(57)【要約】  本発明は、４〜３０重量％の親水性分枝状炭水化物ポリマーを含有する、生体試料保存用のセルロース又はガラス繊維紙を開示する。本発明は、上記紙に生体試料を適用し、乾燥することによって生体試料を保存する方法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０〜８００ｇ／ｍ2の表面重量を有し、セルロース繊維又はガラス繊維を含有し、さらに４〜３０重量％の親水性分枝状炭水化物ポリマーを含有する、生体試料の保存用の紙。
【請求項２】
１０〜２５重量％の親水性分枝状炭水化物ポリマーを含有する、請求項１記載の紙。
【請求項３】
水溶性分枝状炭水化物ポリマーの平均分子量が１５〜８００ｋＤａである、請求項１又は請求項２記載の紙。
【請求項４】
分枝状炭水化物ポリマーの平均分子量が７０〜４００ｋＤａ、例えば約７０ｋＤａ又は約４００ｋＤａである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の紙。
【請求項５】
分枝状炭水化物ポリマーが単又は二糖類と二官能性エポキシド試薬との共重合体を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の紙。
【請求項６】
分枝状炭水化物ポリマーがＦｉｃｏｌｌなどのショ糖とエピクロロヒドリンのポリマーである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の紙。
【請求項７】
１０重量％の分枝状炭水化物ポリマー水溶液の粘度が２０℃で１〜１０ｍＰａ・ｓである、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の紙。
【請求項８】
前記紙の水抽出可能物の含量が０〜２５重量％、例えば０．１〜５重量％又は３〜２０重量％である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の紙。
【請求項９】
さらに、負荷電基又は正荷電基、例えばカルボキシレート基又はアミン基を５〜３００μｍｏｌ／ｇ含有する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の紙。
【請求項１０】
さらに、１つ以上の乾燥生体試料、例えば乾燥血液試料を含有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の紙。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の紙を含む、試料回収装置。
【請求項１２】
１つ以上の試料適用領域が紙に印刷されている、請求項１１記載の試料回収装置。
【請求項１３】
１つ以上の生体試料を保存するにあたり、
ａ）生体試料を用意し、
ｂ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の紙に生体試料を適用し、
ｃ）生体試料を含有する前記紙を乾燥する
工程を含む、生体試料の保存方法。
【請求項１４】
乾燥した、生体試料を含有する紙を１週間以上保存する工程ｄ）を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程ｄ）で、保存温度が０℃以上、例えば０〜４０℃又は２０〜４０℃である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに、保存後の紙から１つ以上のタンパク質を抽出し、タンパク質を分析する工程ｅ）を含む、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が保存の影響を受けやすいタンパク質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
工程ｅ）で、生物活性状態の前記タンパク質の回収率が６０％以上、例えば８０％以上である、請求項１６又は請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程ｅ）で、前記タンパク質をイムノアッセイ又は質量分析法により分析する、請求項１６乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
ａ）水性懸濁液又はベース紙の形態のどちらかのセルロース繊維又はガラス繊維を用意し、
ｂ）前記繊維を、２〜６０重量％の水溶性分枝状炭水化物ポリマーを含有する溶液と接触させ、
ｃ）前記繊維が水性懸濁液状である場合、前記繊維から紙シートを形成し、
ｄ）前記紙を乾燥する
工程を含む、生体試料の保存用の紙の製造方法。
【請求項２１】
ａ）４０〜８００ｇ／ｍ2の表面重量を有し、セルロース繊維又はガラス繊維を含有するベース紙を用意し、
ｂ）ベース紙に、２〜６０重量％の水溶性分枝状炭水化物ポリマーを含有する溶液を含浸し、
ｃ）前記含浸した紙を乾燥する、
工程を含む、生体試料の保存用の紙の製造方法。
【請求項２２】
分枝状炭水化物ポリマーの平均分子量が１５〜８００ｋＤａ又は６０〜５００ｋＤａ、例えば約７０ｋＤａ又は約４００ｋＤａである、請求項２０又は請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
分枝状炭水化物ポリマーが単又は二糖類と二官能性エポキシド試薬との共重合体を含む、請求項２０乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
分枝状炭水化物ポリマーがＦｉｃｏｌｌなどのショ糖とエピクロロヒドリンのポリマーである、請求項２０乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記溶液が分枝状炭水化物ポリマーを２〜６０重量％、例えば２〜１５重量％含有する、請求項２０乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
分枝状炭水化物ポリマー溶液の粘度が２０℃で１〜２０ｍＰａ・ｓ、例えば１〜１０ｍＰａ・ｓである、請求項２０乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
ベース紙が５〜３００μｍｏｌ／ｇのカルボキシレート基などの負荷電基を含有し、負荷電基が水抽出不可能である、請求項２０乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
繊維又はベース紙が化学的に活性化されており、この繊維又はベース紙を分枝状炭水化物ポリマーと反応させる工程を含む、請求項２０乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
活性繊維又はベース紙がエポキシ基を含有する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに、反応後に繊維又はベース紙を洗浄する工程を含む、請求項２８又は請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料保存方法、特に紙基材上への試料保存方法に関する。本発明はまた、試料保存用の紙基材及びこのような基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体物質の分析及び／又は保存において紙基材の使用が増加している。１つの使用分野は、薬物動態研究、例えば創薬プログラムで大量の血液試料を迅速に分析する必要性が増加していることに関係するものである。このような使用には、紙が、十分な機械的特性と保存後に分析及び／又はさらに処理することができるように対象となる生体物質を保持する能力とを兼ね備えることが明らかに望ましい。このような紙の例には、ＦＴＡ及びＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社製）として知られているものがあり、例えば米国特許第５７５６１２６号及び第５９３９２５９号に記載されている。これらの紙は、化学物質を含浸して細胞を溶解したり、核酸を保存したり、核酸のさらなる処理を容易にしたりしている。
【０００３】
しかしながら、これらの紙は核酸分析用に特別に設計されている。タンパク質を分析する試料の処理にも紙基材を用いることに強い関心がもたれている。タンパク質は、乾燥及び保存時に変性し、結果的に生物活性が低下しやすい点で核酸とは異なる。分析するタンパク質、例えば血液中のバイオマーカー又は薬物は、しばしば非常に少量で存在し、添加剤によりマスクされやすい。特に、質量分析、イムノアッセイなどの分析技術は化学添加剤によって影響を受けるおそれがある。９０３又は３１ＥＴＦ紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社製）などのプレーンの未処理セルロース紙を血液試料の保存に用いて、その後タンパク質分析を行うが、これらは、例えば敏感なタンパク質の所望の添加回収率及び生物活性を必ずしも与えない。タンパク質を安定化させる方法として、ポリビニルアルコール、Ｆｉｃｏｌｌ、糖類などの様々なフィラーを添加することが、例えば米国特許出願公開第２０１０／０２０９９５７号及びＷＯ２００３／０２０９２４に言及されている。しかし、これらの組成物も、敏感なタンパク質の回収率と活性において限界がある。
【０００４】
分析用途での安定化に加えて、治療及び診断環境、例えば医薬品製剤又は診断試薬の乾燥状態での保存においてもタンパク質及び他の敏感な生体分子の安定化が必要とされている。
【０００５】
したがって、優れた試料保存方法及び優れた性能をもつ試料保存基材が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第３０７０４８６号
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１態様は、液体生体試料などの試料を受け入れ、乾燥及び保存後の生物活性タンパク質の回収率を向上できる試料適用基材を提供することである。これは請求項１に記載した紙により実現される。
【０００８】
１つの利点は、敏感なタンパク質の回収率を向上できることである。さらなる利点は、均一な円形試料スポットを得ること、かつ液体試料が基材に良好に吸収されることである。
【０００９】
本発明の他の態様は、試料を受け入れ、乾燥及び保存後の生物活性タンパク質の回収率を向上できる試料回収装置を提供することである。これは請求項１２に記載した試料回収装置により実現される。
【００１０】
本発明の第３の態様は、乾燥及び保存後の生物活性タンパク質の回収率を向上する、試料適用基材への試料の適用方法を提供することである。これは請求項１４に記載した方法により実現される。
【００１１】
本発明の第４の態様は、試料を受け入れ、乾燥及び保存後の生物活性タンパク質の回収率を向上できる紙基材の製造方法を提供することである。これは請求項２１及び２２に記載した方法により実現される。
【００１２】
従属請求項に、本発明のさらなる適当な実施形態を記載する。
【００１３】
定義
ここで用いる用語「紙」は繊維ウェブ又はシート材料を意味する。紙は繊維、例えばセルロース又はガラス繊維及び所望により他の成分、例えば粒状フィラー、湿潤紙力又は乾燥紙力増強剤、保持剤などを含有する。
【００１４】
ここで用いる用語「炭水化物ポリマー」は、炭水化物部分（糖類部分ともいう）を含む主鎖を有するポリマーを意味する。炭水化物ポリマーは、多糖類（即ち、結合した炭水化物／糖類部分からなる主鎖をもつポリマー）、修飾多糖類（即ち、置換基又はグラフトされた側鎖を有する多糖類）又は炭水化物部分が合成結合単位により互いに結合されている合成炭水化物ポリマーとすることができる。本発明の文脈では親水性炭水化物ポリマーは水溶性又は膨潤性のどちらかであり、後者の場合、ポリマーを架橋したり、１つ又は２つ以上の表面に結合したりすることにより水への溶解を防止することができる。
【００１５】
ここで用いる用語「被分析物」は、検出、定量化、分析、同定及び／又は評価を受ける物質又は検出、定量化、分析、同定及び／又は評価を受ける予定である物質を意味する。
【００１６】
ここで用いる用語「汚染物質」は、１つ又は２つ以上の被分析物の検出、定量化、分析、同定又は評価を妨害する可能性がある物質を意味する。被分析物は、別の被分析物の検出、定量化、分析、同定又は評価を妨害する可能性があるならば、汚染物質にもなりえる。
【００１７】
ここで用いる用語「試料」は、流体、液体、半固体又は固体材料の一部を意味する。
【００１８】
ここで用いる用語「リガンド」は、化学種であって、他の化学種と結合したり、他の化学種を引きつけたりできるものを意味する。リガンドが固体表面に結合している場合、溶解した物質が、各物質に対するリガンドの選択性に応じて、表面に結合するか、表面に保持される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１態様では、本発明は、生体試料の保存用試料適用基材として有効な紙を開示する。紙は、４０〜８００ｇ／ｍ2の表面重量をもち、セルロース繊維及び／又はガラス繊維を含有し、さらに４〜３０重量％の親水性又は水溶性分枝状炭水化物ポリマーを含有する。表面重量は、紙の所定領域（例えば、１０．０×１０．０ｃｍ）の風乾シートを計量し、シート領域（ｍ2）をその重量（ｇ）で除することにより求める。分枝状炭水化物ポリマーの枝分れ度は、例えば０．０５〜１、具体的に０．１０〜１、０．２０〜１又は０．３０〜１とすることができる。枝分れ度（ＤＢ）はＤＢ＝ｎＤ／（ｎＤ＋Ｌ）と定義され、式中Ｄはポリマー分子中の分枝点モノマー単位の数であり、ｎは各分枝点から伸びている枝の平均数であり、Ｌはポリマー分子中の直鎖状（非分枝状）モノマー単位の数である。枝分れ度は、当業界で既知の方法、例えばＮＭＲ分光法、劣化解析及び光散乱又は粘度検出器を用いたゲル濾過法（Ｋ  Ｇｒａｎａｔｈ：  Ｊ  Ｃｏｌｌ  Ｓｃｉ  １３，  ３０８  １９５８；  Ｊ  Ｓｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ：  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２５，  ３５８５  １９９２）によって求めることができる。分枝状炭水化物ポリマーには、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ、キシランなどの分枝状ヘミセルロースがある。紙に炭水化物ポリマーを含有させる利点は、タンパク質に対する保護効果を、おそらく変性を防止することにより与えることである。分枝状炭水化物ポリマーは、特に良好な保護効果を有し、また、低粘度であるため適用しやすい。紙に含有するポリマーを４％以上にする利点は、このレベル以上で良好な保護が得られることである。紙に含有するポリマーを３０％以下にする利点は、このレベル以下で血液などの液体生体試料の適用により紙に形成したスポットが円形で均一になることである。ポリマー含量が高すぎると、スポット形状が不規則になり、その後の紙からのサンプリングに支障をきたす。紙への試料の吸収もポリマー含量が３０％を超えない場合良好である。ポリマー含量が高すぎると、血液スポットが完全に紙に吸収されず、乾燥血液のフィルムが紙表面に形成する。これは、乾燥血液の一部が保存ポリマーと接触せず、乾燥血液の破片を失う危険もあるため定量的なサンプリングが可能でないことを意味する。紙中の分枝状炭水化物ポリマーの量が１０〜２５重量、例えば１２〜２５重量％の場合、保護効果及びスポット形状／均一性／吸収性の組合せが特に良好となる。分枝状炭水化物ポリマーは、それがアミロース、セルロースなどの直鎖状炭水化物ポリマーより簡単に水に溶解するという溶解性の観点からも有利である。分枝状炭水化物ポリマーはまた、ポリビニルアルコールなどの合成非炭水化物ヒドロキシポリマーより簡単に溶解する。溶解しやすいことは、紙からのタンパク質抽出時に明らかに有利となる。
【００２０】
ある実施形態では、親水性又は水溶性分枝状炭水化物ポリマーの平均分子量は、１５〜８００ｋＤａ、例えば２０〜５００ｋＤａである。具体的には、ポリマーの平均分子量は、７０〜４００ｋＤａ、例えば約７０ｋＤａ又は約４００ｋＤａである。分子量は低すぎない場合に保護効果が高いが、非常に高い分子量では、紙の含浸時及び紙からのタンパク質の抽出時の両方で粘度が問題となるおそれがある。
【００２１】
ある実施形態では、分枝状炭水化物ポリマーはデキストランを含む。デキストランは、分枝状α１→６結合グルカンであり、最も一般的な種類であり、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５１２（Ｆ）バクテリアによってショ糖溶液から産生され、骨格グルコース単位の３つの位置に側鎖が結合しており、分枝点を形成するグルコース単位を約５％含む。これは、上記で定義されたように枝分れ度０．０５を与える。１０重量％のデキストラン水溶液は、ニュートン流動性をもち、粘度が約２ｍＰａ・ｓ（Ｍｗ１０ｋＤａ）、４ｍＰａ・ｓ（４０ｋＤａ）及び１０ｍＰａ・ｓ（７０ｋＤａ）である。Ｂ−５１２（Ｆ）デキストランは、例えばＰｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ  Ａ／Ｓ（デンマーク）又はＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ  ＡＢ（スウェーデン）から市販されている。デキストラン誘導体、例えば硫酸デキストラン、カルボキシメチル（ＣＭ）デキストラン又はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランを用いることも可能である。このような誘導体は、例えばＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ  ＡＢから入手できる。別の実施形態では、分枝状炭水化物ポリマーはデキストランを含まない。
【００２２】
実施形態によっては、分枝状炭水化物ポリマーが単又は二糖類と二官能性エポキシド試薬との共重合体を含む。このようなポリマーは、単／二糖類それぞれの数多くの反応性ヒドロキシル基のために高度分枝状になる。用いる反応条件に依存して、枝分れ度は約０．２〜約１となることができる。これらのポリマーの具体例は、ショ糖とエピクロロヒドリンのポリマーであり、例えば米国特許第３３００４７４号の方法にしたがって形成される。市販のショ糖とエピクロロヒドリンのポリマーは、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）であり、ポリスクロース（ＣＡＳ  Ｎｏ．２５７０２−７４−３）ともいう。これは、平均分子量の７０〜４００ｋＤａのものがＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン）から入手できる。１０重量％のＦｉｃｏｌｌ水溶液は、ニュートン流動性をもち、粘度が約３ｍＰａ・ｓ（７０ｋＤａ）及び約５ｍＰａ・ｓ（４００ｋＤａ）である。おそらくポリマー分子の高度分枝状構造のために粘度が低い。ＣＭ  Ｆｉｃｏｌｌ、ＤＥＡＥ  ＦｉｃｏｌｌなどのＦｉｃｏｌｌの荷電種は、例えばＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ  ＡＢ（スウェーデン）から入手することができる。
【００２３】
ある実施形態では、１０重量％の分枝状炭水化物ポリマー水溶液の粘度は２０℃で１〜１０ｍＰａ・ｓ、例えば１〜５ｍＰａ・ｓである。低い粘度は、いくつかの観点で有利である。低い粘度は、ベース紙の含浸を容易にし、紙中のポリマーの分布を確実に均一にする。低い粘度はまた、抽出や抽出溶液のさらなる取り扱いも容易にする。低い粘度は、試料が紙により簡単に吸収される点や紙がべとつかない点でも有益である。
【００２４】
実施形態によっては、上記紙中の水抽出可能物含量は０〜２５重量％、例えば０．１〜５重量％又は３〜２０重量％である。水抽出可能物の量は以下のように決定する。まず、紙片を水（水／紙の体積比２０／１以上）に浸漬し、室温で２時間おだやかに攪拌する。その後、紙を、例えばガラスフィルター上に集め、乾燥し、計量する。水抽出可能物は重量減少％として計算する。約１％未満の水抽出可能物量は、抽出可能物の存在しないガラス繊維フィルターで濾過した水抽出物を、例えば全有機炭素分析することにより求めることができる。炭水化物ポリマー又は他の抽出可能物の存在に敏感な分析方法をタンパク質の分析に用いる場合、水抽出可能物の量が少ないと有利になることがある。治療用途でも、抽出可能物の量が少ないことが望ましい。炭水化物ポリマーを紙繊維に共有結合及び／又はそれ自体架橋する場合、抽出可能物を非常に少量にできる。
【００２５】
ある実施形態では、上記紙は、５〜３００μｍｏｌ／ｇ、例えば５〜５０、５〜１００又は５０〜３００μｍｏｌ／ｇの負荷電基又は正荷電基を含有する。負荷電基は、例えばカルボキシレート、スルホネート又は硫酸基とすることができ、一方、正荷電基は、例えばアミン又は４級アンモニウム基とすることができる。これらの基の存在が分枝状炭水化物ポリマーの保護効果を向上するようである。負荷電基又は正荷電基は、炭水化物ポリマーに共有結合することができたり、ベース紙のセルロース又はガラス繊維に共有結合できたりする。負荷電基が、繊維或いは繊維に架橋又は共有結合する炭水化物ポリマーに結合する場合、荷電基は水抽出可能ではない。これは、質量分析が分析法として用いられる場合や治療環境でも有利となることができる。負荷電基又は正荷電基の量は、例えば周知の滴定法により求めることができる。さらに、非荷電硫黄又は窒素を含有する種が存在しないという条件を満たせば、スルホネート、硫酸、アミン及び４級アンモニウム基は元素分析によって測定することができる。
【００２６】
実施形態によっては、紙は少なくとも１つの乾燥生体試料、例えば乾燥血液試料を含有する。血液及び他の生体物質、例えば血清、血漿、尿、脳脊髄液、骨髄、生検材料を紙に適用し、保存やその後の分析又は他の用途のために乾燥することができる。乾燥した生体試料は、１つ以上のタンパク質又は別の敏感な生体分子を含有する医薬品製剤又は診断試薬にすることもできる。
【００２７】
１態様では、本発明は、上記の紙を含有する試料回収装置を開示する。試料回収装置は、紙カードとすることができ、印刷するか別の方法でカードに示した１つ又は２つ以上の試料適用領域を有する。指示薬色素をこれらの領域に存在させて非着色試料が適用されたかどうかを示してもよい。装置は、例えばラックでの自動化管理を容易にするカードホルダーを含んでもよいし、試料回収を容易にする様々な形態のサンプリング機能を含むこともできる。
【００２８】
１態様では、本発明は、以下の工程を含む１つ以上の生体試料の保存方法を開示する。
工程ａ）生体試料を用意する。
工程ｂ）前述の紙に生体試料を適用する。
工程ｃ）生体試料を含有する紙を乾燥する。
生体試料は、生体液、例えば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、骨髄とすることができるが、試料はまた、固体又は半固体、例えば組織生検物などでもよい。生体試料は、１つ以上のタンパク質又は別の敏感な生体分子を含有する医薬品製剤又は診断試薬にすることもできる。
流体試料を適用する利点は、流体試料が紙構造によって吸収され、保護分枝状炭水化物ポリマーと直接接触した状態になることである。乾燥は、受動的に行うことができ、即ち試料／製剤／試薬を含有する紙を単純に乾燥するまでそのままにしておく場合であり、或いは能動的に行うことができ、即ち適度に高い温度、赤外線及び／又は空気又はその他の気体の流れにさらす場合である。乾燥は１５〜３５℃、例えば１５〜２５℃の温度で行うのが有利である。乾燥後、紙又は試料を含有する試料適用領域の残留水分含量は約２０重量％未満、例えば約１０重量％未満とすることができる。
【００２９】
実施形態によっては、本方法は、生体試料を含有する紙を乾燥後、１週間以上、例えば１ヶ月間以上又は１年間以上保存する工程ｄ）を含む。工程ｄ）の保存温度は、０℃以上、例えば０〜４０℃又は２０〜４０℃とすることができる。敏感なタンパク質の構造及び生物活性を冷凍の必要性或いは冷蔵さえなしで長期間維持できることは本発明の方法の利点である。試料を含有する紙は、０〜７０％、例えば０〜５０％又は０〜２０％の相対湿度で保存するのが有利である。相対湿度は、例えば試料を含有する紙を密閉プラスチックバッグなどの密閉容器に乾燥剤とともに保存することによって制御することができる。
【００３０】
ある実施形態では、本方法は、１つ以上のタンパク質を保存後の上記紙から抽出し、タンパク質を分析する工程ｅ）を含む。抽出は、例えば乾燥試料を含有する紙から小さな部分をパンチで打ち抜き、これらをバッファなどの水性液体に、例えば１時間〜４８時間浸漬することにより行うことができる。浸漬は攪拌下で行い、温度は、例えば０℃〜３０℃とすることができる。浸漬時間が１〜２時間を超える場合、溶液中の敏感なタンパク質の分解をできるだけ少なくするのに浸漬温度を０〜８℃とすれば有利である。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、保存した上記紙から抽出し、抽出物を医薬として用いる工程ｅ’）を含む。この場合、紙に保存される生体試料は医薬品製剤が適当であり、医薬品製剤の紙への適用、乾燥、保存及び抽出は無菌状態で行うことができる。
【００３２】
実施形態によっては、タンパク質は、保存の影響を受けやすいタンパク質であって、プレーン紙で３７℃１週間乾燥剤とともに保存した生物活性状態のタンパク質の回収率が６０％未満又は約４０％未満のタンパク質と定義されるものである。この値は、紙の乾燥血液スポット（ＤＢＳ）に存在するタンパク質で求めることが好ましい。保存の影響を受けやすいタンパク質の１例はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）であるが、アポリポタンパク質Ａ−１、ＩｇＥなどのタンパク質もＤＢＳでの保存の影響を受けやすいと報告されている（Ｔ  ＭｃＤａｄｅ  ｅｔ  ａｌ：  Ｄｅｍｏｇｒａｐｈｙ  ４４，  ８９９  ２００７）。
【００３３】
ある実施形態では、本方法の工程ｅ）で、生物活性状態のタンパク質の回収率が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％である。
【００３４】
ある実施形態では、タンパク質は、イムノアッセイ、質量分析法又は酵素活性アッセイにより工程ｅ）で分析する。イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡを通常用いて特定なタンパク質の濃度を決定する。それらは、タンパク質の抗体結合特性に頼っているので、タンパク質が生物活性（即ち、変性なし）であることが必須であり、特に立体構造エピトープに対する抗体でのアッセイを用いる場合はそうである。酵素は一般に変性に敏感であり、変性した酵素はアッセイで活性を示さないか非常に低い活性を示す。質量分析法（ＭＳ）が別の通常のタンパク質分析法であり、これには、質量分析器に適用する試料が紙からの浸出可能物、例えば洗浄剤を含有しないことが要求される。使用する分枝状多糖類ポリマーは、ＭＳ分析のための従来の精製分離作業、例えば逆相クロマトグラフィーによって試料から容易に除去することができるため、妨害とならない。
【００３５】
１態様では、本発明は、生体試料の保存用の紙の製造方法を開示する。本方法は以下の工程を含む。
工程ａ）水性懸濁液状又はベース紙の形態のどちらかのセルロース繊維又はガラス繊維を用意する。
工程ｂ）懸濁液状又はベース紙としてのどちらかの繊維を、水溶性分枝状炭水化物ポリマーを２〜６０重量％含有する溶液と接触させる。
工程ｃ）繊維が水性懸濁液状の場合、繊維から紙シートを形成する。
工程ｄ）紙を乾燥する。
【００３６】
繊維懸濁液とポリマー溶液との接触は、単に懸濁液とポリマー溶液を攪拌するか、懸濁液にポリマーを溶解することにより行うことができる。ベース紙とポリマー溶液との接触は、以下に示す含浸工程のように行うことができる。ポリマーが共有結合する場合、溶液のポリマー濃度は、例えば２０〜６０重量％とすることができ、一方、共有結合しない条件下、ベース紙に分枝状炭水化物ポリマーを含浸する場合、濃度は、例えば２〜１５重量％又は４〜１０重量％とすることができる。紙シートの形成は、手抄きシート形成か、モールド、フォードリニア機などの抄紙機での形成のどちらかにより当業界で周知の方法にしたがって行うことができる。乾燥は、受動的に行うことができ、即ち試料を含有する紙を単純に乾燥するまでそのままにしておく場合であり、或いは能動的に行うことができ、即ち高い温度、赤外線及び／又は空気又はその他の気体の流れにさらす場合である。乾燥は２０〜１００℃、例えば２０〜６０℃の温度で行うのが有利である。乾燥後、紙の残留水分含量は約２０重量％未満、例えば約１０重量％未満とすることができる。製造状況では、乾燥は、例えば浸漬コーター又は抄紙機の形成ユニット後に設けたオンラインの乾燥機中で行うのが適当である。
【００３７】
１態様では、本発明は、生体試料の保存用の紙を製造する方法を開示する。本方法は以下の工程を含む。
工程ａ）４０〜８００ｇ／ｍ2の表面重量を有し、セルロース繊維又はガラス繊維を含有するベース紙を用意する。
工程ｂ）ベース紙に１５〜８００ｋＤａの平均分子量をもつ水溶性分枝状炭水化物ポリマーを２〜６０重量％含有する溶液を含浸する。
工程ｃ）含浸した紙を乾燥する。
【００３８】
含浸は、ベース紙シートを溶液に浸漬することにより行われるか、浸漬コーターなどの当業界で既知の種々の含浸装置を用いてロール・ツー・ロールプロセスで行われる。ポリマーが共有結合する場合、溶液のポリマー濃度は、例えば２０〜６０重量％とすることができ、一方、共有結合しない条件下、分枝状炭水化物ポリマーを含浸する場合、濃度は、例えば２〜１５重量％又は４〜１０重量％とするのが適当である。乾燥は、受動的に行うことができ、即ち試料を含有する紙を単純に乾燥するまでそのままにしておく場合であり、或いは能動的に行うことができ、即ち高い温度、赤外線及び／又は空気又はその他の気体の流れにさらす場合である。乾燥は２０〜１００℃、例えば２０〜６０℃の温度で行うのが有利である。乾燥後、紙の残留水分含量は約２０重量％未満、例えば約１０重量％未満とすることができる。製造環境では、乾燥は、浸漬コーター後に設けたオンラインの乾燥機中で行うのが適当である。
【００３９】
実施形態によっては、分枝状炭水化物ポリマーは、上述のようにデキストラン又は単又は二糖類と二官能性エポキシド試薬との共重合体を含む。分枝状炭水化物ポリマーは、具体的にはＦｉｃｏｌｌなどのショ糖とエピクロロヒドリンのポリマーとすることができる。分枝状炭水化物ポリマーの平均分子量は、２０〜５００ｋＤａ又は７０〜４００ｋＤａ、例えば２０ｋＤａ、７０ｋＤａ又は４００ｋＤａとすることができる。
【００４０】
ある実施形態では、分枝状炭水化物ポリマー溶液の粘度は、２０℃で１〜２０ｍＰａ・ｓ、例えば１〜１０ｍＰａ・ｓである。上述のように低粘度溶液は、含浸を容易にし、さらに機能上の利点ももたらす。
【００４１】
実施形態によっては、ベース紙は５〜３００μｍｏｌ／ｇのカルボキシレート基などの負荷電基を含有する。負荷電基は、多糖類ベースのカチオン交換体を生成する既知の方法にしたがって、例えば酸化プロセスにより、或いはクロロ酢酸、ブロモ酢酸、ビニルスルホン酸ナトリウムなどの荷電種の共有結合により紙に導入することができる。
【００４２】
実施形態によっては、繊維又はベース紙は化学的に活性化され、本方法は、その繊維又はベース紙を分枝状炭水化物ポリマーと反応させる工程を含む。活性繊維／ベース紙を用いる利点は、炭水化物ポリマーの共有結合が実現できることである。これは、分析法への抽出ポリマーの妨害を回避することができるという利点をもつ。共有結合ポリマーを含有するとタンパク質の保存にも有益となることができる。活性化はいくつかの異なる方法、例えばエピハロヒドリン（例えば、エピクロロヒドリン）又はジエポキシドとの反応により行うことができ、この場合、活性繊維又は活性紙が反応性エポキシ基を含有する。また、繊維／紙は、トシル化、トレシル化又はメシル化により活性化して対応する反応性脱離基を形成したり、ジビニルスルホンを用いて、或いはアリル化とそれに続くアリル基の臭素化又はアリル基への直接結合により活性化したりすることができる。活性基は、分枝状炭水化物ポリマーのヒドロキシル基に対して反応性であれば有利であるが、活性基が、分枝状炭水化物ポリマーに導入される特定の官能基に反応性であってもよい。官能基としては、例えばアミン又はアミノオキシ基（例えば、アルデヒドに対して反応性）又はカルボキシル基（カルボジイミドに対して反応性）がある。ガラス繊維は、エポキシシランなどのシランとの反応により活性化することができる。炭水化物ポリマーと活性繊維／紙の反応は、懸濁液中で直接起こり、所望により加熱及び／又はｐＨを調節して反応を加速することができる。反応は、紙の乾燥時又は乾燥後、例えば高い温度で起こることもある。
【００４３】
実施形態によっては、本方法は繊維又はベース紙を反応工程後に洗浄する工程も含む。この工程は、未反応ポリマーを系から取り除き、ポリマーが浸出して分析法を妨害することがないようにするさらなる方法である。洗浄工程は上記の反応後に行うのが適当である。
【実施例】
【００４４】
材料
３１ＥＴＦベース紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社製）
９０３ベース紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の一部であるＷｈａｔｍａｎ社製）
デキストランＴ３．５（３．５ｋＤａ）、デキストラン２０（２０ｋＤａ）、デキストラン７０（７０ｋＤａ）、デキストラン１１０（１１０ｋＤａ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ２０（２０ｋＤａ）、Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０（７０ｋＤａ）、Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００（４００ｋＤａ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
ＤＥＡＥ  Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０（７０ｋＤａ）、ＣＭ  Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０（７０ｋＤａ）（ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ  ＡＢ製）
実施例１−Ｆｉｃｏｌｌ及びデキストラン溶液への浸漬
ストリップを選択した紙から切り、風乾重量を記録し、紙ストリップを２つずつ９０ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に置いた。Ｆｉｃｏｌｌ又はデキストランの所望の水溶液（２５ｍＬ）を添加し、ペトリ皿を振盪機に置き、１００ｒｐｍで１時間４５分攪拌した。プロトタイプをペトリ皿から取り出し、Ｗｈａｔｍａｎ９０３  Ｄｒｙ  Ｒａｋに水平に置き、室温で終夜乾燥させた。重さを記録し、増加量を計算した。最後に、プロトタイプにプラスチックラベルを付け、それをその後のＤＢＳ分析のために９０ｍｍのペトリ皿に保存した。
【００４５】
【表１】
2014535011.tif 000002
全てのプロトタイプの重量増加は非常に類似しており、例えば１０重量％溶液を用いた場合、重量増加は、用いたポリマーにかかわらず２５〜２７％である。
【００４６】
実施例２−Ｆｉｃｏｌｌ及びデキストランの共有結合
Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０のエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）結合
典型的な実験では、紙ストリップを３１Ｅｔｆ紙から切り取り、それを実験前に少なくとも終夜６０℃の温度に置き、乾燥させた。プラスチック網を切って１５０ｍＬのガラス反応器の内部を覆い、紙ストリップをその間に挟んだ。反応器に１０３．２ｍＬの水、１０．６ｍＬの５０％ＮａＯＨ及び１６．１ｍＬのＥＣＨを添加し、溶液を１２０分間３０℃で攪拌した。反応混合物をデカンテーションし、１３０ｍＬの水を添加し、攪拌を２０分間継続した。これを２回繰り返した。
【００４７】
１００ｍＬの所望の濃度のＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０溶液を反応器に添加し、溶液を１５分間攪拌した後、２．９１６ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加した。反応混合物を３０℃で終夜攪拌した。２０時間後、反応混合物をデカンテーションし、１３０ｍＬの水を添加し、攪拌を２０分間継続した。紙プロトタイプを反応器から取り出し、６００ｍＬのガラスビーカーに入れ、３００ｍＬの水を紙プロトタイプを完全に覆うように添加した。ビーカーを振盪機により約８０ｒｐｍで２０分間ゆっくり攪拌し、その後、水をデカンテーションし、新しい水を添加した。これを３回繰り返した。紙プロトタイプが確実に平らになるようにプラスチック網上に置き、紙プロトタイプを終夜ドラフト内で乾燥させた。紙プロトタイプをその後の分析までジップロックバッグに保存した。
【００４８】
再パルプ化繊維へのＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０のＥＣＨ結合
典型的な実験では、約１５ｇの３１ＥＴＦ紙を、小片に裂き、約５００ｍｌの水とともにブレンダーに投入し、約３分間激しく混合してパルプにした。パルプスラッシュをガラス濾過器（Ｐ２）に注ぎ、水をほとんど除去した。重量（約８０ｇ）を記録し、若干湿気を含んだパルプを５００ｍＬの丸底フラスコ（ＲＢＦ）に移した。ＲＢＦに１４２ｍＬの水及び２５ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加し、混合物を縦型攪拌機を用いて１５分間攪拌した。攪拌しながら３０ｍＬのＥＣＨを添加し、水浴を３０℃にセットした。その後、混合物をさらに２時間攪拌した。
【００４９】
パルプをガラス濾過器に移し、それを水で５回洗浄することにより反応を終了させた。各洗浄後にパルプを攪拌し、ガラス濾過器から水がしたたり始めたときに吸引を始めた。その後、水を切ったパルプを新しい５００ｍＬのＲＢＦに移し、２５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０溶液を仕込んだ。混合物を約２０分間攪拌した後、８．７５ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加した。３０℃で攪拌を終夜継続した。
【００５０】
約２０時間後、反応を終了させ、繊維プロトタイプをガラスフィルター上で水で５回洗浄した。特に高濃度繊維の場合、これはかなり冗長な操作となることがわかった。最後の洗浄工程で、まだかなり湿っている繊維をジップロックバッグに移し、手抄きシート紙製造に用いた。無修飾３１Ｅｔｆ繊維も形成し、手抄きシート製造に用いた。
Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ２０の浸漬及びＥＣＨ結合及びデキストラン７０の浸漬
上記のような実験を結合Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ２０プロトタイプのためにいくつか変更して行った。
【００５１】
より小型のガラス反応器（１００ｍＬ）を用い、反応体積を減少させ、２３．８３ｍＬの活性化水、２．４５ｍＬの５０％ＮａＯＨ及び３．７２ｍＬのＥＣＨを用いた。結合は、３０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ２０溶液及び７４４．８μＬの５０％ＮａＯＨを用いて行った。
【００５２】
結合したＤＥＡＥ−Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０プロトタイプを元素分析（％Ｎ）に送った（表２）。ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社が出した分析証明書によればＤＥＡＥ−Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０の窒素含量は３．６％であり、したがって、紙のＮ含量０．０８６％は２．４重量％のＤＥＡＥ−Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ７０含量に相当する。
【００５３】
【表２】
2014535011.tif 000003
実施例３−乾燥血液スポットからのＣ反応性タンパク質の回収
血液試料（４μｌ／スポット）を、浸漬及び共有結合した様々な種類のプロトタイプ及び対照紙にスポットした。乾燥後、スポットをパンチで打ち抜き、前試験（セクション２）で用いた条件にしたがって抽出した。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びタンパク質の総量はそれぞれＥＬＩＳＡ及びＡ２８０で求めた。回収率は対照血液試料（ｎ＝３）の量から計算する。
【００５４】
スポットとＤＢＳ試料の保存
４μｌ血液アリコートを異なるプロトタイプ上に３つスポットし、ＤＢＳを室温で４時間乾燥し、乾燥剤とともに使用まで密封バッグに保存（−２０℃）した。対照とするために４μｌ血液アリコートを０．５ｍｌ管に保存した（−２０℃保存）。
【００５５】
ＤＢＳ抽出
血液スポットを３つパンチプライヤーで打ち抜き、寸法はスポット全部をパンチできるように選択した（直径５ｍｍ）。ディスクを９６ウェルプレートに入れ、１００μｌのＰＢＳ−Ｔで振盪（約４００ｒｐｍ）しながら、１時間室温、終夜４℃、１時間室温で抽出した。そのプレートを、インキュベーション時に密封し、試料分析前にプレート遠心分離機により３７００ｒｐｍで遠心分離した。
【００５６】
ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡ／Ａ２８０測定
ヒトＣＲＰ  ＥＬＩＳＡキットを製造業者の取り扱い説明にしたがって使用した。
対照血液アリコート（ｎ＝３）を１００μｌのＰＢＳ−Ｔで希釈した。その後、さらに対照及び抽出試料をＵＶプレート中で最終体積２００μｌになるようにＣＲＰ洗浄バッファで１：１０に希釈した。ＣＲＰ分析前にタンパク質回収率計算のために２８０ｎｍでの吸光度を測定した。ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＤＢＳ試料を１つの試料として分析し、血液対照を反復分析した。
【００５７】
Ａ２８０測定において、スクリーニング試験の第２部ではＤＢＳ試料及び血液対照は１つの試料として分析した。この試験の第１部では血液対照を反復分析した。
【００５８】
ＣＲＰ回収
【００５９】
【数１】
2014535011.tif 000004
タンパク質回収
抽出試料の全タンパク質の回収率の尺度として２８０ｎｍでの吸光度を用いた。
【００６０】
【数２】
2014535011.tif 000005
プロトタイプスクリーニングの第１の部（表３）は、Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００、ＰＭ７０及びＰＭ２０で浸漬したプロトタイプが含まれた。全ての浸漬プロトタイプは対照紙に比べて回収率が約２０％高かった。
【００６１】
【表３】
2014535011.tif 000006
【００６２】
【表４】
2014535011.tif 000007
プロトタイプスクリーニングの第２の部（表４）は、Ｆｉｃｏｌｌを主とした多様なプロトタイプが含まれた。この試験でも概して浸漬プロトタイプは、結合プロトタイプに比べて明らかに回収率が高かった。紙繊維への結合が行われた場合も高いＣＲＰ回収率が得られた。
【００６３】
Ｆｉｃｏｌｌとデキストランとの混合物もＣＲＰ分子への安定化効果を有しているようである。Ｆｉｃｏｌｌとデキストランの比は重要ではなかった。
【００６４】
荷電基を含有するＦｉｃｏｌｌプロトタイプでさえ、この試験で良好に作用した。
【００６５】
荷電Ｆｉｃｏｌｌ誘導体で浸漬したプロトタイプはＥＬＩＳＡ用途で良好に作用した。ＭＳ用途では、荷電ポリマーを最初に試料から除去する必要がある。
【００６６】
全てのプロトタイプからのタンパク質総量の回収率は（示さず）は良好であり、認められた差違は、スポット体積での差違に反映している可能性が高い。
【００６７】
実施例４−乾燥血液スポット中のＣ反応性タンパク質、レプチン及びβ２グリコプロテイン−１の安定性
乾燥血液スポット（ＤＢＳ）試料に照準を合わせた修飾／改質セルロース紙の強制安定性試験を行った。ＤＢＳ試料を、浸漬及び共有結合したＦｉｃｏｌｌプロトタイプにスポットして−２０℃及び３７℃それぞれでの１週間保存後のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、レプチン及びβ２グリコプロテイン−１（β２ＧＰ１）への安定化効果を追跡した。市販のＥＬＩＳＡキットを評価に用いた。目標は、既に高い回収率（対照紙と比べて）が確立されたＣＲＰ以外のタンパク質に有利な修飾／改質を見出すことであった。
【００６８】
結果より、浸漬紙プロトタイプからのＣＲＰの回収率は共有結合で修飾されたプロトタイプに比べて１０〜２０％高いが、レプチンの回収率には効果がないことがわかった。浸漬Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００は、β２ＧＰ１に対して未処理紙とほぼ同程度に良好であり、高い温度での保存時、別のプロトタイプに比べて回収率の低下が少なく、ＣＲＰとβ２ＧＰ１の両方に有益であった。
【００６９】
結果をまとめると、Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００で浸漬した紙は、ＤＢＳとしての保存時、特定のタンパク質に有益のようであると結論づけることができる。
【００７０】
スポットとＤＢＳ試料の保存
１５μｌ血液アリコートを異なるプロトタイプ上に３つスポットし、ＤＢＳを室温で４時間乾燥し、その後、紙を乾燥剤の小さい包みとともに密封バッグに３７℃で１週間保存した。対照とするために１５μｌ血液アリコートを０．５ｍｌ管に保存した（−２０℃保存）。
【００７１】
ＤＢＳ抽出
スポットをパンチで打ち抜き（直径９ｍｍ）、２４ウェルプレート中４００μｌのバッファで１時間室温（混合約５００ｒｐｍ）、終夜４℃、１時間室温（混合約５００ｒｐｍ）で抽出した。プレートをインキュベーション時に密封し、試料分析前にプレート遠心分離機により３７００ｒｐｍで遠心分離した。ＣＲＰ及びＡ２８０分析用の試料を取り出し、試料プレートを−２０℃で保存した。抽出後のディスクは、レプチン及びβ２ＧＰ１分析用の試料の取り出し前に除去した。
【００７２】
ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡ／Ａ２８０測定
ヒトＣＲＰ  ＥＬＩＳＡキットを推奨希釈（血清を１：４０００に希釈）以外製造業者の取り扱い説明にしたがって使用した。試料を上記の試験のように１：２７０に希釈した。
【００７３】
対照血液アリコート（ｎ＝３）を３８５μｌのＰＢＳ−Ｔで希釈した。その後、さらに対照及び抽出試料をＵＶプレート中で最終体積２００μｌになるようにＣＲＰ洗浄バッファで１：１０に希釈した。
【００７４】
タンパク質回収率計算のためにＣＲＰ分析前に２８０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７５】
ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡアッセイ及びＡ２８０測定において、ＤＢＳ試料を１つの試料として分析し、血液対照を反復分析した。
【００７６】
レプチンＥＬＩＳＡ
ヒトレプチンＥＬＩＳＡキットを推奨希釈（血清をキット同梱のバッファで１：３に希釈）以外製造業者の取り扱い説明にしたがって使用した。スパイクした試料は別の希釈が必要であったので、予備試験で３種類の希釈（１：５０、１：８００及び
１：４０００）をテストした。対照及び試料が検量線の直線部分にくる１：８００を選択した。ＤＢＳ試料を１つの試料として分析し、血液対照を反復分析した。
【００７７】
β２ＧＰ１  ＥＬＩＳＡ
ヒトβ２ＧＰ１  ＥＬＩＳＡキットを推奨希釈（血清を１：５０００に希釈）以外製造業者の取り扱い説明にしたがって使用した。予備試験で３種類の希釈（１：５０、１：５００及び１：２５００）をテストした。希釈１：５００が検量線の下部３分の１となり、したがって１：２５０が最終試験で良好に作用すると考え、これを使用した。ＤＢＳ試料を１つの試料として分析し、血液対照を反復分析した。
【００７８】
ＣＲＰ／レプチン／β２ＧＰ１回収
【００７９】
【数３】
2014535011.tif 000008
タンパク質回収
抽出試料の全タンパク質の回収率の尺度として２８０ｎｍでの吸光度を用いた。
【００８０】
【数４】
2014535011.tif 000009
紙プロトタイプのＤＢＳ中の３つの異なるタンパク質の安定性をＥＬＩＳＡで追跡した。表２にこの試験の結果の概要を示す。
【００８１】
【表５】
2014535011.tif 000010
浸漬プロトタイプは、上記試験と同じようにＣＲＰの回収率が高かった。分子の大きさが大きいＦｉｃｏｌｌであるＰＭ７０及びＰＭ４００では、ＰＭ４００で浸漬した紙の３７℃での１週間保存後のＣＲＰ回収率が２５％高かった。共有結合で修飾した紙はＦｉｃｏｌｌが紙繊維に直接結合した場合に最も効果がある。これはおそらく高度の修飾によるものである。
【００８２】
分子量（Ｍｗ）の大きいＦｉｃｏｌｌで浸漬した紙でレプチンの回収率への好ましい効果がいくらか見出されたが、このＥＬＩＳＡにおいては不確実性が高く、３つの結果の標準偏差が２〜２２％の範囲にわたった。
【００８３】
β２ＧＰ１アッセイでも標準偏差は大きかった（最大２７％）。Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００の３７℃での保存後の回収率は、対照紙より高く、このメディアの安定化効果を示した。
【００８４】
３つのタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイを用いてＤＢＳワークフロー時の安定性を評価した。結果の解釈の際、高い回収率が良好な安定性に反映すると仮定した。しかし、アッセイに用いた抗体に依存して、部分的に分解及び変性したタンパク質でさえ全体の結果に影響を与えることがあり、これを制御することが不可能であった。この試験で用いた全てのＥＬＩＳＡキットは血清試料を対象とするものであった。
【００８５】
ＥＬＩＳＡアッセイでは標準偏差が概して大きいためＤＢＳ回収率の詳細評価は困難であった。血清試料からアッセイを行うことに比べて多くの工程がＤＢＳワークフローに含まれる。
【００８６】
結果をまとめると、Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００で浸漬した紙は、ＤＢＳとしての保存時、特定のタンパク質に有益であると結論づけることができる。
浸漬Ｆｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００は、β２ＧＰ１に対して未処理紙とほぼ同程度に良好であり、高い温度での保存時、別のプロトタイプに比べて回収率の低下が少なく、ＣＲＰとβ２ＧＰ１の両方に有益であった。
【００８７】
実施例５−乾燥血液スポット中のアルカリホスファターゼの安定性
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、アルカリ性環境でリン酸エステルの加水分解の触媒となる。この試験では、ＡＬＰ活性を基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）で測定した。反応の１つの生成物であるｐ−ニトロフェノールがアルカリ性条件下で黄色（４０５ｎｍに吸収極大）を示す。反応速度は直接酵素活性に比例する。
【００８８】
３７℃で１週間保存した、ＤＢＳを含有するプロトタイプでＡＬＰ活性を測定した。
【００８９】
血液試料を２０μｇ／ｍｌのＡＬＰでスパイクし、１５μｌのスパイク済みの血液を紙にスポットした。溶液を２時間以上風乾した。１セット１２枚のＤＢＳを含有するプロトタイプ紙全てを−２０℃、別のセットを３７℃で１週間保存した。各プロトタイプ及び各温度につき２スポットずつ作製した。
【００９０】
保存後、紙を室温に置いた。スポットをスチール製穿孔器、ハンマー及びプラスチック製カッティングボードを用いて１０ｍｍディスクに打ち抜いた。ディスクをＵｎｉｐｌａｔｅの１０ｍＬウェルに置き、４００μＬの溶出ＰＢＳ−Ｔバッファ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加した。プレートを振盪機に置き、５００ｒｐｍで１時間振盪し、冷蔵庫で終夜保存し、再度振盪機で１時間振盪した。ＡＬＰ活性測定のために５μｌの抽出溶液を１９５μｌの基質ｐＮＰＰ溶液と混合し、４０５ｎｍでの吸光度を追跡した。
【００９１】
【表６】
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Ｆｉｃｏｌｌ分子が共有結合したプロトタイプを用いたときにＡＬＰ分析で最もよい結果が認められた。３７℃での保存後の活性は、これらのプロトタイプだけでなくＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ４００で浸漬した紙でも良好なようである。これらの結果より、酵素活性が血液スポット紙の３７℃での１週間保存後でさえ良好であることがわかる。
【００９２】
本明細書では、具体例を挙げて、最良の形態を含む本発明を開示するとともに、当業者が装置又はシステムの製造及び使用並びに方法の実行を含めて本発明を実施できるようにしている。本発明の要旨は、特許請求の範囲に規定された通りで、当業者が想起できる他の例を含むことができる。このような他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有するか、特許請求の範囲の文言と実質的に異ならない均等な構造要素を含むならば、特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
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