）Ｒ１が、それぞれがアルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される１〜３つの置換基でさらに置換され得る、フラン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピラゾール、トリアゾール、オキサゾールまたはイソオキサゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ｃ）Ｒ１が、アルキル、アルコキシ、アミン、アミノアルキル、アミドアルキル、ハロ、ヒドロキシ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたはフェニルから選択される基で任意に置換されるイソオキサゾールカルボニルであり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ｄ）Ｒ１が、それが結合される炭素原子と一緒に、アルキルで任意に置換される、単環式または二環式窒素含有複素環を形成する。
ｅ）Ｒ２が、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基であり、ここで、Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される１つ以上の置換基でさらに置換されてもよく、または環式基または複素環基が、任意に置換される芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基と縮合される。
ｆ）Ｒ２が、アルキル、アミン、ヒドロキシから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されるシクロヘキサンまたはフェニルから選択され、または環式基または複素環基が、任意に置換される芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基と縮合される。
ｇ）Ｒ２が、シクロヘキサン、フェニル、（ｐ−メチル）フェニル、（ｐ−アミノ）フェニル、（ｐ−ヒドロキシ）フェニルまたはインドールから選択される。
ｈ）Ｒ３が、水素またはメチルから選択される。
ｉ）Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり、ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
ｊ）Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、アリールアミン、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるベンジル基である。
ｋ）Ｒ４が水素であり；Ｒ５が、アルキルまたはアルコキシで置換されるベンジル基である。
ｌ）Ｒ４が水素であり；Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０で置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
ｍ）Ｒ４が水素であり；Ｒ５が、アルキルまたはアルコキシおよび基−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で置換されるベンジル基であり、ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
ｎ）組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基と縮合され；ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく、または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環基と縮合される。
ｏ）Ｒ６が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
ｐ）Ｒ７が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、飽和または不飽和シクロアルキル、または複素環である。
ｑ）組み合わされたＲ６およびＲ７が、それらが結合される炭素と一緒に、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換される、Ｃ５〜Ｃ８環式基、フェニルまたはＣ５〜Ｃ８複素環式基を形成する。
【００５８】
一般式（Ｉ）に関するさらなる実施形態において、以下の定義の１つ以上が当てはまる：
ｒ）Ｒ１が、それぞれがアルキルまたはフェニルから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換され得る、ピロール、ピリジン、ピラジン、フラン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、トリアゾール、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、フラザン、またはオキサジアゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ｓ）Ｒ１が、それぞれがアルキルまたはフェニルから選択される１〜３つの置換基でさらに置換され得る、フラン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピラゾール、トリアゾール、オキサゾールまたはイソオキサゾールのアシル誘導体から選択され、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ｔ）Ｒ１が、アルキルまたはフェニルから選択される基で任意に置換されるイソオキサゾールカルボニルであり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ｕ）Ｒ２がシクロヘキサンである。
ｖ）Ｒ３が水素である。
ｗ）Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；Ｒ５が、アルキル、アルコキシ、アリールアミン、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり、ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
ｘ）Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で任意に置換されるベンジル基である。
ｙ）Ｒ４が水素であり；Ｒ５が、アルキルまたはアルコキシで置換されるベンジル基である。
ｚ）Ｒ４が水素であり；Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０で置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
ａａ）Ｒ４が水素であり；Ｒ５が、アルキルまたはアルコキシおよび基−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ５Ｒ６から選択される基で置換されるベンジル基であり、ここで、Ｒ５が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ６がＣ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
ａｂ）組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；ここで、フェニル、ベンジルまたは複素環が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよい。
ａｃ）Ｒ６がメチルである。
ａｄ）Ｒ７がエチルである。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、式（Ｉａ）：
【化４】
2014524923.tif 000006
（式中、
Ｒ１１が、アルキル、アミノ、またはフェニルから選択される１つ以上の基で任意に置換される、ＮおよびＯから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５員または６員の不飽和複素環であり、ここで、フェニル基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに任意に置換されてもよく；
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキルまたはトリハロアルコキシから選択される基で置換されるベンジル基であり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；ここで、フェニル、ベンジル、アミノアリール、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルホニル、アルコキシ、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキル、アリールアミン、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、オキソ、任意に置換されるフェニル、任意に置換されるピペリジン、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよく；または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、さらなるＣ６〜Ｃ１０環式基またはＣ６〜Ｃ１０複素環式基と縮合される）によって表される式（Ｉ）の化合物；および
その塩を提供する。
【００６０】
好ましい実施形態において、Ｒ１１がイソオキサゾールである。
【００６１】
したがって、好ましい態様において、本発明は、式（Ｉｂ）：
【化５】
2014524923.tif 000007
（式中、
Ｒ４が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノアルキルまたはアミドアルキルであり；
Ｒ５が、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基で任意に置換されるベンジル基であり；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミノアリール、アミドアルキルまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し、またはピペリジンが、芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基と縮合され；ここで、フェニル、ベンジル、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環式基が、アルキル、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルオキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルキルオキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよい）によって表される式（Ｉ）の化合物；および
その塩を提供する。
【００６２】
さらに好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物に関して、Ｒ１１がイソオキサゾールであり、Ｒ４が水素であり、Ｒ５が、任意に置換されるベンジル基である。
【００６３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、式（Ｉｃ）：
【化６】
2014524923.tif 000008
（式中、
Ｒａ、ＲｂおよびＲｃが、個々に、水素、アルキル、アミノアルキル、アルコキシ、Ｃ４〜Ｃ７複素環、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、トリハロアルキル、トリハロアルコキシまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０から選択される基を表し；ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルであり；または
組み合わされたＲａおよびＲｂまたはＲｂおよびＲｃがジオキサランを形成する）によって表される式（Ｉ）の化合物；および
その塩を提供する。
【００６４】
式（Ｉｃ）に関する好ましい実施形態において、ＲａおよびＲｃが水素であり、Ｒｂが−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ９Ｒ１０であり、ここで、Ｒ９が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり、Ｒ１０が、Ｃ２〜Ｃ５アミノアルキルである。
【００６５】
式（Ｉｃ）に関する別の好ましい実施形態において、ＲａまたはＲｂのうちの一方が、メチル、メトキシまたはエトキシであり、他方が水素であり、Ｒｃが水素である。
【００６６】
式（Ｉｃ）に関するさらなる好ましい実施形態において、組み合わされたＲａおよびＲｂまたはＲｂおよびＲｃがジオキサランを形成し、残りのＲｃまたはＲａが水素である。
【００６７】
別のさらなる好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物に関して、Ｒ１１がイソオキサゾールであり、組み合わされたＲ４およびＲ５が、それらが結合される窒素と一緒に、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキル、アミノアリールまたは複素環から選択される基で任意に置換されるピペリジンを形成し；ここで、
フェニル、ベンジルまたは複素環が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよい。
【００６８】
したがって、別の態様において、本発明は、式（Ｉｄ）：
【化７】
2014524923.tif 000009
（式中、
Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆが、独立して、フェニル、ベンジル、アミノアルキル、アミドアルキル、アミノアリールまたは複素環から選択される基を表し、または組み合わされたＲｄおよびＲｅまたはＲｅおよびＲｆが、縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基を形成し；ここで、
フェニル、ベンジル、複素環または縮合された芳香族または脂肪族Ｃ３〜Ｃ８環式基またはＣ３〜Ｃ８複素環基が、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、アミドアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、ジオキサラン、トリハロアルキル、またはトリハロアルコキシから選択される１〜３つの置換基でさらに置換されてもよい）によって表される式（Ｉ）の化合物；または
その塩を提供する。
【００６９】
さらに他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は：
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチルフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（４−メトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−クロロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−ニトロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−フルオロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３−フルオロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（４−フルオロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（３−［アミノメチル］フェニル）−アミノ−４−アミノブタン−１−カルボキサミド；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（３−［アミノメチル］フェニル）−アミノ−３−アミノプロパン−１−カルボキサミド；または
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−フルオロフェニル）ピペラジン．
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（６，７−ジメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン）；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−｛１−（メチルスルホニル）スピロ［インドリン−３，４’−ピペリジン］｝；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−｛３Ｈ−３−オキソ−スピロ［イソベンゾフラン−１，４’−ピペリジン］｝；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−オキソ−スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］）；
からなる群から選択される。
【００７０】
他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬は：
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３−メトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メチル）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−エトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−プロポキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−イソプロポキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−ブトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−イソブトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−トリフルオロメチル）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３−トリフルオロメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−トリフルオロメチル）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（１，３−ジオキサラン）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，４−ジクロロ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，５−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，３−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，３，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，６−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メトキシ−５−トリフルオロメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２，４−ジメトキシ）フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，５−ビス（トリフルオロメチル））フェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−フェニル）ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−メトキシ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−クロロ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｏ−トリフルオロメチル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｏ−フェニル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｍ−フェニル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−フェニル）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（ｐ−フェノキシ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（２，５−ジメトキシ）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−ベンジル）ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−２Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブチルアミド）ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−４−（４−アセトアミド）フェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｏ−フルオロ）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｍ−フルオロ）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｐ−フルオロ）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｏ−トリフルオロメチル）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｍ−トリフルオロメチル）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−３−（ｐ−トリフルオロメチル）アミノフェニルピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロクロマン−２，４’−ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−［（Ｓ）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）］ピペリジン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノジメチル−（２−メトキシ）フェニル；
からなる群から選択される。
【００７１】
さらに他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬は：
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−ベンズイミダゾール；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−２−ビフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−３−ビフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−４−ビフェニル；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−２−ナフタレン；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル；
Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−（３−アミノ−イソオキサゾリル）−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インダン−１，４’−ピペリジン］；
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１，４’−ピペリジン］；または
５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−オキソ−スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］）
からなる群から選択される。
【００７２】
式（Ｉ）の化合物が、少なくとも２つの不斉中心を有し、したがって、２つ以上の立体異性体で存在することが可能であることが理解されよう。本発明の化合物が、単一のジアステレオマーとして存在することが非常に望ましく、ここで、シクロヘキシルアラニンおよびイソロイシン残基の不斉炭素原子は、Ｌ−配置を有する。したがって、本発明は、シクロヘキシルアラニンおよびイソロイシン残基の少なくとも２つの不斉中心に対して実質的に純粋な、例えば、約９５％〜９７％のｄｅまたは９９％超のｄｅなどの約９０％超のｄｅの立体異性体の化合物、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物にも関する。このようなジアステレオマーは、例えばキラル中間体を用いた不斉合成によって調製されてもよく、または混合物は、従来の方法、例えば、クロマトグラフィー、または分割剤の使用によって分割され得る。
【００７３】
さらに、式（Ｉ）は、必要に応じて、溶媒和形態ならびに非溶媒和形態の化合物を包含することが意図される。したがって、各式は、水和形態ならびに非水和形態を含む、示される構造を有する化合物を含む。
【００７４】
本発明の化合物が塩として存在し得ることが理解されよう。本発明の新規な生物活性化合物は、薬学的に許容できる塩として被験体に投与され得る。しかしながら、薬学的に許容できない塩も、薬学的に許容できる塩の調製における中間体としてまたは生物学的研究のための手段としてこれらが有用であり得るため、本発明の範囲内に含まれることが理解されよう。
【００７５】
本発明の塩に適用されるおよび／または本発明の方法に使用される際の「薬学的に許容できる」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なリスク／治療ベネフィット比を超える過度の毒性、刺激、アレルギー、または同様の負の反応を伴わずに、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適した塩を指す。好ましくは、薬学的に許容できる塩は、患者に投与するのに適した塩である。したがって、本発明は、本発明の化合物のいずれか１つの薬学的に許容できる塩にも及ぶ。
【００７６】
薬学的に許容できる塩は、一般に、当該技術分野において公知であり、本発明の場合、本発明の化合物の比較的非毒性の有機塩または無機塩を含む。このような塩の例としては、以下に限定はされないが、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、酢酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ラウリルスルホン酸塩、グルコヘプトン酸塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ステアリン酸塩、パルミチン酸塩、吉草酸塩、安息香酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｈｔｈｙｌａｔｅ  ｓａｌｔ）、メシル酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩などの酸付加塩が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら，「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７年」，６６，１−１９を参照）。さらに、薬学的に許容できる塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類塩、およびアンモニウム塩などの塩基性塩も含まれる。例えば、薬学的に許容できる塩基性塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩が挙げられる。さらに、例えば、リジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカインおよびトリスの塩を含む有機塩も使用され得る。本発明の化合物中の塩基性窒素含有基は、例えば、アルキルハロゲン化物（メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物を含む低級アルキルハロゲン化物など）、長鎖ハロゲン化物（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物）、アラルキルハロゲン化物（例えば、ベンジルおよびフェネチルの臭化物）、ジアルキル硫酸塩（例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルの硫酸塩）を含む様々な有機作用物質で四級化され得る。
【００７７】
本発明の化合物の塩は、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、酢酸エチルなど、およびそれらの混合物との溶媒和物の形態で存在することもできる。
【００７８】
プロドラッグ誘導体も、本発明の範囲に含まれ、広義で、生体内で本発明の化合物に転化される化合物を包含する。このような誘導体は、当業者が容易に考え付くものであり、例えば、アルキルまたはアシル基、酸化物、糖類またはオリゴペプチドでさらに変性される化合物を含み、これらは、本体が容易に開裂されて、本発明に係る活性化合物が得られる。すなわち、「プロドラッグ」という用語は、生体内でその治療的に有効な形態または利用可能な形態に転化されるまで完全には有効でないかまたは利用可能でない本発明の前駆体または変性された化合物を指す。
【００７９】
本発明の化合物を調製するための方法が、本発明のさらなる実施形態として提供され、以下の一般的な手順によって示される。
【００８０】
化合物は、保護アミノ酸を用いて合成され得る。アミノ保護基は、一般に、当業者に公知であり、化学反応からアミノ基を保護する（またはブロックする）のに適しているが、所望の化学反応が分子中の他の位置で行われた後に容易に除去可能である基に関する。保護基が、所望の反応（または一連の反応）後に除去されるため、それらの性質およびサイズは特に重要でない。アミノ保護基の例としては、以下に限定はされないが、アセチル、プロピオニル、ブチリル、フェニルアセチル、ベンゾイルまたはトルイル基などのアシル保護基；アリールオキシ−アルカノイル保護基；メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルジカルボニル（Ｂｏｃ）、２−ヨードエトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル保護基；カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、４−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（Ｆｍｏｃ）などのアラルコキシカルボニル（ａｒａｌｋｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）保護基；または４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｒ）、ペンタメチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）または２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）などのアリールスルホニル保護基が挙げられる。好ましいアミノ保護基は、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、およびベンジルである、より好ましいアミノ酸保護基はＢｏｃである。
【００８１】
一般に、化合物は、Ｂｏｃ−保護されたイソロイシン残基、１種以上のカップリング試薬または活性化試薬およびＮ．Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ．Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＤＩＰＥＡ）などの塩基が好適な体積の溶媒に溶解された溶液相中で合成される。
【００８２】
アミノ基へのカルボキシル基のカップリングを進行させるためにカルボキシル基を活性化するのに使用されるカップリング試薬は、一般に、当業者に周知であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ：ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ：ＤＩＣ）などのカルボジイミドカップリング試薬ならびに１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム（ＨＡＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＯ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）などのトリアゾールカップリング試薬を含み得る。
【００８３】
一般に、上記の反応は、以下に限定はされないが、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ：ＮＭＰ）、トリフルオロエタノール（ｔｒｉｆｌｏｕｒｏｅｔｈａｎｏｌ：ＴＦＥ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：ＨＦＩＰ）、ジクロロメタノール（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｏｌ：ＤＣＭ）、またはクロロホルムを含む、溶液相ペプチド合成に適した溶媒または溶媒の混合物中で行われ得る。好ましい実施形態において、反応は、ＤＭＦ中で行われる。
【００８４】
次に、溶液は、式（Ｉ）の化合物の置換基Ｒ２およびＲ３によって表されるＣ末端部分を有するアミノに加えられ、反応が完了するまで撹拌される。一般に、反応は、室温で行われる。カップリング反応の完了は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＳＩ  ＭＳ）または他の形態の分光法によって決定される。
【００８５】
次に、中間化合物は、反応混合物から単離され、粗生成物は、ＤＣＭ中のトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＦＡ）の溶液で処理されて、イソロイシンＮ末端Ｂｏｃ−保護基が除去される。次に、溶液は、Ｎ２下で蒸発され、洗浄され、ろ過され、減圧下で蒸発される。次に、後続のアミノ酸およびＮ末端カルボン酸が、同じ条件下で順次カップリングされる。最終的な粗生成物が、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｒｐＨＰＬＣ）によって精製される。本発明の化合物は、高分解能質量分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＨＲＭＳ）およびプロトン核磁気共鳴分光法（ｐｒｏｔｏｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：１Ｈ  ＮＭＲ）によって特性決定され、化合物の純度が、分析的逆相ＨＰＬＣによって評価される。
【００８６】
本発明の化合物は、受容体を活性化するかまたは天然連結配位子の活性を阻害することによるＰＡＲ２活性を調節するそれらの能力によって特定されており、このため、本明細書において「作動薬」、「拮抗薬」、「阻害剤」、「ＰＡＲ２阻害剤」、「ＰＡＲ２の阻害剤」などと呼ばれる場合がある。特定の細胞型のまたは特定の方法で評価されたＰＡＲ２拮抗薬は、異なる細胞型のまたは異なる方法で評価されたＰＡＲ２作動薬または部分作動薬であってもよく、その逆も同様であることに留意することが重要である。例えば、１つの細胞型からの細胞内のカルシウムの放出を活性化する化合物が作動薬または部分作動薬である一方、このような放出を阻害する化合物が拮抗薬であり得る。しかしながら、これらの「作動薬」および「拮抗薬」の効果は、異なる細胞において所与の化合物またはＰＡＲ２配位子で逆になることがあり、または逆の反応が、異なる報告アッセイ（例えばＥＲＫリン酸化またはｃＡＭＰ刺激）を用いて観察され得る。
【００８７】
本明細書における「ＰＡＲ２拮抗薬」という用語は、天然の連結配位子または合成ＰＡＲ２作動薬への受容体の曝露の後の細胞内カルシウムの放出を少なくとも阻害する化合物を指す。例えば、実施例に記載されるアッセイなどの細胞に基づいたインビトロアッセイの使用によって、このような化合物を決定するための技術が当業者には周知である。
【００８８】
本発明の「拮抗薬」、「阻害剤」、「ＰＡＲ２阻害剤」または「ＰＡＲ２の阻害剤」は、天然連結配位子などの天然作動薬によって、ＰＡＲ２受容体に結合し、ＰＡＲ２受容体の活性化を阻害する化合物であり、ＰＡＲ２受容体の拮抗薬ならびに受容体の逆作動薬として働く化合物を含む。拮抗薬が、受容体において結合する作動薬によって誘発される活性化を阻止することによって作用する一方、逆作動薬も、受容体を占有し、作動薬の非存在下で受容体活性化の構造レベルを減少させることによって機能する。本発明の化合物がＰＡＲ２の活性化を阻害する能力は、熟練した取扱者が利用可能な任意の数の手段、例えば、実施例に記載される方法などの、細胞内カルシウム動員を含むいくつかの下流マーカーに対するＰＡＲ２阻害の効果を測定するインビトロアッセイ、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｃＡＭＰ）刺激またはＥＲＫ１／２リン酸化によって評価され得る。
【００８９】
「配位子」という用語は、受容体の特異的結合パートナーを指し、これには、以下に限定はされないが、受容体作動薬、部分作動薬、混合された作動薬、拮抗薬および薬剤などの、天然連結ＰＡＲ２配位子ならびに結合されていない内因性の細胞外配位子が含まれる。「受容体」という用語は、配位子の特異的結合パートナーを指し、これには、限定はされないが膜結合受容体が含まれる。
【００９０】
本発明の化合物がＰＡＲ２を調節する能力は、当業者に利用可能な何種類もの手段、例えば、実施例に記載される方法などの、細胞内カルシウム動員を含むいくつかの下流マーカーに対するＰＡＲ２調節の効果を測定するインビトロアッセイ、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｃＡＭＰ）刺激またはＥＲＫ１／２リン酸化によって評価され得る。
【００９１】
好ましくは、理論に制約されるものではないが、本発明の化合物は、受容体に結合することによって、また、天然連結配位子が受容体結合領域に接触し、または連結配位子と競合し、または受容体の他の箇所に結合して拮抗薬活性の作動薬を誘発するのを防ぐことによって、ＰＡＲ２の活性化を阻害または増幅する。ＰＡＲ２の拮抗薬は、以下に限定はされないが、本明細書に記載される結合されていない内因性配位子および合成作動薬を含む、ＰＡＲ２に対する他の配位子の活性を阻害することによって作用することもできる。
【００９２】
活性化プロテアーゼの非存在下でＰＡＲ２に結合し、それを活性化する本発明の化合物も、本発明のある態様のために好ましい。
【００９３】
本発明の一態様において、細胞を、化合物、またはその塩に曝露する工程を含む、ＰＡＲ２の活性を調節する方法が提供される。細胞を、化合物、またはその塩に曝露する工程は、インビトロ、生体外または生体内で行われ得る。
【００９４】
例えば、細胞を化合物に曝露する工程がインビトロまたは生体外で行われる場合、本発明の方法は、生物学的研究のための手段としてまたは被験体におけるＰＡＲ２活性を調節するための特定の化合物（単独でまたは組み合わせて）の効力を測定するための診断手段として使用され得る。例えば、ＰＡＲ２を発現する細胞は、被験体から除去され、本発明の１種以上の化合物、またはその塩に曝露され得る。化合物（または複数の化合物）がＰＡＲ２の活性を調節する能力は、当業者に公知の方法によっていくつかの下流マーカーのいずれか１つを測定することによって評価され得る。したがって、特定の化合物が別の化合物より有効であるかどうかを確認し、具体的な治療計画を該当する被験体に合わせて調整することができる。
【００９５】
好ましい実施形態において、細胞を、化合物、またはその塩に曝露する工程は生体内で行われる。
【００９６】
本発明の一実施形態において、異常なＰＡＲ２発現および／または活性に関連する疾病または疾患のリスクがあるかまたはそれに罹患しやすい被験体、またはその疾病または疾患に罹患している被験体を処置する予防または治療方法が提供される。具体的な疾病および疾患としては、以下に限定はされないが、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、膵炎、心血管疾患、胃潰瘍、大腸炎、喘息、線維症および線維性疾患、血管炎症などの急性および慢性炎症性疾患、ならびにてんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および線維性疾患、心血管疾患などの炎症性疾患に関連する他の病態、ならびに胃、結腸、大腸、乳房、膵臓、脳または肝臓の癌などを含むがこれらに限定されない癌などの増殖性疾患が挙げられる。
【００９７】
好ましい実施形態において、予防または治療方法は、本明細書に記載される望ましくないまたは不十分なＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を有する被験体に、その疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を治療し、治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、修正し、改善し、好転させ、またはそれに作用するために、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容できる塩を投与する工程を含む。予防的治療は、望ましくないまたは不十分なＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患の発症率を低下させ得る。
【００９８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドロームを治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＰＡＲ２拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。
【００９９】
「メタボリック・シンドローム」は、以下に限定はされないが、腹部肥満、脂肪炎症、脂質異常症、高血糖、血栓形成促進性状態および高血圧症を包含し、これらは、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性および心血管疾患の発症の個体のリスクを上昇させる（Ｖａｎ  Ｇａａｌ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４，８７５−８０；Ｒｅａｖｅｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９８８，３７，１５９５−１６０７；Ｄａｎｄｏｎａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５，１１１，１４４８−５４；Ｚｉｍｍｅｔ，Ｐ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｄ  Ｊ  Ａｕｓｔ  ２００５，１８３，１７５−６；Ｆｅｒｒａｎｎｉｎｉ，Ｅ．，Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ２００６，３８，４２−５１；Ｓｙｍｏｎｄｓ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００９）。メタボリック・シンドロームには、以下に限定はされないが、過剰な内臓脂肪沈着、高血圧症、グルコースおよびインスリン恒常性異常、インスリン抵抗性、内皮障害、心血管肥大、炎症、血管炎症、アテローム性動脈硬化症、心室収縮機能不全、線維症および脂肪肝疾患などの合併症が伴う（Ｖａｎ  Ｇａａｌ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４，８７５−８０；Ｚｉｍｍｅｔ，Ｐ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｊ  Ａｕｓｔ  ２００５，１８３，１７５−６）。
【０１００】
飽和脂肪および加工糖を多く含む食事は、脂肪組織中に脂肪酸およびグルコースを過剰に吸収させ、免疫細胞の浸潤および炎症ストレス経路の活性化を促進し、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、高脂血、高血圧症および心血管疾患を引き起こす。炎症および代謝過程は、共通の細胞内標的、ＰＡＲ２を有するいくつかのタンパク質分解酵素によって媒介される。理論に制約されるものではないが、肥満が、脂肪組織、主に、マクロファージなどの脂肪免疫細胞におけるＰＡＲ２発現の増加と生体内で相関することが理論化されている。一般的な食物脂肪である、パルミチン酸は、ヒトマクロファージにおけるインビトロでのＰＡＲ２発現を増加させ、ＰＡＲ２拮抗薬によって阻害され得る炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１β、ＩＬ−６）のＰＡＲ２誘発性分泌を増幅する。したがって、ＰＡＲ２発現は、肥満と相関し、食餌脂肪酸によって刺激される有望な新規なバイオマーカーである。ＰＡＲ２活性化は、炎症／代謝機能不全の実質的な原因であり、ＰＡＲ２拮抗作用は、食餌性肥満ならびに炎症、代謝および心血管機能不全を予防および治療するのに有効である。
【０１０１】
したがって、一実施形態において、本発明は、肥満を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＰＡＲ２拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＩＩ型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＰＡＲ２拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、線維症を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＰＡＲ２拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＰＡＲ２拮抗薬を投与する工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態において、ＰＡＲ２拮抗薬は、本発明に係る式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬であろう。
【０１０２】
研究により、ＰＡＲ２が、様々な疾病において炎症反応を促進することが示されている。ＰＡＲ２は、トリプシン、肥満細胞トリプターゼおよび組織因子ＶＩＩＡを含む多くのセリンプロテアーゼおよび他のプロテアーゼによって活性化され、多くのセリンプロテアーゼおよび他のプロテアーゼは、体重増加に重要であり得る脂肪組織マクロファージの調節に寄与する可能性がある。しかしながら、ＰＡＲ２は、多くのこのようなプロテアーゼ酵素の主要な細胞内標的であるため、複数の活性化プロテアーゼの何らかの影響を阻止するための考えられる治療標的である。理論によって本発明を制約することを意図するものではないが、パルミチン酸などの、洋風の食事に豊富な脂肪酸が、マクロファージ、ならびに脂肪細胞および脂肪免疫細胞などの免疫細胞上および免疫細胞中のＰＡＲ２の発現の増加に主に関与する内因性の要因として働き得ると仮定される。脂肪酸および多くのプロテアーゼはまた、ＰＡＲ２の発現を上方制御し得ることも提案される。次に、ＰＡＲ２は、様々な増加した循環プロテアーゼおよびおそらくこれまでに報告されていない内因性作動薬によって切断されて、食餌性肥満の際の脂肪組織炎症ならびに代謝および心血管機能不全が誘発される。
【０１０３】
したがって、第２の仮説は、ＰＡＲ２の拮抗薬が、マクロファージ、他の免疫細胞、脂肪細胞、膵臓細胞および肝細胞における任意のＰＡＲ２に媒介される下流のシグナル伝達を制御し、それによって、メタボリック・シンドロームに対する内因性プロテアーゼの影響を緩和するのに有効であり得ることである。したがって、強力かつ特異的なＰＡＲ２拮抗薬が、食餌性肥満およびメタボリック・シンドロームを緩和し得ると想定される。
【０１０４】
本発明の予防または治療方法は、本明細書に記載される望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を有する被験体に、その疾病または疾患、その疾病または疾患の症状、またはその疾病または疾患になりやすい傾向を治療し、治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、修正し、改善し、好転させ、またはそれに作用するために、本発明に係る化合物、またはその薬学的に許容できる塩の組合せを投与する工程も含み得る。予防的治療は、望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患の発症率を低下させ得る。ある実施形態において、本発明の化合物またはその薬学的に許容できる塩の組合せは、本発明の化合物またはその薬学的に許容できる塩の１つのみを用いる予防または治療方法と比較して、ＰＡＲ２活性の阻害の強化を提供し得る。
【０１０５】
本明細書に記載される予防または治療方法が、当該技術分野において現在用いられている他の治療法との何種類もの組合せで使用され得ることも、当業者によって理解されよう。
【０１０６】
ＰＡＲ２発現および／または活性が増大または減少される条件、および前記活性を減少または増大させることが望ましい条件が、当該技術分野において公知の診断または予測アッセイのいずれかまたはその組合せによって、当業者によって特定され得る。例えば、被験体から得られる生物試料（例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、脂肪組織、脳組織および／またはそれに由来する細胞）が、ＰＡＲ２発現および／または活性について分析され得る。このような病態としては、以下に限定はされないが、関節炎、結腸炎および炎症性腸疾患、膵炎、肝臓、腎臓および泌尿生殖器系の疾病、心血管疾患、脳卒中、胃潰瘍、喘息、線維症および線維性疾患などの自己免疫または炎症性疾患、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満およびＩＩ型糖尿病、代謝障害、消化器疾患、神経変性疾患および呼吸器疾患、皮膚および皮下組織の疾病、筋肉、骨および腱の疾病などの炎症性疾患に関連する他の病態、ならびに胃、結腸、大腸、乳房または膵臓の癌を含む癌などの増殖性疾患が挙げられる。
【０１０７】
上記の方法は、以下に限定はされないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラットおよびマウスを含む全ての哺乳動物、ならびにニワトリ、鳥類、は虫類および細菌などの下等生物を含む任意の種の予防および治療処置に適していると考えられる。
【０１０８】
別の実施形態において、望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患の予防または治療処置のための、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のためのＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。
【０１１０】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための、本発明に係る式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物であり得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明は、望ましくないＰＡＲ２活性に関連する疾病または疾患の予防または治療処置のための薬剤の製造における、本明細書において定義される式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）の化合物であり得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造のためのＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。
【０１１３】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、メタボリック・シンドローム、肥満、ＩＩ型糖尿病、線維症および心血管疾患から選択される疾病または疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明に係る式（Ｉ）の化合物によって表されるＰＡＲ２拮抗薬の使用を提供する。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物であり得る。
【０１１４】
本発明の別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物、またはその塩（本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる）を含む医薬組成物が提供される。好ましい実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤および／または補助剤を含み得る。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、単独でまたは治療用化合物などの他の化合物とともに用いられ得る。
【０１１６】
本明細書において使用される際の「薬学的に許容できる担体」という用語は、好ましくは、医薬品投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１１７】
医薬組成物は、一般に、その意図される投与経路と適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための作用物質を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基を用いて調整され得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで作製された、アンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアルに封入され得る。
【０１１８】
注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌注射溶液または分散体の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散体および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は、無菌でなくてはならず、容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度の流体であるべきである。
【０１１９】
それは、製造および貯蔵の条件下で安定性であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、または液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒度の維持によってまたは界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの組み込みによって達成され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、またはソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含むことによってもたらすことができる。
【０１２０】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上に挙げた成分の１つまたはその組合せとともに適切な溶媒に所要量の活性化合物を組み込んだ後、ろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および上に挙げたものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、その予め滅菌ろ過された溶液から、活性成分の粉末に加えて任意のさらなる所望の成分が得られる。
【０１２１】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口の治療的投与のため、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、シロップ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物は、オリーブ油または他の油、または洗口剤として使用するための流体などの流体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合される結合剤、および／または補助剤材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチなどが、以下の成分、または同様の性質を有する化合物：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；でんぷんまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（ｓｔｅｒｏｔｅ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、メチルサリチル酸塩、またはオレンジ香料などの着香料のいずれかを含有し得る。
【０１２２】
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器またはディスペンサー、または噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０１２３】
全身投与も、経粘膜または経皮手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、透過されるバリアに適切な浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は、一般に、当該技術分野において公知であり、これには、例えば、経粘膜投与のため、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与が、鼻腔用スプレーまたは坐薬を用いて行われ得る。化合物は、坐薬（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む）または直腸投与用の停留かん腸の形態で調製され得る。
【０１２４】
経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野において一般に公知の軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームへと製剤化される。
【０１２５】
一実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、徐放性製剤などの、化合物が身体から急速に排除されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかである。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社およびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品として得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的としたリポソームを含む）を、薬学的に許容できる担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されるように、当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。
【０１２６】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態の経口または非経口組成物を製剤化することが有利である。本明細書において使用される際の「投薬単位形態」は、好ましくは、治療される被験体の単回の投薬として適した物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体と合わせて、所望の治療効果を生じるように計算される所定の量の活性化合物を含有する。
【０１２７】
本発明に係る医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
【０１２８】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％致死量）およびＥＤ５０（個体群の５０％に治療効果のある用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な医薬的手順によって決定され得る。毒性作用と治療効果との用量比は、治療指数であり、それは、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方、非感染細胞への考えられる損傷を最小限に抑えるために、このような化合物を罹患組織の部位に標的化し、それによって副作用を軽減する送達系を設計することに注意を払うべきである。
【０１２９】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投薬量を配合するのに使用され得る。投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意の化合物では、治療効果のある用量を、細胞培養アッセイから最初に推測することができる。用量は、細胞培養中で決定される際にＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲を達成するように、動物モデル中で配合され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中濃度が、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１３０】
当業者は、用いられる特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時期、投与経路、排せつ速度、任意の複合薬、調節される発現または活性の程度、疾病または疾患の重症度、前処置および存在する他の疾病を含む特定の要因が、被験体を有効に治療するのに必要な投薬量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。
【０１３１】
上記の適応症では、適切な投薬量は、例えば、用いられる化合物、被験体の年齢、性別、体重および全身的な身体状態、投与形態、病態の性質および／または重症度または所望の効果に応じて変わることになる。これらの特徴のバランスを取ることによって、適切な投薬量を決定することは十分に医師の一般技能の範囲内である。ただし、例として、好適な１日投薬量は、約０．１〜約２０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．２〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．５〜約２００ｍｇ／体重ｋｇ、さらにより好ましくは約１〜約５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内である。
【０１３２】
本発明に使用される手順の実施例が、これ以降により詳細に説明される。しかしながら、以下の説明があくまで例示的なものであり、上述した本発明の一般性に対する限定として決して解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【０１３３】
一般式（Ｉ）の化合物を調製するための方法
以下の実施例は、本発明の代表例であり、本発明の例示的な化合物を調製するための詳細な方法を提供する。
【０１３４】
一般的なアミノ酸カップリング手順（Ａ）：
化合物を、例えば、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ−保護されたアミノ酸を用いて溶液相中で合成することができる。一実施例において、Ｂｏｃ−保護されたイソロイシン（１．２〜１．５当量）を、ＤＭＦ（０．２〜０．５Ｍ）中のＨＢＴＵまたはＢＯＰ（１．５当量）およびＤＩＰＥＡ（１．５当量）を用いて１０分間活性化した。次に、溶液を遊離アミンに加え、反応が完了するまで混合物を撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で（２回）洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空中で乾燥させた。次に、粗生成物をＤＣＭ中２０％のＴＦＡで処理し、１〜２時間撹拌して、Ｂｏｃ−保護基を除去した。反応混合物をＮ２下で蒸発させることによってＴＦＡを除去した。残渣をＤＣＭに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３で（２回）洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、ろ過し、真空中で蒸発させた。次に、Ｂｏｃ−保護されたシクロヘキシルアラニンアミノ酸（Ｂｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ）および任意に置換される複素環カルボン酸を、同じ条件下で順次カップリングした。各カップリング反応をＥＳＩ  ＭＳによって監視したところ、大抵の反応は一晩で完了した。
【０１３５】
一般的なＨＰＬＣ精製および分析方法：
全ての粗生成物を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８カラム（３００Å、２１．２×２５０ｍｍ）を用いて、調整可能な吸光度検出器（λ  ２１４ｎＭ）を備えた半分取ｒｐＨＰＬＣによって精製した。精製された化合物を、ＨＲＭＳおよび１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚまたは６００ＭＨｚ）によって特性決定し、純度を、分析ｒｐＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８カラム、３００、４．６×２５０ｍｍ、λ  ２１４、２３０および２５４ｎｍ）によって評価した。全ての化合物は、９５％以上の純度であった。
【０１３６】
分析ｒｐＨＰＬＣ方法：５０〜１００％のＢで１０分間、１００％のＢでさらに１０分間
溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％のＴＦＡ、溶媒Ｂ：１０％のＨ２Ｏ中０．１％のＴＦＡ、９０％のアセトニトリル（半分取および分析ｒｐＨＰＬＣの場合）。
高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＨＲＭＳ）測定値を、内部標準物質としてギ酸ナトリウムクラスターを用いて、１００μＬ／時におけるＭｅＣＮへの直接注入によって陽イオンモードでＤｉｏｎｅｘ  ＬＣシステム（Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒＯＴＯＦ質量分析計において得た。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３．４ソフトウェアを用いてデータを処理した。質量精度は、１ｐｐｍの誤差より良好であった。
【０１３７】
実施例１．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−フルオロ）フェニル（６）の調製。
【化８】
2014524923.tif 000010
スキーム１．ａ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ
化合物６を、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ０．７９〜０．８６（ｍ，８Ｈ）、０．８８〜０．９８（ｍ，１Ｈ）、１．０１〜１．２３（ｍ，５Ｈ）、１．２７〜１．３７（ｍ，１Ｈ）、１．３９〜１．４９（ｍ，１Ｈ）、１．６３〜１．７７（Ｈ２ＯピークとのＨの重なり）、１．８１〜１．８８（ｍ，１Ｈ）、４．４０〜４．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１４．８Ｈｚ）、４．５１〜４．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１４．８Ｈｚ）、４．７０〜４．７６（ｍ，１Ｈ）、６．６３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、６．８７〜６．８９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、６．９１〜６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．００〜７．１０（ｍ，２Ｈ）、７．２２〜７．３６（ｍ，３Ｈ）、８．３０〜８．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋４８７．２７１５（Ｃ２６Ｈ３６ＦＮ４Ｏ４＋についての計算値）４８７．２７１８（実測値）。
【０１３８】
実施例２．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル（１８）の調製。
【化９】
2014524923.tif 000011
スキーム２．ａ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ。
化合物１８を、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８２〜０．８６（ｍ，７Ｈ）、０．８８〜１．００（ｍ，２Ｈ）、１．０４〜１．２２（ｍ，１Ｈ）、１．２５〜１．３７（ｍ，２Ｈ）、１．４０〜１．４６（ｍ，１Ｈ）、１．５９〜１．７３（ｍ，７Ｈ）、１．７７〜１．８４（ｍ，２Ｈ）、３．８６（ｓ，３Ｈ）、４．１９〜４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，８．８Ｈｚ）、４．３７〜４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６、１４．４Ｈｚ）、４．４６〜４．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６，１４．４Ｈｚ）、４．６０〜４．６５（ｍ，１Ｈ）、６．１９〜６．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）、６．５０〜６．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．８７〜６．９３（ｍ，３Ｈ）、６．９９〜７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．２３〜７．２９（ｍ，２Ｈ）、８．３３１〜８．３３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋４９９．２９１５（Ｃ２７Ｈ３９Ｎ４Ｏ５＋についての計算値）４９９．２９１５（実測値）
【０１３９】
実施例３．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（２−イソプロポキシ）フェニル（２４）の調製。
【化１０】
2014524923.tif 000012
スキーム３．ａ）２−ヨードプロパン、ＤＢＵ、１４０℃；ｂ）ＮＨ２ＯＨ；ｃ）Ｚｎ、ＨＣＯＯＮＨ４
工程ａ：マイクロ波反応バイアル中に、サリチルアルデヒド（１当量）、ＤＭＦ、ＤＢＵ（１当量）および対応する２−ヨードプロパンを入れた。容器を密閉し、混合物にＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒマイクロ波反応器（１４０℃、１０分間）において照射した。反応の進行を、ＴＬＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ  ４：１、生成物Ｒｆ約０．５）によって監視した。完了したら、反応混合物を冷まし、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和Ｎａ２ＣＯ３で（３回）洗浄して、出発材料サリチルアルデヒドを除去した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、黄色の液体としての生成物（７０％の収率）が得られ、それをさらに精製せずに使用した。
【０１４０】
工程ｂ：得られたアルデヒドを、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）中のヒドロキシルアミン塩酸塩（２当量）およびＮａＯＨ（４当量）で処理し、室温で１時間撹拌した。完了した後、反応溶液を蒸発乾固させ、次に、ＥｔＯＡｃに再度溶解させ、１ＭのＨＣｌで（２回）、飽和ＮａＨＣＯ３で（２回）および塩水で（１回）洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、ワックス質の固体（９０％の収率）が得られた。
【０１４１】
工程ｃ：出発材料のＭｅＯＨ中のオキシムに、ギ酸アンモニウム（２当量）および亜鉛末（２当量）を加え、反応混合物を１時間還流させた。反応混合物を、セライトパッドを通してろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、ろ液を蒸発させた。不純粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した。一般的なアミノ酸カップリング手順Ａに記載されるように、精製されたアミンを、Ｂｏｃ−保護されたイソロイシンにカップリングして、２４を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）、δ  ０．８１〜０．８７（ｍ，６Ｈ）、０．８７〜１．０１（ｍ，２Ｈ）、１．０６〜１．３４（ｍ，６Ｈ）、１．３６〜１．３８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ）、１．４０〜１．４９（ｍ，１Ｈ）、１．６３〜１．７３（ｍ，６Ｈ）、１．７６〜１．８４（ｍ，１Ｈ）、４．１９〜４．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，９．０Ｈｚ）、４．３８〜４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１４．４Ｈｚ）、４．４４〜４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１４．４Ｈｚ）、４．５９〜４．６５（ｍ，２Ｈ）、６．２１〜６．２３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ）、６．５８〜６．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、６．８６〜６．８９（ｍ，２Ｈ）、６．９１〜６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、７．０１〜７．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）、７．２２〜７．２４（ｍ，１Ｈ）、８．３３〜８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５２７．３２２８（Ｃ２９Ｈ４３Ｎ４Ｏ５＋についての計算値）５２７．３２３１（実測値）。
【０１４２】
実施例４．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（１，３−ジオキサラン）フェニル（２６）の調製。
【化１１】
2014524923.tif 000013
スキーム４．ａ）ＣＨ２Ｂｒ２、ＣｕＯ、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、１６０℃；ｂ）Ｈ２ＮＯＨ、ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ；ｃ）ＮＨ４ＣＨＯ、Ｐｄ／Ｃ。
工程ａ：ＤＭＦ（１６ｍＬ）を含む丸底フラスコ中に、２，３−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２．０ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）、ジブロモメタン（１．４ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）、酸化第二銅（０．１１ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．４ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を、１６０℃で一晩還流させた。反応混合物を、セライトパッドを通してろ過し、ろ過ケーキをＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液をＨ２Ｏで（３回）洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、暗褐色の油が得られた。Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留装置（沸点１２０℃／０．１ｍｍ）を用いて油を蒸留したところ、黄色の油としての生成物（１．５ｇ、６９％の収率）が得られた。
【０１４３】
工程ｂ：得られたアルデヒドを、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）中のヒドロキシルアミン塩酸塩（２当量）およびＮａＯＨ（４当量）で処理し、室温で１時間撹拌した。完了した後、反応溶液を蒸発乾固させ、次に、ＥｔＯＡｃに再度溶解させ、１ＭのＨＣｌで（２回）、飽和ＮａＨＣＯ３で（２回）および塩水で（１回）洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、白色の固体（７０％の収率）が得られた。
【０１４４】
工程ｃ：出発材料のＭｅＯＨ中のオキシム（２．５ｍｍｏｌ）に、ギ酸アンモニウム（２当量）およびＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ）を加え、反応混合物を、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を、セライトパッドを通してろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、ろ液を蒸発させた。不純粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した。一般的なアミノ酸カップリング手順Ａに記載されるように、精製されたアミンを、Ｂｏｃ−保護されたイソロイシンにカップリングして、２６を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、δ  ０．８４〜０．９０（ｍ，６Ｈ）、０．９０〜１．０１（ｍ，２Ｈ）、１．０５〜１．２３（ｍ，４Ｈ）、１．２９〜１．３７（ｍ，１Ｈ）、１．４３〜１．５０（ｍ，１Ｈ）、１．６０〜１．７５（ｍ，６Ｈ）、１．７６〜１．８１（ｍ，１Ｈ）、１．８４〜１．９２（ｍ，１Ｈ）、４．２５〜４．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，９．０Ｈｚ）、４．３９〜４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６，１５Ｈｚ）、４．４７〜４．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６，１５Ｈｚ）、４．６２〜４．６６（ｍ，１Ｈ）、５．９６〜５．９７（ｍ，２Ｈ）、６．１９〜６．２４（ｍ，１Ｈ）、６．５２〜６．５８（ｍ，１Ｈ）、６．７４〜６．８０（ｍ，３Ｈ）、６．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、７．０３〜７．０８（ｍ，１Ｈ）、８．３３〜８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＮａ］＋５３５．２５２７（Ｃ２７Ｈ３６Ｎ４Ｎａ１Ｏ６＋についての計算値）５３５．２５２８（実測値）。
【０１４５】
実施例５．式（２７）によって表される５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノメチル−（３，４−ジクロロ）フェニルの調製。
【化１２】
2014524923.tif 000014
スキーム５．ａ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ
化合物２７を、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．７９〜０．８２（ｍ，６Ｈ）、０．８５〜０．９１（ｍ，２Ｈ）、１．０３〜１．１６（ｍ，４Ｈ）、１．２３〜１．２９（ｍ，１Ｈ）、１．４０〜１．４７（ｍ，１Ｈ）、１．４８〜１．５３（ｍ，１Ｈ）、１．５６〜１．７６（ｍ，７Ｈ）、４．１５〜４．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．２２〜４．３０（ｍ，２Ｈ）、４．５４〜４．５８（ｍ，１Ｈ）、７．１５〜７．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、７．２１〜７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，７．８Ｈｚ）、７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、８．０４〜８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、８．５８〜８．６０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ）、８．７５〜８．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、８．９３〜８．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５３７．２０３０（Ｃ２６Ｈ３５Ｃｌ２Ｎ４Ｏ４＋についての計算値）５３７．２０２８（実測値）。
【０１４６】
実施例６．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−（４−フェニル）ピペリジン（３０）の調製。
【化１３】
2014524923.tif 000015
スキーム６．ａ）Ｍｇ、ＴＨＦ、６５℃；ｂ）Ｐｄ／Ｃ、触媒ＨＣｌ、５０ｐｓｉ；ｃ）ＴＨＦ中４ＭのＨＣｌ
工程ａ：グリニャール反応：乾燥した、窒素充填した二つ口丸底フラスコに、削り屑状マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｔｕｒｎｉｎｇ）（５００ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）、少量のヨウ素結晶および乾燥ＴＨＦ（３．８ｍＬ）を入れた。温水浴（５５〜６５℃）中で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中のブロモベンゼン（２０．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥したシリンジに入れ、溶液の１／３を、フラスコ中にゆっくりと移して、反応を開始させた（注：色がゆっくりと暗褐色から淡褐色へと変化した）。混合物が沸騰し始めたら、水浴を除去し、混合物を、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）で希釈した。次に、残っているブロモベンゼン溶液をフラスコにゆっくりと加えた。混合物を２０分間還流させた（６５℃）後、混合物を氷水浴中で冷却し、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中の１−Ｂｏｃ−４−ピペリドン（２ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加した（その間、白色の固体が形成された）。添加したら、混合物を室温でさらに３０分間撹拌した。１０％のクエン酸の冷却された溶液を加え、混合物を１分間撹拌した（結果として、粘着性の固体が形成された）。ジエチルエーテルおよび水を加えて、固体を溶解させ、層を分離させた。水層をエーテルで（２回）洗浄した。組み合わされた有機層を、水で（１回）洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空中で蒸発させた。粗生成物を、石油スピリット／酢酸エチル（４：１）で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ、白色の結晶の生成物（０．９６ｇ、３４．５％の収率）が得られた。
【０１４７】
工程ｂ：水素化分解：ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中の、上記の粗生成物（２００ｍｇ）と、１０％のＰｄ／Ｃと、触媒量の濃ＨＣｌ（１．２ｍＬ）との混合物を、５０ｐｓｉで１時間水素化した。Ｐｄ／Ｃを、セライトパッドを通してろ過し、溶媒を真空中で蒸発させた。
【０１４８】
工程ｃ：Ｂｏｃ脱保護：上記の粗生成物を、ＴＨＦ（４ｍＬ）中４ＭのＨＣｌ（４ｍＬ）で１時間処理した。ＴＨＦ溶媒およびＨＣｌを蒸発させ、残渣をＤＣＭに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３で（２回）洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空中で蒸発させた。一般的なアミノ酸カップリング手順Ａに記載されるように、残渣アミン（１１０．４ｍｇ、９５％の収率）を、Ｂｏｃ−保護されたイソロイシンにカップリングして、３０を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８４〜１．０２（ｍ，７Ｈ）、１．０８〜１．２６（ｍ，４Ｈ）、１．３２〜１．５４（ｍ，２Ｈ）、１．５７〜１．８３（ｍ，１０Ｈ）、１．９４〜２．０５（ｍ，３Ｈ）、２．６８〜２．８３（ｍ，２Ｈ）、３．１６〜３．２６（ｍ，１Ｈ）、４．１１〜４．２０（ｍ，１Ｈ）、４．６４〜４．７２（ｍ，１Ｈ）、４．７３〜４．８０（ｍ，１Ｈ）、４．８７〜４．９３（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、６．７６〜６．８４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．９３〜６．９５（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０５〜７．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．１７〜７．２５（ｍ，３Ｈ）、７．２９〜７．３４（ｍ，２Ｈ）、８．３３〜８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５２３．３２７９（Ｃ３０Ｈ４３Ｎ４Ｏ４＋についての計算値）５２３．３２８０（実測値）。
【０１４９】
実施例７．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］（３７）の調製。
【化１４】
2014524923.tif 000016
スキーム７．ａ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ
化合物を、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、δ  ０．８５〜１．００（ｍ，８Ｈ）、１．１１〜１．２４（ｍ，６Ｈ）、１．４９〜１．５９（ｍ，３Ｈ）、１．６０〜１．７２（ｍ，６Ｈ）、１．７４〜１．８５（ｍ，４Ｈ）、１．８６〜２．００（ｍ，１Ｈ）、２．０１〜２．２２（ｍ，１Ｈ）、２．７７〜２．８２（ｍ，１Ｈ）、３．１５〜３．２８（ｍ，１Ｈ）、３．５７〜３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．９２〜４．００（ｍ，１Ｈ）、４．４０〜４．４７（ｍ，１Ｈ）、４．６８〜４．７６（ｍ，１Ｈ）、４．８８〜４．９２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、６．６８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、６．８２〜７．１４（ｍ，４Ｈ）、７．３１〜７．５７（ｍ，１Ｈ）、８．３４〜８．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５６５．３３８４（Ｃ３２Ｈ４５Ｎ４Ｏ５＋についての計算値）５６５．３３８５（実測値）。
【０１５０】
実施例８．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−アミノジメチル−（２−メトキシ）フェニル（３９）の調製。
【化１５】
2014524923.tif 000017
スキーム８．ａ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ
化合物３９を、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ０．７５〜０．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．７８〜０．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、０．８６〜０．８８（ｍ，４Ｈ）、０．９０〜０．９６（ｍ，２Ｈ）、１．００〜１．１５（ｍ，３Ｈ）、１．１８〜１．２２（ｍ，１Ｈ）、１．３２〜１．３８（ｍ，１Ｈ）、１．４５〜１．５９（ｍ，２Ｈ）、１．６０〜１．７８（ｍ，６Ｈ）、１．８３〜１．８８（ｍ，１Ｈ）、２．８０（ｓ，１Ｈ）、３．０９（ｓ，２Ｈ）、３．８２（ｓ，３Ｈ）、４．３〜４．６５（ｍ，４Ｈ）、６．８６〜６．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、６．９４〜６．９６（ｍ，１Ｈ）、７．０１〜７．１１（ｍ，１Ｈ）、７．１９〜７．２０（ｍ，１Ｈ）、７．２６〜７．３３（ｍ，１Ｈ）、８．３３〜８．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）、８．７８〜８．７９（ｍ，１Ｈ）、８．９６〜８．９９（ｍ，１Ｈ）。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５１３．３０７１（Ｃ２８Ｈ４１Ｎ４Ｏ５＋についての計算値）５１３．３０７１（実測値）。
【０１５１】
実施例９．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル（４０）の調製。
【化１６】
2014524923.tif 000018
スキーム９．ａ）ＤＭＦ中のＭｅＩ、ＬｉＯｔＢｕ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール−５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ
工程ａ：Ｂｏｃ−Ｔｈｒ−アミノメチル−（２−メトキシ）フェニル（０．５４１ｍｍｏｌ、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって２−メトキシベンジルアミンおよびＢｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨから調製された）の粗生成物を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた。リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２８．４ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。ヨウ化メチル（３７μＬ、０．５９５ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、ロタベーパ（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で蒸発乾固させた。
【０１５２】
工程ｂ〜ｅ：一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって、上記の粗生成物を脱保護し、Ｂｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨおよびイソオキサゾール−５−カルボン酸と順次カップリングして、化合物４０を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）、δ  ０．８５〜１．４０（ｍ，９Ｈ）、１．６０〜１．８１（ｍ，７Ｈ）、３．３７（ｓ，３Ｈ）、３．７７〜３．８４（ｍ，１Ｈ，Ｔｈｒのβ−ＣＨ）、３．８４（ｓ，３Ｈ）、４．３８〜４．４６（ｍ，２Ｈ、ＰｈＣＨ２）、４．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，３．２Ｈｚ，Ｔｈｒのα−ＣＨ）、４．６３〜４．６９（ｍ，１Ｈ，Ｃｈａのα−ＣＨ）、６．８４〜６．９１（ｍ，３Ｈ）、７．０２〜７．１２（ｍ，３Ｈ）、７．２１〜７．２７（ｍ，２Ｈ）、８．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）、δ  １７１．４、１６８．７、１６２．２、１５７．４、１５５．６、１５１．０、１２９．５、１２９．０、１２５．７、１２０．６、１１０．２、１０６．９、７５．６、５６．９、５５．６、５５．２、５１．４、４０．２、３９．７、３４．１、３３．６、３２．５、２６．２、２６．０、２５．９、１４．０。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５０１．２７０８（Ｃ２６Ｈ３７Ｎ４Ｏ６＋についての計算値）５０１．２７０８（実測値）。
【０１５３】
実施例１０．５−（３−アミノ−イソオキサゾリル）−Ｃｈａ−Ｉｌｅ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］（４２）の調製。
【化１７】
2014524923.tif 000019
スキーム１０．ａ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中の３−アミノイソオキサゾール−５−カルボン酸、ＢＯＰ／ＤＩＰＥＡ。
化合物を、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって合成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）、δ  ０．８６〜２．２３（ｍ，２６Ｈ）、３．０５〜３．１６（ｍ，１Ｈ）、３．４４〜３．５９（ｍ，１Ｈ）、４．１９〜４．２６（ｍ，１Ｈ）、４．３７（塊（ｌｕｍｐ）、Ｄ２Ｏと部分的に交換可能な、ＤＯＨと重なったＮＨ２）、４．６０〜４．７７（ｍ，２Ｈ）、４．９３〜５．０１（ｍ，１Ｈ）、６．４７（ｓ，１Ｈ）、６．８２〜６．８７（ｍ，２Ｈ）、７．１８〜７．４９（ｍ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、アミド結合回転による２つの回転異性体）、δ  １７１．９（０）／１７１．８（４）、１７０．６（８）／１７０．６（４）、１６３．６、１６２．０、１５５．８、１５０．７（５）／１５０．７（０）、１４２．８／１４２．５、１３９．７／１３９．３、１３１．１／１３１．０、１２７．４／１２７．３、１２５．７、１２５．５、１２１．８、１２１．６／１２１．４、９９．９、５３．１、５１．９／５１．８、５１．５／５１．４、４５．６／４５．１、４１．５／４１．４、４０．２／４０．１、３７．９（４）／３７．８（８）、３４．１、３４．０、３３．６（２）／３３．５（９）、３３．４／３３．２、３２．４（２）／３２．４（０）、２６．２、２６．１（３）／２６．１（０）、２６．０、２４．２、１６．０／１５．６、１１．４／１１．２。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５６２．３３８８（Ｃ３２Ｈ４４Ｎ５Ｏ４＋についての計算値）５６２．３３８８（実測値）；
【０１５４】
実施例１１．５−イソオキサゾリル−Ｃｈａ−Ｔｈｒ（Ｍｅ）−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］（４４）の調製。
【化１８】
2014524923.tif 000020
スキーム１１．ａ）ＭｅＩ、ＬｉＯｔＢｕ、ＤＭＦ；ｂ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｃ）ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨ、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；ｄ）ＤＣＭ中２０％のＴＦＡ；ｅ）ＤＭＦ中のイソオキサゾール−５−カルボン酸、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ
工程ａ：Ｂｏｃ−Ｔｈｒ−スピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］（０．２７０ｍｍｏｌ、一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがってスピロ［インデン−１，４’−ピペリジン］およびＢｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨから調製された）の粗生成物を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた。リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２３ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。ヨウ化メチル（１８．５μＬ、０．２９７ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、ロタベーパで蒸発乾固させた。
【０１５５】
工程ｂ〜ｅ：一般的なアミノ酸カップリング手順Ａにしたがって、上記の粗生成物を脱保護し、Ｂｏｃ−Ｃｈａ−ＯＨおよびイソオキサゾール−５−カルボン酸と順次カップリングして、化合物４４を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）、δ  ０．８８〜１．３２（Ｍ，８Ｈ）、１．３６〜１．５０（ｍ，３Ｈ）、１．６３〜２．１６（ｍ，９Ｈ）、３．０７〜３．１７（ｍ，１Ｈ）、３．４４〜３．５３（ｍ，１Ｈ）、３．３５（ｓ）／３．４０（ｓ，３Ｈ、２つの回転異性体のＯＭｅ）、３．６６（ｍ，１Ｈ，Ｔｈｒのβ−ＣＨ）、４．１７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．６５〜４．７２（ｍ，１Ｈ）、４．７２〜４．７９（ｍ，１Ｈ，Ｃｈａのα−ＣＨ）、５．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，４．０Ｈｚ，Ｔｈｒのα−ＣＨ）、６．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、６．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）、７．１９〜７．４０（ｍ，６Ｈ）、８．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、アミド結合回転による２つの回転異性体）、δ１７１．９（０）／１７１．８（４）、１７０．６（８）／１７０．６（５）、１６３．６、１６２．１、１５５．８、１５０．８／１５０．７、１４２．８／１４２．５、１３９．７／１３９．３、１３１．１／１３１．０、１２７．４／１２７．３、１２５．７／１２５．５、１２１．８、１２１．６／１２１．４、９９．９、５３．１、５１．９／５１．８、５１．５／５１．４、４５．６／４５．１、４１．５／４１．１、４０．２／４０．１、３７．９（４）／３７．８（８）、３４．１、３４．０、３３．６（２）／３３．５（９）、３３．４／３３．２、３２．４（２）／３２．４（０）、２６．２、２６．１（３）／２６．１（０）、２６．０、２４．２、１６．０／１５．６、１１．４／１１．２。
ＨＲＭＳ：［ＭＨ］＋５４９．３０７１（Ｃ３１Ｈ４１Ｎ４Ｏ５＋についての計算値）５４９．３０７６（実測値）。
【０１５６】
式（Ｉ）のさらなる例示的な化合物が、以下の表１〜４に提供される。
【０１５７】
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【表１Ｃ】
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【表１Ｄ】
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【０１５８】
【表２】
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【０１５９】
【表３Ａ】
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【表３Ｂ】
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【表３Ｃ】
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【０１６０】
【表４Ａ】
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【表４Ｂ】
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【表４Ｃ】
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【表４Ｄ】
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【０１６１】
実施例１２．ＰＡＲ２活性化の測定。
本発明の化合物がＰＡＲ２を活性化する能力を、カルシウム動員アッセイによって評価し得る。１つの細胞型からの細胞内カルシウムの放出を活性化する化合物が作動薬または部分作動薬である一方、このような放出を阻害する化合物が拮抗薬であり得ることが理解される。しかしながら、これらの「作動薬」および「拮抗薬」の効果は、異なる細胞において所与の化合物またはＰＡＲ２配位子で逆になることがあり、または逆の反応が、異なる報告アッセイ（例えばＥＲＫリン酸化またはｃＡＭＰ刺激）を用いて観察され得る。これらのアッセイに使用される全ての細胞培養試薬を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入する。細胞株を、ＡＴＣＣ社（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）によって提供される情報に基づいて、３７℃および５％のＣＯ２における培地中で培養する。これらの実験に使用され得る細胞株としては、以下に限定はされないが、ヒト細胞株ＨＴ２９、ＨＥＫ２９３、ＭＭ９６Ｌ、Ｓａｏｓ−２、ＭＧ−６３、ＨｅＬａ、ＪＡＭ、Ａ５４９およびＨＯＰ６２が挙げられる。一般的なアッセイプロトコルは、選択される細胞株に応じてわずかに変わり得る。一般に、細胞培養継代の際、細胞解離溶液（ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＣＤＳ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）をトリプシンの代わりに用いて、表面から細胞を解離させる。リポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）およびトリプシンを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入する。トリコスタチン（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ：ＴＳＡ）およびＰＡＲ２活性化ペプチド、２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２を、社内で合成する。ＥＬＩＳＡセットをＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入し、サイトカインアレイキットをＲａｙＢｉｏｔｅｃｈｏ社（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から購入する。抗ＰＡＲ抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入し、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８とコンジュゲートした抗ヤギ抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入する。
【０１６２】
ウェル当たり約２×１０４〜４×１０５個の細胞で、９６ウェルの黒壁透明底プレート中で細胞を一晩播種する。実験の当日に、上清を除去し、細胞を、４μＭ〜２ｍＭのＦｌｕｏ−３ＡＭ、２５μＬのプルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２．５ｍＭのプロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）とともに色素ローディング緩衝液（ｄｙｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）中で３７℃で１時間インキュベートする。次に、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ蛍光分光計（ＢＭＧ，Ｄｕｒｈａｍ  ＮＣ）に移す。
【０１６３】
作動薬活性を測定するために、様々な濃度における読み取りが開始した１０秒後に、本発明の化合物を個々のウェルに加え、４８０ｎｍまたは４９５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長におけるプレートの底部からの蛍光をリアルタイムで測定する。ＨＢＳＳを社内で調製し、全ての他の試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ）から購入する。プレートは、ＤＫＳＨ社（Ｚｕｒｉｃｈ）によって供給される。カルシマイシン（Ａ２３１８７，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、最大蛍光を測定し、個々の結果をそれに応じて正規化する。一般式（Ｉ）の例示される化合物の結果を、以下の表５および６に示す。さらに、ＰＡＲ２作動薬６についての上述した作動薬アッセイのグラフ表示を、図１に示し、後述する。
【０１６４】
３つの異なる濃度の６を、ＨＴ２９細胞に室温で加える。したがって、各データ点で反復測定を行った。各データ点は、平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１００μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。３０μＭにおいて、６は最大５０％の反応率を示しており、これは、６のＥＣ５０が約３０μＭであることを示す。
【０１６５】
【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
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【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
実施例１３．ＰＡＲ２作動薬阻害（拮抗作用）の測定。
本発明の化合物がトリプシンまたは合成ＰＡＲ２作動薬によるＰＡＲ２の活性化を阻害する能力を、実施例１２に上述される細胞内カルシウム放出アッセイによって測定する。
【０１６８】
細胞を上で概説したように調製し、次に、トリプシンまたは合成作動薬のいずれかを作動薬ＥＣ８０に等しい濃度で加える前に、推定上の拮抗薬で３０分間処理する。本発明の化合物がＰＡＲ２の活性化を阻害する能力を、以下の表７、８および９に例示する。さらに、合成実施例（１８、２４、２６、２７、３０、３９および４２）によって表されるＰＡＲ２拮抗薬についての上述した拮抗薬アッセイのグラフ表示を図２〜８に示し、以下に詳細に説明する。
【０１６９】
ＰＡＲ２配位子１８。ＰＡＲ２拮抗薬１８によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図２に示す。化合物１８を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２（図２Ａ、ｎ＝５）または１００ｎＭのトリプシン（図２Ｂ、ｎ＝１）で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２または１００ｎＭのトリプシンによって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７０】
ＰＡＲ２配位子２４。ＰＡＲ２拮抗薬２４によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図３に示す（ｎ＝１）。化合物２４を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７１】
ＰＡＲ２配位子２６。ＰＡＲ２拮抗薬２６によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図４に示す（ｎ＝１）。化合物２６を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７２】
ＰＡＲ２配位子２７。ＰＡＲ２拮抗薬２７によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図５に示す（ｎ＝２）。化合物２７を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７３】
ＰＡＲ２配位子３０。ＰＡＲ２拮抗薬３０によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図６に示す（ｎ＝８）。化合物３０を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７４】
ＰＡＲ２配位子３９。ＰＡＲ２拮抗薬３９によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図７に示す（ｎ＝１）。化合物３９を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７５】
ＰＡＲ２拮抗薬４２。ＰＡＲ２拮抗薬４２によるＨＴ２９細胞における細胞内Ｃａ２＋放出の阻害のグラフ表示を図８に示す（ｎ＝１）。化合物４２を、実験の前に室温で３０分間ＨＴ２９細胞で予めインキュベートした。次に、細胞を、１μＭのＰＡＲ２作動薬２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２で処理した。各データ点は平均±ＳＥＭを表す。蛍光の純変化を、１μＭの２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２によって得られる最大反応に対するパーセンテージとして計算した。蛍光の変化（反応率％）を、対数化合物濃度に対してプロットした。半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５における非線形回帰曲線を用いて用量反応から導き出した。
【０１７６】
【表７Ａ】
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【表７Ｂ】
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【０１７７】
【表８Ａ】
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【表８Ｂ】
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【０１７８】
【表９Ａ】
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【表９Ｂ】
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【０１７９】
実施例１４．本発明の化合物の抗炎症活性の評価。
本発明の化合物が急性および慢性炎症性疾患の両方に関連する症状を改善する能力を、当業者に周知のいくつかの動物モデルによって決定することができ、その一般的な実施例を以下に示す。
【０１８０】
薬物動態
動物
雄および雌のＷｉｓｔａｒラット（８〜９週齢、それぞれ２００〜２５０ｇおよび２５０〜３００ｇ）を、一般に、食物および水を備える保有設備の規格にしたがって１２時間の明暗周期に維持する。
【０１８１】
短期間の薬物動態
雄のＷｉｓｔａｒラットに頸静脈カテーテルを外科的に埋め込む。自由行動動物の留置カテーテルから大量の血液を採取する。（ヘパリン化された）血液試料を、本発明の化合物（１０ｍｇ／ｋｇで経口投与（ｐ．ｏ．））を投与する５分前、ならびに投与の３０分後、１〜６時間後、８時間後および２４時間後に採取する。血液を８Ｋｒｐｍで５分間遠心分離し、血漿をアセトニトリルで３回（ｖ／ｖ）希釈し、後に使用するために−８０℃で貯蔵する。
【０１８２】
長期間の薬物動態
カテーテルを埋め込んでいない動物の一部に、本発明の化合物の経口投与を４日間連続で行う（ｎ＝６）。５日目に、ラットを安楽死させ（ＣＯ２吸入）、心穿刺によって血漿を採取する。脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ：ＣＳＦ）を大槽から採取し、腹腔内脂肪を採取する。清潔な、血液を含まないＣＳＦ試料を、アセトニトリルで２回希釈し、ボルテックスし、８Ｋｒｐｍで５分間遠心分離する。脂肪を、等体積（ｍＬ／ｇ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水中で均一化する。試料の一部をアセトニトリル（３×ｗ／ｖ）で希釈し、後に使用するために−８０℃で貯蔵する。
【０１８３】
流体試料の調製
検量線：本発明の化合物を含む各ストック溶液を、アセトニトリル中で９．１５、４．５７、０．９２、０．４６、０．０９、０．０４６、０．００９および０．００５μＭで調製する。薬剤で処置していないラットに由来する新鮮血漿の２００μＬの試料を２００μＬのストック溶液に移した後、４００μＬのアセトニトリルを加える。混合物を１分間ボルテックスし、１０分間超音波で分解し、１３Ｋｒｐｍで５分間遠心分離し、後に使用するために−８０℃で貯蔵する。
【０１８４】
上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水（３×体積）およびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ：ＴＢＭＥ、ＣＨＲＯＭＡＳＯＬＶ（登録商標）Ｐｌｕｓ、ＨＰＬＣ用、９９．９％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製、３×体積）で希釈する。試料をボルテックスし、水／アセトニトリル相が凍結されるまでドライアイス上に置いておく。有機相をマイクロチューブ中にデカントし、回転真空濃縮器（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によって供給されるＣｈｒｉｓｔ  Ｂｅｔａ−ＲＶＣ）を用いて濃縮する。１００μＬのアセトニトリルを残渣に加え、ボルテックスし、ＬＣＭＳ／ＭＳによって直ぐに分析する。
【０１８５】
急性炎症モデル：ＰＡＲ２誘発性足浮腫
使用される方法は、既述の方法（Ｋｅｌｓｏ，Ｅ．Ｂ．ら，「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００７年」，５６，７６５−７１；Ｋｅｌｓｏ，Ｅ．Ｂ．ら，「Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００６年」，３１６，１０１７−２４；およびＶｅｒｇｎｏｌｌｅ，「Ｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９年」，１６３，５０６４−９）に基づくものである。雄のＷｉｓｔａｒラット（群当たりｎ＝３）を使用する。簡潔に述べると、５または１０ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物（オリーブ油に溶解させた状態での強制経口投与（ｐ．ｏ．）、約５００μＬ、体重により調整）をラットに与える。対照の動物は、オリーブ油（５００μＬの経口投与（ｐ．ｏ．））のみを受ける。２時間後、ＰＡＲ２作動薬２−フロイル−ＬＩＧＲＬＯ（足当たり、生理食塩水中３５０μｇ、１００μＬ）を、３０Ｇの針を用いて、右足の肉球の足底面に（足蹠皮下投与（ｉ．ｐｌ．）で）注射する。生理食塩水のみを受ける左足が対照としての役割を果たす。足の厚さおよび幅を、デジタルキャリパー（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，ＵＳＡ）を用いて３０分後および１時間ごとに測定し、膨張の面積（ｍｍ２；厚さに幅を乗算した値）を計算し、各個々の足の基準値からの変化のパーセンテージとして表す。例示的なＰＡＲ２配位子１８、３０、４２および４４についての結果を図９に示す。
【０１８６】
急性炎症モデル：λ−カラギーナン誘発性足浮腫
使用される方法は、既述の方法（Ｋｅｌｓｏ，Ｅ．Ｂ．ら，「Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ」  ３１６：１０１７−１０２４；およびＦｌｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ」  １１７：３２２４−３２３５）に基づくものである。雄のＷｉｓｔａｒラット（群当たりｎ＝４）を使用する。簡潔に述べると、１０ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物（オリーブ油に溶解させた状態での強制経口投与（ｐ．ｏ．）、５００μＬ）をラットに与える。対照の動物は、オリーブ油（５００μＬの経口投与（ｐ．ｏ．））のみを受ける。３０分後、λ−カラギーナン（生理食塩水中１％  ｗ／ｖ、１００μＬ）を、３０Ｇの針を用いて、右足の肉球の足底面に（足蹠皮下投与（ｉ．ｐｌ．）で）注射する。上記と同様に、生理食塩水のみを受ける左足が対照としての役割を果たす。足の幅および厚さを、１〜６時間、８時間および２４時間の時点で測定する。データを、基準値からの正規化された面積（ｍｍ２）の変化として表す。
【０１８７】
慢性炎症モデル：コラーゲン誘発性関節炎
プロトコルは、既述のプロトコル（Ｅａｒｐ，Ｊ．Ｃ．ら，「Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓ」  ２００８年；Ｌｉｎ，Ｈ．Ｓ．ら，「Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」  ２００７年，１５０，８６２−７２；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ら，「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ」  ２００３年，４８，２６７０−８１；およびＯｌｏｆｓｓｏｎ，Ｐ．ら，「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ」  ２００３年，４８，２３３２−４２）に基づくものである。雌のＷｉｓｔａｒラットを使用する（２００〜２５０ｇ、合計ｎ＝１４）。コラーゲンによる免疫付与を０日目に開始し、その際、２００μｇのコラーゲンを、２００μＬ（５０：５０の０．０５Ｍの酢酸およびフロイント不完全アジュバント）中で、３０Ｇの針を用いて尾の付け根に皮下投与する。シャム手術動物（ｓｈａｍ  ａｎｉｍａｌ）は、コラーゲン抜きの媒体（５０：５０の０．０５Ｍ酢酸およびフロイント不完全アジュバント）を受ける。７日後（７日目）、同じ処置を追加免疫として与える。本発明の化合物（オリーブ油中１０ｍｇ／ｋｇ、５００μＬ、経口投与（ｐ．ｏ．）、体重により調整）を試験被験体に７日目以降毎日投与し、関節炎の対照およびシャム手術動物は、強制投与によるオリーブ油媒体のみを受ける。足の測定（上記のような）、体重、臨床スコアおよび機械的侵害受容閾値を、１０日目〜２８日目に１日おきに測定する。後足のみを測定する。膨張の面積（ｍｍ２）を計算し、基準値からの変化のパーセンテージとして表す。個々の足の膨張が２０％を超えたときに足に関節炎の作用があるとみなし、これは、シャム手術動物群で観察される最大足面積変化（すなわち実験の時間経過のみにより予測される成長）である。
【０１８８】
臨床的測定．
以下の条件を組み込んだ臨床スコアを、専門の研究者によって観測的に測定する：移動度：０：跛行（ｌｉｍｐ）なし、完全な後肢体重支持。１：軽度の跛行、移動度の低下。２：片方の後肢での体重支持の減少／体重支持なし。移動度の低下。３：両方の（２本の）後肢での体重支持なし、移動度ほとんどなし。炎症；０：発赤なし、膨張なし、および関節炎症状なし。１：軽度の発赤および膨張。２：関節炎症状の発現（足指の縮め）、中程度の膨張および発赤。３：重度の膨張および発赤、重度の関節炎症状（足底反射の喪失、足指の縮め、ハンドリング時の後足の回外および内転）。不快感／疼痛；０：発声なし、通常の挙動。１：軽い発声のみ。２：発生の増加およびハンドリング時の軽い後退。３：運動時の自発的な発声（教唆に必要なハンドリングなし）。臨床スコアを、含まれる足の数を３つのスコアに乗算した値の和（最大合計スコアは１８、上記を参照）として表す。
【０１８９】
組織病理学および関節の健康の評価
終点（２８日目）で、ＣＯ２を用いてラットを安楽死させる。後足の皮を剥ぎ、切断し、４％のパラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）に４℃で７日間入れる。足を７２時間脱灰し（１０％のＨＣｌ；０．１８％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡ：Ｈ２Ｏ中０．０９％（ｗ／ｖ）の酒石酸塩）、組織学的分析のためにパラフィンろうに埋め込む。標準的なプロトコルを用いて、切片を１０μｍで切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ：Ｈ＆Ｅ）、マッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｓｔａｉｎ：ＭＴＣ）またはアルシアンブルー／サフラニン−Ｏで染色する。少なくとも６つの切片の脛骨／距骨／踵骨の関節を、動物ごとに撮像（ｉｍａｇｅ）し、評価し／染色法、処置について盲検下に置かれた専門家によって採点する。
【０１９０】
Ｈ＆Ｅ切片を、以下のとおりに、以下の改変された指針（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｔ．Ｍ．ら，「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ」  ２００２年，４６，２４７６−８５）を用いて採点する。浮腫；０：健常な組織、血漿細胞浸潤なし。１：滑膜外腔（ｅｘｔｒａ−ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｓｐａｃｅ）中への軽度の血漿細胞浸潤。２：滑膜外腔中への中程度の血漿細胞浸滑、膜への浸潤が開始する。３：重度の血漿細胞浸潤、滑膜中の米粒体および炎症細胞の発生。滑膜の過形成；０：正常な組織。１：軽度の滑膜腫脹。２：中程度の滑膜腫脹。３：重度の膨張および滑膜腔の成長。軟骨／骨の侵食；０：正常な軟骨。１：関節軟骨への炎症細胞の軽度の付着。２：炎症細胞の中程度の付着が、関節軟骨の第１の層を侵食し始める。３：重度の炎症細胞の付着ならびに軟骨層、軟骨膜および下層の骨の浸食。パンヌス形成；０：パンヌスなし。１：パンヌスが形成され始める。２：パンヌスが滑膜に入る。３：パンヌスが軟骨／骨を浸食し始める。合計病理組織学的スコアを、全てのスコアの和（合計スコアは１２）として表す。コラーゲン損失を、マッソントリクローム染色した切片において、既述したのと同様の脛骨の関節面の赤色染色（アニリンブルーの損失）の相対的比率にしたがって定性的に採点する。０：関節面における赤色染色なし、１：０〜２５％の表面に現れる赤色、２：２５〜５０％の表面に現れる赤色、３：５０％超の関節面において染色された赤色（最大スコアは３）。アルシアンブルー／サフラニン−Ｏ分染により、既述したのと同様に、肥満細胞の活性化状態を決定した。各切片を、脛骨／距骨の関節の上側および下側の領域で、１００倍で撮像する。動物当たり少なくとも６つの切片を撮像する（ラット当たり１２個を超える分析切片）。細胞をＩｍａｇｅＪ  １．４２ｑソフトウェアを用いて画像から計数する。青色が存在しない赤色の細胞を不活性であるとみなす。青色染色が見えるが、ある程度の赤色染色がまだある細胞を活性であるとみなす。目に見える赤色染色がない（青色のみがある）細胞を脱顆粒されているものとみなす。
【０１９１】
実施例１５．本発明の化合物の抗増殖活性の評価。
本発明の化合物が異常な細胞増殖を緩和する能力を、限定はされないが、以下に示される一般的な実施例を含む、当業者に周知のいくつかのアッセイによって測定することができる。
【０１９２】
細胞ＤＮＡ中へのトリチウム化したチミジンの組み込み。
初代ヒト腎尿細管細胞を、４８ウェルプレート中で、ホルモン規定無血清（ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で９０％コンフルエントになるまで成長させる。次に、それらを追加の成長因子を含まないＤＭＥＭで２回洗浄し、この塩基性媒体中でさらに２４時間培養する。この時点で、無血清ＤＭＥＭ中の本発明の化合物を細胞に加え、次に、それらをさらに２４時間培養する。［メチル−３Ｈ］−チミジン（ＴＲＡ１２０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、媒体のｍＬ当たり４μＣｉ（０．１５ＭＢｑ）を、培養の最後の６時間加える。試験期間の終了時に、媒体を除去し（そして、サイトカイン放出の測定のために−８０℃で貯蔵し）、細胞を氷冷ＰＢＳで２回、次に、氷冷１０％トリクロロ酢酸で３回、１０分間にわたって洗浄する。細胞をもう１回メタノールで洗浄する。次に、細胞層を空気乾燥させ、１％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する２００μＬの０．３ＭのＮａＯＨを３７℃で１時間加えることによって可溶化する。混合した後、５０μＬを取り出し、ベータ−計数器で計数するために１ｍＬのシンチレーション流体に入れる。そのままの毎分壊変数（ｒａｗ  ｄｐｍ）に４を乗算し、１０００で除算すると、細胞増殖のプロット値が得られる。
【０１９３】
実施例１６．ラットの血漿および肝臓のホモジネート中の本発明の化合物の安定性
組織液
血液および肝臓を、薬剤を投与していない雄および雌のＷｉｓｔａｒラット（８〜９週齢、それぞれ２００〜２５０ｇおよび２５０〜３００ｇ）から採取する。血液を８Ｋｒｐｍで５分間遠心分離する。血漿をプールし、後に使用するために−８０℃で貯蔵する。ラットの肝臓を均一化し、３つの体積のＰＢＳで希釈し、ろ布でろ過する。ろ液を安定性試験に直接使用する。
【０１９４】
流体試料の調製
各化合物をＤＭＳＯ中に溶解させて、５ｍＭのストック溶液を作製する。１０μＬのストックをラット血漿または肝臓のホモジネート（４９０μＬ）のいずれかで希釈して、１０μＭ（三重反復）の出発濃度を構成する。混合物をボルテックスし、３７℃でインキュベートする。０分、３０分、６０分および１８０分の各時点で、１００μＬの混合物を取り、３００μＬのアセトニトリルで希釈する。混合物をボルテックスし、遠心分離する。３５０μＬの液体をマイクロチューブに移し、回転真空濃縮器（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によって供給されるＣｈｒｉｓｔ  Ｂｅｔａ−ＲＶＣ）を用いて濃縮する。１００μＬのアセトニトリル−水（９：１、ｖ／ｖ）を残渣に加え、ボルテックスし、ＬＣＭＳ／ＭＳによって直ぐに分析する。これらの実験からのデータを、ゼロの時点（ｔ０）でのＬＣＭＳ／ＭＳトレースから記録されるピーク面積のパーセントとして表す。
【０１９５】
一般に、化合物（１８、３０、４２および４４）は、ラット血漿中で安定であり（３時間後に８０％超が存在する）、ラットの肝臓のホモジネート中で様々な程度に分解される（図１０および１１）。結果は、化合物が肝臓中で主に代謝されるという仮説を裏付けるものである。
【０１９６】
実施例１７．マクロファージ炎症、脂肪症、脂肪組織炎症および代謝機能を調節する際のＰＡＲ２拮抗薬の評価。
ＰＡＲ２がマクロファージ炎症に特異的に関連しているかどうかを調べるために、ヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）におけるＰＡＲのｍＲＮＡレベルに対するパルミチン酸の影響を測定した（図１２）。ＨＰＲＴに対して正規化された、ＨＭＤＭにおけるＰＡＲのリアルタイムＰＣＲ測定は、ＰＡＲ２の発現が、ＰＡＲファミリーの残り（ＰＡＲ１、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４）よりかなり高かったことを示し、これは、マクロファージにおけるＰＡＲ２の調節的な役割を示す（図１２Ａ）。パルミチン酸の存在下でのＨＭＤＭにおけるＰＡＲ２  ｍＲＮＡの増加は用量依存的であった（図１２Ｂ）。ＰＡＲ２の倍率変化を、非処理の試料と比べて計算した。図１２ＣおよびＤは、パルミチン酸が、ＨＭＤＭからの炎症誘発サイトカイン、ＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌を刺激することを示す。エラーバーは、平均±ＳＥＭであり；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。パルミチン酸によるヒトマクロファージ（ＨＭＤＭ）のインビトロでの刺激は、ＰＡＲ２のｍＲＮＡ濃度および炎症性サイトカイン（ＩＬ６およびＩＬ８）のタンパク質発現の濃度に依存する増加（２０倍未満）を示した。これは、飽和脂肪酸が、マクロファージに関連した脂肪組織炎症および脂肪細胞機能不全に大きな役割を果たし得るＰＡＲ２活性化を誘発することを示唆する（図１２Ｂ、Ｃ、およびＤ）。
【０１９７】
選択的なＰＡＲ２拮抗薬５２を用いて、炭水化物および脂肪を多く含む食餌（ＨＣＨＦ）を与えられたラットの脂肪症、脂肪組織炎症および代謝機能を調節する際のＰＡＲ２拮抗作用の治療可能性を評価した。週１回の体重測定（０〜１６週間）を、コーンスターチＣＳ（●）および高炭水化物高脂肪（ＨＣＨＦ）（○）を与えられたラット（図１３Ａ）、ならびにＨＣＨＦ（○）およびＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（▲）で処置されたラット（図１３Ｂ）について記録した。さらに、週１回の胴囲測定を、ＣＳ（●）、ＨＣＨＦ（○）、ＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（▲）で処置されたラット（図１３Ｃ）について記録した。図１３Ｄは、ＣＳ（■）、ＨＣＨＦ（■）、ＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（□）で処置されたラットの二重Ｘ線発光分光法による身体組成測定を示す。
【０１９８】
コーンスターチ（ＣＳ）のみを含有する低炭水化物低脂肪食（ｌｅａｎ  ｄｉｅｔ）を与えられたラットと比べて、ＨＣＨＦ食餌を１６週間与えられたラットは肥満になり、５４±４％の体重および２０６±４３％の総脂肪量、特に、内臓（腹部）脂肪が、０週から１６週まで増加した（図１３Ａ〜Ｇ）。図１３Ｆは、ＨＣＨＦ食餌を１６週間与えられ、処置を受けていないラットの、１６週の時点での腹部脂肪体の画像である。図１３Ｇは、ＨＣＨＦ食餌を１６週間、およびＰＡＲ２拮抗薬５２（５ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与（ｐ．ｏ．））を８〜１６週で与えられたラットの、１６週の時点での腹部脂肪体を示す。脂肪組織（図１４Ａ）ならびにその２つの成分分画、すなわち脂肪細胞および間質血管細胞（ＳＶＣ）分画（図１４Ｂ）におけるＰＡＲ２発現の増加が、ＨＣＨＦ食餌によって全て高められ、脂肪症の増加と正に相関していた。局所的な脂肪組織炎症も、ＨＣＨＦ食餌によって増加した（図１５Ａ〜Ｆ）。知見により、様々な内因性シグナル（ＨＣＨＦ食餌で消費されるパルミチン酸などの飽和脂肪酸）が、マクロファージをプライミングして、ＰＡＲ２のそれらの発現を増加させ得ることが示される。
【０１９９】
ＣＳ（●）、ＨＣＨＦ（○）およびＨＣＨＦ＋５２（▲）で処置されたラットの収縮期血圧測定（図１６Ａ）、ＣＳ（●）、ＨＣＨＦ（○）およびＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（▲）で処置されたラットの経口グルコース負荷（図１６Ｂ）、ＣＳ（●）、ＨＣＨＦ（○）、ＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（▲）で処置されたラットのインスリン負荷（図１６Ｃ）、ＣＳ、ＨＣＨＦおよびＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置されたラットの血漿脂質濃度（図１６ＤならびにＣＳ、ＨＣＨＦおよびＨＣＨＦ＋５２で処置されたラットの血漿肝臓酵素（図１６Ｅ、＊ＣＳに対するＰ＜０．０５；＊＊ＨＣＨＦに対するＰ＜０．０５）を含む、ＰＡＲ２拮抗薬５２による代謝パラメータの調節を、食餌性肥満ラットにおいて測定した。Ｗｉｓｔａｒラットによる１６週間のＨＣＨＦ食餌の後、多くの代謝指標（図１３および図１６）が緩和され、またはＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇ／日）の８〜１６週の毎日の経口投与によって改善され、体重増加（８〜１６週のＨＣＨＦ、２１±１％；＋５２、Ｘ±Ｘ％；図１３Ａ）、総脂肪量（５２、Ｘ％；図１３Ｄ）、内臓（腹部）脂肪沈着ならびにＰＡＲ２の全体的な脂肪、脂肪細胞およびＳＶＣ発現（図１３〜１４）が予防された。１６週間にわたるＨＣＨＦ食餌によって誘発される、全体的な脂肪、脂肪細胞および間質血管細胞（ＳＶＣ）におけるＰＡＲ２発現の増加は、８〜１６週のＰＡＲ２拮抗薬５２による処置によって予防され、ＰＡＲ２  ｍＲＮＡ濃度は、ＣＳを与えられたラットのＰＡＲ２  ｍＲＮＡ濃度に匹敵していた（図１４）。
【０２００】
慢性脂肪細胞および代謝機能不全の発生は、脂肪組織への免疫細胞の浸潤または動員の増加にも関連している（Ｌｕｍｅｎｇ，Ｃ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７，１７５−８４；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００９，１５，９１４−２０；Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００９，１５，９４０−４５）。後腹膜脂肪組織中への免疫細胞浸潤を、組織化学的分析によって評価し、組織化学的分析により、ＣＳラットの脂肪組織における単細胞としての単球／マクロファージの非常に少ない分布が示された（図１５Ａ、Ｂ、Ｃ）。しかしながら、ＨＣＨＦラットの脂肪組織における単球／マクロファージの密度は、通常、間質全体にわたる細胞群においてはるかに高かった。マクロファージ活性化は、２つの異なる分化状態、Ｍ１、「古典的活性化（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」およびＭ２、「選択的活性化（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」に大きく分けられ得る。これらの状態の分類は、表面マーカーの発現、代謝酵素およびケモカインの分泌に大きく依存している。Ｍ１または「古典的活性化」マクロファージは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどの細胞媒介性炎症反応に応答して産生される。これらのＭ１マクロファージは、一般に、向上した抗菌機能ならびに炎症性ケモカインおよびメディエータの産生に関連している。Ｍ２または「選択的活性化」は、ＩＬ−４またはＩＬ−１３の存在下で誘発される。Ｍ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージより炎症性メディエータの産生の効率が低く、その代わりに、高レベルの抗炎症性および創傷治癒メディエータを分泌する。
【０２０１】
マクロファージに関連した炎症が、代謝機能不全の発生に重要であることを考えて、本発明者らは、脂肪組織における炎症状態および代謝面に対する５２の有益な効果を調べた。ＨＣＨＦを与えられたラットに由来する脂肪組織は、Ｍ１特異的な炎症性遺伝子、Ｉｌ６（ＩＬ−６）、Ｃｃｌ２（ＭＣＰ−１）およびＣｃｌ９（ＭＩＰ−１）の増加した発現を示した一方、ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置されたラットは、Ｍ１特異的な遺伝子の著しい減少を示した（図１５Ｄ、Ｅ）。対照的に、Ｍ２特異的な遺伝子、Ｍｃｒ２（Ｃ型マンノース受容体２）、Ｍｇｌ１（マクロファージガラクトース型のＣ型レクチン１）、Ｙｍ１（キチナーゼ３様３）およびＡｒｇ１（アルギナーゼ１）の発現は、ＨＣＨＦを与えられたラットにおいて減少したが、５２で処置されたラットにおいて回復または上方制御された（図１５Ｄ、Ｅ）。Ｍ１およびＭ２関連遺伝子以外に、脂質およびエネルギー代謝に関与する代謝遺伝子を調べた。肥満は、脂肪酸代謝、細胞ストレスおよび脂肪細胞分化に関与する遺伝子の調節異常とともに発生することが多い。ＰＡＲ２シグナル伝達も、脂肪酸酸化の調節異常に関与している。後腹膜脂肪組織において、インスリン抵抗性の発生に関与するＰｐａｒｇ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−γ））、Ｕｃｐ２（脱共役タンパク質２）およびＡｄｉｐｏｑ（アディポネクチン）の遺伝子コード化が、ＨＣＨＦを与えられたラットにおいて変化された（図１５Ｆ）。ＰＡＲ２拮抗薬５２による処置により、これらの変化が軽減された（図１５Ｆ）。総合すると、５２は、潜在的に、Ｍ２表現型へのマクロファージの分化を阻止し（ｓｋｅｗｅｒ）、脂肪組織におけるＭ１マクロファージの集積を防止し、したがって、脂肪組織炎症、脂肪細胞および代謝機能を改善する（図１５〜１７）。
【０２０２】
肝臓、骨格筋および膵臓における脂肪酸酸化が、ＣＳ、ＨＣＨＦおよびＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２による処置の後、ラットにおいて観察された。図１７Ａ〜Ｃは、ＣＳ（Ａ）、ＨＣＨＦ（Ｂ）およびＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（Ｃ）で処置されたラットにおける肝細胞超微細構造および脂肪沈着の代表的画像（２０倍の倍率）を示す。図１７Ｄは、コーンスターチ（ＣＳ）、高炭水化物高脂肪（ＨＣＨＦ）およびＰＡＲ２拮抗薬とともにＨＣＨＦで処置した群（ＨＣＨＦ＋５２）のラットの骨格筋における代謝遺伝子を示す。図１７Ｅは、異なる群のラット肝臓における代謝遺伝子を示す。図１７Ｆは、膵臓における代謝遺伝子の発現を示す。ｍＲＮＡの発現を、１８ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化し、倍率変化を、ＣＳ試料と比べて計算した。エラーバーは、平均±ＳＥＭであり；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【０２０３】
ＣＳ、ＨＣＨＦ、ＨＣＨＦ＋化合物５２で処置されたラットにおける拡張期スティフネス定数（ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）測定（図１８Ａ）およびＣＳ、ＨＣＨＦ（処置前の８週間の時点）、ＨＣＨＦおよびＨＣＨＦ＋化合物５２で処置されたラットの心臓の構造の心エコー特性評価（図１８Ｂ）を含む、食餌性肥満ラットにおけるＰＡＲ２拮抗薬５２による心血管の構造および機能の調節も測定した（図１８）。図１８ＣおよびＤは、ＣＳ、ＨＣＨＦ（処置前の８週間の時点）、ＨＣＨＦおよびＨＣＨＦ＋化合物５２で処置されたラットの心臓の機能の心エコー特性評価を示す。図１８Ｅ〜Ｇは、ＣＳ（●）、ＨＣＨＦ（○）およびＨＣＨＦ＋Ｃ５ａＲＡ（▼）で処置されたラットにおけるノルアドレナリン（Ｅ）、ニトロプルシドナトリウム（Ｆ）およびアセチルコリン（Ｇ）に対する血管オルガンバス反応（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎ  ｂａｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示す。ＣＳ（Ｈ）、ＨＣＨＦ（Ｉ）およびＨＣＨＦ＋ＰＡＲ２拮抗薬５２（Ｊ）で処置されたラットの左心室における間質コラーゲン沈着の代表的な画像（４０倍の倍率）。図１８ＫおよびＬは、左心室の血管周囲（Ｋ）および間質（Ｌ）領域におけるコラーゲン沈着の面積のグラフ表示である。＊ＣＳに対するＰ＜０．０５；＊＊ＨＣＨＦに対するＰ＜０．０５。
【０２０４】
ＨＣＨＦ対ＣＳ食餌によるラットにおいて増加した代謝パラメータは、グルコースおよびインスリン負荷の障害（図１６Ｂ〜Ｃ）、増加した血漿脂質および肝臓酵素（図１６Ｄ〜Ｅ）、増加した収縮期血圧血圧（図１６Ａ）ならびに心臓の構造および機能の異常（図１８）を含んでいた。ＰＡＲ２拮抗薬５２が、（例えば、心臓の左心室における）増加したコラーゲン沈着によって測定される、食餌性心臓線維症の発症に対する強力な阻害効果を有していたことは注目すべきである。ＰＡＲ２拮抗作用のこの抗線維化効果は、心血管疾患だけでなく、コラーゲン沈着に起因する組織および器官線維症が組織または器官の機能不全を引き起こす多くの他の適応症についても、重要な治療特性であり得る。
【０２０５】
パラメータは、上昇したトリグリセリドおよび収縮期血圧を除いて、８〜１６週にＰＡＲ２拮抗薬５２による処置によって緩和された（図１６ＡおよびＤ）。さらに、ＣＳを与えられたラットと比較してＨＣＨＦラットに見られる増加した脂肪症は、５２による処置によって予防された（図１７Ａ、Ｂ、Ｃ）。肝臓におけるエネルギー消費および脂肪酸酸化に関与する遺伝子の発現を分析した際、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ（Ｐｐａｒｇ）、Ｓｒｅｂｆ１（ステロール調節因子結合転写因子１）、Ｕｃｐ２、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｃｐｔ（カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ）およびＰｎｐｌａ２（脂肪トリグリセリドリパーゼ）の上方制御が、非処置のＨＣＨＦラットに対してＰＡＲ２拮抗薬５２で処置されたラットにおいて検出された（図１７Ｆ）。上記で調べたＰＰＡＲ−γおよび関連する代謝遺伝子は全て、インスリン抵抗性の改善に関与し、マクロファージおよび肝臓脂質代謝、ミトコンドリア発生およびトリグリセリド加水分解を調節することが周知である（Ｏｄｅｇａａｒｄ，Ｊ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４４７，１１１６−２０；Ｃｈａｗｌａ，Ａ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２０１０，１０６，１５５９−６９；Ｍｅｍｏｎ，Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０００，１４１，４０２１−３１；Ｓｏｏｋｏｉａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１０，５２，１９９２−２０００；Ｏｎｇ，Ｋ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１０）。骨格筋において、Ｐｐａｒｇ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ）、Ｕｃｐ２および３（脱共役タンパク質２／３）およびＰｄｋ４（デヒドロゲナーゼキナーゼ４）などの、脂質代謝およびエネルギー消費に関与する遺伝子が、ＨＣＨＦを与えられたラットにおいて抑制された（図１７Ｇ）。代謝および転写因子に関与するＧｌｕｔ２（グルコース輸送体２）およびＢｅｔａ２（塩基性ヘリックスループヘリックス転写因子）のリアルタイム分析は、ＨＣＦＨを与えられたラットにおいて抑制されるが、ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置すると回復される。Ｉａｐｐ（膵島アミロイドポリペプチド）、Ａｔｆ３（活性化転写因子３）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）およびＩｄ−１（ＤＮＡ結合１の阻害剤）などの他の遺伝子は、ＨＣＨＦ食餌によって上方制御された（図１７Ｆ、Ｇ）。５２による処置により、骨格筋および膵臓の両方におけるこの遺伝子発現の変化が軽減された（図１７Ｆ、Ｇ）。これらの結果は、肝臓、骨格筋および膵臓における脂質処理および脂肪酸酸化遺伝子の発現の変化とともに、ＨＣＨＦを与えられたラットにおけるＰＡＲ２の拮抗作用が代謝を向上させ、処置されたラットの脂肪症および代謝症状（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｍｐｔｏｍ）の減少と相関することを示唆する。
【０２０６】
要約すると、新規なＰＡＲ２拮抗薬の経口投与は、肥満および脂肪症の著しい減少ならびにグルコースおよびインスリン不耐性、脂肪組織炎症、脂肪酸代謝の肥満に関連する変化ならびに複数の脂質および心血管の異常の改善とともに、ＨＣＨＦラットの代謝機能不全の古典的な症状を改善した。これらの効果は、食餌性肥満の際の脂肪組織における脂肪細胞およびマクロファージの両方の上および中におけるＰＡＲ２の発現およびシグナル伝達に起因していた。さらに、細胞外信号またはパルミチン酸およびプロテアーゼなどの内因性配位子は、脂肪組織マクロファージまたは他の内在する浸潤免疫細胞をプライミングし、それによって、食餌性肥満およびメタボリック・シンドロームにおけるＰＡＲ２の増加した発現および活性化を維持するための内因性の要因として働き得る。
【０２０７】
実施例１８．ＰＡＲ２は、グルコース恒常性を調節する。
方法：グルコース促進インスリン分泌。ラット膵臓およびマウスＭＩＮ６  β細胞を、１５％のウシ胎仔血清、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび６０ｍＭの２−メルカプトエタノールが補充されたＤＭＥＭ（２５ｍＭのグルコース）中で培養した。ＭＩＮ６  β細胞を継代し、非酵素的細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて採取した。グルコース促進インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を、次に記載されるように行った。ＭＩＮ６  β細胞を、９６ウェルプレート中で、０．８×１０６／ｍＬで播種し、４８時間培養した。細胞を、グルコースを含まないＫｒｅｂｓ緩衝液で２回洗浄した（ＮａＣｌ  １１９ｍＭ、ＫＣｌ  ４．７４ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２．５４ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １．１９ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  １．１９ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  ２５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１０ｍＭおよび０．０５％のＢＳＡ）。細胞を、２．５ｍＭのグルコースが補充されたＫｒｅｂｓ緩衝液とともに、３０分間にわたって化合物５２で前処理した。インキュベーションの後、細胞を、グルコースを含まないＫｒｅｂｓ緩衝液で２回洗浄した。グルコース（２．５ｍＭおよび２５ｍＭ）および化合物を、特定の濃度で加え、１時間インキュベートした。上清を収集し、インスリン濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）によって測定した。
【０２０８】
結果：膵機能不全の病因は、慢性的な栄養過剰および高い脂肪酸に関連しているため、化合物５２の生体内およびインビトロでの効果を、ラットの膵臓およびマウスのＭＩＮ６  β細胞において評価した。定量的なＲＴ−ＰＣＲ分析により、代謝および転写に関与する膵臓遺伝子Ｇｌｕｔ２（グルコース輸送体２）およびＢｅｔａ２（塩基性ヘリックスループヘリックス転写因子）が、コーンスターチ（ＣＳ）を与えられたラットと比べて、炭水化物および脂肪を多く含む食餌（ＨＣＦＨ）を与えられたラットにおいて抑制されたが、化合物５２で処置するとＨＣＦＨを与えられたラットにおいて正常化されたことが示された。インスリン産生およびストレス反応の媒介に関与する遺伝子、Ｉａｐｐ（膵島アミロイドポリペプチド）、Ａｔｆ３（活性化転写因子３）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）およびＩｄ−１（ＤＮＡ結合１の阻害剤）が、ＨＣＨＦラットにおいて上方制御されたが、化合物５２による生体内での処置によって緩和された。ＨＣＨＦ食餌を与えられたラットは、グルコースおよびインスリン不耐性の異常を発生したが、化合物５２による処置により、経口グルコース負荷試験においてグルコース負荷が改善され、インスリン負荷試験においてインスリンに対する反応性が改善された。化合物５２による処置の後、ＨＣＨＦを与えられたラットは、非処置のＣＳを与えられたラットと同等のインスリン感受性を有していた。ＰＡＲ２作動薬および化合物５２を、マウスのＭＩＮ６  β細胞におけるグルコース促進インスリン分泌（ＧＳＩＳ）および細胞内カルシウム動員についてインビトロでさらに評価した。２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２の投与により、ＭＩＮ６におけるグルコース促進インスリン感受性が阻害された一方、化合物５２による前処理により、インスリン分泌が正常化された。３種の異なるＰＡＲ２作動薬（トリプシン、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２、２ｆ−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２）がそれぞれ、濃度依存的にＭＩＮ６  β細胞における細胞内カルシウム放出を活性化した。これらのデータは、ＰＡＲ２活性化、インスリン調節およびグルコース恒常性の間の密接な関連を裏付けている。
【０２０９】
実施例１９．ヒトおよびラットの肥満が、ＰＡＲ２発現を増加させる。
一対の大網および皮下脂肪生検（ｎ＝１１）を、Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。試料を、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって規定されるボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）にしたがって、痩身被験体（ｎ＝２、ＢＭＩ＝２１．４±１．２ｋｇ／ｍ２）、過体重被験体（ｎ＝５、ＢＭＩ＝２７．３±１．８ｋｇ／ｍ２）および肥満被験体（ｎ＝４、ＢＭＩ＝３２．９±１．５ｋｇ／ｍ２）に分類した。１１人の痩身、過体重および肥満の人の小規模なコホートについて、ヒトの脂肪組織におけるＰＡＲ２  ｍＲＮＡ発現が、体重とともに増加することが分かった。被験体のボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）は、被験体の大網および皮下脂肪組織におけるＰＡＲ２発現と正に相関しており、これは、ＰＡＲ２発現が、ヒトの肥満の新規なバイオマーカーである可能性があることを示唆する。肥満とＰＡＲ２  ｍＲＮＡ発現との間のこの関係が、高炭水化物高脂肪の食餌を１８週間与えられたＷｉｓｔａｒラットにおいて裏付けられ、このＷｉｓｔａｒラットは、低脂肪のコーンスターチの食餌を与えられたラットと比べて、脂肪組織におけるＰＡＲ２  ｍＲＮＡ発現の１５倍の増加およびＰＡＲ２タンパク質発現の２倍の増加を示した。この増加したＰＡＲ２発現の４分の３は、肥満に関連した慢性炎症の発症に関与する広範囲の浸潤したマクロファージおよび他の免疫細胞を含む、ラットの脂肪組織の非脂肪細胞間質血管分画に関連していた。
【０２１０】
実施例２０．実験の関節炎におけるＰＡＲ２拮抗作用。
ヒトプロテアーゼ活性化受容体２拮抗薬が、マクロファージ活性化、肥満細胞脱顆粒およびコラーゲン誘発性関節炎を緩和する。
【０２１１】
ＰＡＲ２拮抗薬５２を、ヒトマクロファージにおけるＰＡＲ２誘発性の細胞内Ｃａ２＋放出の拮抗作用、λ−カラギーナン（１％）またはβ−トリプターゼ（２０μｇ）によって誘発される急性のラット足浮腫の阻害、およびラットのコラーゲン誘発性関節炎における疾患修飾性抗炎症活性について調べた。組織を、コラーゲン損失、マクロファージ浸潤、肥満細胞脱顆粒、および血漿薬物動態について分析し、それらを測定した。
【０２１２】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、ヒトマクロファージにおいて報告される化合物（ＥＮＭＤ−１０６８）より１０００倍強力なＰＡＲ２拮抗薬であった。ＰＡＲ２拮抗薬５２は、足底内の（ｉｎｔｒａｐｌａｎｔａｒ）λ−カラギーナンまたはβ−トリプターゼによって誘発される足浮腫を軽減したが、インビトロでのトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害しなかった。ＰＡＲ２拮抗薬５２は、ラットに経口投与可能であり（Ｆ＝５５％、１０ｍｇ／ｋｇ／日／経口投与（ｐ．ｏ．））、コラーゲン誘発性ラット関節炎を緩和し；疾病に関連する病理学的および組織病理学的変化（足浮腫、マクロファージ浸潤、肥満細胞脱顆粒、パンヌス形成、滑膜の過形成、コラーゲン分解）を改善した。
【０２１３】
材料および方法
動物。雄および雌のＷｉｓｔａｒラット（８〜９週齢、２５０±５０ｇ）を繁殖させ、クイーンズランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで飼育した。動物を、食物および水が提供された飼育設備の規格にしたがって１２時間の明暗周期に維持する。全ての実験は、クイーンズランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）の動物倫理委員会によって承認された。
【０２１４】
薬剤および化学薬品。ウシのＩＩ型コラーゲン（鼻軟骨に由来する）、フロイント不完全アジュバントおよびヘパリンは、Ｓｉｇｍａ（Ａｕｓｔ．）によって供給されるものであった。ヒト組み換え肺β−トリプターゼを、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。２フロイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２、ＰＡＲ２拮抗薬５２およびＥＮＭＤ−１０６８を、文献にしたがって合成した。ＰＡＲ２拮抗薬５２を、オリーブ油に溶解させ、特に記載しない限り、強制経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ／経口投与（ｐ．ｏ．）、ポリプロピレン栄養管、１８Ｇ×７５ｍｍ、Ｉｎｓｔｅｃｈ  Ｓｏｌｏｍｏｎ（Ａｕｓｔ））によって投与した。
【０２１５】
マクロファージの分化、培養およびカルシウム動員アッセイ。末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ密度遠心分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、軟膜から単離した（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｋｅｌｖｉｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＱＬＤ）。ＣＤ１４＋単球を、ＣＤ１４＋  ＭＡＣＳ電磁ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて陽性に選択した（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｓｅｌｅｃｔ）。単球を、Ｍ−ＣＳＦ（ＰｅｐｔｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて完全培地中でＨＭＤＭへと分化させた。播種の５日後、ＨＭＤＭに、ＣＳＦ−１を含有する５０％の新鮮な完全培地を補充し、７日目に使用するための再度平板培養した。
【０２１６】
トリプターゼ活性アッセイ。β−トリプターゼ（１０ｎｇ／μＬ、１００μＬ）±ＰＡＲ２拮抗薬５２（２０μＭ）を１５分間インキュベートし、それに、基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（２５０μＭ）を加えた。吸光度を、１時間にわたって４１秒ごとに４０５ｎｍにおける光学密度として測定した（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ，ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ，Ａｕｓｔ．）。
【０２１７】
薬物動態。雄のＷｉｓｔａｒラットに、頸静脈カテーテルを外科的に埋め込んだ。（ヘパリン化された）血液試料を、麻酔されていない無拘束ラットのカテーテルから、ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇで経口投与（ｐ．ｏ．））を投与する５分前ならびに投与の３０分後、１〜６時間後、８時間後および２４時間後に採取した。カテーテルを埋め込まれていないラットに、ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与（ｐ．ｏ．））を４日間連続で与えた（ｎ＝６）。５日目に、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、足組織および腹腔内の脂肪を、ＬＣＭＳ分析のために採取した。
【０２１８】
ＰＡＲ２誘発性足浮腫。既述の方法（Ｋｅｌｓｏ  ＥＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００６，３１６（３）：１０１７−２４；Ｓｕｅｎ  ＪＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１１，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７６−５３８１．２０１１．０１６１０．ｘ．）に基づいて、ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇを皮下投与（ｓ．ｃ．）；ｎ＝４）、ＥＮＭＤ−１０６８（１００ｍｇ／ｋｇを皮下投与（ｓ．ｃ．）；ｎ＝４）または媒体対照（ＤＭＳＯを皮下投与（ｓ．ｃ．）；ｎ＝２）を、雄のＷｉｓｔａｒラットに投与した。基準値の足の厚さおよび幅を、デジタルキャリパー（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を用いて測定し、面積（ｍｍ２；厚さ×幅）で表した。１５分後、２フロイル−ＬＩＧＬＲＯ−ＮＨ２（１００μＬの生理食塩水中３５０μｇ／足）を、右後足の肉球に注射した（足底内、足蹠皮下投与（ｉ．ｐｌ．））。生理食塩水のみを受ける左後足が対照としての役割を果たした。別の実験において、媒体（５００μＬのオリーブ油）対ＰＡＲ２拮抗薬５２（５００μＬのオリーブ油中１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．））のみを、２つの群のラット（群当たり４匹）に経口投与した。２時間後、β−トリプターゼ（ヒト組み換え肺、１００μＬの生理食塩水中２０μｇ）を、各群の全ての動物の右後足の肉球に注射した（対照のために左後足には媒体を注射した）。全ての実験において、足の膨張を測定し、面積（ｍｍ２；厚さ×幅）で表し、各個体の足の基準値からの変化の％としてプロットした。
【０２１９】
λ−カラギーナン誘発性足浮腫。方法は、文献（Ｋｅｌｓｏ  ＥＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００６，３１６（３）：１０１７−２４；Ｋａｗａｂａｔａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００１，２３（６）：１１８１−３）に基づくものであった。雄のＷｉｓｔａｒラット（群当たりｎ＝４）に、１０ｍｇ／ｋｇのＰＡＲ２拮抗薬５２（オリーブ油に溶解させた状態での強制経口投与（ｐ．ｏ．）、５００μＬ）を与えた。対照の動物は、オリーブ油のみを受けた。３０分後、λ−カラギーナンを、右後足の肉球に投与した（生理食塩水中１％  ｗ／ｖ、１００μＬ、足蹠皮下投与（ｉ．ｐｌ）、左足の肉球には生理食塩水対照）。足の厚さおよび幅を、１〜６時間、８時間および２４時間（上記のように）の時点で測定し、膨張を面積（ｍｍ２）で表し、各個体の足の基準値からの変化の％としてプロットした。
【０２２０】
コラーゲン誘発性関節炎。プロトコルは、既述のプロトコルに基づくものであった（Ｌｉｎ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００７，１５０（７）：８６２−７２；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００３，４８（９）：２６７０−８１）。雌のＷｉｓｔａｒラット（２００〜２５０ｇ、ｎ＝１４）を、０日目に、ウシ鼻コラーゲン（２００μｇ、５０：５０の０．０５Ｍの酢酸およびフロイント不完全アジュバント、尾の付け根に皮下投与（ｓ．ｃ．））で免疫付与した。シャム手術動物（ｓｈａｍ  ａｎｉｍａｌ）は、媒体のみ（コラーゲンなし；５０：５０の０．０５Ｍの酢酸およびフロイント不完全アジュバント、尾の付け根に皮下投与（ｓ．ｃ．））を受けた。同じ用量の追加免疫を、７日目に与えた。ＰＡＲ−２拮抗薬５２（オリーブ油中１０ｍｇ／ｋｇ、５００μＬ、経口投与（ｐ．ｏ．）、体重により調整）またはオリーブ油媒体（関節炎の対照およびシャム手術動物）の毎日の経口投与を７日目に開始した。足の厚さおよび幅（上記のような）、体重、疾患活動性スコアおよび機械的侵害受容閾値を、１０〜２８日目に１日おきに測定した。
【０２２１】
疾患活動性指数（ＤＡＩ）および機械的痛覚過敏を評価し、０〜４＋で質的に採点した。ＤＡＩは、移動度の変化、炎症および不快感／疼痛を含む、複数の特徴的な疾患病状に基づくものである（最大合計スコアは１８）。足底の機械的侵害受容閾値を、Ｓｅｍｍｅｓ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒｓ（Ｔｏｕｃｈ  Ｔｅｓｔ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒｓ，Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【０２２２】
組織病理および関節の評価。２８日目に、全てのラットを安楽死させ、後足を、４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、脱灰し、パラフィンろうに埋め込み、１０μｍで切断した。切片を、一般的な組織構造についてはＨ＆Ｅで、コラーゲン損失についてはマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）でまたは肥満細胞についてはアルシアンブルー／サフラニン−Ｏで染色した ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Lam</Author><Year>2010</Year><RecNum>106</RecNum><record><rec-number>106</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="22rsxpsvof9tvge5dp0xss2oaz5z29trsfpx">106</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Lam, D. K.</author><author>Schmidt, B. L.</author></authors></contributors><auth-address>Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University of California - San Francisco, San Francisco, CA 94143-0440, USA.</auth-address><titles><title>Serine proteases and protease-activated receptor 2-dependent allodynia: a novel cancer pain pathway</title><secondary-title>Pain</secondary-title></titles><periodical><full-title>Pain</full-title></periodical><pages>263-72</pages><volume>149</volume><number>2</number><edition>2010
/03/02</edition><dates><year>2010</year><pub-dates><date>May</date></pub-dates></dates><isbn>1872-6623 (Electronic)&#xD;0304-3959 (Linking)</isbn><accession-num>20189717</accession-num><urls><related-urls><url>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&amp;db=PubMed&amp;dopt=Citation&amp;list_uids=20189717</url></related-urls></urls><custom2>2861734</custom2><electronic-resource-num>S0304-3959(10)00085-0 [pii]&#xD;10.1016/j.pain.2010.02.010</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>（４２）。組織マクロファージを、標準的なＩＨＣ技術を用いて、ＥＤ１モノクローナル抗体（未成熟ラットマクロファージ／単球については、Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて標識した。ＩｍａｇｅＪ  １．４２ｑソフトウェアを用いて、足当たり複数（＞６）の画像から顕微鏡分析および細胞計数を行った。
【０２２３】
データ分析。全ての実験結果を、平均±ＳＥＭとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ５．０ａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてデータを分析した。３つ以上の群を含むデータセットについては二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ。個々の時点については、一元配置ＡＮＯＶＡを使用し、群を、ボンフェローニの事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を用いて比較した。スチューデントのｔ検定を、２つのデータセットのデータ比較に使用した。有意性は、ｐ＜０．０５に設定された。
【０２２４】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、経口投与可能である。強制経口投与によるＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇ）を与えられたラットに由来する血液を、Ｔｍａｘ  ４．０±０．６時間、Ｃｍａｘ  １．７±０．４μＭおよびＴ１／２  １．１３±０．１３時間で、薬剤の血漿濃度（Ｃｐ）について分析した。２４時間後、ＰＡＲ２拮抗薬５２は血漿中に存在しなかった。この化合物は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与するのに十分に水溶性でないが、経口バイオアベイラビリティ（Ｆ  約５５％、ｎ＝３）を、所与の用量（１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．））で、Ｃｐ曲線（ＡＵＣ  ０〜６時間）下の面積から決定することができた。
【０２２５】
予め４日間にわたってＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与（ｐ．ｏ．））を受けた動物から死後に採取された血漿および脂肪組織は、第４の投与の２４時間後の時点で比較的高いＰＡＲ２拮抗薬５２Ｃｐを有していた（０．５±０．１μＭ、ｎ＝６、２４時間の時点で単回投与Ｃｐより約３０％多い）。腹腔内脂肪も、比較的高い濃度のＰＡＲ２拮抗薬５２を有していた（０．１５±０．０２μＭ、ｎ＝６、２４時間の時点でＣｐの約３０％）。ＰＡＲ２拮抗薬５２は、脳脊髄液から検出されず（ＬＣＭＳ／ＭＳ検出限界＜１．８ｎＭ、ｎ＝３）、これは、ＰＡＲ２拮抗薬５２が、血液髄液関門を有効に越えなかったことを示唆し、これは、このような大きい疎水性薬剤には意外ではない（ＣＬｏｇＰ  ５．８）。
【０２２６】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、ＰＡＲ２作動薬誘発性浮腫を減少させる。ＰＡＲ２拮抗薬５２を、研究者によって広く使用されるＰＡＲ２ペプチド作動薬、２フロイル−ＬＩＧＬＲＯ−ＮＨ２（３５０μｇ／足）によって誘発される足浮腫および炎症のラットモデルにおいて生体内で評価して、インビトロおよび生体内でのＰＡＲ２機能を調べた（２）。
【０２２７】
要約すると、図１９は、ＰＡＲ２拮抗薬５２が、ラットの実験の足浮腫を緩和することを示す。（Ａ）ＰＡＲ２拮抗薬５２（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｋｇを皮下投与（ｓ．ｃ．）、ｎ＝３）は、２フロイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２（３５０μｇ／足、１時間の時点で最大の膨張が示された）によって誘発される足浮腫を軽減し、ＥＮＭＤ−１０６８（１００ｍｇ／ｋｇを皮下投与（ｓ．ｃ．）、ｎ＝３）は軽減しなかった。（Ｂ）経口投与されたＰＡＲ２拮抗薬５２（オリーブ油中１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．））は、β−トリプターゼ（２０μｇ／足）によって誘発される浮腫を予防した。（Ｃ）β−トリプターゼ誘発性浮腫は、滑膜外（ｅｘｔｒａｓｙｎｏｖｉｕｍ）における肥満細胞脱顆粒に関連し、これは、ＰＡＲ２拮抗薬５２による前処理（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４／群）によって改善された。（Ｄ）ＰＡＲ２拮抗薬５２（２０μＭ）は、発色性基質トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（４０５ｎｍにおける光学密度としての吸光度、ｎ＝４〜５）におけるβ−トリプターゼ（１ｎｇ／ｍＬ）の酵素活性を阻害しなかった。（Ｅ）１％のλ−カラギーナンの足底内投与が、持続的な浮腫を誘発し、これは、ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ）、ｎ＝４／群、＊ｐ＜０．０５）によって５０％まで減少された。データを平均±ＳＥＭとして表した。
【０２２８】
ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇを皮下投与（ｓ．ｃ．））は、足浮腫を強く軽減することが分かった一方、比較例の化合物ＥＮＭＤ−１０６８は、ラットのＰＡＲ２誘発性の急性炎症のこのモデルにおいて１００ｍｇ／ｋｇの皮下投与（ｓ．ｃ．）で効果を有さなかった（図１９Ａ）。ＰＡＲ２拮抗薬５２は、他のＰＡＲ２作動薬、例えばトリプシン、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２およびＧＢ１１０によって誘発される足浮腫を抑制することが最近分かった。
【０２２９】
経口で与えた場合、ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇ）は、内因性ＰＡＲ２作動薬β−トリプターゼ（２０μｇ／１００μＬ／足）の足底内注射によって２時間後に誘発されるラットの足浮腫を強く抑制した（図１９Ｂ）。このタイミングにより、より高い血中濃度の拮抗薬（Ｃｍａｘ  ４時間）が、最大の足浮腫がトリプターゼによって誘発されたとき（トリプターゼの投与の３０分後）に存在することが可能になる。滑膜外における脱顆粒肥満細胞の数が、アルシアンブルー／サフラニン−Ｏ染色によって組織学的に検出した際に、β−トリプターゼで処置されたラットにおいて著しく増加したが、ＰＡＲ２拮抗薬５２の前処理によって抑制された（ｐ＜０．０５、図１９Ｃ）。この領域における肥満細胞の総数は、β−トリプターゼに応答して変化しなかった。ＬＣＭＳ／ＭＳを用いて、ＰＡＲ２拮抗薬５２も、投与（０．０３５μＭ）の３時間後に足組織ホモジネートにおいて検出され、これは、化合物が、効果が測定される標的組織に到達したことを示す。ヒトβ−トリプターゼ（１ｎｇ／ｍＬ）のインビトロでの活性が、ＰＡＲ２拮抗薬５２（２０μＭ）によって阻害されなかった（図１９Ｄ）ことから、この抗炎症活性は、β−トリプターゼ酵素の直接の阻害によるものではなかった。これは、ラットの生体内でのトリプターゼの炎症誘発作用が、ＰＡＲ２を介して媒介され、ＰＡＲ２拮抗薬によって生体内で阻止され得るという考えを裏付けている。ＰＡＲ２拮抗作用が、ＰＡＲ２の内因性タンパク質分解作動薬によって促進される肥満細胞脱顆粒を生体内で防止することも結論付けられ得る。
【０２３０】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、カラギーナン誘発性足浮腫を軽減する。１％のλ−カラギーナンの足底内投与は、対照ラットにおいて長期にわたる著しい足浮腫を誘発した（ｎ＝４、図１９Ｅ）。カラギーナンの３０分前のＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．）、ｎ＝４）による予防的治療により、６時間の時点で最も顕著であった膨張が著しく軽減された（約５０％）。膨張は、この急性炎症モデルにおいて完全に改善されなかったが、これは、浮腫誘発（Ｔｍａｘ  ４時間）の時点でＣｍａｘに達していない実験の時間経過に関連し得る。したがって、ＰＡＲ２拮抗薬５２は、２フロイル−ＬＩＧＬＲＯ−ＮＨ２およびトリプターゼによって誘発されるＰＡＲ２特異的炎症、ならびにカラギーナンによって誘発される非特異的炎症を阻害した。
【０２３１】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、コラーゲン誘発性関節炎を改善する。経口投与されたＰＡＲ２拮抗薬５２が、ラットの炎症性疾患、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の慢性モデルにおいても抗炎症性であったかどうかを判定するために、試験を行った。
【０２３２】
要約すると、図２０は、予防的ＰＡＲ２拮抗薬５２が、コラーゲン誘発性関節炎の病態生理を改善することを示す。ＰＡＲ２拮抗薬５２（１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与（ｐ．ｏ．））は、（Ａ）後足膨張の著しい減少、（Ｂ）関節炎の兆候のある動物の著しい減少および（Ｃ）非処置のＣＩＡ−対照と比較したＤＡＩの減少（＊ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ、（Ｂ）ではカイ二乗）を引き起こした。（Ｄ）ＰＡＲ２拮抗薬５２は、ＣＩＡに関連する機械的痛覚過敏も予防した（＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。シャム手術動物（黒塗りの丸）；ｎ＝３、ＣＩＡ−対照（黒塗りの四角）ｎ＝６、ＰＡＲ２拮抗薬５２（白抜きの三角）；ｎ＝５。データを平均±ＳＥＭとして表した。
【０２３３】
コラーゲン接種は、特に、後肢における進行性の足膨張を誘発する（図２０Ａ）。２０日目まで、ＣＩＡ−対照群の全てのラットが、少なくとも片方の足に関節炎の兆候があり（図２０Ｂ）、６６±１６％の膨張を有していた（ｎ＝６）。膨張は、ＣＩＡ−対照動物において、２８日目に基準値を９０±１６％超えるまで増大し続けた（図２０Ａ）。対照的に、ＰＡＲ２拮抗薬５２による処置（１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与（ｐ．ｏ．）、ｎ＝５）は、６０％の動物が、２８日目までに発症したことを示し、その全てが、２５±９％の軽度の（最大）膨張を示したに過ぎなかった（ＣＩＡ−対照からｐ＜０．０５、図２０ＡおよびＢ）。足膨張の増大は、観察されたＤＡＩと相関していた。典型的に、ラットは、１７日目に炎症兆候（膨張および発赤）の出現を示した。ＣＩＡ−対照動物は、徐々に悪化するＤＡＩを示し、２８日目までに９．５±２．４まで増加した（図２０Ｃ）。ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置された動物は、関節炎様の兆候の発生をかなり防がれ、２８日目に軽度のＤＡＩスコアを示したに過ぎなかった（最大ＤＡＩ  １．６±０．９（ｐ＜０．０５）、図２０Ｃ）。シャム手術動物は、関節炎疾患の兆候を示さなかった。足膨張に関連する機械的侵害受容閾値は、２８日目にシャム手術動物と比較してＣＩＡ−対照において約３０％低かったが（ｐ＜０．０５）、この影響は、ＰＡＲ２拮抗薬５２による処置によって取り除かれた（ＣＩＡ−対照からｐ＜０．０５、図２０Ｄ）。
【０２３４】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、関節炎発症の際の組織病理学的変化を防止する。
図２１に示されるように、ＰＡＲ２拮抗薬５２の予防的投与は、関節炎発症の際の組織病理学的変化を改善する。（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色した足関節切片（脛骨距骨関節）の代表的な顕微鏡写真は、ＣＩＡ−対照と比較した、ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置された動物の減少した関節炎の組織病理を示す。滑膜外の炎症細胞浸潤（白抜きの矢印）、滑膜の過形成（白抜きの矢尻）、軟骨／骨侵食（黒塗りの矢印）ならびにパンヌスおよび米粒体の形成（黒塗りの矢尻）が全て減少される（スケールバー２００μｍ）。（Ｂ）全ての４つのパラメータ（滑膜の過形成、浮腫、骨／軟骨侵食、パンヌス形成）についてのＣＩＡ−対照およびＰＡＲ２拮抗薬５２で処置された動物の組織病理学的採点により、ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置されたラットにおいて著しく減少された組織病理が定量化される。シャム手術動物は、組織病理を示さなかった（＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定、対照ｎ＝６、ＰＡＲ２拮抗薬５２  ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表した。
【０２３５】
Ｈ＆Ｅで染色された脛骨距骨関節の組織学的検査により、ＣＩＡ−対照動物が、浮腫、炎症細胞浸潤、滑膜の過形成、滑膜の米粒体、パンヌス形成、軟骨損傷および骨侵食などの、関節炎疾患に関連する重度の主要な組織病理を有していたことが示された（図２１ＡおよびＢ）。ＰＡＲ２拮抗薬５２の連日投与により、全ての組織病理学的変化がほぼ完全に予防された（ＣＩＡ−対照からｐ＜０．０５、図２１Ｂ）。マッソントリクロームで染色された組織は、より多い割合のアニリンブルー染色を有するＣＩＡ−対照と比較して、ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置されたラットにおいて著しく減少したコラーゲン損失を示した（図２２ＡおよびＤ）。これは、Ｈ＆Ｅで染色された切片において観察される軟骨／骨侵食の結果とよく一致していた。免疫組織化学により、ＥＤ１陽性マクロファージの数が、ＣＩＡ−対照動物において、特に、滑膜、パンヌスおよび関節面の内層内で、著しく増加されたことが示された（図２２Ｃ、ｐ＜０．０５）。Ｈ＆Ｅの観察結果によれば、ＰＡＲ２拮抗薬５２は、ＣＩＡ−対照におけるＥＤ１−マクロファージの関節炎様の上方制御を予防し、シャム手術動物の細胞数との差を示さなかった（図２２ＣおよびＦ）。全ての組織学的に染色された組織において、シャム手術動物には、関節炎の兆候がなかった。
【０２３６】
ＰＡＲ２拮抗薬５２は、関節炎様の肥満細胞脱顆粒を防止する。
図２２に示されるように、ＰＡＲ２拮抗薬５２は、病変関節における関節炎様のコラーゲン損失、肥満細胞脱顆粒およびマクロファージ集積を防止する。（Ａ）マッソントリクロームで染色された足関節切片（脛骨距骨関節）。黒塗りの矢尻は、コラーゲンおよび骨分解の部位（赤色の染色、スケールバー２００μｍ）を示す。（Ｂ）ラット足切片における示差的なアルシアンブルー／サフラニン−Ｏで染色された肥満細胞（不活性（赤色）、活性（赤色／青色の混合）、脱顆粒（青色）。スケールバー２０μｍ）。（Ｃ）ＥＤ−１（ＤＡＢ、褐色）で染色されたラット足切片は、シャム手術動物およびＰＡＲ２拮抗薬５２で処置された動物の両方と比較した、ＣＩＡ−対照における浸潤マクロファージ（矢印）の著しい増加を示す（スケールバー２００μｍ）。（Ｄ）定量化されたコラーゲン損失は、ＰＡＲ２拮抗薬５２がコラーゲン侵食を防止することを示す（＊ｐ＜０．０５）。（Ｅ）シャム手術動物およびＰＡＲ２拮抗薬５２で処置された動物の両方と比較した、ＣＩＡ−対照における著しく活性が高い脱顆粒肥満細胞の割合を示す染色された肥満細胞の定量分析（＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ）ＥＤ−１で染色されたマクロファージは、シャム手術動物よりＣＩＡにおいてより多い数の浸潤マクロファージを示し、これは、ＰＡＲ２拮抗薬５２による処置（１０ｍｇ／ｋｇ／日の経口投与（ｐ．ｏ．））によって正常化された。（Ｇ）足膨張％および活性／脱顆粒肥満細胞％の回帰分析は、強い相関を示す（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．８５、ｐ＜０．０５）。全てのデータについて、シャム手術動物ｎ＝３、ＣＩＡ−対照  ｎ＝４、ＰＡＲ２拮抗薬５２  ｎ＝４。データを平均±ＳＥＭとして表した。
【０２３７】
示差的なアルシアンブルー／サフラニン−Ｏ染色（図２２Ｂ）は、肥満細胞活性化および脱顆粒が、ＣＩＡ−対照において３３％多かったことを示した。全肥満細胞の３分の２が、活性であるかまたは脱顆粒されていた。ＰＡＲ２拮抗薬５２で処置された動物は、シャム手術動物と比較して肥満細胞活性化状態の差を示さず、全ての肥満細胞の約８０％が不活性であり、５％未満が脱顆粒されていた（図２２Ｅ）。全肥満細胞数の差は全ての処置群間で測定されなかった（７６．７±６．７個の細胞／ｍｍ２、ｎ＝１３）。回帰分析は、足膨張と活性肥満細胞との間（活性であるかまたは脱顆粒されているとみなされる細胞を含む；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．８５、ｐ＜０．０５、図２２Ｇ）、および活性肥満細胞のパーセントと滑膜のマクロファージ数との間（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．８９、ｐ＜０．００５）の強い正の相関を示し、これは、ＣＩＡモデルにおける活性な肥満細胞、マクロファージおよび足膨張の間の機能的関連を裏付けている。肥満細胞と異なり、マクロファージ数と足膨張との間の弱い相関があり（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．６３、ｐ＝０．０２５）、これは、マクロファージが、観察される膨張自体にそれほど寄与せず、骨および軟骨侵食に寄与し得ることを示唆する（図２２Ｃを参照）。
【０２３８】
実施例２１．結腸細胞、大腸炎および炎症性腸疾患の調節。
クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、共通の病理を有する慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の一般的な形態である。ＵＣは、結腸および直腸を侵し、ＣＤは、結腸および回腸の複数の領域を侵し、それぞれの病態は、特徴的な模様の粘膜の潰瘍を有する。ＩＢＤは、狭窄に関連する腸穿孔、結腸直腸癌、および多臓器機能不全の後に敗血症を発症するリスクを高める。
【０２３９】
結腸細胞の調節。ヒト結腸直腸腺癌（ＨＴ２９）細胞を、カルシウム結合色素（Ｆｕｒａ３）緩衝液を用いて、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、様々な濃度の化合物５２または既に報告された化合物Ｎ１−３−メチルブチリル−Ｎ４−６−アミノヘキサノイル−ピペラジン（ＥＮＭＤ−１０６８）で１５分間処理した後、２フロイル−ＬＩＧＲＬＯ−ＮＨ２（１Ｍ）を加えた。細胞内カルシウム動員を、対応する拮抗薬濃度に対してプロットされた蛍光の差によって測定し、拮抗薬の効力の測定を可能にした。化合物５２が、ヒトＨＴ２９結腸細胞における細胞内カルシウム放出を阻害することが分かった。化合物５２は、既に報告された化合物ＥＮＭＤ−１０６８より、結腸細胞におけるＰＡＲ２活性化のより強力な拮抗薬であった（ＩＣ５０が５ｍＭに対して８Ｍ）。
【０２４０】
ＰＡＲ２誘発性急性結腸炎症。Ｗｉｓｔａｒラットを、一晩絶食させ、化合物５２（１０ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．））または媒体（オリーブ油）のいずれかの単回の経口投与を受けさせた２時間後に、イソフルランで麻酔した。ポリエチレンカテーテル（１．７ｍｍの外径）を、肛門を介して結腸内に８ｃｍ挿入し、それを通して、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２（１ｍｇ／ラット）または生理食塩水媒体（５００ｌ）を投与した。ラットを１０分間麻酔したまま、４０°の角度に保って、肛門からの漏れを防いだ。食物および水を与えてラットを回復させた。全てのラットを、誘発の１０時間後に殺処分し、疾患活動性指数（ＤＡＩ）および顕微鏡的疾患（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）（以下の疾患活動性指数を参照）について適切に採点した。結腸組織を、湿潤／乾燥比およびＭＰＯアッセイのために採取した。化合物５２は、このＰＡＲ２作動薬で誘発される急性結腸炎症における抗炎症活性を示した。ＰＡＲ２作動薬ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２によってラットにおいて誘発された急性結腸炎症は、化合物５２（１０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与によって阻害され、浮腫、ムチン減少、ＰＡＲ２受容体内在化、および肥満細胞症が著しく減少された。
【０２４１】
ＴＮＢＳ誘発性慢性大腸炎モデル。０日目に、ラットを秤量し、スルファサラジン（オリーブ油中１００ｍｇ／ｋｇを経口投与（ｐ．ｏ．））、化合物５２（オリーブ油中１０ｍｇ／ｋｇ）、または媒体（５００ｌのオリーブ油を経口投与（ｐ．ｏ．））のいずれかのそれぞれの処置を与え、水を自由に与えながら２４時間絶食させた。翌日（１日目）、ラットを秤量し、それぞれの化合物を投与し、イソフルランで麻酔した。ポリエチレンカテーテルを直腸内に挿入した（８ｃｍ）。対照および薬剤で処置された動物に、ＴＮＢＳ（生理食塩水および２５０ｌの、水中５０％のエタノール中８０ｍｇ／ｋｇ）の結腸内投与を受けさせた（Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。シャム手術動物には、ＴＮＢＳを等体積の水に代えて、媒体のみを投与した。ラットを、傾斜位（４０°）に３０分間保ち、次に、食物および水を与えて回復させた。ラットに、それぞれの化合物を毎日投与し、秤量し、全体的な健康および疾患進行について採点した。より早期に死亡しない限り、実験の８日目に全てのラットを殺処分した。疾患進行および死後の結腸組織病理を、以下の方法によって採点した。ＰＡＲ２およびトリプターゼの共局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を、免疫組織化学を用いて調べた。
【０２４２】
疾患活動性指数（ＤＡＩ）。急性および慢性モデルの両方についてのＤＡＩが、処置内容を知らされていない専門家によって、評価され、採点された。スコアには、移動度、胃腸病変、不快感、および全身性疾病行動の基準が組み込まれていた（それぞれ０〜３で採点された）。いずれかの基準において段階３に達したいずれの動物も、ＣＯ２吸入によって安楽死させ、疾病に関連する死亡として報告した。スコアを合計し、合計疾患スコア（最大１２）として表した。ＤＡＩを、急性試験では終点のみ（１０時間）で、および慢性ＴＮＢＳ試験では毎日測定した。
【０２４３】
顕微鏡的疾患指数。結腸を、死後解剖し、一部の多少の修正を加えた（最大スコアが１４）、既述の顕微鏡的疾患スコア（Ｂｏｂｉｎ−Ｄｕｂｉｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に基づいて顕微鏡的疾患スコアを与えた。結腸長さ全体を、回結腸および結腸直腸接合部の間で取り出した。長さおよび最大膨張幅を測定した。病変のある結腸の切片を、生化学分析、組織学、および湿潤／乾燥重量のために採取した。
【０２４４】
組織学および免疫組織化学。標準的なプロトコルを用いて、組織試料を、パラフィンろうに埋め込み、ミクロトームで切断し（５ｍ）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはアルシアンブルー、ｐＨ１．０、およびサフラニン−Ｏのいずれかで染色した。免疫組織化学のために、組織を、標準的な１０ｍＭのクエン酸塩抗原賦活化（ｃｉｔｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）および４時間の（一次）インキュベーションプロトコルを用いて、ＰＡＲ２に対する抗体（Ｎ１９  １：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）および／または肥満細胞トリプターゼ（ＡＡ１；１：１００；Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で標識した。標準的なＩｍａｇｅＪアルゴリズム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて、全ての蛍光画像に、バックグラウンド除去および輝度向上を行って、染色パターンを明確にした。
【０２４５】
腸壁の厚さ。腸壁の厚さを、処置内容を知らされていない調査員によって測定した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（１．４２ｑ）を用いて、Ｈ＆Ｅで染色された顕微鏡写真（２０個のレンズ）から測定を行った。画像画素をミクロン（０．１４３画素／ｍ）まで調整し、外側の環状筋から内側の陰窩基底部までの距離を測定した。
【０２４６】
ミエロペルオキシダーゼおよびＥＬＩＳＡ。固定されていない結腸切片を、４℃／０．５％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム／リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（１００ｍｇ／ｍＬ  ｗ／ｖ、ｐＨ６．０）中で均質にし、４℃で１０分間にわたって１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清（１００ｌ）を（二通り）９６ウェルプレートに移し、それにジアニシジン（２０ｌ、１％のＨ２Ｏ２／リン酸緩衝生理食塩水中２．８５ｍｇ／ｍｌ）を加え、吸引によって混合した。プレートを、室温（暗所中）で１５分間インキュベートさせ、次に、蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ；ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。データを絶対光学密度単位として表した。製造業者の使用説明書にしたがって、組織ホモジネートにおけるサイトカイン発現（腫瘍壊死因子およびインターロイキン−６）を、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて測定した。
【０２４７】
データ分析。実験結果を平均Ｓ．Ｅ．Ｍとして表した。データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ５．０ａ；Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって分析した。統計比較を、３つ以上の群を含む時間データセットについて二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを用いて行った。個々の時点については、データを、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析し、群を、ボンフェローニの事前比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｌａｎｎｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を用いて比較した。有意性は、ｐ  ０．０５に設定された。
【０２４８】
結果。ラットの慢性大腸炎は、化合物５２（１０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与（ｐ．ｏ．））によって改善され、死亡率および病変（結腸閉塞、潰瘍、壁の厚さ、およびミエロペルオキシダーゼ放出を含む）が、臨床的に使用される薬剤であるスルファサラジン（１００ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与（ｐ．ｏ．））より効果的に減少された。化合物５２とスルファサラジンによる処置は両方とも、２日目以降、ＴＮＢＳ−対照と比較してＤＡＩの著しい改善を示した（図２３ＡおよびＢ；シャム手術動物から＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ＝１０；ＡＮＯＶＡ二元配置反復測定による事前比較）。化合物５２で処置されたラットは、ＤＡＩからのほぼ完全な回復を示した。化合物５２による処置はまた、ＴＮＢＳによる死亡を防ぐのに、スルファサラジンよりはるかに有効であった（図２３Ｃ、３３．３％の死亡率に対して８．３％の死亡率、ｐ＜０．０５）。急性および慢性の実験の大腸炎の両方におけるＰＡＲ２拮抗薬のこれらの疾患修飾性は、ＰＡＲ２およびＰＡＲ２活性化プロテアーゼについての病因的役割ならびに結腸の炎症性疾患におけるＰＡＲ２拮抗作用についての治療可能性を強く裏付けている。
【０２４９】
文献、作業、材料、デバイス、物品などの説明は、あくまでも本発明の内容を提供するために本明細書に含まれる。これらの事項のいずれかまたは全てが従来技術の基礎の一部を成し、優先日以前に存在していたために本発明に関連する分野に共通の一般的な知識であったことは示唆も提示もされていない。
【０２５０】
本明細書における、任意の従来の刊行物（またはそれから得られる情報）への言及、または公知の任意の事項は、該当する従来の刊行物（またはそれから得られる情報）または公知の事項が、本明細書が関する技術分野に共通の一般的な知識の一部を成すという認識または承認または何らかの形態の示唆として解釈されず、また、解釈されるべきではない。
【０２５１】
本明細書および後続の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形は、記載される整数または工程あるいは整数または工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数または工程あるいは整数または工程の群の除外を意味するものと理解されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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