(57)【要約】本発明は、酵素オキシドスクアレンシクラーゼを包含するコレステロール生合成経路を、抗腫瘍治療のための新規タンパク質ターゲットであると同定する。さらに、本発明は、新規抗癌剤として、芳香環構造と連結された三級アミンを含有する一群のオキシドスクアレンシクラーゼ阻害剤を提供する。本明細書に記載の化合物は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞（薬物耐性肺癌Ｈ６９ＡＲを含む）、大腸癌細胞、卵巣癌細胞（薬物耐性ＯＶＣＡＲ−３を含む）、および膵臓癌細胞を含む１９種類の細胞株、ならびにヒト乳房および前立腺異種移植腫瘍増殖において試験され、活性を有することが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置を必要とする患者に、コレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの阻害剤の治療上有効量を投与する工程を含む、癌の処置方法。
【請求項２】
タンパク質ターゲットが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質ターゲットが、オキシドスクアレンシクラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
癌が、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、胃癌、子宮癌、リンパ腫、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、舌癌および膀胱癌、および白血病、ならびにそれらの薬物耐性表現型から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
癌細胞が、ｐ５３変異を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
癌細胞が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の乳癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
癌細胞が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陽性の乳癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対して三重陰性の乳癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
癌細胞が、アポトーシスを受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤が、ＰＲＩＭＡ−１ではない化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該化合物が、少なくとも２つの芳香環構造と結合した三級アミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が、式Ｉ：
【化１】
2014505047.tif 000017
［式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、Ｏ、ＮＲ3Ｒ4、Ｓ、ＣＨ2およびＣＨから選択され；
Ｙは、存在しないか、または、結合、ＯおよびＣＨから選択され；
Ｚは、Ｏ、ＮおよびＣＨから選択され；
破線の結合は、存在しても存在しなくてもよく；存在する場合は、該結合は、単結合であっても二重結合であってもよく；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、アルキル、アルケン、アリール、アルキン、シクロアルキルおよびアルキルシクロアルキルアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｒ3およびＲ4は、独立して、結合、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、アリールおよびシクロアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｑは、臭素、塩素およびフッ素から選択される］
を有するものまたはその塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞のコレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの活性を阻害する工程を含む、癌細胞生存率を低下させる方法。
【請求項１５】
タンパク質ターゲットが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質ターゲットが、オキシドスクアレンシクラーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、甲状腺癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、リンパ腫細胞、脳癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、口腔癌細胞、咽喉癌細胞、舌癌細胞および膀胱癌細胞、および白血病細胞、ならびにそれらの薬物耐性表現型である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
癌細胞が、ｐ５３変異を有していない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
癌細胞が、アポトーシスを受ける、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
癌細胞が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の乳癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
癌細胞が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陽性の乳癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
癌細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対して三重陰性の乳癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
阻害工程が、ＰＲＩＭＡ−１ではない化合物を用いて行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
該化合物が、少なくとも２つの芳香環構造と結合した三級アミンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
化合物が、式Ｉ：
【化２】
2014505047.tif 000018
［式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、Ｏ、ＮＲ3Ｒ4、Ｓ、ＣＨ2およびＣＨから選択され；
Ｙは、存在しないか、または、結合、ＯおよびＣＨから選択され；
Ｚは、Ｏ、ＮおよびＣＨから選択され；
破線の結合は、存在しても存在しなくてもよく；存在する場合は、該結合は、単結合であっても二重結合であってもよく；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、アルキル、アルケン、アリール、アルキン、シクロアルキルおよびアルキルシクロアルキルアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｒ3およびＲ4は、独立して、結合、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、アリールおよびシクロアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｑは、臭素、塩素およびフッ素から選択される］
を有するものまたはその塩である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該化合物が、４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩（Ｒｏ  ４８−８０７１）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
癌の処置のための、細胞のコレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの活性を阻害する化合物の使用。
【請求項２８】
タンパク質ターゲットが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質ターゲットが、オキシドスクアレンシクラーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
癌が、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、胃癌、子宮癌、リンパ腫、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、舌癌および膀胱癌、および白血病、ならびにそれらの薬物耐性表現型から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
癌細胞が、ｐ５３変異を有していない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
癌細胞が、アポトーシスを受ける、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
該癌が、その細胞がＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性である乳癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
該癌が、その細胞がエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陽性である乳癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
該癌が、その細胞がエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対して三重陰性である乳癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
阻害工程が、ＰＲＩＭＡ−１ではない化合物を用いて行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
該化合物が、少なくとも２つの芳香環構造と結合した三級アミンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
化合物が、式Ｉ：
【化３】
2014505047.tif 000019
［式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、Ｏ、ＮＲ3Ｒ4、Ｓ、ＣＨ2およびＣＨから選択され；
Ｙは、存在しないか、または、結合、ＯおよびＣＨから選択され；
Ｚは、Ｏ、ＮおよびＣＨから選択され；
破線の結合は、存在しても存在しなくてもよく；存在する場合は、該結合は、単結合であっても二重結合であってもよく；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、アルキル、アルケン、アリール、アルキン、シクロアルキルおよびアルキルシクロアルキルアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｒ3およびＲ4は、独立して、結合、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、アリールおよびシクロアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｑは、臭素、塩素およびフッ素から選択される］
を有するものまたはその塩である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該化合物が、４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩（Ｒｏ  ４８−８０７１）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
化合物のアポトーシス促進性または抗増殖性を測定する方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む哺乳動物癌細胞の試料を該化合物と接触させること；
ｂ）該試料中の
ｉ）アポトーシスのマーカーおよび
ｉｉ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールの１つ以上
の１つ以上のレベルを測定すること；および
ｃ）化合物と接触させた試料中の（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか１つ以上のレベルを対照試料中の（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか１つ以上のレベルと比較すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレンおよびアポトーシスのマーカーのレベルは、アポトーシスおよび抗増殖のレベルと直接の相関があり、また、ラノステロールおよびコレステロールのレベルは、アポトーシスおよび抗増殖のレベルと逆の相関がある）、方法
【請求項４１】
試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルを測定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
試料中のアポトーシスのマーカーのレベルを測定する（ここで、アポトーシスのマーカーは、アネキシンＶである）、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
癌細胞の増幅を阻害する剤の同定方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）ｉ）試験試料を試験剤と接触させ、試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルを対照試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルと比較することによって、試験試料中のＯＳＣの活性を測定すること；または
ｉｉ）試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのレベルの１回目の測定を行い、該試料を試験剤と接触させ、該試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルの２回目の測定を行うことによって、試験試料中のＯＳＣの活性を測定すること
のいずれかを行うこと；および
ｃ）ｉ）対照試料と比べた試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルの変化；または
ｉｉ）試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルの１回目から２回目への変化
のいずれかに基づいて、試験剤がＯＳＣの細胞内活性を調節する剤であるか決定すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルは、細胞内ＯＳＣ活性のレベルと相関がある）、方法。
【請求項４４】
癌の処置のための化合物を同定する方法であって、
ａ）癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）該試験試料を試験化合物と接触させること；
ｃ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つの減少度を測定すること；
ｄ）ｉ）アポトーシスのマーカーのレベルの増加；および
ｉｉ）生存癌細胞のレベルの減少
を測定してもよいこと；
ｅ）試験化合物を
ｉ）コレステロール生合成経路における酵素の活性を阻害する化合物；
ｉｉ）癌細胞におけるアポトーシスを促進する化合物；または
ｉｉｉ）癌細胞を死滅させる化合物
であると同定すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルは、抗癌活性のレベルと相関がある）、方法。
【請求項４５】
癌の処置のための化合物を含む組成物を製造する方法であって、
ａ）癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）該試験試料を試験化合物と接触させること；
ｃ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれかの減少度を測定すること；
ｄ）ｉ）アポトーシスのマーカーのレベルの増加；および
ｉｉ）生存癌細胞のレベルの減少
を測定してもよいこと；
ｅ）試験化合物を
ｉ）コレステロール生合成経路における酵素の活性を阻害する化合物；
ｉｉ）癌細胞におけるアポトーシスを促進する化合物；または
ｉｉｉ）癌細胞を死滅させる化合物
であると同定すること；および
ｆ）このように同定された試験化合物または該試験化合物の機能的類似体もしくは同族体を担体と混合して、組成物を製造すること
を含む、方法。
【請求項４６】
コレステロール生合成経路における酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
コレステロール生合成経路における酵素が、ＯＳＣである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
アポトーシスのマーカーが、アネキシンＶである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する剤についてスクリーンニングする方法であって、
ａ）細胞を試験剤と接触させること；
ｂ）ＯＳＣの活性を検出すること；
ｃ）試験剤が哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する剤であることの指標として、対照中のＯＳＣの活性と比べたＯＳＣ活性の減少をスコア化すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年１２月２７日に出願した米国仮出願第６１／４６０,１６７号および２０１１年１０月２８日に出願した米国仮出願第６１／６２８,３２４号の優先権の利益を主張するものであり、これらの米国仮出願の記載内容は、全てが本明細書に記載されているかの如く、参照することにより本書の一部を構成する。
【０００２】
助成のステートメント
本発明は、国立衛生研究所から認められた認可番号Ｒ２１ＧＭ０８８５１７、Ｒ５６ＣＡ８６９１６およびＴ１５ＬＭ０７０８９の下、政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書は、抗癌剤および抗癌治療、詳しくは、癌の治療のための新規のタンパク質ターゲットおよびその阻害剤を開示する。
【背景技術】
【０００４】
ＯＳＣおよびその阻害剤。酵素オキシドスクアレンシクラーゼ（「ＯＳＣ」）は、コレステロール生合成経路の一部であると知られており、これにより、ＯＳＣは、オキシドスクアレンを、ステロイドスキャフォールドを形成するラノステロールに変える［文献１、２（非特許文献１、非特許文献２）］。例えば、式Ｉ：
【化１】
2014505047.tif 000002
［式中、
Ｑは、特に、臭素であり得、Ｒ1およびＲ2は、特に、脂肪族基または芳香族基であり得る］
で示されるような、三級アミン、ヘキシルオキシスペーサーおよび無拘束ブロモフェニル基を含有する一連の阻害剤を包含する多数のＯＳＣ阻害剤が報告されている。式Ｉは、以下に詳しく記載される；［文献３、４（非特許文献３、非特許文献４）］も参照。ブロモフェニル環とメトキシフェニル環との間に芳香族リンカーまたはケトンリンカーを有する類似体の例を以下に記載する：
【化２】
2014505047.tif 000003
それらのうち、下記のＲｏ  ４８−８０７１（４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩）は、強力なＯＳＣ阻害剤である。
【化３】
2014505047.tif 000004
(４−ブロモフェニル)[２−フルオロ−４−[[６−(メチル−２−プロペニルアミノ)ヘキシル]オキシ]フェニル]−メタノンとしても知られているＲｏ  ４８−８０７１は、市販されている；例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．  Ｒ２２７８を参照。ＯＳＣおよびその阻害剤は、血漿中コレステロール値を減少させるためのターゲットとして研究されているが［文献５（非特許文献５）］、ＯＳＣは、これまで、有効な抗腫瘍ターゲットとして同定されていなかった。
【０００５】
ｐ５３腫瘍抑制因子。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の変異は、乳癌のような多くのタイプの腫瘍に共通の事象である［文献６〜８（非特許文献６〜８）］。変異ｐ５３（ｍｔｐ５３）タンパク質は、腫瘍細胞の生存および化学療法剤に対する耐性を促進すると考えられている。したがって、既存のｍｔｐ５３を野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）コンフォメーションに変えることによるｐ５３機能の復元は、感受性の癌における腫瘍細胞のアポトーシスを促進する一のストラテジーであると見なされている。
【０００６】
ＰＲＩＭＡ−１。ハイスループット実験によって見つけられた小分子ＰＲＩＭＡ−１（ｐ５３再活性化および大量のアポトーシス誘発；２,２−ビス(ヒドロキシメチル)−３−キヌクリジノンとしても知られている；以下に示される）は、変異ｐ５３タンパク質を活性化することによって野生型ｐ５３と関連する腫瘍抑制機能を回復するその能力のために大きな関心が寄せられている［文献９（非特許文献９）］。
【化４】
2014505047.tif 000005
【０００７】
この効果は、インビトロおよびインビボで立証されており、ヒトの乳癌細胞において大量のアポトーシスを引き起こすことが示されている［文献１０、１１（非特許文献１０、非特許文献１１）］。ＰＲＩＭＡ−１の抗腫瘍効果は、癌に対する有効な剤としてのその重要性を確立しているが、変異ｐ５３の再活性化のメカニズムは、依然として分かりにくい。ｐ５３と直接関連しているのか分からないが、未発表のＮＭＲ実験のなかには、直接的な関連を示唆するものがある。かくして、新しい癌治療パラダイムをもたらし得るＰＲＩＭＡ−１の直接タンパク質ターゲットを同定することが必要である。本発明者らの結果は、ＰＲＩＭＡ−１の化学療法効果のためのタンパク質ターゲットの１つが酵素ＯＳＣであることを示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Abe I, Rohmer M., Prestwich GD. Enzymatic cyclization of squalene and oxidosqualene to sterols and triterpenes. Chem. Rev. 1993, 90:2189-2206.
【非特許文献２】Wendt KU, Schulz GE, Corey EJ, Liu DR. Enzyme mechanisms for polycyclic triterpene formation. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39:2812-2833.
【非特許文献３】Morand OH, Aebi J, Guerry P, Hartman PG, Hennes U, Himber J, Ji YH, Jolidon S, Lengsfeld H. Potent inhibitors of mammalian 2,3-oxidosqualene: lanosterol cyclase are orally active cholesterol lowering agents. Atherosclerosis 1994, 109(suppl):321.
【非特許文献４】Lenhart A, Reinert DJ, Aebi JD, Dehmlow H, Morand OH, Schulz GE. Binding Structures and Potencies of oxidosqualene cyclase inhibitors with the homologous squalene-hopene cyclase.  J. Med. Chem. 2003, 46:2083-2092.
【非特許文献５】Morand OH, Aebi JD, H D, Ji YH, N G, Lengsfeld H, Himber J: Ro 48-8071, a new 2,3-oxidosqualene:lanosterol cyclase inhibitor lowering plasma cholesterol in hamsters, squirrel monkeys, and minipigs: comparison to simvastatin. J. Lipid. Res. 1997, 38:373-390.
【非特許文献６】Levine AJ. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997, 88:323-331.
【非特許文献７】Barnes DM, Camplejohn RS. p53, apoptosis, and breast cancer. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 1996, 1:163-175.
【非特許文献８】Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumor types. Nature 1989, 342:705-708.
【非特許文献９】Bykov VJ, Issaeva N, Shilov A, Hultcrantz M, Pugacheva E, Chumakov P, Bergman J, Wiman KG, Selivanova G. Restoration of the tumor suppressor function to mutant p53 by a low molecular-weight compound. Nat Med 2002, 8:282-288.
【非特許文献１０】Liang Y, Wu J, Stancel GM, Hyder SM. p53-dependent inhibition of progestin-induced VEGF expression in human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Bio. 2005, 93:173-182.
【非特許文献１１】Liang Y, Besch-Williford C, Hyder SM. PRIMA-1 inhibits growth of breast cancer cells by re-activating mutant p53 protein. Int.l J. Oncol. 2009, 35:1015-1023.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、抗癌治療剤のための新しいターゲットの確立が必要とされているが、酵素ＯＳＣおよびそのシグナル伝達経路は、選択的な抗腫瘍ターゲット候補となる。また、ＯＳＣの活性を阻害することによって癌の治療における治療的応用性のある新規阻害剤の同定が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一の態様において、コレステロール生合成経路における酵素オキシドスクアレンシクラーゼ（「ＯＳＣ」）のようなタンパク質をターゲットとすることによる癌治療および処置の方法が提供される。特定の実施態様において、コレステロール生合成経路において酵素を阻害することを含む癌の処置方法を提供する。特定の実施態様において、該酵素は、ＯＳＣである。特定の実施態様において、該方法は、癌細胞におけるＯＳＣの活性の阻害工程を含む。該癌細胞は、ＩＣ50分析によって１９種類の細胞株のインビトロ癌細胞増殖実験において立証されるような、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、甲状腺癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、リンパ腫細胞、脳腫瘍細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、口腔癌細胞、咽喉癌細胞、舌癌細胞、鼻癌細胞、食道癌細胞および膀胱癌細胞、および白血病細胞、ならびにそれらの薬物耐性表現型から選択される細胞のような様々な種類および／または起源のものであり得る。特定の実施態様において、一連のＯＳＣ阻害剤、すなわち、芳香環構造と連結された三級アミンを含有する阻害剤は、癌治療における治療剤として使用される。該化合物４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩（Ｒｏ  ４８−８０７１）は、阻害剤の一例である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＰＲＩＭＡ−１（図示されているように結合ポケットの上部に向かう暗い構造）および該阻害剤Ｒｏ  ４８−８０７１（明るい構造）を結合したオキシドスクアレンシクラーゼ（「ＯＳＣ」）のリボン状描写である。
【図２】図２は、ＰＲＩＭＡ−１、Ｒｏ  ４８−８０７１およびＵ１８６６６Ａの乳癌細胞生存率に対する効果を示す。ＢＴ−４７４細胞（１.０×１０4／ウェル、上方の図２Ａを参照）またはＴ４７−Ｄ細胞（０.６×１０4／ウェル、下方の図２Ｂを参照）を９６ウェルプレートに播種し、一夜おいて、細胞を洗浄し、所定の濃度のＲｏ  ４８−８０７１またはＰＲＩＭＡ−１で２４時間処理した。方法の欄で記載するＳＲＢアッセイによって、細胞増殖および生存率を測定した。ＯＳＣ阻害剤Ｒｏ  ４８−８０７１、ＰＲＩＭＡ−１およびＵ１８６６６Ａは、用量依存的に、ＢＴ−４７４およびＴ−４７−Ｄ細胞の生存率を有意に阻害した。
【図３】図３は、乳癌細胞生存率および正常な乳房細胞生存率に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す。ＢＴ−４７４細胞（１.０×１０4／ウェル）およびＡＧ１１１３２Ａ細胞（０.７×１０4／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、一夜おいて、細胞を洗浄し、所定の濃度のＲｏ  ４８−８０７１で２４時間処理した。正常な乳房ＡＧ１１１３２Ａ細胞生存率の阻害はかなり低い。
【図４】図４は、２４時間および４８時間にわたる、乳癌細胞株ＢＴ−４７４（左上の図４Ａを参照）、Ｔ４７−Ｄ（右上の図４Ｂを参照）およびＭＣＦ−７（下方の図４Ｃを参照）の生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図５】図５は、２４時間および４８時間にわたる、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（左上の図５Ａを参照）、ＰＣ−３（右上の図５Ｂを参照）およびＤＵ１４５（下方の図５Ｃを参照）の生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図６】図６は、２４時間および４８時間にわたる、大腸癌細胞株ＤＬＤ−１（左上の図６Ａを参照）およびＬｏＶｏ（右上の図６Ｂを参照）、ならびに卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３（左下の図６Ｃを参照）およびＳＫ−ＯＶ−３（左下の図６Ｄを参照）の生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図７】図７は、２４時間および４８時間にわたる、肺癌細胞株Ｈ６９ＡＲ（左上の図７Ａを参照）、ＮＣＩ−Ｈ２３（右上の図７Ｂを参照）およびＡ５４９（下方の図７Ｃを参照）の生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図８】図８は、２４時間および４８時間にわたる、膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ−１（左側の図８Ａを参照）およびＢｘＰＣ−３（右側の図８Ｂを参照）の生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図９】図９は、２４時間および４８時間にわたる、エストロゲン、プロゲステロンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陽性乳癌細胞株ＨＣＣ−１４２８（左上の図９Ａを参照）およびＺＲ−７５（右上の図９Ｂを参照）、ならびにエストロゲン、プロゲステロンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−２３１（左下の図９Ｃを参照）およびＢＴ２０（左下の図９Ｄを参照）の生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図１０】図１０は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陰性ヒト乳癌細胞（それぞれ、図１０Ａおよび図１０Ｂを参照）ならびにエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陽性ヒト乳癌細胞（それぞれ、図１０Ｃおよび１０Ｄを参照）におけるアポトーシスアッセイの結果を示す。ＢＴ−４７４細胞（図１０Ａ）、ＭＣＦ−７細胞（図１０Ｂ）、ＢＴ−２０細胞（図１０Ｃ）およびＭＤＡ−２３１細胞（図１０Ｄ）は、初期アポトーシスマーカー（アネキシン（annexin）Ｖ）および後期アポトーシス／細胞死マーカー（ヨウ化プロピジウム）について染色された。象限Ｒ５は、アネキシンＶ陽性細胞を示し、象限Ｒ３は、アネキシンＶ＋ヨウ化プロピジウム陽性細胞を示す。
【図１１】図１１は、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０およびＭＤＡ−２３１腫瘍細胞株からのアネキシンＶ陽性＋ＰＩ陽性細胞（合計死亡細胞）を示す代表的な実験で得られた棒グラフを示す。全ての細胞株において、用量に比例した応答が見られた。
【図１２】図１２は、アンドロゲン受容体陰性ヒト前立腺癌細胞におけるアポトーシスアッセイの結果を示す。ＰＣ−３細胞（図１２Ａ）およびＤＵ−１４５細胞（図１２Ｂ）は、Ｒｏ  ４８−８０７１で処理され、初期アポトーシスマーカー（アネキシンＶ）および後期アポトーシス／ネクローシスマーカー（ヨウ化プロピジウム）について染色された；象限Ｒ５は、アネキシンＶ陽性細胞を示し、象限Ｒ３は、アネキシンＶ陽性＋ヨウ化プロピジウム陽性細胞を示す。図１２Ｃは、代表的な実験で得られたアポトーシスおよび死亡細胞（アネキシンＶ陽性＋ＰＩ陽性細胞）の割合を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＲＯ  ４８−８０７１がインビボで異種移植乳房腫瘍（ＢＴ−４７４）の増殖を抑制することを示す。図１３Ｂは、腫瘍を有するヌードマウスの動物体重に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【図１４】図１４Ａは、ＲＯ  ４８−８０７１がインビボで異種移植前立腺腫瘍（ＰＣ−３）の増殖を抑制することを示す。図１４Ｂは、腫瘍を有するヌードマウスの動物体重に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書は、コレステロール生合成経路における、酵素オキシドスクアレンシクラーゼ（「ＯＳＣ」）のようなタンパク質ターゲットを標的とすることによる癌治療および処置の新規な改良された方法を開示する。また、癌の処置のための、細胞のコレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの活性を阻害する化合物の使用を開示する。また、細胞のコレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの活性を阻害する化合物を含む、癌の処置のための医薬の製造における使用を開示する。
【００１３】
特定の実施態様において、癌の治療および処置の方法は、細胞におけるＯＳＣの活性を阻害する工程によって癌細胞生存率を低下させることを含む。この方法は、限定されるものではないが、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、甲状腺癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、リンパ腫細胞、脳癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、口腔癌細胞、咽喉癌細胞、舌癌細胞、鼻癌細胞、食道癌細胞および膀胱癌細胞、および白血病細胞、ならびにそれらの薬物耐性表現型のような様々な種類および起源の癌細胞に適用できる。
【００１４】
特定の実施態様において、癌の処置を必要とする患者に、コレステロール生合成経路における酵素の阻害剤を投与することを含む、癌の処置方法が提供される。さらなる実施態様において、コレステロール生合成経路における酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害は、実行可能な癌の処置方法であり得るが、その実際の使用を制限する毒物学的副作用に関連している［文献１９］。特定の実施態様において、癌の処置を必要とする患者にＯＳＣ阻害剤を投与することを含む、癌の処置方法が提供される。特定の実施態様において、癌の治療を必要とする患者にＲｏ  ４８−８０７１を投与することを含む、癌の処置方法が提供される。
【００１５】
また、コレステロール生合成経路における酵素を阻害することを含む、薬物耐性のために処置が困難であることがよく知られている癌の処置方法が提供される。したがって、特定の実施態様において、処置しようとする癌は、薬物耐性癌である。特定の実施態様において、酵素は、ＯＳＣである。さらなる実施態様において、ＯＳＣ阻害剤の投与を含む、薬物耐性癌の処置方法が提供される。さらなる実施態様において、ＯＳＣ阻害剤は、Ｒｏ  ４８−８０７１である。さらなる実施態様において、薬物耐性癌は、肺癌または卵巣癌である。薬物耐性癌の処置方法の効力は、下記の表２における肺癌細胞Ｈ６９ＡＲおよび卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ−３に対するＯＳＣ阻害剤（Ｒｏ  ４８−８０７１）の効果によって決定される。
【００１６】
また、コレステロール生合成経路における酵素を阻害することを含む、癌細胞アポトーシスおよびプログラム細胞死を誘発する方法が提供される。特定の実施態様において、該酵素は、ＯＳＣである。さらなる実施態様において、ＯＳＣ阻害剤は、Ｒｏ  ４８−８０７１である。アポトーシスを誘発する方法の効力は、例えば下記の表２、図１０、図１１および図１２に示されるような、４種類の乳癌細胞株および２種類の前立腺癌細胞株に対するＯＳＣ阻害剤（Ｒｏ  ４８−８０７１）の効果によって決定される。
【００１７】
また、コレステロール生合成経路における酵素を阻害することを含む、腫瘍増殖の阻害方法が提供される。特定の実施態様において、該酵素は、ＯＳＣである。さらなる実施態様において、ＯＳＣ阻害剤は、Ｒｏ  ４８−８０７１である。ヒトの乳房および前立腺の腫瘍増殖を阻害する方法の効力は、ヌードマウスにおけるヒト乳房および前立腺異種移植腫瘍増殖に対するＯＳＣ阻害剤（Ｒｏ  ４８−８０７１）の効果によって決定される。例えば、図１３および図１４を参照。
【００１８】
また、ＰＲＩＭＡ−１よりも有効な抗癌剤が提供される。ＰＲＩＭＡ−１は、変異ｐ５３癌細胞株のみに対して作用するが、Ｒｏ  ４８−８０７１は、変異および野生型の両方補ｐ５３癌細胞株に対して作用する。したがって、本明細書では、コレステロール生合成経路における酵素を阻害する化合物であってＰＲＩＭＡ−１ではない化合物の投与を含む、ｐ５３変異細胞およびｐ５３非変異細胞の両方における癌の処置方法が提供される。さらなる実施態様において、コレステロール生合成経路における酵素は、ＯＳＣである。さらなる実施態様において、ＯＳＣ阻害剤は、Ｒｏ  ４８−８０７１である。本明細書は、さらなるＯＳＣ阻害剤もまた開示する。
【００１９】
本明細書は、癌細胞の生存率を抑制するための新規阻害剤としての、芳香環構造と結合した三級アミンを含む一群の化合物を開示する。特定の実施態様において、新規阻害剤は、式Ｉ:
【化５】
2014505047.tif 000006
［式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、Ｏ、ＮＲ3Ｒ4、Ｓ、ＣＨ2およびＣＨから選択され；
Ｙは、存在しないか、または、結合、ＯおよびＣＨから選択され；
Ｚは、Ｏ、ＮおよびＣＨから選択され；
破線の結合は、存在しても存在しなくてもよく；存在する場合は、該結合は、単結合であっても二重結合であってもよく；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、アルキル、アルケン、アリール、アルキン、シクロアルキルおよびアルキルシクロアルキルアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｒ3およびＲ4は、独立して、結合、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、アリールおよびシクロアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｑは、臭素、塩素およびフッ素から選択される］
を有するものまたはその塩である。
【００２０】
特定の実施態様において、Ｘは、ＮＨ2である。
【００２１】
特定の実施態様において、Ｘは、フッ素である。
【００２２】
特定の実施態様において、Ｒは、アルキルである。
【００２３】
特定の実施態様において、Ｒ1およびＲ2は、低級アルキルである。
【００２４】
さらなる実施態様において、新規阻害剤は、式ＩＩ：
【化６】
2014505047.tif 000007
［式中、
Ｘは、Ｏ、Ｎ、ＮＲ3、ＳおよびＣＨから選択され；
Ｙは、存在しないか、または、結合、ＯおよびＣＨから選択され；
Ｚは、Ｏ、ＮおよびＣＨから選択され；
破線の結合は、存在しても存在しなくてもよく；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、アルキル、アルケン、アリール、アルキン、シクロアルキルおよびアルキルシクロアルキルアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｒ3は、結合、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、アリールおよびシクロアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｑは、臭素、塩素およびフッ素から選択される］
を有するものまたはその塩である。
【００２５】
特定の実施態様において、Ｒは、アルキルである。
【００２６】
特定の実施態様において、Ｒ1およびＲ2は、低級アルキルである。
【００２７】
さらなる実施態様において、新規阻害剤は、式ＩＩＩ：
【化７】
2014505047.tif 000008
［式中、
Ｘは、水素、ハロゲンおよびＮＲ3Ｒ4から選択され；
Ｒ、Ｒ1およびＲ2は、独立して、アルキル、アルケン、アリール、アルキン、シクロアルキルおよびアルキルシクロアルキルアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｒ3およびＲ4は、独立して、結合、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、アリールおよびシクロアルキルから選択され、いずれも置換されていてもよく；
Ｑは、臭素、塩素およびフッ素から選択される］
を有するものまたはその塩である。
【００２８】
特定の実施態様において、Ｘは、ＮＨ2である。
【００２９】
特定の実施態様において、Ｘは、フッ素である。
【００３０】
したがって、本明細書では、癌の処置を必要とする患者に、コレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの阻害剤の治療上有効量を投与することを含む、癌の処置方法が提供される。
【００３１】
特定の実施態様において、タンパク質ターゲットは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない。
【００３２】
特定の実施態様において、タンパク質ターゲットは、オキシドスクアレンシクラーゼである。
【００３３】
特定の実施態様において、癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、胃癌、子宮癌、リンパ腫、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、舌癌、鼻癌、食道癌および膀胱癌、および白血病、ならびにそれらの薬物耐性表現型から選択される。
【００３４】
特定の実施態様において、癌細胞は、ｐ５３変異を有していない。
【００３５】
特定の実施態様において、癌細胞は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の乳癌細胞である。
【００３６】
特定の実施態様において、癌細胞は、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陽性の乳癌細胞である。
【００３７】
特定の実施態様において、癌細胞は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対して三重陰性の乳癌細胞である。
【００３８】
特定の実施態様において、癌細胞は、アポトーシスを受ける。
【００３９】
特定の実施態様において、阻害剤は、ＰＲＩＭＡ−１ではない化合物である。
【００４０】
特定の実施態様において、該化合物は、少なくとも２つの芳香環構造と結合した三級アミンである。
【００４１】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式Ｉを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００４２】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式ＩＩを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００４３】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式ＩＩＩを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００４４】
特定の実施態様において、該化合物は、４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩である。
【００４５】
本明細書では、また、細胞のコレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの活性を阻害する工程を含む、癌細胞生存率を低下させる方法が提供される。
【００４６】
特定の実施態様において、タンパク質ターゲットは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない。
【００４７】
特定の実施態様において、タンパク質ターゲットは、オキシドスクアレンシクラーゼである。
【００４８】
特定の実施態様において、該細胞は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、甲状腺癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、リンパ腫細胞、脳癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、口腔癌細胞、咽喉癌細胞、舌癌細胞、鼻癌細胞、食道癌細胞および膀胱癌細胞、および白血病細胞、ならびにそれらの薬物耐性表現型から選択される。
【００４９】
特定の実施態様において、該細胞は、ｐ５３変異を有していない。
【００５０】
特定の実施態様において、癌細胞は、アポトーシスを受ける。
【００５１】
特定の実施態様において、癌細胞は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性である乳癌細胞。
【００５２】
特定の実施態様において、癌細胞は、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陽性である乳癌細胞である。
【００５３】
特定の実施態様において、癌細胞は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対して三重陰性である乳癌細胞である。
【００５４】
特定の実施態様において、阻害工程は、ＰＲＩＭＡ−１ではない化合物を用いて行われる。
【００５５】
特定の実施態様において、該化合物は、少なくとも２つの芳香環構造と結合した三級アミンである。
【００５６】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式Ｉを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００５７】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式ＩＩを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００５８】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式ＩＩＩを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００５９】
特定の実施態様において、該化合物は、４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩（Ｒｏ  ４８−８０７１）である。
【００６０】
本明細書では、また、癌の処置のための、細胞のコレステロール生合成経路におけるタンパク質ターゲットの活性を阻害する化合物の使用が提供される。
【００６１】
特定の実施態様において、タンパク質ターゲットは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない。
【００６２】
特定の実施態様において、タンパク質ターゲットは、オキシドスクアレンシクラーゼである。
【００６３】
特定の実施態様において、癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、胃癌、子宮癌、リンパ腫、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、舌癌、鼻癌、食道癌および膀胱癌、および白血病、ならびにそれらの薬物耐性表現型から選択される。
【００６４】
特定の実施態様において、該細胞は、ｐ５３変異を有していない。
【００６５】
特定の実施態様において、癌細胞は、アポトーシスを受ける。
【００６６】
特定の実施態様において、該癌は、その細胞がＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性である乳癌である。
【００６７】
特定の実施態様において、該癌は、その細胞がエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陽性である乳癌である。
【００６８】
特定の実施態様において、該癌は、その細胞がエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対して三重陰性である乳癌である。
【００６９】
特定の実施態様において、阻害工程は、ＰＲＩＭＡ−１ではない化合物を用いて行われる。
【００７０】
特定の実施態様において、該化合物は、少なくとも２つの芳香環構造と結合した三級アミンである。
【００７１】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式Ｉを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００７２】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式ＩＩを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００７３】
特定の実施態様において、該化合物は、上記式ＩＩＩを有するものであるかまたはその実施態様である。
【００７４】
特定の実施態様において、該化合物は、４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩（Ｒｏ  ４８−８０７１）である。
【００７５】
本明細書では、また、ＯＳＣの細胞内活性を測定する方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性について試験しようとする哺乳動物癌細胞の試料を準備すること、および
ｂ）該試料における２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレンのラノステロールへの転換量を測定すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレンまたはラノステロールのいずれかの量は、細胞内ＯＳＣ活性のレベルと相関がある）、方法が提供される。
【００７６】
本明細書では、また、化合物のアポトーシス促進性または抗増殖性を測定する方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む哺乳動物癌細胞の試料を該化合物と接触させること；
ｂ）該試料中の
ｉ）アポトーシスのマーカーおよび
ｉｉ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールの１つ以上
の１つ以上のレベルを測定すること；および
ｃ）化合物と接触させた試料中の（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか１つ以上のレベルを対照試料中の（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか１つ以上のレベルと比較すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレンおよびアポトーシスのマーカーのレベルは、アポトーシスおよび抗増殖のレベルと直接の相関があり、また、ラノステロールおよびコレステロールのレベルは、アポトーシスおよび抗増殖のレベルと逆の相関がある）、方法が提供される。
【００７７】
特定の実施態様において、該方法は、試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルを測定する。
【００７８】
特定の実施態様において、該方法は、試料中のアポトーシスのマーカーのレベルを測定し、該アポトーシスのマーカーは、アネキシンＶおよびカスパーゼ３から選択される。
【００７９】
本明細書では、また、癌細胞の増殖を阻害する剤の同定方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）ｉ）試験試料を試験剤と接触させ、試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルを対照試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルと比較することによって、試験試料中のＯＳＣの活性を測定すること；または
ｉｉ）試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのレベルの１回目の測定を行い、該試料を試験剤と接触させ、該試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルの２回目の測定を行うことによって、試験試料中のＯＳＣの活性を測定すること
のいずれかを行うこと；および
ｃ）ｉ）対照試料と比べた試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルの変化；または
ｉｉ）試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルの１回目から２回目への変化
のいずれかに基づいて、試験剤がＯＳＣの細胞内活性を調節する剤であるか決定すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルは、細胞内ＯＳＣ活性のレベルと相関がある）、方法が提供される。
【００８０】
本明細書では、また、ＯＳＣの細胞内活性を調節する剤の同定方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）ｉ）該試料を試験剤と接触させ、試験試料中の癌細胞生存率のレベルを対照試料中の癌細胞生存率のレベルと比較することによって、試験試料中のＯＳＣの活性を測定すること；または
ｉｉ）該試料中の生存癌細胞のレベルの１回目の測定を行い、該試料を試験剤と接触させ、該試料中の生存癌細胞のレベルの２回目の測定を行うことによって、試験試料中のＯＳＣの活性を測定すること
のいずれかを行うこと；および
ｃ）ｉ）対照試料と比べた試験試料中の生存癌細胞のレベルの変化；または
ｉｉ）試験試料中の生存癌細胞のレベルの１回目から２回目への変化
のいずれかに基づいて、試験剤がＯＳＣの細胞内活性を調節する剤であるか決定すること
を含む（ここで、生存癌細胞のレベルは、細胞内ＯＳＣ活性のレベルと相関がある）、方法が提供される。
【００８１】
本明細書では、また、ＯＳＣ活性を阻害する化合物を同定するために複数の化合物をスクリーンニングする方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む癌細胞の試験試料を、ＯＳＣ活性を阻害することが知られていない複数の化合物と接触させること；
ｂ）試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルを測定すること（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルは、細胞内ＯＳＣ活性のレベルと相関がある）；
ｃ）試験試料中のＯＳＣの細胞内活性を対照試料と比較すること；および
ｄ）複数の化合物によるＯＳＣ活性の阻害が観察される場合、別々に、複数の化合物に含まれる各化合物のＯＳＣ活性の阻害を測定して、ＯＳＣを阻害するそこに含まれる個々の化合物を同定すること
を含む、方法が提供される。
【００８２】
本明細書では、また、ＯＳＣ活性を阻害する化合物を含む組成物の製造方法であって、
ａ）ＯＳＣ活性を含む癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）該試験試料を試験化合物と接触させること；
ｃ）対照試料と比べた試験試料中のＯＳＣ活性の減少度を測定するか、または対照時点と比べた試験時点での試験試料中のＯＳＣ活性の減少度を測定して、試験試料中のＯＳＣの活性の阻害度を決定すること（ここで、
ｉ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか；
ｉｉ）アポトーシスのマーカー；または
ｉｉｉ）生存癌細胞
のレベルは、ＯＳＣ活性のレベルと相関がある）；
ｄ）試験化合物を、ＯＳＣの活性を阻害する化合物であると同定し、このように同定された試験化合物または該試験化合物の機能的類似体もしくは同族体を担体と混合して、組成物を製造すること
を含む、方法が提供される。
【００８３】
特定の実施態様において、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルは、ＯＳＣ活性のレベルと直接相関がある。
【００８４】
特定の実施態様において、アポトーシスのマーカーは、ＯＳＣ活性のレベルと直接相関があり、該アポトーシスのマーカーは、アネキシンＶおよびカスパーゼ３から選択される。
【００８５】
本明細書では、また、癌の処置のための化合物を同定する方法であって、
ａ）癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）該試験試料を試験化合物と接触させること；
ｃ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つの減少度を測定すること；
ｄ）ｉ）アポトーシスのマーカーのレベルの増加；および
ｉｉ）生存癌細胞のレベルの減少
を測定してもよいこと；
ｅ）試験化合物を
ｉ）コレステロール生合成経路における酵素の活性を阻害する化合物；
ｉｉ）癌細胞におけるアポトーシスを促進する化合物；または
ｉｉｉ）癌細胞を死滅させる化合物
であると同定すること
を含む（ここで、２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれか１つのレベルは、抗癌活性のレベルと相関があり、その結果、対照試料と比べた試験試料中の２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレンの量の減少がより少ないことは、抗癌活性がより高いことを示しており；対照試料と比べたラノステロールまたはコレステロールのレベルの減少が大きいことは、抗癌活性がより高いことを示している）、方法が提供される。
【００８６】
本明細書では、また、癌の処置のための化合物を含む組成物を製造する方法であって、
ａ）癌細胞の試験試料を準備すること；
ｂ）該試験試料を試験化合物と接触させること；
ｃ）２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレン、ラノステロールおよびコレステロールのいずれかの減少度を測定すること；
ｄ）ｉ）アポトーシスのマーカーのレベルの増加；および
ｉｉ）生存癌細胞のレベルの減少
を測定してもよいこと；
ｅ）試験化合物を
ｉ）コレステロール生合成経路における酵素の活性を阻害する化合物；
ｉｉ）癌細胞におけるアポトーシスを促進する化合物；または
ｉｉｉ）癌細胞を死滅させる化合物
であると同定すること；および
ｆ）このように同定された試験化合物または該試験化合物の機能的類似体もしくは同族体を担体と混合して、組成物を製造すること
を含む、方法が提供される。
【００８７】
特定の実施態様において、コレステロール生合成経路における酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼではない。
【００８８】
特定の実施態様において、コレステロール生合成経路における酵素は、ＯＳＣである。
【００８９】
特定の実施態様において、アポトーシスのマーカーは、アネキシンＶおよびカスパーゼ３から選択される。
【００９０】
本明細書では、また、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する剤についてスクリーンニングする方法であって、
ａ）細胞を試験剤と接触させること；
ｂ）ＯＳＣの活性を検出すること；
ｃ）試験剤が哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する剤であることの指標として、対照中のＯＳＣの活性と比べたＯＳＣ活性の減少をスコア化すること
を含む、方法が提供される。
【００９１】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって理解されている意味を同じ意味をもつ。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する。
【００９２】
値の範囲が記載されている場合、および「ｎ１から・・・ｎ２まで」という記載（ここで、ｎ１およびｎ２は、数字である）が使用される場合、特記しない限り、この記載は、これらの数字自体とこれらの間の範囲を含むことを意図する。この範囲は、両端値を含む両端値間の積分範囲であっても連続範囲であってもよい。一例として、「２〜６個の炭素」という範囲は、炭素は整数単位として提供されるので、２個、３個、４個、５個および６個の炭素を含むことを意図する。これに対して、一例として、「１〜３μｍ（マイクロモル）」という範囲は、１μｍ、３μｍ、および有効桁数までのこれらの中間にある全てのもの（例えば、１.２５５μｍ、２.１μｍ、２.９９９９μｍなど）を含むことを意図する。
【００９３】
「約」という用語は、本明細書において使用する場合、誤差の範囲内で変わり得る値を示す、変更する数値を定量化することを意図する。データを示すチャートまたは表に示される平均値に対する標準偏差のような特定の誤差が示されていない場合、「約」という用語は、記載されている値を包含する範囲および同様に有効桁数を考慮して切り上げまたは切り捨てしてその数字にすることによって含まれる範囲を意味すると解すべきである。
【００９４】
「アルケニル」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、１個以上の二重結合を有し、炭素原子２〜２０個を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。特定の実施態様において、該アルケニルは、炭素原子２〜６個を含む。「アルケニレン」という用語は、エテニレン［(−ＣＨ＝ＣＨ−)、(−Ｃ::Ｃ−)］のような２箇所以上の位置で結合される炭素−炭素二重結合系を意味する。好適なアルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、２−メチルプロペニル、１,４−ブタジエニルおよび同類のものが挙げられる。他に特記しない限り、「アルケニル」という用語は、「アルケニレン」基を含み得る。
【００９５】
「アルキル」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、炭素原子１〜２０個を含有する直鎖または分枝鎖アルキル基を意味する。特定の実施態様において、該アルキルは、炭素原子１〜１０個を含む。さらなる実施態様において、該アルキルは、炭素原子１〜６個を含む。アルキル基は、本明細書で定義するように置換されていてもよい。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ノイルおよび同類のものが挙げられる。「アルキレン」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、メチレン（−ＣＨ2−）のような２箇所以上の位置で結合される直鎖または分枝鎖飽和炭化水素から誘導された飽和脂肪族基を意味する。他に特記しない限り、「アルキル」という用語は、「アルキレン」基を含み得る。
【００９６】
「アルキニル」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、１〜３個の三重結合を有し、炭素原子２〜２０個を含有する、直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。特定の実施態様において、該アルキニルは、炭素原子２〜６個を含む。さらなる実施態様において、該アルキニルは、炭素原子２〜４個を含む。「アルキニレン」という用語は、エチニレン（−Ｃ:::Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ−）のような２箇所で結合される炭素−炭素三重結合を意味する。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、ブチン−１−イル、ブチン−２−イル、ペンチン−１−イル、３−メチルブチン−１−イル、ヘキシン−２−イルおよび同類のものが挙げられる。他に特記しない限り、「アルキニル」という用語は、「アルキニレン」基を含み得る。
【００９７】
「アリール」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、１、２または３個の環を含有する芳香族炭素環系を意味し、このような多環式環系は、一緒に縮合されている。「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナントリルのような芳香族基を包含する。
【００９８】
「結合」という用語は、２個の原子の間の共有結合、または、結合によって連結されたこれらの原子がより大きな部分構造の一つであるとみなされる場合の２つの部分の間の共有結合を意味する。結合は、他に特記しない限り、単結合、二重結合または三重結合であり得る。分子の記載における２個の原子の間の破線は、その位置にさらなる結合が存在しても存在しなくてもよいことを示している。環または鎖要素が結合であるように割り当てられる場合、隣接部分がそれらの間に共有結合を有することを意味する。例えば、鎖Ｘ−Ｙ−Ｚにおいて、Ｙが結合である場合、この鎖は、Ｘ−Ｚとなる。
【００９９】
「シクロアルキル」という用語、または「炭素環」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、飽和または部分飽和の、単環式、二環式または三環式アルキル基を意味し、各環部分は、３〜１２個の環構成炭素原子を含有するものであり、本明細書で定義するように置換されていてもよいベンゾ縮合環系であってもよい。特定の実施態様において、該シクロアルキルは、炭素原子５〜７個を含む。このようなシクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、オクタヒドロナフチル、２,３−ジヒドロ−１Ｈ−インデニル、アダマンチルおよび同類のものが挙げられる。「二環式」および「三環式」とは、本明細書において使用する場合、デカヒドロナフタレンおよびオクタヒドロナフタレンのような縮合環系ならびに多環式（多中心）飽和または部分不飽和型のものの両方を含むことを意図する。後者のタイプの異性体はとしては、一般的に、ビシクロ[１,１,１]ペンタン、カンファー、アダマンタンおよびビシクロ[３,２,１]オクタンが例示される。
【０１００】
「ハロ」という用語または「ハロゲン」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【０１０１】
「低級」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて使用する場合、他に特記しない限り、炭素原子１〜６個を含有することを意味する。
【０１０２】
本明細書におけるいかなる定義も、複合構造基を説明するために他の定義と組み合わせて使用することができる。慣例により、このような定義の末尾の要素が、親部分に結合するものである。例えば、複合基アルキルアミドは、アミド基を介して親部分に結合するアルキル基を表し、アルコキシアルキルという用語は、アルキル基を介して親部分に結合するアルコキシ基を表す。
【０１０３】
基が「存在しない」（null）と定義される場合、この基が無いことを意味する。
【０１０４】
「置換されていてもよい」という用語は、対象となる基が置換されていても非置換であってもよいことを意味する。置換されている場合、「置換されていてもよい」基の置換基は、単独または組み合わせた以下の基または特定の割り当てられた基のセットが挙げられるが、これらに限定されるものではない：低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、低級アルカノイル、低級ヘテロアルキル、低級ヘテロシクロアルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルケニル、低級ハロアルキニル、低級パーハロアルキル、低級パーハロアルコキシ、低級シクロアルキル、フェニル、アリール、アリールオキシ、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、オキソ、低級アシルオキシ、カルボニル、カルボキシル、低級アルキルカルボニル、低級カルボキシエステル、低級カルボキサミド、シアノ、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、エステル、アシル、アミノ、低級アルキルアミノ、アリールアミノ、アミド、ニトロ、チオール、低級アルキルチオ、低級ハロアルキルチオ、低級パーハロアルキルチオ、アリールチオ、スルホネート、スルホン酸、三置換シリル、Ｎ3、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｃ(Ｏ)ＣＨ3、ＣＯ2ＣＨ3、ＣＯ2Ｈ、ピリジニル、チオフェン、フラニル、低級カルバメートおよび低級尿素。２個の置換基は、一緒に結合して、０〜３個のヘテロ原子を含む５員、６員または７員の縮合炭素環式または複素環式環を形成してもよく、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシを形成してもよい。置換されていてもよい基は、非置換であっても（例えば、−ＣＨ2ＣＨ3）、完全置換されていても（例えば、−ＣＦ2ＣＦ3）、一置換されていても（例えば、−ＣＨ2ＣＨ2Ｆ）、完全置換から一置換の間のいずれかのレベルで置換されていてもよい（例えば、−ＣＨ2ＣＦ3）。置換基が置換に関して限定なしで記載されている場合、置換および非置換の両方の形態が包含される。置換基が「置換されている」と明記されている場合、置換された形態が明確に意図される。加えて、必要に応じて、特定の部分への任意の置換基の異なるセットが定義され得る；これらの場合、任意の置換は、しばしば「で置換されていてもよい」という記載の直後に、定義される。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、ターゲットの活性または物質の量を増加または減少させることを意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「増加させる」という用語またはそれに関連する「増加した」、「増強させる」または「増強した」という用語は、統計学的に有意な増加を意味する。誤解を避けるために、これらの用語は、一般に、所定のパラメーターの少なくとも１０％増加を意味し、対照値からの少なくとも２０％増加、３０％増加、４０％増加、５０％増加、６０％増加、７０％増加、８０％増加、９０％増加、９５％増加、９７％増加、９９％増加または１００％増加を含み得る。
【０１０７】
「試料」とは、本明細書で使用される場合、例えばＯＳＣ活性の存在について、または試験剤がインビトロでまたは細胞内でＯＳＣの活性を調節する能力を有するかを決定するために、試験され得る生物学的物質を意味する。このような試料は、インビトロ測定のためには、精製もしくは半精製、または非精製のＯＳＣ調製物を含有し得る。試料は、また、ＯＳＣ活性の細胞内測定のためには、細胞内ＯＳＣを含む細胞を含む。細胞試料は、典型的には、生理学的イオン強度およびｐＨを維持するために、また、生存を保持するのに適度な温度で維持されるために、バッファーおよび塩を含有する。細胞は、組織培養液または組織試料を含むいずれかの供給源から得ることができる。一の態様では、このような細胞は、哺乳動物細胞である。試料は、また、好適な対照試薬を含んでもよい（対照試料）。
【０１０８】
「疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、「障害」および「病態」（医学的症状における）という用語と同義語であることを意図し、これらの用語は、正常機能を損ない、典型的には徴候および症候を見分けることにより明らかになり、ヒトまたは動物が寿命または生活の質を低下させる原因となる、人体または動物体の異常な状態またはその部分の１つを反映するという点で、互換性をもって使用される。
【０１０９】
「併用療法」という用語は、本明細書に記載の治療病態または障害を処置するための２つ以上の治療薬の投与を意味する。このような投与は、一定の比率の活性成分を有する単一のカプセルまたは各活性成分のための複数の別個のカプセルにおけるような、実質的に同時にこれらの治療薬を共投与することを包含する。加えて、このような投与は、また、各タイプの治療薬を連続して使用することを包含する。いずれの場合も、治療計画は、本明細書に記載の病態または障害を処置する際に薬物併用の有益な効果を与えるものである。
【０１１０】
「治療上有効な」とは、疾患または障害の処置に使用される活性成分の量を条件付けることを意図する。この量は、該疾患または障害の軽減または除去という目的を達成するものである。
【０１１１】
「治療上許容される」とは、過度の毒性、刺激およびアレルギー反応を伴わずに患者の組織と接触させて使用するのに適しており、合理的なリスク対効果比に見合っており、それらの意図される用途に有効であるこれらの化合物（または塩、多形体、プロドラッグ、互変異性体、両性イオン形態など）を意味する。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、患者の「処置」に対する言及は、予防を含むことを意図する。「患者」という用語は、ヒトを含む全ての動物を意味する。患者の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよびウサギが挙げられる。好ましくは、患者は、ヒトである。
【０１１３】
「プロドラッグ」という用語は、インビボでより活性になる化合物をいう。本明細書に記載の特定の化合物は、Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry, and Enzymology (Testa, Bernard and Mayer, Joachim M. Wiley-VHCA, Zurich, Switzerland 2003) に記載されているように、プロドラッグとして存在することもできる。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、該化合物を提供するための生理学的条件下で化学的変化を受けやすい化合物の構造的に修飾された形態である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的方法または生物学的方法によって当該化合物に変わり得る。例えば、プロドラッグは、好適な酵素または化学試薬を入れた経皮パッチリザーバーに入れた場合、徐々に化合物に変わることができる。プロドラッグは、それらが当該化合物、すなわち親薬物よりも投与しやすい場合があるので、しばしば、有用である。それらは、例えば、経口投与によって生物学的に利用可能であり得るが、親薬物はそうではない。プロドラッグは、また、親薬物と比べて医薬組成物中での溶解度が改善され得る。プロドラッグの加水分解または酸化的活性化によるもののような様々なプロドラッグは誘導体が当該技術分野で知られている。プロドラッグの例は、限定されるものではないが、エステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、活性物質であるカルボン酸に代謝によって加水分解される化合物である。さらなる例としては、化合物のペプチジル誘導体が挙げられる。
【０１１４】
本明細書に記載の化合物は、治療上許容される塩として存在し得る。好適な酸付加塩としては、有機酸および無機酸で形成されるものが挙げられ、通常、医薬上許容される。しかしながら、医薬上許容されない塩の塩は、目的化合物の製造および精製において有用であり得る。塩基付加塩もまた、形成することができ、医薬上許容される。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アルギン酸塩、Ｌ−アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシラート）、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、二グルコン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ゲンチシン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、ＤＬ−マンデル酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ホスホン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピログルタミン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、Ｌ−酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラトルエンスルホン酸塩（ｐ−トシラート）およびウンデカン酸塩が挙げられる。また、本明細書に記載の化合物の塩基性の基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチルおよび硫酸ジアミル；デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；ならびに臭化ベンジルおよび臭化フェネチルによって四級化され得る。塩の製造および選択についてより完全に論じるために、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Stahl, P. Heinrich. Wiley-VCHA, Zurich, Switzerland, 2002)を引用する。
【０１１５】
「治療上許容される塩」という用語は、本明細書において使用する場合、本明細書で定義したような水溶性または油溶性であって治療上許容される、本明細書に記載の化合物の塩または両性イオン形態を表す。該塩は、当該化合物の最終的な単離および精製の間に製造され得るか、または、遊離塩基の形態の適当な化合物を好適な酸と反応させることによって別々に製造され得る。治療上許容される付加塩を形成するために使用され得る酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸のような無機酸ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸のような有機酸が挙げられる。塩はまた、当該化合物へのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の配位によって形成され得る。
【０１１６】
塩基付加塩は、しばしば、カルボキシ基を、金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩のような好適な塩基、またはアンモニアまたは一級、二級もしくは３級有機アミンと反応させることによって、化合物の最終的な単離および精製の間に製造され得る。治療上許容される塩の陽イオンとしては、リチウム、ナトリウム（例えば、ＮａＯＨ）、カリウム（例えば、ＫＯＨ）、カルシウム（例えば、Ｃａ(ＯＨ)2）、マグネシウム（Ｍｇ(ＯＨ)2および酢酸マグネシウムが挙げられる）、亜鉛（Ｚｎ(ＯＨ)2および酢酸亜鉛が挙げられる）およびアルミウム、ならびに無毒性四級アミン陽イオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ,Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン、水酸化コリン、ヒドロキシエチルモルホリン、ヒドロキシエチルピロリドン、イミダゾール、ｎ−メチル−ｄ−グルタミン、Ｎ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ、Ｎ'−ジエチルエタノールアミン、Ｎ、Ｎ'−ジメチルエタノールアミン、トリエタノールアミンおよびトロメタミンが挙げられる。ｌ−グリシンおよびｌ−アルギニンのような塩基性アミノ酸、ならびにベタイン（Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルグリシン）のような自然のｐＨで両性イオンであり得るアミノ酸もまた考えられる。
【０１１７】
本明細書に記載の塩は、１：１のモル比で合わせることができ、実際、このようにしてそれらが最初に合成される。しかしながら、当業者であれば、塩における１つのイオンの他のイオンに対する化学量論は別のものであってもよいと認識する。本明細書に記載の塩は、記載上の便宜のため、１：１比で示し得る；起こり得る全ての化学量論的アレンジメントが本発明の範囲に含まれる。
【０１１８】
「多形体」という用語および関連する用語は、同一分子の結晶形態をいい、異なる多形体は、結晶格子における分子の配置または配座の結果として、例えば溶融温度、融解熱、溶解度、溶解速度および／または振動スペクトルのような異なる物理的性質を有し得る。多形体が示す物理的性質の差異は、貯蔵安定性、圧縮率および密度（製剤化および製品製造において重要）のような医薬的パラメーター、ならびに溶出速度（生物学的利用能において重要な因子）に影響を及ぼす。安定性の差異は、化学的反応性の変化（例えば、酸化差異、その結果、投与剤形が、ある多形体からなる場合に別の多形体からなる場合と比べてより迅速に変色する）または機構変化（例えば、動態学的に好ましい多形体として貯蔵中に崩壊する錠剤が熱力学的に安定な多形体に変わる）または両変化（例えば、ある多形体の錠剤は、高湿度で崩壊しやすい）によってもたらされる。溶解性／溶出の差異の結果として、極端な場合、多形転移によっては、効力の欠如をもたらす場合があったり、別の極端な場合には、毒性をもたらしたりする場合がある。さらに、結晶の物理的性質は、処理中に重要であることがあり、例えば、ある多形体は、溶媒和物を形成する可能性が高いかもしれないか、または、濾過および洗浄によって不純物を取り除くのが困難であるかもしれない（例えば、粒子の形状およびサイズ分布は、多形体間で異なることがある）。
【０１１９】
分子の多形体は、当該技術分野で知られている多くの方法によって得ることができる。このような方法としては、溶融再結晶化、溶融冷却、溶媒再結晶化、脱溶媒化、急速蒸発、急速冷却、徐冷、蒸気拡散および昇華が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
本明細書に記載の化合物およびプロドラッグは、化合物原体として投与することが可能であるが、医薬製剤として提供することもできる。したがって、本明細書では、本明細書に記載の化合物およびプロドラッグの１種類以上またはその医薬上許容される塩、エステル、アミドもしくは溶媒和物の１種類以上を医薬上許容される担体の１種類以上および他の治療成分の１種類以上と一緒に含む医薬製剤が提供される。担体は、製剤の他の成分と適合し得、かつ、そのレシピエントに対して有害ではない、という意味で「許容され」なければならない。適正な製剤は、選択される投与経路に依存する。適切なように、および当該技術分野で理解されているように、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されているように、周知の技術、担体および賦形剤のいずれかを使用することができる。本明細書に記載の医薬組成物は、当該技術分野において知られているいずれかの方法で、例えば、慣用の混合、溶解、造粒、糖衣錠調製、すりつぶし（levigating）、乳化、カプセル化、エントラップまたは打錠の工程によって、製造され得る。
【０１２１】
該製剤としては、経口投与、非経口投与（皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与および髄内投与が挙げられる）、腹腔内投与、経粘膜投与、経皮投与、鼻腔内投与、直腸投与および局所投与（皮膚投与、頬側投与、舌下投与および眼内投与が挙げられる）に適したものが挙げられるが、最も好適な経路は、例えばレシピエントの状態および障害に依存し得る。該製剤は、好都合には、単位投与剤形で提供され得、調剤技術の分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。典型的には、これらの方法は、本発明の化合物またはその医薬上許容される塩、エステル、アミド、プロドラッグもしくは溶媒和物（「活性成分」）を、１種類以上の補助的成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、該製剤は、活性成分を、液体担体または新しく分けた固体担体またはその両方と均一かつ密に合わせ、次いで、必要に応じて、該生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。
【０１２２】
経口投与に適している本明細書に記載の化合物およびプロドラッグの製剤は、各々が予め決められた量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤のような個々のユニットとして；散剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体による液剤または懸濁剤として；または水中油型乳剤または油中水型乳剤として提供され得る。活性成分はまた、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤として提供され得る。
【０１２３】
経口使用され得る医薬製剤としては、錠剤、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル剤およびゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）で作られた密閉型ソフトカプセル剤が挙げられる。錠剤は、任意に１種類以上の補助的成分を用いて、圧縮または成形によって作られ得る。圧縮錠剤は、結合剤、不活性液体希釈剤または滑沢剤、界面活性剤または分散剤と混合していてもよい粉末または顆粒のような流動性形態の活性成分を好適な機械で圧縮することによって製造され得る。錠剤は、また、コーティングまたはスコア付けされていてもよく、活性成分の遅延放出または制御放出を提供するように製剤化され得る。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適している用量にすべきである。押し込み型カプセル剤は、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに所望により安定剤との混合物中に活性成分を含有することができる。ソフトカプセル剤においては、活性化合物およびプロドラッグは、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールのような好適な液体に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤を添加することができる。糖衣錠のコアに好適なコーティングを施す。この目的のために、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有していてもよい濃い糖溶液を使用することができる。活性化合物用量の異なる組み合わせを同定するためまたは特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料および色素を添加することができる。
【０１２４】
化合物およびプロドラッグは、注射、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、保存剤を添加して、単位投与剤形で、例えば、アンプル剤または複数回投与用容器で提供され得る。該組成物は、油性または水性ビヒクルによる懸濁剤、液剤または乳剤のような剤形をとり得、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤のような処方用剤を含有することができる。該製剤は、単位投与用または複数回投与用容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアル中にて提供され得、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または無菌パイロジェンフリー水の添加を必要とするだけの、粉末形態または凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時注射溶液および懸濁液は、先に記載したような無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。
【０１２５】
経口投与用製剤としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を予定レシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る活性成分およびプロドラッグの水性および非水性（油性）無菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌注射用懸濁剤が挙げられる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有することができる。所望により、該懸濁液は、また、好適な安定剤、または化合物およびプロドラッグの溶解度を増大させて高濃度溶液の製剤を可能にする剤を含有することができる。
【０１２６】
先に記載した製剤に加えて、本明細書に記載の化合物およびプロドラッグは、デポー製剤として製剤化することができる。このような長時間作用性製剤は、留置（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉注射によって投与され得る。かくして、例えば、該化合物およびプロドラッグは、好適な高分子物質もしくは疎水性物質（例えば、許容される油中エマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、製剤化することができる。
【０１２７】
頬側または舌下投与のためには、該組成物は、慣用の方法で製剤化された、錠剤、トローチ剤（lozenges）、トローチ剤（pastilles）またはゲル剤の剤形をとり得る。このような組成物は、シュークロースおよびアカシアまたはトラガカントのようなフレーバー基剤中の活性成分を含むことができる。
【０１２８】
当該化合物およびプロドラッグは、例えばカカオバター、ポリエチレングリコールまたは他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸剤のような直腸用組成物に製剤化され得る。
【０１２９】
本明細書に記載の特定の化合物およびプロドラッグは、局所投与されてもよく、これは非全身投与によるものである。これは、化合物が血流に有意に入らないような、本明細書に記載の化合物の表皮または頬腔への外用ならびに該化合物の耳、眼および鼻への滴下を含む。これに対して、全身投与は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与および筋肉内投与をいう。
【０１３０】
局所投与に適している製剤としては、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤のような皮膚を介して炎症部位に浸透するのに適している液体または半液体製剤、ならびに眼、耳または半への投与に適している滴剤が挙げられる。局所投与用活性成分は、例えば、製剤の０.００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ（重量による）を構成し得る。特定の実施態様において、活性成分は、１０％ｗ／ｗも構成し得る。他の実施態様において、５％ｗ／ｗ未満を構成し得る。特定の実施態様において、活性成分は、２％ｗ／ｗ〜５％ｗ／ｗを構成し得る。他の実施態様において、製剤の０.１％ｗ／ｗ〜１％ｗ／ｗを構成し得る。
【０１３１】
吸入による投与については、化合物およびプロドラッグは、好都合には、インサフレーター、ネブライザー、加圧パック、またはエアゾールスプレーを送達する他の慣用手段から送達され得る。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスのような好適な噴射剤を含み得る。加圧エアゾール剤の場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。別法として、吸入またはインサフレーションによる投与については、本明細書に記載の化合物およびプロドラッグは、乾燥粉末組成物、例えば、化合物およびラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤の粉末混合物の形態をとり得る。粉末組成物は、例えば吸入器またはインサフレーターによって粉末を投与し得るカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパック中にて、単位投与剤形で提供され得る。
【０１３２】
特に、鼻腔内送達は、化合物のＣＮＳへの送達に有用である。鼻腔内薬物投与は、血液脳関門（ＢＢＢ）を迂回してニューロトロフィンおよび他の治療剤を脳および脊髄に送達する非侵襲的方法であることが示されている。鼻からＣＮＳへの送達は、嗅覚神経経路および三叉神経経路の両方に沿って数分以内に生じる。鼻腔内送達は、細胞外経路によって生じ、薬物がいずれかの受容体に結合することまたは軸索輸送を受けることを必要としない。鼻腔内送達は、また、鼻関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）および深頚リンパ節を標的とする。加えて、鼻腔内投与治療薬は、脳血管系の血管壁および血管周囲腔中にて高レベルで観察される。動物モデルにおいてこの鼻腔内方法を使用すると、脳卒中による損傷の軽減、アルツハイマー型神経変性症の逆転、不安の軽減、記憶力の改善、脳神経新生の刺激および脳腫瘍の処置が成功裏に行われた。ヒトにおいて、鼻腔内インスリンは、正常な成人およびアルツハイマー病患者において記憶力を改善することが示された。Hanson LR and Frey WH, 2nd, J Neuroimmune Pharmacol. 2007 Mar; 2(1):81-6. Epub 2006 Sep 15.
【０１３３】
好ましい単位投与製剤は、活性成分の、以下に記載するような有効用量を含有するものまたはその適当な分包である。
【０１３４】
当然のことながら、上記製剤は、上記にて特に記載した成分に加えて、目的の製剤の種類に関して当該技術分野で慣用の他の剤を含むことができ、例えば、経口投与に適しているものとしては、フレーバー剤を挙げることができる。
【０１３５】
化合物およびプロドラッグは、１日あたり０.１〜５００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与または注射による投与を行うことができる。成人用の用量範囲は、一般に、５ｍｇ〜２ｇ／日である。錠剤、または個別のユニットで提供される他の剤形は、好都合には、そのような用量で有効な１種類以上の化合物またはプロドラッグの一定量を含有することができるか、または、それが複数であった場合、例えば、ユニットは、５ｍｇ〜５００ｍｇ、通常約１０ｍｇ〜２００ｍｇを含有する。
【０１３６】
単位投与剤形を製造するために担体と合わせ得る活性成分の量は、処置される宿主および個々の投与様式に依存して異なる。
【０１３７】
当該化合物およびプロドラッグは、様々な様式で、例えば、経口投与、局所投与、または注射による投与で投与され得る。患者に投与される化合物の正確な量は、主治医の責任である。特定に患者の特性の用量は、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物併用、処置される正確な障害、および処置される症状または病態の重篤度を含む様々な要因に依存する。また、投与経路は、病態およびその重篤度に依存して異なることがある。
【０１３８】
特定の場合、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物およびプロドラッグ（またはその医薬上許容される塩もしくはエステル）を別の治療薬と合わせて投与することが適切であり得る。単なる例示であるが、アクチニド中毒の処置のために本明細書に記載の化合物の１つを投与された後に患者が経験する副作用の１つは、適正な機能のために身体が要する必須の微量元素の枯渇であり、そこで、強いキレート剤を適正な機能のために身体が要する必須の微量元素のサプリメントと合わせて投与して、キレート療法により不注意に失われるものを補うことが適切であり得る。または、単なる例示であるが、本明細書に記載の化合物の１つの治療的有効性は、アジュバントの投与によって増強され得る（すなわち、アジュバントは、単独では、最小治療効果を有するだけであるが、別の治療薬と合わせると、患者への全体的な治療効果が増強される）。または、単なる例示であるが、患者が受ける効果は、本明細書に記載の化合物の１つを、治療効果を有する別の治療薬（治療計画も含む）と一緒に投与することによって増加し得る。単なる例示であるが、本明細書に記載の化合物の１つの投与を含むサラセミアの処置において、サラセミアのための別の治療薬、例えばデフェロキサミンも患者に投与することによって治療効果の増加をもたらし得る。いずれの場合も、処置される疾患、障害または病態に関係なく、患者が受ける全体的な効果は、単純に２種類の治療薬の相加効果であるか、または、患者は、相乗効果を受けることができる。
【０１３９】
併用療法の特定の非限定的な例としては、本明細書に記載の特定の化合物を、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、抗プロゲスチン剤、抗アンドロゲン剤またはゴナドレリン作用薬、トポイソメラーゼ１および２阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、抗悪性腫瘍薬、代謝拮抗薬、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）または白金含有化合物、脂質またはタンパク質キナーゼターゲティング剤、タンパク質または脂質ホスファターゼターゲティング剤、抗血管新生剤、細胞分化を誘発する剤、ブラジキニン１受容体およびアンギオテンシンＩＩ拮抗薬、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、リンホカインまたはサイトカイン阻害剤、ビスホスホネート製剤、ラパマイシン誘導体、抗アポトーシス経路阻害剤、アポトーシス経路作用薬、ＰＰＡＲ作用薬、Ｒａｓアイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤から選択される１種類以上の剤と一緒に使用することが挙げられる。
【０１４０】
腫瘍性疾患および固形腫瘍の処置のためには、本明細書に記載の化合物は、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、アルキル化剤（例えば、メルファラン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、Ａｋｔ阻害剤（例えば、ペリフォシン）、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、またはゴナドレリン作用薬、トポイソメラーゼ１および２阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、テモゾロミド）、抗悪性腫瘍薬、代謝拮抗薬、または白金含有化合物、ＭＩＴＣ、ニトロソウレア、タキサン、脂質またはタンパク質キナーゼターゲティング剤、タンパク質または脂質ホスファターゼターゲティング剤、抗血管新生剤、ＩＭｉＤs（例えば、タリドミド、レナリドミド）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、ＮＰＩ００５２）、ＩＧＦ−１阻害剤、ＣＤ４０抗体、Ｓｍａｃミメティック（例えば、テロメスタチン）、ＦＧＦ３調節剤（例えば、ＣＨＩＲ２５８）、ｍＴＯＲ阻害剤（Ｒａｄ００１）、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＳＡＨＡ、Ｔｕｂａｃｉｎ）、ＩＫＫ阻害剤、Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤（例えば、１７−ＡＡＧ）、および他の多標的キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）からなる群から選択される剤と一緒に投与され得る。
【０１４１】
いずれの場合も、複数の治療薬（少なくとも１つは、本明細書に記載の化合物である）は、順次または同時に投与され得る。同時の場合、複数の治療薬は、単一の一体化剤形または複数の剤形で（単なる例示であるが、単一の丸剤として、または２つの別個の丸剤として）提供され得る。これらの治療薬の１つは、複数回投与され得るか、または、両方が複数回投与され得る。同時ではない場合、複数の投与の間のタイミングは、数分から４週間までの範囲の期間であり得る。
【０１４２】
かくして、別の態様では、特定に実施態様は、金属毒に関連する障害および症状の処置を必要とするヒトまたは動物対象体における該障害および症状の処置方法であって、該対象体に、本明細書に記載の化合物の、該対象体における該障害の軽減または予防に有効な量を、当該技術分野で公知の該障害のさらなる処置剤の少なくとも１種と合わせて投与することを含む、方法を提供する。関連の態様において、特定の実施態様は、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を、金属毒に関連する障害および症状のさらなる処置剤の１種以上と合わせて含む治療組成物を提供する。
【０１４３】
本明細書に記載の化合物、組成物および方法は、癌の処置に有用である。本明細書に記載の化合物、組成物および方法によって処置しようとする特定の癌としては、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、胃癌、子宮癌、リンパ腫、脳癌（例えば、神経芽腫および膠芽腫が挙げられる）、皮膚癌、腎臓癌、口腔癌、咽喉癌、舌癌および膀胱癌、ならびに白血病が挙げられる。該癌は、例えば乳癌の場合のように、ホルモン依存性またはホルモン耐性であり得る。特定の実施態様において、癌は、固形腫瘍である。特定の実施態様において、癌は、本明細書に記載の、または当該技術分野で知られている癌の薬物耐性表現型である。
【０１４４】
本明細書に記載の特定の化合物および製剤は、また、ヒトの処置に有用であることに加えて、哺乳動物、齧歯動物および同類のものを含む、ペット、珍しい動物および家畜の獣医学的処置に有用でもあり得る。より好ましい動物としては、ウマ、イヌおよびネコが挙げられる。
【０１４５】
本明細書において引用される米国またはその他の国の文献、特許または出願は、全て、出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する。矛盾が生じた場合は、本明細書に記載のとおりである。
【実施例】
【０１４６】
癌治療のためのターゲットとしてのオキシドスクアレンシンターゼ
本明細書に記載のとおり、変異ｐ５３タンパク質を活性化し、野生型ｐ５３に存在する腫瘍抑制機能を回復させる小分子であるＰＲＩＭＡ−１の研究によって、新規抗癌ターゲットが同定された。バイオインフォマティクス手法を用い、逆タンパク質−リガンド・ドッキングを行って、既存のタンパク質構造データベースからＰＲＩＭＡ−１のタンパク質ターゲットについてスクリーンニングを行った。使用したドッキングソフトウェアは、本発明者らが作成したＭＤｏｃｋソフトウェアパッケージ［文献１２〜１６］である。使用したタンパク質データベースは、Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＤＴＤ）［文献１７］である。タンパク質をそのエネルギースコアによってランク付けし（スコアが低いほど、結合親和性は高い）、クラスター化した。最上位のヒトタンパク質ターゲットである酵素オキシドスクアレンシクラーゼ（「ＯＳＣ」）をアッセイのために選択した。
【０１４７】
既存の一連のＯＳＣの阻害剤もまた研究した；ＯＳＣとドッキングした阻害剤の結合様式をＯＳＣとドッキングしたＰＲＩＭＡ−１のものと比較した。図１に示されるように、Ｒｏ  ４８−８０７１（４'−[６−(アリルメチルアミノ)ヘキシルオキシ]−４−ブロモ−２'−フルオロベンゾフェノン・フマル酸塩）およびＰＲＩＭＡ−１のＯＳＣとのドッキング配置は、結合ポケットにおいて部分的に重なっている。
【０１４８】
ＯＳＣの阻害剤
当該技術分野において公知の方法によって、ＯＳＣ阻害剤を同定することができる。例えば、ヒト、ラットまたは他の肝ミクロソームを使用するミクロソームアッセイを使用することができ、このアッセイは、試験化合物で処理されたミクロソームによって消費された放射標識２,３−(Ｓ)−オキシドスクアレンの量または生成されたラノステロールの量を測定し、対照と比較するものである。別法として、全細胞アッセイを使用して、コレステロール生合成を測定することができる。例えば、肝細胞を試験化合物および酢酸またはメバロン酸のような放射標識コレステロール生合成経路基質と一緒にインキュベートし、当該技術分野において公知の方法に従って、生成されたコレステロール（または、おそらく、消費された基質）を測定し、対照と比較することができる。動物実験を使用して、例えば処置対象体対未処置対象体における肝コレステロールまたは血清コレステロールを測定することもできる。例えば、ＷＯ１９９６／１１２０１Ａ１、ＷＯ１９９７／０６８０２Ａ１およびＥＰ０１３４６９９４を参照。
【０１４９】
ＯＳＣ阻害剤のさらなる例を下記の表１に示す。
【表１−１】
2014505047.tif 000009
【０１５０】
【表１−２】
2014505047.tif 000010
【０１５１】
【表１−３】
2014505047.tif 000011
【０１５２】
【表１−４】
2014505047.tif 000012
【０１５３】
【表１−５】
2014505047.tif 000013
【０１５４】
この表の出典は、Lenhart A et al., Binding Structures and Potencies of oxidosqualene cyclase inhibitors with the homologous squalene-hopene cyclase. J. Med. Chem. 2003, 46:2083-2092である。上記化合物の１つであるＲｏ−４８−８０７１は、［文献５］の記載に従って合成することができ、その抜粋を以下に記載する。
【０１５５】
【化８】
2014505047.tif 000014
【０１５６】
上記で示したように、Ｒｏ  ４８−８０７１（フマル酸塩、ＭＷ＝５６４.４５）を合成した。全ての中間体およびＲｏ  ４８−８０７１を２５０ＭＨｚ  1ＨＮＭＲ、ＩＲ、ＭＳおよび微量分析によって特徴付けした。Ｂｉｉｃｈｉ  ５１０装置を使用して、融点（未修正）を測定した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＣ２５０分光計にてプロトンＮＭＲスペクトルを記録し、δ値はテトラメチルシランに対するｐｐｍである。Ｎｉｃｏｌｅｔ  ７１９９−ＦＴ  ＩＲ分光計を使用して、ＫＢｒペレットのＩＲスペクトルを記録した。空気圧アシステッド・エレクトロスプレー技術（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ、ＡＰＩ−１１１型）を使用して、マススペクトル（ＭＳ）を得た。元素分析の結果は、理論値の０.３％の範囲内であった。
【０１５７】
(４−ブロモフェニル)−(２'−フルオロ−４'−メトキシフェニル)−メタノン［１］
温度を＜８℃に保持しながら、予冷ニトロベンゼン４５０ｍｌに塩化アルミニウム（１４４ｇ、１.０８ｍｏｌ）を添加した。次いで、塩化４−ブロモベンゾイル２１９.５ｇ（１ｍｏｌ）のニトロベンゼン２００ｍｌ中懸濁液を２０分間かけて添加し、次いで、１０分後、３−フルオロアニソール１０８.５ｍｌ（０.９５ｍｏｌ）を添加した。該反応混合物を一夜室温に加温し、氷水（１.５Ｌ）と混合し、ジクロロメタン１Ｌで３回抽出した。３つの有機相を水１Ｌで２回連続洗浄し、プールし、乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）。蒸発（８５℃、１トール）により(４−ブロモフェニル)−(２−フルオロ−４−メトキシ−フェニル)−メタノンおよび(４−ブロモフェニル)−(４'−フルオロ−２'−メトキシフェニル)−メタノンの混合物を得、すぐに酢酸エチル３００ｍｌに溶解し、室温で結晶かした。該結晶を濾過し、酢酸エチル１００ｍｌで洗浄し、シクロヘキサン１００ｍｌで３回洗浄して、純粋な(４−ブロモフェニル)−(２'−フルオロ−４'−メトキシフェニル)−メタノン（１２２.４ｇ、４１.６％）を得た：融点１２５〜１２６℃；ＩＲ  １６４３ｃｍ-1；1ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１3）δ  ３.８７（ｓ，ＯＣＨ3）、６.６６（ｄｄ，Ｊ＝１２.１、２.４Ｈｚ  １Ｈ，３'−Ｈ）、６.８０（ｄｄ，Ｊ＝８.７、２.４Ｈｚ，１Ｈ、５'−Ｈ）、７.５４−７.６８（ｍ，５Ｈ、ａｒｏｍ  Ｈ）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３０８（Ｍ+，１  Ｂｒ）。Ｃ14Ｈ16ＯＢｒＦＯ2の計算された分析値：Ｃ，５４.４０；Ｈ，３.２６；Ｆ，６.１５；Ｂｒ，２５.８５。測定値：Ｃ，５４.５７；Ｈ，３.３５；Ｆ，６.２１；Ｂｒ，２６.０７。
【０１５８】
(４−ブロモフェニル)−(２'−フルオロ−４'−ヒドロキシフェニル)−メタノン［２］
化合物［１］６１.８ｇ（２００ｍｍｏｌ）の酢酸４００ｍｌ中懸濁液を６２％臭化水素酸水溶液２３０ｍｌで処理し、１２５℃で８時間撹拌した後、蒸発させた。残留物を酢酸エチル５００ｍｌに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム３００ｍｌおよび１０％塩化ナトリウム溶液３００ｍｌで洗浄した。水相を酢酸エチル５００ｍｌで２回抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させて、(４−ブロモフェニル)−(２'−フルオロ−４'−ヒドロキシフェニル)−メタノン［２］の橙色の結晶（５７.２ｇ、９６.９％９を得た：融点６２〜６３℃；ＩＲ  １６５２ｃｍ-1；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−  ６.６６（ｄｄ，Ｊ＝１２.１、２.４Ｈｚ  １Ｈ，３'−Ｈ）、６.８０（ｄｄ，Ｊ＝８.７，ｄｔｊ）a ６.６８（ｄｄ，Ｊ＝１２.６，２.２Ｈｚ，１Ｈ，３'−Ｈ）、６.７７（ｄｄ，Ｊ＝８.５，２.２Ｈｚ，１Ｈ，５'−Ｈ）、７.４９（ｄｄ，Ｊ＝８.５，８.５Ｈｚ，１Ｈ，６'−Ｈ）、７.６４および７.７５（ＡＡ'ＢＢ'，４Ｈ，２,３,５,６−Ｈ）、１０.８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２９４（Ｍ+，１Ｂｒ）。Ｃ13Ｈ8ＢｒＦＯ2の計算分析値：Ｃ，５２.９１；Ｈ，２.７３；Ｆ，６.４４；Ｂｒ，２７.０８。測定し：Ｃ，５２.９４；Ｈ，２.７４；Ｆ，６.４２；Ｂｒ，２６.８４。
【０１５９】
[４'−(６−アリル−メチル−アミノ−ヘキシルオキシ)−２'−フルオロフェニル]−(４−ブロモフェニル)−メタノン・フマル酸塩［３］
化合物［２］３５.４ｇ（１２０ｍｍｏｌ）、１,６−ジブロモヘキサン５４.９ｍｌ（３６０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム４９.８ｇ（３６０ｍｍｏｌ）のアセトン１１００ｍｌ中混合物を７５℃で５時間激しく撹拌した。濾過および蒸発の後、残留物を、硫酸ナトリウムで処理したジクロロメタンに溶解し、再度、濾過し、蒸発させた。シクロヘキサン−ヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））４００ｍｌで、最初に０℃で、次いで、−７８℃で、結晶化して、粗[４'−(６−ブロモ−ヘキシルオキシ)−２'−フルオロフェニル]−(４−ブロモフェニル)−メタノン５３.２ｇ（１１６ｍｍｏｌ）を得た。この生成物をＮ,Ｎ−ジメチルアセトアミド３９０ｍｌに溶解し、０℃に冷却し、Ｎ−アリルメチルアミン２２.５ｍｌ（２３２ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で２２時間後、該反応を０℃に冷却し、再度、Ｎ−アリルメチルアミン２２.５ｍｌ（２３２ｍｍｏｌ）で処理した。５時間後、該溶液を蒸発させ（７０℃、１トール）、飽和重炭酸ナトリウム３００ｍｌで中和し、ジクロロメタン４００ｍｌで３回抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発乾固させフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル０.０４〜０.０６３ｍｍ、ジクロロメタン−メタノール（９５:５（ｖ／ｖ）））によって精製して、[４'−(６−アリルメチル−アミノ−ヘキシルオキシ)−２'−フルオロフェニル]−(４−ブロモフェニル)−メタノン３７.７ｇ（８４.１ｍｍｏｌ）を得た。該遊離アミンおよびフマル酸８.８ｇ（７５.７ｍｍｏｌ）をエタノール２００ｍｌに溶解し、蒸発させ、アセトン−酢酸エチル−エーテルから結晶化して、[４'−(６−アリルメチル−アミノ−ヘキシルオキシ)−２'−フルオロ−フェニル]−(４−ブロモフェニル)−メタノン・フマル酸塩［３］（３６.２ｇ,５３.４％）を得た：融点８６〜８８℃；ＩＲ  １６５３ｃｍ-1；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−δ６)δ  １.２５−１.６０（ｍ，６Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ）、１.７０−１.８０（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ）、２.２４（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ3）、２.４０−２.５０（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ）、３.１１（ｄ，Ｊ＝６.５Ｈｚ，２Ｈ，ＮＣＨ2ＣＨＣＨ2）、４.０８（ｔ，Ｊ＝６.４Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ）、５.１７−５.２７（ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ2ＣＨＣＨ2）、５.７５−５.９０（ｍ，１Ｈ，ＮＣＨ2ＣＨＣＨ2）、６.６７（ｓ，２Ｈ，フマル酸塩）、６.９１−７.００（ｍ，２Ｈ，３',５'−Ｈ）、７.５６（ｄｄ，Ｊ＝８.６，８.６Ｈｚ，１Ｈ,６'−Ｈ）、７.６５および７.７６（ＡＡ'ＢＢ'，４Ｈ，２,３,５,６−Ｈ）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ４４８（Ｍ+，１Ｂｒ）。Ｃ23Ｈ27ＮＢｒＦＯ2・Ｃ4Ｈ4Ｏ4の計算分析値；Ｃ，５７.４５；Ｈ，５.５４；Ｎ，２.４８；Ｆ，３.３７；Ｂｒ，１４.１６。測定値：Ｃ，５７.３９；Ｈ，５.５７；Ｎ，２.５０；Ｆ，３.３８；Ｂｒ，１４.１５。
【０１６０】
ＯＳＣ阻害剤のさらなる例を以下に示す。一のこのような阻害剤は、以下に示されるＵ１８６６６Ａ（３−β−(２−(ジエチルアミノ)エトキシ)アンドロスト−５−エン−１７−オン）である：
【化９】
2014505047.tif 000015
Ｕ１８６６６Ａは、強力なＯＳＣ阻害剤であるが、その治療用途は、白内障の形成を含む毒物学的作用の可能性によって制限され得る［２０］。
【０１６１】
ＯＳＣ阻害剤のさらなる例は、ＷＯ１９９６／０１１０２１Ａ１“Ｓubstituted heterobicyclic alkyl amines and their use as squalene oxide cyclase inhibitors”およびＥＰ１３４６９９４Ａ１“colesterol biosynthesis inhibitors containing as the active ingredient tricyclic spiro compounds”に記載されている。これらの化合物は、抗癌活性について本明細書の記載に従って試験することができる。
【０１６２】
癌処置のためのストラテジーとしてのＯＳＣの阻害
癌細胞の生存率に対するＲｏ  ４８−８０７１を含む強力なＯＳＣ阻害剤の効果を評価した；これらの阻害剤は、乳癌細胞に対してＰＲＩＭＡ−１の効果と同様の効果を達成することが示された。スルホローダミンＢ（「ＳＲＢ」）アッセイを使用して、ＢＴ−４７４およびＴ４７−Ｄ乳癌細胞に対するＰＲＩＭＡ−１およびＲｏ  ４８−８０７１の存在下および不在下での生存率を評価した。ＮＣＩで確立されたオリジナルの手順を僅かに変更したスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して、乳癌および正常な乳腺細胞の生存率に対するＯＳＣ阻害剤Ｒｏ  ４８−８０７１の効果を評価した。したがって、細胞を９６ウェルプレート中の培養培地１００μｌに播種し、３７℃で５％ＣＯ2の下で一夜インキュベートした。２４時間後、該培養培地を取り出し、付着した細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で洗浄し、種々の濃度のＰＲＩＭＡ−１またはＲｏ  ４８−８０７１で２４時間処理した。増殖培地を吸引し、ＰＢＳ  １００μｌおよび５０％冷トリクロロ酢酸１００μｌを添加し、次いで、４℃で１時間インキュベートすることによって、生存細胞または付着細胞をin situで固定した。生存細胞を氷水で洗浄し、室温（ＲＴ）で乾燥させ、次いで、４％ＳＲＢ  ５０μｌで室温にて８分間染色した。１％冷酢酸で５回洗浄して未結合染料を除去し、プレートを室温で乾燥させた。結合した染料を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー１５０μｌで可溶化し、ＳｐｅｃＴＲＡ  ＭＡＸ  １９０マイクロプレートリーダー（Sunnyvale、CA）を用いて５２０ｎｍで試料の吸光度を測定した。ＢＴ−４７４、Ｔ４７−ＤおよびＡＧ１１１３２Ａ細胞株に対するこれらの実験において、濃度ごとにウェルを６個ずつ使用し、各実験を少なくとも２回行った。
【０１６３】
図２は、漸増濃度のＰＲＩＭＡ−１、Ｒｏ  ４８−８０７１およびＵ１８６６６Ａの存在下での腫瘍細胞の生存率（図２ＡにおけるＢＴ−４７４および図２ＢにおけるＴ４７−Ｄ）を比較する。ＳＲＢアッセイによって、ＯＳＣの強力な阻害剤Ｒｏ  ４８−８０７１およびＵ１８６６６Ａは、両方の腫瘍細胞株の細胞増殖を劇的に抑制し、ＰＲＩＭＡ−１のものと同様の用量反応関係を示すことが判明した。ＢＴ−４７４細胞およびＴ４７−Ｄ細胞に対して２４時間の処理でＲｏ  ４８−８０７１の有効なインビトロ用量は、０.１μｍ〜２５μｍである。
【０１６４】
ＢＴ−４７４腫瘍細胞株および正常な乳房細胞株ＡＧ１１１３１Ａの生存率に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果も比較した。図４は、Ｒｏ  ４８−８０７１の存在下での正常な乳腺細胞と比較して、乳腺腫瘍細胞の生存率の選択的な損失を示す。
【０１６５】
さらなる癌細胞株で同様にＯＳＣ阻害の効果を評価した。癌細胞株はＡＴＣＣ（Manassas、VA）から購入することができる。ＳＲＢアッセイを使用して、種々の癌細胞の増殖に対するＲＯ  ４８−８０７１の阻害効果を測定した。９６ウェルプレートに細胞を播種し、３７℃で５％ＣＯ2下にて一夜インキュベートした。２４時間後、培養培地を取り出し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で洗浄し、次いで、５％ＦＢＳ培養培地中の種々の濃度のＲＯ  ４８−８０７１で２４時間および４８時間処理した。増殖培地を吸引し、ＰＢＳ  １００μｌおよび５０％トリクロロ酢酸１００μｌを添加し、次いで、４℃で１時間インキュベートすることによって、生存細胞または付着細胞をin situで固定した。細胞を氷水で洗浄し、室温（ＲＴ）で乾燥させ、次いで、４％ＳＲＢ  ５０μｌで染色した。１％冷酢酸で５回洗浄して未結合染料を除去し、プレートを室温で乾燥させた。結合した染料を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー１５０μｌで可溶化し、ＳｐｅｃＴＲＡ  ＭＡＸ  １９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Sunnyvale、CA）を用いて５２０ｎｍで試料の吸光度を測定した。濃度ごとにウェルを６個ずつ使用し、各実験を２〜３回行った。
【０１６６】
乳癌細胞株ＢＴ−４７４生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の乳癌（ＢＴ−４７４）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図４Ａを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用した。
【０１６７】
乳癌細胞株Ｔ４７−Ｄ生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の乳癌（Ｔ４７−Ｄ）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図４Ｂを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用した。
【０１６８】
乳癌細胞株ＭＣＦ−７生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の乳癌（ＭＣＦ−７）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図４Ｃを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２および１０μｇ／ｍｌインスリンを使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用した。
【０１６９】
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の前立腺癌（ＬＮＣａＰ）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図５Ａを参照する。培養培地は、培養のために２０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１７０】
前立腺癌細胞株ＰＣ−３生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の前立腺癌（ＰＣ−３）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図５Ｂを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１７１】
前立腺癌細胞株ＤＵ１４５生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の前立腺癌（ＤＵ１４５）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図５Ｃを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＥＭＥＭを使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＥＭＥＭを使用した。
【０１７２】
大腸癌細胞株ＤＬＤ−１生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の大腸癌（ＤＬＤ−１）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図６Ａを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１７３】
大腸癌細胞ＬｏＶｏ生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の乳癌（ＬｏＶｏ）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図６Ｂを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  Ｆ−１２Ｋを使用し、処理のために５％ＦＢＳ  Ｆ−１２Ｋを使用した。
【０１７４】
卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図６Ｃを参照する。培養培地は、培養のために２０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１７５】
卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の卵巣癌（ＳＫ−ＯＶ−３）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図６Ｄを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＭｃＣｏｙ'ｓ  ５ａを使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＭｃＣｏｙ'ｓ  ５ａを使用した。
【０１７６】
肺癌細胞株Ｈ６９ＡＲ生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の乳癌（Ｈ６９ＡＲ）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図７Ａを参照する。培養培地は、培養のために２０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１７７】
肺癌細胞株Ｈ２３生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の肺癌（ＮＣＩ−Ｈ２３）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図７Ｂを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１７８】
肺癌細胞株Ａ５４９生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の肺癌（Ａ５４９）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図７Ｃを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  Ｆ−１２Ｋを使用し、処理のために５％ＦＢＳ  Ｆ−１２Ｋを使用した。
【０１７９】
膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ−１生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の膵臓癌（Ｃａｐａｎ−１）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図８Ａを参照する。培養培地は、培養のために２０％ＦＢＳ  ＩＭＤＭを使用し、処理のために１０％ＦＢＳ  ＩＭＤＭを使用した。
【０１８０】
膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の膵臓癌（Ｂx−ＰＣ−３）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図８Ｂを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１８１】
エストロゲン、プロゲステロンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陽性乳癌細胞株ＨＣＣ−１４２８およびＺＲ−７５生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の膵臓癌（ＨＣＣ−１４２８およびＺＲ−７５）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図９Ａおよび図９Ｂを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１８２】
エストロゲン、プロゲステロンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−２３１およびＢＴ−２０生存率に対するＲＯ  ４８−８０７１の効果。２４時間および４８時間処理後の膵臓癌（ＭＤＡ−２３１およびＢＴ−２０）細胞増殖に対するＲｏ  ４８−８０７１の効果を示す図９Ｃおよび図９Ｄを参照する。培養培地は、培養のために１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用し、処理のために５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。
【０１８３】
種々の癌細胞株（いくつかの細胞株は薬物耐性表現型である）におけるＲＯ  ４８−８０７１のＩＣ50分析値を表２にまとめた。
【表２】
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【０１８４】
ＲＯ  ４８−８０７１は、ヒトの乳癌細胞および前立腺癌細胞のアポトーシスおよび細胞死を誘発する。
アポトーシスは、胚発生の間および組織恒常性の維持において生じる正常な生理学的プロセスである。アポトーシスプログラムは、血漿膜非対称および付着の消失、細胞質および核の凝縮、ならびにＤＮＡのヌクレオソーム間切断を含む特定の形態的特徴によって特徴付けられる。血漿膜の消失は、最も初期の特徴の１つである。アポトーシス細胞において、膜リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、血漿膜の内部リーフレットから外部リーフレットへ転位置され、それによって、ＰＳは細胞の外部環境に曝露される。アネキシンＶは、ＰＳに対して高親和性を有し、曝露されたＰＳと一緒に細胞に結合する３５〜３６ｋＤａ  Ｃａ2+依存性リン脂質結合タンパク質である。アネキシンＶは、ＦＩＴＣを含む蛍光色素と結合することができる。このフォーマットは、ＰＳに対する高親和性を保持しており、かくして、アポトーシスを受ける細胞のフローサイトメトリー分析のための高感度プローブとして機能する。ＰＳの外在化は、アポトーシスの初期の段階で生じるので、ＦＩＴＣアネキシンＶ染色法は、ＤＮＡ断片化のような核変化に基づくアッセイよりも早い段階でアポトーシスを同定することができる。
【０１８５】
ＦＩＴＣアネキシンＶ染色法は、アポトーシスプロセスまたは壊死プロセスにより生じる細胞死の最終段階に付随して起こる膜完全性の損失の前に行う。したがって、ＦＩＴＣアネキシンＶによる染色は、典型的には、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−アミノ−アクチノマイシン（７−ＡＡＤ）のような生体染料と合わせて使用され、初期のアポトーシス細胞（ＰＩ陰性、ＦＩＴＣアネキシンＶ陽性）を同定することができる。無処理の膜を有する生存細胞は、ＰＩを排除するが、死細胞および損傷細胞は、ＰＩに対して透過性がある。例えば、生存していると見なされる細胞は、ＦＩＴＣアネキシンＶおよびＰＩ陰性である；初期アポトーシスにある細胞は、ＦＩＴＣアネキシンＶ陽性およびＰＩ陰性である；後期アポトーシスにある細胞または既に死んでいる細胞は、ＦＩＴＣアネキシンＶおよびＰＩ陽性である。このアッセイは、アポトーシス死を受けた細胞と壊死経路の結果として死んだ細胞を区別しない。というのは、いずれの場合も、死細胞は、アネキシンＦＩＴＣおよびＰＩの両方で染色されるからである。しかしながら、アポトーシスを経時的に測定した場合、細胞は、しばしば、ＦＩＴＣアネキシンＶおよびＰＩ陰性（生存しているか、または測定可能なアポトーシスがない）からＦＩＴＣアネキシンＶ陽性およびＰＩ陰性（初期アポトーシス、膜完全性が存在する）へ、そして、最終的に、ＦＩＴＣアネキシンＶおよびＰＩ陽性（最終段階アポトーシスおよび死）へ追跡され得る。これらの３つの段階を経る細胞の移行は、アポトーシスを示唆する。これに対して、細胞がＦＩＴＣアネキシンＶおよびＰＩ陽性であることを示している１つの観察結果自体は、細胞にそれらの死を及ぼすプロセスについての十分な情報を明らかにしていない。
【０１８６】
ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体陽性）、ＢＴ−２０およびＭＤＡ−２３１(エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体陰性、三重陰性）ヒト乳癌細胞、ならびにＰＣ−３およびＤＵ−１４５（アンドロゲン受容体陰性）ヒト前立腺癌細胞を使用して、ＲＯ  ４８−８０７１の細胞死誘発能を試験した。６ウェルプレートにて、ＢＴ−４７４およびＢＴ−２０細胞についてはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ中にて１.５×１０5／ウェルで、ＰＣ−３およびＤＵ１４５細胞についてはＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％ＦＢＳ中に１.２×１０5／ウェルで、細胞を播種して、一夜おいた。次いで、細胞を洗浄し、５％ＦＢＳを含む増殖培地中の所定の濃度（μｍ）のＲＯ  ４８−８０７１またはビヒクル単独で２４時間処理した。当該薬物と一緒にインキュベートした後、細胞を回収し、１０％ＦＢＳ増殖培地２ｍｌで洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（BioVision Research Products、Mountain View、CA）で提供される結合バッファー５００μｌに再懸濁した。核試料にアネキシンＶ  ５μｌおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）５μｌを添加した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Becton Dickinson、Franklin lakes、NJ）を１処理につき細胞１０,０００個と一緒に使用し、アネキシンＶ陽性およびＰＩ陽性細胞の割合を定量化した。象限Ｒ５は、アネキシンＶ陽性細胞を示し、象限Ｒ３は、アネキシンＶ＋ＰＩ陽性細胞を示す。代表的な実験から得られた棒グラフは、腫瘍細胞株から得られたアネキシンＶ陽性＋ＰＩ陽性細胞（総死細胞数）を示す。＊対照群と比較して有意な差（ｐ＜０.０５、ＡＮＯＶＡ）。実験は、２〜４回行われ、各処理は、３回分析された。
【０１８７】
インビボ研究
乳癌
例示阻害剤Ｒｏ  ４８−８０７１をインビボで評価し、ヌードマウスにおけるヒト乳癌異種移植片の増殖を、毒性を伴わずに阻害することが判明した。例えば、図９および図１０を参照。
【０１８８】
５〜６週齢の雌性胸腺欠損ｎｕ／ｎｕヌードマウス（１８〜２２ｇ）をHarland Sprague-Dawley, Inc.から購入した。腫瘍細胞接種の４８時間前に、ヌードマウスに１７−β−エストラジオールペレット（１.７ｍｇ／ペレット、６０日放出）を摂取した。マトリゲルおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（４／１、ｖ／ｖ）の混合溶液０.１５ｍｌ中５×１０6のＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞を、マウスの各側腹部に皮下注射し、各マウスの両側腹部に注射した。腫瘍体積が約１００ｍｍ3に達した時、動物をランダムに３つのグループに割り当て、尾静脈注射によるＲＯ  ４８−８０７１（５ｍｇ／ｋｇ／日または１０ｍｇ／ｋｇ／日）での５日間の処置で開始し、次いで、図１３Ａに示されるように１日おきにさらに５回同処置を施した。対照群の動物には、同条件下でビヒクルのみを注射した。腫瘍体積は、デジタルカリパスで測定し、式（Ｌ×Ｗ×Ｈ）×０.５２３６を用いて算出した。対照群と比較して、有意な差が見られた（Ｐ＜０.０５、ＡＮＯＶＡを使用）。
【０１８９】
実験の全体を通して動物の体重をモニターした。図１３Ｂに示すように、矢印は、ＲＯ  ４８−８０７１による処置の期間を示す。対照群と処置群との間に有意な差は見られなかった。これは、ＯＳＣ阻害剤ＲＯ  ４８−８０７１が、腫瘍増殖を阻害するために使用される用量では、腫瘍担持ヌードマウスにおいて毒性を示さないことを示している。
【０１９０】
前立腺癌
６週齢の雄性胸腺欠損ｎｕ／ｎｕヌードマウス（２１〜２５ｇ）をHarlan Laboratories, Inc.から購入した。マトリゲルおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１／１、ｖ／ｖ）の混合溶液０.１５ｍｌ中５×１０6のヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を、マウスの各側腹部に皮下注射し、各マウスの両側腹部に注射した。腫瘍体積が約１００ｍｍ3に達した時、動物をランダムに３つのグループに割り当て、尾静脈注射によるＲＯ  ４８−８０７１（５ｍｇ／ｋｇ／日または２０ｍｇ／ｋｇ／日）での５日間の処置で開始し、次いで、図１４Ａに示されるように１日おきにさらに７回同処置を施した。対照群の動物には、同条件下でビヒクルのみを注射した。腫瘍体積は、デジタルカリパスで３日ごとに測定し、式（Ｌ×Ｗ×Ｈ）×０.５２３６を用いて算出した。＊対照群と比較して有意な差（Ｐ＜０.０５、ＡＮＯＶＡを使用）。
【０１９１】
Ｒｏ  ４８−８０７１処置後の動物の体重を示す。図１４Ｂに示すように、矢印は、Ｒｏ  ４８−８０７１による処置の期間を示す。対照群と処置群との間に有意な差は見られなかった。これは、ＯＳＣ阻害剤ＲＯ  ４８−８０７１が、腫瘍増殖を阻害するために使用される用量では、腫瘍担持ヌードマウスにおいて毒性を示さないことを示している。
【０１９２】
“An inverse docking approach for identifying new potential anti-cancer targets”（出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する）［文献１８］に、さらなる実験が記載されている。
【０１９３】
本発明はその特定の実施態様と関連して記載されているが、発明方法論は、さらなる変更が可能である。本特許出願は、一般に発明の原理に従い、当該発明が関連する技術分野内の公知のまたは慣例のやり方の範囲内となるような、かつ、上記されていて特許請求の範囲の範囲に記載される必須の特徴に当てはまるような、記載内容からの逸脱を含む、本発明のいかなるバリエーション、使用または適応も網羅することを意図する。
【０１９４】
文献
［１］Abe I, Rohmer M., Prestwich GD. Enzymatic cyclization of squalene and oxidosqualene to sterols and triterpenes. Chem. Rev. 1993, 90:2189-2206.
［２］Wendt KU, Schulz GE, Corey EJ, Liu DR. Enzyme mechanisms for polycyclic triterpene formation. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39:2812-2833.
［３］Morand OH, Aebi J, Guerry P, Hartman PG, Hennes U, Himber J, Ji YH, Jolidon S, Lengsfeld H. Potent inhibitors of mammalian 2,3-oxidosqualene: lanosterol cyclase are orally active cholesterol lowering agents. Atherosclerosis 1994, 109(suppl):321.
［４］Lenhart A, Reinert DJ, Aebi JD, Dehmlow H, Morand OH, Schulz GE. Binding Structures and Potencies of oxidosqualene cyclase inhibitors with the homologous squalene-hopene cyclase. J. Med. Chem. 2003, 46:2083-2092.
［５］Morand OH, Aebi JD, H D, Ji YH, N G, Lengsfeld H, Himber J: Ro 48-8071, a new 2,3-oxidosqualene:lanosterol cyclase inhibitor lowering plasma cholesterol in hamsters, squirrel monkeys, and minipigs: comparison to simvastatin. J. Lipid. Res. 1997, 38:373-390.
［６］Levine AJ. p53, the cellular gatekeeper forgrowth and division. Cell 1997, 88:323-331.
［７］Barnes DM, Camplejohn RS. p53, apoptosis, and breast cancer. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 1996, 1:163-175.
［８］Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumor types. Nature 1989, 342:705-708.
［９］Bykov VJ, Issaeva N, Shilov A, Hultcrantz M, Pugacheva E, Chumakov P, Bergman J, Wiman KG, Selivanova G. Restoration of the tumor suppressor function to mutant p53 by a lowmolecular-weight compound. Nat Med 2002, 8:282-288.
［１０］Liang Y, Wu J, Stancel GM, Hyder SM. p53-dependent inhibition of progestin-induced VEGF expression in human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Bio. 2005, 93:173-182.
［１１］Liang Y, Besch-Williford C, Hyder SM. PRIMA-1 inhibits growth of breast cells by re-activating mutant p53 protein. Int.l J. Oncol. 2009, 35:1015-1023.
［１２］Huang S-Y, Zou X. An iterative knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions: I. derivation of interaction potentials. J. Comput. Chem. 2006, 27:1865-1875.
［１３］Huang S-Y, Zou X. An iterative knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions: II. validation of the scoring function. J. Comput. Chem. 2006, 27:1876-1882.
［１４］Huang S-Y, Zou X. Ensemble docking of multiple protein structures: considering protein structural variations inmolecular docking. Proteins 2007, 66:399-421.
［１５］Huang S-Y, Zou X. Efficient molecular docking of NMR structures: application to HIV-1 protease. Protein Sci . 2007, 16:43-51.
［１６］http://zoulab.dalton.missouri.edu/software.htm
［１７］Gao Z, Li H, Zhang H, Liu X, Kang L, Luo X, Zhu W, Chen K, Wang X, Jiang H. PDTD: a Web-Accessible Protein Database for Drug Target Identification. BMC Bioinform. 2008, 9:104(pp1-7). (http://www.dddc.ac.cn/pdtd).
［１８］Grinter SZ, Liang Y, Huang S-Y, Hyder SM, Zou X. An inverse docking approach for identifying new potential anti-cancer targets. J. Mol. Graphics Model. 2011, 29:795-799.
［１９］Beltowski, J et al.(2009) Adverse effects of statins-mechanisms and consequences. Curr. Drug Saf. 4:209-228.
［２０］Cenedella RJ et al., “Direct perturbation of lens membrane structure may contribute to cataracts caused by U18666A, an oxidosqualene cyclaseinhibitor,” J Lipid Res. 2004 Jul; 45(7):1232-41.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014505047.tif 000029
【図１１】
2014505047.tif 000030
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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