(57)【要約】本発明は、腫瘍抑制因子遺伝子（これには、とりわけ、ＰＴＥＮ、ｐ５３およびＩＮＰＰ４Ｂが含まれ得る）を調節するマイクロＲＮＡの活性を阻害する薬剤を投与することによる癌の処置および予防に関連する。阻害剤には、これらのｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドが含まれ得る。いくつかの実施形態において、これらの阻害剤は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む化学修飾オリゴヌクレオチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、前記被験体にｍｉＲＮＡの阻害剤を投与することを含み、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡの発現および／または活性が前記阻害剤の投与の後で前記被験体において減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡが、ｐｒｉ形態、ｐｒｅ形態、二重鎖形態、成熟形態およびマイナー（＊）型形態からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）およびｍｉＲ−４９４（配列番号４４）からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡがまた、ｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡがｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡが、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂの２箇所までの部位、４箇所までの部位、６箇所までの部位、８箇所までの部位または１０箇所までの部位と結合する、請求項１または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤が、ｍｉＲＮＡの成熟配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤が、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害剤が、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）およびｍｉＲ−４９４（配列番号４４）からなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤が化学修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学修飾が、ＬＮＡ、ホスホロチオアート、２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−メトキシエチルからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＬＮＡが１６個以下のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＬＮＡが約７個〜８個のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害剤が前記癌の組織環境に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、子宮頸部、乳房、胃、卵巣、食道、頸部、頭部、眼、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、胃腸、血液、神経膠芽細胞腫、肉腫、多発性骨髄腫、黒色腫、原発性腫瘍部位の転移、骨髄増殖性疾患、白血病、甲状腺乳頭状癌、非小細胞肺癌、中皮腫および消化管間質腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が前立腺のものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記前立腺癌が局在化しているか、または転移性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、前記被験体に、
ａ．第１のｍｉＲＮＡの第１の阻害剤であって、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の阻害剤と、
ｂ．第２のｍｉＲＮＡの第２の阻害剤であって、前記ｍｉＲＮＡがｐ５３制御因子またはＩＮＰＰ４Ｂ制御因子である、第２の阻害剤と
を投与することを含み、
ここで、前記第１の阻害剤および前記第２の阻害剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法。
【請求項２５】
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、前記被験体に、
ａ．少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤であるか、または、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤を含む第１の薬剤であって、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の薬剤と、
ｂ．少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物であるか、あるいは、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物を含む第２の薬剤であって、前記癌の細胞において非ＰＴＥＮ標的または非ＰＴＥＮ経路で作用する、第２の薬剤と
を投与することを含み、
ここで、前記第１の薬剤および前記第２の薬剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法。
【請求項２６】
ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御するｍｉＲＮＡの阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒ０１助成金番号ＣＡ０８２３２８によって部分的に支援された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、マイクロＲＮＡの活性または発現を調節する薬剤を投与することによる癌の処置および予防に関連する。具体的には、本発明は一部において、腫瘍抑制因子遺伝子を負に制御する発癌性マイクロＲＮＡの発現および／または活性を阻害することによって癌を処置または予防するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、標的遺伝子の発現を調節することができる短い（通常的には１８ヌクレオチド〜２４ヌクレオチドの）核酸分子である。非特許文献１による総説を参照のこと。ｍｉＲＮＡは、その配列が完全に相補的であるときには標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって、および／または、その配列がミスマッチを含有するときには翻訳を阻害することによって標的ｍＲＮＡの抑制因子として作用する。
【０００４】
理論によってとらわれることはないが、成熟型ｍｉＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）によって生成されると考えられており（非特許文献２を参照のこと）、一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる初期転写物から生じる。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはしばしば数千塩基の長さであり、したがって、はるかにより短い成熟型ｍｉＲＮＡを作製するためにプロセシングされる。このプロセシングは２段階で生じると考えられている。最初に、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが、核において、ＲＮａｓｅのＤｒｏｓｈａによって約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドのヘアピン形状の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされる。次に、細胞質に移行した後で、これらのヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、二本鎖のｍｉＲＮＡを産生させるためにＲＮａｓｅのＤｉｃｅｒによってさらにプロセシングされる。その後、成熟型ｍｉＲＮＡ鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、この複合体において、成熟型ｍｉＲＮＡ鎖が塩基対相補性によってその標的ｍＲＮＡと会合し、タンパク質発現の抑制を引き起こす。
【０００５】
癌は、異常な組織を、ひいては正常な生理学的プロセスの途絶を、場合によっては死をもたらし得る制御されない細胞分裂によって特徴づけられる一群の疾患である。癌はおそらくは、遺伝的要因および環境的要因において病因がある。前者に関して、癌関連遺伝子（ｃａｎｃｅｒ−ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｇｅｎｅ）は、遺伝子における変異が機能の喪失または機能の獲得の最終的結果を生じさせるかどうかに基づいて、大雑把には２つの群に分類することができる。腫瘍抑制因子遺伝子の機能喪失変異は、細胞の数を抑制することを通常の場合には助ける様々な阻害を細胞から取り除き、一方、癌原遺伝子の機能獲得変異は細胞を刺激して、細胞がその数を増大させてはならないときにその数を増大させる。注目すべき腫瘍抑制因子遺伝子には、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシン・ホモログ）、ｐ５３（タンパク質５３または腫瘍タンパク質５３）およびＩＮＰＰ４Ｂ（イノシトールポリリン酸４−ホスファターゼＩＩ型）が含まれる。これらの遺伝子が抑制され得る、したがって、腫瘍形成の開始を抑制するそれらの能力を失い得る１つの機構が、それらのｍＲＮＡ転写物の結合を介してであり、また、翻訳の阻害を介してである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）Ｖｏｌ．３０１（５６３１）：３３６〜３３８
【非特許文献２】Ｑｉら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００６）Ｖｏｌ．３：４１１〜４１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの遺伝子の減少または喪失が癌発達と関連づけられるので、これらの遺伝子をアップレギュレーションすることができる処置方法がこの技術分野では求められている。具体的には、腫瘍抑制因子遺伝子に結合するｍｉＲＮＡを標的とする阻害剤が求められている。さらに、この技術分野では、安価に製造することができ、かつ、効果的に送達することができ、また、十分な生物学的利用能を示す、この目的を達成するために設計される阻害剤が不足している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は一部が、様々なこれまでに研究されていないｍｉＲＮＡが、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを含む腫瘍抑制因子遺伝子を制御するという発見、そして、これらの制御因子が、そのような腫瘍抑制因子遺伝子に結合する核酸の投与によって阻害され得るという発見に基づいている。例えば、そのような阻害が、配列特異的な化学修飾オリゴヌクレオチドによって媒介され得ると考えられる。例示的な修飾がロックド核酸（ＬＮＡ）であり、この場合、核酸のリボース成分が、２’酸素と４’炭素とをつなぐさらなる架橋により修飾され、この架橋により、リボースが３’−ｅｎｄｏ立体配座で固定される。これらのＬＮＡ阻害剤は、とりわけ、腫瘍抑制因子遺伝子を制御する本明細書中に開示されるｍｉＲＮＡに向けられるときには、効率的に送達されることができ、かつ、様々な癌の処置および予防のための十分な生物学的利用能を有することができる費用効果的な抗癌剤を提供する。
【０００９】
１つの局面において、本発明には、癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、前記被験体にｍｉＲＮＡの阻害剤を投与することを含み、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である方法が含まれる。
【００１０】
いくつかの局面において、ＰＴＥＮ制御因子であるｍｉＲＮＡの発現および／または活性が上記阻害剤の投与の後で上記被験体において減少する。
【００１１】
いくつかの局面において、上記ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ形態、ｐｒｅ形態、二重鎖形態、成熟形態およびマイナー（＊）型形態からなる群より選択される。
【００１２】
本発明の方法に含まれ、かつ、本発明の方法によって標的とされるＰＴＥＮ制御因子ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択することができる。
【００１３】
本発明にはまた、ｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂもまた標的とするＰＴＥＮ標的化ｍｉＲＮＡが含まれる。また、これらのｍｉＲＮＡはＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とすることができる。本発明の別の局面には、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂの２箇所までの部位、４箇所までの部位、６箇所までの部位、８箇所までの部位または１０箇所までの部位と結合する制御性ｍｉＲＮＡが含まれる。
【００１４】
特定の局面において、本発明は、腫瘍抑制因子遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡの阻害を包含する。本発明の１つの局面において、阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の別の局面において、阻害剤は、そのようなｍｉＲＮＡの成熟配列に対して少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１５】
１つの局面において、本発明は、上記および本明細書中に記載されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である阻害剤を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの局面には、化学修飾された阻害剤が含まれる。特定の局面において、化学修飾が、ＬＮＡ、ホスホロチオアート、２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−メトキシエチルからなる群より選択される。他の局面において、ＬＮＡは約１６個以下のヌクレオチドを含む。ＬＮＡはまた、約７個〜８個のヌクレオチドを含むことができる。
【００１７】
本発明の別の局面が、癌を処置または予防する方法であって、阻害剤が前記癌の組織環境に基づいて選択される方法である。
【００１８】
本発明のさらに別の局面において、癌を処置する方法であって、前記癌が様々な癌タイプから選択される方法が想定される。
【００１９】
本発明にはまた、癌を処置または予防する方法であって、被験体が哺乳動物である方法が含まれる。本発明にはまた、前記哺乳動物がヒトである場合が含まれる。
【００２０】
本発明の１つの局面が、癌を、該癌の処置または予防を必要とする被験体において処置または予防する方法であって、該被験体に、第１のｍｉＲＮＡの第１の阻害剤であって、該ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の阻害剤と、第２のｍｉＲＮＡの第２の阻害剤であって、該ｍｉＲＮＡがｐ５３制御因子またはＩＮＰＰ４Ｂ制御因子である、第２の阻害剤とを投与することを含み、ここで、前記第１の阻害剤および前記第２の阻害剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法である。
【００２１】
本発明の別の局面が、癌を、該癌の処置または予防を必要とする被験体において処置または予防する方法であって、該被験体に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤であるか、または、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤を含む第１の薬剤であって、該ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である第１の薬剤と、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物であるか、あるいは、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物を含む第２の薬剤であって、前記癌の細胞において非ＰＴＥＮ標的または非ＰＴＥＮ経路で作用する第２の薬剤とを投与することを含み、ここで、前記第１の薬剤および前記第２の薬剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法である。
【００２２】
本発明の別の局面が、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御するｍｉＲＮＡの阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】表１は、本発明において研究されたｍｉＲＮＡの一覧を示す。この表は成熟配列およびマイナー型配列を示すが、本発明はそのようなものとして限定されない（限定されない例として、本発明には、マイクロＲＮＡのプリ形態、プレ形態、二重鎖形態、成熟形態およびマイナー（＊）型形態が含まれ得る）。
【図１−２】表１は、本発明において研究されたｍｉＲＮＡの一覧を示す。この表は成熟配列およびマイナー型配列を示すが、本発明はそのようなものとして限定されない（限定されない例として、本発明には、マイクロＲＮＡのプリ形態、プレ形態、二重鎖形態、成熟形態およびマイナー（＊）型形態が含まれ得る）。
【図１−３】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−４】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−５】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−６】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−７】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−８】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−９】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図１−１０】図１は、示されたｍｉＲＮＡに細胞がさらされたときのＰＴＥＮ発現レベルの減少を示す。図１ＡはＰＴＥＮのタンパク質レベルの減少を示し、一方、図１ＢはＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルの減少を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＰＴＥＮ減少の機能的測定、すなわち、増大したＰＩＰ３および増大したＡｋｔリン酸化を示す。図１Ｅは、発癌性ｍｉＲＮＡとＰＴＥＮとの間における直接的相互作用の確認を示す。図１Ｆは、ＰＴＥＮ、ｐ５３、ＩＮＰＰ４Ｂおよびそれらの組み合わせを制御するｍｉＲＮＡの選択された一群を示す。
【図２−１】図２は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが前立腺癌において過剰発現されることを示す。図２Ａ〜図２Ｃはこの過剰発現を一団の細胞株において様々なｍｉＲＮＡについて示す。図２Ｄはこの過剰発現を原発性腫瘍組織において示す。
【図２−２】図２は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが前立腺癌において過剰発現されることを示す。図２Ａ〜図２Ｃはこの過剰発現を一団の細胞株において様々なｍｉＲＮＡについて示す。図２Ｄはこの過剰発現を原発性腫瘍組織において示す。
【図２−３】図２は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが前立腺癌において過剰発現されることを示す。図２Ａ〜図２Ｃはこの過剰発現を一団の細胞株において様々なｍｉＲＮＡについて示す。図２Ｄはこの過剰発現を原発性腫瘍組織において示す。
【図２−４】図２は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが前立腺癌において過剰発現されることを示す。図２Ａ〜図２Ｃはこの過剰発現を一団の細胞株において様々なｍｉＲＮＡについて示す。図２Ｄはこの過剰発現を原発性腫瘍組織において示す。
【図３−１】図３は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡの過剰発現がＤｉｃｅｒの過剰発現と相関することを示す。図３Ａは、スコア化された組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示し、一方、図３Ｂは、組織クラスによるＤｉｃｅｒ存在量の定量化を示す。
【図３−２】図３は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡの過剰発現がＤｉｃｅｒの過剰発現と相関することを示す。図３Ａは、スコア化された組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示し、一方、図３Ｂは、組織クラスによるＤｉｃｅｒ存在量の定量化を示す。
【図４−１】図４は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが細胞の形質転換をインビトロおよびインビボにおいて高めることを示す。図４ＡはインビトロにおけるＰＴＥＮの存在量および活性の減少を示す。図４ＢはＰＴＥＮのｍｉＲ−２２制御による細胞成長における増大を示す。図４Ｃは、ｍｉＲ２２の影響がＰＴＥＮに依存することを示す。ＰＴＥＮのｍｉＲＮＡ制御のインビボ影響が図４Ｄおよび図４Ｅにおいて認められる。
【図４−２】図４は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが細胞の形質転換をインビトロおよびインビボにおいて高めることを示す。図４ＡはインビトロにおけるＰＴＥＮの存在量および活性の減少を示す。図４ＢはＰＴＥＮのｍｉＲ−２２制御による細胞成長における増大を示す。図４Ｃは、ｍｉＲ２２の影響がＰＴＥＮに依存することを示す。ＰＴＥＮのｍｉＲＮＡ制御のインビボ影響が図４Ｄおよび図４Ｅにおいて認められる。
【図４−３】図４は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが細胞の形質転換をインビトロおよびインビボにおいて高めることを示す。図４ＡはインビトロにおけるＰＴＥＮの存在量および活性の減少を示す。図４ＢはＰＴＥＮのｍｉＲ−２２制御による細胞成長における増大を示す。図４Ｃは、ｍｉＲ２２の影響がＰＴＥＮに依存することを示す。ＰＴＥＮのｍｉＲＮＡ制御のインビボ影響が図４Ｄおよび図４Ｅにおいて認められる。
【図４−４】図４は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが細胞の形質転換をインビトロおよびインビボにおいて高めることを示す。図４ＡはインビトロにおけるＰＴＥＮの存在量および活性の減少を示す。図４ＢはＰＴＥＮのｍｉＲ−２２制御による細胞成長における増大を示す。図４Ｃは、ｍｉＲ２２の影響がＰＴＥＮに依存することを示す。ＰＴＥＮのｍｉＲＮＡ制御のインビボ影響が図４Ｄおよび図４Ｅにおいて認められる。
【図４−５】図４は、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが細胞の形質転換をインビトロおよびインビボにおいて高めることを示す。図４ＡはインビトロにおけるＰＴＥＮの存在量および活性の減少を示す。図４ＢはＰＴＥＮのｍｉＲ−２２制御による細胞成長における増大を示す。図４Ｃは、ｍｉＲ２２の影響がＰＴＥＮに依存することを示す。ＰＴＥＮのｍｉＲＮＡ制御のインビボ影響が図４Ｄおよび図４Ｅにおいて認められる。
【図５】図５は腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡの阻害を示す。
【図６】図６は腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡの阻害のスキームを示す。
【図７−１】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図７−２】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図７−３】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図７−４】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図７−５】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図７−６】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図７−７】図７はｍｉＲ−５１８ｃ＊の様々な特徴づけを示す。図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をある種の細胞株においてもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールであり、グラフにおける最低データセットである）。図７Ｃにおいて、５１８ｃ＊は中央の曲線であり、一方、ｓｉＰＴＥＮは上側の曲線である。図７Ｂは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーター（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ；それぞれの組における左側の棒）、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳレポーター（Ｌｕｃ−ＣＤＳ；それぞれの組における中央の棒）およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲレポーター（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ；それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＣＴＬは陰性コントールである）。図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における左側の棒）およびｐ２１−ルシフェラーゼレポーター（それぞれの組における右側の棒）の活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｅは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下と、ホスホ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大とをもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｆは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにする増殖アッセイを示す（ＮＣは陰性コントロールである）。図７Ｇは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊発現レベルが、選択された癌サンプルにおいて高まることを示す。
【図８】図８は、ｍｉＲ−２３ａ＊の過剰発現が、陰性コントロール（ＮＣ）のトランスフェクションに対して、ＰＴＥＮおよびｐ５３の両方のタンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は一部が、様々なこれまでに研究されていない発癌性ｍｉＲＮＡが、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを含む腫瘍抑制因子遺伝子を制御するという発見、そして、これらの制御因子が、そのような腫瘍抑制因子遺伝子に結合する核酸の投与によって阻害され得るという発見に基づいている。例えば、腫瘍抑制因子のｍｉＲＮＡに基づく制御の阻害が、ＬＮＡ（これに限定されない）を含む化学修飾オリゴヌクレオチドを介して生じ得る。したがって、本発明は、癌のための改善された処置を考案するための土台を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、被験体における癌を、ｍｉＲＮＡの阻害を介して処置するか、または予防する。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を制御することができる短い核酸分子である。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎらによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３０１（５６３１）：３３６−３３８、２００３）を参照のこと。ｍｉＲＮＡは多くの場合、長さが約１８ヌクレオチド〜２４ヌクレオチドの間である。ｍｉＲＮＡは、その配列が完全に相補的であるときには標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって、および／または、その配列がミスマッチを含有するときには翻訳を阻害することによって標的ｍＲＮＡの抑制因子として作用する。
【００２６】
理論によってとらわれることはないが、成熟型ｍｉＲＮＡがｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩによって生成されると考えられており、−ｍｉＲＮＡと呼ばれる初期転写物から生じる。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはしばしば数千塩基の長さであり、したがって、はるかにより短い成熟型ｍｉＲＮＡを作製するためにプロセシングされる。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは多シストロン性である場合があり、また、多くのｍｉＲＮＡに発達するかもしれないものを構成するいくつかのクラスター化された配列の転写に起因する場合がある。ｍｉＲＮＡをもたらすためのプロセシングは２段階であるかもしれない。最初に、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが、核において、ＲＮａｓｅのＤｒｏｓｈａによって約７０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドのヘアピン形状の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされるかもしれない。次に、細胞質に移行した後で、これらのヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、二本鎖のｍｉＲＮＡを産生させるためにＲＮａｓｅのＤｉｃｅｒによってさらにプロセシングされるかもしれない。その後、成熟型ｍｉＲＮＡ鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれるかもしれず、この複合体において、成熟型ｍｉＲＮＡ鎖が塩基対相補性によってその標的ｍＲＮＡと会合するかもしれず、また、タンパク質発現の抑制を引き起こすかもしれない。ＲＩＳＣサイレンシング複合体内への進入のために優先的に選択されないｍｉＲＮＡ二重鎖のもう一方の鎖が、パッセンジャー鎖またはマイナー型ｍｉＲＮＡまたはスター（＊）鎖として知られている。この鎖は分解されるかもしれない。明記されない限り、本明細書中で使用される場合、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのプリ鎖および／またはプレ鎖および／または成熟型鎖および／またはマイナー（スター）鎖および／または二重鎖体を示す場合があることが理解される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ遺伝子が、タンパク質コード遺伝子のイントロンの内部に、あるいは、非コード転写ユニットのイントロンまたはエクソンの内部に位置する場合がある。イントロンｍｉＲＮＡの発現は、ホストとなる転写ユニットの発現と一致するかもしれない。これは、それらが典型的には同じ向きで配向し、かつ、それらが存在するｐｒｅ−ｍＲＮＡとともに協調的に発現されるからである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写物の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の内部の配列に結合してもよい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲの外部の配列に結合してもよい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写物の３’ＵＴＲの内部および外部の両方に結合してもよい。
【００２９】
３’ＵＴＲの外部に結合する限定されない例示的なｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）およびｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）が含まれる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの２番目のヌクレオチドと７番目のヌクレオチドとの間におけるヌクレオチド対形成（ｍｉＲＮＡシード配列）、および、標的の３’ＵＴＲに沿った対応する配列（シードマッチ）が、標的認識のために存在するかもしれない。したがって、ｍｉＲＮＡと標的との間における結合は約５ヌクレオチドの塩基対形成を含む場合がある。加えて、ｍｉＲＮＡと標的との間における結合は、５ヌクレオチドを超える塩基対形成を含む場合がある。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡと、このｍｉＲＮＡが制御する遺伝子との間における結合は、このｍｉＲＮＡが、標的核酸の２箇所までの部位、４箇所までの部位、６箇所までの部位、８箇所までの部位または１０箇所までの部位と結合することによって媒介される場合がある。
【００３２】
本発明のｍｉＲＮＡは、癌関連遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子など）（これらに限定されない）を含む核酸を直接的な結合によって制御するかもしれない。この結合は、標的核酸に対して完全に相補的である場合があり、または、ミスマッチを含有する場合がある。この結合の影響が、標的の分解を促進させること、および／または、標的の翻訳を阻害することであるかもしれない。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明は、被験体における癌を、ｍｉＲＮＡの阻害を介して処置するか、または予防する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは癌関連遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子など）を標的とする。腫瘍抑制因子の限定されない例には、ＰＴＥＮ、ｐ５３およびＩＮＰＰ４Ｂが含まれる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、阻害された癌関連遺伝子が腫瘍抑制因子のＰＴＥＮである。腫瘍抑制因子遺伝子ＰＴＥＮは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔ経路に対抗するホスホイノシチドホスファターゼをコードする。細胞が増殖因子により刺激された後で、ＰＩ３Ｋは、二次メッセンジャーであるホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）へのホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）の変換を触媒し、その後、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）により、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含有する様々なタンパク質が形質膜に補充される。これらの補充されたタンパク質の中に、リン酸化により活性化されるセリン・トレオニンキナーゼＡｋｔがある。結果として、活性なＡｋｔが様々な標的タンパク質を活性化して、栄養分取り込み、タンパク質合成、細胞生存、細胞増殖、細胞運動性および血管形成を促進させる。ＰＴＥＮはＰＩＰ３をＰＩＰ２に脱リン酸化し、これにより、Ａｋｔの活性化を阻害し、したがって、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路を阻害する。
【００３５】
ＰＴＥＮの単一遺伝子座喪失または単一遺伝子座変異が、前立腺癌を含めて、多くの散発性腫瘍の早期段階で検出される場合がある。高い程度のＡｋｔリン酸化およびＡｋｔシグナル伝達経路の過剰活性化が、ＰＴＥＮ機能が損なわれる腫瘍の特徴である。ＰＴＥＮタンパク質における小さい低下が腫瘍の開始および進行に対する顕著な結果を有する。したがって、ＰＴＥＮ遺伝子発現の調節因子（例えば、本明細書中に開示されるｍｉＲＮＡなど）が癌の処置または予防のために非常に重要である。
【００３６】
ＰＴＥＮを制御するかもしれない限定されない例示的なｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）が含まれるかもしれない。
【００３７】
いくつかの実施形態において、阻害された癌関連遺伝子が腫瘍抑制因子のｐ５３である。核のリンタンパク質であるｐ５３は、胸腺、脾臓およびリンパ球造血系の細胞を含めて、正常な組織において低いレベルで遍在的に発現される腫瘍抑制因子タンパク質である。ｐ５３の不活性化または喪失が、ヒトの癌の発達に伴う共通する事象である。機能的不活性化が、ミスセンス変異を含めてｐ５３遺伝子の遺伝的異常の結果として、または、ウイルス性（ｖｉｔａｌ）癌遺伝子および細胞性癌遺伝子との相互作用として生じるかもしれない。野生型（ｗｔ）ｐ５３の機能の喪失が、数ある影響の中でも、制御されない細胞周期進行および細胞複製、非効率的なＤＮＡ修復、選択的な成長優位性、ならびに、結果的には腫瘍形成を引き起こすかもしれない。したがって、ｐ５３は、ゲノムの変異を妨げることによって安定性を保つことにおけるその役割を示して、ゲノムの「すぐれた見張り人」と見なされる。したがって、例えば、ｍｉＲＮＡによるｐ５３の減少は、この遺伝子の保護効果が失われると思われるので、癌を誘導する場合がある。
【００３８】
ｐ５３を制御するかもしれない限定されない例示的なｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）が含まれるかもしれない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、阻害された癌関連遺伝子が腫瘍抑制因子のＩＮＰＰ４Ｂである。ＩＮＰＰ４Ｂは、ＰＩ（３，４）Ｐ２の４位のホスファートを、そして、より小さい程度ではあるが、イノシトール（３，４）二リン酸（Ｉｎｓ（３，４）Ｐ２）およびＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３をインビトロにおいて加水分解する酵素である。インビボにおいて、ＩＮＰＰ４ＢはＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路において役割を果たすと考えられている。この系では、２つの主要なリン脂質プールが生成される：ＰＩ（３，４，５）Ｐ３およびＰＩ（３，４）Ｐ２。ＰＴＥＮ（上記）はＰＩ（３，４，５）Ｐ３の３’−ホスファートを加水分解して、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を終結させる。しかしながら、ｓｒｃ相同２を含有するイノシトール５’−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）ファミリーのメンバーはＰＩ（３，４，５）Ｐ３の５’−ホスファートを加水分解して、ＰＩ（３，４）Ｐ２を生成させ、このＰＩ（３，４）Ｐ２が、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３と同様に、ＡＫＴ（これは、上記で記載されたように、癌に関連づけられているセリン／トレオニンプロテインキナーゼである）のＰＤＫ１依存的なリン酸化および活性化を促進させ得る。ＩＮＰＰ４ＢはＰＩ（３，４）Ｐ２をＰＩ（３）Ｐに変換する。ＰＴＥＮの喪失またはＩＮＰＰ４Ｂの喪失はＡｋｔの長期にわたる活性化をもたらし、その後、増大した細胞増殖、細胞遊走および侵入をもたらす。
【００４０】
ＩＮＰＰ４Ｂを制御するかもしれない限定されない例示的なｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）およびｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）が含まれるかもしれない。
【００４１】
いくつかの実施形態において、阻害剤の配列は一部がヒト転写物の配列から取られる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの阻害剤が癌の組織環境に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、阻害剤が、被験体における標的ｍｉＲＮＡの発現および／または活性を減少させるために選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドあるいはそれらの組み合わせを含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を含む場合がある（限定されない例が糖または骨格の修飾である）。例えば、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の立体配座制約糖ヌクレオシド修飾または二環式糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）から構成されることが可能であり、この修飾により、高まった熱安定性が、ＢＳＮを含有するオリゴヌクレオチドと、それらの相補的なｍｉＲＮＡ標的鎖との間で形成される複合体にもたらされる。例えば、１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのロックド核酸を含有する。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、リボース糖成分が、固定された立体配座にある２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含有する。別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’，４’−Ｃ−架橋された２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を含有する。例えば、米国特許第６，４０３，５６６号、および、Ｗａｎｇら（１９９９）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．９：１１４７−１１５０を参照のこと（これらの両方がそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Ｃで示される構造を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有する。腫瘍抑制因子を制御するｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮ（ＬＮＡおよびＣＤＮＡなど）または他の修飾ヌクレオチドと、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含有することができる。
【００４３】
【化１】
2014515024.tif 000002
代替において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸の骨格ではなく、ペプチドに基づく骨格を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する他の修飾糖またはホスホジエステル修飾もまた意図される。限定されない例として、他の化学修飾には、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾、２’−フルオロ修飾および４’−チオ修飾、ならびに、骨格修飾、例えば、１つ以上のホスホロチオアート連結、モルホリノ連結またはホスホノカルボキシラート連結（例えば、米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号を参照のこと。これらはそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）などが含まれ得る。１つの実施形態において、発癌性ｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル糖修飾をそれぞれの塩基に含有し、ホスホロチオアート連結によって連結される。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、より短い長さ（例えば、１６個未満のヌクレオチド、７個〜８個のヌクレオチド）のものは、１つ以上の親和性増強修飾（例えば、ＬＮＡ、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルマート、２’Ｏ−アルキル修飾など（これらに限定されない））を含むことができる。いくつかの実施形態において、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾されたリボヌクレオチドを５’末端および３’末端の両方に含有し、少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを中心に有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）である。これらのギャップマーは、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅＨ依存的な分解機構を誘発させることができる。安定性を増強し、かつ、効力を改善するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、例えば、米国特許第６，８３８，２８３号（これはその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される修飾などがこの技術分野では知られており、本発明の方法における使用のために好適である。例えば、また、限定であることを意図していないが、インビボでの送達および安定性を容易にするために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ステロイド（例えば、コレステロール成分など）、ビタミン、脂肪酸、炭水化物またはグリコシド、ペプチド、あるいは、他の小さい分子リガンドにその３’末端において連結することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの活性を阻害するために有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドであり、または、長さが約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドであり、または、長さが約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、発癌性ｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約８ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドであり、他の実施形態では長さが約１２ヌクレオチド〜約１６ヌクレオチドであり、他の実施形態では長さが約７ヌクレオチド〜８ヌクレオチドである。発癌性ｍｉＲＮＡに対して相補的である７−ｍｅｒ以上のものはどれも使用される場合があり、すなわち、ｍｉＲＮＡの５’末端に対して相補的であり、かつ、ｍｉＲＮＡの相補的配列全体に及ぶ抗ｍｉＲはどれも使用される場合がある。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟型またはマイナー（すなわち、スター）型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含むことができ、例えば、成熟型またはマイナー（すなわち、スター）型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは成熟型またはマイナー型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的であること、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的であることが可能である。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟型またはマイナー型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的である配列を含む。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、実質的に相補的（である）は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的である配列を示す（限定されない例が、成熟型、マイナー型、前駆体ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列である）。
【００４７】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはａｎｔａｇｏｍｉｒである。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的であり、したがって、ｍｉＲＮＡのサイレンシングをもたらすかもしれない一本鎖の化学修飾されたリボヌクレオチドである。例えば、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）、４３８（７０６８）：６８５−９を参照のこと。ａｎｔａｇｏｍｉｒは１つ以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル−糖修飾など）を含む場合がある。いくつかの実施形態において、ａｎｔａｇｏｍｉｒは修飾ヌクレオチドのみを含む。ａｎｔａｇｏｍｉｒはまた、部分的または完全なホスホロチオアート骨格をもたらす１つ以上のホスホロチオアート連結を含むことができる。インビボでの送達および安定性を容易にするために、ａｎｔａｇｏｍｉｒはコレステロールまたは他の成分にその３’末端において連結することができる。阻害することのために好適なａｎｔａｇｏｍｉｒは、長さが約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドであること、長さが約１８ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドであること、また、長さが約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドであることが可能である。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、成熟型またはマイナー型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的であることが可能である。いくつかの実施形態において、ａｎｔａｇｏｍｉｒは、成熟型またはマイナー型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的である場合があり、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である場合がある。他の実施形態において、ａｎｔａｇｏｍｉｒは成熟型またはマイナー型の発癌性ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的である。
【００４８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはａｎｔａｇｏｍｉｒは、発癌性ｍｉＲＮＡの前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）または一次ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に対して実質的に相補的である配列を含む場合がある。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのようなｍｉＲＮＡの標的の３’非翻訳領域の外部に位置する配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのようなｍｉＲＮＡの標的の３’非翻訳領域の内部に位置する配列を含む。
【００４９】
本明細書中に記載される発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤またはアゴニストのどれも、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡアゴニストをコードする発現ベクターを細胞に送達することによって標的細胞（限定されない例が癌細胞である）に送達することができる。ベクターは、目的とする核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。数多くのベクターがこの技術分野では知られており、これらには、線状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と会合するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが含まれるが、これらに限定されない。したがって、ベクターの用語には、自律的に複製するプラスミド、または、ウイルスが含まれる。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。発現構築物は生細胞において複製され得るか、または、発現構築物は人工的に作製され得る。本出願の目的のために、発現構築物、発現ベクターおよびベクターの各用語は、本発明の適用を一般的な例示的意味で明らかにするために交換可能に使用され、本発明を限定するために意図されない。
【００５０】
１つの実施形態において、発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤を発現させるための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含む。発現させられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、発癌性ｍｉＲＮＡの成熟型またはマイナー型の配列に対して部分的または完全に相補的である場合がある。作動可能に連結される、または、転写統制下にあるという表現は、本明細書中で使用される場合、プロモーターが、ポリヌクレオチドのＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を統制するためにポリヌクレオチドに関して正しい場所および配向であることを意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、プロモーターは、遺伝子の特異的な転写を開始するために要求される、細胞の合成装置によって認識されるＤＮＡ配列、または、導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列を示す。好適なプロモーターには、ＲＮＡ  ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ、および、ウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス長末端反復）が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである（例えば、限定されない例として、前立腺特異的プロバシンプロモーターＡＲＲ２ＰＢなど）。
【００５２】
特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ阻害剤をコードするポリヌクレオチド、または、腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターは誘導性プロモーターであることが可能である。様々な誘導性プロモーターがこの技術分野では知られており、これらには、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーターおよび誘導性のマウス乳腫瘍ウイルスＬＴＲが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
発現構築物および核酸を細胞に送達する様々な方法がこの技術分野では知られており、これらには、限定されない例として、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミン系トランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波照射、高速度の微小飛翔体を使用する遺伝子爆撃、および、受容体媒介トランスフェクションが含まれ得る。
【００５４】
本発明はまた、発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤を処置後に捕捉または除去することを含む。捕捉剤には、ｍｉＲＮＡ阻害剤に対して、または、ｍｉＲＮＡ阻害剤を発現するベクターに対して相補的である単離された核酸が含まれる場合がある。したがって、捕捉剤はｍｉＲＮＡ阻害剤に結合してもよく、または、ｍｉＲＮＡ阻害剤を発現するベクターに結合してもよく、そのように結合することにおいて、ｍｉＲＮＡと標的との間における結合を妨げるかもしれない。この方法は、腫瘍抑制阻害剤のための結合部位を組織において過剰発現することを含む場合がある。
【００５５】
本発明の別の実施形態が、癌を被験体において処置または予防する方法である。癌は、異常な組織を、ひいては正常な生理学的プロセスの途絶を、場合によっては死をもたらし得る制御されない細胞分裂によって特徴づけられる一群の疾患である。癌細胞は、正常な細胞の増殖のために要求される成長促進因子の非存在下で成長することができる場合がある。さらに、癌細胞は、アポトーシスを統制する正常なシグナルに対して抵抗性である場合がある。
【００５６】
癌細胞は腫瘍を形成する場合がある。癌細胞はまた、白血病である場合がある。腫瘍は良性である場合があり、したがって、癌の浸襲的影響がないかもしれない。腫瘍はまた、前悪性である場合がある。すなわち、そのような腫瘍が処置されないまま放置されるならば、その腫瘍は癌に至る場合がある。悪性腫瘍は、次第に悪化し、潜在的には死をもたらす傾向によって特徴づけられる場合がある。悪性腫瘍は、退形成、浸襲性および転移によって特徴づけられる場合がある。悪性は多くの場合、癌の基準である。
【００５７】
癌は局在化している場合があり、これには、ただ１つだけの組織環境に存在する癌が含まれる。癌はまた、転移性である場合がある。この場合、癌細胞は、組織境界をもたらす基底膜を突破することによってであることが多いが、周りの組織に侵入し、二次的な成長領域を確立することがある身体の他の領域に拡大する場合がある。
【００５８】
癌の因果関係が遺伝的要因および環境的要因に関連づけられる場合がある。例示的な癌関連遺伝子は、遺伝子における変異が機能の喪失または機能の獲得の最終的結果を生じさせるかどうかに基づいて、大雑把には２つの群に分類することができる。腫瘍抑制因子遺伝子の機能喪失変異は、細胞の数を抑制することを通常の場合には助ける様々な阻害を細胞から取り除き、一方、癌原遺伝子の機能獲得変異は細胞を刺激して、細胞がその数を増大させてはならないときにその数を増大させる。注目すべき腫瘍抑制因子遺伝子には、数多くある中でも、ＰＴＥＮ、ｐ５３およびＩＮＰＰ４Ｂが含まれる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌を、該癌の処置または予防を必要とする被験体において処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、癌は、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、乳房、胃、卵巣、食道、頸部、頭部、眼、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、胃腸、血液、神経膠芽細胞腫、肉腫、多発性骨髄腫、黒色腫、原発性腫瘍部位の転移、骨髄増殖性疾患、白血病、甲状腺乳頭状癌、非小細胞肺癌、中皮腫および消化管間質腫瘍からなる群より選択される。例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｌｏｎｄｏｎ、２００６）を参照のこと（その内容はここに参照によって組み込まれる）。
【００６０】
いくつかの実施形態において、処置または予防されるべき癌が前立腺癌である。前立腺癌は、６５歳を超える男性の９人に１人を苦しめ、男性の癌関連死亡の第一位の原因である。Ａｂａｔｅ−ＳｈｅｎおよびＳｈｅｎ、２０００、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１４：２４１０；Ｒｕｉｊｔｅｒら、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２０：２２を参照のこと。前立腺癌は典型的には、直腸指診および／または前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）スクリーニングにより診断される。後者では、上昇した血清中ＰＳＡレベルにより、前立腺癌の存在が示され得る。ＰＳＡが前立腺癌のためのマーカーとして使用される。これは、ＰＳＡが前立腺の細胞によってのみ分泌されるからである。健全な前立腺は、典型的には１ミリリットルあたり４ナノグラム未満の安定した量のＰＳＡ、または、４以下のＰＳＡ読み取り値をもたらすであろうが、癌細胞は、癌の重篤度に対応する高まる量を産生する。約４〜１０のＰＳＡレベルは被験体における前立腺癌の可能性を示唆しており、一方、５０を超えるＰＳＡレベルにより、体内のどこか他のところに広がっている腫瘍が示される場合がある。
【００６１】
前立腺の様々な領域の生検物が、前立腺癌が存在しているかを明らかにするために使用される。現在の処置選択肢は癌の病期に依存する。生検組織は、生検サンプルの顕微鏡評価を引き受けたときの病理医によってスコア化される場合がある。グリーソンスコアが、腫瘍の構造的特徴に基づいて組織に割り当てられる場合がある。このグリーソンスコア化システムは、癌が顕微鏡下で正常に対してどのくらい近い（分化している）ように見えるかに基づいて、癌の５つの異なるパターンを特定する（すなわち、１から５までの数字を割り当てる）。１のグリーソンスコアは、最も分化した（または良性に見える）パターンであり、一方、５のグリーソンスコアは、最も脱分化した（または攻撃的に見える）パターンである。分化の２つの共通するパターンが評価されて、１〜５の２つのスコアがもたらされ、これら２つのスコアは、腫瘍のグリーソンスコア（これは２から１０にまで及び得る）を得るために合算される。多くの前立腺癌症例は、５、６または７のグリーソン悪性度を有し、一方、より攻撃的な形態の前立腺癌は、８、９または１０のスコアを有する。
【００６２】
平均余命がより短く、グリーソン数が小さく、腫瘍が前立腺に局在化する男性は多くの場合、処置されるのではなく、モニターリングまたは慎重な経過観察を受ける。より攻撃的な癌は下記の限定されない例により処置されることがある。例えば、外科的処置（例えば、根治的前立腺摘徐術（ＲＰ）（この場合、前立腺が（神経温存技術を伴って、または伴うことなく）完全に除かれる）および放射線（この場合、放射線が、線量を体外から前立腺に向ける体外ビームにより、または、癌細胞を局所的に殺すために前立腺内に埋め込まれる低線量の放射性シードを介して施されることがある）が使用されることがある。併用療法もまた可能である。ホルモン治療もまた、単独で、あるいは、手術または放射線または他の処置と併せて使用されることがある。限定されない一例として、抗アンドロゲンホルモン治療では、テストステロン産生を刺激するホルモンを下垂体が産生することを阻止する黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）アナログが使用されることがある。外科的処置およびホルモン処置は多くの場合、局在化した前立腺癌について効果的である一方で、進行した疾患の処置は現在、それほど成功していない。アンドロゲン除去が、進行した前立腺癌のための最も一般的な治療であり、これにより、アンドロゲン依存性悪性細胞の広範囲のアポトーシスと、一時的な腫瘍退行とが引き起こされる。
【００６３】
本発明はいくつかの実施形態において、局在化した前立腺癌または転移性の前立腺癌を処置するために使用される場合がある。
【００６４】
また、本発明は一部において、癌に苦しむ被験体のためのさらなる処置方法または予防方法を提供する。本明細書中で使用される場合、被験体または患者の用語は、限定されないが、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験室動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなど）および鳥類（例えば、飼育鳥類、野生鳥類および狩猟鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ目鳥類、アヒルならびにダチョウなど）を含むどのような脊椎動物をも示す。いくつかの実施形態において、被験体は哺乳動物である。
【００６５】
本発明の別の実施形態が、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御するｍｉＲＮＡの阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物である。この実施形態には、発癌性ｍｉＲＮＡの１つ以上の阻害剤の投与が含まれる場合がある。臨床適用が意図される場合、医薬組成物が、その意図された適用のために適切である形態で調製される場合がある。一般に、これは、発熱物質、同様にまた、ヒトまたは動物にとって有害であり得ると思われる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴うであろう。
【００６６】
１つの実施形態において、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲＮＡ阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む。有効用量は、有益な臨床結果または所望される臨床結果を達成するために充分な量である。本発明のｍｉＲＮＡの有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇである場合がある。どの位の量が有効用量であると見なされると思われるかの正確な決定は、それぞれの患者にとって個別的な要因に基づく場合があり、これらには、患者のサイズ、年齢、癌のタイプ、および、阻害剤またはアゴニストの性質（非限定的な例には、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、発現構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二重鎖などが含まれる）が含まれる。したがって、投薬量が本開示およびこの技術分野における知識から当業者によって容易に確認され得る。
【００６７】
有益な臨床結果または所望される臨床結果には、とりわけ、阻害剤が投与されない場合に認められるものと比較して、腫瘍サイズおよび／または腫瘍成長における減少、ならびに／あるいは、癌の存在に伴う癌マーカーの減少が含まれることがある。例えば、前立腺癌の処置において、有益な臨床結果または所望される臨床結果には、とりわけ、阻害剤が投与されない場合に認められるものと比較して、前立腺特異的抗原スコアにおける減少が含まれることがある。有益な臨床結果または所望される臨床結果にはまた、とりわけ、阻害剤が投与されない場合に認められるものと比較して、癌の減少に伴うマーカーの増大した存在が含まれることがある。有益な臨床結果または所望される臨床結果に同様に含まれるものが、とりわけ、阻害剤が投与されない場合に認められるものと比較して、腫瘍抑制因子ｍＲＮＡまたは腫瘍抑制因子タンパク質の増大した量である。増大した腫瘍抑制因子には、例えば、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂが含まれる場合がある。
【００６８】
コロイド状分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および、脂質に基づく系（水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む）などが、発癌性ｍｉＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害剤、腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡアゴニストをコードするポリヌクレオチド、または、特定のｍｉＲＮＡ阻害剤もしくはｍｉＲＮＡアゴニストをコードする構築物のための送達ビヒクルとして使用される場合がある。本発明の核酸を癌組織に送達するために好適である市販の脂肪エマルションには、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄおよび他の類似する脂質エマルションが含まれる。インビボでの達ビヒクルとしての使用のためのコロイド状系の１つがリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用がこの技術分野では広く知られている。例示的な配合物がまた、米国特許第５，９８１，５０５号、米国特許第６，２１７，９００号、米国特許第６，３８３，５１２号、米国特許第５，７８３，５６５号、米国特許第７，２０２，２２７号、米国特許第６，３７９，９６５号、米国特許第６，１２７，１７０号、米国特許第５，８３７，５３３号、米国特許第６，７４７，０１４号および国際公開ＷＯ０３／０９３４４９に開示される（これらはそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００６９】
一般には、適切な塩および緩衝剤を用いることが、送達ビヒクルを安定にし、かつ、標的細胞による取り込みを可能にするために所望されるであろう。本発明の水性組成物は、医薬的に許容され得るキャリアまたは水性媒体に溶解または分散される有効量の、阻害剤ポリヌクレオチドを含む送達ビヒクル（例えば、リポソームまたは他の複合体または発現ベクター）を含む。医薬的に許容され得る、または、薬理学的に許容され得るという表現は、動物またはヒトに投与されたとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応をもたらさない分子的実体および組成物を示す。本明細書中で使用される場合、医薬的に許容され得るキャリアには、医薬品（例えば、ヒトへの投与のために好適な医薬品など）を配合する際の使用のために許容され得る溶媒、緩衝剤、溶液、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用がこの技術分野では広く知られている。従来の媒体または薬剤はいずれかが本発明の有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な有効成分もまた、組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しないという条件で、組成物に取り込まれることが可能である。
【００７０】
本発明の活性な組成物には、古典的な医薬調製物が含まれる場合がある。本発明に従うこれらの組成物の投与は、どのような一般的経路であっても、標的組織がその経路を介して対応可能である限り、そのような経路を介する場合がある。これには、経口、鼻腔または口内が含まれる。代替において、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射であるかもしれず、あるいは、癌組織内への直接的な注入によるものであるかもしれない。本明細書中に開示される薬剤はまた、カテーテルシステムによって投与される場合がある。そのような組成物は通常、本明細書中に記載されるような医薬的に許容され得る組成物として投与されると思われる。
【００７１】
活性な組成物はまた、非経口的または腹腔内に投与される場合がある。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性な化合物の溶液を、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなど）と好適に混合された水において調製することができる。分散物もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物において、また、オイルにおいて調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件のもとで、これらの調製物は一般に、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
【００７２】
注射剤使用またはカテーテル送達のために好適な医薬形態物には、例えば、無菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製のための無菌の水溶液または水性分散物および無菌の粉末が含まれる。一般に、これらの調製物は無菌であり、かつ、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である。調製物は製造および貯蔵の条件のもとで安定でなければならず、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌など）の混入作用に対抗して保存されなければならない。適切な溶媒または分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および、植物油を含有する場合がある。適正な流動性を、例えば、被覆剤（例えば、レシチン）の使用によって、また、分散の場合には要求される粒子サイズの維持によって、また、界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止が、様々な抗菌剤および抗真菌剤によって、例えば、各種パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびチメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期に及ぶ吸収が、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアラートおよびゼラチン）の組成物における使用によってもたらされ得る。
【００７３】
無菌の注射可能な溶液が、適量での活性な化合物を所望されるような何らかの他の成分（例えば、上記で列記されるような成分）と一緒に溶媒に取り込み、その後、ろ過滅菌することによって調製される場合がある。一般に、分散物が、様々な無菌化された有効成分を、基礎となる分散媒体と、所望される他の成分（例えば、上記で列記されるような成分）とを含有する無菌のビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好まれる調製方法には、有効成分（１つ以上）および何らかのさらなる所望される成分の粉末をその前もって無菌ろ過された溶液からもたらす真空乾燥技術および凍結乾燥技術が含まれる。
【００７４】
配合されたとき、溶液は、投薬配合物と適合し得る様式で、かつ、治療効果的であるような量で投与されるかもしれない。配合物は、様々な投薬形態物で、例えば、注射可能溶液および薬物放出カプセルなどで容易に投与されるかもしれない。水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は一般に、好適に緩衝化され、また、液体希釈剤が最初に、例えば、十分な生理的食塩水またはグルコースにより等張性にされる。そのような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与のために使用される場合がある。好ましくは、無菌の水性媒体が、特に本開示に照らして、当業者には知られているように用いられる。例示として、単回用量が１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられる場合、または、提案された注入部位において注射される場合がどちらもある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５頁〜１０３８頁および１５７０頁〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量における何らかの変更が、処置されている被験体の状態に依存して必然的に行われるであろう。投与責任者は、どのような場合でも、個々の被験体のための適切な用量を決定するであろう。そのうえ、ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡの生物製剤部（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の基準によって要求されるような、無菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【００７５】
本発明の別の実施形態には、癌を、該癌の処置または予防を必要とする被験体において処置または予防する方法であって、該被験体に、第１のｍｉＲＮＡの第１の阻害剤であって、該ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の阻害剤と、第２のｍｉＲＮＡの第２の阻害剤であって、該ｍｉＲＮＡがｐ５３制御因子またはＩＮＰＰ４Ｂ制御因子である、第２の阻害剤とを投与することを含み、ここで、前記第１の阻害剤および前記第２の阻害剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法が含まれる。
【００７６】
本発明の別の実施形態には、癌を、該癌の処置または予防を必要とする被験体において処置または予防する方法であって、該被験体に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤であるか、または、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤を含む第１の薬剤であって、該ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である第１の薬剤と、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物であるか、あるいは、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物を含む第２の薬剤であって、前記癌の細胞において非ＰＴＥＮ標的または非ＰＴＥＮ経路で作用する第２の薬剤とを投与することを含み、ここで、前記第１の薬剤および前記第２の薬剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法が含まれる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明には、この技術分野で知られている様々な癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物が含まれる。例示的目的だけのために、また、限定であることを意図していないが、下記の薬物が本発明において使用される場合がある。
【００７８】
【表１】
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本発明の別の実施形態には、癌を、該癌の処置または予防を必要とする被験体において処置または予防する方法であって、発癌性ｍｉＲＮＡの阻害剤、および／または、癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤もしくは癌薬物を投与することを含み、処置前の制御された腫瘍抑制因子を特定するために患者を診断するさらなる工程を含む方法が含まれる。そのような診断には、とりわけ、腫瘍抑制因子制御の評価を実際に行うこと、または、そのような測定が行われることを命ずることが含まれ得る。さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤、および／または、癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤もしくは癌薬物の選択は、診断によって助言されると思われる。
【００７９】
本発明がさらに、限定であるとして解釈してはならない下記のさらなる実施例によって例示される。当業者は、多くの変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態に対して行われ得ること、そして、同様な結果または類似する結果を依然としてもたらし得ることを本開示に照らして理解しなければならない。
【実施例】
【００８０】
実施例１：腫瘍抑制因子遺伝子を制御する一群のｍｉＲＮＡ
コンピューター計算による研究を、潜在的な腫瘍抑制因子標的化ｍｉＲＮＡを特定するために着手した。具体的には、４つの標的予測データベースを使用して、可能性のあるＰＴＥＮ標的化ｍｉＲＮＡのプールを作製した：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＳ（Ｌｅｗｉｓら、Ｃｅｌｌ、２００５；１２０：１５−２０）、ＰｉｃＴａｒ（Ｋｒｅｋら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２００５；３７：４９５−５００）、ｍｉＲａｎｄａ（Ｊｏｈｎら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、２００４；２：ｅ３６３）およびｍｉＲＢａｓｅ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００６；３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４）。このプールは、（ｉ）発癌能を有し、かつ、（ｉｉ）ＰＴＥＮを標的とすると多数のアルゴリズムによって予想されるｍｉＲＮＡファミリーについて選択した２段階の選択基準を使用して絞られた（Ｐｏｌｉｓｅｎｏら、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ、２０１０年４月１３日；３（１１７）：ｒａ２９を参照のこと。その内容はここに参照によって組み込まれる）。これらの基準に合うｍｉＲＮＡの多くが表１に列記される。
【００８１】
表１におけるｍｉＲＮＡのすべてが、ＰＴＥＮを制御することができるとして実証された。例として、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−３７２はＰＴＥＮの存在量を低下させ得ることが、図１に示される。これら５つのｍｉＲＮＡのそれぞれを、合成された短い干渉様分子（ｓｉ−ｍｉＲＮＡ）として、この技術分野で知られている分子細胞学技術を使用してＤＵ１４５前立腺癌細胞株において過剰発現させた（Ｐｏｌｉｓｅｎｏら、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ、２０１０年４月１３日；３（１１７）：ｒａ２９を参照のこと）。このＤＵ１４５前立腺癌細胞株はＰＴＥＮについて野生型であり、発現した３’ＵＴＲには、すべての予測されたｍｉＲＮＡ結合部位が含まれる。
【００８２】
ＰＴＥＮタンパク質の存在量がすべての試験されたｍｉＲＮＡによって減少した。トランスフェクションされたＤＵ１４５細胞を指定の時点について成長させて、集め、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦおよび様々なプロテアーゼ阻害剤において溶解した。タンパク質（レーンあたり３０μｇ）を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランの免疫ブロッティングを、ＰＴＥＮに対する一次抗体（１：１０００）およびアクチンに対する一次抗体（１：１００００）を用いて行った。シグナルが、ペルオキシダーゼにカップリングされた推奨される二次抗体とのインキュベーションの後、増強化学発光によって明らかになった。走査された画像をＩｍａｇｅＪソフトウエアにより定量化した。図１Ａは、上記ｍｉＲＮＡにより細胞をトランスフェクションしたときのＰＴＥＮタンパク質レベルの減少を示す。
【００８３】
さらに、ＰＴＥＮ転写物の存在量がすべての試験されたｍｉＲＮＡによって減少した。リアルタイムＰＣＲ（これはこの技術分野では広く知られている）を使用して、この測定を行った。簡単に記載すると、リアルタイムＰＣＲを、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ蛍光を用いて行った。２マイクロリットルのｃＤＮＡを２０μｌの反応において使用した。アクチン（ヒト）を内部標準として使用した。遺伝子発現の相対的定量化を、比較Ｃｔ法を用いて行った。図１Ｂに示されるように、上記で述べられたｍｉＲ−１７ファミリー、ｍｉＲ−１９ファミリー、ｍｉＲ−２２ファミリー、ｍｉＲ−２５ファミリーおよびｍｉＲ−３０２ファミリーのｍｉＲＮＡメンバーは、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの存在量における低下を引き起こす。
【００８４】
ＰＴＥＮ活性におけるこのｍｉＲＮＡ媒介減少がまた、ホスホイノシチド分析を使用して機能的に示された。上記で記載されたように、ＰＴＥＮの基質がＰＩＰ３である。したがって、ＰＴＥＮ活性を、ＰＩＰ３の存在量を測定することによって間接的に評価することができる。簡単に記載すると、ＤＵ１４５細胞を６ウエルディッシュあたり３×１０５個の細胞で播種した。翌日、これらの細胞を種々のｓｉ−ｍｉＲＮＡによりトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、１つの６ウエルプレートの細胞をトリプシン処理し、２つの１０ｃｍプレートに再置床した。翌日、細胞を、１０％のＦＢＳおよび０．５％のＢＳＡが補充されたイノシトール非含有ＤＭＥＭ培地において２４時間、［３Ｈ］イノシトール（１０ｍＣｉ／ｍｌ）により２４時間にわたって標識した。その後、細胞を、［３Ｈ］イノシトール（１０ｍＣｉ／ｍｌ）および０．５％のＢＳＡを含むが、ＦＢＳを伴わないイノシトール非含有ＤＭＥＭにおいて２４時間にわたって血清飢餓にした。２００ｎＭのインスリンによる５分間の刺激の後、細胞を１ＭのＨＣｌにおいて溶解した。脂質を、この技術分野で知られているようにクロロホルム−メタノール（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）において抽出し、脱アシル化した（Ｓｅｒｕｎｉａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９９１：１９８：７８−８７）。ホスファチジルイノシチドをアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって分離し、フローシンチレーション分析器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によって検出し、ＰｒｏＦＳＡソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量化した。３Ｈ−標識されたＰＩ３Ｐ（ホスファチジルイノシトール３−リン酸）、ＰＩＰ２およびＰＩＰ３のピークを、３２Ｐ−標識のインビトロ合成された内部脂質標準（これは、バキュロウイルス発現のＰＩ３Ｋを用いて調製された）によって特定した。［３Ｈ］イノシトール標識化のために、それぞれのピークにおけるカウント数をホスファチジルイノシトールのピークにおいて見出されるカウント数に対して正規化した。図１Ｃは、ＰＴＥＮ制御ｍｉＲＮＡの過剰発現が、増大したレベルのＰＩＰ３をもたらしたことを示す。このことはＰＴＥＮの低下した活性を示唆する。
【００８５】
ＰＴＥＮ存在量におけるｍｉＲＮＡ媒介低下がさらに、増大したＡｋｔリン酸化を認めることによって機能的に確認された。上記で記載されたように、ＰＴＥＮはＰＩＰ３をＰＩＰ２に脱リン酸化し、これにより、Ａｋｔの活性化（これはそのリン酸化を介して媒介される）を阻害する。図１Ｄは、１：ｓｉ−Ｌｕｃ、２〜１３：ｓｉ−ｍｉＲＮＡ  １９ａ、１９ｂ（ｍｉＲ−１９ファミリー）、２２、２５、９２ａ（ｍｉＲ−２５ファミリー）、１７、２０ａ、９３、１０６ｂ（ｍｉＲ−１７ファミリー）、３０２ａ、３７２、３７３（ｍｉＲ−３０２ファミリー）、および、１４：ｓｉ−ＰＴＥＮの一過性トランスフェクションの後でのＰＷＲ−１Ｅ細胞におけるｐＡｋｔ／Ａｋｔ比を示す。
【００８６】
試験されたｍｉＲＮＡと、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡとの間における直接的な相互作用が、ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲの適切なフラグメントがルシフェラーゼレポーター遺伝子の下流側にクローン化されたキメラなルシフェラーゼプラスミドを用いて確認された。この二重ルシフェラーゼレポーターアッセイはこの技術分野では知られている。簡単に記載すると、ＤＵ１４５細胞を２４ウエルプレートあたり６×１０４細胞の密度で播種した。２４時間後、ウエルあたり４００ｎｇのｐ１プラスミドまたはｐ２プラスミドを８０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫとともに共トランスフェクションした。リポフェクタミン２０００を製造者の推奨法に従ってトランスフェクション剤として使用した。トランスフェクションの２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、正規化した。図１Ｅは、野生型または変異型のｐ１レポータープラスミドおよびｐ２レポータープラスミドがＤＵ１４５細胞にトランスフェクションされたことを示す。この場合、変異型は、シードマッチ（すなわち、ｍｉＲＮＡが結合すると疑われる腫瘍抑制因子遺伝子の配列）において操作された変異を示す。トランスフェクションの２４時間後、変異型プラスミドのルシフェラーゼ活性が、対応する野生型プラスミドのルシフェラーゼ活性よりも高かった。このことは、シードマッチにおける導入された変異が、ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲへのｍｉＲＮＡ結合を損なうことを示している。
【００８７】
さらなる腫瘍抑制因子遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡが表１および図１Ｆに示される。それらには、ｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂのいずれかを制御するｍｉＲＮＡが列記される。これらのｍｉＲＮＡのすべてが、ＰＴＥＮ、同様にまた、示された他の腫瘍抑制因子遺伝子を制御する（例えば、ｍｉＲ−１２９９などがＰＴＥＮおよびｐ５３を制御し、一方、ｍｉＲ−２２などがＰＴＥＮおよびＩＮＰＰ４Ｂを制御する）。さらに、これらのｍｉＲＮＡの一部が、ＰＴＥＮ、ｐ５３およびＩＮＰＰ４Ｂを制御する（例えば、数ある中でも、ｍｉＲ−１９１３）。
【００８８】
実施例２：腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡが前立腺癌において過剰発現される
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を下記の様々な細胞に対して行った：正常な上皮に由来する２つの前立腺細胞株、原発性前立腺癌腫に由来する２つの前立細胞株、および、遠位の前立腺癌腫転移物に由来する５つの前立腺細胞株。図２において、下記の細胞が調べられた（細胞には、１から９までの番号が付けられ、順に）：ＲＷＰＥ−１（不死化された正常な前立腺上皮）、ＰＷＲ−１Ｅ（不死化された正常な前立腺上皮）、Ｃａ−ＨｐＶ−１０（原発性前立腺癌腫）、２２Ｒｖ１（原発性癌腫の異種移植片）、ＤＵ１４５、ＬｎＣａＰ、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＰＣ３およびＶＣａｐ（遠位臓器に転移した前立腺癌腫）。ｍｉＲ−２２が、原発性癌腫に由来する両方の細胞株において、また、５つの転移性細胞株のうちの３つにおいて、正常な上皮に由来する細胞株の場合よりも多く存在した（図２Ａ）。ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターにおいて突き止められる３つのＰＴＥＮ標的化成分（ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂ）の存在量におけるロバストな増大が、正常な細胞株の存在量と比較して、前立腺癌細胞株のすべてにおいて認められた（図２Ｂ）。さらに、（ＰＴＥＮを標的とするｍｉＲ−１７〜９２クラスターの）ｍｉＲ−１９ａの存在量が、正常な細胞に対して癌細胞では増大した（図２Ｃ）。
【００８９】
前立腺癌細胞におけるｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの存在量もまた、腫瘍組織および対照非腫瘍組織の１８４事例を含有する前立腺腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に対するインシトゥーハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって調べられた。ＴＭＡに対するＩＳＨを、３’ＤＩＧ−標識されたｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ロックド核酸）プローブを自動染色装置（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）とともに用いて５μｍのパラフィン切片に対して行った。細胞を６０℃で一晩にわたってベーキング処理し、脱ろうし、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において１２分間にわたって後固定し、その後、プロテイナーゼＫ溶液（１５μｇ／ｍｌ）において４分間にわたって消化した。ハイブリダイゼーションを市販のハイブリダイゼーション緩衝液（ＲｉｂｏＨｙｂｅ、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）においてそれぞれのプローブの融解温度（Ｔｍ）よりも２２℃低い温度で一晩行った。２×ＳＣＣにおける２回の１６分のハイブリダイゼーション後の洗浄をハイブリダイゼーション温度よりも４℃高い温度で行った。続いて、切片を、ＤＩＧに対するビオチン化抗体（ＩｎｎｏＧｅｎｅｘ）と４０分間インキュベーションした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ブロモクロロインドリルリン酸−ニトロブルーテトラゾリウム）基質を用いた検出を、ＢｌｕｅＭａｐキット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１０時間行った。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ５０ｉ顕微鏡を画像化のために使用した。図２Ｄに示されるように、ｍｉＲＮＡ存在量を、０〜１：陰性（ｎｅｇ）、または、２〜４：陽性（ｐｏｓ）としてＩＳＨによって検出されるように、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−２５の存在割合について、腫瘍周囲組織（左側の棒）、前立腺の上皮内新生物（ＰＩＮ；中央の棒）および前立腺癌（右側の棒）においてスコア化した。ＩＳＨ実験は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂが非腫瘍組織サンプルのほとんどにおいて存在しなかったことを示した。このことから、正常な前立腺上皮に由来する細胞株におけるＲＴ−ＰＣＲの結果が確認された。しかしながら、腫瘍サンプルの５３％までがこれらのｍｉＲＮＡについて陽性であった。ＰＩＮ、すなわち、前立腺上皮の初期の非浸襲性悪性病変として特徴づけられるＴＭＡサンプルは、中程度の陽性を一貫して示した（それぞれのｍｉＲＮＡについて陽性事例の２５％〜４５％）（図２Ｄ）。
【００９０】
実施例３：腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡの過剰発現がＤｉｃｅｒの過剰発現と相関する
腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡと癌との関連がさらに、Ｄｉｃｅｒ、すなわち、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断して、成熟型ｍｉＲＮＡを放出する酵素の発現を同じＴＭＡにおけるＩＨＣにより研究することによって明らかにされた。増大したＤｉｃｅｒ存在量が腫瘍進行に伴っていた（図３）。図３Ａは、ＩＨＣによってＤＩＣＥＲについて陰性（スコア：０）または陽性（スコア：１〜２）であると見なされたＴＭＡサンプルを示す。図３Ｂは、Ｄｉｃｅｒの存在を、腫瘍周囲組織（左側の棒）、ＰＩＮ（中央の棒）および前立腺癌（右側の棒）において示す。
【００９１】
実施例４：腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡは細胞の形質転換をインビトロおよびインビボにおいて高める
ｍｉＲ−２２はヒト前立腺癌細胞の増殖を高めることができるかを調べた。レトロウイルスｐｒｉ−ｍｉＲ−２２を安定的に発現するＤＵ１４５細胞（ＰＩＧ／２２細胞）を作製した。ＰＴＥＮの存在量および活性が、コントロール細胞（ＰＩＧ）の存在量および活性に対して低下した（図４Ａ、これはＲＴ−ＰＣＲを左側に、ウエスタンブロットを中央に、ＰＩＰ３産生を右側に示す）。さらに、軟寒天上に形成されるコロニーの数をこれらの細胞について研究した。この目的のために、底部層を、６ウエルディッシュをＤＭＥＭ培地における３ｍｌの０．６％寒天により覆うことによって得た。翌日、５×１０４個の感染細胞を、１０％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭにおける２ｍｌの０．３％寒天において三連でこの底部層に置床した。コロニーを、３週間〜４週間（ＤＵ１４５）の後、４０×および１００×の倍率で計数した。それぞれのウエルについて５つの視野を計数した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００顕微鏡を使用し、画像を、ＩＰＬａｂソフトウエアにより取得した。ｍｉＲ−２２によりトランスフェクションされた細胞が、コントロール細胞と比較して、軟寒天において、より多くの数のコロニーを形成した（図４Ｂ）。ｍｉＲ−２２の影響が、低下したＰＴＥＮ存在量に依存したかどうかを明らかにするために、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２２と、その３’ＵＴＲを欠くＰＴＥＮ（したがって、これはｍｉＲＮＡによって標的化され得ないと思われる）との両方を有するレトロウイルス形質導入のＤＵ１４５細胞を作製した。３’ＵＴＲを有しない外因性ＰＴＥＮはｍｉＲ−２２の増殖促進効果に打ち勝った。このことは、このｍｉＲＮＡが、その生物学的活性を発揮するためにＰＴＥＮのダウンレギュレーションに依存することを示している（図４Ｃ）。ヌードマウスのわき腹に皮下注入されたとき、ＰＩＧ／２２細胞は、６週間〜７週間の成長の後でＰＩＧ感染細胞によって生じる腫瘍のサイズの２倍であった腫瘍を生じさせたことによって示されるように（図４Ｄ）、増殖優位性を示した。ｍｉＲ−２２の過剰発現、および、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ存在量における付随する低下が、図４ＥにおけるＲＴ−ＰＣＲデータ（左側の棒がコントロール腫瘍であり、右側がｍｉＲ−２２過剰発現腫瘍である）に示されるように、ＰＩＧ／２２由来腫瘍において確認された。
【００９２】
実施例５：腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡの阻害は癌の縮小または防止をもたらすであろう
コントロール遺伝子のＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅまたはヒトＰＴＥＮを標的とする短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（ｓｈ−Ｒｅｎまたはｓｈ−ＰＴＥＮ）により安定的にトランスフェクションされたＤＵ１４５細胞株を作製した。図５は、ｓｈ−Ｒｅｎ発現細胞が、特定されたＰＴＥＮ標的化ｍｉＲＮＡのアンチセンス阻害剤の混合物（Ｉ−ｍｉｘ：ｍｉＲ−１９ａ／２２／２５／９３／１０６ｂに対するアンチセンス阻害剤の組み合わせ）により一過性トランスフェクションされたとき、コントロールのｍｉＲＮＡ阻害剤（Ｉ−Ｃ）によりトランスフェクションされた細胞と比較して、ＰＴＥＮの存在量が増大し、細胞増殖が低下したことを示す。対照的に、ｓｈ−ＰＴＥＮ発現細胞（これは検出不能なＰＴＥＮを有した）はＩ−ｍｉｘに対する応答を何ら示さなかった。この実験は、ＰＴＥＮ標的化が、ｍｉＲＮＡの生物学的活性を発揮するためにｍｉＲＮＡによって要求されることを示している。図５はウエスタンブロットおよび成長曲線の両方のデータを示す。
【００９３】
発癌性ｍｉＲＮＡの他の阻害剤に対する類似した研究は、癌を処置または予防するために使用されることがあるさらなる分子を示唆するかもしれない。これらの阻害剤は、癌の予防または処置における正の治療応答を示すことが予想される。したがって、腫瘍抑制因子を制御するｍｉＲＮＡを阻害する一般的モデルは、癌処置の基礎となるための土台であることが予想される（ＰＴＥＮを例示的な腫瘍抑制因子として示す図６を参照のこと）。
【００９４】
実施例６：例示的な腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ５１８ｃ＊）のさらなる特徴づけ
ｍｉＲ５１８ｃ＊は、ＰＴＥＮを５’ＵＴＲおよびタンパク質コード配列において標的とすることが予測される。ｍｉＲ５１８ｃ＊の発現がヒトの前立腺癌試料および結腸癌試料において増大している。そのうえ、ｍｉＲ５１８ｃ＊は、去勢抵抗性前立腺癌および他の癌タイプにおいて増幅される染色体１９ｑ１３上のＣ１９ＭＣクラスターの一部である。重要なことに、ｍｉＲ５１８ｃ＊とＰＴＥＮ発現とは前立腺癌において逆相関する。
【００９５】
これらの発見に基づいて、ＰＴＥＮがｍｉＲ５１８ｃ＊の標的として実証された。具体的には、図７Ａは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、陰性コントロール（ＣＴＬ）のトランスフェクションに対して、ＤＵ１４５およびＵ２ＯＳの両方の癌細胞においてＰＴＥＮタンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す。さらに、前立腺癌細胞または骨肉腫細胞へのｍｉＲ５１８ｃ＊の異所性送達はＰＴＥＮ転写物およびＰＴＥＮタンパク質の発現を低下させ、同時にＡＫＴのリン酸化を増大させた。ｍｉＲ５１８ｃ＊はルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ（５’ｕｔｒ）レポーター構築物およびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ（ｃｄｓ）レポーター構築物のルシフェラーゼ活性を減少させた。このことはＰＴＥＮの直接的な標的化を示している。図７Ｂに示されるように、ルシフェラーゼレポーターアッセイは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、陰性コントロール（ＮＣ）のトランスフェクションに対して、ＰＴＥＮ  ５’ＵＴＲ−ルシフェラーゼ（５’ＵＴＲ−ｌｕｃ）レポーター、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ＣＤＳ（Ｌｕｃ−ＣＤＳ）レポーターおよびルシフェラーゼ−ＰＴＥＮ  ３’ＵＴＲ（Ｌｕｃ−３’ＵＴＲ）レポーターの活性における有意な低下をもたらすことを明らかにした。ｍｉＲ５１８ｃ＊によるＰＴＥＮの抑制により、軟寒天における細胞増殖および足場非依存的成長が促進される。このことは、ｍｉＲ５１８ｃ＊の発癌性性質を示唆している。
【００９６】
ＰＴＥＮのほかに、さらなる腫瘍抑制因子がｍｉＲ５１８ｃ＊標的として試験された。具体的には、図７Ｃは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、陰性コントロール（ＮＣ）のトランスフェクションに対して、ｐ５３タンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにするウエスタンブロット分析を示す。同様に、前立腺癌細胞および骨肉腫細胞へのｍｉＲ５１８ｃ＊の送達はｐ５３の発現を低下させ、ｐ５３応答性ルシフェラーゼレポーター構築物の活性を減少させた。具体的には、図７Ｄは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現がｐ５３応答性ＰＩＧ−ルシフェラーゼレポーターおよびｐ２１−ルシフェラーゼレポーターの活性における有意な低下をもたらすことを明らかにするルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。
【００９７】
そのうえ、ｍｉＲ５１８ｃ＊は、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＺＥＢ２の発現を減少させた。図７Ｅに示されるように、ウエスタンブロット分析は、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  ＶＡＰＡおよびＰＴＥＮ  ｃｅＲＮＡ  Ｚｅｂ２のタンパク質レベルにおける有意な低下、そして、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔのタンパク質レベルにおける付随する増大をもたらすことを明らかにした。
【００９８】
同様に、図７Ｆに示されるように、増殖アッセイは、ｍｉＲ−５１８ｃ＊の過剰発現が、ＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡ陽性コントロールに関して認められる増殖と類似するＤＵ１４５前立腺癌細胞の増殖における有意な増大をもたらすことを明らかにした。また、図７Ｇに示されるように、５１８ｃ＊の発現がＧＳＥ２１０３６前立腺癌データセットおよびＧＳＥ１８３９２結腸癌データセットの両方において癌サンプルでは有意に上昇しており、そして、５１８ｃ＊の発現はまた、ＧＳＥ２１０３６前立腺癌データセットにおいてＰＴＥＮと有意に抗共発現している。
【００９９】
インビボにおけるｍｉＲ５１８ｃ＊過剰発現の発癌能を調べるために、遺伝子組換えＣａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ５１８ｃ＊マウスモデルを作製した。このマウス系統を作製するために、ｍｉＲ５１８ｃ＊を含有するゲノムフラグメントをＣａｇｓプロモーターの制御下に置き、Ｃｏｌａ１遺伝子座の中にノックインした。加えて、ｌｏｘＰ隣接の転写停止カセット（ＬＳＬ）をＣａｇｓプロモーターとｍｉＲ５１８ｃ＊との間に挿入し、したがって、ｍｉＲ５１８ｃ＊発現の時間的および空間的な統制を適切なＣｒｅマウス系統の利用によって可能にした。生殖系列を介して導入遺伝子を伝えた高寄与Ｃａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ５１８ｃ＊キメラ体が得られている。Ｃａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ５１８ｃ＊マウスは、ｍｉＲ５１８ｃ＊の全体的発現の影響を調べるために、Ｅｌｌａ−Ｃｒｅの全身欠失体系統に対して交雑され続けている。Ｃａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ５１８ｃ＊マウスはまた、様々な組織におけるｍｉＲ５１８ｃ＊の発癌性性質を評価するために、組織特異的Ｃｒｅ系統（例えば、前立腺特異的Ｐｂ−Ｃｒｅマウスなど）と交雑することができる。
【０１００】
実施例７：例示的な腫瘍抑制因子制御ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ２３ａ＊）のさらなる特徴づけ
ｍｉＲ２３ａはＰＴＥＮおよびｐ５３の両方を標的とする。興味深いことに、ｍｉＲ２３ａの反対鎖、すなわち、ｍｉＲ２３ａ＊もまた、ＰＴＥＮおよびｐ５３を標的とする。実際、成熟型ｍｉＲ２３ａまたはｍｉＲ２３ａ＊の異所性送達はＰＴＥＮおよびｐ５３のタンパク質発現レベルを抑制した。図８に示されるように、ウエスタンブロット分析は、ｍｉＲ−２３ａ＊の過剰発現が、陰性コントロール（ＮＣ）のトランスフェクションに対して、ＰＴＥＮおよびｐ５３の両方のタンパク質レベルにおける有意な低下をもたらすことを明らかにした。
【０１０１】
そのうえ、ｍｉＲ２３ａを含有するゲノムフラグメントの過剰発現もまた、ＰＴＥＮおよびｐ５３の発現を減少させ、また、ルシフェラーゼ−ＰＴＥＮレポーター構築物およびルシフェラーゼ−ｐ５３レポーター構築物の活性を減少させた。興味深いことに、ｍｉＲ２３ａは、マウスにおける黒色腫での、トランスポゾンに基づく将来に向けた遺伝子スクリーニングにおける「当たり」であったものであり、ｍｉＲ２３ａのレベルが、正常なメラノサイトと比較して、ヒト黒色腫転移において上昇している（データは含まれず）。
【０１０２】
インビボにおけるｍｉＲ２３ａの発癌性性質を調べるために、Ｃａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ２３ａマウスをＣａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ５１８ｃ＊マウスと同様に作製した。Ｃａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ２３ａノックイン対立遺伝子が生殖系列を介して伝わっており、マウスは現在、Ｅｌｌａ−Ｃｒｅマウスに対して交雑され続けている。Ｃａｇｓ−ＬＳＬ−ｍｉＲ２３ａマウスは、ｍｉＲ２３ａ過剰発現の組織特異的な発癌性影響を調べるために、組織特異的Ｃｒｅマウス（例えば、メラノサイト特異的ＴｙｒＣｒｅＥＲｔ２系統など）に対して交雑することができる。
【０１０３】
本明細書中において議論および引用されるすべての刊行物、特許および特許出願はそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。開示された発明は、記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料に限定されないことが理解される。なぜならば、これらは変化させることができるからである。本明細書中で使用される用語法は、特定の実施形態を記載するという目的のためだけであり、また、本発明の範囲を限定するために意図されず、本発明の範囲は、添付された請求項によってのみ限定されるであろうこともまた理解される。
【０１０４】
当業者は、本明細書中に記載される発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を、日常的にすぎない実験法を使用して認識するであろうし、または確認することができるであろう。そのような均等物は、下記の請求項によって包含されることが意図される。
【図３−１】
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【図６】
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【図７−１】
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【図８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月11日(2013.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防するための組成物であって、前記組成物はｍｉＲＮＡの阻害剤を含み、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、組成物。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡの発現および／または活性が前記阻害剤の投与の後で前記被験体において減少する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡが、ｐｒｉ形態、ｐｒｅ形態、二重鎖形態、成熟形態およびマイナー（＊）型形態からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）およびｍｉＲ−４９４（配列番号４４）からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡがまた、ｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡがｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡが、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂの２箇所までの部位、４箇所までの部位、６箇所までの部位、８箇所までの部位または１０箇所までの部位と結合する、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記阻害剤が、ｍｉＲＮＡの成熟配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記阻害剤が、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記阻害剤が、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）およびｍｉＲ−４９４（配列番号４４）からなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記阻害剤が化学修飾される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化学修飾が、ＬＮＡ、ホスホロチオアート、２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−メトキシエチルからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＬＮＡが１６個以下のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＬＮＡが約７個〜８個のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記阻害剤が前記癌の組織環境に基づいて選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記癌が、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、子宮頸部、乳房、胃、卵巣、食道、頸部、頭部、眼、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、胃腸、血液、神経膠芽細胞腫、肉腫、多発性骨髄腫、黒色腫、原発性腫瘍部位の転移、骨髄増殖性疾患、白血病、甲状腺乳頭状癌、非小細胞肺癌、中皮腫および消化管間質腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記癌が前立腺のものである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記前立腺癌が局在化しているか、または転移性である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防するための組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は：
ａ．第１のｍｉＲＮＡの第１の阻害剤であって、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の阻害剤と、
ｂ．第２のｍｉＲＮＡの第２の阻害剤であって、前記ｍｉＲＮＡがｐ５３制御因子またはＩＮＰＰ４Ｂ制御因子である、第２の阻害剤と
を含み、
ここで、前記第１の阻害剤および前記第２の阻害剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよいことを特徴とする、組み合わせ物。
【請求項２５】
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防するための組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は：
ａ．少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤であるか、または、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤を含む第１の薬剤であって、前記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の薬剤と、
ｂ．少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物であるか、あるいは、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物を含む第２の薬剤であって、前記癌の細胞において非ＰＴＥＮ標的または非ＰＴＥＮ経路で作用する、第２の薬剤と
を含み、
ここで、前記第１の薬剤および前記第２の薬剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよいことを特徴とする、組み合わせ物。
【請求項２６】
ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御するｍｉＲＮＡの阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の別の局面が、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御するｍｉＲＮＡの阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、上記被験体にｍｉＲＮＡの阻害剤を投与することを含み、上記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である方法。
（項目２）
上記ｍｉＲＮＡの発現および／または活性が上記阻害剤の投与の後で上記被験体において減少する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ｍｉＲＮＡが、ｐｒｉ形態、ｐｒｅ形態、二重鎖形態、成熟形態およびマイナー（＊）型形態からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）およびｍｉＲ−４９４（配列番号４４）からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記ｍｉＲＮＡがまた、ｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御する、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とする、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記ｍｉＲＮＡがｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂをその３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部および／または外部において標的とする、項目６に記載の方法。
（項目９）
上記ｍｉＲＮＡが、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂの２箇所までの部位、４箇所までの部位、６箇所までの部位、８箇所までの部位または１０箇所までの部位と結合する、項目１または６に記載の方法。
（項目１０）
上記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記阻害剤が、ｍｉＲＮＡの成熟配列に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記阻害剤が、ｍｉＲ−９（配列番号１）、ｍｉＲ−１５ｂ（配列番号２）、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ａ（配列番号４）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−１７−５ｐ（配列番号６）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号７）、ｍｉＲ−２０ｂ（配列番号８）、ｍｉＲ−１９ａ（配列番号９）、ｍｉＲ−１９ｂ（配列番号１０）、ｍｉＲ−２１（配列番号１１）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号１６）、ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号１７）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−１３６（配列番号２０）、ｍｉＲ−１４１（配列番号２１）、ｍｉＲ−１４４（配列番号２２）、ｍｉＲ−１８２（配列番号２３）、ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号２４）、ｍｉＲ−２０５（配列番号２５）、ｍｉＲ−２１４（配列番号２６）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）、ｍｉＲ−２２１（配列番号２９）、ｍｉＲ−２２２（配列番号３０）、ｍｉＲ−３０２ａ（配列番号３１）、ｍｉＲ−３０２ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−３０２ｃ（配列番号３３）、ｍｉＲ−３０２ｄ（配列番号３４）、ｍｉＲ−３０２ｅ（配列番号３５）、ｍｉＲ−３０２ｆ（配列番号３６）、ｍｉＲ−３３０−５ｐ（配列番号３７）、ｍｉＲ−３６３（配列番号３８）、ｍｉＲ−３６７（配列番号３９）、ｍｉＲ−３７２（配列番号４０）、ｍｉＲ−３７３（配列番号４１）、ｍｉＲ−３７５（配列番号４２）、ｍｉＲ−４８６（配列番号４３）、ｍｉＲ−４９４（配列番号４４）、ｍｉＲ−５１２−３ｐ（配列番号４５）、ｍｉＲ−５１８ｃ＊（配列番号４６）、ｍｉＲ−５１８ｅ（配列番号４７）、ｍｉＲ−５１９ａ（配列番号４８）、ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ（配列番号４９）、ｍｉＲ−５１９ｃ（配列番号５０）、ｍｉＲ−５１９ｄ（配列番号５１）、ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号５２）、ｍｉＲ−５２０ｂ（配列番号５３）、ｍｉＲ−５２０ｃ（配列番号５４）、ｍｉＲ−５２０ｄ（配列番号５５）、ｍｉＲ−５２０ｅ（配列番号５６）、ｍｉＲ−５５０ａ（配列番号５７）、ｍｉＲ−６２５（配列番号５８）、ｍｉＲ−６５９（配列番号５９）、ｍｉＲ−６６３（配列番号６０）、ｍｉＲ−６７１−５ｐ（配列番号６１）、ｍｉＲ−７６０（配列番号６２）、ｍｉＲ−８７７（配列番号６３）、ｍｉＲ−１２２５−５ｐ（配列番号６４）、ｍｉＲ−１２９９（配列番号６５）、ｍｉＲ−１９１３（配列番号６６）およびｍｉＲ−２３＊（配列番号６７）からなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記阻害剤が、ｍｉＲ−９３（配列番号３）、ｍｉＲ−１０６ｂ（配列番号５）、ｍｉＲ−２２（配列番号１２）、ｍｉＲ−２５（配列番号１５）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２１６ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−２１７（配列番号２８）およびｍｉＲ−４９４（配列番号４４）からなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記阻害剤が化学修飾される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記化学修飾が、ＬＮＡ、ホスホロチオアート、２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−メトキシエチルからなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記ＬＮＡが１６個以下のヌクレオチドを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記ＬＮＡが約７個〜８個のヌクレオチドを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記阻害剤が上記癌の組織環境に基づいて選択される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
上記癌が、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、子宮頸部、乳房、胃、卵巣、食道、頸部、頭部、眼、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、胃腸、血液、神経膠芽細胞腫、肉腫、多発性骨髄腫、黒色腫、原発性腫瘍部位の転移、骨髄増殖性疾患、白血病、甲状腺乳頭状癌、非小細胞肺癌、中皮腫および消化管間質腫瘍からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
上記癌が前立腺のものである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記前立腺癌が局在化しているか、または転移性である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記被験体が哺乳動物である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
上記哺乳動物がヒトである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、上記被験体に、
ａ．第１のｍｉＲＮＡの第１の阻害剤であって、上記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の阻害剤と、
ｂ．第２のｍｉＲＮＡの第２の阻害剤であって、上記ｍｉＲＮＡがｐ５３制御因子またはＩＮＰＰ４Ｂ制御因子である、第２の阻害剤と
を投与することを含み、
ここで、上記第１の阻害剤および上記第２の阻害剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法。
（項目２５）
癌の処置または予防を必要とする被験体において癌を処置または予防する方法であって、上記被験体に、
ａ．少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤であるか、または、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの阻害剤を含む第１の薬剤であって、上記ｍｉＲＮＡがＰＴＥＮ制御因子である、第１の薬剤と、
ｂ．少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物であるか、あるいは、少なくとも１つの他の癌生物製剤、癌治療剤、癌化学療法剤または癌薬物を含む第２の薬剤であって、上記癌の細胞において非ＰＴＥＮ標的または非ＰＴＥＮ経路で作用する、第２の薬剤と
を投与することを含み、
ここで、上記第１の薬剤および上記第２の薬剤はいずれの順序で投与されても、またはそれらは同時に投与されてもよい、方法。
（項目２６）
ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３および／またはＩＮＰＰ４Ｂを制御するｍｉＲＮＡの阻害剤と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014515024000001.app
【国際調査報告】
2014515024.tif 000035
2014515024.tif 000036
2014515024.tif 000037
2014515024.tif 000038
2014515024.tif 000039
2014515024.tif 000040
2014515024.tif 000041