(57)【要約】本発明は、乳癌検体及び健常者検体からの試料において標的の差異あるメチル化プロファイルに基づいて、乳癌の予後予測、診断および治療に用いる新たな標的遺伝子領域を提供する。
2014505475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の階層化及び予後のための方法であって、
ａ）被験者の試料中で、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、及びLAX1からなる群より選択される1種以上の遺伝子のメチル化状態を解析する工程：および
ｂ）工程ａ）で得られた１種以上の遺伝子のメチル化状態と、対照試料のメチル化状態を比較する工程を含み、
前記工程ｂ）でメチル化状態の差異が検出されると、被験者の臨床結果が良好又は不良であることを示しているとする方法。
【請求項２】
配列番号500から512によって定義される免疫遺伝子の一つ以上のCpG領域のメチル化状態が解析される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫遺伝子でメチル化が減少していると、より良好な臨床結果及び良好な予後を示しているとする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
乳癌の分類、階層化、診断、予後又は予測する方法であって
ａ）対照試料中の表2（配列番号1〜86）で定義された８６個すべてのCpG領域のメチル化状態を解析する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた１つ以上の領域のメチル化状態と、対照試料のメチル化状態とを比較する工程を含み、
工程ｂ）でメチル化状態の差異が検出されると、被験者は乳癌を有している又は乳癌を発症するリスクがあることを示しているとする方法。
【請求項５】
表2で同定された８６個のCpGアイランドのメチル化プロファイルを含む分類子が使用されている請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記８６個のCpGアイランドの分類子にしたがって、前記６つのメチル化サブタイプの１つに、前記乳癌を分類する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
乳癌の階層化、予後又は予測するための方法、あるいはホルモン療法に対する感受性についての指示を提供するための方法であって、
ａ）被験者の試料中の、表5b（配列番号87〜321）及び表5c（配列番号322〜499）で定義された１つ以上のCpG領域のメチル化状態を解析する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた１つ以上の領域のメチル化状態における差異と、対照試料のメチル化状態とを比較する工程を含み、
工程ｂ）でメチル化状態の差異が検出されると、対象者の感受性がホルモン療法に反応することを示しているとする方法。
【請求項８】
表5b（配列番号87〜321）で定義されたCpG領域の全て及び／又は表５ｃ（配列番号322〜499）で定義されたCpG領域の全てが解析される請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍がER陽性又はER陰性サブタイプに属するか否かを確立するために使用される請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
メチル化状態の差異は高メチル化又は低メチル化によるものである請求項1〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験者の試料は、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、外科用試料、生検または細針吸引液、あるいは尿、全血、血漿、血清、管液、リンパ節流体、腫瘍滲出または腫瘍空洞液等の体液を含む群から選択される請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
メチル化状態は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、メチル化特異的PCR（MCP）、メチル化CpGアイランド回復アッセイ（MIRA）、亜硫酸水素塩−制限複合解析（COBRA）、亜硫酸水素塩パイロシークエンシング、一本鎖コンフォーメーション多型（SSCP）解析、制限解析、マイクロアレイ解析、またはビーズチップ技術からなる群から選択される１種以上の技術によって解析される請求項1〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、あるいは表2、5b若しくは5cで定義されたCpG領域からなる群から選択された１種以上の遺伝子により定義される、乳癌における異常なメチル化を有する１種以上の遺伝子を標的とすることによって乳癌を治療する方法。
【請求項１４】
前記標的とすることによる治療は、脱メチル化剤又はメチル化剤を用いてメチル化状態を変えること、あるいは発現レベルを変化させることにより、又は１種以上の遺伝子によりコードされるタンパク質のタンパク質活性を変化させることである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記メチル化剤は、葉酸、メチオニン、コリンまたはDNAメチル化を高めることができる任意の他の化学物質のようなメチルドナーである請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b若しくは5cで定義されたCpG領域を含む群から選択された１種以上の遺伝子により定義される、乳癌における異常なメチル化を有する遺伝子または遺伝子産物のうちの1つ以上のメチル化状態を調節する物質を同定するための方法であって、
ａ）候補薬剤を１種以上の遺伝子と接触させる工程；及び
ｃ）前記候補薬剤による１種以上の遺伝子のモジュレートを解析する工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、１種以上の遺伝子のメチル化状態、発現量または活性をモジュレートする請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
基準メチル化状態プロファイルを確立するための方法であって、
被験者の試料における、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、または表2、5b若しくは5cで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子により定義される、乳癌中の異常なメチル化を有する１種以上の遺伝子のメチル化状態を測定する方法。
【請求項１９】
前記被験者は、健常者であり、これにより、健常者の参照プロファイルを生成する、あるいは被験者が乳癌である、または、Basal−like、LuminalＡ、LuminalＢ、HER2-プラスまたはHER2マイナス乳癌、これにより、特定の乳癌タイプ参照プロフィールを生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７から得られ得る、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、あるいは表2、5ｂ若しくは5cで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子の1つ以上のCpG領域のメチル化状態を含む、乳癌の階層化、予後、診断または予測のためのメチル化状態の参照プロファイル。
【請求項２１】
LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、または表2、5b若しくは5cで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子の１つ以上の乳癌特異的CpG領域を含むマイクロアレイまたはチップ。
【請求項２２】
乳癌の階層化、予後診断または予測における、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、または表2、5b若しくは5cで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子の1つ以上のCpGアイランドのメチル化状態の使用。
【請求項２３】
乳癌患者を階層化する方法であって
ａ）被験者の試料中の、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b若しくは5cに定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子の一つ以上のCpGアイランドのメチル化状態を解析する工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた前記１種以上の遺伝子のメチル化状態と、健常者、Basal-like、LuminalＡ、LuminalＢ、HER2＋、HER2−乳癌患者から選択される対照試料のメチル化状態を比較する工程
を含み、工程ａ）と工程ｂ）において対応しているメチル化状態で、乳癌のタイプを同定する階層化方法。
【請求項２４】
乳癌治療を選択する方法であって、
ａ）被験者の試料中の、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b若しくは5cに定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子の一つ以上のCpGアイランドのメチル化状態を解析する工程；及び
ｂ）工程ａ）から得られた前記１種以上の遺伝子のメチル化状態と、健常者、Basal-like、LuminalＡ、LuminalＢ、HER2＋、HER2−乳癌患者から選択される対照試料のメチル化状態を比較し、工程ａ）と工程ｂ）において対応するメチル化状態で、乳癌のタイプを同定する工程；並びに
ｃ）同定された乳癌のタイプから、乳癌のふさわしい治療を同定する工程
を含む方法。
【請求項２５】
請求項21に記載のマイクロアレイ、及び請求項２０に記載の１つ以上の参照プロファイルを含む、乳癌の階層化、予後診断または予測するためのキット。
【請求項２６】
LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、 SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b若しくは5cで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子の一つ以上のCpGアイランドのメチル化状態を解析する手段、及び請求項２０に記載の１つ以上の参照プロファイルを含む、乳癌の階層化、予後診断または予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書で同定された新しい診断ツールや標的に基づく医療診断、治療分野に位置し、特に癌の診断分野、及び癌を治療するための方法に位置する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、分子的、生物学的および臨床的に不均質な疾患グループである。乳癌の多様性を理解することは、診断を改善し、治療を最適化するために不可欠である。遺伝的異常および後天的なエピジェネティック異常のいずれも、癌（Jones P. A.及びBaylin S. B. 2007年Cell 128, 683-692; Feinberg, A. P. 2007年 Nature 447, 433-440）に属するが、乳癌におけるエピゲノムの関与及び疾患の複雑さに対するエピゲノムの影響についての情報は乏しい。
【０００３】
これまでの研究では、乳房発癌において異常なメチル化事象が報告されている（Sunami, E.ら、2008年 Breast Cancer Res. 10:R46; Feng, W.ら、2007年 Breast Cancer Res. 9:R57; Widschwendter, M.他、2004年 Cancer Res. 64,3807-3813; Ordway, J. M.ら、PLoS One 19:e1314）が、このメチル化事象を、特定の腫瘍の特性に正確には関連付けていなかった。本発明の目的は、表現型異種の腫瘍のDNAメチル化領域を探索し、ＤＮＡメチル化領域の特徴を乳癌の多様性に関連付け、そして生物学的および臨床的に意味のある情報を抽出することである。
【０００４】
DNAメチル化は、ほとんど主にCpGジヌクレオチドいわゆるCpG部位中で、5−メチルシトシンとして生じる。それは最も研究されたエピジェネティック修飾（modification）であり転写調節とサイレンシングを支配する（レビューとしてSuzuki MM及びBird A 2008年 Nat Rev Genet 9: 465-476を参照）。比較的健全なゲノムとは異なり、メチローム（methylome）は、発生、組織分化と老化の間で活発に変化する。病的異常となったDNAメチル化は、様々な癌についてよく説明されている（Jones PA及びBaylin SB 2007年 Cell 128: 683-692で検討）。ヒト遺伝子プロモーターの約75％がCpGアイランドに関連付けられる。このCpGアイランドは、比較的高い頻度で、CpGジヌクレオチドの500bpから2キロバイトの長さのクラスターである。それらは通常低レベルのDNAメチル化を含むが、高メチル化になることもあり、このCpGアイランドの高メチル化は、腫瘍形成の間に腫瘍抑制遺伝子の転写を無効にすることが実証された。最近では、CpGアイランドのさらに外側に隣接するCpG部位で、いわゆるCpGアイランドのショア(shore)（Irizarry RAら、2009年 Nat Genet 41: 178-186）と呼ばれる部位におけるDNAメチル化の変化が、ますます注目を集めている。興味深いことに、CpGアイランド内のＤＮＡメチル化に加えて、これらのショア配列内のCpG部位は、異なる組織の細胞間のみならず、癌細胞と正常細胞との間の特異なDNAメチル化を表していると提案されている。
【０００５】
本発明の目的は、これまであまり理解されてこなかった乳癌患者のゲノムの全体的なＤＮＡメチル化状態の関係、即ち健常者との高メチル化および／または低メチル化の双方の関係を明らかにすることである。そして本発明は、乳癌患者を階層化するために、新たな予後や非常に早い段階で乳癌を識別するための診断ツールを提供することを目的とする。本発明は、更に、乳癌の治療のための新しい標的を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Infinium（商標）メチル化プラットフォームを用いて248個の凍結乳房組織がプロファイルされたときに収集された情報に基づく。248個の凍結乳房組織は、123試料（４個の正常試料及び１１９個の浸潤性乳管癌（IDC）試料）の「メインセット」と125試料（8個の正常試料と１１７個のIDC試料）の「検証セット」からなる（表1参照）。
【０００７】
まず、本発明は、ERの状態によって決定される乳癌の二つの主要な表現型が広くエピジェネティックに制御されていることを示す。
【０００８】
第二に、本発明は、独立した腫瘍セット中の6つのメチル化プロファイルベースの腫瘍グループを検証する。腫瘍グループのいくつかは、既知の遺伝子発現腫瘍サブタイプと一致する（Perou, C. M.ら、2000年 Nature 406, 747-752; Sφrlie, T.他、2001年 Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10869-10874; van't Veer, L. J.他、2002年 Nature 415, 530-535; Sotiriou, C.他、2003年 Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 10393-10398）。また、さらに、乳房腫瘍の分類学を洗練するための有意義な根拠を提供する新しいエンティティについても検証を行う。
【０００９】
第三に、本発明は、DNAメチル化プロファイルが、腫瘍微小環境の細胞型組成を反映できることを示している。
【００１０】
最後に、予想外に強いエピジェネティックなコンポーネントがキー免疫経路（key  immune  pathway）の調節において強調された。従って、本発明は、特定の腫瘍のカテゴリーで高い予後値を持つ免疫の遺伝子セットを提供する。
【００１１】
合わせて考えると、乳癌異種および改良された腫瘍の分類をより良く理解するための下地を作ることによって、本発明によって提供される正確なエピジェネティックな肖像は、乳癌患者のよりよい管理に貢献する。
【００１２】
従って、本発明は、乳癌の階層化及び予後のための方法を提供する。当該方法は、
ａ）乳癌を有する被験者の試料中のLCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1を含む群から選択される1種以上の遺伝子のメチル化状態を解析する工程；及び
ｂ）工程ａ）から取得した１種以上の遺伝子の前記メチル化状態を、対照試料のメチル化状態と比較する工程を含み、
前記工程ｂ）でメチル化状態の差異が検出されると、被験者の臨床結果が良好又は不良であることを示しているとする方法である。好ましくは、配列番号500から512で定義された一つ以上のCpG領域又はCpG部位のメチル化状態が解析される。
【００１３】
あるいは、本発明は、乳癌の階層化、診断、予後又は予測する方法を提供する。当該方法は、
a）被験者の試料中の表2（配列番号1〜86）で定義された８６領域すべてのCpGのメチル化状態を解析する工程；及び
b）工程ａ）で取得した１以上の領域のメチル化状態を、対照試料のメチル化状態と比較する工程を含み、
工程ｂ）でメチル化状態の差異が検出されると、被験者が乳癌を発症するリスクがある又は発症していることを示しているとする方法である。
【００１４】
さらに、本発明は、乳癌の階層化、予後又は予測のための方法と同様に、ホルモン療法応答のための指標を提供する。当該方法は、
ａ）被験者の試料中の、表5b（ESR1陽性モジュール、配列番号：87〜321）および表5c（ESR1陰性モジュール、配列番号：322〜499）で定義された１つ以上のCpG領域のメチル化状態を解析する工程；及び
b）工程ａ）で取得した１以上の領域のメチル化状態と、対照試料のメチル化状態を比較する工程
を含み、工程b）でメチル化状態の差異が検出されると、ホルモン療法に対する被験者の反応は感受性であるとする方法である。
好ましくは、ESR1陽性またはESR1陰性のモジュールのいずれか一方のすべてのCpGアイランドまたは領域が解析される。さらにより好ましくは、両方のモジュールの全領域またはアイランドが解析される。
【００１５】
本発明に係る方法のいずれかにおいて、メチル化状態の差異は、高メチル化又は低メチル化のいずれに依拠してもよい。
【００１６】
好ましい実施形態では、被験者の試料は、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、外科用試料、生検または細針吸引液、あるいは尿、全血、血漿、血清、管液、リンパ節流体、腫瘍滲出液または腫瘍空洞流体（tumor  cavity  fluid）等の生物学的流体を含む群から選択される。
【００１７】
好ましい実施形態では、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、及びLAX1を含む群から選択される遺伝子のメチル化状態が決定される。好ましくは、前記遺伝子各々の１つ以上のCpG領域のメチル化状態を解析する。ある実施形態では、前記CpG領域は、配列番号：500〜512（表13b）で定義される。
【００１８】
さらに好ましい実施形態において、乳癌は、HER-2陽性型またはLuminal  B型である。
【００１９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、メチル化状態は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、メチル化特異的PCR（MCP）、メチル化CpGアイランド回復アッセイ（MIRA）、亜硫酸水素塩−制限複合解析（COBRA）、亜硫酸水素塩パイロシークエンシング（pyrosequenceing）、一本鎖構造多型（SSCP）解析、制限解析、マイクロアレイ解析、またはビーズチップ技術からなる群より選択される一つ以上の技術によって解析される。
【００２０】
本発明はさらに、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b、5c、若しくは13bで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子により定義される、異常なメチル化を有する１種以上の遺伝子を標的とすることによって乳癌を治療する方法を提供する。
【００２１】
前記治療方法の特定の実施形態において、前記標的は、脱メチル化剤又はメチル化剤を用いて、あるいは発現レベルを変化させることにより、あるいは1つ以上の前記遺伝子によりコードされるタンパク質のタンパク質活性を変化させることにより、メチル化状態が変わることを意味する。好ましい実施形態において、前記メチル化剤は、例えば葉酸、メチオニン、コリンまたはDNAメチル化を高めることができる他の化学物質のようなメチルドナーである。
【００２２】
本発明はさらに、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b、5c、若しくは13bに定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子によって定義される、乳癌における異常なメチル化を有する１種以上の遺伝子または遺伝子産物のメチル化状態をモジュレートする物質を同定するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）候補薬剤と１種以上の遺伝子を接触させる工程；及び
ｃ）前記候補薬剤による１種以上の遺伝子のモジュレーションを解析する工程。このような方法の好ましい形態においては、前記薬剤は、メチル化状態、１種以上の遺伝子の発現量または活性をモジュレートする。
【００２３】
本発明はさらに、以下の工程を含む基準メチル化状態プロファイルを確立するための方法を提供する。当該方法は、被験者の試料中の、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、または表2、5b、若しくは5cで定義されているCpG領域からなる群から選択される１種以上の遺伝子によって定義される、乳癌における異常なメチル化を有する１種以上の遺伝子のメチル化状態を測定する工程を含む。好ましくは、前記被験者は、健常であり、これにより健常者の参照プロファイルを作成できる。あるいは前記被験者は乳癌を患っている、またはBasal−like、LuminalＡ、LuminalＢ、HER2陽性またはHER2陰性乳癌であり、これにより特定の乳癌タイプの参照プロファイルを作成できる。
【００２４】
本発明はまた、乳癌の階層化、予後、診断または予測のためのメチル化状態のプロファイルを提供する。当該プロファイルは、本発明により取得される、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、または表2、5b、5c、若しくは13bで定義されたCpG領域を含む群から選択される1種以上の遺伝子を含む。
【００２５】
本発明はまた、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、及びLAX1、または表2、5b、5c若しくは13bで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子からの乳癌特異的な１つ以上のCpG領域を含むマイクロアレイまたはチップを提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、乳癌の階層化、予後診断または予測におけるLCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b、5c、若しくは13bに定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子のCpGアイランド又は領域のうちの1つまたは複数のメチル化状態の使用を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、乳癌患者を階層化する方法を提供する。この方法は、
ａ）被験者の試料中のLCK、CD6、CD3D、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1または表2、5b、5c、若しくは13bで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子のCpGアイランド又は領域のメチル化状態を解析する工程；および
b）ａ）工程で取得した１種以上の遺伝子のメチル化状態を、健常者またはBasal-like、LuminalＡ、LuminalＢ、HER2-陽性またはHER2陰性乳癌から選択される対照試料のメチル化状態と比較する工程
を含み、工程a)と工程ｂ）で対応しているメチル化状態により、乳癌タイプを同定する方法。
【００２８】
本発明は、さらに、乳癌患者の治療の選択方法を提供する。この方法は、
ａ）被験者の試料中のLCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、又は表2、5b、5c、若しくは13bで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子のCpGアイランド又は領域のメチル化状態を解析する工程；
b）工程ａ）で取得した１種以上の遺伝子のメチル化状態と、健常者又はBasal−like、LuminalＡ、LuminalＢ、HER2-陽性またはHER2陰性乳癌から選択される対照試料のメチル化状態とを比較し、工程ａ）と工程ｂ）で対応しているメチル化状態で乳癌タイプを同定する工程；及び
c）同定された癌のタイプから乳癌の適切な治療を特定する工程を含む。
【００２９】
最後に、本発明は、乳癌の階層化、予後、診断または予測のためのキットを提供する。当該キットは、本発明に係るマイクロアレイを含む、本発明の１つ以上の参照プロファイルを含む。すなわち、本発明のキットは、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、およびLAX1、または表2、5b、5c、若しくは13bで定義されたCpG領域を含む群から選択される１種以上の遺伝子からのCpGアイランド又は領域のメチル化状態を解析するための手段；及び1つ以上の参照プロファイルを含む。
【００３０】
本発明はさらに、異なる乳癌サブタイプにおいて、異なるようにメチル化されているCpG領域の特定のクラスターの同定に基づいて、乳癌腫瘍の分類（taxonomy）、タイプ、および/または分類（classification）を能率化するためのツールを提供する。
【００３１】
本発明は、CpG領域の2つの主要なクラスターＩ、IIを同定する。これらのクラスターは、ER陽性乳癌（クラスターII）およびER陰性乳癌（クラスターＩ）との間で区別可能であり、また、ESR1陽性乳癌（クラスターI）とESR1陰性乳癌（クラスターII）とを区別できる（表5b及び5c）。
【００３２】
また、86のCpG領域のメチル化データ（表2）を含む分類子を用いて、本発明は、CpGメチル化の６つのサブクラスタ（クラスター1〜6）を同定する。これは、乳癌患者を、HER2陽性（クラスター2）、Basal-like（クラスター3）及びLuminalＡタイプ（クラスター6）に分類できる。
【００３３】
従って、本発明は、上述したクラスターのいずれか1つ以上を用いて、メチル化プロファイルに基づいて、乳癌又は乳癌患者を、特定のタイプのサブグループに分類又は階層化する方法を提供する。この分類又は階層化に基づいて、癌治療を改良することができ、または予後を予測することができる。
【００３４】
加えて、本発明は、HER2過剰発現およびLuminalB型腫瘍に対する１１の免疫予後マーカー（すなわち、LCK、CD3D、CD6、ICOS、CD3G、SIT1、CCL5、HCLS1、CD79B、UBASH3A、及びLAX1）を同定している。発現量の増大は、メチル化の減少と結びついており、良好な臨床結果、ひいては良好な予後をもたらす。健康な乳房組織に対して乳癌中で異なってメチル化されているこれらの遺伝子において、合計で13個のCpGアイランド又は領域（参照：配列番号500〜512、表１３ｂ）が同定された。
【００３５】
本発明は、さらに、それらの細胞の起源を反映する可能性が高い特定の幹細胞/前駆細胞集団に戻り、乳癌の異なるグループを追跡するためのツールを提供する。
【００３６】
本発明は、さらに強力な生存マーカーを明らかにし、癌検診と予後に貢献することができるDNAメチル化プロファイリングを提供する。
【００３７】
本発明は、免疫成分が乳癌の予後、特にその発現が良い臨床結果に関連付けられているT細胞マーカーに重要であることを示した。
【００３８】
本発明およびその代替実施形態は、以下の説明および実施例の欄で、定義される。当業者は、本発明によって提供される知識上でさらに構築して代替実施例を設計することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ヒト凍結乳房組織におけるハイスループットDNAメチル化プロファイリング。A：乳房腫瘍とメインセットの正常試料との間で異なってメチル化されているCpG数を示す円グラフ。（i）CpG位置対CGI（2007年のPLoS Comput. Biol. 3, 1055-1070で、Bockらによって定義された）及びCpG位置対CpGアイランドショア（shore）（2009年 Nat. Genet. 41, 178-186で、Irizarryによって定義された）；（ii）CpG位置対プロモータークラス（2007年 Nat. Genet. 39, 457-466で、Weberらによって定義された）。B：従来の亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング（BGS）によるビーズアレイ法の検証。図１Ｂは、1つの正常な試料（N1）と3つの腫瘍試料（BC）におけるCDK3、GSTP1、TWIST1及びRIMBP2からの例示的に解析された遺伝子座を示している。グレーの矢印は、ビーズアレイによって調査されたCpGの位置を示す。当該CpGの位置は、周囲のCpGの代表と思われる。データ表現は、Bockら、2005年（Bioinformatics 21, 4067-4068）に従って行われた。黒丸はメチル化CpG；白丸はメチル化されていないCpG；丸のプロットがないのは、未定のシーケンス。図１Cは、Infiniumメチル化とCDK3遺伝子座用のBGSデータとの間で有意な正の相関（スピアマンのρ= 0.82；ｐ＜0.001）を示す。
【図２】DNAメチル化プロファイルが異なるERの状態を有する2つの主な乳房腫瘍の種類を識別する。A：ERの状態は、2つの広範な腫瘍群の主な弁別器である。選択された臨床データ：エストロゲン受容体（ER）およびIHCによって決定されたHER2受容体の状態、腫瘍の悪性度、腫瘍サイズ、リンパ節の状態、患者の年齢、5年以内の再発。B：ESR1モジュールスコアの四角のプロットは、ESR1の陽性モジュールの遺伝子（左側部分）が、クラスターIIよりもクラスターIにおいて、より高頻度のメチル化及び低い発現量であることを示している。反対のことが、ESR1陰性モジュール（右側部分）で観察された。ESR1モジュールは、以前にDesmedt、C.ら、2008年（Clin. Cancer Res. 14, 5158-5165）に記載され、マン−ホイットニー検定によるp値を示した。C：ESR1モジュールのバーコードプロット（GSEA解析によって提供された）は、DNAメチル化および発現データの反相関関係を示している。上部と下部のバーはそれぞれ、メチル化ランキング及び発現ランキングにおけるESR1モジュール遺伝子の位置を指定している。点線は０を示す。D：患者メインセット及び臨床データにおけるクラスターＩ、クラスターIIとメチル化との関係。ER陽性腫瘍は、クラスターIIで優勢である一方、クラスターＩは、適度に高い数値のHER2陽性腫瘍を含んでいるように見えた。グレード1の腫瘍は、クラスターIIに分類された。腫瘍サイズ、リンパ節の状態、または年齢との有意な関連は見いだされなかった。
【図３】DNAメチル化によって明らかにされた乳癌の複雑さと異質性。A：メインセットのDNAメチル化プロファイリングは、「発現サブタイプ組成物」及び臨床的特徴の観点から差異を有する腫瘍の6つのグループ（クラスター1〜６と称される）を、同定する（表6を参照）。B：教師なしのクラスター解析（unsupervised  cluster  analysis）によるメインセットの各腫瘍に割り当てられたメチル化グループと、最近隣重心分類法（nearest centroid classification method）により確立された86個のCpG分類子との比較。C：6重心を用いた腫瘍のメインセットの相関プロット。各試料は、図３Aの教師なしのクラスタリング（clustering）により割り当てられた、メチル化グループの色を表示する。D：検証の各腫瘍について、86個のCpG分類子により6つのメチル化グループのいずれかに設定する分類。E：6重心に対する検証セット腫瘍の相関プロット。各試料は、それが最も高い相関を提示するグループに入れた。検証セットとして取得した6グループは、同じ「発現サブタイプの組成」とメインセットのために取得したグループとしての臨床的特徴とを提示したことに留意すること。F：６つのグループの検証セットと臨床データとの間の関連を示す。クラスター５及びクラスター６は、ER陽性腫瘍のみに含まれる一方、クラスター３は、原則としてER陰性腫瘍から構成された。HER2陽性腫瘍は、クラスター1およびクラスター2において優勢であった。クラスター6は、主に、グレード1の腫瘍を含んでいた。腫瘍の大きさや年齢と有意な関連は認められなかった。G：CpG位置対CGI及びCpG位置対プロモータークラスの観点からの86CpG分類の特徴。H：いくつかの正常な乳腺上皮集団の遺伝子発現のシグナチャー（signatures）と、メインセットにおけるDNAメチル化ベースの６つの患者グループの遺伝子発現及びDNAメチル化プロフィールの比較（追加オンライン法のセクションモジュール/シグナチャースコアを参照）。ａ、ｂ、ｃ：乳腺幹細胞（MaSC）、Luminal前駆細胞、およびLuminal成熟体のシグナチャースコアの四角プロットは、それぞれ遺伝子発現プロファイルに基づく6つのメチル化乳癌グループの各々について示す。I：ヒストグラムは、正常試料と比較して、異なってメチル化されているCpG数の観点から、乳房腫瘍の不均一性を示している。J：クラスター2及びクラスター3では高い低メチル化量とともに、ＧＯ解析によって明らかにされるような、免疫に関与する遺伝子の異なった（differential）メチル化。K：（１）リンパ球浸潤を示さない乳腫瘍の組織学的パターン、又は（２）間質浸潤及び腫瘍内浸潤を示す乳腫瘍の組織学的パターン。パネル３は、パネル2に示す腫瘍内浸潤を近接的に観察したものである。黒矢印は、上皮細胞を示し、緑と青の矢印はそれぞれ、間質および腫瘍内リンパ球を示す。L：四角のプロットは、クラスター2及びクラスター3に属するメインセット腫瘍が、他のクラスターに属する腫瘍と比べて、より高いリンパ球浸潤を示している。M：四角のプロットは、LCK及びITGALについて、メチル化とリンパ球浸潤との間の逆相関を示している（トレンドのためのJonckheere−Terpstraテスト、表8参照）。N：DNAメチル化プロファイリングにより評価されるように、乳房上皮細胞株並びにex vivoリンパ球およびリンパ球細胞株におけるＧＯ解析により強調表示された免疫遺伝���のメチル化状態。O：患者メインセットのメチル化クラスター1〜6と、臨床データとの関連付け。クラスター６は、ほとんど独占的にER陽性腫瘍を含んでいた一方、クラスター2及びクラスター3は主にER陰性腫瘍から構成されていた。HER2陽性腫瘍は、クラスター2で優勢であり、HER2陰性腫瘍はクラスター3及びクラスター6で優勢だった。クラスター6は、ほぼ独占的にグレード1の腫瘍を含んでいた。腫瘍のサイズ、リンパ節転移の状態や年齢と有意な関連は認められなかった。
【図４】エピジェネティック的に調節される免疫成分は、乳癌の優れた臨床マーカーである。A：有意な予後マーカーが現れる（FDR＜0.1）全ての遺伝子の中で、免疫遺伝子、特にT細胞生物学に関与している免疫遺伝子が高い割合を示している円グラフ（単変量Cox回帰解析方法を、方法の欄及び表１０で説明するように実施した）。B：四角プロットは、LAX1及びCD3Dについて、メチル化状態（赤）と間質リンパ球浸潤との相関及び発現状態（青）と間質リンパ球浸潤との相関を示す（トレンドのためのJonckheere−Terpstraテスト、表１１、１２参照）。C：ＤＮＡメチル化と遺伝子発現プロファイリングにより決定されるように、乳房上皮細胞球における並びにex  vivoリンパ球およびリンパ球細胞株における11個の予後免疫マーカーのメチル化状態と発現状態との間の反相関。D：11個の免疫遺伝子の高発現は、乳癌におけるより良い臨床結果に関連付けられている。森林プロットは、無再発生存解析の95％信頼区間（バー）についてのlog2ハザード比（正方形）を示す。負のハザード比は、指示された変数の高発現レベルが良好な結果と関連付けられていることを明らかにし、正のハザード比はその反対である。E：乳癌の免疫マーカーのサブタイプ特異的な予後値。既知の各「発現サブタイプ」におけるLAX1とCD3D遺伝子の発現の異なるレベルの例示的（Exemplative）Kaplan−Meier曲線（各サブタイプの詳細な連続変量生存解析は、表15を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
文脈で明確に指示しない限り、本明細書で使用される指示対象は、単数および複数の両方を含む。一例として、「抗体」は、１つまたはそれ以上の抗体を意味し、「抗原」は１つ又はそれ以上の抗原を意味する。
【００４１】
用語「構成する」「有する」「から構成される」 は、明細書において「包含する」「含む」又は「含有する」「含んでいる」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、付加的な、制限していない部材、要件又は方法の工程を除外しない。
【００４２】
本明細書および請求項において使用される用語「および/または」は、この用語の前後のフレーズが代替として又は組み合わせのいずれであるかを考えられるべきであることを意味する。
【００４３】
本明細書において、用語「レベル」又は「発現レベル」は、種々の試料および/または被験者の中で、異なる遺伝子の発現レベルを比較するために使用することができる発現量データを参照する。
【００４４】
あるタンパク質の「量」又は「濃度」の用語は、ある試料中のタンパク質の有効量（すなわち、測定された総タンパク量）、または相対量（すなわち、使用される試料サイズに関して測定された総タンパク量）をそれぞれ意味する。
【００４５】
本明細書で引用した全ての文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。特に、本明細書に具体的に示されるすべての文書の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
用語「CpG領域」または「CpGサイト」は、他のゲノムDNA領域よりも高頻度の5’−CG−3’（CPG）ジヌクレオチドを示すゲノムＤＮＡの領域である。CpGジヌクレオチドにおけるDNAのメチル化、特に、CpGジヌクレオチドにおけるシトシン環の5位置でのメチル基の付加は、哺乳動物細胞におけるエピジェネティックな修飾の一つである。CpG領域又はサイトは、いわゆる「CpGアイランド」と称され、遺伝子のプロモーター領域で頻繁に現れ、遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしている。正常組織では、CpGアイランドは、通常メチル化されていないが、アイランドのサブセットは、疾患の進展中に異なるようにメチル化される（高メチル化または低メチル化）。
【００４７】
CpG領域のメチル化状態の検出は、現在、科学研究で使用される任意の公知のアッセイにより行うことができる。限定はしないが、以下のようなものが挙げられる。メチル化特異的PCR（MSP）は、DNAと亜硫酸水素ナトリウムとの化学反応に基づいて、CpGジヌクレオチドのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換し（UpG）、続いて従来のＰＣＲを行う。メチル化シトシンは亜硫酸水素ナトリウムにより変換されず、関心のあるCpG部位と重なるように設計された特異的ヌクレオチドプライマーが、形成されたPCR産物の量に基づいて、メチル化または非メチル化としてメチル化状態を決定することができる。あるいは、HELPアッセイを用いることができ、これは制限酵素の差異ある能力に基づいて、メチル化された及びメチル化されていないＤＮＡのCpG部位を認識して切断する。また、チップオンチップアッセイは、市販されている抗体のMCP2のようなDNAメチル化関連タンパク質に結合する能力に基づいて、メチル化状態を決定するために用いられることができる。また、制限ランドマークゲノムスキャニングは、制限酵素によりメチル化されたCpG部位及びメチル化されていないCpG部位を異なるように認識することに基づき、用いられることができる。メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）は、クロマチン免疫沈降に類似し、DNAマイクロアレイ（MeDIPチップ）又はDNA配列決定（MeDIP-SEQ）のようなDNA検出方法への入力のためのメチル化DNA断片を単離するのに用いられることができる。あるいは、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ活性のための分子ブレーク光アッセイを用いることができる。これは、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、完全にメチル化されたGATCサイト（アデニンはメチル化されている）用に制限酵素DpnIの特異性を使用するアッセイである。アデニンメチルトランスフェラーゼは、DpnI用の基質となるように、オリゴヌクレオチドをメチル化する。DpnIによりオリゴヌクレオチドを切断すると、蛍光が増加する。さらに、メチル化されたCpGアイランド回復アッセイ（MIRA）を用いることができる。
【００４８】
これらの技術は、制限酵素の切断活性に影響を与える認識配列（例えば、Hpall、Hhal）内のメチル化シトシン残基の存在を必要とする（Singerら（1979））。サザンブロットハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースの技術を、このアプローチと共に用いることができる。
【００４９】
別の実施形態では、亜硫酸水素塩依存性メチル化アッセイは、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別することができるようにTaql（5'TCGA）またはBstUI（5'CGCG）などの5'CGを含む配列を認識する制限酵素を用いて、亜硫酸水素塩処理したDNAから得られるPCR産物も解析されることができ、亜硫酸水素−制限複合分析（COBRAアッセイ）として知られている。
【００５０】
別の実施形態において、メチル化検出技術は、選択的にメチル化DNA配列に結合するMeCP2タンパク質のMBDドメインの能力に基づいている。細菌で発現および精製されたHisタグされたメチル−CpG結合ドメインは、固体マトリックスに固定化され、分取カラムクロマトグラフィーを用いて、高度にメチル化されたDNA配列を単離する。制限エンドヌクレアーゼで消化したゲノムDNAは、アフィニティーカラム上にロードされ、メチル化CpGアイランド濃縮画分が塩化ナトリウムの直線勾配により溶出される。PCRまたはサザンハイブリダイゼーション技術が用いられて、これらの画分中の特定の配列を検出するために使用される。さらに、DNAメチル化解析のためにMALDI-TOFを利用することができる。4塩基特異的切断反応の組み合わせを用いて、標的領域の各々のCpGを個別に解析することができ、複数の表示マスシグナルによって表される。遺伝子のメチル化状態を検出するための別の例示的な方法は、Illumina社、サンディエゴ（米国）から販売されてInfinium（商標）ビードチップのようなビードチップを利用する。
【００５１】
選択された実施形態においては、（一つ以上の）標的遺伝子領域のメチル化状態を決定するための方法は、標的核酸分子のメチル化状態の関数（function）として、標的核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬を用いて標的核酸分子を処理する工程；処理された標的核酸分子を増幅する工程；増幅された核酸を断片化する工程；増幅された標的核酸分子の１つ以上のフラグメントを、該フラグメントに基づいてフラグメントのサイズ及び／又は数を検出する工程；標的核酸分子のメチル化状態、又は核酸分子内のヌクレオチド遺伝子座を同定する工程あるいはその中の核酸分子またはヌクレオチド遺伝子座をメチル化又は非メチル化として同定する工程を含む。断片の検出は、例えば、塩基特異的切断状態下で増幅された生産物を処理することによって行うことができる。断片の検出は、増幅された標的核酸分子断片のうちの一つ以上の質量を測定または検出することによって行うことができる。例えば、MALDI-TOF質量分析法等の質量分析法により、検出することができる。検出は、また、1つ以上の標的核酸分子の断片の測定された質量を、未処理の核酸分子の断片について測定された質量のような、参照核酸の1つ以上の質量と比較することによって、行うこともできる。例示的な方法では、試薬は、非メチル化ヌクレオチドをモデファイし、モデフィケーションに続いて、得られた修飾された標的が特異的に増幅される。いくつかの実施形態では、（一つ以上の）標的遺伝子領域のメチル化状態を決定するための方法は、選択されるヌクレオチドのメチル化状態の関数として、選択されるヌクレオチドを修飾する試薬を用いて標的核酸分子を処理し、異なるヌクレオチドを生成する工程を含む。特定の実施例では、メチル化されていないシトシンを修飾してウラシルを生成する試薬は亜硫酸水素塩である。ある実施形態においては、メチル化または非メチル化核酸塩基がシトシンである。別の実施形態では、亜硫酸水素塩でない試薬は、非メチル化シトシンを修正して、ウラシルを生成する。
【００５２】
本明細書で使用される「核酸標的遺伝子領域」は、本明細書に開示の方法を用いて検査される核酸分子である。本願の目的のために、「核酸標的遺伝子領域」、「標的遺伝子」、 「標的領域」、「領域」および「遺伝子」は交換可能に用いられることができる。核酸標的遺伝子領域は、ゲノムDNAまたはその断片の一部であり、遺伝子、遺伝子のミトコンドリアＤＮＡセグメント、又は遺伝子のＲＮＡ及びＲＮＡのセグメントの部分であってもよいし、部分でなくてもよい。本明細書で定義される「標的」の例は、遺伝子名や遺伝子ID番号で、表2、5b、5c又は13に記載されている。核酸標的遺伝子領域は、本明細書で同定された各標的配列として、例えば、表2、5b、5c又は１３で行われるような、その染色体位置範囲によって定義することができる。本明細書で提供される染色体位置の範囲は、ヒトの参照配列（ゲノムビルドhg18/NCBI36、2006年3月）から収集され、国際ヒトゲノム配列決定コンソーシアムによって生成された。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「核酸標的遺伝子の分子」は、核酸標的遺伝子領域の塩基配列を含む分子である。核酸標的遺伝子分子は、核酸標的遺伝子領域の配列の10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％を超え、100％まで含んでもよい。「標的ペプチド」は、核酸標的遺伝子によりコードされるペプチドを意味する。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「メチル化状態」または核酸標的遺伝子領域の「メチル化状態」は、１つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の存否、又は本明細書で定義される核酸標的遺伝子領域における、メチル化部位でのメチル化シトシン対非メチル化シトシンの比を指す。
【００５５】
例えば、少なくとも一つのメチル化シトシンを含む核酸標的遺伝子領域は、メチル化されたと考えることができる（すなわち、核酸標的遺伝子領域のメチル化状態がメチル化されている）。いずれのメチル化ヌクレオチドも含まない核酸標的遺伝子領域は、メチル化されていないと考えることができる。
【００５６】
同様に、核酸標的遺伝子領域のヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸標的遺伝子領域の特定の遺伝子座でのメチル化ヌクレオチドの有無を意味する。
【００５７】
例えば、核酸標的遺伝子領域での10番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸標的遺伝子領域の10番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが5−メチルシトシンである場合にメチル化されている。同様に、核酸標的遺伝子領域での10番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸標的遺伝子領域での10番目のヌクレオチドで存在するヌクレオチドがシトシン（５−メチルシトシンではない）である場合にメチル化されていない。
【００５８】
これに対応して、メチル化部位（複数可）又は遺伝子座でのメチル化シトシン対非メチル化シトシンの比は、核酸標的遺伝子領域のメチル化状態を提供することができる。ある実施形態において、メチル化状態又は状況は、メチル化される核酸（例えば、アンプリコン又は遺伝子領域）中のメチル化可能なヌクレオチド（例えば、シトシン）の割合で表されることができる（例えば、約5％、約10％、約15 ％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％または約100％である。すなわち80％を超えるメチル化、20％〜80％の間でのメチル化、または20％未満のメチル化）。核酸は、対照または基準に対してメチル化される、大量のメチル化可能なヌクレオチドを有する核酸を意味する「高メチル化」であってもよい。核酸は、対照または基準に対してメチル化されている、より少ない数のメチル化可能なヌクレオチドを有する核酸を意味する「低メチル化」であってもよい。メチル化状況（status）または状態（state）は、ある実施形態では、CpGアイランド又は領域において決定される。本発明に係るCpGアイランド又は領域標的の例を、表2、5b、5cまたは13および配列番号1〜512に記載する。
【００５９】
本明細書で使用される「特徴的なメチル化状態」は、被験者から得られた試料の遺伝子又は遺伝子群の１つ以上の核酸、核酸標的遺伝子領域のメチル化部位のうち少なくとも一つのメチル化状態を含む固有の即ち特異的なデータセットをいう。例えば、健康な被験者からの参照試料と比較して、前記試料中に前記本発明に係る複数の標的遺伝子のパネルのメチル化状態の結合データにすることができる。
【００６０】
本明細書で用いられるように、「メチル化比」は、分子または遺伝子座がメチル化されていないインスタンスの数に対して、分子または遺伝子座がメチル化されたインスタンスの数をいう。
【００６１】
メチル化比は、個人または単一の個体からの試料の集団を記述するために用いられることができる。
【００６２】
例えば、50％のメチル化比を有するヌクレオチド遺伝子座は、インスタンスの50％がメチル化され、インスタンスの50％がメチル化されていない。このような比率は、例えば、ヌクレオチド遺伝子座又は核酸領域が個体の集団においてメチル化されている程度を記述するために用いられることができる。したがって、核酸分子の第一集団またはプール内のメチル化が、核酸分子の第二集団またはプール内のメチル化と異なっている場合に、第一の集団またはプールのメチル化比は、第二集団又はプールのメチル化比と相違するであろう。このような比率はまた、例えば、ヌクレオチド遺伝子座又は核酸領域が単一の個体においてメチル化されている程度を記述するために、用いられることができる。例えば、このような比率は、組織試料からの細胞の群の核酸標的遺伝子領域がヌクレオチド遺伝子座又はメチル化部位でのメチル化またはメチル化されていない程度を記述するために用いることもできる。
【００６３】
本明細書で用いられるように、「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」は、メチル部分が認識され、典型的なヌクレオチド塩基には存在しないヌクレオチド塩基上にメチル部分が存在しているものをいう。シトシンは、ピリミジン環上のメチル部分を含んでいないが、5−メチルシトシンは、ピリミジン環の5位にメチル部分を含む。この点において、シトシンは、メチル化ヌクレオチドではなく、5−メチルシトシンがメチル化ヌクレオチドである。
【００６４】
本明細書で用いられるように、「メチル化部位」は、インビボで自然発生したイベントにより、又はインビトロで化学的に核酸をメチル化するために制定されたイベントのいずれかによるメチル化を受けやすい核酸、核酸標的遺伝子領域又は遺伝子内のヌクレオチドである。
【００６５】
本明細書で用いられるように、「メチル化核酸分子」は、メチル化されている1つ以上のメチル化ヌクレオチドを含有する核酸分子をいう。
【００６６】
本明細書で用いられるように、「CpGアイランド」は、当技術分野で定義されるように、全ゲノムDNAに対して、より大多数のCpGジヌクレオチドを含有するゲノムDNAのG：C-リッチ領域をいう。本発明に係る標的遺伝子の異なるメチル化は、CpGアイランドだけに限定されるものではないことに留意すべきであるが、いわゆる「ショア（shore）」であってもよいし、CpGアイランド領域の外側に完全に横たわっていてもよく、本明細書でより一般的には「CpG領域」又は「CpGサイト」と称することができる。
【００６７】
本明細書で用いられるように、第二のヌクレオチドに「相補的」な第１のヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、第二のヌクレオチドに対して塩基対が結合する第１のヌクレオチドをいう。相補性の一例は、DNA内のワトソン−クリック塩基対（例えば、Tに対するＡおよびＧに対するC）及びRNA内でのワトソン−クリック塩基対（例えば、Uに対するＡおよびＧに対するC）である。従って、高ストリンジェントな条件下では、例えば、Ｇ、Ａ又はＴに対するＧ塩基対よりも、Ｃに対するＧ塩基対の方が高い親和性を有するので、Ｃが選択されるヌクレオチドであるときは、Ｇは選択されたヌクレオチドに対して双方的なヌクレオチドである。
本明細書で用いられるように、試料のまたは個別の特定の診断または治療結果と、核酸標的遺伝子領域のメチル化状態の変化の間としての用語「相関」は、試料または個人特定の診断または治療との間の識別可能な関係をいう。
【００６８】
本明細書で用いられるように、「被験者」としては、限定はしないが、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫および核酸を有する任意の他の生物またはエンティティが挙げられる。動物のなかでも、被験者としては、ヒトなどの霊長類を含む哺乳類が好ましい。本明細書で用いられるように、「被験者」は、「患者」又は「個体」と交換可能に使用され得る。
【００６９】
本明細書で用いられるように、疾患、疾患の結果又は治療計画の結果と相関ある「メチル化」または「メチル化状態」は、それ以外の個体（例えば、すべての個体の集団）のより大きな集団で発生する核酸標的遺伝子領域またはヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態に対してよりも、既知の疾患、疾患の結果または治療計画の結果を有する被験者において、より頻繁に存在又は不在である、核酸標的遺伝子領域またはヌクレオチド遺伝子座の特異的なメチル化状態をいう。
【００７０】
ここで用いられるように、「試料」は、検出される物質を含む組成物をいい、例えば乳癌を患っているヒト又は他の哺乳動物などの生体供給源から得られる任意の材料を指す「生体試料」を含む。生体試料は、任意の形態を採ることができ、例えば、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、外科用試料、生検または細針吸引液などの固体材料であってもよいし、尿、全血、血漿、または血清等の生物学的流体であってもよいし、あるいは管液、リンパ節流体、腫瘍滲出物又は腫瘍腔液等の被検体によって生成される任意の他の流体試料であってもよい。さらに、試料は、例えば乳房組織を含む採集された組織などの組織または器官の固体試料であってもよい。試料は、パラフィンに埋め込まれたホルマリン固定試料のような病理学的試料を含むことができる。所望であれば、固体材料は、流体と混合してもよく、又は精製された増幅された又は他の方法で処理されてもよい。本明細書に記載の方法を用いた検査試料は、試料中の所望の細胞または核酸の純度を高めるために、一回以上の精製工程で処理することができる。試料はまた、任意の精製工程なしに、本明細書に記載の方法を用いて検査して、所望の細胞または核酸の純度を高める。特に、ここでは、試料は、質量分析に使用されるマトリックスと核酸などのバイオポリマーとの混合物を含む。好ましくは、試料は乳癌生検である、または被験者の全血、血漿または血清である。試料はさらに、切り離された腫瘍細胞又は死んだ腫瘍細胞から放出される遊離核酸を含む組織または体液から得られる試験細胞であってもよい。核酸は、RNA、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、場合によってはタンパク質が関連する（protein−associated）核酸を含む。そのような試験細胞から得られる精製形態または非精製の任意の核酸試料は、本発明の方法で利用することができる。
【００７１】
本発明の方法または使用またはキットで説明される用語「乳癌」は、原則的にダクト、腺又は小葉及び浸潤リンパ液および/または血管を含む乳房関連組織のすべての癌に拡張する。乳癌の具体例としては、例えば、非浸潤性乳管癌（DCIS）、管系の内部に閉じ込められた早期乳癌の型。浸潤性腺管癌（IDC）は、すべての悪性腫瘍の78％を示す乳癌の最も一般的なタイプである。これらの疾病は、マンモグラム上で、星状（星のような）または十分な円状になる（円形の）領域として表われる。星状病変（lesion）は、一般的に予後不良である。髄様癌は、すべての乳癌の種類の15％を占める。これは、40代後半と50代女性で最も頻繁に発生し、脳の延髄（灰白質）に似た細胞を提示する。浸潤性小葉癌（ILC）は、乳房の上部外側の4分円において、微妙な肥厚として通常表示される乳癌タイプである。この乳癌のタイプは、すべての診断の5％を表す。しばしばエストロゲンとプロゲステロン受容体陽性で、これらの腫瘍はホルモン療法によく反応する。管状癌は、すべての乳癌診断の約2％を占め、管状癌細胞は、顕微鏡で観察すると、特徴的な管状構造を有する。典型的には、このタイプの乳癌は、50歳以上の女性に見られる。それは95％が優れた10年生存率を有している。粘液性癌（コロイド）は、すべての乳癌の約1％〜2％を占める。このタイプの乳癌の主な差別化できる特徴は、定義が難しい粘液産生および細胞である。それはまた、ほとんどの場合、良好な予後を有する。炎症性乳癌（IBC）は稀であり、乳房の皮膚でリンパ管がブロックになることを引き起こすという、非常に攻撃的なタイプの乳癌である。この乳癌は、乳房はしばしば腫れ、赤色、又は「炎症している」ように見えるので、「炎症」と呼ばれる。IBC、例えば、米国内のすべての乳癌症例の1％〜5％を占めている。乳癌のサブタイプはさらに、2008年にDesmedtら（Clin. Cancer Res. 14, 5158-5165）及び2008年にWirapatiら（Breast Cancer Res. 10:R65）によって説明されたサブタイプ分類モデルを適用することにより、遺伝子発現に基づいて識別される。
【００７２】
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明される。
【実施例】
【００７３】
〔材料と方法〕
〔乳房組織の選択基準〕
メインの試料セットは、1995年から2003年の間にブリュッセルのJules  Bordet研究所で診断された患者からの１１９個のアーカイブされた凍結乳癌試料で構成されている。これらの試料は、以下の基準に従って選択した。
１：病理学者によって定義される侵襲的な細胞が十分に存在する。病理医の現在の慣行は、与えられた腫瘍試料の代表的なスライドを顕微鏡によって検査し、上皮癌細胞を含有する腫瘍の割合（「面積％」として測定）を推定することである。「90％」の推定値の任意の閾値を下回る試料は、いずれも排除された。これは病理医の現在の慣行であり、多年にわたってきたけれども、この「面積」基準は定量的に正確ではないことに気づくことが重要である;
２：使用可能な高品質DNAの＞2μgの収率；
３：IHCによって決定される4つの主要な「乳癌発現サブタイプ」のバランスがとれた分布；及び
４：各サブタイプ内での再発の有無にかかわらず、バランスがとれた患者の分布。十分な高品質DNAを有する正常な乳房組織の4つの試料は、この主なシリーズのためだけでなく、選択した。
【００７４】
検証試料セットは、2004年から2009年の間にブリュッセルのJules  Bordet研究所で診断された患者からの１１７個の凍結した乳癌試料の構成されている。患者データについては、表1を参照されたい。Jules  Bordet研究所の倫理委員会は、現在の研究プロジェクトを承認した。
【００７５】
表１：患者メインセットの乳房組織試料の特徴
【表１】
2014505475.tif 000003
【００７６】
〔DNAメチル化プロファイリング〕
臨床凍結試料からのゲノムDNAは、供給業者（Qiagen、Hilden、ドイツ）の指示に従って、Qiagen-DNeasy  Blood  &Tissueキットを用いて、２０個の10μm切片から抽出した。これは、55℃で一晩のプロテイナーゼK消化を含む。乳房上皮細胞株とリンパ球試料のゲノムDNAは、推奨プロテイナーゼKおよびRNアーゼ消化を含むQIAamp  DNAミニキット（Qiagen、Hilden、ドイツ）を用いて抽出した。DNAは、NanoDrop（商標）ND-1000紫外可視分光光度計（NanoDropテクノロジーズ、ウィルミントン、DE、USA）を用いて定量した。部位特異的CpGメチル化は、Infinium（商標）HumanMethylation27ビーズアレイベースの手法を用いて解析した。このアレイは、14,000以上の遺伝子から選択された27578 CpG部位を評価するために開発された。ゲノムDNA（1μg）を、Illumina  Infinium（商標）メチル化アッセイを使用する際に推奨される代替インキュベーション条件で、Zymo EZ DNAメチル化KitTM（Zymo研究、オレンジ、USA）を用いて、製造者の手順に従って、亜硫酸水素ナトリウムで処理した。このメチル化アッセイは、Illumina  Infinium（商標）メチル化アッセイマニュアルプロトコルに従って、50 ng/μLで4μL換算のgDNAから行った。ビーズアレイデータの品質は、GenomeStudioTMメチル化モジュールソフトウェアを用いて確認した。すべての試料は、この品質管理に合格した。メチル化生データは、オンラインで入手可能である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=bvonpyugyawqqto&acc=GSE20713)
【００７７】
〔遺伝子発現プロファイル〕
メインセットならびに細胞株およびex vivoでの試料の腫瘍に対して、RNAは、メーカーの説明書に従って、トリゾール法（Invitrogen社）またはTripure法（Roche）により単離され、RNeasyミニカラム（Qiagen）で精製した。各腫瘍試料から得られたRNAの品質は、バイオアナライザー（Agilent社製）により生成されたRNAプロファイルに基づいて評価した。トータルRNA（100 ng）が、最初に逆転写され、二本鎖cDNAになった。このcDNAは、in vitroで転写された。aRNAの精製後、アフィメトリクスHG133プラス2.0のGeneChipにハイブリダイゼーションする前に、12.5μgを断片化し、標識した。メインセットの臨床試料のうち、DNAメチル化のために最初にプロファイルされた３０個（thirthy）は、腫瘍細胞の含有率が低い（＜70％の腫瘍細胞、ｎ=11）、試料中に腫瘍が全く残っていない（ｎ=4）、低品質のRNA（n=13）、または低RNA量（ｎ=2）という理由で遺伝子発現プロファイリングを行わなかった。また、CD4 +リンパ球クローンR12C9は、RNA量が低いので、遺伝子発現プロファイリングをしなかった。マイクロアレイデータの品質は、R統計ソフトウェアの「yaqcaffy」パッケージ（http://www.r-project.org/）を用いて調べた。結果に基づいて、２つの試料を、さらなる解析から除外した。遺伝子発現の生データは、オンラインで入手可能（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=bvonpyugyawqqto&acc=GSE20713）。
【００７８】
〔リンパ球浸潤の病理組織学的解析〕
腫瘍間質および腫瘍内の双方のリンパ球浸潤を評価するために、腫瘍の組織病理学的解析を、先に説明したように、ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片について実施した（Denkert, C.ら、2010年、J. CLIN. Oncol. 28, 105-113）。
【００７９】
〔乳房上皮細胞とリンパ系細胞株の培養〕
MCF10A細胞は、DMEM/F12（1:1）培地（Gibco社）で培養した；MCF-7、SKBR3及びMDA-MB-231は、DMEM培地（Gibco社）中で培養した；T47D、ZR-75-1及びMDA-MB-361はRPMI培地（Gibco社）中で培養した；BT20はMEM培地（Gibco社）中で培養した。すべての乳房上皮細胞株について、培地は、10％ウシ胎児血清（Gibco）を補充した。リンパクローンCD4 + R12C9とCD8 + WEIS3E5が、10％ヒト血清HS54、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-グルタミン、２−メルカプトエタノール及びメチルトリプロパン、及び10ng／mLのIL-7、50U／mLのIL-2が補充されたIsocove Dubelcco培地中で保存された。
【００８０】
〔ex vivoリンパ球の単離〕
ヘモクロマトーシスの患者からの血液の単核細胞を、リンホプレップ（Axis−Shield  PoCAS、オスロ、ノルウェー）を用いた密度勾配遠心分離で分離し、2mMのEDTAを含むコールドリン酸緩衝生理食塩水で広範囲に洗浄され、血小板を除去した。CD3＋およびCD20＋細胞は、AUTOMACS磁気ソーター（Milternyi）内で、CD3アイソレーションキットまたはCD20アイソレーションキット（Milternyi  Biotec、Bergisch  Gladbach、ドイツ）を使用した磁気ビーズを用いて、メーカーの指示に従って精製された。細胞純度は、標準的なフローサイトメトリーで決定されたように、CD3＋細胞及びCD20＋細胞について、それぞれ、99％および92％よりも高かった。
【００８１】
〔教師なしのクラスタリング（unsupervised  clustering）〕
最初のステップでは、学習データが全くないアプローチとして、すべての試料の間で最もバリアントである10％のCpGに基づいて、メインセットの123個の乳房組織すべて（１１９個のIDCおよび4個の正常な乳房組織）について、階層的なクラスタリングを行った。これは、検証セットのすべての試料についても行われた。どちらの場合も、正常試料は、単一のクラスター内で、乳癌試料から区別できた。第二工程では、IDCと正常組織との間で差異あるようにメチル化されているCpGが減少しているリストに基づいて、メインセットの１１９個のIDCについてだけ、階層クラスタリングを行った。IDCと正常試料との間で差異あるようにメチル化されていると識別された6,309のCpGのうち、正常な乳房試料と比べて、少なくとも30％のＩＤＣにおいて、20％のメチル化差異を示すCpGを選択した。この選択は、我々のデータセット内で潜在的に有益な相違を有するCpGの合理的な数（2,985）であり、良好な安定性を示すクラスターが得られた。完全なリンケージと距離相関を、クラスタリングアレイとCpGのために用いた。クラスタリングの安定性は、CRAN（http://cran.r-project.org/web/packages/pvclust/）上で利用可能な「pvclust」Rパッケージ（Suzuki R. & Shimodaira, H. 2006年、バイオインフォマティクス22、1540-1542）で推定された。階層的クラスタリングの不確実性は、0から1の範囲のブートストラップ安定確率により測定された。ここで、０は安定性に乏しく、１は安定性が非常に高いことを示す。クラスターのブートストラップ確率値は、それがブートストラップ複製において現れるらしい頻度である。これらの安定性の値は、クラスターが、データによってどれほど強くサポートされているかを定量化している。本発明で定義された６つのメチル化クラスターを選択するために用いられる基準は、（i）安定性確率の最小値0.75と（ii）試料の最小数である８であった。
【００８２】
〔モジュール／シグナチャースコア〕
モジュール／シグナチャースコアの計算は、Desmedtらによる2008年（Clin. Cancer Res. 14, 5158-5165）とWirapatiら、2008年（Breast. Cancer Res. 10:R65）で説明されている。簡単に説明すると、Rsで示されるシグナチャースコアは、対応するシグナチャーのすべての遺伝子発現の重みづけされた組み合わせとして定義された：
【数１】
2014505475.tif 000004
式中、Qはシグナチャーにおける遺伝子セットであり、nQはQの遺伝子の数であり、Xiは遺伝子ｉの発現であり、Ｗiはオリジナルの研究で出版された統計/係数のサインに依存する−１又は＋１のいずれかである。「ESR1陽性」と「ESR1陰性」の２つに分類された特定のケースでは、Ｗiは常に＋1に等しい。DNAメチル化データに対して、シグナチャースコアは、追加のマッピング処理を伴う遺伝子発現データと同様にして計算された。各CpGのプローブはEntrez遺伝子IDを介して対応する遺伝子にマッピングされた。各シグナチャースコアは、2.5％と97.5％がそれぞれ−１と＋１に匹敵するようにスケーリングされた。このスケーリングは、外れ値に対してロバストであり、シグナチャースコアがおおよそ[−１，＋１]区間内に置くことを確実にして、異なるマイクロアレイ技術と正規化に基づいて、データセットを比較した。
【００８３】
〔乳癌「発現サブタイプ」の決定〕
「乳癌発現サブタイプ」を決定するために、二つのアプローチを使用した。まず、IHC決定に基づいて、Basal−like腫瘍を、ER受容体陰性且つHER2受容体陰性で組織学的グレード3と定義し、HER2腫瘍はHER2受容体を過剰発現すると定義し、Luminal腫瘍はER陽性であってHER2陰性と定義した。この最後のグループは、LuminalＡ腫瘍とLuminalＢ腫瘍に分けられ、それぞれ組織学的グレード１の腫瘍とグレード３の腫瘍に対応する。第二に、サブタイプは、Desmedt著ら2008年（Clin. Cancer Res. 14, 5158−5165）及びWirapatiら、2008年（Brest Cancer Res. 10:R65）で説明されたサブタイプ分類モデルを適用することによって、遺伝子発現に基づいて同定された。唯一の違いは、完全なESR1、ERBB2及びAURKAモジュールの代わりに、それぞれ、単一プローブ「205225_at」、「216836_s_at」及び「208079_s_at」を用いたことにある。この簡略化されたバージョンのサブタイプ分類モデルは、クラスタリングモデルにおける遺伝子の数を減らしても、このモデルがアフィメトリクスデータセットに適用するときに優れた性能を示したので、選択された（データは示さず）。「genefu」Rパッケージを使用し、これは、CRAN（http://cran.r-project.org/web/packages/genefu/）上で利用可能である。
【００８４】
〔86のCpG-分類子（classifier）の確立〕
独立的に結果を確認するために、1つのデータセットから別のデータセットへクラス発見結果を転送し、最近隣重心分類法（Sφrlie, T.ら、2003年、Proc. Natll Acad. Sci. 米国100, 8418-8423; Lusa, L.ら、2007年J. Natl Cancer Inst. 99, 1715-1723）を、検証セットの新しい試料を6つのクラスターのいずれかに割り当てるために用いた。この方法は、新しい試料のDNAメチル化プロファイルと先に同定されたクラスターのDNAメチル化プロファイルとの類似性に基づいている。重心は、メインセット内の元の階層的クラスタリングでのそのクラスターに割り当てられたすべての試料のメジアンメチル化値を含むベクトルとして定義した。新しい各試料について、スピアマンの順位相関を、そのメチル化データと6つの重心との間で算出した。予測されたクラスターは、最も高い相関値を有するカテゴリーとして定義した。分類子を訓練するために、6つの最も堅牢なクラスターのいずれにも属さない、メインセット内の患者は除外した。Kruskal−Wallisの非パラメトリック検定が、6つのクラスター間で異なったメチル化CpGの検出に用いた。
ランク付けされたCpGリストは、Kruskal−Wallis検定統計値に従って構築した。最近隣重心分類子に用いられるCpGの最小数を見つけるために、異なる分類子は、このリストから作成され、元のクラスタリングに比べて、メインセットから正しく分類された試料の割合を算出した。我々は、このリストから、６つのクラスター間で最も差異あるようにメチル化されたCpGのトップ5のCpGを用いて、分類を開始し、このリストから、合計1519（FDR調整p値が0となる数）となるまで、一つずつ追加のCpGを追加した。最後に、正しい分類の割合の最大値（96.38パーセント）を得たCpGの最小数は、86であった（図3n及び表2参照）。最後に、得られた86のCpG分類子は、6つのクラスターのいずれかに、新しい患者を分類する検証データセットに適用した。
【００８５】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
2014505475.tif 000008
【００８６】
〔再発なしの生存解析〕
公開されている入手可能な遺伝子発現データについてメタ解析を行うために、メチル化と発現状態の間に高い反相関（ピアソン係数が−７未満）を示す遺伝子だけが、患者のメインセットにおいて、選択された。この基準にあう８５個の遺伝子のうち、いくつかは除外された。マイクロアレイプラットフォームで表されない（9）という理由で、あるいはこれらの遺伝子の情報が以下の700人以下の患者のために利用可能であった（15）という理由のためである。６つの他の遺伝子は、このメタ解析から除外した。これらは、正常な乳房試料と我々の集団のIDCとの間で差異あるメチル化を表わさなかったためである。個々のCpGまたは遺伝子のこの予後値は、単変量Cox回帰により推定した。多変量Cox回帰は、従来の臨床的変数の存在下で、CpGや目的遺伝子の独立した予後値をテストするために使用した。Coxモデルは、CRAN（http://cran.r-project.org/web/packages/survival）上で利用可能な「survival」Rパッケージ内で実行されるように、データセットによって階層化し、患者の選択やその他の潜在的な交絡因子における可能な異質性を考慮した。個々のハザード比の有意性はWald検定により評価した。単変量解析では、p値が偽発見率（FDR）により複数のテストのために修正され、0.1より低いFDRを持つ変数は、予後と考えられた。
【００８７】
〔CpG位置に関するInfiniumアレイの注釈〕
Infiniumアレイの追加の注釈は、CpG位置の（i）対CGI（CGI内のCpG、CpGアイランドのショア、他のCpG）および（ii）対プロモータークラス（高CpG密度、中CpG密度、又は低CpG密度のプロモーター）に関して、llluminaから提供されたものに追加される。
【００８８】
・CGI対CpG位置
CpGは、CpGアイランドに比例したCpGの位置に応じて分類された（例えば、CGI内のCpG、CpGアイランドショア、又は他のCpG）。二つの分類が確立され、これはCGI定義の関数の中で用いた：UCSC定義（CpG_lsland_UCSC分類）またはBockら、2007年PLoSのComput．Biol．３、1055−1070（CpG_lsland_Revisited分類）。CGI周囲の2ｋｂ内の領域に位置するならば、CpGはCpGアイランドのショアとして考えられた（Irizarryらによって定義されている、2009年Nat. Genet. 41, 178-186）。CGIにもCGI周囲の2ｋｂ領域にも位置しないCpGは、他のCpGとして考えられた。すべての解析のためにBockらにより改訂された分類。
【００８９】
・CpGの位置対プロモーターのクラス
Infiniumアレイ上に表されるプロモーターは、Weberら、2007年（Nat. Genet. 39, 457-466）によって定義されるように、CpG含有量を用いて分類した。まず、転写開始部位（TSS）を取り囲む−700〜＋500bpの領域は、UCSCゲノムブラウザデータ（Rheadら、2010年、Nucleic Acids Res. 38, D613-619）を用いて抽出した。その後、それらのプロモーター断片に対応するDNA配列を使用して、CpG比及びGC含量が、５bpのオフセットを有する500塩基対のスライディングウィンドウを算出した。最終的に、Weberら、2007年に提示された定義にしたがって、少なくとも500bpのウィンドウがCpGの比＞0.75及びGC含量＞0.55が見いだされた場合には、プロモーターがHCPS（高−CpG密度プロモーター）として分類された。500bpのウィンドウが0.48のCpG比に到達していない場合にはLCP（低−CpG密度プロモーター）として分類し、その他はICP（中−CpG密度プロモーター）と分類した。
【００９０】
〔メチル化差異の基準〕
いくつかの兆候は、メチル化差異の基準として20％を選択するように、私たちを導いた。まず最初に、Infiniumアッセイが、メチル化されていないCpGのために０〜０．２の範囲の値を与えるように思われた。第二に、最近の研究では、遺伝子座の90％以上に対して、メチル化の差異検出の感度が0.2であることを示していた（Bibikova, M.ら、2009年Epigenomics 1, 177-200）。
【００９１】
〔患者のメインセット中のクラス比較解析〕
両面マンホイットニー検定（Wilcoxon−Mann−Whitney検定とも称される）は、2つの定義されたグループのデータ内のメチル化の値の等価性の０(null)仮説（H０）の仮定をテストするために採用した。複数のテストによって誘導されるパワーの損失が、偽発見率（FDR）アプローチ（Benjamini, Y. & Hochberg, Y. 1995年、J R Stat Soc Series B 57, 289-300）で修正された。通常の試料については、我々は、小さな試料サイズと低分散のために、メチル化値の平均を考慮した。腫瘍試料について、より高い不均一性のために、我々は、極端な値の影響を受けにくい中央値を検討した。
【００９２】
・IDCと正常な乳房組織試料間の比較
特定のCpGが、正常な乳房組織試料と比較して、IDCにおける高メチル化又は低メチル化を、以下の２つの基準に従って考慮した。1：CpGは、正常な乳房組織試料と比較して、IDCにおいて少なくとも20％のメチル化の相違を示さなければならない。２：高メチル化と考えられ、CpGは、乳癌における低メチル化イベントよりも少なくとも10倍以上の高メチル化イベントを示さなければならない。逆に、低メチル化と考えられるのは、乳癌におけるメチル化イベントよりも少なくとも10倍以上の低メチル化イベントを、示さなければならなかった。
【００９３】
・2つの主クラスター（クラスターI、II）間の比較
クラスターＩとIIとの間でのCpGの差異あるメチル化は、以下の二つの基準に従って決定した。
１：二つのグループ間で少なくとも20％のメチル化差異を示す；
２：関係するCpGに対してFDR補正されたWilcoxonのp値は、0.1よりも低くなる。
【００９４】
・各メチル化サブクラスターと正常な乳房組織試料間の比較
所与のメチル化サブクラスターが正常な乳房組織試料に対して差異あるメチル化を示していると判定するための基準は、以下のとおりであった。
１：関係しているCpGは、2つのグループ間で少なくとも20％のメチル化差異を示さなければならない。
２：関係しているCpGのためのWilcoxonのp値は、0.1よりも低くなる。
ここでは、各グループを構成する試料が少数なので、上述のFDR基準を使用しなかった。
【００９５】
〔亜硫酸水素塩ゲノムシークエンシング〕
4つのCpG部位のメチル化状態−cg07471052、cg11566244、cg22498251及びcg09847584は、それぞれCDK3、GSTP1、TWIST1及びRIMBP2遺伝子の転写開始部位の近くに配置され、1つの正常試料（N1）と3個の乳癌試料（BC10、BC32とBC109）に適用された亜硫酸水素塩ゲノム配列決定により調べた。プライマーは手動で設計した。その配列を表3に示す。PCR増幅断片をQIAquick（商標）ゲル抽出キット（Qiagen）により精製し、pCR（商標）ll−TOPO（商標）ベクター（Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA）内にクローン化され、コンピテント大腸菌TOP10細胞を形質転換するのに用いた。クローンは、青/白コロニースクリーニングによって選択され、増幅された。プラスミドをQiagen-Miniprepキット（Qiagen）で精製した。PCR産物は、Genoscreen（Lille、フランス）によって配列決定され、CpGメチル化状態は、Bockら、2005年（Bioinformatics21、4067-4068）に記載されているBIQ Analyzerソフトウェアを用いて解析された。
【００９６】
表３：亜硫酸水素塩ゲノムシークエンシングで用いたプライマー（代表配列番号513-529）
【表３】
2014505475.tif 000009
【００９７】
〔亜硫酸水素塩パイロシーケンシング〕
750 ngのゲノムDNAは、亜硫酸メチル化プロファイリングのために、EZ  DNAメチル化（商標）キット（Zymo  Research）を用いて亜硫酸水素変換された。変換されたＤＮＡの3分の1を、後続の各PCRのための鋳型として用いた。配列決定のための十分量のPCR産物を確保するために、Nested  ＰＣＲシーケンシングを行った。プレ増幅のためのプライマー（EF、ERプライマー）を、手動または「BiSearch  Primer  Design  and  Search  Tool」（http://bisearch.enzim.hu）を用いて設計し、Generunnerソフトウェア（バージョン3.05、Hastings  Software社）を用いて、オリゴマーやヘアピンループなどを形成する傾向をチェックした。ネスト増幅および配列決定のためのプライマーは、手動又はPyroMark（商標）アッセイデザイン2.0ソフトウェア（Qiagen）を用いて設計した。3mMのMgCl2、1ｍMの各dNTP、12％（v／v）のDMSO、500nMの各プライマー（EF＋ERプライマー、表4を参照）および任意の500mMのベタインを用いて、次の条件（95℃で3時間と〔95℃で3時間；51℃で40分間；72℃で1時間30分〕を２５サイクル；72℃で5時間）下で熱蓋された（heated−lid）サーモサイクラー中で、プレ増幅PCRを行った。プレ増幅PCRの2％（v/ v）を鋳型として用いて、HotStarTaq PCRキット（Qiagen）で、次の条件下（95℃で15時間；〔94℃で３０分間；55℃で３０分間、72℃で３０分間〕を４５サイクル;72℃で１０時間）で、NestedＰＣＲ（F, RBioプライマー）を行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で評価し、PCR産物（Sプライマー）のパイロシーケンシングは、Pyromark（商標）Q24システム（Qiagen）を用いて行った。
【００９８】
表４：亜硫酸水素塩パイロシーケンシングで用いたプライマー（各配列番号530〜575）
【表４】
2014505475.tif 000010
【００９９】
〔遺伝子セット濃縮解析（GSEA）〕
GSEAは、与えられた遺伝子セットのメンバーが、2つの試料グループ間で最も差異があるように発現した遺伝子中で大幅に濃縮されているかどうかを調べるために、最初に開発された強力な解析方法である（Mootha, V. K.ら、2003年Nat. Genet. 34, 267-273）。ここでは、この方法は、メチル化及び発現データに双方に適用されて、ER生態がDNAメチル化によって調節される可能性を評価した。このためには、ESR1遺伝子モジュールがクラスターII（「ER-陽性腫瘍」）よりも、クラスターI（「ER-陰性腫瘍」）において、より高くメチル化されていると仮定された。この解析のために、Desmedt著ら2008年（Clin. Cancer Res. 14, 5158-5165）によって説明されたESR1モジュールは、2つのサブモジュールに分割しなければならなかった。すなわち、発現がESR発現と正に相関するすべてのESR1モジュール遺伝子をすべて含むESR1陽性モジュールと；発現が、ESR1発現と負の相関するすべてのESR1モジュール遺伝子をすべて含むESR1陰性モジュールに分割しなければならなかった。ビーズアレイ上で表される14,475の遺伝子のすべてが、クラスターIIに関してクラスターIにおいて、最も高メチル化から最も低メチル化までランク付けした。シグナル対ノイズ比（二つのクラスの標準偏差の和で割った二つのクラスの平均の差）がランク付けを実行するために使用された。遺伝子はビーズアレイ上のいくつかのプローブで表わされるとき、最もバリアントなものが、この解析のために選択された。Affimetrixアレイ上に表された20606個の遺伝子は、同様の方法に従ってランク付けした。このGSEA解析の目的は、ESR1モジュール遺伝子がランク一覧全体にランダムに分布されている（2つのクラスターのいずれかでこれらの遺伝子セットの濃縮を示唆していない）あるいは主に上部または下部で見出される（2つのクラスターのいずれかでこれらの遺伝子セットの濃縮を示唆している）かどうかを決定することであった。濃縮スコアに対応する実行中の合計統計は、メンバーでないものに対して、調査した遺伝子セットのメンバーのランクに基づいて各遺伝子セットについて計算した。そのような濃縮の意義は、偽発見率（FDR）アプローチにより複数の試験について補正された、順列ベース（permutation−based）のp値を計算することによって推定した。この解析は、Broad研究所（http://www.broadinstitute.org/gsea/）によって提供されるフリーアクセス可能なソフトウェアGSEA-Pを用いて行った。このGSEA技術は、Subramanianら、2005年（Proc. Natl Acad. Sci. 米国102, 15545-15550）で詳細に記載されている。
【０１００】
〔メチル化と発現データの相関関係〕
患者のメインセットにおけるメチル化と発現データとの相関を、各Infiniumメチル化プローブと、関連の遺伝子用の最もバリアントなAffimetrix発現プローブとの間でのピアソン相関試験により評価した。20％よりも低い範囲の値を提示するInfiniumメチル化プローブは、この解析から除外した。範囲は、各プローブの最大のものから最小のメチル化値を減算することにより算出した。
【０１０１】
〔遺伝子オントロジー解析〕
遺伝子オントロジー解析はDAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）を用いて行った。これは、遺伝子の大きなリスト（Huang, D. W.ら、2009年 Nat. Protoc. 4, 44-57）の生物学的意味を理解するための機能的な注釈ツールの包括的なセットを提供するWebアクセス可能なプログラムである。各サブクラスターと正常な乳房試料との間での差異あるメチル化された遺伝子と、メチル化と発現状態との間で許容される反相関（ピアソン係数が−0.4より低い）だけが、この解析のために選択された。このことは、遺伝子の発現がメチル化の変化に影響され、結果の生物学的解釈を容易にする遺伝子の選択を確実にした。
【０１０２】
〔公的に入手可能な遺伝子発現データセットの収集〕
遺伝子発現データセットは、公共データベースや著者のウェブサイトから取得した。我々は、正規化されたデータ（シングルチャネルプラットフォームにおけるLog2強度又はデュアルチャネルプラットフォームにおけるLog2比率）を用いた。ハイブリダイゼーションプローブは、RefSeqとEntrezのデータベース（バージョン2007.01 0.21）を用いて、described33としてEntrezのGenelDにマッピングされた。複数のプローブが同じGenelDにマッピングされたとき、特定のデータセットで最も高い分散を有するものが選択された。１０個の乳癌マイクロアレイデータセットを使用した。遠隔転移がない生存（DMFS）は、生存エンドポイントとして使用された。（Desmedt, C.ら、2008年Clin. Caner Res. 14, 5158-516517,34; Haibe-Kains, Bら、2008年Bioinformatics 24, 2200-2208で）説明されているように、異なる研究間で比較可能な追跡をできるように、１０年間での生存データを検閲した。
【０１０３】
〔5−アザ−2'−デオキシシチジンと乳癌上皮細胞株の治療〕
乳癌上皮細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361、T47D、SKBR3、BT20及びZR-75-1が、1μΜの5−アザ−2'−デオキシシチジン（Sigma）を用いて、4日間処理した。薬剤を含有する培地は、毎日リフレッシュされた。
【０１０４】
〔追加の統計解析〕
スピアマンの相関は、Infiniumデータを、亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング又はパイロシーケンシングデータと比較するために用いた。Mann−WhitneyU検定及びKruskal−Wallis検定を、それぞれ二つ又は複数のサブグループ間で連続可変の差異のために、試験に用いた。カイ二乗検定を用いて離散的な変数を比較し、p値は、見込み比又はフィッシャーの正確確率検定（バイナリ変数の比較用）により推定した。ファイ係数は、乳癌の「既知の発現サブタイプ」と我々のDNAメチル化ベースのクラスターとの間の関連の強さを決定するために使用された。値は0〜1の範囲にあり、スピアマンの順位相関係数と同様の方法で解釈することができる。このような関連付けの重要性はカイ二乗検定を用いて計算した。
【０１０５】
実施例1：凍結乳房組織試料の2つの独立したセットのDNAメチル化プロファイリングのInfiniumメチル化解析プラットフォーム解析。
123個の試料の「メインセット」（４個の正常腫瘍及び119個の浸潤性乳管癌、（IDC））および125の試料の「検証セット」（８個の正常と117個のIDC）（図1Ａ：補足表S1、S2及びS15参照）は、Infinium（商標）メチル化プラットフォームを用いて解析した。ハイスループットのInfinium技術は、メチル化特異的DNAオリゴマー上で亜硫酸水素変換されたgDNAのハイブリダイゼーションに基づき、14475コンセンサスコード配列とよく知られている癌遺伝子（Bibikova, M.ら、2009年Epigenomics 1, 177-200）のプロモーター領域内（好ましくはCpGアイランド内）に位置27578のCpG部位でのメチル化レベルの定量化を可能にした。
乳房組織のメインセットに適用した場合、この方法は、正常試料とIDC間で差異あるメチル化を示す6,309のCpGを明らかにした。これらのデータの検証を、表５及び図１Ｂ，Ｃに示す。CpGアイランド（CGI）に対するCpG位置の点で、高メチル化CpGがCGIの内側にほとんど位置する一方、低メチル化CpGは主にCGIの外側に位置することを、我々は見出した（図1Ａ、左側部分）。アレイ上で提示される第４のCpGアイランドショア以上が、正常試料とＩＤＣの間で差異あるメチル化を表し、先のIrizaryの業績（R.A.ら、2009年Nat. Genet. 41, 178-186）と一致して、癌においてCpGアイランドショアの差異あるメチル化が重要な役割を果たすことを示唆した。さらに、高CpG密度プロモーター（HCP）1をよく説明した差異あるメチル化に加えて、中CpG密度プロモーターと低CpG密度プロモーター（それぞれICP及びLCP）（図1Ａ、右側部分）で、さらにはっきりとメチル化が変化していることを見出した。特に、ICP（弱いHCPとも称される）は、de novo DNAメチル化の影響を非常に受けやすいように見え（図1Ａ、右側部分）、以前の研究と一致している（Weber, M.ら、2007年Nat. Genet. 39, 457-466）。
【０１０６】
表５：このInfinium研究と以前に報告されたデータとの相関により提供される代表的なCpGのメチル化の頻度。
MSP：メチル化特異的PCR；
BPS：亜硫酸水素塩パイロシークエンシング；
MS-HRM：メチル化感受性高解像度融解；
MSP：メチル化特異的PCR；
BPS：亜硫酸水素パイロシーケンシング；
MS-HRM：メチル化感受性高解像度融解。
【表５】
2014505475.tif 000011
△：陽性と同定された各腫瘍は、正常試料の平均メチル化と比べて、指示されたＣｐＧサイトの少なくとも２０％高メチル化を示す。
○：ＭＳＰデータとして、ＰＣＲプライマーの遺伝子座と、Infinium技術によって調査されたＣｐＧの遺伝子座が異なることによる不一致を避けるために、ＭＳＰ解析で用いられたプライマー配列に含まれるＣｐＧのみを選択した。
＊：全ての参照論文はコード鎖のメチル化をチェックし、メチル化は２つの鎖間で対称であるとする仮定に基づく。
【０１０７】
実施例2：生物学的および臨床的関連性があるかもしれないDNAメチル化プロファイルの確立。
教師なしの階層的クラスター解析を、正常試料とIDC（これらのうちの2,985）の差異あるメチル化を示すCpGの縮小リストを用いて、メインセットの119個のIDCについて行った。主たる２つのクラスター（IとII）は、クラスターメンバーシップと腫瘍グレード及びエストロゲン受容体（ER）の状態の双方との間で有意な相関関係を有するように現れた（図2）。クラスターIおよびIIは、それぞれ、ER陰性腫瘍及びER陽性腫瘍で濃縮された。重要なことは、遺伝子発現研究が、ER及びHER2のような臨床的なバイオマーカーは、氷山の一角にすぎないことを明らかにした。この現実は、遺伝子共発現モジュールとともにとりこまれることができる。すなわち、異なる生物学的プロセスに関係し、高い相関発現を示している遺伝子の包括的なリストを取り込むことができる。最も区別明確な共発現モジュールの１つは、ESR1モジュール（Desmedt, C.ら、2008年 Clin. Cancer Res. 14, 5158-5165）である。これは、ERpathway遺伝子だけでなく、ER-陰性腫瘍からER陽性腫瘍を区別する他の生物学的プロセスに関与する遺伝子も含む。したがって、我々は、ESR1遺伝子がエピジェネティックなレベルでどの程度まで調節され得るかということを調べた。先に説明したESR1モジュールを2つのサブモジュールに分割した。２つのサブモジュールである、「ESR1陽性」モジュールと「ESR1陰性」モジュールは、それぞれESR1の発現と正または負の相関関係にある遺伝子を含んでいる（表5b及び5cを参照）。遺伝子セット濃縮解析（Gene  Set  Enrichment  Analysis）に由来する四角プロット及びバーコードプロットに示されるように、ESR1陽性モジュール遺伝子はクラスターIIにおいてよりも、クラスターＩにおいて、より高いメチル化レベルを示した（Mann−Whitney検定：ｐ＜0.001、図２C、D参照）。反対に、ESR1陰性モジュール遺伝子は、クラスターＩにおいてよりも、クラスターIIにおいて、顕著により高いメチル化レベルを示した（Mann−Whitney検定：ｐ＜0.001、図２B、C参照）。遺伝子発現マイクロアレイ解析は、これらの遺伝子のDNAメチル化レベルとその対応する遺伝子の発現レベルとの間に有意な反相関であることを明らかにした（図２B、C）。全体的に、上記の結果は印象的である：これらは、はじめに、ER生物学をはるかに超えるプロセスに関与し、その発現状況がER陰性腫瘍からER陽性腫瘍を区別できる遺伝子の全体のセットが、エピジェネティックに調節されることを提案している。図2Dに、臨床パラメータが、上記で同定されたメチル化ベースのクラスタリングにリンクされ、ER陽性腫瘍がクラスターIIで優勢であったことを示している。一方で、クラスターＩは、適度に大きい数のHER2陽性腫瘍を含んでいるように見えた。グレード1の腫瘍は、クラスターIIに分類された。腫瘍サイズ、リンパ節の状態、または年齢と有意な関連は見出されなかった。
【０１０８】
表５ｂ：ＥＳＲ１陽性モジュールのＣｐＧアイランド
【表５ｂ−１】
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【表５ｂ−２】
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【表５ｂ−３】
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【表５ｂ−４】
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【表５ｂ−５】
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【表５ｂ−６】
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【表５ｂ−７】
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【表５ｂ−８】
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【表５ｂ−９】
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【０１０９】
表５ｃ：ＥＳＲ１陰性モジュールのＣｐＧアイランド
【表５ｃ−１】
2014505475.tif 000021
【表５ｃ−２】
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【表５ｃ−３】
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【表５ｃ−４】
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【表５ｃ−５】
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【表５ｃ−６】
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【表５ｃ−７】
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【０１１０】
実施例3：腫瘍セットのメチル化に基づく分類の洗練化
図３Ａに示すように、再発性のメチル化パターンの教師なしの解析により、６つの異なるエンティティ（クラスター1〜6）を得た。これらのメチル化クラスターは、次に、既知の乳癌「発現サブタイプ」と比較した。現在、遺伝子発現プロファイルに基づいて、4つのサブタイプが識別されている：Basal−like乳癌（たいていはER陰性およびHER2陰性に相当）、HER2アンプリコンのいくつかの遺伝子の発現増加によって特徴付けられるHER2陽性癌、２つのLuminal−likeサブタイプとして低グレードのLuminalＡと高グレードのLuminalＢ（これらは支配的なER陽性である）（Sotiriou, C. & Piccart, M. J. 2007年Nat. Rev. Cancer 7, 545-553）。IHCおよび遺伝子発現プロファイリング（図３Ａおよび表6）は、クラスター2においてはHER2過剰発現、クラスター3においてはBasal−like腫瘍、及びクラスター６におけるLuminalＡ腫瘍が顕著に圧倒的多数である。興味深いことに、単一の「発現サブタイプ」は、メチル化クラスター１、４、および５において支配するようには見えない。クラスター１は、HER2、Basal−like腫瘍と同様にLuminalＢ腫瘍も含んでいて、クラスター4はHER2とLuminalB腫瘍の混合物であるように見えた。そして、クラスター5はLuminalＡ及びBの双方の腫瘍を含んでいた（図３Ａ）。図３Ｆにおいて、臨床パラメータとの相関を示した。クラスター５及び６が、排他的にER陽性腫瘍を含むのに対して、クラスター３はER陰性腫瘍で主に構成されていた。HER2陽性腫瘍は、クラスター１および２で優勢だった。クラスター6は、主としてグレード1の腫瘍を含んでいた。腫瘍の大きさや年齢との有意な関連は認められなかった。
【０１１１】
【表６】
2014505475.tif 000028
表６：患者のメインセットで同定された６つのメチル化クラスターと「既知の発現サブタイプ」との間の関連。上側の表は、フィッシャーの正確確率検定によって与えられたｐ値を示しており、免疫化学（IHC）および括弧内のファイ（Phi）値により決定された各「既知の発現サブタイプ」と各メチル化グループとの間の関連を評価している。下側の表は、カイ二乗検定で提供された見込み比ｐ値を示し、遺伝子発現（GE）と同様に括弧内のPhi値によって決定される各「既知の発現タイプ」と各メチル化グループとの関連を評価している。
【０１１２】
これらの6つのメチル化クラスターを評価するために、Infiniumメチル化アッセイを、１１７個の乳房腫瘍に適用し、効率的な最近隣重心分類法（Sφrlie, T.ら、2003年Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 8418-8423; Lusa, L.ら、2007年J. Natl Cancer Inst. 99, 1715-1723）が、DNAメチル化プロファイルの類似性に基づいて、新しい各試料を６クラスターの１つに割り当てるために使用された。メインセットに最初にフォーカスし、８６個のキーCpGからなる86CpG−分類が設立された。これは、教師なしの解析に基づく６つのクラスターを検索することを要求する最小数のCpGである（図3Ｂ、3Ｃ、表２参照）。この86CpGのリストから、我々は、6つのメチル化グループごとに6重心（すなわち、86個のCpGのそれぞれの中央のメチル化値から成るプロファイル）を計算した。そして、計算された各重心を有する６つの検証セットの各腫瘍のスピアマン相関を計算することにより、新しい各試料を６つのメチル化クラスターのいずれかに分類した（補足図3c(図３Ｄ)）。著しく本質的に、検証セットのすべての腫瘍は、６つのメチル化グループの１つと強い相関を示した（図３Ｄおよび図３Ｅ）。また、独立した検証セットで実行されたIHCは、メインセットの場合として、６つのグループの各々に対して非常に類似した「発現サブタイプ組成物」を示した（図３Ｄ、図３Ｆ、表7）。８６CpG−分類は、乳癌に関与するとしてよく知られている遺伝子に関係しているCpG、例えば、エストロゲン誘導遺伝子（TFF1）、サイクリンD1（CCND1）、分泌されたfrizzled関連タンパク質2（SFRP2）、カスパーゼ1（CASP1）、POUクラス4ホメオボックス1（POU4F1）およびインターロイキン1、アルファおよびベータ（IL1AとIL1B）（完全なリストについては、表2を参照）などを含むことに注目すべきである。この分類は、ＬＣＰと同様にICPに位置する大多数のCpGを含むことに留意すべきである。まとめると、これらの結果は、現在知られている「発現サブタイプ」を越える乳癌グループの存在を明らかにし、改善された腫瘍分類の基礎を提供することを示唆している。さらに、これらの観察結果は、ここで区別されているメチル化パターンが研究された腫瘍の起源の細胞タイプを反映することを示唆している（図3Ｈ参照）。クラスター３は、最も高いLuminal前駆体のシグナチャースコアを表示する（クラスター2及び4についてはｐ＝0.001；他のクラスターについてはp＜0.001；ｂ）一方、Luminal成熟体のシグナチャースコアは、クラスター1、4、5及び6について、より高かった（クラスター２に対してクラスター４がｐ=0.019であることを除いて、クラスター２、３についてはこれらのクラスターのそれぞれはｐ＜0.001；c）。クラスター２は、３つのシグナチャースコア（ｄ，ｅ，ｆ）のいずれかと関連していなかった。MaSC、Luminal前駆体、及びLuminal成熟体のシグナチャースコアのそれぞれの四角のプロットは、ＤＮＡメチル化プロファイルに基づき、６つのメチル化乳癌グループの各々に対応する。Luminal前駆体と成熟体のシグナチャーのための遺伝子発現とＤＮＡメチル化データとの間に、強い逆相関が観察された（ｅとｂ、ｆとｃのそれぞれの比較）（それぞれのピアソン係数：−0.59、ｐ=1.10〜9と−0.70、ｐ= 6.10〜14）。MaSCのシグナチャースコアとしては弱かった（ｄとａの比較；ピアソン係数:−0.47、ｐ= 4.10〜6）。
【０１１３】
表７：検証腫瘍セットのために得られた６つのメチル化グループと「既知の発現サブタイプ」との間の関連。表は、フィッシャーの正確確率検定によって提供されたp値を示し、検証のセット各メチル化グループと、免疫化学（IHC）と同様に括弧内のファイ値によって決定された各「既知の発現サブタイプ」との関連を評価している。
【表７】
2014505475.tif 000029
【０１１４】
実施例4：6つのメチル化クラスターの生物学的意義を探る。
このために、（正常試料と比較して）異なってメチル化されている標的の数が、メインセットで上記各クラスターを特徴付け定量化された。標的の数は、クラスター間で大きく異なり、クラスター3が最低で（CpG数276）、クラスター4が最高（CpG数1378、図３Ｉ）であることがわかった。次に、遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析は、（正常試料と比較して）差異あるメチル化およびメチル化と発現の間の有意な反相関の両方を示す各クラスター内の遺伝子に着目して行った。これは、異なる「エピジェネティックな免疫プロファイル」（図3Ｊ）を示す異なるクラスターとともに、免疫に関与するいくつかの遺伝子の差異あるメチル化を明らかにした。特に、クラスター2（HER2濃縮）及びクラスター3（Basal−like濃縮）の腫瘍は、いくつかの免疫遺伝子の低メチル化を示した（図3Ｊ）。本研究では腫瘍組織全体を考慮したため、試料が主に上皮細胞から構成されているが、免疫細胞を含む周囲の間質からの細胞からも構成されていた。したがって、クラスター2及び3の免疫遺伝子で観察された低メチル化は、リンパ球などの免疫細胞により、これらの腫瘍の浸潤を示すことができるだろう。この仮説が正しいことが証明された。図３Ｋに示すように、前述（Denkert, C.ら、2010年 J. Clin. Oncol. 28, 105-113）のように、組織学的解析を行い、間質及び腫瘍内のリンパ球浸潤を決定した。驚くべきことに、クラスター2および3の腫瘍は、他のクラスターの腫瘍と比べて、リンパ球よりはるかに浸潤であった（図３Ｌ）。さらに、ＧＯ解析によって強調された免疫の遺伝子のほとんどのメチル化状態は、リンパ球浸潤の程度と逆相関にあった（図3Ｍ及び表8）。
【０１１５】
表８：図３で示した免疫遺伝子のメチル化状態と間質及び腫瘍内のリンパ球湿潤との間のスピアマン相関。
【表８】
2014505475.tif 000030
【０１１６】
また、正常細胞株及び乳癌上皮細胞株のDNAメチル化プロファイルと同様に、ex vivoでTリンパ球およびBリンパ球細胞株並びにリンパ球細胞株のＤＮＡメチル化プロファイルは、多数の研究された免疫遺伝子が乳癌および正常上皮細胞株で高度にメチル化されているが、リンパ球でほとんどないことを明らかにした（図3Ｎ）。これらのデータは、クラスター2腫瘍及びクラスター３腫瘍で検出された免疫遺伝子の低メチル化が腫瘍の微小環境の細胞タイプの組成、特にこれらの腫瘍のリンパ球浸潤を反映していることを強く示唆している。これらの遺伝子を詳しく見ると、クラスター2において、T細胞生物学に関与する遺伝子の低メチル化、例えばCD6抗原のようにT細胞マーカーをコードする遺伝子、LCKチロシンキナーゼ又はT細胞受容体シグナル伝達に関与するPTPN22チロシンホスファターゼのようなT細胞活性化マーカーを明らかにした。これらのデータは、クラスター２腫瘍、他のクラスターのデータよりも簡易に、腫瘍環境におけるTリンパ球の動員をともなって、抗腫瘍T細胞応答を誘導している可能性がある。
【０１１７】
次に、乳房の発癌における上記エピジェネティックな変化の臨床的関連性を解析した。この目的のために、単変量生存解析は、本発明で識別された（すなわち正常乳房試料と腫瘍との間で差異あるメチル化がされているとする）6,309のCpGのすべてについて行った。疑われるように、メインセットは、解釈可能な結果を許可するには小さすぎるようだった。したがって、バイオマーカーの真の予後値を評価するために、公に利用可能なより豊富な遺伝子発現データを用いて、未治療患者（730〜952個の試料で考慮される遺伝子に依存する、表9）だけを選んだ。
【０１１８】
表９：メタ解析のために用いられる公に有用な遺伝子発現データ。「生存（Survival）」の欄は、各データセットとして有用な生存データのタイプを示す。
ＲＦＳ：再発なしの生存、ＤＭＦＳ：遠隔転移なしの生存、ＯＳ：概して生存。
【表９】
2014505475.tif 000031
【０１１９】
次に、55個の遺伝子が、メチル化と発現状態との間の強力な抗相関関係を示すように選択され、単変量Cox回帰解析にかけた。驚くべきことに、これらの遺伝子の32以上（58％）が、重要な予後マーカーとして現れた（表10）。
【０１２０】
さらに、32個の遺伝子中の13個は免疫に関与し、特に９個はTリンパ球生物学（CD3D、CD3G、CD6、LCK、LAX1、SIT1、RHOH、UBASH3A及びICOS；図４Ａ）に関与している。これらのうちのいくつか、例えばLAX1、SIT1、またはUBASH3Aは、乳癌における生存マーカーとして、以前は強調されなかった。
図3Ｋ−Ｎで提示したデータと一致して、上記遺伝子の低メチル化は高いリンパ球浸潤と相関していた（RHOHとBST2を除くため、これらはその後に考慮されなかった）（図4Ｂ、表１１）。上記の遺伝子の発現レベルで見たときに、逆のこと、すなわち高い遺伝子発現量が高いリンパ球浸潤と相関していることが見いだされた（図４Ｂ及び表12）。免疫遺伝子のメチル化と発現状態との間のこの反相関も、乳房上皮細胞株においてだけでなく、ex  vivoリンパ球およびTリンパ球細胞株で、DNAメチル化及び遺伝子発現プロファイリングによって決定されるように見出された（図４Ｃ）。このことは、腫瘍試料全体において、これらの遺伝子のメチル化と発現状態との間で観察された強い反相関を伴うように保持している。さらに、これらの遺伝子のいくつか（CD3D、CD3G、ICOSおよびUBASH3A）は、ex vivoBリンパ球で高度にメチル化され、Ｔリンパ球の試料中では高度にメチル化されていないらしい（図４Ｃ）。また、観察されたリンパ球湿潤（図４Ｂ）は、図４Ａで提案したように、たいていはTリンパ球に関与していることを示している。
【０１２１】
表１０：公に利用可能な遺伝子発現データについての単変量Cox回帰メタ解析
【表１０−１】
2014505475.tif 000032
【表１０−２】
2014505475.tif 000033
【０１２２】
上記表10のメタ解析は、補足する方法で説明したように、メチル化と発現状態との間で高い反相関を示す（ピアソン係数−０．７以下）遺伝子について行われた。古典的なマーカー（グレード、腫瘍サイズ、結節状態（nodal  status）、診断時の患者の年齢、ERの状態）の予後値についても評価した。「Lower.95」及び「Upper.95」はハザード比の95％信頼間隔を示し、ｎは患者数を示す。
【０１２３】
表１１：図４で説明した免疫遺伝子のメチル化状態と間質及び腫瘍内のリンパ湿潤との間のスピアマン相関
【表１１】
2014505475.tif 000034
【０１２４】
表１２：図４で示した免疫遺伝子の発現状態と間質及び腫瘍内部のリンパ湿潤との間のスピアマン相関
【表１２】
2014505475.tif 000035
【０１２５】
次に、上述の１１個の免疫遺伝子と臨床結果との間の関連を解析した。これらのすべての発現は、より良好な結果に関連し（図４Ｄ）、興味深いことに、ＣＤ６を除いて、これらのすべてが、現在使用されている臨床指標に対して、独立した予後値を有することを、多変量解析が明らかにした（表13および14）。１１個の免疫遺伝子の詳細な生存解析は、これらの遺伝子のサブタイプ特異的な予後値を明らかにした。
【０１２６】
表１３：公的に利用可能な遺伝子発現データセットについての多変量Cox回帰メタ解析。
この解析は、補足表S25で提供される単変量Cox回帰で良い予後マーカーとして現れ、且つ間質及び腫瘍内部の浸潤を表示している（補足表S26およびS27）11個の免疫遺伝子について行った。「Lower.95」及び「Upper.95」は、ハザード比の95％信頼間隔を示し、ｎは患者数を示す。
【表１３−１】
2014505475.tif 000036
【表１３−２】
2014505475.tif 000037
【０１２７】
表１３ｂ：さらに免疫遺伝子についての情報と、上述のように、乳癌に相関があることが見いだされるIluminaＩＤについての情報
【表１３ｂ】
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【０１２８】
表１４：実施例で用いたLAX1とCD3Dで示されるように、免疫マーカーは、臨床で用いた古典的マーカーの全てを用いた多量変数解析における意義を表すらしい（完全な解析に対する表１５も参照）。ｎは患者数を示し、ＣＩは信頼間隔を示す。
【表１４】
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【０１２９】
これらのマーカーのほとんどは、HER2過剰発現とLuminalＢ腫瘍における高い予後値を示したが、それらのどれもLuminalＡ腫瘍においてで影響を及ぼしていない。いくつかだけが、Basal-Like腫瘍において予後値を有するように見えた（図４Ｅおよび表15）。全体として、これらの結果は、これらのマーカーの存在が、よりよい予後と関連し、ある腫瘍カテゴリーに特異的な抗腫瘍T細胞応答を反映していることを示している。さらに、これらのデータは、ここで説明するような免疫成分のように、古典的な遺伝子発現解析に基づいて明らかにすることはなかった乳癌の成分を明らかにすることにおけるDNAメチル化解析の重要性を強調する（後者は、癌のための主要な予後マーカーとしての細胞増殖成分を、主に明らかにした）。
【０１３０】
表１５：「既知の発現サブタイプ」それぞれに対して特異的な、公的に利用可能な遺伝子発現データセットについての単変量Cox回帰メタ解析。「Lower.95/upper.95」は、ハザード比の95％信頼区間を示し、ｎは患者数を示す。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｂ−３】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｄ−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ−１】
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【図３Ｆ−２】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ−１】
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【図３Ｈ−２】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ−１】
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【図３Ｏ−２】
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【図３Ｏ−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ−１】
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【図４Ｅ−２】
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【図３Ｋ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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