(57)【要約】  熱ショックタンパク質、免疫グロブリン、およびレトロウイルス抗原を含む組成物が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレトロウイルスによる感染に対する全身性かつ粘膜性免疫を誘導する。治療方法には、レトロウイルスの抗原または免疫原に対する免疫システムの応答をブーストする組成物の投与が含まれる。
2014508762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ウイルス抗原特異的免疫応答を生成させるための組成物であって、熱ショックタンパク質および免疫グロブリンであるか、または熱ショックタンパク質および免疫グロブリンをコードする核酸である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を含む組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記熱ショックタンパク質またはその核酸が、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記熱ショックタンパク質またはその核酸がｇｐ９６であることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、請求項１に記載の組成物において、前記免疫グロブリンまたはその核酸が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはそれらの断片を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物において、前記断片が、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物において、前記熱ショックタンパク質および免疫グロブリンが、共有結合または非共有結合を介して結合しているか、融合しているか、または連結されていることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記少なくとも１つのウイルス分子がレトロウイルス分子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物において、前記レトロウイルスが、ヒトまたはサルの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ）であることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の組成物において、前記ウイルス分子が、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、またはｇｐ１６０もしくはその断片の少なくとも１つを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の組成物において、前記ウイルス分子が、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物において、前記ワクチン分子と結合しておらず、かつレトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物において、前記第２のウイルス免疫原が、糖タンパク質またはその核酸であることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物において、前記第２のウイルス免疫原が、ヒトまたはサルの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ）分子であることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
熱ショックタンパク質および免疫グロブリンであるか、または熱ショックタンパク質および免疫グロブリンをコードする核酸である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を発現するベクターを含む単離細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離細胞において、前記熱ショックタンパク質が、宿主細胞から分泌されるように改変されることを特徴とする単離細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の単離細胞において、前記細胞がヒトまたは霊長類の細胞であることを特徴とする単離細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の組成物において、前記レトロウイルス分子が、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、またはｇｐ１６０もしくはその断片の少なくとも１つを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の単離細胞において、前記第２ドメインのウイルス分子が、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含むレトロウイルス分子であることを特徴とする単離細胞。
【請求項１９】
請求項１４に記載の単離細胞において、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を発現するベクターを任意選択で含むことを特徴とする単離細胞。
【請求項２０】
請求項１４に記載の単離細胞において、前記ベクターが、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を任意選択で発現することを特徴とする単離細胞。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の単離細胞において、前記レトロウイルス免疫原が、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする単離細胞。
【請求項２２】
請求項１４に記載の単離細胞において、前記熱ショックタンパク質またはその核酸が、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含むことを特徴とする単離細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離細胞において、前記熱ショックタンパク質またはその核酸が、ｇｐ９６であることを特徴とする単離細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の単離細胞において、前記熱ショックタンパク質が、改変されて機能的な小胞体保持配列を欠くｇｐ９６を含むことを特徴とする単離細胞。
【請求項２５】
請求項１４に記載の単離細胞において、前記細胞が照射されたことを特徴とする単離細胞。
【請求項２６】
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）を含むアジュバントと、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含む１つまたは複数のレトロウイルス分子とを発現する複数の細胞を含むワクチン。
【請求項２７】
請求項２６に記載のワクチンにおいて、前記細胞がアジュバントを分泌することを特徴とするワクチン。
【請求項２８】
請求項２６に記載のワクチンにおいて、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含むレトロウイルス免疫原をさらに含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２９】
請求項２６に記載のワクチンにおいて、前記ベクターが、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を任意選択で発現することを特徴とするワクチン。
【請求項３０】
請求項２６に記載のワクチンにおいて、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を発現する第２のベクターを任意選択で含むことを特徴とするワクチン。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載のワクチンにおいて、前記レトロウイルス免疫原が、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項３２】
ウイルスに対する抗原特異的免疫応答を被験体に誘導する方法であって、前記方法が、
熱ショックタンパク質および免疫グロブリンである、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有する分泌可能なワクチン分子を発現する宿主細胞を含むアジュバント組成物を被験体に投与すること、
ウイルス免疫原を投与すること、および
ウイルスに対する抗原特異的免疫応答を被験体に誘導すること
を含む方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記熱ショックタンパク質が、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法において、前記熱ショックタンパク質が、機能的な小胞体保持配列を欠くｇｐ９６であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の方法において、前記第２ドメインのウイルス分子が、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐｌ６０またはその断片を含むレトロウイルス分子であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法において、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含むレトロウイルス免疫原をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３２に記載の方法において、前記ベクターが、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を任意選択で発現することを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３２に記載の方法において、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を発現する第２のベクターを任意選択で含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の方法において、前記レトロウイルス免疫原が、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３２に記載の方法において、前記宿主細胞が照射されたことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３２に記載の方法において、前記組成物の投与が、被験体の末梢血において抗原に特異的なＢおよびＴ細胞の増殖をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３２に記載の方法において、前記組成物の投与が、被験体の粘膜において抗原に特異的なＢおよびＴ細胞の増殖をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項４３】
被験体のレトロウイルス感染を予防または治療する方法であって、
熱ショックタンパク質および免疫グロブリンである、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を発現する宿主細胞を含む組成物の治療有効量を投与すること、
ウイルス免疫原を投与すること、および
ウイルスに対する抗原特異的免疫応答を被験体に誘導すること
を含む方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法において、前記熱ショックタンパク質が、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法において、前記熱ショックタンパク質が、機能的な小胞体保持配列を欠くｇｐ９６であることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４３に記載の方法において、前記第２ドメインのウイルス分子が、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐｌ６０またはその断片を含むレトロウイルス分子であることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法において、前記宿主細胞が照射されたことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４３に記載の方法において、前記組成物の投与が、被験体の末梢血において抗原に特異的なＢおよびＴ細胞の増殖をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４３に記載の方法において、前記組成物の投与が、被験体の粘膜において抗原に特異的なＢおよびＴ細胞の増殖をもたらすことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年２月２３日に出願された、「ＣＯＭＢＩＮＥＤ  ＣＥＬＬ  ＢＡＳＥＤ  ＧＰ９６−ＩＧ−ＳＩＶ／ＨＩＶ，ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＧＰ１２０  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＶＡＣＣＩＮＡＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＳＩＶ／ＨＩＶ」と題する米国仮特許出願第６１／４４５，８８４号明細書の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金第Ｒ３３ＡＩ０７３２３４号の下で、米国政府の支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明の実施形態は、細胞分泌性アジュバントおよび抗原担体の組成物、抗原、ならびに使用方法を含む。さらなる実施形態は、一定期間にわたりワクチンを産生するための生細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
全世界的には、異性間の行為がすべてのＨＩＶ感染の４分の３を説明する。欧州および米国では、高リスク群は、同性愛者および両性愛者、売春婦、注射針を共有する静脈注射薬使用者、汚染血液製剤で治療された血友病患者および他の患者である。異なる地域では異なるウイルス型がより一般的であるので、先進国と開発途上国でのリスクの分布は異なってくる。ウイルスは体外では短命であり、そのため、性的接触、輸血、および注射器の共有以外の方法による感染伝播は極めて可能性が低い。ＨＩＶに感染した妊婦が、子宮内にいる胎児にＨＩＶを移行させる可能性は低いが、誕生時に膣体液を介してまたは小児に授乳した後に、そうなることはかなり可能性がある。親が抗レトロウイルス薬で治療されていない場合、ＨＩＶ陽性の母親から生まれた小児の９０％超は、この疾患に罹患することになる。
【０００５】
１９９１年に、世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）は、ブラジル、タイ、およびウガンダに集中したワクチン開発エトロット（ｅｔｌｏｔｔ）の先頭に立った。１９９６年のＬＴＮＡＩＤＳの創設と共に、このプログラムは国連組織に引き継がれた。ＨＩＶワクチンの治験は、５，０００人の高リスクボランティア（同性愛者およびＨＩＶに感染したパートナーがいる者）にワクチンまたはプラセボを投与して、１９９８年６月に米国で開始した。
【０００６】
２００３年２月に、米国バイオ企業であるＶａｘＧｅｎは、５，０００人のボランティア群に対する３年間のワクチン試験が単に限定的な成功に帰したことを発表した。全体として、彼らのワクチンは、ＨＩＶ感染率を３．８％低下させることができたにすぎなかった。しかしながら、そのワクチンは黒人およびアジア人のボランティアの間では感染率を６７％低下させることができたので、その薬物が部分的に使用される期待はあった。ＶａｘＧｅｎは、２００３年１１月にタイにおいて、２，５００人の麻薬使用者を含むプログラムで、彼らのワクチンであるＡＩＤＶＡＸを試験したが、この治験は、ワクチンが疾患の伝播または進行を防止することができずに失敗に終わった。
【発明の概要】
【０００７】
本概要は、本発明の本質および実質を簡潔に示すための本発明の概要を提示するために提供されるものである。本概要は、特許請求の範囲または意味を解釈または限定するために使用されることはないとの理解で提出されるものである。
【０００８】
実施形態は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成のためのアジュバントおよび抗原担体として、かつｇｐｌ２０特異的抗体産生（Ｔｈｌ抗体）のためのアジュバントとして、ｇｐ９６−Ｉｇを含む組合せ組成物またはワクチンに関する。組成物中の抗原は、ＨＩＶまたはＳＩＶの抗原、例えばカプシド抗原、糖タンパク質、外被抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態での組合せ組成物は、一定期間にわたってｇｐ９６−Ｉｇを放出する単離細胞を含む。細胞は、ドナー由来細胞株等を含む、いかなる供給源に由来するものであってもよい。
【０００９】
他の態様は以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンが細胞性および体液性免疫応答を誘導することを示す。図１Ａは、ワクチン接種およびチャレンジのプロトコールを示す概略図である。図１Ｂは、ポリエピトープ特異的な直腸固有層のＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＳＩＶ特異的ペプチドの刺激の下でＴＮＦα、ＩＦＮγを分泌することを示すグラフである。２６週目におけるＳＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、マルチパラメーターであるＴＮＦαおよびＩＦＮγのＩＣＳアッセイにより、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、およびＥｎｖタンパク質全部をカバーする、１１アミノ酸が重複する１５残基ペプチドのプールを使用して検出した。モネンシンおよびブレフェルジンＡの存在下、重複ＳＩＶペプチドで５時間刺激され、新たに単離された直腸固有層単核細胞について、ＴＮＦα、ＩＦＮγに対する細胞内染色を行った。生きているＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲーティングした後、サイトカイン陽性細胞の頻度を決定した。図１Ｃは、５週目および２６週目におけるＳＩＶｍａｃ２５１  Ｅｎｖ  ＥＬＩＳＡをＥＬＩＳＰＯＴにより測定した結果を示すグラフである。図１Ｄは、２６週目におけるＳＩＶｍａｃ２５１  Ｅｎｖ特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）をＥＬＩＳＰＯＴにより測定した結果を示すグラフである。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表わす。
【図２】図２は、ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンの防御効果を示す。図２Ａは、チャレンジ後３、７、１５、および１７週目における、各ワクチン群に関する、１ｍｌ血漿あたりの平均ＳＩＶ  ＲＮＡコピーを示すグラフである。図２Ｂは、個々のサルに関する、１ｍｌ血漿あたりの平均ＳＩＶ  ＲＮＡコピーを示すグラフである。図２Ｃは、各ワクチン群において感染獲得に必要なチャレンジ数を示すグラフである。図２Ｄは、各群における、５０％感染に必要なチャレンジ数、９５％信頼区間（ＣＩ）を含むハザード比、および暴露ごとのワクチン防御が含まれる統計分析を示す表である。Ｐ値は、比例ハザードモデルを使用するワルド検定によるものである。
【図３】図３は、感染獲得に対する防御とｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンとの関連を示す。図３Ａは、ＳＩＶｍａｃ２５１  Ｅｎｖ抗体についての平均ＯＤと感染確立に必要なチャレンジ数との相関を示すグラフであり、図３Ｂは、ＳＩＶｍａｃ２５１  Ｅｎｖ特異的抗体分泌細胞の頻度と感染確立に必要なチャレンジ数との相関を示すグラフであり、図３Ｃは、２６週目における血中形質芽細胞と感染確立に必要なチャレンジ数との相関を示すグラフである。相関分析には、１２匹のｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇ＋ｇｐ１２０ワクチン接種サルが含まれる。Ｐ値は、スピアマンの順位相関検定によるものである。
【図４】図４は、３６匹のアカゲザルのＭＨＣタイプＩ、ＴＲＩＭ５αの発現（Ｒ−制限ＴＲＩＭ５αの遺伝子多型）、および性別（Ｆ−雌；Ｍ−雄）を示す表である。
【図５】図５は、ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンの防御効果を示すグラフである。ＴＲＩＭ５α制限対立遺伝子を有する動物（黒線）またはそれを有しない動物（灰色線）のワクチン群における感染獲得に必要なチャレンジ数。
【図６】図６Ａは、ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンの防御効果を示すグラフである。動物に陽性ウイルス力価（力価は各チャレンジ後５日目に評価された）があった場合に、各ワクチン群における感染獲得に必要なチャレンジ数である感染回数がスコア化された。図６Ｂは、ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンの防御効果を示すグラフである。１チャレンジ前に記録された失敗で、改訂失敗回数ファイル中の感染回数が再スコア化された（最初の陽性検出日に、１０６ＲＮＡコピー／１ｍｌ血漿以上のウイルス負荷がある動物について）。
【図７】図７は、Ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチンが腸粘膜において細胞性免疫応答を誘導することを示す図である。ポリエピトープ特異的な直腸固有層のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＩＶ特異的ペプチドの刺激で、１Ｌ−２およびＣＤ１０７ａを発現する。２６週目におけるＳＩＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を、マルチパラメーターＩＣＳアッセイにより、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、およびＥｎｖタンパク質全部をカバーする、１１アミノ酸が重複する１５残基ペプチドのプールを使用して検出した。モネンシンおよびブレフェルジンＡの存在下、重複ＳＩＶペプチドで５時間刺激され、新たに単離された直腸固有層単核細胞について、ＩＬ−２、ＣＤ１０７ａに対する細胞内染色を行った。生きているＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲーティングした後、サイトカインまたはＣＤ１０７ａ陽性細胞の頻度を決定した。
【図８】図８は、Ｇｐ９６−ＳＩＶ免疫処置が、直腸粘膜の固有層および上皮内コンパートメントに、ＳＩＶ−ｇａｇおよびＳＩＶ−ｔａｔ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することを示す。２４時間以内にｇｐ９６−Ｉｇを１０ｍｇ分泌する細胞を用いる腹腔内経路により、ｇｐ９６−ＳＩＶ、ｇｐ９６−ＳＩＶ＋組換え体ｇｐ１２０、またはｇｐ９６−模擬で、８匹のＭａｍｕ−Ａ０１＋アカゲザルを免疫した。免疫処置投与は、０、６、および２５週目の３回行った。７週目および２６週目（第２回および第３回のワクチン接種後５日目）に直腸粘膜から試料を回収した。図８Ａは、ＳＩＶ−Ｇａｇ−ＣＤ８  Ｔ細胞を、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１／Ｇａｇ１８１〜１８９  ＣＭ９（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ（配列番号１）；Ｇａｇ−ＣＭ９）およびＴａｔ２８〜３５  ＳＬ８（ＴＴＰＥＳＡＮＬ（配列番号２）；Ｔａｔ−ＳＬ８）のテトラマー染色により検出した結果を示すグラフである。ＣＤ８＋集団にゲーティングした後、テトラマー陽性細胞のパーセントを決定した。図８Ｂは、ＳＩＶ−Ｇａｇ−ＣＤ８  Ｔ細胞を、Ｍａｍｕ−Ａ＊０１／Ｇａｇ１８１〜１８９  ＣＭ９（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭ（配列番号１）；Ｇａｇ−ＣＭ９）およびＴａｔ２８〜３５  ＳＬ８（ＴＴＰＥＳＡＮＬ（配列番号２）；Ｔａｔ−ＳＬ８）のテトラマー染色により検出した結果を示すグラフである。ＣＤ８＋集団にゲーティングした後、テトラマー陽性細胞のパーセントを決定した。図８Ｃは、固有層および上皮内コンパートメントにおけるＣＤ８＋ＳＩＶｇａｇ＋Ｔ細胞の表現型分析を示すグラフである。マーカーのＣＤ２８およびＣＤ９５は、アカゲザルＴ細胞の中の中央記憶（ＴＣＭ）、移行記憶（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｍｅｍｏｒｙ）（ＴＴＭ）、およびエフェクター記憶（ＴＥＭ）を定義する。ＴＣＭ、ＴＴＭ、およびＴＥＭ細胞は、それぞれＣＤ２８＋ＣＤ９５＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５−、およびＣＤ２８−ＣＤ９５−表現型を発現する。図８Ｄは、固有層および上皮内コンパートメントにおけるＣＤ８＋ＳＩＶｇａｇ＋Ｔ細胞の表現型分析を示すグラフである。マーカーのＣＤ２８およびＣＤ９５は、アカゲザルＴ細胞の中の中央記憶（ＴＣＭ）、移行記憶（ＴＴＭ）、およびエフェクター記憶（ＴＥＭ）を定義する。ＴＣＭ、ＴＴＭ、およびＴＥＭ細胞は、それぞれＣＤ２８＋ＣＤ９５＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５−、およびＣＤ２８−ＣＤ９５−表現型を発現する。
【図９】図９は、ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇ＋ｇｐ１２０のワクチン接種により誘導された短寿命形質芽細胞を示す。短寿命形質芽細胞（ＳＰＢ）は、最後のワクチン接種（２６週目）後５日目にフローサイトメトリーにより血液で測定した。図９Ａは、代表的なｇｐ９６ＳＩＶ＋ｇｐｌ２０およびｇｐ９６模擬のワクチン接種動物について、ＳＰＢ（ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ２０ｎｅｇ／ＣＤ２１ｌｏｗ／ＣＤ２７ｈｉ／Ｋｉ６７＋）のゲーティング戦略および頻度を示す図である。図９Ｂは、ＳＰＢの平均頻度±平均の標準誤差を、１１匹の模擬接種マカクおよび１２匹のワクチン接種マカクについて報告するグラフである。
【図１０】図１０は、ＳＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＩｇＡ抗体産生応答を示すグラフである。上段のパネルは、５および２６週目における、ＳＩＶｍａｃ２５１  Ｅｎｖ特異的ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡを示す。中下段の２つのグラフは、全およびＥｎｖ特異的ＩｇＡ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）のＥＬＩＳＰＯＴによる定量を示す。第３回ワクチン接種後５日目に、ｇｐ９６ＳＩＶ＋ｇｐｌ２０および模擬をワクチン接種したサルから回収した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について、ＥＬＩＳＰＯＴにより、全およびＳＩＶ  ｇｐｌ２０特異的ＩｇＡ  ＡＳＣをアッセイした。マルチスクリーン９６ウェルプレートを、ヤギ抗サルＩｇＧまたは組換えＳＩＶ  ｇｐ１２０のいずれかでコーティングした。ＰＢＭＣを加えて（全ＩｇＡに対して２×１０４／ウェルまたはＥｎｖ特異的ＩｇＡに対して２×１０５）、３７℃で一晩インキュベートした。ブロッキングに続いて、プレートをビオチン化ヤギ抗サルＩｇＡとインキュベートした。ＨＲＰ−アビジンコンジュゲートを加えた後、ＡＥＣを使用してプレートを発色させた。自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃ．Ｔ．Ｌ．ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  ５．０．３）を使用してスポットをカウントした。平均値（ＰＢＭＣ１００万当たりのスポット数）±平均値の標準誤差を、１２匹の模擬接種マカクおよび１２匹のワクチン接種マカクについて報告する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のいくつかの態様を、説明のための実例適用と関連して以下に記載する。本発明についての完全な理解を提供するために、数多くの具体的な詳細、関係、および方法が示されることを理解されたい。しかしながら、当業者は、具体的な詳細の１つまたは複数がなくても、または他の方法により本発明が実行できることを容易に認識するであろう。一部の行為は、異なる順序でかつ／または他の行為または事象と同時に起こってもよいので、本発明は、行為または事象の説明された順序により限定されない。さらに、説明された行為または事象すべてが、本発明による方法論を実行するために要求されるとは限らない。
【００１２】
本明細書に開示された遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物はすべて、本明細書に開示された組成物および方法が適用可能な任意の種に由来するホモログに対応させるように意図するものである。したがって、この用語は、これらに限定されないが、ヒトおよびマウスに由来する遺伝子および遺伝子産物を含む。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物を開示する場合、この開示は、例示目的のみを意図するものであり、それが現れる文脈により明確に示されない限り、限定として解釈されるべきではない。したがって、例えば、本明細書に開示された分子の場合、ｇｐ９６−Ｉｇは単一種に限定されないが、ヒト免疫グロブリンが好ましく、一部の実施形態では、哺乳動物の核酸配列およびアミノ酸配列に関連する分子は、これらに限定されないが、他の哺乳動物、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類を含む、他の動物に由来する同種および／またはオルソロガス遺伝子および遺伝子産物を包含するように意図される。好ましい実施形態では、遺伝子または核酸配列はヒトである。
【００１３】
定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を限定するように意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別に明確に示されない限り、同様に複数形も含むように意図される。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変化形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限りでは、このような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であるように意図される。
【００１４】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者により決定される特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味し、その値が測定または決定される方法、すなわち測定系の限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１または２以上の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、より一層好ましくは１％までの範囲を意味することができる。あるいは、生物系または生物過程に関して具体的に、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、そしてより好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、他に記載がない限り、用語「約」は、特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【００１５】
用語「熱ショックタンパク質」は、本明細書で使用される場合、細胞がストレスにさらされたときに、細胞内で発現の増加を示す任意のタンパク質を指す。用語「熱ショックタンパク質」は、ストレス状態に応答して誘導されるタンパク質および構成的に発現されるそのようなタンパク質のホモログの両方を包含すると理解されるべきである。好ましい非限定実施形態では、熱ショックタンパク質は、本来真核細胞に由来する；より好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質は、本来哺乳動物細胞に由来する。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質はヒト由来である。例えば、限定する意図はないが、本発明により使用することができる熱ショックタンパク質としては、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８とも呼ばれる）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、およびｈｓｐ９０が挙げられる。好ましい熱ショックタンパク質は、ＢｉＰ、ｇｐ９６、およびｈｓｐ７０である。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質はｇｐ９６である。熱ショックタンパク質の天然または組換え由来変異体もまた、本発明により使用することができる。
【００１６】
「免疫原」または「抗原」は、抗体媒介性免疫応答（すなわち、「Ｂ細胞」応答または体液性免疫）、細胞媒介性免疫応答（すなわち、「Ｔ細胞」応答）、またはそれらの組合せを被験体に誘発する、細胞または生物由来の化合物または分子である。化合物または分子は、アミノ酸、炭水化物、核酸、または脂質から個々にまたは任意の組合せで構成され得る。細胞媒介性応答は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、またはその両方の動員を含むことができる。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、抗体媒介性応答、ＣＤ４＋Ｔｈ１媒介性応答（Ｔｈ１：１型ヘルパーＴ細胞）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の１つまたは複数を誘発する。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さのアミノ酸ポリマーを指さないことを理解されたい。したがって、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質という用語は、ポリペプチドの定義内に含まれる。本明細書で使用される場合、「接触させる」は、薬剤に十分接近させ、かつ例えば、濃度、温度、時間、イオン強度の適切な条件下で、例えば、薬剤と生体試料中に存在する核酸またはポリペプチドとの間の特異的相互作用を可能にするように生体試料を置くことを意味する。一般に、薬剤を生体試料と接触させるための条件は、生体試料において、分子とそのコグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）（例えば、タンパク質とその受容体コグネート、抗体とそのタンパク質抗原コグネート、核酸とその相補配列コグネート）との間の特異的相互作用を促進する、当業者に公知の条件である。分子とそのコグネートとの間の特異的相互作用を促進するための代表的な条件は、Ｌｏｗらによる米国特許第５，１０８，９２１号明細書に記載されている。
【００１７】
状態、障害、または症状の「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、以下のことを含む：（１）状態、障害、または症状に罹患した可能性または罹患しやすい状態にある可能性があるが、状態、障害、または症状の臨床的または準臨床的な徴候をまだ経験または示していない哺乳動物で進展する状態、障害、または症状の臨床的または準臨床的な徴候の出現を防止または遅延させること；または（２）状態、障害、または症状を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその再発（維持療法の場合）またはその少なくとも１つの臨床的または準臨床的な徴候の発症を阻止、軽減、または遅延させること；または（３）疾患を緩和すること、すなわち、状態、障害、もしくは症状またはその臨床的もしくは準臨床的な徴候の少なくとも１つの緩解を引き起こすこと。治療される被験体にとっての有益性は、統計的に有意であるかまたは患者または医師にとって少なくとも認知可能であるかのいずれかである。
【００１８】
「患者」または「被験体」は、哺乳動物を指し、ヒトおよび獣医学的被験体を含む。
【００１９】
「予防有効量」は、必要な投与量および期間において、所望の予防成績を達成するために効果的な量を指す。典型的には、疾患の前または初期段階に、被験体に予防用量が使用されるので、予防有効量は、治療有効量よりも少量であって、疾患または感染を予防または防御する。
【００２０】
組合せワクチンまたは組成物
多くの生命を脅かすウイルス感染に対する防御ワクチン接種は、流行の遮断に、また疾患の排除にも成功している。しかしながら、ＨＩＶまたは高度に病原性で伝染力の強いＳＩＶ株による感染に対するワクチン誘導防御は、達成しがたい状況にある。
【００２１】
一般的な実施形態では、被験体を防御または治療する防御的および効果的なワクチンのための分子の組合せは、防御的または治療的免疫応答を誘導するように、アジュバントまたは抗原担体および２つ以上の特異的抗原を含む。抗原は、好ましくは２つの異なる抗原、例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０およびｇｐ１６０である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの分子組成物の成果は、イムノアッセイ、ウイルス負荷アッセイ、ｐ２４などの特定のレトロウイルス抗原の測定を含む、任意のアッセイを介してモニターすることができる。
【００２２】
手短に言えば、新規の非定型的ワクチン手法が、ＳＩＶｍａｃ２５１の高度病原性株による粘膜感染からマカクを顕著に防御することがデータにより示される。ＳＩＶ抗原由来クライアントペプチドを負荷された改変ＥＲシャペロンｇｐ９６ＳＩＶＩｇを分泌する、照射された生ワクチン細胞をマカクにワクチン接種した。ｇｐ９６は、ＳＩＶ外皮の組換えｇｐ１２０−タンパク質と組み合わせると、ＳＩＶ抗原特異的ＣＴＬをクロスプライミングし、抗体産生応答を活性化する危険関連分子パターン（ｄａｎｇｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）（ＤＡＭＰ）である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの数日間のｇｐ９６ＳＩＶ分泌により、ＳＩＶ特異的ＣＴＬ増殖および抗体産生に対する強力なシグナルが生成し、その両方がＳＩＶ獲得の防御に必要であった。ワクチン接種は、６回の粘膜ＳＩＶチャレンジによる感染から、１２匹のマカクのうちの３匹を防御し、ワクチン組合せで免疫されたすべてのマカクへの感染を顕著に遅延させた。７回のチャレンジ後、ハザード比は、ウイルス獲得リスクの７３％低下に相当する０．２７であった。癌患者にも治療ワクチンとして使用される、細胞ベースの分泌ｇｐ９６ワクチンには、医療に重要な役割を果たす見込みが大いにある。
【００２３】
好ましい実施形態では、分子の組合せ組成物は、ＣＤ８  ＣＴＬ生成のためのアジュバントおよび抗原担体として、かつｇｐｌ２０特異的抗体産生（Ｔｈ１抗体）のためのアジュバントとして、細胞分泌ｇｐ９６−Ｉｇを含む。一実施形態では、数日間にわたりｇｐ９６−Ｉｇを分泌するワクチンとして生細胞を利用する。
【００２４】
好ましい一実施形態では、組成物は、アジュバントとしてｇｐ９６−Ｉｇを使用する、細胞をベースとした、例えば、単離細胞−ｇｐ９６−Ｉｇ−ＨＩＶ−（またはＳＩＶ）−ｇａｇ、ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、組換えｇｐ１２０−タンパク質を含むｇｐ１６０ワクチン接種物の組合せである。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、単離細胞は、免疫応答を生成するために、少なくとも１つのアジュバントおよび抗原担体（例えば、ｇｐ９６−Ｉｇ）ならびに抗原を含む組合せ分子をコードするベクターまたはポリヌクレオチドを含む。抗原は、ＨＩＶもしくはＳＩＶ抗原、その変異体、変種、または断片などのレトロウイルス抗原を含む。好ましくは、細胞は、一定期間にわたりｇｐ９６−Ｉｇを分泌するような生細胞である。細胞は、複製を防止するために照射することができる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致した自己由来細胞株またはそれらの組合せである。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、アジュバントおよび抗原担体は、これらの目的に役立ち得る任意の分子であってよい。例えば、ｇｐ９６は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子による提示に向けてペプチドの中間担体として抗原プロセシングに関与する、小胞体の９６−ｋＤａ糖タンパク質である。この機能は、ｇｐ９６が、細胞の抗原性を示し、かつすべてのＭＨＣクラスＩ分子に送達され得る、数多くの種々のペプチドを運搬することを意味する。したがって、ｇｐ９６は、ＨＩＶ抗原、（例えばｇｐ１６０、ｇｐｌ２０の組合せ）を「運搬し」、ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成させる。レトロウイルス抗原は、組換え体であっても、天然であっても、それらの組合せであってもよい。レトロウイルス抗原の例は、例えばｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｔａｎｅｆ等のＨＩＶ、ＳＩＶ抗原を含む。抗原は、任意のＨＩＶまたはＳＩＶの変種に由来してもよい。
【００２７】
好ましい実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ウイルス抗原特異的免疫応答を生成させるための組成物は、熱ショックタンパク質および免疫グロブリンであるか、または熱ショックタンパク質および免疫グロブリンをコードする核酸である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を含む。
【００２８】
好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質またはその核酸は、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含む。好ましくは、熱ショックタンパク質またはその核酸は、ｇｐ９６である。
【００２９】
他の実施形態では、免疫グロブリンまたはその核酸は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはそれらの断片を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンの断片は、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらの組合せを含む。
【００３０】
他の実施形態では、熱ショックタンパク質および免疫グロブリンは、共有結合または非共有結合を介して結合しているか、融合しているか、または連結している。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、組成物は、レトロウイルス分子を含む少なくとも１つのウイルス分子を含む。好ましくは、レトロウイルスは、ヒトまたはサルの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ）である。好ましい実施形態では、レトロウイルス分子は、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含む。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、組成物は、ワクチン分子と結合しておらず、かつレトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を含む。本明細書で使用される場合、「ワクチン分子に結合していない」は、別々にまたは免疫原をコードする別の第２のベクターの形態で投与され得る、任意の他の免疫原を含むことが意図される。この場合、この第２ベクターは、組成物をコードする第１ベクターと同じ細胞内に含むことができるか、または別の細胞にトランスフェクトすることができる。加えて、免疫原はまた、任意のタイプの分子、例えば組換えｇｐ１２０ペプチドとして投与することができる。一実施形態では、第２のウイルス免疫原は、糖タンパク質またはその核酸である。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、単離細胞は、熱ショックタンパク質および免疫グロブリンであるか、または熱ショックタンパク質および免疫グロブリンをコードする核酸である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を発現するベクターを含む。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質は宿主細胞から分泌されるように改変される。一実施形態では、細胞はヒトまたは霊長類の細胞である。好ましくは、ウイルス分子は、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含むレトロウイルス分子である。
【００３４】
一部の実施形態では、単離細胞は、レトロウイルス免疫原である第２のウイルス分子を発現するベクターを含む。例としては、限定するものではないが、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せが挙げられる。好ましい実施形態、熱ショックタンパク質またはその核酸は、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含む。好ましくは、熱ショックタンパク質またはその核酸は、ｇｐ９６である。実施形態では、ｇｐ９６は、熱ショックタンパク質−免疫グロブリンが分泌されるように、機能的な小胞体保持配列を欠く。一部の実施形態では、細胞は照射される。
【００３５】
他の実施形態では、単離細胞は患者の自己由来細胞である。他の実施形態では、細胞は、同系、異種、同種異系である。
【００３６】
別の実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）を含むアジュバントと、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含む１つまたは複数のレトロウイルス分子とを発現する複数の細胞を含む。好ましくは、細胞はアジュバントを分泌する。別の実施形態では、ワクチンは、糖タンパク質、外被抗原、カプシド抗原、核抗原、またはそれらの組合せを含むレトロウイルス免疫原をさらに含む。好ましくは、レトロウイルス免疫原、例えば組換えｇｐ１２０を含む第２の免疫原も投与される。
【００３７】
他の実施形態では、ウイルスに対する抗原特異的免疫応答を被験体に誘導する方法であって、この方法は、熱ショックタンパク質および免疫グロブリンである、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有する分泌可能ワクチン分子を発現する宿主細胞を含むアジュバント組成物を被験体に投与すること、ならびにウイルスに対する抗原特異的免疫応答を被験体に誘導するウイルス免疫原を投与することを含む。好ましくは、熱ショックタンパク質は、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８）、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ９０、それらの変異体、断片、変種、または置換分子を含む。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質は、機能的な小胞体保持配列を欠くｇｐ９６である。好ましい実施形態では、第２ドメインのウイルス分子は、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含むレトロウイルス分子である。
【００３８】
好ましい実施形態では、組成物の投与は、被験体の末梢血および被験体の粘膜において抗原に特異的なＴ細胞の増殖をもたらす。他の好ましい実施形態では、Ｂ細胞もまた増殖して、抗原特異的抗体を産生する。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、被験体のレトロウイルス感染を予防または治療する方法は、熱ショックタンパク質および免疫グロブリン（ｈｓｐ−Ｉｇ）である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を発現する宿主細胞を含む、本明細書で具体化された組成物の治療有効量を投与することを含む。好ましい実施形態では、ウイルス免疫原が被験体に投与される。ウイルス免疫原の投与は、ｈｓｐ−Ｉｇと同時に、ｈｓｐ−Ｉｇの前または後に行うことができる。他の実施形態では、免疫原は、一定期間にわたって複数回投与される。ｈｓｐ−Ｉｇは、一定期間にわたって組成物を分泌する細胞組成物として投与することができる。
【００４０】
さらなる実施形態では、免疫原は感染症と関連するものであってよく、そのため、細菌、ウイルス、原生動物、マイコプラズマ、菌類、酵母、寄生生物、またはプリオンであってもよい。例えば、限定されるものではないが、免疫原は、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスまたは帯状ヘルペスなどのヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１または２などのレトロウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、肺炎マイコプラズマ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌、アメーバ、マラリア原虫、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）等であってもよい。好ましくは、免疫原はレトロウイルス抗原である。
【００４１】
好ましい一実施形態では、免疫グロブリン（Ｉｇ）またはその断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＤを含む。
【００４２】
一実施形態では、ウイルス感染に罹患した患者を治療する方法は、有効量の熱ショックタンパク質−免疫グロブリン組成物、例えばｇｐ９６−Ｉｇと、ウイルス抗原エピトープ、例えばＨＩＶ抗原性エピトープを含む免疫原とを患者に投与することを含む。他の好ましい実施形態では、自己由来細胞は、本明細書の組成物とｅｘ  ｖｉｖｏで培養され、患者に再注入される。所望の抗原が培養物に投入され、いったん所望量の抗原特異的Ｔ細胞が生成すれば、細胞は患者に再注入される。
【００４３】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの熱ショックタンパク質、１つまたは複数の病原体または疾患に由来する少なくとも１つの免疫原、断片、変種、派生体、変異体、またはそれらの組合せを有するワクチンの治療有効量を、その必要性のある患者に投与することを含む、粘膜性かつ全身性免疫と全身性免疫との両方を誘導する方法。
【００４４】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原特異的粘膜性かつ全身性免疫と全身性免疫とをｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する方法は、例えばｇｐ９６などの熱ショックタンパク質、またはその断片を含む抗原の治療有効量を、その必要性のある患者に投与することを含む。好ましくは、ｇｐ９６は分泌される（ｇｐ９６−Ｉｇ）。熱ショックタンパク質は、ｇｐ９６に限定されないだけでなく、他のすべての熱ショックタンパク質に及ぶ。熱ショックタンパク質は、存在する中で最も高度に保存されたタンパク質の１つである。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｈｓｐ７０であるＤｎａＫは、擦過傷（ｅｘｃｏｒｉａｔｅｓ）由来のｈｓｐ７０タンパク質と約５０％のアミノ酸配列同一性がある（Ｂａｒｄｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８４８−８５２）。ｈｓｐ６０およびｈｓｐ９０のファミリーも同様に、高レベルのファミリー内保存性を示す（Ｈｉｃｋｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２６１５−２６２６；Ｊｉｎｄａｌ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２２７９−２２８３）。加えて、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、およびｈｓｐ９０のファミリーは、例えば、３５％超のアミノ酸同一性を有するが、発現レベルがストレスによって変化しない、ストレスタンパク質と配列が関連するタンパク質から構成される。したがって、熱ショックタンパク質またはストレスタンパク質の定義は、本明細書で使用される場合、細胞での発現レベルがストレス性刺激に応じて増強される３ファミリーのメンバーと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、そして最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、その突然変異タンパク質、アナログ、および変種を包含すると意図される。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、その必要性のある患者へのｇｐ９６−Ｉｇ組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞免疫応答の誘導を含む、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原特異的粘膜性かつ全身性免疫応答を誘導する。好ましくは、抗原特異的Ｔ細胞応答は、ＣＤ８、ＣＤ４  Ｔ細胞、自然樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、多特異性である。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原は、ｇｐ９６−Ｉｇ、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇａｇ、ｇｐ１６０、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せをコードするプラスミドを有する単離細胞を含む。ｒｅｔａｎｅｆは、好ましくは、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せの少なくとも１つを含む。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、単離細胞は、ｇｐ９６、ｒｅｔａｎｅｆ、ｇａｇ、ｇｐｌ６０、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せを含む、少なくとも１つの分子の内因型、膜結合型、分泌型、またはそれらの組合せを発現する。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、単離細胞は、自己由来、同系、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）の細胞、細胞株、またはそれらの組合せを含む。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、ＨＩＶに感染するリスクのある患者においてＨＩＶを予防するまたはＨＩＶに感染した患者を治療する方法は、抗原特異的Ｂ細胞およびＴ細胞免疫応答を含むＨＩＶ／ＳＩＶ抗原特異的粘膜性かつ全身性免疫を誘導する、ｇｐ９６を含む抗原の治療有効量を、その必要性のある患者に投与することを含む。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原は、中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ；ＣＤ９５＋ＣＤ２８＋）、エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭＪ；ＣＤ９５＋ＣＤ２８＋）、またはナイーブＴ細胞（ＣＤ９５ｌｏｗＣＤ２８ｉｍｔ）を含む免疫細胞を誘導する。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、ｇｐ９６−Ｉｇ、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇａｇ、ｇｐ１６０、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せを含む、少なくとも１つの分子をコードする単離核酸。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、ｇｐ９６−Ｉｇ、免疫原（例えば、腫瘍抗原、感染性生物の関連抗原等）、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せを含む、少なくとも１つの分子をコードする単離核酸。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、発現ベクターはバイシストロニックベクターである。一態様では、ベクターはＳＶ４０プロモーターを含むが、組織特異的プロモーターを含めた、種々の細胞タイプで機能的な任意のタイプのプロモーターを使用することができる。本発明を実行するために有用なプロモーターの例としては、これらに限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなど）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ即時早期プロモーターなど）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に由来するプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。
【００５４】
好ましい一実施形態では、コードされた分子は、内因型、膜結合型、分泌型、またはそれらの組合せである。好ましくは、分子は分泌される。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、ｇｐ９６−Ｉｇ、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇａｇ、ｇｐ１６０、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せの少なくとも１つを含む融合タンパク質。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、ｇｐ９６−Ｉｇ、免疫原、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せの少なくとも１つを含む融合タンパク質。好ましくは、ｇｐ９６は、免疫原に融合または連結されており、この分子は分泌される。この分子は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞の発現ベクターによりコードすることができる。細胞は患者から入手することができ、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養される；細胞は発現ベクターと接触させられる；次いで、分子を産生する細胞は、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．等の任意の方式で患者に再注入される。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、ｇｐ９６−Ｉｇ、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇａｇ、ｇｐ１６０、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せの少なくとも１つまたは複数をコードする核酸分子を含む単離細胞。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的免疫応答を誘導する方法であって、治療有効量のＨＩＶ／ＳＩＶ特異的分子（例えば、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇａｇ、ｇｐ１６０、それらの断片、変種、変異体、派生体、または組合せ）およびｇｐ９６−Ｉｇを含むアジュバントまたは抗原担体を、その必要性のある患者に投与することを含む方法。好ましくは、ｇｐ９６を含む免疫原は、抗原特異的ＴおよびＢ細胞免疫応答を含む、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原特異的粘膜性かつ全身性免疫を誘導する。抗原特異的Ｔ細胞応答は、好ましくは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、多特異性であり、Ｔ細胞はＩＦＮγおよびＩＬ−２を共発現し、産生する。別の実施形態では、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原特異的粘膜性かつ全身性免疫は、自然樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ＣＤ１０３＋細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞、および／または記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに含む。好ましくは、記憶細胞は、中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ；ＣＤ９５＋ＣＤ２８＋）、エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ；ＣＤ９５＋ＣＤ２８−）、またはナイーブＴ細胞（ＣＤ９５ｌｏｗＣＤ２８＋）を含む。
【００５９】
上記に論述されたように、熱ショックタンパク質は、任意のファミリーのｈｓｐに由来するものでよく、免疫原は目的の疾患から選択される。本明細書の例示的な例では、ＨＩＶのｒｅｔａｎｅｆ、ｇａｇが記載された。ｈｓｐを含む組成物は、抗原性分子または免疫原に融合、連結、共有または非共有結合することができ、この分子に対する効果的な特異的免疫応答を誘発するように投与される。本明細書に記載の方法に従って、ｈｓｐ−抗原性分子複合体は、好ましくは、全ｍｇタンパク質の６０〜１００パーセントの範囲に、または全ｍｇタンパク質の少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％に精製される。別の実施形態では、ｈｓｐ−抗原性分子複合体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるアッセイで、見かけ上均一になるまで精製される。
【００６０】
好ましい実施形態では、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、およびｇｐ９６とペプチドの複合体は、例えば、癌患者から得られる腫瘍細胞から、または例えばＨＩＶ感染などの感染患者に由来する細胞から、手術後調製および精製される。
【００６１】
本明細書に記載の方法に従って、ｈｓｐまたはＭＨＣ抗原と内因的に複合体を形成する免疫原性または抗原性ペプチドは、抗原性分子として使用することができる。例えば、種々の腫瘍抗原（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、メラン−Ａ、ｇｐ７５、ムチン等）およびこれらに限定されないが、Ｉ型免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、およびポリオウイルスのタンパク質を含むウイルスタンパク質に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激する、このようなペプチドを調製することができる。抗原性分子がｉｎ  ｖｉｖｏでｈｓｐに連結されたペプチドである実施形態では、その複合体は細胞から単離することができるか、または代替的に、ｈｓｐおよび抗原性分子のそれぞれの精製した調製物からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成させることができる。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、粘膜性かつ全身性免疫応答は、１つまたは複数の免疫原に連結されたｈｓｐを含む組成物の投与により調節される。分子は好ましくは分泌型分子であり、発現ベクターとして単独で、または所望の分子をコードするベクターを含む細胞の形態で投与することができる。例えば、免疫原は、免疫原性または抗原性ペプチドに由来する１つまたは複数の抗原を含む。例えば、種々の腫瘍抗原（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、メラン−Ａ、ｇｐ７５、ムチン等）、ならびにこれらに限定されないが、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２などのヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタンウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）、出血熱ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、デルタ肝炎の未分類病原体、非Ａ型非Ｂ型肝炎の病原体；以下のような感染性細菌：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジュネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（ＢＣＧ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔｈａｒｒａｌｉｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バチルス・アントラシア（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉａ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ク���ストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、およびトレポネーマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）；以下のような伝染性真菌：クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；以下のような感染性原生生物、例えば：熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、およびトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；ならびに例えばヒストプラスマ症、カンジダ症、クリプトコッカス症、分芽菌症、およびコクシジオイデス症の原因となるものなどの感染性真菌；ならびにカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種（すなわち、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．クルゼイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、またはＣ．ルシタニア（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｗ）；トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｕｓ）種（すなわち、Ｔ．グラブラタ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ））；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（すなわち、Ａ．フミガルス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｌｕｓ））（ヒストプラスマ種（すなわち、Ｈ．カプスラタム（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））；クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（すなわち、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））；ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）種（すなわち、Ｂ．デルマチリディス（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｌｉｄｉｓ））；フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種；トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、シュードアレシェリア・ボイディイ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉ）、コクシジオイデス・イミッツ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｓ）、およびスポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）；ならびにヒト腫瘍細胞の抗原を含むウイルスタンパク質および／または他の病原体に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する、このようなペプチドを調製することができる。抗原性分子がｉｎ  ｖｉｖｏでｈｓｐと非共有結合的に複合体を形成するペプチドである実施形態では、その複合体は細胞から単離することができるか、または代替的に、ｈｓｐおよび抗原性分子のそれ��れの精製した調製物からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成させることができる。
【００６３】
抗原またはその抗原性部分は、当技術分野で公知のものの中から、あるいは抗体もしくはＭＨＣ分子に結合（抗原性）または上記に記載のような免疫応答（免疫原性）を生成することができることがイムノアッセイにより判定されたものの中から、ｈｓｐとの結合のための抗原性分子として使用するために選択することができる。好ましい実施形態では、ワクチンは粘膜性かつ全身性免疫応答と全身性免疫応答とを刺激する。これは、例えば、侵入点が通常粘膜を介するＨＩＶのような場合に、特に重要である。粘膜性かつ全身性免疫応答の調節は、免疫系がその疾患に関連している場合にも重要である。例としては、大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、関節炎、自己免疫疾患または障害、アレルギー、アレルギー反応、喘息、肺炎症等が挙げられる。
【００６４】
他の実施形態では、免疫原または抗原は腫瘍抗原であってもよい。
【００６５】
涙腺、唾液腺、胃腸管、気道、および尿生殖路、ならびに授乳乳腺に関連したリンパ組織からなる粘膜性かつ全身性免疫系は、体内リンパ組織の大半を量的に占める。胃腸の粘膜性かつ全身性免疫系にはいくつかの重要な特徴がある：粘膜性かつ全身性免疫系は、免疫応答が惹起されると考えられている、パイエル板などの特殊化した構造物を含有する；粘膜性かつ全身性ホーミングとして知られている、粘膜へのリンパ球系細胞の比較的特異的な再循環パターンがある；リンパ球系細胞のサブセット、具体的にはＩｇＡ  Ｂ細胞および記憶Ｔ細胞が、粘膜性かつ全身性表面で優勢である；そして、優勢な粘膜性かつ全身性免疫グロブリンである分泌型ＩｇＡは、特に、粘膜性かつ全身性表面で宿主防御によく適合する。胃腸の粘膜性かつ全身性免疫系のこれらの要素は、一方では有害な病原体から宿主を防御するが、他方では遍在する食餌性抗原および正常微生物叢に寛容である免疫応答を生成するために一緒に機能する。
【００６６】
製剤
本発明は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ベクター、ｇｐ９６−Ｉｇの核酸またはポリペプチドを含む細胞、スプライスバリアント等を含むｇｐ９６−Ｉｇ分子の送達を意図する。ポリペプチドおよびペプチドの送達は、当技術分野で周知の標準ワクチン接種プロトコールに従って達成することができる。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、ベクターは、例えば、ｇａｇ、ｒｅｔａｎｅｆ、ｇｐ１６０−ｇｐ９６−Ｉｇポリヌクレオチド、それらの天然スプライスバリアント、欠失体、変種、変異体、または活性断片などのｈｓｐ−免疫原を含む。
【００６８】
いくつかのベクターは、当技術分野で知られているように、また本明細書に記載されているように、哺乳動物細胞への遺伝子産物の移入を媒介できることが知られている。「ベクター」（時として遺伝子送達または遺伝子移入「ビヒクル」と呼ばれる）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達される、ポリヌクレオチドを含む高分子または分子複合体を指す。送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコード配列を含むことができる。ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス（「Ａｄ」）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ならびにレトロウイルスなど）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびに宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することができる他の巨大分子複合体が挙げられる。ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する、またはそうでなければ標的細胞に有益な特性を付与する他の成分または機能性を含むことができる。以下により詳細に記載および説明されるように、他のそのような成分としては、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響を及ぼす成分（細胞型または組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後のポリヌクレオチドの細胞内局在化に影響を及ぼす成分（核局在化を媒介する薬剤など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分が挙げられる。そのような成分はまた、ベクターにより送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出または選択するために使用することができる検出可能および／または選択可能マーカーなど、マーカーを含むことができる。そのような成分は、ベクターの天然の特徴として提供することができる（結合および取り込みを媒介する成分または機能性を有する特定のウイルスベクターの使用など）。またはベクターをそのような機能性を備えるように改変することができる。他のベクターとしては、Ｃｈｅｎら；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７−１７１（２００３）により記載されたものが挙げられる。多種多様なそのようなベクターが当技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【００６９】
「組換えウイルスベクター」は、１つまたは複数の異種遺伝子の産物または配列を含むウイルスベクターを指す。多くのウイルスベクターがパッケージングと関係したサイズの制約を示すので、異種遺伝子の産物または配列は、典型的には、ウイルスゲノムの１つまたは複数の部分と置換することで導入される。そのようなウイルスは、複製欠損になることがあり、ウイルス複製およびキャプシド形成中に欠失機能がトランスで提供される必要がある（例えば、複製および／またはキャプシド形成に必要な遺伝子産物を運搬するヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を使用することにより）。送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側で運搬される改変ウイルスベクターも記載されている（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８８：８８５０−８８５４，１９９１を参照のこと）。
【００７０】
適切な核酸送達系には、ウイルスベクター、典型的にはアデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも１つからの配列が含まれる。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに機能的に連結された強力な真核生物プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。
【００７１】
加えて、好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルスを含む。１つの好ましいＨＩＶベースのウイルスベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルスに由来する少なくとも２つのベクターを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．：９０  ７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８７：１１４９（１９９０）］，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ［ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）］およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）］。
【００７２】
ポックスウイルスベクターは、細胞質の中に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、一部の発明実施形態に適用することができる。アデノウイルスベクターは、一部の実施形態においてはるかに長期間の発現を示し得るアデノ随伴ウイルスよりも短期間の発現（例えば、約１か月未満）をもたらす。選ばれる特定のベクターは、標的細胞および治療される症状に依存することになる。適切なプロモーターの選択は、容易に達成することができる。好ましくは、高発現プロモーターが使用されるであろう。適切なプロモーターの一例は、７６３塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：４：１５１（１９９３））およびＭＭＴプロモーターも使用することができる。特定のタンパク質は、その天然プロモーターを使用して発現させることができる。エンハンサー、またはｔａｔ遺伝子およびｔａｒ要素などの高レベル発現をもたらす系など、発現を増強することができる他の要素も含めることができる。次いで、このカセットは、ベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、または他の公知のプラスミドベクターなど、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点を含むプラスミドベクターに挿入することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，（１９８９）を参照のこと。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが治療されている生物の代謝に悪影響を及ぼさない場合には、アンピシリン抵抗性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択可能マーカーを含むことができる。カセットはまた、国際公開第９５／２２６１８号パンフレットに開示された系など、合成送達系において核酸結合成分に結合させることができる。
【００７３】
所望により、本発明のポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなどの微小送達ビヒクルと共に使用することができる。リポソーム調製の手順、内容物のターゲティングおよび送達に関するレビューについては、Ｍａｎｎｉｎｏ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照されたい。Ｆｅｉｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２１（１９８９）およびＭａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２５（１９８９）も参照されたい。
【００７４】
複製欠損の組換えアデノウイルスベクターは、公知の手法に従って作製することができる。Ｑｕａｎｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０（１９９２）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５（１９９２）を参照されたい。
【００７５】
別の送達方法は、ｇｐ９６−Ｉｇを細胞内で生成することができる一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを使用することである。例えば、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７−１７１（２００３）を参照されたい。
【００７６】
ｈｓｐ−免疫原分子の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー要素により制御することができるが、これらの調節要素は、発現用に選択された宿主で機能的でなければならない。ｇｐ９６−Ｉｇ遺伝子発現を制御するために使用することができるプロモーターとしては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書および同第５，１６８，０６２号明細書）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２，１９８２）；β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１，１９７８）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５，１９８３）などの原核生物の発現ベクター；また“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０も参照のこと；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなど、酵母または他の真菌類に由来するプロモーター要素；および組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている動物の転写制御領域：膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９，１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２，１９８５）、リンパ球系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８，１９８４；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８，１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４，１９８７）、睾丸、乳房、リンパ、および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５，１９８６）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６，１９８７）、肝臓で活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８，１９８７）、肝臓で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１，１９８７）、骨髄性細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４，１９８６）、脳の希突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２，１９８７）、骨格筋で活性なミオシンＬ鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６，１９８５）、および視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８，１９８６）が挙げられる。
【００７７】
多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを本発明のＤＮＡ配列の発現に使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成のＤＮＡ配列セグメントからなってもよい。適切なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌性プラスミド、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９、およびそれらの派生体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージｌの数多くの派生体、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ）；２．ｍｕ．プラスミドまたはその派生体などの酵母プラスミド、昆虫または哺乳動物細胞に有用なベクターなど、真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するために改変されたプラスミドなど、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター；ならびに同種のものが挙げられる。
【００７８】
酵母発現系もまた、ＴＮＦＲ２５を発現するために本発明に従って使用することができる。例えば、２例のみを挙げると、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、Ｋｐｎｌ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、本発明に従って使用することができる。酵母ツーハイブリッド発現系を本発明に従って調製することができる。
【００７９】
好ましい送達システムの１つは、その中に１つまたは複数のポリヌクレオチド、好ましくは１つのポリヌクレオチドを組み込む組換えウイルスベクターである。好ましくは、本発明の方法で使用されるウイルスベクターは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕのｐｆｕ（プラーク形成単位）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターで投与されることになる実施形態では、約０．１ナノグラム〜約４０００マイクログラムの間の使用、例えば、約１ナノグラム〜約１００マイクログラムの間の使用が有用となることが多いであろう。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、免疫処置経路を介して患者に投与される。例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内等。好ましくは、免疫処置は、粘膜性かつ全身性免疫応答、全身性免疫応答を誘導する。
【００８１】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの場合、例えばｇｐ９６−Ｉｇをコードする核酸の送達は、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法により、すなわち、被験体から細胞を取り出すこと、その核酸を含むように細胞を遺伝子操作すること、および操作された細胞を被験体に再導入することにより達成することができる。そのような手順の一例が米国特許第５，３９９，３４６号明細書に概説されている。一般に、それには、被験体の細胞の中に遺伝子の機能的コピーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入すること、および遺伝子操作された細胞を被験体に戻すことが含まれる。遺伝子の機能的コピーは、遺伝子操作された細胞での遺伝子発現を可能にする調節要素の操作制御下にある。数多くのトランスフェクションおよび形質導入手法ならびに適切な発現ベクターが当業者には周知であり、その一部は、ＰＣＴ出願国際公開第９５／００６５４号パンフレットに記載されている。ウイルスおよび標的リポソームなどのベクターを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ核酸送達もまた、本発明に従って考慮される。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、単離細胞はｈｓｐ−免疫原、例えばｇｐ９６−Ｉｇ分子を発現する。細胞は、自己由来、同系、異種等の幹細胞、免疫細胞、粘膜性かつ全身性細胞などであってよい。
【００８３】
別の実施形態では、ワクチンを自己由来細胞に接種し、細胞を増殖させ、次いで患者に細胞を再注入することができる。
【００８４】
組成物は、ベクター中のポリヌクレオチド、リポソーム、核酸ペプチド等として、医薬組成物で投与することができる。
【００８５】
別の好ましい実施形態では、組成物は、１つもしくは複数のまたはさらなる薬理学的に活性な薬剤と共に投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「薬理学的に活性な薬剤」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、原核生物または真核細胞に生理的効果（例えば、治療または予防効果）を有し得る、これらに限定されないが、化学療法剤、抗ウイルス薬、毒素、放射線療法、増感剤、遺伝子治療ベクター、アンチセンス核酸コンストラクト、または低分子干渉ＲＮＡ、イメージング剤、診断薬、細胞内タンパク質と相互作用することが知られている薬剤、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含む、薬物などの任意の薬剤を指す。
【００８６】
さらなる薬理学的に活性な薬剤は、例えば、鎮痛剤、麻酔剤、抗炎症剤、駆虫剤、抗不整脈剤、抗喘息剤、抗生物質（ペニシリンを含む）、抗癌剤（タキソールを含む）、抗凝血剤、抗うつ剤、抗糖尿病薬、抗てんかん剤、抗ヒスタミン剤、鎮咳剤、血圧降下剤、抗ムスカリン剤、抗マイコバクテリア剤、抗腫瘍薬、抗酸化剤、解熱剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗甲状腺薬、抗ウイルス剤、抗不安鎮静剤（催眠剤および神経遮断薬）、収れん剤、静菌剤、ベータ−アドレナリン受容体遮断薬、血液製剤および代替品、気管支拡張剤、緩衝剤、心臓陽性変力薬、化学療法剤、造影剤、コルチコステロイド、鎮咳剤（去痰剤および粘液溶解剤）、診断薬、診断用造影剤、利尿剤、ドーパミン作動薬（抗パーキンソン病薬）、フリーラジカル消去剤、増殖因子、止血剤、免疫薬、脂質調節剤、筋弛緩剤、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチド、副交感神経刺激薬、副甲状腺のカルシトニンおよび二リン酸塩、プロスタグランジン、放射性医薬品、ホルモン、性ホルモン（ステロイドを含む）、除放性結合剤、抗アレルギー剤、刺激薬および食欲減退剤、ステロイド、交感神経刺激薬、甲状腺薬、ワクチン、血管拡張剤、およびキサンチンを含む、種々の公知の薬物類から選択することができる。
【００８７】
さらなる薬理学的に活性な薬剤は、治療剤である必要はない。例えば、薬剤は、それが送達される局所細胞には細胞傷害性であるが、被験体に対して全体として有益な効果を及ぼす可能性がある。さらに、薬剤は、バイオイメージング用の造影剤など、それ自体直接の治療活性を有さない診断薬であってもよい。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、本明細書で具体化された組成物のいずれも、例えばｇｐ１６０−ｇｐ９６−Ｉｇポリヌクレオチドまたはペプチドは、例えば、蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ等）または放射標識などの検出可能マーカーで標識される。
【００８９】
「検出可能成分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用されるような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能成分は、多くの場合、試料中の結合した検出可能成分の量を定量するために使用することができる、放射性、発色性、または蛍光性のシグナルなど、測定可能なシグナルを生成する。シグナルの定量は、例えば、シンチレーション測定、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーにより達成することができる。
【００９０】
組成物の投与
本発明の組成物は、１つまたは複数のさらなる活性成分、医薬組成物、または他のワクチンと併せて投与することができる。本発明の治療剤は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与することができる。
【００９１】
医薬製剤およびワクチンは、経口（固体または液体）、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下の注射）、経皮（受動的またはイオン泳動もしくは電気穿孔を使用するかのいずれか）、経粘膜全身性（鼻、膣、直腸、舌下）、または吸入投与経路による投与、または生体内分解性のインサートを使用する投与に向けたものであってよく、各投与経路に適切な投与剤形に製剤化することができる。
【００９２】
薬剤は、生理食塩水または緩衝食塩水など、医薬として許容される担体または希釈剤中で製剤化することができる。適切な担体および希釈剤は、投与の方法および経路ならびに標準的医療に基づいて選択することができる。代表的な医薬として許容される担体および希釈剤ならびに医薬製剤についての説明は、この分野の標準的教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵＳＰ／ＮＦに見出すことができる。組成物を安定化および／または保存するために、他の物質を組成物に加えることができる。
【００９３】
本発明の組成物は、任意の通常の手法により動物に投与することができる。組成物は、例えば、内部もしくは外部の標的部位への外科的な送達によって、または血管が到達可能な部位へのカテーテルによって、標的部位に直接投与することができる。送達の他の方法、例えば、リポソーム送達または組成物を含浸させたデバイスからの拡散は、当技術分野で公知である。組成物は、単回ボーラス、複数回注射で、または持続注入（例えば、静脈内）により投与することができる。非経口投与のために、組成物は、好ましくは、滅菌されたパイロジェンフリー形態で製剤化される。
【００９４】
一部の実施形態では、組成物またはワクチンは、肺送達により投与される。組成物またはワクチンは、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流に移行する［例えば、Ａｄｊｅｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９０；７：５６５  ５６９；Ａｄｊｅｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １９９０；６３：１３５  １４４（酢酸リュープロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９８９；１３（ｓｕｐ５）：１４３  １４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐｐ．２０６  ２１２（α１アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９；８４：１１４５−１１４６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．”Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，１９９０；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏ．（遺伝子組換え型ヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；１４０：３４８２  ３４８８（インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子α）；およびＰｌａｔｚらの米国特許第５，２８４，６５６号明細書（顆粒球コロニー刺激因子）を参照のこと］。全身性作用を目的とする、薬物の肺送達のための方法および組成物は、Ｗｏｎｇらの米国特許第５，４５１号明細書に記載されている。またＬｉｃａｌｓｉらの米国特許第６，６５１，６５５号明細書も参照されたい。
【００９５】
これらに限定されないが、噴霧器、定量噴霧式吸入器、および粉末吸入器を含む、治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械的デバイスが、本発明の実施で使用するために考慮される。これらのデバイスはすべて当業者に熟知されている。本発明の実施に適した市販のデバイスの具体例の一部は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）である。このようなデバイスではすべて、治療剤の調合に適した製剤の使用が必要である。典型的には、各製剤は使用されるデバイスのタイプに特有であり、治療に有用な通常の希釈剤、補助剤、界面活性剤、および／または担体に加えて、適切な噴霧剤物質の使用を含むことができる。また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接複合体、または他のタイプの担体の使用も考慮される。
【００９６】
定量噴霧式吸入器デバイスで使用するための製剤は、界面活性剤の補助によって噴霧剤中に懸濁された治療剤を含有する微粉を一般に含むであろう。噴霧剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２テトラフルオロエタンを含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、もしくは炭化水素、またはそれらの組合せなど、この目的のために使用される通常の任意の物質であってよい。適切な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタン、および大豆レシチンが含まれる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用であり得る。
【００９７】
粉末吸入器デバイスから投薬するための製剤は、治療剤を含有する、微粉化された乾燥粉末を含み、デバイスからの粉末の分散を促進する量、例えば５０〜９０重量％で、ラクトース、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールなどの増量剤を含むこともできる。治療剤は、最も有利には、末梢肺に最も効果的に送達するために、平均粒径が１０ｍｍ未満（またはミクロン）、最も好ましくは０．５〜５ｍｍである微粒子形態で調製されるべきである。
【００９８】
治療剤の経鼻または他の粘膜性かつ全身性送達も考慮される。経鼻送達により、組成物の鼻への投与後、肺への製剤の沈着を必要とせずに、血流への直接の移行が可能になる。経鼻送達用の製剤には、補助剤としてデキストランまたはシクロデキストランおよびサポニンを含むものが含まれる。
【００９９】
免疫応答を刺激する方法：本発明のワクチンを使用する典型的な免疫処置レジメンでは、製剤は複数回（例えば、１〜４回）投与することができる。用量は、組成物が生成する免疫活性および患者の症状ならびに治療される患者の体重または表面積により決定されることになる。用量範囲はまた、特定の患者への特定の組成物の投与に付随し得る、あらゆる有害な副作用の存在、性質、および程度により決定されることになる。例えば、組成物がワクチンを含む細胞である場合、患者に投与される前に、細胞数が計算され、かつ／または分泌されるｇｐ−Ｉｇの量が計算されることになる。
【０１００】
本発明の組成物は、非粘膜性かつ全身性または粘膜性かつ全身性の経路により投与することができる。これらの投与は、非経口的注射（例えば、静脈内、皮下、および筋肉内）またはバッカル／舌下、直腸、経口、経鼻、局所（経皮および眼）、膣、肺、動脈内、腹腔内、眼内、もしくは鼻腔内の経路など、他の従来の直接経路を介する、または直接特定の組織へのｉｎ  ｖｉｖｏでの投与を含むことができる。あるいは、本発明の組成物は、経口、局所、皮下、粘膜性かつ全身性、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、経皮、皮下、皮内、および坐剤を介してなど、種々の経路のいずれによっても投与することができる。投与は、パッチ、注射針、カテーテル、または関連デバイスを使用する直接投与によって、１回の時点または複数の時点で、簡単に遂行することができる。
【０１０１】
粘膜性かつ全身性表面を介する免疫処置には、免疫処置の他の経路にまさる数多くの潜在的な利点がある。最も明白な利点は、１）粘膜性かつ全身性免疫処置が、投与のために注射針または高度に訓練された人員を必要とせず、２）免疫応答が、病原体侵入の部位で、かつ全身性に上昇することである。
【０１０２】
持続放出系：第１の持続放出系には、水性環境（すなわち、消化管の管腔液）への薬剤の放出を遅延させる役目をする、別の材料のマトリックス中に、薬剤が埋め込まれているかまたは分散しているマトリックス系が含まれる。この種のマトリックス中に薬剤が分散する場合、薬物の放出は主にマトリックスの表面から起こる。したがって、薬物は、マトリックスを組み込んだデバイスの表面から、薬物がマトリックス全体に拡散した後またはデバイスの表面が浸食され、薬物が曝露されたときに放出される。一部の実施形態では、両方の機序を同時に作動させることができる。マトリックス系は大きくても、例えば錠剤サイズ（約１ｃｍ）でもよく、または小さくても（＜０．３ｃｍ）よい。この系は、単一（例えば、ボーラス）であっても、実質的に同時に投与される、いくつかのサブ単位（例えば、単回用量を構成するいくつかのカプセル剤）から構成されて分割されていても、または多重粒子とも表示される複数の粒子を含んでもよい。多重粒子には数多くの製剤用途があり得る。例えば、多重粒子は、カプセルシェルを充填するための粉末として使用すること、またはそれ自体、摂取を容易にするために食物と混合して使用することができる。
【０１０３】
特定の実施形態では、マトリックス多重粒子は、複数の薬剤含有粒子を含み、各粒子は、例えば、水性媒体中への薬剤の溶出速度を制御することができるマトリックスを形成するために選択された１つまたは複数の賦形剤と共に固溶体／分散剤の形態で、薬剤および／またはそのアナログを含む。この実施形態に有用なマトリックス材料は、一般に、ワックス、一部のセルロース誘導体、または他の疎水性ポリマーなどの疎水性材料である。必要に応じて、マトリックス材料は、結合剤または促進剤として使用することができる疎水性材料と共に、任意選択で製剤化してもよい。これらの投与剤形の製造に有用なマトリックス材料は、エチルセルロース、パラフィン、加工植物油、カルナウバロウ、硬化ヒマシ油、密蝋等のワックス、およびポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、酢酸ビニルとエチレンのコポリマー、ポリスチレン等の合成ポリマーなどである。任意選択でマトリックス中に製剤化することができる水溶性または親水性の結合剤または放出改変剤には、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、キサンタンガム、カラゲナンなどの親水性ポリマー、および他のそのような天然および合成材料が含まれる。加えて、放出改変剤として機能する材料には、糖類または塩類などの水溶性材料が含まれる。好ましい水溶性材料には、ラクトース、ショ糖、グルコース、およびマンニトール、ならびに例えばＨＰＣ、ＨＰＭＣ、およびＰＶＰのような親水性ポリマーが含まれる。
【０１０４】
特定の実施形態では、多重粒子製剤は、制御された凝集により処理されたものとして定義される。この場合、薬剤は、適切な溶解可能担体に溶解または部分的に溶解され、マトリックス物質を含む担体粒子上に噴霧される。
【０１０５】
用量：本開示対象の組成物の有効用量が、その必要性のある被験体に投与される。「治療有効量」または「治療量」は、測定可能な応答（例えば、治療されている被験体における生物学的または臨床的に関連する応答）をもたらすのに十分な治療用組成物の量である。この応答は、上記に論述されたように、例えば、サイトカインプロファイル、細胞型、細胞表面分子等の多くの方法で測定することができる。本開示対象の組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の被験体に対して所望の治療効果を達成するために効果的である活性化合物の量を投与するように変えることができる。選択される投与量レベルは、治療用組成物の活性、投与経路、他の薬物または治療との併用、治療されている症状の重症度、および治療されている被験体の症状および以前の病歴に依存することになる。しかしながら、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルより低レベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させることは、当分野の技術範囲内である。組成物の効力は変動することがあり、したがって、「治療有効量」も変動することがある。しかしながら、本明細書に記載されたアッセイ法を使用して、当業者は、本開示対象の候補化合物の効力および有効性を容易に評価し、それに応じて治療レジメンを調整することができる。
【０１０６】
上記の組成物は、任意の適切な製剤でヒトを含む動物に投与することができる。例えば、生細胞を含む組成物は、生理食塩水または緩衝食塩水など、医薬として許容される担体または希釈剤中で製剤化することができる。適切な担体および希釈剤は、投与の方法および経路ならびに標準的医療に基づいて選択することができる。代表的な医薬として許容される担体および希釈剤ならびに医薬製剤についての説明は、この分野の標準的教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵＳＰ／ＮＦに見出すことができる。組成物を安定化および／または保存するために、他の物質を組成物に加えることができる。
【０１０７】
本発明の組成物は、任意の通常の手法により動物に投与することができる。組成物は、例えば、内部もしくは外部の標的部位への外科的な送達によって、または血管が到達可能な部位へのカテーテルによって、標的部位に直接投与することができる。送達の他の方法、例えば、リポソーム送達または組成物を含浸させたデバイスからの拡散は、当技術分野で公知である。組成物は、単回ボーラス、複数回注射で、または持続注入（例えば、静脈内）により投与することができる。非経口投与のために、組成物は、好ましくは、滅菌されたパイロジェンフリー形態で製剤化される。
【０１０８】
本発明を、その好ましい実施形態に関連して詳細に記載してきた。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲の中で、変更および改良をなすことができる。以下の非限定例は、本発明の例示である。
【０１０９】
本明細書に記載の文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。本出願に引用のすべての刊行物および特許文献は、あたかも個々の刊行物または特許文献がそれぞれ、まさに個々に表示されているかのように、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。本文書中への種々の参考文献の引用によって、出願人は、いかなる特定の参考文献も出願人の発明に対する「従来技術」であるとは認めない。
【実施例】
【０１１０】
以下の非限定実施例は、本発明の選択された実施形態を例示するために役立つ。示された成分要素における寸法の変動および代替物は、当業者には明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることが認識されよう。
【０１１１】
実施例１：組合せワクチン
直腸のＳＩＶｍａｃ２５１チャレンジからマカクを防御するために、アジュバントとしてｇｐ９６−Ｉｇを使用する、細胞ベースの２９３−ｇｐ９６−Ｉｇ−ＳＩＶ−ｇａｇ、ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇｐ１６０ワクチン接種と組換えｇｐ１２０タンパク質との組合せを使用して得られた結果を、以下（表１）に示す。
【０１１２】
ワクチン：照射された２９３−ＳＩＶｇａｇ、ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ−Ｔａｔ−Ｎｅｆ）、ｇｐｌ６０−ｇｐ９６−Ｉｇ生細胞
【０１１３】
用量：２４時間でｇｐ９６−Ｉｇを１０μｇ分泌する細胞数
【０１１４】
ワクチン接種スケジュール：０、６、２６週目
【０１１５】
ワクチン接種経路：腹腔内
【０１１６】
表示のように、１２匹マカクを３群、各群に１〜２匹の雌、各群に２〜３匹のＭａｍｕＡｌ、Ｔｒｉｍ５ａ
【０１１７】
２９３−ＳＩＶｇａｇ、ｒｅｔａｎｅｆ  ｇｐ１６０−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞をワクチン接種した群１
【０１１８】
同じ注射針により２９３−ＳＩＶｇａｇ、ｒｅｔａｎｅｆ：ｇｐｌ６０−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞＋１００μｇ組換えｇｐ１２０タンパク質を、トランスでアジュバントとしてｇｐ９６−Ｉｇをワクチン接種した群２
【０１１９】
２９３−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞（ＳＩＶ抗原ない）を模擬ワクチン接種した群３
【０１２０】
チャレンジ：最終ワクチン接種後６週目。
【０１２１】
経路：直腸点滴注入
【０１２２】
ウイルス：ＳＩＶｍａｃ２５１（スウォーム（ｓｗａｒｍ）ウイルス）
【０１２３】
用量：１２０  ＴＣＩＤ
【０１２４】
スケジュール：週一回直腸チャレンジ×５、または血漿中にウイルス力価が検出されるまで。データによれば、模擬ワクチン接種したマカクの１２匹の対照のうちの６匹が、１回の直腸チャレンジ後、感染したことがわかる。ｇｐ９６−Ｉｇ−ＳＩＶ単独をワクチン接種した１２匹のマカクのうち１匹のみ、またｇｐ９６−Ｉｇ−ＳＩＶ＋ｇｐ１２０タンパク質の組合せをワクチン接種した１２匹のマカクのうち０匹が感染した。組合せワクチン接種が、ＳＩＶ感染に対して最も良好な防御を提供するように見える。
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【０１２５】
Ｔ＋−高いＴｒｉｍ５α；Ｆ−雌。最初の直腸チャレンジ後５日目のデータ。
【０１２６】
表２は、２９３ＳＩＶＧｐ９６Ｉｇ＋Ｇｐｌ２０タンパク質対模擬の間のカプラン・マイヤー感染曲線の比較を示す。
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【０１２７】
実施例２：ｇｐｌ２０−タンパク質と組み合わせたｇｐ９６ＳＩＶＩｇを分泌するワクチン細胞は、病原性の高いＳＩＶｍａｃ２５１による粘膜感染を防御する
動物モデルでＣＴＬ誘導の分子および細胞機序を研究するため、そしてＩＲＢ／ＯＢＡ／ＦＤＡが承認した臨床試験で癌ワクチンとして研究するために、ｇｐ９６のＫＤＥＬ配列をＩｇＧ１のＦｃに置換することにより、ｇｐ９６−Ｉｇを融合タンパク質として遺伝子改変し、目的の抗原を含有する細胞から分泌させた。分泌されたｇｐ９６−Ｉｇは、ｇｐ９６−シャペロンペプチドのＭＨＣ  Ｉ交差提示およびＣＴＬプライミングのための強力なアジュバントであり、かつタンパク質抗原のＭＨＣ  ＩＩ提示および抗体産生のためのアジュバントであった。細胞分泌ｇｐ９６−Ｉｇのユニークな特性および免疫原性を、ＳＩＶｍａｃ２５１感染に対する防御ワクチンとしてそれを評価するために使用した。
【０１２８】
最初の免疫原性および用量設定試験において、２９３ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチン接種による７匹のマカクへの腹腔内ワクチン接種を使用して、刺激でＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌する、ＳＩＶ  ｇａｇ、ｔａｔ、ｎｅｆ、およびｇｐ１２０に対するポリエピトープ特異的ＣＴＬを顕著な粘膜レベルで見出した。ｇｐ９６ＳＩＶＩｇ−ワクチン手法の防御活性を判定するために、性別、ＭＨＣタイプ、およびＴＲＩＭ５α発現のバランスがよく取れた、３６匹のインド起源のアカゲザル（マカカムラート）を、１２匹のマカクの３群にして、（１）２４時間当たりｇｐ９６ＳＩＶＩｇを１０μｇ分泌する、２９３−ｇｐ９６ＳＩＶＩｇ細胞；（２）２９３−ｇｐ９６ＳＩＶＩｇ＋１００μｇ  ｇｐ１２０−タンパク質（ＡＢＬ  Ｉｎｃ、ＳＩＶｍａｃ２５１由来の天然タンパク質）；（３）２９３−ｇｐ９６−Ｉｇ（模擬、ＳＩＶ抗原なし）を用いて、腹腔内経路により免疫した。非増殖性（照射された）ワクチン細胞は、３〜４日間、生存しかつｇｐ９６−Ｉｇを分泌する。マカクを０週目にｉ．ｐ．でプライミングし、６および２５週目にブーストした（図１Ａ−１Ｄ）。群ＩＩのマカクには、５および２５週目に、ワクチン細胞と同じ注射針により、ＨＢＳＳ中の天然ｇｐ１２０外皮タンパク質（ＳＩＶｍａｃ２５１）を１００μｇ投与した。
【０１２９】
２９３−ｇｐ９６ＳＩＶＩｇまたは模擬のワクチン接種に対する免疫応答を７および２６週目に判定した。細胞性免疫応答は、多重パラメーター細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイにより、そしてＳＩＶ  ｇａｇおよびｔａｔテトラマーにより測定した（図１Ｂおよび図７、８Ａ−８Ｄ）；体液性免疫応答は、ｇｐ１２０特異的抗体に対するＥＬＩＳＡにより（図１Ｃ）、ｇｐ１２０特異的抗体分泌細胞に対するＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより（図１Ｄ）、そして形質芽細胞に対する多重パラメーター染色により（図９Ａ、９Ｂ）測定した。最後のワクチン接種の１週間後の免疫学的分析により、直腸のＬＰＬおよびＩＥＬにおける、腸粘膜での極めて強力なＣＴＬ活性化が示された（図１Ｂおよび図７）。ＳＩＶ  ｇａｇおよびｔａｔ特異的ＣＴＬ応答を、８匹のＭＡＭＵ−Ａ０１＋アカゲザルで判定した（図８Ａ、８Ｂ）。両方のワクチンレジメン（ｇｐ９６ＳＩＶＩｇ単独およびｇｐ１２０タンパク質との組合せ）とも、固有層および特に上皮内コンパートメントにおいて、高レベルのＧａｇおよびＴａｔ−特異的免疫応答を誘発した（図８Ｂ）。アカゲザルにおける、プライム／ブーストｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチン戦略は、本発明者らの研究室で得られたデータと一致して、固有層および上皮層におけるＴＥＭの発生を優先的にもたらした（図８Ｃ、８Ｄ）。
【０１３０】
２９３−ｇｐ９６ＳＩＶＩｇワクチン接種にｇｐ１２０タンパク質を加えることは抗体産生に必要である（図１Ｃ）。血中における顕著なＳＩＶ  ｇｐ１２０抗体価および抗体分泌細胞は、組換えｇｐ１２０タンパク質を２９３−ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇ細胞と混合して同時注入する場合にのみ検出される。血中のＧｐ１２０特異的抗体は、ＩｇＡ以外は、すべてのＩｇＧアイソタイプであった（図１０）。
【０１３１】
ｇｐ９６ＳＩＶＩｇワクチンにより誘導される免疫応答の防御力を評価するために、３６匹のマカクすべてに、３３週目（最後のワクチン接種後の５週目）に開始して７週間にわたるＳＩＶｍａｃ２５１ウイルスの直腸内接種でチャレンジした（１２０  ＴＣＩＤ５０、Ｎａｎｃｙ  ＭｉｌｌｅｒおよびＧｅｎｏｖｅｆｆａ  Ｆｒａｎｃｈｉｎｉにより提供されたＮＩＨストック）（図１Ａ）。各チャレンジ後の５日目に評価してウイルス力価が陽性になった場合に、個々のマカクのチャレンジを中止した。１２０ＴＣＩＤ５０  ＳＩＶｍａｃ２５１の直腸内接種は、ワクチン接種をしていない対照サルにおいて３〜４の腸炎ウイルスを生成する。７回の直腸チャレンジ後のＳＩＶ獲得に対するｇｐ９６ＳＩＶＩｇ＋ｇｐ１２０ワクチン接種マカクのワクチン防御は、７３％のワクチン有効性（ＶＥ＝１００×［１−ＨＲ］）に相当して、統計的に有意（ｐ＝０．０１；ＨＲ＝０．２７；９５％ＣＩ  ０．０９、０．７９、ゲーハン、ブレスロー検定）であることが見出された（図２Ｃ）。防御は、ＴＲＩＭ５αまたは制限ＭＨＣ対立遺伝子の存在に完全に影響されなかった（図５）。第１回のチャレンジ後、ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇワクチン接種動物のわずか４．１％と対照的に、模擬対照マカクの５０％が感染した。ｇｐ９６ＳＩＶＩｇ＋ｇｐｌ２０を投与されたマカクは、動物の５０％が感染するのに３回のチャレンジが必要であった（図２Ｄ）。ｇｐ９６ＳＩＶＩｇ単独を投与された動物については、５０％が感染するのに２回のチャレンジが必要であった
【０１３２】
一部の動物に、最初の検出日に極めて高いウイルス力価があることが観察された。１０６ＲＮＡコピー／ｍｌ血漿を上回るウイルス負荷を有する動物については、動物がすでに１週間前に感染していたが、その時点ではまだウイルスが血中で検出できなかった可能性がある。この控えめな仮定の下でデータを再スコアしてもまた、有意な防御が得られる（ｐ＝０．０１７；ＨＲ＝０．３９；９５％ＣＩ  ０．１７および０．８８）（図６Ａ、６Ｂ）。
【０１３３】
組換えｇｐ１２０を加えないＧｐ９６ＳＩＶ単独は、防御を与えなかった（図２Ｃ、２Ｄ）。同様に組換えｇｐ１２０単独も防御的でなかった。感染は、組合せワクチンでワクチン接種したほとんどのマカクで起こったが（図２Ｂ）、ウイルス獲得には、他の群よりも有意に多くのチャレンジを必要とし（図２Ｂ−２Ｄ）、かなりの程度の免疫が示された。ワクチンカクテル中のｇｐ１２０タンパク質は、ＳＩＶ抗原のｇｐ９６媒介ＭＨＣ  Ｉ交差提示によるＣＤ８  ＣＴＬの生成に加えて、抗体の生成にとっても重要である（図３Ａ−３Ｃ）。
【０１３４】
感染したマカクは、感染後１４日目に最大ウイルス負荷を示し（図２Ｂ）、次いで１ｍｌ当たりのＳＩＶ  ＲＮＡコピーの比較的安定な平均設定値ウイルス負荷を示した。ｇｐ９６ＳＩＶ−Ｉｇ＋ｇｐｌ２０をワクチン接種したマカクでは、模擬対照と比較して３週目に平均最大ウイルス負荷が１ログ低減した（ｐ＝０．０４８、ウィルコクソン順位和検定）。しかしながら、全体として、ワクチン接種した群は、いったん感染すると、ウイルス学的制御を示さなかった（図２Ａ）。
【０１３５】
次に、感染を確立するのに必要なチャレンジ数として定義される、感染獲得に対する防御の免疫学的関連を評価した。感染獲得に対する防御は、チャレンジに先立つ、Ｅｎｖ特異的ＥＬＩＳＡ抗体産生応答（図３Ａ、Ｐ＝０．０００６、スピアマンの順位相関検定）およびＥｎｖ特異的抗体分泌細胞（図３Ｂ）および形質芽細胞（図３Ｃ）の頻度と最もよく相関した。細胞性免疫パラメーター（チャレンジ前のＧａｇ、Ｎｅｆ、およびＥｎｖ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答）は、感染獲得に対する防御と有意には相関しなかった。細胞性および体液性応答のワクチン誘導プレチャレンジレベルならびに感染した動物の血漿ウイルスレベルの相関分析は、Ｔ細胞またはＢ細胞の応答との有意な相関を実証しなかった。
【０１３６】
要約すると、これらのデータから、分泌された熱ショックタンパク質ｇｐ９６が、ＣＤ８  ＣＴＬプライミング／増殖およびｇｐ１２０特異的抗体の両方のアジュバントとして役立ち得ることが初めて実証される。さらに、細胞ベースのワクチン接種と組換えタンパク質との組合せは、アカゲザルにおける、病原性が高く、中和抵抗性のＳＩＶｍａｃ２５１のチャレンジの獲得に対して防御することができる。ＳＩＶ感染からの防御の類似性にもかかわらず、このワクチン手法は、他のグループのそれとは顕著に異なり、ワクチン有効性をさらに改善するために、さらなるアジュバントと容易に組み合わせることができることを含む柔軟性を提供する。細胞性ｇｐ９６−Ｉｇワクチン手法はまた、研究中の一部を挙げると、癌（乳癌、小細胞肺癌、膀胱癌、卵巣癌）および他の感染病原体（ＨＣＶ、マラリア）などの異なる標的に対して試験されている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月23日(2013.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類レンチウイルスの感染を予防するためのワクチンであって、前記ワクチンが、（ａ）Ｇａｇの少なくとも一部、Ｔａｔの少なくとも一部、Ｒｅｖの少なくとも一部、Ｎｅｆの少なくとも一部、およびｇｐ１６０の少なくとも一部からなる群から選択される少なくとも３つの異なる霊長類レンチウイルス抗原、および（ｂ）宿主細胞のそれぞれから分泌されるように改変された熱ショックタンパク質をそれぞれが共発現する複数の照射宿主生細胞を含み、前記ワクチンが、霊長類レンチウイルス由来のｇｐ１２０の少なくとも一部および医薬として許容される担体を含む医薬組成物と同時に、別々に、または逐次的に投与されるワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記改変された熱ショックタンパク質が、機能的な小胞体保持配列を欠くｇｐ９６であることを特徴とするワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記ワクチンが、投与前に医薬組成物と混合されることを特徴とするワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記霊長類レンチウイルス由来のｇｐ１２０の少なくとも一部が、組換えｇｐ１２０であることを特徴とするワクチン。
【請求項５】
霊長類レンチウイルスの感染を予防するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、霊長類レンチウイルス由来のｇｐ１２０の少なくとも一部および医薬として許容される担体を含み、前記医薬組成物が、（ａ）Ｇａｇの少なくとも一部、Ｔａｔの少なくとも一部、Ｒｅｖの少なくとも一部、Ｎｅｆの少なくとも一部、およびｇｐ１６０の少なくとも一部からなる群から選択される少なくとも３つの異なる霊長類レンチウイルス抗原、および（ｂ）宿主細胞のそれぞれから分泌されるように改変された熱ショックタンパク質をそれぞれが共発現する複数の照射宿主生細胞を含むワクチンと同時に、別々に、または逐次的に投与される医薬組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の医薬組成物において、前記改変された熱ショックタンパク質が、機能的な小胞体保持配列を欠くｇｐ９６であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の医薬組成物において、前記医薬組成物が、投与前に医薬組成物と混合されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項５に記載の医薬組成物において、前記霊長類レンチウイルス由来のｇｐ１２０の少なくとも一部が、組換えｇｐ１２０であることを特徴とするワクチン。
【請求項９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ウイルス抗原特異的免疫応答を生成させるための組成物であって、熱ショックタンパク質および免疫グロブリンであるか、または熱ショックタンパク質および免疫グロブリンをコードする核酸である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を含む組成物。
【請求項１０】
熱ショックタンパク質および免疫グロブリンであるか、または熱ショックタンパク質および免疫グロブリンをコードする核酸である、少なくとも１つのアジュバントまたは抗原担体を含む第１ドメインと、少なくとも１つのウイルス分子を含む第２ドメインとを有するワクチン分子を発現するベクターを含む単離細胞。
【請求項１１】
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）を含むアジュバントと、Ｇａｇ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇｐ１６０またはその断片を含む１つまたは複数のレトロウイルス分子とを発現する複数の細胞を含むワクチン。
【国際調査報告】
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2014508762.tif 000021