(57)【要約】  本質的にヒトゲノム全体を表す複数の異なる遺伝子プローブを含む測定デバイスを使用して、試料中で、急性感染性および／または急性炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するために、ヒトゲノムに対応するポリヌクレオチドの初期セットから、ポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法であって、被験者を、その感染および／または炎症状況に応じて、臨床的に決定された表現型群の少なくとも２つに分類し、表現型群間の遺伝子発現シグナルの変化を統計的に比較し、遺伝子発現シグナルが少なくとも２つの表現型群間で統計的に有意に変化した遺伝子プローブを選択する方法に関する。そこから、宿主応答の重症度の測定値としてマスタースコアが決定され、マスタースコアからの予め決定された偏差を超えないスコアを決定することによって、初期セットと比較してより数の少ないポリヌクレオチドが同定される。本スコアは、患者の急性感染性および／または炎症性状態の診断、発症の予測、またはモニタリング、および／または治療の進行の制御、および／または病巣制御に使用しうる。【選択図】  図４
2014508525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的にヒトゲノム全体を表す複数の異なる遺伝子プローブを含む測定デバイスを使用して、試料中で、急性感染性および／または急性炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するために、ヒトゲノムに対応するポリヌクレオチドの初期セットからポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法であって、
・既知の表現型生理学的状態を示す複数の被験者の核酸の試料を、遺伝子の各々の発現のシグナルが得られるように、測定デバイスのプローブと接触させ；
・前記使用した遺伝子プローブの総数のうち、被験者の少なくとも１つの核酸の試料について、検出可能な強度の発現シグナルを与えるものを選択し：
・前記被験者を、その感染および／または炎症状況に応じて、以下の臨床的に決定された表現型群の少なくとも２つに分類し：
【表１】
2014508525.tif 000016
表中、「ａ」は、性質Ｓ、ＬおよびＮ間のＡＮＤ演算を表す；
・前記表現型群間の遺伝子発現シグナルの変化を統計的に比較して、表現型群の少なくとも２つの間に有意差があるかどうかについて評価し；
・前記遺伝子発現シグナルが少なくとも２つの表現型群間で統計的に有意に変化した遺伝子プローブを選択し、かつ、予め決定された閾値に関する偽陽性結果を与える遺伝子プローブの推定数を除外し；
・前記選択された遺伝子プローブの遺伝子発現強度の増加および減少を定量することによって、急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてマスタースコアを決定し；そして
・最大でも予め決定されたマスタースコアからの偏差を示し、かつ急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度に関する測定値として同様に役立つスコアを決定することによって、初期セットと比較してより少ない数のポリヌクレオチドを同定することを特徴とするポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法。
【請求項２】
２０，０００〜５０，０００個の遺伝子プローブを含む測定デバイスが使用されること、および／または測定デバイスがマトリックス状の固定化遺伝子プローブが載っているバイオチップであって、各遺伝子プローブが前記バイオチップ上の位置座標と一対一に関連付けられていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現シグナルが、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅、特にＰＣＲ、好ましくは定量ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、および／またはタンパク質の検出によって得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
表１に示す６つの表現型の群が互いにペアで比較されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
群間の統計的有意差が決定され、そのうちの少なくとも１つの群が２つ以上の表現型群を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
偽陽性を与える遺伝子プローブの推定数に関する予め決定された閾値が、使用される遺伝子プローブの数の０．１〜５％の範囲内、特に０．３％の範囲内にあり、かつ偽陽性遺伝子プローブの推定数を除外することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
表現型群ＳａＳの平均値ｍＳと表現型群ＮａＮの平均値ｍＨとの間のユークリッド距離に対する遺伝子発現シグナルの相対的距離がマスタースコアとしての機能を果たすことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
相対的距離が、次のようにして得られることを特徴とする、請求項７に記載の方法：
【数１】
2014508525.tif 000017
［式中、ｄ（Ｘ1，Ｘ2）はユークリッド距離を表し、ｃｏｒ（Ｘ1，Ｘ2）は２つのベクトルＸ1とＸ2の間のピアソンによる相関係数を表す］。
【請求項９】
スコアが、マスタースコアから最大５〜１５パーセント点、特に最大１０パーセント点だけ上方または下方に逸脱するものであることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
マスタースコアが、配列番号１〜配列番号７７０４のポリヌクレオチドの群から形成されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
以下に示すポリヌクレオチドのサブセット（「ｎ」は各セットのポリヌクレオチドの数を示す）が得られることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法：
セット１（ｎ＝４９））配列番号：５０８，５５３，６１１，６７９，７３４，７６９，８５１，８６０，８７１，８９６，１１１７，１２６３，１６４６，１６４７，１６４８，１６７５，１６８８，１９７５，２０１１，２０７７，２４１５，２５１６，２５６０，２５８１，３３８１，３４９１，３８２０，３９４７，４１５６，４２３０，４５０６，４５７６，５０１２，５２３５，５６１４，５７３０，５８０３，５８７３，６１１４，６２６２，６２６５，６３０１，６６８９，６７３８，６８２０，６８４７，６８７９，７０６９，７２３０
セット２（ｎ＝４７）配列番号：１６０，３０９，３７４，４２８，４６２，９１１，９３７，１０３９，１０９２，１１０５，１４５８，１５３３，１６０４，１８９５，１９１７，１９９７，２００２，２０５５，２２４２，２３３２，２３６９，２３８６，２４２７，２５１６，２５４１，２５６０，２７８５，３３５９，３４０７，３６２４，４２３０，４５８７，４６３６，５１６４，５２３５，５２４７，５３７１，５７７６，６２７８，６３２８，６４９７，６６３６，７１５６，７２０１，７２３０，７３１４，７４５０
セット３（ｎ＝４８）配列番号：１０，３６６，４１１，４６２，４９３，４９５，５６７，１２０４，１２２６，１４０９，１４１４，１４４９，１４８７，１５８３，１７２４，１７４４，２０１３，２０５５，２０６４，２２０８，２２４８，２６９２，２８９１，３０５１，３６２４，４１５６，４２０５，４５１０，４５８７，４９２３，５１７６，５３７３，５４００，５４３５，５８７３，５９１２，５９５４，６０４１，６０７３，６２４７，６３０１，６４７８，６５２５，６９２３，７２０７，７４５０，７６７０，７６８１
セット４（ｎ＝４７）配列番号：１６０，３５９，４４１，４９３，５２２，５４１，６５２，６９１，１１２８，１４０８，１５８３，１６５１，１６５２，１６６４，１６８８，２００２，２０７７，２２４８，２２７３，２４１５，２６７６，２６９０，２７５５，２８７６，３０５３，３６２３，４２１６，４３２７，４５２５，４５８７，４７６５，４８７０，５０１３，５１６４，５４３１，５６１４，５９５０，６０９８，６２６５，６４３２，６４９７，６９８１，７０６２，７２０２，７３１４，７４５０，７６０７
セット５（ｎ＝４９）配列番号：９７，４２８，４４１，５４３，６１１，８５１，１１３６，１３８４，１５３３，１８６８，１９９７，２０７７，２１８３，２２０８，２２２６，２２６０，２３２９，２３８６，２４７５，２６８６，２６９０，２８７６，３０５４，３８２１，４０００，４３５７，４４７９，４５３０，４６３６，４７６５，４９２３，５０１３，５１３７，５２０４，５７６０，５７７６，５８１９，５８７３，５９０８，６００５，６０９９，６２４２，６４１７，６４９９，６５８５，６８４７，７４５０，７６７０，７６８１
セット６（ｎ＝４８）配列番号：１０，９７，３５９，４７５，４９５，６２７，９２８，１０３９，１１１７，１２４８，１３８４，１４０８，１４７２，１６５２，１６７５，１７４４，１８６８，１９１８，２３７０，２４２３，２５３７，２７４２，２８６５，３０５１，３０８６，３４０８，３９１６，４０３０，４０７８，４２７４，４２９４，４３６２，４７５１，５１２９，５２３５，５２４７，５４３１，５７３４，５８０３，５８１１，５９０８，５９５０，６００５，６４１７，６４９７，６５２５，６９２３，７４５６
セット７（ｎ＝４９）配列番号：３２，１６０，３８３，４１４，４９３，６１１，６５２，６７９，７３４，８８５，８９６，９４６，１１７７，１６４０，１６５０，１７０４，１８８２，２０７７，２２４８，２２５０，２２６０，２４１５，２５６１，３０８６，３４８８，３６２３，３６２４，４１３５，４１５６，４１６０，４５１０，４５２５，４５３０，４７４２，５１３７，５２０４，５２４７，５７３０，５９５０，６１１４，６２１０，６２２５，６４３０，６４７８，６４９７，６５４５，６６６８，７３１４，７６０７
セット８（ｎ＝４８）配列番号：３５９，３８３，５１５，５３８，５４４，６９１，７６９，８１３，１０２４，１０３９，１０９２，１４０９，１５１９，１６４０，１６４９，１６６５，１６９６，１７３１，１７４４，２１６７，２１８３，２２２６，２２６０，２２７３，２４２５，２５１６，２６１８，２６３４，２６７２，３０５１，３１６８，３２０２，４１６０，４７５４，４９６６，５３７３，５４６５，５４９３，５５４１，５５７４，５９１２，６００５，６２１６，６４３２，６６３６，６７４８，６８４７，７４２３
セット９（ｎ＝４６）配列番号：１６０，３５２，５４４，６９１，８０２，８８５，１１２６，１１４７，１１６３，１３３６，１４１６，１６３９，１９６９，２００２，２０５８，２０７７，２１８３，２３３１，２３３２，２４２６，２５２６，２７４２，２８５５，２８６０，２８９１，３０５４，３１３８，３４８８，３９４７，４５６０，４５７６，４７０７，４７７６，５２３５，５３７１，５４００，５４３１，５７６０，５８７３，６２４７，６３０１，６４１７，６６７３，６８２０，７４４７，７６０４
セット１０（ｎ＝４９）配列番号：８，１６４，４６２，４９４，４９５，５１０，５４５，５６７，６１１，６７９，９４１，１０３９，１１０５，１１２８，１１４７，１３１８，１５３３，１６４９，１９１８，１９７３，１９７５，２０１１，２０７７，２０８０，２３７０，２５３７，３０５１，３２０２，３６７６，４２７４，４５８７，４９２８，５２０４，５３７３，５４３１，５４６５，５５４１，５７３４，５９０８，５９１２，５９５０，６２７８，６４１７，６４９７，６６６８，６６７３，７１５６，７２３０，７６７０
セット１１（ｎ＝４６）配列番号：８９，９７，１６０，３５５，３５９，３６６，３７４，４１１，４６２，４７５，５１５，５３８，５４３，６９１，１３８４，１６４７，１６４９，１６５１，１７２４，２０１１，２０５８，２０６４，２２４２，２３６９，２８５９，３４１４，４０００，４７４２，４７６５，４８７０，４９６６，５０４０，５２３２，５２４７，５２７６，５３７３，５４３１，５７６０，５８７３，５９５４，６４１７，６４１９，６４９７，６５４５，６６３６，７４８４
セット１２（ｎ＝４９）配列番号：８，８９，５１５，５４３，５８５，７６９，９６９，１１２６，１１６３，１５２６，１５８３，１６３９，１７４４，２０１９，２３９３，２４１５，２４５３，２６１８，２６９０，２６９２，２８１０，２８５５，２８６３，３１５３，３１５８，３１９０，３４０８，４０００，４０８３，４１０４，４２４８，４４７９，４４９１，４５５０，４６６１，４８７７，４９９５，５１７６，５２７６，５５９９，５６９５，６０７３，６１１４，６２６５，６４１７，６４９９，６５８５，６６３２，６６７３
セット１３（ｎ＝４８）配列番号：４１４，５３８，９４６，１２６３，１３８４，１５１２，１８９５，２０７７，２２４８，２２６０，２５１６，２６７６，２９７５，３１６８，３４１４，４０８３，４２７４，４７７６，４８００，４９１９，４９２３，５１７９，５２０４，５４３１，５４９３，５５４１，５６１９，５６９５，５８１９，６００５，６０７３，６０９９，６２１０，６２４７，６２６５，６３５０，６４１７，６４３２，６４９９，６５３６，６５４５，６６３６，６６６８，６６８９，７０４０，７０６２，７４７２，７６０４
セット１４（ｎ＝４７）配列番号：３８３，４２８，５３８，５５３，６９１，８１４，８７１，８９６，９１１，９３７，１４２６，１６３９，１６８５，１６８８，１９８３，２０９３，２２５３，２２６０，２４５４，２５１６，２５８７，２６７２，２７６１，２８６５，２９７５，３０８６，３７８１，４０００，４０３０，４３０８，４５１０，４６３６，４９２３，５１３７，５２３５，５５７４，５７７６，５８１９，５９０８，６２２６，６２７８，６４１７，６６３２，７２０２，７２３０，７３１５，７４５６
セット１５（ｎ＝４６）配列番号：９７，３６６，３８３，８０２，１４２６，１５１４，１５５８，１６８５，１７４４，１９７５，２０１１，２０１３，２３６９，２４１５，２４５４，２５１０，２５１６，２５７７，２５８７，２７５９，２９６８，３１６８，３３６４，３６４１，３７８０，４０８３，４２３０，４２９４，４５８７，４６３８，４８１７，５０４０，５１６４，５２７６，５３７１，５４６５，５５４１，６０７３，６０９８，６１１４，６１８４，６２１６，６４９７，６５１５，７０６２，７２０２
セット１６（ｎ＝４９）配列番号：１０，５０４，５４１，５５３，５６７，６５２，８０２，１０２４，１０９２，１１３６，１１９７，１５１９，１６４６，１６４７，１６４８，１６５２，２０５５，２０５８，２２６０，２２７３，２３３０，２３３１，２４１５，２４９１，２５８１，２６１８，２６７６，２７４２，３０５３，３４０８，３６５２，３９１５，４２１６，４８７０，５２３５，５６４１，５６９５，５９５４，６１１４，６２７８，６４１９，６４６１，６７９１，６８２０，６８４７，６９２３，７４２８，７６０４，７６７０
セット１７（ｎ＝２０）配列番号：１０，１６０，４２８，８７１，９４１，１１３６，１１９７，１４１６，１５５８，１７８６，１９５１，２３８６，２５１０，２５６０，３４８８，３６５２，３７８１，５１７６，５４００，６５１５
セット１８（ｎ＝２０）配列番号：８７１，１１６３，１４１４，１４１６，１４２６，１４８７，２００１，２０５５，２３６９，２３８６，２５５２，２５７７，２８６５，３０５１，４５５０，４５７７，５６１４，６０９８，７３６９，７４２３
セット１９（ｎ＝２０）配列番号：５６７，９５８，２２２６，２２５０，２２６０，２４２７，２５１６，３３６４，４０３０，４１３５，５２３５，５５７４，５９５０，６１１４，６２２６，６２６７，６２７８，６４１８，７０６９，７５１８
セット２０（ｎ＝２０）配列番号：４０９，１６４７，１６４８，１７７０，１８８３，１９５１，２０１３，２３８６，２４２３，３１５２，３４９１，４２０５，４５７７，４６６１，４７６５，４９１９，７４２８，７６０４
セット２１（ｎ＝２０）配列番号：３５５，４８０，４９４，６６７，１４９２，２４７５，２８５５，２９４８，３１５５，３１５８，３４０８，３７８０，４６６１，５１１３，５２３２，５３６８，５５７４，６１１４，６４１９，６４９９
セット２２（ｎ＝１９）配列番号：７６９，１１６３，１４７２，２０７７，２３７０，２７５９，３４８８，３５６７，３７３７，３７８０，４２３０，４２４５，４２７４，４５５０，５９５０，６４９７，７０６９，７１０９，７６８１
セット２３（ｎ＝２０）配列番号：１６０，１６４，３５５，４１１，１１０６，１４０８，１６７５，１６７９，２３８６，２４５３，２５１６，２８１０，３１６８，３２０２，３６５２，４２３０，５５７４，５９８６，７４２８，７４８４
セット２４（ｎ＝１９）配列番号：１０，１６４，８８５，１２６３，１３１８，１４１６，１４９２，１５０８，１６４７，１９５１，２２５０，２５６０，２７８５，２８２７，３０８６，４５０６，５１３７，５５７５，５９５４
セット２５（ｎ＝１９）配列番号：３２，５２２，６７９，１５１９，２００１，２４９１，２５１６，２６７６，３４１２，３７３７，４２０５，４２９４，４５６０，５２３５，５９５４，６００５，６１１４，６４９９，６５２５
セット２６（ｎ＝１９）配列番号：９５８，１４４９，１４７２，１５８２，２３３２，２５１６，２５５２，２８９１，２９７５，３１６８，３１９０，３６８３，３８２０，３９４７，４２４５，４５３０，７０４０，７０６９，７１４５
セット２７（ｎ＝２０）配列番号：４２８，５１５，５４４，５６２，５６７，１２６３，２００２，２３３２，２５２６，３４３８，４５７７，４７５４，５５７４，５６１４，５９１２，６３２８，６５１５，７１５６，７４２３，７４５６
セット２８（ｎ＝２０）配列番号：３５５，５０８，９３７，１２６３，１９７３，２００２，２５１０，４０７８，４１５６，４５５０，４６７３，４８１７，５２４７，５３６８，５７３０，６００５，６２４７，６５１５，７２０１，７２０７
セット２９（ｎ＝２０）配列番号：１０，５４４，８７１，１４０８，１４８７，１６４９，２００２，２４１５，２６９０，２８５９，２９７５，３１２６，４５７７，４６３６，５５４１，６０７３，６４１７，６４３２，６８６６，６８７９
セット３０（ｎ＝２０）配列番号：８９６，１２４８，１３１８，１４７２，１７８６，１８３０，１９８３，２３８６，２８６５，２９７５，３６４１，３９１６，４０３０，４５３０，４９９５，５４７２，５６１９，６０９９，６２４７，６２６５
セット３１（ｎ＝２０）配列番号：３５５，４６２，１４１６，１９８３，２０１１，２１８３，２２４８，２６１８，３１９０，３４１２，４４９０，４５７６，４７７６，４９２３，５１６４，６１０１，６１１４，６２７８，７３１４，７３６９
セット３２（ｎ＝２０）配列番号：３１０，１２２６，１８９５，２２４８，２４２７，２５１６，２５５２，２６９０，３０８６，３４３８，３９１５，４２１６，４５８７，５２３５，５２７６，５９５４，６２６５，６４７８，６５１５，７２０７
セット３３（ｎ＝２０）配列番号：４９３，５８４，６３３，９３７，２３３０，２３７７，２４９１，２５８７，３１５３，３６８３，４２１６，４２４８，４５３０，６１１４，６４１９，６４７８，６５２５，６６８９，７２０２，７４５６
セット３４（ｎ＝２０）配列番号：１０，３５９，３８３，４７８，６２６，１４７２，１４８７，１６４７，２４７５，３６８３，３７８０，４４９０，４６３６，５１７９，５２４７，５３７１，５９５０，６７４８，６９２３，７６７０
セット３５（ｎ＝２０）配列番号：９７，６２６，１０３９，１１６３，１４２６，１６１７，１７０４，２００２，２２４８，２６９０，３１６８，４２１６，４６３８，５２４７，５６１４，５９５０，６２６５，６４６１，６６３２，７４２８
セット３６（ｎ＝２０）配列番号：３６６，４１４，５４４，７３４，１２６３，１４１６，２１６７，２２０８，２２５０，２３７０，２４９１，２５２６，２８５５，３１９０，３４８８，４０８３，４２４８，６６７３，６８４５，６８４７
セット３７（ｎ＝１０）：配列番号：１９８３，５０７，５４３１，３０４３，１６６５，５７７６，２９０２，６５８５，３１６７および７４５；
セット３８（ｎ＝７）：配列番号：１９８３，５０７，５４３１，３０４３，１６６５，５７７６および７６９５。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドのフラグメント、特に２０〜１，０００、特に１５〜５００ヌクレオチド、好ましくは１５〜２００、特に好ましくは２０〜２００ヌクレオチドの長さを有するもの、および／またはポリヌクレオチドに対して少なくとも約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を有するフラグメントが使用されることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
急性感染性および／または炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度の時間依存的経過を決定するために、異なる時点のそれぞれにおいて、一連のスコア値が測定されることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
急性感染性状態が以下の病態生理学的状態の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法：膿瘍；細菌血症；術後感染；創傷感染；局所性感染；全身性感染；敗血症；重症敗血症；敗血症性ショック。
【請求項１５】
急性炎症性状態が以下の病態生理学的状態の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法：外傷；熱傷；放射線傷害；毒性傷害；虚血／再灌流傷害；急性拒絶反応；炎症性腸疾患；腫瘍疾患；術後状態；局所性炎症；全身性炎症；ＳＩＲＳ；アレルギー反応；アナフィラキシーショック。
【請求項１６】
スコアが、患者の急性感染性および／または炎症性状態の診断、発症の予測、またはモニタリング、および／または治療の進行の制御、および／または病巣制御に使用されることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
スコアが、急性感染性および／または急性炎症性状態である患者の回復または非回復の可能性を示すために使用されることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてスコアを評価するための、配列番号１〜配列番号７７０４のｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋタプル（ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である）の使用。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施するための、配列番号１〜配列番号７７０４のｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋタプル（ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である）の使用。
【請求項２０】
以下に示すポリヌクレオチドのサブセットの少なくとも１つが使用されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の使用（「ｎ」は各セットのポリヌクレオチドの数を示す）：
セット１（ｎ＝４９））配列番号：５０８，５５３，６１１，６７９，７３４，７６９，８５１，８６０，８７１，８９６，１１１７，１２６３，１６４６，１６４７，１６４８，１６７５，１６８８，１９７５，２０１１，２０７７，２４１５，２５１６，２５６０，２５８１，３３８１，３４９１，３８２０，３９４７，４１５６，４２３０，４５０６，４５７６，５０１２，５２３５，５６１４，５７３０，５８０３，５８７３，６１１４，６２６２，６２６５，６３０１，６６８９，６７３８，６８２０，６８４７，６８７９，７０６９，７２３０
セット２（ｎ＝４７）配列番号：１６０，３０９，３７４，４２８，４６２，９１１，９３７，１０３９，１０９２，１１０５，１４５８，１５３３，１６０４，１８９５，１９１７，１９９７，２００２，２０５５，２２４２，２３３２，２３６９，２３８６，２４２７，２５１６，２５４１，２５６０，２７８５，３３５９，３４０７，３６２４，４２３０，４５８７，４６３６，５１６４，５２３５，５２４７，５３７１，５７７６，６２７８，６３２８，６４９７，６６３６，７１５６，７２０１，７２３０，７３１４，７４５０
セット３（ｎ＝４８）配列番号：１０，３６６，４１１，４６２，４９３，４９５，５６７，１２０４，１２２６，１４０９，１４１４，１４４９，１４８７，１５８３，１７２４，１７４４，２０１３，２０５５，２０６４，２２０８，２２４８，２６９２，２８９１，３０５１，３６２４，４１５６，４２０５，４５１０，４５８７，４９２３，５１７６，５３７３，５４００，５４３５，５８７３，５９１２，５９５４，６０４１，６０７３，６２４７，６３０１，６４７８，６５２５，６９２３，７２０７，７４５０，７６７０，７６８１
セット４（ｎ＝４７）配列番号：１６０，３５９，４４１，４９３，５２２，５４１，６５２，６９１，１１２８，１４０８，１５８３，１６５１，１６５２，１６６４，１６８８，２００２，２０７７，２２４８，２２７３，２４１５，２６７６，２６９０，２７５５，２８７６，３０５３，３６２３，４２１６，４３２７，４５２５，４５８７，４７６５，４８７０，５０１３，５１６４，５４３１，５６１４，５９５０，６０９８，６２６５，６４３２，６４９７，６９８１，７０６２，７２０２，７３１４，７４５０，７６０７
セット５（ｎ＝４９）配列番号：９７，４２８，４４１，５４３，６１１，８５１，１１３６，１３８４，１５３３，１８６８，１９９７，２０７７，２１８３，２２０８，２２２６，２２６０，２３２９，２３８６，２４７５，２６８６，２６９０，２８７６，３０５４，３８２１，４０００，４３５７，４４７９，４５３０，４６３６，４７６５，４９２３，５０１３，５１３７，５２０４，５７６０，５７７６，５８１９，５８７３，５９０８，６００５，６０９９，６２４２，６４１７，６４９９，６５８５，６８４７，７４５０，７６７０，７６８１
セット６（ｎ＝４８）配列番号：１０，９７，３５９，４７５，４９５，６２７，９２８，１０３９，１１１７，１２４８，１３８４，１４０８，１４７２，１６５２，１６７５，１７４４，１８６８，１９１８，２３７０，２４２３，２５３７，２７４２，２８６５，３０５１，３０８６，３４０８，３９１６，４０３０，４０７８，４２７４，４２９４，４３６２，４７５１，５１２９，５２３５，５２４７，５４３１，５７３４，５８０３，５８１１，５９０８，５９５０，６００５，６４１７，６４９７，６５２５，６９２３，７４５６
セット７（ｎ＝４９）配列番号：３２，１６０，３８３，４１４，４９３，６１１，６５２，６７９，７３４，８８５，８９６，９４６，１１７７，１６４０，１６５０，１７０４，１８８２，２０７７，２２４８，２２５０，２２６０，２４１５，２５６１，３０８６，３４８８，３６２３，３６２４，４１３５，４１５６，４１６０，４５１０，４５２５，４５３０，４７４２，５１３７，５２０４，５２４７，５７３０，５９５０，６１１４，６２１０，６２２５，６４３０，６４７８，６４９７，６５４５，６６６８，７３１４，７６０７
セット８（ｎ＝４８）配列番号：３５９，３８３，５１５，５３８，５４４，６９１，７６９，８１３，１０２４，１０３９，１０９２，１４０９，１５１９，１６４０，１６４９，１６６５，１６９６，１７３１，１７４４，２１６７，２１８３，２２２６，２２６０，２２７３，２４２５，２５１６，２６１８，２６３４，２６７２，３０５１，３１６８，３２０２，４１６０，４７５４，４９６６，５３７３，５４６５，５４９３，５５４１，５５７４，５９１２，６００５，６２１６，６４３２，６６３６，６７４８，６８４７，７４２３
セット９（ｎ＝４６）配列番号：１６０，３５２，５４４，６９１，８０２，８８５，１１２６，１１４７，１１６３，１３３６，１４１６，１６３９，１９６９，２００２，２０５８，２０７７，２１８３，２３３１，２３３２，２４２６，２５２６，２７４２，２８５５，２８６０，２８９１，３０５４，３１３８，３４８８，３９４７，４５６０，４５７６，４７０７，４７７６，５２３５，５３７１，５４００，５４３１，５７６０，５８７３，６２４７，６３０１，６４１７，６６７３，６８２０，７４４７，７６０４
セット１０（ｎ＝４９）配列番号：８，１６４，４６２，４９４，４９５，５１０，５４５，５６７，６１１，６７９，９４１，１０３９，１１０５，１１２８，１１４７，１３１８，１５３３，１６４９，１９１８，１９７３，１９７５，２０１１，２０７７，２０８０，２３７０，２５３７，３０５１，３２０２，３６７６，４２７４，４５８７，４９２８，５２０４，５３７３，５４３１，５４６５，５５４１，５７３４，５９０８，５９１２，５９５０，６２７８，６４１７，６４９７，６６６８，６６７３，７１５６，７２３０，７６７０
セット１１（ｎ＝４６）配列番号：８９，９７，１６０，３５５，３５９，３６６，３７４，４１１，４６２，４７５，５１５，５３８，５４３，６９１，１３８４，１６４７，１６４９，１６５１，１７２４，２０１１，２０５８，２０６４，２２４２，２３６９，２８５９，３４１４，４０００，４７４２，４７６５，４８７０，４９６６，５０４０，５２３２，５２４７，５２７６，５３７３，５４３１，５７６０，５８７３，５９５４，６４１７，６４１９，６４９７，６５４５，６６３６，７４８４
セット１２（ｎ＝４９）配列番号：８，８９，５１５，５４３，５８５，７６９，９６９，１１２６，１１６３，１５２６，１５８３，１６３９，１７４４，２０１９，２３９３，２４１５，２４５３，２６１８，２６９０，２６９２，２８１０，２８５５，２８６３，３１５３，３１５８，３１９０，３４０８，４０００，４０８３，４１０４，４２４８，４４７９，４４９１，４５５０，４６６１，４８７７，４９９５，５１７６，５２７６，５５９９，５６９５，６０７３，６１１４，６２６５，６４１７，６４９９，６５８５，６６３２，６６７３
セット１３（ｎ＝４８）配列番号：４１４，５３８，９４６，１２６３，１３８４，１５１２，１８９５，２０７７，２２４８，２２６０，２５１６，２６７６，２９７５，３１６８，３４１４，４０８３，４２７４，４７７６，４８００，４９１９，４９２３，５１７９，５２０４，５４３１，５４９３，５５４１，５６１９，５６９５，５８１９，６００５，６０７３，６０９９，６２１０，６２４７，６２６５，６３５０，６４１７，６４３２，６４９９，６５３６，６５４５，６６３６，６６６８，６６８９，７０４０，７０６２，７４７２，７６０４
セット１４（ｎ＝４７）配列番号：３８３，４２８，５３８，５５３，６９１，８１４，８７１，８９６，９１１，９３７，１４２６，１６３９，１６８５，１６８８，１９８３，２０９３，２２５３，２２６０，２４５４，２５１６，２５８７，２６７２，２７６１，２８６５，２９７５，３０８６，３７８１，４０００，４０３０，４３０８，４５１０，４６３６，４９２３，５１３７，５２３５，５５７４，５７７６，５８１９，５９０８，６２２６，６２７８，６４１７，６６３２，７２０２，７２３０，７３１５，７４５６
セット１５（ｎ＝４６）配列番号：９７，３６６，３８３，８０２，１４２６，１５１４，１５５８，１６８５，１７４４，１９７５，２０１１，２０１３，２３６９，２４１５，２４５４，２５１０，２５１６，２５７７，２５８７，２７５９，２９６８，３１６８，３３６４，３６４１，３７８０，４０８３，４２３０，４２９４，４５８７，４６３８，４８１７，５０４０，５１６４，５２７６，５３７１，５４６５，５５４１，６０７３，６０９８，６１１４，６１８４，６２１６，６４９７，６５１５，７０６２，７２０２
セット１６（ｎ＝４９）配列番号：１０，５０４，５４１，５５３，５６７，６５２，８０２，１０２４，１０９２，１１３６，１１９７，１５１９，１６４６，１６４７，１６４８，１６５２，２０５５，２０５８，２２６０，２２７３，２３３０，２３３１，２４１５，２４９１，２５８１，２６１８，２６７６，２７４２，３０５３，３４０８，３６５２，３９１５，４２１６，４８７０，５２３５，５６４１，５６９５，５９５４，６１１４，６２７８，６４１９，６４６１，６７９１，６８２０，６８４７，６９２３，７４２８，７６０４，７６７０
セット１７（ｎ＝２０）配列番号：１０，１６０，４２８，８７１，９４１，１１３６，１１９７，１４１６，１５５８，１７８６，１９５１，２３８６，２５１０，２５６０，３４８８，３６５２，３７８１，５１７６，５４００，６５１５
セット１８（ｎ＝２０）配列番号：８７１，１１６３，１４１４，１４１６，１４２６，１４８７，２００１，２０５５，２３６９，２３８６，２５５２，２５７７，２８６５，３０５１，４５５０，４５７７，５６１４，６０９８，７３６９，７４２３
セット１９（ｎ＝２０）配列番号：５６７，９５８，２２２６，２２５０，２２６０，２４２７，２５１６，３３６４，４０３０，４１３５，５２３５，５５７４，５９５０，６１１４，６２２６，６２６７，６２７８，６４１８，７０６９，７５１８
セット２０（ｎ＝２０）配列番号：４０９，１６４７，１６４８，１７７０，１８８３，１９５１，２０１３，２３８６，２４２３，３１５２，３４９１，４２０５，４５７７，４６６１，４７６５，４９１９，７４２８，７６０４
セット２１（ｎ＝２０）配列番号：３５５，４８０，４９４，６６７，１４９２，２４７５，２８５５，２９４８，３１５５，３１５８，３４０８，３７８０，４６６１，５１１３，５２３２，５３６８，５５７４，６１１４，６４１９，６４９９
セット２２（ｎ＝１９）配列番号：７６９，１１６３，１４７２，２０７７，２３７０，２７５９，３４８８，３５６７，３７３７，３７８０，４２３０，４２４５，４２７４，４５５０，５９５０，６４９７，７０６９，７１０９，７６８１
セット２３（ｎ＝２０）配列番号：１６０，１６４，３５５，４１１，１１０６，１４０８，１６７５，１６７９，２３８６，２４５３，２５１６，２８１０，３１６８，３２０２，３６５２，４２３０，５５７４，５９８６，７４２８，７４８４
セット２４（ｎ＝１９）配列番号：１０，１６４，８８５，１２６３，１３１８，１４１６，１４９２，１５０８，１６４７，１９５１，２２５０，２５６０，２７８５，２８２７，３０８６，４５０６，５１３７，５５７５，５９５４
セット２５（ｎ＝１９）配列番号：３２，５２２，６７９，１５１９，２００１，２４９１，２５１６，２６７６，３４１２，３７３７，４２０５，４２９４，４５６０，５２３５，５９５４，６００５，６１１４，６４９９，６５２５
セット２６（ｎ＝１９）配列番号：９５８，１４４９，１４７２，１５８２，２３３２，２５１６，２５５２，２８９１，２９７５，３１６８，３１９０，３６８３，３８２０，３９４７，４２４５，４５３０，７０４０，７０６９，７１４５
セット２７（ｎ＝２０）配列番号：４２８，５１５，５４４，５６２，５６７，１２６３，２００２，２３３２，２５２６，３４３８，４５７７，４７５４，５５７４，５６１４，５９１２，６３２８，６５１５，７１５６，７４２３，７４５６
セット２８（ｎ＝２０）配列番号：３５５，５０８，９３７，１２６３，１９７３，２００２，２５１０，４０７８，４１５６，４５５０，４６７３，４８１７，５２４７，５３６８，５７３０，６００５，６２４７，６５１５，７２０１，７２０７
セット２９（ｎ＝２０）配列番号：１０，５４４，８７１，１４０８，１４８７，１６４９，２００２，２４１５，２６９０，２８５９，２９７５，３１２６，４５７７，４６３６，５５４１，６０７３，６４１７，６４３２，６８６６，６８７９
セット３０（ｎ＝２０）配列番号：８９６，１２４８，１３１８，１４７２，１７８６，１８３０，１９８３，２３８６，２８６５，２９７５，３６４１，３９１６，４０３０，４５３０，４９９５，５４７２，５６１９，６０９９，６２４７，６２６５
セット３１（ｎ＝２０）配列番号：３５５，４６２，１４１６，１９８３，２０１１，２１８３，２２４８，２６１８，３１９０，３４１２，４４９０，４５７６，４７７６，４９２３，５１６４，６１０１，６１１４，６２７８，７３１４，７３６９
セット３２（ｎ＝２０）配列番号：３１０，１２２６，１８９５，２２４８，２４２７，２５１６，２５５２，２６９０，３０８６，３４３８，３９１５，４２１６，４５８７，５２３５，５２７６，５９５４，６２６５，６４７８，６５１５，７２０７
セット３３（ｎ＝２０）配列番号：４９３，５８４，６３３，９３７，２３３０，２３７７，２４９１，２５８７，３１５３，３６８３，４２１６，４２４８，４５３０，６１１４，６４１９，６４７８，６５２５，６６８９，７２０２，７４５６
セット３４（ｎ＝２０）配列番号：１０，３５９，３８３，４７８，６２６，１４７２，１４８７，１６４７，２４７５，３６８３，３７８０，４４９０，４６３６，５１７９，５２４７，５３７１，５９５０，６７４８，６９２３，７６７０
セット３５（ｎ＝２０）配列番号：９７，６２６，１０３９，１１６３，１４２６，１６１７，１７０４，２００２，２２４８，２６９０，３１６８，４２１６，４６３８，５２４７，５６１４，５９５０，６２６５，６４６１，６６３２，７４２８
セット３６（ｎ＝２０）配列番号：３６６，４１４，５４４，７３４，１２６３，１４１６，２１６７，２２０８，２２５０，２３７０，２４９１，２５２６，２８５５，３１９０，３４８８，４０８３，４２４８，６６７３，６８４５，６８４７
セット３７（ｎ＝１０）：配列番号：１９８３，５０７，５４３１，３０４３，１６６５，５７７６，２９０２，６５８５，３１６７および７４５；
セット３８（ｎ＝７）：配列番号：１９８３，５０７，５４３１，３０４３，１６６５，５７７６および７６９５。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドのアイソフォーム、特に配列番号５０７、７６９５、７６９６、７６９７、７６９８、７６９９、７７００、７７０１；５４３１、４６３６；７７０２、７７０３、７７０４のポリヌクレオチドからなる群より選択されるアイソフォームが使用されることを特徴とする、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドのフラグメント、特に２０〜１，０００、特に１５〜５００ヌクレオチド、好ましくは１５〜２００、特に好ましくは２０〜２００ヌクレオチドの長さを有するもの、および／またはポリヌクレオチドに対して少なくとも約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を有するフラグメントが使用されることを特徴とする、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
ハイブリダイゼーションおよび／または増幅、特にＰＣＲ、好ましくは定量ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、および／またはタンパク質の検出によって得られる発現シグナルによって、スコアが評価されることを特徴とする、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてのスコアを評価するための、配列番号１〜配列番号７７０４のポリヌクレオチドからなる群より選択される、複数の、ポリヌクレオチドのタンパク質遺伝子産物の使用。
【請求項２５】
配列番号１〜配列番号７７０４のｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋタプルのポリヌクレオチドのタンパク質遺伝子産物が使用されることを特徴とし、ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ＴＬＲ５、ＣＤ５９、ＣＰＶＬ、ＦＧＬ２、ＩＬ７Ｒ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲ；およびＣＬＵからなる群より選択されるタンパク質遺伝子産物が使用されることを特徴とする、請求項２４または２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
タンパク質に対して少なくとも約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を有するタンパク質のフラグメントが使用されることを特徴とする、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
請求項１によれば、本発明は、ヒトゲノムに対応するポリヌクレオチドの初期セットから、急性感染性および／または急性炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するためのポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法に関する。請求項１８によれば、本発明はさらに、急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度に関する測定値としてのスコアを決定するための、配列番号１〜配列番号７７０４を有するｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋタプル（ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である）の使用に関する。請求項１９は本発明の方法を実施するためのポリヌクレオチドの使用に関する。また本発明は、請求項２４によれば、ポリヌクレオチドから得られるタンパク質遺伝子産物の使用にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症（血液中毒）は、全身を冒しうる生死にかかわる感染症である。これは高い死亡率を伴い、ますます蔓延しつつあり、あらゆる年齢層の人々を冒す。敗血症は、高品位医療の多くの分野において医療過程を危険にさらし、医療資源のかなりの部分を消耗する。重症敗血症の死亡率は、ここ数十年にわたって、あまり改善していない。血液培養の導入（１８８０年頃）後になされた技術革新のうち最後の２段階は、６０年以上前の抗生物質の導入と、約５０年前の集中治療の開始である。今日の処置において同じように有意義な進歩を達成するには、新しいタイプの診断を利用できるようにしなければならない。
【０００３】
国際的文献において、敗血症という用語の定義については、１９９２年の「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ）」のコンセンサス会議において制定された基準が、最も幅広い賛同を得ている［Ｂｏｎｅら，１９９２］。さらにまた、２００１年の国際的敗血症会議では、素因、感染、免疫応答（応答）および臓器機能障害の基準から構成される、敗血症を記述するための新しい概念（ＰＩＲＯと呼ばれる）が提唱された［Ｌｅｖｙら，２００３］。頭字語ＰＩＲＯによるＳＩＲＳ／敗血症の新しい定義［Ｏｐａｌら，２００５］にもかかわらず、大半の研究は、依然として、１９９２年のＡＣＣＰ／ＳＣＣＭコンセンサス会議［Ｂｏｎｅら，１９９２］を使って、その患者を分類している。
【０００４】
生死にかかわる細菌感染とその帰結、すなわち敗血症と続発性臓器不全は、入院患者にしばしばみられる合併症であり、世界的に毎年２％〜７％ずつ増加している。ドイツでは、およそ１５４，０００人の病者のうち６０，０００人が重症敗血症で死亡するので、これは集中治療室では最も頻度の高い死因の一つである。感染後最初の数時間以内に開始される特異的抗生物質治療が、処置の成功にとって極めて重要であると考えられる［Ｉｂｒａｈｉｍら，２０００；Ｆｉｎｅら，２００２；Ｇａｒｒａｃｈｏ−Ｍｏｎｔｅｒｏら，２００３；Ｖａｌｌｅｓら，２００３］。現在の死亡率は４０％〜６０％と容認できないほどに高く、耐性検査に基づく抗生物質治療が遅れた場合のリスクはかなり高くなる。現在、敗血症における病原体の特異的検出は、臨床応用では不十分である。血液培養という「ゴールドスタンダード」には感度が低いという難点があり、敗血症の全症例の８０％〜９０％では、今なお陰性である。その上、血液培養の結果は２４〜７２時間後まで得られず、しかもそれは、さらなる微生物診断（種弁別、アンチバイオグラムの作成）の基礎となるに過ぎない。多くの場合、敗血症が最初に疑われた時点で、万全な微生物学的結果がないままに、広域抗生物質を使った治療が開始されるであろう。一方では、これが多耐性病原菌の発生を促し、他方では、抗生物質前処置が、後に行われる血液培養の成功率を低下させる。治療が不適切である場合は死亡率が倍増したこと［Ｖａｌｌｅｓら，２００３］および有効な治療の開始が遅れた場合の死亡率の増加は１時間につき５％を上回ると予想されること［Ｉｒｅｇｕｉら，２００２；Ｉｂｒａｈｉｍら，２０００；Ｆｉｎｅら，２００２；Ｇａｒｎａｃｈｏ−Ｍｏｎｔｅｒｏら，２００３；Ｖａｌｌｅｓら，２００３；Ｋｕｍａｒら，２００６］が、疫学的データによって判明している。
【０００５】
全身性炎症および感染疾患関連状態と、それらの原因および続発する合併症に関する関連リスクの正確な診断は、敗血症に限らず、数多くの他の適応症でも、患者を処置するための臨床判断およびその後の経過観察に重要な役割を果たしている。この関連において、急性疾患および慢性疾患患者の処置ならびに周術期モニタリングを考えてみる。急性膵炎の場合、感染は、致死的アウトカムの予後を、有意に、１６％〜４０％悪化させることが知られている。複雑な重複感染の場合には、敗血症のリスクが上昇し、死亡率は最高９０％になる。さらにまた、慢性疾患患者、術後患者および外傷患者における腹腔内炎症および／または感染の経過観察も重要である。腹腔内感染の明快な臨床診断は今日でもなお困難である。肝硬変または腎不全を有する患者などの慢性的な病者の追跡モニタリングは、臨床的に重要である。というのも、これらの患者は、臓器代償不全に応じて、炎症性および／または感染性の疾患経過をとるように、予め運命づけられているだろうからである。特に、腹膜透析を受けている腎不全患者は、慢性の炎症および感染を起こしやすい［Ｂｌａｋｅ，２００８］。特に関心がもたれるのは肝硬変を有する患者の観察である。なぜなら、これらの患者は、高い死亡率を有する細菌性腹膜炎を自発的に発症しうるからである［Ｋｏｕｌａｏｕｚｉｄｉｓら，２００９］。術後処置の範囲における続発性腹膜炎の診断は大きな臨床的価値を有し、手術の成功を大きく左右しうる。術後感染は、今日なお、外科的処置における大問題である。実行された開腹術の１パーセントは手術後に合併症をもたらす。この場合、合併症率は外科的手術間でかなり異なりうる。特に、不十分な縫合は、消化管の手術では、無菌の腹腔への細菌の劇的な蔓延をもたらしうる。
【０００６】
感染経過は、なかんずく、移植、開胸術、四肢および関節の矯正、ならびに神経外科手術後の術後追跡処置に関与する。
【０００７】
これらの例が説明のための例に過ぎないこと、そして感染炎症過程の同定および経過の観察ならびにその重症度および結果として生じる対応合併症のリスクの評価が極めて重要であるような応用分野が他にも数多く存在することは、当業者であれば知っている。本発明はこの診断上の課題に対する解決策を提供する。
【０００８】
ＳＩＲＳおよび敗血症の罹病率および死亡率への寄与は、臨床的にも医学的にも学際的に重要である。なぜなら、これは、平衡を失った制御されていない感染炎症過程によるＳＩＲＳおよび敗血症に関する疾患リスクの増加を例外なく内包している多くの医学分野（例えば外傷学、神経外科学、心肺外科学、内臓外科学、移植医学、血液学／腫瘍学など）の先進的治療法において達成される処置結果の向上を、今後ますます、危険にさらすことになるからである。これは、着実に上昇している敗血症の頻度にも反映しており、１９７９年から１９８７年までの間に、１３９％の増加、すなわち入院患者１００，０００人あたり７３．６症例から１７６症例への増加が記録された［ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９０］。それゆえに、数多くの重体患者に関する罹病率および死亡率の低下は、敗血症および重症敗血症の防止、処置、そして特に、検出および追跡モニタリングの同時進歩と結びついている。
【０００９】
特に、毒性の高い病原体に対する初期の劇症全身性炎症応答を克服した患者では、敗血症誘導性多臓器不全のリスクが増加する時期が長く（最長で数週間）存在する。現在のところ、そのようなリスクの原因としては、誘導免疫抑制が論じられている。集中治療患者は、免疫系が一次感染を中和する能力を持たないだけでなく、多重抗生物質耐性病原菌および低毒性病原菌による二次感染を、極めて高頻度に発症するか、または潜伏ウイルス感染の発現が起こり［Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら，２００９，２０１０］、それは、特に抗生物質に対する耐性の発達の増加と新しい有効な抗微生物剤の不足とを考えると、高い臨床的関連性を持つ。それゆえに、臨床研究の重要な目的は、そのような敗血症誘導性免疫抑制の防止である。分子免疫治療の形態をとる介入のための分子ターゲットは、よく知られているが（例えば抗アポトーシス性および免疫賦活性サイトカインとしてのＩＬ−１５およびＩＬ−７）、最初の臨床試験により、治療法の決定は個々の免疫状況に基づくべきであることが明らかにされている。さらなる研究における自然免疫機能および適応免疫機能の緻密なモニタリングには、炎症促進シグナルと抗炎症シグナルのバランスを患者の利益になる方向へシフトさせるために、免疫抑制患者のための新しい、より複雑な、測定機器が必要になる。
【００１０】
現在、免疫抑制の機序としては、以下の機序が考えられている：
・抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１０の生産；これにより、いわゆるＴ細胞アネルギーの発生が誘導されうる（非応答性挙動）
・免疫担当細胞の大量死
・免疫エフェクター細胞（例えばリンパ球および樹状細胞）のアポトーシスによる枯渇
・特定細胞の正常集団の復活は、明らかに、予後の改善と結びついている
・ＭＨＣクラスＩＩ分子の抑制（適応免疫応答の誘導の抑制）
・負の共刺激分子（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４）の発現
【００１１】
ある研究［Ｍｅｉｓｅｌら，２００９］により、免疫抑制患者における治療的介入の最初の例が示されている。免疫状況に関する記述を得るために、単球の分子表面マーカー（ＨＬＡ−ＤＲ）が利用された。単球数の著しい減少は、敗血症関連免疫抑制の特徴的な目安である（Ｖｅｎｅｔら，２０１０にも示されている）。患者の血中におけるＨＬＡ−ＤＲ発現が微量である場合は、患者が、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦまたはプラセボで処置された。ＧＭ−ＣＳＦは強い免疫賦活性を有し、特に好中球および単球／マクロファージの貪食、増殖、および病原体防御が刺激される。以前の研究により、免疫賦活薬は長時間持続する単球の非活性化を解消しうることが明らかにされた。研究の結果、多くの免疫細胞集団について数の増加を証明することができ、単球と好中球およびリンパ球集団はいずれも、処置により恩恵を受けていた。また、処置群の患者は、その臨床状況の改善も示し、人工呼吸期間と入院期間の短縮が注目される。免疫学的レベルおよび臨床レベルでの、バイオマーカーガイド下免疫賦活治療の正の影響を、初めて証明することができた。
【００１２】
さらにもう一つの研究では、敗血症の免疫抑制期がより綿密に特徴づけられた［Ｍｕｅｎｚｅｒら，２０１０］。いわゆるサイトカインストームと関連しうる初期の高炎症期の後に、免疫抑制が継続している時期が続き、それが早期の臓器損傷と患者の死をもたらす。したがって免疫系のバランスはどちらの時期にも乱され、２番目の時期における介入の重要性は、二次感染の発生と極めて高い死亡率とによって強調される。マウスモデルでは、７日間にわたる敗血症の経過において、どのようにして、免疫調節物質を使ってＩＬ−１０合成を遮断することができるか、および炎症誘発性サイトカインの生産を刺激することができるかを、実証することができた。特に、いわゆる「二次ヒット」、すなわち二次感染の時点は、その生物の生存にとって決定的に重要であることが確認された。マウスモデルにおける免疫麻痺の状況は４日間持続し、７日目には、敗血症刺激後の免疫応答が部分的に復活した。このことは、４日後より７日後の方が高いという、敗血症刺激後の動物の生存率に表れた。また、低炎症時間枠（４日間）中は、免疫調整物質ＡＳ１０１によって、および／またはＩＬ−１０を遮断することによって、生存率を増加させることができた。このように、免疫状況が正常化し、先天免疫細胞が再起し、炎症促進シグナリングカスケードと抗炎症シグナリングカスケードのバランスが再現されるまでは、さらなる感染と患者の生存にとってリスクが高い危機的な空白が生じる。
【００１３】
さらにもう一つの研究では、敗血症性ショックを患う患者におけるリンパ球集団の激烈な変化が記述されている［Ｖｅｎｅｔら，２０１０］。そのような大規模な変化を、ほとんどの場合、診断時点で検出することができるという事実は、それらが、免疫麻痺およびさらなる感染の素因につながる一連の過程において極めて早期の事象を構成するという事実を指摘している。患者を対象とする研究では、敗血症エピソードの正確な始まりを厳密に定義することはできないので、研究対象集団を、疾患の経過に関して、確実に同期させることはできない。しかし、敗血症性ショックの発現後に、免疫抑制状態が、集中治療措置にもかかわらず約４８時間継続することは確かめることができた。ここに、患者が免疫調節介入に適格であると判断するためのモニタリングツールの非常に大きな必要性が生じる。
【００１４】
敗血症と診断された患者の免疫状況は、結果として、強く損なわれる。減損は、自然免疫系と適応免疫系の両方に関係する。そのような減損の特徴は、アポトーシスによる末梢血流からの免疫エフェクター細胞の喪失、ＭＨＣＩＩ分子の発現量の低下、およびサイトカインによって刺激されうる単球数の低下である。免疫状態のそのような減損は可逆的でありうる。そのような減損の帰結は、一方では、感染の排除と感染源の制御とが不十分になり、それゆえに、それが活動性のままでありつづけることである。他方では、二次院内感染が形成される可能性が、非常に高くなる。そのような感染は、多くの場合、完全な免疫状態であれば害にならない軽微な病原性細菌によって引き起こされる。
【００１５】
敗血症または敗血症性ショックが死因となった２３５人の重病患者の肉眼的剖検では、これらの症例のうち８０％において、活動性感染源が確かめられた［Ｔｏｒｇｅｒｓｅｎら，２００９］。最も打撃を受けた臓器は肺、腹部、および尿生殖路であった。これらの患者の多くは、敗血症と診断されたために集中治療室に移され、その死亡前に７日を超える処置を受けた。このような期間は、感染源を制御下におくには充分に長いとみなしうる。抗生作用と組み合わされた感染源の即時制御は敗血症治療の中心的措置を構成するが、感染源を制御するためのこれらの措置は、試験に参加した患者の大半において成功せず、彼らの死の原因になったと思われる。この刊行物の著者は、この分野における医学的ニーズに対処するために、改良された診断方法および治療方法の開発を促している。
【００１６】
最近公表された研究は、精査後に敗血症の疑いで入院した患者の約２０％は、実際には、非感染性の疾患原因を示すが、その症状は敗血症のそれに等しいという結論を出している。著者らは、彼らの知見を、敗血症はどちらかといえば症候群の連続体を含むのであって、はっきりと限定された一特定疾患を構成するのではないと解釈している［Ｈｅｆｆｎｅｒら，２０１０］。
【００１７】
患者８５７人のコホートにおいて、患者が集中治療室に移された日に、エンドトキシンレベルが調べられた。そうすることで、エンドトキシン血症、すなわち患者の血液におけるエンドトキシンレベルの有意な増加が、重病患者では広まっていることがわかった。検査した全ての患者の半分以上において、健常被験者で決定された値の２標準偏差より高いエンドトキシンレベルが測定された。それと同時に、高いエンドトキシン値とグラム陰性病原体による感染確定例の数との間に大きな不一致が観察された。エンドトキシンの起源は、内因性の性質を有し、腸内フローラに存在するに違いない（エンドトキシンと生細菌はどちらもトランスロケーション過程によって血流中に進入することができる）と結論づけられる。高いエンドトキシン値は、高いＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコアおよび高い重症敗血症有病率と相関したので、エンドトキシン血症は、重病患者における高リスク亜集団の目安であると考えられている［Ｍａｒｓｈａｌｌら，２００４］。また、エンドトキシン血症は、免疫系の過剰な刺激の原因であるとみなすこともできる。
【００１８】
ある総説に、大手術および外傷後に致死的帰結を伴う敗血性合併症を発症するリスクを決定する臨床的および免疫学的パラメータの概要が記載されている［Ｋｉｍｕｒａら，２０１０］。最新の従来技術は、外科手術および外傷性傷害がいわゆる自然免疫応答および適応免疫応答に非常に大きな影響を及ぼすので、過剰な炎症反応の結果としての身体の細胞性免疫の抑制が、その後の敗血症エピソードへの高い罹患性の原因になることを示唆している。自然免疫応答および適応免疫応答の反応カスケードは、いわゆる病原体関連分子構造（ＰＡＭＰＳ）および組織損傷関連分子構造（ＤＡＭＰＳ）により、対応する同定受容体を介して、開始され、調整される。
【００１９】
したがって、本発明によって包含される病理発生の範囲は、病原体と効果的に戦うことができるところから、病原体が感染場所に存続し、二次感染および／または院内感染が起こる、免疫防御の抑制に至るまでの、宿主応答とも呼ばれる身体の感染炎症反応の進行である。
【００２０】
分子診断法によるＤＮＡベースの病原体同定の使用において、非疾患関連菌血症などの臨床的に無関係な結果、菌叢から遊離して循環する細菌および真菌核酸の存在、ならびに非生病原体細胞の検出は、結果を評価する上で問題になる。トランスロケーション過程または血液における非疾患関連細菌の一過性の存在に起因する循環微生物ＤＮＡの存在は、インビボで立証されている［Ｄａｇａｎら，１９９８；Ｉｓａａｃｍａｎら，１９９８］。そのような偽陽性所見の起源と臨床的意義はほとんど不明であり、宿主と病原体との今のところ未知の相互作用に起因するのかもしれない［Ｓｃｈｒｅｎｚｅｌ，２００７］。さらにまた、無症状血液ドナーの血液から細菌が分離された例も知られているし、明白な臨床的意義がない一過性の真菌血症さえ既に報告されている［Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら，２００７、Ｒｏｄｅｒｏら，２００２］。
【００２１】
上述の「不明」症例では、当然のことながら、ＤＮＡベースの病原体検出から得られた知見の意義および臨床的関連性をより高い信頼性で評価するために、免疫状態の測定値を使用することができる。
【００２２】
本発明の主題は、次のように要約することができる。大手術後のＰＡＭＰＳおよびＤＡＭＰＳを介した、例えば制御されていない感染中心または過剰な炎症発生などによる、免疫系の過剰な刺激は、自然免疫系および適応免疫系に影響を有する。その結果生じる身体の反応（宿主応答とも呼ばれる）と、その結果生じる「免疫負荷」は、感染性および／または炎症性刺激の程度、量、継続時間および／または頻度に依存する。刺激を直接測定することはできず、刺激に対する身体の反応として、宿主応答の重症度として測定するしかない。反応は、健常者の状況から、例えば血流中の感染という極端な例において当てはまるような最大限までの増加という形で、連続的な変化を起こす。多数の研究で示されたとおり、そのような状況にある身体は、もはや、免疫系の防御機構を備えていない。既存の感染とはもはや効果的に戦うことができない。この時期は二次感染を発症するリスクが高い。このことは、無菌過程が免疫抑制誘導の原因であった場合には、とりわけそうであるといえる。これらの症例では、例えば過剰刺激の原因を同定すること、感染中心を制御すること、感染源の外科的制御、特異的抗生作用、または免疫抑制の終結／遮断のための予防医学的治療などといった臨床措置を、直ちに開始する必要がある。本発明は、上述の疾患過程の決定および経過観察、ならびに治療措置の成功を管理するために使用しうる、診断テストを提供する。
【００２３】
過剰な刺激は以下の原因を有しうる：
・制御されていない感染中心
・無菌炎症事象による傷害
・手術による組織損傷
・外傷による組織損傷
・壊死過程
・エンドトキシン血症
・重症な病理学的事象による腸からのトランスロケーション。
【００２４】
ここに示した過程は自然免疫系および適応免疫系の一過性誘導免疫抑制につながり、
・制御されていない感染中心による高い死亡率
・生死にかかわる合併症に関連する院内感染または二次感染の高いリスク
と相関関係にある。
【００２５】
そのような病態生理学的事象は、各症例に適した臨床措置、すなわち
・診断措置の強化による感染の同定、
・感染源制御（外科的介入によるものを含む）、
・既知の病原体における特異的抗生作用、
・二次感染を予防するための予測的抗生作用、
・免疫賦活治療措置、
・無菌感染事象における抗炎症治療措置
によって対抗する必要がある。
【００２６】
ＳＩＲＳおよび敗血症の診断にはいくつかのアプローチが開発されている。
【００２７】
ある群には、幅広い多様な生理学的指標に基づいて患者を層別化することができるＡＰＡＣＨＥ、ＳＡＰＳおよびＳＩＲＳなどのスコア化システムが含まれている。いくつかの研究では、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩスコアについて、診断能を立証することができたが、他の研究では、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩおよびＳＡＰＳ  ＩＩが、敗血症とＳＩＲＳとを弁別できないことが示されている［Ｃａｒｒｉｇａｎら，２００４］。
【００２８】
ＰｉｅｒｒａｋｏｓとＶｉｎｃｅｎｔは、その総説［Ｐｉｅｒｒａｋｏｓら，２０１０］において、敗血症の目安となるバイオマーカーに関する研究の状況を要約している。１７８個の異なるバイオマーカーに関する３３７０の刊行物が点検された。大半のバイオマーカーは、主として臨床試験において、主に予後マーカーとして調べられたと結論づけられた。診断マーカーとして試験されたものは数少ない。それらの候補はいずれも、病院におけるルーチン応用にとって充分な感度または特異度を示さなかった。患者の免疫状況の問題について調べられたマーカーはなかった。プロカルシトニン（ＰＣＴ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が使用されているが、これらもまた、敗血症と他の炎症状態との弁別、または特定アウトカムの予測における有用性については、限られた性質しか示さない。
【００２９】
プロカルシトニンは、炎症応答に関与する１１６アミノ酸タンパク質である。バイオマーカーＰＣＴは幅広く受け入れられているにもかかわらず、国際的研究により、敗血症マーカーＰＣＴによって達成される感度および特異度は、とりわけ全身性細菌性ＳＩＲＳ、すなわち敗血症と、非細菌性ＳＩＲＳとの弁別については、依然として不十分であることが明らかにされている［Ｒｕｏｋｏｎｅｎら，１９９９；Ｓｕｐｒｉｎら，２０００；Ｒｕｏｋｏｎｅｎら，２００２；Ｔａｎｇら，２００７ａ］。１８の研究が考慮されたＴａｎｇとその共同研究者らによるメタアナリシス［Ｔａｎｇら，２００７ａ］は、ＰＣＴが、ＳＩＲＳと敗血症とを判別するのにあまり適していないことを示している。さらにまた、著者らは、ＰＣＴは、オッズ比（ＯＲ）が７．７９で、極めて弱い診断精度を有することを強調している。
【００３０】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症反応に関与する２２４アミノ酸タンパク質である。ＣＲＰ測定は、疾患の進行のインジケーターならびに選択した治療法の有効性のインジケーターとして役立つ。
【００３１】
いくつかの方法が、集中治療領域では、ＰＣＴの方がＣＲＰよりも診断用のマーカーとして適していると記述している［Ｓｐｏｎｈｏｌｚら，２００６；Ｋｏｆｏｅｄら，２００７］。加えて、ＰＣＴは、非感染性ＳＩＲＳと感染性ＳＩＲＳとの識別にも、細菌感染とウイルス感染とを識別するためにも、ＣＲＰより適しているとみなされている［Ｓｉｍｏｎら，２００４］。
【００３２】
診断的価値を拡大するために、本発明によって提供される解決策を、上記のバイオマーカー、例えば限定するわけではないがＰＣＴまたはＣＲＰと組み合わせうることは、当業者には自明である。
【００３３】
さらにもう一つの群には、トランスクリプトームレベルで同定されたバイオマーカーまたはプロファイルが含まれる。遺伝子発現プロファイルまたは分類子は、敗血症の重症度の決定［ＷＯ２００４／０８７９４９］、局所性感染と全身性感染との区別［未公開のＤＥ１０  ２００７  ０３６  ６７８．９］、感染源の同定［ＷＯ２００７／１２４８２０］、またはさまざまな病因を識別するための遺伝子発現シグネチャーおよび病原体関連シグネチャーの同定［Ｒａｍｉｌｏら，２００７］に適切である。しかし、現在利用できるタンパク質マーカーの［Ｂｏｎｅら，１９９２］によるコンセンサス基準の特異度と感受性は不十分であるため、また血液培養による感染源の証明には時間を要するため、この疾患の複雑さを考慮に入れた新しい手法が、至急必要とされている。分類子と同定された個々の遺伝子および／または遺伝子の組み合わせに基づく多くの遺伝子発現研究と、スコアおよび／または指標を引き出すための統計的方法の数多くの説明［ＷＯ２００３／０８４３８８；ＵＳ６９６０４３９］は、従来技術の一部である。
【００３４】
病態生理学的状態を同定するための遺伝子発現マーカーの使用では、試料中に存在する対応するｍＲＮＡの量、遺伝子発現レベルが定量される。そのような遺伝子発現レベルによって決定される情報は、対照状態に基づいてまたは対照遺伝子に基づいて実験的に決定される、これらのｍＲＮＡの各々の過剰発現または過少発現である。過剰発現または過少発現の確認は、タンパク質バイオマーカーの濃度の決定と同様に考えることができる。
【００３５】
従来技術では、遺伝子発現プロファイルの応用例がいくつか知られている。
【００３６】
Ｐａｃｈｏｔとその共同研究者ら［Ｐａｃｈｏｔら，２００６］は、差異的全血遺伝子発現に基づいて、敗血症性ショックを有する患者におけるアウトカム変数である生存と非生存についての予測を行いうるかどうかを調べた。この課題のために、彼らは、アフィメトリクスアレイでのスクリーニングにより、２８個の差異的発現遺伝子のシグネチャーを同定した。非常に小さな試験データセットにおいて、彼らは、このシグナチャーにより、生存者と非生存者とを高い感度および特異度で弁別できることを実証した。彼らの結果の裏付けに関して、彼らは、敗血症性ショックの後期は免疫抑制状態の発生を特徴とすることと、患者の生存には免疫機能の復活が必要であることとを、推論している。これに関連して、彼らは、生存者における多くの過剰発現遺伝子が先天免疫系に割り当てられるべきであると言明し、確認された過剰発現を、免疫系の復活によって説明している。
【００３７】
ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１は、血中の宿主遺伝子発現バイオマーカーを使用することによる、感染性疾患、臨床的表現型および他の生理的状態の診断および予後に関する。
【００３８】
要約によれば、ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１の要点は、末梢血（白血球）からの遺伝子発現マーカーの特定のセットは、曝露に対する宿主応答、応答および感染性病原体感染の回復の目安になりうる。
【００３９】
ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１は、ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１に開示されたユニークな技法を用いることによって、数多くのさまざまな疾患を診断することが可能であるという事実を、一般論として指摘しているに過ぎない。さらにまた、ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１の２２頁、右カラムの段落［０２９３］において、従来どおりの統計的方法に言及されているだけである。
【００４０】
ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１は、２４頁の段落［０３２４］に診断における可能性を列挙しており、その際に、炎症性疾患に言及しているが、そこでは、関節リウマチについて４８個の炎症遺伝子が使用され、それらは商業的供給源、すなわち「Ｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」から得られている。４５頁右カラムの段落［０６０８］から４６頁左カラムの第１段落までは、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で「バッチ検索」として行われた遺伝子のリストを引用している。
【００４１】
４４頁左カラムの段落［０５３３］は、細胞レベルで差異的に発現する生体分子パスウェイによってアデノウイルス感染と非アデノウイルス感染とを弁別できることを開示している。これらのパスウェイを決定するために、段落［０５３３］では、次に、分子的問題に関してこれらの遺伝子の機能を解明するためにＥＡＳＥ（７０）を使って行われた、ＫＥＧＧパスウェイおよび「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」データベースでの解析が、言及されている。
【００４２】
段落［０６０８］に示されている上述の遺伝子リストもこれに属するので、ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１は、アデノウイルス感染と非アデノウイルス感染との区別に関する。
【００４３】
ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１の明細書のどこを見ても、被験者が、その感染状況および／または情報に応じて、局所性と全身性とを分類されたとは書かれていない。
【００４４】
特許文献ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１は、臓器系の、ならびに特定の医学専門領域および総合的健康状態の、例えば疾患、障害、処置および状態などといった特定表現型についての、遺伝子解析と、遺伝的健康スコアの決定とに関する。
【００４５】
ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１の段落［０１９５］は、いわゆる表現型群のパネルを同文書の範囲内で精査することができると述べて、図１５〜２４、２６〜３３および３９に言及している。示されたパネルは一般的であり、臨床診断全体に−個別の証拠はないものの−多かれ少なかれ関係しており、例えば病因不明の胃腸疾患、ウイルス性肝炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、マラリア、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患などといったさまざまな炎症性疾患、ならびに感染パネル（４２頁右カラム）を含んでいる。例えば、ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１の図１５Ｒでは、関節リウマチが、カラム２に示す遺伝子のリストおよびいわゆる「反射テスト表現型」で処置されている。しかし、全身性または非全身性への分割はここでは行われず、紙巻き煙草の煙への曝露に関連して関節リウマチを患うリスクが精査されている。
【００４６】
ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１の図１５Ｖには、炎症性腸疾患としてのクローン病および／または潰瘍性大腸炎が含まれている。さらにまた、表現型として、年齢およびクローン病の発現、ならびに大腸炎の局在および／または重症度が、そこには示されている。段落［０２３２］は、ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１によれば感染性疾患および肺臓学の相関ゆえに同定することができる一組の表現型に言及している。そのような表現型は２つまたは数個の表現型を含みうる。しかしここでは、例えば世界感染性疾患パネル（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｎｅｌ）、ＨＩＶパネル、マラリアパネル、ウイルス性肝炎パネル、感染症パネルなどといった一般パネルに言及されているだけである。
【００４７】
ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１の９４頁左カラムの段落［０４０８］には、他の数多くの選択肢の中から、心房細動の他、例えば急性および慢性感染症、敗血症ならびにＳＩＲＳも示されている。
【００４８】
当業者にとって、ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１に示されている豊富な例は、大部分が生物統計学的データを伴っておらず、再現可能な教示を欠いている。この見解は、例えば、「コンピュータを使って少なくとも２つの表現型について該個体の素因または保因状況を決定し…」と書かれているＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１の請求項１の特徴ｂ）によって確証される。そのような決定を実施する方法に関してアルゴリズムが言及されていないので、ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１の教示は−認識すべきものであるとしても−説明のつかないものであり、実施不可能である。
【００４９】
特許文献ＵＳ２０１０／０２９３１３０Ａ１は、遺伝子解析システムとこれらのシステムのための方法に関する。要約によれば、この文書は本質的に個体の遺伝子型と少なくとも１つの疾患または状態との間の関連を評価するための遺伝子複合指標スコアを決定する方法の提供に関するものである。
【００５０】
特に、ＵＳ２０１０／０２９３１３０Ａ１は、個体のゲノムプロファイルを、ある特定疾患またはある特定病態生理学的状態と関連づけるために設立された医学的に関連する遺伝子変異のデータベースと比較している。
【００５１】
特許文献ＵＳ２０１０／０２９３１３０Ａ１は、１２頁右カラムの段落［０１１５］において、特定の表現型を、それと相関する対応遺伝子型と関連づけうることを開示している。ＵＳ２０１０／０２９３１３０Ａ１によれば、これは、クローン病、狼蒼、乾癬ならびに炎症性疾患としての関節リウマチを含みうる。
【００５２】
ＵＳ２０１０／０２９３１３０Ａ１の請求項１は、表現型相関に基づいて少なくとも１つの遺伝子複合指標スコアを生成させる一般方法に関し、どの遺伝子を使用すべきかの明白な表示はない。数多くの他の疾患に加えて、狼蒼および関節リウマチについては、特定遺伝子発現プロファイルが作成されて、ＳＮＰと表現型の間の相関関係と比較されること、および特定表現型と関連する特定ＳＮＰのリストが示されていることが、３３頁の請求項１３３からわかる。
【００５３】
Ｂｏｌｄｒｉｃｋら（２００２）「Ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａ」ＰＮＡＳ  ９９，９７２−９７７は、特に９７３頁左カラムの最後の段落に、２０６遺伝子の群に基づいて解析された、グラム陰性細菌による免疫誘発に対する宿主応答が記載されているが、Ｂｏｌｄｒｉｃｋら（２００２）のどこにも、局所性および全身性への表現型分類は見いだされない。
【００５４】
Ｔａｎｇら（２００７ｂ）「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｐｓｉｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７６，６７６−６８４は、ヒト敗血症における遺伝子候補を同定するための、遺伝子発現プロファイルの使用に関する。
【００５５】
要約および６７６頁右カラムに示されている枠内によると、Ｔａｎｇら（２００７ｂ）は、遺伝子発現プロファイルによる敗血症の診断に関し、敗血症における宿主応答への機械生物学的洞察にも言及している。
【００５６】
したがってＴａｎｇら（２００７ｂ）は、敗血症のための特定「リード遺伝子」を検索し、その遺伝子発現を敗血症の経過に関する予後と相関させる「古典的」アプローチに関する。
【００５７】
このことは、Ｔａｎｇら（２００７ｂ）による５０個のシグネチャー遺伝子のセットが敗血症を正しく同定し、トレーニングセットと検証セットにおける予後確率が９１％および８８％だったという事実からわかる。Ｔａｎｇら（２００７ｂ）はさらに、免疫調整および炎症応答に関与する特定遺伝子が敗血症患者では低下した発現を示したと主張している。
【００５８】
特にＴａｎｇら（２００７ｂ）は、核内因子カッパＢ代謝パスウェイの活性化が減少する一方、対応する阻害遺伝子ＮＦＫＢＩＡは有意に高く制御されたことを実証している。
【００５９】
したがって、Ｔａｎｇら（２００７ｂ）は、見いだされたシグネチャー遺伝子は、敗血症において好中球の免疫および炎症機能を抑制すると結論づけた。したがって、Ｔａｎｇら（２００７ｂ）の著者らの見解によれば、遺伝子発現プロファイルは、敗血症における宿主応答を把握するための新しいアプローチになる。
【００６０】
Ｔａｎｇら（２００７ｂ）の６７８頁によれば、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」という見出しの下に、著者らがトレーニングセットのデータを使って敗血症の予後のためのモデルを開発したことが記載されている。６７９頁左カラム、表の下の段落および図３Ａによれば、Ｔａｎｇら（２００７ｂ）は、協調的に発現する遺伝子のクラスターを３つ同定した。図３Ａのヒートマップによれば、これらのクラスターは、ミトコンドリア機能クラスター、免疫調節クラスターおよび炎症応答クラスターに関係する。
【００６１】
しかし、Ｔａｎｇら（２００７ｂ）のどこを見ても、表現型が本出願の請求項１に従って形成されるべきであるとは認識できない。
【００６２】
Ｗａｒｒｅｎら（２００９）「Ａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｃｏｒｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｆ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １５，２２０−２２７は、外傷患者におけるアウトカムに関して予後因子となるゲノムスコアに関する。
【００６３】
最後に、Ｘｕら（２０１０）「Ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ」ＰＮＡＳ  １０８，３７０７−３７１２には、臨床研究におけるハイスループット用のトランスクリプトームアレイが記載されており、特に６９０万個のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドアレイが記載されている。
【００６４】
本発明は、初めに論じた従来技術とは一線を画することができる。本発明の主題は、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応（宿主応答ともいう）ならびにその結果生じる「免疫負荷」の決定および経過観察である。これは敗血症性ショックの存在には依存せず、そのような患者群に制限されない。本発明は、特定の状態を決定するためになされたものであり、敗血症性ショック後の生存と非生存を識別するためになされたのではない。さらにまた、本発明は、敗血症の最新の定義による感染の存在にも依存しない。本明細書において示すように、危篤状態、すなわち最大「免疫負荷」は、例えば他の原因による自然免疫系の過剰な刺激など、感染がない場合でも存在しうる。本発明の応用は、適切な治療措置を引き出すこと、および疾患の経過をモニタリングすることにあり、どの患者が生き延びるかを予測することにあるのではない。
【００６５】
総説［Ｍｏｎｎｅｒｅｔら，２００８］では、効果的に機能する免疫系の重要性がいくつかの科学的結果に基づいて例解され、どの試験がそのような仮説を裏付けているかを要約している。同時に、この総説は、免疫状況のルーチン決定のための適切な方法を決定する必要が依然としてあることも述べている。
【００６６】
従来技術には、全身性感染を決定するための遺伝子発現マーカー［Ｔａｎｇら，２００７ｂ］または遺伝子発現プロファイル［Ｊｏｈｎｓｏｎら，２００７］を同定するための数多くの研究が含まれている。
【００６７】
Ｔａｎｇとその共同研究者ら［Ｔａｎｇら，２００７ｂ］は、特定の血液細胞集団、すなわち好中球の中に、ＳＩＲＳ患者と敗血症患者との識別を可能にするシグネチャーを探した。この細胞集団からの５０個のマーカーは、全身性感染に対する免疫応答を再現するのに十分であり、病態生理学および関与するシグナリングパスウェイにおける新しい発見を可能にする。
【００６８】
敗血症を有する患者と敗血症を有さない患者の分類は、高い信頼度で成功する（ＰＰＶはトレーニングデータセットおよびテストデータセットで８８％および９１％）。しかし、臨床診断への応用可能性は、血中では他の血球タイプからのシグナルのシグネチャーが重なりうるという事実による制約を受ける。応用可能性について言えば、そのような血球集団の調製には、労力の著しい増加が伴う。しかし、この研究で公表された結果の意義は、実用面では制約される。なぜなら、患者選別が極めて不均一だったからである。この研究には、例えば１１％〜１６％までの腫瘍疾患など、極めて多様な併発疾患を有するか、または極めて多様な治療措置（例えば２７％〜６４％の昇圧薬治療）に供されたために、遺伝子発現プロファイルが強い影響を受けている患者が、組み入れられた。
【００６９】
Ｊｏｈｎｓｏｎとその共同研究者ら［Ｊｏｈｎｓｏｎら，２００７］は、外傷患者の群に基づいて、敗血症の発現は、臨床診断の４８時間前までには既に、分子変化に基づいて測定することができると記載している。外傷患者が数日にわたって調べられた。一部の患者は敗血症を発症した。非感染性ＳＩＲＳ患者が前敗血症患者と比較された。同定された４５９転写産物のシグネチャーは免疫応答のマーカーおよび炎症マーカーからなった。試料は全血であり、分析はマイクロアレイで行われた。このシグネチャーを他のタイプの敗血症患者または前敗血症患者の群にも拡張できるかどうかは不明である。このシグネチャーの分類および診断上の利益は示されていない。
【００７０】
これらの論文の目的はいずれも、差異的遺伝子発現によって感染の発生を同定することである。したがって、これらの刊行物は、本発明の主題、すなわち、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応（宿主応答ともいう）およびその結果生じる「免疫負荷」の同定および経過観察とは、明確に一線を画することができる。
【００７１】
Ｆｅｅｚｏｒとその共同研究者ら［Ｆｅｅｚｏｒら，２００３］の目標は、グラム陰性病原体による感染とグラム陽性病原体による感染との間の相違を同定することであった。３人の異なるドナーの血液試料が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳおよび熱処理した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を使って、エクスビボで刺激された。マイクロアレイ技術を使って、遺伝子発現研究が行われた。この研究グループは、黄色ブドウ球菌刺激後にアップレギュレートされかつＬＰＳ刺激後にダウンレギュレートされる遺伝子と、熱活性化黄色ブドウ球菌病原菌の添加後よりもＬＰＳによる処理後の方が強く発現する遺伝子とを、どちらも見いだした。それと同時に、多くの遺伝子が、グラム陽性刺激でもグラム陰性刺激でも、同じ程度にアップレギュレートされた。これは、例えば、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６に関係する。差異的発現遺伝子は、残念ながら、名指しでは公表されていないので、他の結果とは間接的な比較しかできない。遺伝子発現に加えて、Ｆｅｅｚｏｒとその共同研究者らは、いくつかのサイトカインの血漿中濃度も調べた。遺伝子発現データは必ずしも血漿中濃度と相関しないことがわかった。遺伝子発現では、ｍＲＮＡの量が測定される。しかしこれは、タンパク質合成の前に転写後調節を受け、観察された相違はそれに起因しうる。
【００７２】
この話題に関する最も興味深い刊行物は、Ｒａｍｉｌｏのテキサス研究グループ［Ｒａｍｉｌｏら，２００７］によって公表された。ここでも、ヒト血球での遺伝子発現研究が行われ、それにより、さまざまな病原体に対する分子宿主応答の相違が明らかになった。そのために、急性呼吸器疾患、尿路感染、細菌血症、局所膿瘍、骨関節感染および髄膜炎などの急性感染を有する小児科患者が調べられた。大腸菌感染または黄色ブドウ球菌感染を有する１０人の患者それぞれの末梢単核血球から単離されたＲＮＡ試料を使って、マイクロアレイ実験が行われた。病原体の同定は、血液培養によって行われた。トレーニングデータセットに基づいて、３０個の遺伝子が同定され、それらを使って、原因病原体菌を高い正確度で診断することができた。
【００７３】
これらの論文は、本発明とは明確に一線を画することができる。というのも、ここでは、遺伝子発現シグネチャーによって原因病原体の宿主応答が同定されるのに対し、本発明は、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応ならびにその結果生じる「免疫負荷」の決定および経過観察のために使用されるものだからである。
【００７４】
これらの刊行物はいずれも、ここに開示する本発明の信頼度、正確度およびロバストネスを提供しない。これらの研究は、本発明のように特定の臨床課題のための最適なマルチ遺伝子バイオマーカーではなく、科学的観点から見て「最善」のマルチ遺伝子バイオマーカー（分類子）を同定することに的が絞られている［Ｓｉｍｏｎら，２００５］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００７５】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８７９４９
【特許文献２】ＤＥ１０  ２００７  ０３６  ６７８．９
【特許文献３】ＷＯ２００７／１２４８２０
【特許文献４】ＷＯ２００３／０８４３８８
【特許文献５】ＵＳ２００８／００２０３７９Ａ１
【特許文献６】ＵＳ２００９／０３０７１８１Ａ１
【特許文献７】ＵＳ２０１０／０２９３１３０Ａ１
【非特許文献】
【００７６】
【非特許文献１】［Ｉｂｒａｈｉｍら，２０００；Ｆｉｎｅら，２００２；Ｇａｒｒａｃｈｏ−Ｍｏｎｔｅｒｏら，２００３；Ｖａｌｌｅｓら，２００３］
【非特許文献２】［Ｉｒｅｇｕｉら，２００２；Ｉｂｒａｈｉｍら，２０００；Ｆｉｎｅら，２００２；Ｇａｒｎａｃｈｏ−Ｍｏｎｔｅｒｏら，２００３；Ｖａｌｌｅｓら，２００３；Ｋｕｍａｒら，２００６］
【非特許文献３】［ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９０］
【非特許文献４】Ｂｏｌｄｒｉｃｋら（２００２）「Ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａ」ＰＮＡＳ  ９９，９７２−９７７
【非特許文献５】Ｔａｎｇら（２００７ｂ）「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｐｓｉｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７６，６７６−６８４
【発明の概要】
【００７７】
したがって本発明の目的は、病態生理学的状態の迅速かつ信頼できる評価、本例では、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応（宿主応答ともいう）およびその結果生じる「免疫負荷」の決定および経過観察を、状態特異的なバイオマーカーに頼る必要なく行うことができるような検査システムを提供することである。
【００７８】
方法に関して言えば、この課題は、請求項１の特徴によって解決される。
【００７９】
応用に関して言えば、この課題は、請求項１８、１９および２４の特徴によって解決される。
【００８０】
本発明は、特に、本質的にヒトゲノム全体を表す複数の異なる遺伝子プローブを含む測定デバイスを使用して、試料中で、急性感染性および／または急性炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するために、ヒトゲノムに対応するポリヌクレオチドの初期セットからポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法であって、
・既知の表現型生理学的状態を示す複数の被験者の核酸の試料を、遺伝子の各々の発現のシグナルが得られるように、測定デバイスのプローブと接触させ；
・使用した遺伝子プローブの総数のうち、被験者の少なくとも１つの核酸の試料について、検出可能な強度の発現シグナルを与えるものを選択し：
・被験者を、その感染および／または炎症状況に応じて、以下の臨床的に決定された表現型群の少なくとも２つに分類し：
炎症    全身性          局所          なし
感染                  ［Ｓ］          ［Ｌ］        ［Ｎ］
全身性［Ｓ］          ＳａＳ
局所  ［Ｌ］          ＬａＳ          ＬａＬ
なし  ［Ｎ］          ＮａＳ          ＮａＬ        ＮａＮ
表中、「ａ」は、性質Ｓ、ＬおよびＮ間のＡＮＤ演算を表す；
・表現型群間の遺伝子発現シグナルの変化を統計的に比較して、表現型群の少なくとも２つの間に有意差があるかどうかについて評価し；
・遺伝子発現シグナルが少なくとも２つの表現型群間で統計的に有意に変化した遺伝子プローブを選択し、かつ、予め決定された閾値に関する偽陽性結果を与える遺伝子プローブの推定数を除外し；
・選択された遺伝子プローブの遺伝子発現強度の増加および減少を定量することによって、急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてマスタースコアを決定し；そして
・最大でも予め決定されたマスタースコアからの偏差を示し、かつ急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度に関する測定値として同様に役立つスコアを決定することによって、初期セットと比較してより少ない数のポリヌクレオチドを同定するポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法に関する。
【００８１】
さらにまた、本発明は、急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度に関する測定値としてのスコアを同定するための、配列番号１〜配列番号７７０４のｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋ−タプル（ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である）の使用に関する。
【００８２】
本発明の方法を実施するための、配列番号１〜配列番号７７０４のｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋ−タプル（ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である）の使用。
【００８３】
サブクレームは本発明の好ましい実施形態に関する。
【００８４】
本出願人の経験上、遺伝子活性が、酵素法、特に増幅法、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、とりわけプローブベースの方法、例えばＴａｑ−Ｍａｎ、スコーピオン、モレキュラービーコンによって、および／またはハイブリダイゼーション法、特にマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション法；および／またはｍＲＮＡの直接検出、特に配列決定もしくは質量分析；および／または等温増幅法によって捕捉されることを特徴とするような使用は、特に適していることが判明した［Ｖａｌａｓｅｋら，２００５；Ｋｌｅｉｎ  ２００２］。これらの古典的方法は、ＤＮＡを、また逆転写（ＲＴ）によってＲＮＡも、高感度に検出することを可能にする［Ｗｏｎｇら，２００５；Ｂｕｓｔｉｎ，２００２］。
【００８５】
リアルタイムＰＣＲは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも呼ばれ、核酸をリアルタイムに検出し定量するための方法である［Ｎｏｌａｎら，２００６］。これは、分子生物学では既に、数年前から確立された標準的技法の一部になっている。
【００８６】
テンプレートの定量的決定は絶対的定量または相対的定量によって行いうる。絶対的定量では、測定が外部標準、例えばさまざまな希釈度のプラスミドＤＮＡに基づいて行われる。これに対して相対的定量は、いわゆるハウスキーピング遺伝子または参照遺伝子を基準として利用する［Ｈｕｇｇｅｔｔら，２００５］。
【００８７】
本発明の方法（アレイ技法および／または増幅法）の場合、試料は、組織、体液、特に血液、血清、血漿、尿、唾液または細胞もしくは細胞成分；またはそれらの混合物から選択される。
【００８８】
試料、特に細胞の試料は、その細胞内容物を遊離させるために、溶解処理に供することが好ましい。
【００８９】
クレームに記載する本発明の個々の特徴を、互いに、制限なく自由に組み合わせうることは、当業者には明白である。
【００９０】
本発明のさらなる利点および特徴は、実施形態の説明および図面によって明らかになる。
【００９１】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態は、個々の特定遺伝子活性から形成される指標を特徴とする応用にあり、この指標は、対応するキャリブレーション後に、病態生理学的状態の重症度および／または過程に関する測定値を構成し、ここではその指標が、好ましくは、容易に解釈することができるスケール上に示される。
【００９２】
さらにまた、集約された遺伝子活性は、少なくとも１つの病態生理学的状態を記述するためのソフトウェアおよび／または調査用の質問の創製のために、および／または診断用の補助として、および／または、特に患者層別化に使用するための、および臨床試験用の組み入れ基準としての、患者のデータ用の管理システムのために使用することが好ましい。
【００９３】
さらにまた、遺伝子活性データをコンパイルするために、配列番号１〜７７０４によるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約１０％、特に約２０％、好ましくは約５０％の配列相同性、特に好ましくは約８０％の配列相同性を有する、特定遺伝子座、プレｍＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖、低分子ＲＮＡ、特にｓｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、または転位因子、遺伝子および／または少なくとも５ヌクレオチドの長さを有する遺伝子フラグメントを使用する応用も好ましい。
【００９４】
試料核酸は、ＲＮＡ、特に全ＲＮＡまたはｍＲＮＡであるか、ＤＮＡ、特にｃＤＮＡであることが好ましい。
【００９５】
ただし、上記のプライマーが単なる例であることは強調しておく必要がある。
【００９６】
上記のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）は、例えばハイブリダイゼーション法のためのプローブとして使用しうる。
【００９７】
最適化ＥＤＰ支援病院管理において、また敗血症の分野におけるさらなる研究のためには、集約された遺伝子活性データを、少なくとも１つの病態生理学的状態を記述するためのソフトウェアおよび／または調査用の質問の創製のために、および／または診断用の補助として、および／または患者のデータ用の管理システムのために、利用することが有利であると判明した。
【００９８】
好ましいのは、マルチ遺伝子バイオマーカー、すなわち、その遺伝子活性に基づいて、解釈関数および／または形成された指標もしくはスコアを使った分類を実施しうるような、数個のポリヌクレオチド配列（特に遺伝子配列）の組み合わせである。
【００９９】
本発明の目的には、酵素法、とりわけ増幅法、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくはリアルタイムＰＣＲによって、および／またはハイブリダイゼーション法、特にマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション法によって、遺伝子活性を検出することが有利であると判明した。
【０１００】
遺伝子活性の検出中に生じるマルチ遺伝子バイオマーカーに含まれるポリヌクレオチド配列の差異的発現シグナルは、病態生理学的状態、過程および／または治療モニタリングに、有利かつ明白な形で関連付けることができる。
【０１０１】
本スコアにより、担当医は、迅速診断ツールを手にすることができる。
【０１０２】
本出願人は、状態を確認および／または弁別するために、または所定の研究課題に答えるために、異なる配列プールを利用する方法を、いくつか開発してきた。その例は、以下の公開特許明細書に見いだされる：ＳＩＲＳ、敗血症および敗血症様状態の弁別［ＷＯ２００４／０８７９４９；ＷＯ２００５／０８３１１５］、敗血症における疾患経過を予測するための基準の樹立［ＷＯ０５／１０６０２０］、多臓器不全の非感染性の原因と感染性の原因との弁別［ＷＯ２００６／０４２５８１］、感染性／非感染性多臓器不全を有する患者の遺伝子発現プロファイルのインビトロ分類［ＷＯ２００６／１００２０３］、起源不明の熱の局所的原因の確立［ＷＯ２００７／１４４１０５］、局所性感染と全身性感染とを識別するための遺伝子活性を検出するためのポリヌクレオチド［ＤＥ１０２００７０３６６７８．９］。
【０１０３】
本発明は、１つおよび／または数個のモジュールにおいて「体外診断多変数インジケーター測定（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ａｓｓａｙ）」（ＩＶＤＭＩＡ）［ＦＤＡ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ａｓｓａｙｓ，２００７］の特徴を示すマルチ遺伝子バイオマーカーを創製するためのポリヌクレオチド配列、方法およびキットに関する。
【０１０４】
本願において使用されるヌクレオチド配列については、次のことに注意すべきである。
【０１０５】
ＲｅｆＳｅｑは、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列の情報がそれらの性質ならびに書誌情報と共に含まれている公共データベースである。
【０１０６】
ＲｅｆＳｅｑデータベースは、米国国立衛生研究所の一部である国立医学図書館の一部門、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって設立され、継続的に維持され、アップデートされている［Ｐｒｕｉｔｔら，２００７］。
【０１０７】
ＮＣＢＩは、米国のＧｅｎＢａｎｋ、英国のＥＭＢＬデータライブラリー、および日本のＤＮＡデータベースに設定されこれらのデータベース間でデータ交換もされている、配列の包括的公共データベースであるアーカイブデータベース「ＧｅｎＢａｎｋ」［Ｂｅｎｓｏｎら，２００９］の配列データから、ＲｅｆＳｅｑを創製している。
【０１０８】
ＲｅｆＳｅｑコレクションは、エラー訂正された、非冗長の、明示的にリンクされたヌクレオチドおよびタンパク質データベースの提供という点で、ユニークである。エントリーは、生物、株またはハプロタイプに特有な異なる生物学的分子を表現する目的で、非冗長である。
【０１０９】
コレクション中に一定のエントリーが複数回現れる場合、それにはいくつかの理由が存在しうる：
・選択的スプライス転写産物が、同じタンパク質産物をコードする（いわゆる転写産物変異体）、
・種内または種間に、同じタンパク質産物をコードする数個のゲノム領域が存在する、
・代替ハプロタイプを表現するＲｅｆＳｅｑが創製され、ｍＲＮＡおよびタンパク質配列の一部が、全てのハプロタイプにおいて同一である場合。
【０１１０】
ＲｅｆＳｅｑデータベースは、配列統合、遺伝情報および機能情報に関する決定的基礎を提供し、国際的にゲノムアノテーションのための標準とみなされている。ＢＬＡＳＴを使った配列検索では、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ、Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒを含むいくつかのＮＣＢＩリソースにおいて、ＦＴＰダウンロードによって、またはＰｕｂＭｅｄとのネットワーキングによって、ＲｅｆＳｅｑ表示を利用することができる［Ｐｒｕｉｔｔら，２００７；Ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２００２］。ＲｅｆＳｅｑ情報は、アンダースコア（＿）を含むそのユニークなアクセッション形式によって同定しうる。
【０１１１】
作業グループは、さまざまな方法およびプロトコールを利用して、さまざまな生物についてＲｅｆＳｅｑコレクションをコンパイルする。ＲｅｆＳｅｑ記録はいくつかの異なる方法を使って創製される［Ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２００２］：
１．科学的協力
２．コンピュータ支援ゲノムアノテーションプロセス
３．ＮＣＢＩスタッフによるエラー訂正
４．ＧｅｎＢａｎｋからの抽出。
【０１１２】
データの各項目には、対応するエラー訂正ならびに協力している作業グループへの割り当てを示すコメントが付される。これにより、ＲｅｆＳｅｑ表示は、元のＧｅｎＢａｎｋエントリーの本質的に不変の、最初から有効なコピーであるか、協力パートナーまたは専門家によって付加された訂正および追加情報を含んでいる［Ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２００２］。
【０１１３】
ＧｅｎＢａｎｋ中の一分子が数個の配列によって表される場合は、ＮＣＢＩスタッフが「最善」の配列を決定し、それがＲｅｆＳｅｑとして提示される。
【０１１４】
ＲｅｆＳｅｑデータベースの上述の性質ゆえに、本願では、本発明の目的のために、そのＲｅｆＳｅｑアイデンティティに基づいて指定されるマーカー集団を使用することにした。調製、品質、管理および生物学的配列のアップデートに関するデータベースの特性、ならびに核酸レベルでの機能情報の存在も、選択的スプライス変異体に関する情報と同様に、決め手となった。
【０１１５】
既に説明したように、選択的スプライシングの生物学的機序は、当業者に、保護の範囲を拡大する余地を与える。したがって、新しい転写産物変異体と共に、全く新しい一次構造が同定されるか、または既知の転写産物変異体中に配列変化が起こるであろうと考えられる。他方、完全なゲノム機能単位として、それぞれのシス調節配列を含む、コード転写産物のこれら既知および未知変異体を全て包含するゲノム領域が、クレームされ、したがって本発明の範囲に包含されるか、またはそれらは、少なくとも、特許請求の範囲、明細書および配列表に示す配列に対する等価物を、当業者が容易に入手できるようにする。
【発明の詳細な説明】
【０１１６】
（定義）
本発明においては、以下の定義が使用される。
【０１１７】
ＳＩＲＳ：Ｂｏｎｅ［Ｂｏｎｅら，１９９２］およびＬｅｖｙ［Ｌｅｖｙら，２００３］による全身性炎症反応症候群、患者の全般性、炎症性、非感染性状態。
【０１１８】
敗血症：Ｂｏｎｅ［Ｂｏｎｅら，１９９２］およびＬｅｖｙ［Ｌｅｖｙら，２００３］による、患者の全般性、炎症性、感染性状態。
【０１１９】
炎症：これは、傷害性作用因子または傷ついた組織を除去、希釈または隔離しようとして、組織の傷害または破壊によって引き起こされる、身体の反応である。
【０１２０】
炎症過程は、物理的、化学的または生物学的作用因子、例えば機械的外傷、太陽による放射線、レントゲン線および核放射線、腐食性化学薬品、超高温または超低温、ならびに細菌、ウイルス、真菌および他の病原体生物などといった感染性因子への曝露によって引き起こされうる。しかし、炎症という用語と、感染という用語とを、同義語として使用することはできない。
【０１２１】
炎症の古典的指標は、発熱、発赤、腫脹、痛み、関与する組織の機能の喪失である。これらは、炎症過程中に起こる生理的変化の発露である。そのような過程の３つの主要成分は
１）血管の直径およびこれらの血管を通る血流の速度の変化（血行力学的変化）
２）毛細管の透過性の増加、および
３）白血球の遊走
である。
【０１２２】
感染：細胞または細胞複合体の傷害、毒素の分泌、または宿主の抗原−抗体反応によって疾患を引き起こす、病原体微生物の身体への侵入と、そこでのそれらの増倍。
【０１２３】
全身性感染は、病原体が血流を介して体中に蔓延している感染である。
【０１２４】
生体液：本発明に関して生体液とは、ヒトを含む哺乳動物の全ての体液を指す。
【０１２５】
遺伝子：遺伝子は、生物学的に活性なリボ核酸（ＲＮＡ）を産生するための基本情報とそのような産生を活性化または不活化する調節要素とを含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のセグメントである。あらゆる派生ＤＮＡ配列、部分配列および合成アナログ（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ））も、本発明にいう遺伝子と理解される。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の決定に関する本発明の説明は、限定を構成するものではなく、例示的応用に過ぎない。
【０１２６】
遺伝子座：遺伝子座はゲノムにおける遺伝子の位置である。ゲノムが数個の染色体からなる場合は、その遺伝子が位置する染色体内での位置を意味する。この遺伝子の異なる形態または変異体はアレルと呼ばれ、それらは全て染色体上の同じ場所、すなわち遺伝子座に位置する。したがって「遺伝子座」という用語は、一方では、特定遺伝子産物に関する純粋な遺伝情報を含み、他方では、全ての調節ＤＮＡセグメント、ならびにその遺伝子座上の遺伝子に何らかの機能的関係で関係する全ての追加ＤＮＡ配列を含む。後者は、遺伝子座のすぐ近傍（１Ｋｂ）ではあるが、５’端および／または３’端の外側に位置する配列領域に属している。遺伝子座の指定は、その座に由来するＲＮＡ主産物のアクセッション番号および／またはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤによって行われる。
【０１２７】
遺伝子活性：遺伝子活性とは、転写されるおよび／または翻訳産物を形成する遺伝子の能力と理解される。
【０１２８】
遺伝子発現：遺伝子産物が形成される過程および／または遺伝子型が表現型へと発現する過程。
【０１２９】
マルチ遺伝子バイオマーカー：解釈関数を使用することで複合的総合的結果（例えば分類および／または指標）を与えるような遺伝子活性を有する数個の遺伝子配列の組み合わせ。この結果は、一つの状態および／または研究課題に特異的である。
【０１３０】
ハイブリダイゼーション条件：遊離分子と結合分子の熱力学的平衡の樹立に影響を及ぼしうる、当業者に周知の物理的および化学的パラメータをいう。最適なハイブリダイゼーション条件のためには、プローブと試料分子の接触の継続時間、ハイブリダイゼーションバッファー中のカチオン濃度、温度、体積、ならびにハイブリダイズする分子の濃度および濃度比を、調和させなければならない。
【０１３１】
増幅条件：核酸の形態にある基礎材料の増倍を可能にする一定のまたは周期的に変化する反応条件。反応混合物は、結果として生じる核酸のための個々の成分（デオキシリボヌクレオチド）、ならびに基礎材料中の相補的領域に結合しうる短いオリゴヌクレオチド、およびポリメラーゼと呼ばれる核酸合成酵素を含む。当業者にはよく知られているカチオン濃度、ｐＨ値、体積ならびに個々の反応ステップの継続時間および温度は、増幅の進行において重要である。
【０１３２】
プライマー：本発明では、例えばＤＮＡポリメラーゼなどの核酸複製酵素の出発点として役立つオリゴヌクレオチドをプライマーという。プライマーはＤＮＡとＲＮＡの両方からなりうる（Ｐｒｉｍｅｒ３，例えばＭＩＴのｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉを参照されたい）。
【０１３３】
プローブ：本願において、プローブとは、分子マーカー（例えば蛍光ラベル、とりわけスコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標））、モレキュラービーコン、副溝結合性プローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、同位体標識など）を備えていてもよい核酸フラグメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり、ターゲットＤＮＡおよび／またはターゲットＲＮＡ分子の配列特異的検出に使用される。
【０１３４】
ＰＣＲ：これは、英語の用語「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応）」（ＰＣＲ）の省略形である。ポリメラーゼ連鎖反応は、生体外で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用して、ＤＮＡをインビトロで複製する方法である。本発明では、特に、目的のＤＮＡ鎖の短い−約３，０００塩基対までの−セグメント−を複製するために、ＰＣＲが使用される。これは、遺伝子であっても、遺伝子の一部だけであっても、さらには非コードＤＮＡ配列であってもよい。当技術分野ではいくつかのＰＣＲ法が知られており、その全てが「ＰＣＲ」という用語に包含されるという事実を、当業者はよく知っている。このことは特に「リアルタイムＰＣＲ」にも当てはまる（下記の説明も参照されたい）。
【０１３５】
転写産物：本願において、転写産物は、ＤＮＡテンプレートに基づいて産生される任意のＲＮＡ産物と理解されるべきである。
【０１３６】
低分子ＲＮＡ：これは低分子ＲＮＡ全般を指す。限定するわけではないが、この群の代表例には、特に、次に挙げるものがある：
ａ）ｓｃＲＮＡ（低分子細胞質ＲＮＡ）、これは、真核生物の細胞質中のいくつかの低分子ＲＮＡ分子の一つである。
ｂ）ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、核内にしか存在しない数多くの低分子型ＲＮＡの一つ。一部のｓｎＲＮＡはスプライシングまたは他のＲＮＡプロセシング反応に関与する。
ｃ）低分子非タンパク質コードＲＮＡ、これには、クロマチン構造、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ安定性、翻訳、そしておそらくは転写およびスプライシングをも含む数多くのレベルで遺伝子発現に関与する、いわゆる核小体低分子量ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が包含される。一般に、これらのＲＮＡは、複数の道筋で、より長い一次転写産物（タンパク質コード転写産物を含む）のイントロンおよびエクソンからプロセシングされる。タンパク質をコードしているのはヒトゲノムの約１．２％に過ぎないが、それにもかかわらず、大部分が転写される。実際、哺乳動物およびヒトに見いだされる転写産物の約９８％が、タンパク質コード遺伝子のイントロンならびに非タンパク質コード遺伝子のエクソンおよびイントロンに由来する非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）からなり、その中には、タンパク質コード遺伝子に対してアンチセンスであるか、これらとオーバーラップしているものも多い。核小体低分子量ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、ターゲットＲＮＡ中のヌクレオチドの配列特異的修飾を調節する。ここでは、２タイプの修飾、すなわち２’−Ｏ−リボースメチル化とシュードウリジル化とがあり、これらは、一つはｂｏｘＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡと呼ばれ、もう一つはｂｏｘＨ／ＡＣＡ  ｓｎｏＲＮＡと呼ばれる、２つの大きなｓｎｏＲＮＡファミリーによって調節される。そのようなｓｎｏＲＮＡは、約６０〜３００ヌクレオチドの長さを有する。ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）およびｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）は、概して２１〜２５ヌクレオチドと、さらに小さいＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、内在性の短いヘアピン前駆体構造物に由来し、通常は、翻訳抑制のターゲットとして、類似しているが同一ではない配列を有する他の座を使用する。ｓｉＲＮＡは、しばしば外因性の起源を持つ、より長い二本鎖ＲＮＡまたは長いヘアピンから生じる。それらは通常、ターゲットと同じ座またはゲノム中のどこかに相同配列を有し、そこで、いわゆる遺伝子サイレンシング（この現象はＲＮＡｉとも呼ばれる）に関与する。ただし、ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの境界は曖昧である。
ｄ）加えて、「低分子ＲＮＡ」という用語には、いわゆる転位因子（ＴＥｓ）、とりわけレトロエレメントを含めてもよく、これらも、本発明においては、「低分子ＲＮＡ」という用語の意味に包含される。
【０１３７】
ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：この用語は、ＮＣＢＩデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）中のエントリーを指す。このデータベースはゲノム情報に関する非冗長参照標準を提供する。そのようなゲノム情報には、なかんずく、染色体、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。各ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤは、ある生物の単一の天然分子を表す。ＲｅｆＳｅｑを表す生物学的配列は、ＧｅｎＢａｎｋエントリ（やはりＮＣＢＩ）に由来するが、それらは情報要素の編集物である。これらの情報要素は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでの一次研究に由来する。
【０１３８】
アクセッション番号：アクセッション番号は、当業者に知られているＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベース中のポリヌクレオチドのエントリー番号である。このデータベースでは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤと、それほど十分には特徴づけられていない冗長な配列とが、どちらも管理され、公に利用できるようになっている（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【０１３９】
局所性感染：感染が病原体の進入口に制約されるもの（例えば創傷感染）。
【０１４０】
全般性感染：病原体が血管系に侵入し、それにより、生物全体を冒しているもの。全般性感染は敗血症につながりうる。
【０１４１】
定着：微生物の存在が生物において何の疾患症状も惹起しないこと。
【０１４２】
菌血症：細菌が血液中に短時間かつ一時的に存在する状態であり、これは、細菌による臨床症状の発生を、必ずしも伴わない。
【０１４３】
選択的スプライシング：一次遺伝子転写産物（プレｍＲＮＡ）のエクソンが、さまざまな組合せで、イントロンの切除後に再結合される過程。
【０１４４】
ＢＬＡＳＴ：基本ローカルアラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０；１９９０による］。速度最適化された配列比較アルゴリズムが、リクエスト配列に対する最適な局所的一致に関する配列データベースの検索に使用される。
【０１４５】
ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ。ｍＲＮＡの逆転写の産物であるＤＮＡ配列。
【０１４６】
コード配列：遺伝子またはｍＲＮＡのタンパク質コードセグメントであって、それを、イントロン（非コード配列）および５’−または３’−非翻訳セグメントと識別するための用語。ｃＤＮＡまたは成熟ｍＲＮＡのコード配列には、開始コドン（ＡＵＧまたはＡＴＧ）と停止コドンの間の領域が含まれる。
【０１４７】
ＥＳＴ：発現配列タグ。通常は大量に生産されるｃＤＮＡの短いｓｓＤＮＡセグメント（典型的には約３００〜５００ｂｐ）。特定組織中でかつ／または一定の発生段階中に発現する遺伝子を表す。ｃＤＮＡライブラリーのための発現の部分コードまたは非コードラベル。完全な遺伝子のサイズの決定やマッピングにおいて役立つ。
【０１４８】
エクソン：ｍＲＮＡに対応する典型的真核生物遺伝子のコード配列領域。エクソンはコード配列、５’−非翻訳領域、または３’−非翻訳領域を含みうる。エクソンは、完全なタンパク質の特定区間をコードし、通常は、長いセグメント（イントロン）（これは「ジャンクＤＮＡ」と呼ばれることもあり、その機能は正確にはわかっていないが、おそらくは、短い非翻訳ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）または調節情報をコードしている）によって分離されている。
【０１４９】
ＧｅｎＢａｎｋ：１００，０００を超える生物からの配列を持つヌクレオチド配列データベース。コード領域の性質についてアノテートされた記録には、翻訳産物も含まれる。ＧｅｎＢａｎｋは、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪをも含む配列データベースの国際協力の一角である。
【０１５０】
イントロン：典型的真核生物遺伝子の非コード配列領域であって、ＲＮＡスプライシング中に一次転写産物から切り出されるので、成熟した機能的ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ中には、もはや存在しない。
【０１５１】
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ、時には単に「メッセージ」と呼ばれる。タンパクを質コードするのに必要な配列を含有するＲＮＡ。ｍＲＮＡという用語は、それを（スプライシングされていない）一次転写産物と識別するために、ポリＡテールを有する成熟転写産物（スプライシングによって除去されたイントロンを除く）だけに使用される。５’−非翻訳領域、アミノ酸コード領域、３’−非翻訳領域および（ほとんど常に）ポリ（Ａ）テールを有する。典型的には、全細胞ＲＮＡの約２％を構成する。
【０１５２】
ポリ（Ａ）テール：スプライシング中にｍＲＮＡの３’端に懸垂される、ｓｓアデノシン伸長部（約５０〜２００モノマー）。ポリ（Ａ）テールはおそらくｍＲＮＡの安定性を増加させる（おそらくはヌクレアーゼからの保護）。。例えばヒストンｍＲＮＡのように全てのｍＲＮＡがこのコンストラクトを有するわけではない
【０１５３】
ＲｅｆＳｅｑ：参照配列のＮＣＢＩデータベース。ゲノムＤＮＡコンティグ、ｍＲＮＡおよびタンパク質配列の、ならびに既知遺伝子および完全な染色体の、エラー訂正された非冗長配列のコレクション。
【０１５４】
ＳＮＰｓ：一塩基多型。単一ヌクレオチド変異に基づく同じ遺伝子のアレル間の遺伝的差異。遺伝子内の特定の個別位置に出現する。
【０１５５】
転写産物変異体：選択的スプライシング産物。一次遺伝子転写産物（プレｍＲＮＡ）のエクソンが異なる方法で再接合されたもので、後に翻訳される。
【０１５６】
３’−非翻訳領域：タンパク質コード情報を持たない転写される３’−末端ｍＲＮＡ領域（停止コドンとポリ（Ａ）テールの間の領域）。ｍＲＮＡの翻訳効率または安定性に影響を及ぼしうる。
【０１５７】
５’−非翻訳領域：タンパク質コード情報を持たない転写される５’−末端ｍＲＮＡ領域（最初の７−メチルグアノシンとＡＴＧ開始コドンの直前の塩基との間の領域）。ｍＲＮＡの翻訳効率または安定性に影響を及ぼしうる。
【０１５８】
ポリヌクレオチドアイソフォーム：同じ機能を持つが配列が異なるポリヌクレオチド。
【０１５９】
（略号）
ＣＲＰ：        Ｃ反応性タンパク質
ＯＲ：          オッズ比
ＰＣＴ：        プロカルシトニン
感度：指定された疾患を有する群（感染性ＳＩＲＳまたは敗血症）における正しい検査の比率
特異度：指定された疾患を有さない群（非感染性ＳＩＲＳ）における正しい検査の比率。
【０１６０】
さらにまた、本願出願前に公開されていなかったＤＥ１０２００９０４４０８５には、次の要素を含むシステムが開示されている：
・遺伝子活性マーカーのセット
・全血中の遺伝子活性マーカーシグナルの内部コントロールとしての参照遺伝子
・主としてリアルタイムＰＣＲまたは他の増幅もしくはハイブリダイゼーション法による検出
・遺伝子活性マーカーの個々の結果を共通の数値、指標またはスコアに変換するためのアルゴリズムの使用
・相応に目盛づけされたスケールでの、この数値の表現
・キャリブレーション、すなわち先の検証実験による、意図した応用に応じたスケールの分割。
【０１６１】
本システムは、疾患状態の決定、例えば感染性および非感染性多臓器不全の区別という課題に対する解決策を提供するが、これに関連する他の応用および課題にも解決策を提供する。
【０１６２】
しかし、従来技術において本願出願前に公表されていて、本願の出願時にはまだ公開されていなかった上記特許文献ＤＥ１０２００９０４４０８５にも記載されていた、炎症性および／または感染性状態の診断的／予後的検出のためのアプローチは全て、初めに説明したとおり、臨床ルーチンとなるには制約がある。
【０１６３】
健常被験者から、局所性炎症および局所性感染症を有する患者ないし全身性炎症（ＳＩＲＳ）および全身性感染（敗血症）を有する集中治療患者までにわたる広範な炎症性−感染性臨床表現型と、２５，０００個の異なるプローブの形態で全ヒトゲノムを表現する測定プラットフォームとを使って、全血の末梢試料から差異的遺伝子発現に関する試験を行った。その結果、驚いたことに、異なる表現型に基づく不規則な変化ではなく差異的遺伝子発現の炎症性−感染性連続体を表すトランスクリプトームシグネチャーが同定された。この知見から得られたさらにもう一つの驚くべき結果は、感染特異的遺伝子群の欠如であった。さらにまた、全身性炎症を有する群では、血流中に感染を有する患者のそれに匹敵する差異的遺伝子発現を確かめることができた。
【０１６４】
これらの結果は、血液試料からの病原体の検出が敗血症の疑いがある症例の半数未満でしか成功しないという、以下に説明する知見に対する説明になりうる。特定遺伝子転写産物の幅広い同時的な過剰および過少発現によって表される状態は危篤的とみなすことができ、下記の段落で示す敗血症の特徴を含みうる。これは、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応ならびにその結果生じる「免疫負荷」を特徴とし、宿主応答とも呼ばれる。全ての有意な差異的発現遺伝子転写産物によって表されるそのような状態に関する情報は、数学的に、無次元の数値であるスコアに要約することができ、健常者の状態までの距離として表すことができる。スコアの数値が大きいほど、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応ならびにその結果生じる「免疫負荷」の強度は大きい。また、感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応ならびにその結果生じる「免疫負荷」に関する比較可能な情報は、全ての差異的発現遺伝子から選択された一部で形成されるスコアに基づいて集約することもできる。
【０１６５】
感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応ならびにその結果生じる「免疫負荷」は、強くなる、または悪化するだけでなく、反対方向にも動きうる、すなわち、健常者の状態に向かって動きうる、または改善しうる。この逆戻りは回復過程とみなしうる。この回復が治療措置のすぐ後に続くのであれば、それは治療の成功の目安になる。
【０１６６】
危篤領域への状態の進行は、患者の死亡リスクが高いことを示す。そのような状態では、患者が、制御されていない一次感染および／または二次感染の形態の、生死にかかわる合併症を患う可能性、および／または制御されていない炎症性−感染性宿主応答の帰結によって死亡する可能性が高い。
【０１６７】
危篤状態への進行を、早期診断として利用し、それに基づいて必要な治療措置および介入を開始することができる。
【０１６８】
感染性および／または炎症性刺激に対する身体の反応ならびにその結果生じる「免疫負荷」は、ある状態を検出するために、関連する基準として使用することができる。
【０１６９】
免疫状況は、適時に継続して行われる複数回の決定により、患者における追跡モニタリングおよび治療管理のために使用することができる。
【０１７０】
医学的措置は、医学的処置およびその強化もしくは段階的縮小、感染源制御のための外科手術などといった侵襲的措置、および／またはさらなる診断措置でありうる。
【０１７１】
免疫状況の決定は、免疫系が疾患の急性的発生の一因になるか、それとも患者の生死にかかわる状態の原因にはなりえないかを確かめる鑑別診断に使用しうる。
【０１７２】
今までの敗血症診断のための大半の遺伝子発現研究の目的は、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ、ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ、１９９２）が病原体によって引き起こされたものであるか否かを識別するマーカーを見いだすことであった。これらの研究では、とりわけ集中治療患者の試料が分析された。「無菌性ＳＩＲＳ」群と「敗血症」群（ＳＩＲＳおよび病原体の陽性検出）との区別は、特に、微生物学的証拠に従って行われた。これらの研究は、最新の比較論文において確かめられているように［Ｔａｎｇら（２０１０）］、著しく不均一な結果を与えた。本発明は、その実験アプローチを使って、その原因を調べるものである。本発明者らの試験スキームは、以下に述べる概念に基づいた。
【０１７３】
敗血症を診断するためのこれまでのアプローチを、局所性炎症の場合のやり方から集約した。ここでも、臓器の炎症が、病原体によって引き起こされたものであるか否か（これを、例えば細菌性または無菌性心筋炎または膵炎という）を識別したい。必ずしも全身性炎症によって発露したのではなく、その臓器／患部における炎症を引き起こしているに過ぎない感染の場合でも、感染特異的遺伝子マーカーは、増加した、さもなければ減少した、発現を示すはずである。しかし、従来技術において今までに見いだされた遺伝子マーカーの場合は、これを示すことができなかった。
【０１７４】
不均一な結果に関するもう一つの説明は、遺伝子発現研究では血液からのＲＮＡ試料が利用されることにあると考えられる。したがって、感染特異的遺伝子マーカーを見いだす最善のチャンスは、血流中の感染に関する「ゴールドスタンダード」である陽性血液培養による試料だけを測定した場合に得られるはずである。過去の研究では、感染の拡がりとは無関係に、敗血症患者を一つの試験群として見ていた。
【０１７５】
本出願人は、空間的拡がりに関する感染および炎症の特徴を互いに独立して分類する試験スキームに、その研究の基礎を置いている。区別は、炎症が全身性であるか、局所性であるか、全く明確でないかについてなされた。その際、全身性炎症は、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）の定義によって決定した。さらにまた、病原体が血中に見いだされるか（全身性）、臓器に見いだされるか（局所性）、または全く見いだされないかを調べた。感染および炎症の拡がりの組み合わせから、考えうる９つの表現型が定義された。それらを表１に要約する。
【表１】
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【０１７６】
本発明によれば、上述の分類は明快であり、完全であり、他の因子に依存しない。すなわち、どの被験者でも、試料採取の時点において、これらの群の一つに関連付けることができる。
【０１７７】
炎症は必ずしも病原体が引き起こすとは限らないが、炎症反応を伴わない感染は、診断には関連しない。限局性炎症しか引き起こさない全身性感染（例えば心内膜炎におけるいわゆる菌血症）は、稀な現象であり、特殊な例を構成する。それゆえに、組み合わせＬａＮ、ＳａＮおよびＳａＬは、臨床に関連する表現型を形成せず、本発明においては無視した。
【０１７８】
本発明者らは、この研究のために、診断に関連する患者試料を、炎症および／または感染の空間的拡がりに応じて分類して、６つの試験群を得た（表１において太字で示されている群）。これらの群は、もっとも重要であり、かつもっとも頻度の高い感染−炎症表現型を表す。特に４つの表現型、局所性および全身性炎症を伴う局所性感染（ＬａＬおよびＬａＳ）と、感染を伴わない対応する対照群（ＮａＬおよびＮａＳ）は、統計比較において、感染特異的遺伝子マーカーの発見を可能にする。ＳａＳ群とＬａＳ群の比較は、全身性炎症において、循環細胞の感染（血流感染）が、局所に制限された感染の場合とは異なる遺伝子発現パターンを示すかどうかに関するヒントを与える。
【０１７９】
配列番号１〜７７１８の配列表を本願に添付する。その配列表の内容は全て、本願の開示内容の一部である。
【０１８０】
さらなる利点および特徴は実施形態の説明と図面からわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】発現パターンが試験群によってソートされているヒートマップを示す図である。
【図２】発現パターンがスコア（マスタースコア）によってソートされているヒートマップを示す図である。
【図３】試験試料に関して、さまざまな距離で形成される三角形を示す図である。
【図４】患者における２つの経過に関して、さまざまな距離で形成される三角形を示す図である。
【図５】本試験における全試料に関するスコアの経過を示す図である。
【図６】マスタースコアと比較した、リアルタイムＰＣＲ遺伝子発現測定のΔＣＴ値から計算されたスコアの経過を示す図である。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１）急性炎症による免疫系の負荷に対する宿主応答の重症度の決定
患者の群
選定には以下の被験者の試料を含めた；健常ドナー、イエナ大学病院の耳鼻咽喉科（耳、鼻、喉−ＥＮＴ）および麻酔・集中治療科（ＫＡＩ）からの患者。群を次のように割り当てた：
ＳａＳ：重症敗血症／敗血症性ショックと診断された６人の集中治療患者。被験試料は、２つの独立した検査（血液培養およびＤＮＡ検出）において、血液中の同一病原体が確認された日に採取された。
ＬａＳ：重症敗血症／敗血症性ショックと診断された１３人の集中治療患者であって、疾患中に、少なくとも１つの血液試料が、２つの独立した検査（血液培養およびＤＮＡ検出）を含めて、病原体について調べられたが、全ての所見が陰性のままであった患者。被験試料は、病原体が局所的に確認された最初の日に採取された。
ＮａＳ：ＳＩＲＳと診断された、感染の徴候を伴わない、１３人の集中治療患者。被験試料はＳＩＲＳ診断から、最初の３日以内に採取された。
ＬａＬ：急性扁桃周囲膿瘍（ＰＴＡ）を有するＥＮＴ科の患者７人。被験試料は、感染性膿瘍の外科的除去の直前に採取された。対応する微生物学的血液分析（ＬａＳの場合と同様）は陰性だった。
ＮａＬ：慢性扁桃腺炎を有し、かつ急性感染中心を持たない、ＥＮＴ科の患者８人。被験試料は、扁桃腺切除術（扁桃の外科的切除）の実施後、最初の３日以内に採取された。患者はＳＩＲＳの症状をなにも示さず、手術を行った箇所には、創傷の無菌性炎症を検出することができた。さらに、慢性非感染性膵炎を有しＳＩＲＳを有さない患者４人をこの群に含めた。
ＮａＮ：７人の健常ドナー、慢性扁桃腺炎を有しかつ急性感染中心を持たない患者３人。被験試料は扁桃腺切除前に採取され、これらの患者の術後試料はＮａＬ群には含まなかった。
経過試料：この研究では、２人の患者の試料をそれぞれ連続６日間にわたって調べた。どちらの症例でも、第１試料は予定された外科的介入の直前に採取され、その後の試料は集中治療室で採取された。症例１：手術後に患者は回復しない。炎症関連パラメータは術後２日目から増加し、３日目には感染症と診断され、患者は１０日後に死亡した。症例２：患者は手術後に非常にゆっくりと回復する。３日目に、一部の炎症関連パラメータが増加する。医学的措置を講じた後に患者の状態が改善し、合計６日後に、患者を移動させる。被験試料に関する最も重要な臨床パラメータを表２にまとめる。
【表２】
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2014508525.tif 000005
2014508525.tif 000006
【０１８３】
実験手順
６３人のＲＮＡ全血試料７３個を測定した。これには、Ｉｌｌｕｍｉｎａの市販マイクロアレイＢｅａｄＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  ＨＴ−１２ｖ３を使用した。組織に依存しないヒトゲノム全体を表す４８８０３個の異なる遺伝子プローブが、使用した測定プラットフォーム上に配置された。試料は次のステップを使って処理し、測定した。
【０１８４】
１．全血試料からの全ＲＮＡの単離および安定化：血液試料のトランスクリプトームを解析するための基礎材料は２．５ｍｌの全血である。全血をＰＡＸｇｅｎｅチューブ（ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅ  ＰｒＡｎａｌｙｔｉＸ  ＃７６２１６５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））に採取し、再処理まで−８０℃で保存した。
【０１８５】
２．ＰＡＸｇｅｎｅ血液試料からの標準的自動ＲＮＡ単離：ＱＩＡｃｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）とＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ＃７６２１７４）を利用し、それにより、プログラム「ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  （ＣＥ）」を使って、全ＲＮＡを単離した。プロトコールの終了後に、ＲＮＡ単離物を含む溶出チューブを密封した。試料を６５℃で５分間加熱することによって残存ＤＮａｓｅ酵素活性を失活させた後、試料を直ちに氷上で冷却し、−８０℃で保存した。
【０１８６】
３．全ＲＮＡの品質管理：単離されたＲＮＡの検査は、ハイブリダイゼーション結果の質を保証するための重要な措置である。優れたハイブリダイゼーション結果を与えることができるのは、無傷のＲＮＡだけである。単離された全ＲＮＡの完全性の検査は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を使ったキャピラリー電気泳動法で、ＲＮＡ６０００Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号５０６７−１５１１）を利用して、製造者の説明書に従って行った。１〜１０のスケールで７．５前後のＲＩＮ値が指針レベルとみなされる。使用した試料は全て、遺伝子発現解析の目的には十分なＲＩＮ＞５に達した（ＦｌｅｉｇｅおよびＰａｆｆｌ，２００６参照）。
【０１８７】
４．グロビンｍＲＮＡの削減：非常に豊富なグロビンｍＲＮＡがある全血における遺伝子発現測定の感度を改良するために、この目的で、Ａｍｂｉｏｎ  ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの「ＧＬＯＢＩＮｃｌｅａｒ（商標）−Ｈｕｍａｎ」キット＃ＡＭ１９８０）を使用することが推奨された。製造者の推測によると、グロビン転写産物は、比率が血中の全てのｍＲＮＡの７０％であり、存在量が少ない転写産物をかなり圧倒している。処理には各試料の全ＲＮＡ１μｇを使用した。
【０１８８】
５．全ＲＮＡのｃＲＮＡへの増幅：ハイブリダイゼーション用のグロビン削減ＲＮＡの調製は、Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの「Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット」（ＡＭＩＬ１７９１）を製造者の説明書に従い、５００ｎｇの量を使って行った。ｃＲＮＡ溶出物を氷上で冷却し、ｃＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−２０００で分光光度法によって測定した。
【０１８９】
６．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐでのハイブリダイゼーション：Ｐａｎｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐのＨｕｍａｎ  ＨＴ−１２ｖ３バージョンを使用した。各アレイに５μｌの体積で７５０ｎｇのｃＲＮＡ試料を適用し、５８℃で終夜ハイブリダイズさせた。うまくハイブリダイズしたプローブのシグナル検出は、ＣＹ３−ストレプトアビジン染色（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）により，製造者の説明書に従って行われる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコール：Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＩｎｔｅｌｌｉＨｙｂ（商標）Ｓｅａｌ；Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  Ｕｓｅｒ  Ｃａｒｄ；Ｐａｒｔ＃１１２２６０３０  Ｒｅｖ．Ｂ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）。蛍光シグナルの読出しは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒ  ５００と対応するＩｌｌｕｍｉｎａ「ＢｅａｄＳｃａｎ」ソフトウェア（バージョン３．６．１７）を使って達成した。
【０１９０】
７．マイクロアレイの画像解析：蛍光色素で染色したＢｅａｄＣｈｉｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒでスキャンした。その結果得られた画像は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）「Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｔｕｄｉｏ」ソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２００９．２バージョン）を使って解析される。ハイブリダイゼーションの最初の評価のために、テクニカル対照シグナルを引き出す。最初の定性的レビューは、アレイあたりの検出された遺伝子の数と平均シグナル強度によって得られる。生データを品質管理および統計解析に供する。
【０１９１】
データ解析および統計評価
データ解析は、ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇで入手することができる無料公開ソフトウェアＲ  ＰｒｏｊｅｃｔバージョンＲ２．８．０（Ｒ．ａｐｐ  ＧＵＩ  １．２６  （５２５６），  Ｓ．ＵｒｂａｎｅｋおよびＳ．Ｍ．Ｉａｃｕｓ、（著作権）Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２００８）を使って行った［Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ  （２００６）］。遺伝子発現データの解析にはこのソフトウェアを使用することが好ましい。というのも、これには、そのような種類のデータを処理するためのアルゴリズムが数多く用意されているからである。特に、本発明者らの研究には、以下のソフトウェアパッケージを使用することができた：Ｉｌｌｕｍｉｎａ測定値および関連遺伝子のアノテーションを読むためのｌｕｍｉ、データ標準化のためのｖｓｎ（どちらもＤｕら，２００８）、偽陽性率を決定するためのｆｄｒｔｏｏｌ（Ｓｔｒｉｍｍｅｒ，２００８）、および結果をクラスター化し視覚化するために統計的有意性検定を行うためのｓｔａｔｓ。
【０１９２】
解析は、以下のステップを使って行った。生データと追加利用できるアノテーションデータとを読み込んだ。試料を処理する際の技術的理由による変動と試薬量の偏差のために、異なる試料の蛍光強度は、一般に、互いに直接比較することはできない。これを可能にするために、適切な標準化、分散安定化変換を使用することによって、そのような変動が補償される［Ｈｕｂｅｒら，２００２］。
【０１９３】
データ解析には、底を２とする対数をとった標準化データおよび測定データを含めた。統計解析では、６試験群の６１個の試料を調べた。これらの群間の遺伝子発現を一元配置分散分析によって比較した［Ｍａｒｄｉａら，１９７９］。そうすることで、解析した群の少なくとも２つの間に有意差があるかどうかを調べた。対応する有意性検定を、少なくとも１つのＲＮＡ試料について検出可能な強度のシグナルを与えた１８５１７個の遺伝子プローブについて、遺伝子ごとに計算した。偽発見率（ＦＤＲ）を使って偽陽性検査の数を決定した［Ｓｔｏｒｅｙら（２００３）］。各遺伝子プローブについて、プローブが有意に調整されたと思われる最小ＦＤＲと定義されるいわゆるｑ値を計算した。ＦＤＲ制御に使用したこの方法では、８７．５％の遺伝子プローブが有意に調整されたと見積もられた。これは、調べた１８５１７個のプローブのうち、１６２０４個のプローブに相当する。
【０１９４】
さらに、６つの患者群の遺伝子発現パターンを、ｔ検定により、ペアワイズに比較した。検定は、合計１５の群の組み合わせについて、遺伝子ごとに適用した。そうすることで、同じ遺伝子プローブの選択を考慮し、一元配置分散分析について説明したＦＤＲ制御を行った。結果を表３に要約した。
【表３】
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【０１９５】
この表（最後の列）からわかるように、最も明確な相違は、敗血症を患っている患者（ＬａＳおよびＳａＳ）と、群ＮａＮ（炎症なし）およびＮａＬ（非感染性局所性炎症）との間に見いだされる。これとは対照的に、群ペアＮａＳとＬａＬ、ＳａＳとＬａＳおよびＬａＳとＮａＳの間には、明確な相違がほとんどなかった。ＬａＳ対ＮａＳおよびＮａＳ対ＬａＬの比較で、ＦＤＲ＜０．１に達した遺伝子プローブの量を比較したところ、感染において遺伝子発現に同じ調整を示す遺伝子プローブを見いだすことはできなかった。したがって、感染特異的発現パターンを示す遺伝子プローブを検出することはできなかった。さらなる統計比較、とりわけ群ＮａＬ、ＮａＳ、ＬａＬおよびＬａＳ間の二元配置分散分析［Ｍａｒｄｉａら，１９７９］ならびに群ＬａＬおよびＬａＳ対ＮａＳの比較も、同じ陰性の結果につながることに言及しておかなければならない。
【０１９６】
驚いたことに、ペアワイズの比較により、以下の試験群の配置が可能になる：（１）ＮａＮ、（２）ＮａＬ、（３）ＬａＬ、（４）ＮａＳ、（５）ＬａＳ、（６）ＳａＳ。この配置は、隣り合う群はそれらの発現が統計的に少ししか異ならないという事実によって識別される。より厳密にいうと、統計比較において、十分な数の調整された遺伝子プローブが見いだされ、十分に小さい偽陽性率（約５％）を有する遺伝子プローブ群を、隣り合う群間に見いだすことができなかった。この現象は、平均群値は互いに異なるが、群の分散が大きく、それが比較している２つの群のオーバーラップにつながっている場合に生じる。群が遠く離れているほど、相違は大きくなる。試験群の有向的配置は遺伝子発現の決定がなくても可能であったことに言及しておくべきである。
【０１９７】
試験群内の遺伝子発現の明らかになった変化を描写するために、一元配置分散分析によって群間差を大まかに調べた最初の統計比較からの８５３７個の遺伝子プローブを、さらなる解析に含めた。選択は０．３％という偽陽性率の見積もりに基づいた。これは、統計的には、８５３７個のプローブの選択リストのうち、約２６個（すなわち０．３％）が偽陽性であるというように解釈される。選択の拡大はいずれも偽陽性率の上昇につながるだろう。選ばれた８５３７遺伝子プローブは、合計７６９４個の異なるＲＮＡ転写産物をアドレスする。
【０１９８】
試験内でのこれらの遺伝子プローブの遺伝子発現を、それらの類似性に基づき、ｋ平均アルゴリズム（ＨａｒｔｉｇａｎおよびＷｏｎｇ，１９７９）によって、９つの遺伝子クラスターにグループ分けした。これには、発現シグナルを平均値および分散に関して遺伝子毎に前もって標準化するＲ関数ｋｍｅａｎｓを使用した。クラスターの数の見積もりは、１〜２０クラスターについてのクラスター化法の反復から得られる誤差関数（コスト関数）の二次微分に従って行った［Ｇｏｕｔｔｅら，１９９９］。
【０１９９】
患者の群を、（１）ＮａＮ、（２）ＮａＬ、（３）ＬａＬ、（４）ＮａＳ、（５）ＬａＳ、（６）ＳａＳという順序で配置した。最後に、２人の患者の経過試料の８５３７遺伝子プローブからの１２の遺伝子発現パターンを付加した。ソートされた発現マトリックスをいわゆるヒートマップで視覚化した。図１では、各行が遺伝子プローブを表し、各列がＲＮＡ試料を表す。遺伝子発現の相対的変化がモノクロ階調で図示されている。したがって、遺伝子プローブ毎の平均として決定されるものより、濃い灰色〜黒色は、低い発現をコードし、明るい灰色〜白色は、高い発現をコードしている。クラスターには１〜９の番号を付し、クラスター番号の後ろの括弧内の数字は、そのクラスター内の遺伝子プローブの数を示している。クラスター内では、遺伝子プローブを、試験群内でより大きな差を持つプローブほどクラスターの上端に置かれるように、降順にソートした。
【０２００】
図１から、左から右に向かって発現に傾向があることは明白である。群ＮａＮから群ＳａＳに向かって、遺伝子クラスター１〜４における発現は増大し、遺伝子クラスター５〜９では減少する。しかし、個々の群内（特にＮａＳ群）における高い変動性も示されている。個々の群間では流れるような移行があり、群は互いにオーバーラップしている。
【０２０１】
群ＮａＮ（急性炎症なし）とＳａＳ（ＳＩＲＳを患い、血流中の感染が確認されている患者）の間の平均差は、最も明確な差である。次のステップでは、この相違を、間隔（次のセクション参照）によって定量した。他の試料は全て、これら２つの群までのそれらの距離に従って配置した。図２に図示するソートされたヒートマップでは、そのような配置が視覚化されている。健常者のパターンに似ている試料ほど左側にソートされ、血中に感染がある集中治療患者のパターンに似ている試料ほど右側にソートされた。
【０２０２】
ソートされたヒートマップは、大部分の患者の試料が上に列挙した順序での群所属に従ってソートされるか、隣り合う群と混じり合ったことを示している。しかし個々の試料は、大半の群代表より明確に高いまたは低いランクにソートされる。このヒートマップの遺伝子発現パターンは、遺伝子活性がＮａＮからＳａＳまで同時に増加および減少することを示している。個々の遺伝子クラスターは逸脱の進行に差を示すだけである。
【０２０３】
この結果は、遺伝子発現が炎症によって引き起こされる生物の負荷に対する宿主応答の強さを特に反映しているという事実を指摘している。実際、全身性炎症を伴う血流中の感染は、免疫系への最大のストレスを示す。免疫系が感染源において病原体と戦う能力を持たない場合は、同様のストレスが局所性感染によって生じるであろう。しかし外傷性事象、例えば大手術によっても、免疫系は、ストレスに耐えるために、短時間、最大限に、その能力の限界まで使用されうる。さらにまた、遺伝子発現は、局所炎症によって引き起こされる弱いストレスの場合における宿主応答の重症度も示す。既に述べたように、選ばれた遺伝子は、わずか２つの群に分かれる。３０４１遺伝子プローブ（３６％）の第１群では、遺伝子発現が、免疫系の負荷と共に増加し（クラスター１〜４）、５４９６遺伝子プローブ（６４％）の他方の群では、遺伝子発現が減少する（クラスター５〜９）。公知の文献ゆえに［（Ｃａｌｖａｎｏら（２００５）およびＦｏｔｅｉｎｏｕら，２００８参照］、遺伝子発現が増加する場合は（プロ−およびアンチ−）炎症応答が言及され、遺伝子発現が減少する場合はエネルギー応答が言及されるだろう。炎症が進行している場合のエネルギー消耗は、制御できない免疫応答につながるであろう。
【０２０４】
宿主応答の重症度の定量
ヒートマップのソーティングは以下のスコアに従って行った。Ｘを、選ばれた遺伝子プローブの発現シグナルを合計した、ＲＮＡ試料についての対応する遺伝発現ベクトルとする。２つのベクトルＸ1およびＸ2間のユークリッド距離をｄ（Ｘ1，Ｘ2）という。さらにまた、ｃｏｒ（Ｘ1，Ｘ2）は、ピアソンによるＸ1とＸ2の間の相関係数を表すものとし、これは、Ｘ1とＸ2の間の角度のコサイン値に相当する［Ｍａｒｄｉａら，１９７９］。スコアは、次式に従って計算される
【数１】
2014508525.tif 000008
ｍＨとｍＳは、群ＮａＮ（ｍＨ）およびＳａＳ（ｍＳ）の遺伝子毎の平均値を合計した２つの遺伝子発現ベクトルである。スコアは、次のように図解することができる。距離ｄ（ｍＳ，ｍＨ）、ｄ（ｍＳ，Ｘ）およびｄ（Ｘ，ｍＨ）から三角形が形成され、その角を、簡略化のために、Ｘ、ｍＨおよびｍＳと表す（図３参照）。値：
【数２】
2014508525.tif 000009
は、角Ｘからｄ（ｍＳ，ｍＨ）によって規定される直線への垂線の足の位置を規定する。Ｌxの値は、ｍＨと垂線の足との距離に対応する。これは、三角形の角Ｘが、角ｍＨからどれくらい離れているかも示し、三角形の高さは評価されない。
【０２０５】
最後に、式１によって定義されるスコアは、距離ｄ（ｍＳ，ｍＨ）に対する距離Ｌxの相対的比率を示す。実際、式１から、Ｘ＝ｍＨの場合はスコア（ｍＨ）＝０％、Ｘ＝ｍＳの場合はスコア（ｍＳ）＝１００％が得られる。
【０２０６】
図３において、試料３は、ｍＳからは、ｍＨからよりも遠く離れており、−９．３％のスコア値が与えられる。試料５９は、ｍＨからは、ｍＳからよりも遠く離れており、１２７．８％のスコア値が与えられる。最後に、試料３７は、ｍＨとｍＳの間にあって、２７．７％のスコア値が与えられる。５０％という値は、ｍＨとｍＳに対して等しい距離を有する試料に割り当てられるだろう。
【０２０７】
距離ｄ（ｍＳ，ｍＨ）は、個々の遺伝子プローブの距離から、相加的に構成される。総距離を２成分に分けて、一方の成分ｄ+（ｍＳ，ｍＨ）をクラスター１〜４の遺伝子プローブから計算し、他方の成分ｄ-（ｍＳ，ｍＨ）をクラスター５〜９の遺伝子プローブから計算すると、総偏差における発現増加と発現減少の構成比に関する情報が得られる。本発明者らが調べたデータセットでは、３６％の遺伝子プローブによって表される増加が、総距離の５１％であった。全プローブのうちの６４％によって表される減少は、総距離の４９％だった。したがって平均すると、クラスター１〜４からの１遺伝子プローブの発現はクラスター５〜９の場合よりも大きく低下していた。増加と減少の合計比はほぼ等しかった。増加と減少の比を各試料から計算すれば、示された方向への偏差の進行に関する情報が得られる。
【０２０８】
図４は、２例の患者について上記の距離によって形成される三角形が、疾患の経過中にどのように動くかを示している。三角形の先端の上にある指標は試料を採取した日を示し、０は術前試料を示している。
【０２０９】
図５は、全ての試験試料に関するスコアを図示している。試験群と２つの経過を図１の場合と同様に配置した。黒い点はスコア値を表し、バーは７．５パーセント点の上方偏差または下方偏差を表す。
【０２１０】
ここに提案するスコアが、試験群の遺伝子発現の相違を定量するために使用しうる唯一のものではないことに留意すべきである。スコアの利点は、それによって相対的測定値、すなわち、急性炎症を伴わない群の遺伝子発現と、血液感染を有するＳＩＲＳ患者の遺伝子発現との間で決定される差のパーセント比率が定義されるという点にある。このスコアは、測定プラットフォームおよび使用する遺伝子マーカーの数に依存しない。
【０２１１】
スコアによって定量されるのは遺伝子活性の同時的増加および減少だけであるが、これは数千の遺伝子の発現から計算される。その原因は調べた現象の中にある。使用される遺伝子は、一般に、異なる過程を担っている。それゆえに、個々の遺伝子については、健常者からの発現の偏差は、さまざまな原因を有しうる。明示された方向への多くの遺伝子の群としての挙動は、免疫負荷の定量的な程度を反映している。
【０２１２】
２人の患者について術後状態を観察した実施例から、本スコアは宿主応答の目下の程度を捕捉していることがわかる。それゆえにこれを観察／モニタリングに使用することができる。実際、ある患者に関するスコアの値は、６日以内に、約２０％のパーセント点から約９０％のパーセント点まで変化している。さらにまた、これは免疫負荷を大まかに評価するのに適している。事実、２人の患者の術前試料は、２０％を超える増加したスコア値を示している。これは合併症が多い術後経過の原因の一つでありうる。
【０２１３】
（実施例２）数を減らしたマーカーによる急性炎症を有する患者における宿主応答の重症度の決定
シミュレーションに基づく遺伝子マーカーの選択
宿主応答の強度を決定するために、多数の遺伝子マーカーを使用した。一般に、調べた遺伝子は、異なる過程を担っており、個々の遺伝子ごとに、健常者からの発現の偏差はさまざまな原因を有している。より多くの遺伝子を観察するほど、発現の偏差について、免疫系の負荷以外の異なる原因を、より良く排除することができる。全ての関連遺伝子を観察すれば他の原因は完全に排除される。しかし、数を減らした遺伝子プローブでも免疫系のストレス状態を十分に反映するだろうという、根拠の確かな仮説がある。しかし、遺伝子数の削減は、結果として得られるスコアが元のスコア（マスタースコア）に十分近い場合にのみ、妥当と思われる。本発明者らの研究では、その平均発現が２つの試験群間で少なくとも０．８になる４３７２個の遺伝子プローブから、高い正確度でマスタースコアを決定することができた。実際、偏差が１パーセント点を上回ることはなかった。スコアを残り４１６５個の遺伝子プローブから計算した場合、偏差は８パーセント点未満だった。
【０２１４】
マーカーを選択するためのアルゴリズムはないので、マスタースコアを表現する好ましい遺伝子の数および量があるかどうかに関して、コンピュータシミュレーションによって調べることは、自明である。必要な遺伝子プローブの数を見積もるために、最初のシミュレーションでは、マスタースコアの８３５７個の遺伝子プローブのなかから最大１５００個をランダムに選択した。そのうちの３６％は、クラスター１〜４からとし、６４％はクラスター５〜９からとした。各選択ごとに、７３個のＲＮＡ試料全てについて、式１に従ってスコアを計算した。マスタースコアから±７．５パーセント点を超えて逸脱することのないスコアを持つ遺伝子プローブのセットを残した。５００回の繰り返しにおいて、そのような遺伝子マーカーのセットが２４１個、見つかった。これらのセットは全８３７５個の遺伝子プローブの代理になった。最も短いセットは１３８個の遺伝子プローブを含んでいた。次の５０００回の繰り返しでは、１回あたり最大１５０個の遺伝子プローブをランダムに選択し、クラスター間でのそれらの分布は１回目の場合と同じにした。結果として、本発明者らは、８６〜１４８遺伝子プローブの長さを有する２４セットを得た；対応するスコア値は、マスタースコアから±７．５パーセント点を超えて逸脱することはなかった。予備検査の結果、マスタースコアからの過度でない偏差を許容するのであれば、遺伝子マーカーの数をかなり減らしうることが実証される。以下に説明するシミュレーションでは、遺伝子プローブの最大数をさらに減らした。これらのシミュレーションの結果を表５にまとめる。
【０２１５】
最初のシミュレーションにおけるアプローチは、次のとおりであった。８３５７個の遺伝子マーカーと、６つの試験群からの６１個の発現ベクトルとの発現マトリックスを、主成分分析に供した（Ｍａｒｄｉａら，１９７９）。これにはＲ関数ｐｒｃｏｍｐを使用した。主成分と最も強く相関する５１２個の遺伝子プローブを選択した。これは、遺伝子クラスター１〜４からの１８３個（３６％）と遺伝子クラスター５〜９からの３２９個（６４％）を含んだ。こうして、選択量は、検討された遺伝子発現の変化における傾向を最も明確に示した遺伝子プローブに低減され、ここでは増加と減少が一次選択の場合と同じ比率だった。
【０２１６】
この事前選択（５１２遺伝子プローブ）から、５０００回のシミュレーションステップにおいて、４０〜５０個の遺伝子プローブをランダムに選択し、これらの遺伝子プローブから、７３個の遺伝子パターンの全てについて、式１に従ってスコアを計算した。少なくとも１つの試料に関するマスタースコアと新しいスコアの間の絶対差が７．５パーセント点を上回った場合には、その選択は廃棄した。そうでない場合は、その選択を保存した。このシミュレーションにより、この条件を満たす遺伝子プローブのセットが、２セット得られた。これらのセットを、セット１およびセット２として、対応する配列番号により、表４に記載する。これらは４９個および４７個の遺伝子配列を含んでいた。
【０２１７】
次の５０００回のシミュレーションステップでは、７０個の試料（９５％）について、簡約スコアがマスタースコアから７．５パーセント点を超えて逸脱しない遺伝子プローブタプルを残した。このシミュレーションステップでは、１４個の異なる組合せが見つかった。表４にセット３〜セット１６として配列番号で記載するそれらの量は、４６〜４９個の遺伝子配列を含んでいた。
【０２１８】
３回目のシミュレーションでは、ランダムに選択されるプローブの数を最大２０に減らし、選択手順を５００００回繰り返した。同様に、７０個の試料（９５％）について、簡約スコアがマスタースコアから７．５パーセント点を超えて逸脱しない遺伝子プローブタプルを残した。このシミュレーションでは、選択条件を満たす異なる組合せが２０個見つかった。
【０２１９】
表４にセット１７〜セット３６として配列番号で記載するそれらの量は、１８〜２０個の遺伝子配列を含んでいた。
【０２２０】
シミュレーションの結果は、明らかに数を減らしたプローブからでも、十分正確にスコアを決定しうることを示している。実際、１５パーセント点のエラーバー（これは±７．５パーセント点の誤差に相当する）は、それが、遺伝子マーカーの数をかなり減らすことにつながるのであれば、許容できると思われる。元のスコアがランダム偏差を生じやすく、基礎を成すランダム試料に依存することも、考慮すべきである。
【０２２１】
さらにまた、これらのシミュレーションは、スコアを決定づける好ましい遺伝子プローブはないことを示している。事実、異なる遺伝子プローブタプルが、類似するマスタースコアの見積もりをもたらす。実際、この見積もりは、合計４２３個の異なる配列数を含んでいる。
【表４】
2014508525.tif 000010
セット１（ｎ＝４９）５０８，５５３，６１１，６７９，７３４，７６９，８５１，８６０，８７１，８９６，１１１７，１２６３，１６４６，１６４７，１６４８，１６７５，１６８８，１９７５，２０１１，２０７７，２４１５，２５１６，２５６０，２５８１，３３８１，３４９１，３８２０，３９４７，４１５６，４２３０，４５０６，４５７６，５０１２，５２３５，５６１４，５７３０，５８０３，５８７３，６１１４，６２６２，６２６５，６３０１，６６８９，６７３８，６８２０，６８４７，６８７９，７０６９，７２３０
セット２（ｎ＝４７）１６０，３０９，３７４，４２８，４６２，９１１，９３７，１０３９，１０９２，１１０５，１４５８，１５３３，１６０４，１８９５，１９１７，１９９７，２００２，２０５５，２２４２，２３３２，２３６９，２３８６，２４２７，２５１６，２５４１，２５６０，２７８５，３３５９，３４０７，３６２４，４２３０，４５８７，４６３６，５１６４，５２３５，５２４７，５３７１，５７７６，６２７８，６３２８，６４９７，６６３６，７１５６，７２０１，７２３０，７３１４，７４５０
セット３（ｎ＝４８）１０，３６６，４１１，４６２，４９３，４９５，５６７，１２０４，１２２６，１４０９，１４１４，１４４９，１４８７，１５８３，１７２４，１７４４，
２０１３，２０５５，２０６４，２２０８，２２４８，２６９２，２８９１，３０５１，３６２４，４１５６，４２０５，４５１０，４５８７，４９２３，５１７６，５３７３，５４００，５４３５，５８７３，５９１２，５９５４，６０４１，６０７３，６２４７，６３０１，６４７８，６５２５，６９２３，７２０７，７４５０，７６７０，７６８１
セット４（ｎ＝４７）１６０，３５９，４４１，４９３，５２２，５４１，６５２，６９１，１１２８，１４０８，１５８３，１６５１，１６５２，１６６４，１６８８，２００２，２０７７，２２４８，２２７３，２４１５，２６７６，２６９０，２７５５，２８７６，３０５３，３６２３，４２１６，４３２７，４５２５，４５８７，４７６５，４８７０，５０１３，５１６４，５４３１，５６１４，５９５０，６０９８，６２６５，６４３２，６４９７，６９８１，７０６２，７２０２，７３１４，７４５０，７６０７
セット５（ｎ＝４９）９７，４２８，４４１，５４３，６１１，８５１，１１３６，１３８４，１５３３，１８６８，１９９７，２０７７，２１８３，２２０８，２２２６，２２６０，２３２９，２３８６，２４７５，２６８６，２６９０，２８７６，３０５４，３８２１，４０００，４３５７，４４７９，４５３０，４６３６，４７６５，４９２３，５０１３，５１３７，５２０４，５７６０，５７７６，５８１９，５８７３，５９０８，６００５，６０９９，６２４２，６４１７，６４９９，６５８５，６８４７，７４５０，７６７０，７６８１
セット６（ｎ＝４８）１０，９７，３５９，４７５，４９５，６２７，９２８，１０３９，１１１７，１２４８，１３８４，１４０８，１４７２，１６５２，１６７５，１７４４，１８６８，１９１８，２３７０，２４２３，２５３７，２７４２，２８６５，３０５１，３０８６，３４０８，３９１６，４０３０，４０７８，４２７４，４２９４，４３６２，４７５１，５１２９，５２３５，５２４７，５４３１，５７３４，５８０３，５８１１，５９０８，５９５０，６００５，６４１７，６４９７，６５２５，６９２３，７４５６
セット７（ｎ＝４９）３２，１６０，３８３，４１４，４９３，６１１，６５２，６７９，７３４，８８５，８９６，９４６，１１７７，１６４０，１６５０，１７０４，１８８２，２０７７，２２４８，２２５０，２２６０，２４１５，２５６１，３０８６，３４８８，３６２３，３６２４，４１３５，４１５６，４１６０，４５１０，４５２５，４５３０，４７４２，５１３７，５２０４，５２４７，５７３０，５９５０，６１１４，６２１０，６２２５，６４３０，６４７８，６４９７，６５４５，６６６８，７３１４，７６０７
セット８（ｎ＝４８）３５９，３８３，５１５，５３８，５４４，６９１，７６９，８１３，１０２４，１０３９，１０９２，１４０９，１５１９，１６４０，１６４９，１６６５，１６９６，１７３１，１７４４，２１６７，２１８３，２２２６，２２６０，２２７３，２４２５，２５１６，２６１８，２６３４，２６７２，３０５１，３１６８，３２０２，４１６０，４７５４，４９６６，５３７３，５４６５，５４９３，５５４１，５５７４，５９１２，６００５，６２１６，６４３２，６６３６，６７４８，６８４７，７４２３
セット９（ｎ＝４６）１６０，３５２，５４４，６９１，８０２，８８５，１１２６，１１４７，１１６３，１３３６，１４１６，１６３９，１９６９，２００２，２０５８，２０７７，２１８３，２３３１，２３３２，２４２６，２５２６，２７４２，２８５５，２８６０，２８９１，３０５４，３１３８，３４８８，３９４７，４５６０，４５７６，４７０７，４７７６，５２３５，５３７１，５４００，５４３１，５７６０，５８７３，６２４７，６３０１，６４１７，６６７３，６８２０，７４４７，７６０４
セット１０（ｎ＝４９）８，１６４，４６２，４９４，４９５，５１０，５４５，５６７，６１１，６７９，９４１，１０３９，１１０５，１１２８，１１４７，１３１８，１５３３，１６４９，１９１８，１９７３，１９７５，２０１１，２０７７，２０８０，２３７０，２５３７，３０５１，３２０２，３６７６，４２７４，４５８７，４９２８，５２０４，５３７３，５４３１，５４６５，５５４１，５７３４，５９０８，５９１２，５９５０，６２７８，６４１７，６４９７，６６６８，６６７３，７１５６，７２３０，７６７０
セット１１（ｎ＝４６）８９，９７，１６０，３５５，３５９，３６６，３７４，４１１，４６２，４７５，５１５，５３８，５４３，６９１，１３８４，１６４７，１６４９，１６５１，１７２４，２０１１，２０５８，２０６４，２２４２，２３６９，２８５９，３４１４，４０００，４７４２，４７６５，４８７０，４９６６，５０４０，５２３２，５２４７，５２７６，５３７３，５４３１，５７６０，５８７３，５９５４，６４１７，６４１９，６４９７，６５４５，６６３６，７４８４
セット１２（ｎ＝４９）８，８９，５１５，５４３，５８５，７６９，９６９，１１２６，１１６３，１５２６，１５８３，１６３９，１７４４，２０１９，２３９３，２４１５，２４５３，２６１８，２６９０，２６９２，２８１０，２８５５，２８６３，３１５３，３１５８，３１９０，３４０８，４０００，４０８３，４１０４，４２４８，４４７９，４４９１，４５５０，４６６１，４８７７，４９９５，５１７６，５２７６，５５９９，５６９５，６０７３，６１１４，６２６５，６４１７，６４９９，６５８５，６６３２，６６７３
セット１３（ｎ＝４８）４１４，５３８，９４６，１２６３，１３８４，１５１２，１８９５，２０７７，２２４８，２２６０，２５１６，２６７６，２９７５，３１６８，３４１４，４０８３，４２７４，４７７６，４８００，４９１９，４９２３，５１７９，５２０４，５４３１，５４９３，５５４１，５６１９，５６９５，５８１９，６００５，６０７３，６０９９，６２１０，６２４７，６２６５，６３５０，６４１７，６４３２，６４９９，６５３６，６５４５，６６３６，６６６８，６６８９，７０４０，７０６２，７４７２，７６０４
セット１４（ｎ＝４７）３８３，４２８，５３８，５５３，６９１，８１４，８７１，８９６，９１１，９３７，１４２６，１６３９，１６８５，１６８８，１９８３，２０９３，２２５３，２２６０，２４５４，２５１６，２５８７，２６７２，２７６１，２８６５，２９７５，３０８６，３７８１，４０００，４０３０，４３０８，４５１０，４６３６，４９２３，５１３７，５２３５，５５７４，５７７６，５８１９，５９０８，６２２６，６２７８，６４１７，６６３２，７２０２，７２３０，７３１５，７４５６
セット１５（ｎ＝４６）９７，３６６，３８３，８０２，１４２６，１５１４，１５５８，１６８５，１７４４，１９７５，２０１１，２０１３，２３６９，２４１５，２４５４，２５１０，２５１６，２５７７，２５８７，２７５９，２９６８，３１６８，３３６４，３６４１，３７８０，４０８３，４２３０，４２９４，４５８７，４６３８，４８１７，５０４０，５１６４，５２７６，５３７１，５４６５，５５４１，６０７３，６０９８，６１１４，６１８４，６２１６，６４９７，６５１５，７０６２，７２０２
セット１６（ｎ＝４９）１０，５０４，５４１，５５３，５６７，６５２，８０２，１０２４，１０９２，１１３６，１１９７，１５１９，１６４６，１６４７，１６４８，１６５２，２０５５，２０５８，２２６０，２２７３，２３３０，２３３１，２４１５，２４９１，２５８１，２６１８，２６７６，２７４２，３０５３，３４０８，３６５２，３９１５，４２１６，４８７０，５２３５，５６４１，５６９５，５９５４，６１１４，６２７８，６４１９，６４６１，６７９１，６８２０，６８４７，６９２３，７４２８，７６０４，７６７０
セット１７（ｎ＝２０）１０，１６０，４２８，８７１，９４１，１１３６，１１９７，１４１６，１５５８，１７８６，１９５１，２３８６，２５１０，２５６０，３４８８，３６５２，３７８１，５１７６，５４００，６５１５
セット１８（ｎ＝２０）８７１，１１６３，１４１４，１４１６，１４２６，１４８７，２００１，２０５５，２３６９，２３８６，２５５２，２５７７，２８６５，３０５１，４５５０，４５７７，５６１４，６０９８，７３６９，７４２３
セット１９（ｎ＝２０）５６７，９５８，２２２６，２２５０，２２６０，２４２７，２５１６，３３６４，４０３０，４１３５，５２３５，５５７４，５９５０，６１１４，６２２６，６２６７，６２７８，６４１８，７０６９，７５１８
セット２０（ｎ＝２０）４０９，１６４７，１６４８，１７７０，１８８３，１９５１，２０１３，２３８６，２４２３，３１５２，３４９１，４２０５，４５７７，４６６１，４７６５，４９１９，７４２８，７６０４
セット２１（ｎ＝２０）３５５，４８０，４９４，６６７，１４９２，２４７５，２８５５，２９４８，３１５５，３１５８，３４０８，３７８０，４６６１，５１１３，５２３２，５３６８，５５７４，６１１４，６４１９，６４９９
セット２２（ｎ＝１９）７６９，１１６３，１４７２，２０７７，２３７０，２７５９，３４８８，３５６７，３７３７，３７８０，４２３０，４２４５，４２７４，４５５０，５９５０，６４９７，７０６９，７１０９，７６８１
セット２３（ｎ＝２０）１６０，１６４，３５５，４１１，１１０６，１４０８，１６７５，１６７９，２３８６，２４５３，２５１６，２８１０，３１６８，３２０２，３６５２，４２３０，５５７４，５９８６，７４２８，７４８４
セット２４（ｎ＝１９）１０，１６４，８８５，１２６３，１３１８，１４１６，１４９２，１５０８，１６４７，１９５１，２２５０，２５６０，２７８５，２８２７，３０８６，４５０６，５１３７，５５７５，５９５４
セット２５（ｎ＝１９）３２，５２２，６７９，１５１９，２００１，２４９１，２５１６，２６７６，３４１２，３７３７，４２０５，４２９４，４５６０，５２３５，５９５４，６００５，６１１４，６４９９，６５２５
セット２６（ｎ＝１９）９５８，１４４９，１４７２，１５８２，２３３２，２５１６，２５５２，２８９１，２９７５，３１６８，３１９０，３６８３，３８２０，３９４７，４２４５，４５３０，７０４０，７０６９，７１４５
セット２７（ｎ＝２０）４２８，５１５，５４４，５６２，５６７，１２６３，２００２，２３３２，２５２６，３４３８，４５７７，４７５４，５５７４，５６１４，５９１２，６３２８，６５１５，７１５６，７４２３，７４５６
セット２８（ｎ＝２０）３５５，５０８，９３７，１２６３，１９７３，２００２，２５１０，４０７８，４１５６，４５５０，４６７３，４８１７，５２４７，５３６８，５７３０，６００５，６２４７，６５１５，７２０１，７２０７
セット２９（ｎ＝２０）１０，５４４，８７１，１４０８，１４８７，１６４９，２００２，２４１５，２６９０，２８５９，２９７５，３１２６，４５７７，４６３６，５５４１，６０７３，６４１７，６４３２，６８６６，６８７９
セット３０（ｎ＝２０）８９６，１２４８，１３１８，１４７２，１７８６，１８３０，１９８３，２３８６，２８６５，２９７５，３６４１，３９１６，４０３０，４５３０，４９９５，５４７２，５６１９，６０９９，６２４７，６２６５
セット３１（ｎ＝２０）３５５，４６２，１４１６，１９８３，２０１１，２１８３，２２４８，２６１８，３１９０，３４１２，４４９０，４５７６，４７７６，４９２３，５１６４，６１０１，６１１４，６２７８，７３１４，７３６９
セット３２（ｎ＝２０）３１０，１２２６，１８９５，２２４８，２４２７，２５１６，２５５２，２６９０，３０８６，３４３８，３９１５，４２１６，４５８７，５２３５，５２７６，５９５４，６２６５，６４７８，６５１５，７２０７
セット３３（ｎ＝２０）４９３，５８４，６３３，９３７，２３３０，２３７７，２４９１，２５８７，３１５３，３６８３，４２１６，４２４８，４５３０，６１１４，６４１９，６４７８，６５２５，６６８９，７２０２，７４５６
セット３４（ｎ＝２０）１０，３５９，３８３，４７８，６２６，１４７２，１４８７，１６４７，２４７５，３６８３，３７８０，４４９０，４６３６，５１７９，５２４７，５３７１，５９５０，６７４８，６９２３，７６７０
セット３５（ｎ＝２０）９７，６２６，１０３９，１１６３，１４２６，１６１７，１７０４，２００２，２２４８，２６９０，３１６８，４２１６，４６３８，５２４７，５６１４，５９５０，６２６５，６４６１，６６３２，７４２８
セット３６（ｎ＝２０）３６６，４１４，５４４，７３４，１２６３，１４１６，２１６７，２２０８，２２５０，２３７０，２４９１，２５２６，２８５５，３１９０，３４８８，４０８３，４２４８，６６７３，６８４５，６８４７
【０２２２】
表４に示す個々のセット１〜３６と、以下の２つのセット：セット３７（ｎ＝１０）：配列番号：１９８３、５０７、５４３１、３０４３、１６６５、５７７６、２９０２、６５８５、３１６７および７４５；ならびにセット３８（ｎ＝７）：配列番号：１９８３、５０７、５４３１、３０４３、１６６５、５７７６および７６９５は、それぞれ、それ自体が、本発明の好ましい実施形態を構成し、これらを使って、本発明に示すマスタースコアからの偏差の限度内のみに存在するスコア値を得ることができるので、個々のセット１〜３８はそれぞれ、急性感染性および／または急性炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度のインビトロ決定に関して、被験者または患者の試料における正確な記載を可能にすることに留意すべきである。
【０２２３】
好ましい遺伝子マーカータプル
本願出願前に公開されていなかった出願人らによる先の特許出願ＤＥ１０２００９０４４０８５では、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）を有する患者における感染を示す遺伝子発現マーカーが見いだされた（ＤＥ１０２００９０４４０８５）。そこで調べられた１３個の遺伝子マーカーのうち、６〜７個のマーカーは、ここで調べられた８５３７個の遺伝子プローブのリストの中にも見いだされる。これの説明は、感染を有するＳＩＲＳ患者は、感染を伴わないＳＩＲＳ患者よりも頻繁に、高い免疫負荷にさらされることである。以下のステップでは、式１に従ってこれらのマーカーの発現から計算されたスコアが、１つ目の応用例において導入されたマスタースコアと同じように宿主応答を表現することが示される。さらにまた、マーカーセットを拡張することによって、マスタースコアからの偏差を非常に明確に低減させうることも示される。
【０２２４】
１つ目の応用例の遺伝子選択では、本願出願前に公開されていなかった本出願人らの出願（ＤＥ１０２００９０４４０８５）からの６個の遺伝子配列が見いだされ、それらを本明細書ではその記号で示す：ヒートマップクラスター２のＴＬＲ５およびＣＤ５９、ヒートマップクラスター５のＣＰＶＬおよびＦＧＬ２、ヒートマップクラスター６のＨＬＡ−ＤＰＡ１およびＩＬ７Ｒ。さらにもう一つの遺伝子マーカー（ＣＬＵ）については、マイクロアレイＢｅａｄＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  ＨＴ−１２  ｖ３上で使用される遺伝子プローブが、シグナルを与えなかった。これらの７つの遺伝子マーカーに関して、代替的プラットフォーム、いわゆるリアルタイムＰＣＲで測定された発現値を、表２からの６７個の患者試料について得た。８５３７個の遺伝子プローブのリストから、マイクロアレイ上での発現値が、マーカーＣＬＵに対応するリアルタイムＰＣＲ上での発現値と共に、０．８の相関関係（ピアソンによる相関係数）に達したＴＦＰＩを、ＣＬＵの代わりに選択した。
【０２２５】
７タプルの遺伝子プローブについてマイクロアレイで決定された、７３個の被検ＲＮＡ試料の遺伝子発現から、本発明者らは、式１に従ってスコアを計算した。マスタースコアからのその偏差は、半分の試料については、最大で±６パーセント点になり、四分の三の試料については最大で±１１パーセント点になり、９０％の試料については±１８．３パーセント点になった。
【０２２６】
次のステップでは、残り８５３０個の遺伝子プローブのうち１個の遺伝子プローブをそれぞれ逐次的に、上記７マーカーのセットに付加し、対応するスコアを式１に従って計算した。このセットを最小誤差を与えるプローブによって拡張した。誤差は、マスタースコアからの全ての絶対偏差の９５％分位点と定義した。この手順を、誤差が±１０パーセント点未満になるまで繰り返した。これは、遺伝子マーカータプルを１０遺伝子プローブまで拡張した後に起こった。７個のおよび１０個の遺伝子プローブについてのスコアの値ならびにマスタースコアを、表５に要約した。この表はさらに、底を２とする対数をとった対応する遺伝子配列の発現シグナルも示している。
【表５】
2014508525.tif 000011
2014508525.tif 000012
【０２２７】
（実施例３）代替的プラットフォームでの宿主応答の重症度の決定
２番目の実施例で既に述べたように、表５からの７個の関連遺伝子マーカーと６７個のＲＮＡ試料について、リアルタイムＰＣＲによって、遺伝子発現シグナルを測定した。そのために、以下の測定ステップおよび分析ステップを行った。
【０２２８】
リアルタイムＰＣＲ
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ、ドイツ連邦共和国カールスルーエ）を使用した。患者のｃＤＮＡを１：２５の比で水に希釈し、そのうちの１μｌをＰＣＲに利用した。ピペットを使って各試料を３回複製した。
１ウェル（１０μｌ）あたりのＰＣＲ調製物
２μｌのテンプレートｃＤＮＡ１：１００
１μｌのフォワードプライマー、１０ｍＭ
１μｌのリバースプライマー、１０ｍＭ
１μｌのフルオレシンリファレンス色素
５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ
【０２２９】
テンプレートを含まないマスターミックスを調製し、それをＰＣＲプレートに９μｌずつ分注した。そこに、患者のｃＤＮＡをそれぞれピペッティングした。
【０２３０】
以降のＰＣＲプログラムは次のステップからなった：
９５℃：２分（ポリメラーゼの活性化）
９５℃：１０秒（変性）*
５８℃：１５秒（付着）*
７２℃：２０秒（伸長）*
５５℃〜９５℃：１０秒（融解曲線の生成**、各ステップ後に初期温度を１℃ずつ増加）
*４０回
**４１回
【０２３１】
ＢＩＯＲＡＤのｉＱ（商標）５マルチカラーリアルタイムＰＣＲ検出システムを対応する評価ソフトウェアと共に使用した。いわゆるＣｔ値（閾を超える推定サイクル数）を、曲線の線形増加範囲における測定結果として、プログラムにより自動的に計算した。測定値をストリング形式で保存した。
【０２３２】
データ解析：
データ解析は、ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇから入手することができるフリーソフトウェアＲ  ＰｒｏｊｅｃｔバージョンＲ２．８．０（Ｒ．ａｐｐ  ＧＵＩ１．２６  （５２５６）、Ｓ．ＵｒｂａｎｅｋおよびＳ．Ｍ．Ｉａｃｕｓ、（著作権）Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２００８）を使って行った（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，２００６参照）。解析に使用したＣｔ測定値のデータマトリックスを次のように処理した。マーカー遺伝子と一緒に、参照物質として使用した３つのいわゆるハウスキーパー遺伝子を測定した。標準化のために、選択した３つのハウスキーパー遺伝子の平均値を各試料について計算した。この値から個々のマーカーのＣｔ値を差し引いた。こうして得た各ΔＣｔ値は、キャリブレーターに対するターゲット転写産物の相対的存在量を反映しており、正のΔＣｔ値は、参照物質の平均値より高い存在量を示し、負のΔＣｔ値は参照物質の平均値より低い存在量を示す。
【０２３３】
標準化されたΔＣｔ値のデータマトリックスを表６に要約する。
【０２３４】
式１および実施例１に従って、リアルタイムＰＣＲによって測定された発現シグナルから、宿主応答の重症度を定量するための対応するスコアを計算した。このスコアとマスタースコアとの比較を図６に示す。ここでは、マスタースコアが、上方および下方に１０パーセント点の、対応するエラーバーで図示されており、ＰＣＲ測定から決定されたスコアは菱形で図示されている。実施例１で既に説明したとおり、スコアの計算規則は、使用する遺伝子マーカーの数にも、測定プラットフォームにも依存せず；スコアを計算するには、表１に定義する表現型群ＮａＮおよびＳａＳの平均発現シグナルしか必要ない。
【０２３５】
図６から明らかなように、７個のマーカーのリアルタイムＰＣＲ測定によって決定されたスコアは、マスタースコアと類似する傾向を示すので、その生物に急性炎症の負荷が掛かっている時の宿主応答の重症度を指摘する。リアルタイムＰＣＲが、マイクロアレイと比べると、遺伝子発現を決定するための、より簡便で、より迅速で、より安価な測定プラットフォームであることに言及しておかなければならない。その制約は、同時に測定することができるマーカーの数が少ないということである。
【表６】
2014508525.tif 000013
2014508525.tif 000014
【０２３６】
（実施例４）患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するためのタンパク質の差異的発現
患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するためのマーカーの差異的発現は、トランスクリプトームマーカーによって達成することができるだけでなく、タンパク質レベルでも達成することができる。バイオマーカーとしてのタンパク質の使用については、数多くの例があり、それらは既に手短に論じられている（Ｐｉｅｒｒａｋｏｓ，２０１０）。また、個々のタンパク質マーカーが、今までのところ、満足のいく結果を与えていないか、平凡な結果しか与えていないという事実、および好ましくはタンパク質マーカーの組合せを応用すべきであるという事実も指摘されている。
【０２３７】
一例として、タンパク質マーカーが、患者の宿主応答の重症度のインビトロ決定に、同じように適していることを証明する結果を与える実験を、以下に説明する。遺伝子転写産物の検討のために選択したタンパク質であって、その遺伝子転写物については、表示の目的に適していることが既に先の実施例で示されているタンパク質を、好ましく選択した。
【０２３８】
調べた患者群
敗血症を有する患者９人、心臓外科的介入後の患者３人、および健常被験者７人の試料を調べた（ＥＤＴＡ血液試料）。心臓外科的介入を受けた患者（ＩＣＵ患者）は、臨床基準に従って、試料採取時点でＳＩＲＳ（全身性炎症応答症候群）の診断に分類された。これら３つの患者群は、表１の表現型ＬａＳおよびＳａＳ（両方）、ＮａＳ、ならびにＮａＮを表す。
【０２３９】
実験手順
血液試料から、密度勾配（リンパ球分離用培地ＬＳＭ１０７７、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、ケルベ）を利用して、２つの白血球細胞集団、すなわち、末梢単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）と、多形核細胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＭＮ）を単離した。実験に使用した細胞は、ＰＢＭＣの２つの亜集団、すなわちＴリンパ球と単球に相当した。
【０２４０】
タンパク質の検出はフローサイトメトリーとウェスタンブロットによって行い、表面タンパク質にはフローサイトメトリーを、また細胞内タンパク質にはウェスタンブロットを使用した。どちらの方法にも、モノクローナル抗体を、好ましく使用した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク）では、Ｔリンパ球および単球について、次に挙げる遺伝子のタンパク質の発現を調べた：ＣＤ５９、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＩＬ７Ｒ、ＴＬＲ５、およびＨＬＡ−ＤＲ複合体。分析した血液試料は次のような構成であった：敗血症患者（ｎ＝９）、ＩＣＵ患者（ｎ＝３）および健常対照（ｎ＝７）。Ｔリンパ球と単球は、２つの表面マーカー、すなわち、Ｔリンパ球用のＣＤ３補助受容体［Ｔｓｏｕｋａｓら，１９８５］と単球用のＣＤ１４受容体［Ｇｏｙｅｒｔら，１９８８］とを使って識別した。さらにまた、細胞を、それらの細胞サイズ（ＦＳＣ−Ｈ）およびそれらの顆粒度（ＳＳＣ−Ｈ）によって同定した。ウェスタンブロットでは、敗血症患者および健常被験者におけるＰＢＭＣの全集団の溶解物において、次に挙げる遺伝子からのタンパク質の発現を調べた：ＦＧＬ２、ＣＬＵおよびＣＰＶＬ。実験は標準的なウェスタンブロットプロトコールを使って行った。陽性対照（トランスフェクト細胞の溶解物）を常に実施し、実験の標準化はβアクチンに基づいて行った。抗フィブリノゲン様タンパク質２（ＦＧＬ２の産物）抗体、抗クラスタリン（ＣＬＵ遺伝子の産物）抗体および抗卵黄形成カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＣＰＶＬ遺伝子の産物）抗体はモノクローナルマウス抗体であり、二次抗体はＨＲＰ結合ウサギ抗マウス抗体であった。βアクチン用の抗体はモノクローナル（１３Ｅ５）ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、米国ダンバーズ）であった。
【０２４１】
データ解析
測定データは各測定デバイスのソフトウェアによって与えられた。それらを表７に要約する。調べた２〜３の表現型の群について、個々のタンパク質の発現を、統計的有意性について検定した。この際、実施例１の場合と同様に、一元配置分散分析（Ａｎｏｖａ）およびペアワイズｔ検定を使用した。比較の結果を表７の最後に列挙する。それらは次のように要約される。
【０２４２】
Ｔリンパ球では、ＩＬ７Ｒ遺伝子からのタンパク質発現が、敗血症患者では健常ドナーより有意に低かった。したがって遺伝子発現の場合と同方向の変化が認められた。ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＰＡ１抗原（ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子からの産物）の発現は、敗血症患者では健常ドナーより有意に高かった。したがって、遺伝子発現の場合とは反対方向の変化が認められた。ＣＤ５９、ＴＬＲ５およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子からのタンパク質発現において、Ｔリンパ球は、検討した表現型の群の間で有意差を示さなかった。
【０２４３】
遺伝子ＨＬＡ−ＤＰＡ１およびＴＬＲ５からのタンパク質発現において、単球は、３つの群で何も相違を示さなかったが、ＣＤ５９およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子からのタンパク質発現は、健常被験者では、ＳＩＲＳ患者および敗血症患者より有意に高かった。ＩＬ７Ｒ遺伝子産物は単球では追跡することができなかった。
【０２４４】
ＰＢＭＣ溶解物のウェスタンブロット分析により、ＦＧＬ２遺伝子からのタンパク質発現は、敗血症患者では、健常対照と比較して有意に増加し、一方、ＣＬＵ遺伝子からのタンパク質発現は、敗血症患者では減少することが明らかになった。
【０２４５】
したがってどちらのタンパク質についても、遺伝子発現の場合とは反対方向の発現の変化が明らかになった。ＣＰＶＬ遺伝子産物は溶解物では追跡することができなかった。
【表７】
2014508525.tif 000015
【０２４６】
まとめ
上述の実施例は、急性炎症の場合の宿主応答の重症度が、選ばれた遺伝子からのタンパク質の発現にも反映されることを明らかにしている。遺伝子発現解析の結果は、マーカー候補の大規模なコレクションをもたらす。それゆえに、実施例１で確立された遺伝子発現からのマスタースコアに十分に似た適切な重症度スコアをタンパク質発現から決定することは、自明である。
【０２４７】
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Ｉｂｒａｈｉｍ  ＥＨ，  Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｇ，  Ｗａｒｄ  Ｓ，  Ｆｒａｓｅｒ  ＶＪ，  Ｋｏｌｌｅｆ  ＭＨ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＣＵ  ｓｅｔｔｉｎｇ．  Ｃｈｅｓｔ．  ２０００；  １１８（１）：１４６−５５．
Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，  Ｕｎｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｄａｖｉｓ  ＣＧ，  Ｍｕｅｎｚｅｒ  ＪＴ，  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＴＡ，  Ｃｈａｎｇ  Ｋ，  Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＤＦ，  Ｃｌａｒｋ  ＡＴ，  Ｃｏｏｐｅｒｓｍｉｔｈ  ＣＭ，  ＭｃＤｕｎｎ  ＪＥ，  Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ  ＲＳ．  （２０１０）  ＩＬ−１５  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８４（３）：１４０１−９．  
Ｉｒｅｇｕｉ，  Ｍ．，  Ｗａｒｄ，  Ｓ．，  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｇ．，  Ｆｒａｓｅｒ，  Ｖ．Ｊ．，  Ｋｏｌｌｅｆ，  Ｍ．Ｈ．  （２００２）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｌａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ｃｈｅｓｔ  １２２（１）：２６２−２６８．
Ｉｓａａｃｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，  １９９８；１０１：８１３-６．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＢ，  Ｌｉｓｓａｕｅｒ  Ｍ，  Ｂｏｃｈｉｃｃｈｉｏ  ＧＶ，  Ｍｏｏｒｅ  Ｒ，  Ｃｒｏｓｓ  ＡＳ，  Ｓｃａｌｅａ  ＴＭ．  （２００７）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  ＳＩＲＳ  ａｎｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２４５（４），  ６１１−６２１
Ｋｏｕｌａｏｕｚｉｄｉｓ  Ａ，  Ｂｈａｔ  Ｓ，  Ｓａｅｅｄ  ＡＡ  （２００９）  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １５（９）：１０４２−９．
Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ−−Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  １９７９−１９８７．  ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９０  ３９，  ３１−３４
Ｋｉｍｕｒａ  Ｆ，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｈ，  Ｙｏｓｈｉｄｏｍｅ  Ｈ，  Ｏｈｔｓｕｋａ  Ｍ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ．  （２０１０）  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｓｕｒｇ．  Ｔｏｄａｙ  ４０（９）：７９３−８０８．
Ｋｌｅｉｎ  Ｄ．  （２００２）  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ８（６）：２５７−２６０．
Ｋｏｆｏｅｄ  Ｋ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｏ，  Ｋｒｏｎｂｏｒｇ  Ｇ，  Ｔｖｅｄｅ  Ｍ，  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｊ，  Ｅｕｇｅｎ−Ｏｌｓｅｎ  Ｊ，  Ｌａｒｓｅｎ  Ｋ  （２００７），  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ−１  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １１，  Ｒ３８
Ｋｕｍａｒ  Ａ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｄ，  Ｗｏｏｄ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｔｈｅｎｓｉｏｎ  ｂｅｆｏｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３４（６），  １５８９−１５９６
Ｌｅ−Ｇａｌｌ  ＪＲ，  Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ，  Ｌｅｌｅｕ  Ｇ，  Ｋｌａｒ  Ｊ，  Ｈｕｉｌｌａｒｄ  Ｊ，  Ｒｕｅ  Ｍ，  Ｔｅｒｅｓ  Ｄ，  Ａｒｔｉｇａｓ  Ａ  （１９９５）  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｓｅｖｅｒｅ  Ｓｅｐｓｉｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃａｒｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．  ＪＡＭＡ  ２７３，  ６４４−６５０  
Ｌｅｖｙ  ＭＭ，  Ｆｉｎｋ  ＭＰ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＪＣ，  Ａｂｒａｈａｍ  Ｅ，  Ａｎｇｕｓ  Ｄ，  Ｃｏｏｋ  Ｄ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｊ，  Ｏｐａｌ  ＳＭ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＬ，  Ｒａｍｓａｙ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  ２００１  ＳＣＣＭ／ＥＳＩＣＭ／ＡＣＣＰ／ＡＴＳ／ＳＩＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２９，  ５３０−５３８  
Ｍａｒｄｉａ，  ＫＶ，  Ｋｅｎｔ，  ＪＴ，  Ｂｉｂｂｙ，  ＪＭ  （１９７９）：  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７９
Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＪＣ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｄ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＬ，  Ｃｏｏｋ  ＤＪ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｊ，  Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ  ＲＰ，  Ｏｐａｌ  Ｓ，  Ａｂｒａｈａｍ  Ｅ，  Ｂｒｅｔｔ  ＳＪ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，  Ｍｅｈｔａ  Ｓ，  Ｄｅｒｚｋｏ  Ａ，  Ｒｏｍａｓｃｈｉｎ  Ａ；  ＭＥＤＩＣ  ｓｔｕｄｙ．  （２００４）  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｉｌｌｎｅｓｓ：  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＥＤＩＣ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １９０（３）：５２７−３４．
Ｍｅｉｓｅｌ  Ｃ，  Ｓｃｈｅｆｏｌｄ  ＪＣ，  Ｐｓｃｈｏｗｓｋｉ  Ｒ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｔ，  Ｈｅｔｚｇｅｒ  Ｋ，  Ｇｒｅｇｏｒ  Ｊ，  Ｗｅｂｅｒ−Ｃａｒｓｔｅｎｓ  Ｓ，  Ｈａｓｐｅｒ  Ｄ，  Ｋｅｈ  Ｄ，  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｈ，  Ｒｅｉｎｋｅ  Ｐ，  Ｖｏｌｋ  ＨＤ．  （２００９）  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｅｐｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ：  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｔｒｉａｌ．
Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １８０（７）：６４０−８．
Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｇ，  Ｖｅｎｅｔ  Ｆ，  Ｐａｃｈｏｔ  Ａ，  Ｌｅｐａｐｅ  Ａ．  （２００８）  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｋｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｏｌｄ  Ｃｅｒｅｍｏｎｙ，  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  １４（１−２）：６４−７８．
Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｇ，  Ｖｅｎｅｔ  Ｆ，  Ｍｅｉｓｅｌ  Ｃ，  Ｓｃｈｅｆｏｌｄ  ＪＣ．  （２０１０）  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ＨＬＡ−ＤＲ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＩＣＵ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １４（４）：４３２．  
Ｍｕｅｎｚｅｒ  ＪＴ，  Ｄａｖｉｓ  ＣＧ，  Ｃｈａｎｇ  Ｋ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＲＥ，  Ｄｕｎｎｅ  ＷＭ，  Ｃｏｏｐｅｒｓｍｉｔｈ  ＣＭ，  Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ  ＲＳ．  （２０１０）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７８（４）：１５８２−９２．  
Ｎｏｌａｎ  Ｔ，  Ｈａｎｄｓ  ＲＥ，  Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ．    （２００６）  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌｔ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  １（３）：１５５９−１５８２．
Ｏｐａｌ  ＳＭ，  Ｌｉｍ  Ｙ−Ｐ，  Ｓｉｒｙａｐｏｒｎ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｌｙ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ３５（２），  ３８７−２９２
Ｐａｃｈｏｔ  Ａ，  Ｌｅｐａｐｅ  Ａ，  Ｖｅｙ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｓｕｒｖｉｖｏｒ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｕｒｖｉｖｏｒ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  １０６（１），  ６３−７１．  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｙ  １７
Ｐｉｅｒｒａｋｏｓ  Ｃ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＬ．  （２０１０）  Ｓｅｐｓｉｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ，  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  １４：Ｒ１５．
Ｐｒｕｉｔｔ  Ｋ．Ｄ．，  Ｔａｔｕｓｏｖａ  Ｔ．，  Ｍａｇｌｏｔｔ  Ｄ．Ｒ．  （２００７）  ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  （ＲｅｆＳｅｑ）：  ａ  ｃｕｒａｔｅｄ  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ，  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６１−５．
Ｒｏｄｅｒｏ  Ｌ，  Ｃｕｅｎｃａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  Ｍ，  Ｃｏｒｄｏｂａ  Ｓ，  Ｃａｈｎ  Ｐ，  Ｄａｖｅｌ  Ｇ，  Ｋａｕｆｍａｎ  Ｓ，  Ｇｕｅｌｆａｎｄ  Ｌ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｕｄｅｌａ  ＪＬ．  （２００２）  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｆｕｎｇｅｍｉａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４０：２２６６-９．
Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ  （２００６），  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ．  ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０，  ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ
Ｒａｍｉｌｏ  Ｏ，  Ａｌｌｍａｎ  Ｗ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｗ，  Ｍｅｊｉａｓ  Ａ，  Ａｒｄｕｒａ  Ｍ，  Ｇｌａｓｅｒ  Ｃ，  Ｗｉｔｔｋｏｗｓｋｉ  ＫＭ，  Ｐｉｑｕｅｒａｓ  Ｐ，  Ｂａｎｃｈｅｒａｕ  Ｊ，  Ｐａｌｕｃｋａ  Ｋ  Ａ，  Ｃｈａｕｓｓａｂｅｌ  Ｄ，  （２００７）    Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０９，  ２０６６−２０７７
Ｒｕｏｋｏｎｅｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ  ｆｅｖｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８（４），  ２８３−５
Ｒｕｏｋｏｎｅｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ４６（４），  ３９８−４０４  
Ｓｃｈｒｅｎｚｅｌ  Ｊ．  （２００７）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ．  ３０  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２−６．
Ｓｉｍｏｎ  Ｌ，  Ｇａｕｖｉｎ  Ｆ，  Ａｍｒｅ  ＤＫ，  Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｉｓ  Ｐ，  Ｌａｃｒｏｉｘ  Ｊ，    ２００４）  Ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ａｎｄ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｓ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ  ３９，  ２０６−２１７
Ｓｉｍｏｎ  Ｒ．  （２００５）  Ｒｏａｄｍａｐ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３，  ７３３２−７３４１  
Ｓｐｏｎｈｏｌｚ  Ｃ，  Ｓａｋｒ  Ｙ，  Ｒｅｉｎｈａｒｔ  Ｋ，  Ｂｒｕｎｋｈｏｒｓｔ  Ｆ，  （２００６）  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  １０，  Ｒ１４５        
Ｓｔｏｒｅｙ  ＪＤ，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ  （２００３）．  ＰＮＡＳ  １００  （１６）：  Ｓ９４４０-Ｓ９４４５
Ｓｔｒｉｍｍｅｒ，  Ｋ．  （２００８）．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：  １４６１−１４６２
Ｓｕｐｒｉｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ：  ａ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ＩＣＵ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２６（９），  １２３２−１２３８  
Ｔａｎｇ  ＢＭＰ，  Ｅｓｌｉｃｋ  ＧＤ，  Ｃｒａｉｇ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７ａ）  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｆｏｒ  ｓｅｐｓｉｓ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ７，  ２１０−２１７
Ｔａｎｇ  ＢＭＰ，  ＭｃＬｅａｎ  ＡＳ，  Ｄａｗｅｓ  ＩＷ，  Ｈｕａｎｇ  ＳＪ，  Ｌｉｎ  ＲＣＹ  （２００７ｂ）  Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｐｓｉｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７６（７），  ６７６−６８４  
Ｔａｎｇ  ＢＭ，  Ｈｕａｎｇ  ＳＪ，  ＭｃＬｅａｎ  ＡＳ  （２０１０）．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，  １４：Ｒ２３７，  ｄｏｉ：１０．１１８６／ｃｃ９３９２
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ＵＳ  ２０１０／０２９３１３０  Ａ１
ＵＳ  ２００９／０３０７１８１  Ａ１
ＵＳ  ２００８／００２０３７９  Ａ１
ＵＳ  ２００６０２４６４９５
ＵＳ  ６９６０４３９  
Ｖａｌａｓｅｋ  ＭＡ，  Ｒｅｐａ  ＪＪ．  （２００５）  Ｔｈｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．  Ａｄｖａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｄｕｃ．  ２９：１５１−１５９．
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Ｖｅｎｅｔ  Ｆ，  Ｄａｖｉｎ  Ｆ，  Ｇｕｉｇｎａｎｔ  Ｃ，  Ｌａｒｕｅ  Ａ，  Ｃａｚａｌｉｓ  ＭＡ，  Ｄａｒｂｏｎ  Ｒ，  Ａｌｌｏｍｂｅｒｔ  Ｃ，  Ｍｏｕｇｉｎ  Ｂ，  Ｍａｌｃｕｓ  Ｃ，  Ｐｏｉｔｅｖｉｎ−Ｌａｔｅｒ  Ｆ，  Ｌｅｐａｐｅ  Ａ，  Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｇ．  （２０１０）  Ｅａｒｌｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．  Ｓｈｏｃｋ  ３４（４）：３５８−６３．
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ＷＯ  ２００６／１００２０３
ＷＯ  ２００４／０８７９４９
ＷＯ  ２００５／０８３１１５
ＷＯ  ２００５／１０６０２０
ＷＯ  ２００６／０４２５８１
ＷＯ  ２００７／１４４１０５
ＷＯ  ２００７／１２４８２０
ＷＯ  ２００３／０８４３８８
Ｗｏｎｇ  ＭＬ，  Ｍｅｄｒａｎｏ  ＪＦ  （２００５）  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３９（１）：１−１１．
【図１】
2014508525.tif 000018
【図２】
2014508525.tif 000019
【図３】
2014508525.tif 000020
【図４】
2014508525.tif 000021
【図５】
2014508525.tif 000022
【図６】
2014508525.tif 000023
【配列表】
2014508525000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月8日(2013.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的にヒトゲノム全体を表す複数の異なる遺伝子プローブを含む測定デバイスを使用して、試料中で、急性感染性および／または急性炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度をインビトロ決定するために、トランスクリプトームに対応するポリヌクレオチドの初期セットからポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法であって、
・既知の表現型生理学的状態を示す複数の被験者の核酸の試料を、遺伝子の各々の発現のシグナルが得られるように、測定デバイスのプローブと接触させ；
・前記使用した遺伝子プローブの総数のうち、被験者の少なくとも１つの核酸の試料について、検出可能な強度の発現シグナルを与えるものを選択し：
・前記被験者を、その感染および／または炎症状況に応じて、以下の臨床的に決定された表現型群の少なくとも２つに分類し：
【表１】
2014508525.tif 000024
表中、「ａ」は、性質Ｓ、ＬおよびＮ間のＡＮＤ演算を表す；
・前記表現型群間の遺伝子発現シグナルの変化を統計的に比較して、表現型群の少なくとも２つの間に有意差があるかどうかについて評価し；
・前記遺伝子発現シグナルが少なくとも２つの表現型群間で統計的に有意に変化した遺伝子プローブを選択し、かつ、予め決定された閾値に関する偽陽性結果を与える遺伝子プローブの推定数を除外し；
・前記選択された遺伝子プローブの遺伝子発現強度の増加および減少を定量することによって、急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてマスタースコアを決定し；そして
・最大でも予め決定されたマスタースコアからの偏差を示し、かつ急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度に関する測定値として同様に役立つスコアを決定することによって、初期セットと比較してより少ない数のポリヌクレオチドを同定することを特徴とするポリヌクレオチドのサブセットを同定するための方法。
【請求項２】
２０，０００〜５０，０００個の遺伝子プローブを含む測定デバイスが使用されること、および／または測定デバイスがマトリックス状の固定化遺伝子プローブが載っているバイオチップであって、各遺伝子プローブが前記バイオチップ上の位置座標と一対一に関連付けられていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現シグナルが、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅、特にＰＣＲ、好ましくは定量ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、および／またはタンパク質の検出によって得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
表１に示す６つの表現型の群が互いにペアで比較されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
群間の統計的有意差が決定され、そのうちの少なくとも１つの群が２つ以上の表現型群を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
偽陽性を与える遺伝子プローブの推定数に関する予め決定された閾値が、使用される遺伝子プローブの数の０．１〜５％の範囲内、特に０．３％の範囲内にあり、かつ偽陽性遺伝子プローブの推定数を除外することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
表現型群ＳａＳの平均値ｍＳと表現型群ＮａＮの平均値ｍＨとの間のユークリッド距離に対する遺伝子発現シグナルの相対的距離がマスタースコアとしての機能を果たすことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
相対的距離が、次のようにして得られることを特徴とする、請求項７に記載の方法：
【数１】
2014508525.tif 000025
［式中、ｄ（Ｘ1，Ｘ2）はユークリッド距離を表し、ｃｏｒ（Ｘ1，Ｘ2）は２つのベクトルＸ1とＸ2の間のピアソンによる相関係数を表す］。
【請求項９】
スコアが、マスタースコアから最大５〜１５パーセント点、特に最大１０パーセント点だけ上方または下方に逸脱するものであることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
マスタースコアが、配列番号１〜配列番号７７０４のポリヌクレオチドの群から形成されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
急性感染性および／または炎症性状態にある患者の宿主応答の重症度の時間依存的経過を決定するために、異なる時点のそれぞれにおいて、一連のスコア値が測定されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
急性感染性状態が以下の病態生理学的状態の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法：膿瘍；細菌血症；術後感染；創傷感染；局所性感染；全身性感染；敗血症；重症敗血症；敗血症性ショック。
【請求項１３】
急性炎症性状態が以下の病態生理学的状態の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１から１１に記載の方法：外傷；熱傷；放射線傷害；毒性傷害；虚血／再灌流傷害；急性拒絶反応；炎症性腸疾患；腫瘍疾患；術後状態；局所性炎症；全身性炎症；ＳＩＲＳ；アレルギー反応；アナフィラキシーショック。
【請求項１４】
急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてスコアを評価するための、配列番号１〜配列番号７７０４のｍ個のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドのｋタプルの使用（ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下であり、以下に示すポリヌクレオチドのサブセット（「ｎ」は各セットのポリヌクレオチドの数を示す）の少なくとも１つが使用される）： 
セット１（ｎ＝４９））配列番号：５０８，５５３，６１１，６７９，７３４，７６９，８５１，８６０，８７１，８９６，１１１７，１２６３，１６４６，１６４７，１６４８，１６７５，１６８８，１９７５，２０１１，２０７７，２４１５，２５１６，２５６０，２５８１，３３８１，３４９１，３８２０，３９４７，４１５６，４２３０，４５０６，４５７６，５０１２，５２３５，５６１４，５７３０，５８０３，５８７３，６１１４，６２６２，６２６５，６３０１，６６８９，６７３８，６８２０，６８４７，６８７９，７０６９，７２３０
セット２（ｎ＝４７）配列番号：１６０，３０９，３７４，４２８，４６２，９１１，９３７，１０３９，１０９２，１１０５，１４５８，１５３３，１６０４，１８９５，１９１７，１９９７，２００２，２０５５，２２４２，２３３２，２３６９，２３８６，２４２７，２５１６，２５４１，２５６０，２７８５，３３５９，３４０７，３６２４，４２３０，４５８７，４６３６，５１６４，５２３５，５２４７，５３７１，５７７６，６２７８，６３２８，６４９７，６６３６，７１５６，７２０１，７２３０，７３１４，７４５０
セット３（ｎ＝４８）配列番号：１０，３６６，４１１，４６２，４９３，４９５，５６７，１２０４，１２２６，１４０９，１４１４，１４４９，１４８７，１５８３，１７２４，１７４４，２０１３，２０５５，２０６４，２２０８，２２４８，２６９２，２８９１，３０５１，３６２４，４１５６，４２０５，４５１０，４５８７，４９２３，５１７６，５３７３，５４００，５４３５，５８７３，５９１２，５９５４，６０４１，６０７３，６２４７，６３０１，６４７８，６５２５，６９２３，７２０７，７４５０，７６７０，７６８１
セット４（ｎ＝４７）配列番号：１６０，３５９，４４１，４９３，５２２，５４１，６５２，６９１，１１２８，１４０８，１５８３，１６５１，１６５２，１６６４，１６８８，２００２，２０７７，２２４８，２２７３，２４１５，２６７６，２６９０，２７５５，２８７６，３０５３，３６２３，４２１６，４３２７，４５２５，４５８７，４７６５，４８７０，５０１３，５１６４，５４３１，５６１４，５９５０，６０９８，６２６５，６４３２，６４９７，６９８１，７０６２，７２０２，７３１４，７４５０，７６０７
セット５（ｎ＝４９）配列番号：９７，４２８，４４１，５４３，６１１，８５１，１１３６，１３８４，１５３３，１８６８，１９９７，２０７７，２１８３，２２０８，２２２６，２２６０，２３２９，２３８６，２４７５，２６８６，２６９０，２８７６，３０５４，３８２１，４０００，４３５７，４４７９，４５３０，４６３６，４７６５，４９２３，５０１３，５１３７，５２０４，５７６０，５７７６，５８１９，５８７３，５９０８，６００５，６０９９，６２４２，６４１７，６４９９，６５８５，６８４７，７４５０，７６７０，７６８１
セット６（ｎ＝４８）配列番号：１０，９７，３５９，４７５，４９５，６２７，９２８，１０３９，１１１７，１２４８，１３８４，１４０８，１４７２，１６５２，１６７５，１７４４，１８６８，１９１８，２３７０，２４２３，２５３７，２７４２，２８６５，３０５１，３０８６，３４０８，３９１６，４０３０，４０７８，４２７４，４２９４，４３６２，４７５１，５１２９，５２３５，５２４７，５４３１，５７３４，５８０３，５８１１，５９０８，５９５０，６００５，６４１７，６４９７，６５２５，６９２３，７４５６
セット７（ｎ＝４９）配列番号：３２，１６０，３８３，４１４，４９３，６１１，６５２，６７９，７３４，８８５，８９６，９４６，１１７７，１６４０，１６５０，１７０４，１８８２，２０７７，２２４８，２２５０，２２６０，２４１５，２５６１，３０８６，３４８８，３６２３，３６２４，４１３５，４１５６，４１６０，４５１０，４５２５，４５３０，４７４２，５１３７，５２０４，５２４７，５７３０，５９５０，６１１４，６２１０，６２２５，６４３０，６４７８，６４９７，６５４５，６６６８，７３１４，７６０７
セット８（ｎ＝４８）配列番号：３５９，３８３，５１５，５３８，５４４，６９１，７６９，８１３，１０２４，１０３９，１０９２，１４０９，１５１９，１６４０，１６４９，１６６５，１６９６，１７３１，１７４４，２１６７，２１８３，２２２６，２２６０，２２７３，２４２５，２５１６，２６１８，２６３４，２６７２，３０５１，３１６８，３２０２，４１６０，４７５４，４９６６，５３７３，５４６５，５４９３，５５４１，５５７４，５９１２，６００５，６２１６，６４３２，６６３６，６７４８，６８４７，７４２３
セット９（ｎ＝４６）配列番号：１６０，３５２，５４４，６９１，８０２，８８５，１１２６，１１４７，１１６３，１３３６，１４１６，１６３９，１９６９，２００２，２０５８，２０７７，２１８３，２３３１，２３３２，２４２６，２５２６，２７４２，２８５５，２８６０，２８９１，３０５４，３１３８，３４８８，３９４７，４５６０，４５７６，４７０７，４７７６，５２３５，５３７１，５４００，５４３１，５７６０，５８７３，６２４７，６３０１，６４１７，６６７３，６８２０，７４４７，７６０４
セット１０（ｎ＝４９）配列番号：８，１６４，４６２，４９４，４９５，５１０，５４５，５６７，６１１，６７９，９４１，１０３９，１１０５，１１２８，１１４７，１３１８，１５３３，１６４９，１９１８，１９７３，１９７５，２０１１，２０７７，２０８０，２３７０，２５３７，３０５１，３２０２，３６７６，４２７４，４５８７，４９２８，５２０４，５３７３，５４３１，５４６５，５５４１，５７３４，５９０８，５９１２，５９５０，６２７８，６４１７，６４９７，６６６８，６６７３，７１５６，７２３０，７６７０
セット１１（ｎ＝４６）配列番号：８９，９７，１６０，３５５，３５９，３６６，３７４，４１１，４６２，４７５，５１５，５３８，５４３，６９１，１３８４，１６４７，１６４９，１６５１，１７２４，２０１１，２０５８，２０６４，２２４２，２３６９，２８５９，３４１４，４０００，４７４２，４７６５，４８７０，４９６６，５０４０，５２３２，５２４７，５２７６，５３７３，５４３１，５７６０，５８７３，５９５４，６４１７，６４１９，６４９７，６５４５，６６３６，７４８４
セット１２（ｎ＝４９）配列番号：８，８９，５１５，５４３，５８５，７６９，９６９，１１２６，１１６３，１５２６，１５８３，１６３９，１７４４，２０１９，２３９３，２４１５，２４５３，２６１８，２６９０，２６９２，２８１０，２８５５，２８６３，３１５３，３１５８，３１９０，３４０８，４０００，４０８３，４１０４，４２４８，４４７９，４４９１，４５５０，４６６１，４８７７，４９９５，５１７６，５２７６，５５９９，５６９５，６０７３，６１１４，６２６５，６４１７，６４９９，６５８５，６６３２，６６７３
セット１３（ｎ＝４８）配列番号：４１４，５３８，９４６，１２６３，１３８４，１５１２，１８９５，２０７７，２２４８，２２６０，２５１６，２６７６，２９７５，３１６８，３４１４，４０８３，４２７４，４７７６，４８００，４９１９，４９２３，５１７９，５２０４，５４３１，５４９３，５５４１，５６１９，５６９５，５８１９，６００５，６０７３，６０９９，６２１０，６２４７，６２６５，６３５０，６４１７，６４３２，６４９９，６５３６，６５４５，６６３６，６６６８，６６８９，７０４０，７０６２，７４７２，７６０４
セット１４（ｎ＝４７）配列番号：３８３，４２８，５３８，５５３，６９１，８１４，８７１，８９６，９１１，９３７，１４２６，１６３９，１６８５，１６８８，１９８３，２０９３，２２５３，２２６０，２４５４，２５１６，２５８７，２６７２，２７６１，２８６５，２９７５，３０８６，３７８１，４０００，４０３０，４３０８，４５１０，４６３６，４９２３，５１３７，５２３５，５５７４，５７７６，５８１９，５９０８，６２２６，６２７８，６４１７，６６３２，７２０２，７２３０，７３１５，７４５６
セット１５（ｎ＝４６）配列番号：９７，３６６，３８３，８０２，１４２６，１５１４，１５５８，１６８５，１７４４，１９７５，２０１１，２０１３，２３６９，２４１５，２４５４，２５１０，２５１６，２５７７，２５８７，２７５９，２９６８，３１６８，３３６４，３６４１，３７８０，４０８３，４２３０，４２９４，４５８７，４６３８，４８１７，５０４０，５１６４，５２７６，５３７１，５４６５，５５４１，６０７３，６０９８，６１１４，６１８４，６２１６，６４９７，６５１５，７０６２，７２０２
セット１６（ｎ＝４９）配列番号：１０，５０４，５４１，５５３，５６７，６５２，８０２，１０２４，１０９２，１１３６，１１９７，１５１９，１６４６，１６４７，１６４８，１６５２，２０５５，２０５８，２２６０，２２７３，２３３０，２３３１，２４１５，２４９１，２５８１，２６１８，２６７６，２７４２，３０５３，３４０８，３６５２，３９１５，４２１６，４８７０，５２３５，５６４１，５６９５，５９５４，６１１４，６２７８，６４１９，６４６１，６７９１，６８２０，６８４７，６９２３，７４２８，７６０４，７６７０
セット１７（ｎ＝２０）配列番号：１０，１６０，４２８，８７１，９４１，１１３６，１１９７，１４１６，１５５８，１７８６，１９５１，２３８６，２５１０，２５６０，３４８８，３６５２，３７８１，５１７６，５４００，６５１５
セット１８（ｎ＝２０）配列番号：８７１，１１６３，１４１４，１４１６，１４２６，１４８７，２００１，２０５５，２３６９，２３８６，２５５２，２５７７，２８６５，３０５１，４５５０，４５７７，５６１４，６０９８，７３６９，７４２３
セット１９（ｎ＝２０）配列番号：５６７，９５８，２２２６，２２５０，２２６０，２４２７，２５１６，３３６４，４０３０，４１３５，５２３５，５５７４，５９５０，６１１４，６２２６，６２６７，６２７８，６４１８，７０６９，７５１８
セット２０（ｎ＝２０）配列番号：４０９，１６４７，１６４８，１７７０，１８８３，１９５１，２０１３，２３８６，２４２３，３１５２，３４９１，４２０５，４５７７，４６６１，４７６５，４９１９，７４２８，７６０４
セット２１（ｎ＝２０）配列番号：３５５，４８０，４９４，６６７，１４９２，２４７５，２８５５，２９４８，３１５５，３１５８，３４０８，３７８０，４６６１，５１１３，５２３２，５３６８，５５７４，６１１４，６４１９，６４９９
セット２２（ｎ＝１９）配列番号：７６９，１１６３，１４７２，２０７７，２３７０，２７５９，３４８８，３５６７，３７３７，３７８０，４２３０，４２４５，４２７４，４５５０，５９５０，６４９７，７０６９，７１０９，７６８１
セット２３（ｎ＝２０）配列番号：１６０，１６４，３５５，４１１，１１０６，１４０８，１６７５，１６７９，２３８６，２４５３，２５１６，２８１０，３１６８，３２０２，３６５２，４２３０，５５７４，５９８６，７４２８，７４８４
セット２４（ｎ＝１９）配列番号：１０，１６４，８８５，１２６３，１３１８，１４１６，１４９２，１５０８，１６４７，１９５１，２２５０，２５６０，２７８５，２８２７，３０８６，４５０６，５１３７，５５７５，５９５４
セット２５（ｎ＝１９）配列番号：３２，５２２，６７９，１５１９，２００１，２４９１，２５１６，２６７６，３４１２，３７３７，４２０５，４２９４，４５６０，５２３５，５９５４，６００５，６１１４，６４９９，６５２５
セット２６（ｎ＝１９）配列番号：９５８，１４４９，１４７２，１５８２，２３３２，２５１６，２５５２，２８９１，２９７５，３１６８，３１９０，３６８３，３８２０，３９４７，４２４５，４５３０，７０４０，７０６９，７１４５
セット２７（ｎ＝２０）配列番号：４２８，５１５，５４４，５６２，５６７，１２６３，２００２，２３３２，２５２６，３４３８，４５７７，４７５４，５５７４，５６１４，５９１２，６３２８，６５１５，７１５６，７４２３，７４５６
セット２８（ｎ＝２０）配列番号：３５５，５０８，９３７，１２６３，１９７３，２００２，２５１０，４０７８，４１５６，４５５０，４６７３，４８１７，５２４７，５３６８，５７３０，６００５，６２４７，６５１５，７２０１，７２０７
セット２９（ｎ＝２０）配列番号：１０，５４４，８７１，１４０８，１４８７，１６４９，２００２，２４１５，２６９０，２８５９，２９７５，３１２６，４５７７，４６３６，５５４１，６０７３，６４１７，６４３２，６８６６，６８７９
セット３０（ｎ＝２０）配列番号：８９６，１２４８，１３１８，１４７２，１７８６，１８３０，１９８３，２３８６，２８６５，２９７５，３６４１，３９１６，４０３０，４５３０，４９９５，５４７２，５６１９，６０９９，６２４７，６２６５
セット３１（ｎ＝２０）配列番号：３５５，４６２，１４１６，１９８３，２０１１，２１８３，２２４８，２６１８，３１９０，３４１２，４４９０，４５７６，４７７６，４９２３，５１６４，６１０１，６１１４，６２７８，７３１４，７３６９
セット３２（ｎ＝２０）配列番号：３１０，１２２６，１８９５，２２４８，２４２７，２５１６，２５５２，２６９０，３０８６，３４３８，３９１５，４２１６，４５８７，５２３５，５２７６，５９５４，６２６５，６４７８，６５１５，７２０７
セット３３（ｎ＝２０）配列番号：４９３，５８４，６３３，９３７，２３３０，２３７７，２４９１，２５８７，３１５３，３６８３，４２１６，４２４８，４５３０，６１１４，６４１９，６４７８，６５２５，６６８９，７２０２，７４５６
セット３４（ｎ＝２０）配列番号：１０，３５９，３８３，４７８，６２６，１４７２，１４８７，１６４７，２４７５，３６８３，３７８０，４４９０，４６３６，５１７９，５２４７，５３７１，５９５０，６７４８，６９２３，７６７０
セット３５（ｎ＝２０）配列番号：９７，６２６，１０３９，１１６３，１４２６，１６１７，１７０４，２００２，２２４８，２６９０，３１６８，４２１６，４６３８，５２４７，５６１４，５９５０，６２６５，６４６１，６６３２，７４２８
セット３６（ｎ＝２０）配列番号：３６６，４１４，５４４，７３４，１２６３，１４１６，２１６７，２２０８，２２５０，２３７０，２４９１，２５２６，２８５５，３１９０，３４８８，４０８３，４２４８，６６７３，６８４５，６８４７
セット３７（ｎ＝１０）：配列番号：１９８３，５０７，５４３１，３０４３，１６６５，５７７６，２９０２，６５８５，３１６７および７４５；
セット３８（ｎ＝７）：配列番号：１９８３，５０７，５４３１，３０４３，１６６５，５７７６および７６９５。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドのアイソフォーム、特に配列番号５０７、７６９５、７６９６、７６９７、７６９８、７６９９、７７００、７７０１；５４３１、４６３６；７７０２、７７０３、７７０４のポリヌクレオチドからなる群より選択されるアイソフォームが使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドのフラグメント、特に２０〜１，０００、特に１５〜５００ヌクレオチド、好ましくは１５〜２００、特に好ましくは２０〜２００ヌクレオチドの長さを有するもの、および／またはポリヌクレオチドに対して少なくとも約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を有するフラグメントが使用されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
ハイブリダイゼーションおよび／または増幅、特にＰＣＲ、好ましくは定量ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、および／またはタンパク質の検出によって得られる発現シグナルによって、スコアが評価されることを特徴とする、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
スコアが、患者の急性感染性および／または炎症性状態の診断、発症の予測、またはモニタリング、および／または治療の進行の制御、および／または病巣制御に使用されることを特徴とする、請求項１４から１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
スコアが、急性感染性および／または急性炎症性状態である患者の回復または非回復の可能性を示すために使用されることを特徴とする、請求項１４から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
急性感染性および／または急性炎症性状態にある被験者の宿主応答の重症度の測定値としてのスコアを評価するための、ＴＬＲ５、ＣＤ５９、ＣＰＶＬ、ＦＧＬ２、ＩＬ７Ｒ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲ；およびＣＬＵからなる群より選択される複数のタンパク質遺伝子産物の使用。
【請求項２１】
タンパク質遺伝子産物のｋタプルが使用されることを特徴とし、ここで、ｋは少なくとも７、かつ群内のポリヌクレオチドの数ｍ以下である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
タンパク質に対して少なくとも約２０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約８０％の配列相同性を有するタンパク質のフラグメントが使用されることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の使用。
【国際調査報告】
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