(57)【要約】  本発明は、特に、アクティブローディングによる、水溶解性の低い物質のリポソームへの内部封入の分野に関する。本発明者らは、驚くべきことに、高いリポソームローディングを伴うリポソームの効率的なアクティブローディングは、溶解促進剤を使用して、それ自体水に難溶性である機能的化合物をまず可溶化することによって達成され得るということを見出した。これは、脂質質量に対する機能的物質の比率を、従来のアクティブ又はパッシブローディング技術によって達成される程度を上回るレベルまで著しく高め、リポソームに内部封入されやすい、薬物を含む機能的化合物の範囲を広げる。本発明の一態様は、アクティブローディングプロセスを提供する。本発明によって、高薬物含量のリポソーム組成物も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームに難水溶性物質をロードする方法であって、
ａ）ｉ．内部水性媒体を内部に封入しているリポソームと、
ｉｉ．前記難水溶性物質と、
ｉｉｉ．外部水性媒体と、
ｉｖ．外部水性媒体中での難水溶性物質の溶解性を高める溶解促進性薬剤と
を含有する混合物を用意するステップであり、
プロトン勾配及び／又はイオン勾配が、リポソーム膜を横切って存在する、ステップと、
ｂ）前記難水溶性物質の少なくとも一部を、外部水性媒体から引き出させ、前記プロトン勾配及び／又はイオン勾配の影響下でリポソーム中に蓄積させるのに十分な期間、前記混合物をインキュベートするステップと
を含む、方法。
【請求項２】
溶解促進性薬剤が、錯化剤、好ましくは、シクロデキストリン及びその誘導体、ポビドン並びにそれらの組合せの群から選択される錯化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶解促進性薬剤が、共溶媒、好ましくは、ポリエチレングリコール、ニコチンアミド、脂肪族カルボン酸のＮ，Ｎ−ジアルキルアミド、アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ピロリドン及びそれらの組合せの群から選択される共溶媒、より好ましくは、ポリエチレングリコール、ニコチンアミド、脂肪族カルボン酸のＮ，Ｎ−ジアルキルアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ピロリドン及びそれらの組合せの群から選択される共溶媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
溶解促進性薬剤が、界面活性剤又は乳化剤、好ましくは、ポリエトキシル化ヒマシ油、マクロゴール−１５−ヒドロキシステアレート、ＰＥＧ−脂質、ポロキサマー、ドクサートナトリウム、脂肪酸のスクロースエステル、脂肪酸、ポリソルベート、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース及びその誘導体、糖又はその代替物並びにそれらの組合せの群から選択される界面活性剤又は乳化剤、より好ましくは、ポリエトキシル化ヒマシ油、マクロゴール−１５−ヒドロキシステアレート、ＰＥＧ−脂質、ポロキサマー、ドクサートナトリウム、脂肪酸のスクロースエステル、脂肪酸、ポリソルベート、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース及びその誘導体並びにそれらの組合せの群から選択される界面活性剤又は乳化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
溶解促進性薬剤が、リポソーム膜を透過性にするアルコールではない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
インキュベートしている間のプロセス温度が、０〜１００℃の間、好ましくは、０〜７０℃の間、最も好ましくは、４〜６５℃の間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
難水溶性物質が、＜１．９ｍＭの水への溶解性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
溶解促進剤が、外部水性媒体における難水溶性物質の初期濃度を、少なくとも２倍、２０℃で少なくとも１．９ｍＭの値に高める、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
所望によりリポソーム膜中のイオノフォアを使用する、ｐＨ勾配、硫酸塩勾配、リン酸塩勾配、クエン酸塩勾配、若しくは酢酸塩勾配、ＥＤＴＡイオン勾配、アンモニウム塩勾配、アルキル化アンモニウム塩勾配、Ｍｎ２＋勾配、Ｃｕ２＋勾配、Ｎａ＋勾配、Ｋ＋勾配又はそれらの組合せが、ステップｂ）の間にリポソーム膜を横切って存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
外部水性媒体が、生理食塩水及び／又はスクロース及び／又はＥＤＴＡ、好ましくは、スクロース及び／又はＥＤＴＡを含み、内部水性媒体が、難水溶性物質及び硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩又は酢酸塩、アルキル化アンモニウム塩、Ｍｎ２＋イオン、Ｃｕ２＋イオン、Ｎａ＋イオン又はＫ＋イオンのうち少なくとも１種を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記難水溶性物質が、プロトン化できるアミン又はカルボキシル官能基又は両方を含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記難水溶性物質が、ステロイド、アントラサイクリン、パクリタキセル、ラパマイシン（シロリムス）、ＣＫＤ−６０２、ジクロフェナク、ドキソルビシン、ブピバカイン、ビンクリスチン、トポテカン、シプロフロキサシン、セチリジン、フェキソフェナジン、プリミドン及びその他のカテコールアミン、エピネフリン、これらの化合物の塩及び誘導体並びにそれらの混合物の群から選択される、より好ましくは、ステロイド、アントラサイクリン、パクリタキセル、ラパマイシン（シロリムス）、ジクロフェナク、クリゾチニブ、キノリン酸、ＰＤ１５０６０６、ブピバカイン、ビンクリスチン、トポテカン、シプロフロキサシン、セチリジン、フェキソフェナジン、プリミドン及びその他のカテコールアミン、エピネフリン、これらの化合物の塩及び誘導体並びにそれらの混合物の群から選択される医薬化合物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）が、ステップａ）において混合物に添加される難水溶性物質の総量の少なくとも２５％、好ましくは、少なくとも５０％のローディングを達成するのに十分な期間、混合物をインキュベートするステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
溶解促進性薬剤が、ステップｂの間にリポソーム膜を横切って輸送されない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
溶解促進性薬剤が、リポソーム膜を透過性にしない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
リポソームに難水溶性物質をアクティブローディングするプロセスにおいてローディング効率を改善するための、溶解促進性薬剤、好ましくは、共溶媒、錯化剤、界面活性剤又は乳化剤の使用。
【請求項１７】
溶解促進性薬剤を、難水溶性物質、第１の水性媒体及び第２の水性媒体を内部に封入しているリポソームと混合するステップを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるリポソーム組成物。
【請求項１９】
難水溶性物質がロードされたリポソームを含むリポソーム組成物であって、少なくとも１：２５、好ましくは、少なくとも１：１５、より好ましくは、少なくとも１：７、より好ましくは、少なくとも１：５、より好ましくは、少なくとも１：２の薬物対脂質重量比を有し、難水溶性物質の総量に対して２０ｍｏｌ％未満の溶解促進剤を含む組成物。
【請求項２０】
リポソームが、難水溶性物質の総量に対して１０ｍｏｌ％を超える量の溶解促進性薬剤を含まない、請求項１８又は１９に記載のリポソーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームへの水溶解性が低い物質の内部封入の分野に関する。より詳細には、リポソームへの難溶性薬物のアクティブローディングに関する。本発明によって、高薬物含量（ｈｉｇｈ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄ）のリポソーム組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
細胞及び組織への診断薬及び治療薬の有効な送達は、医療現場及び研究現場の両方において非常に望ましいものである。長年にわたって診断薬及び治療薬の多数の送達系が作り出されてきたが、副作用が最小で、毒性の低い、難水溶性の化合物の有効な送達系は、実現していないままである。したがって、これらの目標を達成する診断薬及び治療薬送達技術は、引き続き必要とされている。
【０００３】
脳は、医学的治療及び診断の特別に困難な標的である。特に、血液脳関門（ＢＢＢ）が、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する診断薬及び治療薬の全身投与の有効性を阻害するためである。ＢＢＢを通過できるほとんどの薬物は、多数の薬理学的に興味深い化合物と同様に親油性であり、結果的に、極めて低い水溶解性を有するか、さらには水に不溶性である。乏しい水溶解性は、薬物又は機能的化合物の静脈内への投与を妨げる。さらに、血液を介した投与は、身体において毒性副作用をもたらし得る。さらに、薬物又は機能的化合物が、治療量で標的臓器に到達するかどうかは疑わしい。ＢＢＢを越えるＣＮＳ標的への治療用及び／又は診断用化合物の有効な送達のための組成物及び方法は、依然として必要とされている。
【０００４】
リポソームは、ＢＢＢを越える脳への薬物送達を増強し得るということが示唆されている（欧州特許第０６５２７７５号及びその中の参考文献）。リポソームには、薬物、ペプチド及びタンパク質を含めた種々の成分がロードされ得ることは、当業者には一般に知られている。薬物及びその他の機能的化合物の送達のためのリポソームの利点は、遊離化合物を静脈内に投与することと比較して、主に、リポソーム製剤によって示される低減された毒性副作用である。
【０００５】
機能的化合物の送達のためのリポソームの利用では、一般に、リポソームを高濃度にロードし、その結果、高い機能的化合物−脂質質量比を得ることが望ましいが、その理由は、これによって、必要な治療効果を得るための処置につき投与されるリポソームの量が低減されるからであり、リポソーム中に使用される脂質のいくつかは、それ自体、用量規制毒性を有する（参考文献）ため、なおさらである。低含量のローディングは、多くの活性化合物を失わせる結果になるので、ローディング率はまた費用効率のためにも重要である。
【０００６】
リポソーム中に機能的化合物、特に薬物、を内部封入するための種々のローディング法が利用可能である。親水性化合物は、例えば、機能的化合物と、小胞形成性脂質の混合物を水和することによって、リポソーム中に内部封入され得る。この技術は、「パッシブローディング（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）」と呼ばれる。機能的化合物は、ナノ粒子が形成されるときに、リポソーム中に内部封入される。親油性機能的化合物及びより少ない程度で、両親媒性機能的化合物は、親水性機能的化合物よりも幾分か効率的にロードされるが、この理由は、それらが、脂質二重層及びリポソーム内水性媒体の両方に分配するからである。しかし、パッシブローディングを使用すると、最終機能的化合物対脂質比並びに内部封入効率は、一般的に低い。リポソーム中の薬物の濃度は、周囲の流体のものに等しく、遊離の封入されていない薬物は、内部封入後に洗い流される。
【０００７】
パッシブローディング技術の最終機能的化合物対脂質比は、リポソーム外水性媒体中の親油性化合物の濃度を高めるための溶解促進剤を使用して高めることができる。水中で親油性化合物を可溶化するための、共溶媒、界面活性剤及び錯化剤の使用に基づく多数の方法が開発されている。水性薬物製剤において、いくつかのよく使用される溶解促進剤として、シクロデキストリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、ソルビトール、非イオン性界面活性剤及びポリエトキシル化ヒマシ油がある。難溶性薬物の溶解性を促進するために、極端なｐＨが使用される場合もある。しかし、これらの溶解促進剤及び溶解促進条件は、ヒトに対しては、毒性又は刺激性であることがある。
【０００８】
シクロデキストリン−薬物複合体形成の概要は、Ｃｈａｌｌａら、２００５年によって示されている。ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、１９９４年＆１９９８年には、パッシブローディング技術を用いてリポソーム中にヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン−薬物包接複合体を封入する方法が記載されている。修飾シクロデキストリンは、水に不溶性の薬物デキサメタゾン、デヒドロエピアンドロステロン、レチノール及びレチノイン酸に対して溶解促進剤として作用し、複合体形成されていない薬物を用いてロードされた場合に得られるリポソームと比較して、薬物対脂質質量比が高まったリポソームをもたらす。
【０００９】
米国特許出願公開第２００９／０１９６９１８号には、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン又はスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンと疎水性ラクトン薬物の包接複合体を含むリポソーム製剤が開示されている。シクロデキストリン−薬物包接複合体は、パッシブローディングによってリポソーム中に封入される。
【００１０】
米国特許出願公開第２００７／００１４８４５号には、約５０μｇ／ｍｌ未満の通常の水溶解性を有する疎水性薬物のための、親水性ポリマーを用いて誘導体化された脂質を含むリポソーム送達ビヒクルが開示されている。リポソーム内での疎水性薬物の溶解性は、薬物−シクロデキストリン包接複合体の形成によって増強される。リポソーム内でのシクロデキストリン濃度は、４００ｍｇ／ｍｌ超であることが好ましい。包接複合体の内部封入は、パッシブローディングによって行われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これらのパッシブローディング技術の欠点は、必要な機能的化合物に加えて溶解促進剤シクロデキストリンを望ましくないが投与すること並びに内部封入効率が依然として十分でないという事実である。
【００１２】
特定の親水性又は両親媒性化合物は、膜を隔てたｐＨ勾配又はイオン勾配を使用して予め形成されたリポソーム中にロードされ得る（Ｚｕｃｋｅｒら、２００９年）。この技術はアクティブ又はリモートローディングと呼ばれる。アクティブローディングに従う化合物は、リポソーム膜を横切って拡散できる非荷電形態から、それができない電荷形態に変化できなければならない。通常、機能的化合物は、より低い外側／より高い内側のｐＨ勾配又はイオン勾配を有するよう調製されたリポソームの懸濁液に、機能的化合物を添加することによってロードされる。アクティブローディングによって、高い機能的化合物対脂質質量比及び高いローディング効率（最大１００％）が達成され得る。例として、抗癌薬ドキソルビシン、ダウノルビシン及びビンクリスチンのアクティブローディングがある（Ｃｕｌｌｉｓら、１９９７年及びその中の参考文献）。
【００１３】
非極性／極性表面積比＞２．３１を有する親油性化合物については、可溶性非荷電分子のみが、リポソームに入ることができるので、有効なアクティブローディングを達成するには、薬物が妥当な溶解性＞１．９ｍＭを有することが必要である（Ｚｕｃｋｅｒら、２００９年）。このことは、多数の親油性機能的化合物、例えば、ＢＢＢを通過することに関連した薬物は、アクティブローディングを介して、脂質質量に対して十分に高い機能的化合物比率をもたらさないということを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、それ自体が水に不溶性であるか、そうでなければ、水溶解性の極めて低い機能的物質を、溶解促進剤を使用して、まず可溶化することによって、高いリポソームローディングを伴うリポソームの効率的なアクティブローディングが達成され得ることを見出した。したがって、本発明は、水溶解性の低い物質の、脂質質量に対する機能的物質比率を、従来のリポソームのアクティブ又はパッシブローディング技術によって達成されるものを超えるレベルに高め、リポソーム中に内部封入されやすい薬物を含めた機能的物質の範囲を広げる。
【００１５】
いずれかの理論に拘束されようとは、又は本発明の範囲を制限しようとは思わないが、本発明は、ローディングの間及びその後に溶解促進剤をリポソームの外側に残したままで、リポソームのローディングを可能にすると考えられる。リポソームを、封入されていない機能的化合物を含む流体相から分離した後には、通常、残りのリポソーム製剤中には、極僅かの可溶化剤しか存在しないか、又は全く存在しない。
【００１６】
当業者にはすぐにわかるであろうが、本プロセスの有用性は、医薬製剤に制限されない。難水溶性物質のリポソーム内部封入を必要とする任意の製品又はプロセスが、本発明から恩恵を受け得る。したがって、本明細書に具体的に例示され、及び／又は定義されたすべての実施形態が、医薬製剤に関するものであっても、医薬製剤に関連しない実施形態も、本願によって包含される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第１の態様として、リポソームに、難水溶性物質をロードする方法であって、
ａ）ｉ．内部水性媒体を内部に封入しているリポソームと、
ｉｉ．前記難水溶性物質と、
ｉｉｉ．外部水性媒体と、
ｉｖ．外部水性媒体中での難水溶性物質の溶解性を高める溶解促進性薬剤と
を含有する混合物を用意するステップであり、
プロトン勾配及び／又はイオン勾配が、リポソーム膜を横切って存在する、ステップと、
ｂ）前記難水溶性物質の少なくとも一部を、外部水性媒体から引き出させ、前記プロトン勾配及び／又はイオン勾配の影響下でリポソーム中に蓄積させるのに十分な期間、前記混合物をインキュベートするステップと
を含む方法に関する。
【００１８】
本文書では、その特許請求の範囲では、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、その単語に続く事項が、具体的に記載されない事項を排除せずに含まれることを意味するよう、その制限されない意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、１つの、及び唯一１つの要素があることを文脈が明確に要求しない限り、１つ又は複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は普通、「少なくとも１つの」を意味する。
リポソーム
【００１９】
本方法は、内部水性媒体を内部に封入している予め形成されたリポソームを含有する混合物を用意することを含む。用語「リポソーム」は、本明細書において、内部水性媒体を内部に封入しているリン脂質又は任意の同様の両親媒性脂質の二層からなる微視的脂質小胞を指す、その通常の意味に従って使用される。本発明のリポソームは、通常、５０ｎｍ〜２００ｎｍの大きさで変動する、小単層膜小胞（ＳＵＶ）及び大単層膜小胞（ＬＵＶ）などの単層膜小胞及び多重膜小胞（ＭＬＶ）であり得る。本発明では、リポソーム膜構造に特定の制限は課されない。用語「リポソーム膜」とは、内部水性媒体を外部水性媒体から分離するリン脂質の二層を指す。
【００２０】
本発明において有用なリポソーム膜は、通常、リン脂質、ジグリセリド、ジアリファティック糖脂質などのジアリファティック鎖脂質、スフィンゴミエリン及びスフィンゴ糖脂質などの単一脂質、コレステロール及びその誘導体並びにそれらの組合せを含めた種々の小胞形成性脂質から形成され得る。本明細書に定義されるように、リン脂質は、長鎖アルキル鎖から形成される疎水基とリン酸部分を含有する親水基を有する両親媒性物質である。リン脂質の群は、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びそれらの混合物を含む。好ましくは、リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）又は水素添加卵黄ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）から選択される。
【００２１】
本発明のリポソーム膜は、ナイジェリシン及びＡ２３１８７のようなイオノフォアをさらに含み得る。
【００２２】
本発明の方法では、リポソームの相転移温度は、０℃〜１００℃の間、好ましくは、４℃〜６５℃の間であることが好ましい。相転移温度とは、炭化水素鎖が十分に広がり、ぎっしり詰まっている秩序正しいゲル相から、炭化水素鎖が不規則に配向しており、流体である無秩序な液晶相へと、リポソームを構成する脂質の物理的状態の変化を誘導するのに必要な温度である。リポソーム相転移温度を超えると、リポソーム膜の透過性は増大する。リポソームが常にゲル状態にあるであろう高い転移温度を選択することで、非漏出性リポソーム組成物を提供できる、すなわち、内部水性媒体中の難水溶性物質の濃度が、環境への曝露の間、維持される。代わりに、曝露される環境の出発から終了温度の間の転移温度を有するリポソームは、リポソームがその転移温度を通るときに難水溶性物質を放出する手段を提供する。したがって、アクティブローディング技術のプロセス温度は、通常、アクティブローディングプロセスを容易にするためにリポソーム相転移温度より高い。当技術分野で一般に知られているように、その他のパラメータ中でもリポソームの相転移温度は、リン脂質の選択によって、またコレステロール、ラノステロール、コレスタノール、コプロスタノール、エルゴステロールなどのようなステロイドの添加によって影響を受け得る。したがって、本発明の実施形態では、リポソームが、転移、必要なプロセス温度及び血漿中でのリポソーム安定性を修飾するために、種々のリン脂質及びコレステロールから選択される１種又は複数の成分を、いくつかのモル比で含む、前記のいずれかの方法が提供される。混合物中のコレステロールが少ないほど、血漿中で、より安定でないリポソームが結果として得られる。好ましいリン脂質組成物は、１０〜５０ｍｏｌ％の間のステロイド、好ましくは、コレステロールを含む。
【００２３】
本発明に従って、リポソームは、リポソームを調製するために現在知られているか、又はその後に開発された技術のいずれかによって調製され得る。例えば、リポソームは、多重膜脂質小胞（ＭＬＶ）を調製するための従来技術によって、すなわち、クロロホルムに脂質を溶解すること、次いで、クロロホルムを蒸発させることにより、１種又は複数の選択された脂質を適した容器の内壁上に沈着させることによって、次いで、内部に封入されるべき水溶液を容器中に添加して、水溶液が脂質を水和するのを可能にし、得られた脂質懸濁液を回旋させるか、ボルテックス処理することによって形成され得る。このプロセスによって、所望のリポソームを含む混合物が生じる。代わりに、逆相蒸発、注入手順及び洗浄剤希釈などの大単層膜脂質小胞（ＬＵＶ）を製造するために使用される技術を使用して、リポソームを製造してもよい。脂質小胞を製造するためのこれら及びその他の方法の概説は、参照により本明細書に組み込まれる、教本Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、（１９８４年）に見出すことができる。例えば、脂質を含有する粒子は、ステロイド性脂質小胞、安定な多層（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ）脂質小胞（ＳＰＬＶ）、単相小胞（ＭＰＶ）又は脂質マトリックス担体（ＬＭＣ）の形態であり得る。ＭＬＶの場合には、必要に応じて、リポソームは、捕獲容積及び捕獲効率を高め、溶質のより均一な層間分布を提供するために複数の（５回以上）凍結−解凍サイクルに付され得る。
【００２４】
リポソーム調製後、リポソームは、所望の大きさ範囲及びリポソームサイズの比較的狭い分布を達成するようサイズ分けされ得る。約２０〜２００ナノメートルのサイズ範囲によって、リポソーム懸濁液が、従来フィルター、通常、０．２２又は０．４ミクロンフィルターを通す濾過によって滅菌されることを可能にする。リポソームが約２０〜２００ナノメートルにサイズ分類されている場合には、フィルター滅菌法は、ハイスループット方式で実施され得る。リポソームを所望のサイズにサイズ分けするためにいくつかの技術が利用可能である。リポソーム懸濁液を浴超音波処理又はプローブ超音波処理のいずれかによって超音波処理することによって、約５０ナノメートル未満の大きさの小単層膜小胞への漸進的サイズ低下が生じる。均質化は、せん断エネルギーに頼って、大きなリポソームをより小さいものに断片化する別の方法である。通常の均質化手順では、多重膜小胞は、標準エマルジョンホモジナイザーによって、選択されたリポソームサイズ、通常約５０〜５００ナノメートルの間、が観察されるまで再循環される。両方法において、粒径分布は、従来のレーザービーム粒径決定によってモニタリングされ得る。小孔ポリカーボネートメンブレン又は非対称セラミックメンブレンを通るリポソームの押し出しも、リポソームサイズを、比較的に明確に定義されたサイズ分布に低減する有効な方法である。通常、懸濁液は、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、メンブレンを通して１回又は複数回循環される。リポソームは、リポソームサイズの段階的低下を達成するために、連続してより小さい孔のメンブレンを通して押し出され得る。超音波処理、溶媒蒸発又は逆相蒸発などのその他の有用なサイズ分け法が、当業者に公知である。
【００２５】
本発明において使用するために、約５０ナノメートル〜約１８０ナノメートルのサイズのリポソームが好ましい。
【００２６】
本明細書において言及される「内部水性媒体」とは、通常、その中でリポソームが調製され、リポソームの形成時に最初に内部に封入される、元の媒体である。本発明に従って、元の水性媒体を内部に封入している新たに調製されたリポソームが、アクティブローディングに直接使用され得る。しかしながら、リポソームが、調製後に、例えば、保存のために脱水される実施形態も想定される。このような実施形態では、本プロセスは、膜の内外で生じる勾配を作製するために使用された外部水性媒体への、脱水されたリポソームの直接的な添加を含み得る。しかし、当業者によって理解されるように、まず、別の外部媒体においてリポソームを水和することも可能である。リポソームは、標準の凍結乾燥機器又は同等の装置を使用して減圧下で脱水されることが好ましい。リポソーム及びその周囲の媒体は、液体窒素中で凍結され、その後、脱水され、減圧下に置かれ得る。先行する凍結を伴わない脱水は、先行する凍結を伴う脱水よりも長くかかるが、プロセス全体は、凍結ステップを伴わず、より穏やかであり、したがって、リポソームへのその後の損傷が少なく、内部の内容物の喪失がより少ない。リポソームが、その内部の内容物の相当な部分を喪失することなく、脱水プロセスを存続することを確実にするために、系中の水が除去されるときに、脂質小胞膜と相互作用し、それらを無傷で維持するよう、通常、１種又は複数の保護的糖が使用される。トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース及びデキストランなどの糖を含めた種々の糖が使用され得る。一般に、二糖の糖は単糖の糖よりも良好に働き、二糖の糖、トレハロース及びスクロースが最も有効であるとわかっている。その他のより複雑な糖も使用され得る。例えば、ストレプトマイシン及びジヒドロストレプトマイシンを含めたアミノグリコシドは、脱水の間にリポソームを保護することがわかっている。通常、１種又は複数の糖が、脂質小胞の内部又は外部媒体のいずれかの部分として含まれる。最も好ましくは、糖は、それらがリポソームの膜の内側及び外側表面の両方と相互作用し得るよう、内部及び外部媒体の両方に含まれる。内部媒体中への内包は、糖（単数又は複数）を、リポソーム形成プロセスの際に脂質小胞中に内部に封入されるようになるバッファーに添加することによって達成される。これらの実施形態では、アクティブローディングプロセスの際に使用される外部媒体もまた、好ましくは、１種又は複数の保護的糖を含むべきである。
【００２７】
当業者に一般的に知られるように、リポソームに内部封入された機能的化合物の循環時間を改善するために、リポソーム組成物からの機能的化合物の早すぎる漏出を避けるか、又は低減するために、また、身体の免疫系によるリポソームの検出を避けるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質コンジュゲートが広く使用されてきた。リポソームへのＰＥＧ由来脂質の結合は、ペグ化と呼ばれる。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、リポソームは、ペグ化リポソームである。ペグ化は、ＰＥＧの反応性誘導体を標的リポソームとともにインキュベートすることによって達成され得る。本発明に従う適したＰＥＧ由来脂質として、カルボン酸、グルタチオン（ＧＳＨ）、マレイミド（ＭＡＬ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＰＤＰ）、シアヌル、アジド、アミン、ビオチン又は葉酸のうちの１種で官能基付与された、ＤＳＰＥ−ＰＥＧのコンジュゲートが挙げられ、これでは、ＰＥＧの分子量は、２０００〜５０００ｇ／ｍｏｌの間である。その他の適したＰＥＧ由来脂質として、Ｃ８又はＣ１６テールのいずれかを有する、セラミドとコンジュゲートしているｍＰＥＧがあり、これでは、ｍＰＥＧの分子量は、７５０〜５０００ｇ／ｍｏｌの間である。さらにその他の適当なリガンドとして、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのようなグリセロリン脂質とコンジュゲートしている、ｍＰＥＧ又は官能基付与されたＰＥＧがある。リポソームのペグ化は、当業者に一般に知られている技術である。
【００２８】
本発明の特に好ましい実施形態では、リポソームは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＧＳＨコンジュゲート（最大５ｍｏｌ％）及び／又はＤＳＰＥ−ｍＰＥＧコンジュゲート（これでは、ＰＥＧの分子量は、通常、７５０〜５０００ｇ／ｍｏｌの範囲内、例えば、２０００ｇ／ｍｏｌである）を用いてペグ化されている。本発明のリン脂質組成物は、最大５〜２０ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質コンジュゲートを含み得る。
【００２９】
さらに、特定の実施形態では、特定の細胞種、組織などにリポソームを特異的にターゲッティングするリポソーム膜部分中に組み込むことが望ましい。種々のターゲッティング部分（例えば、リガンド、受容体及びモノクローナル抗体）を使用してリポソームをターゲッティングすることは、これまでに記載されている。このようなターゲッティング部分の適した例として、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、［α］２−マクログロブリン（［α］２Ｍ）、受容体結合型タンパク質（ＲＡＰ）、ラクトフェリン、デスモテプラーゼ、組織型及びウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ／ｕＰＡ）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ−Ｉ）、ｔＰＡ／ｕＰＡ：ＰＡＩ−ｌ複合体、メラノトランスフェリン（又はＰ９７）、トロンボスポンジン１及び２、肝性リパーゼ、Ｖｌｌａ因子／組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ａ［β］１−４０、アミロイド−［β］前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ｃｌ阻害剤、補体Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、シュードモナス外毒素Ａ、ＣＲＭ６６、ＨＩＶ−Ｉ  Ｔａｔタンパク質、ライノウイルス、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）、スフィンゴ脂質（ｓｐｉｎｇｏ脂質）アクチベータータンパク質（ＳＡＰ）、妊娠領域タンパク質、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、［α］１−アンチトリプシン、熱ショックタンパク質９６（ＨＳＰ−９６）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アポリポタンパク質Ｊ（アポＪ又はクラステリン）、アポＪ及びアポＥと結合しているＡ［β］、アプロチニン、アンギオペプ（ａｎｇｉｏｐｅｐ）−２（ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ）、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、トランスフェリン、インスリン、レプチン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、レクチン、ペプチドミメティック及び／又はヒト化モノクローナル抗体又は前記受容体に特異的なペプチド（例えば、ヒトトランスフェリン受容体又は抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）モノクローナル抗体Ａ２４と結合する配列ＨＡＩＹＰＲＨ及びＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ）、ヘモグロビン、ジフテリア毒素ポリペプチド鎖の非毒性部分、ジフテリア毒素Ｂ鎖のすべて又は一部、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の非毒性変異株のすべて又は一部、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ（例えば、ポリソルブ（ｐｏｌｙｓｏｒｂ）−８０コーティングと結合後）、ビタミンＤ結合性タンパク質、ビタミンＡ／レチノール結合性タンパク質、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、グルタチオン及びトランスコバラミン−Ｂ１２が挙げられる。
【００３０】
ターゲッティング機序は、一般に、標的部分が、標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるように、ターゲッティング薬剤がリポソームの表面上に位置されることを必要とする。リポソームは、通常、膜を形成するときに、コネクター部分が膜中に最初に組み込まれるように作られる。コネクター部分は、膜中に堅く埋め込まれ、固定された親油性部分を有さなくてはならない。リポソームの水性表面上に化学的に利用可能である親水性部分も有さなくてはならない。親水性部分は、後に添加されるターゲッティング剤と安定な化学結合を形成するのに化学的に適しているように選択される。したがって、コネクター分子は、親油性アンカー及びリポソームの表面から伸びた、ターゲッティング剤と反応するのに、及びターゲッティング剤をその正しい位置に保持するのに適した親水性の反応性基の両方を有さなくてはならない。リポソーム膜中にターゲッティング部分を組み込む技術は、当技術分野で一般に知られている。
難水溶性物質
【００３１】
上記に示されるように、本発明は、難水溶性物質をリポソームにロードすることに関する。本発明との関連で、用語「難水溶性」とは、水に不溶性であるか、又は極めて制限された溶解性を有すること、より特には、通常、約２０℃である周囲温度及びｐＨ＝７で、１．９ｍＭ未満の水溶解性を有すること、さらにより好ましくは、１ｍＭ未満の水溶解性を有することを意味する。
【００３２】
本発明の実施形態によれば、難水溶性物質は、ステロイド、アントラサイクリン、パクリタキセル、ラパマイシン（シロリムス）、ＣＫＤ−６０２、ジクロフェナク、ドキソルビシン、ブピバカイン、ビンクリスチン、トポテカン、シプロフロキサシン、セチリジン、フェキソフェナジン、プリミドン及びその他のカテコールアミン、エピネフリン、これらの医薬化合物の塩及び誘導体並びにそれらの混合物の群から選択される医薬化合物である。
【００３３】
しかし、化合物のこの一覧は、本発明の範囲を制限しようとするものではない。実際、機能的化合物は、任意の難水溶性両親媒性弱塩基又は両親媒性弱酸であり得る。上記のように、難水溶性物質が製薬物質又は医薬物質ではない実施形態も想定される。
【００３４】
好ましい実施形態では、難水溶性物質は、ステロイド、アントラサイクリン、パクリタキセル、ラパマイシン（シロリムス）、ジクロフェナク、クリゾチニブ、キノリン酸、ＰＤ１５０６０６、ブピバカイン、ビンクリスチン、トポテカン、シプロフロキサシン、セチリジン、フェキソフェナジン、プリミドン及びその他のカテコールアミン、エピネフリン、これらの医薬化合物の塩及び誘導体並びにそれらの混合物の群から選択される医薬化合物である。
【００３５】
通常、本発明の関連内で、難水溶性両親媒性弱塩基は、ｐＨ７で、−２．５から２の間のオクタノール−水分配係数（ｌｏｇＤ）及びｐＫａ≦１１を有し、一方、難水溶性両親媒性弱酸は、ｐＨ７で−２．５から２の間のｌｏｇＤ及びｐＫａ＞３を有する。好ましくは、アクティブローディングされる難水溶性物質は、良好な熱安定性（約７０℃に対し、４時間）及びより高（７〜１１）又はより低（４〜７）ｐＨで良好な化学安定性を有する。
【００３６】
通常、前記において使用されるような、用語「弱塩基」及び「弱酸」は、それぞれ、水中で部分的にのみプロトン化又は脱プロトン化される化合物を指す。プロトン化可能な薬剤の例として、酸性媒体中でプロトン化され得るアミノ基を有する化合物及び中性媒体中で双性イオンであり、酸性環境ではまたプロトン化され得る化合物が挙げられる。脱プロトン化可能な薬剤の例として、アルカリ媒体中で脱プロトン化され得るカルボキシ基を有する化合物及び中性媒体中で双性イオンであり、アルカリ環境ではまた、脱プロトン化され得る化合物が挙げられる。
【００３７】
用語「双性イオン」とは、異なる原子に正及び負の電荷を同時に保持することができる化合物を指す。前記において使用されるような、用語「両親媒性の」とは、通常、親油性及び親水性両方の部分を有する化合物を指すために使用される。前記のものは、弱い両親媒性酸又は塩基である化合物の水溶液は、前記化合物の荷電形態及び非荷電形態を同時に含むことを示唆する。非荷電形態のみが、リポソーム膜を超えることができ得る。
アクティブローディング
【００３８】
上記に示されるように、予め形成されたリポソームは、アクティブ又はリモートローディング技術に従って、難水溶性物質をロードされる。「アクティブローディング」のプロセスは、膜を隔てた電位の使用を含む。アクティブローディングの原理は、一般に、当技術分野で広く記載されている。用語「アクティブローディング」及び「リモートローディング」は、同義語であり、同義的に使用される。
【００３９】
アクティブローディングの際には、難水溶性物質は、膜を隔てたプロトン又はイオン勾配によって、外部水性媒体から、リポソーム膜を横切って、内部水性媒体に移される。本明細書において使用の場合、特定の化合物の用語「勾配」とは、リポソームの外側（外部水性媒体）から内側（内部水性媒体）へのリポソーム膜を隔てた前記化合物の濃度の不連続な増大を指す。
【００４０】
濃度勾配を作り出すためには、通常、リポソームを、第１の液体、通常、水性の相中で形成し、続いて、前記の第１の液相を置換又は希釈する。希釈されたか、又は新規外部媒体は、異なる濃度の荷電種又は全体として異なる荷電種を有し、それによって、イオン又はプロトン勾配を確立する。
【００４１】
外部媒体の置換は、脂質小胞調製物をゲル濾過カラム、例えば、新規媒体を用いて平衡化されているＳｅｐｈａｄｅｘ又はＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに通すことによって、又は遠心分離、透析若しくは関連技術によってなど、種々の技術によって達成され得る。
【００４２】
リポソームへのアクティブローディングの効率は、他の態様の中でも、ロードされる物質の化学的特性並びに適用される勾配の種類及び規模に応じて変わる。本発明の実施形態では、リポソーム膜を横切る勾配を使用する前記のもののいずれかに定義される方法が提供され、これでは、前記勾配は、ｐＨ勾配、硫酸塩勾配、リン酸塩勾配、クエン酸塩勾配、又は酢酸塩勾配、ＥＤＴＡイオン勾配、アンモニウム塩勾配、アルキル化、例えば、メチル、エチル、プロピル及びアミルアンモニウム塩勾配、イオノフォアを使用するか、若しくは使用しないＭｎ２＋勾配、Ｃｕ２＋勾配、Ｎａ＋勾配、Ｋ＋勾配又はそれらの組合せから選択される。これらのローディング技術は、当技術分野で広く記載されている。
【００４３】
予め形成された、すなわち、ロードされていないリポソームの内部水性媒体は、水を含み、アクティブローディングの際に使用される勾配の種類に応じて、ｐＨ勾配を維持するために、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩又は酢酸塩、アンモニウム塩、アルキル化、例えば、メチル、エチル、プロピル及びアミルアンモニウム塩、Ｍｎ２＋塩、Ｃｕ２＋塩又はＮａ＋／Ｋ＋塩、ＥＤＴＡイオン塩、所望により、ｐＨバッファーをさらに含み得る、いわゆるアクティブローディングバッファーを含むことが好ましい。ロードされていないリポソームの内部水性媒体中の塩の好ましい濃度は、１から１０００ｍＭの間である。
【００４４】
アクティブローディングのための膜を隔てた勾配を確立するために使用される外部水性媒体は、水、溶解促進剤、ロードされる難水溶性物質（単数又は複数）、所望により、浸透圧を調整するためのスクロース及び／又はイオノフォア活性を補助するためのＥＤＴＡのようなキレート剤、より好ましくは、スクロース及び／又はＥＤＴＡを含む。浸透圧を調整するために、生理食塩水もまた使用され得る。本発明の好ましい実施形態では、アクティブローディングの間にリポソーム膜を横切る難水溶性物質（単数又は複数）の正味の輸送が起こるような程度の、内部水性媒体中の勾配を形成する塩の濃度及び外部媒体中の難水溶性物質（単数又は複数）及び溶解促進剤の濃度が確立される、リポソームをアクティブローディングするための方法が提供される。
【００４５】
より好ましい実施形態では、ｐＨ勾配、硫酸アンモニウム及び酢酸カルシウム勾配から勾配が選択される。当業者によって一般に知られるように、両親媒性弱酸をアクティブローディングするために、膜を隔てたｐＨ勾配（より低い内側、より高い外側ｐＨ）又は酢酸カルシウム勾配が使用され得る。両親媒性弱塩基はまた、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム勾配を使用してリポソーム中にアクティブローディングされ得る。イオン化していない難水溶性両親媒性化合物は、膜を越え、プロトン化されるか、若しくは脱プロトン化され、及び／又は硫酸塩、塩化物若しくはカルシウムリポソーム内対イオンと不溶性塩沈殿物を形成する。
【００４６】
脂質小胞膜の透過性に応じて、濃度勾配に対応する最大の膜を隔てた電位は、自発的に生じるか、又は透過性促進剤、例えば、プロトンイオノフォアが、浴媒体に添加されなければならない場合もある。必要に応じて、透過性促進剤は、クロマトグラフィー又はその他の技術を使用して、ローディングが完了した後に調製物から除去され得る。
【００４７】
通常、アクティブローディングの間のプロセス温度は、０〜１００℃の間、好ましくは、０〜７０℃の間、最も好ましくは、４〜６５℃の間である。
【００４８】
外部水相中の難水溶性物質のモルの初期量によって除された、内部水相中の難水溶性物質のモルの内部に封入された量に１００％をかけたものとして定義される、内部封入又はローディング効率は、少なくとも２５％、好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７０％である。
溶解促進剤
【００４９】
本明細書において先に記載されたように、本発明の主旨は、外部媒体からリポソーム中への難溶性物質の取り込みの速度及び効率を増大するために、外部水性媒体に溶解促進剤を添加することである。それによって、本発明の外部水性媒体中に溶解している難水溶性物質の濃度が増大される。本発明の実施形態によれば、錯化剤、共溶媒、界面活性剤及び乳化剤から選択される溶解促進剤を使用する、前記のものにおいて定義される方法が提供される。溶解促進剤は、通常、外部水性媒体における難水溶性化合物の溶解性を、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも３倍、好ましくは、周囲温度で１．９ｍＭを超える値に、より好ましくは、３．８ｍＭを超える値に高める。
【００５０】
本明細書において定義される錯化剤は、難水溶性化合物と水溶性包接複合体を形成する、したがって、難水溶性化合物の水溶解性を高める水溶性化合物である。本発明の一実施形態では、溶解促進剤は、シクロデキストリン及びポリビニルピロリドン（ポビドン）から選択される錯化剤である。
【００５１】
ポビドンは、多数の機能的化合物と水溶性複合体を形成するとわかっている。シクロデキストリンはまた、さまざまな両親媒性及び親油性ゲスト分子と、安定な非共有結合包接複合体を形成する能力について当技術分野で周知である（Ｃｈａｌｌａら、２００５年）。それらは、親油性内部空洞及びその良好な水溶解性になる親水性外表面を有する。３種の天然に存在するシクロデキストリン、α−、β−及びγ−シクロデキストリンは、その環の大きさ及び水溶解性が異なる。これらのうち、天然に存在するシクロデキストリン、β−シクロデキストリンの親油性内部空洞は、種々の機能的化合物にとって最も適している。ヒドロキシプロピル基及びスルホアルキルエーテル基を用いる化学修飾は、天然に存在するシクロデキストリンの水溶解性及び錯化活性を高め得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  １９９７年、Ｍｕｌｌｅｒら、１９８５年、Ｓｚｅｎｔｅら、１９９９年）。本発明の一実施形態では、錯化剤は、α−、β−及びγ−シクロデキストリン並びにアルキル−、ヒドロキシアルキル−、ジアルキル及びスルホアルキルエーテル基で修飾されたシクロデキストリンから選択される。
【００５２】
好ましい実施形態では、溶解促進剤は、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）及びスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンから選択される錯化剤である。好ましくは、錯化剤は、外部水性媒体の総質量に基づいて、外部水性媒体中に、０．１〜２５ｗ％の量で、より好ましくは、０．５〜１５ｗ％の量で、最も好ましくは、１〜１２ｗ％の量で存在する。
【００５３】
上記で示されるように、溶解促進剤はまた、共溶媒であり得る。有機薬物様化合物の水溶解性を高めるための共溶媒の使用は、当技術分野で周知である（Ｓｗｅｅｔａｎａら、１９９６年；Ｒｙｔｔｉｎｇら、２００５年）。
【００５４】
したがって、別の実施形態では、溶解促進剤は、共溶媒である。本発明との関連で、共溶媒は、水に添加されると、純粋な水と比較して、難水溶性化合物に対して大きく高められた溶解性を有する混合物をもたらす水混和性溶媒である。本発明によれば、適当な共溶媒として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ニコチンアミド、脂肪族カルボン酸のＮ，Ｎ−ジアルキルアミド、ジメチルホルムアミド、アルコール、ポリオール、ジメチルスルホキシド及びピロリドン、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ニコチンアミド、脂肪族カルボン酸のＮ，Ｎ−ジアルキルアミド、ジメチルホルムアミド、ポリオール、ジメチルスルホキシド及びピロリドンがある。しかし、共溶媒のこの一覧は、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００５５】
好ましい実施形態では、溶解促進剤は、リポソーム膜を透過性にするアルコールではない。
【００５６】
好ましい実施形態では、溶解促進剤は、ＰＥＧ及びニコチンアミドの群から選択される共溶媒であり、さらにより好ましくは、共溶媒は、２００〜４００ｇ／ｍｏｌの間の分子量を有するＰＥＧである。好ましくは、共溶媒は、外部水性媒体の総質量に基づいて、少なくとも１重量％、より好ましくは、少なくとも２重量％、最も好ましくは、少なくとも５重量％の量で存在する。さらに、共溶媒の量が、外部水性媒体の総質量に基づいて、７５重量％未満、好ましくは、５０重量％未満、より好ましくは、３３重量％未満、最も好ましくは、１０重量％未満であることが好ましい。
【００５７】
本明細書において先に記載されたように、溶解促進剤はまた、界面活性剤及び／又は乳化剤であり得る。本明細書において定義される界面活性剤又は乳化剤は、外部水性媒体中の機能的化合物の微量の流体液滴又は固体コロイド粒子を安定化し、それによって、程度の差はあるが、水相を横切る機能的化合物の分布を均質にする化合物である。いずれか特定の理論に拘束されようとは思わないが、界面活性剤又は乳化剤は、難水溶性化合物の飽和濃度を維持する貯蔵所のように作用することによって、外部水性媒体における前記難水溶性化合物の利用可能性を高めるという仮説が立てられる。
【００５８】
したがって、さらに別の実施形態では、溶解促進剤は、ポリエトキシル化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｓ（登録商標））、マクロゴール−１５−ヒドロキシステアレート、ＰＥＧ−脂質、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標））、ドクサートナトリウム、脂肪酸のスクロースエステル、脂肪酸、ポリソルベート、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース及びその誘導体、スクロースのような糖又はその代替物（Ｍｅｔｏｌｏｓｅｓ（登録商標））及びそれらの組合せの群から選択される、より好ましくは、ポリエトキシル化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｓ（登録商標））、マクロゴール−１５−ヒドロキシステアレート、ＰＥＧ−脂質、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標））、ドクサートナトリウム、脂肪酸のスクロースエステル、脂肪酸、ポリソルベート、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース及びその誘導体及びそれらの組合せの群から選択される界面活性剤及び／又は乳化剤である。好ましい乳化剤／界面活性剤として、スクロースエステルがある。通常、界面活性剤及び／又は乳化剤は、１０容量％の量で存在する。
【００５９】
最も好ましい実施形態では、リポソームをアクティブローディングする方法が提供され、前記方法は、ＨＰβＣＤ、２００〜４００ｇ／ｍｏｌの間の分子量を有するＰＥＧ、スクロース及びそれらの混合物から選択される溶解促進剤の使用を含む。
【００６０】
本明細書において先に記載されたように、外部水性媒体中に存在する溶解促進剤は、好ましくは、難水溶性化合物のアクティブローディングの際にリポソーム膜を横切って移動しない。したがって、好ましい実施形態によれば、溶解促進剤が、リポソーム膜を、物理的に及び時間内にの両方で、通過できないか、僅かにしか通過できない、前記のいずれかによるアクティブローディング法が提供される。
【００６１】
好ましい実施形態では、外部水性媒体中に存在する溶解促進性薬剤は、リポソーム膜を透過性にしない。
【００６２】
溶解促進剤が錯化剤であるという場合には、外部媒体中での錯化剤及び難水溶性物質の解離速度が、外部媒体からリポソーム中への難水溶性物質の取り込み速度を超えることが好ましい。いずれか特定の理論に拘束されようとは思わないが、前者は、外部媒体中の錯化剤と難水溶性物質の濃度及び／又は組合せ並びにリポソーム膜を横切るプロトン勾配及び／又はイオン勾配を最適化することによって確立され得ると考えられる。したがって、好ましい実施形態では、アクティブローディングの間の処理温度、リポソームの相転移温度、外部媒体中の錯化剤と難水溶性物質の濃度及び／又は組合せ並びにリポソーム膜を横切るプロトン勾配及び／又はイオン勾配が、溶解促進剤のリポソーム取り込みが十分に低いような程度に最適化される、前記のいずれかに従う予め形成されたリポソームをロードする方法が提供される。好ましくは、ロードされたリポソームの内部水性媒体中の溶解促進剤の濃度は、難水溶性物質及び溶解促進剤のモルの総数に基づいて、２０ｍｏｌ％より低く、より好ましくは、ロードされたリポソーム中の溶解促進剤の濃度は、５ｍｏｌ％よりも低く、最も好ましくは、１ｍｏｌ％未満である。
【００６３】
前記のものから明らかであろうが、リポソーム中に所与の難水溶性物質をアクティブロードする速度及び効率は、多数の因子によって、特に、膜を隔てた勾配、溶解促進性薬剤の選択、リポソーム膜の組成、処理温度などによって影響を受ける。これらのパラメータを、最も効率的なプロセスに到達するよう、すなわち、所与の難水溶性物質のために、同時に適応させ、最適化することは、当業者の能力及び標準的手順の範囲内である。
【００６４】
それにもかかわらず、初めて認識された本発明の長所は、外部媒体における溶解促進剤の使用が、溶解促進剤が使用されない同一のアクティブローディングプロセスと比較して、取り込みの速度を概して高めるということである。
【００６５】
したがって、本発明の別の態様は、難水溶性物質のローディング効率及び／又は速度を高めるための、リポソームのアクティブローディングにおける前記において記載されたような溶解促進剤の使用に関する。好ましい実施形態では、前記溶解促進剤は、錯化剤、共溶媒、界面活性剤、乳化剤及びそれらの組合せからなる群から選択される。理解されるであろうが、好ましい実施形態は、前記のいずれかにおいて定義されたような、予め形成されたリポソーム、難水溶性物質、内部水性媒体、外部水性媒体、勾配などの適用を含む。本発明の好ましい実施形態では、使用は、溶解促進性薬剤を、難水溶性物質、第１の水性媒体（すなわち、先に本明細書において定義された外部媒体）及び第２の水性媒体（すなわち、内部媒体）を内部に封入しているリポソームと混合することを含む。
【００６６】
本発明の第３の態様は、前記において記載されたアクティブローディング法によって得られることができるリポソーム組成物に関する。理解されるであろうが、好ましい実施形態は、リポソーム、難水溶性物質、内部水性媒体などがすべて、前記のいずれかにおいて定義されるとおりであるリポソーム組成物を含む。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、この組成物は、少なくとも１：２５、好ましくは、少なくとも１：１５、より好ましくは、少なくとも１：１０、より好ましくは、少なくとも１：７、より好ましくは、少なくとも１：５、さらにより好ましくは、少なくとも１：２の難水溶性物質対脂質質量比を有する。
【００６８】
当業者には理解されるであろうが、通常、前記リポソーム組成物は、主に沈殿形態の難水溶性物質を含む。通常、リポソーム内の難水溶性物質のほんの一部しか、溶解促進剤と錯体を形成しない、例えば、難水溶性化合物の１０ｍｏｌ％未満、好ましくは、１ｍｏｌ％未満が、内部水性媒体中の溶解促進剤と錯体を形成する。
【００６９】
さらに、一実施形態では、ロードされたリポソームの内部水性媒体中の溶解促進剤の量は、難水溶性物質及び溶解促進剤の総量に対して２０ｍｏｌ％より少なく、より好ましくは、ロードされたリポソーム中の溶解促進剤の濃度は、５ｍｏｌ％よりも低く、最も好ましくは、１ｍｏｌ％未満である。
【００７０】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、決して本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１：予め形成されたアクティブローディングリポソームの製造
リポソームは、遷移／処理温度及び血漿における粒子安定性を修飾するために数モルの割合の種々のリン脂質及びコレステロールからなってもよい。具体的には、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又は卵黄ホスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）のようなリン脂質が、コレステロール（Ｃｈｏｌ）とともに種々の割合で使用され、混合物中のより少ないＣｈｏｌが、血漿中においてより安定でないリポソームをもたらす。成分は、エタノール又はイソプロパノールに溶解される。さらに、（ｉｎ  ｖｉｖｏ）粒子の安定性を高め、脳送達を増強する目的で、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ及び還元型グルタチオンの新鮮な溶液を使用するリポソームの調製の前に合成される、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＧＳＨ（最大５ｍｏｌ％）からなるミセル、及び／又はＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ（Ｍｗ  ２０００）を、種々のｍｏｌパーセンテージ（合計最大５〜１０ｍｏｌ％）で溶液に添加してもよい。種々のイオン強度（１〜１０００ｍＭ）のアクティブローディングバッファー、例えば、２ｍｇ／ｍＬ硫酸アンモニウム又は１ｍｇ／ｍＬ酢酸カルシウムを含有する水溶液中に、（脂質）混合物を注入する。撹拌した後、形成された小胞を、膜を通して押し出すか、又は乳化剤中で均質化して、均一な大きさのリポソームを作製する。代わりに、２５℃から最大６０℃で、２時間から最大２４時間の間（脂質混合物の相転移温度及び薬剤の温度感受性に応じて）のインキュベーションによるリポソームの調製後に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＧＳＨ又はＤＳＰＥ−ｍＰＥＧを添加する。リポソームを、透析又は透析濾過のような一般的な分離法によって、過剰のアクティブローディングバッファーから分離する。粒径（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで５０〜２００ｎｍ）、ゼータ電位、リン脂質含量（リン脂質Ｂキット又はＨＰＬＣ／ＵＰＬＣシステムを使用して）及びペプチド含量（ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ又はＯＰＡアッセイに基づいて０．２〜１０ｍｏｌ％  ＧＳＨ）を測定することによって、リポソームの特性を明らかにする。
【００７２】
実施例２：難溶性化合物Ａの高度なアクティブリポソームローディング
低分子量を有する小分子（化合物Ａ）は、周囲温度（約２０℃）で０．００３ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。溶解性は、異なるｐＨ（ｐＨ１．５〜１０の間の試験範囲）で大幅には増大せず、シクロデキストリン、ＰＥＧ２００及びニコチンアミド中で、溶解性は、ｐＨ＝７で２．５ｍｇ／ｍｌに増大する。
【００７３】
化合物は、５〜６０μｇ／ｍｌの間の濃度で２６２ｎｍのＵＶを用いて、又はＣ−１８  ＲＰカラムを備えたＨＰＬＣシステムを用いて測定される。
【００７４】
可溶化された化合物を、実施例１に記載されたような一連の予め形成されたリポソームに、種々の薬物対脂質比（４：１、２：１、１：１、１：２、１：４）で接触させて、最適内部封入効率条件を決定する。
【００７５】
具体的には、最適ローディング条件は以下のとおりである。ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、６０℃の２ｍｇ／ｍＬの硫酸アンモニウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（６０℃で）に溶解したＨＳＰＣ（５５％）及びコレステロール（４０％）を加え、約１００ｎｍの粒子が得られるまで、フィルターを通して押し出すことによってリポソームを調製する。続いて、遊離硫酸アンモニウムを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。次いで、１０％ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）中の化合物Ａの２．５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、予め形成されたリポソームに添加し（６０℃で６０分間）、化合物Ａが硫酸アンモニウムのアンモニウムと交換し、リポソームコア内に沈殿するのを可能にする。直後に、ロードされたリポソームを氷上で冷却し、ＨＰβＣＤ中の過剰の化合物Ａを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。最適ローディング条件に対応する初期薬物対脂質比は、１：４である。
【００７６】
最適内部封入効率は、６０〜７０％であり、最終生成物は、１ｍｇ／ｍｌの化合物Ａを含有するリポソームを有し、薬物対脂質比は１：５．７である。このリポソーム溶液を、続いて、２〜３倍濃縮し、さらに濃い溶液にすることができる。対照的に、ＰＥＧ２００及びニコチンアミドに可溶化された化合物Ａは、同じ予め形成されたリポソーム中へのアクティブローディングをもたらさない。
【００７７】
ロードされたリポソームを、４℃及び３７℃で、１２日間（２、４、６、２４、４８、１２０、２８８時間）の５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４、５％スクロースにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ漏出について試験する。測定の前に、放出された化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して溶液から除去し、内部に封入された化合物を５０％の２−プロパノールを用いて遊離させ、測定を実施する。この分析から、一部の化合物が、最初の２４時間の間は、両温度で同様にリポソームから遊離し（およそ２０％）、この漏出は２４時間後に安定化することが確認される。
【００７８】
細胞ベースのアッセイから、化合物Ａは、薬物流出ポンプ乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ、ＡＢＣＧ２としても知られる）の基質であることがわかったので、製剤を野生型及びＢＣＲＰノックアウトマウスの両方で試験する。化合物を、２．５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈に注入する。動物に、リポソーム化合物又はＨＰβＣＤで製剤された遊離化合物のいずれかを注射する。注射の６時間後、野生型マウスの血漿では、リポソーム化合物Ａの注射用量の５２％が、脳ホモジネートでは０．５％が回収される。ＢＣＲＰノックアウトマウスでは、これらの値は、それぞれ、血漿では５０％及び脳ホモジネートでは０．６％である。対照的に、野生型動物では、これらの値は、血漿においてＨＰβＣＤ製剤については、わずかに０．０１％、脳ホモジネートでは０．０３％であり、これに対して、ＢＣＲＰノックアウトマウスは、８時間後に脳ホモジネートにおいて、ＨＰβＣＤで製剤された化合物Ａの注射用量の０．２３％を有し、血漿では、濃度は、検出レベル未満である。
【００７９】
結論として、ＨＰβＣＤにおける化合物Ａの溶解性を増強することによって、硫酸アンモニウム勾配を用いるアクティブローディング機序によって、高度に濃縮された、安定なリポソーム製剤が調製される。このリポソーム製剤によって、長い血液循環時間が可能となり、化合物Ａの脳送達が、ＨＰβＣＤ単独で製剤化された化合物Ａの最大耐量を注射されたＢＣＲＰノックアウトマウスにおいて得られ得るレベルの２倍超に、また野生型マウスにおいて達成され得るレベルの１５倍超に大幅に増強される。
【００８０】
実施例３：難溶性化合物Ｂの高度なアクティブリポソームローディング
低分子量を有する化学分子（化合物Ｂ）が提示される。水への溶解性は０．０４８ｍｇ／ｍｌであり、化合物は、塩基性ｐＨで分解する。溶解性は、ＰＥＧ２００中で最大８ｍｇ／ｍｌに増大される。
【００８１】
化合物は、５〜６０μｇ／ｍｌの間の濃度で２９５ｎｍのＵＶを用いて測定される。可溶化された化合物を、実施例１に記載されたような一連の予め形成されたリポソームに接触させる。具体的には、好ましい内部封入効率を有する２種の異なる組成物を製造する。最初に、ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、６０℃の２５０ｍＭ酢酸カルシウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（６０℃の）に溶解したＨＳＰＣ（５５％）及びコレステロール（４０％）を加える。第２に、ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、２５℃の２５０ｍＭの酢酸カルシウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（２５℃の）に溶解したＤＭＰＣ（５５％）及びコレステロール（４０％）を加える。両組成物について、約１００ｎｍの粒子が得られるまで、フィルターを通して押し出すことによってリポソームを調製する。続いて、遊離酢酸カルシウムを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。次いで、ＰＥＧ２００及び５％スクロース水溶液の（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物中の、４ｍｇ／ｍＬの化合物Ｂの溶液を調製し、種々の薬物対脂質比で予め形成されたリポソームに添加し（第１の組成物には６０℃で、第２のものには２５℃で、両方とも６０分間）、化合物Ｂが酢酸カルシウムと交換し、リポソームコア内に沈殿するのを可能にする。ロードされたリポソームを氷上で冷却した直後、ＰＥＧ２００／スクロース混合物中の過剰の化合物Ｂを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【００８２】
第１の組成物の最適内部封入効率は、１：３の初期薬物対脂質比で６０〜７０％である。最終生成物は、１．８ｍｇ／ｍｌの化合物Ｂ及び１：４．５の薬物対脂質比を含有するリポソームを有する。第２の組成物については、最適内部封入効率は、１：３の初期薬物対脂質比で２５〜３０％内部封入である。最終生成物は、２ｍｇ／ｍｌの化合物Ｂを含有するリポソームを有し、薬物対脂質比は１：２５である。これらのリポソーム溶液を、２〜３倍濃縮し、さらに濃い溶液にすることができる。対照的に、純粋なＰＥＧ２００及びＨＰβＣＤに可溶化された化合物Ｂは、同じ予め形成されたリポソーム中へのもたらさず、硫酸アンモニウムを含有する予め形成されたリポソームにおいてもアクティブローディングをもたらさない。
【００８３】
ロードされたリポソームを、４℃及び３７℃で、製造の１、３及び７日後に、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４、５％スクロースにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ漏出について試験する。測定の前に、放出された化合物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して溶液から除去し、内部封入された化合物を５０％の２−プロパノールを用いて遊離させ、測定を実施する。この分析から、両製剤が、冷蔵庫中で少なくとも１週間、また第１の組成物については、３７℃で少なくとも１日間安定であることが確認される。第２の組成物は、３７℃で１日後にその化合物のほとんどを失う。
【００８４】
製剤された化合物を、２ｍｇ／ｋｇの用量でラットの尾静脈中に注射する。動物に、リポソーム化合物（組成物１及び２）又はＰＥＧ４００−ＨＰβＣＤ（１０：９０ｖ／ｖ）で製剤された遊離化合物のいずれかを注射する。しかし、両リポソーム製剤は、驚くほど短い血漿半減期を有する。そこで、製剤間の分布の相違の評価は、注射の１５分後に行われる。これらのサンプルでは、組成物１及び２について、血漿においてリポソーム化合物Ｂの注射用量の５２％及び１８％がそれぞれ、脳ホモジネートにおいて３．１％及び１．０％がそれぞれ回収される。対照的に、ＰＥＧ４００−ＨＰβＣＤ製剤のこれらの値は、血漿において７％、脳ホモジネートにおいて２．８％である。
【００８５】
結論として、ＰＥＧ２００及び５％スクロースの１：１混合物における化合物Ｂの溶解性を増強することによって、酢酸カルシウムを使用するアクティブローディング機序によって、高度に濃縮された、安定なリポソーム製剤が調製される。これらのリポソーム製剤は、短い血液循環時間を有し、注射直後のリポソームを用いない場合よりも高い血漿レベル（Ｃｍａｘ）にもかかわらず、リポソーム製剤は、ＰＥＧ４００−ＨＰΒＣＤ製剤によって得られるすでに高い脳レベルと比較して、化合物Ｂの脳送達を大幅には増強しなかった。例えば、酢酸カルシウムバッファー濃度を低下させることによって、リポソームの血漿安定性を高めることは、化合物Ｂの脳への送達をさらに増強するであろう。
【００８６】
実施例４：難溶性化合物Ｃの高度なアクティブリポソームローディング
低分子量を有するＮＭＤＡ受容体の血液脳関門不透過性アゴニスト（化合物Ｃ）は、ｐＨ５で０．００３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６で０．０２０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７で０．３５ｍｇ／ｍＬからｐＨ８で０．９ｍｇ／ｍＬの範囲のｐＨ依存性の水への溶解性を有する。溶解性は、ｐＨ＝７のＨＰβＣＤにおいて最大２．２ｍｇ／ｍＬにさらに増大される。
【００８７】
化合物は、５〜６０μｇ／ｍｌの間の濃度で２６２ｎｍのＵＶを用いて、又はＣ−１８  ＲＰカラムを備えたＨＰＬＣシステムを用いて測定される。
【００８８】
可溶化された化合物を、実施例１に記載されたような一連の予め形成されたリポソームに、種々の薬物対脂質比（４：１、２：１、１：１、１：２、１：４）で接触させ、最適な内部封入効率条件を決定する。
【００８９】
具体的には、最適ローディング条件は以下のとおりである。ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、２５℃の２５０ｍＭ酢酸カルシウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（２５℃で）に溶解したＤＭＰＣ（５７％）及びコレステロール（３８％）を加え、約１００ｎｍの粒子が得られるまで、フィルターを通して押し出すことによってリポソームを調製する。続いて、遊離酢酸カルシウムを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。次いで、２ｗ／ｗ％のＨＰβＣＤの水溶液中の化合物Ｃの２．２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、予め形成されたリポソームに添加し（２５℃で６０分間）、化合物Ｃが酢酸カルシウムのカルシウムと交換し、リポソームコア内に沈殿するのを可能にする。ロードされたリポソームを氷上で冷却した直後、ＨＰβＣＤ中の過剰の化合物Ｃを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【００９０】
内部封入効率は、６０〜７０％であり、最終生成物は、１：２の薬物対脂質比で１ｍｇ／ｍｌの化合物Ｃを含有するリポソームを有する。このリポソーム溶液を、３．５倍濃縮し、さらに濃い溶液にすることができる。
【００９１】
化合物を、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈中に注射する。動物に、リポソーム化合物又はＨＰΒＣＤで製剤された遊離化合物のいずれかを注射する。注射の３０分後、血漿においてリポソーム化合物Ｃの注射用量の１４％が、脳ホモジネートにおいて０．２６％が、脳脊髄液（ＣＳＦ）において０．０９％が回収される。対照的に、化合物ＣのＨＰβＣＤ製剤のこれらの値は、血漿において６％、脳ホモジネートにおいて０．０８％、及びＣＳＦにおいて０．０３％である。ＮＭＤＡ受容体に対するアゴニストの効果は、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルの増大の定量化によってマウスの小脳において生化学的に評価される。注射の３０分後、化合物ＣのＨＰβＣＤ製剤は、ｃＧＭＰレベルの変化をもたらさず、一方で、リポソーム製剤は、対照レベルの１６０％という大幅な増大をもたらす。
【００９２】
結論として、ＨＰβＣＤにおける化合物Ｃの溶解性を増強することによって、酢酸カルシウム勾配を使用するアクティブローディング機序によって、高度に濃縮されたリポソーム製剤が調製される。このリポソーム製剤は、比較的短い血漿半減期にもかかわらず、化合物Ｃの脳及びＣＳＦ送達を、ＨＰβＣＤ単独で製剤化された化合物Ｃの最大耐量を、同じ投与量で注射されたマウスにおいて得られ得るレベルの３倍超に、及び濃縮リポソーム製剤の最大耐量を用いて達成され得るレベルの１５倍超に大幅に増強する。例えば、酢酸カルシウムバッファー濃度を低下させることによって、リポソームの血漿安定性を増大することは、化合物Ｃの脳への送達をさらに増強するであろう。このリポソーム製剤によって得られる増強された脳への送達は、遊離化合物を用いた場合には観察されなかった、小脳における受容体特異的効果を誘発し得る。
【００９３】
実施例５：難溶性クリゾチニブの高度なアクティブリポソームローディング
４５０Ｄａの低分子量を有する小分子チロシンキナーゼ阻害剤（クリゾチニブ）は、周囲温度（約２０℃）で＜０．１ｍｇ／ｍｌの水溶解性を有する。ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）における溶解性は、ＰＥＧ２００及びニコチンアミドにおける場合には２．２ｍｇ／ｍｌに増大し、溶解性はｐＨ＝７で少なくとも５ｍｇ／ｍｌに増大する。
【００９４】
化合物を、５〜６０μｇ／ｍｌの間の濃度でＵＶを用いて、又はＣ−１８  ＲＰカラムを備えたＨＰＬＣシステムを用いて測定する。
【００９５】
可溶化された化合物を、実施例１に記載されたような一連の予め形成されたリポソームに、種々の薬物対脂質比（４：１、２：１、１：１、１：２、１：４）で接触させ、最適な内部封入効率条件を決定する。
【００９６】
具体的には、最適ローディング条件は以下のとおりである。ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、６０℃の２ｍｇ／ｍＬの硫酸アンモニウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（６０℃で）に溶解したＨＳＰＣ（５５％）及びコレステロール（４０％）を加え、約１００ｎｍの粒子が得られるまで、フィルターを通して押し出すことによってリポソームを調製する。続いて、遊離硫酸アンモニウムを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。次いで、２０％のＨＰβＣＤ中のクリゾチニブの２．２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、予め形成されたリポソームに添加し（６０℃で６０分間）、クリゾチニブが硫酸アンモニウムのアンモニウムと交換し、リポソームコア内に沈殿するのを可能にする。ロードされたリポソームを氷上で冷却した直後、ＨＰβＣＤ中の過剰のクリゾチニブを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。最適ローディング条件に対応する初期薬物対脂質比は、１：４である。
【００９７】
最適内部封入効率は、６０〜７０％であり、最終生成物は、１：５．７の薬物対脂質比で１ｍｇ／ｍｌのクリゾチニブを含有するリポソームを有する。次に、このリポソーム溶液を２〜３倍濃縮し、さらに濃い溶液にすることができる。
【００９８】
ロードされたリポソームを、４℃及び３７℃で、１２日間（２、４、６、２４、４８、１２０、２８８時間）の５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４、５％スクロースにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ漏出について試験する。測定の前に、放出された化合物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して溶液から除去し、内部に封入された化合物を５０％の２−プロパノールを用いて遊離させ、測定を実施する。この分析から、一部の化合物が、最初の２４時間の間は、両温度で同様にリポソームから遊離し（およそ２０％）、この漏出は２４時間後に安定化することが確認される。
【００９９】
細胞ベースのアッセイから、チロシンキナーゼ阻害剤は、薬物流出ポンプ乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ、ＡＢＣＧ２としても知られる）の基質であることが多いことがわかり、そこで、製剤を野生型及びＢＣＲＰノックアウトマウスの両方で試験する。化合物を、２．５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈に注入する。動物に、リポソーム化合物又はＨＰβＣＤで製剤された遊離化合物のいずれかを注射する。注射の６時間後、野生型マウスの血漿では、リポソームクリゾチニブの注射用量の５２％が、脳ホモジネートでは０．５％が回収される。ＢＣＲＰノックアウトマウスでは、これらの値は、それぞれ、血漿では５０％及び脳ホモジネートでは０．６％である。対照的に、野生型動物では、これらの値は、血漿においてＨＰβＣＤ製剤については、ほんの０．０１％、及び脳ホモジネートでは０．０３％であり、一方で、ＢＣＲＰノックアウトマウスは、８時間後に脳ホモジネートにおいて、ＨＰβＣＤで製剤されたクリゾチニブの注射用量の０．２３％を有し、血漿では、濃度は検出レベル未満である。
【０１００】
結論として、ＨＰβＣＤにおけるクリゾチニブの溶解性を増強することによって、硫酸アンモニウム勾配を用いるアクティブローディング機序によって、高度に濃縮された、安定なリポソーム製剤が調製される。このリポソーム製剤によって、長い血液循環時間が可能となり、クリゾチニブの脳送達が、ＨＰβＣＤ単独で製剤化されたクリゾチニブの最大耐量を注射されたＢＣＲＰノックアウトマウスにおいて得られ得るレベルの２倍超に、また野生型マウスにおいて達成され得るレベルの１５倍超に大幅に増強される。
【０１０１】
実施例６：難溶性ＰＤ１５０６０６の高度なアクティブリポソームローディング
３０６Ｄａという低分子量を有するカルパイン阻害剤（ＰＤ１５０６０６）が提示される。水への溶解性は、０．０５ｍｇ／ｍｌ未満であり、化合物は、塩基性ｐＨで分解する。溶解性は、ＰＥＧ２００中で最大８ｍｇ／ｍｌに増大される。
【０１０２】
化合物は、５〜６０μｇ／ｍｌの間の濃度でＵＶを用いて測定される。可溶化された化合物を、実施例１に記載されたような一連の予め形成されたリポソームに接触させる。具体的には、好ましい内部封入効率を有する２種の異なる組成物を製造する。最初に、ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、６０℃の２５０ｍＭ酢酸カルシウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（６０℃の）に溶解したＨＳＰＣ（５５％）及びコレステロール（４０％）を加える。第２に、ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、２５℃の２５０ｍＭの酢酸カルシウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（２５℃の）に溶解したＤＭＰＣ（５５％）及びコレステロール（４０％）を加える。両組成物について、約１００ｎｍの粒子が得られるまで、フィルターを通して押し出すことによってリポソームを調製する。続いて、遊離酢酸カルシウムを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。次いで、ＰＥＧ２００及び５％スクロース水溶液の（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物中の、４ｍｇ／ｍＬの化合物Ｂの溶液を調製し、種々の薬物対脂質比で予め形成されたリポソームに添加し（第１の組成物には６０℃で、第２のものには２５℃で、両方とも６０分間）、ＰＤ１５０６０６が酢酸カルシウムと交換し、リポソームコア内に沈殿するのを可能にする。ロードされたリポソームを氷上で冷却した直後、ＰＥＧ２００／スクロース混合物中の過剰のＰＤ１５０６０６を透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【０１０３】
第１の組成物の最適内部封入効率は、１：３の初期薬物対脂質比で６０〜７０％である。最終生成物は、１．８ｍｇ／ｍｌのＰＤ１５０６０６及び１：４．５の薬物対脂質比を含有するリポソームを有する。第２の組成物については、最適内部封入効率は、１：３の初期薬物対脂質比で２５〜３０％内部封入である。最終生成物は、２ｍｇ／ｍｌのＰＤ１５０６０６及び１：２５の薬物対脂質比を含有するリポソームを有する。これらのリポソーム溶液を、２〜３倍濃縮し、さらに濃い溶液にすることができる。対照的に、純粋なＰＥＧ２００及びＨＰβＣＤに可溶化されたＰＤ１５０６０６は、同じ予め形成されたリポソーム中へのアクティブローディングをもたらさず、硫酸アンモニウムを含有する予め形成されたリポソームにおいてももたらさない。
【０１０４】
ロードされたリポソームを、４℃及び３７℃で、製造の１、３及び７日後に、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４、５％スクロースにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ漏出について試験する。測定の前に、放出された化合物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して溶液から回収し、内部に封入された化合物を５０％の２−プロパノールを用いて遊離させ、測定する。この分析から、両製剤が、冷蔵庫中で少なくとも１週間、また第１の組成物については、３７℃で少なくとも１日間安定であることが決定される。第２の組成物は、３７℃で１日後にその化合物のほとんどを失う。
【０１０５】
製剤された化合物を、２ｍｇ／ｋｇの用量でラットの尾静脈中に注射する。動物に、リポソーム化合物（組成物１及び２）又はＰＥＧ４００−ＨＰβＣＤ（１０：９０ｖ／ｖ）で製剤された遊離化合物のいずれかを注射する。しかし、両リポソーム製剤は、驚くほど短い血漿半減期を有する。そこで、製剤間の分布の相違の評価は、注射の１５分後に行われる。これらのサンプルでは、組成物１及び２について、血漿においてリポソームＰＤ１５０６０６の注射用量の５２％及び１８％がそれぞれ、及び脳ホモジネートにおいて３．１％及び１．０％がそれぞれ回収される。対照的に、ＰＥＧ４００−ＨＰβＣＤ製剤のこれらの値は、血漿において７％、脳ホモジネートにおいて２．８％である。
【０１０６】
結論として、ＰＥＧ２００及び５％スクロースの１：１混合物におけるＰＤ１５０６０６の溶解性を増強することによって、酢酸カルシウムを使用するアクティブローディング機序によって、高度に濃縮された、安定なリポソーム製剤が調製される。これらのリポソーム製剤は、短い血液循環時間を有し、注射直後のリポソームを用いない場合よりも高い血漿レベル（Ｃｍａｘ）にもかかわらず、リポソーム製剤は、ＰＥＧ４００−ＨＰΒＣＤ製剤によって得られるすでに高い脳レベルと比較して、ＰＤ１５０６０６の脳送達を大幅には増強しなかった。例えば、酢酸カルシウムバッファー濃度を低下させることによって、リポソームの血漿安定性を高めることは、ＰＤ１５０６０６の脳への送達をさらに増強するであろう。
【０１０７】
実施例７：難溶性キノリン酸の高度なアクティブリポソームローディング
１６７Ｄａという低分子量を有するＮＭＤＡ受容体の血液脳関門不透過性アゴニスト（キノリン酸）は、ｐＨ５で０．００３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６で０．０２０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７で０．３５ｍｇ／ｍＬからｐＨ８で０．９ｍｇ／ｍＬの範囲のｐＨ依存性の水への溶解性を有する。溶解性は、ｐＨ＝７のＨＰβＣＤにおいて最大２．２ｍｇ／ｍＬにさらに増大される。
【０１０８】
化合物は、５〜６０μｇ／ｍｌの間の濃度で２６２ｎｍのＵＶを用いて、又はＣ−１８  ＲＰカラムを備えたＨＰＬＣシステムを用いて測定される。
【０１０９】
可溶化された化合物を、実施例１に記載されたような一連の予め形成されたリポソームに、種々の薬物対脂質比（４：１、２：１、１：１、１：２、１：４）で接触させ、最適な内部封入効率条件を決定する。
【０１１０】
具体的には、最適ローディング条件は以下のとおりである。ＧＳＨ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル（５％）を、２５℃の２５０ｍＭ酢酸カルシウム溶液に溶解する。この溶液に、エタノール（２５℃で）に溶解したＤＭＰＣ（５７％）及びコレステロール（３８％）を加え、約１００ｎｍの粒子が得られるまで、フィルターを通して押し出すことによってリポソームを調製する。続いて、遊離酢酸カルシウムを透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。次いで、２ｗ／ｗ％のＨＰβＣＤの水溶液中のキノリン酸の２．２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、予め形成されたリポソームに添加し（２５℃で６０分間）、キノリン酸が酢酸カルシウムのカルシウムと交換し、リポソームコア内に沈殿するのを可能にする。ロードされたリポソームを氷上で冷却した直後、ＨＰβＣＤ中の過剰のキノリン酸を透析によって除去し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【０１１１】
内部封入効率は、６０〜７０％であり、最終生成物は、１：２の薬物対脂質比で１ｍｇ／ｍｌのキノリン酸を含有するリポソームを有する。このリポソーム溶液を、３．５倍濃縮し、さらに濃い溶液にすることができる。
【０１１２】
化合物を、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈中に注射する。動物に、リポソーム化合物又はＨＰΒＣＤで製剤された遊離化合物のいずれかを注射する。注射の３０分後、血漿においてリポソームキノリン酸の注射用量の１４％が、脳ホモジネートにおいて０．２６％が、脳脊髄液（ＣＳＦ）において０．０９％が回収される。対照的に、キノリン酸のＨＰβＣＤ製剤のこれらの値は、血漿において６％、脳ホモジネートにおいて０．０８％、ＣＳＦにおいて０．０３％である。ＮＭＤＡ受容体に対するアゴニストの効果は、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルの増大の定量化によってマウスの小脳において生化学的に評価される。注射の３０分後、キノリン酸のＨＰβＣＤ製剤は、ｃＧＭＰレベルの変化をもたらさず、一方で、リポソーム製剤は、対照レベルの１６０％という大幅な増大をもたらす。
【０１１３】
結論として、ＨＰβＣＤにおけるキノリン酸の溶解性を増強することによって、酢酸カルシウム勾配を使用するアクティブローディング機序によって、高度に濃縮されたリポソーム製剤が調製される。このリポソーム製剤は、比較的短い血漿半減期にもかかわらず、キノリン酸の脳及びＣＳＦ送達を、ＨＰβＣＤ単独で製剤化されたキノリン酸の最大耐量を、同じ投与量で注射されたマウスにおいて得られ得るレベルの３倍超に、濃縮リポソーム製剤の最大耐量を用いて達成され得るレベルの１５倍超に大幅に増強する。例えば、酢酸カルシウムバッファー濃度を低下させることによって、リポソームの血漿安定性を増大することは、キノリン酸の脳への送達をさらに増強するであろう。このリポソーム製剤によって得られる増強された脳への送達は、遊離化合物を用いた場合には観察されなかった、小脳における受容体特異的効果を誘発し得る。
【０１１４】
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