(57)【要約】  本開示は、ａ）ＨＡ２２の抗原結合領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；又はｂ）ＢＬ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲに関連する、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体又はその抗原結合部位、及び医薬組成物が開示される。哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＨＡ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；又は、
ｂ）ＢＬ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにｉ）ＣＤ２８及び／若しくはｉｉ）ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
抗原結合ドメインが、配列番号１又は２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
抗原結合ドメインが、配列番号３又は４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
抗原結合ドメインが、配列番号５又は６を含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
配列番号７を含むリーダー配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
免疫グロブリンドメインをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
免疫グロブリンドメインが、配列番号８、９又は３６を含むアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
膜貫通ドメインがｉ）ＣＤ８及び／又はｉｉ）ＣＤ２８を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
膜貫通ドメインが、（ａ）配列番号１０若しくは３３を含むＣＤ８アミノ酸配列、及び／又は（ｂ）配列番号１１を含むＣＤ２８アミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＣＤ１３７、及びｉｉｉ）ＣＤ３ζのうち１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号１２を含むＣＤ２８アミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号１３又は３４を含むＣＤ１３７アミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号１４又は３５を含むＣＤ３ζアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
配列番号１５〜２０及び３２のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１６】
配列番号２１〜２３及び３８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
配列番号２４〜２５及び３９からなる群より選択されるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換え発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の宿主細胞を少なくとも１つ含む、細胞集団。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲと特異的に結合する、抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８に記載の組換え発現ベクター、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞集団、又は請求項２１に記載の抗体若しくはその抗原結合部分と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
（ａ）哺乳動物由来の１つ以上の細胞を含むサンプルを、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８に記載の組換え発現ベクター、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞集団、又は請求項２１に記載の抗体若しくはその抗原結合部分と接触させることによって、複合体を形成する工程、及び
（ｂ）複合体を検出する工程であって、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す工程、
を含む哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８に記載の組換え発現ベクター、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞集団、請求項２１に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項２２に記載の医薬組成物を、哺乳動物においてがんを治療又は予防するのに有効な量で投与することを含む、哺乳動物におけるがんの治療又は予防方法。
【請求項２５】
哺乳動物におけるがんの治療又は予防に使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８に記載の組換え発現ベクター、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞集団、請求項２１に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１１年１０月２０日出願の米国仮特許出願第６１／５４９，５１６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
電子提出された物件の参照による組み込み
本明細書と同時提出される以下：
６９，１２７バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件、名称「７１１０２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」２０１２年１０月１８日作成、
と特定される、コンピューターで可読なヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、本明細書中、参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、公衆衛生上の問題である。化学療法などの治療法の進歩にも関わらず、血液系悪性腫瘍（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）を含む多くのがんの予後は、不良であり得る。例えば、２０００年にアメリカ合衆国では、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び白血病に起因して４５，０００例超の死亡が予想されたと見積もられている（Ｇｒｅｅｎｌｅｅら，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．，５０：７−３３（２０００））。従って、がん、特に血液系悪性腫瘍に対して、満たされていない更なる治療のニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の簡単な要旨
本発明は、ａ）ＨＡ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；又はｂ）ＢＬ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにｉ）ＣＤ２８及び／若しくはｉｉ）ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００５】
本発明の更なる実施形態は、本発明のＣＡＲに関連する、関連の核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体又はその抗原結合部位、及び医薬組成物を提供する。
【０００６】
本発明の更なる実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんの治療又は予防方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図面の各図の簡単な説明
【図１】図１は、以下のＣＡＲ：ＨＡ２２−第二世代バージョン１（■；黒四角、配列番号１５）、ＨＡ２２−第三世代（□；白四角、配列番号１６）、ＢＬ２２−第二世代バージョン１（●；黒丸、配列番号１９）、ＢＬ２２−第三世代（○；白丸、配列番号２０）、ＨＡ２２−ＳＨ−第二世代バージョン１（上向き黒三角；黒三角、配列番号１７）、ＨＡ２２−ＳＨ−第三世代（△；白三角、配列番号１８）、ｍｏｃｋ導入（形質導入されていない、Ｘ）、又はＣＤ１９特異的ＣＡＲ（＊）のうちの一種を形質導入されたエフェクターヒトＴ細胞による、５１Ｃｒで標識されたターゲット白血病細胞の溶解（％）（％  ｌｙｓｉｓ）を、様々なエフェクターとターゲットの比（Ｅ：Ｔ比）において示すグラフである。Ｘ軸にＥ：Ｔ比を、Ｙ軸にターゲットの溶解（％）を示す。該図は、ＳＥＭ細胞株の直接分析を示し、試験した他の細胞株で見られる溶解特性を代表する。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、三種の異なる第二世代バージョン１ 抗ＣＤ２２ ＣＡＲ構築物：ＨＡ２２−ＣＨ２ＣＨ３（■；四角、配列番号１５）、ＢＬ２２−ＣＨ２ＣＨ３（上向き黒三角；三角、配列番号１９）、又はＨＡ２２−ＳＨ（短い免疫グロブリン定常ドメイン配列；Ｘ、配列番号１７）のうちの一種を形質導入されたエフェクター細胞による、ターゲット白血病細胞株（ＫＯＰＮ８（Ａ）又はＮＡＬＭ６（Ｂ））の溶解（％）を、様々なＥ：Ｔ比において示すグラフである。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（◆；ひし形）は、コントロールとして含めた。Ｙ軸はターゲット細胞の溶解（％）を指す。Ｘ軸は、実施例４に記載されるようにそれぞれ個別のＣＡＲ構築物の形質導入率によって正規化したＥ：Ｔ比を示す。線は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）の対数曲線のあてはめ（Ｌｏｇ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を用いて描いた。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、三種の異なる第二世代バージョン１ 抗ＣＤ２２ ＣＡＲ構築物：ＨＡ２２−ＣＨ２ＣＨ３（■；四角、配列番号１５）、ＢＬ２２−ＣＨ２ＣＨ３（上向き黒三角；三角、配列番号１９）、又はＨＡ２２−ＳＨ（短い免疫グロブリン定常ドメイン配列、Ｘ、配列番号１７）のうちの一種を形質導入されたエフェクター細胞による、ターゲット白血病細胞株（ＲＥＨ（Ａ）又はＳＥＭ（Ｂ））の溶解（％）を、様々なＥ：Ｔ比において示すグラフである。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（◆；ひし形）はコントロールとして含めた。Ｙ軸はターゲット細胞の溶解（％）を指す。Ｘ軸は、実施例４に記載されるようにそれぞれ個別のＣＡＲ構築物の形質導入率によって正規化したＥ：Ｔ比を示す。線は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）の対数曲線のあてはめを用いて描いた。
【図４】図４は、様々なＣＡＲ構築物：ＨＡ第二（配列番号１５）；ＨＡ第三（配列番号１６）；ＨＡＳＨ第二（配列番号１７）；又はＨＡＳＨ第三（配列番号１８）のうちの一種を発現するレトロウイルスベクターを形質導入されたエフェクターＴ細胞による、ターゲット細胞株（Ｋ５６２（濃い灰色）、ＲＥＨ（黒）、ＳＥＭ（白）又はＮＡＬＭ６（薄い灰色））の溶解（％）を示すグラフである。Ｘ軸には、試験したトランスフェクトされた細胞集団のそれぞれを記載する。Ｍｏｃｋ：他の群のように活性化され培養されたが、ＣＡＲベクターを含むレトロウイルス上清（ｓ／ｎ）に曝露されなかったＴ細胞（形質導入されていない）。抗ＣＤ１９抗原は、コントロールとして使用した。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、形質導入されていないエフェクターＴ細胞（Ａ、「ｍｏｃｋ」）、又は第二世代バージョン１ ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ（配列番号１７）（Ｂ、「ＨＡＳＨ２８ｚ」）を形質導入されたエフェクターＴ細胞による、ＣＤ２２を発現するターゲット白血病細胞株（ＲＥＨ（ひし形）、ＳＥＭ（四角）、ＮＡＬＭ６（三角）、ＫＯＰＮ８（Ｘ）、Ｄａｕｄｉ（丸）、Ｒａｊｉ（｜））又はＣＤ２２陰性コントロールターゲット細胞株（Ｋ５６２（＊））の溶解（％）を、様々なＥ：Ｔ比において示すグラフである。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、形質導入されていないエフェクターＴ細胞（三角、「ｍｏｃｋ」）、又は第二世代バージョン１ ＨＡ２２ ＣＡＲ（丸、ＨＡ２２ ２８ｚ、配列番号１５）若しくは第二世代バージョン１ ＢＬ２２ ＣＡＲ（四角、ＢＬ２２ ２８ｚ、配列番号１９）を形質導入されたエフェクター細胞による、ＣＤ２２を発現するターゲット白血病細胞株（ＲＥＨ（Ａ）、ＳＥＭ（Ｂ）、ＮＡＬＭ−６（Ｃ）又はＫＯＰＮ−８（Ｄ））の溶解（％）を、様々なＥ：Ｔ比において示すグラフである。図６Ｅ〜６Ｈは、形質導入されていないエフェクターＴ細胞（三角、「ｍｏｃｋ」）、又は第三世代 ＨＡ２２ ＣＡＲ（丸、ＨＡ２２ ２８ＢＢｚ、配列番号１６）若しくは第三世代 ＢＬ２２ ＣＡＲ（四角、ＢＬ２２ ２８ＢＢｚ、配列番号２０）を形質導入されたエフェクター細胞による、ＣＤ２２を発現するターゲット白血病細胞株（ＲＥＨ（Ｅ）、ＳＥＭ（Ｆ）、ＮＡＬＭ−６（Ｇ）又はＫＯＰＮ−８（Ｈ））の溶解（％）を、様々なＥ：Ｔ比において示すグラフである。図６Ｉ〜６Ｌは、形質導入されていないエフェクターＴ細胞（三角、「ｍｏｃｋ」）、又はＣＨ２ＣＨ３ドメインを伴った（丸、ＨＡ２２ ２８ｚ、配列番号１５）若しくは伴わない（四角、ＨＡＳＨ２２ ２８ｚ、配列番号１７）第二世代バージョン１ ＨＡ２２ ＣＡＲを形質導入されたエフェクター細胞による、ＣＤ２２を発現するターゲット白血病細胞株（ＲＥＨ（Ｉ）、ＳＥＭ（Ｊ）、ＮＡＬＭ−６（Ｋ）又はＫＯＰＮ−８（Ｌ））の溶解（％）を、様々なＥ：Ｔ比において示すグラフである。
【図７】図７Ａは、３０日の期間にわたり計測した、ルシフェラーゼ（白血病細胞にトランスフェクトし、マウスに注入した）とルシフェリン（マウスに注入した）との反応により生じた生物発光シグナル（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示すグラフである。コントロールＴ細胞（「ｍｏｃｋ」、形質導入されていない、下向き黒三角）、又はＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン１（配列番号１７、黒四角）、ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第三世代（配列番号１８、上向き黒三角）若しくはＨＡ２２ＳＨ−ＣＡＲ−第二世代バージョン２（配列番号３２、白四角）を形質導入されたＴ細胞で、マウスを処理した。光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ値が高くなればなるほど、より大きな全身腫瘍組織量を指す。図７Ｂは、３０日間にわたり、コントロールＴ細胞（「ｍｏｃｋ」、形質導入されていない、丸）、又はＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン１（配列番号１７、四角）、ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第三世代（配列番号１８、△）若しくはＨＡ２２ＳＨ 第二世代バージョン２（配列番号３２、▽）を形質導入されたＴ細胞で処理したマウスの生存（％）を示すグラフである（Ｍｏｃｋ対ＨＡ２２ＳＨ ２８ｚ、Ｐ＝０．００１；ｍｏｃｋ対ＨＡ２２ＳＨ ２８ＢＢｚ、Ｐ＝０．００４；ｍｏｃｋ対ＨＡ２２ＳＨ ＢＢｚ、ｐ＝０．００１；ＨＡ２２ＳＨ ２８Ｚ対ＨＡ２２ＳＨ ２８ＢＢｚ、ｐ＝０．０３、ＨＡ２２ＳＨ ２８ｚ対ＨＡ２２ＳＨ ＢＢｚ、非有意）。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、ターゲット細胞（ＲＥＨ（Ａ）、ＳＥＭ（Ｂ）、ＮＡＬＭ−６（Ｃ）又はＫＯＰＮ−８（Ｄ））と共培養した際の、ＨＡ２２ ２８ｚ（配列番号１５）、ＨＡ２２ ２８ＢＢｚ（配列番号１６）、ＢＬ２２ ２８ｚ（配列番号１９）、ＢＬ２２ ２８ＢＢｚ（配列番号２０）、ＨＡＳＨ２２ ２８ｚ（配列番号１７）又はＨＡＳＨ２２ ２８ＢＢｚ（配列番号１８）のうちの一種を形質導入されたエフェクター細胞における、実施例４に記載されるように計算した、溶解単位を示すグラフである。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、白血病細胞株（ＮＡＬＭ６−ＧＬ（低ＣＤ２２）（Ａ）、Ｒａｊｉ（高ＣＤ２２）（Ｂ）又はＫ５６２（ＣＤ２２陰性）（Ｃ））と共培養した際に、以下のＣＡＲ：抗ＣＤ１９、ＨＡＳＨ２２−第二世代バージョン１（ＨＡ２２ＳＨ−２８Ｚ）、ＨＡＳＨ２２−第二世代バージョン２（ＨＡ２２ＳＨ−ＢＢＺ）若しくはＨＡＳＨ２２−第三世代（ＨＡ２２ＳＨ−２８ＢＢＺ）のうちの一種を形質導入された、又は形質導入されていない（ｍｏｃｋ）Ｔ細胞が分泌するインターフェロン（ＩＦＮ）−γの量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。図９Ｄ〜９Ｆは、白血病細胞株（ＮＡＬＭ６−ＧＬ（低ＣＤ２２）（Ａ）、Ｒａｊｉ（高ＣＤ２２）（Ｂ）又はＫ５６２（ＣＤ２２陰性）（Ｃ））と共培養した際に、以下のＣＡＲ：抗ＣＤ１９、ＨＡＳＨ２２−第二世代バージョン１、ＨＡＳＨ２２−第二世代バージョン２若しくはＨＡＳＨ２２−第三世代のうちの一種を形質導入された、又は形質導入されていない（ｍｏｃｋ）、Ｔ細胞により分泌されるインターロイキン（ＩＬ）−２の量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。図９Ｇ〜９Ｉは、白血病細胞株（ＮＡＬＭ６−ＧＬ（低ＣＤ２２）（Ａ）、Ｒａｊｉ（高ＣＤ２２）（Ｂ）又はＫ５６２（ＣＤ２２陰性）（Ｃ））と共培養した際に、以下のＣＡＲ：抗ＣＤ１９、ＨＡＳＨ２２−第二世代バージョン１、ＨＡＳＨ２２−第二世代バージョン２若しくはＨＡＳＨ２２−第三世代のうちの一種を形質導入された、又は形質導入されていない（ｍｏｃｋ）Ｔ細胞が分泌する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、ａ）ＨＡ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；又はｂ）ＢＬ２２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びにｉ）ＣＤ２８及び／若しくはｉｉ）ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと結合した抗体の抗原結合ドメイン（例、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの特徴は、モノクローナル抗体の抗原結合能力をいかし、ＭＨＣ非拘束性の方法で、選択されたターゲットに対するＴ細胞の反応性と特異性を再指示（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）する能力を含む。ＭＨＣ非拘束性抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に抗原処理とは独立に抗原を認識する能力を与え、したがって腫瘍回避の主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞に発現させた場合、有利なことに、ＣＡＲは、内在のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及びベータ鎖と二量体化しない。
【００１０】
本明細書で使用する場合、用語「抗原特異性を有する」及び「抗原特異的応答をひきおこす」とは、ＣＡＲと抗原との結合が免疫応答をひきおこすように、ＣＡＲが抗原に特異的に結合し、抗原を免疫学的に認識し得ることを意味する。
【００１１】
本発明のＣＡＲは、ＣＤ２２に対する抗原特異性を有する。ＣＤ２２は、系統が制限された（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）Ｂ細胞の抗原で、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに所属する。ＣＤ２２は、６０〜７０％のＢ細胞リンパ腫及び白血病（例、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及びバーキットリンパ腫）において発現し、Ｂ細胞発生の初期段階の細胞表面、又は幹細胞には存在しない（Ｖａｉｃｋｕｓら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：２６７−２９７（１９９１）；Ｂａｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１：１５４５−５０（２００５））。
【００１２】
特定の理論又はメカニズムに束縛されるものではないが、ＣＤ２２に対する抗原特異的応答をひきおこすことによって、本発明のＣＡＲは以下のうち１つ以上を提供すると考えられる：ＣＤ２２を発現するがん細胞をターゲットとし破壊する、がん細胞を減少させる又は排除する、腫瘍部位へ免疫細胞の浸潤を促進する、及び抗がん応答を増強する／拡大させる。Ｂ細胞発生の初期段階又は幹細胞ではＣＤ２２を発現していないため、有利なことに、本発明のＣＡＲは、幹細胞及び／又は発生初期段階のＢ細胞をターゲットとし／破壊することを実質的に避けることが予期される。
【００１３】
本発明は、免疫毒素ＨＡ２２又はＢＬ２２の抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。免疫毒素ＢＬ２２及びＨＡ２２は、バクテリア毒素と融合させたＣＤ２２特異的ｓｃＦｖを含む治療剤である。該免疫毒素は、がん細胞の表面に結合し、がん細胞を殺す。ＢＬ２２は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エンドトキシンＡの３８−ｋＤ切断型と融合させた、ジスルフィド安定化された抗ＣＤ２２抗体の一本鎖可変断片（ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ｄｓＦｖ）ＲＦＢ４を含む（Ｂａｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１：１５４５−５０（２００５））。ＨＡ２２（ＣＡＴ８０１５、モキセツモマブ・パスドトックス（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ））は、変異の入った、ＢＬ２２の高親和性バージョンである（Ｈｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１）：６０７−１７（２００５））。
【００１４】
ＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインは、特異的にＣＤ２２と結合する。ＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインの適切な配列は、例えば、米国特許第７，５４１，０３４号；７，３５５，０１２号；及び７，９８２，０１１号（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、ＨＡ２２若しくはＢＬ２２抗原結合ドメインの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか、ＨＡ２２若しくはＢＬ２２抗原結合ドメインの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなるか、又は本質的にＨＡ２２若しくはＢＬ２２抗原結合ドメインの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。
【００１５】
ＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインそれぞれは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。ＨＡ２２又はＢＬ２２の軽鎖可変領域は、配列番号１若しくは２それぞれを含んでよく、配列番号１若しくは２それぞれからなってよく、又は本質的に配列番号１若しくは２それぞれからなってよい。ＨＡ２２又はＢＬ２２の重鎖可変領域は、配列番号３若しくは４それぞれを含み得、配列番号３若しくは４それぞれからなり得、又は本質的に配列番号３若しくは４それぞれからなり得る。従って、本発明の一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１若しくは２を含む軽鎖可変領域、及び／又は配列番号３若しくは４を含む重鎖可変領域を含む。
【００１６】
本発明の一実施形態において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、リンカーにより結合されてよい。リンカーは、任意の適切なアミノ酸配列を含んでよい。本発明の一実施形態において、リンカーは、配列番号３７を含んでよく、配列番号３７からなってよく、又は本質的に配列番号３７からなってよい。
【００１７】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含んでよい。これに関して、ＨＡ２２又はＢＬ２２の抗原結合ドメイン（各々が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）は、それぞれ配列番号５若しくは６を含むか、配列番号５若しくは６からなるか、又は本質的に配列番号５若しくは６からなる。
【００１８】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、リーダー配列を含む。リーダー配列は、軽鎖可変領域のアミノ末端に位置してよい。リーダー配列は、任意の適切なリーダー配列を含んでよい。一実施形態において、リーダー配列は、ヒト顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体配列である。これに関して、抗原結合ドメインは、配列番号７を含むか、配列番号７からなるか、又は本質的に配列番号７からなるリーダー配列を含む。本発明の一実施形態において、リーダー配列は細胞表面におけるＣＡＲの発現を促進し得る一方、発現したＣＡＲにおいてリーダー配列の存在は、ＣＡＲが機能するために必須ではない。本発明の一実施形態において、細胞表面上でのＣＡＲの発現に際し、リーダー配列はＣＡＲから切り離されてよい。従って、本発明の一実施形態において、ＣＡＲはリーダー配列を欠く。
【００１９】
一実施形態において、ＣＡＲは免疫グロブリンドメインを含む。好ましくは、その免疫グロブリンドメインは、ヒトの免疫グロブリン配列である。一実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）ドメイン配列（ＣＨ２ＣＨ３）を含む。これに関して、ＣＡＲは、配列番号８を含むか、配列番号８からなるか、又は本質的に配列番号８からなる免疫グロブリンドメインを含む。本発明の一実施形態において、免疫グロブリンドメインは、短い免疫グロブリン定常ドメイン配列を含んでもよい。これに関して、ＣＡＲは、配列番号９若しくは３６を含むか、配列番号９若しくは３６からなるか、又は本質的に配列番号９若しくは３６からなる免疫グロブリンドメインを含む。特定の理論に束縛されるものではないが、ＣＨ２ＣＨ３ドメインは、ｓｃＦｖの結合モチーフをＣＡＲ発現細胞の細胞膜から離れた場所へと伸ばし、かつ、野生型のＴＣＲのサイズとドメイン構造をより正確に模倣し得ると考えられる。
【００２０】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲは膜貫通ドメインを含む。本発明の一実施形態において、膜貫通ドメインは、ｉ）ＣＤ８及び／又はｉｉ）ＣＤ２８を含む。好ましい実施形態において、ＣＤ８及びＣＤ２８は、ヒトのものである。ＣＤ８又はＣＤ２８は、全長に満たないＣＤ８又はＣＤ２８それぞれを含んでよい。これに関して、ＣＡＲは、ａ）配列番号１０若しくは３３を含むか、配列番号１０若しくは３３からなるか又は本質的に配列番号１０若しくは３３からなるＣＤ８膜貫通ドメイン、及び／又はｂ）配列番号１１を含むか、配列番号１１からなるか、又は本質的に配列番号１１からなるＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。
【００２１】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲは、ｉ）ＣＤ２８、ｉｉ）ＣＤ１３７、及びｉｉｉ）ＣＤ３ゼータ（ζ）のうちの１つ以上を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。好ましい実施形態において、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζのうちの１つ以上は、ヒトのものである。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激に重要な、Ｔ細胞マーカーである。４−１ＢＢとしても知られているＣＤ１３７は、Ｔ細胞への強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進させ、かつＴリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３ζは、ＴＣＲと関連してシグナルを生じ、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭｓ）を含む。ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζのうちの１つ以上は、それぞれ、全長に満たないＣＤ２８、ＣＤ１３７又はＣＤ３ζを含んでよい。これに関して、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号１２を含むか、配列番号１２からなるか、又は本質的に配列番号１２からなるＣＤ２８アミノ酸配列；配列番号１３若しくは３４を含むか、配列番号１３若しくは３４からなるか、又は本質的に配列番号１３若しくは３４からなるＣＤ１３７アミノ酸配列；及び／又は配列番号１４若しくは３５を含むか、配列番号１４若しくは３５からなるか、又は本質的に配列番号１４若しくは３５からなるＣＤ３ζアミノ酸配列、のうちの１つ以上を含む。
【００２２】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメイン、並びにＣＤ２８及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。これに関して、ＣＡＲは、配列番号１１、１２及び１４のそれぞれを含んでよい。好ましくは、ＣＡＲは、ａ）配列番号１、３、８、１１、１２及び１４のそれぞれ；ｂ）配列番号２、４、８、１１、１２及び１４のそれぞれ；又はｃ）配列番号１、３、９、１１、１２及び１４のそれぞれを含む。
【００２３】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、並びにＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。これに関して、ＣＡＲは、配列番号１０、１２、１３及び１４のそれぞれを含んでよい。好ましくは、ＣＡＲは、ａ）配列番号１、３、８、１０、１２、１３及び１４のそれぞれ；ｂ）配列番号２、４、８、１０、１２、１３及び１４のそれぞれ；又はｃ）配列番号１、３、９、１０、１２、１３及び１４のそれぞれを含む。
【００２４】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、並びにＣＤ１３７及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。これに関して、ＣＡＲは、配列番号３３〜３５のそれぞれを含んでよい。好ましくは、ＣＡＲは、配列番号１、３及び３３〜３６のそれぞれを含む。
【００２５】
本発明の更なる実施形態は、表１に記載のアミノ酸配列のいずれかを含むか、該アミノ酸配列のいずれかからなるか、又は本質的に該アミノ酸配列のいずれかからなるＣＡＲを提供する。
【００２６】
【表１】
2014534207.tif 000002
【００２７】
本発明の範囲には、本明細書に記載の本発明のＣＡＲの機能的部分が含まれる。ＣＡＲに関して使用される場合、用語「機能的部分」は、本発明のＣＡＲの任意の部分又は任意の断片であって、その部分又は断片がＣＡＲ（その部分又は断片はこれの一部である）（親ＣＡＲ）の生物活性を保持するものをいう。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲに対して、類似の程度、同程度又はより高い程度に、ターゲット細胞を認識する能力、又は疾患を検出、治療、若しくは予防する能力を保持するＣＡＲの部分を含む。親ＣＡＲに関連して、機能的部分は、親ＣＡＲの例えば約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含み得る。
【００２８】
機能的部分は、当該部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端又は両端に、更なるアミノ酸であって、親ＣＡＲのアミノ酸配列には見られないものを含み得る。望ましくは、更なるアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能（例えば、ターゲット細胞を認識し、がんを検出し、がんを治療し又は予防する等のこと）を妨害しない。さらに望ましくは、更なるアミノ酸が、親ＣＡＲの生物活性と比較して、その生物活性を増強する。
【００２９】
本発明の範囲には、本明細書に記載の、本発明のＣＡＲの機能的変異体が含まれる。本明細書に使用される用語「機能的変異体」は、親ＣＡＲと実質的な又は顕著な配列同一性又は類似性を有する、ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質であって、当該機能的変異体がＣＡＲ（当該機能的変異体はこれの変異体である）の生物活性を保持するものをいう。機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲと、類似の程度に、同程度に、又はより高い程度にターゲット細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載のＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体を含む。親ＣＡＲに関連して、機能的変異体は、親ＣＡＲに対してアミノ酸配列において、例えば、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上同一であり得る。
【００３０】
機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を伴う親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。或いは又はさらに、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を伴う親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、親ＣＡＲと比較して機能的変異体の生物活性が増大するように、機能的変異体の生物活性を増強してよい。
【００３１】
本発明のＣＡＲのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸／負に帯電した極性アミノ酸の、別の酸性アミノ酸／負に帯電した極性アミノ酸での置換（例、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、非極性側鎖を有するアミノ酸の、非極性側鎖を有する別のアミノ酸での置換（例、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）、塩基性アミノ酸／正に帯電した極性アミノ酸の、別の塩基性アミノ酸／正に帯電した極性アミノ酸での置換（例、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有する非荷電アミノ酸の、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸での置換（例、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）、ベータ分枝した側鎖を伴うアミノ酸の、ベータ分枝した側鎖を伴う別のアミノ酸での置換（例、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、及びＶａｌ）、芳香族の側鎖を伴うアミノ酸の、芳香族の側鎖を伴う別のアミノ酸での置換（例、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）などであり得る。
【００３２】
ＣＡＲは、他の構成要素（例えば他のアミノ酸）が機能的変異体の生物活性を物質的に変化させないように、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列（単数）又は配列（複数）から本質的になり得る。
【００３３】
本発明の実施形態のＣＡＲ（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、ＣＡＲ（又はその機能的部分若しくはその機能的変異体）が生物活性（例えば、抗原に特異的に結合する、哺乳動物において疾患細胞を検出する、又は哺乳動物において疾患を治療若しくは予防するなどの能力）を保持するならば、任意の長さのものであり得、言い換えれば、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ＣＡＲは、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上のアミノ酸長など、約５０〜約５０００のアミノ酸長であり得る。
【００３４】
本発明の実施形態のＣＡＲ（本発明の機能的部分及び機能的変異体を含む）は、１つ以上の自然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン  β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【００３５】
本発明の実施形態のＣＡＲ（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化（例えばジスルフィド架橋を介して）、又は酸付加塩に変換され、かつ／或いは任意選択で二量体化若しくは重合化、又はコンジュゲート化され得る。
【００３６】
本発明の実施形態のＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、当該分野で公知の方法で得ることができる。ＣＡＲは、ポリペプチド又はタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製されてよい。ポリペプチド及びタンパク質を新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成する適切な方法は、例えば以下の参考文献に記載されている：Ｃｈａｎら，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１；及び米国特許第５，４４９，７５２号。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法を使用して、本明細書に記載の核酸を使用して組換え産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照。さらに、本発明のＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）のあるものは、植物、細菌、昆虫、哺乳動物（例えば、ラット、ヒトなど）などの供給源から、単離及び／又は精製され得る。単離及び精製の方法は当該分野で周知である。或いは、本明細書に記載のＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のＣＡＲは、合成、組換え、単離及び／又は精製され得る。
【００３７】
本発明の一実施形態はさらに、本発明のＣＡＲのエピトープに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合部分を提供する。抗体は、当該分野で公知の任意の型の免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど）のものであり得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、天然に存在する抗体、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなど）から単離及び／又は精製された抗体であり得る。或いは、抗体は、遺伝子改変された抗体、例えば、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。抗体は、モノマー形態でもポリマー形態でもあり得る。また、抗体は、本発明のＣＡＲの機能的部分に対し、任意のレベルの親和性又は結合活性を有し得る。
【００３８】
本発明のＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、任意の抗体−抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降及び競合阻害アッセイ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（下記）及び米国特許出願公開２００２／０１９７２６６Ａ１を参照）などが挙げられる。
【００３９】
抗体の製造に適切な方法は、当該分野で公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，５１１−５１９（１９７６）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、並びにＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら（編），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。或いは、他の方法が当該分野で公知である（例えば、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ及びＡｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、並びにＲｏｄｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０−６７（１９８６））、及びバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）を参照））。さらに、非ヒト動物において抗体を産生する方法が、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開２００２／０１９７２６６Ａ１に記載されている。
【００４０】
さらにファージディスプレイが、抗体を産生するために使用され得る。これに関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーが、標準的な分子生物学技術及び組換えＤＮＡ技術を使用して産出され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージが、所望の抗原への特異的結合について選択され、選択された可変ドメインを含む完全又は部分抗体が再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、適切な細胞株（例えば、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞）中に導入され、その結果、モノクローナル抗体の特徴を有する抗体がこの細胞によって分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）、Ｈｕｓｅら（上記）及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照）。
【００４１】
抗体は、特定の重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニックマウスにより産生され得る。かかる方法は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙら（上記）に記載されている。
【００４２】
ヒト化抗体を産生する方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許０２３９４００Ｂ１、並びに英国特許第２１８８６３８号に詳細に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５，９５９−９７３（１９９４）に記載された抗体リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）技術を使用して生成され得る。
【００４３】
本発明の一実施形態はまた、本明細書に記載の任意の抗体の抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及びトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ））であり得る。
【００４４】
一本鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片（これは、合成ペプチドを介して抗体軽鎖の可変（Ｖ）ドメインに連結された抗体重鎖のＶドメインを含む、切断型Ｆａｂ断片である）は、慣用的な組換えＤＮＡ技術の技術を使用して生成され得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）を参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４（１９９４）を参照）。しかし、本発明の抗体断片は、これらの例示的な抗体断片の型に限定されない。
【００４５】
また、抗体又はその抗原結合部分は、検出可能な標識（例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例えば、金粒子）など）を含むように改変され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態はさらに、本明細書に記載のＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、本明細書に記載の、リーダー配列、抗原結合ドメイン、免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
【００４７】
本発明の一実施形態は、リーダー配列、ＢＬ２２又はＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、及びＣＨ２ＣＨ３をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、配列番号２１若しくは２２のそれぞれを含んでよく、配列番号２１若しくは２２のそれぞれからなってよく、又は本質的に配列番号２１若しくは２２のそれぞれからなってよい。本発明の別の実施形態は、リーダー配列、ＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、及び短い免疫グロブリン定常ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、配列番号２３若しくは３８を含んでよく、配列番号２３若しくは３８からなってよく、又は本質的に配列番号２３若しくは３８からなってよい。
【００４８】
本発明の核酸は、本明細書に記載の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及び／又は膜貫通ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。本発明の一実施形態は、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、配列番号２４を含んでよく、配列番号２４からなってよく、又は本質的に配列番号２４からなってよい。本発明の別の実施形態は、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、配列番号２５を含んでよく、配列番号２５からなってよく、又は本質的に配列番号２５からなってよい。本発明の更に別の実施形態は、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、配列番号３９を含んでよく、配列番号３９からなってよく、又は本質的に配列番号３９からなってよい。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態として、核酸は、リーダー配列、ＢＬ２２又はＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。これに関して、核酸は、配列番号２１及び２４の両方若しくは配列番号２２及び２４の両方を含んでよく、配列番号２１及び２４の両方若しくは配列番号２２及び２４の両方からなってよく、又は本質的に配列番号２１及び２４の両方若しくは配列番号２２及び２４の両方からなってよい。
【００５０】
別の好ましい実施形態として、核酸は、リーダー配列、ＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、短い免疫グロブリン定常ドメイン配列、ＣＤ２８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。これに関して、核酸は、配列番号２３及び２４の両方を含んでよく、配列番号２３及び２４の両方からなってよく、又は本質的に配列番号２３及び２４の両方からなってよい。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態として、核酸は、リーダー配列、ＢＬ２２又はＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。これに関して、核酸は、配列番号２１及び２５の両方若しくは配列番号２２及び２５の両方を含んでよく、配列番号２１及び２５の両方若しくは配列番号２２及び２５の両方からなってよく、又は本質的に配列番号２１及び２５の両方若しくは配列番号２２及び２５の両方からなってよい。
【００５２】
別の好ましい実施形態として、核酸は、リーダー配列、ＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、短い免疫グロブリン定常ドメイン配列、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。これに関して、核酸は、配列番号２３及び２５の両方を含んでよく、配列番号２３及び２５の両方からなってよく、又は本質的に配列番号２３及び２５の両方からなってよい。
【００５３】
更に別の好ましい実施形態として、核酸は、リーダー配列、ＨＡ２２の抗原結合ドメイン（軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む）、短い免疫グロブリン定常ドメイン配列、ＣＤ８を含む膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７を含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。これに関して、核酸は、配列番号３８及び３９の両方を含んでよく、配列番号３８及び３９の両方からなってよく、又は本質的に配列番号３８及び３９の両方からなってよい。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡ又はＲＮＡの重合体を意味し、これは一本鎖の又は二本鎖の、合成された又は自然の供給源から得た（例、単離された及び／又は精製された）ものであり得、天然、非天然、又は変更されたヌクレオチドを含み得、修飾されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるホスホジエステル結合の代わりに、天然、非天然、又は変更されたヌクレオチド間結合（ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）結合又はホスホロチオエート結合など）を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、挿入、欠失、逆位及び／又は置換を何れも含まない。しかし、本明細書で議論するように、ある場合には、核酸が１つ以上の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むことが適切であるかもしれない。いくつかの実施形態において、核酸は、ＣＡＲの機能に影響を与えず、宿主細胞による核酸の発現時に翻訳されてもされなくてもよく、更なるアミノ酸配列をコードしてよい（例、配列番号３１）。
【００５５】
本発明の一実施形態の核酸は組換えであってよい。本明細書で使用する場合、用語「組換え」とは、（ｉ）天然若しくは合成の核酸セグメントを、生きた細胞中で複製できる核酸分子に連結することにより、生きた細胞の外側で構築された分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載した分子の複製から生じる分子をいう。本明細書の目的のために、複製は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製又はｉｎ  ｖｉｖｏ複製であり得る。
【００５６】
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するものであっても、配列が分離していたであろう２つのセグメントの人工的な組み合わせによって製造された配列を有するものであってよい。この人工的な組み合わせは、化学合成によって達成される場合が多く、又はより一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載されたような遺伝子改変技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的な改変によって達成される。核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増加させるように若しくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された多様な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して、化学的に合成され得る。核酸を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリン。或いは、本発明の核酸の１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）などの企業から購入できる。
【００５７】
核酸は、ＣＡＲ又はＣＡＲの機能的部分又はＣＡＲの機能的変異体のいずれかをコードする、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含み得る。或いは、ヌクレオチド配列は、該配列のいずれかに縮重するヌクレオチド配列、又は縮重配列の組み合わせを含み得る。
【００５８】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸も提供する。
【００５９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしてよい。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量でターゲット配列（本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件には、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又は数個の散らばったミスマッチのみを含むポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列にマッチした数塩基の小領域（例えば３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列から識別する条件が含まれる。かかる相補的な小領域は、１４〜１７又はそれ以上の塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらを容易に識別できる。比較的高ストリンジェンシーの条件には、例えば、低塩及び／又は高温条件（例えば、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物、約５０〜７０℃の温度により提供される）が含まれる。かかる高ストリンジェンシー条件は、存在したとしても、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖又はターゲット鎖との間のミスマッチをほとんど許容せず、本発明のＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適している。条件は、増加量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。
【００６０】
本発明は、また、本明細書に記載の核酸のいずれかに対して同一性が少なくとも約７０％以上（例、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％）であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００６１】
一実施形態において、本発明の核酸は、組換え発現ベクター中に組み込まれ得る。これに関して、本発明の一実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書中の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物を意味し、ここで、構築物は、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触させられる。本発明のベクターは、全体としては天然に存在するものではない。しかし、ベクターの一部は天然に存在するものであり得る。本発明の組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか又は一部を天然供給源から得ることができ、天然、非天然又は変更されたヌクレオチドを含み得る）が挙げられるがそれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の型の結合を含み得る。好ましくは、天然に存在しない又は変更されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写も複製も妨害しない。
【００６２】
一実施形態において、本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターとしては、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）及び増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のため若しくは発現のため、又はそれら両方のために設計されたベクター（例えば、プラスミド及びウイルス）が挙げられる。ベクターは、以下からなる群より選択され得る：ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。バクテリオファージベクター（例えば、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９）もまた使用され得る。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）であってよい。
【００６３】
多くのトランスフェクションの技法が当該技術分野において一般に公知である（例、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）；及びＣｈｕら，Ｇｅｎｅ，１３：９７（１９８１）を参照）。トランスフェクションの方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法（例、Ｇｒａｈａｍら，上記を参照）、培養細胞への直接マイクロインジェクション（例、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，２２：４７９−４８８（１９８０）を参照）、エレクトロポーレーション（例、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）を参照）、リポソームを介した遺伝子導入（例、Ｍａｎｎｉｎｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２−６９０（１９８８）を参照）、脂質を介した形質導入（例、Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）を参照）、及び高速ミクロ射出粒子を用いる核酸送達（例、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３（１９８７）を参照）が挙げられる。
【００６４】
一実施形態において、本発明の組換え発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載された、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製できる。環状又は線状の発現ベクターの構築物は、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含むように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
【００６５】
組換え発現ベクターは、必要に応じて、そのベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の型（例えば、細菌、真菌、植物又は動物）に特異的な調節配列（例えば、転写及び翻訳の開始及び終止コドン）を含んでよい。終始コドンを含む配列の例としては、配列番号２９及び３０が挙げられる。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限酵素認識部位を含んでよい。制限酵素認識部位を含む配列の例として、配列番号２６〜２８が挙げられる。
【００６６】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供する補完などが挙げられる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００６７】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列又はＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と相補的であるか若しくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、天然又は非天然のプロモーターを含み得る。プロモーター（例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的）の選択は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、又はマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復配列中に見出されるプロモーター）であり得る。
【００６８】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために製造され得る。
【００６９】
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように製造され得る。本明細書中で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、その自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子をいう。自殺遺伝子は、その遺伝子が発現される細胞に対し薬剤（例えば薬物）に対する感受性を付与し、細胞がその薬剤と接触したとき又はその薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は当該分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【００７０】
本発明の範囲内には、本発明のＣＡＲ（その機能的部分又は変異体のいずれかを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分のいずれかを含むコンジュゲート（例えば、バイオコンジュゲート）が含まれる。コンジュゲート及びコンジュゲートの合成方法は一般に、当該分野で公知である（例えば、Ｈｕｄｅｃｚ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：２０９−２２３（２００５）及びＫｉｒｉｎら，Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．４４（１５）：５４０５−５４１５（２００５）を参照）。
【００７１】
本発明の一実施形態はさらに、本明細書に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含み得る任意の型の細胞をいう。宿主細胞は、真核生物細胞（例えば、植物、動物、真菌又は藻類）であり得、或いは原核生物細胞（例えば、細菌又は原生生物）であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞（即ち、ヒトなどの生物から直接単離された）であり得る。宿主細胞は、接着細胞又は浮遊細胞（即ち、懸濁物中で増殖する細胞）であり得る。適切な宿主細胞は当該分野で公知であり、例えば、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞はＤＨ５α細胞などの原核生物細胞であってよい。組換えＣＡＲを産生する目的のために、宿主細胞は哺乳動物細胞であってよい。宿主細胞はヒト細胞であってよい。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の組織型に由来し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核球（ＰＭＢＣ）であってよい。宿主細胞はＴ細胞であってよい。
【００７２】
本明細書中の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞（例えば培養Ｔ細胞（例えば初代Ｔ細胞）若しくは培養Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）由来のＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞）であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数の供給源（血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液が挙げられるが、これらに限定されない）から得ることができる。Ｔ細胞はまた、濃縮又は精製され得る。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重ポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などが含まれるが、これらに限定されない）。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であってよい。
【００７３】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も提供する。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞（例えば、記載された組換え発現ベクターをいずれも含まない宿主細胞（例えばＴ細胞）又はＴ細胞以外の細胞（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞など））に加えて、この組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均質な集団であり得る。或いは、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、このとき、集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、組換え発現ベクターを含む宿主細胞から本質的になる）。集団は細胞のクローン集団でもあり得、このとき、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態において、細胞集団は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００７４】
ＣＡＲ（その機能的部分及び変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（その抗原結合部分を含む）（これらは全て、本明細書中以下、集合的に「本発明のＣＡＲ材料」と呼ぶ）は、単離及び／又は精製され得る。本明細書中で使用する場合、用語「単離された」とは、その天然の環境から取り出されたことを意味する。用語「精製された」又は「単離された」は、絶対的な純度又は単離を必要としない。むしろ、相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製された（又は単離された）宿主細胞調製物は、宿主細胞が身体内のその天然の環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって生成され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞の調製物は、その調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７０％を宿主細胞が占めるように、精製される。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％若しくは約８０％より高くてもよく、又は約１００％であり得る。
【００７５】
本発明のＣＡＲ材料は、医薬組成物などの組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明の一実施形態は、ＣＡＲ、機能的部分、機能的変異体、核酸、発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（その抗原結合部分を含む）のいずれかと、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。本発明のＣＡＲ材料のいずれかを含む本発明の医薬組成物は、１種より多い本発明のＣＡＲ材料（例えば、ＣＡＲ及び核酸）又は２種以上の異なるＣＡＲを含み得る。或いは、医薬組成物は、他の医薬上活性な薬剤又は薬物（例えば、化学療法剤、例：アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）と組み合わせて、本発明のＣＡＲ材料を含み得る。好ましい実施形態において、医薬組成物は、本発明の宿主細胞又はその集団を含む。
【００７６】
本発明のＣＡＲ材料は、塩（例えば、医薬上許容される塩）の形態で提供され得る。適切な医薬上許容される酸付加塩には、鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸及び硫酸）由来の塩、及び有機酸（例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、及びｐ−トルエンスルホン酸などのアリールスルホン酸）由来の塩が含まれる。
【００７７】
医薬組成物に関して、医薬上許容される担体は、従来使用される担体のいずれかであり得、化学−物理的考慮事項（例えば、溶解度、及び活性薬剤に対する反応性の欠如）及び投与経路のみによって限定される。本明細書に記載の医薬上許容される担体（例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤）は、当業者に周知であり、公に容易に入手可能である。医薬上許容される担体は、活性薬剤に対し化学的に不活性な担体及び使用条件下で有害な副作用も毒性もない担体であることが好ましい。
【００７８】
担体の選択は、本発明の特定のＣＡＲ材料によって、及び本発明のＣＡＲ材料を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定されよう。従って、本発明の医薬組成物の適切な製剤は多様である。保存剤が使用されてよい。適切な保存剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムが挙げられてよい。２種以上の保存剤の混合物が、任意選択で使用されてよい。保存剤又はその混合物は、典型的には、総組成物の約０．０００１重量％〜約２重量％の量で存在する。
【００７９】
適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム並びに種々の他の酸及び塩が挙げられ得る。２種以上の緩衝剤の混合物が、任意選択で使用されてもよい。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、総組成物の約０．００１重量％〜約４重量％の量で存在する。
【００８０】
医薬製剤中の本発明のＣＡＲ材料の濃度は、例えば、約１重量％未満、通常約１０重量％又は少なくとも約１０重量％から、約２０重量％〜約５０重量％以上まで変動し得、選択される特定の投与様式に従って、流体の体積及び粘度によって主に選択され得る。
【００８１】
投与可能な（例えば、非経口投与可能な）組成物を調製するための方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば以下においてより詳細に記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；第２１版（２００５年５月１日）。
【００８２】
経口、エアロゾル、非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋内、皮内、腹腔内（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）及び髄腔内）及び局所投与のための以下の製剤は、単なる例示であり、何ら限定ではない。本発明のＣＡＲ材料を投与するために１より多い経路が使用され得、ある場合には、特定の経路が、別の経路よりも迅速且つ有効な応答を提供し得る。
【００８３】
経口投与に適切な製剤は、以下を含むか又は以下からなり得る：（ａ）希釈剤（例えば、水、生理食塩水又はオレンジジュース）中に溶解させた有効量の本発明のＣＡＲ材料などの、液体溶液；（ｂ）カプセル、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、ロゼンジ及びトローチ（それぞれ、固体又は顆粒として所定量の活性成分を含む）；（ｃ）粉末；（ｄ）適切な液体中の懸濁物；及び（ｅ）適切な乳濁物。液体製剤は、医薬上許容される界面活性剤の添加あり又はなしのいずれかの、水及びアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコール）などの希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、滑沢剤及び不活性フィラー（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチ）を含む、通常の硬ゼラチン型及び軟ゼラチン型のものであり得る。錠剤形態は、以下の１つ以上を含み得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、加湿剤、保存剤、香味料及び他の薬理学的に適合性の賦形剤。ロゼンジ形態は、香料（通常、スクロース及びアラビアゴム又はトラガント）中に本発明のＣＡＲ材料を含み得、不活性基剤（例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴム）中に本発明のＣＡＲ材料を含む香錠（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、乳濁物、ゲルなど（当該分野で公知のかかる賦形剤を加えて含む）も同様である。
【００８４】
非経口投与に適切な製剤には、水性及び非水性の等張無菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る）並びに水性及び非水性の無菌懸濁物（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を含み得る）が挙げられる。本発明のＣＡＲ材料は、医薬上許容される界面活性剤（例えば、石鹸又は洗剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロース）又は乳化剤及び他の医薬的アジュバントの添加あり又はなしの、医薬的担体（例えば、無菌の液体又は液体混合物（水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連の糖溶液、アルコール（例えば、エタノール又はヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む））中の生理学的に許容される希釈剤中で投与され得る。
【００８５】
非経口製剤で使用され得る油には、石油、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。油の具体的例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム及び鉱油が挙げられる。非経口製剤での使用に適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００８６】
非経口製剤での使用に適切な石鹸には、脂肪酸のアルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な洗剤には以下が挙げられる：（ａ）カチオン性洗剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド）、（ｂ）アニオン性洗剤（例えば、アルキル、アリール及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリド硫酸塩及びスルホコハク酸塩）、（ｃ）非イオン性洗剤（例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー）、（ｄ）両性洗剤（例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸塩及び２−アルキル−イミダゾリン第４級アンモニウム塩）、並びに（ｅ）それらの混合物。
【００８７】
非経口製剤は典型的に、例えば、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の本発明のＣＡＲ材料を含むであろう。保存剤及び緩衝液を使用してよい。注射部位での刺激を最小化又は排除するために、かかる組成物は、例えば、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含んでよい。かかる製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、例えば、約５重量％〜約１５重量％の範囲であろう。適切な界面活性剤としては、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基とエチレンオキシドとの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、単一用量又は複数用量の密封容器（例えば、アンプル及びバイアル）中に提示され得、使用直前の無菌液体賦形剤（例えば注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射溶液及び懸濁物は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【００８８】
注射可能な製剤は、本発明の一実施形態に従う。注射可能な組成物のための有効な医薬的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ及びＣｈａｌｍｅｒｓ編，２３８−２５０頁（１９８２）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，第４版，６２２−６３０頁（１９８６）を参照）。
【００８９】
局所製剤（経皮薬物放出に有用なものを含む）は、当業者に周知であり、本発明の実施形態の皮膚への適用に関して適切である。本発明のＣＡＲ材料は、単独で又は他の適切な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にされ得る。これらのエアロゾル製剤は、加圧された許容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に入れられ得る。これらはまた、例えばネブライザー又はアトマイザー中の非加圧製剤のための医薬として製剤化されてよい。かかるスプレー製剤は、粘膜にスプレーするために使用されてもよい。
【００９０】
「有効量」又は「治療に有効な量」とは、個体におけるがんを予防又は治療するのに適切な用量をいう。治療的使用又は予防的使用に有効な量は、例えば、治療される疾患又は障害の病期及び重篤度、患者の年齢、体重及び全般的健康状態、並びに処方医師の判断に依存するであろう。用量のサイズもまた、選択された活性剤、投与方法、投与のタイミング及び頻度、特定の活性剤の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度、並びに所望の生理学的効果によって決定されよう。種々の疾患又は障害が、おそらく投与の各ラウンド又は様々なラウンドで本発明のＣＡＲ材料を使用する、複数の投与を含む長期治療を必要とし得ることが、当業者に理解されよう。本発明の限定を意図しない例として、本発明のＣＡＲ材料の用量は、約０．００１〜約１０００ｍｇ／治療される対象の体重ｋｇ／日、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。本発明のＣＡＲ材料が宿主細胞である場合、宿主細胞の例示的な用量は最低で百万細胞（１ｍｇ細胞／用量）であってよい。本発明のＣＡＲ材料がウイルス中にパッケージングされた核酸である場合、ウイルスの例示的な用量は１ｎｇ細胞／用量であってよい。
【００９１】
本発明の目的のために、投与される本発明のＣＡＲ材料の量又は用量は、合理的な時間枠にわたって対象又は動物において治療応答又は予防応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明のＣＡＲ材料の用量は、投与時点から約２時間以上の期間（例えば、約１２時間〜約２４時間又はそれ以上）において、抗原に結合するため、又は疾患を検出、治療若しくは予防するために、十分でなければならない。特定の実施形態において、この期間はさらに長くてもよい。用量は、本発明の特定のＣＡＲ材料の効力及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療する動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。
【００９２】
本発明の目的のために、例えば、本発明のＣＡＲを発現するＴ細胞の所与の用量を哺乳動物に投与した際に、かかるＴ細胞によってターゲット細胞が溶解される及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度を、種々の用量のＴ細胞をそれぞれ与えた哺乳動物のセット間で比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与される出発用量を決定するために使用され得る。特定の用量の投与の際にターゲット細胞が溶解される及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当該分野で公知の方法によってアッセイできる。
【００９３】
上記医薬組成物に加えて、本発明のＣＡＲ材料は、包接錯体（例えば、シクロデキストリン包接錯体）又はリポソームとして製剤化され得る。リポソームは、特定の組織に本発明のＣＡＲ材料をターゲット化するために機能し得る。リポソームは、本発明のＣＡＲ材料の半減期を増加させるためにも使用され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９，４６７（１９８０）並びに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号及び同第５，０１９，３６９号に記載されるように、リポソームを調製するための多くの方法が利用可能である。
【００９４】
本発明の実施形態に関連して有用な送達系には、本発明の組成物の送達が、治療される部位の感作の前に及び感作を引き起こすのに十分な時間で生じるような、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）、遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）及び徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）送達系が挙げられてよい。本発明の組成物は、他の治療剤又は療法と合わせて使用され得る。かかる系は、本発明の組成物の反復投与を回避することにより、対象及び医師の利便性を向上させることができ、本発明の特定の組成物実施形態に特に適切なものであってよい。
【００９５】
多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。これらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート（ｃｏｐｏｌｙｏｘａｌａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ無水物などの、ポリマーベースの系が挙げられる。上記ポリマーの薬物含有マイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系には、ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル）及び脂肪酸又は中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド）を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分融合移植物（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）などの、非ポリマー系も含まれる。具体例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号及び同第５，２３９，６６０号に記載されるような、活性組成物がマトリックス内にある形態で含まれる、侵食性（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ）の系、及び（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号及び同第３，８５４，４８０号に記載されるような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系も使用され得、そのうちいくつかは、移植のために適合している。
【００９６】
当業者は、本発明の本発明のＣＡＲ材料が、本発明のＣＡＲ材料の治療効力又は予防効力を改変によって増加させるために、多数の方法で改変され得ることを容易に理解するであろう。例えば、本発明のＣＡＲ材料は、直接的又は架橋を介して間接的にかのいずれかで、ターゲット化部分にコンジュゲート化され得る。化合物（例えば、本発明のＣＡＲ材料）をターゲット化部分にコンジュゲート化する実務は、当該分野で公知である。例えば、Ｗａｄｗａら，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ３：１１１（１９９５）及び米国特許第５，０８７，６１６号を参照。
【００９７】
或いは、本発明のＣＡＲ材料は、デポー（ｄｅｐｏｔ）形態に改変され得、その結果、投与される身体中に本発明のＣＡＲ材料が放出される様式は、時間及び身体内の位置に関して制御される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照）。本発明のＣＡＲ材料のデポー形態は、例えば、本発明のＣＡＲ材料及び多孔性又は非多孔性の材料（例えばポリマー）を含む移植可能な組成物であって、本発明のＣＡＲ材料が、材料に封入されるか又は材料を通して拡散され、及び／又は非多孔性材料の分解によって拡散されるものであり得る。次いでデポーは、身体内の所望の位置に移植され、本発明のＣＡＲ材料が、所定の速度で移植物から放出される。
【００９８】
本発明のＣＡＲ材料を１種以上の更なる治療剤と共に投与する場合、１種以上の更なる治療剤は、哺乳動物に共投与され得る。「共投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、本発明のＣＡＲ材料が１種以上の更なる治療剤の効果を増強でき、また１種以上の更なる治療剤が本発明のＣＡＲ材料の効果を増強できるように十分に近接した時間で、１種以上の更なる治療剤及び本発明のＣＡＲ材料を投与することを意味する。これに関して、本発明のＣＡＲ材料が最初に投与されかつ１種以上の更なる治療剤が２番目に投与され得、１種以上の更なる治療剤が最初に投与され且つ本発明のＣＡＲ材料が２番目に投与され得る。或いは、本発明のＣＡＲ材料及び１種以上の更なる治療剤は、同時に投与され得る。ＣＡＲ材料と共投与され得る例示的な治療剤は、ＩＬ−２である。ＩＬ−２は、本発明のＣＡＲ材料の治療効果を増強すると考えられる。宿主細胞又は細胞集団が哺乳動物に投与される本発明の方法の目的のために、細胞は哺乳動物に対して同種又は自己の細胞であり得る。
【００９９】
本発明の医薬組成物、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団は、哺乳動物における疾患を治療又は予防する方法で使用され得ることが企図される。特定の理論又はメカニズムに束縛されないが、本発明のＣＡＲは、細胞により発現された場合に、ＣＡＲが特異性を有する抗原（例えば、ＣＤ２２）を発現する細胞に対して免疫応答を媒介できるように、生物活性（例えば、抗原（例としてＣＤ２２）を認識する能力）を有する。これに関して、本発明の一実施形態は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防方法であって、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するのに有効な量で、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体及び／若しくはその抗原結合部分、並びに／又は医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【０１００】
本発明の一実施形態は、本発明のＣＡＲ材料を投与する前に哺乳動物をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅ）ことをさらに含む。リンパ枯渇法（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）の例としては、骨髄非破壊的なリンパ枯渇化学療法（ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、骨髄破壊的なリンパ枯渇化学療法（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、全身照射法等が挙げられるが、これらに限定されなくてもよい。
【０１０１】
宿主細胞又は細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳動物に対して同種又は自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物に対して自己性である。
【０１０２】
本明細書中で言及する哺乳動物は任意の哺乳動物であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、任意の哺乳動物をいい、Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳動物（例えば、マウス及びハムスター）並びにＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ目の哺乳動物（例えばウサギ）が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物は、Ｃａｒｎｉｖｏｒａ目（Ｆｅｌｉｎｅｓ（ネコ）及びＣａｎｉｎｅｓ（イヌ）を含む）由来であってよい。哺乳動物は、Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目（Ｂｏｖｉｎｅｓ（ウシ）及びＳｗｉｎｅｓ（ブタ）を含む）由来又はＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目（Ｅｑｕｉｎｅｓ（ウマ）を含む）由来であってよい。哺乳動物は、Ｐｒｉｍａｔｅｓ目、Ｃｅｂｏｉｄｓ目若しくはＳｉｍｏｉｄｓ目（サル）又はＡｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ目（ヒト及び類人猿）のものであってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１０３】
本発明の方法に関して、がんは、以下のいずれかを含む任意のがんであり得る：急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）（例、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、骨がん、脳がん（例、髄芽細胞腫）、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸（ａｎｏｒｅｃｔｕｍ）のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔又は中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（例、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例、非小細胞肺癌）、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、並びに尿管がん。好ましくは、がんは、血液系悪性腫瘍（例、白血病又はリンパ腫、例としてホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない）である。好ましくは、がんはＣＤ２２の発現によって特徴づけられる。
【０１０４】
用語「治療」及び「予防」並びにそれらの派生語は、本明細書中で使用する場合、１００％又は完全な治療又は予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益効果又は治療効果を有すると認識する、変動する程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物中のがんの任意のレベルの治療又は予防の任意の量を提供し得る。さらに、本発明の方法が提供する治療又は予防は、治療又は予防される疾患（例えばがん）の１つ以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを含み得る。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体若しくはその抗原結合部分、又は医薬組成物の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防のための使用を提供する。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法を提供し、この方法は以下を含む：（ａ）哺乳動物由来の１つ以上の細胞を含むサンプルを、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体及び／又はその抗原結合部分と接触させることによって、複合体を形成する工程、及び（ｂ）複合体を検出する工程であって、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す、工程。
【０１０７】
サンプルは、任意の適切な方法（例えば、生体検査又は死体解剖）により得てもよい。生体検査は、個体からの組織及び／又は細胞の除去である。かかる除去は、除去された組織及び／又は細胞で実験を行うために、個体から組織及び／又は細胞を集めるためであってもよい。この実験は、個体が特定の状態又は病状（ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｔａｔｅ）を有している及び／又は患っているかどうかを決定するための実験を含んでもよい。状態又は疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）は、例えばがんでもよい。
【０１０８】
本発明の哺乳動物におけるがんの存在の検出方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含むサンプルは、全細胞、その溶解物又は全細胞溶解物の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）（例えば、核又は細胞質画分、全タンパク質画分又は核酸画分）を含むサンプルであり得る。サンプルが全細胞を含む場合、細胞は、哺乳動物の任意の細胞（血液細胞又は内皮細胞を含む、任意の組織又は器官の細胞）であり得る。
【０１０９】
本発明の検出方法の目的のために、接触は、哺乳動物に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。好ましくは、接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【０１１０】
また、複合体の検出は、当該技術分野で公知の、任意の数の方法を通して起こり得る。例えば、本明細書中に記載の、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、蛍光色素（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例、金粒子）等の検出可能な標識で標識され得る。
【０１１１】
ターゲット細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０７−５１３（１９９９）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）又はインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：４４１５−４４２３（２００５）に記載されるように、細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）の測定によって評価できる。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、その範囲を限定するものであると決して解釈すべきではないことは当然である。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
この実施例により、抗ＣＤ２２−ＣＡＲの合成、ＰＢＭＣへの抗ＣＤ２２−ＣＡＲの形質導入、及び形質導入されたＰＢＭＣの表面のＣＡＲ発現の解析を実証する。
【０１１４】
コドン最適化アルゴリズム（Ｍｒ．Ｇｅｎｅ  ＧｍＢＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＣＡＲをコードする配列を合成し、上述の表１に示すように、第二世代バージョン１（ＣＤ２８膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、並びにＣＤ３−ζ鎖細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン）；第二世代バージョン２（ＣＤ１３７及びＣＤ３−ζの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと結合したＣＤ８膜貫通ドメイン）又は第三世代（ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３−ζの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと結合したＣＤ８膜貫通ドメイン）の配列をコードする「目的」ベクターに、記載されるように（Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３（９）：５５６３−７４（２００９））、サブクローニングした。
【０１１５】
２９３ＧＰ細胞へＣＡＲレトロウイルスベクター及びＲＤ１１４ウイルス被膜糖タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトし、４８〜７２時間後に培養上清（ｓ／ｎ）を集めることにより、レトロウイルスベクターの上清を作製した。培養上清は凍結するか、又は即座に使用し、Ｙ．Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：５５６３（２００９）に以前記載されるように、連続した２日間にわたる「培養皿上の」方法（ベクターを含むｓ／ｎの希釈物にあらかじめ曝露させたレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）をコートした培養皿上での、リンパ球培養）を用いてＯＫＴ３及びＩＬ−２により活性化したヒトＰＢＭＣに形質導入した。本研究において、恒久的産生細胞株由来のＣＤ１９特異的ＣＡＲを含むレトロウイルスのｓ／ｎ（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，１１６：４０９９（２０１０））も使用した。
【０１１６】
形質導入されたＴ細胞でのＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより決定した。ＣＨ２ＣＨ３をコードしないＣＡＲを検出するために、形質導入されたＴ細胞をＣＤ２２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とともにインキュベートし、続いてヒトＩｇＧ−Ｆｃに特異的なＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともにインキュベートした。ＣＨ２ＣＨ３ドメインによってＣＡＲを発現する細胞を検出するために、ヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を用いた。ＨＡ２２ＳＨ ＣＡＲは、ＣＨ２ＣＨ３の代わりに短い免疫グロブリン定常ドメイン配列を発現する。ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、Ｉｇ領域を含まず、プロテインＬを用いて検出した。ビオチン化プロテインＬ（５０ｎｇ／ｕｌ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を結合させ、細胞を洗浄し、その後、ＳＡ−ＦＩＴＣ（４ｕｇ／ｍｌ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて検出した。レトロウイルスベクターを含む二種類の上清希釈物を使用した（１：４及び１：８）。対照用に、ＣＤ１９−ＣＡＲベクターのｓ／ｎもまた評価した。フローサイトメトリー実験により、形質導入されたＴ細胞における、表１に記載したＣＡＲ群中のＣＡＲの発現を確認した。
【０１１７】
実施例２
本実施例は、白血病細胞株でのＣＤ２２及びＣＤ１９抗原の発現を実証する。
【０１１８】
ＱＵＡＮＴＩ−ＢＲＩＴＥ  ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）並びにＰＥ−標識された抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２抗体（表２）を用い、ヒト白血病細胞株（ＲＥＨ、ＳＥＭ、ＮＡＬＭ−６、ＫＯＰＮ−８、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ及びＫ５６２）の細胞表面におけるＣＤ１９及びＣＤ２２の発現レベルを評価した。「細胞あたりの受容体数」は、示したそれぞれの細胞株の、細胞あたりの分子のおよその絶対数を指す。データは、製造業者の指示書に従い、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェア（ＢＤ）データ解析ツールを用いて、細胞あたりの結合した抗体（ＡＢＣ）を決定することにより計算した。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
実施例３
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてシグナリングモチーフ及びＣＨ２ＣＨ３がＣＡＲ活性へ及ぼす影響を実証する。
【０１２１】
第二世代又は第三世代ＣＡＲ構築物が溶解活性の増加をもたらしたか否かを決定するために、白血病細胞株を５１Ｃｒで標識し、ＣＴＬアッセイにおいてターゲットとして使用した。エフェクター細胞は、以下のＣＡＲ：ＨＡ２２−第二世代（配列番号１５）、ＨＡ２２−第三世代（配列番号１６）、ＢＬ２２−第二世代（配列番号１９）、ＢＬ２２−第三世代（配列番号２０）、ＨＡ２２−ＳＨ−第二世代（配列番号１７）、ＨＡ２２−ＳＨ−第三世代（配列番号１８）、ｍｏｃｋ導入（形質導入されていない）及びＣＤ１９特異的ＣＡＲ、のうちの一種が形質導入されたヒトＴ細胞であった。エフェクター細胞は、ターゲット細胞と様々なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。結果を図１及び図６Ａ〜６Ｌに示す。図１及び図６Ａ〜６Ｈに示すように、第二世代ＣＡＲは、第三世代ＣＡＲと比較して優れた溶解活性を実証した。更に、図６Ｉ〜６Ｌに示すように、ＩｇＧ１由来のＣＨ２ＣＨ３の付加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイでＣＡＲの機能に影響を及ぼさない。
【０１２２】
実施例４
本実施例は、異なるＣＡＲ構築物を分析する場合、溶解単位を使用して形質導入効率を正規化できることを実証する。
【０１２３】
各々のＣＡＲの形質導入効率を正規化するために、エフェクターＴ細胞のＣＡＲ発現割合を分析した。次いで、ウェルあたりのエフェクターの実数に対して、Ｅ：Ｔ比を補正した（すなわち、形質導入率が５０％の場合、Ｅ：Ｔ比を１０：１から５：１へと減少させる）。補正したＥ：Ｔ比と溶解（％）とのプロットを、次いで作成した。１溶解単位を、１０：１のＥ：Ｔ比においてターゲット細胞が３０％溶解するものとして定義した。この機能的な「単位」の定義により、比較される形質導入されたエフェクター細胞集団のそれぞれにおける、溶解活性の量が定量化される。溶解単位は、構築物間の形質導入効率の差異に対して正規化したＥ：Ｔ比を表す。図８Ａ〜８Ｄは、細胞株ＲＥＨ、ＳＥＭ、ＮＡＬＭ−６又はＫＯＰＮ−８に関して、ＣＡＲ ＨＡ２２ ２８ｚ（配列番号１５）；ＣＡＲ ＨＡ２２ ２８ＢＢｚ（配列番号１６）；ＣＡＲ ＢＬ２２ ２８ｚ（配列番号１９）；ＣＡＲ ＢＬ２２ ２８ＢＢｚ（配列番号２０）；ＣＡＲ ＨＡＳＨ２２ ２８ｚ（配列番号１７）；又はＣＡＲ ＨＡＳＨ２２ ２８ＢＢｚ（配列番号１８）の溶解活性を示す。
【０１２４】
実施例５
本実施例は、ＨＡ２２及びＢＬ２２をベースとした抗ＣＤ２２ ＣＡＲの溶解活性を実証する。
【０１２５】
ＣＤ２２に対する親和性の違いがＣＡＲの溶解活性の差異を生み出すか否かを決定するために、実施例２に記載の４種の白血病細胞株：ＫＯＰＮ８（図２Ａ）、ＮＡＬＭ６（図２Ｂ）、ＲＥＨ（図３Ａ）及びＳＥＭ（図３Ｂ）をターゲットとして用いて、５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイにより、ＨＡ２２及びＢＬ２２のｓｃＦｖ配列をコードするＣＡＲを比較した。３種の異なる第二世代バージョン１ 抗ＣＤ２２ ＣＡＲ構築物：ＨＡ２２−ＣＨ２ＣＨ３（配列番号１５）、ＢＬ２２−ＣＨ２ＣＨ３（配列番号１９）及びＨＡ２２−ＳＨ（短い免疫グロブリン定常ドメイン配列）（配列番号１７）を比較した。高活性抗ＣＤ１９ ＣＡＲはコントロールとして含めた。実施例４に記載したとおり、各々個別のＣＡＲ構築物の形質導入率によりＥ：Ｔ比を正規化し、それによって溶解値を直接比較可能であった。図２Ａに示すように、細胞株ＫＯＰＮ８は、ｓｃＦｖ親和性に基づく溶解活性の違いをはっきりと実証した。１：１を超える全ての割合に対して個別のＥ：Ｔ比をスチューデントＴ検定（対応のない、両側）により比較した場合、ＢＬ２２活性は、ＨＡ２２（ｐ＜０．０４）又はＨＡＳＨ（ｐ＜０．００５）よりも有意に低かった。本実施例により、数種の白血病細胞株においてＣＡＲ構築物を用いた場合、高親和性ｓｃＦＶがより効率的なターゲット細胞の溶解を生じさせること、かつ、この違いはＣＤ２２発現レベルと関連しないようであることが実証された。
【０１２６】
実施例６
本実施例は、ＨＡ２２をベースとした抗ＣＤ２２ ＣＡＲの溶解活性を実証する。
【０１２７】
Ｔリンパ球をＯＫＴ３及びＩＬ−２で二日間活性化させ、空のベクター（ｍｏｃｋ）又は以下のＣＡＲ構築物を発現するレトロウイルスベクターを形質導入した：ＨＡ２２（第二世代バージョン１）（配列番号１５）、ＨＡ２２（第三世代）（配列番号１６）、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＨＡＳＨ２２（第二世代バージョン１、短い免疫グロブリン定常ドメイン配列）（配列番号１７）又はＨＡＳＨ２２（第三世代、短い免疫グロブリン定常ドメイン配列）（配列番号１８）。その後、形質導入された細胞が、ＣＤ２２を発現する白血病細胞株、ＲＥＨ、ＳＥＭ及びＮＡＬＭ６を溶解する能力を試験した（８時間の５１Ｃｒ放出アッセイ）（図４）。これらの三種の細胞株は、ＣＤ１９抗原も発現していた。エフェクター：ターゲットの比は、３０：１であった。Ｋ５６２細胞株は、抗原陰性コントロールとして含めた。Ｋ５６２細胞株は、抗原陰性コントロールとして含めた。図４に示すように、抗ＣＤ２２ ＣＡＲは、白血病細胞株ＲＥＨ、ＳＥＭ及びＮＡＬＭ６を効果的に溶解させた。
【０１２８】
実施例７
本実施例は、第二世代バージョン１ ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲの溶解活性を実証する。
【０１２９】
第二世代 ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ（配列番号１７）をコードするヌクレオチド配列を用いて、レトロウイルスベクターを含む上清を作製した。当該上清を用いてヒトＴリンパ球に形質導入し、形質導入されたＴリンパ球が、ＣＤ２２抗原を産生する細胞株を溶解する能力を試験した。
【０１３０】
Ｔリンパ球をＯＫＴ３及びＩＬ−２で二日間活性化させ、レトロウイルスＣＡＲベクターを含む上清を用いて形質導入し、続いて、ＣＤ２２を発現する白血病細胞株（ＲＥＨ、ＳＥＭ、ＮＡＬＭ６、ＫＯＰＮ８、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ）及びＣＤ２２陰性コントロール細胞株（Ｋ５６２）を溶解する能力を試験した。コントロール（Ｍｏｃｋ）として、Ｔ細胞を、同様の方法で活性化及び培養したが、ＣＡＲベクターを含むレトロウイルス上清に曝露しなかった（形質導入されていない）。
【０１３１】
結果を図５Ａ及び５Ｂに示す。コントロール細胞では、腫瘍ターゲットの溶解は、ほとんど観察されなかった（図５Ａ）。ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲを形質導入された細胞では、ＲＥＨ、ＳＥＭ及びＫＯＰＮ８細胞株の溶解が観察された（図５Ｂ）。
【０１３２】
実施例８
本実施例は、ＨＡ２２をベースとしたＣＡＲを形質導入された細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで疾患の進行を遅延させ、生存を延長させることを実証する。
【０１３３】
ルシフェラーゼを発現するよう操作したＣＤ２２陽性ヒト白血病（０．５ｘ１０６のＮＡＬＭ６−ＧＬ（ルシフェラーゼをトランスフェクトしたＮＡＭＬ６））を、免疫不全マウスＮＳＧ（ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ）へ０日目（ｄａｙ０）に注入した。３日目に、１ｘ１０７のコントロールＴ細胞（「ｍｏｃｋ」、形質導入されていない）、又はＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン１（配列番号１７）、ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第三世代（配列番号１８）若しくはＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン２（配列番号３２）を形質導入させた１ｘ１０７個のＴ細胞を用いて、マウスを処理した。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ装置を用いた生物発光イメージングにより、全身腫瘍組織量を３０日の期間にわたって計測した。Ｄ−ルシフェリン ３ｍｇ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）をマウスに腹腔内注入（ｉ．ｐ．）し、注入４分後、麻酔をかけられたマウスを露光時間３０秒で撮影した。各マウスあたりの生物発光シグナルを光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして解析するために、ＬＩＶＩＮＧ  ＩＭＡＧＥソフトウェアを使用した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを図７Ａに示す。
【０１３４】
図７Ａに示すように、３日目では、全てのマウスが同程度の疾患を有した。ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン１（配列番号１７）、ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第三世代（配列番号１８）又はＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン２（配列番号３２）を形質導入されたＴ細胞で処理したマウスは、コントロール細胞で処理したマウスと比較して、マウスの全身腫瘍組織量が減少した。
【０１３５】
マウスの生存を３０日間計測し、ログランク（マンテル・コックス）解析を用いて生存統計値を計算して、生存結果を図７Ｂに示す。図７Ｂに示すように、ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン１（配列番号１７）、ＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第三世代（配列番号１８）又はＨＡＳＨ２２ ＣＡＲ−第二世代バージョン２（配列番号３２）を形質導入されたＴ細胞で処理したマウスは、コントロール細胞で処理したマウスと比較して、生存期間が延長することを実証した。
【０１３６】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれ
の参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度かつその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１３７】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての用語は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０１３８】
発明を実施するための発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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