(57)【要約】【課題】本発明は、個体の癌の酸素状態を判定する方法を提供する。【解決手段】当該方法は、ADM (SEQ ID NO:1)、及び/又はANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、及び/又はALDOA (SEQ ID NO:2)から選択された少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルを癌試料中で判定することを含む。転写レベルは、その後、少なくとも1個の基準遺伝子の転写レベルに相関させ、次に、相関転写レベルを、高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料と比較することにより、酸素状態を評価する。【選択図】図4【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADM遺伝子 (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルに相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADMの所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む方法。
【請求項２】
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADMと、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルと相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADM及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項３】
ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及びそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、更に好ましくは少なくとも4個、更により好ましくは少なくとも5個の遺伝子の転写発現レベルが、ステップii) において決定される、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４】
少なくともADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、及び/又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルをステップii) において決定する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項５】
少なくともADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、及び/又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルをステップii) において決定する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項６】
ステップiv) における前記所定の被相関転写発現レベルは、
高い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料、及び
低い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1個の基準遺伝子は、ACTR3 (SEQ ID NO:53)、NDFIP1 (SEQ ID NO:54)、RPL37A (SEQ ID NO:55)、及びそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体のうち1つ又は複数である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1個の基準遺伝子は、ACTR3 (SEQ ID NO:53)、NDFIP1 (SEQ ID NO:54)、及びRPL37A (SEQ ID NO:55)である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記試料は、生検材料である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は、ホルマリン固定されている、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞は、扁平細胞癌又は腺癌である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、扁平上皮癌である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記扁平上皮癌は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記癌は、扁平上皮癌腫である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記扁平上皮癌は、頭頸部癌である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
前記頭頸部癌は、口、口唇の癌、鼻腔癌、及び鼻咽腔癌からなる群から選択される、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
酸素状態は、 iii) の被相関転写発現レベルと、高い酸素レベルを有する所定の基準試料及び低い酸素レベルを有する所定の基準試料の1個又は複数の遺伝子の被相関転写発現レベルとの差(D)を計算することにより評価され、
【数１】
2014518616.tif 000039
ここで、mは、ii) の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、「低酸素」又は「高酸素」基準試料を示し、zは、基準試料の平均発現レベル、Wは、算出された共通分散、yは、癌細胞を含む試料の転写遺伝子発現であり、
癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、高酸素レベルを有し、
癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、低酸素レベルを有する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
ii) の前記転写発現レベルは、定量的PCR(qPCR)により決定される、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
ii) の少なくとも1個の遺伝子の前記転写発現レベルは、少なくとも1個、例えば3個の、基準遺伝子のそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を、ii) の少なくとも1個の遺伝子のCt値から減算することによりΔCtを求め、2-ΔCtを計算することにより、ii) の遺伝子の発現値を、前記基準遺伝子に対する倍率差に変換し、倍率差をlog2変換して遺伝子発現値(y)を求めることにより、前記少なくとも1個の基準遺伝子と相関させ、ここで、Ct値は、qPCR蛍光シグナルが基線変動に基づいて選択された閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
個体の癌の治療に使用するための低酸素改質剤であって、前記癌において、
i) ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子の発現に相関させた際に、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の被相関転写発現レベルに対応する、低酸素改質剤。
【請求項２１】
前記癌において、
i) ADM又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子に相関させた際に、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルに対応すると共に、
iv) 高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルとは異なる、請求項20記載の低酸素改質剤。
【請求項２２】
前記低酸素改質剤は、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される、請求項20及び21の何れかに記載の低酸素改質剤。
【請求項２３】
前記低酸素改質剤は、ニモラゾール、ミソニダゾール、及びドラニダゾールからなる群から選択される、請求項20及び21の何れかに記載の低酸素改質剤。
【請求項２４】
前記低酸素改質剤は、ニモラゾール(4-[2-(5-ニトロ-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン)である、請求項20及び21の何れかに記載の低酸素改質剤。
【請求項２５】
癌の治療に使用するための電磁放射線源に関し、前記癌において、
i) ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子の発現に相関させた際に、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の被相関転写発現レベルに対応する、電磁放射線源。
【請求項２６】
前記癌において、
i) ADM又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子に相関させた際に、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルに対応すると共に、
iv) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルとは異なる、請求項20乃至24の何れかに記載の低酸素改質剤又は請求項25記載の電磁放射線源。
【請求項２７】
ADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又は変異体との被相関転写発現レベルは、高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルよりも、低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルに類似する、請求項20乃至26の何れかに記載の低酸素改質剤又は電磁放射線源。
【請求項２８】
前記少なくとも1個の追加遺伝子は、請求項2乃至5の何れかに定める通りであり、前記所定の基準試料は、請求項6に定める通りであり、前記基準遺伝子は、請求項7及び8の何れかに定める通りであり、前記試料は、請求項9及び10の何れかに定める通りであり、前記癌は、請求項11乃至16の何れかに定める通りであり、前記酸素状態は、請求項17に定めるように評価され、前記転写発現レベルは、請求項18乃至19の何れかに定めるように決定される、請求項20乃至27の何れかに記載の低酸素改質剤又は電磁放射線源。
【請求項２９】
個体の癌を改善及び/又は治療する方法であって、
a.前記個体からの癌の試料を提供するするステップと、
b.請求項1乃至19の何れかに定めた方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
c.低酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
d.低酸素改質剤を治療的に有効な量で前記個体に投与するステップと、を備える方法
【請求項３０】
前記低酸素改質剤は、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記方法は、更に、前記個体に放射線療法を施すことを含む、請求項29又は30記載の方法。
【請求項３２】
前記放射線療法は、単一又は複数の分割単位で行われる、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
低酸素改質剤は、前記放射線療法の前又は前記放射線療法と同時に投与される、請求項29及び31の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
前記方法は、更に、追加化合物を投与するステップを備える、請求項29乃至33の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
前記追加化合物は、抗増殖及び/又は抗悪性腫瘍剤である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも1つの追加化合物は、放射線増感剤である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
個体の癌の予後を判定する方法であって、請求項1乃至19の何れかに定めた方法により前記癌の酸素状態を判定することを含む方法。
【請求項３８】
低酸素状態を特徴とする癌は、予後不良に関連付けられる、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
癌を改善及び/又は治療する方法であって、
i) 前記個体からの癌の試料を提供するステップと、
ii) 請求項1乃至19の何れかに定めた方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すステップと、を備える方法。
【請求項４０】
放射線療法の前又は放射線療法と同時に低酸素改質剤による治療を必要としない、癌を有する個体を選択する方法であって、
i) 前記個体からの癌の試料を提供することと、
ii) 請求項1乃至19の何れかに定めた方法により前記癌の酸素状態を判定することと、
iii) 高酸素状態を特徴とする癌を有する個体を選択することと、
iv) 高酸素状態を特徴とする癌を有する前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すことと、を含む方法。
【請求項４１】
前記癌は、請求項11乃至16の何れかに定めた通りである、請求項37及び40の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な酸素レベルで差次的に発現される遺伝子(群)の転写発現レベルに基づいた、癌の酸素状態を判定する方法に関する。更に、本発明は、酸素状態が判定された時の、癌の治療方法、医薬組成物、及び低酸素改質剤の形態である薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
低酸素症は、侵攻性の腫瘍及び治療反応の低下に関連した腫瘍に頻発する特徴である。放射線療法において、反応低下は、主に低酸素症が誘発する耐放射線性によるものであり、これは照射中に放出されたフリーラジカルと反応する酸素が無い場合に発生し、腫瘍内部での損傷化合物の形成を低減する。しかしながら、低酸素症は、低酸素改質療法と共に放射線療法を行うことで潜在的に低減可能な臨床問題でもある。低酸素改質剤、例えば、ニトロイミダゾール等の低酸素増感剤を、治療に加えることにより、嫌気的条件下において酸素フリーラジカルに似た損傷化合物を形成可能な反応性のNO2基が供給される。したがって、この相加作用により、低酸素腫瘍における治療反応を向上させることが可能となり、これはDAHANCA5試験においても検証され、放射線療法と共に低酸素増感剤ニモラゾールにより治療した頭頸部癌患者において、プラセボと比較して結果の向上が得られた。しかしながら、低酸素改質剤の投与を含む治療には、罹患個体に好ましくない副作用があるため、すべての腫瘍が低酸素改質剤の使用が正当化される程の低酸素症を示す訳ではない。DAHANCA5試験の結論の1つは、腫瘍の低酸素症を検出することにより、低酸素改質療法から恩恵を受ける患者の特定を支援する優れた方法に対する需要が存在するということである。
【０００３】
低酸素腫瘍状態の特徴付けに関する確立されたアプローチには、酸素検出電極の使用、外因性低酸素トレーサー(ピモニダゾール、18F-miso、18F-FAZA)の注入、又は低酸素誘発HIF-1αカスケードに関連した内因性マーカーの定量化(Moon et al., The potential role of intrinsic hypoxia markers as prognostic variables in cancer. Antioxid Redox Signal 9:1237-1294, 2007)が含まれる。これらの方法は、全て重要な情報をもたらすが、侵襲的処置の必要性、或いは低酸素症との関連性に関する不十分な特異性という形で欠点を伴う。
【０００４】
cDNAマイクロアレイ技術及び遺伝子発現プロファイリングにより、特定の関連条件下で上方制御又は下方制御されることを特徴とする遺伝子群(シグネチャー、プロフィール、メタジーン)の特定が可能となっている。更に、低酸素症に注目したシグネチャーも開発されている。こうしたシグネチャーにより、微小環境において低酸素症を調整する細胞代謝の理解は深まったが、更に、シグネチャーは、腫瘍生検材料における特異的な低酸素応答性遺伝子の発現に基づいて、腫瘍の低酸素状態を評価することを可能にする潜在的な利点も有している。このような「低酸素遺伝子発現シグネチャー」の臨床的関連性は、更に多くのグループにより記述されてきた。2006年に、Chiらは、一連の乳癌及び卵巣癌において臨床転帰の有力な予測因子となることも証明された168の様々なインビトロ誘導低酸素応答性遺伝子を示唆した(Chi et al., Gene expression programs in response to hypoxia: Cell type specificity and prognostic significance in human cancers. PLoS Med 3:e47, 2006)。Winterらは、公表された頭頸部癌のセットにおいて無再発生存期間の独立した予後因子になること、更に、公開された乳癌シリーズにおいて全生存期間の有意な予後因子となることが証明された99の遺伝子を含む低酸素シグネチャーを開発した(Winter et al., Relation of a hypoxia metagene derived from head and neck cancer to prognosis of multiple cancers. Cancer Res 67:3441-3449, 2007)。このシグネチャーからの遺伝子のコアのインシリコ解析に基づいて、Buffaらは、「共通低酸素メタジーン」を、更なる予後的な影響と共に定めた(Buffa et al., Large meta-analysis of multiple cancers reveals a common, compact and highly prognostic hypoxia metagene. Br J Cancer 102:428-435, 2010)。これらの研究で述べられているように、低酸素症に注目した遺伝子発現シグネチャーは、低酸素症の分類と、より多くの癌の転帰の予測とに関する有望な戦略を構成する。
【０００５】
しかしながら、既存の文献によれば、最終的な低酸素シグネチャーは、未だに得られておらず、臨床場面における低酸素改質療法による付加的治療の予測因子として実現されていない。
【０００６】
この障害に関する開発途中の戦略は、腫瘍生検材料における低酸素応答性遺伝子の発現を、腫瘍における現在の酸素状態の評価として用いることにより、この評価に従って治療をガイドすることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、酸素状態にも相関する腫瘍内の特異的遺伝子の転写レベルを測定することに基づいて、腫瘍の酸素状態の予後的及び予測的影響を判定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADM遺伝子 (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルに相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADMの所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む、方法に関する。
【０００９】
好適な一実施形態において、方法は、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADMと、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルと相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADM及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む。
【００１０】
他の態様において、本発明は、個体の癌の治療に使用するための低酸素改質剤を提供し、前記癌において、
i) ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子の発現に相関させた際に、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の被相関転写発現レベルに対応する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、癌の治療に使用するための電磁放射線源に関し、前記癌において、
i) ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子の発現に相関させた際に、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の被相関転写発現レベルに対応する。
【００１２】
他の態様において、本発明は、個体の癌を改善及び/又は治療する方法であって、
a.前記個体からの癌の試料を提供するステップと、
b.本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
c.低酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
d.低酸素改質剤を治療的に有効な量で前記個体に投与するステップと、を備える方法に関する。
【００１３】
本発明は、更に、一態様において、癌を改善及び/又は治療する方法であって、
i) 前記個体からの癌の試料を提供するステップと、
b.本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すステップと、を備える方法に関する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、放射線療法の前又は放射線療法と同時に低酸素改質剤による治療を必要としない、癌を有する個体を選択する方法を提供し、前記方法は、
i) 前記個体からの癌の試料を提供するステップと、
b.本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 高酸素状態を特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 高酸素状態を特徴とする癌を有する前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すステップと、を備える。
【００１５】
他の態様において、本発明は、個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 癌細胞を含む試料において、
ii) ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れかの変異体からなる群から選択された少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルを決定するステップと、
iii) ii) の少なくとも1個の遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子と相関させるステップと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、
高い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料、及び
低い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料
のii) と同じ1個又は複数の遺伝子の同じ被相関転写発現レベルと比較することにより、酸素状態を評価するステップと、を含む方法に関する。
【００１６】
酸素状態は、 iii) の被相関転写発現レベルと、高い酸素レベルを有する所定の基準試料及び低い酸素レベルを有する所定の基準試料の、同じ1個又は複数の遺伝子の同じ被相関転写発現レベルとの差(D)を計算することにより評価することが好ましく、
【数１】
2014518616.tif 000002
ここで、mは、ii) の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、「低酸素」又は「高酸素」基準試料、zは、基準試料の平均発現レベル、Wは、算出された共通分散、yは、癌細胞を含む試料の転写遺伝子発現であり、
癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、高酸素レベルを有し、
癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、低酸素レベルを有する。
【００１７】
ii) の転写発現レベルは、定量的PCR(qPCR)により決定することが好ましい。
【００１８】
好ましくは、ii) の少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルは、少なくとも1個、例えば3個の、基準遺伝子のそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を、ii) の少なくとも1個の遺伝子のCt値から減算することによりΔCtを求め、2-ΔCtを計算することにより、ii) の遺伝子の発現値を、前記基準遺伝子に対する倍率差に変換し、倍率差をlog2変換して遺伝子発現値(y)を求めることにより、前記少なくとも1個の基準遺伝子と相関させ、ここで、Ct値は、qPCR蛍光シグナルが基線変動に基づいて選択された閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める。最も好適な実施形態において、ii) の少なくとも1個の遺伝子は、ACTR3、NDFIP1、及び/又はRPL37Aから選択された1個又は複数の基準遺伝子と相関させる。より好適な実施形態において、少なくとも1個の遺伝子は、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aのそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を減算することにより、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aの発現と相関させる。
【００１９】
試料は、一実施形態において、ホルマリン固定される。
【００２０】
癌細胞は、例えば、低酸素細胞である。
【００２１】
本発明の癌細胞は、一実施形態において、扁平細胞癌の細胞、扁平上皮癌の細胞であり、及び/又は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択し得る。非限定的な例は、頭頸部癌等の扁平上皮癌腫、扁平上皮癌であり、頭頸部癌は、例えば、口、口唇の癌、鼻腔癌、及び鼻咽腔癌からなる群から選択される。
【００２２】
本発明の方法において、転写発現レベルは、ステップii) においてADM (SEQ ID No:1)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、LOX (SEQ ID NO:9)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、及びSLC2A1 (SEQ ID NO:15)、及びその変異体からなる群から選択された少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、更に好ましくは少なくとも4個、更により好ましくは少なくとも5個の遺伝子について決定される。
【００２３】
本発明の方法の他の実施形態において、転写発現レベルは、ステップii) においてADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及びその変異体からなる群から選択された少なくとも6個、好ましくは少なくとも7個、更に好ましくは8個、更により好ましくは少なくとも9個、好ましくは少なくとも10個、更に好ましくは11個、更により好ましくは少なくとも11個、好ましくは少なくとも12個、更に好ましくは13個、更により好ましくは少なくとも14個、好ましくは少なくとも15個の遺伝子について決定される。
【００２４】
最も好適な実施形態において、転写発現レベルは、15個の遺伝子、ADM、ALDOA、ANKRD37、BNIP3、BNIP3L、C3orf28、EGLN3、KCTD11、LOX、NDRG1、P4HA1、P4HA2、PDK1、PFKFB3、及びSLC2A1について決定される。
【００２５】
他の態様において、本発明は、個体の癌の予後を判定する方法に関し、これにおいて、癌の酸素状態は、上述したような方法、即ち、個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADM遺伝子 (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルに相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADMの所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む方法により判定される。
【００２６】
一実施形態において、方法は、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADMと、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルと相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADM及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む。
【００２７】
本発明の予後的方法において、低酸素状態を有する癌は、予後不良に関連付けられる。
【００２８】
他の態様において、本発明は、癌を改善及び/又は治療する方法であって、
i) 個体から癌の試料を取得するステップと、
ii) 本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 低酸素改質剤を治療的に有効な量で前記個体に投与するステップと、を備える方法に関する。
【００２９】
癌は、低酸素レベルを特徴とすることが好ましい。
【００３０】
限定ではなく、低酸素改質剤は、例えば、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される。
【００３１】
例えば、低酸素改質剤は、ニモラゾール、ミソニダゾール、及びドラニダゾールからなる群から選択され、或いは低酸素改質剤は、ニモラゾール(4-[2-(5-ニトロ-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン)である。
【００３２】
本発明の方法によれば、更に、1つ又は複数の抗増殖及び/又は抗悪性腫瘍剤、及び/又は放射線増感剤等の追加化合物を投与するステップを追加し得る。
【００３３】
他の態様において、本発明は、癌を改善及び/又は治療する方法であって、
i) 前記個体から癌の試料を取得するステップと、
ii) 本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すステップと、を備える方法に関する。
【００３４】
前記癌は、この場合、高酸素レベルを特徴とすることが好ましい。
【００３５】
他の態様において、本発明は、癌を治療するための低酸素改質剤又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物に関する。癌は、低酸素レベルを特徴とすることが好ましい。低酸素改質剤は、例えば、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される。他の例において、低酸素改質剤は、ニモラゾール、ミソニダゾール、及びドラニダゾールからなる群から選択され、更に他の実施形態において、低酸素改質剤は、ニモラゾール(4-[2-(5-ニトロ-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン)である。
【００３６】
他の態様において、本発明は、癌を治療する薬剤の製造のための低酸素改質剤の使用に関する。癌は、低酸素レベルを特徴とすることが好ましい。
【００３７】
本発明の方法、医薬組成物、及び使用において、癌試料の酸素レベルは、請求項1に一般的に定めたような、本発明の方法により決定される。本発明の方法、医薬組成物、及び使用では、癌は、一例において、扁平細胞癌、扁平上皮癌であり、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択される。特定の例において、扁平上皮癌は、扁平上皮癌腫であり、或いは、扁平上皮癌は、頭頸部癌である。頭頸部癌は、口、口唇の癌、鼻腔癌、及び鼻咽腔癌からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】低酸素応答性及びpH非依存型遺伝子の特定及び検証。a.低酸素誘発上方制御とpH変動に対する非感受性とを特徴とするインビトロ誘導遺伝子(CA9を除く)。b乃至c.異種移植片腫瘍における低酸素トレーサー18F FAZAの分布をHE及びオートラジオグラフィーにより表したもの。(H)低酸素腫瘍組織に類似するトレーサー陽性領域、(N)非低酸素腫瘍組織に類似するトレーサー陰性領域、(M)低酸素及び非低酸素腫瘍組織の異種混合体に類似する全切片。d.非低酸素腫瘍領域(N)と比較した低酸素腫瘍領域(H)における上方制御倍率。e.非低酸素腫瘍組織(N)と比較した異種腫瘍全切片(Mにおける上方制御倍率。
【図２】15遺伝子低酸素遺伝子発現分類指標の開発及び評価。a.転移リンパ節における酸素電極による低酸素症評価に基づく所定の「強」及び「弱」低酸素腫瘍。b.所定のグループ化の基準は、遺伝子発現(B/W比)に関して、所定のグループ間での識別に最も適した能力に基づいて作成した。c.「leave-one-out」交差検定解析における、分類指標に含まれる遺伝子の数及び腫瘍試料を予め定めたものと同じグループに分類する能力。d.15遺伝子低酸素症分類指標において最も頻繁に存在する遺伝子。e.従来の放射線療法のみにより治療し、15遺伝子低酸素指標により「強」及び「弱」低酸素腫瘍に分類した、156人の独立した頭頸部癌患者における局所腫瘍制御。
【図３】15遺伝子の低酸素遺伝子発現分類指標の予後的及び予測的影響。  a.従来の放射線療法と併せたプラセボ又はニモラゾールによる治療についてランダム化した、323人の頭頸部癌患者群におけるニモラゾールによる低酸素改質の効果。b.ニモラゾール又はプラセボによる付加的治療に関係なく、15遺伝子低酸素症指標により分類したグループにおける局所腫瘍制御。c.プラセボ又はニモラゾールについてランダム化した、「強」低酸素腫瘍を有するものに分類されたグループにおける局所腫瘍制御。d.プラセボ又はニモラゾールについてランダム化した、「弱」低酸素腫瘍を有するものに分類されたグループにおける局所腫瘍制御。
【図４】DAHANCA5研究設計の概要。*LCR(局所領域)
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
【００４０】
本明細書で使用する「個体」及び「必要とする個体」という用語は、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌を有する疑いがある、或いは癌に罹患した、好ましくは任意の年齢のヒトである、男又は女(雄又は雌)の哺乳動物を示す。
【００４１】
「治療的に有効な量」という用語は、所望の反応を引き出すために十分な量を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、その通常の意味を示し、転写能力を有する、即ち、発現を調整する又は発現配列の発現に携わる制御配列と共に、殆どの場合はアミノ酸配列へ翻訳される、RNA配列(発現配列)への転写が可能な、核酸配列を示す。
【００４３】
二本鎖ポリヌクレオチドは、配列が相補的で、互いにハイブリダイズ可能な二本鎖を含む。
【００４４】
ヌクレオチドは、本明細書において、RNA又はDNAの単量体として定義される。ヌクレオチドは、塩基とリン酸基との両方に付着したリボース又はデオキシリボース環である。一リン酸、二リン酸、及び三リン酸のヌクレオシドを全てヌクレオチドと呼ぶ。
【００４５】
本明細書で使用する「ヌクレオチド」という用語は、天然又は組み換えDNA又はRNAポリメラーゼの変異体及び機能等価物を含め、好ましくは、DNA又はRNA依存性のDNA又はRNAポリメラーゼ活性を含む酵素により、鋳型に従う形でオリゴヌクレオチドに組み込まれることが可能な天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドの両方を示す。コード要素及びヌクレオチド部分を含む相補要素の形態となる対応する結合パートナは、水素結合により互いに相互作用することができる。相互作用は、一般に「塩基対合」と呼ばれる。ヌクレオチドは、異なるリン酸塩部分、糖部分、及び/又は塩基部分を有することにより天然ヌクレオチドから変化し得る。したがって、ヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合の形態の天然結合、或いは、PNA(ペプチド核酸)の場合のペプチド結合等、非天然結合の形態で、鋳型又は相補的な鋳型においてそれぞれに隣接する(複数の)ものと結合し得る。本発明によるヌクレオチドは、アデニン(A)、ウラシル(U)、グアニン(G)、及びシトシン(C)からなる群から選択された核酸塩基を含むリボヌクレオチドと、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)、及びシトシン(C)からなる群から選択された核酸塩基を含むデオキシリボヌクレオチドとを含む。核酸塩基は、水素結合を介して1つ又は複数の他の核酸塩基と特異的に結びつくことができる。したがって、1個又は幾つかの他の核酸塩基とのみ安定した水素結合を形成可能であるが、通常はそれ自体を含む他の殆どの核酸塩基とは安定した水素結合を形成できないことは、核酸塩基の重要な特徴となる。ある核酸塩基の他の核酸塩基との特異的相互作用は、一般に「塩基対合」と呼ばれる。塩基対合により、所定の相補的ヌクレオチド間での特異的なハイブリダイゼーションが生じる。本発明による相補的ヌクレオチドは、塩基対合が可能な核酸塩基を含むヌクレオチドである。自然発生ヌクレオチドのうち、アデニン(A)は、チミン(T)又はウラシル(U)と対合し、グアニン(G)は、シトシン(C)と対合する。したがって、例えば、Aを含むヌクレオチドは、T又はUを含むヌクレオチドに対して相補的となり、Gを含むヌクレオチドは、Cを含むヌクレオチドに対して相補的となる。
【００４６】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書においてポリヌクレオチドと相互に交換可能に用いられる。本明細書において「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)又はその模倣物の一本鎖又は二本鎖のオリゴマー又はポリマーを示す。この用語は、自然発生塩基、糖、及びヌクレオシド間共有結合(例えば、骨格)により構成されるオリゴヌクレオチドと、それぞれの自然発生部分と同様に機能する非自然発生部分を有するオリゴヌクレオチドとを含む。したがって、オリゴヌクレオチドという用語は、更に、天然及び非天然ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの任意の組み合わせを示す。天然及び/又は非天然ヌクレオチドは、天然のリン酸ジエステル結合又は非天然結合により結合され得る。好適なオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合により結合された天然ヌクレオチドのみを含む。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと相互に交換可能に用いられる。本発明のオリゴマー又はポリマー配列は、モノマーサブユニットの化学的又は酵素的追加により形成される。本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、ワトソン-クリック型の塩基対合、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対合等の規則的なパターンのモノマー間相互作用により一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能な、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのアノマ形態、ペプチド核酸モノマー(PNA)、ロックドヌクレオチド酸モノマー(LNA)等含む、天然または改変核酸モノマー又は連鎖の線状オリゴマーを示す。通常、モノマーはホスホジエステル結合又はその類似体により連結されて、数個のモノマー単位、例えば3乃至4個から数十個のモノマー単位、例えば40乃至60個の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドを「ATGCCTG」等の文字列により表す際は常に、ヌクレオチドは5’→3’の順序で左から右へ記載され、「A」は、デオキシアデノシン、「C」は、デオキシシチジン、「G」は、デオキシグアノシン、「T」は、チミジンを表すことは理解されよう。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、4個の天然ヌクレオチドを含むが、しかしながら、これらは更に、メチル化又は非天然ヌクレオチド類似体を含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドの100%相補的形態に加え、本明細書で使用する「二本鎖」という用語は、更に、バルジ及びループ等の構造的特徴を含む形態を示すものである。
【００４７】
単一分子内で共に結合した複数の個別のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを形成し得る。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、PNA、LNA等の任意の誘導体化ヌクレオチドを対象とする。オリゴヌクレオチドは何れもポリヌクレオチドであるが、全てのポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドではない。
【００４８】
酸素状態を判定する方法
【００４９】
本発明は、悪性腫瘍を強又は弱低酸素サブタイプに分類する方法に関する。こうした2群への癌の分類は、どの個体が特定の治療計画により恩恵を受けるかを判定する時に、予後的又は予測的に重要となる場合がある。こうした特定の治療計画は、強化した従来の治療、付加的な低酸素改質、又は反応性低酸素サイトトキシンによる治療の形態にすることができる。
【００５０】
一般に、低酸素症は、固形癌において、不十分な血管化、急速な細胞増殖、及び腫瘍細胞内での代謝増加により生じる。酸素レベルが20 mmHg未満の腫瘍は、一般に低酸素症と考えられるが、酸素レベルが2.5乃至5 mmHgの範囲の腫瘍は、更に放射線療法に耐性を示す場合が多い。耐性は、照射中に放出されたフリーラジカルと反応する酸素が欠如し、これにより腫瘍内部での損傷化合物の形成が低減されることに関与する。結果として、酸素レベルが低い(「強」低酸素症)と分類された癌に罹患した個体を、低酸素改質剤、低酸素サイトトキシンのみ、又は放射線と組み合わせて治療することにより、治療結果は改善する。
【００５１】
したがって、一態様において、本発明は、個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADM遺伝子 (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルに相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADMの所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む方法に関する。
【００５２】
好適な一実施形態において、方法は、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADMと、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルと相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADM及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む。
【００５３】
一態様において、本発明は、個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 癌細胞を含む試料において、
ii) ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つの変異体からなる群から選択された少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルを決定するステップと、
iii) ii) の少なくとも1個の遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子と相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、
高い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料、及び
低い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料
のii) と同じ1個又は複数の遺伝子の同じ被相関転写発現レベルと比較することにより、酸素状態を評価するステップと、を含む方法に関する。
【００５４】
酸素状態は、 iii) の被相関転写発現レベルと、高い酸素レベルを有する所定の基準試料及び低い酸素レベルを有する所定の基準試料の、同じ1個又は複数の遺伝子の同じ被相関転写発現レベルとの差(D)を計算することにより評価することが好ましく、
【数２】
2014518616.tif 000003
ここで、mは、ii) の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、「低酸素」又は「高酸素」基準試料、zは、基準試料の平均発現レベル、Wは、算出された共通分散、yは、癌細胞を含む試料の転写遺伝子発現であり、
癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、高酸素レベルを有し、
癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、低酸素レベルを有する。
【００５５】
好ましくは、ii) の少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルは、少なくとも1個、例えば3個の、基準遺伝子のそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を、ii) の少なくとも1個の遺伝子のCt値から減算することにより、ΔCtを求め、2-ΔCtを計算することにより、ii) の遺伝子の発現値を、前記基準遺伝子に対する倍率差に変換し、倍率差をlog2変換することにより、遺伝子発現値(y)を求めることにより、前記少なくとも1個の基準遺伝子と相関させ、ここで、Ct値は、qPCR蛍光シグナルが基線変動に基づいて選択された閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める。最も好適な実施形態において、ii) の少なくとも1個の遺伝子は、ACTR3、NDFIP1、及び/又はRPL37Aから選択された1個又は複数の基準遺伝子と相関させる。より好適な実施形態において、少なくとも1個の遺伝子は、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aのそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を減算することにより、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aの発現と相関させる。
【００５６】
本発明の方法において、転写発現レベルは、ステップii) において、ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及びその変異体からなる群から選択された少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、更に好ましくは少なくとも4個、更により好ましくは少なくとも5個の遺伝子について決定される。
【００５７】
最も好適な実施形態において、転写発現レベルは、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAについて決定される。
【００５８】
他の方法において、転写レベルは、ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)から選択された、少なくとも6個、例えば7個、例として8個、例えば9個、例として10個、例えば11個、例として12個、例えば13個、例として14個、例えば15個の遺伝子について決定される。
【００５９】
本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAからなる群から選択された少なくとも1個の遺伝子について決定される。
【００６０】
例えば、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、ADMと、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６１】
同じように、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、ANKRD37と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６２】
同様に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、P4HA2と、ADM、ANKRD37、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６３】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、NDRG1と、ADM、ANKRD37、P4HA2、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６４】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、SLC2A1と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６５】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、P4HA1と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６６】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、LOXと、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６７】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、C3orf28と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６８】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、BNIP3Lと、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００６９】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、BNIP3と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、EGLN3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００７０】
加えて、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、EGLN3と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、PDK1、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００７１】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、PDK1と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PFKFB3、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００７２】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、PFKFB3と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、KCTD11、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００７３】
加えて、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、KCTD11と、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、及びALDOAから選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００７４】
更に、本発明の一実施形態において、転写発現レベルは、ALDOAと、ADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、及びKCTD11から選択された少なくとも1個の遺伝子とについて決定される。
【００７５】
本発明の特定の一実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM遺伝子について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM及びANKRD37について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、及びP4HA2について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、及びNDRG1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、及びSLC2A1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、及びP4HA1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、及びLOXについて決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、及びC3orf28について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、及びBNIP3Lについて決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、及びBNIP3について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、及びEGLN3について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、及びPDK1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、及びPFKFB3について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、BNIP3、EGLN3、PDK1、PFKFB3、及びKCTD11について決定される。
【００７６】
他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともANKRD37、P4HA2、NDRG1、SLC2A1、及びP4HA1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、P4HA2、及びNDRG1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、及びLOXについて決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともP4HA2、NDRG1、P4HA1、LOX、C3orf28、及びBNIP3Lについて決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA2、NDRG1、及びSLC2A1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくとも、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、LOX、C3orf28、BNIP3L、及びBNIP3について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、NDRG1、SLC2A1、及びP4HA1について決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともADM、ANKRD37、P4HA1、及びLOXについて決定される。他の特定の実施形態において、転写発現レベルは、少なくともANKRD37、NDRG1、SLC2A1、P4HA1、及びLOXについて決定される。
【００７７】
しかしながら、本発明の遺伝子は、他の実施形態において、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選択された、当該遺伝子に対して少なくとも85%、例えば90%、例えば少なくとも91、92、93、94、又は少なくとも95%の同一性、例えば少なくとも96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する核酸を含むポリヌクレオチドに対して相補的となり得る。
【００７８】
本発明の遺伝子は、自然発生対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含み得る。
【００７９】
本発明の遺伝子の核酸配列は、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群から選択された核酸配列から、単一のヌクレオチドだけ異なるものとなり得る。しかしながら、遺伝子の核酸配列は、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15からなる群から選択された核酸配列から、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個以上のヌクレオチドで異なるものにもなり得る。
【００８０】
次の用語は、2個以上のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために使用される:「所定配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的同一性」。
【００８１】
「所定配列」は、配列の比較の基準として用いられる規定配列である。所定配列は、大きな配列のサブセット、例えば、完全長DNAのセグメント、その転写産物、SEQ ID NO:1乃至15のポリヌクレオチド配列等の配列表に記載した遺伝子配列となる場合があり、或いは、完全なDNA又は遺伝子配列を含み得る。一般に、所定配列は、少なくとも20個のヌクレオチドの長さを有し、少なくとも25個のヌクレオチドの長さを有する頻度が高く、少なくとも50個のヌクレオチドの長さを有する場合が多い。
【００８２】
2個のポリヌクレオチドは、それぞれ(1) 2個のポリヌクレオチド間で類似する配列(即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含み得ると共に、(2) 更に、2個のポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るものであり、2個(以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、通常、2個のポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」において比較することにより、配列類似性の局所領域を特定及び比較することにより実行される。「比較ウィンドウ」は、本明細書での使用において、少なくとも20個の隣接ヌクレオチド位置の概念的なセグメントを示し、ここで、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも20個の隣接ヌクレオチドの所定配列と比較してよく、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、2配列の最適なアラインメントのための所定配列(付加又は欠失を含まない)と比較して、20パーセント以下の付加又は欠失(即ち、ギャップ)を含んでよい。
【００８３】
比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444の類似性検索方法、こうしたアルゴリズムのコンピュータによる実施 (Wisconsin Genetics Software Package Release7.0のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ575)、又は検査により実施してよく、様々な方法により生成された最善のアライメント(即ち、比較ウィンドウにおいて相同性の最高パーセンテージをもたらす)を選択する。
【００８４】
「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにおいて同一であること(即ち、ヌクレオチド単位で同一であること)を意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、2つの最適な整列状態にある配列を比較のウィンドウにおいて比較し、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U、又はI) が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較のウィンドウ内の位置の合計数(ウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算される。本明細書で使用する「実質的同一性」という用語は、少なくとも20個のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにおいて、多くの場合は、少なくとも25乃至50個のヌクレオチドのウィンドウにおいて、所定の配列と比較して、ポリヌクレオチドが少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90乃至95パーセントの配列同一性、更に通常は少なくとも99パーセント配列同一性を有する、ポリヌクレオチド配列の特性を示し、配列同一性のパーセンテージは、所定配列を、比較のウィンドウにおいて所定配列の合計20パーセント以下となる欠失又は付加を含み得るポリヌクレオチド配列と比較することにより計算される。所定配列は、大きな配列のサブセット、例えば、本明細書に開示した完全長のSEQ ID NO:1乃至15のポリヌクレオチド配列のセグメントとなり得る。
【００８５】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15からなる群から選択されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００８６】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:1として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００８７】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:2として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００８８】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:3として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００８９】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:4として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９０】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:5として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９１】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:6として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９２】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:7として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９３】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:8として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９４】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:9として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９５】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:10として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９６】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:11として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９７】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:12として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９８】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:13として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【００９９】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:14として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【０１００】
一実施形態において、本発明の遺伝子(群)の核酸配列は、SEQ ID NO:15として提示したヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも96%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも97%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも98%の配列同一性、より好ましくは、例として少なくとも99%の配列同一性、より好ましくは、例えば少なくとも99.5%の配列同一性を有する。
【０１０１】
本発明のSEQ ID NOにより特定されるものに対する相補的配列は、本発明においても有用であるため、本発明の範囲に含まれると考えられる。相補的又は一部相補的とは、ヌクレオチド又は核酸間、例えば、二本鎖DNA分子の二本鎖間、RNA-DNA二本鎖の二本鎖間、又はオリゴヌクレオチドプライマーと、本発明による配列決定、増幅、又は逆転写の対象となる一本鎖核酸プライマー結合部位との間でのハイブリダイゼーション又は塩基対合を示す。相補的ヌクレオチドは、一般に、A及びT(又はA及びU)又はC及びGである。2本の一本鎖RNA又はDNA分子は、一方の鎖のヌクレオチドが最適に整列し、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失を有する状態で、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80%、通常は少なくとも90%乃至95%、より好ましくは約98乃至100%と対形成する時、実質的に相補性であると言える。
【０１０２】
或いは、実質的な相補性は、RNA又はDNA鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下で、その相補体とハイブリダイズする時に存在する。選択的ハイブリダイゼーション条件には、限定ではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が含まれる。選択的ハイブリダイゼーションは、一実施形態において、少なくとも14乃至25個のヌクレオチドの長さにおいて、少なくとも約65%の相補性、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%の相補性が存在する時に生じる。出典を明記することにより本願明細書の一部とした、M. Kanehisa (Nucleic Acids Res. 12, 203, 1984) を参照されたい。より短いヌクレオチド配列では、少なくとも8乃至12個のヌクレオチドの長さにおいて、少なくとも約65%の相補性、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%の相補性が存在する時に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常、約1 M未満、より一般的には約500 mM未満、好ましくは約200 mM未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、5℃まで低下させることが可能であり、好ましくは、約30℃より低い。しかしながら、より長いフラグメントでは、特異的ハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度を必要とする場合がある。ハイブリダイゼーション温度は、約20個未満のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでは、Tm=4×(G+C含有量)+2×(A+T含有量)として計算可能な融点(Tm)より、一般に約2℃乃至6℃低い。塩基組成、相補鎖の長さ、有機溶媒の存在、及び塩基不一致の程度を含め、他の要素もハイブリダイゼーションのストリンジェンシに影響を与える場合があるため、パラメータの組み合わせは、何れか1つの単独の絶対尺度よりも重要となる。
【０１０３】
本発明には、表1によるオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズ可能な遺伝子又はその変異体の転写物が含まれる。
【０１０４】
【表１】
2014518616.tif 000004
【０１０５】
RPL37A:
順方向プライマー TGT GGT TCC TGC ATG AAG ACA
逆方向プライマー GTG ACA GCG GAA GTG GTA TTG TAC
プローブ TG GCT GGC GGT GCC TGG A
【０１０６】
SLC2A1:
方向プライマー GCTACAACACTGGAGTCATCAATG
逆方向プライマー TGTCTGGTTGTAGAACTCCTCGAT
プローブ CCCCCCAGAAGGTG
【０１０７】
SEQ ID NO:1又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、ADM遺伝子 (SEQ ID NO:1)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:16を有する転写物である。
【０１０８】
SEQ ID NO:2又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、ALDOA (SEQ ID NO:2)の転写物とハイブリダイズ可能であり、この非限定的な例は、SEQ ID NO:17、18、19、及び20を有する転写物である。
【０１０９】
SEQ ID NO:3又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:21を有する転写物である。
【０１１０】
SEQ ID NO:4又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、BNIP3 (SEQ ID NO:4)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:22を有する転写物である。
【０１１１】
SEQ ID NO:5又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、BNIP3L (SEQ ID NO:5)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:23を有する転写物である。
【０１１２】
SEQ ID NO:6又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、C3orf28 (SEQ ID NO:6)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:24を有する転写物である。
【０１１３】
SEQ ID NO:7又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、EGLN3 (SEQ ID NO:7)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:25を有する転写物である。
【０１１４】
SEQ ID NO:8又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、KCTD11 (SEQ ID NO:8)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:26を有する転写物である。
【０１１５】
SEQ ID NO:9又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、LOX (SEQ ID NO:9)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:27及び28を有する転写物である。
【０１１６】
SEQ ID NO:10又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、NDRG1 (SEQ ID NO:10)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:29及び30を有する転写物である。
【０１１７】
SEQ ID NO:11又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、P4HA1 (SEQ ID NO:11)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:31乃至34を有する転写物である。
【０１１８】
SEQ ID NO:12又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、P4HA2 (SEQ ID NO:12)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:35乃至39を有する転写物である。
【０１１９】
SEQ ID NO:13又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、PDK1 (SEQ ID NO:13)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:40を有する転写物である。
【０１２０】
SEQ ID NO:14又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:41及び42を有する転写物である。
【０１２１】
SEQ ID NO:15又はその相補体から選択された10乃至90個の連続する核酸の配列を含むオリゴヌクレオチドは、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)の転写物とハイブリダイズ可能である。
【０１２２】
核酸配列CCCCCCAGAAGGTGを有するオリゴヌクレオチド (SEQ ID NO:61)は、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)の転写物とハイブリダイズ可能である。この非限定的な例は、SEQ ID NO:43を有する転写物である。
【０１２３】
癌
【０１２４】
本発明は、癌の酸素状態を判定する方法と、癌の酸素状態の判定に基づいて前記癌を治療する方法及び組成物並びにその使用とに関する。本発明によれば、酸素状態は、癌治療の選択にとって決定的となる。任意の癌種に対して、酸素状態を判定する本発明の方法を施し得る。低酸素状態/低酸素症を特徴とすることが分かっている癌種は、低酸素改質剤により治療し得る。したがって、好適な実施形態において、方法、組成物、及びその使用は、低酸素性癌、即ち、低酸素を特徴とする癌の治療を対象とし、前記癌に罹患している患者を、低酸素改質剤により治療する。
【０１２５】
好適な実施形態において、本発明の癌細胞は、例えば、低酸素細胞である。本発明の癌細胞は、一実施形態において、扁平細胞癌細胞、扁平上皮癌細胞であり、及び/又は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択し得る。非限定的な例は、頭頸部癌等の扁平上皮癌腫、及び扁平上皮癌であり、頭頸部癌は、例えば、口、口唇の癌、鼻腔癌、及び鼻咽腔癌からなる群から選択される。
【０１２６】
本発明の癌は、任意の癌を含み、特に、低酸素性癌等、酸素状態が予後に関連する任意の癌を含む。したがって、癌は、一実施形態において、肉腫から選択される。しかしながら、他の実施形態において、癌は、癌腫である。更に特定の実施形態において、癌は、扁平細胞癌、扁平上皮癌、及び腺癌からなる群から選択される。特定の好適な一実施形態において、癌は、扁平上皮癌であり、したがって、癌は、扁平上皮癌から選択される。
【０１２７】
扁平上皮癌
【０１２８】
扁平上皮癌は、重層扁平上皮に由来する癌腫であり、更に通常は腺又は円柱上皮が存在する部位に生じる癌を含む。扁平上皮は、最上層が扁平上皮細胞と呼ばれる平坦な鱗状の細胞からなることを特徴とする上皮である。上皮は、こうした細胞の1層により構成される場合があり、この場合は単層扁平上皮と呼ばれ、或いは、複数の層を有する場合があり、この場合、重層扁平上皮と呼ばれる。したがって扁平上皮癌のグループは、身体の様々な部分における扁平上皮癌腫を含む。
【０１２９】
癌腫は、臓器の裏層(上皮細胞)において始まる悪性腫瘍として定義される。癌腫は、隣接する組織に浸潤し、骨、肝臓、肺、又は脳といった離れた臓器に広がる(転移する)傾向を有する。本発明は、癌腫の初期形態であり周囲組織への浸潤の欠如により定義される上皮内癌(Carcinoma in situ、CIS)の形態の扁平上皮癌に罹患した患者に関する。言い換えれば、上皮内癌は、正常な存在位置において増殖する細胞の異常な成長であり、したがって、「in situ(原位置)」の名称を有する。上皮内癌は、高度異形成という用語に等しい。
【０１３０】
扁平上皮癌は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、及び肺からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部、腟、及び子宮頸からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部、腟、肺、及び子宮頸からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部、腟、及び子宮頸からなる群から選択される。
【０１３１】
本発明の他の実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部、肺、及び子宮頸からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部、膀胱、前立腺、及び肺からなる群から選択される。
【０１３２】
扁平上皮癌が、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸からの任意の癌であることは、本発明の範囲に含まれる。
【０１３３】
好適な実施形態において、扁平上皮癌は、頭頸部の癌である。
【０１３４】
頭頸部癌は、口、口唇、口腔(口)の癌、鼻腔、副鼻腔、咽喉、及び咽頭の癌において見られる。したがって、本発明の一実施形態において、頭頸部癌は、口、口唇の癌、鼻腔、咽喉、及び咽頭の癌からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、頭頸部癌は、口及び口唇の癌からなる群から選択される。本発明の他の実施形態において、頭頸部癌は、鼻腔の癌及び鼻咽腔癌からなる群から選択される。頭部及び頸頸部癌が、口及び口唇の癌、鼻腔の癌及び鼻咽腔癌の何れかであることは、本発明の範囲に含まれる。したがって、頭頸部癌は、例えば、腫瘍が声門上喉頭、下咽頭、中咽頭、又は鼻咽腔に位置する癌である。
【０１３５】
扁平上皮癌の病期は、身体検査、画像検査により得られた結果、又は手術後の組織の病理検査に基づくものにすることができる。現在の病期分類体系は、手術により取り除いた腫瘍組織及びリンパ節の検査後に病理医が出した病理学的結論に基づく。本発明の癌は、任意の病期であってよい。
【０１３６】
本発明の癌腫は、大きさ及び転移の特性に関連する明確な特徴により病期分類し得る。
【０１３７】
癌を病期に分類するために一般に用いられる一つの病期分類体系は、AJCC-TNMシステム(American Joint Committee on Cancer(AJCC))のものである。ここでは、癌をT、N、及びM病期に基づいて分類し、Tは、腫瘍(tumour)の略であり(腫瘍のサイズと臓器内及び近隣臓器においてどこまで広がっているか)、Nは、リンパ節(感染及び癌との闘いを支援する免疫系細胞の豆形状の集合)の広がりを意味し、Mは、転移(離れた臓器への広がり)を意味する。
【０１３８】
腫瘍、リンパ節、及び転移の詳細情報を提供するためにT、N、及びMの後に追加の文字及び数字が付く場合がある。T0乃至4は、腫瘍のサイズと、周囲の臓器又は皮膚への広がりを表し、Tの高い数字は、大きな腫瘍及び/又は広い範囲を示す。同様に、0乃至3の数字が付いたNは、癌が原発腫瘍の近くのリンパ節まで広がっているか、及び、広がっている場合、何個のリンパ節が影響されているかを示す。同じく、Mは、癌が離れた臓器まで広がっているかを示し、0は、例えば、肺又は骨への広がりを表し、1は、癌が原発腫瘍から遠いリンパ節に広がっていることを示す。
【０１３９】
扁平上皮癌の病期は、上述した特徴を組み合わせることにより決定される。病期は、病期0、及びローマ数字による病期I(最も進行の少ない病期)から病期IV(最も進行した病期)として表現される。
【０１４０】
病期0 上皮内癌
病期I 癌は、身体の一部に局在している。
病期II 癌は、局部的に進行している。
病期III 癌は、同じく局部的に進行している。癌が病期IIに指定されるか、病期IIIに指定されるかは、癌の特定のタイプに依存する場合がある。
病期IV 癌は転移しているか、他の臓器又は全身に広がっている場合が多い。
【０１４１】
本発明は、病期0(上皮内癌)、I、IIA、IIB、IIIA、IIIB、IIIC、又はIV、及び上述したTNM病期の何れか等、任意の病期の癌に関連すると理解される。
【０１４２】
試料
【０１４３】
分析対象の試料は、上述したような任意の癌種の細胞、例えば、扁平上皮癌細胞等の癌細胞を含むと理解される。試料は、一般に、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の生検材料である。試料は、新鮮な状態、凍結状態、又はホルマリン固定状態となる。好適な実施形態において、試料は、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌の腫瘍をホルマリン固定したもの等、癌腫瘍細胞の生検材料である。
【０１４４】
転写発現レベルの決定
【０１４５】
RNAの抽出
【０１４６】
RNA又はタンパク質は、当該技術分野において公知の任意の手法を用いて被験試料から単離及び検定可能となる。これらは、例えば、新鮮な状態、ホルマリン固定状態、又は凍結状態の生検材料等、本発明による試料から単離することができる。
【０１４７】
全mRNAを単離する方法は、当業者に周知である。一実施形態において、全核酸は、所定の試料から、例えば、酸性グアニジン・フェノール・クロロホルム抽出法を用いて単離され、polyA mRNAは、オリゴdTカラムクロマトグラフィー、又は(dT)n磁気ビーズを用いることにより単離される(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)参照)。
【０１４８】
試料は、本明細書の他の部分で定めたような、組織及び/又は体液からのものにし得る。試料を、例えばオリゴヌクレオチドアレイにより分析する前に、試料に対して1つ又は複数の試料調製工程を行うことが望ましい場合がある。一般に、こうした試料調製工程は、細胞内物質、例えば、全細胞試料やウイルスからの核酸の抽出、核酸の増幅、断片化、転写、反応物の標識及び/又は伸長といった操作を含む。こうした様々な工程の1つ又は複数は、本発明のデバイスに容易に組み込み得る。
【０１４９】
多数の応用では、細胞からのメッセンジャーRNA、細胞残屑、及び他の汚染物を抽出及び分離することが望ましい場合がある。そのため、本発明のデバイスは、場合によっては、mRNA精製チャンバー又はチャネルを含んでもよい。一般に、こうした精製は、mRNA上のpoly-A尾部を利用する。特に、上述したように、poly-Tオリゴヌクレオチドは、デバイスのチャンバー又はチャネル内で固定し、mRNAに対する親和性リガンドとして機能させ得る。poly-Tオリゴヌクレオチドは、チャンバー又はチャネル内に組み込まれた固体支持部上に固定するか、或いは、チャンバー又はチャネル自体の(複数の)表面上に固定し得る。チャンバー又はチャネルの表面上でのオリゴヌクレオチドの固定は、例えば、表面の酸化及びシラン化に続くオリゴヌクレオチドの標準的なDMT合成を含む本明細書で説明した方法により実施し得る。
【０１５０】
実施においては、溶解させた試料を高塩濃度溶液に導入し、ハイブリダイゼーションのためにイオン強度を高めると、mRNAは、固定したpoly-Tにハイブリダイズする。固定したpoly-Tオリゴヌクレオチドに結合したmRNAは、低イオン強度の緩衝液中に洗い出す。poly-Tオリゴヌクレオチドは、例えば、多孔質シリコン、ゼオライトシリカキセロゲル、焼結粒子、又は他の固体支持物といった多孔面上に固定し得る。
【０１５１】
ハイブリダイゼーション
【０１５２】
試料の調製に続いて、試料に対して、1つ又は複数の異なる分析工程を行うことができる。一般に、様々な分析工程を実行してよく、例えば、マイクロキャピラリー電気泳動を用いたサイズに基づく分析、及び/又は、オリゴヌクレオチドアレイに対するハイブリダイゼーションを用いた配列に基づく分析が含まれる。
【０１５３】
後者の場合、核酸試料は、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて調査し得る。オリゴヌクレオチドアレイは、一般に、基板を含み、基板には、多数のオリゴヌクレオチドプローブが明確な位置に付着している。これらのアレイは、フォトリソグラフィ法と固相オリゴヌクレオチド合成法との組み合わせを取り入れた、機械的又は光指向性の合成方法を用いて製造し得る。
【０１５４】
アフィニティマトリクス
【０１５５】
使用するアフィニティマトリクスの種類は、分析の目的に応じて決まる。例えば、複合核酸試料(例えば、全mRNA)中の特定の遺伝子のmRNA発現レベルを分析することが望ましい場合、構成的に過剰発現され、特徴的に低いレベルで発現する遺伝子産物をマスクする傾向がある遺伝子により生成される核酸を取り除くことが望ましい場合がある。したがって、一実施形態において、アフィニティマトリクスは、多数の事前に選択した遺伝子産物(例えば、アクチン、GAPDH等)を除去するために使用することができる。これは、遺伝子産物(例えば、mRNA又はそれに由来する核酸)又はその部分配列に対して相補的な核酸親和性リガンドを有するアフィニティマトリクスを提供することで達成される。核酸試料のアフィニティマトリクスに対するハイブリダイゼーションは、親和性リガンドとその標的核酸との間での二本鎖形成をもたらす。アフィニティマトリクスからの試料の溶出時に、マトリクスは、二本鎖核酸を保持し、過剰発現した標的核酸の無い試料が残る。
【０１５６】
アフィニティマトリクスは、試料中の未知のmRNA又はcDNA(mRNAから合成された相補的DNA)を同定するために使用することができる。アフィニティマトリクスが、試料中の(例えば、cDNAライブラリ、mRNAから逆転写されたDNA、直接使用又は増幅、或いはDNA鋳型から重合されたmRNA中の)公知の全遺伝子を含む場合、アフィニティマトリクスにより公知の核酸を捕獲することにより、こうした未知の核酸配列が濃縮された試料が残る。実際には、アフィニティマトリクスは、サブトラクティブハイブリダイゼーションを行って、未知の核酸配列を単離するために用いられる。残存する「未知」の配列は、標準的な方法により生成及び配列決定することができる。
【０１５７】
アフィニティマトリクスは、未知の核酸配列を捕獲(単離)することで精製するために使用することができる。例えば、以前に同定されていない、或いは特定の核酸試料において発現することが以前に知られていない配列に対して相補的な核酸(親和性リガンド)を含むアフィニティマトリクスを準備することができる。その後、試料をアフィニティマトリクスにハイブリダイズさせ、アフィニティマトリクス上に保持された配列は、「未知」の核酸となる。保持された核酸は、(例えば、温度を上昇させた状態、不安定化剤濃度を上昇させた状態、又は塩を減少させた状態で)マトリクスから溶出させることが可能であり、その後、標準的な方法により、核酸の配列決定を行うことができる。
【０１５８】
同様に、アフィニティマトリクスは、多数の公知の核酸配列を効率的に捕獲(単離)するために使用することができる。ここでも、単離することが望ましい核酸に対して相補的な核酸を有するマトリクスを準備する。相補的核酸配列がマトリクス中の親和性リガンドにハイブリダイズする条件下で、試料をマトリクスに接触させる。ハイブリダイズしない物質は、マトリクスから洗い落とし、結合した所望の配列を残す。ハイブリッド二本鎖を変性させ、単離した核酸のプールを得る。プール内の様々な核酸は、その後、標準的な方法(例えば、ゲル電気泳動)により分離することができる。
【０１５９】
上述したように、アフィニティマトリクスは、(例えば、cDNAライブラリ、mRNAから逆転写されたDNA、直接使用又は増幅或いはDNA鋳型から重合されたmRNA中の)核酸を含む事実上任意の試料から核酸を選択的に除去するために使用することができる。カラムに付着する核酸は、低塩濃度の緩衝液、ホルムアミド等の不安定化剤を含む緩衝液により洗浄すること、又はカラム温度を上昇させることで、除去可能となる。
【０１６０】
特に好適な一実施形態において、アフィニティマトリクスは、未知のRNA配列(発現配列タグ(EST))について試料を濃縮する方法において使用することができる。方法は、最初に、公知のRNA(例えばEST)配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブのライブラリを有するアフィニティマトリクスを提供することを含む。次に、未分化及び/又は非活性化細胞からのRNAと、分化又は活性化又は病理的(形質転換)又は他の異なる代謝状態を有するものからのRNAとを、アフィニティマトリクスに対して別個にハイブリダイズさせ、公知のRNA配列が欠如した2つのRNAのプールを得る。
【０１６１】
好適な実施形態において、アフィニティマトリクスは、カラム状のケースにパッケージされる。その後、試料をアフィニティマトリクスに付与する(例えば、カラム上に注入、或いは、オートサンプラーにより駆動されるサンプリングポンプ等のポンプによりカラムへ付与する)。試料を有するアフィニティマトリクス(例えば、アフィニティカラム)は、アフィニティマトリクスに含まれる核酸プローブが相補的な標的核酸と特異的にハイブリダイズする条件に置く。こうした条件は、適切なpH、塩、及び温度条件を維持することにより達成し、上述したハイブリダイゼーションを促進する。
【０１６２】
多数の応用では、細胞からのメッセンジャーRNA、細胞残屑、及び他の汚染物を抽出及び分離することが望ましい場合がある。そのため、本発明のデバイスは、場合によっては、mRNA精製チャンバー又はチャネルを含んでもよい。一般に、こうした精製は、mRNA上のpoly-A尾部を利用する。特に、上述したように、poly-Tオリゴヌクレオチドは、デバイスのチャンバー又はチャネル内で固定し、mRNAに対する親和性リガンドとして機能させ得る。poly-Tオリゴヌクレオチドは、チャンバー又はチャネル内に組み込まれた固体支持部上に固定するか、或いは、チャンバー又はチャネル自体の(複数の)表面上に固定し得る。チャンバー又はチャネルの表面上でのオリゴヌクレオチドの固定は、例えば、表面の酸化及びシラン化に続くオリゴヌクレオチドの標準的なDMT合成を含む本明細書で説明した方法により実施し得る。
【０１６３】
実施においては、溶解させた試料を高塩濃度溶液に導入し、ハイブリダイゼーションのためにイオン強度を高めると、mRNAは、固定したpoly-Tにハイブリダイズする。固定したpoly-Tオリゴヌクレオチドに結合したmRNAは、低イオン強度の緩衝液中に洗い出す。poly-Tオリゴヌクレオチドは、例えば、多孔質シリコン、ゼオライトシリカキセロゲル、焼結粒子、又は他の固体支持物といった多孔面上に固定し得る。
【０１６４】
オリゴヌクレオチドアレイの光指向性合成
【０１６５】
オリゴヌクレオチドアレイの光指向性合成の基本戦略は次の通りである。感光保護基により修飾した固体支持部の表面を、フォトリソグラフマスクを通して照明し、照明した領域に反応性のヒドロキシル基を発生させる。選択されたヌクレオチドを、通常は3’-O-ホスホラミダイト活性デオキシヌクレオシド(5’ヒドロキシルの位置において感光保護基により保護される)の形態で表面に提供することで、露光させた部位において結合が生じる。キャッピング及び酸化に続いて、基板をリンスし、第2のマスクを通して表面を照明し、追加のヒドロキシル基を結合のために露光させる。第2の選択されたヌクレオチド(例えば、5’保護された3’-O-ホスホラミダイト活性デオキシヌクレオシド)を表面に提供する。選択的な脱保護及び結合のサイクルを、産物の所望のセットが得られるまで繰り返す。フォトリソグラフィを用いるため、プロセスを容易に縮小し、オリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを生成することができる。更に、各部位のオリゴヌクレオチドの配列は公知である。Pease et al. を参照されたい。機械的合成方法は、光指向性方法に類似するが、但し、合成ステップにおける脱保護及び追加のために流体の機械的な方向付けが含まれる。
【０１６６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドアレイは、所定の長さの可能な全てのプローブを有して準備される。アレイ上の標的配列のハイブリダイゼーションパターンは、標的DNA配列を再構築するために使用し得る。多数のプローブのハイブリダイゼーションの解析を用いて、長い範囲のDNA配列を決定すること、或いは、特定の核酸配列に特異的及び相補的なオリゴヌクレオチドアレイを提供することが可能となる。例えば、特定の好適な態様において、オリゴヌクレオチドアレイは、特異的な標的配列と、その個別又は多重突然変異とに対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含む。こうしたアレイは、特定の核酸配列の存在を特徴とする特異的な障害の診断に特に有用となる。
【０１６７】
試料の採取と核酸の抽出に続いて、試料の核酸部分には、通常、1つ又は複数の調製反応を施す。こうした調製反応は、インビトロ転写、標識、断片化、増幅、及び他の反応が含まれる。核酸の増幅は、対象となる標的核酸配列のコピー数を増加させる。様々な増幅方法が、本発明の方法及びデバイスでの使用に適しており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)又はリガーゼ連鎖反応(LCR)、自家持続配列複製法(3SR)、及び核酸ベース配列増幅(NASBA)が含まれる。
【０１６８】
後者の2つの増幅方法には、等温転写に基づく等温反応が伴い、一本鎖RNA(ssRNA)及び二本鎖DNA(dsDNA)が、増幅産物として、それぞれ約30又は100対1の比で生成される。結果として、これらの後者の方法が採用される場合、配列解析は、何れかの種類、即ち、DNA又はRNAに相補的な基板を用いて実施し得る。
【０１６９】
多くの場合、核酸試料をハイブリダイゼーションの前に増幅することが望ましい。どの増幅方法を用いても、定量的結果が望ましい場合、増幅された核酸の相対頻度を維持又は制御する方法を使用するように注意する必要があることは当業者に理解されよう。
【０１７０】
転写発現レベルの決定
【０１７１】
遺伝子の発現は、一般に、細胞からのmRNAを検出すること、及び/又は、ペプチド及びタンパク質等の発現産物を検出することの何れかにより検出し得る。
【０１７２】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、転写産物を決定する、周知の十分に確立された手法であるため、一実施形態において、本発明の遺伝子(群)又はその変異体の転写発現レベルを決定するために使用される。
【０１７３】
「定量的」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量的PCRには、同じプライマーを用いた公知の量の対照配列を共増幅することが含まれる。これにより、PCR反応を較正するために使用し得る内部標準が提供される。そのため高密度アレイは、増幅した核酸の定量化用の内部標準に特異的なプローブを含み得る。
【０１７４】
したがって、一実施形態において、本発明は、特定の遺伝子を検出するプローブセットを最適化する方法を提供する。一般に、この方法は、標的遺伝子により転写されたmRNAの部分配列に相補的な1つ又は複数の特定の長さ(群)の多数のプローブを含む高密度アレイを提供することを含む。一実施形態において、高密度アレイは、特定のmRNAに相補的な特定の長さの全てのプローブを含み得る。高密度アレイのプローブは、その標的核酸のみとハイブリダイズされ、その後、プローブに対して相補的な標的を含まない、高複雑性の高濃度核酸試料とハイブリダイズされる。したがって、例えば、標的核酸がRNAである場合、プローブは、最初に標的核酸のみとハイブリダイズされ、その後、(高複雑性試料がプローブに対する標的を含まない状態を保証するために)ハイブリダイズされたRNAのセンスが標的核酸のものと反対であるcDNAライブラリ(例えば、逆転写polyA+mRNA)から作成されたRNAとハイブリダイズされる。標的との強いハイブリダイゼーション信号を示すと共に、高複雑性試料との交差ハイブリッド形成を殆ど又は全く示さない、こうしたプローブは、本発明の高密度アレイでの使用に好適なプローブとなる。
【０１７５】
PCR増幅は、一般に、標的核酸配列の一本鎖を、その配列に対する多数の相補体を生成する鋳型として用いることを含む。一般に、標的配列の相補鎖のセグメントの異なる端部に対して相補的な2つのプライマーは、標的配列のそれぞれの鎖とハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素及びヌクレオチド三リン酸の存在下で、プライマーは標的配列に沿って伸長する。伸長部分は、標的配列から溶解し、今度は前回のステップで合成された標的配列の追加コピーと共に、プロセスが反復される。PCR増幅は、一般に、変性、ハイブリダイゼーション、及び伸長反応の反復サイクルを含み、十分な量の標的核酸を生成する。PCRの各サイクルの第1のステップは、プライマーの伸長により形成された核酸二本鎖の分離を含む。鎖が分離された後、PCRの次のステップには、分離した鎖を、標的配列に隣接するプライマーにハイブリダイズさせることを含む。プライマーは、その後、伸長され、標的鎖の相補的コピーを形成する。PCR増幅を成功させるため、プライマーは、各プライマーが二本鎖配列に沿ってハイブリダイズする位置が、あるプライマーから合成された伸長産物が鋳型(相補体)から分離した時に他のプライマーの伸長部にとって鋳型の役割を果たすような位置となるように設計される。変性、ハイブリダイゼーション、及び伸長のサイクルは、所望の量の増幅された核酸を得るために必要な回数だけ反復される。
【０１７６】
PCR法において、鎖の分離は、通常、二本鎖の変性は引き起こすがポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさない十分な温度まで、十分な時間に亘って、反応を加熱することにより達成される。一般的な加熱変性には、約80℃乃至105℃の範囲の温度が数秒から数分に亘って伴う。しかしながら、鎖の分離は、物理的、化学的、又は酵素的な手段を含む任意の適切な変性方法により達成することができる。鎖の分離は、例えばヘリカーゼ、或いは、ヘリカーゼ活性を示すことが可能な酵素により誘発し得る。
【０１７７】
PCR及びIVT反応に加え、本発明の方法は、他の多数の反応型、例えば、逆転写、ニックトランスレーション等に応用し得る。
【０１７８】
ハイブリダイゼーション前の標識
【０１７９】
試料中の核酸は、後続ステップ中の検出を容易にするため、一般に標識される。標識は、増幅中、インビトロ転写、又はニックトランスレーション処理中に実施し得る。特に、増幅、インビトロ転写、又はニックトランスレーションでは、標識プライマーの使用、又は標識dNTPの増幅配列への組み込みにより、増幅又は転写配列に標識を組み込み得る。
【０１８０】
試料の核酸とアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブとの間でのハイブリダイゼーションは、その後、例えば、落射蛍光共焦点顕微鏡を用いて検出される。一般に、試料は、ハイブリダイゼーション中に混合し、アレイ上の核酸プローブに対する試料中の核酸のハイブリダイゼーションを促進する。
【０１８１】
ハイブリダイゼーション後の標識
【０１８２】
場合によっては、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションに続いて標識してもよい。例えば、ビオチン標識dNTPを、例えば、増幅又は転写に用いる場合、ストレプトアビジン結合レポータを用いて、ハイブリダイズした複合体を標識し得る。こうした工程は、本発明のシステムに容易に統合することができる。或いは、試料中の核酸は、増幅に続いて標識し得る。増幅後の標識は、一般に、増幅配列上での特定の検出可能な基の共有結合を伴う。適切な標識又は検出可能な基には、当該技術分野において周知の様々な蛍光又は放射性標識基が含まれる。こうした標識は、当該技術分野において周知の方法を用いて標識に結合させ得る。
【０１８３】
所望の標識又はその一部を検出する方法は、選択した標識に応じて決まる。非常に感度が高く簡便であることから、蛍光標識が好適となる。標準的な標識手順を用いて、配列及び試薬間の反応が起こる位置を決定する。例えば、標的配列を標識して、異なるプローブのマトリクスに露出させる場合には、プローブが標的と相互作用する位置のみが任意のシグナルを発することになる。或いは、他の方法を用いて、マトリクスを走査し、相互作用の起こる場所を決定し得る。当然ながら、多数の条件のそれぞれにおいて発生する相互作用の走査を繰り返し、相互作用の範囲を時間的に決定してもよい。しかしながら、個別の相互作用を別々に試験する代わりに、多数の配列の相互作用をマトリクス上で同時に決定し得る。
【０１８４】
標識標的(試料)を検出する手段は、当業者に公知の高密度アレイのプローブにハイブリダイズした核酸にし得る。したがって、例えば、比色標識を用いる場合、標識の単純な視覚化で十分となる。放射性標識プローブが用いられる場合、放射の検出(例えば、写真用フィルム又は固体検出器による)で十分となる。
【０１８５】
しかしながら、好適な実施形態において、標的核酸は、蛍光標識により標識され、プローブアレイ上での標識の位置の特定は、蛍光顕微鏡により達成される。ハイブリダイズしたアレイは、特定の蛍光標識の励起波長で光源により励起し、結果的に生じた発光波長での蛍光を検出する。特定の好適な実施形態において、励起光源は、蛍光標識の励起に適したレーザーである。
【０１８６】
標的ポリヌクレオチドは、任意の数の簡便な検出可能マーカーにより標識し得る。蛍光標識は、非常に強いシグナルを低いバックグラウンドと共にもたらすため、好適となる。更に、高い解像度及び感度で、迅速な操作手順により光学的に検出可能でもある。他の可能な標識成分には、放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、スペクトルマーカー、磁気標識、及び結合酵素が含まれる。
【０１８７】
他の標識方法では、標的配列の任意の標識を回避し得る。標的は、プローブに接触させてよく、二本鎖ハイブリッドが、こうした位置のみで形成される。二本鎖に特異的な試薬の添加により、ハイブリダイゼーションが起きた場所が検出される。臭化エチジウム等のインターカレート染料は、プローブ自体がヘアピンループを形成する著しい程度の折り返しを生じることが無い限り使用し得る。しかしながら、短いオリゴヌクレオチドプローブにおけるヘアピンループの長さは、通常、安定した二本鎖を形成するには不十分となる。
【０１８８】
適切な色素原には、色を観察し得るように特有の波長範囲内の光を吸収する、或いは、蛍光体等、特定の波長又は波長範囲の放射を受けた際に光を発する、分子及び化合物が含まれる。
【０１８９】
幅広い適切な染料が利用可能であり、主として、周囲での吸収が最小限となる強い色をもたらすように選択される。染料の種類の例には、キノリン染料、トリアリールメタン色素、アクリジン色素、アリザリン染料、フタレイン、昆虫染料、アゾ染料、アントラキノイド染料、シアニン染料、フェナザチオニウム染料、及びフェナゾキソニウム染料が含まれる。
【０１９０】
幅広い蛍光体を、単独で、或いはクエンチャー分子と併せて利用し得る。対象となる蛍光体は、特定の一次官能基を有する様々なカテゴリに含まれる。こうした一次官能基には、1-及び2-アミノナフタレン、p,p’-ジアミノスチルベン、ピレン、4級フェナントリジン塩、9-アミノアクリジン、p,p’-ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、メロシアニン、3-アミノエキレニン、ペリレン、bis-ベンゾキサゾール、bis-p-オキサゾリルベンゼン、1,2-ベンゾフェナジン、レチノール、bis-3-アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアラニン、2-oxo-3-クロメン、インドール、キサンテン、7-ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチラート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、及びフラビンが含まれる。結合するための官能基を有する、或いは、こうした官能基を組み込むために修飾可能な個別の蛍光化合物には、例えば、ダンシルクロリド、3,6-ジヒドロキシ-9-フェニルキサントヒドロール等のフルオレセイン、ローダミンイソチオシアネート、N-フェニル1-アミノ-8-スルホナトナフタレン、N-フェニル2-アミノ-6-スルホナトナフタレン、4-アセタミド-4-イソチオシアナト-スチルベン-2、2’-ジスルホン酸、ピレン-3-スルホン酸、2-トルイジノナフタレン-6-スルホネート、N-フェニル1,N-メチル2-アミノナフタレン-6-スルホネート、臭化エチジウム、ステブリン(stebrine)、オーラミン-0,2-(9’-アントロイル)パルミテート、ダンシルホスファチジルエタノールアミン、N,N’-ジオクタデシルオキサカルボシアニン、N,N’-ジヘキシルオキサカルボシアニン、メロシアニン、4-(3’ピレニル)ブチラート、d-3-デソキシ-エキレニン、12-(9’アントロイル )ステアレート、2-メチルアントラセン、9-ビニルアントラセン、2,2’(ビニレン-p-フェニレン)ビスベンズオキサゾール、p-bis[2-(4- メチル-5-フェニル-オキサゾリル)]ベンゼン、6-ジメチルアミノ-1,2-ベンゾフェナジン、レチノール、bis(3’-アミノピリジニウム)1,10-デカンジルジイオダイド、ヘリブリエニンのスルホナフチルヒドラゾン、クロロテトラサイクリン、N(7-ジメチルアミノ-4-メチル-2-オキソ-3-クロメニル)マレイミド、N-[p-(2-ベンズイミダゾリル)-フェニルマレイミド、N-(4-フルオランチル)マレイミド、bis(ホモバニリン酸)、レサザリン、4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール、メロシアニン540、レゾルフィン、ローズベンガル、及び2,4-ジフェニル-3(2H)-フラノンが含まれる。
【０１９１】
望ましくは、蛍光体は約300nm以上、好ましくは約350nm、更に好ましくは約400nmより上で光を吸収し、通常は、吸収された光の波長より約10nm高いものを上回る波長で発光するべきである。結合染料の吸光及び発光特性は、非結合染料とは異なることに留意されたい。したがって、様々な波長範囲及び染料の特性に言及する場合には、任意の溶媒中において非コンジュゲート状態で特徴付けられる染料ではなく、使用された状態の染料を示すものとする。
【０１９２】
蛍光体が一般に好適となるのは、蛍光体に光を照射することにより、複数の発光を得ることができるためである。したがって、単一の標識が複数の測定可能な事象を提供することができる。
【０１９３】
検出可能なシグナルは、化学発光及び生物発光源によっても提供され得る。化学発光源には、化学反応により電子的に励起されて、その後、検出可能なシグナルの役割を果たす光を発し得るか、或いはエネルギーを蛍光受容体に供与する化合物が含まれる。多数の族の化合物が様々な条件下で化学発光を提供することが分かっている。化合物の1族は、2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオンである。最も一般的な化合物は、5-アミノ化合物のルミノールである。その族の他の構成要素には、5-アミノ-6,7,8-トリメトキシ-及びジメチルアミノ[ca]ベンズ類似体が含まれる。これらの化合物は、アルカリ性過酸化水素又は次亜塩素酸カルシウム及び塩基により発光させることができる。他の族の化合物は、2,4,5-トリフェニルイミダゾールであり、親生成物の一般名としてロフィンである。化学発光類似体としては、パラ-ジメチルアミノ及び-メトキシ置換基が挙げられる。化学発光は、塩基性条件下でシュウ酸塩、通常は、オキサリル活性エステル、例えばp-ニトロフェニル及び過酸化物、例えば過酸化水素により取得し得る。或いは、ルシフェリンをルシフェラーゼ又はルシゲニンと共に使用して生物発光を提供し得る。
【０１９４】
スピン標識は、電子スピン共鳴(ESR)分光法により検出可能な不対電子スピンを伴うレポータ分子により提供される。スピン標識の例には、有機フリーラジカル、遷移金属錯体、特に、バナジウム、銅、鉄及びマンガン等が含まれる。スピン標識の例には、ニトロキシドフリーラジカルが含まれる。
【０１９５】
加えて、増幅配列には、他の増幅後処理を施し得る。例えば、場合によっては、プローブへのアクセスが更に容易であり、ループ形成及び/又は複数のプローブとのハイブリダイゼーションを回避するセグメントを提供するために、オリゴヌクレオチドアレイによるハイブリダイゼーションの前に、配列を断片化することが望ましいことがある。核酸の断片化は、当該技術分野において公知の物理的、化学的、又は酵素的な方法により一般に実施し得る。
【０１９６】
様々な試料調製工程に続いて、試料に対して、一般に1つ又は複数の分析工程が行われる。特に好適な分析工程には、例えば、オリゴヌクレオチドアレイを用いた配列に基づく分析、及び/又は、例えば、マイクロキャピラリーアレイ電気泳動を用いたサイズに基づく分析が含まれる。
【０１９７】
一部の実施形態においては、試料からの核酸を分析する付加的又は代替的手段を提供することが望ましい場合がある。
【０１９８】
マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は、一般に、細いキャピラリー又はチャネルの使用を含み、これには特定の分離媒体を充填しても充填しなくてもよい。
【０１９９】
試料のキャピラリー中の電気泳動により、試料のサイズに基づく分離プロフィールが得られる。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は、一般に、サイズに基づく配列決定、PCR産物の解析、及び制限フラグメントのサイジングのための迅速な方法を提供する。こうしたキャピラリーの高い表面対体積比により、キャピラリー全体での実質的な熱的変動の無い状態で、キャピラリー全体に高い電場を付与することが可能となり、結果的により迅速な分離が可能となる。更に、共焦点画像化方法と組み合わせた場合、こうした方法では、放射性配列決定法の感度に匹敵するアトモルの範囲の感度が得られる。
【０２００】
多くのキャピラリー電気泳動法では、キャピラリー、例えば、平面基板内にエッチング、機械加工、又は成形された石英ガラスキャピラリー又はチャネルに、適切な分離/ふるい分けマトリクスが充填される。通常、当技術分野において公知の様々なふるい分けマトリクスを、マイクロキャピラリーアレイにおいて使用し得る。こうしたマトリクスの例には、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリルアミド、及びアガロースが含まれる。ゲルマトリックスを、キャピラリーチャネル内に導入し重合させ得る。しかしながら、場合によっては、これにより、試料の分離に干渉する恐れのあるチャネル内での気泡の閉じ込めが生じ得る。したがって、キャピラリー部分の平面要素を合わせる前に、事前に形成した分離マトリクスをキャピラリーチャネル(群)内に配置することが望ましい場合が多い。2つの部分を、例えば超音波溶接により固定することで、チャネル内のマトリクスを恒久的に固定する。チャネルの外側での重合は、気泡が形成されない状態を確保するのに役立つ。更に、溶接プロセスの圧力は、空隙の無いシステムを確保するのに役立つ。
【０２０１】
核酸「フィンガープリント法」及び他のサイズに基づく分析での使用に加え、キャピラリーアレイは、配列決定の用途においても使用し得る。特に、ゲルに基づく配列決定手法は、キャピラリーアレイ電気泳動に容易に適合させ得る。
【０２０２】
本発明の遺伝子(群)からの転写発現産物は、個体の診断等、試験した試料の扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の徴候として検出し得る。本発明の遺伝子(群)からの転写発現産物は、本発明による試料において検出し得る。
【０２０３】
所望の遺伝子(群)の転写発現レベルを決定する様々な方法を実施及び選択する方法は当業者に知られている。したがって、転写発現レベルを決定する方法は、本発明のものに限定されない。要するに、本発明者は、定量的RT-qPCRに基づく手法を採用し、cDNAを単離RNAから生成した。転写の検出には、TaqMan Gene発現アッセイを採用した。
【０２０４】
酸素状態及びそれに相関する遺伝子の判定
【０２０５】
本発明による扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の酸素状態の判定は、前記癌を罹患した個体にその後提供する治療を決定する、低度の低酸素症を有するもの、又は高度の低酸素症を有するものとして、癌を特徴付ける役割を果たす。酸素状態を決定するために、本発明では、以下及び実施例1において説明するようなトレーニングセットを用いて決定したカットオフ値を利用する。
【０２０６】
低酸素状態は、一時的(急性)である場合、或いはより慢性的な性質のものとなる場合がある。一般に、腫瘍は、酸素レベルが20 mmHg未満の場合、低酸素症と考えられる。外因性の低酸素トレーサーは、10 mmHg未満の酸素レベルである低酸素領域を緩和する。酸素レベルが約2.5乃至5 mmHgである場合、放射線に対する耐性が顕著となる。
【０２０７】
一般に、カットオフ値は、酸素状態が公知である(例えば酸素検出電極の使用、低酸素トレーサー等の従来の方法により決定された)扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌を罹患した個体の低酸素試料のトレーニングセットを用いて確立される。試料は、酸素状態を判定する方法により区別可能であることを期待される所定の2群に分ける。一方の群は、例えば、2.5 mmHgを下回る測定値の相対数が最も高いことを特徴とする所定の「強低酸素症」群とする。第2の群は、例えば残りの低酸素試料を含む「弱低酸素症」群とする。
【０２０８】
その後、多数の遺伝子の転写発現レベルを決定し、公知の酸素状態と相関させる。このようにして、発現が異なる遺伝子を2群に分けることができる。以前に検証した低酸素応答性遺伝子の実績(B/W比)に基づいて、患者を「強」及び「弱」低酸素症群に分割することができる。2群を互いから分離する各遺伝子の能力は、B/W比により記述することができる。比が高いほど、対象となる遺伝子の発現における2群間の距離が大きくなる。したがって、別個の試料を一方の群に分類する力は、B/W比が低い場合と比べ、B/W比が高い場合に最適となる。
【０２０９】
B/W比:
【数３】
2014518616.tif 000005
Kは群数、iは群に関連し、zバーは全試料の平均である(合計はn)。Bは、群iの平均が全体の平均とどのくらい離れているかの加重和である。
【数４】
2014518616.tif 000006
si2は、群i内での分散の推定である。Wは、「共通」分散を構成する分散推定値の加重和である。
【０２１０】
Leave-One-Out(LOO)解析を用いることにより、トレーニングセット試料の独立性を推定する。分類されている各試料は、分類指標を構築する試料から除外され、分類指標を構成する事前に定めた群の何れにおいても平均及び分散に影響を与えない。
【０２１１】
「強」又は「弱」低酸素症群の何れかに属するものとして別個の試料を分類するために最適な遺伝子の組み合わせは、Leave-One-Out-Cross-Validation解析(LOOCV)の実施により特定することができる。一度に1つずつトレーニングセットから試料を除外して、残りの試料から分類指標を構築することにより、独立性を推定する。特定の試料の発現値には変動が存在するため、B/W比に基づいた遺伝子の順位付けは、異なるものとなり、各個体試料を分類する時に、分類指標内の遺伝子を潜在的に変化させる。したがって、「15遺伝子分類指標」は、全試料の分類に亘って、正確に同じ遺伝子の組み合わせを構成しない場合がある。分類指標において、例えば15遺伝子を組み合わせることにより、正確に分類される試料数は最も高くなり得る。
【０２１２】
したがって、得られたカットオフ値は、使用された特定の試料、例えば、試料がホルマリン固定か新鮮かに関連して、更に、「強」又は「弱」低酸素症である試料に対するカットオフ値を決定するために用いたトレーニングセット試料との比較において、異なるものになり得ると理解される。転写発現レベルが決定される条件も、カットオフ値に影響し得る(緩衝液の状態、転写発現決定のプラットホームの選択、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の低酸素状態に影響されない基準遺伝子の選択、試料中のSEQ ID NO:1乃至15により同定される遺伝子の何れかの転写発現レベルの標準化等)。しかしながら、本発明のもの以外の条件を用いた個体の酸素レベルの決定は、酸素状態が高度又は低度の低酸素症として特徴付けされる場合、本発明に開示した条件を用いることにより、本発明の特定の条件による高度又は低度の低酸素症を有するものとして、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の分類が為される場合、本発明の範囲に含まれると理解される。
【０２１３】
トレーニングセットに基づいてカットオフ値を確立するために用いる条件は、未知の酸素状態の試料を用いる時の条件と同様にするべきである。
【０２１４】
SEQ ID NO:1乃至15により同定した遺伝子の転写レベルを相関させ、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の酸素状態を取得するためのカットオフ値については後述する。
【０２１５】
低酸素症を判定するサイクル閾値
【０２１６】
癌の酸素状態の低酸素又は高酸素としての分類は、好ましくは、決定された遺伝子の被相関転写発現レベルを、高及び低酸素レベルを特徴とする癌細胞をそれぞれ含む2つの基準試料の、同じ遺伝子の被相関転写発現レベルと比較することにより決定される。基準試料に含まれる癌細胞は、公知の方法により低酸素症又は非低酸素症/低又は高酸素レベルとして予め定められており、例えば実施例2を参照されたい。
【０２１７】
酸素状態は、選択した遺伝子の被相関転写発現レベルと、高い酸素レベルを有する所定の基準試料及び低い酸素レベルを有する所定の基準試料の、同じ1個又は複数の遺伝子の被相関転写発現レベルとの差(D)を計算することにより評価することが好ましい。距離は、次のように計算され、
【数５】
2014518616.tif 000007
ここで、mは、ii) の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、「低酸素」又は「高酸素」基準試料、zは、基準試料の平均発現レベル、Wは、算出された共通分散、yは、癌細胞を含む試料の転写遺伝子発現である。癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、癌試料は、高酸素レベルを有する。反対に、癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、試料は、低酸素レベルを有する。
【０２１８】
決定した1個又は複数の遺伝子の転写発現レベルは、好ましくは、少なくとも1個、例えば3個の、基準遺伝子のそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を、1個又は複数の決定された遺伝子のCt値から減算することにより、ΔCtを求め、2-ΔCtを計算することにより、1個又は複数の決定された遺伝子の発現値を、前記基準遺伝子に対する倍率差に変換し、倍率差をlog2変換することにより、(-ΔCt)に等しい遺伝子発現値(y)を求めることにより、少なくとも1個の基準遺伝子と相関させる。
【０２１９】
幾何平均は、平均又はアベレージの一種であり、一組の数の中心傾向又は標準値を示す。
【０２２０】
幾何平均は、算術平均に類似しているが、数を乗算し、結果的に得られた積のn乗根(nは一組の数の個数)を取り出す点が異なる。例えば、2つの数、2及び8の幾何平均は、単純に、その積の平方根であり、即ち、2√2×8=4となる。別の例として、3つの数4、 1、及び1/32の幾何平均は、その積(1/8)の立方根、1/2であり、即ち3√4×1×1/32=1/2となる。
【０２２１】
更に一般的には、数が、x1、...、Xnである場合、幾何平均Gは、
【数６】
2014518616.tif 000008
を満たし、したがって
【数７】
2014518616.tif 000009
を満たす。
【０２２２】
本発明の遺伝子のそれぞれについて、平均(-ΔCt)値は、少なくとも1個の基準遺伝子、特にACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aのうち1つ又は複数と相関させ、好ましくは、平均(-ΔCt)値は、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aと特異的に、例えば、これらの遺伝子の発現の幾何平均値と相関させる。Ct値は、サイクル閾値に対応し、qPCR蛍光シグナルが基線変動に基づいて選択された閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める。
【０２２３】
したがって、好適な実施形態において、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aに相関させた本発明の各遺伝子の平均ΔCt値は、各遺伝子について、「強低酸素症群」及び「弱低酸素症群」として表2a及び/又は2bに示した通りとなる。したがって、癌の酸素状態は、表2a及び/又は2bの遺伝子の相関転写レベルが「強低酸素症群」として表2a及び/又は2bに示した範囲に含まれる場合、低酸素/(強)低酸素症として分類され、反対に、表2a及び/又は2bの遺伝子の相関転写レベルが「弱低酸素症群」として表2a及び/又は2bに示した範囲に含まれる場合、酸素状態は、高酸素/弱低酸素症として分類される。
【０２２４】
表2. ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aと相関させた平均(-ΔCt)値(zim)及び分散(Wm)の区間。平均値は、各試験遺伝子及び基準遺伝子間の発現レベルにおけるlog2変換した倍率差として表現している。倍率差は、2-ΔCtとして計算される。ΔCtは、試験遺伝子のCt値から基準遺伝子のCt値を引いたものとして計算される。基準遺伝子のCt値は、3個の基準遺伝子のそれぞれのCt値の幾何平均である。Ct値(サイクル閾値)は、蛍光シグナルが一定の閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める。閾値は、基線変動に基づいて選択された任意の蛍光レベルである。こうした閾値レベルの決定は、当業者に周知である。
【表２ａ】
2014518616.tif 000010
【表２ｂ】
2014518616.tif 000011
【０２２５】
更に特定の実施形態において、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aに相関させた本発明の各遺伝子の平均ΔCt値は、正確に、或いはおよそ、「強低酸素症群」及び「弱低酸素症群」として表3に示した値の1.0、例えば0.9、例えば0.8、例えば0.7、例えば0.6、例えば0.5、例えば0.4、例えば0.3、例えば0.2、例えば0.1、例えば0.05以内となる。
【０２２６】
【表３】
2014518616.tif 000012
【０２２７】
したがって、一般に、癌の酸素状態は、ここではDmore及びDlessとして指定される2つのD値に基づいて特徴付けされる。Dmoreが最低である場合、癌は、「強低酸素症」、或いは低酸素/低酸素症として分類され、Dlessが最低である場合、癌は、「弱低酸素症」、或いは高酸素/非低酸素症として分類される。D値は、次の一般式により計算され、
【数８】
2014518616.tif 000013
ここで、mは、1乃至15個の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、群(強又は弱低酸素症)であり、zは、群の平均(例えば、表2及び3に示したもの等)であり、Wは、算出された共通分散(例えば、同じく表2及び3参照)であり、yは、分類された試料の遺伝子発現(相関遺伝子発現等)である。
【０２２８】
測定される遺伝子数は、任意の数及び/又は組み合わせにすることができるが、好ましくは少なくとも5個であり、更に好適には、本発明の15個の遺伝子全て(表2又は表3参照)の転写が測定される。15個の遺伝子のうち1個又は複数が測定されない場合、式は、これに応じて低減される。したがって、表3の特定の実施形態においてADM、ANKRD37、P4H4、及びNDRG1のみが測定される場合、Dmore及びDlessの式は、次の通りとなる。
【数９】
2014518616.tif 000014
【数１０】
2014518616.tif 000015
【０２２９】
しかしながら、それぞれの平均ΔCt値及び共通分散は、表2に特定した区間のそれぞれから選択し得る。
【０２３０】
したがって、上述した定義に基づくと、「強低酸素症群」について表2及び/又は3に記載された、ΔCt及び分散値に基づいて計算されたDmoreが、「弱低酸素症群」に対する表2及び3の、対応するΔCt及び分散値に基づいて計算された対応するDlessより低い場合、癌の酸素状態は、低酸素/(強)低酸素症として分類される。
【０２３１】
反対に、「弱低酸素症群」について表2及び/又は3に記載された、ΔCt及び分散値に基づいて計算されたDlessが、「強低酸素症群」に対する表2及び3の、対応するΔCt及び分散値に基づいて計算された対応するDmoreより低い場合、癌の酸素状態は、高酸素/(弱)低酸素症として分類される。
【０２３２】
治療
【０２３３】
本明細書の別の箇所において説明したように、低酸素レベルを有する腫瘍は、放射線治療に耐性を示す場合が多い。耐性は、照射中に放出されたフリーラジカルと反応する酸素が欠如し、これにより腫瘍内部での損傷化合物の形成を低減することに関与する。結果として、酸素レベルが低い(「強」低酸素症)と分類された、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌に罹患した個体を、低酸素改質剤のみ、或いは放射線と組み合わせて治療することにより、治療結果は改善する。低酸素改質剤による治療は、悪心、嘔吐、及び例えば神経障害等の多数の副作用を有するため、低酸素改質剤による治療により恩恵を受ける、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌に罹患した個体を選択することが望ましい。結果として、低酸素改質剤による治療により恩恵を受けない、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌に罹患した患者は、低酸素改質剤により治療するべきではなく、したがって、このような低酸素改質剤の重度の副作用に晒されるべきではない。
【０２３４】
したがって、本発明の一実施形態は、必要とする個体において、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌を改善及び/又は治療する方法に関し、前記方法は、
a.個体から扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の試料を取得又は提供するステップと、
b.本発明において開示した方法を実施して、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の前記癌の酸素状態を判定するステップと、
c.高度の低酸素症を有する個体を選択するステップと、
d.低酸素改質剤を治療的に有効な量で前記個体に投与するステップと、を備え、
これにより、必要とする前記個体において、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の前記癌を改善及び/又は治療する。
【０２３５】
「酸素状態を判定する方法」の節において説明したように遺伝子の転写レベルを決定することは、治療の方法の範囲に含まれる。
【０２３６】
一実施形態において、治療は、更に、「放射線療法」の節において説明したような条件下で個体に放射線を照射するステップを備える。放射線療法は、単一又は複数の分割単位で行うものと理解される。したがって、低酸素改質剤は、放射線療法の前又は放射線療法と同時に投与される。好適な実施形態において、投与は、放射線療法の前となる。
【０２３７】
本発明の第2の態様は、低酸素症が低度である、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌に罹患した個体の治療に関する。こうした個体は、低酸素改質剤を放射線療法に組み合わせて投与する治療から恩恵を受けない。低酸素改質剤による副作用は重度であり、悪心、嘔吐等につながり、個体は必要な放射線療法に耐えることができなくなる。したがって、本発明は、必要とする個体において、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の低度低酸素性癌を改善及び/又は治療する方法に関し、前記方法は、
a.個体から扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の試料を取得又は提供するステップと、
b.本明細書において開示した方法を実施することにより、癌の酸素状態を判定するステップと、
c.扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の低度低酸素性癌を有する個体を選択するステップと、
d.前記個体に放射線療法を施すステップと、を備え、
これにより、必要とする前記個体において前記低度低酸素性癌を改善及び/又は治療する。
【０２３８】
本発明は、更に一態様において、放射線療法の前又は放射線療法と同時に低酸素改質剤による治療を必要としない癌を有する個体を選択する方法を提供し、前記方法は、
i) 前記個体から癌の試料を提供することと
ii) 本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定することと、
iii) 高酸素状態を特徴とする癌を有する個体を選択することと、
iv) 高酸素状態を特徴とする癌を有する前記個体に、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すことと、を含む
【０２３９】
「治療」という用語は、本明細書のあらゆる箇所での使用において、上述したような臨床状態を治療、改善、及び/又は低減することを目的とする任意の種類の療法を含む。したがって、「治療」、「治療する」等は、本明細書での使用において、所望の薬理的及び/又は生理的効果を得ることを示し、ヒトを含む哺乳動物の病的状態又は障害の任意の治療を対象とする。効果は、障害及び/又は障害に起因する悪影響の部分的又は完全な治癒に関して治療的なものとなり得る。即ち、「治療」には、(1) 障害の進行の停止等、障害を阻害すること、(2) 喪失、消失、又は欠損機能の回復又は修復或いは非効率的プロセスに対する刺激付与により障害又は症状の後退を生じさせること等、罹患者が障害又はその症状で苦しむことが無くなるように、障害又は少なくとも障害に関連する症状を停止又は終了させること、或いは(3) 障害又はそれに関連する症状を緩和、軽減、又は改善することが含まれ、ここで改善は、広義で用いられ、腫瘍の酸素レベルが低い本発明の扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌といったパラメータの大きさを少なくとも減少させることを示す。
【０２４０】
低酸素改質剤
【０２４１】
本発明は、一態様において、本発明の方法により低酸素症であると判断された癌の治療において、任意に放射線療法と併せて使用する、低酸素改質剤に関する。したがって、本発明は、一態様において、個体における癌の治療に使用する低酸素改質剤を提供し、前記癌において、
i) ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子の発現に相関させた際に、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の被相関転写発現レベルに対応する。
【０２４２】
本発明の低酸素改質剤の好適な実施形態において、癌は、上述したように、本発明の方法により低酸素症であることが見いだされる。したがって、こうした好適な実施形態では、低酸素改質剤が治療に使用されることが主張される癌において、
i) ADM又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子に相関させた際に、
iii) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルに対応すると共に、
iv) 高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルとは異なる。
【０２４３】
特定の好適な実施形態において、ADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又は変異体との被相関転写発現レベルは、高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルよりも、低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルに類似する。
【０２４４】
少なくとも1個の追加遺伝子、所定の基準試料、基準遺伝子、試料、癌、及び酸素状態の評価、及び/又は転写発現レベルは、本明細書の何れかの箇所で定めるように決定される。
【０２４５】
本発明の低酸素改質剤は、腫瘍において低酸素環境を少なくすることを支援する作用剤である。したがって、本発明の低酸素改質剤は、腫瘍の酸素レベルを高める、或いは放射線療法中に発生する放射化学的プロセスにおける酸素の効果を模倣する化合物、又は低酸素細胞を破壊する低酸素サイトトキシンである。
【０２４６】
一実施形態において、低酸素改質剤は、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される。
【０２４７】
低酸素改質剤は、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAの何れかから選択し得ると理解される。
【０２４８】
したがって、本発明の低酸素改質剤は、血中で送給される腫瘍の酸素レベルを高める化合物となり得る。したがって、低酸素改質剤は、一実施形態において、高酸素ガス呼吸のための作用剤、例えば、HBO(高圧酸素)及び/又はカルボゲン(二酸化炭素及び酸素ガスの混合物)又はARCON(カルボゲンと組み合わせたニコチンアミド)となり得る。酸素レベルを高めることにより作用する本発明の低酸素改質剤は、より多くの酸素を運ぶ必要がある個体のヘモグロビンの能力を変化させており、こうした作用剤は、輸血、EPO(エリトロポエチン)、2,3-BPG、2,3-ビスホスホグリセリン酸としても知られる2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸(ヘモグロビン-酸素解離曲線を制御する重要なアロステリック因子)、又はニコチンアミド(血流の過渡的変化を防止/低減)である。
【０２４９】
他の実施形態において、低酸素改質剤は、低酸素細胞を優先的に殺す作用剤である。1作用剤は、放射線誘発DNA損傷に対処する身体の能力を支援するハイパーサーミアである。低酸素細胞を優先的に殺す他の作用剤は、MMC(マイトマイシンC)、TPZ(チラパザミン)、AQ4N(バノキサントロ)、PR-104、LCQ-1、RH1、又はインジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸、及びスルファミド等の抗カーボニックアンヒドラーゼIX(CAIX)薬であり、或いは、例えばクロストリジウム等、低酸素腫瘍内で胞子形成する腫瘍溶解性菌等の嫌気性菌で、更に遺伝子改変により非病原性であるか(例えば、ビフィドバクテリウム)或いは弱毒化されており(例えば、クロストリジウム)、例えば、シトシンデアミナーゼ(E.coliから)+5-フルオロウラシル(5FU)を発現するものである。
【０２５０】
特定の実施形態において、低酸素改質剤は、TPZチラパザミンである。
【０２５１】
本発明の他の実施形態において、低酸素改質剤は、アバスチン、DC101、又はチミジンキナーゼ阻害剤等の血管新生阻害剤を標的とする薬品、或いは、CA4O(コンブレタスタチン)、OXi4503、又はDMXAA等の血管破壊事象を標的とする薬品である。
【０２５２】
本発明の他の実施形態において、低酸素改質剤は、NIM(ニモラゾール、Naxogin又はNimoralとしても知られる、下記参照)、MISO(ミソニダゾール)、又はDORA(ドラニダゾール)等の放射線療法中に酸素の効果を模倣する薬品である。
【０２５３】
本発明の一実施形態において、低酸素改質剤は、以下に記載のものとして知られるニモラゾールである:
【０２５４】
ニモラゾール:4-[2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン、1-(2-N-モルホリノエチル)-5-ニトロイミダゾール、 1-(β-モルホリノエチル)-5-ニトロイミダゾール、1-(β-モルホリノエチル)-5-ニトロイミダゾール、1-(N-p-エチルモルホリン)-5-ニトロイミダゾール、4-[2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン、4-(2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル)モルホリン、4-(2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル)-モルホリン、4-[2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン、6506-37-2、Acterol、Acterol forte、BRN 0533758、C9H14N4O3、D07352、EINECS 229-394-4、Esclama、K1900、K-1900、LS-93226、モルホリン,4-(2-(5-nitro-1H-イミダゾール-1-yl)エチル)-、モルホリン,4-[2-(5-nitro-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]-、モルホリン,4-(2-(5-nitro-1H-イミダゾール-1-yl)エチル)-(9CI) 、モルホリン,4-(2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル)-、モルホリン,4-[2-(5-ニトロイミダゾール-1-yl)エチル]-、N-2-モルホリノエチル-5-ニトロイミダゾール、Naxofem、Naxogin、Naxogin(TN)、Nimorazol、Nimorazole、Nimorazole[BAN:INN]、Nimorazole(INN)、Nimorazol[INN-Spanish]、Nimorazolo[DCIT]、Nimorazolum[INN-Latin]、Nitrimidazine、NSC107524、NSC 107524、Nulogyl、Sirledi、WLN:T6N DOTJ A2- AT5N CNJ ENW。
【０２５５】
本発明の特に好適な実施形態において、低酸素改質剤は、Naxoginである。
【０２５６】
放射線療法
【０２５７】
本発明は、一態様において、本発明の方法により低酸素症ではないと判定された癌の治療において使用する電磁放射線源に関する。したがって、一態様において、本発明は、個体における癌の治療に使用する電磁放射線源を提供し、前記癌において、
i) ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子の発現に相関させた際に、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の被相関転写発現レベルに対応する。
【０２５８】
本発明の電磁放射線源は、放射線療法による癌の治療に適した、ガンマ線、X線、及び/又は他の任意の電磁放射線等の電磁放射線を発生させる任意の手段を含む。
【０２５９】
本発明の電磁放射線源の好適な実施形態において、癌は、上述したように、本発明の方法により低酸素症ではないことが見いだされる。したがって、このような好適な実施形態では、電磁放射線源が治療に使用されることが主張される癌において、
i) ADM又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルは、
ii) 少なくとも1個の基準遺伝子に相関させた際に、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルに対応すると共に、
iv) 低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料の、ADM (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体と、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との被相関転写発現レベルとは異なる。
【０２６０】
特定の好適な実施形態において、ADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又は変異体との被相関転写発現レベルは、低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルよりも、高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルに類似する。
【０２６１】
少なくとも1個の追加遺伝子、所定の基準試料、基準遺伝子、試料、癌、及び酸素状態及び/又は転写発現レベルの評価は、本明細書の何れかの箇所で定めるように決定される。
【０２６２】
本発明は、一実施形態において、低酸素改質剤の投与と放射線療法との組み合わせに関する。
【０２６３】
本発明による放射線療法(radiation threapy)は、放射線療法(radiotherapy)及び/又は放射線腫瘍学(radiation oncology)とも呼ばれ、XRTと略される場合があり、悪性細胞を制御する癌治療の一部としての電離放射線(IR)の医学的使用である(医学的な画像化及び診断における放射線の使用である放射線学とは異なる)。放射線療法は、治癒的又は補助的治療に使用し得る。対症療法(治癒が不可能であり、局所的な疾患管理又は症状緩和を目的とする場合)又は治療的処置(療法に延命効果があり治癒的である場合)として用いられる。
【０２６４】
放射線療法は、腫瘍(良性又は悪性)の治療に使用してよく、一次又は補助モダリティとして使用し得る。放射線療法を、外科手術、細胞傷害性薬物、ホルモン療法、又はこれら3種類の何らかの混合に組み合わせることも一般的である。最も一般的な腫瘍の種類は、何らかの形で放射線療法により治療することができる。正確な治療の意図(治癒的、補助的、術前補助的、治療的、又は対症療法的)は、腫瘍の種類、位置、及び病期、更に患者の全般的健康状態に依存する。
【０２６５】
正常な組織(腫瘍を治療するために放射線が通過する必要のある皮膚又は臓器)の損傷を避けるため、本発明においては、成形放射線ビームを幾つかの露出角度から当てて腫瘍の位置で交差させ、周囲の健康な組織より遙かに大きな吸収線量を得る。
【０２６６】
放射線療法は、細胞のDNAに損傷を与えることで機能する。損傷は、光子、電子、陽子、中性子、又はイオンビームにより直接的又は間接的にDNA鎖を構成する原子をイオン化することにより生じる。間接的イオン化は、水のイオン化の結果として起こり、フリーラジカル、特にヒドロキシルラジカルを形成し、その後、DNAに損傷を与える。最も一般的な放射線療法の形態において、放射線の効果の殆どは、フリーラジカルによるものである。細胞はDNA損傷を修復するメカニズムを有するため、両方の鎖においてDNAを切断することが、細胞の特性を変更する上で最も重要な手法ということになる。癌細胞は一般に分化しておらず、幹細胞様であるため、増殖が多く、殆どの健康な分化細胞と比較して、致死未満の損傷を修復する能力が低下している。DNA損傷は、細胞分裂を介して引き継がれ、癌細胞への損傷は蓄積され、細胞の死滅又は増殖の鈍化をもたらす。
【０２６７】
本発明において、放射線療法に用いられる放射線の量は、グレイ( Gy)単位で測定され、治療中の癌の種類及び病期に応じて変化する。本発明の一実施形態において、放射線療法は、治癒的な場合に行われ、固形上皮性腫瘍に対する一般的な線量は、1.8乃至2 Gy、例えば約2 Gy単位で、60乃至80 Gyである。
【０２６８】
本発明の他の実施形態において、放射線療法は、予防的(補助的)目的で行われ、この場合、線量は、1.8乃至2 Gy、例えば約2 Gy単位で、約45乃至60 Gyである(扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌、例えば頭頸部癌)。
【０２６９】
線量を選択する際には、患者が細胞傷害性薬物を投与されているか、患者の併存症、放射線療法は手術の前又は後に行われているか、及び手術の成功の度合いを含む他の多くの要素が放射線腫瘍医により考慮される。
【０２７０】
本発明において、使用される放射線の量は、好ましくは60乃至80 Gy、例えば60乃至70 Gy、更に好ましくは40乃至60 Gy、例えば40乃至50 Gy、更に好ましくは20乃至40 Gy、例えば20乃至30 Gy、更に好ましくは1乃至20 Gy、例えば1乃至10 Gy、更に好ましくは1乃至2 Gyの範囲である。
【０２７１】
放射線送達方法に応じて、幾つかの角度又はソースを用いて、併せて必要な合計線量となるようにし得る。合計線量は、幾つかの重要な理由から分割し得る(時間的に分散させ得る)。分割により、正常な細胞を回復させることができる一方、腫瘍細胞は、一般に分割間で修復する効率が低い。更に、分割により、ある治療中、細胞周期において比較的放射線耐性である段階にある腫瘍細胞は、次の分割単位を実施する前に、感度の高い段階へ進む場合がある。同様に、慢性的又は急性的に低酸素症である(したがって放射線耐性が高い)腫瘍細胞を、分割単位間で再酸素化し、腫瘍細胞の死滅を増加させ得る。本発明の一実施形態では、1日に2分割単位の放射線療法を、治療過程の終わり近くに用いる。このスケジュールは、同時追加法又は過分割照射法として知られており、小さい時により迅速に再生する腫瘍に対して用いる。特に、頭頸部の腫瘍は、この挙動を示す。
【０２７２】
本発明において、分割スケジュールは、1日1.8乃至2 Gyを週に3乃至7日間、好ましくは5日間、更に好ましくは1日1.5乃至1.8 Gyを週に3乃至7日間、好ましくは5日間とし得る。
【０２７３】
本発明の一実施形態において、低酸素改質剤は、「低酸素改質剤」の節において説明したように、放射線療法の実施直前に、上述したように投与し得る。本明細書において、放射線療法の直前とは、他の記述がない限り、放射線療法の開始から5日以内、更に好ましくは4日以内、例えば3日以内、更に好ましくは2日以内、例えば1日以内、更に好ましくは20時間以内、例えば10時間以内、更に好ましくは5時間以内、更に好ましくは4.5時間以内、例えば4時間以内、更に好ましくは3.5時間以内、例えば3時間以内、更に好ましくは2.5時間以内、例えば2時間以内、更に好ましくは1.5時間以内、例えば1時間以内、更に好ましくは0.5時間以内、例えば15分以内、更に好ましくは10分以内、例えば放射線療法の開始から5分以内の投与である。好適な実施形態において、低酸素改質剤は、放射線療法の開始から1.5時間以内に投与される。
【０２７４】
追加化合物及び併用治療
【０２７５】
本発明の治療の方法、低酸素改質剤及び医薬組成物の使用では、追加化合物を、1つ又は複数の他の抗増殖又は抗悪性腫瘍剤の形態で、併用治療に使用し得る。
【０２７６】
こうした抗増殖剤には、限定ではないが、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、細胞分化プロセスを誘発する化合物、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、抗悪性腫瘍性代謝拮抗剤、白金化合物、タンパク質又は脂質キナーゼ活性及び他の血管新生阻害剤を標的にする/減少させる化合物、タンパク質又は脂質ホスファターゼの活性を標的とする、減少させる、又は阻害する化合物、ゴナドレリンアゴニスト、抗アンドロゲン剤、血管新生阻害ステロイド、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、生体応答修飾剤、抗増殖性抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォーム、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤が含まれる。
【０２７７】
本発明の追加化合物は、例えば、放射線療法に対して低い感度を示す腫瘍の治療を含め、放射線増感剤としても使用し得る。
【０２７８】
本発明において使用される放射線増感薬は、放射線療法に対する腫瘍の感度を高める薬物である。こうした放射線増感剤には、限定ではないが、シスプラチン又は例えばセツキシマブが含まれる。本発明の一実施形態において、低酸素改質剤は、シスプラチン及び/又はセツキシマブと組み合わせて投与される。低酸素改質剤及び放射線増感剤は、同時に又は連続して、組み合わせた薬剤として、又は別個の薬として投与し得る。一実施形態において、放射線増感剤及び低酸素改質剤は、組み合わせた薬剤として処方される。
【０２７９】
「組み合わせ」という用語は、1つの単位剤形において固定された組み合わせか、或いは、本発明の化合物と併用相手とを、独立して同時に、或いは特に併用相手が協同効果、例えば相乗効果を示すことが可能な間隔で別個に投与し得る場合に、併用投与用のパーツキット、又はその任意の組み合わせを意味する。
【０２８０】
医薬組成物、使用、及び投与
【０２８１】
医薬組成物
【０２８２】
本発明の一態様では、必要とする個体において、「強」低酸素症であること、即ち、本明細書の別の箇所に定めた低酸素状態を有することを特徴とする扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌を治療するための低酸素改質剤又はその医薬的に許容可能な塩と、任意に1つ又は複数の医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。したがって、一態様において、本発明は、必要とする個体において、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌を治療するための低酸素改質剤又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物に関し、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の前記癌は、高度の細胞低酸素症を有するものとして特徴付けられ、ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)及び/又はその変異体からなる群から選択された少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルを決定し、カットオフ値と相関させる。
【０２８３】
例えば、ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び/又はその変異体からなる群から選択された少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、更に好ましくは少なくとも4個、更により好ましくは少なくとも5個の遺伝子の転写発現レベルを、方法において使用し得る。
【０２８４】
本発明の他の実施形態では、少なくともC3orf28 (SEQ ID NO:6)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、及びPFKFB3 (SEQ ID NO:14)又はその変異体の発現レベルである。
【０２８５】
同様に、本発明は、他の実施形態において、必要とする個体において、扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌を治療する薬剤を製造するための低酸素改質剤の使用に関し、前記癌は、高度の細胞低酸素症を有するものとして特徴付けられ、ADM (SEQ ID No:1)、及び/又は任意にANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)及び/又はその変異体からなる群から選択された少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルを決定し、カットオフ値と相関させる。。
【０２８６】
扁平細胞癌及び/又は扁平上皮癌等の癌の酸素状態を判定する方法は、「酸素状態を判定する方法」の節において説明した、癌が高度の低酸素症を有するかを確定する一つの方法にし得ると理解される。
【０２８７】
医薬組成物の低酸素改質剤は、「低酸素改質剤」の節に列挙した多数の作用剤から選択し得る。一つの好適な低酸素改質剤は、ニモラゾール(4-[2-(5-ニトロ-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン)である。
【０２８８】
本発明の低酸素改質剤は、単独で、或いは医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、単回又は複数回の用量で投与し得る。適切な医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤には、不活性の固体希釈剤又は充填剤、無菌水溶液、及び様々な有機溶媒が含まれる。
【０２８９】
本発明による医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と共に、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2000, Lippincott Williams & Wilkins に開示されるもの等、従来の手法による他の任意の公知であるアジュバント及び賦形剤と共に処方し得る。
【０２９０】
低酸素改質剤又はその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、又はプロドラッグを、1つ又は複数の疏水性アミノ酸及び医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせることにより形成された本発明の医薬組成物は、タブレット、粉末、トローチ、シロップ、坐剤、注入可能溶液等の様々な剤形で容易に投与することができる。粉末中では、担体は、微粉化した活性成分との混合物中に存在するタルク又は澱粉等、微粉化した固体となる。タブレットにおいて、活性成分は、必要な結合特性を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形状及び大きさに圧縮される。
【０２９１】
適切な固体担体には、限定では無いが、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン(例えばヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、HPCD)、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はセルロースの低級アルキルエーテルが含まれる。
【０２９２】
液体担体の例には、限定では無いが、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、ポリソルベート(Tween-20又はTween-80等)、クレモフォールEL、又は水が含まれる。同様に、担体又は希釈剤は、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリル等、当該技術分野において公知の徐放材料を、単独で又はワックスと混合して含み得る。更に、ナノ乳液又はナノ分散液等のナノ処方も考えられる。本発明の好適な実施形態において、製剤処方に用いられる賦形剤は、FDAが提供する「一般に安全と認められる」GRASリストに適合する。
【０２９３】
医薬組成物は、経口、非経口(皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内、及び皮内を含む)、硝子体腔内、及び鼻腔内の経路等、任意の適切な経路による投与用に特に処方し得る。本発明における好適な投与経路は、経口である。好適な経路は、治療対象の個体の全般的状態及び年齢と、治療される状態の性質とに依存することは理解されよう。
【０２９４】
経口投与用の医薬組成物は、カプセル、タブレット、糖衣錠、丸薬、トローチ、粉末、顆粒等の固体剤形を含む。適切である場合、腸溶性コーティング等のコーティングにより調製することが可能であり、当該技術分野において周知の方法による徐放又は持続放出等、活性成分の制御放出を行うように処方することもできる。
【０２９５】
タブレット又はカプセルの形態での経口投与では、本発明の低酸素改質剤は、エタノール、グリセロール、水等、経口の非毒性である医薬的に許容可能な担体と適切に組み合わせ得る。更に、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、香味剤、及び着色剤を、必要に応じて混合物に添加し得る。適切な結合材には、例えば、ラクトース、グルコース、澱粉、ゼラチン、アカシアガム、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれる。潤滑剤には、例えば、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、例えば、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム等が含まれる。カプセル用の付加的な賦形剤には、マクロゴール又は脂質が含まれる。タブレットとしての固形組成物の調製では、低酸素改質剤は、上述したもの等の1つ又は複数の賦形剤、及び水等の医薬的希釈剤と混合し、本発明の化合物の均質な混合物を含む固形予備処方組成物を作成する。「均質」という用語は、本発明の化合物が組成物全体に均一に分散しており、タブレット又はカプセル等、効果の等しい単位剤形へ容易に細分し得ることを意味する。
【０２９６】
本発明の化合物の経口又は非経口投与用の液剤には、例えば、水溶液、シロップ、エリキシル剤、水性又は油性懸濁液、及び綿実油、ゴマ油、ヤシ油、又は落花生油等の食用油を含む乳剤が含まれる。水性懸濁液用の適切な分散又は懸濁剤には、トラガント、アルジネート、アカシア、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ゼラチン、メチルセルロース、又はポリビニルピロリドン等の合成又は天然ガムが含まれる。非経口投与用の医薬組成物には、無菌水性及び非水性注入可能溶液、分散液、懸濁液、又は乳液と、使用前に無菌注入可能溶液又は分散液中で元に戻すための無菌粉末とが含まれる。非経口投与用には、本発明の対象となるタンパク質又はその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、又はプロドラッグを、ゴマ油又は落花生油、水性プロピレングリコール中、又は水溶液中に含む溶液を利用し得る。こうした水溶液は、必要な場合適切に緩衝するべきであり、液体希釈剤は、十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張化する。こうした特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。油性溶液は、関節内、筋肉内、及び皮下注入の目的に適している。こうした全ての溶液の無菌条件下での調製は、当業者に周知の標準的な製剤手法により容易に達成される。蓄積注射可能な剤形も本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２９７】
上述した材料に加え、本発明の化合物の処方は、希釈剤、緩衝剤、香味剤、着色剤、表面活性剤、増粘剤、保存料、例えば、オキシ安息香酸メチル(抗酸化剤を含む)、乳化剤等の1つ又は複数の材料を含み得る。
【０２９８】
本発明の医薬組成物の適切な用量は、患者の年齢及び状態、治療対象の疾患の重症度、及び開業医に周知の他の要因に応じて決まる。医薬組成物は、例えば、毎日、或いは週間隔のような間隔を空けて等、様々な投薬スケジュールの何れかに従って経口投与し得る。一般に、単回用量の範囲は
【０２９９】
低酸素改質剤がニモラゾールであり、経口投与される場合、医薬組成物は、最初に毎日の放射線治療が行われる前に、1乃至2500 mg/体表面平方メートルの範囲内、好ましくは約100乃至2000 mg/体表面平方メートル、更に好ましくは約500乃至1800 mg/体表面平方メートル、更に好ましくは1000乃至1500 mg/体表面平方メートル、最も好ましくは1100乃至1400 mg/体表面平方メートル、好ましくは1200 mg/体表面平方メートルで投与し得る。低酸素改質剤がニモラゾールであり、経口投与される場合、医薬組成物は、その後の毎日の放射線治療前に、1乃至2500 mg/体表面平方メートルの範囲内、好ましくは約100乃至2000 mg/体表面平方メートル、更に好ましくは約500乃至1800 mg/体表面平方メートル、更に好ましくは800乃至1500 mg/体表面平方メートル、最も好ましくは900乃至1200 mg/mg/体表面平方メートル、好ましくは1000 mg/体表面平方メートルで投与し得る。
【０３００】
本発明の低酸素改質剤は、一般に、遊離物質又はその医薬的に許容可能な塩又はエステルとして利用される。一例は、遊離塩基の有用性を有する化合物の酸付加塩である。ヒドロキシ基を有する化合物の生理学的に許容可能な塩には、ナトリウム又はアンモニアイオン等の適切な陽イオンと組み合わせた前記化合物の陰イオンが含まれる。
【０３０１】
本発明の低酸素改質剤は、更に、1つ又は複数の他の活性物質を単独で、或いは医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、単回又は複数回の用量で含む医薬組成物においても処方し得る。適切な医薬的に許容可能な担体、希釈剤、及び賦形剤は、上述した通りであり、1つ又は複数の他の活性物質は任意の活性物質、或いは、好ましくは、以下の「併用治療」の節に記載したような活性物質にしてよい。
【０３０２】
投与は、通常の技術を有する医師に有効であることが知られている任意の経路にし得る。経口投与が好適となる。持続時間の延長は、適切なマクロカプセル、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又は硫酸プロタミンを選択すること、或いはマクロ分子の濃度を選択すること、及び組み込みの方法により、放出を長く行うために達成し得る。放出制御調製物により作用持続時間を延長する他の可能な方法は、本発明において用いられる活性化合物を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ(乳酸)、又はエチレン酢酸ビニル共重合体等の重合材料の粒子に組み込むことである。或いは、こうした重合体粒子に化合物を組み込む代わりに、本発明において用いられる化合物を、例えば、コアセルベーション手法又は界面重合により調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、或いは、コロイド状薬物送達システム、例えば、リポソーム、アルブミン、マイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル、或いはマクロエマルションに閉じ込めることができる。こうした内容は、Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)に開示されている。
【０３０３】
低酸素改質剤を投与しない放射線療法による治療
【０３０４】
本発明は、一態様において、放射線治療前又は放射線治療と同時に低酸素改質剤による治療を必要としない癌を有する個体を選択する方法に関し、前記方法は、
i) 前記個体からの癌の試料を提供するステップと、
ii) 本発明の方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 高酸素状態を特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 高酸素状態を特徴とする癌を有する前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すステップと、を備える。
【０３０５】
予後
【０３０６】
特定の一態様において、本発明は、個体の癌の予後を判定する方法を提供し、ここで、癌の酸素状態は、本明細書に定めた方法により判定され、即ち、個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADM遺伝子 (SEQ ID NO:1)又はそれに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体の転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルに相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADMの所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む方法により判定される。
【０３０７】
好適な一実施形態において、方法は、
i) 前記癌の細胞を含む試料において、
ii) ADMと、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する変異体からなる群から選択された少なくとも1個の追加遺伝子との転写発現レベルを決定することと、
iii) ADM遺伝子及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子の発現レベルと相関させることと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、ADM及び前記少なくとも1個の追加遺伝子の所定の被相関転写発現レベルと比較することにより、前記癌の酸素状態を評価することと、を含む。
【０３０８】
本発明の予後方法によれば、低酸素状態を特徴とする癌は、予後不良に関連付けられる。したがって、予後不良は、ADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又は変異体との被相関転写発現レベルが、高酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルよりも、低酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料のADM又はその変異体と、任意である前記1個又は複数の追加遺伝子又はその変異体との被相関転写発現レベルに類似する癌に関連付けられる。
【０３０９】
予後不良に関連付けられる癌は、例えば、遠隔転移を形成する強い傾向を示す。更に、こうした予後不良に関連付けられる癌は、治療反応の減少を示す場合が多い。したがって、一般に、予後不良に関連付けられる癌は、他の癌よりも侵攻性の腫瘍となる傾向がある。したがって、本発明の方法により予後が不良になることが判明した癌に対しては、好ましくは、治療的処置を強くするべきであり、例えば全身的な化学療法による治療及び/又は他の抗癌治療を、例えば外科的治療に加えて含めるべきである。
【実施例】
【０３１０】
以下は、本発明の組成物及び処方の様々な成分の量の非限定的な例である。本発明の組成物及び処方は、以下の例とは異なる量の成分を含み得ると理解される。したがって、以下の実施例は、本発明の好適な実施形態と見做し得る。
【０３１１】
実施例1
【０３１２】
遺伝子分類指標による頭頸部癌における放射線療法の低酸素改質の予測
【０３１３】
この例は、生検材料による遺伝子発現定量化に基づいて腫瘍の低酸素状態を特徴付け、更にこの特徴付けにより治療を個別化する方法をどのように作成するかを示す。したがって、実験プランには、放射線治療の低酸素改質による恩恵を受ける患者を特定することが可能な、放射線生物学的に関連する酸素レベル(<10 mmHg)に相関する発現の有意の増加に応答する、特異的な低酸素応答性遺伝子を同定することが含まれた。こうした「低酸素調節遺伝子」は、文献において以前に示唆されていたが、開発された低酸素遺伝子発現シグネチャーには、予測的であることが示されたものは無く、結果として、医院で実践されているものは無い。
【０３１４】
低酸素応答性遺伝子は、pH及び酸素圧が考慮された、ヒトの扁平上皮癌腫の多くの細胞株における遺伝子発現のマイクロアレイ解析から知られている。29の遺伝子が低酸素条件下で上方制御され、更に多くのものが細胞外pH変動と無関係であることが示唆されている(図1a)。加えて、文献において低酸素症に関連することが多い遺伝子CA9を含めることを選択した(表4)。これらの遺伝子のインビボ低酸素特異性を確認するため、インビボ実験に用いた多くの細胞株により、ヌードマウスにおける皮下異種移植腫瘍を形成した。発生した腫瘍の切除前に、マウスには、オートラジオグラフィーによる低酸素腫瘍領域の生体外での視覚化を可能にする低酸素トレーサー[18F]-FAZAを投与した。低酸素及び非低酸素腫瘍組織からの遺伝子発現をそれぞれ単離及び定量化するために、[18F]-FAZA陽性及び[18F]-FAZA陰性領域の境界を定めたコンピュータ支援1:1テンプレートを生成し、切開をガイドした(図1b及び1c)。定量的リアルタイムRT-PCRにより測定した遺伝子発現の腫瘍内変動性のウィルコクソンの符号順位検定により、示唆された全遺伝子が、非低酸素腫瘍領域(N)と比較して、低酸素腫瘍領域(H)において有意に上方制御された(図1d)。生検材料が十分に酸素化した領域と低酸素領域との両方を含み得る臨床的シナリオを模倣するために、非低酸素腫瘍領域からの遺伝子発現を、隣接する切片で実施された全組織切片(M)の解析と比較した。これにより、低酸素及び非低酸素腫瘍領域の混合物から定量化されたことに関係なく、低酸素誘発上方制御が遺伝子発現に関して追跡可能であるかが検証されると予測される。3つの遺伝子を除く全てで有意な上方制御が見られ(図1e)、低酸素症マーカーとしての潜在的な役割が裏付けられた。
【０３１５】
ヒトの生検材料における関連する分類のための最も有益な遺伝子は、低酸素症状態を表す転移頸部リンパ節のpO2電極測定値により予め順位付け及び評価を行った、58の頭頸部癌生検材料における遺伝子発現を定量化することにより特定した。このように、低酸素遺伝子発現分類指標を開発して、腫瘍の低酸素症を評価した。低酸素症分類指標を構築するために、58人の患者を、低pO2電極測定値の腫瘍を最も高い頻度で含む「強」低酸素症群と、残りの腫瘍を含む「弱」低酸素症群とに分割及び分類した(図2a)。この低酸素症順位付け腫瘍の正確な分割により、群内での平均遺伝子発現レベル間の距離が最も遠い可能性のある2群が得られ、これにより、遺伝子発現に関する最大の差別化が行われた。要するに、発現レベルにおける、群内変動に対する群間変動(B/W)の比(ratio of between to within variation)により群を決定した。最も高いB/W比は、「強」低酸素症群が、10の最も強い低酸素腫瘍で構成された時に得られた(図2b)。その後、別個の腫瘍は、別個の腫瘍の遺伝子発現レベルから、所定の群の平均遺伝子発現レベルまでの距離が最低となる所定の群(「強」又は「弱」低酸素症)に属するものとして分類される(分類及び表2、3、及び8についての情報は実施例2参照)。
【０３１６】
次に、最も適切な分類指標を構成するために、遺伝子の数を決定した。十分に確立された「leave-one-out」交差検定のアプローチを用いて、トレーニングセットからの各試料を、1つずつ、2群の何れかに属するものとして分類した。分類は、分類しようとする試料を除くトレーニングセットからの全試料に基づいて行った。58の試料それぞれを、29個、28個等の最も良く分割する遺伝子の組み合わせによりそれぞれ分類した。殆どの腫瘍を予め定められたものと同じ群に分類するために最適な遺伝子数は、15であることが判明した(図2c)。最終的な分類指標として、15遺伝子分類指標による58回の「leave-one-out」分類において最も高い頻度で存在した15の候補遺伝子(表2、3、7)を選択した(図2d)。
【０３１７】
作成した15遺伝子低酸素症分類指標の予後の関連性を検証するため、DAHANCA5試験のプラセボ群の患者からの156のHNSCC生検材料を、「強」又は「弱」低酸素症として分類した。これらの患者は、従来の放射線療法(62乃至68 Gy、2 Gy/fx、5fx/週)により、低酸素改質せずに治療していた。予後値は、図2eに示しており、ここで、「強」低酸素腫瘍を有すると分類された患者では、「弱」低酸素症に分類された患者と比較して、5年経過時の保険数理による局所腫瘍制御確率は有意に悪化していた(95% CI 1.24乃至2.90、p=0.003)。
【０３１８】
ニトロイミダゾールにより得た放射線療法の低酸素改質の予測可能性を試験するために、15遺伝子分類指標を、DAHANCA5試験に参加した患者の323のHNSCC生検材料全てに適用した。これらの患者は、従来の放射線療法と併せたプラセボ又はニモラゾール[4-[2-(5-nitro-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン]による低酸素改質に対してランダム化されており(図4)、ニモラゾールを受けた患者では、放射線療法後の局所腫瘍制御に関して、結果が有意に改善された(p=0.03)(図3a)。全体では、低酸素症分類指標により、114の腫瘍(35%)が「強」低酸素症として、209の腫瘍(65%)が「弱」低酸素症として分類された。リンパ節転移陽性の疾患が「弱」低酸素腫瘍に多いことを除けば、患者及び腫瘍の特性に関して、群に有意な違いは無かった(表5)。局所腫瘍制御における有意な差は、治療的介入を無視した場合、2群間に検出できなかった(p=0.07)(図3b)。しかしながら、「強」低酸素症として分類された群に注目すると(図3c)、放射線療法と併せてニモラゾールにより治療した患者では、プラセボ及び放射線療法により治療した患者と比較した時、5年後の局所腫瘍制御が有意に改善した(49%対18%、p=0.002)。「弱」低酸素症として分類された群では(図3d)、患者が放射線療法と併せて受けた治療がニモラゾールかプラセボかに関係なく、局所腫瘍制御に関して均一な予後が観察された(50%対44%、p=0.42)。低酸素症の分類に基づく遺伝子発現と、ニモラゾールによる治療との相互作用は、関連する予後パラメータ(T1-2対T3-4分類、N0対N1-3、HPV/p16陽性腫瘍対HPV/p16陰性腫瘍、性別、及び年齢)について調整した場合、有意となることが分かった(p=0分類、N0対N1-3、HPV/p16陽性腫瘍対HPV/p16陰性腫瘍、g.007)。Cox多変量回帰分析において、これは、「強」低酸素症と分類された群におけるニモラゾールでの追加治療による結果の改善及びハザード比0.44(95%CI0.27乃至0.73)と良好に相関しており、一方、「弱」低酸素症と分類された群において、ハザード比は0.97となった(95% CI 0.65乃至1.44)(表6)。これらの結果は、腫瘍のHPV/p16状態に影響されていない。DAHANCA5調査では、ニモラゾールによる低酸素改質が、予後の良好なHPV/p16陽性腫瘍の局所腫瘍制御に対して有益な効果を全く有していないことは既に明らかになっているため、妥当な説明は、こうした腫瘍における低酸素症の欠如となり得る。この仮説は、HPV/p16陰性腫瘍間と同様の、PV/p16陽性腫瘍間での「強」低酸素腫瘍の相対分布を特定した15遺伝子低酸素症分類指標によって裏付けできなかった(表5)。したがって、異なる予後の原因は、他の場所で探す必要があり、HPV/p16陰性腫瘍における放射線耐性癌幹細胞数の減少に関連し得ると思われる。
【０３１９】
15遺伝子低酸素症分類指標に基づく「強」低酸素腫瘍としての分類は、有意に不良な臨床転帰に関連すると結論される。この転帰は、放射線療法に低酸素症放射線増感剤ニモラゾールを追加することにより、「弱」低酸素腫瘍のものと等しいレベルに改善することができる。したがって、分類指標は、放射線療法の低酸素改質に対する候補HNSCC患者のサブグループを特定する。予後及び予測可能性の両方が達成されると共に、放射線療法の低酸素改質は、「強」低酸素腫瘍に分類された遺伝子発現を有する患者のサブグループに対してのみ準備するべきであることが示唆される。
【０３２０】
方法の概要
【０３２１】
低酸素応答性及びpH非依存型遺伝子は、微環境条件を操作した(0.1%対5%pO2及び7.4対6.3pH)インビトロで培養した扁平上皮癌腫の関連細胞株のマイクロアレイ解析(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)により同定した。インビボ検証は、細胞株を異種移植モデルに変換し、十分に確立された低酸素トレーサー及び[18F]FAZAによりガイドした低酸素及び非低酸素腫瘍領域における遺伝子発現を比較することにより実行した(ウィルコクソンの符号順位解析)。低酸素遺伝子発現分類指標は、58の以前に低酸素と評価されたホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)頭頸部腫瘍生検材料を「強」及び「弱」低酸素腫瘍に分けることにより構築した。形成された2群における遺伝子発現を定量化することにより、最高の識別能力を示した遺伝子を選択し、最終的な15遺伝子低酸素症指標を構成した。その後、別個の腫瘍を、その遺伝子発現の類似性が最も高い群(「強」又は「弱」低酸素症)に分類した。分類指標は、患者をランダム化して従来の放射線療法と併せてプラセボ又は低酸素改質剤ニモラゾールにより治療した、頭頸部癌の323のFFPE生検材料の別個のセットにおいて試験した。15遺伝子低酸素症分類指標が、放射線療法と組み合わせたニモラゾールが有益となる腫瘍のサブセットを特定可能であるかを、対数順位検定、Cox回帰分析、及び相互作用の試験により、分類された2群での臨床転帰及び低酸素改質に対する応答を比較することにより検証した。
【０３２２】
方法
【０３２３】
生体材料
【０３２４】
インビトロ実験は、ヒト扁平上皮癌腫細胞株UTSCC5、UTSCC14、UTSCC15(口腔癌)、FADUDD(下咽頭癌)、及びSiHa(子宮頚癌)に基づくものとした。インビボ検証用の異種移植腫瘍は、UTSCC33、FADUDD、又はSiHaの細胞株により生成した。低酸素症分類指標は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料(FFPE)として保存された58の以前に低酸素と評価された頭頸部癌生検材料から生成した。作成した分類指標の予後的及び予測的影響を試験するために、ランダム化二重盲検DAHANCA5試験からの323の保存用の声門上喉頭又は咽頭腫瘍試料(FFPE)を用いた。
【０３２５】
低酸素応答性pH非依存型遺伝子の特定
【０３２６】
対象遺伝子は、以前に公表されたインビトロ研究からのデータにより選択し、この研究では上述した細胞株を異なる酸素濃度及びpH(7.5又は6.3)の状態に置いた。遺伝子発現は、マイクロアレイ(Affymetrix-Human Genome U133 Plus 2.0 Array)により分析した。
【０３２７】
低酸素トレーサー及び低酸素異種移植組織の単離
【０３２８】
[18F]FAZAを、低酸素腫瘍領域(<10 mmHg)を明らかにする外因性トレーサーとして使用した。切除した腫瘍の凍結切片形成直後に、オートラジオグラフィーを-20℃で実行した。[18F]-FAZA陽性領域(H)及び[18F]-FAZA-陰性領域(N)の境界を定めることにより、コンピュータ支援(ImageGauge)1:1テンプレートを、腫瘍内部の低酸素状態を示すものとして作成した。切片5枚毎のHE染色に従って、可能な場合は壊死領域を避けて、区切られた領域を切り離した。複数の該当切片(但し各領域を表す)からの組織をプールし、qPCR定量化に十分な量の組織を得た。5枚毎の腫瘍切片は、RNA抽出、cDNA調製、及びqPCRの前に全体(M領域)を残した。全ての切片は、RNAlater-ICEにおいて、切り離しの前に-80℃で保存した。
【０３２９】
遺伝子発現の定量
【０３３０】
製造業者の指示に従い、RNeasyキット(Quiagen)を用いて、新鮮な凍結組織からのRNAを抽出し、High Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems、ABI) を用いてcDNAを生成した。対象となる転写物を検出するために、全ての潜在的な分類指標及び基準遺伝子に対して、TaqMan Gene Expressionアッセイ(ABI) を用いた(表7)。反応は、ABI Prism 7900 Sequence Detector (ABI) 上で実行し、重複しておこなった。結果は、インビトロでの研究及びRealTime Statminer(Intergromics)において利用可能なgeNORM Visual Basicアプリケーションに基づいて選択した3つの基準遺伝子RPL37A、ACTR3、及びNDFIP1により標準化した。異種移植片での研究において、データは、Comparative CT法を用いて解析した。FFPE腫瘍生検材料から、全RNAを、VERSANT Tissue Preparation Reagentを用いたロボット式Tissue Preparation System(Siemens Healthcare Diagnostics、ニューヨーク州タリタウン)上でRNA用のシリカビーズに基づく完全自動単離方法により抽出した。このシステムは、僅か1個の5乃至10μm全FFPE組織切片から、古典的なキシレン脱パラフィンステップを行うことなく、全核酸を抽出する。100μlの最終的な溶出液は、自動化されたDNaseI処理ステップにより消化し、正確な発現プロファイルを行った。10サイクルの前増幅ステップを、RT-qPCR前に製造業者の詳細説明書(TaqMan PreAmp、ABI) にしたがって実行した。結果は、上述した3つの基準遺伝子により標準化した。35を超える、或いは標準偏差が0.3を上回るCt値は、排除し、空のウェルとして解釈した。RealTime Statminer (Intergromics)を用いて、ΔCt値を計算した。遺伝子発現レベルは、2-ΔCtとして定量化し、log2変換を行って、分類指標を構築した。
【０３３１】
統計的分析
【０３３２】
異種移植片腫瘍のH、N、及びM領域は、ウィルコクソンの符号順位分析により比較した。独立データセットにおける分類指標の評価に用いたエンドポイントは、5年経過時の保険数理による局所腫瘍制御確率とし、放射線療法後の原発腫瘍(T部位)及び所属リンパ節(N部位)における疾患の完全且つ永続的な消失と定義した。腫瘍が再発した場合、又は腫瘍が完全に消失することが無かった場合、失敗を記録した。追跡調査は、元の研究の一部として完了させた。全ての患者を少なくとも5年間又は死亡まで観察した。低酸素症分類指標により区分した「強」及び「弱」低酸素症群の患者及び腫瘍の特性は、カテゴリ変数に対するカイ二乗検定を用いて比較した。2群における局所腫瘍制御は、カプラン・マイヤプロットにより示し、対数順位検定を用いて比較した。Cox多変量比例ハザード解析を用いて、腫瘍特性の非依存性及び予後有意性を評価した。解析に含めたパラメータは、腫瘍及びリンパ節の分類、腫瘍の部位、性別、中央値より上又は下の年齢、ニモラゾール対プラセボ、HPV/p16の状態、及び15遺伝子低酸素症分類指標により分類した低酸素症状態である。統計的分析は、STATA10ソフトウェアにより行った。全てのp値は、有意水準5%の両側検定のものである。ハザード比(HR)は、95% CIと共に提示している。
【０３３３】
【表４】
2014518616.tif 000016
【０３３４】
【表５】
2014518616.tif 000017
【０３３５】
【表６】
2014518616.tif 000018
【０３３６】
【表７】
2014518616.tif 000019
【０３３７】
実施例2
【０３３８】
58のHNSCC試料(トレーニングセット)の「強」及び「弱」低酸素症群への分割
【０３３９】
58のHNSCC試料は、転移リンパ節において取得したpO2電極測定値の相対数により予め順位付けした。以前に検証した低酸素応答性遺伝子の実績に基づいて、患者を 「強」及び「弱」低酸素症群に分割することを選択した。群内変動(W)に対する群間変動(B)の比(B/W)を用いて、試料の識別に有用な遺伝子を選択した。2群を互いに分離する各遺伝子の能力は、B/W比により記述することができる。比が高いほど、対象となる遺伝子の発現における2群間の距離が大きくなる。したがって、別個の試料を一方の群に分類する力は、B/W比が低い場合と比べ、B/W比が高い方が有利となる。遺伝子間で最も高いB/W比が観察されたところでpO2により順位付けた患者の分割を選択することにより、作成した分類指標の能力が大きくなるようにした。
【０３４０】
B/W比:
【数１１】
2014518616.tif 000020
Kは群の数、iはi番目の群、zは全試料の平均である(合計はn)。Bは、群iの平均が全体の平均とどのくらい離れているかの加重和である。
【数１２】
2014518616.tif 000021
si2は、群iの分散の推定値である。Wは、共通分散を構成する分散推定値の加重和である。
【０３４１】
別個の試料の分類
【０３４２】
新たな別個の試料を分類するために、新たな試料から既存の試料(トレーニングセット試料及び所定の群)までの距離を測定した。分類指標内のM個の遺伝子のそれぞれについて、新たな試料の発現値と所定の2群内の試料の平均との間の距離(D)をそれぞれ計算した。
【数１３】
2014518616.tif 000022
ここで、mは、M個の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは群、zは群の平均、Wは算出された共通分散、yは分類された試料の遺伝子発現である。
【０３４３】
最小のDが計算されたグループiは、分類中の試料に最も類似しているため、試料は、この群に属するものとして分類される。
【０３４４】
実施例3
【０３４５】
表8. ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aに相関させた平均(-ΔCt)値(zim)及び分散(Wm)。平均値は、各試験遺伝子及び基準遺伝子間の発現レベルにおけるlog2変換した倍率差として表現している。倍率差は、2-ΔCtとして計算している。ΔCtは、試験遺伝子のCt値から基準遺伝子のCt値を減算したものとして計算している。基準遺伝子のCt値は、3個の基準遺伝子のそれぞれのCt値の幾何平均である。Ct値(サイクル閾値)は、蛍光シグナルが特定の閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める。閾値は、基線変動に基づいて選択された任意の蛍光レベルである。
【表８】
2014518616.tif 000023
【０３４６】
実施例4
【０３４７】
本発明の遺伝子の発現レベルは、強低酸素及び弱低酸素性癌からの細胞のホルマリン試料においてそれぞれ判定しており、したがって、本発明による所定の強低酸素症群及び所定の弱低酸素症群を表す。試験した試料の幾何平均ΔCt値、分散、及び推定共通分散を計算した。
【０３４８】
【表９】
2014518616.tif 000024
【０３４９】
D値は、次の一般式により計算され、
【数１４】
2014518616.tif 000025
ここで、mは、1乃至15個の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、群(強又は弱低酸素症)であり、zは、群の平均(表2及び3に示したもの等)であり、Wは、算出された共通分散であり、yは、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aの平均発現に相関させた、分類試料の遺伝子発現である。癌の低酸素プロフィールを判定するためには、表9の15個の遺伝子のうち1つ又は複数を用いて、両方の群のD値を計算する必要がある。例えば、最初の4個の遺伝子ADM、ANKRD37、P4H4、及びNDRG1に対する表9の値を用いて、Dmore及びDlessは、次のように計算される。
【数１５】
2014518616.tif 000026
【数１６】
2014518616.tif 000027
【０３５０】
同様に、15個の遺伝子全て、更には、1乃至15の任意の中間数の遺伝子についての値を使用することができる。計算値に基づいて、癌の酸素状態は、「強低酸素症群」に対する表9のΔCt及び分散値に基づいて計算されたDmoreが、「弱低酸素症群」に対する、同じ遺伝子の対応するΔCt及び分散値に基づいて計算されたDlessより低い場合、低酸素/(強)低酸素症として分類される。反対に、癌の酸素状態は、「弱低酸素症群」に対する表9のΔCt及び分散値に基づいて計算されたDlessが、「強低酸素症群」に対する、同じ遺伝子の対応するΔCt及び分散値に基づいて計算されたDmoreより低い場合、高酸素/(弱)低酸素症として分類される。
【０３５１】
配列
【０３５２】
【表１０−１】
2014518616.tif 000028
【表１０−２】
2014518616.tif 000029
【表１０−３】
2014518616.tif 000030
【表１０−４】
2014518616.tif 000031
【表１０−５】
2014518616.tif 000032
【表１０−６】
2014518616.tif 000033
【表１０−７】
2014518616.tif 000034
【表１０−８】
2014518616.tif 000035
【表１０−９】
2014518616.tif 000036
【表１０−１０】
2014518616.tif 000037
【０３５３】
項目
【０３５４】
以下の項目は、本発明の好適な実施形態を表す。
【０３５５】
1.個体の癌の酸素状態を判定する方法であって、
i) 癌細胞を含む試料において、
ii) ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及び前記遺伝子の何れかの変異体からなる群から選択された少なくとも1個の遺伝子の転写発現レベルを決定するステップと、
iii) ii) の少なくとも1個の遺伝子の前記転写発現レベルを、少なくとも1個の基準遺伝子と相関させるステップと、
iv) iii) の被相関転写発現レベルを、
高い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料、及び
低い酸素レベルを特徴とする癌細胞を含む所定の基準試料
のii) と同じ1個又は複数の遺伝子の同じ被相関転写発現レベルと比較することにより、酸素状態を評価するステップと、を備える方法。
2.酸素状態は、 iii) の被相関転写発現レベルと、高い酸素レベルを有する所定の基準試料及び低い酸素レベルを有する所定の基準試料の、同じ1個又は複数の遺伝子の同じ被相関転写発現レベルとの差(D)を計算することにより評価され、
【数１７】
2014518616.tif 000038
ここで、mは、ii) の遺伝子のうち、m番目の遺伝子を示し、iは、「低酸素」又は「高酸素」基準試料を示し、zは、基準試料の平均発現レベル、Wは、算出された共通分散、yは、癌細胞を含む試料の転写遺伝子発現であり
癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、高酸素レベルを有し、
癌細胞を含む試料と低酸素基準試料との間の距離(D)が癌細胞を含む試料と高酸素基準試料との間の距離(D)よりも小さい場合、i) の試料は、低酸素レベルを有する、項目1記載の方法。
3.ii) の前記転写発現レベルは、定量的PCR(qPCR)により決定される、先行項目の何れかに記載の方法。
4.ii) の少なくとも1個の遺伝子の前記転写発現レベルは、少なくとも1個、例えば3個の、基準遺伝子のそれぞれのサイクル閾値(Ct)の幾何平均を、ii) の少なくとも1個の遺伝子のCt値から減算することによりΔCtを求め、2-ΔCtを計算することにより、ii) の遺伝子の発現値を、前記基準遺伝子に対する倍率差に変換し、倍率差をlog2変換して遺伝子発現値(y)を求めることにより、前記少なくとも1個の基準遺伝子と相関させ、ここで、Ct値は、qPCR蛍光シグナルが基線変動に基づいて選択された閾値を超えるまでに要したサイクル数として定める、項目3記載の方法。
5.前記少なくとも1個の基準遺伝子は、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37のうちの1個又は複数である、先行項目の何れかに記載の方法。
6.前記少なくとも1個の基準遺伝子は、ACTR3、NDFIP1、及びRPL37Aである、項目5記載の方法。
7.前記試料は、生検材料である、先行項目の何れかに記載の方法。
8.前記試料は、ホルマリン固定されている、先行項目の何れかに記載の方法。
9.癌細胞は、低酸素細胞である、先行項目の何れかに記載の方法。
10.癌細胞は、扁平細胞癌の細胞である、先行項目の何れかに記載の方法。
11.癌細胞は、扁平上皮癌の細胞である、先行項目の何れかに記載の方法。
12.前記扁平上皮癌は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択される、項目10記載の方法
13.前記癌細胞は、扁平上皮癌腫である、先行項目の何れかに記載の方法。
14.前記扁平上皮癌は、頭頸部癌である、先行項目の何れかに記載の方法。
15.前記頭頸部癌は、口、口唇の癌、鼻腔癌、及び鼻咽腔癌からなる群から選択される、項目14記載の方法。
16.ADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、BNIP3L (SEQ ID NO:5)、BNIP3 (SEQ ID NO:4)、EGLN3 (SEQ ID NO:7)、PDK1 (SEQ ID NO:13)、PFKFB3 (SEQ ID NO:14)、KCTD11 (SEQ ID NO:8)、ALDOA (SEQ ID NO:2)、及びその変異体からなる群から選択された少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、更に好ましくは少なくとも4個、更により好ましくは少なくとも5個の遺伝子の転写発現レベルを、ステップii) において決定する、先行項目の何れかに記載の方法。
17.少なくともADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、及び/又はその変異体の転写発現レベルを、ステップii) において決定する、先行項目の何れかに記載の方法。
18.少なくともADM (SEQ ID No:1)、ANKRD37 (SEQ ID NO:3)、P4HA2 (SEQ ID NO:12)、NDRG1 (SEQ ID NO:10)、SLC2A1 (SEQ ID NO:15)、P4HA1 (SEQ ID NO:11)、LOX (SEQ ID NO:9)、C3orf28 (SEQ ID NO:6)、及び/又はその変異体の転写発現レベルを、ステップii) において決定する、先行項目の何れかに記載の方法。
19.前記変異体は、前記遺伝子の核酸配列に対して、少なくとも95%、好ましくは少なくとも99%の同一性を有する任意の核酸配列である、先行項目の何れかに記載の方法。
20.癌を改善及び/又は治療する方法であって、
a.個体から癌の試料を取得するステップと、
b.項目1乃至19の何れかに定めた方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
c.低酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
d.低酸素改質剤を治療的に有効な量で前記個体に投与するステップと、を備える方法。
21.前記癌は、低酸素レベルを特徴とする、項目20記載の方法。
22.前記低酸素改質剤は、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される、項目20乃至21の何れかに記載の方法。
23.前記低酸素改質剤は、ニモラゾール、ミソニダゾール、及びドラニダゾールからなる群から選択される、項目20乃至21の何れかに記載の方法
24.前記低酸素改質剤は、ニモラゾール(4-[2-(5-ニトロ-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン)である、項目20乃至23の何れかに記載の方法。
25.方法は、更に、前記個体に放射線療法を施すステップを備える、項目20乃至24の何れかに記載の方法。
26.前記放射線療法は、単一又は複数の分割単位で行われる、項目25記載の方法。
27.低酸素改質剤は、前記放射線療法の前又は前記放射線療法と同時に投与される、項目25記載の方法。
28.方法は、更に、追加化合物を投与するステップを備える、項目20乃至27の何れかに記載の方法。
29.前記追加化合物は、抗増殖及び/又は抗悪性腫瘍剤である、項目28記載の方法。
30.前記少なくとも1つの追加化合物は、放射線増感剤である、項目28記載の方法。
31.癌を改善及び/又は治療する方法であって、
i) 前記個体から癌の試料を取得するステップと、
ii) 項目1乃至19に何れかに定めた方法により前記癌の酸素状態を判定するステップと、
iii) 高酸素レベルを特徴とする癌を有する個体を選択するステップと、
iv) 前記個体に対して、低酸素改質剤を投与せずに放射線療法を施すステップと、を備える。
32.前記癌は、高酸素レベルを特徴とする、項目31記載の方法。
33.癌の治療用の低酸素改質剤又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
34.前記癌は、低酸素レベルを特徴とする、項目33記載の医薬組成物。
35.前記低酸素改質剤は、HBO、カルボゲン、ARCON、輸血、EPO、2,3-DPG、2,3-ジホスホグリセリン酸、ニコチンアミド、MMC、TPZ、AQ4N、PR-104、LCQ-1、RH1、インジスラム、スルホンアミド、スルファミン酸塩、スルファミド、腫瘍溶解性バクテリア、アバスチン、DC101、チミジンキナーゼ阻害剤、CA4O OXi4503、DMXAA、ニモラゾール、MISO、及びDORAからなる群から選択される、項目33及び34の何れかに記載の医薬組成物。
36.前記低酸素改質剤は、ニモラゾール、ミソニダゾール、及びドラニダゾールからなる群から選択される、項目33及び35の何れかに記載の医薬組成物。
37.前記低酸素改質剤は、ニモラゾール(4-[2-(5-ニトロ-1H-イミダゾール-1-yl)エチル]モルホリン)である、項目33及び36の何れかに記載の医薬組成物。
38.癌の治療用の薬剤を製造するための低酸素改質剤の使用。
39.前記癌は、低酸素レベルを特徴とする、項目38記載の使用。
40.前記酸素レベルは、項目1乃至19の何れかに定めた方法により決定される、項目20乃至30の何れかに記載の方法、項目31乃至32の何れかに記載の方法、項目33乃至37の何れかに記載の医薬組成物、及び項目38乃至39の何れかに記載の使用。
41.前記癌は、扁平細胞癌である、項目20乃至30の何れかに記載の方法、項目31乃至32の何れかに記載の方法、項目33乃至37の何れかに記載の医薬組成物、及び項目38乃至39の何れかに記載の使用。
42.前記癌は扁平上皮癌である、項目41記載の方法、組成物、及び使用。
43.前記扁平上皮癌は、頭頸部、皮膚、食道、膀胱、前立腺、肺、腟、及び子宮頸の扁平上皮癌からなる群から選択される、項目42記載の方法、組成物、及び使用。
44.前記扁平上皮癌は、扁平上皮癌腫である、項目42記載の方法、組成物、及び使用。
45.前記扁平上皮癌は、頭頸部癌である、項目42記載の方法、組成物、及び使用。
46.前記頭頸部癌は、口、口唇の癌、鼻腔癌、及び鼻咽腔癌からなる群から選択される、項目45記載の方法、組成物、及び使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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