(57)【要約】組み換え微生物において油、燃料、油脂化学品、及び他の化合物を生成する方法及び組成物が提供されており、油を生み出す微生物、及びこのような微生物を低コストで育てる方法を含む。例えば、リパーゼ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、多糖分解酵素、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ酵素、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、デサチュラーゼ酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、及び／又はアシルキャリアータンパク質をコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞は、再生可能ディーゼル、バイオディーゼル、及び再生可能ジェット燃料などの輸送燃料、並びに機能液、界面活性剤、石鹸及び潤滑剤などの油脂化学品を製造するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリアシルグリセリドを含む天然油、又は前記天然油から生成される生成物を生成する方法であって、
組み換え微生物の細胞であって、
（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きであって、場合により前記細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む細胞を育てることと；
前記細胞から前記天然油を回収することとを含み、場合により前記天然油を処理して食品、燃料、又は化学製品を作り出すことをさらに含む方法において、
前記天然油が、前記組み換え核酸によって変化した脂肪酸プロフィールを有する、方法。
【請求項２】
前記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路によって脂肪酸を合成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が微細藻類である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類が偏性従属栄養生物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記育てることが、従属栄養で育てることである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％のトリグリセリドを含むように育てられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記油が、５００、５０、又は５ｐｐｍ未満の有色分子を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換え核酸が安定に組み込まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換え核酸が、前記微生物の染色体に安定に組み込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によって前記酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の前記低下又は消失が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によって前記１つ以上の遺伝子が分断又は置換されることに起因する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換え細胞が、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子をさらに含み、それによりリシノール酸を合成する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え細胞が、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、少なくとも４０、５０、６０、７０、又は８０％のＣ１６脂肪酸を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、少なくとも５０〜７５％のＣ１６：０を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有することによってさらに特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、前記細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｒａｓｅ）と比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解においてより高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、前記ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組み換え細胞が、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記生成される油が、前記組み換え核酸の結果としてのより短い平均脂肪酸鎖長によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換え細胞が、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
核酸が、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子が、前記脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生成される油が、高オレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％をオレイン酸が構成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組み換え細胞が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記生成される油が、前記組み換え核酸の結果としてＣ１８：１脂肪酸が高まり、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられ、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法、前記組み換え細胞が、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生成される油が、Ｃ１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生成される油が、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生成される油が、少なくとも５０〜７５％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生成される油が、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有する脂肪酸プロフィールによってさらに特徴づけられる、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記生成される油が、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有することによって特徴づけられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記油をさらに処理することが、精製、漂白、脱臭、メタセシス、トランスエステル化、水素化、加水分解、水素化、脱酸素、ハイドロクラッキング、異性化、ヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｌｘｙｌａｔｉｏｎ）、インターエステル化、アミド化、スルホン化、及び硫化（ｓｕｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）のうちの１つ以上を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記油が、食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、硫化油、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン、燃料ブレンドストック、燃料添加剤、潤滑油用添加剤、又は塗料を作り出すために処理される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法によって得られる天然油。
【請求項４５】
請求項４４に記載の天然油から作られる生成物。
【請求項４６】
食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、硫化油、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン、燃料ブレンドストック、燃料添加剤、化学添加物、又は塗料を含む、請求項４５に記載の生成物。
【請求項４７】
組み換え細胞であって、
（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きであって、場合により前記細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む、細胞。
【請求項４８】
前記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路によって脂肪酸を合成する、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４９】
前記微生物が微細藻類である、請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
前記微細藻類が偏性従属栄養生物である、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
前記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５４】
活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５５】
従属栄養で成長することができる、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５６】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上である、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５７】
乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％のトリグリセリドを含むように育てられる能力を有する、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５８】
前記組み換え核酸が安定に組み込まれる、請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５９】
前記組み換え核酸が、前記微生物の染色体に安定に組み込まれる、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含む、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によって前記酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、請求項４６〜６０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６２】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の前記低下又は消失が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によって前記１つ以上の遺伝子が分断又は置換されることに起因する、請求項４６〜６１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６３】
前記組み換え細胞が、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子をさらに含み、それによりリシノール酸を合成する、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６４】
前記組み換え細胞が、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６５】
少なくとも４０、５０、６０、７０、又は８０％のＣ１６脂肪酸を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６６】
少なくとも５０〜７５％のＣ１６：０を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有することによってさらに特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、請求項６６に記載の細胞。
【請求項６８】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、前記細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｒａｓｅ）と比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解においてより高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成する、請求項６４又は６５に記載の細胞。
【請求項６９】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断する、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７０】
前記組み換え細胞が、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７１】
前記生成される油が、前記組み換え核酸の結果としてのより短い平均脂肪酸鎖長によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、請求項７０に記載の細胞。
【請求項７２】
前記組み換え細胞が、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７３】
核酸が、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
前記ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子が、前記脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる、請求項７２又は７３に記載の細胞。
【請求項７５】
前記生成される油が、高オレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７６】
前記脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％をオレイン酸が構成する、請求項７５に記載の細胞。
【請求項７７】
前記組み換え細胞が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７８】
前記生成される油が、前記組み換え核酸の結果としてＣ１８：１脂肪酸が高まり、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、請求項７７に記載の細胞。
【請求項７９】
前記組み換え細胞が、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８０】
前記生成される油が、Ｃ１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、請求項７９に記載の細胞。
【請求項８１】
前記生成される油が、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８２】
前記生成される油が、少なくとも５０〜７５％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８３】
前記生成される油が、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有する脂肪酸プロフィールによってさらに特徴づけられる、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８４】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８５】
活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８６】
前記生成される油が、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、請求項８５に記載の細胞。
【請求項８７】
前記油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有することによって特徴づけられる、請求項８６に記載の細胞。
【請求項８８】
請求項４６〜８７のいずれか一項に記載の細胞から生成される天然油又は油含有生成物。
【請求項８９】
リシノール酸を含むトリアシルグリセリドを含む天然油、又は前記天然油から生成される生成物を生成する方法であって、
組み換え微生物の細胞を育てることを含み、前記細胞が、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それにより前記リシノール酸を合成する、方法。
【請求項９０】
前記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項９１】
前記微生物が微細藻類である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記微細藻類が偏性従属栄養生物である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記微細藻類がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、請求項４６〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記育てることが、従属栄養で育てることである、請求項４６〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞が、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする前記組み換え核酸が存在しないときに少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％のオレイン酸を生成する、請求項４６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼに対する基質レベルを高めるためオレイン酸生成を高める働きをする組み換え核酸をさらに含む、請求項８９〜９８  ９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞が、
（ａ）活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
請求項８９〜１００のいずれか一項に記載の方法に従って作られる生成物。
【請求項１０２】
活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それによりリシノール酸を合成する微生物細胞。
【請求項１０３】
前記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する、請求項１０２に記載の細胞。
【請求項１０４】
前記微生物が微細藻類である、請求項１０３に記載の細胞。
【請求項１０５】
前記微細藻類が偏性従属栄養生物である、請求項１０４に記載の細胞。
【請求項１０６】
前記微細藻類がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種である、請求項１０５に記載の細胞。
【請求項１０７】
前記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１０８】
前記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、請求項１０４に記載の細胞。
【請求項１０９】
活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、請求項１０２〜１０８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１０】
従属栄養で成長することができる、請求項１０２〜１０９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１１】
活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする前記組み換え核酸が存在しないときに少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％のオレイン酸を生成する、請求項１０２〜１０９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１２】
前記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼに対する基質レベルを高めるためオレイン酸生成を高める働きをする組み換え核酸をさらに含む、請求項１０２〜１１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１３】
（ａ）活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む、請求項１１２に記載の細胞。
【請求項１１４】
請求項４４に記載の油を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１１年２月２日に出願した米国仮出願第６１／４３８，９６９号、２０１１年４月１８日に出願した米国仮出願第６１／４７６，６９１号、２０１１年５月１０日に出願した米国仮出願第６１／４８４，４５８号、２０１１年１０月１８日に出願した米国仮出願第６１／５４８，６１６号の利益を請求する。これらの出願は、それぞれ、あらゆる目的のために内容全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本明細書は、発明を実施するための形態の末尾に示されるとおり、配列表を含んでいる。
【０００３】
本発明は、微生物から作られる、油、燃料、油脂化学品の生成に関する。特定的には、本開示は、油を生み出す微細藻類、脂質、脂肪酸エステル、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカンといった有用な化合物を産生するために微生物を育てる方法、並びに、上述の微生物の遺伝子を組み換えて、微細藻類による油の産生効率を高め、産生される油の種類及び組成物を変える方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
化石燃料は、有機材料が地下に埋まった地質堆積物のうち、燃焼性のものを指す一般的な用語であり、腐敗した植物及び動物から作られ、地殻の熱及び圧力に何億年もさらされることによって、未精製油、石炭、天然ガス又は重油に変換されたものである。化石燃料は、限りある再生不可能な資源である。世界経済によってエネルギーの必要性が増しているが、炭化水素のコストも重くのしかかってきている。エネルギー以外でも、プラスチック及び化学薬品の製造業者を含む多くの産業には、製造プロセスの原料としての炭化水素の供給力が大きく関与している。現行の供給源に代わる費用効率のよい代替法があれば、エネルギー及びこれらの原材料の費用が高騰するのを緩和することができるだろう。
【０００５】
特許文献１は、油を生成するために微細藻類を育てる方法及び材料を記載しており、特に、微細藻類Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓが生成する油から、ディーゼル燃料を生成することを例として挙げている。燃料用、化学用、食品用、および他の利用のための生成するための改良法、特に、色素を含まずに、鎖長が短く、飽和度の高い油を高収率及び高効率で製造する方法が依然として必要とされている。本発明は、この要求を満たすものである。
【０００６】
ポリウレタンは、カルバメート（ウレタン）結合を含む化合物である。典型的には、ポリウレタンは有機単位のポリマーである。ポリマーは、イソシアネート部分（Ｃ（Ｏ）Ｎ−Ｒ１−ＮＣ（Ｏ））を含む第１の有機単位と、ヒドロキシル基（ＨＯ−Ｒ２−ＯＨ）を含む第２の有機単位との反応により調製される。ポリウレタンは、−［Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ１−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ２−Ｏ］ｍ−として表され、式中、添え字ｍは、ポリマー中に含まれる単量体の数を表す数字である。Ｒ１とＲ２とは同じであっても又は異なってもよく、しかしながら典型的には異なる。ポリウレタンは、可撓性及び剛性の両方の材料を含めてさまざまな用途に用いられる。ポリウレタンは、靴、自動車、航空機、套管、ガスケット、接着剤、カーペット、スパンデックス繊維、エレクトロニクス用の筐体などに使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５１１４９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の例示的な実施形態は、改変されたグリセロ脂質プロフィールを生成する油産生細胞及びその細胞から生成される生成物を提供する。油産生細胞（ｏｌｅａｇｎｉｎｏｕｓ  ｃｅｌｌ）の例としては、ＩＩ型脂質生合成経路を有する微生物細胞が挙げられる。また、実施形態は天然油も特徴とし、これはそのような細胞を使用して得ることができる天然油である。実施形態は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどのタンパク質をコードする外来遺伝子を発現する組み換え細胞を含む。また、本発明は、そのような細胞から、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル及びジェット燃料などの燃料、食用油及び化学薬品を含む、脂質及び油をベースとする生成物を製造する方法も提供する。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、少なくとも３％がＣ８：０である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、脂質プロフィールは、少なくとも１２％のＣ８：０である。ある実施形態では、細胞は組み換え細胞である。ある場合では、組み換え細胞は、鎖長がＣ８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、外来遺伝子はＣｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。ある場合では、細胞は、表１に特定される微細藻類から選択される微細藻類の属又は種の細胞である。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、少なくとも４％がＣ１０：０である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、脂質プロフィールは少なくとも１８％のＣ１０：０である。ある場合では、脂質プロフィールは少なくとも２０％のＣ１０：０である。ある場合では、微細藻類細胞の脂質含有量はＣ１２：０をさらに含む。ある場合では、Ｃ１０：０のＣ１２：０に対する比は少なくとも３：１である。ある場合では、微細藻類細胞の脂質含有量はＣ１４：０をさらに含む。ある場合では、Ｃ１０：０のＣ１４：０に対する比は少なくとも１０：１である。ある実施形態では、細胞は組み換え細胞である。ある場合では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、外来遺伝子は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群から選択される種に由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群から選択される種に由来する。ある場合では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、鎖長がＣ１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａに由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子からなる群から選択される。
【００１１】
ある場合では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。ある実施形態では、細胞は、表１に特定される微細藻類から選択される微細藻類の属又は種の細胞である。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、少なくとも１３％がＣ１２：０である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１２の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質は、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ及びＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａからなる群から選択される種に由来する。ある場合では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、鎖長がＣ１２の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ及びＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａに由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子からなる群から選択される。ある実施形態では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、少なくとも１０％がＣ１４：０である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、脂質プロフィールは、少なくとも３５％のＣ１４：０である。ある場合では、微細藻類細胞の脂質含有量はＣ１２：０をさらに含む。ある場合では、Ｃ１４：０のＣ１２：０に対する比は少なくとも３：１である。ある場合では、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質は、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群から選択される種に由来する。ある場合では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するＣｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子からなる群から選択される。ある場合では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。ある実施形態では、細胞は、表１に特定される微細藻類から選択される微細藻類の属又は種の細胞である。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、少なくとも１５％がＣ１６：０である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、脂質プロフィールは、少なくとも３９％のＣ１６：０である。ある場合では、脂質プロフィールは、少なくとも６７％のＣ１６：０である。ある場合では、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１６の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ及びＵｌｍｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎａから選択される種に由来する。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１６の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群から選択される種に由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある場合では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。ある実施形態では、微細藻類細胞は、内在するデサチュラーゼ遺伝子をさらに含み、ここで内在するデサチュラーゼ遺伝子は、不活性なデサチュラーゼ又は変異していないデサチュラーゼと比べて活性が低いデサチュラーゼをコードするように変異されているか、又は前記内在するデサチュラーゼが微細藻類細胞ゲノムから欠失されている。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、少なくとも６０％が飽和脂肪酸である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では微細藻類細胞は、少なくとも８５％が飽和脂肪酸である脂質プロフィールを有する。ある場合では、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１０〜Ｃ１６の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある場合では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。
【００１６】
第７の態様において、本発明は、少なくとも１９％がＣ１８：０である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、脂質プロフィールは、少なくとも２７％がＣ１８：０である。ある場合では、細胞は組み換え細胞である。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓから選択される種に由来する。ある実施形態では、組み換え細胞は、鎖長がＣ１６の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有するＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓに由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む。
【００１７】
第８の態様において、本発明は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｎ  ｃａｍｐｈｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ、Ｉｒｉｓ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａからなる群に由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞を提供する。
【００１８】
第９の態様において、本発明は、発現構築物を含む微細藻類細胞を提供し、ここで発現構築物は、内因性遺伝子が不活性な遺伝子産物、又は変異していない遺伝子産物と比べて活性が低い遺伝子産物をコードするように変異されている、内因性遺伝子が微細藻類細胞ゲノムから欠失されている、及びＲＮＡ誘導性機構を介する、からなる方法から選択されて内因性遺伝子の発現を下方調節する。ある場合では、この方法は、ＲＮＡｉ、アンチセンス及び／又はｄｓＲＮＡなどのＲＮＡ誘導性機構である。ある場合では、内因性遺伝子はデサチュラーゼ遺伝子である。ある実施形態では、デサチュラーゼ遺伝子はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子である。ある場合では、細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞である。
【００１９】
第１０の態様において、本発明は、上記の態様のいずれかに記載されるとおりの微細藻類細胞を提供し、ここで微細藻類細胞は、スタキオース、ラフィノース又はメリビオースを炭素源として使用して育てられる。
【００２０】
第１１の態様において、本発明は、２％以下の１８：２である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、本発明は、７％以下の１８：２である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。
【００２１】
第１２の態様において、本発明は、脂質を生産する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）細胞が乾燥重量で少なくとも２０％の脂質になるまで、上記に考察したような微細藻類細胞を育てることと；（ｂ）水溶性バイオマス成分から脂質を分離することとを含む。
【００２２】
第１３の態様において、本発明は、脂質を生産する別の方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）２つの異なるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする２つの異なる外来遺伝子を含む微細藻類細胞を育てることと、（ｂ）水溶性バイオマス成分から脂質を分離することとを含む。ある場合では、外来遺伝子の少なくとも１つは、表４に特定されるチオエステラーゼからなる群から選択される脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。
【００２３】
第１４の態様において、本発明は、油をベースとする生成物を生産する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）細胞が乾燥重量で少なくとも１０％の脂質になるまで、上記に考察したような微細藻類細胞を育てることと；（ｂ）微細藻類細胞から脂質を分離することと；（ｃ）鹸化；メタセシス；酸加水分解；アルカリ加水分解；酵素加水分解；触媒的加水分解；加圧熱水による加水分解；脂質がグリセロールと脂肪酸とに分解する触媒的加水分解反応；脂肪族窒素化合物を生成するアミノ化反応；一塩基酸及び二塩基酸を生成するオゾン分解反応；酵素による分解及び加圧による分解からなる群から選択されるトリグリセリド分解反応；加水分解反応の後に続く縮合反応；水素化処理反応；水素化処理反応及び水素化処理反応の前の、又は水素化処理反応と同時の脱酸素反応及び／又は縮合反応；気体除去反応；水素化分解反応、水素化、水素化−水素化分解の連続反応、水素化分解−水素化の連続反応、及び水素化−水素化分解反応の組み合わせからなる群から選択される脱酸素反応；脱酸素反応の後の縮合反応；エステル化反応；インターエステル化反応；トランスエステル化反応；ヒドロキシル化反応；及びヒドロキシル化反応の後の縮合反応からなる群から選択される少なくとも１つの化学反応に脂質を供することと；（ｄ）場合により、反応の生成物を他の成分から単離することとを含み、それにより油をベースとする生成物が生成される。
【００２４】
ある場合では、油をベースとする生成物は、石鹸又は燃料生成物から選択される。ある実施形態では、油をベースとする生成物は、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、及びジェット燃料からなる群から選択される燃料生成物である。ある場合では、燃料生成物は、（ｉ）０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）３５〜１７５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール（ｓｔｉｇｎａｓｔｅｒｏｌ）、又はβ−シトステロール；（ｖｉｉ）２２５〜３５０ｍｃｇ／ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；又は（ｉｘ）５０〜３００ｍｃｇ／ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロールのうち、１つ以上の属性を有しているバイオディーゼルである。ある場合では、燃料生成物は、少なくとも２０℃、４０℃又は６０℃のＴ１０−Ｔ９０を有する再生可能ディーゼルである。ある場合では、燃料生成物は、ＨＲＪ−５及び／又はＡＳＴＭ仕様Ｄ１６５５を満たすジェット燃料である。
【００２５】
第１５の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１〜５％、好ましくは少なくとも３％のＣ８：０、少なくとも２．５％、好ましくは少なくとも４％のＣ１０：０、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１３％のＣ１２：０、少なくとも１０％のＣ１４：０、及び／又は少なくとも６０％の飽和脂肪酸という脂質プロフィールと、（ｂ）（ｉ）０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）３５〜１７５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール（ｓｔｉｇｎａｓｔｅｒｏｌ）、又はβ−シトステロール；（ｖｉｉ）２２５〜３５０ｍｃｇ／ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；又は（ｉｘ）５０〜３００ｍｃｇ／ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロールのうち、１つ以上の属性とを含むトリグリセリド油脂を提供する。
【００２６】
第１６の態様において、本発明は、少なくとも５：１のＣ８：Ｃ１０脂肪酸比を有する微細藻類から単離されるトリグリセリド油脂を提供する。ある実施形態では、トリグリセリド油脂は微細藻類細胞（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類細胞）から単離され、ここで微細藻類細胞は外来遺伝子を含む。関連する態様において、本発明は、飽和脂肪酸が少なくとも６０％である微細藻類から単離されるトリグリセリド油脂を提供する。
【００２７】
別の関連する態様において、本発明は、約２：１のＣ１６：１４脂肪酸比を有する脂質プロフィールを有する微細藻類から単離されるトリグリセリド油脂を提供する。別の関連する態様において、本発明は、微細藻類細胞から生成されるトリグリセリド油脂を提供し、ここで微細藻類細胞は外来遺伝子を含む。ある場合では、微細藻類はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類である。
【００２８】
別の関連する態様において、本発明は、約３：１のＣ１２：１４脂肪酸比を有する脂質プロフィールを有する微細藻類から単離されるトリグリセリド油脂を提供する。別の関連する態様において、本発明は、微細藻類細胞から生成されるトリグリセリド油脂を提供し、ここで微細藻類細胞は外来遺伝子を含む。ある場合では、微細藻類はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類である。
【００２９】
第１７の態様において、本発明は、（ａ）１％未満の＜Ｃ１２脂肪酸；１％〜１０％、好ましくは２％〜７％のＣ１４：０脂肪酸；２０％〜３５％、好ましくは２３％〜３０％のＣ１６：０脂肪酸；５％〜２０％、好ましくは７％〜１５％のＣ１８：０脂肪酸；３５％〜６０％、好ましくは４０％〜５５％のＣ１８：１脂肪酸；及び１％〜２０％、好ましくは２％〜１５％のＣ１８：２脂肪酸という脂質プロフィールと；（ｂ）（ｉ）０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／ｇの総カロチノイド；（ｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のリコピン；（ｉｉｉ）０．００５ｍｃｇ／ｇ未満、好ましくは０．００３ｍｃｇ／ｇ未満のβ−カロチン；（ｉｖ）０．０２５〜０．３ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／ｇのクロロフィルＡ；（ｖ）３５〜１７５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／ｇのγ−トコフェロール；（ｖｉ）０．２５％未満のブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール（ｓｔｉｇｎａｓｔｅｒｏｌ）、又はβ−シトステロール；（ｖｉｉ）２２５〜３５０ｍｃｇ／ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／ｇの総トコトリエノール；（ｖｉｉｉ）０．００２５〜０．０５ｍｃｇ／ｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９ｍｃｇ／ｇのルテイン；又は（ｉｘ）５０〜３００ｍｃｇ／ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／ｇのトコフェロールのうち、１つ以上の属性とを含むトリグリセリド油脂を提供する。
【００３０】
ある場合では、トリグリセリド油脂は、１つ以上の外来遺伝子を含む細菌から単離される。ある実施形態では、１つ以上の外来遺伝子は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する。ある実施形態では、細菌は発現構築物をさらに含み、ここで発現構築物は、内因性遺伝子が不活性な遺伝子産物、又は変異していない遺伝子産物と比べて活性が低い遺伝子産物をコードするように変異されている、内因性遺伝子が微細藻類細胞ゲノムから欠失されている、及びＲＮＡ誘導性機構を介する、からなる方法から選択されて内因性遺伝子の発現を下方調節する。ある実施形態では、内因性遺伝子はデサチュラーゼをコードする。ある場合では、デサチュラーゼは、ステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）又は脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。
【００３１】
第１８の態様において、本発明は、１％未満の＜Ｃ１２脂肪酸；２％〜７％のＣ１４：０脂肪酸；２３％〜３０％のＣ１６：０脂肪酸；７％〜１５％のＣ１８：０脂肪酸；４０〜５５％のＣ１８：１脂肪酸；及び２〜１５％のＣ１８：２脂肪酸という脂質プロフィールを含むトリグリセリド油脂を生成する方法を提供し、ここでトリグリセリド油脂は、１つ以上の外来遺伝子を含む細菌から単離される。ある場合では、トリグリセリド油脂は、３〜５％のＣ１４：０；２５〜２７％のＣ１６：０；１０〜１５％のＣ１８：０；及び４０〜４５％のＣ１８：１という脂質プロフィールを含む。ある実施形態では、１つ以上の外来遺伝子は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する。
【００３２】
第１９の態様において、本発明は、リシノール酸を生成する微生物細胞を提供する。ある場合では、微生物細胞は微細藻類細胞である。ある場合では、微生物細胞及び微細藻類細胞は、脂肪酸ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子を含む。ある実施形態では、脂肪酸ヒドロキシラーゼはオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼである。ある場合では、脂肪酸ヒドロキシラーゼはＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来する。ある場合では、微生物細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属、例えばＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの微生物細胞である。
【００３３】
第２０の態様において、本発明は、α−ガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞を提供する。ある場合では、α−ガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞、ここでα−ガラクトシダーゼは分泌される。ある実施形態では、α−ガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＣｙａｍｏｐｓｉｓからなる群から選択される属に由来する。
【００３４】
第２１の態様において、本発明は、脂質組成物を生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）従属栄養条件下、固定炭素源が存在する状態で微細藻類細胞を育てる工程であって、微細藻類細胞が、α−ガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子を含み、且つ固定炭素源が、ラフィノース、スタキオース及びメリビオースからなる群から選択される工程と；（ｂ）脂質を非脂質成分から分離する工程とを含み；それにより脂質組成物を生成する。ある場合では、微細藻類細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類細胞である。
【００３５】
第２２の態様において、本発明は、ＴＨＩＣ酵素をコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞を提供する。ある場合では、ＴＨＩＣ酵素は、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓからなる群から選択される属に由来する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、ＴＨＩＣ酵素をコードする外来遺伝子を発現させることを含む、チアミンが存在しない状態で微細藻類細胞を育てる方法を提供する。ある場合では、ＴＨＩＣ酵素は、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓからなる群から選択される属に由来する。
【００３７】
他の態様において、本発明は、本明細書に記載されるような微細藻類細胞を提供し、ここで前記微細藻類細胞は、ショ糖インベルターゼ、α−ガラクトシダーゼ、及びＴＨＩＣ酵素からなる群から選択される別の外来遺伝子をさらに含む。
【００３８】
この発明の別の態様は、微生物細胞から単離されるヒドロキシル化油脂を提供する。一態様において、ヒドロキシル化油脂は微生物細胞から単離され、ここで微生物細胞は微細藻類細胞（例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類細胞）である。さらなる態様において、ヒドロキシル化油脂はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から単離される。一実施形態では、ヒドロキシル化油脂はヒドロキシル化トリグリセリドである。ヒドロキシル化トリグリセリドは、ヒマシ油と化学的に同様又は同一であってもよい。
【００３９】
本発明のさらなる態様はヒドロキシル化脂肪酸である。ヒドロキシル化脂肪酸の一実施形態はリシノール酸である。
【００４０】
さらに別の態様において、微生物のヒドロキシル化油脂又はヒドロキシル化脂肪酸はさらにヒドロキシル化される。リシノール酸がヒドロキシル化されると、２個のヒドロキシル基を含む脂肪酸が提供される。
【００４１】
本発明のさらに別の態様は、ヒドロキシル化油脂及び／又はヒドロキシル化脂肪酸を、イソシアネート部分を含む化合物と反応させてポリウレタンを形成することにより調製される組成物を提供する。
【００４２】
本発明の別の態様は、少なくとも２０％がＣ１８：２である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも３０％がＣ１８：２である脂質プロフィールを有する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも４０％がＣ１８：２である脂質プロフィールを有する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも５０％がＣ１８：２である脂質プロフィールを有する。
【００４３】
本発明の別の態様は、脂質を生産する方法を提供し、この方法は、（ａ）培地において微細藻類細胞を育て、糖濃度をモニタリングすることと；（ｂ）培地の糖濃度が約１ｇ毎リットル未満に達したら、その培地に、約２グラム毎時毎リットル〜約１０グラム毎時毎リットルの連続的な速度で約２〜約２４時間にわたり第１の糖液を添加することと；（ｃ）培地に第２の糖液を添加して培地の糖濃度を約１５〜約２０グラム毎リットルに維持することと；（ｄ）微細藻類のバイオマスから脂質を単離することとを含む。ある場合では、第１の糖液は、約４グラムのショ糖毎時毎リットル〜約６グラムのショ糖毎時毎リットルの速度で培地に添加される。ある場合では、第１の糖液は、約５．２５グラムのショ糖毎時毎リットルの速度で培地に添加される。ある場合では、糖はショ糖又はグルコースである。
【００４４】
本発明の別の態様は、少なくとも１０％がＣ１８：３である脂質プロフィールを有する微細藻類細胞を提供する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも２０％がＣ１８：３である脂質プロフィールを有する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも３０％がＣ１８：３である脂質プロフィールを有する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも４０％がＣ１８：３である脂質プロフィールを有する。ある場合では、微細藻類細胞は、少なくとも５０％がＣ１８：３である脂質プロフィールを有する。
【００４５】
本発明の別の態様は、リノール酸又はリノレン酸を含むトリグリセリドを生成する微生物を提供し、ここで微生物は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳ  ＩＩ）酵素をコードする組み換え核酸を含む。ある場合では、微生物は、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）酵素をコードする組み換え核酸をさらに含む。ある場合では、微生物は、オレイン酸特異的チオエステラーゼ酵素をコードする組み換え核酸をさらに含む。ある場合では、微生物は、脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）酵素をコードする組み換え核酸をさらに含む。ある場合では、微生物は、グリセロ脂質デサチュラーゼをコードする組み換え核酸をさらに含む。
【００４６】
上記で考察される操作された微生物において、ＫＡＳ  ＩＩ酵素は、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ある場合では、ＳＡＤ酵素は、配列番号１７２、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、及び配列番号２０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ある場合では、オレイン酸特異的チオエステラーゼ酵素は、配列番号１９５、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、及び配列番号２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ある場合では、ＦＡＤ酵素は、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。ある場合では、ＦＡＤ酵素は、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、及び配列番号２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むΔ１２  ＦＡＤ酵素である。ある場合では、ＦＡＤ酵素は、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、及び配列番号２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むΔ１５  ＦＡＤ酵素である。ある場合では、グリセロ脂質デサチュラーゼは、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼである。
【００４７】
上記で考察される操作された微生物の任意のものが、ショ糖利用経路酵素をコードする組み換え核酸をさらに含むことができる。ある場合では、ショ糖利用経路酵素はショ糖インベルターゼである。
【００４８】
上記で考察される操作された微生物の任意のものにおいて、微生物は、他の脂肪酸に対するリノール酸又はリノレン酸の比率が増加するようにさらに操作されることができる。
【００４９】
上記で考察される操作された微生物の任意のものにおいて、微生物は、Ｃ１８基質に対して特異的又は選択的なチオエステラーゼを過剰発現するようにさらに操作されることができる。
【００５０】
上記で考察される操作された微生物の任意のものにおいて、微生物は、Ｃ８〜Ｃ１６基質に対して特異的又は選択的なチオエステラーゼの発現が低下するようにさらに操作されることができる。
【００５１】
上記で考察される操作された微生物の任意のものにおいて、微生物は微細藻類細胞であってもよい。ある場合では、微細藻類細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類細胞である。ある場合では、微細藻類細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞である。
【００５２】
本発明の別の態様は、上記で考察される操作された微生物の任意のものにより生成される油を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、リノール酸又はリノレン酸を含むトリグリセリドを生成するように組み換え核酸の１つ以上を微生物に導入することにより、上記で考察される操作された微生物を生成する方法を提供する。
【００５４】
本発明の別の態様は、トリアシルグリセリドを含む天然油を生成する方法、又はその天然油から生成される生成物を提供し、この方法は、（ｉ）組み換え微生物の細胞であって、（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き（場合により細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む）；又は（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含む細胞を育てることと；（ｉｉ）細胞から天然油を回収することとを含み、場合により天然油をさらに処理して食品、燃料、又は化学製品を作り出すことを含み、ここで天然油は、組み換え核酸によって変化した脂肪酸プロフィールを有する。
【００５５】
ある場合では、微生物はＩＩ型脂肪酸生合成経路により脂肪酸を合成する。ある場合では、微生物は微細藻類である。ある場合では、微細藻類は偏性従属栄養生物である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。ある場合では、微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである。ある場合では、細胞は、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である。ある場合では、育てることは、従属栄養で育てることである。ある場合では、脂肪酸デサチュラーゼは、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上である。ある場合では、細胞は、乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％のトリグリセリドを含むように育てられる。ある場合では、油は、５００、５０、又は５ｐｐｍ未満の有色分子を含む。ある場合では、組み換え核酸は安定に組み込まれる。ある場合では、組み換え核酸は、微生物の染色体に安定に組み込まれる。ある場合では、細胞は少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含む。
【００５６】
ある場合では、細胞は、酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によってその酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む。ある場合では、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の低下又は消失は、１つ以上の遺伝子が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子により分断又は置換されることに起因する。ある場合では、組み換え細胞は、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子をさらに含み、それによりリシノール酸を合成する。ある場合では、組み換え細胞は、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。ある場合では、細胞は、少なくとも４０、５０、６０、７０、又は８０％のＣ１６脂肪酸を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。ある場合では、細胞は、少なくとも５０〜７５％のＣ１６：０を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。ある場合では、細胞は、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有することによってさらに特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。ある場合では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子は、細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｒａｓｅ）と比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解においてより高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成する。ある場合では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子は、ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断する。ある場合では、組み換え細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む。
【００５７】
ある場合では、生成される油は、組み換え核酸の結果としてより短い平均脂肪酸鎖長によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、組み換え細胞は、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。ある場合では、核酸は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする。ある場合では、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる。ある場合では、生成される油は、高オレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、オレイン酸は、脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％を構成する。ある場合では、組み換え細胞は、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。ある場合では、生成される油は、組み換え核酸の結果としてＣ１８：１脂肪酸が増加し、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる。ある場合では、組み換え細胞は、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む。ある場合では、生成される油は、Ｃ１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、生成される油は、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる。ある場合では、生成される油は、少なくとも５０〜７５％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる。ある場合では、生成される油は、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有する脂肪酸プロフィールによってさらに特徴づけられる。ある場合では、細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む。ある場合では、この核酸は、活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする。ある場合では、生成される油は、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有することによって特徴づけられる。ある場合では、油をさらに処理することは、精製、漂白、脱臭、メタセシス、トランスエステル化、水素化、加水分解、水素化、脱酸素、ハイドロクラッキング、異性化、ヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｌｘｙｌａｔｉｏｎ）、インターエステル化、アミド化、スルホン化、及び硫化（ｓｕｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）のうちの１つ以上を含む。ある場合では、油は、食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、硫化油、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン、燃料ブレンドストック、燃料添加剤、潤滑油用添加剤、又は塗料を作り出すように処理される。
【００５８】
本発明の別の態様は、上記で考察される方法により得られる天然油を提供する。
【００５９】
本発明の別の態様は、上記で考察される天然油から作られる生成物を提供する。ある場合では、この生成物は、食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、硫化油、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン、燃料ブレンドストック、燃料添加剤、化学添加物、又は塗料を含む。
【００６０】
本発明の別の態様は、組み換え細胞であって、（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き（場合により細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む）；又は（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含む組み換え細胞を提供する。
【００６１】
ある場合では、微生物は、ＩＩ型脂肪酸生合成経路によって脂肪酸を合成する。ある場合では、微生物は微細藻類である。ある場合では、微細藻類は偏性従属栄養生物である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。ある場合では、微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである。ある場合では、細胞は、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である。ある場合では、細胞は、従属栄養で成長することができる。ある場合では、脂肪酸デサチュラーゼは、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上である。ある場合では、細胞は、乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％のトリグリセリドを含むように育てられる能力を有する。ある場合では、組み換え核酸は安定に組み込まれる。ある場合では、組み換え核酸は、微生物の染色体に安定に組み込まれる。ある場合では、細胞は少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含む。ある場合では、細胞は、酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によってその酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む。ある場合では、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の低下又は消失は、１つ以上の遺伝子が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子により分断又は置換されることに起因する。
【００６２】
ある場合では、組み換え細胞は、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子をさらに含み、それによりリシノール酸を合成する。ある場合では、組み換え細胞は、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。ある場合では、細胞は、少なくとも４０、５０、６０、７０、又は８０％のＣ１６脂肪酸を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。ある場合では、細胞は、少なくとも５０〜７５％のＣ１６：０を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。ある場合では、細胞は、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有することによってさらに特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。ある場合では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子は、細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｒａｓｅ）と比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解においてより高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成する。ある場合では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子は、ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断する。ある場合では、組み換え細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む。ある場合では、生成される油は、組み換え核酸の結果としてより短い平均脂肪酸鎖長によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、組み換え細胞は、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。ある場合では、核酸は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする。ある場合では、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる。
【００６３】
ある場合では、生成される油は、高オレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、オレイン酸は、脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％を構成する。ある場合では、組み換え細胞は、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。ある場合では、生成される油は、組み換え核酸の結果としてＣ１８：１脂肪酸が増加し、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる。ある場合では、組み換え細胞は、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む。ある場合では、生成される油は、Ｃ１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、生成される油は、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる。ある場合では、生成される油は、少なくとも５０〜７５％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる。ある場合では、生成される油は、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有する脂肪酸プロフィールによってさらに特徴づけられる。ある場合では、細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む。ある場合では、核酸は、活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする。ある場合では、生成される油は、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。ある場合では、油の脂肪酸プロフィールは、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有することによって特徴づけられる。
【００６４】
本発明の別の態様は、上述の細胞から生成される天然油又は油含有生成物を提供する。
【００６５】
本発明の別の態様は、リシノール酸を含むトリアシルグリセリドを含む天然油、又はその天然油から生産される生成物を生成する方法を提供し、この方法は、組み換え微生物の細胞あって、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それによりリシノール酸を合成する細胞を育てることを含む。
【００６６】
ある場合では、微生物はＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する。ある場合では、微生物は微細藻類である。ある場合では、微細藻類は偏性従属栄養生物である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの種である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。ある場合では、微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである。ある場合では、細胞は、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である。ある場合では、育てることは、従属栄養で育てることである。ある場合では、細胞は、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸が存在しないときに少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％のオレイン酸を生成する。ある場合では、細胞は、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼに対する基質レベルを高めるためオレイン酸生成を高める働きをする組み換え核酸をさらに含む。ある場合では、細胞は、（ａ）活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含む。
【００６７】
本発明の別の態様は、上記で考察される方法のうちのいずれかにより生成される生成物を提供する。
【００６８】
本発明の別の態様は、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それによりリシノール酸を合成する微生物細胞を提供する。
【００６９】
ある場合では、微生物はＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する。ある場合では、微生物は微細藻類である。ある場合では、微細藻類は偏性従属栄養生物である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの種である。ある場合では、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。ある場合では、微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである。ある場合では、細胞は、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である。ある場合では、細胞は従属栄養で成長することができる。ある場合では、細胞は、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸が存在しないときに少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％のオレイン酸を生成する。ある場合では、細胞は、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼに対する基質レベルを高めるためオレイン酸生成を高める働きをする組み換え核酸をさらに含む。ある場合では、細胞は、（ａ）活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含む。
【００７０】
本発明の別の態様は、上記に考察したような油を含む食品を提供する。
【００７１】
本発明のこれらの及び他の態様及び実施形態を、添付の図面（図面の簡単な説明はこのすぐ後に続く）、以下の本発明の詳細な説明において説明し、及び以下の例において例証する。上記で及び本出願全体にわたって考察される特徴のいずれも、本発明の種々の実施形態に組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａトリグリセリド油脂から生成される再生可能なディーゼルのクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、リシノール酸標準及び野生型対照と比較した代表的な陽性トランスジェニッククローンのＧＣ保持時間を示す。
【図３】図３は、実施例１８で記載されるような、標的遺伝子破壊を有する、及び有しない、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＤｃ対立遺伝子のＰｓｔＩ制限地図を示す。
【図４】図４は、実施例１８で記載されるサザンブロットの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明の詳細な説明
本発明の例示的な実施形態は、改変されたグリセロ脂質プロフィールを生成する油産生細胞、及びその細胞から生成される産物を特徴とする。油産生細胞（ｏｌｅａｇｎｉｎｏｕｓ  ｃｅｌｌ）の例としては、ＩＩ型脂質生合成経路を有する微生物細胞が挙げられる。実施形態には、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｔｕｒａｓｅ）、ケトアシルシンテターゼのようなタンパク質をコードする１つ以上の外来遺伝子を発現し、且つ場合により、同様の活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子の１つ以上のノックダウンを有する組み換え細胞が含まれる。結果として、いくつかの実施形態は、これまでには得ることのできなかった天然油を特徴とする。また、本発明は、そのような細胞から、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル及びジェット燃料のような燃料、食用油及び化学薬品を含む、脂質及び油をベースとする生成物を製造する方法も提供する。
【００７４】
本発明の実施形態により作られる油は、他の用途の中でも、輸送燃料、油脂化学品、及び／又は食品及び香粧品産業で使用することができる。例えば、脂質のトランスエステル化によって、バイオディーゼルに有用な長鎖脂肪酸エステルを得ることができる。他の酵素プロセス及び化学プロセスを、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン、及びアルケンを生成するように調節することができる。いくつかの用途では、再生可能ディーゼル、ジェット燃料、又は他の炭化水素化合物を生成する。また、本発明は、生産性を高め、脂質収量を増やし、及び／又は、本明細書に記載される組成物を高い費用効率で生成するために、微細藻類を育てる方法も提供する。
【００７５】
本発明の実施形態は、トリアシルグリセリドを含む天然油を生成する方法、又はその天然油から生成される生成物を生成する方法を提供する。天然油は非植物油又は非種子油であってよい。この方法は、組み換え微生物の細胞を育てて用途に応じた油；すなわち、細胞中に組み換え核酸が存在することによって改変された脂肪酸プロフィールを有する油を生成することを含む。次いで、その天然油をさらに処理して、食品、燃料、又は化学製品を製造することができる。細胞中の組み換え核酸は、（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする。場合により細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物（例えば、二倍体生物における２つの対立遺伝子）の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む；又は（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする；又は（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする；又は（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする。
【００７６】
１つ以上の脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔｕｒａｓｅ）をコードする組み換え核酸が細胞中に存在する場合、核酸は、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上をコードし得る。
【００７７】
細胞が、酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む場合、これは、酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によって行われても、又は定方向突然変異、完全欠失、若しくは部分欠失を含む他の適した手段により行われてもよい。従って、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の低下又は栄養（ａｌｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、１つ以上の遺伝子を、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子により分断又は置換することに起因し得る。
【００７８】
好ましくは、組み換え核酸は細胞に；例えば、細胞の染色体、又はエピソームに安定に組み込まれる。安定に組み込まれた核酸を有する細胞の選択は、本明細書に記載するとおり、ショ糖インベルターゼ、抗生物質耐性遺伝子、又はチアミン栄養要求相補体のような選択可能なマーカーを用いることで促進され得る。
【００７９】
好ましくは、微生物は、ＩＩ型脂肪酸生合成経路によって脂肪酸を合成する微生物であり得る。例えば、微生物は微細藻類であってもよく、しかしながら、また、通常はＩ型脂肪酸生合成経路を有する微生物（例えば、油を生成する酵母）であって、それに遺伝子操作技法を用いてＩＩ型の遺伝機構が導入されたものであってもよい。微生物は、従属栄養生物、及び特定の実施形態では偏性従属栄養生物であってもよい。微細藻類が使用される場合、微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種であってもよい。例示的な種としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓが挙げられる。サトウキビ汁及び本明細書に記載される他のもののようなショ糖原材料の使用を可能にするため、組み換え細胞は、活性なショ糖インベルターゼを発現するためショ糖インベルターゼ遺伝子を含む組み換え核酸を含むことができる。ショ糖インベルターゼは、微生物によって培地中に分泌され得る。
【００８０】
培養は従属栄養培養であってもよく；例えば、バイオリアクター内でグルコース又はショ糖のような固定炭素源を使用して実施することができる。培養は、細胞が乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％トリグリセリドに達するまで継続され得る。これは、以下に記載するとおり、制限窒素を用いた培養を伴い得る。
【００８１】
細胞によって生成される油は、細胞から抽出され得る。ある実施形態では、この油は、５００、５０、又は５ｐｐｍ未満の有色分子を含む。場合により、油はその脂肪酸プロフィールについて分析される；例えばＬＣ−ＭＳによる。また、油は、実施例１９、表６０〜表６３の油の特性のうちの１つ以上を有し得る。
【００８２】
特定の実施形態では、組み換え細胞は、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。結果として、細胞は、少なくとも４０、５０、６０、又は７０％のＣ１６脂肪酸（例えば、パルミチン酸）を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する。従って、油は、より短い鎖長の方にシフトした脂肪酸分布を有し得る。脂肪酸分布のシフトは、平均脂肪酸長の減少又は（ｏ９ｒ）分布についての他の統計的特徴によって特徴づけることができる。例えば、平均脂肪酸長を計算するには、トリグリセリドを構成している検出可能な各脂肪酸の割合に脂肪酸中の炭素の数を乗じ、その積の合計を１００で除す。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子は、細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼと比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解において高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成し得る。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子は、ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断し得る。このように、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの挿入はまた、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を一工程で消失させることができる。実施例１５及び１６を参照。
【００８３】
別の特定の実施形態では、組み換え細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む。結果として、生成される油は、組み換え核酸を有しない同等の細胞より短い脂肪酸鎖長の分布によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する。これは、平均脂肪酸鎖長の減少として表現され得る。組み換え細胞は、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含むことができる。場合により、核酸は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物（例えば、対立遺伝子）によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする。特定の実施形態では、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる。結果として、生成される油は、この核酸を有しない同等の細胞により生成される油と比較して、高濃度のオレイン酸を有することができる。オレイン酸は、脂肪酸プロフィールにおいて脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％を構成する。実施例１０を参照。
【００８４】
別の特定の実施形態では、組み換え細胞は、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む。結果として、生成される油は、組み換え核酸の結果として１８：１脂肪酸が上昇し、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられ得る。実施例１３を参照、ここではＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現によってＣ１８脂肪酸の割合が非形質転換細胞における約６８％から約８４％に増加した。関連する実施形態では、この増加は７０％超、７５〜８５％、又は７０〜９０％である。
【００８５】
別の特定の実施形態では、組み換え細胞は、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む。結果として、生成される油は、１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有することができる。１８：０脂肪酸は、プロフィールにおける脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％であってよい。実施例１２を参照。
【００８６】
別の特定の実施形態では、細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物（例えば２つの対立遺伝子）の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む。実施例１４を参照、ここではＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおいて内在するＫＡＳＩ対立遺伝子がノックアウトされた。結果として、内在するＫＡＳＩの破壊により、約３５％〜４００％の総Ｃ１４脂肪酸の割合の増加及び約３０〜５０％のＣ１６脂肪酸の割合の増加が認められた。
【００８７】
別の特定の実施形態では、細胞は、活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含む。結果として、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方が細胞によって生成され、及び細胞脂質の脂肪酸プロフィールに検出され得る。例えば、細胞は、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有し得る。例えば、実施例１１のとおり、組み換えΔ１５デサチュラーゼ酵素を発現させることができる。結果として、Ｃ１８：３脂肪酸（すなわち、リノレン酸）を約２〜１７倍、又はそれ以上増加させることができる。
【００８８】
別の実施形態では、組み換え微生物の細胞が育てられる。細胞は、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それによりリシノール酸を合成する。この遺伝子は、前述の実施形態の任意のものに存在し得る。実施例７を参照。１２−ヒドロキシラーゼに好ましい基質はオレイン酸である。従って、好ましい実施形態では、オレイン酸生成を増加させる働きをする組み換え核酸を細胞に含めることで、より高収率のリシノール酸を得ることができる。限定なしに、細胞は、活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含む。
【００８９】
本発明の任意の実施形態において、油は抽出され、さらに、精製、漂白、脱臭、メタセシス、トランスエステル化、水素化、加水分解、水素化、脱酸素、ハイドロクラッキング、異性化、ヒドロキシル化、インターエステル化、アミド化、スルホン化、及び硫化（ｓｕｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）の１つ以上によって処理され得る。油を処理することにより、例えば、食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、又は硫化油、ディーゼル、ジェット用ガソリン、又はブレンドストック又は添加剤、潤滑剤、又はペンキが作り出され得る。
【００９０】
本明細書で言及する実施形態のいずれも、食品又は食用油として有用であり得る。全有機体を食品中に組み込むことができる。有機体は、インタクトであっても、部分的に溶解していても、ほとんど溶解していても、又は完全に溶解していてもよい。油産生有機体を調製して食品に使用する方法は、国際公開第２０１１／１５０４１１号、国際公開第２０１０／１２０９３号、国際公開第２０１１１３０５７８号、及び国際公開第２０１１／１３０５７６号に教示されている。あるいは、有機体から抽出され、場合により精製された油は、スプレッド、ソース、糖菓、及び冷凍糖菓などの加工食品中の食用油成分としての使用を含め、食用油として使用することができる。特定の実施形態では、油産生細胞又は食用油は、５０〜７０％のＣ１８：０及び２０〜４０％の１８：１（例えばオレイン酸）を含む。別の特定の実施形態では、油産生細胞又は食用油は、５０〜７０％のＣ１６：０及び２０〜４０％の１８：１（例えばオレイン酸）を含む。
【００９１】
読者が読みやすいように、本発明の詳細な説明をいくつかの章に分けている。第Ｉ章は、本明細書で用いる用語の定義を記載している。第ＩＩ章は、本発明の方法で有用な培養条件を記載している。第ＩＩＩ章は、遺伝子操作の方法及び材料を記載している。第ＩＶ章は、ショ糖を利用することが可能となるように遺伝子操作することを記載している。第Ｖ章は、脂質生合成を改変するための遺伝子操作を記載している。第ＶＩ章は、燃料及び化学物質を製造する方法を記載している。第ＶＩＩ章は、本発明の実施例及び実施形態を開示している。本発明の詳細な説明の後に、本発明の種々の態様及び実施形態を説明する実施例が続く。
【００９２】
Ｉ．定義
他の意味であると定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び化学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書で使用される場合、他の意味であると明記されていない限り、以下の用語は、それらに属する以下の意味を有する。
【００９３】
「微細藻類内で活性」は、微細藻類内で機能を発揮する核酸を指す。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を付与するために、抗生物質耐性遺伝子を動かすために用いられるプロモーターは、微細藻類内で活性である。
【００９４】
「面積百分率」は、サンプル中の全ての脂肪酸を、検出前に脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換し、ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ検出法を用いて観察したピークの面積を指す。例えば、炭素原子１４個で、不飽和部のない脂肪酸（Ｃ１４：０）について、分離したピークが、任意の他の脂肪酸、例えば、Ｃ１４：１と比較すると観察される。それぞれの種類のＦＡＭＥに対するピーク面積は、混合物中のその組成物における割合と正比例しており、サンプル中に存在する全ピークの合計に基づいて算出される（すなわち、［特定のピークの面積／測定した全ピークの合計面積］×１００）。本発明の油及び細胞の脂質プロフィールについて述べる場合、「Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％」は、細胞中、又は抽出したグリセロ脂質組成物中の総脂肪酸のうち、少なくとも４％が、炭素原子が８個、１０個、１２個又は１４個の鎖長を有することを意味している。
【００９５】
「純培養」は、他の生物によって汚染されていない、微生物の培養物である。
【００９６】
「バイオディーゼル」は、ディーゼルエンジンの燃料として使用するのに適した、生物によって生成された脂肪酸アルキルエステルである。
【００９７】
「バイオマス」は、細胞の成長及び／又は増殖によって生成する物質である。バイオマスは、細胞及び／又は細胞内成分、並びに、限定されないが、細胞によって分泌された化合物のような細胞外物質を含有していてもよい。
【００９８】
「バイオリアクター」は、細胞を場合により懸濁物の状態で培養する、閉じられた筐体又は部分的に閉じられた筐体である。
【００９９】
「セルロース系材料」は、セルロース及び場合によりヘミセルロースを含む生物学的材料である。従ってこれは、グルコース及びキシロースなどの糖に消化可能であり、場合により、二糖類、オリゴ糖類、リグニン、フルフラール類のようなさらなる化合物及び他の化合物を含み得る。セルロース系材料の供給源の非限定的な例としては、サトウキビの絞りかす、テンサイパルプ、トウモロコシ茎葉、木片、おがくず及びスイッチグラスが挙げられる。
【０１００】
「共生培養」、及び「共生生育」及び「共生発酵」などのこの用語の変形は、同じバイオリアクター内で２種類以上の細胞を育てることを指す。２種類以上の細胞は、全てが微細藻類のような微生物であってもよく、異なる細胞種と共に培養された微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、２種類以上の細胞の成長及び／又は増殖を進めるような条件であってもよく、又は、２種類以上の細胞のうち１種類、又は部分的な集合の成長及び／又は繁殖を容易にしつつ、残りの細胞の成長を維持する条件であってもよい。
【０１０１】
「有色分子」又は「着色性不純物」は、本明細書で使用される場合、抽出した油に色を付与する任意の化合物を指す。「有色分子」又は「着色性不純物」には、例えば、クロロフィルａ、クロロフィルｂ、リコピン、トコフェロール、カンペステロール、トコトリエノール、及びカロチノイド、例えばβ−カロチン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンが含まれる。これらの分子は、好ましくは微生物バイオマス又は抽出油中に５００ｐｐｍ以下、２５０ｐｐｍ以下、１００ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、又は２５ｐｐｍ以下の濃度で存在する。他の実施形態では、微生物バイオマス又は抽出油中に存在するクロロフィルの量は、５００ｍｇ／ｋｇ未満、１００ｍｇ／ｋｇ未満、１０ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、０．５ｍｇ／ｋｇ未満、０．１ｍｇ／ｋｇ未満、０．０５ｍｇ／ｋｇ未満、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ未満である。
【０１０２】
「育てられた」、及びこの語句の別の言い方である「培養された」、「発酵された」は、選択した条件及び／又は制御された条件を利用することによって、１つ以上の細胞の成長（細胞の大きさ、細胞成分が増え、及び／又は細胞活性が高まる）及び／又は増殖（細胞の数が増える）を意図的に進めることを指す。成長と増殖を組み合わせて、「繁殖」と呼ぶ。選択した条件及び／又は制御された条件の例としては、十分に定義されている培地（ｐＨ、イオン強度、炭素源のような既知の特徴を有する）、特定の温度、酸素圧、二酸化炭素濃度、バイオリアクター内の成長を用いることが挙げられる。「育てること」は、微生物の成長又は増殖が自然に起こること、又は人の介入なしに起こることを指さず、例えば、微生物が地中で最終的に化石化し、未精製油を生成するような天然の成長は、育てられたとは言わない。
【０１０３】
「デサチュラーゼ」は、トリアシルグリセリド分子の脂肪酸鎖に二重結合（不飽和）を組み込むことに関与する脂質合成経路の酵素を指す。例としては、限定されないが、ステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）及び脂肪酸アシルデサチュラーゼとしても知られる脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）が挙げられる。
【０１０４】
「発現ベクター」又は「発現構築物」又は「プラスミド」又は「組み換えＤＮＡ構築物」は、宿主細胞に核酸を導入するための媒体である。この核酸は、特定の核酸の転写及び／又は翻訳を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いた、組み換え手段又は直接的な化学合成によるなどの、人の介入によって生じたものであってよい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸フラグメント、又は他の適した媒体の一部であってもよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに動作可能に連結した、転写されるべき核酸を含む。
【０１０５】
「外来遺伝子」は、細胞に導入された（例えば形質転換／トランスフェクションにより）、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現をコードする核酸であり、「トランス遺伝子」とも呼ばれる。外来遺伝子を含む細胞は組み換え細胞と呼ぶことができ、そこに１つ又は複数のさらなる外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子は、形質転換される細胞と異なる種に由来していてもよく（つまり、異種）、同じ種に由来していてもよい（つまり、同種）。従って、外来遺伝子は、この細胞のゲノムでは異なる位置にあるような同種遺伝子を含んでいてもよく、内在する遺伝子複製物と比較して、異なる制御下にある同種遺伝子を含んでいてもよい。外来遺伝子は、この細胞の２種類以上の複製物中に存在していてもよい。外来遺伝子は、ゲノム（核またはプラスチド）への挿入物として細胞中に維持されてもよく、又はエピソーム分子として細胞中に維持されてもよい。
【０１０６】
「外部から与えられた」は、細胞培養物の培地に与えられた分子を指す。
【０１０７】
文脈によっては、「脂肪酸」は、遊離脂肪酸、脂肪酸塩、又はグリセロ脂質中の脂肪酸アシル部分を意味するものとする。
【０１０８】
「固定炭素源」は、培地中で、周囲温度及び周囲圧力で固体又は液体の形態として存在し、培地で培養されている微生物が利用することが可能な、炭素を含有する分子、典型的には有機分子である。従って、二酸化炭素は固定炭素源ではない。
【０１０９】
「従属栄養性」は、それが培養条件に関連する場合、固定炭素源を利用又は代謝する間に光が実質的に存在しない状態で培養することである。
【０１１０】
「ホモジネート」は、物理的に破壊されたバイオマスである。
【０１１１】
「水素：炭素比」は、原子単位であらわした、分子中の水素原子と炭素原子との比率である。この比率は、炭化水素分子中の炭素原子及び水素原子の数を述べるときに用いられ得る。例えば、最も大きな比率を有する炭化水素は、メタンＣＨ４である（４：１）。
【０１１２】
「誘発性プロモーター」は、特定の刺激に応答し、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターである。そのようなプロモーターの例は、ｐＨ又は窒素レベルが変化する条件下で誘導されるプロモーター配列であり得る。
【０１１３】
「動作可能に連結した状態で」は、制御配列（典型的には、プロモーター）、連結した配列（典型的には、タンパク質をコードする配列、コード配列とも呼ばれる）のような、２個の核酸配列間の機能的な連結である。プロモーターは、遺伝子の転写に介在することができる場合、外来遺伝子と動作可能に連結した状態である。
【０１１４】
「脂質改変酵素」は、脂質の共有結合構造を変える、又は他の形で細胞における脂肪酸プロフィールの改変をもたらす酵素を指す。脂質改変酵素の例としては、リパーゼ、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、ステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）及び脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）（ＦＡＤ）を含むデサチュラーゼ、及び脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。
【０１１５】
「脂質経路に関連する酵素」は、脂質代謝、すなわち、脂質合成、改変又は変性においてなんらかの役割をはたす任意の酵素であり、脂質を化学的に改変するタンパク質、及びキャリアータンパク質である。
【０１１６】
「脂質プロフィール」又は「グリセロ脂質プロフィール」は、細胞又は細胞から得られた油における脂肪酸の鎖長及び／又は飽和パターンに関しての分布を指す。これに関連して、飽和パターンは、細胞のさまざまな脂肪酸における飽和酸対不飽和酸の尺度、又は二重結合の位置の分布のより詳細な分析を含み得る。
【０１１７】
「溶解」は、生物有機体の原形質膜、場合により、細胞壁を、多くは生物有機体の一体性を失わせるような機械的な機構、化学的な機構、ウイルスによる機構、又は浸透力による機構によって、細胞内成分を少なくともいくらか放出させるのに十分な程度まで破壊することである。
【０１１８】
「溶解すること」は、溶解のプロセスである。
【０１１９】
「微細藻類」は、葉緑体又はプラスチドを含み、場合により、光合成を行うことができる微生物であるか、又は、光合成を行うことができる原核性微生物である。微細藻類には、固定炭素源をエネルギーとして代謝することができない偏性光合成独立栄養生物と、単に固定炭素源がないと生存することができない従属栄養生物とが存在する。微細藻類には、細胞分裂の直後に、妹細胞から分離するＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような単細胞有機体、２種類の別個の細胞型を有する単純な多細胞光合成細菌である、例えば、Ｖｏｌｖｏｘのような細菌が含まれる。微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａのような細胞を含む。また、微細藻類には、Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓのような、細胞−細胞接着性を示す他の細菌の有機体も含まれる。また、微細藻類には、特定のｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ａｌｇａｅ種、及びＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種のような、光合成を行う能力が失われている偏性従属栄養微生物も含まれる。
【０１２０】
「中鎖」は、脂肪酸に関連して本明細書で使用される場合、Ｃ１０〜Ｃ１６脂肪酸を指す。これに関連して「短鎖」はＣ６〜Ｃ１０脂肪酸を指し、一方「長鎖」はＣ１７以上の脂肪酸を指す。特に指示されない限り、これらの境界は正確に定義することを意図するものではない。
【０１２１】
「天然油」は、有機体から得られる、主にトリグリセリドの油を意味するものとし、ここで油は、トリグリセリドの脂肪酸プロフィールを実質的に変化させるような別の天然油若しくは合成油との混合、又は画分化を受けていない。ここで、用語「画分化」は、その有機体から生じる、しかしながら完成されたプロフィールと比べて、その脂肪酸プロフィールが変化する方法で、油から材料を取り出すことを意味する。天然油は、有機体から得られる油を包含し、ここで油は、そのトリグリセリドプロフィールを実質的に変化させることのない、精製、漂白及び／又は脱ガムを含めた処理を、最小限だけ受けている。また、天然油は「非インターエステル化天然油」であってもよく、これは、その天然油が、脂肪酸をそのアシル結合においてグリセロールに再分布させるプロセスを受けておらず、有機体から回収されたときと本質的に同じ構造のままであることを意味する。
【０１２２】
「自然に共発現する」は、２種類のタンパク質あるいは遺伝子に関する際、例えば、２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、共通の制御配列の制御下にあるため、又は、上述の２種類のタンパク質をコードする遺伝子が、同じ刺激に応答して発現するため、そのタンパク質又は遺伝子が、これらが誘導される組織又は有機体で自然に共発現することを意味する。
【０１２３】
「浸透圧衝撃」は、浸透圧が突然下がることによって、細胞が溶液中で破裂することである。浸透圧衝撃は、時に、誘発されてこのような細胞の細胞成分が溶液内に放出される。
【０１２４】
「多糖分解酵素」は、任意の多糖の加水分解又は糖化を触媒することができる任意の酵素である。例えば、セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する。
【０１２５】
「多糖類」又は「グリカン」は、単糖類がグリコシド結合によって接続したもので構成される炭水化物である。セルロースは、特定の植物細胞壁を構成する多糖である。セルロースは、酵素によって解重合し、キシロース及びグルコースのような単糖類や、これより大きな二糖類及びオリゴ糖を生成し得る。
【０１２６】
「プロモーター」は、核酸の転写に関連する核酸制御配列である。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位の近くに、必要な核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。また、プロモーターは、場合により、遠位エンハンサーエレメント又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位から数千塩基対離れた位置にあってもよい。
【０１２７】
「組み換え体」は、外来の核酸を導入するか、又は天然の核酸を変えることによって改変された細胞、核酸、タンパク質又はベクターである。従って、例えば、組み換え細胞は、この細胞の天然の（組み換えされていない）形態にはみられない遺伝子を発現することも、組み換えされていない細胞によって発現する遺伝子とは異なる天然遺伝子を発現することもできる。組み換え細胞には、限定なしに、細胞における活性な遺伝子産物のレベルを低下させる突然変異、ノックアウト、アンチセンス、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）又はｄｓＲＮＡなどの遺伝子産物又は抑制エレメントをコードする組み換え核酸が含まれ得る。「組み換え核酸」は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、一般的に核酸を操作することによって元々作られている核酸が、ポリメラーゼ、リガーゼ、エクソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、又はそれ以外のものを用いて、天然には通常みられない形態になっているような核酸である。組み換え核酸は、例えば、動作可能に連結した状態にある２種類以上の核酸を配置することによって生成させてもよい。従って、天然では通常は接続していないＤＮＡ分子を結合させることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した核酸又は発現ベクターの単離物は、両方とも本発明の目的で組み換えであると考える。組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は有機体に導入されると、宿主細胞の細胞機構を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで複製し得るが、このような核酸は、いったん組み換え状態で産生すると、その後に細胞内で複製されたものであっても、本発明の目的で組み換えと考える。同様に、「組み換えタンパク質」は、組み換え技術によって、すなわち、組み換え核酸の発現によって作られるタンパク質である。
【０１２８】
「再生可能なディーゼル」は、天然油から、たとえば脂質の水素化及び脱酸素によって生成するアルカン混合物（例えば、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０）である。
【０１２９】
「糖化」は、バイオマス、通常はセルロース系バイオマス又はリグノセルロース系バイオマスを、グルコース及びキシロースのような単糖類に変換するプロセスである。「糖化された」又は「解重合された」セルロース系材料又はバイオマスは、糖化によって単糖類に変換されたセルロース系材料又はバイオマスを指す。
【０１３０】
「フルフラール種」は、２−フランカルボキサアルデヒド、又は同じ基本構造の特徴を保持した誘導体である。
【０１３１】
本明細書の実施形態に従い組み換え株を作成するための株の形質転換との関連において（及び必ずしも先行技術の考察との関連ではなく）、「安定な」又は「安定に組み込まれる」は、株の細胞によって少なくとも１０世代にわたり組み換え核酸が維持されることを意味するものとする。例えば、組み換え株が、選択圧の存在下で育てることを可能にする選択可能なマーカーを有する場合、その組み換え核酸は、選択圧が存在しない状態で１０世代を育てた後に維持される。
【０１３２】
「ショ糖利用遺伝子」は、発現すると、ショ糖をエネルギー源として利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖利用遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書では「ショ糖利用酵素」と呼ばれ、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、グルコキナーゼやフルクトキナーゼのようなヘキソキナーゼを含む。
【０１３３】
ＩＩ．育てること
本発明は、一般的には、微生物、特に、微細藻類のような、ＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する油産生微生物を育ててトリグリセリドを生成することに関する。ある実施形態では、微生物は偏性従属栄養生物である。微生物は、例えば下記に開示される遺伝子操作方法に基づく、組み換え微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｍ）であってもよい。読者が読みやすいように、この章をいくつかの節に分けている。第１節は、微生物の種及び株について記載している。第２節は、育てるのに有用なバイオリアクターについて記載している。第３節は、育てるための培地について記載している。第４節は、本発明の例示的な育てる方法に従って油を生成することについて記載している。
【０１３４】
１．微生物（ｍｉｃｒｏｏｇａｎｓｉｍ）種及び微生物株
以下に提示する例示的な実施形態は、多くの微生物に適用することができるが、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａが、脂質の生成に使用するのに好ましい微生物である。重要なことには、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを例として本明細書に記載される遺伝子操作方法は、他の微生物（例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、又はＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）に適用可能である。
【０１３５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａのような偏性従属栄養微細藻類から得られる脂質又は油は、一般的に色素が少なく（例えば、クロロフィル及び特定のカロチノイド類が低い乃至検出不能なレベル、例えば有色分子、着色性不純物、又はクロロフィルとカロチノイドとの合計濃度が５００、５０又は５ｐｐｍ未満）、いずれの場合にも他の微細藻類由来の脂質と比べて含有する色素がはるかに少ないものであり得る。さらに、本発明によって与えられる組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を用い、他の微生物から脂質を産生する場合と比較して、低コストで、高収率及び高効率で脂質を生成させることができる。本発明の方法で用いる具体的なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株としては、が挙げられる。それに加え、この微細藻類は、従属栄養性で成長し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  ３２７を含む）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ポートｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ株１４４１、１４３５を含む）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉとして遺伝子操作することができる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種は、偏性従属栄養生物である。
【０１３６】
本発明の実施形態で用いるための微生物の選択に影響を及ぼす考慮事項としては、油、燃料、及び油脂化学品を生成するのに適した脂質又は炭化水素の生成に加え、（１）細胞重量を基準とした割合で脂質含有量が高いこと；（２）成長が容易であること；（３）遺伝子操作が容易であること；及び（４）バイオマスの処理が容易であることが挙げられる。特定の実施形態では、野生型の微生物又は遺伝子操作された微生物から、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又はそれ以上が脂質である細胞が得られる。他の特定の実施形態では、野生型の微生物又は遺伝子操作された微生物から、４０〜８０％又は５０〜９０％がトリグリセリドである細胞が得られる。好ましい有機体は、従属栄養で（光がない状態の糖上で）成長する。
【０１３７】
本発明の実施に使用することのできる藻類の例としては、限定されないが、以下の表１に列挙される藻類が挙げられる。
【０１３８】
【表１】
2014511140.tif 000002
【０１３９】
【表２】
2014511140.tif 000003
【０１４０】
２．バイオリアクター
微生物を、遺伝子操作を行うという目的で、及び炭化水素（例えば、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール、アルカン）を生成するという目的で培養する。前者の種類の培養では、小スケールで実施し、最初は、少なくとも、原料微生物が成長可能な条件下で実施する。炭化水素を生成させるための培養は、通常は、バイオリアクター中、大スケールで実施する（例えば、１０，０００リットル、４０，０００リットル、１００，０００リットル、又はそれより大きなバイオリアクター）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含む微細藻類は、典型的には、バイオリアクター内の液体培地にて、本発明の方法で培養する。典型的には、バイオリアクターには光を入れない
【０１４１】
バイオリアクター又は発酵槽を用い、生理学的周期の種々の段階を経て、微細藻類細胞を培養する。バイオリアクターは、従属栄養を成長及び増殖させる方法で用いると、多くの利点を与える。バイオマスを生成させるために、微細藻類を、好ましくは、液体中で、一例として懸濁培養物中で、大量に発酵させる。鋼鉄製発酵槽のようなバイオリアクターは、非常に大きな容積の培養物を収容する（種々の本発明の実施形態では、４０，０００リットル以上の容量を有するバイオリアクターを用いる）。また、バイオリアクターによって、典型的には、温度、ｐＨ、酸素圧、二酸化炭素濃度のような培養条件を制御することができる。例えば、バイオリアクターは、典型的には、例えば、酸素又は窒素のような気体成分を液体培養物にバブリングすることが可能な配管に接続したポートを用いて構築することができる。また、培地のｐＨ、微量元素が何であるか及びその濃度、他の培地構成要素のような他の培養パラメーターは、バイオリアクターを用いて簡単に操作することができる。
【０１４２】
スピニングブレード、インペラー、揺動機構、撹拌棒、加圧気体を注入する手段のようなデバイスを備えるバイオリアクターを用い、培養物を混合することができる。混合は、連続的であってもよく、断続的であってもよい。例えば、ある実施形態では、細胞が望ましい数に増えるまで細胞を繁殖させるために、気体及び培地を入れるのに乱流を用いる形態は維持されない。
【０１４３】
気体、固体、半固体、液体を、微細藻類を含むバイオリアクターチャンバーに入れるため、又は抽出するために、バイオリアクターポートを用いてもよい。多くのバイオリアクターは、２個以上のポートを備えているが（例えば、１つは培地を入れるため、他方はサンプリングのため）、１種類の基質だけを１個のポートから入れたり、出したりする必要はない。例えば、バイオリアクターに培地を流し、その後で、サンプリングしたり、ガスを入れたり、ガスを出したり、又は他の目的のために１個のポートを使用してもよい。好ましくは、培養物の純培養性を損なうことなく、サンプリングポートを繰り返し用いることができる。サンプリングポートは、サンプルの流れを止めるか、開始させるか、又は連続的なサンプリング手段を与えるようなバルブ又は他のデバイスを備えるような構成であってもよい。バイオリアクターは、典型的には、培養物を播種することができるような少なくとも１個のポートを備えており、このようなポートを、培地又は気体を入れるような他の目的で用いることもできる。
【０１４４】
バイオリアクターポートによって、微細藻類の培養物の気体内容物を操作することができる。説明のために、バイオリアクターの容積の一部分は、液体ではなく気体であってもよく、バイオリアクターの気体注入口から、ポンプによって気体をバイオリアクターに入れることができる。ポンプによってバイオリアクターへと有益に入れることが可能な気体としては、空気、酸素、空気／ＣＯ２混合物、アルゴンのような希ガス、他の気体が挙げられる。バイオリアクターは、バイオリアクターにガスを入れる速度をユーザーが制御することができるように取り付けられ得る。上述のとおり、バイオリアクターへの気体の流れを増やすことによって、培養物の混合性を高めることができる。
【０１４５】
気体の流れを増やすことは、培地の濁度にも影響を及ぼす。乱流は、バイオリアクターに入った気体が培地表面でバブリングするように、水性培地の液量より低いところに気体注入ポートを配置することによって起こすことができる。１種類以上の気体がポートを出て行き、気体が外に逃げ、それにより、バイオリアクター中に圧力が蓄積されるのを防ぐ。好ましくは、気体流出ポートは、バイオリアクターに微生物が入り込んで汚染されることを防ぐような「一方向」バルブにつながっている。
【０１４６】
３．培地
微生物の培地は、典型的には、固定窒素源、固定炭素源、微量元素、場合により、ｐＨを維持するためのバッファー、ホスフェート（典型的には、リン酸塩として与えられる）のような成分を含有する。他の成分は、特に、海水微細藻類の場合には、塩化ナトリウムのような塩を含んでいてもよい。窒素源としては、有機窒素源及び無機窒素源が挙げられ、例えば、限定されないが、分子状窒素、硝酸エステル、硝酸塩、アンモニア（純水なもの、又は塩形態、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮＨ４ＯＨ）、タンパク質、大豆ミール、コーンスティープリカー、酵母抽出物が挙げられる。微量元素の例としては、例えば、それぞれＺｎＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏのような形態の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンが挙げられる。
【０１４７】
本発明の方法で有用な微生物は、世界中の種々の場所及び環境で発見されている。他の種からの単離、及び得られる進化多様性の結果として、最適な成長、及び脂質及び／又は炭化水素構成要素の最適な発生のための特定の成長培地は、予測することが困難な場合がある。ある場合では、特定の微生物株は、ある種の阻害成分が存在するか、又は、特定の微生物株が必要とするある種の必須栄養分が必要量存在しないために、特定の成長培地上で成長することができない場合がある。
【０１４８】
固体及び液体の成長培地は、一般的に、さまざまな供給源から入手可能であり、さまざまな微生物株に適した特定の培地を調製する方法の説明は、例えば、オンラインでは、藻類の培養物を収集するためのＡｕｓｔｉｎ、１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ａ６７００、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、７８７１２−０１８３のテキサス大学によって運営されているサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｔｅｘ．ｏｒｇ／で見つけることができる（ＵＴＥＸ）。例えば、種々の淡水培地及び塩水培地としては、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号に記載されているものが挙げられ、この文献は、参照により組み込まれる。
【０１４９】
特定の例では、プロテオース培地は、純培養の培地に適しており、培地１リットル（ｐＨ約６．８）は、プロテオースペプトン１ｇを、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  １リットルに加えることによって調製することができる。Ｂｒｉｓｔｏｌ  ｍｅｄｉｕｍは、水溶液中に、２．９４ｍＭのＮａＮＯ３、０．１７ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４３ｍＭ、１．２９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．４３ｍＭのＮａＣｌを含む。１．５％寒天培地の場合、寒天１５ｇを上述の溶液１リットルに加えればよい。この溶液に蓋をし、オートクレーブにかけ、次いで、使用するまで冷蔵温度で保存する。別の例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ単離培地（ＰＩＭ）であり、１０ｇ／Ｌのフタル酸水素カリウム（ＫＨＰ）、０．９ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、０．３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌのグルコース、０．００１ｇ／Ｌの塩酸チアミン、２０ｇ／Ｌの寒天、０．２５ｇ／Ｌの５−フルオロシトシンを含み、ｐＨ範囲が５．０〜５．２である（Ｐｏｒｅ、１９７３、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６：６４８−６４９を参照）。本発明の方法と共に用いるのに適した他の培地は、上に特定したＵＲＬを閲覧することによって、又はＳＡＧ、ＣＣＡＰ又はＣＣＡＬＡのような、微生物の培地を保有している他の機関に助言を求めることによって、簡単に特定することができる。ＳＡＧは、ゲッティンゲン大学（ドイツ、ゲッティンゲン）のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅを指し、ＣＣＡＰは、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（英国、スコットランド）によって管理されている藻及び原生動物の培養株保存機関を指し、ＣＣＡＬＡは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ（トシェボニュ、チェコ共和国）の藻研究所の培養株保存機関を指す。さらに、米国特許第５，９００，３７０号は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種の従属栄養性発酵に適した培地の処方及び条件について記載している。
【０１５０】
油の生成について、固定炭素源の費用は、油生成を経済的なものにするには十分低くなければならないため、固定炭素源の選択が重要である。従って、適切な炭素源は、例えば、アセテート、フロリドシド、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸、グルコース、グリセロール、ラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース、ショ糖、及び／又はキシロースを含み得るが、これらの化合物を含有する原材料の選択は、本発明の実施形態の方法の重要な態様である。本発明の方法で有用な適切な原材料としては、例えば、黒液、トウモロコシデンプン、解重合されたセルロース系材料、乳清、糖液、ジャガイモ、ソルガム、ショ糖、テンサイ、サトウキビ、イネ、小麦を挙げることができる。また、炭素源は、混合物として、例えば、ショ糖と解重合されたテンサイパルプの混合物として与えられてもよい。１つ以上の炭素源は、１つ以上の外から与えられた固体炭素源の少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭの濃度で供給されてもよい。発酵用原材料として高濃縮の炭素源が好ましい。例えば、ある実施形態では、育てる工程の前に少なくとも３００ｇ／Ｌ、少なくとも４００ｇ／Ｌ、少なくとも５００ｇ／Ｌ、又は少なくとも６００ｇ／Ｌのグルコース濃度又はそれ以上のグルコース濃度である原材料を加えて流加回分式で育てられ、ここでは細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと、細胞に高濃縮固定炭素源が供給される。他の実施形態では、育てる前に少なくとも５００ｇ／Ｌ、少なくとも６００ｇ／Ｌ、少なくとも７００ｇ／Ｌ、少なくとも８００ｇ／Ｌのショ糖濃度又はそれ以上のショ糖を加えて流加回分式で育てられ、ここでは細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと、細胞に高濃縮固定炭素源が供給される。ショ糖のような高濃縮固定炭素源の非限定的な例としては、濃いサトウキビ汁、サトウキビ汁、テンサイ汁及び糖液が挙げられる。本発明のための特に関心のある炭素源としては、セルロース（解重合された形態で）、グリセロール、ショ糖、ソルガムが挙げられ、これらについては、以下にさらに詳細に記載する。
【０１５１】
本発明によれば、原材料として解重合されたセルロース系バイオマスを用い、微生物を培養してもよい。セルロース系バイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉のような茎葉）は安価であり、入手が容易であるが、このような原材料は、酵母の成長を阻害することがわかっており、酵母は、セルロース系材料から生成した五炭糖（例えば、ヘミセルロースから生成したキシロース）を用いることができない。対照的に、少なくともいくつかの微細藻類は、処理したセルロース系材料を用いて成長することができる。セルロース系材料は、一般的に、約４０〜６０％のセルロースと；約２０〜４０％のヘミセルロースと；１０〜３０％のリグニンとを含む。
【０１５２】
セルロース系材料としては、草及び木のエネルギー作物、及び農業用作物から得られた残渣、すなわち、主要な食品又は繊維製品の分野から除去されなかった植物の一部、主に茎及び葉が挙げられる。例としては、農業廃棄物、例えば、サトウキビの絞りかす、モミ殻、トウモロコシ繊維（茎、葉、皮及び穂軸を含む）、麦わら、稲わら、テンサイパルプ、シトラスパルプ、柑橘類の皮；森林の廃棄物、例えば、硬材及び軟材の間伐、伐採作業から得られる硬材及び軟材の残渣；木材廃棄物、例えば、製材工場の廃棄物（木片、おがくず）、パルプ工場の廃棄物；都市廃棄物、例えば、都市固形廃棄物の紙片、都会の廃材、都市の伐採した草のような、都市の緑廃棄物；木材製造の廃棄物が挙げられる。さらなるセルロース含有材料としては、スイッチグラス、ハイブリッドポプラ材、ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、テンサイ繊維、ソルガム繊維のような専用のセルロース含有作物が挙げられる。このような材料から生成する五炭糖としては、キシロースが挙げられる。
【０１５３】
細菌が上述の材料を含む糖類を利用することができる効率を高めるために、セルロース系材料を処理することができる。本発明の実施形態は、上述の材料を、細菌（例えば、微細藻類及び油産生酵母）の従属栄養性培養物で用いるのに適しているように酸爆発させた後、セルロース系材料を処理するための方法を提供する。上述のとおり、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、β１，４結合したグルコース（六炭糖）の結晶性ポリマー、ヘミセルロース、主にキシロース（五炭糖）で構成され、少量のマンノース、ガラクトース、アラビノース、リグニンで構成されている、ゆるく会合したポリマー、シナピルアルコール及びその誘導体で構成される複雑な芳香族ポリマー、α１，４結合したポリガラクツロン酸の直鎖であるペクチンのような、種々の画分で構成されている。セルロース及びヘミセルロースがポリマー構造であるため、これらの中に含まれる糖類（例えば、単糖類のグルコース及びキシロース）は、多くの細菌によって有効に使用する（代謝する）ことができるような形態ではない。このような細菌の場合、セルロース系バイオマスをさらに処理し、このポリマーを構成している単糖類を作成することは、セルロース系材料を原材料（炭素源）として有効に利用するのに非常に役立つ場合がある。
【０１５４】
セルロース又はセルロース系バイオマスに、「爆発」と呼ばれるプロセスを行い、このプロセスで、バイオマスは、高温高圧で、希硫酸（又は他の酸）で処理される。このプロセスは、セルロース系及びヘミセルロース系の画分をグルコースモノマー及びキシロースモノマーにする酵素加水分解を効率よく行うことができるようにバイオマスを調節する。得られた単糖類は、セルロース系糖と呼ばれる。その後に、セルロース系糖が微生物に利用され、種々の代謝物（例えば、脂質）を産生する。酸爆発工程によって、ヘミセルロース画分が、構成成分である単糖類へと部分的に加水分解する。これらの糖類を、さらなる処理によって、バイオマスから完全に遊離させることができる。ある実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料を熱水で洗浄することを含む熱水処理であり、これによって、塩のような混入物質が除去される。この工程は、セルロース系エタノール発酵では、このようなプロセスで用いられる糖の濃度はもっと薄いため、必要ではない。他の実施形態では、さらなる処理は、さらなる酸処理である。さらに他の実施形態では、さらなる処理は、爆発した材料の酵素加水分解である。また、これらの処理を任意の組み合わせで用いてもよい。この種の処理は、遊離する糖の種類（例えば、五炭糖対六炭糖）、このプロセス中で糖類が遊離する段階に影響を及ぼす場合がある。その結果、五炭糖又は六炭糖のどちらかが主成分の異なる糖の流れを作成することができる。これらの五炭糖又は六炭糖を豊富に含む流れは、異なる炭素利用能を有する特定の微生物用に向けることができる。
【０１５５】
本発明の方法は、エタノール発酵で通常達成されるよりも高い細胞密度になるまで発酵することを含み得る。従属栄養セルロース系の油を生成するための培養物の密度が高いため、固定炭素源（例えば、セルロース系から誘導される糖の流れ）は、好ましくは、濃縮された形態である。解重合されたセルロース系材料のグルコース濃度は、好ましくは、育てる工程の前に、少なくとも３００ｇ／Ｌ、少なくとも４００ｇ／Ｌ、少なくとも５００ｇ／Ｌ、又は少なくとも６００ｇ／Ｌであり、場合により、細胞が成長し、脂質を蓄積する間ずっと、上述の物質を細胞に供給するような流加回分式で育てる。従って、リグノセルロース系の油を生成している間、非常に高密度の細胞を生成し、維持するために、炭素原材料を、非常に濃縮された形態で従属栄養培養物に運ぶことができる。しかし、油産生微生物の基質ではなく、油産生微生物によって代謝されないような供給物流中の任意の成分は、バイオリアクター中に蓄積し、その成分が、毒性であるか、又は望ましい最終産物を生成するのを阻害する場合には、問題となり得るであろう。リグニン及びリグニンから誘導される副産物、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類のような炭水化物から誘導される副産物、セルロース系材料の生成から誘導される塩（爆発プロセス及びその次の中和プロセスの両方で）、さらに、代謝されていないペントース／ヘキソース糖ですら、エタノール発酵では問題となり得る場合があり、これらの影響は、初期原材料中のこれらの物質の濃度が高いプロセスでは、顕著に大きくなる。本明細書に記載されるリグノセルロース系の油を大量生成するのに用いることが可能な六炭糖について、３００ｇ／Ｌの範囲（又はそれ以上）の糖濃度を達成するために、これらの毒性のある物質の濃度は、典型的には、セルロース系バイオマスのエタノール発酵中に存在する濃度の２０倍より高くなり得る。
【０１５６】
セルロース系材料の爆発プロセスによる処理は、かなりの量の硫酸、熱、圧力を利用するため、炭水化物の副産物、つまり、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が遊離する。フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類は、ヘミセルロースの加水分解中に、キシロースを水和してフルフラール及び水にすることによって生成する。本発明のある実施形態では、これらの副産物（例えば、フルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類）は、バイオリアクターに入れる前に、糖化されたリグノセルロース系材料から除去される。本発明の特定の実施形態では、炭水化物の副産物を除去するプロセスは、爆発したセルロース系材料の熱水処理である。それに加え、本発明は、リグノセルロース系の油を生成するのに、フルフラール類又はヒドロキシメチルフルフラール類のような化合物に耐え得る株を用いる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、発酵培地中のフルフラール類に耐え得るだけでなく、リグノセルロース系の油を生成させている間に、実際には、これらの副産物を代謝することができるような方法及び微生物も提供する。
【０１５７】
また、この爆発プロセスは、顕著な量の塩も生じる。例えば、爆発の典型的な条件によって、爆発したセルロース系バイオマスを、水：固形分（乾燥重量）を１０：１の比率で再び懸濁させた場合、５ｍＳ／ｃｍを超える導電率が生じ得る。本発明の特定の実施形態では、爆発したバイオマスを希釈したものに対し、酵素による糖化を行い、得られた上澄みを、バイオリアクター中で使用するために最大２５倍まで濃縮する。濃縮した糖の流れ中の塩濃度（導電率で測定した場合）は、許容できないほど高い場合がある（最大１．５Ｍ  Ｎａ＋に相当）。同様に、その後の酵素による糖化プロセスのために、爆発した物質を中和すると、さらなる塩が生成する。本発明の実施形態は、上述のとおり得られる濃縮したセルロース系糖の流れを、リグノセルロース系の油を生成するための従属栄養プロセスで使用することができるように、これらの塩を除去する方法を提供する。ある実施形態では、これらの塩を除去する方法は、限定されないが、ＤＯＷＥＸ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＭＲ３のような樹脂を用いた脱イオン化である。特定の実施形態では、樹脂を用いた脱イオン化工程は、糖の濃縮前に行うか、又は、糖化の前のバイオマスのｐＨ調節及び熱水処理の前に行うか、又はこれらの任意の組み合わせであってもよく、他の実施形態では、この工程は、これらの１つ以上のプロセスの後に行う。他の実施形態では、爆発プロセス自体を、塩が許容されない高濃度で生成するのを避けるように変更する。例えば、セルロース系バイオマスを硫酸（又は他の酸）で爆発させるのに代わる代替法は、セルロース系バイオマスが酵素加水分解（糖化）を受けやすくなるような機械的なパルプ化である。さらに他の実施形態では、高濃度の塩に耐性の天然微生物株、又は高濃度の塩に耐性を有するように遺伝子操作された株を用いる。
【０１５８】
油産生細菌を用いて従属栄養性のリグノセルロース系油の生成で使用するための、爆発したセルロース系バイオマスを調製するプロセスに好ましい実施形態は以下の通りである。第１の工程は、爆発したセルロース系バイオマスを再懸濁させたもののｐＨを、５．０〜５．３の範囲に調節した後、セルロース系バイオマスを３回洗浄することを含む。この洗浄工程は、脱塩性及びイオン交換性の樹脂、逆浸透膜、熱水処理（上述のようなもの）の使用、又は、脱イオン水に再懸濁させ、遠心分離するのを単に繰り返す、といった種々の手段によって達成することができる。この洗浄工程によって、セルロース系の流れの導電率が１００〜３００μＳ／ｃｍになり、かなりの量のフルフラール類及びヒドロキシメチルフルフラール類が除去される。この洗浄工程からデカンテーションを行い、ヘミセルロース画分から遊離した五炭糖を濃縮するために残しておいてもよい。第２の工程は、洗浄したセルロース系バイオマスを酵素によって糖化することを含む。好ましい実施形態では、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を用いる。第３の工程は、糖化されたバイオマスを遠心分離するか、又はデカンテーションし、次いですすぐことによる、糖の回収を含む。得られたバイオマス（固形分）は、エネルギー密度が高く、リグニンを豊富に含む成分であり、これを燃料として使用してもよく、廃棄するために送ってもよい。遠心分離／デカンテーション及びすすぎを行うプロセス中で回収された糖の流れを集める。第４の工程は、透過物を回収しつつ、混入している固形物を除去する精密濾過を含む。第５の工程は、濃縮工程を含み、この工程は、減圧エバポレーターを用いることによって達成されてもよい。この工程は、場合により、Ｐ’２０００（Ｓｉｇｍａ／Ｆｌｕｋａ）のような消泡剤の添加を含んでいてもよく、この作業は、得られる糖原料のタンパク質含有量によっては、時に必要である。
【０１５９】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、バイオディーゼルのトランスエステル化から得られる、酸性化されたグリセロール及び酸性化されていないグリセロールを含むグリセロールである。一実施形態では、炭素源は、グリセロールと、少なくとも１つの他の炭素源とを含んでいる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源の全てが、発酵開始時に微生物に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、微生物に対して所定の比率で同時に与えられる。ある場合では、グリセロール及び少なくとも１つの他の固定炭素源が、発酵している間、所定の速度で細菌に供給される。
【０１６０】
ある種の微細藻類は、グルコースが存在する状態よりも、グリセロールが存在する状態ですばやく細胞分裂を受ける（ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号）。これらの状況では、細胞に、細胞の密度をすばやく上げるためにグリセロールを供給し、次いで、脂質の蓄積を高めるためにグルコースを供給するような二段階成長プロセスによって、脂質が産生する効率を高めることができる。トランスエステル化プロセスのグリセロール副産物を使用することによって、この物質が生成プロセスに戻されると、経済的に顕著な利点を与えることができる。例えば、グリセロール及びグルコースの混合物のような他の供給方法も同様に与えられる。また、このような混合物を供給することによって、同じ経済的な利点が得られる。それに加え、本発明は、ショ糖のような代わりとなる糖をグリセロールとの種々の組み合わせで微細藻類に供給する方法を提供する。
【０１６１】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は転化糖である。転化糖はショ糖と比較して結晶化しにくく、従って、保存上の利点、及び微細藻類を含む微生物を従属栄養で育てる場合に濃縮炭素源が必要となる流加回分発酵における利点を与え得る。一実施形態では、炭素源は、好ましくは濃縮された形態の、場合により流加回分式で育てるものである育てる工程の前に好ましくは少なくとも８００ｇ／リットル、少なくとも９００ｇ／リットル、少なくとも１０００ｇ／リットル又は少なくとも１１００ｇ／リットルである転化糖である。転化糖は、好ましくは濃縮された形態であり、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１６２】
本発明の方法の別の実施形態では、炭素源は、ショ糖であり、ショ糖を含む複雑な原材料、例えば、サトウキビの処理から得られる濃いサトウキビ汁を含む。従属栄養油を生成するための培養物の密度は高いため、固定炭素源（例えば、ショ糖、グルコース等）は、好ましくは濃縮された形態の、育てる工程の前に好ましくは少なくとも５００ｇ／リットル、少なくとも６００ｇ／リットル、少なくとも７００ｇ／リットル又は少なくとも８００ｇ／リットルである固定炭素源であり、育てる工程は、場合により、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと材料が細胞に供給される流加回分式で育てるものである。ある場合では、炭素源は、好ましくは濃縮された形態の、場合により流加回分式で育てるものである育てる工程の前に好ましくは少なくとも固形分６０％又は約７７０ｇ／リットル糖、少なくとも固形分７０％又は約９２５ｇ／リットル糖、又は少なくとも固形分８０％又は約１１２５ｇ／リットル糖である、濃いサトウキビ汁の形態のショ糖である。濃縮された濃いサトウキビ汁は、細胞が成長して脂質を蓄積する間ずっと細胞に供給される。
【０１６３】
一実施形態では、培地は少なくとも１つのショ糖利用酵素をさらに含む。ある場合では、ショ糖利用酵素はショ糖インベルターゼである。ショ糖インベルターゼ酵素は、微生物集団により発現される外来ショ糖インベルターゼ遺伝子によりコードされる分泌可能な（ｓｅｃｒｅｃｔａｂｌｅ）ショ糖インベルターゼ酵素であってもよい。分泌可能なショ糖インベルターゼは微生物によって培地に分泌され、それにより培地中のショ糖が、微生物によって用いられるグルコース及びフルクトースに変換され得る。以下に記載するとおり、ショ糖インベルターゼは組み換えであってもよく、それにより微生物に、成長又は油生成のため固定炭素源として純粋な又は複合的なショ糖原材料を利用する能力を付与することができる。いくつかの状況では、以下の第ＩＶ章にさらに詳細に記載されるとおり、微細藻類は、ショ糖トランスポーター、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、又はフルクトキナーゼのようなショ糖利用酵素を発現するように遺伝子操作されている。
【０１６４】
ショ糖を含有する複雑な原材料としては、サトウキビの処理から得られる廃棄糖液が挙げられ、サトウキビ処理の価値の低い上述の廃棄生成物によって、炭化水素及び他の油の生成において、顕著に費用を節約することができる。本発明の方法で有用な、ショ糖を含有する別の複雑な原材料は、ソルガムであり、ソルガムシロップ及び純粋なソルガムを含む。ソルガムシロップは、甘いソルガムの茎の汁から生成する。ソルガムシロップの糖プロフィールは、主に、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ショ糖からなる。
【０１６５】
４．油の生成
本発明の方法に従って油を生成する場合、例えば、光が培養物にあたらないような、きわめて大きな（４０，０００リットル以上の）発酵槽の場合のように、細胞を暗い場所で培養することが好ましい。従属栄養種は、固定炭素源を含有する培地内で、光が存在しない状態で、油を生成するように成長し、増殖する。このような成長は、従属栄養性の成長として知られている。
【０１６６】
一例として、脂質を生成する微細藻類細胞の播種物質が培地に入れられ、細胞が増殖し始めるまでに遅延期間（遅延期）が存在する。遅延期間の後、増殖速度は徐々に上がっていき、対数期すなわち指数増殖期に入る。次いで、指数増殖期の後、窒素のような栄養物が少なくなったり、毒性基質が増えたり、菌体数感知機構のために増殖が遅くなる。このように増殖が遅くなった後、増殖が止まり、細胞は、細胞に与えられている特定の環境に依存して、静止期又は安定成長状態に入る。脂質を豊富に含むバイオマスを得るために、培養物は、典型的には、指数増殖期が終わった後に良好に収穫され、指数増殖期は、窒素又は別の鍵となる栄養物（炭素以外のもの）を枯渇させることによって初期に終わらせてもよく、細胞は、過剰に存在する炭素源を脂質、特にトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｃｙｅｒｉｄｅ）に変換する。培養条件のパラメーターは、油の合計生成量、生成する脂質種の組み合わせ、及び／又は特定の油の生成を最適にするように操作することができる
【０１６７】
本明細書に開示されている細胞による脂質の生成は、対数期の間に行ってもよく、細胞分裂しない状態で、脂質を生成し続けるように、栄養物を供給するか、又は栄養物がまだ利用可能であるような静止期を含め、ｌｏｇ期の後に行ってもよい。
【０１６８】
好ましくは、本明細書に記載されている条件及び／又は当該技術分野で公知の条件を用いて成長させた微生物は、乾燥細胞重量で少なくとも約２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、又は８０〜９０％のトリグリセリドを含む。プロセスの条件は、特定の用途に適した脂質の収量を高めるように、及び／又は、生産費用を減らすように調節することができる。例えば、特定の実施形態では、微細藻類を、グルコースのような固定炭素エネルギーを過剰量与えつつ、制限濃度の１つ以上の栄養物、例えば、窒素、リン又は硫黄が存在する状態で培養する。窒素の制限により、窒素が過剰に与えられる培地での微生物脂質収率と比べて、微生物脂質収率（乾燥細胞重量１ｇあたりに生成される脂質量の尺度）が増加する傾向がある。特定の実施形態では、脂質収量の増加は、少なくとも約１０％、約５０％、約１００％、約２００％、又は約５００％である。全培養期間の一部又は全期間にわたって、制限量の栄養物が存在する状態で細菌を培養してもよい。特定の実施形態では、栄養物の濃度は、全培養期間の間に、制限濃度及び非制限濃度を少なくとも２回繰り返す。過剰量の炭素を与えつつ、窒素量を制限するか、又はまったく窒素を含まない状態で、時間を延長させて培養を続けることによって、細胞の脂質含有量を増やすことができる。
【０１６９】
別の実施形態では、脂質経路に関連する酵素（例えば、補酵素または脂肪酸合成酵素の補欠分子族）のための１つ以上の補因子が存在する状態で、脂質を産生する細菌（例えば、微細藻類）を培養することによって、脂質収量を増やす。一般的に、補因子の濃度は、補因子が存在しない状態での微生物脂質収量よりも、微生物脂質（例えば、脂肪酸）の量を増やすのに十分な濃度である。特定の実施形態では、補因子をコードする外来遺伝子を含む細菌（例えば、微細藻類）を培養物に含むことによって、培養物に補因子を与える。又は、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する細菌（例えば、微細藻類）を含むことによって、培養物に補因子を与えてもよい。特定の実施形態では、適切な  補因子は、ビオチンまたはパントテン酸化合物のような、脂質経路に関連する酵素に必要な任意のビタミンを含む。本発明で使用するのに適した補因子をコードする遺伝子、又はこのような補因子の合成に関与する遺伝子は、十分に知られており、上述のような構築物及び技術を用い、細菌（例えば、微細藻類）に導入することができる。
【０１７０】
本明細書に記載されているバイオリアクター、培養条件、従属栄養性成長及び増殖方法の特定の例を任意の適切な様式で組み合わせ、微生物の成長効率、及び脂質及び／又はタンパク質の生成効率を高めることができる。
【０１７１】
乾燥重量で、高い割合の油／脂質が蓄積した微細藻類のバイオマスは、異なる培養方法を用いて作成されており、この方法は、当該技術分野で知られている（ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号）。本明細書に記載されている培養方法で作成され、本発明で有用な微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、少なくとも１０％の微細藻類の油を含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％または少なくとも８０％含む。ある実施形態では、微細藻類のバイオマスは、乾燥重量で、微細藻類の油を１０〜９０％、２５〜７５％、４０〜７５％、７５〜８５％又は５０〜７０％含む。
【０１７２】
本明細書に記載されているバイオマスの微細藻類の油、又は本発明の方法及び組成物で使用するために、バイオマスから抽出された微細藻類の油は、１つ以上の別個の脂肪酸エステル側鎖を有するグリセロ脂質を含む。グリセロ脂質は、１個、２個又は３個の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロール分子から成り、脂肪酸分子は、長さはさまざまであってもよく、種々の飽和度を有していてもよい。脂肪酸分子（及び微細藻類の油）の長さ及び飽和度の特徴によって、以下の第ＩＶ章にさらに詳細に記載されるとおり、培養条件又は脂質経路の操作によって、本発明の微細藻類の油中の脂肪酸分子の性質又は比率を改変するように操作することができる。特性及び比率の詳細な改変には、鎖長プロフィール、飽和プロフィールの変化、及び脂肪酸のヒドロキシル化のような、微生物トリグリセリドの脂肪酸分布の変化が含まれる。そのように生成された油は天然油を含み得る。代わりに、微生物油の特定のブレンドは、２種類以上の微細藻類に由来するバイオマス又は藻の油を混合することによって、１種類の藻の中で調製されてもよく、又は、本発明の藻の油と、大豆、菜種、キャノーラ、パーム、パーム核、ココナツ、トウモロコシ、野菜くず、ナンキンハゼ、オリーブ、ヒマワリ、綿実、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類、大型藻類、クフェア、亜麻、ピーナッツ、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナ・サティバ、カラシの種子、カシューナッツ、オーツ麦、ハウチワマメ、ケナフ、キンセンカ、麻、コーヒー、亜麻仁（亜麻）、ヘーゼルナッツ、ユーホルビア、カボチャの種、コリアンダー、ツバキ、ゴマ、ベニバナ、イネ、アブラギリ、ココア、コプラ、ケシ（ｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）、トウゴマの実、ピーカン、ホホバ、ジャトロファ、マカダミア、ブラジルナッツ、アボカド、石油、又は上述のいずれかの油の留分のような他の供給源に由来する油とをブレンドすることによって調製されてもよい。
【０１７３】
油の組成、すなわち、グリセロ脂質の脂肪酸構成要素の性質及び比率も、少なくとも２種類の別個の微生物に由来するバイオマス又は油を混ぜあわせることによって操作することができる。ある実施形態では、少なくとも２種類の別個の微細藻類は、異なるグリセロ脂質プロフィールを有している。この別個の種類の微細藻類を、好ましくは、それぞれの油を生成するような従属栄養条件下で、本明細書に記載されるとおり一緒に培養してもよく、又は別個に培養してもよい。異なる種類の微細藻類は、細胞のグリセロ脂質の構成成分である別個の脂肪酸を異なる割合で含有していてもよい。
【０１７４】
一般的に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、鎖長がＣ８〜Ｃ１４の脂肪酸をほとんど含まないか、まったく含まない。例えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ（ＵＴＥＸ  ３２９）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ（ＵＴＥＸ  １４４２）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ（ＵＴＥＸ  １４３８）は、Ｃ８脂肪酸をまったく含まず（又は検出可能な量含まず）、Ｃ１０脂肪酸を０〜０．０１％、Ｃ１２脂肪酸を０．０３〜２．１％、Ｃ１４脂肪酸を１．０〜１．７％含んでいる。
【０１７５】
ある場合では、鎖長がＣ８又はＣ８〜１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ８の脂肪酸を少なくとも１．５％、少なくとも３．０％，少なくとも１０％、少なくとも１２％以上有している。別の状況では、鎖長がＣ１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１０の脂肪酸を少なくとも５．０％、少なくとも１０．０％、少なくとも２４％、少なくとも２９％以上有している。別の状況では、鎖長がＣ１２の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１２の脂肪酸を少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも３４％、少なくとも５０％以上有している。他の場合では、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１４の脂肪酸を少なくとも２．０％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも３０％、少なくとも４３％以上有している。他の場合では、鎖長がＣ１６の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１６の脂肪酸を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも６６％以上有している。さらに他の場合では、鎖長がＣ１８の、特にＣ１８：０についての脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２６％、少なくとも４０％又はそれ以上のＣ１８：０脂肪酸濃度を有している。これらの例のいずれにおいても、細菌はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａのような微細藻類であってよい。
【０１７６】
非限定的な例では、鎖長がＣ８の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ８の脂肪酸を１〜２０％、好ましくは１．８〜１３％有している。他の非限定的な例では、鎖長がＣ１０の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１０の脂肪酸を１〜４０％、好ましくは１．９１〜３０％有している。他の非限定的な例では、鎖長がＣ１２の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１２の脂肪酸を１０〜６０％、好ましくは１３．５５〜５５％有している。他の非限定的な例では、鎖長がＣ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１４の脂肪酸を１〜５０％、好ましくは２．５９〜４３．２７％有している。他の非限定的な例では、さまざまな炭素鎖長さの脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する広い特異性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１６の脂肪酸を最大７０％有している。他の場合では、鎖長がＣ１６の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、鎖長Ｃ１６の脂肪酸を最大７５％、好ましくは最大６７．４２％有している。ある場合では、鎖長Ｃ８〜Ｃ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、（Ｃ８〜Ｃ１４）脂肪酸を１〜７９０％、又は約２〜８０％有している。ある場合では、鎖長Ｃ１２〜Ｃ１４の脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質に対する活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするトランス遺伝子を含む微生物株は、Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸を少なくとも５０％又は６０％有している。ある場合では、トランスジェニック微生物株を、外来遺伝子を保持する一定で高い選択圧下に保つことが、特定の鎖長の望ましい脂肪酸が増えるため、有益である。高レベルの外来遺伝子の保持はまた、本明細書に開示される相同組み換えベクター及び方法を用いて細胞の核染色体に外来遺伝子を挿入することによっても実現することができる。核染色体に組み込まれた外来遺伝子を含む組み換え細胞は、本発明の目的である。これらの例のいずれにおいても、細菌はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａのような微細藻類であってよい。
【０１７７】
場合により、微生物油はまた、微細藻類が産生した、又は培地から微細藻類の油に組み込まれた他の構成要素を含んでいてもよい。これらの他の構成要素は、微細藻類を培養するために用いられる培養条件、微細藻類の種、バイオマスから微細藻類の油を回収するのに用いられる抽出方法、及び微細藻類の油組成に影響を与え得る他の要因に基づいて、さまざまな量で存在し得る。このような構成要素の非限定的な例としては、０．０２５〜０．３ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．０５〜０．２４４ｍｃｇ／油ｇの量で存在するカロチノイド；０．０２５〜０．３ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは０．０４５〜０．２６８ｍｃｇ／油ｇの量で存在するクロロフィル；０．０３ｍｃｇ／油ｇ未満、好ましくは０．０２５μｇ／油ｇ未満の総クロロフィル；３５〜１７５ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは３８．３〜１６４ｍｃｇ／油ｇの量で存在するγ−トコフェロール；５０〜３００ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは６０．８〜２６１．７ｍｃｇ／油ｇの量で存在する総トコフェロール；０．５％未満、好ましくは０．２５％未満、ブラシカステロール、カンペステロール、スチグマステロール、又はβ−シトステロール；３００ｍｃｇ／油ｇ未満の総トコトリエノール；及び２２５〜３５０ｍｃｇ／油ｇ、好ましくは２４９．６〜３２５．３ｍｃｇ／油ｇの量で存在する総トコトリエノールが挙げられる。
【０１７８】
他の構成要素としては、限定なしに、リン脂質、トコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド（例えば、α−カロチン、β−カロチン、リコピンなど）、キサントフィル（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、α−クリプトキサンチン及びβ−クリプトキサンチン（ｃｒｙｔｏｘａｎｔｈｉｎ））、及びさまざまな有機又は無機化合物を挙げることができる。ある場合では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種から抽出した油は、油１ｇあたり０．００１〜０．０５μｇ、好ましくは０．００３〜０．０３９μｇのルテイン、油１ｇあたり０．００５μｇ未満、好ましくは０．００３μｇ未満のリコピン；及び油１ｇあたり０．００５μｇ未満、好ましくは０．００３μｇ未満のβ−カロチンを含む。
【０１７９】
ＩＩＩ．遺伝子操作方法及び材料
本発明は、本発明の方法で有用なＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞及び組み換え宿主細胞、限定されないが、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ宿主細胞を遺伝的に改変する方法及び材料を提供する。読者が読みやすいように、これらの方法及び材料の記載をいくつかの節に分けている。第１節では、形質転換方法について記載している。第２節では、相同組み換えを用いた遺伝子操作方法について記載している。第３節では、発現ベクター及び成分について記載している。
【０１８０】
１．操作方法−形質転換
細胞を、例えば、微粒子銃、エレクトロポレーション（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：８２１−８２６）、ガラスビーズによる形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカーによる形質転換のような任意の適切な技術によって形質転換することができる。使用可能な別の方法は、プロトプラストを作成し、ＣａＣｌ２及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用い、組み換えＤＮＡを微細藻類細胞に導入することを含む（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３、この論文は、Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを形質転換するために、この方法を用いることを報告している）。微細藻類の共形質転換を利用し、２種類の別個のベクター分子を細胞に同時に導入することができる（例えば、Ｐｒｏｔｉｓｔ  ２００４  Ｄｅｃ；１５５（４）：３８１−９３）。
【０１８１】
微粒子銃による方法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６：２９９  ３０２、米国特許第４，９４５，０５０号；エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：５８２４  ５８２８）；レーザービーム、マイクロインジェクション、又はＤＮＡを微細藻類に導入することが可能な任意の他の方法の使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を形質転換するために用いることができる。
【０１８２】
２．操作方法−相同組み換え
相同組み換えは、相補的ＤＮＡ配列を整列させ、相同領域の置き換えを可能にすることである。標的となるゲノム配列（「テンプレート」）と同種の配列を含むトランスジェニックＤＮＡ（「ドナー」）を有機体に導入し、次いで、対応するゲノム同種配列の部位にあるゲノムで組み換えが起こる。
【０１８３】
宿主又は有機体で相同組み換えを行う能力は、分子の遺伝子レベルで行うことができ、用途に応じた油を産生することができる油産生細菌の生成に有用であるといった多くの実用的意義がある。相同組み換えは、それ自体の本来の性質により、正確な遺伝子標的事象であり、従って、同じ標的配列を用いて作られたほとんどのトランスジェニック系は、表現型の観点では本質的に同一であり、それほど多くの形質転換事象をスクリーニングする必要はない。また、相同組み換えは、遺伝子が宿主の染色体に挿入される事象を標的としており、これにより、遺伝子の選択が存在しない状態であっても、優れた遺伝子安定性が得られる可能性がある。染色体上の遺伝子座が異なることは、異種プロモーター／ＵＴＲに由来するものであっても、遺伝子発現に影響を与えると考えられるため、相同組み換えは、よく知られていないゲノム環境にある遺伝子座を検索し、これらの環境が遺伝子発現に与える影響を評価する方法になり得る。
【０１８４】
相同組み換えを用いる特に有用な遺伝子操作アプローチは、プロモーター／ＵＴＲのような選択特異的な宿主制御エレメントが、非常に特異的な様式で異種遺伝子を発現させることである。例えば、選択マーカーをコードする異種遺伝子でデサチュラーゼ遺伝子／遺伝子ファミリーを切断又はノックアウトすると、宿主細胞で生成される飽和脂肪酸の全体的な割合が増加することが予想され得る。実施例６は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおいて生じさせたそのようなデサチュラーゼ遺伝子の切断又はノックアウトの相同組み換え標的構築物及び実施例について記載している。内因性遺伝子の発現を低下させる別のアプローチは、限定されないがＲＮＡｉアプローチ又はアンチセンスアプローチ、並びにｄｓＲＮＡアプローチを含め、遺伝子発現のＲＮＡ誘導性の下方調節又はサイレンシングを用いることである。アンチセンスアプローチ、ＲＮＡｉアプローチ、ｄｓＲＮＡアプローチは当該技術分野で周知されており、発現構築物の導入を含み、その発現構築物がｍＲＮＡとして発現すると、ヘアピンＲＮＡ又はアンチセンスの向きに転写され得る標的遺伝子の一部を含む発現構築物の形成がもたらされ得る。３つアプローチはいずれも、標的遺伝子の発現の低下が生じ得る。実施例６はまた、内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２デサチュラーゼ遺伝子（ＦＡＤｃ）のＲＮＡｉ及びアンチセンスアプローチによる下方調節の発現構築物及び実施例について記載している。
【０１８５】
相同組み換えが、正確な遺伝子標的事象であるため、十分なフランキング領域が特定されていれば、目的の遺伝子又は領域の中にある任意のヌクレオチドを正確に改変するために用いることができる。従って、相同組み換えは、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列を改変する手段として用いることもできる。また、相同組み換えは、基質特異性、親和性及びＫｍのような酵素活性を改変する試みにおいて、タンパク質コード領域を改変するために用いることもでき、これにより、宿主細胞の代謝に望ましい変化を起こすことができる。相同組み換えは、遺伝子標的化、遺伝子変換、遺伝子欠失、遺伝子重複、遺伝子反転を生じるようにホストゲノムを操作し、プロモーター、エンハンサー、３’ＵＴＲのような遺伝子発現制御エレメントを交換するための強力な手段を与える。
【０１８６】
相同組み換えは、内在する宿主細胞ゲノム内にある目的の遺伝子又は領域を「標的とする」ために、内在する配列の一部を含む標的構築物を用いることによって行うことができる。このような標的配列は、目的の遺伝子又は領域の５’末端に位置していてもよく、目的の遺伝子／領域の３’末端に位置していてもよく、目的の遺伝子／領域に隣接していてもよい。このような標的構築物を、さらなるベクター骨格を有する超らせん構造のプラスミドＤＮＡとして、ベクター骨格を有さないＰＣＲ産物として、又は線状分子として宿主細胞内で形質転換してもよい。ある場合では、まず、制限酵素を用いて、トランスジェニックＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）内にある同種配列にさらすことが有益な場合がある。この工程によって、組み換え効率が増し、望ましくない事象の発生を減らすことができる。組み換え効率を高める他の方法としては、処理されるゲノム配列に対して同種の線状末端を含有する形質転換されたトランスジェニックＤＮＡを作成するためにＰＣＲを用いることが挙げられる。
【０１８７】
非限定的な例示の目的のために、相同組み換えに有用なドナーＤＮＡ配列の領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるＤＮＡのＫＥ８５８領域を含む。ＫＥ８５８は１．３ｋｂのゲノムフラグメントであり、タンパク質のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）ファミリーと相同性を共有するタンパク質のコード領域の一部を包含する。サザンブロットから、ＫＥ８５８配列がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ゲノムに単一配列で存在することが示されている。この領域及び相同組み換えの標的化にこの領域を使用する実施例が、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号に記載されている。有用なドナーＤＮＡの別の領域は、ここで「６Ｓ」と呼ばれるゲノム配列である（配列番号８２、配列番号８４のドナー配列）。６Ｓ配列は６Ｓ  ｒＲＮＡ配列ではないことに留意されたい。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｍｉｓの相同組み換えにおけるこの配列の使用については、以下の実施例に記載している。
【０１８８】
３．ベクター及びベクター成分
本発明に従う微生物を形質転換するためのベクターは、本明細書の開示を考慮して、当業者には有名な既知の技術によって調製することができる。ベクターは、典型的には、１つ以上の遺伝子を含有しており、それぞれの遺伝子は、望ましい生成物（遺伝子産物）を発現するようにコードしており、この遺伝子発現を制御し、組み換え細胞内の特定の位置に向かうように遺伝子産物を標的化するような１つ以上の制御配列に動作可能に連結している。読者の助けとなるように、この章をいくつかの節に分けている。Ａ節は、制御配列、典型的には、ベクター上に含まれている制御配列、及び本発明によって提供される新規制御配列について記載している。Ｂ節は、遺伝子、典型的には、ベクターに含まれる遺伝子、及び新規コドン最適化方法、及び本発明によって提供される方法によって調製される遺伝子について記載している。
【０１８９】
Ａ．制御配列
制御配列は、コード配列の発現を制御するか、又は遺伝子産物を、細胞内又は細胞外の特定の位置に向かわせる核酸である。発現を制御する制御配列としては、例えば、コード配列の転写を制御するプロモーター、コード配列の転写を止めるターミネーターが挙げられる。別の制御配列は、コード配列の末端に位置する３’非翻訳配列であり、ポリアデニル化シグナルをコードする。遺伝子産物を特定の位置に向かわせる制御配列としては、シグナルペプチドをコードする配列が挙げられ、この配列は、細胞内又は細胞外の特定の位置に、この配列が結合したタンパク質を向かわせる。
【０１９０】
従って、微細藻類において外来遺伝子を発現するような例示的なベクターの設計は、望ましい遺伝子産物（例えば、選択可能なマーカー、脂質経路改変酵素、又はショ糖利用酵素）のためのコード配列を、微細藻類内で活性なプロモーターと動作可能に連結した状態で含む。又は、ベクターが、目的のコード配列と動作可能に連結した状態でプロモーターを含まない場合、コード配列を、ベクターの組み込み位置で内在するプロモーターに動作可能に連結するように、細胞内で形質転換してもよい。プロモーターを用いずに形質転換する方法は、微細藻類でうまく働くことがわかっている（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：４、（１９９８）、ｐｐ．４４１−４４７）。
【０１９１】
多くのプロモーターは、微細藻類内で活性であり、形質転換される藻に内在するプロモーター、形質転換される藻に内在しないプロモーター（すなわち、他の藻に由来するプロモーター、高等植物に由来するプロモーター、特定の植物ウイルス又は藻ウイルスに由来するプロモーター）を含む。微細藻類内で活性な、具体的な外来のプロモーター及び／又は内在するプロモーター（微細藻類中で機能する抗生物質耐性のある遺伝子）は、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号及びこの明細書に引用されている参考文献に記載されている）。
【０１９２】
外来遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターは、その外来遺伝子に天然で連結しているプロモーターであってもよく、又は、異種プロモーターであってもよい。ある種のプロモーターは、１つより多い微細藻類において活性である。他のプロモーターは、種に特異的である。具体的なプロモーターとしては、以下の実施例で用いられる、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−チューブリンのようなプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）及びクロレラウイルスのような、微細藻類の複数の種の中で活性であることが示されているウイルスプロモーターが挙げられる（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２００５  Ｍａｒ；２３（１０−１１）：７２７−３５；Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ａｕｇ；４３（４）：３６１−５；Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＮＹ）．２００２  Ｊａｎ；４（１）：６３−７３）。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で外来遺伝子を発現させるのに適切な別のプロモーターは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａグルタミン酸脱水素酵素プロモーター／５’ＵＴＲである。場合により、これらの配列のうち、プロモーターを含有し、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ヌクレオチド、又はそれ以上が使用される。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で外来遺伝子を発現させるのに有用な代表的なプロモーターは、本明細書の配列表に列挙されており、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ＨＵＰ１遺伝子のプロモーター（配列番号１）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ硝酸還元酵素プロモーター（配列番号２）がある。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスプロモーターを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で遺伝子を発現させるために用いることもでき、例えば、米国特許第６，３９５，９６５号の配列番号１〜７が挙げられる。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で活性なさらなるプロモーターは、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４  Ｏｃｔ  １４；２０４（１）：１８７−９４；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｏｃｔ；２６（１）：８５−９３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ａｕｇ  １５；３２６（１）：１５０−９；及び、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊａｎ  ５；３１８（１）：２１４−２３に見いだすことができる。他の有用なプロモーターについては、以下の実施例に詳細に記載している。
【０１９３】
プロモーターは、一般的に、構成的であるか、又は誘発性であると特徴づけることができる。構成的プロモーターは、一般的に、いつでも（又は、細胞周期の特定の時期に）同じレベルで活性であるか、又は発現を起こすように機能する。誘発性プロモーターは、これとは異なり、刺激に応答したときのみ、活性である（又は不活性化する）か、又は顕著に上方調節されるか、又は下方調節される。どちらの種類のプロモーターも、本発明の方法での用途がある。本発明で有用な誘発性プロモーターとしては、例えば、外から与えられる低分子（例えば、配列番号１の場合には、グルコース）、温度（熱いか、又は冷たい）、培地中の窒素不足などの刺激に応答して、動作可能に連結した遺伝子の転写に介在するプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターは、本質的にサイレント遺伝子である遺伝子の転写を活性化させることができるか、又は、低濃度で転写されるような動作可能に連結した遺伝子の転写を上方調節し、好ましくは、かなり上方調節することができる。以下の実施例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞において有用なさらなる誘導性プロモーターについて記載している。
【０１９４】
停止領域の制御配列の包含は任意であり、利用される場合には、停止領域は比較的置き換え可能であるため、その選択は、主に簡便なものである。停止領域は、転写開始領域（プロモーター）に由来するものであってもよく、目的のＤＮＡ配列に由来するものであってもよく、又は、別の供給源から得られるものであってもよい。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｏｚｃｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：８４１１。
【０１９５】
また、本発明は、目的の遺伝子産物を特定の細胞区画、例えば、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリア、又は小胞体に誘導するための組み換え遺伝子及びそれを含むベクター並びに対照配列も提供する。さらに、本発明の実施形態は、タンパク質の細胞外分泌をもたらす組み換え遺伝子及びそれを含むベクター並びに対照配列を含む。
【０１９６】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの核ゲノム内で発現するタンパク質は、プラスチド標的シグナルを用い、プラスチドを標的としてもよい。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａに内在するプラスチド標的配列は知られており、例えば、プラスチドを標的とするタンパク質をコードする、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ核ゲノム内の遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ６４６１９７及びＡＦ４９９６８４が挙げられ、一実施形態では、このような制御配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａプラスチドでタンパク質を発現させることを標的とするために、本発明のベクター内で使用される。
【０１９７】
以下の実施例は、宿主細胞の正しい区画に異種タンパク質を向かわせるために、プラスチド標的配列を使用することを記載している。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｄｉｅｓ細胞を用いて作られ、ＰＣＴ出願米国特許出願公開第２００９／０６６１４２号明細書に記載されている。
【０１９８】
本発明の別の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でのポリペプチドの発現は、小胞体を標的としている。発現ベクター内の適切な保持シグナル又は選別シグナルによって、タンパク質が確実に小胞体（ＥＲ）に保持され、ゴルジ体の下流には行かない。例えば、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  ＵＲ−Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＩＭＰＡＣＴベクター１．３ベクターは、よく知られているＫＤＥＬ保持シグナル又は選別シグナルを含んでいる。このベクターを用い、ＥＲを保持することは、発現レベルが５倍以上に高まることが報告されているという点で、実益がある。この現象の主な理由は、ＥＲが、細胞質に存在するプロテアーゼより低い濃度のプロテアーゼを含んでいるか、及び／又は、細胞質に存在するプロテアーゼとは異なる、発現したタンパク質の翻訳後の分解に関与するプロテアーゼを含んでいるからだと思われる。緑色微細藻類内で機能するＥＲ保持シグナルが知られている。例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｐｒ  ２６；１０２（１７）：６２２５−３０を参照。
【０１９９】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、細胞から出て、培地に分泌することを標的としている。本発明の方法に従ってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で使用することが可能な、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ内で活性なシグナルの分泌については、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３８（１９９９）、ｐｐ．３３５−３４１を参照。
【０２００】
Ｂ．遺伝子及びコドンの最適化
典型的には、遺伝子は、プロモーターと、コード配列と、停止制御配列とを含む。組み換えＤＮＡ技術によって組み立てられる場合、遺伝子は、発現カセットと呼ばれることもあり、組み換え遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターに簡便に挿入するために、制限配列に隣接していてもよい。発現カセットは、ゲノム由来のＤＮＡ配列、又は相同組み換えにいよって発現カセットをゲノムに安定に組み込みやすくすることを標的とした他の核酸に隣接していてもよい。又は、ベクター及びその発現カセットは、組み込まれないままであってもよく、（例えば、この場合には、ベクターは、典型的には、異種ベクターＤＮＡを複製するために与えることができるような、複製起源を含んでいてもよい。
【０２０１】
ベクター上に存在する共通の遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であり、この発現によって、このタンパク質を含有する組み換え細胞が、このタンパク質を発現しない細胞と分化する。このような遺伝子、及びその対応する遺伝子産物は、選択可能なマーカーまたは選択的マーカーと呼ばれる。任意のさまざまな選択可能なマーカーが、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを形質転換するのに有用なトランス遺伝子構築物中で用いられてもよい。適切な選択可能なマーカーの例としては、Ｇ４１８耐性遺伝子、硝酸還元酵素遺伝子（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：３５６−３６２を参照）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｍａｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：６３−７３を参照）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、フレオマイシン対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１９７−２０５）が挙げられる。微細藻類の抗生物質に対する感度を決める方法はよく知られている。例えば、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６年１０月１６日；２５２（５）：５７２−９、本明細書に記載されるようなショ糖インベルターゼ、及び同様に本明細書に記載されるチアミン栄養要求相補体。
【０２０２】
抗生物質ベースでない他の選択可能なマーカーもまた、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種を含めた、一般に微細藻類の形質転換に有用なトランス遺伝子構築物に用いることができる。これまで微細藻類が利用できなかった特定の炭素源の利用能を付与する遺伝子もまた、選択可能なマーカーとして使用することができる。例示として、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株は、ショ糖上では、たとえ成長したとしても、典型的には生育が悪い。ショ糖インベルターゼ遺伝子を含む構築物を使用すると、炭素基質としてショ糖で成長する陽性形質転換体の能力を付与することができる。他の選択可能なマーカーとともに、選択可能なマーカーとしてショ糖利用を用いることについてのさらなる詳細は、以下の第ＩＶ章で考察する。
【０２０３】
本発明の目的のために、本発明の組み換え宿主細胞を調製するために用いられる発現ベクターは、遺伝子のひとつが選択可能なマーカーである場合、少なくとも２個、多くは３個の遺伝子を含んでいるだろう。例えば、本発明の遺伝子改変されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、選択可能なマーカーに加え、例えば、ショ糖インベルターゼ遺伝子又はアシルＡＣＰ−チオエステラーゼ遺伝子のような１つ以上の外来遺伝子を含む本発明のベクターで形質転換させることによって作られてもよい。１個又は全部の遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよく、これにより、これらの遺伝子が発現する相対的なタイミングを制御し、脂質収量及び脂肪酸エステルへの変換を高めることができる。２種以上の外来遺伝子の発現は、同じ誘発性プロモーターで制御されていてもよく、異なる誘発性（又は構成的）プロモーターで制御されていてもよい。後者の状況では、第１の外来遺伝子の発現は、第１の期間に誘発されてもよく（この間に、第２の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよく）、第２の外来遺伝子の発現は、第２の期間に誘発されてもよい（この間に、第１の外来遺伝子の発現が誘発されてもよく、誘発されなくてもよい）。
【０２０４】
他の実施形態では、２種以上の外来遺伝子（任意の選択可能なマーカーに加えて）は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、アルコール産物を与えるこれらの組み合わせ作用である。さらに、限定されないが、アルデヒドを生成するための脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素のような他の外来遺伝子の組み合わせも提供される。一実施形態では、ベクターは、アルカンを生成するための、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼの組み合わせを与える。これらのそれぞれの実施形態では、１つ以上の外来遺伝子が、誘発性プロモーターを用いて発現してもよい。
【０２０５】
２種以上の外来遺伝子を発現する、他の代表的な本発明のベクターとしては、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼ酵素の両方をコードするベクター、選択可能なマーカーと、分泌されたショ糖インベルターゼとの両方をコードするベクターが挙げられる。いずれかの種類のベクターで形質転換された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、サトウキビ（サトウキビから誘導される糖類）を炭素源として使用する能力が操作されているため、低い製造コストで脂質を産生する。上述の２種類の外来遺伝子の挿入は、定方向変異誘発法及び／又はランダム変異導入法によって多糖生合成を乱すことと組み合わせることができ、脂質産生へと進む炭素の流れが大きくなる方向に進む。個々に、及び組み合わせて、栄養転換、脂質の産生を変えるような操作、外来の酵素を用いた処理によって、微生物が産生する脂質の組成が変わる。この変化によって、産生する脂質の量、他の脂質に対する的な１つ以上の炭化水素種の相対量、及び／又は微生物が産生する脂質種の種類を変えることができる。例えば、微細藻類を、ＴＡＧ（トリアシルグリセリド）の量及び／又は割合を増やすように操作することができる。
【０２０６】
組み換えタンパク質の最適な発現のために、形質転換されるべき宿主細胞で優先的に用いられるコドンを用いてｍＲＮＡを生成するコード配列を利用することが有益である。従って、トランス遺伝子の適切な発現は、トランス遺伝子のコドンの使用が、トランス遺伝子を発現する有機体の特定のコドンの偏りと適合していることが必要な場合がある。この影響の元になる正確な機構は多くあるが、利用可能なアミノアシル化されたｔＲＮＡプールと、細胞内で合成されるタンパク質との適切なバランス、この要求を満たす場合に、トランスジェニックメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をもっと効果的な翻訳との組み合わせを含む。トランス遺伝子内のコドンの使用が最適化されていない場合、利用可能なｔＲＮＡプールは、異種ｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能にするのに十分ではなく、その結果、リボソームが失速し、停止し、トランスジェニックｍＲＮＡが不安定になる場合がある。
【０２０７】
本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内で組み換えタンパク質が首尾よく発現するのに有用な、コドンが最適化された核酸を提供する。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種内のコドンの使用を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから単離されたｃＤＮＡ配列を研究することによって分析した。この分析から、２４，０００を超えるコドンを調べ、以下の表２に結果を示している。
【０２０８】
【表３】
2014511140.tif 000004
【０２０９】
他の実施形態では、組み換えベクター内の遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株以外の微細藻類株に関して言うと、コドンが最適化されている。例えば、微細藻類内で発現させるために遺伝子を記録する方法は、米国特許第７，１３５，２９０号に記載されている。コドンの最適化に関するさらなる情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのコドン利用に関するデータベースが利用可能である。
【０２１０】
コドンが最適化された遺伝子を有する実施形態に関連して、最適化遺伝子は、好ましくは、最適化される遺伝子の遺伝子産物の発現が少なくとも１０％、及びより好ましくは少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、又は２００％増加するように最適化される。
【０２１１】
本発明の方法及び材料によって、外来遺伝子をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａに導入することが可能な場合、ショ糖の利用及び脂質経路の改変に関する遺伝子は、以下の章で記載するとおり、特に興味深い。
【０２１２】
ＩＶ．選択可能なマーカー
１．ショ糖の利用
一実施形態では、本発明の組み換え細胞は、１つ以上の外来のショ糖利用遺伝子をさらに含む。種々の実施形態では、１つ以上の遺伝子は、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ショ糖インベルターゼ、ショ糖トランスポーターからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする。例えば、ショ糖トランスポーター及びショ糖インベルターゼの発現によって、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａは、ショ糖を培地から細胞に移動させ、ショ糖を加水分解し、グルコース及びフルクトースを得ることができる。場合により、フルクトキナーゼは、内在するヘキソキナーゼ活性が、フルクトースの最大リン酸化には不十分であるような状況でも同様に発現することができる。適切なショ糖トランスポーター典枝は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＡＤ９１３３４、ＣＡＢ９２３０７、ＣＡＡ５３３９０である。適切なフルクトキナーゼの例は、寄託番号Ｐ２６９８４、Ｐ２６４２０、ＣＡＡ４３３２２である。
【０２１３】
一実施形態では、本発明は、ショ糖インベルターゼを分泌する宿主細胞を提供する。ショ糖インベルターゼの分泌は、ショ糖を細胞に移動させることが可能なトランスポーターを発現する必要性をなくす。というのは、分泌されたインベルターゼが、ショ糖分子をグルコース分子及びフルクトース分子に変換するのを触媒し、これらの分子が運ばれ、本発明によって提供される最近によって利用されるからである。例えば、分泌シグナル（例えば、配列番号４（酵母に由来する）、配列番号５（高等植物に由来する）、配列番号６（真核性のコンセンサス分泌シグナルなど）、配列番号７（高等植物及び真核性のコンセンサスに由来するシグナル配列の組み合わせ）を用いたショ糖インベルターゼ（例えば、配列番号３）の発現によって、インベルターゼ活性が細胞外で発生する。このようなタンパク質の発現は、本明細書に開示されている遺伝子操作方法によって可能となるが、それによって細胞外グルコースをエネルギー源としてすでに利用可能な細胞が、ショ糖を細胞外エネルギー源として利用することができる。
【０２１４】
ショ糖を含有する培地中でインベルターゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種は、油を生成するのに好ましい微細藻類の種である。この完全に活性なタンパク質の発現及び細胞外標的化によって、得られた宿主細胞がショ糖で成長することが可能となる一方、対応する非形質転換細胞はショ糖上では成長できない。従って、本発明の実施形態は、インベルターゼ活性及びショ糖の加水分解によって評価される場合にインベルターゼ遺伝子が発現するようにそのゲノムに組み込まれた、コドンが最適化されたインベルターゼ遺伝子、例えば、限定されないが酵母インベルターゼ遺伝子を含む組み換え微細藻類（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを含む）細胞を提供する。インベルターゼ遺伝子は、組み換え細胞がショ糖で成長することができる一方、対応する非形質転換細胞が成長できないため、組み換え細胞における選択可能なマーカーとして有用である；及びインベルターゼを藻類の分子遺伝学用の強力な選択可能なマーカーとして使用して組み換え宿主細胞を選択する方法を提供する。
【０２１５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でショ糖インベルターゼを首尾よく発現することも、異種（組み換え）タンパク質を、藻の細胞内で発現させることができ、細胞から外に出し、完全に活性で機能的な形態で培地に首尾よく移すことができるという点で、本発明の別の態様を示している。従って、本発明の実施形態は、微細藻類内でさまざまで多様なタンパク質を発現させ、これらのタンパク質を宿主細胞の外で集める方法及び試薬を提供する。このようなタンパク質としては、例えば、工業用酵素、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ラクターゼ、異性化酵素、インベルターゼ、及び治療用タンパク質、例えば、成長因子、サイトカイン、２個の軽鎖と２個の重鎖を含む全長抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、ｃａｍｅｌｌｉｄ型抗体、抗体フラグメント、抗体フラグメント融合物、抗体−受容体重合物、インスリン、インターフェロン、インスリン様成長因子が挙げられる。
【０２１６】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でショ糖インベルターゼを首尾よく発現させることも、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でタンパク質を分泌させるために、藻の中で真菌トランジットペプチドを使用するための方法及び試薬を提供し、あるペプチドを機能させるかどうかを決定する方法及び試薬、また、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内でトランジットペプチドとして機能させる能力を提供するという点で、本発明の別の態様を示している。本発明の方法及び試薬を、タンパク質を細胞の外側に首尾よく移動させることができ、酵母インベルターゼがこれらの方法で大きな有用性を有するような他のトランジットペプチドを同定するためのツール及びプラットフォームとして用いることができる。この例で示されているとおり、内在する酵母インベルターゼトランジットペプチドの除去、及び宿主である藻に内在するか、又は他の供給源（真核性、原核性、ウイルス）に由来する他のトランジットペプチドによる置き換えによって、任意の目的のペプチドが、細胞から出て行くタンパク質を導くトランジットペプチドとして機能させることが可能かどうかを特定することができる。
【０２１７】
適切なショ糖インベルターゼの例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＡＢ９５０１０、ＮＰ＿０１２１０４、ＣＡＡ０６８３９で特定されるものが挙げられる。適切なインベルターゼの非限定的な例を以下の表３に列挙している。それぞれの列挙したインベルターゼのアミノ酸配列は、以下の配列表に含まれている。ある場合では、本発明の方法及びベクターで使用するのに適した外来のショ糖利用遺伝子は、表３から選択されるショ糖インベルターゼとのアミノ酸同一性が少なくとも４０％、５０％、６０％、７５％、又は９０％、又はそれ以上であるショ糖インベルターゼをコードする。
【０２１８】
【表４】
2014511140.tif 000005
【０２１９】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａによって、インベルターゼを培地に分泌させると、細胞は、純粋な試薬グレードのグルコースを用いても成長するため、サトウキビの処理から得た廃棄糖液を用いても同様に細胞を成長させることができる。サトウキビ処理の価値の低い廃棄産物を用いることによって、脂質及び他の油の生成において、費用を顕著に節約することができる。従って、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ微生物の集合を含む微生物の培養物を提供し、この培養物は、（ｉ）ショ糖と、（ｉｉ）ショ糖インベルターゼ酵素とを含む。種々の実施形態では、培養物中のショ糖は、ソルガム、テンサイ、サトウキビ、糖液、又は解重合されたセルロース系材料に由来するものである（場合により、リグニンを含んでいてもよい）。別の態様では、本発明の方法及び試薬は、組み換え微細藻類または他の微生物が利用可能な原材料の数及び種類を顕著に増やす。ここに例示した細菌は、ショ糖を利用することができるように変えられているが、セルロース系のような原材料を、セルラーゼ、ペクチナーゼ、異性化酵素などを分泌する能力を有する本発明の操作された宿主細菌が利用することができるように、本発明の方法及び試薬を適用してもよく、その結果、酵素反応の分解産物に単純に耐え得るというだけではなく、宿主が炭素源として利用する。これの例については、以下に、及び分泌可能なα−ガラクトシダーゼを発現するように操作された、それにより農業廃液流に見られる２つのオリゴ糖であるラフィノース及びスタキオースに含まれるものなどの、オリゴ糖類のα−ガラクトシル結合の加水分解能を付与する微生物の実施例に記載している。
【０２２０】
２．α−ガラクトシダーゼの発現
上述のような、ショ糖インベルターゼの発現は、（二糖類ショ糖のフルクトース分子とグルコース分子との間のα結合を加水分解する酵素を介して）ショ糖を炭素源としてより効率的に利用するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の能力を付与するが、オリゴ糖類における他の種類のα結合を加水分解する他の酵素の発現は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞に他の炭素源の利用能を付与し得る。これらの酵素の発現（及びそれにより得られる、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ及び他の微細藻類細胞が通常は利用することができない炭素源の利用能）は、そうした炭素源で成長可能な陽性クローンの選択を可能にすることによるこれらのトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞についての選択可能なマーカーとして用いることができる。
【０２２１】
ある実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、多糖分解酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子をさらに含む。種々の実施形態では、多糖分解酵素をコードする１つ以上の遺伝子は、分泌型α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞における外来性の分泌型α−ガラクトシダーゼの発現は、そのような形質転換株が、ガラクトースとグルコースとの単糖単位間のα結合のような、Ｄ−ガラクトシル結合を含む糖（炭素源）で成長する能力を付与する。外来性の分泌型α−ガラクトシダーゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、メリビオース（α−Ｄ−ガラクトース−グルコースから構成される二糖）などの二糖類の利用能を有し得る。
【０２２２】
ラフィノース（α結合したガラクトース−グルコース−フルクトースから構成される三糖）及びスタキオース（２つのα結合したＤ−ガラクトース単位と、それに続くα結合したグルコース及びフルクトースとから構成される四糖）などの糖は、テンサイパルプ（ラフィノース）及び大豆ミール（スタキオース）などの農業廃液流中に大きい比率で存在する。このような農業残渣は、利用能を有する微生物（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを含む）によって油に変換するための重要な未利用炭素源に相当する。
【０２２３】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、ラフィノース及びスタキオースなどのオリゴ糖類を有意な量で利用することができず、又は全く利用することができない。ラフィノース及びスタキオースの場合、ショ糖インベルターゼ（上述のような）を発現するトランスジェニック株が、ショ糖のα−ガラクトシル誘導体におけるフルクトースとグルコースとの間のα結合の加水分解能を有するが、しかしながらショ糖インベルターゼはそのような糖の残りのα結合を切断せず、得られる二糖は利用可能でないため、オリゴ糖の他の部分は利用されないままである。別の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、ショ糖インベルターゼをコードする外来遺伝子とα−ガラクトシダーゼをコードする外来遺伝子との両方を含む。従って、ショ糖インベルターゼとα−ガラクトシダーゼとの両方を発現する株は、ラフィノース及びスタキオースなどのオリゴ糖類を完全に加水分解する能力を有し、構成単量体を消費することが可能となる。さらに、α−ガラクトシダーゼコード遺伝子は、形質転換についての選択可能なマーカーとして使用することができる。外来性のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むクローンは、メリビオースで成長する能力を有し得る。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株での使用に適したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のＭＥＬ１遺伝子、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のＡｇｌＣ遺伝子が挙げられる。興味深いことに、遺伝子がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株における好ましいコドン使用に従い最適化されたとしても、全てのα−ガラクトシダーゼ遺伝子がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種において機能するわけではないことが分かっている。以下の実施例は、コドンが最適化されたＳ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のＭＥＬ１遺伝子及びＡ．ｎｉｇｅｒ由来のＡｇｌＣ遺伝子で形質転換したときにはあるが、高等植物のＣｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｂｏｌａ（グアー豆）由来のα−ガラクトシダーゼコード遺伝子で形質転換したときにはない、トランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞がメリビオースで成長する能力を示している。
【０２２４】
３．チアミン栄養要求相補体
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株は、チアミン栄養要求性であることが知られており（例えば、Ｃｉｆｅｒｒｉ，Ｏ．（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ，ｖ．１７８，ｐｐ．１４７５−１４７６を参照）、すなわちこれらの株は、成長するために栄養培地中にチアミンを必要とする。チアミン栄養要求性は、チアミン生合成経路における酵素の突然変異又は発現の欠如の結果であり得る。このとき、チアミン生合成経路における欠損した１つ又は複数の酵素を発現する相補的トランスジェニック株は、チアミンの添加なしに生育することができ、従って栄養培地の費用を抑えるとともに、得られる微細藻類バイオマスを動物用飼料としての使用により望ましいものにすることができる。トランスジェニック遺伝子がチアミン不含のプレート／培地での成長能を付与するため、チアミン生合成経路酵素の相補体はまた、選択可能なマーカーとして使用することができる。
【０２２５】
ある実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、チアミン生合成経路酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子をさらに含む。別の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、藻類、植物又はシアノバクテリアの供給源由来のヒドロキシメチルピリミジンリン酸シンターゼをコードする外来遺伝子を含む。さらに他の実施形態では、ヒドロキシメチルピリミジンリン酸シンターゼは、ＴＨＩＣ遺伝子によりコードされる。さらに他の実施形態では、ＴＨＩＣ遺伝子のＣｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣ、又はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３  ｔｈｉＣ。以下の実施例は、回復したチアミン原栄養性を有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の操作について詳細に記載する。
【０２２６】
Ｖ．脂質経路の操作
ショ糖を含有する原材料のような原材料を微細藻類または他の微生物が利用する能力を変えることに加え、本発明は、産生する脂質の性質及び／又は割合を変えるように改変された組み換え微細藻類または他の微生物も提供する。上述の経路は、さらに、又は上述のことに変えて、脂質の酵素処理によって産生する種々の脂質分子及び脂肪酸経路の中間体の性質及び／又は割合を変えるように改変されてもよい。種々の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、形質転換されていない対応する細胞と比較して、単位容積あたり及び／又は単位時間あたりの脂質収量が最適化されており、炭素鎖長（例えば、再生可能なディーゼルを生成するための、又は、脂質原材料を必要とする産業的な化学用途のための）を有しており、二重結合の数および／または位置が減っているか増えており、場合によりゼロになっており、脂肪酸のヒドロキシル化、および特定の脂質種又は個々の脂質の集合について、水素：炭素比が大きくなっている。
【０２２７】
特定の実施形態では、脂肪酸の合成に対し、代謝における分岐点を制御するような１つ以上の鍵となる酵素を上方調節するか、又は下方調節し、脂質の産生を高める。上方調節は、例えば、転写を増やす強力なプロモーターエレメント及び／又はエンハンサーエレメントを用い、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子が発現するような発現構築物を用いて細胞を形質転換することによって達成することができる。このような構築物は、形質転換体を選択することができるような選択可能なマーカーを含んでいてもよく、それにより、遺伝子の管理、および構築物が増幅され、コードされた酵素の発現量が増える可能性がある。本発明の方法に従って上方調節するのに適した酵素の例としては、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する役割を担うピルビン酸脱水素酵素（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿４１５３９２；ＡＡＡ５３０４７；Ｑ１ＸＤＭ１；ＣＡＦ０５５８７を含む）が挙げられる。ピルビン酸脱水素酵素を上方調節すると、アセチル−ＣｏＡの産生量が増え、それによって脂肪酸の合成量が増える。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の最初の工程を触媒する。従って、この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＢＡＡ９４７５２；ＡＡＡ７５５２８；ＡＡＡ８１４７１；ＹＰ＿５３７０５２；ＹＰ＿５３６８７９；ＮＰ＿０４５８３３；ＢＡＡ５７９０８を含む）。また、脂肪酸合成中に、アシル鎖を成長させるアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）を上方調節することによって、脂肪酸産生量を増やすこともできる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａ０Ｔ０Ｆ８；Ｐ５１２８０；ＮＰ＿８４９０４１；ＹＰ＿８７４４３３を含む）。グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速工程を触媒する。この酵素を上方調節すると、脂肪酸の産生量を増やすことができる（例えば、微細藻類由来のもの、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７４３１９；ＡＡＡ３３１２２；ＡＡＡ３７６４７；Ｐ４４８５７；ＡＢＯ９４４４２を含む）。
【０２２８】
遺伝子の上方調節及び／又は下方調節は、脂肪酸の生合成経路に関する遺伝子の発現を制御する包括的な制御因子に適用することができる。従って、脂肪酸合成の１つ以上の包括的な制御因子を、適切な場合に上方調節するか、又は下方調節し、それぞれ、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現を阻害するか、又は高め、最終的に、脂質の産生量を増やすことができる。例としては、ステロール制御エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、例えば、ＳＲＥＢＰ−１ａ及びＳＲＥＢＰ−１ｃ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３５６１０及びＱ９ＷＴＮ３を参照）。
【０２２９】
また、本発明は、例えば、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（表４を参照）、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素（表６を参照）、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素（表７を参照）、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ（表８を参照）、脂肪族アルデヒド還元酵素、デサチュラーゼ（例えばステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及び脂肪酸アシルデサチュラーゼ及びスクアレンシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２０５７９１を参照）などの脂質改変酵素をコードする１つ以上の外来遺伝子を含むように改変された組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞も提供する。脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、典型的には脂質を直接化学的に改変することはないが、本発明の実施形態における操作により、細胞の脂肪酸プロフィールを、特に鎖長及び二重結合分布の点で変化させることができる。ある実施形態では、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子及び自然に共発現するアシルキャリアータンパク質が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又は他の微細藻類細胞若しくは微生物細胞に、場合により他の脂質改変酵素をコードする１つ以上の遺伝子とともに形質転換される。他の実施形態では、ＡＣＰと脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとは互いに親和性を有してもよく、これは、それらが特定の組織又は有機体で自然に共発現するか否かに関係なく、その２つが本発明の微生物及び方法で同時に使用されるとき利点を与える。従って、本発明の実施形態は、これらの酵素の自然に共発現する対、並びにＡＣＰから特定長さの炭素鎖の切断を促進するよう互いに作用し合う親和性を共有する対の両方を包含する。
【０２３０】
さらに他の実施形態では、デサチュラーゼをコードする外来遺伝子を、脂質の飽和度を変える他の脂質改変酵素をコードする１つ以上の遺伝子とともに、微細藻類または他の微生物細胞内で形質転換する。他の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子は、微細藻類細胞又は他の微生物の細胞において（例えば、遺伝子のさらなる複製物を導入することにより）過剰発現する。ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＦ１５３０８；ＡＢＭ４５９１１；ＡＡＹ８６０８６）は、例えば、ステアロイル−ＡＣＰからオレイル−ＡＣＰへの変換を触媒する。この遺伝子を上方調節すると、細胞が産生する一価飽和脂肪酸の比率を増やす事ができ、一方、下方調節すると、一価不飽和物の比率を減らすことができる。例示を目的として、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）は、Ｃ１８：０前駆体からのＣ１８：１脂肪酸の合成に関与する。デサチュラーゼの別のファミリーは、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２  ＦＡＤ）を含めた脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。これらのデサチュラーゼはまた、脂質飽和に関する改変ももたらす。例示を目的として、デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼは、Ｃ１８：１前駆体からのＣ１８：２脂肪酸の合成に関与する。同様に、例えば、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６−オレイン酸デサチュラーゼのような１つ以上のグリセロ脂質デサチュラーゼの発現によって、飽和脂肪酸に対する不飽和脂肪酸の比率を変えるように制御することができる。ある実施形態では、デサチュラーゼは、望ましい炭素鎖長によって選択することができ、デサチュラーゼは、特定の炭素鎖を有する基質、又は特定の範囲内にある炭素長を有する基質の中で、位置特異的に改変させることができる。別の実施形態では、望ましい脂肪酸プロフィールが一価不飽和物（Ｃ１６：１及び／又はＣ１８：１など）の増加である場合、ＳＡＤの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現を、脂肪酸アシルデサチュラーゼ（ＦＡＤ）又は別のデサチュラーゼ遺伝子のサイレンシング又は不活性化（例えば、内在するデサチュラーゼ遺伝子の突然変異、ＲＮＡｉ、アンチセンス、又はノックアウトなどによる）と組み合わせることができる。
【０２３１】
他の実施形態では、微細藻類細胞又は他の微生物の細胞が変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子を有するように改変されており、ここでは突然変異により遺伝子又はデサチュラーゼ酵素が不活性になる。ある場合では、変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子は脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）である。他の場合では、変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子はステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼ（ＳＡＤ）である。以下の実施例６は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼの標的化した切断又はノックアウトについて記載している。実施例６はまた、ＲＮＡｉ又はアンチセンス構築物を使用した内在するデサチュラーゼ遺伝子の発現の低下についても記載している。
【０２３２】
ある場合では、望ましい脂質プロフィールを生じさせるトランスジェニック細胞（ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）を得るため、遺伝子操作技法の１つ以上を組み合わせることが有益な場合がある。一実施形態では、微細藻類細胞又は他の微生物の細胞は、変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子及び１つ以上の外来遺伝子を含む。非限定的な例では、変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子を含む微細藻類細胞又は他の微生物の細胞はまた、外来性の脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子及び／又はショ糖インベルターゼ遺伝子も発現することができる。以下の実施例６は、内在するＳＡＤの標的化した切断又はノックアウトを含み、また、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４選択的チオエステラーゼ及びショ糖インベルターゼを発現するトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞について記載している。この場合、トランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、獣脂に見られる脂質プロフィールと非常に近い脂質プロフィールを生じる。獣脂は、典型的にはレンダリングされた牛脂又は羊脂から得られ、室温で固体であり、食品、香粧品、及び化学品産業においてさまざまな用途に利用される。獣脂の脂肪酸プロフィールは、４％のＣ１４：０；２６％のＣ１６：０；３％のＣ１６：１；１４％のＣ１８：０；４１％のＣ１８：１；３％のＣ１８：２；及び１％のＣ１８：３である。以下の実施例６に示すとおり、内在するＳＡＤの標的化された切断又はノックアウトを含み、且つＣ．ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４選択的チオエステラーゼを発現するトランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞のクローンは、１％未満のＣ１２及びより短い炭素鎖長の脂肪酸；２．７４％〜６．１３％のＣ１４：０；２３．０７％〜２５．６９％のＣ１６：０；７．０２％〜１１．０８％のＣ１８：０；４２．０３％〜５１．２１％のＣ１８：１；及び９．３７％〜１３．４５％のＣ１８：２（面積パーセントで表される）の脂質プロフィールを有する。ある場合では、トランスジェニックＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、３〜５％のＣ１４：０；２５〜２７％のＣ１６：０；１０〜１５％のＣ１８：０；及び４０〜４５％のＣ１８：１の脂質プロフィールを有する。
【０２３３】
特定の実施形態では、本発明の細菌を、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、又は自然に共発現するアシルキャリアータンパク質から選択される１つ以上の外来遺伝子を発現するように遺伝子操作する。適切な発現方法は、リパーゼ遺伝子の発現に関して上に記載されており、他の方法の中で、特に、誘発的発現及び区画化された発現が挙げられる。脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂質合成中に、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から脂肪酸を開裂させる。さらなる酵素処理によって、開裂した脂肪酸と補酵素とが組み合わさって、アシル−ＣｏＡ分子が得られる。このアシル−ＣｏＡは、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素が酵素活性を発揮してアルデヒドを生じるための基質であり、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素が酵素活性を発揮してアルコールを生じるための基質である。上述のとおり特定した、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素の作用によって産生するアルデヒドは、さらに、脂肪族アルデヒド還元酵素が酵素活性を発揮してアルコールを生じるための基質であるか、又は、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼが酵素活性を発揮してアルカン又はアルケンを生じるための基質である。
【０２３４】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する脂肪酸、グリセロ脂質、又は対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカン又はアルケンは、８個、１０個、１２個、又は１４個の炭素原子を含む。ディーゼル、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル又はジェット燃料を生成するために好ましい脂肪酸、又は工業用途のための、対応する一級アルコール、アルデヒド、アルカン及びアルケンは、８〜１４個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、上述の脂肪酸、及び他の対応する炭化水素分子は、飽和であり（炭素−炭素二重結合又は三重結合を含まない）；一価飽和であり（二重結合が１個）；多価不飽和であり（２種以上の二重結合）；直鎖であるか（環状ではない）、又は分枝鎖である。燃料生成の場合、飽和度が高い方が好ましい。
【０２３５】
すぐ上に記載されている酵素は、特定の数の炭素原子を含む基質の加水分解に対し、優先的な特異性を有する。例えば、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、炭素原子を１２個含む脂肪酸をＡＣＰから優先的に開裂させ得る。ある実施形態では、ＡＣＰ及び長さ特異的なチオエステラーゼは、組み合わせると特に有用なような、お互いに対する親和性を有する場合がある（例えば、外来のＡＣＰ及びチオエステラーゼ遺伝子は、これらが誘導される特定の組織又は有機体で自然に共発現する場合がある）。従って、種々の実施形態では、本発明の組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、酵素活性（例えば、ＡＣＰからの脂肪酸開裂、アシル−ＣｏＡをアルデヒド又はアルコールに還元すること、又は、アルデヒドからアルカンへの変換）を、基質に含まれる炭素原子の数によって特異的に触媒するようなタンパク質をコードする外来遺伝子を含んでいてもよい。この酵素の特異性は、種々の実施形態では、炭素原子を８〜３４個、好ましくは、８〜１８個、より好ましくは、８〜１４個有する基質に対する特異性であり得る。好ましい特異性は、炭素原子が少ない、すなわち１２個から、多い、すなわち１８個含む基質に対する特異性である。
【０２３６】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した他の脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとしては、限定されないが、表４に列挙されたものが挙げられる。
【０２３７】
【表５】
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【０２３８】
以下の実施例は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種のＣｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｎ  ｃａｍｐｈｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ、Ｉｒｉｓ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ及びＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａに由来する異種脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを首尾よく標的化し、発現させることについて記載している。さらに、これらの異種脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する宿主細胞では脂肪酸プロフィールが変わることが確認された。これらの実施例に示されるとおり、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるこれらの異種チオエステラーゼの発現により、いくつかの種子作物の油をブレンドしたとしても現時点では市販の種子作物からは入手できない、真に独特の脂肪酸プロフィールを有する油／脂質を産生することが可能なトランスジェニック微細藻類が生成される。表５は、一般的な市販の種子油の脂肪酸プロフィールを示す。以下の市販の種子油のデータは全て、ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｄｅｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．２０１０−２０１１から編集した。獣脂データは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ：Ｆａｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（１９７６）による。
【０２３９】
【表６】
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【０２４０】
例として、これらの一般的な種子油のなかにＣ８又はＣ１０脂肪酸を高量で含有するものは一つもなく、ココナツ油及びパーム核油が最大の供給源であるが、いずれも約１：１の比（Ｃ８：Ｃ１０脂肪酸）を有する。実施例に示されるとおり、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｃ：８選択的チオエステラーゼで形質転換したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、１２％を超えるＣ８脂肪酸濃度を達成できたばかりでなく、またＣ８：Ｃ１０脂肪酸の比が約５：１であった。脂肪酸濃度を変化させることは、さまざまな商業的用途に応じた脂肪酸プロフィールを含む油の生成に有用である。さらに、種々の脂肪酸鎖長の間の比の変化は、別途コストのかかる化学的プロセス（エステル化、蒸留、画分化、及び再エステル化など）を受けていない油では商業的に得ることのできなかったものである。別の例として、ヤシ油は、最高のＣ１６：０脂肪酸（３２〜４７％）を含有する油であるが、ヤシ油にはＣ１４：０脂肪酸がほとんどない。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、約３３〜３８％のＣ１６：０脂肪酸及び約１０〜１６％のＣ１４：０脂肪酸（約２：１のＣ１６：０対Ｃ１４：０比）を達成した。１６：０脂肪酸が高い種子油は通常はそれほど多くの１４：０脂肪酸を含まないため、商業的レベルで既存の油をブレンドすることによっては、この脂肪酸プロフィールは商業的には非実際的であった。
【０２４１】
以下の実施例はまた、１つのクローンで少なくとも２つの脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを首尾よく標的化し、発現させることについても記載している。これらのクローンでは脂肪酸プロフィールが変わることが確認され、１つのクローン内でどの２つのチオエステラーゼを共発現させるかに応じて、脂肪酸プロフィールがさまざまな形で影響を受けた。例として、上記の表５から、ココナツ油及びパーム核油の両方が約３：１のＣ１２：Ｃ１４比を有する。以下の実施例で記載するとおり、２つの異種チオエステラーゼ遺伝子を含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ形質転換体は、約５：１の比のＣ１２：Ｃ１４脂肪酸濃度を生じることが可能であった。この種のＣ１２：Ｃ１４脂肪酸比は、商業的には（すなわち、種子油をブレンドすることによるのは）非実際的なものであった。
【０２４２】
トランスジェニック微細藻類により生成される油の別の新規の態様は、脂肪酸の飽和度である。現時点ではヤシ油が最大の飽和油供給源であり、全体の飽和対不飽和が５２％〜４８％である。以下の実施例に示すとおり、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ及びＣ．ｃａｍｐｈｏｒａに由来する異種チオエステラーゼを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、それが生成する油中の６０％超の総飽和物濃度を達成した。同様に以下の実施例に示すとおり、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａに由来する異種チオエステラーゼを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａは、それが生成する油中の８６％超の総飽和物濃度を達成した。
【０２４３】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素としては、限定されないが、表６に列挙したものが挙げられる。
【０２４４】
【表７】
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【０２４５】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素としては、限定されないが、表７に列挙したものが挙げられる。
【０２４６】
【表８】
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【０２４７】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼとしては、限定されないが、表８に列挙したものが挙げられる。
【０２４８】
【表９】
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【０２４９】
自然に共発現する脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びアシルキャリアータンパク質の組み合わせは、本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適している。
【０２５０】
炭化水素改変酵素又は脂質改変酵素のさらなる例としては、以下のいずれかの米国特許に含まれるか、以下のいずれかの米国特許で参照されているか、又は以下のいずれかの米国特許に含まれるか又は参照されている核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が挙げられる：第６，６１０，５２７号；第６，４５１，５７６号；第６，４２９，０１４号；第６，３４２，３８０号；第６，２６５，６３９号；第６，１９４，１８５号；第６，１１４，１６０号；第６，０８３，７３１号；第６，０４３，０７２号；第５，９９４，１１４号；第５，８９１，６９７号；第５，８７１，９８８号；第６，２６５，６３９号、さらに、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号で記載されているもの：ＡＡＯ１８４３５；ＺＰ＿００５１３８９１；Ｑ３８７１０；ＡＡＫ６０６１３；ＡＡＫ６０６１０；ＡＡＫ６０６１１；ＮＰ＿１１３７４７；ＣＡＢ７５８７４；ＡＡＫ６０６１２；ＡＡＦ２０２０１；ＢＡＡ１１０２４；ＡＦ２０５７９１；ＣＡＡ０３７１０。
【０２５１】
脂質生合成経路の他の酵素もまた、本発明の微生物及び方法での使用に適している。例えば、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（Ｋａｓ）酵素は、脂質生合成経路において上記に列挙した酵素の一部とともに働く。Ｋａｓ酵素にはさまざまなクラスが存在する：Ｋａｓ  Ｉは、成長し続けるアシルＡＣＰ鎖とマロニル−ＡＣＰとの間の逐次的な縮合工程に関与する。ＫＡＳ  ＩＩは典型的には、Ｃ１６：０−ＡＣＰからマロニル−ＡＣＰを組み込むＣ１８：０−ＡＣＰに至らせる最終的な縮合工程に関与する。従って、主にＣ１６〜Ｃ１８：０脂肪酸を合成する高等植物及び一部の微細藻類の種／株（及びその不飽和誘導体）では、ＫＡＳ  ＩＩ酵素は、ＦａｔＡ遺伝子の産物（アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ）と相互作用する。
【０２５２】
アシル−ＡＣＰは、脂肪酸生合成の間にＡＣＰから成長する脂肪酸鎖を遊離し、及びこれはほとんどの植物種でＦａｔＡ遺伝子ファミリーのメンバーによって行われ、ＦａｔＡ遺伝子ファミリーの役割は、Ｃ１６：０からＣ１８：０への工程で伸長を終結させることである。より短鎖の脂肪酸を合成する種（Ｃｕｐｈｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ、又はＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａなど）では、ＦａｔＢ遺伝子によりコードされるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのさまざまな群がこの終結工程を行う。ＫＡＳ  ＩＩ酵素とアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの間の相互作用は、脂肪酸鎖伸長の正しい終結に重要である。結果として、より短鎖の脂質生合成が可能なＦａｔＢ遺伝子が進化した高等植物種（及び微細藻類種）では、Ｋａｓ  ＩＶ遺伝子と称されるさらなるＫａｓ遺伝子クラスの対応する共進化が存在する。Ｋａｓ  ＩＶ遺伝子は、特定の脂肪酸サイズ範囲、４〜１４炭素長の鎖長伸長に関与する。
【０２５３】
本発明の細菌及び方法とともに用いるのに適した他の酵素としては、表４、６〜８に列挙したタンパク質の１つとのアミノ酸同一性が少なくとも７０％であり、対応する望ましい酵素活性（例えば、アシルキャリアータンパク質からの脂肪酸の開裂、アシル−ＣｏＡからアルデヒド又はアルコールへの還元、又はアルデヒドからアルカンへの変換）を示すものが挙げられる。さらなる実施形態では、酵素活性は、上述の望ましい配列の１つとの同一性が少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列に存在し、これらは全て、完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
【０２５４】
発現させるべき外来遺伝子の望ましい組み合わせを選択することによって、細菌が生成する産物を用途に応じて調節することができ、次いで、この産物を水系バイオマスから抽出してもよい。例えば、細菌は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子と；場合により、（ｉｉ）自然に共発現するアシルキャリアータンパク質、又は脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとの親和性を有する（又はその逆の）それ以外のアシルキャリアータンパク質と；場合により、（ｉｉｉ）脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素又は脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードする外来遺伝子と；場合により、（ｉｖ）脂肪族アルデヒド還元酵素又は脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼをコードする外来遺伝子とのうちの１つ以上を含んでいてもよい。この細菌はまた、外来性のステアロイル（ｓｔｅａｒｏｉｌ）ＡＣＰデサチュラーゼ（ｄｅｓｔｕｒａｓｅ）、脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（例えばＫＡＳＩ遺伝子によりコードされるようなもの）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（例えばＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるようなもの）、又はオレイン酸−１２ヒドロキシラーゼの１つ以上も含むことができる。細菌は、本明細書に記載の培養条件で、ＡＣＰに結合した脂肪酸を合成し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰから脂肪酸を開裂させることを触媒し、さらなる酵素処理によって脂肪酸アシル−ＣｏＡ分子を与える。存在する場合、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素は、アシル−ＣｏＡからアルコールへの還元を触媒する。同様に、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素が存在する場合、この酵素は、アシル−ＣｏＡからアルデヒドへの還元を触媒する。脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードする外来遺伝子が存在し、発現してアルデヒド産物を与えるような実施形態では、第３の外来遺伝子によってコードされる脂肪族アルデヒド還元酵素が、アルデヒドからアルコールへの還元を触媒する。同様に、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼが存在する場合、この触媒は、アルデヒドからアルカン又はアルケンへの変換を触媒する。
【０２５５】
別の実施形態では、細菌は、（ｉ）脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子；（ｉｉ）場合により、自然に共発現するアシルキャリアータンパク質、又は脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに対して親和性を有するアシルキャリアータンパク質；（ｉｉｉ）変異型の内在するデサチュラーゼ遺伝子、ここでは、標的化したＲＮＡｉ、アンチセンス又はｄｓＲＮＡ構築物のようなデサチュラーゼノックアウト又はデサチュラーゼ（ｄｅｓｔｕｒａｓｅ）抑制エレメントのように、この突然変異によってデサチュラーゼ遺伝子又はデサチュラーゼタンパク質が不活性となる；（ｉｖ）内在するステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼの過剰発現又は異種ＳＡＤの発現；及び（ｖ）前述の任意の組み合わせを含むことができる。
【０２５６】
このような酵素をコードする遺伝子、たとえば脂肪酸アシルＡＣＰチオエステラーゼなどは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓのような、顕著な量の脂質産生を示すことがすでに知られている細胞から得ることができる。脂質産生の役割を担うことがすでに知られている遺伝子、例えば、二重結合を飽和させる酵素をコードする遺伝子は、レシピエント細胞内で個々に形質転換されてもよい。しかし、本発明を実施するために、どの遺伝子が必要となるかといった推測的仮定を行う必要はない。微細藻類において脂質産生を変える（向上させる）ことが可能な遺伝子を特定する方法は、ＰＣＴ公開番号第２００８／１５１１４９号に記載されている。
【０２５７】
従って、本発明は、同じ種の野生型細胞と比較して、異なるレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞を提供する。ある場合では、遺伝子操作された細胞は、野生型細胞と同じ条件で成長させた場合に、野生型細胞と比べて脂質を多く産生する。ある場合では、上述の細胞は、野生型細胞よりも高いレベルまたはより低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、野生型細胞よりも高いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ピルビン酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、グリセロール−３  ホスフェートアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。ある場合では、上述の細胞は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、野生型細胞よりも低いレベルで脂質経路に関連する酵素を発現するように選択される。細胞が、脂質経路に関連する酵素を低いレベルで発現する少なくとも１つの実施形態では、脂質経路に関連する酵素は、クエン酸シンターゼを含む。
【０２５８】
ある実施形態では、上述の細胞は、野生型細胞と比べ、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように遺伝子操作されているか、及び／又は、異なるレベルで脂肪酸合成の包括的な制御因子を発現するように選択され、それにより、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現レベルは、野生型細胞と比べて変化している。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、脂肪酸を改変する酵素を含む。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼから選択される。ある場合では、細胞は、より低レベルの脂質経路酵素を発現するように、又は特定の脂質経路酵素を全く発現しないように遺伝子操作され、及び／又は選択されている（すなわち、ここでは脂質経路酵素がＲＮＡｉ法又はアンチセンス法を用いてノックアウトされているか、外来遺伝子に置き換えられているか、又は発現が低減されている）。別の実施形態では、脂質経路酵素は、限定されないがステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）を含めた、デサチュラーゼ遺伝子の異種発現である。実施例６は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景におけるＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａに由来する異種ステアロイル−ＡＣＰの発現について記載している。
【０２５９】
他の実施形態では、本発明は、１つ以上の外来遺伝子を含む油産生細菌に関し、ここで外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、デサチュラーゼ、及びアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質をコードする。別の実施形態では、内在するデサチュラーゼ遺伝子は、上記の外来遺伝子の１つ以上を含む細菌において過剰発現する。一実施形態では、外来遺伝子は、プロモーターに動作可能に連結した状態であり、刺激に応答して、誘発的であるか、又は抑制的である。ある場合では、刺激は、外から与えられる低分子、熱さ、冷たさ、培地中の窒素が制限されていること、又は窒素がないことからなる群から選択される。ある場合では、外来遺伝子は、細胞内のある区画で発現する。ある実施形態では、細胞内の区画は、葉緑体、プラスチド、ミトコンドリアからなる群から選択される。ある実施形態では、細菌は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである。
【０２６０】
一実施形態では、外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。ある場合では、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）から、炭素が８〜１８の脂肪酸が開裂することを触媒する。ある場合では、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１０〜１４の脂肪酸が開裂することを触媒する。一実施形態では、外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１２の脂肪酸が開裂することを触媒する。
【０２６１】
一実施形態では、外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードする。ある場合では、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元することを触媒する。ある場合では、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１０〜１４の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元することを触媒する。一実施形態では、外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１２の脂肪酸アシル−ＣｏＡをドデカノールへと還元することを触媒する。
【０２６２】
また、本発明は、２個の外来遺伝子を含有する組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞または他の細胞も提供しており、第１の外来遺伝子は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードし、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、アシルキャリアータンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。ある場合では、この２個の外来遺伝子は、それぞれプロモーターに動作可能に連結した状態であり、刺激に応答して誘発的である。ある場合では、それぞれのプロモーターは、培地中の窒素が制限されているか、又は窒素がないといった同じ刺激に応答して誘発的である。培地中の制限されているか、又は窒素がまったくないことによって、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種のようなある種の微生物では油の産生が刺激され、油をより高いレベルで産生のを誘発する引き金として用いることができる。本明細書に開示されている遺伝子操作方法と組み合わせて用いる場合、脂質量は、細胞乾燥重量の割合として、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または７５％〜９０％のような高いレベルまで引き上げられ得；本明細書に開示されている方法は、このようなレベルの脂質を有する細胞を提供し、ここで、脂質は、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり、Ｃ８が少なくとも０．３％であり、Ｃ１０が少なくとも２％であり、Ｃ１２が少なくとも２％であり、Ｃ１４が少なくとも２％である。ある実施形態では、細胞は、細胞乾燥重量によって２５％を超える脂質を有しており、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも１０％、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも２０％、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％、Ｃ８〜Ｃ１４が１０〜３０％、Ｃ８〜Ｃ１４が２０〜３０％の脂質を含む。
【０２６３】
本明細書に開示されている新しい油は、ヤシ油、パーム核油、ココナツ油のような中鎖脂肪酸が多い他の天然に存在する油とは明らかに異なっている。例えば、カロチノイドのような混入物質の濃度は、ヤシ油やパーム核油において、本発明の油におけるよりもはるかに高い。パーム油及びパーム核油は、特に、本発明の油よりも、α−カロチン、β−カロチン、リコピンを非常に多く含んでいる。それに加え、パーム油及びパーム核油では、２０種類を超える異なるカロチノイドが見つかっているが、一方、実施例からは、本発明の油は、含有するカロチノイド種の種類が非常に少なく、濃度も非常に低いことが示されている。それに加え、トコトリエノールのようなビタミンＥ化合物の濃度は、パーム油、パーム核油、ココナツ油では、本発明の油と比べてかなり大きい。
【０２６４】
一実施形態では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が８〜１８の脂肪酸が開裂することを触媒する。ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードし、この酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元するのを触媒する。ある場合では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１０〜１４の脂肪酸が開裂することを触媒し、第２の外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１０〜１４の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルコールへと還元するのを触媒し、ここで、チオエステラーゼと還元酵素は、同じ炭素鎖長に作用する。一実施形態では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が１２の脂肪酸が開裂することを触媒し、第２の外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が１２の脂肪酸アシル−ＣｏＡをドデカノールへと還元することを触媒する。ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードし、この酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応するアルデヒドへと還元することを触媒する。ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ内で必然的に一緒に発現するアシルキャリアータンパク質をコードする。
【０２６５】
ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードし、細菌は、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第３の外来遺伝子をさらに含む。ある場合では、第１の外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、ＡＣＰから、炭素が８〜１８の脂肪酸が開裂することを触媒し、第２の外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素が８〜１８の脂肪酸アシル−ＣｏＡを、対応する一級アルデヒドへと還元するのを触媒し、第３の外来遺伝子によってコードされるデカルボニラーゼは、炭素が８〜１８の脂肪族アルデヒドから対応するアルカンへの変換を触媒し、ここで、チオエステラーゼ、還元酵素、デカルボニラーゼは、同じ炭素鎖長に作用する。
【０２６６】
ある実施形態では、第２の外来遺伝子は、アシルキャリアータンパク質をコードし、細菌は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする第３の外来遺伝子をさらに含む。ある場合では、第３の外来遺伝子は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードし、細菌は、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第４の外来遺伝子をさらに含む。
【０２６７】
また、本発明は、培地中で、組み換えＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の集合を培養することを含む、アルコールを生成する方法を提供し、ここで、細胞は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする第１の外来遺伝子と、（ｉｉ）脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素をコードする第２の外来遺伝子とを含み、細胞は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に結合した脂肪酸を合成し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰから脂肪酸が開裂するのを触媒し、さらなる処理によって脂肪酸アシル−ＣｏＡが得られ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素は、アシル−ＣｏＡからアルコールへの還元を触媒する。
【０２６８】
また、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内で脂質分子を生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、培地中でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の集合を培養することを含み、ここで、この細胞は、（ｉ）脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする第１の外来遺伝子と、（ｉｉ）脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素をコードする第２の外来遺伝子とを含み、細菌は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に結合した脂肪酸を合成し、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰから脂肪酸が開裂するのを触媒し、さらなる処理によって脂肪酸アシル−ＣｏＡが得られ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素は、アシル−ＣｏＡからアルデヒドへの還元を触媒する。
【０２６９】
また、本発明は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞内で、特定の炭素鎖長を有する脂肪酸分子を生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、培地中でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞の集合を培養することを含み、ここで、この細胞は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含み、特定の炭素鎖長、例えば、炭素原子が８個、１０個、１２個、又は１４個の炭素鎖長に対して特異的であるか、これらの鎖長を好む活性を有しており、細菌は、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に結合した脂肪酸を合成し、チオエステラーゼは、脂肪酸が特定の炭素鎖長を有するように合成された場合には、ＡＣＰから、その脂肪酸を開裂することを触媒する。
【０２７０】
上述の種々の実施形態では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、脂質経路酵素又は遺伝子産物の発現を抑制するＲＮＡ干渉エレメントのような抑制エレメントをコードする少なくとも１つの外来遺伝子を含むことができる。ある場合では、脂質経路に関連する酵素は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、グリセロ脂質デサチュラーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアータンパク質、グリセロール−３  ホスフェートアシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。他の場合では、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞は、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ、及び／又はアシルキャリアータンパク質からなる群から選択される脂質改変酵素を含有する。
【０２７１】
また、本発明は、ヒドロキシル化脂肪酸を産生するヒドロキシラーゼをコードする異種遺伝子を含む微生物細胞も提供する。微生物細胞はＩＩ型脂肪酸合成経路を含み得る。例えば、微生物細胞は微細藻類細胞であってもよい。ある実施形態では、微細藻類細胞は、上記の表１に列挙される微細藻類細胞から選択される。他の実施形態では、微細藻類細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類細胞である。さらに他の実施形態では、微細藻類細胞はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓである。ヒドロキシラーゼは、ヒドロキシル基（−ＯＨ）を基質に加える酵素である。脂肪酸ヒドロキシラーゼは、一部の高等植物に見られる天然に存在する酵素である。高等植物に見られる天然に存在するヒドロキシラーゼの非限定的な例は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼであり、これはリシノール酸の産生に関与する。実施例７は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞におけるヒドロキシラーゼの異種発現、具体的には、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞におけるＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｌａｓｅ）の発現の例を記載している。
【０２７２】
ＶＩ．燃料及び化学物質の生成
本発明の方法に従って燃料を生成する場合、本発明の細胞が産生する細胞を収穫するか、又は任意の好都合な方法によって、それ以外の方法で集める。全細胞の抽出によって脂質を単離することができる。まず、細胞を破壊し、次いで、例えば、上述のような遠心分離を用いることによって、細胞内の脂質及び細胞膜／細胞壁に関連する脂質、及び細胞外の炭化水素を細胞塊から分けることができる。微生物中で生成する細胞内脂質を、ある実施形態では、微生物の細胞を溶解させた後に抽出する。抽出したら、脂質をさらに精製し、油、燃料又は油脂化学品を作り出す。
【０２７３】
培養が終了したら、微生物を発酵ブロスから分離することができる。場合により、分離は、遠心分離によって行い、濃縮ペーストを作成する。遠心分離によって、微生物に由来するかなりの量の細胞内の水が除去されず、この工程は乾燥工程ではない。次いで、バイオマスを場合により、洗浄溶液（例えば、脱イオン水）を用いて洗浄し、発酵ブロス及び発酵片を取り除く。場合により、洗浄した微生物バイオマスを乾燥させ（乾燥機で乾燥させる、凍結乾燥させる、など）、その後に細胞を破壊してもよい。又は、発酵が完全に終わっている場合には、細胞を発酵ブロスの一部又は全部と分離することなく溶解させてもよい。例えば、細胞を溶解させたときに、細胞と細胞外の液体とのｖ：ｖ比が１：１未満であってもよい。
【０２７４】
脂質を含有する微生物を溶解し、溶解物を作成してもよい。本明細書で詳細に記載するように、微生物を溶解する工程（細胞溶解とも呼ばれる）は、熱による溶解、塩基を加えること、酸を加えること、プロテアーゼのような酵素、アミラーゼのような多糖分解酵素を用いること、超音波を用いること、機械的な溶解、浸透圧衝撃を用いること、溶解性ウイルスに感染させること、及び／又は１つ以上の溶解遺伝子の発現を含む、任意の簡便な手段によって行うことができる。溶解を行い、微生物によって産生された細胞内分子を放出させる。微生物を溶解させるための、これらのそれぞれの方法を単独の方法として用いてもよく、同時又は連続して、組み合わせとして用いてもよい。細胞の破壊度は、顕微鏡分析によって観察することができる。本明細書に記載した１つ以上の方法を用い、典型的には、７０％を超える細胞の破壊が観察される。好ましくは、細胞の破壊は、８０％を超えており、より好ましくは、９０％を超えており、最も好ましくは、約１００％である。
【０２７５】
特定の実施形態では、成長した後に微生物を溶解させ、例えば、抽出又はさらなる処理のために、細胞内の脂質及び／又は炭化水素がさらされる程度を増やす。リパーゼ発現（例えば、誘発性プロモーターによる）又は細胞溶解のタイミングは、脂質及び／又は炭水化物の収量を最適化するように調節することができる。以下に、いくつかの溶解技術を記載している。これらの技術を個々に用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【０２７６】
本発明の一実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物を加熱することを含む。この実施形態では、微生物を含む発酵ブロス（又は、発酵ブロスから単離した微生物の懸濁物）を、微生物、すなわち、微生物の細胞壁及び細胞膜が分解するか、又は破壊するまで加熱する。典型的には、かけられる温度は、少なくとも５０℃である。もっと効率よく細胞を溶解させるために、もっと高い温度、例えば、少なくとも３０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、少なくとも１２０℃、少なくとも１３０℃、又はそれ以上の温度を使用する。熱処理によって細胞を溶解することは、微生物を沸騰させることによって行ってもよい。又は、熱処理（沸騰させない）をオートクレーブ中で行ってもよい。熱処理された溶解物を、さらなる処理のために冷却してもよい。また、細胞の破壊は、蒸気による処理によって、すなわち、加圧した蒸気を加えることによって行ってもよい。細胞を破壊するための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号に記載されている。ある実施形態では、蒸気処理は、蒸気を発酵槽に吹き込み、ブロスを所望の温度に約９０分未満、好ましくは約６０分未満、より好ましくは約３０分未満維持することによって行ってもよい。
【０２７７】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に塩基を加えることを含む。塩基は、少なくとも、使用した微生物の水系タンパク質化合物の一部分を加水分解するのに十分なほど強いことが必要である。タンパク質を溶解するのに有用な塩基は、化学分野で知られている。本発明の方法で有用な、例示的な塩基としては、限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましい塩基はＫＯＨである。細胞を破壊するための微細藻類の塩基処理は、例えば、米国特許第６，７５０，０４８号に記載されている。
【０２７８】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を含有する細胞懸濁物に酸を加えることを含む。酸による溶解は、１０〜５００ｍＮの濃度、又は好ましくは、４０〜１６０ｎＭの濃度の酸を用いて行うことができる。酸による溶解は、好ましくは、室温より高い温度（例えば、４０〜１６０℃、好ましくは、５０〜１３０℃の温度）で行われる。中程度の温度（例えば、室温〜１００℃、特に、室温〜６５℃）の場合、酸による処理は、有益には、音波処理又は他の細胞破壊方法と組み合わせてもよい。
【０２７９】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、酵素を用いることによって微生物を溶解することを含む。微生物を溶解するのに好ましい酵素は、プロテアーゼ、及びヘミセルラーゼのような多糖分解酵素（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するヘミセルラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｈ２１２５）、ペクチナーゼ（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．に由来するペクチナーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｐ２４０１）、Ｍａｎｎａｗａｙ  ４．０Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、セルラーゼ（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅに由来するセルロース；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｃ９４２２）、ドリセラーゼ（例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐ．に由来するドリセラーゼ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、モントリオール；＃Ｄ９５１５）である。
【０２８０】
本発明の他の実施形態では、溶解は、例えば、多糖分解酵素のようなセルラーゼ、場合により、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスに由来するもの、又は、プロテアーゼ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ、Ｏｄａ  Ｙｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、第８巻、Ｎｕｍｂｅｒ  １、２０００年１月、ｐｐ．２９−３２（４）、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４  ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、に列挙されているプロテアーゼ、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）のような酵素によって行われる。先に示したプロテアーゼ及び多糖分解酵素の任意の組み合わせを含む、プロテアーゼと多糖分解酵素の任意の組み合わせを用いてもよい。
【０２８１】
別の実施形態では、溶解は、連続圧搾機を用いて行うことができる。このプロセスでは、バイオマスに、高圧状態で、スクリュー型デバイスを用いて力を加え、細胞を溶解させ、細胞内脂質を放出させ、細胞内のタンパク質及び繊維（及び他の成分）と分離させる。
【０２８２】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、超音波を用いて、すなわち、音波処理によって行われる。従って、高周波数の音を用いて細胞を溶解させることができる。音は、電子的に発生させ、適切に濃縮した細胞懸濁物に対し、金属片を介して伝搬させてもよい。この音波処理（又は超音波処理）は、細胞懸濁物中に空洞を作り出すことに基づいて、細胞の一体性を破壊する。
【０２８３】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、機械的な溶解によって行われる。細胞は、機械的に溶解されてもよく、場合により、炭化水素（例えば、脂質）を集めやすいように均質化してもよい。例えば、加圧による破壊を利用し、細胞を含有するスラリーを制水型オリフィス弁にポンプで圧送してもよい。高圧（１５００ｂａｒまで）をかけ、その後、出口ノズルを通して瞬間的に拡散させてもよい。細胞の破壊は、弁での衝撃、オリフィス内での大きな液体剪断力、放出による急な圧力低下といった３種類の異なる機構によって行われ、これにより、細胞が爆発する。この方法によって、細胞内の分子が放出される。又は、ボールミルを用いてもよい。ボールミルの場合、ビーズのような小さな研磨粒子を含む懸濁物中で細胞を撹拌する。細胞は、剪断力、ビーズ間で研磨されること、ビーズと衝突することによって破壊される。ビーズは、細胞を破壊して、細胞内容物を放出させる。また、細胞は、細胞を破壊するためのブレンド（例えば、例として高速ブレンダー又はＷａｒｉｎｇブレンダー）を用いるか、フレンチプレスを用いるか、又は細胞壁が弱い場合には、遠心分離を用い、剪断力によって破壊されてもよい。
【０２８４】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、浸透圧衝撃を与えることによって行われる。
【０２８５】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、微生物を溶解性ウイルスに感染させることを含む。本発明で用いるのに微生物を溶解するのに適したさまざまなウイルスが知られており、特定の微生物に特定の溶解性ウイルスを選択し、使用することは、当業者の知識の範囲内である。例えば、ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ  ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルス（ＰＢＣＶ−１）は、特定の単細胞性の、真核性のクロレラに似た緑色の藻の中で複製し、溶解させる、大きな２０面体のプラークを形成する二本鎖ＤＮＡウイルスのグループ（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、クロロウイルス属）の原型である。従って、培養物を任意の適切なクロレラウイルスに感染させることによって、任意の感染しやすい微細藻類を溶解させることができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を、クロレラウイルスを用いて感染させる方法は知られている。例えば、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２００６；６６：２９３−３３６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年４月２５日；２５７（１）：１５−２３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年１月５日；３１８（１）：２１４−２３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２０００；（４４）：１６１−２；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６年３月；８０（５）：２４３７−４４；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９；５３：４４７−９４を参照。
【０２８６】
本発明の別の実施形態では、微生物を溶解する工程は、自己消化を含む。この実施形態では、本発明の微生物を、微生物を溶解する溶解性タンパク質を生成するように遺伝子操作する。この溶解遺伝子を、誘発性プロモーターを用いて発現させ、まず、細胞は、発酵槽内で望ましい密度まで成長し、その後、プロモーターの誘発によって、細胞を溶解させる溶解遺伝子が発現する。一実施形態では、溶解遺伝子は、多糖分解酵素をコードしている。特定の他の実施形態では、溶解遺伝子は、溶解性ウイルスに由来する遺伝子である。従って、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスに由来する溶解遺伝子を、藻の細胞中で発現させてもよい。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０、３０８−３１５（１９９９）；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８０（１９９９）４５−５３；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３、３７６−３８７（１９９９）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３０、３６１−３６８（１９９７）を参照。溶解遺伝子の発現は、好ましくは、誘発性プロモーター、例えば、低分子、光、熱及び他の刺激の存在のような刺激によって誘発される、微細藻類内で活性なプロモーターを用いてなされる。
【０２８７】
上述の方法によって生成した細胞溶解物から脂質を分離するための種々の方法が利用可能である。例えば、脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、疎水性溶媒、例えば、ヘキサンで抽出してもよい（Ｆｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：７１７を参照）。また、脂質及び脂質誘導体を、液化によって抽出してもよく（例えば、Ｓａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １７：３３−３９、及びＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６（４）：２６９−２７４を参照）；油の液化によって抽出してもよく（例えば  Ｍｉｎｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｆｕｅｌ  ７４（１２）：１７３５−１７３８を参照）；超臨界ＣＯ２抽出によって抽出してもよい（例えば、Ｍｅｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３５６：３２８−３３４を参照）。Ｍｉａｏ及びＷｕは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｏｃｏｉｄｅｓの培養物から、微細藻類の脂質を回収するプロトコルを記載しており、このプロトコルでは、細胞を遠心分離処理によって集め、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させた。得られた細胞粉末を乳鉢で細かく粉砕し、次いで、ｎ−ヘキサンで抽出した。Ｍｉａｏ及びＷｕ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）９７：８４１−８４６。
【０２８８】
従って、本発明の微生物によって生成した脂質、脂質誘導体、炭化水素を、有機溶媒を用いた抽出によって回収することができる。ある場合では、好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。典型的には、事前に溶解物成分を分離させることなく、溶解物に有機溶媒を直接加える。一実施形態では、上述の１つ以上の方法によって生成した溶解物を、脂質及び／又は炭化水素成分が有機溶媒と溶液を形成するのに十分な時間、有機溶媒と接触させる。ある場合では、溶液をその後にさらに精製し、特定の望ましい脂質成分又は炭化水素成分を回収する。ヘキサンによる抽出方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０２８９】
本明細書に記載されるとおり、細胞によって産生される脂質及び脂質誘導体、例えば、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール、アルカンのような炭化水素を、上述のとおり、リパーゼのような１つ以上の酵素を用いて改変してもよい。炭化水素が、細胞の外の環境に存在する場合、１つ以上の酵素を、この酵素が炭化水素を改変しするか、又は炭化水素前駆体からの合成を完結させるような条件下で、この環境に加えてもよい。又は、炭化水素を、細胞材料から部分的又は完全に単離してから、酵素のような１つ以上の触媒を加えてもよい。このような触媒は、外から加えられ、触媒の活性は、細胞の外で生じるか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる。
【０２９０】
従って、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞によって産生されるか、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素によって改変される脂質及び炭化水素は、本明細書に記載されるとおり、従来の手段によってさらに処理されてもよい。処理は、「クラッキング」して、炭化水素分子を小さくし、水素：炭素比を大きくすることを含んでいてもよい。触媒によるクラッキング方法及び熱によるクラッキング方法は、炭化水素及びトリグリセリド油脂の処理において通常用いられる。触媒による方法は、固体酸触媒のような触媒の使用を含む。触媒は、シリカ−アルミナ又はゼオライトであってもよく、この触媒により、炭素−炭素結合が不均衡又は非対称に破壊され、カルボカチオンとヒドリドアニオンが生じる。これらの反応性中間体は、次いで、転移するか、又は別の炭化水素にヒドリドが移動する。このように、この反応によって、中間体が再生し、自己連鎖的な機構を生じ得る。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の炭素−炭素二重結合又は三重結合を減らしてもよく、場合によりゼロにしてもよい。また、炭化水素を処理し、炭化水素中の環又は環状構造を除去するか、又は取り除いてもよい。また、水素：炭素比が大きくなるように、炭化水素を処理してもよい。この処理は、水素添加（「水素化」）及び／又は炭化水素を小さな炭化水素にする「クラッキング」を含んでいてもよい。
【０２９１】
熱による方法は、炭化水素を小さくするために、高温及び高圧の使用を含む。約８００℃の高温及び約７００ｋＰａの高圧を用いてもよい。これらの条件によって「軽質」のものが発生し、軽質との用語は、水素を多く含む炭化水素分子を指すために用いられ（光量子束によって区別する場合）、また、縮合により、水素が相対的に失われた、重い炭化水素分子によっても生成する。この方法によって、均衡、又は対称的に破壊され、アルケンを生じ、このアルケンは、場合により、上述のとおり酵素によって飽和になってもよい。
【０２９２】
触媒による方法及び熱による方法は、植物において、炭化水素の処理及び油の精製を行うのに標準的な方法である。従って、本明細書に記載されるような細胞が産生した炭化水素を集め、従来の手段によって処理するか、又は精製することができる。微細藻類が産生した炭化水素のハイドロクラッキングに関する論文は、Ｈｉｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．ＸＸＩＶ：１９３−２０５（１９８２））を参照。代替的な実施形態では、画分を、有機化合物、熱及び／又は無機化合物のような別の触媒で処理する。バイオディーゼル内の脂質を処理する場合、本章の以下に記載されているトランスエステル化プロセスを使用する。
【０２９３】
本発明の方法によって生成する炭化水素は、さまざまな工業用途で有用である。例えば、ほぼあらゆる種類の洗浄剤及び洗浄調製物で用いられるイオン系界面活性剤である直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の生成は、一般的に、炭素原子が１０〜１４の鎖を含む炭化水素を利用する。例えば、米国特許第６，９４６，４３０号；第５，５０６，２０１号；第６，６９２，７３０号；第６，２６８，５１７号；第６，０２０，５０９号；第６，１４０，３０２号；第５，０８０，８４８号；第５，５６７，３５９号を参照。例えば、米国特許第５，９４２，４７９号；第６，０８６，９０３号；第５，８３３，９９９号；第６，４６８，９５５号；第６，４０７，０４４号に記載されるとおり、界面活性剤、例えば、ＬＡＳを、パーソナルケア組成物及び洗浄剤で用いてもよい。
【０２９４】
再生可能な生物由来の出発物質を、化石燃料から誘導される出発物質と置き換えて利用可能であり、その使用が望ましいために、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料といった燃料に、生物由来の炭化水素成分を用いることに関心が高まっている。生物由来の材料から炭化水素成分を生成する方法が緊急に必要とされている。本発明は、本明細書に記載の方法によって生成した脂質を生物由来の原料として用い、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料を生成するような、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料を生成する方法を提供することによって、この要求を満たす。
【０２９５】
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素を豊富に含む石油留分である。これらの沸点範囲は、３７０°Ｆ〜７８０°Ｆ（約１８８°Ｃ〜約４１６°Ｃ）と広範囲であり、ディーゼルエンジン車のような圧縮点火エンジンでの燃焼に適している。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）は、例えば、セタン価、曇り点、引火点、粘度、アニリン点、硫黄含有量、含水量、灰分、銅板腐食、炭素残渣のような他の燃料特性の許容範囲とともに、沸点範囲に従って、ディーゼルのグレードを確立している。技術的には、バイオマス、又は適切なＡＳＴＭ仕様を満たすそれ以外のものから誘導される任意の炭化水素留分を、ディーゼル燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ９７５）、ジェット燃料（ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５）、又は脂肪酸メチルエステルである場合にはバイオディーゼル（ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１）と定義できる。
【０２９６】
抽出の後、本明細書に記載されているような微生物バイオマスから回収した脂質成分及び／又は炭化水素成分を、化学処理し、ディーゼル車及びジェットエンジン用の燃料を製造することができる。
【０２９７】
バイオディーゼルは、生成物の原材料に依存して、金色から濃い褐色までの色をした液体である。実質的に水には混和せず、高い沸点を有し、蒸気圧が低い。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車で使用するために、ディーゼルと等価な処理した燃料を指す。バイオディーゼルは、生分解性であり、毒性がない。従来のディーゼル燃料に比べて、バイオディーゼルのさらなる利点は、エンジンの摩耗が少ないことである。典型的には、バイオディーゼルは、Ｃ１４〜Ｃ１８のアルキルエステルを含む。種々のプロセスによって、バイオマス又は脂質が生成し、本明細書に記載されるとおり、単離してディーゼル燃料にする。バイオディーゼルを生成する好ましい方法は、本明細書に記載されるような脂質のトランスエステル化である。バイオディーゼルで用いるのに好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
【０２９８】
本明細書に記載の方法によって生成するバイオディーゼルは、単独で用いてもよく、ほとんどのディーゼルエンジン車における任意の濃度で、従来のディーゼル燃料とブレンドしてもよい。従来のディーゼル燃料（石油ディーゼル）とブレンドする場合、バイオディーゼルは、約０．１％〜約９９．９％存在してもよい。世界のほとんどで、燃料混合物中のバイオディーゼルの量を述べるために、「Ｂ」ファクターとして知られるシステムを用いる。例えば、２０％のバイオディーゼルを含む燃料は、Ｂ２０というラベルが付けられる。純粋なバイオディーゼルは、Ｂ１００と呼ばれる。
【０２９９】
また、バイオディーゼルを、家庭用ボイラ及び商業用ボイラの加熱燃料として用いてもよい。既存の灯油式ボイラは、ゴム部材を備える可能性があり、バイオディーゼルで動かすために改造する必要がある。改造プロセスは、通常は、比較的単純なものであり、バイオディーゼルが強い溶媒であるため、ゴム部材を合成部材と交換することを含む。バイオディーゼルの溶媒力が強いため、バイオディーゼルを燃やすと、ボイラの効率は上がるだろう。バイオディーゼルを、純粋な超低硫黄ディーゼル（ＵＬＳＤ）燃料の潤滑性を向上させるために、ディーゼル配合物の添加剤として用いてもよく、バイオディーゼルは硫黄を含有しないため、有益である。バイオディーゼルは、石油系ディーゼルよりも良好な溶媒であり、石油系ディーゼルで走っていた車両の燃料ラインに残る残留分の沈殿を分解するために用いてもよい。
【０３００】
バイオディーゼルは、油を豊富に含むバイオマスに含まれるトリグリセリドのトランスエステル化によって生成することができる。従って、本発明の別の態様では、バイオディーゼルを生成する方法が提供されている。好ましい実施形態では、バイオディーゼルを生成する方法は、（ａ）本明細書に開示されている方法を用い、脂質を含有する微生物を育てる工程と、（ｂ）脂質を含有する微生物を溶解させ、溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物をトランスエステル化する工程とを含み、これによってバイオディーゼルが生成する。微生物を成長させ、微生物を溶解させ、溶解物を生成し、有機溶媒を含む培地中、溶解物を処理し、不均一な混合物を生成し、処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は、上に記載されており、バイオディーゼルを生成する方法でも用いることができる。
【０３０１】
バイオディーゼルの脂質プロフィールは、通常は、原材料である油の脂質プロフィールと非常によく似ている。本発明の方法及び組成物によって与えられる他の油をトランスエステル化し、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．３％であり；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも２％であり；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも２％であり；（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％である脂質プロフィールを有するバイオディーゼルを得ることができる。
【０３０２】
脂質組成物をトランスエステル化し、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを得ることができる。好ましいトランスエステル化反応について、以下に概略を説明しており、塩基触媒によるトランスエステル化と、組み換えリパーゼを用いたトランスエステル化を含む。塩基触媒によるトランスエステル化プロセスでは、トリアシルグリセリドを、アルカリ触媒、典型的には、水酸化カリウム存在下、メタノール又はエタノールのようなアルコールと反応させる。この反応から、メチルエステル又はエチルエステルと、副生成物としてグリセリン（グリセロール）とが生成する。
【０３０３】
動物性油及び植物性油は、典型的には、遊離脂肪酸と三価アルコールであるグリセロールとのエステルであるトリグリセリドから作られる。トランスエステル化において、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）中のグリセロールを、メタノール又はエタノールのような短鎖アルコールと交換する。典型的な反応スキームは、以下のとおりである。
【化１】
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【０３０４】
この反応では、アルコールを塩基で脱プロトン化し、もっと強い求核試薬にする。一般的に、エタノール又はメタノールを大過剰に用いる（最大５０倍まで）。通常は、この反応は、非常にゆっくりと進むか、まったく進まないであろう。反応をもっとすばやく進めるために、熱とともに、酸又は塩基を用いてもよい。トランスエステル化反応によって酸又は塩基は消費されず、従って、これらは反応剤ではなく、触媒である。ほとんど全てのバイオディーゼルは、低い温度及び低い圧力のみを必要とし、変換収率が９８％を超えるため、塩基触媒による技術を用いて生成されている（但し、出発原料の油は、水分量が低く、遊離脂肪酸の量が少ないことを条件とする）。
【０３０５】
また、トランスエステル化は、塩基の代わりに、リパーゼのような酵素を用いて上述のとおり行われる。リパーゼによって触媒されるトランスエステル化は、例えば、ＴＡＧと低級アルコールとのモル比が、１：１より大きく、好ましくは約３：１の比率で、室温〜８０℃の温度で行われて得る。トランスエステル化で用いるのに適したリパーゼとしては、限定されないが、表９に列挙されるものが挙げられる。トランスエステル化に有用なリパーゼの他の例は、例えば、米国特許第４，７９８，７９３号；第４，９４０，８４５号、第５，１５６，９６３号；第５，３４２，７６８号；第５，７７６，７４１号、ＷＯ８９／０１０３２号に見いだされる。このようなリパーゼとしては、限定されないが、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａの微生物によって産生されるリパーゼ及び膵臓リパーゼが挙げられる。
【０３０６】
【表１０】
2014511140.tif 000012
【０３０７】
バイオディーゼルに適した脂肪酸エステルを生成するために、リパーゼを用いることの課題の１つは、リパーゼの価格が、強塩基プロセスで用いる水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の価格よりもかなり高いことである。この課題は、リサイクル可能な固定化されたリパーゼを用いることによって対処される。しかし、固定化されたリパーゼの活性は、生成費用の観点で、リパーゼによるプロセスが、強塩基プロセスと匹敵するようになるような最低限のサイクル数リサイクルした後にも維持されていなければならない。固定化されたリパーゼは、典型的には、トランスエステル化で用いられる低級アルコールによって毒化されやすい。米国特許第６，３９８，７０７号（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．に対し、２００２年６月４日発行）は、固定化されたリパーゼを高める方法、及び活性が低下した、固定化されたリパーゼを再生する方法を記載している。いくつかの適切な方法は、固定化されたリパーゼを、炭素原子数が３個未満のアルコールに所定時間、好ましくは、０．５〜４８時間、より好ましくは、０．５〜１．５時間浸すことを含む。また、いくつかの適切な方法は、不活性化した、固定化されたリパーゼを、炭素原子が３個を超えないアルコールで洗浄し、次いで、この不活性化した、固定化されたリパーゼを、植物油に０．５〜４８時間浸すことを含む。
【０３０８】
特定の実施形態では、組み換えリパーゼを、リパーゼが作用して脂質を産生する同じ微生物中で発現する。適切な組み換えリパーゼとしては、上の表９に列挙されているもの、及び／又は上の表９に列挙されているＧｅｎｂａｎｋ寄託番号を有するもの、又は、上の表９に列挙されているリパーゼの１つとのアミノ酸同一性が少なくとも７０％であり、リパーゼ活性を示すポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態では、酵素活性は、上に記載した配列の１つとの同一性が少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列に存在し、これらは全て、完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。リパーゼ及び選択可能なマーカーをコードするＤＮＡは、好ましくは、コドンが最適化されたｃＤＮＡである。微細藻類において発現させるための遺伝子を書き換える方法は、米国特許第７，１３５，２９０号に記載されている。
【０３０９】
バイオディーゼルに関する一般的な国際標準は、ＥＮ  １４２１４である。ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１は、米国及びカナダで参照されている最も一般的なバイオディーゼル標準である。ドイツは、ＤＩＮ  ＥＮ  １４２１４を使用しており、英国は、ＢＳ  ＥＮ  １４２１４の順守が必要である。上述の製品がこれらの標準を満たしているか否かを決定するための基本的な工業用試験としては、典型的には、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。上述の品質表寿を満たすバイオディーゼルは、非常に毒性が低く、毒性の評価（ＬＤ５０）は、５０ｍＬ／ｋｇより大きい。
【０３１０】
ＡＳＴＭ標準を満たすバイオディーゼルは、毒性が低くなければならないが、堆積物として溶液から結晶化し、及び／又は沈殿し、沈む傾向のある混入物質が存在している場合がある。堆積物の生成は、バイオディーゼルが低い温度で使用される場合、特に問題である。堆積物又は沈殿は、燃料の流れを減らし、燃料ラインを詰まらせ、フィルターを詰まらせるなどの問題を引き起こす場合がある。もっと品質の高い製品を製造するために、バイオディーゼル中の上述の混入物質及び堆積物を除去することに特に対処するプロセスが、当該技術分野でよく知られている。このようなプロセスの例としては、限定されないが、リン脂質及び遊離脂肪酸のような混入物質を除去するための、油の前処理（例えば、ガム状物質の除去、苛性ソーダによる精製、シリカ吸着剤による濾過）及び冷却状態での濾過が挙げられる。冷却状態での濾過は、生成した後のバイオディーゼル中に存在する任意の粒状物及び堆積物を除去するために特に開発されたプロセスである。このプロセスは、バイオディーゼルを冷却し、低い温度で燃料を用いる場合に生成するかもしれない任意の堆積物又は沈殿を濾別する。このようなプロセスは、当該技術分野でよく知られており、米国特許公開第２００７−０１７５０９１号に記載されている。適切な方法は、バイオディーゼルを約３８℃より低い温度まで冷却し、不純物及び混入物質をバイオディーゼル液体中、粒状物として析出させる。次いで、この冷却したバイオディーゼル材料に、珪藻土又は他の濾過材料を加えてスラリーを作成し、次いで、これを葉状圧力フィルター又は他の種類のフィルターで濾過し、粒状物を除去する。次いで、濾過したバイオディーゼルを、最終的なバイオディーゼル製品が得られるように、研磨フィルターに通し、残った任意の堆積物及び珪藻土を除去する。
【０３１１】
実施例９は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに由来するトリグリセリド油脂を用いた、バイオディーゼルの生成について記載している。実施例９で生成したバイオディーゼルのＡＳＴＭ  Ｄ６７５１  Ａ１法による、Ｃｏｌｄ  Ｓｏａｋ  Ｆｉｌｔｅｒａｂｉｌｉｔｙは、容積３００ｍｌで１２０秒であった。この試験は、Ｂ１００  ３００ｍｌを濾過し、４０°Ｆ（約４．５°Ｃ）で１６時間冷却し、室温まで加温し、減圧下、ステンレス鋼の支持材を取り付けた０．７マイクロメートルガラス繊維を用いて濾過する。本発明の油を、トランスエステル化し、冷状態浸漬時間が、１２０秒未満、１００秒未満、９０秒未満のバイオディーゼルを得ることができる。
【０３１２】
バイオディーゼルが、特定の冷温で使用される場合、次のプロセスを用いてもよい。このようなプロセスは、脱ろう及び画分化を含む。両プロセスは、曇り点（バイオディーゼルが結晶化し始める温度）を下げることによって、冷状態での流動性を高め、冬の燃料の性能を高める。バイオディーゼルを脱ろうするために、いくつかのアプローチが存在する。アプローチのひとつは、バイオディーゼルと、石油ディーゼルとをブレンドすることである。別のアプローチは、バイオディーゼルの曇り点を下げることが可能な添加剤を使用することである。別のアプローチは、添加剤中で混合し、飽和物質を結晶化させ、次いで結晶を濾別することによって、飽和メチルエステルを無差別に除去することである。画分化は、メチルエステルを個々の成分又は画分に選択的に分離し、これにより、特定のメチルエステルを除去するか、又は含むようにすることができる。画分化方法は、尿素による画分化、溶媒による画分化、熱による蒸留が挙げられる。
【０３１３】
本発明の方法によって提供される別の価値の高い燃料は、再生可能なディーゼルであり、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０のようなアルカンを含み、従って、バイオディーゼルとは区別することができる。高品質の再生可能なディーゼルは、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５の標準に適合している。本発明の方法によって生成する脂質は、再生可能なディーゼルを製造する原材料として役立たせることができる。従って、本発明の別の態様では、再生可能なディーゼルを製造する方法が提供される。再生可能なディーゼルは、熱水で処理すること（熱水処理）；水素化処理；間接的な液化といった、少なくとも３種類のプロセスで製造することができる。これらのプロセスによって、エステルではない留分が得られる。これらのプロセスの間、本明細書に記載されるとおり生成し、単離されたトリアシルグリセリドを、アルカンへと変換する。
【０３１４】
一実施形態では、再生可能なディーゼルを生成する方法は、（ａ）脂質を含有する微生物を本明細書に開示されている方法を用いて育てることと、（ｂ）微生物を溶解させ、溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質を脱酸素し、熱水処理してアルカンを生成することとを含み、これによって再生可能なディーゼルが得られる。再生可能なディーゼルを製造するのに適した脂質は、ヘキサンのような有機溶媒を用い、微生物バイオマスから抽出することによって、又は米国特許第５，９２８，６９６号に記載されるような他の方法によって得ることができる。いくつかの適切な方法は、機械的に加圧し、遠心分離処理することを含んでいてもよい。
【０３１５】
いくつかの方法では、まず、微生物脂質を、熱処理と組み合わせてクラッキングし、それぞれ、炭素鎖長を短くし、二重結合を飽和させる。次いで、この物質を異性化し、これも熱水処理と組み合わせる。次いで、ナフサ画分を蒸留によって除去し、次いで、さらに蒸留し、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５の標準を満たすように、ディーゼル燃料中の望ましい成分を蒸気にし、蒸留しつつ、Ｄ９７５の標準を満たすのに望ましいものよりも重い成分は残す。トリグリセリド油脂を含む油を化学的に改変する熱水処理方法、ハイドロクラッキング方法、脱酸素方法、異性化方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＥＰ１７４１７６８（Ａ１）；ＥＰ１７４１７６７（Ａ１）；ＥＰ１６８２４６６（Ａ１）；ＥＰ１６４０４３７（Ａ１）；ＥＰ１６８１３３７（Ａ１）；ＥＰ１７９５５７６（Ａ１）；米国特許第７，２３８，２７７号；第６，６３０，０６６号；第６，５９６，１５５号；第６，９７７，３２２号；第７，０４１，８６６号；第６，２１７，７４６号；第５，８８５，４４０号；第６，８８１，８７３号を参照。
【０３１６】
再生可能なディーゼルを生成する方法の一実施形態では、脂質を処理してアルカンを得ることは、脂質組成物の熱水処理によって行われる。熱水処理において、典型的には、バイオマスを、高温高圧下、水中で反応させて、油と残留する固体を生成させる。変換温度は、典型的には、３００°Ｆ〜６６０°Ｆ（約１４９°Ｃ〜約３４９°Ｃ）であり、圧力は、水が主に液体のままであるのに十分な圧力であり、１００〜１７０標準大気圧（ａｔｍ）である。反応時間は、１５〜３０分程度である。反応が終了した後、有機物を水から分離する。それにより、ディーゼルに適した留分が得られる。
【０３１７】
再生可能なディーゼルを製造するいくつかの方法では、トリグリセリドを処理する第１の工程は、二重結合を飽和させる水素化処理であり、次いで、水素及び触媒存在下、高温で脱酸素させる。いくつかの方法では、水素化及び脱酸素は、同じ反応中に起こる。他の方法では、水素化の前に脱酸素が起こる。次いで、場合により、これも水素及び触媒が存在する条件で、異性化を行う。ナフサ成分は、好ましくは、蒸留によって除去される。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）；第５，０９１，１１６号（ｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇａｓ  ｒｅｍｏｖａｌ）；第６，３９１，８１５号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）；第５，８８８，９４７号（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を参照。
【０３１８】
トリグリセリドを水素化するのに適した方法のひとつは、銅、亜鉛、マグネシウム、ランタニウムの塩の水溶液と、アルカリ金属、又は好ましくは、炭酸アンモニウムの別の溶液とを調製することを含む。この２種類の溶液を、約２０℃〜約８５℃の温度まで加熱し、触媒を生成させるために、沈殿容器のｐＨが５．５〜７．５に維持されるように、沈殿容器に秤量しながら一緒に加える。沈殿容器にさらなる水を最初に入れておいてもよく、又は、塩溶液及び沈殿溶液と同時に入れてもよい。得られた沈殿を十分に洗浄し、乾燥させ、約３００℃で焼結し、約１００℃〜約４００℃の範囲の温度で、水素で活性化する。次いで、容器中、１つ以上のトリグリセリドを接触させ、上述の触媒存在下、水素と反応させてもよい。この反応槽は、トリクルベッド反応槽、固定床気体−固体反応槽、充填気泡反応槽、連続撹拌型タンク反応槽、スラリー相反応槽、又は当該技術分野で既知の任意の他の適切な反応槽であってもよい。このプロセスは、バッチ式で行ってもよく、連続的な様式で行ってもよい。反応温度は、典型的には、約１７０℃〜約２５０℃の範囲であり、一方、反応圧力は、典型的には、約３００ｐｓｉｇ〜約２０００ｐｓｉｇの範囲内にある。さらに、本発明のプロセスにおいて、水素とトリグリセリドとのモル比は、典型的には、約２０：１〜約７００：１の範囲にある。このプロセスは、典型的には、約０．１ｈｒ−１〜約５ｈｒ−１の範囲の重量空間速度（ＷＨＳＶ）で行われる。当業者は、反応に必要な時間は、使用する温度、水素とトリグリセリドとのモル比、水素の分圧によってさまざまであることを認識するだろう。このような水素化プロセスで生成する生成物は、脂肪族アルコール、グリセロール、微量のパラフィン及び未反応のトリグリセリドを含む。これらの生成物を、典型的には、例えば、蒸留、抽出、濾過、結晶化などの従来の手段によって分離する。
【０３１９】
石油精製業者は、水素化処理を利用し、原料を水素で処理することによって不純物を除去する。水素化処理による変換温度は、典型的には、３００°Ｆ〜７００°Ｆ（約１４９°Ｃ〜約３７１°Ｃ）である。圧力は、典型的には、４０〜１００ａｔｍである。反応時間は、典型的には、１０〜６０分程度である。固体触媒を利用し、特定の反応速度を上げ、特定の生成物の選択性を上げ、水素の消費量を最適化する。
【０３２０】
油を脱酸素するのに適した方法は、油を約３５０°Ｆ〜約５５０°Ｆ（約１７７°Ｃ〜約２８８°Ｃ）の範囲の温度まで加熱することと、少なくとも大気圧よりも高い圧力で、少なくとも５分間、加熱した油を窒素と連続的に接触させることとを含む。
【０３２１】
異性化に適した方法は、アルカリ異性化、及び当該技術分野で既知の他の油異性化を含む。
【０３２２】
熱水処理及び水素化処理によって、最終的に、トリグリセリド供給物の分子量が低下する。トリグリセリド分子は、水素化処理条件で、プロパン分子と、３種類のこれより重い炭化水素分子、典型的には、Ｃ８〜Ｃ１８の範囲の炭化水素分子の４種類の炭化水素へと還元される。
【０３２３】
従って、一実施形態では、本発明の脂質組成物で行われる１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ９７５の再生可能なディーゼルを有するアルカン混合物である。微生物による炭化水素の産生は、Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）６６：４８６−４９６及びＡ  Ｌｏｏｋ  Ｂａｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ：Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  Ａｌｇａｅ、ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２４１９０、Ｊｏｈｎ  Ｓｈｅｅｈａｎ、Ｔｅｒｒｉ  Ｄｕｎａｈａｙ、Ｊｏｈｎ  Ｂｅｎｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｒｏｅｓｓｌｅｒ（１９９８）にまとめられている。
【０３２４】
ディーゼル燃料の蒸留特性は、Ｔ１０−Ｔ９０（それぞれ、容積で１０％及び９０％が留出した温度）の観点で記載される。再生可能なディーゼルは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓトリグリセリド油脂から作られ、実施例９に記載されている。実施例９で作られた物質のＴ１０−Ｔ９０は、５７．９℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、本明細書に開示されている方法に従って作られるトリグリセリド油脂を用い、他のＴ１０−Ｔ９０範囲、例えば、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃、６５℃の再生可能なディーゼル組成物を生成することができる。
【０３２５】
実施例９で作られる材料のＴ１０は、２４２．１℃であった。本明細書に開示されている油の方法水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、他のＴ１０値、例えば、Ｔ１０が１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を生成してもよい。
【０３２６】
実施例９で作られる材料のＴ９０は、３００℃であった。本明細書に開示されている油の方法水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、他のＴ９０値、例えば、Ｔ９０が２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を生成してもよい。
【０３２７】
実施例９で作られる材料の最終沸点（ＦＢＰ）は、３００℃であった。本明細書に開示されている油の方法は、水素化処理、異性化、他の共有結合の改変、及び、本明細書に開示されている蒸留及び画分化（例えば、冷状態での濾過）を利用し、他のＦＢＰ値、例えば、ＦＢＰが２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、少なくとも３００の再生可能なディーゼル組成物を生成してもよい。
【０３２８】
本発明の方法及び組成物によって提供される他の油に、水素化処理、異性化、他の共有結合の改変を組み合わせて行ってもよく、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり、；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．３％；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも２％；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも２％；（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％の脂質プロフィールを有する油を含む。
【０３２９】
従来の超低硫黄ディーゼルは、２工程プロセスによって、バイオマスの任意の形態から製造してもよい。第１に、バイオマスを、水素及び一酸化炭素を豊富に含む気体状混合物である合成ガスに変換する。次いで、この合成ガスを、触媒によって液体に変換する。典型的には、液体の生成は、Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈ（ＦＴ）合成を用いて行われる。この技術は、石炭、天然ガス、重油に応用される。従って、再生可能なディーゼルを製造する方法のさらに別の好ましい実施形態では、脂質組成物を処理し、アルカンを得ることは、脂質組成物を間接的に液状化することによって行われる。
【０３３０】
また、本発明は、ジェット燃料を生成する方法を提供する。ジェット燃料は、透明から麦わら色である。最も一般的な燃料は、航空機Ａ−１と分類される、鉛を含んでいない／パラフィン油系の燃料であり、国際的な標準化された一連の仕様を満たすように製造される。ジェット燃料は、多種類の異なる炭化水素の混合物であり、おそらく、数千種類以上が含まれているだろう。これらの物質の大きさの範囲（分子量又は炭素数）は、例えば、凍結点又は発煙点のような生成物の要求によって制限される。ケロシン（Ｋｅｒｏｓｏｎｅ）型の航空機燃料（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ａ−１を含む）は、炭素数が約８〜１６の炭素分布を有する。ワイドカット型又はナフサ型の航空機燃料（Ｊｅｔ  Ｂを含む）は、典型的には、炭素数が約５〜１５の炭素分布を有する。
【０３３１】
両方の航空機燃料（Ｊｅｔ  Ａ及びＪｅｔ  Ｂ）は、多くの添加剤を含み得る。有用な添加剤としては、限定されないが、酸化防止剤、帯電防止剤、腐食阻害剤、燃料計凍結阻害（ＦＳＩＩ）剤が挙げられる。酸化防止剤は、ガム化を防ぎ、通常は、アルキル化フェノール系のものであり、例えば、ＡＯ−３０、ＡＯ−３１又はＡＯ−３７である。帯電防止剤は、静電気を発散させ、火花を防ぐ。ジノニルナフチルスルホン酸（ＤＩＮＮＳＡ）を活性な成分として含むＳｔａｄｉｓ  ４５０は、一例である。腐食阻害剤、例えば、ＤＣＩ−４Ａは、民間用燃料及び軍事用燃料に用いられ、ＤＣＩ−６Ａは、軍事用燃料に用いられる。ＦＳＩＩ剤としては、例えば、Ｄｉ−ＥＧＭＥが挙げられる。
【０３３２】
本発明の一実施形態では、ジェット燃料は、藻の燃料と、既存のジェット燃料とをブレンドすることによって作られる。本発明の方法によって生成した脂質を、原材料として使い、ジェット燃料を製造する。従って、本発明の別の態様では、ジェット燃料を生成する方法が提供される。これとともに、本発明の方法によって生成される脂質からジェット燃料を製造する、流体触媒クラッキング（ＦＣＣ）及び水素化脱酸素（ＨＤＯ）の２つの方法が提供される。
【０３３３】
流体触媒クラッキング（ＦＣＣ）は、重い未精製画分から、オレフィン、特にプロプレンを製造するのに用いられる方法のひとつである。本発明の方法によって生成した脂質を、オレフィンへと変換することができる。このプロセスは、生成した脂質をＦＣＣゾーンに流すことと、ジェット燃料として有用な、オレフィンを含む生成物流を集めることとを含む。生成した脂質を、クラッキング条件で、クラッキング触媒と接触させ、ジェット燃料として有用なオレフィン及び炭化水素を含む生成物流を得る。
【０３３４】
一実施形態では、ジェット燃料を生成する方法は、（ａ）脂質を含有する微生物を、本明細書に開示されている方法を用いて育てることと、（ｂ）微生物を溶解させ、溶解物を生成する工程と、（ｃ）溶解した微生物から脂質を単離する工程と、（ｄ）脂質組成物を処理することとを含み、それによって、ジェット燃料が作られる。ジェット燃料を生成する方法の一実施形態では、脂質組成物は、流体触媒クラッキングゾーンへと流れてもよく、一実施形態では、脂質組成物と、クラッキング触媒とをクラッキング条件で接触させ、Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを含む生成物流を得てもよい。
【０３３５】
この方法の特定の実施形態では、脂質組成物に存在し得る任意の混入物質を除去することが望ましい場合がある。従って、脂質組成物を、流体触媒クラッキングゾーンに流す前に、脂質組成物を前処理する。前処理は、脂質組成物と、イオン交換樹脂とを接触させることを含み得る。イオン交換樹脂は、ＡｍｂｅｒｌｙｓｔＴＭ−１５のような酸性イオン交換樹脂であり、脂質組成物が上向又は下向に流れる、反応槽中の床として用いてもよい。他の前処理は、脂質組成物を、硫酸、酢酸、硝酸又は塩酸のような酸と接触させることによる、穏和な酸洗浄を含んでいてもよい。接触は、通常は、周囲温度及び周囲圧力で、希釈酸溶液を用いて行われる。
【０３３６】
脂質組成物は、場合により前処理されており、これをＦＣＣゾーンに流し、このゾーンで、炭化水素系成分をクラッキングしてオレフィンにする。触媒クラッキングは、反応ゾーンで、脂質組成物を、細かく分割した粒状物質で構成される触媒と接触させることによって行われる。反応は、ハイドロクラッキングとは対照的な触媒クラッキングであり、水素を加えない状態で行われるか、又は水素を消費する状態で行われる。クラッキング反応が進むにつれて、かなりの量のコークスが触媒上に蓄積する。再生ゾーンで、触媒から高温でコークスを燃焼させることによって、触媒は再生する。コークスを含有する触媒は、本明細書では「コークス化触媒」と呼ばれ、反応ゾーンから再生ゾーンへと連続的に移動し、再生し、再生ゾーンから、本質的にコークスを含まない再生された触媒に置き換わる。種々の気体流によって触媒粒子を流動化すると、反応ゾーンと再生ゾーンとの間を触媒が移動することができる。炭化水素をクラッキングする方法、例えば、流動化した触媒流の中で本明細書に記載の脂質組成物の炭化水素をクラッキングし、反応ゾーンと再生ゾーンとの間を触媒が移動し、再生槽でコークスを燃焼させる方法は、ＦＣＣプロセスの分野で当業者には周知である。例示的なＦＣＣ用途、及びＣ２〜Ｃ５オレフィンを得るために、脂質組成物をクラッキングするのに有用な触媒は、米国特許第６，５３８，１６９号、第７，２８８，６８５号に記載されており、これらの文献は、内容全体が参照により組み込まれる。
【０３３７】
適切なＦＣＣ触媒は、一般的に、少なくとも２つの成分を含み、この２つの成分は、同じマトリックス上にあってもよく、同じマトリックス上になくてもよい。ある実施形態では、２つの成分は、両方とも、反応容器全体を循環していてもよい。第１の成分は、一般的に、流動化した触媒クラッキングの分野で用いられる、よく知られている任意の触媒、例えば、活性アモルファスクレイ型触媒及び／又は高い活性を有する結晶性分子ふるいを含んでいる。分子ふるい触媒は、望ましい生成物に対する選択性がかなり向上しているため、アモルファス触媒よりも好ましい場合がある。いくつかの好ましい実施形態では、ゼオライトを、ＦＣＣプロセスの分子ふるいとして用いてもよい。好ましくは、第１の触媒成分は、大きな孔のゼオライト、例えば、Ｙ型ゼオライト、活性アルミナ材料、シリカ又はアルミナのいずれかを含むバインダー材料、カオリンのような不活性フィラーを含んでいる。
【０３３８】
一実施形態では、本発明の脂質組成物のクラッキングは、ＦＣＣゾーンのライザー部分、又はリフト部分で起こる。脂質組成物は、ノズルによってライザー部分に導入され、その結果、脂質組成物がすばやく蒸気になる。触媒を接触させる前に、脂質組成物は、一般的には、約１４９℃〜約３１６℃（３００°Ｆ〜６００°Ｆ）の温度を有しているであろう。この触媒は、ブレンド容器からライザー部分に流れ、この部分で、約２秒又はそれより短い時間、脂質組成物と接触する。
【０３３９】
ブレンドされた触媒及び反応した脂質組成物の蒸気は、出口を通って、ライザー上部から排出され、オレフィンを含むクラッキングした生成物の蒸気流の中で分離し、かなりの量のコークスで覆われた、一般的に「コークス触媒」と呼ばれる触媒粒子を集める。望ましい生成物が望ましくない他の生成物にさらに変換されるのを促進するおそれがある、脂質組成物と触媒とが接触している時間を最小限にする試みにおいて、旋回アームの配置のような、セパレーターの配置を利用し、生成物流からコークス化触媒をすばやく離すことができる。セパレーター、例えば、旋回アームセパレーターは、チャンバの下側部分に位置するストリッピングゾーンを備えるチャンバの上側部分に位置している。旋回アームの配置から離れた触媒は、ストリッピングゾーンに落ちる。軽質オレフィン及びいくつかの触媒を含む、クラッキングした炭化水素を含むクラッキングした生成物の蒸気流は、サイクロンとつながった管を通ってチャンバを出る。サイクロンは、生成物の蒸気流から、残留する触媒粒子を除去し、粒子の濃度を非常に低いレベルまで下げる。次いで、生成物の蒸気流は、分離容器の上側を出る。サイクロンによって分離された触媒は、分離容器に戻り、次いで、ストリッピングゾーンに戻る。ストリッピングゾーンは、蒸気と向流で接触させることによって、触媒表面から吸着した炭化水素を除去する。
【０３４０】
炭化水素の分圧は、低い状態で軽質オレフィンを生成しやすくするように働く。従って、ライザーの圧力は、約１７２〜約２４１ｋＰａ（２５〜３５ｐｓｉａ）に設定し、炭化水素の分圧は約３５〜１７２ｋＰａ（５〜２５ｐｓｉａ）に設定し、好ましい炭化水素の分圧は、約６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉａ）である。このように比較的低い炭化水素の分圧は、希釈剤が脂質組成物の１０〜５５ｗｔ％、好ましくは、約１５ｗｔ％になる程度まで、蒸気を希釈剤として用いることによって達成される。同等な炭化水素分圧を達成するために、乾燥ガスのような他の希釈剤を用いてもよい。
【０３４１】
ライザー出口でのクラッキングした蒸気の温度は、約５１０℃〜６２１℃（９５０°Ｆ〜１１５０°Ｆ）であろう。しかし、ライザー出口の温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）より高いと、もっと気体は乾燥し、もっとオレフィンが増える。一方、ライザー出口の温度が５６６℃（１０５０°Ｆ）より低いと、エチレン及びプロピレンが減る。従って、約５６６℃〜約６３０℃の好ましい温度で、約１３８ｋＰａ〜約２４０ｋＰａ（２０〜３５ｐｓｉａ）の好ましい圧力で、ＦＣＣプロセスを行うことが好ましい。このプロセスの別の条件は、脂質組成物に対する触媒の比率であり、この比率は、約５〜約２０、好ましくは、約１０〜約１５の間で異なる。
【０３４２】
ジェット燃料を生成する方法の一実施形態では、脂質組成物は、ＦＣＣ反応槽のリフト部分に導入される。リフト部分での温度は、非常に熱く、約７００℃（１２９２°Ｆ）〜約７６０℃（１４００°Ｆ）の範囲であり、脂質組成物に対する触媒の比率は、約１００〜約１５０であろう。脂質組成物をリフト部分に導入すると、かなりの量のプロピレン及びエチレンを生成するであろうことが予測される。
【０３４３】
本明細書で記載されるとおり生成した脂質組成物及び脂質を用い、ジェット燃料を生成する方法の別の実施形態では、脂質組成物又は脂質の構造は、水素化脱酸素（ＨＤＯ）と呼ばれるプロセスによって破壊される。ＨＤＯは、水素を用いて酸素を除去することを意味し、つまり、この材料の構造を破壊しつつ、酸素を除去することを意味する。オレフィン系二重結合を水素化し、任意の硫黄化合物及び窒素化合物を除去する。硫黄の除去は、水素化脱硫黄（ＨＤＳ）と呼ばれる。原材料（脂質組成物又は脂質）の前処理及び純度は、触媒の寿命に関わる。
【０３４４】
一般的に、ＨＤＯ／ＨＤＳ工程において、水素を、供給原料（脂質組成物又は脂質）と混合し、この混合物を、並流として、単一成分又は二成分の供給原料として触媒床に流す。ＨＤＯ／ＭＤＳ工程の後、生成物の画分を分離し、別個の異性化反応槽に流す。生物学的出発物質のための異性化反応槽は、並流反応槽として文献に記載されている（ＦＩ  １００  ２４８）。
【０３４５】
供給される炭化水素、例えば、本明細書の脂質組成物又は脂質を水素化することによって燃料を生成するプロセスは、脂質組成物又は脂質を、第１の水素化ゾーンを通って水素ガスとともに並流として流すことによって行われ、その後に、水素ガスを、炭化水素流出物に対して向流で第２の水素化ゾーンに流すことによって、炭化水素流出物を第２の水素化ゾーンでさらに水素化する。Ｃ２〜Ｃ５オレフィンを生成するために、脂質組成物をクラッキングするのに有用な、例示的なＨＤＯ用途及び触媒は、米国特許第７，２３２，９３５号に記載されており、内容全体が参照により組み込まれる。
【０３４６】
典型的には、水素化脱酸素工程において、本明細書の脂質組成物又は脂質のような生物学的成分の構造は分解され、酸素化合物、窒素化合物、リン化合物、硫黄化合物、軽質炭化水素が気体として除去され、オレフィン性結合は水素化される。このプロセスの第２の工程、すなわち、いわゆる異性化工程では、炭化水素鎖を分岐させ、低温でパラフィンの性能を向上させるために、異性化が起こる。
【０３４７】
クラッキングプロセスの第１の工程、すなわち、ＨＤＯ工程では、水素ガス及び水素化されるべき本明細書の脂質組成物又は脂質は、ＨＤＯ触媒床系に向かって並流又は向流で流れ、この触媒床系は、１つ以上の触媒床、好ましくは、１〜３個の触媒床を有する。ＨＤＯ工程は、典型的には、並流の様式で操作される。２種以上の触媒床を含むＨＤＯ触媒床系の場合には、床のうち１つ以上を、向流の原理を用いて操作してもよい。ＨＤＯ工程では、圧力は、２０〜１５０ｂａｒを変動し、好ましくは、５０〜１００ｂａｒを変動し、温度は、２００〜５００℃で変動し、好ましくは、３００〜４００℃の範囲で変動する。ＨＤＯ工程では、周期律表のＶＩＩ族及び／又はＶＩＢ族の金属を含む既知の水素化触媒を用いてもよい。好ましくは、水素化触媒は、担持されたＰｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏの触媒であり、担持体は、アルミナ及び／又はシリカである。典型的には、ＮｉＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒及びＣｏＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒を用いる。
【０３４８】
ＨＤＯ工程の前に、本明細書の脂質組成物又は脂質を、場合により、穏和な条件下で前水素化することにより処理し、二重結合の副作用を避けることができる。このような前水素化は、前水素化触媒存在下、温度が５０〜４００℃、水素圧が１〜２００ｂａｒ、好ましくは、１５０〜２５０℃の温度で、水素圧が１０〜１００ｂａｒで行われる。触媒は、周期律表のＶＩＩＩ族及び／又はＶＩＢ族の金属を含んでいてもよい。好ましくは、前水素化触媒は、担持されたＰｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、ＮｉＭｏ又はＣｏＭｏの触媒であり、担持体は、アルミナ及び／又はシリカである。
【０３４９】
ＨＤＯ工程からの水素を含む気体の流れを冷却し、次いで、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素化合物、リン化合物、硫黄化合物、気体状軽質炭化水素及び他の不純物をここから除去する。圧縮した後、精製された水素又はリサイクルされた水素を第１の触媒床に戻すか、及び／又は、触媒床の間に戻し、抜き取られた気体の流れを構成する。圧縮された液体から水が取り除かれる。この液体を第１の触媒又は触媒床の間に流す。
【０３５０】
ＨＤＯ工程の後、生成物に対し、異性化工程を行う。このプロセスにとって、炭化水素を異性化触媒と接触させる前に、可能な限り完全に不純物が除去されることが重要である。異性化工程は、場合により、ストリッピング工程を含んでおり、ＨＤＯ工程の反応生成物を、水蒸気又は軽質炭化水素、窒素又は水のような適切な気体を用いてストリッピングすることによって精製してもよい。この場合によって行われるストリッピング工程は、異性化触媒の上流にあるユニットで、向流様式で行われ、気体及び液体が互いに接触するか、又は向流の原理を利用する別個のストリッピングユニット中、実際の異性化反応槽の前に行われる。
【０３５１】
ストリッピング工程の後、水素ガス及び本明細書の水素化された脂質組成物又は脂質と、場合により、ｎ−パラフィン混合物は、１個又は複数個の触媒床を含む反応異性化ユニットを通る。異性化工程の触媒床は、並流又は向流の様式で操作されてもよい。
【０３５２】
このプロセスについて、異性化工程に向流の原理が適用されることが重要である。異性化工程では、このことは、場合により行われるストリッピング工程、又は異性化反応工程、又はこの両方の工程を向流の様式で行うことによってなされる。異性化工程では、圧力は、２０〜１５０ｂａｒ、好ましくは、２０〜１００ｂａｒの範囲で変動し、温度は、２００〜５００℃、好ましくは、３００〜４００℃である。異性化工程では、当該技術分野で知られている異性化触媒を用いてもよい。適切な異性化触媒は、分子ふるい及び／又はＶＩＩ属の金属及び／又はキャリアを含んでいる。好ましくは、異性化触媒は、ＳＡＰＯ−１１又はＳＡＰＯ４１又はＺＳＭ−２２又はＺＳＭ−２３又はフェライト、Ｐｔ、Ｐｄ又はＮｉ、Ａｌ２Ｏ３又はＳｉＯ２を含む。典型的な異性化触媒は、例えば、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２２／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＺＳＭ−２３／Ａｌ２Ｏ３、Ｐｔ／ＳＡＰＯ−１１／ＳｉＯ２である。異性化工程及びＨＤＯ工程は、同じ加圧容器で行われてもよく、別個の加圧容器で行われてもよい。場合により行われる前水素化は、ＨＤＯ工程及び異性化工程と加圧容器で行われてもよく、別個の加圧容器で行われてもよい。
【０３５３】
従って、一実施形態では、１つ以上の化学反応の生成物は、ＨＲＪ−５を含むアルカン混合物である。別の実施形態では、１つ以上の化学反応の生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ１６５５ジェット燃料を含むアルカン混合物である。ある実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、硫黄含有量が１０ｐｐｍ未満である。他の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、蒸留曲線のＴ１０値が、２０５℃未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、最終沸点（ＦＢＰ）が３００℃未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、引火点が少なくとも３８℃である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、密度が７７５Ｋ／Ｍ３〜８４０Ｋ／Ｍ３である。さらに別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、凍結点が−４７℃未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、正味の燃焼熱が、少なくとも４２．８ＭＪ／Ｋである。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、水素含有量が、少なくとも１３．４質量％である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、定量重量分析ＪＦＴＯＴで、２６０℃で試験した場合、熱安定性を有し、Ｈｇ３ｍｍ未満である。別の実施形態では、ＡＳＴＭ  １６５５ジェット燃料の仕様に適合する組成物は、存在するガム状物が７ｍｇ／ｄｌ未満である。
【０３５４】
従って、本発明は、微細藻類の脂質を化学的に改変し、種々の工業用途及び他の用途で有用な生成物を得る種々の方法を開示している。本明細書に開示されている方法によって精製する油を改変するプロセスの例としては、限定されないが、油の加水分解、油の水素化処理、油のエステル化が挙げられる。微細藻類脂質の他の化学的な改変としては、限定なしに、エポキシ化、酸化、加水分解、硫酸化、スルホン化、エトキシ化、プロポキシル化、アミド化、及び鹸化が挙げられる。微細藻類の油の改変によって、望ましい機能のために選択された誘導体の油脂化学品へとさらに改変することが可能な、基本的な油脂化学品が得られる。燃料生成プロセスについて上述のと類似した様式で、これらの化学的な改変を、本明細書に記載されている微生物の培養物から生成した油に対して行ってもよい。基本的な油脂化学品の例としては、限定されないが、石鹸、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、脂肪族窒素化合物、脂肪酸メチルエステル、及びグリセロールが挙げられる。誘導体の油脂化学品の例としては、限定されないが、脂肪族ニトリル、エステル、ダイマー酸、四級アンモニウムカチオン、界面活性剤、脂肪族アルカノールアミド、脂肪族アルコールサルフェート、樹脂、乳化剤、脂肪族アルコール、オレフィン、掘削泥、ポリオール、ポリウレタン、ポリアクリレート、ゴム、ロウソク、化粧品、金属石鹸、石鹸、α−スルホン酸化メチルエステル、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、イミダゾリン、界面活性剤、デタージェント、エステル、四級アンモニウムカチオン、オゾン分解生成物、脂肪族アミン、脂肪族アルカノールアミド、エトキシサルフェート、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド（中鎖トリグリセリドを含む）、潤滑剤、油圧作動液、グリース、誘電性流体、離型剤、金属加工液、熱媒液、他の機能液、工業用化学物質（例えば、クリーナー、繊維加工助剤、可塑剤、安定剤、添加剤）、表面塗料、塗料及びラッカー、電気配線絶縁材、及び高級アルカンが挙げられる。
【０３５５】
本発明の方法によって生成するグリセロ脂質に由来する脂肪酸構成要素を加水分解することによって、他の有用な化学物質を生成するように誘導体化することが可能な遊離脂肪酸が得られる。加水分解は、水及び触媒の存在下で起こり、触媒は、酸であっても、塩基であってもよい。以下に報告されているように、放出された遊離脂肪酸を誘導体化して、種々の生成物を得ることができる。米国特許第５，３０４，６６４号（Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ）；第７，２６２，１５８号（Ｃｌｅａｎｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第７，１１５，１７３号（Ｆａｂｒｉｃ  ｓｏｆｔｅｎｅｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第６，３４２，２０８号（Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｓｋｉｎ）；第７，２６４，８８６号（Ｗａｔｅｒ  ｒｅｐｅｌｌａｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第６，９２４，３３３号（Ｐａｉｎｔ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）；第６，５９６，７６８号（Ｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｒｕｍｉｎａｎｔ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）；第６，３８０，４１０号（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｅａｎｅｒｓ）。
【０３５６】
加水分解に関し、本発明の一実施形態では、トリグリセリド油脂を、場合により、まず、水又は水酸化ナトリウムのような液体培地中で加水分解し、グリセロール及び石鹸を得る。種々の適切なトリグリセリド加水分解方法が存在し、限定されないが、鹸化、酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素加水分解（本明細書で、分解とも呼ばれる）、加圧熱水を用いた加水分解が挙げられる。当業者は、油脂化学品を生成するためにトリグリセリド油脂を加水分解する必要はないことを理解するだろう。むしろ、油を、他の既知のプロセスによって、望ましい油脂化学品に直接変換してもよい。例えば、トリグリセリド油脂を、エステル化によって、メチルエステル脂肪酸に直接変換してもよい。
【０３５７】
ある実施形態では、本明細書に開示されている方法によって生成した油の触媒的加水分解は、油をグリセロールと脂肪酸とに分解することによって起こる。上述のとおり、脂肪酸を、誘導体の油脂化学品を得るためのいくつかの他の改変によって、さらに処理してもよい。例えば、一実施形態では、脂肪酸は、アミノ化反応を受け、脂肪族窒素化合物を生成してもよい。別の実施形態では、脂肪酸は、オゾン分解を受け、一塩基酸及び二塩基酸を生成してもよい。
【０３５８】
他の実施形態では、加水分解は、本明細書で生成した油の分解によって起こり、油脂化学品を生成してもよい。いくつかの本発明の好ましい実施形態では、トリグリセリド油脂を分解してから、他のプロセスを行ってもよい。当業者は、限定されないが、酵素分解及び加圧分解を含む多くの適切なトリグリセリド分解方法が存在することを認識しているであろう。
【０３５９】
一般的に、酵素による油分解方法は、酵素リパーゼを、水／油混合物に作用する生体触媒として使用する。次いで、酵素分解によって、油又は脂肪を、それぞれグリセロールと遊離脂肪酸とに分解する。次いで、グリセロールは、水相に移動し、一方、有機相には、遊離脂肪酸が豊富に含まれる。
【０３６０】
酵素分解反応は、一般的に、有機相と水相との間の相の境界で起こり、酵素は、相の境界にしか存在しない。相の境界に来たトリグリセリドが、分解反応に寄与するか、又は分解反応に参加する。反応が進むにつれて、脂肪酸の占有密度又は濃度が、遊離脂肪酸と比較すると、まだグリセリドと化学的に結合しており、相の境界での占有密度又は濃度が低くなり、その結果、反応が遅くなる。特定の実施形態では、酵素分解を室温で行ってもよい。当業者は、所望な脂肪酸へと分解するのに適切な条件を知っているであろう。
【０３６１】
例として、反応速度は、界面の境界面が増えることによって速くすることができる。反応が終了したら、遊離脂肪酸を、有機相から酵素を含まずに分離し、まだグリセリドと化学的に結合した脂肪酸を含む残渣を、再び再び供給するか、又はリサイクルし、分解させるべき新しい油又は脂肪と混合する。この様式で、リサイクルされたグリセリドについて、次いで、さらなる酵素分解プロセスを行う。ある実施形態では、遊離脂肪酸を、このような様式で部分的に分解した油又は脂肪から抽出する。この様式で、化学的に結合している脂肪酸（トリグリセリド）が、分解プロセスに戻されるか、又は再び供給される場合、酵素の消費を顕著に減らすことができる。
【０３６２】
分解度は、測定した酸価を、所与の油又は脂肪からコンピューターで割り出すことが可能な理論的に可能な酸価で割った比率として決定される。好ましくは、酸価は、標準的な一般的な方法による滴定手段によって測定される。又は、グリセロール水相の密度は、分解度の測定値として測ることができる。
【０３６３】
一実施形態では、本明細書に記載されているような分解プロセスは、生成した油のアルカリ精製プロセスから得られる、いわゆる石鹸ストックに含まれるモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドを分解するのにも適している。このように、石鹸ストックは、それより前に天然の油が脂肪酸へと鹸化されることなく、定量的に変換することができる。この目的で、石鹸に化学的に結合している脂肪酸は、好ましくは、酸を加えることによって、分解の前に放出される。特定の実施形態では、分解プロセスのために、水及び酵素に加えて、緩衝溶液を用いる。
【０３６４】
一実施形態では、本発明の方法に従って生成した油に対し、加水分解方法として鹸化を行うことができる。動物性油及び植物性油は、典型的には、遊離脂肪酸と三価アルコールであるグリセロールとのエステルであるトリグリセリド（ＴＡＧ）から作られる。アルカリ加水分解反応において、ＴＡＧ中のグリセロールが除去され、ナトリウム又はカリウムのようなアルカリ金属と会合し、脂肪酸塩を生成することができる、３個のカルボン酸アニオンが残る。このスキームで、カルボン酸の構成要素が、グリセロール部分から開裂し、ヒドロキシル基によって置き換えられる。この反応で用いられる塩基（例えば、ＫＯＨ）の量は、望ましい鹸化度によって決定される。目的が、例えば、ＴＡＧ組成物に元も存在している油をいくらか含んでいる石鹸を生成することである場合、ＴＡＧの全てを脂肪酸に変換するのには十分でない塩基の量が、反応混合物に入れられる。通常は、この反応は水溶液中で行われ、ゆっくりと進むが、熱を加えて反応を速め得る。脂肪酸塩の沈殿は、例えば、水溶性のアルカリ金属ハロゲン化物（例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌ）のような塩を反応混合物に加えることによって促進され得る。好ましくは、塩基は、ＮａＯＨ又はＫＯＨのようなアルカリ金属の水酸化物である。又は、例えば、トリエタノールアミン及びアミノメチルプロパノールを含め、アルカノールアミンのような他の塩基を反応スキームで用いてもよい。ある場合では、これらの代替法は、透明な石鹸製品を作るのに好ましい場合がある。一実施形態では、鹸化に供される脂質組成物は、本明細書に記載されるとおり生成された獣脂の模倣物（すなわち、獣脂の組成と同様の脂質組成物）、又は獣脂の模倣物の別のトリグリセリド油脂とのブレンドである。
【０３６５】
いくつかの方法では、化学的な改変の第１の工程は、二重結合を飽和させるための水素化処理であってもよく、次いで、水素及び触媒が存在する条件下、高温で脱酸素を行う。他の方法では、水素化及び脱酸素は、同じ反応で行ってもよい。さらに他の方法では、脱酸素は、水素化の前に行う。次いで、場合により、異性化を行ってもよく、これも水素及び触媒の存在下で行ってもよい。最後に、所望の場合、気体及びナフサ成分を除去することができる。例えば、米国特許第５，４７５，１６０号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）；第５，０９１，１１６号（ｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇａｓ  ｒｅｍｏｖａｌ）；第６，３９１，８１５号（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）；第５，８８８，９４７号（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を参照。
【０３６６】
本発明のある実施形態では、トリグリセリド油脂を、部分的に脱酸素するか、又は完全に脱酸素する。脱酸素反応によって、限定されないが、脂肪酸、脂肪族アルコール、ポリオール、ケトン、アルデヒドのような所望な生成物が得られる。一般的に、いかなる特定の理論によっても限定されないが、脱酸素反応は、限定されないが、水素化分解、水素化、連続的な水素化−水素化分解、連続的な水素化分解−水素化、水素化−水素化分解反応の組み合わせを含む種々の異なる反応経路の組み合わせを含んでおり、その結果、脂肪酸又は脂肪酸エステルから酸素が少なくとも部分的に除去され、脂肪族アルコールのような反応生成物が生成し、さらなるプロセスによって、この生成物を所望な化学物質へと簡単に変換することができる。例えば、一実施形態では、脂肪族アルコールを、ＦＣＣ反応によってオレフィンへと変換してもよく、縮合反応によって高級アルカンへと変換してもよい。
【０３６７】
このような化学的な改変のひとつは水素化であり、水素化は、グリセロ脂質又は遊離脂肪酸の脂肪酸構成要素中にある二重結合に水素を添加することである。水素化プロセスによって、液体の油が、特定の用途ではさらに適切な場合がある半固体又は固体の脂肪へと変換される。
【０３６８】
本明細書に記載の方法によって生成する油の水素化は、米国特許第７，２８８，２７８号（Ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｏｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）；第５，３４６，７２４号（Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，４７５，１６０号（Ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）；第５，０９１，１１６号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｏｉｌｓ）；第６，８０８，７３７号（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆａｔｓ  ｆｏｒ  ｍａｒｇａｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｓ）；第５，２９８，６３７号（Ｒｅｄｕｃｅｄ−ｃａｌｏｒｉｅ  ｆａｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）；第６，３９１，８１５号（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ａｎｄ  ｓｕｌｆｕｒ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔ）；第５，２３３，０９９号及び第５，２３３，１００号（Ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌｓ）；第４，５８４，１３９号（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ）；第６，０５７，３７５号（Ｆｏａｍ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）；第７，１１８，７７３号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｓｐｒｅａｄｓ）に報告されているとおり、本明細書で提供している１つ以上の方法及び／又は材料と組み合わせて行うことができる。
【０３６９】
当業者は、種々のプロセスを用いて炭水物を水素化してもよいことを認識するだろう。適切な方法のひとつは、炭水化物を、水素化反応槽中で、水素化生成物を得るのに十分な条件で、水素又は適切な気体と混合した水素及び触媒と接触させることを含む。水素化触媒は、一般的に、Ｃｕ、Ｒｅ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｉｒ、及びこれらの合金又は任意の組み合わせを、単独で、又は、Ｗ、Ｍｏ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂ、Ｐ、Ｂｉ、及びこれらの合金又は任意の組み合わせのようなプロモーターとともに含んでいてもよい。他の有効な水素化触媒材料としては、レニウムで改変された、担持されたニッケル又はルテニウムが挙げられる。一実施形態では、水素化触媒も、触媒の望ましい機能性に依存して、任意の担持体を含んでいてもよい。水素化触媒を、当業者に既知の方法によって調製してもよい。
【０３７０】
ある実施形態では、水素化触媒は、担持されたＶＩＩＩ属の金属触媒、金属スポンジ材料（例えば、スポンジニッケル触媒）を含んでいる。ラネーニッケルは、本発明で用いるのに適した、活性化されたスポンジニッケルの一例である。他の実施形態では、本発明の水素化反応は、ニッケル−レニウム触媒又はタングステンによって改変されたニッケル触媒を含む触媒を用いて行われる。本発明の水素化反応に適切な触媒の一例は、炭素に担持されたニッケル−レニウム触媒である。
【０３７１】
一実施形態では、適切なラネーニッケル触媒を、適切な等重量のニッケル及びアルミニウムの合金を、アルカリ水溶液、例えば、約２５重量％の水酸化ナトリウムを含むアルカリ水溶液で処理することによって調製し得る。アルミニウムを、アルカリ水溶液によって選択的に溶解し、ほとんどがニッケルで、少量のアルミニウムを含むスポンジ型の材料を得る。最初の合金は、生成したスポンジニッケル触媒に約１〜２重量％が残るような量で、プロモーター金属（すなわち、モリブデン又はクロム）を含んでいる。別の実施形態では、水素化触媒は、ニトロシル硝酸ルテニウム（ＩＩＩ）、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）の水溶液を用い、適切な支持材料に含浸させて調製する。次いで、この溶液を乾燥させ、含水量が約１重量％未満の固体を得る。次いで、回転式のボール型炉で、水素を流しつつ、３００℃（焼成しない）〜４００℃（焼成する）で４時間かけて、この固体を大気圧で還元してもよい。冷却し、触媒を窒素で不活性化した後、窒素中、５容積％の酸素を触媒に２時間流す。
【０３７２】
特定の実施形態では、記載されている触媒は、触媒担持体を含む。触媒担持体は、触媒を安定化し、担持する。使用される触媒担持体の種類は、選択した触媒及び反応条件に依存する。本発明に適した担持体としては、限定されないが、炭素、シリカ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、チタニア、セリア、バナジア、窒化物、窒化ホウ素、ヘテロポリ酸、ヒドロキシアパタイト、酸化亜鉛、クロミア、ゼオライト、カーボンナノチューブ、炭素フラーレン、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３７３】
本発明で用いられる触媒は、当業者に既知の従来の方法を用いて調製することができる。適切な方法としては、限定されないが、初期湿潤法、蒸発させ、含浸させる方法、化学蒸着法、洗浄−コーティング、マグネトロンスパッタリング技術などが挙げられる。
【０３７４】
水素化反応を行う際の条件は、出発物質及び望ましい生成物の種類によって変わるだろう。当業者は、本開示の利益とともに、適切な反応条件を認識しているであろう。一般的に、水素化反応は、８０℃〜２５０℃の温度で行われ、好ましくは、９０℃〜２００℃、最も好ましくは、１００℃〜１５０℃の温度で行われる。ある実施形態では、水素化反応は、５００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａの圧力で行われる。
【０３７５】
本発明の水素化分解反応で用いられる水素としては、外から加えられる水素、リサイクルした水素、系中で生成した水素、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「外から加えられる水素」は、バイオマス反応自体に由来する水素ではなく、別の供給源からシステムに加えられた水素を指す。
【０３７６】
本発明のある実施形態では、出発物質の炭水化物を、小さな分子に変換することが望ましく、この小さな分子は、望ましい高級炭化水素へと簡単に変換されるだろう。この変換の適切な方法のひとつは、水素化分解反応によるものである。炭水化物の水素化分解を行う種々のプロセスが知られている。適切な方法のひとつは、水素化分解反応槽中で、小さな分子又はポリオールを含む反応生成物を得るのに十分な条件で、水素又は適切な気体と混合した水素及び水素化分解触媒と接触させることを含む。本明細書では、用語「小さな分子又はポリオール」は、小さな分子量を有する任意の分子を含み、出発の炭水化物よりも炭素原子又は酸素原子の数が少ないものを含み得る。一実施形態では、この反応生成物は、ポリオール及びアルコールを含む小さな分子を含む。当業者は、水素化分解反応を行うのに適切な方法を選択することができるであろう。
【０３７７】
ある実施形態では、５炭糖及び／又は６炭糖又は糖アルコールを、水素化分解触媒を用い、プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロールに変換してもよい。水素化分解触媒としては、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ及びこれらの合金又は任意の組み合わせを、単独で、又は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｂｉ、Ｂ、Ｏ、及びこれらの合金又は任意の組み合わせのようなプロモーターとともに含んでいてもよい。また、水素化分解触媒は、遷移金属（例えば、クロム、モリブデン、タングステン、レニウム、マンガン、銅、カドミウム）又はＶＩＩＩ族の金属（例えば、鉄、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、オスミウム）を含む炭素系パイロポリマー触媒を含んでいてもよい。特定の実施形態では、水素化分解触媒は、上述の金属を、アルカリ土類金属酸化物と組み合わせたもの、又は、触媒活性のある担持体に接着したものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、水素化分解反応で記載されている触媒は、水素化反応について上に記載したような触媒担持体を含んでいてもよい。
【０３７８】
水素化分解反応を行う際の条件は、出発物質及び望ましい生成物の種類によって変わるだろう。当業者は、本開示の利益とともに、この反応を行うのに適切な反応条件を認識しているであろう。一般的に、水素化分解反応は、１１０℃〜３００℃の温度で行われ、好ましくは、１７０℃〜２２０℃、最も好ましくは、２００℃〜２２５℃の温度で行われる。ある実施形態では、水素化分解反応は、塩基性条件で行われ、好ましくは、ｐＨが８〜１３、さらにより好ましくは、ｐＨが１０〜１２の条件で行われる。ある実施形態では、水素化分解反応は、６０ＫＰａ〜１６５００ＫＰａの範囲の圧力で、好ましくは、１７００ＫＰａ〜１４０００ＫＰａ、さらにより好ましくは、４８００ＫＰａ〜１１０００ＫＰａの圧力で行われる。
【０３７９】
本発明の水素化分解反応で用いられる水素としては、外から加えられる水素、リサイクルした水素、系中で生成した水素、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３８０】
ある実施形態では、上述の反応生成物を、縮合反応槽中、縮合反応によって高級な炭化水素へと変換されてもよい。このような実施形態では、反応生成物の縮合は、高級な炭化水素を生成することが可能な触媒が存在する条件で行われる。理論によって限定されることを意図していないが、高級な炭化水素の生成は、炭素−炭素結合、又は炭素−酸素結合の生成を含む、段階的な付加反応によって進むと考えられる。得られた反応生成物は、以下にさらに詳細に記載されるとおり、これらの部分を含む任意の数の化合物を含んでいる。
【０３８１】
特定の実施形態では、適切な縮合触媒としては、酸触媒、塩基触媒、又は酸／塩基触媒が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「酸／塩基触媒」は、酸と塩基の両方の機能を有する触媒を指す。ある実施形態では、縮合触媒としては、限定されないが、ゼオライト、カーバイド、窒化物、ジルコニア、アルミナ、シリカ、アルミノシリケート、ホスフェート、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バナジウム、酸化ランタン、酸化イットリウム、酸化スカンジウム、酸化マグネシウム、酸化セリウム、酸化バリウム、酸化カルシウム、水酸化物、ヘテロポリ酸、無機酸、酸で改変された樹脂、塩基で改変された樹脂、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある実施形態では、縮合触媒としては、改変剤も含まれる。適切な改変剤としては、Ｌａ、Ｙ、Ｓｃ、Ｐ、Ｂ、Ｂｉ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある実施形態では、縮合触媒は、金属を含んでいてもよい。適切な金属としては、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｓｎ、Ｏｓ、合金、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０３８２】
特定の実施形態では、縮合反応で記載されている触媒は、水素化反応について上に記載した触媒担持体を含んでいてもよい。特定の実施形態では、縮合触媒は、自立型である。本明細書で使用される場合、用語「自立型」は、触媒が、担持体として機能する別の材料を必要としないことを意味する。他の実施形態では、縮合触媒を、触媒を担持するのに適した別個の担持体と組み合わせて使用する。一実施形態では、縮合触媒担持体は、シリカである。
【０３８３】
縮合反応が起こる条件は、出発物質及び望ましい生成物の種類によって変わるだろう。当業者は、本開示の利益とともに、この反応を行うのに適切な反応条件を認識しているであろう。ある実施形態では、縮合反応は、提示されている反応の熱力学が好ましくなるような温度で行われる。縮合反応の温度は、出発物質の特定のポリオール又はアルコールによって変わるだろう。ある実施形態では、縮合反応の温度は、８０℃〜５００℃の範囲であり、好ましくは、１２５℃〜４５０℃、最も好ましくは、１２５℃〜２５０℃の範囲である。ある実施形態では、縮合反応は、０Ｋｐａ〜９０００ＫＰａの範囲の圧力で行われ、好ましくは、０ＫＰａ〜７０００ＫＰａ、さらにより好ましくは、０ＫＰａ〜５０００ＫＰａの範囲の圧力で行われる。
【０３８４】
本発明で得られる高級なアルカンとしては、限定されないが、炭素原子が４〜３０個の分枝鎖又は直鎖のアルカン、炭素原子が４〜３０個の分枝鎖又は直鎖のアルケン、炭素原子が５〜３０個のシクロアルカン、炭素原子が５〜３０個のシクロアルケン、アリール、縮合アリール、アルコール、ケトンが挙げられる。適切なアルカンとしては、限定されないが、ブタン、ペンタン、ペンテン、２−メチルブタン、ヘキサン、ヘキセン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２，−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプテン、オクタン、オクテン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルヘキサン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、ノナン、ノネン、デカン、デセン、ウンデカン、ウンデセン、ドデカン、ドデセン、トリデカン、トリデセン、テトラデカン、テトラデセン、ペンタデカン、ペンタデセン、ノニルデカン、ノニルデセン、エイコサン、エイコセン、ウンエイコサン、ウンエイコセン、ドエイコサン、ドエイコセン、トリエイコサン、トリエイコセン、テトラエイコサン、テトラエイコセン、及びこれらの異性体が挙げられる。これらの生成物のいくつかは、燃料として用いるのに適し得る。
【０３８５】
ある実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは置換されていない。他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは、一置換されている。さらに他の実施形態では、シクロアルカン及びシクロアルケンは、多置換されている。置換されたシクロアルカン及びシクロアルケンを含む実施形態では、置換された基としては、限定されないが、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキル、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキレン、フェニル、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。適切なシクロアルカン及びシクロアルケンとしては、限定されないが、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、メチル−シクロペンタン、メチル−シクロペンテン、エチル−シクロペンタン、エチル−シクロペンテン、エチル−シクロヘキサン、エチル−シクロヘキセン、及びこれらの異性体、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。
【０３８６】
ある実施形態では、生成したアリールは、置換されていない。別の実施形態では、生成したアリールは、一置換されている。置換アリールを含む実施形態では、置換された基としては、限定されないが、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキル、炭素原子が１〜１２個の分枝鎖又は直鎖のアルキレン、フェニル、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。本発明に適したアリールとしては、限定されないが、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、パラキシレン、メタキシレン、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。
【０３８７】
本発明で生成したアルコールは、炭素原子を４〜３０個有している。ある実施形態では、アルコールは環状である。他の実施形態では、アルコールは、分岐している。別の実施形態では、アルコールは、直鎖である。本発明に適したアルコールとしては、限定されないが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプチルデカノール、オクチルデカノール、ノニルデカノール、エイコサノール、ウンエイコサノール、ドエイコサノール、トリエイコサノール、テトラエイコサノール、及びこれらの異性体が挙げられる。
【０３８８】
本明細書で生成するケトンは、炭素原子を４〜３０個有している。一実施形態では、ケトンは環状である。別の実施形態では、ケトンは、分岐している。別の実施形態では、ケトンは、直鎖である。本発明に適したケトンとしては、限定されないが、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ウンデカノン、ドデカノン、トリデカノン、テトラデカノン、ペンタデカノン、ヘキサデカノン、ヘプチルデカノン、オクチルデカノン、ノニルデカノン、エイコサノン、ウンエイコサノン、ドエイコサノン、トリエイコサノン、テトラエイコサノン、及びこれらの異性体が挙げられる。
【０３８９】
別のこのような化学的な改変は、インターエステル化である。天然で生成するグリセロ脂質は、脂肪酸の構成要素が均一に分布していない。油に関しては、インターエステル化は、異なるグリセロ脂質の２個のエステル間のアシル基が交換することを指す。インターエステル化のプロセスは、グリセロ脂質の混合物の脂肪酸構成要素を、分布パターンを改変するように再配置することができるという機構を与える。インターエステル化は、よく知られている化学プロセスであり、一般的には、アルカリ金属又はアルカリ金属アルキレート（例えば、ナトリウムメトキシド）のような触媒存在下、油混合物を所定時間（例えば、３０分）加熱すること（約２００℃まで）を含む。このプロセスを用い、油混合物の脂肪酸構成要素の分布パターンをランダム化することができ、又は、望ましい分布パターンを作成するようにすることができる。このような脂質の化学的な改変方法は、本明細書に与えられている材料、例えば、細胞乾燥重量の割合で、脂質として少なくとも２０％含む微生物バイオマスで行うことができる。
【０３９０】
脂肪酸の特定の分布パターンを求める、方向性を持ったインターエステル化は、油混合物を、融解が起こり得るいくつかのＴＡＧの融点よりも低い温度に維持することによって行うことができる。これにより、これらのＴＡＧが選択的に結晶化し、それらが結晶化する際に、反応混合物から効果的に除去される。このプロセスを、例えば、油中のほとんどの脂肪酸が沈殿するまで行ってもよい。方向性を持ったインターエステル化を、例えば、長鎖脂肪酸を、これよりも鎖が短い対応する脂肪酸と置き換えることによって、カロリー含有量が低い生成物を得るために使用してもよい。また、方向性を持ったインターエステル化を用い、望ましくないｔｒａｎｓ異性体を生じてしまう可能性がある水素化を行うことなく、所望の融解特性を有しており、食品添加物又は製品（例えば、マーガリン）中で求められている構造的特徴を有するような脂肪混合物を含む生成物を得ることができる。
【０３９１】
本明細書で記載されている方法によって生成する油のインターエステル化は、１つ以上の方法及び／又は材料、又は米国特許第６，０８０，８５３号（Ｎｏｎｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅ  ｆａｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）；第４，２８８，３７８号（Ｐｅａｎｕｔ  ｂｕｔｔｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）；第５，３９１，３８３号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｓｐｒａｙ  ｏｉｌ）；第６，０２２，５７７号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔｓ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，４３４，２７８号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔｓ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，２６８，１９２号（Ｌｏｗ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｎｕｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；第５，２５８，１９７号（Ｒｅｄｕｃｅ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｅｄｉｂｌｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）；第４，３３５，１５６号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ）；第７，２８８，２７８号（Ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｏｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）；第７，１１５，７６０号（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）；第６，８０８，７３７号（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆａｔｓ）；第５，８８８，９４７号（Ｅｎｇｉｎｅ  ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）；第５，６８６，１３１号（Ｅｄｉｂｌｅ  ｏｉｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ）；第４，６０３，１８８号（Ｃｕｒａｂｌｅ  ｕｒｅｔｈａｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）で報告されているとおり、生成物を生成するための１つ以上の方法及び材料と組み合わせて行うことができる。
【０３９２】
一実施形態では、本発明によれば、上に記載されているとおり、油をトランスエステル化した後に、米国第６，４６５，６４２号で報告されているとおり、ポリオールポリオールを用いてトランスエステル化した生成物の反応を行う。このようなエステル化及び分離プロセスは、石鹸存在下、低級アルキルエステルとポリオールとを反応させる工程と；生成物の混合物から、残った石鹸を除去する工程と；生成物の混合物を水で洗浄し、乾燥させ、不純物を取り除く工程と；生成物の混合物を精製のために漂白する工程と；生成物の混合物中のポリオール脂肪酸ポリエステルから、未反応の低級アルキルエステルの少なくとも一部分を分離する工程と；未反応の低級アルキルエステルを分離させたものをリサイクルする工程とを含んでいてもよい。
【０３９３】
また、トランスエステル化は、米国特許第６，２７８，００６号に報告されているとおり、短鎖脂肪酸エステルを有する微生物バイオマスを用いて行ってもよい。一般的に、トランスエステル化は、適切な触媒存在下、短鎖脂肪酸エステルを、油に加え、この混合物を加熱することによって行われてもよい。ある実施形態では、油は、反応混合物の約５重量％〜約９０重量％含まれる。ある実施形態では、短鎖脂肪酸エステルは、反応混合物の約１０重量％〜約５０重量％含まれていてもよい。触媒の非限定的な例としては、塩基触媒、ナトリウムメトキシド、硫酸及び酸性クレイのような無機酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸のような有機酸、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５のような酸性樹脂を含む酸触媒が挙げられる。ナトリウム及びマグネシウムのような金属、金属ヒドリドも有用な触媒である。
【０３９４】
別のこのような化学的な改変は、ヒドロキシル化であり、二重結合に水を付加し、飽和状態にし、ヒドロキシル部分を組み込むことを含む。ヒドロキシル化プロセスは、グリセロ脂質の１つ以上の脂肪酸構成要素をヒドロキシ脂肪酸に変換する機構を与える。ヒドロキシル化は、例えば、米国特許第５，５７６，０２７号に報告されている方法によって行うことができる。ヒマシ油及びその誘導体を含むヒドロキシル化脂肪酸は、食品添加物、界面活性剤、色素湿潤剤、消泡剤、撥水添加剤、可塑剤、香粧品用乳化剤及び／又は消臭剤、及びエレクトロニクス、医薬、塗料、インク、接着剤、滑沢剤のような、いくつかの工業用途での成分として有用である。グリセリドのヒドロキシル化をどのように行うかの一例を以下に示す。脂肪を、好ましくは、ヘプタンと組み合わせて約３０〜５０℃の温度まで加熱し、この温度に３０分以上維持してもよく；次いで、この混合物に酢酸を加えた後、硫酸水溶液を加え、次いで、過酸化水素水溶液を１時間かけて混合物に少量ずつ加えてもよく；過酸化水素水溶液を加えた後、温度を少なくとも約６０℃まで上げ、少なくとも６時間撹拌してもよく；撹拌した後、この混合物を静置し、反応によって生成した下側の水層を除去しつつ、反応によって生成した上側のヘプタン層を約６０℃の温度を有する熱水で洗浄してもよく；次いで、洗浄したヘプタン層を水酸化カリウム水溶液でｐＨが約５〜７になるまで中和し、次いで、減圧下で蒸留によって除去してもよく；次いで、反応生成物を減圧下、１００℃で乾燥させ、乾燥した生成物を、減圧条件下、蒸気で消臭し、珪藻土を用いて約５０℃〜６０℃で濾過してもよい。
【０３９５】
本明細書に記載されている微生物油のヒドロキシル化を、１つ以上の方法及び／又は材料と組み合わせて行ってもよく、米国特許第６，５９０，１１３号（Ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｉｎｋ）；第４，０４９，７２４号（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）；第６，１１３，９７１号（Ｏｌｉｖｅ  ｏｉｌ  ｂｕｔｔｅｒ）；第４，９９２，１８９号（Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ  ａｎｄ  ｌｕｂｅ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）；第５，５７６，０２７号（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ｍｉｌｋ）；第６，８６９，５９７号（Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）で報告されているとおり、生成物を生成するための１つ以上の方法及び材料と組み合わせて行ってもよい。リシノール酸のヒドロキシル化によりポリオールがもたらされる。
【０３９６】
ヒドロキシル化されたグリセロ脂質をエストライドに変換することができる。エストライドは、ヒドロキシル化された脂肪酸構成要素が、別の脂肪酸分子でエステル化されたグリセロ脂質からなる。ヒドロキシル化されたグリセロ脂質をエストライドに変換することは、Ｉｓｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＡＯＣＳ  ７１（２）：１６９−１７４（１９９４）に記載されるとおり、グリセロ脂質及び脂肪酸の混合物を加熱し、この混合物を鉱物酸と接触させることによって行うことができる。エストライドは、米国特許第７，１９６，１２４号（エラストマー材料および床仕上げ材）；第５，４５８，７９５号（高温度での用途のための濃化油）；第５，４５１，３３２号（工業用途のための液体）；第５，４２７，７０４号（燃料添加剤）；第５，３８０，８９４号（潤滑油、グリース、可塑剤、印刷インク）で報告されているものに限定されないが、種々の用途で有用である。
【０３９７】
別のこのような化学的な改変は、オレフィンメタセシスである。オレフィンメタセシスでは、触媒がアルケン（オレフィン）のアルキリデン炭素を与え、その各々が種々のアルキリジン炭素と組み合わさることによって新しいアルケンを形成する。オレフィンメタセシス反応は、エテノリシスによるアルケンでの不飽和脂肪酸アルキル鎖の切断、セルフメタセシスによるアルケン結合を介した脂肪酸の架橋、及び誘導体化アルケンとのクロスメタセシスによる脂肪酸に対する新規官能基の組み込みなどのプロセスの機構を提供する。
【０３９８】
トランスエステル化及び水素化などの他の反応と併せて、オレフィンメタセシスは不飽和グリセロ脂質を多様な最終生成物に変えることができる。このような生成物としては、ワックス用のグリセロ脂質オリゴマー；潤滑剤用の短鎖グリセロ脂質；化学品及びポリマー用のホモ及びヘテロ二官能性アルキル鎖；バイオ燃料用の短鎖エステル；及びジェット燃料用の短鎖炭化水素が挙げられる。オレフィンメタセシスはトリアシルグリセロール及び脂肪酸誘導体上で、米国特許第７，１１９，２１６号、米国特許出願公開第２０１０／０１６０５０６号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１４５０８６号に報告される触媒及び方法を用いて行うことができる。
【０３９９】
バイオ油のオレフィンメタセシスは、一般的に、Ｒｕ触媒の溶液を、他のアルケンの存在下（クロスメタセシス）又は非存在下（セルフメタセシス）において不活性条件下約１０〜２５０ｐｐｍの負荷で不飽和脂肪酸エステルに添加することを含む。反応を典型的には数時間乃至数日間進行させると、最終的にある分布のアルケン生成物が得られる。オレフィンメタセシスが脂肪酸誘導体上でどのように行われ得るかについての一例は、以下のとおりである：トルエン中の第１世代グラブス触媒（ジクロロ［２（１−メチルエトキシ−α−Ｏ）フェニル］メチレン−α−Ｃ］（トリシクロヘキシルホスフィン）の溶液が、２２２ｐｐｍの触媒負荷で、脱気及び乾燥したオレイン酸メチルが入った容器に加えられ得る。次いで容器が約６０ｐｓｉｇのエチレンガスで加圧され、約３０℃以下に３時間維持されてもよく、それにより約５０％収率のメチル９−デセノエートが生成され得る。
【０４００】
本明細書に記載される方法により生成される油のオレフィンメタセシスは、方法及び／又は材料の１つ以上と併せて、又は、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８１４２７号（α−オレフィン脂肪酸）及び米国特許出願第１２／２８１，９３８号（石油クリーム）、同第１２／２８１，９３１号（ペイントボール弾カプセル）、同第１２／６５３，７４２号（可塑剤及び潤滑剤）、同第１２／４２２，０９６号（二官能性有機化合物）、及び同第１１／７９５，０５２号（ろうそく用ワックス）に報告されるとおり、生成物を生成するため、実施することができる。
【０４０１】
微生物油で行うことが可能な他の化学反応としては、米国特許第６，０５１，５３９号で報告されているとおり、トリアシルグリセロールと、シクロプロパン化剤と反応させ、流動性及び／又は酸化安定性を高めること；米国特許第６，７７０，１０４号で報告されているとおり、トリアシルグリセロールからワックスを製造すること；「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ、７９：１、５９−６３（２００１）及びＦｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７：１、１０４−１１４（２００４）に報告されているとおり、トリアシルグリセロールをエポキシ化することが挙げられる。
【０４０２】
上述のような燃料及び化学製品のために、油を生み出す微生物バイオマスを作成すると、脱脂したバイオマス食料が生成される。脱脂した食料は、藻の油を調製したときの副産物であり、例えば、反すう動物、鳥類、ブタ、水産養殖のような農場動物用の動物の餌として有用である。得られた食料は、油含有量が減ってはいるが、高品質のタンパク質、炭水化物、繊維、灰分、残留油、及び動物の餌に適した他の栄養物はいまだ含まれている。油分離プロセスによって細胞は大部分が溶解しているため、脱脂した食料は、このような動物によって簡単に消化される。脱脂した食料を、場合により、例えば、動物の餌の中で、穀物のような他の成分と組み合わせてもよい。脱脂した食料は、均一な粉末であるため、押出機、エクスパンダー又は市販されている別の種類の機械を用いてペレットへと圧縮することができる。
【０４０３】
ヒマシ油は、トウゴマの実から単離される、天然に存在する油である。ヒマシ油を加水分解するとリシノール酸が得られる。トウゴマの実は多量のリシンを含むため、トウゴマの実からのヒマシ油の生成は難しい。リシンは極めて危険な毒であり、化学兵器禁止条約（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗｅａｐｏｎｓ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）のｓｃｈｅｄｕｌｅ  １化合物に収載されている。従ってトウゴマの実からのヒマシ油の生成においては、多大な注意を払わなければならない。微細藻類細胞から単離されるヒドロキシル化油脂が、本発明の実施形態によって提供される。このようにして、リシノール酸を生成することができる。一実施形態では、ヒドロキシル化油脂はヒドロキシル化トリグリセリドである。本発明のヒドロキシル化トリグリセリドはヒマシ油と化学的に類似したものであり得る。実施例７に示すとおり、本発明はヒドロキシル化された微生物油を提供する。実施例７の油から、ＧＣ／ＭＳにより分析するとき、本発明者らがリシノール酸（１２−ヒドロキシ−９−ｃｉｓ−オクタデセン酸）を生成したことが示された。
【０４０４】
本発明の実施形態における脂肪酸は、ヒドロキシル化脂肪酸である。ヒドロキシル化脂肪酸の一実施形態はリシノール酸である。
【０４０５】
微生物のヒドロキシル化油脂又はヒドロキシル化脂肪酸は、さらにヒドロキシル化されてもよい。リシノール酸がさらにヒドロキシル化される場合、２個のヒドロキシル基を含有する脂肪酸、ポリオールが提供される。
【０４０６】
本発明は、ポリオール（例えば、ヒドロキシル化油脂及び／又はヒドロキシル化脂肪酸）を、イソシアネート部分を含む化合物と反応させることにより調製される組成物を提供する。ヒマシ油及びイソシアネートを使用するポリウレタンが生成されている。ポリウレタンは現在の我々が使用する生成物の至る所に見られる。ポリウレタンは、自動車、玩具、運動器具、家電、靴、マットレス、クッション、接着剤、建設資材などに見られる。現在、ヒマシ油で作られたポリウレタンが、ＢＡＳＦ、伊藤製油（Ｉｔｏｈ  Ｏｉｌ）などから市販されている。ヒドロキシル化された大豆油で作られたポリウレタンは、Ｃａｒｇｉｌｌ、Ｄｏｗ、Ｂａｙｅｒなどから市販されている。
【０４０７】
ある実施形態では、微生物細胞により生成されるリシノール酸は、当該技術分野において公知の方法により、リシノール酸エステル、リシノール酸アミド、ポリウレタン、ポリウレタンフォーム、又はポリウレタン部分を含む油脂化学製品にさらに加工することができる。例えば、米国特許第６１９４４７５号、同第４２６６６１７号、同第６４０３６６４号、及び同第４０５８４９２号、及び米国特許出願公開第２０１００２２７１５１号明細書を参照のこと。
【０４０８】
本発明について上に詳細に説明し、以下の実施例で例示するが、これらは説明のために与えられたものであり、特許請求の範囲に書かれた発明を限定するために与えられているのではない。
【実施例】
【０４０９】
（ＶＩＩ．実施例）
（実施例１：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａを培養する方法）
細胞乾燥重量で高い割合の油を得るようにＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を育てた。凍結保存した細胞を室温で解凍し、細胞５００μｌを、２％グルコースを含む培地４．５ｍｌ（４．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．１ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  クエン酸一水和物、０．０２５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  酵母抽出物）に入れ、６ウェルプレートで撹拌しつつ（２００ｒｐｍ）、２８℃で７日間成長させた。細胞乾燥重量は、あらかじめ秤量しておいたエッペンドルフ管中、培養物１ｍｌを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって決定した。培養物の上澄みを棄て、得られた細胞ペレットを脱イオン水１ｍｌで洗浄した。培養物を再び遠心分離処理し、上澄みを棄て、細胞ペレットを凍結するまで−８０℃に置いた。次いで、サンプルを２４時間凍結乾燥し、細胞乾燥重量を算出した。培養物中の総脂質を決定するために、培養物３ｍｌを取り出し、Ａｎｋｏｍシステム（Ａｎｋｏｍ  Ｉｎｃ．、Ｍａｃｅｄｏｎ、ＮＹ）を用い、製造業者のプロトコルに従って分析した。サンプルを、Ａｍｋｏｍ  ＸＴ１０抽出機を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶媒抽出した。酸によって加水分解して乾燥させたサンプルと、溶媒抽出して乾燥させたサンプルとの質量差として、総脂質を決定した。細胞乾燥重量での油の割合を測定した値を表１０に示す。
【０４１０】
【表１１】
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【０４１１】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の複数の株に由来する微細藻類サンプルの遺伝子型を解析した。藻類のバイオマスからゲノムＤＮＡを以下のように単離した。液体培養物から、細胞（約２００ｍｇ）を１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。次いで、細胞を滅菌蒸留水に再び懸濁させ、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上澄みを棄てた。このバイオマスに、直径約２ｍｍの１個のガラスビーズを加え、この管を−８０℃で少なくとも１５分間置いた。サンプルを取り出し、研磨バッファー（１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０．２５Ｍ  ショ糖、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、ＲＮａｓｅ  Ａ  ０．５ｕｇ／μｌ）１５０μｌを加えた。ペレットを短時間ボルテックスすることによって再び懸濁させた後、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを加えた。サンプルを簡単にボルテックスした後、５％  ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）６６μｌを加え、最後に短時間ボルテックスした。次いで、サンプルを６５℃で１０分間インキュベートした後、１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理した。新しい管に上澄みを移し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ３００μｌで１回抽出し、次いで、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。０．７体積部のイソプロパノール（約１９０μｌ）を含む新たな管に、得られた水相を移し、ひっくり返すことによって混合し、室温で３０分間インキュベートするか、又は４℃で一晩インキュベートした。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離処理することによってＤＮＡを回収した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールで２回洗浄した後、１００％エタノールで最後に洗浄した。ペレットを室温で２０〜３０分風乾した後、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５０μｌで再び懸濁させた。
【０４１２】
上述のとおり調製した藻の全ＤＮＡ５μｌを、これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で１：５０に希釈した。最終容積が２０μｌのＰＣＲ反応を以下のとおり設定した。２×ｉＰｒｏｏｆ  ＨＦマスターミックス（ＢＩＯ−ＲＡＤ）１０μｌを、０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１３（１０ｍＭストック濃度の５’−ＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣ−３’（配列番号９））に加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置５６７〜５８８であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、これに０．４μｌのプライマーＳＺ０２６１５（１０ｍＭストック濃度の５’−ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’（配列番号１０））を加えた。このプライマー配列は、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｌ４３３５７の位置１１１２〜１０９３と相補性であり、高等植物及び藻のプラスチドゲノムにおいて高度に保存されている。次いで、希釈した全ＤＮＡ５μｌ及びｄＨ２Ｏ  ３．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応を以下のとおり行った。９８℃、４５秒；９８℃、８秒；５３℃、１２秒；７２℃、２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で１分、２５℃で保持。ＰＣＲ産物を精製するために、各反応物に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０  ２０μｌを加えた後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール  １２：１２：１  ４０μｌで抽出し、ボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心分離処理した。ＰＣＲ反応物をＳ−４００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れ、３，０００×ｇで２分間遠心分離処理した。次いで、精製したＰＣＲ産物を、ＰＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯへとＴＯＰＯクローン化し、ＬＢ／Ｓｐｅｃプレートで陽性クローンを選択した。精製したプラスミドＤＮＡについて、Ｍ１３の順プライマー及び逆プライマーを用い、両方向で配列を決定した。２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡの配列が決定された全部で１２種類のＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を選択し、これらの配列を、配列表に列挙している。株及び配列表の番号のまとめは、以下にある。ＵＴＥＸ  １４３５（配列番号１５）配列との全体的な違いについて、配列を分析した。最も違う配列として、２対があらわれた（ＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １５３３及びＵＴＥＸ  ３２９／ＵＴＥＸ  １４４０）。これら両者の場合で、ペアワイズアラインメントから、一対の配列同一性が７５．０％であった。ＵＴＥＸ  １４３５の配列同一性の割合も、以下に示している。
【０４１３】
【表１２】
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【０４１４】
上に列挙した株の部分集合から得られた脂質サンプルについて、ＨＰＬＣを用いて脂質プロフィールを分析した。結果を以下の表１１に示す。あるいは、実施例１１の手順の概要を用いて脂質プロフィールを決定した。
【０４１５】
【表１３】
2014511140.tif 000015
【０４１６】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から抽出した油（溶媒抽出によるか、又は連続圧搾機を用いる）について、カロチノイド、クロロフィル、トコフェロール、他のステロール及びトコトリエノールを分析した。結果を以下の表１２にまとめる。
【０４１７】
【表１４】
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【０４１８】
４つの別個のロットからの、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出した油を、標準的な植物油の処理方法を用いて精製し、漂白した。簡潔に言えば、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓから抽出した未精製油を水平デカンターで透明にし、ここで油から固形分を分離した。次いで透明にした油をクエン酸及び水とともにタンクに移し、約２４時間静置しておいた。２４時間後、タンク内の混合物が２つの別個の層を形成した。下層は水及びガムから構成され、次いでガムをデカンテーションにより除去してから、その脱ガム油を漂白タンクに移した。次いで油を別の一添加量のクエン酸とともに加熱した。次いで漂白クレイを漂白タンクに加え、混合物を真空下でさらに加熱することで、存在した水を全て蒸発させた。次いで混合物を葉状濾過器でポンピングすることで、漂白クレイを除去した。次いで濾過した油を最終的な５μｍ仕上げフィルターに通し、次いで、回収して、使用時まで保存した。次いで精製及び漂白した（ＲＢ）油について、カロチノイド、クロロフィル、ステロール、トコトリエノール及びトコフェロールを分析した。これらの分析の結果を以下の表１３にまとめる。「Ｎｄ」は、検出されなかったことを示し、検出感度は以下に掲載する：
検出感度
カロチノイド（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．００３ｍｃｇ／ｇ
クロロフィル（ｍｃｇ／ｇ）ｎｄ＝＜０．０３ｍｃｇ／ｇ
ステロール（％）ｎｄ＝０．２５％
トコフェロール（ｍｃｇ／ｇ）；ｎｄ＝３ｍｃｇ／ｇ
【０４１９】
【表１５】
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【０４２０】
また、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ油の同じ４つのロットについて、微量元素を分析した。結果を以下の表１４にまとめる。
【０４２１】
【表１６】
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【０４２２】
実施例２：微粒子銃によってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａを形質転換する一般的な方法
Ｓｅａｓｈｅｌｌ製の金マイクロキャリア５５０ナノメートルを製造業者のプロトコルに従って調製した。プラスミド（２０μｇ）を、結合バッファー５０μｌ及びＳ５５０ｄ金担体６０μｌ（３０ｍｇ）と混合し、氷中、１分間インキュベートした。沈殿バッファー（１００μｌ）を加え、この混合物を氷中でさらに１分間インキュベートした。ボルテックスした後、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、エッペンドルフ５４１５Ｃ微量遠心器で１０，０００ｒｐｍで１０秒間回転させることによって、ペレット状にした。この金ペレットを冷たい１００％エタノール５００μｌで１回洗浄し、微量遠心器で軽く回転させることによってペレット状にし、氷冷したエタノール５０μｌで再び懸濁させた。軽く（１〜２秒）音波処理した後、１０μｌのＤＮＡコーティングされた粒子を、すぐにキャリア膜に移した。
【０４２３】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ株を、２％グルコースを含むプロテオース培地（２ｇ／Ｌ  酵母エキス、２．９４ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１７ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．２８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４３ｍＭ  ＮａＣｌ）中、旋回シェーカー上に置いて、細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌになるまで成長させた。この細胞を収穫し、滅菌蒸留水で１回洗浄し、培地５０μｌに再び懸濁させた。非選択的なプロテオース培地プレートの中央の１／３に１×１０７細胞を広げた。この細胞を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で撃った。破裂ディスク（１３５０ｐｓｉ）を用い、上述のプレートを、スクリーン／マクロキャリアの集合体から６ｃｍ下に置く。細胞を２５℃で１２〜２４時間回復させた。回復したら、ゴム製スパチュラで細胞をプレートから掻き取り、培地１００μｌと混合し、適切に選別した抗生物質を含むプレートに広げた。２５℃でインキュベーションして７〜１０日経過後、形質転換された細胞を示すコロニーがプレート上にあるのが目視で確認された。コロニーを取り出し、２回目の選択のために選択的な（抗生物質あるいは炭素源のいずれか）寒天プレートにスポットとして乗せた。
【０４２４】
実施例３：Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるさまざまなチオエステラーゼの発現
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種において異種チオエステラーゼ遺伝子を発現させる方法及び効果については、以前、本明細書によって参照により組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号で記載されている。高等植物種に由来する他のチオエステラーゼ遺伝子／遺伝子産物の効果については、さらなる研究がなされた。それらのチオエステラーゼとしては、以下の高等植物に由来するチオエステラーゼが挙げられる：
【０４２５】
【表１７】
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【０４２６】
いずれの場合にも、上記のチオエステラーゼ構築物の各々は、微粒子銃照射を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）に形質転換した。ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号に開示されるような相同組み換えを含む他の形質転換方法もまた、目的の遺伝子の異種発現に適し得る。上記のチオエステラーゼ構築物の各々によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の形質転換は、実施例２に記載される方法を用いて実施した。構築物の各々はＮｅｏＲ遺伝子を含み、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を使用して陽性クローンの選択を行った。コード領域は全て、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５（表２を参照）核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。使用した構築物についてのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列の両方を、配列アイデンティティの表に列挙する。特記されない限り、高等植物チオエステラーゼの各々のトランジットペプチドは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号４８）又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（配列番号４９）に由来する藻類コドン最適化トランジットペプチドに置き換えた。チオエステラーゼ構築物は全て、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍａｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲによって駆動した。選択された陽性クローンの成長及び脂質生成を、野生型（非形質転換）Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）と比較した。野生型及び選択された陽性クローンを、２％グルコースＧ４１８プレートで成長させた。各構築物の選択された陽性クローンに関する脂質プロフィール分析を、以下の表１５にまとめている（面積％で表されている）。
【０４２７】
【表１８】
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【０４２８】
結果は、発現したチオエステラーゼの全てが脂肪酸プロフィールに何らかの程度影響を及ぼしたことを示している。「総飽和」の行を見ると、飽和度は、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ、及び最も顕著には、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａを含め、いくつかのチオエステラーゼの発現によって大きい影響を受けた。これらの総飽和度の変化は、高等植物に由来するチオエステラーゼの異種発現が影響を及ぼすのが一見したところ単に脂質鎖長のみでない可能性がある点で予想外であった；それはまた、微細藻類によって生じる脂質プロフィールの他の属性、すなわち脂肪酸の飽和度にも影響を及ぼし得る。
【０４２９】
Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｃ８チオエステラーゼ、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼ、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ及びＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼで形質転換した選択クローンを、さまざまな量のＧ４１８（２５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ）及びさまざまな温度（２２℃〜２５℃）でさらに成長させ、これらのクローンの脂質プロフィールを決定した。表１６は、各チオエステラーゼを含む代表的なクローンの脂質プロフィール（面積％）をまとめている。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含む第２の構築物を構築し、上述の微粒子銃法を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）に形質転換した。この第２の構築物を相同組み換えによって細胞に導入した。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種における相同組み換えの方法は、以前にＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号に記載されている。使用した相同ＤＮＡは、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の６ＳゲノムＤＮＡ配列に由来した（配列番号９２及び配列番号８４で示されるドナー配列）。選択剤は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  βチューブリンプロモーターにより駆動されるＳ．ｃｅｒｅｖｅｉｓｉａｅに由来するコドンが最適化されたｓｕｃ２遺伝子を使用した、ショ糖で成長する能力であった。天然Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａトランジットペプチドは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドに置き換えた。この構築物のｃＤＮＡは、配列表に配列番号５０として掲載する。２％ショ糖プレート上で陽性クローンの選択を実施し、脂質プロフィール決定用の得られた培養物もまた、２％ショ糖を含有する培地で成長させた。相同組み換えした異種Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むこのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株の代表的な脂質プロフィールを表１６にまとめている。
【０４３０】
【表１９】
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【０４３１】
上述のクローンと同様に、異種チオエステラーゼ遺伝子を含む全ての形質転換体が何らかの程度影響を受けた脂肪酸プロフィールを示し、野生型（非形質転換）Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓと比較したとき全飽和脂肪酸割合もまた変化した。総飽和の増加については、相同組み換えによって導入されたＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓが最大であった。
【０４３２】
さらに、外来性のＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ、Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ又はＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むトランスジェニッククローンについて、新規脂質プロフィールを評価した。Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼを含むクローンは、２％グルコース、２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、２２℃で生育させたとき、以下の脂質プロフィール：５．１０％のＣ８：０；１８．２８％のＣ１０：０；０．４１％のＣ１２：０；１．７６％のＣ１４：０；１６．３１％のＣ１６：０；１．４０％のＣ１８：０；４０．４９％のＣ１８：１；及び１３．１６％のＣ１８：２を実現した。Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼを含むクローン（外来性ショ糖インベルターゼもまた含む）は、２％ショ糖、２５℃で生育させたとき、以下の脂質プロフィール：０．０４％のＣ１０：０；６．０１％のＣ１２：０；３５．９８％のＣ１４：０；１９．４２のＣ１６：０；１．４８％のＣ１８：０；２５．４４％のＣ１８：１；及び９．３４％のＣ１８：２を実現した。Ｕ．ｃａｌｆｏｒｎｉｃａチオエステラーゼを含むクローンは、２％グルコース、２５〜１００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、２２℃で生育させたとき、以下の脂質プロフィール：０％のＣ８：０；０．１１％のＣ１０：０；３４．０１％のＣ１２：０；５．７５％のＣ１４：０；１４．０２％のＣ１６：０；１．１０％のＣ１８：０；２８．９３％のＣ１８：１；及び１３．０１％のＣ１８：２を実現した。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼを含むクローンは、２％グルコース、２８℃で生育させたとき、以下の脂質プロフィール：１．５４％のＣ１０：０；０．４３％のＣ１２：０；７．５６％のＣ１４：０；３９．４５％のＣ１６：０；２．４９％のＣ１８：０；３８．４９％のＣ１８：１；及び７．８８％のＣ１８：２を実現した。
【０４３３】
高等植物に由来するさらなるチオエステラーゼもまたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。そのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、上記に特定する配列表に列挙される。これらのさらなるチオエステラーゼには、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓに由来する広い特異性のチオエステラーゼ（Ｃ１４：０〜Ｃ１８：０）、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａに由来するＣ１６：０選択的チオエステラーゼ、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａに由来するＣ１６：０選択的チオエステラーゼ、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓに由来するＣ１６：０選択的チオエステラーゼ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓに由来するＣ１８：０選択的チオエステラーゼ、及びＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するＣ１８：１選択的チオエステラーゼが含まれる。発現構築物の詳細及び上記のトランス遺伝子／形質転換の各々から得られたトランスジェニッククローンについては、以下に記載している。
【０４３４】
Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓに由来する広い特異性のチオエステラーゼ（Ｃ１４：０〜Ｃ１８：０）のチオエステラーゼを、上述の方法を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。２つの異なる発現構築物を試験し、各々が異なるプラスチド標的配列を含んだ。いずれの構築物においても、選択可能なマーカーとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅショ糖インベルターゼ遺伝子ｓｕｃ２を利用し、陽性形質転換体に、ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで成長する能力を付与した。両方の発現構築物ｐＳＺ１３１８及びｐＳＺ１３１７が、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは、配列番号１５９として列挙される。ｐＳＺ１３１８は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にある、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２  ＦＡＤ（配列番号４８）に由来するトランジットペプチドによって天然のトランジットペプチドが置き換えられたＭ．ｆｒａｇｒａｎｓチオエステラーゼコード領域を含んだ。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２  ＦＡＤに由来するトランジットペプチドを含む、コドンが最適化されたＭ．ｆｒａｇｒａｎｓチオエステラーゼは、配列番号１４５として列挙される。ｐＳＺ１３１７は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にある、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（配列番号４９）に由来するトランジットペプチドによって天然のトランジットペプチドが置き換えられたＭ．ｆｒａｇｒａｎｓコード領域を含んだ。Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼに由来するトランジットペプチドを含む、コドンが最適化されたＭ．ｆｒａｇｒａｎｓチオエステラーゼは、配列番号１５８として列挙される。両方の発現構築物ｐＳＺ１３１８及びｐＳＺ１３１７をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞に形質転換し、選択は、ショ糖が唯一の炭素源であるプレート上で行った。各形質転換から陽性クローンを選択し、ショ糖を唯一の炭素源とする培地において脂質生成のため窒素制限条件下で成長させた。上述の直接的なトランスエステル化法を用いて、選択された陽性クローンの一部の脂質プロフィールを決定した。表１７にまとめている。
【０４３５】
【表２０】
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【０４３６】
Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓチオエステラーゼトランス遺伝子を含む陽性クローンは、脂質プロフィールの変化を示した。しかしながら、上記にまとめた結果からは、予想外の結果が示された；高等植物では、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓチオエステラーゼはＣ１６：０脂肪酸アシル−ＡＣＰに対して有意な活性を示すが（Ｖｏｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞では、Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓチオエステラーゼの影響はＣ１４：０＞Ｃ１８：０＞Ｃ１６：０に対して段階的であるように見え、Ｃ１６：０だけではなく、より広範囲にわたる。
【０４３７】
Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａに由来するＣ１６：０選択的チオエステラーゼを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。そのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、上記に特定する配列表に列挙される。発現構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｇ．ｍａｎｏｇｓｔａｎａコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。また、Ｇ．ｍａｎｏｇｓｔａｎａ天然トランジットペプチドが、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルデサチュラーゼ（配列番号４９）に由来するトランジットペプチドによって置き換えられた。その置き換えられたトランジットペプチドを含むチオエステラーゼのｃＤＮＡ配列は、配列番号１４７として列挙される。Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ発現カセットの全体をｐＳＺ１４５２と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂質プロフィールを以下の表１８にまとめている。
【０４３８】
【表２１】
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【０４３９】
結果は、Ｇ．ｍａｎｇｏｓｔａｎａチオエステラーゼトランス遺伝子を含む形質転換体が、Ｃ１６：０脂肪酸濃度に大きい影響を及ぼし、それより程度は少ないが、Ｃ１４：０及びＣ１８：０脂肪酸濃度にも影響を及ぼし、野生型と比較してＣ１８：１脂肪酸濃度の激減を伴ったことを示している。
【０４４０】
Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａに由来するＣ１６：０選択的チオエステラーゼを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。２つの発現構築物を作成し、ｐＳＺ１４１７と命名される１つは、天然Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１６選択的チオエステラーゼトランジットペプチド配列を含み、ｐＳＺ１４６２と命名される２つ目は、その天然トランジットペプチド配列を、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（配列番号４９）に由来するトランジットペプチドに置き換えた。天然トランジットペプチドを含むＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼのコード配列は、配列番号１４９として列挙され、置き換えられたトランジットペプチドを含むＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼのコード配列は、配列番号１６０として列挙される。両方の発現構築物とも、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。いずれの構築物においても、Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。両方の構築物をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換し、ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂質プロフィールを以下の表１９にまとめている。
【０４４１】
【表２２】
2014511140.tif 000024
【０４４２】
結果は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１６：０選択的チオエステラーゼ構築物のいずれを含む形質転換体も、Ｃ１６：０脂肪酸濃度に大きい影響を及ぼし、それより程度は少ないがＣ１４：０脂肪酸濃度にも影響を及ぼし、野生型と比較してＣ１８：１脂肪酸濃度の激減を伴ったことを示している。２つの構築物におけるトランジットペプチドの違いが、ｐＳＺ１４１７形質転換体と比較したｐＳＺ１４６２形質転換体におけるＣ１６：０脂肪酸濃度の増加を説明し得る。
【０４４３】
Ｅ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びＥ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼＰＡＴＥとそれぞれ命名されるＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＤ４２２２２０．２（配列番号１５２）及びＡＢＤ８３９３９（配列番号１６２）のアミノ酸配列に対応する、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓ（アフリカアブラヤシ）に由来する２つのＣ１６：０選択的チオエステラーゼを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、上記に特定する配列表に列挙される。２つのチオエステラーゼは互いに高度なアミノ酸同一性を有し（９４％超）、しかしながらアフリカアブラヤシ植物におけるそれぞれの役割は未だ明らかではない。Ｅ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする構築物をｐＳＺ１４３７と命名し、Ｅ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼＰＡＴＥをコードする構築物をｐＳＺ１４３６と命名した。両方の発現構築物とも、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。いずれの構築物においても、Ｅ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓチオエステラーゼコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。両方の構築物ともＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換し、ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂質プロフィールを以下の表２０にまとめている。
【０４４４】
【表２３】
2014511140.tif 000025
【０４４５】
ｐＳＺ１４３７によりコードされるＥ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓ  Ｃ１６：０選択的チオエステラーゼはＣ１６：０脂肪酸濃度に対して大きい影響を有し、それより程度は少ないがＣ１４：０脂肪酸濃度にも影響を有し、野生型と比較したときＣ１８：１脂肪酸濃度が激減した。意外にも、ｐＳＺ１４３６によりコードされるこのＥ．ｇｕｉｎｉｅｎｓｉｓ  Ｃ１６：０選択的チオエステラーゼＰＡＴＥは、ｐＳＺ１４３６によりコードされるチオエステラーゼとの高度なアミノ酸同一性にもかかわらず、Ｃ１６：０又はＣ１４：０脂肪酸濃度に関して比較的活性が低かった。
【０４４６】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓに由来するＣ１８：０選択的チオエステラーゼを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。そのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、上記に特定する配列表に列挙される。発現構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは、配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｂ．ｎａｐｕｓコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ発現カセットの全体をｐＳＺ１３５８と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂質プロフィールを以下の表２１にまとめている。
【０４４７】
【表２４】
2014511140.tif 000026
【０４４８】
結果は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｃ１８：０選択的チオエステラーゼトランス遺伝子を含む形質転換体が、Ｃ１８：０脂肪酸濃度に大きい影響を及ぼし、それより程度は少ないがＣ１６：０脂肪酸濃度にも影響を及ぼし、野生型と比較してＣ１８：１脂肪酸濃度の激減を伴ったことを示している。
【０４４９】
Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。そのコドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、上記に特定する配列表に列挙される。発現構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。また、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ天然トランジットペプチドを、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルデサチュラーゼ（配列番号４９）に由来するトランジットペプチドによって置き換えた。その置き換えられたトランジットペプチドを含むチオエステラーゼのｃＤＮＡ配列は、配列番号１５５として列挙される。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ発現カセットの全体をｐＳＺ１３７５と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂質プロフィールを以下の表２２にまとめている。
【０４５０】
【表２５】
2014511140.tif 000027
【０４５１】
結果は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓチオエステラーゼトランス遺伝子を含む形質転換体がＣ１６：０脂肪酸のレベルに影響を及ぼし、それより程度は少ないがＣ１８：０脂肪酸濃度にも影響を及ぼしたことを示している。また、同時に、野生型レベルと比較したときのＣ１８：１脂肪酸濃度の増加も起きた。
【０４５２】
実施例４：複数の外来性異種チオエステラーゼ遺伝子によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの形質転換
微細藻類株Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を、上記に開示する方法を用いて、単一のクローンで複数のチオエステラーゼを発現するように形質転換した。単一のクローンで複数のチオエステラーゼが発現することにより、微細藻類は、任意の単一のチオエステラーゼが単独で発現するときに産生されるものと全く異なる脂肪酸プロフィールを有する油を生成することが可能となる（前述の実施例で示したとおり）。最初に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するショ糖インベルターゼ遺伝子ｓｕｃ２とともに（選択は、ショ糖で成長する能力であった）、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ（Ｃ１４選択的チオエステラーゼ）により相同組み換えを用いて形質転換した。この相同組み換え構築物に使用したＤＮＡは、上記の第ＩＩＩ章に記載されるとおりの、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡのＫＥ８５８領域に由来する。この構築物の関連する一部は、配列表に配列番号５１として列挙される。ショ糖含有プレートで陽性クローンをスクリーニングした。次いで、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性並びにさらなるチオエステラーゼ：（１）Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａに由来するチオエステラーゼ遺伝子（Ｃ８〜１０選択的）、配列番号５２；（２）Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａに由来するチオエステラーゼ遺伝子（Ｃ１２選択的）、配列番号５３；又はＵｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａに由来するチオエステラーゼ（広い；Ｃ１０〜Ｃ１６選択的）、配列番号５４を各々がコードする３つのカセットのうちの１つで陽性クローンを再び形質転換した。配列表には、各構築物の関連する部分の配列が含まれる。双方のチオエステラーゼ遺伝子を発現するクローンを、５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むショ糖含有培地でスクリーニングした。陽性クローンを選択して成長させ、脂質プロフィールを評価した。表２３は、代表的な陽性クローンの脂質プロフィール（面積％で表されている）をまとめている。
【０４５３】
【表２６】
2014511140.tif 000028
【０４５４】
さらに、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼとＵ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａチオエステラーゼとを有する二重チオエステラーゼクローンを、２２℃の５０ｍｇ／Ｌ  Ｇ４１８を含む２％ショ糖含有培地で成長させた。このような成長条件下でこの株から得られた脂肪酸プロフィールは、Ｃ８：０（０）；Ｃ１０：０（０．１０）；Ｃ１２：０（３１．０３）；Ｃ１４：０（７．４７）；Ｃ１６：０（１５．２０）；Ｃ１８：０（０．９０）；Ｃ１８：１（３０．６０）；Ｃ１８：２（１２．４４）；及びＣ１８：３α（１．３８）で、総飽和が５４．７であった。
【０４５５】
Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｓｅ）を含有する２つの相同組み換え構築物を有する二重チオエステラーゼクローン（一方は６Ｓ領域を標的とし、他方はＫＥ８５８領域を標的とする）を作製した。陽性の代表的なクローンは、０％  Ｃ８：０；０．０６％  Ｃ１０：０；５．９１％  Ｃ１２：０；４３．２７％  Ｃ１４：０；１９．６３％  Ｃ１６：０；０．８７％  Ｃ１８：０；１３．９６％  Ｃ１８：１；及び１３．７８％  Ｃ１８：２、総飽和が６９．７４％の脂肪酸プロフィールを有した。このクローンは、４９％を超えるＣ１２〜Ｃ１４濃度を有した。これは、野生型細胞のＣ１２〜Ｃ１４濃度の３７倍超である。
【０４５６】
上記のデータは、複数のチオエステラーゼが微細藻類において首尾よく共発現し得ることを示している。複数のチオエステラーゼが共発現することにより、野生型株と大きく異なるばかりでなく、個々のチオエステラーゼのいずれか一つの発現によって得られる脂肪酸プロフィールとも大きく異なる、改変された脂肪酸プロフィールがもたらされる。鎖長特異性が重複する複数のチオエステラーゼの発現により、それらの特異的脂肪酸の累積的増加がもたらされ得る。
【０４５７】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける異種チオエステラーゼの（単独での、あるいは組み合わせでの）発現は、宿主株における脂肪酸／脂質プロフィールを変化させるのみならず、現在さまざまな種子作物から利用可能な油（表５）と比較したとき、こうしたプロフィールは、現在利用可能な他のシステムには見出すことのできない真に独特の油のプロフィールである。トランスジェニック株は、非形質転換野生型株と大きな差異を示すのみならず、表５に示される市販の油のいずれとも顕著に異なるプロフィールを有する。例として、ココナツ油及びパーム核油のいずれも、５．５〜１７％の範囲のＣ８〜Ｃ１０脂肪酸濃度を有する。Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｃ８選択的チオエステラーゼ又はＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１０選択的チオエステラーゼを発現するトランスジェニック株は、それぞれ３．６６〜８．６５％の範囲を蓄積する。これらのＣ８〜Ｃ１０脂肪酸濃度はココナツ油及びパーム核油と同程度であるが、しかしながら、トランスジェニック藻類株は著しく高いＣ１２：０脂肪酸を欠いており、且つ極度に高いＣ１６：０（ココナツ油又はパーム核油におけるそれぞれ１１〜１６％と比べて、トランスジェニックでは２３％）及び／又は１８：１を有する（ココナツ油又はパーム核油におけるそれぞれ８〜１９％と比べて、トランスジェニックでは５０〜５７％）。
【０４５８】
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼの発現によるＵＴＥＸ１４３５株におけるラウリン酸塩及びミリスチン酸塩を豊富に含む油の生成：Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉの種子は、２５％超のＣ１０：０脂肪酸及び６５％超のＣ１２：０脂肪酸を含有する油を蓄積することが示されている。２つのＦａｔＢチオエステラーゼ、ＣｗＦａｔＢ１（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ５６１０３）及びＣｗＦａｔＢ２（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｕ５６１０４）が、Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉからクローン化されており（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４（４）：６６９−７９（１９９７）で記載されるとおり）、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａで発現されている（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３（５）：６２１−８（１９９８）で記載されるとおり）。ＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２を発現するＡ．ｔｈａｌｉａｎａトランスジェニック系の脂肪酸プロフィールは、最大１６％〜２５％のＣ１２：０脂肪酸種の増加を示す（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９８、前出）。ここで本発明者らは、ＵＴＥＸ１４３５株においてＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼのＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２を発現させることによりラウリン酸塩及びミリスチン酸塩を豊富に含む油を生成する能力を実証する。ここに記載する例では、ＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２を発現するトランスジェニック株を、先述の形質転換方法を用いて生成した。
【０４５９】
ＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２のアミノ酸配列を以下に示し、予測される葉緑体標的配列には下線を引いている。これらの一次アミノ酸配列を使用して、形質転換構築物に対応する遺伝子を合成した。２つの遺伝子のヌクレオチド配列は、先述のとおりその好ましいコドン使用を利用するＵＴＥＸ  １４３５株における発現に最適化した。
【化２】
2014511140.tif 000029
【化３】
2014511140.tif 000030
【０４６０】
Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼによるＵＴＥＸ１４３５の形質転換：この例では、ＵＴＥＸ  １４３５株をレシピエント株として使用し、そこに、Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ１及びＦａｔＢ２チオエステラーゼを発現するカセットを導入した。これらの形質転換構築物は、ショ糖での選択を可能にするカセット（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子）をチオエステラーゼとともに含む。細胞を、先述のとおり微粒子銃を使用して形質転換した。細胞は、２％ショ糖を含有する培地に直接形質転換した。チオエステラーゼの発現がＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  Ｂ−チューブリンプロモーター又は内在するＵＴＥＸ  １４３５  Ａｍｔ３プロモーターのいずれかによって駆動されるような形質転換構築物を作製した。
【０４６１】
別種のチオエステラーゼカセットを作製し、ここでは天然の高等植物トランジットペプチドを藻類トランジットペプチドに置き換えた。これらの構築物に使用したトランジットペプチドは、以下のとおり命名した：ＴＰ１は、ＵＴＥＸ２５０に由来するステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ用のトランジットペプチドをコードする；ＴＰ２は、ＵＴＥＸ  １４３５に由来するステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ用のトランジットペプチドをコードする；ＴＰ３は、ＵＴＥＸ  １４３５に由来するデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのトランジットペプチドをコードする；及びＴＰ４は、ＵＴＥＸ  １４３５に由来するイソペンテニルジホスフェートシンターゼのトランジットペプチドをコードする。この例で使用した構築物は、以下の表２４に列挙される。
【０４６２】
【表２７】
2014511140.tif 000031
【０４６３】
ｓｕｃ２及びＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ１チオエステラーゼを発現する形質転換ＤＮＡ（構築物１）：構築物１と命名される形質転換構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＣｗＦａｔＢ１＿ｎｒ−６Ｓの配列を以下に示す。関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＳａｐＩ、ＫｐｎＩ、ＡｓｃＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＡｓｃＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ及びＳａｐＩである。ＳａｐＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。構築物の５’及び３’フランクの下線の配列は、相同組み換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にするＵＴＥＸ１４３５由来のゲノムＤＮＡを表す（６Ｓ領域）。５’から３’方向に進んで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子（ショ糖加水分解活性をコードし、それによりショ糖上での株の成長を可能にする）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  Ｂ−チューブリンプロモーターを、小文字の囲い文字テキストで示す。ｓｕｃ２のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の太字テキストにより示し、その後にスペーサー領域が続く。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＴＥ（ＣｗＦａｔＢ１）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  Ｂ−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。チオエステラーゼ（ＣｗＦａｔＢ１）のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックテキストで示し、一方、残りのコード領域を小文字のイタリックで示す。チオエステラーゼの予想されるプラスチド標的配列が、配列中、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃＩ部位との間にある。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを太字テキストにより示す。
構築物１：
【化４】
2014511140.tif 000032
【化５】
2014511140.tif 000033
【化６】
2014511140.tif 000034
【０４６４】
ｓｕｃ２及びＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼを発現する形質転換ＤＮＡ（構築物２）：小文字で太字且つ下線で示されるＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位を利用して、構築物１のＣｗＦａｔＢ１遺伝子をコドン最適化ＣｗＦａｔＢ２遺伝子に置き換えることにより、構築物２と命名される形質転換構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＣｗＦａｔＢ２＿ｎｒ−６Ｓを作成した。チオエステラーゼ（ＣｗＦａｔＢ２）のイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックテキストで示し、一方、残りのコード領域を小文字のイタリックで示す。チオエステラーゼの予想されるプラスチド標的配列が、配列中、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃＩ部位との間にある。
構築物２（一部）：
【化７】
2014511140.tif 000035
【０４６５】
ｓｕｃ２及びａｍｔ３プロモーターにより駆動されるＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ１及びＦａｔＢ２チオエステラーゼを発現する形質転換ＤＮＡ（構築物３及び４）：構築物１及び構築物２のチオエステラーゼを駆動するＣｒｂＴｕｂプロモーターを、以下に小文字で太字且つ下線で示されるＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限酵素フラグメントとしてのＵＴＥＸ１４３５に由来するＡｍｔ３プロモーターに置き換えることにより、構築物３と命名される形質転換構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：Ａｍｔ３＿ＣｗＦａｔＢ１＿ｎｒ−６Ｓ、及び構築物４と命名される６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：Ａｍｔ３＿ＣｗＦａｔＢ２＿ｎｒ−６Ｓを作成した。Ａｍｔ３プロモーター領域を、小文字の囲い文字のテキストにより示す。
構築物３及び構築物４（一部）：
【化８】
2014511140.tif 000036
【０４６６】
藻類トランジットペプチドの制御下においてＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ１チオエステラーゼを発現する形質転換ＤＮＡ：構築物１のＣｗＦａｔＢ１の天然トランジットペプチドを、以下で、小文字、太字且つ下線で示されるＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素フラグメントとして示される、対応する藻類トランジットペプチドに置き換えることにより、構築物５と命名される形質転換構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ１−ＣｗＦａｔＢ１＿ｎｒ−６Ｓ；構築物６と命名される構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ２−ＣｗＦａｔＢ１＿ｎｒ−６Ｓ；構築物７と命名される構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ３−ＣｗＦａｔＢ１＿ｎｒ−６Ｓ、及び構築物８と命名される構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ４−ＣｗＦａｔＢ１＿ｎｒ−６Ｓを作成した。得られた藻類トランジットペプチド配列は、以下の配列中、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃＩ部位との間にある。
構築物５〜１２（一部）：
【化９】
2014511140.tif 000037
【０４６７】
藻類トランジットペプチドの制御下においてＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦａｔＢ２チオエステラーゼを発現する形質転換ＤＮＡ：構築物２のＣｗＦａｔＢ２の天然トランジットペプチドを、上記で、小文字、太字且つ下線で示されるＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素フラグメントとして示される、対応する藻類トランジットペプチドに置き換えることにより、構築物９と命名される形質転換構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ１−ＣｗＦａｔＢ２＿ｎｒ−６Ｓ；構築物１０と命名される構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ２−ＣｗＦａｔＢ２＿ｎｒ−６Ｓ；構築物１１と命名される構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ３−ＣｗＦａｔＢ２＿ｎｒ−６Ｓ、及び構築物１２と命名される構築物６Ｓ−ＣｒｂＴｕｂ＿ｓｕｃ２＿ｎｒ：：ＣｒｂＴｕｂ＿ＴＰ４−ＣｗＦａｔＢ２＿ｎｒ−６Ｓを作成した。藻類トランジットペプチド配列は、上記の配列中、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃＩ部位との間にある。
【０４６８】
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼを発現する株から得られる脂肪酸プロフィール：上述の構築物によって形質転換した株を、先述のような油の生成を可能にする条件下で成長させた。野生型ＵＴＥＸ  １４３５をグルコースで成長させた一方、ＵＴＥＸ  １４３５の形質転換により作成した全てのトランスジェニック系をショ糖で成長させた。試験した各構築物について、４つの形質転換体の脂肪酸プロフィールに対する影響を分析した。トランスジェニック株の脂肪酸プロフィールは、以下の表２５〜表２８に示される。
【０４６９】
ＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２を発現するＡ．ｔｈａｌｉａｎａのトランスジェニック系（表２５）は、Ｃ１４：０及びＣ１２：０脂肪酸の蓄積とともに、Ｃ１６：０脂肪酸の蓄積に対して大きい影響を示す（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９８、前出より）。
【０４７０】
表２６から分かるとおり、天然の高等植物トランジットペプチドを含むＣｗＦａｔＢ１を発現するトランスジェニックＵＴＥＸ  １４３５系統（構築物１及び構築物３）は、主にＣ１４：０脂肪酸の蓄積に対する影響、及びそれより程度は少ないがＣ１２：０脂肪酸の蓄積に対する影響を示した。天然の高等植物トランジットペプチドを含むＣｗＦａｔＢ２を発現するトランスジェニックＵＴＥＸ１４３５系統（構築物２及び構築物４）は、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積に対して大きい影響を示し、Ｃ１２：０に対する影響がＣ１４：０に対する影響より高かった。２つのプロモーターＣｒｂＴｕｂ（構築物１及び構築物２）とＡｍｔ３（構築物３及び構築物４）との間の比較から、Ａｍｔ３プロモーターにより駆動されるとき、ＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２を発現するトランスジェニック系がＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸に対して著しく高い影響を示すことが実証される。
【０４７１】
ＣｗＦａｔＢ１チオエステラーゼの発現が４つの異なる藻類葉緑体標的配列により駆動される場合のトランスジェニック系（構築物５、６、７、及び８）の分析は、藻類トランジットペプチドが、いずれも、天然の高等植物トランジットペプチドと比べてより効率的にチオエステラーゼをプラスチドに標的化させることを示している（構築物５〜８、表２７におけるＣ１２：０及びＣ１４：０濃度を、構築物１、表２６のものと比較のこと）。これらのトランスジェニック系をさらに分析すると、４つの藻類トランジットペプチドのうち、ＴＰ２（ＵＴＥＸ１４３５ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ葉緑体標的配列）及びＴＰ３（ＵＴＥＸ  １４３５デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ葉緑体標的配列）はＣ１２：０及びＣ１４：０の蓄積に対してより大きい影響を示すことが明らかとなる。これらの２つのトランジットペプチド（ＴＰ１及びＴＰ２）は、ＵＴＥＸ  １４３５においてＣｗＦａｔＢ１をプラスチドに標的化させるためにより優れているように思われる。
【０４７２】
ＣｗＦａｔＢ２チオエステラーゼの発現が４つの異なる藻類葉緑体標的配列（構築物９、１０、１１、及び１２）により駆動される場合のトランスジェニック系の分析から、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸に対するより大きい影響で分かるとおり（構築物９を構築物２と比較のこと）、これらの藻類トランジットペプチドのうち１つのみ、すなわちＴＰ−１のみが天然の高等植物トランジットペプチドより優れた効果をもたらすことが分かる。
【０４７３】
ＵＴＥＸ  １４３５で発現したときのこれらのＣ．ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼの影響は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓで発現したときの影響と大きく異なる。ＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２を発現するＡ．ｔｈａｌｉａｎａのトランスジェニック系（表２５）は、Ｃ１４：０及びＣ１２：０脂肪酸の蓄積とともに、Ｃ１６：０脂肪酸の蓄積に対する大きい影響を示す。しかしながら、ＵＴＥＸ  １４３５で発現したＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２が示すＣ１６：０脂肪酸に対する影響の程度は異なる。ＣｗＦａｔＢ１を発現する全てのＵＴＥＸ  １４３５トランスジェニック系及びＣｗＦａｔＢ２を発現する一部（構築物１０、１１、１２）におけるＣ１２：Ｃ１４比は、このチオエステラーゼを発現するＡ．ｔｈａｌｉａｎａトランスジェニック系と同様である（表２９）。しかしながら、ＵＴＥＸ  １４３５トランスジェニック系は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａトランスジェニック系と比べて著しく低いＣ１４：Ｃ１６比を示す（表２９）。構築物２、４、９で作成されたＵＴＥＸ  １４３５トランスジェニック系におけるＣ１２：Ｃ１４比及びＣ１４：Ｃ１６比は、同じチオエステラーゼを発現するＡ．ｔｈａｌｉａｎａトランスジェニック系と大きく異なる（表２９）。従って、ＵＴＥＸ  １４３５でのＣｗＦａｔＢ１及びＣｗＦａｔＢ２の発現は、同じチオエステラーゼを発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのトランスジェニック系でもたらされた油プロフィールと大きく異なる油プロフィールをもたらした。これらのＵＴＥＸ  １４３５トランスジェニック系における油プロフィールはまた、野生型ＵＴＥＸ  １４３５におけるものとも明確に異なる。
【０４７４】
最後に、この実施例で記載されるトランスジェニック系により生成される改変油はまた、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａに由来するＣ１２：０特異的チオエステラーゼを発現するトランスジェニックＵＴＥＸ  １４３５系統（先述される）で作成されるラウリン酸塩を豊富に含む油とも大きく異なる。
【０４７５】
まとめると、これらのデータは、ことを示している：（１）ＵＴＥＸ  １４３５におけるＣｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉチオエステラーゼの発現が脂肪酸プロフィールに対して大きい影響を有し、固有の油を生じさせる；（２）ＵＴＥＸ  １４３５株におけるＣｗＦａｔＢ１チオエステラーゼの発現が、ミリスチン酸塩が豊富な油の産生をもたらす；（３）ＵＴＥＸ  １４３５におけるＣｗＦａｔＢ２チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｓｅ）の発現が、ラウリン酸塩及びミリスチン酸塩の両方が豊富な油の産生をもたらす；及び（４）藻類におけるＣｗＦａｔＢ１及びＦａｔＢ２の発現が、生成される中鎖脂肪酸の絶対濃度の点でも、及びその互いの相対比の点でも、モデル高等植物系統で生じるプロフィールとは全く異なるプロフィールを生じる。
【０４７６】
【表２８】
2014511140.tif 000038
【０４７７】
【表２９】
2014511140.tif 000039
【０４７８】
【表３０】
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【０４７９】
【表３１】
2014511140.tif 000041
【０４８０】
【表３２】
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【０４８１】
実施例５：内在する窒素依存性Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａプロモーターの同定
Ａ．内在する窒素依存性プロモーターの同定及び特徴付け
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）から、標準的な技術を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞を、窒素が枯渇した条件下で４８時間成長させた。次いで、５％の播種物質（ｖ／ｖ）を低窒素環境に移し、細胞を２４時間ごとに７日間採集した。培養して約２４時間後、培地への窒素の供給を完全に絶った。集めたサンプルを、ドライアイス及びイソプロパノールですぐに凍結させた。次いで、凍結した細胞ペレットサンプルから全ＲＮＡを単離し、各サンプルの一部をＲＴ−ＰＣＲ試験のために残しておいた。サンプルから採集した全ＲＮＡの残りに、ｐｏｌｙＡ選択を行った。それぞれの条件から、等モル量のｐｏｌｙＡで選択したＲＮＡを保存しておき、ベクターｐｃＤＮＡ３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを作成するために使用した。このようにして得られた保存しておいたｃＤＮＡライブラリーから、ほぼ１２００種類のクローンを無作為に取り出し、両方の鎖について塩基配列を決定した。これらの１２００個の配列の中から、ほぼ６８種類の異なるｃＤＮＡを選択し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試験で使用するためのｃＤＮＡ特異的なプライマーを設計するのに使用した。
【０４８２】
保存容器に入れておいた細胞ペレットサンプルから単離したＲＮＡを、上述のとおり作成したｃＤＮＡ特異的なプライマーセットを用い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ試験で基質として使用した。この保存しておいたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、６８個の遺伝子特異的なプライマーセットそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲの基質として使用した。閾値サイクル数、つまりＣＴ数を用い、６８種のｃＤＮＡそれぞれについて、時間経過にともなって集めたそれぞれのＲＮＡサンプル内の相対的な転写産物量を示した。窒素が豊富にある状態と、窒素が枯渇している状態との間で、顕著な増加を示す（３倍以上）ｃＤＮＡを、窒素の枯渇によって発現を上方調節する有望な遺伝子としてフラグ付けした。本明細書で記載しているとおり、窒素の枯渇／制限は、油産生微生物が脂質産生する際の既知の誘発因子である。
【０４８３】
窒素の枯渇／制限の間、発現が上方調節されるような、ｃＤＮＡから得た推定プロモーター／５’ＵＴＲ配列を同定するために、窒素が枯渇した状態で成長させたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）から全ＤＮＡを単離し、次いで、４５４  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、塩基配列を決定した。上のＲＴ−ＰＣＲ結果によって、上方調節されるとフラグ化されたｃＤＮＡを、４５４  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓから生じる、アセンブリしたコンティグに対し、ＢＬＡＳＴを用いて比較した。ｃＤＮＡの５’末端を特定のコンティグに対してマッピングし、可能な場合、５’フランキングＤＮＡの５００ｂｐを超える部分を使用し、プロモーター／ＵＴＲを推定した。次いで、プロモーター／５’ＵＴＲの存在を確認し、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を用いてクローン化した。個々のｃＤＮＡ  ５’末端を用い、３’プライマーを設計し、４５４コンティグアセンブリの５’末端を使用し、５’遺伝子特異的なプライマーを設計した。
【０４８４】
第１のスクリーニングとして、推定プロモーターの１つである、Ａａｔ２（アンモニウムトランスポーター、配列番号６３）から単離した５’ＵＴＲ／プロモーターを、Ｃ．ｓｏｒｏｋｉｎａｎａグルタミン酸脱水素酵素プロモーターの代わりに、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを用い、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４チオエステラーゼ構築物内でクローン化した。この構築物を、配列番号８１として列挙している。この推定プロモーターを試験するために、チオエステラーゼ構築物をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞内で形質転換し、上述の方法を用い、低／無窒素状態でＣ１４／Ｃ１２脂肪酸の増加についてスクリーニングすることによって、実際のプロモーター活性を確かめた。ｃＤＮＡ／ゲノムスクリーニングから単離した推定窒素制御プロモーターを、同じ方法を用いて同様に試験することができる。
【０４８５】
ｃＤＮＡ／ゲノムスクリーニングから単離した他の推定窒素制御プロモーター／５’ＵＴＲは、以下のものであった。
【０４８６】
【表３３】
2014511140.tif 000043
【０４８７】
何倍増加したかは、低窒素培地で２４時間培養した後の、ｃＤＮＡ産出量が何倍増えたかを指す。
【０４８８】
これらの推定プロモーター／５’ＵＴＲの潜在的な調節能力についてさらに洞察を得るため、配列のうち８つをさらなる試験用に選択した：（１）ＦａｔＢ／Ａ；（２）ＳｕｌｆＲｅｄ亜硫酸還元酵素；（３）ＳｕｇＴ糖トランスポーター；（４）Ａｍｔ０２−アンモニウムトランスポーター０２；（５）Ａａｔ０１−アミノ酸トランスポーター０１；（６）Ａａｔ０３−アミノ酸トランスポーター０３；（７）Ａａｔ０４−アミノ酸トランスポーター０４；及び（８）Ａａｔ０５−アミノ酸トランスポーター０５。さまざまな時間点でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞から単離したＲＮＡに対し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングリードを利用する高分解能トランスクリプトーム解析を行った：Ｔ０（種）；種からの播種後２０時間；３２時間；４８時間；６２時間；及び１１４時間。Ｔ０（種）における培地は窒素が枯渇しており、一方、２０時間経った時点又はそれ以降は、培地はほとんど乃至全く窒素を含まなかった。次いで、時間点の各々から単離されたＲＮＡから生じるアセンブリした転写物コンティグを、８つの先に特定した転写物の各々を用いて独立してＢＬＡＳＴにかけた。結果を以下の表３０にまとめる。
【０４８９】
【表３４】
2014511140.tif 000044
【０４９０】
上にまとめた結果から、転写物のいくつかは時間の経過に伴う蓄積の増加を示し、しかしながら興味深いことに、亜硫酸塩還元酵素ｍＲＮＡは、時間の経過に伴いｍＲＮＡ蓄積の明らかな減少を示す。
【０４９１】
天然トランジットペプチドが取り去られてＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＵＴＥＸ  ２５０）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼに由来するトランジットペプチドに置き換えられた、Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼコード領域の上流に、８つの推定プロモーター／５’ＵＴＲ領域をクローン化した。各推定プロモーター／５’ＵＴＲ領域構築物を、６Ｓゲノム配列のＤＮＡを使用した相同組み換えによってＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５に導入した。また、構築物内には、ショ糖含有培地／プレート上での陽性クローンの選択用のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子も含まれた。Ａａｔ０１についての構築物の関連する部分のｃＤＮＡ配列は、配列表に配列番号６７として列挙される。他の構築物についても同じ骨格を使用し、変化する要素は推定プロモーター／５’ＵＴＲ配列のみであった。さらなる対照トランスジェニック株を作成し、ここではＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを使用してＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ遺伝子の発現を駆動した。このプロモーターは、目的の遺伝子の構成的発現を駆動し、従って試験されるさまざまな推定Ｎ調節プロモーター／５’ＵＴＲにより駆動されるとき、同じチオエステラーゼメッセージの発現を比べて計測するのに有用な対照を提供することが分かっている。
【０４９２】
トランスジェニッククローンを作成した後、３つの別個の実験を実施した。最初の２つの実験は、ＲＴ−ＰＣＲによる安定成長状態のチオエステラーゼｍＲＮＡレベル、脂肪酸プロフィール及び培養上澄み中のアンモニア濃度を計測することにより、８つ全ての推定プロモーターの潜在的な窒素調節可能性を評価する。クローンは最初、窒素を豊富に含む種培地（１ｇ／Ｌ硝酸アンモニウム−１５ｍＭ窒素（アンモニアとして）、４ｇ／Ｌ酵母エキス）で振とうしながら（２００ｒｐｍ）２８℃で２４〜４８時間成長させ、その時点で２０ＯＤ単位（Ａ７５０）を使用して５０ｍｌの低窒素培地（０．２ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム−３ｍＭ窒素（アンモニアとして）、０．２ｇ／Ｌ酵母エキス）に播種した。細胞のサンプルを２４時間毎に６日間にわたり採取し、サンプルはまた、低窒素条件への切り換え直前にも収集した。次いで、各サンプルからの細胞の一部を用いて、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用した全ＲＮＡ抽出を（製造業者の示す方法に従い）行った。アンモニアアッセイから、低窒素培地において２４時間後に上澄み中のアンモニア濃度が検出限界（約１００μＭ）未満に降下したことが明らかとなった。
【０４９３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲについては、全てのＲＮＡレベルを、各時間点についてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）で発現させた内部対照ＲＮＡのレベルに対して正規化した。ｃｄ１８９と命名される内部対照ＲＮＡは、Ｎ−アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするＡＲＧ９遺伝子の産物である。これらの実験でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマーセットは、以下であった：
【０４９４】
【表３５】
2014511140.tif 000045
【０４９５】
各時間点からの形質転換体の各々の脂質プロフィールもまた作成し、ＲＴ−ＰＣＲ結果と比較した。アンモニアレベル、ＲＴ−ＰＣＲ結果及びＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸濃度の変化に基づくと、アミノ酸トランスポーター０１（Ａａｔ−０１）配列、アミノ酸トランスポーター０４（Ａａｔ−０４）配列、及びアンモニウムトランスポーター０２（Ａｍｔ−０２）配列が機能的な窒素調節性プロモーター／５’ＵＴＲを確かに含むと結論付けられた。
【０４９６】
このＲＴ−ＰＣＲ結果から、Ａａｔ−０１は、対照（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  βチューブリンプロモーター）より最大で４倍高い安定成長状態のＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼｍＲＮＡレベルを駆動する能力を示した。また、ｍＲＮＡレベルは窒素制限及びＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸濃度の著しい増加とも相関を有した。これらの結果から、Ａａｔ−０１プロモーターに関連する５’ＵＴＲが、脂質生合成下でのタンパク質合成の駆動において対照のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉプロモーターより高効率である可能性が高いことが示される。Ａａｔ−０１プロモーターと同様に、Ａａｔ−０４プロモーターは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ対照プロモーターより最大５倍高いｍＲＮＡ蓄積を駆動することができた。しかしながら、Ａａｔ−０４プロモーター構築物によって生じたＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸濃度に影響を及ぼす能力は、中程度に過ぎなかった。これらのデータは、Ａａｔ−０４プロモーターは窒素の枯渇により明らかに調節可能であるが、プロモーターに関連するＵＴＲは、翻訳エンハンサーとしては不十分にしか機能しない可能性が高いことを示している。最後に、Ａｍｔ−０２プロモーターは、対照プロモーターより最大３倍高いｍＲＮＡ蓄積を駆動することができた点で、Ａａｔ−０１プロモーターと同様であった。ｍＲＮＡレベルもまた窒素制限及びＣ１２〜Ｃ１４脂肪酸濃度の著しい増加と相関を有した。まとめると、これらのプロモーターの３つ全てが、窒素により調節されることが示された。
【０４９７】
Ｂ．アンモニウムトランスポーター３（ａｍｔ０３）プロモーターのさらなる特徴付け及びさまざまなチオエステラーゼの発現
上述のような、アンモニウムトランスポーター０２及び０３（ａｍｔ０２及びａｍｔ０３）と命名される部分ｃＤＮＡを同定した。これらの２つの部分ｃＤＮＡとともに、アンモニウムトランスポーター０１（ａｍｔ０１）と命名される第３の部分ｃＤＮＡもまた同定した。部分ｃＤＮＡと推定上の翻訳されたアミノ酸配列とのアラインメントを比較した。結果は、ａｍｔ０１が３つの配列のなかでより遠い関係にあり、一方でａｍｔ０２とａｍｔ０３とは単一のアミノ酸が異なるに過ぎないことを示している。
【０４９８】
最初はインシリコで、Ｒｏｃｈｅ  ４５４ゲノムＤＮＡアセンブリ及び上述のようなＩｌｌｕｍｉｎａトランスクリプトームアセンブリに対して部分ｃＤＮＡ配列をＢＬＡＳＴにかけることにより、プロモーター／５’ＵＴＲを作成した。ａｍｔ０１、ａｍｔ０２、及びａｍｔ０３をコードするｃＤＮＡと同一性を示す転写物コンティグが同定されたが、しかしながらこの転写物コンティグは３つ全てによって共有される配列を含んだため、コンティグについて３つのｍＲＮＡの間を区別することはできなかった。Ｒｏｃｈｅ  ４５４ゲノムＤＮＡアセンブリはａｍｔ０２及びａｍｔ０３  ｃＤＮＡ配列にヒットを与え、Ｎ末端タンパク質配列を含んでいた。ＰＣＲを実施して５’フランキング領域をクローン化した。クローンａｍｔ０２及びａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲの検証に使用したＰＣＲプライマーは以下のものであった：
Ａｍｔ０３順方向：５’−ＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＧＣＧＣＧＴＣＡ−３’（配列番号８５）
Ａｍｔ０３逆方向：５’−ＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号８６）
Ａｍｔ０２順方向：５’−ＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＧ−３’（配列番号８７）
Ａｍｔ０２逆方向：５’−ＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号８８）
いずれの場合にも、５’及び３’プライマーは、これらのプロモーター／５’ＵＴＲ領域の機能性を検証するための発現ベクターへの予想されるクローニングに有用な制限部位を含んだ。
【０４９９】
この組み合わされたインシリコ及びＰＣＲベースの方法によりクローン化されたＤＮＡと、ａｍｔ０２（配列番号６１）及びａｍｔ０３（配列番号６０）をコードする元のｃＤＮＡとの間のペアワイズアラインメントを実施した。これらのアラインメントの結果から、元のｃＤＮＡとクローン化したゲノム配列との間の著しい差異が示され、アンモニウムトランスポーターが多様な遺伝子ファミリーを表す可能性が高いことが示された。さらに、ａｍｔ０３についての組み合わされた方法に基づくプロモーター／５’ＵＴＲクローンは元のａｍｔ０３配列と異なったが、一方、ａｍｔ０２配列は同じであった。Ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ配列（配列番号８９）を特徴付けるさらなる実験を行い、以下に記載した。
【０５００】
この推定プロモーター／ＵＴＲ配列をクローン化して４つの異なるチオエステラーゼの発現を駆動することにより、上記で同定されたａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ配列（配列番号８９）を試験した。発現カセットは、ゲノムの６Ｓ遺伝子座の上流及び下流の相同組み換え配列を含んだ（それぞれ配列番号８２及び８４）。カセットはまた、ショ糖含有培地での陽性クローンの選択を可能にするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２ショ糖インベルターゼｃＤＮＡも含んだ。ショ糖インベルターゼの発現は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  βチューブリンプロモーターにより駆動され、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲも同様に含んだ。次いで、ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ配列がショ糖インベルターゼカセットの下流にクローン化され、後に、４つのチオエステラーゼ遺伝子：（１）Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａに由来するＣ１４チオエステラーゼ；（２）Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のＣ１２チオエステラーゼ；（３）Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ由来のＣ１０〜Ｃ１６チオエステラーゼ；又は（４）Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａに由来するＣ１０チオエステラーゼのうちの１つに由来するインフレームのチオエステラーゼｃＤＮＡ配列が続き、またＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲが含まれた。Ｃ１４  Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼ、Ｃ１２  Ｕ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａチオエステラーゼ、及びＣ１０〜Ｃ１６  Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａは全て、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼに由来するトランジットペプチドを含んだ。Ｃ１０  Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａチオエステラーゼはＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）に由来するトランジットペプチドを含んだ。いずれの場合にも、配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現に対してコドンを最適化した。前述のチオエステラーゼ構築物に対する配列は、配列表に記載される：
【０５０１】
【表３６】
2014511140.tif 000046
【０５０２】
上記の実施例２に記載したとおりの微粒子銃による形質転換方法によって、野生型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞にトランスジェニック系を作成し、ショ糖を含有するプレート／培地上で選択を行った。次いで、その脂肪酸プロフィールが変化した程度について、陽性の系統をスクリーニングした。次いで、上述の４つの構築物の各々による形質転換から得られたものである４つの系統を、さらなる分析に供した。系統７６はＣ．ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４チオエステラーゼを発現し、系統３７はＵ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｃ１２チオエステラーゼを発現し、系統６０はＵ．ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｃ１０〜Ｃ１６チオエステラーゼを発現し、及び系統５６はＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１０チオエステラーゼを発現した。各系統を、ショ糖を唯一の炭素源として含む培地において４８時間成長させ、１４時間、２４時間、３６時間及び４８時間（種培養）で細胞のサンプルを取り出して、脂肪酸メチルエステルに直接トランスエステル化し、続いてＧＣ−ＦＩＤ（上述）によって分析することにより脂肪酸プロフィールを決定し、全ＲＮＡを単離した。４８時間の終了時、これらの細胞を用いて、ｐＨ５．０（クエン酸緩衝化、０．０５Ｍの最終濃度）又はｐＨ７．０（ＨＥＰＥＳ緩衝化、０．１Ｍの最終濃度）のいずれかに維持し、ゼロか、又は低い窒素濃度で（ショ糖を唯一の炭素源として含む）、培養物を播種した。培養物サンプルを１２時間、２４時間、７２時間及び１０８時間（脂質生成）で取り出して、脂肪酸プロフィールを決定し、全ＲＮＡを単離した。これらの培養物のアンモニアアッセイから、低窒素培地で２４時間後、アンモニア濃度が検出限界（約１００μＭ）未満に降下したことが明らかとなった。
【０５０３】
上記で収集した時間点の各々からの全ＲＮＡに対して、チオエステラーゼのｍＲＮＡレベルに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施し、全てのｍＲＮＡレベルを内部対照ＲＮＡ（ｃｄ１８９）のレベルに対して正規化した。リアルタイムＰＣＲで使用したプライマーセットは、以下の表３１に示される：
【０５０４】
【表３７】
2014511140.tif 000047
【０５０５】
種培養期の時間点の各々における脂肪酸プロフィールからの結果は、チオエステラーゼからの影響がほとんどないことを示した。脂質生成期が始まると、脂肪酸プロフィールは大きい影響を受け、その増加は、ｐＨ５．０で維持した培養物と比較して、ｐＨ７．０で維持した培養物についてはるかに劇的であった。ｐＨ７．０とｐＨ５．０との間の標的脂肪酸蓄積の差の程度は、試験したチオエステラーゼ毎に異なったが、全体的な効果は同じであった：ｐＨ５．０で成長させた細胞は、大幅に低いレベルの、しかし対照の野生型細胞と比べると多い標的脂肪酸の蓄積を示した。
【０５０６】
これらの同じサンプルから単離したＲＮＡの分析は、脂肪酸プロフィールデータと極めて良好に相関し、すなわちチオエステラーゼの各々について安定成長状態のｍＲＮＡレベルに対する培養ｐＨの明らかな影響があった。脂肪酸蓄積データとｍＲＮＡデータとを合わせて考えると、ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲにより駆動されるチオエステラーゼ遺伝子発現のｐＨ調節は、転写、ｍＲＮＡ安定性又はその双方のいずれかのレベルで明らかに媒介された。さらに、安定成長状態レベルのＵ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｍＲＮＡは、安定成長状態レベルのＣ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  ｍＲＮＡと比較したとき４対数低かったことが認められた。この観察は、個々のｍＲＮＡ配列が発現の制御において役割を果たし得るという仮説と一致している。これらのデータは、トランスポーターのａｍｔ０３ファミリーによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおけるアンモニウムの取り込みがｐＨと直接結び付けられることを意味している。
【０５０７】
Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｃ１０〜Ｃ１６チオエステラーゼの発現を駆動する構築物ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞の形質転換から作成した１２個の系統に対し、さらなる脂肪酸プロフィール分析を実施した。上述の系統６０は、以下の分析の一部であった。以下の表３２は、野生型対照とともに分析した１２個の系統のうちの３個の脂質プロフィールを示す。
【０５０８】
【表３８】
2014511140.tif 000048
【０５０９】
上記の表に示されるとおり、総飽和の濃度は野生型の濃度に対して劇的に増加し、系統４０の場合には野生型と比較して２．６倍超であった（分析した１２個の系統の総飽和は約６３％〜８６％超の範囲であった）。さらに、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼは、これらの濃度で発現したとき、不飽和物、特にＣ１８：１及びＣ１８：２（系統４０及び４４を参照）の濃度を劇的に低下させ、ここで系統４４では、Ｃ１８：１濃度が野生型と比較して８倍超低下している。また、Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼ（ａｍｔ０３プロモーターにより駆動される）は中鎖脂肪酸の濃度を大幅に増加させた。系統４４は、野生型株に見られる濃度の約４２倍高い５６％超のＣ１０：０〜Ｃ１４：０濃度を示し、及び５７％超のＣ８：０〜Ｃ１４：０濃度を示す。Ｕ．ａｍｅｒｉｃａｎａチオエステラーゼの発現を駆動するＡｍｔ０３プロモーターの構築物で形質転換したさらなる株は、以下の代表的な脂質プロフィールを有した：０．２３％  Ｃ８：０；９．６４％  Ｃ１０：０；２．６２％  Ｃ１２：０；３１．５２％  Ｃ１４：０；３７．６３％  Ｃ１６：０；５．３４％  Ｃ１８：０；７．０５％  Ｃ１８：１；及び５．０３％  Ｃ１８：２、総飽和率８６．９８％。
【０５１０】
Ｃ．ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ  Ｃ１０チオエステラーゼ（配列番号９４）の発現を駆動する構築物ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ（配列番号８９）によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞の形質転換から生じたさらなる脂質プロフィール。この構築物を発現する陽性クローンを選択し、ｐＨ７．０条件で成長させた。陽性クローンの代表的な脂質プロフィールは以下であった：９．８７％  Ｃ８：０；２３．９７％  Ｃ１０：０；０．４６％  Ｃ１２：０；１．２４％  Ｃ１４：０；１０．２４％  Ｃ１６：０；２．４５％  Ｃ１８：０；４２．８１％  Ｃ１８：１；及び７．３２％  Ｃ１８：２。このクローンは３３．８４のＣ８〜Ｃ１０率を有した。
【０５１１】
まとめると、データから、ａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲ、及びそれと同様の他のプロモーターを緊密に調節されるプロモーターとして使用できることが示唆され、特に潜在的に毒性の化合物を発現させるのに有用であり得るとともに、遺伝子発現の厳密な実施が要求される。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは幅広い（少なくともｐＨ５．０〜７．０の）ｐＨレジーム下で成長可能なことから、この有機体はａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲなどの調節エレメントと組み合わせることで特に有用となる。さらに、上記の脂質プロフィールデータは、遺伝子発現を駆動するａｍｔ０３プロモーター／ＵＴＲの印象的な能力を示している。
【０５１２】
実施例６：微細藻類Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける飽和脂肪酸濃度の改変
Ａ．遺伝子ノックアウトアプローチによるステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ発現の低下
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）からのゲノムＤＮＡのｃＤＮＡ、Ｉｌｌｕｍｉａトランスクリプトーム及びＲｏｃｈｅ  ４５４シーケンシング（ｓｑｕｅｎｃｉｎｇ）に基づくバイオインフォマティクスベースのアプローチを使用したゲノムスクリーンの一部として、脂肪酸不飽和化に関わる２つの特定の遺伝子群：ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２  ＦＡＤ）を同定した。ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ酵素は脂質合成経路の一部であり、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する働きをし、例えばＣ１８：０脂肪酸からＣ１８：１脂肪酸を合成する。デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼもまた脂質合成経路の一部であり、既に不飽和の脂肪酸に二重結合を導入する働きをし、例えばＣ１８：１脂肪酸からＣ１８：２脂肪酸を合成する。バイオインフォマティクスを試みるなかで同定された２つの脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子クラスに基づくプローブを使用したサザンブロット分析から、デサチュラーゼ遺伝子クラスの各々は複数のファミリーメンバーで構成されている可能性があることが示された。さらにステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする遺伝子は、２つの別個のファミリーに分けられた。これらの結果に基づき、デサチュラーゼ酵素の各ファミリー内でより高度に保存されたコード領域を標的とすることにより、潜在的に複数の遺伝子ファミリーメンバーを破壊するように、３つの遺伝子破壊構築物を設計した。
【０５１３】
３つの相同組み換え標的構築物は、以下を使用して設計した：（１）デルタ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ｄ１２ＦＡＤ）ファミリーメンバーのコード配列の高度に保存された部分、及び（２）ＳＡＤの２つの別個のファミリーの各々（各々が各ファミリーに由来するコード配列の保存領域を含む）を標的とする２つの構築物。この戦略によれば、相同組み換えによって標的遺伝子のフランキング領域を標的とし得る古典的な遺伝子置換戦略ではなく、選択可能なマーカー遺伝子（ショ糖の加水分解能力を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｕｃ２ショ糖インベルターゼカセット）が、これらの高度に保存されたコード領域（複数のファミリーメンバーを標的とする）に組み込まれ得る。
【０５１４】
上述の方法を用いて全ての構築物を微粒子銃形質転換により細胞に導入し、構築物は細胞に撃ち込む前に線状化した。ショ糖含有プレート／培地で形質転換体を選択し、上述の方法を用いて脂質プロフィールの変化を評価した。３つの標的構築物の各々の関連する配列を以下に列挙する。
【０５１５】
【表３９】
2014511140.tif 000049
【０５１６】
構築物の各々を含む形質転換からの代表的な陽性クローンを取り出し、それらのクローンの脂質プロフィールを決定して（面積％で表されている）、以下の表３３にまとめた。
【０５１７】
【表４０】
2014511140.tif 000050
【０５１８】
構築物の各々が望ましい脂肪酸クラスに対して計測可能な影響を有し、且つ３つ全ての場合においてＣ１８：０濃度が、特に２つのＳＡＤノックアウトで、著しく上昇した。ＳＡＤノックアウトからの複数のクローンのさらなる比較から、ＳＡＤ２Ｂノックアウト系統が、ＳＡＤ２Ａノックアウト系統で観察されるＣ１８：１脂肪酸濃度と比べて、Ｃ１８：１脂肪酸の大幅な減少を有したことが示された。
【０５１９】
さらなるΔ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）ノックアウトを、上述の方法を用いてＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景に作成した。Δ１２ＦＡＤの潜在的な相同性を同定するため、以下のプライマーを使用することにより推定ＦＡＤをコードするゲノム領域を増幅した：
【０５２０】
【表４１】
2014511140.tif 000051
【０５２１】
上記のプライマーを使用してＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡのゲノム増幅から得られた配列は、高度な類似性を有したが、ＰｒｏｔｏｔｈｅｃａのΔ１２ＦＡＤに複数の遺伝子又は対立遺伝子が存在することが示された。
【０５２２】
この結果に基づき、１つ以上のΔ１２ＦＡＤ遺伝子を不活性化するための２つの遺伝子破壊構築物を設計した。この戦略によれば、古典的な遺伝子置換戦略を用いるのではなく、高度に保存されたコード領域にショ糖インベルターゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するｓｕｃ２）カセットを組み込み、それにより選択可能なマーカーとしてショ糖を加水分解する能力を付与し得る。ｐＳＺ１１２４と命名される第１の構築物は、５’及び３’ゲノム標的配列と、それに隣接するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを含んだ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２カセット）。ｐＳＺ１１２５と命名される第２の構築物は、５’及び３’ゲノム標的配列と、それに隣接するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを含んだ。構築物の関連する配列を配列表に列挙する：
【０５２３】
【表４２】
2014511140.tif 000052
【０５２４】
ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５を、それぞれＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景に導入し、ショ糖を加水分解する能力に基づき陽性クローンを選択した。表３４は、ｐＳＺ１１２４及びｐＳＺ１１２５標的ベクターが利用された２つのトランスジェニック系で得られた脂質プロフィール（面積％、上述の方法を用いて生成した）をまとめている。
【０５２５】
【表４３】
2014511140.tif 000053
【０５２６】
ＦＡＤ２Ｂ（ｐＳＺ１１２４）構築物を含むトランスジェニックは、極めて興味深い予想外の脂質プロフィール結果をもたらし、すなわち低下が予想され得たＣ１８：２濃度が約１面積％しか低下しなかった。しかしながら、Ｃ１８：１脂肪酸濃度は、ほぼ、大幅に低下したＣ１６：０濃度のみを代償にして、大幅に増加した。ＦＡＤ２Ｃ（ｐＳＺ１１２５）構築物を含むトランスジェニックもまた、脂質プロフィールの変化をもたらした：Ｃ１８：２の濃度は、Ｃ１８：１濃度の対応する増加を伴い大幅に低下する。
【０５２７】
牛脂模倣物
上述のとおり上記のＳＡＤ２Ｂノックアウト実験から作成した１つの陽性クローンを、Ｃ１４選択的脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をさらに導入するための背景として用いるため選択した。Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４選択的チオエステラーゼを導入する構築物は、６Ｓゲノム領域に対する標的配列（相同組み換えによる形質転換ＤＮＡの標的化した組み込みを可能にする）を含み、及びこの発現構築物は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを伴うｎｅｏＲ遺伝子の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを含み、その後に、第２のＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを伴うＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイルＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むコドンが最適化されたＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼの発現を駆動する第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（ｐｒｏｍｔｅｒ）が続いた。５’  ６Ｓゲノムドナー配列は配列番号８２に列挙され；３’  ６Ｓゲノムドナー配列は配列番号８４に列挙され；及びＣ．ｃａｍｐｈｏｒａチオエステラーゼに関連する発現構築物は配列番号８３に列挙される。
【０５２８】
上述のとおり微粒子銃法を用いて形質転換を行い、２％ショ糖を含有するプレート上で細胞を２４時間回復させた。この時間の後、細胞を再び懸濁させ、選択のため２％ショ糖及び５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレートに再び播種した。脂質生成及び脂質プロフィール用に、生成された陽性クローンのうち９個のクローンを選択した。９個のトランスジェニッククローン（ＳＡＤ２ＢがＫＯされている、及びＣ．ｃａｍｐｈｏｒａ  Ｃ１４選択的チオエステラーゼを発現する）を上述のとおり培養し、脂質プロフィールについて分析した。結果を以下の表３５にまとめる。以下の表３５には獣脂についての脂質プロフィールも含まれる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  １９７６：Ｆａｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）。
【０５２９】
【表４４】
2014511140.tif 000054
【０５３０】
表３５で分かるとおり、トランスジェニック系の脂質プロフィールは獣脂の脂質プロフィールと非常によく似ている。まとめて考えると、このデータは、獣脂の脂質プロフィールと同様の油を生成するトランスジェニック藻類株を生じさせるために、特定のトランスジェニック背景、この場合ＳＡＤ２ＢノックアウトをＣ１４選択的チオエステラーゼ（Ｃ．ｃａｍｐｈｏｒａに由来する）と組み合わせることの有用性を示している。
【０５３１】
Ｂ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ細胞においてデルタ１２デサチュラーゼ遺伝子（ＦＡＤｃ）を下方調節するためのＲＮＡｉアプローチ
ＲＮＡｉによってＦＡＤｃ（デルタ１２デサチュラーゼ遺伝子）遺伝子発現を下方調節するベクターを、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５の遺伝的背景に導入した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子を選択可能なマーカーとして利用し、ショ糖を唯一の炭素源として成長する能力を陽性クローンに付与した。第１のタイプの構築物は、ＦＡＤｃコード領域の第１エクソンがシスでその第１のイントロンに連結し、それに逆方向の第１エクソンの反復単位が続く部分を利用した。このタイプの構築物は、理論的には、ｍＲＮＡとして発現するときヘアピンＲＮＡの形成をもたらす。この第１のタイプの構築物を２つ作成し、１つはｐＳＺ１４６８と称される、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号８９）により駆動されるものであり、及び第２の構築物は、ｐＳＺ  １４６９と称される、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（ｐｒｏｍｔｅｒ）（配列番号１１４）により駆動されるものであった。第２のタイプの構築物は、ｐＳＺ１４７０と称されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター（配列番号８９）により駆動されるか、或いはｐＳＺ  １４７１と称されるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター（ｐｒｏｍｔｅｒ）（配列番号１１４）により駆動されるアンチセンス方向の大型のＦＡＤｃエクソン２を利用した。４つの構築物は全て、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼカセット（配列番号１５９）と、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）とを有した。各ＲＮＡｉ構築物のＦＡＤｃ部分の配列は、各構築物の関連する部分とともに、以下のとおり配列表に列挙される：
【０５３２】
【表４５】
2014511140.tif 000055
【０５３３】
４つの構築物の各々をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの背景に形質転換し、ショ糖の唯一の炭素源とするプレートを使用して陽性クローンをスクリーニングした。各形質転換から陽性クローンを取り出し、ｐＳＺ１４６８、ｐＳＺ１４６９、ｐＳＺ１４７０及びｐＳＺ１４７１に含まれるヘアピン及びアンチセンスカセットの脂肪酸プロフィールに対する影響を決定する一部を選択した。各形質転換から選択されたクローンを脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。形質転換の各々からの代表的な脂質プロフィールを、以下の表３６にまとめる。野生型１及び２細胞は、陰性対照として形質転換体の各々とともに実行した非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞であった。
【０５３４】
【表４６】
2014511140.tif 000056
【０５３５】
上記にまとめた結果から、ヘアピン構築物ｐＳＺ１４６８及びｐＳＺ１４６９が特定の予想された表現型、すなわちそれぞれ野生型１及び野生型２と比較したときＣ１８：２脂肪酸濃度の低下及びＣ１８：１脂肪酸濃度の上昇を示したことが示された。アンチセンス構築物ｐＳＺ１４７０及びｐＳＺ１４７１は、Ｃ１８：２脂肪酸濃度の低下をもたらさなかったが、代わりにそれぞれ野生型１及び野生型２と比較したときの僅かな増加、及びＣ１６：０脂肪酸濃度の僅かな低下を示した。
【０５３６】
Ｃ．外来性ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現
Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ６７８４０．１）を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５の遺伝的背景に導入した。この発現構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、天然トランジットペプチドがＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号４９）によって置き換えられた。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（置き換えられたトランジットペプチドを含む）は、配列表にそれぞれ配列番号１７１及び配列番号１７２として列挙される。Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａ  ＳＡＤ発現カセットの全体をｐＳＺ１３７７と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、上述のような直接的なトランスエステル化方法を用いて脂質プロフィールを決定した。選択されたクローンの脂質プロフィールを以下の表３７にまとめている。
【０５３７】
【表４７】
2014511140.tif 000057
【０５３８】
上記にまとめた結果は、異種デサチュラーゼ、この場合Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａに由来するステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの導入が、より高濃度のＣ１８：１脂肪酸及びそれに伴うＣ１８：０及びＣ１６：０脂肪酸濃度の低下をもたらし得ることを示している。
【０５３９】
実施例７：ヒドロキシル化脂肪酸を生成するためのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの操作
Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ（Ｒｃ１２ｈｙｄｒｏ）（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ４９０１０．１）を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ１４３５の遺伝的背景に導入した。この発現構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。コドンが最適化されたｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列表にそれぞれ配列番号１７３及び配列番号１７４として列挙される。Ｒｃ１２ｈｙｄｒｏ発現カセットの全体をｐＳＺ１４１９と命名し、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの遺伝的背景に形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源とするプレートで陽性クローンをスクリーニングした。陽性クローンの一部を選択し、脂質生成条件下で成長させ、Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼの生成物、すなわちリシノール酸についてＧＣ／ＭＳ方法を用いてスクリーニングした。
【０５４０】
陽性Ｒｃ１２ｈｙｄｒｏトランスジェニックで生成された任意のリシノール酸を検出するために用いられるＧＣ／ＭＳ方法は、以下のとおりであった。陽性クローンのサンプル及び野生型対照を乾燥させ、次いで、メタノール−トルエン１０：１（ｖ／ｖ）中４．５Ｈ２ＳＯ４、２．２ｍＬで懸濁させた。次いで断続的な音波処理及びボルテックスを伴いながら混合物を７０〜７５℃で３．５時間加熱した。室温に冷却した後、２ｍＬの６％Ｋ２ＣＯ３（ａｑ）及び２ｍＬのヘプタンを添加し、次いで、混合物を激しくボルテックスし、９００ｒｐｍで２分間遠心分離処理することにより層の分離物を回収した。上側の層を取り出し、窒素流で濃縮乾固した。得られた油に５００μＬの乾燥ピリジン及び５００μＬのＢＳＴＦＡ／１％ＴＭＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。得られた溶液を７０〜７５℃で１．５時間加熱し、次いで、窒素流で濃縮乾固した。次いで、残渣を２ｍＬのヘプタンに再び懸濁させ、再び濃縮した。サンプルを２ｍＬのヘプタンで再び懸濁させ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ  ＧＣ  Ｕｌｔｒａ／ＤＳＱＩＩシステムにおいてＥＩモードで、リシノール酸メチルのいずれかＴＭＳの基準ピーク（ｍ／ｚ１８７）の選択的イオンモニタリングを使用して、ＧＣ／ＭＳにより分析した。Ｒｅｓｔｅｋ  Ｒｘｉ−５Ｓｉｌ  ＭＳカラム（０．２５ｍｍＩＤ、３０ｍ長さ、０．５μｍ膜厚）において、ヘリウムをキャリアーガスとして１ｍＬ／分の流量で使用して、脂肪酸メチルエステルを分離した。カラムの初期温度は１３０℃に４分間保ち、続いて２４０℃の最終温度まで４℃／分で上昇させた。上述のとおり処理したリシノール酸の標準サンプルと保持時間及びフルスキャン質量スペクトルを比較することにより、サンプル中のリシノール酸の存在を確認した。図２は、リシノール酸標準及び野生型対照と比較した代表的な陽性トランスジェニッククローンのＧＣ保持時間を示す。陽性トランスジェニッククローンはＲＴ：３３．２２／３３．２３に導き出せる（ｄｅｒｉｖａｂｌｅ）ピークを有し、それはリシノール酸標準における同様のピークに対応したことから、トランスジェニッククローン及び陽性対照の双方に導き出せるリシノール酸の存在が示された。野生型対照サンプルにこのピークは全くなかった。
【０５４１】
実施例８：代替的な選択可能マーカーによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの操作
Ａ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける分泌可能なα−ガラクトシダーゼの発現
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ種において異種ショ糖インベルターゼ遺伝子を発現する方法及び効果は、以前、本明細書によって参照により組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６６１４２号で記載されている。本実施例では、他の異種多糖分解酵素の発現について調べた。α−ガラクトシダーゼをコードする以下の外来遺伝子のうちの一つを含むＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５によりメリビオース（α−Ｄ−ｇａｌ−ｇｌｕ）で成長する能力を試験した：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓに由来するＭＥＬ１遺伝子（ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ０４８２４に対応するアミノ酸配列）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するＡｇｌＣ遺伝子（ＮＣＢＩ寄託番号Ｑ９ＵＵＺ４に対応するアミノ酸配列）、及び高等植物Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｂｏｂｏｌａ（グアー豆）に由来するα−ガラクトシダーゼ（ＮＣＢＩ寄託番号Ｐ１４７４９に対応するアミノ酸配列）。上記の寄託番号及び対応するアミノ酸配列は、本明細書により参照によって組み込まれる。いずれの場合にも、遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける好ましいコドン使用により最適化した。発現カセットの関連する部分は、配列表番号とともに以下に列挙される。全ての発現カセットは、安定なゲノム組み込みのための５’及び３’Ｃｌｐ相同組み換え標的配列、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを使用した。
【０５４２】
【表４８】
2014511140.tif 000058
【０５４３】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞を、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡｌｇＣ、又はＣ．ｔｅｔｒａｇｏｎｏｂｏｌａ  α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む３つの発現カセットの各々により、上記の実施例２で記載されるような微粒子銃による形質転換方法を用いて形質転換した。２％メリビオースを唯一の炭素源として含むプレートを使用して、陽性クローンをスクリーニングした。Ｃ．ｔｅｔｒａｇｏｎｏｂｏｌａ発現カセット形質転換体については、プレート上にコロニーは出現しなかった。Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１形質転換体及びＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡｌｇＣ形質転換体を含むプレートから陽性クローンを取り出した。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲの一部分を標的とするプライマー及び３’Ｃｌｐ相同組み換え標的配列によるＰＣＲを用いて、形質転換ＤＮＡの組み込みを確認した。
５’プライマー  Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲ：下流Ｃｌｐ配列（配列番号１２３）
ＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＧＡ  
３’プライマー  Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲ：下流Ｃｌｐ配列（配列番号１２４）
ＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＧＣＡＣＴ
【０５４４】
陰性対照として、非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞に由来するゲノムＤＮＡもまたこのプライマーセットで増幅した。野生型細胞に由来するゲノムＤＮＡからの産物の増幅はなかった。
【０５４５】
Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１形質転換体及びＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡｌｇＣ形質転換体の各々からの（ＰＣＲにより確認されるような）いくつかの陽性クローンを、液体培地中メリビオースを唯一の炭素源として成長するそれらの能力について試験した。これらの選択されたクローンを、メリビオースを唯一の炭素源として上記の実施例１に記載される条件及び基本的な培地で３日間成長させた。いずれかのα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含む全てのクローンが、この時間中に強く成長し、一方で非形質転換野生型株及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２ショ糖インベルターゼを発現するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓは、双方ともメリビオース培地で成長が不良であった。これらの結果から、α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を、形質転換の選択可能なマーカーとして使用できることが示唆される。また、これらのデータは、Ｓ．ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＭＥＬ１（配列番号１０９）又はＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡｌｇＣ（配列番号１１７）に存在する天然のシグナルペプチドが、タンパク質をＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞おけるペリプラズムに標的化させるのに有用であることを示している。
【０５４６】
Ｂ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａにおけるチアミン栄養要求性のＴＨＩＣ遺伝子相補体
外来性ＴＨＩＣ遺伝子の発現を使用して、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のチアミン原栄養性を調べた。植物及び藻類のチアミン生合成は、典型的にはプラスチドで行われ、従ってその生成に関わる、核によりコードされるほとんどのタンパク質が、効率的にプラスチドを標的化する必要がある。Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のＤＮＡ配列決定及びトランスクリプトーム配列決定から、チアミン生合成酵素をコードする遺伝子は、ＴＨＩＣを除き全てゲノムに存在することが明らかになった。チアミン栄養要求性に関与する損傷を生化学的レベルで精査するため、５つの異なるレジーム下でＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞の成長を調べた：（１）２μＭの塩酸チアミンの存在下；（２）チアミンなし；（３）チアミンなし、但し２μＭのヒドロキシエチルチアゾール（ＴＨＺ）を含む；（４）チアミンなし、但し２μＭの２−メチル−４−アミノ−５−（アミノメチル）ピリミジン（ＰＹＲ）を含む；及び（５）チアミンなし、但し２μＭのＴＨＺ及び２μＭのＰＹＲを含む。これらの５つの異なる条件下における成長実験の結果から、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞はデノボ合成可能であるが、ＰＹＲ前駆体が与えられる場合に生成することができるのはピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）のみであることが示された。この結果は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのチアミン栄養要求性が、ＴＨＩＣ酵素による変換触媒である、アミノイミダゾールリボヌクレオチドからのヒドロキシメチルピリミジンホスファート（ＨＭＰ−Ｐ）の合成能力がないことに起因するという仮説に一致している。
【０５４７】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞を、上記の実施例２に記載される微粒子銃による形質転換方法、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ（ＪＧＩタンパク質ＩＤ  ３０４８１に対応するアミノ酸配列、本明細書によって参照により組み込まれる）の発現、及び選択マーカーとしてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２ショ糖インベルターゼを用いて形質転換した。この発現構築物は、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣに由来する天然トランジットペプチド配列、ゲノムＤＮＡの６Ｓ領域に対する上流及び下流の相同組み換え標的配列、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ領域（配列番号１０４）、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１１５）を含んだ。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２の発現もまたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ領域（配列番号１１４）により駆動され、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号１１５）を含んだ。遺伝子は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける好ましいコドン使用により最適化した。関連する発現カセット配列を配列表に列挙し、以下に詳細に記載する：
【０５４８】
【表４９】
2014511140.tif 000059
【０５４９】
チアミンを含まず、且つショ糖を唯一の炭素源として含むプレートで、陽性クローンの選択を実施した。Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ遺伝子内で結合する５’プライマーと、６Ｓ遺伝子座における形質転換ＤＮＡの下流にアニーリングする３’プライマーとによるＰＣＲを用いて、陽性クローンを確認した。また、ＰＣＲで確認した陽性クローンは、サザンブロットアッセイを用いても確認した。
【０５５０】
野生型Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のチアミン栄養要求性を観察するため、最初に目的の細胞の内部的なチアミン貯蔵を枯渇させる必要があった。チアミン不含培地での成長を試験するため、最初に２μＭチアミンを含有する培地で細胞を静止期まで成長させ、次いで細胞をチアミン不含培地に約０．０５の７５０ｎｍ光学密度（ＯＤ７５０）に希釈した。次いで、希釈した細胞をチアミン不含培地で再び静止期まで成長させた（約２〜３日）。これらのチアミン枯渇細胞を使用して、チアミン不含培地に成長試験用の培養物を播種した。野生型細胞は、グルコースを炭素源として含有する培地（チアミン不含又は含有）で成長させ、天然トランジットペプチドＣｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９  ＴＨＩＣ構築物を含む陽性クローンは、ショ糖を唯一の炭素源として含有する培地で成長させた。成長は、７５０ｎｍの吸光度をモニタリングすることによって計測した。この成長実験の結果から、チアミン不含培地における野生型細胞と比較して、トランス遺伝子を発現する株のチアミン不含培地における実質的に大きい成長が示された。しかしながら、これらの形質転換体は、チアミン含有培地では野生型細胞の成長率及び細胞密度に達することはなかった。また、チアミン不含培地における形質転換体クローンの成長量と、組み込まれたＣｏｃｃｏｍｙｘａ酵素の複製物数との間には、強い相関があった（すなわち、トランス遺伝子の複製物数が多いほど、チアミン不含培地での細胞の成長がより良好である）。
【０５５１】
Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ＴＨＩＣ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣ遺伝子、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３  ＴＨＩＣ遺伝子を含む発現構築物を使用して、さらなる形質転換体を作成した。Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａのＴＨＩＣ遺伝子の場合、天然トランジットペプチド配列を、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）遺伝子に由来するトランジットペプチド配列に置き換えた。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．はシアノバクテリアであり、ｔｈｉＣタンパク質は天然トランジットペプチド配列を含まない。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ  ｔｈｉＣ構築物では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ＳＡＤ遺伝子に由来するトランジットペプチド配列を、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ｔｈｉＣのＮ末端に融合した。いずれの場合にも、配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンを最適化した。前述の構築物の３つ全てが、ゲノムの６Ｓ領域に対する上流及び下流の相同組み換え標的配列（配列番号８２及び８４）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓアクチンプロモーター／５’ＵＴＲ、及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ＥＦ１Ａ遺伝子３’ＵＴＲを含んだ。３つの構築物全てが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＴＵＢ２プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号１１４）により駆動されるｎｅｏＲ遺伝子を含み、及びＧ４１８による選択性を付与するＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ３’ＵＴＲ（配列番号１１５）を含んだ。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣのアミノ酸配列はＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿１８０５２４に対応し、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ｔｈｉＣのアミノ酸配列はＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿４４２５８６に対応した（双方の配列とも、本明細書によって参照により組み込まれる）。関連する発現カセット配列を配列表に列挙し、以下に詳細に記載する：
【０５５２】
【表５０】
2014511140.tif 000060
【０５５３】
Ｇ４１８を含有するプレートで陽性クローンをスクリーニングし、各形質転換から、ＰＣＲによる検証用にいくつかのクローンを取り出した。Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓトランジットペプチドを含む）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３  ＴＨＩＣ遺伝子を含む形質転換ＤＮＡ構築物のそれぞれの、ゲノムの６Ｓ遺伝子座への組み込みを、以下のプライマーによるＰＣＲ分析を用いて確認した：
５’ＴＨＩＣ  Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ確認用プライマー配列（配列番号１４１）
ＡＣＧＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＴＧＣＴＴＣＣ
３’ＴＨＩＣ確認用プライマー配列（配列番号１４２）
ＧＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＡ
５’ＴＨＩＣ  Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ確認用プライマー配列（配列番号１４３）
ＧＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＡ
５’ｔｈｉＣ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．確認用プライマー配列（配列番号１４４）
ＣＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＴＧＡ
【０５５４】
チアミン枯渇細胞に対する成長実験（上述のような）を、Ｇ４１８を含有する培地において異なる構築物の各々の形質転換体から選択して確認した陽性クローンを使用して実施した。全ての形質転換体がチアミン不含培地で成長可能であった（ロバスト性の程度は様々であった）。チアミン不含培地での形質転換体の成長をチアミン含有培地における野生型細胞と比較することにより、チアミン不含培地での成長を支持するその能力に関して以下の順位が示された：（１）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ形質転換体；（２）Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓトランジットペプチドを含む）形質転換体；及び（３）Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．形質転換体。これらの結果から、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＨＩＣの単一配列はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のチアミン栄養要求性を補うことができるが、チアミンが存在しない状態で速い成長を可能にするには、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  Ｃ−１６９（天然トランジットペプチド配列又はＣ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓに由来するトランジットペプチド配列のいずれかを含む）及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＴＨＩＣの複数の複製物が必要であったことが示唆される。異なる供給源からの異なるＴＨＩＣの結果のばらつきを考慮すると、任意の特定のＴＨＩＣ遺伝子がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種に存在する損傷を完全に補う能力は予想し得ない。
【０５５５】
３つのＴＨＩＣアミノ酸配列のアラインメントを実施した。Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａに由来するＴＨＩＣと比較したＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．に由来するｔｈｉＣには高い配列保存が存在するが（アミノ酸レベルで４１％の同一性）、シアノバクテリアタンパク質は、藻類及び植物タンパク質で十分に保存されているＮ末端のドメインを欠いている。ドメインが欠けている（及びおそらく構造的差異をもたらす）にもかかわらず、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ｔｈｉＣを発現する構築物は、少なくとも部分的に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ細胞のチアミン原栄養性を回復することができた。
【０５５６】
実施例９：燃料生成
Ａ．連続圧搾機及び圧縮助剤を用いた、微細藻類に由来する油を抽出
ドラム乾燥機を用い、ＤＣＷで３８％の油を含む微細藻類バイオマスを乾燥させ、得られた含水量は５〜５．５％であった。バイオマスをＦｒｅｎｃｈ  Ｌ２５０プレスに供給した。バイオマス３０．４ｋｇ（６７ｌｂｓ．）をプレスに供給したが、油は回収されなかった。同じ乾燥させた微生物バイオマスに、種々の割合のスイッチグラスを圧縮助剤として組み合わせ、プレスに供給した。乾燥微生物バイオマス及び２０％ｗ／ｗ  スイッチグラスを組み合わせることによって、最終的には最も良好な油回収率が得られた。次いで、圧縮したケーキをヘキサンで抽出し、スイッチグラスが２０％の条件で、最終収率は、６１．６％の利用可能な油（重量によって算出）の総量であった。細胞乾燥重量の５０％を超える油を有するバイオマスは、油を放出させるために、スイッチグラスのような圧縮助剤を使う必要はなかった。
【０５５７】
Ｂ．Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａの油に由来するバイオディーゼルの生成
上に記載した方法に従って生成した、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から得た脱ガム油に、トランスエステル化を行い、脂肪酸メチルエステルを得た。結果を以下表３８に示す。
【０５５８】
油の脂質プロフィールは、以下のとおりであった。
Ｃ１０：０  ０．０２
Ｃ１２：０  ０．０６
Ｃ１４：０  １．８１
Ｃ１４．１  ０．０７
Ｃ１６：０  ２４．５３
Ｃ１６：１  １．２２
Ｃ１８：０  ２．３４
Ｃ１８：１  ５９．２１
Ｃ１８：２  ８．９１
Ｃ１８：３  ０．２８
Ｃ２０：０  ０．２３
Ｃ２０：１  ０．１０
Ｃ２０：１  ０．０８
Ｃ２１：０  ０．０２
Ｃ２２：０  ０．０６
Ｃ２４：０  ０．１０
【０５５９】
【表５１】
2014511140.tif 000061
【０５６０】
【表５２】
2014511140.tif 000062
【０５６１】
バイオディーゼルの脂質プロフィールは、原材料油の脂質プロフィールと非常に似ていた。本発明の方法及び組成物によって与えられる他の油を、トランスエステル化し、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．３％であり；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも２％であり；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも２％であり；（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％であるといった脂質プロフィールを有するバイオディーゼルを得ることができる。
【０５６２】
生成したバイオディーゼルのＡＳＴＭ  Ｄ６７５１  Ａ１法による冷状態浸漬時の濾過性は、容積３００ｍｌで１２０秒であった。この試験は、Ｂ１００  ３００ｍｌを濾過し、４０°Ｆ（約４．５°Ｃ）まで１６時間かけて冷やし、室温まで加温し、ステンレス鋼の支持板がついた０．７マイクロメートルガラス繊維フィルターを用い、減圧下で濾過することを含む。本発明の油を、トランスエステル化し、冷状態浸漬時間が１２０秒未満、１００秒未満、９０秒未満のバイオディーゼルを作成することができる。
【０５６３】
Ｃ．再生可能なディーゼルの生成
上に記載の方法に従って生成した、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５に由来する脱ガム油は、上記実施例でバイオディーゼルを製造するために使用した油と同じ脂質プロフィールを有しており、この油をトランスエステル化し、再生可能なディーゼルを生成させてもよい。
【０５６４】
まず、上述の油を水素化処理し、酸素とグリセロール骨格を取り除き、ｎ−パラフィンを得た。次いで、ｎ−パラフィンをクラッキングし、異性化した。この物質のクロマトグラムを図１に示している。次いで、この物質を冷状態で濾過し、約５％のＣ１８材料を除去した。冷状態で濾過した後、材料全容積から引火点のために抜き取り、引火点、ＡＳＴＭ  Ｄ−８６の蒸留分布、曇り点、粘度を評価した。引火点は６３℃であり；粘度は２．８６ｃＳｔ（センチストークス）であり；曇り点は４℃であった。ＡＳＴＭ  Ｄ８６の蒸留値を表３９に示している。
【０５６５】
【表５３】
2014511140.tif 000063
【０５６６】
生成した物質のＴ１０−Ｔ９０は、５７．９℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を使用し、本明細書に開示されている方法に従って生成したトリグリセリド油脂を用いて、他のＴ１０−Ｔ９０範囲、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５℃を有する再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０５６７】
生成した物質のＴ１０は、２４２．１℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を利用し、他のＴ１０値、例えば、Ｔ１０が１８０〜２９５、１９０〜２７０、２１０〜２５０、２２５〜２４５、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０５６８】
生成した物質のＴ９０は、３００℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を利用し、他のＴ９０値、例えば、Ｔ９０が２８０〜３８０、２９０〜３６０、３００〜３５０、３１０〜３４０、少なくとも２９０の再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０５６９】
生成した物質のＦＢＰは、３００℃であった。本明細書に開示されている油の水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変方法、及び本明細書に開示されている蒸留及び分別の方法（例えば、冷却濾過）を利用し、他のＦＢＰ値、例えば、ＦＢＰが２９０〜４００、３００〜３８５、３１０〜３７０、３１５〜３６０、少なくとも３００の再生可能なディーゼル組成物を作成することができる。
【０５７０】
本発明の方法及び組成物によって得られる他の油を、（ａ）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％であり；（ｂ）Ｃ８が少なくとも０．３％であり；（ｃ）Ｃ１０が少なくとも２％であり；（ｄ）Ｃ１２が少なくとも２％であり；（３）Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％であるといった脂質プロフィールを有する脂肪酸プロフィールとともに、水素化処理、異性化、及び他の共有結合改変を組み合わせて行うことができる。
【０５７１】
本発明を、特定の実施形態と関連させて記載してきたが、さらなる改変ができることは理解されるであろう。本明細書は、本発明の原理に一般的に従い、本発明のいかなる変更、応用又は適応をも包含することを意図しており、それらは、本発明が属する技術分野の範囲内にある知られているあるいは慣例の実践範囲内で行われ、また本明細書に記載する本質的な特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む。
【０５７２】
実施例１０：Ｃ１８：２及びＣ１８：３グリセロ脂質を生成するための微生物の操作
藻類及び植物における脂質の合成は、プラスチドのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を介したグルコース又は他の炭素源からアセチルＣｏＡへの変換から始まる。次いで、重炭酸塩を基質として利用するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）が、３−Ｃ化合物のマロニルＣｏＡを生成する。β−ケトアシル−ＡＣＰ（アシルキャリアータンパク質）シンターゼＩＩＩ（ＫＡＳ  ＩＩＩ）が、次いでマロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡとの間の最初の縮合反応を触媒して４−Ｃ化合物を生成する。Ｃ１６：０を通じた連続する２−Ｃ付加は、ＫＡＳ  Ｉにより触媒される。Ｃ１８：０までの最終的な２−Ｃ伸長は、ＫＡＳ  ＩＩにより触媒される。チオエステラーゼ（ＴＥ）は伸長を終結させてアシル−ＡＣＰを切り離す。可溶性酵素ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）は、Ｃ１８：０−ＡＣＰ基質に対する活性を有してΔ９位に二重結合を形成し、その結果、オレイン酸−ＡＣＰを生じる。得られたＣ１８：１脂肪酸は、オレイン酸ＴＥ又は広い特異性のＴＥのいずれかの働きを介してＡＣＰから遊離される。
【０５７３】
全ての脂肪酸は、プラスチドにおいてＡＣＰから遊離するとＥＲに輸送され、そこで脂質（ＴＡＧ）生合成が起きる。おおまかに言えば、高等植物のＥＲにおける脂質生合成には２つの経路があるが、しかしながら２つの経路の基質はおそらくある程度共通している。脂肪酸アシルＣｏＡ独立経路は、極めて選択的な基質特異性を呈し得るアシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼを用いてホスファチジルコリン（Ｐ−コリン）部分間で脂肪酸アシル基を運び、最終的にそれらをジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に運ぶ。酵素ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）が脂肪酸アシル基のアシルＣｏＡ基質からＤＡＧへの最終的な転移を担い、最終的なトリアシルグリセロールがもたらされる。他方で、脂肪酸アシルＣｏＡ依存経路は脂肪酸アシル基を、脂肪酸アシルＣｏＡを基質として用いて、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びＤＡＧへと、それぞれ、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）及びＤＧＡＴの働きによって運ぶ。
【０５７４】
Ｃ１８：２及びＣ１８：３を含むＴＡＧを合成するように微生物を操作するために有用な酵素としては、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳ  ＩＩ）、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）、オレイン酸特異的チオエステラーゼを含むチオエステラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓａｔｕｒａｔｅ）（ＦＡＤ）、及びグリセロ脂質デサチュラーゼ、例えば、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６−オレイン酸デサチュラーゼが挙げられる。これらの種々の酵素が単独で、又は組み合わさって微生物において過剰発現することで、Ｃ１８：２若しくはＣ１８：３脂肪酸又はＴＡＧ生成が増加し得る。ＫＡＳ  ＩＩ酵素活性の発現の増加は、パルミテート（Ｃ１６：０）からステアリン酸塩（Ｃ１８：０）以上への炭素蓄積を後押しする。いくつかの候補ＫＡＳ  ＩＩ酵素のアミノ酸配列を以下の表４０に示す。開示されるＫＡＳ  ＩＩ配列は、高レベルのオレイン酸、リノール酸又はリノレン酸脂肪酸を特に生成する高等植物種に由来する。当業者は、限定なしに、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢＪ９０４６９．２）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＷ８８７６２．１）、Ｅｌａｅｉｓ  ｏｌｅｉｆｅｒａ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣＱ４１８３３．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９１１７４）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＢＩ２７７６７）、及びＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＤＫ２３９４０．１）を含むＫＡＳ  ＩＩの他の遺伝子を同定することが可能であろう。
【０５７５】
【表５４】
2014511140.tif 000064
【０５７６】
高レベルのリノール酸及びリノレン酸脂肪酸を生成するための高レベルのステアリン酸塩からオレイン酸（Ｃ１８：１）への変換は、微生物が１つ以上の脂質経路酵素を過剰発現することにより実現される。不飽和物濃度を上昇させるのに有用性を有する２つのさらなる酵素活性は、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）及びオレイン酸特異的チオエステラーゼである。これらの酵素の一方又は両方の働きを介した高レベルのステアリン酸塩（Ｃ１８：０）からオレイン酸への変換は、初めにリノール酸及びリノレン酸脂肪酸の形成について達成される。
【０５７７】
オレイン酸濃度を上昇させるための過剰発現に有用な例示的ＳＡＤ酵素のアミノ酸配列は、表４１に参照される。さらに、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓに由来する内在するＳＡＤ（配列番号１８０）もまた、Ｃ１８：１濃度を増加させるのに効果的である。開示されるＳＡＤ配列は、高濃度のオレイン酸、リノール酸又はリノレン酸脂肪酸を特に生成する高等植物種に由来する。当業者は、ＳＡＤについて他の遺伝子を同定することが可能であろう。
【０５７８】
【表５５】
2014511140.tif 000065
【０５７９】
ＳＡＤ酵素は、Ｃ１８：０−ＡＣＰ基質に対する活性を有してΔ９位に炭素−炭素二重結合を形成し、その結果、オレイン酸−ＡＣＰを生じる。生じたＣ１８：１脂肪酸は、オレイン酸ＴＥ又は広い特異性のＴＥのいずれかの働きを介してＡＣＰから遊離される。本発明者らは、本明細書の例のなかで、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（寄託番号ＡＡＢ６７８４０．１；配列番号１７２）又はＣａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕ  ＡＣＰチオエステラーゼ（寄託番号ＡＡＡ３３０１９．１；配列番号１９５）の過剰発現により、Ｃ１８：１脂肪酸の蓄積の増加がもたらされることを示している。オレイン酸脂肪酸を増加させるのに有用な例示的オレイン酸チオエステラーゼのアミノ酸配列は、表４２に参照される。当業者は、オレイン酸チオエステラーゼについて他の遺伝子を同定することが可能であろう。
【０５８０】
【表５６】
2014511140.tif 000066
【０５８１】
脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓａｔｕｒａｔｅ）は、微生物におけるリノール酸及びリノレン酸脂肪酸の蓄積を増加させるのに有用性を有する別の酵素である。特に、２つの酵素活性ＦＡＤ２及びＦＡＤ３が、微生物におけるリノール酸及びリノレン酸脂肪酸の蓄積の増加をもたらす。例示的なＦＡＤ２及びＦＡＤ３酵素のアミノ酸配列を以下の表４３に示す。
【０５８２】
【表５７】
2014511140.tif 000067
【０５８３】
表４３に列挙される酵素に加え、例示的なΔ１２  ＦＡＤ酵素のアミノ酸配列が、表４４に列挙される。微生物での過剰発現に適した他のΔ１２  ＦＡＤ酵素が、表４５に参照される。不飽和脂肪酸及びＴＡＧのレベルを増加させるのに有用な例示的なΔ１５  ＦＡＤ及び他の酵素のアミノ酸配列が、表４６に列挙される。さらなるグリセロ脂質デサチュラーゼ酵素が、表４７に提供される。
【０５８４】
【表５８】
2014511140.tif 000068
【０５８５】
【表５９】
2014511140.tif 000069
【０５８６】
【表６０】
2014511140.tif 000070
【０５８７】
【表６１】
2014511140.tif 000071
【０５８８】
本明細書に開示されるアミノ酸配列は、本明細書に開示される方法を用いて微生物で発現される。コード配列は、その微生物での発現に最適化され得る。例えば、Ｐ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでの発現について、本明細書の表２に開示されるとおりの好ましいコドン使用が利用される。
【０５８９】
実施例１１：リノレン酸不飽和脂肪酸及びグリセロ脂質の生成を増加させるための微生物の操作
実施例１０で記載されるとおり、Δ１５デサチュラーゼ酵素は、Ｃ１８：２（リノール酸）脂肪酸又は脂肪酸アシル分子の１５位での二重結合の形成を触媒し、それによりＣ１８：３（リノレン酸）脂肪酸又は脂肪酸アシル分子を生じる。リノレン酸不飽和脂肪酸を豊富に含む油を生成するＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（Ｂｎ）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（Ｃｓ）、及びＬｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍを含む特定の高等植物種は、微生物で発現して脂肪酸プロフィールに影響を及ぼすことができるΔ１５デサチュラーゼをコードする遺伝子の供給源である。この例は、Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを用いた微生物の操作について記載し、ここでは形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが、リノレン酸を豊富に含むものとなった。
【０５９０】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、個々に、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、表４９に列挙されるプラスミド構築物の各々で形質転換した。各構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、ショ糖インベルターゼ遺伝子が選択マーカーとして機能した。全てのタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（Ｂｎ  ＦＡＤ３、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ３２９９４）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ  ＦＡＤ−７、及びＬｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（Ｌｕ  ＦＡＤ３Ａ及びＬｕ  ＦＡＤ３Ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢＡ０２１７２及びＡＢＡ０２１７３）に由来するデサチュラーゼ遺伝子のコード領域は、各々、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ配列が、組み換えデサチュラーゼ遺伝子配列のＮ末端細胞質ループにコードされた。
【０５９１】
【表６２】
2014511140.tif 000072
【０５９２】
構築物ｐＳＺ２１２４、ｐＳＺ２１２５、ｐＳＺ２１２６、及びｐＳＺ２１２７の各々を、個々に株Ａに形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源として含有する寒天プレートで、一次形質転換体を選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示されるものと同様の、脂質生成に適した条件下、ｐＨ７．０で成長させた。脂質サンプルは、各形質転換体から得たバイオマスを乾燥させたものから調製した。それぞれの乾燥バイオマス２０〜４０ｍｇをＭｅＯＨ中５％  Ｈ２ＳＯ４  ２ｍＬに再び懸濁させ、適切な量の適した内部標準（Ｃ１９：０）を含む２００ｕｌのトルエンを加えた。この混合物を軽く超音波処理してバイオマスを分散させ、次いで、７０〜７５℃で３．５時間加熱した。ヘプタン２ｍＬを加え、脂肪酸メチルエステルを抽出した後、６％  Ｋ２ＣＯ３（ａｑ）２ｍＬを加え、酸を中和した。混合物を激しく撹拌し、標準的なＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ（脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化検出）方法を用いたガスクロマトグラフィー分析のために、上側の層の一部を、Ｎａ２ＳＯ４（無水）の入ったバイアルに移した。脂肪酸プロフィールを、標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出方法を用いて分析した。ｐＳＺ２１２４、ｐＳＺ２１２５、ｐＳＺ２１２６及びｐＳＺ２１２７の株Ａ形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）は、表５０に示される。比較のため、非形質転換株Ａ対照細胞から得られた脂質の脂肪酸プロフィールが、表５０にさらに示される。
【０５９３】
【表６３】
2014511140.tif 000073
【０５９４】
非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）株Ａ株は、１％未満のＣ１８：３脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを呈する。対照的に、高等植物の脂肪酸デサチュラーゼ酵素を発現する株Ａの脂肪酸プロフィールは、Ｃ１８：３脂肪酸の組成の増加を示し、増加は約２〜１７倍の範囲であった。Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのＦＡＤ３Ａ若しくはＦＡＤ３Ｂ又はＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのＦＡＤ３遺伝子産物を発現する操作された株は、Ｃ１８：３の増加程度が最大を示した（表５０）。総Ｃ１８不飽和物に対する１８：３の比率は、非形質転換株において約１％であり、及び形質転換株において約２％〜１７％の範囲であった。総Ｃ１８：０に対する１８：２の比率は、非形質転換株（ｕｎｔｒａｓｎｆｏｒｍｅｄ  ｓｔｒａｉｎ）において約１２〜１３％であり、及び形質転換株において約１％〜１５％の範囲で、ＦＡＤ３Ａ形質転換体が最も低いレベルであった。これらのデータから、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるための、特に、微生物細胞において１８：３脂肪酸の濃度を増加させることにおける、Δ１５デサチュラーゼ脂肪酸デサチュラーゼ酵素の外来性発現を可能にするポリヌクレオチドの有用性及び有効性が示される。
【０５９５】
実施例１２：ヘアピンＲＮＡアプローチによってステアリン酸及びステアリン酸塩の生成を増加させるための微生物の操作
ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ（ＳＡＤ）酵素は脂質合成経路の一部である。この酵素は、脂肪酸アシル鎖に二重結合を導入する働きをする。例えば、ＳＡＤ酵素は、Ｃ１８：０脂肪酸（ステアリン酸）からのＣ１８：１脂肪酸の合成を触媒する。実施例６に示すとおり、標的遺伝子破壊によるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＳＡＤ２対立遺伝子の分断により、操作された微生物の脂肪酸プロフィールにおけるＣ１８：０脂肪酸濃度の計測可能な増加が生じた。本実施例は、ＳＡＤ２の発現を下方調節するヘアピンＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの使用による微生物の操作について記載し、ここでこの形質転換微生物の脂肪酸プロフィールは、飽和Ｃ１８：０脂肪酸を豊富に含むものとなった。
【０５９６】
表５１に列挙される４つの構築物ｐＳＺ２１３９〜ｐＳＺ２１４２を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２遺伝子産物の発現を減弱させるように設計した。各構築物は、ステム長さが１８０〜２４０塩基対のサイズ範囲の、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＡＤ２  ｍＲＮＡ転写物に対して標的化されたヘアピンＲＮＡをコードする異なる核酸配列、並びに核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）、及びＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。各構築物のＳＡＤ２  ＲＮＡヘアピンをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。
【０５９７】
【表６４】
2014511140.tif 000074
【０５９８】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、個々に、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、表５１に列挙されるプラスミド構築物で形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源として含有する寒天プレートで、一次形質転換体を選択し、クローン精製し、標準的な脂質生成条件下で成長させた。実施例１１で記載されるような直接的なトランスエステル化法を用いて、脂肪酸プロフィールを決定した。ｐＳＺ２１３９、ｐＳＺ２１４０、ｐＳＺ２１４１、及びｐＳＺ２１４２による株Ａの形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）は、以下の表５２に示される。比較のため、非形質転換株Ａ対照細胞から得られた脂質の脂肪酸プロフィールを、表５２にさらに提供する。
【０５９９】
【表６５】
2014511140.tif 000075
【０６００】
表５２に示されるデータは、宿主生物のＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸プロフィールに対するＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＳＡＤ２ヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ａ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、飽和Ｃ１８：０脂肪酸の割合の増加と、それに伴う不飽和Ｃ１８：１脂肪酸の減少を示した。非形質転換株の脂肪酸プロフィールは約３％のＣ１８：０を含む。形質転換株の脂肪酸プロフィールは、３％超〜約２７％のＣ１８：０を含む。総Ｃ１８不飽和物に対するＣ１８：０の比率は、非形質転換株において約４％であり、形質転換株において約５％〜６９％の範囲であった。これらのデータは、操作された宿主微生物における飽和脂肪酸の割合を変化させるための、特に、微生物細胞においてＣ１８：０脂肪酸の濃度を増加させ、Ｃ１８：１脂肪酸を減少させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでのポリヌクレオチドＳＡＤ  ＲＮＡヘアピン構築物の発現及び使用の成功を示している。
【０６０１】
実施例１３：β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子の過剰発現による微細藻類の脂肪酸プロフィールの改変
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）は、脂肪酸生合成においてＣ１６：０−ＡＣＰからＣ１８：０−ＡＣＰへの２炭素伸長を触媒する。ＫＡＳＩＩ遺伝子が発現する結果として宿主細胞の脂肪酸プロフィールが影響を受け得るかどうかを評価するため、プラスミド構築物を作製した。ＫＡＳＩＩ遺伝子配列の供給源は、Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５から、又は高等植物（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＷ８８７６３、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢＩ１８１５５、及びＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ３３８７２）から選択した。
【０６０２】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、個々に、実施例２の方法を用いて、以下の表５３のプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。各構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号２９として列挙され、選択マーカーとして機能した。各構築物について、ＫＡＳＩＩコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号３７）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。各ＫＡＳＩＩ酵素の天然トランジットペプチドは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号５４）に置き換えられた。全てのタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。
【０６０３】
【表６６】
2014511140.tif 000076
【０６０４】
構築物６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：Ａｍｔ０３：Ｓ１０６ＳＡＤ：ＰｍＫＡＳＩＩ：ｎｒ：：６Ｓにおける関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによる６Ｓ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰ．ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内在するＡｍｔ０３プロモーターが続く。ＰｍＫＡＳＩＩのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りの遺伝子を太字のイタリックにより示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドが、イニシエーターＡＴＧとＡｓｃ  Ｉ部位との間にある。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ａ  ６Ｓゲノム領域が続く。構築物６Ｓ：：β−ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：Ａｍｔ０３：Ｓ１０６ＳＡＤ：ＰｍＫＡＳＩＩ：ｎｒ：：６Ｓの関連するヌクレオチド配列は、配列表に配列番号２３４として提供される。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  Ｓ１０６ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチドを含むＰｍＫＡＳＩＩのコドンが最適化された配列は、配列表に配列番号２３５として提供される。配列番号２３６は配列番号２３５のタンパク質翻訳を提供する。
【化１０】
2014511140.tif 000077
【化１１】
2014511140.tif 000078
【化１２】
2014511140.tif 000079
【０６０５】
各プラスミド構築物を株Ａに個々に形質転換した後、ショ糖を唯一の炭素源として含む寒天プレートで、陽性クローンを選択した。先述の実施例にあるとおり、一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ７で成長させ、各形質転換体から得られたバイオマスを乾燥したものから、脂質サンプルを調製した。実施例１１で記載されるような直接的なトランスエステル化法を用いて、脂肪酸プロフィールを決定した。株Ａの形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）  非形質転換株Ａ対照と比較したときの、いくつかの陽性形質転換体の脂肪酸プロフィール（面積％として表される）を、以下の表５４に各プラスミド構築物についてまとめている。
【０６０６】
【表６７】
2014511140.tif 000080
【０６０７】
ｐＳＺ２０４１を使用して、表２に示されるコドン頻度を使用してさらにコドンを最適化したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ＫＡＳＩＩ遺伝子を過剰発現させると、Ｃ１６：０鎖長の明らかな減少と、それに伴うＣ１８：１長さの脂肪酸の増加が観察された。β−チューブリンプロモーターにより駆動されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）ＫＡＳＩＩ遺伝子を発現する構築物を形質転換すると、同様の脂肪酸プロフィールの変化が観察された。
【０６０８】
これらの結果は、コドンを最適化したＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質生合成遺伝子の外来性の過剰発現により、遺伝子操作された微細藻類の脂肪酸プロフィールを変えることができることを示している。特に、ＫＡＳＩＩ遺伝子の過剰発現は、Ｃ１８脂肪酸の割合を、非形質転換細胞における約６８％から約８４％に増加させることができる。
【０６０９】
実施例１４：ＫＡＳＩ対立遺伝子の標的化したノックアウトによる、操作されたＰｒｏｔｏｔｈｅｃａにおける中鎖脂肪酸濃度の改変
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ＫＡＳＩ）は、脂肪酸生合成において、Ｃ４：０、Ｃ６：０、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子の２炭素伸長を触媒する。本実施例では、ＫＡＳＩ遺伝子座を標的化して破壊したときの宿主細胞の脂肪酸プロフィールに対する影響を評価するため、ノックアウトプラスミド構築物ｐＳＺ２０１４を作製した。
【０６１０】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、実施例２で記載される微粒子銃による形質転換方法を用いて、ｐＳＺ２０１４構築物で形質転換した。ｐＳＺ２０１４は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２  インベルターゼ発現カセットを含み、両側に、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｉｏｒｍｉｓゲノムのＫＡＳＩ遺伝子座に組み込むため構築物を標的化するためのＫＡＳＩ遺伝子特異的相同性領域が隣接した。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。核ゲノム組み込みのためＫＡＳＩ遺伝子座に標的化する領域に関連する配列は以下に示され、配列番号２３８及び配列番号２３９に列挙される。小文字、太字且つ下線で示されるｐＳＺ２０１４における関連する制限部位は、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、ＡｓｃＩ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉであり、以下の配列に示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによるＫＡＳＩ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、コドンが最適化された酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｂ−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。ｓｕｃ２インベルターゼのイニシエーターＡＴＧコドン及びターミネーターＴＧＡコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示す。ｐＳＺ２０１４の形質転換配列を以下に示し、配列番号２３７として列挙される。
【化１３】
2014511140.tif 000081
【０６１１】
プラスミド構築物ｐＳＺ２０１４を株Ａに形質転換した後、ショ糖を唯一の炭素源として含むプレートで、陽性クローンを選択した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質生成条件下で成長させた。脂質サンプルは、各形質転換体から得られたバイオマスを乾燥したものから調製した。実施例１１で記載されるような直接的なトランスエステル化法を用いて、脂肪酸プロフィールを決定した。非形質転換株Ａ対照と比較した、いくつかの陽性形質転換体の脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）を、以下の表５５にまとめている。
【０６１２】
【表６８】
2014511140.tif 000082
【０６１３】
上記の表５５に示されるとおり、ＫＡＳＩ対立遺伝子を標的化して分断すると、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが影響を受けた。ｐＳＺ２０１４形質転換ベクターを含む株Ａの脂肪酸プロフィールは、Ｃ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸の組成の増加と、それに伴うＣ１８：１脂肪酸の減少を示した。全ての形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓ）でＣ１８：０脂肪酸が減少した。一部の形質転換では、ＫＡＳＩ対立遺伝子の分断により、非形質転換株Ａ有機体の脂肪酸プロフィールと比べて低下した割合のＣ１８：２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールがさらに生じた。
【０６１４】
従って、本発明者らは、内在するＫＡＳＩの破壊により、総Ｃ１４脂肪酸の割合を約３５％〜４００％、及びＣ１６脂肪酸の割合を約３０〜５０％増加させた。
【０６１５】
これらのデータは、宿主細菌の脂肪酸プロフィールを変えるための、内在するＫＡＳＩ対立遺伝子の標的遺伝子分断の有用性を示している。
【０６１６】
実施例１５：遺伝子改変アプローチを組み合わせることによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの脂肪酸プロフィールの改変
本実施例では、ＫＡＳＩＩ対立遺伝子をノックアウトし、同時に、中鎖脂肪酸の加水分解に選択性を示す外来性チオエステラーゼを過剰発現させる遺伝子改変の組み合わせが、微生物において宿主生物の脂肪酸プロフィールを変えることを示す。
【０６１７】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、株Ｃの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）株を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、最初にプラスミド構築物ｐＳＺ１２８３で形質転換した。ｐＳＺ１２８３（配列番号２５８）は、先にＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号及び第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号に記載があり、Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦＡＴＢ２（ＣｗＴＥ２）チオエステラーゼのコード配列、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含む。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。ＣｗＴＥ２コード配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号３２）の制御下にあった。ＣｗＴＥ２及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。
【０６１８】
ｐＳＺ１２８３を株Ｃに形質転換した後、ショ糖を唯一の炭素源として含む寒天プレートで、陽性クローンを選択した。次いで、一次形質転換体をクローン精製し、さらなる遺伝子改変用に単一の形質転換体、株Ｂを選択した。この遺伝子操作された株をプラスミド構築物ｐＳＺ２１１０（配列番号２４０）で形質転換して、ＫＡＳＩＩ対立遺伝子１の遺伝子座を分断した。ＫＡＳＩＩ‘５：：ＣｒｂＴｕｂ：ＮｅｏＲ：ｎｒ：：ＫＡＳＩＩ−‘３と書かれるｐＳＺ２１１０は、Ｇ４１８耐性を付与するネオマイシン耐性（ＮｅｏＲ）発現カセットを含み、これはＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｉｏｒｍｉｓゲノムのＫＡＳＩＩ遺伝子座への組み込みのため構築物を標的化するためのＫＡＳＩＩ遺伝子特異的相同性領域が隣接した。ｐＳＺ２１１０構築物における関連する制限部位は、５’−３’に、ＢｓｐＱ  １、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＭｆｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、Ｓａｃ  Ｉ、及びＢｓｐＱＩであり、小文字、太字、且つ下線の書式で示される。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。形質転換構築物の５’末端及び３’末端の太字で小文字の配列は、相同組み換えによるＫＡＳＩＩ対立遺伝子１遺伝子座に対する組み込みを標的化するＵＴＥＸ  １４３５由来のゲノムＤＮＡを表す。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンは、小文字、囲い文字で示す。ＮｅｏＲのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡは大文字のイタリックにより示し、一方、コード領域は小文字のイタリックで示す。
【０６１９】
３’ＵＴＲは、小文字の下線を引いたテキストにより示す。
【化１４】
2014511140.tif 000083
【０６２０】
株ＢをｐＳＺ２１１０で形質転換した後、Ｇ４１８を含有する選択的寒天プレートで、陽性クローンを選択した。次いで、一次形質転換体をクローン精製し、炭素源としてのショ糖上で、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ５．０及びｐＨ７．０の両方で成長させた。脂質サンプルは、実施例１１で記載されるとおり各形質転換体から得られたバイオマスを乾燥したものから調製した。５つの陽性形質転換体（Ｔ１〜Ｔ５）の脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）、唯一の炭素源としてのショ糖上で成長させた株Ｂ（Ｕ１）のプロフィール、及び唯一の炭素源としてのグルコース上で成長させた非形質転換ＵＴＥＸ  １４３５（Ｕ１）のプロフィールを、以下の表５６に示す。
【０６２１】
【表６９】
2014511140.tif 000084
【０６２２】
表５６に示されるとおり、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）株ＢにおけるＣｗＴＥ２の発現の影響は、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールの顕著な変化である。ＣｗＴＥ２を発現する、且つＡｍｔ０３プロモーターからのＣｗＴＥ２の発現を促進するためｐＨ７．０で培養された株Ｂ株の脂肪酸プロフィールは、非形質転換ＵＴＥＸ  １４３５の脂肪酸プロフィールと比べて、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の組成の増加と、それに伴うＣ１６：０及びＣ１８：１脂肪酸の組成の減少を示した。続いて、Ｃ１６：０からＣ１８：０脂肪酸への２炭素伸長を触媒する酵素をコードするＫＡＳＩＩ対立遺伝子が分断されるように株Ｂを改変すると、ｐＨ５．０で成長させたときに新しく操作した株の脂質プロフィールに存在するＣ１６：０脂肪酸の増加と、それに伴うＣ１８：１脂肪酸の減少が生じた。ｐＨ５．０での形質転換体の増殖は、この培地のｐＨがＡｍｔ０３プロモーターの活性に最適ではないことから、改変された脂肪酸プロフィールに対するチオエステラーゼの寄与とは別のＫＡＳＩＩ対立遺伝子ノックアウトの影響を説明する。ｐＨ７．０で脂質を生成し、それによりＣｗＴＥ２が発現した後、ｐＳＺ２０１１形質転換体は、ＵＴＥＸ  １４３５株のプロフィールと比べてＣ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０脂肪酸の組成が増加し、それに伴いＣ１６：０及びＣ１８：１脂肪酸の組成が減少した脂肪酸プロフィールを示した。一部のｐＳＺ２０１１形質転換体は、ｐＨ７．０で培養されたとき、ｐＨ７．０で培養したその親株である株Ｂの脂肪酸プロフィールと比べてＣ１６：０脂肪酸が豊富になり、それでもなおＣ１８：１脂肪酸の組成がさらに減少した脂肪酸プロフィールを示した。
【０６２３】
これらのデータは、宿主生物の脂肪酸プロフィールに影響を及ぼすための複数の遺伝子改変の有用性を示している。さらに、この実施例は、内在するＫＡＳＩＩ対立遺伝子の遺伝子分断を標的化することにより宿主細菌の脂肪酸プロフィールを変化させるための、この組み換えポリヌクレオチドの使用を示している。
【０６２４】
実施例１６：遺伝子改変アプローチを組み合わせることによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａのパルミチン酸組成の改変
本実施例では、ＫＡＳＩＩ対立遺伝子をノックアウトし、同時に、Ｃ１４及びＣ１６脂肪酸の加水分解に対して選択的特異性を示す外来性チオエステラーゼを過剰発現させる遺伝子改変の組み合わせが、微生物において宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させることを示す。
【０６２５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）株を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物ｐＳＺ２００４で形質転換した。ＫＡＳＩＩ＿５’＿ｂｔｕｂ−ＳＵＣ２−ｎｒ＿２Ｘ＿Ａｍｔ０３−Ｃｈ１６ＴＥ２−ｎｒ＿ＫＡＳＩＩ＿３’と書かれるｐＳＺ２００４は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｈ１６ＴＥ２、ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｑ３９５１３）のコード配列、核ゲノムのＫＡＳＩＩ遺伝子座で標的化して組み込むための５’及び３’相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含んだ。Ｃｈ１６ＴＥ２は、Ｃ１４及びＣ１６脂肪酸に対して選択的特異性を示すチオエステラーゼである。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｃｈ１６ＴＥコード配列は、タンデムリピートのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）、及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。Ｃｈ１６ＴＥ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。ｐＳＺ２００４は、配列表に配列番号２５０として示される。
【０６２６】
ｐＳＺ２００４による形質転換後、ショ糖を唯一の炭素源として含有するプレートで、一次形質転換体を選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示される条件と同様に、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ７．０で成長させた。実施例１１で記載されるような標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出方法を用いて、脂肪酸プロフィールを分析した。形質転換ベクターｐＳＺ２００４の形質転換から生じる代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）は、表５７に示される。グルコースを唯一の炭素源として含む脂質生成条件下で成長させた非形質転換株から得られた脂質の脂肪酸プロフィールを、表５７にさらに示す。
【０６２７】
【表７０】
2014511140.tif 000085
【０６２８】
上記の表５７に示されるとおり、選択可能なマーカー及びＣ１４／Ｃ１６選択的チオエステラーゼを発現させるための発現カセットによるＫＡＳＩＩ対立遺伝子の標的化した分断は、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールに影響を及ぼした。ｐＳＺ２００４形質転換ベクターを含む株の脂肪酸プロフィールは、Ｃ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸の組成の増加と、それに伴うＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸の減少を示した。非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）株は、約２７％のＣ１６脂肪酸及び約５８％のＣ１８：１脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを示した。対照的に、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び選択可能なマーカーの発現が可能なカセットによりＫＡＳＩＩ遺伝子座が破壊された株の脂肪酸プロフィールは、約７０％のＣ１６脂肪酸及び約１４％の脂肪酸を含んだ。Ｃ１６：０の濃度は２．５倍超増加した。これらのデータは、外来遺伝子の過剰発現及び内因性遺伝子の除去の遺伝子改変を組み合わせることで、宿主生物における脂肪酸プロフィールを変化させ得ることを示している。
【０６２９】
比較として、ショ糖インベルターゼ遺伝子の発現が可能なカセットによりＫＡＳＩＩ遺伝子座が破壊された株の脂肪酸プロフィールは、約３５％のＣ１６脂肪酸及び約５０％のＣ１８：１脂肪酸を有する株をもたらした。
【０６３０】
これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるための、特に、Ｃ１４及びＣ１６脂肪酸の濃度を増加させることと同時に、前記ポリヌクレオチドでＫＡＳＩＩ対立遺伝子が標的化して破壊されて、微生物細胞におけるＣ１８：０及びＣ１８：１脂肪酸の減少が生じることにおける、チオエステラーゼ酵素の外来性発現を可能にするポリヌクレオチドの有用性及び有効性を示している。
【０６３１】
実施例１７：リノール酸不飽和脂肪酸及びグリセロ脂質を生成するための微生物の操作
特定のΔ１２脂肪酸デサチュラーゼ酵素は、Ｃ１８：１脂肪酸又は脂肪酸アシル分子における二重結合の形成を触媒することができ、それによりＣ１８：２（リノール酸）脂肪酸又は脂肪酸アシル分子を生じ得る。Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｃｎｔｏｒｉｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ、及びＺｅａ  ｍａｙｓを含めた、リノール酸不飽和脂肪酸を豊富に含む油を生成する特定の植物種は、脂肪酸プロフィールに影響を及ぼすように微生物で発現させることができるΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子の供給源である。本実施例は、微生物を操作するためのΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの使用について記載し、ここでは形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが、リノール酸を豊富に含むものとなった。
【０６３２】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、以下の表５８に列挙されるプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。各構築物は、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。全てのタンパク質コード領域は、表２に従いＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（Ｇｈ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ７１１９９）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｃｎｔｏｒｉｕｓ（Ｃｔ  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＤＭ４８７８９）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｇｍ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＤ８９８６２）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ（Ｈａ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ６８９８３）、及びＺｅａ  ｍａｙｓ（Ｚｍ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢＦ５００５３）に由来するデサチュラーゼ遺伝子のコード領域は、各々、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。
【０６３３】
【表７１】
2014511140.tif 000086
【０６３４】
表５８に列挙される構築物の各々を、個々に株Ａに形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源として含有するプレートで、一次形質転換体を選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示される条件と同様に、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ７．０で成長させた。実施例１１で記載される標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出方法を用いて、脂肪酸プロフィールを分析した。表５８の対応する株Ａの形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールが、表５９に示される。比較のため、非形質転換株Ａ対照細胞から得られた脂質の脂肪酸プロフィールを、表５９にさらに示す。
【０６３５】
【表７２】
2014511140.tif 000087
【０６３６】
非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）株は、８．５％未満のＣ１８：２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを示す。表５９に示されるとおり、高等植物の脂肪酸デサチュラーゼ酵素を発現する株Ａ株の脂質プロフィールは、Ｃ１８：２脂肪酸の増加を示した。総Ｃ１８不飽和脂肪酸は約６４％から約６７〜７２％に増加した。同様に、全てを合わせたＣ１８不飽和脂肪酸（Ｃ１８：１、Ｃ１８：２及びＣ１８：３）に対する全Ｃ１８多価不飽和脂肪酸（Ｃ１８：２及びＣ１８：３）の比は、１４％未満から１９％超に増加した。これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるための、Δ１２デサチュラーゼ脂肪酸デサチュラーゼ酵素の外来性発現を可能にするポリヌクレオチドの有用性及び有効性を示している。
【０６３７】
実施例１８：脂肪酸デサチュラーゼの複数の対立遺伝子破壊による操作された微生物の脂肪酸濃度の改変
本実施例は、選択可能なマーカーと外来性ＳＡＤ酵素をコードする配列とを含む形質転換カセットでＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓのＦＡＤｃ遺伝子座を破壊して微生物を操作するための形質転換ベクターの使用について記載し、ここでは形質転換微生物の脂肪酸プロフィールが変化した。
【０６３８】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、株Ｃの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、形質転換構築物ｐＳＺ１４９９（配列番号２４６）で形質転換した。ｐＳＺ１４９９は、Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５での発現にコドンが最適化された、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を含んだ。ｐＳＺ１４９９発現構築物は、核ゲノムに組み込むためのＦＡＤｃゲノム領域に対する５’（配列番号２４７）及び３’（配列番号２４８）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼコード領域は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあり、且つ天然トランジットペプチドが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼトランジットペプチド（配列番号４９）に置き換えられた。Ｏ．ｅｕｒｏｐａｅａ  ＳＡＤ発現カセット全体をｐＳＺ１４９９と命名し、これはＦＡＤｃ５’＿ｂｔｕｂ−Ｓｕｃ２−ｎｒ＿ａｍｔ０３−Ｓ１０６ＳＡＤ−ＯｅＳＡＤ−ｎｒ−ＦＡＤｃ３’と書くことができる。
【０６３９】
ショ糖を唯一の炭素源として含有するプレートで、一次形質転換体を選択した。個々の形質転換体をクローン精製し、実施例１に開示される条件と同様に、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ７．０で成長させた。実施例１１で記載されるような標準的な脂肪酸メチルエステルガスクロマトグラフィー炎イオン化（ＦＡＭＥ  ＧＣ／ＦＩＤ）検出方法を用いて、脂肪酸プロフィールを分析した。形質転換ベクターの形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィールが、表６０に示される。グルコースを唯一の炭素源として含む脂質生成条件下（ｐＨ５．０）で成長させた非形質転換株Ｃ株から得られた脂質の脂肪酸プロフィールを、表６０にさらに示す。
【０６４０】
【表７３】
2014511140.tif 000088
【０６４１】
表６０に示されるとおり、ｐＳＺ１４９９による株Ｃの形質転換は、形質転換微生物の脂肪酸プロフィールに影響を及ぼす。非形質転換Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）株Ｃ株は、６０％未満のＣ１８：１脂肪酸及び７％超のＣ１８：２脂肪酸を含む脂肪酸プロフィールを示す。対照的に、ｐＳＺ１４９９で形質転換した株Ｃ株は、Ｃ１８：１脂肪酸の組成の増加及びそれに伴うＣ１８：０及びＣ１８：２脂肪酸の減少を有する脂肪酸プロフィールを示した。Ｃ１８：２脂肪酸は、ｐＳＺ１４９９で形質転換した株Ｃの脂肪酸プロフィールには検出されなかった。ｐＳＺ１４９９形質転換体に検出可能なＣ１８：２脂肪酸が存在しないことから、複数のＦＡＤｃゲノム遺伝子座に組み込むための相同組み換え標的配列を有するｐＳＺ１４９９による形質転換が、ＦＡＤ活性を消失させたことが示された。
【０６４２】
サザンブロット分析を実施し、複数のＦＡＤｃ対立遺伝子がｐＳＺ１４９９形質転換ベクターによって分断されたことを確認した。標準的な分子生物学的方法を用いて株Ｃ及びｐＳＺ１４９９形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出した。各サンプルからのＤＮＡは、制限酵素ＰｓｔＩで消化した後、０．８％アガロースゲル上で泳がせた。このゲルからのＤＮＡをナイロン＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、次にそれを、ＦＡＤｃ  ３’領域に対応するＰ３２標識ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。図３は、ｐＳＺ１４９９形質転換カセットのマップ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）の２つの配列決定したＦＡＤｃ対立遺伝子、及びｐＳＺ１４９９形質転換ベクターにより破壊された対立遺伝子の予想サイズを示す。ＦＡＤｃ対立遺伝子１はＰｓｔＩ制限部位を含み、一方、ＦＡＤｃ対立遺伝子２はそれを含まない。ＳＡＤカセットの組み込みにより、破壊されたＦＡＤｃ対立遺伝子にＰｓｔＩ制限部位が導入され、その結果、どの対立遺伝子が破壊されたかに関係なく、約６ｋｂフラグメントがサザンで解像され得る。図４は、サザンブロット分析の結果を示す。双方の形質転換体で、約６ｋｂでのハイブリダイゼーションバンドが検出される。分断されていない対立遺伝子を示すものであり得る、それより短いハイブリダイゼーションバンドは、検出されなかった。これらの結果は、いずれのＦＡＤｃ対立遺伝子もｐＳＺ１４９９により破壊されたことを示している。
【０６４３】
ＳＡＤ発現カセットでＦＡＤｃ脂肪酸デサチュラーゼの双方の対立遺伝子を除去すると、約７４％のＣ１８：１を含む脂肪酸プロフィールが生じる。まとめると、これらのデータは、操作された微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるための、ＦＡＤ対立遺伝子のノックアウトを、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ酵素の外来性発現と同時に可能にするポリヌクレオチドの有用性及び有効性を示している。
【０６４４】
実施例１９：操作された微生物から生成される加工油の特徴付け
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を形質転換ベクターｐＳＺ１５００（配列番号２５１）で形質転換する方法及び効果は、先にＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号及び第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号に記載されている。
【０６４５】
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、株Ｃの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、形質転換構築物ｐＳＺ１５００で形質転換した。ショ糖を唯一の炭素源として含有する寒天プレートで一次形質転換体を選択し、クローン精製し、分析のために、単一の操作された系統、株Ｄを選択した。株Ｄを本明細書に記載されるとおり成長させた。次いで、標準方法を用いて、生じたバイオマスからの油のヘキサン抽出を行い、得られたトリグリセリド油脂が残留ヘキサンを含まないことを決定した。連続圧搾機を用いた微細藻類からの油の他の抽出方法が、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号に記載され、本明細書によって参照により組み込まれる。
【０６４６】
次いで、株Ｄのバイオマスから抽出した油を、公知の植物油処理方法を用いて精製し、漂白し、脱臭した。これらの手順により油サンプルＲＢＤ４６９が生じ、これを、米国油脂化学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、及び国際標準化機構（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）によって定義される方法により、いくつかの分析的試験プロトコルに供した。これらの分析の結果を、以下の表６０にまとめている。
【０６４７】
【表７４】
2014511140.tif 000089
【０６４８】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ株Ｄ  ＲＢＤ４６９油の同じロットを、ＡＯＣＳ方法によって微量元素含有量、固形脂肪含有量、及びロビボンド色について分析した。それらの分析の結果は、以下の表６１、表６２、及び表６３に示す。
【０６４９】
【表７５】
2014511140.tif 000090
【０６５０】
【表７６】
2014511140.tif 000091
【０６５１】
【表７７】
2014511140.tif 000092
【０６５２】
ＲＢＤ４６９油をトランスエステル化に供し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成した。ＲＢＤ４６９の得られた脂肪酸メチルエステルプロフィールは、表６４に示される：
【０６５３】
【表７８】
2014511140.tif 000093
【０６５４】
実施例２０：改変された脂肪酸プロフィールを有する操作された微細藻類
上述のとおり、異種遺伝子の組み込みによるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ種の特定の内在する脂質経路酵素のノックアウト又はノックダウンにより、操作された細菌の脂肪酸プロフィールを変化させることができる。本実施例では、宿主細胞の脂質プロフィールが、内在する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子ＦＡＴＡ１をノックアウト又はノックダウンする結果として影響を受け得るかどうかを評価するため、プラスミド構築物を作製した。
【０６５５】
Ａ．内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓチオエステラーゼ遺伝子のノックアウトによる脂質プロフィールの改変
Ｐｒｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）誘導体を、実施例２の方法を用いて、以下の表６５のプラスミド構築物のうちの１つで形質転換した。各構築物は、核ゲノムに組み込んで内在するＦＡＴＡ１遺伝子を分断するための領域と、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域とを含んだ。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。全てのタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。核ゲノムの組み込みに使用したＦＡＴＡ１遺伝子の標的領域に関連する配列を、以下に示す。
【０６５６】
【表７９】
2014511140.tif 000094
【０６５７】
【表８０】
2014511140.tif 000095
【０６５８】
構築物ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１（配列番号２５５）における関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによるＦＡＴＡ１遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ａ  ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。
【化１５】
2014511140.tif 000096
【化１６】
2014511140.tif 000097
【０６５９】
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＡＣＰ−チオエステラーゼ２（ＣｗＴＥ２）遺伝子（寄託番号Ｕ５６１０４）を株ＡのＦＡＴＡ１遺伝子座に導入するため、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下でＣｗＴＥ２遺伝子のタンパク質コード領域を発現するよう構築物を生じさせた。株Ａで発現させた構築物は、ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１（配列番号２５６）と書くことができる。
【０６６０】
構築物ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１における関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによるＦＡＴＡ１遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に囲い文字のイタリックテキストにより示されるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓの内在するＡｍｔ０３プロモーターが続く。Ｃ．ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＡＣＰ−チオエステラーゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、残りのＡＣＰ−チオエステラーゼコード領域を太字のイタリックにより示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ａ  ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く：
【化１７】
2014511140.tif 000098
【化１８】
2014511140.tif 000099
【化１９】
2014511140.tif 000100
【化２０】
2014511140.tif 000101
【０６６１】
プラスミド構築物１又は２を株Ａに個々に形質転換した後、ショ糖を唯一の炭素源として含む寒天プレートで、陽性クローンを選択した。先述の実施例にあるとおり、一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ７で成長させ、各形質転換体から得られたバイオマスを乾燥したものから、脂質サンプルを調製した。実施例１１で記載されるような直接的なトランスエステル化法を用いて、脂肪酸プロフィールを決定した。非形質転換株Ａ対照と比較したときの、構築物１による形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）を、表６６に示す。非形質転換株Ａ対照と比較したときの、構築物２による形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）を、表６７に示す。
【０６６２】
【表８１】
2014511140.tif 000102
【０６６３】
表６６に示される結果は、宿主の内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子を除去すると、操作された微細藻類の脂肪酸プロフィールが変化することを示している。選択可能なマーカーを内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子に標的化させることによって形質転換細菌の脂肪酸プロフィールに及ぶ影響は、Ｃ１６：０脂肪酸の明らかな減少と、それに伴うＣ１８：１脂肪酸の増加である。
【０６６４】
【表８２】
2014511140.tif 000103
【０６６５】
選択可能なマーカーが単独で宿主のＦＡＴＡ１対立遺伝子を標的化することと一致して、選択可能なマーカーを外来性チオエステラーゼと同時に組み込むと、操作された微細藻類の脂肪酸プロフィールの変化が生じる。上記の表６７に示されるとおり、外来性チオエステラーゼ遺伝子がＦＡＴＡ１対立遺伝子を分断するように標的化すると、Ｃ１６：０脂肪酸生成の明らかな減少が生じる。ＦＡＴＡ１遺伝子座でのＣｗＴＥ２チオエステラーゼの発現もまた中鎖脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸生成に影響し、その程度は、分析される形質転換体に存在する外来性チオエステラーゼ活性のレベルに依存する。標的組み込み部位で増幅されるトランス遺伝子の複製物の数とチオエステラーゼ濃度との間には、ウエスタンブロッティングにより評価されるときの、脂肪酸プロフィール又は組み換えタンパク質蓄積のいずれかに対する影響によって明らかなように、良好な一致がある。
【０６６６】
ＣｗＴＥ２遺伝子が増幅を受けたトランスジェニック系は、Ｃ１０：０〜Ｃ１４：０脂肪酸の著しい増加及び同時に起こるＣ１８：１脂肪酸の減少を示す。対照的に、ＣｗＴＥ２が増幅をほとんど又は全く受けなかった形質転換体は、外来性チオエステラーゼのより低い発現と一致して、中鎖脂肪酸の僅かな増加及びそれよりはるかに大きい、Ｃ１８：１脂肪酸の増加に対する影響を生じた。
【０６６７】
まとめると、これらのデータは、宿主の内在するＦＡＴＡ１対立遺伝子を標的化して破壊すると、操作された微細藻類の脂質プロフィールが変化することを示している。これらのデータは、操作された微生物細胞の脂肪酸プロフィールを変化させるための、特に、Ｃ１６脂肪酸の濃度を低下させ、及びＣ１８：１脂肪酸の濃度を増加させることにおける、ＦＡＴＡ対立遺伝子の標的破壊を可能にするポリヌクレオチドの有用性及び有効性を示している。これらのデータはさらに、操作された微生物細胞の脂肪酸プロフィールを変化させるための、特に、Ｃ１６脂肪酸の濃度を低下させることにおける、ＦＡＴＡ対立遺伝子の標的破壊を可能にすると同時に外来性チオエステラーゼを発現するポリヌクレオチドの有用性及び有効性を示している。
【０６６８】
Ｂ．内在するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓチオエステラーゼ遺伝子のノックダウンによる脂質プロフィールの改変
ＲＮＡｉによりＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＦＡＴＡ１の遺伝子発現を下方調節する構築物を、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５株Ａの遺伝的背景に導入した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼ遺伝子を、唯一の炭素源としてショ糖で成長する能力を付与する選択可能なマーカーとして利用した。この構築物は、ＦａｔＡ１コード領域の第１エクソンと、それに続く内在するイントロン、及び逆方向の第１エクソンの反復単位を利用した。ヘアピン構築物を核ゲノムに組み込むため、それぞれ配列番号８２及び８４として列挙される６Ｓゲノム領域に対する５’及び３’相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）が含まれた。この構築物を、６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓと命名する。
【０６６９】
６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓにおける関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによる６ｓ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるヘアピンＦａｔＡ１の発現を駆動する第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターが続く。ＦａｔＡ１のイニシエーターＡＴＧコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、ＦａｔＡ１コード領域の残りの第１エクソンを大文字により示す。ＦａｔＡ遺伝子のイントロンを下線の大文字として示し、下線、大文字、太字のイタリックで示すリンカー領域を、ＦａｔＡ１イントロン／逆方向の第１エクソンジャンクションに設け、これらのベクターにおけるＲＮＡスプライシングを促進した。ＦａｔＡ１の反転した第１エクソンは大文字により示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ａ  ６Ｓゲノム領域が続く。このＲＮＡｉ構築物のＦＡＴＡ部分の配列は、配列番号２５７として列挙される。
【化２１】
2014511140.tif 000104
【化２２】
2014511140.tif 000105
【化２３】
2014511140.tif 000106
【０６７０】
６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓの発現によりヘアピンＲＮＡが形成され、標的ＦａｔＡ遺伝子産物のサイレンシングがもたらされる。この構築物６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓを株Ａに形質転換した後、ショ糖を唯一の炭素源として含む寒天プレートで、陽性クローンを選択した。一次形質転換体をクローン精製し、標準的な脂質生成条件下、ｐＨ５．０で成長させ、各形質転換体から得られたバイオマスを乾燥したものから、脂質サンプルを調製した。実施例１１で記載されるような直接的なトランスエステル化法を用いて、脂肪酸プロフィールを決定した。非形質転換株Ａ対照と比較したときの、形質転換から生じる一組の代表的なクローンから得られた脂肪酸プロフィール（総脂肪酸の面積％として表される）を、表６８に示す。
【０６７１】
【表８３】
2014511140.tif 000107
【０６７２】
表６８に示されるデータは、宿主生物のＣ１６及びＣ１８：１の脂肪酸プロフィールに対するＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物の発現の明らかな影響を示している。ＦＡＴＡヘアピンＲＮＡ構築物を含む株Ａ形質転換体の脂肪酸プロフィールは、Ｃ１８：１脂肪酸の割合の増加と、それに伴うＣ１６脂肪酸の減少を示した。これらのデータは、操作された宿主微生物の脂肪酸プロフィールを変えるための、特に、微生物細胞においてＣ１８：１脂肪酸の濃度を増加させ、及びＣ１６脂肪酸を低下させることにおける、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓでのポリヌクレオチドＦＡＴＡ  ＲＮＡヘアピン構築物の発現及び使用の成功を示している。
【０６７３】
実施例２１：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書で考察されるとおりＤａｗｓｏｎらにより教示される方法及びベクターを改良して達成することができる。簡潔に言えば、Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３５（１９９７）ｐｐ．３５６−３６２は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定した核形質転換を報告した。Ｄａｗｓｏｎは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、完全なＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子（ＮＲ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ３９９３１）をコードするプラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇを突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａに導入した（ＮＲ突然変異体）。ＮＲ突然変異体は、窒素供給源として硝酸塩を使用しない限り、成長することができない。硝酸還元酵素が硝酸塩の亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前には、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体は、硝酸塩（ＮＯ３−）を唯一の窒素供給源として含む培地で微小コロニー段階より先に成長することができなかった。ＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝欠損をレスキューした。ｐＳＶ７２−ＮＲｇプラスミドで形質転換すると、硝酸塩を唯一の炭素源として含む寒天プレートで微小コロニー段階より先に成長することが可能な、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＮＲ遺伝子産物を安定に発現するＮＲ突然変異体Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａが得られた。安定な形質転換体のＤＮＡの評価はサザン解析によって行われ、安定な形質転換体のＲＮＡの評価はＲＮａｓｅ保護によって行われた。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、０．６７ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ  Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・Ｈ２Ｏ及び１６．０ｇ／Ｌ  寒天、適切な窒素供給源（例えば、ＮＯ３−）、微量栄養物、及び炭素源を含む寒天プレート（ｐＨ７．４）で行われた。Ｄａｗｓｏｎはまた、液体培地におけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄａｗｓｏｎは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体における異種遺伝子発現を可能にするのに、プラスミドｐＳＶ７２−ＮＲｇ並びにＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが適していたことを報告した。Ｄａｗｓｏｎはまた、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体において選択可能なマーカーとして用いるのに、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が適していたことも報告した。
【０６７４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素（ＣｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＶ７２−ＮＲｇが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９Ｄに従うＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｖＮＲプロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、ＣｖＮＲ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ＣｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異株の窒素同化（ａｓｓｉｍｉｌｉａｔｉｏｎ）欠損をレスキューし、形質転換ベクターを安定に発現するＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＮＲ突然変異体を選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、微量栄養物並びに適切な窒素及び炭素源を追加した、０．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏが挙げられる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ  Ｖｏｌ．５：７（１９７０），ｐｐ．５９７−６００）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０６７５】
実施例２２〜４４：序論及び表
以下の実施例２２〜４４は、本発明におけるさまざまな微生物の操作を記載する。微生物の脂肪酸プロフィールを変化させるため、微生物を遺伝子改変することができ、ここでは内在する又は外来性の脂質生合成経路酵素を発現させるか、過剰発現させるか、又は減弱させる。細菌を遺伝子操作して脂肪酸の不飽和度に関するその脂肪酸プロフィールを変化させ、脂肪酸鎖長を低下又は増加させる工程には、形質転換ベクター（例えばプラスミド）の設計及び構築、１つ以上のベクターによる細菌の形質転換、形質転換された微生物（形質転換体）の選択、形質転換細菌の成長、及び操作された細菌によって生成される脂質の脂肪酸プロフィールの分析が含まれる。
【０６７６】
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させるトランス遺伝子は、多数の真核微生物で発現させることができる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｃｃａｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅ、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含めた真核微生物におけるトランス遺伝子の発現の例が、科学文献に見出され得る。これらの発現技法を本発明の教示と組み合わせて、改変された脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成することができる。
【０６７７】
宿主生物の脂肪酸プロフィールを変化させるトランス遺伝子はまた、多数の原核微生物でも発現させることができる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓを含めた油産生微生物におけるトランス遺伝子の発現の例は、文献に見出すことができる。これらの発現技法を本発明の教示と組み合わせて、改変された脂肪酸プロフィールを有する操作された微生物を生成することができる。
【０６７８】
【表８４】
2014511140.tif 000108
【０６７９】
【表８５】
2014511140.tif 000109
【０６８０】
【表８６】
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【０６８１】
【表８７】
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【０６８２】
【表８８】
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【０６８３】
【表８９】
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【０６８４】
【表９０】
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【０６８５】
【表９１】
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【０６８６】
【表９２】
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【０６８７】
【表９３】
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【０６８８】
【表９４】
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【０６８９】
【表９５】
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【０６９０】
【表９６】
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【０６９１】
実施例２２：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＣｈｏｗ及びＴｕｎｇらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８（１９９９），ｐｐ．７７８−７８０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの安定した核形質転換を報告した。Ｃｈｏｗ及びＴｕｎｇは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ４８９１４２）をＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓに導入した。ｐＩＧ１２１−Ｈｍのヌクレオチド配列は、ＧＵＳタンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＧＵＳタンパク質コード配列の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍの配列はさらにハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットを含んだ。このハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＨ２４２５９）遺伝子産物をコードする配列に動作可能に連結したＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓは、５０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む培地で増殖することができなかった。ｐＩＧ１２１−Ｈｍプラスミドで形質転換すると、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの形質転換体が得られ、これは５０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ｈｙｒｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）を含む培地で増殖した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおいてｈｐｔ遺伝子産物が発現することにより、５０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ｈｙｒｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）の存在下での形質転換Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖が可能となり、それによりＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓに用いられる選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることが示された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの選択及び維持は、ＹＡ培地（寒天及び４ｇ／Ｌ酵母エキス）を含む寒天プレートで行われた。液体培地中でのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖は、Ｃｈｏｗ及びＴｕｎｇにより考察されるとおり実施された。ＹＡ培地以外の培地中でのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖については、記載がなされている（例えば、Ｃｈａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｅｒｇｉｅｓ  Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １４（２０１１），ｐｐ．２１−２６及びＩｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙ���ｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐｐ．６３１−６３５を参照）。Ｃｈｏｗ及びＴｕｎｇは、プラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍ、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｃｈｏｗ及びＴｕｎｇは、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、Ｃｈａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｅｒｇｉｅｓ  Ｒｅｎｏｕｖｅｌａｂｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １４（２０１１），ｐｐ．２１−２６に考察がなされている。
【０６９２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるハイグロマイシンＢ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むｐＩＧ１２１−Ｈｍが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓの安定な形質転換は、エレクトロポレーションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがハイグロマイシンを含む寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓを選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、微量金属、及び場合により１．５ｇ／Ｌ  ＮａＮＯ３を追加したＢＧ１１培地（０．０４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０７５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．０３６ｇ／Ｌ  クエン酸、０．００６ｇ／Ｌ  クエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、及び０．０２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３）が挙げられる。脂質生成のためＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓを培養するのに適したさらなる培地としては、例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ培地（１．５ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、１．２５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２５ｇｌ−１  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇｌ−１  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（微量栄養物含有）を含む）、及びＩｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７（２０００），ｐｐ．６３１−６３５により報告されるような低窒素培地（２０３ｍｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．２３６ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、２．４６５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、１．３６１ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４及び１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４）が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０６９３】
実施例２３：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＣｈｅｎらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３９：５（２００１），ｐｐ．３６５−３７０は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換を報告した。Ｃｈｅｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いてＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにプラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１を導入した。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１のヌクレオチド配列は、ＮＰ−１タンパク質コード領域の上流でＺｅａ  ｍａｙｓユビキチン（ｕｂｉ１）遺伝子プロモーターに動作可能に連結され、且つＮＰ−１タンパク質コード領域の下流でノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、好中球ペプチド−１（ＮＰ−１）ウサギ遺伝子産物をコードする配列を含んだ。プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１の配列は、Ｇ４１８抗生物質耐性カセットをさらに含んだ。このＧ４１８抗生物質耐性カセットは、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ  ３’）遺伝子産物をコードする配列を含んだ。ａｐｈ  ３’遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａは、３０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１プラスミドで形質転換すると、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの形質転換体が得られ、これは、３０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地で増殖した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおけるａｐｈ  ３’遺伝子産物の発現により、３０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で形質転換Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの増殖が可能となり、それによりＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａに用いられる選択可能なマーカーとしてのＧ４１８抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＮＰ−１遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることが示された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの選択及び維持は、１５ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（液体培養用）又は３０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（１．８％寒天を含む固体培養用）を含有するＫｎｏｐ培地（０．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、及び１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３を含む、ｐＨ６．０〜８．０、０．１％酵母エキス及び０．２％グルコースを追加）で行われた。Ｋｎｏｐ培地以外の培地中でのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの増殖については、記載がなされている（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．７３：５（２００７），ｐｐ．１０５０−１０５６、Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１９（１９９１），ｐｐ．３１７−３２１及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、報告がなされている（Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４（２００２），ｐｐ．６３−７３を参照）。Ｃｈｅｎは、プラスミドｐＢｉｎＵΩＮＰ−１、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｃｈｅｎは、ｐＢｉｎＵΩＮＰ−１でコードされるＧ４１８耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０６９４】
本発明の実施形態では、Ｇ４１８に対する耐性を付与する選択可能なマーカーとして用いられるａｐｈ  ３’遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢｉｎＵΩＮＰ−１が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＺｅａ  ｍａｙｓ  ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの安定な形質転換は、エレクトロポレーションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ａｐｈ  ３’遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがＧ４１８を含むＫｎｏｐ寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｋｎｏｐ培地並びにＪａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ及びＫｉｍらにより報告される培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０６９５】
実施例２４：Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの操作
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＥｌ−Ｓｈｅｅｋｈらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｉｕｍ，Ｖｏｌ．４２：２（１９９９），ｐｐ．２０９−２１６は、プラスミドＤＮＡによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換を報告した。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにプラスミドｐＢＩ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４８５７８３）を導入した。プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットを含んだ。このカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーター、カナマイシン及びＧ４１８に対する耐性のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターを含んだ。ｐＢＩ１２１はさらに、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉは１５ｕｇ／Ｌのカナマイシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＢＩ１２１プラスミドで形質転換すると、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの形質転換体が得られ、これは、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む選択培地で増殖した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉに用いられる選択可能なマーカーとしてのカナマイシン／ネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳ遺伝子産物の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることが示された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈにより報告されるとおり、形質転換したＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの選択及び維持は、ＹＥＧ培地（１％酵母エキス、１％グルコース）及び１５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む半流動寒天プレートで実施された。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈはまた、ＹＥＧ液体培地中でのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの増殖も報告した。脂質生成のためＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉを培養するのに適したさらなる培地については、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．１６３３（２００３），ｐｐ．２７−３４に開示され���。Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、プラスミドｐＢＩ１２１、ＣａＭＶプロモーター、及びノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈは、ｐＢＩ１２１でコードされるカナマイシン／ネオマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０６９６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＢＩ１２１が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むためのＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがカナマイシン又はネオマイシンを含むＹＥＧ寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉを選択することができる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＹＥＧ培地、及びＳａｔｏらにより報告される培地が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０６９７】
実施例２５：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＷａｌｋｅｒらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７（２００５），ｐｐ．３６３−３６８は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定した核形質転換を報告した。Ｗａｌｋｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにプラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２を導入した。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２は、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ５３０１５５）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結した、抗生物質フレオマイシンに対する耐性のための、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含む、ブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａは、１ｍｇ／Ｌのフレオマイシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２プラスミドで形質転換すると、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの形質転換体が得られ、これは、１ｍｇ／Ｌのフレオマイシンを含む選択培地で増殖した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／Ｌのフレオマイシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａに用いられる選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｗａｌｋｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの選択及び維持は、４．５ｇ／ＬのＮａＣｌ及び１ｍｇ／Ｌのフレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）をさらに含むＤｕｎａｌｉｅｌｌａ培地（ＤＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｖｏｌ．２５（１９５７），ｐｐ．３９２−４２８により記載されるようなもの）で実施された。脂質生成のためＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａを培養するのに適したさらなる培地については、Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０１：３（２００６），ｐｐ．２２３−２２６及びＭａｓｓａｒｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｔｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｖｅｎｉｃｅ  ２０１０，Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｗａｓｔｅに考察される。Ｗａｌｋｅｒは、プラスミドｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける異種発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｗａｌｋｅｒは、ｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０６９８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤｂｌｅＦＬＡＧ１．２が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でｒｂｃＳ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、ｒｂｃＳ１  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な形質転換は、エレクトロポレーションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがフレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含むＤＭ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａを選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＤＭ培地並びにＴａｋａｇｉら及びＭａｓｓａｒｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｔｏｎにより記載される培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０６９９】
実施例２６：Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの操作
Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＨａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １７（１９９９），ｐｐ．９９−１０９は、プラスミドＤＮＡによるＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの安定した核形質転換を報告した。Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにｐｚｅｏＥプラスミドを導入した。ｐｚｅｏＥプラスミドは、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２４５４７）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結した、抗生物質ゼオシンに対する耐性のための、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含む、ブレオマイシン抗生物質耐性カセットをコードする配列を含んだ。形質転換前、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉは、１．５ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐｚｅｏＥプラスミドで形質転換すると、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの形質転換体が得られ、これは、２０ｕｇ／ｍｌ超のゼオシンを含む選択培地で増殖した。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、２０ｕｇ／ｍｌのゼオシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉに用いられる選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌにより報告されるとおり、形質転換したＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの選択及び維持は、１ｍｇ／Ｌ  フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）を含有するＶｏｌｖｏｘ培地（ＶＭ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ  ａｎｄ  Ｐｉｎｔｎｅｒ，Ｔｈｅ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２（１９５９），Ｔｙｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｈａｒｔｍａｎ，Ｒ．Ｔ．，ｅｄｓ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ：Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ｐｐ．８８−９６により記載されるようなもの）で実施された。脂質生成のためＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉを培養するのに適した培地については、ＳｔａｒｒによってＳｔａｒｒ  Ｒ，Ｃ，．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．４（１９７０），ｐｐ．５９−１００にも考察されている。Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌは、プラスミドｐｚｅｏＥ並びにＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリン遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける異種発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｈａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｐｅｌは、ｐｚｅｏＥでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃ��ｒｔｅｒｉにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適した、且つＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける選択マーカーとして用いるのに適した、さらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、報告がなされている（例えば、Ｈａｌｌａｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｕｍｐｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９１（１９９４），ｐｐ  １１５６２−１１５６６及びＨａｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｏｄｎｉｏｋ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２５（２００６），ｐｐ．５８２−５８１を参照）。
【０７００】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐｚｅｏＥが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリンプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  β−チューブリン３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ｐｒｏｃｈｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３２９：５９８８（２０１０），ｐｐ２２３−２２６による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがゼオシンを含むＶＭ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉを選択することができる。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＶＭ培地及びＳｔａｒｒにより考察される培地が挙げられる。Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７０１】
実施例２７：Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの操作
Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＳｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２：１２（２００６），ｐｐ．７４７７−７４８４は、プラスミドＤＮＡによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定した核形質転換を報告した。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにプラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒを導入した。プラスミドｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒは、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（Ｐｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ７８１１７０）のプロモーター、タンパク質コード配列、及び３’ＵＴＲを含むノルフルラゾン耐性カセットを含み、ここでＰｄｓのタンパク質コード配列は、除草剤ノルフルラゾンに対する耐性を付与する遺伝子産物（Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ）をコードするように、５０４位で改変された（それによりロイシンがアルギニンに変更された）。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒによる形質転換前、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓは、５ｕＭのノルフルラゾンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミドで形質転換すると、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの形質転換体が得られ、これは、５ｕＭのノルフルラゾンを含む選択培地で増殖した。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおけるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の発現により、５ｕＭのノルフルラゾンの存在下での増殖が可能となり、それによりＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓに用いられる選択可能なマーカーとしてのノルフルラゾン除草剤耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒにより報告されるとおり、形質転換したＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの選択及び維持は、２．４２ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−アセテート、及び５ｍＭノルフルラゾンを追加したＯＨＡ培地（ＯＨＭ（０．４１ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、０．０３ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４６ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．６２ｍｇ／Ｌ  Ｆｅ（ＩＩＩ）クエン酸塩×Ｈ２Ｏ、０．０１１ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１２ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０７５ｍｇ／Ｌ  Ｃｒ２Ｏ３、０．９８ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．１２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００５ｍｇ／Ｌ  ＳｅＯ２及び２５ｍｇ／Ｌ  ビオチン、１７．５ｍｇ／Ｌ  チアミン、及び１５ｍｇ／Ｌ  ビタミンＢ１２）を含む寒天プレートで実施された。液体培地中でのＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの増殖は、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａ���ｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎにより基本培地（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５９（１９９３），ｐｐ．８６７−８７３により記載されるような基本培地）を使用して行われた。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒプラスミド並びにＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｍａｎｎは、ｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒでコードされるノルフルラゾン耐性カセットが、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、報告がなされている（Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４５（２００９），ｐｐ  ６４２−６４９を参照）。
【０７０２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるＰｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｌａｔ−ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  ｐｄｓ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  ｐｄｓ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。Ｐｄｓ−Ｌ５０４Ｒ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがノルフルラゾンを含むＯＨＡ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓを選択することができる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、基本培地、並びにＫｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ、及びＧｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９：５（１９９７），ｐｐ．４３７−４４４により記載される培地が挙げられる。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７０３】
実施例２８：Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の操作
Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＡｂｅらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２：９（２０１１），ｐｐ．１６７６−１６８５は、プラスミドＤＮＡによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定した核形質転換を報告した。Ａｂｅは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体にプラスミドｐＳＡ１０６を導入した。プラスミドｐＳＡ１０６は、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子（ＣＡＢ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ３６３４０３）のプロモーター及び３’ＵＴＲに動作可能に連結したＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質遺伝子（ｂｌｅ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ３７０５０）をコードする配列を含む、ブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＳＡ１０６による形質転換前、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体は、３ｕｇ／ｍｌのフレオマイシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＳＡ１０６で形質転換すると、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の形質転換体が得られ、これは、３ｕｇ／ｍｌのフレオマイシンを含む選択培地で増殖した。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体におけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、３ｕｇ／ｍｌのフレオマイシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体に用いられる選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ａｂｅにより報告されるとおり、形質転換したＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の選択及び維持は、初めにＣ培地（０．１ｇ／Ｌ  ＫＮＯ３、０．０１５ｇ／Ｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／Ｌ  グリセロリン酸Ｎａ２、０．０４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ヒドロキシルメチル）アミノメタン、微量ミネラル、ビオチン、ビタミンＢ１及びＢ１２）を含む上層寒天で実施された後、続いてフレオマイシンを追加したＣ培地を含む寒天プレートに単離された。Ａｂｅにより報告されるとおり、液体培地中でのＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖は、Ｃ培地で行われた。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の増殖に適したさらなる液体培地については、Ｓｅｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：４（２００３），ｐｐ．１４７−１５３により考察されている。Ａｂｅは、ｐＳＡ１０６プラスミド並びにＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらにＡｂｅは、ｐＳＡ１０６でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、報告がなされている（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４９（２００８），ｐｐ．６２５−６３２を参照）。
【０７０４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＳＡ１０６が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体における発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ＣＡＢ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体ゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがフレオマイシンを含むＣ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体を選択することができる。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｃ培地並びにＡｂｅら及びＳｅｋｉｍｏｔｏらにより報告される培地が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒａｃｅｒｏｓｕｍ−ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ−ｌｉｔｔｏｒａｌｅ複合体の脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７０５】
実施例２９：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＳｕｎらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３７７（２００６），ｐｐ．１４０−１４９は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの安定な形質転換を報告した。Ｓｕｎらは、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の形質転換方法を用いて、突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓに、完全なＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子をコードするプラスミドｐＤＶＮＲを導入した（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体）。このＮＲ突然変異体は、窒素供給源として硝酸塩を使用しない限り、成長することができない。硝酸還元酵素は硝酸塩の亜硝酸塩への変換を触媒する。形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体は、硝酸塩（ＮＯ３−）を唯一の窒素供給源として含む培地で増殖することができなかった。ＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓにおけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ遺伝子産物の発現を選択可能なマーカーとして使用して、硝酸塩代謝欠損がレスキューされた。ｐＤＶＮＲプラスミドで形質転換すると、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ遺伝子産物を安定に発現するＮＲ突然変異体Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓが得られ、これは、硝酸塩を唯一の炭素源として含む寒天プレートで成長することができた。安定な形質転換体のＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＲ突然変異体）の選択及び維持は、５ｍＭのＫＮＯ３を含む寒天プレートで行われた。Ｓｕｎらはまた、液体培地におけるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ及びＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体の増殖も報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの増殖に適したさらなる培地は、Ｇｏｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０：２（１９９８），ｐｐ．１３５−１４４及びＭｏｕｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｆｏｒｄ，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．２０４−２０５：１（１９９０），ｐｐ．４０１−４０８により報告される。Ｓｕｎらは、プラスミドｐＤＶＮＲ並びにＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体における異種発現を可能にするのに適していたことを報告した。Ｓｕｎらはまた、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素遺伝子産物の発現が、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体における選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことも報告した。
【０７０６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ硝酸還元酵素（ＤｖＮＲ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤＶＮＲが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＤｖＮＲプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、ＤｖＮＲ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体の安定な形質転換は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ＤｖＮＲ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異株の窒素同化（ａｓｓｉｍｉｌｉａｔｉｏｎ）欠損をレスキューし、形質転換ベクターを安定に発現するＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ  ＮＲ突然変異体を選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｕｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｆｏｒｄ及びＧｏｒｄｉｌｌｏらにより考察されるものが挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７０７】
実施例３０：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの操作
Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＧｅｎｇらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５（２００３），ｐｐ．４５１−４５６は、プラスミドＤＮＡによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの安定な形質転換を報告した。Ｇｅｎｇらは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドを導入した。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、ＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の上流でＺｅａ  ｍａｙｓ  ｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つＨＢｓＡＧタンパク質コード領域の下流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする配列を含むＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）発現カセットを含む。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴは、シミアンウイルス４０プロモーター及びエンハンサーに動作可能に連結した、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与する、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子産物をコードする配列を含む、クロラムフェニコール耐性カセットをさらに含んだ。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴによる形質転換前、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａは、６０ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコールを含む培地で増殖することができなかった。ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴプラスミドで形質転換すると、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの形質転換体が得られ、これは、６０ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコールを含む選択培地で増殖した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおけるＣＡＴ遺伝子産物の発現により、６０ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコールの存在下での増殖が可能となり、それによりＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａに用いられる選択可能なマーカーとしてのクロラムフェニコール耐性カセットの有用性が確立された。ＨＢｓＡｇ遺伝子産物の検出可能な活性から、ｕｂｉ１プロモーター及びｎｏｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける遺伝子発現を可能にするのに適していることが示された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｇｅｎｇらは、形質転換したＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの選択及び維持が、６０ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコールを含有するＪｏｈｎｓｏｎ培地（Ｊ１、Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ  ａｎｄ  Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ（ｅｄｓ），Ｍｉｃｒｏ−ａｌｇａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．４６０−４６１により記載される）を含む寒天プレ−トで行われたことを報告した。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの液体増殖は、Ｇｅｎｇらにより６０ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコールを含有するＪ１培地において行われた。Ｊ１培地以外の培地中でのＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの増殖については、考察がなされている（��ｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．３６（２００９），ｐｐ．１４３３−１４３９及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌｓ．１１６−１１７：１（１９８４），ｐｐ．１１５−１２１を参照）。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、Ｆｅｎｇらにより報告がなされている。Ｇｅｎｇらは、プラスミドｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴ、ｕｂｉ１プロモーター、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｇｅｎｇらは、ｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴでコードされるＣＡＴ耐性カセットが、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７０８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるＣＡＴ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＵΩＨＢｓＡｇ−ＣＡＴが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でｕｂｉ１プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの安定な形質転換は、エレクトロポレーションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ＣＡＴ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがクロラムフェニコール（ｃｈｒｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含むＪ１培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＤｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａを選択することができる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｊ１培地並びにＦｅｎｇら及びＢｏｒｏｗｉｔｚｋａらにより記載される培地が挙げられる。Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７０９】
実施例３１：Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌの操作
Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＬｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９：６４，２００９は、プラスミドＤＮＡによるＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定した核形質転換を報告した。Ｌｅｒｃｈｅは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにプラスミドｐＰｍｒ３を導入した。プラスミドｐＰｍｒ３は、ａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の上流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結し、且つａｐｈＶＩＩＩタンパク質コード領域の下流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、抗生物質パロモマイシンに対する耐性のためのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓのアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈＶＩＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ０３８５６）をコードする配列を含む、パロモマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＰｍｒ３による形質転換前、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅは、０．０６ｕｇ／ｍｌのパロモマイシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＰｍｒ３で形質転換すると、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの形質転換体が得られ、これは、０．７５ｕｇ／ｍｌを超えるパロモマイシンを含む選択培地で増殖した。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおけるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の発現により、０．７５ｕｇ／ｍｌを超えるパロモマイシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅに用いられる選択可能なマーカーとしてのパロモマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎは、形質転換したＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの選択及び維持が、１．０ｕｇ／ｍｌのパロモマイシンを含有する液体Ｊａｗｏｒｓｋｉ培地（２０ｍｇ／Ｌ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、１２．４ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５．９ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、２．２５ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ−ＦｅＮａ、２．２５ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ  Ｎａ２、２．４８ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３９ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、０．０４ｍｇ／Ｌ  ビタミンＢ１２、０．０４ｍｇ／Ｌ  チアミンＨＣｌ、０．０４ｍｇ／Ｌ  ビオチン、８０ｍｇ／Ｌ  ＮａＮＯ３、３６ｍｇ／Ｌ  Ｎａ４ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ）で行われたことを報告した。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎによりさらに考察される。Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎは、プラスミドｐＰｍｒ３、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーター、及びＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｒｂｃＳ３遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｌｅｒｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｍａｎは、ｐＰｍｒ３でコードされるパロモマイシン耐性カセットが、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７１０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＰｍｒ３が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＶｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｈｓｐ７０Ａ−ｒｂｃＳ３ハイブリッドプロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｒｂｃＳ３遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成することができる。ａｐｈＶＩＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがパロモマイシンを含むＪａｗｏｒｓｋｉ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＧｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅを選択することができる。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅの脂質生成に適した成長培地としては、Ｊａｗａｏｒｓｋｉ培地及びＳｔｅｉｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．４５：９（１９５８），ｐｐ．６６４−６７２により報告される培地が挙げられる。Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌｅ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７１１】
実施例３２：Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの操作
Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＡｐｔらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２５２（１９９６），ｐｐ．５７２−５７９は、ベクターＤＮＡによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定した核形質転換を報告した。Ａｐｔは、微粒子ボンバードメントの形質転換技法を用いて、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにプラスミドｐｆｃｐＡを導入した。プラスミドｐｆｃｐＡは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍフコキサンチンクロロフィルａ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ）のプロモーターに動作可能に連結し、且つｂｌｅタンパク質コード領域の３’領域で、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性のための、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含む、ブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐｆｃｐＡによる形質転換前、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、５０ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐｆｃｐＡで形質転換すると、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの形質転換体が得られ、これは、５０ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含む選択培地で増殖した。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｂｌｅ遺伝子産物の発現により、５０ｕｇ／ｍｌのゼオシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍに用いられる選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ａｐｔは、形質転換したＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの選択及び維持が、５０ｍｇ／Ｌのゼオシンを含有するＬＤＭ培地（Ｓｔａｒｒ  ａｎｄ  Ｚｅｉｋｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，（１９９３）により報告されるようなもの）を含む寒天プレートで行われたことを報告した。Ａｐｔは、５０ｍｇ／Ｌのゼオシンを含有するＬＤＭ培地におけるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体の液体増殖を報告した。ＬＤＭ培地以外の培地中でのＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの増殖については、考察がなされている（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９２（２００１），ｐｐ．２０７３−２０７５、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１３（２０１１），ｐｐ．８９−９５による）。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、Ａｐｔら、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら、及びＲａｄｏｋｏｖｉｔｓらによる同じ報告中に報告がなされている。Ａｐｔは、プラスミドｐｆｃｐＡ、並びにＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ａｐｔは、ｐｆｃｐＡでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７１２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐｆｃｐＡが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ｂｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４５６（２００８），ｐｐ．２３９−２４４による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがパロモマイシンを含むＬＤＭ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍを選択することができる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｒａｄｏｋｏｖｉｔｓらにより報告されるようなｆ／２培地が挙げられる。Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７１３】
実施例３３：Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の操作
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＹａｍａｇｕｃｈｉらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５９：２（２０１１），ｐｐ．１１３−１１９は、プラスミドＤＮＡによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の安定した核形質転換を報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．にプラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔを導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、ノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含む、ノーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性カセットを含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ノーセオスリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．は、５００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔで形質転換すると、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の形質転換体が得られ、これは、５００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンを含む選択培地で増殖した。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．におけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、５００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．に用いられる選択可能なマーカーとしてのノーセオスリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、形質転換したＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の選択及び維持が、５００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンを含有するｆ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｍａｒｉｎｅ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｌｅｙ（ｅｄｓ）１９７５，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−６０により報告されるようなもの）を含む寒天プレートで行われたことを報告した。Ｙａｍａｇｕｃｈｉによって行われたようなＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．形質転換体の液体増殖は、５００ｍｇ／Ｌのノーセオスリシンを含有するｆ／２培地で実施された。別の培地中でのＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の増殖については、報告がなされている（例えば、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏ��．２１：２（１９９０），ｐｐ．１２２−１３０、及びＶｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０による）。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするのに適したさらなるプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーについては、Ｙａｍａｇｕｃｈｉらによる同じ報告に報告がなされている。Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、プラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｙａｍａｇｕｃｈｉは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされるノーセオスリシン耐性カセットが、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７１４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｎａｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、近縁のＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．ゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換又は他の公知の方法により達成される。ｎａｔ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがノーセオスリシンを含むｆ／２寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．を選択することができる。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．の脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ｆ／２培地、並びにＮａｐｏｌｉｔａｎｏら及びＶｏｌｋｍａｎらにより考察される培地が挙げられる。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７１５】
実施例３４：Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの操作
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２７２（２００５），ｐｐ．３４１３−３４２３は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにｐＣＦ−ｂｌｅプラスミドを導入した。プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅは、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓフコキサンチン（ｆｕｃｏｚａｎｔｈｉｎ）クロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ１２５５８０）プロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｂｌｅタンパク質コード領域の下流）でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐＡ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、抗生物質ゼオシン及びフレオマイシンに対する耐性のための、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）をコードする配列を含む、ブレオマイシン耐性カセットを含んだ。ｐＣＦ−ｂｌｅによる形質転換前、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓは、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＣＦ−ｂｌｅで形質転換すると、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの形質転換体が得られ、これは、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含む選択培地で増殖した。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓに用いられる選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、形質転換したＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの選択及び維持が、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含有する人工海水培地を含む寒天プレートで行われたことを報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含有する人工海水培地中でのＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ形質転換体の液体増殖を報告した。別の培地中でのＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：１（２００５），ｐｐ．６１−６５、及びＯｒｃｕｔｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．９：１２（１９７４），ｐｐ．１０００−１００３による）。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするさらなるプラスミド、プロモーター、及び３’ＵＴＲ／ターミネータ��については、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒによる同じ報告に報告がなされている。Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、プラスミドｐＣＦ−ｂｌｅ並びにＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒは、ｐＣＦ−ｂｌｅでコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７１６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＣＦ−ｂｌｅが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがゼオシンを含む人工海水寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓを選択することができる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、人工海水並びにＬｉａｎｇら及びＯｒｃｕｔｔ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎにより報告される培地が挙げられる。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７１７】
実施例３５：Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の操作
Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓは、炭化ケイ素ウィスカーの存在下で撹拌する形質転換技法を用いて、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．にプラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳを導入した。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流で、又は５’で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列を含む、ネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳプラスミドは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ  ３５Ｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換前、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．は、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳで形質転換すると、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の形質転換体が得られ、これは、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地で増殖した。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．におけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下での増殖が可能となり、それによりＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．に用いられる選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における遺伝子発現を可能にするのに適していることが示された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給者Ｓｉｇｍａにより提供される）及び３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を追加した海水を含む培地中でのＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ形質転換体の液体増殖、並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を追加した海水を含む寒天培地でのＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．形質転換体の選択及び維持を報告した。別の培地中でのＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の増殖については、報告がなされている（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７：４（２００５）ｐｐ．２８７��ｖ３００）。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における異種遺伝子発現を可能にするさらなるプロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含むさらなるプラスミドについては、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告に報告がなされている。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７１８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９Ｄのとおりの近縁の種Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．における発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、ｎｏｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．ゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の安定な形質転換は、ケイ素繊維媒介マイクロインジェクションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがＧ４１８を含む海水寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＡｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．を選択することができる。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．の脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、人工海水並びにＭａｎｓｏｕｒら及びｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒにより報告される培地が挙げられる。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７１９】
実施例３６：Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの操作
Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３：３（１９９８），ｐｐ．４２７−４３５は、プラスミドＤＮＡによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換を報告した。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓは、ケイ素繊維媒介マイクロインジェクションの形質転換技法を用いて、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにプラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳを導入した。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳは、ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の上流で、又は５’で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩタンパク質コード領域の下流）でｎｏｓ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＬ９２０３９）をコードする配列を含む、ネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳプラスミドは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに動作可能に連結され、且つＣａＭＶ  ３５Ｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターにさらに動作可能に連結された、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子産物をコードする配列をさらに含んだ。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳによる形質転換前、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍは、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で増殖することができなかった。ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳで形質転換すると、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの形質転換体が得られ、これは、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地で増殖した。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下での増殖が可能となり、それによりＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍに用いられる選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。ＧＵＳレポーター遺伝子の検出可能な活性から、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及び３’ＵＴＲが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける遺伝子発現を可能にするのに適していることが示された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、Ｆ／２濃縮溶液（供給者Ｓｉｇｍａにより与えられる）及び３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を追加した海水を含む培地中でのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ形質転換体の液体増殖、並びにＦ／２濃縮溶液及び３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を追加した海水を含む寒天培地でのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ形質転換体の選択及び維持を報告した。別の培地中でのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．８９：２１（１９９２）ｐｐ．１０３０２−１０３０５）。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける異種遺伝子発現を可能にするさらなるプロモーター、３’ＵＴＲ／ターミネーター、及び選択可能なマーカーを含むさらなるプラスミドについては、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒによる同じ報告に考察がなされている。ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、プラスミドｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳ並びにｎｏｓ及びＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、ｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒは、ｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳでコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７２０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＭＴ  ＮＰＴ／ＧＵＳが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、ｎｏｓ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの安定な形質転換は、ケイ素繊維媒介マイクロインジェクションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがＧ４１８を含む海水寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍを選択することができる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、人工海水並びにＩｇｌｅｓｉａｓ−Ｐｒｉｅｔｏら及びｔｅｎ  Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒにより報告される培地が挙げられる。Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｃｒｏａｄｒｉａｃｔｉｃｕｍ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７２１】
実施例３７：Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．の操作
Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＫｉｌｉａｎらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｋｉｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０８：５２（２０１１）ｐｐ．２１２６５−２１２６９は、形質転換構築物によるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの安定した核形質転換を報告した。Ｋｉｌｉａｎは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂに形質転換構築物Ｃ２を導入した。Ｃ２形質転換構築物は、ｂｌｅタンパク質コード領域の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーターに動作可能に連結し、且つｂｌｅタンパク質コード領域の下流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、抗生物質フレオマイシン及びゼオシンに対する耐性のための、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン結合タンパク質（ｂｌｅ）のコード配列を含む、ブレオマイシン耐性カセットを含んだ。Ｃ２による形質転換前、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂは、２ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地で増殖することができなかった。Ｃ２で形質転換すると、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの形質転換体が得られ、これは、２ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含む選択培地で増殖した。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおけるｂｌｅ遺伝子産物の発現により、２ｕｇ／ｍｌのゼオシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓに用いられる選択可能なマーカーとしてのブレオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、ＰＣＲによって行われた。Ｋｉｌｉａｎは、５倍濃度の微量金属、ビタミン、及びリン酸溶液を含み、及び２ｕｇ／ｍｌのゼオシンをさらに含むＦ／２培地（Ｇｕｉｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｙｔｈｅｒ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８（１９６２），ｐｐ．２２９−２３９により報告される）でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の液体増殖を報告した。Ｋｉｌｉａｎはまた、人工海水２ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む寒天Ｆ／２培地でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ形質転換体の選択及び維持も報告した。別の培地中でのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１００：２（２００９），ｐｐ．８３３−８３８及びＰａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９０：４（２０１１），ｐｐ．１４２９−１４４１）。Ｎａｎｎｏｃ���ｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける異種遺伝子発現を可能にするさらなるプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターを含むさらなる形質転換構築物並びに形質転換体を選択するための選択可能なマーカーについては、Ｋｉｌｉａｎによる同じ報告に記載されている。Ｋｉｌｉａｎは、形質転換構築物Ｃ２並びにＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ２のプロモーター及びＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子ＶＣＰ１の３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｋｉｌｉａｎは、Ｃ２でコードされるブレオマイシン耐性カセットが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７２２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｂｌｅ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む形質転換構築物Ｃ２が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．の核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ  ＶＣＰ２遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、且つタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ  ＶＣＰ１遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの安定な形質転換は、エレクトロポレーションを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｂｌｅ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがゼオシンを含むＦ／２培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂを選択することができる。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｆ／２培地並びにＣｈｉｕら及びＰａｌらにより報告される培地が挙げられる。Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．Ｗ２Ｊ３Ｂ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７２３】
実施例３８：Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの操作
Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＤｕｎａｈａｙらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５），ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにプラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１を導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣａｓｅ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含む、ネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む５０％人工海水培地で増殖することができなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１で形質転換すると、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの形質転換体が得られ、これは、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択的５０％人工海水培地で増殖した。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下での増殖が可能となり、それによりＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａに用いられる選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭのケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を追加した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるようなもの）におけるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＡＳＷ培地を含む寒天プレートでのＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ形質転換体の選択及び維持も報告した。別の培地中でのＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｓｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８−２９：１（１９９１），ｐｐ．３１７−３２６及びＰａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０９：３（２０１０），ｐｐ．２３５−２３９）。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及び���ｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子のプロモーターが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７２４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣａｓｅプロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣａｓｅ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがＧ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａを選択することができる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎら（１９９１）及びＰａｈｌらにより報告される培地が挙げられる。Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７２５】
実施例３９：Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの操作
Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＤｕｎａｈａｙらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１（１９９５），ｐｐ．１００４−１０１２は、プラスミドＤＮＡによるＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換を報告した。Ｄｕｎａｈａｙは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにプラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１を導入した。プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１は、ｎｐｔＩＩコード領域の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ２０７８４）のプロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｎｐｔＩＩコード領域の下流）でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣａｓｅ遺伝子の３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子産物のコード配列を含む、ネオマイシン耐性カセットを含んだ。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１による形質転換前、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａは、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む人工海水培地で増殖することができなかった。ｐＡＣＣＮＰＴ５．１で形質転換すると、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの形質転換体が得られ、これは、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択的人工海水培地で増殖した。Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおけるｎｐｔＩＩ遺伝子産物の発現により、Ｇ４１８の存在下での増殖が可能となり、それによりＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａに用いられる選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｄｕｎａｈａｙは、１．０７ｍＭのケイ酸ナトリウム及び１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を追加した人工海水培地（ＡＳＷ、Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．２１（１９８２），ｐｐ．４０８−４１０により考察されるようなもの）でのＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの液体増殖を報告した。Ｄｕｎａｈａｙはまた、１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＡＳＷ培地を含む寒天プレートでのＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ形質転換体の選択及び維持も報告した。別の培地中でのＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｔａｄｒｏｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：４（１９８８），ｐｐ．４４５−４５２及びＳｒｉｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０−２１：１（１９８９），ｐｐ．２８１−２９１）。Ｄｕｎａｈａｙは、プラスミドｐＡＣＣＮＰＴ５．１及びＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子のプロモーターが、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｄｕｎａｈａｙは、ｐＡＣＣＮＰＴ５．１でコードされるネオマイシン耐性カセットが、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７２６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｎｐｔＩＩ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＡＣＣＮＰＴ５．１が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９Ｄのとおりの近縁のＮａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣａｓｅ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ  ＡＣＣａｓｅ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。形質転換ベクターによるＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｎｐｔＩＩ遺伝子産物の活性を選択可能なマーカーとして使用して、限定されないがＧ４１８を含む寒天ＡＳＷ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＮａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａを選択することができる。Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＡＳＷ培地並びにＳｒｉｈａｒａｎら（１９８９）及びＴａｄｒｏｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｅｎにより報告される培地が挙げられる。Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７２７】
実施例４０：Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの操作
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＰｏｕｌｓｅｎらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｐｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２（２００６），ｐｐ．１０５９−１０６５は、プラスミドＤＮＡによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換を報告した。Ｐｏｕｌｓｅｎは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにプラスミドｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔを導入した。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔは、ｎａｔタンパク質コード領域の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａフコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質遺伝子（ｆｃｐ）プロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ｎａｔタンパク質コード配列の下流）でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、ノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ）遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０４３９）をコードする配列を含む、ノーセオスリシン耐性カセットを含んだ。ｎａｔ遺伝子産物は、抗生物質ノーセオスリシンに対する耐性を付与する。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔによる形質転換前、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａは、１０ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔで形質転換すると、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの形質転換体が得られ、これは、１００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンを含む選択培地で増殖した。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおけるｎａｔ遺伝子産物の発現により、１００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンの存在下での増殖が可能となり、それによりＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａに用いられる選択可能なマーカーとしてのノーセオスリシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｐｏｕｌｓｅｎは、形質転換したＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの選択及び維持が、１００ｕｇ／ｍｌのノーセオスリシンを含有する変法ＥＳＡＷ培地（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６（１９８０），ｐｐ．２８−３５により考察されるようなもの）を含む液体培地中で行われたことを報告した。別の培地中でのＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｖｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８：３（１９８９），ｐｐ．２１９−２４０）。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａでの使用に適したさらなる選択可能なマーカーを含むさらなるプラスミドについては、Ｐｏｕｌｓｅｎによる同じ報告に考察がなされている。Ｐｏｕｌｓｅｎは、プラスミ��ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔ、並びにＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｐｏｕｌｓｅｎは、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔでコードされるノーセオスリシン耐性カセットが、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７２８】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｎａｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔが、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｆｃｐ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ａｒｍｂｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３０６：５６９３  （２００４）：ｐｐ．７９−８６による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｎａｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがノーセオスリシンを含むＥＳＡＷ寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａを選択することができる。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＶｏｌｋｍａｎら及びＨａｒｒｉｓｏｎらにより考察される培地が挙げられる。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７２９】
実施例４１：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの操作
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＣｅｒｕｔｔｉらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｃｅｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１４５：１（１９９７），ｐｐ．９７−１１０は、形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの安定した核形質転換を報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉは、微粒子ボンバードメントの形質転換方法を用いて、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに形質転換構築物ｐ［１０３０］を導入した。構築物Ｐ［１０３０］は、ａａｄＡタンパク質コード領域の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子（ＲｂｃＳ２、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０４４７２）プロモーターに動作可能に連結し、且つ３’領域（ａａｄＡタンパク質コード配列の下流）でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲｂｃＳ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結した、アミノグルコシド３’’−アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子産物をコードする配列を含む、スペクチノマイシン耐性カセットを含んだ。ａａｄＡ遺伝子産物は、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与する。Ｐ［１０３０］による形質転換前、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、９０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む培地で増殖することができなかった。Ｐ［１０３０］で形質転換すると、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの形質転換体が得られ、これは、９０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む選択培地で増殖し、それによりＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおいて用いられる選択可能なマーカーとしてのスペクチノマイシン抗生物質耐性カセットの有用性が確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン解析により行われた。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換したＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの選択及び維持が、９０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＴｒｉｓ−酢酸−リン酸培地（ＴＡＰ、Ｈａｒｒｉｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９８９により記載されるようなもの）を含む寒天プレートで行われたことを報告した。Ｃｅｒｕｔｔｉは、９０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＴＡＰ液体培地でのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖をさらに報告した。代替的な培地におけるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの増殖については、考察がなされている（例えば、Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５：３（２０１１），ｐｐ．２６０−２７０及びＹａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０７：２（２０１０），ｐｐ．２５８−２６���）。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉでの使用に適したさらなる選択可能なマーカーを含むさらなる構築物、並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける異種遺伝子発現を促進するのに適したプロモーター（ｐｒｏｔｏｍｅｒ）及び３’ＵＴＲを含めた多数の制御配列は、当該技術分野において公知であり、考察がなされている（レビューとして、Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９：４（２０１０），ｐｐ．４８６−５０１を参照）。Ｃｅｒｕｔｔｉは、形質転換ベクターＰ［１０３０］並びにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける外来遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｃｅｒｕｔｔｉは、Ｐ［１０３０］でコードされるスペクチノマイシン耐性カセットが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７３０】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるａａｄＡ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターＰ［１０３０］が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲｂｃＳ２プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＲｂｃＳ２  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１８：５８４８（２００７），ｐｐ．２４５−２５０による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの安定な形質転換は、微粒子ボンバードメントを含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ａａｄＡ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがスペクチノマイシンを含むＴＡＰ寒天培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを選択することができる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＥＳＡＷ培地、並びにＹａｎｔａｏら及びＤｅｎｔらにより考察される培地が挙げられる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７３１】
実施例４２：Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの操作
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＦｉｃｋｅｒｓらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｆｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５５（２００３），ｐｐ．７２７−７３７は、プラスミドＤＮＡによるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定した核形質転換を報告した。Ｆｉｃｋｅｒｓは、酢酸リチウム形質転換方法を用いて、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにプラスミドＪＭＰ１２３を導入した。プラスミドＪＭＰ１２３は、ｈｐｈタンパク質コード領域の上流でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ０１２６３２）に動作可能に連結され、且つｈｐｈタンパク質コード領域の下流でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｈ）をコードする配列を含む、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んだ。ＪＭＰ１２３による形質転換前、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地で増殖することができなかった。ＪＭＰ１２３で形質転換すると、形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが得られ、これは、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地で増殖することができ、それによりＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに用いられる選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。ＪＭＰ１２３に与えられる、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子のプロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターのヌクレオチド配列は、ｈｐｈコード配列のＬＩＰ２遺伝子座への相同組み換えのドナー配列として機能した。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン法によって行われた。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの選択及び維持が、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する標準的なＹＰＤ培地（酵母エキスペプトンデキストロース）を含む寒天プレートで行われたことを報告した。形質転換したＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの液体培養は、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ培地で行われた。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの培養に用いられる他の培地及び技法並びにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに用いられる数多くの他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーについては、報告がなされている（例えば、Ｐｉｇｎｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６：８（２０００），ｐｐ．３２８３−３２８９、Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７：４（２０１０），ｐｐ．２７７−２８２、及びＢａｒｔｈ  ａｎｄ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，（１９９６），Ｉｎ：Ｋ，Ｗ．（Ｅｄ．），Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙ��ａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｔｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ，ｐｐ．３１３−３８８を参照）。Ｆｉｃｋｅｒｓは、形質転換ベクターＪＭＰ１２３並びにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子プロモーター及び３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｆｉｃｋｅｒｓは、ＪＭＰ１２３でコードされるハイグロマイシン耐性カセットが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７３２】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｈｐｈ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターＪＭＰ１２３が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＩＰ２遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ｄｕｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３０（２００４），ｐｐ．３５−４４による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの安定な形質転換は、酢酸リチウム形質転換を含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｈｐｈ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを選択することができる。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、ＹＰＤ培地、及びＣｈｕａｎｇらにより記載される培地が挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７３３】
実施例４３：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅの操作
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅにおける本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＭａｃｋｅｎｚｉｅらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（２０００），ｐｐ．４６５５−４６６１は、プラスミドＤＮＡによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの安定した核形質転換を報告した。ＭａｃＫｅｎｚｉｅは、プロトプラスト形質転換方法を用いて、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにプラスミドｐＤ４を導入した。プラスミドｐＤ４は、ｈｐｔタンパク質コード領域の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ２４９８１２）に動作可能に連結され、且つｈｐｔタンパク質コード領域の下流でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  Ｎ−（５’−ホスホリボシル（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ））アントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ）遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結された、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物（ｈｐｔ）をコードする配列を含む、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを含んだ。ｐＤ４による形質転換前、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａは、３００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＤ４で形質転換すると、形質転換されたＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａが得られ、これは、３００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む培地で増殖し、それによりＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａに用いられる選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシンＢ抗生物質耐性カセットが確立された。安定な形質転換体のゲノムＤＮＡの評価は、サザン法によって行われた。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの選択及び維持が、ハイグロマイシンを含むＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）培地で行われたことを報告した。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅによる形質転換したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの液体培養は、ハイグロマイシンを含有するＰＤＡ培地又はＳ２ＧＹＥ培地（５％グルコース、０．５％酵母エキス、０．１８％ＮＨ４ＳＯ４、０．０２％ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０００１％ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ、０．１％微量元素、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む）で行われた。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの培養に用いられる他の培地及び技法については、報告がなされており、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａに用いられる他のプラスミド、プロモーター、３’ＵＴＲ、及び選択可能なマーカーについては、報告がなされている（例えば、Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５：１７（２００９）  ｐｐ．５５２９−３５及びＬｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６４：７（２００１），ｐｐ．９７９−９０を参照）。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、形質転換ベクターｐＤ４並びにＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１プロモーター及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣ遺伝子３’ＵＴＲ／ターミネーターが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおける異種遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅは、ｐＤ４でコードされるハイグロマイシン耐性カセットが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおける選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７３４】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｈｐｔ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＤ４が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおける発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａヒストンＨ４．１遺伝子プロモーターに動作可能に連結し、及びタンパク質コード配列の３’領域で、又は下流で、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣ  ３’ＵＴＲ／ターミネーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．６：１２（２０１１）による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの安定な形質転換は、プロトプラスト形質転換を含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。ｈｐｔ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがハイグロマイシンを含むＰＤＡ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａを選択することができる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａの脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｓ２ＧＹＥ培地、並びにＬｕら及びＡｎｄｏらにより記載される培地が挙げられる。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７３５】
実施例４４：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の操作
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における本発明に従う組み換え遺伝子の発現は、本明細書に考察されるとおりＫａｌｓｃｈｅｕｅｒらにより教示される方法及びベクターを改良することによって達成することができる。簡潔に言えば、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２（１９９９），ｐｐ．５０８−５１５は、プラスミドＤＮＡによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓの安定な形質転換を報告した。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、エレクトロポレーションの形質転換方法を用いて、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０にプラスミドｐＮＣ９５０１を導入した。プラスミドｐＮＣ９５０１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を、この遺伝子のプロモーター及び３’ターミネーター配列とともに含む、チオストレプトン耐性（ｔｈｉｏｒ）カセットを含んだ。ｐＮＣ９５０１による形質転換前、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓは、１ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む培地で増殖することができなかった。ｐＮＣ９５０１でＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０を形質転換すると、形質転換体が得られ、これは１ｍｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む培地で増殖し、それによりＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における選択可能なマーカーとしてのチオストレプトン耐性カセットの使用が確立された。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒにより記載される第２のプラスミド、ｐＡＫ６８は、耐性ｔｈｉｏｒカセット、並びにポリヒドロキシアルカノエート生合成のための、ｌａｃＺプロモーターにより駆動される、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  β−ケトチオラーゼ（ｐｈａＢ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ｐｈａＡ）、及びポリ３−ヒドロキシアルカン酸シンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子の遺伝子配列を含んだ。ポリヒドロキシアルカノエート生合成欠損Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０株のｐＡＫ６８形質転換後、形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０が得られ、これは非形質転換株と比べてより多量のポリヒドロキシアルカノエートを生成した。導入されたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ｐｈａＢ、ｐｈａＡ、及びｐｈａＣ酵素の検出可能な活性から、ｐＡＫ６８プラスミドでコードされる調節エレメントが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における異種遺伝子発現に適していたことが示された。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の選択及び維持が、チオストレプトンを含む標準的なルリアブロス（ＬＢ）培地、栄養ブイヨン（ＮＢ）、又は無機塩類培地（ＭＳＭ）で行われたことを報告した。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の培養に用いられる他の培地及び技法については、記載がなされている（例えば、Ｋｕｒｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４７：３−４（２０１０），ｐｐ．２１２−２１８及びＡｌｖｅｒｅｚ  ｅｔ  ���ｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５４：２（２０００），ｐｐ．２１８−２２３を参照）。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、形質転換ベクターｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子及びｌａｃＺ遺伝子のプロモーターが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における異種遺伝子発現を可能にするのに適していることを報告した。さらに、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒは、ｐＮＣ９５０１及びｐＡＫ６８でコードされるｔｈｉｏｒカセットが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における選択可能なマーカーとして用いるのに適していたことを報告した。
【０７３６】
本発明の実施形態では、選択可能なマーカーとして用いられるｔｈｉｏｒ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターｐＮＣ９５０１が、脂質生合成経路発現カセット配列をさらに含むように作製及び改変され、それにより形質転換ベクターを作り出す。脂質生合成経路発現カセットは、表７０から選択される１つ以上の脂質生合成経路タンパク質をコードし、各タンパク質コード配列は、表６９Ａ〜表６９ＤのとおりのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓの核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するように、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０における発現用にコドンが最適化される。表７０の各脂質生合成経路タンパク質について、コドンが最適化された遺伝子配列は、個々に、タンパク質コード配列の上流でｌａｃＺ遺伝子プロモーターに動作可能に連結することができる。形質転換構築物は、形質転換ベクターを標的化してゲノムに組み込むための、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０ゲノムに対する相同性領域をさらに含み得る。相同性領域は、内在する脂質生合成経路遺伝子の１つ以上のゲノム部位を破壊するように選択され得る。当業者は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０ゲノムの配列内にあるそのような相同性領域を同定することができる（Ｈｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７：９（２０１１）による文献中に参照される）。形質転換ベクターによるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の形質転換は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む周知の形質転換技法又は他の公知の方法により達成される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ａ１０６７メチルトランスフェラーゼ遺伝子産物の活性をマーカーとして使用して、限定されないがチオストレプトンを含むＬＢ培地で、形質転換ベクターにより形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０を選択することができる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０の脂質生成に適した成長培地としては、限定されないが、Ｋｕｒｏｓａｗａら及びＡｌｖａｒｅｚらにより考察される培地が挙げられる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０脂質の脂肪酸プロフィールの評価は、本明細書に記載される標準的な脂質抽出及び分析方法により評価することができる。
【０７３７】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、特許、特許明細書、刊行物を含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号も含め、その内容がすでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が本明細書によって参照により組み込まれる。本明細書で述べられている刊行物は、本発明と組み合わせて使用することが可能な試薬、方法及び概念を記載し、開示する目的で引用されている。本明細書におけるいかなる記載も、これらの引用文献が本明細書に記載した本発明との関連で従来技術であることを認めたものと解釈されるべきではない。特に、以下の特許明細書は、あらゆる目的のために、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれる：２００８年６月２日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５５６３号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、２０１０年４月１４日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、及び２００９年１１月３０日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」。
【数１】
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【数２】
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【数１３７】
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【数１４０】
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【数１４２】
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【数１４３】
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【数１４４】
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【数１４５】
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【数１４６】
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【数１４７】
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【数１４８】
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【数１４９】
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【数１５０】
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【数１５１】
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【数１５２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月6日(2013.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１７】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、株Ｃの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）株を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法によって、最初にプラスミド構築物ｐＳＺ１２８３で形質転換した。ｐＳＺ１２８３（配列番号２５６）は、先にＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号及び第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号に記載があり、Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＦＡＴＢ２（ＣｗＴＥ２）チオエステラーゼのコード配列、核ゲノムに組み込むための６Ｓゲノム領域に対する５’（配列番号８２）及び３’（配列番号８４）相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含む。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。ＣｗＴＥ２コード配列は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲ（配列番号３２）の制御下にあった。ＣｗＴＥ２及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６２５】
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）、株Ａの古典的に変異を誘発した（より多量の油生成のための）株を、実施例２に詳細に記載される微粒子銃による形質転換方法により、プラスミド構築物ｐＳＺ２００４で形質転換した。ＫＡＳＩＩ＿５’＿ｂｔｕｂ−ＳＵＣ２−ｎｒ＿２Ｘ＿Ａｍｔ０３−Ｃｈ１６ＴＥ２−ｎｒ＿ＫＡＳＩＩ＿３’と書かれるｐＳＺ２００４は、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｈ１６ＴＥ２、ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｑ３９５１３）のコード配列、核ゲノムのＫＡＳＩＩ遺伝子座で標的化して組み込むための５’及び３’相同組み換え標的配列（構築物に隣接する）、並びにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーター／５’ＵＴＲ及びＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２ショ糖インベルターゼコード領域を含んだ。Ｃｈ１６ＴＥ２は、Ｃ１４及びＣ１６脂肪酸に対して選択的特異性を示すチオエステラーゼである。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｃ２発現カセットは配列番号１５９として列挙され、選択マーカーとして機能した。Ｃｈ１６ＴＥコード配列は、タンデムリピートのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）、及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下にあった。Ｃｈ１６ＴＥ及びｓｕｃ２のタンパク質コード領域は、表２に従うＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  ＵＴＥＸ  １４３５核遺伝子に固有のコドンの偏りを反映するようにコドンを最適化した。ｐＳＺ２００４は、配列表に配列番号２４９として示される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４４】
実施例１９：操作された微生物から生成される加工油の特徴付け
Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ（ＵＴＥＸ  １４３５）を形質転換ベクターｐＳＺ１５００（配列番号２５０）で形質転換する方法及び効果は、先にＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号及び第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８４６３号に記載されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５６】
【表７９】
2014511140.tif 000429
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５８】
構築物ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１（配列番号２５３）における関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによるＦＡＴＡ１遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ａ  ＦＡＴＡ１ゲノム領域が続く。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５９】
Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ  ＡＣＰ−チオエステラーゼ２（ＣｗＴＥ２）遺伝子（寄託番号Ｕ５６１０４）を株ＡのＦＡＴＡ１遺伝子座に導入するため、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ  Ａｍｔ０３プロモーター／５’ＵＴＲ（配列番号８９）及びＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲの制御下でＣｗＴＥ２遺伝子のタンパク質コード領域を発現するよう構築物を生じさせた。株Ａで発現させた構築物は、ＦＡＴＡ１−ＣｒｂＴｕｂ＿ｙＩｎｖ＿ｎｒ：：ａｍｔ０３＿ＣｗＴＥ２＿ｎｒ−ＦＡＴＡ１（配列番号２５４）と書くことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６６９】
６Ｓ：：β−Ｔｕｂ：ｓｕｃ２：ｎｒ：：β−ｔｕｂ：ヘアピンＦａｔＡ：ｎｒ：：６Ｓにおける関連する制限部位を小文字、太字且つ下線で示し、５’−３’にそれぞれＢｓｐＱ  １、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、ＢｓｐＱ  Ｉである。ＢｓｐＱＩ部位が形質転換ＤＮＡの５’末端及び３’末端を区切る。太字で小文字の配列は、相同組み換えによる６ｓ遺伝子座での標的化した組み込みを可能にする株Ａ由来のゲノムＤＮＡを表す。５’から３’方向に進んで、酵母ショ糖インベルターゼ遺伝子（株Ａがショ糖を代謝する能力を付与する）の発現を駆動するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターを、囲い文字のテキストにより示す。インベルターゼのイニシエーターＡＴＧ及びターミネーターＴＧＡを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、コード領域を小文字のイタリックで示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲを小文字の下線テキストにより示し、その後に、囲い文字のイタリックテキストにより示されるヘアピンＦａｔＡ１の発現を駆動する第２のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  β−チューブリンプロモーターが続く。ＦａｔＡ１のイニシエーターＡＴＧコドンを、大文字、太字のイタリックにより示し、一方、ＦａｔＡ１コード領域の残りの第１エクソンを大文字により示す。ＦａｔＡ遺伝子のイントロンを下線の大文字として示し、下線、大文字、太字のイタリックで示すリンカー領域を、ＦａｔＡ１イントロン／逆方向の第１エクソンジャンクションに設け、これらのベクターにおけるＲＮＡスプライシングを促進した。ＦａｔＡ１の反転した第１エクソンは大文字により示す。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ硝酸還元酵素３’ＵＴＲはここでも小文字の下線テキストにより示し、その後に、太字の小文字テキストにより示される株Ａ  ６Ｓゲノム領域が続く。このＲＮＡｉ構築物のＦＡＴＡ部分の配列は、配列番号２５５として列挙される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７３７】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、特許、特許明細書、刊行物を含め、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号も含め、その内容がすでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その全体が本明細書によって参照により組み込まれる。本明細書で述べられている刊行物は、本発明と組み合わせて使用することが可能な試薬、方法及び概念を記載し、開示する目的で引用されている。本明細書におけるいかなる記載も、これらの引用文献が本明細書に記載した本発明との関連で従来技術であることを認めたものと解釈されるべきではない。特に、以下の特許明細書は、あらゆる目的のために、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれる：２００８年６月２日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５５６３号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、２０１０年４月１４日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３１１０８号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｏｉｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、及び２００９年１１月３０日に出願したＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６１４２号、名称「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｉｌｓ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」。
【数１】
2014511140.tif 000430
【数２】
2014511140.tif 000431
【数３】
2014511140.tif 000432
【数４】
2014511140.tif 000433
【数５】
2014511140.tif 000434
【数６】
2014511140.tif 000435
【数７】
2014511140.tif 000436
【数８】
2014511140.tif 000437
【数９】
2014511140.tif 000438
【数１０】
2014511140.tif 000439
【数１１】
2014511140.tif 000440
【数１２】
2014511140.tif 000441
【数１３】
2014511140.tif 000442
【数１４】
2014511140.tif 000443
【数１５】
2014511140.tif 000444
【数１６】
2014511140.tif 000445
【数１７】
2014511140.tif 000446
【数１８】
2014511140.tif 000447
【数１９】
2014511140.tif 000448
【数２０】
2014511140.tif 000449
【数２１】
2014511140.tif 000450
【数２２】
2014511140.tif 000451
【数２３】
2014511140.tif 000452
【数２４】
2014511140.tif 000453
【数２５】
2014511140.tif 000454
【数２６】
2014511140.tif 000455
【数２７】
2014511140.tif 000456
【数２８】
2014511140.tif 000457
【数２９】
2014511140.tif 000458
【数３０】
2014511140.tif 000459
【数３１】
2014511140.tif 000460
【数３２】
2014511140.tif 000461
【数３３】
2014511140.tif 000462
【数３４】
2014511140.tif 000463
【数３５】
2014511140.tif 000464
【数３６】
2014511140.tif 000465
【数３７】
2014511140.tif 000466
【数３８】
2014511140.tif 000467
【数３９】
2014511140.tif 000468
【数４０】
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【数４１】
2014511140.tif 000470
【数４２】
2014511140.tif 000471
【数４３】
2014511140.tif 000472
【数４４】
2014511140.tif 000473
【数４５】
2014511140.tif 000474
【数４６】
2014511140.tif 000475
【数４７】
2014511140.tif 000476
【数４８】
2014511140.tif 000477
【数４９】
2014511140.tif 000478
【数５０】
2014511140.tif 000479
【数５１】
2014511140.tif 000480
【数５２】
2014511140.tif 000481
【数５３】
2014511140.tif 000482
【数５４】
2014511140.tif 000483
【数５５】
2014511140.tif 000484
【数５６】
2014511140.tif 000485
【数５７】
2014511140.tif 000486
【数５８】
2014511140.tif 000487
【数５９】
2014511140.tif 000488
【数６０】
2014511140.tif 000489
【数６１】
2014511140.tif 000490
【数６２】
2014511140.tif 000491
【数６３】
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【数６４】
2014511140.tif 000493
【数６５】
2014511140.tif 000494
【数６６】
2014511140.tif 000495
【数６７】
2014511140.tif 000496
【数６８】
2014511140.tif 000497
【数６９】
2014511140.tif 000498
【数７０】
2014511140.tif 000499
【数７１】
2014511140.tif 000500
【数７２】
2014511140.tif 000501
【数７３】
2014511140.tif 000502
【数７４】
2014511140.tif 000503
【数７５】
2014511140.tif 000504
【数７６】
2014511140.tif 000505
【数７７】
2014511140.tif 000506
【数７８】
2014511140.tif 000507
【数７９】
2014511140.tif 000508
【数８０】
2014511140.tif 000509
【数８１】
2014511140.tif 000510
【数８２】
2014511140.tif 000511
【数８３】
2014511140.tif 000512
【数８４】
2014511140.tif 000513
【数８５】
2014511140.tif 000514
【数８６】
2014511140.tif 000515
【数８７】
2014511140.tif 000516
【数８８】
2014511140.tif 000517
【数８９】
2014511140.tif 000518
【数９０】
2014511140.tif 000519
【数９１】
2014511140.tif 000520
【数９２】
2014511140.tif 000521
【数９３】
2014511140.tif 000522
【数９４】
2014511140.tif 000523
【数９５】
2014511140.tif 000524
【数９６】
2014511140.tif 000525
【数９７】
2014511140.tif 000526
【数９８】
2014511140.tif 000527
【数９９】
2014511140.tif 000528
【数１００】
2014511140.tif 000529
【数１０１】
2014511140.tif 000530
【数１０２】
2014511140.tif 000531
【数１０３】
2014511140.tif 000532
【数１０４】
2014511140.tif 000533
【数１０５】
2014511140.tif 000534
【数１０６】
2014511140.tif 000535
【数１０７】
2014511140.tif 000536
【数１０８】
2014511140.tif 000537
【数１０９】
2014511140.tif 000538
【数１１０】
2014511140.tif 000539
【数１１１】
2014511140.tif 000540
【数１１２】
2014511140.tif 000541
【数１１３】
2014511140.tif 000542
【数１１４】
2014511140.tif 000543
【数１１５】
2014511140.tif 000544
【数１１６】
2014511140.tif 000545
【数１１７】
2014511140.tif 000546
【数１１８】
2014511140.tif 000547
【数１１９】
2014511140.tif 000548
【数１２０】
2014511140.tif 000549
【数１２１】
2014511140.tif 000550
【数１２２】
2014511140.tif 000551
【数１２３】
2014511140.tif 000552
【数１２４】
2014511140.tif 000553
【数１２５】
2014511140.tif 000554
【数１２６】
2014511140.tif 000555
【数１２７】
2014511140.tif 000556
【数１２８】
2014511140.tif 000557
【数１２９】
2014511140.tif 000558
【数１３０】
2014511140.tif 000559
【数１３１】
2014511140.tif 000560
【数１３２】
2014511140.tif 000561
【数１３３】
2014511140.tif 000562
【数１３４】
2014511140.tif 000563
【数１３５】
2014511140.tif 000564
【数１３６】
2014511140.tif 000565
【数１３７】
2014511140.tif 000566
【数１３８】
2014511140.tif 000567
【数１３９】
2014511140.tif 000568
【数１４０】
2014511140.tif 000569
【数１４１】
2014511140.tif 000570
【数１４２】
2014511140.tif 000571
【数１４３】
2014511140.tif 000572
【数１４４】
2014511140.tif 000573
【数１４５】
2014511140.tif 000574
【数１４６】
2014511140.tif 000575
【数１４７】
2014511140.tif 000576
【数１４８】
2014511140.tif 000577
【数１４９】
2014511140.tif 000578
【数１５０】
2014511140.tif 000579
【数１５１】
2014511140.tif 000580
【数１５２】
2014511140.tif 000581
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
本発明のこれらの及び他の態様及び実施形態を、添付の図面（図面の簡単な説明はこのすぐ後に続く）、以下の本発明の詳細な説明において説明し、及び以下の例において例証する。上記で及び本出願全体にわたって考察される特徴のいずれも、本発明の種々の実施形態に組み合わせることができる。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
トリアシルグリセリドを含む天然油、又は上記天然油から生成される生成物を生成する方法であって、
組み換え微生物の細胞であって、
（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きであって、場合により上記細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む細胞を育てることと；
上記細胞から上記天然油を回収することとを含み、場合により上記天然油を処理して食品、燃料、又は化学製品を作り出すことをさらに含む方法において、
上記天然油が、上記組み換え核酸によって変化した脂肪酸プロフィールを有する、方法。
（項目２）
上記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路によって脂肪酸を合成する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記微生物が微細藻類である、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記微細藻類が偏性従属栄養生物である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種である、項目２に記載の方法。
（項目６）
上記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、項目２に記載の方法。
（項目８）
上記細胞が、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
上記育てることが、従属栄養で育てることである、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記脂肪酸デサチュラーゼが、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上である、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
上記細胞が、乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％のトリグリセリドを含むように育てられる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記油が、５００、５０、又は５ｐｐｍ未満の有色分子を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
上記組み換え核酸が安定に組み込まれる、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記組み換え核酸が、上記微生物の染色体に安定に組み込まれる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記細胞が、酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によって上記酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の上記低下又は消失が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によって上記１つ以上の遺伝子が分断又は置換されることに起因する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記組み換え細胞が、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子をさらに含み、それによりリシノール酸を合成する、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記組み換え細胞が、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
上記細胞が、少なくとも４０、５０、６０、７０、又は８０％のＣ１６脂肪酸を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記細胞が、少なくとも５０〜７５％のＣ１６：０を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記細胞が、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有することによってさらに特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、項目２０又は２１に記載の方法。
（項目２３）
上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、上記細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｒａｓｅ）と比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解においてより高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成する、項目１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、上記ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断する、項目１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
上記組み換え細胞が、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
上記生成される油が、上記組み換え核酸の結果としてのより短い平均脂肪酸鎖長によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記組み換え細胞が、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
核酸が、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子が、上記脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる、項目２７又は２８に記載の方法。
（項目３０）
上記生成される油が、高オレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する、項目２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
上記脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％をオレイン酸が構成する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記組み換え細胞が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
上記生成される油が、上記組み換え核酸の結果としてＣ１８：１脂肪酸が高まり、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられ、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法、上記組み換え細胞が、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記生成される油が、Ｃ１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記生成される油が、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記生成される油が、少なくとも５０〜７５％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記生成される油が、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有する脂肪酸プロフィールによってさらに特徴づけられる、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
上記細胞が、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
上記生成される油が、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有することによって特徴づけられる、項目３５に記載の方法。
（項目４２）
上記油をさらに処理することが、精製、漂白、脱臭、メタセシス、トランスエステル化、水素化、加水分解、水素化、脱酸素、ハイドロクラッキング、異性化、ヒドロキシル化（ｈｙｄｒｏｌｘｙｌａｔｉｏｎ）、インターエステル化、アミド化、スルホン化、及び硫化（ｓｕｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ）のうちの１つ以上を含む、項目１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
上記油が、食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、硫化油、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン、燃料ブレンドストック、燃料添加剤、潤滑油用添加剤、又は塗料を作り出すために処理される、項目１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法によって得られる天然油。
（項目４５）
項目４４に記載の天然油から作られる生成物。
（項目４６）
食用油、脂肪酸、脂肪族アルコール、潤滑剤、石鹸、脂肪酸エステル、脂肪酸エトキシレート、脂肪族アミン、塩化アルキル（ａｋｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、脂肪族アルコールエトキシレート、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪酸アルカノールアミド、スルホン化油、硫化油、ディーゼル燃料、ジェット燃料、ガソリン、燃料ブレンドストック、燃料添加剤、化学添加物、又は塗料を含む、項目４５に記載の生成物。
（項目４７）
組み換え細胞であって、
（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きであって、場合により上記細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｃ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ又はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き；又は
（ｄ）ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させ、且つ活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む、細胞。
（項目４８）
上記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路によって脂肪酸を合成する、項目４６に記載の細胞。
（項目４９）
上記微生物が微細藻類である、項目４８に記載の細胞。
（項目５０）
上記微細藻類が偏性従属栄養生物である、項目４９に記載の細胞。
（項目５１）
上記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ又はＣｈｌｏｒｅｌｌａの種である、項目５０に記載の細胞。
（項目５２）
上記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、項目５１に記載の細胞。
（項目５３）
上記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、項目５１に記載の細胞。
（項目５４）
活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５５）
従属栄養で成長することができる、項目４６〜５４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５６）
上記脂肪酸デサチュラーゼが、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、又はω−６オレイン酸デサチュラーゼ、又はデルタ１２脂肪酸デサチュラーゼのうちの１つ以上である、項目４６〜５５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５７）
乾燥細胞重量で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は５０〜９０％のトリグリセリドを含むように育てられる能力を有する、項目４６〜５６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５８）
上記組み換え核酸が安定に組み込まれる、項目４６〜５７のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５９）
上記組み換え核酸が、上記微生物の染色体に安定に組み込まれる、項目５８に記載の細胞。
（項目６０）
少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含む、項目５９に記載の細胞。
（項目６１）
酵素をコードする遺伝子の転写物を標的とするアンチセンス、ＲＮＡｉ、又はｄｓＲＮＡの発現によって上記酵素の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、項目４６〜６０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６２）
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現の上記低下又は消失が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼ、又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によって上記１つ以上の遺伝子が分断又は置換されることに起因する、項目４６〜６１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６３）
上記組み換え細胞が、オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子をさらに含み、それによりリシノール酸を合成する、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６４）
上記組み換え細胞が、ＫＡＳＩＩ遺伝子によりコードされるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩの発現を低下又は消失させ、且つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６５）
少なくとも４０、５０、６０、７０、又は８０％のＣ１６脂肪酸を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、項目６４に記載の細胞。
（項目６６）
少なくとも５０〜７５％のＣ１６：０を有することによって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、項目６５に記載の細胞。
（項目６７）
少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有することによってさらに特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する油を生成する、項目６６に記載の細胞。
（項目６８）
上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、上記細胞の天然のアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅａｒａｓｅ）と比べてＣ８〜Ｃ１６脂肪酸アシル鎖の加水分解においてより高い活性を有する活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを生成する、項目６４又は６５に記載の細胞。
（項目６９）
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子が、ＫＡＳＩＩ遺伝子を分断する、項目６４〜６６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７０）
上記組み換え細胞が、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働きをする核酸を含む、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７１）
上記生成される油が、上記組み換え核酸の結果としてのより短い平均脂肪酸鎖長によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、項目７０に記載の細胞。
（項目７２）
上記組み換え細胞が、少なくとも１つのＦＡＤ遺伝子によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させ、且つ活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードするステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７３）
核酸が、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の複数の複製物によりコードされる脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓｔａｕｒａｓｅ）の発現を低下又は消失させる働きをする、項目７２に記載の細胞。
（項目７４）
上記ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ外来遺伝子が、上記脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のコード領域内の遺伝子座に組み換えられる、項目７２又は７３に記載の細胞。
（項目７５）
上記生成される油が、高オレイン酸を有する脂肪酸プロフィールを有する、項目７２〜７４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７６）
上記脂肪酸の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％をオレイン酸が構成する、項目７５に記載の細胞。
（項目７７）
上記組み換え細胞が、活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ外来遺伝子の産物を発現する働きをする核酸を含む、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７８）
上記生成される油が、上記組み換え核酸の結果としてＣ１８：１脂肪酸が高まり、且つＣ１６脂肪酸が低下した脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、項目７７に記載の細胞。
（項目７９）
上記組み換え細胞が、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現をＲＮＡ干渉によって低下又は消失させる働きをする核酸を含む、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８０）
上記生成される油が、Ｃ１８：０脂肪酸の増加によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、項目７９に記載の細胞。
（項目８１）
上記生成される油が、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、項目８０に記載の細胞。
（項目８２）
上記生成される油が、少なくとも５０〜７５％のＣ１８：０を有する脂肪酸プロフィールによって特徴づけられる、項目８０に記載の細胞。
（項目８３）
上記生成される油が、少なくとも２０〜４０％のＣ１８：１を有する脂肪酸プロフィールによってさらに特徴づけられる、項目７９〜８２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８４）
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ、ステアロイルＡＣＰデサチュラーゼ、又は脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の２つの複製物の発現を低下又は消失させる働きをする組み換え核酸を含む、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８５）
活性なω−３脂肪酸デサチュラーゼ及び／又はω−６オレイン酸デサチュラーゼをコードする脂肪酸デサチュラーゼ外来遺伝子の産物を発現する働きをする、項目４６〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８６）
上記生成される油が、高レベルのリノール酸、リノレン酸、又はその両方によって特徴づけられる脂肪酸プロフィールを有する、項目８５に記載の細胞。
（項目８７）
上記油の脂肪酸プロフィールが、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０％のリノール酸、リノレン酸、又はその両方を有することによって特徴づけられる、項目８６に記載の細胞。
（項目８８）
項目４６〜８７のいずれか一項に記載の細胞から生成される天然油又は油含有生成物。
（項目８９）
リシノール酸を含むトリアシルグリセリドを含む天然油、又は上記天然油から生成される生成物を生成する方法であって、
組み換え微生物の細胞を育てることを含み、上記細胞が、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それにより上記リシノール酸を合成する、方法。
（項目９０）
上記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する、項目４８に記載の方法。
（項目９１）
上記微生物が微細藻類である、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
上記微細藻類が偏性従属栄養生物である、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
上記微細藻類がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種である、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
上記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
上記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、項目９１に記載の方法。
（項目９６）
上記細胞が、活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、項目４６〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
上記育てることが、従属栄養で育てることである、項目４６〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
上記細胞が、活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする上記組み換え核酸が存在しないときに少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％のオレイン酸を生成する、項目４６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
上記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼに対する基質レベルを高めるためオレイン酸生成を高める働きをする組み換え核酸をさらに含む、項目８９〜９８  ９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
上記細胞が、
（ａ）活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
項目８９〜１００のいずれか一項に記載の方法に従って作られる生成物。
（項目１０２）
活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする組み換え核酸を含み、それによりリシノール酸を合成する微生物細胞。
（項目１０３）
上記微生物がＩＩ型脂肪酸生合成経路を有する、項目１０２に記載の細胞。
（項目１０４）
上記微生物が微細藻類である、項目１０３に記載の細胞。
（項目１０５）
上記微細藻類が偏性従属栄養生物である、項目１０４に記載の細胞。
（項目１０６）
上記微細藻類がＰｒｏｔｏｔｈｅｃａの種である、項目１０５に記載の細胞。
（項目１０７）
上記微細藻類が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、又はＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉである、項目１０６に記載の細胞。
（項目１０８）
上記微細藻類が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、項目１０４に記載の細胞。
（項目１０９）
活性なショ糖インベルターゼを発現する組み換え細胞である、項目１０２〜１０８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１０）
従属栄養で成長することができる、項目１０２〜１０９のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１１）
活性なオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働きをする上記組み換え核酸が存在しないときに少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％のオレイン酸を生成する、項目１０２〜１０９のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１２）
上記オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼに対する基質レベルを高めるためオレイン酸生成を高める働きをする組み換え核酸をさらに含む、項目１０２〜１１１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１３）
（ａ）活性なステアロイルＡＣＰデサチュラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ脂肪酸デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子によりコードされる酵素の発現を低下又は消失させる働き；又は
（ｂ）活性なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする外来遺伝子の産物を発現し、且つ活性なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする外来遺伝子の産物を発現する働き
をする組み換え核酸を含む、項目１１２に記載の細胞。
（項目１１４）
項目４４に記載の油を含む食品。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014511140000001.app
【国際調査報告】
2014511140.tif 000582
2014511140.tif 000583