(57)【要約】  物質を抽出するための固相の抽出ピペット２０であって、入口２１、柄２２、及び弾性の室２８を備える概して中空の本体部２９と、中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体２７と、中空の本体部の内部に含まれており、第１の抽出媒体が本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリット２４とを備えるピペットが提供される。本体部は、低密度ポリエチレンなどの、透明な材料から作られていてもよい。室は、第１の容積を有する第１の拡張した形状から、第１の容積より小さい第２の容積を有する第２の収縮した形状へと移行するように構成されてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質を抽出するためのピペットであって、
入口、柄、及び弾性の室を備える概して中空の本体部と、
前記中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体と、
前記中空の本体部の内部に含まれており、前記第１の抽出媒体が前記本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットと
を備えるピペット。
【請求項２】
前記本体部は透明な材料から成る、請求項１に記載のピペット。
【請求項３】
前記本体部は低密度ポリエチレンから成る、請求項１に記載のピペット。
【請求項４】
前記室は、第１の容積を有する第１の拡張した形状から、前記第１の容積より小さい第２の容積を有する第２の収縮した形状へと移行するように構成される、請求項１に記載のピペット。
【請求項５】
前記室は、前記第１の拡張した形状で保持するように弾性的に付勢される、請求項４に記載のピペット。
【請求項６】
前記本体部は薄く着色されている、請求項１に記載のピペット。
【請求項７】
前記第１のフリットは、１０〜８５ミクロンの大きさの細孔から成る、請求項１に記載のピペット。
【請求項８】
前記第１のフリットはシリカ又はポリエチレンから成る、請求項７に記載のピペット。
【請求項９】
前記第１のフリットは、前記本体部によって圧縮されて保持される、請求項１に記載のピペット。
【請求項１０】
前記第１の抽出媒体は、シリカ系、アルミナ系、又は炭素系である、請求項１に記載のピペット。
【請求項１１】
前記第１の抽出媒体は、シリカ、ホウケイ酸塩、ニッケル、亜鉛、銅、鉄、分割されたナノファイバ、又はガラスを含む、請求項１に記載のピペット。
【請求項１２】
前記第１の抽出媒体はビーズを含む、請求項１に記載のピペット。
【請求項１３】
前記ビーズは１５０〜２１２ミクロンの間の直径を有する、請求項１２に記載のピペット。
【請求項１４】
前記ビーズは常磁性である、請求項１２に記載のピペット。
【請求項１５】
前記ビーズは被覆を備える、請求項１２に記載のピペット。
【請求項１６】
前記被覆は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩を用いたタンパク質単離、アニオン交換抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、又は、抗体に基づいた抽出／精製について構成される、請求項１５に記載のピペット。
【請求項１７】
ピペットは内容物を渦化するように構成される、請求項１に記載のピペット。
【請求項１８】
ピペットは内容物をビーズ破砕するように構成される、請求項１に記載のピペット。
【請求項１９】
ピペットは内容物を研磨するように構成される、請求項１に記載のピペット。
【請求項２０】
ピペットは、前記ピペット内の内容物を挟むために折り畳めるように構成される、請求項１に記載のピペット。
【請求項２１】
第２のフリットをさらに備え、前記第２のフリットは、前記第１の抽出媒体が前記第１のフリットと前記第２のフリットとの間にあるように配置される、請求項１に記載のピペット。
【請求項２２】
第２の抽出媒体をさらに備える、請求項１に記載のピペット。
【請求項２３】
第３のフリットと、前記第２のフリットと前記第３のフリットとの間に配置された第２の抽出媒体とをさらに備える、請求項２１に記載のピペット。
【請求項２４】
試料から物質を抽出する方法であって、
試料を準備するステップと、
前記試料を液体中に浮遊させるステップと、
ピペットを準備するステップであって、前記ピペットは、入口、柄、及び弾性の室を備える概して中空の本体部と、前記中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体と、前記中空の本体部の内部に含まれており、前記第１の抽出媒体が前記本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットとを備える、ステップと、
前記室を変形及び収縮させるために、前記ピペットを手で圧縮するステップと、
前記室を拡張させ、前記液体を、前記第１の抽出媒体を通過させることで、前記物質が前記第１の抽出媒体に選択的に付着させるステップと、
前記液体を前記ピペットから出すために、前記ピペットを手で圧縮するステップと、
抽出溶液を準備するステップと、
前記室を拡張させて、前記抽出溶液を、前記抽出媒体を通過させることで、前記物質が前記第１の抽出媒体に選択的に付着されることなく、前記物質が抽出される、ステップと
を含む方法。
【請求項２５】
前記ピペットの内容物を前記ピペットの内部に拘束させるために、前記ピペットを折り畳むステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ピペットの内容物を研磨するために、前記中空の本体部を搾るステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料をビーズ破砕するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料を渦化するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記液体を前記ピペットから出すために、前記ピペットを手で圧縮する前記ステップの後に、前記抽出媒体を洗浄溶液で洗浄するステップをさらに含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項３０】
空気に前記第１の抽出媒体を通過させるように、前記ピペットを圧縮及び解放するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料を結合溶液と混合するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記結合溶液はカオトロピック塩を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抽出溶液は固相の抽出溶液である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記抽出溶液は液相の抽出溶液である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料を結合溶液と混合するステップと、溶出溶液を前記抽出媒体と接触するステップとをさらに含み、前記結合溶液、前記溶出溶液、及び前記抽出媒体は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩タンパク質単離、セルロース・イオン交換抽出、カルボキシメチルセルロース抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、抗体に基づいた抽出／精製、又は、分割された繊維に基づいた抽出から成る群から選択された抽出を行う化学作用を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項３６】
前記室は、第１の拡張した形状で保持するように弾性的に付勢される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
化学抽出キットであって、
前記キットはピペットを備え、前記ピペットは、
入口、柄、及び弾性の室を備える概して中空の本体部と、
前記中空の本体部の内部に配置された抽出媒体と、
前記中空の本体部の内部に含まれており、前記抽出媒体が前記本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットと
を備え、前記キットは、
結合溶液と、
抽出溶液と
を備えるキット。
【請求項３８】
前記抽出溶液は固相の抽出溶液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抽出溶液は液相の抽出溶液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
洗浄溶液をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
前記結合溶液、前記溶出溶液、及び前記抽出媒体は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩タンパク質単離、セルロース・イオン交換抽出、カルボキシメチルセルロース抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、抗体に基づいた抽出／精製、又は分割された繊維に基づいた抽出から成る群から選択された抽出を行う化学作用を含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
物質検出器をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項４３】
前記物質検出器は、免疫に基づいた分析器、ＰＣＲに基づいた分析器、等温増幅器、又はゲル電気泳動器である、請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、２０１０年１２月２９日に出願された、米国仮特許出願第６１／４２７，８７４号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
技術分野は、抽出のための器具及び方法に関し、より詳細には、タンパク質又は核酸を生物試料から抽出するための、効率のよい器具及び方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
単に例示を目的とし、限定のためでない、開示された実施例の対応する部品部分又は部品表面を参照すると、本実施例は、物質を抽出するためのピペット（２０）であって、入口（２１）、柄（２２）、及び弾性の室（２８）を備える概して中空の本体部（２９）と、中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体（２７）と、中空の本体部の内部に含まれており、第１の抽出媒体が本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリット（２４）とを備えるピペットを提供する。本体部は、低密度ポリエチレンなどの、透明な材料から作られていてもよい。室は、第１の容積を有する第１の拡張した形状（図１）から、第１の容積より小さい第２の容積を有する第２の収縮した形状（図３）へと移行するように構成されてもよい。室は、第１の拡張した形状で保持するように弾性的に付勢されてもよい。室は、第１の拡張した状態から、弾性の室が挟まれる又は外部から隔離される第３の折り畳まれた状態へと移行するように構成されてもよい。中空の本体部は薄く着色されていてもよく、薄い着色は、ピペットが含む抽出媒体の種類など、ピペットの特性に対応してもよい。
【０００４】
第１のフリットは、１０〜８５ミクロンの大きさの細孔から成ってもよく、また、シリカ又はポリエチレンを含んでもよい。第１のフリットは、ピペットの本体部によって、圧縮されて保持されてもよい。抽出媒体は、シリカ系、アルミナ系、又は炭素系であってもよい。抽出媒体は、シリカ、ホウケイ酸塩、ニッケル、亜鉛、銅、鉄、繊維、又はガラスを含んでもよい。繊維は、分割されたナノファイバであってもよいし、及び／又はセルロースを含んでもよい。抽出媒体はビーズを含んでもよく、そのビーズは４２５〜６００ミクロンの間の直径を有してもよい。或いは、ビーズは１５０〜２１２ミクロンの間の直径を有してもよい。ビーズの直径は、第１のフリットの細孔の大きさより大きくてもよい。抽出媒体は、常磁性ビーズなど常磁性であってもよい。また、ビーズは被覆を含んでもよく、その被覆は、ブーム化学核酸単離、カオトロピック塩を用いたタンパク質単離、アニオン交換抽出、金属イオン交換クロマトグラフィについて構成されてもよく、又は抗体を含んでもよい。このような被覆は、ビーズを含まない抽出媒体に行われてもよい。
【０００５】
ピペットは、それの内容物の渦を作るように、内容物をビーズ破砕するように、及び／又は研磨するように構成されてもよい。ピペットの内容物の研磨は、中空の本体部の２つの壁がくっつくまでそれら壁を搾ることで行われてもよい。ピペットの柄は、ピペットを折り畳まれた第３の形状にするのを促進し、任意の内容物が中空の本体部から出るのを防止する助けとするために、グローブを含んでもよい。ピペットは、第２のフリットを備えてもよく、その第２のフリットは、抽出媒体が第１のフリットと第２のフリットとの間で保持されるように配置される。ピペットは、第２の抽出媒体を備えてもよく、その第２の抽出媒体は、第２のフリットの中空の本体部側にあるように配置されてもよい。ピペットは、第３のフリットを備えてもよく、第２の抽出媒体は、第２のフリットと第３のフリットとの間に配置されてもよい。
【０００６】
別の態様では、試料から物質を抽出するための方法が提供され、その方法は、試料を準備するステップ（５２）と、試料を液体に懸濁するステップと、ピペットを準備するステップ（５５）であって、ピペットは、入口、柄、及び弾性の室を備える概して中空の本体部と、中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体と、中空の本体部の内部に含まれており、抽出媒体が本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットとを備えるステップと、室を変形及び収縮させるために、ピペットを手で圧縮するステップ（６１）と、室を拡張させるステップ（６３）であって、液体を、第１の抽出媒体を通過させることで、物質が抽出媒体に選択的に付着するステップと、液体をピペットから出すためにピペットを手で圧縮するステップと、抽出溶液を準備するステップと、室を拡張させるステップ（６６）であって、抽出溶液を抽出媒体を通過させることで、物質が前記第１の抽出媒体に選択的に付着されることなく前記物質が抽出される（９５）ステップ（６６）とを含む。
【０００７】
方法は、ピペットの内容物を前記ピペットの内部に拘束させるために、ピペットを第３の折り畳まれた形状に構成するステップをさらに含んでもよい。方法は、試料をビーズ破砕、渦化、又は研磨するステップをさらに含んでもよい。方法は、抽出媒体を洗浄溶液で洗浄するステップ、又は、液体をピペットから出すために、ピペットを手で圧縮するステップをさらに含んでもよい。洗浄溶液は、水、又はアルコールであってもよい。方法は、空気を第１の抽出媒体を通過させるように、ピペットを圧縮及び解放するステップを含んでもよい。また、方法は、抽出媒体を乾燥するステップ、又は、試料を結合溶液と混合するステップを含んでもよい。この結合溶液は、カオトロピック塩を含んでいてもよい。用いられる抽出溶液は、固相の抽出溶液、又は液相の抽出溶液であってもよい。抽出溶液は、溶出溶液であってもよい。結合溶液、溶出溶液、及び抽出媒体は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩タンパク質単離、セルロース・イオン交換抽出、カルボキシメチルセルロース抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、抗体に基づいた抽出／精製、又は分割された繊維に基づいた抽出についての抽出プロトコルを実施する化学作用を含んでもよい。繊維は、ナノファイバであってもよいし、セルロースを含んでもよい。
【０００８】
方法は、第１の拡張した形状で保持するように弾性的に付勢される室を備えたピペッタを用いてもよい。
【０００９】
別の態様では、化学抽出キットが提供され、そのキットはピペットを備え、そのピペットは、入口、柄、及び弾性の室を備える概して中空の本体部と、中空の本体部の内部に配置された抽出媒体と、中空の本体部の内部に含まれており、抽出媒体が前記本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットとを備え、キットは、結合溶液と、抽出溶液とをさらに備える。抽出溶液は、固相の抽出溶液、又は液相の抽出溶液であってもよい。抽出溶液は、溶出溶液であってもよい。キットは、洗浄溶液をさらに備えてもよい。結合溶液、溶出溶液、及び抽出媒体は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩タンパク質単離、セルロース・イオン交換抽出、カルボキシメチルセルロース抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、抗体に基づいた抽出／精製、又は分割された繊維に基づいた抽出についての抽出プロトコルを実施する化学作用を含んでもよい。分割された繊維は、ナノファイバであってもよいし、セルロースを含んでもよい。
【００１０】
キットは、物質検出器をさらに備えてもよい。物質検出器は、免疫に基づいた分析器、ＰＣＲに基づいた分析器、等温増幅器、又はゲル電気泳動器であってもよい。物質検出器は、ピペットに一体的に取り付けられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１の実施例２０の側面図である。
【図２】第２の実施例３０の側面図である。
【図３】圧縮された状態の第１の実施例２０の側面図である。
【図４】圧縮された状態の第１の実施例２０の側面図である。
【図５】抽出の方法の第３の実施例のフローチャートである。
【図６】第４の実施例の側面図である。
【図７】第５の実施例の側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
最初に、同様の参照符号は、複数の図面を通じて一貫して、同じ構造的な要素、部分、又は表面を識別することが意図されており、そのため、要素、部分、又は表面は、この詳細な説明が不可欠な部分となっている、本発明の記載全体によってさらに記述又は説明され得ることは、明確に理解されるべきである。別段示されていない限り、図面は、明細書と共に読み取られることが意図されており（例えば、格子状の網掛け、部品の配置、比率、角度など）、本発明の記載全体の一部として考慮されることになる。以下の説明で用いられる用語「水平」、「垂直」、「左」、「右」、「上」、及び「下」、並びにそれらの形容詞的派生語及び副詞的派生語（例えば、「水平に」、「右方に」、「上方に」など）は、特定の図面上の図が読者に面したときの例示された構造の向きについて単に言及しているだけである。同様に、用語「内向き」及び「外向き」は、概して、表面の伸長する軸線又は回転軸線に対する表面の向きについて適宜言及している。
【００１３】
実施例は、実験室以外において、又は現場での設定において実施することができる、物質を抽出又は精製するための、効率のよい器具及び方法を提供する。より小さなサイズの試料で使うことができ、また、電子ピペッタ及び遠心分離機などの典型的な実験装置を用いずに効率よく使用できる、抽出及び精製する器具が必要とされている。実施例は、様々な混合物を抽出又は精製することができる。さらに、実施例は、最少の量の使用する溶液しか必要としない抽出方法又は精製方法を提供し、多くの実施例においてその溶液は無毒である。
【００１４】
ここで、図面を参照すると、図１には、物質を抽出するためのピペットの第１の実施例２０が第１の拡張した形状で示される。第１の実施例２０は、入口２１、柄部２２、２３、２６、及び室２８から成る概して中空の本体部２９を備える。中空の本体部２９の左端には、第１の柄部２２と連通する円形の入口２１がある。第１の柄部２２は第２の柄部２３と連通し、第２の柄部２３は第３の柄部２６と連通し、第３の柄部２６は室２８と連通する。それら柄部は、概して管状であり、左から右へと続く連続する各柄部は、概して前の柄部よりも大きな直径を有している。室２８は概して円筒状である。
【００１５】
中空の本体部２９は、低密度ポリエチレンから作られており、弾性である。中空の本体部２９は透明であり、ピンクで薄く着色されている。着色の色は使用される抽出媒体の種類に対応する。
【００１６】
図１に示すように、第３の柄部２６の左側の内部には、第１のフリット２４、抽出媒体２７、及び第２のフリット２５が配置されている。フリットは、フィルタ又は多量のビーズ若しくは粒子などの多孔質母材又は網である。第１のフリット２４及び第２のフリット２５は、ポリエチレンから作られた多孔質の網である。網は１０〜８５ミクロンの大きさの粒子で作られる。網は、５０ミクロン以上の直径の物質が通過できる大きさの細孔を備えないように作られていることが重要である。第１のフリット２４及び第２のフリット２５は円形であり、第３の柄部２６の内部に圧縮されて保持されている。
【００１７】
抽出媒体２７は、直径が５０ミクロンより大きいシリカのビーズから作られている。或いは、抽出媒体２７はシリカ系の他の化合物であってもよいし、アルミナ系又は炭素系であってもよい。抽出媒体は、ホウケイ酸塩、ニッケル、亜鉛、銅、鉄、繊維、又はガラスを含んでもよい。また、抽出媒体は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩を用いたタンパク質単離、アニオン交換抽出、金属イオン交換クロマトグラフィについて構成された被覆を含んでもよいし、又は抗体を含んでもよい。抽出媒体２７の重要な機能は、第１の溶液の存在下において所望の物質に選択的に付着又は結合すること、及び、第２の溶液の存在下において所望の物質に選択的に付着又は結合しないことである。抽出媒体２７は、第１のフリット２４と第２のフリット２５との間に保持される。第１の実施例２０では、抽出媒体２７によって、第１のフリット２４と第２のフリット２５との間の容積が完全に満たされるべきである。
【００１８】
室２８内の容積は、柄部１及び２を合わせた容積よりも相当に大きくあるべきである。
【００１９】
実施例２０は、吸込み及び送出のために、手によってピペッタとして作動させることができる弾性の室を供給することにより、及び、溶液中の核酸やタンパク質などの様々な物質への相対的親和力を変化させる抽出媒体を供給することにより、概して機能する。図３は第２の圧縮された形状の第１の実施例２０を示す。室２８を手で搾ることで実施例は第２の圧縮された形状を取り、その形状では、室２８の容積が、図１に示された拡張した形態の室２８の容積と比較して大幅に減少されている。柄部２６及び室２８にある流体の大部分は、室２８が圧縮されると、フリット２５、抽出媒体２７、フリット２４を通って入口から出るように押し込まれる。
【００２０】
室２８を手で握りしめているのが解除されると、ポリエチレンの本体部の弾性的性質によって、実施例２０は元の拡張した形状に戻され、その戻される処理の間に入口を通じて流体を吸い込む。入口へと吸い込まれた流体の一部は、フリット２４、抽出媒体２７、及びフリット２５を通じて押し込まれる。
【００２１】
実施例２０へと吸い込まれた流体における任意の液体が、器具を上方に向けられた入口２１を備える構成とすることで、室２８へと導かれてもよい。この構成の場合、実施例２０は選択的に渦化され得る。また、この構成では、器具を片手で保持し、流体の流出を防止するために人差し指を使って柄部２２又は２３を折り曲げるのが容易であるため、内容物を混合するために装置を振るのが容易である。或いは、実施例２０は、柄部２６を挟んで閉じることで、室２８にある任意の液体が実施例２０内から流出するのを防止するために、柄部２６に沿って折り畳まれてもよい。実施例２０が、入口２１が上方を向く状態で保持されている間に、使用者は室２８の側面を全体で搾ることができ、室２８の壁の間にある任意の固形の内容物を強制的に研磨することができる。
【００２２】
説明した実施例は、いくつかの予想外の有利性をもたらした。実施例２０は、ピペッタ、ピペット、抽出媒体、混合管、及び蓄積管の役割を満たしている。実施例は、多くの物質に対して抽出を行うための、非常に効率がよく、コンパクトで持ち運びできるシステムを提供する。様々な他の実施例も可能である。
【００２３】
図２は、単一のフリット３４だけを含む第２の実施例３０を示す。図に示すように、ビーズから成る抽出媒体２７は、柄部３６及び室３８内を自在に移動することができる。細胞が流体中に含まれてもよく、その流体は器具へと吸い込まれる。実施例２０を振って、そのような細胞を含む内容物を混合するとき、抽出媒体３７内のビーズは自在に移動し、ビーズが細胞を溶解する助けとなる「ビーズ破砕」の効果が得られる。ビーズ破砕の効果は、装置が渦化される場合により顕著である。また、抽出媒体３７が室３８に自由に入ることができるため、実施例３０が、空気中に入口２１がある状態で構成されている場合、抽出媒体３７のビーズは室３８に集まることになる。これは、試料が実施例３０に吸い込まれた場合に有用であり、試料を抽出媒体３７の表面に長時間接触させることができるという有利性があり、したがって、試料をある時間の長さ培養させられる。
【００２４】
図５に示すように、第３の実施例１５が開示されており、その実施例は、分離ピペッタ、遠心分離機、又は毒性の溶液を用いることなくタンパク質及び核酸を生物試料から抽出する方法を概して提供する。
【００２５】
図５に示すように生物試料５２が準備される。生物試料５２は、少なくとも１つのタンパク質又は少なくとも１つの核酸を含むべきであり、細胞又はウイルスの形態であってもよい。
【００２６】
次いで、核酸結合溶液５４が準備される。核酸結合溶液は、核酸の抽出媒体２７への親和力を効率よく増加し、及び／又は、核酸の溶解性を低下させるものである。核酸結合溶液５４はカオトロピック剤も含んでいる。この実施例において、カオトロピック剤は６Ｍの濃度でのチオシアン酸グアニジンである。或いは、尿素又は過塩素酸リチウムなどのカオトロピック剤が用いられてもよい。カオトロピック剤は、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、及び疎水性効果を妨害することで、生物試料における分子の構造を破壊することになる。核酸結合溶液は、他の組成物と結合されたカオトロピック剤を含んでもよい。例えば、核酸結合溶液５４は、生物試料５２の細胞膜を溶解するために溶解質を含んでもよい。
【００２７】
次いで、生物試料５２は核酸結合溶液５４と混合される６１。前述の第２の実施例３０と同等の抽出ピペット５５が準備される。試料５２及び核酸結合溶液は、抽出ピペット５５の室３８を搾り、入口３１を核酸結合溶液５４及び試料５２を保持する容器へと入れ、そして室を解放し、試料５２及び溶液５４が室３８の内部へと引き入れられることで混合されてもよい。次いで、抽出ピペット５５は上下逆にされ、柄部２２又は２３が折り曲げられ、経路を挟んで流体が流出するのを防止し、抽出ピペット５５を振って試料５２と溶液５４とを混合することができる。抽出ピペット５５における第１のフリット３４及び第２のフリット３５の粒子の大きさは１０〜８５ミクロンの間にあるように制御されるため、作り出された細孔は生物試料５２にある細胞が通過するに十分な大きさである。試料５２にある細胞は、抽出ピペット５５の抽出媒体３７にあるシリカのビーズのビーズ破砕の効果によって溶解されてもよい。混合物は、選択的に、ある時間の長さ培養され６２、試料５２を抽出媒体３７と長時間接触させることができる。抽出媒体３７は、核酸に可逆的に結合するように構成されるべきである。この実施例では、抽出媒体３７はシリカのビーズであり、このビーズは核酸に可逆的に結合することが知られている。
【００２８】
これにより、生物試料５２からの核酸は、５８で指示されるケイ酸塩ピペット５５に結合され、それによって溶液から除去され溶液中に存在しなくなる。生物試料からのタンパク質は、混合物の流れる溶液５６中に留まる。流れる溶液５６は、以下においては核酸結合流れ５６と称され、以下に説明するように、ケイ酸塩ピペットから分離され、タンパク質抽出に用いられる。
【００２９】
次いで、核酸洗浄溶液５９は、室３８を圧縮及び解放することで抽出ピペット５５に吸い込まれる。洗浄溶液５９は、シリカのビーズに付いているであろう何らかの不純物、又は、表面粘着によってシリカのビーズに結合し続ける溶液中にある何らかの不純物を除去する助けとなる。この実施例では、エタノール及びアセトンの混合物が核酸洗浄溶液として用いられる。抽出ピペットは、洗浄溶液が内部にある、振られるものでもよいし、渦化されるものでもよい。洗浄の後、核酸を含む抽出ピペット９３は乾燥されてもよい。
【００３０】
次に、核酸溶出溶液９４がケイ酸塩ピペット先端９３と接触される６６。この実施例では、水及び塩の混合物が核酸溶出溶液として用いられる。核酸は、核酸溶出溶液に対して、シリカに対してよりも大きな親和力を有しており、核酸をシリカのフリットから解放させ、溶液へ入る。次に、その結果生じる溶液９５は集められ、それによって元の生物試料５２から単離された核酸を回収する。回収された核酸は、その後に生物探知機８１で用いられてもよい。この核酸単離手順は、現在の核酸単離の至適基準と同等の性能特性を有し、また、単離された核酸は、すべての試験された下流のＰＣＲに基づいた検出プラットフォームと適合する。
【００３１】
タンパク質は、以下のように、より早く集められた核酸結合フロースルー５６から抽出される。タンパク質結合溶液は、先ず抽出ピペット９９へと吸い込まれる（核酸抽出の段階と同じ抽出ピペットが用いられてもよいし、或いは新しい抽出ピペットが用いられてもよい）。タンパク質結合溶液９８は、シリカのビーズと接触したときに、タンパク質を溶液から抽出するのを助けるように適合されている結合剤又は沈殿剤である。核酸結合フロースルー５６は、タンパク質結合溶液９８とタンパク質結合溶液９８を抽出ピペット９９に吸い込むことで混合６８される。混合物は振られ、入口側を上にして培養される。培養６９は６０分未満続けられるべきである。ある用途では、培養は、処理の効果を著しく低減せずに５分間以下の短さとすることができる。５分間未満の培養時間が用いられてもよいが、タンパク質結合溶液９８の有効性は培養時間が短くなると低下するかもしれない。この実施例において、タンパク質結合溶液９８は、２．５％のドデシル硫酸ナトリウム及びグリコーゲンと混合されたイソプロパノールである。或いは、イソプロパノール、エタノール、トリクロロ酢酸、アセトン、又はメタノールなど、他の化合物がタンパク質結合溶液として用いられてもよい。タンパク質結合溶液に、沈殿の促進剤を含ませることも有益な場合がある。この実施例では、グリコーゲンはタンパク質結合溶液９８において沈殿の促進剤として作用する。タンパク質結合溶液は洗浄剤を含んでもよい。用いられ得る洗浄剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルがある。
【００３２】
培養６９の後、混合物はピペット９９の抽出媒体３７と再び接触される７１が、これはタンパク質と可逆的に結合するように構成されるべきである、
【００３３】
前述のように、振ること及び渦化することは、混合物を抽出媒体３７のシリカのビーズに接触させるために用いられる。流れ４１は廃棄される。次いで、タンパク質洗浄溶液４３が抽出ピペット９９に吸い込まれ、シリカに付いているであろう何らかの不純物、又は、表面粘着によってシリカのビーズに結合され続ける、任意の溶液中にある何らかの不純物を除去するように混合される。この実施例では、イソプロパノールがタンパク質洗浄溶液４３として用いられる。洗浄溶液４３は混合の後に廃棄される。洗浄の後、タンパク質４５を含む抽出ピペットは乾燥７３されてもよい。
【００３４】
タンパク質は、シリカに対してよりも大きな親和力を有するタンパク質溶出溶液４８を用いて、乾燥された抽出ピペット４６から除去される。この実施例では、タンパク質溶出溶液４８は水と塩との混合物である。洗浄剤がタンパク質溶出溶液に添加されてもよく、洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルなどである。タンパク質溶出溶液４８は、ピペッタを用いてケイ酸塩ピペット先端４６を複数回通過７４させられ、タンパク質は、シリカのフリットへの結合から解放され溶液へ入る。次いで、その結果生じる溶液４９が集められ、それによって、元の生物試料の残余から単離されたタンパク質を回収する。以下で実例１に示すように、処理は、元の試料におけるタンパク質の大部分を抽出することとなり、平均して７０％を超えるタンパク質を抽出するという予想外の結果となる。回収されたタンパク質４９は、引き続き生物探知機８１で用いられてもよい。
【００３５】
説明した方法は多くの予想外の結果をもたらした。第１に、処理は、試料を分けることなく、また外部の実験機器を必要とせずに、核酸とタンパク質との両方を試料から単離する。処理は短時間のものであり、３０分未満で単離することができる。処理は、順次進めていく方式で行うことができ、先ず核酸を試料から単離し、続いてすぐにタンパク質が単離されて核酸が洗浄され、同時に回収が行われてタンパク質が単離される。処理は、試料中のタンパク質の大部分を単離することができ、平均では７３％である。回収されたタンパク質は、免疫反応性である。したがって、この処理は、生物剤鑑定者が下流の分析器の大部分で用いる２つの最も顕著な高分子の種類を素早く単離する手段を提供し、それにより、高められた試験結果の信頼を使用者に提供する。最後に、この処理は、危険な試薬を用いずに、そして遠心分離機又は分離ピペッタなどの高度な実験機器を使わずに、同じ生物試料から大きな生成量で核酸とタンパク質とを抽出する。実施例は、すべてが一体化された器具となっており、必要なのは単一の抽出ピペットと適切な無毒の溶液だけである、という方法である。
【００３６】
本発明はキットも提供し、その実施例は図５において符号９１で示される。そのキットは、核酸及び／又はタンパク質を、遠心分離機、分離ピペッタ、又は他の高価な実験機器を必要とせずに、生物試料から素早く単離するように用いることができる。好ましい実施例では、キットは、概して、核酸結合溶液、タンパク質結合溶液、及び実施例３０と同一の抽出ピペットを備える。核酸結合溶液は、カオトロピック剤だけから、又は他の要素と混合されたカオトロピック剤から作られてもよい。この実施例では、カオトロピック剤は、尿素、グアニジン塩、過塩素酸リチウムから成る群から選択され、ドデシル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルなどの洗浄剤を含む。この実施例では、タンパク質結合溶液は沈殿剤を含み、また、沈殿剤は、イソプロパノール、エタノール又はメタノールなどのアルコールである。或いは、沈殿剤はトリクロロ酢酸又はアセトンであってもよい。またタンパク質結合溶液は、沈殿の促進剤、及び洗浄剤を含んでもよい。この実施例では、沈殿の促進剤はグリコーゲンである。
【００３７】
またキットは、核酸溶出溶液、並びに、水及び塩などのタンパク質溶出溶液を含んでもよい。多孔質のシリカ化合物は、シリカの注射器のフィルタ、シリカ母材、シリカのフリット、シリカ微粒子の柱、ケイ酸塩ピペット先端、又はホウケイ酸塩にあってもよい。キットは遠心分離機又はピペッタを含む必要はない。
【００３８】
上記の実施例の多くの変形が可能である。例えば、様々な異なる種類の抽出媒体が用いられてもよく、それには、ホウケイ酸塩、ニッケル、亜鉛、銅、鉄、分割されたナノファイバ、ガラス、常磁性体、抗体で被覆された材料、又はニッケル交換抗体などの金属イオン交換クロマトグラフィ媒体が含まれる。抽出媒体は、１５０〜２１２ミクロン、４２５〜６００ミクロン、又は５０ミクロンを超える直径を有するビーズの形状であってもよい。様々な範囲の大きさの有利性は、表面積、ビーズ破砕の効果、及び可変の流れ抵抗による抽出の効率のよさである。抽出媒体は、母材の形態であってもよいし、圧縮された粉状の形態であってもよい。様々な抽出媒体の化学的性質の各々は、着色がされた抽出ピペット本体部と適合させることができる。
【００３９】
また、用いられる溶液に対する様々な追加の化学的性質が用いられてもよく、それには、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩を用いたタンパク質単離、アニオン交換抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、又は抗体に基づいた抽出／精製などがある。
【００４０】
追加のフリット及び追加の抽出媒体が単一のピペットで用いられてもよい。例えば、図６は、第２の抽出媒体６１を保持するための第３のフリット６２を有する実施例を示す。図７は、第２の抽出媒体が室２８に入ることができ、前述のようにビーズ破砕を助ける別の実施例を示す。
【００４１】
このように、抽出ピペット及び抽出の方法の現在の好ましい形態を例示及び説明し、またそれらのいくつかの変形を説明したが、以下の特許請求の範囲によって定義及び区別されるように、様々な追加の変更を本発明の精神から逸脱することなく行うことができることは、当業者は容易に理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月4日(2013.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出ピペットであって、
入口、柄、弾性の室を備える概して中空の本体部と、
前記中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体と、
前記中空の本体部の内部に含まれており、前記第１の抽出媒体が前記中空の本体部から出るのを防止するように構成され、前記中空の本体部によって圧縮されて保持された第１のフリットと
を備えるピペット。
【請求項２】
前記中空の本体部は透明な材料、低密度ポリエチレンから成る、若しくは薄く着色され、又はそれらの任意の組合せである、請求項１のピペット。
【請求項３】
前記室は、第１の容積を有する拡張した形状から、前記第１の容積より小さい第２の容積を有する収縮した形状へと移行するように弾性的に構成される、請求項１のピペット。
【請求項４】
前記第１のフリットは、シリカ、ポリエチレン、若しくは１０〜８５ミクロンの大きさの細孔、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項１のピペット。
【請求項５】
前記第１の抽出媒体は、シリカ系、アルミナ系、又は炭素系である、請求項１のピペット。
【請求項６】
前記第１の抽出媒体は、ビーズ、シリカ、ホウケイ酸塩、ニッケル、亜鉛、銅、鉄、分割されたナノファイバ、又はガラスを含む、請求項１のピペット。
【請求項７】
前記ビーズは約１５０〜２１２ミクロンの直径を有する、常磁性体である、若しくは被覆を備える、又はそれらの任意の組合せである、請求項６のピペット。
【請求項８】
前記被覆は、ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩溶液を用いたタンパク質単離、アニオン交換抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、又は親和力に基づいたクロマトグラフィについて構成される、請求項７のピペット。
【請求項９】
前記ピペットはそれの内容物を渦化する、研磨する、挟む、又はビーズ破砕するように構成される、請求項１のピペット。
【請求項１０】
第２のフリットをさらに備え、前記第２のフリットは、前記第１の抽出媒体が前記第１のフリットと前記第２のフリットとの間にあるように配置される、請求項１のピペット。
【請求項１１】
第２の抽出媒体をさらに備える、請求項１のピペット。
【請求項１２】
第３のフリットと、前記第２のフリットと前記第３のフリットとの間に配置された第２の抽出媒体とをさらに備える、請求項１０のピペット。
【請求項１３】
物質を抽出する方法であって、
試料を準備するステップと、
前記試料を液体中に浮遊させるステップと、
ピペットを準備するステップであって、前記ピペットは、入口、柄、弾性的に付勢される室を備える概して中空の本体部と、前記中空の本体部の内部に配置された第１の抽出媒体と、前記中空の本体部の内部に含まれており、前記第１の抽出媒体が前記中空の本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットとを備える、ステップと、
前記ピペットを圧縮するステップと、
前記室を拡張させて、前記液体を、前記第１の抽出媒体を通過させるステップであって、前記物質が前記第１の抽出媒体と相互作用するステップと、
前記液体を前記ピペットから出すために前記ピペットを圧縮するステップと、
抽出溶液を準備するステップと、
前記室を拡張させるステップであって、前記抽出溶液が前記抽出媒体を通過し、前記物質が前記第１の抽出媒体と相互作用することなく、前記物質が抽出される、ステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記ピペットの内容物を拘束させるために前記ピペットを折り畳む、又は前記中空の本体部をそれの中にある内容物を研磨するために搾る、又はビーズ破砕する、又は前記試料を渦化する、又はそれらの任意の組合せのステップをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記圧縮する前記ステップの後に、前記抽出媒体を洗浄溶液で洗浄するステップをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１６】
空気に前記第１の抽出媒体を通過させるように、前記ピペットを圧縮及び解放するステップをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記試料を結合溶液と混合するステップであって、前記結合溶液はカオトロピック塩を含むステップをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１８】
前記抽出溶液は固相の抽出溶液又は液相の抽出溶液である、請求項１３の方法。
【請求項１９】
前記試料を結合溶液と混合するステップと、溶出溶液を前記抽出媒体と接触させるステップとをさらに含み、
前記結合溶液、前記溶出溶液、及び前記抽出媒体は、
ブーム化学の核酸単離、カオトロピック塩タンパク質単離、セルロース・イオン交換抽出、カルボキシメチルセルロース抽出、金属イオン交換クロマトグラフィ、親和力に基づいたクロマトグラフィ、又は分割された繊維に基づいた抽出から成る群から選択された抽出を提供する、請求項１３の方法。
【請求項２０】
抽出キットであって、
前記キットはピペットを備え、前記ピペットは、
入口、柄、及び弾性の室を備える概して中空の本体部と、
前記中空の本体部の内部に配置された抽出媒体と、
前記中空の本体部の内部に含まれており、前記抽出媒体が前記本体部から出るのを防止するように構成された第１のフリットと
を備え、前記キットは、
結合溶液と、
抽出溶液と
を備えるキット。
【国際調査報告】
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