(57)【要約】  本発明は、癌の処置が必要な対象、例えば癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法であって、前記ヒトに由来するサンプル中において以下の少なくとも一つを決定する工程：（ａ）前記ヒトに由来するサンプル中におけるＥＺＨ２のアラニン６７７（Ａ６７７）残基における変異の有無、（ｂ）ＥＺＨ２中のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基における変異の有無、または（ｃ）対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の有無、および前記サンプル中に前記Ａ６７７変異、Ｙ６４１変異、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の少なくとも一つがある場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程を含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含んでなる、癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法：
前記ヒトに由来するサンプル中の以下の少なくとも一つを決定する工程：
ａ．前記ヒトに由来するサンプル中のＥＺＨ２中のアラニン６７７（Ａ６７７）残基における変異の有無、
ｂ．ＥＺＨ２中のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基における変異の有無、または
ｃ．対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の有無、および
前記サンプル中に前記Ａ６７７変異、Ｙ６４１変異、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベル増加の少なくとも一つが存在する場合、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程。
【請求項２】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１に記載の方法：
【化１】
2014534178.tif 000026
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣＲ２であり、
ＸおよびＺは、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、ハロゲン、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＣＯＮＲａＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、および−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂからなる群からそれぞれ独立して選択され、
Ｙは、水素またはハロゲンであり、
Ｒ１は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、非置換もしくは置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、非置換もしくは置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、非置換もしくは置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換の（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、または−ＣＯＮＲａＮＲａＲｂであり、
Ｒ２は、存在する場合、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、またはハロゲンであり、ここで、前記（Ｃ１−Ｃ８）アルキルは、アミノおよび（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択される１〜２個の基で置換されていてよく、
Ｒ７は、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、またはアルコキシであり、Ｒ３は、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、シアノ、トリフルオロメチル、−ＮＲａＲｂ、またはハロゲンであり、
Ｒ６は、水素、ハロ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、−Ｂ（ＯＨ）２、置換または非置換の（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＣＯＮＲａＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、および−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂからなる群から選択され、
ここで、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基はいずれも、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｒｃ）１−２、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｒｃ）１−２、−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｒｃ）１−２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ヘテロシクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、およびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルからなる群から独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、
ここで、前記アリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルの、アリールまたはヘテロアリール部分はいずれも、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、および−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂからなる群から独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、
各Ｒｃは、独立して（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＲｂ、または−ＣＯ２Ｒａであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであり、前記（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＣＯＮ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または−ＳＯ２Ｎ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）から独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、
あるいは、ＲａおよびＲｂはそれらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される更なるヘテロ原子を含んでいてよい５〜８員の飽和または不飽和環を表し、前記環は、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、ヒドロキシル、オキソ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、および（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、前記環は、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよく、
あるいは、ＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素と一緒に、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよい６〜１０員の架橋された二環式の環系を表す］。
【請求項３】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、ＷがＣＲ２である式（Ｉ）の化合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＺＨ２阻害剤が下記化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
【化２】
2014534178.tif 000027
【請求項５】
ａ、ｂ、およびｃの少なくとも二つが決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ、ｂ、およびｃが決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｙ６４１変異の有無が決定され、該Ｙ６４１変異がＹ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｓ、Ｙ６４１Ｈ、Ｙ６４１Ｎ、またはＹ６４１Ｃである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ａ６７７変異の有無が決定され、該Ａ６７７変異がＡ６７７Ｇである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、少なくとも一つの癌細胞を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌がリンパ腫である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンパ腫が、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症リンパ形質細胞性リンパ腫（ＷＭ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ａ６７７変異および／またはＹ６４１変異が体細胞変異である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ＥＺＨ２中のＡ７６６変異の存在、（ｂ）ＥＺＨ２中のＹ６４１変異の存在、および／または対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の少なくとも一つを有するヒトが、ａ、ｂ、またはｃを有さないヒトと比較して、ＥＨＺ２阻害剤で処置された時に奏効率の上昇および／または無増悪生存期間の延長を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
１または複数の更なる抗新生物剤を投与することを更に含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のａ、ｂ、またはｃの１または複数を決定するためのキットおよび請求項１に記載のａ、ｂ、またはｃの１または複数を決定する手段を含んでなる、癌を処置するためのキット。
【請求項１６】
前記手段が、プライマー、プローブ、および抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
治療に有用なバイオマーカーとしての、Ａ６７７変異をコードするＥＺＨ２核酸またはポリペプチド配列。
【請求項１８】
Ａ６７７変異がＡ６７７Ｇである、請求項１７に記載のＥＺＨ２配列。
【請求項１９】
癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法であって、前記ヒトに由来するサンプル中における請求項１に記載のａ、ｂ、またはｃの１または複数を決定する工程ならびに該サンプル中における前記変異および／または対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の１または複数の存在を、前記変異を有さず、かつ対照と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加がないヒトと比較して前記癌の処置が必要なヒトにおける奏効率の上昇および／または無増悪生存期間の延長とを相関させる工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、癌の処置が必要な対象における癌の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
癌を処置するための標的化された治療法の開発および利用の拡大は、主要な発癌経路およびどのようにこれらの経路の標的化された撹乱が臨床反応に対応するかの理解が進んできていることを反映している。標的化療法の有効性の予測における難点は、経路の調節解除の原因となる機構（例えば、活性化型の変異、増幅）の全体的な知識が限定的であることによるものと考えられる。腫瘍治療のための前臨床トランスレーショナル研究調査は、どの腫瘍型および遺伝子型が処置の恩恵を最も受け易いかを決定することに焦点を合わせている。選択された患者集団の処理は、治療の可能性を最大にするのに役立ち得る。腫瘍モデルの前臨床細胞反応プロファイリングが新規癌治療開発の土台となっている。インビトロ腫瘍モデルのコホートを用いて臨床的有効性を予測しようとする努力が成功を収めている（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤はＥＧＦＲ変異を有する腫瘍で選択的に有用である）。したがって、多様な腫瘍に由来する細胞株の拡張的パネルで「来る人全員(all comers)」の有効性試験を要約することができ、これにより、どの組織構造および特異的腫瘍遺伝子型が最も処置の恩恵を受け易いかが特定される。臨床状況で恩恵を最も受け易い患者を特定するために多くの特異的分子マーカーが現在用いられている。
【０００３】
ＥＺＨ２（enhancer of zeste homolog 2、ヒトＥＺＨ２遺伝子：Cardoso, C, et al、 European J of Human Genetics, Vol. 8, No. 3 Pages 174-180, 2000）は、ヒストンＨ３のリジン２７をトリメチル化する（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）ことにより標的遺伝子の発現を抑制するように機能するポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の触媒サブユニットである。ヒストンＨ３は、真核生物細胞中のクロマチン構造に関わる５個の主要なヒストンタンパク質の一つである。ヒストンは主要な球状ドメインおよび長いＮ末端テールを特徴とし、ヌクレオソームの構造、すなわち「数珠玉（beads-on-a-string）」構造に関与する。ヒストンタンパク質は高度に翻訳後修飾を受けるが、ヒストンＨ３が５個のヒストンの中で最も広く修飾される。単独の「ヒストンＨ３」という用語は、配列バリアント間または修飾状態を区別しない点で意図的に曖昧にしている。ヒストンＨ３は新興のエピジェネティクス分野で重要なタンパク質であり、その配列バリアントおよび可変な修飾状態は遺伝子の動的なおよび長期間の制御に関与していると考えられている。
【０００４】
癌の処置に有用なＥＺＨ２阻害剤が、引用することにより本明細書の開示の範囲とされる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５３３６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５３４０号、および同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５３４４号に報告されている。これらの化合物に対してより応答し易い遺伝子型を同定することが望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、癌の処置（治療）が必要なヒトにおける癌の処置（治療）方法であって、
前記ヒトのサンプル中の以下の少なくとも一つを決定する工程：
ａ．前記ヒトのサンプル中のＥＺＨ２のアラニン６７７（Ａ６７７）残基における変異の有無、または
ｂ．ＥＺＨ２のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基における変異の有無、または
ｃ．対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の有無、および
前記Ａ６７７変異、Ｙ６４１変異、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の少なくとも一つが前記サンプル中に存在する場合、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】リンパ腫細胞株のサブセットがＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの全体的増加を示す図である。（Ａ）７種類の異なる癌に由来する１１１個の癌細胞株についてグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベル（全Ｈ３に対して標準化）を決定した。Ｙ６４１変異を有するリンパ腫細胞株がアスタリスクで示されている。（Ｂ）リンパ腫細胞株のパネルに由来するタンパク質ライセートにおけるグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ１のウェスタンブロット分析。
【図２】パイフェルリンパ腫細胞株がＥＺＨ２中にヘテロ接合性Ａ６７７Ｇ変異を有することを示す図である。（Ａ）パイフェルＤＬＢＣＬ細胞株および原発性ＤＬＢＣＬ患者サンプル中のＥＺＨ２のサンガーシークエンシングの配列トレース。Ｃ２０４５Ｃ／Ｇヘテロ接合性非同義ミスセンス変異（アスタリスク）はＡ６７７Ａ／Ｇへと翻訳される（ＮＭ＿００１２０３２４７に基づく残基ナンバリング）。（Ｂ）ＥＺＨ２ドメイン構造（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１５９１０）。パイフェル細胞および原発性腫瘍で同定された変異を強調している。（Ｃ）Ｙ６４１およびＡ６７７が高度に保存されていることを示す、ヒトＥＺＨ２と、ハエのオルソログＥＺであるヒトＥＺＨ１、および６個の他の関連するＳＥＴドメイン含有ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼのアラインメント。白字に濃い灰色の影は同一残基を表し、四角で囲んだアミノ酸は保存残基を表す。列に影が付されるには、アラインメント中で９個中７個の保存／同一残基がある必要がある。
【図３】Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２変異体が全てのＨ３Ｋ２７メチル化状態に活性を示すことを示す図である。基質としてＨ３Ｋ２７ｍｅ０（黒色バー）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１（灰色バー）、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ２（白色バー）を用いた、野生型、Ａ６７７Ｇ、およびＹ６４１Ｎ  ＥＺＨ２のｋｃａｔ（ｍｉｎ−１）。
【図４】Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２の外因的発現がＨ３Ｋ２７のトリメチル化を刺激することを示す図である。野生型または変異型のＥＺＨ２のいずれかをコードする発現コンストラクトでＭＣＦ−７乳癌細胞を一過的にトランスフェクトした。（Ａ）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、全Ｈ３、およびＥＺＨ２のウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照とした。（Ｂ）空のベクターでトランスフェクトした細胞に対するパーセンテージとしての、ヒストンＨ３を基準に標準化したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベル。
【図５】Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２変異がＹ６４１への影響を介してリジン結合ポケットを変化させることを示す図である。Ｈ３Ｋ９ｍｅ２ペプチド基質に結合したＧＬＰ／ＥＨＭＴ１の結晶構造を用いて野生型ＥＺＨ２の相同性モデルを作製した。（Ａ）野生型、（Ｂ）Ｙ６４１Ｎ、および（Ｃ）Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２における活性部位領域のモデル構造。
【図６】高レベルのＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびＥＺＨ２変異状態からＥＺＨ２阻害への感受性が予測されることを示す図である。リンパ腫細胞株をＥＺＨ２阻害剤化合物Ａの存在下で６日間成長させた。５０％の成長阻害が起こる化合物Ａの濃度を成長ＩＣ５０として示し、線で表す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルは、細胞株パイフェルで得られたＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルに対するパーセンテージとして表されている（棒グラフ）。ＥＺＨ２のＹ６４１またはＡ６７７のいずれかに変異を有する細胞株を黒色のバーで示し、これらの位置が野生型のものを灰色のバーで示す。
【図７】ＧＳＫ１２６の生化学的および細胞機構的活性を示す図である。（Ａ）ＧＳＫ１２６の構造（Ｂ）ＷＴおよび変異ＥＺＨ２に対するＧＳＫ１２６の効力。Ｋ２７ｍｅ０、Ｋ２７ｍｅ１、またはＫ２７ｍｅ２を有するヒストンＨ３ペプチド（２１〜４４）を基質として用いた（ｎ＝２、平均値±ｓ．ｄ．を示す）。（Ｃ）ＧＳＫ１２６で４８時間処理したリンパ腫細胞株におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３へのＧＳＫ１２６の影響。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＥＬＩＳＡを用いてＩＣ５０値を決定した（ｎ≧２、平均値±ｓ．ｄ．を示す）。（Ｄ）７２時間処理後のＫＡＲＰＡＳ−４２２におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３／２／１の評価。全ヒストンＨ３をローディング対照として示す。
【図８】化合物Ｂ（ＧＳＫ１２６）の予測結合様式およびＥＺＨ２の相同性モデルを示す図である。（Ａ）化合物Ｂ（ＧＳＫ１２６）の予測結合様式およびＥＺＨ２の相同性モデル。ＳＡＭ結合部位中で結合したＧＳＫ１２６がＳＡＨと重なっている。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２ペプチド基質、ＳＥＴドメイン、およびポストＳＥＴドメイン、ならびにＧＳＫ１２６の予測結合様式の１０Å以内におけるＥＺＨ２とＥＺＨ１との残基の違いを示す。（Ｂ）ＧＳＫ１２６の結合様式の点から拡大したＡを示す。特異的な水素結合およびアレーン−Ｈ相互作用を点線で示す。ポストＳＥＴドメインからの残基の寄与を受ける結合部位表面を示す。（Ｃ）ＥＺＨ２の残基とＧＳＫ１２６の間の特異的相互作用を強調した２Ｄリガンド相互作用図。（Ｄ）ＳＥＴドメイン内のＡ６７７およびＹ６４１活性化変異の位置を強調したＥＺＨ２機能ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１５９１０）の図。
【図９】ＧＳＫ１２６で処理した細胞株におけるＨ３Ｋ２７メチル化の分析を示す図である。（Ａ）ＥＺＨ２  ＷＴ（ＴｏｌｅｄｏおよびＳＵ−ＤＨＬ−８）および変異体（パイフェルおよびＫＡＲＰＡＳ−４２２）リンパ腫細胞株間のグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ１レベルの比較。（Ｂ）ＫＡＲＰＡＳ−４２２、パイフェル、およびＳＵ−ＤＨＬ−８  Ｂ細胞リンパ腫細胞株におけるグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの低減として測定した経時的なＧＳＫ１２６の効力。ＧＳＫ１２６の３倍希釈系列で細胞を処理した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを５０％下げるのに必要なＧＳＫ１２６濃度（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＩＣ５０）をＥＬＩＳＡで決定した（ｎ≧２、平均値±ｓ．ｄ．を示す）。（Ｃ）７２時間処理後のＨ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ１の評価。全ヒストンＨ３をローディング対照として示す。
【図１０】ウェスタンブロット分析を示す図である。ＥＺＨ２変異（ａ、ｂ）またはＷＴ（ｃ、ｃ）リンパ腫細胞株を０．１％ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）、２５ｎＭ、１５０ｎＭ、５００ｎＭ、または２μＭ  ＧＳＫ１２６で７２時間処理した後のＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、およびＥＥＤのウェスタンブロッティング。アクチンをローディング対照として含める。
【図１１】ＧＳＫ１２６が複数のＥＺＨ２変異リンパ腫細胞株の増殖を阻害することを示す図である。成長を５０％阻害するのに必要なＧＳＫ１２６濃度（成長ＩＣ５０）として表した、６日後における４６個のリンパ腫細胞株の成長に対するＧＳＫ１２６の影響。ＤＬＢＣＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫。ＢＬ、バーキットリンパ腫。ＢＣＢＬ、ＡＩＤＳ体腔性リンパ腫。ＦＬ、濾胞性リンパ腫。ＨＬ、ホジキンリンパ腫。ＮＨＬ、非ホジキンリンパ腫。（Ｂ）成長ＩＣ５０として表した、パイフェルおよびＫＡＲＰＡＳ−４２２の成長に対するＧＳＫ１２６の経時的効力。（Ｃ、Ｆ）パイフェルまたはＫＡＲＰＡＳ−４２２における経時的な細胞増殖へのＧＳＫ１２６の用量依存的な影響。成長を時間ゼロ（Ｔ０）のＣＴＧのパーセンテージとして表す。（Ｄ、Ｇ）７２時間後の細胞周期へのＧＳＫ１２６の影響を示すＤＮＡ含量のヒストグラム。（Ｅ、Ｈ）ビヒクル対照に対するカスパーぜ３／７活性の平均変化倍率±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝４）。
【図１２】１８個のＤＬＢＣＬ細胞株の成長へのＧＳＫ１２６の影響を示す複合用量反応曲線を示す図である。細胞株を種々の濃度のＧＳＫ１２６で６日間処理した後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）で細胞成長を評価した。ｙ軸はビヒクル対照（０．１５％ＤＭＳＯ）と比較した成長率を表す。
【図１３】Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の阻害、細胞成長、およびＥＺＨ２レベルの間の相関分析を示す図である。（Ａ）図７ｃのＧＳＫ１２６のＨ３Ｋ２７ｍｅ３  ＩＣ５０値に対してプロットした表６のＧＳＫ１２６の細胞成長ＩＣ５０値。ピアソン相関値を示す。（Ｂ）リンパ腫細胞株の全細胞抽出物から得られたＥＺＨ２およびアクチンの代表的ウェスタンブロット。ＥＺＨ２およびアクチンのウェスタンブロットシグナル強度はライコア社製Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを用いて定量化した。（Ｃ）ＥＺＨ２シグナル強度を全アクチンレベルを基準にして標準化し、表６の６日間の増殖アッセイにおけるＧＳＫ１２６の細胞成長ＩＣ５０値に対してプロットした。
【図１４】ｓｈＲＮＡによるＥＺＨ２ノックダウンの表現型への影響を示す図である。（Ａ）ＥＺＨ２に対するｓｈＲＮＡまたは非標的化対照ｓｈＲＮＡを発現するＫＡＲＰＡＳ−４２２（左）およびパイフェル（右）の６日間にわたる細胞増殖。各時点におけるＣＴＧシグナルを０日目（Ｔ０）の細胞に対するパーセンテージとして表す。（Ｂ）ＥＺＨ２に対するｓｈＲＮＡまたは非標的化対照ｓｈＲＮＡを発現するＫＡＲＰＡＳ−４２２（左）およびパイフェル（右）における経時的カスパーゼ３／７活性。各時点におけるカスパーゼ３／７活性を０日目（Ｔ０）の活性に対するパーセンテージとして表す。（Ｃ）ＥＺＨ２のｓｈＲＮＡノックダウン後のＥＺＨ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、および全ヒストンＨ３のウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として含める。
【図１５】ＧＳＫ１２６が感受性細胞株において転写活性化を誘導することを示す図である。（Ａ）５００ｎＭ  ＧＳＫ１２６を用いた７２時間処理（ｎ＝２）後に有意に変化した遺伝子発現（ＦＤＲ＜０．１および変化倍率＞２または＜−２）を示すプローブセットの数。（Ｂ）ＧＳＫ１２６処理後にアップレギュレートされた遺伝子、ダウンレギュレートされた遺伝子、または全部のヒト転写産物の基礎Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ濃縮(enrichmento)プロファイル。（Ｃ）ＧＳＫ１２６を用いた７２時間処理後のＴＸＮＩＰおよびＴＮＦＲＳＦ２１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝３、平均値±ｓ．ｄ．を示す）。（Ｄ）２倍の発現変化をカットオフとして用いた、１０個のＤＬＢＣＬ細胞株間のアップおよびダウンレギュレートされたプローブセットの重複。（Ｅ）最も感受性の高い５個の変異ＤＬＢＣＬ細胞株（パイフェル、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、およびＳＵ−ＤＨＬ−６）のうちの少なくとも４個で発現の有意な増加を示した３５個のプローブセットの平均遺伝子発現強度を示すヒートマップ。
【図１６】ＤＬＢＣＬ細胞株の発現分析を示す図である。（Ａ）ＧＳＫ１２６で７２時間処理した後の発現量に差のあるプローブセット(Differentially-expressed probe set)の標準化された遺伝子発現データの遺伝子発現ヒートマップ。色が濃いほど発現が多いことを示す。（Ｂ）０．１％ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）と比較して１０個のＤＬＢＣＬ細胞株（２連）を５００ｎＭ  ＧＳＫ１２６で７２時間処理した後に有意な遺伝子発現の変化（＞１．５倍）を示したプローブセットの数。（Ｃ）転写応答性および非応答性の変異ＥＺＨ２  ＤＬＢＣＬ細胞株（パイフェル、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、ＤＢ、およびＳＵ−ＤＨＬ−４）におけるアップレギュレートされたプローブセットの数と基礎Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの間の相関。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを全ヒストンＨ３を基準に標準化し、パイフェル細胞株で観察されたレベルに対するパーセンテージとして表す。転写応答性および非応答性の細胞株が丸で囲まれている。（Ｄ）ＧＳＫ１２６処理で１．５または２倍の発現増加を示した、記載の細胞株内の共通プローブセットの数。
【図１７】ＧＳＫ１２６に応答してアップレギュレートされた遺伝子がＨ３Ｋ２７ｍｅ３で濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）されていることを示す図である。５００ｎＭ  ＧＳＫ１２６で７２時間後にパイフェル、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、およびＫＡＲＰＡＳ４２２細胞において同定された有意にアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされたまたは変化しなかったプローブセットを個々の遺伝子についてマッピングし、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータから各遺伝子および±１０ｋｂでＨ３Ｋ２７ｍｅ３の濃縮を決定した。白色が濃縮なし、灰色が最大の濃縮を表すとして、相対的なＨ３Ｋ２７ｍｅ３濃縮を白色から灰色のグラジエントとして表す。各列が固有の遺伝子を表す。
【図１８】ジーンオントロジー濃縮分析を示す図である。Ａ．パイフェル、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、またはＳＵ−ＤＨＬ−６において５００ｎＭ  ＧＳＫ１２６で有意にアップレギュレートされたプローブセットのＧＯ濃縮分析。Ｂ．パイフェル、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、またはＳＵ−ＤＨＬ−６細胞株において５００ｎＭ  ＧＳＫ１２６で有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたプローブセットのＧＯ濃縮分析。大きな比率を占める生物学的プロセスおよび分子機能の用語を、ｐ値＜０．０１（破線）、用語当たり少なくとも５個の遺伝子、３個以上の細胞株で共通している、という条件でフィルタリングした。
【図１９】ＧＳＫ１２６を用いたＨ３Ｋ２７ｍｅ３および腫瘍成長反応のインビボ阻害を示す図である。（Ａ）ＧＳＫ１２６を１０日間ＱＤ投与した後の腫瘍異種移植片におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の反応。（ｂ）ＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍異種移植片中のＥＺＨ２標的遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。平均値±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す（Ａ、Ｂ）。（Ｃ）皮下ＫＡＲＰＡＳ−４２２異種移植片の成長に対するＧＳＫ１２６の活性。平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍを示す（ｎ＝１０）。（Ｄ）（Ｃ）で処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。ノンパラメトリックなログ・ランク検定を用いて計算されたビヒクルおよび処理群の間な有意なＰ値を示す。処理群間に有意な差は観察されなかった（ｐ値＝０．０７〜０．３２）。
【図２０】ＧＳＫ１２６の薬物動態分析を示す図である。（Ａ）パイフェル異種移植片を有する雌ベージュＳＣＩＤマウスに５０ｍｇ／ｋｇ  ＧＳＫ１２６を腹腔内投与した後の血中および腫瘍中における分布。各時点で３頭のマウスを評価した。（Ｂ）ａに示したデータの曲線下面積（ＡＵＣ０−１４４０）、腫瘍／血液ＡＵＣ比、最高到達濃度（Ｃｍａｘ）、および最高濃度時間（Ｔｍａｘ）。Ｎ／Ａ、適用不可。
【図２１】ＧＳＫ１２６がインビボで腫瘍成長を阻害することを示す図である。（Ａ）皮下パイフェル異種移植片の成長に対するＧＳＫ１２６の有効性。（Ｂ）１週間の休薬期間ありまたはなしでの皮下ＫＡＲＰＡＳ−４２２異種移植片の成長に対するＧＳＫ１２６断続投与の有効性。値は平均腫瘍体積±標準誤差（ｎ＝１０）である。Ｐ値はビヒクルおよび各処理群を比較するノンパラメトリックなログ・ランク検定を用いて計算された。
【図２２】体重および末梢血液へのＧＳＫ１２６の影響を示す図である。（Ａ〜Ｃ）ビヒクルまたはＧＳＫ１２６で処置している間の、パイフェル（Ａ）またはＫＡＲＰＡＳ−４２２（Ｂ、Ｃ）皮下異種移植片を有するマウスの平均体重測定値。値は投薬開始時の平均体重に対するパーセンテージとして表される。（Ｄ）１８日間にわたる週２回投与後のＣＤ−１マウスの全血球計算分析。ＲＢＣ、赤血球（×１０６細胞／μｌ）、ＨＧＢ、ヘモグロビン（ｇ／ｄｌ）、ＨＣＴ、ヘマトクリット（パーセント）、ＭＣＶ、平均血球体積（ｆｌ）、ＭＣＨ、平均血球ヘモグロビン（ｐｇ）、ＭＣＨＣ、平均血球ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）、ＰＬＴ、血小板（×１０５血小板／μｌ）、ＷＢＣ、白血球細胞（×１０３細胞／μｌ）、ＮＥＵＴ、好中球（×１０３細胞／μｌ）、ＬＹＭＰＨ、リンパ球（×１０３細胞／μｌ）、ＭＯＮＯ、単球（×１０３細胞／μｌ）、ＥＯＳ、好酸球（×１０３細胞／μｌ）、ＢＡＳＯ、好塩基球（×１０３細胞／μｌ）、ＬＥＵＫ、白血球（×１０３細胞／μｌ）。
【図２３】遺伝子発現プロファイリングデータの主成分分析および相関分析を示す図である。（Ａ）ビヒクルまたは５００ｎＭのＧＳＫ１２６で７２時間処理した１０個のＤＬＢＣＬ細胞株の生物学的複製物(biological replicate)から得られたデータのＰＣＡプロット。（Ｂ）ＤＬＢＣＬ細胞株の生物学的複製物と強い転写変化との相関。Ｋ、ＫＡＲＰＡＳ−４２２、Ｐ、パイフェル、Ｗ、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、Ｓ１０、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、Ｓ６、ＳＵ−ＤＨＬ−６。
【発明の具体的説明】
【０００７】
近年のゲノムワイドなシークエンシング研究により、非ホジキンリンパ腫においてしばしば変化している、とりわけＥＺＨ２、ＭＬＬ２、ＭＥＦ２Ｂ、ＣＲＥＢＢＰ、およびＴＰ５３を含む複数の遺伝子が明らかとなった（１〜３）。これらの遺伝子の多くは、直接的または補助因子のリクルートを介して間接的に、ヒストンのアミノ末端テール上で観察される一連の翻訳後修飾を仲介している。更に、同様な実験により、これらおよび他のエピジェネティックな因子が膀胱の移行上皮癌（例えば、ＵＴＸ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＭＬＬ、ＭＬＬ３）、頭頸部扁平上皮癌（例えば、ＥＺＨ２、ＭＬＬ２）、および骨髄性悪性腫瘍（例えば、ＩＤＨ１／２、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２）（４〜６）にも関連付けられている（４〜６）。転写因子およびヒストン修飾遺伝子に影響を与える遺伝的変化の多いことは、腫瘍形成において適切な転写調節を維持することの重要性を示している。
【０００８】
ＥＺＨ２遺伝子は、ＥＥＤ、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８、およびＡＥＢＰ２と共にポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）を形成するＳＥＴドメイン含有リジンメチルトランスフェラーゼをコードする（７、８）。ＥＺＨ２は、ジまたはトリメチル化状態で存在する時に一般的に転写抑制に関連するヒストンＨ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７）残基のメチル化を担う（７〜９）。ＥＺＨ２は、プロＢ細胞で高度に発現しており、細胞がプレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、再循環Ｂ細胞へと進行するにつれて発現が連続的に低下する（１０）。ＥＺＨ２の遺伝的不活性化はプロＢ細胞段階の細胞を蓄積させることから、ＥＺＨ２発現は骨髄中におけるプロＢ細胞からプレＢ細胞および未熟Ｂ細胞への進行に必要である（１０）。しかし、プロＢ細胞段階の後にＥＺＨ２を不活性化した場合、その後の成熟工程が妨げられないことから、ＥＺＨ２はＢ細胞分化の初期に機能することが示唆される（１０）。実際、複数のグループが、造血幹細胞および前駆細胞の維持にＥＺＨ２が重要な役割を果たすことを示している（１１、１２）。特に、造血幹細胞（ＨＳＣ）中でのＥＺＨ２過剰発現は累代移植モデルにおいて連続的自己複製能を生じさせることから、ＥＺＨ２が再増殖能に寄与し、複製ストレスへの細胞の抵抗を助けることが示唆される（１１）。
【０００９】
ＥＺＨ２はほとんどの固形腫瘍型でしばしば増幅および／または過剰発現される（１３）が、これはリンパ腫の場合には当てはまらないようであり、これはおそらく、正常な増殖性Ｂ細胞におけるＥＺＨ２の高い基礎発現によると考えられる。その代わり、ＥＺＨ２は胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の２２％および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）の７％でチロシン６４１（Ｙ６４１）残基に再発性変異を有することが報告されている（３）。最初は機能喪失型変異であるとして報告された（３）が、その後の生化学的研究により、このＹ６４１変異ＥＺＨ２について新規な機能獲得活性が示された（１４、１５）。野生型ＥＺＨ２は非メチル化およびモノメチル化Ｈ３Ｋ２７基質に強力な選好性を示すが、リンパ腫で観察されたＹ６４１  ＥＺＨ２変異体（Ｙ６４１Ｆ／Ｎ／Ｓ／Ｈ）は、ジメチル化基質に対する顕著な活性の増大および非メチル化およびモノメチル化Ｈ３Ｋ２７に対する活性の欠如を示す（１４、１５）。野生型および変異型ＥＺＨ２タンパク質の協調的活性を介して、Ｙ６４１変異リンパ腫においてＨ３Ｋ２７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）がグローバルに増加し、それに付随してモノおよびジメチル化Ｈ３Ｋ２７が減少する（１４）。
【００１０】
これらのＥＺＨ２  Ｙ６４１変異は、多くの腫瘍におけるＥＺＨ２過剰発現と共に、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの調節解除がヒト腫瘍形成に重要であることを示唆している。実際、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルは、腎細胞癌における無増悪生存期間（１６）ならびに食道扁平上皮癌（１７）における疾患の重症度および腫瘍分化不良と相関する。ＥＺＨ２  Ｙ６４１の変異に加えて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の調節解除の更なる機構として、ｍｉＲ−１０１レベルの低減（２０、２１）、異常なＥ２Ｆ活性（２２）、および染色体増幅（２３）等の複数の機構によるＥＺＨ２の過剰発現およびＨ３Ｋ２７デメチラーゼＵＴＸの不活性化変異（４、１８、１９）が含まれる。
【００１１】
１００個を超える細胞株におけるグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの調査により、本発明者らは、いくつかのリンパ腫細胞においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増加に関わるＡ６７７残基に新規なＥＺＨ２変異を同定した。この変異タンパク質の特徴解析により、Ｙ６４１  ＥＺＨ２変異同様、６７７位のアラニンがグリシンに交換される（Ａ６７７Ｇ）とジメチル化Ｈ３Ｋ２７基質との活性が増大することが明らかになった。しかし、重要なことに、この置換は野生型ＥＺＨ２中に存在する重要な相互作用を維持しており、非、モノ、ジメチル化を含む全てのＨ３Ｋ２７メチル化状態を効率的に利用する。この変異は、Ｙ６４１  ＥＺＨ２変異体の場合に必要な野生型ＥＺＨ２との協調を必要とせずに細胞にＨ３Ｋ２７メチル化を調節解除させるユニークなアプローチをもたらす。
【００１２】
本発明は、癌の処置が必要なヒトにおいて癌を処置する方法であって、
前記ヒトに由来するサンプル中で以下の少なくとも一つを決定する工程：
ａ．前記ヒトに由来するサンプル中のＥＺＨ２中のアラニン６７７（Ａ６７７）残基における変異の有無、または
ｂ．ＥＺＨ２中のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基における変異の有無、または
ｃ．対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加の有無、および
前記サンプル中に前記Ａ６７７変異、Ｙ６４１変異、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベル増加の少なくとも一つが存在する場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤、例えば本明細書に記載の本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本明細書中の方法の特定の実施形態では、ａ、ｂ、およびｃの少なくとも二つ、例えばａおよびｂ、ａおよびｃ、またはｂおよびｃが任意の順番で決定される。更なる実施形態では、ａ、ｂ、およびｃのそれぞれが決定され、Ａ６７７変異、Ｙ６４１変異、または対照と比較したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベル増加のいずれかが存在することが決定された場合に、本明細書に記載の本発明の化合物等のＥＺＨ２阻害剤が投与される。
【００１４】
更なる実施形態では、Ｙ６４１変異の有無が決定され、Ｙ６４１変異はＹ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｓ、Ｙ６４１Ｈ、Ｙ６４１Ｎ、またはＹ６４１Ｃである。別の更なる実施形態では、Ａ６７７変異の有無が決定され、Ａ６７７変異はＡ６７７Ｇである。
【００１５】
更なる実施形態では、癌細胞または腫瘍細胞のグローバルなメチル化レベルの増加が決定される。別の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７メチル化レベルが決定される。別の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルが決定され、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加によりＥＺＨ２阻害剤を用いた処置が示唆される。本パラグラフ中の本発明の更なる実施形態では、メチル化レベルを対照と比較し、対照と比較したメチル化の相対的増加により、ＥＺＨ２阻害剤を用いた処置が示唆される。
【００１６】
ＥＺＨ２中のＹ６４１またはＡ６７７に変異を検出する方法は当業者に周知であり、本明細書中の発明を実施するための形態および実施例に記載されている。対照と比較したメチル化レベルの増加（例えば、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）を決定する方法は当該技術分野で周知であり、実施例に示されており、例えばヒストン３のトリメチル化リジン２７に特異的な抗体の使用が挙げられる。対照は、当業者が選択するであろう任意のもの、例えば、ヒトに由来する対応する細胞、ヒトに由来する対応する組織、腫瘍と同じ起源であるが野生型ＥＺＨ２を有することが知られている細胞、または同じ起源の非癌性細胞もしくは野生型ＥＺＨ２を有する細胞で見られるものと相関する開発された対照であり得る。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、サンプルは少なくとも一つの癌細胞を含んでなる。特定のそのような実施形態では、サンプルは生物学的サンプルである。
【００１８】
本明細書中の発明の実施形態のいずれかにおいて、癌はリンパ腫である。本発明の方法の更なる実施形態では、リンパ腫は、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症リンパ形質細胞性リンパ腫（ＷＭ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫(Extra nodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue)からなる群から選択される。
【００１９】
本明細書の発明の方法の方法の実施形態では、Ａ６７７変異および／またはＹ６４１変異は体細胞変異である。
【００２０】
癌を処置する方法の別の実施形態では、処置は、非処置のヒトと比較した奏効率の上昇および／または無増悪生存期間の延長を含んでなる。
【００２１】
本発明は、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法を提供する：（ａ）前記ヒトに由来する少なくとも一つの腫瘍細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを検出する工程、および（ｂ）前記少なくとも一つの腫瘍細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが高い場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物の形態で前記ヒトに投与する工程。
【００２２】
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する：（ａ）対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がＥＺＨ２のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）前記変異の検出を、ＥＺＨ２阻害剤が投与された時の奏効率の上昇および／または無増悪生存期間の延長の可能性増大と相関させる工程。
【００２３】
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する：（ａ）対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がＥＺＨ２のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）前記腫瘍がＥＺＨ２のチロシン６４１残基に変異を有していた場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程。
【００２４】
本発明は更に、ヒトにおいて癌を処置する方法であって、（ａ）対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がＥＺＨ２のチロシン６４１（Ｙ６４１）残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）前記腫瘍がＥＺＨ２のチロシン６４１残基に変異を有していた場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程を含んでなり、そのようなＥＺＨ２変異がＹ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｓ、Ｙ６４１Ｈ、またはＹ６４１Ｃである、方法に関する。
【００２５】
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する：（ａ）対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がＥＺＨ２のＡ６７７残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）前記変異の検出を、ＥＺＨ２阻害剤が投与された時の奏効率の上昇および／または無増悪生存期間の延長の可能性増大と相関させる工程。
【００２６】
本発明は更に、以下の工程を含んでなるヒトにおいて癌を処置する方法に関する：（ａ）対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がＥＺＨ２のＡ６７７残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）前記腫瘍がＥＺＨ２のＡ６７７残基に変異を有していた場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程。
【００２７】
本発明は更に、ヒトにおいて癌を処置する方法にであって、（ａ）対象腫瘍に由来する生物学的サンプルに遺伝子タイピング技術を行って前記腫瘍がＥＺＨ２のＡ６７７残基に体細胞変異を有するか否かを決定する工程、および（ｂ）前記腫瘍がＥＺＨ２のＡ６７７残基に変異を有していた場合に、有効量のＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩を前記ヒトに投与する工程を含んでなり、そのようなＥＺＨ２変異がＡ６７７Ｇである、方法に関する。
【００２８】
定義
「野生型」という用語は、当該技術分野で理解されるように、遺伝的改変のない天然集団で生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。また、当該技術分野で理解されるように、「バリアント」には、野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド中に見られる対応するアミノ酸または核酸と比較してそれぞれアミノ酸または核酸に少なくとも一つの改変を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が含まれる。バリアントという用語には、最も多く見られる（野生型）核酸鎖と比較して核酸鎖の配列中に一塩基対の違いがある一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。
【００２９】
本発明において、「遺伝的改変」または「遺伝的に改変された」またはその文法的バリエーションは、限定されるものではないが、ＤＮＡ配列中への１または複数の塩基のあらゆる抑制、置換、増幅、欠失、および／または挿入を指す。また、本発明において、「遺伝的に改変された」とは、それぞれ核酸またはアミノ酸の少なくとも一つの欠失、置換、または抑制を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはポリペプチドを指すこともある。遺伝的バリアントおよび／またはＳＮＰは公知の方法により確認することができる。例えば、野生型またはＳＮＰはＤＮＡの増幅およびシークエンシング技術、ＤＮＡおよびＲＮＡの検出技術、例えば、限定されるものではないが、それぞれノーザンおよびサザンブロット、ならびに／または種々のバイオチップおよびアレイ技術により同定することができる。ＷＴおよび変異ポリペプチドは種々の技術により検出することができ、そのような技術としては、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット等の免疫診断技術が含まれる。本発明において、対立遺伝子または多型の検出プロセスは、限定されるものではないが、血清学的および遺伝学的方法を含む。検出される対立遺伝子または多型は、個体の表現型への影響に機能的に関与し得、あるいは機能的多型／対立遺伝子と連鎖不平衡な対立遺伝子または多型であり得る。当業者に明らかであるように、多型／対立遺伝子は、対象のゲノムＤＮＡ中に見出されるが、この領域から転写または翻訳されたＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質の配列からも検出可能であり得る。
【００３０】
遺伝学において周知なように、同じ遺伝子について異なる供給源から得られたヌクレオチドおよび関連アミノ酸配列はナンバリングスキームおよび正確な配列の両方において異なり得る。そのような差異は、ナンバリングスキーム、遺伝子内の固有の配列のばらつき、および／またはシークエンシングエラーによるものであり得る。したがって、本明細書中における数字による特定の多型部位への言及は、それらの記述に異なるナンバリング／命名法スキームが用いられたとしても、遺伝子内の配列および位置の対応する多型部位を含むことが当業者には理解されよう。
【００３１】
本発明において、少なくとも一つのポリペプチドまたは少なくとも一つのポリペプチドをコードする遺伝子中における変異または遺伝子の多型対立遺伝子についての対象（またはＤＮＡ等のサンプル）の「遺伝子タイピング」とは、どの変異した対立遺伝子型または多型の形態の遺伝子または遺伝子発現産物（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質）が対象（またはサンプル）中に存在するか、または存在しないことを検出することを意味する。そのような遺伝子から発現された関連ＲＮＡまたはタンパク質も変異体または多型体バリエーションの検出に用いることができる。当該技術分野で周知のように、個体は特定の対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。３種類以上の対立遺伝子形態が存在し得るので、４種類以上の可能な遺伝子タイプがあり得る。本発明において、対立遺伝子は、他の可能な対立遺伝子バリアントが除外された時に「検出」され得、例えば、特定の核酸位置がアデニン（Ａ）、チミン（Ｏ）、またはシトシン（Ｃ）のいずれでもないことが判明した場合、その位置にグアニン（Ｇ）が存在すると結論付けることができる（すなわち、対象中でＧが「検出」または「診断」される）。配列のバリエーションは直接的（例えばシークエンシングにより）または間接的（例えば、制限断片長の多型分析、または既知配列のプローブのハイブリダイゼーションの検出、または参照鎖のコンホメーション多型）にまたは他の公知の方法により検出することができる。
【００３２】
本発明において、集団の「遺伝的サブセット」は、少なくとも一つの体細胞変異を有する特定の遺伝子型または腫瘍を有する集団のメンバーからなる。二対立遺伝子多型の場合、集団は潜在的に三つのサブセット、すなわち対立遺伝子１のホモ接合型（１，１）、ヘテロ接合型（１，２）、および対立遺伝子２のホモ接合型（２，２）に分けることができる。対象の「集団」は種々の基準を用いて定義され得る。
【００３３】
本発明において、癌の処置が必要なヒトは、遺伝子タイピングに基づいて特定の表現型応答の「素因を有する」または「リスクが高い」ヒトであり得、標的多型座の遺伝子型が異なる個体よりその表現型を示し易い。表現型応答が複数の対立多型に基づくか、２以上の遺伝子の遺伝子タイピングに基づく場合、複数の可能な遺伝子型間で相対的リスクが異なり得る。
【００３４】
あるいは、癌の処置が必要なヒトは体細胞変異のある腫瘍または癌細胞を有し得、遺伝子タイピングまたは他の変異検出法が行われ得る。
【００３５】
本発明において、処置に対する「応答（反応）」およびその文法的バリエーションは、限定されるものではないが、患者が薬物療法を受けた後の患者の臨床状態の改善を含む。応答は、処置の開始後に患者の状態が悪化しないことを意味することもある。応答は、疾患または障害の特定の徴候の測定によって定義することもできる。癌に関して、応答とは、限定されるものではないが、患者における腫瘍および／または腫瘍細胞のサイズおよびまたは数の減少を意味し得る。また、応答は、他のエンドポイント、例えば患者における前腫瘍細胞(pre-tumorous cell)の数の減少または低下によって定義することもできる。
【００３６】
「遺伝子検査」（遺伝子スクリーニングとも呼ばれる）は、本明細書中で使用されるように、対象の遺伝子型を決定するための、対象に由来する生物学的サンプルの検査を指し、対象の遺伝子が特定の表現型を生じさせるまたはその表現型へのなり易さを増大させる（またはその表現型を生じさせる、もしくはその表現型へのなり易さを増大させる対立遺伝子と連鎖不平衡である）対立遺伝子を含んでなるか否かを判定するために用いられ得る。
【００３７】
１または複数の変異を検査または判定するためのサンプル、例えば生物学的サンプルは、タンパク質、ヌクレオチド、細胞のブレブ(bleb)または構成要素、血清、細胞、血液、血液成分、尿、および唾液の群から選択され得る。変異の検査は当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載の複数の技術により行うことができる。
【００３８】
遺伝子、ＰＣＲ産物、またはその断片もしくは一部を含む任意の核酸の配列は、当該技術分野で公知の任意の方法（例えば、化学的シークエンシングまたは酵素的シークエンシング）によりシークエンシングされ得る。ＤＮＡの「化学的シークエンシング」とは、個々の塩基特異的反応を用いてＤＮＡをランダムに切断するMaxam and Gilbert (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)に記載の方法などの方法を意味し得る。ＤＮＡの「酵素的シークエンシング」とは、Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)に記載の方法などの方法を意味し得る。
【００３９】
シークエンシング技術を含む従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術は当業者に周知である。そのような技術は文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書中では"Sambrook, et al., 1989")、 DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)、 Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)、 Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985))、 Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984))、 Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986))、 Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))、 B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)、 F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994参照。
【００４０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）アフィニティーアッセイは従来のハイブリダイゼーションアッセイに由来する（Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)、 Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897 (1992)、 James et al., Protein Science 3:1347-1350 (1994)）。ＰＮＡは、ワトソン・クリック塩基対形成規則に従う構造的ＤＮＡ模倣物であり、標準的ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイで用いられる。ＰＮＡ／ＤＮＡミスマッチはＤＮＡ／ＤＮＡミスマッチより不安定であり、相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖は相補的ＤＮＡ／ＤＮＡ鎖より強力な結合を形成するので、ＰＮＡはハイブリダイゼーションアッセイでより大きな特異性を示す。
【００４１】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝的変動(variation)および多型を検出するために開発された（Taton et al., Science 289:1757-60, 2000、 Lockhart et al., Nature 405:827-836 (2000)、 Gerhold et al., Trends in Biochemical Sciences 24:168-73 (1999)、 Wallace, R. W., Molecular Medicine Today 3:384-89 (1997)、 Blanchard and Hood, Nature Biotechnology 149:1649 (1996)）。ＤＮＡマイクロアレイは、高速ロボット工学によりガラスまたはナイロン基体上に作製され、既知のアイデンティティーのＤＮＡ断片（「プローブ」）を含む。マイクロアレイは、従来の塩基対形成規則に基づく既知および未知のＤＮＡ断片（「標的」）のマッチングに用いられる。
【００４２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に用いられており、本明細書中では、天然タンパク質、断片、ペプチド、またはポリペプチド配列のアナログを指す一般的な用語として用いられる。したがって、天然タンパク質、断片、およびアナログはポリペプチド属の種である。
【００４３】
ポリペプチド配列中の変異の文脈における「Ｘ番号（#）Ｙ」という用語法は当該技術分野で認識されており、「番号（#）」は、ポリペプチドのアミノ酸番号でで表した変異の位置を示し、「Ｘ」は、野生型アミノ酸配列においてその位置に見られるアミノ酸を示し、「Ｙ」は、その位置の変異アミノ酸を示す。例えば、Ｋ−ｒａｓポリペプチドに関して「Ｇ１２Ｓ」という表記は、野生型Ｋ−ｒａｓのアミノ酸番号１２にグリシンがあり、変異Ｋ−ｒａｓ配列中ではグリシンがセリンで置換されていることを示している。
【００４４】
ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子中の「変異」およびその文法的バリエーションは、１または複数の対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導バリアント、置換バリアント、欠失バリアント、および／または挿入バリアント、融合ポリペプチド、オルソログ、および／または種間ホモログを有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。例えば、ＥＺＨ２の少なくとも一つの変異には、細胞中で生産されるＥＺＨ２タンパク質の少なくとも一つについて、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子の配列の一部または全部が細胞中で発現されないまたは存在しないＥＺＨ２が含まれる。例えば、ＥＺＨ２タンパク質は切断型で細胞により生産され得、切断型の配列は、その切断体の配列全体にわたって野生型であってよい。欠失とは、遺伝子または遺伝子にコードされるタンパク質の全部または一部が存在しないことを意味し得る。ＥＺＨ２変異は更に、ポリヌクレオチド中の一塩基における変異または１アミノ酸置換を意味し得る。更に、細胞中で発現されるまたは細胞にコードされるタンパク質のいくつかが、例えば１アミノ酸で、変異しており、一方、同じ細胞中で生産される同じタンパク質の他のコピーが野生型であってもよい。
【００４５】
変異は、当該技術分野で周知の複数の方法によりポリヌクレオチドまたは翻訳されたタンパク質中に検出され得る。これらの方法としては、限定されるものではないが、シークエンシング、ＲＴ−ＰＣＲ、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、抗体検出、タンパク質分解シークエンシング等が含まれる。メチル化状態等のエピジェネティックな変化によっても、変異および／またはタンパク質をコードする対応するポリヌクレオチドからのタンパク質の一部または全部の発現の欠如が生じ得る。
【００４６】
本発明において、「遺伝的異常」とは、対象の細胞の正常な天然核酸内容物との比較による欠失、置換、付加、転位、増幅等を意味する。本発明において、「ＥＺＨ２タンパク質をコードする遺伝子」とは、任意のＥＺＨ２タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの任意の部分を意味する。この用語の意味には、ＥＺＨ２をコードするエキソンが含まれる。ＥＺＨ２タンパク質をコードする遺伝子としては、限定されるものではないが、ＥＺＨ２の一部または全部をコードする遺伝子が含まれる。
【００４７】
本明細書中で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態を意味し、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態のいずれであってもよい。この用語は一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを含む。
【００４８】
本明細書中で言及される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然および非天然のオリゴヌクレオチド結合により連結された、天然および修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般的に長さが２００塩基以下のポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは例えば遺伝子変異体の構築に使用するためには二本鎖であり得るが、オリゴヌクレオチドは通常（例えばプローブ用に）一本鎖である。オリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれでもあり得る。
【００４９】
オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブとは、サイズが典型的には約８ヌクレオチドから数百ヌクレオチド長の核酸分子である。そのような分子は、典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸配列にハイブリダイズさせることによりサンプル中の標的核酸配列を同定するために用いられる。ハイブリダイゼーション条件は上記で詳細に説明した。
【００５０】
ＰＣＲプライマーも核酸配列であるが、ＰＣＲプライマーは通常、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるかなり長さの短いオリゴヌクレオチドである。当業者は、標的配列からの配列情報を用いて、ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを容易に設計および作製することができる（例えば、Sambrook et al.,（前述）またはGlick et al.（前述）参照）。
【００５１】
本発明において、「過剰発現された」、「過剰発現」、およびこれらの文法的バリエーションは、所与の細胞が正常細胞よりも特定のタンパク質を多く産生することを意味する。例えば、一部の腫瘍細胞は、正常胸部組織の細胞と比較して細胞表面にＨｅｒ２またはＥｒｂ２を過剰発現することが知られている。遺伝子導入実験により、ＨＥＲ２の過剰発現がＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を癌化させ、また、毒性マクロファージサイトカイン腫瘍壊死因子に対する抵抗性を上昇させることが示されている（Hudziak et al., "Amplified Expression of the HER2/ERBB2 Oncogene Induces Resistance to Tumor Necrosis Factor Alpha in NIH 3T3 Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5102-5106 (1988)）。特定の細胞におけるポリペプチドの発現レベルは、限定されるものではないが、細胞ゲノム中の種々の調節エレメントおよび／または非コード配列の変異、欠失、および／または置換に影響され得る。
【００５２】
本発明において、「処置（処理）」とは、障害に付随する１または複数の症状が有益に変化する任意の方法を意味する。したがって、この用語は、障害の症状もしくは副作用の治癒もしくは回復または障害の進行速度の低下を含む。
【００５３】
本発明において、「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、交換可能に、単数形または複数形のいずれでも使用され、宿主生物にとって病的な細胞にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。初代癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られた細胞）は、よく確立された技術、特に組織検査により、非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書で用いられる癌細胞の定義は、初代癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来するあらゆる細胞を含む。これには、転移した癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。固形腫瘍として通常現れる癌の種類に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、腫瘍塊に基づいて、例えばＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像法、Ｘ線、超音波、もしくは触診等の方法により検出可能な腫瘍であり、且つ／または患者から得ることができるサンプル中における１もしくは複数の癌特異的抗原の発現により検出可能な腫瘍である。腫瘍は、造血器腫瘍、例えば血液細胞等の腫瘍であり得る。そのような腫瘍が原因の臨床状態の具体例としては、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病等の白血病、多発性骨髄腫等の骨髄腫、リンパ腫等が含まれる。
【００５４】
癌は、異常な数の芽細胞が存在するか、白血病、骨髄性悪性腫瘍、または骨髄異形成等の血液系の癌または異形成、例えば、限定されるものではないが、未分化急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、および巨核芽球性白血病として診断される任意の癌であり得る。一態様では、癌は骨髄性悪性腫瘍癌である。別の態様では、癌は白血病である。白血病は、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性（または骨髄球性）白血病（ＣＭＬ）、および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）であり得る。一実施形態では、ヒトは原因不明性骨髄様化生および／またはプアリスク脊髄形成異常（ＭＤＳ）を有する。いくつかの態様では、癌は再発性または難治性である。
【００５５】
造血癌としては更に、リンパ節、脾臓、骨髄、末梢血液、および／または結節外部位に影響を与え得るリンパ性腫瘍が含まれる。リンパ癌としてはＢ細胞悪性腫瘍が含まれ、Ｂ細胞悪性腫瘍には、限定されるものではないが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）が含まれる。Ｂ−ＮＨＬは、無痛性（または低悪性度）、中悪性度（または侵襲性）、または高悪性度（非常に高い侵襲性）であり得る。無痛性Ｂ細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、例えば結節性ＭＺＬ、節外ＭＺＬ、脾臓ＭＺＬ、および有毛リンパ球を伴う脾臓ＭＺＬ、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、および粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴまたは節外辺縁帯）リンパ腫を含む。中悪性度のＢ−ＮＨＬには、白血病を伴うまたは伴わないマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性大細胞（またはグレード３もしくはグレード３Ｂ）リンパ腫、および縦隔原発リンパ腫（ＰＭＬ）が含まれる。高悪性度Ｂ−ＮＨＬには、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫（ＳＮＣＣＬ）、およびリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。その他のＢ−ＮＨＬとしては、免疫芽球性リンパ腫（または免疫細胞腫）、原発性滲出性リンパ腫、ＨＩＶ関連（またはＡＩＤＳ関連）リンパ腫、および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）またはリンパ腫が含まれる。Ｂ細胞悪性腫瘍は更に、限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病、急性リンパ性（またはリンパ球性もしくはリンパ芽球性）白血病、およびキャッスルマン病を含む。ＮＨＬは更に、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ）を含み得、Ｔ−ＮＨＬとしては、限定されるものではないが、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫−非特定型（ＮＯＳ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、血管免疫芽球性リンパ節症（angioimmunoblastic lymphoid disorder：ＡＩＬＤ）、鼻腔ナチュラルキラー（nasal natural killer）（ＮＫ）細胞／Ｔ細胞リンパ腫、ガンマ／デルタリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、およびセザリー症候群が含まれる。
【００５６】
造血癌はまた、古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型（ＬＰ）ホジキンリンパ腫、結節性ＬＰホジキンリンパ腫、およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫（またはホジキン病）を含む。造血癌は更に、形質細胞の疾患または癌、例えば多発性骨髄腫（ＭＭ）、例えばくすぶり型ＭＭ、意義不明（未知、不明瞭）の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、形質細胞腫（骨、髄外）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞性白血病、および原発性アミロイドーシス（ＡＬ）を含む。造血癌としては更に、多型核の白血球（または好中球）、好塩基球、好酸球、樹状細胞、血小板、赤血球、およびナチュラルキラー細胞等の更なる造血細胞のその他の癌が含まれ得る。本明細書中で「造血細胞組織」として言及される造血細胞を含む組織は、骨髄、末梢血液、胸腺、および末梢リンパ組織、例えば脾臓、リンパ節、粘膜関連リンパ組織（例えば、消化管関連リンパ組織）、扁桃腺、パイエル板、および虫垂、ならびに他の粘膜、例えば気管支内層（bronchial lining）に関連するリンパ組織を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、サンプルは、癌細胞、腫瘍細胞、細胞、血液、血液成分、尿、および唾液からなる群から選択される。
【００５８】
本発明の化合物
癌の処置を必要とするヒトにおける癌の処置方法の特定の実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、下記式ＩのＥＺＨ２阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩である：
【００５９】
【化１】
2014534178.tif 000002
［式中、
Ｗは、ＮまたはＣＲ２であり、
ＸおよびＺは、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルまたは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、ハロゲン、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＣＯＮＲａＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、および−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂからなる群からそれぞれ独立して選択され、
Ｙは、水素またはハロゲンであり、
Ｒ１は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、非置換もしくは置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、非置換もしくは置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、非置換もしくは置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換の（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロシクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換もしくは置換のアリール、非置換もしくは置換のアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、非置換もしくは置換のヘテロアリール、非置換もしくは置換のヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルもしくは−（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、または−ＣＯＮＲａＮＲａＲｂであり、
Ｒ２は、存在する場合、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、またはハロゲンであり、前記（Ｃ１−Ｃ８）アルキルは、アミノおよび（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノから選択される１〜２個の基で置換されていてよく、
Ｒ７は、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、またはアルコキシであり、Ｒ３は、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、シアノ、トリフルオロメチル、−ＮＲａＲｂ、またはハロゲンであり、
Ｒ６は、水素、ハロ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、−Ｂ（ＯＨ）２、置換または非置換の（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、非置換または置換の（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、非置換または置換の（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル、非置換または置換のヘテロシクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、非置換または置換のヘテロアリール、非置換または置換のヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＣＯＮＲａＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、および−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂからなる群から選択され、
ここで、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基はいずれも、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｒｃ）１−２、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｒｃ）１−２、−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（Ｒｃ）１−２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ヘテロシクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル−ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、およびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルからなる群から独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、
ここで、前記アリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ４）アルキルのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、シアノ、−ＣＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲａＲｂ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ニトロ、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＮＲａＳＯ２ＮＲａＲｂ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、および−ＯＣ（Ｏ）ＮＲａＲｂからなる群から独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、
各Ｒｃは、独立して（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＳＯＲａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲａＲｂ、または−ＣＯ２Ｒａであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ５−Ｃ８）シクロアルケニル、（Ｃ６−Ｃ１０）ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであり、前記（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＣＯＮ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または−ＳＯ２Ｎ（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）から独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく
あるいは、ＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される更なるヘテロ原子を含んでいてよい５〜８員飽和または不飽和環を表し、前記環は、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ、（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）（（Ｃ１−Ｃ４）アルキル）アミノ、ヒドロキシル、オキソ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、および（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから独立して選択される１、２、または３個の基で置換されていてよく、前記環は、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよく、
あるいは、ＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素と一緒に、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール環と縮合していてよい６〜１０員架橋二環系を表す］。
【００６０】
式Ｉの化合物およびその製造方法は、その全体を引用することにより本明細書の開示の範囲とされる国際公開第２０１１／１４０３２４号に開示されている。
【００６１】
更なる実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、ＷがＣＲ２である式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００６２】
更に別の実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は式Ｂで表される式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩である：
【００６３】
【化２】
2014534178.tif 000003
。
【００６４】
式Ｂで表される化合物およびその製造方法が国際公開第２０１１／１４０３２４号（例えば、実施例２７０）に開示されている。
【００６５】
別の実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、式、１−（１−メチルエチル）−Ｎ−［（６−メチル−２−オキソ−４−プロピル−１，２−ジヒドロ−３−ピリジニル）メチル］−６−［６−（４−メチル−１−ピペラジニル）−３−ピリジニル］−１Ｈ−インダゾール−４−カルボキサミドで表される化合物Ａである。
【００６６】
更なるＥＺＨ２阻害剤が当該技術分野で周知である。例えば、ＥＺＨ２阻害剤は、それぞれの全体を引用することにより本明細書の開示の範囲とされる国際公開第２０１１／１４０３２４号、国際公開第２０１１／１４０３２５号、および国際公開第２０１２／０７５０８０号に開示されている。本明細書中の実施形態のいずれかで、ＥＺＨ２阻害剤は、国際公開第２０１１／１４０３２４号、国際公開第２０１１／１４０３２５号、または国際公開第２０１２／０７５０８０号に開示されている化合物であり得る。
【００６７】
誤解のないように、特に断りのない限り、「置換」という用語は、１または複数の定義された基による置換を意味する。基が複数の代替的な基から選択され得る場合、選択される基は同じであっても異なってもよい。
【００６８】
「独立して」という用語は、複数の可能な置換基から二つ以上の基が選択される場合、それらの置換基が同じであっても異なってもよいことを意味する。
【００６９】
「有効量」とは、例えば研究者または臨床医が求める組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的反応を惹起する薬物または医薬品の量を意味する。更に、「治療有効量」という用語は、そのような量を投与されていない対応する対象と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の向上された処置、治癒、防止、もしくは改善または疾患もしくは障害の進行速度の低下が達成される任意の量を意味する。この用語の範囲には、正常な生理機能を増強するのに有効な量も含まれる。
【００７０】
本発明において、「アルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。したがって、例えば、本明細書中で使用されるように、「Ｃ１Ｃ８アルキル」という用語は、それぞれ少なくとも１個から８個までの炭素原子を有するアルキル基を指す。本発明に有用なそのような分岐鎖または直鎖アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチル、ならびに後半の５個のノルマルアルカンの分岐アナログが含まれる。
【００７１】
本発明において、「アルコキシ」という用語は、上記アルキルの定義によれば−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、および−ＯＣ（ＣＨ３）３等を含む−Ｏ（Ｃ１Ｃ８アルキル）を意味する。
【００７２】
本発明において、「アルキルチオ」という用語は、上記アルキルの定義に則った−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３等を含む−Ｓ（Ｃ１Ｃ８アルキル）を意味する。
【００７３】
「アシルオキシ」という用語は、上記アルキルの定義に則った−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１Ｃ８アルキル等を意味する。
【００７４】
「アシルアミノ」とは、上記アルキルの定義に則ったＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１Ｃ８アルキル等を意味する。
【００７５】
「アリールオキシ」とは、−Ｏ（アリール）、−Ｏ（置換アリール）、−Ｏ（ヘテロアリール）、または−Ｏ（置換ヘテロアリール）を意味する。
【００７６】
「アリールアミノ」とは、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（置換アリール）、−ＮＨ（ヘテロアリール）、または−ＮＨ（置換ヘテロアリール）等を意味する。
【００７７】
「アルケニル」（または「アルケニレン」）という用語が用いられる場合、この用語は、指定された数の炭素原子および少なくとも１個から５個までの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例としては、エテニル（またはエテニレン）およびプロペニル（またはプロペニレン）が含まれる。
【００７８】
「アルキニル」（または「アルキニレン」）という用語が用いられる場合、この用語は、指定された数の炭素原子および少なくとも１個から５個までの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例としては、エチニル（またはエチニレン）およびプロピニル（またはプロピニレン）が含まれる。
【００７９】
「ハロアルキル」とは、１または複数のハロゲン置換基、好ましくは１〜６個の置換基で置換されたアルキル基基を指す。ハロアルキルはトリフルオロメチルを包含する。
【００８０】
「シクロアルキル」が用いられる場合、これは、指定された数の炭素原子を含む非芳香族飽和環状炭化水素環を指す。したがって、例えば、「Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル」という用語は、３〜８個の炭素原子を有する非芳香族環状炭化水素環を指す。本発明において有用な「Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル」基の例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれる。
【００８１】
「Ｃ５Ｃ８シクロアルケニル」という用語は、指定された数の炭素原子および３個までの炭素−炭素二重結合を有する非芳香族単環炭素環式環を指す。「シクロアルケニル」は、例えばシクロペンテニルおよびシクロヘキセニルを包含する。
【００８２】
「Ｃ３Ｃ８ヘテロシクロアルキル」が用いられる場合、これは、Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１または複数のヘテロ原子置換を含み、指定された数の環原子を含む、飽和または１もしくは複数の程度の不飽和の非芳香族複素環式環を指す。そのような環は、１または複数の他の「複素環式」環またはシクロアルキル環と縮合していてもよい。例は後述する。
【００８３】
「アリール」とは、６〜１４個の炭素原子を有し、ヒュッケル則に従う少なくとも一つの芳香族環を有し、置換されていてもよい、単環式または多炭素環式の非縮合または縮合基を指す。アリール基の例としては、以下で更に説明するように、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル等が挙げられる。
【００８４】
「ヘテロアリール」とは、少なくとも一つの環が、ヒュッケル則に従い、指定された数の環原子を有し、その環がＮ、Ｏ、およびＳから独立して選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む、置換されていてよい多炭素環式縮合環系または芳香族単環式環を意味する。「ヘテロアリール」基の例は本明細書中で以下に記載されている。
【００８５】
「されてもよい(optionally)」という用語は、その後に記載されている事象が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、起こる事象および起こらない事象の両方を包含する。
【００８６】
本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、対象化合物の所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒物学的影響が最小限である塩を指す。これらの薬学的に許容可能な塩は、化合物の最終的な単離および精製中にその場で（in situ）、あるいは、その遊離酸または遊離塩基の形態の精製化合物をそれぞれ好適な塩基または酸と別個に反応させることにより製造され得る。
【００８７】
医薬製剤
本発明の化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物は原体（raw chemical）として投与することも可能であるが、活性成分を医薬組成物として与えることも可能である。したがって、本発明の実施形態は更に、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、化合物Ａ、または化合物Ｂ、および１または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または補形剤を含む医薬組成物を提供する。担体、希釈剤、または補形剤は、製剤のその他の成分と適合性であるという意味で許容可能でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。本発明の別の態様によれば更に、式Ｉ、化合物Ａ、または化合物Ｂの化合物を１または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または補形剤と混合することを含む医薬製剤の製造プロセスが提供される。
【００８８】
医薬製剤は、単位用量当たり所定の量の活性成分を含む単位用量形態（unit dose form）で与えられ得る。そのような単位は、処置される状態、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、および状態に応じて、例えば０．５ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜８００ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含み得る。好ましい単位投与量製剤（unit dosage formulation）は、前述したような一日用量またはサブ用量、またはその適切な分割量（fraction）の活性成分を含むものである。更に、そのような医薬製剤は、当該技術分野、例えば薬学分野の熟練者に周知の方法のいずれかによって製造され得る。
【００８９】
医薬製剤は、任意の適切な経路による、例えば経口（頬側または舌下を含む）、直腸、経鼻、局所、（頬側、舌下、または経皮を含む）、腟内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、または皮内を含む）経路による投与に適応し得る。そのような製剤は、薬学分野で公知の任意の方法で、例えば活性成分を担体または補形剤と会合させることにより製造され得る。
【００９０】
経口投与に適応する医薬製剤は、個別の単位、例えばカプセル剤または錠剤、散剤または顆粒剤、水性または非水性液体中の、液剤または懸濁剤、食用の泡（edible foam）またはホイップ、水中油滴型液体エマルションまたは油中水滴型液体エマルションであり得る。
【００９１】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与するために、活性薬物成分をエタノール、グリセロール、水等の薬学的に許容可能な経口非毒性不活性担体と組み合わせることができる。散剤は、化合物を好適な微細サイズに粉砕し、同様に粉砕した、例えばデンプンまたはマンニトール等の食用炭水化物等の薬学的担体と混合することにより製造される。香味剤、保存剤、分散剤、および着色剤も存在してよい。
【００９２】
カプセル剤は、上記のように粉末混合物を調製し、形成されたゼラチン被覆に充填することにより製造される。滑剤および滑沢剤、例えばコロイダルシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、または固体ポリエチレングリコールを充填作業の前に粉末混合物に添加することができる。崩壊剤または可溶化剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムを添加して、カプセル剤が摂取された時の医薬の利用能を改善することもできる。
【００９３】
更に、所望であれば、または必要であれば、混合物中に好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を組み込むこともできる。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはベータ−ラクトース、コーン甘味料、天然および合成のゴム、例えばアカシア、トラガント、またはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれる。これらの剤形で使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤としては、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。錠剤は、例えば粉末混合物を調製し、造粒またはスラッギング（slugging）し、滑沢剤および崩壊剤を加え、錠剤へとプレスすることにより製剤化される。粉末混合物は、好適に粉砕された化合物を前述の希釈剤または基剤ならびに任意で結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩（ａｌｉｇｉｎａｔｅ）、ゼラチン、またはポリビニルピロリドン、溶解遅延剤、例えばパラフィン、吸収促進剤、例えば第四級塩および／または吸収剤、例えばベントナイト、カオリン、またはリン酸二カルシウムと混合することにより調製される。粉末混合物は、結合剤、例えばシロップ、デンプン糊、アカディア粘液、またはセルロース系もしくは高分子系の材料の溶液で湿らせて篩に押し通すことで造粒することができる。造粒する代わりに、粉末混合物を打錠機に通し、不完全形成スラグを得て顆粒に砕いてもよい。打錠用ダイへの付着を防ぐために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、またはミネラル油を加えることにより顆粒を滑らかにしてもよい。次いで、滑らかにした混合物を打錠する。本発明の化合物はまた、自由に流動することができる不活性担体と組み合わせ、造粒またはスラグ化工程を介さずに直接打錠してもよい。セラックのシーリングコート、糖または高分子材料のコーティング、およびワックスの光沢コーティング（ｐｏｌｉｓｈ  ｃｏａｔｉｎｇ）からなる透明または不透明な保護コーティングを設けてもよい。異なる単位投与量を識別するために、これらのコーティングに色素を添加してもよい。
【００９４】
内服用の流体、例えば液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤は、所与の量が所定の量の化合物を含むように投与単位形態(dosage unit form)で調製することができる。シロップ剤は、好適に香味付けした水溶液に化合物を溶解することで調製することができ、エリキシル剤は、非毒性アルコール溶媒を用いて調製される。懸濁剤は、化合物を非毒性溶媒中に分散させることで製剤化することができる。可溶化剤および乳化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテル、保存剤、香味添加剤、例えばペパーミントオイル、天然甘味剤、サッカリン、またはその他の人工甘味剤等も添加することができる。
【００９５】
適切な場合、経口投与用の投与単位製剤(dosage unit formulation)をマイクロカプセル化することができる。製剤はまた、例えば微粒子材料をポリマー、ワックス等の中にコーティングするか埋め込むことにより、放出が延長または持続されるように調製することができる。
【００９６】
投与単位製剤は、当業者が提供することができるｉ．ｖ．送達用の形態であってもよい。
【００９７】
投与単位形態（例えばｉ．ｖ．送達用）は、リポソーム送達システムの形態、例えば小さな単層リポソーム(small unilamellar vesicle)、大きな単層リポソーム(large unilamellar vesicle)、および多重層リポソーム(multilamellar vesicle)であってもよい。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリン、または当業者に公知のその他の形態から形成され得る。
【００９８】
上記で具体的に述べた成分に加えて、製剤は、問題の製剤の種類に関連してこの分野で通常用いられるその他の薬剤を含み得る（例えば経口投与に適したものは着香料を含み得る）と理解するべきである。
【００９９】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の治療有効量は複数の要因、例えば、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、製剤の性質、ならびに投与経路に依存し、最終的には主治医または獣医の裁量による。しかし、本明細書に記載したような癌状態を処置するための式（Ｉ）の化合物またはその塩の有効量は通常、レシピエント（哺乳動物）の体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１００ｍｇであり、より一般的には体重１ｋｇ当たり１日１〜１２ｍｇである。したがって、７０ｋｇの成体の哺乳動物では、１日当たりの実際の量は通常、７０〜８４０ｍｇであり、この量は１日１回用量で与えられてもよく、より一般的には１日の総用量が同じになるように１日複数回（例えば２、３、４、５、または６回）のサブ用量で与えられてもよい。その塩または溶媒和物の有効量は、式（Ｉ）の化合物自体の有効量に対する割合として決定され得る。同様な投与量が上記で言及したその他の状態の処置にも適切であると考えられる。
【０１００】
本発明のこれらの態様に係る投与または処方される化合物の量は、複数の要因、例えば、患者の年齢および体重、処置が必要な正確な状態、状態の重症度、製剤の性質、投与経路等に依存する。最終的に、この量は主治医の裁量による。
【０１０１】
組合せおよび更なる抗新生物剤
特定の実施形態では、本発明の方法は１または複数の更なる抗新生物剤を投与することを更に含んでなる。
【０１０２】
ＥＺＨ２阻害剤、限定されるものではないが例えば式Ｉ、化合物Ａ、または化合物Ｂが癌の処置のために投与される場合、「共投与する」という用語およびその派生形は、本明細書中で使用されるように、本明細書に記載のＥＺＨ２阻害化合物と、化学療法および放射線照射処置等の癌の処置において有用であることが知られている更なる活性成分との同時投与または任意の様式による別個の逐次投与を意味する。更なる活性成分という用語は、本明細書中で使用されるように、癌の処置を必要とする患者に投与された時の有益な特性が知られているまたは実証されているあらゆる化合物または治療薬剤を含む。投与が同時でない場合、化合物は互いに近い時間で投与される。更に、化合物が同じ製剤で投与されるか否かは問題ではなく、例えば、一つの化合物が局所または静脈内（ｉ．ｖ．）投与され、別の化合物が経口投与であってもよい。
【０１０３】
典型的には、処置されている感受性の腫瘍または癌（例えばリンパ腫）に対する活性を有する任意の抗新生物剤が本発明における癌の処置において共投与され得る。そのような薬剤の例はCancer Principles and Practice f Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見つけることができる。当業者であれば、関係する薬物および癌の具体的性質に基づいて、どの薬剤の組合せが有用であるかを知ることができる。本発明において有用な典型的な抗新生物剤としては、限定されるものではないが、リンパ腫の任意の処置、例えば、リツキシマブと、ＤＮＡアルキル化架橋剤であるシクロホスファミドと、ＤＮＡ挿入剤であるヒドロキシダウノルビシン（すなわち、ドキソルビシンまたはアドリアマイシン）と、チューブリンタンパク質に結合して細胞分裂を阻害するオンコビン（ビンクリスチン）と、コルチコステロイドであるプレドニゾンまたはプレドニゾロンとを含んでなる、非ホジキンリンパ腫に対する５つの成分による処置であるＲ−ＣＨＯＰ、ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＶＰ（Ｒ−ＣＨＯＰに類似しており、リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロン／プレドニゾンを含んでなる）、ＣＶＰ、ボルテゾミブ、ベンダムスチン、アレムツズマブ、および放射免疫療法（例えば、イブリツモマブ（ゼヴァリン）、トシツモマブ（ベキサール））が含まれる。
【０１０４】
本発明において有用なその他の典型的な抗新生物剤としては、限定されるものではないが、クラスＩおよびクラスＩＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、ボリノスタット）、ＤＮＡメチラーゼ阻害剤（例えば、デシタビンまたはアザシチジン）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害剤（例えば、ｐ３００およびＰＣＡＦ阻害剤）、微小管阻害剤、例えばジテルペノイドおよびビンカアルカロイド、白金配位化合物、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホナート、ニトロソウレア、およびトリアゼン、抗生剤、例えばアントラサイクリン、アクチノマイシン、およびブレオマイシン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばエピポドフィロトキシン、代謝拮抗薬、例えばプリンおよびピリミジンアナログならびに葉酸代謝拮抗化合物、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばカンプトテシン、ホルモンおよびホルモンアナログ、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体型チロシンキナーゼ血管新生抑制薬、免疫療法剤、アポトーシス促進剤、および細胞周期シグナル伝達阻害剤が含まれる。
【０１０５】
本発明のＥＺＨ２阻害化合物と組み合せて使用するためのまたは共投与される更なる活性成分の例としては化学療法剤が挙げられる。
【０１０６】
微小管阻害剤または有糸分裂阻害剤は、細胞周期のＭ期、すなわち分裂期の腫瘍細胞の微小管に対して活性な周期特異的薬剤（phase specific agent）である。微小管阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが含まれる。
【０１０７】
天然供給源に由来するジテルペノイドは、細胞周期のＧ２／Ｍ期に作用する周期特異的抗癌剤である。ジテルペノイドは、微小管のβチューブリンサブユニットとの結合によりこのタンパク質を安定化すると考えられている。次いで、タンパク質の解体が阻害されて、有糸分裂が停止し、細胞死が起こるようである。ジテルペノイドの例としては、限定されるものではないが、パクリタキセルおよびそのアナログであるドセタキセルが含まれる。
【０１０８】
パクリタキセル、すなわち（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンとの５β，２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサ−ヒドロキシタキサ−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセタート２−ベンゾアート１３−エステルは、北大西洋のイチイ属の木であるタイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）から単離された天然ジテルペン製品であり、注射用液剤ＴＡＸＯＬ（商標）として市販されている。これはテルペンのタキサンファミリーのメンバーである。これは、化学的およびＸ線結晶学的方法でその構造を解析したWani et al. J. Am. Chem, Soc., 93:2325. 1971）によって１９７１年に最初に単離された。その活性機構の一つは、パクリタキセルがチューブリンに結合することで癌細胞の成長を阻害する能力に関連する（Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980)、Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979)、Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981)）。いくつかのパクリタキセル誘導体の合成および抗癌活性の概括については、D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, “New trends in Natural Products Chemistry 1986”, Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235を参照されたい。
【０１０９】
パクリタキセルは米国において難治性卵巣癌の処置（Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991、McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111:273,1989）および乳癌の処置（Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991）における臨床使用が承認されている。パクリタキセルは、皮膚癌（Einzig et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46）および頭頸部癌（Forastire et. al., Sem. Oncol., 20:56, 1990）における新生物の処置に有望な候補である。この化合物はまた、多発性嚢胞腎疾患（Woo et. al., Nature, 368:750. 1994）、肺癌、およびマラリアの処置にも可能性を示している。パクリタキセルで患者を処置すると、閾値濃度（５０ｎＭ）（Kearns, C.M. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995）を超える投薬期間に関連して、骨髄抑制が起こる（複数の細胞系統、Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998）。
【０１１０】
ドセタキセル、すなわち５β−２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサヒドロキシタキサ−１１−エン−９−オン４−アセタート２−ベンゾアート，三水和物との（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステルは、注射用液剤としてＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）として市販されている。ドセタキセルは乳癌の処置に適応される。ドセタキセルは、ヨーロッパイチイの木の針葉から抽出される天然の前駆物質１０−デアセチル−バッカチンＩＩＩを用いて製造されるパクリタキセル（ｑ．ｖ．）の半合成誘導体である。ドセタキセルの用量制限毒性は好中球減少症である。
【０１１１】
ビンカアルカロイドは、ニチニチソウに由来する周期特異的な抗新生物剤である。ビンカアルカロイドは、チューブリンに特異的に結合することにより細胞周期のＭ期（有糸分裂）に作用する。その結果、結合チューブリン分子は重合して微小管を形成することができなくなる。有糸分裂が中期に停止した後、細胞死が起こると考えられている。ビンカアルカロイドの例としては、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１１２】
ビンブラスチン、すなわちビンカロイコブラスチン硫酸塩は、ＶＥＬＢＡＮ（商標）として注射用液剤として市販されている。これは様々な固形腫瘍の第二選択治療として可能な適応を有するが、精巣癌および種々のリンパ腫、例えばホジキン病、ならびにリンパ球性リンパ腫および組織球性リンパ腫の処置に主に適応される。ビンブラスチンの用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１１３】
ビンクリスチン、すなわちビンカロイコブラスチン，２２−オキソ−，硫酸塩は、ＯＮＣＯＶＩＮ（商標）として注射用液剤として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の処置に適応され、ホジキンおよび非ホジキン悪性リンパ腫の治療レジメンにも使用される。脱毛症および神経学的効果がビンクリスチンの最も一般的な副作用であり、それより軽い程度で、骨髄抑制および胃腸粘膜炎効果が生じる。
【０１１４】
ビノレルビン、すなわち３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−Ｃ’−ノルビンカロイコブラスチン［Ｒ−（Ｒ＊，Ｒ＊）−２，３−ジヒドロキシブタンジオアート（１：２）（塩）］は、酒石酸ビノレルビンの注射用液剤として市販されており（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（商標））、半合成ビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、種々の固形腫瘍、特に非小細胞肺癌、進行性乳癌、およびホルモン不応性前立腺癌の処置において、単一の薬剤または他の化学療法剤、例えばシスプラチンとの併用で適応される。ビノレルビンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１１５】
白金配位錯体は、ＤＮＡと相互作用する周期特異的でない抗癌剤である。白金錯体は、腫瘍細胞に入り、アクア化し、ＤＮＡと鎖内および鎖間架橋を形成して、腫瘍に有害な生物学的効果を生じる。白金配位錯体の例としては、限定されるものではないが、シスプラチンおよびカルボプラチンが含まれる。
【０１１６】
シスプラチン、すなわちシス−ジアミンジクロロ白金は、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（商標）として注射用液剤として市販されている。シスプラチンは、転移性の精巣癌および卵巣癌ならびに進行膀胱癌の処置に主に適応される。シスプラチンの主な用量制限副作用は、水分摂取および利尿により制御され得る腎毒性、ならびに中毒性難聴である。
【０１１７】
カルボプラチン、すなわち白金，ジアミン［１，１−シクロブタン−ジカルボキシラート（２−）−Ｏ，Ｏ’］は、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（商標）として注射用液剤として市販されている。カルボプラチンは、進行卵巣癌の第一および第二選択処置で主に適応される。カルボプラチンの用量制限毒性は骨髄抑制である。
【０１１８】
アルキル化剤は、周期非特異的な抗癌剤であり、強力な求電子剤である。典型的には、アルキル化剤は、アルキル化により、リン酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、イミダゾール基等のＤＮＡ分子の求核部分を介してＤＮＡに共有結合を形成する。このようなアルキル化は、核酸機能を乱し、細胞死を招く。アルキル化剤の例としては、限定されるものではないが、ナイトロジェンマスタード、例えばシクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル、アルキルスルホナート、例えばブスルファン、ニトロソウレア、例えばカルムスチン、ならびにトリアゼン、例えばダカルバジンが含まれる。
【０１１９】
シクロホスファミド、すなわち２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサザホスホリン２−オキシド一水和物は、注射用液剤または錠剤としてＣＹＴＯＸＡＮ（商標）として市販されている。シクロホスファミドは、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤との併用で適応される。シクロホスファミドの最も一般的な用量制限副作用は脱毛症、悪心、嘔吐、および白血球減少症である。
【０１２０】
メルファラン、すなわち４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンは、注射用液剤または錠剤としてＡＬＫＥＲＡＮ（商標）として市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および切除不能な卵巣の上皮癌の緩和処置に適応される。メルファランの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１２１】
クロラムブシル、すなわち４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンゼンブタン酸は、ＬＥＵＫＥＲＡＮ（商標）錠として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病ならびに悪性リンパ腫、例えばリンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫、およびホジキン病の緩和処置に適応される。クロラムブシルの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１２２】
ブスルファン、すなわち１，４−ブタンジオールジメタンスルホナートは、ＭＹＬＥＲＡＮ（商標）錠として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の緩和処置に適応される。ブスルファンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１２３】
カルムスチン、すなわち１，３−［ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレアは、凍結乾燥材料の単一バイアルとしてＢｉＣＮＵ（商標）として市販されている。カルムスチンは、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫に対して単一薬剤としてまたは他の薬剤と併用して緩和処置に適応される。カルムスチンの最も一般的な用量制限副作用は遅発性の骨髄抑制である。
【０１２４】
ダカルバジン、すなわち５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドは、単一バイアルの材料としてＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（商標）として市販されている。ダカルバジンは、転移性悪性メラノーマの処置に適応され、また、ホジキン病の第二選択処置に他の薬剤と併用して適応される。ダカルバジンの最も一般的な用量制限副作用は悪心、嘔吐、および食欲不振である。
【０１２５】
抗生物質抗新生物剤は、ＤＮＡに結合またはインターカレートする、周期非特異的な薬剤である。典型的には、このような作用は、ＤＮＡ複合体を安定化するか鎖を破壊して核酸の通常の機能を乱し、細胞死を招く。抗生物質抗新生物剤の例としては、限定されるものではないが、アクチノマイシン、例えばダクチノマイシン、アンスロサイクリン、例えばダウノルビシンおよびドキソルビシン、ならびにブレオマイシンが含まれる。
【０１２６】
ダクチノマイシンは、アクチノマイシンＤとしても知られ、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（商標）として注射用の形態で市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルムス腫瘍および横紋筋肉腫の処置に適応される。ダクチノマイシンの最も一般的な用量制限副作用は悪心、嘔吐、および食欲不振である。
【０１２７】
ダウノルビシン、すなわち（８Ｓ−シス−）−８−アセチル−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、注射可能なリポソーム形態としてＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（商標）としてまたは注射剤としてＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（商標）として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ球性白血病および進行ＨＩＶ関連カポジ肉腫の処置における寛解導入に適応される。ダウノルビシンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１２８】
ドキソルビシン、すなわち（８Ｓ、１０Ｓ）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−８−グリコロイル、７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、ＲＵＢＥＸ（商標）またはＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ  ＲＤＦ（商標）として注射可能な形態で市販されている。ドキソルビシンは、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の処置に主に適応されるが、一部の固形腫瘍およびリンパ腫の処置においても有用な成分である。ドキソルビシンの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。
【０１２９】
ブレオマイシンは、Streptomyces verticillusの株から単離された細胞毒性グリコペプチド抗生物質の混合物であり、ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（商標）として市販されている。ブレオマイシンは、単一薬剤としてまたは他の薬剤と併用して、扁平細胞癌、リンパ腫、および精巣癌の緩和療法に適応される。ブレオマイシンの最も一般的な用量制限副作用は肺毒性および皮膚毒性である。
【０１３０】
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としてはエピポドフィロトキシンが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１３１】
エピポドフィロトキシンは、マンドレークに由来する周期特異的抗新生物剤である。エピポドフィロトキシンは通常、トポイソメラーゼＩＩおよびＤＮＡと三元複合体を形成してＤＮＡ鎖を破壊することにより細胞周期のＳ期およびＧ２期の細胞に影響を与える。鎖の破壊が蓄積し、細胞死が起こる。エピポドフィロトキシンの例としては、限定されるものではないが、エトポシドおよびテニポシドが含まれる。
【０１３２】
エトポシド、すなわち４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射用液剤もしくはカプセル剤としてＶｅＰＥＳＩＤ（商標）として市販されており、ＶＰ−１６として一般的に知られる。エトポシドは、精巣癌および非小細胞肺癌の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。エトポシドの最も一般的な副作用は骨髄抑制である。白血球減少症の発生が血小板減少症より重度な傾向がある。
【０１３３】
テニポシド、すなわち４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−テニリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射用液剤としてＶＵＭＯＮ（商標）として市販されており、ＶＭ−２６として一般的に知られる。テニポシドは、小児の急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。テニポシドの最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制である。テニポシドは白血球減少症および血小板減少症の両方を誘発し得る。
【０１３４】
代謝拮抗新生物剤は、ＤＮＡ合成を阻害するかプリンまたはピリミジンの塩基合成を阻害することによりＤＮＡ合成を制限することで細胞周期のＳ期（ＤＮＡ合成）に作用する周期特異的な抗新生物剤である。これにより、Ｓ期が進行せず、細胞死が起こる。代謝拮抗抗新生物剤の例としては、限定されるものではないが、フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メカプトプリン、チオグアニン、およびゲムシタビンが含まれる。
【０１３５】
５−フルオロウラシル、すなわち５−フルオロ−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）ピリミジンジオンはフルオロウラシルとして市販されている。５−フルオロウラシルは投与されるとチミジル酸合成を阻害し、更にＲＮＡおよびＤＮＡの両方に取り込まれる。その結果、通常、細胞死が起こる。５−フルオロウラシルは乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、および膵臓癌の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。５−フルオロウラシルの用量制限副作用は骨髄抑制および粘膜炎である。他のフルオロピリミジンアナログとしては、５−フルオロデオキシウリジン（フロクスウリジン）および５−フルオロデオキシウリジン一リン酸が含まれる。
【０１３６】
シタラビン、すなわち４−アミノ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノンは、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（商標）として市販されており、Ａｒａ−Ｃとして一般的に知られる。シタラビンは、成長しているＤＮＡ鎖中へのシタラビンの末端取り込みによりＤＮＡ鎖伸張を阻害することによりＳ期に細胞周期特異性を示すと考えられている。シタラビンは、急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。他のシチジンアナログとしては、５−アザシチジンおよび２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）が含まれる。シタラビンは白血球減少症、血小板減少症、および粘膜炎を誘発する。
【０１３７】
メルカプトプリン、すなわち１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオン一水和物は、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（商標）として市販されている。メルカプトプリンはまだ特定されていない機構によりＤＮＡ合成を阻害することによりＳ期に細胞周期特異性を示す。メルカプトプリンは急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。高用量のメルカプトプリンの予想される副作用は骨髄抑制および胃腸粘膜炎である。有用なメルカプトプリンアナログはアザチオプリンである。
【０１３８】
チオグアニン、すなわち２−アミノ−１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオンは、ＴＡＢＬＯＩＤ（商標）として市販されている。チオグアニンはまだ特定されていない機構によりＤＮＡ合成を阻害することでＳ期に細胞周期特異性を示す。チオグアニンは、急性白血病の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。チオグアニン投与の最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制、例えば白血球減少症、血小板減少症、および貧血であるが、胃腸の副作用が生じることもあり、これが用量制限となることもある。他のプリンアナログとしては、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビンが含まれる。
【０１３９】
ゲムシタビン、すなわち２’−デオキシ−２’、２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（β異性体）は、ＧＥＭＺＡＲ（商標）として市販されている。ゲムシタビンはＧ１／Ｓ境界で細胞進行をブロックすることによりＳ期に細胞周期特異性を示す。ゲムシタビンは局所進行性非小細胞肺癌の処置においてシスプラチンと併用しておよび局所進行性膵臓癌の処置において単独で適応される。ゲムシタビン投与の最も一般的な用量制限副作用は骨髄抑制、例えば白血球減少症、血小板減少症、および貧血である。
【０１４０】
メトトレキサート、すなわちＮ−［４［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸はメトトレキサートナトリウムとして市販されている。メトトレキサートは、プリンヌクレオチドおよびチミジル酸の合成に必要なジヒドロ葉酸還元酵素の阻害を介してＤＮＡの合成、修復、および／または複製を阻害することにより、Ｓ期で特異的に細胞周期に影響を与える。メトトレキサートは、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫、ならびに乳癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌、および膀胱癌の処置において単一薬剤としてまたは他の化学療法剤と併用して適応される。メトトレキサート投与の予想される副作用は骨髄抑制（白血球減少症、血小板減少症、および貧血）および粘膜炎である。
【０１４１】
カンプトテシン、例えば、カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体は、トポイソメラーゼＩ阻害剤として入手可能であるか開発中である。カンプトテシンの細胞毒性活性は、そのトポイソメラーゼＩ阻害活性に関連すると考えられている。カンプトテシンの例としては、限定されるものではないが、イリノテカン、トポテカン、および後述する種々の光学的形態の７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０−カンプトテシンが含まれる。
【０１４２】
イリノテカンＨＣｌ、すなわち（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４−ヒドロキシ−９−［（４−ピペリジノピペリジノ）カルボニルオキシ］−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン塩酸塩は、注射用液剤ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（商標）として市販されている。
【０１４３】
イリノテカンは、その活性代謝物質ＳＮ−３８と共にトポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体に結合するカンプトテシンの誘導体である。トポイソメラーゼＩ：ＤＮＡ：イリンテカンまたはＳＮ−３８三元複合体と複製酵素の相互作用によって生じる修復不能な二本鎖破壊により細胞毒性が生じると考えられている。イリノテカンは結腸または直腸の転移性癌の処置に適応される。イリノテカンＨＣｌの用量制限副作用は好中球減少症等の骨髄抑制および下痢等の胃腸への影響である。
【０１４４】
トポテカンＨＣｌ、すなわち（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン一塩酸は、注射用液剤ＨＹＣＡＭＴＩＮ（商標）として市販されている。トポテカンは、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体に結合するカンプトテシンの誘導体であり、ＤＮＡ分子の鎖のねじれに応答してトポイソメラーゼＩにより生じる一本鎖破損部分の再ライゲーションを防ぐ。トポテカンは転移性卵巣癌および小細胞肺癌の第二選択処置に適応される。トポテカンＨＣｌの用量制限副作用は骨髄抑制、主に好中球減少症である。
【０１４５】
また、ラセミ混合物（Ｒ，Ｓ）形態ならびにＲおよびＳエナンチオマーを含む、化学名「７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｒ，Ｓ）−カンプトテシン（ラセミ混合物）または「７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｒ）−カンプトテシン（Ｒエナンチオマー）または「７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン（Ｓエナンチオマー）で知られる、現在開発中の下記式Ｆ
【０１４６】
【化３】
2014534178.tif 000004
のカンプトテシン誘導体も興味深い。製造方法を含むこのような化合物および関連化合物は、米国特許第６，０６３，９２３号、同第５，３４２，９４７号、同第５，５５９，２３５号、同第５，４９１，２３７号、および１９９７年１１月２４日付で提出された係属中の米国特許出願第０８／９７７，２１７号に記載されている。
【０１４７】
ホルモンおよびホルモンアナログは、ホルモンと癌の成長および／または成長の欠如との間に関係がある癌の処置に有用な化合物である。癌の処置に有用なホルモンおよびホルモンアナログの例としては、限定されるものではないが、小児の悪性リンパ腫および急性白血病の処置に有用な副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾンおよびプレドニゾロン、副腎皮質癌およびエストロゲン受容体を含むホルモン依存性乳癌の処置に有用な、アミノグルテチミドおよびその他のアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール、およびエキセメスタン、ホルモン依存性乳癌および子宮内膜癌の処置に有用なプロゲストリン、例えば酢酸メゲストロール、前立腺癌および良性前立腺肥大症の処置に有用な、エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン剤（例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン）、および５α還元酵素、例えばフィナステリドおよびデュタステリド、ホルモン依存性乳癌およびその他の感受性癌の処置に有用な、抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、ならびに米国特許第５，６８１，８３５号、同第５，８７７，２１９号、および同第６，２０７，７１６号に記載されているような選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭＳ）、ならびに前立腺癌を処置するための、黄体ホルモン（ＬＨ）および／または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激する生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およびそのアナログ、例えばＬＨＲＨアゴニストおよびアンタガゴニスト、例えば酢酸ゴセレリンおよびルプロリドが含まれる。
【０１４８】
レトロゾール（商標フェマーラ）は、手術後のホルモン応答性乳癌を処置するための経口非ステロイド性アロマターゼ阻害剤である。アロマターゼ酵素の活性を介したアンドロゲンの変換によりエストロゲンが産生される。その後、エストロゲンはエストロゲン受容体に結合し、細胞を分裂させる。レトロゾールは、アロマターゼのチトクロームＰ４５０ユニットのヘムに競合的且つ可逆的に結合して、アロマターゼによるエストロゲンの産生を妨げる。この作用は特異的であり、レトロゾールはミネラルコルチコイドまたはコルチコステロイドの産生を減少させない。
【０１４９】
シグナル伝達経路阻害剤とは、細胞内変化を引き起こす化学的プロセスをブロックまたは阻害する阻害剤である。本明細書において、この変化は細胞増殖または分化である。本発明において有用なシグナル伝達阻害剤としては、受容体型チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、ＳＨ２／ＳＨ３ドメインブロッカー、セリン／スレオニンキナーゼ、ホスフォチジルイノシトール−３キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達、およびＲａｓ癌遺伝子の阻害剤が含まれる。
【０１５０】
複数のタンパク質チロシンキナーゼが、細胞成長の制御に関与する種々のタンパク質の特異的チロシル残基のリン酸化を触媒する。そのようなタンパク質チロシンキナーゼは、受容体型または非受容体型キナーゼとしておおまかに分類することができる。
【０１５１】
受容体型チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを有する膜貫通タンパク質である。受容体型チロシンキナーゼは、細胞成長の制御に関わり、一般に成長因子受容体と呼ばれる。これらのキナーゼの多くの不適切なまたは制御されていない活性化、すなわち異常なキナーゼ成長因子受容体活性（例えば過剰発現または変異による）は、制御されない細胞成長を招くことが示されている。したがって、そのようなキナーゼの活性異常が悪性腫瘍の成長に関連付けられている。したがって、そのようなキナーゼの阻害剤は癌の処置方法を提供し得る。成長因子受容体としては、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦｒ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ４、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦｒ）、免疫グロブリン様および上皮成長因子相同性領域（ＴＩＥ−２）を有するチロシンキナーゼ、インスリン成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（ｃｆｍｓ）、ＢＴＫ、ｃｋｉｔ、ｃｍｅｔ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、Ｔｒｋ受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ）、エフリン（ｅｐｈ）受容体、ならびにＲＥＴ癌原遺伝子が含まれる。成長受容体の阻害剤が複数開発中であり、これにはリガンドアンタゴニスト、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。成長因子受容体および成長因子受容体機能を阻害する薬剤は、例えば、Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818、Shawver et al DDT Vol 2, No. 2 February 1997、およびLofts, F. J. et al, “Growth factor receptors as targets”, New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０１５２】
成長因子受容体キナーゼでないチロシンキナーゼは非受容体型チロシンキナーゼと呼ばれる。抗癌薬の標的または標的候補である本発明に有用な非受容体型チロシンキナーゼとしては、ｃＳｒｃ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｊａｋ、ｃＡｂｌ、ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）、ブルトン型チロシンキナーゼ、およびＢｃｒ−Ａｂｌが含まれる。このような非受容体型キナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤はSinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80、 and Bolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
【０１５３】
ＳＨ２／ＳＨ３ドメインブロッカーとは、ＰＩ３−Ｋ  ｐ８５サブユニット、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、アダプター分子（Ｓｈｃ、Ｃｒｋ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２）、およびＲａｓ−ＧＡＰを含む種々の酵素またはアダプタータンパク質中のＳＨ２またはＳＨ３ドメイン結合を乱す薬剤である。抗癌薬の標的としてのＳＨ２／ＳＨ３ドメインがSmithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32に考察されている。
【０１５４】
Ｒａｆキナーゼ（ｒａｆｋ）、マイトジェンまたは細胞外制御キナーゼ（ＭＥＫ）、および細胞外制御キナーゼ（ＥＲＫ）のブロッカーを含むＭＡＰキナーゼカスケードブロッカーを含むセリン／スレオニンキナーゼの阻害剤、およびＰＫＣ（アルファ、ベータ、ガンマ、イプシロン、ミュー、ラムダ、イオタ、ゼータ）のブロッカーを含むタンパク質キナーゼＣファミリーメンバーブロッカー、ＩｋＢキナーゼファミリー（ＩＫＫａ、ＩＫＫｂ）、ＰＫＢファミリーキナーゼ、ＡＫＴキナーゼファミリーメンバー、およびＴＧＦベータ受容体キナーゼ。そのようなセリン／スレオニンキナーゼおよびその阻害剤はYamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803、Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107、Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64、Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226、米国特許第６，２６８，３９１号、および Martinez-Iacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
【０１５５】
ＰＩ３−キナーゼ、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫ、およびＫｕのブロッカーを含むホスフォチジルイノシトール−３キナーゼファミリーメンバーの阻害剤も本発明に有用である。このようなキナーゼはAbraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8、Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308、Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8、およびZhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545に考察されている。
【０１５６】
ホスホリパーゼＣブロッカーおよびミオイノシトールアナログ等のミオイノシトールシグナル伝達阻害剤も本発明に有用である。このようなシグナル阻害剤はPowis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０１５７】
もう一つのグループのシグナル伝達経路阻害剤はＲａｓ癌遺伝子の阻害剤である。そのような阻害剤としては、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニル−ゲラニルトランスフェラーゼ、およびＣＡＡＸプロテアーゼの阻害剤ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および免疫療法が含まれる。このような阻害剤は、野生型変異体ｒａｓを含む細胞中でｒａｓ活性化をブロックすることにより抗増殖剤として作用することが示されている。Ｒａｓ癌遺伝子阻害についてはScharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8、Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102、およびBennett, C.F. and Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489(1):19-30に記載されている。
【０１５８】
前述したように、受容体型キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストもシグナル伝達阻害剤となり得る。このグループのシグナル伝達経路阻害剤としては、受容体型チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用が含まれる。例として、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｃ２２５  ＥＧＦＲ特異的抗体（Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286参照）、ハーセプチン（商標）ｅｒｂＢ２抗体（Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照）、および２ＣＢ  ＶＥＧＦＲ２特異的抗体（Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照）が挙げられる。
【０１５９】
非受容体型キナーゼ血管新生阻害剤も本発明に有用であり得る。血管新生関連ＶＥＧＦＲおよびＴＩＥ２の阻害剤はシグナル伝達阻害剤に関連して上記で説明されている（どちらの受容体も受容体型チロシンキナーゼである）。ｅｒｂＢ２およびＥＧＦＲの阻害剤が血管新生、主にＶＥＧＦの発現を阻害することが示されているので、血管新生は一般的にｅｒｂＢ／ＥＧＦＲシグナル伝達と関連付けられる。したがって、ｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲ阻害剤と血管新生阻害剤の組合せは理に適っている。したがって、非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は本発明のＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２阻害剤と併用され得る。例えば、ＶＥＧＦＲ（受容体型チロシンキナーゼ）を認識しないがリガンドに結合する抗ＶＥＧＦ抗体、血管新生を阻害するインテグリン（αｖ、β３）の小分子阻害剤、エンドスタチンおよびアンジオスタチン（非ＲＴＫ）も、開示されているｅｒｂファミリー阻害剤との併用に有用であることが示され得る（Bruns CJ et al (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935、Schreiber AB, Winkler ME, and Derynck R. (1986), Science, 232: 1250-1253、Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469参照）。
【０１６０】
ヴォトリエント（商標）として市販されているパゾパニブはチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。パゾパニブは、化学名５−［［４−［（２，３−ジメチル−２Ｈ−インダゾール−６−イル）メチルアミノ］−２−ピリミジニル］アミノ］−２−メチルベンゼンスルホンアミド一塩酸塩で塩酸塩として提供される。パゾポニブは進行腎細胞癌の患者の処置に承認されている。
【０１６１】
アバスチン（商標）として市販されているベバシスマブは、ＶＥＧＦ−Ａをブロックするヒト化モノクローナル抗体である。アバスチン（商標）は、結腸直腸、肺、胸、腎臓、および膠芽腫等の種々の癌の処置に承認されている。
【０１６２】
ｍＴＯＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、ラパマイシン（ＦＫ５０６）およびラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）、ＲＡＤ００１すなわちエベロリムス（アフィニトール）、ＣＣＩ−７７９すなわちテムシロリムス、ＡＰ２３５７３、ＡＺＤ８０５５、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６００、ＷＹＥ−６８７、およびＰｐ１２１が含まれる。
【０１６３】
エベロリムスは、ノバルティス社からアフィニトール（商標）として販売されており、シロリムスの４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）誘導体であり、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的）阻害剤としてシロリムスと同様に作用する。これは現在、臓器移植片の拒絶を防止するための免疫抑制薬および腎細胞癌の処置として使用されている。複数の癌における使用について、エベロリムスおよび他のｍＴＯＲ阻害剤について多くの研究がなされてきた。これは以下の化学構造（式Ｖ）および化学名を有する。
【０１６４】
【化４】
2014534178.tif 000005
ジヒドロキシ−１２−［（２Ｒ）−１−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］プロパン−２−イル］−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペントン
【０１６５】
ベキサロテンはターグレチン（商標）として販売されており、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を選択的に活性化するレチノイドのサブクラスのメンバーである。これらのレチノイド受容体は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）とは異なる生物学的活性を有する。化学名は４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）エテニル］安息香酸である。ベキサロテンは、少なくとも一つの他の薬物療法による処置が疾患に奏功しなかった人々の皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ、皮膚癌の一種）の処置に用いられる。
【０１６６】
ソラフェニブはネクサバール（商標）として販売されており、マルチキナーゼ阻害剤と呼ばれる薬物のクラスに属し、化学名は４−［４−［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミドである。ソラフェニブは進行腎細胞癌（腎臓中で始まる癌の一種）の処置に用いられる。ソラフェニブは切除不能な肝細胞癌（手術により処置することができない肝癌の一種）の処置にも用いられる。
【０１６７】
免疫療法のレジメンに使用される薬剤も式（Ｉ）の化合物との併用に有用であり得る。ｅｒｂＢ２またはＥＧＦＲに対する免疫応答を生じさせる免疫学的戦略は複数ある。これらの戦略は、通常、腫瘍ワクチン接種の領域に含まれる。免疫学的アプローチの有効性は、小分子阻害剤を用いたｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲシグナル伝達経路の組合せ阻害によって大きく上昇し得る。ｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲに対する免疫学的／腫瘍ワクチンアプローチについての考察がReilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576およびChen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, and Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971に記載されている。
【０１６８】
ｅｒｂＢ阻害剤の例としては、ラパチニブ、エルロチニブ、およびゲフィチニブが含まれる。ラパチニブ、すなわちＮ−（３−クロロ−４−｛［（３−フルオロフェニル）メチル］オキシ｝フェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン（図示されているように、式ＶＩで表される）は、ＨＥＲ２陽性転移乳癌の処置にカペシタビンとの併用で承認されているｅｒｂＢ−１およびｅｒｂＢ−２（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２）チロシンキナーゼの強力な経口小分子二重阻害剤である。
【０１６９】
【化５】
2014534178.tif 000006
【０１７０】
式（ＶＩ）の化合物の遊離塩基、ＨＣｌ塩、およびジトシラート塩は、１９９９年７月１５日付で公開された国際公開第９９／３５１４６号および２００２年１月１０日付で公開された国際公開第０２／０２５５２号に開示されている方法に従って製造することができる。
【０１７１】
タルセバ）の商標名で市販されているエルロチニブ、すなわちＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス｛［２−（メチルオキシ）エチル］オキシ｝−４−キナゾリンアミンは、図示されているように式ＶＩＩで表される。
【０１７２】
【化６】
2014534178.tif 000007
【０１７３】
エルロチニブの遊離塩基およびＨＣｌ塩は例えば米国特許第５，７４７，４９８号の実施例２０に従って製造することができる。
【０１７４】
ゲフィチニブ、すなわち４−キナゾリンアミン，Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−４−モルホリン）プロポキシ］は、図示されているように式ＶＩＩＩで表される。
【０１７５】
【化７】
2014534178.tif 000008
【０１７６】
イレッサ（商標）（アストラゼネカ社）の商標名で市販されているゲフィチニブは、白金系およびドセタキセルによる化学療法の両方が失敗した後の、局所的進行性または転移性の非小細胞肺癌の患者の処置に単剤治療として指定されているｅｒｂＢ−１阻害剤である。ゲフィチニブの遊離塩基、ＨＣｌ塩、および二塩酸塩は、１９９６年４月２３日付で提出されて１９９６年１０月３１日付で国際公開第９６／３３９８０号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９６／００９６１号の方法に従って製造することができる。
【０１７７】
トラスツズマブ（ＨＥＲＥＰＴＩＮ（商標））はＨＥＲ２受容体に結合するヒト化モノクローナル抗体である。この最初の適応はＨＥＲ２陽性乳癌である
【０１７８】
セツキシマブ（アービタックス（商標））は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を阻害するキメラマウスヒト抗体である。
【０１７９】
ペルツズマブ（２Ｃ４とも呼ばれる、商標オムニターグ）はモノクローナル抗体である。「ＨＥＲ２量体化阻害剤」と呼ばれる薬剤ラインのクラスの最初のものである。ペルツズマブは、ＨＥＲ２に結合することにより、ＨＥＲ２と他のＨＥＲ受容体の２量体化を阻害し、これは腫瘍の成長を遅らせるという仮説が立てられている。ペルツズマブは２００１年１月４日付で公開された国際公開第０１／００２４５号に記載されている。
【０１８０】
リツキシマブは、リツキサン（商標）およびマブセラ（商標）として販売されているキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０に結合し、細胞のアポトーシスを引き起こす。リツキシマブは関節リウマチおよびＢ細胞非ホジキンリンパ腫の処置に承認されており、静脈内投与される。
【０１８１】
オファツムマブは、アルゼラ（商標）として販売されている完全ヒトモノクローナル抗体である。オファツムマブはＢ細胞上のＣＤ２０に結合し、フルダラビン（フルダラ）およびアレムツズマブ（キャンパス）による処置に抵抗性の成人の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ、白血球の癌の一種）の処置に用いられる。
【０１８２】
アポトーシス促進療法に使用される薬剤（例えば、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）も本発明の組合せに用いられ得る。Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーのタンパク質はアポトーシスをブロックする。そのため、ｂｃｌ−２のアップレギュレーションが化学療法抵抗性に関連付けられている。研究により、上皮成長因子（ＥＧＦ）がｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（すなわちｍｃｌ−１）を刺激することが示されている。したがって、腫瘍中のｂｃｌ−２の発現をダウンレギュレートするように設計された戦略は臨床的有益性が実証されており、現在、Ｇｅｎｔａ’ｓ  Ｇ３１３９  ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドとして第ＩＩ／ＩＩＩ相治験が行われている。ｂｃｌ−２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド戦略を用いたこのようなアポトーシス促進戦略はWater JS et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823および Kitada S et al. (1994), Antisense Res. Dev. 4: 71-79に記載されている。
【０１８３】
細胞周期シグナル伝達阻害剤は細胞周期の制御に関わる分子を阻害する。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれるタンパク質キナーゼのファミリーおよびサイクリンと名付けられたタンパク質ファミリーとのそれらの相互作用が、真核生物の細胞周期の進行を制御する。細胞周期の正常な進行には種々のサイクリン／ＣＤＫ複合体の協調的な活性化および不活性化が必要である。細胞周期シグナル伝達の複数の阻害剤が開発中である。例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６を含むサイクリン依存性キナーゼならびにその阻害剤の例が例えばRosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。
【０１８４】
ＥＺＨ２のＹ６４１もしくはＡ６７７における変異のいずれかまたはＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加が検出された場合、特許請求される発明の癌処置方法はいずれも、微小管阻害剤、白金配位化合物、アルキル化剤、抗生剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ホルモンおよびホルモンアナログ、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体型チロシンキナーゼ血管新生抑制薬、免疫療法剤、アポトーシス促進剤、ならびに細胞周期シグナル伝達阻害剤からなる群から選択される抗新生物剤等の少なくとも一つの更なる抗新生物剤を用いた処置を更に含んでなってよい。
【実施例】
【０１８５】
実施例１
細胞培養および原発性腫瘍検体
パイフェルＤＬＢＣＬ細胞株（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマ  アルドリッチ社製）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（メディアテック社（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）製）中に維持した。他の細胞株は全てＡＴＣＣまたはＤＳＭＺのずれかから入手し、推奨される細胞培養培地中に維持した。４１名のリンパ腫患者のゲノムＤＮＡの提供をオリジーン社（ＯｒｉＧｅｎｅ、メリーランド州ロックヴィル）から受けた。高腫瘍含有率（＞４０％）の病理検証された腫瘍組織の凍結ブロックからＤＮＡを抽出した。ＩＲＢの承認および患者のインフォームド・コンセントに準じ、分子的分析のために組織を採取した。腫瘍検体の詳細な臨床的特徴を表２に示す。
【０１８６】
実施例２
ＥＬＩＳＡを用いたヒストンＨ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの定量化
細胞株を回収し、１×ＰＢＳですすぎ、遠心した。細胞ペレットを０．２Ｎ  ＨＣｌで３０分間溶解してヒストンを抽出した。酸不溶性部分を遠心によりペレット化し、上清をプロテアーゼ阻害剤（ロシュ社製）を含む中和バッファー（１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ１２．５、アクティブ・モティフ社（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）製）で中和した。タンパク質ライセートおよび組換え体Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（アクティブ・モティフ社製）を、中和した溶解バッファー中で滴定し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に、二つのプレートのそれぞれに２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で添加した。ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ）を加え、プレートを１時間インキュベートした後、Ｔｗｅｅｎ−２０（ＫＰＬ）を含むイミダゾール緩衝食塩水で４回洗浄した。プレートを、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に対する一次抗体（セル・シグナリング・テクノロジー社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製）または全Ｈ３に対する一次抗体（アクティブ・モティフ社製）とインキュベートし、洗浄し、抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ連結二次抗体（セル・シグナリング・テクノロジー社製）とインキュベートした。Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｆｏｒｔｅ基質（ミリポア社製）を加え、５分後に、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（パーキンエルマー社製）を用いて化学発光を定量した。組換え体Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルを標準対照として細胞株のＨ３Ｋ２７ｍｅ３および全Ｈ３のレベルを計算し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を全Ｈ３値に基づいて標準化した。
【０１８７】
実施例３
Ｈ３Ｋ２７メチル化状態のウェスタンブロット分析
細胞株をＰＢＳですすぎ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロシュ社製）を含むＲＩＰＡバッファー（サーモサイエンティフィック社製）を用いて氷上で溶解した。その後、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  １５０（設定＝２）でライセートを１５秒間超音波処理し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（サーモサイエンティフィック社）によりタンパク質濃度を測定した。その後、タンパク質ライセート（１〜５□ｇ）を変性させ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン社製）を用いて電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレン（インビトロジェン社製）に転写した。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ライコア社（Ｌｉ−Ｃｏｒ）製）でメンブレンをブロッキングし、ＥＺＨ２認識抗体（ＢＤトランスダクションラボラトリーズ社（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ）製）ヒストンＨ３認識抗体（アブカム社（Ａｂｃａｍ）製）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３認識抗体（セル・シグナリング・テクノロジー社製）、またはアクチン認識抗体（シグマ社製）で探索した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、蛍光二次抗体（ライコア社製）でメンブレンをハイブリダイズし、ＰＢＳＴで洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（ライコア社）を用いてイメージングした。
【０１８８】
実施例４
ＥＺＨ２の全長サンガーシークエンシング
Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて細胞ペレットからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。改変したＲＮｅａｓｙキットの方法（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＨｉＦｉ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔのプロトコール（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてｃＤＮＡに変換した。Ｍ１３ユニバーサルシークエンシングプライマー配列を末端付加したプライマー（表３）（インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社製）およびＨｏｔｓｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡ（５０ｎｇ）を増幅し、ＡｍＰｕｒｅ（アジェンコート・バイオサイエンス社（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。ｖ３．１  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ−ターミネーターサイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた３７３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）により、Ｍ１３プライマーを用いた精製ＰＣＲ産物の直接シークエンシングを行った。シークエンシング反応を分析し、Ｃｏｄｏｎ  Ｃｏｄｅ  Ａｌｉｇｎｅｒ（コドンコードコーポレーション（ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製）を用いて全ての配列を構築および分析した。
【０１８９】
実施例５
細胞中での野生型および変異型ＥＺＨ２タンパク質の一過的発現
トランスフェクションの前日に、６ウェル組織培養プレートの１０％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩ−１６４０培地にＭＣＦ−７乳癌細胞（３×１０５、ＡＴＣＣ）を播種した。メーカーの推奨に従い、５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン製）中で２μｇのプラスミドＤＮＡおよび６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）を混合し、室温で２０分間インキュベートした後、細胞に添加した。次いで、前述したタンパク質ライセートおよびウェスタンブロット分析のために回収するまで、細胞を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
【０１９０】
実施例６
ＥＺＨ２が野生型および変異体である５個のメンバーで構成されるＰＲＣ２のクローニング、発現、および精製
ヒトＥＥＤ１（ＮＭ＿００３７９７）、ＳＵＺ１２（ＮＰ＿０５６１７０）、ＲｂＡｐ４８（ＲＢＢＰ４、ＮＰ＿００５６０１）、およびＡＥＢＰ２（ＮＰ＿６９４９３９）をｐＥＮＴＲ／ＴＥＶ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にクローニングし、ｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン社製）中にサブクローニングした。ヒトＥＺＨ２（ＮＰ＿００１１９０１７６）をｐＥＮＴＲ／ＴＥＶ／Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングし、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含むｐＤＥＳＴ８にサブクローニングした。ｐＥＮＴＲ／ＴＥＶ／Ｄ−ＴＯＰＯ中のヒトＥＺＨ２を、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ、アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製）により変異させてＡ６７７Ｇ、Ｙ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｃ、Ｙ６４１Ｈ、またはＹ６４１Ｓの単一アミノ酸変化を導入し（表４）、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含むｐＤＥＳＴ８にサブクローニングした。全ての変異体の全コード領域を二本鎖シークエンシングにより確認した。哺乳動物の発現実験では、野生型ヒトＥＺＨ２をｐＩＲＥＳ２−ＺｓＧｒｅｅｎ１（クロンテック社製）にサブクローニングした。その後、上記のように部位特異的突然変異誘発を用いてＡ６７７およびＹ６４１変異体を得た。
【０１９１】
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標）システム（インビトロジェン社製）を用いて、ＥＥＤ１、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２、およびＦＬＡＧ−ｔｅｖ−ＥＺＨ２の発現用に個々のバキュロウイルスストックを作製した。ＰＲＣ２の５つの構成要素全てを、各構成要素について１０Ｌの振盪バッグ（ｗａｖｅ  ｂａｇ）当たり２×１０７バキュロウイルス感染昆虫細胞を加えることによりＳｆ９昆虫細胞中で共発現させた。細胞を２７℃でインキュベートし、感染後６６〜７０時間の間に細胞ペーストを回収した。
【０１９２】
ｆｌａｇタグ化野生型ＥＺＨ２または変異ＥＺＨ２（Ａ６７７Ｇ、Ｙ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｓ、Ｙ６４１Ｈ、またはＹ６４１Ｃ）を含むＰＲＣ２複合体（ＥＺＨ２、ＥＥＤ、ＳＵＺ１２、ＡＥＢＰ２、ＲｂＡｐ４８）を、１０ｍｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２樹脂（シグマ社製）を用いて４℃で、１ＬのＳｆ９細胞ペーストライセートから精製した。樹脂をＸＫ２６カラムに充填し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄した。その後、１００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（カリフォルニアペプチドリサーチ社（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）製）を含むＢｕｆｆｅｒ  ＡでＰＲＣ２複合体を溶出した。その後、ＥＺＨ２を含む画分をプールし、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（１６／６０）（ＧＥファルマシア社製）にアプライした。単量体ＰＲＣ２複合体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を評価し、ペプチドマッピング分析により全ての構成要素およびＥＺＨ２変異を確認した。
【０１９３】
実施例７
メチルトランスフェラーゼ活性の生化学的評価
特に断りのない限り、全ての試薬はシグマ社から入手しており、最低でも試薬グレードである。リジン２７が未修飾であるか、モノメチル化またはジメチル化された、ヒストンＨ３ペプチド（ＡＡ２１〜４４、ＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＧ［Ｋ−Ａｈｘ−ビオチン］−アミド）のカスタム合成品を２１ｓｔセンチュリー・バイオケミカルズ社（２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、マサチューセッツ州マールバロ）から購入した。ライブラリーに含まれるペプチドは、２１ｓｔセンチュリー・バイオケミカルズ社、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ、カリフォルニア州フリーモント）、またはアルタバイオサイエンス社（Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国バーミンガム）から入手した。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ２０、ストレプトアビジンＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ０２６１）、および［３Ｈ−］Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）はパーキンエルマー社から購入した。
【０１９４】
全ての反応は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、およびＴｗｅｅｎ−２０（ＥＺＨ２ペプチド活性アッセイでは０．００１％、ヌクレオソーム活性アッセイでは０．００２％）を含むアッセイバッファー中、周囲温度で評価した。
【０１９５】
ペプチドアッセイでは、種々の濃度のＨ３Ｋ２７ペプチドおよび［３Ｈ−］ＳＡＭを含む９６ウェル反応プレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）製）にＥＺＨ２（２０ｎＭ）を加えた。プログレス曲線の直線部分中に０．１ｍＭ非標識ＳＡＭを加えて反応をクエンチした。クエンチした反応混合物を、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）（ウォッシュバッファー１）で予め洗浄した９６ウェルマルチスクリーンＨＴＳフィルタープレート（ミリポア社製、ＭＳＰＨＮＸＢ５０）に移し、３０分間インキュベートして捕捉させた。その後、フィルタープレートを更なる１５０μＬずつのウォッシュバッファー１で４回洗浄し、乾燥させた。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ２０（６０μＬ／ウェル）を加え、密封したプレートを３０分間インキュベートし、捕捉された［３Ｈ−］Ｍｅ−ペプチドまたは［３Ｈ−］Ｍｅ−ヌクレオソームの定量化をＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンターでモニタリングした。ろ過後に個々のプレート上に置いた反応標準を基準にアウトプットＤＰＭを標準化した。
【０１９６】
ヌクレオソームアッセイでは、フィルタープレート（ミリポア社製、ＭＳＤＥＮ６Ｂ５０）およびウォッシュバッファー（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、ウォッシュバッファー２）以外は同様な手法を用いた。以前に報告されているように（３５）、モノおよびジヌクレオソームをＨｅＬａ細胞から精製した。ヘテロ天然ヌクレオソーム調製物内の個々のモノヌクレオソームユニットの分子量を、個々のヒストンの累積重量［２×Ｈ２Ａ（２×１４．０ｋＤａ）＋２×Ｈ２Ｂ（２×１３．８ｋＤａ）＋２×Ｈ３（２×１５．２ｋＤａ）＋２×Ｈ４（２×１１．２ｋＤａ）＋２００塩基対ｄｓＤＮＡ（２００×０．６６ｋＤａ）］に基づいて評価した。
【０１９７】
基質共滴定から得られた速度データを、逐次的反応速度機構に適合する等式（１）に当てはめた。等式（１）中、Ｖは最大速度であり、ｋｃａｔは酸素濃度に対して標準化されたＶを表し、ＡおよびＢは基質濃度を表し、ＫｉａはＡの解離定数であり、ＫａおよびＫｂはそれぞれ基質ＡおよびＢのミカエリス定数である。
ｖ＝ＶＡＢ／（ＫｉａＫｂ＋ＫａＢ＋ＫｂＡ＋ＡＢ）    （１）
【０１９８】
実施例８
ＥＺＨ２の構造的モデリング
Ｈ３Ｋ９ｍｅ２ペプチド基質（ＰＤＢ  ＩＤ＝２ＲＦＩ）に結合したＧＬＰ／ＥＨＭＴ１を一次テンプレートとして用いて、野生型ＥＺＨ２の相同性モデルを構築し、結晶構造が決定されているヒストンリジンメチルトランスフェラーゼを含む他の関連ＳＥＴドメインと構造比較した。相同性モデルはケミカルコンピューティンググループ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ：ＣＣＧ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）の２００９バージョンを用いて構築した。残基をＭＯＥ中で変異させ、回転異性体（ｒｏｔａｍｅｒ）の形状の探索から最適な配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を選択した。Ａ６７７Ｇ変異体のモデルでは（図５Ｃ）、トリメチル化に最適な配向でジメチル化リジンを手動で回転させた後に、Ｙ６４１の低エネルギー回転異性体が選択された。
【０１９９】
実施例９
増殖への影響を評価するためおよび成長ＩＣ５０（ｇＩＣ５０）を計算するためのアッセイプロトコール
フラスコに入った適切な培地中で細胞を細胞密度が８０〜１００％になるまで培養した。細胞を回収、計数し、３８４ウェル組織培養プレート（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）製、＃７８１０９０）中に個々の細胞株の成長特性に応じて５０〜４０００細胞／ウェルの所定の最適な播種密度でプレーティングした。その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。終濃度０．１５％ＤＭＳＯとなる２０ポイントの２倍希釈スキームを用いて化合物で細胞を処理した。プレートの一つの列は０．１５％ＤＭＳＯのみで処理された細胞を含み、一つの列は細胞を含んでおらず、バックグランドとしての役割を果たす。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。化合物を添加した日に時間ゼロ（ｔ０）の読取り値を取った。プレートを現像するために、２５μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（プロメガ社製、＃Ｇ７５７２）を各ウェルに加え、室温で１２分インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２を用いて発光を測定した。
【０２００】
Ａｓｓａｙ  Ｃｌｉｅｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータを分析した。ｔ０と比較した成長率に基づいて用量反応曲線を生成した。４パラメーターのロジスティックモデルを用いて成長ＩＣ５０値を計算した。
【０２０１】
【化８】
2014534178.tif 000009
【０２０２】
化合物ＡはＥＺＨ２阻害剤である。
【０２０３】
実施例１０
Ｙ６４１野生型リンパ腫細胞株におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの異常な上昇
ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ、ＦＬ、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に由来する原発性腫瘍においてＥＺＨ２の種々の活性化および不活性化変異が報告されている（１〜３、２４〜２６）。これらの変異の最終的な結果は、Ｈ３Ｋ２７のメチル化の増加または減少である（１４、１５、２４、２６）。ヒト癌細胞株におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の変化を特徴解析するために、本発明者らは、ユニークな７つの腫瘍型に由来する１１１個の細胞株におけるＥＬＩＳＡにより、グローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３および全ヒストンＨ３のレベルを定量化した（図１Ａ）。調べた各腫瘍型は、様々なＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを示し、複数のリンパ腫細胞株は、最も高い非リンパ腫細胞株よりＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが２〜３倍高かった。これらの細胞株の複数に由来するタンパク質ライセートの更なる分析により、Ｈ３Ｋ２７のメチル化状態間に明白な不均衡があることが明らかとなった（図１Ｂ）。全体として、グローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルがより低いリンパ腫細胞株と比較して、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが増加し、その代わりにＨ３Ｋ２７ｍｅ１が減少していた。
【０２０４】
実施例１１
リンパ腫細胞株におけるＥＺＨ２のＡ６７７残基のグリシンへの変異はＨ３Ｋ２７ｍｅ３を異常に増加させた
ＥＨＺ２のＹ６４１残基がフェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、またはヒスチジン（Ｈ）のいずれかに変異したリンパ腫細胞におけるＨ３Ｋ２７のハイパートリメチル化表現型を示す最近の知見に基づき、本発明者らは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが最高のリンパ腫細胞株がＹ６４１に活性化変異を有するという仮説と立てた。Ｙ６４１コドンについての全細胞株のサンガーシークエンシングにより、グローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルで順位付けした時に上位７つのリンパ腫のうちの６つで活性化変異が明らかになった。
【０２０５】
Ｙ６４１に変異がなかったＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが高い一つの細胞株はパイフェルであった。パイフェル細胞株はＤＬＢＣＬの白血病の時期の患者の胸水から１９９２年に樹立された（２７）。全ＥＺＨ２コードエキソンのゲノムＤＮＡのサンガーシークエンシングにより、Ａ６７７残基のグリシンへの非同義変異（Ａ６７７Ｇ）を生じさせるヌクレオチド２０４５におけるＣからＧへのヘテロ変異が明らかになった（図２Ａ）。ｃＤＮＡの配列分析により、野生型および変異型の対立遺伝子の両方が発現されていることが明らかになった（非掲載データ）。この残基はＥＺＨ２の触媒ＳＥＴドメイン内にあり、エキソン１８中のＹ６４１残基の２エキソン下流に位置している（図２Ｂ）。この残基は、複数の種および複数のヒストンメチルトランスフェラーゼで高度に保存されており（図２Ｃ）、このことは、この残基がＥＺＨ２の機能に重要な役割を果たすことを示している。
【０２０６】
実施例１２
原発性リンパ腫サンプルにおけるＡ６７７Ｇ  ＥＺＨ２変異の発生
パイフェル細胞株で確認された変異が原発性ヒトリンパ腫で生じているか否かを調べるために、４１個のリンパ腫検体のパネルにおいてこの残基をシークエンシングした。このパネルは、３０個のＤＬＢＣＬ、６個のＦＬ、１個の粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、１個のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、１個の脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、および２個のワルデンシュトレームマクログロブリン血症またはリンパ形質細胞性リンパ腫（ＷＭ）からなる（表２）。Ｙ６４１変異の発生４つに加え、非同義ミスセンス変異がＰ４８８およびＡ６７７で観察された。Ａ６７７変異はヘテロ接合性であり、７４歳の女性から得られたステージＩＩＥのＤＬＢＣＬで生じていた（図２Ａ、表２）。ｃＤＮＡ中で両方の対立遺伝子が検出されたことから、この変異は発現されていた（非掲載データ）。これらのデータは、Ａ６７７Ｇ変異が原発性ヒトリンパ腫で発生しており、単に細胞培養のアーチファクトではないことを示している。
【０２０７】
実施例１３
ＥＺＨ２  Ａ６７７Ｇ変異はＨ３Ｋ２７メチル化状態に依存しない生化学的活性を付与する
ＥＺＨ２  Ｙ６４１変異は基質特異性に影響を与え、その結果、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２が非修飾型およびモノメチル化型よりも優先されるようになる（図２Ｂ）（３、１４）。基質選択性に対するＡ６７７Ｇ変異の影響を更に調べるために、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ２を含むペプチド基質を用いて、野生型および変異型ＥＺＨ２複合体の定常状態キネティクスを特徴解析した。３種類のペプチド基質との代謝回転を比較すると（ｋｃａｔまたはｋｃａｔ／Ｋｍのいずれかとして）、野生型ＥＺＨ２は、Ｈ３Ｋ２７中により多くのメチル基が導入されるにつれて活性を失う（すなわち、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０＞Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１＞Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２）（図３、表１）。対照的に、評価した全てのＹ６４１変異酵素は逆の傾向を示し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２ペプチドが最も効率的に利用された（すなわち、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２＞Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１＞Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０）（図３、表１）。一方、Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２複合体は、野生型およびＹ６４１変異体のどちらとも異なるプロファイルを示した。Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２は３種類の基質全てをほぼ等しい効率で且つ野生型酵素の最高の代謝回転に匹敵する速度で利用した（それぞれｋｃａｔ＝０．６４ｓ−１対０．６２ｓ−１）（図３、表１）。ＨｅＬａ細胞から精製したヌクレオソームを評価した時、Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２の活性は野生型ＥＺＨ２およびＹ６４１変異体より高かった（ｋｃａｔ＝０．１７ｓ−１対０．１０ｓ−１（野生型）および０．１１ｓ−１（Ｙ６４１Ｓ））。この観察結果は、Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２複合体が、Ｈ３Ｋ２７の修飾が不均一なより大きなヒストン集団に作用できるためであると考えられる。
【０２０８】
実施例１４
Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２の発現はＨ３Ｋ２７のハイパートリメチル化を起こすのに十分である
Ａ６７７ＧおよびＹ６４１  ＥＺＨ２変異体がヒストンメチル化レベルに与える影響を調べるために、野生型および変異体バージョンのＥＺＨ２を細胞中で一過的に発現させた後、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルを評価した。ＭＣＦ−７細胞が比較的低レベルのＨ３Ｋ２７ｍｅ３を示し（パイフェルＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの２６％、図１Ａ）、トランスフェクションが容易であるため、この分析にＭＣＦ−７細胞を選択した。実際、Ａ６７７ＧまたはＹ６４１変異ＥＺＨ２の外因的発現は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の２〜３倍の増加を誘導することができ、このマークのグローバルなレベルをパイフェル細胞で観察されたのと同様なレベルにした（図４）。これらのデータは、Ｈ３Ｋ２７残基のグローバルなハイパートリメチル化を誘導するのにＡ６７７Ｇの発現が十分であることを示している。
【０２０９】
実施例１５
Ａ６７７Ｇ変異ＥＺＨ２の基質選択性および生成物特異性の構造的根拠
ＥＺＨ２の結晶構造なしで、野生型ＥＺＨ２のタンパク質配列およびＨ３Ｋ９ｍｅ２を含むヒストンＨ３ペプチド基質に結合したＧＬＰ／ＥＨＭＴ１の結晶構造に基づいて相同性モデルを構築した（図５Ａ）。このモデルは、野生型ＥＺＨ２がＨ３Ｋ２７のモノおよびジメチル化を主に触媒するがトリメチル化は触媒しないことを示す生化学的データと一致する。Ｓｅｔ７／９等のその他のメチルトランスフェラーゼ同様、高度に保存されたＥＺＨ２  Ｙ６４１残基は、リジンε−アミン基との水素結合を介したメチル基転移に最適なように非メチル化およびモノメチル化型のＨ３Ｋ２７を配向させると考えられる（２８、２９）。更に、Ｐｈｅ／Ｔｙｒスイッチ位置にチロシンの代わりに保存されたフェニルアラニン残基（Ｆ７２４）が存在することで、非メチル化リジンを更に配向させることが示されている（２８）構造的に保存された水分子への水素結合が失われている（図５中には示されていない）。保存された水は、更なる水素結合を有さないので、おそらくより弱く結合しており、そのためモノメチル化リジンが第２のメチル基転移のための位置へと回転する時により容易に置換される。したがって、このモデルは、モノおよびジメチルトランスフェラーゼとしてＥＺＨ２が効率的に機能することを裏付けている。しかし、Ｙ６４１のヒドロキシル酸素とＨ３Ｋ２７ｍｅ２のε−アミン基との間は３．３Åしかなく、ジメチル化リジンが第３のメチル基を受け入れる位置に回転する余地はほとんどない。したがって、ＥＺＨ２のＹ６４１残基は非メチル化およびモノメチル化リジンの配向に関与しつつ、同時にトリメチル化を立体的に制限するという二重の目的を有している。
【０２１０】
このモデルから、Ｙ６４１からアスパラギン等のより小さな残基への変異（Ｙ６４１Ｎ）は重要な水素結合の消失およびより大きなリジントンネルの生成の両方が生じると予測される（図５Ｂ）。より大きなリジントンネルおよび適切な水素結合の消失はおそらく、柔軟性の大きい非修飾またはモノメチル化リジンの安定化を妨げる。一方、Ｙ６４１をアスパラギン等のより小さな残基で置換すると、ジメチル化リジンが回転して第３のメチル基転移の位置になることを可能にする、より大きなトンネル（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２メチル炭素からＮ６４１側鎖への距離＝３．８Å）が生じる。おそらく、Ｈ３Ｋｍｅ２の２個のメチル基もジメチル化リジンの配向を更に助ける有利な疎水性相互作用をリジントンネル中で作る。この解釈は、Ｙ６４１変異体が非メチル化リジンを効率的に利用しないがジメチル化基質との強力な活性を獲得していることを示す本発明者らおよび他の人々により提示されているデータと一致する。
【０２１１】
興味深いことに、野生型ＥＺＨ２の構造的モデルは、高度に保存されたＡ６７７残基がＳＡＭまたはＨ３Ｋ２７のいずれとも直接相互作用しないことを示唆しているが、この残基はＹ６４１のヒドロキシル酸素に近接している（３．３Å）（図５Ａ）。したがって、Ａ６７７をより小さなグリシン残基に変異させることで、Ｙ６４１がリジントンネル内に更なるスペースを生じさせる別のコンホメーションを取ることができ、メチル基転移に適した配向にジメチル化基質が回転できるようになると予測される（図５Ｃ）。この別のＹ６４１コンホメーションでは、リジンテールが回転して第３のメチル基転移の位置にある時でも、Ｙ６４１のヒドロキシル酸素とＨ３Ｋ２７ｍｅ２の最も近いメチル炭素との間に十分な空間（３．１Å）がある。したがって、このモデルは、別のＹ６４１配向と組み合わされたＹ６４１残基の保持が、非修飾、モノ、およびジメチル化基質の効率的なメチル化に寄与していることを示唆している。
【０２１２】
実施例１６
増殖アッセイ（アッセイ１）におけるＥＺＨ２阻害剤への細胞株の感受性
ＥＺＨ２阻害に対する感受性へのＥＺＨ２変異およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの影響を評価するために、化合物Ａとして表されるＥＺＨ２阻害剤を用いて６日間の増殖アッセイ（増殖アッセイ１）で３８個のリンパ腫細胞株を評価した。表５および図６に示されているように、ＥＺＨ２中に変異を有し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３が高い（パイフェルの１００％以上）細胞株はＥＺＨ２阻害に感受性である。ＥＺＨ２阻害に抵抗性または弱い感受性であるＥＺＨ２変異を有する細胞株がいくつかある（例えば、ＳＵＤＬ−４、ＤＢ、ＯＣ１−ＬＹ−１９、およびＳＫＭ１）ことから、ＥＺＨ２変異状態だけからは、これらの条件下におけるＥＺＨ２阻害への感受性を予測することはできない。更に、ＥＺＨ２阻害アッセイの更なる最適化。
【０２１３】
実施例１７
ＥＺＨ２変異、癌、およびＥＺＨ２阻害剤を用いた処置についての考察
ＥＺＨ２レベルの増加は、多くの癌の特徴であり、ＳＵ−ＤＨＬ−４  ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＥＺＨ２のノックダウンはＧ１／Ｓ遷移で成長を停止させることから、一部のリンパ腫細胞の増殖に必要であると考えられている（３０）。最近の研究で、Ｈ３Ｋ２７ハイパートリメチル化を生じさせる、リンパ腫におけるＥＺＨ２のＹ６４１の変異が同定された（１、３、１４、１５）。本明細書において、本発明者らは、ヒトリンパ腫細胞におけるグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３を増加させることができる新規なＥＺＨ２変異の同定および特徴解析を報告しており、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルが増加しており且つＥＺＨ２中のＹ６４１またはＡ６７７変異のいずれかを有するリンパ腫細胞株がＥＺＨ２の阻害に感受性であることを実証している。
【０２１４】
ＥＺＨ２  Ｙ６４１変異はＧＣＢ  ＤＬＢＣＬの２２％およびＦＬの７％で生じている（３）が、本発明者らの研究は、ＥＺＨ２  Ａ６７７のグリシンへの変異がかなり珍しい事象であることを示している。本発明者らは、この変異を５０個のリンパ腫細胞株中の１個および４１個の原発性リンパ腫サンプル中の１個で観察した。更に、Morin et alが最近、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ｅｘｏｍｅ−ｓｅｑ、および／またはｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑにより評価した１２７サンプル中、Ａ６７７Ｇ変異を有するＤＬＢＣＬを１例（６３歳、女性、ステージ１ＡＥ）観察している（１）。したがって、この変化の真の発生率を確立するためにはＡ６７７コドンの焦点を合わせた遺伝子タイピングを含む更に詳細な研究が必要であるが、これらの初期のデータは、この変異の頻度が２〜３％未満であろうことを示唆している。
【０２１５】
これら二つの変異の最終的な結果（すなわち、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の増加）が非常に似たものであり得ることを考慮すると、最初、これらの変異がそのような異なる割合で起こることは幾分驚きである。しかし、この矛盾は各部位における可能な活性化変異の幅により大部分が説明され得る。これまで、５つの異なる残基（Ｆ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、またはＨ）のいずれかへのＹ６４１の変異がＨ３Ｋ２７ｍｅ２基質との活性を増大させることが報告されている（（１、３、１４、１５）および本研究）。この活性増大は、より大きなＨ３Ｋ２７ｍｅ２基質がメチル基転移のための位置へと回転できるようにする、より小さな残基とＹ６４１の交換によるものであった。Ａ６７７Ｇ変異は、アラニンとより小さなアミノ酸の交換を介してリジントンネルのサイズを同様に大きくするようであるが、アラニンは既に２番目に小さいアミノ酸であるので、グリシンとしか交換され得ない。ヌクレオチドレベルでは、Ａ６７７コドン内の９個の単一ヌクレオチド変異の１個だけがグリシン残基を生じさせ、一方、９個のうち５個がＹ６４１で活性化変異を生じさせる。したがって、一見低いＥＺＨ２  Ａ６７７Ｇ変異の発生率は単に、この特定の部位に可能な変化の数が非常に限定されていることによると考えられる。
【０２１６】
オルソロガスなおよび相同なメチルトランスフェラーゼ間でＳＥＴドメインが高度に保存されていることから、一つのメチルトランスフェラーゼからの知見を別のメチルトランスフェラーゼへと容易に翻訳することができる。例えば、ＥＺＨ２のＹ６４１残基における変化の影響を、生化学的性質がより詳細に研究されている他のＳＥＴドメインメチルトランスフェラーゼの変異分析に基づいて予測することができる。ヒトＳＥＴ７／９メチルトランスフェラーゼは通常Ｈ３Ｋ４をモノメチル化するが、ＳＥＴ７／９のＹ２４５残基（ＥＺＨ２のＹ６４１に相当）がアラニンに変異している場合、この変異体はもはやＨ３Ｋ４ｍｅ０基質を修飾することができず、その代わり、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１ペプチド基質をジおよびトリメチル化する能力を獲得している（３１）。Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼＧ９ａの更なる研究から、Ｙ１０６７のフェニルアラニンへの変異により酵素がモノおよびジメチルトランスフェラーゼからトリメチルトランスフェラーゼへと変換されることが示されている（３２）。
【０２１７】
実施例１８
ＥＺＨ２  Ａ６７７変異体、例えばＥＺＨ２  Ａ６７７Ｇは治療に有用な新規なバイオマーカーである
本発明者らの知る限り、この研究は、複数のＰＫＭＴアーゼ間で保存されているＥＺＨ２のＡ６７７残基の生化学的および細胞的活性を調べた最初の報告である。しかし、興味深いことに、アカパンカビ（N. crassa）のＤＩＭ−５を含む構造的に関連するＳＥＴドメインは相当する位置にグリシンを有し（図２Ｃ）、そのＨ３Ｋ９基質に３つのメチル化事象全てを行うことが報告されている（３３、３４）。したがって、ＥＺＨ２の残基６７７のアラニンおよび他のＳＥＴドメインメチルトランスフェラーゼ中の相当すると考えられる残基は、基質と直接接触することなく基質特異性の調節に重要な役割を果たしているようである。このＥＺＨ２のＹ６４１とＡ６７７の間の相互関係は、リジンメチルトランスフェラーゼの基質および生成物の特異性を調節するために進化してきたであろう多くの重要な機構の一つだけを強調している。
【０２１８】
実施例１９
インビトロおよびインビボでのＥＺＨ２変異体におけるＥＺＨ２阻害剤化合物Ｂ処置の概要
真核生物では、ヒストンのエピジェネティックな翻訳後修飾がクロマチン構造および遺伝子発現の調節に重要である。ＥＺＨ２はポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の触媒サブユニットであり、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３Ｋ２７）のメチル化を介した遺伝子発現の抑制を担う。ＥＺＨ２過剰発現は腫瘍形成に関係し、複数の腫瘍型における予後不良に関連する（２１、３６〜３９）。更に、ＥＺＨ２の触媒ＳＥＴドメイン内のＹ６４１およびＡ６７７残基の体細胞ヘテロ変異がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）中で生じる（１、３、４０〜４２）。Ｙ６４１残基は最も頻度の高い変異残基であり、ＧＣＢ（胚芽細胞Ｂ細胞）  ＤＬＢＣＬおよびＦＬの最大２２％がこの部位に変異を有する。これらのリンパ腫は、変異酵素の基質選択性の変化によるＨ３Ｋ２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）の増加を示す（１４、１５、４１、４３）。しかし、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の特異的な直接的阻害がＥＺＨ２変異リンパ腫の処置に有効であるか否かは知られていない。本明細書において、本発明者らは、強力で選択性の高い、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）競合的な、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の小分子阻害剤であるＧＳＫ１２６が、グローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを低減し、サイレンシングされたＰＲＣ２標的遺伝子を再活性化することを示した。ＧＳＫ１２６はＥＺＨ２変異ＤＬＢＣＬ細胞株の増殖を効果的に阻害し、マウス中でＥＺＨ２変異ＤＬＢＣＬ異種移植片の成長を劇的に阻害する。総合すると、これらのデータは、ＥＺＨ２活性の薬理学的阻害がＥＺＨ２変異リンパ腫に対する有望な処置を提供し得ることを示している。
【０２１９】
化合物Ｂ（ＧＳＫ１２６）はＥＺＨ２阻害剤である。化合物Ｂは以下の式で表される。
【０２２０】
【化９】
2014534178.tif 000010
【０２２１】
実施例２０
ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の強力な阻害剤としての化合物Ｂ（ＧＳＫ１２６）を同定するためのハイスループットスクリーニング
ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤を同定するために、５個のメンバーで構成されるＰＲＣ２タンパク質複合体を用いたハイスループットな生化学的スクリーニングを行った（４４）。この研究により、Ｋｉａｐｐ＝７００ｎＭの小分子ＥＺＨ２阻害剤が同定された。医薬品化学によるこの化合物の徹底的な最適化によりＧＳＫ１２６が作製された（図７Ａ）。ＧＳＫ１２６は、利用される基質とは関係なく同様な強さでＷＴおよび変異ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の両方を強力に阻害し（Ｋｉａｐｐ＝０．５〜３ｎＭ）、ＳＡＭと競合し、ペプチド基質とは競合しない（図７Ｂ、非掲載データ）。ＧＳＫ１２６は他のメチルトランスフェラーゼおよびタンパク質クラスに対して高い選択性を有する（非掲載データ）。特に、ＧＳＫ１２６は、ＳＥＴドメインを含むメチルトランスフェラーゼおよびＳＥＴドメインを含まないメチルトランスフェラーゼの両方を含む他の２０種類のヒトメチルトランスフェラーゼと比較してＥＺＨ２に対して１，０００倍超の選択性を有する（４５）。ＥＺＨ２とＳＥＴドメイン内で９６％同一、全体で７６％同一のＥＺＨ１でさえ、１５０分の１未満の強さでしか阻害されない（Ｋｉａｐｐ＝８９ｎＭ）。酵素作用機序および阻害剤の構造と活性との関連性データと組み合せてＥＺＨ２相同性モデル（４１）を用い、イン・シリコドッキングにより、ＳＡＭ結合ポケットがＧＳＫ１２６の最もそれらしいドッキング部位として示された。ここで、これはＳＡＭ結合ポケットの片側を形成するポストＳＥＴドメインと広く接触することが予測される（図８ａ〜ｄ）。興味深いことに、予測されたＧＳＫ１２６結合部位の１０Å内に、ＥＺＨ２とＥＺＨ１の間で異なる６個の残基のうち、４個がポストＳＥＴドメイン内にあり、これらがＥＺＨ１に対する効力の消失に寄与していると考えられる。
【０２２２】
実施例２１
化合物Ｂ（ＧＳＫ１２６）はＨ３Ｋ２７ｍｅ３の消失を誘導する
ＥＺＨ２変異体の基質選択性の変化は細胞Ｈ３Ｋ２７メチル化状態の不均衡を引き起こす（図９ａ）（１４、４１）。それにもかかわらず、ＧＳＫ１２６は、ＥＺＨ２の変異状態に関係なく１０〜２５２ｎＭのＩＣ５０値で、ＥＺＨ２がＷＴであるＤＬＢＣＬ細胞株およびＥＺＨ２が変異体であるＤＬＢＣＬ細胞株の両方でＨ３Ｋ２７ｍｅ３の消失を誘導した（Ｔ検定、ｐ＝０．２７）（図７ｃ）。更なる分析により、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の阻害が２４時間より前に始まり、効力は２日後に最大であることが示された（図９ｂ）。ＧＳＫ１２６はＨ３Ｋ２７ｍｅ３を最も強力に阻害し、次いでＨ３Ｋ２７ｍｅ２を阻害し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１は最高阻害剤濃度で弱く減少しただけであった（図７、および図９ｃ）。全ヒストンＨ３およびＰＲＣ２構成要素はＧＳＫ１２６の影響を受けなかった（図９ｃおよび１０）ので、Ｈ３Ｋ２７メチル化の減少はＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の直接阻害によるものであり、ヒストンＨ３またはＰＲＣ２の分解によるものではない。これは、ＰＲＣ２複合体の分解を促進し且つ細胞内Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）濃度への影響を介してＥＺＨ２を間接的に阻害する、ＳＡＨヒドロラーゼの阻害剤である３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）（４６）とは対照的である。
【０２２３】
実施例２２
化合物ＢはＢ細胞リンパ腫細胞の成長を阻害する
本発明者らは、化合物Ａで用いたｈａｔと比較して（前述の化合物Ａ処理ではアッセイ１を用いた）改良された増殖アッセイを用いてＢ細胞リンパ腫細胞株のパネルにおいて細胞増殖への化合物Ｂ（ＧＳＫ１２６）の影響を評価した。したがって、実施例２２および表６は、細胞株、例えばリンパ腫細胞株へのＨＺＨ２阻害剤の阻害をよりよく反映している。ＤＬＢＣＬ細胞株がＥＺＨ２阻害に最も感受性が高かった（図１１ａ）。最も感受性の高いＤＬＢＣＬ細胞株７個の内の６個がＹ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｆ、またはＡ６７７ＧのＥＺＨ２変異を有していた（成長ＩＣ５０＝２８〜８６１ｎＭ）（図１１ａ、表６、および図１２）。例外はＨＴであり、これはＥＺＨ２が野生型である（成長ＩＣ５０＝５１６ｎＭ）。興味深いことに、ＨＴは、複数の腫瘍型でしばしば不活性化されているＨ３Ｋ２７デメチラーゼであるＵＴＸに変異を有する（Ｒ１１１１Ｃ）（１９）。残りの１１個のＤＬＢＣＬ細胞株のうち、２個だけがＥＺＨ２変異を有しており、このことは、ほとんどの場合において、変異ＥＺＨ２を有するＤＬＢＣＬ細胞株が細胞成長に関してＥＺＨ２活性に依存しているが、場合によっては、一緒に起こっている変化がＥＺＨ２活性への細胞の依存を克服させてＥＺＨ２阻害への感受性を下げ得ることを示唆している。ＥＺＨ２変異細胞株中、ＧＳＫ１２６への感受性は、ＤＬＢＣＬで見られる共通する変化であるＢＣＬ２の転位またはｐ５３の変異とは無関係である（表６）。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の阻害と細胞成長との間には中程度の相関があった（ピアソン、ｒ＝０．６２）が、ＧＳＫ１２６への感受性とＥＺＨ２タンパク質レベルとの間には相関はなかった（図１３ａ〜ｃ）。興味深いことに、最も感受性の高いＤＬＢＣＬ細胞株の二つ、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２およびＫＡＲＰＡＳ−４２２は難治性疾患の患者に由来する（４７、４８）。このことは、治療標準に抵抗性のＤＬＢＣＬ細胞がＥＺＨ２阻害に感受性であり得ることを示唆している。バーキット（ＢＬ）およびホジキン（ＨＬ）リンパ腫細胞株は、ＷＴ  ＥＺＨ２を有するＢＬ細胞株であるＪｉｙｏｙｅ（成長ＩＣ５０＝０．２３μＭ）を除いて、一般的にＥＺＨ２阻害にさほど感受性ではなかった（成長ＩＣ５０＞１．３μＭ）。リンパ腫亜型間の感受性の決定要因を完全に解明するには、更なるリンパ腫細胞株におけるＧＳＫ１２６の評価ならびに大規模なゲノムおよびエピゲノムの特徴解析が必要である。最も感受性の高い細胞株中で細胞分裂停止反応および細胞毒性反応の両方が観察された（表６）。そこで、最も感受性の高い細胞株の二つにおいてＧＳＫ１２６により誘導される増殖および細胞死への影響のタイミングを詳細に調べた。パイフェルでは、２日後に細胞増殖の強力な阻害が観察され（図１１ｂ）、３日後に細胞数の純減が明白であった（図１１ｃ）。この細胞死は、サブＧ１集団の増加（図１１ｄ）および用量依存的なカスパーぜ活性の誘導（図１１ｅ）に示されるように、カスパーゼを介したアポトーシスにより起こっているようである。ＫＡＲＰＡＳ−４２２における応答はそれより遅く、効力が最大になるまで６〜７日必要であった（図１１ｂ）。更に、０日目のレベルより高く維持されているＣＴＧ値、サブＧ１量がほとんどないＧ１停止（ＤＭＳＯおよび５００ｎＭ  ＧＳＫ１２６でそれぞれ細胞の４３％および７７％がＧ１）、および１μＭ未満のＧＳＫ１２６でカスパーぜ活性が最小限であることから示されるように、ＫＡＲＰＡＳ−４２２では主に細胞分裂停止効果が観察された（図１１ｆ〜ｈ）。これらの観察結果と一致し、ｓｈＲＮＡを介したＥＺＨ２のノックダウンにおいては、パイフェルでは重度の細胞毒性応答およびアポトーシス応答が生じ、ＫＡＲＰＡＳ−４２２では、細胞増殖が低減し、カスパーぜの活性化が起こらなかった。このことは、ＧＳＫ１２６で観察された表現型への影響がＥＺＨ２の阻害によるものであることを示している（図１４ａ〜ｃ）。
【０２２４】
実施例２３
遺伝子発現への化合物Ｂの影響
ＥＺＨ２は転写抑制に関わるので、本発明者らは、ＧＳＫ１２６への感受性が様々なＤＬＢＣＬ細胞株において遺伝子発現へのＧＳＫ１２６の影響を評価した。最も感受性の高い細胞株で強力な転写活性化が確認された（図１５ａ、図１６ａ、および非掲載データ）。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２／３が抑制性であることを考慮すれば驚くべきことではないが、転写変化の大部分はアップレギュレーションを伴った。ＧＳＫ１２６処理とＫＡＲＰＡＳ−４２２およびパイフェル細胞におけるＥＺＨ２ノックダウンとで観察された遺伝子発現変化間の高度な類似性は、これらの転写変化がＥＺＨ２活性の消失によるものであり、非特異的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）影響によるものではないことを示唆している（非掲載データ）。更に、最も反応性の３個の細胞株についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑデータの分析から、処理前、アップレギュレートされた遺伝子はＨ３Ｋ２７ｍｅ３の広範な濃縮を示すことが明らかになり、このことは、これらの遺伝子がＨ３Ｋ２７ｍｅ３でマーキングされたＥＺＨ２標的であることを示唆ている（図１５ｂおよび図１７ａ〜ｃ）。
【０２２５】
感受性細胞株で観察された反応とは対照的に、成長がＥＺＨ２阻害の影響を受けないＷＴ  ＥＺＨ２を有する細胞株のＴｏｌｅｄｏではＧＳＫ１２６による転写変化は最小限であった（図１５ａ、図１６ｂ）。２μＭのＧＳＫ１２６でさえ、この用量および時間ではＨ３Ｋ２７ｍｅ３がほぼ完全に消失するにも関わらず、Ｔｏｌｅｄｏでは非常にわずかな転写変化しか観察されなかった（２３個のアップレギュレートおよび１０個のダウンレギュレートされたプローブセット）（図９ｃおよび非掲載データ）。同様に、二つのＨ３Ｋ２７ｍｅ３濃縮遺伝子について行ったｑＲＴ−ＰＣＲでは、パイフェルおよびＫＡＲＰＡＳ−４２２ではたった２５ｎＭのＧＳＫ１２６で遺伝子発現が用量反応的に増加していたが、Ｔｏｌｅｄｏでは１μＭまでのＧＳＫ１２６で転写変化がなかった（図１５ｃおよび非掲載データ）。興味深いことに、最も感受性の高いＷＴ  ＥＺＨ２細胞株であるＨＴでさえ、同様な感受性のＥＺＨ２変異ＤＬＢＣＬ細胞株と比較した時、転写応答はそれほど顕著でなかった（図１５ａ）。転写の変化倍率の基準を２．０から１．５に緩和したところ、ＨＴ細胞において中程度の更なる転写変化が明らかになった（図１６ｂ）。ＥＺＨ２  ＷＴおよびより感受性の低い変異体細胞株におけるこの弱い転写応答は、これらの細胞株に転写応答を弱める別の補償的な機構（Ｈ３Ｋ９、Ｈ４Ｋ２０、またはＤＮＡのメチル化等）が存在し得ることを示唆している。
【０２２６】
ＥＺＨ２変異細胞株中、グローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルは転写応答性の細胞株で統計的により高く（Ｔ検定、ｐ＝０．０１９）、このことは、グローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルと組み合せたＥＺＨ２変異状態が変異状態単独よりも良好な予測バイオマーカーであり得ることを示唆している（図１６ｃ）。最も感受性の高い５個のＥＺＨ２変異体細胞株はアップレギュレートされた遺伝子発現変化が優勢であった（６９〜９５％）が、２倍または１．５倍の有意性基準を用いた場合、発現量に差のあるプローブセット間でほとんど重複が見られなかった（図１５ｄおよび１６ｄ）。３５個のアップレギュレートされたプローブセットだけが、これら５個の変異細胞株の少なくとも４個で共通していた（表７）。これら共通のアップレギュレートされたプローブセットの検査により、多くでＨ３Ｋ２７ｍｅ３の濃縮が明らかになった（３２／３５）（表７および非掲載データ）。更に、これらのプローブセットの多くは、弱くではあるが、他の細胞株でも誘導されており、これらの設定下での完全な遺伝子活性化には更なる時間またはクロマチン因子が必要であることが示唆される（図１５ｅおよび表７）。最後に、共通してアップレギュレートされた限定された遺伝子セット中、どの単一の経路またはプロセスも有意に濃縮されていなかったが、個々の各細胞株における制御された遺伝子セットのジーンオントロジーエンリッチメント解析により、細胞周期制御、細胞死、および生物学的／細胞プロセスの制御を含む複数の共通するプロセスが明らかになった（図１８および非掲載データ）。これらのデータは、ＧＳＫ１２６を用いたＥＺＨ２の阻害に続くＨ３Ｋ２７ｍｅ３のグローバルな消失が、感受性とよく相関するＥＺＨ２標的遺伝子の転写活性化に関連すること、および変異ＥＨＺ２が、標的化された様式ではなくグローバルな様式でＨ３Ｋ２７ｍｅ３の制御を解除することを示している。感受性細胞株のアップレギュレートされた遺伝子セット間の有意なばらつきは、各細胞株におけるエピゲノムの複雑さおよび独自性、ならびに個々のリンパ腫の発達中の選択圧の多様性を強調していると考えられる驚くべき観察結果である。
【０２２７】
実施例２４
化合物Ｂはインビボで腫瘍の成長を阻害する
細胞培養における強力な作用に基づき、本発明者らは、ＫＡＲＰＡＳ−４２２およびパイフェルの皮下異種移植片を用いてマウスにおいてＧＳＫ１２６を評価した。ＧＳＫ１２６の１日１回（ＱＤ）投与を１０日間行った後、細胞培養で得られた観察結果と一致して、用量依存的にグローバルなＨ３Ｋ２７ｍｅ３が減少し、遺伝子発現が増加した（図１９ａ、ｂ）。ＧＳＫ１２６は初期に血中から急速に除去（ｃｌｅａｒ）されたが、血液および腫瘍からの薬物消去がより遅い、延長された最終期があった（図２０ａ、ｂ）。５０ｍｇ／ｋｇの連日投薬で、ＫＡＲＰＡＳ−４２２およびパイフェルモデルの両方において完全な腫瘍成長阻害が観察された（図１９ｃおよび図２１ａ）。ＫＡＲＰＡＳ−４２２異種移植片でより多い投与計画を調べたところ、顕著な腫瘍退縮が観察された（図１９ｃ）。投薬休止後、５０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ群の腫瘍は腫瘍停滞を示したが、１５０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤおよび３００ｍｇ／ｋｇ、週２回の群では完全な腫瘍の根絶が観察された。腫瘍成長阻害は更に、より侵襲性の強いＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍を有するマウスの統計的に有意な生存率増加と相関しており、ビヒクル処置動物では自然死（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅａｔｈ）が起こった（図１９ｄ）。これらの驚くべき観察結果に基づき、より低量のＧＳＫ１２６を週１回または１週間の休薬期間を設けて与える断続的な投与計画を、大きな腫瘍を有するＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍異種移植片中で調べた（図２１ｂ）。全てのスケジュールで腫瘍成長阻害が示された（９１〜１００％、Ｔ検定、ｐ値＝０．０００８〜０．００２４）。これらの結果は、ＧＳＫ１２６に対する応答が長時間続き、断続的な投薬スケジュールが、進行した腫瘍においてでさえ臨床状況で有効であり得ることを示している。
【０２２８】
ＫＡＲＰＡＳ−４２２異種移植片を有するマウスにおいて体重がほとんどまたは全く減少せず、毛づくろいおよび行動が正常であり、生存率が大幅に改善されたことから示されるように、ＧＳＫ１２６は調べた用量およびスケジュールで忍容性が良好であった（図２２ａ〜ｃおよび図１９ｄ）。正常な造血におけるＥＺＨ２の役割および骨髄悪性腫瘍におけるＥＺＨ２の機能喪失型変異の同定を考慮して（４９〜５２）、本発明者らは、免疫適格性マウスの末梢血液へのＧＳＫ１２６処置の影響を調べた。全血球計算分析の結果、腫瘍異種移植片で有効性が観察された用量および時間で、いずれの血液細胞タイプでも有意な変化は見られなかった（図２２ｄ）。
【０２２９】
過去１０年間で、活性化体細胞変異を有する腫瘍性タンパク質を特異的に阻害する標的化試薬の開発により、癌患者にとって大きな臨床的利益がもたらされた（５３、５４）。本明細書のデータは、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の阻害が、ＥＺＨ２に活性化変異を有するＤＬＢＣＬおよび無痛性ＦＬの処置に実行可能な戦略であり得ることの有力な証拠を提供する。ＧＳＫ１２６はまた、ＥＺＨ２過剰発現が予後不良と関連付けられている腫瘍（３６〜３９）およびＵＴＸに機能喪失型変異を有する腫瘍（１９、５０、５５）の生存にＥＺＨ２活性が必要であるか否かを評価する手段を提供する。本発明者らは、ＥＺＨ２中に機能喪失型変異を有する骨髄性悪性腫瘍（５０〜５２）の処置にＧＳＫ１２６が有効であるとは予想していないが、ＧＳＫ１２６は正常な骨髄の発達におけるＥＺＨ２の役割を評価するためおよび骨髄増殖性新生物におけるＥＺＨ２の発癌的役割を理解するための重要なツールとなるであろう。最後に、ＰＲＣ２複合体の分解を引き起こさない選択的ＥＺＨ２阻害剤の同定は、従来の遺伝子操作実験では解明できなかった発生、腫瘍形成、および腫瘍進行におけるその足場的役割に対してＥＺＨ２のメチルトランスフェラーゼ活性の役割を理解するのに有用なツールを提供する。
【０２３０】
実施例２５
ＧＳＫ１２６（化合物Ｂ）を開示する実施例の方法の要約
生化学的アッセイには、ＷＴまたは変異ＥＺＨ２を含む５個のメンバーで構成されるＰＲＣ２複合体（ヒトＦｌａｇ−ＥＺＨ２、ＥＥＤ、ＳＵＺ１２、ＡＥＢＰ２、ＲｂＡｐ４８）、［３Ｈ−］ＳＡＭ、および記載のペプチド基質を用い、反応液は３０分間インキュベートした。グローバルなヒストン修飾レベルは、全ヒストンＨ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット法により決定した。細胞増殖およびカスパーゼ−３／７活性はそれぞれＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏおよびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７（プロメガ社製）を用いて評価した。遺伝子発現プロファイリングは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０マイクロアレイを用いて行った。ｌｉｍｍａ統計パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）を用いて線形モデルにデータを当てはめ、処理と対照の対で対比を行うことにより、発現量に差のあるプローブセットを決定した。有意なプローブセットを検出用のフィルターにかけた（ｌｏｇ２シグナル域値８）、平均変化倍率＞２もしくは＜−２または＞１．５もしくは＜−１．５（記載されている通り）、ＦＤＲ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）により多重検定に対して補正したｐ値＜０．１。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰのリードをＢｏｗｔｉｅ（５６）を用いて整列させた。パラメーターを最適化したＳＩＣＥＲ（５７）を用いてＨ３Ｋ２７ｍｅ３濃縮ピークを同定した。カスタムのＰＥＲＬスクリプトを用いて、遺伝子セット間の平均基礎Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰ−ｓｅｑタグ密度を定量化した。全てのインビボ実験は、ＧＳＫの動物実験委員会による審査後、実験動物の取り扱いに関するＧＳＫの方針（ＧＳＫ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ，  Ｗｅｌｆａｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に準じて行われた。ＧＳＫ１２６およびビヒクルはマウス腹腔内に投与した。二つのサンプルの分散が等しいと仮定して両側ｔ検定を行った。
【０２３１】
ＷＴおよび変異ＥＺＨ２のＧＳＫ１２６阻害のＫｉａｐｐ値の決定
ＷＴまたは変異（Ａ６７７Ｇ、Ｙ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｃ、Ｙ６４１Ｈ、Ｙ６４１Ｓ、またはＹ６４１Ｆ）ＥＺＨ２のいずれかを含む５個のメンバーで構成されるＰＲＣ２複合体（Ｆｌａｇ−ＥＺＨ２、ＥＥＤ、ＳＵＺ１２、ＡＥＢＰ２、ＲｂＡｐ４８）は以前に報告されているように調製した（４１）。ＧＳＫ１２６をＤＭＳＯに溶解し、最終ＤＭＳＯ濃度を２．５％として０．６〜３００ｎＭの濃度で試験した。インビトロで基質にＨ３Ｋ２７ｍｅ０を好む野生型ＥＺＨ２とは対照的に、ＥＺＨ２  Ｙ６４１変異体はＨ３Ｋ２７ｍｅ２を好み、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０またはＨ３Ｋ２７ｍｅ１にはほとんど活性を有さない。Ａ６７７Ｇ変異体はＨ３Ｋ２７ｍｅ０、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ２を効率的にメチル化する点でＥＺＨ２の野生型およびＹ６４１変異体型のどちらとも異なるので、Ｋ２７ｍｅ０（ＷＴ、Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２）、Ｋ２７ｍｅ１（Ａ６７７Ｇ  ＥＺＨ２）、またはＫ２７ｍｅ２（Ａ６７７Ｇ、Ｙ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｃ、Ｙ６４１Ｈ、Ｙ６４１Ｓ、およびＹ６４１Ｆ  ＥＺＨ２）のいずれかを有するヒストンＨ３ペプチド（残基２１〜４４、最終１０μＭ）をメチルトランスフェラーゼ基質として用いた。ＧＳＫ１２６をプレートに加えた後、６ｎＭ  ＥＺＨ２複合体およびペプチドを加えた。ＧＳＫ１２６の効力は［ＳＡＭ］＝Ｋｍのアッセイランの密着結合限界（ｔｉｇｈｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｍｉｔ）であるかそれに近いので、本発明者らは、そのＫｍと比較して高濃度の競合基質ＳＡＭ（ＳＡＭのＫｍを０．３μＭとして、７．５μＭ  ＳＡＭ）でＩＣ５０値を測定する方法を用いた。これらの条件下では、酵素濃度の寄与が比較的小さくなり（等式１参照）、Ｋｉの正確な推定値を計算することができる（５８）。［３Ｈ−］ＳＡＭで反応を開始させ、３０分間インキュベートし、５００倍過剰の非標識ＳＡＭを加えてクエンチし、ＭＳＰＨ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（ＥＭＤミリポア社製、米国マサチューセッツ州ビルリカ）用のメーカーが提供しているプロトコールに従い、メチル化された生成ペプチドをホスホセルロースフィルター上に捕捉した。２０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０カクテルを添加した後にＴｏｐＣｏｕｎｔ（どちらもパーキンエルマー社製、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いてプレートを読み取った。競合阻害剤のチェン−プルソフ（Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ）の関係（５９）を用いて見かけのＫｉ値±ｓ．ｄ．を計算した（ｎ＝２）。
等式１：ＩＣ５０＝Ｋｉ＊（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）＋［Ｅ］／２
【０２３２】
ＧＳＫ１２６のＥＺＨ２阻害機構
前述のアッセイ条件を用いて、０．１〜１５μＭの複数のＳＡＭ濃度、次いで別個に１６〜６０μＭの複数のペプチド濃度で、ＧＳＫ１２６によるＥＺＨ２阻害のＩＣ５０値を決定した。得られたＩＣ５０値をそれぞれ［ＳＡＭ］／Ｋｍ比または［ペプチド］／Ｋｍ比に対してプロットした。
【０２３３】
細胞培養およびイムノブロッティング
細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｂｕｌｔｕｒｅｎから入手し、推奨される細胞培養培地中に３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞を放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファー（サーモサイエンティフィック社製）で溶解し、以前に報告（４１）されているようにウェスタンブロット分析を行った。抗体は以前に報告（４１）されているように得たか、セル・シグナリング・テクノロジー社から得た（ＳＵＺ１２、３７３７）か、サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得た（ＥＥＤ、ｓｃ−２８７０１）。
【０２３４】
ＧＳＫ１２６処理後のＨ３Ｋ２７メチル化状態およびＰＲＣ２構成要素
処理の２４時間前に細胞（２×１０５／ウェル）を６ウェル組織培養プレート中の適切な細胞培養培地に播種した。次いで、細胞を０．１％ＤＭＳＯまたは種々の濃度のＧＳＫ１２６（範囲＝２５ｎＭ〜２μＭ）に２４、７２、または１４４時間晒した。
【０２３５】
全ヒストンＨ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルのＥＬＩＳＡに基づく定量化
組織をホモジナイズした後、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＯＰ−０００６）を用いて腫瘍組織ライセートを調製した。あるいは、細胞を９６ウェルプレートに２，０００細胞／ウェルで播種し、ＧＳＫ１２６の１０ポイントの３倍希釈系列（用量範囲＝２ｎＭ〜３８μＭ）で４８時間処理した。細胞を０．２Ｎ  ＨＣｌで３０分間溶解してヒストンを抽出し、酸不溶性部分を遠心でペレットにし、上清を、プロテアーゼ阻害剤（ロシュ社製）を含む中和バッファー（１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ１２．５、アクティブ・モティフ社製）で中和した。ライセートをＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に、２枚のプレートのそれぞれにつき２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ）と共に加えた。プレートを１時間インキュベートし、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むイミダゾール緩衝食塩水（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で４回洗浄し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３または全Ｈ３に対する一次抗体とインキュベートし、洗浄し、ＨＲＰ連結二次抗ウサギＩｇＧ抗体とインキュベートし、再度洗浄した。Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｆｏｒｔｅ基質（ミリポア社製）を加えた５分後に、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（パーキンエルマー社製）を用いて化学発光を定量化した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを全Ｈ３値を基準に標準化し、４パラメーターの曲線に当てはめてＩＣ５０値を決定した。
【０２３６】
細胞増殖アッセイ
６日間の増殖が可能な条件を特定するために、３８４ウェルフォーマットで幅広い播種密度の成長を調べることにより、全細胞株についての最適な細胞播種を実験的に決定した。次いで、細胞を最適な播種密度でプレーティングし、２４時間後、ＧＳＫ１２６の２０ポイントの２倍希釈系列または０．１５％ＤＭＳＯで処理した（２連）。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。その後、細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）で溶解し、ＴＥＣＡＮ  Ｓａｆｉｒｅ２マイクロプレートリーダーで化学発光シグナルを検出した。更に、化合物添加時（Ｔ０）に細胞の非処理プレートを回収して、開始時の細胞数を定量化した。６日間の処理後に得られたＣＴＧ値をＴ０値に対するパーセントとして表し、化合物濃度に対してプロットした。データを４パラメーターの等式に当てはめて、濃度反応曲線を作製し、成長を５０％阻害するのに必要なＧＳＫ１２６濃度（ｇＩＣ５０）を決定した。
【０２３７】
カスパーゼ３／７アッセイ
カスパーゼ−３／７活性を検出するために、細胞を９６ウェルプレートで培養し、ＧＳＫ１２６の１０ポイントの３倍希釈系列（０．０３ｎＭ〜５μＭ）で処理し、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７（プロメガ社製）をメーカーの指示書に従って用いて評価した。各時点でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（プロメガ社製）レベルに対して値を標準化し、ビヒクル処理対照に対するパーセンテージとして表した。データはｎ＝４の平均値を表す。
【０２３８】
細胞周期分析
細胞周期分布はフローサイトメトリーにより調べた。６ウェル培養プレートに細胞を播種した２４時間後に、細胞をＧＳＫ１２６または０．１％ＤＭＳＯ（ビヒクル）で３日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＤバッファー溶液中でペレット化し、急速冷凍し、−８０℃で保存した。ＣｙｃｌｅＴｅｓｔ（商標）  ＰＬＵＳ  ＤＮＡ試薬キット（ベクトン・ディッキンソン社製、３４０２４２）をメーカーの指示書に従って用いて核を調製してヨウ化プロピジウムで染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いてサンプルを評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリー・スター社（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）製）を用いてデータを分析した。
【０２３９】
遺伝子発現プロファイリング
処理の２４時間前に細胞（２×１０５／ウェル）を６ウェル組織培養プレート中の適切な細胞培養培地に播種した。次いで、２連のウェル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｗｅｌｌ）を０．１％ＤＭＳＯ、５００ｎＭ、または２μＭ  ＧＳＫ１２６に７２時間晒した。細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製）中に回収し、フェノール：クロロホルム抽出し、ーカーの指示書に従って用いたＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社製）により全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡを標識し、メーカーの指示書に従い（アフィメトリクス社、米国カリフォルニア州サンタクララ）、エクスプレッション・アナリシス社（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ノースカロライナ州ダーラム）でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０オリゴヌクレオチドマイクロアレイのアレイにハイブリダイズさせた。これらのデータはアクセッション番号ＧＳＥ４０９７２でＧＥＯからアクセスできる。主成分分析および相関分析を用いてデータの再現性を確認した（図１６）。
【０２４０】
アフィメトリクス遺伝子チップデータ分析
個々のサンプルに対応するＣＥＬファイルを、シグナル値を標的強度５００に倍率変更してｌｏｇ２変換するＭｉｃｒｏ  Ａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（ＭＡＳ５）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ  ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｉｎｄｅｘ．ａｆｆｘ）で処理した。発現量に差のあるプローブセットは、データを線形モデルに当てはめ、処理と対照を対比することにより決定した。有意なプローブセットを検出のためのフィルターにかけた（ｌｏｇ２シグナル閾値８）、平均変化倍率＞２もしくは＜−２または＞１．５もしくは＜−１．５（記載されている通り）、ＦＤＲ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）により多重検定に対して補正したｐ値＜０．１。バイオコンダクター社（Bioconductor、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のｌｉｍｍａパッケージを用いて統計分析を行った。発現量に差のあるプローブセットの機能的分析をＤＡＶＩＤを用いて行った（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）。有意に大きな比率を占めるＧＯの生物学的プロセス（ＢＰ）および分子機能（ＭＦ）用語（レベル３〜５）をＥＡＳＥｐ値＜０．０１でフィルタリングした。
【０２４１】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
細胞を０．１％ＤＭＳＯまたは種々の濃度のＧＳＫ１２６（範囲＝２５ｎＭ〜１μＭ）で７２時間処理し、全ＲＮＡを前述したように単離した。ＲＮＡ（２．８μｇ）を、MultiScribe Reverse Transcriptase（アプライドバイオシステムズ社製）をメーカーの指示書に従って用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡを希釈し、TaqMan遺伝子発現アッセイ（アプライドバイオシステムズ社製、ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１、ＴＮＦＲＳＦ２１、Ｈｓ００２０５４１９＿ｍ１、ＴＸＮＩＰ、Ｈｓ００１９７７５０＿ｍ１）と共に用いた。TaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製）およびViiA 7 Real-Time PCR System（アプライドバイオシステムズ社製）をメーカーの指示書に従って用いて遺伝子発現を定量化した。
【０２４２】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ
固定する２４時間前に細胞（５×１０７）を適切な細胞培養培地中に２４時間維持した。新たに調製したホルムアルデヒド溶液（終濃度１％ホルムアルデヒド、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９））で細胞を室温で１５分間固定した後、グリシンを１２５ｍＭになるように加えた。固定した細胞を、０．５％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（シグマ社製）を含むＰＢＳで２回すすぎ、細胞ペレットを急速凍結した。ＣｈＩＰアッセイは、アクティブ・モティフ社（カリフォルニア州サンディエゴ）でカスタムのアッセイプロトコールを用いて行われた。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰおよびインプットライブラリーを、イルミナ社製ＧＡＩＩｘシーケンサーをメーカーの指示書に従って用いた３５ヌクレオチドのシングルエンドシークエンシングのために調製した。これらのデータはアクセッション番号ＧＳＥ４０９７０でＧＥＯからアクセス可能である。リードの質を評価し（ベースの質＜２０は除外）、Ｂｏｗｔｉｅ２７アルゴリズムを用いて最大２個のミスマッチを許容してヒト参照配列（ｈｇ１９  ｂｕｉｌｄ）と整列させた。ユニークにマッピングされたリードだけをその後の分析に用いた。
【０２４３】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析
ＧＳＫ１２６処理後にアップレギュレートされた、ダウンレギュレートされた、または変化しなかった遺伝子について、カスタムＰＥＲＬスクリプトを用いて平均基礎Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ＣｈＩＰ−ｓｅｑタグ数を定量化した。遺伝子本体に加え、転写開始部位の１０ｋｂ上流および転写終結部位の１０ｋｂ下流を含む領域を評価した。全遺伝子を鎖に基づいて方向を定め、遺伝子本体の可変長を１０，０００ｂｉｎに標準化した。各塩基対の配列タグの数を平均化した後、この値を、ＣｈＩＰ毎のマッピングされた配列タグの総数を基準に標準化した。次いで、５００塩基対の中心化移動平均を適用して、より大きな傾向を強調し、小さな変動を除去した。ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇ／ｍｅｖ／）を用いて個々の遺伝子の濃縮を評価した。ピーク同定ソフトウェアのＳＩＣＥＲ２８を以下のパラメーターで用いてＨ３Ｋ２７ｍｅ３濃縮のピークを同定した：断片サイズ：２５０ｂｐ、有効なゲノムサイズフラクション：０．８６、ウィンドウサイズ：７５０ｂｐ、ギャップサイズ：３、重複性域値：１、ＦＤＲ：０．００１。対応するインプットサンプルと比較してＣｈＩＰサンプルにおいて濃縮された統計的に有意なピーク（ＦＤＲ＜０．００１）にゲノム位置についてアノテーションを付加し、転写開始部位（ＴＳＳ）から±１０ｋｂ内で遺伝子に割り当てて、標的遺伝子：上流（ＴＳＳから−１０〜２．５ｋｂ）、プロモーター（−２．５ｋｂ〜＋２．５ｋｂ）、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲを特定した。全ての遺伝子は５’→３’方向で考察した。データの操作および分析にＢｅｄｔｏｏｌｓを用い、可視化にＩＧＶ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖを用いた。アノテーションファイルはＵＣＳＣからダウンロードした。発現量に差のあるプローブセットの機能的分析はＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）を用いて行った。
【０２４４】
腫瘍異種移植片からのＲＮＡ単離
Ｑｉａｚｏｌ（３００μｌ／ｍｇ腫瘍）（キアゲン社製）を腫瘍異種移植片組織に加えた。キアゲン社製ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒおよびステンレス鋼ビーズを用いて、腫瘍を溶解し、ホモジナイズした。Ｑｉａｚｏｌライセートにクロロホルムを加えた。次いで、Ｑｉａｚｏｌ／クロロホルムホモジネートをＱｕｉａｇｅｎ  ＭａＸｔｒａｃｔ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙチューブ（キアゲン社製）に加えた。水相を新しいチューブに移し、等体積の７０％ＥｔＯＨと混合し、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラム（キアゲン社製）にアプライした。残りのＲＮＡ単離はメーカーのプロトコールに従って行った。
【０２４５】
インビボ実験
全ての実験はＧＳＫの動物実験委員会の審査を受けた後、実験動物の取り扱いに関するＧＳＫの方針に則って行われた。全てのインビボ実験について、ＧＳＫ１２６またはビヒクルは、１Ｎ酢酸でｐＨ４〜４．５に調整した２０％ｃａｐｔｉｓｏｌ中、体重２０ｇ当たり０．２ｍＬの用量体積で腹腔内投与した。１００％マトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社製）中のパイフェルまたはＫＡＲＰＡＳ−４２２細胞（１×１０７）は、雌のベージュＳＣＩＤマウスに皮下移植した。腫瘍はノギスで測定し、腫瘍サイズに従って処理群にブロックランダム化した。有効性の実験では、投薬開始前に１０頭のマウスを各処理群にランダム化し、腫瘍体積がパイフェルおよびＫＡＲＰＡＳ−４２２の実験（図１０ｃおよび図２１ａ）では約２００ｍｍ３になった時、ＫＡＲＰＡＳ−４２２断続投薬実験（図２１ｂ）では５００ｍｍ３になった時にＧＳＫ１２６処理を開始した。週２回、マウスを計量し、腫瘍をノギスで測定した。マウス薬物動態実験では、記載されている時間に安楽死させたマウスから腫瘍および血液サンプルを回収した。血液および腫瘍ホモジネートは急速凍結し、その後、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析してＧＳＫ１２６濃度を評価した。薬力学的実験では、各腫瘍の一部を、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３  ＥＬＩＳＡ用に凍結するか、ＲＮＡ単離用にＲＮＡｌａｔｅｒ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）製）中に入れた。末梢血液分析では、１８日目に、安楽死させた免疫適格性ＣＤ−１マウス（３マウス／群）から心臓穿刺により血液を回収した。血液はすぐにＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ社製）に入れ、反転させることで穏やかに混合した。全血球計算分析は、メーカーの指示書に従ってｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓソフトウェアを用いるアドヴィア２１２０血液学検査装置（シーメンスメディカルソリューションズ社製）を用いて行った。
【０２４６】
参考文献
本文の全体にわたって参考文献リストが引用されている。例えば更なる実験の詳細を提供するために、参考文献のそれぞれの全体は引用することにより本明細書の開示の範囲とされる。参考文献が請求項、実施形態、または本明細書中の定義と矛盾する場合、本明細書が優先される。
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【０２４７】
【表１】
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【０２４８】
【表２】
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【０２４９】
【表３】
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【０２５０】
【表４】
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【０２５１】
【表５】
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【０２５２】
【表６】
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【０２５３】
【表７】
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【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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