(57)【要約】本発明は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞を、老化の特徴を失った多能性細胞へとリプログラミングするための方法に関する。特に、本発明は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞を含むターゲット細胞集団から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）をex vivoにおいて調製するための方法に関し、前記方法は、前記細胞をｉＰＳＣｓへとリプログラミングするための適切な条件下で前記ターゲット細胞集団を培養する工程を含み、前記の適切な条件は、前記ターゲット細胞における、少なくとも以下のリプログラミング因子：Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの発現を増加させることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞を含むターゲット細胞集団から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）をex vivoにおいて調製するための方法であって、前記方法は、
ａ）高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞を含む前記ターゲット細胞集団を準備する工程、および
ｂ）前記ターゲット細胞集団をｉＰＳＣｓへとリプログラミングするための適切な条件下で前記ターゲット細胞集団を培養する工程、ここで前記の適切な条件は、前記のターゲット細胞集団における、少なくとも以下のリプログラミング因子：
ｉ．Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉ．Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉｉ．Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｖ．Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、および
ｖ．Ｌｉｎ２８、
ｖｉ．および場合によりＮａｎｏｇ
の組合せの発現を増加させることを含む
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記のリプログラミング因子の組合せが、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ターゲット細胞集団が、
ａ．ヒト老化細胞、例えばヒト老化線維芽細胞を含む細胞集団；
ｂ．少なくとも５０歳の成人被験者から得られたヒト細胞集団；
ｃ．より高い比率の老齢細胞または老化細胞に至る加齢に伴う疾患を患う被験者から得られたヒト細胞集団
のいずれかである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記ターゲット細胞集団における老化エフェクターをサイレンシングさせる工程をさらに含まない、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
前記の老化エフェクターをサイレンシングさせるさらなる工程が、ｐ２１ＣＩＰおよび／またはｐ１６ＩＮＫ４ａおよび／またはｐ５３エフェクターをサイレンシングさせることからなる、請求項４の方法。
【請求項６】
リプログラミング因子の発現を増加させるための前記条件が、
ａ）前記のリプログラミング因子の組合せのコード配列を含む１つ以上の発現ベクターを、前記ターゲット細胞集団に導入する工程；または
ｂ）前記組合せの各々のリプログラミング因子またはその前駆ＲＮＡの有効量を、前記ターゲット細胞集団に直接送達する工程
を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲット細胞集団をウイルスベクターの組合せを用いてトランスフェクションする工程を含み、各ウイルスベクターは、それぞれのリプログラミング因子：Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの各々のコード配列を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに定義した通りの方法に従って得ることのできる人工多能性幹細胞。
【請求項９】
前記の人工多能性幹細胞が、高齢ドナーの細胞または老化細胞から得られる、請求項８記載の人工多能性幹細胞。
【請求項１０】
所望の細胞系統への請求項９のｉＰＳＣｓの分化によって得られた分化細胞。
【請求項１１】
高齢ドナーからの細胞または老化細胞をin vitroにおいて幼若化するための方法であって、前記方法は、前記の老齢細胞または老化細胞における少なくとも以下のリプログラミング因子：
ｉ．Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉ．Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉｉ．Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｖ．Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、および
ｖ．Ｌｉｎ２８、
ｖｉ．および場合によりＮａｎｏｇ
の組合せの発現を増加させることによって、前記の高齢ドナーからの細胞または老化細胞を人工多能性幹細胞へとリプログラミングすることを含む、前記方法。
【請求項１２】
以下のリプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの発現を増加させるための適切な条件下で前記の高齢ドナーからの細胞または老化細胞を培養することを含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
必要とする被験者における老化細胞または高齢ドナーからの細胞を幼若化するためにin vivoにおいて使用するための組成物であって、前記組成物は、以下のプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの発現を増加させるための手段を含む、前記組成物。
【請求項１４】
前記のリプログラミング因子の発現を増加させるための前記手段が、幼若化しようとする老化細胞の細胞質への各前駆ＲＮＡの送達のための適切な手段に結合させた、適切な量のＯｃｔ４前駆ＲＮＡ、Ｋｌｆ４前駆ＲＮＡ、Ｓｏｘ２前駆ＲＮＡ、ｃ−Ｍｙｃ前駆ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８前駆ＲＮＡおよび場合によりＮａｎｏｇ前駆ＲＮＡを含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
必要とする高齢患者における自己移植片としての使用のための、請求項９記載の人工多能性幹細胞、または請求項１０記載の分化細胞、または請求項１３もしくは１４の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞を、老化の特徴を失った多能性細胞へとリプログラミングするための方法に関する。特に、本発明は、高齢ドナーまたは老化細胞からのターゲット細胞集団から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）をex vivoにおいて調製するための方法に関し、前記方法は、前記細胞をｉＰＳＣｓへとリプログラミングするために適切な条件下で前記ターゲット細胞集団を培養する工程を含み、前記の適切な条件は、前記ターゲット細胞における、少なくとも以下のリプログラミング因子：Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの組合せの発現を増加させることを含む。
【０００２】
発明の背景
S. Yamanaka１，２による人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）の発見、およびｉＰＳＣ技術の非常に急速な進歩は、自己再生医療における新たな活路を開き、これにより患者特異的な多能性細胞を潜在的に成人体細胞から誘導することができる。ｉＰＳＣｓは、種々の細胞型において、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４転写因子カクテルの強制発現によって、またはＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣをＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８によって置換した代替的な因子の組合せによって、再現性よく得られている３。
【０００３】
細胞老化は生理学的な加齢に関連し、そして、発ガン遺伝子活性化または複製老化と呼ばれる極めて短くなったテロメラーゼを含む、種々の形態のストレス刺激に応答した安定な細胞周期停止によって特徴付けられる９，１０。共通の特徴は、形態の変化を伴う、これらの細胞におけるｐ５３／ｐ２１ＣＩＰ１およびｐＲｂ／ｐ１６ＩＮＫ４Ａ腫瘍サプレッサー経路の活性化、老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性の増加、特異的ＳＡセクレトーム（ＳＡＳＰ）および老化関連ヘテロクロマチン構造（これは細胞分裂を促進する遺伝子の抑制に関与すると考えられている）の形成である。
【０００４】
欧州特許第２０９６１６９号は、以下の６個の遺伝子（Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇ）を体細胞に導入する工程を含む、体細胞から人工多能性幹細胞を生成するためのプロセスを開示している。しかしながら、この特定のリプログラミング因子の組合せは、老化細胞または高齢ドナーからの細胞には適用されていない。
【０００５】
細胞の老化は、ｐ５３、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ２１ＣＩＰ１のアップレギュレーションに因り、リプログラミングに対する障壁であることがいくつかのグループによって近年記載されており、このことは、細胞の加齢が、この技術の重要な制約であり得ることを示唆する。従って、種々の老化エフェクターの除去が、ｉＰＳＣｓ生成効率を向上させるための可能性ある解決策として提案されている４−８。
【０００６】
国際公開公報第２０１１／０１６５８８号は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−ｍｙｃおよびＬｉｎ２８からなるリプログラミング因子のカクテルと共にｐ５３の機能的阻害剤を使用することを示唆する。ｐ５３ｓｈＲＮＡがｐ５３の機能的阻害剤として使用された。
【０００７】
本発明者らは、今回、６個の因子ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣおよびＬＩＮ２８の特定の組合せの使用は、老化細胞のリプログラミングに関連した当技術分野における技術的偏見に反して、老化エフェクターを消失させる必要性なく、増殖性の百寿者の線維芽細胞および老化線維芽細胞の両方をヒトｉＰＳＣｓへと効率的にリプログラミングすることを可能とすることを示した。
【０００８】
さらに、本発明者らは、このリプログラミングは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）に観察されるようなテロメアサイズ、遺伝子発現プロファイル、酸化ストレスおよびミトコンドリア代謝を回復させることを示した。驚くべきことに、老齢細胞および老化細胞から誘導されたｉＰＳＣｓは、検出可能な細胞老化表現型の特徴を保持せず、そしてｈＥＳＣｓと区別できない。最後に、線維芽細胞へと再分化したｉＰＳＣｓは、高まった増殖能、および幼若増殖性線維芽細胞に等価である遺伝子発現プロファイルを示し、このことは、本発明によるリプログラミング戦略が、細胞老化表現型の特徴を消し、幼若化した細胞を産生するための新規な方法を規定することを実証する。
【０００９】
出願人の知る限りでは、本発明は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞を用いてｉＰＳＣｓを産生するための方法の初めての記載であり、それ故、本発明は、特に、自己再生医療において非常に有用であり得、これにより患者特異的な多能性細胞を、潜在的には、成人で老齢のまたは老化した体細胞から誘導することができ、そしてまた研究分野において数多くの適用を見出す。さらに、本発明は、in vitroまたはin vivoのいずれかにおいて、老化細胞または高齢ドナーからの細胞を幼若化するための一般的な方法として有用である。
【００１０】
発明の要約
本発明の第１の局面は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞を含むターゲット細胞集団から、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）をex vivoにおいて調製するための方法に関し、前記方法は、
ａ）高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞を含む前記ターゲット細胞集団を準備する工程、および
ｂ）前記ターゲット細胞集団をｉＰＳＣｓへとリプログラミングするための適切な条件下で前記ターゲット細胞集団を培養する工程、ここで前記の適切な条件は、前記ターゲット細胞集団において、少なくとも以下のリプログラミング因子：
ｉ．Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉ．Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉｉ．Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｖ．Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、および
ｖ．Ｌｉｎ２８、
ｖｉ．および場合によりＮａｎｏｇ
の組合せの発現を増加させることを含む
を含む。
【００１１】
好ましい態様において、前記の適切な条件は、前記ターゲット細胞集団において、以下のリプログラミング因子：Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ（またはＬ−ｍｙｃ）、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの発現を増加させることを含む。関連した態様において、前記の適切な条件は、前記ターゲット細胞集団において、以下のリプログラミング因子：Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ（またはＬ−ｍｙｃ）、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇの発現を増加させることを含む。
【００１２】
本発明者らは、老化の特徴を、本発明の方法によって完全に消すことができることを示した。従って、有利には、ターゲット細胞集団は、高齢ドナーからの成人体細胞または老化細胞、例えば老化線維芽細胞を含む細胞集団から、あるいは、早老症候群のような加齢または老化に関連した生理機能を有する任意の種類の細胞から選択され得る。１つの特定の態様において、ターゲット細胞集団は、例えば再生自己細胞療法を必要としている、少なくとも５０歳（明白に年齢に制限はなく、１０１歳のドナーの細胞集団が、この戦略を用いて効率的にリプログラミングされた）、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０または１００歳の成人被験者から得られたヒト細胞集団である。
【００１３】
有利には、前記方法は、ｐ２１ＣＩＰ１および／またはｐ１６ＩＮＫ４ａおよびまたはｐ５３などの、老化エフェクターを直接的にサイレンシングする工程を全く含まなくてもよい。特に、前記方法は、ｐ５３ｓｈＲＮＡなどのｐ５３の機能的阻害剤の使用を全く含まなくてもよい。
【００１４】
１つの態様において、上に列挙したリプログラミング因子の発現を増加させるための条件は、前記ターゲット細胞集団に、
（ａ）前記リプログラミング因子のコード配列を含む１つ以上の発現ベクターを導入すること；または
（ｂ）有効量の各リプログラミング因子またはその前駆ＲＮＡを直接的に送達すること
のいずれかを含む。
【００１５】
１つの特定の態様において、本発明の方法は、前記ターゲット細胞集団を、ウイルスベクターの組合せを用いてトランスフェクションする工程を含み、各ウイルスベクターは、各リプログラミング因子、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ（またはＬ−ｍｙｃ）、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇのコード配列を含む。
【００１６】
本発明はさらに、上記された方法によって得ることのできる人工多能性幹細胞、特に、前記方法によって得ることのできる、そして老齢細胞または老化細胞から得られた人工多能性幹細胞に関する。
【００１７】
本発明はさらに、高齢ドナーからの細胞または老化細胞における、少なくとも以下のリプログラミング因子：
ｉ．Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉ．Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉｉ．Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｖ．Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｖ．Ｌｉｎ２８、
ｖｉ．および場合によりＮａｎｏｇ
の組合せの発現を増加させることによって、前記の高齢ドナーからの細胞または老化細胞を人工多能性幹細胞へとリプログラミングすることを含む、前記の高齢ドナーからの細胞または老化細胞をin vitroにおいて幼若化するための方法に関する。
【００１８】
本発明はさらに、必要とする被験者における高齢ドナーからの細胞または老化細胞を幼若化するためにin vivoにおいて使用するための組成物に関し、前記組成物は、以下のリプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの前記の老齢細胞または老化細胞への発現を増加させるための手段を含む。
【００１９】
１つの態様において、前記リプログラミング因子の発現を増加させるための前記手段は、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質および場合によりＮａｎｏｇタンパク質の組合せを含み、各タンパク質は、幼若化しようとする細胞の核への前記タンパク質の送達のための適切な手段に結合している。
【００２０】
あるいは、前記リプログラミング因子の発現を増加させるための前記手段は、Ｏｃｔ４前駆ＲＮＡ、Ｋｌｆ４前駆ＲＮＡ、Ｓｏｘ２前駆ＲＮＡ、ｃ−Ｍｙｃ前駆ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８前駆ＲＮＡおよび場合によりＮａｎｏｇ前駆ＲＮＡの組合せを含み得、各前駆ＲＮＡは、幼若化しようとする細胞の細胞質への各前駆ＲＮＡの送達のための適切な手段に結合している。
【００２１】
上記したような本発明の組成物は、有利には、局所適用に適し得る。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明の第１の局面は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞を含むターゲット細胞集団から、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）をex vivoにおいて調製するための方法に関し、前記方法は、
ａ）高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞を含む前記ターゲット細胞集団を準備する工程、および
ｂ）前記ターゲット細胞集団をｉＰＳＣｓへとリプログラミングするための適切な条件下で前記ターゲット細胞集団を培養する工程、ここで前記の適切な条件は、前記ターゲット細胞集団における、少なくとも以下のリプログラミング因子：
ｉ．Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉ．Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉｉ．Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｖ．Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子によってコードされるリプログラミング因子、および
ｖ．Ｌｉｎ２８、および、場合により
ｖｉ．Ｎａｎｏｇ
の組合せの発現を増加させることを含む。
【００２３】
本明細書において使用する「多能性」という用語は、三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に由来する細胞系統に関連した特徴をまとめて示す細胞型へと適切な条件下において分化を受けることのできる子孫を生じる能力を有する細胞を指す。多能性幹細胞は、出生前、出生後または成人の生命体の組織に寄与することができる。８〜１２週令のＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力などの、標準的な技術として公認の試験を使用して、細胞集団の多能性を確立することができる。しかしながら、種々の多能性幹細胞の特徴の同定を使用して、多能性細胞を同定することもできる。
【００２４】
より具体的には、ヒト多能性幹細胞は、以下の非制限的なリスト：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−Ｉ−６０、ＴＲＡ−Ｉ−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、ＵＴＦ−Ｉ、Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｒｅｘ１およびＮａｎｏｇからのマーカーの少なくともいくつか、および場合により全てを発現し得る。
【００２５】
本明細書において使用する「人工多能性幹細胞」という用語は、非多能性細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞を指す。非多能性細胞は、多能性幹細胞よりも自己再生能力および分化能力がより低い細胞であり得る。より低い効力の細胞は、体性幹細胞、組織特異的前駆細胞、初代細胞または二次細胞であり得るが、それらに限定されない。本発明の方法の１つの顕著な利点は、それが、その老化表現型に因り多能性を誘導できないと以前に考えられていた、老齢細胞または老化細胞を含む任意の体細胞からの人工多能性幹細胞の産生を可能とすることである。
【００２６】
「リプログラミング」という用語は、ターゲット細胞における少数の因子（またはリプログラミング因子）の発現によって引き起こされた、ターゲット細胞の運命を異なる細胞型の運命へと変化させるプロセスを指す。例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４を異所的に発現させることによって線維芽細胞を人工多能性幹細胞へとリプログラミングするための方法が、TakahashiおよびYamanaka, 20061によって記載されている。
【００２７】
従って、「リプログラミング因子」は因子であり、例えばそれは、ターゲット細胞をリプログラミングするために使用することのできる転写因子であり得る。「リプログラミング因子」という用語はさらに、リプログラミング能力に関して因子の機能を模倣した任意の類似分子を含む。
【００２８】
本発明の方法における使用のためのターゲット細胞集団
本発明の方法における使用のためのターゲット細胞集団は、有利には、高齢ドナーからの細胞または老化細胞またはｐ１６ＩＮＫ４Ａもしくはｐ２１ＣＩＰ老化エフェクターを過剰発現している細胞のいずれかを含む細胞集団である。これらの細胞は、動物の凍結組織の生命体から得ることができる。
【００２９】
「老化細胞」という用語は、テロメア摩耗に因る複製消耗によって、またはＤＮＡ損傷、化学療法薬もしくは異常な発ガン遺伝子の発現などのストレスに応答して誘発される、一般的に細胞周期のＧ１移行期中またはいくつかの場合ではＧ２において、細胞周期停止を示す細胞を指す。この停止は、主に、ｐ５３の活性化およびサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１ＣＩＰ１のアップレギュレーションを通して行なわれる（Collado et al. 2007, Cell, 130: 223-233）。
【００３０】
「老化細胞」は、以下の特徴：
−  ｐ５３／ｐ２１ＣＩＰ１およびｐＲｂ／ｐ１６ＩＮＫ４Ａ腫瘍サプレッサー経路（以後、老化エフェクターと呼ぶ）の活性化、
−  Ｇ１において不可逆的に停止した細胞、
−  テロメアサイズの短縮、
−  老化関連β−ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ β−Ｇａｌ）の発現、
−  老化関連ヘテロクロマチン構造（ＳＡＨＦ）としての特異的なクロマチンの修飾、
−  特異的セクレトーム、
−  減少／変化した全ミトコンドリア活性
の少なくとも１つ以上によって特徴付けられ得る。
【００３１】
Ｇ１における不可逆的な細胞停止は、Matsuura et al25に記載されそして以下に簡潔に要約されているようにＦＡＣＳによって評価され得る：
【００３２】
細胞周期を分析するために、トリプシン処理した細胞を、少なくとも１５分間４℃で冷７０％ＥｔＯＨを用いて固定する。固定した細胞を遠心分離にかけ、そしてＰＢＳに再懸濁し、その後、ヨウ化プロピジウム（１０μg/ml）とＲＮａｓｅＡ（２５０μg/ml）を用いて３０分間の間に染色し、そして例えばFacsCalibur II (BD Biosciences)を使用してフローサイトメトリーによって分析する。
【００３３】
テロメアサイズの短縮は、例えば以下の実施例に記載したような、例えばサザンブロット分析によって平均の末端制限酵素断片（ＴＲＦ）長を評価することによって特徴付けられ得る。
【００３４】
老化関連β−ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ β−Ｇａｌ）の発現を検出するための方法は、Matsuura et al25に記載され、そして以下に簡潔に要約されている：
【００３５】
細胞培養液を記載の通りに染色する（Dimri et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Sep 26;92(20):9363-7）。簡潔に言うと、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、そして室温で３分間かけて１％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、その後、ＰＢＳを用いて５分間かけて各々室温で３回洗浄する。染色を、４０mMリン酸ナトリウム（二塩基性）、４０mMクエン酸、１５０mM ＮａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ２、５mMフェロシアン化カリウム、５mMフェリシアン化カリウム、１mg/ml Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド、Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を含むｐＨ６の溶液を使用してＣＯ２の濃縮されていないインキュベーター中で３７℃で一晩かけて行なう。シアン化物塩およびＸ−ｇａｌを、ＰＢＳおよびジメチルホルムアミド中の新たに作製した１００倍ストック液からそれぞれ加える。その後、細胞を、ＰＢＳを用いて５分間かけて各々室温で３回洗浄し、その後、顕微鏡検査および写真撮影を行なった。
【００３６】
間接的な免疫蛍光法による老化関連ヘテロクロマチン構造（ＳＡＨＦ）の発現を検出するための方法が、以下の実施例に記載されている。
【００３７】
全ミトコンドリア活性を、プロトン勾配によって生じる膜電位差を測定することによって評価することができる。カチオン性ダイＪＣ−１を使用してこのパラメーターを測定するための方法は、例えば以下の実施例に記載されている。
【００３８】
高齢ドナーからの細胞は、老化細胞の特定の特徴、特に
−  腫瘍サプレッサーｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１ＣＩＰ１（以後、老化エフェクターと呼ぶ）のアップレギュレーション、
−  低下した増殖能、
−  ゲノム全体におけるＣｐＧの低メチル化、
−  無計画なヘテロクロマチン化
を示す多くの増殖細胞を含む。
【００３９】
腫瘍サプレッサーｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１ＣＩＰ１のアップレギュレーションは、タンパク質の発現および／またはｍＲＮＡの発現を測定するための当技術分野における通常の技術、例えばウェスタンブロット、ノザンブロットまたはリアルタイムＰＣＲを使用して観察することができる。ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１ＣＩＰ１の有意により高度な発現が、対照（非老化）細胞、例えば胚性幹細胞と比較して、試験細胞において観察された場合に、アップレギュレーションが観察される。
【００４０】
本発明者らは、高齢ドナー（７０歳を超える）からの増殖性細胞および老化細胞が、例えば遺伝子の発現または代謝の点において、幼若ドナーの細胞とは異なるサインを有することを示した。前記方法に従って得られたｉＰＳＣｓは、胚性幹細胞により近いサインを有し、そして慣用的な４個のリプログラミング因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４のカクテルを用いて得られたｉＰＳＣｓとはその点で区別される。
【００４１】
出願人の知る限りでは、少なくとも５個、好ましくは６個の特定のリプログラミング因子の組合せの使用を含む本発明の方法は、老化細胞または高齢ドナーの細胞から人工多能性幹細胞を生成するために当技術分野において記載された唯一の方法である。従って、本発明の方法は、特に、高い比率で老化細胞を含みやすい細胞集団に対して有用である。
【００４２】
本発明の方法の１つの好ましい態様において、前記ターゲット細胞集団は、以下の老化表現型の特徴：
−腫瘍サプレッサーｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ２１ＣＩＰ１（以後、老化エフェクターと呼ぶ）のアップレギュレーション、
−  Ｇ１において不可逆的に停止した細胞、
−  老化関連β−ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ β−Ｇａｌ）の発現、
−  老化関連ヘテロクロマチン構造（ＳＡＨＦ）の発現、
−  変化した全ミトコンドリア活性
の少なくとも１つ以上（または全て）を示す、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または少なくとも５０％の細胞を含む。
【００４３】
別の特定の態様において、前記ターゲット細胞集団は、少なくとも５０歳、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０または少なくとも１００歳である成人被験者から得られた、真皮細胞または線維芽細胞などの細胞である。
【００４４】
このようなターゲット細胞集団を、哺乳動物種から、好ましくはげっ歯類、霊長類またはヒト種から、より好ましくはヒト種から得ることができる。
【００４５】
ターゲット細胞集団を、種々の組織から、好ましくは自己再生処置の必要な高齢ヒト患者から得ることができる。
【００４６】
種々の組織から試料を得るための方法および初代細胞を確立するための方法は当技術分野において周知である（例えばJonesおよびWise, Methods Mol Biol. 1997参照）。
【００４７】
１つの特定の態様において、前記ターゲット細胞集団は、血液、骨髄、脂肪組織、皮膚、髪、皮膚付属器、内臓、例えば心臓、腸または肝臓、間葉組織、筋肉、骨、軟骨または骨格組織に由来する初代細胞から得られる。
【００４８】
ｉＰＳＣｓの幼若化または生成における使用のためのリプログラミング因子の組合せ
本発明の１つの必要不可欠な特徴は、ターゲット細胞集団からの多能性幹細胞の幼若化または誘導における使用のための以下のリプログラミング因子：
ｉ．Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子、好ましくはＯｃｔ４によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉ．Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子、好ましくはＫｌｆ４によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｉｉ．Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子、好ましくはＳｏｘ２によってコードされるリプログラミング因子、
ｉｖ．Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子、好ましくはｃ−Ｍｙｃによってコードされるリプログラミング因子、
ｖ．Ｌｉｎ２８、および場合により
ｖｉ．Ｎａｎｏｇ
の組合せの使用である。
【００４９】
老化細胞または高齢ドナーからの細胞などのターゲット細胞集団からの多能性幹細胞の幼若化または誘導における使用のためのリプログラミング因子の組合せは、例えば、５個のリプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ（またはＬ−ｍｙｃ）およびＬｉｎ２８、または６個のリプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ（またはＬ−ｍｙｃ）、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇの組合せを含み得る。１つの好ましい態様において、ｐ５３の機能的阻害剤は全く使用されない。
【００５０】
本明細書において使用するｐ５３の機能的阻害剤は、（ａ）ｐ５３タンパク質の機能または（ｂ）ｐ５３遺伝子の発現のいずれかを阻害することのできる任意の物質である。このような物質は、例えば、国際公開公報第２０１１／０１６５８８号に記載されている。最も具体的には、本発明の方法は、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをターゲット細胞集団（例えば老化細胞）に発現させるための手段の使用を全く含まない。
【００５１】
本明細書において使用する「Ｏｃｔファミリー」という用語は、多能性の維持に非常に重要な役割を果たす、オクタマー（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーを指す。Ｏｃｔ３／４としても知られるＰＯＵ５Ｆ１（ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１）はＯｃｔファミリーの１つの代表である。卵割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ−３／４＋細胞においてＯｃｔ３／４が無いことにより自発的な栄養膜の分化が起こり、従ってＯｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化能をもたらす。例示的なＯｃｔ３／４タンパク質は、マウスＯｃｔ３／４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１３６３３）およびヒトＯｃｔ３／４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００２７０１）によってコードされるタンパク質である。
【００５２】
従って「Ｏｃｔ３／４」、「Ｏｃｔ４」、「ＯＣＴ４」、「Ｏｃｔ４タンパク質」、「ＯＣＴ４タンパク質」などという用語は、天然形のオクトマー４転写因子のいずれか、またはＯｃｔ４転写因子活性（例えば、当技術分野において公知の方法によって測定されるような野生型Ｏｃｔ４と比べて少なくとも５０％、８０％、９０％または１００％以内の活性）を維持したその変異体を指す。いくつかの態様において、前記変異体は、天然Ｏｃｔ４ポリペプチドと比べてその全配列におよび少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、Ｏｃｔ４タンパク質は、ＧｅｎｂａｎｋリファレンスＡＤＷ７７３２７．１によって同定されたようなタンパク質である。
【００５３】
本明細書において使用する「Ｓｏｘファミリー」という用語は、Ｏｃｔ−３／４と類似した多能性の維持に関連したＳｏｘ遺伝子を指すが、それは、多能性幹細胞に専ら発現されているＯｃｔ−３／４とは対照的に多能性および単能性の幹細胞に関連している。Ｓｏｘ２は誘導のために使用された最初の遺伝子であったが１，３、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も、誘導プロセスにおいて同様に作動することが判明した。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と類似した効率でｉＰＳＣｓをもたらし、そして遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８もまたｉＰＳＣｓを生じる。
【００５４】
例示的なＳｏｘ２タンパク質は、マウスＳｏｘ２遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１１４４３）およびヒトＳｏｘ２遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００３１０６）によってコードされるタンパク質である。
【００５５】
従って、本明細書において言及したような「Ｓｏｘ２」、「ＳＯＸ２」、「Ｓｏｘ２タンパク質」、「ＳＯＸ２タンパク質」などという用語は、天然形のＳｏｘ２転写因子のいずれか、またはＳｏｘ２転写因子活性（例えば、当技術分野において公知の方法によって測定されるような野生型Ｓｏｘ２と比べて少なくとも５０％、８０％、９０％または１００％以内の活性）を維持したその変異体を含む。いくつかの態様において、前記変異体は、天然Ｓｏｘ２ポリペプチドと比べてその全配列におよび少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、Ｓｏｘ２タンパク質は、ＮＣＢＩリファレンスＮＰ＿００３０９７．１によって同定されたようなタンパク質である。
【００５６】
本明細書において使用する「Ｋｌｆファミリー」という用語は、マウスｉＰＳＣｓの生成のための因子として最初に同定されたＫｌｆ遺伝子を指し、そしてまた、ヒトｉＰＳＣｓの生成のための因子であることが実証された。例示的なＫｌｆ４タンパク質は、マウスｋｌｆ４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１０６３７）およびヒトｋｌｆ４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００４２３５）によってコードされるタンパク質である。
【００５７】
従って、本明細書において言及されるような「ＫＬＦ４」、「ＫＬＦ４タンパク質」などという用語は、天然形のＫＬＦ４転写因子のいずれか、またはＫＬＦ転写因子活性（例えば、当技術分野において公知の方法によって測定されるような野生型ＫＬＦ４と比べて少なくとも５０％、８０％、９０％または１００％以内の活性）を維持したその変異体を含む。いくつかの態様において、前記変異体は、天然ＫＬＦ４ポリペプチドと比べてその全配列におよび少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、ＫＬＦ４タンパク質は、ＮＣＢＩリファレンスＮＰ＿００４２２６．３によって同定されるようなタンパク質である。
【００５８】
本明細書において使用するようなＭｙｃファミリーの因子は、ガンに関与しているｍｙｃガン原遺伝子によってコードされる因子を指す。ｃ−Ｍｙｃは、マウスｉＰＳＣｓおよびヒトｉＰＳＣｓの生成に関与する因子であることが示された。例示的なｃ−Ｍｙｃタンパク質は、マウスｃ−ｍｙｃ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１０８４９）およびヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００２４６７）によってコードされるタンパク質である。Ｎ−ＭｙｃまたはＬ−ｍｙｃはまた、ｃ−Ｍｙｃを置きかえる可能なリプログラミング因子としても使用された。
【００５９】
従って、本明細書において言及したような「ｃ−Ｍｙｃ」、「Ｃ−ＭＹＣ」、「ｃ−Ｍｙｃタンパク質」、「Ｃ−ＭＹＣタンパク質」などという用語は、天然形のｃＭｙｃ転写因子のいずれか、またはｃＭｙｃ転写因子活性（例えば、当技術分野において公知の方法によって測定されるような野生型ｃＭｙｃと比べて少なくとも５０％、８０％、９０％または１００％以内の活性）を維持したその変異体を含む。いくつかの態様において、前記変異体は、天然ｃ−Ｍｙｃポリペプチドと比べてその全配列におよび少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、ＮＣＢＩリファレンスＮＰ＿００２４５８．２によって同定されるようなタンパク質である。
【００６０】
「Ｎａｎｏｇ」または「ｎａｎｏｇ」という用語は、未分化胚性幹細胞の自己再生に決定的に関与する転写因子を指す。ヒトにおいて、このタンパク質はＮＡＮＯＧ遺伝子によってコードされている。例示的なｎａｎｏｇは、マウス遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＸＭ＿１３２７５５）およびヒトＮａｎｏｇ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０２４８６５）によってコードされるタンパク質である。
【００６１】
従って、本明細書において言及したような「Ｎａｎｏｇ」または「ｎａｎｏｇ」などという用語は、天然形のＮａｎｏｇ転写因子のいずれか、またはＮａｎｏｇ転写因子活性（例えば、当技術分野において公知の方法によって測定されるような野生型Ｎａｎｏｇと比べて少なくとも５０％、８０％、９０％または１００％以内の活性）を維持したその変異体を含む。いくつかの態様において、前記変異体は、天然Ｎａｎｏｇポリペプチドと比べてその全配列におよび少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、Ｎａｎｏｇタンパク質は、ＮＣＢＩリファレンスＮＰ＿０７９１４１によって同定されるようなタンパク質である。
【００６２】
「Ｌｉｎ２８」または「Ｌｉｎ−２８ホモログＡ」という用語は、ヒトにおいてＬＩＮ２８遺伝子によってコードされるタンパク質である。それは、未分化ヒト胚性幹細胞のマーカーであり、そしてＩＧＦ−２（インシュリン様成長因子２）ｍＲＮＡに結合しそしてその翻訳を増強する細胞質ｍＲＮＡ結合タンパク質をコードする。Ｌｉｎ２８はまた、ｌｅｔ−７ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに結合し、そしてマウス胚性幹細胞において成熟ｌｅｔ−７マイクロＲＮＡの産生を遮断することが示された。Yu et al.は、それはｉＰＳＣｓ生成における一因子であるが、必須ではないことを実証した３。例示的なＬｉｎ２８は、マウス遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿１４５８３３）およびヒトＬｉｎ２８遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０２４６７４）によってコードされるタンパク質である。
【００６３】
従って、本明細書において言及したような「Ｌｉｎ２８」または「Ｌｉｎ２８ホモログＡ」などという用語は、天然形のＬｉｎ２８転写因子のいずれか、またはＬｉｎ２８転写因子活性（例えば、当技術分野において公知の方法によって測定されるような野生型Ｌｉｎ２８と比べて少なくとも５０％、８０％、９０％または１００％以内の活性）を維持したその変異体を含む。いくつかの態様において、前記変異体は、天然Ｌｉｎ２８ポリペプチドと比べてその全配列におよび少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の態様において、Ｌｉｎ２８タンパク質は、ＮＣＢＩリファレンスＮＰ＿０７８９５０によって同定されるようなタンパク質である。
【００６４】
本明細書において使用する２つのアミノ酸配列間の同一率は、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち同一％＝同一位置の数／位置の総数×１００）であり、これには、２つの配列の最適なアラインメントのために導入されることが必要である、ギャップの数および各ギャップの長さが考慮される。配列の比較および２つの配列間の同一率の決定は、以下に記載したような数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
【００６５】
２つのアミノ酸配列間の同一率は、ＰＡＭ１２０残基質量表、ギャップ長ペナルティー＝１２およびギャップペナルティー＝４を使用し、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. MeyersおよびW. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００６６】
当業者は、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カモシカおよびイヌなどの他の哺乳動物を起源とする他の対応するリプログラミング因子を選択してもよい。有利には、当業者は、本発明の方法において出発材料として使用したターゲット細胞と同じ種に由来する対応するリプログラミング因子を選択することができる。
【００６７】
当業者はまた、上の１つ以上のリプログラミング因子の類似体を選択することができる。本明細書において使用する「類似体」という用語は、異なる構造を有するが、ｉＰＳＣｓの生成における使用のためのリプログラミング因子と同じ結果を与え、従って、人工多能性幹細胞の生成のための方法において前記リプログラミング因子を置き換えることができる。
【００６８】
例えば、このようなリプログラミング因子の類似体は、Wenlin LiおよびSheng Ding、Trends in Pharmacological Sciences、第３１巻、第１号、２０１０年１月、３６〜４５頁またはFeng et al. Cell Stem Cell.２００９年４月３日;4(4):301-12 (特に、Feng et al., 2009の表１および２に開示された類似体を参照）に記載されている。
【００６９】
リプログラミング因子の発現を増加させるための条件
リプログラミング因子の発現を増加させるための当技術分野において利用可能な任意の条件を（ただし、このような条件が、前記ターゲット細胞を人工多能性幹細胞へとリプログラミングするための適切な量のリプログラミング因子の存在をもたらす限り）、本発明の方法に使用することができる。
【００７０】
リプログラミング因子の発現を増加させるための種々の方法が当技術分野において記載されている。総説については、Hanna JH, Saha K, Jaenisch R. Cell.２０１０年１１月１２日; 143(4):508-25;または、Sheng Ding. Trends in Pharmacological Sciences、第３１巻、第１号、２０１０年１月、３６〜４５頁;およびFeng et al. Cell Stem Cell.２００９年４月３日;4(4):301-12を参照されたい。
【００７１】
好ましい態様において、以下の代替手段をリプログラミング因子の発現を増加させるために使用し得る：
（ｉ）前記リプログラミング因子をコードする遺伝子の内因性発現を増強させること、
（ｉｉ）制御配列に作動可能に連結された前記リプログラミング因子のコード配列を含む発現ベクターをターゲット細胞集団に導入することによって、前記リプログラミング因子の異所性発現を可能とすること、または
（ｉｉｉ）細胞に、適切な量の前記リプログラミング因子またはその前駆ＲＮＡを送達すること。
【００７２】
別の態様において、リプログラミング因子の組合せのコード配列、例えば、Ｏｃｔ４コード配列、Ｓｏｘ２コード配列、Ｋｌｆ４コード配列、ｃ−Ｍｙｃコード配列、Ｌｉｎ２８コード配列および場合によりＮａｎｏｇコード配列、および／またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇの対応するネイティブなコード配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有するコード配列を含む、１つ以上の発現ベクターを使用する。
【００７３】
本明細書において使用する「コード配列」という用語は、転写されるとコードされた産物を生じるヌクレオチド配列に関する。本発明によるコード配列の転写は、適切なプロモーターに関連して容易に行なうことができる。好ましくは、コード配列は、転写されるとリプログラミング因子を生じる遺伝子のｃＤＮＡ配列に対応する。
【００７４】
２つのヌクレオチド配列間の同一率は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）＝１１、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用して、核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムなどの例えばアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００７５】
リプログラミング因子の異所性発現のための発現ベクターは、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター、トランスポゾンをベースとしたベクター（ＰｉｇｇｙＢａｃなど）またはウイルスベクターであり得る。
【００７６】
１つの特定の態様において、前記リプログラミング因子の発現を増加させるために使用された発現ベクターはウイルスベクターである。このようなウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血症ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳ガンウイルス）など、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスを起源とするベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７７】
リプログラミング因子をコードする発現ベクターに基づいた人工多能性幹細胞を生成するための方法は、当技術分野において記載されており、例えば、国際公開公報第２００７／６９６６６号、欧州特許第２０９６１６９−Ａ１号または国際公開公報第２０１０／０４２４９０号を参照されたい。
【００７８】
典型的には、本発明の方法において使用されるような任意のリプログラミング因子のコード配列、例えばＯｃｔ４コード配列、Ｓｏｘ２コード配列、Ｋｌｆ４コード配列、ｃ−Ｍｙｃコード配列、Ｎａｎｏｇコード配列および／またはＬｉｎ２８コード配列は、ターゲット細胞集団におけるコード配列の発現を奏功することのできる、例えばプロモーターなどの制御配列に作動可能に連結されていてもよい。このような発現ベクターはさらに、その発現を制御する調節エレメント、例えばプロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを含み得る。プロモーターは構成性であってもまたは誘導性であってもよい。ベクターは自己複製性であっても、または宿主細胞のＤＮＡに組み込まれていてもよい。
【００７９】
あるいは、異所性発現のためのベクターはウイルスベクターであり、そしてウイルス粒子は、老齢細胞または老化細胞を含む前記ターゲット細胞集団に前記リプログラミング因子のコード配列を導入するために産生および使用される。「ウイルス粒子」という用語は、ウイルス構造タンパク質と前記リプログラミング因子をコードする配列とを含む粒子を指すことを意味する。
【００８０】
ウイルス粒子は、前記のリプログラミング因子の組合せのヌクレオチドコード配列を有するウイルスベクターを用いてパッケージング細胞を形質転換またはトランスフェクションすることによって調製され得る。以下の実施例において、ウイルス粒子はレンチウイルスから調製される。
【００８１】
その後、ターゲット細胞集団を、上記したような発現ベクターを使用してトランスフェクションすることができる。
【００８２】
「トランスフェクション」または「トランスフェクションする」という用語は、核酸分子を細胞に導入するプロセスを指す。核酸分子は、完全タンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であり得る。任意の適切なトランスフェクション法が、本明細書に記載された方法において有用である。
【００８３】
コード配列およびその制御配列を直接ターゲット細胞のゲノムに組み込むことは、発ガン遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子の突然変異のそれぞれ活性化または不活性化を引き起こす可能性がある。特定の適用、特に医学的適用のために、ターゲット細胞のあらゆる遺伝子的改変を回避することが必要とされ得る。
【００８４】
第３の態様において、リプログラミング因子、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｆｌｋ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８、または対応するコードＤＮＡもしくはＲＮＡは、宿主ＤＮＡに外来性遺伝子材料が組み込まれることなく、すなわち、細胞のゲノムにヌクレオチド配列が導入されることなく、ターゲット細胞に導入される。
【００８５】
プラスミドベクターなどの発現ベクターを、ネイキッドなＤＮＡの形態で、リプログラミング因子の異所性発現のために前記細胞に送達することができる。あるいは、化学的に改変されたまたは改変されていないのいずれかである前記リプログラミング因子をコードするＲＮＡを細胞に導入することによりそれらをリプログラミングすることができる（例えば、Warren L, et al, 2010, Cell Stem Cell.１１月５日;7(5):618-30参照）。
【００８６】
他の発現ベクターが、例えば、国際公開公報第２００９１１５２９５号に記載されている。
【００８７】
これらの核酸を、例えば、哺乳動物細胞における慣用的なトランスフェクションプロトコールを使用して、例えばリポソームまたはカチオン性ポリマーを活用してターゲット細胞に送達することができる。
【００８８】
特に、ターゲット細胞に核酸分子を導入するために送達システムとしてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない適切なトランスフェクション法を、本明細書に記載された方法において使用し得る。例示的なトランスフェクション法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション法、リポソームトランスフェクション法、ヌクレオフェクション、ソノポレーション法、熱ショックを通したトランスフェクション法、マグネトフェクション法および電気穿孔法が挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの態様において、核酸分子を、当技術分野において周知の標準的な手順に従って電気穿孔法を使用してターゲット細胞に導入する。
【００８９】
あるいは、リプログラミング因子タンパク質、またはターゲット細胞のリプログラミングに関してインタクトなタンパク質と類似した特性を示すそのフラグメントを、ペネトラチンまたはＴＡＴ由来ペプチドを含むがそれらに限定されない細胞透過性ペプチドなどの化学的担体を活用して、前記ターゲット細胞に送達することができる。
【００９０】
ｉＰＳＣｓの生成効率を改善するための方法もまた当技術分野において記載されている。特に、本発明の方法において、種々の生成効率改善剤の導入および／または添加を実施し得る。ｉＰＳＣｓの生成効率を改善するための物質の例としては、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばバルプロ酸、トリコスタチンＡ、乳酸ナトリウム、ＭＣ１２９３およびＭ３４４など）、並びに核酸発現阻害剤、例えばＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡｓおよびｓｈＲＮＡ、並びにＧ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、並びに核酸発現系阻害剤、例えばＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが挙げられるがそれらに限定されない（Feng et al., 2009、前記も参照）。
【００９１】
１つの特定の態様において、本発明による方法は、老化エフェクターの直接的なサイレンシングの工程、および特にｐ５３エフェクターの直接的なサイレンシングの工程を全く含まない。
【００９２】
「直接的なサイレンシング」によって、対象となる遺伝子、例えばｐ５３遺伝子の発現に対して直接的に作用する物質を使用することを意味し、上流の因子に対して作用する物質の使用は意味しない。遺伝子をサイレンシングするための１つの方法は、抑制しようとする遺伝子配列に対して直接的に指向されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用である。
【００９３】
本発明の方法から得ることのできるｉＰＳＣｓを含む組成物
本発明はさらに、上記したような方法から得ることのできるｉＰＳＣｓおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む細胞ベースの組成物（以後、「ｉＰＳＣｓ組成物」と呼ぶ）に関する。顕著には、本発明によるｉＰＳＣｓは、高齢ドナーからの細胞または老化細胞から誘導されているが、老化表現型の特徴を全く有さない。
【００９４】
これらのｉＰＳＣｓ組成物は、典型的には、ヘリカーゼの異常によって引き起こされる疾患（ウェルナー症候群、コケイン症候群、ロトムンド・トムソン症候群およびブルーム症候群および色素性乾皮症および裂毛症を含む）または他の疾患（ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群またはウィーデマン・ラウテンストラウヒ症候群を含む）などの加齢に伴う疾患を患う患者から得られたｉＰＳＣｓを含み得る。
【００９５】
本発明の方法から得ることのできるｉＰＳＣｓの分化によって得られた細胞の組成物およびその使用
本発明の方法から得られた、特に高齢ドナーの細胞から得られたｉＰＳＣｓは、有利には、in vitroにおいて分化条件下で培養されることにより、筋肉、軟骨、骨、真皮組織、心臓もしくは血管組織、または他の対象となる組織などの分化細胞を生成し得る。
【００９６】
従って、本発明は、分化細胞を含む組成物を調製するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）高齢ドナーのターゲット細胞から、本発明の方法から得られたｉＰＳ細胞を含む組成物を準備する工程；および
（ｂ）ｉＰＳ細胞を含む前記組成物を、所望の細胞系統へのその分化のための適切な条件下で培養する工程
を含む。
【００９７】
当業者は、人工多能性幹細胞、ＥＳ細胞または間葉系幹細胞などの幹細胞を、所望の細胞系統へと分化するための公知のプロトコールを使用し得る。
【００９８】
本発明の別の局面は、ｉＰＳＣの分化から誘導された前記細胞系統を含む前記組成物の使用に関し、以後これを本発明の分化細胞と呼ぶ。
【００９９】
本発明の分化細胞は、例えば７０歳を超えるドナーなどの高齢ドナーの細胞から誘導されているが、老化表現型の出現前に、例えばテロメアサイズ、遺伝子発現プロファイル、代謝および細胞周期の数に関して、幼若化表現型を有するという特殊性を有する。従って、本発明の分化細胞は、多種多様な適用、特に、研究分野または治療分野において使用され得る。
【０１００】
１つの主要な適用分野は、細胞療法または再生医療である。これらのｉＰＳＣｓまたは分化細胞組成物はまた、上記したような加齢に伴う疾患の細胞モデルを生成するのに有用であり得る。
【０１０１】
例えば、遺伝子異常を患う患者から得られた線維芽細胞などの初代細胞を、当技術分野において公知の方法に従って培養および遺伝子的に修正し、そして続いて、本発明の方法に従ってｉＰＳＣｓへとリプログラミングおよび幼若化し、そして患者、例えば細胞ドナーと同じ患者への再投与のために（自己処置）適切な細胞系統へと分化させ得る。
【０１０２】
同様に、再生医療を使用して、ｉＰＳＣｓまたはその誘導体（本発明の適切な前駆体または細胞系統または分化細胞を含む）を含む組成物をin vivoにおいて直接移植することによって、損傷を受けた組織をin vivoにおいて再生することによって、機能不全の組織、損傷を受けた組織または衰えている組織から生じたあらゆる疾病を潜在的に治癒することができる。好ましくは、このような損傷を受けた組織は、加齢に伴う疾患から損傷を受けた組織または５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００歳を超える高齢患者からの組織である。
【０１０３】
１つの局面において、本発明のｉＰＳ細胞または分化細胞は、ガン疾患、炎症疾患および自己免疫疾患、筋肉および骨格疾患、神経疾患、糖尿病および他の代謝疾患を含むがそれらに限定されない、特定の疾患またはこのような疾患に関連した処置に因り、再生療法の必要な加齢に伴う疾患を患う患者または高齢患者の自己再生療法に有用であり得る。
【０１０４】
それ故、１つの局面において、本発明は、哺乳動物、例えばヒト患者、好ましくは５０、６０、７０、８０、９０または１００歳を超える高齢患者に、最も好ましくは自己移植片として（すなわち前記細胞は患者の細胞と同じ遺伝子型を有する）移植するための細胞療法製品としての使用のための本発明のｉＰＳＣｓ組成物または分化細胞に関する。
【０１０５】
別の特定の態様において、本発明のｉＰＳＣｓ組成物または分化細胞は、関節または軟骨、筋肉または骨の損傷の処置のために使用される。
【０１０６】
別の特定の態様において、本発明のｉＰＳＣｓ組成物または分化細胞はまた、有利には、再生医療（細胞ベースの療法）または研究における使用のための、真皮組織、例えば皮膚組織の産生のために使用され得る。
【０１０７】
別の特定の態様において、本発明のｉＰＳＣｓ組成物または分化細胞はまた、有利には、医薬品業界における適用をスクリーニングするための、健康な患者または疾病を有する患者からの真皮細胞、筋肉細胞または骨格細胞（これらに限定されないが）の産生のために使用され得る。このようなスクリーニング試験は、臨床適用を有する新規な薬物を探索するために、または毒性試験のために使用することができる。
【０１０８】
別の特定の態様において、本発明のｉＰＳＣｓ組成物または分化細胞はまた、心臓組織または血管組織を再生するために使用され得る。
【０１０９】
別の特定の態様において、本発明のｉＰＳＣｓ組成物または分化細胞はまた、例えば神経変性疾患を患う患者における、脳組織または神経組織の再生のために使用され得る。
【０１１０】
ターゲット細胞を幼若化するための方法
別の局面において、本発明は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞を幼若化するための方法に関する。
【０１１１】
特に、本発明は、高齢ドナーからの細胞または老化細胞をin vitroにおいて幼若化するための方法に関し、前記方法は、前記ターゲット細胞における少なくとも以下のリプログラミング因子：
（ｉ）Ｏｃｔファミリー遺伝子の１つの遺伝子、例えばＯｃｔ４によってコードされるリプログラミング因子、
（ｉｉ）Ｋｌｆファミリー遺伝子の１つの遺伝子、例えばＫｌｆ４によってコードされるリプログラミング因子、
（ｉｉｉ）Ｓｏｘファミリー遺伝子の１つの遺伝子、例えばＳｏｘ２によってコードされるリプログラミング因子、
（ｉｖ）Ｍｙｃファミリー遺伝子の１つの遺伝子、例えばｃ−ｍｙｃまたはＬ−ｍｙｃによってコードされるリプログラミング因子、および
（ｖ）Ｌｉｎ２８、
（ｖｉ）および場合によりＮａｎｏｇ
の発現を増加させることによって、前記ターゲット細胞を人工多能性幹細胞へとリプログラミングすることを含む。
【０１１２】
「幼若化する」という用語は、細胞老化表現型に関与するエピジェネティックな改変を消すプロセスを指す。細胞老化表現型は、とりわけ、以下のマーカー：
−  ｐ５３／ｐ２１ＣＩＰ１およびｐＲｂ／ｐ１６ＩＮＫ４Ａ腫瘍サプレッサー経路（以後、老化エフェクターと呼ぶ）の活性化、
−  Ｇ１において不可逆的に停止した細胞、
−  テロメアサイズの短縮、
−  老化関連β−ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ β−Ｇａｌ）の発現、
−  老化関連ヘテロクロマチン構造（ＳＡＨＦ）としての特異的なクロマチンの修飾、
−  特異的セクレトーム、
−  減少／変化した全ミトコンドリア活性
によって特徴付けられ得る。
【０１１３】
幼若化のプロセスは、これらの老化表現型マーカーの１つまたは全てが、幼若化プロセスに因り、老齢細胞型または老化細胞型において減少または抑制されている場合に観察される。
【０１１４】
１つの好ましい態様において、高齢ドナーからの細胞または老化細胞をin vitroにおいて幼若化するための方法は、高齢ドナーからの前記細胞または老化細胞を、以下のＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇからなるリプログラミング因子の組合せの発現を増加させるための適切な条件下で培養することを含む。
【０１１５】
リプログラミング因子の組合せは、それを必要とする被験者の組織をin vivoにおいて幼若化するために使用され得る。従って、本発明はさらに、それを必要とする被験者における老化細胞または老齢細胞の幼若化のためのin vivoにおいての使用のための組成物に関し、前記組成物は、以下のＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８および場合によりＮａｎｏｇからなるリプログラミング因子の組合せの発現を増加させるための手段を含む。
【０１１６】
いくつかの態様において、前記リプログラミング因子の発現を増加させるための前記手段は、適切な量のＯｃｔ４タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質および場合によりＮａｎｏｇタンパク質を含み、各タンパク質は、幼若化しようとする老化細胞の核への前記タンパク質の送達のための適切な手段に結合している。
【０１１７】
細胞へのタンパク質の送達のための手段としては、化学的担体、例えば細胞透過性ペプチド、例えばペネトラチンまたはＴＡＴ由来ペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１８】
他の態様において、前記リプログラミング因子の発現を増加させるための前記手段は、幼若化しようとする老化細胞の細胞質への各前駆ＲＮＡの送達のための適切な手段に結合させた、適切な量のＯｃｔ４前駆ＲＮＡ、Ｋｌｆ４前駆ＲＮＡ、Ｓｏｘ２前駆ＲＮＡ、ｃ−Ｍｙｃ前駆ＲＮＡ、Ｌｉｎ２８前駆ＲＮＡおよび場合によりＮａｎｏｇ前駆ＲＮＡを含む。
【０１１９】
上記したようなこれらの組成物は、特に、局所適用のために、例えば皮膚または真皮への適用のために、例えば皮膚疾患の処置のために適している。
【０１２０】
本発明はさらに、以下の実施例によって説明される。しかしながら、これらの実施例は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと捉えるべきではない。
【０１２１】
実施例：
方法
高齢ドナーからの細胞は、Coriell Institute for Medical Research (NJ, USA)から入手した。複製老化細胞を、細胞周期増殖停止までの十分な細胞培養によって得、ＦＡＣＳによって評価し、そして老化関連β−ガラクトシダーゼ活性が以前に記載されているように検出された２５。
【０１２２】
Ｈ９およびＨ１ヒト胚性幹細胞を、WiCell Research Institute (WI, USA)から入手した。ｈＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓはいずれも、２０％ノックアウト血清代替品、０．１mM非必須アミノ酸、２mM Ｌ−グルタミン（全てInvitrogen製）、０．１mM β−メルカプトエタノールおよび１０ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Peprotech）の補充されたＫＯ ＤＭＥＭ培養培地（ｈＥＳＣ培地）中の、または以前に記載されたような２６既知組成のｍＴｅＳＲ培地（Stemcell Technologies）を含むマトリゲル上のフィーダーフリー培養液（BD Biosciences）中のマイトマイシンＣで処理したＯＦ−１マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で標準的なｈＥＳＣ手順を使用して維持した。
【０１２３】
ヒトｉＰＳＣｓの生成のために、ヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８遺伝子のｃＤＮＡを含むレンチウイルスベクターをAddgeneから入手し、そしてこれは以前にYu et al3によって記載された。ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣ ｃＤＮＡを、Takahashi et al.2,3によって記載されたベクターと同じベクター骨格にサブクローニングした。２９３Ｔ細胞株（Invitrogen）を使用して、導入遺伝子を発現するレンチウイルスを産生した。ヒト初代線維芽細胞を、形質導入の１日前に３５mmの皿あたり２×１０５個の細胞で播種した。６個の各々のレンチウイルスを含む等量の上清を混合し、線維芽細胞皿に移し、そして一晩かけてインキュベーションした。形質導入から２４時間後、レンチウイルスを含む培地を第２の上清と交換した。形質導入から６日後、線維芽細胞をトリプシン処理によって収集し、そして１００mm皿のＭＥＦフィーダー層上に再播種した。次の日、培地を、１０ng/mlのｂＦＧＦの補充されたｈＥＳＣｓ培地と交換した。培地を隔日で交換した。形質導入から４０日後に３０個のコロニーを拾い上げ、そして３５mm皿の、１０ng/mlのｂＦＧＦの補充された２mlのｈＥＳＣｓ培地を含むフィーダー層上に移した。
【０１２４】
結果
７４歳のドナーの増殖性ヒト二倍体線維芽細胞（以後７４Ｐ）を、連続継代によって複製老化へと誘導した（７４Ｓ）。細胞老化を、１８回の継代後に（集団倍加数５１）、ＦＡＣＳ分析、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性の増加、ＣＤＫ阻害剤ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ２１ＣＩＰ１のアップレギュレーションおよびＳＡＨＦｓの形成によって評価した。また、これらの老化細胞は、検出可能な細胞数の増加を全く伴うことなく、培養液中で２か月を超えて維持され、これにより細胞周期停止の頑強性が確認された。本発明者らは最初に、ＬＩＮ２８を含む遺伝子のセット（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８）の過剰発現によって、これらの老化線維芽細胞からｉＰＳＣｓを生成することを試みて、４個のリプログラミング因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣのセットを用いて公表されそして老化迂回のために非効率として最初に記載された以前の実験結果と比較した。これらの全てのリプログラミング因子の遺伝子が、個々のレンチウイルスによって形質導入された。４０日後、本発明者らは、ｉＰＳＣｓに似たｈＥＳＣコロニーの新たな増殖または形成を全く観察しなかった。これは、感染した細胞集団において検出可能な内因性多能性遺伝子の発現がないことによって確認され、一方で定量ＲＴ−ＰＣＲは効率的なウイルス形質導入を実証した。これらの結果は、ＬＩＮ２８を含むリプログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣの組合せを用いて以前に記載されたように、複製老化状態を逆行させることによりｉＰＳＣｓを生成することはできないことを実証する。
【０１２５】
興味深いことに、ＮＡＮＯＧの過剰発現は、主に細胞分裂速度非依存的にリプログラミングを加速させると記載され、そしてＬＩＮ２８の過剰発現は、ｐ５３／ｐ２１ＣＩＰ１経路の阻害と同じように細胞分裂速度を高め、結果として、加速されたｉＰＳＣｓの産生速度がもたらされた１３、１４。それ故、本発明者らは、個々のレンチウイルス粒子によって導入された６個のリプログラミング因子ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびｃ−ＭＹＣの組合せに基づいたリプログラミング効率向上のために最適化されたプロトコールを使用して、老化誘導原のさらなる一過的または永久的な阻害を伴うことなく、老化障壁は克服され得ると仮定した。
【０１２６】
本発明者らの仮説を試験するために、７４Ｐ細胞および７４Ｓ細胞を、６個の各遺伝子を有する個々のレンチウイルスの混合液を用いて２回感染させた。感染から１週間後、本発明者らは、感染老化線維芽細胞（７４Ｓ ｉｎｆ）におけるＳＡＨＦｓの消失を観察し、これによりリプログラミングの最初の工程が明らかとなった。その後、細胞をｈＥＳＣｓ培地中のマウス線維芽細胞フィーダー上に蒔き、そして１８〜２０日後、感染老化細胞における増殖が回復した。ｈＥＳＣｓに似たコロニーが、感染から３５〜４０日後に出現した。ｉＰＳＣに似たコロニーが老化線維芽細胞（７４Ｓ）から産生され、平均リプログラミング効率は０．０１５〜０．０３％であり、これは同じ条件下で感染させた増殖性線維芽細胞（７４Ｐ）と類似していた。本発明者らは、７４歳のドナーの増殖性線維芽細胞（ｉＰＳＣ ７４Ｐ）および老化線維芽細胞（ｉＰＳＣ ７４Ｓ）から６個のコロニーを無作為に選択し、そしてさらに、その後通常のｈＥＳＣｓフィーダーまたはフィーダーフリー培養条件のいずれかにおいて成功裏に増殖した３個のコロニーを特徴付けた。幹細胞マーカーの発現のための長期培養および評価は、今では３５回を超える継代におよび増殖しているこれらの細胞の成功裏の維持およびリプログラミングを確認した。免疫細胞化学分析は、ヒト多能性幹細胞を特徴付ける細胞表面マーカーＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の継続した存在を実証した。定量ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｉＰＳＣｓが、Thomson Laboratory (ｉＰＳＣ ＩＭＲ９０ ＴＨ Ｃｌ ４３)で生成されそして平行して増殖されたＨ１およびＨ９ｈＥＳＣ系またはＩＭＲ９０クローン４ｉＰＳＣ系と同じレベルで内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＲＥＸ１多能性マーカー遺伝子を再発現したが、親線維芽細胞では転写物は全く検出されなかったことを示した。内因性遺伝子のこの再活性化を実証するために、本発明者らは、ＯＣＴ４プロモーターおよびＮＡＮＯＧプロモーターにおける１つの記載されたＣｐＧリッチ領域におけるＣｐＧジヌクレオチドのＤＮＡメチル化状態を調べた。バイサルファイトゲノムシークエンス分析は、ＯＣＴ４プロモーターおよびＮＡＮＯＧプロモーターの両方が、ｈＥＳＣ Ｈ９のメチル化状態と比べた場合、以前に公表されたｉＰＳＣ ＩＭＲ９０ ＴＨ Ｃｌ ４３と同じくらい効率的に、老化細胞（ｉＰＳＣ ７４Ｓ Ｃｌ Ｆ）または増殖性細胞（ｉＰＳＣ ７４Ｐ Ｃｌ Ｈ）に由来するいずれのｉＰＳＣｓにおいても脱メチル化され、一方、親線維芽細胞における同じ領域は高度にメチル化されていたことを示した。
【０１２７】
あらゆる細胞型特異的作用を排除するために、本発明者らは、連続継代によって複製老化を誘発させたＩＭＲ９０ヒト胚線維芽細胞を使用して同じプロトコールを繰り返した。７４歳のドナーの線維芽細胞と同じように、本発明者らは、以前に記載された両方の４個の因子のセットを使用してｉＰＳＣｓを生成することに成功しなかったが、一方、本発明者らは６個の因子の組合せを用いて増殖性ＩＭＲ９０線維芽細胞または老化ＩＭＲ９０線維芽細胞から類似したリプログラミング効率を得た。
【０１２８】
次に本発明者らはｉＰＳＣ ７４Ｐクローンと比べてｉＰＳＣ ７４Ｓの分化能を評価することによって本発明者らが生成したｉＰＳＣｓの多能性状態を評価した。全てのｉＰＳＣｓは、それぞれＳＭＡ、ＭＡＰ２およびＦＯＸＡ２に対する特異的な抗体を用いた免疫染色を使用して実証されたように、３つの初期胚系統、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉へと分化することができた。本発明者らは、老化ＩＭＲ９０線維芽細胞を用いて類似した結果を得た。要するに、これらの結果は、６個の転写因子、すなわちＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびｃ−ＭＹＣの組合せは、ｉＰＳＣｓの生成へと至る、細胞老化状態を逆行させるための成功裏なリプログラミング戦略であることを示す。
【０１２９】
加齢中に、老化細胞の数はヒト体内において増加し、そして組織の恒常性を損なうと考えられている。しかしながら、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ２１ＣＩＰ１の増加した発現は、高齢ドナーからの増殖細胞において起こり、そして進行的にその増殖能を減少させると考えられている１５。百寿者の増殖細胞が多能性に向かって効率的にリプログラミングされ得るかどうか、そしてそれらが細胞老化表現型のいくつかの特定のマーカーを保持しているかどうかは、未解決の問題である。この特定の論点を調べるために、本発明者らは、６個の因子を組み合わせて使用することによって、リプログラミング実験のために９２、９４、９６および１０１歳のドナーの線維芽細胞を使用した。老化細胞に対する本発明者らの以前の実験によって示唆されるように、本発明者らは老化線維芽細胞を用いて得られたのと類似した効率で、全ての高齢ドナーの線維芽細胞からｉＰＳＣｓを生成することができた。生成された全てのｉＰＳＣクローンは、各々の親線維芽細胞系の２つのクローンについて提示されているような、内因性多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＲＥＸ１を再発現し、これはまた、ＯＣＴ４プロモーター領域およびＮＡＮＯＧプロモーター領域におけるＣｐＧの脱メチル化によっても確認された。興味深いことに、本発明者らはまた、高齢ドナーからの親線維芽細胞におけるＮＡＮＯＧプロモーターの部分的脱メチル化を観察し、これは高齢者においてすでに記載１６されているゲノムの全体的な脱メチル化に一致し、これもまたリプログラミングにおいて寄与効果を有し得る。さらに、本発明者らは多能性細胞表面マーカーＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の再発現を検出し、そして最後に、本発明者らは、それぞれＳＭＡ抗体、ＭＡＰ２抗体およびＦＯＸＡ２抗体を用いて免疫染色することによって判断したところ、内胚葉、外胚葉および中胚葉の派生物へと分化するその能力を実証した。
【０１３０】
これらの結果は、成功裏に多能性状態を元通りにしそして百寿者の線維芽細胞からの自己再生を行なうための本発明者らのリプログラミング手順の効率を実証し、従って、細胞の加齢および頻繁に伴う老化表現型は、多能性に向けてのリプログラミングに対する制約ではない。
【０１３１】
本発明者らは高齢ドナーおよび老化線維芽細胞を使用してｉＰＳＣｓの生成に成功したが、最も重要な問題は、多能性状態の誘導が細胞老化表現型の主なマーカーを消し得るかどうかを解明することであった。本発明者らは以前にリプログラミングがＳＡＨＦの消失を誘導することを示し、老化細胞のゲノム構成の可塑性を実証した。その後、本発明者らは本発明者らのｉＰＳＣｓにおける加齢および老化の他の特徴を分析し、そして７４歳のドナーからの複製老化線維芽細胞から生成したｉＰＳＣｓは、イムノブロット分析によって示されるように、その以前の老化状態から遺伝されたｐ２１ＣＩＰ１およびｐ１６ＩＮＫ４Ａの増加した発現を保持していないことを見出した。類似した結果が、ＩＭＲ９０胚複製老化線維芽細胞を用いても得られた。さらに、百寿者から生成された全てのｉＰＳＣｓはまた、ｈＥＳＣ系と同じように、ｐ２１ＣＩＰ１タンパク質およびｐ１６ＩＮＫ４Ａタンパク質のダウンレギュレーションされた発現を有する。これらの結果は、本発明者らが、ｐ２１ＣＩＰ１およびｐ１６ＩＮＫ４Ａの発現を、ｈＥＳＣｓに見られる低いレベルまでリセットすることができたことを示す。
【０１３２】
高齢ドナーからの増殖性線維芽細胞は、通常、不均一なサイズのテロメアによって特徴付けられ、その平均長は、親から遺伝されたサイズおよび生涯期間の間に起こる種々の分裂回数に依存するが、増殖能とは必ずしも相関しない。しかしながら、複製老化は、常に、短いテロメアに関連している。短いテロメアは損傷されたＤＮＡとして認識され、ＤＮＡ損傷応答シグナリングカスケードの活性化および老化関連細胞周期停止のトリガーが起こる。ｉＰＳＣｓは一般的に、親分化細胞と比べて増加したテロメアサイズを示すが１７、本発明者らは老化細胞または百寿者の細胞から得られたｉＰＳＣｓが、増加した長さのテロメアを示すかどうかを疑った。この問題に取り組むために、本発明者らは、増殖細胞と比べて、複製老化細胞から得られたｉＰＳＣｓの平均の末端制限酵素断片（ＴＲＦ）長を調べるためにサザンブロット分析を使用した。本発明者らは、７４歳のドナーからの増殖細胞または老化細胞の両方からのｉＰＳＣｓのテロメア長は、Ｈ９ ｈＥＳＣにおいて観察されたものと等しいサイズまで増加することを見出した。集団倍加数５０の後に複製老化に入る親線維芽細胞とは異なり（胚線維芽細胞ＩＭＲ９０については倍加数６０〜６３）、本発明者らは、全てのｉＰＳＣ系を連続的に培養することができ、これは集団倍加数が１１０を超えた後も依然として安定であった。同様に、テロメアＤＮＡ長は、リプログラミング後に、老化ＩＭＲ９０胚線維芽細胞または増殖性ＩＭＲ９０胚線維芽細胞から誘導されたｉＰＳＣｓにおいて増加していた。百寿者のテロメアは、老化線維芽細胞よりもサイズが短縮されていたが、本発明者らはそのサイズをｈＥＳＣｓと同じ長さまでリセットすることができた。興味深いことに、いくつかのｉＰＳＣクローンにおいては、本発明者らはＨ９ ｈＥＳＣに見られるよりも長い上限サイズを見出し、このことは多能性細胞におけるテロメアサイズが、遺伝された最大サイズを有さないことを示唆する。それはまた、再生医療における細胞ベース療法に適した、分化細胞の増殖能の向上したｉＰＳＣ生成におけるいくつかのさらなる開発の可能性を示唆する。
【０１３３】
まとめると、これらのデータは、本発明者らのリプログラミングプロトコールが、生成されたｉＰＳＣｓにおける老化および加齢の最も一般的な特徴を消去することを強調する。
【０１３４】
老化および老齢から誘導されたｉＰＳＣｓの多能性をさらに評価するために、本発明者らは、老齢増殖性線維芽細胞および老化線維芽細胞からの３つのｉＰＳＣクローン、すなわちｉＰＳＣ ７４Ｐ Ｃｌ Ｈ、ｉＰＳＣ ７４Ｓ Ｃｌ ＦおよびｉＰＳＣ ９６ Ｃｌ １を選択した。本発明者らは最初に、マウスにおける奇形腫の形成によって最終分化へと進行し、これにより３つの胚系統の組織化された器官様の構造の出現に至る、これらのクローンの全能力を確認した。ＤＮＡフィンガープリント分析（ショートタンデムリピート、ＳＴＲ）も実施することにより、ｉＰＳＣクローンが、その対応する親線維芽細胞から誘導されたことを確認した。本発明者らはまた、リプログラミングに使用した６個の導入遺伝子がほぼ完全にダウンレギュレーションされたことを確認した。
【０１３５】
その後、本発明者らは、３個の選択されたクローンおよびその親対応物のトランスクリプトーム分析を実施し、本発明者らは、一覧（１８）として構築されたｈＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓのデータセットと比較した。本発明者らは最初に、特定の多能性遺伝子が、一覧（１９）のｈＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓと同じレベルで本発明者らのｉＰＳＣｓにおいて発現されたことを確認した。その後、本発明者らは、いくつかのｈＥＳＣｓ、ｉＰＳＣｓおよび生後線維芽細胞と組み合わせた、本発明者らの３つのｉＰＳＣクローンおよびその親線維芽細胞の階層的クラスタリングを実施した。顕著には、本発明者らは、増殖性線維芽細胞、老化線維芽細胞および老齢線維芽細胞は、生後線維芽細胞と比べて一緒にクラスタリングすることを見出し、このことはそれらが一般的な共通した加齢サインを共有することを示唆する。さらに、６個の因子の感染を使用して得られた増殖性線維芽細胞および老化老齢線維芽細胞から誘導されたｉＰＳＣｓは、４個の因子の感染から誘導された以前に記載されたｉＰＳＣｓよりもｈＥＳＣｓに有意により類似している。
【０１３６】
酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全は、老化および加齢において十分に記載されており２０，２１、本発明者らは老化細胞および老齢細胞のこれらの機能が特異的にリプログラミングされるかどうかを疑った。トランスクリプトーム分析は、以前に記載されているように２２、両方のプロセスに関与する遺伝子を本発明者らが研究することを可能とした。ここでも、この特定の遺伝子のサブセットを含むトランスクリプトームのクラスタリングは、これらの変化した機能に関連した発現プロファイルの全体的な改変が、幼若増殖性胚線維芽細胞または生後線維芽細胞と比べた場合、老齢線維芽細胞および老化線維芽細胞に特異的であり、そして本発明者らの誘導されたｉＰＳＣｓは、これらの機能を胚様状態にリセットすることを示した。次に、本発明者らは、プロトン勾配によって生じた（DYm）膜電位差を測定することによって、ｈＥＳＣｓと比較して、誘導されたｉＰＳＣｓにおける全ミトコンドリア活性を評価し、これは健康なミトコンドリア機能の指標である。この目的のために、本発明者らはカチオン性ダイＪＣ−１を使用し、そして共焦点顕微鏡およびフローサイトメトリー分析によってその２つの形態の蛍光強度比を定量した。以前に示されているように、赤／緑の比は老化と共に減少し２０，２１、そしてまた、加齢と関連しているようである。顕著には、本発明者らはｈＥＳＣｓに見られるのと同じレベルにまで増加したｉＰＳＣｓにおける比を見出し、これにより、リプログラミングが、年月を経た線維芽細胞および老化線維芽細胞から誘導されたｉＰＳＣｓのミトコンドリア活性を回復したことが確認された。類似の結果が、増殖性ＩＭＲ９０線維芽細胞または老化ＩＭＲ９０線維芽細胞からのｉＰＳＣｓを用いて得られた。さらに、本発明者らは、電子顕微鏡によって、Ｈ１ ｈＥＳＣと比較して、ｉＰＳＣｓにおけるミトコンドリアの分布および形態に差異を観察しなかった。ミトコンドリア特性の分析は、遺伝子発現プログラムのリセットにおいて核リプログラミングがどのように、細胞小器官（その機能不全は細胞の加齢に関与する）の損なわれた機能の回復を通して健康な細胞生理機能へと幼若化し得るかを示す。
【０１３７】
最後に、線維芽細胞分化アッセイを使用して２３，２４、本発明者らは、これらの細胞が早まって老化に進入しなかったことを実証した。実際に、７４Ｐ、Ｓおよび９６ｉＰＳＣｓから誘導された線維芽細胞は、集団倍加数１０の後にＳＡ−β−Ｇａｌ活性を示さず、そして幼若増殖性線維芽細胞と等しい増殖速度を示した。本発明者らのリプログラミング戦略が、老化誘導経路における突然変異と全く関連していないという可能性を排除するために、本発明者らは、再分化した線維芽細胞が複製老化に再進入する能力を実証した。十分な培養後、これらの細胞は老化し、これは細胞周期停止に関連した増加したＳＡ−β−Ｇａｌ活性、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ２１ＣＩＰ１の再増加した発現、並びに再短縮されたテロメアサイズによって示された。より興味深いことには、複製老化をトリガーするに必要とされる集団倍加（ＰＤ）数は増加した。７４歳の親線維芽細胞はＰＤ５１の後に複製老化に進入したが、ｉＰＳＣ ７４Ｓ Ｃｌ Ｆから再分化した線維芽細胞はＰＤ５８の後にのみ複製老化に進入した。この再度獲得された増殖能は、ＰＤ１２で感染させた、７４歳の増殖性親線維芽細胞ＰＤ６０から誘導されたｉＰＳＣ７４Ｐ Ｃｌ Ｈと類似している。これらの細胞は、複製老化による消耗の前に集団倍加能ＰＤ３９を示した。９６歳の線維芽細胞の増殖能の同じようなリセットが観察され、そしてこれはテロメアの延長によって説明された。本発明者らは、老化状態を克服した本発明者らのリプログラミング戦略が、細胞の寿命をも増加させることができたと結論付ける。親線維芽細胞を、線維芽細胞における生後のおよび分化したＨ１ ｈＥＳＣｓと比較した、階層的クラスタリングによるトランスクリプトーム分析は、最終的に、年月を経たドナーの線維芽細胞および老化線維芽細胞から生成された本発明者らのｉＰＳＣｓからの初期の再分化した線維芽細胞の全遺伝子発現プロファイルは親線維芽細胞とは明確に異なり、そしてＨ１ｈＥＳＣ系から誘導された胚線維芽細胞に近いことを実証した。この結果はまた、酸化ストレスおよびミトコンドリア活性に関連した遺伝子発現プロファイルによって確認され、これにより本発明者らの老齢細胞および老化細胞の幼若化した生理機能が確認された。
【０１３８】
総合すれば、本発明者らの結果は、複製老化細胞および百寿者に由来する細胞を、特定の遺伝子の組合せを使用してｉＰＳＣｓへとリプログラミングすることが可能であることを示し、このことは、加齢および老化は、多能性に向けてのリプログラミングに対する障壁ではないことを実証する。それはまた、基本的な細胞リプログラミングの本発明者らの理解を向上させ、そして細胞加齢プロセス（これも同様に明白にリプログラミングを受けやすい）に関与するエピジェネティックな改変の過小評価された重要性を強調する。しかし最も重要なことには、本発明者らはまた、適切なリプログラミング戦略を使用して、細胞生理機能を幼若化することが可能であることを実証し、このことは、老化表現型の主要な局面の可逆性の可能性を示唆する。これらの結果はまた、加齢に伴う疾病モデルの開発の可能性を促進し、そして加齢に伴ういくつかの病態を消すための新たな治療的な細胞ベースの戦略の開発を支持する。
【０１３９】
【表１】
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2014511689.tif 000003
2014511689.tif 000004
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【０１４０】
【表２】
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2014511689.tif 000016
【配列表】
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【国際調査報告】
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