(57)【要約】ウイルスなどの病原体中に見出される、天然に存在するタンパク質配列から生成される鋳型化コンジュゲートが開示されている。配列は、プラットフォーム内で「鋳型化されて」コンセンサスコイルドコイル配列にされることによって、被験体の免疫化に適した二本鎖抗原が形成される。本発明は、２つのペプチドの鋳型化コンジュゲートを包含する。このコンジュゲートは、天然に存在するアルファヘリックスエピトープの第１のアミノ酸配列を７アミノ酸反復に適合させて、第１の鋳型化エピトープを形成し、天然に存在するアルファヘリックスのエピトープの第２の配列を７アミノ酸反復に適合させて、第２の鋳型化エピトープを形成し、２つの鋳型化エピトープの複合体を形成してコイルドコイル構造を生成し、コイルドコイル構造を担体タンパク質などの担体に連結してコンジュゲートを形成することによって生成される。
2014508144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ポリペプチドが少なくとも２つの７アミノ酸反復を含み、長さがおよそ等しい２つの鋳型化アルファヘリックスポリペプチドであり、少なくとも１つのウイルスに由来するポリペプチドと、
前記２つのポリペプチドの間の共有結合性連結と、
前記ポリペプチドの１つに共有結合的に連結された担体タンパク質と、
を含む、コンジュゲートであって、
第１のポリペプチドは、形態：
［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］ｎ、
を含み、ここで、［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］は、前記第１のポリペプチドの配列中でｎ回反復するパターンであり、少なくとも２つの別個の７アミノ酸セグメントを生じ、
各セグメント中のＩは、イソロイシンであり、
各セグメント中のＬは、ロイシンであり、
ｎは、少なくとも２の整数であり、
ｉは、１〜ｎの整数であり、ここで、ｉの値は、それが現れる前記セグメントの位置によって、前記配列中に最初に現れるＮ末端セグメントにｉ＝１の値が割り当てられ、セグメントが追加されるごとにｉが１ずつ増え、Ｃ末端セグメントにｉ＝ｎの値が割り当てられるように決定され、
前記ｎセグメントのそれぞれにおける各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇは、前記第１のポリペプチドのすべての他のセグメント中の、および第２のポリペプチドのすべてのセグメントの各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸とは独立に選択され、
前記ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、１つのエピトープから選択され、
前記第２のポリペプチドは、形態：
［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］ｎ、
を含み、ここで、［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］は、前記第２のポリペプチドの配列中でｎ回反復するパターンであり、少なくとも２つの別個の７アミノ酸セグメントを生じ、
各セグメント中のＩは、イソロイシンであり、
各セグメント中のＬは、ロイシンであり、
ｎは、少なくとも２の整数であり、前記第１のポリペプチドのｎと同じであり、
ｉは、１〜ｎの整数であり、ここで、ｉの値は、それが現れる前記セグメントの位置によって、前記配列中に最初に現れるＮ末端セグメントにｉ＝１の値が割り当てられ、セグメントが追加されるごとにｉが１ずつ増え、Ｃ末端セグメントにｉ＝ｎの値が割り当てられるように決定され、
前記ｎセグメントのそれぞれにおける各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇは、前記第２のポリペプチドのすべての他のセグメント中の、および前記第１のポリペプチドのすべてのセグメントの各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸とは独立に選択され、
前記ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、前記第１のポリペプチドの前記エピトープとは異なる１つのエピトープから選択され、
前記コンジュゲートは、形態：
【化８】
2014508144.tif 000024
を有し、
ここで、担体部分、リンカーＡ、リンカーＢ１、モディファイヤーＢ２、エピトープ１モディファイヤー、およびエピトープ２モディファイヤーは、任意選択により存在し、
鋳型化エピトープ１と鋳型化エピトープ２との間に追加の共有結合性リンカーＣを任意選択により含むか、
エピトープ１モディファイヤーとエピトープ２モディファイヤーとの間に追加の共有結合性リンカーＤを任意選択により含むか、または
鋳型化エピトープ１と鋳型化エピトープ２との間の追加の共有結合性リンカーＣ、およびエピトープ１モディファイヤーとエピトープ２モディファイヤーとの間の追加の共有結合性リンカーＤを任意選択により含み、ここで、前記エピトープ１モディファイヤーおよび前記エピトープ２モディファイヤーは存在し、親水性アミノ酸、極性アミノ酸、および荷電アミノ酸から選択され、前記［リンカーＡ］部分は存在し、前記［リンカーＢ１］部分は存在し、
ただし、エピトープ１モディファイヤーおよびエピトープ２モディファイヤーの両方が存在するか、またはリンカーＣが存在するか、またはリンカーＤが存在するのいずれかである、コンジュゲート。
【請求項２】
鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２が、同じウイルスの同じ株から選ばれる２つの異なるエピトープ配列に由来する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
鋳型化エピトープ１が由来するエピトープ配列が、一ウイルスの一株から選ばれ、鋳型化エピトープ２が選ばれるエピトープ配列が、同じウイルスの異なる株中の同じエピトープからのものである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
鋳型化エピトープ１が由来するエピトープ配列が、一ウイルスの一株から選ばれ、鋳型化エピトープ２が選ばれるエピトープ配列が、同じウイルスの異なる株中の異なるエピトープからのものである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
鋳型化エピトープ１が由来するエピトープ配列が、一ウイルスから選ばれ、鋳型化エピトープ２が選ばれるエピトープ配列が、異なるウイルスからのものである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１から４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項７】
鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の一方が、インフルエンザウイルスから選ばれる配列に由来し、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の他方が、インフルエンザウイルス以外のウイルスから選ばれる配列に由来する、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
鋳型化エピトープ１が、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）鋳型化エピトープ５Ｐ（ＩＥＮＬＮＫＫＩＤＤＬＦＬＤＩＷＴＬＮＡＥＩＬＶＬＬＥＮＣＲＲ−アミド（配列番号：））であり、鋳型化エピトープ２が、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）鋳型化エピトープ６Ｐ（ＩＲＴＬＤＦＨＩＳＮＬＫＮＬＩＥＫＬＫＳＱＩＫＮＬＡＫＥＣＲＲ−アミド（配列番号：））である、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
形態：
【化９】
2014508144.tif 000025
の請求項８に記載のコンジュゲートであって、ここで、ＫＬＨは、キーホールリンペットヘモシニアンであり、Ｎｌｅは、ノルロイシンであり、各鎖中の各Ｃ残基の間の垂直の棒｜は、シスチンジスルフィド結合を示す、コンジュゲート。
【請求項１０】
形態：
【化１０】
2014508144.tif 000026
の請求項８に記載のコンジュゲートであって、ここで、ＫＬＨは、キーホールリンペットヘモシニアンであり、Ｎｌｅは、ノルロイシンであり、各鎖中の各Ｃ残基の間の垂直の棒｜は、シスチンジスルフィド結合を示す、コンジュゲート。
【請求項１１】
前記担体部分が、タンパク質、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、破傷風トキソイド、コレラサブユニットＢ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａのタンパク質Ｄ、ジフテリアトキソイド、無差別Ｔ細胞ペプチドエピトープ、無差別ヒト麻疹Ｔ細胞ペプチドエピトープ、ペプチドＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ（配列番号：）、非タンパク質性部分、多糖、またはアルギン酸（アルギネート）から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記担体部分と、リンカーＡ（存在する場合）、リンカーＢ１（リンカーＡの非存在下で存在する場合）、または鋳型化エピトープ１（リンカーＡおよびリンカーＢ１が存在しない場合）との間の前記連結が、化学的に確定されたものである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
防御免疫応答を生じさせる必要のある被験体において防御免疫応答を生じさせる方法であって、被験体に、前記防御免疫応答を生成するのに十分な量で請求項１から１２のいずれかに記載のコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
抗体応答を誘導する必要のある個体において抗体応答を誘導する方法であって、その必要のある個体に、前記個体において抗体応答を誘導するのに十分な量で請求項１から１２のいずれかに記載のコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記抗体応答が中和抗体の生成である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
防御免疫応答を生じさせる必要のある被験体において防御免疫応答を生じさせる方法であって、被験体に、前記防御免疫応答を生成するのに十分な量で請求項１に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項１７】
抗体応答を誘導する必要のある個体において抗体応答を誘導する方法であって、その必要のある個体に、前記個体において抗体応答を誘導するのに十分な量で請求項１に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記抗体応答が中和抗体の生成である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年１月２６日に出願された米国特許出願第６１／４３６，５８２号に対する優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の技術分野
本願は、多種多様なウイルス性疾患に対して免疫応答を刺激するのに有効なコンジュゲートを生成するための技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザなどの感染性疾患は、毎年数億の人に感染する。世界的には、インフルエンザは、毎年、人口の最大５〜１５％を罹患させ得、３００万〜５００万の症例が重度の疾病と推定され、２５０，０００〜５００，０００の死亡が推定されている。（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／２００３／ｆｓ２１１／ｅｎ／を参照）。これに加えて、他のウイルス病原体、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、および呼吸器合胞体ウイルスなどが、毎年罹患率および死亡率を生み出している。
【０００４】
これらの疾患の制御は、病原体の突然変異、例えば、インフルエンザウイルスの一定の抗原ドリフトおよび周期的な抗原シフトなどによって複雑化している。疾患の伝播は、突然変異が先に循環しているインフルエンザウイルス株からの抗原変化を蓄積させ、その結果、変異ウイルスが、変異ウイルス株に対する防御抗体を有さない個体に遭遇する場合に増大する。免疫圧力による突然変異インフルエンザウイルスの迅速な選択は、毎年、新規インフルエンザワクチンの開発および生産を必要とする。
【０００５】
有効なワクチンストラテジーの必要性は、何人かの研究者によって言及されている。非特許文献１において、広く保護的な「ユニバーサルインフルエンザワクチン」の必要性についてコメントしている。非特許文献２および特許文献１において、ペプチドワクチンに対する一手法を記載している。Ｗｒａｍｍｅｒらは、「Ｂｒｏａｄｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ２００９  ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年１月１０日、印刷前の電子出版、ＰＭＩＤ：２１２２０４５４において、インフルエンザの複数の株と交差反応した中和抗体を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７７１０３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＮａｂｅｌおよびＦａｕｃｉは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１０年）１６巻（１２号）：１３８９頁
【非特許文献２】Ｔｒｉｐｅｔらは、「Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＳＡＲＳ−ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６年）１５５巻：１７６〜１９４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、呼吸器系ウイルスなどの病原体に対する有効なワクチンの必要性に対処する。本発明は、１つのワクチンを用いて、急速に突然変異する病原体、１つの病原体の複数の抗原性の異なる株、または複数の病原体から保護する必要性にも対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、２つのペプチドの鋳型化（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）コンジュゲートを包含する。このコンジュゲートは、天然に存在するアルファヘリックスエピトープ（ａｌｐｈａ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）の第１のアミノ酸配列を７アミノ酸反復（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）に適合させて、第１の鋳型化エピトープを形成し、天然に存在するアルファヘリックスのエピトープの第２の配列を７アミノ酸反復に適合させて、第２の鋳型化エピトープを形成し、２つの鋳型化エピトープの複合体を形成してコイルドコイル構造を生成し、コイルドコイル構造を担体タンパク質などの担体に連結してコンジュゲートを形成することによって生成される。一実施形態では、２つの鋳型化エピトープは、異なる配列を有する。本発明は、免疫応答を生じさせる必要のある被験体などの被験体にコンジュゲートを投与することによって免疫応答を生じさせる方法も包含する。コンジュゲートは、被験体において防御免疫応答を生成するのに十分な量で被験体に投与される。一実施形態では、エピトープの少なくとも１つは、インフルエンザウイルスタンパク質に由来しない。
【００１０】
一実施形態では、コンジュゲートは、２つのポリペプチド、すなわち、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドであって、各ポリペプチドは、少なくとも１つの７アミノ酸反復を含み、２つのポリペプチドは、約９０％未満または約９０％以下の配列同一性を有する、ポリペプチドと、２つのポリペプチド間の共有結合性連結と、ポリペプチドの１つに共有結合的に連結された担体タンパク質などの担体とを含む。別の実施形態では、コンジュゲートは、２つのポリペプチド、すなわち、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドであって、各ポリペプチドは、少なくとも１つの７アミノ酸反復を含み、２つのポリペプチドは、約１００％の配列同一性を有する、ポリペプチドと、２つのポリペプチド間の共有結合性連結と、ポリペプチドの１つに共有結合的に連結された担体タンパク質などの担体とを含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも２つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも３つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも４つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも５つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも６つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも７つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも８つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも９つの７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも１０個の７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも１１個の７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも１２個の７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも１３個の７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも１４個の７アミノ酸反復を含む。実施形態のいずれにおいても、コンジュゲートは、少なくとも１５個の７アミノ酸反復を含む。追加の実施形態では、１個の追加のイソロイシン残基が最後の７アミノ酸反復の直後に存在する。追加の実施形態では、１個の追加のシステイン残基が最後の７アミノ酸反復の直後に存在する。実施形態のいずれにおいても、エピトープの少なくとも１つは、インフルエンザウイルスタンパク質に由来しない。
【００１１】
一実施形態では、コンジュゲートの第１のポリペプチドは、形態：
［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］ｎ、
を含むことができ、ここで［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］は、第１のポリペプチドの配列中にｎ回反復するパターンまたはセグメントである。各セグメントまたはパターンは、同じであっても、異なっていてもよく、すなわち、ｎセグメントまたはパターンのいずれか１つにおける「ｂ」、「ｃ」、「ｅ」、「ｆ」、および「ｇ」中のアミノ酸は、他のｎセグメントまたはパターンのいずれかにおける「ｂ」、「ｃ」、「ｅ」、「ｆ」、および「ｇ」中のアミノ酸とは独立に選ばれる。各セグメント中の「Ｉ」は、イソロイシンであり、各セグメント中の「Ｌ」は、ロイシンである。数値ｎは、少なくとも３の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、３〜１５（両端を含む）の整数であり、すなわち、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
【００１２】
数値ｉは、１〜ｎの整数であり、ここでｉの値は、セグメントが現れるセグメントの位置によって決定される。配列中に最初に現れるＮ末端セグメントに、ｉ＝１の値が割り当てられる。数値ｉは、Ｃ−末端セグメントにｉ＝ｎの値が割り当てられるまで、各追加のセグメントについて１ずつ増える。ｎセグメントのそれぞれにおける各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇは、第１のポリペプチドのすべての他のセグメント中の、および第２のポリペプチドのすべてのセグメントの各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸とは独立に選択することができる。一実施形態では、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、免疫応答が望まれる病原体のクラス１ウイルス融合タンパク質のアルファヘリックス領域から選択される。追加の実施形態では、１個の追加のイソロイシン残基が最後のセグメントの直後に（すなわち、最後のセグメントのＣ末端に）存在する。
【００１３】
一実施形態では、コンジュゲートの第２のポリペプチドは、形態：
［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］ｎ、
を含むことができ、ここで、［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］は、第２のポリペプチドの配列中でｎ回反復するセグメントである。各セグメント中の「Ｉ」は、イソロイシンであり、各セグメント中の「Ｌ」は、ロイシンである。数値ｎは、少なくとも３の整数であり、第１のポリペプチドについてのｎと同じである。いくつかの実施形態では、ｎは、３〜１５（両端を含む）の整数であり、すなわち、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり、第１のポリペプチドについてのｎと同じである。数値ｉは、１〜ｎの整数であり、ここでｉの値は、セグメントが現れるセグメントの位置によって決定され、その結果、配列中の最初に現れるＮ末端セグメントに、ｉ＝１の値が割り当てられ、ｉは、各追加のセグメントについて１ずつ増え、Ｃ末端セグメントにｉ＝ｎの値が割り当てられる。ｎセグメントのそれぞれにおける各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇは、第２のポリペプチドのすべての他のセグメント中の、および第１のポリペプチドのすべてのセグメントの各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸とは独立に選択される。ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、免疫応答が望まれる病原体のクラス１ウイルス融合タンパク質のアルファヘリックス領域から選択される。一実施形態では、コンジュゲートの第２のポリペプチドは、コンジュゲートの第１のポリペプチドと同じ配列を有する。別の実施形態では、コンジュゲートの第２のポリペプチドは、コンジュゲートの第１のポリペプチドと異なる配列を有し、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、第１のポリペプチドが選択されるタンパク質と異なるクラス１ウイルス融合タンパク質から選択され、または第１のポリペプチドが選択される領域と、同じクラス１ウイルス融合タンパク質の異なる部分から選択される。追加の実施形態では、１個の追加のイソロイシン残基は、最後のセグメントの直後に（すなわち、最後のセグメントのＣ末端に）存在する。一実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの長さは等しい。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、形態：
【００１５】
【化１】
2014508144.tif 000003
のコンジュゲートを取り入れ、ここで、リンカーＡ、リンカーＢ１、モディファイヤーＢ２、エピトープ１モディファイヤー、およびエピトープ２モディファイヤーは、任意選択により存在する。いくつかの実施形態では、［担体部分］は存在しない。さらなる実施形態では、コンジュゲートは、鋳型化エピトープ１と鋳型化エピトープ２との間に追加の共有結合性リンカーＣを任意選択により含むことができ、エピトープ１モディファイヤーとエピトープ２モディファイヤーとの間に追加の共有結合性リンカーＤを任意選択により含むことができ、または鋳型化エピトープ１と鋳型化エピトープ２との間の追加の共有結合性リンカーＣ、およびエピトープ１モディファイヤーとエピトープ２モディファイヤーとの間の追加の共有結合性リンカーＤの両方を任意選択により含むことができる。
【００１６】
コンジュゲートの一実施形態では、エピトープ１モディファイヤーおよびエピトープ２モディファイヤーがともに存在し、親水性アミノ酸、極性アミノ酸、および荷電アミノ酸から選択される。エピトープ１モディファイヤーおよびエピトープ２モディファイヤーは、鋳型化エピトープ１と鋳型化エピトープ２との間でジスルフィド結合を形成するのに使用するために、それぞれ１個のシステイン残基を含むことができる（そのとき、このようなジスルフィド結合は、エピトープ１モディファイヤーとエピトープ２モディファイヤーとの間にリンカーＤを含む）。エピトープ１モディファイヤーおよびエピトープ２モディファイヤーは、同じであっても、異なっていてもよく、−Ａｒｇ、−（Ａｒｇ）２、−（Ａｒｇ）３、−（Ａｒｇ）４、−Ｌｙｓ、−（Ｌｙｓ）２、−（Ｌｙｓ）３、−（Ｌｙｓ）４、−Ａｒｇ−アミド、−（Ａｒｇ）２−アミド、−（Ａｒｇ）３−アミド、−（Ａｒｇ）４−アミド、−Ｌｙｓ−アミド、−（Ｌｙｓ）２−アミド、−（Ｌｙｓ）３−アミド、−（Ｌｙｓ）４−アミド、−Ｃｙｓ、−Ｃｙｓ−Ａｒｇ、−Ｃｙｓ−（Ａｒｇ）２、−Ｃｙｓ−（Ａｒｇ）３、−Ｃｙｓ−（Ａｒｇ）４、−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ）２、−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ）３、−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ）４、−Ｃｙｓ−アミド、−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−アミド、−Ｃｙｓ−（Ａｒｇ）２−アミド、−−Ｃｙｓ−（Ａｒｇ）３−アミド、−−Ｃｙｓ−（Ａｒｇ）４−アミド、−−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−アミド、−−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ）２−アミド、−−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ）３−アミド、および−−Ｃｙｓ−（Ｌｙｓ）４−アミドから選ぶことができる。
【００１７】
［リンカーＡ］が存在する場合、これは、ペプチド、遺伝的にコードされないアミノ酸、例えば、ノルロイシン、アルファ−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、もしくはベータ−アラニンなど、または遺伝的にコードされないアミノ酸を含むペプチドとすることができる。［リンカーＢ１］が存在する場合、これは、アミノ酸またはペプチド、例えば、−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−（Ｇｌｙ）３−、−（Ｇｌｙ）４−、−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、−（Ａｒｇ）３−、−（Ａｒｇ）４−、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−、または−−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−などとすることができる。［モディファイヤーＢ２］が存在する場合、これは、アミノ酸またはペプチド、例えば、Ｇｌｙ−、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、（Ｇｌｙ）３−、（Ｇｌｙ）４−、Ａｒｇ−、Ａｒｇ−Ａｒｇ−、（Ａｒｇ）３−、（Ａｒｇ）４−、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−、または−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−などとすることができる。［エピトープ１モディファイヤー］および［エピトープ２モディファイヤー］が存在する場合、［リンカーＢ１］に好適な部分は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−であり、好ましくは、［モディファイヤー（Ｍｏｄｉｆｅｒ）Ｂ２］は存在しない。［エピトープ１モディファイヤー］および［エピトープ２モディファイヤー］が存在しない場合、［リンカーＢ１］に好適な部分は、−−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−であり、好ましくは、［モディファイヤーＢ２］は存在し、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。存在する場合、［モディファイヤーＢ２］は、そのＮ末端窒素上で任意選択によりアセチル化することができる（例えば、アセチル−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）。
【００１８】
一実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２を生成するのに使用されるエピトープは、以下のように選択される：
鋳型化エピトープ１は、一ウイルスの一株中の一エピトープの一配列に由来し、一方、鋳型化エピトープ２は、同じウイルスの同じ株中の異なるエピトープの一配列に由来し；
鋳型化エピトープ１は、一ウイルスの一株中の一エピトープの一配列に由来し、一方、鋳型化エピトープ２は、同じウイルスの異なる株中の同じエピトープの一配列に由来し；
鋳型化エピトープ１は、一ウイルスの一株中の一エピトープの一配列に由来し、一方、鋳型化エピトープ２は、同じウイルスの異なる株中の異なるエピトープの一配列に由来し、または
鋳型化エピトープ１は、第１のウイルス中の一エピトープの一配列に由来し、一方、鋳型化エピトープ２は、第２の異なるウイルス由来の一エピトープの一配列に由来する。
【００１９】
一実施形態では、コンジュゲート中に使用され、またはコンジュゲート中に使用するために修飾もしくは鋳型化されるエピトープは、クラス１ウイルス融合タンパク質を有する１つまたは複数のウイルス由来のクラス１ウイルス融合タンパク質のステム領域に由来する。一実施形態では、１つまたは複数のウイルスは、インフルエンザＡウイルス株、ＳＡＲＳウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス５、パラインフルエンザウイルス４、またはパラインフルエンザウイルス３を含む群から選択される。一実施形態では、１つまたは複数のウイルスは、ＳＡＲＳウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス５、パラインフルエンザウイルス４、またはパラインフルエンザウイルス３を含む群から選択される。一実施形態では、クラス１ウイルス融合タンパク質は、インフルエンザＰＲ８（インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））ＨＡ２ドメイン、ＳＡＲＳコロナウイルスＳ２、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ、またはパラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆからなる群から選択することができる。別の実施形態では、クラス１ウイルス融合タンパク質は、ＳＡＲＳコロナウイルスＳ２、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ、またはパラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆからなる群から選択することができる。ウイルスタンパク質の７アミノ酸反復領域は、コンジュゲート中に使用するために修飾または鋳型化されるエピトープとして選択される。
【００２０】
鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２として本発明において使用するための鋳型化エピトープは、
【００２１】
【化２】
2014508144.tif 000004
からなる群から選択することができる。一実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一でない（非同一の鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２がコンジュゲート中に使用される場合、このコンジュゲートは、ヘテロ二本鎖コンジュゲートである）。別の実施形態では、鋳型化エピトープ１または鋳型化エピトープ２の一方のみが、インフルエンザウイルスエピトープから選択され、他方の鋳型化エピトープは、異なるウイルスから選択される。別の実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一である（同一の鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２がコンジュゲート中に使用される場合、このコンジュゲートは、ホモ二本鎖コンジュゲートである。）。上記に列挙した鋳型化エピトープの任意の別の実施形態では、２個のＣ末端アルギニン残基は存在しない。
【００２２】
鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２として本発明において使用するための鋳型化エピトープは、
【００２３】
【化３】
2014508144.tif 000005
からなる群から選択することができる。一実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一でない。別の実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一である。上記に列挙した鋳型化エピトープの任意の別の実施形態では、２個のＣ末端アルギニン残基は存在しない。
【００２４】
別の実施形態では、鋳型化エピトープ１、鋳型化エピトープ２、または鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の両方は、
インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）鋳型化エピトープ３ＭＰ、
インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）鋳型化エピトープ５Ｐ；
インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）鋳型化エピトープ６Ｐ、
Ｓ２（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープのＳＡＲＳコロナウイルスＨＲＣドメイン、
呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープ、
呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープ；
呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（４９２−５２０）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（４６０−４８８）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（４５３−４８１）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープ；および
パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（４４７−４７５）鋳型化エピトープ
からなる群から選択することができ、この場合、選択される鋳型化エピトープは、遊離カルボキシ末端を有する（すなわち、この配列は、Ｃ末端アミドを欠く）。一実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一でない。別の実施形態では、鋳型化エピトープ１または鋳型化エピトープ２の一方のみが、インフルエンザウイルスエピトープから選択され、他方の鋳型化エピトープは、異なるウイルスから選択される。別の実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一である。
【００２５】
別の実施形態では、鋳型化エピトープ１、鋳型化エピトープ２、または鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の両方は、
Ｓ２（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープのＳＡＲＳコロナウイルスＨＲＣドメイン；
呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープ、
呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープ；
呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（４９２−５２０）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（４６０−４８８）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（４５３−４８１）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープ；
パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープ；および
パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（４４７−４７５）鋳型化エピトープ
からなる群から選択することができ、この場合、選択される鋳型化エピトープは、遊離カルボキシ末端を有する（すなわち、この配列は、Ｃ末端アミドを欠く）。一実施形態では、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、同一でない。上記に列挙した鋳型化エピトープの任意の別の実施形態では、２個のＣ末端アルギニン残基は存在しない。
【００２６】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）鋳型化エピトープ３ＭＰであり、鋳型化エピトープ２は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）鋳型化エピトープ５Ｐである。
【００２７】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）鋳型化エピトープ３ＭＰであり、鋳型化エピトープ２は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）鋳型化エピトープ６Ｐである。
【００２８】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）鋳型化エピトープ５Ｐであり、鋳型化エピトープ２は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）鋳型化エピトープ６Ｐである。
【００２９】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）鋳型化エピトープ３ＭＰであり、鋳型化エピトープ２は、Ｓ２（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープのＳＡＲＳコロナウイルスＨＲＣドメインである。
【００３０】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）鋳型化エピトープ５Ｐであり、鋳型化エピトープ２は、Ｓ２（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープのＳＡＲＳコロナウイルスＨＲＣドメインである。
【００３１】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、インフルエンザＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）鋳型化エピトープ６Ｐであり、鋳型化エピトープ２は、Ｓ２（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープのＳＡＲＳコロナウイルスＨＲＣドメインである。
【００３２】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００３３】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（４９２−５２０）鋳型化エピトープである。
【００３４】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（４９２−５２０）鋳型化エピトープである。
【００３５】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープである。
【００３６】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（４６０−４８８）鋳型化エピトープである。
【００３７】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（４６０−４８８）鋳型化エピトープである。
【００３８】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープである。
【００３９】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００４０】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００４１】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス３  ＰＩＶ  ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープである。
【００４２】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープである。
【００４３】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（４５３−４８１）鋳型化エピトープである。
【００４４】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（４５３−４８１）鋳型化エピトープである。
【００４５】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープである。
【００４６】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００４７】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００４８】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス５  ＰＩＶ  ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープである。
【００４９】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープである。
【００５０】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（４４７−４７５）鋳型化エピトープである。
【００５１】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（４４７−４７５）鋳型化エピトープである。
【００５２】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープである。
【００５３】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００５４】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープである。
【００５５】
コンジュゲートの別の実施形態では、鋳型化エピトープ１は、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープであり、鋳型化エピトープ２は、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープである。
【００５６】
上記に列挙した鋳型化エピトープの任意の追加の実施形態では、２個のＣ末端アルギニン残基は存在しない。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、コンジュゲートの担体部分は、タンパク質またはペプチドである。タンパク質は、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、破傷風トキソイド、コレラサブユニットＢ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａのタンパク質Ｄ、またはジフテリアトキソイドとすることができる。本発明の別の実施形態では、担体部分は、Ｈｏ  Ｐ．Ｃ．ら、（１９９０年）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０巻：４７７〜８３頁に開示されたものなどの無差別Ｔ細胞ペプチドエピトープとすることができる。本発明の別の実施形態では、担体部分は、無差別ヒト麻疹Ｔ細胞ペプチドエピトープとすることができる。本発明の別の実施形態では、担体部分は、ペプチドＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ（配列番号：）、またはＫａｕｍａｙａ  Ｐ．Ｔ．ら（２００９年）、「Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ，  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２，  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｎｄ／ｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．２７巻：５２７０頁、もしくはＳｕｎｄａｒａｍ  Ｒ．ら、（２００２年）、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、６６巻：２００〜２１６頁に開示された任意の他の無差別Ｔ細胞ペプチドエピトープとすることができる。本発明の別の実施形態では、コンジュゲートの担体部分は、非タンパク質性部分である。非タンパク質性部分は、アルギン酸（アルギネート）などの多糖とすることができる。本発明の別の実施形態では、担体部分を省略することができる。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、担体部分と、リンカーＡ（存在する場合）、リンカーＢ１（リンカーＢ１が存在し、リンカーＡが存在しない場合）、または鋳型化エピトープ１（リンカーＡおよびリンカーＢ１が存在しない場合）との間の連結は、化学的に確定されたものである。
【００５９】
コンジュゲートの一実施形態では、使用される鋳型化エピトープは、鋳型化インフルエンザエピトープを除外し、この場合、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の両方は、同じ配列を有する。
【００６０】
コンジュゲートの一実施形態では、使用される鋳型化エピトープは、鋳型化インフルエンザエピトープを除外する。
【００６１】
本明細書に記載されるペプチド、エピトープ、および鋳型化エピトープの実施形態のいずれにおいても、「ａ」位または「ｄ」位における残基の１個、２個、または３個は、示された残基から変更することができる。一実施形態では、１個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から選択される。一実施形態では、２個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、３個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、１個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から選択される。一実施形態では、２個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、３個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、１個または２個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択され、１個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、１個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択され、１個または２個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む組成物、および被験体において使用するための指示書を含むキットを取り入れる。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、抗体応答の誘導を必要とする個体において抗体応答を誘導する方法であって、それを必要とする個体に、個体において抗体応答を誘導するのに十分な量で、本明細書に開示されるコンジュゲートのいずれかを投与するステップを含む、方法を取り入れる。一実施形態では、抗体応答は、中和抗体の産生である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−１】図１は、鋳型化コンジュゲートの模式図である。（Ａ）任意選択のリンカーＣを含む鋳型化コンジュゲート、（Ｂ）任意選択のリンカーＤを含む鋳型化コンジュゲート、（Ｃ）任意選択のリンカーＣおよびモディファイヤーＢ２を含む鋳型化コンジュゲート、（Ｄ）任意選択のリンカーＣ、モディファイヤーＢ２を含み、担体部分を含まない鋳型化コンジュゲート。
【図１−２】図１は、鋳型化コンジュゲートの模式図である。（Ａ）任意選択のリンカーＣを含む鋳型化コンジュゲート、（Ｂ）任意選択のリンカーＤを含む鋳型化コンジュゲート、（Ｃ）任意選択のリンカーＣおよびモディファイヤーＢ２を含む鋳型化コンジュゲート、（Ｄ）任意選択のリンカーＣ、モディファイヤーＢ２を含み、担体部分を含まない鋳型化コンジュゲート。
【図２】図２は、コイルドコイル構造中の残基の配置を示す図である。
【図３−１】図３は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）インフルエンザウイルスＰＲ８に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図３−２】図３は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）インフルエンザウイルスＰＲ８に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図４】図４は、（Ａ）ホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図５−１】図５は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）インフルエンザとＳＡＲＳウイルスの組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図５−２】図５は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）インフルエンザとＳＡＲＳウイルスの組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図６−１】図６は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図６−２】図６は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図７−１】図７は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図７−２】図７は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図８−１】図８は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図８−２】図８は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図９−１】図９は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図９−２】図９は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１０−１】図１０は、（Ａ）４つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）ＲＳＶとＰＩＶ３の組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１０−２】図１０は、（Ａ）４つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）ＲＳＶとＰＩＶ３の組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１１−１】図１１は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１１−２】図１１は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１２−１】図１２は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１２−２】図１２は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１３−１】図１３は、（Ａ）４つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）ＲＳＶとＰＩＶ５の組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１３−２】図１３は、（Ａ）４つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）ＲＳＶとＰＩＶ５の組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１４−１】図１４は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス４（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１４−２】図１４は、（Ａ）３つのホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス４（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１５−１】図１５は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス４（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１５−２】図１５は、（Ａ）３つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）パラインフルエンザウイルス４（ＰＩＶ５）に由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１６−１】図１６は、（Ａ）４つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）ＲＳＶとＰＩＶ４の組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１６−２】図１６は、（Ａ）４つのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを生成するのに使用される天然配列、（Ｂ）ＲＳＶとＰＩＶ４の組合せに由来する天然配列、（Ｃ）モディファイヤーＢ２を含む代替のプラットフォーム配置における天然配列を表す図である。
【図１７】図１７は、ホモ鎖（ｈｏｍｏ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）鋳型ペプチドコンジュゲート５Ａおよび５Ｐを生成するのに使用される鋳型化インフルエンザ配列、ならびに抗体結合を試験するのに使用されるＨＡタンパク質を表す図である。
【図１８】図１８は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体５Ａの結合性を表す図である。
【図１９】図１９は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体５Ｐの結合性を表す図である。
【図２０】図２０は、ホモ鎖鋳型ペプチドコンジュゲート６Ａおよび６Ｐを生成するのに使用される鋳型化インフルエンザ配列を表す図である。
【図２１】図２１は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体６Ａの結合性を表す図である。
【図２２】図２２は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体６Ｐの結合性を表す図である。
【図２３】図２３は、Ｈ１Ｎ１  ＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体（５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６Ｐ）の結合性を表す図である。
【図２４】図２４は、Ｈ５Ｎ１  ＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体（５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６Ｐ）の結合性を表す図である。
【図２５】図２５は、Ｈ２Ｎ２  ＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体（５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６Ｐ）の結合性を表す図である。
【図２６】図２６は、Ｈ３Ｎ２  ＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体（５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６Ｐ）の結合性を表す図である。
【図２７】図２７は、Ｈ７Ｎ７  ＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体（５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６Ｐ）の結合性を表す図である。
【図２８】図２８は、ホモ鎖鋳型ペプチドコンジュゲート５Ａおよび５Ｐ、ならびにヘテロ鎖（ｈｅｔｅｒｏ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）鋳型ペプチドコンジュゲート５Ａ／５Ｐを生成するのに使用される鋳型化インフルエンザ配列を表す図である。
【図２９】図２９は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体５Ｐ／６Ｐの結合性を表す図である。
【図３０】図３０は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体５Ｐの結合性を表す図である。
【図３１】図３１は、様々なＨＡタンパク質へのインフルエンザ抗体６Ｐの結合性を表す図である。
【図３２】図３２は、異なるペプチド抗原に対する５Ｐ−６Ｐ抗体の結合性を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
一実施形態では、本発明は、被験体において免疫応答を生じさせるのに使用するための鋳型化コンジュゲートを含む。
【００６６】
「被験体」とは、脊椎動物、例えば、トリまたは哺乳動物など、好ましくはヒトを意味する。
【００６７】
「遺伝的にコードされない」アミノ酸は、遺伝子コードで使用される２０のアミノ酸以外のアミノ酸である。これらの２０の遺伝的にコードされるアミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンである。本発明において有用な遺伝的にコードされないアミノ酸の例は、ノルロイシン、α−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、およびベータ−アラニンである。
【００６８】
本明細書において、「ワクチン」は、個体において免疫応答を誘導するのに使用される免疫原性配合物である。ワクチンは、免疫原性である１つを超える成分を有することができる。ワクチンは、予防目的および／または治療目的に使用され得る。ワクチンは、必ずしもウイルス感染を防止しなければならないわけではない。理論によって束縛されることなく、本発明のワクチンは、ウイルス感染がより少ない量（まったくないを含む）で起こり、またはウイルス感染の生物学的もしくは生理的影響が、ワクチンが本明細書に記載されるように投与される場合に回復される様式で、個体の免疫応答に影響し得る。
【００６９】
本明細書において、用語「エピトープ」は、免疫応答を誘発することができる領域を含有し、かつ／または抗体と特異的に結合することができる領域を含有する分子（または分子の会合）を指す。エピトープは、例えば、抗体に特異的に結合することが以前に公知でないタンパク質の部分から選択される場合がある。
【００７０】
「特異的結合」は、約１０−６Ｍ以下、好ましくは約１０−７Ｍ以下、より好ましくは約１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは約１０−９Ｍ以下、なおより好ましくは約１０−１０Ｍ以下の解離定数を伴い、または代わりに、少なくとも約１０６／Ｍ、好ましくは少なくとも約１０７／Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０８／Ｍ、さらにより好ましくは少なくとも約１０９／Ｍ、なおより好ましくは少なくとも約１０１０／Ｍの親和定数を伴う結合を指す。
【００７１】
物質の「有効量」または「十分な量」は、臨床結果を含めた有利な結果などの所望の生物学的効果を引き起こすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、これが適用される状況に依存する。本発明との関連で、ワクチンの有効量の例は、個体において免疫応答（例えば、抗体産生）を誘導するのに十分な量である。有効量は、１つまたは複数の投与で投与することができる。
【００７２】
免疫応答の「刺激」または「誘導」は、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の両方を含み得る。一態様では、これは、ワクチンがまったく与えられない場合の免疫応答と比較した場合に、応答の誘発および／または増強から生じ得る、応答の増大を指す。
【００７３】
本明細書において、かつ当技術分野でよく理解されているように、「治療」は、臨床結果を含めた、有利な結果または所望の結果を得るための手法である。本発明の目的に関して、有利な臨床結果または所望の臨床結果として、それだけに限らないが、１つまたは複数の症状の軽減または回復、感染症の程度の縮小、感染症の安定した（すなわち、悪化でない）状態、感染状態の回復または寛解、およびウイルス力価の減少（検出可能であっても検出不可能であっても）が挙げられる。「治療」は、治療を受けない場合に予期される生存時間と比較した場合の生存時間の延長も意味し得る。ウイルス感染症（インフルエンザ感染症など）の症状は、当業者に公知であり、これらとして、それだけに限らないが、発熱、咳嗽、鼻水、うっ血、筋肉痛、喘鳴、吐き気、および疲労を挙げることができる。
【００７４】
「防御免疫応答」は、有利な臨床結果または所望の臨床結果をもたらす任意の免疫応答を含むことができる。個体における生存率の改善は、防御免疫応答と考えることができる。
【００７５】
ある特定のワクチンの実施形態との関連で、「広く保護的な」は、異なるインフルエンザウイルスに対して、例えば、複数の血清学的に異なるインフルエンザウイルス株に対して保護効果を誘導する能力を指す。
【００７６】
「中和抗体」は、当技術分野で理解されており、ある特定の例については、ウイルス感染症を防止または阻害することができる、宿主動物由来の免疫グロブリンを指す。赤血球凝集素糖タンパク質構造を論じるときのある特定の実施形態について、「ステム領域」は、インフルエンザＨＡタンパク質のＨＡ２ドメインに関係する。
【００７７】
本明細書において、アルキル基は、一価飽和炭化水素であり、これらは、直鎖状、分岐状、もしくは環状、またはこれらの組合せであることができる。アルキル基は、指定された数の炭素原子を有し、例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基は、１〜１２個の間の炭素原子を有することができ、または数値が指定されていない場合、約１〜８個の炭素原子を有する。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロブチル、シクロプロピル−メチル、メチル−シクロプロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ヘプチル、シクロヘプチル、オクチル、およびシクロオクチルである。アルキル基は、対応するアルカンから水素が除去され得るアルキル基上の任意の位置で、分子の残りに付着することができる。
【００７８】
本明細書において、ヘテロアルキル基は、基中の炭素原子の１つまたは複数がヘテロ原子によって置きかえられている、直鎖状、分岐状、もしくは環状、またはこれらの組合せであり得る一価飽和炭化水素である。ヘテロ原子には、酸素（−Ｏ−）、窒素（好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキルで置換されており、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）−）、および硫黄（−Ｓ−）が含まれる。ヘテロアルキル基は、指定された数の炭素原子を有し、例えば、Ｃ１〜Ｃ１２ヘテロアルキル基は、１〜１２個の間の炭素原子を有することができ、または数値が指定されていない場合、約１〜８個の炭素原子を有し、ヘテロ原子の数は制限されないが、好ましくは１〜３個のヘテロ原子である。ヘテロアルキル基の一例は、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−である。
【００７９】
本明細書において、ヒドロカルビル基は、直鎖状、分岐状、もしくは環状、またはこれらの組合せであり得るが、アリール系および芳香族系を除く、一価飽和または不飽和炭化水素である。ヒドロカルビル基は、指定された数の炭素原子を有し、例えば、Ｃ１〜Ｃ１２ヒドロカルビル基は、１〜１２個の間の炭素原子を有することができ、または数値が指定されていない場合、約１〜８個の炭素原子を有する。ヒドロカルビル基の例は、メチル、エチル、エテニル、アセチレニル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロブチル、１、３−ブタジエニル、シクロプロピル−メチル、メチル−シクロプロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ヘプチル、シクロヘプチル、オクチル、およびシクロオクチルである。ヒドロカルビル基は、ヒドロカルビル基の任意の化学的に実現可能な位置で、分子の残りに付着することができる。
【００８０】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の示唆のない限り、複数形の言及を含む。例えば、「ａｎ」エピトープは、１つまたは複数のエピトープを含む。
【００８１】
一般的な方法
本発明の実践では、別段の示唆のない限り、当技術分野のスキルの範囲内である、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技法が使用されることになる。このような技法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１年）、（合同で、個々に「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と本明細書で呼ぶ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、２００１年に至るまでの補遺を含む）；ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）；Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄ．  Ｗｉｌｄ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ、１９９４年）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．  Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ、Ｗ．Ｈ．  Ａｌｂｅｒｔ、およびＮ．Ａ．  Ｓｔａｉｎｅｓ編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ、１９９３年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９９年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｅａｕｃａｇｅら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年）；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９３年）、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、４版、２００４年）；ならびにＶａｃｃｉｎｅｓ（Ｓ．  Ｐｌｏｔｋｉｎ、３版、１９９９年）などに十分に説明されている。
【００８２】
鋳型化コンジュゲートの概要
一実施形態では、本発明は、図１に示したものなどの鋳型化コンジュゲートを取り入れる。このコンジュゲートは、第１のポリペプチド（鋳型化エピトープ１）、第２のポリペプチド（鋳型化エピトープ２）、任意選択のリンカーＡおよび任意選択のリンカーＢ１、担体、任意選択のリンカーＣ（図１Ａ）、任意選択のリンカーＤ（図１Ｂ）、ならびに任意選択のエピトープ１修飾体および任意選択のエピトープ２修飾体を含む。これらの要素のそれぞれを、以下により詳細に論じる。
【００８３】
担体
担体をコンジュゲートとともに使用することができる。担体の使用は任意選択である。ヒトまたは他の哺乳動物において使用するのに適した任意の担体を使用することができる。一態様では、コンジュゲートに使用される担体は一般に、タンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、破傷風トキソイド、コレラサブユニットＢ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａのタンパク質Ｄ、もしくはジフテリアトキソイドなど、または多糖アルギン酸（アルギネート）などの非タンパク質性部分である。別の態様では、コンジュゲートに使用される担体は、ペプチド、例えば、ペプチドＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ（配列番号：）などの無差別ヒト麻疹Ｔ細胞ペプチドエピトープなどの無差別Ｔ細胞ペプチドエピトープなどである。担体は、ペプチドエピトープの免疫原性を増強することができる。一態様では、使用される担体は、ヒトにおいて使用するために食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている担体である。
【００８４】
任意選択のリンカーＡ、任意選択のリンカーＢ１
リンカーＡおよびリンカーＢ１は、鋳型化エピトープ１と称されるエピトープに付けられる任意選択の成分である。これらは、鋳型化エピトープ１、および鋳型化エピトープ１に付随した鋳型化エピトープ２を担体タンパク質に連結する機能を果たす。これらは、追加の機能性をもたらすことができ、例えば、これらは、ペプチドエピトープの所望のコイルドコイル構造が担体タンパク質によって変えられないように、エピトープ複合体が担体タンパク質から十分な距離で保持されることを保証するスペーサーとして作用することができる。遺伝的にコードされないアミノ酸、例えば、ノルロイシンもしくはアルファ−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸など、または遺伝的にコードされるアミノ酸から妨害されることなく容易にアッセイすることができる別の部分を含めると、所与の配合物中のコンジュゲートの濃度をアッセイする好都合な方法がもたらされる。
【００８５】
一実施形態では、任意選択のリンカーＡは、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−であり、任意選択のリンカーＢ１は、−ノルロイシン−グリシン−グリシン−（−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）であり、この場合、リンカーＡのメチレン基は、担体に共有結合的に付着しており、リンカーＡのカルボニル基は、リンカーＢ１のノルロイシン残基のアミノ基に共有結合的に付着しており、リンカーＢ１のＣ末端グリシンは、鋳型化エピトープ１のＮ末端アミノ基に共有結合的に付着している。鋳型化エピトープ１が固相ペプチド合成によって調製される場合、リンカーＢ１は、鋳型化エピトープ１のＮ末端においてＮｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含むように合成を拡張することによって、鋳型化エピトープ１上に容易に組み込むことができる。
【００８６】
リンカーＡがＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、これは、ヨード酢酸無水物を使用して、ヨードアセチル基、Ｉ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−を、リンカーＢ１が存在する場合、リンカーＢ１に、またはリンカーＢ１が存在しない場合、鋳型化エピトープ１のＮ末端に付着することによって、容易に組み込むことができる。これは、Ｉ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］を生じ、または鋳型化エピトープ２が、リンカーＡを組み込む前に鋳型化エピトープ１に付随している場合、これは、Ｉ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］を生じる。次いで、ヨードアセチル化された複合体は、遊離チオール基を含むシステイン残基などの求核部分を含有する担体タンパク質と反応させることができ、［担体タンパク質］−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］をもたらす。
【００８７】
使用することができる他の連結には、リンカーＡとして、ｎが１〜１２の整数である−ＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−、リンカーＢ１として、−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−が含まれる。ＰＧａｃｉｄがｔ−ブチルまたはベンジルなどのカルボン酸保護基である化合物ＰＧａｃｉｄ−ＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨを、−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］にカップリングさせて、ＰＧａｃｉｄ−ＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］を形成することができる。次いで保護基を除去し、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］を生じさせることができ、これは、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）などの縮合試薬を使用して、担体タンパク質上のアミノ基に連結することができる。ｎの例示的な値は、ｎ＝４（アジピン酸リンカー）、またはｎ＝３（グルタル酸リンカー）である。
【００８８】
リンカーＡとして使用することができるさらに別のリンカーは、形態：
【００８９】
【化４】
2014508144.tif 000006
のマレイミド−（ＣＨ２）ｎ−カルボン酸であり、式中、ｎは、１〜２０の整数である。これらの化合物は、式Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨの化合物を無水マレイン酸と反応させ、その後閉環することによって容易に調製することができる（例えば、米国特許第５，３６０，９１４号を参照）。形態マレイミド−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］のリンカーＡ−リンカーＢ１−エピトープ複合体について、遊離チオール（スルフヒドリル）基を有する担体タンパク質と反応させると、チオール基（複数可）がマレイミド部分に付着する。
【００９０】
リンカーＡとして使用することができる別のリンカーは、ベンゾイル安息香酸、（Ｃ６Ｈ５）−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６Ｈ４）−ＣＯＯ−、または
【００９１】
【化５】
2014508144.tif 000007
であり、「ＢＢ」と省略される。これは、−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］に容易にカップリングして、ＢＢ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［鋳型化エピトープ１］−［鋳型化エピトープ２］を形成することができる。ベンゾフェノン部分は、ＵＶ光を介して活性化されて三重項ジラジカル−Ｃ・（−Ｏ・）−を形成し、次いでこれを、担体分子上のＣ−Ｈ結合中に挿入することができる。
【００９２】
担体からエピトープ複合体への連結は、「化学的に明確」であることが好ましい。すなわち、リンカーＡ（リンカーＢ１が存在しない場合）、リンカーＢ１（リンカーＡが存在しない場合）、リンカーＡ−リンカーＢ１（両方が存在する場合）、または担体からエピトープ複合体への直接的な連結（リンカーＡおよびリンカーＢ１が存在しない場合）は、担体上の１つまたは複数の特定の官能基に対するものである。この点において、ヨード酢酸部分、ジカルボン酸部分、およびマレイミド−カルボン酸部分は、担体分子上の１つまたは複数の特定の官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐ）において、担体分子と「化学的に明確な」反応をもたらし、一方、ＢＢ部分は、様々な官能基中に組み込むことができ、「化学的に明確」でない。
【００９３】
任意選択のエピトープ１モディファイヤー、任意選択のエピトープ２モディファイヤー
鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２は、任意選択により修飾されて、追加の所望の特性を組み込むことができる。例えば、荷電残基、例えば、アルギニンもしくはリシンなど、または親水性残基、例えば、ヒスチジン、アスパラギン、もしくはセリンなどを、エピトープのＣ末端に付加することができ、これにより、複合体の溶解度が増大する。一実施形態では、１個、２個、３個、または４個のアルギニン残基が鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の両方のＣ末端に付加されて、複合体の溶解度が増強される。
【００９４】
コイルドコイルペプチドおよび７アミノ酸反復
コイルドコイルアルファヘリックスモチーフは、７アミノ酸反復：
（ａｂｃｄｅｆｇ）
によって特徴付けられることが多く、ここで文字は、配列中の位置を指定するのに使用される（すなわち、「ａ」は、アラニン、またはＤ−アラニンを称するのに使用されるのではなく、配列中の第１の位置を指定するのに使用され、「ｂ」は、アスパラギン酸／アスパラギン対またはＤ−Ａｓｘを称するのに使用されるのではなく、配列中の第２の位置を指定するのに使用されるなどである）。７アミノ酸反復中の中断、すなわち、「スタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）」（３個のアミノ酸の欠失）または「スタマー（ｓｔａｍｍｅｒ）」（４個のアミノ酸の欠失）が分類されており、他の反復配列（１つの７アミノ酸反復とその後のスタッターを有する７アミノ酸反復に等価な「１１アミノ酸反復（ｈｅｎｄｅｃａｄ  ｒｅｐｅａｔ）」など）も特徴付けることができる。
【００９５】
７アミノ酸反復（ａｂｃｄｅｆｇ）は、コンセンサスパターン：
（ＨＰＰＨＣＰＣ）
内で見出されることが多く、ここで、Ｈは、疎水性残基であり、Ｐは、極性残基であり、Ｃは、荷電残基である。「ａ」位および「ｄ」位の残基は、疎水性である傾向があり、「ｂ」位、「ｃ」位、および「ｆ」位の残基は、極性（親水性）である傾向があり、「ｅ」位および「ｇ」位の残基は、帯電している傾向がある。しかし、極性残基および荷電残基のこのパターンは絶対的ではなく、以下の鋳型化配列の考察において、「ｂ」、「ｃ」、「ｅ」、「ｆ」、および「ｇ」は、ＨＰＰＨＣＰＣコンセンサスパターンに準拠する必要はないことが分かる。
【００９６】
図２から分かるように、コイルドコイル構造の７アミノ酸反復は、ヘリックスの１つの側が疎水性であり、１つの側が親水性である両親媒性ヘリックス構造を形成する。ヘリックスは、各ヘリックス上の「ａ」位および「ｄ」位（これらの位置は、図２の左側のヘリックス上でａおよびｄ、図２の右側のヘリックスにおいてａ’およびｄ’と指定されている）が互いに相互作用し、溶媒との相互作用から相対的に遮蔽されるように配置されている。疎水性残基は、他の疎水性残基との熱力学的に好都合な相互作用を有し、一方、荷電残基および親水性残基は、溶媒に曝露されている。このことは、コイルドコイル構造の安定化に寄与する。
【００９７】
７アミノ酸反復は、相互作用しているアルファヘリックスのオリゴマー化状態を決定する単純な配列モチーフである。イソロイシンが「ａ」位にあり、ロイシンが「ｄ」位にある７アミノ酸反復は、二量体のアルファヘリックスコイルドコイルを形成する傾向がある。２９アミノ酸の７アミノ酸反復コンセンサス配列の例は：
【００９８】
【化６】
2014508144.tif 000008
である。
【００９９】
このコンセンサス配列では、４つの完全な７アミノ酸反復（２８アミノ酸残基の長さ）、およびさらに第５の７アミノ酸反復の第１の残基（「ａ」位）の、合計で２９アミノ酸残基が存在する。
【０１００】
７アミノ酸反復鋳型配列
上述した２９残基の７アミノ酸反復配列などの７アミノ酸反復配列は、天然に存在するペプチド配列の鋳型として使用することができる。天然に存在するペプチド配列は、「ａ」位におけるイソロイシン残基および「ｄ」位におけるロイシン残基を残して、鋳型中の「Ｘ」位を補うのに使用することができる。
【０１０１】
例えば、呼吸器合胞体ウイルス配列ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）（図６を参照）ＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶ（配列番号：）は、「ａ」位および「ｄ」位の下線を引いた残基によって示されるように、７アミノ酸反復パターンを含有する。この天然に存在する配列を鋳型配列中に「移入する」ために、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）配列中の下線を引いた残基は、それぞれ、「ａ」位および「ｄ」位においてイソロイシン残基およびロイシン残基と置きかえられる。このプロセスは、「天然に存在する配列を鋳型化する」と本明細書で呼ばれ、得られる修飾された配列は、「鋳型化配列」、「鋳型化エピトープ配列」、または「鋳型化エピトープ」と呼ばれる。このプロセスにより、鋳型化エピトープ配列ＩＬＨＬＥＧＥＩＮＫＬＫＳＡＩＬＳＬＮＫＡＩＶＳＬＳＮＧＩ（配列番号：）が生じる。次いで、この鋳型化エピトープ配列は、およそ等しい長さの別の７アミノ酸反復配列との会合に有利となり、アルファヘリックスのコイルドコイル立体配置で両方の配列を安定化させる。図６Ｂ中の鋳型化コンジュゲートと同様に、２つの同一の配列を使用することができ、または図７Ｂに表した鋳型化コンジュゲートと同様に、２つの異なる配列を使用することができる。安定性をより大きくするための鎖間ジスルフィド結合を形成するのに、最後の残基をシステインと置きかえること、および溶解度を増強するためにＣ末端に２個のアルギニン残基を付加することなど、図６Ｂおよび図７Ｂ中の鋳型化配列に追加の修飾を行うことができることに留意されたい。一方の配列（表した鋳型化コンジュゲート中の「下」の配列）は、さらなる修飾からＮ末端アミノ基を保護するためにアセチル化されている。他方の配列（表した鋳型化コンジュゲート中の「上」の配列）は、３個の追加のＮ末端アミノ酸、ノルロイシン−グリシン−グリシン−で延長されている。次いで、ノルロイシン残基が、例えば、ヨード酢酸無水物と反応させられて、Ｎ末端ヨードアセチル基がもたらされる。次いでこのペプチド複合体は、担体タンパク質に付着される。これらの修飾を、以下にさらに詳細に論じる。
【０１０２】
天然に存在する配列の「ａ」位の残基は、鋳型配列のイソロイシン残基で置きかえられ、天然に存在する配列の「ｄ」位の残基は、鋳型配列のロイシン残基で置きかえられる。図２から分かるように、７アミノ酸反復の「ａ」位および「ｄ」位は、コイルドコイル構造の内側上にあり、一方、「ｂ」位、「ｃ」位、「ｅ」位、「ｆ」位、および「ｇ」位は、構造の外側の溶媒に曝露される部分上にある。これらの外側の位置は、構造の内側に埋められた疎水性残基より、免疫系によって認識される可能性がはるかに高い。したがって、「ｂ」位、「ｃ」位、「ｅ」位、「ｆ」位、および「ｇ」位に天然配列を使用すると、天然に存在するタンパク質中に存在するエピトープと非常に同様の鋳型化配列中のエピトープがもたらされる。
【０１０３】
したがって、２つのポリペプチドを組み込んでいる鋳型化コンジュゲートについて、第１のポリペプチドは、形態［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］ｎを含み、式中、ｎは、反復単位の数を示し、ｎは、３〜２０の間（両端を含む）、３〜１５の間（両端を含む）、３〜１０の間（両端を含む）の整数とすることができ、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０とすることができる。［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］セグメントは、第１のポリペプチドの配列中でｎ回反復する。各セグメント中のＩは、イソロイシンであり、各セグメント中のＬは、ロイシンである。セグメントにおいて、ｉは、１〜ｎの整数であり、ここでｉの値は、セグメントが現れるセグメントの位置によって決定され、その結果、配列中の最初に現れるＮ末端セグメントに、ｉ＝１の値が割り当てられ、ｉは、各追加のセグメントについて１ずつ増え、Ｃ末端セグメントにｉ＝ｎの値が割り当てられる。したがって、ｎ＝３を有するペプチドは、配列［Ｉ−ｂ１１−ｃ１１−Ｌ−ｅ１１−ｆ１１−ｇ１１］−［Ｉ−ｂ１２−ｃ１２−Ｌ−ｅ１２−ｆ１２−ｇ１２］−［Ｉ−ｂ１３−ｃ１３−Ｌ−ｅ１３−ｆ１３−ｇ１３］を有する。ｎセグメントのそれぞれにおける各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇは、第１のポリペプチドのすべての他のセグメント中の、および第２のポリペプチドのすべてのセグメントの各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸とは独立に選択される。
【０１０４】
同様に、第２のポリペプチドは、形態［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］ｎを含み、式中、ｎは、反復単位の数を示し、ｎは、３〜２０の間（両端を含む）、３〜１５の間（両端を含む）、３〜１０の間（両端を含む）の整数とすることができ、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０とすることができ、第２のポリペプチドのｎの値は、第１のポリペプチドのｎの値に等しい。第２のポリペプチド中で、セグメント［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］は、ｎ回反復する。各セグメント中のＩは、イソロイシンであり、各セグメント中のＬは、ロイシンである。第１のポリペプチドのセグメントと同様に、ｉは、１〜ｎの整数であり、ここでｉの値は、セグメントが現れるセグメントの位置によって決定され、その結果、配列中の最初に現れるＮ末端セグメントに、ｉ＝１の値が割り当てられ、ｉは、各追加のセグメントについて１ずつ増え、Ｃ末端セグメントにｉ＝ｎの値が割り当てられる。第１のポリペプチドについてｎ＝３である場合、第２のポリペプチドについてｎ＝３であり、第２のポリペプチドは、配列［Ｉ−ｂ２１−ｃ２１−Ｌ−ｅ２１−ｆ２１−ｇ２１］−［Ｉ−ｂ２２−ｃ２２−Ｌ−ｅ２２−ｆ２２−ｇ２２］−［Ｉ−ｂ２３−ｃ２３−Ｌ−ｅ２３−ｆ２３−ｇ２３］を有する。ｎセグメントのそれぞれにおける各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇは、第２のポリペプチドのすべての他のセグメント中の、および第１のポリペプチドのすべてのセグメントの各ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸とは独立に選択される。１つの連続したポリペプチドのすべてのセグメントについてのｂ位、ｃ位、ｅ位、ｆ位、およびｇ位は、病原体中の天然に存在するアルファヘリックス配列から選択され、すなわち、第１の鋳型化エピトープの配列［Ｉ−ｂ１ｉ−ｃ１ｉ−Ｌ−ｅ１ｉ−ｆ１ｉ−ｇ１ｉ］ｎは、病原体由来の第１の天然に存在する配列に由来し、第２の鋳型化エピトープの配列［Ｉ−ｂ２ｉ−ｃ２ｉ−Ｌ−ｅ２ｉ−ｆ２ｉ−ｇ２ｉ］ｎは、病原体由来の第２の天然に存在する配列に由来することに留意されるべきである。第１の天然に存在する配列および第２の天然に存在する配列は、同じ配列であることができ（ホモ二本鎖コンジュゲートを形成するために）、または異なる配列であることができる（ヘテロ二本鎖コンジュゲートを形成するために）。
【０１０５】
ヘテロ二本鎖コンジュゲートについては、第１のポリペプチドのセグメントに使用するためのｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、第１のエピトープから選択され、第２のポリペプチドのセグメントに使用するためのｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇアミノ酸は、第１のポリペプチドのエピトープと異なるエピトープから選択される。一実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、互いに異なる。別の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、「ａ」位および「ｄ」位が比較に含まれる場合、約７０％未満の配列相同性を有する。別の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、「ａ」位および「ｄ」位が比較から除外される場合、約９０％未満の配列同一性を有する。別の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、「ａ」位および「ｄ」位が比較から除外される場合、約８０％未満の配列同一性を有する。別の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、「ａ」位および「ｄ」位が比較から除外される場合、約７０％未満の配列同一性を有する。別の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、「ａ」位および「ｄ」位が比較から除外される場合、約６０％未満の配列同一性を有する。
【０１０６】
鋳型化コンジュゲート中のコイルドコイルペプチドエピトープの整列
好適な実施形態では、複数のペプチドがコンジュゲート中に使用される場合、これらは、整合して整列される。例えば、２つのペプチドが使用される場合、これらの７アミノ酸反復は、以下のように整列される：
（ａｂｃｄｅｆｇ）
（ａｂｃｄｅｆｇ）  。
【０１０７】
すなわち、一方のペプチド上の「ａ」残基は、整列されて、他方の鎖上の「ａ」残基と相互作用する。複数の７アミノ酸反復が存在する場合、すべての七つ組は、整合して整列され、例えば、２つのペプチドについて、各ペプチドが４つの７アミノ酸反復を有する場合、ペプチドは、以下のように整列される：
（ａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇ）
（ａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇ）  。
【０１０８】
この整列により、コイルドコイル構造中の両方のヘリックスが安定化する。７アミノ酸反復ａｂｃｄｅｆｇが２つのペプチドの整列を示すのに使用されているが、この２つのペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する必要はないことに留意されたい。すなわち、表した２つのペプチドは、同じ配列を有していてもよく、または異なる配列を有していてもよいが、両方の場合において、一方のペプチドの７アミノ酸反復は、他方のペプチドの７アミノ酸反復と整合して整列される。
【０１０９】
ペプチドのいずれか、または両方は、鎖内架橋によって、これらのアルファヘリックス形態で安定化させることもできる。（例えば、Ｈｅｎｃｈｅｙａ，  ＬＫ、Ｊｏｃｈｉｍａ，  ＡＬ、Ａｒｏｒａａ，  ＰＳ、「Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１２巻（６号）：６９２〜６９７頁を参照）。このような鎖内安定化の例には、アルファヘリックス内の残基（ｉ）と（ｉ＋４）の間の１つまたは複数のラクタム架橋（Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＭＥ  Ｊｒ、Ｇａｎｎｏｎ  ＣＬ、Ｋａｙ  ＣＭ、Ｈｏｄｇｅｓ  ＲＳ、「Ｌａｃｔａｍ  ｂｒｉｄｇｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｒｉｎｇ  ｓｉｚｅ，  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ」、Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．、１９９５年、１巻（４号）：２７４〜８２頁）、および「ステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」オレフィンメタセシス法（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，  ＣＥ、Ｐｏ，  Ｊ、Ｖｅｒｄｉｎｅ，  Ｇ、「Ａｎ  Ａｌｌ−Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｅｌｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２０００年、１２２巻、５８９１〜２頁；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ＨＥ、Ｇｒｕｂｂｓ，  ＲＨ、「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｈｅｌｉｃｅｓ  ｂｙ  Ｒｉｎｇ−Ｃｌｏｓｉｎｇ  Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ」、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、１９９８年、３７巻、３２８１〜３２８４頁）が含まれる。
【０１１０】
任意選択のリンカーＣおよび任意選択のリンカーＤ：共有結合性連結による二本鎖コイルドコイル構造の立体構造的安定化
二本鎖コイルドコイル中の等しい長さ、またはほぼ等しい長さの２つのペプチドが整列すると、両ヘリックスが安定化する。追加の安定性は、鎖間連結を介して２つのペプチドを一緒に共有結合的に連結することによってもたらすことができる。これは、例えば、２つのペプチド中の同一の位置にシステイン残基を置き、２つのペプチドの間にジスルフィド結合を形成することによって、アミンを持つ側鎖（例えば、リシン側鎖）と、カルボン酸を持つ側鎖（例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖）との間にラクタム架橋を形成することによって、オレフィンメタセシスによって、ペプチドのカルボキシ末端を一緒に連結することによって（例えば、ペプチド合成の開始点としてジアミン化合物の２個のアミノ基を使用して）、または他の方法によって、いくつかの当技術分野で公知の方法を介して達成することができる。鋳型化エピトープ１と鋳型化エピトープ２との間のこのような共有結合性連結は、図１Ａに示す任意選択のリンカーＣを形成する。図１Ａにおいて、任意選択のリンカーＣは、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２のＣ末端付近に位置しているように表されている。しかし、任意選択のリンカーＣは、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の配列中のどこにでも組み込むことができ、例えば、システイン残基を鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の両方のＮ末端に付加して、Ｎ末端でジスルフィド架橋を形成することができる。任意選択のリンカーＣは、エピトープ１モディファイヤーとエピトープ２モディファイヤーとの間に位置することもできる。
【０１１１】
ペプチド同士間のジスルフィド架橋の形成の例は、合成実施例１に記載されている。
【０１１２】
鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２のＣ末端における連結の形成の例は、合成実施例２に記載されている。２，３，−ジアミノプロピオン酸がこの実施例において使用される。固相または溶液相ペプチド合成に適合性の任意のジアミノ化合物、例えば、形態Ｒ１（−ＮＨ２）−Ｒ２−Ｒ３（−ＮＨ２）の化合物を使用することができることが理解されるべきであり、式中、Ｒ１およびＲ３は独立に、Ｃ１〜Ｃ８ヒドロカルビル（好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキル）、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、またはＨＯＯＣ−Ｃ１〜Ｃ８ヒドロカルビル（好ましくはＨＯＯＣ−Ｃ１〜Ｃ８アルキル）とすることができ、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ８ヒドロカルビレン（好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキレン）、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキレン、または非実在とすることができる。このような化合物の例は、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）ｚ−Ｈであり、式中、ｘ、ｙ、およびｚは、互いに独立に、０〜６の間（両端を含む）の整数である（すなわち、Ｒ１は、ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−であり、Ｒ２は、Ｃ０〜Ｃ６アルキレンであり、Ｒ３は、−ＣＨ（ＮＨ２）−（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）である）。（２，３，−ジアミノプロピオン酸については、Ｒ１は、ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−であり、Ｒ２は、実在せず、Ｒ３は、−ＣＨ２（ＮＨ２）である）。このような化合物は、２つの窒素基上で直交性に保護することができ（例えば、第１の窒素上に９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、および第２の窒素上にアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ａｌｌｏｃ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、または１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）基）、その結果、第２の窒素が保護されたままで、１つのエピトープの合成を第１の窒素上で実施することができ、第１のエピトープの合成が完了した後、第２の窒素を脱保護することができ、第２のエピトープを合成することができる。
【０１１３】
任意選択のエピトープモディファイヤー領域１、および任意選択のエピトープモディファイヤー領域２が存在する場合、図１Ｂに示すように、任意選択のリンカーＤも、これらの間に置くことができる。
【０１１４】
さらに別の実施形態では（表さず）、任意選択のリンカーＣおよび任意選択のリンカーＤの両方が存在し得る。
【０１１５】
鋳型化コンジュゲートの詳細
図１に示されている例である鋳型化コンジュゲートに戻ると、この鋳型は、天然に存在する病原体に由来する多種多様なエピトープの宿主として働くことができることが分かる。２つの所与の抗原１および２について、抗原１が鋳型化エピトープ１として使用され、抗原２が鋳型化エピトープ２として使用される場合、ペプチドの「鋳型化」、または２つのペプチドからの鋳型化コンジュゲートの生成は、１）第１の抗原中の７アミノ酸反復領域を同定するステップと、２）少なくとも１つの７アミノ酸反復を含む第１の抗原の一領域を選択するステップと、３）選択された第１の抗原性７アミノ酸反復領域を適合させて、７アミノ酸反復コンセンサス配列［Ｉ−ｂ−ｃ−Ｌ−ｅ−ｆ−ｇ］ｎにするステップであって、式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｌはロイシンであり、「ｂ」位、「ｃ」位、「ｅ」位、「ｆ」位、および「ｇ」位は、第１の抗原の選択された領域の配列、第１の抗原の７アミノ酸反復中のそれぞれの位置に由来し、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である、ステップと、４）鋳型化コンジュゲートの鋳型化エピトープ１の配列として、第１の抗原性７アミノ酸反復領域の適合された配列を使用するステップと、５）第２の抗原中の７アミノ酸反復領域を同定するステップと、６）少なくとも１つの７アミノ酸反復を含む第２の抗原の一領域を選択するステップと、７）選択された第２の抗原性７アミノ酸反復領域を適合させて、７アミノ酸反復コンセンサス配列［Ｉ−ｂ−ｃ−Ｌ−ｅ−ｆ−ｇ］ｎにするステップであって、式中、Ｉはイソロイシンであり、Ｌはロイシンであり、「ｂ」位、「ｃ」位、「ｅ」位、「ｆ」位、および「ｇ」位は、第２の抗原の選択された領域の配列、第２の抗原の７アミノ酸反復中のそれぞれの位置に由来し、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、第１の抗原から適合された第１の７アミノ酸反復コンセンサス配列中のｎの値と同じである、ステップと、８）鋳型化コンジュゲートの鋳型化エピトープ２の配列として、第２の抗原性７アミノ酸反復領域の適合された配列を使用するステップであって、鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２の７アミノ酸反復は、整列され、その結果、鋳型化エピトープ１の「ａ」位は、鋳型化エピトープ２の「ａ」位と整列し、鋳型化エピトープ１の「ｂ」位は、鋳型化エピトープ２の「ｂ」位と整列し、鋳型化エピトープ１の「ｃ」位は、鋳型化エピトープ２の「ｃ」位と整列し、鋳型化エピトープ１の「ｄ」位は、鋳型化エピトープ２の「ｄ」位と整列し、鋳型化エピトープ１の「ｅ」位は、鋳型化エピトープ２の「ｅ」位と整列し、鋳型化エピトープ１の「ｆ」位は、鋳型化エピトープ２の「ｆ」位と整列し、鋳型化エピトープ１の「ｇ」位は、鋳型化エピトープ２の「ｇ」位と整列する、ステップとからなる。
【０１１６】
上記手順によって鋳型化エピトープ１および鋳型化エピトープ２として使用される配列を決定した後、次いで、鋳型化コンジュゲートが以下のステップによって合成され、これは、化学的に実現可能である任意の順序で実施することができる：鋳型化エピトープ１を合成するステップ（必要に応じて適切なエピトープ１モディファイヤーとともに）、鋳型化エピトープ２を合成するステップ（必要に応じて適切なエピトープ２モディファイヤーとともに）、必要に応じてペプチドエピトープを共有結合的に連結するステップ（このステップは、化学的に実現可能である場合、合成の任意の時点で実施することができる）、任意選択のリンカーＢ１（存在する場合）および任意選択のリンカーＡ（存在する場合）を、鋳型化エピトープ１に付加するステップ（このステップは、化学的に実現可能である場合、鋳型化エピトープ１の合成が完了する前、同時、または後に実施することができる）、コンジュゲートのエピトープ含有断片に担体タンパク質を付着させて、完成した鋳型化コンジュゲートを生成するステップ。
【０１１７】
コンジュゲートの設計
２つの異なるペプチド免疫原を含有するヘテロ二本鎖コンジュゲートは、ウイルスおよび他の病原体に対して使用される以下の有効なストラテジーを可能にする。これらのストラテジーは、細胞の感染に関してクラス１ウイルス融合タンパク質に依存するエンベロープウイルスに対して使用するために、一実施形態において説明される。
【０１１８】
同じクラス１ウイルス融合タンパク質のステムにおける２つの異なるアルファヘリックス領域に対する抗体を誘発するためのヘテロ二本鎖コンジュゲートの使用。単一のウイルス株由来の融合タンパク質のステム上の２つの異なるエピトープを標的化すると、免疫された人におけるモノクローナル抗体耐性ウイルスの選択の可能性が著しく減少する。これは、Ｂ細胞の複数の集団からの抗体産生を刺激することによって、ウイルスに対する相乗的保護の潜在性ももたらす。
【０１１９】
このストラテジーの一例は、鋳型化ペプチド５Ｐの１本の鎖と鋳型化ペプチド６Ｐの１本の鎖とからなる二本鎖ペプチド（Ｈ１ペプチド５，６）を合成することによる、インフルエンザＡウイルス、汎発性Ｈ１Ｎ１株ＰＲ８の赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質のステム領域を標的にするコンジュゲートである。図３Ｂの、エピトープ５Ｐ／６Ｐを使用する鋳型化コンジュゲートを参照。このヘテロ（ＨＡペプチド５，６）二本鎖コンジュゲートは、株ＰＲ８由来のＨ１のステムにおけるアルファヘリックスエピトープ５Ｐおよび６Ｐの両方に対する抗体を誘発し、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１に対する相乗的保護の潜在性を与える。さらに、選択されたペプチドは、他のインフルエンザＡウイルス株のＨ１タンパク質中、および群１におけるＨ２およびＨ５などの関連ＨＡタンパク質中で高度に保存されているので、このコンジュゲートは、ワクチンとして使用される場合、群１内の異なるＨＡタイプを有するインフルエンザウイルスの複数の株に対する広い交差保護をもたらす潜在性を有する。
【０１２０】
同じウイルスの２つの異なる株のウイルス融合糖タンパク質のステムにおける同じアルファヘリックス領域に対する抗体を誘発するためのヘテロ二本鎖コンジュゲートの使用。同じウイルスの異なる株の同じタンパク質領域由来のエピトープを標的化すると、ウイルスの多くの、ほとんどの、またはすべての株に対して保護的な、広く有効な「ユニバーサル」ワクチンを開発する潜在性が確保される。例えば、インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１およびＨ２Ｎ１のＨＡ糖タンパク質のステム領域における同じエピトープを、インフルエンザＨ２の鋳型化ペプチド５Ｐの１本の鎖に連結したインフルエンザＨ１の鋳型化ペプチド５Ｐの１本の鎖からなるヘテロ二本鎖コンジュゲート（ペプチド５Ｐ：Ｈ１，Ｈ２）を作製することによって標的化することができる。１６の公知の血清学的に異なるインフルエンザＨＡタンパク質は、２つの株発生的クラスター、すなわち、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ５などを含む群１、およびＨ３、Ｈ７などを含む群２を形成する。群１のＨＡタンパク質のステム領域内の選択されたアミノ酸配列は、群２のＨＡタンパク質の対応する配列と著しく異なる。インフルエンザＨ１およびＨ２（ともに群１から）上の同じエピトープ（ペプチド５Ｐなど）のヘテロ二本鎖コンジュゲートは、Ｈ１およびＨ２ウイルスのそれぞれのホモ二本鎖コンジュゲートを用いて単独で免疫される被験体と比較して、Ｈ１およびＨ２の両方を含有するウイルスでのチャレンジからの保護効果を増強する潜在性を有する。このヘテロ二本鎖「ペプチド５Ｐ：Ｈ１，Ｈ２」コンジュゲートは、単一のＨＡタイプのエピトープに対するホモ二本鎖コンジュゲートを用いた免疫化より、群１におけるＨＡタンパク質を有するインフルエンザ株に対するより広い保護効果をもたらすことが予期される。
【０１２１】
より遠縁のウイルスのステム内の同じアルファヘリックスエピトープを標的にするヘテロ二本鎖鋳型化コンジュゲートも調製することができる。例えば、鋳型化コンジュゲートを、インフルエンザＨ１（群１から）のペプチド３ＭＰから、およびインフルエンザＨ５（群２から）のペプチド３ＭＰから調製することができる。これは、「ペプチド３ＭＰ：Ｈ１，Ｈ５」と呼ばれることになる。この免疫原は、Ｈ１およびＨ５タンパク質の両方の選択されたステム領域に対する抗体を誘発し、インフルエンザウイルスのＨ１およびＨ５株の両方／Ｈ１またはＨ５株でのチャレンジに対して、かつ潜在的に群１および２の両方における他のインフルエンザＡウイルスに対して被験体を保護することが予期される。このようなヘテロ二本鎖免疫原は、念願の広く保護的なユニバーサルインフルエンザワクチンとしての潜在的な効果を伴って、多くの異なるインフルエンザ株に対して、はるかにより広い保護効果をもたらすことが予期される。
【０１２２】
２つの無関係のウイルスのタンパク質中の非相同アルファヘリックス領域に対する抗体を誘発するためのヘテロ二本鎖コンジュゲートの使用。このストラテジーは、単一の免疫原を用いて、いくつかの異なる一般的な呼吸器系ウイルスに対して有効に免疫化することができる。このようなワクチンは、例えば、ウイルス感染にクラス１ウイルス融合タンパク質を使用する無関係の呼吸器系ウイルスに対して有用であるはずである。いくつかの無関係の呼吸器系ウイルスを有効に標的にする単独ワクチンを作製することのメリットは大きい。呼吸器感染症は、ヒトにおいて最も一般的な感染症である。多くの異なる呼吸器系ウイルスが同様の症候群を引き起こすことができ、これらのウイルスのほとんどは、ヒトに非常に効率的に伝染する。配列が、完全に無関係のタンパク質のアルファヘリックスドメインに由来するヘテロ二本鎖コンジュゲートを合成することができるので、２つの無関係の呼吸器系ウイルスのステムドメイン内の重要なアルファヘリックス領域を同時に標的にすることができる免疫原を作製することができる。このようなヘテロ二本鎖コンジュゲートの合成の困難さは、ホモ二本鎖コンジュゲートの合成と同程度である。
【０１２３】
このようなワクチンの一例は、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦ糖タンパク質のステム領域内の非相同エピトープを標的にするワクチンである。このワクチンは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の鋳型化ペプチドＢの１本の鎖に連結したＰＩＶ３  Ｆタンパク質の鋳型化ペプチドＡの１本の鎖からなるヘテロ二本鎖コンジュゲート（ＰＩＶ３ペプチドＡ、ＲＳＶペプチドＢ）を合成することによって構築することができる。ＰＩＶ３およびＲＳＶは、鋳型化ヘテロ二本鎖コンジュゲートが、被験体において２つの無関係の呼吸器系ウイルスから保護する潜在性を示すのに使用されることになる。ＰＩＶ３およびＲＳＶは、生後１年未満の乳児において重要な呼吸器病原体であり、一般に、すべての年齢の人に感染および再感染する。これらのウイルスのいずれに対する能動免疫化も、現在、まったく認可されておらず、有効なワクチンは、大きな価値のあるものとなるはずである。インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、メタニューモウイルス、コロナウイルスＨＫＵ１、２２９Ｅ、ＯＣ４３、およびＮＬ６３、ならびにパラインフルエンザウイルス１、２、４、および５を含めた、クラス１ウイルス融合タンパク質を有する多くの他の呼吸器病原体を、このようにして標的にすることができる。これらの鋳型化コンジュゲートの例を、図１０Ｂおよび図１３Ｂに示す。
【０１２４】
コンジュゲート立体配置
２つのペプチド（これらは、同じ鋳型化エピトープであっても、異なる鋳型化エピトープであってもよい）が、本発明のコンジュゲート中に存在する場合、コンジュゲートは、以下のように分類することができる：
１つのウイルスからの１つのエピトープを含む（したがって、ホモ二本鎖の）タイプＩコンジュゲート；
１つのウイルスからの２つのエピトープを含む（したがって、ヘテロ二本鎖の）タイプＩＩコンジュゲート；
２つのウイルスからの２つのエピトープを含む（したがって、ヘテロ二本鎖の）タイプＩＩＩコンジュゲート。
【０１２５】
インフルエンザ鋳型化コンジュゲート
インフルエンザ鋳型化コンジュゲートを、１つのウイルスからのインフルエンザＡ糖タンパク質赤血球凝集素（ＨＡ）由来の２つの異なるエピトープを含むように設計した（すなわち、タイプＩＩコンジュゲート）。エピトープは、とりわけ、２９残基配列のＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）（３ＭＰと呼ばれる）、ＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）（５Ｐと呼ばれる）、およびＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）（６Ｐと呼ばれる）から選択することができる（図３Ａを参照）。インフルエンザウイルス鋳型化エピトープには、ＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）鋳型化エピトープ３ＭＰ：ＩＫＳＬＱＮＡＩＮＧＬＴＮＫＩＮＴＬＩＥＫＩＮＩＬＦＴＡＣＲＲ−アミド（配列番号：）；ＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）鋳型化エピトープ５Ｐ：ＩＥＮＬＮＫＫＩＤＤＬＦＬＤＩＷＴＬＮＡＥＩＬＶＬＬＥＮＣＲＲ−アミド（配列番号：）；およびＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）鋳型化エピトープ６Ｐ：ＩＲＴＬＤＦＨＩＳＮＬＫＮＬＩＥＫＬＫＳＱＩＫＮＬＡＫＥＣＲＲ−アミド（配列番号：）が含まれる。３つからなるセットから２つを選択すると、ヘテロ二本鎖鋳型化コンジュゲートに使用するための３つの異なる組合せ、すなわち、３ＭＰ／５Ｐ、３ＭＰ／６Ｐ、および５Ｐ／６Ｐがもたらされる（図３Ｂを参照）。
【０１２６】
ＳＡＲＳ鋳型化コンジュゲート
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを、ＳＡＲＳ−コロナウイルスのスパイク糖タンパク質由来の単一のエピトープを含むように設計した（タイプＩコンジュゲート）。図４Ａ（エピトープ）および図４Ｂ（鋳型化コンジュゲート）を参照。これは、ＳＡＲＳ  ＨＲＣ（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープＨＲＣ１：ＩＳＧＬＮＡＳＩＶＮＬＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＩＫＮＬＮＥＳＣＲＲ−アミド（配列番号：）を使用する。
【０１２７】
ＳＡＲＳ／インフルエンザ鋳型化コンジュゲート
複合ＳＡＲＳ／インフルエンザ鋳型化コンジュゲートを設計した。これは、２つの異なるウイルスからの２つの異なるエピトープを含み、タイプＩＩＩコンジュゲートである。一方のエピトープは、インフルエンザＡ糖タンパク質赤血球凝集素に由来し、鋳型化エピトープＰＲ８  ＨＡ２  ３ＭＰ（３８１−４０９）、鋳型化エピトープＰＲ８  ＨＡ２  ５Ｐ（４２０−４４８）、および鋳型化エピトープＰＲ８  ＨＡ２  ６Ｐ（４４８−４７６）、またはそれぞれ、３ＭＰ、５Ｐ、および６Ｐに適合した２９残基インフルエンザ配列から選択される（「インフルエンザ鋳型化コンジュゲート」の下での上記を参照）。他方のエピトープ、ＳＡＲＳ  ＨＲＣ（１１５１−１１７９）鋳型化エピトープＨＲＣ１は、ＳＡＲＳ−コロナウイルスのスパイク糖タンパク質に由来する。図５Ａは、特定の天然に存在するエピトープを示し、一方、図５Ｂは、鋳型化エピトープを使用する鋳型化コンジュゲートを示す。
【０１２８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）鋳型化コンジュゲート
タイプＩコンジュゲートを、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質由来の単一のエピトープを使用して設計した。選択した天然に存在するエピトープは、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）（図６Ａ中のエピトープ１）、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）（図６Ａ中のエピトープ２）、およびＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（４９２−５２０）（図６Ａ中のエピトープ３）である。使用した鋳型化エピトープ配列は、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）鋳型化エピトープ１：ＩＬＨＬＥＧＥＩＮＫＬＫＳＡＩＬＳＬＮＫＡＩＶＳＬＳＮＧＣＲＲ−アミド（配列番号：）、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）鋳型化エピトープ２：ＩＬＳＬＮＫＡＩＶＳＬＳＮＧＩＳＶＬＴＳＫＩＬＤＬＫＮＹＣＲＲ−アミド（配列番号：）、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（４９２−５２０）鋳型化エピトープ３：ＩＳＱＬＮＥＫＩＮＱＬＬＡＦＩＲＫＬＤＥＬＩＨＮＬＮＡＧＣＲＲ−アミド（配列番号：）である。対応するタイプＩ鋳型化コンジュゲートを図６Ｂに示す。
【０１２９】
タイプＩＩコンジュゲートも、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質由来の２つの異なるエピトープを使用して設計した。エピトープを図７Ａに示す。可能な組合せは、鋳型化エピトープ１／２、鋳型化エピトープ１／３、および鋳型化エピトープ２／３であり、これらのヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを図７Ｂに示す。
【０１３０】
パラインフルエンザウイルス３鋳型化コンジュゲート
タイプＩコンジュゲートを、図８Ｂに示したＰＩＶ３  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープ１：ＩＥＫＬＫＥＡＩＲＤＬＮＫＡＩＱＳＬＱＳＳＩＧＮＬＩＶＡＣＲＲ−アミド（配列番号：）、ＰＩＶ３  Ｆ（１５１−１７９）鋳型化エピトープ２：ＩＲＤＬＮＫＡＩＱＳＬＱＳＳＩＧＮＬＩＶＡＩＫＳＬＱＤＹＣＲＲ−アミド（配列番号：）、またはＰＩＶ３  Ｆ（４６０−４８８）鋳型化エピトープ３：ＩＮＫＬＫＳＤＩＥＥＬＫＥＷＩＲＲＬＮＱＫＩＤＳＬＧＮＷＣＲＲ−アミド（配列番号：）のうちの２つのコピーを使用して、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆタンパク質（ＡＡＢ４８６８８．１）由来の単一のエピトープを使用して設計した（図８Ａを参照）。
【０１３１】
タイプＩＩコンジュゲートを、図９Ｂに示した（鋳型化エピトープ１）／（鋳型化エピトープ２）、（鋳型化エピトープ１）／（鋳型化エピトープ３）、または（鋳型化エピトープ２）／（鋳型化エピトープ３）を使用して、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆタンパク質（ＡＡＢ４８６８８．１）由来の２つの異なるエピトープを使用して設計した（図９Ａを参照）。
【０１３２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）／パラインフルエンザウイルス３鋳型化コンジュゲート
ＲＳＶ由来の鋳型化エピトープをＰＩＶ３由来の鋳型化エピトープと組み合わせるタイプＩＩＩコンジュゲートを設計した。天然に存在するエピトープＰＩＶ３  Ｆ（１４４−１７２）、ＰＩＶ３  Ｆ（１５１−１７９）、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）、およびＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）を、図１０Ａに示す。鋳型化コンジュゲート［（鋳型化エピトープＰＩＶ３  Ｆ（１４４−１７２）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）］、［鋳型化エピトープＰＩＶ３  Ｆ（１４４−１７２）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）］、［鋳型化エピトープＰＩＶ３  Ｆ（１５１−１７９）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）］、および［鋳型化エピトープＰＩＶ３  Ｆ（１５１−１７９）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）］を、図１０Ｂに示す。
【０１３３】
パラインフルエンザウイルス５鋳型化コンジュゲート
タイプＩホモ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆタンパク質（ＹＰ＿１３８５１５）由来の単一のエピトープを使用して設計した。天然に存在するエピトープＰＩＶ５  Ｆ（１３０−１５８）、ＰＩＶ５  Ｆ（１４４−１７２）、およびＰＩＶ５  Ｆ（４５３−４８１）について図１１Ａを、ＰＩＶ５  Ｆ（１３０−１５８）鋳型化エピトープ：ＩＮＥＬＡＡＡＩＬＮＬＫＮＡＩＱＫＬＮＡＡＩＡＤＬＶＱＡＣＲＲ−アミド（配列番号：）、ＰＩＶ５  Ｆ（１４４−１７２）鋳型化エピトープ：ＩＱＫＬＮＡＡＩＡＤＬＶＱＡＩＱＳＬＧＴＡＩＱＡＬＱＤＨＣＲＲ−アミド（配列番号：）、およびＰＩＶ５  Ｆ（４５３−４８１）鋳型化エピトープ：ＩＡＡＬＮＫＳＩＳＤＬＬＱＨＩＡＱＬＤＴＹＩＳＡＬＴＳＡＣＲＲ−アミド（配列番号：）を使用する鋳型化コンジュゲートについて図１１Ｂを参照。
【０１３４】
タイプＩＩコンジュゲートを、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆタンパク質由来の２つの異なるエピトープを使用して設計した。エピトープを図１２Ａに示し、ヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲートを図１２Ｂに示す。
【０１３５】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）／パラインフルエンザウイルス５鋳型化コンジュゲート
ＲＳＶ由来のエピトープをＰＩＶ５由来のエピトープと組み合わせるタイプＩＩＩコンジュゲートを設計した。パラインフルエンザエピトープは、ＰＩＶ５  Ｆ（１３０−１５８）およびＰＩＶ５  Ｆ（１４４−１７２）であり、ＲＳＶエピトープは、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）およびＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）である（図１３Ａを参照）。ヘテロ二本鎖鋳型化ペプチドコンジュゲート（図１３Ｂを参照）は、鋳型化エピトープＰＩＶ５  Ｆ（１３０−１５８）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）、鋳型化エピトープＰＩＶ５  Ｆ（１３０−１５８）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）、鋳型化エピトープＰＩＶ５  Ｆ（１４４−１７２）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）、および鋳型化エピトープＰＩＶ５  Ｆ（１４４−１７２）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）を組み合わせる。
【０１３６】
パラインフルエンザウイルス４鋳型化コンジュゲート
タイプＩコンジュゲートを、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆタンパク質（ＢＡＪ１１７４５）由来の単一のエピトープを使用して設計した。天然に存在するエピトープＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）、ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）、およびＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（４４７−４７５）について図１４Ａを参照。パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）鋳型化エピトープ：（ＩＱＥＬＡＫＬＩＬＴＬＫＫＡＩＴＥＬＮＥＡＩＲＤＬＡＮＳＣＲＲ−アミド（配列番号：））、パラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）鋳型化エピトープ：（ＩＴＥＬＮＥＡＩＲＤＬＡＮＳＩＫＩＬＶＫＭＩＳＡＬＱＮＱＣＲＲ−アミド（配列番号：））、およびパラインフルエンザウイルス４  ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（４４７−４７５）鋳型化エピトープ：（ＩＬＤＬＳＴＤＩＮＱＬＮＱＬＩＫＳＬＥＤＨＩＱＲＬＴＤＹＣＲＲ−アミド（配列番号：））を使用する鋳型化コンジュゲートについて図１４Ｂを参照。
【０１３７】
タイプＩＩコンジュゲートを、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）Ｆタンパク質由来の２つの異なるエピトープを使用して設計した。エピトープを図１５Ａに示し、鋳型化コンジュゲートを図１５Ｂに示す。
【０１３８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）／パラインフルエンザウイルス４鋳型化コンジュゲート
ＲＳＶ由来のエピトープをＰＩＶ４由来のエピトープと組み合わせるタイプＩＩＩコンジュゲートを設計した。ＲＳＶエピトープは、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）およびＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）であり、ＰＩＶ４エピトープは、ＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）およびＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）である（図１６Ａを参照）。鋳型化コンジュゲート（図１６Ｂを参照）は、鋳型化エピトープＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）／鋳型化エピトープＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）、鋳型化エピトープＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１３１−１５９）／ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）、鋳型化エピトープＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）／ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１７１−１９９）、および鋳型化エピトープＰＩＶ  ４Ａ  Ｆ（１４５−１７３）／ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ（１５７−１８５）を組み合わせる。
【０１３９】
配列のバリエーション
鋳型化エピトープのバリエーションを、コンジュゲートに使用することができる。本記述には、配列情報によるバリアント、および指定されたレベルの相対相同性またはパーセント同一性にあることによって関係づけられる配列が含まれることを、当業者は理解するはずである。
【０１４０】
本明細書に開示される鋳型化エピトープと、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有する鋳型化エピトープのバリアントを使用することができる。一実施形態では、バリエーションは、同類置換である。別の実施形態では、バリアントは、開示される鋳型化エピトープに対して１、２、３、４、または５つの変化を有する。置換または変更は、ｂ位、ｃ位、ｅ位、ｆ位、またはｇ位において行われ、一方、７アミノ酸反復のａ位およびｄ位は、鋳型化エピトープの配列中に見出されるように残される。
【０１４１】
比較のために配列を整列する方法は、当技術分野で周知である。したがって、任意の２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。このような数学アルゴリズムの例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１頁）のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈら（１９８１年、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁）の相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁）の類似性検索法、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０巻：５８７３頁）のように改良された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：２２６４頁）のアルゴリズムである。Ｒａｇｈａｖａ  ＧＰ、Ｂａｒｔｏｎ  ＧＪ．、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００６年９月１９日；７巻：４１５頁。Ｒａｇｈａｖａ  ＧＰ、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＭ、Ａｕｄｌｅｙ  ＰＣ、Ｂａｒｂｅｒ  ＪＤ、Ｂａｒｔｏｎ  ＧＪ．、ＯＸＢｅｎｃｈ：ａ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｃｃｕｒａｃｙ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００３年１０月１０日；４巻：４７頁。
【０１４２】
これらの数学アルゴリズムのコンピューターによる実施を、配列を比較して配列同一性を決定するのに利用することができる。このような実施には、それだけに限らないが、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）、ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡから入手可能）が含まれる。これらのプログラムを使用する整列は、デフォルトのパラメータを使用して実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８年、Ｇｅｎｅ、７３巻：２３７頁）、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９年、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１頁）、Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：１０８８１頁）、Ｈｕａｎｇら（１９９２年、ＣＡＢＩＯＳ、８巻：１５５頁）、およびＰｅａｒｓｏｎら（１９９４年、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２４巻：３０７頁）によって十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、上記のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３頁、および１９９７年、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁）のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、上記のアルゴリズムに基づく。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公的に入手可能である。
【０１４３】
本明細書において、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウ中のポリペプチド配列の部分は、２つの配列を最適に整列するための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。百分率は、アミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を求めて、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、比較のウィンドウ中の位置の合計数で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって計算される。長さの異なる２つの配列が比較される場合、パーセント配列同一性は、より短い配列の長さに対して計算されることに留意されるべきである。
【０１４４】
天然に存在するアミノ酸残基は、一般的な側鎖の特性に基づく群、すなわち、（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ、（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅに分けられる。同様のアミノ酸の置換は、親水性／疎水性に基づいても行うことができる。本研究で使用される親水性／疎水性のスケールを、以下の通り列挙する：Ｔｒｐ、３３．０；Ｐｈｅ、３０．１；Ｌｅｕ、２４．６；Ｉｌｅ、２２．８；Ｍｅｔ、１７．３；Ｔｙｒ、１６．０；Ｖａｌ、１５．０；Ｐｒｏ、１０．４；Ｃｙｓ、９．１；Ｈｉｓ、４．７；Ａｌａ、４．１；Ｔｈｒ、４．１；Ａｒｇ、４．１；Ｇｌｎ、１．６；Ｓｅｒ、１．２；Ａｓｎ、１．０；Ｇｌｙ、０．０；Ｇｌｕ、−０．４；Ａｓｐ、−０．８、およびＬｙｓ、−２．０。これらの疎水性係数は、２０すべての天然に存在するアミノ酸の１個の置換を伴ったモデルランダムコイルペプチドのｐＨ７（５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのＰＯ４緩衝液）での逆相クロマトグラフィーから求めた（Ｋｏｖａｃｓ，  Ｊ．Ｍ．、Ｃ．Ｔ．  Ｍａｎｔ、およびＲ．Ｓ．  Ｈｏｄｇｅｓ、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｏｒ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）８４巻：２８３〜２９７頁（２００６年）を参照）。本発明者らは、このＨＰＬＣで得られるスケールは、２０のアミノ酸側鎖の親水性（ｈｙｄｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）／疎水性の相対的差異を、以前に求められたスケールより正確に反映することを提案した（Ｍａｎｔ，  Ｃ．Ｔ．、Ｊ．Ｍ．  Ｋｏｖａｃｓ、Ｈ．Ｍ．  Ｋｉｍ、Ｄ．Ｄ．  Ｐｏｌｌｏｃｋ、およびＲ．Ｓ．  Ｈｏｄｇｅｓ、Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｍｏｄｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｓｃａｌｅｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）９２巻：５７３〜５９５頁（２００９年）を参照）。
【０１４５】
バリアントポリペプチドを生成するための例示的な置換には、以下に示されるものが含まれる。「ｂ」位、「ｃ」位、「ｅ」位、「ｆ」位、および「ｇ」位は、置換に最も寛容であるが、限定された数の置換を、「ａ」位、および「ｄ」位で行うことができる。したがって、本明細書に記載されるペプチドの実施形態のいずれにおいても、「ａ」位、または「ｄ」位の残基のうちの１個、２個、または３個を、示された残基から変更することができる。一実施形態では、１個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から選択される。一実施形態では、２個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、３個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、１個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から選択される。一実施形態では、２個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、３個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、１個または２個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択され、１個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。一実施形態では、１個の「ａ」残基が、イソロイシン以外のアミノ酸から独立に選択され、１個または２個の「ｄ」残基が、ロイシン以外のアミノ酸から独立に選択される。以下の置換は、「ａ」位、「ｂ」位、「ｃ」位、「ｄ」位、「ｅ」位、「ｆ」位、および「ｇ」位で許される置換の例であるが、置換は、以下の表に列挙されたものに限定されない。
【０１４６】
【表１−１】
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ペプチドエピトープの合成
本発明で使用されるペプチドエピトープは、当技術分野で公知の化学的または生物学的方法によって調製することができる。これらの方法には、固相ペプチド合成、溶液相ペプチド合成、断片縮合（溶液相中または固相上で）、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。
【０１４７】
一実施形態では、ペプチドエピトープは、固相ペプチド合成によって合成される（ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）、１９８４年；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．、１９６３年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、８５巻：２１４９〜２１５４頁；Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２０００年を参照）。ペプチドエピトープは、別個に合成および精製することができ、ペプチドエピトープは、両エピトープの合成および精製が完了した後、結合させることができる。あるいは、ペプチドエピトープは、ペプチドエピトープの結合の維持を補助するリンカー上で合成することによって順次または同時に合成される。例えば、形態Ｈ２Ｎβ−（ＣＨ２）−ＣＨ（ＮαＨ２）−ＣＯＯＨの分岐分子を、そのカルボキシル基を介して固相合成樹脂、例えば、架橋ベンズヒドリルアミンまたはメチルベンズヒドリルアミン樹脂などに付着することができる。α窒素およびβ窒素は、直交性に保護することができ（Ｍｔｔ基とＦｍｏｃ基、ｉｖＤｄｅ基とＦｍｏｃ基を用いて、またはＡｌｌｏｃ基とＦｍｏｃ基を用いてなど）、一方の鎖が所望の長さに合成され、その後、他方の鎖がその所望の長さに合成される。次いで、共有結合的に連結された二本鎖ペプチドは、固相樹脂から切断され、精製される。
【０１４８】
ペプチドは、慣例的な修飾、例えば、Ｎ末端残基のアセチル化、Ｃ末端残基のアミド化、またはＮ末端残基のアセチル化とＣ末端残基のアミド化の両方などを有することができる。
【０１４９】
コンジュゲートを使用する方法
本発明の鋳型化コンジュゲートは、様々な方法で使用することができる。一態様では、鋳型化コンジュゲートは、個体の免疫応答（例えば、抗体応答）を増強するために、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用され得る。免疫応答の増強は、コンジュゲートに曝露されない場合の個体の免疫応答に対するものである。本発明の別の態様では、コンジュゲートは、コンジュゲートを与えられている個体において免疫応答（例えば、抗体応答）を誘導するのに使用され得る。例えば、個体の抗体応答は、対象とするウイルス（複数可）および／または病原体（複数可）の中和により有効である、より多い量の１つおよび／または複数の抗体を生成することによって増強または誘導することができる。抗体応答は、抗体の標的により大きい親和性を伴って結合する抗体を生成することによっても増強または誘導することができる。場合によっては、生成される抗体は、様々なサブタイプのウイルス株に結合することができる。本明細書に記載されるコンジュゲートを使用することによって誘導または増強される抗体は、立体構造エピトープおよび線状エピトープに向けることができる。
【０１５０】
他の態様では、本明細書に記載されるコンジュゲートを含む組成物は、抗体を産生することができる血漿細胞および／またはメモリーＢ細胞の数を増加させるのに使用され得る。特異的抗体応答を測定するための方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれ、これは、当技術分野で周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）を参照。いくつかの態様では、本明細書に記載されるコンジュゲートを投与すると、抗体産生に有用であるサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３）を誘導することができる。サイトカイン濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。免疫原に対する免疫応答を評価するためのこれらのアッセイおよび他のアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８０年）ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）を参照。
【０１５１】
したがって、本明細書に記載されるコンジュゲートは、免疫原性組成物と考えることができる。一態様では、コンジュゲートは、免疫原性組成物中の成分であり得る。別の態様では、コンジュゲートは、ワクチン組成物中の成分であり得る。
【０１５２】
一態様では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、ウイルス感染が低減され、いくつかの場合では、阻害されるように、個体の免疫応答（例えば、抗体産生または抗体応答）を誘導または増強するのに使用される。ウイルス感染の低減は、免疫応答が誘導または増強されなかった場合に起こる感染の量から、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ウイルス感染のアッセイは、慣例的であり、当業者に公知である。
【０１５３】
別の態様では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、ウイルス複製が低減され、いくつかの場合では、阻害されるように、個体の免疫応答（例えば、抗体産生または抗体応答）を誘導または増強するのに使用される。ウイルス複製の低減は、免疫応答が誘導または増強されなかった場合に起こる複製の量から、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ウイルス複製のアッセイは、慣例的であり、当業者に公知である。
【０１５４】
投与量
コンジュゲートの投与を必要とする個体に投与される、ワクチンとして使用される場合のコンジュゲートの量は、様々な要因、例えば、ウイルス感染のタイプ、ワクチンを受けている個体からの生物学的および／または生理的応答、ならびに当業者に公知の他の要因などによって決定され得る。したがって、投与されるコンジュゲートの量は、それなりに調整することによって、所望の有利な効果を実現することができる。一態様では、使用されるコンジュゲートの量は、個体１ｋｇ当たり少なくとも約１μｇのコンジュゲートである。他の態様では、使用されるコンジュゲートの量は、少なくとも約２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２１μｇ／ｋｇ、２２μｇ／ｋｇ、２３μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、２６μｇ／ｋｇ、２７μｇ／ｋｇ、２８μｇ／ｋｇ、２９μｇ／ｋｇまたは３０μｇ／ｋｇである。他の態様では、使用されるコンジュゲートの量は、少なくとも約３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇである。他の態様では、使用されるコンジュゲートの量は、個体１ｋｇ当たり、約１μｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２１μｇ／ｋｇ、２２μｇ／ｋｇ、２３μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、２６μｇ／ｋｇ、２７μｇ／ｋｇ、２８μｇ／ｋｇ、２９μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、または１００μｇのコンジュゲートである。
【０１５５】
他の態様では、使用されるコンジュゲートの量は、個体１ｋｇ当たり、せいぜい約１μｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２１μｇ／ｋｇ、２２μｇ／ｋｇ、２３μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、２６μｇ／ｋｇ、２７μｇ／ｋｇ、２８μｇ／ｋｇ、２９μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、または１００μｇのコンジュゲートである。他の態様では、本発明は、上記に示した値のいずれかの範囲の投与量をもたらす。例えば、投与量範囲の下限を、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２１μｇ／ｋｇ、２２μｇ／ｋｇ、２３μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、２６μｇ／ｋｇ、２７μｇ／ｋｇ、２８μｇ／ｋｇ、２９μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇとすることができ、一方、投与量範囲の上限を、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２１μｇ／ｋｇ、２２μｇ／ｋｇ、２３μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、２６μｇ／ｋｇ、２７μｇ／ｋｇ、２８μｇ／ｋｇ、２９μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、または１００μｇ／ｋｇとすることができる。
【０１５６】
投与様式
本明細書に記載されるコンジュゲートは、様々な方法で投与することができる。一態様では、コンジュゲートは、注射用化合物として投与される。注射は、針注射または無針注射（例えば、ジェット注射）によるものとすることができる。別の態様では、コンジュゲートは、鼻腔内送達として投与される。コンジュゲートは、筋肉内、皮下、皮内、または３つすべてのある組合せで投与することもできる。注射のこれらのタイプは、当業者に公知である。
【０１５７】
投与のタイミング
本発明のコンジュゲートは、様々なタイミングで投与することができる。タイミングは、個体の免疫パラメータに基づいて当業者によって容易に決定され得る。一態様では、一回投与が企図されている。他の態様では、一回を超えるコンジュゲートの投与が企図されている。これらの場合では、コンジュゲートは、２、３、４、５回、またはそれ以上の回数投与することができる。
【０１５８】
コンジュゲートが一回を超えて投与される場合、投与同士間の間隔は、個体の必要に応じて異なる継続時間のものとすることができる。いくつかの態様では、投与同士間の間隔は、約１、２、３、４、５、６、または７日である。他の態様では、投与同士間の間隔は、約８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日である。他の態様では、間隔は、約２．５、３、３．５、または４週間である。他の態様では、１カ月単位の間隔が企図されている。コンジュゲートは、個体における免疫パラメータの試験に基づいて、あるいは個体によって経験されている症状、またはウイルス（複数可）および／もしくは他の病原体（複数可）への個体の曝露に基づいて、必要性を決定した後、投与することができる。
【０１５９】
医薬組成物
本発明のコンジュゲートは、医薬組成物および／または免疫原性組成物と考えることができる。本明細書に記載される他の担体に加えて、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含んでもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在し得る。コンジュゲートは、その後再構成し、本発明に従って使用するために、当技術分野で周知の手段を使用して凍結乾燥することもできる。
【０１６０】
吸収促進剤、洗剤、および化学性刺激物（例えば、角質溶解剤（ｋｅｒｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ））を、標的組織への送達を増強するのに使用することができる。有機薬物、およびペプチド系薬物の粘膜送達において使用されて成功している吸収促進剤および洗剤に関する一般的原理に関する参考文献については、Ｃｈｉｅｎ、Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、４章（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２年）を参照。
【０１６１】
特に、適当な経鼻吸収促進剤の例は、Ｃｈｉｅｎ、上記、５章、表２および３に示されており、より穏やかな作用物質が好適である。粘膜／経鼻送達のために本発明の方法で使用するのに適した作用物質は、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｓａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、「Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、９章、およびその表３〜４Ｂ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２年）にも記載されている。皮膚を通じた薬物の吸収を増強することが公知である適当な作用物質は、Ｓｌｏａｎ、Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｇｕｌａｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  Ｄｅｓｃｒｉｂｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、５章、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２年）、およびこの教科書の他の場所に記載されている。
【０１６２】
医薬組成物は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するのに使用するために製剤化されたワクチンも含むことができる。一態様では、本発明は、およそ等しい長さの２つの鋳型化アルファヘリックスポリペプチドであって、各ポリペプチドは、少なくとも１つの７アミノ酸反復を含み、２つのポリペプチドは、約９０％未満の配列同一性を有する、ポリペプチドと、２つのポリペプチドの間の共有結合性連結と、ポリペプチドの１つに共有結合的に連結した担体タンパク質とを含むワクチンを提供する。
【０１６３】
ワクチンは、ここで記載される担体も含むことができる。使用することができる担体には、それだけに限らないが、ミョウバン、微粒子、リポソーム、およびナノ粒子が含まれる。
【０１６４】
アジュバント
コンジュゲート、免疫原、およびワクチンは、アジュバントとともに投与することもできる。例示的なアジュバントには、ミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク；水酸化アルミニウム））、ならびにフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントが含まれる。
【０１６５】
滅菌性
コンジュゲート、免疫原、およびワクチンは、滅菌組成物として投与することができる。滅菌した医薬製剤は、当業者に公知の医薬品グレード滅菌基準（米国薬局方７９７章、１０７２章、および１２１１章、カリフォルニア州企業職業法４１２７．７項、カリフォルニア州規則集タイトル１６、１７５１項、連邦規制基準タイトル２１、２１１項）に従って、配合または製造される。
【０１６６】
キット
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートを含むキット（または製造品）を提供する。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載されるコンジュゲートを含む組成物、および（ｂ）被験体において組成物を使用するための指示書の両方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、指示書は、ラベル上にある。他の実施形態では、指示書は、キット内に入れられたインサート上にある。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載されるコンジュゲートを含む組成物、および（ｂ）被験体に組成物を投与するための指示書の両方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、指示書は、ラベル上にある。他の実施形態では、指示書は、キット内に入れられたインサート上にある。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載されるコンジュゲートを含む組成物、および（ｂ）組成物が投与される被験体を選択するための指示書の両方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、指示書は、ラベル上にある。他の実施形態では、指示書は、キット内に入れられたインサート上にある。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）それぞれが本明細書に記載されるコンジュゲートを含む少なくとも２つの組成物、および（ｂ）個体に投与するための１つまたは複数の組成物を選択するための指示書の両方を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、指示書は、ラベル上にある。他の実施形態では、指示書は、キット内に入れられたインサート上にある。
【実施例】
【０１７１】
合成実施例
（合成実施例１）
鋳型化コンジュゲート中の２つのペプチドエピトープ間のジスルフィド連結
ジスルフィド架橋されたペプチドエピトープを形成するために、以下の手順を使用する：１．エピトープ１（例えば、アセチル化されたペプチド）を合成し；２．エピトープ１を切断および分析し；３．逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって、エピトープ１を精製し；４．画分を分析し、合わせ、凍結乾燥し；５．ＤＴＤＰを用いてエピトープ１のＣｙｓを誘導体化してエピトープ１  ＴＰを得；６．ＲＰ−ＨＰＬＣによって、エピトープ１  ＴＰを精製し；７．エピトープ２（例えば、Ｎｌｅ−Ｇ−Ｇリンカーを含むことができる）を合成し；８．エピトープ２を切断および分析し；９．ＲＰ−ＨＰＬＣによって、エピトープ２を精製し；１０．画分を分析し、合わせ、凍結乾燥し；１１．エピトープ１  ＴＰとエピトープ２の間にジスルフィド架橋を形成し；１２．ＲＰ−ＨＰＬＣによって、ジスルフィド架橋されたエピトープ１−エピトープ２を精製し；１３．画分を分析し、合わせ、凍結乾燥し；１４．ジスルフィド架橋されたエピトープ１−エピトープ２のＮ末端をヨードアセチル化し；１５．ＲＰ−ＨＰＬＣによって、ヨードアセチル化された、ジスルフィド架橋されたエピトープ１−エピトープ２を精製し；１６．画分を分析し、合わせ、凍結乾燥し；１７．ジスルフィド架橋されたエピトープ１−エピトープ２を担体タンパク質にコンジュゲートし；１８．担体タンパク質コンジュゲートを透析および凍結乾燥する。
【０１７２】
２つのシステイン含有ペプチド間のジスルフィドリンカー（任意選択のリンカーＣ）の合成。システイン含有ペプチドを２，２’−ジチオジピリジンと反応させて、混合ジスルフィド［ペプチド］−Ｓ−Ｓ−２−ピリジン（すなわち、［ペプチド−Ｓ−２−チオピリジン］）を形成する。そのシステイン残基上に遊離チオール部分を含有する第２のペプチドを付加して、ジスルフィド連結二本鎖ペプチド（これは、ホモ鎖であっても、ヘテロ鎖であってもよい）を形成する。
【０１７３】
ステップ１：反応の第１ステップを、１：１０のペプチド：ＤＴＤＰのモル比で実施する。ペプチド（例えば、２０ｍｇ）を、反応溶液（３：１（ｖ／ｖ）の酢酸／Ｈ２Ｏ）６ｍｌ中に溶解させる。１０当量の２，２’−ジチオピリジン（ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（ＤＴＤＰ）をＤＭＦ  １００μｌ中に添加し、反応物を室温で４時間攪拌する。反応をＬＣ−ＭＳによってモニターして、ペプチド−ＴＰ生成物の形成を検出することができる。反応が完了した後、反応混合物をＨ２Ｏ中に希釈し、その後、ＨＰＬＣ（例えば、逆相ＨＰＬＣ）によって精製する。ＨＰＬＣから収集した画分（複数可）をフリーズドライして、精製ペプチド−ＴＰを得る。
【０１７４】
ステップ２：ステップ１からのペプチド−ＴＰ生成物、および遊離チオールを含有する第２のペプチドを、６ＭのＧｄｎＨＣｌを含むｐＨ５．５の４０ｍＭのＮＨ４Ａｃ  １０ｍｌ中に当モル量で溶解させる。反応物をＲＴで１時間インキュベートする。二本鎖ペプチドの形成は、ＬＣ−ＭＳによってモニターすることができる。反応が完了した後、二本鎖ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、収集した画分（複数可）をフリーズドライして、ジスルフィド連結二本鎖ペプチドを得る。
【０１７５】
ジスルフィド連結二本鎖ペプチドのヨードアセチル化。試薬、反応物、および生成物を光から保護して、ヨード酢酸無水物を、１００ｍＭの濃度で１，４−ジオキサン中に溶解させる。ジスルフィド連結二本鎖ペプチドを、ｐＨ６．０／６０％のＡＣＮの１００ｍＭのＭＥＳ中に、０．１５ｍＭで別個に溶解させる。ヨード酢酸無水物溶液を、１．２：１のモル比に到達するまでペプチド溶液に徐々に添加し、ＲＴで１０分間インキュベートする。反応をＨＰＬＣによってモニターする。完了後、ヨードアセチル化物をＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥する。
【０１７６】
ヨードアセチル化は、ヨードアセチル化されたジスルフィド連結二本鎖ペプチドを、６ＭのＧｄｎＨＣｌ、ＰＢＳ、ｐＨ８．６中に溶解させ、１０ｍＭの濃度でＤＴＴを添加することによって確認することができる。ＤＴＴは、ジスルフィド結合を還元し、ヨードアセチル基とも反応する。反応物は、ジスルフィド結合の還元のために、ＬＣ−ＭＳによって分析されるとき、２つのピークを生じるはずであり、質量は、以前にヨードアセチル化されたペプチドがＤＴＴ−アセチル基の追加の質量を有する場合、別個のペプチドに対応するはずである。
【０１７７】
遊離チオール基を導入するための、トラウト試薬によるＫＬＨの修飾。ＫＬＨを、ＰＢＳ、ｐＨ８．９；８Ｍの尿素、５ｍＭのＥＤＴＡ  １ｍｌ中に溶解させて、ＫＬＨの０．１ｍＭの溶液を調製する。トラウト試薬を、４ｍｇ／ｍｌ（２８ｍＭ）で水中に溶解させる。このトラウト試薬を、１：４０のモル比でＫＬＨ溶液に添加する。混合物を、光から保護しながら、ＲＴで１時間インキュベートする。未使用のトラウト試薬を、透析を使用して除去する。
【０１７８】
ヨードアセチル化された、共有結合的に連結された二本鎖ペプチドの、トラウト試薬によって修飾されたＫＬＨへのコンジュゲーション。ヨードアセチル化された、共有結合的に連結された二本鎖ペプチドを、トラウト試薬によって修飾されたＫＬＨと、６：１の二本鎖ペプチド：ＫＬＨの比で、８Ｍの尿素およびＰＢＳ中で、ＲＴで最大４８時間反応させる。コンジュゲーションの進行を逆相ＨＰＬＣによって追跡する。反応を終わらせるために、２８ｍＭの濃度の水１ｍｌ中のヨードアセトアミドを反応物に添加し、反応物をＲＴで３０分間インキュベートする。透析を使用して、ＰＢＳ／８Ｍの尿素、５０％のＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／０．２％のＴＦＡ中で、遊離ペプチドを除去する。試料をフリーズドライすることによって、無塩ＫＬＨ−ペプチドコンジュゲートを得る。
【０１７９】
ヨードアセチル化された、ジスルフィド連結二本鎖ペプチドの、トラウト試薬によって修飾されたＢＳＡへのコンジュゲーション。ＢＳＡ、６８ｋＤ（トラウト試薬で修飾済み、０．２ｍＭ、８Ｍの尿素、ＰＢＳ）の溶液Ａ、ならびにヨードアセチル化された二本鎖ペプチド（０．５ｍＭ、８Ｍの尿素、ＰＢＳ）の溶液Ｂを調製した後、以下の反応を行う：反応Ｘ：１：５のＡ：Ｂで、８Ｍの尿素、ＰＢＳ中でＡ  ２０μｌをＢ  ４０μｌと、ＲＴで１時間、４時間、および一晩反応させる。（ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を使用してコンジュゲーションをモニターする）；ならびに反応Ｒ：１：５のＡ：Ｂで、８Ｍの尿素、ＰＢＳ中でＡ  ８０μｌをＢ  １６０μｌと、ＲＴで１時間、４時間、および一晩反応させる。（ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を使用してコンジュゲーションをモニターする）。２８ｍＭの濃度の水１ｍｌ中のヨードアセトアミドを調製し、１００μｌを反応ＸおよびＲに添加し、その後ＲＴで３０分間インキュベートする。ＸとＲを合わせ、透析することによって、ＰＢＳ／８Ｍの尿素中で、次いで水／６０％のＡＣＮ／０．２％のＴＦＡ中で遊離ペプチドを除去する。逆相ＨＰＬＣ分析を使用して、遊離ペプチドの除去をモニターする。試料をフリーズドライすることによって、無塩ＢＳＡ−二本鎖ペプチドコンジュゲートを得る。
【０１８０】
（合成実施例２）
鋳型化コンジュゲート中の２つのペプチドエピトープ間のジアミノプロピオン酸連結
以下の樹脂に結合した二保護された（ｄｉｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）２，３−ジアミノプロピオン酸試薬：
【０１８１】
【化７】
2014508144.tif 000010
から出発して、Ｃ末端で共有結合的に連結された２本鎖ペプチド複合体を、容易に合成することができる。Ｆｍｏｃ基を、樹脂に結合した２，３−ジアミノプロピオン酸のアルファ窒素から除去し、アセチル化されたエピトープ１を合成する。樹脂に結合した２，３−ジアミノプロピオン酸のベータ窒素から保護基ＰＧ（ＰＧは、Ａｌｌｏｃ、Ｍｔｔ、またはｉｖＤｄｅなどの保護基とすることができる）を選択的に脱保護した後、Ｎｌｅ−Ｇ−Ｇ−エピトープ２を合成する。Ｎｌｅ−Ｇ−Ｇ−エピトープ２のＮ末端のヨードアセチル化を実施し、その後、樹脂からペプチドを切断する。ペプチド複合体を逆相ＨＰＬＣによって精製し、画分を分析し、合わせ、凍結乾燥する。次いで、ペプチド複合体を担体タンパク質にコンジュゲートし、その後、担体タンパク質−ペプチド複合体コンジュゲートを透析および凍結乾燥する。
【０１８２】
生物学的な実施例
抗ペプチド抗体の生成、精製、および特徴付け。各鋳型化コンジュゲートについて、３匹のニュージーランド白ウサギを、２つの筋肉内部位で免疫する。一次用量は、フロイント完全アジュバントとともにコンジュゲート５０μｇを含有する。７、２８、および５０日目のブースターは、フロイント不完全アジュバント中にコンジュゲート５０μｇを含有する。あるいは、ウサギを、２つの筋肉内部位で、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）水酸化アルミニウムアジュバントとともにコンジュゲート５０μｇで免疫し、７、２８、および５０日目にブースター免疫化を行う。動物を免疫するのに使用するコンジュゲートの量は、得られる応答に基づいて調整する。５８日目に血清を収集し、抗体をプロテインＧ親和性クロマトグラフィーで精製する。ウサギを安楽死させると同時にさらなる試料を収集する。ＢＳＡ−ペプチドコンジュゲートでコートされたプレートを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施することによって、抗体のそれぞれのコイルドコイル鋳型について、抗体の特異性を評価する。
【０１８３】
鋳型化コンジュゲートに対するウサギＩｇＧを用いたマウスの受動免疫、および病原体を用いたチャレンジに対する応答。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ウイルスチャレンジに対して−１、１、および３日目にウサギにおいて生成された抗体をマウス１匹当たり１ｍｇで、腹腔内経路によって受動免疫する。対照動物に、免疫前ウサギ抗体、または緩衝液単独を投与する。０日目に、マウスに、１０ＬＤ５０の病原体、または緩衝液で鼻腔内にチャレンジする。体重変化および死亡率を、２週間にわたって毎日モニターする。動物が死亡または安楽死した後、ウイルス力価を測定し、病理組織学的試験を実施する。
【０１８４】
コンジュゲートの生物物理学的試験。生物物理学的試験を実施して、コンジュゲートを特徴付ける。ワクチンとして使用するためのペプチドの構造および安定性を、温和な緩衝液（ＰＢＳ）中、および５０％のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中で、円偏光二色性（ＣＤ）分光法によって、かつ熱変性プロファイルによっても評価する。鋳型化ペプチドのオリゴマー化状態を、分析的超遠心分離分析およびサイズ排除クロマトグラフィーによって検査する。
【０１８５】
抗体の特徴付け。免疫原に対するウサギ抗体を、例えば、ペプチド特異性、親和性、および構造依存性の特質に関して特徴付ける。分析は、抗体が、免疫ペプチドに特異的であるか否か、ペプチド免疫原のアルファヘリックス構造、またはペプチド免疫原が由来するタンパク質（複数可）全体のネイティブコンホメーションを認識するか否かの特性を含むことができる。
【０１８６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。免疫ペプチドに対するウサギ抗体の特異性を特徴付けるために、ＥＬＩＳＡアッセイを行う。コンジュゲートを、９６ウェルポリスチレンプレートにコートする。ブロッキングのために、５％のＢＳＡを使用する。ウサギＩｇＧ抗体またはウサギ免疫前血清由来のＩｇＧのＰＢＳ中の連続１０倍希釈液を、結合抗原とともにインキュベートし、西洋わさびペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて結合ＩｇＧを検出する。それぞれのウサギ抗ペプチドＩｇＧまたは正常血清由来のＩｇＧを、免疫原、およびＢＳＡ単独に対しても試験することによって、合成ペプチド免疫原に対する抗体の特異性を判定する。水酸化アルミニウムアジュバントとともに投与される各コンジュゲートの免疫原性の判定は、ＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルを与える抗体の希釈液によって示される。
【０１８７】
同様に、ＥＬＩＳＡを実施することによって、各抗体が、立体配置的に安定化された二本鎖コイルドコイルペプチド（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）免疫原のみを認識するか、または免疫原、および天然エピトープ配列を含む一本鎖ペプチドの両方を認識するかを判定する。このアッセイでは、天然エピトープ配列を、一本鎖ペプチドとしてＢＳＡにカップリングさせる。これは、ネイティブタンパク質から取り出されるので、構造化されない可能性がある。アルファヘリックスエピトープに特異的ないくつかの高親和性抗体は、一本鎖、非構造化ペプチド抗原に、これをヘリックス構造と仮定するように誘導することによって結合することができる。特定の免疫原については、この免疫原によって生成されるいくつかの抗体は、この免疫原と天然ペプチドの両方を認識することができるが、他の免疫原に対する抗体は、この免疫原のコイルドコイル構造に特異的となり得る。
【０１８８】
抗体の天然可溶性またはアンカー型三量体ＨＡタンパク質への結合。免疫前またはナイーブウサギＩｇＧに対するウサギ抗体の、ネイティブタンパク質中のアルファヘリックスエピトープを特異的に認識する能力。これは、ＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーによって行う。ネイティブタンパク質は、適切な細胞中で発現され、親和性精製される。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、誘導されたウサギ抗体対通常のウサギＩｇＧの、ネイティブタンパク質中の標的エピトープへの結合性を比較する。
【０１８９】
可溶性ＨＡ三量体についての抗ペプチド抗体の交差反応性の評価。多様な病原体株に関するものを含めて、結合パラメータを評価する。様々な病原体株由来のペプチド免疫原への抗血清の結合親和性を、表面プラズモン共鳴技法を使用して、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーを用いて定量化する。免疫原のそれぞれに対する免疫血清からのＩｇＧ、または免疫前血清からのＩｇＧを、バイオセンサーチップ表面上に固定化する。各株由来の精製可溶性天然エピトープを、固定化された抗血清上に流す。センサーグラムを作成して、結合のオン率およびオフ率、ならびに所与の抗体配合物についての対応する親和定数を示す。
【０１９０】
中和アッセイ。ペプチド免疫原に対する抗体を、病原体の中和について試験する。マイクロ中和アッセイは、ウサギ抗ペプチド抗体の病原体中和活性を評価する。アッセイでは、１００  ＴＣＩＤ５０の病原体を、等体積の抗体の４倍連続希釈液とともに、３７℃で１時間インキュベートする（ストックＩｇＧ濃度、２ｍｇ／ｍｌ）。対象とする病原体の感染に感受性の組織培養細胞株を各ウェルに添加し、プレートを１８時間インキュベートする。コンジュゲートのエピトープ領域と異なるウイルスの部分に対するＭａｂを用いて、間接ＥＬＩＳＡによって、アルコール固定細胞内のウイルス抗原を検出する。対照には、媒体のみで接種されたウェル、ＩｇＧを含まない、ウイルスのみを含む細胞、および免疫前ウサギ血清からのＩｇＧの希釈液と混合されたウイルスが含まれる。結果は、病原体を中和する抗体の能力を実証する。抗体配合物の組合せも、中和活性について評価することができる。一実施形態では、組合せ組成物が、ペプチド系化合物またはコンジュゲートに対する２つ以上の異なる抗体を用いて生成される。
【０１９１】
抗体耐性突然変異病原体の選択についての試験を任意選択により実施する。抗体中和実験の終点希釈からのウイルスを増幅させ、同じ抗体による中和について再び試験する。抗体中和に対する耐性が増大したウイルスは、もしあれば、潜在的な抗体エスケープ突然変異体と考えることができる。このようなウイルス由来の遺伝子を、例えば、配列決定により試験することによって、ある特定のエピトープに対する抗体を用いた中和に対する耐性に関係する突然変異を同定する。抗体エスケープ突然変異体を同定した後、これらのウイルスを、異なるペプチド免疫原に対する抗体を用いて中和することができるか否かに関して、さらに判定を行う。異なるエピトープに対する抗体を用いた中和に対する、候補エスケープ突然変異体ウイルスの感受性を、抗体カクテルの適用の評価における要因として使用する。数十年にわたって地理的に異なる領域におけるヒトまたは動物から単離された１つまたは複数の病原体に対する誘導された抗体を試験するのに、マイクロ中和アッセイも使用する。このような分離株は、これらの中和エピトープにおいてかなりの多様性を示す。
【０１９２】
所与のエピトープに対して誘導された抗体を、人畜共通ウイルス株のクラス１ウイルス融合タンパク質を含有するレトロウイルスシュードタイプの流入をブロックする能力について評価する。異なる病原体株のタンパク質を含むマウスレトロウイルスを作製する。異なるタンパク質、およびベータ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するシュードタイプを使用して、感受性細胞のトランスダクションの抗体媒介阻害を評価する。
【０１９３】
受動免疫。ワクチンから生じる抗体配合物を、病原体によるチャレンジに対する効力について試験する。ワクチンとして使用されるコンジュゲートを用いた免疫化から得られるウサギ抗体配合物を用いて受動免疫を実証する。１０ＬＤ５０ユニットの病原体でチャレンジしたマウスにおいて保護効果をアッセイする。
【０１９４】
これらのｉｎ  ｖｉｖｏ保護試験についてのプロトコールは、ワクチン接種されたウサギ、または免疫化前の対照由来のＩｇＧを用いた、ウイルスチャレンジに対して−１、＋１、および＋３日目の腹腔内接種を含む。ウイルスを接種した動物を、定期的に計量して毎日観察する。死亡までの平均時間に関して、個体被験体または処置群（所与の免疫原についての免疫前対免疫ウサギＩｇＧ）の判定を行う。生存動物についての２、４、６、８、および１４日目のマウス血清中のウサギＩｇＧの滴定とともに、ウイルス接種後の２および４日目に、適切な組織（例えば、肺）内の感染性病原体について滴定を実施する。該当する組織（例えば、マウスの肺）の組織病理学の検査を、接種後の該当する時間に行う。
【０１９５】
能動免疫化。ワクチンとして使用されるコンジュゲートで、マウスを能動免疫する。伝染性の強い病原体でのチャレンジに対する保護または感受性の程度を評価する。
【０１９６】
物質および方法。生後４週間のＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝１０）に、水酸化アルミニウムゲルアジュバント５００μｇと、ＰＢＳ、対照として担体単独、またはワクチンとして使用されるコンジュゲート１０μｇ（これは、ペプチド約１μｇに対応し得る）を含有する１００μｌで腹腔内に免疫する。同じ免疫原を用いた２回または３回のブースター免疫化を、２週間間隔で与える。各ブーストの直前に、各群からの代表動物で血液試料を収集する。ペプチド免疫原に対する抗体価を、ＢＳＡにカップリングしたペプチド免疫原を用いたＥＬＩＳＡによって試験する。マイクロ中和アッセイで、病原体を中和する能力について、マウス抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。１０ＬＤ５０ユニットの病原体を用いた接種によって動物にチャレンジする。生存時間、体重減少、および臨床症状について、チャレンジ後１４日間毎日動物をモニターする。適切な組織（例えば、肺）内のウイルス力価を、接種後２、４、および６日目に求め、適切な組織（例えば、肺）の病理組織学的検査を、コンジュゲートで免疫された動物対対照動物において比較する。
ホモ二本鎖コンジュゲート応答に対するヘテロ二本鎖コンジュゲート応答の比較
ウサギおよびマウスを、図３Ｂのエピトープ５Ｐ／エピトープ６Ｐから構成されるヘテロ二本鎖コンジュゲート（ＨＡ１ペプチド５Ｐ，６Ｐ）で免疫する。これらの動物の免疫応答を、それぞれが致死性ウイルスチャレンジからの部分的な保護をもたらす、エピトープ５Ｐ／エピトープ５Ｐ（ＨＡ１ペプチド５Ｐ，５Ｐ）、またはエピトープ６Ｐ／エピトープ６Ｐ（ＨＡ１ペプチド６Ｐ，６Ｐ）から構成されるホモ二本鎖コンジュゲートで単独で免疫された動物の応答と比較する。
【０１９７】
生物学的実施例の結果
（生物学的実施例１）
ホモ二本鎖コンジュゲート５Ａおよび５Ｐに対する抗体
鋳型化抗原５Ａへのホモ二本鎖コンジュゲート、および鋳型化抗原５Ｐへのホモ二本鎖コンジュゲートを調製し（使用したコンジュゲートについては、図１７を参照）、抗体を、記載したコンジュゲートに対して生成させた。抗体５Ａならびに５Ｐは、５Ａ抗体がＨ７Ｎ７  ＨＡ（群２）に結合しないことを除いて、５つのＨＡタンパク質、すなわち、Ｈ１Ｎ１  Ｓｏｌｏｍｏｎ  ２００６、Ｈ５Ｎ１  Ｌａｏｓ  ２００６、Ｈ２Ｎ２  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  １９５７（群１）、ならびにＨ３Ｎ２  Ｕｒｕｇｕａｙ  ２００７およびＨ７Ｎ７  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  ２００３（群２）への同様の結合性を示す。５Ｐに対する抗体は、群１のＨＡタンパク質に、群２のＨＡタンパク質より強く結合する。５Ｐ抗体は、５Ａ抗体よりＨＡタンパク質に対して強い親和性を有する。これらの結果を、図１８（５Ａ）および図１９（５Ｐ）に表示する。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表１および表２に示す。
【０１９８】
５Ｐ抗体は、群２と交差反応する（ＨＡタンパク質の配列を参照）。この華々しい結果は、Ｈ３Ｎ２  ＨＡ中のＷＳ−ＮＡＥ−ＬＶ−ＬＥＮ、またはＨ７Ｎ７  ＨＡ中のＷＳ−ＮＡＥ−ＬＶ−ＭＥＮとほとんど同一である免疫原ＷＴ−ＮＡＥ−ＬＶ−ＬＥＮ中の配列に起因し得る。
【０１９９】
ＥＬＩＳＡアッセイで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２００】
【表１−２】
2014508144.tif 000011
【０２０１】
【表２】
2014508144.tif 000012
（生物学的実施例２）
ホモ二本鎖コンジュゲート６Ａおよび６Ｐに対する抗体
鋳型化抗原６Ａへのホモ二本鎖コンジュゲート、および鋳型化抗原６Ｐへのホモ二本鎖コンジュゲートを調製した（使用したコンジュゲートについては、図２０を参照）。抗体を、記載したコンジュゲートに対して生成させた。
【０２０２】
６Ａ抗体は、群１中のＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質に特異的に結合するが、Ｈ２Ｎ２およびＨ５Ｎ１に特異的に結合しない。６Ａ抗体は、群２のＨＡタンパク質Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ７に結合しない。６Ｐ抗体は、群１のＨＡタンパク質（Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ２Ｎ２）のみに結合し、群２のＨＡタンパク質Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ７に結合しない。結合性を、図２１（６Ａ）および図２２（６Ｐ）に示し、グラフ用のＥＬＩＳＡデータを、以下の表３および表４に示す。ＥＬＩＳＡアッセイで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。これらの結合性の結果は、免疫原６ＰのＮ末端長が延長されていることに起因し得る。これらの３つのＨＡタンパク質は、免疫原配列ＲＴ−ＤＦＨ−ＳＮ−ＫＮＬと配列同一性を有する。ＨＡタンパク質Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ７は、この領域において著しく異なり、それぞれＨＴ−ＤＬＴ−ＳＥ−ＮＫＬまたはＨＴ−ＤＬＡ−ＳＥ−ＮＫＬである。
【０２０３】
【表３】
2014508144.tif 000013
【０２０４】
【表４】
2014508144.tif 000014
インフルエンザ抗体５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６ＰのＨ１Ｎ１  ＨＡタンパク質への結合性を、図２３で比較する。４つすべての抗体は、Ｈ１Ｎ１  ＨＡに結合するが、５Ｐおよび６Ｐ抗体は、５Ａおよび６Ａより良好にＨ１Ｎ１  ＨＡに結合する。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表５に示す。「Ｒ２Ｔ」は、「ウサギ２ターミナルブリード（ｒａｂｂｉｔ  ２  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄ）」を表す。ＥＬＩＳＡで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２０５】
【表５】
2014508144.tif 000015
インフルエンザ抗体５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６ＰのＨ５Ｎ１  ＨＡタンパク質への結合性を、図２４で比較する。６Ａ抗体は、Ｈ５Ｎ１  ＨＡに結合しないが、５Ｐ、６Ｐ、および５Ａ抗体は、Ｈ５Ｎ１  ＨＡに確かに結合する。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表６に示す。「Ｒ２Ｔ」は、「ウサギ２ターミナルブリード」を表す。ＥＬＩＳＡで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２０６】
【表６】
2014508144.tif 000016
インフルエンザ抗体５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６ＰのＨ２Ｎ２  ＨＡタンパク質への結合性を、図２５で比較する。抗体５Ａ、５Ｐ、および６Ｐは、Ｈ２Ｎ２  ＨＡに結合するが、６Ａ抗体は、Ｈ２Ｎ２  ＨＡに結合しない。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表７に示す。「Ｒ２Ｔ」は、「ウサギ２ターミナルブリード」を表す。ＥＬＩＳＡで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２０７】
【表７】
2014508144.tif 000017
インフルエンザ抗体５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６ＰのＨ３Ｎ２  ＨＡタンパク質への結合性を図２６で比較する。抗体５Ａおよび５Ｐは、Ｈ３Ｎ２  ＨＡに結合するが、抗体６Ａおよび６Ｐは、Ｈ３Ｎ２  ＨＡに結合しない。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表８に示す。「Ｒ２Ｔ」は、「ウサギ２ターミナルブリード」を表す。ＥＬＩＳＡで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２０８】
【表８】
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インフルエンザ抗体５Ａ、６Ａ、５Ｐ、および６ＰのＨ７Ｎ７  ＨＡタンパク質への結合性を、図２７で比較する。５Ｐ抗体のみがＨ７Ｎ７  ＨＡに結合する。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表９に示す。「Ｒ２Ｔ」は、「ウサギ２ターミナルブリード」を表す。ＥＬＩＳＡで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２０９】
【表９】
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（生物学的実施例３）
ヘテロ二本鎖コンジュゲート５Ｐ／６Ｐ、ホモ二本鎖コンジュゲート５Ｐ、およびホモ二本鎖コンジュゲート６Ｐに対する抗体の比較
鋳型化抗原５Ｐ／鋳型化抗原６Ｐへのヘテロ二本鎖コンジュゲート、鋳型化抗原５Ｐへのホモ二本鎖コンジュゲート、および鋳型化抗原６Ｐへのホモ二本鎖コンジュゲートを調製し（使用したコンジュゲートについては、図２８を参照）、抗体を、記載したコンジュゲートに対して生成させた
５Ｐホモ二本鎖免疫原は、５Ｐ／６Ｐヘテロ二本鎖抗体よりはるかに大きく交差反応性である抗体を生成し、６Ｐホモ二本鎖免疫原は、５Ｐ／６Ｐヘテロ二本鎖抗体より良好な交差反応性を示す抗体を生成する。
【０２１０】
５Ｐ／６Ｐヘテロ二本鎖抗体は、他のホモ二本鎖５Ｐまたは６Ｐ抗体と比較して異なる特異性を示す。例えば、５Ｐ／６Ｐ抗体は、群１のＨＡタンパク質Ｈ２Ｎ２  ＨＡに最も良好に結合し、群１のＨＡタンパク質Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１  ＨＡにより弱く結合するが、群２のＨＡタンパク質：Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ７に結合せず（図２９を参照）、一方、５Ｐおよび６Ｐ抗体は、Ｈ１Ｎ１  ＨＡに最も良好に結合し、その次に良好にＨ５Ｎ１  ＨＡおよびＨ２Ｎ２  ＨＡに結合する。（５Ｐ抗体は、群１のＨＡタンパク質Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ２Ｎ２に結合し、群２のＨＡタンパク質Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ７に結合し（図３０を参照）、６Ｐ抗体は、群１のＨＡタンパク質Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ２Ｎ２に結合するが、群２のＨＡタンパク質Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ７に結合しない（図３１を参照））。図２９、図３０、および図３１でグラフ化したＥＬＩＳＡデータを、それぞれ以下の表１０、表１１、および表１２に示す。ＥＬＩＳＡで使用した赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、図１７に示す。
【０２１１】
５Ｐ／６Ｐヘテロ二本鎖免疫原のこれらの結果は、２つの異なるエピトープに対する抗体を生成するのに１つのヘテロ二本鎖免疫原を使用することの実現可能性を実証する。
【０２１２】
【表１０】
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【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
【表１２】
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ペプチド免疫原に対する５Ｐ／６Ｐ抗体の結合性を、図３２で比較する。ヘテロ二本鎖５Ｐ／６Ｐに対する抗体は、鋳型化ホモ二本鎖５Ｐおよび６Ｐペプチド、ならびにヘテロ二本鎖５Ｐ／６Ｐペプチドに結合する。グラフ化したＥＬＩＳＡデータを、以下の表１３に示す。
【０２１５】
【表１３】
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引用を特定することによって本明細書で参照されたすべての刊行物、特許、特許出願、および公開特許出願の開示は、その全体が、本明細書によって参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１６】
前述の発明を、理解を明瞭にする目的で例示および実施例によって幾分詳細に記述してきたが、ある特定の軽微な変更および改変が実施されることは、当業者に明らかである。したがって、これらの記述および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2014508144.tif 000071
【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月11日(2013.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014508144000001.app
【国際調査報告】
2014508144.tif 000073
2014508144.tif 000074