(57)【要約】本発明は、特に、ＣＯを含む基質を微生物発酵することによる、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の製造方法、当該方法で使用するための遺伝子改変微生物、遺伝子改変微生物の調製に適した核酸、新規のアルコール脱水素酵素およびそれをコードする核酸を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯを含む基質を発酵させることにより、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産することができる組換えカルボキシド栄養性酢酸生産性微生物。
【請求項２】
前記微生物が：
ａ．組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在しない、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素；
ｂ．組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在しない、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素、
の１種またはそれより多くを発現するように適合されている、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記微生物が：
ａ．組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在する、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素；
ｂ．組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在する、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素、
の１種またはそれより多くを過剰発現するように適合されている、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物が：
ａ．組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在しないアセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている；および／または、
ｂ．組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在するアセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
前記親微生物が、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンを生産することができるが、アセトンをイソプロパノールに変換することはできず、前記組換え微生物が、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
前記親微生物が、アセトンをイソプロパノールに変換することができるが、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンを生産することはできず、前記組換え微生物が、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
前記親微生物が、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンおよびイソプロパノールを生産することはできず、前記組換え微生物が、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素と、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素とを発現するように適合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
前記イソプロパノールおよび／またはアセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素が、以下からなる群：
アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）；
アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）；
アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）；
アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）；
アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）；および、
それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体、
より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）が、Ｃ．アセトブチリカム由来の酵素である、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
前記酵素アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）が、Ｃ．ベイジェリンキ由来である、請求項８に記載の微生物。
【請求項１１】
前記アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）が、ラクトコッカス・ラクティス由来である、請求項８に記載の微生物。
【請求項１２】
前記アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素が、以下からなる群：
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）；
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）；および、
その機能的に等価な変異体、
より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）が、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、および／または、Ｃ．ラグスダレイ由来である、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）が、Ｓ．セレビジエ由来である、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１５】
前記アルコール脱水素酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１６】
前記機能的に等価な変異体が、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の微生物。
【請求項１７】
前記微生物が、親微生物にとって天然型の１種またはそれより多くの核酸の発現を増加させるように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含み、前記１種またはそれより多くの核酸は、アセトン生合成経路および／またはイソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素をコードする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１８】
発現を増加させるように適合させた前記１種またはそれより多くの外因性の核酸が、調節要素である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
前記微生物が、アセトン生合成経路および／またはイソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素をコードし、それらが発現するように適合させた、１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２０】
前記微生物が、前記酵素のうち少なくとも２種をコードし、それらが発現するように適合させた、１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
前記微生物が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２２】
前記微生物が、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２３】
前記微生物が、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２４】
前記微生物が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、および、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２５】
前記微生物が、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２６】
前記微生物が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２７】
前記微生物が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２８】
前記アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸が、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の配列、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項２９】
前記アルコール脱水素酵素をコードする核酸の機能的に等価なものが、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％の配列同一性を有する、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３０】
前記外因性の核酸が、配列番号４６、４８、８１、８２、９３、９６または９９に記載のヌクレオチド配列を有する発現プラスミドである、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３１】
前記親微生物が、以下を含むカルボキシド栄養性の酢酸生産性細菌の群より選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の微生物：クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、ブチリバクテリウム・リモーサム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッチィ、ブラウチア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモーサム、ムーレラ・サーモアセチカ、ムーレラ・サーマウトトロフィカ、オキソバクター・フェニジイ、および、サーモアナエロバクター・キウヴィ。
【請求項３２】
前記親微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、または、クロストリジウム・リュングダリイである、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３３】
前記微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、または、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（または、ＡＴＣＣ５５３８３）である、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３４】
前記親微生物が、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、Ａｄｃ、ＫｉｖＤ、Ａｄｈ２、および、Ａｄｈをコードする１種またはそれより多くの遺伝子を欠失している、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３５】
前記親微生物が、Ａｄｈをコードする遺伝子を欠失している、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３６】
前記親微生物が、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、ＡｄｃおよびＫｉｖＤをコードする遺伝子のそれぞれを欠失している、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３７】
配列番号１のアミノ酸配列、または、そのいずれか１種の機能的に等価な変異体を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）。
【請求項３８】
前記機能的に等価な変異体が、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％の配列同一性を有する、請求項３７に記載のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）。
【請求項３９】
配列番号１のＡｄｈをコードする核酸、または、その機能的に等価な変異体。
【請求項４０】
以下からなる群より選択される配列を有する核酸：配列番号２；配列番号３；配列番号４；および、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体。
【請求項４１】
前記機能的に等価な変異体が、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％の配列同一性を有する核酸である、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
配列番号２、３もしくは４の核酸、配列番号２、３もしくは４の核酸に相補的な核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる核酸。
【請求項４３】
配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７；配列番号６８；配列番号６９；配列番号７０；配列番号７１；配列番号８５；配列番号８６；配列番号８７；配列番号８８；配列番号８９；配列番号９０；配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；配列番号９６；配列番号９７；配列番号９９；配列番号１００からなる群より選択される核酸。
【請求項４４】
微生物中で発現すると、その微生物が、ＣＯを含む基質の発酵によりアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるようになる１種またはそれより多くの酵素をコードする核酸。
【請求項４５】
前記核酸が、微生物中で発現すると、その微生物が、ＣＯを含む基質の発酵によりアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるようになる２種またはそれより多くの酵素をコードする、請求項４４に記載の核酸。
【請求項４６】
前記酵素が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）、および、それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体から選択される、請求項４５または４６に記載の核酸。
【請求項４７】
前記核酸が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４８】
前記核酸が、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列、または、その機能的に等価な変異体を含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項４９】
前記核酸が、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５０】
前記核酸が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５１】
前記核酸が、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）をコードする核酸配列、または、その機能的に等価な変異体を含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５２】
前記核酸が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５３】
前記核酸が、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれをコードする核酸配列、および、それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５４】
前記核酸が、配列番号１の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列を含む、請求項４７に記載の核酸。
【請求項５５】
前記アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）の機能的に等価な変異体が、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％の配列同一性を有する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５６】
前記アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列が、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含むか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５７】
前記機能的に等価な変異体が、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％の配列同一性を有する、請求項５６に記載の核酸。
【請求項５８】
請求項４４〜５７のいずれか一項に記載の核酸を含む核酸コンストラクトまたはベクター。
【請求項５９】
前記コンストラクトまたはベクターが、発現コンストラクトである、請求項５８に記載のコンストラクトまたはベクター。
【請求項６０】
前記コンストラクトまたはベクターが、配列番号４６、４７、４８、８３、８４、９５、９８または１０１に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項５９に記載のコンストラクトまたはベクター。
【請求項６１】
請求項４４〜５７に記載の核酸、あるいは、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のベクターまたはコンストラクトのいずれか１種またはそれより多くを含む宿主生物。
【請求項６２】
請求項５８〜６１のいずれか一項に記載のコンストラクトまたはベクター、および、メチル化コンストラクトまたはベクターを含む組成物。
【請求項６３】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組換え微生物の生産方法であって、
ａ．シャトル微生物に、（ｉ）請求項５９または６０に記載のコンストラクト／ベクター、および、（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化コンストラクト／ベクターを導入すること；
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させること；
ｃ．シャトル微生物から１種またはそれより多くのコンストラクト／ベクターを単離すること；ならびに、
ｄ．少なくとも該発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入すること、
を含む、上記方法。
【請求項６４】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組換え微生物の生産方法であって、
ａ．インビトロでメチルトランスフェラーゼにより請求項５９または６０に記載の発現コンストラクト／ベクターをメチル化すること；
ｂ．該発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入すること、
を含む、上記方法。
【請求項６５】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組換え微生物の生産方法であって、
ａ．シャトル微生物のゲノムにメチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入すること；
ｂ．シャトル微生物に、請求項５９または６０に記載の発現コンストラクト／ベクターを導入すること；
ｃ．シャトル微生物から１種またはそれより多くのコンストラクト／ベクターを単離すること；および、
ｄ．少なくとも該発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入すること、
を含む、上記方法。
【請求項６６】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組換え微生物を用いてＣＯを含む基質を発酵させることを含む、微生物発酵によるアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の製造方法。
【請求項６７】
前記方法が、以下の工程：
（ａ）１種またはそれより多くの微生物の培養物を含むバイオリアクターに、ＣＯを含む基質を提供すること；および、
（ｂ）バイオリアクター中の培養物を嫌気的に発酵させて、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産すること、
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法が、以下の工程：
ａ．工業的過程の結果として生産されたＣＯを含むガスが大気に放出される前に、該ガスを捕捉すること；
ｂ．前記１種またはそれより多くの微生物を含む培養物によって、ＣＯを含むガスを嫌気的に発酵させて、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産すること、
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＯを含む基質が、ＣＯを含むガス状基質である、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記基質が、工業的な排ガスを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ガスが、製鋼工場の排ガスまたは合成ガスである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記基質が、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯを含む、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の１種またはそれより多くを回収する工程をさらに含む、請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の方法によって生産された、アセトン、イソプロパノール、ならびにアセトン前駆体および／またはイソプロパノール前駆体。
【請求項７５】
組換え微生物であって、該組換え微生物は、アセトンを生産することができ、かつ、アセトアセテートをアセトンに変換するように適合された１種またはそれより多くの酵素をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸を含み、該組換え微生物は、アセトラクテートを生産できるがアセトンを生産できない親微生物由来である、上記微生物。
【請求項７６】
前記１種またはそれより多くの酵素が、ＫｉｖＤ、または、その機能的に等価な変異体を含む、請求項７５に記載の組換え微生物。
【請求項７７】
組換え微生物であって、該組換え微生物は、アセトンを生産することができ、かつ、酵素ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびｋｉｖＤのそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含み、該組換え微生物は、アセトラクテート、アセトアセチル−ＣｏＡ、および、アセトンを生産することができない親微生物由来である、上記微生物。
【請求項７８】
組換え微生物であって、該組換え微生物は、アセトンを生産することができ、かつ、酵素ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびｋｉｖＤのそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含み、該組換え微生物は、アセトラクテートおよびアセトンを生産できない親微生物由来である、上記微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素を含む基質を微生物発酵させることによる、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の製造方法、加えて、このような方法で使用するための遺伝子改変微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）またはクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）などのある種の微生物は、ブタノール発酵（ＡＢＥまたはＩＢＥ発酵）における主な副産物としてアセトンまたはイソプロパノールを生産することが知られている[George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, Chen JS: Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii (syn.Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45: 1160-1163]。しかしながら、これらの生物はいずれも、糖またはデンプンをベースとした基質に依存している。酢酸生産性の生物、例えばそれぞれ関連の深いクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（C. ljungdahlii）、および、クロストリジウム・ラグスダレイ（C. ragsdalei）などの微生物は、単独のエネルギーおよび炭素源としてＣＯまたはＣＯ２／Ｈ２含有ガスを利用した化学合成独立栄養によって成長し、酢酸塩、エタノールまたは２，３−ブタンジオールのような生成物を合成することができるが、アセトンまたはイソプロパノールは合成しない[Munasinghe PC, Khanal SK: Biomass-derived syngas fermentation into biofuels: Opportunities and challenges. Bioresource Technol 2010, 5013-22]。
【０００３】
近年、１００Ｌのパイロット規模の発酵槽中のクロストリジウム・ラグスダレイ（クロストリジウムＰ１１株）を用いた研究で、アメリカクサキビから生じた合成ガスからのイソプロパノールの生産が報告されている[Kundiyana DK, Huhnke RL, Wilkins MR: Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor: Design and process considerations. J Biosci Bioeng 2010, 109: 492-498]。しかしながら、同じ研究所による関連研究によれば、合成ガスは２０％アセトンを含む洗浄混合物（scrubbing mixture）を通過したものであったため、これは、使用された合成ガスの汚染によるものであったことが示されている[Ramachandriya KD: Effect of biomass generated producer gas, methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain P11. Masters thesis, Oklahoma State University 2009]。またその著者は、イソプロパノールの生産は、アセトンではなくプロピオン酸が還元された結果である可能性にも注目している。本発明の発明者等によって行われたクロストリジウム・ラグスダレイ（クロストリジウムＰ１１株）、加えてＣ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイを用いた実験では、アセトン、イソプロパノールまたはプロピオン酸の生産は示されていない。
【０００４】
アセトンおよびイソプロパノールなどの化学生成物の生産に適した多くの炭水化物供給ストックにかかるコストは、それらが人間の食物としてか、または動物用飼料としてかによって影響を受け、さらに、このような生産のためのデンプンまたはスクロースを生産する穀物の栽培は、あらゆる地理的条件において経済的に継続することが困難である。それゆえに、より低いコストの炭素資源および／またはより豊富な炭素資源をアセトンおよびイソプロパノールのような有用な化学生成物に変換する技術を開発することに関心が寄せられている。
【０００５】
ＣＯは、石炭または石油および石油から得られる生成物などの有機材料の不完全燃焼により生じる自由エネルギー豊富な主な副産物である。例えば、オーストラリアにおける鉄鋼産業は、毎年５００，０００メートルトンのＣＯを生産して大気に放出していることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, Chen JS: Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii (syn.Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45: 1160-1163
【非特許文献２】Munasinghe PC, Khanal SK: Biomass-derived syngas fermentation into biofuels: Opportunities and challenges. Bioresource Technol 2010, 5013-22
【非特許文献３】Kundiyana DK, Huhnke RL, Wilkins MR: Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor: Design and process considerations. J Biosci Bioeng 2010, 109: 492-498
【非特許文献４】Ramachandriya KD: Effect of biomass generated producer gas, methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain P11. Masters thesis, Oklahoma State University 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術の不利な点の１つまたはそれより多くを克服すること、または、少なくとも公に有用な選択を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、概して、特に、ＣＯを含む基質を微生物発酵することによる、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の製造方法、当該方法で使用するための遺伝子改変微生物、遺伝子改変微生物の製造に適した核酸、ならびに、新規のアルコール脱水素酵素およびそれをコードする核酸を提供する。
【０００９】
第一の形態において、本発明は、ＣＯを含む基質を発酵させることにより、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産することができるカルボキシド栄養性の酢酸生産性の組換え微生物を提供する。
【００１０】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在しない、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。その他の実施態様において、本微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在する、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている。
【００１１】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在しない、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。その他の実施態様において、本微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在する、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている。
【００１２】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在しない、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。その他の実施態様において、本微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に天然で存在する、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている。
【００１３】
一実施態様において、親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンを生産することができるが、アセトンをイソプロパノールに変換することはできず、その組換え微生物は、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。
【００１４】
その他の実施態様において、親微生物は、アセトンをイソプロパノールに変換することができるが、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンを生産することはできず、その組換え微生物は、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。
【００１５】
一実施態様において、親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンおよびイソプロパノールを生産することはできず、その組換え微生物は、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素と、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素とを発現するように適合されている。
【００１６】
一実施態様において、イソプロパノールおよび／またはアセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素は：
アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）；
アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）；
アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）；
アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）；
アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）；および、
それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体、
からなる群より選択される。
【００１７】
一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）は、Ｃ．アセトブチリカム由来の酵素である。
一実施態様において、酵素アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）は、Ｃ．ベイジェリンキ由来である。
【００１８】
一実施態様において、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）由来の酵素である。
【００１９】
一実施態様において、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素は：
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）；
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）；および、
その機能的に等価な変異体、
からなる群より選択される。
【００２０】
一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、および／または、Ｃ．ラグスダレイ由来である。一実施態様において、アルコール脱水素酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、このような機能的に等価な変異体は、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００２１】
一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）は、サッカロミセス・セレビジエ（S. cerevisiae）由来である。
一実施態様において、本微生物は、親微生物にとって天然型の１種またはそれより多くの核酸の発現を増加させるように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含み、ここでこの１種またはそれより多くの核酸は、本明細書において上述した酵素の１種またはそれより多くをコードする。
【００２２】
一実施態様において、発現を増加させるように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸は、調節要素である。一実施態様において、調節要素は、プロモーターである。一実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。一実施態様において、プロモーターは、ウッド−リュングダール（Wood-Ljungdahl）の遺伝子クラスター、または、リン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターからなる群より選択される。一実施態様において、プロモーターは、配列番号２２または配列番号７７の配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。
【００２３】
一実施態様において、本微生物は、本明細書において上述した酵素の１種またはそれより多くをコードし、それらが発現するように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む。一実施態様において、本微生物は、上記酵素のうち少なくとも２種をコードし、それらが発現するように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む。その他の実施態様において、本微生物は、上記酵素のうち３種、４種、５種または６種をコードし、それらが発現するように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む。
【００２４】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【００２５】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む。
【００２６】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【００２７】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【００２８】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、および、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【００２９】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む。
【００３０】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【００３１】
その他の特定の実施態様において、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【００３２】
一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）をコードする核酸は、配列番号１８の配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）をコードする核酸は、配列番号１９の配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）をコードする核酸は、配列番号２０の配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。一実施態様において、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）をコードする核酸は、配列番号２１の配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。一実施態様において、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）をコードする核酸は、配列番号７１の配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸は、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４の配列、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体を含む。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸の機能的に等価な変異体は、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）をコードする核酸は、配列番号７５の配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。
【００３３】
一実施態様において、１種またはそれより多くの外因性の核酸は、核酸コンストラクトまたはベクターであり、特定の実施態様の一つにおいて、本明細書において上述した酵素の１種またはそれより多くを任意の組み合わせでコードするプラスミドである。
【００３４】
一実施態様において、外因性の核酸は、発現プラスミドである。特定の実施態様の一つにおいて、発現プラスミドは、配列番号４６、４８、８３、８４、９５、９８または１０１に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００３５】
一実施態様において、親微生物は、カルボキシド栄養性の（carboxydotrophic）酢酸生産性細菌の群より選択され、ここで酢酸生産性細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）、ブチリバクテリウム・リモーサム（Butyribacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクラム・バッチィ（Alkalibaculum bacchii）、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモーサム（Eubacterium limosum）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ムーレラ・サーマウトトロフィカ（Moorella thermautotrophica）、オキソバクター・フェニジイ（Oxobacter pfennigii）、および、サーモアナエロバクター・キウヴィ（Thermoanaerobacter kiuvi）からなる群より選択される。
【００３６】
一実施態様において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、または、クロストリジウム・リュングダリイである。特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３である。その他の特定の実施態様において、本微生物は、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（または、ＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００３７】
一実施態様において、親微生物は、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、Ａｄｃ、ＫｉｖＤ、ＡｄｈおよびＡｄｈ２をコードする１種またはそれより多くの遺伝子を欠失している。特定の実施態様の一つにおいて、親微生物は、Ａｄｈをコードする遺伝子を欠失している。その他の特定の実施態様において、親微生物は、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、ならびに、ＡｄｃおよびＫｉｖＤをコードする遺伝子のそれぞれを欠失している。
【００３８】
第二の形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体を提供する。
特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）の機能的に等価な変異体は、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００３９】
第三の形態において、本発明は、配列番号１のＡｄｈをコードする核酸、または、その機能的に等価な変異体を提供する。
第四の形態において、本発明は：
配列番号２
配列番号３
配列番号４；および、
それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体、
からなる群より選択される配列を有する核酸を提供する。
【００４０】
特定の実施態様の一つにおいて、配列番号２、３または４の機能的に等価な変異体は、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸である。
【００４１】
第五の形態において、本発明は、配列番号２、３または４の核酸、それらのいずれか１種に相補的な核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる核酸を提供する。
【００４２】
第六の形態において、本発明は、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７；配列番号６８；配列番号６９；配列番号７０；配列番号７１；配列番号８５；配列番号８６；配列番号８７；配列番号８８；配列番号８９；配列番号９０；配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；配列番号９６；配列番号９７；配列番号９９；配列番号１００からなる群より選択される核酸を提供する。
【００４３】
第七の形態において、本発明は、微生物中で発現されると、その微生物が、ＣＯを含む基質の発酵によりアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるようになる１種またはそれより多くの酵素をコードする核酸を提供する。
【００４４】
一実施態様において、上記核酸は、微生物中で発現されると、その微生物が、ＣＯを含む基質の発酵によりアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるようになる２種またはそれより多くの酵素をコードする。
【００４５】
一実施態様において、本発明の核酸は、このような酵素の３種、４種、５種または６種をコードする。
一実施態様において、上記酵素は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）、および、それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体から選択される。
【００４６】
一実施態様において、上記核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【００４７】
一実施態様において、上記核酸は、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列、または、その機能的に等価な変異体を含む。
一実施態様において、上記核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【００４８】
一実施態様において、上記核酸は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
一実施態様において、上記核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【００４９】
一実施態様において、上記核酸は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【００５０】
一実施態様において、上記核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【００５１】
一実施態様において、上記核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【００５２】
一実施態様において、上記核酸は、配列番号４２の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）をコードする。
【００５３】
一実施態様において、上記核酸は、配列番号４３の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）をコードする。
【００５４】
一実施態様において、上記核酸は、配列番号４３および配列番号４４の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）をコードする。
【００５５】
一実施態様において、上記核酸は、配列番号４５の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）をコードする。
一実施態様において、上記核酸は、配列番号３８および配列番号４０の配列を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする。特定の実施態様の一つにおいて、上記核酸は、配列番号１の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする。特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）の機能的に等価な変異体は、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００５６】
一実施態様において、上記核酸は、配列番号７３の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）をコードする。
【００５７】
一実施態様において、上記核酸は、配列番号７５の配列、または、その機能的に等価な変異体を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）をコードする。
一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）をコードする核酸配列は、配列番号１８を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。
【００５８】
一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）をコードする核酸配列は、配列番号１９を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。
【００５９】
一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）をコードする核酸配列は、配列番号２０を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。
【００６０】
一実施態様において、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）をコードする核酸配列は、配列番号２１を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。
一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列は、配列番号３９または４１を含む。特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含むか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。一実施態様において、配列番号２、配列番号３または配列番号４の機能的に等価な変異体は、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００６１】
一実施態様において、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）をコードする核酸配列は、配列番号７２または７６を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。
【００６２】
一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）をコードする核酸配列は、配列番号７４または７７を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。
一実施態様において、本発明の核酸は、プロモーターをさらに含む。一実施態様において、プロモーターは、そのコントロール下で上記遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施態様において、ウッド−リュングダールクラスターのプロモーターが用いられる。その他の特定の実施態様において、リン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターが用いられる。特定の実施態様の一つにおいて、プロモーターは、Ｃ．オートエタノゲナム由来である。特定の実施態様の一つにおいて、プロモーターは、配列番号２２、配列番号７９の配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。
【００６３】
第八の形態において、本発明は、第七の形態に記載の１種またはそれより多くの核酸を含む核酸コンストラクトまたはベクターを提供する。
特定の実施態様の一つにおいて、核酸コンストラクトまたはベクターは、発現コンストラクトまたはベクターである。特定の実施態様の一つにおいて、発現コンストラクトまたはベクターは、プラスミドである。特定の実施態様の一つにおいて、発現プラスミドは、配列番号４６、４７、４８、８３、８４、９５、９８または１０１に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００６４】
第九の形態において、本発明は、第七の形態に記載の核酸、または、第八の形態に記載のベクターもしくはコンストラクトのいずれか１種またはそれより多くを含む宿主生物を提供する。
【００６５】
第十の形態において、本発明は、本発明の第八の形態に記載された発現コンストラクトまたはベクター、および、メチル化コンストラクトまたはベクターを含む組成物を提供する。
【００６６】
好ましくは、本組成物は、本発明の第一の形態に係る組換え微生物を生産することができる。
特定の実施態様の一つにおいて、発現コンストラクト／ベクター、および／または、メチル化コンストラクト／ベクターは、プラスミドである。
【００６７】
第十一の形態において、本発明は、本発明の組換え微生物を生産する方法を提供し、本方法は：
ａ．シャトル微生物（shuttle microorganism）に、（ｉ）本発明の第八の形態発現コンストラクト／ベクター、および、（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化コンストラクト／ベクターを導入すること；
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させること；
ｃ．シャトル微生物から１種またはそれより多くのコンストラクト／ベクターを単離すること；および、
ｄ．少なくともその発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入すること、
を含む。
【００６８】
一実施態様において、工程Ｂに記載のメチルトランスフェラーゼ遺伝子はいずれも、構成的に発現される。その他の実施態様において、工程Ｂに記載のメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、誘導される。
【００６９】
一実施態様において、メチル化コンストラクト／ベクターおよび発現コンストラクト／ベクターの両方が、工程Ｃで単離される。その他の実施態様において、発現コンストラクト／ベクターだけが、工程Ｃで単離される。
【００７０】
一実施態様において、発現コンストラクト／ベクターだけが、目的微生物に導入される。その他の実施態様において、発現コンストラクト／ベクターおよびメチル化コンストラクト／ベクターの両方が、目的微生物に導入される。
【００７１】
関連する形態において、本発明は、本発明の組換え微生物を生産する方法を提供し、本方法は：
ａ．インビトロでメチルトランスフェラーゼにより本発明の第八の形態に記載の発現コンストラクト／ベクターをメチル化すること；
ｂ．その発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入すること、
を含む。
【００７２】
さらなる関連する形態において、本発明は、本発明の組換え微生物を生産する方法を提供し、本方法は：
ａ．シャトル微生物のゲノムにメチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入すること、
ｂ．シャトル微生物に本発明の第八の形態に記載の発現コンストラクト／ベクターを導入すること、
ｃ．シャトル微生物から１種またはそれより多くのコンストラクト／ベクターを単離すること；および、
ｄ．少なくともその発現コンストラクト／ベクターを目的微生物に導入すること、
を含む。
【００７３】
第十二の形態において、本発明は、微生物発酵によるアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の製造方法を提供し、本方法は、本発明の第一の形態に記載の組換え微生物を用いてＣＯを含む基質を発酵させることを含む。
【００７４】
一実施態様において、本方法は、以下の工程：
（ａ）本発明の第一の形態に記載の１種またはそれより多くの微生物の培養物を含むバイオリアクターに、ＣＯを含む基質を提供すること；および
（ｂ）バイオリアクター中の培養物を嫌気的に発酵させて、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産すること、
を含む。
【００７５】
一実施態様において、本方法は、以下の工程：
（ａ）工業的過程の結果として生産されたＣＯを含むガスが大気に放出される前に、該ガスを捕捉すること；
（ｂ）本発明の第一の形態に記載の１種またはそれより多くの微生物を含む培養物によってＣＯを含むガスを嫌気的に発酵させて、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産すること、
を含む。
【００７６】
この方法の形態の特定の実施態様において、本微生物は、水性培養培地中で維持される。
この方法の形態の特定の実施態様において、上記基質の発酵は、バイオリアクター中で起こる。
【００７７】
好ましくは、ＣＯを含む基質は、ＣＯを含むガス状基質である。一実施態様において、上記基質は、工業的な排ガスを含む。所定の実施態様において、上記ガスは、製鋼工場の排ガスまたは合成ガスである。
【００７８】
一実施態様において、上記基質は、典型的には、ＣＯを主成分として含むと予想され、例えば、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％〜７０体積％のＣＯ、３０体積％〜６０体積％のＣＯ、および、４０体積％〜５５体積％のＣＯを含む。特定の実施態様において、上記基質は、約２５体積％、または、約３０体積％、または、約３５体積％、または、約４０体積％、または、約４５体積％、または、約５０体積％のＣＯ、または、約５５体積％のＣＯ、または、約６０体積％のＣＯを含む。
【００７９】
所定の実施態様において、本方法は、発酵液体培地から、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の１種またはそれより多くを回収する工程をさらに含む。
【００８０】
第十三の形態において、本発明は、第六の形態に記載の方法によって生産が行われる場合、アセトン、イソプロパノール、ならびにアセトン前駆体および／またはイソプロパノール前駆体の１種またはそれより多くを提供する。
【００８１】
その他の形態において、本発明は、本発明の第一の形態に記載の微生物の製造方法を提供し、本方法は、カルボキシド栄養性の酢酸生産性の親微生物が、ＣＯを含む基質を発酵させることにより、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるように、その親微生物を１種またはそれより多くの外因性の核酸で形質転換することを含み、ここでその親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵させることによりアセトン、イソプロパノールおよび／またはそれらの前駆体を生産できない。
【００８２】
特定の実施態様の一つにおいて、親微生物は、天然で親微生物に存在しない、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている１種またはそれより多くの外因性の核酸で形質転換される。その他の実施態様において、親微生物は、天然で親微生物に存在する、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている１種またはそれより多くの核酸で形質転換される。
【００８３】
特定の実施態様の一つにおいて、親微生物は、天然で親微生物に存在しない、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている１種またはそれより多くの外因性の核酸で形質転換される。その他の実施態様において、親微生物は、天然で親微生物に存在する、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている１種またはそれより多くの外因性の核酸で形質転換される。
【００８４】
特定の実施態様の一つにおいて、親微生物は、天然で親微生物に存在しない、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている１種またはそれより多くの核酸で形質転換される。その他の実施態様において、親微生物は、天然で親微生物に存在する、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている１種またはそれより多くの核酸で形質転換される。
【００８５】
所定の実施態様において、１種またはそれより多くの酵素は、上述した通りである。
その他の形態において、本発明は、アセトンを生産することができ、かつ、アセトアセテートをアセトンに変換するように適合された１種またはそれより多くの酵素をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む組換え微生物を提供し、ここでこの組換え微生物は、アセトラクテートは生産可能であるがアセトンは生産可能ではない親微生物由来である。一実施態様において、１種またはそれより多くの酵素は、ＫｉｖＤ、または、その機能的に等価な変異体を含む。
【００８６】
その他の形態において、本発明は、アセトンを生産することができ、かつ、酵素ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびｋｉｖＤのそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む組換え微生物を提供し、ここでこの組換え微生物は、アセトラクテート、アセトアセチル−ＣｏＡ、および、アセトンを生産することができない親微生物由来である。
【００８７】
その他の形態において、本発明は、アセトンを生産することができ、かつ、酵素ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびｋｉｖＤのそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む組換え微生物を提供し、ここでこの組換え微生物は、アセトラクテートおよびアセトンを生産できない親微生物由来である。
【００８８】
本発明はまた、概して、本願明細書で個々にまたは集合的に述べられた、または、示された、部分、要素および特徴のいずれか、または、それら２以上のあらゆる組み合わせよりなると言え、ここで具体的な整数が述べられる場合、それには、本発明が属する技術分野において公知の等価な値も含み、このような公知の等価な値は、それぞれが個々に明示されたものとして本明細書に包含されるものとみなされる。
【００８９】
本発明のこれらおよびその他の形態は、全てその新規の形態で考察されるものと予想されるが、添付の図を参照しながら一例として示された以下の説明によって明らかになると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、Ｃ．オートエタノゲナム（ＣＡＵ）、Ｃ．リュングダリイ（ＣＬＪ）、および、Ｃ．ラグスダレイ（ＣＲＡ）の新規のアルコール脱水素酵素のアミノ酸のアライメントを、Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３株の２級アルコール脱水素酵素のアミノ酸のアライメントと共に示す。
【図２】図２は、典型的な発酵工程中のクロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３の新規のアルコール脱水素酵素遺伝子の発現、加えて、ウッド−リュングダールオペロンプロモーター、Ｆ１ＦＯＡＴＰアーゼオペロンプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、および、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーターによって制御された遺伝子の発現を示す。対象の２００種を超える遺伝子のｍＲＮＡレベルを比較した。
【図３】図３は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃを示す。
【図４】図４は、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃを有する加工されたＣ．オートエタノゲナム、および、Ｃ．リュングダリイにおける、ＣＯまたはＣＯ／Ｈ２含有ガスからアセトンおよびイソプロパノールを生産する経路を示す。
【図５】図５は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃの配列解析結果を示す。
【図６】図６は、設計されたメチル化プラスミドを説明する。
【図７】図７は、形質転換されたＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、および、Ｃ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８から単離したプラスミドのＰＣＲからのｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（２．２ｋｂ）の検出を示す。ラダー＝１ＫＢプラスＤＮＡラダー（KB Plus DNA ladder）（インビトロジェン（Invitrogen））；１＝テンプレートではないコントロール；２＝Ｃ．オートエタノゲナムから単離したプラスミド；３＝Ｃ．リュングダリイから単離したプラスミド；４＝元のｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（ポジティブコントロール）。
【図８】図８は、製鋼工場のガスでＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３と、ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃとを用いた増殖実験の結果を示す。
【図９】図９は、製鋼工場のガスでＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８と、ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃとを用いた増殖実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、製鋼工場のガスからＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１３５２８およびｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（上）、ならびに、Ｃ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８およびｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（下）を用いてアセトンが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図１１】図１１は、合成ガスからＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３＋ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃを用いてアセトンが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図１２】図１２は、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３培養におけるアセトンの毒性を示す。
【図１３】図１３は、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３培養におけるイソプロパノールの毒性を示す。
【図１４】図１４は、配列番号１を示し、これは、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、および、Ｃ．ラグスダレイ由来の新規のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列である。
【図１５】図１５は、配列番号２を示し、これは、Ｃ．オートエタノゲナム由来の新規のアルコール脱水素酵素遺伝子の核酸配列である。
【図１６】図１６は、配列番号３を示し、これは、Ｃ．リュングダリイ由来の新規のアルコール脱水素酵素遺伝子の核酸配列である。
【図１７】図１７は、配列番号４を示し、これは、Ｃ．ラグスダレイ由来の新規のアルコール脱水素酵素遺伝子の核酸配列である。
【図１８】図１８は、配列番号１８を示し、これは、Ｃ．アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来のチオラーゼ遺伝子（ｔｈｌＡ）の核酸配列である。
【図１９】図１９は、配列番号１９を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ｃｔｆＡ）遺伝子の核酸配列である。
【図２０】図２０は、配列番号２０を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ｃｔｆＢ）遺伝子の核酸配列である。
【図２１】図２１は、配列番号２１を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ａｄｃ）遺伝子の核酸配列である。
【図２２】図２２は、配列番号２２を示し、これは、Ｃ．オートエタノゲナム由来のウッド−リュングダールクラスターのプロモーター（ＰＷＬ）の核酸配列である。
【図２３】図２３は、配列番号３４を示し、これは、設計されたＩＩ型メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列である。
【図２４】図２４は、配列番号３５を示し、これは、設計されたＩＩ型メチルトランスフェラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【図２５】図２５は、配列番号３８を示し、これは、クロストリジウム・ベイジェリンキＮＲＲＬＢ−５９３由来のＮＡＤＰ依存性アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列である。
【図２６】図２６は、配列番号３９を示し、これは、クロストリジウム・ベイジェリンキＮＲＲＬＢ−５９３由来のＮＡＤＰ依存性アルコール脱水素酵素の核酸配列である。
【図２７】図２７は、配列番号４０を示し、これは、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）ＡＴＣＣ５３５５６由来のＮＡＤＰ依存性アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列である。
【図２８】図２８は、配列番号４１を示し、これは、サーモアナエロバクター・ブロッキイ由来のアルコール脱水素酵素の核酸配列である。
【図２９】図２９は、配列番号４２を示し、これは、Ｃ．アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来のチオラーゼＴｈｌＡのアミノ酸配列である。
【図３０】図３０は、配列番号４３を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡＣｔｆＡのアミノ酸配列である。
【図３１】図３１は、配列番号４４を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡＣｔｆＢのアミノ酸配列である。
【図３２】図３２は、配列番号４５を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼＡｄｃのアミノ酸配列である。
【図３３−１】図３３は、配列番号４６を示し、これは、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃの核酸配列である。
【図３３−２】図３３は、配列番号４６を示し、これは、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃの核酸配列である。
【図３４】図３４は、配列番号４７を示し、これは、Ｃ．ベイジェリンキのアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ｃｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ｃｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（ａｄｃ）オペロンの核酸配列である。
【図３５−１】図３５は、配列番号４８を示し、これは、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈの核酸配列である。
【図３５−２】図３５は、配列番号４８を示し、これは、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈの核酸配列である。
【図３５−３】図３５は、配列番号４８を示し、これは、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈの核酸配列である。
【図３６−１】図３６は、配列番号４９を示し、これは、設計されたメチル化プラスミドの核酸配列である。
【図３６−２】図３６は、配列番号４９を示し、これは、設計されたメチル化プラスミドの核酸配列である。
【図３７】図３７は、配列番号５０を示し、これは、ｌａｃプロモーターの核酸配列である。
【図３８】図３８は、配列番号５１を示し、これは、クロストリジウム・オートエタノゲナムＦ１ＦＯＡＴＰアーゼオペロンプロモーター領域の核酸配列である。
【図３９】図３９は、配列番号５２を示し、これは、クロストリジウム・オートエタノゲナムＲｎｆ複合体のオペロンプロモーター領域の核酸配列である。
【図４０】図４０は、配列番号５３を示し、これは、クロストリジウム・オートエタノゲナムのピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター領域の核酸配列である。
【図４１】図４１は、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−ａｄｈの配列解析結果を示す。
【図４２】図４２は、Ｅ．コリ（E. coli）ＸＬ−１ ＢＬＵＥ ＭＲＦ’Ｋａｎを有するコントロールプラスミド（ｐＭＴＬ８５１４７）、アセトン発現プラスミド（ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ）、および、新規のアルコール脱水素酵素を含むアセトン発現プラスミド（ｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−ａｄｈ）を用いたアセトンおよびイソプロパノール生産の結果を示す。
【図４３】図４３は、新規のアルコール脱水素酵素を含む発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−ａｄｈを示す。
【図４４】図４４は、配列番号５６を示し、これは、Ｃ．リュングダリイ由来のウッド−リュングダールクラスターのプロモーター（ＰＷＬ）の核酸配列である。
【図４５】図４５は、配列番号５７を示し、これは、Ｃ．ラグスダレイ由来のウッド−リュングダールクラスターのプロモーター（ＰＷＬ）の核酸配列である。
【図４６】図４６は、配列番号５８を示し、これは、クロストリジウム・リュングダリイＦ１ＦＯＡＴＰアーゼオペロンプロモーター領域の核酸配列である。
【図４７】図４７は、配列番号５９を示し、これは、クロストリジウム・ラグスダレイＦ１ＦＯＡＴＰアーゼオペロンプロモーター領域の核酸配列である。
【図４８】図４８は、配列番号６０を示し、これは、クロストリジウム・リュングダリイＲｎｆ複合体のオペロンプロモーター領域の核酸配列である。
【図４９】図４９は、配列番号６１を示し、これは、クロストリジウム・ラグスダレイＲｎｆ複合体のオペロンプロモーター領域の核酸配列である。
【図５０】図５０は、配列番号６２を示し、これは、クロストリジウム・リュングダリイ  ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター領域の核酸配列である。
【図５１】図５１は、配列番号６３を示し、これは、クロストリジウム・ラグスダレイのピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター領域の核酸配列である。
【図５２】図５２は、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃを含むクロストリジウム・オートエタノゲナムにおける、異種遺伝子ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびａｄｃに関するプローブの増幅を確認するｑＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図５３】図５３は、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃを含むクロストリジウム・リュングダリイにおける、異種遺伝子ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびａｄｃに関するプローブの増幅を確認するｑＲＴ−ＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図５４】図５４は、ラクトコッカス・ラクティスＫＦ１４７由来のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼＫｉｖＤのアミノ酸配列である配列番号７３、および、アルファ−ケト酸  デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）の核酸配列である配列番号７２を示す。
【図５５】図５５は、アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）のコドン最適化配列である配列番号７６、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素Ａｄｈ２のアミノ酸配列である配列番号７５、および、アルコール脱水素酵素（ａｄｈ２）の核酸配列である配列番号７４を示す。
【図５６−１】図５６は、コドン最適化アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）、および、アルコールリボゾーム結合部位を有するスペーサー配列を含み、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを両端に有する脱水素酵素（Ａｄｈ２）の合成オペロンである配列番号７８、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のコドン最適化配列である配列番号７７を示す。
【図５６−２】図５６は、コドン最適化アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）、および、アルコールリボゾーム結合部位を有するスペーサー配列を含み、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを両端に有する脱水素酵素（Ａｄｈ２）の合成オペロンである配列番号７８、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のコドン最適化配列である配列番号７７を示す。
【図５７−１】図５７は、Ｅ．コリ−クロストリジウムのシャトルベクターｐＭＴＬ８５２４５の核酸配列である配列番号８２、および、Ｃ．オートエタノゲナム由来のリン酸トランスアセチラーゼ酢酸キナーゼプロモーターの核酸配列である配列番号７９を示す。
【図５７−２】図５７は、Ｅ．コリ−クロストリジウムのシャトルベクターｐＭＴＬ８５２４５の核酸配列である配列番号８２、および、Ｃ．オートエタノゲナム由来のリン酸トランスアセチラーゼ酢酸キナーゼプロモーターの核酸配列である配列番号７９を示す。
【図５８−１】図５８は、配列番号８３を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図５８−２】図５８は、配列番号８３を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図５８−３】図５８は、配列番号８３を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図５９−１】図５９は、配列番号８４を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄの核酸配列である。
【図５９−２】図５９は、配列番号８４を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄの核酸配列である。
【図６０−１】図６０は、配列番号９３を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−Ｐ−ｔｈｌ−ｃｔｆＡＢ−Ｐ−ｋｉｖｄの核酸配列である。
【図６０−２】図６０は、配列番号９３を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−Ｐ−ｔｈｌ−ｃｔｆＡＢ−Ｐ−ｋｉｖｄの核酸配列である。
【図６０−３】図６０は、配列番号９３を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−Ｐ−ｔｈｌ−ｃｔｆＡＢ−Ｐ−ｋｉｖｄの核酸配列である。
【図６１−１】図６１は、配列番号９８を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６１−２】図６１は、配列番号９８を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６１−３】図６１は、配列番号９８を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６１−４】図６１は、配列番号９８を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６２−１】図６２は、配列番号１０１を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６２−２】図６２は、配列番号１０１を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６２−３】図６２は、配列番号１０１を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６２−４】図６２は、配列番号１０１を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６２−５】図６２は、配列番号１０１を示し、これは、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の核酸配列である。
【図６３】図６３は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２を示す。
【図６４】図６４は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄを示す。
【図６５】図６５は、ＣＯを含む製鋼工場のガスから、コントロール株としてＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３（上）、および、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３＋ｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２（下）を用いてアセトンおよびイソプロパノールが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図６６】図６６は、ＣＯを含む製鋼工場のガスから、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３＋ｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄを用いてアセトンおよびイソプロパノールが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図６７】図６７は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄを示す。
【図６８】図６８は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−ａｄｈを示す。
【図６９】図６９は、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈを示す。
【図７０】図７０は、ＣＯを含む製鋼工場のガスから、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３（上）、および、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３＋ｐＭＴＬ８５２４５−ＰＷＬ−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ｋｉｖｄを用いてアセトンおよびイソプロパノールが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図７１】図７１は、ＣＯを含む製鋼工場のガスから、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３＋ｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２を用いてアセトンおよびイソプロパノールが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図７２】図７２は、ＣＯを含む製鋼工場のガスから、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３＋ｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２を用いてアセトンおよびイソプロパノールが生産されたことを確認するＧＣの結果を示す。
【図７３】図７３は、クロストリジウム経路（Clostridial pathway）の遺伝子、および、Ｌ．ラクティス由来のコドン最適化アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼＫｉｖｄ、および、Ｅ．コリおよびＣ．オートエタノゲナムで異種発現されたＳ．セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素Ａｄｈ２の試験された遺伝子の組み合わせを示す。
【図７４】図７４は、基質としてＣＯを含む製鋼工場のガスを用いたＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３の安定な連続培養物に供給したところ、高濃度および高速でアセトンからイソプロパノールに完全に変換されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
以下は、本発明の詳細な説明であり、一般論として示されたそれらの好ましい実施態様を含む。本発明はさらに、本発明を支持する実験データ、本発明の様々な形態の具体例および本発明を行うための手段を提供した後述の「実施例」に示された開示によって説明される。
【００９２】
ＣＯを含む基質を微生物発酵することによるアセトンおよび／またはイソプロパノールの生産は、これまでに報告されていない。ここで本発明の発明者等は、（特に）遺伝学的改変によって、炭素およびエネルギー源としてＣＯを利用することができるカルボキシド栄養性の酢酸生産性細菌種がアセトンおよびイソプロパノールを生産できることを実証した。驚くべきことに、本発明者等はさらに、それぞれ関連の深いカルボキシド栄養性の酢酸生産性種であるＣ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイおよびＣ．ラグスダレイによって、ＣＯを含むガスの存在下で天然の酵素によりアセトンからイソプロパノールへ変換されることも実証することができた。新規のアルコール脱水素酵素が同定され、この酵素は、Ｃ．オートエタノゲナムを用いた通常の発酵運転中に高いレベルで構成的に発現することが示され、さらにこの酵素は、高濃度および高い比率でアセトンをイソプロパノールに変換することができる。本発明者等はさらに、驚くべきことにＣ．オートエタノゲナムにおいてアセトンおよびイソプロパノールに対する活性を付与する２種の遺伝子も見出した。これらの遺伝子、すなわちラクトコッカス・ラクティス由来のアルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（Ｋｉｖｄ）、および、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）が、アセトンもしくはイソプロパノールまたはその前駆体のいずれかに対する活性を付与することは未だ報告されておらず、むしろアミノ酸前駆体を分岐鎖アルコールに変換する。本発明者等は、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて、数種の異なる遺伝子と酵素との組み合わせを用いることによりＣＯからアセトンおよびイソプロパノールが生産されることを実証した。
【００９３】
従って、本発明は、例えば、ＣＯを含む基質を微生物発酵することによるアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体の製造方法、当該方法で使用するための遺伝子改変微生物、遺伝子改変微生物の製造に適した核酸、ならびに、新規のアルコール脱水素酵素およびそれをコードする核酸を提供する。
【００９４】
本明細書で述べられているように、「発酵培養液」は、少なくとも栄養培地と細菌細胞とを含む培養培地である。
本明細書で述べられているように、シャトル微生物は、メチルトランスフェラーゼ酵素を発現する微生物であって、目的微生物とは異なる。
【００９５】
本明細書で述べられているように、目的微生物は、発現コンストラクト／ベクターに含まれる遺伝子を発現する微生物であって、シャトル微生物とは異なる。
用語「主要な発酵産物」は、最大の濃度および／または収量で生産される１種の発酵産物を意味することとする。
【００９６】
用語「効率を高めること」、「高められた効率」等は、発酵工程に関して用いられる場合、これらに限定されないが、発酵に触媒作用を及ぼす微生物の増殖速度、高いアセトンおよび／またはイソプロパノール濃度における増殖および／または生成物の生産速度、消費された基質の単位体積あたりの生産された望ましい生成物の体積、望ましい生成物の生産速度または生産レベル、および、生産された望ましい生成物と他の発酵副産物との相対的比率の１種またはそれより多くを高めることを含む。
【００９７】
成句「一酸化炭素を含む基質」およびそれと類似の用語は、例えば増殖および／または発酵のために１種またはそれより多くの細菌株に一酸化炭素を提供することができるあらゆる基質を含むと解釈されることとする。
【００９８】
成句「一酸化炭素を含むガス状基質」ならびにそれと類似の成句および用語は、所定レベルの一酸化炭素を含むあらゆるガスを含む。所定の実施態様において、上記基質は、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％〜７０体積％のＣＯ、３０体積％〜６０体積％のＣＯ、および、４０体積％〜５５体積％のＣＯを含む。特定の実施態様において、上記基質は、約２５体積％、または、約３０体積％、または、約３５体積％、または、約４０体積％、または、約４５体積％、または、約５０体積％のＣＯ、または、約５５体積％のＣＯ、または、約６０体積％のＣＯを含む。
【００９９】
このような基質は必ずしも水素を含む必要はないが、Ｈ２の存在が、本発明の方法に係る生成物の形成にとって有害であるべきではない。ある種の実施態様において、水素の存在は、全体のアルコール生産効率の改善をもたらす。例えば、特定の実施態様において、上記基質は、約２：１、または、１：１、または、１：２の比率のＨ２：ＣＯを含んでもよい。一実施態様において、上記基質は、約３０体積％またはそれ未満のＨ２、２０体積％またはそれ未満のＨ２、約１５体積％またはそれ未満のＨ２、または、約１０体積％またはそれ未満のＨ２を含む。その他の実施態様において、上記基質のストリームは、低濃度のＨ２を含み、例えば５％未満、または、４％未満、または、３％未満、または、２％未満、または、１％未満のＨ２を含み、あるいは実質的に水素を含まない。上記基質はまた、ある程度のＣＯ２を含んでいてもよく、例えば約１体積％〜約８０体積％のＣＯ２、または、１体積％〜約３０体積％のＣＯ２を含んでいてもよい。一実施態様において、上記基質は、約２０体積％未満またはそれに等しいＣＯ２を含む。特定の実施態様において、上記基質は、約１５体積％未満またはそれに等しいＣＯ２、約１０体積％未満またはそれに等しいＣＯ２、約５体積％未満またはそれに等しいＣＯ２を含むか、または、実質的にＣＯ２を含まない。
【０１００】
以下に記載された説明において、本発明の実施態様は、「ＣＯを含むガス状基質」を送達し発酵させることに関して説明される。しかし当然のことながら、ガス状基質は、その代わりとなる形態で提供されてもよい。例えば、ＣＯを含むガス状基質は、液体に溶解させた状態で提供されてもよい。実質的に、液体は一酸化炭素含有ガスで飽和しており、この液体がバイオリアクターに添加される。これは、標準的な方法を用いて達成することが可能である。一例として、マイクロバブルを用いた分散装置（Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology 第101巻, 第3号/2002年10月）を使用することができる。さらなる例を挙げれば、ＣＯを含むガス状基質は、固体支持体に吸着させてもよい。このようなその代わりとなる方法は、用語「ＣＯを含む基質」等の使用に包含される。
【０１０１】
本発明の特定の実施態様において、ＣＯを含むガス状基質は、工場から出たガスまたは排ガスである。「工業的な排ガスまたは廃ガス」は、概して、工業的過程によって生じたＣＯを含むあらゆるガスを含み、加えて、鉄金属製品の製造、非鉄製品の製造、石油精製過程、石炭のガス化、バイオマスのガス化、発電、カーボンブラック生産、および、コークス製造の結果として生じたガスも含むと解釈されることとする。本明細書においてさらなる例が示される場合もある。
【０１０２】
文中に特に他の指定がない限り、成句「〜を発酵させること」、「発酵工程」または「発酵反応」等は、本明細書で用いられる場合、増殖期間と、生成物が生合成される工程の期間との両方を包含することとする。以下でさらに説明されるように、いくつかの実施態様において、バイオリアクターは、第一の増殖リアクター、および、第二の発酵リアクターを含んでもよい。そのようなものとして、発酵反応への金属または組成物の添加は、これらのリアクターのいずれか、または、それら両方への添加を含むと解釈されることとする。
【０１０３】
用語「バイオリアクター」は、１つまたはそれより多くの容器および／もしくは塔、または、配管からなる発酵装置を含み、このようなバイオリアクターとしては、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト型発酵槽（Gas Lift Fermenter）、スタティックミキサー、または、気液接触に適したその他の容器もしくはその他の装置が挙げられる。いくつかの実施態様において、バイオリアクターは、第一の増殖リアクターと、第二の発酵リアクターとを含んでもよい。そのようなものとして、バイオリアクターまたは発酵反応への基質の添加について述べる際は、当然のことながら、必要に応じてこれらのリアクターのいずれかまたはこれら両方への添加を含む。
【０１０４】
「外因性の核酸」は、それらが導入される微生物の外部に由来する核酸である。外因性の核酸は、あらゆる適切な源から得ることが可能であり、このような源としては、これらに限定されないが、それらを導入しようとする微生物、それらを導入しようとする生物とは異なる微生物株または種が挙げられ、または、このような源は、人工的に作製されたものでもよいし、または、組換えによって作製されたものでもよい。一実施態様において、外因性の核酸は、それらを導入しようとする微生物中に天然に存在する核酸配列であり、このような核酸は、（例えば、配列（例えば遺伝子）のコピー数を増加させたり、または、強力プロモーターまたは構成的プロモーターを導入して発現を増加させたりすることによって）特定の遺伝子の発現を増加させるかまたは過剰発現させるように導入される。その他の実施態様において、外因性の核酸は、天然ではそれらを導入しようとする微生物中に存在しない核酸配列であり、このような核酸は、天然では微生物中に存在しない生成物の発現、または、（例えばプロモーターのような調節要素を導入する場合）微生物にとって天然型の遺伝子の発現の増加を可能にする。外因性の核酸は、それらを導入しようとする微生物のゲノムに統合されるように適合されていてもよいし、または、染色体外の状態のままでもよい。
【０１０５】
当然のことながら、本発明は、実質的に同じ機能を有するのであれば、配列が本明細書において具体的に例示された配列とは異なる核酸を用いて実施されてもよい。これは、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列の場合、コードされたタンパク質またはペプチドが実質的に同じ機能を有することを意味する。プロモーター配列を示す核酸配列の場合、その変異配列は、１種またはそれより多くの遺伝子の発現を促進する能力を有すると予想される。このような核酸は、本明細書では「機能的に等価な変異体」と述べられる場合もある。一例として、機能的に等価な核酸変異体としては、対立遺伝子変異体、遺伝子のフラグメント、突然変異（欠失、挿入、ヌクレオチド置換など）を含む遺伝子、および／または、多型などが挙げられる。またその他の微生物由来の相同遺伝子も、本明細書において具体的に例示された配列の機能的に等価な変異体の例とみなされる場合もある。このような相同遺伝子としては、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロブチリカム（C. saccharobutylicum）、および、Ｃ．サッカロパーブチルアセトニカム（C. saccharoperbutylacetonicum）種における相同遺伝子が挙げられ、これらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトで公式に入手することができる。サッカロミセス・セレビジエおよびラクトコッカス・ラクティス由来の遺伝子の場合、例えばスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis)（例えば、ＮＰ＿７６５７６５．１、ＥＧＧ６７３５２．１、ＺＰ＿０４８２６１４４．１、ＺＰ＿０４７９７９９９．１）、バチルス・セレウス（Bacilluscereus）（例えば、ＺＰ＿０４２７３４６８．１、ＺＰ＿０４３１７６２０．１）、および、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillusthuringiensis）（例えば、ＹＰ＿００３６６４７２０．１）において相同遺伝子を見出すことができる。成句「機能的に等価な変異体」は、特定の生物についてコドン最適化を行った結果として配列が変化した核酸も含むと解釈すべきである。本明細書において核酸の「機能的に等価な変異体」は、好ましくは、同定された核酸と、少なくともおよそ７０％、好ましくはおよそ８０％、より好ましくはおよそ８５％、好ましくはおよそ９０％、好ましくはおよそ９５％またはそれより大きい核酸配列同一性を有すると予想される。
【０１０６】
また当然のことながら、本発明は、配列が本明細書において具体的に例示されたアミノ酸配列とは異なるポリペプチドを用いて実施されてもよい。これらの変異体は、本明細書では「機能的に等価な変異体」と述べられる場合もある。タンパク質またはペプチドの機能的に等価な変異体としては、同定されたタンパク質またはペプチドと、少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％またはそれより大きいアミノ酸同一性を有するタンパク質またはペプチドが挙げられ、これらは対象のペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ機能を有する。このような変異体としては、その範囲内に含まれるタンパク質またはペプチドのフラグメントが挙げられ、ここでこのようなフラグメントは、ポリペプチドのトランケーションされた形態を含み、ここで１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個のアミノ酸の欠失が存在していてもよく、さらに、どちらかのポリペプチド末端において１〜２５個の残基が伸長していてもよく、さらに、欠失は、領域内においてどのような長さでもよいし、または、内側の位置に存在していてもよい。本明細書において特定のポリペプチドの機能的に等価な変異体は、例えば以前の段落でも例示されたように、その他の細菌種における相同遺伝子によって発現されたポリペプチドも含むと解釈されるべきである。
【０１０７】
本明細書で用いられる「実質的に同じ機能」は、変異体の核酸またはポリペプチドが、その元となる核酸またはポリペプチドの機能を果たすことができることを意味することとする。例えば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同じ反応を触媒することができると予想される。しかしながら、変異体は、その元となるポリペプチドまたは核酸と同レベルの活性を有することを意味すると解釈されるべきではない。
【０１０８】
よく知られた様々な方法を用いて、機能的に等価な変異体が、その変異体の元となる核酸またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有するかどうかを評価することが可能である。しかしながら、一例として、Wiesenborn等[Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and Its Role in the Synthesis of Acids and Solvents. Appl Environ Microbiol.1988, 54: 2717-2722]、Wiesenborn等[Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the uptake of acids. Appl Environ Microbiol.1989, 55:323-9.]、PetersonおよびBennet [Purification of acetoacetate decarboxylase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and cloning of the acetoacetate decarboxylase gene in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol.1990 56: 3491-3498]、Ismail等[Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J Bacteriol 1993, 175: 5097-5105]、de la Plaza等[Biochemical and molecular characterization of a-ketoisovalerate decarboxylase, an enzyme involved in the formation of aldehydes from amino acids by Lactococcus lactis. FEMS Microbiol Lett.2004 238: 367-374]、または、Khorkin等[NADP-dependent bacterial alcohol dehydrogenases: crystal structure, cofactor-binding and cofactor specificity of the ADHs of Clostridium beijerinckii and Thermoanaerobacter brockii. J Mol Biol.1998, 22: 278(5): 967-981]で概説された方法を酵素活性を評価するのに用いることも可能である。
【０１０９】
「〜を過剰発現する」、「過剰発現」ならびにそれと類似の用語および成句は、本発明に関して用いられる場合、概して、同じ条件下で親微生物のタンパク質発現レベルと比較した際に１種またはそれより多くのタンパク質の発現が少しでも増加していることを含むと解釈されるべきである。この用語および成句は、そのタンパク質が何らかの具体的なレベルで発現することを意味すると解釈されるべきではない。
【０１１０】
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を作製するのに用いられる微生物である。親微生物は、天然に存在している微生物（すなわち野生型微生物）、または、これまでに改変されているが、本発明に係る１種またはそれより多くの酵素を発現または過剰発現しない微生物であってよい。従って、本発明の組換え微生物は、親微生物では発現または過剰発現されなかった１種またはそれより多くの酵素を発現または過剰発現するように改変される。
【０１１１】
核酸「コンストラクト」または「ベクター」という用語およびそれと類似の用語は、概して、遺伝物質を細胞に移す媒体として使用するのに適したあらゆる核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）を含むと解釈されるべきである。この用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミド、および、人工染色体を含むと解釈されるべきである。コンストラクトまたはベクターとしては、１種またはそれより多くの調節因子、複製起点、マルチクローニング部位、および／または、選択マーカーが挙げられる。特定の実施態様の一つにおいて、このようなコンストラクトまたはベクターは、そのコンストラクトまたはベクターによってコードされた１種またはそれより多くの遺伝子が発現されるように適合されている。核酸コンストラクトまたはベクターは、裸の核酸を含み、加えて、細胞への送達を容易にする１種またはそれより多くの物質と組み合わせた核酸（例えば、リポソームに結合させた核酸、そのような核酸が含まれる生物）も含む。
【０１１２】
「イソプロパノール生合成経路」は、ＣＯまたはＣＯ／Ｈ２をイソプロパノールに代謝させる酵素に関する経路であり、例えば図４に概説されているような経路である。
「アセトン生合成経路」は、ＣＯまたはＣＯ／Ｈ２をアセトンに代謝させる酵素に関する経路であり、例えば図４に概説されているような経路である。
【０１１３】
アセトンの「前駆体」としては、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、アセチルリン酸、および、酢酸が挙げられる。
イソプロパノールの「前駆体」としては、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、アセチルリン酸、および、酢酸が挙げられる。
【０１１４】
「アルコール脱水素酵素」と述べられる場合、ケトン（例えばアセトン）から２級アルコール（例えばイソプロパノール）への変換（またはその逆）を触媒することができるアルコール脱水素酵素を含むと解釈されるべきである。このようなアルコール脱水素酵素は、２級アルコール脱水素酵素、および、１級アルコール脱水素酵素を含む。「２級アルコール脱水素酵素」は、ケトン（例えばアセトン）を２級アルコール（例えばイソプロパノール）に（またはその逆に）変換することができる酵素である。「１級アルコール脱水素酵素」は、アルデヒドを１級アルコールに（またはその逆に）変換することができる酵素であるが、多くの１級アルコール脱水素酵素は、ケトンから２級アルコール（またはその逆）の変換を触媒することもできる。またこれらのアルコール脱水素酵素は、「１級−２級アルコール脱水素酵素」と称される場合もある。
【０１１５】
本明細書の上記において考察されたように、本発明は、ＣＯを含む基質を発酵させることにより、アセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産することができる組換え微生物を提供する。
【０１１６】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、天然で親微生物に存在しない、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。その他の実施態様において、本微生物は、天然で親微生物に存在する、イソプロパノール生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている。
【０１１７】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、天然で親微生物に存在しない、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。その他の実施態様において、本微生物は、天然で親微生物に存在する、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている。
【０１１８】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、天然で親微生物に存在しない、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。その他の実施態様において、本微生物は、天然で親微生物に存在する、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を過剰発現するように適合されている。
【０１１９】
一実施態様において、親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンを生産することができるが、アセトンをイソプロパノールに変換することはできず、一方でその組換え微生物は、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。
【０１２０】
その他の実施態様において、親微生物は、アセトンをイソプロパノールに変換することができるが、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンを生産することはできず、一方でその組換え微生物は、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素を発現するように適合されている。
【０１２１】
一実施態様において、親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵させてアセトンおよびイソプロパノールを生産することはできず、一方でその組換え微生物は、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素と、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素とを発現するように適合されている。
【０１２２】
本微生物は、あらゆる組換え技術により１種またはそれより多くの酵素を発現または過剰発現するように適合させてもよく、このような組換え技術としては、例えば、微生物内における天然型遺伝子の発現を増加させること（例えば、より強力なプロモーターまたは構成的プロモーターを導入して遺伝子発現を稼動させることによって）、特定の酵素をコードしておりそれを発現するように適合されている外因性の核酸を導入することによってその酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させること、天然では親微生物中に存在しない酵素をコードしておりそれを発現するように適合されている外因性の核酸を導入すること、が挙げられる。
【０１２３】
所定の実施態様において、親微生物は、親微生物にとって天然型の１種またはそれより多くの遺伝子の高い発現または過剰発現と、親微生物にとって天然型ではない１種またはそれより多くの遺伝子の導入との組み合わせがもたらされるように形質転換されてもよい。例えば、アセトン生合成経路における酵素をコードする１種またはそれより多くの遺伝子は、親微生物にとって天然型であってもよいが、アセトンからイソプロパノールへの変換（またはその逆）に関与する酵素をコードする１種またはそれより多くの遺伝子を含まない場合もある。このような微生物は、アセトン生合成経路における酵素をコードする１種またはそれより多くの天然型の遺伝子を過剰発現して、さらに、アセトンからイソプロパノール（またはその逆）への変換に関与する酵素をコードする遺伝子が導入されるように加工することができる。同様に、このような微生物は、アセトン生合成経路（および／またはアセトンからイソプロパノールへの変換）における１種またはそれより多くの酵素を過剰発現して、さらに、同経路に関与する酵素をコードする１種またはそれより多くの遺伝子が導入されるように加工することができる。当業者であれば、本発明における使用の様々なその他の組み合わせについて十分認識しているであろう。
【０１２４】
一実施態様において、アセトン生合成経路における１種またはそれより多くの酵素は：
アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）；
アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）；
アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）；
アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）；
アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）；および、
それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体、
からなる群より選択される。
【０１２５】
例を挙げれば、これらのペプチドそれぞれの配列情報は、以下の表６または表１８に示される。
本発明の微生物で用いられる酵素は、あらゆる適切な源から得ることができ、このような源としては、様々な細菌の属および種、または、その他の生物が挙げられる。しかしながら、一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）は、Ｃ．アセトブチリカム由来の酵素である。一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼは、以下の表６に例示されたアミノ酸配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。
【０１２６】
一実施態様において、酵素アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）は、Ｃ．ベイジェリンキ由来の酵素である。
【０１２７】
一実施態様において、酵素アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）は、Ｌ．ラクティス由来の酵素である。
一実施態様において、それぞれの酵素は、以下の表６または１８で例示されたアミノ酸配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。
【０１２８】
一実施態様において、アセトンからイソプロパノールへの変換に関与する１種またはそれより多くの酵素は：
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）；
アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）；および、
その機能的に等価な変異体、
からなる群より選択される。
【０１２９】
ここでも、本発明で用いられるアルコール脱水素酵素は、あらゆる適切な源から得ることができ、このような源としては、様々な細菌の属および種（例えば、以下の表１３に例示された細菌種）が挙げられる。しかしながら、特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、および／または、Ｃ．ラグスダレイから得られる。一実施態様において、アルコール脱水素酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、このような機能的に等価な変異体は、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０１３０】
一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）は、Ｓ．セレビジエから得られる。
一実施態様において、本微生物は、親微生物にとって天然型の１種またはそれより多くの核酸の発現を増加させるように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含み、ここでこの１種またはそれより多くの核酸は、本明細書において上述した酵素の１種またはそれより多くをコードする。一実施態様において、発現を増加させるように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸は、調節要素である。一実施態様において、調節要素は、プロモーターである。一実施態様において、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高い活性を示す構成的プロモーターである。誘導性プロモーターを用いることも可能である。好ましい実施態様において、プロモーターは、ウッド−リュングダールの遺伝子クラスター、または、リン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターからなる群より選択される。一実施態様において、プロモーターは、配列番号２２または７７の配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。その他の実施態様において、ウッド−リュングダールクラスターのプロモーター（ＰＷＬ）（配列番号５６または５７）、Ｆ１ＦＯ−ＡＴＰアーゼオペロンのプロモーター領域（配列番号５１、５８または５９）、Ｒｎｆ複合体のオペロンプロモーター領域（配列番号５２、６０または６１）、または、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（配列番号５３、６２または６３）プロモーター領域を用いることができる。当業者であれば認識しているものと思われるが、例示された実施態様の代わりに、発現を指示できるプロモーター、好ましくは適切な発酵条件下で高いレベルの発現を指示できるその他のプロモーターが有効であると予想される。
【０１３１】
一実施態様において、本微生物は、本明細書において上述した酵素の１種またはそれより多くをコードし、それらが発現するように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む。一実施態様において、本微生物は、上記酵素のうち少なくとも２種をコードし、それらが発現するように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む。その他の実施態様において、本微生物は、上記酵素のうち３種、４種、５種または６種をコードし、それらが発現するように適合させた１種またはそれより多くの外因性の核酸を含む。
【０１３２】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１３３】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む。
【０１３４】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１３５】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１３６】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、および、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１３７】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）をコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１３８】
特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１３９】
その他の特定の実施態様において、本微生物は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ；ＥＣ２．８．３．９）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ；ＥＣ４．１．１．４）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ；ＥＣ４．１．１．７４）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２；ＥＣ１．１．１．１）のそれぞれをコードする１種またはそれより多くの外因性の核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を含む。
【０１４０】
一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）は、配列番号１８を含む核酸、または、その機能的に等価な変異体によってコードされている。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）は、配列番号１９を含む核酸、または、その機能的に等価な変異体によってコードされている。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）は、配列番号２０を含む核酸、または、その機能的に等価な変異体によってコードされている。一実施態様において、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）は、配列番号２１を含む核酸、または、その機能的に等価な変異体によってコードされている。一実施態様において、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）は、配列番号７２もしくは７６を含む核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体によってコードされている。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）は、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４を含む核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体によってコードされている。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）は、配列番号７４もしくは７７を含む核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体によってコードされている。
【０１４１】
本微生物は、１種またはそれより多くの外因性の核酸を含んでもよい。親微生物を２種またはそれより多くの遺伝学的要素（例えば遺伝子または調節因子（例えばプロモーター））で形質転換することが望ましい場合、それらの要素は、１種またはそれより多くの外因性の核酸に含まれていてもよい。
【０１４２】
一実施態様において、１種またはそれより多くの外因性の核酸は、核酸コンストラクトまたはベクターであり、特定の実施態様の一つにおいて、本明細書において上述した酵素の１種またはそれより多くを任意の組み合わせでコードするプラスミドである。特定の実施態様の一つにおいて、上記コンストラクトは、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、および、Ａｄｃのそれぞれをコードしており、さらに、任意にＡｄｈをコードしていてもよい。その他の実施態様において、１種またはそれより多くの外因性の核酸は、核酸コンストラクトまたはベクターであり、特定の実施態様の一つにおいて、Ａｄｈをコードし、任意にＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、および／または、Ａｄｃをコードしていてもよいプラスミドである。特定の実施態様の一つにおいて、上記コンストラクトは、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、Ａｄｃ、および、Ａｄｈの全てをコードする。また上記ベクターは、この文書の他の所にも明記されているように、代替の酵素の組み合わせをコードする核酸のその他の組み合わせを含んでいてもよい。特定の実施態様の一つにおいて、上記ベクターは、配列番号１９、２０、２１および２２の核酸配列、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体の１種、２種、３種もしくは４種を任意の順番で含む。その他の実施態様において、上記ベクターは、配列番号２、３および／または４、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。一実施態様において、上記ベクターは、配列番号１９、２０、２１および２２の配列、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体、および、配列番号２、３または４の配列、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体の１種、２種、３種もしくは４種を任意の順番で含む。
【０１４３】
その他の実施態様において、上記ベクターは、配列番号７２、７６、７４、７７の１種またはそれより多くを、単独で含むか、または、配列番号１９、２０、２１、２２、２、３および４で示される核酸の１種またはそれより多くと組み合わせて含む。
【０１４４】
外因性の核酸は、親微生物の形質転換の際に染色体外に存在しているままでもよいし、または、親微生物のゲノムに統合されてもよい。従って、これらの核酸は、統合されるように適合させた追加のヌクレオチド配列（例えば、相同組換えや宿主ゲノムへの標的化統合を可能にする領域）、または、染色体外コンストラクトが発現および複製されるように適合させた追加のヌクレオチド配列（例えば、複製起点、プロモーターおよびその他の調節因子または配列）を含んでいてもよい。
【０１４５】
一実施態様において、上述したように１種またはそれより多くの酵素をコードする外因性の核酸は、その外因性の核酸によってコードされた１種またはそれより多くの酵素の発現を促進するように適合させたプロモーターをさらに含むと予想される。一実施態様において、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高い活性を示す構成的プロモーターである。誘導性プロモーターを用いることも可能である。好ましい実施態様において、プロモーターは、ウッド−リュングダールの遺伝子クラスター、および、リン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターからなる群より選択される。一実施態様において、プロモーターは、配列番号２２、配列番号７７の配列を有するか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。その他の実施態様において、ウッド−リュングダールクラスターのプロモーター（ＰＷＬ）（配列番号５６または５７）、Ｆ１ＦＯ−ＡＴＰアーゼオペロンのプロモーター領域（配列番号５１、５８または５９）、Ｒｎｆ複合体のオペロンプロモーター領域（配列番号５２、６０または６１）、または、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（配列番号５３、６２または６３）プロモーター領域を用いることができる。当業者であれば認識しているものと思われるが、例示された実施態様の代わりに、発現を指示できるプロモーター、好ましくは適切な発酵条件下で高いレベルの発現を指示できるその他のプロモーターが有効であると予想される。
【０１４６】
一実施態様において、外因性の核酸は、発現プラスミドである。特定の実施態様の一つにおいて、発現プラスミドは、配列番号４６、４８、８３、８４、９５、９８または１０１に記載のヌクレオチド配列を有する。
【０１４７】
一実施態様において、親微生物は、カルボキシド栄養性の酢酸生産性細菌からなる群より選択される。所定の実施態様において、本微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）、ブチリバクテリウム・リモーサム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッチィ、ブラウチア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモーサム、ムーレラ・サーモアセチカ、ムーレラ・サーマウトトロフィカ、オキソバクター・フェニジイ、および、サーモアナエロバクター・キウヴィからなる群より選択される。
【０１４８】
特定の実施態様の一つにおいて、親微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム種、Ｃ．リュングダリイ種およびＣ．ラグスダレイ種、ならびに関連する分離株を含むエタノール生産性、酢酸生産性のクロストリジウム属の群から選択される。このような微生物としては、これらに限定されないが、Ｃ．オートエタノゲナムＪＡＩ−１Ｔ株（ＤＳＭ１００６１）［Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp.nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351］、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）［Simpson SD, Forster RL, Tran PT, Rowe MJ, Warner IL: Novel bacteria and methods thereof. 国際特許ＷＯ／２００９／０６４２００（２００９年）］、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ５５３８３）［Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp.nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236］、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）［Gaddy JL: Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases. 米国特許第５，５９３，８８６号（１９９７年）］、Ｃ．リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）［Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. 米国特許第６，３６８，８１９号（２００２年）］、Ｃ．リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）［Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. 米国特許第６，３６８，８１９号（２００２年）］、Ｃ．ラグスダレイＰ１１Ｔ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）［Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 国際特許ＷＯ２００８／０２８０５５（２００８年）］、関連する分離株、例えば「Ｃ．コスカッティ」［Zahn et al - Novel ethanologenic species Clostridium coskatii (米国特許出願第２０１１０２２９９４７号)］、または、突然変異株、例えばＣ．リュングダリイＯＴＡ−１（Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010）が挙げられる。これらの株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ内でサブクラスターを形成し、それらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の同一性は９９％より大きく、約３０％の類似の低ＧＣ含量を有する。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡの再会合とＤＮＡフィンガープリント実験から、これらの株は別の種に属することが示された［Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 国際特許ＷＯ２００８／０２８０５５（２００８年）]。
【０１４９】
この群の全ての種は、類似した形態と大きさを有し（対数増殖期の細胞は０．５〜０．７×３〜５μｍ）、中等温度好性であり（最適な増殖温度は、３０〜３７℃）、および、厳密に嫌気性の菌である［Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp.nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp.nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 国際特許ＷＯ２００８／０２８０５５（２００８年）］。さらにこれらはいずれも、同じ主要な系統発生学的特徴を共有しており、例えば、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適な初期ｐＨは５．５〜６）、ＣＯを含むガスの存在下で強い独立栄養増殖性を示し、ここで所定の条件下で主要な発酵最終産物としてエタノールと酢酸が形成され、少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸が形成されるという類似の増殖速度と類似の代謝プロファイルを示す。［Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp.nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp.nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 国際特許ＷＯ２００８／０２８０５５（２００８年）］。さらに、３種全てにおいてインドール生産が観察された。しかしながら、これらの種は、様々な糖類（例えばラムノース、アラビノース）、酸（例えばグルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばアルギニン、ヒスチジン）、または、その他の基質（例えばベタイン、ブタノール）の基質利用において違いがある。その上これらの種のうちいくつかは、所定のビタミン（例えばチアミン、ビオチン）に対して栄養要求性の微生物であるが、その他の種はそうではないことが見出された。
【０１５０】
一実施態様において、親株は、単独の炭素およびエネルギー源としてＣＯを使用する。
一実施態様において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、または、クロストリジウム・リュングダリイである。特定の実施態様の一つにおいて、本微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３である。その他の特定の実施態様において、本微生物は、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（または、ＡＴＣＣ５５３８３）である。
【０１５１】
一実施態様において、親微生物は、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、Ａｄｃ、ＫｉｖＤ、ＡｄｈおよびＡｄｈ２をコードする１種またはそれより多くの遺伝子を欠失している。特定の実施態様の一つにおいて、親微生物は、Ａｄｈをコードする遺伝子を欠失している。その他の特定の実施態様において、親微生物は、ＴｈｌＡ、ＣｔｆＡ、ＣｔｆＢ、ＡｄｃおよびＫｉｖＤをコードする遺伝子のそれぞれを欠失している。
【０１５２】
本発明者等は、新規のＡｄｈタンパク質を同定した。従って、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体を有するアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）を提供する。特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）の機能的に等価な変異体は、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０１５３】
加えて本発明は、配列番号１のＡｄｈをコードする核酸、または、その機能的に等価な変異体を提供する。当業者であれば、このような核酸を、本明細書で示されたアミノ酸配列とそこに含まれる遺伝子コードおよび縮重とを考慮しつつ容易に認識できるであろう。しかしながら、一例として、配列番号１のＡｄｈをコードする核酸は、配列番号２、３または４の核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む。特定の実施態様の一つにおいて、配列番号２、３または４の機能的に等価な変異体は、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸である。
【０１５４】
本発明はまた、配列番号２、３または４の核酸、それらのいずれか１種に相補的な核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体の少なくとも一部にハイブリダイズできる核酸も提供する。このような核酸は、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２、３または４の核酸、それらのいずれか１種に相補的な核酸、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体にハイブリダイズすると予想される。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えばSambrook等の、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）, 米国ニューヨークで説明されているような標準的なハイブリダイゼーション条件下で、核酸が標的テンプレートにハイブリダイズできることを意味する。当然のことながら、このような核酸の最小サイズは、所定の核酸と、ハイブリダイズするように設計された相補配列との間で安定なハイブリッドを形成できるサイズである。従って、このサイズは、核酸の組成および核酸とその相補配列との相同性（パーセント）、加えて利用されるハイブリダイゼーション条件（例えば、温度および塩濃度）によって変化する。一実施態様において、上記核酸は、長さが少なくとも１０個のヌクレオチド、長さが少なくとも１５個のヌクレオチド、長さが少なくとも２０個のヌクレオチド、長さが少なくとも２５個のヌクレオチド、または、長さが少なくとも３０個のヌクレオチドである。
【０１５５】
本発明者はまた、プローブおよびプライマーとして有用な多数の新規の核酸も同定した（以下の実施例の章で詳述する）。例えば、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７；配列番号６８；配列番号６９；配列番号７０；配列番号７１；配列番号８５；配列番号８６；配列番号８７；配列番号８８；配列番号８９；配列番号９０；配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；配列番号９６；配列番号９７；配列番号９９；配列番号１００である。
【０１５６】
本発明はまた、本発明の組換え微生物の生成で使用される核酸および核酸コンストラクトも提供する。
一実施態様において、上記核酸は、微生物中で発現されると、その微生物が、ＣＯを含む基質の発酵によりアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるようになる１種またはそれより多くの酵素をコードする配列を含む。特定の実施態様の一つにおいて、本発明は、微生物中で発現されると、その微生物が、ＣＯを含む基質の発酵によりアセトン、イソプロパノール、ならびに／または、アセトン前駆体および／もしくはイソプロパノール前駆体を生産できるようになる２種またはそれより多くの酵素をコードする核酸を提供する。一実施態様において、本発明の核酸は、このような酵素の３種、４種、５種または６種をコードする。
【０１５７】
特定の実施態様の一つにおいて、上記酵素は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）、および、それらのいずれか１種またはそれより多くの機能的に等価な変異体から選択される。
【０１５８】
一実施態様において、本発明の核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【０１５９】
一実施態様において、本発明の核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【０１６０】
一実施態様において、本発明の核酸は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれをコードする核酸配列、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【０１６１】
一実施態様において、本発明の核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、および、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）のそれぞれをコードする核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【０１６２】
一実施態様において、本発明の核酸は、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）をコードする核酸、または、その機能的に等価な変異体を含む。
【０１６３】
一実施態様において、本発明の核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれをコードする核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【０１６４】
その他の実施態様において、本発明の核酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ）、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、および、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）のそれぞれをコードする核酸、または、それらのいずれか１種もしくはそれより多くの機能的に等価な変異体を任意の順番で含む。
【０１６５】
上記の酵素のそれぞれをコードする典型的なアミノ酸配列および核酸配列は、本明細書の他の場所でも説明されているようにＧｅｎＢａｎｋで提供される（具体的には、以下の表６および１８に示される例を参照）。しかしながら、当業者であれば、本明細書に記載されたＧｅｎＢａｎｋおよびその他のデータベースの情報ならびに遺伝子コードを考慮しつつ、上記酵素をコードするその代わりの核酸配列またはその機能的に等価な変異体を容易に認識できるであろう。
【０１６６】
一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）は、配列番号４２の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）は、配列番号４３の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）は、配列番号４４の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。一実施態様において、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）は、配列番号４５の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。一実施態様において、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）は、配列番号７３の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）は、配列番号３８、および、配列番号４０の配列を有する。特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）は、配列番号１の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）の機能的に等価な変異体は、配列番号１に対して少なくともおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）は、配列番号７５の配列、または、その機能的に等価な変異体を有する。
【０１６７】
一実施態様において、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ；ＴｈｌＡ）をコードする核酸配列は、配列番号１８を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＡ）をコードする核酸配列は、配列番号１９を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート補酵素ＡトランスフェラーゼＢ（ＣｏＡトランスフェラーゼ；ＣｔｆＢ）をコードする核酸配列は、配列番号２０を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ａｄｃ）をコードする核酸配列は、配列番号２１を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）をコードする核酸配列は、配列番号７２または７６を含むか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）をコードする核酸配列は、配列番号７４または７７を含むか、または、その機能的に等価な変異体である。一実施態様において、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列は、配列番号３９または配列番号４１を含むか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。特定の実施態様の一つにおいて、アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ）をコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含むか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。一実施態様において、配列番号２、配列番号３または配列番号４の機能的に等価な変異体は、配列番号２、３または４に対して少なくともおよそ８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０１６８】
一実施態様において、本発明の核酸は、プロモーターをさらに含むと予想される。一実施態様において、プロモーターは、そのコントロール下で上記遺伝子の構成的発現を可能にする。しかしながら、誘導性プロモーターを用いることも可能である。当業者であれば、本発明で使用されるプロモーターを容易に認識できるであろう。好ましくは、このようなプロモーターは、適切な発酵条件下で高レベルの発現を指示することができる。特定の実施態様において、ウッド−リュングダールクラスターのプロモーターが用いられる。その他の実施態様において、リン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターが用いられる。その他の実施態様において、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体のオペロンプロモーター、または、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモーターである。特定の実施態様の一つにおいて、プロモーターは、Ｃ．オートエタノゲナム由来である。特定の実施態様の一つにおいて、プロモーターは、配列番号２２、配列番号７９の配列を有するか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。その他の実施態様において、プロモーターは、配列番号５６、５７、５１、５８、５９、５２、６０、６１、５３、６２または６３の配列を有するか、または、それらのいずれか１種の機能的に等価な変異体である。
【０１６９】
本発明の核酸は、親微生物の形質転換の際に、染色体外の状態のままでもよいし、または、微生物のゲノムに統合されるように適合されていてもよい。従って、本発明の核酸は、統合されるように適合させた追加のヌクレオチド配列（例えば、相同組換えや宿主ゲノムへの標的化統合を可能にする領域）、または、染色体外コンストラクトが安定して発現および複製されるように適合させた追加のヌクレオチド配列（例えば、複製起点、プロモーターおよびその他の調節配列）を含んでいてもよい。
【０１７０】
一実施態様において、上記核酸は、核酸コンストラクトまたはベクターである。特定の実施態様の一つにおいて、核酸コンストラクトまたはベクターは、発現コンストラクトまたはベクターであるが、クローニングに用いられるもののようなその他のコンストラクトおよびベクターも本発明に包含される。特定の実施態様の一つにおいて、発現コンストラクトまたはベクターは、プラスミドである。特定の実施態様の一つにおいて、発現プラスミドは、配列番号４６、４８、８３、８４、９５、９８または１０１に記載のヌクレオチド配列を有する。
【０１７１】
当然のことながら、本発明の発現コンストラクト／ベクターは、プロモーターに加えて様々な調節因子を含んでいてもよく、さらに必要に応じて追加のタンパク質の発現に適した追加の遺伝子を含んでいてもよい。一実施態様において、発現コンストラクト／ベクターは、１つのプロモーターを含む。その他の実施態様において、発現コンストラクト／ベクターは、２つまたはそれより多くのプロモーターを含む。特定の実施態様の一つにおいて、発現コンストラクト／ベクターは、発現させようとする遺伝子のそれぞれに応じて１つのプロモーターを含む。一実施態様において、発現コンストラクト／ベクターは、１つまたはそれより多くのリボゾーム結合部位を含み、好ましくは、発現させようとする遺伝子のそれぞれに応じて１つのリボゾーム結合部位を含む。
【０１７２】
当業者であれば当然のことながら、本明細書において説明される核酸配列およびコンストラクト／ベクター配列は、標準的なリンカーヌクレオチド、例えばリボソーム結合部位および／または制限部位に必要なリンカーヌクレオチドを含んでいてもよい。このようなリンカー配列は、必須のものと解釈されるべきではなく、定義された配列に限定を与えるものではない。
【０１７３】
本発明の発現コンストラクト／ベクターを含む核酸および核酸コンストラクトは、当業界において標準的な様々な技術を用いて構築することができる。例えば、化学合成または組換え技術を用いることができる。このような技術は、例えばSambrook等（Molecular Cloning: A laboratory manual, コールドスプリングハーバーラボラトリープレス, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989年）で説明されている。さらなる典型的な技術は以下の実施例の章で説明される。実質的に、個々の遺伝子と調節因子とは、その遺伝子が発現されて望ましいタンパク質を形成できるように互いに機能するように連結されると予想される。本発明で使用するのに適したベクターは、当業者であればよく認識しているものと予想される。しかしながら、一例として、以下に示すベクター、すなわちｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、および、以下の実施例の章で例示されたプラスミドが適切であり得る。
【０１７４】
当然のことながら、本発明の核酸は、適切であればどのような形態であってもよく、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、または、ｃＤＮＡなどである。
本発明はまた、宿主生物、具体的には微生物も提供し、このようなものとしては、例えば、本明細書において説明される核酸のいずれか１種またはそれより多くを含むウイルス、細菌および酵母が挙げられる。
【０１７５】
１種またはそれより多くの外因性の核酸は、親微生物に裸の核酸として送達されてもよいし、または、形質転換過程を容易にする１種またはそれより多くの物質と組み合わせてもよい（例えば、リポソームに結合させた核酸、そのような核酸が含まれる生物）。１種またはそれより多くの核酸は、適宜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの組み合わせであってよい。所定の実施態様において、制限阻害剤（restriction inhibitor）を用いることができる（例えば、Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412を参照）。
【０１７６】
本発明の微生物は、組換え微生物生産に関する技術分野でよく知られている様々な技術を用いて親微生物と１種またはそれより多くの外因性の核酸とから製造することができる。例を挙げれば、形質転換（導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコールが介在する形質転換、化学的または天然の能力、または、接合によって達成することが可能である。適切な形質転換技術は、例えば、Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual,コールドスプリングハーバーラボラトリープレス, コールドスプリングハーバー, 1989年で説明されている。
【０１７７】
所定の実施態様において、形質転換しようとする微生物において活性な制限システムのために、微生物に導入しようとする核酸をメチル化することが必要である。これは、以下で説明される技術などの様々な技術を用いて行うことができ、さらに以下の実施例の章で例示される。
【０１７８】
一例として、一実施態様において、本発明の組換え微生物は、以下の工程：
シャトル微生物に、（ｉ）本明細書で説明された発現コンストラクト／ベクター、および、（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化コンストラクト／ベクターを導入すること；
メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させること；
シャトル微生物から１種またはそれより多くのコンストラクト／ベクターを単離すること；および、
そのコンストラクト／ベクターの１種またはそれより多くを目的微生物に導入すること、
を含む方法によって生産される。
【０１７９】
一実施態様において、工程Ｂに記載のメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、構成的に発現される。その他の実施態様において、工程Ｂに記載のメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、誘導される。
【０１８０】
シャトル微生物は、微生物であり、好ましくは、発現コンストラクト／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を容易にする制限陰性（restriction negative）の微生物である。特定の実施態様において、シャトル微生物は、制限陰性Ｅ．コリ、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtillis）、または、ラクトコッカス・ラクティスである。
【０１８１】
メチル化コンストラクト／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
シャトル微生物に発現コンストラクト／ベクター、および、メチル化コンストラクト／ベクターが導入されると、メチル化コンストラクト／ベクターに存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導される。本発明の具体的な一実施態様においてメチル化コンストラクト／ベクターは、（好ましくは配列番号５０によってコードされた）誘導型ｌａｃプロモーターを含むが、誘導は、あらゆる適切なプロモーター系によって行うことが可能であり、ラクトースまたはそれらの類似体、より好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導される。その他の適切なプロモーターとしては、ａｒａ、ｔｅｔ、または、Ｔ７系が挙げられる。本発明のさらなる実施態様において、メチル化コンストラクト／ベクターのプロモーターは、構成的プロモーターである。
【０１８２】
特定の実施態様において、メチル化コンストラクト／ベクターは、メチル化コンストラクト／ベクターに存在するあらゆる遺伝子がシャトル微生物で発現されるように、シャトル微生物の同一部分に特異的な複製起点を有する。好ましくは、発現コンストラクト／ベクターは、発現コンストラクト／ベクターに存在するあらゆる遺伝子が目的微生物で発現されるように、目的微生物の同一部分に特異的な複製起点を有する。
【０１８３】
メチルトランスフェラーゼ酵素が発現されると、発現コンストラクト／ベクターに存在する遺伝子のメチル化が起こる。続いて発現コンストラクト／ベクターは、よく知られた様々な方法のいずれか一つに従ってシャトル微生物から単離してもよい。例を挙げれば、以下に記載される実施例の章で説明されている方法論を用いて、発現コンストラクト／ベクターを単離することができる。
【０１８４】
特定の実施態様の一つにおいて、両方のコンストラクト／ベクターが同時に単離される。
発現コンストラクト／ベクターは、よく知られた様々な方法を用いて目的微生物に導入することができる。しかしながら、一例として、以下の実施例の章で説明されている方法論を用いることができる。発現コンストラクト／ベクターはメチル化されているため、発現コンストラクト／ベクターに存在する核酸配列を目的微生物に取り込ませて、うまく発現させることができる。
【０１８５】
シャトル微生物にメチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入させて、過剰発現させることが想定される。従って、一実施態様において、得られたメチルトランスフェラーゼ酵素をよく知られた方法を用いて回収して、インビトロで発現プラスミドをメチル化するのに使用することができる。続いて発現コンストラクト／ベクターを、発現のために目的微生物に導入してもよい。その他の実施態様において、メチルトランスフェラーゼ遺伝子をシャトル微生物のゲノムに導入し、続いて発現コンストラクト／ベクターをシャトル微生物に導入し、シャトル微生物から１種またはそれより多くのコンストラクト／ベクターを単離し、続いて目的微生物に発現コンストラクト／ベクターを導入する。
【０１８６】
上記で定義されたような発現コンストラクト／ベクターとメチル化コンストラクト／ベクターとを組み合わせて、所定の組成物を提供することが想定される。このような組成物は、制限バリアメカニズム（restriction barrier mechanism）を回避して本発明の組換え微生物を生産することにおいて特に有用である。
【０１８７】
特定の実施態様の一つにおいて、発現コンストラクト／ベクター、および／または、メチル化コンストラクト／ベクターは、プラスミドである。
当業界における通常の技術を有する者であれば、本発明の微生物を生産するのに利用できる多数の適切なメチルトランスフェラーゼについて認識しているであろう。しかしながら、例として、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)のファージΦＴ１メチルトランスフェラーゼ、および、以下の実施例で説明されているメチルトランスフェラーゼが用いられる可能性がある。一実施態様において、メチルトランスフェラーゼは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するか、または、その機能的に等価な変異体である。適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、望ましいメチルトランスフェラーゼの配列と遺伝子コードを考慮すれば容易に認識できるであろう。一実施態様において、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、以下の実施例で説明されている通りである（例えば、配列番号３５に記載の核酸であるか、または、その機能的に等価な変異体である）。
【０１８８】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子が発現されるように適合させた様々なコンストラクト／ベクターを用いて、メチル化コンストラクト／ベクターを生成することができる。しかしながら、一例として、以下の実施例の章で説明されているプラスミドを用いることができる。特定の実施態様の一つにおいて、このようなプラスミドは、配列番号４９の配列を有する。
【０１８９】
本発明は、微生物発酵による１種またはそれより多くの望ましい生成物（アセトン、イソプロパノール、および／または、または、アセトン前駆体および／またはイソプロパノール前駆体）の製造方法を提供し、本方法は、本発明の組換え微生物を用いてＣＯを含む基質を発酵させることを含む。本発明の方法を用いて、工業的過程から大気に放出される炭素の総量を減少させることができる。
【０１９０】
好ましくは、発酵は、本発明の組換え微生物を用いて、バイオリアクター中で基質を嫌気的に発酵させて、１種またはそれより多くの生成物を生産する工程を含む。
一実施態様において、本方法は、以下の工程：
（ａ）本発明の１種またはそれより多くの微生物の培養物を含むバイオリアクターに、ＣＯを含む基質を提供すること；および
（ｂ）バイオリアクター中の培養物を嫌気的に発酵させて、１種またはそれより多くの生成物を生産すること、
を含む。
【０１９１】
一実施態様において、本方法は、以下の工程：
（ａ）工業的過程の結果として生産されたＣＯを含むガスが大気に放出される前に、該ガスを捕捉すること；
（ｂ）１種またはそれより多くの本発明の微生物を含む培養物によってＣＯを含むガスを嫌気的に発酵させて、１種またはそれより多くの生成物を生産すること、
を含む。
【０１９２】
本発明の実施態様において、本微生物によって発酵されるガス状基質は、ＣＯを含むガス状基質である。このようなガス状基質は、工業的過程の副産物として得られたＣＯを含む排ガスであってもよいし、または、例えば自動車の排ガスなどのその他の様々な発生源からのＣＯを含む排ガスであってもよい。所定の実施態様において、工業的過程は、鉄金属製品の製造、例えば製鋼工場、非鉄製品の製造、石油精製過程、石炭のガス化、発電、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、および、コークス製造からなる群より選択される。これらの実施態様において、ＣＯを含むガスは、何らかの便利な方法を用いて大気に放出される前に工業的過程から捕捉してもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素と水素とを含むガス）の成分であってもよい。工業的過程から生産されたＣＯは通常、燃やされてＣＯ２を生産するために、本発明は、温室効果ガスであるＣＯ２の放出を低減し、生物燃料として使用するためのブタノールを生産することにおいて特に有用である。ＣＯを含むガス状基質の組成に応じて、その基質を発酵に導入する前に、塵粒などのあらゆる望ましくない不純物を除去するように処理することが望ましい場合もある。例えば、よく知られた方法を用いて、ガス状基質をろ過したり、または、それから不純物を除去したりしてもよい。
【０１９３】
当然のことながら、細菌の増殖のため、さらにＣＯ由来の１種またはそれより多くの生成物を発生させるために、基質のＣＯ含有ガスに加えて、バイオリアクターに適切な液状栄養培地を供給する必要があると予想される。基質および培地は、連続的に、バッチ式で、または、バッチ供給式でバイオリアクターに供給することができる。栄養培地は、用いられる微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミンおよび無機質を含むと予想される。ＣＯを用いてブタノールを生産するための発酵に適した嫌気性培地は、当業界でよく知られている。例えば、適切な培地はBiebel（2001）で説明されている。本発明の一実施態様において、培地は、以下の実施例の章で説明されているような培地である。
【０１９４】
発酵は、望ましくは、ＣＯ由来の１種またはそれより多くの生成物の発酵が起こるような適切な条件下で行われると予想される。考慮されるべき反応条件としては、圧力、温度、ガスの流速、液体の流速、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型反応器を用いる場合）、植菌レベル、液相中のＣＯが頭打ちにならないような最大のガス基質濃度、および、生成物阻害が起こらないような最大の生成物濃度が挙げられる。
【０１９５】
加えて、基質のストリームのＣＯ濃度（または、ガス状基質中のＣＯ分圧）を高めることにより、ＣＯが基質である場合の発酵反応効率を高めることが望ましい場合が多い。高圧下で運転することにより、ＣＯの気相から液相への移動速度を有意に高めることができ、この液相で、微生物が１種またはそれより多くの生成物を生産するための炭素源としてＣＯを取り込むことができる。これはすなわち、バイオリアクターが大気圧よりも高い圧力で維持される場合、保持時間（投入されるガスの流速で割ったバイオリアクター中の液体の体積として定義される）を短縮することができることを意味する。最適な反応条件は、部分的には、用いられる具体的な本発明の微生物によって決まると予想される。しかしながら、一般的には、発酵は大気圧よりも高い圧力で行われることが好ましい。また、所定のＣＯ由来の１種またはそれより多くの生成物の変換速度は基質の保持時間と部分的に相関しており、続いて望ましい保持時間を達成することによりバイオリアクターの必要な体積が決定されることから、加圧システムを使用することで、必要なバイオリアクターの体積を大きく低減させることができ、その結果として発酵装置にかかる資本コストを低減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号で示された実施例によれば、リアクターの運転圧力を高めることにより直線的に比例してリアクターの体積を減少させることができ、すなわち１０気圧で操作されるバイオリアクターの体積は、１気圧で操作されるバイオリアクターの体積のわずか１０分の１でよい。
【０１９６】
一例として、高い圧力でガスからエタノールへの発酵を行う利点は、すでに説明されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの加圧下で行われるガスからエタノールへの発酵を説明しており、それによれば、エタノール生産性は、それぞれ１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日である。しかしながら、大気圧で類似の培地およびインプットガスの組成を用いて行われた実施例の発酵は、１日当たりそれよりも１０分の１から２０分の１も少ない量のエタノール／リットルしか生産しないことが見出された。
【０１９７】
また、ＣＯを含むガス状基質の導入速度は、液相中のＣＯ濃度が頭打ちにならないような速度であることも望ましい。これはなぜなら、ＣＯが限られる状態になれば、生成物のエタノールが培養物に消費されることになるためである。
【０１９８】
発酵反応に供給するのに用いられるガスストリームの組成は、その反応の効率および／またはコストに有意な影響を与えることができる。例えば、Ｏ２は、嫌気発酵工程の効率を低下させる可能性がある。発酵工程段階における発酵の前後の望まれていないガスまたは不必要なガスの処理は、このような段階における負担を増す可能性がある（例えば、バイオリアクターに入れられる前にガスストリームが圧縮される場合、発酵には必要のないガスを圧縮するための不必要なエネルギーが用いられる可能性がある）。従って、不要な成分を取り除き、望ましい成分の濃度を高めるために、基質のストリーム、具体的には工業的な源から得られた基質のストリームを処理することが望ましい場合がある。
【０１９９】
所定の実施態様において、本発明の細菌培養物は、水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、嫌気性微生物の最少栄養培地である。適切な培地は当業界でよく知られており、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号および５，５９３，８８６号、ならびに、ＷＯ０２／０８４３８で説明されており、さらに以下の実施例の章で説明されている通りである。
【０２００】
アセトン、イソプロパノール、または、アセトンおよび／もしくはイソプロパノールおよび／もしくは１種またはそれより多くのその他の生成物を含む混合ストリームは、当業界公知の方法で発酵培養液から回収することができ、このような方法としては、例えば、分別蒸留または蒸発、透析蒸発、ガスストリッピング、および、例えば液体−液体抽出などの抽出発酵が挙げられる。
【０２０１】
本発明のある種の好ましい実施態様において、１種またはそれより多くの生成物は、バイオリアクターから培養液の一部を連続的に取り出すこと、培養液から微生物細胞を分離すること（都合のよい形態としてはろ過によって）、および、培養液から１種またはそれより多くの生成物を回収することによって発酵培養液から回収される。都合のよい形態としては、アルコールは、例えば蒸留によって回収することができる。アセトンは、例えば蒸留によって回収することができる。生産されたあらゆる酸は、例えば活性炭に吸着させることにより回収することができる。分離した微生物細胞は、好ましくは発酵バイオリアクターに戻される。また全てのアルコールおよび酸を除去した後に残った細胞を含まないろ過液も、発酵バイオリアクターに戻されることが好ましい。細胞を含まないろ過液をバイオリアクターに戻す前に、そこに追加の栄養素（例えばＢビタミン群）を添加して栄養培地を補充してもよい。
【０２０２】
また、上述したように活性炭への酢酸の吸着が強化されるように培養液のｐＨを調節した場合も、ｐＨは、バイオリアクターに戻される前の発酵バイオリアクター中の培養液のｐＨと類似したｐＨに再調節されるべきである。
【実施例】
【０２０３】
以下、以下の非限定的な実施例を参照しながら本発明をより詳細に説明する。
微生物および増殖条件
アセトバクテリウム・ウッディＤＳＭ１０３０、クロストリジウム・アセティカムＤＳＭ１４９６、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、Ｃ．カルボキシディボランスＤＳＭ１５２４３、および、Ｃ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８は、ＤＳＭＺ（ドイツの微生物および細胞培養物の保存機関（The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）、インホーフェンストラーセ（Inhoffenstrasse）７Ｂ、３８１２４ブラウンシュバイク、ドイツ）から提供された。Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３は、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１から派生した株である。
【０２０４】
Ｃ．ラグスダレイＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（マナサス、バージニア州２０１０８、米国）から提供された。
【０２０５】
Ｃ．アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４、Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３、および、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２は、David Jones教授（オタゴ大学（University of Otago））から入手し、さらに、公共の菌株保存機関のＤＳＭＺおよびＡＴＣＣからもそれぞれＡＴＣＣ８２４／ＤＳＭ７９２、ＤＳＭ６４２３、および、ＡＴＣＣ５１７４３という受託番号で得ることができる。
【０２０６】
エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α−Ｔ１Ｒは、インビトロジェン（カールスバッド、カリフォルニア州９２００８、米国）から、エシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ、および、ＡＢＬＥ Ｋは、ストラタジーン（Stratagene）（サンタクララ、カリフォルニア州９５０５１−７２０１、米国）から提供された。エシェリキア・コリＪＷ３３５０−２は、大腸菌遺伝学情報ストックセンター（The Coli Genetic Stock Center）（ＣＧＳＣ）（ニューヘブン、コネチカット州０６５２０−８１０３）から提供された。
【０２０７】
Ｅ．コリは、好気性条件と嫌気性条件との両方で培養し、その他の全ての株は、フルクトースを含む血清ボトル中の体積５０ｍｌの液状培地中で（従属栄養増殖）、または、上部空間の３０ｐｓｉのＣＯを含む製鋼工場のガス（ニュージーランド、グレンブルックのニュージーランド・スティール・サイト（New Zealand Steel site）から回収した；組成：４４％のＣＯ、３２％のＮ２、２２％のＣＯ２、２％のＨ２）で（独立栄養増殖）、厳密に嫌気的に増殖させた。
【０２０８】
表２〜４で示された配合に従って、標準的な嫌気技術を用いて培地を調製した［Hungate RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, in Norris JR and Ribbons DW （編集）， Methods in Microbiology,第3B巻. アカデミック・プレス（Academic Press）, ニューヨーク, 1969: 117-132; Wolfe RS: Microbial formation of methane. Adv Microb Physiol 1971, 6: 107-146］。固形培地については、１．２％のバクトアガー（ＢＤ、フランクトンレイクス、ニュージャージー州０７４１７、米国）を添加した。
【０２０９】
Ａ．ウッディ、Ｃ．アセティカムおよびＣ．ラグスダレイを３０℃で増殖させたことを除き、全ての菌株を３７℃で増殖させた。
【０２１０】
【表１】
2014506478.tif 000002
【０２１１】
【表２】
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【０２１２】
【表３】
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【０２１３】
【表４】
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【０２１４】
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いた発酵を、３７℃の１．５Ｌバイオリアクターと、以下で説明されるように単独のエネルギーおよび炭素源としてＣＯを含む製鋼工場のガスとを用いて行った。培養物を増殖させるために、１リットルあたりＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含む、所定の使用培地を調製した。この培地をバイオリアクターに移し、１２１℃で４５分間オートクレーブした。オートクレーブ処理後、培地にチアミン、パントテン酸塩（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）を補充し、３ｍＭのシステイン・ＨＣｌで還元した。嫌気的環境を達成するために、リアクター容器に０．２μｍのフィルターを介して窒素を注入した。植菌の前に、ガスをＣＯを含む製鋼工場のガスに切り替え、リアクターに連続供給した。ガスフローは、最初は８０ｍｌ／分に設定して、対数増殖期の半ばに２００ｍｌ／分に増加させ、同時に撹拌も２００ｒｐｍから３５０ｒｐｍに高めた。バイオリアクターにＮａ２Ｓを０．２５ｍｌ／時間で投入した。ＯＤ６００が０．５に達したら、バイオリアクターを速度１．０ｍｌ／分の連続モードに切り替えた（希釈度０．９６ｄ−１）。バイオマスと代謝産物を測定するために培地サンプルを採取し、規則的に上部空間の流入ガスおよび流出ガスの解析を行った。
【０２１５】
代謝産物の解析
３５℃で操作されるＲＩＤ（屈折率検出器）を備えたアジレント（Agilent）１１００シリーズＨＰＬＣシステム、および、６０℃で維持されたオールテック（Alltech）ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒度５μｍ）を用いて、アセトン、イソプロパノールおよびその他の代謝産物のＨＰＬＣ解析を行った。移動相として流速０．７ｍｌ／分のわずかに酸性化した水を使用した（０．００５ＭのＨ２ＳＯ４）。タンパク質およびその他の細胞残渣を除去するために、４００μｌのサンプルと１００μｌの２％（質量／体積）５−スルホサリチル酸とを混合し、１４，０００×ｇで３分間遠心分離して、沈殿した残渣を分離した。続いて解析のために１０μｌの上清をＨＰＬＣに注入した。
【０２１６】
スペルコ（Supelco）ＰＤＭＳ１００の１ｃｍの繊維、オールテックＥＣ−１０００（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム、および、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたアジレント６８９０ＮヘッドスペースＧＣ（Agilent 6890N headspace GC）を用いて、アセトン、イソプロパノールおよびその他の代謝産物のＧＣ解析を行った。５ｍｌのサンプルをフンゲート（Hungate）チューブに移し、水浴中で４０℃に加熱し、正確に５分間、繊維に晒した。注入装置を２５０℃で維持し、キャリアーガスとして１ｍｌ／分の一定流量のヘリウムを使用した。オーブンプログラムは、４０℃で５分とし、続いて１分ごとに１０℃の割合で２００℃まで高めた。次に温度を５０℃／分の速度でさらに２２０℃に高め、続いてこの温度を５分保持し、その後、温度を５０℃／分の速度で４０℃に下げ、最後に１分保持した。ＦＩＤを、２５０℃で、構成ガスとして水素を４０ｍｌ／分、空気を４５０ｍｌ／分、および、窒素を１５ｍｌ／分にして維持した。
【０２１７】
上部空間の解析
２つの内蔵チャンネルを有するバリアンＣＰ−４９００マイクロＧＣ（Varian CP-4900 micro GC）で測定を行った。チャンネル１は、７０℃で稼動する１０ｍＭｏｌの篩カラム、２００ｋＰａのアルゴン、および、バックフラッシュ時間４．２秒であり、チャンネル２は、９０℃で稼動する１０ｍのＰＰＱカラム、１５０ｋＰａヘリウム、および、バックフラッシュなしであった。両方のチャンネルの注入装置温度は７０℃であった。稼働時間を１２０秒に設定したが、対象となる全てのピークは、一般的には１００秒の前に溶出すると予想された。
【０２１８】
クロストリジウム経路を用いたアセトン生産のためのＣ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイの遺伝学的改変
Ｃ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイは、天然ではアセトンを生産することができないため、他のクロストリジウム種に存在するアセトン生合成経路を両方の生物に導入した（図４）。アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへのクロストリジウムのアセトン生合成経路における第一の工程は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼまたはチオラーゼによって触媒される。続いてアセトアセチル−ＣｏＡからアセトンへの変換は、Ｃ．アセトブチリカムおよびＣ．ベイジェリンキのようなわずかな生物で見出すことができる特殊化した一連の酵素であるアセテート／ブチレート−アセトアセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ複合体、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼによって触媒される（表６）。
【０２１９】
【表５】
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【０２２０】
それぞれの酵素をコードするＣ．アセトブチリカムの遺伝子は２つのオペロンに分けられるが、Ｃ．ベイジェリンキの遺伝子は共通のオペロンを形成しており、本発明者は後者のほうが利益があると考えている。Ｃ．アセトブチリカム由来のチオラーゼをコードする遺伝子、ならびに、酵素アセテート／ブチレート−アセトアセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼのサブユニットＡ、アセテート／ブチレート−アセトアセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼのサブユニットＢ、および、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードするオペロンを、強力な天然型Ｃ．オートエタノゲナムプロモーターの制御下の合成オペロンに構築した（図３）。このコンストラクトを使用して、両方の生物をアセトン生産に関して遺伝子操作した。組換え株を作製するために、新規のメチルトランスフェラーゼを使用してこのコンストラクトをメチル化し、これを次にＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３およびＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８に形質転換して発現させた（以下で説明される）。アセトンの生産は、様々な工業的なガスストリーム（製鋼工場の排ガス、合成ガス）で示された。
【０２２１】
クロストリジウムのアセトン経路遺伝子を含む発現プラスミドの構築：
本発明において標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用した［Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, コールドスプリングハーバーラボラトリープレス, コールドスプリングハーバー， 1989; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. ジョン・ワイリー＆サンズ社（John Wiley & Sons, Ltd.）, ホーボーケン, 1987］。表７に、アセトン生合成遺伝子のＤＮＡ配列を示す。標的遺伝子の発現には、Ｃ．オートエタノゲナムのウッド−リュングダールクラスターのプロモーター（ＣＯデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｃｓＡの上流）を使用した（表７）。
【０２２２】
【表６】
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【０２２３】
クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２、および、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１由来のゲノムＤＮＡを、BertramおよびDurreによる改変法を用いて単離した（Conjugal transfer and expression of streptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum. Arch Microbiol 1989, 151: 551-557）。一晩培養したもの１００ｍｌを回収し（６，０００×ｇ、１５分間、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース；ｐＨ８．０）１．９ｍｌに懸濁した。３００μｌのリゾチーム（約１００，０００Ｕ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分インキュベートし、続いて２８０μｌの１０％（質量／体積）ＳＤＳ溶液を添加し、さらに１０分インキュベートした。２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌのトリス−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、および、１０μｌのＲＮアーゼＡの添加により室温でＲＮＡを消化した。次に、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、３７℃で１〜３時間タンパク質分解を起こした。最後に６００μｌの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を添加し、続いてフェノール−クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿を行った。分光光度法によりＤＮＡの量と品質を検査した。
【０２２４】
アセトン生合成遺伝子およびウッド−リュングダールクラスターのプロモーターを、表８に記載のオリゴヌクレオチドを用いて、アイプルーフ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（iProof High Fidelity DNA Polymerase）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Labratories）、ハーキュリーズ、カリフォルニア州９４５４７、米国）と、以下のプログラム、すなわち最初の変性を９８℃で３０秒、続いて変性（９８℃で１０秒）、アニーリング（５０〜６２℃で３０〜１２０秒）、および、伸長（７２℃で４５秒）を３２サイクル、続いて最終的な伸長工程（７２℃で１０分間）というプログラムとを用いたＰＣＲによって増幅した。
【０２２５】
【表７】
2014506478.tif 000008
【０２２６】
ウッド−リュングダールクラスター（ＰＷＬ）の増幅した５７３ｂｐのプロモーター領域を、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位とＤＨ５α−Ｔ１Ｒ株とを用いて、Ｅ．コリ−クロストリジウムのシャトルベクターｐＭＴＬ８５１４１（ＦＪ７９７６５１．１；Nigel Minton、ノッティンガム大学（University of Nottingham）、英国）［Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85］にクローニングした。作製したプラスミドｐＭＴＬ８５１４７、および、チオラーゼ遺伝子の１，１９４ｂｐのＰＣＲ産物をいずれもＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ライゲーションしたものをＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎに形質転換し、その結果、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡを得た。その後、このベクターに、Ｃ．ベイジェリンキＮＣＩＭＢ８０５２由来のｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃオペロンの増幅した２，１７７ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ、ならびにＥ．コリＡＢＬＥ  Ｋを用いてクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃを作製した。結果得られたプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃのインサートを、表９で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、結果から、アセトン生合成遺伝子およびプロモーター領域は突然変異を含まないことが確認された（図５）。
【０２２７】
【表８】
2014506478.tif 000009
【０２２８】
クロストリジウムのアセトン経路遺伝子を有するＥ．コリにおけるアセトンの生産：
構築されたプラスミドの機能を確認するために、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃを含むＥ．コリＡＢＬＥ  Ｋを一晩培養したもの５ｍｌからの代謝プロファイルをＧＣとＨＰＬＣを用いて得て、アセトンの生産を確認した。
【０２２９】
これをさらに調査するために、詳細な増殖実験を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７（ネガティブコントロール）、または、発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃのいずれかを含むＥ．コリＸＬ−１ ＢＬＵＥ ＭＲＦ’Ｋａｎとを含むＳＤ−８最少培地を用いて三連で行った（図４２）。ネガティブコントロールではアセトンの生産は観察できなかったが、アセトンプラスミドを含む株については、１．４４ｇ／Ｌの平均乾燥生物量で、７５．０５ｍｇ／Ｌのアセトンの平均最大生産量が測定された。
【０２３０】
クロストリジウムのアセトン経路遺伝子を有する発現プラスミドのメチル化：
Ｅ．コリにおいて、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．ラグスダレイおよびＣ．リュングダリイ由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計された合成ハイブリッドＩＩ型メチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号３５）を用いてアセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃのメチル化をインビボで行った。メチルトランスフェラーゼ（配列番号３４）を合成し、ベクターｐＧＳ２０（ＡＴＧ：バイオシンセティクス社（ATG:biosynthetics GmbH）、メルツハウゼン、ドイツ）（図６；配列番号４９）中で誘導型ｌａｃプロモーターと融合させた。
【０２３１】
発現プラスミドおよびメチル化プラスミドの両方を同じ制限陰性Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ細胞に形質転換したが、これは、それらの適合するグラム−（−）複製起点（発現プラスミドでは高コピー数ＣｏｌＥ１、および、メチル化プラスミドでは低コピー数ｐ１５Ａ）のために可能である。１ｍＭのＩＰＴＧの添加によりインビボでのメチル化を誘導し、キアゲン・プラスミドＭｉｄｉキット（QIAGEN Plasmid Midi Kit）（キアゲン社（QIAGEN GmbH）、ヒルデン、ドイツ）を用いてメチル化プラスミドを単離した。結果得られた混合物を、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３およびＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８を用いた形質転換実験で使用したが、ここで大量の（高コピー数の）発現プラスミドだけが、クロストリジウム属での複製を可能にするためにグラム−（＋）複製起点（ｒｅｐＬ）を有している。
【０２３２】
Ｃ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイにおけるメチル化されたアセトン発現プラスミドの形質転換：
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３およびＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８のコンピテント細胞を作製するために、５０ｍｌの培養物（ＰＥＴＣ培地（表２）、炭素源として製鋼工場のガスおよびフルクトースを含む；３７℃）を、連続して３日間、新鮮な培地に継代培養した。これらの細胞を使用して、４０ｍＭのＤＬ−スレオニンを含むＰＥＴＣ培地５０ｍｌにＯＤ６００ｎｍが０．０５になるように植菌した。培養物のＯＤ６００ｎｍが０．４に達したら、細胞を嫌気性チャンバーに移し、４，７００×ｇおよび４℃で回収した。培養物を氷冷したエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最後に体積５００μｌの新鮮なエレクトロポレーション緩衝液に懸濁した。この混合物を、約１μｇのメチル化プラスミド混合物を含む０．４ｃｍの電極ギャップを備えた予冷したエレクトロポレーションキュベットに移した。Ｃ．オートエタノゲナムと比べてＣ．リュングダリイのゲノムにおいて追加のＩ型制限系が同定されたことから、プラスミド混合物に５μｌのＩ型制限阻害剤（エピセンター・バイオテクノロジーズ（EPICENTRE Biotechnologies）、マディソン、ウィスコンシン州５３７１３、米国）を添加したところ、Ｃ．リュングダリイの形質転換効率が２〜１０倍に増加した。細胞をプラスミドおよび制限阻害剤と混合し、ジーン・パルサー・Ｘセル（Gene pulser Xcell）エレクトロポレーションシステム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州９４５４７、米国）を、以下の設定、すなわち２．５ｋＶ、６００Ωおよび２５μＦで用いて即座にパルスを与えた。時間定数は、３．７〜５．１ミリ秒であった。再生のために培養物を５ｍｌの特殊な再生培地（表１０）中に移したところ、細胞の回収量が向上し、これを、チューブホルダーを備えたスペクトロニック・ヘリオス・イプシロン分光光度計（Spectronic Helios Epsilon Spectrophotometer）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific Inc.）、ウォルサム、マサチューセッツ州０２４５４、米国）を用いて波長６００ｎｍでモニターした。増殖が観察されたら（１回の倍増）、細胞を回収し、２００μｌの新鮮な培地に懸濁し、１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコール（１００％（体積／体積）のジメチルフラン（ＤＭＦ）に溶解させた）と上部空間に３０ｐｓｉの製鋼工場のガスとを含む選択的ＰＥＴＣプレートで平板培養した。４〜６日後に５０〜２００個のコロニーが見られ、これを使用して、１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコール（ＤＭＦ中）およびフルクトース、ならびに炭素源として３０ｐｓｉの製鋼工場のガスを含むＰＥＴＣ培地２ｍｌに植え付けた。増殖が起こったら、培養のスケールを、ＰＥＴＣ培地５ｍｌに増やし、その後ＰＥＴＣ培地５０ｍｌに増やした（それぞれ１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコール（ＤＭＦ中）と、単独の炭素源として上部空間に３０ｐｓｉの製鋼工場のガスとを含む）。
【０２３３】
【表９】
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【０２３４】
クロストリジウムのアセトン経路遺伝子を有するアセトンプラスミドを含むＣ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイの形質転換の成功の確認：
ＤＮＡの移動を検証するために、ジッピー（Zyppy）プラスミドミニプレップキット（ザイモ・リサーチ（Zymo Research）、アーバイン、カリフォルニア州９２６１４、米国）を用いて体積１０ｍｌの培養物からプラスミドのミニプレップを行った。クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のために制限酵素消化するには単離したプラスミドの品質が不十分であったため［Burchhardt G and Durre P, Isolation and characterization of DNase-deficient mutants of Clostridium acetobutylicum. Curr Microbiol 1990, 21: 307-311］、テンプレートとして単離したプラスミドを用い、プライマーｃｔｆ−ａｄｃ−ｃｂｅｉ−ＫｐｎＩ−Ｆ（配列番号２５）、および、ｃｔｆ−ａｄｃ−ｃｂｅｉ−ＢａｍＨ１−Ｒ（配列番号２６）を用いてプラスミドの存在を確認した（図７）。イントロン・マキシマイズ・プレミックスＰＣＲキット（iNtRON Maximise Premix PCR kit）（イントロン・バイオテクノロジーズ（Intron Bio Technologies））を、以下の条件、すなわち最初の変性を９４℃で２分、続いて変性（９４℃で２０秒）、アニーリング（５５℃で２０秒）および伸長（７２℃で１３５秒）を３５サイクル、続いて最終的な伸長工程（７２℃で５分間）という条件で用いてＰＣＲを行った。
【０２３５】
クローンの同一性を確認するために、上記で示されたプロトコールを用いて、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、および、Ｃ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８それぞれの培養物５０ｍｌからゲノムＤＮＡを単離した。オリゴヌクレオチドｆＤ１（配列番号３６：ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ）、および、ｒＰ２（配列番号３７：ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）［Weisberg WG, Barns SM, Pelletier BA and Lane DJ, 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 1990, 173: 697-703］、および、イントロン・マキシマイズ・プレミックスＰＣＲキット（イントロン・バイオテクノロジーズ、Sangdaewon Joongwon Seognam Kyunggi、韓国）を用いて、以下の条件、すなわち最初の変性が９４℃で２分間、続いて変性（９４℃で２０秒）、アニーリング（５５℃で２０秒）および伸長（７２℃で６０秒）を３５サイクル、続いて最終的な伸長工程（７２℃で５分間）という条件で１６ｓのｒＲＮＡ遺伝子に対してＰＣＲを行った。得られた全ての配列は、Ｃ．オートエタノゲナム（Ｙ１８１７８、ＧＩ：７２７１１０９）およびＣ．リュングダリイ（ＣＰ００１６６６．１；ＧＩ：３００４３３３４７）の１６ｓのｒＲＮＡ遺伝子（ｒｒｓＡ）それぞれに対して９９．９％より高い同一性を有していた。
【０２３６】
Ｃ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイにおけるクロストリジウムのアセトン経路遺伝子を用いたＣＯおよびＣＯ２／Ｈ２からのアセトンの生産：
プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃを有する形質転換したＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３およびＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８を用いて、ゴムストッパーを有する１ｌのスコット（Schott）ボトル中のＰＥＴＣ培地（表２；フルクトースおよび酵母抽出物を含まない）２５０ｍｌと、単独のエネルギーおよび炭素源として上部空間の３０ｐｓｉの製鋼工場のガス（ニュージーランド、グレンブルックのニュージーランド・スティール・サイトから回収した；組成：４４％のＣＯ、３２％のＮ２、２２％のＣＯ２、２％のＨ２）とを用いて増殖実験を行った。両方の株について、ＨＰＬＣおよびＧＣ解析によりアセトン生産が確認された。Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３（図８および１０）ならびにＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８（図９および１０）の両方について、４８時間後にスコットボトル中で約０．３ｇ／ｌ（６．５ｍＭ）のアセトン濃度が達成された。続いて適切な条件を用いることにより、生産されたアセトンはさらにイソプロパノールに変換することができる。単独のエネルギーおよび炭素源として３０ｐｓｉのバイオマスの合成ガス（レンジ・フューエルズ社（Range Fuels Inc.）、コロラド州ブルームフィールド；組成：２９％のＣＯ、４５％のＨ２、１３％のＣＨ４、１２％のＣＯ２、１％のＮ２）で、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を含む血清ボトル中のＰＥＴＣ培地（表２；フルクトースおよび酵母抽出物を含まない）５０ｍｌにおいて、１５３ｍｇ／ｍｌのアセトン生産も実証された（図１１）。
【０２３７】
Ｃ．オートエタノゲナムにおけるクロストリジウムのアセトン経路遺伝子を有する異種の発現：
Ｃ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイにおいてアセトンの生産をもたらす導入された遺伝子ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびａｄｃ発現の成功を確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。全ての遺伝子のシグナルをうまく検出することができた（図５２および５３）。
【０２３８】
プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−を含むＣ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイそれぞれの培養物５０ｍｌを遠心分離（６，０００×ｇ、５分間、４℃）によって回収し、液体窒素中で急速冷凍し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。ピュアリンク（PureLinkTM）ＲＮＡミニキット（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いてトータルＲＮＡを単離し、ＲＮアーゼ非含有の水１００μＬ中で溶出させた。ＤＮアーゼＩ処理（ロシュ・アプライド・サイエンス（Roche Applied Science）、米国インディアナ州インディアナポリス）の後、スーパースクリプトＩＩＩ（SuperScript III）逆転写酵素キット（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて逆転写工程を行った。アジレント・バイオアナライザー２１００（アジレント・テクノロジーズ（Agilent Technologies)、米国カリフォルニア州サンタクララ）、キュービット（Qubit）蛍光測定器（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、さらにゲル電気泳動によって、ＲＮＡをチェックした。プライマー対毎にｎｏｎ−ＲＴコントロールを行った。全てのｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＭｙｉＱシングルカラー検出システム（MyiQ Single Colour Detection System）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭの各プライマー（表１７）、および、１×ｉＱ  ＳＹＢＲグリーン・スーパーミックス（iQ SYBR Green Supermix）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を含む合計体積１５μＬの反応液を用いて二連で行った。反応条件は、９５℃で３分、続いて９５℃で１５秒、５５℃で１５秒および７２℃で３０秒を４０サイクルとした。プライマーの二量体化またはその他の増幅のアーティファクトを検出するために、ｑＰＣＲ（１℃／秒で５８℃から９５℃を３８サイクル）が完了した直後に溶融曲線解析を行った。標準化のために、各ｃＤＮＡサンプルに２種のハウスキーピング遺伝子（グアニル酸キナーゼ、および、ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼ）を入れた。レラティブ・エクスプレッション・ソフトウェア・ツール（Relative Expression Software Tool）（REST(C)）２００８Ｖ２．０．７（３８）を用いて相対的な遺伝子発現の導出を行った。４対数単位にわたるｃＤＮＡの希釈系列を使用して標準曲線を作製し、得られた増幅効率でｍＲＮＡ濃度を計算した。
【０２３９】
【表１０】
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【０２４０】
Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイおよびＣ．ラグスダレイによるアセトンからイソプロパノールへの変換：
アセトンはさらにアルコール脱水素酵素の作用によってイソプロパノールに変換させることができる。しかしながら、Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３などのわずかな微生物のみがイソプロパノールを生産することが記述されており、自然界においてアセトンからイソプロパノールへの変換を行う酵素は極めてまれである。これまでに同定され説明された２級アルコール脱水素酵素は、Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３由来の２級アルコール脱水素酵素［Ismaiel AA, Zhu CX, Colby GD, Chen JS: Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J Bacteriol 1993, 175: 5097-5105］（配列番号３８〜３９）、および、サーモアナエロバクター・ブロッキイ由来の２級アルコール脱水素酵素［Peretz M and Burstein Y: Amino acid sequence of alcohol dehydrogenase from the thermophilic bacterium Thermoanaerobium brockii. Biochemistry. 1989, 28:6549-6555］（配列番号４０〜４１）のわずか２種である。
【０２４１】
それゆえに、一群の微生物、すなわち酢酸生産性細菌、アセトンおよびイソプロパノール生産性クロストリジウム属およびＥ．コリを、アセトンをイソプロパノールに変換する能力について試験した（表１１）。
【０２４２】
【表１１】
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【０２４３】
全ての培養物を、従属栄養菌用の炭素源と３０ｐｓｉの製鋼工場のガスとを含む適切な培地５０ｍｌ中にＯＤ６００ｎｍが０．１になるように植え付けた。アセトン添加前に、この培養物を２倍にした（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）。アセトン添加直後にサンプルを採取し、ＨＰＬＣとＧＣで解析し、増殖の終了時にも再度行った（これに続いて光学密度を測定した）。表１１に結果をまとめた。ネガティブコントロールとしてブランク培地を使用した。
【０２４４】
予想通りに、イソプロパノール生産株Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３［George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, Chen JS: Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45: 1160-1163］は、そのアルコール脱水素酵素の作用により外部的に添加されたアセトンをイソプロパノールに還元する能力を有していた。この酵素を欠失している異なるＣ．ベイジェリンキ株のＮＲＣＩＭＢ８０５２は、アセトン生産性Ｃ．アセトブチリカムＡＴＣＣ−８２４のようにアセトンをイソプロパノールに変換することができなかった。Ｅ．コリにも同じことがあてはまった。
【０２４５】
驚くべきことに、クロストリジウムｒＲＮＡ相同性グループＩ内にサブクラスターを形成する３種のカルボキシド栄養性の酢酸生産性細菌Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイおよびＣ．ラグスダレイは、同様にアセトンをイソプロパノールに変換できることが見出されたが、試験されたその他全ての酢酸生産性細菌はアセトンを利用することができなかった（表１１）。次に、異なる濃度を用いて、Ｃ．オートエタノゲナムによって様々な量のアセトンをイソプロパノールに変換する試験を行った（表１２）。
【０２４６】
【表１２】
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【０２４７】
アセトンからイソプロパノールへの高速での効率的な変換を実証するためにＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いたリアクターの研究を行った。リアクターを上述のようにセットアップした。連続モードで安定なバイオマスと代謝産物生産が達成されたら、バイオリアクターと供給培地の両方にアセトンを添加した。リアクターにアセトンを所定レベルまで加え、そのレベルはその後連続供給することにより得た。最初のうちは１ｇ／Ｌのアセトンを添加し、代謝産物濃度が安定したら、濃度を５ｇ／Ｌ、１５ｇ／ｌに高め、第二の実験では２０ｇ／Ｌまで高めた。２０ｇ／Ｌもの高濃度においても、培養物は高速で全てのアセトンをイソプロパノールに変換し、これより、同定された１級：２級アルコール脱水素酵素は極めて効率的であることが実証された（図７４）。
【０２４８】
Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイおよびＣ．ラグスダレイにおける新規のアルコール脱水素酵素の同定：
Ｃ．オートエタノゲナムによるアセトンからイソプロパノールへの変換は酵素によってなされることを確認するために、Ismaiel等［Ismaiel AA, Zhu CX, Colby GD, Chen JS: Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J Bacteriol 1993, 175: 5097-5105］に従って、Ｃ．オートエタノゲナム２３６９３、Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３、および、Ｃ．カルボキシディボランスＤＳＭ１５２４３の粗抽出物を用いて酵素分析を行った。指数増殖期後半の培養物の超音波処理とリゾチーム処理（１００，０００Ｕ／ｍｌ）によって粗抽出物を得た。遠心分離によって細胞片を除去し、ピアース（Pierce）のＢＣＡプロテインアッセイ−還元剤対応タイプ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州０２４５４、米国）を用いてタンパク質濃度を決定した。分析混合物（１ｍｌ）には、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および、０．２ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈが含まれていた。（１０倍希釈の水溶液から）１０ｍＭの基質のアセトンを添加することによって反応を開始させ、続いてスペクトラマックスＭ２（Spectramax M2）（モレキュラー・デバイス社（Molecular Devices, Inc.）、サニーベール、カリフォルニア州９４０８９−１１３６、米国）を波長３６５ｎｍで用いて分光光度法で分析した。ネガティブコントロールとして、粗抽出物およびアセトンそれぞれの代わりにＨ２Ｏを使用した。Ｃ．ベイジェリンキおよびＣ．オートエタノゲナムの両方、ならびにＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨを含まない）の粗抽出物では、酵素活性を検出することができたが、Ｃ．カルボキシディボランスＤＳＭ１５２４３またはＨ２Ｏ（ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方を含む）の粗抽出物では検出されなかった。このことから、Ｃ．オートエタノゲナムによるアセトンからイソプロパノールへの変換は、酵素によってなされることが実証され、そしてＮＡＤＨを含む場合には活性が検出されなかったことから、この酵素はＮＡＤＰＨ依存性のようである。
【０２４９】
配列の決定と慎重な解析によって、３種全ての株、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイおよびＣ．ラグスダレイにおいて新規のアルコール脱水素酵素遺伝子／酵素を同定した（図１；配列番号１〜４）。３種全ての種においてアミノ酸配列が同一であり、Ｃ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３の１級−２級アルコール脱水素酵素（８７％）、および、Ｔ．ブロッキイＡＴＣＣ５３５５６の１級−２級アルコール脱水素酵素（７６％）（表１３）とある程度の相同性を有することが見出された。十分な説明がなされているＣ．ベイジェリンキＮＲＲＬ−Ｂ５９３の２級アルコール脱水素酵素［Ismaiel AA, Zhu CX, Colby GD, Chen JS: Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J Bacteriol 1993, 175: 5097-5105］と比較したところ、合計で４９個のアミノ酸の変換が見出された。タンパク質の触媒中心にある４個のアミノ酸は保存されているが、触媒ドメインにあるその他のアミノ酸は保存されていない（図１）。モチーフ検索から、新規のアルコール脱水素酵素遺伝子／酵素は亜鉛およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性であることが予想された。新規のアルコール脱水素酵素をコードするそれぞれの遺伝子は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイおよびＣ．ラグスダレイの３種の中で９８％の同一性を有していたが、Ｃ．ベイジェリンキ由来の遺伝子とは８２％の同一性、および、Ｔ．ブロッキイ由来の遺伝子とは７２％の同一性しかなかったことが見出された（表１４）。
【０２５０】
【表１３】
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【０２５１】
【表１４】
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【０２５２】
Ｃ．オートエタノゲナム由来の新規のアルコール脱水素酵素発現の研究
新規のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子がＣ．オートエタノゲナムを用いた通常の発酵中に活性であるかどうかを確認するために、加えて、遺伝子過剰発現に関連する可能性があるプロモーター領域を確認するために、２５０種を超える遺伝子を用いてｑＲＴ−ＰＣＲ研究を行った。
【０２５３】
増殖期全体にわたり（４日）上述のような典型的な１．５ｌの流加培養の発酵運転からサンプルを採取した。遠心分離（６，０００×ｇ、５分間、４℃）によってサンプルを回収し、細胞ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。氷上で細胞ペレットを融解させて、それを１００μＬのリゾチーム溶液（５０，０００Ｕのリゾチーム、０．５μＬの１０％ＳＤＳ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ８）に懸濁することによりＲＮＡを単離した。５分後、３５０μＬの溶解緩衝液（１０μＬの２−メルカプトエタノールを含む）を添加した。細胞懸濁液を１８〜２１ゲージの針に５回通過させることにより機械的に破壊した。次に、ピュアリンク（PureLinkTM）ＲＮＡミニキット（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州９２００８、米国）を用いてＲＮＡを単離し、１００μＬのＲＮアーゼ非含有の水に溶出させた。ＲＮＡをＰＣＲとゲル電気泳動によってチェックし、分光光度法により定量し、必要に応じてＤＮアーゼＩ（ロシュ）で処理した。スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド９２００８、米国）を用いて逆転写工程を行った。ＭｙｉＱシングルカラーリアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州９４５４７、米国）で、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭの各プライマー（表１５）、および、１×ｉＱ  ＳＹＢＲグリーン・スーパーミックス（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州９４５４７、米国）を含む体積１５μＬの反応液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ハウスキーピング遺伝子としてグアニル酸キナーゼ（ＧｎＫ）、および、ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼ（ＦｏＴ４Ｌ）とを使用し、テンプレートではないコントロールを包含させた。反応条件は、９５℃で３分、続いて９５℃で１５秒、５５℃で１５秒、および、７２℃で３０秒を４０サイクルとした。プライマーの二量体化またはその他の増幅のアーティファクトを検出するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ（１℃／秒で５８℃から９５℃を３８サイクル）が完了した直後に溶融曲線解析を行った。発現レベルに関するデータを、バイオ・ラッドｉＱ５  ２．０ソフトウェアで計算されるようなＰＣＲ基準線を差し引いた曲線適合法に基づき、閾値サイクル（Ｃｔ）値の形態でコンピューターで計算した。測定したままのＣｔ値をレラティブ・エクスプレッション・ソフトウェア・ツール（REST(C)）２００８Ｖ２．０．７を用いてさらに解析した。
【０２５４】
【表１５】
2014506478.tif 000016
【０２５５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ研究の結果から、新規のアルコール脱水素酵素に関する遺伝子は、増殖期全体にわたり比較的一定したレベルで発現され、増殖期の終わりのときだけ停止することが示された（図２）。代謝のあらゆる部分から選択された２００種を超える遺伝子と比較したところ、アルコール脱水素酵素遺伝子は、発現された遺伝子の上位５０種に属する。解析された全ての遺伝子のなかでも最高の遺伝子発現を示したのはウッド−リュングダールオペロンの遺伝子であり、そのｍＲＮＡレベルはアルコール脱水素酵素遺伝子の１０倍よりも多かった（図２）。従って、それぞれのプロモーター（配列番号２２）領域は、アセトン生合成酵素に関する遺伝子およびアルコール脱水素酵素遺伝子のような遺伝子を過剰発現するのに理想的であるが、微生物にとって天然型のアルコール脱水素酵素遺伝子が過剰発現されるケースにおいては、十分な補因子が利用できるように追加の遺伝学的改変を必要とする場合もある。この例としては、トランスヒドロゲナーゼのようなＮＡＤＰＨの蓄積を増加させるさらなる遺伝子の（過剰）発現、競合するＮＡＤＰＨを消費する反応の除去、または、ＮＡＤＨに対する補因子の必要性を変化させるタンパク質工学が挙げられる。遺伝子の過剰発現に関して同定されたその他の有用なプロモーター領域としては、Ｆ１ＦＯ−ＡＴＰアーゼオペロンのプロモーター領域（配列番号５１）、Ｒｎｆ複合体オペロンのプロモーター領域（配列番号５２）、および、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼのプロモーター領域（配列番号５３）が挙げられる。
【０２５６】
クロストリジウムのアセトン遺伝子を含む発現プラスミドを有するＣ．オートエタノゲナムおよびＣ．リュングダリイによるＣＯおよびＣＯ２／Ｈ２からのイソプロパノール生産
アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃを有するＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３およびＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８の組換え株の２５０ｍｌスコットボトル培養物は、アセトンを生産することを示したが、イソプロパノールは検出できなかった（図８および９）。これは、スコットボトル内が一定の静止状態であり、上部空間からＣＯが枯渇し、流加培養または連続発酵法の場合のように一定供給がなされないために、増殖の終了時に還元力が不足していたためと思われる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはフェレドキシンのような還元当量は、ＣＯから生成するが、それ以前に指数関数的な増殖期と初期の定常増殖期の最中に起こるエタノール生産で消費もされる。この時点で、イソプロパノール生産のための前駆体として必要な生産されたアセトンの濃度は、それでもなお比較的低い。
【０２５７】
それゆえに、４８時間増殖させた後に、両方の培養物を３０ｐｓｉの新鮮な製鋼工場のガスで再度ガス処理し、再度植え付けた。バイオマスはそれ以上増加しなかったが、生産されたアセトンの一部は２４時間以内にイソプロパノールに変換された（表１６）。
【０２５８】
【表１６】
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【０２５９】
ＣＯが一定供給される発酵系では、アセトン発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃを有するＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いたそれぞれの発酵運転において、ＣＯまたはＣＯ／Ｈ２からのイソプロパノール連続生産に十分な還元力が提供され、アセトンおよびイソプロパノールの両方が生産された。
【０２６０】
新規のアルコール脱水素酵素のクローニング
新規のアルコール脱水素酵素をアセトン発現プラスミドにクローニングし、Ｅ．コリにおける遺伝子の過剰発現および機能の試験のためにウッド−リュングダールプロモーターの制御下に置いた。
【０２６１】
単離したＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の染色体ＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＳｅｃＡｄｈ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号５４：ＴＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧ）、および、ＳｅｃＡｄｈ−ＸｈｏＩ−Ｒ（配列番号５５：ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＣＧＡＣＡＧ）を用いてアルコール脱水素酵素を増幅した。１１２９ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＥ．コリＸＬ−１ ＢＬＵＥ ＭＲＦ’Ｋａｎを用いて、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃにクローニングした。得られたプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−ａｄｈ（配列番号４８；図４３）を表９で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、結果から、イソプロパノール生合成遺伝子およびプロモーター領域は、突然変異を含まないことが確認された（図４１）。
【０２６２】
Ｅ．コリにおけるＣ．オートエタノゲナム由来の新規のアルコール脱水素酵素を用いたイソプロパノールの生産
Ｃ．オートエタノゲナム由来の新規のアルコール脱水素酵素の機能をさらに試験するために、クロラムフェニコールを含む１００ｍｌのＳＤ−８最少培地中で、アセトン生合成遺伝子のみを発現するＥ．コリＸＬ−１ ＢＬＵＥ ＭＲＦ’Ｋａｎ（プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃを有する）、および、アセトン生合成遺伝子に加えて新規のアルコール脱水素酵素を発現するＥ．コリＸＬ−１ ＢＬＵＥ ＭＲＦ’Ｋａｎ（プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ−ａｄｈを有する）を用いて増殖実験を行った（図４２）。
【０２６３】
アセトンプラスミドを有する株においてはイソプロパノールは検出されなかったが、Ｃ．オートエタノゲナム由来の新規のアルコール脱水素酵素を追加で発現する株においては平均で最大３２．７ｍｇ／Ｌのイソプロパノールが測定された。
【０２６４】
Ｃ．オートエタノゲナムにおいてアセトンまたはイソプロパノールに対する新規の活性を付与する、ラクトコッカス・ラクティスおよびサッカロミセス・セレビジエ由来の遺伝子の同定
クロストリジウムのアセトンおよびイソプロパノール経路に加えて、Ｃ．オートエタノゲナムにおいてアセトンおよびイソプロパノール生産に対する活性を付与する２種の酵素、ラクトコッカス・ラクティス由来のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）、および、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）（表１８）を同定した。これら２種の酵素が、アセトンまたはイソプロパノール生産に関与すること、または、クロストリジウムのアセトンおよびイソプロパノール経路における前駆体のいずれかに対して触媒的な機能を有することは未だ報告されていない。Ｅ．コリ（Atsumi et al., 2008. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature, 451: 86-90）、あるいは、コリネバクテリウム・グルタミカス（Blombach et al., 2011. Corynebacterium glutamicum tailored for efficient Isobutanol production. Appl. Environ. Microbiol. 77: 3300-10）、または、クロストリジウム・セルロリティカム（Higashide W., et al.2011. Metabolic Engineering of Clostridium cellulolyticum for Production of Isobutanol from Cellulose. Appl. Environ. Microbiol.77: 2727-33）のようなその他の生物におけるこれらのタンパク質の異種発現は、アミノ酸前駆体からのイソブタノール、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、および、２−フェニルエタノールのような分岐鎖高級アルコールの生産をもたらすが、アセトンまたはイソブタノールは報告されていない。しかしながら、驚くべきことに、Ｃ．オートエタノゲナムにおける、ラクトコッカス・ラクティス由来のコドン最適化アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）単独、または、ラクトコッカス・ラクティス由来のコドン最適化アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）と、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）との組み合わせの発現は、アセトンおよびイソプロパノールの生産をもたらした。
【０２６５】
【表１７】
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【０２６６】
ラクトコッカス・ラクティス由来のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）、および、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）を含む発現プラスミドの構築
Ｌ．ラクティス由来のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（デカルボキシラーゼ；ＫｉｖＤ）、および、Ｓ．セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）（表１８）を、ＡＴＧ：バイオシンセティクス社（Biosynthetics GmbH）（メルツハウゼン、ドイツ）によってコドンを最適化し、さらなるサブクローニングのためにＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限部位を両端につけた。標的遺伝子の発現のために、Ｃ．オートエタノゲナムのリン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを使用した。表１９に用いられた全てのＤＮＡ配列を示す。
【０２６７】
【表１８】
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【０２６８】
プライマーＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｏｔＩ−Ｆ（配列番号８０：ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣ）、および、Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号８１：ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣ）を用いて、リン酸トランスアセチラーゼ−酢酸キナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）のプロモーター領域を増幅し、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位ならびにＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ株を用いて、Ｅ．コリ−クロストリジウムのシャトルベクターｐＭＴＬ ８５１４１（ＦＪ７９７６５１．１；Nigel Minton、ノッティンガム大学、英国）［Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85］にクローニングした。
【０２６９】
続いて作製されたプラスミドｐＭＴＬ８５１４５中の抗生物質耐性遺伝子を、ＦｓｅＩおよびＰｍｅＩ制限部位ならびにＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ株を用いて、ｐＭＴＬ８２２５４（ＦＪ７９７６４６．１；Nigel Minton、ノッティンガム大学、英国）［Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85］由来のエリスロマイシン耐性遺伝子で置換した。
【０２７０】
作製されたプラスミドｐＭＴＬ８５２４５（配列番号８０）、および、デカルボキシラーゼおよびアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）遺伝子クラスターの２７４６ｂｐのコドン最適化生成物をいずれも、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで切断した。ライゲーションしたものをＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎに形質転換し、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２（配列番号８３；図６３）を得た。得られたプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈのインサートを、表２０で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、その結果から、遺伝子およびプロモーター領域は突然変異を含まないことが確認された。
【０２７１】
Ｍ１３リバース（配列番号５７：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）、および、Ａｄｈ＿ｓｅｑＲ１（配列番号８５；表１６）のプライマー対を用いてｋｉｖＤ遺伝子単独を増幅した。ＫｉｖＤの２６３５ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位、ならびにＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ株を用いてＥ．コリ−クロストリジウムのシャトルベクターｐＭＴＬ８５２４５にクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ（配列番号８４；図６４）を作製した。得られたプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄのインサートを、表２０で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、その結果から、アセトン生合成遺伝子は突然変異を含まないことが確認された。
【０２７２】
【表１９】
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【０２７３】
アセトンおよびイソプロパノールを生産するための、Ｃ．オートエタノゲナムにおける、ラクトコッカス・ラクティス由来のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）、および、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）に関するコドン最適化遺伝子の発現
構築された発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２、および、ｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄをＥ．コリＪＷ３３５０−２株に形質転換し、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３で形質転換するために調製した（これは上述したようにして行った）。２つのプラスミドを含むＥ．コリにおいては、アセトンもイソプロパノールも検出できなかったが（ただし、文献で説明されているように、イソブタノールのようなより高次の分岐鎖アルコールを除く）、Ｃ．オートエタノゲナムでは、アセトンとイソプロパノールの両方を検出することができた。血清ボトル実験において、ＣＯを含む製鋼工場のガスからの最大のイソプロパノール濃度は、両方の発現プラスミドについて、０．０５０〜０．０６４ｇ／Ｌであった（図６５および６６）。
【０２７４】
クロストリジウム経路遺伝子と、ラクトコッカス・ラクティス由来のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）、および、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ２）との組み合わせを用いたアセトンおよびイソプロパノールの生産
何らかの特定の理論に縛られることは望まないが、本発明者等は、ラクトコッカス・ラクティス由来のコドン最適化アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼＫｉｖｄは、クロストリジウムのアセトアセテートデカルボキシラーゼのように、アセトアセテートをアセトンに変換する活性を有するが、サッカロミセス・セレビジエ由来のコドン最適化アルコール脱水素酵素Ａｄｈ２は、同定された新規の１級：２級アルコール脱水素酵素、または、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の１級：２級アルコール脱水素酵素のように、アセトンをイソプロパノールに変換する活性を有すると考える。この仮説を試験するために、クロストリジウムのアセトン／イソプロパノール経路遺伝子、および、ラクトコッカス・ラクティス由来のアルファ−ケト酸デカルボキシラーゼＫｉｖｄ、および、サッカロミセス・セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素Ａｄｈ２の数種の組み合わせを作製し、Ｅ．コリ、および、Ｃ．オートエタノゲナム中で試験したところ、アセトンおよびイソプロパノールの生産が実証された。
【０２７５】
異なる遺伝子の組み合わせを含む発現プラスミドの構築
構築された発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ、ｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２、および、ｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄをベースとして、新しい組み合わせを構築した。
【０２７６】
３１２２ｂｐのＰＷＬ−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢフラグメントを、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃから、オリゴヌクレオチドＰ−ｔｈｌ−ｃｔｆＡＢ＿Ｆ２（配列番号９３：ＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＡＧＴＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＣＣＡＧ）、および、Ｐ−ｔｈｌ−ｃｔｆＡＢ＿Ｒ２（配列番号９４：ＡＧＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＡＴＣ）を用いて増幅した。増幅したフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ制限部位、ならびにＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ株を用いてプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄにクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ＰＷＬ−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ｋｉｖｄ（配列番号９５；図６７）を作製した。得られたプラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ＰＷＬ−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ｋｉｖｄのインサートを、表９および２０で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、そのプラスミドは突然変異を含まないことが確認された。
【０２７７】
Ａｄｈ２遺伝子を、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２から、ａｄｈ＿Ｆ（配列番号９６：ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＡＣＣ）、および、Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ＿Ｒ（配列番号９７：ＡＧＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣ）のプライマー対を用いて増幅した。１０８４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ制限部位、ならびにＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ株を用いてプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃにクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２（配列番号９８；図６８）を作製した。作製したプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２、および、ｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６４７．１；Nigel Minton、ノッティンガム大学、英国）［Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85］からのｒｅｐＬ遺伝子の１６２５ｂｐのフラグメントを両方ともＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで切断した。ライゲーションを行い、プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２を得た。得られたプラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２のインサートを、表９および２０で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、その結果から、フラグメントは突然変異を含まないことが確認された。
【０２７８】
オリゴヌクレオチドＰ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ＿Ｆ（配列番号９９：ＡＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧ）、および、Ｐ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ＿Ｒ（配列番号１００：ＡＧＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣ）を使用して、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２からＰｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２の３２６６ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅し、次にこれを、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ制限部位、ならびにＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ株を用いてプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃにクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２（配列番号１０１；図６９）を作製した。作製したプラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２、および、ｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６４７．１；Nigel Minton、ノッティンガム大学、英国）［Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85］からのｒｅｐＬ遺伝子の１６２５ｂｐのフラグメントを両方ともＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで切断した。ライゲーションを行い、プラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２を得た。得られたプラスミドｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２のインサートを、表９で示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列解析したところ、その結果から、そのプラスミドは突然変異を含まないことが確認された。
【０２７９】
異なる遺伝子の組み合わせを用いたＣ．オートエタノゲナムにおけるアセトンおよびイソプロパノールの生産
インビボで、Ｅ．コリにおいて、新たに構築した発現プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃ、ｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２、および、ｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２のメチル化を、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．ラグスダレイ、および、Ｃ．リュングダリイ由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計した合成ハイブリッドＩＩ型メチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号３５）を用いて行い、上述のようにしてＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３に形質転換した。
【０２８０】
単独の基質として糖（Ｅ．コリ）またはＣＯを含む製鋼工場のガス（Ｃ．オートエタノゲナム）を使用した血清ボトル実験によって、全てのプラスミドコンストラクトを、Ｅ．コリ、および、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３において試験した。全ての組み合わせを試験したところ、アセトンおよびイソプロパノール生産は、Ｃ．オートエタノゲナムで異種発現された場合に測定され、一方で、Ｅ．コリの場合は、アセトンの生産は少数の組み合わせでのみ起こり、イソプロパノール生産にはアルコール脱水素酵素遺伝子が必要であった（表２１）。この結果から、Ｅ．コリとＣ．オートエタノゲナムの両方において、ラクトコッカス・ラクティス由来のコドン最適化アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼＫｉｖｄは、クロストリジウムのアセトアセテートデカルボキシラーゼの代わりになって、アセトアセテートからアセトンへの変換を触媒することができることが示される（図４）。Ｃ．オートエタノゲナムにおいて、アセトンおよびイソプロパノール生産は、デカルボキシラーゼが異種遺伝子としてのみ発現され、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性を示したときでも起こった。図４は、提唱されている経路を説明しており、表２１は、ＣＯからのアセトンおよびイソプロパノール形成を示しており、図７３は、Ｅ．コリおよびＣ．オートエタノゲナムにおいて試験された、クロストリジウム経路遺伝子、および、Ｌ．ラクティス由来のアルファ−ケト酸デカルボキシラーゼＫｉｖｄ、および、Ｓ．セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素Ａｄｈ２に関するコドン最適化遺伝子の組み合わせの概説を示す。
【０２８１】
図７０、７１および７２にそれぞれ、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、および、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ＰＷＬ−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ｋｉｖｄ、ｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−ａｄｈ２、および、ｐＭＴＬ８３１４７−ｔｈｌＡ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ−Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ｋｉｖｄ−ａｄｈ２を用いた、ＣＯを含む製鋼工場のガスからのアセトンおよびイソプロパノールの生産を示す。
【０２８２】
【表２０】
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【０２８３】
酢酸生産菌（acetogen）におけるアセトンおよびイソプロパノールに対する耐性ならびに酢酸塩の解毒
アルコール（エタノールおよびブタノール）、または、酸（酢酸および酪酸）などの数種の代謝産物は、高濃度では細菌にとって毒性であることが知られており、そのためそれらの生物工学的な生産能には限界がある［Alsaker KV, Parades C, Papoutsakis ET: Metabolite stress and tolerance in the production of biofuels and chemicals - systems analysis of butanol, butyrate, and Acetate Stresses in the Anaerobe Clostridium acetobutylicum. Biotechnol Bioeng, 2009, 105: 1131-1147］。アセトンおよびイソプロパノールが培養物に対して毒作用を有するのかどうかを調べるために、血清ボトル中の５０ｍｌのＰＥＴＣ培地（表２）で増殖実験を行い、増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３の培養物に、様々な濃度のアセトン（図１２）、および、イソプロパノール（図１３）を添加した。５％もの高いアセトンまたはイソプロパノール濃度の存在下でも、細胞増殖を目視で観察することができた（わずかに増殖速度が抑制されただけであった）。
【０２８４】
一方で、高濃度の遊離の酢酸または解離していない酢酸は、ほとんどの嫌気性細菌（酢酸生産性細菌を含む）にとって、膜における勾配に対する有害作用のために有害であることが知られている［Warnecke T, Gill RT: Organic acid toxicity, tolerance, and production in Escherichia coli biorefining applications. Microb Cell Fact, 2005, 4: 25; Kopke M, Durre P: Biochemical production of biobutanol, in Luque R, Campelo J, Clark JH (編集): Handbook of biofuel production - Processes and technologies, Woodhead Publishing, Camebridge, 2010: 221-257］。しかしながら、酢酸生産性細菌は、基質レベルのリン酸化から酢酸を生産してＡＴＰを得る必要があり［Drake HL, Kusel K, Matthies C: Acetogenic Prokaryotes. In Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E (編集): The Prokaryotes, 第3版, 第2巻, スプリンガー(Springer), ニューヨーク, 2006: 354-420］、従って、全ての既知の酢酸生産性種は、酢酸を生産する［Drake HL, Kusel K, Matthies C: Acetogenic Prokaryotes. In Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E (編集): The Prokaryotes, 第3版, 第2巻, スプリンガー, ニューヨーク, 2006: 354-420］。酢酸を、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）によってエタノールのようなその他の生成物に変換すること、または、リン酸トランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼ（Ｐｔａ／Ａｃｋ）、または、ＡＭＰ依存性アセチル−ＣｏＡシンターゼ（Ａｃｓ）によってアセチル−ＣｏＡに戻すことは、エネルギーを還元フェレドキシンまたはＡＴＰの形態で必要とするために都合が悪い［Wolfe AJ: The acetate switch. Microbiol Mol Biol Rev, 2005, 69: 12-50］。本発明は、エネルギーを必要としない、酢酸生産性細菌における新規の酢酸解毒法を提供する。酢酸は、アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート／ブチレート補酵素ＡトランスフェラーゼＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート／ブチレート補酵素ＡトランスフェラーゼＢからなるアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート／ブチレート補酵素Ａトランスフェラーゼ系によって、アセチル−ＣｏＡに戻され再利用が可能である。この反応によってアセトアセチル−ＣｏＡからアセトアセテートへの変換が誘発され、続いてアセトアセテートは、脱カルボキシル化されてアセトンになり、イソプロパノールに還元される（図４）。
【０２８５】
本明細書において、読者が余計な実験を行うことなく本発明を実施できるように、所定の好ましい実施態様を参照しながら本発明を説明した。しかしながら、当業界において通常の技術を有するものであれば、構成要素およびパラメーターの多くは、本発明の範囲から逸脱することなく、ある程度変更または改変してもよいし、または、よく知られた等価体に置換してもよいことは、容易に理解できるものと思われる。当然のことながら、このような改変および等価体は、それぞれ個々に明示されたものとして本明細書に包含される。発明の名称、項目等は、読者がこの文書を理解しやするために記載されたものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０２８６】
上記および下記で引用された全ての出願、特許および出版物の開示は全て、存在する場合、参照により本発明に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるあらゆる出願、特許および出版物への言及は、それらが有効な従来技術を構成するか、もしくは世界中のどこの国でも共通する一般的な知見の一部を形成することへの承認、または、あらゆる形態の示唆ではなく、そのように解釈されるべきでもない。
【０２８７】
本明細書および以下に記載される全ての請求項において、文中で他の規定がない限り、「〜を含む（comprise）」、「〜を含む（comprising）」等の用語は、排他的な意味ではなく、包括的な意味で解釈されることとし、すなわち、「〜としては、これらに限定されないが、〜を含む」という意味で解釈されることとする。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５８−３】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６０−３】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６１−３】
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【図６１−４】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６２−３】
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【図６２−４】
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【図６２−５】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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