(57)【要約】  本発明は、サリチル酸の経路、ジャスモン酸／エチレン酸の経路および過敏感反応に関連する遺伝子を同時に活性化することにより、植物において自然防御を刺激し、かつ疾病に対する抵抗力を誘発するための方法に関する。本発明はまた、病原体により引き起こされる疾病に対する植物の予防および治療的処置のためのブラシノステロイド類の使用にも関する。本発明は更に、柑橘類果実における疾病であるカンキツグリーニング病を予防および治療するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において自然防御を刺激し、かつ疾病に対する抵抗力を誘発するための方法であって、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子を同時に活性化する化合物を植物に適用することを特徴とする、方法。
【請求項２】
植物疾病の予防および治療的処置のために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子を同時に活性化する化合物が植物ホルモンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
植物ホルモンがブラシノステロイドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予防または治療される疾病が、柑橘類におけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」により引き起こされる疾病（カンキツグリーニング病）、トマトにおけるトマト輪紋病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）により引き起こされる疾病、およびタバコにおける疫病菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａにより引き起こされる疾病を含む、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ブラシノステロイドが植物に周期的に、少なくとも月１回適用される、請求項４および５に記載の方法。
【請求項７】
更に、殺虫剤が植物に適用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
植物において自然防御を刺激し、かつ疾病に対する抵抗力を誘発するための組成物であって、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子を同時に活性化する化合物を含み、該化合物が植物ホルモンである、組成物。
【請求項９】
植物ホルモンが天然ブラシノステロイドまたはブラシノステロイド類似体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
天然ブラシノステロイドまたはブラシノステロイド類似体が化学合成によって得られる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
天然ブラシノステロイドまたはブラシノステロイド類似体は、０．０１〜２０μＭの範囲内であるか、または少量または超少量で使用する場合にはその当量である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
植物において自然防御を刺激し、かつ、疾病に対する抵抗力を誘発するための組成物を製造するためのブラシノステロイドの使用であって、該組成物が周期的に適用される、使用。
【請求項１３】
植物疾病が細菌、真菌または卵菌により引き起こされる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
疾病が、柑橘類におけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」により引き起こされる疾病（カンキツグリーニング病）、トマトにおけるトマト輪紋病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）により引き起こされる疾病、およびタバコにおける疫病菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａにより引き起こされる疾病を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ブラシノステロイドが天然化合物またはブラシノステロイド類似体である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
天然ブラシノステロイドまたはブラシノステロイド類似体は、０．０１〜２０μＭの範囲内であるか、または少量または超少量で使用する場合にはその当量である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ブラシノステロイドを植物に周期的に適用することを特徴とする、柑橘類植物におけるカンキツグリーニング病（ＨＬＢ）を予防または治療するための方法。
【請求項１８】
ブラシノステロイドが天然化合物またはブラシノステロイド類似体であり、少なくとも月１回適用される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業バイオテクノロジー分野に関し、特に、病原体によって引き起こされる疾病を回避するかまたはそれと戦うための、植物における自然防御の刺激および疾病に対する抵抗力の誘発に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年、形態学的、生理学的、生化学的および分子的観点からの植物病原体の相互作用に関する多くの研究がなされている。しかしながら、今までに得た結果は、世界の主要な研究グループの必要性や知識を満たしておらず、安定的かつ効果的な作物生産による高生産量は達成されていない。統合された作物生産のために数多くの対策が全世界的になされているにもかかわらず、特に疫病が発生する状況で、毎年、疾病による主要な作物損害が生産の８０％に達していることが報告されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１８：１３０７−１３１０）。
【０００３】
植物および病原体は、数百万年にわたって共進化してきた。この相互作用の間、植物に、潜在的な侵入病原体を認識させ、かつ、防御を成功させる方策が出現している。同様に、病原体は、それらが植物の防御応答を回避するおよび／または抑制することができる機序を発現している。この植物に対する選択的な圧力の影響により、それらの防御機序が向上してきた。結果として、病原体が首尾よく疾病を引き起こすことは、決して通例ではなく、例外である（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２５：７３−７６）。
【０００４】
植物による特定的かつ一般的なエリシターの知覚は、病原体の認識を可能にするだけでなく、応答機序の活性化のためのシグナル変換をも可能にする。様々なシグナル伝達経路の中で活性化されるのは、反応性酸素、サリチル酸、エチレンおよびジャスモン酸などの中間体により仲介されるものである。これらの植物ホルモンシグナル伝達経路間の交差は、特定の病原体に応じた応答の最適な組み合わせの活性化を可能にする制御力をもたらす。病原性（ＰＲ）に関連する遺伝子の発現や、病原体を直接攻撃するために産生される一般にフィトアレキシン類、デフェンシン類、フェノール類およびフラボノイド類である抗菌化合物の合成も活性化される（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：７２６−７３３）。
【０００５】
植物において機能する他の応答機序があり、それらの効果は感染後比較的長い期間持続する。これらは、獲得局所反応および全身性獲得反応と呼ばれる。獲得局所反応は、過敏感反応により引き起こされる外傷の周囲にある５〜１０ｍｍ厚の細胞環において観察される。この領域は、主に塩基性である病原性関連タンパク質の大量の蓄積（Ｆｒｉｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：１６−２２）やメチルトランスフェラーゼなどの酵素の刺激（Ｌｅｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｐｌａｎｔａ  １４４：１０１−１０８）、病原体にとって好適な環境を付与せず、植物全体へのそれらの拡散を防止するスコポレチンなどの抗生物質の産生に関与するフェニルプロパノイド経路を特徴とする。全身性獲得反応は、同病原体の続発性感染症に対するより高レベルの抵抗力を植物に与える。それは、感染組織だけでなく、植物全体に発現する。それは、サリチル酸のシグナル伝達機序に関連する、特に酸性のＰＲタンパク質の蓄積を特徴とする（Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５１：１０９−１１８）。
【０００６】
植物は、ホルモンとして機能する様々なステロイド類を合成する能力を有する。しかしながら、１９７９年になって初めて、ステロイドホルモン類の存在が植物において確認された。その年に、アメリカ人科学者が、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）花粉から単離したブラシノリドと呼ばれる新規ステロイドラクトンに関するデータを出版した（Ｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：２１６−２１７）。ブラシノステロイド類は、成長調節において重要な役割を果たす植物ホルモンの新規クラスとして認識されている（Ａｚｐｉｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：２１９−２３０）。ブラシノステロイド類の生理学的特性により、それらは環境に影響を及ぼすことなく使用するのに非常に有望であると考えることができる。天然物質は、植物保護および農業における効率の促進における広範な用途に好適であり得る。
【０００７】
当初から、ブラシノステロイド類は、植物の成長および発育において様々な種類の制御活性を示し、かつ、性能を支持するものとして経済価値を有するため、農業用途のために有望な化合物であると考えられていた（Ｋｈｒｉｐａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）ＡｎｎＢｏｔａｎｙ  ８６：４４１−４４７）。重要な特徴は、極めて低濃度で作用するブラシノステロイド類の能力である。この現象の間接的な確認は、植物中のブラシノステロイド類の濃度が低いことである。農業で使用するための典型的な量は、植物を成長させる場合、１ヘクタール当たり５〜５０ｍｇである（Ｋｈｒｉｐａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）ＡｎｎＢｏｔａｎｙ  ８６：４４１−４４７）。
【０００８】
ブラシノステロイド類はまた、植物の病原体に対する応答においても役割を果たし得る。細菌および真菌病原体に対する抵抗力は、コメおよびタバコ中のブラシノステロイド類によって誘発されているが、この抵抗力は、サリチル酸の蓄積増加または全身獲得抵抗力と関連する遺伝子の発現増加とは相関していなかった（Ｎａｋａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３：８８７−８９８）。
【０００９】
細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」により引き起こされる「カンキツグリーニング病（Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ）」（ＨＬＢ）は、症状の重篤性、それが蔓延して全ての商業的な柑橘種に影響を及ぼす速度によって、世界中で最も有害な柑橘類の疾病である。それは、いまだ治療法のない疾病である（Ｇｏｔｔｗａｌｄ（２０１０）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４８：６．１−６．２１）。この疾病は、１９世紀後半にアジアで最初に検出され、次いでその存在が２０世紀初めに南アフリカで報告され、何年にもわたって両大陸で蔓延した（Ｇｏｔｔｗａｌｄ（２０１０）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４８：６．１−６．２１）。現在、当該疾病の３種の変異型が認識されている（アジア型、アフリカ型およびアメリカ型）。原因生物は、「好みがうるさい（ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ）」グラム陰性細菌であり、これは人工培地上の純粋培養では得ることができない。この生物はミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）の師部に制限されるが、キジラミ媒介生物の血リンパおよび唾液腺において繁殖する能力を有する（アジアミカンキジラミ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｃｉｔｒｉ））。昆虫内で、株の毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）に応じて１〜３週間で腸壁を貫通し、血リンパを介して唾液腺まで到達する。
【００１０】
症状が若くて丈夫な木に認められる場合、これらの症状は罹患した植物の品種および年齢によって様々であるが、発育後に罹患したものはそれほど顕著でない症状を呈する。成葉では、中肋や支脈に沿った組織が黄変し、葉が落ちるまで萎黄病が側脈に広がる（ｄａ  Ｇｒａｃａ（１９９１）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ２９：１０９−３６）。このプロセスは若葉ではより深刻であり、サイズが小さいままである。植物は、感染後数年で頂端死を伴う相当な落葉を示し、斑点形成および黄変も一般化する。それらは、色が薄く、斑点が形成された小さな葉を伴う複数の若枝を伸ばす。感染している間、果実は貧弱で、早期に落ち、木の上に残っているものは小さく、かつ非対称であり、日光に当たっている側しか適切な色にならず、他方の側は、非常に濃いオリーブグリーン色になる（Ｂｏｖｅ  Ｊ（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ８８：７−３７）。果実は少量の果汁および低濃度の可溶性固形物や糖分を有し、非常に酸味が強く、産業で使用するには不適切となる（Ｇｏｔｔｗａｌｄ（２０１０）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４８：６．１−６．２１）。
【００１１】
柑橘類におけるＨＬＢの存在に関する生産国への経済的影響は、年々増加しており、生産量および果実品質の低下による損失は約３０〜１００％と推定される。今まで、ＨＬＢが十分に制御され、かつその重篤性および発生率の増加に寄与する疾病が存在しない地域は世界中にない（Ｇｏｔｔｗａｌｄ（２０１０）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４８：６．１−６．２１）。
【００１２】
最近、全身獲得抵抗力の使用が、ＨＬＢ感染木を生産状態で維持するために微量栄養素と組み合わせてサリチル酸および亜リン酸塩などの化合物を使用することによって評価されている。しかしながら、処置された木と処置されていない木の間に、ＨＬＢ、果実落下、生産量および品質の低下に関して、著しい差異がない場合もあった（Ｇｏｔｔｗａｌｄ（２０１０）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４８：６．１−６．２１）。
【００１３】
故に、農業に残る重要な課題は、毎年世界中で農業生産を制限する植物の疾病を抑制することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１８：１３０７−１３１０
【非特許文献２】Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２５：７３−７６
【非特許文献３】Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：７２６−７３３
【非特許文献４】Ｆｒｉｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：１６−２２
【非特許文献５】Ｌｅｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｐｌａｎｔａ  １４４：１０１−１０８
【非特許文献６】Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５１：１０９−１１８
【非特許文献７】Ｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：２１６−２１７
【非特許文献８】Ａｚｐｉｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：２１９−２３０
【非特許文献９】Ｋｈｒｉｐａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）ＡｎｎＢｏｔａｎｙ  ８６：４４１−４４７
【非特許文献１０】Ｎａｋａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３：８８７−８９８
【非特許文献１１】Ｇｏｔｔｗａｌｄ（２０１０）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４８：６．１−６．２１
【非特許文献１２】ｄａ  Ｇｒａｃａ（１９９１）ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ２９：１０９−３６
【非特許文献１３】Ｂｏｖｅ  Ｊ（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ８８：７−３７
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子を同時に活性化する化合物を植物に適用することにより、植物における自然防御を刺激し、かつ疾病に対する抵抗力を誘発するための効果的な方法を提供することによって、上記課題を解決するのに役立つ。
【００１６】
疾病に対する抵抗力の誘発は、疾病抑制に使用するための植物に既に存在する生化学的かつ分子的機序の使用を可能にする、現在非常に重要かつ興味深い方法である。植物の疾病に対する防御は、植物における認識、シグナル伝達および先天性免疫として定義される応答に関連する一連の事象を含む。この先天性免疫は、疾病抑制に決定的に寄与する多数の要因によって活性化され得る。植物によって活性化される防御機序の中では、抗菌性フィトアレキシン類、デフェンシン類および病原性関連タンパク質の合成である。これらの応答は、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子の活性化により仲介される。
【００１７】
本発明において初めて達成されるのは、酵素キチナーゼ、β１，３グルカナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびアレンオキシドシンターゼの同時活性化であり、それらは、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンのシグナル伝達経路および過敏感反応の一部である。この活性化は、細菌、卵菌および真菌に対する防御と相関する。
【００１８】
更に、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に属する新規遺伝子群の同時活性化を実証し、それらの活性化は、細菌、卵菌および真菌からの保護と相関する。これらの遺伝子は、遺伝子発現の連続分析技術（ＳｕｐｅｒＳＡＧＥ）により同定され、かつ、特徴付けられる。従来技術を考慮すると、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に属する遺伝子の活性化が天然化合物の適用により同時に起こることは驚くべきことである。
【００１９】
本発明との関連で、前記化合物は、とりわけ、植物ホルモン、核酸、脂質またはペプチドであり得る。
【００２０】
本発明の一実施形態において、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンおよび過敏感反応に関連する遺伝子の同時活性化による、植物における自然防御の刺激および疾病に対する抵抗力の誘発は、このような植物に対する植物ホルモンの適用後に起こる。特定実施形態において、植物ホルモンは、天然のブラシノステロイドまたはその類似体である。本発明との関連で、その活性を増大させるべく天然ブラシノステロイドの環構造における変化を発端として合成されるこのような化合物はブラシノステロイドの類似体と考えられる。
【００２１】
本発明に開示される方法により、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子の同時活性化を通じて、細菌、卵菌および真菌が引き起こす植物疾病を予防および治療することができる。本発明の一実施形態において、治療または予防される疾病は、柑橘類における細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」により引き起こされる「カンキツグリーニング病」（ＨＬＢ）である。別の実施形態において、治療または予防される疾病は、トマト栽培におけるトマト輪紋病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）により引き起こされるものまたはタバコ栽培における疫病菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａにより引き起こされるものである。
【００２２】
本発明はまた、植物疾病の効果的な抑制を可能にする天然ブラシノステロイド類（およびそれらの類似体）の濃度および適用頻度を初めて開示する。本発明の一実施形態において、０．０１〜２０μＭの濃度範囲内での天然ブラシノステロイドまたは類似体の適用は、病気の植物の治療を通じて、細菌、卵菌および真菌のコピー数を低減することにより、細菌および真菌起源の疾病を引き起こす薬剤を劇的に低減させる。本発明で提案される方法は、天然ブラシノステロイドおよびその類似体を周期的に適用することにより、健康な植物の感染を予防するために使用することができる。本発明の特定実施形態において、植物に対するブラシノステロイドの適用は、少なくとも月１回行う。別の実施形態において、病気の植物に対するブラシノステロイドの適用は、少なくとも１ヶ月に２回の頻度で行う。適用すべきブラシノステロイドの濃度範囲は、天然の場合も類似体の場合も、保護または治療すべき作物に応じて、また、適用技術に応じて変わる。本技術分野の当業者によって知られているように、効果的な化合物の濃度は、少量適用または超少量適用を使用する場合にはかなり低下し得る。
【００２３】
本発明の一実施形態において、植物において自然防御を刺激し、かつ、疾病に対する抵抗力を誘発する方法は、殺虫剤と組み合わせてブラシノステロイドまたは類似体を適用することを包含する。
【００２４】
本発明の別の目的は、植物において自然防御を刺激し、かつ、疾病に対する抵抗力を誘発する組成物であって、当該組成物は、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンの経路および過敏感反応に関連する遺伝子を同時に活性化する化合物を含み、前記化合物は植物ホルモンである。
【００２５】
好ましい実施形態において、前記組成物は、天然ブラシノステロイドまたはブラシノステロイド類似体を含む。本発明の特定実施形態において、天然ブラシノステロイド類および類似体は、化学合成により得られる。本発明の目的のため、ブラシノステロイド類を、溶液、懸濁液、エマルション、粉末、顆粒、乳剤、エアロゾル、含浸顆粒、アジュバント、ペーストとして、またはカプセル化により処方することができる。
【００２６】
本発明の一実施形態において、植物疾病を予防または治癒するための組成物中、天然ブラシノステロイドまたはブラシノステロイド類似体は、０．０１〜２０μＭの範囲内であるか、または少量または超少量で使用する場合にはその当量である。
【００２７】
本発明の別の目的は、植物において自然防御を刺激し、かつ、疾病に対する抵抗力を誘発するための組成物を調製するためのブラシノステロイドの使用であり、ここで、当該組成物は周期的に適用される。本発明の一実施形態において、このブラシノステロイドの新規使用により予防または治療され得る植物疾病は、細菌、卵菌または真菌により引き起こされる。
【００２８】
本発明の別の態様は、柑橘類におけるカンキツグリーニング病（ＨＬＢ）を予防または治療するための方法に関し、ここで、ブラシノステロイドが植物に対して周期的に、少なくとも月１回適用される。前記方法において、ブラシノステロイドは、天然化合物またはブラシノステロイド類似体であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンで処置された柑橘類植物における疾病に対する防御応答に関する遺伝子の相対的発現。本図は、キチナーゼ（Ａ）、β−１，３−グルカナーゼ（Ｂ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｃ）、フェニルアラニン−アンモニアリアーゼ（Ｄ）、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｅ）、アレンオキシドシンターゼ（Ｆ）をコードする遺伝子の相対的発現を示す。曲線上の棒線は、各試験時間に関する１０個の植物の平均の標準偏差を表す。試験遺伝子は、サリチル酸、ジャスモン酸／エチレンおよび過敏感反応による植物の抵抗力に関連する。
【００３０】
【図２】ブラシノステロイド類似体での処置中に活性化された、ＳｕｐｅｒＳＡＧＥ技術により同定された新規遺伝子の相対的発現。棒線は、各時間点における植物１個当たり１０枚の葉の平均の標準偏差を表す。遺伝子は以下のカテゴリーにグループ分けされた：一般に病原体に対する植物の防御応答と関連する遺伝子（Ａ）；細菌に対する植物の防御応答と関連する遺伝子（Ｂ）；疾病に対する植物の防御と関連する転写因子（Ｃ）；防御応答に対するシグナル伝達（Ｄ）；およびフィトアレキシン生合成と関連する遺伝子（Ｅ）。
【００３１】
【図３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により決定される、１反応当たりのＨＬＢ細菌のコピーとして測定される、発育中（Ａ）および成体（Ｂ）の柑橘類植物におけるＨＬＢの低減に対するブラシノステロイド類似体の効果。曲線上の棒線は、各試験時間に関する１０枚の葉の平均の標準偏差を表す。
【００３２】
【図４】ブラシノステロイド類似体で処置した（Ａ）および処置していない（Ｂ）ＨＬＢ感染植物からの葉の電子顕微鏡写真。２０枚の電子顕微鏡写真は、様々な倍率で分析した各サンプルを撮影したものである。サンプル１個当たり合計１０個のグリッドを調査した。各銅グリッドは４００個の観察用穴を有する。
【００３３】
【図５】１反応当たりのＨＬＢ細菌のコピーとして測定される、ＨＬＢ低減に対する天然ブラシノステロイドおよび類似体の効果の評価。曲線上の棒線は、各試験時間に関する１０個の植物の平均の標準偏差を表す。
【００３４】
【図６】１反応当たりのＨＬＢ細菌のコピーとして測定される、ＨＬＢ低減に対するブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの適用頻度の効果。曲線上の棒線は、各試験時間に関する植物１個当たり１０枚の葉の平均の標準偏差を表す。
【００３５】
【図７】１ＰＣＲ反応当たりのＨＬＢ細菌のコピーとして測定される、柑橘類のＨＬＢに対するブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの保護効果。生成物の適用は月１回行った。曲線上の棒線は、各試験時間に関する植物１個当たり１０枚の葉の平均の標準偏差を表す。
【実施例】
【００３６】
（実施例１．ブラシノステロイド類似体での処置後の、植物の疾病に対する自然抵抗力に関連する遺伝子の同時活性化）
柑橘類植物（オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））を、２０μＭのブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンで処置した（Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８：７５−８１）。スプレー塗布後０、１、５、１０、２４および４８時間後に、５個の植物からの葉を収集した。全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して葉から抽出した（ＤＮａｓｅ処置を包含する）。製造業者の指示に従って、オリゴ−ｄＴプライマーおよび逆転写キットＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用することによってｃＤＮＡを合成した。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００  ＰＣＲ機（Ｃｏｒｂｅｔｔ、オーストラリア）およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行った。柑橘類植物の疾病に対する防御に関連する遺伝子についてのプライマー配列を全て表１に示す。リアルタイムＰＣＲでの反応条件は、９５℃で１５分間の最初の変性工程、次いで９５℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間の整列工程および７２℃で３０秒間の伸長工程を４０サイクルであった。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００ソフトフェア（Ｃｏｒｂｅｔｔ、オーストラリア）を使用して分析を行い、５つの複製を各サンプルについて使用した。実験を２度繰り返した。
【表１】
2014511385.tif 000002
【００３７】
図１は、ブラシノステロイド類似体で柑橘類植物を処置した後に全分析遺伝子が活性化されたことを示している。アレンオキシドシンターゼ遺伝子は２４時間での発現レベルが最も高く、残りの遺伝子は類似体適用後５時間での発現が最も高かった。この遺伝子群は、病原菌に対する植物防御において重要な役割を果たしている。
【００３８】
（実施例２．ブラシノステロイド類似体で処置した植物における自然防御応答に関連する新規遺伝子の同定）
柑橘類植物（オレンジ）を２０μＭのブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンで処置した。スプレー塗布後０、１、５、１０、２４および４８時間後に、５個の植物からの葉を収集した。全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して葉から抽出した。製造業者の指示に従って、ビオチニル化オリゴ−ｄＴプライマーおよび逆転写キットＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用することによってｃＤＮＡを合成した。水で処置し、先に列挙した時間に収集した５個の柑橘類植物のサンプルを対照として使用した。ＳｕｐｅｒＳＡＧＥ技術による２つのｃＤＮＡライブラリーの構築によって新規遺伝子の同定および特徴付けを行った（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）ＰＮＡＳ  １００：１５７１８−１５７２３）。対照ライブラリーは、様々な時間に水で処置した植物の葉の混合物であり、標的サンプルは様々な時間に類似体で処置した柑橘類植物の葉の混合物であった。ブラシノステロイド類似体の適用により活性化された、ＨＬＢに対する植物応答に関連する新規遺伝子を単離し、配列決定し、かつ、分析した。図２は、疾病に対する植物の自然防御機序に関連する、類似体により活性化された新規遺伝子を示す。重要なことに、過敏感反応、サリチル酸およびジャスモン酸／エチレンに関連する遺伝子を同時に活性化するブラシノステロイド類のこの類似体として、これは、これまで記載されていない新規機序である。
【００３９】
（実施例３．発育段階の植物および成体植物における柑橘類のＨＬＢの抑制に対するブラシノステロイド類似体適用の効果の評価）
ａ）発育段階の柑橘植物に対する効果の評価
実験を温室の条件下で行った。ＨＬＢの症状を伴う植物（オレンジ）を黒色のプラスチックバッグ内に適切な潅漑管理を行って置いた。ＨＬＢの症状を伴う植物における細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」のレベルを、標準曲線および細菌から増幅した１６ＳリボソームＤＮＡに従って、葉中の細菌類の絶対的定量（１反応当たりのコピー）を通じて、リアルタイムＰＣＲにより決定した。細菌類の定量を６ヶ月間毎月評価した。最後の評価は、植物の葉の全てを採取し、ＤＮＡの単離前に混合することによって行った。ブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの濃度は２０μＭであり、１５日ごとにスプレー塗布した。ＰｒｏｍｅｇａからのＤＮＡ単離プロトコールに従って、ＤＮＡを葉から抽出した。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００  ＰＣＲ機（Ｃｏｒｂｅｔｔ、オーストラリア）およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行った。細菌類の定量に使用したオリゴ類は、ＣＴＡＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＴＣＴＣおよびＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＴＣＣであった。リアルタイムＰＣＲにおける反応条件は、９５℃で１５分間の最初の変性工程、次いで９５℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間の整列工程および７２℃で３０秒間の伸長工程を４０サイクルであった。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００ソフトフェア（Ｃｏｒｂｅｔｔ、オーストラリア）を使用して分析を行い、５つの複製を各サンプルについて使用した。実験を２度繰り返した。対照として、病気の柑橘類植物を使用し、これらにはブラシノステロイドを適用しなかった。その月から細菌レベルが著しく低下し、４ヶ月目には検出不能なレベルに到達し、実験最後に最終評価を行った。図３Ａに示すように、２ヶ月目から細菌レベルが著しく低下し、４ヶ月目には検出不能なレベルに到達し、実験最後に最終評価が行われるまで持続した。重要なことに、この挙動は、このブラシノステロイド類似体で処置した全ての植物において認められた。
【００４０】
ｂ）成体柑橘類植物に対する効果の評価
実験を自然条件下で行った。ＨＬＢの症状を伴う３０個の植物における細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」のレベルを、標準曲線および細菌から増幅した１６ＳリボソームＤＮＡに従って、葉中の細菌類の絶対的定量（１反応当たりのコピー）を通じて、リアルタイムＰＣＲにより決定した。細菌類の定量を１年間毎月評価した。最後の評価は、植物の葉の全てを採取し、ＤＮＡの単離前に混合することによって行った。ブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの濃度は２０μＭであり、１５日ごとにスプレー塗布した。ＰｒｏｍｅｇａからのＤＮＡ単離プロトコールに従って、ＤＮＡを葉から抽出した。実施例３ａに記載されるように、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。罹患した柑橘類植物を対照として使用し、これらにはブラシノステロイドを適用しなかった。図３Ｂに示すように、３ヶ月目から細菌レベルが著しく低下し、８ヶ月目には検出不能なレベルに到達し、実験最後に最終評価が行われるまでパターンが続いた。このブラシノステロイド類似体で処置した全ての植物において細菌レベルが低下した。
【００４１】
ｃ）処置した柑橘類商物の電子顕微鏡写真
この実験の目的は、同ブラシノステロイド類似体で処置したＨＬＢ感染柑橘類植物（オレンジ）における透過電子顕微鏡法による超構造研究を通じた細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」の診断である。葉のサンプルをＨＬＢ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」）感染柑橘類植物から採取し、１年間処置した。対照として、生成物を適用しない感染植物から葉のサンプルを採取した。異なるサンプルをグルタルアルデヒド５％中一晩真空下４℃で固定し、１％四酸化オスミウム中１２時間４℃で後固定した。その後、サンプルをカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、濃度を増加させたアセトン（２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００％）で１を用いて分間毎回４℃（室温で１時間行った１００％を除く）で脱水した。低粘度で封入を行った。超薄切片を、超ミクロトーム（ＮＯＶＡ、ＬＫＢ）を用いて厚さ４０〜５０ｎｍで作製し、４００穴の銅グリッド上に置いた。次いで、グリッドを飽和酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛と対比し、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ  ２０００  ＥＸ（ＪＥＯＬ）で検査した。様々な倍率で分析した各サンプルに関して２０枚の電子顕微鏡写真を撮影した。サンプル１個当たり合計１０個のグリッドを調査した。各銅グリッドは４００個の観察用穴を有する。処置したサンプルでは細菌類の存在は観察されなかった（図４Ａ）が、処置されていない柑橘類の葉（対照）では長手方向および横断方向の細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」の存在が超構造レベルで観察された（図４Ｂ）。
【００４２】
（実施例４．柑橘類ＨＬＢの抑制における様々な濃度のブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの評価）
本実験の目的は、柑橘類ＨＬＢを抑制するのに必要なブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの最低濃度を算定することであった。ＨＬＢを伴う５個の柑橘類植物（オレンジ）を、各類似体濃度について使用した。試験濃度は０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、４０、６０μＭであり、ブラシノステロイド類似体を１５日ごとに６ヶ月間スプレー塗布した。処置後６ヶ月で評価を行った。細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」のレベルを実施例３ａに従って決定した。表２に示すように、０．０１〜６０μＭの濃度のブラシノステロイド類似体の場合に、細菌レベルが劇的に低減された。
【表２】
2014511385.tif 000003
【００４３】
（実施例５．柑橘類ＨＬＢの抑制における天然ブラシノステロイド（ブラシノリド）およびブラシノステロイド類似体の適用の効果の評価）
同実験での、ＨＬＢ抑制における天然ブラシノステロイド（ブラシノリド）（Ｋｈｒｉｐａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｎ．Ｂｏｔａｎｙ  ８６：４４１−４４７）およびブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンの効果を評価するために、１０個のＨＬＢ感染した柑橘類植物を各処置のために用いた。両化合物を濃度１μＭで１５日ごとに６ヶ月間スプレー塗布した。細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」のレベルを実施例３ａに従って決定した。図５は、天然化合物および類似体化合物の両方がどのように評価期間中細菌レベルの著しい低下を達成する上でプラスの効果を有していたかを示している。
【００４４】
（実施例６．柑橘類ＨＬＢの抑制に対するブラシノステロイド類似体の適用頻度の効果の評価）
本実験の目的は、罹患した柑橘類植物でのＨＬＢの抑制におけるブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンのスプレー塗布の頻度の影響を決定することであった。１処置当たり５個の植物を使用し、適用頻度は一月に１、２および４回であった、使用した類似体濃度は１μＭであり、細菌レベルの決定は毎月６ヶ月まで行った。細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」のレベルを実施例３ａに従って決定した。図６に示すように、細菌類の低下が全ての試験変種で観察された。１ヶ月に２回および毎週化合物を適用すると、毎月１回の適用に比べてより早く細菌レベルが著しく低下した。
【００４５】
（実施例７．柑橘類ＨＬＢに対するブラシノステロイド類似体の予防効果の評価）
本実験は、ＨＬＢおよび高媒介昆虫個体群（アジアミカンキジラミ、Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｃｉｔｒｉ）を伴う柑橘類植物を伴う領域において、類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンを１μＭの濃度で１ヶ月に２回、ＨＬＢを伴わない柑橘類植物に適用したときの予防効果を決定するために行われた。１０枚の葉に類似体をスプレー塗布し、他の１０枚は生成物を適用しないで使用した。細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ「Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｓｉａｔｉｃｕｓ」のレベルを実施例３ａに従って決定した。図７に示すように、ＨＬＢを伴わない柑橘類植物の類似体適用により、媒介生物を介した細菌感染から植物を保護することができたが、類似体を適用しなかった植物は、年月が過ぎるにつれ、細菌レベルおよびＨＬＢの症状が増加した。これは、別の驚くべき予想外の結果であり、この重大な疾病から柑橘類を保護するための本方法の使用を許容する。
【００４６】
（実施例８．他の植物疾病の抑制に対する天然ブラシノステロイドおよび類似体の適用の効果の評価）
他の植物疾病の抑制に対するブラシノステロイド類似体（２５Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｃ−ホモ−１１−オキサ−５−エスピロスタン−１２−オンおよび天然ブラシノステロイド（ブラシノリド）の効果を評価するために、疫病菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａおよびトマト輪紋病菌をそれぞれ接種したタバコおよびトマト植物を用いて行った。天然ブラシノステロイドおよび類似体をいずれも１μＭの濃度で１５日ごとに３ヶ月間スプレー塗布した。死亡率を３ヶ月目に測定した。表３は、これら病原菌により引き起こされた疾病の発生を低減する上でどのように両ブラシノステロイドが顕著な効果を有していたかを示す。１００個の植物を各処置のために使用した。未処置の植物を対照として使用した。
【表３】
2014511385.tif 000004
【図１】
2014511385.tif 000005
【図２−１】
2014511385.tif 000006
【図２−２】
2014511385.tif 000007
【図３】
2014511385.tif 000008
【図４】
2014511385.tif 000009
【図５】
2014511385.tif 000010
【図６】
2014511385.tif 000011
【図７】
2014511385.tif 000012
【国際調査報告】
2014511385.tif 000013
2014511385.tif 000014
2014511385.tif 000015
2014511385.tif 000016
2014511385.tif 000017
2014511385.tif 000018