(57)【要約】  置換シクロヘキサノールのシス／トランス混合物をリパーゼの存在下でジカルボン酸無水物と反応させてトランスセミエステルを得、これを未反応の置換シクロヘキサノールシス異性体から分離することを含む、シス／トランス置換シクロヘキサノールの混合物から出発する異性体として純粋な置換シクロヘキサノールの調製方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異性体として実質的に純粋な置換シクロヘキサノールの調製方法であって、以下のステップ：
i)置換シクロヘキサノールのシス／トランス混合物を、配列番号２で示されるタンパク質配列を有するリパーゼ、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の全体に対して少なくとも75％同一のタンパク質配列を有し、かつ配列番号２の酵素活性の少なくとも50％を有するリパーゼの存在下でジカルボン酸無水物と反応させてトランスセミエステル（semi-ester）を得、
ii)未反応の置換シクロヘキサノールのシス異性体からトランセミエステルを分離し、
iii)シスまたはトランスの置換シクロヘキサノールを単離する、
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ(i)で使用するリパーゼが
a)配列番号１で規定されるポリヌクレオチド、または
b)配列番号１の配列のコード領域の全長にわたって配列番号１の配列に対して少なくとも75％同一であるポリヌクレオチド
によってコードされるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リパーゼがブルクホルデリア・プランタリイ（Burkholderia plantarii）中で発現している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(i)においてC2-C10ジカルボン酸無水物を使用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
無水コハク酸を使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(i)におけるリパーゼが固定化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ(i)の反応を溶媒としての炭化水素、エーテル、またはアルコール中で実施する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
溶媒がトルエン、石油エーテル（petrolether）、MTBE、テトラヒドロフラン、またはシクロヘキサンから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ(ii)の分離をpH8-10での抽出によって実施する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
使用する置換シクロヘキサノールの混合物がOH-基に対して位置4で置換されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
4-tert-ブチル-シクロヘキサノールを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
発酵液を噴霧乾燥によって固定化する、固相支持体上へのタンパク質の固定化方法。
【請求項１３】
固相支持体としてNa2SO4を使用する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シス／トランス置換シクロヘキサノールの混合物から出発して、異性体として実質的に純粋な置換シクロヘキサノールを調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シス／トランス異性体混合物の分離は、当業者に公知の様々な技術、例えば蒸留、クロマトグラフィー、結晶化等を用いて達成することができる。
【０００３】
WO 2005/073215号には、エナンチオマーとして純粋なアミノアルコールの製造方法が記載されている。この文献には、無水コハク酸を用いたラセミアルコールのリパーゼの存在下でのエナンチオ選択的アシル化によってコハク酸セミエステル（semi-ester）が得られ、これを未反応のエナンチオマーから分離できることが開示されている。
【０００４】
EP 1069183 A2号には、シュードモナス・ブルクホルデリア（Pseudomonas burkholderia）由来の固定化リパーゼの存在下での無水コハク酸によるラセミ体トランス-2-メトキシシクロヘキサノールのエナンチオ選択的アシル化が教示されている。
【０００５】
シス／トランス異性体の分離には蒸留による分離がしばしば用いられている。しかしながら、置換シクロヘキサノールの場合、その昇華特性のために、この方法は満足できるものではなかった。従って、解決すべき技術的課題は、シス／トランス置換シクロヘキサノール混合物を分離するための方法を見出すことであった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、異性体として実質的に純粋な形態で置換シクロヘキサノールを分離する方法であって、
i)置換シクロヘキサノールのシス／トランス混合物を、配列番号２で示されるタンパク質配列を有するリパーゼ、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の全体に対して少なくとも75％同一のタンパク質配列を有し、かつ配列番号２の酵素活性の少なくとも50％を有するリパーゼの存在下でジカルボン酸無水物と反応させてトランスセミエステルを得、
ii)未反応の置換シクロヘキサノールのシス異性体からトランスセミエステルを分離し、
iii)異性体として純粋なシスまたはトランスの置換シクロヘキサノールを単離する、
を含む上記方法を提供することにより、上記課題を解決するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
驚くべきことに、本発明の方法で使用するリパーゼは、高い選択性でジカルボン酸無水物による置換シクロヘキサノールのトランス形態のアシル化をもたらす。本発明の方法により、置換シクロヘキサノールのシスまたはトランス異性体が異性体として実質的に純粋な形態で得られる。
【０００８】
「異性体として実質的に純粋な」とは、シスまたはトランス生成物に他方の異性体が実質的に混入していないことを意味する。従って、「異性体として実質的に純粋な」とは、その異性体が少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、特に少なくとも96、97、98、99％で得られることを意味する。
【０００９】
本発明の方法の第1ステップは以下の通りである：
置換シクロヘキサノールのシス／トランス混合物（下記式A1〜A3）を、配列番号２で示されるタンパク質配列を有するリパーゼ、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の全体に対して少なくとも75％同一のタンパク質配列を有し、かつ配列番号２の酵素活性の少なくとも50％を有するリパーゼの存在下でジカルボン酸無水物と反応させてセミエステル（下記式C1〜C3）および未反応の異性体（下記式B1〜B3）を得る。特に、上記リパーゼを使用することによって、トランス異性体が選択的にアシル化される。
【化１】
2014500020.tif 000002
【００１０】
好ましい実施形態において、出発物質は4-置換シクロヘキサノールのシス／トランス混合物（上記式A3）であり、これを配列番号２で示されるタンパク質配列を有するリパーゼ、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の全体に対して少なくとも75％同一のタンパク質配列を有し、かつ配列番号２の酵素活性の少なくとも50％を有するリパーゼの存在下でジカルボン酸無水物と反応させ、セミエステル（上記式C3）および未反応の異性体（上記式B3）を得る。
【００１１】
本発明の方法で使用する式A1〜A3の置換シクロヘキサノールはR1で置換されている。R1は反応条件下で不活性の任意の置換基であり得る。
【００１２】
例えば、R1は置換もしくは非置換C1-C10アルキル、置換もしくは非置換C3-C8-シクロアルキル、置換もしくは非置換C2-C10-アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換アリールであり得る。
【００１３】
「非置換C1-C10」とは、1〜10個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、1-メチル-エチル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、および1,1-ジメチルエチル等をいう。これらは本発明の文脈において非置換と呼ばれる置換基である。
【００１４】
用語「非置換C3-C8-シクロアルキル」とは、3〜8個の炭素環メンバーを有する単環の飽和炭化水素ラジカル、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチル等をいう。
【００１５】
「非置換C2-C10-アルケニル」とは、2〜10個の炭素原子を有し、任意の位置に二重結合を有する直鎖状もしくは分岐状不飽和炭化水素ラジカル、例えばエテニル、1-プロペニル、2-プロペニル（アリル）、1-メチルエテニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-1-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル等をいう。また、本発明の目的のためにこの定義に含まれるものは、5〜8個の炭素環メンバーを有する環状不飽和炭化水素ラジカル、例えばシクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタジエニルである。
【００１６】
用語「C2-C10-アルキニル」とは、2〜10個の炭素原子を有し、少なくとも1個の三重結合を含む直鎖状もしくは分岐状不飽和炭化水素ラジカル、例えばエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル（プロパルギル）、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-メチル-2-プロピニル等をいう。
【００１７】
用語「複素環」とは、例えば複素環の環メンバーの原子が炭素原子の他に1、2、3または4個のN、OおよびSの群から選択されるヘテロ原子を含む「5-、6-、または7-員の複素環」を意味し、飽和および部分不飽和の双方、並びに芳香族の複素環（すなわちヘテロアリール）を意味するものと理解すべきである。例としては以下のものが挙げられる：
飽和および部分不飽和の5-、6-、または7-員の複素環であって、複素環の環メンバーの原子が炭素原子の他に1、2または3個のN、OおよびSの群から選択されるヘテロ原子を含み、飽和又は部分不飽和であるもの、例えばピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1,3-ジオキソラン-4-イル、イソオキサゾリジン-3-イル、イソオキサゾリジン-4-イル、イソオキサゾリジン-5-イル、イソチアゾリジン-3-イル、イソチアゾリジン-4-イル、イソチアゾリジン-5-イル、ピラゾリジン-3-イル、ピラゾリジン-4-イル、ピラゾリジン-5-イル、オキサゾリジン-2-イル、オキサゾリジン-4-イル、オキサゾリジン-5-イル、チアゾリジン-2-イル、チアゾリジン-4-イル、チアゾリジン-5-イル、イミダゾリジン-2-イル、イミダゾリジン-4-イル、2-ピロリン-2-イル、2-ピロリン-3-イル、3-ピロリン-2-イル、3-ピロリン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、1,3-ジオキサン-5-イル、テトラヒドロピラン-2-イル、テトラヒドロピラン-4-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、ヘキサヒドロピリダジン-3-イル、ヘキサヒドロピリダジン-4-イル、ヘキサヒドロピリミジン-2-イル、ヘキサヒドロピリミジン-4-イル、5-ヘキサヒドロピリミジニルおよびピペラジン-2-イル；
ヘテロアリールの環メンバーの原子が炭素原子の他に1、2または3個のN、OおよびSの群から選択されるヘテロ原子を含む5-員のヘテロアリール（ヘテロ芳香族ラジカル）、例えばピロル-1-イル、ピロル-2-イル、ピロル-3-イル、チエン-2-イル、チエン-3-イル、フラン-2-イル、フラン-3-イル、ピラゾール-1-イル、ピラゾール-3-イル、ピラゾール-4-イル、ピラゾール-5-イル、イミダゾール-1-イル、イミダゾール-2-イル、イミダゾール-4-イル、イミダゾール-5-イル、オキサゾール-2-イル、オキサゾール-4-イル、オキサゾール-5-イル、イソオキサゾール-3-イル、イソオキサゾール-4-イル、イソオキサゾール-5-イル、チアゾール-2-イル、チアゾール-4-イル、チアゾール-5-イル、イソチアゾール-3-イル、イソチアゾール-4-イル、イソチアゾール-5-イル、1,2,4-トリアゾリル-1-イル、1,2,4-トリアゾール-3-イル、1,2,4-トリアゾール-5-イル、1,2,4-オキサジアゾール-3-イル、1,2,4-オキサジアゾール-5-イルおよび1,2,4-チアジアゾール-3-イル、1,2,4-チアジアゾール-5-イル；
ヘテロアリールの環メンバーの原子が炭素原子の他に1、2または3個のN、OおよびSの群から選択されるヘテロ原子を含む6-員のヘテロアリール（ヘテロ芳香族ラジカル）、例えばピリジン-2-イル、ピリジン-3-イル、ピリジン-4-イル、ピリダジン-3-イル、ピリダジン-4-イル、ピリミジン-2-イル、ピリミジン-4-イル、ピリミジン-5-イル、ピラジン-2-イルおよび1,3,5-トリアジン-2-イル。
【００１８】
「非置換アリール」とは、特にフェニル、ナフチル、アントリルまたはフェナントリルである。
【００１９】
本発明の文脈において「置換」とは、対応する非置換の置換基と比較して、1個以上のH原子が本発明の方法において不活性である他の原子または分子基、例えばアルキル、N(アルキル)2、O-アルキル、S-アルキル、CN、NO2、I、Cl、Br、F、カルボニル、カルボキシル、R3がアルキルであるCOOR3、5-、6-、もしくは7-員の複素環、アリール（最後の2つは上記で定義されている）で置換されていることを意味する。不活性の置換基の文脈において、「アルキル」とは1〜10個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状の飽和炭化水素基であるC1-C10-アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル等を意味する。
【００２０】
本発明のリパーゼ触媒アシル化反応はジカルボン酸無水物の使用を必要とする。原理的には全てのジカルボン酸無水物、例えば式Dのものがこの目的のために使用可能である。
【化２】
2014500020.tif 000003
【００２１】
好ましくは、R2はC2-C10アルキルである。本発明の方法のために使用されるジカルボン酸の例は以下のものである：無水プロパン二酸（すなわちマロン酸）、無水ブタン二酸（すなわちコハク酸）、無水ペンタン二酸（すなわちグルタル酸）、無水ヘキサン二酸（すなわちアジピン酸）、無水ヘプタン二酸（すなわちピメリン酸）、無水オクタン二酸（すなわちスベリン酸）、無水ノナン二酸（すなわちアゼライン酸）、無水デカン二酸（すなわちセバシン酸）、無水ウンデカン二酸、無水ドデカン二酸。特に好ましいのはC3-C8ジカルボン酸無水物、例えば無水コハク酸の使用である。
【００２２】
本発明の方法で使用するジカルボン酸無水物は、トランス異性体の完全なアシル化を可能とするために、好ましくは等モル量、より好ましくは少なくとも10％過剰で使用される。出発物質の組成、すなわちシス／トランス置換シクロヘキサノール混合物中のトランス異性体のパーセンテージは、本発明の方法で使用するジカルボン酸無水物の量を決定する上で重要である。例えばシス／トランス異性体の30:70混合物の場合、0.7当量または0.8当量を超えるジカルボン酸無水物の使用がトランス置換シクロヘキサノールのほぼ完全なアシル化の目的を果たし得るであろう。
【００２３】
本発明の方法で使用するリパーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるものから誘導され、アミノ酸残基の25％まで、好ましくは20％まで、より好ましくは15％まで、特に10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％までが欠失、置換、挿入またはこれらの組み合わせによって変化している配列を有するリパーゼから選択される。これは、本発明の方法で使用するリパーゼが配列番号２に示すアミノ酸配列の全体に対して少なくとも 75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一の配列を有することを意味する。2つの配列間の配列同一性％は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、配列同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×100）。
【００２４】
本発明の方法で使用するリパーゼは、リパーゼ産生生物中で発現させることができる。リパーゼ産生生物とは、自然界で、または遺伝子改変によって、例えば生物のゲノム中にリパーゼ遺伝子を挿入することによって、配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の全体に対して少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一である配列を有するリパーゼを産生することができる任意の生物を意味する。リパーゼ産生生物の例は、アスペルギルス（Aspergillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、バシラス（Bacillus）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、カンジダ（Candida）、フザリウム（Fusarium）、ゲオトリクム（Geotrichum）、フミコーラ（Humicola）、ムコール（Mucor）、ピキア（Pichia）、ペニシリウム（Penicillium）、リゾムコール（Rhizomucor）、リゾプス（Rhizopus）またはサーマス（Thermus）属の微生物である。シュードモナス・ブルクホルデリア（Pseudomonas burkholderia）（すなわちブルクホルデリア・プランタリイ(Burkholderia plantarii)）中での発現が好ましい。
【００２５】
リパーゼ産生生物中に挿入される好ましいリパーゼ遺伝子は、a) 配列番号１で規定されるポリヌクレオチド、b) 配列番号１の配列のコード領域の全長にわたって配列番号１の配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも70％、75％、80％、85％または90％、更により好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、99％以上同一であるポリヌクレオチド、である。2つの配列間の配列同一性％は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、配列同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×100）。
【００２６】
リパーゼ産生生物の培養は、それ自体公知の方法、例えば、栄養素、微量元素、適切な場合には抗生物質の他に、例えばタンパク質および酵素を安定化させる緩衝系を含む栄養培地中での発酵によって行うことができる。リパーゼ産生生物の培養は、例えば米国特許第6596520号、特に実施例1の段落1.1.（例としてブルクホルデリア・プランタリイが使用されている）に記載されている。
【００２７】
配列番号２と比較して、本発明の方法で使用する誘導されたアミノ酸配列は、配列番号２の酵素活性の少なくとも50％、好ましくは65％、より好ましくは80％、特に90％以上の酵素活性を有する。この文脈において、配列番号２の酵素活性とは、置換シクロヘキサノールのトランス選択的アシル化をもたらす能力を意味する。トランス選択性は少なくとも95％、より好ましくは少なくとも98％、更により好ましくは99％である。参照物質として、4-tert-ブチル-シクロヘキサノールを用いることができる。
【００２８】
リパーゼ活性自体は公知の方法によって測定することができる（Gupta等、Review: Lipase assays for conventional and molecular screening: an overview, Biotechnol. Appl. Biochem. (2003) 37, 63-71）。水性媒体において、触媒活性は好ましくはトリブチリン試験（Tributyrin-test）を用いて測定する。有機系ではフェニルエタノール試験が適用できる。
【００２９】
意図される3-次元構造にフォールディングできない場合、通常は不活性のタンパク質または酵素が製造される。フォールディングはしばしばフォールディングヘルパータンパク質と呼ばれる専門的な分子の指揮下で行われる。好ましい一実施形態において、
配列番号２に示すアミノ酸配列、または配列番号２に示すアミノ酸配列の全体に対して少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一の配列を有するリパーゼは、
配列番号１で規定されるポリヌクレオチド、または配列番号１の配列のコード領域の全長にわたって配列番号１の配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、75％、80％、85％または90％、更により好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％以上同一であるポリヌクレオチドによってコードされており、これは
ブルクホルデリア・プランタリイで発現している。
【００３０】
従って、ブルクホルデリア・プランタリイにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列、または配列番号３に示すものから誘導され、配列番号３に示すアミノ酸配列の全体に対して少なくとも85％、特に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一の配列を有するフォールディングヘルパータンパク質をリパーゼと共に共発現させる。
【００３１】
本発明の方法で使用するリパーゼは、全細胞の粗抽出物として、また高度に精製された形態に到るまでの様々な純度の調製物（例えば無細胞抽出物）で使用することができる。好ましくは、部分精製されたまたは高度に精製されたタンパク質溶液の形態でリパーゼを使用する。好ましい実施形態で使用するブルクホルデリア・プランタリイの細胞は、培養媒体の比重に匹敵する比重を有する小さなものである。好ましくは細胞は当業者に公知の適切な濾板および強力なポンプを使用した精密濾過によって上清から分離される。更なる濃縮は、例えば当業者に公知の限外濾過を使用して達成することができる。
【００３２】
基質を変換するために溶液中で使用するリパーゼと比較して、固定化リパーゼは、通常安定性が上昇しており、連続的な反応およびバッチ式の反応を実施するために有用である。固定化（した、された）（immobilized）とは、当業者に公知の方法を用い、通常は固相支持体上で、担体に結合していることを意味し、次いでこれを本発明に係る方法で用いる（下記参照）。固定化したリパーゼの使用は、特にプロセスを連続的に実施する場合に好ましい実施形態である。この目的のために、リパーゼは、例えばカラムまたはチューブ状の反応器内に保持された状態で有利に使用することができる。
【００３３】
本発明の方法で使用するリパーゼを固定化するために利用できる種々の可能性がある。全細胞懸濁液の粗抽出物、または細胞培養上清、並びに精製タンパク質溶液を、例えばPersson等、Biotechnology Letters 2000, 22(19): 1571-1575; 米国特許第6,596,520号−特に実施例1−に記載されたような方法に従って固定化することができる。
【００３４】
また、リパーゼ産生生物の培養媒体（または発酵液）をそのまま50-150℃、好ましくは70-100℃、より好ましくは75-85℃、更により好ましくは80-85℃の温度（噴霧乾燥器の出口温度）で噴霧乾燥することができる。噴霧乾燥は担体物質の存在下で行うこともできる。担体は、本発明の方法が実施できるように選択することが必要である。好ましくは、担体として多糖類（例えばマルトデキストリン）または無機化合物（例えばNa2SO4）を使用する。担体の重量は発酵液の固形含量に基づいて5-200重量％、好ましくは10-200重量％、より好ましくは20-150重量％、特に好ましくは50-100重量％である。また、精製したリパーゼ溶液をこうした方法で固定化することができる。残留水分は固形物質に基づいて10％未満、好ましくは7％未満であり、特に好ましくは残留水分含量は5％未満である。
【００３５】
本発明の方法において、（固定化）リパーゼは、出発物質（シス／トランス混合物）に基づいて0.5-10重量％、好ましくは0.5-5重量％、より好ましくは0.5-1、特に1重量％の量で使用される。
【００３６】
本発明のアシル化反応は溶媒なしに、または溶媒の存在下で行うことができる。反応は好ましくは有機溶媒、例えば炭化水素、エーテル、またはアルコール中で実施する。この反応に特に好適な溶媒は以下のものである：
脂肪族炭化水素、例えばヘキサン、ヘプタンおよびオクタンまたはこれらの混合物、特に石油エーテル（petrolether）、または
芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエン、キシレン、または
エーテル類、例えばメチル-tert-ブチルエーテル（MTBE）、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ジオキサン、または
脂環式化合物、例えばシクロペンタン、シクロヘキサン、または
第三級アルコール、例えばtert-ブチルアルコール、tert-アミルアルコール。
【００３７】
溶媒を使用する場合、出発材料（シス／トランス混合物）を有機溶媒で希釈して、出発材料（シス／トランス混合物）の0.2-5モル液、好ましくは0.5-2モル液、より好ましくは0.6-1.2モル液が得られるようにする。
【００３８】
反応は連続的に、またはバッチ式で実施することができる。特に支持されたリパーゼを用いた連続合成が工業規模での実施のために推奨される。
【００３９】
本発明の方法の第2ステップは以下の通りである：
セミエステルと未反応の異性体との混合物は、未反応の異性体からのセミエステルの分離を必要とする。これは水性抽出、例えばセミエステルの塩、特にそのアルカリまたはアルカリ土類金属塩の水性抽出によって都合よく達成される。好ましい実施形態は、炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウム等の塩基の存在下での水性抽出である。この理由のために、好ましくは、pHは7.5-10、好ましくは8-10、より好ましくは8-9.5、特に9-9.5の範囲内であるべきである。
【００４０】
本発明の方法の第3ステップは以下の通りである：
アルコールのどちらの異性体が必要であるかに応じて、シス異性体を含有する有機相、またはトランス異性体をセミエステルの形態で含有する水相のいずれかを後処理することができる。慣用されている加水分解方法を用い、例えば塩基（例えばNaOH、KOH、Na2CO3）または酸（例えばH2SO4、HCl）で処理してセミエステルを対応する酸と所望のトランス異性体のアルコールに分離することができる。
【００４１】
以下に示す実施例によって本発明を更に説明する。この説明は決して本発明を限定することを意味するものではない。
【実施例１】
【００４２】
振とうフラスコでの前培養物の調製
2個の1000 mlの三角フラスコを脱脂綿の栓で密閉し、アルミ箔で覆い、134℃で30分間滅菌した。250 mlのガラス製メスシリンダーをアルミ箔で密閉し、同様に134℃で30分間滅菌した。
【００４３】
微量成分の塩溶液を以下の成分で調製した：2リットルの完全に脱塩した水、77.2 gのクエン酸一水和物、22.6 gの硫酸亜鉛七水和物、17.3 gの硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物、5.7 gの硫酸マンガン一水和物、1.2 gの硫酸銅五水和物、0.5 gの硫酸コバルト七水和物および3.0 gの塩化カルシウム二水和物。
【００４４】
以下の成分を含有する500 mlの培地を作製した：500 gの水あたり3.8 gの酵母抽出物乾燥粉末、0.5 gのリン酸二水素カリウム、1.5 gのリン酸水素二アンモニウム、0.5 gの硫酸マグネシウム七水和物、5 gの微量元素塩溶液。リン酸を用いてpHを6.5にした。完成した培地を濾過滅菌した（0.22 μm）。200 mlの培地を2個の三角フラスコのそれぞれに無菌的に移し、次いでフラスコにそれぞれ1 mlのブルクホルデリア・プランタリイ（LU 8093）保存株を播種した。
【００４５】
次いで三角フラスコの培養液を振とうインキュベーターにより30℃で12時間、200 rpmでインキュベートした（振とう器の軌道半径＝25 mm）。
【実施例２】
【００４６】
発酵槽での前培養物の調製
実施例１で特定した培地10リットルをステンレス製のバケツ中に作製し、リン酸を用いてpHを6.5にした。次いで、培地を伝統的な3枚の回転翼付き撹拌器を備えた21リットルの発酵槽に移した。発酵槽を121℃で60分間滅菌し、次いで30℃に冷却した。
【００４７】
次いで、十分に増殖した三角フラスコ前培養物を無菌的に前発酵槽（prefermenter）に移し、発酵槽を以下の条件で8時間作動させた：給気速度0.5 vvmの圧搾空気、30℃の定温、オーバーレイ圧＝0.1 bar、回転数＝1000 rpm、25％濃度の水酸化ナトリウム溶液および20％濃度のリン酸でpHを6.5に調整。
【実施例３】
【００４８】
発酵槽におけるリパーゼの産生
全容積300 リットルの発酵槽に以下の出発物質を順次投入した：
150 リットルの完全に脱塩した水、1207 gの酵母抽出物乾燥粉末、160 gのリン酸二水素カリウム、480 gのリン酸水素二アンモニウム、432 gの硫酸マグネシウム七水和物、1600 gの微量元素塩溶液（実施例１のもの）、30 mlのTegosipon（登録商標）3062（シリコンベースの消泡剤）。培地のpHは20％濃度のリン酸で4.5に調整した。
【００４９】
発酵槽を121℃で60分間殺菌し、次いで30℃に冷却した。次いで、発酵槽に実施例２の前培養物を無菌的に播種し、以下の条件で作動させた：給気速度0.4 vvmの圧搾空気、30℃の定温、オーバーレイ圧＝0.3 bar、回転数＝550 rpm、25％濃度の水酸化ナトリウム溶液および20％リン酸でpHを6.5に調整。
【００５０】
4時間の発酵後、菜種油を細孔径0.2μmの濾過滅菌ユニットを介してポンプで注入した。最初の供給段階では、供給は以下の式に従って実施した：
供給量 [g/l] = 19.7 * e(0.11 * t)
式中、tは発酵時間（時間）を表す。
【００５１】
最初の供給段階は17時間後に停止させた。その直後により多くの菜種油を以下の式に従ってポンプで注入した：
供給量 [g/l] = 168.6 * e(0.0069 * t)
96時間後、油の供給を停止し、発酵槽の稼働を培地中の油が消費されるまで継続した。その後、発酵槽を4℃に冷却した。速やかにサンプルを採取し、液中の乾燥物(DM)の総量と酵素活性（単位/ml）を測定した。乾燥物の含量は赤外水分分析器によって測定した。酵素活性は基質としてトリブチリンを用いた滴定によって測定した。トリブチリンから１μmol酪酸/分を遊離させる液の量を１酵素単位と定義した。
【００５２】
300リットルの発酵槽において、7.56％の乾燥物含量が測定され、10256 U/mlの酵素活性を有していた。発酵槽の重量は186.8 kgであった。乾燥物の総量は14.1 kgに達した。総酵素活性は1916 MUに達した。１MU＝1 000 000 単位。
【実施例４】
【００５３】
固定化リパーゼの製造
発酵液中に存在するリパーゼを噴霧乾燥によって硫酸ナトリウム上に固定化した。
【００５４】
この目的で、14.1 kgの硫酸ナトリウムを発酵槽内容物に添加し、発酵槽の最低回転速度で1時間かけて溶解させた。その後、発酵槽の内容物全体を噴霧乾燥した。噴霧乾燥器は250 m3/hの窒素を用いて操作した。入り口温度は180℃であった。出口温度は75℃であった。発酵槽の内容物を2流体ノズル（two-substance nozzle）によって窒素流中に注入した。ポンプの速度は所望の出口温度が得られるように調整した（およそ15 kg/h）。乾燥粉末をサイクロンによって分離し、セルホイールスルース（cell-wheel sluice）によってサイクロンから排出させた。
【００５５】
総量25.6 kgの乾燥粉末が得られた。粉末内の残留水分含量は1.8％であった。乾燥粉末サンプルを水に溶解させ、トリブチリンを用いて酵素活性を測定した。この粉末は67 360単位/gDMの活性を有していた。
【００５６】
固定化酵素は有機媒体中で以下のエステル交換反応を触媒する：
【化３】
2014500020.tif 000004
【００５７】
有機系での変換における固定化物（immobilizate）の適合性を以下のように試験した：
反応はガラス製のプロペラ式攪拌器を備えた500 mlのジャケット型容器で構成される試験反応器で実施した。攪拌器はHeidolphのモーター（RZR 2051型）で磁気結合を介して作動させた。セットアップはサーモスタット（Huber Ministat）で加熱した。
【００５８】
およそ0.5gの固定化物を50 mlのファルコン（登録商標）チューブに量り採り、正確な重量を記録した。
【００５９】
サーモスタットを22℃に設定し、スターラーの速度を350 rpmに設定した。
【００６０】
ガラス漏斗を介して、乾燥した反応器に50.0 gの1-フェニルエタノールおよび95.0 gのMTBEを入れた。過剰な水は反応を妨害するため、水の混入を避けるようにした。
【００６１】
予め秤量したリパーゼ含有固定化物をガラス漏斗を介して添加した。
【００６２】
反応は20.4 gのプロピオン酸ビニルの添加によって開始した。
【００６３】
プロピオン酸ビニルの添加の60分後、サンプル（およそ1 ml）を採取し、速やかに0.2μm シリンジフィルター（SPARTAN(登録商標) 30/02 RC, Schleicher & Schuell）を通して濾過した。
【００６４】
100μlの濾過したサンプルと900μlのHPLC溶離液（アセトニトリル20％、メタノール40％、トリフルオロ酢酸1％および水39％）とを2 mlのエッペンドルフ（登録商標）容器に入れた。この溶液100μlを次にHPLCチューブに入れ、同様に900μlのHPLC溶離液を足し、チューブを密閉した。次いでサンプルをHPLCによって分析した。
【００６５】
有機系におけるリパーゼ活性の単位はPEU（フェニルエタノール単位）である。１PEUは、上記の試験条件下で1分間にフェニルエタノールから1μmolのプロピオン酸フェニルエチル（PEP）の生成を触媒するリパーゼ量である。
【００６６】
計算に必要なパラメーターは以下の通り：
プロピオン酸フェニルエチル濃度（PEP）  [mmol/l]
反応体積  [l]
時間（反応時間）  [分]
重量（使用した酵素量）  [g]
【数１】
2014500020.tif 000005
【００６７】
この実施例で得られた固定化物は842 PEU/g固定化物の比活性を有していた。
【実施例５】
【００６８】
シス-4-tert-ブチル-シクロヘキサノールの調製
【化４】
2014500020.tif 000006
【００６９】
113.4 kgの4-tert-ブチル-シクロヘキサノールのシス／トランス(30:70) 混合物（726 mol, 1 eq）を453 lのMTBE (1.6 mol)を入れた反応容器に加えた。58.1 kgの無水コハク酸 (580 mol；0.8 eq)、並びにNa2SO4上に固定化したブルクホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼ1.1 kg（1重量％；上記実施例を参照）を添加した。反応混合物を20℃で撹拌した。反応工程はガスクロマトグラフィーでチェックした。23時間の反応後、0.9 GC 面積％のトランス異性体がなおも検出され（表１、No. 3）、反応混合物を更に27時間撹拌した。
【表１】
2014500020.tif 000007
【００７０】
反応混合物を珪藻土（Kieselgur、例えばセライト(登録商標)）を介して濾過し、容器並びにMTBEを追加のMTBEですすいだ。濾過した反応混合物およびすすいだMTBE-相に蒸留水を添加した後、25％ NaOH溶液を20℃でpHが9.3になるまで段階的に添加した。更に蒸留水を添加して相分離させた。水相（pH 9.3）からMTBEで更に2回抽出した。有機相を合わせ、蒸留によって白色の懸濁液が得られるまで溶媒を除去した（50 mbar, max. 40℃）。この懸濁液（109 kg）をロータリーエバポレーターで更に濃縮した。
【表２】
2014500020.tif 000008
【００７１】
蒸留のために、充填物質を保持したカラム（充填カラム、Raschigrings, 8×8 mm）および加熱したソリッドブリッジ（heated solids bridge）（調節されたコンデンサー）を用いた簡単な蒸留装置を使用した。転移温度は26 mbarのウォータージェットバキューム（water-jet vacuum）で118℃であった。
【００７２】
全体で24.8 kgのシス-4-(1,1-ジメチルエチル)-シクロヘキサノール（収率73％）が白色固体の形態で得られた。
【実施例６】
【００７３】
シス-4-tert-ブチル-シクロヘキサノールの調製
1 gの4-tert-ブチル-シクロヘキサノール（シス／トランス 30:70；1 eq）を10 mlのトルエン（0.6 mol）と混合した。0.5 gの無水コハク酸（0.8 eq）およびNa2SO4上に固定化したリパーゼ0.1 gを添加した（10重量％）。反応条件は実施例１と同じとした。
【００７４】
反応混合物を20℃で24時間撹拌し、更に実施例５で記載したように処理した。1時間および24時間の撹拌後にプローブを分析した。
【表３】
2014500020.tif 000009
【実施例７】
【００７５】
20℃で24時間後に溶媒を変える（0.6mol）以外は実施例６と同様にした。
【表４】
2014500020.tif 000010
【実施例８】
【００７６】
20℃で24時間後の溶媒を1.2molとする以外は実施例６と同様にした。
【表５】
2014500020.tif 000011
【配列表】
2014500020000001.app
【国際調査報告】
2014500020.tif 000012
2014500020.tif 000013
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