(57)【要約】  本発明は、インビトロならびにインビボにて、肝臓、好ましくは肝細胞への化合物の特異的送達のための疎水性修飾ペプチドに関する。本発明は、該疎水性修飾ペプチドおよび肝臓に特異的に送達される化合物を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、本発明の疎水性修飾ペプチドの使用ならびに肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
［Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｒｏ］Ａｐ
［式中、
Ｐは、アミノ酸配列ＮＰＬＧＦＸａａＰを有するペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸であり；
Ｘは、ｍ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列であり、ここで、１つ以上のアミノ酸は、好ましくはカルボン酸、脂肪酸、Ｃ８からＣ２２脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸での、アシル化、および、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環芳香族性化合物から選択される疎水性部分の付加から選択される疎水性修飾のための１つ以上の基を有し；ｍは少なくとも４であり；
Ｙは、ｎ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列であり、ｎは０または少なくとも１であり；
ｍ＋ｎは１１以上であり、
Ｒは、好ましくはアミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然および合成ポリマー、例えば、ＰＥＧ、グリカンから選択される分解から保護する部分である、該疎水性修飾ペプチドのＣ−末端修飾であり、ｏは０または少なくとも１であり、
Ａは、アンカー基であり、好ましくはエステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択され、ｐは、０または少なくとも１である］
で示される疎水性修飾ペプチドであって、
ここで、１つ以上の化合物が、Ｘの１つ以上のアミノ酸に結合または連結されている、ペプチド。
【請求項２】
ｍが４から１９であり、そして／または、ｎが０から７８である、請求項１に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項３】
ＸａａがＦまたはＬ、好ましくはＦである、請求項１または２に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項４】
１つ以上の化合物が、リンカーまたはスペーサーを介して、該ペプチドに連結されている、請求項１から３のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項５】
リンカーまたはスペーサーが、肝臓タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素により、疎水性修飾ペプチドから開裂される、請求項４に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項６】
リンカーまたはスペーサーが、シトクロム、例えば、シトクロムＰ４５０、エンドサイトーシス経路のプロテアーゼおよびリアーゼ、マトリックス−メタロ−プロテアーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２、好ましくはＭＭＰ７から選択される酵素により開裂される、請求項５に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項７】
リンカーまたはスペーサーが、ペプチド配列ＧＣＨＡＫまたはＲＰＬＡＬＷＲＳを含む、請求項６に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項８】
１つ以上の化合物が、好ましくはリジン、α−アミノグリシン、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸から選択される、側鎖においてアミノ基を有するＸの１つ以上のアミノ酸と結合している、請求項１から７のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項９】
側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸がリジンである、請求項８に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１０】
側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸が、ＸのＮ−末端に位置している、請求項１から９のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１１】
１から１１個、好ましくは１から３個の側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸が、ＸのＮ−末端に位置している、請求項１０に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１２】
化合物が、活性化エステルを使用することにより、側鎖においてアミノ基を有する該アミノ酸に結合している、請求項１１に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１３】
−アミンおよび活性化カルボン酸、好ましくはＮＨＳ−エステルまたはカルボジイミドの反応によるアミドの形成；
−ピリジルジスルフィドと特異的に反応する２つのチオールまたは１つのチオールを使用するジスルフィド結合；
−マレイミドまたはハロアセチルおよびチオール成分を使用するチオエーテル形成；
−イミドエステルおよびアミンを使用するアミジン形成；
−カルボニル（例えば、アルデヒド）およびヒドラジドを使用するヒドラジド結合；
−還元条件下でカルボニルおよびアミンを使用するアミン結合；
−ニトリルおよびアジドを使用するトリアゾール形成；
−イソチオシアネートおよびアミンを使用するチオウレア形成；
−アルコールおよび活性化カルボン酸、好ましくは酸塩化物またはカルボジイミドの反応によるエステルの形成；
−アルコールおよびハロゲン化アルキルの反応によるエーテルの形成
から選択される１つ以上の方法を使用することにより、薬物が、該Ｘのアミノ酸と結合している、請求項１から１２のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１４】
疎水性修飾が、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択されるアシル化による、請求項１から１３のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１５】
疎水性修飾が、ミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による、請求項１４に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１６】
疎水性修飾が、ステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による、請求項１４に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１７】
好ましくはＨＢＶまたはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の遺伝子型またはそれらの変異体の、種々のウイルス種、株またはサブタイプのアミノ酸配列を有する配列番号２から１３の変異体を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１８】
１つ以上のＸのアミノ酸に結合または連結されている１つ以上の化合物が、１つ以上の薬物または２つ以上の薬物の組合せである、請求項１から１７のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１９】
薬物が、放射性分子またはアイソトープ、例えば、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、抗代謝産物、例えば、アザチオプリン；抗腫瘍剤、例えば、ブレオマイシン、アクチノマイシン；アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン；抗葉酸剤、例えば、メトトレキサート；抗ウイルス剤、例えば、リバビリン(ribovarin)、テノホビル；細胞骨格破壊剤、例えば、ビンブラスチン、タキソール；サイトカイン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β；ケモカイン、例えば、ＣＣＬ１、ＣＸＣ１；ｓｉＲＮＡ、例えば、ＣＡＬＡＡ−０１、ＳＩＲＮＡ−０３４；ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−２６ａ、オリゴヌクレオチドおよび核酸、例えば、プラスミド、短鎖ｄｓＤＮＡ、短鎖ｓｓＤＮＡ；核受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、ミフェプリストン；エポチロン、例えば、パツピロン(patupilone)、イクサベピロン；ホルモン、例えば、プロゲスチン(progestrines)、フルオキシメステロン；ホルモンアンタゴニスト、例えば、トレミフェン、フルベストラント；免疫抑制剤、例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡ；免疫調節剤、例えば、レナリドミド；免疫刺激剤、例えば、ＳＤＣ１０１、ＩＴＭＮ−１９１；免疫刺激配列、例えば、ＴＬＲアゴニスト；キナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ、イマチニブ、エルロチニブ；プロテアーゼ阻害剤、例えば、ボセプレビル、テラプレビル；ポリメラーゼ阻害剤、例えば、ＭＫ−０６０８、Ｒ７１２８；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン；ヌクレオシド類似体、例えば、テルビブジン、エンテカビル；前駆体類似体、例えば、フルオロウラシル；ペプチドおよびペプチド抗生物質、例えば、デフェンシン１；抗生物質、例えば、アジスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピシン、フルオロキノロンクラスのジャイレース阻害剤、例えば、レボフロキサシン、白金ベースの薬剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン；レチノイド、例えば、タザロテン、ベキサロテン；ビンカアルカロイド、例えば、ビンポセチン、ビノレルビンおよびそれらの誘導体；細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤、例えば、リボソーム不活性化タンパク質、例えば、ａ−サルシン、レストリクトシン(restrictotin)；ビタミン、例えば、ビタミンＢ６；α−鎖毒素、例えば、ジフテリア毒素；ヘビの毒素およびそれらの成分、例えば、コブラトキシン；真菌由来剤、例えば、アスペルギリン；細菌エクソトキシン、例えば、緑膿菌外毒素；細菌エンテロトキシン、例えば、コレラ毒素および細菌エンドトキシン、例えば、リポ多糖類およびそれらの類似体；抗体、例えば、ベバシズマブ、セツキシマブおよび陽イオン性両親媒性(amphilic)薬物（ＣＡＤ）、例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、トリフルオロフェナジンおよびそれらの組合せから選択される、請求項１８に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２０】
薬物が、ダプソーン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シクロスポリンＡ、テノホビル、ラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、リバビリン、テラプレビル、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ドキシフルリジン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、エストラムスチン、ブスルファン、クロルメチン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ストレプトゾシン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロマイド、チオテパ、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シトシン−アラビノシド、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、ヒドロキシカルバミド、ミトタン、アザシチジン、シタラビン、ゲムシタビン、ネララビン、ボルテゾミブ、アナグレリド、好ましくはイマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブまたはニロチニブ、ＭＫ  ８８６、ピゾチフェン、トレミフェン、ＳＤＣ−１０１、ＩＴＭＮ−１９１、ＲＧ７２２７、ニタゾキサニド、ＶＸ−９５０、ＶＸ−２２２、ＢＭＳ−７９００５２、ＢＭＳ−６５００３２、ＧＳ  ９１９０、ＧＳ  ９２５６、ＢＩ  ２０１３３５、ＢＩ  ２０７１２７、ＩＤＸ１８４、Ｒ７１２８、ボセプレビル、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ｒ７１２８、ＲＧ７３４７、ＲＧ７３４８、ＴＭＣ４３５、ＰＦ−８６８５５４、ＰＦ−４８７８６９１、ＴＴ０３３、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ  ２０７１２７、ＢＭＳ−７９００５２、ＢＭＳ−７９１３２５、ＢＭＳ−６５００３２、ＢＭＳ−８２４３９３、ＡＮＡ５９８、ＶＣＨ−７５９、Ｇｌ  ５０００５、ＩＴＸ５０６１、ＩＴＸ４５２０、ＩＤＸ１８４、ＩＤＸ３２０、ＩＤＸ３７５、Ａ−８３７０９３、ＧＳ  ９１９０、ＧＳ  ９２５６、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−１６２５、ＰＰＩ−４６１、ＰＰＩ１３０１、ＴＧ４０４０、ＡＺＤ７２９５、クレミゾール(chemizole)、ＳＰＣ３６４９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤ−１２、ＧＳＫ６２５４３３、ＡＢＴ−４５０、ＡＢＴ−０７２、ＡＢＴ−３３３、ＰＳＯ−７９７７、ＩＮＸ０９１８９、ＰＳＩ−９３８、ＥＤＰ−２３９、ＳＤＣ−１０１、ＳＰ−３０、ＡＶＬ−１８１、ＶＸ−５００およびそれらの組合せから選択される、請求項１８または１９に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２１】
薬物または２つ以上の薬物の組合せにおける少なくとも１つの薬物が、プリマキン、ドキソルビシンおよびジャイレース阻害剤、好ましくはレボフロキサシンからなる群から選択される、請求項１８から２０のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２２】
２つ以上の薬物の組合せが、ボルテゾミブおよびドキソルビシン；ソラフェニブおよびドキソルビシン；ボルテゾミブおよびソラフェニブ；エルロチニブおよびフルオロウラシル；エルロチニブ、フルオロウラシルおよびインターフェロン−α；シスプラチンおよびドキソルビシン；シスプラチン、ドキソルビシンおよびエルロチニブ；イリノテカンおよびフルオロウラシル；イリノテカンおよびエルロチニブ；オキサリプラチンおよびフルオロウラシル；ＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン、フルオロウラシル、ロイコボリン(lencovorin)）；シスプラチンおよびドキシサイクリン(doxocyclin)；プリマキンおよびクリンダマイシン；プリマキンおよびアジスロマイシン；シプロフロキサシン、ドキシサイクリンおよびアトバコン；プリマキン、シプロフロキサシンおよびリファンピシン；プリマキン、リファンピシンおよびダプソーン；インターフェロン−αおよびリバビリン；テラプレビルおよびリバビリン；テラプレビル、リバビリンおよびインターフェロン−α；ボセプレビルおよびリバビリン；ボセプレビル、リバビリンおよびインターフェロン−α；シクロスポリンＡおよびインターフェロン−α；テノホビルおよびエンテカビル；テノホビルおよびインターフェロン−α；エンテカビルおよびインターフェロン−α；テノホビル、エンテカビルおよびインターフェロン−αの組合せから選択される、請求項１９から２１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２３】
ステアロイル−［Ｋ（プリマキンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ−プリマキンＴＭ）］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ドキシサイクリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ドキシサイクリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ペニシリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ペニシリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（シクロスポリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  シクロスポリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ラパミューンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ラパミューンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（ＲＰＬＡＬＷＲＳ−ベルケイドＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（ネクサバールＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアリル−［Ｋ（ＲＰＬＡＬＷＲＳ−ネクサバールＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（チアゾリジンジオン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、および
ミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ
からなる群から選択される、請求項１から２１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２４】
Ｘの１つ以上のアミノ酸に結合または連結されている１つ以上の化合物が、１つ以上の細胞透過性ペプチド（ＣＣＰ）である、請求項１から２１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２５】
１つ以上の標識が疎水性修飾ペプチドとさらに結合している、請求項１８から２４のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれかに記載の少なくとも１つの疎水性修飾ペプチド；および、所望により薬学的に許容される担体および／または賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項２７】
肝臓への化合物の特異的送達における使用のための、請求項１から２５のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
肝臓疾患または障害の処置または予防における使用のための、請求項２７に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２９】
肝臓疾患または障害が、肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、好ましくはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ型肝炎ウイルスにより引き起こされる肝炎、またはウイルスにより引き起こされる同時(concomitant)肝炎から選択される、請求項２８に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３０】
肝臓疾患または障害が、ウイルスまたは非ウイルス病原体の肝臓期に関わる疾患である、請求項２８または２９に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３１】
肝臓疾患または障害が、熱帯病、マラリア、住血吸虫症、リーシュマニア症である、請求項２８に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３２】
肝臓疾患または障害が、肝腫瘍、好ましくは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項２８に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３３】
肝臓疾患または障害が、代謝疾患、好ましくは肥満、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項２８または２９に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３４】
疎水性修飾ペプチドが、１０ｐｍｏｌ／ｋｇから２０μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲の用量にて、患者に適用される、請求項２７から３３のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３５】
疎水性修飾ペプチドが、１００ｎｍｏｌ／ｋｇから２μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲の用量にて、患者に適用される、請求項３４に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３６】
投与経路が、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐薬投与経路から選択される、請求項２７から３５のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３７】
肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための医薬の製造のための、請求項１から３６のいずれかに定義されている疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の使用。
【請求項３８】
請求項１から３６のいずれかに定義されている治療有効量の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロならびにインビボにて、肝臓、好ましくは肝細胞への化合物の特異的送達のための汎用ビヒクルであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｐｒｅＳ−ドメイン由来の疎水性修飾ペプチドに関する。任意の種の化合物、特に薬物は、肝臓に特異的に標的化することができ、肝臓において濃縮される。該肝臓標的化は、さらに、肝臓疾患または障害、例えば、肝炎、マラリア、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の標的化予防および／または処置のために、ならびにＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよび／またはＨＤＶ感染の予防のために使用することができる。本発明は、該疎水性修飾ペプチドおよび肝臓に特異的に送達される化合物を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための本発明の疎水性修飾ペプチドの使用、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法、および、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための医薬の製造のための疎水性修飾ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脊椎動物および他の動物に存在する臓器である肝臓は、代謝において主な役割を果たし、身体における多くの機能、例えば、グリコーゲン貯蔵、赤血球の分解、血漿タンパク質の合成および解毒を有する。肝臓はまた、人体において最も大きな腺である。肝臓は、腹部の胸郭部における横隔膜の下にある。肝臓は、脂質の乳化を介して、消化を助けるアルカリ化合物である胆汁を生産する。肝臓はまた、特殊組織を必要とする多種多様な大量の生化学的反応を行い、調節する。
【０００３】
肝細胞は、肝臓の細胞質塊の７０から８０％を構成している。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質貯蔵および炭水化物の変換、コレステロール、胆汁塩およびリン脂質の合成、ならびに外因性および内因性物質の解毒、修飾および排出に関与する。肝細胞はまた、胆汁の形成および分泌を開始する。
【０００４】
多数の既知の肝臓疾患、例えば：
−肝炎：主に種々のウイルスにより引き起こされるが、特定の毒、自己免疫または遺伝的状態によっても引き起こされる肝臓の炎症；
−肝硬変症：死滅肝細胞に置き換わる肝臓における線維組織の形成。肝細胞の死滅は、例えば、ウイルス肝炎、アルコール依存症または他の肝臓毒性化学物質との接触により引き起こされ得る；
−ヘモクロマトーシス：身体における鉄の蓄積を引き起こし、結局は肝臓損傷をもたらす遺伝的疾患；
−肝臓癌：通常、胃腸管の他の部分に由来する原発性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）または胆管癌腫および転移性癌；
−ウィルソン病：銅が身体に保持される遺伝的疾患；
−原発性硬化性胆管炎：事実上自己免疫性である胆管の炎症性疾患；
−原発性胆汁性肝硬変：小胆管の自己免疫疾患；
−バッド・キアリ症候群：肝静脈の閉塞；
−ジルベール症候群：集団の約５％に見られるビリルビン代謝の遺伝性障害；
−ＩＩ型糖原病：全身の進行性の筋衰弱（ミオパチー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系における種々の体内組織に影響を与えるグリコーゲンの蓄積
が存在する。
【０００５】
また、多数の小児肝疾患、例えば、胆道閉鎖症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群および進行性家族性肝内胆汁うっ滞；ならびに代謝疾患が存在する。
【０００６】
さらに、特に熱帯病の、いくつかの病原体および寄生生物は、そのライフサイクル中に肝臓段階を有する。例えば、マラリアは、最も一般的な感染症の１つであり、多大な公衆衛生問題である。マラリアは、プラスモジウム(Plasmodium)属の寄生原生動物により引き起こされる。疾患の最も重い型は、熱帯マラリア原虫(Plasmodium falciparum)および三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)により引き起こされるが、他の関連種（卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、およびときどき二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi）もまた、ヒトに感染することができる。ヒト病原性のマラリア原虫種のこのグループは、通常、マラリア寄生生物と称される。マラリア寄生生物は、メスのハマダラカ(Anopheles mosquitoes)により伝播される。ヒトにおいてマラリアは、二相を介して発症する：赤血球外（肝臓相または「肝臓段階」）および赤血球相。感染した蚊が人の皮膚を刺し、血粉を採るとき、蚊の唾液中の種虫が血流に入り、肝臓へ移動する。ヒト宿主に導入されて約３０分以内に、種虫は肝細胞に感染し、無性的および無症候性的に６−１５日間で増殖する。一旦、肝臓において、これらの生物体が分化し、数千のメロゾイトを生じると、宿主細胞の破壊後、血液へ逃げ、赤血球に感染し、かくして、ライフサイクルの赤血球段階が始まる。寄生生物は、感染した宿主肝細胞の細胞膜に、自身を包み込むことにより検出されることなく肝臓から逃げる。ヒトライフサイクルのほとんどで、肝臓および血球内に存在し、免疫監視に比較的探知されないため、寄生生物は、身体の免疫系による攻撃から比較的保護される。血液段階の発症を回避するために、マラリア寄生生物の肝臓特異的段階に特異的に対処する薬物（例えば、プリマキン、ジャイレースインヒビター、例えば、レボフロキサシン、ドキソルビシン）を開発することへの関心が高まっている。
【０００７】
別の例は、いくつかの種の扁形動物により引き起こされる寄生虫疾患である住血吸虫症またはビルハルツ住血吸虫症である。住血吸虫症は低い死亡率であるが、非常に衰弱性であり得る。住血吸虫症は、しばしば、寄生性の扁形動物（住血吸虫）での血液の感染に起因する慢性疾患である。住血吸虫症は、衰弱をもたらし、肝臓および腸損傷を引き起こす。住血吸虫症は、最も一般的には、アジア、アフリカおよび南アメリカ、とりわけ寄生生物を含む淡水貝で汚染されている水を用いる地域において見出される。
【０００８】
Ｂ型肝炎の原因となるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、哺乳動物および鳥類の小エンベロープＤＮＡウイルスのファミリーのプロトタイプである（１）。ＨＢＶエンベロープは、Ｌ−（大型）、Ｍ−（中型）およびＳ−（小型）と称される３つのタンパク質を取り囲んでいる（図１参照）。それらは、４つの膜貫通領域を有するＣ−末端Ｓ−ドメインを共有する。Ｍ−およびＬ−タンパク質は、５５個のさらなるＮ−末端伸長、および、遺伝子型依存の１０７または１１８個のａａ（ｐｒｅＳ２−およびｐｒｅＳｌ）を有する。ビリオンにおいて、Ｌ、ＭおよびＳの化学量論比は、約１：１：４であるが、より豊富に分泌される非感染性サブウイルス粒子（ＳＶＰ）は、ほぼ例外なくＳ−タンパク質を含み、ほんの微量のＬ−タンパク質しか含まない（２）。合成中、ＬのｐｒｅＳｌ−ドメインは、ミリストイル化し、ＨＢＶライフサイクルのいくつかの時点で、ＥＲ由来膜を介して位置を変える。該修飾は、感染性に必須である（３，４）。ＨＢＶの顕著な特徴は、その肝臓指向性であり、すなわち、肝臓は、ＨＢＶの増殖を特異的に支持する組織である。
【０００９】
理想的には、薬物標的化は、以下の基準：１）要求される作用部位への薬物の排他的送達；２）残りの組織に対する最小の効果；３）薬理学的に不活性なベクターの使用を満たすべきである。
【００１０】
特定の組織へ薬物、すなわち治療活性剤を送達するために、種々の戦略が追究されている。これらは、例えば薬理学的に活性な部分が組織特異的酵素により標的組織に放出されるプロドラッグの使用である。さらなる可能性は、有効な非組織特異的薬物を組織特異的であるが薬理学的に不活性な担体システム、例えば、受容体−アフィンペプチドまたはコロイド粒子に結合させることである。
【００１１】
種々の薬物担体が、薬物の肝臓標的化を増強するために使用されている。直接的なアプローチは、薬物、特に担体、例えば、リポソームおよびミクロスフェアを送達することによる肝臓における細網内皮系の活性な食作用に基づく。例えば、ｉ．ｖ．（静脈内）注射の後に、薬物が組み込まれた微粒子担体が主に肝臓における細網内皮系により捕捉され、肝臓の薬物標的化がもたらされることが示されている（５）。他方では、正に荷電した水溶性ポリマーでの薬物の肝臓標的化は、肝臓の血管系からのほとんどの水溶性物質の自由溢出ならびに肝臓細胞表面上の負電荷の基づく（６）。したがって、ポリマーは、肝臓のこのような解剖学的および生化学的特性に基づいて、薬物を肝臓に標的化させる担体として使用されている。肝臓のより特異的な薬物標的化は、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体を使用することにより試みられている。アシアロ糖タンパク質受容体（ガラクトース受容体）は、高密度で肝細胞上に存在する。加えて、リガンドがガラクトース受容体に結合すると、リガンド−受容体複合体は、内在化し、ガラクトシル化リガンドの細胞摂取を可能にする（７）。ナノ粒子を使用するさらなる送達アプローチは、例えば、両親媒性(amphilic)ポリマーおよびウイルスベクターにより実施されている（８）。また、薬物および遺伝物質の送達は、バイオナノカプセル（ＢＮＣ）の使用を介して実施されている。ＢＮＣは、「バイオテクノロジー技術により生産されたタンパク質からなるナノスケールのカプセル」として示され、臓器特異的薬物送達のための送達系として使用することができる（９）。
【００１２】
ＵＳ  ７，００１，７６０  Ｂ２は、遺伝子治療、例えば、肝細胞への治療遺伝子の送達および肝細胞における異種遺伝子の発現のために使用することができる、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の組換えベクターを記載している。
【００１３】
出典明示によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２００９／０９２６１２は、ＨＢＶの疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチド、および肝臓への化合物の特異的送達のためのビヒクルとしてのその使用を記載している。該文献において、ＨＢＶの疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチドは、好ましくは疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチドの「Ｃ−末端」である任意のアンカー基（Ａ）を介して診断または治療活性剤と結合され得る。
【００１４】
本発明は、Ｘにより示されるペプチドのＮ−末端アミノ酸配列と結合している１つ以上の化合物、好ましくは薬物に結合された疎水性修飾ペプチドを提供し、肝臓特異性を維持しているより短いペプチドを作製することを可能にする。驚くべきことに、肝臓指向性を排除することなく疎水性部分をペプチドへ結合させることができるようになった。Ｎ−末端部位への化合物、例えば、薬物の結合は、細胞膜を介して活性化合物のより良い送達を可能にし、また、細胞膜上で活性である薬物を、作用部位に直接的に指向することができる。さらに、ペプチドのＮ−末端領域への薬物の結合は、該活性物質の安定性に寄与する。図３において、肝細胞の表面への疎水性修飾ペプチドの結合の分子メカニズムが、概略的に説明されている。
【発明の概要】
【００１５】
発明の概要
本発明において、該目的は、疎水性修飾ペプチドを提供することにより解決される。図２において、本発明の疎水性修飾ペプチドの構築は、概略的に説明されている。該疎水性修飾ペプチドは、一般式：［Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｒｏ］Ａｐ、［式中、Ｐは、アミノ酸配列ＮＰＬＧＦＸａａＰ（１文字コード；ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはＦまたはＬ、さらに好ましくはＦである）を有する］ペプチドである。Ｘは、ｍ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列であり、ここで、Ｘの１つ以上のアミノ酸は、好ましくはカルボン酸、飽和および不飽和脂肪酸、Ｃ８からＣ２２脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸での、アシル化、および、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環芳香族性化合物から選択される疎水性部分の付加から選択される疎水性修飾のための１つ以上の基を有し、ｍは少なくとも４（ｍは４以上である）である。好ましい態様において、疎水性修飾は、好ましくはミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）から選択されるアシル部分でのアシル化、さらに好ましくはミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化またはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化により引き起こされる。Ｙは、ｎ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列である（ｎは０または少なくとも１である）。上記一般式において、ｍ＋ｎは少なくとも１１であり、すなわち、本発明の疎水性修飾ペプチドは、全体において少なくとも１８個のアミノ酸（ａａ）の長さを有する。Ｒは、好ましくはアミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然および合成ポリマー、例えば、ＰＥＧ、グリカンから選択される分解から保護する部分である、該疎水性修飾ペプチドのＣ−末端修飾である（ｏは０または少なくとも１である）。Ａは、アンカー基であり、好ましくはエステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択され、ｐは、０または少なくとも１である。好ましい態様において、ｍは４から１９であり、そして／または、ｎは０から７８である。１つ以上の化合物、好ましくは１つ以上の薬物は、Ｘの１つ以上のアミノ酸に結合されている。化合物は、１つの物質からなるか、または２つ以上の物質を含み得、これは、任意の種類の化学的または物理的結合、例えば、共有結合、イオン結合などにより互いに連結しているか、または複合体の形態である。
【００１６】
本発明の好ましい態様において、１つ以上の化合物は、リンカーまたはスペーサーを介して、該ペプチドに連結されており、リンカーまたはスペーサーは、好ましくは肝臓タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素により、疎水性修飾ペプチドとの結合から開裂され、該肝細胞タンパク質分解酵素は、シトクロム、例えば、シトクロムＰ４５０、エンドサイトーシス経路のプロテアーゼおよびリアーゼ（例えばエステラーゼ）、マトリックス−メタロ−プロテアーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２、好ましくはＭＭＰ７から選択され得る。この場合において、リンカーまたはスペーサーは、好ましくはペプチド配列ＧＣＨＡＫまたはＲＰＬＡＬＷＲＳを含む。
【００１７】
さらなる好ましい態様において、１つ以上の薬物は、好ましくはリジン、α−アミノグリシン、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸、さらに好ましくはリジンから選択される、側鎖においてアミノ基を有するＸの１つ以上のアミノ酸と結合している。側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸は、好ましくはＸのＮ−末端に位置しており、ここで、好ましくは１から１１個、さらに好ましくは１から３個の側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸は、ＸのＮ−末端に位置している。
【００１８】
本発明において、該目的は、本明細書に定義されている少なくとも１つの疎水性修飾ペプチド、および本明細書に定義されている肝臓、好ましくは肝細胞に特異的に送達されるべき少なくとも１つの化合物（例えば薬物）、および所望により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供することによりさらに解決される。好ましい態様において、疎水性修飾ペプチドおよび医薬組成物は、好ましくは肝臓疾患または障害の処置および予防における使用のための、肝臓への薬物の特異的送達において使用される。
【００１９】
好ましい態様において、化合物は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００２０】
好ましい態様において、２つ以上の異なる化合物の組合せは、１つの疎水性修飾ペプチドと結合している。さらに好ましくは、Ｘの１つ以上のアミノ酸に結合または連結されている１つ以上の化合物は、１つ以上の薬物または２つ以上の薬物の組合せである。
【００２１】
本発明において、目的は、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための医薬の製造のための、本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の使用を提供することによりさらに解決される。
【００２２】
本発明において、目的は、治療有効量の本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法を提供することによりさらに解決される。
【００２３】
本発明のさらなる好ましい態様は、従属する請求項に定義されている。
【００２４】
本発明の好ましい態様の記載
本発明を以下でより詳細に記載する前に、本発明は、様々であり得るため、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないと理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は、特定の態様を記載する目的のためだけであり、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないと理解すべきである。他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての専門および科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書に引用されている全ての文献を、その全体において出典明示により包含させる。
【００２５】
疎水性修飾ペプチド
上記で概説されるとおり、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｐｒｅＳドメイン（「ｐｒｅＳ−ペプチド」とも称される）に由来する疎水性修飾ペプチドを提供する。ＨＢＶのエンベロープは、Ｌ（大型）、Ｍ（中型）およびＳ（小型）と称される３つのタンパク質を取り囲んでいる（図１参照）。それらは、４つの膜貫通領域を有するＣ−末端Ｓ−ドメインを共有する。Ｍ−およびＬ−タンパク質は、５５個のさらなるＮ−末端伸長、および、遺伝子型依存の１０７または１１８個のアミノ酸（ｐｒｅＳ２−およびｐｒｅＳｌ）を有する。
【００２６】
したがって、本発明のペプチドは、好ましくは遺伝子型ＡからＨならびにウーリーモンキー（ＷＭＨＢＶ）、オランウータン、チンパンジーおよびゴリラＢ型肝炎ウイルスの、ＨＢＶのＬ−タンパク質、ｐｒｅＳｌのＮ−末端伸長に対応するか、またはそれらに基づくアミノ酸配列を有するペプチドを示すが、それらの変異体、好ましくはＣ−末端切断変異体、アミノ酸置換変異体も示す。必須の配列として、配列番号：１（ＮＰＬＧＦＸＰ）において示される、ＨＢＶの疎水性修飾ｐｒｅＳ由来ペプチドの肝臓指向性のために重要であるアミノ酸残基が、本発明の疎水性修飾ペプチドのアミノ酸配列に存在する。特に、本発明の疎水性修飾ペプチドは、以下の配列（１文字コードにおけるアミノ酸；必須のドメインは下線が引かれている）に基づく。
【００２７】
疎水性修飾ペプチドの必須のドメイン（配列番号：１）：
ＮＰＬＧＦＸＰ（Ｘは任意のアミノ酸、好ましくはＦまたはＬ、さらに好ましくはＦである）
【００２８】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ａ（ＩＤ：Ｍ５７６６３；配列番号：２）：
【表１】
2014506574.tif 000002
【００２９】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｂ（ＩＤ：Ｄ００３２９、配列番号：３）
【表２】
2014506574.tif 000003
【００３０】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｃ（ＩＤ：ＡＢ０４８７０４、配列番号：４）
【表３】
2014506574.tif 000004
【００３１】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−チンパンジー（ＩＤ：ＡＢ０３２４３２、配列番号：５）
【表４】
2014506574.tif 000005
【００３２】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｄ（ＩＤ：ＡＢ０４８７０２、配列番号：６）
【表５】
2014506574.tif 000006
【００３３】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｅ（ＩＤ：Ｘ６５６５７、配列番号：７）
【表６】
2014506574.tif 000007
【００３４】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｆ（ＩＤ：Ｘ６９７９８＠８、配列番号：８）
【表７】
2014506574.tif 000008
【００３５】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｇ（ＩＤ：ＡＦ１６０５０１、配列番号：９）
【表８】
2014506574.tif 000009
【００３６】
ＨＢＶ  Ｇｉｂｂｏｎ（ＩＤ：ＡＪ１３１５７２、配列番号：１０）
【表９】
2014506574.tif 000010
【００３７】
ＨＢＶ−Ｈ（ＩＤ：Ｑ８ＪＭＹ６、配列番号：１１）
【表１０】
2014506574.tif 000011
【００３８】
ＨＢＶオランウータン（ＩＤ：ＡＦ１９３８６４、配列番号：１２）
【表１１】
2014506574.tif 000012
【００３９】
ＨＢＶウーリーモンキー（ＩＤ：ＮＣ＿００１８９６、配列番号：１３）
【表１２】
2014506574.tif 000013
【００４０】
「変異体」は、好ましくは、疎水性修飾を有する配列番号：２−１３の配列のＮ−末端および／またはＣ−末端切断変異体、アミノ酸置換または欠失変異体、または伸長変異体であり、ここに、１つ以上の薬物が該疎水性修飾ペプチドの必須のドメインのＮ−末端で１つ以上のアミノ酸に結合している。変異体はさらに、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模擬物またはペプチド骨格／構造を模倣することができるさらなる化合物を含むアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体は、配列番号２から１３のＣ−末端切断変異体；アミノ酸置換または欠失変異体；修飾アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模擬物またはペプチド骨格／構造を模倣することができるさらなる化合物を含む変異体から選択される。
【００４１】
本発明において、疎水性修飾ペプチドの変異体は、配列番号：１の配列を有するアミノ酸を少なくとも含み、上記配列番号：２から１３の１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９個のアミノ酸、またはそれらの変異体からなり得る。
【００４２】
Ｎ−末端および／またはＣ−末端切断変異体は、好ましくは、配列番号２から１３の少なくとも１８個の連続アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１９個の連続アミノ酸、よりさらに好ましくは少なくとも２０個、よりさらに好ましくは少なくとも２１個の連続アミノ酸、またはそれらの変異体を含む。
【００４３】
ｍ個のアミノ酸の長さを有する疎水性修飾ペプチドのＮ−末端配列（Ｘ）は、少なくとも４つのアミノ酸（すなわちｍ＝４）を含む。好ましくは、疎水性修飾ペプチドのＮ−末端配列（Ｘ）は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のアミノ酸からなり得る。すなわち、ｍは４から１９であり得る。
【００４４】
好ましい態様において、Ｘの１つ以上のアミノ酸は、好ましくはリジン、α−アミノグリシン、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸から選択され、さらに好ましくはリジンである側鎖においてアミノ基を有する。側鎖においてアミノ基を有するＸのアミノ酸は、好ましくは、ＸのＮ−末端に位置し、側鎖においてアミノ基を有する１から１１（１−１１）、好ましくは１から３（１−３）個のアミノ酸が、ＸのＮ−末端に位置する。
【００４５】
好ましい態様において、疎水性修飾ペプチドのＮ−末端配列（Ｘ）は、好ましくは配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３（配列番号：１６）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、配列番号：１６のＸ１はＬ、ＩまたはＱ、さらに好ましくはＬである。好ましくは、配列番号：１６のＸ２はＴ、Ｖ、Ａであるか、または存在せず、好ましくはＴまたはＶ、さらに好ましくはＴである。好ましくは、配列番号：１６のＸ３はＰ、Ｓ、ＴまたはＦ、さらに好ましくはＰまたはＳ、よりさらに好ましくはＳである。好ましくは、配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３（配列番号：１６）は、ペプチドＰ（配列番号：１；ＮＰＬＧＦＸａａＰ）のＮ−末端に直接結合し、配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３ＮＰＬＧＦＸａａＰを含むペプチドとなり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸａａは上記で定義のとおりである。
【００４６】
ｎ個のアミノ酸の長さを有する疎水性修飾ペプチドのＣ−末端配列（Ｙ）は、０または少なくとも１つのアミノ酸（すなわちｎ≧０）を含む。好ましくは、疎水性修飾ペプチドのＣ−末端配列（Ｙ）は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２または９３個のアミノ酸からなり得る。すなわち、ｎは０から９３であり得る。
【００４７】
好ましい態様において、疎水性修飾ペプチドのＣ−末端配列（Ｙ）は、少なくとも４つのアミノ酸（ｎ＝４）からなり、好ましくは配列Ｘ４ＨＱＬＤＰ（配列番号：１７）を有し、ここで、Ｘ４は任意のアミノ酸である。好ましくは、配列番号：１７のＸ４は、Ｄ、ＥまたはＳ、さらに好ましくはＤまたはＥ、よりさらに好ましくはＤである。好ましくは、配列Ｘ４ＨＱＬＤＰ（配列番号：１７）は、ペプチドＰ（配列番号：１；ＮＰＬＧＦＸａａＰ）のＮ−末端に直接結合し、配列ＮＰＬＧＦＸａａＰＸ４ＨＱＬＤＰを含むペプチドとなり、ここで、Ｘ４およびＸａａは上記で定義のとおりである。
【００４８】
好ましい態様において、本発明の疎水性修飾ペプチドは、アミノ酸配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３ＮＰＬＧＦＸａａＰＸ４ＨＱＬＤＰ（配列番号：１８）によってコードされるペプチドを含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸａａは上記で定義のとおりである。
【００４９】
「変異体」なる用語はまた、肝炎ウイルス属、例えば、ＨＢＶ株アルファ、ＨＢＶ株ＬＳＨ（チンパンジー単離）、ウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の種々のウイルス種、株またはサブタイプ、またはＨＢＶ遺伝子型ＡからＨ（配列番号：２−１３参照）からなる群から選択される株において見られる同種配列を示す。
【００５０】
「変異体」なる用語はまた、不変異体ＮＰＬＧＦＸａａＰ−ドメイン、および配列番号２−１３の隣接配列または本明細書に記載されている任意の他のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも５０％配列同一性、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、よりさらに好ましくは９０％または９５％配列同一性を示す同種配列を示す。
【００５１】
したがって、本発明の好ましい疎水性修飾ペプチドは、好ましくはＨＢＶまたはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の遺伝子型の、種々のウイルス種、株またはサブタイプ、またはそれらの変異体のアミノ酸配列を有する配列番号２から１３の変異体を含む。
【００５２】
配列番号２から１３の「変異体」はまた、配列が肝臓指向性を示す、好ましくは注射された用量の１０％以上が静脈内注射１時間後に肝臓組織に蓄積する限り、アミノ酸欠失、アミノ酸置換、例えば、他のアミノ酸または均等物（タンパク質アミノ酸と密接に構造的および空間的類似性を有する修飾アミノ酸）による保存的または非保存的置換、アミノ酸付加または均等物付加を含む変異体または「類似体」を含む。疎水性修飾ペプチドまたはその「変異体」の肝臓指向性は、好ましくは１時間後に注射された用量の１０％以上、さらに好ましくは１時間後に注射された用量の２５％以上、より好ましくは１時間後に注射された用量の５０％以上である。
【００５３】
保存的アミノ酸置換は、一般的に、同じくクラスのアミノ酸中の置換に関する。これらのクラスは、例えば、
−非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシン；
−塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン；
−酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸；および、
−非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステイン
を含む。
【００５４】
「Ｎ−末端」は、ＸのＮ−末端、すなわちそれぞれの第１のアミノ酸残基を示すが、Ｎ−末端に極めて接近、例えば、それぞれのアミノ酸残基（−４）、（−３）、（−２）、（−１）、１、２または３または４での疎水性修飾も含む。したがって、化合物（例えば薬物）および疎水性修飾の結合は、さらに、ＸのＮ−末端に近い部位で薬物および疎水性部分の結合により得ることができる。
【００５５】
本発明の該疎水性修飾ペプチドの疎水性修飾は、ペプチドへ疎水性部分を付加する。
【００５６】
Ｘは、少なくとも１つの疎水性部分または基で修飾される。本発明の好ましい態様において、Ｘは、１、２、３、４またはそれ以上の疎水性部分または基で修飾される。すなわち、Ｘは、２つ以上、例えば２つの疎水性部分または基で修飾することができる。疎水性部分または基は、互いに同じか、または異なっていてもよい。本発明の該ペプチドの疎水性修飾は：
−アシル化；
−疎水性部分の付加
から選択される。
【００５７】
アシル化は、好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸でのアシル化から選択される。好ましい脂肪酸は、好ましくは８から２２個の炭素原子（Ｃ８からＣ２２）を有する飽和または不飽和脂肪酸、分岐または非分岐脂肪酸である。さらに好ましくは、アシル化による疎水性修飾は、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択される。ミリストイル化による修飾は、より安全性が高い、例えばステアロイル基の副作用（先天性免疫応答など）を示さないため、インビボおよび医薬用途に好ましい。疎水性部分の付加は、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環芳香族性化合物の付加から選択されるのが好ましい。疎水性部分の結合は共有結合によるのが好ましく、この結合は、カルバメート、アミド、エーテル、ジスルフィド、当業者の技術内である任意の他の結合を介してなし遂げることができる。したがって、本発明の疎水性修飾された、好ましくはアシル化ペプチドは、Ｎ−末端において親油性または疎水性基／部分があるためリポペプチドであるのが好ましい。
【００５８】
ＹのＣ−末端修飾（Ｒ）は、好ましくは、分解、例えば、インビボ分解から保護する部分での修飾である。
【００５９】
「Ｃ−末端」は、Ｃ−末端、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基での修飾を示すが、Ｃ−末端に極めて近くの、例えば、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目のアミノ酸残基または最後から３番目以上のアミノ酸残基での修飾（例えば、例えばカルボキシペプチダーゼの作用による、酵素分解から担体を保護する１つのＤ−アミノ酸の導入）も含む。当業者は、それぞれの用途に依存して、それぞれの適当な部分を選択することができる。分解から保護する好ましい部分は、アミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然および合成ポリマー、例えば、ＰＥＧ、グリカンから選択される。さらに、ｏは０または少なくとも１であり、すなわちＣ−末端修飾（Ｒ）は任意である。好ましくは、ｏは１である。本発明のさらなる態様において、ｏは１、２、３、４またはそれ以上である。すなわち、疎水性修飾ペプチドのＣ−末端またはその近くは、２つ以上の部分または基、例えば２つで修飾することができる。部分または基は、互いに同じか、または異なっていてもよい。
【００６０】
本発明の態様において、疎水性修飾および／またはＲは、リンカーまたはスペーサーを介してペプチドに連結される。リンカーまたはスペーサー、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、（ＣＨａ）ｎ基は、当業者に知られている。したがって、当業者は、それぞれの適用に依存して、それぞれの適当なリンカーまたはスペーサーを選択することができる。
【００６１】
任意のアンカー基（Ａ）は、化合物、タグ、標識に対する結合点として働き、Ｙのアミノ酸に位置する。すなわち、少なくとも１つのアンカー基（Ａ）が存在（すなわちｐ≧１）する場合、Ｙも、少なくとも１つ（すなわちｎ≧１）のアミノ酸を含む。好ましい態様において、アンカー基は、Ｙの「Ｃ−末端」であり、「Ｃ−末端」は、Ｃ−末端、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基での修飾を示すが、Ｃ−末端の極めて近く、例えば、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目のアミノ酸残基または最後から３番目以上のアミノ酸残基も含む。この場合、ｏは０であり得、したがって他のＣ−末端修飾Ｒが存在しないこともある。アンカー基Ａは、Ｙのアミノ酸側鎖にあるか、またはＹのアミノ酸側鎖自体であってよく、すなわちＡは、側鎖自体または修飾側鎖であり得る。アンカー基はまた、アンカー基として働くようにＹのアミノ酸配列に導入された修飾アミノ酸残基であり得る。本発明の他の態様において、アンカー基Ａは、Ｘの疎水性修飾および／またはＣ−末端修飾Ｒに結合される。好ましいアンカー基は、エステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択される。当業者は、結合されるそれぞれの化合物、タグ、標識などに依存して、それぞれの適当なアンカー基を選択することができる。アンカー基はさらに、例えば、ビオチン／アビジン、ポリアルギニン／オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）複合体の、複合体形成成分に結合させるために適当であり得る。さらに、ｏは０または少なくとも１であり、すなわちアンカー基（Ａ）は任意である。好ましくは、ｏは１である。本発明のさらなる態様において、ｏは１、２、３、４またはそれ以上である。すなわち、２つ以上のアンカー基、例えば、２つが存在する。アンカー基は、互いに同じか、または異なっていてもよく、いくつかの化合物、例えば、薬物および標識または異なる薬物の結合を可能にする。
【００６２】
疎水性修飾ペプチドの合成
本発明のペプチドは、当業者に容易に知られている種々の処理、一般的に合成化学処理および／または遺伝子操作処理により、調製することができる。合成化学処理はさらに特に、固相逐次およびブロック(block)合成（Erickson and Merrifield, 1976）を含む。より詳細は、ＷＯ２００９／０９２６１２から得ることができる。
【００６３】
固相逐次処理は、例えば、自動ペプチドシンセサイザーの使用により、確立された自動方法を使用して行うことができる。この処理において、［アルファ］−アミノ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合させる。使用される樹脂支持体は、（ポリ）ペプチドの固相調製のための当分野で慣用に使用される任意の適当な樹脂、好ましくはポリオキシエチレンでコポリマー化され、最初に導入されるｏ−アミノ保護アミノ酸でのエステル形成のための部位を提供するポリスチレンであり得る。本発明者らにより適用されたこの最適な方法は、明白に記載されている（例えば１２参照）。アミノ酸を一つずつ（段階的に）導入する。１つのアミノ酸の導入に対応するそれぞれの合成サイクルは、脱保護工程、連続洗浄工程、アミノ酸の活性化でのカップリング工程、および後の洗浄工程を含む。これらの工程のそれぞれに続いて濾過を行う。カップリングのための反応剤は、（ポリ）ペプチド合成のための従来反応剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアジル−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、およびジフェニルホスホリルアジドである。樹脂上でのポリペプチドの合成後、ポリペプチドは、アニソール、エタンジチオールまたは２−メチルインドールの存在下で、強酸、例えば、トリフルオロ酢酸での処理により樹脂から分離される。次に、化合物を、精製の従来技術、特にＨＰＬＣの手段により精製する。
【００６４】
本発明のペプチドはまた、選択的に保護される（ポリ）ペプチドフラグメントをカップリングすることにより得ることができ、このカップリングは例えば溶液中で行われる。ペプチドはさらに、当業者に知られている遺伝子操作技術により生産することができる。真核発現系、例えば、バキュロウイルス系が、特に適当である。この処理によって、タンパク質は、異種タンパク質をコードする核酸配列および調節核酸配列、例えば、プロモーターを含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞において発現させる。いくつかの細胞株、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＲＬ  １７１１）から利用できる細胞系Ｓｆ−９を、組換えバキュロウイルスでの感染のために利用できる。原核生物発現系、例えば、大腸菌における発現もまた、特に適当である。
【００６５】
ペプチドへの疎水性部分の導入は、当業者に容易に知られている種々の処理、例えば、合成および遺伝子操作処理により成し遂げることができる。
【００６６】
あるいは、ペプチドおよび／または融合ペプチド（すなわち、疎水性修飾ペプチド）は、安定にトランスフェクトされた真核細胞系、例えば、ＣＨＯおよび当分野で知られており、ワクチンを作製するために通常使用される他の細胞系などにより生産することができる。Ｎ−末端の４７−ｐｒｅＳｌアミノ酸がミリストイル化タンパク質／ペプチドの分泌を促進する内因性特性のために、生物学的に活性な疎水性修飾ペプチドは、細胞培養上清から抽出することができる。
【００６７】
肝臓標的化のためのベクターおよびシャトル
上記で概説されているとおり、本発明は、本明細書に記載されている疎水性修飾ペプチドと結合されている化合物（例えば薬物）の肝臓への特異的送達のためのビヒクルまたはシャトルとしての疎水性修飾ペプチドの使用を提供する。
【００６８】
本発明による肝臓への化合物の特異的送達のための「ビヒクル」または「シャトル」は、本発明者らにより見出され、本明細書に記載されている疎水性修飾ペプチドの肝臓指向性または肝指向性、すなわち肝臓に選択的に蓄積する、好ましくは肝細胞の細胞膜に選択的に蓄積する、ならびに肝細胞に選択的に入る能力を示す。本発明は、本発明者らによる、高度に特異的な肝臓蓄積の発見およびＨＢＶのｐｒｅＳ  １配列におけるＨＢＶの肝臓指向性の決定因子の同定に基づく。したがって、本発明は、特異的な肝臓標的化または送達それぞれのための普遍的なビヒクルまたはシャトルの設計のために、肝臓指向性の決定因子についての知識を使用する。本発明の疎水性修飾ペプチドは、肝臓に化合物を特異的に送達させるための汎用ビヒクルまたはシャトルである。
【００６９】
好ましくは、肝臓への化合物の特異的送達は、肝細胞への化合物の特異的送達である。さらに、化合物は、インビトロならびにインビボで肝細胞に特異的に送達することができる。好ましくは化合物は、動物、好ましくは哺乳動物またはヒト、または鳥類の肝臓に特異的に送達される。
【００７０】
送達される化合物
本発明による肝臓に特異的に送達される化合物（例えば薬物）は、好ましくは治療目的のために適当である、任意の種の化合物であり得る。薬物は、プロドラッグまたはプレプロドラッグの形態であり得る。化合物はまた、表面に標的配列を暴露するように化学的または遺伝的に修飾されており、それにより肝細胞に感染するように再指向されているウイルスまたはその誘導体、例えば、複製欠損または複製コンピテント組換えウイルス（例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）であり得る。これらのウイルスは、肝細胞特異的遺伝子送達に適用可能である。
【００７１】
薬物（治療剤）
本発明の好ましい態様において、肝細胞に特異的に送達される化合物は、薬物（またはプロドラッグの形態における薬物）である。該薬物／プロドラッグは、好ましくは、治療活性化合物、薬物、薬剤、さらに好ましくは以下のクラスの物質から選択される：
放射性分子またはアイソトープ（例えば、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン）、抗代謝産物（例えば、アザチオプリン）、抗腫瘍剤（例えば、ブレオマイシン、アクチノマイシン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン）、抗葉酸剤（例えば、メトトレキサート）、抗ウイルス剤（例えば、リバビリン(ribovarin)、テノホビル）、細胞骨格破壊剤（例えば、ビンブラスチン、タキソール）、サイトカイン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ１、ＣＸＣ１）、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＣＡＬＡＡ−０１、ＳＩＲＮＡ−０３４）、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２６ａ）、核受容体アゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ミフェプリストン）、オリゴヌクレオチドおよび核酸（例えば、プラスミド、短鎖ｄｓＤＮＡ、短鎖ｓｓＤＮＡ）、エポチロン（例えば、パツピロン(patupilone)、イクサベピロン）、ホルモン（例えば、プロゲスチン(progestrines)、フルオキシメステロン）、ホルモンアンタゴニスト（例えば、トレミフェン、フルベストラント）、免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡ）、免疫調節剤（例えば、レナリドミド）、免疫刺激剤（例えば、ＳＤＣ１０１、ＩＴＭＮ−１９１）、免疫刺激配列、例えば、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ、イマチニブ、エルロチニブ）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ボセプレビル、テラプレビル）、ポリメラーゼ阻害剤（例えば、ＭＫ−０６０８、Ｒ７１２８）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン）、ヌクレオシド類似体（例えば、テルビブジン、エンテカビル）、前駆体類似体（例えば、フルオロウラシル）、ペプチドおよびペプチド抗生物質（例えば、デフェンシン１）、抗生物質（例えば、アジスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピシン）、フルオロキノロンクラスのジャイレース阻害剤（例えば、レボフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン、プルリフロキサシン、ガレノキサシン、デラフロキサシン(delafloxacin)）、白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン）、レチノイド（例えば、タザロテン、ベキサロテン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンポセチン、ビノレルビン）およびそれらの誘導体、細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤、例えば、リボソーム不活性化タンパク質（例えば、ａ−サルシン、レストリクトシン(restrictotin)）、ビタミン（例えば、ビタミンＢ６）、α−鎖毒素（例えば、ジフテリア毒素）、ヘビの毒素およびそれらの成分（例えば、コブラトキシン）、真菌由来剤（例えば、アスペルギリン）、細菌エクソトキシン（例えば、緑膿菌外毒素）、細菌エンテロトキシン（例えば、コレラ毒素）および細菌エンドトキシン（例えば、リポ多糖類）およびそれらの類似体、抗体（例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ）およびＣＡＤ（陽イオン性両親媒性(amphilic)薬物）、例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、トリフルオロフェナジン。
【００７２】
本発明の好ましい態様は、上記クラスの物質の１つ以上のメンバー、特に、ダプソーン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シクロスポリンＡ、テノホビル、ラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、リバビリン、テラプレビル、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ドキシフルリジン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、エストラムスチン、ブスルファン、クロルメチン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ストレプトゾシン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロマイド、チオテパ、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シトシン−アラビノシド、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、ヒドロキシカルバミド、ミトタン、アザシチジン、シタラビン、ゲムシタビン、ネララビン、ボルテゾミブ、アナグレリド、好ましくはイマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブまたはニロチニブ、ＭＫ  ８８６、ピゾチフェン、トレミフェン、ＳＤＣ−１０１、ＩＴＭＮ−１９１、ＲＧ７２２７、ニタゾキサニド、ＶＸ−９５０、ＶＸ−２２２、ＢＭＳ−７９００５２、ＢＭＳ−６５００３２、ＧＳ  ９１９０、ＧＳ  ９２５６、ＢＩ  ２０１３３５、ＢＩ  ２０７１２７、ＩＤＸ１８４、Ｒ７１２８、ボセプレビル、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ｒ７１２８、ＲＧ７３４７、ＲＧ７３４８、ＴＭＣ４３５、ＰＦ−８６８５５４、ＰＦ−４８７８６９１、ＴＴ０３３、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ  ２０７１２７、ＢＭＳ−７９００５２、ＢＭＳ−７９１３２５、ＢＭＳ−６５００３２、ＢＭＳ−８２４３９３、ＡＮＡ５９８、ＶＣＨ−７５９、Ｇｌ  ５０００５、ＩＴＸ５０６１、ＩＴＸ４５２０、ＩＤＸ１８４、ＩＤＸ３２０、ＩＤＸ３７５、Ａ−８３７０９３、ＧＳ  ９１９０、ＧＳ  ９２５６、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−１６２５、ＰＰＩ−４６１、ＰＰＩ１３０１、ＴＧ４０４０、ＡＺＤ７２９５、クレミゾール(chemizole)、ＳＰＣ３６４９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤ−１２、ＧＳＫ６２５４３３、ＡＢＴ−４５０、ＡＢＴ−０７２、ＡＢＴ−３３３、ＰＳＯ−７９７７、ＩＮＸ０９１８９、ＰＳＩ−９３８、ＥＤＰ−２３９、ＳＤＣ−１０１、ＳＰ−３０、ＡＶＬ−１８１、ＶＸ−５００およびそれらの組合せを含み得る。
【００７３】
好ましい態様において、薬物は、プリマキン、ドキソルビシンおよびジャイレース阻害剤、好ましくはレボフロキサシンからなる群から選択される。
【００７４】
ドキソルビシンは、原発性ＨＣＣの処置のための第一選択薬物として使用され、抗マラリア薬物として作用することが見出されている（Friedman R, (2009); 38; Gamo FJら (2010); 39）。しかしながら、ドキソルビシンは、重度の心臓毒性および腎臓毒性を示す。本発明の疎水性修飾ペプチドへのドキソルビシンのカップリングは、該薬物の標的毒性を除去する。
【００７５】
レボフロキサシンのようなフルオロキノロンクラスのジャイレース阻害剤は、肝臓期マラリアを阻害することが知られている（Friesenら Scie. Transl. Med., 2010; 40）。抗マラリア剤として有効であるために、毎日の長期使用が必要である。さらに、高用量の長期使用を必要とするとき、ジャイレース阻害剤は、不耐用性を発生することが知られている。レボフロキサシンのようなジャイレース阻害剤のカップリングは、高用量の使用を減少させ、皮下注射を使用するデポー誘導を可能にし得る。
【００７６】
上記特定の薬物は、単独で、または互いに任意の適当な組合せにおいて使用され得る。切除不能な肝細胞癌腫の処置のための好ましい組合せは、ボルテゾミブおよびドキソルビシン；ソラフェニブおよびドキソルビシン；ボルテゾミブおよびソラフェニブ；エルロチニブおよびフルオロウラシル；エルロチニブ、フルオロウラシルおよびインターフェロン−α；シスプラチンおよびドキソルビシン；ならびにシスプラチン、ドキソルビシンおよびエルロチニブの組合せである。
【００７７】
転移結腸直腸癌の処置のための好ましい組合せは、イリノテカンおよびフルオロウラシル、イリノテカンおよびエルロチニブ、オキサリプラチンおよびフルオロウラシル、ＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン、フルオロウラシル、ロイコボリン(lencovorin)）、シスプラチンおよびドキシサイクリン(Doxocyclin)である。
【００７８】
肝臓期マラリアの処置のための好ましい組合せは、プリマキンおよびクリンダマイシン、プリマキンおよびアジスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリンおよびアトバコン、プリマキン、シプロフロキサシンおよびリファンピシン、プリマキン、リファンピシンおよびダプソーンである。
【００７９】
慢性Ｃ型肝炎の処置のための好ましい組合せは、インターフェロン−αおよびリバビリン、テラプレビルおよびリバビリン、テラプレビル、リバビリンおよびインターフェロン−α、ボセプレビルおよびリバビリン、ボセプレビル、リバビリンおよびインターフェロン−ａ、シクロスポリンＡおよびインターフェロン−αである。
【００８０】
Ｂ型肝炎の処置のための好ましい組合せは、テノホビルおよびエンテカビル、テノホビルおよびインターフェロン−α、エンテカビルおよびインターフェロン−α、テノホビル、エンテカビルおよびインターフェロン−αである。
【００８１】
肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための薬物についてのさらなる情報、薬物の作用および適当な組合せは、Chen, K. F., H. C. Yuら (2010); Czauderna, P., G. Mackinlayら (2002); Javle, M. and C. T. Hsueh (2009); Lee, J., J. O. Parkら (2004); Mendelsohn, J. and J. Baselga (2000); Patt, Y. Z., M. M. Hassanら (2003); Richly, H., B. Schultheisら (2009). Falcone; A., S. Ricciら (2007); Javle, M. and C. T. Hsueh (2009); Sagar, J., K. Salesら (2010); Seymour, M. T., T. S. Maughanら (2007); Tournigand, C., T. Andreら (2004); Kappe, S. H., A. M. Vaughanら (2010); Goodman, C. D., V. Suら (2007); Zeuzem, S. (2004). McHutchison, J. G., G. T. Eversonら (2009); Nelson, DR, Ghalib, RH, Sulkowski, Mら (2009). “EASL Clinical Practice Guidelines: management of chronic hepatitis B.” J Hepatol 50(2): 227-242; Liaw, Y. F., N. Leungら (2005); Lok, A. S. and B. J. McMahon (2009) Kornhuber, J., P. Tripalら (2008); Gastaminza, P., C. Whitten-Bauerら (2010)から得ることができる。
【００８２】
細胞透過性ペプチド
プロドラッグおよび細胞内活性剤を肝細胞に効率的に送達するために、１つ以上の細胞透過性ペプチド（ＣＣＰ）は、本発明の疎水性修飾ペプチドと結合させることができる。好ましくは、ＣＣＰは、他の化合物／薬物と組み合わせて使用される。好ましい態様は、マラリアの処置のためのＮ−末端に結合されたＣＰＰおよびプリマキンおよび／または抗生物質、ＨＢＶおよびＨＣＶの処置のためのＮ−末端に結合されたＣＰＰおよびヌクレオシド類似体、ＨＣＶの処置のためのＮ−末端に結合されたＣＰＰおよびプロテアーゼ阻害剤ならびにそれらの組合せである。好ましい態様において、ＣＰＰは、ポリアルギニン、ペネトラチン、ＨＢＶｐｒｅＳ２−ＴＬＭ、アンテナペディアから選択される。
【００８３】
Ｎ−末端に結合されたＣＰＰは、オリゴヌクレオチド−ペプチド抱合体およびペプチド核酸抱合体の肝細胞への送達ために使用することができる。１つの好ましい態様は、Ｎ−末端に結合されたＨＩＶ−ＴＡＴペプチドを使用する、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニルブチレート）結合抗−ＨＣＶ  ｓｉＲＮＡの肝細胞への送達である。ＣＣＰに関するさらなる詳細は、Meng, S., B. Weiら (2009); de Koning, M. C., G. A. van der Marelら (2003)およびZatsepin, T. S., J. J. Turnerら (2005) から得ることができる。
【００８４】
標識との組合せ
さらなる好ましい態様において、薬物は標識と結合させる、すなわち１つ以上の標識が１つ以上の薬物が結合している本発明の疎水性修飾ペプチドと結合されている。該組合せによって、肝臓への薬物の送達は、標識を検出することによりモニタリングすることができる。標識は、診断目的のために適当であるあらゆる種の化合物であり得、本明細書に記載されている方法により本発明の疎水性修飾ペプチドと結合させることができる。好ましくは、標識は、蛍光色素、放射性同位体または造影剤から選択される。本発明にしたがって、造影剤は、体内の異常地域を示す手助けをする色素または他の物質である。好ましい放射性同位体／蛍光放出アイソトープは、アルファ放射線放出アイソトープ、ガンマ放射線放出アイソトープ、オージェ電子放出アイソトープ、Ｘ−線放出アイソトープ、蛍光放出アイソトープ、例えば、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ，８８Ｙ、９０Ｙ、１４９Ｐｍ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄ、２１２Ｂｉ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９７Ｒｕ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０１ｍ１５Ｒｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、１６９Ｅｕ、２０３Ｐｂ、２１２Ｐｂ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１９８Ａｕおよび１９９Ａｇからなる群から選択される。好ましい蛍光色素は、以下の種類の色素：キサンテン(Xanthens)（例えば、フルオレセイン）、アクリジン（例えば、アクリジンイエロー）、オキサジン（例えば、オキサジン１）、シアニン（例えば、Ｃｙ７／Ｃｙ３）、スチリル色素（例えば、Ｄｙｅ−２８）、クマリン（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０）、ポルフィン（例えば、クロロフィルＢ）、金属−リガンド−複合体（例えば、ＰｔＯＥＰＫ）、蛍光タンパク質（例えば、ＡＰＣ、Ｒ−フィコエリトリン）、ナノ結晶（例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ  ７０５）、ペリレン（例えば、Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｒｅｄ  Ｆ３００）およびフタロシアニン（例えば、ＩＲＤＹＥＴＭ７００ＤＸ）ならびにこれらの種類の色素の抱合体および組合せから選択される。好ましい造影剤は、好ましくはキレート化剤と複合体化されている、常磁性剤、例えば、Ｇｄ、Ｅｕ、ＷおよびＭｎから選択される。さらなる選択肢は、超磁性鉄（Ｆｅ）錯体および粒子、コンピュータートモグラフィー（ＣＴ）のための高い原子番号の原子、すなわちヨウ素を含む化合物、これらの造影剤を含むマイクロバブルおよび担体、例えば、リポソームである。
【００８５】
キレート化剤
肝細胞に特異的に送達される化合物は、それぞれの化合物との複合体を形成することができるキレート化剤との複合体の形成において疎水性修飾ペプチドに結合され得る。本発明の好ましい態様において、キレート化剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）および６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）からなる群から選択されるが、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）が特に好ましい。
【００８６】
疎水性修飾ペプチドへの化合物のカップリング
Ｘのそれぞれのアミノ酸への化合物のカップリングは、当業者に知られている任意の適当な方法により行われ得る。
【００８７】
本発明の好ましい態様において、化合物は、活性化エステルを使用することによりＸのそれぞれのアミノ酸と結合される。特に、側鎖においてアミノ基を有するＸのアミノ酸へ化合物をカップリングする場合、この方法を使用することができる。あるいは、非常に要約されている以下のカップリング方法を、Ｘのそれぞれのアミノ酸へ１つ以上の化合物をカップリングするために使用することができる。リンカー有または無での、アミノ酸への化合物のカップリングを達成するための特定の反応条件は、化学者により容易に決定することができる。
【００８８】
−アミンおよび活性化カルボン酸、好ましくはＮＨＳ−エステルまたはカルボジイミドの反応によるアミドの形成；カルボジイミドは、第一級アミンへのカルボキシルの直接結合を促進する完全架橋剤である。ＮＨＳエステルは、カルボキシレート基を含む分子のカルボジイミド活性化により形成される反応基である。
【００８９】
−ピリジルジスルフィドと特異的に反応する２つのチオールまたは１つのチオールを使用するジスルフィド結合；ピリジルジスルフィドは、広範なｐＨ範囲にわたって（最適はｐＨ４−５である）スルフヒドリル基と反応し、ジスルフィド結合を形成する。該反応中、ジスルフィド結合が、分子のＳＨ基および２−ピリジルジチオール基間で起こる。結果として、ピリジン−２−チオンが放出される。
【００９０】
−マレイミドまたはハロアセチルおよびチオール成分を使用するチオエーテル形成；ハロアセチルは、生理学的ｐＨでスルフヒドリル基と反応する。ヨードアセチル基の反応は、スルフヒドリル基由来の硫黄原子でのヨウ素の求核置換により進行し、安定なチオエーテル結合をもたらす。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５から７．５であるとき、スルフヒドリル基と特異的に反応し、可逆性ではない安定なチオエーテル結合を形成する。
【００９１】
−イミドエステルおよびアミンを使用するアミジン形成；イミドエステル架橋剤は、アルカリ性ｐＨでアミンと迅速に反応するが、短い半減期を有する。ｐＨがさらにアルカリ性になるとき、半減期およびアミンとの反応性は増加される；したがって、架橋は、ｐＨ１０で行われるとき、ｐＨ８よりもさらに効率的である。ｐＨ１０未満の反応条件は、副反応をもたらし得、アミジン形成はｐＨ８−１０が好ましい。
【００９２】
−カルボニル（例えば、アルデヒド）およびヒドラジドを使用するヒドラジド結合；カルボニル（アルデヒドおよびケトン）は、ｐＨ５−７でヒドラジドおよびアミンと反応する。カルボニルは、タンパク質中に容易に存在しない；しかしながら、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを使用する糖グリコールの穏やかな酸化は、隣接ヒドロキシルをアルデヒドまたはケトンへ変換する。ヒドラジドでの後の反応は、ヒドラゾン結合の形成をもたらす。
【００９３】
−還元条件下でカルボニルおよびアミンを使用するアミン結合；還元的アミノ化（還元的アルキル化としても知られている）は、中間体イミンを介するカルボニル基のアミンへの変換を含むアミノ化の型である。カルボニル基は、最も一般的にはケトンまたはアルデヒドである。
【００９４】
−ニトリルおよびアジドを使用する銅触媒トリアゾール形成。アジドおよび末端または内部アルキン間のヒュスゲン型１，３−双極性環状付加を使用して、安定な１，２，３−トリアゾールを得る。
【００９５】
−イソチオシアネートおよびアミンを使用するイソチオウレア形成；イソチオシアネートおよびアミン間の反応、すなわちリジンのε−アミノ基は、安定なイソチオウレア結合をもたらす。
【００９６】
−アルコールおよび活性化カルボン酸、好ましくは酸塩化物またはカルボジイミドの反応によるエステルの形成；高い温度反応は、アルコールおよびカルボン酸間の直接的反応を可能にし、安定なエステル、あるいはカルボン酸を形成し、酸性または塩基性触媒条件下で活性化される。
【００９７】
−アルコールおよびハロゲン化アルキルの反応によるエーテルの形成。ハロアルカンは、求核反応性である。それらは極性分子であり：ハロゲンが結合する炭素は、わずかに陽性であり、ハロゲンはわずかに電気陰性である。これは、必然的に求核原子を引きつける電子不足（求電子）炭素をもたらす。
【００９８】
化合物（例えば、薬物）のためのリンカー／スペーサー
本発明の疎水性修飾ペプチド、特に抱合体は、好ましくは、肝臓中に、肝臓にシャトルされる化合物を濃縮するために使用される。好ましくは、化合物を、特にインビボで肝臓中で、肝臓タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素により、疎水性修飾ペプチドを有する抱合体と開裂させる。化合物（例えば薬物）および疎水性修飾ペプチドは抱合体を形成する。好ましくは、化合物および疎水性修飾ペプチドの抱合体は、共有結合または複合体形成により形成される。結合の形態は、化合物の型に依存する。
【００９９】
Ｘのそれぞれのアミノ酸への化合物（例えば、薬物）のカップリングは、スペーサーまたはリンカーを使用することにより行われ得る。リンカーまたはスペーサー、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、（ＣＨ２）ｎ基またはアミノ酸配列は、当業者に知られている。したがって、当業者は、それぞれの適用に依存してそれぞれの適当なリンカーまたはスペーサーを選択することができる。好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、好ましくは肝臓または腫瘍特異的タンパク質により認識される、肝細胞特異的活性化のための認識部位を含む。認識部位は、好ましくはタンパク質分解切断部位である。したがって、肝臓タンパク質は、好ましくは肝細胞タンパク質、さらに好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素または腫瘍において過剰発現されるタンパク質分解酵素、例えばＭＭＰ７である。したがって、疎水性修飾ペプチドは、対象に投与することができ、身体中、例えば、体液中に、開裂されることなく輸送される。しかしながら、疎水性修飾ペプチドが標的、肝臓または肝細胞それぞれに到達するとすぐに、肝臓タンパク質、例えば、肝細胞タンパク質分解酵素はタンパク質分解切断部位を開裂し、シャトル、すなわち疎水性修飾ペプチドから化合物を放出する。
【０１００】
さらに好ましい肝臓タンパク質は、シトクロム、例えば、シトクロムＰ４５０またはエンドサイトーシス経路のリアーゼである。アデフォビルまたはプラデフォビル(Pradevofir)において使用されるＨｅｐＤｉｒｅｃｔ（Ｒ）技術（Metabasis Technologies, Inc.）もまた、本発明のために適当である。
【０１０１】
癌腫、例えば、大腸癌腫の転移による腫瘍性変化のような腫瘍疾患に特に重要なのは、悪性組織および周囲組織間の交流である。健常上皮細胞の活性化および／または原発性腫瘍の遠隔転移の形成のための必要条件である免疫細胞の動員の必要性がある。組織分析は、マトリックス−メタロ−プロテアーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２）の腫瘍特異的ｍＲＮＡ発現レベルが、腫瘍患者の悪い予後と関連することが示されている（Gentner Bら Anticancer Res. 2009 Jan; 29(1) :67-74）。これらのプロテアーゼから、とりわけＭＭＰ７は、腫瘍細胞により主に発現されるため、非常に興味がある。ＭＭＰ７（例えば、短いペプチド配列ＧＣＨＡＫまたはＲＰＬＡＬＷＲＳ）、また全ての他のＭＭＰ７基質（例えば、フィブロネクチン、エラスチン、カゼインまたは他のもの）に対する特異的なタンパク質分解結合部位を含むリンカー配列を介する記載のペプチド配列への薬物のカップリングは、上記手段により元のペプチドの修飾を介して肝臓に不活性なプロドラッグを送達することを可能にさせる。肝臓において、次に、修飾ペプチドは、腫瘍組織の周囲で優先的に開裂され、不活性なプロドラッグを活性化させる。上記ＭＭＰの１つを過剰発現する肝臓における肝臓標的化原発性肝細胞癌腫または転移（例えば、大腸癌腫転移）への薬物送達のこの方法は、腫瘍組織への薬物の標的化の新規方法を示す。
【０１０２】
１つの態様において、化合物および疎水性修飾由来ペプチドの抱合体は、複合体形成により形成される。本発明において有用な好ましい複合体は、ビオチン／アビジン、ポリアルギニン／オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。当業者は、適当な複合体成分を決定すること、および化合物および疎水性修飾ペプチドを設計することができる。
【０１０３】
肝臓疾患の予防および／または処置
好ましい態様において、本発明の上記疎水性修飾ペプチド、特に化合物とその抱合体は、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のために提供される。
【０１０４】
予防および／または処置される肝臓疾患または障害に依存して、それぞれの化合物は、選択され、選択的に、肝臓に特異的に送達される。本発明の「肝臓疾患」または「肝臓障害」は、肝臓、肝臓組織または肝細胞に影響する、またはこれらに関与するあらゆる疾患または障害を示す。
【０１０５】
肝臓疾患の例は：
−肝炎：主に種々のウイルスにより引き起こされるが、特定の毒、自己免疫または遺伝的状態によっても引き起こされる肝臓の炎症；
−肝硬変症：死滅肝細胞に置き換わる肝臓における線維組織の形成。肝細胞の死滅は、例えば、ウイルス肝炎、アルコール依存症または他の肝臓毒性化学物質との接触により引き起こされ得る；
−ヘモクロマトーシス：身体における鉄の蓄積を引き起こし、結局は肝臓損傷をもたらす遺伝的疾患；
−肝臓癌：通常、胃腸管の他の部分に由来する原発性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）または胆管癌腫および転移性癌；
−ウィルソン病：銅が身体に保持される遺伝的疾患；
−原発性硬化性胆管炎：事実上自己免疫性である胆管の炎症性疾患；
−原発性胆汁性肝硬変：小胆管の自己免疫疾患；
−バッド・キアリ症候群：肝静脈の閉塞；
−ジルベール症候群：集団の約５％に見られるビリルビン代謝の遺伝性障害；
−ＩＩ型糖原病：全身の進行性の筋衰弱（ミオパチー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系における種々の体内組織に影響を与えるグリコーゲンの蓄積；
−小児肝疾患、例えば、胆道閉鎖症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群、および進行性家族性肝内胆汁うっ滞；
−代謝疾患
である。
【０１０６】
さらに、動物、例えば、ペットまたは家畜の肝臓疾患はまた、特に動物に伝播し得る疾患、例えば、トキソプラズマ症を含む。
【０１０７】
予防および／または処置される肝臓疾患または障害は、好ましくは肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、好ましくはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ型の肝炎ウイルスにより引き起こされる肝炎から選択される。予防および／または処置される肝臓疾患または障害はまた、ウイルス、例えば、ヘルペスウイルス科のウイルス、例えばヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により、また水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、コクサッキーウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルスにより引き起こされる同時肝炎であり得る。
【０１０８】
予防および／または処置される肝臓疾患または障害はまた、例えば、多くの熱帯病における、ウイルスまたは非ウイルス病原体の肝臓期に関わる疾患であり得る。いくつかの病原体の肝臓期が初期であるため、それぞれの感染は、このような初期に選択的に、特異的に処置することができる。このようなウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ型の肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスである。
【０１０９】
このような非ウイルス病原体は、細菌、寄生生物および／または虫である。寄生生物は、例えば、マラリアを引き起こすプラスモジウム（Plasmodium）属の寄生原生動物、例えば、熱帯マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、および関連種（例えば、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowles)）である。このような虫は、例えば、住血吸虫症またはビルハルツ住血吸虫症を引き起こすシストソーマ（Schistosoma）属の扁形動物、例えば、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、インターカラタム住血吸虫（Schistosoma intercalatum）、ヘマトビウム住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）およびメコン住血吸虫（Schistosoma mekongi）である。このような寄生生物はまた、例えば、リーシュマニア症に関与するサンショウバエ（Phlebotomus）属およびルツォミヤ（Lutzomyia）属のリーシュマニアトリパノソーマ（Leishmania trypanosome）原生生物である。したがって、マラリア、住血吸虫症（ビルハルツ住血吸虫症）、および／またはリーシュマニア症は、本発明の手段により予防および／または処置することができる。したがって、特定の熱帯病は、本発明の手段により予防および／または処置することができる。
【０１１０】
予防および／または処置される肝臓疾患または障害は、好ましくは肝腫瘍、好ましくは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）または固形腫瘍、例えば大腸癌腫の転移による腫瘍性変化物である。予防および／または処置される肝臓疾患または障害はまた、代謝疾患、例えば、糖尿病、脂質異常症、メタボリック・シンドロームおよび肥満、慢性高血糖、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であり得る（（９）も参照）。
【０１１１】
本発明の好ましい態様において、上記疎水性修飾ペプチド、特に化合物とのそれらの抱合体は、肝臓機能の制御のために提供される。
【０１１２】
肝細胞媒介抗原提示および肝臓指向性免疫学的応答の活性化のための使用が好ましい。この場合、肝臓に送達される化合物は、好ましくは免疫原性エピトープである。
【０１１３】
本発明の好ましい態様において、上記疎水性修飾、好ましくはアシル化由来ペプチド、特に化合物とのそれらの抱合体は、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための医薬の製造のために使用することができる。
【０１１４】
医薬組成物
上記で概説されているとおり、本発明は、本明細書に定義されている少なくとも１つの疎水性修飾ペプチドおよび本明細書に定義されている肝臓に特異的に送達される少なくとも１つの化合物、および所望により薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、
−上記定義の少なくとも１つの疎水性修飾ペプチド；
および
−所望により薬学的に許容される担体および／または賦形剤
を含む。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されている全ての使用および方法に非常に適している。
【０１１７】
「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、本発明の医薬またはワクチン組成物が製剤化され得るあらゆるビヒクル、または本発明の医薬またはワクチン組成物と共に製剤化され得るあらゆるビヒクルを示す。それは、塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸バッファー、ＮａＣｌ、オクチルグルコシドおよび／またはポロキサマーを含む。一般的に、希釈剤または担体は、投与様式および経路、ならびに標準医薬経験に基づいて選択される。
【０１１８】
処置方法
さらに、上記で概説されているとおり、本発明は、本発明の上記疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物を利用することによる、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法を提供する。
【０１１９】
本発明はまた、疎水性修飾由来ペプチドおよび化合物（例えば、薬物）を含む本明細書に定義されている抱合体、または本明細書に定義されている医薬組成物を対象に投与することによる、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法を提供する。本発明の肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法は、治療有効量において、
（ａ）本明細書に定義されている疎水性修飾ペプチドおよび本明細書に定義されている少なくとも１つの化合物（例えば、薬物）、または
（ｂ）本明細書に定義されている医薬組成物
を対象に投与することを含む。
【０１２０】
投与経路
好ましくは、特に処置方法における、本発明の抱合体または医薬組成物の投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐薬投与経路から選択される。経鼻投与または適用のための好ましい態様は、鼻腔用スプレーである。
【０１２１】
さらなる好ましい態様において、化合物（例えば、薬物）を含む本発明の疎水性修飾ペプチドは、患者からの血清に溶解されるか、または、注射を介して適用される。
【０１２２】
治療有効量
本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物「治療有効量」は、それぞれの肝臓疾患または障害を予防および／または処置するために十分である量を示す。好ましい治療有効量は、送達され、それぞれの治療可能性のあるそれぞれの化合物に依存する。当業者は、適当な治療有効量を決定することができる。好ましい態様において、治療有効量は、１０ｐｍｏｌ／ｋｇから２０μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲である。治療剤（すなわち、薬物が疎水性修飾ペプチドと結合されている）としての使用のための、患者に適用される好ましい量は、１００ｎｍｏｌ／ｋｇから２μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲である。
【０１２３】
本発明の好ましい疎水性修飾ペプチド
以下において、本発明の好ましい疎水性修飾ペプチドを挙げる。これらの疎水性修飾ペプチドは、アミノ酸配列ＫＫＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ（配列番号．１４）またはＫＫＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（配列番号．１５）に基づき、１または２つのＮ−末端リジン（Ｋ）が欠失されていてもよく、または別のアミノ酸に置換されていてもよい。
【０１２４】
典型的な疎水性修飾ペプチドは、以下の化学構造を有する：
【化１】
2014506574.tif 000014
【０１２５】
上記の例示された化学構造を有する化合物のアミノ酸配列は、３つのＮ−末端リジン（ＫＫＫ）のそれぞれに、プリマキン分子が結合されており、第１のＮ−末端リジンが疎水性ステアロイル基でさらに修飾されているステアロイル−［Ｋ（プリマキン）］［Ｋ（プリマキン）］［Ｋプリマキン）］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰである。この結合において、上記の例示された疎水性修飾ペプチドも示すことができるように、本発明の疎水性修飾ペプチドの式は、簡略化されていることに注意すること。
「ステアロイル−［Ｋ（プリマキン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ」
【０１２６】
さらなる典型的な好ましい疎水性修飾ペプチドは、以下の化学構造を有する：
【化２】
2014506574.tif 000015
ミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−ドキソルビシン］３−２０）。
【０１２７】
さらに好ましい典型的な疎水性修飾ペプチドは、以下の化学構造を有する：
【化３】
2014506574.tif 000016
ミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０）。
【０１２８】
以下において、本発明の好ましい疎水性修飾ペプチドならびに肝臓の疾患または障害の処置および／または予防におけるこれらの好ましい特定の使用を挙げる：
【０１２９】
−好ましくはマラリア、とりわけ三日熱マラリアの肝臓期の処置における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（プリマキン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰおよびステアロイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ−プリマキン）］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；
【０１３０】
−好ましくは肝臓におけるＭＭＰ７を過剰発現する腫瘍性変化物の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（ドキシサイクリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ドキシサイクリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；
【０１３１】
−好ましくは肝臓における細菌感染の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（ペニシリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ペニシリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；
【０１３２】
−好ましくは肝臓移植前および後の患者の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（シクロスポリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  シクロスポリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；
【０１３３】
−好ましくは肝臓移植前および後の患者の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（ラパミューンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ラパミューンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；
【０１３４】
−好ましくは肝臓の腫瘍性変化物における血管新生の阻害における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（ＲＰＬＡＬＷＲＳ−ベルケイドＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；
【０１３５】
−好ましくは肝臓の腫瘍性変化物における血管新生の阻害における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（ネクサバールＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰおよびステアリル−［Ｋ（ＲＰＬＡＬＷＲＳ−ネクサバールＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；および
【０１３６】
−好ましくは脂肪症、２型糖尿病の処置および新生組織再生の阻害における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（チアゾリジンジオン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
【０１３７】
−好ましくはマラリア、とりわけ三日熱マラリアの肝臓期の処置における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（プリマキン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤおよびステアロイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ−プリマキン）］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１３８】
−好ましくは肝臓におけるＭＭＰ７を過剰発現する腫瘍性変化物の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（ドキシサイクリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ドキシサイクリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１３９】
−好ましくは肝臓における細菌感染の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（ペニシリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ペニシリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１４０】
−好ましくは肝臓移植前および後の患者の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（シクロスポリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  シクロスポリン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１４１】
−好ましくは肝臓移植前および後の患者の処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ（ラパミューンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤおよびミリストイル−［Ｋ（ＧＣＨＡＫ  ラパミューンＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１４２】
−好ましくは肝臓の腫瘍性変化物における血管新生の阻害における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（ＲＰＬＡＬＷＲＳ−ベルケイドＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１４３】
−好ましくは肝臓の腫瘍性変化物における血管新生の阻害における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（ネクサバールＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤおよびステアリル−［Ｋ（ＲＰＬＡＬＷＲＳ−ネクサバールＴＭ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１４４】
−好ましくは脂肪症、２型糖尿病の処置および新生組織再生の阻害における使用のための、ステアロイル−［Ｋ（チアゾリジンジオン）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ；
【０１４５】
−好ましくは癌、好ましくは原発性ＨＣＣ（肝細胞癌腫）またはマラリアの処置における使用のための、ミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ；および
【０１４６】
−マラリアの処置のための、ミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ）。
【０１４７】
表１  好ましい疎水性修飾ペプチド
【表１３】
2014506574.tif 000017
【表１４】
2014506574.tif 000018
ｍｙｒは、Ｎ−末端のミリストイル化を示し；ｐａｌｍは、Ｎ−末端のパルミトイル化を示し；ステアロイルは、Ｎ−末端のステアロイル化を示す；
【０１４８】
以下の実施例および図面は、本発明を説明するが、しかしながら、それらに限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ＨＢＶ粒子およびＨＢＶ  Ｌ−、Ｍ−およびＳ−タンパク質の略図。部分的に二本鎖のＤＮＡは、末端タンパク質、（ＴＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮａｓｅＨからなるウイルスポリメラーゼ複合体と共有結合する。ゲノムは、１２０個のコアタンパク質二量体から構成される２０面体シェルによりカプセル化される。３つのＨＢＶ表面タンパク質Ｌ−、Ｍ−およびＳ−は、ＥＲ由来脂質二重層に組み込まれている。Ｌ−およびＭ−タンパク質は、膜アンカーとして働く完全Ｓ−ドメインを含む。ＨＢＶの部分的に二本鎖のＤＮＡゲノムの略図；Ｃ＝ウイルスカプシドを形成するコアタンパク質；Ｘ＝Ｘタンパク質、未定義の機能を有する多面的転写活性化因子；Ｐ＝ウイルスポリメラーゼ；ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ組合せの形態、大型（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）ＨＢＶ表面タンパク質（Ｌタンパク質）、中型（ｐｒｅＳ２／Ｓ）ＨＢＶ表面タンパク質および小型（Ｓ）ＨＢＶ表面タンパク質。
【０１５０】
【図２】本発明の疎水性修飾ペプチドおよび本発明の疎水性修飾ペプチドの一例の一般式の接続図。
【０１５１】
【図３】肝細胞の表面への本発明の疎水性修飾ペプチドの結合の接続図。
【０１５２】
【図４】腫瘍を有するラットのＰＥＴイメージ。図４Ａ、ｉ．ｖ．注射５分後のＷＡＧ／Ｒｊｉラットの肝臓における４００ｎｍｏｌ／ｋｇのステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドの特異的濃縮。図４Ｂ、最初の測定２４時間後に１８Ｆ−ＦＤＧを使用する対比染色。１８Ｆ−ＦＤＧは、多い量のグルコースを消費する臓器において豊富であり、図において心臓（上側のグレー色の塊）および腫瘍は、グルコースが豊富である（脳において豊富な１８Ｆ−ＦＤＧは、技術的理由のために示されない）。図４Ｃ、腫瘍組織ではなく肝臓組織のみだけの、ペプチド染色の特異性を証明する両方のイメージの合併。
【０１５３】
【図５】ドキソルビシン修飾ペプチドの臓器分布。
【０１５４】
【図６】Ｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞での細胞生存能力アッセイ。図６Ａ、Ｎ−末端修飾ｐｒｅＳペプチドと結合しているドキソルビシン（抱合体）およびコントロールと１２時間インキュベートされたｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞の１２時間測定。図６Ｂ、Ｎ−末端修飾ｐｒｅＳペプチドと結合しているドキソルビシン（抱合体）およびコントロールと１２時間インキュベートされたｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞の２４時間測定。
【０１５５】
【図７】ＨｅｐＧ２細胞での細胞生存能力アッセイ。Ｎ−末端修飾ｐｒｅＳペプチドと結合しているドキソルビシン（抱合体）およびコントロールと１２時間インキュベートされたＨｅｐＧ２細胞の１２時間測定。
【０１５６】
【図８】ミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。図８Ａ、注射後０−２０分にわたってＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉを注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。図８Ｂ、注射後２０−４０分にわたってミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。図８Ｃ、注射後４０−６０分にわたってミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。図８Ｄ、注射後６時間１０分間測定されたミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。
【実施例】
【０１５７】
以下の実施例１および２において、ＤＯＴＡと複合体化された標識としてＧｄを有する疎水性ペプチド（ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドを、本発明の動作原理を証明するために使用した。
【０１５８】
実施例１
疎水性修飾ペプチドの合成
ペプチドの合成を、(10) Gripon, Pら J Virol 79, 1613-1622 (2005)に記載されているＦｍｏｃ方法を使用することにより行った。
【０１５９】
ＤＯＴＡ−ＤＦＰ合成
ジイソプロピルカルボジイミド（５ｍｍｏｌ、６３１ｍｇ、７７４μｌ）を、ピリジン（１５ｍｌ）に溶解し、水（６０ｍｌ）中のＤＯＴＡ（５ｍｍｏｌ、２．０２ｇ）およびジフルオロフェノール（５ｍｍｏｌ、６５０ｍｇ）の溶液に１０分間にわたって撹拌しながら滴下した。添加３０分後、反応混合物をジクロロメタンで３回抽出し、回転エバボレーターを使用することにより、水相を蒸発させ乾燥させた。粗生産物を水（１１ｍｌ）およびアセトニトリル（３ｍｌ）の混合物に溶解し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣを介して精製した。生産物を含むＨＰＬＣ画分を、凍結乾燥により濃縮した。収量：１．０６３３ｇ（４１％）。
【０１６０】
ペプチドへのカップリング
ペプチドステアロイル−ＫＫＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド（１４０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＭＦに溶解した。ＤＯＴＡ−ＤＦＰ（１２９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加え、さらに、ＤＩＰＥＡ（４１０μｌ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃で一晩撹拌した。ジエチルエーテルを沈殿するまで加えた；沈殿を遠心を使用することにより分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。粗生産物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用することにより精製した。精製を、両方とも０，１％のトリフルオロ酢酸を含む水およびアセトニトリルの勾配を使用することにより行った。生産物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥により濃縮した。収量：１１２ｍｇ（５５％）。
【０１６１】
Ｇｄ３＋の複合体化
ペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド（１１２ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を０．４Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）に溶解し、ＧｄＣｌ３＊６  Ｈ２Ｏ（３３５ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を撹拌しながら水浴中で１時間加熱した。生産物の得られた混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用することにより精製した。精製を、両方とも０，１％のトリフルオロ酢酸を含む水およびアセトニトリルの勾配を使用することにより行った。生産物（ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド）を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥により濃縮した。収量：９４ｍｇ（７７％）。
【０１６２】
実施例２
ＰＥＴにおけるイメージング
ペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドをクエン酸バッファー（ｐＨ８．０）＋４％  ＢＳＡ中に溶解させ、腫瘍を有するＷＡＧ／Ｒｉｊラットの尾の静脈にｉ．ｖ．注射した。測定の１０日前に、ラットに１ｘ１０６個の同系大腸癌腫細胞（ＣＣ５３１細胞）を同所性に注入した。測定の日に、ラットに４００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の濃度においてペプチドを与えた。実験中、ラットをイソフルランにより麻酔し、３７℃で維持した。ＰＥＴイメージングを、ＳｉｅｍｅｎｓからのＩｎｖｅｏｎ小動物ＰＥＴを使用して行い、イメージングをステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドを使用する最初の測定２４時間後にペプチドのｉ．ｖ．注射後即座に開始し、ラットに、コントロールとして５ミリキュリーの濃度において１８Ｆ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ）を注入した。図４Ａ−Ｃは、腫瘍を有するラットの典型的なＰＥＴイメージを示す。図４Ａ、ｉ．ｖ．注射５分後のＷＡＧ／Ｒｊｉラットの肝臓における４００ｎｍｏｌ／ｋｇのステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドの特異的濃縮。図４Ｂ、最初の測定２４時間後に１８Ｆ−ＦＤＧを使用する対比染色。１８Ｆ−ＦＤＧは、多い量のグルコースを消費する臓器において豊富であり、図において心臓（上側のグレー色の塊）および腫瘍は、グルコースが豊富である（脳において豊富な１８Ｆ−ＦＤＧは、技術的理由のために示されない）。図４Ｃ、腫瘍組織ではなく肝臓組織のみだけの、ペプチド染色の特異性を証明する両方のイメージの合併。
【０１６３】
実施例３
ドキソルビシンと結合されたＮ−末端修飾ｐｒｅＳペプチドの肝臓特異性および細胞毒性の試験
ペプチドと結合されたドキソルビシンを本明細書に記載されているとおりに合成した。簡潔には、ＦＭＯＣで保護された固相ペプチド合成をペプチド骨格（ＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ）を合成するために使用し、次に、ドキソルビシンをアミド形成を使用してペプチド骨格と結合させた。ペプチド骨格における「ｙ」は、ラットにおいて修飾ペプチドを検出するための標識として作用するように１３１ヨウ素が結合され得るＤ−チロシンを示す。得られたペプチドをＨＰＬＣにより精製し、純度を質量分析により分析した。得られたペプチドの純度は９７％以上であった。
【０１６４】
修飾ペプチドの略図を以下に示す：
【化４】
2014506574.tif 000019
ミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−アミド（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−ドキソルビシン］３−２０ｙ）
【０１６５】
得られた合成ペプチドが未だ肝臓特異性であることを示すために、上記略図ペプチドを、（Eisenhut and Mier, 2011; 36）に記載されているクロラミンＴ方法を使用して、放射性１３１ヨウ素でＣ−末端に標的化した。
【０１６６】
チロシン特異的ヨウ素標識化：
１０μｌの１ｍＭのペプチド溶液（水に溶解された）を２０μｌのリン酸バッファーに加える。種々の量の放射性Ｎａ１３１Ｉ溶液を、完全標識化をなし遂げる必要に応じてペプチド溶液に加え、量は放射性Ｎａ１３１Ｉ溶液の寿命に基づいて変化する。当業者は、放射性活性（秒）を測定することにより必要な量をコントロールすることができる。次に、５μｌのクロラミン−Ｔ溶液（水中２ｍｇ／ｍｌ）を加え、得られる溶液をボルテックスし（５回）、遠心する（８０００ｇ、３０秒、５回）。その後、１０μｌの飽和メチオニン溶液を加え、バイアルを注意深く反転させ、混合する。次に、得られる溶液をＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製する。ペプチド画分を回収し、真空乾燥させる。次に、凍結乾燥されマークされたペプチドを、所望の実験バッファーに溶解し、下流実験のために使用することができる。
【０１６７】
次に、放射性標識ペプチドを、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡに溶解し、３７℃に加熱し、ＷＡＧ／ＲＪラットの尾静脈に注射した。次に、動物を示される時点で麻酔し（図５）、臓器に外植し、ガンマカウンターを使用して測定した。４匹の動物を時点ごとに測定した。図５は、注射用量のパーセントとして臓器ごとに測定される平均放射を示すことにより、ドキソルビシン修飾ペプチドの臓器分布を示す。図５において証明されるとおり、肝臓指向性は、ドキソルビシンでのＨＢＶ  ｐｒｅＳペプチドのＮ−末端修飾により損傷しない。
【０１６８】
次に、修飾ドキソルビシンが細胞に対する細胞毒性を未だ有するか否かを分析した。該実験において、Galleら(1994) (37)に記載されているＣ５７ＢＬ／６マウスから単離されたｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞をインキュベートし、９６ウェル平底プレートに再播種し、コンフルエント細胞層を形成した。播種２４時間後、細胞を合成ペプチド（抱合体）、ドキソルビシンの不活性な合成中間体、ドキソルビシン単独のいずれかとインキュベートし、さらなるコントロールとして、細胞をドキソルビシン（Ｃｏｌｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）の添加なしに非修飾ペプチド、次に、示された濃度で合成ペプチド（抱合体）を使用して３０分間プレインキュベートした（図６Ａおよび６Ｂ）。次に、細胞をそれぞれ１２時間（図６Ａ）または２４時間（図６Ｂ）インキュベートした。インキュベーション後、残っている細胞生存能力を決定するために、ＭＴＴアッセイ（Cell proliferation Kit, Roche Mannheim Germany）を製造業者の指示により指示されるとおりに行った。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す（細胞生存能力アッセイ）。
【０１６９】
図６ａ（１２時間測定）：Ｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞を、ドキソルビシン単独、上記で示されているＮ−末端修飾ｐｒｅＳ  ペプチドと結合されているドキソルビシン（抱合体）またはドキソルビシンの不活性な合成中間体のいずれかと１２時間インキュベートした。非修飾ｐｒｅＳペプチド（Ｃｏｌｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）と３０分のプレインキュベーション、次に抱合体とインキュベーションは、受容体特異的相互作用コントロールとして働いた。
【０１７０】
図６ｂ（２４時間測定）：Ｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞を、ドキソルビシン単独、上記で示されているＮ−末端修飾ｐｒｅＳ  ペプチドと結合されているドキソルビシン（抱合体）またはドキソルビシンの不活性な合成中間体のいずれかと１２時間インキュベートした。非修飾ｐｒｅＳペプチド（Ｃｏｌｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）と３０分のプレインキュベーション、次に抱合体とインキュベーションは、受容体特異的相互作用コントロールとして働いた。
【０１７１】
ｐｒｉｍａｒｙマウス肝細胞とドキソルビシン単独またはミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−アミド（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−ドキソルビシン］３−２０ｙ）ペプチドのいずれかとのインキュベーションは、インキュベーション１２時間および２４時間後に有意な細胞毒性効果を示す。カップリング反応の不活性な合成中間体とのインキュベーションは、何ら毒性を示さない。さらに、細胞をミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−アミド（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−ドキソルビシン］３−２０ｙ）で処理する３０分前に、細胞を非修飾ｐｒｅＳペプチドとプレインキュベートすることによるペプチド特異的受容体のブロッキングは、修飾ペプチドの細胞毒性効果を完全に破棄する。
【０１７２】
さらなるコントロールとして、ＨｅｐＧ２を、上記示されている同じ条件下で１２時間細胞とインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞は、特異的ペプチド受容体を発現しない。この理由のため、観察される効果がペプチドおよび受容体特異的であるとき、ＨｅｐＧ２細胞は、ミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−アミド（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−ドキソルビシン］３−２０ｙ）ペプチドの観察される細胞毒性効果により影響されないはずである。該実験の結果を図７に示す。図７（１２時間測定）：ＨｅｐＧ２細胞を、ドキソルビシン単独、上記示されているＮ−末端修飾ｐｒｅＳペプチド（抱合体）と結合しているドキソルビシンまたはドキソルビシンの不活性な合成中間体のいずれかと１２時間インキュベートした。非修飾ｐｒｅＳペプチド（Ｃｏｌｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ；  Ｃ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ）と３０分のプレインキュベーション、次に抱合体とインキュベーションは、受容体特異的相互作用コントロールとして働いた。
【０１７３】
図７に示されるとおり、ミリストイル−［Ｋ−ドキソルビシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−アミド（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−ドキソルビシン］３−２０ｙ）ペプチドは、細胞において細胞毒性活性を示さず、ペプチド特異的受容体を発現しないが、ドキソルビシン単独は、インキュベーション１２時間後に有意な細胞毒性をまだ示す。
【０１７４】
実施例４
肝臓期マラリアの処置のためのレボフロキサシンと結合しているＮ−末端修飾ＨＢＶｐｒｅＳペプチドの肝臓特異性
レボフロキサシン結合ペプチドを本明細書に記載されているとおりに合成した。簡潔には、ＦＭＯＣで保護された固相ペプチド合成をペプチド骨格（ＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ）を合成するために使用し、次に、レボフロキサシンをアミド形成を使用してペプチド骨格と結合させた。得られたペプチドをＨＰＬＣにより精製し、純度を質量分析により分析した。得られたペプチドの純度は以上であった。
【０１７５】
修飾ペプチドの略図を以下に示す：
【化５】
2014506574.tif 000020
ミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−アミド（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ）
【０１７６】
得られた合成ペプチドが未だ肝臓特異性であることを示すために、上記略図ペプチドを、（３６）に記載され、上記されているクロラミンＴ方法を使用して、放射性１３１ヨウ素でＣ−末端に標的化した。次に、放射性標識ペプチドを、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡに溶解し、３７℃に加熱し、ＷＡＧ／ＲＪラットの尾静脈に注射した。次に、動物をイソフルランを使用して麻酔し、ペプチド分布を、小動物ＰＥＴスキャナーを使用してモニタリングした。イメージを示された時点でとり、動物中のペプチド分布をモニターした。
【０１７７】
イメージ８Ａから８Ｄは、示された時点にわたる要約イメージである：
図８Ａ：注射０−２０分後にわたるミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。全放射の約１００％が肝臓において見られる。
【０１７８】
図８Ｂ：注射２０−４０分後にわたるミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。全放射の約１００％が肝臓において見られる。
【０１７９】
図８Ｃ：注射４０−６０分後にわたるミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。ほとんどの放射が肝臓において見られ、穏やかな濃縮が腸および膀胱において観察された。
【０１８０】
図８Ｄ：注射６時間１０分後に測定されたミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）を注入されたラットのＰＥＴ要約イメージ。ほとんどの放出が肝臓においてまだ見られるが、しかしながら腸および膀胱における放射の明らかな蓄積が観察することができる。
【０１８１】
これらの実験は、ミリストイル−［Ｋ−レボフロキサシン］−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰｙ−１３１Ｉ（ＨＢＶｐｒｅＳ／ｍｙｒ−［Ｋ−レボフロキサシン］３−２０ｙ−１３１Ｉ）ペプチドが、ＷＡＧ／ＲＪラットの肝臓において特異的に豊富であり、肝細胞により取り込まれ、放射能の痕跡が注射６時間後に動物の腸および膀胱において見ることができることを証明する。
【０１８２】
前記、特許請求の範囲および／または図面に記載されている特徴は、別々にまたはそれらを組み合わせて、種々の形態における本発明を理解するための材料であり得る。
【０１８３】
参考文献
【表１５】
2014506574.tif 000021
【表１６】
2014506574.tif 000022
【表１７】
2014506574.tif 000023
【表１８】
2014506574.tif 000024
【図１】
2014506574.tif 000025
【図２】
2014506574.tif 000026
【図３】
2014506574.tif 000027
【図４】
2014506574.tif 000028
【図５】
2014506574.tif 000029
【図６】
2014506574.tif 000030
【図７】
2014506574.tif 000031
【図８Ａ】
2014506574.tif 000032
【図８Ｂ】
2014506574.tif 000033
【図８Ｃ】
2014506574.tif 000034
【図８Ｄ】
2014506574.tif 000035
【配列表】
2014506574000001.xml
【国際調査報告】
2014506574.tif 000045
2014506574.tif 000046
2014506574.tif 000047