(57)【要約】  キトサンを用いた非ウイルス性送達システムの具体的な製剤によって、インビトロ及びインビボの両方で治療用ＲＮＡｉ誘導性核酸を細胞へ効率的に送達するための組成物及び方法を開示する。特に、組成物は、以下の物理化学的特性を有する核酸及び特定のキトサンを含有する：数平均分子量は５ｋＤａ〜２００ｋＤａの間、脱アセチル化度は８０％〜９５％の間、及び、キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率は２０未満。【選択図】図４Ａ
2014518875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでの遺伝子の発現を阻害するための組成物であって、キトサン及び前記遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸配列を含み、前記キトサンは５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｎ）、８０％〜９５％の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有し、前記キトサンのアミンと前記核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は２０未満である、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記キトサンの分子量は５〜１５ｋＤａ、ＤＤＡは９０〜９５％、及びＮ：Ｐ比は２〜１０である、組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物であって、前記キトサンの分子量は１０ｋＤａ、ＤＤＡは９２％、及びＮ：Ｐ比は５である、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記キトサンの分子量は１０ｋＤａ、４０ｋＤａ、８０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、又は２００ｋＤａである、組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記キトサンはアセチル基のブロック分布又は化学修飾を含む、組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記キトサンは１．０〜７．０の間の多分散性を有する、組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ヌクレオチドが１０〜５０個の間の二本鎖線状デオキシリボ核酸又はリボ核酸の配列である、組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸の配列のヘアピン構造である、組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、糖骨格、リン酸骨格、及び／又はヌクレオチド塩基環のいずれかにおいて化学的に修飾されている、組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、又はＲＮＡｉ誘導ベクターである、組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌の病因に関与する遺伝子を標的とする、組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、腫瘍の発生、転移、又は化学療法抵抗性の誘導に関与する遺伝子を標的とする、組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は糖調節タンパク質を標的とする、組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、前記糖調節タンパク質はインクレチン分解酵素である、組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の組成物であって、前記インクレチン分解酵素はジペプチジルペプチダーゼ‐ＩＶ（ＤＰＰ‐ＩＶ）である、組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列はアテローム生成タンパク質を標的とする、組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記アテローム生成タンパク質は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ＡｐｏＢ１００）、アポリポタンパク質Ｂ４８（ＡｐｏＢ４８）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、マトリックスメタロプロテアーゼ‐９（ＭＭＰ‐９）、又はコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）である、組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ヘリカーゼタンパク質、ＲＮＡヘリカーゼ、Ｐ６８、ＤＤＸ５、ＤＤＸ３２、ＤＤＸ１、Ａｋｔ、ＰＫＢ、ＡＢＣ輸送体のメンバー、ＭＤＲ１、ＭＲＰ、ＲＡＳタンパク質ファミリーのメンバー、ＳＲＣ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、Ａｂｌ、又はＲａｆを標的とする、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記ヘリカーゼタンパク質はＲｅｃＱヘリカーゼファミリーのメンバーである、組成物。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の組成物であって、前記ヘリカーゼタンパク質はＲｅｃＱＬ１ＤＮＡヘリカーゼである、組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組成物であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列はＭＤＲ１を標的とする、組成物。
【請求項２２】
患者における糖尿病及びその関連状態、アテローム性動脈硬化症及びその関連状態、又は癌及びその関連状態を治療するための、請求項１〜２１のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記糖尿病関連状態は、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、糖尿病誘発性高血圧、肥満、血管の損傷、目の損傷、腎臓の損傷、神経の損傷、自律神経系の損傷、皮膚の損傷、結合組織の損傷、及び免疫系の損傷である、組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の組成物であって、前記アテローム性動脈硬化症関連状態は心血管疾患である、組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、前記心血管疾患は、冠動脈心疾患、急性冠症候群、又は狭心症である、組成物。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は前記ＡｐｏＢの血漿濃度を低下させる、組成物。
【請求項２７】
請求項２２〜２５のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物はＧＬＰ‐１の生物学的利用能を増加させる、組成物。
【請求項２８】
請求項２２〜２７のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は更に前記患者のグルコース代謝の制御を向上させる、組成物。
【請求項２９】
請求項２２〜２８のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は更に前記患者の血糖値を低下させる、組成物。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は更に患者のコレステロール値を低下させる、組成物。
【請求項３１】
請求項２２〜３０のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は更に前記患者の低密度リポタンパク質濃度を低下させる、組成物。
【請求項３２】
請求項２２〜３１のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は更に前記患者の体重増加を減少させる、組成物。
【請求項３３】
請求項２２〜３２のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は、前記ＡｐｏＢの血漿濃度を少なくとも３５％低下させ、かつＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール値を少なくとも２０％低下させる、組成物。
【請求項３４】
請求項２２〜３２のうちいずれか一項に記載の組成物であって、更にインスリン、グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素、ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤、又は血糖降下化合物を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項２２〜３４のうちいずれか一項に記載の組成物であって、好適な送達剤、インスリン、又は血糖降下化合物との同時投与のために製剤化される、組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物であって、前記好適な送達剤は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン、又はリポソームである、組成物。
【請求項３７】
請求項３５に記載の組成物であって、前記血糖降下化合物は、メトホルミン、アカルボース、アセトヘキサミド、グリメピリド、トラザミド、グリピジド、グリブリド、トルブタミド、クロルプロパミド、チアゾリジンジオン、アルファ‐グルコシダーゼ阻害剤、ビグアニジン誘導体、トログリタゾン、又はこれらの混合物である、組成物。
【請求項３８】
請求項３４に記載の組成物であって、前記スルホニル尿素は、トルブタニド、トラザミド、グリソキセピド、グリミペイド、又はグリボムリドである、組成物。
【請求項３９】
請求項３４に記載の組成物であって、前記ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、又はサクサグリプチンである、組成物。
【請求項４０】
請求項２２に記載の組成物であって、前記癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部若しくは頸部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸若しくは結腸直腸の癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫、又は肉腫である、組成物。
【請求項４１】
請求項２２又は４０に記載の組成物であって、好適な送達剤のうちの少なくとも１つ及び抗癌化合物との同時投与のために製剤化される、組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物であって、前記好適な送達剤は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン、又はリポソームである、組成物。
【請求項４３】
請求項２２及び４１‐４２のうちいずれか一項に記載の組成物であって、好適な抗癌療法の間の同時投与のために製剤化される、組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の組成物であって、前記抗癌療法は、外科手術、化学療法、ホルモン療法、及び定位放射線のうちの少なくとも１つである、組成物。
【請求項４５】
請求項１〜４４のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は１ｍｇ／ｋｇの用量での注射用に製剤化される、組成物。
【請求項４６】
請求項１〜４５のうちいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は投与したときに肝臓毒性を誘発しない、組成物。
【請求項４７】
核酸配列を細胞内に送達する方法であって、請求項１〜４６のうちいずれか一項に記載の組成物を前記細胞と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記細胞は、一次細胞、形質転換細胞、又は不死化細胞である、方法。
【請求項４９】
キトサンとＲＮＡｉ誘導性核酸配列とを酸性媒体中で混合することを含む、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌を治療するための組成物を製造する方法であって、前記キトサンは、５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｎ）、８０％〜９５％の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有し、前記キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は２０未満である、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記キトサンは前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列と混合する前に、塩酸に溶解させる、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、前記キトサンは１：１の比率のグルコサミン：ＨＣｌに溶解させる、方法。
【請求項５２】
請求項４９〜５１のうちいずれか一項に記載の方法であって、前記キトサンのＭｎは１０ｋＤａ、ＤＤＡは８０％又は９２％であり、前記キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は５又は１０である、方法。
【請求項５３】
請求項４９〜５２のうちいずれか一項に記載の方法であって、前記キトサンと前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列との混合により、２００ｎｍ未満のサイズの球状ナノ粒子が生成される、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記ナノ粒子のサイズは４５〜１５６ｎｍである、方法。
【請求項５５】
キトサン及びＲＮＡ誘導性核酸配列を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む、前記患者における糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌、を治療する方法であって、前記キトサンは、５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｎ）、８０％〜９５％の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有し、前記キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は２０未満である、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記キトサンの分子量は５〜１５ｋＤａ、ＤＤＡは９０〜９５％、及びＮ：Ｐ比は２〜１０である、方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法であって、前記キトサンの分子量は１０ｋＤａ、ＤＤＡは９２％、及びＮ：Ｐ比は５である、方法。
【請求項５８】
請求項５５に記載の方法であって、前記キトサンの分子量は１０ｋＤａ、４０ｋＤａ、８０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、又は２００ｋＤａである、方法。
【請求項５９】
請求項５５に記載の方法であって、前記キトサンはアセチル基のブロック分布又は化学修飾を含む、方法。
【請求項６０】
請求項５５に記載の方法であって、前記キトサンは１．０〜７．０の間の多分散性を有する、方法。
【請求項６１】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ヌクレオチドが１０〜５０個の間の二本鎖線状デオキシリボ核酸又は二本鎖線状リボ核酸の配列である、方法。
【請求項６２】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸の配列のヘアピン構造である、方法。
【請求項６３】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、糖骨格、リン酸骨格、及び／又はヌクレオチド塩基環のいずれかにおいて化学的に修飾されている、方法。
【請求項６４】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、またＲＮＡｉ誘導ベクターである、方法。
【請求項６５】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌の病因に関与する遺伝子を標的とする、方法。
【請求項６６】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、腫瘍の発生、転移、又は化学療法抵抗性の誘導に関与する遺伝子を標的とする、方法。
【請求項６７】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は糖調節タンパク質を標的とする、方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、前記糖調節タンパク質はインクレチン分解酵素である、方法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法であって、前記インクレチン分解酵素はジペプチジルペプチダーゼ‐ＩＶ（ＤＰＰ‐ＩＶ）である、方法。
【請求項７０】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列はアテローム生成タンパク質を標的とする、方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法であって、前記アテローム生成タンパク質は、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ＡｐｏＢ１００）、アポリポタンパク質Ｂ４８（ＡｐｏＢ４８）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、マトリックスメタロプロテアーゼ‐９（ＭＭＰ‐９）、又はコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）である、方法。
【請求項７２】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ヘリカーゼタンパク質、ＲＮＡヘリカーゼ、Ｐ６８、ＤＤＸ５、ＤＤＸ３２、ＤＤＸ１、Ａｋｔ、ＰＫＢ、ＡＢＣ輸送体のメンバー、ＭＤＲ１、ＭＲＰ、ＲＡＳタンパク質のファミリーのメンバー、ＳＲＣ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、Ａｂｌ、又はＲａｆを標的とする、方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法であって、前記ヘリカーゼタンパク質はヘリカーゼのＲｅｃＱファミリーのメンバーである、方法。
【請求項７４】
請求項７２に記載の組成物であって、前記ヘリカーゼタンパク質はＲｅｃＱＬ１ＤＮＡヘリカーゼである、方法。
【請求項７５】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＲＮＡｉ誘導性核酸配列はＭＤＲ１を標的とする、方法。
【請求項７６】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は前記ＡｐｏＢの血漿濃度を低下させる、方法。
【請求項７７】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物はＧＬＰ‐１の生物学的利用能を増加させる、方法。
【請求項７８】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は更に前記患者のグルコース代謝の制御を向上させる、方法。
【請求項７９】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は更に前記患者の血糖値を低下させる、方法。
【請求項８０】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は更に患者のコレステロール値を低下させる、方法。
【請求項８１】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は更に前記患者の低密度リポタンパク質濃度を低下させる、方法。
【請求項８２】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は更に前記患者の体重増加を減少させる、方法。
【請求項８３】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は、前記ＡｐｏＢの血漿濃度を少なくとも３５％低下させ、かつＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール値を少なくとも２０％低下させる、方法。
【請求項８４】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は更に、インスリン、グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素、ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤、又は血糖降下化合物を含む、方法。
【請求項８５】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は、好適な送達剤、インスリン、又は血糖降下化合物との同時投与のために製剤化される、方法。
【請求項８６】
請求項８５に記載の方法であって、前記好適な送達剤は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン、又はリポソームである、方法。
【請求項８７】
請求項８５に記載の方法であって、前記血糖降下化合物は、メトホルミン、アカルボース、アセトヘキサミド、グリメピリド、トラザミド、グリピジド、グリブリド、トルブタミド、クロルプロパミド、チアゾリジンジオン、アルファ‐グルコシダーゼ阻害剤、ビグアニジン誘導体、トログリタゾン、又はこれらの混合物である、方法。
【請求項８８】
請求項８４に記載の方法であって、前記スルホニル尿素は、トルブタニド、トラザミド、グリソキセピド、グリミペイド、又はグリボムリドである、方法。
【請求項８９】
請求項８４に記載の方法であって、前記ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、又はサクサグリプチンである、方法。
【請求項９０】
請求項５５に記載の方法であって、前記癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸又は結腸直腸の癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫、又は肉腫である、方法。
【請求項９１】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は、好適な送達剤のうちの少なくとも１つ及び抗癌化合物と共に投与される、方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の方法であって、前記好適な送達剤は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン、又はリポソームである、方法。
【請求項９３】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は好適な抗癌療法の間に同時投与される、方法。
【請求項９４】
請求項９３に記載の方法であって、前記抗癌療法は、外科手術、化学療法、ホルモン療法、及び定位放射線のうちの少なくとも１つである、方法。
【請求項９５】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は１ｍｇ／ｋｇの用量で注射される、方法。
【請求項９６】
請求項５５に記載の方法であって、前記組成物は投与したときに肝臓毒性を誘発しない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４８９，３０６号、及び２０１１年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４８９，３０２号の優先権を主張し、それらの全内容を本明細書において援用する。
【０００２】
技術分野
本発明の記載は、特定のキトサン系ナノ複合体を用いて治療用ＲＮＡｉ誘導性核酸を効率的に送達するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ｓｉＲＮＡ（低分子（short）干渉ＲＮＡ）による遺伝子サイレンシングは、生物学における発展分野であり、かつ治療可能性を有する新規な転写後遺伝子サイレンシング戦略として進化してきた。ヒトゲノムの配列決定及び疾患の分子原因の理解に基づき、意のままに病原性遺伝子をオフにできる可能性は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び癌などの多種多様な臨床的病状を治療するための魅力的な手法である。ｓｉＲＮＡにより、疾患に関与するヒトゲノム中のほぼ全ての遺伝子は制御の影響を受けやすいため、創薬に対する機会が開かれている。局所投与されるｓｉＲＮＡについては既に最初の臨床試験に入っている一方で、ｓｉＲＮＡの全身送達を成功させるための戦略は、まだ開発の前臨床段階にある。
【０００４】
ＩＩ型糖尿病
ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は、多様な病的症状を伴う進行性代謝障害であり、多くの場合、脂質代謝及び糖代謝における障害と関連している（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４：７８８‐７９１）。ＩＩ型糖尿病は、筋肉、脂肪組織、及び肝臓などの末梢組織におけるインスリン作用に対する抵抗性を特徴とする。また、膵β細胞のインスリンを分泌する能力における進行性障害も特徴とする。糖尿病の長期的な影響は、その血管合併症：微小血管合併症、網膜症、神経障害、及び腎症から生じる。大血管合併症も同様にＩＩ型糖尿病と関連し、かつ心血管及び脳血管の合併症を含む。
【０００５】
今日知られている抗糖尿病薬の主な種類は以下の通りである。ビグアニドは、肝臓でのグルコース産生を阻害し、腸管吸収を減少させ、かつ末梢でのグルコースの取り込みを強化することによって、血糖を制御するのに役立つ薬物の種類である。この種類には、グルコース及び血中トリグリセリドの濃度の両方を下げる薬物であるメトホルミンが含まれる。スルホニル尿素は、膵臓のβ細胞からの内因性インスリンの放出を刺激することにより、ＩＩ型糖尿病を制御又は管理するのに役立つ薬物の種類である。この種類には、とりわけ、トルブタミド、トラザミド、グリソキセピド、グリミペイド（ｇｌｉｍｉｐｅｉｄｅ）、及びグリボムリド（ｇｌｉｂｏｍｕｒｉｄｅ）が含まれる。グリコシダーゼ阻害剤は、膵臓細胞からのインスリンの放出を刺激するため血糖値を下げ、レパグリニド及びナテグリニドを含む。
【０００６】
残念ながら、これらの治療法は組み合わせたとしても、頻繁に安全性、忍容性、体重増加、浮腫、及び胃腸不耐性によって制約される（Ｄｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，９：２６７‐２６８；Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，３２：８４‐９０；Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｉｍ  Ｃａｒｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４：６１‐６３；Ｔｒｕｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ，２６：１３２１‐１３３１；及びＷａｊｃｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｔａｖａｒｉａ，２００９，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，１０：１３５‐１４２）。更に、疾患が進行し、β細胞の機能が低下すると、進行中の治療の有効性が減少する（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＪＡＭＡ，２８１：２００５‐２０１２）。
【０００７】
インクレチン効果の発見により、最小限の副作用を有するＴ２ＤＭを制御可能な治療薬の種類を用いて、治療の新しい道が提供されてきた。インクレチン効果は、インスリン分泌の刺激を介して食後の血糖値を調節するグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ‐１）によって主に仲介される。ＧＬＰ‐１はまた、動物モデルにおいて実証されているように、胃内容排出の遅延、ＧＬＰ‐１が中枢神経系に与える効果による満腹感の促進、β細胞増殖の促進、β細胞アポトーシスの阻害などの間接的な効果も有する（Ｎａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，８７：１２３９‐１２４６；及びＣｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，１９：５８０‐５８６）。しかしながら、臨床におけるＧＬＰ‐１の可能性は、遍在性のセリンプロテアーゼジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ‐ＩＶ）によるＧＬＰ‐１の急速な分解によって妨害されていた。ＤＰＰ‐ＩＶがＧＬＰ‐１のＮ末端領域におけるＨｉｓ：Ａｌａ：Ｇｌｕ配列を開裂するという発見により、ＤＰＰ‐ＩＶ抵抗性ＧＰｌ‐１類似体の開発、及びＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤の開発が可能となった。
【０００８】
ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのタンパク質分解活性を阻害する新たな種類の薬物である。ＤＰＰ‐ＩＶのタンパク質分解活性は、インクレチンとして知られている糖調節(glycoregulation)ペプチドの血中濃度を低下させる。それ故、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害により、これらのインクレチン、特に、グルカゴン様ペプチド１（ＧＰｌ‐１）の作用が増強する。これらの阻害剤には、シタグリプチン、ビルダグリプチン、及びサクサグリプチンが含まれ、かつ１日１回経口投与される。
アテローム性動脈硬化症
【０００９】
アテローム性動脈硬化症は、動脈内でのアテローム斑の形成によって引き起こされる慢性疾患である。アテローム性動脈硬化症は、冠動脈心疾患、急性冠症候群、及び狭心症などの多くの心血管疾患を表す（Ｌｌｏｙｄ‐Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２１：ｅ４６‐ｅ２１５）。米国では、２０１０年のアテローム性動脈硬化症の予測経済コストは５０３０億ＵＳドルであり、それは主に、直接的な医療及び間接的な生産コストによるものであった（Ｌｌｏｙｄ‐Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２１：９４８‐９５４）。アテローム性動脈硬化症に対する原因因子は不明のままであるが、証拠の増加から、脂質異常症、高脂血症、及び炎症のこの疾患の病因における高い役割が示唆されている（Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：５０８‐５１９；Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｈ，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ａｇｉｎｇ，３：３４１‐３４９）。現在、アテローム性動脈硬化症及び関連病態の心血管疾患（ＣＶＤ）による罹患率及び死亡率の減少は、一般的にスタチン系の治療と称される、３‐ヒドロキシ‐３‐メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ‐ＣｏＡ）還元酵素阻害剤の積極的な臨床使用に主に起因する（Ｖｅｒｍｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＢＭＪ，３３７：ａ２４２３）。これらの治療は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ‐Ｃ）を減少させる。介入研究により、脂質低下治療が施されると、ＣＶＤの罹患率及び死亡率におけるリスクが減少することが実証された。更に、減少した罹患率／死亡率、及びＬＤＬ‐Ｃの低下から、対数線形的な関連性が示された（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＢＭＪ，３０８：３６７‐３７２）。
【００１０】
ＬＤＬ‐Ｃを低下させるため、従って、アテローム性動脈硬化症を減少させるための別の手法は、肝臓からの超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）分泌の阻害又は遮断である。アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）はＶＬＤＬの分泌に必要であるため、この阻害はＡｐｏＢを標的とすることにより達成することができる（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８８：２５１‐２６７）。ＡｐｏＢは主に、ヒトの肝細胞及び腸細胞で発現される。
【００１１】
ヒトでは、ＡｐｏＢ遺伝子は染色体２（２ｑ）に位置し、かつ４３ｋｂにわたる。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡは２８個のイントロン及び２９個のエキソンから成り、１６時間の半減期を特徴とする（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＤＮＡ，６：３６３‐３７２；Ｓｃｏｔｔ，１９８９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１：１１４１‐１１４７）。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの翻訳から、４，５３６個のアミノ酸、かつ５１７‐５５０ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質が生じ、それ故、最大の単量体タンパク質の１つとして表される。アテローム性動脈硬化症及びその関連するＣＶＤのための代替療法としてのＡｐｏＢ阻害の重要性は、ＡｐｏＢのβシートドメインを介して、例えばリン脂質、コレステロール、及びコレステロールエステルなどの脂質と物理的に相互作用するＡｐｏＢの能力により、肝臓において大きなリポタンパク質粒子、すなわちＶＬＤＬが形成され、かつ腸においてカイロミクロンが形成されることにある（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８８：２５１‐２６７において検討された）。
癌
【００１２】
古典的な癌療法には、１つ又はいくつかの化学療法薬の使用が含まれる。これらの治療法は、化学療法薬の非特異性により、毒性及び重度の副作用と関連する。化学療法に関連する別の主要な問題は、経時的な化学療法抵抗性の発生である。例えば、化学療法に対する抵抗性は乳癌の管理に関連する主要な問題の１つである。
【００１３】
癌細胞は１以上の化学療法剤に対する抵抗性を獲得するための多くのメカニズムを使用している。薬剤耐性の主要なメカニズムとしては、（１）可溶性薬物の細胞内取り込みの減少、（２）所望の細胞損傷を引き起こす薬物の能力を変化させる細胞内の遺伝子及び表現型の変化、及び（３）多剤耐性（ＭＤＲ）をもたらす細胞表面輸送体による薬物流出の増加、が挙げられる。これら全ての場合において、単一の化学療法物質に対する抵抗性は、常に他の化学療法薬に対する広範囲の薬剤耐性パターンと関連する。
【００１４】
最も一般的かつ研究された抵抗メカニズムの１つは、輸送タンパク質による細胞内薬物濃度の減少であり、輸送タンパク質は薬物が作用部位に到達する前に薬物を細胞外に排出するため、細胞は薬剤誘発性細胞死を受けることなく低薬物濃度に適応する。これらの輸送体のほとんどは、ＡＴＰ結合カセット膜貫通タンパク質スーパーファミリーに属する。
【００１５】
ヒトでは、４８個のＡＢＣ遺伝子（ＡＴＰ結合カセットファミリーの遺伝子）がこれまでに特定されている。乳癌では、実際にこれまでに報告された全てのＭＤＲ耐性は、以下のタンパク質のうちの１つと密接に関連していた：ｐ糖タンパク質（Ｐ‐ｇｐ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、及び乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）。
【００１６】
Ｐ‐ｇｐは、種々の癌組織における薬物のＡＴＰ依存性排出に関与する最も一般的なタンパク質である。しばらくの間、過剰発現Ｐ‐ｇｐは、哺乳動物の腫瘍細胞においてＭＤＲをもたらし得る唯一のタンパク質であると考えられていた。乳癌において、化学療法の治療を受けた５２％の患者では、治療により患者らのＰ‐ｇｐは上方制御されていた。Ｐ‐ｇｐをコードする遺伝子はＡＢＣＢ１（ｍｄｒ１）と称され、染色体７の位置ｑ２１．１２に位置する。ＡＢＣＢ１は２８個のエキソンから構成されており、その産物は１．２ｋｂのｍＲＮＡをもたらす。Ｐ‐ｇｐのタンパク質配列分析から、２つの細胞質外ドメインの存在が明らかとなり、各々は６個の推定膜貫通領域、及びＡＴＰ結合共通モチーフを含む。
【００１７】
更に、ゲノムの完全性及び安定性の維持に関与する興味深い酵素の１種類は、ＤＮＡヘリカーゼである。これらのタンパク質は、二本鎖ゲノムをほどき、損傷又は誤対合したＤＮＡへの修復機構の接近を可能とするＡＴＰ依存性機構による、ＤＮＡの複製、修復、組み換え、及び転写において重要な役割を果たしている。
【００１８】
例えば、ヘリカーゼのＲｅｃＱファミリーは、組換え、修復、及びホリデイジャンクションの形成において重要な役割を果たすことが示されている。より最近では、これらのヘリカーゼは、転写後の遺伝子サイレンシングの過程に関与していた（Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：２３４２‐２３４４）。この過程では、あらゆるハイブリダイゼーション及びサイレンシング機構が開始され得る前に、二本鎖ＤＮＡを分離するためにヘリカーゼが必要とされる。このファミリーのタンパク質に対して、他の役割が提唱されている。例えば、ＲｅｃＱＬ１は、２つのハイブリッドスクリーニングで実証されるように、核局在シグナルとして機能するＱＩＰ１及びＱＩＰ２のタンパク質の両方と相互作用するので、核タンパク質輸送において役割を担っていると考えられている（Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，２３４：４８‐５３）。
【００１９】
ＲｅｃＱファミリーは、５つのメンバーから構成され、それらが付加的なカルボキシ末端基又はアミノ末端基を含有するか否かに応じて２つのグループに分けることができる。これらの遺伝子の変異は、癌だけでなく、他の生理学的な異常の発生率の増加を引き起こす（Ｋａｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，１０：３２‐３８；Ｋａｗａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：４７６７‐４７７２）。このような異常としては、ブルーム症候群（ＢＬＭ）、ウェルナー症候群（ＷＲＮ）、及びロスモンド‐トムソン症候群（ＲｅｃＱ４）が挙げられる。ヒトＲｅｃＱＬ１遺伝子は特定されたこのファミリーの最初のヒトメンバーであり、大腸菌ＤＮＡヘリカーゼ、ＲｅｃＱとの広範な相同性を有することが示されており、かつ染色体１２ｐ１１に位置している（Ｐｕｒａｎａｍ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｓｈｅａｒ，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：２９８３８‐２９８４５；Ｐｕｒａｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６：５９５‐５９８）。
【００２０】
とりわけ、ＡｓＰＣ１、Ａ５４９、及びＬＳ１７４Ｔなどの癌性細胞株におけるＲｅｃＱＬ１の過剰発現は、これらの癌性細胞において高い組換え率を補償するために引き起こされ、それ故、アポトーシスを防止すると考えられている（Ｆｕｔａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，９９：７１‐８０）。これらの細胞株において、又はマウス異種移植モデルにおいて、特定のｓｉＲＮＡを用いたＲｅｃＱＬ１遺伝子サイレンシングは、癌性細胞死の増加及び腫瘍塊の減少をもたらす（Ｆｕｔａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，９９：７１‐８０）。
【００２１】
恒常的安定性及び機能的完全性の維持に関与する酵素の他の種類には、ＲＮＡヘリカーゼがある。これらの酵素は、８個の保存モチーフから成る、中央に位置する「ヘリカーゼドメイン」の存在を特徴とする。これらのモチーフに基づいて、ＲＮＡヘリカーゼはファミリーに分類される。これらの保存モチーフは、ＮＴＰ加水分解及びＲＮＡ巻き戻し機能を実行するために必要とされる（Ｌｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．，２６：３３９‐３４１；Ｔａｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｒ，２００１，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，８：２５１‐２６２）。ＲＮＡヘリカーゼと関連する他の機能は、ＲＮＡ‐タンパク質相互作用の破壊である（Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１２１‐１２５）。これらの酵素は、それらのＮＴＰａｓｅ及びヘリカーゼの活性の両方を制御することができる分子複合体のメンバーである（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３１２：１‐１６）。ＲＮＡ二次構造の調節により、スプライシング（Ｂａｌｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１５：１６５‐１６９）、及び翻訳（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，１９９９，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３１：８７‐１０６）などの段階が制御されるので、これらのヘリカーゼに固有の特徴は、転写後の事象において重要な役割を果たしている。
【００２２】
ＲＮＡヘリカーゼなどのＲＮＡプロセシング分子の調節不全は、ヒトの病理及び癌の発生に関与している。ヒトの病理に関与するこれらのヘリカーゼの例としては、とりわけ、ＤＤＸ１／５／６／９／１０、及びＤＨＸ３２が挙げられる（Ａｂｄｅｌｈａｌｅｅｍ，２００４，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４，２４：３９５１‐３９５３；Ａｂｄｅｌｈａｌｅｅｍ，２００４，Ｂｉｏｃｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７０４：３７‐４６）。これらのヘリカーゼは、特徴的なＤＥＡＤボックスドメインを含み、かつほとんどの癌において上方制御されている（Ａｂｄｅｌｈａｌｅｅｍ，２００４，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４，２４：３９５１‐３９５３；Ａｂｄｅｌｈａｌｅｅｍ，２００４，Ｂｉｏｃｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７０４：３７‐４６）。
【００２３】
今日のところ、インビボにおいてｓｉＲＮＡ送達を維持することにより、代替療法を提供する必要性がなお存在する。特に、ＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び癌を治療するための代替手段を提供することが非常に望ましいであろう。
【発明の概要】
【００２４】
本発明の記載の目的の１つは、キトサン及びＲＮＡ誘導性核酸配列を含む組成物を提供することであり、キトサンは、５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｎ）、８０％〜９５％の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有し、キトサンのアミンと核酸のリン酸（phosphate）との比率（Ｎ：Ｐ）は２０未満である。
【００２５】
本発明の記載の他の目的は、患者における、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌、及び／又は関連状態を治療するために、本明細書に記載の組成物を提供することである。
【００２６】
本発明の記載によれば、キトサン及びＲＮＡ誘導性核酸配列を酸性媒体中で混合することを含む、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌、及び／又は関連状態を治療するための組成物を製造する方法が提供され、キトサンは、５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｎ）、８０％〜９５％の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有し、キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は２０未満である。
【００２７】
本発明の記載によれば、患者における糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌、及び／又は関連状態を治療するための；又は患者における糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌、及び／又は関連状態を治療するための薬剤の製造における、本明細書で定義する組成物の使用も提供される。
【００２８】
本発明の記載の目的の１つは、患者における癌の治療、又は化学療法抵抗性の逆転、又は両方の組み合わせのために、本明細書に記載の組成物を提供することである。本発明の記載によれば、癌を治療するため、又は古典的な化学療法に対する化学療法抵抗性の癌における感受性を増加させるため、又は両方のために、組成物を製造する方法が提供される。
【００２９】
本発明の記載の他の目的は、患者における糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌、及び／又は関連状態を治療する方法を提供することであり、それは本明細書で定義する組成物、より具体的には、キトサン及びＲＮＡ誘導性核酸配列を含む組成物の有効量を患者に投与することを含み、キトサンは、５ｋＤａ〜２００ｋＤａの分子量（Ｍｎ）、８０％〜９５％の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有し、キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は２０未満である。
【００３０】
また、本明細書に記載の組成物が細胞と接触する段階を含む、核酸配列を細胞に送達する方法を提供する。
【００３１】
一実施形態では、キトサンの分子量は、５〜１５ｋＤａ、ＤＤＡは９０〜９５％、かつＮ：Ｐ比は２〜１０であり、好ましくはキトサンの分子量は１０ｋＤａ、ＤＤＡは９２％、かつＮ：Ｐ比は５である。
【００３２】
さらなる実施形態では、キトサンの分子量は１０ｋＤａ、４０ｋＤａ、８０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、又は２００ｋＤａである。
【００３３】
他の実施形態では、キトサンは、アセチル基のブロック分布又は化学修飾を含む。
【００３４】
さらなる実施形態では、キトサンは１．０〜７．０の間の多分散性を有する。
【００３５】
さらなる実施形態では、ＲＮＡ誘導性核酸配列は、ヌクレオチドが１０〜５０個の間の二本鎖線状デオキシリボ核酸配列であり；ＲＮＡ誘導性核酸配列は、ヌクレオチドが１０〜５０個の間の二本鎖線状リボ核酸配列であり；ＲＮＡ誘導性核酸配列は、デオキシリボ核酸配列又はリボ核酸配列のヘアピン構造であり；及び／又はＲＮＡ誘導性核酸配列は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、又はＲＮＡｉ誘導ベクターである。
【００３６】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、糖骨格、リン酸骨格、及び／又はヌクレオチド塩基環のいずれかにおいて化学的に修飾されている。
【００３７】
好ましくは、ＲＮＡ誘導性核酸配列は、ＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は癌の病因に関与する遺伝子；例えば腫瘍の発生、転移、又は化学療法抵抗性の誘導若しくは獲得などに関与する遺伝子、糖調節タンパク質又はアテローム生成タンパク質；例えばインクレチン分解酵素など；例えばジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ‐ＩＶ）など；例えばアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ＡｐｏＢ１００）、アポリポタンパク質Ｂ４８（ＡｐｏＢ４８）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ‐９（ＭＭＰ‐９）、又はコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）などを標的とする。
【００３８】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ヘリカーゼタンパク質、ＲＮＡヘリカーゼ、Ｐ６８、ＤＤＸ５、ＤＤＸ３２、ＤＤＸ１、Ａｋｔ、ＰＫＢ、ＡＢＣ輸送体のメンバー、ＭＤＲ１、ＭＲＰ、ＲＡＳタンパク質ファミリーのメンバー、ＳＲＣ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、Ａｂｌ、又はＲａｆを標的とする。
【００３９】
他の実施形態では、ヘリカーゼタンパク質は、例えば、ＲｅｃＱＬ１  ＤＮＡヘリカーゼなどの、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリーのメンバーである。更に、ＲＮＡｉ誘導性核酸配列は、ＭＤＲ１を標的とする。
【００４０】
他の実施形態では、糖尿病関連状態は、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、糖尿病誘発性高血圧、肥満、血管の損傷、目の損傷、腎臓の損傷、神経の損傷、自律神経系の損傷、皮膚の損傷、結合組織の損傷、及び免疫系の損傷である。
【００４１】
さらなる実施形態では、アテローム性動脈硬化症に関連する状態は、冠動脈心疾患、急性冠症候群、又は狭心症などの心血管疾患である。
【００４２】
他の実施形態では、組成物は、ＡｐｏＢの血漿濃度を低下させ； ＧＬＰ‐１生物学的利用能を増加させ；患者のグルコース代謝の制御を向上させ；患者の血糖値を低下させ；患者のコレステロール値を低下させ；患者の低密度リポタンパク質濃度を低下させ、及び／又は患者の体重増加を減少させる。
【００４３】
さらなる実施形態では、組成物はＡｐｏＢの血漿濃度を少なくとも３５％低下させ、かつＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール値を少なくとも２０％低下させる。
【００４４】
他の実施形態では、組成物は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、乳房内投与、腹腔内投与、経口投与、又は胃腸投与用に製剤化される。
【００４５】
特定の実施形態では、組成物は１ｍｇ／ｋｇの用量での注射用に製剤化される。
【００４６】
他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、インスリン、グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素、ＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤、又は血糖降下化合物を含むことができる。
【００４７】
本明細書に記載の組成物はまた、好適な送達剤、インスリン、又は血糖降下化合物との同時投与のために製剤化することができる。このような送達剤は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン、若しくはリポソームであり；又はこのような血糖降下化合物は、メトホルミン、アカルボース、アセトヘキサミド、グリメピリド、トラザミド、グリピジド、グリブリド、トルブタミド、クロルプロパミド、チアゾリジンジオン、アルファ‐グルコシダーゼ阻害剤、ビグアニジン（ｂｉｇｕａｎｉｎｄｉｎｅ）誘導体、トログリタゾン、又はこれらの混合物であり；このようなスルホニル尿素は、トルブタニド（ｔｏｌｂｕｔａｎｉｄｅ）、トラザミド、グリソキセピド、グリミペイド、又はグリボムリドであり；このようなＤＰＰ‐ＩＶ阻害剤は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、又はサクサグリプチンである。
【００４８】
一実施形態では、癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部若しくは頸部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸若しくは結腸直腸の癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫、又は肉腫である。
【００４９】
他の実施形態では、組成物は、好適な送達剤のうちの少なくとも１つ及び抗癌化合物との同時投与のために製剤化される。
【００５０】
好適な送達剤は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン、又はリポソームとすることができる。
【００５１】
また、組成物は、好適な抗癌療法の間の同時投与のために製剤化されることが記載されており、このような抗癌療法は、外科手術、化学療法、ホルモン療法、及び定位放射線のうちの少なくとも１つである。
【００５２】
好ましい実施形態では、組成物は、投与されたときに肝臓毒性及び炎症を誘導しない。
【００５３】
本明細書に記載の組成物は、更に、５〜７．１の間で変化するｐＨを有するトランスフェクション媒体を含むことができ；乾燥粉末として製剤化することができ；及び／又は水性媒体中で粒子の懸濁液である。
【００５４】
他の実施形態では、キトサンはＲＮＡ誘導性核酸配列と混合する前に、塩酸に溶解させる。
【００５５】
好ましくは、キトサンは１：１の比率のグルコサミン：ＨＣｌに溶解させる。
【００５６】
他の実施形態では、キトサンとＲＮＡ誘導性核酸配列との混合により、２００ｎｍ未満のサイズ、好ましくは４５〜１５６ｎｍのサイズの球状ナノ粒子が生成される。
【００５７】
一実施形態では、細胞は一次細胞、形質転換細胞、又は不死化細胞である。
【００５８】
他の実施形態では、キトサンはＲＮＡｉ誘導性核酸配列と混合する前に、塩酸に溶解させる。
【００５９】
他の実施形態では、キトサンのＭｎは１０ｋＤａ、ＤＤＡは８０％又は９２％であり、キトサンのアミンと核酸のリン酸との比率（Ｎ：Ｐ）は５又は１０である。
【００６０】
次に、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１Ａは、（Ａ）９２‐１０‐５キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶナノ粒子、（Ｂ）８０‐８０‐５キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶナノ粒子、（Ｃ）８０‐１０‐１０キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶナノ粒子、（Ｄ）９２‐１０‐５キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢナノ粒子、（Ｅ）８０‐８０‐５キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢナノ粒子、及び（Ｆ）８０‐１０‐１０キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢナノ粒子の、球状キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子及び集団サイズ分布における環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）画像を示している。図１Ｂは、（Ａ）９２‐１０‐５キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＲｅｃＱＬ１ナノ粒子、（Ｂ）８０‐４０‐５キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＲｅｃＱＬ１ナノ粒子、及び（Ｃ）８０‐１０‐１０キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＲｅｃＱＬ１ナノ粒子の、球状キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子及び集団サイズ分布における環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）画像を示している。
【図２】（００６２）図２Ａは、（Ａ）８０‐１０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子、（Ｂ）８０‐４０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子、（Ｃ）９２‐１０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子、及び（Ｄ）９２‐４０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子の、球状キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子及び集団サイズ分布における環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）画像を示している。図２Ｂは、（Ａ）８０‐１０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＭＤＲ１ナノ粒子、（Ｂ）８０‐２００‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＭＤＲ１ナノ粒子、（Ｃ）９２‐１０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＭＤＲ１ナノ粒子、及び（Ｄ）９２‐１５０‐５キトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＭＤＲ１ナノ粒子の、球状キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子及び集団サイズ分布の環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）画像を示している。
【図３】（００６３）図３Ａは、異なるｐＨ値及び異なる時間の間インキュベートした様々なＮ：Ｐ比を有するキトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真表示を示している。（Ａ）ｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶ及び（Ｂ）ｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢと複合体を形成し、ｐＨ６．５（ＭＥＳ）及びｐＨ８（ＴＡＥ）中で０．５時間、４時間、及び２０時間インキュベートしたキトサン９２−１０を示している。図３Ｂは、異なるｐＨ値及び異なる時間の間インキュベートした様々なＮ：Ｐ比を有するキトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示している。キトサン９２‐１０はｄｓＯＤＮ‐ＲｅｃＱＬ１と複合体を形成して、かつｐＨ６．５（ＭＥＳ）及びｐＨ８（ＴＡＥ）中で０．５時間、４時間，及び２０時間インキュベートした。ナノ粒子が上記の条件で安定でない場合、ｓｉＲＮＡを模倣したｄｓＯＤＮは放出され、ゲル中に移動する。
【図４】（００６４）図４ＡはｐＨ６．５でのキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子の安定性における柱状図を示している。異なるＤＤＡ及びＭＷのキトサン製剤は、Ｎ：Ｐ比が５及び１０で３つの異なる抗ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＡｐｏＢ１、ｓｉＡｐｏＢ２、及びｓｉＡｐｏＢ３）と複合体化し、かつ２０時間インキュベートし、ナノ粒子形成後、核酸定量に用いるＲＮＡ挿入色素であるＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）を各試料に添加して複合体化していないＲＮＡ画分を測定した。高い蛍光値は粒子分解及び不安定性を表している。図４Ｂは、ＭＷがナノ粒子サイズに及ぼす影響を示す柱状図を示している。９２％のＤＤＡ及び異なるＭＷのキトサンが、異なるＮ：Ｐ比で抗ＲｅｃＱＬ１  ｓｉＲＮＡと複合体化した。図４Ｃは、ＭＷがナノ粒子サイズに及ぼす影響を示す柱状図を示している。８０％のＤＤＡ及び異なるＭＷのキトサンが、異なるＮ：Ｐ比で抗ＲｅｃＱＬ１  ｓｉＲＮＡと複合体化した。図４Ｄは、ＭＷがナノ粒子サイズに及ぼす影響を示す柱状図を示している。７２％のＤＤＡ及び異なるＭＷのキトサンが、異なるＮ：Ｐ比で抗ＲｅｃＱＬ１  ｓｉＲＮＡと複合体化した。図４Ｅは、動的光散乱で測定した、ＲｅｃＱＬ１  ｓｉＲＮＡ濃度がナノ粒子サイズに及ぼす影響、及び塩がナノ粒子サイズに及ぼす影響を示す柱状図を示しており、Ｎ：Ｐ比が５で、９２％のＤＤＡ、１０の分子量を有するキトサンは、増加する濃度の抗ＲｅｃＱＬ１  ｓｉＲＮＡと複合体化した。
【図５】（００６５）図５は、異なるｐＨにおいて、ＤＤＡ、ＭＷ、及びＮ：Ｐ比がナノ粒子の安定性に及ぼす影響を示しており、低い蛍光は粒子の安定性を示している。様々なＤＤＡ、ＭＷのキトサンが、異なるＮ：Ｐ比で抗ＭＤＲ１  ｓｉＲＮＡと複合体化してナノ粒子を形成した。ナノ粒子を異なるｐＨでインキュベートし、ｓｉＲＮＡの放出をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを用いて測定した。
【図６】（００６６）図６Ａは、キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子のヌクレアーゼ保護アッセイ：（Ａ）ｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶと複合体を形成したキトサン（９２‐１０‐５又は８０‐１０‐１０）、（Ｂ）ＤＮＡｓｅ  Ｉ消化後に残ったｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶ、（Ｃ）ｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢと複合体を形成したキトサン（９２‐１０‐５又は８０‐１０‐１０）、（Ｄ）ＤＮＡｓｅ  Ｉ消化後に残ったｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢ、の結果を示しており、全ての消化は対照を用いて処理試料の信号強度により評価した（すなわち、０Ｕ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ＝強度１００％）。図６Ｂは、キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子のヌクレアーゼ保護アッセイ：（Ａ）ｄｓＯＤＮ‐ＲｅｃＱＬ１と複合体を形成したキトサン（９２‐１０‐５、８０‐４０‐５、又は８０‐１０‐１０）、及び（Ｂ）ＤＮＡｓｅ  Ｉ消化後に残ったｄｓＯＤＮ‐ＲｅｃＱＬ１、の結果を示しており、全ての消化は対照を用いて処理試料の信号強度により評価した（すなわち、０Ｕ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ＝強度１００％）。
【図７】（００６７）図７Ａは、いくつかの細胞株でのトランスフェクションから２４時間後のｄｓＯＤＮ／ナノ粒子の細胞内取り込み：（Ａ）ＨｅｐＧ２細胞株におけるキトサン（９２‐１０‐５、８０‐８０‐５、又は８０‐１０‐１０）／５’‐６ＦＡＭ標識ｄｓＯＤＮ  ＤＰＰ‐ＩＶの取り込み；及び（Ｂ）ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３、及びＲＡＷ２６４．７細胞におけるキトサン（９２‐１０‐５、８０‐８０‐５、又は８０‐１０‐１０）／５’‐６ＦＡＭ標識ｄｓＯＤＮ‐ＡｐｏＢの取り込み、における柱状図表現を示しており、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）＃１及び４を取り込みの陽性対照として用いた。図７Ｂは、いくつかの細胞株でのトランスフェクションから２４時間後のｄｓＯＤＮ／ナノ粒子の細胞取り込み：ＡｓＰＣ１、ＬＳ１７４Ｔ、及びＡ５４９細胞株におけるキトサン（９２‐１０‐５、８０‐４０‐５、又は８０‐１０‐１０）／５’‐６ＦＡＭ標識ｄｓＯＤＮ  ＲｅｃＱＬ１の取り込み、を示す柱状図を示しており、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）＃１を取り込みの陽性対照として用いた。
【図８】（００６８）図８は、キトサン／ｄｓＯＤＮ‐ＤＰＰ‐ＩＶナノ粒子でトランスフェクトした（Ａ）ＨｅｐＧ２、（Ｂ）Ｃａｃｏ‐２、及び（Ｃ）ＨＴ‐２９の細胞株、キトサン／ｄｅＯＤＮ‐ＡｐｏＢナノ粒子でトランスフェクトした（Ｄ）ＨｅｐＧ２、（Ｅ）ＨＥＫ２９３、及び（Ｆ）ＲＡＷ２６４．７の細胞株における、トランスフェクションから２４時間後のキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子取り込みの共焦点画像を示している。キトサン９２‐１０（ＤＤＡ、Ｍｎ）をローダミン（赤）で標識し、かつｄｓＯＤＮを６ＦＡＭ（緑）で５’標識した。キトサン９２‐１０はＮ：Ｐ比が５でｓｉＲＮＡと複合体化した。細胞膜を染色してから膜アンカー両親媒性色素であるＣｅｌｌＭａｓｋ(登録商標)（青）で造影し、内部移行したナノ粒子と膜に結合したナノ粒子とを区別した。示される画像は、ｄｓＯＤＮは緑、キトサンは赤、膜は青、透過ＤＩＣは灰色でそれぞれ別々のチャネルを表しており、合成画像を左下部分に示す。
【図９】（００６９）図９は、トランスフェクションから２４時間後のキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子取り込みの共焦点画像を示している。ＬＳ１７４Ｔ細胞株をキトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＲｅｃＱＬ１ナノ粒子でトランスフェクトした。画像はトランスフェクションから２４時間後に撮影した。キトサン９２‐１０（ＤＤＡ、Ｍｎ）をローダミン（赤）で標識し、かつｓｉＲＮＡを６ＦＡＭ（緑）で５’標識した。キトサン９２‐１０はＮ：Ｐ比が５でｓｉＲＮＡ‐ＲｅｃＱＬ１と複合体化した。細胞膜を染色してからＣｅｌｌＭａｓｋ(登録商標)（青）で造影した。示される画像は、ｓｉＲＮＡは緑、キトサンは赤、膜は青、透過ＤＩＣは灰色でそれぞれ別々のチャネルを表しており、合成画像を左下部分に示す。
【図１０】（００７０）図１０は、トランスフェクションから２４時間後のキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子取り込みの共焦点画像を示している。ＭＣＦ‐７ＭＤＲ細胞株をキトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＭＤＲ１ナノ粒子でトランスフェクトした。画像はトランスフェクションから２４時間後に撮影した。キトサン９２‐１０（ＤＤＡ、Ｍｎ）をローダミン（赤）で標識し、かつｓｉＲＮＡをＣｙ３（緑）で５’標識した。キトサン９２‐１０（Ａ）キトサン８０‐１０（Ｂ）、及びキトサン８０‐２００（Ｃ）は、Ｎ：Ｐ比が５でｓｉＲＮＡ‐ｃｙ３と複合体化した。細胞膜を染色してからＣｅｌｌＭａｓｋ(登録商標)（青）で造影した。示される画像は、ｓｉＲＮＡは緑、キトサンは赤、膜は青、透過ＤＩＣは灰色でそれぞれ別々のチャネルを表しており、合成画像を左下部分に示す。
【図１１】（００７１）図１１Ａは、特定の細胞株におけるＤＰＰ‐ＩＶ及びＡｐｏＢの遺伝子発現阻害におけるリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析の柱状図を示している。ＨｅｐＧ２細胞を（Ａ）キトサン（９２‐１０‐５、８０‐８０‐５、及び８０‐１０‐１０／ｓｉＲＮＡ‐ＤＰＰ‐ＩＶ）；（Ｂ）キトサン（９２‐１０‐５／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢ）ナノ粒子でトランスフェクトし、阻害率は△△ＣＴ法を用いて、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞とを比較することにより得た。図１１Ｂは、特定の細胞株におけるＲｅｃＱＬ１遺伝子発現阻害におけるリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を示す柱状図を示している。ＬＳ１７４Ｔ細胞をキトサン（９２‐１０‐５、８０‐４０‐５、及び８０‐１０‐１０／ｓｉＲＮＡ‐ＲｅｃＱＬ１）でトランスフェクトし、阻害率は△△ＣＴ法を用いて、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞とを比較することにより得た。
【図１２】（００７２）図１２は、３つの異なるＤＰＰ‐ＩＶ発現細胞株におけるＤＰＰ‐ＩＶの酵素活性を示す柱状図を示している。ＤＰＰ‐ＩＶ阻害率は、ｓｉＲＮＡ‐モックトランスフェクト細胞と比較して決定した。値は、平均±ｓ．ｄ．；ｎ＝４／群として表す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図１３】（００７３）図１３は、キトサン／ｓｉＲＮＡの投与がＡｐｏＢの血漿濃度に及ぼす影響を示す柱状図を示している。タンパク質濃度は、各処理群においてＥＬＩＳＡにより測定した。柱及びエラーバーは、未処理のアテローム硬化性群であるＤαに対する平均タンパク質濃度を表している。グループＤμは、通常の低脂肪食が与えられた正常陰性対照群である。
【図１４】（００７４）図１４は、キトサン／ｓｉＲＮＡ投与後のＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールの治療的低下を示す柱状図を示している。ＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール値は、安楽死の日に採取した試料において比色定量ＥＬＩＳＡキットにより測定した。柱及びエラーバーは、未処理のアテローム硬化性群であるＤαに対する平均コレステロール値を表している。グループＤμは、通常の低脂肪食が与えられた正常陰性対照群である。
【図１５】（００７５）図１５は、治療用ナノ複合体（ＴＮＣ）処理動物の肝臓における肝臓コレステロールの小滴の減少を示している。（Ａ）Ｃ１‐１、（Ｂ）Ｃ２‐１、（Ｃ）Ｃ３‐１、（Ｄ）Ｃ４‐１、（Ｅ）Ｃ５‐１、（Ｆ）Ｄα‐２日、（Ｇ）Ｄα‐３、（Ｈ）Ｄβ‐１、及び（Ｉ）Ｄμ‐１のマウスの、ヘマトキシリン‐エオシンで染色してパラフィン固定した肝臓切片は、キトサン／ｓｉＲＮＡの投与が肝臓におけるコレステロールの蓄積に及ぼす効果を実証している。矢印（→）は、コレステロールの小滴の蓄積を示している。Ｄα群は未処理のアテローム硬化性陽性対照であり、一方で、Ｄμは、低脂肪食が与えられた正常陰性対照である。
【図１６】（００７６）図１６はＴＮＣ処理動物の肝臓における炎症の吸収を示している。（Ａ）Ｃ１‐１、（Ｂ）Ｃ２‐１、（Ｃ）Ｃ３‐１、（Ｄ）Ｃ４‐１、（Ｅ）Ｃ５‐１、（Ｆ）Ｄα‐２日、（Ｇ）Ｄα‐３、（Ｈ）Ｄβ‐１、及び（Ｉ）Ｄμ‐１のマウスの、サフラニン‐Ｏ／ファストグリーン／鉄‐ヘマトキシリンで染色してパラフィン固定した肝臓切片は、キトサン／ｓｉＲＮＡ投与又はアテローム性動脈硬化症の発生に関連する炎症反応の吸収を実証している。円（Ｏ）及び矢印（→）は、リンパ球浸潤を示している。
【図１７】（００７６）図１７は、全ての動物群の毎週の体重（ｇ）の測定値を示す柱状図を示している。全ての動物は、各キトサン／ｓｉＲＮＡ投与の前に、各週の初日に体重を測定した。低脂肪で正常対照のＤμと比較して、高脂肪食を与えられた全ての動物について４週間を超える継続的な体重増加が観察され、それはＴＮＣ処理によって基本的に影響を受けなかった。
【図１８】（００７８）図１８は、週当たりの体重増加の割合を示す柱状図を示している。全ての動物は、キトサン／ｓｉＲＮＡ投与の前に、各週の初日に体重を測定した。体重増加は、動物の体重と前の週のその動物の記録体重との間の相対的な差である［（ｔn-1‐ｔn）／ｔn-1）］。この図は最初のＴＮＣ投与後の即座の体重の増加又は減少を示している。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（００７９）本発明の開示によれば、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びＲＮＡｉ誘導ベクター（すなわち、細胞内でのベクターの存在がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの産生をもたらすベクター）などのＲＮＡｉ誘導性物質を、哺乳動物、例えばヒトの細胞、組織、及び臓器に効率的に送達するための、非ウイルスベクターの新規かつ特定の組成物が提供される。特に、本発明の記載では、特定のキトサンと核酸との比率でＲＮＡｉ誘導性物質を含む、特定の平均分子量（Ｍｎ）及び脱アセチル化度（ＤＤＡ）の範囲を有するキトサン組成物を提供する。
【００６３】
（００８０）従って、標的転写物の過剰な発現又は異常な発現、又は標的転写物によりコードされるポリペプチドの異常又は過剰な活性に関連する疾患又は状態を、治療又は予防する組成物及び方法を提供する。
【００６４】
（００８１）本明細書において提供される組成物は、症状が発現する前に、発現している間に、又は発現後に、適切な時間枠内で、このような状態の危険性がある、又は患っている患者に、本明細書に開示の組成物を用いたＲＮＡｉ誘導性物質を投与することで症状の緩和をもたらすために使用することができる。
【００６５】
（００８２）組成物及び方法は、限定されるものではないが、例えば転写物の機能を研究するために、転写物によってコードされるポリペプチドが存在しない、又はポリペプチドの活性が低下した細胞又は生物における種々の化合物の効果を研究するためなど、様々な目的のために適用することができる。更に、組成物及び方法は、ＩＩ型糖尿病及びその関連病状、アテローム性動脈硬化症及びその関連病状、並びに癌の臨床治療に適用することができる。具体的には、組成物及び方法は、糖尿病を治療するために、インクレチン分解酵素（ＤＰＰ‐ＩＶ）又はあらゆる糖調節タンパク質を阻害するために適用することができ、アテローム性動脈硬化症を治療するために、ＡｐｏＢ遺伝子又はあらゆるアテローム生成タンパク質（すなわち、ＡｐｏＥ）を阻害するために適用することができ、又は限定されるものではないが、癌を治療するために、ＲｅｃＱＬ１ＤＮＡヘリカーゼ、又はＤＤＸ５‐ｐ６８‐ＲＮＡヘリカーゼそれぞれの発現を下方制御するために適用することができる。
【００６６】
（００８３）特に、本発明の記載は、例えばヘリカーゼ過剰発現腫瘍の直接の治療として、又は緩和医療のための放射線増感物質として、本明細書に記載の組成物と合わせたこのような核酸の使用に関する。更に、本明細書に記載の組成物及び方法は、例えば、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、又は従来の化学療法などのあらゆる他の癌治療と組み合わせて使用することができる。本発明の記載では更に、放射線治療を強化するための、又は他の治療法と組み合わせて使用する、組成物及び方法を提供する。
【００６７】
（００８４）本明細書に開示の組成物は、以下の物理化学的特性を有するＲＮＡｉ誘導性核酸及びキトサンを含む：Ｎ：Ｐ比は２５未満、キトサンは５ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲の数平均分子量（Ｍｎ）、及び８０％ＤＤＡ〜９５％ＤＤＡの範囲の脱アセチル化度を有する。本発明の記載では、市販のリポプレックスに匹敵して、効果的に種々の細胞株をトランスフェクトし、かつ遺伝子サイレンシングを誘導する組成物及び方法の有効性を示し、いくつかの例において、明らかな細胞毒性なしに、トランスフェクション効率はｍＲＮＡレベルにおいて８０％に達し、かつ細胞取り込みは９５％に達した。
【００６８】
（００８５）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡなどの細胞転写物を配列特異的分解に向かわせる過程である（Ｓｈａｒｐ，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１５：４８５‐４９０；Ｖａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：２２７７‐２２８０）。この現象は、最初はシー・エレガンスで発見された（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６‐８１１）。自然に発生するＲＮＡｉは、２１‐２５の間のヌクレオチドの小さな二本鎖断片によって仲介され、それは低分子干渉ＲＮＡと称されている。これらのｓｉＲＮＡは、ダイサーと呼ばれるｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼによって、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を２１塩基対の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断する過程により生成され、ｓｉＲＮＡは２つのヌクレオチド３’オーバーハングが隣接する１９塩基対二本鎖領域のコア領域から成る（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３‐３６６）。その後、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、ＲＩＳＣをｓｉＲＮＡと相補的な配列を有する標的ｍＲＮＡを認識するよう誘導して、特定の転写物の切断がもたらされる。
【００６９】
（００８６）その後、ＲＮＡｉは合成された２１個のヌクレオチドＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）を導入することで哺乳動物細胞において誘発することが可能であり（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４‐４９８）、そのため長いｄｓＲＮＡのダイサー仲介過程における必要条件を回避できることが発見されたため、ＲＮＡｉは臨床応用において大きな可能性を有するとすぐに認められた。
【００７０】
（００８７）例えば、ＡｐｏＢの発現を標的とし、かつ減少させることによって、ＶＬＤＬの過剰形成を防止することが可能であるため、生物におけるこれらのアテローム生成物質の蓄積が減少する（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１７３‐１７８）。配列特異的ｓｉＲＮＡを用いて非ヒト霊長類においてｍＲＮＡレベルでＡｐｏＢを標的とすることにより、処理から２４時間後にＡｐｏＢタンパク質、血清コレステロール、及び低密度リポタンパク質の濃度の著しい減少が実証された（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１‐１１４）。脂質ベースのナノ粒子（ＳＮＡＬＰ‐ｓｉＲＮＡ）を用いたこのような処理における治療効果は、最大のｓｉＲＮＡ用量で１１日間持続し、こうしてｓｉＲＮＡ処理の即時、強力、かつ持続的な生物学的効果が実証された。残念なことに、これらの脂質ベースのベクターは、肝細胞壊死を示唆するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清濃度の上昇によって示されるように、高レベルの肝臓毒性をもたらした（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１‐１１４）。従って、これらの報告は、アテローム性動脈硬化及びＣＶＤの治療のための標的としてＡｐｏＢの重要性を実証しているが、それらはまた全身的なＡｐｏＢにおける安全かつ効果的な減少を達成するための、ｓｉＲＮＡ送達システムにおける現在の欠点を強調している。
【００７１】
（００８８）合成低分子干渉ＲＮＡの形態におけるＲＮＡｉの直接送達は、乏しい細胞標的及び取り込み、細胞内及び／又は細胞外でのヌクレアーゼ分解（すなわちＲＮＡｓｅ）による短い半減期だけでなく、制限された血液の安定性及び毒性に悩まされ、依然として問題のままである（Ｓｔｅｉｎ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４：１４７‐１４９；Ｕｒｂａｎ‐Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１‐６；Ｋａｔａｓ  ａｎｄ  Ａｌｐａｒ，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５）。その結果、ＲＮＡｉの臨床治療への置き換えは、これらの問題において未解決事項のままである。ＲＮＡｉは、トランスフェクションなどの手段により細胞内に導入されると、幅広い種類の異なる細胞型において機能することが示されている。しかしながら、トランスフェクション効率は、低分子干渉ＲＮＡ分子を担持する送達ビヒクルに依存する。ベクターと称される送達ビヒクルは、ｓｉＲＮＡを濃縮、保護し、かつ標的細胞内へ運ぶことが可能でなければならない。標的の近傍では、非ウイルスベクターは細胞内取り込みを促進し、リソソーム隔離を回避し、かつ非ウイルスベクターの内容物を放出することで、所望の生物学的効果を達成する。
【００７２】
（００８９）合成ｓｉＲＮＡの化学修飾により、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性、かつ向上した血液の安定性がもたらされた。例えば、特定のリボースのＣ２位置でのホスホロチオエート結合の選択的添加又は２’‐Ｏ‐メチルでの置換により、活性を妥協することなく、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性が増加する（Ｃｏｒｅｙ，２００７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１７：３６１５‐３６２２；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，８：１２９‐１３８；Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１３：４９４‐５０５）。それでもなお、いくつかの化学修飾は、細胞毒性及びオフターゲット効果を増加させ、かつｍＲＮＡハイブリダイゼーションを減少させ得る（Ｗｅｙｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，５９：４３１‐４３８；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３１：５８９‐５９５）。ｓｉＲＮＡの半減期を増加させるための化学修飾を介して達成された進歩にもかかわらず、トランスフェクション効率、細胞標的化、及び取り込みは、効果的な送達に対する障壁のままである。従って、化学的に非修飾／修飾したｓｉＲＮＡの保護、及び標的細胞への輸送の両方が可能なパッケージングシステムが必要である。しかしながら、トランスフェクション効率は、低分子干渉ＲＮＡ分子を担持する送達ビヒクルに依存する。ベクターと称される送達ビヒクルは、ｓｉＲＮＡを濃縮、保護し、かつ標的細胞内へ運ぶことができなければならない。標的の近傍では、非ウイルスベクターは、細胞内取り込みを促進し、リソソーム隔離を回避し、かつ非ウイルスベクターの内容物を放出することで、所望の生物学的効果を達成する。このような非ウイルスベクターはインビトロ及びインビボで試験されており、ｓｉＲＮＡの臨床的実現への置き換えの可能性を示している。それでもなお、主要な欠点はこのような非ウイルスベクターに関連している。低いトランスフェクション効率、血清安定性、凝集、及び毒性は、臨床における薬剤送達のための強力かつ非毒性の手段として非ウイルスベクターの商業化が現実になる前に対処されるべき主な障害として残っている。非ウイルスベクターの主な種類を以下に説明する。
【００７３】
リン酸カルシウム
（００９０）このベクターの主な欠点は、限られた効率及びヌクレアーゼ分解から核酸を保護することができないことである。核酸を保護するこのベクターの能力の改善にもかかわらず、そのトランスフェクション効率は低いままであるため、インビボでのその有効な使用が妨げられている。
【００７４】
カチオン性脂質
（００９１）カチオン性脂質は、静電相互作用を介して核酸と複合体を形成し、最終的に多層状の脂質‐核酸複合体（リポプレックス）を形成する。リポソーム製剤は、通常、カチオン性脂質及びＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などの中性脂質を含む。中性脂質は、リポソーム製剤の安定性に寄与し、膜融合を促進するだけでなく、エンドソームを不安定化することでリソソーム脱出に寄与している。リポプレックスは、核酸を培養細胞に送達する最も効率的な方法の１つである。それらのトランスフェクション効率にもかかわらず、リポプレックスは培養細胞で観察され、かつインビボでのいくつかの調査で確認されたように、有毒である。毒性は複合体中のカチオン性脂質と核酸との電荷比、及び投与量に密接に関連している。リポプレックスに関連する毒性を低減するために、さらなる生体適合性製剤が試験されて開発されている。毒性の減少は、主に、他のポリマーとのグラフト化、又はカチオン性ポリマーの全電荷を減少させることによって達成される。
【００７５】
カチオン性ポリマー
（００９２）カチオン性ポリマーは、逆帯電したポリカチオンとポリアニオン種（すなわち核酸）との間の相互作用を介してナノメートルサイズのナノ粒子を形成する。これらのナノ粒子は核酸をカプセル化し、結果的に、ヌクレアーゼによる積荷の劣化を防ぐ（Ｒｏｍｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２６１：１１５‐１２７）。多数の天然及び合成のカチオン性ポリマーは、遺伝子の送達又はサイレンシングのためのビヒクルとして使用されてきた。カチオン性ポリマーを用いたこれらのナノ粒子の多くは、リポプレックスと比較して優れたトランスフェクション効率及び低い血清感受性を有する。天然に存在するポリカチオンの中には、ヒストン、カチオン化ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、及びキトサン、アミノ多糖類がある。
【００７６】
（００９３）合成ポリカチオン群としては、ポリ‐Ｌ‐リジン（ＰＬＬ）、ポリ‐Ｌ‐オルニチン、並びにポリアミン、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン、及びポリアミドアミンデンドリマーが挙げられる。
【００７７】
（００９４）ポリプレックスの利点は、リポソームでは複数の脂質成分が必要であるのとは逆に、ポリプレックス形成は複数のポリカチオンの相互作用を必要としないことであり、それはポリプレックスの巨視的特性を制御容易とする。ポリカチオンの他の主な利点はそれらのブロック構造であり、それ故、直接的な化学修飾によってより高い効率又は特異的な細胞標的を達成することが可能である。しかしながら、これらの利点にもかかわらず、高い電荷密度のナノ粒子はより毒性があるようであるため、多くのカチオン性ポリマーは高い表面電荷密度により毒性が見出されている。更に、ポリマー中の電荷密度は総電荷量よりも細胞毒性においてより重要な役割を果たしていることが報告されている。ＰＥＩの細胞毒性は分子量と共に直線的に増加するので、毒性は分子量にも依存する可能性がある。更に、リソソーム隔離と呼ばれる現象である、リソソーム中でのＰＥＩなどの非分解性ポリマーの蓄積はまた、毒性に対するさらなる寄与となり得る。
【００７８】
（００９５）キトサンは、キチンのアルカリ中での脱アセチル化から生じる、グルコサミン及びＮ‐アセチルグルコサミンのモノマーがβ‐１，４グリコシド結合によって連結した天然高分子である。キトサンの分子量及び脱アセチル化度は、その生物学的及び物理化学的な特性を決定づける。例えば、キトサンの生分解性はアセチル基の量及び分布に影響される。これらのアセチル基の欠如、又はこれらのブロック分布ではなくランダム分布により、非常に低い分解率がもたらされる。
【００７９】
（００９６）キトサンは、生体適合性、生分解性、粘膜付着性、抗菌／抗真菌活性、及び非常に低い毒性を含む、幅広い有益な特性を有している。従って、キトサンは薬学及び生物医学の分野の注目を集め、かつ核酸のパッケージング及び濃縮のために最も広く使用される非ウイルスベクターの１つとなった。
【００８０】
（００９７）いくつかの研究では、キトサンの分子量及び脱アセチル化度（ＤＤＡ）がキトサン‐プラスミドＤＮＡナノ粒子の取り込みに及ぼす影響、種々の細胞株に対するナノ粒子輸送及びトランスフェクション効率について取り組んでいる。Ｈｕａｎｇらは、Ａ５４９細胞においてこの主題に取り組んでいる（２００５，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０６：３９１‐４０６）。しかしながら、この研究では、平均分子量（Ｍｎ）及びＤＤＡがｐＤＮＡのトランスフェクション効率に及ぼす影響を研究するために、わずか７つの製剤（８８％のＤＤＡの１０、１７、４８、９８、及び２１３ｋＤａのキトサン；６１及び４６％のＤＤＡの２１３ｋＤａのキトサン）しか使用せず、プラスミド中の数千の塩基対に対して通常２１ｂｐであるはるかに小さいｓｉＲＮＡには対処しなかった。彼らは、Ｍｎ及びＤＤＡが減少すると、プラスミドにおいてより低いトランスフェクション効率がもたらされることを見出した。しかしながら、これらの２つのパラメータの間の関係はこれよりずっと複雑であり、最適な安定性を達成するためにはキトサンのＭｎとＤＤＡとの間の微妙なバランスが要求される。彼らが複雑な関係を描くことができなかったのは、彼らの限られた数の製剤に起因する。更に、一度に１つのパラメータのみを変化させており、それは彼らがトランスフェクション媒体のｐＨ、及びキトサンとＤＮＡとの比率（Ｎ：Ｐ）と関連してＭｎとＤＤＡとの間の連結効果を確認することを妨げた。プラスミド‐キトサンのポリプレックスについて、この複雑な関係に取り組む他の研究が、Ｌａｖｅｒｔｕらによって実施された（２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５‐４８２４）。彼らの研究では、彼らはいくつかの異なるＤＤＡレベルに対して分子量を変化させ、また、キトサンとＤＮＡとの比率（Ｎ／Ｐ）及び／又はトランスフェクション媒体のｐＨを調査した。この研究は、こうした最適化により、ＨＥＫ２９３細胞において、広く使用されている商業的リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標））と同等である高いトランスフェクション効率が達成されたことを実証した。
【００８１】
（００９８）キトサンの脱アセチル化度が増加すると鎖に沿ってより高い電荷密度が生成され、ｐＤＮＡとより強固に結合してナノ粒子を形成するため、キトサンのＤＮＡ結合能／親和性が増加する（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０：１４９０‐１４９９）。このように、非常に低いＤＤＡのキトサンは、効率的にＤＮＡを結合することができず、細胞をトランスフェクトするための物理的に安定な複合体を形成することが不可能である（Ｋｏｐｉｎｇ‐Ｈｏｇｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，５：１３０−１４１）。本明細書において上述したように、ＤＤＡはまた、生分解性に対して支配的な影響を与え、高いＤＤＡは分解されにくい。この観点から、Ｋｏｐｉｎｇ‐Ｈｏｇｇａｒｄら（２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：１１０８‐１１２１）による最近の研究により、高いＭｎのキトサン系複合体のエンドソーム脱出はキトサンの酵素分解に依存し、かつ高いＤＤＡのキトサンではあまり容易に起こらないであろうことが示唆された。結果的に生じた分解断片は、エンドソーム浸透圧を高め、膜の破裂につながると仮定される。従って、高度に脱アセチル化されたキトサン（ほぼ１００％のＤＤＡ）について、分解性の低下はエンドソーム脱出の減少をもたらすであろう。
【００８２】
（００９９）キトサンのＭｎが核酸と結合する能力に及ぼす影響は、いくつかの研究で評価された。逆帯電した巨大分子間の結合親和性は、各分子の原子価に強く依存し、低原子価からは弱い結合のみが生じる（Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，５：９２８‐９３６）。短い鎖を有する低分子量におけるキトサンの原子価の低下は、そのＤＮＡへの親和性を減少させることが示されている（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０：１４９０‐１４９９）。高度な複合体の安定性は、酵素攻撃に対する保護のために細胞外において望ましいが、ＭａｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９９８，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５６：２５９‐２７２）は、高いＭｎのキトサンは、ひとたび細胞内に入れば分解され得ず、細胞をトランスフェクトするのに過度に安定した複合体を形成し得ることを示唆した。更に、Ｌａｖｅｒｔｕら（２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５‐４８２４）は、Ｍｎは細胞内取り込みにおいて支配的な要因ではないようであるが、核酸結合親和性及び細胞内放出において役割を果たしているようであることを示した。これらの解釈及び核酸と結合するキトサンの微妙にバランスのとれた中間の安定性の必要性は、更に等温滴定熱量測定（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０：１４９０‐１４９９）により、及びポリプレックス輸送及び分解の生細胞内イメージング（Ｔｈｉｂａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１８：１７８７‐１７９５）により、結合親和性を直接評価することで支持された。
【００８３】
（００１００）アミンとリン酸との比率は、ＤＮＡ結合及びナノ粒子形成において重要な役割を果たしていることが見出されている。例えば、Ｎ：Ｐ比の増加は、ＤＮＡへのキトサンの結合を増強する。同じＤＤＡの場合、低いＭｎのキトサンにはプラスミドＤＮＡを完全に結合するために高いＮ：Ｐ比が必要である。同様に、等しいＭｎでは、低いＤＤＡにはＤＮＡを完全に結合するために高いＮ：Ｐ比が必要である（Ｋｏｐｉｎｇ‐Ｈｏｇｇａｒｄ，２００３，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，５：１３０‐１４１；Ｋｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５：５２９３‐５３０１）。ｐＨはトランスフェクション効率において重要な役割を果たすことが示されている。Ｌａｖｅｒｔｕら（２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５‐４８２４）は、わずかに酸性の媒体中において複合体はより安定であり、かつトランスフェクション効率の上昇が達成されることを示した。これは、ｐＨの低下によりキトサンのプロトン化が増加し、その結果ポリプレックスの正電荷（ゼータ電位）及びキトサンのＤＮＡに対する結合親和性が増加するという事実によって説明することができる。キトサン製剤のパラメータ（ＤＤＡ、Ｍｎ、Ｎ：Ｐ、及びｐＨ）の複合効果は、Ｌａｖｅｒｔｕら（２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５‐４８２４）によるインビトロでのプラスミドＤＮＡ送達において研究された。彼らは興味深いことに、最大の導入遺伝子の発現は、高ＤＤＡ／低Ｍｎから低ＤＤＡ／高Ｍｎの斜め線に沿って伸びるＤＤＡ：Ｍｎ値において起こることを見出した（Ｌａｖｅｒｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５−４８２４）。従って、ＤＤＡを増加／減少させる場合、最大のトランスフェクションを維持するために、それに対応してＭｎを減少／増加させなければならない。
【００８４】
（００１０１）上述したように、ｐＨは、トランスフェクション効率において重要な役割を果たしている。Ｌａｖｅｒｔｕら（２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５‐４８２４）は、ｐＨが上昇すると、プラスミドＤＮＡを用いた最も効率的な製剤のためのＭｎはより高いＭｎの方へ移動し、それはより高いｐＨでのキトサンの中和によってキトサンの電荷密度の減少がもたらされるためであることを示した。一方、所定のＤＤＡでは、Ｎ：Ｐ比が５：１から１０：１へ変化すると、恐らくキトサン濃度の増加による安定化効果によって、最も効率的な製剤のためのＭｎはより低いＭｎの方へ移動する。従って、トランスフェクション効率に対する、及びより効率的かつ安定したキトサン‐ＤＮＡ製剤の開発において、これらの種々の製剤パラメータの重要性を確認することができる。
【００８５】
（００１０２）ｐＤＮＡとｓｉＲＮＡとの間の構造的差異は、効果的な送達のために必要なナノ粒子の複合体形成／安定性及び最適パラメータに影響すると考えられている。キトサンは、インビトロ及びインビボの両方においてｓｉＲＮＡの送達のために使用されてきた（ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，６：４４３‐４５３；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４；Ｋａｔａｓ  ａｎｄ  Ａｌｐａｒ，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１‐１１４；及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：１２８０‐１２８８）。しかしながら、またｓｉＲＮＡ送達のための最適な物理化学的パラメータを特定する試みにもかかわらず、決定的な結果は、実験的不一致により文献において認められていない。例えば、ｓｉＲＮＡ積荷のナノ粒子形成、安定性、及び保護は、典型的でない生理的環境のｐＨであるｐＨ７．９で評価された。このｐＨでは、キトサンは、その見かけのｐＫａが６．５に近いため、主に脱プロトン化されており、それ故、ｓｉＲＮＡ積荷を効率的に結合することが不可能である。複合体形成はこれらの条件下で試験されていたので、いくつかのグループは、キトサンのｐＫａよりも高いｐＨで見られるキトサンのｓｉＲＮＡに対する乏しい結合を補うために、高いＮ：Ｐ比を用いていた。これらの高いｐＨ値（すなわち、７．９）の使用は、重大な設計上の誤り、かつ実験的不一致の原因を示しており、これらの研究者を、ナノ粒子の複合体形成、安定性、及び積荷の保護を達成するために、高いＮ：Ｐ比を使用するよう導いた。残念ながら、過剰なキトサンは、トランスフェクション効率に競合的に影響し、複数の非特異的効果を生み出し、かつ毒性を増加させる可能性があり、間違った結論につながり得る。
【００８６】
（００１０３）例えば、ｓｉＲＮＡの送達において、中間のＤＤＡ（８０％）及び高いＭｎ（６４‐１７０ｋＤａ）は、低分子量のキトサン（１０ｋＤａ）よりも明らかに効率的であることが報告された（Ｋａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５；及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：１２８０‐１２８８）。しかしながら、これらの高分子量のキトサンは、毒性があることが見出された（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４；及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，１７８：２３１‐２４３）。更に、キトサン／ｓｉＲＮＡのナノ粒子の複合体形成、他の物理化学的特性、及びトランスフェクション効率を評価した全ての以前の報告では、製剤は非常に高いＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ＞２５）でのみ効率的であると一様に結論づけていた（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４；Ｋａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：１２８０‐１２８８）。これらの報告では、過剰なキトサンの大部分は実際に可溶性であり、ナノ粒子の構造的要素ではないことを認識していなかった（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１１：５４９−５５４）。非常に高いＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ＞２５）を有するこのような製剤では、大量の可溶性キトサンの凝集及び非特異的毒性作用による制限された投与を含む、重要な現実的問題が提示されている。
【００８７】
（００１０４）本発明の開示において示されるように、ナノ粒子の物理化学的特性を評価するために、キトサンのｐＫａに近いだけでなく生理的ｐＨにも近い適切なｐＨ条件の本発明での使用から、このような高いＮ：Ｐは、効率的なナノ粒子送達ビヒクルを形成するために必要ではないことが明らかとなった（図３）。
【００８８】
（００１０５）キトサンは、鼻腔内、経口、腹腔内、及び筋肉内の経路を含む様々な投与経路を介して薬理学的に活性な化合物を送達するために使用されていた。キトサン／インスリンは、ラット及びヒツジにおいて鼻腔内経路を介して投与された。これらの製剤は、脱アセチル化度に関して指定はなく、１０ｋＤａ以上の分子量の水溶性キトサンの使用を含むものであった（Ｉｌｉｕｍ，１９９６，Ｄａｎｂｉｏｓｙｓｔ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，ｖｏｌ．５５５４３８８；１９９８，Ｄａｎｂｉｏｓｙｓｔ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，ｖｏｌ．５７４４１６６）。
【００８９】
（００１０６）キトサンはまた、可溶性製剤を用いた鼻腔内経路を介したマウスの免疫付与のための抗原性補強剤として使用されている（米国特許出願公開第２００３／００３９６６５号）。これらの製剤は、脱アセチル化度が５０‐９０％の間で、Ｍｎが１０‐５００ｋＤａの間の範囲のキトサングルタメートを含むものであった。
【００９０】
（００１０７）キトサンはまた、インビトロ及びインビボでも同様に、プラスミドＤＮＡからｓｉＲＮＡまで様々な核酸を送達するために使用されてきた。様々な送達ビヒクルと共にｓｉＲＮＡを用いた４０を超えるインビボ研究の例が、眼を治療するため（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ，１０：７０３‐７１１）、及び肺標的を治療するため（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４）に報告されており（ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，６：４４３−４５３）、又は局所若しくは全身の送達によって、神経系（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｌｏｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３：５０５‐５１４）、肝臓（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１７３‐１７８）、腫瘍（Ｇｒｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ，１７：７５１‐７６６）、及び他の臓器に対して行われてきた。一実施例では、キトサン／ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、関節炎のマウスモデルにおいて、抗炎症治療のための腹腔マクロファージにおけるＴＮＦ‐αノックダウンを仲介した（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４）。
【００９１】
（００１０８）いくつかの研究では、インビトロ及びインビボにおいてｓｉＲＮＡを送達するキトサンの能力を調査した。Ｋａｔａｓら（２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５）は、８４％のＤＤＡを有するキトサン塩の２つの異なる形態（ＣＳ‐ＨＣｌ及びＣＳ‐グルタメート）を使用して、キトサンパラメータがトランスフェクション効率に及ぼす影響を調査した。４つの異なる高分子量のキトサン（４７０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、及び１１０ｋＤａ）を使用して、２５μｇ／ｍｌ（１．２５：１）から３００μｇ／ｍｌ（１５：１）へのキトサン濃度の上昇は、ナノ粒子サイズを約１５０ｎｍから４５０ｎｍに増加させることを彼らは見出した（Ｋａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５）。
【００９２】
（００１０９）更に、キトサン‐グルタメートからはキトサン‐ＨＣｌよりも小さいナノ粒子が生じることが彼らの研究で示された。Ｋａｔａｓら（２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５）は、彼らの実験条下において、ｓｉＲＮＡのキトサンへの完全な結合は、キトサンが極端に過剰な条件であるＮ：Ｐ比が１００：１を超える場合にのみ起こり、キトサンのたぶん＞９５％は可溶性であり、ｓｉＲＮＡと複合体を形成しないことを見出した（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１１：５４９‐５５４）。この多量で過剰かつ中程度のＤＤＡ（８４％）のキトサンは、インビボにおいて持続的な炎症を引き起こし、かつ有害な免疫学的応答を増加させることが予想される（Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１６：１０９７‐１１１０）。彼らの研究では、４７０ｋＤａの分子量を有するキトサングルタメートは、その低分子量又はキトサン塩酸塩と比較して、インビトロにおいてトランスフェクションから２４時間後に最大の遺伝子サイレンシング効果を示した（Ｋａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５）。４７０ｋＤａの平均分子量を有するキトサングルタメートのイオンゲル化は、単純な複合体形成により形成されたキトサン‐ｓｉＲＮＡナノ粒子（５１％ｍＲＮＡノックダウン）よりも、高いサイレンシング効率（８２％ｍＲＮＡノックダウン）を示した（Ｋａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１５：２１６‐２２５）。
【００９３】
（００１１０）Ｈｏｗａｒｄら（２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４）らが率いる別のグループは、鼻腔内投与経路を介して、キトサン‐ｓｉＲＮＡナノ粒子を遺伝子組み換えＥＧＦＰマウスモデルに送達した。彼らの研究について、彼らは４つの異なるＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ６、３３、７１、及び２８５）で、８４％のＤＤＡかつ１１４ｋＤａのキトサンを使用した。より高いＮ：Ｐ比では、２５０μｇ／ｍｌの低いキトサン濃度で、より小さなナノ粒子がもたらされた（Ｎ：Ｐ６＝２２３．６ｎｍ  ｖｓ  Ｎ：Ｐ３３＝１８１．６ｎｍ）（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４）。より高いキトサン濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でも同様のパターンが観察され、８４％のＤＤＡ、１１４のＭｎ、及び３３のＮ：Ｐ比を有するキトサンのナノ粒子は、製剤８４‐１１４‐２８５に対する１３９ｎｍと比較して、３２８ｎｍの平均直径を有していた（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４）。
【００９４】
（００１１１）彼らの予備的なインビトロでの研究から、ナノ粒子サイズはＮ：Ｐ比に依存し、かつより低いＮ：Ｐ比においてサイズが増加し、それは高いＮ：Ｐ比が必要であることを示唆していることが示された。この知見は、本明細書に提示の結果と矛盾し、本明細書では、キトサン‐ｓｉＲＮＡの複合体形成及び安定性を評価するとき、ｐＨの重要な役割の下に実証している。彼らの知見に基づき、ＮＩＨ３Ｔ３及びＨ１２９９細胞株において、細胞内取り込み及びサイレンシング効率がそれぞれ３６及び５７の高いＮ：Ｐ比で測定された。３６の高いＮ：Ｐ比におけるキトサン製剤は、ＥＧＦＰ安定細胞株のサイレンシング効率を調査するために使用された。サイレンシング効率はそれぞれ、Ｈ１２９９及び原発性腹膜マウスマクロファージにおいて、７７．９％及び８６．９％であった。Ｎ：Ｐが３６のキトサン製剤８４‐１１４のインビボでのサイレンシング効率において、１日に３０μｇのｓｉＲＮＡの注入を５日間行った後に、未処理の対照と比較して、ＥＧＦＰ遺伝子組み換えマウスモデルにおいて４３％のサイレンシング効率が達成された（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４：４７６‐４８４）。
【００９５】
（００１１２）Ｈｏｗａｒｄら（２００９，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７：１６２‐１６８）らの他のインビボ研究では、ＴＮＦ‐αｍＲＮＡを標的とした２７塩基対のｓｉＲＮＡを、Ｎ：Ｐ比が６３でキトサン８４‐１１４と複合体化して、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルに注射した。彼らの製剤は、ＴＮＦ‐αの血漿濃度から測定したところ、４３％のサイレンシングを達成した。
【００９６】
（００１１３）Ｊｉら（２００９，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：４０５１０３）は、ＤＤＡ範囲が７５％〜８５％の１９０ｋＤａ及び３１０ｋＤａのキトサンは、ｓｉＲＮＡのための適した送達ビヒクルであることを示唆した。上記の研究と同様に、Ｊｉらは、Ｌｏｖｏ細胞におけるＦＨＬ２癌遺伝子のノックダウン実験のために、５０の高いＮ：Ｐ比でキトサン製剤を使用した。彼らの製剤は６９％のｍＲＮＡノックダウンを達成した。
【００９７】
（００１１４）ｓｉＲＮＡのキトサン送達に対する最適なパラメータを特定する試みにおいて、Ｌｉｕら（２００７，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：１２８０‐１２８８）は、様々なＤＤＡ、Ｍｎ、及びＮ：Ｐ比で広範なキトサンを試験し、Ｎ：Ｐ比＞２５が効率的なサイレンシングのために必要であることを明言した。彼らはまた、Ｎ：Ｐが５０で調製した低分子量のキトサン‐ｓｉＲＮＡ（１０ｋＤａ）製剤は、Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞において内在性のＥＧＦＰのノックダウンを示さないが、ＤＤＡが８０％でより高いＭｎ（６４．８‐１７０ｋＤａ）で調製したキトサン製剤は、４５％〜６５％の間の範囲のより優れた遺伝子サイレンシングを示すことを見出した。最も高い遺伝子サイレンシング効率（８０％）は、それぞれ１１４及び１７０ｋＤａのＭｎで８４％のＤＤＡ、極端に高いＮ：Ｐ１５０のキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子を用いて達成し、それは約２００ｎｍの直径を有するナノ粒子の安定形成における彼らの評価と相関していた。更に、Ｌｉｕら（２００７，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：１２８０‐１２８８）は、Ｎ：Ｐ比が５０で抗ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡと複合体化した９５％のＤＤＡ及び９ｋＤａのキトサンは、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定したところ、３５００ｎｍの望ましくない大きなサイズを有していることを見出した。更に、基本的なｐＨ７．９で行われた安定性試験に対する彼らのゲルシフトアッセイによると、この特定の製剤は、５０の大きさのＮ：Ｐ比ではｓｉＲＮＡと複合体を形成しなかったと彼らは述べており、それは本明細書では技術的副作用として粒子分解がもたらされることが示された。更に、未処理の陰性対照と比較した場合、この特定の製剤はＥＧＦＰノックダウンを示さなかった。
【００９８】
（００１１５）他の研究者によって見出された上記の結果は、本明細書に提示の新規な知見とは対照的であり、本明細書では、キトサン‐ｓｉＲＮＡナノ粒子は、８０％〜９５％の間のＤＤＡで広範な分子量（５〜２００ｋＤａ）のキトサンを用いて、中程度から低度のＮ：Ｐ比（２５未満、好ましくは５）で形成することができ、これらのナノ粒子は、以前に報告された系と比較して、高いレベルの遺伝子サイレンシング、良好な安定性、及び小さいサイズ範囲を達成する。
【００９９】
（００１１６）キトサンコーティングされたポリ（イソヘキシルシアノアクリレート（ｉｓｏｈｅｘｙｌ  ｃｙｎｏａｃｒｙｌａｔｅ））（ＰＩＨＣＡ）ナノ粒子は、異種移植侵襲性乳癌モデルにおいて抗ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡ物質を静脈内送達するために使用されてきた（Ｐｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ，１７：１０１９‐１０２６）。キトサンコーティングされたＰＩＨＣＡ‐抗ＲｈｏＡ  ｓｉＲＮＡナノ粒子の投与は、癌細胞において過剰発現されたＲｈｏＡをノックダウンすることによって、インビボでの癌の侵襲性を著しく減少させた。Ｚｈａｎｇらは、Ｂａｌｂ／ｃモデルにおける呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防及び治療するために、肺組織中のＮＳ１タンパク質を標的としたｓｉＲＮＡの新規発現のための、キトサン由来製剤であるＮａｎｏｇｅｎｅ０４２を研究した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１１：５６‐６２）。Ｚｈａｎｇらは、ｓｈＲＮＡ系のプラスミドを使用して、インビボでの低下したウイルス価及びウイルス負荷（ｖｉｒａｌ  ｔｉｔｅｒ  ｌｏａｄ）と合わせて、ＮＳ１遺伝子の効率的なサイレンシング、及びＲＳＶ感染の減衰を観察した。Ｎａｎｏｇｅｎｅ０４２は、典型的な高いＭＷのキトサンと比較して、より高いトランスフェクション効率を示し、かつより少ない炎症を誘導した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１１：５６‐６２）。しかしながら、Ｎａｎｏｇｅｎｅ０４２の分子量は、記載の参考文献に開示されていない。
【０１００】
（００１１７）本発明の記載における目的のために、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ）マウスモデルを、種々の実施形態の実施を可能とするために使用する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓによって開発された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルは、高脂肪食（Ｄ１２４９２）を与えると、痩せた対照と比較して、高脂肪食から２週間後に明らかに体重が増加し、肥満となり得る。Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルは、多目的研究及び高脂血症調査に使用し、高脂肪食の間の循環血液中のＬＤＬコレステロール値を調査する（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１７３‐１７８；Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，４６：８７２‐８８４；Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｎｕｔｒ，１３８：１６７７‐１６８３）。高脂肪食（Ｄ１２４９２）の脂肪は、わずか１０ｋｃａｌ％の脂肪を含む対照食Ｄ１２４５０Ｂの脂肪の６倍超に相当する。更に、高脂肪食のＤ１２４９２は、１８（ｍｇ）／ｋｇの対照食Ｄ１２４５０Ｂと比較して、３００．８（ｍｇ）／ｋｇのコレステロールを含んでいる。従って、このような高脂肪な固形試料の供給は、肝臓でのＬＤＬの除去に対する動脈内でのＬＤＬの蓄積における不安定さをもたらすため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の発生に至らせる。
【０１０１】
（００１１８）本明細書の以下に記載の通り、本明細書に記載の組成物はｓｉＲＮＡと組み合わせると、有効な遺伝子導入ベクターとなり、市販のリポソームであるＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）と類似のインビトロでのトランスフェクション効率を達成することが見出された。更に、組成物は、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）と、ｓｉＲＮＡの細胞への送達における同等の効率、及び類似のサイレンシングを達成するだけでなく、より低い毒性を有する。
【０１０２】
（００１１９）キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子を用いた取り込み効率は、細胞型間での類似した相対的ばらつきはあるが、商業的に使用されるリポプレックス（ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標））に匹敵するか又はより高いレベルを達成した（図７Ａ及び７Ｂ）。更に、これらの結果は以下に記載の共焦点顕微鏡データと一致している（図８）。画像は全ての細胞株でのキトサン及びｄｓＯＤＮの細胞分布を示しており、それはＦＡＣＳの定量的データとの定性的相関関係を示唆している。複数の細胞株をトランスフェクトし、かつ種々のｓｉＲＮＡを複数の細胞株に効率的に送達する記載した製剤の能力が、本明細書において実証されている（例えば、図７Ａ及び８を参照のこと）。
【０１０３】
（００１２０）本明細書に開示の結果は、当技術分野において以前に使用されていたＮ：Ｐ比をはるかに下回るＮ：Ｐ比で、効率的にｓｉＲＮＡを送達し、かつ特定の遺伝子をノックダウンするための、記載のキトサン系製剤の有効性を明確に示している。一般に、本明細書において使用される全ての低いＮ：Ｐ比のキトサン製剤は、高いレベルの遺伝子サイレンシングを達成した。
【０１０４】
（００１２１）本結果から、使用するキトサン製剤（８０‐１０‐５、８０‐４０‐５、９２‐１０‐５、９２‐４０‐５、８０‐１０‐１０、８０‐８０‐５、９２‐１５０‐５、及び８０‐２００‐５）、及びｓｉＲＮＡの化学修飾の程度に応じて、４５‐１５６ｎｍの間の範囲の平均直径（表２）を有する球状のナノ粒子が示される（図１及び２）。キトサンと複合体化したｄｓＯＤＮと、未修飾ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢ（Ｓｅｑ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と、適度に修飾されたｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢ（Ｓｅｑ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）との間に、ナノ粒子サイズにおける統計的な差異は認められなかった。一方で、完全に修飾されたｓｉＲＮＡ配列は、種々のキトサンと複合体化すると、より大きなナノ粒子が生じた。
【０１０５】
（００１２２）本明細書に記載の特定の製剤から得られた結果は、得られた動的光散乱の結果と一致しており（表２）、そのため本明細書に記載の組成物及び方法の頑健性が示唆される。更に、形成したナノ粒子は２００ｎｍ未満の再現可能なサイズをもたらし、それは腎クリアランスを回避可能とする。それ故インビボにおけるトランスフェクション効率を改善し、かつ循環ナノ粒子の半減期を増加させる。
【０１０６】
（００１２３）キトサン／ｓｉＲＮＡの安定性を、蛍光に基づくアッセイであるＲｉｂｏｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙ（登録商標）を用いて評価し、複合体の不安定化後に放出されるｓｉＲＮＡを定量した。結果から、Ｎ：Ｐ比が５及び１０のキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ｐＨ６．５で最大２０時間安定であったことが示された。キトサン８０‐１０‐５は、他の製剤と比較した場合、最も低い安定性を示した。キトサン８０‐１０におけるＮ：Ｐ比の増加によりナノ粒子の安定性の改善がもたらされた。キトサン８０‐１０を除いて、５を超えるＮ：Ｐ比の増加は、ナノ粒子の安定性の増加をもたらさなかった（例えば、図４Ａを参照のこと）。
【０１０７】
（００１２４）本明細書に記載の製剤は、明らかな細胞毒性なしで、市販のリポソームであるＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）に匹敵する遺伝子サイレンシングのレベルを達成可能であることが実証されている。本明細書に開示の結果から、他の研究者において以前に使用されていたＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ＞２０）をはるかに下回るＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ＝５）で、効率的にｓｉＲＮＡを送達し、かつ特定の遺伝子をノックダウンするための、記載のキトサン系製剤の有効性が明確に示された（例えば図１１Ａ及び１１Ｂを参照のこと）。一般に、我々の低いＮ：Ｐ比のキトサン製剤の全ては、ＦＡＣＳデータを支持する高いレベルの遺伝子サイレンシングに達した（例えば図７Ａ及び７Ｂを参照のこと）。低分子量（１０ｋＤａ）及び高ＤＤＡ（９２％）のキトサンが最も効率的（図１１及び１２）であり、かつより小さい（図４Ｂ）傾向があることが見出され、それはＮ：Ｐ比が５での特に最適な製剤を示唆するものである。
【０１０８】
（００１２５）また、アテローム性動脈硬化症の治療のために本明細書に記載の組成物は、未処理の陽性対照（以下、Ｄαと称する）と比較して、インビボでのＡｐｏＢの血漿濃度を約３０％低下させたことが記載されている（図１３）。また、このような低下により、非アテローム硬化性の動物群の陰性対照におけるＡｐｏＢ血清濃度と同様のＡｐｏＢ血清濃度がもたらされ、それ故、治療域にあることが実証される。また、本明細書において、アテローム性動脈硬化症の治療のために本明細書に記載の組成物は、明らかないかなる毒性なしに、ＬＤＬコレステロールの２０％の低下をもたらしたことが実証されている（図１４）。また、ｓｉＲＮＡを含むキトサン系の治療用ナノ複合体（ＴＮＣ）は、血清中の正常ＡＬＴ／ＡＳＴ濃度により実証されるように如何なる肝臓毒性ももたらさないことが実証されている。
【０１０９】
（００１２６）更に、ＴＮＣで処理した動物肝臓におけるコレステロールの蓄積は著しく減少し、ＴＮＣ処理は注射から３週間後の肝臓でのコレステロールの蓄積において治療効果を有することが実証されている（図１５）。同様に、キトサン系のＴＮＣは、本明細書の他の実施形態に示されるように、毒性なしで肝臓内に急速に吸収される一過性の免疫細胞の浸潤を誘導した（図１６）。肝臓毒性の欠如及び免疫細胞浸潤の急速な吸収は、更により高いＡｐｏＢ及びＬＤＬ‐Ｃの血漿における減少を達成するために、注射量を増加できる可能性を示した。
【０１１０】
（００１２７）更に、ＡｐｏＢを標的にしたキトサンを有さない裸のｓｉＲＮＡは、強力な炎症反応を誘導するため、非複合体化形態での治療的使用においてそれらの投薬及び可能性が制限されることが記載されている。１ｍｇ／ｋｇの抗ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの試験用量でのＴＮＣ処理動物における毒性／炎症性の欠如は、ＡｐｏＢの血漿濃度を３５％減少させるそれらの能力と合わせて、最大耐量（ＭＴＤ）を決定し、かつより高いＡｐｏＢの血漿中での減少を達成するために、用量反応研究におけるそれらの重要性及び潜在的な使用を示唆している。
【０１１１】
（００１２８）ＴＮＣ処理動物は、３番目かつ最後の注射後から少なくとも８週間、減少したＡｐｏＢの血漿濃度を有していたことが実証される。低いＮ：Ｐのキトサン系ＴＮＣにおけるＡｐｏＢの血漿濃度の減少は、明らかないかなる炎症又は肝臓毒性を有さずに、Ｃ１動物群での最後の注射後から７週間を超えて維持された（図１３及び１６）。これらの結果は、特に有望なＴＮＣ処理における長命な特性、及び効果的な制御された放出特性を示している。
【０１１２】
（００１２９）従って、本明細書に記載の低いＮ：ＰのキトサンＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのＴＮＣは、１ｍｇ／ｋｇの注射量で、ＡｐｏＢの血漿濃度の〜３５％の低下、及びＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール減少における〜２０％の低下を達成したことが本明細書において開示される（図１３及び１４）。これらの結果から、効果的な治療結果が得られたことが示唆される。なぜなら、ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのためのリポソーム送達システムを用いた、以前に公開されて特許請求された成功結果は、同様か又はより高いＡｐｏＢ／ＬＤＬ‐ＶＬＤＬコレステロールの減少を達成するためにより多くの用量を必要とし、これらの用量は肝臓毒性並びにＡＬＴ及びＡＳＴの濃度の増加に関連するためである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，１１１‐１１４；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３‐１７８）。例えば、脂質製剤（ＳＮＡＬＰ）と一体となった５ｍｇｋｇ-1のｓｉＲＮＡの使用は、ＡｐｏＢの血漿濃度において７３％の低下を達成した（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，１１１‐１１４）。この５倍高い注射濃度は、本発明の結果と比較して２．５倍高いＡｐｏＢの血漿における減少を達成した。更に、Ｍｅｒｃｋ社によって開発された第二世代の脂質ＬＮＰ‐ＯＣＤ（ＬＮＰ２０１）を用いた、Ｌｄｌｒ−／＋、Ｃｅｔｐ−／＋マウスモデルにおけるＡｐｏＢを標的としたｓｉＲＮＡの使用により、３ｍｇｋｇ-1にてＬＤＬの約７０％の減少が示された（Ｔａｄｉｎ‐Ｓｔｒａｐｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，５２：１０８４−１０９７）。更に、使用されるｓｉＲＮＡ配列に依存して、ＡｐｏＢの血漿濃度の６８％及び３１％の低下を達成するために、５０ｍｇｋｇ-1の裸のコレステロール修飾ｓｉＲＮＡが必要であった（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  １７３‐１７８）。更に、これらの研究は、アテローム性動脈硬化症を模倣するためにＣ５７ＢＬ／６マウス群に試験終了まで高脂肪食を与えた包含の研究とは逆に、標準の固形飼料（脂肪分制御）を与えた正常なＣ５７ＢＬ／６マウスで実施されていた。
【０１１３】
（００１３０）更に、現在のところ第ＩＩＩ相臨床試験にある、抗ＡｐｏＢアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＳ）ＩＳＩＳ‐１４７７６４の腹腔内投与では、高脂肪が与えられたＣ５７ＢＬ／６に対して、少なくとも２５ｍｇｋｇ-1の週２回の投与が必要とされ、治療から６〜８週間後に５５％のＡｐｏＢの血漿濃度の減少を達成した。更に、Ｃｒｏｏｋｅらは、６〜８週間の間、週２回の５０ｍｇｋｇ-1の投与後に、血漿コレステロールが正常に戻ったことを報告した（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，４６：８７２‐８８４）。ＩＳＩＳ‐１４７７６４が血漿中のコレステロールの減少に及ぼす影響は、治療の４週目に観察された（５０ｍｇｋｇ-1  ２回／週）。
【０１１４】
（００１３１）本明細書に記載の組成物及び方法は、従来技術と比較して、比較的低用量（１ｍｇｋｇ-1）にてＡｐｏＢの減少における効率を明確に実証する。更に、ＡｐｏＢの減少は常に用量依存性であることが示されているので、本発明の開示及び開示のＴＮＣを用いて用量を増加させることは、血漿中でのＡｐｏＢ及びＬＤＬ／ＶＬＤＬ‐Ｃの減少の強化につながることが本明細書から明確になる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１‐１１４；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１７３‐１７８；Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，４６：８７２‐８８４；及び、Ｃｒｏｏｋｅ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，５：９０７‐９１７）。
【０１１５】
（００１３２）本発明の記載では、糖尿病、並びに関連した状態及び症状を治療するための方法を提供する。このような糖尿病及び関連する状態としては、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、及び糖尿病誘発性高血圧が挙げられる。他の糖尿病に関連する状態としては、肥満、並びに血管、目、腎臓、神経、自律神経系、皮膚、結合組織、及び免疫系の損傷が挙げられる。本明細書に記載の組成物は、単独で、又はインスリン及び／又は血糖降下化合物と組み合わせて使用することができる。
【０１１６】
（００１３３）本発明の記載では、癌を治療するための方法を提供する。このような癌としては、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸又は結腸直腸の癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、 中枢神経系腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫、及び肉腫が挙げられる。
【０１１７】
（００１３４）ＭＤＲを回避する１つの手法は、Ｐ‐ｇｐの輸送活性を阻害する、Ｐ‐ｇｐ調節物質又は拮抗薬化合物の使用である。しかしながら、それらの化学療法剤及び毒性との薬物動態学的相互作用により、臨床でのそれらの使用は制限されている。あるいは、Ｐ‐ｇｐの発現はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害することができる。化学調節剤とは異なり、この技術は、Ｐ‐ｇｐの下方制御及び耐性逆転に対するより特異的な手法を提供することができる。
【０１１８】
（００１３５）ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを用いた様々な研究により、多剤耐性表現型を克服するためのＲＮＡｉの使用の可能性が実証されてきた。ｐ‐ｇｐ阻害によるＲＮＡｉ仲介性の耐性逆転の原理の証明を示す最初の研究は、２００３年に公表された（Ｎｉｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５４５（２‐３）：１４４‐１５０）及び（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３（７）：１５１５）。両研究は、ｓｉＲＮＡを用いた過渡的な手法を使用して、様々な細胞モデルにおいて多剤耐性表現型を調節した。Ｈａｏらは２００ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて、高耐性ＭＤＲ細胞株に対して、ＭＣＦ‐７／ＡＤＲ及びＡ２７８０Ｄｘ５においてＰ‐ｇｐ濃度を６５％抑制することができた。更に、彼らは、ＭＤＲ１標的ｓｉＲＮＡは、ｐ‐ｇｐ輸送可能薬物（ドキソルビシン）に対する耐性を逆転したが、非Ｐ‐ｇｐ基質であるヒドロキシウレアに対する感受性には影響しないことを示した。これらのデータから、ｓｉＲＮＡによって仲介されるＰ‐ｇｐ発現のサイレンシングは特異的であることが示唆される。しかしながら、９０％近くの最も顕著な一過性のＭＤＲ逆転は、より低い濃度（１００ｎＭ）のｓｉＲＮＡの使用にもかかわらず、膵臓癌由来の細胞株（ＥＰＰ８５‐１８１ＲＤＢ）及び胃癌細胞（ＥＰＧ８５‐２５７ＲＤＢ）において達成された（Ｎｉｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５４５（２‐３）：１４４−１５０）。最近、Ｄｏｎｍｅｚら（２０１１，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５（２）：８５‐８９）は、濃度は２０ｎＭと低いが、ドキソルビシン耐性ＭＣＦ‐７細胞においてＭＤＲ１の８９％の遺伝子サイレンシング活性を示した。これらのデータは、ＲＮＡｉの有効性がｓｉＲＮＡ配列依存的、及び細胞株依存的であり得ることを示している。
【０１１９】
（００１３６）ｓｉＲＮＡに加えて、安定した抗ＭＤＲ１／Ｐ‐ｇｐ  ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、ＭＤＲ表現型を調節するために使用されていた。ある研究では、ｓｈＲＮＡ発現は、パクリタキセル耐性のＳＫＯＶ‐３ＴＲ及びＯＶＣＡＲ８ＴＲの卵巣癌細胞株でのＭＤＲ１／Ｐ‐ｇｐの下方制御において、ｓｉＲＮＡと比較して同様の効率を有していた（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３（７）：８３３）。更に、Ｓｔｅｇｅら（２００４，Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １１（１１）：６９９‐７０６）は、ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｐｓｉＲＮＡ／ＭＤＲ‐Ａ）を非常に高い薬物耐性を有するヒト胃癌細胞株のＥＰＧ８５‐２５７ＲＤＢへ導入することにより、Ｐ‐ｇｐ発現の完全な逆転を報告した。同様に、Ｙａｇｕｅら（２００４，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １１（１４）：１１７０‐１１７４）は、ｓｈＲＮＡ発現ベクターであるｐＳＵＰＥＲを導入することにより、Ｋ５６２白血病細胞におけるドキソルビシン耐性の完全な逆転を観察した。同様の手法を用いて、Ｓｈｉら（２００６，Ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ＆ｔｈｅｒａｐｙ  ５（１）：３９‐４７）はまた、ヒト扁平上皮癌細胞株（ＫＢｖ２００）において、ＭＤＲ１‐ｓｉＲＮＡ発現カセット及びＥＧＦＰ発現遺伝子を含む新規ベクターから発現されるｓｈＲＮＡの内因性発現により誘導されるＭＤＲ１／Ｐ‐ｇｐ遺伝子の発現及び機能において安定した下方制御を示した。
【０１２０】
（００１３７）上記の研究の全てにおいて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５３６（１）：９３‐９７）及び（Ｄｏｎｍｅｚ，Ｙ．ａｎｄ  Ｕ．Ｇｕｎｄｕｚ，２０１１，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５（２）：８５‐８９）、並びにｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｎｉｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５４５（２‐３）：１４４‐１５０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３（７）：１５１５；Ｓｔｉｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７０（１０）：１４２４‐１４３０；及び、Ｓｔｉｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８９（８）：１０３３‐１０３６）の２つの市販のリポソームが使用されていた。これまでに、キトサンはＭＤＲ１遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを送達するために使用されてきた。この研究では、ナノ粒子は、複合コアセルベーションにより形成された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ｕｎｉｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．Ａｐｒ；２９（２）：２３９‐４２）。当該研究で報告された最大のｍＲＮＡの減少は５２．６％であり、最大６１．３％のパクリタキセル化学療法抵抗性における時間依存的な逆転を含むものであった。抗Ｐ‐ｇｐ  ｓｉＲＮＡの送達におけるキトサンの使用はこれまでのところ報告書に記載されていない。
【０１２１】
（００１３８）本明細書に記載の組成物は、単独で、又は、例えば、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート（Ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα‐２ａ；インターフェロンα‐２ｂ；インターフェロンα‐ｎ１；インターフェロンα‐ｎ３；インターフェロンβ‐ｌａ；インターフェロンγ‐ｌｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸リュープロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン（Ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；ミトマイシン；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（Ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマー���トリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；タキソール；タキソテール；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（Ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；又は塩酸ゾルビシンなどの他の抗癌化合物と組み合わせて使用することができる。
【０１２２】
（００１３９）他の抗癌剤としては、２０‐ｅｐｉ‐１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５‐エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ‐ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質‐１（ａｎｔｉ‐ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ‐１）；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ‐ＣＤＰ‐ＤＬ‐ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ‐アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルフォスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックスＩＬ‐２；カペシタビン；カルボキサミド‐アミノ‐トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス‐ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ‐５‐アザシチジン；ジヒドロタキソール、９‐；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ：エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ���エフロルニチン；エレメン（ｅｌｅｍｅｎｅ）；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルビシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｎｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ホルフェニメックス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子‐１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４‐；イリノテカン；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン‐Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ  ７）；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；ミトマイシン類似体；ミトナフィド；ミトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞成長因子‐サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体；ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子１に基づく治療；マスタード抗癌化合物；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ‐アセチルジナリン；Ｎ‐置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；窒素酸化物酸化防止剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６‐ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘発剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ（ｐｌａｃｅｔｉｎ  Ａ）；プラセチンＢ（ｐｌａｃｅｔｉｎ  Ｂ）；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金‐トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プロピルビス‐アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａに基づいた免疫調節物質；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ‐ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム； ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣剤；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節物質；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテイトナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン（ｓｏｎｅｒｍｉｎ）；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）；サリドマイド；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣剤；チマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホル���ン；スズエチルエチオプルプリン（ｔｉｎ  ｅｔｈｙｌ  ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トポテカン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系；赤血球遺伝子治療；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマー、が挙げられる。
【０１２３】
（００１４０）抗癌補助増強化合物には、三環系抗うつ剤（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、トリミプラミン、ドキセピン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アモキサピン、及びマプロチリン）；非三環系抗うつ剤（例えば、セルトラリン、トラゾドン、及びシタロプラム）；Ｃａ++アンタゴニスト（例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ニトレンジピン、及びカロベリン）；カルモジュリン阻害剤（例えば、プレニラミン、トリフルオロペラジン、及びクロミプラミン）；アムホテリシンＢ；トリパラノール類似体（例えば、タモキシフェン）；抗不整脈薬（例えば、キニジン）；抗高血圧薬（例えば、レセルピン）；チオール枯渇剤（Ｔｈｉｏｌ  ｄｅｐｌｅｔｅｒ）（例えば、ブチオニン及びスルホキシイミン）、並びに多剤耐性低減化合物、例えばＣｒｅｍａｐｈｏｒ  ＥＬがある。
【０１２４】
（００１４１）本発明の目的のために併用療法において有用である他の化合物としては、抗増殖化合物、ピリトレキシムイセチオネート（Ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ  Ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）；抗前立腺肥大化合物、シトグルシド（Ｓｉｔｏｇｌｕｓｉｄｅ）；良性前立腺過形成治療化合物、塩酸タムスロシン；前立腺成長阻害剤、ペントモン；放射性化合物、例えば、フィブリノーゲンＩ１２５、フルデオキシグルコースＦ１８、フルオロドーパＦ１８、インスリンＩ１２５、インスリンＩ１３１、ヨーベングアンＩ１２３、ヨージパミドナトリウムＩ１３１、ヨードアンチピリンＩ１３１、ヨードコレステロールＩ１３１、ヨード馬尿酸ナトリウムＩ１２３、ヨード馬尿酸ナトリウムＩ１２５、ヨード馬尿酸ナトリウムＩ１３１、ヨードピラセトＩ１２５、ヨードピラセトＩ１３１、塩酸イオフェタミンＩ１２３、ヨーメチンＩ１２５、ヨーメチンＩ１３１、ヨータラム酸ナトリウムＩ１２５、ヨータラム酸ナトリウムＩ１３１、ヨーチロシンＩ１３１、リオチロニンＩ１２５、リオチロニンＩ１３１、酢酸メリソプロールＨｇ１９７、酢酸メリソプロールＨｇ２０３、メリソプロールＨｇ１９７、セレノメチオニンＳｅ７５、テクネチウムＴｃ９９ｍ三硫化アンチモンコロイド、テクネチウムＴｃ９９ｍビシセート、テクネチウムＴｃ９９ｍジソフェニン、テクネチウムＴｃ９９ｍエチドロネート、テクネチウムＴｃ９９ｍエキサメタジム、テクネチウムＴｃ９９ｍフリホスミン、テクネチウムＴｃ９９ｍグルセプテート、テクネチウムＴｃ９９ｍリドフェニン、テクネチウムＴｃ９９ｍメブロフェニン、テクネチウムＴｃ９９ｍメドロネート、テクネチウムＴｃ９９ｍメドロネート二ナトリウム、テクネチウムＴｃ９９ｍメルチアジド、テクネチウムＴｃ９９ｍオキシドロネート、テクネチウムＴｃ９９ｍペンテテート、テクネチウムＴｃ９９ｍペンテテートカルシウム三ナトリウム、テクネチウムＴｃ９９ｍセスタミビ、テクネチウムＴｃ９９ｍシボロキシム、テクネチウムＴｃ９９ｍサクシマー、テクネチウムＴｃ９９ｍ硫黄コロイド、テクネチウムＴｃ９９ｍテボロキシム、テクネチウムＴｃ９９ｍテトロホスミン、テクネチウムＴｃ９９ｍチアチド、チロキシンＩ１２５、チロキシンＩ１３１、トルポビドンＩ１３１、トリオレインＩ１２５、及びトリオレインＩ１３１、が挙げられる。
【０１２５】
（００１４２）本明細書で使用するとき、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ及びｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、糖尿病並びに関連する状態及び症状を予防、抑制、及び軽減することを含む。治療は、本明細書に記載の組成物の治療上有効な量を投与することによって行うことができる。他の例では、治療は、インスリン及び本明細書に記載の組成物の組み合わせにおける治療上有効な量を同時に投与することによって行うことができる。更に他の例では、治療される糖尿病及び関連状態が、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、糖尿病誘発性高血圧、肥満、又は血管、眼、腎臓、神経、自律神経系、皮膚、結合組織、若しくは免疫系の損傷である場合、治療は、血糖降下化合物及び本明細書に記載の組成物の組み合わせにおける治療上有効な量を同時に投与することを含み得る。
【０１２６】
（００１４３）化学修飾を含むキトサンの例としては、（ｉ）核酸又はオリゴヌクレオチドと複合体を形成する、キチン及び／又はキトサンと共有結合可能な、又はキトサン系化合物とイオン的又は疎水的に結合可能な、特異的又は非特異的な細胞標的部分、及び（ｉｉ）、キチン及びキトサンの物理的、化学的、又は生理学的な特性を変化させるのに役立つ、キチン及びキトサンの様々な誘導体又は修飾体、を有するキトサン系化合物がある。このような修飾キトサンの例は、特異的又は非特異的な標的リガンド、膜透過剤、亜細胞局在性成分、エンドソーム分解（溶解）剤、核局在シグナル、コロイド安定化剤、血中の長い循環半減期を促進する薬剤、化学誘導体、例えば塩、Ｏアセチル化及びＮアセチル化誘導体などを有するキトサン系化合物である。キトサンの化学修飾のためのいくつかの部位には：Ｃ2（ＮＨ‐ＣＯ‐ＣＨ3又はＮＨ2）、Ｃ3（ＯＨ）、又はＣ6（ＣＨ2ＯＨ）がある。
【０１２７】
（００１４４）本明細書に記載の組成物は、効果的な制御放出特性を有する好適な薬物送達システムである。本発明の組成物は、限定されるものではないが、Ｍｉｒｕｓ社のＴｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）親油性試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン（例えばポリリジン）、又はリポソームなどの好適な送達剤との同時投与など、あらゆる周知の併用療法によって投与することができる。
【０１２８】
（００１４５）本明細書で使用するとき、「同時投与（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ及びｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、本明細書に記載の組成物、及びインスリン及び／又は血糖降下化合物を混合物で、例えば医薬組成物で、又は別々の製剤、例として、同時に、連続的に、又は異なる時間に投与する別々の医薬組成物として、投与することを含む。
【０１２９】
（００１４６）好適な血糖降下化合物としては、例えば、メトホルミン、アカルボース、アセトヘキサミド、グリメピリド、トラザミド、グリピジド、グリブリド、トルブタミド、クロルプロパミド、チアゾリジンジオン、アルファグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニジン誘導体、及びトログリタゾン、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１３０】
（００１４７）本明細書に記載の組成物の投与は、皮下、筋肉内、皮内、乳房内、静脈内、及び当該分野で周知のその他の投与方法を含む、非経口投与とすることができる。
【０１３１】
（００１４８）本発明は、以下の実施例を参照することでより容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１３２】
キトサン／ｄｓＯＤＮ又はｓｉＲＮＡ系のナノ粒子製剤の調製
（００１４９）超高純度キトサン試料は、タンパク質、細菌内毒素、有害金属、無機及び有機不純物を含む汚染物質を除去する品質管理製造工程により製造した。全てのキトサンは、５０ＥＵ／ｇ未満の細菌内毒素を有した。キトサンは、９２％及び８０％の脱アセチル化度を有するよう選択した（表１）。これらのキトサンを、不均一脱アセチル化により製造し、アセチル基はランダム分布ではなくブロック分布で得られた。キトサンは、以前に記載されているように（Ｌａｖｅｒｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７：４８１５‐４８２４；Ｌａｖｅｒｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，３２：１１４９‐１１５８）亜硝酸を使用して化学的に分解し、１０ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び８０ｋＤａの特定の分子量を得て、１０ｋＤａ、４０ｋＤａのキトサンは両方とも９２％及び８０％のＤＤＡであり、８０ｋＤａのキトサンは８０％のＤＤＡであった（表１）。
【０１３３】
【表１】
2014518875.tif 000003
【０１３４】
（００１５０）ＤＰＰ‐ＩＶ遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）から購入した。これらのｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２個のヌクレオチド（ＵＵ）の３’オーバーハングを有するよう合成する。候補は、ＤＰＰ‐ＩＶ配列を標的とする４つの配列（ＤＰＰ‐ＩＶ  Ｓｅｑ１：ＣＡＣＵＣＵＡＡＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；ＤＰＰ‐ＩＶ  Ｓｅｑ２：ＵＡＧＣＡＵＡＵＧＣＣＣＡＡＵＵＵＡＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；ＤＰＰ‐ＩＶ  Ｓｅｑ  ３：ＣＡＡＧＵＵＧＡＧＵＡＣＣＵＣＣＵＵＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；ＤＰＰ‐ＩＶ  Ｓｅｑ  ４：ＵＡＵＡＧＵＡＧＣＵＡＧＣＵＵＵＧＡＵ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のプールにあった。ＡｐｏＢ標的ｓｉＲＮＡ配列は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社からの２‐ＡＣＥ  ＲＮＡ化学により注文合成された（ＡｐｏＢ  Ｓｅｑ１：ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵ，（アンチセンス鎖は、２個のヌクレオチド（ＡＣ）の３’オーバーハングを有するよう合成される），ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；ＡｐｏＢ  Ｓｅｑ  ２（センス）：５’ＣＵＣ  ＵＣＡ  ＣＡＵ  ＡＣＡ  ＡＵＵ  ＧＡＡ  ＡｄＴｄＴ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；ＡｐｏＢ  ｓｅｑ  ２（アンチセンス）５’ＵＵＵ  ＣＡＡ  ＵＵＧ  ＵＡＵ  ＧＵＧ  ＡＧＡ  ＧＵＵｏＵｏＵ３’（ｏＵ‐ｏＵ）＝２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジンオーバーハング，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；ＡｐｏＢ  Ｓｅｑ３（センス）：ＧＧＡＡＵＣｕｕＡｕＡｕｕｕＧＡＵＣｃＡ*Ａ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；ＡｐｏＢ  Ｓｅｑ３（アンチセンス）：ｕｕＧＧＡＵｃＡＡＡｕＡｕＡＡＧＡｕＵＣｃ*ｃ*Ｕ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；２’Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチドは小文字であり、ホスホロチオエート結合はアスタリスクで表されている）。これらの配列は、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１７３‐１７８）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら（２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：１１１‐１１４）、及びＳｔｒａｐｐｓら（２０１０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１４）によって公表された。
【０１３５】
（００１５１）ＲｅｃＱＬ１標的ｓｉＲＮＡ配列は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社からの２‐ＡＣＥ  ＲＮＡ化学により注文合成された（Ｓｅｑ１：５’‐ＧＵＵＣＡＧＡＣＣＡＣＵＵＣＡＧＣＵＵｄＴｄＴ‐３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。この配列は、Ｆｕｔａｍｉら（２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，９９：７１‐８０；２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，９９：１２２７‐１２３６）によって公表された。ＭＤＲ１標的配列は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社により予め合成されたものを購入し、製品番号：Ｍ‐００３８６８‐０２‐００１０を使ってＤｈａｒｍａｃｏｎ社のカタログから入手可能である。候補は、ＭＤＲ１配列を標的とする４つのｓｉＲＮＡ：Ｓｅｑ  １（センス）：５’ＧＣＵＧＡＵＣＵＡＵＧＣＡＵＣＵＵＡＵＵＵ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；Ｓｅｑ  １（アンチセンス）：５’ＡＵＡＡＧＡＵＧＣＡＵＡＧＡＵＣＡＧＣＵＵ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２；Ｓｅｑ  ２（センス）：５’ＧＡＣＣＡＵＡＡＡＵＧＵＡＡＧＧＵＵＵＵＵ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；Ｓｅｑ  ２（アンチセンス）：５’ＡＡＡＣＣＵＵＡＣＡＵＵＵＡＵＧＧＵＣＵＵ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；Ｓｅｑ  ３（センス）：５’ＧＡＡＡＣＵＧＣＣＵＣＡＵＡＡＡＵＵＵＵＵ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；Ｓｅｑ  ３（アンチセンス）：ＡＡＡＵＵＵＡＵＧＡＧＧＣＡＧＵＵＵＣＵＵ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；Ｓｅｑ  ４（センス）：５’ＵＣＧＡＧＵＣＡＣＵＧＣＣＵＡＡＵＡＡＵＵ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７；Ｓｅｑ  ４（アンチセンス）：５’ＵＵＡＵＵＡＧＧＣＡＧＵＧＡＣＵＣＧＡＵＵ３’，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８から構成された。
【０１３６】
（００１５２）ｄｓＯＤＮ配列は、ホスホルアミダイト化学（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により合成し、ナノ粒子の安定性及びヌクレアーゼ保護アッセイのために使用した。フローサイトメトリー分析について、６‐カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）５’標識ｄｓＯＤＮを使用した（（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）。
【０１３７】
（００１５３）本明細書に提示のキトサンナノ粒子の物理化学的特性評価のためにｄｓＯＤＮを使用する理論的根拠は、ｄｓＯＤＮのｓｉＲＮＡを模倣する特性にある。これらの模倣特性は、ｓｉＲＮＡとｄｓＯＤＮとの間の構造レベル（二本鎖構造、長さ（２１塩基長）、及びヌクレオチドオーバーハング）の類似性に起因している。更に、電荷密度は、ｓｉＲＮＡとｄｓＯＤＮとの間では、同一のリン酸残基数／それらの骨格の間隔により類似している。ｓｉＲＮＡとｄｓＯＤＮとの間の差異は、ｄｓＯＤＮ配列中のウラシルからチミンへの置換（Ｕ→Ｔ）、及びｄｓＯＤＮの糖骨格のデオキシリボシル化（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｌａｔｉｏｎ）にある。ｄｓＯＤＮ配列は、ホスホルアミダイト化学（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により合成し、サイズ及びゼータ電位の測定、ナノ粒子の安定性、並びにヌクレアーゼ保護のアッセイのために使用した。共焦点顕微鏡法、及びフローサイトメトリー分析について、６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）５’標識ｄｓＯＤＮを使用した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）。
【０１３８】
（００１５４）特定のＭｎ及びＤＤＡを有するキトサンを、１：１のグルコサミン：ＨＣｌの比率を用いた塩酸中において０．５％（ｗ／ｖ）にて回転ミキサーで一晩溶解し、最終濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。その後、滅菌濾過した溶液を脱イオン水で希釈し、アミン（キトサン脱アセチル基）とリン酸（ｄｓＯＤＮ又はｓｉＲＮＡの核酸）との所望の比率（Ｎ：Ｐ）を得る。その後、ナノ粒子（９２‐１０‐５、９２‐１５０‐５、８０‐４０‐５、８０‐１０‐１０、８０‐１０‐５、８０‐２００‐５、及び８０‐８０‐５）は、１００μＬの希釈したキトサン溶液に、それぞれ０．０５μｇ／μＬの濃度の１００μＬのｄｓＯＤＮ又はｓｉＲＮＡを急速に混合（ピペット操作）することで調製した。０．３３μｇ／μＬの濃度のｄｓＯＤＮは安定性及びヌクレアーゼ保護のアッセイに使用し、その一方で、０．１μｇ／μＬの濃度はＤＬＳ及びＥＳＥＭに使用した。ナノ粒子は使用する前に室温で３０分間インキュベートした。
【実施例２】
【０１３９】
トランスフェクション実験
（００１５５）インビトロでのトランスフェクションについて、高グルコースのダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ‐ＨＧ）を、０．９７６ｇ／ＬのＭＥＳ及び０．８４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）を用いてｐＨ６．５で調製した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含まないトランスフェクション培地を、５％ＣＯ2のインキュベータ中で３７℃にて一晩平衡化し、トランスフェクションの直前に無菌ＨＣｌ（１Ｎ）を用いて３７℃でｐＨ値を６．５に調節した。９６ウェルプレートで行うｓｉＲＮＡのトランスフェクションについて、キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子は使用する３０分前に上記のように調製した。０．０５μｇ／μｌ（３，７０４ｎＭ）の濃度の１００μｌのｓｉＲＮＡ溶液は、１：１の比率（ｖ／ｖ）でキトサンとのｓｉＲＮＡ複合体を形成するために使用した。複合体形成後、ｓｉＲＮＡ濃度は０．０２５μｇ／μｌ（１，８５２ｎＭ）となり、ナノ粒子を、ウェル当たり（１０ｐモル／ウェル）１００ｎＭのｓｉＲＮＡに等しい０．００１３５μｇ／μｌの最終濃度で、ＤＭＥＭ‐ＨＧ培地を含むゴーストプレート中でインキュベートした。２４ウェルプレートで行うｄｓＯＤＮのトランスフェクションについて、キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子は使用する３０分前に上記のように調製した。０．０５μｇ／μｌ（３，７１７ｎＭ）の濃度の１００μｌのｄｓＯＤＮ溶液をは、１：１の比率（ｖ／ｖ）でキトサンとのｄｓＯＤＮ複合体を形成するために使用した。複合体形成後、ｓｉＲＮＡ濃度は０．０２５μｇ／μｌ（１，８５８ｎＭ）となり、ナノ粒子を、ウェル当たり（６０ｐモル／ウェル）６００ｎＭのｄｓＯＤＮに等しい０．００１３５μｇ／μｌの最終濃度で、ＤＭＥＭ‐ＨＧ培地を含むゴーストプレート中でインキュベートした。ＦＡＣＳに使用するｄｓＯＤＮとｓｉＲＮＡとの間の分子量における僅かな差異は、ｄｓＯＤＮの６ＦＭＡ標識に起因している。ナノ粒子を含むプレートを、５％のＣＯ2で３７℃にて１０分間平衡化した。細胞上の培地を吸引し、ｄｓＯＤＮ又はｓｉＲＮＡ系のナノ粒子を含むｐＨ６．５の平衡化トランスフェクション培地を、ウェル当たり５００μｌ（２４ウェルプレート）又は１００μｌ（９６ウェルプレート）補充し、最終濃度を１００ｎＭ／ウェルとした。ＦＢＳをトランスフェクションから４時間後に添加し、ウェル当たり最終濃度を１０％とした。細胞は、トランスフェクションから２４時間後の分析まで、キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子と共にインキュベートした。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）を陽性対照として使用し、未処理細胞及び非複合体化ｓｉＲＮＡ処理細胞の両方を陰性対照として使用した。
【０１４０】
（００１５６）市販のリポソームであるＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国コロラド州ラファイエット）を、全ての試験細胞株においてトランスフェクション効率ための陽性対照として使用した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）／ｄｓＯＤＮ（フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡法）又はＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）／ｓｉＲＮＡ（ｑＰＣＲ）のリポプレックス（１：２［ｗ／ｖ］比率）を、製造業者のプロトコルに従って調製した。
【０１４１】
（００１５７）インビトロでのトランスフェクションでは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ社（ＡＴＣＣ社、バージニア州マナッサス）から購入したＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２（ＡｐｏＢ及びＤＰＰ‐ＩＶ）、ＨＴ‐２９（ＤＰＰ‐ＩＶ）、Ｃａｃｏ‐２（ＤＰＰ‐ＩＶ）、Ｒａｗ２６４．７（ＡｐｏＢ）、Ａ５４９、ＬＳ１７４Ｔ、及びＡｓＰＣ１の細胞株が関与した。ＭＣＦ７‐ＭＤＲ細胞株は、Ｈａｍｉｄ  Ｍｏｒｊａｎｉ博士（フランス、パリ）から寄贈された。細胞は、３７℃かつ５％のＣＯ2にて、１．８５ｇ／Ｌ（ＨＥＫ２９３）又は１．５ｇ／ｌ（ＲＡＷ２６４．７）の重炭酸ナトリウム、（ＬＳ１７４Ｔ）、Ｆ１２Ｋ（Ａ５４９）、ＲＰＭＩ‐１６４０（ＭＣＦ‐７ＭＤＲ）、及びＲＰＭＩ‐１６４０（ＡｓＰＣ１）を用いて、最小必須培地（ＨｅｐＧ２）、ＭｃＣｏｙｓ（ＨＴ‐２９）、高グルコースのダルベッコ最小必須培地（ＨＥＫ２９３及びＲＡＷ２６４．７）中で培養し、かつ１０％のＦＢＳ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、オンタリオ州バーリントン）で補充した。ＨｅｐＧ２細胞は８％のＦＢＳで補充した。トランスフェクションについて、細胞を９６ウェル又は２４ウェルの培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国ニューヨーク州）に播種し、トランスフェクションの日に５０％〜７０％の集密を得た。
【実施例３】
【０１４２】
ＲＮＡ抽出及び遺伝子発現解析
（００１５８）全ＲＮＡ抽出は、Ｍａｃｈｅｒｙ‐Ｎａｇｅｌ社からのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  ＸＳキットを用いて行った。細胞溶解は、各ウェルに、２μｌのＴＣＥＰ及びストレプトマイセス・グリセウス・キトサナーゼで補充された１００μｌのＲＡ１溶解緩衝液を添加することで行った（Ａｌａｍｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｅｃｉｎｅ，５：４７３−４８１）。溶離する前に試料をＲＡ３緩衝液でインキュベートするときに、試料のＤＮＡｓｅ処理を行った。ＲＮＡの定量及び品質（完全性）の評価は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を用いて実施した。７．５に等しいＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）をｑＰＣＲ分析のための受容閾値と見なした。
【０１４３】
（００１５９）全ＲＮＡの逆転写は、ファーストストランドｃＤＮＡトランスクリプターキット（Ｒｏｃｈｅ社、カナダ、ラヴァル）を用いて行った。全部で０．５‐１μｇのＲＮＡ／試料を製造業者のプロトコルに従って、ｏｌｉｇｏｄＴプライマーを用いた逆転写反応に使用した。キトサン／ｓｉＲＮＡ処理した細胞の遺伝子定量を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。全ての反応を３回行い、Ｃｔの平均値を定量に使用した。遺伝子発現レベルを、Ｒｏｃｈｅ（登録商標）社からのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（登録商標）（ＵＰＬ）を用いたアッセイにより決定した。一方で、内在性コントロール（ＴＢＰ、ＨＰＲＴ）に対する遺伝子発現レベルは、検証済みのＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを用いて決定した。標的遺伝子の相対定量は、△△ＣＴ法を用いて決定した。つまり、標的遺伝子のＣｔ（閾値サイクル）値は、内在性コントロール遺伝子（内在性コントロール）に対して標準化し（△ＣＴ＝Ｃｔ標的−Ｃｔ内在性コントロール）、標準物質と比較した：△△ＣＴ＝△Ｃｔ試料−△Ｃｔ標準物質。相対式（ＲＱ）を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）２．２．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて計算し、式はＲＱ＝２-△△CTである。
【実施例４】
【０１４４】
ナノ粒子分析
（００１６０）キトサン／ｄｓＯＤＮ及びキトサン／ｓｉＲＮＡの複合体のサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（登録商標）を用いて、２５℃で１３７°の角度にて動的光散乱により決定した。試料は、計算において純水の屈折率及び粘度を用いて３回測定した。ゼータ電位は、計算のために同じ機器及び水の誘電率を用いて、２５℃にてレーザードップラー速度計測により同様に３回測定した。強度平均径として報告されるサイズ決定について、５０μｌのキトサンを５０μｌのｄｓＯＤＮ又はｓｉＲＮＡと混合し、その後、１０ｍＭのＮａＣｌを用いて５００μｌで完成した。ゼータ測定について、ナノ粒子を５００μｌの１０ｍＭＮａＣｌを用いて１：２に希釈した。キトサン／ｄｓＯＤＮのナノ粒子の全ての製剤は、ＤＬＳで測定したところ、４５‐１５６ｎｍの範囲にあった。キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ｓｉＲＮＡ配列１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及び２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と複合体化すると、ＤＬＳでの測定から５５‐１０５ｎｍの範囲の平均直径を有していた（表２）。ｓｉＲＮＡ配列３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）について、完全に修飾されたキトサン‐ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、１０４‐１３０ｎｍの範囲の平均直径を有していた（表２）。キトサンと複合体化したｄｓＯＤＮと、未修飾ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢ（配列１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と、適度に修飾されたｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢ（配列２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）との間に、ナノ粒子サイズにおける統計的な差異は認められなかった。しかしながら、完全に修飾されたｓｉＲＮＡ配列は、種々のキトサンと複合体を形成すると、より大きなナノ粒子が生じた。キトサン／ｄｓＯＤＮ及びキトサン／ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、Ｍｎが増加するとより大きなサイズ値を示した。これらの特定の製剤においてＤＤＡを比較した場合、統計的に有意な差異は認められなかった。予想されたように、全ての製剤における過剰のキトサンは、表２のゼータ電位によって示されるように、正に帯電したナノ粒子をもたらした。ＤＬＳによりサイズ及びゼータ電位の決定が可能であり、一方でＥＳＥＭではサイズのみを測定した。
【０１４５】
【表２】
2014518875.tif 000004
【０１４６】
（００１６１）上記のように形成したナノ粒子は、環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ、Ｑｕａｎｔａ  ２００  ＦＥＧ、ＦＥＩ社、米国オレゴン州ヒルズボロ）を用いて画像化した。ナノ粒子形成に続いて、ＴＮＣをシリコンウエハ基板上に噴霧した後、以前に記載されているように（Ｌａｖｅｒｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ，３２：１１４９‐１１５８）金を用いてスパッタコーティングした（Ａｇａｒ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒ、Ｍａｒｉｖａｃ社）。ＥＳＥＭ顕微鏡の高真空モードで２０ｋＶにて観察を行った。平均粒径（＋／−標準偏差）は、顕微鏡のＸＴ  Ｄｏｃｕソフトウェア（ＸＴ  Ｄｏｃｕ，ＦＥＩ社）を用いて、各分画において少なくとも６つの異なる視野から１５０を超える粒子の直径を測定することにより決定した。サイズ決定の頑健性は、ＥＳＥＭ画像分析サイズ決定とＤＬＳサイズデータとを比較することで分析した。
【０１４７】
（００１６２）結果は、使用するキトサン製剤に応じて、４５‐１５６ｎｍの間の範囲の平均直径を有する球状ナノ粒子（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、及び２Ｂ）を示している（表２、ＥＳＥＭ）。本明細書に記載の特定の製剤から得られた結果は、動的光散乱の結果と一致しており（表２）、そのため本明細書に記載の組成物及び方法の頑健性を示唆している。更に、形成したナノ粒子は２００ｎｍ未満の再現可能なサイズをもたらし、それは腎クリアランスを回避可能とする。それ故インビボにおけるトランスフェクション効率を改善し、かつ循環ナノ粒子の半減期を増加させる。
【０１４８】
（００１６３）キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子及びキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子の形成及び安定性は、異なる方法を用いてｐＨ６．５及び８にて最大２０時間試験した。キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子を形成し、これは弱酸性のｐＨ（ｐＨ６．５）でＮ：Ｐ比が２超にて最大２０時間安定した（図３Ａ及び３Ｂ）。ナノ粒子の形成から４時間後では、検出可能なｄｓＯＤＮはＮ：Ｐ比が１以上（ｐＨ６．５）では観察されなかった一方で、完全なｄｓＯＤＮの放出が同一のＮ：Ｐ比でｐＨ８にて観察された。より長い暴露時間の２０時間では、ＡｐｏＢのｄｓＯＤＮにおいてＮ：Ｐ比が２でｄｓＯＤＮの放出がもたらされ、一方で、より高いＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ１０）ではナノ粒子の安定性を維持することができた。ｐＨ値が８で、かつ同じＮ：Ｐ比１０では、部分的なｄｓＯＤＮの放出が観察された。本明細書に記載の特定のキトサン製剤では、Ｎ：Ｐ比が２超（Ｎ：Ｐ＞２）で、２０時間の最小期間の間、ナノ粒子の安定性を確実とした。キトサン／ｓｉＲＮＡの安定性を、蛍光に基づくアッセイであるＲｉｂｏｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙ（登録商標）を用いて評価し、複合体の不安定化後に放出されるｓｉＲＮＡを定量した。結果は、Ｎ：Ｐ比が５及び１０のキトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ｐＨ６．５で最大２０時間安定であることを示した。キトサン８０‐１０‐５は、他の製剤と比較した場合、最も低い安定性を示した。キトサン８０‐１０におけるＮ：Ｐ比の増加により、ナノ粒子の安定性における改善がもたらされた。キトサン８０‐１０を除いて、５を超えるＮ：Ｐ比の増加は、データによって示されるように、ナノ粒子安定性の増加をもたらさなかった（図４Ａ及び５）。従って、より低いＮ：Ｐ比ではナノ粒子は不安定であり、複合体形成効率は最適ではなかった。中性ｐＨでは、ナノ粒子は、Ｎ：Ｐ比が２〜５の間で安定であった。より塩基性のｐＨ８では、ナノ粒子は不安定であり、安定性増加のために、より高いＮ：Ｐ比及びより大きい分子量が明らかに必要であった。
【０１４９】
（００１６４）キトサンパラメータ（ＤＤＡ、ＭＷ、及びＮ：Ｐ比）の効果は、例えば、抗ＲｅｃＱＬ１  ｓｉＲＮＡを用いて調査した。キトサンのＭＷが増加するとナノ粒子サイズが増大するため、分子量の明確な効果は明らかである（図４Ｂ、４Ｃ、及び４Ｄ）。ＤＤＡはナノ粒子サイズに対して非常にわずかな影響を有していた。増加したＮ：Ｐにおいてより大きなナノ粒子サイズを有するため、Ｎ：Ｐ比はナノ粒子サイズに影響を与えるようである。
【０１５０】
（００１６５）ｓｉＲＮＡ濃度がナノ粒子サイズに及ぼす影響を検討した。我々の結果は、増加したｓｉＲＮＡ濃度において増加したナノ粒子サイズを示している（図４Ｅ）。
【０１５１】
（００１６６）低いＮ：Ｐ比でｄｓＯＤＮ配列を保護するキトサンの能力は、ＤＮＡｓｅ  Ｉ保護アッセイを用いて評価した。キトサン／ｄｓＯＤＮのナノ粒子（６μｌ）を、（ｐＨ６．５）２０ｍＭのＭＥＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、及びＤＮＡｓｅ  Ｉの０、０．５、１、２、５、又は１０ユニットの濃度を含む緩衝液中でインキュベートした。試料は３７℃で３０分間インキュベートした。反応を２μｌのＥＤＴＡ（５０ｍＭ）を添加して停止し、その後１５分間７２℃で加熱した。その後、試料をゲル電気泳動で評価した。結果は、ｓｉＲＮＡ模倣二本鎖オリゴヌクレオチドを保護する製剤の能力を実証するものであった（図６Ａ及び６Ｂ）。全ての消化は対照（即ち、０Ｕ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ＝１００％強度）を用いて処理試料の信号強度により評価した。ＤＮＡ１μｇ当たり１ユニットのＤＮＡｓｅ  Ｉを使用した場合、保護は考慮されるべきであり、複合体の約７０％を占めている。一方で、陰性対照は、ＤＮＡ１μｇ当たり０．５ユニットのＤＮＡｓｅ  Ｉを使用すると、完全に消化される。ＤＮＡ１μｇ当たりＤＮＡｓｅ  Ｉ濃度が５ユニットまで増加しても、保護は依然として有効なままである。
【０１５２】
（０００１６７）異なるＤＤＡ、Ｍｎ、及びＮ：Ｐ比での、ＲｅｃＱＬ１、ＤＰＰ‐ＩＶ、及びＡｐｏＢのｄｓＯＤＮナノ粒子の細胞内取り込みは、トランスフェクト細胞のキトサナーゼ処理後にフルオレセイン標識ｄｓＯＤＮをＦＡＣＳ分析することで評価した。それにより、以前に記載されているように（Ａｌａｍｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，５：４７３‐４８１）、膜結合ナノ粒子に関連するあらゆる偏見の可能性を低減することができる。興味深いことに、ｄｓＯＤＮ／キトサンナノ粒子から得られた結果は、効率的な取り込みにおける細胞株依存性を示唆している。キトサンナノ粒子の取り込みにおける細胞株依存性は、以前の研究において種々のエンドサイトーシス経路と関連していた（Ｂｉｓｈｏｐ，１９９７，Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ，７：１９９‐２０９；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１９：１４８８‐１４９４）。ＦＡＣＳの結果は、概して、これらのｄｓＯＤＮを用いた細胞内取り込みでは、製剤間に差異はないことを示している（図７Ａ及び７Ｂ）。本明細書に提示の組成物を用いた取り込み効率は、ＲｅｃＱＬ１（ＬＳ１７４Ｔ、Ａ５４９、及びＡｓＰＣ１の細胞株）において８０％〜９８％、ＡｐｏＢ（ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、及びＲＡＷ２６４．７の細胞株）において５５％〜８０％の範囲であった。ＨｅｐＧ２細胞株におけるＤＰＰ‐ＩＶ  ｄｓＯＤＮナノ複合体の取り込み効率は、異なる製剤間（９２‐１０‐５、８０‐１０‐１０、及び８０‐８０‐５）に統計学的な差異はなく、７３％〜９９％の範囲であった。キトサン／ｄｓＯＤＮナノ粒子を用いた取り込み効率は、細胞型間での類似した相対的ばらつきはあるが、商業的に使用されるリポプレックス（ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標））に匹敵するか又はより高いレベルを達成した（図７Ａ及び７Ｂ）。更に、これらの結果は、以下に記載の共焦点顕微鏡データ（図８〜１０）と一致している。画像は全ての細胞株におけるキトサン及びｄｓＯＤＮの細胞分布を示しており、それはＦＡＣＳの定量的データとの定性的相関関係を示唆している。
【０１５３】
（００１６８）共焦点顕微鏡法を使用して、本明細書に記載の種々の細胞株（ＬＳ１７４Ｔ、ＭＣＦ‐７ＭＤＲ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ‐２、及びＲＡＷ２６４．７）への粒子の取り込み及び内部移行を評価した。キトサンはローダミンを用いて標識し、一方でＲｅｃＱＬ１‐ｓｉＲＮＡ、ＤＰＰ‐ＩＶ‐ｄｓＯＤＮ、及びＡｐｏＢ‐ｄｓＯＤＮはフルオレセインを用いて標識した。ＭＣＦ‐７ＭＤＲナノ粒子の評価では、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡを使用した。標識処理の後、ナノ粒子は前述の手順を用いて、キトサン‐ローダミンとｓｉＲＮＡ模倣ｄｓＯＤＮとを１：１の体積で混合して形成した。結果は、本明細書に記載の製剤は、トランスフェクションから２４時間後にｓｉＲＮＡ又はｄｓＯＤＮを最大放出し、効率的に細胞内に内部移行したことを示唆している。包含される結果は、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＯＤＮとキトサンとの間の２４時間時点での共局在の欠如を示しており、それはｓｉＲＮＡ又はｄｓＯＤＮの積荷の完全な放出がトランスフェクションから２４時間後に達成されたことを実証している。更に、ほとんどのトランスフェクト細胞において見られるｓｉＲＮＡ又はｄｓＯＤＮのびまん性染色パターンは、エンドサイトーシス小胞を脱出した複合体を表しており（図８〜１０）、それはキトサン‐プラスミドＤＮＡのナノ粒子を使用した以前の生細胞イメージング研究と一致する（Ｔｈｉｂａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１８：１７８７‐１７９５）。経時変化調査から、粒子の内部移行はゆっくりした放出動態でトランスフェクションから１時間以内に開始し、トランスフェクションから２４時間後に最大に到達することが示された。
【０１５４】
（００１６９）上記の結果は、種々のｄｓＯＤＮ及びｓｉＲＮＡを複数の細胞株にトランスフェクトし、かつ効率的に送達する、本明細書に記載の製剤の能力を示している（図８〜１１）。
【実施例５】
【０１５５】
生体外でのｓｉＲＮＡ送達及び遺伝子発現抑制
（００１７０）キトサンの特定の製剤（９２‐１０‐５、８０‐４０‐５、８０‐１０‐１０、及び８０‐８０‐５）を、種々の細胞株におけるｓｉＲＮＡ送達、及びその後の遺伝子発現（ＲｅｃＱＬ１  ｍＲＮＡ、ＤＰＰ‐ＩＶ、又はＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ）の阻害について評価した。結果は、ＲｅｃＱＬ１、ＤＰＰ‐ＩＶ、及びＡｐｏＢをコードするｍＲＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲで測定すると２倍を超えて下方制御されたことを示している（図１１Ａ及び１１Ｂ）。これらの結果は、アラマーブルーアッセイで観察すると、本明細書に記載の製剤は明らかな細胞毒性を有さずに、市販のリポソームであるＤｈａｍａＦＥＣＴ（登録商標）に匹敵する遺伝子サイレンシングのレベルを達成できることを実証している。
【０１５６】
（００１７１）より具体的には、ＬＳ１７４Ｔ細胞におけるＲｅｃＱＬ１  ｍＲＮＡの阻害に関して、キトサン９２‐１０‐５は陽性対照として本明細書で使用されている現在のゴールドスタンダードである市販製剤（〜８０％）と類似した、高いレベルのサイレンシング（〜８０％）を示した。製剤８０‐４０‐５及び８０‐１０‐１０もまた、著しいサイレンシングを誘導するが、９２‐１０‐５よりも低い程度に誘導し、また、特に製剤８０‐１０‐１０においては非特異的なモックサイレンシングが増加した（図１１Ｂ）。本明細書に開示の結果は、以前に他の研究者により使用されていたＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ＞２０）をはるかに下回るＮ：Ｐ比（Ｎ：Ｐ＝５）で、効率的にｓｉＲＮＡを送達し、かつ特定の遺伝子をノックダウンするための、記載のキトサン系製剤の有効性を明確に示している。概して、我々の全ての低いＮ：Ｐ比のキトサン製剤は、ＦＡＣＳデータを支持する高いレベルの遺伝子サイレンシングを達成した（図７Ｂ）。
【０１５７】
（００１７２）ＤＰＰ‐ＩＶ又はＡｐｏＢのｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡレベル（ｍＲＮＡ）での７０％の遺伝子サイレンシングは、Ｎ：Ｐ比が５のキトサン９２‐１０から成る特定の製剤を用いて達成可能であることが見出された（図１１Ａ）。しかしながら、メッセンジャーレベルでの７０％の阻害は、ＤＰＰ‐ＩＶにおける酵素活性の５０％の減少に変換される（図１２）。酵素レベルでのこの阻害は、市販のリポプレックスであるＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）を使用する場合に達成されるレベルに匹敵する。
【実施例６】
【０１５８】
キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子のインビボでの効率分析
（００１７３）ｓｉＮＲＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子のインビボでの効率を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて評価した。各治療法について、４匹の動物（ｎ＝２のＤα及びｎ＝３のＣ１群を除いてｎ＝４）に、ＡｐｏＢ遺伝子を標的とする１ｍｇｋｇ-1のｓｉＲＮＡを注射した。ＡｐｏＢ遺伝子を標的とする１ｍｇｋｇ-1のｓｉＲＮＡを低分子量のキトサン（ＬＭＷ‐ＣＳ）と複合体化させて、最終量を０．２ｍｌとした（例えば、１：１の比率でのキトサン９２‐１０‐５と０．５μｇ／μｌの７８μｌのｓｉＲＮＡ量（３７，０３７ｎＭ）との複合体形成後に、１ｍｇｋｇ-1の投与量として計算される、３９ｇのマウスに対して３９μｇのｓｉＲＮＡの注射量を投与した）。その後、１５６μｌの全量を投与した。複合体形成後のｓｉＲＮＡ濃度は、０．２５μｇ／μｌ（１８，５１８ｎＭ）となる。具体的には、ＡｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを、Ｎ：Ｐ比が５（Ｎ：Ｐ５）でキトサン製剤９２‐１０（ＤＤＡ、Ｍｎ）と複合体化した。合計で、５つの群（Ｃ１〜Ｃ５；ｎ＝４／群）を表３のスケジュールに従って異なる時にＴＮＣ処理した。様々なＣ５７ＢＬ／６マウス群（群当たりｎ＝４動物）における、１ｍｇｋｇ-1の抗ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの用量でのキトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子の静脈注射スケジュールに関するデータを表３に開示する。それぞれの日は、１週間の内で唯一注射が行われた日か又は安楽死が行われた日を表している。治療反応の速度を調査するために、ＴＮＣ９２‐１０‐５を１回のみ注射して２日後に安楽死させたＤα群からの２匹のマウスを除き、全てのマウスにＴＮＣ９２‐１０‐５（Ｍｎ‐ＤＤＡ‐Ｎ：Ｐ）を３週間の間、週に１回注射した。これらの２匹のマウスを除いて、他の全てのマウスは２０１１年１月の最後の週内に安楽死させた。Ｄα群は未処理のアテローム硬化性の陽性対照としての役割を果たし、Ｄμは通常の低脂肪食を与えられた陰性対照群であった。Ｄβ群は、キトサンを含まないｓｉＲＮＡ送達のための陰性対照群であり、複合体化されていない裸のｓｉＲＮＡを注射した。この調査に用いた動物の総数は３２匹であった。
【０１５９】
【表３】
2014518875.tif 000005
【０１６０】
（００１７４）全ての動物は、モントリオール大学の動物倫理委員会（ＣＤＥＡ）によって要求されるように、実験前に２週間順化させた。２週間の順化後、動物が安楽死した日に相当する調査完了時まで、Ｄα陽性群（未処理群、ｎ＝４）及びＤβの裸ｓｉＲＮＡ処理群（ｎ＝４）を含む全ての処理群に高脂肪の固形試料のＤ１２４９２を供給した（表３）。Ｄμ群（ｎ＝４）には通常の固形試料のＤ１２４５０Ｂを与え、正常陰性対照（低脂肪群）としての役割を果たした。全ての処理動物に３週間、週に１回注射した（表３）。全てのＣ群の動物には、低いＮ：Ｐのキトサン製剤９２‐１０‐５を用いて、１ｍｇｋｇ-1のＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡを注射した。３週間の注入の最後は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５群を安楽死させる７、６、５、４、及び３週間前に行い、処理の経時変化を調査した。４匹の陽性対照のアテローム硬化性Ｄα動物のうちの２匹に、安楽死の２日前に上記製剤を注射し、他の残りの未処理の２匹と合わせて治療の開始を調査した。Ｄβ群は１ｍｇｋｇ-1にて複合体化されていない裸のＡｐｏＢｓｉＲＮＡを用いて処理し、一方で通常の低脂肪食群のＤμは処理しなかった（詳細は表３に示す）。
【０１６１】
（００１７５）実験スケジュールの間、調査が完了するまで、ＴＮＣ注射の前に、静脈切開を２週間に１回実施し、一方で動物の体重測定を１週間に１回実施した。実験スケジュールの終了時、かつ全ての動物を犠牲にした後（表３）、肝臓及び腸などの臓器を分析のために取り除いた。
【０１６２】
（００１７６）血液学的、生化学的、血清学的、及び組織学的な分析を全ての動物について行った。例えば、血清の血液学的及び生化学的な分析は、カナダ、モントリオールのＶｉｔａＴｅｃｈ社で行った。血清中のＡｐｏＢ減少における定量は抗ＡｐｏＢ  ＥＬＩＳＡにより行い、一方でＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールの定量は、比色分析により実施した。肝臓切片の染色はヘマトキシリン‐エオシン染色で行い、脂肪空胞を可視化した。肝臓への免疫細胞浸潤の評価について、パラフィン包埋切片をサフラニン‐Ｏ／ファストグリーン／鉄‐ヘマトキシリンで染色した。
【０１６３】
（００１７７）全ての動物の血液学的及び生化学的な分析は、安楽死の日に血清収集後に実施した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の２つの肝障害の感受性指標を、処理及び未処理の動物において定量した。処理群（Ｃ５）と陽性対照群（Ｄα）との間のＡＬＴ及びＡＳＬの血漿濃度の比較からは如何なる有意な差も示されず、それは低いＮ：Ｐのキトサン‐ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡのＴＮＣを用いた処理は、肝臓毒性作用を有さないことを示唆するものである（表４）。
【０１６４】
（００１７８）更に、結果は、血清アルブミン濃度が処理及び未処理の群の両方において正常であったことを示し、それもまた正常な肝機能を示している。しかしながら、ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢ処理動物における総コレステロールの定量により、陽性対照群と類似して血清濃度が高い可能性が示され（表４）、それぞれＣ５‐２にはキトサン／ｓｉＲＮＡ‐ＡｐｏＢナノ粒子が投与され、一方でＤα‐３はアテローム性動脈硬化症発症の陽性対照である。群当たり１匹の動物のみを血液学的分析に使用した。なぜなら必要な血清量が多く、１匹の動物の犠牲を必要とするためである。
【０１６５】
【表４】
2014518875.tif 000006
【０１６６】
（００１７９）これらの結果を合わせると、低いＮ：Ｐのキトサン系ｓｉＲＮＡナノ粒子は如何なる肝障害も誘発しないため、その安全性が示される。
【０１６７】
（００１８０）アポリポタンパク質Ｂの血漿濃度値μｇ／ｍｌは、抗ＡｐｏＢの市販のＥＬＩＳＡキット（Ｕｓｃｎ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社、中国）を用いて評価した。ＡｐｏＢの血漿濃度の測定値は試験した群及び対照によって、５９７μｇ／ｍＬ〜１，４３３μｇ／ｍＬの間で変化した。得られた結果は、全ての処理群はアテローム硬化性の陽性対照群Ｄαから〜３５％減少したＡｐｏＢの血漿濃度を有しており、正常陰性対照（Ｄμ）の血漿濃度と類似の濃度を達成したことを示している（図１３）。Ｄα‐２日群は、注射から２日後に類似した減少を示しており、それはＴＮＣの注射後の迅速なサイレンシング効果を示唆するものである。
【０１６８】
（００１８１）ＡｐｏＢ濃度は、複合体化されていないｓｉＲＮＡ（対照群；Ｄβ-１）を受けた動物において３５％減少した。この処理法（Ｄβ-１）は、血漿中でのＡｐｏＢの減少においてＴＮＣ処理法と同様に有効であったが（図１３）、それは肝臓における高い炎症反応をもたらしたため（図１６Ｈ）、効果的かつ治療的なサイレンシング／血漿中でのＡｐｏＢの減少を達成するための複合体化されていないｓｉＲＮＡの投薬は制限される。更に、結果は、低いＮ：Ｐのキトサン系ＴＮＣにおけるＡｐｏＢの血漿濃度の減少は、あらゆる明らかな炎症又は肝臓毒性を有さずに、Ｃ１動物群において最後の注射から７週間を超えて維持されたことを示している（図１３）。これらの結果は、特に有望なＴＮＣ処理における長命な特性、及び効果的な制御された放出特性を示している。
【０１６９】
（００１８２）毒性／炎症性の特性におけるＤβ-１とＣ１‐Ｃ５群との間の比較から、これらの特定のＬＭＷ‐ＴＮＣの使用において明らかな毒性／炎症性の特性が認められなかったので、裸のｓｉＲＮＡに勝る利点が示される（図１６及び表４）。
【０１７０】
（００１８３）ＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール値は、市販の比色定量分析キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を用いて決定した。本明細書における結果は、処理動物では陽性対照（Ｄα）と比較して、〜２０％のＬＤＬ／ＶＬＤＬの減少が実証されたことを示している（図１４）。興味深いことに、Ｃ５群は、ＡｐｏＢの減少が観察されたにもかかわらず（図１３）、未処理群と比較してより高い濃度のＬＤＬ／ＶＬＤＬを示した。他のグループと同程度の減少は、ＡｐｏＢ及びＬＤＬ／ＶＬＤＬの両方の血漿濃度における同時減少を示している。裸のｓｉＲＮＡ処理動物とＴＮＣ処理動物との間の比較から、ＡｐｏＢの減少が類似していた前の結果と一致して、ＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール値において類似した減少が示される（図１３及び１４）。
【０１７１】
（００１８４）ヘマトキシリン‐エオシンで染色してパラフィン固定した肝臓切片の組織学的分析により、ＴＮＣ処理動物は陽性対照Ｄαと比較して、より低いコレステロールの蓄積を有していたことが示される。ＴＮＣ処理群、Ｃ３、及びＤβからの肝臓切片は、低脂肪食が与えられた正常陰性対照群Ｄμと類似した低いレベルの蓄積コレステロールを有することが見出された（図１５）。逆に、Ｃ４、Ｃ５、及びＤα２群は、陽性対照Ｄαと類似した脂肪肝を提示し（図１５）、一方でＣ１及びＣ２は中間の脂肪肝を提示している。全て合わせると、結果は、ＴＮＣはＡｐｏＢ阻害からＬＤＬ／ＶＬＤＬ減少を通して肝臓での過剰なコレステロール蓄積を防ぐことができ、それ故、Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３群において肝臓でのコレステロールから胆汁への変換を可能とすることを実証している。Ｃ４及びＣ５群で観察された結果は、ＴＮＣ処理前のコレステロールの過剰な蓄積に起因すると思われる。これらの結果は、アテローム性動脈硬化症の治療におけるキトサン系ＴＮＣの有効性を実証するものである。
【０１７２】
（００１８５）サフラニン‐Ｏ／ファストグリーン／鉄‐ヘマトキシリン染色してパラフィン固定した肝臓切片の組織学的分析により、キトサン系ＴＮＣは裸のＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ処理と比較して、炎症反応を減少させたことが示される（図１６）。結果は、Ｃ５群はアテローム硬化性対照群よりも高いリンパ細胞浸潤率を提示し、それ故、炎症は肝臓におけるキトサンの蓄積に起因していることが示唆される（図１６）。しかしながら、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、及びＣ１群からの肝臓の組織学的分析から、炎症の時間依存的吸収が示される（図１６）。更に、Ｄα‐２日と未処理の陽性対照Ｄα‐３との比較から、リンパ細胞浸潤におけるキトサンの効果は時間依存的であることが示される（図１６、Ｆ及びＧ）。処理から数週間以内のナノ粒子依存性の炎症は、吸収されるまで約３週間の間持続することが推定される。
【０１７３】
（００１８６）図１５と１６との比較から、キトサン系ナノ粒子の効率を評価することにより、ＡＬＴ／ＡＳＬ特性によって示されるように肝臓の完全性を崩壊することなく肝臓におけるコレステロールの蓄積を防止することが可能である。また、図１３と１４との間の比較により、治療の長命な特性が正確に示され、それ故、キトサン仲介性の徐放における我々の以前の見解を確認することができる。
【０１７４】
（００１８７）処理が体重増加に及ぼす影響は、本研究の間に週に１回、各動物／群の体重を測定することにより評価した。結果は、処理が体重増加に影響を及ぼさないことを示している（図１７）。しかしながら、体重増加は最初のＴＮＣ投与の翌週において減速したことに留意されたい。例えば、Ｃ４及びＣ５群はそれぞれ調査の３週目及び４週目にそれらの最初の注射を受け、それはＣ４群において体重の安定、及びＣ５においては体重の減少をもたらした。この効果はまた、Ｃ２及びＣ３群においてより小さな規模で存在している（図１７）。実際に、Ｃ５の平均体重は全ての群と比較して、調査開始からＣ５の最初の注射日の２０１０年１２月２８日まで、加速した体重増加（平均体重）を有していた。この注射の効果は２０１１年１月４日（５週目）に観察される。Ｃ５の体重増加率は大幅に減速し、それは図１８で認められる体重増加率と合致する。
【０１７５】
（００１８８）本発明を具体的な実施形態に関連させて説明してきたが、本発明はさらなる修正が可能であり、この適用は、本発明が関係する技術分野において周知又は慣習的な実施の範囲内であり、かつ添付の特許請求の範囲の通りに、本発明の開示からのさらなる発展を含む、本発明のあらゆる変更、使用、又は適応を包含することを意図することが理解される。
【図１Ａ】
2014518875.tif 000007
【図１Ｂ】
2014518875.tif 000008
【図２Ａ】
2014518875.tif 000009
【図２Ｂ】
2014518875.tif 000010
【図８Ａ】
2014518875.tif 000011
【図８Ｂ】
2014518875.tif 000012
【図８Ｃ】
2014518875.tif 000013
【図８Ｄ】
2014518875.tif 000014
【図８Ｅ】
2014518875.tif 000015
【図８Ｆ】
2014518875.tif 000016
【図９】
2014518875.tif 000017
【図１０Ａ）】
2014518875.tif 000018
【図１０Ｂ）】
2014518875.tif 000019
【図１０Ｃ）】
2014518875.tif 000020
【図１５Ａ】
2014518875.tif 000021
【図１５Ｂ】
2014518875.tif 000022
【図１５Ｃ】
2014518875.tif 000023
【図１５Ｄ】
2014518875.tif 000024
【図１５Ｅ】
2014518875.tif 000025
【図１５Ｆ】
2014518875.tif 000026
【図１５Ｇ】
2014518875.tif 000027
【図１５Ｈ】
2014518875.tif 000028
【図１５Ｉ】
2014518875.tif 000029
【図１６Ａ】
2014518875.tif 000030
【図１６Ｂ】
2014518875.tif 000031
【図１６Ｃ】
2014518875.tif 000032
【図１６Ｄ】
2014518875.tif 000033
【図１６Ｅ】
2014518875.tif 000034
【図１６Ｆ】
2014518875.tif 000035
【図１６Ｇ】
2014518875.tif 000036
【図１６Ｈ】
2014518875.tif 000037
【図１６Ｉ】
2014518875.tif 000038
【図３Ａ】
2014518875.tif 000039
【図３Ｂ】
2014518875.tif 000040
【図４Ａ】
2014518875.tif 000041
【図４Ｂ】
2014518875.tif 000042
【図４Ｃ】
2014518875.tif 000043
【図４Ｄ】
2014518875.tif 000044
【図４Ｅ】
2014518875.tif 000045
【図５】
2014518875.tif 000046
【図６Ａ】
2014518875.tif 000047
【図６Ｂ】
2014518875.tif 000048
【図７Ａ】
2014518875.tif 000049
【図７Ｂ】
2014518875.tif 000050
【図１１Ａ】
2014518875.tif 000051
【図１１Ｂ】
2014518875.tif 000052
【図１２】
2014518875.tif 000053
【図１３】
2014518875.tif 000054
【図１４】
2014518875.tif 000055
【図１７】
2014518875.tif 000056
【図１８】
2014518875.tif 000057
【配列表】
2014518875000001.app
【国際調査報告】
2014518875.tif 000058
2014518875.tif 000059
2014518875.tif 000060
2014518875.tif 000061