(57)【要約】生物学的サンプル中の第１種のＩｇ−ＣＴＦを検出する方法であって、生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又は抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露すること、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、及び生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦを検出することを含む。
2014517911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法であって、前記方法は以下：
ａ．第１種の被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；及び
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
第１種の被験者においてＩｇ−ＣＴＦのレベルをモニターする方法であって、以下：
ａ．前記被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、
ｉ．公知の標準又は
ｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること
を含む、方法。
【請求項３】
第１種の被験者においてインスリン抵抗性を診断するための方法であって、以下：
ａ．前記被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又は前記抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること；及び
ｅ．サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、インスリン抵抗性と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項４】
第１種の被験者においてインスリン抵抗性を処置する方法であって、以下：
ａ．前記被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること；
ｅ．サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、インスリン抵抗性と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること；及び
ｆ．被験者に、インスリン抵抗性のための処置を施す、又は処方すること
を含む、方法。
【請求項５】
第１種の被験者においてインスリン抵抗性をモニタリングする方法であって、以下：
ａ．前記被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、
ｉ．公知の標準又は
ｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること；及び
ｅ．被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、インスリン抵抗性の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項６】
第１種の被験者において癌を診断するための方法であって、以下：
ａ．前記被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること；及び
ｅ．サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項７】
第１種の被験者において癌を処置する方法であって、以下：
ａ．前記被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること；
ｅ．サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること；及び
ｆ．被験者に、癌のための処置を施す、又は処方すること
を含む、方法。
【請求項８】
第１種の被験者において癌をモニターする方法であって、以下：
ａ．前記被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、
ｉ．公知の標準又は
ｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること；及び
ｅ．被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、癌の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項９】
第１種の被験者において肝臓疾患を診断するための方法であって、以下：
ａ．前記被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること；及び
ｅ．サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、肝臓疾患と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項１０】
第１種の被験者において肝臓疾患を処置する方法であって、以下：
ａ．前記被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること；
ｅ．サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、肝臓疾患と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること；及び
ｆ．被験者に、肝臓疾患のための処置を施す、又は処方すること
を含む、方法。
【請求項１１】
第１種の被験者において肝臓疾患をモニターする方法であって、以下：
ａ．前記被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること；
ｃ．前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること；
ｄ．サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、
ｉ．公知の標準又は
ｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること；及び
ｅ．被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、前記被験者における肝臓疾患の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項１２】
第１種、第２種、及び第３種が同じ種ではない、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
Ｉｇ−ＣＴＦが、Ｉｇに共有結合的に付着したＡｄｉｐｏＲ１のＣ末端フラグメントを含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ＡｄｉｐｏＲ１のＣ末端フラグメントが、配列番号１〜２２のアミノ酸配列の１つ又は複数を含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
Ｉｇ−ＣＴＦが、Ｉｇに共有結合的に付着したＡｄｉｐｏＲ２のＣ末端フラグメントを含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ＡｄｉｐｏＲ２のＣ末端フラグメントが、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列の１つ又は複数を含む、請求項１〜１２及び１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
生物学的サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来する、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
生物学的サンプルが、血液又は血漿に由来する、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを、生物学的サンプルに加える、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
組織が、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
生物学的サンプルが哺乳動物に由来する、請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物が非ヒト霊長類である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタである、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
第１抗体又は抗原結合フラグメントが、固体支持体に結合されている、請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
固体支持体がＥＩＡ／ＲＩＡプレートである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第２抗体又は抗原結合フラグメントが、検出可能に標識される、請求項１〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
検出可能な標識が、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
酵素がアルカリホスファターゼである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項記載の方法であって、ここで、第１抗体が以下：
ａ．受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇＣＴＦに優先的に結合する単離抗体（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）；
ｂ．受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体（ｍＡｂ−５１０−６Ｂ６）；又は
ｃ．受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体（ｍＡｂ−５１５−４Ｄ６）
を含む、方法。
【請求項３１】
ＩｇがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥである、請求項１〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
ＩｇがＩｇＧである、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
Ｉｇが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖である、請求項１〜３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
Ｉｇが、ＩｇＧのガンマ重鎖である、、請求項１〜３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
Ｉｇが抗原結合領域（Ｆａｂ）である、請求項１〜３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
遊離ＣＴＦが検出されない、請求項１〜３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
インスリン抵抗性が、耐糖能障害、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、若年性糖尿病、妊娠糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と関連する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
癌が、乳癌、転移性癌、膵臓癌、又は肝細胞癌である、請求項６、７、又は８記載の方法。
【請求項３９】
肝臓疾患が、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はアルコール性肝炎である、請求項９、１０、又は１１記載の方法。
【請求項４０】
公知の標準が、正常なインスリン感受性を有するとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項３、４、又は５記載の方法。
【請求項４１】
公知の標準が、インスリン抵抗性として同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項３、４、又は５記載の方法。
【請求項４２】
公知の標準が、糖尿病として同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項３、４、又は５記載の方法。
【請求項４３】
工程ａに記載する生物学的サンプルが、インスリン抵抗性又は糖尿病のための処置に続いて、被験者から得られる、請求項３、４、又は５記載の方法。
【請求項４４】
より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプルが、インスリン抵抗性又は糖尿病のための処置に続いて、被験者から得られる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
公知の標準が、癌がないとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項６、７、又は８記載の方法。
【請求項４６】
公知の標準が、癌を有するとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項６、７、又は８記載の方法。
【請求項４７】
工程ａに記載する生物学的サンプルが、癌のための処置に続いて、被験者から得られる、請求項６、７、又は８記載の方法。
【請求項４８】
より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプルが、癌のための処置に続いて、該被験者から得られる、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
公知の標準が、正常として同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項９、１０、又は１１記載の方法。
【請求項５０】
公知の標準が、肝臓疾患を有するとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルを含む、請求項９、１０、又は１１記載の方法。
【請求項５１】
工程ａに記載する生物学的サンプルが、肝臓疾患のための処置に続いて、被験者から得られる、請求項９、１０、又は１１記載の方法。
【請求項５２】
より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプルが、肝臓疾患のための処置に続いて、該被験者から得られる、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、経時的に、増加、減少、又は安定化しているか否かを決定することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項５４】
生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの存在を検出するためのキットであって、以下：
ａ．受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ  ＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）；
受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体（ｍＡｂ−５１０−６Ｂ６）；及び／又は
受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体（ｍＡｂ−５１５−４Ｄ６）；
ｂ．ヒトＩｇに優先的に結合する第２抗体又は抗原結合フラグメント
ｃ．同一のためのパッケージングと一緒での、第１抗体又は抗原結合フラグメント及び第２抗体又は抗原結合フラグメントの使用のための指示
を含む、キット。
【請求項５５】
ＩｇがＩｇＧである、請求項５４記載のキット。
【請求項５６】
第２抗体又は抗原結合フラグメントが、検出可能に標識される、請求項５４又は５５記載のキット。
【請求項５７】
検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素である、請求項５６記載のキット。
【請求項５８】
酵素がアルカリホスファターゼである、請求項５７記載のキット。
【請求項５９】
第１抗体又は抗原結合フラグメントを含むための容器をさらに含む、請求項５４、５５、５６、５７、又は５８記載のキット。
【請求項６０】
第１抗体又は抗原結合フラグメントが固体支持体に結合されている、請求項５４、５５、５６、５７、５８、又は５９記載のキット。
【請求項６１】
固体支持体がＥＩＡ／ＲＩＡプレートである、請求項６０記載のキット。
【請求項６２】
使用されない場合、第２抗体又は抗原結合フラグメントを含むための容器をさらに含む、請求項５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、又は６１記載のキット。
【請求項６３】
配列番号４９のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号５０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号５１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項６６】
配列番号５２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項６７】
配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１〜４４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む単離ポリペプチド複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年２月１１日に出願された米国仮出願第６１／４４５，１０３号の利益を主張し、それは、本明細書において、参照により、その全体において組み入れられる。以下の出願及び公開も、本明細書において、参照により、それらの全体において組み入れられる：
米国出願第１０／５７２，８８２号（米国公開第２００７／００５３９１３号）、それは国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１０３８３号の国内段階である；
米国出願第１０／５７２，８８３号（米国公開第２００７／００３７２２６号）、それは国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００４／１０３８４号の国内段階である；
米国出願第６０／７４８，３０５号；国際公開第ＷＯ２００７／１２０３１１号；
米国出願第６０／９９１３２８号；
米国公開第２０１１／０３０１０８９号；
米国出願第１２／１６９９８３号（米国特許第８，０１７，５７３号）；及び
米国出願第１３／２６５，９６８号（国際公開第ＷＯ２０１０／１２３７２０号）。
【０００２】
技術分野
本明細書において提供する主題は、一般的に、Ｉｇ−ＣＴＦの検出のための、ならびに糖尿病、癌、及び肝臓疾患の診断、処置、及びモニタリングのための方法、キット、及び薬剤に関する。
【０００３】
背景
慢性炎症を伴う肥満は、大きく、増大する集団に影響を与える。この集団は、心臓血管疾患及び糖尿病を発生する高いリスクを有し、高頻度に、インスリン抵抗性に関連するメタボリックシンドロームを発生する。近年、アディポネクチン及び他のアディポカインが、グルコース代謝を制御する脂肪細胞ホルモンとして発見されている。脂肪細胞の型及び位置の両方が重要である。肥満は、血液中にアディポネクチンを分泌する追加の脂肪細胞を産生し、脂肪及びグルコースの筋肉細胞代謝を助ける。一部の過体重患者は、インスリン抵抗性になる。この場合において、脂肪細胞はアディポネクチン産生を停止する。血液中のアディポネクチンレベルは、肥満、インスリン抵抗性、及び２型糖尿病の条件下で減少する。方法が、これら及び他の疾患状態の予後について被験者においてアディポネクチンレベルを測定するために存在する。アディポネクチンレベルの測定は、しかし、疾患の弱い指標であることが証明されている。必要性が、異常な脂肪細胞活性に関連する疾患状態をモニターするより良い方法について存在する。本発明は、この及び他のニーズを提供する。
【０００４】
アディポネクチン受容体１（ＡＤＩＰＯＲ１）は、７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。例えば、ＷＯ０１／０１２６６２及びＷＯ０１／０９０３０４を参照のこと。多くの医学的に有意な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質を含むシグナル伝達経路により媒介される［Lefkowitz, Nature 351, 353-354 (1991)］。特定の細胞外メッセンジャー（ＥＣＭ）は、ＡＤＩＰＯＲ１のＣ末端からのペプチドフラグメントであり、ヒト血液において診断的価値を有する。それらの有用性は、ポリクローナル抗体を使用し、質量測定ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ免疫親和性方法を用いて確認した。それらの発明は、関連出願ＷＯ２００７／１２０，３１１の対象であって、それは、本明細書において、参照により組み入れられる。
【０００５】
概要
予想外に、ＡＤＩＰＯＲ１及びＡＤＩＰＯＲ２（配列番号１〜４４）のＣ末端フラグメント（ＣＴＦ）が、タンパク質構造の一部として免疫グロブリンガンマ鎖及びカッパ鎖中に共有結合的に組み込まれていることが発見された。加えて、ＣＴＦ−免疫グロブリンは、患者の血漿、細胞、及び組織中にあり、ＣＴＦ−免疫グロブリンにおける変化が、患者におけるインスリン抵抗性及び癌と相関することが見出された。したがって、ＣＴＦ−免疫グロブリンのＣＴＦ部分は、細胞インスリン応答を低下させることが見出され、このように、細胞成長の予想される阻害及び血液グルコースレベルを下げるための低下した能力を起こす。
【０００６】
ＣＴＦ−免疫グロブリンの免疫グロブリン部分は、細胞、組織、及び血液中の抗原に結合することが見出された。抗原の結合は、Ｉｇ−ＣＴＦに導き、血漿を離れ、細胞及び組織に入り、細胞成長を阻害し、インスリン応答を低下させる。したがって、ＣＴＦ−免疫グロブリンの免疫グロブリン部分及びその抗原は、ＣＴＦが細胞及び組織に入るか否かを方向付けるための方法において有用である。さらに、ＣＴＦ−免疫グロブリンの免疫グロブリン部分及び結合した抗原を測定し、使用し、ＣＴＦの診断的測定を改善することができる。
【０００７】
本明細書において提供するのは、それを必要とする患者においてインスリン抵抗性を処置する及び／又は細胞成長を阻害する方法であって、以下の工程を含む：前記患者に、タンパク質構造の一部として免疫グロブリンに共有結合的に組み込まれたＣＴＦペプチド又はその医薬的に許容可能な塩の効果的な量を投与すること；それにおいて、ペプチドは、配列番号１〜４４と少なくとも７５%の同一性を有し、それにおいて、配列番号４５及び４６と少なくとも７５%の同一性のガンマ及びカッパ免疫グロブリン鎖に共有結合的に付着されている。
【０００８】
また、提供するのは、それを必要とする患者においてインスリン抵抗性を処置する及び細胞成長の阻害の方法であって、以下の工程を含む：前記患者に、ＣＴＦに結合する免疫グロブリンの効果的な量を投与すること、それにおいて、免疫グロブリンは、配列番号１〜４４と少なくとも７５%の同一性を有するペプチドに結合する。
【０００９】
また、提供するのは、それを必要とする患者においてインスリン抵抗性を処置する方法及び細胞成長を阻害する方法であって、以下の工程を含む：前記患者に、ＣＴＦ免疫グロブリン中のガンマ鎖又はカッパ鎖と少なくとも７５%の同一性を有する免疫グロブリンの効果的な量を投与すること。
【００１０】
本明細書においてさらに開示されるのは、それを必要とする患者においてインスリン抵抗性を処置する方法及び細胞成長を阻害する方法であって、以下の工程を含む：前記患者に、ＣＴＦ免疫グロブリンの免疫グロブリン部分に結合することが示されている、ペプチド抗原又はその医薬的に許容可能な塩の効果的な量を投与すること。
【００１１】
それを必要とする患者においてインスリン抵抗性及び／又は異常な細胞成長を、患者の生物学的サンプル中のＣＴＦペプチド及び免疫グロブリン部分を測定することにより診断する方法（それにおいて、前記ＣＴＦペプチドが、配列番号１〜４４のアミノ酸配列と少なくとも７５%の同一性を有し、それにおいて、免疫グロブリン部分が、配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列を含むガンマ又はカッパ免疫グロブリン鎖と少なくとも７５%の同一性を有する）をさらに提供する。
【００１２】
さらに提供するのは、それを必要とする患者においてインスリン抵抗性及び／又は異常な細胞成長を、患者の生物学的サンプル中のＣＴＦ免疫グロブリンの免疫グロブリン部分を測定することにより、診断する方法（それにおいて、免疫グロブリン部分が、配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列を含むガンマ又はカッパ免疫グロブリン鎖と少なくとも７５%の同一性を有する）である。
【００１３】
また、提供するのは、それを必要とする患者においてインスリン抵抗性及び／又は異常な細胞成長を、患者の生物学的サンプル中のＣＴＦ免疫グロブリンの免疫グロブリン部分に結合することが示されているペプチド抗原を測定することにより、診断する方法（それにおいて、免疫グロブリン部分が、配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列を含むガンマ重鎖又はカッパ軽鎖と少なくとも７５%の同一性を有する）である。
【００１４】
一部の実施態様において、提供するのは、生物学的サンプル中の第１種のＩｇ−ＣＴＦを検出する方法であって、生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又は抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、及び前記生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦを検出することを含む。
【００１５】
また、提供するのは、第１種の被験者においてインスリン抵抗性を診断するための方法であって、この方法が、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又は抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること、及び、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、インスリン抵抗性と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定することを含む。
【００１６】
また、提供するのは、第１種の被験者において癌を診断するための方法であって、前記方法が、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること、及び、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定することを含む。
【００１７】
第１種の被験者においてインスリン抵抗性を処置するための方法を提供し、この方法は、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、インスリン抵抗性と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること、及び、被験者に、インスリン抵抗性のための処置を施す、又は処方することを含む。
【００１８】
また、提供するのは、第１種の被験者において癌を処置する方法であって、前記方法が、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること、及び、被験者に、癌のための処置を施す、又は処方することを含む。
【００１９】
さらに、本明細書において提供するのは、生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの存在を検出するためのキットであって、このキットは、受託番号 ）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ  ＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２、受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体（ｍＡｂ−５１０−６Ｂ６）、及び／又は受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体（ｍＡｂ−５１５−４Ｄ６）、ヒトＩｇに優先的に結合する第２抗体又は抗原結合フラグメント、及び、同のためのパッケージングと一緒での、第１抗体又は抗原結合フラグメント及び第２抗体又は抗原結合フラグメントの使用のための指示を含む。
【００２０】
また、開示されるのは、第１種の被験者においてインスリン抵抗性をモニタリングする方法であって、前記方法は、前記被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露させること、前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、ｉ．公知の標準又はｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること、及び、被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、インスリン抵抗性の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定することを含む。
【００２１】
一部の実施態様において、提供するのは、第１種の被験者において癌をモニターする方法であって、前記方法は、前記被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、それにより、混合物を形成すること、前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、ｉ．公知の標準又はｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること、及び、被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、インスリン抵抗性の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定することを含む。
【００２２】
さらに、本明細書において提供するのは、第１種の被験者においてＩｇ−ＣＴＦのレベルをモニターする方法であって、前記方法は、被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露すること、混合物を形成すること、前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、ｉ．公知の標準又はｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較することを含む。
【００２３】
第１種の被験者において肝臓疾患を診断するための方法も開示し、前記方法は、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること、及び、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、肝臓疾患と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定することを含む。
【００２４】
一部の実施態様において、第１種の被験者において肝臓疾患を処置する方法を提供し、前記方法は、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、それにより、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較すること、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、肝臓疾患と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定すること、及び、被験者に、肝臓疾患のための処置を施す、又は処方することを含む。
【００２５】
また、第１種の被験者において肝臓疾患をモニターする方法を提供し、前記方法は、被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露し、混合物を形成すること、前記混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露すること、前記サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を定量化すること、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、ｉ．公知の標準又はｉｉ．より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較すること、及び、被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、被験者における肝臓疾患の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定することを含む。
【００２６】
別の局面において、提供するのは、配列番号４９（受託番号 を有する、２０１２年２月２１日にＡＴＣＣに寄託された抗体ｍＡｂ  ４６１−４Ｈ１１を作る細胞株を作るために使用された抗原）、配列番号５０（受託番号 を有する、２０１２年２月２１日にＡＴＣＣに寄託された抗体ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２を作る細胞株を作るために使用された抗原）、配列番号５１（受託番号 を有する、２０１２年２月２１日にＡＴＣＣに寄託された抗体ｍＡｂ  ５１５−４Ｄ６を作る細胞株を作るために使用された抗原）、及び配列番号５２（受託番号 を有する、２０１２年２月２１日にＡＴＣＣに寄託された抗体ｍＡｂ  ５１０−６Ｂ６を作る細胞株を作るために使用された抗原）のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドである。また、提供するのは、配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列にあるいはそれらのフラグメントに共有結合的に付着した、配列番号１〜４４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む単離ポリペプチド複合体である。
【００２７】
さらに、生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法を提供し、前記方法は、第１種の被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させること、混合物を形成すること、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露させること、及び、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを検出することを含む。
【００２８】
一部の実施態様において、第１種、第２種、及び第３種は同じ種ではない。一部の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦは、Ｉｇに共有結合的に付着したＡｄｉｐｏＲ１のＣ末端フラグメントを含む。一部の実施態様において、ＡｄｉｐｏＲ１のＣ末端フラグメントは、配列番号１〜２２のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。一部の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦは、Ｉｇに共有結合的に付着したＡｄｉｐｏＲ２のＣ末端フラグメントを含む。他の適した実施態様において、ＡｄｉｐｏＲ２のＣ末端フラグメントは、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。一部の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦは、Ｉｇに共有結合的に付着したＡｄｉｐｏＲ１のＣ末端フラグメント及びＩｇに共有結合的に付着したＡｄｉｐｏＲ２のＣ末端フラグメントを含む。一部の実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露する工程は、生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又は抗原結合フラグメントに優先的に結合する１を上回るそのような第２種の第１抗体に曝露することを包含する。
【００２９】
一部の実施態様において、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来する又はそれらから得られる。好ましい実施態様において、生物学的サンプルは、血液又は血漿に由来する。フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを、生物学的サンプルに加えることができる。組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳でありうる。
【００３０】
生物学的サンプルは、哺乳動物に由来しうる。その哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類でありうる。あるいは、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタでありうる。
【００３１】
一部の実施態様において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合している。その固体支持体は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）プレートでありうる。
【００３２】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。例えば、検出可能な標識は、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素（例、アルカリホスファターゼ）を含む。
【００３３】
適した実施態様において、第１抗体は以下を含む：受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇＣＴＦに優先的に結合する単離抗体（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）、受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体（ｍＡｂ−５１０−６Ｂ６）、又は、受託番号 を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体（ｍＡｂ−５１５−４Ｄ６）。一部の実施態様において、第１抗体はこれらの抗体の２つ又はそれ以上を含む。
【００３４】
一部の実施態様において、免疫グロブリン（「Ｉｇ」）は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥである。好ましい実施態様において、ＩｇはＩｇＧである。他の実施態様において、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖であり、あるいは、ＩｇはＩｇＧのガンマ重鎖である。別の実施態様において、Ｉｇは抗原結合領域（Ｆａｂ）である。一部の実施態様において、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する工程は、混合物を、第１種のＩｇに優先的に結合する、１を上回るそのような第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露することを包含する。他の実施態様において、第１種のＩｇに優先的に結合する、１を上回るそのような第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖、ＩｇＧのガンマ重鎖、抗原結合領域（Ｆａｂ）、又はそれらの任意の組み合わせに結合することができる。
【００３５】
一部の好ましい実施態様において、遊離ＣＴＦは検出されない。
【００３６】
一部の実施態様において、インスリン抵抗性は、耐糖能障害、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、若年性糖尿病、妊娠糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と関連する。
【００３７】
一部の実施態様において、癌は、乳癌、転移性癌、膵臓癌、又は肝細胞癌である。
【００３８】
一部の実施態様において、肝臓疾患は、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はアルコール性肝炎である。
【００３９】
添付の図面は、非限定的であり、本明細書に記載する実施態様のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書において組み込まれ、その一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、アディポネクチン受容体応答に対するアディポネクチンの提案された機構を例示する。正常な患者において、アディポネクチンは、ＡＭＰＫ  ＭＡＰＫ  ｐ３８及びＰＰＡＲαのアディポネクチン受容体シグナル伝達経路を活性化し、筋肉において解糖及び脂肪酸酸化を起こし、肝臓においてグルコース産生を遅らせる。アディポネクチンは、アディポネクチンのＣ末端フラグメントに直接的に結合しない、又は、ＣＴＦの放出を活性化しない。代わりに、アディポネクチンは、Ｃ末端フラグメントの放出を遮断する。これは、細胞をインスリンに感作させる。なぜなら、ＣＴＦは、肝臓においてインスリン分解酵素（ＩＤＥ）を阻害するために放出されないからである。これは、ＩＤＥが細胞間インスリンを分解することを許し、それは、より強いインスリン受容体応答を維持する。
【図２】図２は、Ｉｇ−ＣＴＦ自己免疫の提案された病理を例示する。異常な患者において、腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）は、アディポネクチンが遮断するアディポネクチン受容体からＣＴＦを切断する。この切断は、アディポネクチン受容体を囲む領域に引き付けられた免疫グロブリンへのＣＴＦの共有結合的な連結を可能にする。免疫グロブリンは、細胞上にある又は自由に循環するのいずれかである。一度、共有結合的に連結されると、Ｉｇ−ＣＴＦは組織中に吸収される。この吸収は、ＣＴＦの細胞間濃度を増加させる。これは、細胞をインスリンに脱感作させる。なぜなら、ＣＴＦは、肝臓においてインスリン分解酵素（ＩＤＥ）を阻害するからである。これは、ＩＤＥが細胞間インスリンを分解することを防止し、それは、より弱いインスリン受容体応答を起こす。
【図３ａ】図３に、ＣＴＦが免疫グロブリンに結合していることを示す。図３ａは、３人の正常なヒト患者、３人の糖尿病患者、及び３人の耐糖能障害患者からの血漿についての変性ウエスタンブロットの結果を示す。ＣＴＦ抗体は、共有結合的に結合した免疫グロブリンを表す種々の分子量のバンドを検出する。塩基条件を用いて処理した同じサンプルについてのウエスタンブロットを、図３ｂに示す。ＣＴＦバンドは、もはや明らかでない、恐らくは、なぜなら、結合が破壊されていたからである。これらの同じサンプルを、図３ｃにおいて、抗ＩｇＧ抗体を用いてテストし、免疫グロブリンが残っていることを示す。
【図３ｂ】図３に、ＣＴＦが免疫グロブリンに結合していることを示す。図３ａは、３人の正常なヒト患者、３人の糖尿病患者、及び３人の耐糖能障害患者からの血漿についての変性ウエスタンブロットの結果を示す。ＣＴＦ抗体は、共有結合的に結合した免疫グロブリンを表す種々の分子量のバンドを検出する。塩基条件を用いて処理した同じサンプルについてのウエスタンブロットを、図３ｂに示す。ＣＴＦバンドは、もはや明らかでない、恐らくは、なぜなら、結合が破壊されていたからである。これらの同じサンプルを、図３ｃにおいて、抗ＩｇＧ抗体を用いてテストし、免疫グロブリンが残っていることを示す。
【図３ｃ】図３に、ＣＴＦが免疫グロブリンに結合していることを示す。図３ａは、３人の正常なヒト患者、３人の糖尿病患者、及び３人の耐糖能障害患者からの血漿についての変性ウエスタンブロットの結果を示す。ＣＴＦ抗体は、共有結合的に結合した免疫グロブリンを表す種々の分子量のバンドを検出する。塩基条件を用いて処理した同じサンプルについてのウエスタンブロットを、図３ｂに示す。ＣＴＦバンドは、もはや明らかでない、恐らくは、なぜなら、結合が破壊されていたからである。これらの同じサンプルを、図３ｃにおいて、抗ＩｇＧ抗体を用いてテストし、免疫グロブリンが残っていることを示す。
【図４】図４は、ＣＴＦへの抗体を産生するウサギにおける肝臓、脳、及び膵臓中へのＩｇＧ−ＣＴＦ及びＣＴＦの増加吸収の例画像を示す。
【００４１】
例示的な実施態様の詳細な説明
本明細書に引用する特許、特許出願、刊行物、及び参考文献の各々が、参照により、その全体において組み入れられる。
【００４２】
上記及び本開示を通して用いる通り、以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有すると理解するものとする。
【００４３】
本明細書において使用する通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の参照を含む。
【００４４】
本明細書において使用する通り、用語「約」は、測定可能な値（例えば量、時間的な持続期間など）を指す場合、特定の値からの±２０%、好ましくは±１０%、より好ましくは±５%、さらにより好ましくは±１%、及び、さらにより好ましくは±０．１%の変動を包含することを意味する。なぜなら、そのような変動は、開示する方法及び組成物を実施するために適切であるからである。
【００４５】
本明細書において使用する通り、ＣＴＦは、表１に示すアミノ酸配列ならびにそれと少なくとも７５%、好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、及び、さらにより好ましくは少なくとも９５%の同一性を有する配列を含む。
【００４６】
【表１】
2014517911.tif 000003
2014517911.tif 000004
2014517911.tif 000005
【００４７】
本明細書において使用する通り、「免疫グロブリンガンマ重鎖」又は「免疫グロブリンガンマ軽鎖」は、表２に示すそれぞれのアミノ酸配列ならびにそれと少なくとも７５%、好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%の同一性、及び、さらにより好ましくは少なくとも９８%又は９９%の同一性を有する配列を含む。
【００４８】
【表２】
2014517911.tif 000006
【００４９】
本明細書において使用する通り、用語「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスならびに抗原結合領域（Ｆａｂ）を含むそれらのフラグメント、免疫グロブリンカッパ軽鎖、又は免疫グロブリンガンマ重鎖（例えば、配列番号４５又は４６を含む免疫グロブリン鎖など）を含む、抗原に向けられた抗体を指す。さらに、用語「免疫グロブリン」は、それが天然又は改変免疫グロブリン（例えばヒト化抗体、キメラ抗体、二官能性抗体、又は相同配列に基づき調製された組換え抗体など）を問わず、アディポネクチン受容体を発現する全ての種からの免疫グロブリンを含む。
【００５０】
本明細書において使用する通り、「付着した」は、化学結合による共有結合的な付着を意味する。Ｉｇ−ＣＴＦの参照において使用される場合、「付着した」は、配列番号１〜４４のアミノ酸配列を含むＣＴＦ及び免疫グロブリンの間の共有結合的な化学結合を指す。
【００５１】
例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの参照において使用される場合、「付着した」は、エステル又はアミドを形成するＣＴＦと、配列番号４５又は４６中の残基との付着を含む。機構に拘束されないが、共有結合的な付着が、活性化した内部チオエステルが、ＣＴＦにおいて、ペプチド配列（配列番号１〜４４）中のシステイン及びグルタミンの間で形成された後、生じると考えられる。この活性化チオエステルは、免疫グロブリンがチオエステルの近くにもたらされる場合、免疫グロブリンとの結合を形成することができる。この提案された付着の機構は、抗原への補体Ｃ３ｂの付着プロセスと同様であると考えられ、それは、以下に示す通り、内部チオエステルを通じて生じる：Sim R. B. and Twose TM, R. C. The covalent-binding reaction of complement component C3 Biochem J 193; 115-27 (1981)；Lutz H. U. and Stammler P. Preferential formation of C3b-IgG Complexes in vitro and in vivo from nascent C3b and naturally occurring anti-band 3 antibodies J Bio Chem 268, 17418-426, 1993；及びSuhn A and Pangburn MK. Covalent Attachment of Human Complement C3 to IgG J Bio Chem 269, 28997-29002, 1994。
【００５２】
介してさらに「付着した」は、機構を介してを意味し、それにより、ＣＴＦは、ペプチドＲ１  ＣＴＦ配列（配列番号４７）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ中のシステイン及びグルタミン酸の間の内部チオエステルとして活性化される。配列番号４７のアミノ酸配列が、ＣＴＦ  ＡｄｉｐｏＲ１配列の多く（例えば配列番号１〜２２中など）において生じる。Ｒ２  ＣＴＦ配列（配列番号４８）において、アミノ酸配列はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕである。配列番号４８のアミノ酸配列が、ＣＴＦ  ＡｄｉｐｏＲ２配列の多く（例えば配列番号２３〜４４中など）において生じる。
【００５３】
さらに「付着した」は、Ｉｇ−ＣＴＦの参照において使用される場合、エステル結合を通じたＣＴＦと免疫グロブリン中（例えば、配列番号４５又は４６中）のチロシンとの付着を含む。
【００５４】
さらに「付着した」は、Ｉｇ−ＣＴＦの参照において使用される場合、エステル結合を通じたＣＴＦと免疫グロブリン中のＣ３ｂ補体結合位置中（例えば、配列番号４５又は４６、例えば配列番号４５の位置１４４など）のチロシンとの付着を含む。
【００５５】
さらに「付着した」は、Ｉｇ−ＣＴＦの参照において使用される場合、エステル結合を通じたＣＴＦと抗原結合領域（Ｆａｂ）中の免疫グロブリン（例えば、配列番号４５又は４６）との付着を含む。
【００５６】
さらに「付着した」は、Ｉｇ−ＣＴＦの参照において使用される場合、エステル結合を通じたＣＴＦと抗原結合領域（Ｆａｂ）中の免疫グロブリン（例えば、配列番号４５又は４６）との付着を含む。
【００５７】
さらに「付着した」は、２つのペプチド又はタンパク質を結合する他の手段を意味しうる。一部の一般に使用される架橋試薬は、以下を含む：ペプチド分子を別のペプチドのＮ末端に連結するグルタルアルデヒド；ペプチドを別のペプチドのＣ末端に付着するカルボジイミド（ＥＤＣ）；遊離アミノ基及びＣｙｓ残基を結合するスクシンイミドエステル（例、ＭＢＳ、ＳＭＣＣ）；Ｔｙｒ残基に連結するベンジジン（ＢＤＢ）；炭水化物基をペプチド及びイソチオシアネート、トリアゾールに付着する過ヨウ素酸、ならびに、他の適した方法が、一般的に、例えば、以下：
L. A. Carpino "1-Hydroxy-7-azabenzotriazole.An efficient peptide coupling additive," J. Am. Chem. Soc. 115 (10): 4397-4398 (1993)；
C. Niemeyer, Bio conjugation Protocols: Strategies and Methods Humana Press, 2004, 344 pp., hard cover；
O'Sullivan, M. J., and Marks, V., Meth. Enzymol., 73, 147-166 (1981).
Harlow, E., and Lane, D., 
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY: 1988) Chapter 9, p.349
に記載されている。
【００５８】
さらに「付着した」は、リンカーアーム、例えば６炭素直鎖など、例えばホモ二官能性リンカーであるＢＳ−３又はヘテロ二官能性リンカーであるＭＳＨなどの手段によるを含む。それらの両方が、ヘキサメチレン、−ＣＨ６−、ペプチドと担体タンパク質の間に７．５オングストロームのスペースを形成する基を含む。それらのリンカーの利点は、７．５オングストロームスペーサーの距離が、任意のスペーサーを有さないグルタルアルデヒドを使用した従来の方法と比較し、共役ペプチドが、担体タンパク質の表面から突き出すことを可能にするということである。ペプチドは、従って、よりアクセス可能であり、抗原性である。ペプチドと担体タンパク質の間の共有結合的な結合は、非常に安定であり、通常の免疫化手順の間での剥離の可能性を低くする。
【００５９】
さらに「付着した」は、配列のＮもしくはＣ末端又は中央にありうる共役部位の手段によるを含む。共役の点は、スルフヒドリル（ＳＨ）基又はアミノ基（ＮＨ２）でありうる。ホモ二官能性リンカーは、両側上のＬｙｓを通じてペプチド及びタンパク質を連結することである。ヘテロ二官能性リンカーは、Ｃｙｓを通じてペプチドを及びＬｙｓ又はＮ末端を通じてタンパク質を連結することである。
【００６０】
他の手段による、さらに「付着した」は、配列番号１〜４４のいずれか１つのＣＴＦと天然ＣＴＦ免疫グロブリンタンパク質と似たＣＴＦ配列番号４５〜４６における残基の間に「コンジュゲート」を産生するカップリング反応、このように、因子（例えばタンパク質内の残基配列の位置など）は、担体が連結されるはずの場所を決定しうる。また、免疫原の組成を考えなければならない。なぜなら、異なる技術は、特定の化学を要求するからである。一般のカップリング方法では、遊離アミノ酸、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を介して、担体を抗原に連結する。
【００６１】
本明細書において使用する通り、「パーセント同一性」は、参照ポリペプチド配列とマッチし、比較ウィンドウにわたり、２つの最適に整列させた配列を比較することにより決定することができるポリペプチド配列の割合を指し、それにおいて、比較ウィンドウ中のポリペプチド配列は、２つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（それは、付加又は欠失を含まない）と比較される通り、付加、欠失（即ち、ギャップ）、誘導体化、及び／又は保存的アミノ酸置換を含むことができる。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定し、マッチする位置の数をもたらし、マッチする位置の数を、比較のウィンドウ中の位置の総数により割り、結果を１００により乗じ、配列同一性のパーセンテージをもたらすことにより算出する。同一性を、当技術分野において公知の種々の配列比較アルゴリズム及びプログラムのいずれかを使用して評価する。そのようなアルゴリズム及びプログラムは、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＦＡＳＴＤＢを含むが、しかし、それらに決して限定されず、それらの全開示が、本明細書において参照により組み入れられる。また、Pearson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448, 1988；Atlschul, et al., J. Mol. Biol., 215: 403410, 1990；Thompson, et al., Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680, 1994；Higgins, et al., Meth. Enzymol., 266: 383402, 1996；Altschul, et al., Nature Genetics, 3: 266-272, 1993；Brutlag, et al., Comp. App. Biosci., 6: 237-44, 1990を参照のこと。
【００６２】
本明細書において使用する通り、「誘導体化」は、技術、例えばユビキチン化、標識、ペグ化（即ち、ポリエチレングリコールを用いた誘導体化）、及び化学的挿入又はアミノ酸（例えばオルニチンなど）の置換（それらは、ヒトタンパク質において通常は生じない）などにより化学的に修飾するプロセスを指す。
【００６３】
本明細書において使用する通り、「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸の、同様の構造を有する及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸との置換（例えばロイシンとイソロイシン又はバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、又はトレオニンとセリンの置換など）を指す。
【００６４】
本明細書において使用する通り、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「鎖」、及び「タンパク質フラグメント」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに自然発生のアミノ酸ポリマー及び非自然発生のアミノ酸ポリマーを含む。
【００６５】
本明細書において使用する通り、「ＣＴＦ免疫グロブリン」又は「Ｉｇ−ＣＴＦ」は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、又は免疫グロブリンフラグメント（例、Ｆａｂ）に付着したＣＴＦペプチドを指す。例えば、ＣＴＦは、免疫グロブリンに、配列番号４５と少なくとも７５%の同一性を伴うガンマ重鎖又は配列番号４６と少なくとも７５%の同一性を伴うカッパ軽鎖上で付着しうる。ＣＴＦは、配列番号１〜４４のいずれか１つと少なくとも７５%の同一性を有する。特定の例において、方法、組成物、及びキットにおいて有用なＣＴＦ及び免疫グロブリンは、本明細書において記載する通りの正確な配列を有さないが、しかし、保存的アミノ酸置換及び／又は誘導体化を伴う変異体形態として存在する。例えば、一部の実施態様において、ＣＴＦは、機能の喪失を有することなく、そのアミノ酸の少なくとも５%、少なくとも１０%、又はさらに少なくとも２５%において置換することができる。したがって、配列番号１から配列番号４６のペプチド中のアミノ酸の少なくとも一部を、他のアミノ酸を用いて置換することができる。特定の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦは以下を指す：配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号５のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号７のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号８のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号９のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１５のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１７のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１８のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２５のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２７のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２８のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号２９のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３５のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３７のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３８のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号３９のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号４０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号４１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号４２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号４３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；配列番号４５又は配列番号４６のアミノ酸配列に共有結合的に付着された配列番号４４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド複合体；又はそれらの任意の組み合わせ。
【００６６】
本発明において有用な免疫グロブリンは、モノクローナルハイブリドーマにより組換え的に産生されうる、又は、それらの自然環境から（例、細胞、動物、又はヒトから）生物学的に単離されうる。例えば、抗体産生細胞を、培養中で継続的に成長させ、ハイブリドーマを形成する細胞と融合させる。単一のハイブリドーマが、１つの抗体だけを産生する。単一のハイブリドーマは分裂し、「クローン」の大集団を産生し、全てが同じ「モノクローナル」抗体を作る。生きたハイブリドーマを、液体窒素中に、無期限に凍結することができる。遊離ＣＴＦとして又はＩｇ−ＣＴＦのＣＴＦ部分としてＣＴＦに優先的に結合する好ましい抗体を提供する。特定の実施態様において、提供するのは、配列番号４９（４６１−４Ｈ１１を作るために使用される抗原）のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド；配列番号５０（４４４−１Ｄ１２を作るために使用される抗原）のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド；配列番号５１（５１５−４Ｄ６を作るために使用される抗原）のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド；又は配列番号５２（５１０−６Ｂ６を作るために使用される抗原）のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに優先的に結合する抗体である。
【００６７】
本明細書において使用する通り、「ＣＴＦ免疫グロブリンの抗原」は、ＣＴＦ免疫グロブリンにより認識される又はそれに結合している分子、物質、タンパク質、又はペプチドとして定義され、ＣＴＦ免疫グロブリンを産生する細胞、動物、及びヒトから生物学的に単離される。さらに、この「ＣＴＦ免疫グロブリンの抗原」は、ＣＴＦ免疫グロブリンを産生する全ての種により作られうるが、細胞上、組織中、又は液体（例えば尿、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、又は間質液など）中に浮遊する抗原でありうる。
【００６８】
「ＣＴＦ」及び「ＣＴＦ免疫グロブリンへの抗原」を生物学的材料から単離してもよく、又は組換え的に、もしくは、好ましくは、ペプチドとして、液相もしくは固相中での合成の合成的な従来方法により、マニュアル技術又は自動化技術を使用して、調製してもよい。適した方法が、一般的に、例えば、以下において記載されている：Atherton, E. and Sheppard, R.C., Solid Phase peptide synthesis: a practical approach.Oxford, England: IRL Press (1989)；Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid phase peptide synthesis, 2nd edition, Rockford: Pierce Chemical Company, 91 (1984)；R. B. Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide," J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154 (1963)；及びL. A. Carpino "1-Hydroxy-7-azabenzotriazole.効率的なペプチドカップリング添加剤、J. Am. Chem. Soc. 115 (10): 4397-4398 (1993)。それは、本明細書において参照により組み入れられる。加えて、ペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を、直接合成の間に変える及び／又は配列を用いた、もしくは他のタンパク質を用いた化学的方法を使用して組み合わせ、変異体ペプチドを産生することができる。
【００６９】
本明細書において使用する通り、「優先的に結合する」は、抗体が標的に結合するが、しかし、また、限定された数の他の分子に結合しうることを意味する。「優先的な結合」は、抗体、又は抗体フラグメントの文脈において使用される場合、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによりコードされるドメインを介した、目的のタンパク質の１つ又は複数のエピトープへの結合を表し、分子の混合集団を含むサンプル中の他の分子への結合を支持することを伴わない。
【００７０】
好ましくは、ペプチドは、従来の固相ペプチド合成方法論により調製される。Ｆｍｏｃ化学に基づく標準的な合成プロトコールを使用してもよい。合成後、粗ペプチドを固体支持体から切断し、側鎖保護基を除去する。粗ペプチドを、例えば、調製用の高速液体クロマトグラフィー（例えばＣ１８逆相ＨＰＬＣなど）により精製することができる。精製ペプチドを、さらに、ＨＰＬＣにより脱塩し、乾燥形態に凍結乾燥することができる。好ましくは、ペプチドを、密封容器中で、窒素下で保存する。
【００７１】
配列番号１〜４６のペプチドの全ての形態（遊離酸、遊離塩基、双性イオン形態、同形の結晶形態、全てのキラル形態、エナンチオマー形態、ラセミ形態、水和物、溶媒和物、塩、及び酸塩水和物を含む）が、本明細書において記載する対象物の範囲内であると熟慮される。遊離酸ならびにナトリウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩が好ましい形態である。
【００７２】
本明細書において記載する対象物に従い、配列番号１〜４６のペプチドは、１つ又は複数の非対称的に置換された炭素原子を含みうるが、光学的に活性な形態又はラセミ形態で単離されうる。このように、構造の全てのキラル形態、ジアステレオマー形態、ラセミ形態、及び全ての幾何異性体形態が、特定の立体化学又は異性体形態が具体的に示されない限り、意図される。そのような光学的に活性な形態をどのように調製及び単離するかは、当技術分野において周知である。例えば、立体異性体の混合物は、標準的な技術（しかし、限定しないが、ラセミ形態の解像、通常の逆相及びキラルクロマトグラフィー、優先的な塩形成、再結晶化などを含む）により、又はキラル出発材料からのキラル合成により、もしくは標的キラル中心の計画的合成により分けてもよい。
【００７３】
容易に理解されるであろう通り、存在する官能基は、合成の経過の間に、保護基を含みうる。保護基は、それ自体が、官能性に選択的に付加する及びそれからから除去することができる化学的な官能基として公知である（例えばヒドロキシル基及びカルボキシル基など）。これらの基は、化学的化合物中に存在し、化合物が曝露される化学反応条件に対して不活性なそのような官能性を与える。種々の保護基のいずれかを、本発明と用いてもよい。好ましい保護基は、ベンジルオキシカルボニル基及びｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基を含む。本発明に従って用いてもよい他の好ましい保護基が、Greene, T.W. and Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis 2d.Ed., Wiley & Sons, 1991に記載されているであろう。
【００７４】
本明細書において使用する通り、「処置する」は、状態の予防的、治癒的、及び緩和的処置を指し、最小限に緩和的効果を要求する。用語「処置する」又は「処置」は、傷害、病理、又は状態の減弱又は寛解における任意の成功又は成功の兆候を指し、任意の客観的又は主観的パラメーター（例えば症状の軽減、緩解、縮小など）を含み、又は、状態を患者により容認できるようにし、変性又は減退の速度を遅くし、変性の最終点をそれほど衰弱させず、被験者の身体的又は精神的な幸福を改善し、又は生存の長さを延長する。処置は、客観的及び主観的パラメーターにより評価されうる；身体検査、神経学的検査、又は精神医学的評価の結果を含む。
【００７５】
用語「サンプル」は、本明細書において使用する通り、被験者から単離された同様の液体、細胞、又は組織（例、外科的に切除された腫瘍組織、生検、穿刺吸引を含む）、ならびに被験者内に存在する液体、細胞、又は組織の回収を指す。一部の実施態様において、サンプルは生物学的液体である。生物学的液体は、典型的には、生理学的温度で液体であり、被験者又は生物学的供給源において存在する、それから取り除いた、それから発現した又は、そうでなければ、抽出した自然発生する液体を含みうる。特定の組織、器官、又は局所領域に由来する特定の生物学的液体及び特定の他の生物学的液体は、被験者又は生物学的供給源においてより全体的又は全身的に位置付けられうる。生物学的液体の例は、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙滴、糞便、喀痰、分泌組織及び器官の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水（例えば非固形腫瘍に関連するものなど）、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の液体、気管支洗浄により回収された液体などを含む。生物学的液体は、また、被験者又は生物学的供給源と接触する液体溶液、例えば、細胞及び器官培養培地（細胞又は器官条件培地を含む）、洗浄液体などを含みうる。用語「サンプル」は、本明細書において使用する通り、被験者から除去される材料又は被験者において存在する材料を包含する。
【００７６】
用語「進行」は、状態の進行の文脈において使用される通り、あまり重度ではない容態からより重度の又は進行した容態への状態の変化を含む。
【００７７】
用語「退行」は、状態の退行の文脈において使用される通り、より重度の容態からあまり重度ではない又は進行した容態への状態の変化を含む。
【００７８】
用語「安定した」は、安定状態の文脈において使用される通り、臨床的に関連する期間にわたり有意に十分に変化しない、又はしていない、進行状態又は退行状態と考えられる疾患状態を記載することが意図される。
【００７９】
本明細書において使用する通り、用語「被験者」及び「患者」は、互換的に使用され、動物（哺乳動物を含む）、好ましくはヒトを指す。
【００８０】
本明細書において使用する通り、「健常な」は、現在、状態又は疾患に苦しんでいない患者を指し、状態に苦しむ素因のある患者を含む。
【００８１】
本明細書において使用する通り、「診断」又は「診断する」は、状態（例えばインスリン抵抗性、異常な細胞成長、又は肝臓疾患など）を伴う患者の同定を指す。「診断」又は「診断する」は、また、処置を必要とする患者の同定を指す。一部の実施態様において、インスリン抵抗性は、耐糖能障害、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、若年性糖尿病、又は妊娠糖尿病と関連する。一部の実施態様において、異常な細胞成長は、癌、例えば、乳癌、転移性癌、膵臓癌、又は肝細胞癌などである。一部の実施態様において、肝臓疾患は、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はアルコール性肝炎である。
【００８２】
本明細書において使用する通り、「糖尿病」は、糖尿病、欠損したインスリン分泌及び／又は作用に起因する慢性の高血糖症を指す。世界保健機関は、糖尿病の３つの主な形態を認識する：Ｉ型、ＩＩ型、３型糖尿病、若年性糖尿病、及び妊娠糖尿病。全ての形態が、高血糖症を防止するために十分なインスリンを産生することができない膵臓のベータ細胞に起因しており、原因が異なる。Ｉ型糖尿病は、通常、膵臓ベータ細胞の自己免疫破壊に起因している。ＩＩ型糖尿病は、標的組織におけるインスリン抵抗性により特徴付けられ、それは、異常に高い量のインスリンについての必要性を作り、糖尿病は、ベータ細胞がこの需要を満たすことができない場合に発生する。妊娠糖尿病は、それがインスリン抵抗性を含む点で、ＩＩ型糖尿病と同様である；妊娠のホルモンは、この状態を発生する遺伝的な素因がある女性においてインスリン抵抗性を起こしうる。妊娠糖尿病は、典型的には、子供の分娩に伴い消散するが、しかし、Ｉ及びＩＩ型糖尿病は慢性的な状態である。全ての型が、インスリンを用いて処置可能である。Ｉ型糖尿病は、それにおいて、インスリンが膵臓により分泌されず、注射又は吸入されたインスリンだけで直接的に処置可能であるが、食事及び他のライフスタイルの調整は管理の一部である。ＩＩ型は、食事処置、錠剤、及び注射ならびに、高頻度に、インスリン補充の組み合わせを用いて管理してもよい。
【００８３】
本明細書において使用する通り、「心臓血管疾患」は、心臓発作及び特定の型の脳卒中を起こしうるアテローム性動脈硬化症（動脈疾患）に関連する疾患を含む、心臓及び血管に影響を与える任意の疾患を指す。
【００８４】
本明細書において使用する通り、「インスリン抵抗性」は、血流からの（例、インスリン感受性組織、例えば筋肉、脂肪、及び肝臓などの中への）グルコースの廃棄の速度により評価される通りの、インビボでのインスリンの生物学的作用における個人における減少を指す。インスリン抵抗性は、糖尿病、心臓血管疾患、異常な脂肪細胞活性、及びメタボリックシンドロームを伴う患者において生じる。特定の実施態様において、「インスリン抵抗性」は、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）のＣＴＦ阻害を指し、細胞間インスリンを上げ、インスリン受容体応答を低下させる（図１）。「インスリン抵抗性」は、また、アルツハイマー病に関連する沈着物に導くアミロイドベータの分解を防止するインスリン分解酵素の阻害を指す。さらなる実施態様において、「インスリン抵抗性」は、ＣＴＦ免疫グロブリンにより標的化されている正常細胞上の抗原による抵抗性を指し、ＩＤＥの阻害剤としてのＣＴＦの利用のための、血漿から細胞中へのＣＴＦ免疫グロブリンの能動輸送に導く（図２）。
【００８５】
本明細書において使用する通り、「異常な細胞成長」は、細胞増殖及び異常な細胞成長により評価される通り、癌又は炎症性疾患を伴う個人における増加した細胞成長を指す。一部の実施態様において、「異常な細胞成長」は、低下したインスリン受容体応答に起因する「インスリン抵抗性」により減少し、「異常な細胞成長」を伴う患者は、ＣＴＦ免疫グロブリンのレベルを有する。他の実施態様について、「異常な細胞成長」が、ＣＴＦがＡＤＡＭ−１７酵素を阻害する場合に生じ、患者における増加したＴＮＦ−アルファ及びＨＥＲ２  ｎｅｕに関連する。他の実施態様について、ＣＴＦ免疫グロブリンは、異常細胞（例えば、成長がインスリン抵抗性により遅くなる前癌性細胞又は老齢細胞及び異常細胞を正常細胞から区別する抗原により標的化される異常細胞など）において細胞成長を阻害するための機構である。
【００８６】
本明細書において使用する通り、「医薬的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は合理的な利益／リスク比と釣り合った他の問題の合併症を伴わず、ヒト及び動物の組織との接触のために適しているそれらの化合物、材料、組成物、及び／又は投与形態を指す。
【００８７】
本明細書において使用する通り、「医薬的に許容可能な塩」は、開示する化合物の誘導体を指し、それにおいて、親化合物は、酸塩又はその塩基塩（酸付加塩及び塩基付加塩を含む）を作ることにより修飾される。医薬的に許容可能な塩の例は、しかし、限定しないが、塩基残基（例えばアミンなど）の鉱酸塩又は有機酸塩；酸性残基（例えばカルボン酸など）のアルカリ塩又は有機塩；などを含む。用語「酸付加塩」は、酸の付加により調製されている親化合物の対応する塩誘導体を指す。
【００８８】
本明細書において使用する通り、「医薬的に許容可能な担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み、医薬的な投与に適合する。医薬的に活性な物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒質又は薬剤が活性化合物と不適合である限りを除き、組成物中でのその使用が熟慮される。補充の活性化合物は、また、組成物中に組み入れることができる。
【００８９】
本明細書において使用する通り、「投与単位」は、処置される特定の患者のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各々の単位が、要求される医薬的担体との関連において、所望の治療的効果を産生するように算出された、活性化合物の所定の量を含みうる。本発明の投与単位形態についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成すべき特定の治療的効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を配合する当技術分野において固有の限度により定められうる。
【００９０】
本明細書において使用する通り、「効果的な量」は、症状又は状態を防止、低下、又は除去するために効果的でありうる、本明細書において記載する通りの活性成分の量を指し、本発明に関して、インスリン抵抗性及び異常な細胞成長を処置することを含む。
【００９１】
一般的に、本発明のＣＴＦフラグメントの効果的な量は、約０．２５mg/kg患者体重〜約２００mg/kg患者体重、好ましくは約２５mg/kg患者体重〜約１７５m/kg患者体重、及び、より好ましくは約３０mg/kg患者体重〜約１５０mg/kg患者体重（ならびにそれらの全ての組み合わせ及び部分組み合わせ）である。
【００９２】
ＣＴＦ免疫グロブリンの有用な組成物、投与形態、及びキットも発見されている。このように、本明細書において提供するのは、Ｉｇ−ＣＴＦの医薬的組成物である。一部の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦは、医薬的に許容可能な塩の形態である。一部の実施態様において、Ｉｇ＿ＣＴＦの医薬的組成物は、Ｉｇ−ＣＴＦ及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む。好ましい実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦの医薬的組成物は、注射可能な、非経口の、注入可能な、又は吸入可能な投与形態である。一部の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦ又はその医薬的組成物及び同を投与するための指示を含むキットを提供する。
【００９３】
本発明の特定の実施態様において、ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を、非経口経路を介して投与する。特定の好ましい実施態様において、ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を、注射を介して投与する。他の好ましい実施態様において、ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を、注入を介して投与する。さらに他の好ましい実施態様において、ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を、吸入を介して投与する。
【００９４】
例えば、インスリン抵抗性、肝臓疾患、又は異常な細胞成長の処置において有用な医薬的キットは、配列番号１〜４６のペプチド又はその医薬的に許容可能な塩のいずれかの効果的な量を、１つ又は複数の滅菌容器中に含み、また、本発明の範囲内である。容器の滅菌は、当業者に周知の従来の滅菌方法論を使用して行ないうる。材料の滅菌容器は、別々の容器、あるいは１つ又は複数のマルチパート容器を、UNIVIAL（商標）ツーパート容器（Abbott Labs, Chicago, Illinoisから利用可能）により例示される通り、望ましい通りに含みうる。そのようなキットは、さらに、望ましい場合、１つ又は複数の種々の従来の医薬的キット成分、例えば、成分を混合するための追加バイアルなどを、当業者に明かな通りに含みうる。投与される成分の量を示す指示（インサートとして又はラベルとしてのいずれか）、投与のためのガイドライン、及び／又は成分を混合するためのガイドラインも、キット中に含まれうる。
【００９５】
「レポーター分子」により、本明細書において使用する通り、その化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを産生する分子を意味する。検出は定性的又は定量的のいずれかでありうる。アッセイのこの型において最も一般に使用されるレポーター分子は、着色ラテックス粒子、金属粒子、酵素、フルオロフォア、又は放射性核種を含む分子（即ち、ラジオアイソトープ）のいずれかである。
【００９６】
本明細書において記載する実施態様は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システム（それらは、もちろん、変動しうる）に限定されない。
【００９７】
Ｉｇ−ＣＴＦの検出及びモニタリング
本発明は、Ｉｇ−ＣＴＦを検出する方法を提供する。一実施態様において、第１種の被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを検出する。Ｉｇ−ＣＴＦを検出するために使用されうる多くの異なるアッセイプラットフォームがある。
【００９８】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイにおいて用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析（ｉｍｍｕｎｏｎｅｐｈｒｏｍｅｔｒｉｃ）、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【００９９】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０１００】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方を、同時に、結合抗体に加える）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０１０１】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０１０２】
Ｉｇ−ＣＴＦは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０１０３】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０１０４】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０１０５】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０１０６】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０１０７】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）は、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０１０８】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０１０９】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０１１０】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０１１１】
一部の実施態様において、二次抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０１１２】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０１１３】
別の実施態様において、第１種、第２種、及び第３種は同じ種ではない。
【０１１４】
一部の実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦのレベルをモニターし、それを検出するだけではないことが望ましい。また、Ｉｇ−ＣＴＦのレベルをモニターする方法を提供する。一実施態様において、第１種の被験者から得られた生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化し、次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と、又はより早期の時間点で被験者から得られる生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量と比較する。別の実施態様において、この比較は、Ｉｇ−ＣＴＦが、経時的に増加、減少、又は安定化しているか否かを示しうる。Ｉｇ−ＣＴＦのレベルをモニターするために使用されうる多くの異なるアッセイプラットフォームがある。
【０１１５】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれ４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０１１６】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０１１７】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０１１８】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０１１９】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法によりモニターすることができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０１２０】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０１２１】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０１２２】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０１２３】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０１２４】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様において、サンプルはヒトから得られる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０１２５】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０１２６】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０１２７】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０１２８】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０１２９】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０１３０】
別の実施態様において、第１種、第２種、及び第３種は同じ種ではない。
【０１３１】
本発明は、また、生物学的サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの存在を検出するためのキットを提供し、受託番号 （ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ  ＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体、受託番号 （ｍＡｂ−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体；及び／又は受託番号 （ｍＡｂ−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する第１の単離抗体、ヒトＩｇに優先的に結合する第２抗体又は抗原結合フラグメント、及び、同のためのパッケージングと一緒での、第１抗体又は抗原結合フラグメント及び第２抗体又は抗原結合フラグメントの使用のための指示を含む。
【０１３２】
好ましい実施態様において、Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇはＩｇＧである。別の好ましい実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０１３３】
本発明の実施態様において、キットは、また、第１抗体又は抗原結合フラグメントを含むための容器を含む。例えば、容器は、１．５mLチューブ、５mLチューブ、１５mLチューブ、２５mLチューブ、又は５０mLチューブでありうる。これらのチューブは、材料（例えばポリカーボネート、プラスチック（ｐｌａｔｉｃｓ）、又はガラスなど）から作ることができる。本発明の別の実施態様において、キットは、また、使用されない場合、第２抗体又は抗原結合フラグメントを含むための容器を含む。例えば、容器は、１．５mLチューブ、５mLチューブ、１５mLチューブ、２５mLチューブ、又は５０mLチューブでありうる。これらのチューブは、材料（例えばポリカーボネート、プラスチック、又はガラスなど）から作ることができる。
【０１３４】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０１３５】
インスリン抵抗性の診断、処置、及びモニタリングにおけるＩｇ−ＣＴＦの使用
提供する本発明の実施態様は、被験者においてインスリン抵抗性を診断するための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。最後に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較し、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、インスリン抵抗性と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定する。
【０１３６】
例として、インスリン抵抗性は、耐糖能障害、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、若年性糖尿病、妊娠糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と関連しうる。
【０１３７】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０１３８】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０１３９】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０１４０】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０１４１】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０１４２】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポネクチンレセプター１（アディポレセプター１；「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポネクチンレセプター２（アディポレセプター２；「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０１４３】
本明細書に記載する方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０１４４】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０１４５】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０１４６】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０１４７】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０１４８】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０１４９】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０１５０】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０１５１】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０１５２】
提供する本発明の別の実施態様は、被験者においてインスリン抵抗性を処置するための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。最後に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較し、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、インスリン抵抗性と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定する、及び、被験者に、インスリン抵抗性のための処置を施す、又は処方すること。
【０１５３】
例として、インスリン抵抗性は、耐糖能障害、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、若年性糖尿病、妊娠糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と関連しうる。
【０１５４】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０１５５】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０１５６】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０１５７】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０１５８】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０１５９】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０１６０】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０１６１】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０１６２】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０１６３】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０１６４】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０１６５】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０１６６】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０１６７】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０１６８】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０１６９】
インスリン抵抗性のための処置の例は、インスリンの必要性を低下させること、インスリン又は補充インスリンの作用への細胞の感受性を増加させることを含む。インスリンについての必要性を低下させることは、例えば、食事における変化を通じて生じうる。インスリンの作用への細胞の感受性を増加させることは、例えば、医薬（例えばグルコファージ、ピオグリタゾン、及びロシグリタゾンなど）を取ることにより生じうる。補充インスリンは、例えば、インスリンを被験者中に導入することにより生じうる。
【０１７０】
提供する本発明の別の実施態様は、被験者においてインスリン抵抗性をモニターするための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの分量を、次に、公知の標準又はより早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較する。次に、被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、インスリン抵抗性の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定することができる。
【０１７１】
例として、インスリン抵抗性は、耐糖能障害、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、若年性糖尿病、妊娠糖尿病、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と関連しうる。
【０１７２】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０１７３】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０１７４】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０１７５】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０１７６】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０１７７】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０１７８】
本明細書に記載する方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０１７９】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０１８０】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０１８１】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０１８２】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０１８３】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０１８４】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０１８５】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は125Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０１８６】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０１８７】
本発明の別の実施態様において、公知の標準は、正常なインスリン感受性を有するとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、公知の標準は、インスリン抵抗性として同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、公知の標準は、糖尿病として同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、工程に記載する生物学的サンプルが、インスリン抵抗性又は糖尿病のための処置に続いて、前記被験者から得られる、あるいは、より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプルが、インスリン抵抗性又は糖尿病のための処置に続いて、被験者から得られる。
【０１８８】
癌の診断、処置、及びモニタリングにおけるＩｇ−ＣＴＦの使用
本明細書において提供する別の実施態様は、被験者において癌を診断するための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。最後に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較し、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定する。
【０１８９】
例として、癌は、乳癌、転移性癌、肝細胞癌、又は膵臓癌でありうる。
【０１９０】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０１９１】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０１９２】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０１９３】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０１９４】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０１９５】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０１９６】
本明細書に記載する方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０１９７】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０１９８】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０１９９】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０２００】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０２０１】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０２０２】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０２０３】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０２０４】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０２０５】
提供する本発明の別の実施態様は、被験者において癌を処置するための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。最後に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較し、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定し、及び、被験者に、癌のための処置を施す、又は処方すること。
【０２０６】
例として、癌は、乳癌、転移性癌、肝細胞癌、又は膵臓癌でありうる。
【０２０７】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０２０８】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０２０９】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０２１０】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０２１１】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０２１２】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０２１３】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０２１４】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０２１５】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０２１６】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０２１７】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０２１８】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０２１９】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０２２０】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０２２１】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０２２２】
癌処置の例は、外科手術、ホルモン治療、放射線、化学療法、免疫療法、標的治療、及びそれらの組み合わせを含む。ホルモン治療薬物の例は、アロマターゼ阻害剤ならびに黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体及び阻害剤を含む。放射線処置の例は、原体陽子ビーム放射線治療、定位放射線手術、定位放射線治療、術中放射線治療、化学修飾剤、及び放射線増感剤の関連技術を含む。化学療法薬物の例は、アミノプテリン、シスプラチン、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ならびに、その他の単独及び組み合わせを含む。癌処置の例は、また、生物学的応答修飾因子（ＢＲＭ）治療、生物学的治療、生物療法、及び免疫療法を含む。ＢＲＭの例は、インターフェロン、インターロイキン、ならびに他のサイトカイン及び抗体（例えばリツキシマブ及びトラスツズマブなど）及びさらに癌ワクチン（例えばSipuleucel-Tなど）を含む。癌治療の他の例は、成長シグナル阻害剤（例えばトラスツズマブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、セツキシマブ（ｃｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、ダサチニブ、及びニロチニブなど）などの標的治療を含む。標的治療の別の型は、血管新生阻害剤（例えば、周囲の血管構造及び血液供給の増加から癌を阻害するベバシズマブなど）を含む。標的治療の最終的な型は、直接的な癌細胞死を誘導することができるアポトーシス誘導薬物を含む。
【０２２３】
提供する本発明の別の実施態様は、被験者において癌をモニターするための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの分量を、次に、公知の標準又はより早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較する。次に、被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、癌の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定することができる。
【０２２４】
例として、癌は、乳癌、転移性癌、肝細胞癌、又は膵臓癌でありうる。
【０２２５】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０２２６】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０２２７】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０２２８】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０２２９】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０２３０】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０２３１】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０２３２】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０２３３】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０２３４】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０２３５】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０２３６】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０２３７】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０２３８】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０２３９】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０２４０】
本発明の別の実施態様において、公知の標準は、癌がないとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、公知の標準は、癌を有するとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、工程ａに記載する生物学的サンプルが、癌のための処置に続いて、被験者から得られる、あるいは、より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプルが、癌のための処置に続いて、被験者から得られる。
【０２４１】
肝臓疾患の診断、処置、及びモニタリングにおけるＩｇ−ＣＴＦの使用
提供する本発明の実施態様は、被験者において肝臓疾患を診断するための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。最後に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較し、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、肝臓疾患と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定する。
【０２４２】
肝臓疾患の例は、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はアルコール性肝炎を含む。
【０２４３】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０２４４】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０２４５】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０２４６】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０２４７】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０２４８】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０２４９】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０２５０】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０２５１】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０２５２】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０２５３】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０２５４】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０２５５】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０２５６】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０２５７】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０２５８】
提供する本発明の別の実施態様は、被験者において肝臓疾患を処置するための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。最後に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量を、公知の標準と比較し、サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの量が、癌と関連するＩｇ−ＣＴＦのレベル内に入るか否かを決定し、及び、被験者に、肝臓疾患のための処置を施す、又は処方すること。
【０２５９】
肝臓疾患の例は、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、又はアルコール性肝炎を含む。
【０２６０】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０２６１】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０２６２】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０２６３】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０２６４】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０２６５】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０２６６】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０２６７】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０２６８】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０２６９】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０２７０】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０２７１】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０２７２】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０２７３】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、化学発光標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０２７４】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０２７５】
肝臓疾患の処置の例は、医薬、外来処置、外科手術、及び肝臓移植を含む。
【０２７６】
提供する本発明の別の実施態様は、被験者において肝臓疾患をモニターするための方法である。一実施態様において、被験者に由来する生物学的サンプルを、第１種のＩｇ−ＣＴＦ又はその第１抗体の抗原結合フラグメントに優先的に結合する第２種の第１抗体に曝露させ、これによって混合物を形成する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。この混合物を、次に、第１種のＩｇに優先的に結合する第３種の第２抗体又は抗原結合フラグメントに曝露する。この工程後、任意の洗浄工程を実施することができる。次に、サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦを定量化する。サンプル中のＩｇ−ＣＴＦの分量を、次に、公知の標準又はより早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプル中に存在するＩｇ−ＣＴＦの量のいずれかと比較する。次に、被験者のＩｇ−ＣＴＦのレベルが、肝臓疾患の進行、退行、又は安定化を示しているか否かを決定することができる。
【０２７７】
特定の実施態様において、発現のレベル（少なくとも１つの可溶性Ｉｇ−ＣＴＦの存在又は非存在を含む）を、イムノアッセイによりアッセイする。当業者は、その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」が、テストサンプルを、標的について特異的な１つ又は複数の免疫相互作用分子と、それに結合し、前記結合を検出するために十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートすることを含むことを知っている。本明細書において使用する通り、用語「標的」は、プローブが結合するようにデザインされた分析物を指す。例えば、本明細書において、寄託された抗体の特異的なＣＴＦ標的を提供する：配列番号４９、ＨＶＬＶＶＡＡＡＦＶＨＦＣＹＳ、配列番号５０、ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＳＬＬ、配列番号５１、ＧＧＣＴＤＤＴＬＬ、及び配列番号５２、ＧＧＣＳＥＥＤＡＬ。特定の好ましい実施態様において、免疫相互作用分子は抗体である。例えば、これらの配列は、寄託された抗体により認識される：それぞれクローン４６１−４Ｈ１１、クローン４４４−１Ｄ１２、クローン５１５−４Ｄ６５、及びクローン５１０−６Ｂ６。抗体をテストサンプルとインキュベートするための条件は、アッセイに用いられるフォーマット、用いられる検出方法、ならびにアッセイにおいて使用される抗体分子の型及び性質に依存し、変動する。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのいずれか１つ、例えば、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁、免疫比濁分析、磁気免疫粒子分離、イムノクロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散ベースのオクタロニー、ロケットゲル免疫電気泳動、又はインサイチュイムノアッセイを、本目的に容易に適応することができることを認識するであろう。
【０２７８】
イムノアッセイは、テストサンプル中のアディポネクチン受容体の少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦの定量化において、特に、少なくとも１つのＩｇ−ＣＴＦのレベルが、非罹患個体において検出可能な正常レベルと比較し、変わっているか否かを決定するために有用である。結果として、そのようなイムノアッセイは、患者が疾患又は疾患への素因を有しうるか否かを決定する際に特に有用である。イムノアッセイは、他の使用、例えば、疾患進行のモニタリング又は治療的介入への応答のモニタリングにおける使用なども有しうる。本明細書において記載する本発明は、それらの性能のために前記イムノアッセイを要求する、免疫相互作用分子及び診断アッセイの全てのそのような使用にまで及ぶ。
【０２７９】
例としてだけ、特定の実施態様において、フラグメントに対して産生された抗体を固体基質上に固定化し、第１複合体を形成し、患者からの生物学的テストサンプルを結合分子と接触させる。インキュベーションの適した期間後、抗体−二次複合体の形成を可能にするために十分な期間にわたり、検出可能なシグナルを産生することが可能な受容体分子を用いて標識した第２抗体を、次に、加え、インキュベートし、三次複合体の形成のための十分な時間を可能にする。任意の未反応材料を洗い流し、三次複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、目に見えるシグナルの簡単な観察により定性的でありうる、又は、公知の量のハプテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量化されうる。このアッセイのバリエーションは、同時アッセイ（それにおいて、サンプル及び標識抗体の両方が、同時に、結合抗体に加えられる）又はリバースアッセイ（それにおいて、標識抗体及びテストされるサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、次に、同時に、結合抗体に加える）を含む。これらの技術は当業者に周知であり、バリエーションの可能性は容易に明らかであろう。
【０２８０】
Ｉｇ−ＣＴＦを検出する他の例は、定量的ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、タンパク質バイオチップ、マススペクトロメトリー及び他を含む。
【０２８１】
ＣＴＦ免疫グロブリンは、任意の適した方法により検出することができる。用いることができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリー及びアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡法、及び無線周波数方法（例、多極共鳴スペクトロスコピー）を含む。光学的方法は、例えば、比色アッセイ、電子インピーダンススペクトロスコピー、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、蛍光の検出、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率（例、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー方法、格子結合器導波管方法又はインターフェロメトリー）を含む。
【０２８２】
Ｉｇ−ＣＴＦ自体は、免疫グロブリンに共有結合的に付着されたアディポレセプターのＣ末端フラグメントを含むことができる。用語「アディポレセプター」は、アディポレセプター１（「ＡｄｉｐｏＲ１」）及びアディポレセプター２（「ＡｄｉｐｏＲ２」）を含む。ＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の例は、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を含む。ＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の例は、配列番号２３〜４４のアミノ酸配列を含む。本発明の方法において、Ｉｇ−ＣＴＦの１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を検出することができる。例えば、Ｉｇ−ＣＴＦの任意の１つ又は組み合わせ（それにおいて、ＣＴＦは、配列番号１〜配列番号４４のアミノ酸配列により表されるフラグメントの１つである）を検出することができる。
【０２８３】
本発明の方法において、生物学的サンプルは、多数の供給源から来うる。例えば、生物学的サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に関連しない細胞、組織、外科的に切除された腫瘍組織、生検、細針吸引サンプル、脳脊髄液、白血球、間質液、又は組織学的調製物に由来しうる。入手及び取り扱いのそれらの簡単さのため、血液及び血漿は、生物学的サンプルの特に有用な供給源でありうる。
【０２８４】
一部の場合において、保存剤は、冷蔵又は冷凍しながら、保存のために生物学的サンプルを安定化させるのに役立ちうる。適した保存剤の例は、フッ化物、ヘパリン、又はＥＤＴＡを含む。
【０２８５】
他の実施態様において、組織は、肝臓、膵臓、リンパ節、脂肪、筋肉、又は脳である。これらの組織においてＩｇ−ＣＴＦを検出するための方法の例は、免疫組織化学（組織染色）である。
【０２８６】
生物学的サンプルは、任意の哺乳動物に由来しうる。好ましい実施態様は、哺乳動物がヒトである場合でありうる。しかし、他の哺乳動物（動物園、研究、及び飼育動物（ペット）、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、又はブタなどを含む）も、生物学的サンプルの潜在的な供給源でありうる。
【０２８７】
本発明の他の実施態様において、抗体が提供され、それらは、方法のための第１抗体として使用できうる。例えば、受託番号 （クローン４４４−１Ｄ１２）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＩｇ−ＣＴＦに優先的に結合する単離抗体、受託番号 （クローン−５１０−６Ｂ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体；又は受託番号 （クローン−５１５−４Ｄ６）を有し、ＡＴＣＣに寄託された細胞株により産生されたＣＴＦに優先的に結合する単離抗体。これらの抗体を調製するために使用される抗原及び方法論を、実施例１２において完全に説明する。
【０２８８】
一部の場合において、第１抗体又は抗原結合フラグメントは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスク、プレート、もしくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを行うために適した任意の他の表面の形態でありうる。結合プロセスは、当技術分野において周知であり、一般的に、分子を不溶性担体に共有結合させる又は物理的に吸着させる架橋からなる。一実施態様において、固体支持体はＥＩＡ／ＲＩＡプレートである。
【０２８９】
Ｉｇ−ＣＴＦにおいて、Ｉｇは、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥでありうる。Ｉｇ−ＣＴＦにおけるＩｇの好ましい例は、ＩｇＧである。免疫グロブリンは、いくつかのサブユニットから作られる。例えば、ＩｇＧは、ガンマ（γ）重鎖、及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＡは、アルファ（α）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＭは、ミュー（μ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＤは、デルタ（δ）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。ＩｇＥは、エプシロン（ε）重鎖及びカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖で作られる。Ｉｇ−ＣＴＦのＩｇは、また、免疫グロブリンのアイソタイプの１つのサブユニットでありうる。例えば、Ｉｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡのカッパ軽鎖でありうる。又は、Ｉｇは、ＩｇＧのガンマ重鎖でありうる。あるいは、Ｉｇは、抗原結合領域（Ｆａｂ）でありうる。
【０２９０】
一部の実施態様において、第２抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。検出可能な標識の例は、放射性標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、電気化学発光（ＥＣＬ）標識、又は酵素を含む。放射性標識は１２５Ｉを含み、それは、抗体に付着することができる（Harlow and Lane, supra, 1988）。有用な蛍光標識は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ランタニド金属、Hoechst 33258、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。フルオレセイン又はローダミン標識α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、又はＹＫＬ−４０特異的結合薬剤（例えば抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、もしくは抗ＹＫＬ−４０抗体、又はフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体など）が、本発明において有用でありうる。有用な蛍光抗体は、商業的に、例えば、Tago Immunologicals（Burlingame, Calif）から得ることができる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく、抗体に化学的に共役することができる。特定の波長の光を用いた照射により活性化される場合、蛍光色素で標識された抗体は、光エネルギーを吸着し、分子中に興奮状態を誘導し、光顕微鏡を用いて視覚的に検出可能な特徴的な色での光の放出が続く。酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、又はウレアーゼなどを、本発明の方法における使用のために、例えば、抗アディポネクチンレセプターＣ末端フラグメントに又は二次抗体に連結することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と使用することができ、それは、４５０nmで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性産物をもたらす。
【０２９１】
他の実施態様において、遊離ＣＴＦは、アッセイのデザインのため、検出されない。
【０２９２】
本発明の別の実施態様において、公知の標準は、正常として同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、公知の標準は、肝臓疾患を有するとして同定されている被験者のＩｇ−ＣＴＦレベルでありうる。本発明の別の実施態様において、工程ａに記載する生物学的サンプルが、肝臓疾患のための処置に続いて、被験者から得られる、あるいは、より早期の時間点で被験者から得られた生物学的サンプルが、肝臓疾患のための処置に続いて、被験者から得られる。
【０２９３】
本発明は、さらに、以下の実施例において定義され、それにおいて、全ての部分及びパーセンテージが、特に明記しない限り、重量による。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しており、例示だけにより与えられることを理解すべきである。上の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を、その精神及び範囲から逸脱することを伴わず、確認することができ、本発明の種々の変化及び改変を作り、それを、種々の使用及び条件に適応することができる。
【０２９４】
実施例
実施例１  血液、組織、及び細胞中でのＣＴＦ免疫グロブリンの検出
ウエスタンブロット分析を、ヒト血漿、膵臓、脂肪、肝臓、及び筋肉組織、ならびに筋細胞及び上皮細胞の培養ホモジネートで、以下の方法及びそれらのバリエーションに従って実行した。
【０２９５】
タンパク質濃度約２０μg/mlを伴うサンプル及びホモジネートを、水中で５分間にわたり、ＳＤＳを伴う緩衝液中で煮沸し、氷上で冷却し、タンパク質を変性させた。サンプルを、次に、遠心し、沈殿を除去し、サンプルを、５%ベータ−メルカプトエタノールを伴うBiorad Laemmli緩衝液と１：１で煮沸し、ジスルフィド結合を破壊した。処理したサンプルを、１２%又は１０%のReady Gel（Biorad）上に添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、Ｔｒｉｓ、グリシン、ＳＤＳ緩衝液（Biorad）中で、１１０Ｖ（Biorad PROTEAN Tetra Cel）で、１〜１．５時間にわたり、ブロモフェノールブルーがゲルの底に達するまで、泳動した。ゲルプレートを解体し、トランスファー緩衝液中に浸した。ゲルを、０．２μmニトロセルロースペーパーに、３０Ｖで、４℃チェンバー中で一晩トランスファーした。
【０２９６】
タンパク質のトランスファー後、ニトロセルロースを、ＴＴＢＳ緩衝液（２０mM  Ｔｒｉｓ、５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．１%  Tween-20）を用いてリンス及び洗浄した。膜を、次に、ＴＴＢＳ中の５%  ＢＳＡを用いて、室温で、穏やかな撹拌を伴い、ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、次に、除去し、膜を、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼに共役した抗体を用いてインキュベートした。ＡｄｉｐｏＲ１  ＣＴＦについて、アルカリホスファターゼに共役したｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２を使用した（２．５mg/mlを１：１０００に希釈、Siemens Healthcare Diagnostics）。抗体コンジュゲートを伴う膜を、室温で３時間にわたり又は４℃で一晩、穏やかな撹拌を伴いインキュベートした。抗体を、次に、捨て、ゲルを、ＴＴＢＳを用いて、各々５分間にわたり３回洗浄した。膜を、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼを用いてインキュベートし、色を発生させ、記録した。一部の場合において、膜を、所望の時間（３秒から１０分）でのＸ線フィルム（Fisher）への曝露により撮像し、次に、Kodak GBX現像剤／固定剤を使用して現像した。
【０２９７】
ＣＴＦへのモノクローナル抗体を用いてヒト血漿で得られたウエスタンブロットの結果を、図３に示す。結果は、ＣＴＦ  Ｒ１及びＲ２への全てのモノクローナル抗体について典型的である。図３ａは、３人の非糖尿病（Ｎ）患者、３人のインスリン抵抗性（ＩＲ）患者、及び３人の糖尿病（Ｄ）患者の血漿についての結果を示す。全てが、ＣＴＦが１６０kDaの免疫グロブリン、５５kDaの免疫グロブリン重鎖、及び２６kDaの免疫グロブリン軽鎖ならびのそれらのフラグメント中に存在した。サンプルは、メルカプトエタノールを用いて処理し、メルカプトエタノールはジスルフィド連結を破壊するため、従って、ＣＴＦは、ジスルフィド連結により、免疫グロブリンに付着されていない。図３ｂは、アルカリ条件（２５０mM  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ１１．５、及び３７℃、２時間にわたる）を用いた処理後での同じ患者サンプルを示す。処置は、ヒト免疫グロブリンへのＣＴＦ連結を破壊し、ＣＴＦが検出された。図３ｃにおいて、アルカリ処理されたサンプルについてのゲルを、抗ヒトＩｇＧ−ＡＬＰを用いて測定し、結果は、ヒト免疫グロブリンが、依然として、ＣＴＦの放出後に存在していることを実証した。これらのアルカリ条件、及びＣ３ｂ及び免疫グロブリン鎖の間のエステル結合を破壊することが示されている他のものが、また、免疫グロブリンからＣＴＦを解放した（Lutz H. U. and Stammler P. Preferential formation of C3b-IgG Complexes in vitro and in vivo from nascent C3b and naturally occurring anti-band 3 antibodies J Bio Chem 268, 17418-426, 1993）。
【０２９８】
正常ラット、糖尿病ラット、及びＡｄｉｐｏＲ１  ＣＴＦ２５（配列番号１１）を用いて処置された糖尿病ラットの肝臓、膵臓、筋肉、及び腸間膜組織で得られたウエスタンブロットの結果を、表３中に示す。結果は、ＣＴＦ  ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２への全てのモノクローナル抗体及びテストされた処置について典型的である。組織の全てが、ＣＴＦ免疫グロブリンの存在を示す。肝臓サンプルは、２６kDaの免疫グロブリン軽鎖ならびに１００及び１６０kDaの一部の完全ＩｇＧ及びフラグメント（しかし、５０kDaの免疫グロブリン重鎖ではない）を示した。膵臓サンプルは、重鎖及び一部の軽鎖（しかし、完全ＩｇＧではない）を示した。筋肉及び脂肪サンプルは、重鎖及び一部の軽鎖（しかし、完全ＩｇＧではない）を示した。ＣＴＦを用いた処置は、バンドを増加させなかった。なぜなら、遊離ＣＴＦは、共有結合的な結合を形成するためのペプチドの活性化を伴わず、免疫グロブリンに付着しないからである。ＣＴＦを伴う免疫グロブリン鎖の量における差が、個々のラットの間及び正常ラット及び糖尿病ラットの間で観察された。全ての組織がＩＤＥ及びＴＡＣＥを含んだ。
【０２９９】
【表３】
2014517911.tif 000007
【０３００】
さらに、標的器官試験を実施した。２群のウサギ（抗ポリクローナルＣＴＦ産生者及び非産生者）を、クライオスライススライドのために、肝臓、筋肉、脂肪、脳、及び膵臓について収集した。組織を、遊離ＣＴＦ（ｍＡｂ  ４６１−４Ｈ１１）、ＣＴＦ−ＩｇＧ（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）、腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ  ａｋａ  ＡＤＡＭ−１７）、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、及びＩｇＧについて染色した。結合を、Ｆｃ受容体遮断ペプチドを用いて、及び、走査顕微鏡を用いた蛍光標識抗体を使用して行った。結果は、肝臓が、ＣＴＦ吸収についての主な標的器官であることを示した。罹患肝臓、脳、及び膵臓は、増加した吸収を示す。肝臓、脳、及び膵臓は、ＩＤＥが存在する場所である（ＣＴＦはＩＤＥに作用する）。筋肉及び一部の褐色脂肪は、ＣＴＦを放出するためにＴＡＣＥを有した。ＣＴＦへの免疫応答は、脳、膵臓、及び肝臓中へのＣＴＦ−ＩｇＧの吸収を大きく増加させる。結果を表４に示す。脳及び膵臓は、時折、特に、病変又は白血球浸潤（ＷＢＣ）を示す内皮及び間質部分の周りの一部の組織部分の内部でのＣＴＦについて弱く陽性であった。筋肉は、インタクトな受容体のため、細胞の外膜上でだけ陽性であった。白色脂肪はＣＴＦを示さなかったが、しかし、褐色脂肪中に増大した一部の微量ＣＴＦがあった。
【０３０１】
【表４】
2014517911.tif 000008
【０３０２】
ＣＴＦへの抗体は、脳、膵臓、及び肝臓中へのＣＴＦ−ＩｇＧ及びＣＴＦの大きく増加した吸収を例示した。これは、抗ＣＴＦ抗体を伴うウサギにおいてであった。ウサギは、ＢＳＡ及びＬＢＨに付着したＡｄｉｐｏＲ１ＣＴＦ  ３３ｍｅｒ（配列番号１）を用いて接種していた。結果を表５中及び図４中に示す。
【０３０３】
【表５】
2014517911.tif 000009
【０３０４】
さらに、標的器官試験を実施した。３群のラットを屠殺し、クライオスライススライドのために、肝臓、筋肉、脂肪、脳、リンパ節、及び膵臓について収集した。これらの３群は、糖尿病を伴わないラットを表す（早期糖尿病及び後期糖尿病中への２〜４週間）。全てが、糖尿病状態について、経口耐糖能テスト（ＯＧＴＴ）及びｈｂＡ１ｃテストにより特徴付けられた。組織を、遊離ＣＴＦ（ｍＡｂ  ４６１−４ｈ１１）、ＩｇＧ−ＣＴＦ（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）、ＴＡＣＥ、ＩＤＥ、及びＩｇＧについて染色した。結合を、Ｆｃ受容体遮断ペプチドの存在において、及び、走査顕微鏡を用いた蛍光標識抗体を使用して行った。結果は、リンパ節がＣＴＦ吸収のための別の主な標的であることを示した。糖尿病は進行するにつれて、肝臓及びリンパ節において観察されるＣＴＦの量は増加した。脳及び膵臓が、また、増加した吸収を示した。これらの結果を表６にまとめる。
【０３０５】
【表６】
2014517911.tif 000010
【０３０６】
細胞培養マウス筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）及びミドリザル上皮細胞（ＶＥＲＯ）（American Type Cell Culture, ATCC, Manassa VA）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用した培養中で維持し、正常細胞を、改変イーグル培地（ＭＥＭ）を用いて維持した。両方の培地が、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（５０単位/ml）、ストレプトマイシン（５０μg/ml）、及び１０%ウシ胎児血清を含んだ。培地はサイトカインを含まなかった。細胞を、３７℃で、９５%空気及び５%ＣＯ２の雰囲気中で成長させ、細胞成長のコンフルエンスでＰＢＳ／ＥＤＴＡを使用した１〜４希釈物を用いて分割することにより増殖させた。細胞株を同期化し、Ｒ１  ＣＴＦ２５配列番号１１又は球状アディポネクチンを用いて誘導した。結果を表７に示す。
【０３０７】
【表７】
2014517911.tif 000011
【０３０８】
両方の細胞株が、アディポネクチン受容体１を発現した。両方の細胞株からのライセートが、ＣＴＦ免疫グロブリンを含み、変性ウエスタンブロット上で、重鎖及び完全ＩｇＧを含んだが、しかし、軽鎖形態を伴わなかった。これらは、ウシＩｇＧを含むウシ胎児血清中で成長させた細胞培養物であるため、細胞は、ＣＴＦをＩｇＧに付着する。従って、アディポネクチン受容体を発現する任意の細胞は、抗原提示細胞として機能し、免疫グロブリンへの付着のために、ＣＴＦの活性化を起こす（図２）。アディポネクチン受容体１及び２を発現する細胞及び組織の一覧については、Golzを参照のこと。
【０３０９】
ＣＴＦ  Ｒ１  ＣＴＦ２５配列番号１１を用いた細胞培養物の処理は、ＣＴＦ免疫グロブリンを増加させなかった。なぜなら、このＣＴＦは、活性化を伴わず、免疫グロブリンにしないからである。加えて、アディポネクチン処理は、ＣＴＦ免疫グロブリンのバンドを増加させなかった。恐らくは、血清が、既に、受容体に結合するためのアディポネクチンを含んでいたからである。
【０３１０】
血液分画も試験し、ＣＴＦ−ＩｇＧが血液中にあるか否か及び免疫細胞がＣＴＦを運ぶか否かを見た。細胞を、ろ過により単離し、遊離ＣＴＦ−ＩｇＧ（ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２）及び蛍光標識を伴うＩｇＧについての抗体を用いて染色した。細胞を、次に、ＤＡＰＩ及び二次蛍光標識を伴う抗白血球抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＣＤ１９）を用いて対比染色した。結合は、Ｆｃ受容体遮断ペプチドの存在において行った。結果は、走査型顕微鏡で決定した。結果は、ＩｇＧ  ＣＴＦが、白血球（多形核Ｂ及びＴ細胞）上で運ばれることを示した。これらの多形核Ｂ及びＴ細胞は、好中球及び好塩基球であるように見える。赤血球はＣＴＦを運ばない。ＣＴＦ及びＣＴＦ  ＩｇＧを、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、別々に、完全な受容体から検出する。これらの結果を表８に示す。
【０３１１】
【表８】
2014517911.tif 000012
【０３１２】
受容体発現が検出されていないことが確認された（ＩｇＧ−ＣＴＦ及びＣＴＦだけ）。  
【０３１３】
実施例２  アルカリ条件は、ＩｇからＣＴＦを解放する；インスリン抵抗性への相関
血漿サンプルを、アルカリを用いて処理し、免疫グロブリンからＣＴＦを遊離させ、全血漿中ＣＴＦを測定することを可能にした。血漿サンプルを、耐糖能テスト及び糖尿病の診断を伴う患者から回収した（表９を参照のこと）。サンプルを、ＣＴＦについての２つの抗体に基づくイムノアッセイによりアッセイし、解放されたＣＴＦとインスリン抵抗性との相関を決定した。
【０３１４】
【表９】
2014517911.tif 000013
【０３１５】
典型的なサンプルＥＬＩＳＡプレートを、プレートを、最初に、抗ＣＴＦ抗体（例えばＭａｂ  ４４４−１Ｄ１２など）を用いて、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の濃度１２μg/mlでコーティングすることにより調製した。プレートを、次に、ＴＢＳを用いて、自動プレートウォッシャーを使用して洗浄した（３００μLで５回）。プレートを、次に、ＴＢＳ中の１%ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングした。プレートを、再び、ＴＢＳを用いて洗浄した。ＣＴＦキャリブレーターを、ｐＨ６．５のＴＢＳ中で、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２、及び０ng/mlで、ＣＴＦＲ１２５、アミノ酸配列（配列番号１１）  ＨＦＹＧＶＳＮＬＱＥＦＲＹＧＬＥＧＧＣＴＤＤＴＬＬを使用して調製した。処理された患者サンプルを、５０μLのサンプルを、４０μLのＴｒｉｓ  ５０mM（ｐＨ１０．５）と、１時間にわたり、３７℃で混合することにより調製し、１２０μLのＴｒｉｓ  ０．５M（ｐＨ５．２）を用いたｐＨ中和が続いた。キャリブレーター及びサンプルを１００μLで添加した。プレートを密封し、シェーカースピード１０００rpmで、３５℃で６０分間にわたりインキュベートした（プレート当たり）。
【０３１６】
典型的なアッセイＥＬＩＳＡプレートを、再びＴＴＢＳを用いて洗浄後に測定し、非結合ＣＴＦを除去した。ＴＴＢＳ中の濃度４．０μg/mlでのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に共役した二次抗ＣＴＦ抗体、例えばｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２（Siemens Healthcare Diagnostic）などを、１００μLで、各々のウェルに適用した。プレートを密封し、シェーカー中で、スピード１０００rpmで、３５℃で６０分間にわたりインキュベートし、再び、ＴＴＢＳを用いた洗浄が続いた。各々のウェル中のＡＬＰの量を、1-Step（商標）PNPP基質（Fisher Thermo Scientific）を使用し、プレートリーダーにおいて測定し、３７℃までインキュベートし、プレートを、正時に、４０５nmでの吸光度を使用し、１２時間にわたり読んだ。
【０３１７】
【表１０】
2014517911.tif 000014
【０３１８】
得られた相関の結果を表１０に示す。全ての患者が、低いバックグラウンドを伴い、ならびにプレート範囲＜１０%ＣＶ及びアッセイ範囲１００〜１０，０００pg/mL内で測定可能であった。全結合値が、インスリン抵抗性を伴う患者において１．８倍に増加した。
【０３１９】
ｐＨ７．０以上での遊離ＣＴＦ（配列番号１〜４４）の不安定性を確認した。結果として、ｐＨ処理を慎重に制御し、遊離ＣＴＦの再現可能な測定値を得なければならなかった。そのようなコントロールを用いてでさえ、プレート間の値の変動は、しばしば、臨床適用について望ましいよりも〜２０%及びそれより高かった。遊離ＣＴＦは、ｐＨ７、好ましくはｐＨ６．５以下でより安定である。なぜなら、それは、典型的には、細胞内部の酸性環境中に存在するからである。ここで、以前に開示した通り、遊離ＣＴＦは二量体を形成する。免疫グロブリンＣＴＦは、ｐＨ＜８未満において安定であり、細胞外部で見出されるＣＴＦの原理的な形態であるため、免疫グロブリンＣＴＦの測定が、臨床適用のために望ましかった。
【０３２０】
実施例３  ＣＴＦを含む免疫グロブリン鎖の同定
商業的グレードのヒト血清タンパク質を、ｍＡｂ４４４−１Ｄ１２  ＡＬＰを用いて、実施例１の方法に従い、ウエスタンブロットした。テストした商業的グレードは、ＩｇＧ（I4506 Sigma Aldrich Chemical Co, St Louis Mo）、カッパ軽鎖（AG744 Millipore Billerica, MA formerly Chemicon）、ラムダ（P164-1 ScipacLtd, Kent UK）、Ｆｃフラグメント（AG744 Chemicon）、ＩｇＡ（I-0633 Sigma）、及びＩｇＭ（I-8260, Sigma）を含んだ。免疫グロブリンＣＴＦは、約２６kDaのカッパ軽鎖及びラムダ軽鎖ならびに２つのガンマ重鎖から成る。ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥはガンマ重鎖を含まず、代わりに、それぞれアルファ、ミュー、デルタ、及びイプシロン重鎖に基づく。全ての免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが、カッパ軽鎖を含む。結果を表１１にまとめる。
【０３２１】
【表１１】
2014517911.tif 000015
【０３２２】
データは、ＣＴＦがＩｇＧのガンマ鎖及びカッパ鎖に付着していることを示した。単量体又は二量体としての遊離ＣＴＦは、ＩｇＧ中で観察されなかった。データは、また、ＣＴＦがＩｇＡ及びＩｇＭのカッパ鎖に付着していることを示した。２５kDaより小さいカッパ鎖フラグメントが観察された。ＩｇＤ及びＩｇＥは、また、カッパ鎖を含み、従って、また、付着ＣＴＦを含むことが予想される。ガンマ重鎖のＦｃ領域は、また、エフェクター機能ドメインとして公知であり、５０又は２５kDaの重鎖フラグメントに結合したＣＴＦを含まなかった。これは、ＣＴＦがＩｇＧのＦａｂ領域においてガンマ鎖及びカッパ鎖に付着していることを示す。
【０３２３】
ＣＴＦは、カッパ鎖においてＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ中に組み込まれるため、抗カッパ及び抗ＣＴＦモノクローナルサンドイッチアッセイを使用することで、全ての免疫グロブリンにおいて結合したＣＴＦが測定される。対照的に、抗ガンマ及び抗ＣＴＦモノクローナルサンドイッチアッセイを用いたアッセイでは、ＩｇＧアイソタイプにおいてだけ結合したＣＴＦが測定される。同様に、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥについて特異的な他の抗体は、その形態において結合したＣＴＦを測定するモノクローナルサンドイッチアッセイを可能にする。
【０３２４】
実施例４  免疫グロブリンＣＴＦの相関
血漿サンプルを、ＣＴＦ免疫グロブリンについて、  ＣＴＦ  Ｒ１及びＣＴＦ  Ｒ２についてのモノクローナル抗体ならびに免疫グロブリンについての抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法を使用し、ＡＬＰに共役されたカッパ又はガンマ免疫グロブリン鎖についてのモノクローナル抗体を使用し、測定した。使用したＥＬＩＳＡ方法論は、以前に記載されたものと同じであったが、サンプルのアルカリ処理を伴わず、ＣＴＦ免疫グロブリンを伴う患者サンプルを、標準として割り当て、アッセイのためにより短い読み取り時間を使用した。
【０３２５】
結合ＣＴＦ免疫グロブリンアッセイを使用し、インスリン抵抗性患者コホートをテストした（表１２を参照のこと）。全ての患者が、低いバックグラウンドを伴い、ならびにプレート範囲＜１０%ＣＶ及びアッセイ範囲１００〜１０，０００pg/mL内で測定可能であった。極めて上昇した遊離ＣＴＦが、依然として検出されたが、しかし、正常サンプルにおいてより多かった。加えて、プレート間のＣＶが＜１０%まで低下し、患者群内の標準偏差が低下した。
【０３２６】
【表１２】
2014517911.tif 000016
【０３２７】
相関の結果を表１２に示す。血漿中のＣＴＦ免疫グロブリンにおける２．０倍の減少が、インスリン抵抗性を伴う患者において観察された。ＣＴＦ免疫グロブリンが組織及び細胞中に蓄積し、インスリン抵抗性を起こす。測定値は、ＣＴＦ  Ｒ１免疫グロブリン対ＣＴＦ  Ｒ２免疫グロブリンを測定した際、同様であった。測定値は、カッパ鎖免疫グロブリン対ガンマ鎖免疫グロブリンを測定した際、同様であった。組み合わせの内、ＣＴＦ  Ｒ１ガンマ鎖免疫グロブリンが、インスリン抵抗性において最も大きな減少を有した。ここで、ＣＴＦ免疫グロブリンの閾値＜３００pg/mLをインスリン抵抗性の指標として使用し、診断感度が７０%、特異性が７０%であった。
【０３２８】
これらの結果は、実施例１３のプロトコールを使用して確認された。試験をデザインし、非糖尿病と早期糖尿病及び後期糖尿病を比較した。ＩｇＧ−ＣＴＦアッセイを、空腹時グルコーススクリーニングを受けた患者から得られた全血サンプルを用いて使用した。患者は、彼らが正常な空腹時全血グルコース＜１００mg/dL及び正常な全血ＨｂＡ１ｃ＜６．５%の両方を有した場合、正常として定義した。異常な全血空腹時グルコース（＞１３５mg/dL）を伴う患者は、経口耐糖能テスト（ＯＧＴＴ）を受けた。異常なＯＧＴＴ結果［血漿中グルコース値＞１２６mg/dL（０時間目）又は＞２００mg/dL（２時間目）］又は異常な全血ＨｂＡ１ｃ＜６．５%を伴う患者は、前糖尿病として又は耐糖能障害に分類した。
【０３２９】
このプロセスを通じて、１０１人の患者を非糖尿病として分類し、１２７人の患者を糖尿病として分類した。ＥＬＩＳＡアッセイによるＩｇＧ−ＣＴＦを、全ての糖尿病患者及び非糖尿病患者で実施した。ＩｇＧ−ＣＴＦ結果を表１３及び１４にまとめる。
【０３３０】
【表１３】
2014517911.tif 000017
【０３３１】
陽性は、１４０mg/dLより大きい１２０分値又は長期間の糖尿病を伴う耐糖能障害として定義した。使用した閾値は、５．５ng/mlのＩｇＧ−ＣＴＦであった。感度は８３．２%であった。特異性は８４%であった。陽性予測値（ＰＰＶ）は８７%であった。陰性予測値（ＮＰＶ）は８０%であった。ＰＰＶは真陽性として算出した（ＴＰ）／（ＴＰ＋偽陽性（ＦＰ））。ＮＰＶは真陰性として算出した（ＴＮ）／（ＴＮ＋偽陰性（ＦＮ））。
【０３３２】
【表１４】
2014517911.tif 000018
【０３３３】
使用した閾値は、５．５ng/mlのＩｇＧ−ＣＴＦであった。ＰＰＶは８４%であった。ＮＰＶは８４%であった。
【０３３４】
これらの実験から引き出された結論は、良い相関が得られたことである。０及び１２０分は、同じＩｇＧ−ＣＴＦ値を与えた。そのため、それは、０時間の測定値だけを要求する慢性マーカーである。
【０３３５】
また、ＣＴＦ免疫グロブリンについてのテストを、異常な細胞成長を伴う患者からの血清サンプルのコホートにおいて行った（表１５を参照のこと）。転移性癌及び限局性癌を伴う患者を、インスリン抵抗性及びアルコール性肝炎により特徴付けられる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに肝臓における炎症性細胞の存在によって特徴付けられる自己免疫性肝炎から分けた。
【０３３６】
【表１５】
2014517911.tif 000019
【０３３７】
相関の結果を表１６に示すＣＴＦ免疫グロブリンにおける２．５倍の増加が、乳癌及び肝臓癌を伴う患者において観察された。１．７倍の増加が、転移性癌を伴う患者において観察された。膵臓癌を伴う患者は、ＣＴＦ免疫グロブリンにおける減少を有した。増殖性肝臓疾患（例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性肝炎、及び自己免疫性肝炎など）を伴う患者は、ＣＴＦ免疫グロブリンにおけるさらにより有意な増加（５．５倍までの増加）を有した。特定の作用機構に拘束されないが、インスリンを産生する膵臓は、ＣＴＦ免疫グロブリンであることから保護され、インスリンを分解する肝臓は、ＣＴＦ免疫グロブリンにより感受性であると考えられる。
【０３３８】
【表１６】
2014517911.tif 000020
【０３３９】
実施例５  天然ＣＴＦ免疫グロブリンの単離
天然ＣＴＦ免疫グロブリンを、ウエスタンブロット方法により単離した。あるいは、天然ＣＴＦ免疫グロブリンを、それを、モノクローナル抗体ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２と共役させたポリマー樹脂ビーズ上に捕捉することにより単離した。PolyLink Protein Coupling Kit（Bangs Laboratories Inc.）を、この共役のために使用した。一般に使用される他の捕捉ビーズ及び粒子も機能した。天然ＣＴＦ免疫グロブリンが、ｐＨ調整により、捕捉ビーズから放出された。それは、また、プロテインＡカラム精製によるＩｇＧ中への分画により精製することができた。精製及び同定は、抗ヒトカッパ鎖、抗ヒトガンマ鎖、及び抗ＣＴＦ抗体へのウエスタンブロットにより確立することができた。マススペクトロメトリーもピーク同定のために使用した。同定された免疫グロブリンの主要な形態は、  ＩｇＭ、ＩｇＧ、Ｆａｂ２、Ｉｇ、ガンマ鎖、及び軽鎖を含む。結果を表１７に示す。
【０３４０】
【表１７】
2014517911.tif 000021
【０３４１】
表１７は、ＡｄｉｐｏＲ１受容体についての質量が、完全長の形態について４３kDaであることを示す。完全な受容体は、膜を含む組織サンプル中で現れているが、血漿中では現れていない。組織は、一般的には、検出可能な二量体を含まなかったが、しかし、これは、ウエスタンの検出限界を下回りうる。
【０３４２】
ＩｇＧ−ＣＴＦをＩｇＧと比較するＥＬＩＳＡによる分析では、患者血漿中でのＩｇＧ  ＣＴＦのパーセンテージが、大半の患者における全ての血漿ＩｇＧの＜０．２%であることが見出された。このパーセンテージは、ＩｇＧ  ＣＴＦ  Ｒ１及びＲ２について同様であった。ＩｇＭ  ＣＴＦのパーセンテージは、典型的には、より低かったが、しかし、患者血漿中では、大半の患者における全ての血漿ＩｇＭの約＜０．０３%であることが見出された。このパーセンテージは、Ｒ１及びＲ２付着について同様であった。ＣＴＦとＩｇＧの比率は、典型的には、大半の患者において、１〜２であったが、１〜５の範囲を伴った。
【０３４３】
ＩｇＭ、ＩｇＧ、ガンマ、カッパ、及びＦａｂ抗体の交差反応性を伴うＥＬＩＳＡ試験を、血漿中で、ＣＴＦ結合フラグメントについてテストし、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ガンマ、カッパ、及びＦａｂが存在することが確認された。加えて、２つのＣＴＦが、典型的には、ＩｇＧ上であることが確認された。
【０３４４】
実施例６  天然ＣＴＦ免疫グロブリンへの抗原の単離
天然ＣＴＦ免疫グロブリンを結合する細胞を、生物学的材料（例えば組織、液体、及び細胞培養物など）から、本明細書において開示するＣＴＦ−ＩｇＧアッセイ（ＩＨＣ又はＥＬＩＳＡ）を使用して単離することができる。細胞の単離方法では、しばしば、磁気粒子、蛍光粒子、捕捉ビーズ、及び細胞を単離及び選別するために（例えばフロー細胞診、顕微鏡イメージング、ろ過、及びその他などにおいて）有用な他の材料に付着した抗体を使用する。天然ＣＴＦ免疫グロブリンは、捕捉相において又は細胞検出による選別のために、抗体として役立つことができる。
【０３４５】
天然ＣＴＦ免疫グロブリンを、シグナル生成化合物としてのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に付着した。癌細胞をろ過方法により単離し、血液中で、循環腫瘍細胞を他の細胞から単離した。患者の血液を、塩化アンモニウムにより溶解し、赤血球（しかし、白血球又は癌細胞ではない）を除去した。白血球又は癌細胞を、赤血球が通過することを可能にする８μm細孔膜上に捕捉した。膜を、走査型蛍光顕微鏡を用いて撮像し、天然ＣＴＦ免疫グロブリンに結合する癌細胞及び白血球を見出す。白血球を、Ｃｙ５色素を伴うＣＤ３、ＣＤ４５、及びＣＤ１９抗体を用いて対比染色し、好中球、ベータ細胞、及びＴ細胞としてのＣＴＦ免疫グロブリン結合細胞の同定を確認した。癌細胞を、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ色素を伴うＥｐＣＡＭ抗体を用いて対比染色し、癌細胞としてのＣＴＦ免疫グロブリン結合細胞の同定を確認した。
【０３４６】
天然ＣＴＦ免疫グロブリンに結合し、膜から除去される個々の細胞を、細胞培養により増幅させてもよい。この細胞単離及び増幅は、細胞応答によって、ＣＴＦがＩｇＧに結合するのを防止するための生化学的な方法を同定し、ＣＴＦ−ＩｇＧが組織中に吸収されるのを遮断し、免疫細胞に対するＣＴＦ−ＩｇＧの影響を変えるために有用である。このように、この測定値を使用し、潜在的な薬物を同定することができる。これらの細胞を、また、ＣＴＦ免疫グロブリンに結合する分子の単離のために使用し、潜在的な新たな薬物を同定することができる。
【０３４７】
例えば、抗原は、細胞ライセートから、それらを、捕捉相としての天然ＣＴＦ免疫グロブリンを伴うポリマー樹脂ビーズコンジュゲート上に捕捉することにより単離することができる。親和性精製抗原がビーズから放出される。
【０３４８】
実施例７  ＣＴＦ免疫グロブリン及び抗原に結合する特定の免疫グロブリンの単離
免疫グロブリン及び他のタンパク質に結合したＣＴＦを使用し、モノクローナル抗体を作ることができる。また、天然ＣＴＦ免疫グロブリンへの親和性精製抗原を使用し、モノクローナル抗体（免疫グロブリン）を作ることができる。
【０３４９】
これらの抗原へのモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を、標準的な担体タンパク質［例えばキーホールリンペットヘモヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＡ）、又は同様のものなど］上の抗原を用いて免疫化されているマウスからの脾臓細胞と融合させることにより作った。抗体産生細胞を、培養中で継続的に成長させ、選択培養ＨＡＴ培地中でハイブリドーマを形成する細胞と融合する。選択培養培地は、ＨＡＴ培地と呼ばれる。なぜなら、それは、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むからである。この培地は、融合（ハイブリドーマ）細胞について選択的である。１つの抗原への１つの抗体だけを産生する単一抗体を単離した。単一のハイブリドーマは分裂し、「クローン」の大集団を産生し、全てが同じ「モノクローナル」抗体を作る。生きたハイブリドーマを、液体窒素中に、無期限に凍結する。
【０３５０】
実施例８  ＣＴＦ免疫グロブリンへの特定抗原の単離
モノクローナル抗体を使用し、ＣＴＦ免疫グロブリンへの特定抗原を、実施例６からの特異的なモノクローナル抗体を伴うポリマー樹脂コンジュゲート上に捕捉することによる細胞抗原の精製により単離することができる。PolyLink Protein Coupling Kit（Bangs Laboratories Inc.）を、この共役のために使用した。一般に使用される他の捕捉ビーズ及び粒子も用いることができる。モノクローナル抗体に特異的に結合する抗原を、ｐＨ調整により、捕捉ビーズから放出することができる。精製及び同定は、天然ＣＴＦ免疫グロブリン及び実施例６からのモノクローナル抗体へのウエスタンブロットにより最初に確立することができる。反応性ビーズを単離し、同一性を、Ｎ末端テールのペプチド配列により又はマススペクトロメトリーにより決定することができる。
【０３５１】
実施例９  免疫グロブリンのＣＴＦ共役
ＣＴＦ免疫グロブリンは、免疫グロブリンＦｉｔｇｅｒａｌｄ産物コード３０−ＡＩ１７）へのＣＴＦ  Ｒ１  ＣＴＦ２５配列番号１１の付着により産生されたが、それは、ペプチドを、別のペプチドのＣ末端に、遊離アミノ基及びビステイン（ｖｙｓｔｅｉｎ）残基を結合するスクシンイミドエステル（例、ＭＢＳ、ＳＭＣＣ）を通じて付着させる。これらの材料を、ＥＬＩＳＡ方法のための標準として使用した。この同じＣＴＦ付着プロセスを、多くの他の免疫グロブリンを用いて行うことができる。例えば、実施例６から単離されたもの又は他の免疫グロブリン。例えば、ＣＴＦは、また、トラスツズマブ、フルベストラント、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｎｏｍａｂ）、イブリツモマブ、イマチニブ、レナリドミド、セツキシマブ、ダサチニブ、パニツムマブ（ｐａｎｔｕｍｕｍａｂ）、ラパチニブ、及びニロチニブに付着することができた。実際には、マレイミド活性化ＩｇＧを、ＣＴＦのシステイン残基上のスルフヒドリル（−ＳＨ）部分を用いて処理し、合成ＣＴＦ−グロブリンを産生した。
【０３５２】
実施例１０  インスリン応答及び細胞成長のＣＴＦ免疫グロブリン影響
ＣＴＦは、以前に、動物モデルにおいてインスリン応答に影響を与えることが見出された。インスリン応答を、以前に開示された通り（国際公開第ＷＯ  ２００７／１２０，３１１号）、動物モデルにおける耐糖能テストにより測定した。ＣＴＦを用いて処置された動物モデルを、未処置群と比較し、応答及び有効性を決定した。同様に、動物モデルを、天然サンプルから単離された又は合成ＣＴＦ免疫グロブリンコンジュゲートとして産生されたＣＴＦ免疫グロブリンを用いて処置することができる。動物モデルを、また、ＣＴＦ免疫グロブリンへの抗原又は前記抗原への特定の免疫グロブリンを用いて処置することができる。
【０３５３】
インスリン抵抗性及び異常な細胞成長は、また、細胞モデルを使用して測定することができる。一般的に、細胞培養、例えば癌細胞（例、ＭＣＦ、ＭＤＡ  ＳＫＢＲ）、筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）、及びミドリザル上皮細胞（ＶＥＲＯ）（American Type Cell Culture, ATCC, Manassa VA）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用した培養中で維持し、筋細胞及び癌細胞を、改変イーグル培地（ＭＥＭ）を用いて維持する。両方の培地が、２mMグルタミン、ペニシリン（５０単位/ml）、ストレプトマイシン（５０μg/ml）、及び１０%ウシ胎児血清（インスリン及びアディポネクチンを含む）を含んだ。細胞を、３７℃で、９５%空気及び５%ＣＯ２の雰囲気中で成長させ、細胞成長のコンフルエンスで、ＰＢＳ／ＥＤＴＡを使用した１〜４希釈物を用いて分割することにより増殖させた。細胞株を同期化することができ、天然ＣＴＦ免疫グロブリン；ＣＴＦ−ＩｇＧを伴う血漿、合成ＣＴＦ免疫グロブリンコンジュゲートを用いて、又はＣＴＦ免疫グロブリンへの抗原もしくは前記抗原への免疫グロブリンを用いて誘導（処置）することができる。
【０３５４】
処理された細胞培養物におけるインスリン応答を、インスリンをインスリン受容体に結合させることにより又は細胞間インスリンの喪失を測定することにより直接的に測定することができる。より少ないインスリン結合は、より低いインスリン受容体レベル及びインスリン応答を示す。受容体への結合は、全細胞をＥＬＩＳＡプレートに、１２時間にわたるインキュベーションを伴い測定する。プレートの洗浄にはＴＢＳを用い、ブロッキングには２００μLのＰＢＳ中Blocker Casein（Thermo Fisher 37528）を用い、ＴＴＢＳを用いた洗浄が続く。各々のウェルを、２５mM  Ｔｒｉｓ、２５mM  ＨＥＰＥＳ、０．１M  ＮａＣｌ、及び１０%トレハロース（ｐＨ７．５に調整）中のインスリン−ビオチン（５ng/ml又は１．４μM）を用いてインキュベートした。３７℃での１時間のインキュベーション後、プレートを、ＴＴＢＳを用いて洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＬＰ（０．３mg/ml又は０．０７４μM）を用いてさらに１時間にわたりインキュベートし、洗浄した。結合ＡＬＰを、パラ−ニトロフェノールホスフェートを加えることにより測定した。
【０３５５】
処置した細胞培養におけるインスリン抵抗性又は異常な細胞成長を、インスリンにより起こる細胞シグナルを使用して測定することができる。インスリンは、グルコース輸送、グリコーゲン合成、タンパク質合成、細胞増殖、細胞遊走接着、生存、タンパク質合成、ニトロオキシド（ｎｉｔｒｏｘｏｉｄｅ）合成、及び神経保護（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｔｃｔｉｏｎ）を、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ及びＭＡＰＫ／ＥＲｋシグナル伝達を通じて、ならびに、結果としてのチューブリン重合、βカテニン（ｃａｒｔｅｎｉｎ）分解、サイクリンＤ１分解、及びｍＴＯＲ阻害シグナル伝達を活性化する。一般的に、インスリンは、身体の細胞増殖を制御し、肝臓及び筋肉中へのグルコースの入りを加速し、インスリン分泌は、血糖のレベルにより決定される。対照的に、アディポネクチンシグナル（レプチン及びアルファ−アドレナリン受容体など）は、グルコース取り込み、解糖、脂肪酸酸化、血圧、及び血流を増加させ；グリコーゲン合成、糖新生、脂肪酸合成、ステロール合成、脂肪分解、細胞増殖（ＡＭＰＫ合成を通じて）を減少させ、一般的に、身体のエネルギーを燃焼し、長いエネルギー保存を停止する。
【０３５６】
キナーゼリン酸化アッセイは、一般的に、細胞をマイクロタイタープレートのウェルへ加え、それらを、１００μLのＰＢＳ中４%ホルムアルデヒドを用いて固定することにより行うことができる。プレートを、追加の２０分間にわたり室温で保ち、次に、パラフィンを用いてカバーし、アッセイするまで４℃で保存した。Ａｋｔ及びＰＩＫ３のリン酸化における相対的な増加のＥＬＩＳＡ測定を、ＥＬＩＳＡ製造者の指示（Superarray, Frederick, MD）に従って実施した。ＭＡＰＫ  ＥＲＫリン酸化における相対的な増加の測定を、ＥＬＩＳＡ製造者の指示（Assay Designs, Ann Arbor MI）に従って実施した。結果を、３つの独立した実験において、新たな培養物を用いて繰り返した。細胞を、マイクロタイタープレートへ固定し、固定緩衝液の除去が続き、細胞クエンチングを、Ｈ２Ｏ２及びＮａＮ３を用いて実施した。クエンチング緩衝液を除去し、プレートを加熱し、洗浄し、ブロッキングした。これには、Ａｋｔ、Ｐｈｏｓ−Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、及びＰｈｏｓ−ＰＩ３Ｋについての一次抗体（１：１００希釈）を用いた１時間のインキュベーションが続いた。各々の抗体及び誘導条件を、別々の３通りのウェル中でテストした。非結合の一次抗体を、洗浄により除去し、プレートを、次に、ＨＲＰに共役した二次抗体（１：１６希釈）を用いて１時間にわたりインキュベートした。プレートを２回洗浄し、現像溶液を加えた。インキュベーション後、停止溶液の添加後に形成された、結果としての暗い青色を、４５０nmで読み取った。
【０３５７】
インスリン抵抗性又は異常な細胞成長は、また、細胞アポトーシスシグナル伝達により測定することができる。アポトーシスのシグナル伝達を、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦカッパＢ）により阻害し、それは腫瘍壊死因子（ＴＮＦアルファ）により制御される。アポトーシスのシグナル伝達は、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔキナーゼリン酸化により阻害され、それはインスリンにより制御される。従って、ＣＴＦはインスリン抵抗性を誘導し、ＣＴＦ阻害はＴＮＦアルファ放出を阻害し、両方がアポトーシスシグナル伝達を支持した。
【０３５８】
アポトーシスシグナル伝達は、核凝縮、細胞萎縮、膜埋め込み、及びＤＮＡ断片化により特徴付けられる、調節された細胞自殺機構である。アポトーシスの活性化を、カスパーゼプロテアーゼ、即ち、カスパーゼ３、５、６及び９の活性化により測定することができる。これらのカスパーゼは、アポトーシスの中心レギュレーターであり、実行されたアポトーシスの決定的な測定である。アポトーシスシグナル伝達を、また、ホスファチジルセリン分析により、蛍光分析を使用して測定することができ、アポトーシスプロセスの間での膜変化の測定である（B. D. Smith, Cell Death and Differentation 2003; 10; 1357-9）。
【０３５９】
カスパーゼ活性化によるアポトーシスアッセイは、一般的に、種々の細胞抽出物及び上清を使用することにより行う。ウエスタンブロットを、抗カスパーゼ抗体（３／８／９）に対して実施した（Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA）。電気泳動を、標準的な条件下で、Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液を使用し、１８〜２０mAmpで、３μgのBiorad前染色標準を用いて実行した。電気泳動後、タンパク質を、ゲルからニトロセルロース膜上に、８０Ｖで１時間にわたり又は４０Ｖ一晩４℃でトランスファーした。トランスファーしたタンパク質を、上に言及する特異的抗体（１mg/ml）を用いて、カゼインブロッカーを用いた１時間のブロッキング後、反応させた。非結合抗体を洗い流し、Tween20を含むＴＢＳを用いてブロッキングした後、ブロットした膜を、ＡＬＰ共役した対応する二次抗体を用いて、さらに１時間にわたりインキュベートした。最後に、サンプルと抗体との交差反応性を、１０mLのＴＢＳ中の６６μlのニトロブルーテトラゾリウム（５０mg/ml  ７０%  ＤＭＦ）及び３５μlのブロモクロロインドリルホスフェート（５０mg/ml  ＤＭＦ，１００%）の添加によりモニターした。
【０３６０】
ホスファチジルセリン分析を使用したアポトーシスアッセイを、一般的に、生細胞を使用することにより行う。誘導した細胞を、ＰＳＳ−３８０色素を用いて処理し、アポトーシス細胞の外葉上でホスファチジルセリンを認識した（９）。細胞を、Falcon Microslide System（Fisher）上に蒔き、ＴＥＳ緩衝液（５mM  Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］  −２−アミノエタンスルホン酸：ＴＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて２回洗浄し、それには、２５μm  ＰＳＳ−３８０を含む２００μLの新しいＴＥＳ緩衝液を用いた３７℃で１０分間にわたるインキュベーションが続いた。緩衝液を染色後に除去し、細胞を、ＴＥＳ緩衝液を用いて１回、蛍光についての観察前に洗浄した。位相差画像を使用し、蛍光シグナルの領域を位置付け、罹患細胞のパーセンテージを算出した。
【０３６１】
天然ＣＴＦ免疫グロブリン；合成ＣＴＦ免疫グロブリン、ＣＴＦ免疫グロブリンへの抗原、及び前記抗原への特異的な免疫グロブリンを用いて誘導された癌細胞培養での予想結果を、表１８において下に示す。
【０３６２】
【表１８】
2014517911.tif 000022
【０３６３】
実施例１１  ＣＴＦの測定に対する免疫グロブリンＣＴＦの影響
血漿サンプルを、ＣＴＦについての３つのアッセイにより測定した。これらの３つのアッセイを、表１６において比較する。第１アッセイは、ＣＴＦについてのモノクローナル抗体及びＡＬＰに共役したＣＴＦについてのポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法を使用した、遊離ＣＴＦについてのサンドイッチアッセイであった。
【０３６４】
第２アッセイは、ＣＴＦについてのモノクローナル抗体及びＡＬＰに共役したヒトアルブミンについてのポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法を使用した、アルブミンに非共有結合的に結合した遊離ＣＴＦについてのサンドイッチアッセイであった。遊離ＣＴＦ分子は、「非共有結合的」様式において、アルブミンに会合し、強く結合することが見出された。結果として、血漿中のほぼ全ての遊離ＣＴＦが、アルブミンと会合している。アルブミン結合を、血漿を、捕捉ビーズに結合したＣＴＦを用いて処理することにより確認した。ＣＴＦに結合したタンパク質を、ウエスタンブロット上で、ＳＤＳ変性ゲル電気泳動を用いて解離（破壊）し、最後の数個のＮ末端ペプチドを、配列決定し、結合タンパク質をアルブミンとして同定した。この結合は、遊離ＣＴＦイムノアッセイにおいて破壊されなかった。
【０３６５】
第３アッセイは、ＣＴＦについてのモノクローナル抗体及びＡＬＰに共役したヒト免疫グロブリン鎖についてのモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ方法を使用した、免疫グロブリンに共有結合的に結合したＣＴＦについてのサンドイッチアッセイであった。ＣＴＦ分子は、共有結合的に付着している「及び会合しているだけではない」ことが見出された。結果として、血漿中の免疫グロブリンに付着したほぼ全てのＣＴＦが、変性を伴う又は伴わないウエスタンブロット上で又はイムノアッセイにおいて、解離（破壊）することができない。そこでは、ＣＴＦと会合したアルブミンを、変性を伴うウエスタンブロット上で又はイムノアッセイ洗浄手順において解離（破壊）することができる。洗浄は、アルブミンのこの干渉会合の除去を可能にする。ヒト血液中のＩｇＧ  ＣＴＦの量は、遊離ＣＴＦ又はアルブミンに会合した遊離ＣＴＦの量に対し、はるかに過剰である。従って、遊離ＣＴＦ及びアルブミンの両方の影響が低下し、ＩｇＧ  ＣＴＦアッセイへの干渉はしない。
【０３６６】
これらのアッセイの臨床成績の比較を、表１６において下に示す。３つのイムノアッセイを使用し、患者からの１００の血漿サンプルをテストし、結果を標準と比較した。遊離ＣＴＦ及びＣＴＦアルブミンアッセイでは、合成ＣＴＦペプチドを、標準として、ならびに、較正及びＣＴＦ免疫グロブリンアッセイのために、ヒトＩｇＧに共役した合成ＣＴＦペプチドを使用した。臨床サンプルテストのための理想的なイムノアッセイでは、標準への高い相関（Ｒ２＞０．９５）が維持されうるが、バックグラウンドにおける増加は受けないであろう（臨床サンプル中での干渉により起こされる、検出限界での＜１０%増加）。
【０３６７】
【表１９】
2014517911.tif 000023
【０３６８】
ＣＴＦ免疫グロブリンについてのアッセイは、干渉を受けず、臨床テストのために適していた。
【０３６９】
実施例１２  モノクローナル抗体の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μg/マウスの合成ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２ペプチド免疫原組成物を用いて免疫化した。表２０に示す通りに含まれる、これらのＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２ペプチド免疫原組成物：
【０３７０】
【表２０】
2014517911.tif 000024
【０３７１】
１ヶ月後、眼球出血を各々のマウスから取り、免疫原に対するＥＬＩＳＡによりタイターし、免疫応答を評価した。最善の応答を示しているマウスを、免疫原を伴う１００μg/マウスの注射により追加免疫した。４日後、マウスを屠殺し、それらの脾臓を、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)の方法に従った融合のために使用した。脾細胞を、ＳＰ２−０  Ａｇ１４ミエローマ細胞と、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を使用して融合し（脾細胞とミエローマ細胞との比率は５：１）、９６ウェルプレート中に、５０%  ＰＥＧ／ＨＡＴ成長培地を使用して蒔いた。３７℃摂氏での７〜１０日間のインキュベーション後、融合細胞を、成長について、３〜４日毎の供給により、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択方法を利用してモニターし、ＨＡＴ成長培地を用いた継代培養が続いた。
【０３７２】
２〜３週間後、ハイブリドーマコロニー成長を有するウェルを、ＥＬＩＳＡによりテストし、いずれの成長が、ペプチドへの抗体免疫応答を産生したかを決定した。９６ウェルプレート培養物を、ウリスタチン（ｕｒｉｓｔａｔｉｎ）ペプチドを用いて、１００μg/mLコーティングプレートでテストした。プレートを一晩２〜８℃でコーティングした後、全てのプレートを洗浄し、ブロッキングした。細胞培養上清を、次に、１００μl/ウェル、１時間にわたり室温で適用した。プレートを洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：２０００希釈で）を、１００μl/ウェルで１時間にわたり適用した。プレートを、１回、再び洗浄し、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）基質が続き、４９０nmで、Spectra Maxプレートリーダー上で読み取った。
【０３７３】
陽性応答を与えるコロニーを、さらなる増大及び再テストのために２４ウェルプレートに移し、陽性結果を検証した。テストで陽性となったコロニーを、さらに、６ウェルプレート中で、１０%ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で増大させた。増大後、コロニーを−７０℃で凍結し、次に、長期保存のために液体窒素に移した。精製ペプチドを使用したＥＬＩＳＡ結果に基づき、種々のコロニーを、さらに、ＩＭＤＭ、１０%  ＦＢＳ中で増大させ、凍結して落とした。
【０３７４】
上のプロトコールを使用して作った抗体産生細胞を、  American Type Culture Collection（「ＡＴＣＣ」）（10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209）に、２０１２年２月２１日に寄託し、ｍＡｂ  ４６１−４Ｈ１１を産生する細胞について受託番号ＰＴＡ− 、ｍＡｂ  ４４４−１Ｄ１２を産生する細胞について受託番号ＰＴＡ− 、及び、５１０−６Ｂ６を産生する細胞について受託番号ＰＴＡ− が割り当てられている。
【０３７５】
実施例１３  結合アッセイプロトコール
これらの方法を使用し、インスリン抵抗性への相関試験においてＩｇＧ−ＣＴＦを測定することができる。材料は、濃度２．５mg/mlの抗Ｒ１  ＣＴＦ抗体Ｍａｂ  ４４４−１Ｄ１２−１ｈ７を含み、１５０μLの抗体を１０mLのＴＢＳ中に、プレートコーティングのために希釈した。あるいは、濃度１．２５mg/mlの抗Ｒ１  ＣＴＦ抗体Ｍａｂ  ４６１−４Ｈ１１．２Ａ４を、３００μLの抗体を１０mLのＴＢＳ中に、プレートコーティングのために希釈した。あるいは、濃度０．４７mg/mlの抗Ｒ２  ＣＴＦ抗体Ｍａｂ  ５１０−６Ｂ６−１Ｇ１１を、１０００μLの抗体を１０mLのＴＢＳ中に、プレートコーティングのために希釈した。ＡＬＰに共役した抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ＩｇＧ  ＡＬＰ）［Siemensによりマウスにおいて産物７６０１ＭＲとして産生されたモノクローナル抗ヒトＦａｂ抗体を、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に共役した（Biozyme ALPI12Gロット１６６２ＡＡ）］。抗ＩｇＧ  ＡＬＰを、０．３mg/mlストックとして精製し、それを、２５μLで、１０mLの０．０５%  Ｔ−ＴＢＳ中に、アッセイにおける使用のために希釈した。テスト標準を、実施例９に記載する通り、ＣＴＦ  Ｒ１  ２５ｍｅｒ（配列番号１１）に共役したヒトＩｇＧ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ産物コード３０−ＡＩ１７）から作った。Tweenを伴わないＴＢＳを、ＢｕｐＨ  Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Fisher Catalog#  PI-28376）から作ったが、２５mM  ｔｒｉｓ及び０．１５M塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）である。ブロッキング緩衝液は、Super blockerであった。それは、供給（Pierce）として使用した。Ｔ−ＴＢＳを、１０%  Tween-20（Biorad Catalog# 161-0781）をＴＢＳ中に加えることにより調製し、０．０５%  Tween-20を作った。キャリブレーター緩衝液は、１%  ＢＳＡ（SigmaP3688）を伴い、１．９２g/Lクエン酸（０．１M）を伴い、ｐＨが６．４に調整されたＰＢＥであった。イムノアッセイを読み取るために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを使用した（Costar cat #  3590）。平底を伴うＥＩＡプレート及び高結合Fisher Catalog# 07-200-35。Corning低温バイアル１．２mL  Ｃ（４３０６５８）を保存のために使用した。BD Vacutainer K2EDTA  １０．８mg滅菌ｒｅｆ  ３６７８９３プラスチックチューブ及びヘパリンナトリウム、ガラスチューブｒｅｆ  ８０９１４３７、及びグレートップグルコースチューブも使用した。
【０３７６】
第１工程は、８つのプレート（Costar 96-Well EIA/RIA Plates Flat Well;High Binding）を、ＣＴＦについてのｍＡｂを用いて、ＴＢＳ中の濃度１２μg/mlでコートすることであった。１００μl/ウェルのコーティング溶液をプレートに適用した。プレートを密封し、冷蔵庫（４℃）中で一晩（〜５ｐｍ〜〜９ａｍ）又は３時間にわたり室温でインキュベートすることを可能にした。コーティング溶液を、ピペッティングにより捨て、徹底的に水を切った。保存するためのプレートは、洗浄しなかった。それらは、プレートシーラー（Fisher Scientific Catalog #NC9479592）を用いて密封し、乾燥剤を伴う密封バッグ中に入れた。それらを、使用の日まで、−２０℃で保存した。コーティングしたプレートは３ヶ月間持続する。
【０３７７】
第２工程は、４０人の患者について１つのプレートのブロッキング調製であった。各々のウェルを、３００μlのＴＢＳを用いて、自動プレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。次に、３００μlのSuper Blockerを、各々のウェルに、ブロッキングのために加えた。プレートを、シェーカースピード１０００rpm（設定５）を用いて、３７．５℃で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、３００μlの０．０５%  Ｔ−ＴＢＳを用いて、自動プレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。
【０３７８】
第３工程は、濃縮した合成ＣＴＦ試薬（２０μL  ＩｇＧ−ＣＴＦ、１８．８mg/μL、１０mL  ＰＢＳ中）の以下の希釈を実施することにより、サンプルキャリブレーターを調製し、ストックを作ることであった。このストックを、３ヶ月間にわたり、保存（例、冷凍）することができる。キャリブレーターは、キャリブレーター緩衝液（ＰＢＳ＋クエン酸＋１%  ＢＳＡ、ｐＨ６．４）中で作った。キャリブレーターは、毎日新たに作らなければならない。キャリブレーターは、表２１に従って作り上げた。
【０３７９】
【表２１】
2014517911.tif 000025
【０３８０】
４番目の工程は、患者のサンプルを調製することであった。５０μlのサンプル（４３／プレート）を、ポリプロピレンサンプルプレート中の二通りのレーンのウェル中に加えた。６００μlのＴＢＳを加え、十分に混合した（プレートを、この点で、４℃で５日まで又は−２０℃で少なくとも５日間にわたり保存することができる）。５０μlの希釈サンプル（１：１２）及び５０μLのキャリブレーターを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートの個々のウェル中に移した。
【０３８１】
第５工程は、１度に１つのプレートについてのイムノアッセイ結合及び洗浄であった。プレートを密封し、シェーカースピード１０００rpmで、３５℃で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、０．０５%  Ｔ−ＴＢＳを用いて、自動プレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。１００μlの抗ＩｇＧアルカリホスファターゼｍＡｂを、各々のウェルに、０．０５%  Ｔ−ＴＢＳ中で適用した。プレートを密封し、シェーカースピード１０００rpmで、３５℃で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、０．０５%  Ｔ−ＴＢＳを用いて、自動プレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。
【０３８２】
第６工程は、１度に１つのプレートについてのイムノアッセイ結合及び洗浄であった。ＰＮＰＰ基質を、１シルバー及び１パケット錠剤を１０mLのＰＮＰＰ緩衝液中に室温で溶解することにより、新たに調製した（Sigma Catalog # N189）。次に、９０μlのＰＮＰＰを、各々のウェルに加えた。プレートをプレートリーダー中に置き、３７℃でインキュベートし、プレートを、１６分間にわたり、４０５nm／９５０nmでの吸光度を使用し、２分毎に読み取った。
【０３８３】
実施例１４  組織単離のための癌及び血液細胞染色ならびに組織サンプル染色
以下は、組織テストのために使用することができる抗体材料である。それらを、ラット及びウサギからの組織について使用した。１０μLを１０mLのＰＢＳ中に希釈した場合、２．５８mg/ml（ＦからＰ  ４：３）の抗ＣＴＦＲ１−ＦＩＴＣマウスモノクローナルｍＡｂ（クローン４４４−１Ｄ１２  Ekhart IN）。抗ＣＴＦＲ１マウスモノクローナルｍＡｂ（クローン４６１−４Ｈ１１  Ekhart IN）を、抗マウスｍＡｂ  ＦＩＴＣヤギｐＡｂの１．０mL（２mg/ml）（クローンＵＣＨＬ１  ＰＥ  ａｂ６７８５  Abcam Inc.）と使用した。抗ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）マウスｍＡｂ（R&D systems MAB2129）を、ＦＩＴＣに共役した抗マウスＦＩＴＣヤギポリクローナル抗体（Abcam ab6785）と使用した。抗ＩＤＥ（ｉｎｓｕｌｙｓｉｎ）ヤギｐＡｂ（R&D systems AF2496）を、ＦＩＴＣに共役した抗ヤギＦＩＴＣロバポリクローナル抗体（Abcam 97109）と使用した。
【０３８４】
以下は、細胞単離のために使用することができる方法である。細胞材料を、赤血球が通過することを可能にする８μm細孔膜を通じてろ過した。膜を、走査型蛍光顕微鏡を用いて撮像し、以下を使用し、天然ＣＴＦ免疫グロブリンに結合する癌細胞及び白血球を見出す：抗ＣＴＦＲ１−ＦＩＴＣマウスモノクローナルｍＡｂを伴う抗ＣＤ  ４５  ＴＲ（Ekhart IN）、抗ＣＴＦＲ１−ＦＩＴＣマウスモノクローナルｍＡｂを伴う抗ＣＤ  １９  ＴＲ（Abcam）、抗ＣＴＦＲ１−ＦＩＴＣマウスモノクローナルｍＡｂを伴う抗ＣＤ  ３  ＴＲ（Abcam）。細胞を、次に、膜から、Eppendorf Transfermanマイクロマニピュレーターを使用して除去した。
【０３８５】
以下は、ヒト癌細胞（成長する癌細胞については、実施例１０を参照のこと）モデルテストのために使用することができる材料である：抗ＣＴＦＲ１−ＦＩＴＣマウスモノクローナルｍＡｂ（クローン４４４−１Ｄ１２  Ekhart IN）（２．５８mg/ml、ＦからＰ  ４：３、２．３mL）を、細胞のために使用し、陰性を示した。ＴＲ（Abcam Ab 6716）に共役した、マウスへの抗ウサギＴＲヤギポリクローナルを混合した抗ＩＤＥ（ｉｎｓｕｌｙｓｉｎ）ウサギｐＡｂ（calibiochem ST1120）を、ＳＫＢＲ細胞モデルテストのために使用した。ＴＲ（Abcam Ab 6716）に共役した、マウスへの抗ウサギＴＲヤギポリクローナルを混合した抗ＴＡＣＥウサギｐＡｂ（calibiochem PC491）を、ＳＫＢＲ細胞モデルテストのために使用した。マルチプレックス抗ＩＤＥ  抗ＩＤＥ（ｉｎｓｕｌｙｓｉｎ）ウサギｐＡｂ（calibiochem ST1120）を、ＴＲ（Ａｂｃａｍ）に共役したマウスへの抗ウサギＴＲヤギポリクローナルを伴う細胞モデルのために使用し、抗ＩＤＥ  ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）トリｐＡｂ（R&D systemsAF930）と混合し、Ｃｙ５（Abcam）を用いて共役したマウスへの抗トリＣｙ５ヤギポリクローナルを伴う細胞モデルのために使用し、ＳＫＢＲ細胞モデルテストのためのマルチプレックスアッセイとして使用した。
【０３８６】
以下は、ブロッキングのために使用することができる材料である：ウサギにおいて産生した抗Ｆｃ受容体抗体（Abcam）、ウサギにおいて産生した抗ＣＤ３２抗体、ウサギにおいて産生した抗Ｆｃ−γ  ＲＩＩ−ａ抗体、ウサギにおいて産生した抗Ｆｃ−γ−ＲＩＩａ抗体、ウサギにおいて産生した抗ＦｃＲＩＩ−ａ抗体、ウサギにおいて産生した抗ＩｇＧ  Ｆｃ受容体ＩＩ−ａ抗体、ウサギにおいて産生した抗低親和性免疫グロブリンγ  Ｆｃ領域受容体ＩＩ−ａ前駆体抗体、抗ヒト共役ＡＬＰ抗体（抗ＩｇＧ  ＡＬＰ）：以下は、ブロッキングのために典型的に使用された材料であり、ＩｇＧガンマグロブリンヒト結腸分画（G4368 Sigma Aldrich）であった。
【０３８７】
以下は、一般的な材料及び組織である：遠心チューブNalgene  ５０mL（＃３１１０−９５００）（フタを伴う）。
【０３８８】
膵臓、肝臓、脂肪、及び大腿四頭筋を、ＺＤＦラットから単離し、組織の超音波処理試験（Sonicato Misonix Inc Sonicaton XL 2010 hornを使用）のために使用した。組織の第２セットを、肝臓及びリンパ節を含むＺＤＦラットから単離した。膵臓、脳、肝臓、脂肪、及び大腿四頭筋を、ポリクローナル発生の間に処置したウサギから単離し、クライオスライス（AML labloratories）のために使用し、別々のスライスを左右の大脳半球及び小脳について得た。組織を、ＰＢＳを用いて、回収時に灌流した。組織を、（ＯＣＴ化合物）を伴う凍結組織スライスについて包埋し、氷槽中のディスポーザブルベース（ｃａｔ  ｎｏ  ２２．３６３．５４４）中に置き、次に、−７０℃で凍結した。ウサギ４６４、４６５、及び４６６は、キーホールリンペットヘモシアニンＫＬＨ  ＣＴＦ３３（配列番号１）を用いて接種し、応答者であり、全てが、ＣＴＦに対するポリクローナル抗体を作った。それに対して、ウサギ４６７、４６８、及び４６９は、ＢＳＡ  ＣＴＦ３３（配列番号１）を用いて接種し、非応答者であり、ＣＴＦに対するポリクローナル抗体を作らなかった。ウサギを、応答者又は非応答者として、Ｒ１  ＣＴＦ２５（配列番号１１）を使用して判断した。細胞透過溶液は、０．２%  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（ＰＢＳ中）であった。細胞洗浄溶液：１から１０にＰＢＳ中に希釈し、０．１%のＰＢＳ／Tween-20を作る。ＤＡＰＩ：４，６ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライドＭＷ  ３５０．２５  ＤＡＰＩは、１ｍｇバイアル中で来る。ＤＡＰＩを１mlのＴＥＳ中に溶解し、１mg/mlを作る。ＤＡＰＩストック溶液は数ヶ月にわたり安定であり、光から保護して−２０℃で保存した場合、繰り返し使用される。ＤＡＰＩワーキング溶液を、ＤＡＰＩストック溶液をＴＥＳ中で１：１０に希釈することにより作る（１００μg/ml  ＤＡＰＩ）。癌細胞：乳癌細胞（ＡＴＣＣ）を、実施例１０に記載する通りに培養し、そこで、濃度〜２００，０００細胞/mLまで成長させた。細胞を、１０μlを１ｍＬ中に希釈し、〜２０００細胞/mL、又は２細胞/μL又は０．．５／ＨＲＰ（ＨＲＰ＝０．２μL）を提供した。顕微鏡法を、Leica DM5000顕微鏡を用いた位相差及び蛍光顕微鏡法により行った。使用したカバースリップはFisher 12-548-6,  Permafrostスライドであった。
【０３８９】
顕微鏡法において使用したフィルターを表２２に示す。
【０３９０】
【表２２】
2014517911.tif 000026
【０３９１】
癌及び血液細胞染色
細胞サンプルを、１００μLの細胞懸濁液を、５%  ＩｇＧ又はＢＳＡを伴う１．０mLのＰＢＳに、洗浄緩衝液中で、２０，０００細胞/mL（２０細胞/μL又は５／ＨＲＰ（ＨＲＰ＝０．２μL））のために加えることにより作った（これは、また、全血を用いて行うことができる）。細胞が均等に分布したことを確保するために、細胞をボルテックスした。１００mLのテスト標準に、２０μLのＤＡＰＩを加えた（希釈１：１０）。２０μL抗体を加えた。細胞を、１５分間にわたり、３７℃でインキュベートした。細胞を、１０分間＠７５００rpmで遠心し、上清をタッピングによりデカントした（〜４５０μL）。細胞を、１０００μLのＰＢＳを用いて洗浄し、ボルテックスした。細胞を、１０分間＠７５００rpmで遠心し、上清をタッピングによりデカントした（〜４５０μL）。１００μLのＰＢＳ洗浄緩衝液を、最終的なイメージング溶液について加えた。５μLを、ガラスの長いカバースリップを伴うスライドに適用した。位相差及び蛍光顕微鏡法を、Leica DM5000を用いて行った。
【０３９２】
細胞単離のためのラット組織サンプル染色
１mLのＰＢＳへの１００mgの組織の組織サンプルを作り、２４０ワット（４０%）で１時間にわたり、細胞が均等に分布するまで、超音波処理した。細胞は加熱しなかった。むしろ、細胞を冷蔵し、冷やした。５μLのＤＡＰＩ（希釈）を、１００μLの組織サンプルに加えた。１０μLの抗体（非希釈）をサンプルに加え、１５分間にわたり室温でインキュベートした。サンプルを、５分間＠７５００rpmで遠心し、上清をタッピングによりデカントオフした（〜４５０μL）。１００μLのＰＢＳ洗浄緩衝液を、最終的なイメージング溶液について加えた。５μLのサンプルを、ガラスの長いカバースリップを伴うスライドに適用した。位相差及び蛍光顕微鏡法を、Leica DM5000顕微鏡を用いて行った。
【０３９３】
組織固定のためのラット組織サンプル染色
組織サンプルを、１mLのＰＢＳへの１００mgの組織を用いて作った。サンプルを、２４０ワットで１５分間〜３０分間にわたり、組織が薄くなるまで、超音波処理した。組織は加熱しなかった。むしろ、それを冷蔵し、冷やした。プロセス組織を顕微鏡スライドに加えた。組織部分に、疎水性ペンを用いて円を描き、液体を保持するための部分を作った。１００μLの５%ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を円部分に加えた。スライドを１５分間にわたり室温でインキュベートした。スライドを、次に、透過処理緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、０．２%）中で、洗浄槽において５〜１５分間にわたり洗浄した。スライドを除去した。スライドを、ドリップドライすることを可能にした。組織上のＦｃ受容体を、次に、５%の５０μLのＩｇＧ（ＰＢＳ中）（５mg/ml）を、スライドの円部分に加え、スライドを１５分間にわたり室温で放置することによりブロッキングした。スライドを除去し、スライドを洗浄槽中に５分間にわたり浸すことにより、細胞洗浄（ＰＢＳ／Tween-20、０．１%）中で洗浄した。スライドを除去した（ペンを再適用しなければならないことがある）。５０μLの染色を円部分に加えた。染色を、（２．０mLのＰＢＳ、１００μLのＤＡＰＩ（０．０１mg/mlに希釈））から作った。１００μLの抗体（０．１mg/mlに希釈）を加えた。スライドを１５分間にわたり３７℃でインキュベートし、次に、除去した。スライドを、次に、スライドを洗浄槽中に５分間にわたり浸すことにより、細胞洗浄緩衝液（ＰＢＳ／Tween-20、０．１%）中で洗浄した。位相差及び蛍光顕微鏡法を、Leica DM5000顕微鏡を用いて行った。
【０３９４】
組織固定のためのウサギ組織サンプル染色
顕微鏡用の組織スライスを、当技術分野に一般的な任意の慣例に従って作ることができる。作ったスライスは、灌流組織上の８umのクライオスライスであった。スライド上の組織を、疎水性ペンを用いて円を描き、液体を保持するための部分を作った。１００μLの５%ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を円部分に加えた。スライドを１５分間にわたり室温でインキュベートした。スライドを、次に、透過処理緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、０．２%）中で、洗浄槽において５〜１５分間にわたり洗浄した。スライドを除去した。スライドを、ドリップドライすることを可能にした。組織上のＦｃ受容体を、次に、５%の５０μLのＩｇＧ（ＰＢＳ中）（５mg/ml）を、スライドの円部分に加え、スライドを１５分間にわたり室温で放置することによりブロッキングした。スライドを除去し、スライドを洗浄槽中に５分間にわたり浸すことにより、細胞洗浄（ＰＢＳ／Tween-20、０．１%）中で洗浄した。スライドを除去した（ペンを再適用しなければならないことがある）。５０μLの染色を円部分に加えた。染色を、（２．０mLのＰＢＳ、１００μLのＤＡＰＩ（０．０１mg/mlに希釈））から作った。１００μLの抗体（０．１mg/mlに希釈）を加えた。スライドを１５分間にわたり３７℃でインキュベートし、次に、除去した。スライドを、次に、スライドを洗浄槽中に５分間にわたり浸すことにより、細胞洗浄緩衝液（ＰＢＳ／Tween-20、０．１%）中で洗浄した。位相差及び蛍光顕微鏡法を、Leica DM5000顕微鏡を用いて行った。
【図１】
2014517911.tif 000027
【図２】
2014517911.tif 000028
【図３ａ】
2014517911.tif 000029
【図３ｂ−３ｃ】
2014517911.tif 000030
【図４】
2014517911.tif 000031
【配列表】
2014517911000001.app
【国際調査報告】
2014517911.tif 000032
2014517911.tif 000033
2014517911.tif 000034