(57)【要約】    【課題】本発明は、従来の多くの合成殺菌剤より毒性が低く、いずれの化合物を個別に散布する場合よりも低量で散布できる成分を含む、毒性が低く、抵抗誘導性が低く、有効性の高い殺菌剤組成物を提供することを課題とする。    【解決手段】本発明は、ポリエン系殺菌剤と、少なくとも１つのリポペプチドとの相乗的殺菌剤の組み合わせを含む組成物、及び病原真菌の制御に前記組成物を使用する方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエン系殺菌剤及び少なくとも１つのリポペプチドの相乗的殺菌剤の組み合わせを含む組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのリポペプチドが、イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物、フェンジシン型化合物及びフサリシジンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも１つのリポペプチドが、１つ又は複数のイチュリン型化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのリポペプチドが、１つ又は複数のフェンジシン型化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのリポペプチドが、１つ又は複数のサーファクチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
イチュリン型化合物が、イチュリンＡである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
イチュリン型化合物が、バシロマイシンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのリポペプチドが、フサリシジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも２つのリポペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのリポペプチドが、イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物及びフェンジシン型化合物からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのリポペプチドが、イチュリン、サーファクチン及びフェンジシン型化合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのリポペプチドが、リポペプチド含有発酵産物の一部又は抽出物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポペプチド含有発酵産物が、バチルス属の種の細菌に由来する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記バチルス属の種の細菌が、枯草菌又はバチルス・アミロリクエファシエンスからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記枯草菌が、枯草菌ＱＳＴ７１３及びその変異株からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナタマイシン又はその誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナイスタチン又はその誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ポリエン系殺菌剤が、アムホテリシンＢ又はその誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリエン系殺菌剤が、オーレオファンギン又はその誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリエン系殺菌剤が、フィリピン又はその誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリエン系殺菌剤が、ルセノソマイシン又はその誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約５００：１〜約１：５００である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約１００：１〜約１：１００である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約１０：１〜約１：１０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約５：１〜約１：５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約２：１〜約１：２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約１：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
ポリエン系殺菌剤と少なくとも１つのリポペプチドの相乗作用を有する組み合わせを含む組成物を、処置を必要とする領域に有効量適用する工程を含む、病原真菌を制御するための方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのリポペプチドが、イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物、フェンジシン型化合物及びフサリシジンからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのリポペプチドが、１つ又は複数のイチュリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのリポペプチドが、１つ又は複数のサーファクチンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのリポペプチドが、１つ又は複数のフェンジシン型化合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナタマイシン又はその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナイスタチン又はその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリエン系殺菌剤が、アムホテリシンＢ又はその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリエン系殺菌剤が、オーレオファンギン又はその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリエン系殺菌剤が、フィリピン又はその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリエン系殺菌剤が、ルセノソマイシン又はその誘導体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約５００：１〜約１：５００である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約１００：１〜約１：１００である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約１０：１〜約１：１０である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約５：１〜約１：５である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約２：１〜約１：２である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリエン系殺菌剤と前記少なくとも１つのリポペプチドとの重量比が、約１：１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのリポペプチドが、リポペプチド含有発酵産物の一部又は抽出物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記リポペプチド含有発酵産物が、バチルス属の種の細菌に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記バチルス属の菌が、枯草菌ＱＳＴ７１３及びその変異株である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記領域が収穫後の食品であり、前記病原真菌が収穫後病原体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
前記収穫後病原体が、ペニシリウム属の種又はジオトリクム属の種である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリエン系殺菌剤がナタマイシンであり、前記少なくとも１つのリポペプチドが、イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物、及びフェンジシン型化合物からなる群から選択される、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記領域が植物、根、種子又は植物周囲の土壌であり、前記病原真菌が植物病原真菌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５２】
前記領域が食品又は飼料であり、前記ポリエン系殺菌剤がナタマイシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項５３】
前記領域がヒト又は動物であり、前記病原真菌がカンジダ属である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナイスタチンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記領域がヒト又は動物であり、前記病原真菌がコウジカビ属の種又はフザリウム属の種であり、前記ポリエン系殺菌剤がナタマイシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項５６】
対象の真菌感染の治療又は予防の方法であって、ポリエン系殺菌剤及び少なくとも１つのリポペプチドの相乗作用を有する組み合わせを含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５７】
前記対象がヒト又は動物であり、前記真菌感染がカンジダ属によって引き起こされる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナイスタチンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記真菌感染が、フザリウム属の種又はコウジカビ属の種によって引き起こされる、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリエン系殺菌剤が、ナタマイシンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ポリエン系殺菌剤及びリポペプチド含有発酵産物を含む組成物。
【請求項６２】
前記リポペプチド含有発酵産物が、バチルス属の種の細菌に由来する、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
ポリエン系殺菌剤及びリポペプチド含有発酵産物を含む組成物を、処置を必要とする領域に適用する工程を含む、病原真菌を制御するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、ポリエン系殺菌剤と、両親媒性の環状リポペプチドなどの抗生物質性非リボソーム型ペプチドとの、両成分の殺菌活性を高めるための相乗的組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  殺菌剤には、作物保護用、食品、飼料、化粧品保存料として、また人間及び動物双方に応用するための医薬品として無数の用途がある。収穫量の減少、食品媒介性疾患、及び人間及び動物双方の真菌感染は、先進国、途上国のいずれでも問題になっている。そのため、既存の殺菌剤、特に環境に優しく、かつ真菌の耐性を作りにくいものの有効性向上が強く望まれる。
【０００３】
[0003]  ポリエン系殺菌剤は、上述のすべての分野で使用されてきた抗真菌性抗生物質である。これは、ストレプトミセス・ナタレンシス（Streptomyces natalensis）などの、土壌中に広く見られるストレプトミセス属の種の発酵を通じて得られる。ポリエン系殺菌剤の活性の一部は、エルゴステロールとの複合体形成による細胞膜損傷能力に由来する。多数の研究により、真菌がナタマイシン耐性を獲得する可能性は非常に低いことが確認されている。更に、ポリエン系殺菌剤は哺乳動物の細胞中にあるコレステロールに影響しないため、その毒性は無視できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]  サーファクチン、イチュリン（iturin）、及びフェンジシン（fengycin）などの両親媒性環状リポペプチドを含む非リボソーム型ペプチドは、その抗菌特性が広く認められ、作物保護の分野で使用されてきた。その作用機序のため、バイオ医薬品及びその他のバイオ技術用途に利用できる可能性もある。リポペプチドは、枯草菌及びバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）を含む多様な土壌細菌の発酵を通じて得られる。リポペプチドは、ポリエン系殺菌剤と同様に、細胞膜を破壊することによって真菌を殺す。これらの化合物は、一部位のタンパク質標的にではなく膜の脂質に直接作用するため、真菌がこれに対する耐性を獲得する可能性は非常に低いと予想される。更に、リポペプチドは環境に優しく、作業員及び消費者へのリスクが低いため、実際に、リポペプチドを含むバチルス属の株で処置された作物は処置の当日に収穫することができる。出願人は、ポリエン系殺菌剤とリポペプチドの組み合わせが、真菌などの微生物に対する有効性を、単に相加的にではなく相乗的に向上させることを発見した。出願人は、いかなる理論にも拘束されるものではないが、それぞれのタイプの化合物が異なる作用機序を通じて真菌の細胞膜を破壊することから、本発明のリポペプチドとポリエン系殺菌剤が相乗的な殺菌方法で作用するとの仮説を立てる。
【０００５】
[0005]  本発明は、従来の多くの合成殺菌剤より毒性が低く、いずれの化合物を個別に散布する場合よりも低量で散布できる成分を含む、毒性が低く、抵抗誘導性が低く、有効性の高い殺菌剤組成物を提供する。この殺菌剤組成物は、１つ又は複数のポリエン系殺菌剤と少なくとも１つのリポペプチドとの相乗的殺菌剤の組み合わせを含む。
【０００６】
一実施形態では、ポリエン系殺菌剤は、ナタマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、オーレオファンギン、フィリピン、ルセノソマイシン、及び／又はこれらのポリエン系殺菌剤それぞれの誘導体のうちの１つ又は複数である。別の実施形態では、組成物は２つ以上のポリエン系殺菌剤を含む。
【０００７】
[0006]  この相乗的殺菌剤の組み合わせのうちリポペプチド成分は、リポペプチド生成微生物によって産出される発酵産物の一部であっても、上記殺菌性発酵産物の粗抽出物であっても、又は上記発酵産物の精製物若しくは半精製物であってもよい。他の実施形態では、リポペプチドは、合成物又は半合成物（すなわち、母体のリポペプチドを微生物から得て誘導されたもの）である。ある実施形態では、リポペプチド生成微生物はバチルス属の種の細菌である。他の実施形態では、リポペプチド生成微生物はストレプトミセス属の細菌である。更に他の実施形態では、パエニバチルス属の種の細菌である。
【０００８】
[0007]  特定の例では、リポペプチド生成微生物は、枯草菌、バチルス・アミロリクエファシエンス、又は１つ又は複数のリポペプチドを生成する任意の他のバチルス属の種である。更に別の例では、上記バチルス属の種によって生成されたリポペプチドは、サーファクチン型化合物、イチュリン型化合物、及びフェンジシン型化合物のうち１つ又は複数の族に属する。リポペプチドを生成するバチルス属の種の幾つかは、「発明を実施するための形態」で記載されている（例：アミロリクエファシエンス、セレウス（cereus）、チューリンゲンシス（thuringiensis）、コアグランス（coagulans）、プミルス（pumilus）、リケニフォルミス（licheniformis））。その他は当業者には既知である。特定の例では、リポペプチド生成微生物は枯草菌ＱＳＴ７１３である。一実施形態では、組成物はポリエン系殺菌剤成分とリポペプチド含有発酵産物を含む。１つの例では、リポペプチド含有発酵産物は、上記細菌などのバチルス属の種の細菌に由来する。
【０００９】
[0008]  ある実施形態では、本発明の組成物のリポペプチド成分は、以下の化合物、すなわち、サーファクチン型化合物、フェンジシン型化合物、イチュリン型化合物、及びフサリシジンのうちもう１つを含む。本発明に適したイチュリン型化合物は、以下の化合物、すなわち、バシロマイシンＤ、バシロマイシンＦ、バシロマイシンＬ、バシロマイシンＬＣ（バシロペプチンとしても知られている）、マイコサブチリン、イチュリンＡ、イチュリンＡ１、及びイチュリンＣ（本明細書では、化合物の後三者を総称してイチュリンという）のうち１つ又は複数を含む。本発明に適したフェンジシン型化合物は、米国特許第６，２９１，４２６号に記載されているようなフェンジシンＡ、フェンジシンＢ、プリパスタチンＡ、プリパスタチンＢ、プリパスタチン類及びアグラスタチン類である（本明細書では、化合物の後四者を総称してプリパスタチンという）。本発明に適したサーファクチン型化合物は、エスペリン、リケニシン、プミラシジン及びサーファクチンである。特定の実施形態では、リポペプチド成分は、イチュリンＡ類、マイコサブチリン、及び／又はバシロマイシンなどのイチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及びサーファクチンのうち１つ又は複数を含む。更に別の実施形態では、リポペプチド成分は、以下の化合物、すなわち、イチュリン、フェンジシン型化合物及びサーファクチンのうち少なくとも２つの化合物を含む。
【００１０】
[0009]  ある実施形態では、相乗的殺菌剤の組み合わせは、１つのポリエン系殺菌剤と、１つ又は複数のリポペプチドとを含む。別の実施形態では、相乗的殺菌剤の組み合わせは、１つのポリエン系殺菌剤と、２つ以上のリポペプチドを含む。リポペプチドは、以下の化合物族、すなわち、サーファクチン型化合物、イチュリン型化合物、及び／又はフェンジシン型化合物のうち１つ又は複数に属する１つ又は複数の化合物であってもよい。１つの例では、リポペプチドは、１つ又は複数のイチュリン、及び／又は１つ又は複数のフェンジシン型化合物、及び／又はサーファクチンを含む。一実施形態では、組成物のポリエン系殺菌剤成分はナタマイシン又はナイスタチンであり、リポペプチド成分はイチュリン（Ａ、Ｂ及び／又はＣ）、バシロマイシン、サーファクチン、フサリシジン、及び／又はフェンジシン型化合物を個別に又は組み合わせて含む。１つの特定の例では、リポペプチドは、リポペプチドを生成するバチルス属の種の細菌の発酵産物を半精製又は精製したものである。本実施形態の更に別の例では、ポリエン系殺菌剤は、ナタマイシン若しくはその誘導体、又はナイスタチン若しくはその誘導体である。
【００１１】
[0010]  組成物のポリエン系殺菌剤成分とリポペプチド成分（例えば、リポペプチド含有発酵培養物、リポペプチド含有粗抽出物、精製又は半精製リポペプチド抽出物、又は化学合成した若しくは誘導された純粋リポペプチド）との重量比は、約５００：１〜１：５００である。一実施形態では、ナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体と、サーファクチン型化合物、イチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及び／又はフサリシジンのうち１つ又は複数の化合物族に属する１つ又は複数の化合物を含むリポペプチド成分との重量比は、約５００：１〜約１：５００である。特定の一実施形態では、ナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体と、イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物、及び／又はフェンジシン型化合物の組み合わせを含むリポペプチド成分との重量比は、約５００：１〜約１：５００である。ある実施形態では、ナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体と、イチュリンＡ類及び／又はバシロマイシンなどの１つ又は複数のイチュリン型化合物を含むリポペプチド成分との重量比は、約５００：１〜約１：５００である。他の実施形態では、ナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体と、フェンジシン型化合物を含むリポペプチド成分との重量比は、約５００：１〜約１：５００である。更に他の実施形態では、ナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体と、サーファクチンなどのサーファクチン型化合物を含むリポペプチド成分との重量比は、約５００：１〜約１：５００である。一実施形態では、ナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体と、フェンジシン型化合物、イチュリン型化合物、及び／又はサーファクチン型化合物を含む発酵培養液を含めて、発酵培養液からのリポペプチド粗抽出物との重量比は、約１：５００〜約５００：１である。ある実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド成分との上述のいずれかの組み合わせの重量比は、約１００：１〜約１：１００であり、他の実施形態では、約１０：１〜約１：１０であり、更に他の実施形態では、約５：１〜約１：５であり、更に他の実施形態では、約２：１〜約１：２であり、更に他の実施形態では、１：１である。
【００１２】
[0011]  一実施形態では、ポリエン系殺菌剤成分はナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体であり、リポペプチド成分は、以下のもの、すなわち、（ｉ）イチュリン、（ｉｉ）バシロマイシン、（ｉｉｉ）マイコサブチリン、（ｉｖ）エスペリン、（ｖ）リケニシン、（ｖｉ）プミラシジン、（ｖｉｉ）サーファクチン、（ｖｉｉｉ）フェンジシンＡ、（ｉｘ）フェンジシンＢ、（ｘ）プリパスタチンＡ、（ｘｉ）プリパスタチンＢ、及び／又は（ｘｉｉ）アグラスタチンのうち１つ又は複数を含む。上記実施形態の別の例では、組成物からサーファクチンが除外される。更に別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤成分はナタマイシン若しくはその誘導体又はナイスタチン若しくはその誘導体であり、リポペプチド成分は、以下のもの、すなわち、（ｉ）イチュリン、（ｉｉ）サーファクチン、（ｉｉｉ）フェンジシン、及び／又は（ｖ）プリパスタチンのうち１つ又は複数を含む。この実施形態の別の例では、ナタマイシン又はナイスタチンの誘導体は、親化合物と同等又はそれ以上の殺菌活性を有する。
【００１３】
[0012]  本発明の組成物は、多様な真菌制御用途に有用である。上記組成物は、植物病原真菌、収穫後病原真菌、食品又は飼料の病原真菌、及びヒト病原真菌の制御に使用することができる。
【００１４】
[0013]  一実施形態では、上記組成物のいずれかを、組成物を植物、植物周辺領域、又は食用栽培キノコ、キノコの種菌、キノコ用配合土に散布することによって、フザリウム属の種、ボトリチス属の種、バーティシリウム属の種、リゾクトーニア属の種、トリコデルマ属の種、及びクサレカビ属の種などの標的病原体の制御に使用する。一実施形態では、上記病原体の制御に使用される本発明の組成物のポリエン系殺菌剤成分は、ナタマイシン又はその誘導体である。別の実施形態では、同成分はナイスタチン又はその誘導体である。
【００１５】
[0014]  別の実施形態では、本発明の組成物は、ペニシリウム属、ジオトリクム属、クロカビ、及びコレトトリチュム属の種などの収穫後病原体の制御に使用される。一実施形態では、上記病原体の制御に使用される組成物のポリエン系殺菌剤成分は、ナタマイシン又はその誘導体である。別の実施形態では、同成分はナイスタチン又はその誘導体である。
【００１６】
[0015]  更に別の実施形態では、本発明の組成物は、ペニシリウム属の種、コウジカビ属の種、及びフザリウム属の種などの食品又は飼料に発生する病原真菌の制御に使用される。一実施形態では、上記病原体の制御に使用される組成物のポリエン系殺菌剤成分は、ナタマイシン又はその誘導体である。別の実施形態では、同成分はナイスタチン又はその誘導体である。更に別の実施形態では、リポペプチド成分は、１つ又は複数のリポペプチドの精製抽出物である。
【００１７】
[0016]  更に別の実施形態では、本発明の組成物は、ポリエン系殺菌剤と少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を対象に投与することによって、対象の真菌感染の治療又は予防に使用される。一実施形態では、カンジダ属によって真菌感染が引き起こされ、組成物中で使用されるポリエン系殺菌剤はナイスタチン又はその誘導体である。別の実施形態では、カンジダ属によって真菌感染が引き起こされ、組成物中で使用されるポリエン系殺菌剤はナタマイシン又はその誘導体である。別の実施形態では、真菌感染はフザリウム属又はコウジカビ属によって引き起こされ、角膜感染の場合がある。上記例では、組成物中で使用されるポリエン系殺菌剤成分はナタマイシン又はその誘導体である。角膜感染の治療に組成物を使用する別の例では、ポリエン系殺菌剤成分はナイスタチン又はその誘導体である。更に別の例では、組成物のリポペプチド成分は、１つ又は複数のリポペプチドの精製抽出物である。
【００１８】
[0017]  本発明はまた、１つ又は複数のポリエン系殺菌剤を１つ又は複数のリポペプチドと組み合わせ、その組み合わせの標的真菌に対する相乗的有効性を試験し、上記組み合わせと担体を含む殺菌剤組成物を生産する方法も含む。一実施形態では、１つ又は複数のリポペプチドは、上記及び「発明を実施するための形態」で記載されている細菌などのバチルス属の種の細菌の発酵産物の一部又はその抽出物である。この実施形態の別の例では、組み合わせの作成に先立ち、バチルス属の種の株又はパエニバチルス属の種の株などのリポペプチド生成細菌を選択し、このリポペプチド生成細菌を使用してリポペプチドを含む発酵産物を生産し、上記発酵産物又はその抽出物を使用して組み合わせを作る。１つの例では、上記発酵産物は、以下のリポペプチド、すなわち、サーファクチン型化合物、フェンジシン型化合物、イチュリン型化合物、及び／又はフサリシジンのうち１つ又は複数を含む。更に特定の例では、上記発酵産物は、以下のリポペプチド、すなわち、サーファクチン、プリパスタチン、フェンジシン、イチュリン、及び／又はバシロマイシンのうち１つ又は複数を含む。別の実施形態では、各々のポリエン系殺菌剤成分及びリポペプチド成分は、組み合わせの作成に先立ち標的病原体に対する殺菌活性で選別され、少なくとも多少の殺菌活性を有するポリエン系殺菌剤とリポペプチド成分のみが組み合わせの作成に使用される。他の実施形態では、標的真菌は、フザリウム属、ボトリチス属、バーティシリウム属などの植物病原体；ペニシリウム属、ジオトリクム属などの収穫後病原体；コウジカビ属、フザリウム属、ペニシリウム属などの食品又は飼料の病原真菌；及びカンジダ属、コウジカビ属、フザリウム属などのヒト病原真菌である。サッカロミセス・セレビシエも、カンジダ属についてのモデルとして上記方法における標的病原体として使用できる。１つの例では、試験対象の組み合わせのポリエン系殺菌剤成分は、ナタマイシン若しくはその誘導体、又はナイスタチン及びその誘導体である。別の例では、試験対象のリポペプチドは、サーファクチン型化合物、イチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及び／又はフサリシジンのうち１つ又は複数である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[0018]（ｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３からのリポペプチド粗抽出物とナタマイシン、（ｉｉ）リポペプチド単独、又は（ｉｉｉ）ナタマイシン単独の存在下での、陰性対照（無処理）と比較したサッカロミセス・セレビシエの増加率（％）を示す。
【図２】[0019]（ｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉ）ナタマイシン、及び（ｉｉｉ）リポペプチドとナタマイシンの存在下での、陰性対照と比較したペニシリウム・エクスパンサムの増加率（％）を示す。
【図３】[0020]（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）ナタマイシン、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナタマイシンと各々の半精製若しくは精製リポペプチド又は全部の半精製若しくは精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照（負の対照）と比較したペニシリウム・エクスパンサムの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎ」はナタマイシンを指し、「粗リポ」はリポペプチド粗抽出物を指し、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を指し、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を指し、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【図４】[0021]（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナタマイシンと各々の半精製又は精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照と比較したジオトリクム・カンジダムの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎ」はナタマイシンを指し、「Ｌ」はリポペプチド粗抽出物を指し、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を指し、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を指し、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【図５】[0022]（ｉ）ナイスタチン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナイスタチンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナイスタチンと各々の半精製又は精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照と比較したジオトリクム・カンジダムの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎｙ」はナイスタチンを指し、「Ｌ」はリポペプチド粗抽出物を指し、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を指し、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を指し、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【図６】[0023]（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナタマイシンと各々の半精製又は精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照と比較したジオトリクム・シトリ‐アウランティの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎ」はナタマイシンを指し、「Ｌ」はリポペプチド粗抽出物を指し、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を指し、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を指し、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【図７】[0024]（ｉ）ナイスタチン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナイスタチンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナイスタチンと各々の半精製又は精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照と比較したジオトリクム・シトリ‐アウランティの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎｙ」はナイスタチンを指し、「Ｌ」はリポペプチド粗抽出物を指し、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を指し、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を指し、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【図８】[0025]（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナタマイシンと各々の半精製又は精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照と比較したサッカロミセス・セレビシエの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎ」はナタマイシンを指し、「Ｌ」はリポペプチド粗抽出物を指し、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を指し、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を指し、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【図９】[0026]（ｉ）ナイスタチン、（ｉｉ）リポペプチド粗抽出物、（ｉｉｉ）多様な半精製リポペプチド又は精製リポペプチド、（ｉｖ）ナイスタチンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせ、及び（ｖ）ナイスタチンと各々の半精製又は精製リポペプチドとの組み合わせの存在下での、陰性対照と比較したサッカロミセス・セレビシエの増加率（％）を示す。図中で使用される「Ｎｙ」はナイスタチンを指し、「Ｌ」はリポペプチド粗抽出物を、「Ｉ」は半精製イチュリン型化合物を、「Ｆ」は半精製フェンジシン型化合物を、また「Ｓ」は精製サーファクチン型化合物を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0027]  すべての公報、特許及び特許出願は、その中の図面及び付録を含め、各個別の公報又は特許出願を参照により組み込むものと具体的かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込むものとする。
【００２１】
[0028]  以下の説明は、本発明の理解に役立ち得る情報を含む。それは、本明細書に記載されている情報のいずれかが、本発明の先行技術若しくは関連技術であること、又は具体的に若しくは暗黙に参照される公報が先行技術であることを認めるものではない。
【００２２】
[0029]  本発明は、真菌、卵菌類及び／又は細菌などの微生物病原体の制御のための、ポリエン系殺菌剤と、酵素以外の抗生物質性非リボソーム型ペプチドとの相乗的組み合わせを包含する。
【００２３】
[0030]  本発明のポリエン系殺菌剤は、（ｉ）硬質親油性ポリエン部分及び柔軟で親水性のヒドロキシル化された部分と、（ｉｉ）大半の真菌の細胞膜中のステロール、主としてエルゴステロールを固定する能力とを有する大環状ラクトンの環を備える抗真菌抗生物質である。大環状ラクトンの環は、１２〜４０個の炭素、６〜１４個の水酸基を有することがあり、また炭水化物と結びつくことも、結びつかないこともある。環は、５個以上の炭素単位を有する単糖、デオキシ糖、アミノ糖などの１つ又は複数の糖と結びつくことがあり、これらは含酸素結合を含む環に付随する置換基を含有する。本発明のポリエン系殺菌剤は、ストレプトミセス属細菌の１種から得ることができる。上記殺菌剤は、ナタマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、オーレオファンギン、フィリピン、及びルセンソマイシン及びそれらの誘導体を含む。誘導体の例には、例えば米国特許第５，６０６，０３８号に記載されているアムホテリシンＢ誘導体、又はS44HP、NYST1068、及びBruheim他の、「ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY」、２００４年１１月、ｐｐ．４１２０−４１２９に記載されているオクタン・ナイスタチンなどのナイスタチン誘導体／類似体などがある。誘導体は、自然発生する親分子の類似物質、又は親分子から誘導される合成若しくは半合成化合物で、親分子と比較して少なくとも多少の殺菌活性を保持するものである。ある実施形態では、誘導体は、親分子と比較して少なくとも同等かそれ以上の殺菌活性を有する。誘導体には、塩及び溶媒和物、及び親分子と比較して溶解度を向上させたその他の修飾形態などがある。
【００２４】
[0031]  本発明の抗生物質性非リボソーム型ペプチド（ＮＲＰ）は、酵素以外の、細胞膜又は細胞壁を破壊する非リボソーム型ペプチドである。上記抗生物質性ＮＲＰは、リボソームによってではなく、非リボソーム型ペプチドシンテターゼと称する大型の酵素錯体によって合成される。本明細書で使用する「抗生物質性」という用語は、真菌、卵菌類、及び／又は細菌などの微生物病原体を殺すか、又はその増殖を鈍化させる能力をいう。Norineと称する非リボソーム型ペプチドのデータベースは、インターネット上で提供され、またCaboche, S.他の、「NORINE: A Database of Nonribosomal Peptides」、Nucleic Acids Research. 36:D326−D331, (2008)に記載されている。本発明の抗生物質性ＮＲＰは、細胞小器官膜を含む細胞膜、又は細胞壁を破壊する。膜又は壁は、細胞膜又は細胞壁の成分の合成阻害、膜の可溶化又は浸透性動揺のいずれかによるリン脂質膜の易透化を通じてなどの細胞膜の成分の物理的破壊、又は細胞膜内の小分子への結合を含む、多様な手段を通じて破壊することができる。
【００２５】
[0032]  細胞壁を破壊する本発明の抗真菌ＮＲＰにはエキノカンジンなどがあり、これは可変的に構成される脂質側鎖に結合した環状ヘキサペプチド核を含む半合成両親媒性リポペプチドである。エキノカンジンは、細胞の浸透圧の健全性を維持し、細胞分裂及び増殖に関与する子嚢菌細胞壁の優越多糖成分である１，３−β−グルカンの合成を阻害する。エキノカンジンには、カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギンが含まれる。
【００２６】
[0033]  本発明の細胞膜破壊抗真菌ＮＲＰにはまた、バチルス属の種、パエニバチルス属の種、及びストレプトミセス属の種などの多様な細菌から得られる、両親媒性環状ペプチドなどのリポペプチドも含まれる。本明細書で使用する「リポペプチド」という用語は、両親媒性環状ペプチドをいう。
【００２７】
[0034]  ある実施形態では、これらの両親媒性環状ペプチドは、フェンジシン型化合物、イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物及びフサリシジンなどの、β−アミノ又はβ−ヒドロキシ脂肪酸と結合した６〜１０個のα−アミノ酸で構成される。イチュリン型化合物は、７個のアミノ酸で構成され、β−アミノ脂肪酸と結合している。脂肪酸鎖の長さは、Ｃ１４〜Ｃ１７まで様々である。これらの化合物は、枯草菌及びアミロリクエファシエンスなどのバチルス属の多様な種から得ることができる。イチュリンとその変異体は、Ongena, M他の、「Bacillus Lipopeptides: Versatile Weapons for Plant Disease Biocontrol」、Trends in Microbiology, 16(3):115−125, (2007)に記載されている。本発明のイチュリン型化合物には、以下の化合物、すなわち、バシロマイシンＤ、バシロマイシンＦ、バシロマイシンＬ、バシロマイシンＬＣ（バシロペプチンとしても知られている）、マイコサブチリン、イチュリンＡ、イチュリンＡ１、及びイチュリンＣ（本明細書では、化合物の後三者を総称してイチュリンという）のうち１つ又は複数が含まれる。
【００２８】
[0035]  フェンジシン型化合物は、Ｃ１４〜Ｃ１８の様々な長さの鎖を有するβ−ヒドロキシ脂肪酸と結合した１０個のアミノ酸で構成される。これらの化合物は、枯草菌、アミロリクエファシエンス、セレウス及びチューリンゲンシスなどのバチルス属の多様な種、及びストレプトミセス属の種から得ることができる。フェンジシン型化合物は、上記Ongenaに記載されている。本明細書に記載されている組成物に適したフェンジシン型化合物には、フェンジシンＡ、フェンジシンＢ、プリパスタチンＡ、プリパスタチンＢ、Kimura他の、「SNA 60−367 − New Peptide Enzyme Inhibitors against Aromatase」、Journal of Antibiotics, 50(6): 529−531, (1997)に記載されているストレプトミセス属の種由来のプリパスタチン類、及び米国特許第６，２９１，４２６号に記載されているアグラスタチン類（本明細書では、後四者を総称してプリパスタチンという）が含まれる。
【００２９】
[0036]  サーファクチン型化合物は、Ｃ１３〜Ｃ１６の様々な長さの鎖を有するβ−ヒドロキシ脂肪酸と結合した７個のアミノ酸で構成される。これらの化合物は、枯草菌、アミロリクエファシエンス、コアグランス、プミルス及びリケニフォルミスなどのバチルス属の多様な種から得ることができる。サーファクチン族化合物は、上記Ongenaに記載されている。本発明のサーファクチン型化合物には、以下の化合物、すなわち、エスペリン、リケニシン、プミラシジン及びサーファクチンのうち１つ又は複数が含まれる。
【００３０】
[0037]  フサリシジンは、１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカン酸と結合した６個のアミノ酸で構成される。フサリシジンは、ポリミクサなどのパエニバチルス属の種から得ることができる。フサリシジン族化合物は、Choi, S−K他の、「Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681」、Biochemical and Biophysical Research Communications, 365:89−95, (2008)に記載されている。本発明のフサリシジンには、以下の化合物、すなわち、フサリシジンＡ〜Ｄと、フサリシジンＬＩ−Ｆ０３、ＬＩ−Ｆ０４、ＬＩ−Ｆ０５、ＬＩ−Ｆ０６、ＬＩ−Ｆ０７及びＬＩ−Ｆ０８のうち１つ又は複数が含まれる。
【００３１】
[0038]  ある特定の細菌が１つ又は複数のリポペプチドを生産し、また多様なリポペプチドの組み合わせが相乗的な殺菌活性を有することがわかっている。一実施形態では、組成物のリポペプチド成分は、以下のクラスのリポペプチド、すなわち、サーファクチン型化合物、イチュリン型化合物、及びフェンジシン型化合物のうち少なくとも２つのリポペプチドの組み合わせを含む。別の実施形態では、組み合わせには、以下の化合物、すなわち、イチュリンＡ類、プリパスタチンＡ及びＢ、フェンジシンＡ及びＢ、及びサーファクチンのうち２つ以上が含まれる。更に別の実施形態では、組み合わせには、以下の化合物、すなわち、イチュリンＡ類、プリパスタチンＡ及びＢ、フェンジシンＡ及びＢ、サーファクチン、及びアグラスタチンのうち１つ又は複数が含まれる。
【００３２】
[0039]  本発明のリポペプチドは、上記細菌などの１つ又は複数の細菌によって生産されるか、又は化学的に合成される。本明細書で使用する「発酵培養液」という用語は、微生物の発酵後にできる培養基をいい、とりわけ微生物とその成分部位、使用されなかった原料基質、及び微生物が発酵中に生産した代謝産物を包含する。本明細書で使用する「発酵固形物」という用語は、濃縮及び／又は乾燥された発酵培養液をいう。本明細書で使用する「発酵産物」という用語は、発酵培養液及び／又は発酵固形物をいう。本明細書で使用する「リポペプチド」という用語は、発酵産物の一部であるリポペプチド、及び化学合成されたか生物学的に生産されたかを問わず、少なくともある程度精製されたリポペプチドをいう。
【００３３】
[0040]  細菌を培養する方法は、当業者には周知である。従来の大規模微生物培養プロセスには、液中発酵、固体発酵、又は液面培養などがある。バチルス属では、発酵が終わりに近づき、栄養が枯渇するにつれて、細胞は成長期から胞子形成期への移行を開始し、発酵の最終産物は大部分が胞子、代謝産物及び残存発酵培養基である。胞子形成は、多数のバチルス属の自然のライフサイクルの一部であり、一般には栄養の制約に反応した細胞によって開始される。本発明では、発酵は高レベルのリポペプチドを取得し、胞子形成を促進するために設定される。
【００３４】
[0041]  発酵の結果得られた培養基（すなわち発酵培養液）中の細菌の細胞、胞子及び発酵産物は、直接、又は（発酵固形物を作るために）遠心分離法、タンジェンシャルフロー濾過、深層濾過、及び蒸発などの従来の工業的方法によって濃縮して、使用することができる。ある実施形態では、濃縮された発酵固形物は、残存発酵培養液と代謝産物を取り除くために、例えば透析濾過プロセスを経て洗浄される。
【００３５】
[0042]  発酵培養液又は発酵固形物は、担体を付加するか、又は付加せずに、噴霧乾燥、凍結乾燥、棚段乾燥、流動層乾燥、ドラム乾燥、又は蒸発などの従来の乾燥プロセス又は方法を用いて乾燥することができる。その結果得られた乾燥発酵固形物は、特定の粒径又は物理的形式にするために、フライス削り又は造粒などによって更に加工されることがある。後述する担体も、希望する使用方法に合わせて、乾燥後に付加してもよい。
【００３６】
[0043]  細菌によって生産されるリポペプチドは、細菌細胞から分離されるか、又はその他の細菌成分から、またある実施形態では相互から更に精製される。「無細胞製剤」という用語は、当業者には周知の手段で細胞を除去又は実質的に除去した発酵培養液をいう。無細胞製剤を作成するある方法を後述する。発酵培養液の無細胞製剤は、発酵培養液の抽出、遠心分離、及び／又は濾過などの技術的に知られているいずれの手段によっても得ることができる。当業者は、いわゆる無細胞製剤には細胞がまったくないよりも、細胞の除去に使用した技術（例えば、遠心分離の速度）に応じて、主として無細胞又は実質的に無細胞である方を高く評価する。その結果得られた無細胞製剤は、乾燥及び／又はその特定の用途を補助する成分を加えての処方に従った処理をされる。発酵培養液についての上記濃縮方法及び乾燥技術は、無細胞製剤にも適用できる。
【００３７】
[0044]  ある実施形態では、発酵培養液の遠心分離によって無細胞製剤を作成した後、代謝産物を分子量約２０００ダルトン未満、約１５００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満といった形で分子量で分けて別々の分級物に分類するＬＨ−２０、Ｇ１０、及びＧ１５及びＧ２５を含むセファデックスの樹脂などのサイズ排除濾過によって代謝産物を精製することができる。リポペプチドは、８００ダルトン〜１６００ダルトンの間である。
【００３８】
[0045]  本明細書で使用する「粗抽出物」という用語は、酢酸エチル抽出液などの、抽出液中にリポペプチドが豊富な発酵培養液の有機抽出液をいう。細胞培養物からリポペプチド粗抽出物を得る１つの方法は実施例１に記載されている。
【００３９】
[0046]  本明細書で使用する「半精製」という用語は、純度約５０％〜約９０％である発酵培養液から分離したリポペプチドをいう。本明細書で使用する「精製」という用語は、純度約９１％〜約１００％である発酵培養液から分離したリポペプチドをいう。本発明のリポペプチドは、精製又は半精製のいずれでもよい。
【００４０】
[0047]  一実施形態では、本発明のリポペプチドを枯草菌ＱＳＴ７１３から得るか、又は枯草菌ＱＳＴ７１３の発酵産物を組成物のリポペプチド含有成分として使用する。枯草菌ＱＳＴ７１３、その突然変異体、その上澄み、及びそのリポペプチド代謝産物、及びそれらを植物病原体及び昆虫の制御に使用する方法は、米国特許第６，０６０，０５１号、第６，１０３，２２８号、第６，２９１，４２６号、第６，４１７，１６３号及び第６，６３８，９１０号に詳細に記載されている。これらの特許において、上記株はＡＱ７１３と称される。枯草菌ＱＳＴ７１３は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、受託番号Ｂ２１６６１として１９９７年５月７日にＮＲＲＬへ寄託されている。本明細書中でＱＳＴ７１３というときは、枯草菌ＱＳＴ７１３を指す。また、本発明に適する枯草菌ＱＳＴ７１３の特定の変異株（例えば、受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４２１及びＮＲＲＬ  Ｂ−５０４５５として寄託されている枯草菌ＡＱ３０００２及びＡＱ３０００４）は、米国特許出願第１３／３３０，５７６号に記載されている。
【００４１】
[0048]  他の実施形態では、本発明のリポペプチドの出所として、リポペプチドを産生できる他のバチルス属の株が使用される。上述の通り、発酵培養液又は発酵培養液の抽出物は、本発明の相乗的殺菌剤の組み合わせのリポペプチド含有成分として使用することができる。ＱＳＴ７１３の発酵培養液からリポペプチドを取得する方法は、実施例に記載されている。バチルス属細菌一般の発酵培養液からのリポペプチドの取得、及び発酵培養液のリポペプチドの存在分析は、当業者であれば周知であり、本発明に適する他の細菌株は、当業者には容易に特定できる。多様なリポペプチドを産生するバチルス属の株は、上記引用のOngenaの総論（Trends in Microbiology (2007) Vol. 16, No. 3）に記載されている。その他多数の論文に、リポペプチド産生バチルス属株及び上記株の発酵培養液からのリポペプチド抽出方法が記載されている。例えば、Alvarez, F. 他の、「The plant−associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP218 and ARP23 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease」、Journal of Applied Microbiology (2011) 112: 159−174；Ongena, M. 他の、「Involvement of fengycin−type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential of Bacillus subtilis」、Applied Microbiology Biotechnology (2005) 69: 29−38；Wang, Y. 他の、「Separation and extraction of antimicrobial lipopeptides produced by Bacillus amyloliquefaciens ES−2 with macroporous resin」、Eur. Food Res. Technol. (2010) 231: 189−196を参照されたい。
【００４２】
[0049]  本発明の組成物は、回収率、有効性又は物理特性を高めるため、及び／又は包装及び投与を補助するために、リポペプチド含有発酵産物、リポペプチドの無細胞製剤、又はリポペプチドの精製物、半精製物若しくは粗抽出物を含む組成物に添加される不活性配合剤である担体を含んでもよい。上記担体は、個別に、又は組み合わせて添加してもよい。
【００４３】
[0050]  本発明の組成物は、作物及び収穫後の果実、野菜及び植物の保護、化粧品、加工食品、動物用飼料、又は材木の保存料として、及び医薬品及び獣医用途を含む多様な目的に使用することができる。具体的な用途に応じ、組成物は、その散布又は投与を補助するために適切な担体と合わせて調製される。ある実施形態では、担体は、固結防止剤、酸化防止剤、充填剤、及び／又は保護剤である。有用な担体の例としては、多糖類（デンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、乳清タンパク質などのタンパク質、ペプチド、ゴム）、糖（乳糖、トレハロース、ショ糖）、脂質（レシチン、植物油、鉱物油）、塩（塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム）、ケイ酸塩（粘土、アモルファスシリカ、ヒュームドシリカ／沈降性シリカ、ケイ酸塩）、蝋、油、アルコール及び界面活性剤が挙げられる。
【００４４】
[0051]  動物用飼料に適した担体は、毎年発行されるAmerican Feed Control Officials社のOfficial Publicationに示される。例えば、Official Publication of American Feed Control Officials、Sharon Krebs編集、２００６年版、ISBN 1−878341−18−9を参照されたい。
【００４５】
[0052]  医薬品又は獣医学の用途に使用される組成物は、投薬形態に応じて異なる薬学的に許容可能な担体と組み合わせる。
【００４６】
[0053]  本発明の組成物は、処置の必要な領域に、病原体の制御に有効な量を適用することができる。本明細書で使用する「制御」という用語は、病原体を殺すか、又はその増殖を阻止することをいう。一実施形態では、病原体は真菌である。別の実施形態では、病原体は卵菌類である。
【００４７】
[0054]  一実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分（例えば、精製又は半精製リポペプチド、粗抽出物、発酵産物又は化学的に合成した若しくは誘導された産物）が、１：１の比率（重量比）で適用される。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分の比率は、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、又は約５０：１である。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分の比率は、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：１０、約１：１５、約１：２０、又は約１：５０である。
【００４８】
[0055]  特定の実施形態では、ポリエン系殺菌剤と、１つ又は複数のリポペプチドを含むリポペプチド含有成分とが、組成物中に様々な重量比で供給されることがある。一実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分との重量比は、約５００：１〜約１：５００である。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分との重量比は、約１００：１〜約１：１００である。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分との重量比は、約１０：１〜約１：１０である。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分との重量比は、約５：１〜約１：５である。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分との重量比は、約２：１〜約１：２である。別の実施形態では、ポリエン系殺菌剤とリポペプチド含有成分との重量比は、約１：１である。
【００４９】
[0056]  一実施形態では、組成物は植物又は食用栽培キノコに散布される。植物への散布では、組成物は、植物の根、葉、又は果実を含むいずれかの部位に、あるいは植物周囲の土壌を含む植物周辺領域に、散布することができる。キノコへの散布では、組成物は、キノコに、又はキノコの種菌、若しくはキノコ用配合土に散布することができる。散布は、植え付け前、植え付け時、及び／又は植え付け後に行うことができる。標的病原体の例は、フザリウム属の種、ボトリチス属の種、バーティシリウム属の種、リゾクトーニア属の種、トリコデルマ属の種（緑カビ）、クサレカビ属の種及びエキビョウキン属の種である。本組成物の散布量の決定は、当業者には周知である。本発明の組成物は、通常、ポリエン系殺菌剤と、リポペプチドなどの非リボソーム型タンパク質を、それぞれ０．００５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ含む。相乗的組成物が植物、植物部位若しくは植物周辺領域へ、又は食用栽培キノコ、キノコの種菌、若しくはキノコ用配合土へ散布される一実施形態では、ポリエン系殺菌剤成分は、ナタマイシン又はその誘導体である。
【００５０】
[0057]  別の実施形態では、適用領域は、収穫後の食品、又はバイオ燃料用飼料などの収穫後の非食用植物資材である。本明細書で、収穫後の食品とは、すでに畑から収穫したがまだ包装されていない、果実、野菜、穀物、種油、及び任意の他の食用植物及び堅果をいう。収穫後病原体の例としては、ボトリチス・シネレア（灰色カビ）、コレトトリチュム・アクタータム、コレトトリチュム・コッコデス、コレトトリチュム・ムサ及びコレトトリチュム・カプシシなどの病原性コレトトリチュム属の種、エルウィニア・カルトボラの亜種カルトボラ、ジオトリクム・カンジダム、ジオトリクム・シトリ‐アウランティ（白カビ病）、ヘルミントスポリウム・ソラニ（ジャガイモのシルバースカーフ）、モニリニア・フルクチコーラ（褐色腐れ）、ディギタータム（柑橘類の緑カビ）及びエクスパンサム（リンゴ科の青カビ）を含むペニシリウム属の種、クモノスカビ属の種（黒カビ病）、クロカビ（黒カビ）、シーラビオプシス・バシコラ（ニンジンの黒根腐れ病）、果物のムコール腐敗病（例えばナシのムコール・ピリフォルミス）、及びアルテルナリア腐敗（最も影響が大きいのはニンジン、ブロッコリー、ジャガイモ、コショウ、リンゴ、キウイ、ナシ、マルメロ及びトマト）が挙げられるが、これらに限定されない。収穫後の食品及び収穫後の非食用植物資材への本組成物の散布量の決定は、当業者には周知である。収穫後の食品及びバイオ燃料用飼料などの収穫後の非食用植物資材に本組成物が散布される一実施形態では、ポリエン系殺菌剤成分は、ナタマイシン又はその誘導体である。
【００５１】
[0058]  更に別の実施形態では、適用領域は、食品又は飼料である。本明細書で使用する食品という用語は、乳製品、パン、トルティーヤ、加工肉及びベーカリー製品などの加工食品、食肉及びカット済みの果物及び野菜などの半加工食品又は最小限の加工をした食品、及びパック入りのレタス、ホウレンソウ及びその他の野菜などの包装食品を含む。飼料という用語には、加工済み動物用飼料及び貯蔵生牧草を含む。上記用途では、標的病原体は、損傷を起こす病原体及び真菌毒素を産生する病原体である。病原体の例は、コウジカビ属の種、ペニシリウム属の種、及びフザリウム属の種である。本組成物の散布量の決定は、当業者には周知である。投与量及び推奨散布方法は、Davidson, P. Michael他編、Antimicrobials in Food第３版、CRC Press 2005, Ch. 8, pp. 275−289を含む、多数の参照文献に詳しく説明されている。食品又は飼料に本発明の相乗的な組成物が散布される一実施形態では、ポリエン系殺菌剤成分はナタマイシン又はその誘導体である。
【００５２】
[0059]  別の実施形態では、適用領域はヒトまたは動物である。ヒト用及び獣医学用の用途では、組成物は、カンジダ・アルビカンス及び／又はフザリウム属の種を制御するために、皮膚及び粘膜へ局所的に塗布される。一実施形態では、組成物は、膣感染症、とりわけカンジダ・アルビカンスによるのみならず、Ｃ．グラブラタ、Ｃ．パラプシローシス、Ｃ．ギリエルモンディ及びＣ．トロピカリスによって引き起こされる感染症の予防又は治療に使用される。カンジダの治療に相乗的な組成物が適用される一実施形態では、ポリエン系殺菌剤成分はナイスタチンである。ヒトでは、本発明の組成物は、体のケラチン化組織（皮膚、爪及び毛）に限局する多様な疾病の発現原因である、ハクセンキン、表皮菌、ミクロスポルムなどの皮膚糸状菌制御のために、爪、頭皮及び皮膚に塗布することもできる。ヒトでは、口腔カンジダ症の治療のため、又は腸カンジダ症の経口治療若しくは予防のために、組成物をトローチ剤として投与することができる。本発明の組成物は、コウジカビ属及びフザリウム属の角膜感染症治療にも使用できる。角膜感染の治療に組成物が使用される一実施形態では、組成物のポリエン系殺菌剤成分はナタマイシン又はその誘導体である。本組成物の適切な投与量の決定は、当業者には周知である。
【００５３】
[0060]  ある実施形態では、治療の必要な領域は組成物の適用又は投与の前に特定される。
【００５４】
[0061]  一実施形態では、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、様々な投薬形態への適合性に応じて変わることがある。一実施形態では、組成物は、局所用組成物として１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。局所用組成物は、クリーム状、ゲル状、オイル状、スプレー状、パウダー状、ペースト状、クレイ状、又は当技術分野で組成物をヒト又は動物の皮膚又は対象に塗布するために知られている任意の他の形態、経路又は方法であることが可能である。局所用組成物に含まれる承認される担体は、剤形の種類によって変わることがある。例えば、軟膏、ペースト、クリーム又はゲルの剤形は、動物及び植物の脂肪、蝋、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛、又はこれらの物質の混合物を含んでもよい。
【００５５】
[0062]  一実施形態では、組成物は、経口組成物として、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。経口投与の形態は、固体粉末、カプレット、錠剤、トローチ、丸剤、カプセル、ソフトカプセル又は液体の形態が可能であり、それらを単独で、又は他の成分と適切に組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の組成物は、実用として投与しやすくするために、１つ又は複数のカプレット又はトローチにして投与することができる。経口投与用の組成物の製剤では、通常のどの媒体も利用できる。液剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤及び水薬）については、例えば、水、油、アルコール、芳香剤、保存料、着色料などを含む媒体を使用することができる。デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの薬学的に許容可能な担体は、経口固形剤（例えば、粉末、カプレット、丸剤、錠剤、カプセル及びトローチ）の製剤に使用できる。徐放性形態をとることもできる。カプレット、錠剤、丸薬及びカプセルは、投与が容易なことから最も好適な経口投与単位形式で、この場合、固形担体が採用される。必要ならば、錠剤を標準的な技術で糖衣又は腸溶性コーティングにしてもよい。これらすべての医薬担体及び製剤は、当業者には周知である。例えば、WADE & WALLER, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS（第２版、１９９４）を参照されたい。
【００５６】
[0063]  本発明の特定の実施形態では、ソフトカプセル状の投薬形態の組成物を含んでもよい。ソフトカプセルは、水薬、懸濁液又は半固形ペーストを収容した、一体型で密封された軟質ゼラチンの殻である。ソフトカプセルは、活性成分が溶解又は懸濁状態で存在する液体の収容に広く使用される。ソフトカプセルは、多年にわたり、多様な目的で広く知られ、使用されてきた。ソフトカプセルはツーピース型のハードシェルカプセルとはまったく異なる特性を有するため、ソフトカプセルは、液体の内容物を保持することができる。ソフトカプセルは、多くの場合、液体の媒質又は担体に入ったビタミン、治療食サプリメント、医薬品などを含む消費財を封入するために使用される。ソフトカプセルは、錠剤、ハードシェルカプセル及び液体などの従来型の投薬形態に比べ、明白な利点を提供することができる独自の投薬形態である。これらの利点には、患者のコンプライアンス及び消費者の選好、バイオアベイラビリティの向上、多くの場合での製品開発の迅速化、製造時間の短縮、活性成分の酸素への暴露が減ることによる薬剤安定性の改善、用量の均一性、及び製品差別化が含まれる。
【００５７】
[0064]  一実施形態では、本発明の組成物と方法は、快適な心地よい芳香を有することがある。心地よい芳香は、甘味料及び／又は香料を含有することによって達成できる。本発明の組成物に含有することのできる甘味料には、例として、ショ糖、果糖、高果糖コーンシロップ、デキストロース、サッカリンナトリウム、マルトデキストリン、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、スクラロース、グリチルリジン酸アンモニウム、及び当業者には既知のその他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
[0065]  本発明の組成物には、溶解を促進するために、崩壊剤も含まれることがある。透水剤及び導水剤を含む崩壊剤は、水又は唾液を組成物内部へ引き込み、組成物の外部からと同様に、内部から崩壊を促進する能力がある。本発明に使用できる上記崩壊剤、透水剤、及び／又は導水剤には、例として、コーンスターチ、片栗粉、それらのアルファ化化工デンプンなどのデンプン、アクジゾルなどのセルロース剤、モンモリロナイト粘土、交差結合ＰＶＰ、甘味料、ベントナイト、結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、アラビアゴム、キサンタン及びトラガカントなどのゴム、コロイド状シリカ、沈降性シリカなどの水性溶媒用の高親和性シリカ、マルトデキストリン、ベータシクロデキストリン、カーボポールなどのポリマー、及びヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
[0066]  本発明の組成物の製剤には、上記担体に加え、本明細書に記載する目的と整合する範囲で適切な充填剤及び賦形剤を利用することができる。例えば、結合剤は顆粒中の粉末粒子の粘着力を引き出すために使用される物質である。本発明での使用に適したこうした化合物には、例として、アカシア、圧縮糖、ゼラチン、ショ糖及びその誘導体、マルトデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びメチルセルロースなどのセルロースポリマー、不溶性アクリル酸塩アンモニオメタクリレート共重合体、ポリアクリレート又はポリメタクリル共重合体などのアクリルポリマー、ポビドン、コポビドン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、デンプン、アルファ化デンプン、グアーガム、ポリエチレングリコール、及び当業者であれば既知のその他の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
[0067]  本発明の組成物には、組成物の造粒を改善するために、希釈剤も含まれることがある。希釈剤には、例として、結晶セルロース、ショ糖、リン酸二石灰、デンプン、乳糖、及びマンニトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトールなどの炭素原子数１３未満のポリオール、及びグリシンなどの薬学的に許容可能なアミノ酸、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
[0068]  潤滑剤は、組成物の製剤に使用される組成物圧縮中の摩擦を減らす物質である。本発明に使用できる潤滑剤には、例として、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、タルク、鉱物油及び植物油、安息香酸、ポリ（エチレングリコール）、グリセリルベヘネート、フマル酸ステアリル、及び当業者には既知のその他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
[0069]  流動促進剤は、製造中の粉末混合の流れを改善し、組成物の重量変動を最小限に抑制する。本発明に使用できる流動促進剤には、例として、二酸化ケイ素、コロイド状シリカ又はヒュームドシリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、コーンスターチ、タルク、及び当業者には既知のその他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
[0070]  着色剤も、本発明の組成物に含まれることがある。本明細書で使用する「着色剤」という用語には、医薬製剤に色彩を与えるために使用される化合物を含む。このような化合物には、例として、赤色３号（FD&C Red No.3）、赤色２０号（FD&C Red No.20）、黄色６号（FD&C Yellow No.6）、青色２号（FD&C Blue No.2）、緑色５号（D&C Green No.5）、橙色５号（FD&C Orange No.5）、赤色８号（D&C Red No.8）、カラメル、及び酸化鉄、赤及び当業者には既知のその他の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。着色料には、顔料、染料、チント、二酸化チタン、ブドウ果皮抽出物、ビーツ粉末、ベータカロテン、アナトー、カーマイン、ターメリック、パプリカなどの天然着色料、及び当業者には既知のその他の化合物も含むことができる。
【００６４】
[0071]  水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ソルビトール又はデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含んでもよい。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性懸濁注射液として製剤されることがある。適切な親油性溶媒又は媒体には、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。非脂質性ポリカチオン系アミノポリマーも送達に使用することができる。
【００６５】
[0072]  組成物は、殺菌剤及び／又はリポペプチドなどの活性成分の良好な溶解及び／又は分解を確保するために、可溶化剤を含むことができる。可溶化剤は、殺菌剤及び／又はリポペプチド及び／又は界面活性剤などのその他の成分の溶解性を高めるため、又は組成物を安定若しくは均一な溶液若しくは分散に保つために添加することもできる。
【００６６】
[0073]  適切な可溶化剤の例としては、以下のもの、すなわち、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール及びその異性体、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、トランスクトール、ジメチルイソソルビド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体、シクロデキストリン及びシクロデキストリン誘導体などのアルコール及びポリオール；テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル（グリコフロール）又はメトキシポリエチレングリコールなどの、平均分子量が約２００〜約６０００のポリエチレングリコールのエーテル；２−ピロリドン、２−ピペリドン、ε−カプロラクタム、Ｎ−アルキルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシアルキルピロリドン、Ｎ−アルキルピペリドン、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルアセトアミド及びポリビニルピロリドンなどのアミド及びその他の窒素含有化合物；プロピオン酸エチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸アセチルトリブチル、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ブチル酸エチル、トリアセチン、プロピレングリコールモノアセタート、プロピレングリコールジアセタート、ε−カプロラクトン及びその異性体、δ−バレロラクトン及びその異性体、β−ブチロラクトン及びその異性体などのエステル；及びジメチルアセトアミド、ジメチルイソソルビド、Ｎ−メチルピロリドン、モノオクタノイン、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、及び水などの当技術分野で知られているその他の可溶化剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
[0074]  可溶化剤の混合物も使用できる。例として、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ポリエチレングリコール２００−１００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、及びジメチルイソソルビドが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、可溶化剤は、ソルビトール、グリセロール、トリアセチン、エチルアルコール、ＰＥＧ‐４００、グリコフロール及びプロピレングリコールを含む。
【００６８】
[0075]  含有できる可溶化剤の量には特定の制限はない。所与の可溶化剤の量は、生物学的に許容できる量に制限され、その量は当業者には容易に決定できる。ある状況においては、生物学的に許容できる量をはるかに超える量の可溶化剤を含むことが好適になりうる。一例は、薬剤の濃度を最大限に高めるために、１組成物を対象に提供するに蒸留又は蒸発などの従来の技術を用いて過剰な可溶化剤を除去する場合である。このようにして、可溶化剤が存在する場合には、薬剤と他の賦形剤の総重量に基づく重量比で、約１０％、２５％、５０％、１００％、又は最大約２００％になりうる。必要なら、約５％、２％、１％又はそれ未満などのごく少量の可溶化剤を使用することもできる。一般的に、可溶化剤は約１％〜約１００％の量が存在することができ、更に一般的には重量の約５％〜約２５％である。
【００６９】
[0076]  以下の実施例は、純粋に説明のために提示され、本発明の目的を制限するものではない。
【００７０】
実施例
実施例１：サッカロミセス・セレビシエに対するリポペプチドとナタマイシンの相乗的効果
[0077]  一般に真菌に対する活性試験のモデル生物とされ、カンジダ属に密接に関連するサッカロミセス・セレビシエに対するリポペプチドとナタマイシンの組み合わせの有効性について試験した。Smits, GJ他の、「Stress Tolerance in Fungi − To Kill a Spoilage Yeast」、Current Opin Biotechnol., 16(2): 225−30, (2005)、及びCastrillo, JL他の、「Yeast as a Touchstone in Post−Genomic Research: Strategies for Integrative Analysis in Functional Genomics.」、J Biochem Mol Biol.、37(1): 93−106, (2004)を参照されたい。
【００７１】
[0078]  使用したリポペプチドは、イチュリン型化合物、プリパスタチン型化合物、及び枯草菌ＱＳＴ７１３の発酵培養液から部分的に精製したサーファクチンの複合混合物である。ルリア培地（ＬＢ）を含む種菌フラスコにＱＳＴ７１３株を接種し、これらのフラスコを３０℃で一晩培養した。翌日、種菌フラスコのアリコートを大豆主体の培地に接種し、胞子形成まで培養した。枯草菌ＱＳＴ７１３の発酵培養液をｐＨ２まで酸性化し、遠心分離して上澄みから固形物を分離した。リポペプチドは、ペレット状に濃縮した。上澄みはデカントし、ペレットは水性有機溶媒混合物（望ましくはアセトニトリル／水比８０／２０）で抽出した。各抽出の上澄みを合わせ、真空中で（en vacuo）溶媒を除去した。乾燥抽出物には、枯草菌ＱＳＴ７１３に見られる全３クラスのリポペプチド、すなわちイチュリンＡ２、イチュリンＡ３、Ａ４又はＡ５、イチュリンＡ６、イチュリンＡ７を含むイチュリン型化合物；プリパスタチンＡ１、プリパスタチンＡ２、プリパスタチンＢ１、プリパスタチンＢ２、アグラスタチンＡ、アグラスタチンＢ、フェンジシンＡ、フェンジシンＢを含むフェンジシン型化合物；サーファクチンＡ１、Ａ２又はＡ３、サーファクチンＢ１又はＢ２、及びサーファクチンＣ１又はＣ２が、濃縮されて含まれていた。乾燥抽出物は、水性有機溶媒混合物（望ましくはアセトニトリル／水比８０／２０）で再懸濁できる。
【００７２】
[0079]  サッカロミセス・セレビシエ野生型株ＢＹ４７４２を、（１）ナタマイシン（Haorui Pharma−Chem Inc）、（２）上記リポペプチド抽出物、（３）ナタマイシン＋リポペプチド抽出物、及び（４）リポペプチドもナタマイシンも無し（対照）の存在下で、液体ＹＰＤで培養した。液体培養物に添加される前のナタマイシンの初期濃度は１ｐｐｍ、リポペプチド抽出物の初期濃度は１５ｐｐｍであった。液体培養物中のナタマイシンの最終濃度は０．０８ｐｐｍ、リポペプチド抽出物の最終濃度は１．１２ｐｐｍであり、両者を含むサンプル中のナタマイシンとリポペプチドの重量比は１：１４であった。
【００７３】
[0080]  ナタマイシン及び／又はリポペプチドを含む液体培養物３０℃で１６時間培養した後、その光学濃度（ＯＤ）を対照培養物のＯＤと比較した。比較のために、無処理対照培養物のＯＤを１００％に設定し、処理済み培養物はこの値に対して標準化した。
【００７４】
[0081]  Gowingの方程式を以下のように適用し、リポペプチドとナタマイシンとの相乗効果を決定した。
Gowingの方程式：Exp=X+[Y*(100−X)]/100
Eob>>Expならば、相乗性が存在する。
注記：上記方程式中のＥｏｂ、Ｅｘｐ、Ｘ及びＹは、増殖抑制を表す。したがって、ＸとＹは、下記に示す通り、処理済みプレートの増殖量を１００から差し引いて計算する。
X=100−77.89=22.11,Y=100−93.87=6.13
Eob=100−8.51=91.49
Exp=22.11+[6.13*(100−22.11)]/100=26.88
Eob >> Exp
結果は図１にも示す。
【００７５】
実施例２：市販製品から取得したリポペプチドを用いた、Ｓ．セレビシエに対するナタマイシンとリポペプチドの相乗的効果
[0082]  実施例１に記載された研究と類似するこの研究は、出発点として、（枯草菌ＱＳＴ７１３の無調合発酵培養液からではなく）SERENADE（登録商標）ＭＡＸ殺菌剤又はSERENADE（登録商標）ＡＳＯ殺菌剤から取得したリポペプチド粗抽出物を用いて実施する。SERENADE（登録商標）製品は市販されており、その活性成分は枯草菌ＱＳＴ７１３である。リポペプチド粗抽出物は、SERENADE（登録商標）ＡＳＯ（又は水に溶かしたSERENADE（登録商標）ＭＡＸ）をｐＨ２まで酸性化し、遠心分離し、こうしてできたペレットを有機溶媒混合物で抽出して得る。結果として得られたリポペプチドは、上記の通りナタマイシンと混合し、この混合物のＳ．セレビシエに対する活性を試験する。上記で得られたものと同じ結果が予想される。
【００７６】
実施例３：ペニシリウム・エクスパンサムに対するナタマイシンとリポペプチド粗抽出物の相乗的効果
[0083]  （ｉ）ナタマイシン（Haorui Pharma − Chem Inc）、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１に記載通りに作製）、及び（ｉｉｉ）ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との組み合わせの、ペニシリウム・エクスパンサムに対する効果を調査した。リポペプチドとナタマイシンの組み合わせが真菌の増殖抑制において相乗効果を有するか否かを決定するために、９６ウェルプレートで真菌液体培養アッセイを実施した。すべての処理過程は無菌で実施された。
【００７７】
[0084]  各９６ウェルプレートについて、各ウェルに３種の別個の添加を行った。第一に、１００ｐｐｍのクロラムフェニコールを加えたジャガイモのデキストロース培養液１００μＬを添加した。次に、各サンプル（希釈プレート由来の、リポペプチド、ナタマイシン、又はその組み合わせ）の２５μＬを追加した。最後に、空のプレート（ＯＤの参照用に意図的に空にしてあったプレート）に５０μＬのＤ１  Ｈ２Ｏを追加するか、又はそれぞれのプレートの各ウェルに５０μＬの１０５真菌接種材料を追加した。こうして、各ウェルの最終リポペプチド濃度は１．１ｐｐｍに、また各ウェルの最終ナタマイシン濃度は１．１ｐｐｍになった。次に、プレートに蓋をし、２０℃で３日間培養した。
【００７８】
プレートの評価とデータの解釈
[0085]  培養期間経過後、各プレートの各ウェルの増殖状況を、PerkinElmer Victorプレートリーダーを用い、Wallac（登録商標）Victor（登録商標）ソフトウェアにある「ＭＩＣ設定＠６００（０．１ｓ）」の設定で、光学濃度６００ｎｍで評価した。また、結果は、サンプルの活性が低下した希釈系内に現れた濁ったウェル（部分的な増殖）として大まかに視覚的に評価した。
【００７９】
[0086]  各ウェルについてのＯＤを取得した後、以下の計算によって相対的増殖状況を決定した：〔（細菌有り処理）−（細菌無し処理）／（細菌有り希釈対照）−（細菌無し希釈対照）〕×１００。細菌増殖についての正の対照のウェルは、６００ｎｍでのＯＤ示度の平均及び標準偏差が非接種ＯＤ対照ウェルの範囲を大きく上回った場合に合格とみなした。（確実に良好な増殖を得るためには、非接種希釈対照と接種希釈対照のウェルの示度に大きな差がなければならない。）
【００８０】
[0087]  次に、増加率（％）を、試験した希釈のサンプルと比較してグラフ化し、最終的に少なくとも８０％の増殖抑制を示した希釈度を最小増殖阻止濃度（ＭＩＣ）とした。
【００８１】
[0088]  次に、上記のGowingの方程式によって相乗効果を決定した。
【００８２】
[0089]  この実施例では、リポペプチド１．１ｐｐｍの増加率（％）は１１３％であった。ナタマイシン１．１ｐｐｍの増加率（％）は１０２％であった。リポペプチド１．１ｐｐｍ＋ナタマイシ１．１ｐｐｍの増加率（％）は２０．４％であった。
【００８３】
[0090]  X=100−102.1
Y=100−112.9
Exp=−2.1+(−12.9(102.1))/100
Exp=−15.3
あるいは、１００を超える増加率（％）については切り捨てて１００にする。我々の実施例では、これによってＥxp＝０になり、
Eob=100−20.4
Eob=79.6
79.6>>−15.3
Eob>>Expであるため、図２に示した通り、相乗性が認められる。
【００８４】
実施例４：ペニシリウム・エクスパンサムに対する、半精製及び精製プリパスタチン、イチュリン及びサーファクチン及びナタマイシンとの相乗的効果
[0091]  ペニシリウム・エクスパンサムを標的病原体に使用して、（ｉ）ナタマイシンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（上述の通りに取得した）、及び（ｉｉ）ナタマイシンと、枯草菌ＱＳＴ７１３から取得した半精製及び精製リポペプチドの組み合わせで、上記の実験と類似した実験を以下のように実施した。イチュリンＡ類を含むイチュリン型化合物、及びプリパスタチン類（Ａ、Ｂ及びアグラスタチン）及びフェンジシン類を含むフェンジシン型化合物を、酸性化した後に有機溶媒で抽出する方法で、枯草菌ＱＳＴ７１３発酵培養液から沈殿させ、抽出した。これらのリポペプチドを、逆相クロマトグラフィーによって更に精製、分離し、純度約８３％のフェンジシン型化合物と、純度約８８％のイチュリンを得た。サーファクチン類は、有機溶媒を用いて抽出し、その後、サイズ排除カラムクロマトグラフィーを用いて純度９５％まで更に精製した。リポペプチド各クラスの純度は、高速液体クロマトグラフィーのトレースを用いて決定した。
【００８５】
[0092]  各試験ウェルの最終的なナタマイシン濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は２．２３ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【００８６】
[0093]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図３及び表１に示す。表１は、上記のGowingの方程式を用いた相乗効果の計算を示す。
【表１】
2014518878.tif 000002
【００８７】
実施例５：ジオトリクム・カンジダムに対する、半精製及び精製イチュリン、フェンジシン及びサーファクチン及びナタマイシンとの相乗的効果
[0094]  ジオトリクム・カンジダムを標的病原体に使用して、上記の実験と類似した実験を、（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１の上述の通りに取得した）、（ｉｉｉ）ナタマイシンと上記粗抽出物の組み合わせ、及び（ｉｖ）ナタマイシンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来の半精製及び精製リポペプチド（すなわちイチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及びサーファクチン型化合物）との組み合わせで実施した。
【００８８】
[0095]  イチュリン型化合物とサーファクチンは、上記説明の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３から抽出及び精製した。フェンジシン型化合物は、イチュリン型化合物と同じ方法で抽出したが、低圧の逆相クロマトグラフィーを使用して少なくとも純度９０％まで更に精製した。
【００８９】
[0096]  各試験ウェルの最終的なナタマイシン濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は２．２３ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【００９０】
[0097]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図４及び表２に示す。
【表２】
2014518878.tif 000003
【００９１】
実施例６：ジオトリクム・カンジダムに対する、半精製及び精製イチュリン、フェンジシン及びサーファクチン及びナイスタチンとの相乗的効果
[0098]  ジオトリクム・カンジダムを標的病原体に使用して、上記の実験と類似した実験を、（ｉ）ナイスタチン（ポリエン系殺菌剤の別の実施例）、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１の上述の通りに取得した）、（ｉｉｉ）ナイスタチンと上記粗抽出物の組み合わせ、及び（ｉｖ）ナイスタチンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来の半精製及び精製リポペプチド（すなわちイチュリン、フェンジシン及びサーファクチン）との組み合わせで実施した。
【００９２】
[0099]  イチュリン型化合物、サーファクチン型化合物、及びフェンジシン型化合物は、上記説明の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３から抽出及び精製した。各試験ウェルの最終的なナイスタチン濃度は１．１２ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は１．１２ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は１．１２ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【００９３】
[00100]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図５及び表３に示す。出願人は、本実験で使用した濃度のサーファクチンとナイスタチンの間では相乗効果が見られなかったことを注記する。最終濃度を変更すれば、相乗効果が見られると予想される。実施例９末尾の同様の状況に関するコメントを参照されたい。
【表３】
2014518878.tif 000004
【００９４】
実施例７：ジオトリクム・シトリ‐アウランティに対する、半精製及び精製イチュリン、フェンジシン及びサーファクチン及びナタマイシンとの相乗的効果
[00101]  ジオトリクム・シトリ‐アウランティを標的病原体に使用して、上記の実験と類似した実験を、（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１の上述の通りに取得した）、（ｉｉｉ）ナタマイシンと上記粗抽出物の組み合わせ、及び（ｉｖ）ナタマイシンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来の半精製及び精製リポペプチド（すなわちイチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及びサーファクチン型化合物）との組み合わせで実施した。
【００９５】
[00102]  イチュリン型化合物、サーファクチン、及びフェンジシン型化合物は、上記説明の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３から抽出及び精製した。各試験ウェルの最終的なナタマイシン濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は２．２３ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【００９６】
[00103]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図６及び表４に示す。
【表４】
2014518878.tif 000005
【００９７】
実施例８：ジオトリクム・シトリ‐アウランティに対する、半精製及び精製イチュリン、フェンジシン及びサーファクチン及びナイスタチンとの相乗的効果
[00104]  ジオトリクム・シトリ‐アウランティを標的病原体に使用して、上記の実験と類似した実験を、（ｉ）ナイスタチン（ポリエン系殺菌剤の別の例）、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１の上述の通りに取得した）、（ｉｉｉ）ナイスタチンと上記粗抽出物の組み合わせ、及び（ｉｖ）ナイスタチンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来の半精製及び精製リポペプチド（すなわちイチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及びサーファクチン型化合物）との組み合わせで実施した。
【００９８】
[00105]  イチュリン型化合物、サーファクチン、及びフェンジシン型化合物は、上記説明の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３から抽出及び精製した。各試験ウェルの最終的なナイスタチン濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は２．２３ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は２．２３ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【００９９】
[00106]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図７及び表５に示す。
【表５】
2014518878.tif 000006
【０１００】
実施例９：サッカロミセス・セレビシエに対する、半精製及び精製イチュリン、フェンジシン及びサーファクチン及びナタマイシンとの相乗的効果
[00107]  サッカロミセス・セレビシエを標的病原体に使用して、上記の実験と類似した実験を、（ｉ）ナタマイシン、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１の上述の通りに取得した）、（ｉｉｉ）ナタマイシンと上記粗抽出物の組み合わせ、及び（ｉｖ）ナタマイシンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来の半精製及び精製リポペプチド（すなわちイチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及びサーファクチン型化合物）との組み合わせで実施した。
【０１０１】
[00108]  上記実施例と同じく、リポペプチドとナタマイシンの組み合わせが真菌の増殖抑制において相乗効果を有するか否かを決定するために、９６ウェルプレートで真菌液体培養アッセイを実施した。プレートの各ウェルに、３種の別個の添加を行った。第一に、酵母、ペプトン、デキストロース培地（ＹＰＤ）を使用した。次に、各サンプル（リポペプチド、ナタマイシン、又は希釈プレート由来のその組み合わせのいずれでも）の２５μＬを追加した。最後に、５０μＬの酵母接種材料又は５０μＬのＤ１  Ｈ２Ｏを追加した（後者のオプションは空欄を設ける際に使用する）。酵母接種材料は、単コロニーを５ｍＬのＹＰＤに接種し、３０℃で一晩振とう培養して作製した。翌朝、一晩おいた接種材料２００μＬを５ｍＬのＹＰＤで継代培養し、３０℃で４〜５時間振とう培養した。これを、光学濃度０．０１５まで希釈した。３回の添加をすべて終えた後、プレートに蓋をし、３０℃で一晩培養して翌日分析した。
【０１０２】
[00109]  上記説明の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３からイチュリン型化合物、サーファクチン及びフェンジシン型化合物を抽出、精製した。各試験ウェルの最終的なナタマイシン濃度は１．１２ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は１．１２ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は１．１２ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【０１０３】
[00110]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図８及び表６に示す。出願人は、Ｓ．セレビシエに対するナタマイシンとサーファクチンそれぞれの最終濃度１．１２ｐｐｍでの相乗効果の欠如を調査する追加実験を、最終濃度をもっと高くすれば相乗効果が見られると予想して行った。ナタマイシンの最終濃度を１．１２ｐｐｍに維持し、サーファクチンの最終濃度を高めた。予想通り、サーファクチンの濃度を１７．８６ｐｐｍまで高めたときに、相乗効果が見られた。
【表６】
2014518878.tif 000007
【０１０４】
実施例１０：サッカロミセス・セレビシエに対する、半精製及び精製イチュリン、フェンジシン及びサーファクチン及びナイスタチンとの相乗的効果
[00111]  サッカロミセス・セレビシエを標的病原体に使用して、上記の実験と類似した実験を、（ｉ）ナイスタチン、（ｉｉ）枯草菌ＱＳＴ７１３由来のリポペプチド粗抽出物（実施例１の上述の通りに取得した）、（ｉｉｉ）ナイスタチンと上記粗抽出物の組み合わせ、及び（ｉｖ）ナイスタチンと、枯草菌ＱＳＴ７１３由来の半精製及び精製リポペプチド（すなわちイチュリン型化合物、フェンジシン型化合物、及びサーファクチン型化合物）との組み合わせで実施した。
【０１０５】
[00112]  上記説明の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３からイチュリン型化合物、サーファクチン及びフェンジシン型化合物を抽出、精製した。各試験ウェルの最終的なナタマイシン濃度は０．５６ｐｐｍであった。各ウェルの最終的なリポペプチド粗抽出物濃度は０．５６ｐｐｍであった。各ウェルのイチュリン型化合物、サーファクチン又はフェンジシン型化合物の半精製又は精製リポペプチド抽出物それぞれの最終的な濃度は０．５６ｐｐｍであった。このように、組み合わせを含有するウェル内の各成分の重量比は１：１であった。
【０１０６】
[00113]  多様な組み合わせの相乗効果を示す結果を図９及び表７に示す。
【表７】
2014518878.tif 000008
【０１０７】
実施例１１：重量比が異なる場合のペニシリウム・エクスパンサムに対するナタマイシンとリポペプチド粗抽出物の相乗的効果
[00114]  ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との重量比を変えた場合に相乗効果が見られるか否かを決定するために、研究を実施した。実施例１の上述の通り、枯草菌ＱＳＴ７１３からリポペプチドを抽出した。実施例３に記載された多数ウェルプレートアッセイを使用し、ペニシリウム・エクスパンサムの様々な組み合わせに対する有効性を試験した。ナタマイシンとリポペプチド粗抽出物との重量比は１：５００〜５００：１まで様々であり、表８にまとめた通り、相乗効果はすべての場合で観察された。表８の濃度は、ウェルごとの各成分の最終濃度を表す。
【表８】
2014518878.tif 000009
【図１】
2014518878.tif 000010
【図２】
2014518878.tif 000011
【図３】
2014518878.tif 000012
【図４】
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【図５】
2014518878.tif 000014
【図６】
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【図７】
2014518878.tif 000016
【図８】
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【図９】
2014518878.tif 000018
【国際調査報告】
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