(57)【要約】ＩＬ−６非応答性である（１）および／またはＣＤ４５−表現型を有する（２）ＭＭ細胞の罹患率の増加によって特徴づけられる病期における多発性骨髄腫患者を治療する方法であり、式Ｉｂの化合物のある量を患者に投与することを含む。【化１】2014514337.tif 000007
2014514337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６非応答性である（１）および／またはＣＤ４５−表現型を有する（２）ＭＭ細胞の罹患率の増加によって特徴づけられる病期において多発性骨髄腫患者を治療する方法であって、
ＭＭ細胞の生存能力を減少させるのに効果的な式Ｉｂの化合物、または式Ｉｂの化合物のエナンチオマー、式Ｉｂの化合物のプロドラッグ、または式Ｉｂの化合物の薬学的に許容できる塩のある量を患者に投与することを含み、
【化１】
2014514337.tif 000005
式中、
ＺはＮおよびＣＨから独立して選択され、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＮＨＲ２、ＣＯＮ（Ｒ２）２、ＣＦ３、Ｒ２ＯＲ２、ＣＮ、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ−１、１−ジオキシド、置換もしくは非置換ピペリジニル、置換もしくは非置換ピペラジニル、イミダゾリル、置換もしくは非置換ピロリジニル、およびＣ１−４アルキレンから独立して選択され、ここで炭素原子は、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ−１、１−ジオキシド、置換もしくは非置換ピペリジニル、置換もしくは非置換ピペラジニル、イミダゾリルまたは置換もしくは非置換ピロリジニルで置換されるＮＲＹおよび／またはＯと任意に置き換えられる；
Ｒ２は、置換もしくは非置換Ｃ１−４アルキルである；
ＲＹは、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−４アルキルである；
Ｒ８は、ＲＸＣＮである；
ＲＸは、置換もしくは非置換Ｃ１−４アルキレンであり、ここで最大２つまでの炭素原子が、ＣＯ、ＮＳＯ２Ｒ１、ＮＲＹ、ＣＯＮＲＹ、ＳＯ、ＳＯ２もしくはＯで任意に置換されることができる；
Ｒ１１は、ＨもしくはＣ１−４アルキルである、
多発性骨髄腫患者を治療する方法。
【請求項２】
多発性骨髄腫患者を治療する方法であって、
ＩＬ−６非応答性である（１）および／またはＣＤ４５−表現型を有する（２）前記ＭＭ細胞の罹患率の増加を診断された患者を治療のために選択するステップ（１）；および、
前記ＭＭ細胞の生存能力を減少させるために効果的な請求項１の化合物で定義された式Ｉｂのある量を患者に投与するステップ（２）、
を含む、多発性骨髄腫患者を治療する方法。
【請求項３】
多発性骨髄腫患者を治療する方法であって、
前記患者からＭＭ細胞の試料を得るステップ（１）；
ＩＬ−６非応答性であり、および／またはＣＤ４５−表現型を有する前記細胞の罹患率のために前記ＭＭ細胞を分析するステップ（２）；
前記ＭＭ細胞の罹患率が、多発性骨髄腫の初期段階の患者と比較して増加している患者を治療のために選択するステップ（３）、および
前記ＭＭ細胞の生存能力を減少させるために効果的な請求項１で定義された式Ｉｂの化合物のある量を前記選択された患者に投与するステップ（４）、
を含む、多発性骨髄腫患者を治療する方法。
【請求項４】
前記患者は、ＣＹＴ３８７、またはＣＹＴ３８７のエナンチオマー、ＣＹＴ３８７のプロドラッグ、またはＣＹＴ３８７の薬学的に許容できる塩で治療され、前記ＣＹＴ３８７は、Ｎ−（シアノメチル）−４−［２−［［４−（４−モルホリニル）フェニル］アミノ］−４−ピリミジニル］−ベンズアミドであり、以下に示される構造
【化２】
2014514337.tif 000006
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者は、新たに診断された、または再発した多発性骨髄腫に罹患している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記患者は、少なくとも１０％がＣＤ４５−であるＭＭ細胞の集団を呈する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者は、ＣＹＴ３８７ならびにメルファランおよびボルテゾミブから選択される二次治療薬剤で治療される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１で定義された式Ｉｂの化合物を含む容器、および前記容器と関連して、ＭＭ細胞がＩＬ−６非応答性であるもしくはＣＤ４５−表現型を有する、新たに診断されたもしくは再発した多発性骨髄腫患者の治療を指示するラベル、を含む製品。
【請求項９】
ＭＭ細胞がＩＬ−６非応答性であるもしくはＣＤ４５−表現型を有する、新たに診断されたもしくは再発した多発性骨髄腫患者を治療するために有用な量で請求項１に定義された式Ｉｂの化合物、およびそれらに関して、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法を教示する印刷された指示書を含む容器を備えたキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、酵素ヤヌス（Ｊａｎｕｓ）キナーゼ２、またはＪＡＫ２に関する。より詳細には、本発明は、多発性骨髄腫および関連する骨髄増殖性腫瘍の治療におけるＪＡＫ２阻害剤の使用に関する。
［発明の背景］
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄に局在する不治の薬物耐性クローンＢ細胞悪性新生物であり、腎機能障害および心機能障害の形態において破壊的な溶解性骨病変および末端器官障害を引き起こす形質細胞によるモノクローナル抗体の過剰産生と最終的に関連している。最近の研究は、形質細胞の成長および増殖の原因となるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の当該刺激を介するＭＭの発症において中心的な役割を果たすと考えられているインターロイキン−６（ＩＬ−６）の活性を低下させる物質に注目している。
【０００２】
いくつかのヒト骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ）は、外因性ＩＬ−６［９，１０］なしでは増殖または生存することができず、いくつかの従来の薬剤は、ＩＬ−６［１１−１３］の存在下では効果がない。ＭＭ細胞に対して補助シグナルを与えるものとして知られている骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）は、ＩＬ−６を生成し［１４］、したがって、ＩＬ−６の生存促進効果を低下させることは、ＭＭの薬物耐性表現型を抑止し得る。
【０００３】
ヤヌス活性化キナーゼ（ＪＡＫｓ）は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２の４つのファミリーメンバーを含むシグナル伝達キナーゼによってよく特徴づけられ、これらは、ＪＡＫ変異が骨髄増殖性疾患［１−３］および白血病［４］の両方の発病に貢献することが明らかとされてきたように血液悪性腫瘍に重要である。ＪＡＫは、多くの細胞のシグナル伝達において確立された役割を有する［５のレビュー］。ＭＭにおいて、ＪＡＫは、インターロイキン−６（ＩＬ−６）［６，７］、インターフェロン−α［６，８］、および表皮成長因子［６］を含むさまざまなサイトカインによって活性化される。ＪＡＫの下流の多くの経路は、悪性細胞によって利用される。
【０００４】
さまざまなＪＡＫ阻害剤が最近開発されており、ＭＭの治療手段としてのＪＡＫ阻害剤の有用性が調査されている。ＣＹＴ３８７は新規のＪＡＫ阻害剤であり、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２キナーゼ活性を阻害することができる［１５，１６］。ＣＹＴ３８７の構造および開発は、最近述べられている［１７］。現在開発および調査の様々な段階にある他のＪＡＫ阻害剤は、ＷＰ１０６６［２４］だけでなく、ＩＮＣＢ００００２０［１８］，ＩＮＣＢ１６５６２［１９］，ＡＧ４９０［２０，２１］，ＡＺＤ１４８０［２２］およびピリドン６［２３］を含む。ＭＭ薬物耐性ＪＡＫ阻害剤におけるＩＬ−６の与えられた推定上の役割が、ＭＭのための単剤としてまたは併用療法においてＭＭ薬物耐性ＪＡＫ阻害剤の潜在的使用のために調査されている。さらに、予備的なインビトロデータは、通常療法に対してＭＭ細胞を敏感にさせるためのＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害の可能性を示している［２１］。
【０００５】
このような努力にもかかわらず、ＭＭは難病のままであり、年間１１，０００名の死者を生じ、毎年１６，０００名の追加患者に影響を及ぼす。この病気に苦しめられる患者の治療のための追加的な薬剤および方法を提供することは有用であるだろう。
［発明の要旨］
ＣＹＴ３８７は、多発性骨髄腫の治療に活性であるということ、特に標的ＭＭ細胞がＣＤ４５−および／またはＩＬ−６非応答性であるＭＭの治療形態において活性であるということが明らかになっている。よって、ＣＹＴ３８７の多発性骨髄腫治療の効果は、ＪＡＫ阻害活性を示す他の薬剤と比較して、治療されることが可能な多発性骨髄腫の型を拡大している。
【０００６】
より詳細には、一態様において、本願発明は、ＣＤ４５−表現型を有するＭＭ細胞の成長および／または増殖、すなわち生存性を阻害するためのＣＹＴ３８７の使用を提供する。加えて、別の態様において、本願発明は、ＩＬ−６非応答性と考えられるＭＭ細胞の成長および／または増殖、すなわち生存性を阻害するためのＣＹＴ３８７の使用を提供する。ＣＹＴ３８７のようにＪＡＫキナーゼ阻害プロフィールを有する化合物も本願方法で有用である。
【０００７】
ＣＹＴ３８７の活性は、ＭＭ細胞がＣＤ４５＋表現型からＣＤ４５−表現型に優位に表現型の上で変化する病気の後期でＭＭの治療を可能にさせ、それによって治療が絶望的な患者の生存を延長させることが可能になる。
【０００８】
関連する態様において、本願方法は、患者または患者から得られた生物学的試料を評価するステップ、上述した基準の少なくとも一つに適合する多発性骨髄腫患者を同定するステップ、その後ＣＹＴ３８７または関連化合物を用いて同定された患者を治療するステップを含む。
【０００９】
本願発明の別の態様において、少なくとも一つの上述した基準を示す患者の治療を指示するラベルと組み合わせて、ＣＹＴ３８７または関連化合物を含む製品を提供する。
本願発明の関連する態様において、本願で述べられた選択基準に基づいて、ＣＹＴ３８７治療または関連化合物治療のための患者を選択する方法を教示する印刷された指示書と組み合わせて、ＣＹＴ３８７または関連化合物を含むキットを提供する。
【００１０】
本願発明のこれらのおよび他の態様ならびに実施形態は、添付図面を参照してより詳細に述べる。
［図の参照］
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＣＹＴ３８７は、ＩＬ−６または共培養刺激の下流のシグナル伝達を防ぐ。ＨＭＣＬを、ＣＹＴ３８７（０．５〜２μＭ）と、またはＣＹＴ３８７（０．５〜２μＭ）なしで、１時間インキュベートし、１５分間１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６で刺激した。細胞をその後採取し、ｐ−ＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５）を測定した。（Ａ）幾何平均蛍光強度で細胞内ＦＡＣＳによって測定し、グラフ化した（ｎ＝３、平均値±ＳＥ、刺激細胞±ＣＹＴ３８７を、テューキー事後テスト（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔで一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）（Ｂ）ｐ−ＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５）、全ＳＴＡＴ３およびローディングコントロールとしてα−チューブリンをウェスタンブロットによって測定した。（Ｃ）ｐ−ＳＴＡＴ３はまた、不死化骨髄間質細胞もしくは一次骨髄間質細胞をＨＳ５との直接共培養（ＣＣ）を用いて、または、ＨＳ５とトランスウェル（ＴＷ）「水溶性のみ」ＣＣを用いて、ＨＭＣＬにおいて誘導された。ＨＭＣＬをＣＤ３８またはＣＤ１３８で蛍光標識し、２μＭＣＹＴ３８７で共処理して、または共処理せずに１５分間刺激した。示されるものはＮＣＩ−Ｈ９２９のプロットである。（ｎ＝３、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６）（Ｄ）ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６細胞を一晩飢餓状態にさせ、２μＭＣＹＴ３８７で共処理して、または共処理せずに１５分間５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１で刺激した。ｐ−ＡＫＴ（ｐＳ４７３）およびｐ−ＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４）は、未処理（ＵＴ）コントロールに標準化された幾何平均蛍光強度で細胞内ＦＡＣＳによって測定され平均化された（ｎ＝４、平均値±ＳＥ、刺激細胞±ＣＹＴ３８７をテューキー事後テスト（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）で一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）。
【図２】ＣＹＴ３８７はＨＭＣＬ増殖を阻害する。（Ａ）ＣＹＴ３８７は時間、および用量依存的にＨＭＣＬを阻害する。ＩＬ−６表現型ＨＭＣＬ（ＡＮＢＬ−６、ＯＣＩＭＹ１、Ｕ２６６およびＸＧ−１）および非ＩＬ−６表現型ＨＭＣＬ（ＬＰ−１、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＰＭ２、およびＲＰＭＩ−８２２６）をＵＴ、ＣＹＴ３８７（０．１、０．５、１、２．５または５μＭ）と、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）と２４時間、４８時間、および７２時間で培養した。細胞増殖をその後、ＭＴＳ分析によって決定した（７２時間データを示す、ｎ＝３、平均値±ＳＥ）（Ｂ）ＣＹＴ３８７を用いた処理は、ＩＬ−６の存在下でさえ骨髄腫細胞増殖を阻害する。生存細胞の絶対細胞数を、単独で培養されたＨＭＣＬ（未処理）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）と培養されたＨＭＣＬ、ＣＹＴ３８７（０．５〜１μＭ）と培養されたＨＭＣＬ、またはＩＬ−６およびＣＹＴ３８７と培養されたＨＭＣＬの血球計算機カウントによって決定した。ＣＹＴ３８７との培養は７２時間にわたってＨＭＣＬの増殖を非常に減少させた（０時に処理のみ）。結果は３回の独立した実験の平均値±ＳＥを示す。（Ｃ）ＣＹＴ３８７は、細胞周期を妨げる。ＨＭＣＬを２４時間および７２時間、ＣＹＴ３８７（１μＭまたは５μＭ）で処理し、その後、それらを採取し、固定し、細胞周期をＦＡＣＳによって分析した。示される細胞周期は、細胞周期のＧ２／Ｍ期における細胞周期中の細胞数の４回の独立した実験の平均値±ＳＥで、２４時間または７２時間のＣＩＨ９２９  ＵＴまたは５μＭ  ＣＹＴ３８７のプロットである。
【図３】ＣＹＴ３８７はＨＭＣＬにおけるアポトーシスを誘導する。（Ａ）示されるアネキシン−Ｖおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＵＴ、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理、２４時間５μＭ  ＣＹＴ３８７処理、および７２時間５μＭ  ＣＹＴ３８７処理のプロットである。（Ｂ）ＵＴと比較してＣＹＴ３８７処理後の生存（アネキシン−ＶおよびＰＩ−）細胞の比率。示されたデータは、４回の独立した実験の平均値±ＳＥである。
【図４】ＣＹＴ３８７は、ＨＭＣＬにおけるメルファランおよびボルテゾミブと相乗作用する。（Ａ）ＰＩ＋細胞負のバックグラウンド死（未処理）の比率によって決定したＣＹＴ３８７処理（０．５〜１０μＭ）の２４時間および４８時間処理後のＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６の用量効果曲線。４回の独立した実験の平均値±ＳＥ。（Ｂ）メルファランまたはボルテゾミブと組み合わせたＣＹＴ３８７は相乗作用を示す。相乗作用は、カルクシン（Ｃａｌｃｕｓｙｎ）ソフトウェアによって計算されたコンビネーションインデックスを用いて測定し（１未満の値は相乗作用を示す）、死滅した細胞のフラクションに対して薬物の様々な用量／比率でプロットした。相乗作用は、メルファランおよびＣＹＴ３８７の間で用量／比率／細胞株および時点のある範囲で見られる。ボルテゾミブとＣＹＴ３８７は、１８／２４併用で相乗性または、ほぼ相加性を示した。相乗作用は、４回の独立した実験の平均の用量効果曲線から計算した。
【図５】ＣＹＴ３８７は、単一薬剤、またはメルファランおよびボルテゾミブとの併用で一次サンプルにおけるアポトーシスを誘導する。（Ａ）４８時間ＣＹＴ３８７処理（ｎ＝６）後のアポトーシス（Ａｐｏ２．７＋）ＣＤ３８＋ＣＤ４５−一次患者骨髄腫細胞の比率。（Ｂ）一次患者ＣＤ３８＋ＣＤ４５−細胞におけるカルクシン（Ｃａｌｃｕｓｙｎ）ソフトウェアによって決定した２４時間処理後のＣＹＴ３８７およびメルファランまたはボルテゾミブとの間の相乗作用。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［発明の詳細な説明］
ＣＹＴ３８７は、ＣＡＳ登録番号ＣＡＳ１０５６６３４−６８−４、化学名Ｎ−（シアノメチル）−４−［２−［［４−（４−モルホリニル）フェニル］アミノ］−４−ピリミジニル］−ベンズアミド、および下記の構造を有するフェニルアミノピリミジン化合物である。
【００１３】
【化１】
2014514337.tif 000003
【００１４】
ＣＹＴ３８７の合成、製剤、および治療用途は、２００８年９月１８日に公表された国際公開第ＷＯ２００８／１０９９４３号、およびＢｌｏｏｄ，２０１０，１１５（２５）：５２３２―４０に記載されている。言うまでもなく、ＣＹＴ３８７は、必要に応じて、塩、溶媒和物、またはプロドラッグの形態で使用されることができる。
【００１５】
「関連化合物」は、選択的ＪＡＫ阻害サインによってＣＹＴ３８７と関連している化合物であり、好ましいのは、ＪＡＫ３および他のキナーゼファミリーメンバーと比較してＪＡＫ２およびＪＡＫ１への結合および阻害が示され、ならびにＣＹＴ３８７と式：
【００１６】
【化２】
2014514337.tif 000004
【００１７】
に対して構造的適合によって関連している化合物、または、その化合物のエナンチオマー、その化合物のプロドラッグ、またはその化合物の薬学的に許容できる塩であり、
式中、
ＺはＮおよびＣＨから独立して選択され、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＮＨＲ２、ＣＯＮ（Ｒ２）２、ＣＦ３、Ｒ２ＯＲ２、ＣＮ、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ−１、１−ジオキシド、置換もしくは非置換ピペリジニル、置換もしくは非置換ピペラジニル、イミダゾリル、置換もしくは非置換ピロリジニル、およびＣ１−４アルキレンから独立して選択され、ここで炭素原子は、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ−１、１−ジオキシド、置換もしくは非置換ピペリジニル、置換もしくは非置換ピペラジニル、イミダゾリルまたは置換もしくは非置換ピロリジニルで置換されるＮＲＹおよび／またはＯと任意に置き換えられる；
Ｒ２は、置換もしくは非置換Ｃ１−４アルキルである；
ＲＹは、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−４アルキルである；
Ｒ８は、ＲＸＣＮである；
ＲＸは、置換もしくは非置換Ｃ１−４アルキレンであり、ここで最大２つまでの炭素原子が、ＣＯ、ＮＳＯ２Ｒ１、ＮＲＹ、ＣＯＮＲＹ、ＳＯ、ＳＯ２もしくはＯで任意に置換されることができる；
Ｒ１１は、ＨもしくはＣ１−４アルキルである。
【００１８】
用語「Ｃ１−４アルキル」は、１〜４の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基をさす。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルを含む。
【００１９】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をさす。
用語「置換」は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルキルアリール、アリール、ヘテロシクリル、ハロ、ハロＣ１−６アルキル、ハロＣ３−６シクロアルキル、ハロＣ２−６アルケニル、ハロＣ２−６アルキニル、ハロアリール、ハロヘテロシクリル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニルオキシ、Ｃ２−６アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、カルボキシ、ハロＣ１−６アルコキシ、ハロＣ２−６アルケニルオキシ、ハロＣ２−６アルキニルオキシ、ハロアリールオキシ、ニトロ、ニトロＣ１−６アルキル、ニトロＣ２−６アルケニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、アジド、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ２−６アルケニルアミノ、Ｃ２−６アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロ環アミノアシル、Ｃ１−６アルキルアシル、Ｃ２−６アルケニルアシル、Ｃ２−６アルキニルアシル、アリールアシル、ヘテロシクリルアシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルデヒド、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アリールスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ、Ｃ１−６アルキルスルフェニル、Ｃ２−６アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、カルボアルコキシ、カルボアリールオキシ、メルカプト、Ｃ１−６アルキルチオ、アリールチオ、アシルチオ、シアノなどから選択される一つ以上の基で置換される基をさす。好ましくは、置換基は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルキルアリール、アリール、ヘテロシクリル、ハロ、ハロアリール、ハロヘテロシクリル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、アリールオキシ、カルボキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアシル、アリールアシル、ヘテロシクリルアシル、アシルアミノ、アシルオキシ、Ｃ１−６アルキルスルフェニル、アリールスルホニル、およびシアノからなる群から選択される。
【００２０】
用語「アリール」は、芳香族炭化水素の単一の、多核の、共役した、結合した残基をさす。例えば、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、クアテルフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、アントラセニル、ジヒドロアントラセニル、ベンズアントラセニル、ジベンズアントラセニル、およびフェナントレニルを含む。
【００２１】
用語「不飽和Ｎ−含有５または６員ヘテロシクリル」は、不飽和の、少なくとも一つの窒素原子を含む環状炭化水素基をさす。
適切なＮ−含有複素環基は、１〜４個の窒素原子を含む不飽和５〜６員ヘテロ単環基を含み、例えば、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル；例えば、オキサゾリル、イソキサゾリル、およびオキサジアゾリルなどのような１〜２個の酸素原子、および１〜３個の窒素原子を含む不飽和の５員または６員ヘテロ単環基；ならびに、例えば、チアゾリル、およびチアジアゾリルなどのような１〜２個の硫黄原子、および１〜３個の窒素原子を含む不飽和の５員または６員ヘテロ単環基を含む。
【００２２】
好ましい実施形態において、ＣＹＴ３８７に関連する化合物には、化合物中、Ｒ１は、パラ位がモルホリニルによって置換され、オルト位がＨによって置換され、Ｚは炭素であり、Ｒ１１は、Ｈ、メチル、またはメトキシであるものを含む。
【００２３】
特に好ましい実施形態において、Ｒ８は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝Ｎ；または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎである。
【００２４】
本願の方法に従って有用なＣＹＴ３８７に関連する特定の化合物は、
Ｎ−（シアノメチル）−４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンズアミド；
Ｎ−（シアノメチル）−３−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンズアミド；
Ｎ−（シアノメチル）−３−メチル−４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンズアミド；
Ｎ−（シアノメチル）−２−メチル−４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンズアミド；
２−シアノ−Ｎ−（３−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンジル）アセトアミド；
２−シアノ−Ｎ−（３−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）フェニル）アセトアミド；
Ｎ−（シアノメチル）−４−（２−（３−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンズアミド；
Ｎ−（シアノメチル）−４−（２−（４−チオモルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンズアミド；および、
Ｎ−（シアノメチル）−４−（２−（４−モルホリノメチル）フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル））ベンズアミド、
を含む。
【００２５】
本発明において、ＣＹＴ３８７および関連化合物は、ＣＤ４５ネガティブ（ＣＤ４５−）表現型を有する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を、および／またはＩＬ−６非応答性と考えられるＭＭ細胞を治療するために使用される。ＭＭ細胞は、多発性骨髄腫の特徴である形質細胞腫腫瘍を形成する異常細胞である。「ＣＤ４５−表現型」は、すべての造血細胞のよく知られたマーカーであるＣＤ４５として知られるタンパク質マーカーの表面発現について、中陽性〜強陽性は除外して、陰性又は弱陽性を検出するＭＭ細胞をさす。ＣＤ４５−表現型はまた、本願においてＭＭ細胞の集団に関連しているとみなされ、ＭＭ細胞の集団において、集団内のＣＤ４５−細胞の罹患率は、集団の少なくとも約１５％、または約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または少なくとも約５０％のように、集団の少なくとも約１０％を超える。細胞表面でのＣＤ４５の検出は、蛍光標識ＣＤ４５モノクローナル抗体を用いて容易に達成され、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術またはＣＤ４５抗体に結合する細胞を同定する任意の関連方法が確立されている。引例には、例えばＭｏｒｅａｕらによって公表された文献Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００４，８９（５）：５４７、およびＫｕｍａｒらによって公表された文献Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００５，１９：１４６６をあげることができ、その開示内容を本願に引用して援用する。
【００２６】
「ＩＬ−６非応答性」であるＭＭ細胞は、生存をインターロイキン−６（ＩＬ−６）に依存しない細胞として同定される。したがって、ＩＬ−６非応答性であるＭＭ細胞は、ＩＬ−６の別の刺激性の量でインキュベートされるとき、ＩＬ−６受容体刺激または下流シグナル伝達イベントなどのような点で実態のない応答を示す。当該ＭＭ細胞は、骨髄環境にあるＭＭ細胞を特に含み、従って骨髄間質細胞と同じ環境で成長することができる。しかし、当該ＭＭ細胞は、骨髄環境に曝されない循環中のＭＭ細胞も含む。
【００２７】
ＭＭ、ならびにＭＭの進みおよび進行において、ＣＤ４５は、異常ＭＭ細胞の初期マーカーである。病気が進行するにつれて、異常ＭＭ細胞のＣＤ４５表現型の変化が起こり、異常ＭＭ細胞においては、ＣＤ４５＋細胞の優位性は衰退し、異常な形質細胞の集団は、ＣＤ４５−優位性になる（Ｋｕｍａｒら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００５，１９（８）：１４６６を参照）。ＩＬ−６非応答性細胞の数にも変化が起こり、ＩＬ−６非応答性細胞は、病気の後期において優位になる。
【００２８】
本発明の方法において、ＪＡＫ阻害剤の使用は、ＣＤ４５−および／またはＩＬ−６非応答性表現型を得たＭＭ細胞およびＭＭ細胞から起こる形質細胞腫腫瘍の治療のために提案される。この特定の細胞集団におけるＪＡＫ阻害効果は、ＩＬ−６受容体の刺激に対するＪＡＫ２応答が、ＭＭの進行において中心的かつ重要な役割を有することが確信されることを考えれば、驚くべきものである。ＩＬ−６経路がＭＭの病気の進行に関与しないときでさえ、ＣＹＴ３８７は、これらのＭＭ細胞の成長および／または増殖を阻害するために機能する。
【００２９】
「関連疾患」は、モノクローナルタンパク質（Ｍタンパク質、またはパラタンパク質）を生産する造血Ｂ細胞のクローン集団によって特徴づけられる形質細胞疾患としてＭＭに関連する疾患である。これらの疾患の臨床症状は、形質細胞クローンの制御されない増殖および進行性の増殖、通常の骨髄補填の影響、およびモノクローナルタンパク質の過剰産生に起因する。ＭＭは、形質細胞疾患であり、再発したＭＭだけでなく新規に診断されたＭＭを含む。
【００３０】
ＭＭ患者、中でも注目すべきはヒトの患者は、任意の確立された診断基準および診断パラメーターを用いて同定できる。これらには、国際骨髄腫ワークショップ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）によって設定された基準を含み、その基準は徴候的なＭＭ患者と無症状のＭＭ患者または意義不明の免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）とを、血清もしくは尿中のＭタンパク質、クローナル骨髄形質細胞増加症、または形質細胞腫ならびに関連する器官および組織の障害の存在によって区別する。ＭＭの病期診断のために、南西部腫瘍学グループ（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）（ＳＷＯＧ）によって提案されたガイドラインを使用することができ、ガイドラインはＢ２−ミクログロブリンの測定および血清アルブミンの相対的な存在の測定に本質的に依存しており、＞５．５ｍｇ／Ｌβ２−Ｍおよび＜３．０ｇ／ｄＬでＩＶ期の病気を示す。他の有用なガイドラインは、デューリーおよびサーモンによる病期分類システム（Ｄｕｉｒｅ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（ヘモグロビン、血清カルシウム、Ｘ線撮影、およびＭタンパク質を用いる）を使用して確立されている。
【００３１】
本願方法において、治療のために選択される患者は、ＭＭ細胞の集団内でＣＤ４５−細胞の存在の増加も示すＭＭ患者である。ＣＤ４５−細胞の存在の増加は、くすぶり型ＭＭまたはＭＧＵＳで悩む患者と比較して、新規に診断されたＭＭ患者または再発したＭＭ患者にみられる。ＣＤ４５−ＭＭ細胞の罹患率の相対的に劇的な増加を有する患者には、特にＩＩＩ期またはＩＶ期と診断されたＭＭ患者を含む。好ましい実施形態において、集団内のＣＤ４５−細胞の数は、全集団の少なくとも１０％であり、例えば、全ＭＭ細胞集団の１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上である。したがって、患者から抽出された１００個のＭＭ細胞の代表サンプルにおいて、本願方法によって治療するための標的とされる患者集団には、ＣＤ４５マーカーについてＭＭ細胞の１０〜５０％またはそれ以上が検査で陰性反応を示すＭＭ細胞集団を呈する患者を含む。
【００３２】
本願方法において、ＭＭと診断された患者は、例えばくすぶり型ＭＭ病期等のように病気の初期で苦しめられる患者と比較して、ＣＤ４５−表現型が増加しているＭＭ細胞集団の患者を選択するために最初にスクリーニングされることができる。スクリーニングは、患者から抽出されたＭＭ細胞集団を用いて、その後、例えばＣＤ４５−ＭＭ細胞の増加がある患者を同定するためにＣＤ４５  ＭＡｂに基づくフローサイトメトリーによって患者から抽出されたＭＭ細胞集団を分析して達成される。ＭＭ細胞集団はまた、ＩＬ−６非応答性細胞の罹患率を明らかにするために評価され、ＩＬ−６非応答性細胞の存在は、患者が本願方法によって治療する候補者となることを示す。
【００３３】
本願方法の使用のために、ＣＹＴ３８７または関連化合物は、標準的な薬務に従って製剤化される。
本発明の化合物は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびアルキルアンモニウムなどのような薬学的に許容できるカチオンの塩；例えば、塩化水素酸、オルトリン酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸などのような薬学的に許容できる無機酸の酸付加塩；または、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トリハロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、バレリアン酸、およびオロチン酸などのような薬学的に許容できる有機酸の塩、などの薬学的に許容できる塩として調製されてもよい。アミン基の塩はまた、アミノ窒素原子が、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアラルキル部分を有する第４級アンモニウム塩を含んでもよい。
【００３４】
化合物がキラル中心を有する場合には、化合物を、精製されたエナンチオマーもしくはジアステレオマーとして、または立体異性体の任意の比率の混合物として使用することができる。しかしながら好ましくは、混合物は、少なくとも好ましい異性体の７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％または９９％を含み、好ましい異性体は、所望の程度の有効性および選択性を与える。
【００３５】
式Ｉｂの化合物のプロドラッグを投与することもできる。例えば、遊離のアミノ基、アミド基、ヒドロキシ基、またはカルボン酸基を有する式Ｉｂの化合物をプロドラッグに変換することができる。プロドラッグは、アミノ酸残基が、または２個以上（例えば、２個、３個または４個）のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、ペプチド結合により本発明の化合物の遊離のアミノ基、ヒドロキシ基、カルボン酸基に共有結合される化合物を含む。アミノ酸残基は、一般に３文字記号で表示される２０種類の天然アミノ酸を含み、また、アミノ酸残基には４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、３−メチルヒスチジン、ノルバリン、βアラニン、γ−アミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチンおよびメチオニンスルホンも含む。プロドラッグには、カーボネート、カルバメート、アミド、およびアルキルエステルが、カルボニル炭素プロドラッグ側鎖により本発明の化合物の上記置換基に共有結合したものも含まれる。プロドラッグには、式Ｉｂの化合物の遊離ヒドロキシルにリン酸−酸素結合により結合した化合物のリン酸誘導体（例えば、酸、酸の塩、またはエステルなど）も含む。プロドラッグには、式Ｉｂの適切な窒素原子および硫黄原子のＮ−オキシド、およびＳ−オキシドも含まれてもよい。
【００３６】
本発明の化合物は、式Ｉｂの少なくとも１種の化合物、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物として投与されてもよい。担体は、組成物の他の成分と適合し、患者に有害でない「薬学的に許容できる」手段でなければならない。本発明の組成物は、以下に記載する他の治療剤を含んでもよく、医薬製剤化の分野でよく知られているような技術に従って、例えば、通常の固体または液体ビヒクル、または希釈剤、および所望の投与形態に適した種類の医薬添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香味剤など）を用いて製剤化されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。
【００３７】
本発明の化合物は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、または粉末剤などの形態で経口投与、舌下投与、口腔投与、例えば皮下、静脈内、筋内、皮内（経皮）、もしくは嚢内注射、または注入技法などによる非経口投与（例えば、無菌注入可能水性もしくは非水性溶液または懸濁剤として）；吸入スプレーもしくはガス注入等による鼻腔内投与、例えば、クリームもしくは軟膏などの形態での局所投与、または、溶液もしくは懸濁剤の形態での点眼投与、ペッサリー、タンポン、もしくはクリームの形態での経膣投与、または坐剤などの形態で直腸投与などの任意の適切な手段によって、非毒性の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤を含む投与単位製剤で投与されてもよい。化合物は、例えば即時放出または持続放出に適した形態で投与されてもよい。即時放出または持続放出は、本発明の化合物を含む適切な医薬組成物を用いて、または特に持続放出の場合には、皮下インプラントまたは浸透圧ポンプなどの装置を用いて達成されてもよい。
【００３８】
投与のための医薬組成物は、好適には投与単位で提供され、薬学分野でよく知られている任意の方法によって調製されてもよい。このような方法は、式Ｉｂの化合物を一つ以上の補助成分を構成する担体と結合させるステップを含む。概して、医薬組成物は、本発明の化合物を液体担体、または微細に分割された固体担体、またはその両方と均一および十分に結合させ、その後、必要であれば、所望の製剤に産物を成形することによって調製される。医薬組成物において、活性な対象化合物は、疾患の経過または状態に対して所望の効果を生じるために十分な量で含まれる。本願で使用される用語「組成物」は、指定量の指定成分を含む生成物、および指定量の指定成分の組み合わせから直接または間接的に結果として得られる任意の生成物を包含する。
【００３９】
医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性粉もしくは顆粒剤、エマルジョン、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤などの経口使用に適切な形態であってもよい。経口用である組成物は、医薬組成物の製造のために当分野で知られている任意の方法に従って調製されてもよく、当該組成物は、薬学的に安定で、味の良い製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤などの一つ以上の物質を含有してもよい。錠剤は、錠剤の製造に適する薬学的に許容できる非毒性の賦形剤と混合した式Ｉｂの化合物を含む。このような賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、および、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤であってもよい。錠剤は、被覆されていなくてもよく、または錠剤は消化管での崩壊および吸収を遅らせ、それによって、長時間にわたる持続性作用を提供するために、公知の技法によって被覆されてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル、またはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いてもよい。それらは、放出を制御するために浸透性治療錠剤を形成するために被覆されてもよい。
【００４０】
経口使用のための製剤は、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性固体希釈剤と式Ｉｂの化合物が混合されている硬質ゼラチンカプセル剤として、または、水もしくは、例えば落花生油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油などの油性媒体と式Ｉｂの化合物が混合されている軟質ゼラチンカプセル剤として提供されてもよい。
【００４１】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合した活性材料を含む。当該賦形剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴムなどの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は、例えばレシチンなどの天然ホスファチド、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸およびヘキシトールから生じる部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または、脂肪酸およびヘキシトール無水物から生じる部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁剤はまた、例えば、ｎ−プロピルヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルなどの一つ以上の保存剤、一つ以上の着色剤、一つ以上の香味剤、および例えばショ糖またはサッカリンなどの一つ以上の甘味剤も含んでもよい。
【００４２】
油性懸濁剤は、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油に式Ｉｂの化合物を懸濁することによって製剤化されてもよい。油性懸濁剤は、例えば、蜜ロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含んでもよい。風味の良い経口製剤を提供するために、上記のような甘味剤、および香味剤を添加してもよい。これらの組成物を、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存してもよい。
【００４３】
水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散性粉剤および顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁化液、および一つ以上の保存剤と混合した本発明の化合物を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤の例は、前に述べたものである。例えば甘味剤、香味剤、および着色剤などの付加的な賦形剤も提供されてよい。
【００４４】
本発明の薬剤組成物は、水中油型エマルションの形態であってもよい。油相は、例えばオリーブ油もしくは落花生油などの植物油、または例えば流動パラフィンなどの鉱油、またはそれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、例えばアカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然ゴム、例えば大豆、レシチンなどの天然ホスファチド、および例えばモノオレイン酸ソルビタンなどの脂肪酸とヘキシトール無水物から生じるエステルまたは部分エステル、および例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合生成物であってもよい。エマルションはまた、甘味剤および香味剤を含んでもよい。
【００４５】
シロップ剤およびエリキシル剤は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはショ糖などの甘味剤を用いて製剤化されてもよい。当該製剤はまた、粘滑剤、保存剤、香味剤、および着色剤を含んでもよい。
【００４６】
医薬組成物は、注射可能な無菌水性または油性懸濁剤の形態であってみよい。この懸濁剤は、上述の適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を用いて、当分野に知られている技術に従って製剤化されてもよい。注射可能な無菌製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液など、非毒性の非経口で許容される希釈剤または溶媒の無菌注射可能溶液または懸濁液であってもよい。使用可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液を用いてもよい。さらに、無菌固定油も従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を用いてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射可能製剤の調製において利用を見出す。
【００４７】
鼻腔内投与を含む気道への投与のために、活性化合物は、気道への投与のための分野で用いられる任意の方法および製剤によって投与されてもよい。
したがって、一般に活性化合物は、溶液、もしくは懸濁液の形態で、または乾燥粉末として投与されてもよい。
【００４８】
水剤および懸濁剤は、一般的に、例えば、水のみ（例えば滅菌水もしくは発熱物質を含まない水）または水および生理学的に許容される共溶媒（例えば、エタノール、プロピレングリコールもしくはＰＥＧ４００のようなポリエチレングリコール）であるだろう。
【００４９】
当該水剤または懸濁剤には、さらに、例えば、保存剤（例えば塩化ベンザルコニウム）、例えばポリソルベートのような可溶化剤／界面活性剤（例えば、ツイーン８０、スパン８０、塩化ベンザルコニウム）、緩衝剤、等張性調節剤（例えば塩化ナトリウム）、吸収増強剤および増粘剤のような他の賦形剤を含んでいてもよい。懸濁剤には、さらに、懸濁化剤（例えば微結晶性セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）を含んでいてもよい。
【００５０】
水剤または懸濁剤は、例えば、スポイト、ピペットまたはスプレーなどの従来の手段により、鼻腔に直接適用される。製剤は、単一用量または多用量の形態で提供されてもよい。後者の場合、用量の測定手段が、望ましくは提供される。スポイトまたはピペットの場合、これは、適切な所定量の溶液または懸濁液を患者に投与することによって達成されてもよい。スプレーの場合、これは、例えば定量噴霧スプレーポンプなどにより達成されてよい。
【００５１】
気道への投与はまた、エアロゾル製剤により達成されてもよく、化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンもしくはジクロロテトラフルオロエタンなどのクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、二酸化炭素または他の適切な気体のなどのような適切な噴霧剤を用いた加圧パックで提供されてもよい。エアロゾルには、通常、レシチンのような界面活性剤も含んでよい。活性化合物の量は、定量バルブの提供により制御されてもよい。
【００５２】
あるいは、活性化合物は、乾燥粉末の形態、例えば、ラクトース、デンプン、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなデンプン誘導体、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような適切な粉末基材において化合物の粉末混合物の形態で提供されてもよい。通常、粉末担体は、鼻腔内においてゲルを形成するだろう。粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセルもしくはカートリッジまたは粉末が吸入器により投与されるブリスターパックの単位用量形態で提供されてもよい。
【００５３】
鼻腔内製剤を含む気道投与用の製剤において、活性化合物は、例えば５ミクロン以下のオーダーの一般的に小さい粒子サイズを有するだろう。当該粒子サイズは、当業者に公知の方法、例えば微粉化により得てもよい。
【００５４】
所望される場合には、活性化合物が徐放されるように適応した製剤が用いられてもよい。
活性化合物は、「ディスクへラー」（グラクソグループリミテッドの商標）または定量エアロゾル吸入器を介して、流動性の粉末として経口吸入により投与されてよい。
【００５５】
本発明の化合物は、薬物の直腸投与のための坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、常温で固体であるが直腸の温度で液体になる適切な非刺激性の賦形剤と薬物を混合することにより調製されることができ、それ故、直腸で溶解して薬物を放出する。このような物質は、ココアバターおよびポリエチレングルコールである。
【００５６】
膣投与に適した組成物は、適切であるとして当該分野で公知である担体を、活性成分に加えて含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレーとして提供されてもよい。
【００５７】
局所的な使用のために、本発明の化合物を含むクリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液等が用いられる。この適用の目的のために、局所的な適用は、洗口剤および含嗽剤を含むことができる。
【００５８】
目への適用のために、活性化合物は、適切な無菌の水性もしくは非水性ビヒクルの溶液または懸濁液の形態であってもよい。例えば、緩衝剤、殺菌剤および殺真菌剤などを含む、例えば、フェニル酢酸水銀もしくは硝酸塩、塩化ベンザルコニウムまたはクロルヘキシジンなどのような保存剤、およびヒプロメロースのような増粘剤といった添加剤も含まれていてもよい。
【００５９】
本発明の化合物は、リポソームの形態で投与されてもよい。当該分野で公知のように、リポソームは、一般的に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒質中に分散したモノラメラーまたはマルチラメラーの水和した液晶により形成される。リポソームを形成することができる任意の非毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤等を含むことができる。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリンである。リポソームを形成する方法は、当該分野で公知である。
【００６０】
本発明の化合物は、獣医学の組成物の形態で使用するために提供されてもよく、例えば、当該分野における従来の方法により調製されてよい。当該獣医学の組成物の例には、
（ａ）経口投与、例えば水薬（例えば水性もしくは非水性の水剤または懸濁剤）のような外用剤；錠剤またはボーラス；飼料原料と混合するための粉末、顆粒またはペレット；舌に適用するためのペースト；
（ｂ）例えば無菌の溶液または懸濁液として、例えば、皮下、筋肉もしくは静脈注射による非経口投与；または（適切な場合）懸濁液もしくは溶液を乳首を介して乳房に導入する乳房内注入による非経口投与；
（ｃ）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏もしくはスプレーとして局所的適用；または
（ｄ）例えば、ペッサリー、クリームもしくは泡として直腸または膣内適用、に適合したものを含む。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、さらに、上述した病態の治療において通常使用される、本願で述べるような他の治療学的に活性な化合物を含んでもよい。併用療法において使用するための適切な薬剤の選択は、従来の薬学的原理に従って、当業者によりなされ得る。治療剤の組み合わせは、上述した種々の疾患の治療または予防に効果的であるように相乗的に作用し得る。このアプローチを用いることにより、各薬剤をより低い用量で用いて治療的な効果を達成し、これにより副作用に対する可能性を低下させられる可能性がある。
【００６２】
他の治療剤の例には以下を含む；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、アンブリセンタン、ボセンタン、シタキセンタン）、ＰＤＥ−Ｖ阻害剤 (例えば、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル)、カルシウムチャネルブロッカー (例えば、アムロジピン、フェロジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、メントール)、プロスタサイクリン、トレプロスチニル（ｔｒｅｐｒｏｓｔｉｎｉｌ）、イロプロスト、ベラプロスト、一酸化窒素、酸素、ヘパリン、ワルファリン、利尿薬、ジゴキシン、シクロスポリン（例えばシクロスポリンＡ）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＩＣＡＭ３のような抗体、抗ＩＬ−２受容体（抗Ｔａｃ）、抗ＣＤ４５ＲＢ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、ＣＤ４０および／またはｇｐ３９に対して特異的な抗体のように、ＣＤ４０とｇｐ３９（すなわちＣＤ１５４）との間の相互作用を遮断する薬剤、ＣＤ４０およびｇｐ３９（ＣＤ４０１ｇおよびＣＤ８ｇｐ３９）から構成される融合タンパク質、デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ  （ＤＳＧ））のようなＮＦ−κＢ機能の核転位阻害剤のような阻害剤、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤（ロバスタチンおよびシンバスタチン）のようなコレステロール生合成阻害剤、イブプロフェン、アスピリンのような非ステロイド性消炎鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン、レフルノミド、デオキシスペルグアリン、セレコキシブのようなシクロオキシゲナーゼ阻害剤、プレドニゾロンもしくはデキサメタゾンのようなステロイド、金化合物、サルブタモールのようなβ−アゴニスト、サルメテロールのようなＬＡＢＡ’ｓ、モンテルカストのようなロイコトリエンアンタゴニスト、メトトレキサートのような増殖阻害剤、ＦＫ５０６（タクロリムス、プログラフ（登録商標）)、ミコフェノール酸モフェチル、例えば、アザチオプリン、ＶＰ−１６、エトポシド、フルダラビン、ドキソルビン、アドリアマイシン、アムサクリン、カンプトセシン、シタラビン、ゲムシタビン、フルオロデオキシウリジン、メルファランおよびシクロホスファミドのような細胞障害性薬剤、メトトレキサートのような代謝拮抗薬、カンプトセシンのようなトポイソメラーゼ阻害剤、シスプラチンのようなＤＮＡアルキル化剤、ソラフェニブのようなキナーゼ阻害剤、パクリタキセルのような微小管毒素、テニダップのようなＴＮＦ−α阻害剤、抗ＴＮＦ抗体もしくは可溶性ＴＮＦ受容体、ヒドロキシウレアおよびラパマイシン(シロリムスもしくはラパミューン（登録商標）)、またはそれらの誘導体。
【００６３】
一つの実施形態において、ＭＭ患者は、ＣＹＴ３８７または関連化合物とメルファランとの組み合わせで治療される。
別の実施形態において、ＭＭ患者は、ＣＹＴ３８７または関連化合物とボルテゾミブとの組み合わせで治療される。
【００６４】
本発明の化合物と組み合わせて他の治療剤が使用される場合、それらは、例えば、米国医師用卓上参考書（ＰＤＲ）に記載の量、または当業者により決定された量で使用されてもよい。
【００６５】
好ましい実施形態において、本願方法は、メルファランおよびボルテゾミブから選択される化合物と組み合わせてＣＹＴ３８７を利用する。
本願発明はまた、ＭＭを治療するために効果的な量でＣＹＴ３８７または関連化合物を含む容器を含む製品およびキットの両方を提供する。容器は、経口投与形態の本発明の化合物を含む単なるボトルであってもよく、各投与形態には、例えば２００ｍｇまたは３００ｍｇなど約５０ｍｇから４００ｍｇの量の本発明の化合物の単位用量を含む。キットはさらに、治療患者を選択する本願方法を教示する印刷された指示書を含む。製品は、患者を選別する本願方法に従って患者の治療を指示するラベルまたはそれと同様のものを含むだろう。
【００６６】
一般的に、「治療」という用語は、患者、組織もしくは細胞に影響を与え、望ましい薬理学的および／または生理学的な効果を得ることを意味し：（ａ）疾患になる可能性があるが、まだ疾患を有するとは診断されていない患者において疾患が発生するのを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち疾患の進展を抑制すること；または（ｃ）疾患の影響を軽減もしくは改善すること、すなわち疾患の影響の軽減を生じさせることを含む。一つの実施形態において、治療は、レシピエント患者におけるＣＤ４５−および／またはＩＬ−６非応答性ＭＭ細胞集団の減少という結果を達成する。
【００６７】
「患者」という用語は、本願方法で治療することが必要な疾患を有する任意の動物をさす。ヒトのような霊長類に加え、種々の他の哺乳類が、本発明の方法を用いて治療されることができる。例えば、限定するものではないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラットまたは他のウシ種、ヒツジ種、ウマ種、イヌ種、ネコ種、げっ歯類もしくはマウス種を含む哺乳類が治療されることができる。特に犬は、多発性骨髄腫を発症することが知られている。
【００６８】
「投与する」という用語は、治療を必要とする患者に本発明の化合物を提供することを意味すると解されるべきである。
「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師もしくは他の臨床医により探究されている組織、系、動物もしくはヒトの生物学的または医学的な応答を誘発するだろう本発明の化合物の量を意味する。
【００６９】
多発性骨髄腫の治療または予防において、適切な化合物用量レベルは、一般
的に、１日当り患者の体重kg当り約０．０１〜５００ｍｇであるだろうし、単一または複数用量で投与されることができる。好ましくは、用量レベルは、１日当り約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは、１日当り約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇであるだろう。適切な用量レベルは、１日当り約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日当り約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１日当り約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。この範囲内において、用量は、１日当り０．０５〜０．５、０．５〜５または５〜５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。経口投与のために、組成物は、好ましくは、１．０〜１０００ｍｇの活性成分、特に、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、および１０００．０ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供される。用量は、例えばこれら範囲内の任意の用量で、治療される患者に対する治療効果および／または症状による用量の調節により選択されてもよい。化合物は、好ましくは、１日に１〜４回、好ましくは１日に１回または２回投与されるだろう。
【００７０】
任意の特定の患者に対する特異的な用量レベルおよび投与頻度変更することができ、使用される特異的な化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与の形態および時間、排出速度、薬物の併用、特定の状態の重篤度、および治療を受けているホストを含む様々な要因に依存するだろう。
【００７１】
本発明の性質をより明確に理解されるように実証するために、以下の非限定的な実施例を提供する。
本明細書に記載したすべての刊行物は参照により本明細書に組み込まれる。幅広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示される本発明に、多くの変更および/または改変を加えることができることは当業者によって理解されるだろう。したがって本発明の実施形態は、全ての点において例示的なものであり、限定的なものでないと見なすべきである。
［実施例］
ＣＹＴ３８７は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２キナーゼ酵素の阻害剤であり、骨髄線維症を含む骨髄増殖性腫瘍として知られている血液学的な病気のファミリーに、その上、血液性疾患、腫瘍および炎症性疾患における兆候を含む多くの疾患に関係している。骨髄線維症は慢性消耗性疾患であり、骨髄線維症の患者の骨髄は、瘢痕組織に置き換えられ、そしてそのために治療の選択肢は、制限されるか不満足なものである。
［ＣＹＴ３８７の合成］
４−エトキシカルボニルフェニルボロン酸（２３．１１ｇ，１１９ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロピリミジン（１６．９０ｇ，１１３ｍｍｏｌ）、トルエン（２３０ｍｌ）および含水炭酸ナトリウム（２Ｍ，５６ｍｌ）の混合物を激しく撹拌し、その懸濁液中で窒素を１５分間泡立てた。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム［０］（２．６１ｇ，２．２６ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物中で窒素をさらに１０分間泡立て、その混合物を１００℃まで加熱した後、７５℃で一晩加熱した。混合物を冷却し、酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈し、水（１００ｍｌ）を加え、そして生じた層を分離した。水層を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出し、抽出した二つの有機抽出物を合わせた。有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムを通してろ過し、濃縮し、結果として得られる固体をメタノール（１００ｍｌ）を加えて粉末にし、ろ過した。固体をメタノール（２×３０ｍｌ）で洗浄し、空気乾燥した。得られた物質をアセトニトリル（１５０ｍｌ）とジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解し、ＭＰ．ＴＭＴ  Ｐｄ−捕捉樹脂（Ａｇｒｏｎａｕｔ  品番８００４７１）（７．５ｇ）と２日間撹拌した。溶液をろ過し、得られた固体をジクロロメタン（２×１００ｍｌ）で洗浄し、ろ液を濃縮し、オフホワイトの固体としてエチル４−（２−クロロピリミジン−４−イル）ベンゾエートを得た（１７．７３ｇ，６０％）。ジクロロメタンで追加洗浄し、１．３８ｇおよび０．５ｇの生成物をさらに得た。
【００７２】
エチル４−（２−クロロピリミジン−４−イル）ベンゾエート（２６．１５ｇ，９９．７ｍｍｏｌ）および４−モルホリノアニリン（２３．１０ｇ，１２９．６ｍｍｏｌ）の混合物を、１，４−ジオキサン（２５０ｍｌ）中に懸濁した。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１７．０７ｇ，８９．７３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０時間加熱還流し、室温まで冷却し、濃縮し、その後残渣を、酢酸エチルと１：１の飽和炭酸水素ナトリウム／水（全量１Ｌ）の間で分配した。有機相を水（２×１００ｍｌ）で洗浄し、濃縮した。水相をジクロロメタン（３×２００ｍｌ）で抽出した。このワークアップの間に沈殿した物質をろ過によって集め、取っておいた。液体有機物を混合して濃縮し、メタノール（２００ｍｌ）を加えて粉末にして、ろ過し、追加の黄色固体を得た。得られた固体を混合して、メタノール（５００ｍｌ）中に懸濁し、一晩静置させた後、超音波処理してろ過した。固体をメタノール（２×５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥後、エチル４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンゾエート（３５．３９ｇ，８８％）を得た。
【００７３】
３：１のメタノール／テトラヒドロフラン（３５０ｍｌ）中にエチル４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）ベンゾエート（３５．３９ｇ，８７．６ｍｍｏｌ）を有する溶液を、水（９０ｍｌ）中で水酸化リチウム（４．４１ｇ，１８３．９ｍｍｏｌ）を用いて処理した。混合物を２時間加熱還流し、冷却し、濃縮し、塩酸（２Ｍ，９２．５ｍｌ，１８５ｍｍｏｌ）を用いて酸性化した。暗色の沈殿物をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥した。得られた固体を、乳鉢と乳棒を用いて粉にし、メタノール（５００ｍｌ）を加えて粉にした後、再びろ過し、泥状の固体として４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）安息香酸を得た。得られた物質をエーテルで洗浄し、一晩空気乾燥させ、乳鉢と乳棒を用いて微粉にした。質量回収率（ｍａｓｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）（３４．４９ｇ）に基づいて、収率は定量的であると推定された。
【００７４】
ＤＭＦ（４００ｍｌ）中に４−（２−（４−モルホリノフェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）安息香酸（理論的に３２．５９ｇ，８６．６ｍｍｏｌ）を有する懸濁液にトリエチルアミン（７２．４ｍｌ，５１９．６ｍｍｏｌ，６ｅｑ）を加えた。混合物は、溶解を確実にするために超音波処理された。アミノアセトニトリル塩酸塩（１６．０２ｇ，１７３．２ｍｍｏｌ）を加えて、続いてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（無水，１４．０４ｇ，１０３．８ｍｍｏｌ）、および１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１９．９２ｇ，１０３．８ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を一晩激しく撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を５％炭酸水素ナトリウム（４００ｍｌ）および水（３００ｍｌ）で希釈し、黄色固体を得た。その黄色固体を細かくし、ろ過した。得られた固体を、水１００ｍｌ部で数回洗浄し、温かいメタノール／ジクロロメタン（５００ｍｌ，１：１）で粉末にし、約３００ｍｌの体積に濃縮し、冷却してろ過した。固体を乾燥前に冷メタノール（３×１００ｍｌ）、エーテル（２００ｍｌ）、およびヘキサン（２００ｍｌ）で洗浄し、ＣＹＴ３８７（３１．６９ｇ，８８％）を得た。Ｍ．ｐ．２３８−２４３℃。
【００７５】
関連する化合物の合成は、Ｂｕｒｎｓら著のＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００９，１９：５８８７、および国際公開第ＷＯ２００８／１０９９４３号に記載されており、両文献の開示内容を、本願に引用して援用する。
［材料および方法］
［試薬］
ＪＡＫ１／２阻害剤ＣＹＴ３８７をＤＭＳＯに溶解した。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（ヤンセン−シラグ社（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ））を生理食塩水で、再構成した。アルキル化剤メルファラン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を０．５％ＨＣｌ．ＥｔＯＨに溶解した。すべてのストック薬液を、完全なＲＰＭＩ−１６４０培地で実験のための様々な濃度に希釈した。
［細胞株および培養条件］
ＨＭＣＬ  ＬＰ−１、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＰＭ２、ＲＰＭＩ−８２２６、およびＵ２６６、並びにヒト間質細胞株ＨＳ５を、米国に所在するアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得た。ＡＮＢＬ６、ＯＣＩ−ＭＹ１およびＸＧ−１を米国アーカンソー州（Ａｒｋａｎｓａｓ）に所在するウィンスロップ  ピー  ロックフェラー癌研究所（Ｗｉｎｔｈｒｏｐ  Ｐ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から譲り受けた。ＨＭＣＬは、１０％熱失活させたウシ胎児血清（ＦＢＳ，ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））および２ｍＭＬグルタミン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標），インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標），インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で２．０〜５．０×１０５細胞／ｍｌの間の密度に成長および処理された。ＩＬ−６依存性細胞株を、必要に応じて２〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と培養した。すべての細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で３７℃で培養した。すべてのＨＭＣＬを、高い生存性および循環を確実にするために、実験のセットアップ前に２４時間経過させた。
［一次試料］
一次ＭＭ試料を、アルフレッドホスピタル（Ａｌｆｒｅｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）研究および倫理委員会の認可を受けた書面によるインフォームドコンセントにしたがって、再発性のＭＭ患者および難治性のＭＭ患者の骨髄穿刺液から得て、上述したように単離および処理した［２５］。簡潔に云えば、骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）を、フィコール−パック  プラス（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ）（アマシャム  バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離し、ＰＢＳで洗浄し、赤血球をＮＨ４Ｃｌ溶液（８．２９ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、０．０３７ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ  炭酸水素カリウム）で溶解した。細胞をその後、ＰＢＳで再度洗浄し、血球計算機によって定量化した。ＢＭＭＣ試料をその後、完全なＲＰＭＩ−１６４０培地（上記ＨＭＣＬのように）で２４時間培養した。続いて、ＢＭＭＣを５×１０５細胞／ｍｌで蒔き、ＣＹＴ３８７（５〜５０μＭ）単独または（細胞数に依存して）ボルテゾミブ（５〜４０ｎＭ）またはメルファラン（５０〜２００μＭ）と混合して、２４時間および／または４８時間処理した。薬物誘導ＭＭ特異的細胞アポトーシスをその後、ＣＤ４５  ＦＩＴＣ（ＢＤ）、ＣＤ３８ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ）、およびＡｐｏ２．７ＰＥ（イムノテック社（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ））で染色することによって未処理、およびビヒクルコントロールと比較し、ＣＤ４５−ＣＤ３８＋ＭＭ細胞におけるアポトーシスを決定した。試料を続いてＦＡＣＳによって分析した。一次骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）をまた、患者のＢＭＭＣから集め、初めの２４時間培養後のフラスコに付着した細胞は、いくつかの継代にわたって付着した細胞の連続的な選抜を伴って培養された。細胞が培養中で拡大されると、それらはＨＳ５間質細胞を利用する実験と並行してＭＭ細胞を刺激するための共培養（ＣＣ）で使用された。
［ウェスタンブロット（ＷＢ）］
ＨＭＣＬをＣＹＴ３８７（１または２μＭ）で６０分間処理し、その後１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−６で１５分間刺激した。ＣＹＴ３８７で処理されたＨＭＣＬのタンパク質溶解物およびＣＹＴ３８７未処理のＨＭＣＬのタンパク質溶解物をＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ）で調製した。簡潔に云えば、細胞をＲＩＰＡバッファーで氷上で３０〜６０分間インキュベートし、１６，０００×ｇ２０分間４℃で遠心分離し、上清を集めた。タンパク質濃縮物をＤＣプロテインアッセイ（バイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて製造者の指示にしたがって定量化した。次に、各タンパク質溶解物の１００μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、バイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のセミドライ転写システム（ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いてニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））にブロッティングした。膜を、５％スキムミルク粉末０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで６０分間ブロッキングし、その後、マウスモノクローナル抗ホスホ−ＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５、サンタクルーズ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、マウスモノクローナル抗−ＳＴＡＴ３（サンタクルーズ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））またはマウスモノクローナル抗−α−チューブリン（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて１〜２時間室温でもしくは４℃で一晩インキュベートした。ブロットを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで１５分間３回洗浄し、その後、二次ＨＲＰタグ抗体（ブタ抗ウサギＩｇＨＲＰ（ダコ社（Ｄａｋｏ）またはウサギ抗マウスＩｇＨＲＰ（ダコ社（Ｄａｋｏ））と１〜２時間室温でインキュベートし、上記のように洗浄した。ブロットをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ウェストピコＥＣＬ試薬（ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ  ＥＣＬ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））で可視化した。
［細胞内ＦＡＣＳ］
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、およびＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化を、細胞内フローサイトメトリーを用いて調査し、チロシン７０５（ｐ−ＳＴＡＴ３）でのＳＴＡＴ３リン酸化、セリン４７３（ｐ−ＡＫＴ）でのＡＫＴリン酸化、ならびにスレオニン２０２およびチロシン２０４（ｐ−ＥＲＫ）でのＥＲＫ１／２のリン酸化を測定した。ＨＭＣＬは、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６±２００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１と単独で刺激され、または、ＣＹＴ３８７処理を伴うもしくは伴わないＨＢ５間質細胞または一次ＢＭＳＣとのＣＣで刺激された。ＣＣ  ＨＳ５および一次ＢＭＳＣを２４ウェルプレートに２×１０５細胞／ｍｌで蒔き、４時間株化させた後、ＣＤ３８またはＣＤ１３８ＦＩＴＣ（ＢＤ）で前染色されてＨＭＣＬを加えた。ＭＭ細胞を単独（１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６もしくは５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、および１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１）またはＣＣで（間質と直接ＣＣまたは間質とトランスウェル（ＴＷ）ＣＣ）、６０分間のＣＹＴ３８７前処理、または１５分間ＣＹＴ共処理のどちらかを伴うまたは伴わないで刺激した。刺激±処理後、ＭＭ細胞を採取し、２％パラホルムアルデヒドで１０〜３０分間固定し、洗浄し、その後一晩メタノールで透過処理した。メタノールを洗い流し、細胞をｐ−ＳＴＡＴ３  ＰＥ（ＢＤ）、ｐ−ＡＫＴ  ＰＥ（ＢＤ）、またはｐ−ＥＲＫ（ＢＤ）で再懸濁し、４５〜６０分間室温で染色した。非結合抗体を洗い流し、細胞を２％ＦＢＳ  ＰＢＳで再懸濁し、ＦＡＣＳによって得た。
［増殖および生死判別試験］
ＣＹＴ３８７処理ＨＭＣＬおよび未処理／ビヒクルコントロールの生存能力および増殖を上述のような様々な方法を用いて決定した［２６］。増殖を、８ＨＭＣＬパネルでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）アクオス  ワン  ソリューション  セル  プロリフェレーション  アッセイ（ＡＱｅｏｕｓ  ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）ＭＴＳ試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて最初に測定した。細胞を、ＣＹＴ３８７（０．１〜５μＭ）と２４、４８、および７２時間、９６ウェルプレートで１００μｌの新鮮培地で、２．０×１０５細胞／ｍｌに培養した。ＭＴＳ試薬２０μｌを、処置の最後の４時間に加えて、プレートをフロースター  オプティマ  プレート  リーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（ＢＭＧラボテック社（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ））を用いて４９０ｎｍで読んだ。ＩＬ−６共処理行ったＣＹＴ３８７で処理した５ＨＭＣＬパネルの生存細胞数、およびＩＬ−６共処理を行っていないＣＹＴ３８７で処理した５ＨＭＣＬパネルの生存細胞数も、トリパンブルー染色および血球計算機カウントによって測定した。その後、ＨＭＣＬ  ＮＣＩ−９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６をさらなる分析のために選択した。ＣＹＴ３８７処理細胞のアポトーシスを、アネキシン−Ｖおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色してＦＡＣＳによって評価した。ＨＭＣＬを１μＭまたは５μＭＣＹＴ３８７を用いて２４時間または７２時間処理し、その後採取し、アネキシンバッファー（０．０１ＨＥＰＥＳ，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で３０分間アネキシンバッファーから成るアネキシン−Ｖ  ＦＩＴＣ（バイオソース社（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で染色した。非結合抗体をその後アネキシンバッファーで洗い流し、細胞を６２．５ｎｇ／ｍｌ  ＰＩ（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））のアネキシンバッファーで再懸濁し、ＦＡＣＳによって分析した。
【００７６】
相乗効果実験のために、採取前に、ＨＭＬＣを、２４時間および４８時間、ボルテゾミブまたはメルファランと組み合わせてＣＹＴ３８７と処理し、６２．５ｎｇ／ｍｌ  ＰＩ（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で補充されたＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中、０．５％ＨＩ  ＦＢＳ）で再懸濁した。細胞をすぐにＦＡＣＳによって分析した。ＰＩポジティブ細胞の比率を、未処理細胞のバックグラウンドの死を差し引くことによって定量化した。単一薬物処理した細胞を、複合処理した細胞と比較し、相乗作用をカルクシン（Ｃａｌｃｕｓｙｎ）ソフトウェア（バイオソフト社）を用いて計算した。
［細胞周期］
ＨＭＣＬ細胞周期におけるＣＹＴ３８７処理の効果を２４時間後および７２時間後に測定した。ＣＹＴ３８７（１μＭまたは５μＭ）処理したＨＭＣＬおよびＣＹＴ３８７（１μＭまたは５μＭ）未処理のＨＭＣＬを採取し、ＰＢＳで洗浄し、１００μｌＰＢＳで再懸濁した。細胞を、ボルテックスしながら７０％低温エタノールの１ｍｌで固定した。試験管を分析まで−２０℃で保存した。すべての試料を試験管に集めた後、１０分間５００×ｇで遠心分離し、上清を注意深く除去し、細胞を５ｍｌＰＢＳで洗浄した。最後の洗浄の後、細胞を２５０〜５００μｌのＰＩ／ＲＮａｓｅ染色バッファー（ＢＤ）で再懸濁し、１５分間室温で暗室中でインキュベートして、ＦＡＣＳによって分析した。
［データ分析］
すべてのＦＡＣＳデータをＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで、およびＦｌｏｗｊｏ７．６ソフトウェア（米国に所在するツリースター社（Ｔｒｅｅｓｔａｒ））用いて行なわれるデータ解析で得た。すべての統計学的分析は、グラフパッド  プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ）５．０３ソフトウェア（米国）を用いて行った。
［結果］
ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してＣＹＴ３８７ＩＬ−６シグナル伝達によって阻害され、ＳＴＡＴ３をリン酸化するためにＪＡＫ２を誘導する受容体へのＩＬ−６結合を伴うＭＭ細胞でよく特徴づけられる。ＣＹＴ３８７のＪＡＫ２を阻害する能力が、ウェスタンブロッティングおよびＦＡＣＳによってＳＴＡＴ３リン酸化のレベルを測定することによって、最初に確認された。ＨＭＣＬ（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１およびＵ２６６）を、１時間ＣＹＴ３８７を用いてインキュベートし、１５分間ＩＬ−６で刺激し、ｐ−ＳＴＡＴ３を誘導した。ＣＹＴ３８７（０．５〜２μＭ）は、ＦＡＣＳ（図１Ａ）によって実証およびウェスタンブロッティング（図１Ｂ）によって確認されたようにＩＬ−６刺激されたサンプルにおいてＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。すべてのＳＴＡＴ３タンパク質は、影響されなかった。
【００７７】
ＭＭの成長および生存におけるＢＭＭＥの重要性を考慮すると、ＣＹＴ３８７が、ＢＭＳＣとＣＣでＭＭ細胞におけるシグナル伝達を同様に調節するかどうかをはっきりさせることが重要であった。これは不死化ＢＭＳＣ（ＨＳ５）および一次患者ＢＭＳＣの両方で行われた。各ケースにおいて、ＢＭＳＣと１５分間のＣＣ（接触を伴う、または伴わない）は、ＭＭ細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導することができ、一方、ＣＹＴ３８７との同時処理は、ＨＭＣＬにおけるｐ−ＳＴＡＴ３の量を劇的に減少させた（図１Ｃ）。したがって、ＣＹＴ３８７は、ＭＭ−ＢＭＳＣ微環境内の可溶性によって、またＢＭＳＣによってＭＭに提供された接触を介したシグナル伝達によって誘導されたＭＭ細胞におけるＳＴＡＴ３活性化を予防することができることを示している。
［ＣＹＴ３８７は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害する］
ＪＡＫシグナル伝達キナーゼは、たくさんの細胞経路に関与しており、このことは、我々にＩＬ−６およびＩＧＦ−１誘導ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴならびにＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６細胞におけるＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達でのＣＹＴ３８７の影響を調査させた（図１Ｄ）。ＯＣＩ−ＭＹ１は、ＣＹＴ３８７共処理によって大きく減少したＩＬ−６およびＩＧＦ−１刺激の後、明らかなｐ−ＡＫＴ活性を示した。ＩＬ−６およびＩＧＦ−１刺激は、ＣＹＴ３８７によって大きく阻害されたＵ２６６細胞でのｐ−ＥＲＫを誘導した。ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫのレベルは、ＮＣＩ−Ｈ９２９におけるＩＬ−６およびＩＧＦ−１刺激に対して、わずかな上昇を示したのみであった。
［ＣＹＴ３８７はＨＭＣＬにおける増殖を阻害する］
細胞増殖でのＣＹＴ３８７（０．１〜５μＭ）の効果は、８個のＨＭＣＬ（ＩＬ−６非応答性表現型−ＬＰ−１、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＰＭ２、ＲＰＭＩ−８２６６、およびＩＬ−６応答性表現型−ＡＮＢＬ−６、ＯＣＩ−ＭＹ１、Ｕ２６６、およびＸＧ−１）のパネルで２４時間、４８時間、および７２時間でＭＴＳ分析によって測定された。８個のＨＭＣＬのうち６個は、２４時間以内にいくつかのＨＭＣＬにおける阻害を伴うＣＹＴ３８７に対して時間および用量依存的応答を有した。７２時間で、ＮＣＩ−Ｈ９２９、およびＸＧ−１は、ＣＹＴ３８７処理に対して最も感受性があった。
【００７８】
７２時間にわたってＣＹＴ３８７と培養したＨＭＣＬの増殖は、血球計算機によって生存細胞数の定量化によっても評価された（図２Ｂ）。ＩＬ−６シグナル伝達およびＣＹＴ３８７によるＪＡＫ２の阻害との間の明らかな関連性のため、３個のＨＭＣＬ（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６）の増殖をＩＬ−６および／またはＣＹＴ３８７を添加して測定した。１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６およびＣＹＴ３８７（０．５〜１μＭ）を補充する、または補充しない完全培地における３個のＨＭＣＬ増殖ウェルは、ＩＬ−６の存在下でさえ、培養中にＨＭＣＬの増殖を減少させることができた。ＣＹＴ３８７は、７２時間後、５０％ＮＣＩ−Ｈ９２９（１μＭ）、５０％ＯＣＩ−ＭＹ１（０．５μＭ）、および４４％Ｕ２６６（１μＭ）によって細胞増殖を阻害した。
［ＣＹＴ３８７を用いたＨＭＣＬの処理は、結果として細胞周期のＧ２／Ｍ期における細胞の蓄積を生じる］
ＣＹＴ３８７の抗増殖効果は、ＣＹＴ３８７で処理されたＨＭＣＬの細胞周期を評価することによってさらに特徴づけられた。ＣＹＴ３８７（１〜５μＭ）で処理されたＨＭＣＬ（ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６）は、細胞周期のＧ２／Ｍ期における細胞の著しい蓄積を示した。これは、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞で最も顕著であり（図２Ｃ）、ここで、未処理のまたは２４時間、および７２時間処理後にビヒクル処理したコントロールと比較して、薬物処理した試料において２倍を超えるＧ２／Ｍの細胞の増加があった。付加的なポリプロイド集団が、ＣＹＴ３８７処理試料で発見され、ＣＹＴ３８７処理は、ＭＭ細胞の通常の細胞周期からさらなる異常を引き起こすことを示唆している。
［ＣＹＴ３８７は、ＨＭＣＬおよび一次ＭＭ細胞におけるアポトーシスを誘導する］
ＣＹＴ３８７処理細胞のアポトーシスを３個のＨＭＣＬ（ＮＣＩＨ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６）においてアネキシン−Ｖ／ヨウ化プロピジウムＦＡＣＳ染色を用いて調査した。アポトーシス細胞の増加した比率を３個すべてのＨＭＣＬで検出し、アポトーシス細胞の増加した比率はＮＣＩ−Ｈ９２９において最も顕著であり（図３Ａ）、５μＭ  ＣＹＴ３８７で処理後、２４時間および７２時間で検出された生存細胞がそれぞれ２１％および５２％減少した（図３Ｂ）。混合療法の一環としてＣＹＴ３８７を評価するために、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＯＣＩ−ＭＹ１、およびＵ２６６を、各薬物の用量効果曲線を確立するためにＣＹＴ３８７、ボルテゾミブ、メルファランの用量範囲で処理し、ＣＹＴ３８７と結合させ、カルクシン（Ｃａｌｃｕｓｙｎ）（商標）ソフトフェアを用いて相乗作用を測定した。各化合物の線量効果曲線（メルファラン、およびボルテゾミブのデータは示されていない）は、時間および用量依存的に３個のＨＭＣＬでＣＹＴ３８７（０．５〜１０μＭ）誘導アポトーシスを示す（図４Ａ）。ＣＹＴ３８７は、ボルテゾミブおよびメルファランの両方で相乗作用を示したが、異なる薬物用量および分析時点において、相乗作用のレベルのばらつきが見られた（図４Ｂ）。
【００７９】
エキソビボ一次ＭＭ細胞でのＣＹＴ３８７の効果も、単一薬剤および混合療法の一部分として調査した。ＭＭ患者ＢＭＡを２４時間および４８時間様々な用量のＣＹＴ３８７（５〜５０μＭ）と培養し、その後ＣＤ３８＋ＣＤ４５−ＭＭ細胞集団を、フローサイトメトリーによってアポトーシスを評価した。６人の患者に処理し、アポトーシスは、４８時間後に２０μＭ  ＣＹＴ３８７で処理されたＭＭ細胞の５〜５９％で見られた（図５Ａ）。メルファランおよびボルテゾミブと混合したＣＹＴ３８７の効果も調査した。ＣＹＴ３８７は、２／３の患者でメルファランと相乗作用をすることが示され、相乗作用はまた、数人の患者／用量においてボルテゾミブでも観察された（図５Ｂ）。
［考察］
証拠の複数の線は、いくつかのＭＭ細胞のＩＬ−６依存を示す実験を含むＭＭにおけるＩＬ−６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の役割、ＩＬ−６を用いたＭＭ細胞の増殖の上方調節、ＩＬ−６による薬物誘導アポトーシスの阻害、およびこの調査で最も重要なＩＬ−６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害によるＭＭ細胞におけるアポトーシスの直接誘導を裏付けた。これらのデータおよびＢＭＭＥにおける多数のＩＬ−６は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を新たな化学療法での阻害の合理的な標的とし、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のｓｉＲＮＡ標的によるＭＭ細胞アポトーシス誘導を示した予備インビトロ研究によって裏付けられる［２７］。さらに、他の重要な経路におけるＪＡＫのシグナル伝達の役割［５のレビュー］、および他の血液系腫瘍におけるＪＡＫ変異の生存促進性効果［１〜４］には、すでにＪＡＫ阻害の治療有効性が証明されている。治療的挑戦は、それからＩＬ−６またはＢＭＳＣの存在下でＭＭ細胞を阻害することである。ここで、我々は、ＨＭＣＬのより広範囲の研究によって、ＣＹＴ３８７が共培養モデルにおいてＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性化を阻害することができることを証明することによって、および一次ＭＭ腫瘍細胞に対するＣＹＴ３８７の効果を証明することによって、ＭＭにおけるＪＡＫ阻害を評価する前研究を拡大した。ＭＭの初期では悪性細胞がＣＤ４５＋優性であるが、より進行すると、薬物耐性疾患であり、ＣＤ４５−ＭＭ細胞が優勢であるという仮説が立てられている［２８］。さらに、ＣＤ４５−ＭＭ細胞はＩＬ−６応答性が低いと考えられ、ＣＤ４５＋ＭＭよりより少ないＩＬ−６受容体を発現する［２９］。ＪＡＫ阻害の他の研究は、ＣＤ４５＋ＩＬ−６応答性ＨＭＣＬでの優位性に焦点があてられており、これは予備研究に関する論理的な焦点であるが、そのような標的細胞集団はＭＭ細胞の一部にすぎないということを強調しなければならない。さらに、患者は、ＣＤ４５−とＣＤ４５＋ＭＭ細胞の両方の混合集団を示すこともある［２９］。重要なことは、我々は、ＮＣＩ−Ｈ９２９に対する、またＩＬ−６非応答性表現型を有すると考えられるＨＭＣＬに対するＣＹＴ３８７の効果を示し、これは、ＣＹＴ３８７がＭＭ表現型のある範囲に対して効果的であるだろうと示唆しており、これに対し、他のもの［１９］は、代替的なＪＡＫ阻害剤を用いてＣＤ４５−ＭＭに対して、限定的な成功のみを報告している。いくつかのＨＭＣＬおよび一次ＭＭ腫瘍細胞に対するＣＹＴ３８７とボルテゾミブまたはメルファランとの相乗作用を示す我々のデータは、以前公表された研究を裏付ける［１９］。
【００８０】
有効データは、ＭＭ細胞におけるＪＡＫの阻害は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の直接阻害以外の下流での効果を有し得ることを示唆している。ＭＭ細胞生存においてＩＬ−６の重要性は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路においてよく特徴づけられているが、今、ＩＬ−６誘導ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化［１８、３０］、および様々なＨＭＣＬにおけるＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化［２０，３０〜３３］の証拠が増えている。ＭＭにおけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に加えて、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の確立した重要性を考慮すると、３個全てを調節することが可能な小分子阻害剤は、巨大な臨床的有効性を有する可能性がある。
【００８１】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＲａｓ／ＭＡＰＫ経路でのＪＡＫ阻害剤の効果を研究することは、対照的な結果を生んだ。ＡＺＤ１４８０およびＡＧ４９０は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫの活性化を誘導するＩＬ−６を減少させることが示された［２０、２２］が、他のものに依存するＡＧ４９０は、ＩＬ−６誘導Ｒａｓ／ＭＡＰＫ活性化の減少を示さなかった［３１］。ＪＡＫ阻害剤ＩＮＣＢ２０は、ＭＭ．１Ｓ細胞におけるＩＬ−６誘導Ｒａｓ／ＭＡＰＫ活性化を阻害することが可能であったが、ＩＮＡ−６−細胞における構成的なＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化には影響しなかった［１８］。ＡＧ４９０によるＪＡＫ阻害もまた、ＰＴＥＮ変異ＯＰＭ２  ＭＭ細胞のＡＴＫ活性化を無効にすることが可能であった［３０］。同様に、ＩＮＣＢ２０もまたＩＬ−６誘導ｐ−ＡＫＴを阻害することができたが、ＩＮＡ−６細胞におけるＩＧＦ−１誘導ｐ−ＡＫＴには効果はなかった［１８］。有効データにおけるばらつきは、阻害剤の違い、および一般に研究されているＨＭＣＬ間での不均一性の結果である可能性がある。我々の研究では、他のもののデータを裏付けるＯＣＩＭＹ１細胞におけるＩＬ−６およびＩＧＦ−１誘導ｐ−ＡＫＴの劇的な減少のみならず、Ｕ２６６細胞におけるＩＬ−６およびＩＧＦ−１誘導ｐ−ＥＲＫの重大な減少があり、ＪＡＫ阻害が最初に予測されるよりも広範な抗−ＭＭ活性を有し得ることを示している。ＩＬ−６誘導ＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の阻害は、ＭＭ細胞表面でのＩＬ−６Ｒ発現の減少ももたらす可能性があり［３０］、これは、ＩＬ−６の生存促進効果の減少にもつながり得る。
【００８２】
単一投与後の様々なＨＭＣＬでのＣＹＴ３８７の重大な抗増殖効果は、ＣＹＴ３８７の効果の重要な証拠になる。さらに、薬物耐性のメディエーターとして何度も示されてきた外因性ＩＬ−６［１１〜１３］が存在する場合でさえＨＭＣＬの成長を阻害するＣＹＴ３８７の能力は、注目すべきものである。ＪＡＫ阻害の重大な効果は、増殖シグナルのための、またはより高い可能性で、上述した代替的なシグナル伝達経路の障害およびそれに続く阻害のためのＪＡＫ／ＳＴＡＴに幾分依存するＨＭＣＬの結果であり得る。増殖に対する効果はまた、細胞周期分析でも見られ、これは、ＣＹＴ３８７が細胞周期を防ぐことができることを示している。  また興味が持たれるのは、ＣＹＴ３８７処理によって誘導される付加的な倍数性集団（８ｎ）であり、付加的な倍数性集団は、細胞周期調節につながるＪＡＫシグナル伝達のための役割を示す可能性があり、またはＰａｒｄａｎａｎｉら、２００９に記載されているようにオーロラＢ、オーロラＣ，サイクリンＡ、またはサイクリンＢのような細胞周期に関与する他のキナーゼのＣＹＴ３８７阻害の結果である可能性がある。細胞周期タンパク質におけるＪＡＫ阻害の直接または下流の効果は、他のＪＡＫ阻害剤についての研究によって裏付けられる；ＳｃｕｔｏらはＡＺＤ１４８０が２個のＨＭＣＬにおいてサイクリンＤ２を阻害することを発見した［２２］。一次骨髄共培養におけるＭＭ細胞のアポトーシスの誘導は、ＣＹＴ３８７の有効性の重大な証拠である。対照的に、ＩＬ−６シグナル伝達を阻害する他の研究は、ＭＭ細胞がＢＭＳＣの存在下で処理されたときのアポトーシスの有力な証拠を示すことに失敗している［３２］。研究者らは、これは、ＢＭＳＣの存在下におけるＭＭ細胞のＩＬ−６からの独立性を示している可能性があると示唆した。ＣＹＴ３８７についての我々の研究結果は、後者を反証するもの、あるいは非ＩＬ６媒介生存経路を解釈するためのＪＡＫシグナル伝達阻害の能力と一致するものとして解釈され得る。後者と一致するということは、ＣＹＴ３８７で処理された一次ＭＭ試料は、処理細胞の４〜６７％を構成するＣＤ３８＋ＣＤ４５−ＭＭ細胞と自己全骨髄共培養の代表となるものである。それゆえ、ＣＹＴ３８７が、これらの厳しく処理されたＭＭ細胞のアポトーシスを誘導することができるという証拠は、特に有望である。
［付加的な化合物評価］
式Ｉｂの化合物は、Ｄａｌｔｏｎ，Ｗ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００６：１２（２２），６６０３―６６１０に記述されたように多発性骨髄腫のマウスモデルで試験可能である。マウスモデル５Ｔ２ＭＭおよび５Ｔ３３ＭＭは、骨髄に対する多発性骨髄腫の局在性、血清中の測定可能なＭ−タンパク質、溶骨性骨疾患の誘導、および骨髄における増加した血管形成を含むヒト疾患に類似の臨床特徴を有するとしてＤａｌｔｏｎらにより報告されている。両モデルは、したがって、式Ｉｂの化合物を試験するために使用されてもよく、疾患発症前または疾患の発症後に式Ｉｂの化合物が多発性骨髄腫細胞のホーミングに影響するかどうかを試験するために使用されてもよい。これらのモデルを用いて、血清Ｍ−タンパク質のレベルにおける化合物の効果を決定してもよく、例えば溶骨性骨疾患の減少、腫瘍組織量の減少、および生存性の改善などの病気の進行を妨げることに対する化合物の効果も決定してもよい。
【００８３】
ヒト骨髄腫に対する式Ｉｂの化合物の効果を分析するために、化合物は、マウスにおいてヒト骨髄腫の異種移植モデルに対して試験されてもよい。これらの試験のために、ヒト骨髄腫腫瘍または細胞株の異種移植モデルが、例えばＳＣＩＤ−Ｈｕ、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスなどに移植されてもよい。ＳＣＩＤ−Ｈｕモデルは、ヒト微環境における骨髄腫を研究するために使用されてもよく、一次骨髄腫細胞の再生可能な成長における式Ｉｂの化合物の影響も研究されてもよい。ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルは、多発性骨髄腫細胞を緑色蛍光タンパク質で標識することを含む。このモデルは病気の進行を追跡調査するために使用されてもよい。
【００８４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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