(57)【要約】本発明は、RSPO結合剤および、癌などの疾患を処置するために該剤を使用する方法に関する。本発明は、ヒトRSPOタンパク質に特異的に結合し、かつβ-カテニン活性を調節する抗体を提供する。本発明はさらに、RSPOタンパク質の活性を調節する剤、例えば、RSPO1、RSPO2、および/またはRSPO3に特異的に結合して腫瘍成長を阻害する抗体を使用する方法を提供する。腫瘍または癌を有する患者に本発明の剤または抗体の治療有効量を投与する工程を含む、癌を処置する方法も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000115
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000116
を含む重鎖CDR3;ならびに/または
（b）
2014524746.tif 000117
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3
を含み、ヒトR-Spondin 1（RSPO1）に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
（a）（a）SEQ ID NO: 10に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）（b）SEQ ID NO: 11に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含み、ヒトRSPO1に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項３】
（a）（a）SEQ ID NO: 10に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）（b）SEQ ID NO: 11に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項2記載の抗体。
【請求項４】
（a）SEQ ID NO: 10を含む重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 11を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項2記載の抗体。
【請求項５】
（a）SEQ ID NO: 10から本質的になる重鎖可変領域;および
（b）SEQ ID NO: 11から本質的になる軽鎖可変領域
を含む、請求項2記載の抗体。
【請求項６】
（a）SEQ ID NO: 55に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 59に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含み、ヒトRSPO1に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項７】
（a）SEQ ID NO: 55に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 59に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項6記載の抗体。
【請求項８】
（a）SEQ ID NO: 55を含む重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 59を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項6記載の抗体。
【請求項９】
（a）SEQ ID NO: 55から本質的になる重鎖可変領域;および
（b）SEQ ID NO: 59から本質的になる軽鎖可変領域
を含む、請求項6記載の抗体。
【請求項１０】
RSPO1への特異的結合について請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体と競合する、単離された抗体。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体と同じRSPO1上のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体に結合されるRSPO1上のエピトープと重複するRSPO1上のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項１３】
組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、または二重特異性抗体である、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
ヒト化抗体である、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト抗体である、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１６】
IgG1抗体またはIgG2抗体である、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１７】
抗原結合部位を含む抗体断片である、請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１８】
ATCC寄託番号PTA-11970を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項１９】
ヒト化型の、請求項18記載の抗体。
【請求項２０】
少なくとも1つのロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体（LGR）へのRSPO1の結合を阻害する、請求項1〜19のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２１】
前記LGRが、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される、請求項20記載の抗体。
【請求項２２】
前記LGRが、LGR5である、請求項21記載の抗体。
【請求項２３】
RSPO1シグナル伝達を阻害する、請求項1〜22のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２４】
β-カテニンの活性化を阻害する、請求項1〜23のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２５】
β-カテニンシグナル伝達を阻害する、請求項1〜24のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２６】
腫瘍成長を阻害する、請求項1〜25のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２７】
腫瘍内の分化マーカーの発現を誘導する、請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２８】
腫瘍内の細胞の分化を誘導する、請求項1〜27のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２９】
腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる、請求項1〜28のいずれか一項記載の抗体。
【請求項３０】
SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 68、およびSEQ ID NO: 69からなる群より選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３１】
抗体である、請求項30記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の抗体またはポリペプチドを含むかまたは産生する、細胞。
【請求項３３】
ATCC寄託番号PTA-11970を有する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項３４】
請求項1〜31のいずれか一項記載の抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３５】
SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、およびSEQ ID NO: 58からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３６】
請求項34または請求項35記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３７】
請求項34もしくは請求項35記載のポリヌクレオチドまたは請求項36記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の抗体またはポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３９】
腫瘍の成長を阻害する方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の有効量と該腫瘍を接触させる工程を含む、方法。
【請求項４０】
対象における腫瘍の成長を阻害する方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
対象における腫瘍細胞の分化を誘導する方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４２】
対象における腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４３】
細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の有効量と該細胞を接触させる工程を含む、方法。
【請求項４４】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍が、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸管腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される、請求項39〜42または44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
対象における癌を処置する方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４９】
前記癌が、結腸直腸癌、卵巣癌、膵癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸管癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、および頭頸部癌からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が、結腸直腸癌または膵癌である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記結腸直腸癌が、大腸腺腫症（APC）遺伝子における不活性化変異を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記結腸直腸癌が、APC遺伝子における不活性化変異を含まない、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
前記結腸直腸癌が、野生型APC遺伝子を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
前記結腸直腸癌が、β-カテニン遺伝子における活性化変異を含まない、請求項50記載の方法。
【請求項５５】
前記癌が卵巣癌である、請求項49記載の方法。
【請求項５６】
前記腫瘍または前記癌が、正常組織におけるRSPO1のレベルと比べて上昇したレベルのRSPO1を発現する、請求項39〜42または44〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、腫瘍または癌を除去されたことがある、請求項40〜42または45〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
前記腫瘍または癌におけるRSPO1発現のレベルを測定する工程をさらに含む、請求項39〜42または44〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
前記腫瘍または癌が、APC遺伝子における不活性化変異を有しているかを判定する工程をさらに含む、請求項39〜42または44〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
前記腫瘍または癌が、β-カテニン遺伝子における活性化変異を有しているかを判定する工程をさらに含む、請求項39〜42または44〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
RSPO1発現のレベルを測定する前記工程が、前記抗体による処置または該抗体との接触の前に行われる、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍または癌が、上昇したレベルのRSPO1発現を有する場合、前記抗体を、
（a）前記対象に投与するか;または
（b）該腫瘍もしくは腫瘍細胞と接触させる、
請求項61記載の方法。
【請求項６３】
対象における疾患を処置する方法であって、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を投与する工程を含み、該疾患が、β-カテニンの活性化に関連する、方法。
【請求項６４】
少なくとも一種のさらなる治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項39〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
前記さらなる治療剤が、化学療法剤である、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
前記さらなる治療剤が、血管新生阻害剤である、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
前記対象がヒトである、請求項39〜42または45〜66のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
RSPO1に結合する抗体による処置のためのヒト対象を選択する方法であって、該対象が、上昇した発現レベルのRSPO1を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、該腫瘍が、上昇した発現レベルのRSPO1を有する場合、該対象が、RSPO1に特異的に結合する抗体による処置のために選択される、方法。
【請求項６９】
前記腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
RSPO1の前記発現レベルが、PCRベースのアッセイ、マイクロアレイ解析、またはヌクレオチド配列決定によって試料中で測定される、請求項58、68、または69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
RSPO1に結合する抗体による処置のためのヒト対象を選択する方法であって、該対象が、APC遺伝子における不活性化変異を含む腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、該腫瘍が、該APC遺伝子における不活性化変異を有する場合、該対象が、RSPO1に特異的に結合する抗体による処置のために選択される、方法。
【請求項７２】
前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
APC遺伝子における不活性化変異が、PCRベースのアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイ解析、またはヌクレオチド配列決定によって試料中で判定される、請求項59、71、または72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
前記試料が、新鮮腫瘍試料、凍結腫瘍試料、またはホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項70または請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記抗体が、請求項1〜29のいずれか一項記載の抗体である、請求項68〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
（a）SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000118
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000119
を含む重鎖CDR3;ならびに/または
（b）
2014524746.tif 000120
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3
を含み、ヒトR-Spondin 2（RSPO2）に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項７７】
（a）SEQ ID NO: 27に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 28に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含み、ヒトRSPO2に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項７８】
（a）SEQ ID NO: 27に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 28に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項77記載の抗体。
【請求項７９】
（a）SEQ ID NO: 27を含む重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 28を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項77記載の抗体。
【請求項８０】
（a）SEQ ID NO: 27から本質的になる重鎖可変領域;および
（b）SEQ ID NO: 28から本質的になる軽鎖可変領域
を含む、請求項77記載の抗体。
【請求項８１】
（a）SEQ ID NO: 63に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 67もしくはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含み、ヒトRSPO2に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項８２】
（a）SEQ ID NO: 63に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 67もしくはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項81記載の抗体。
【請求項８３】
（a）SEQ ID NO: 63を含む重鎖可変領域;および/または
（b）SEQ ID NO: 67もしくはSEQ ID NO: 76を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項81記載の抗体。
【請求項８４】
（a）SEQ ID NO: 63から本質的になる重鎖可変領域;および
（b）SEQ ID NO: 67から本質的になる軽鎖可変領域
を含む、請求項81記載の抗体。
【請求項８５】
（a）SEQ ID NO: 63から本質的になる重鎖可変領域;および
（b）SEQ ID NO: 76から本質的になる軽鎖可変領域
を含む、請求項81記載の抗体。
【請求項８６】
RSPO2に対する特異的結合について請求項76〜85のいずれか一項記載の抗体と競合する、単離された抗体。
【請求項８７】
請求項76〜86のいずれか一項記載の抗体と同じRSPO2上のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項８８】
請求項76〜86のいずれか一項記載の抗体に結合されるRSPO2上のエピトープと重複するRSPO2上のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項８９】
組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、または二重特異性抗体である、請求項76〜88のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９０】
ヒト化抗体である、請求項76〜89のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９１】
ヒト抗体である、請求項76〜89のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９２】
IgG1抗体またはIgG2抗体である、請求項76〜91のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９３】
抗原結合部位を含む抗体断片である、請求項76〜92のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９４】
ATCC寄託番号PTA-12021を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項９５】
ヒト化型の、請求項94記載の抗体。
【請求項９６】
少なくとも1つのロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体（LGR）へのRSPO2の結合を阻害する、請求項76〜95のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９７】
前記LGRが、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される、請求項96記載の抗体。
【請求項９８】
前記LGRがLGR5である、請求項97記載の抗体。
【請求項９９】
RSPO2シグナル伝達を阻害する、請求項76〜98のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１００】
β-カテニンの活性化を阻害する、請求項76〜99のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０１】
β-カテニンシグナル伝達を阻害する、請求項76〜100のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０２】
腫瘍成長を阻害する、請求項76〜101のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０３】
腫瘍内の分化マーカーの発現を誘導する、請求項76〜102のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０４】
腫瘍内の細胞の分化を誘導する、請求項76〜103のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０５】
腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる、請求項76〜104のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０６】
SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、およびSEQ ID NO: 76からなる群より選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１０７】
抗体である、請求項106記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
請求項76〜107のいずれか一項記載の抗体またはポリペプチドを含むかまたは産生する、細胞。
【請求項１０９】
ATCC寄託番号PTA-12021を有する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１１０】
請求項76〜107のいずれか一項記載の抗体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１１１】
SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72、およびSEQ ID NO: 75からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１１２】
請求項110または請求項111記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１１３】
請求項110もしくは請求項111記載のポリヌクレオチドまたは請求項112記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１１４】
請求項76〜107のいずれか一項記載の抗体またはポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１１５】
腫瘍の成長を阻害する方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の有効量と該腫瘍を接触させる工程を含む、方法。
【請求項１１６】
対象における腫瘍の成長を阻害する方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１７】
対象における腫瘍細胞の分化を誘導する方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１８】
対象における腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１９】
細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の有効量と該細胞を接触させる工程を含む、方法。
【請求項１２０】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項119記載の方法。
【請求項１２１】
前記腫瘍が、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸管腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される、請求項115〜118または120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
前記腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項121記載の方法。
【請求項１２４】
対象における癌を処置する方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１２５】
前記癌が、結腸直腸癌、卵巣癌、膵癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸管癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、および頭頸部癌からなる群より選択される、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
前記結腸直腸癌が、大腸腺腫症（APC）遺伝子における不活性化変異を含む、請求項126記載の方法。
【請求項１２８】
前記結腸直腸癌が、APC遺伝子における不活性化変異を含まない、請求項126記載の方法。
【請求項１２９】
前記結腸直腸癌が野生型APC遺伝子を含む、請求項126記載の方法。
【請求項１３０】
前記結腸直腸癌が、β-カテニン遺伝子における活性化変異を含まない、請求項126記載の方法。
【請求項１３１】
前記癌が膵癌である、請求項125記載の方法。
【請求項１３２】
前記腫瘍または前記癌が、正常組織におけるRSPO2のレベルと比べて上昇したレベルのRSPO2を発現する、請求項115〜118または120〜131のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３３】
前記対象が、腫瘍または癌を除去されたことがある、請求項116〜118または121〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
前記腫瘍または癌におけるRSPO2の発現レベルを測定する工程をさらに含む、請求項115〜118または120〜133のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
前記腫瘍または癌が、APC遺伝子における不活性化変異を有しているかを判定する工程をさらに含む、請求項115〜118または120〜134のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３６】
前記腫瘍または癌が、β-カテニン遺伝子における活性化変異を有しているかを判定する工程をさらに含む、請求項115〜118または120〜135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
RSPO2発現のレベルを測定する前記工程が、前記抗体による処置または前記抗体との接触の前に行われる、請求項134記載の方法。
【請求項１３８】
前記腫瘍または癌が、上昇した発現レベルのRSPO2を有する場合に、前記抗体を、
（a）前記対象に投与するか;または
（b）該腫瘍もしくは腫瘍細胞と接触させる、
請求項137記載の方法。
【請求項１３９】
対象における疾患を処置する方法であって、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を投与する工程を含み、該疾患が、β-カテニンの活性化に関連する、方法。
【請求項１４０】
少なくとも一種のさらなる治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項115〜139のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４１】
前記さらなる治療剤が、化学療法剤である、請求項140記載の方法。
【請求項１４２】
前記さらなる治療剤が、Wnt経路阻害剤である、請求項140記載の方法。
【請求項１４３】
前記対象がヒトである、請求項116〜118または121〜142のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４４】
RSPO2に結合する抗体による処置のためのヒト対象を選択する方法であって、該対象が、上昇した発現レベルのRSPO2を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、該腫瘍が、上昇した発現レベルのRSPO2を有する場合、該対象が、RSPO2に特異的に結合する抗体による処置のために選択される、方法。
【請求項１４５】
前記腫瘍が膵腫瘍である、請求項144記載の方法。
【請求項１４６】
前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項144記載の方法。
【請求項１４７】
前記腫瘍が肺腫瘍である、請求項144記載の方法。
【請求項１４８】
前記腫瘍が黒色腫腫瘍である、請求項144記載の方法。
【請求項１４９】
前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項144記載の方法。
【請求項１５０】
RSPO2の前記発現レベルが、PCRベースのアッセイ、マイクロアレイ解析、またはヌクレオチド配列決定によって試料中で測定される、請求項134または144〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
RSPO2に結合する抗体による処置のためのヒト対象を選択する方法であって、該対象が、APC遺伝子における不活性化変異を含む腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、該腫瘍が、該APC遺伝子における不活性化変異を有する場合、該対象が、RSPO2に特異的に結合する抗体による処置のために選択される、方法。
【請求項１５２】
前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項151記載の方法。
【請求項１５３】
APC遺伝子における不活性化変異が、PCRベースのアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイ解析、またはヌクレオチド配列決定によって試料中で判定される、請求項135、151、または152のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５４】
前記試料が、新鮮腫瘍試料、凍結腫瘍試料、またはホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項150または請求項153記載の方法。
【請求項１５５】
前記抗体が、請求項76〜105のいずれか一項記載の抗体である、請求項144〜154のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５６】
SEQ ID NO: 25の重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO: 26の軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項１５７】
SEQ ID NO: 41の重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO: 42の軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項１５８】
SEQ ID NO: 68の重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO: 69の軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項１５９】
SEQ ID NO: 70の重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO: 71の軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項１６０】
SEQ ID NO: 70の重鎖アミノ酸配列およびSEQ ID NO: 74の軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項１６１】
RSPO3に結合する抗体による処置のためのヒト対象を選択する方法であって、該対象が、上昇した発現レベルのRSPO3を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、該腫瘍が、上昇した発現レベルのRSPO3を有する場合、該対象が、RSPO3に特異的に結合する抗体による処置のために選択される、方法。
【請求項１６２】
前記腫瘍が肺腫瘍である、請求項161記載の方法。
【請求項１６３】
前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項161記載の方法。
【請求項１６４】
前記腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項161記載の方法。
【請求項１６５】
前記腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項161記載の方法。
【請求項１６６】
RSPO3の前記発現レベルが、PCRベースのアッセイ、マイクロアレイ解析、またはヌクレオチド配列決定によって試料中で測定される、請求項161〜165のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６７】
前記試料が、新鮮腫瘍試料、凍結腫瘍試料、またはホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項166記載の方法。
【請求項１６８】
RSPO4に結合する抗体による処置のためのヒト対象を選択する方法であって、該対象が、上昇した発現レベルのRSPO4を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、該腫瘍が、上昇した発現レベルのRSPO4を有する場合、該対象が、RSPO4に特異的に結合する抗体による処置のために選択される、方法。
【請求項１６９】
前記腫瘍が肺腫瘍である、請求項168記載の方法。
【請求項１７０】
前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項168記載の方法。
【請求項１７１】
前記腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項168記載の方法。
【請求項１７２】
RSPO3の前記発現レベルが、PCRベースのアッセイ、マイクロアレイ解析、またはヌクレオチド配列決定によって試料中で測定される、請求項168〜171のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７３】
前記試料が、新鮮腫瘍試料、凍結腫瘍試料、またはホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項172記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明の分野は、概して、R-Spondinタンパク質（RSPO）、特にヒトR-Spondinタンパク質（RSPO1、RSPO2、およびRSPO3を含む）に結合する抗体および他の剤、ならびに癌などの疾患を処置するために該抗体または他の剤を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
R-Spondin（RSPO）ファミリーのタンパク質は、脊椎動物の間で保存されており、4つのメンバーRSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4を含む。これらのタンパク質は、蓋板特異的スポンジン、hPWTSR（hRSPO3）、THS2D（RSPO3）、Cristin1-4、およびFutrin1-4をはじめとした種々の名称で呼ばれている。RSPOは、全体的におよそ40〜60％の配列相同性およびドメイン構成を共有する小さな分泌タンパク質である。全てのRSPOタンパク質が、N末端に2つのフューリン様システインリッチドメインを含み、続いてトロンボスポンジンドメインおよび塩基性の荷電C末端テイルを含む（Kim et al, 2006, Cell Cycle, 5: 23-26（非特許文献1））。
【０００３】
研究から、RSPOタンパク質が、脊椎動物の発生（Kamata et al., 2004, Biochim. Biophys Acta, 1676: 51-62（非特許文献2））およびアフリカツメガエル（Xenopus）の筋形成（Kazanskaya et al., 2004, Dev. Cell, 7: 525-534（非特許文献3））に関与することが示されている。RSPO1は、胃腸管上皮細胞に対して強力なマイトジェンとして機能することも示されている（Kim et al., 2005, Science, 309: 1256-1259（非特許文献4））。RSPOタンパク質は、Wntシグナル伝達に類似したβ-カテニンシグナル伝達を活性化すると知られているが、しかしながら、RSPOタンパク質とWntシグナル伝達との関連性は依然、調査中である。RSPOタンパク質が、Wntリガンドに対して正の調節活性を有することが報告されている（Nam et al, 2006, JBC 281: 13247-57（非特許文献5））。この研究は、RSPOタンパク質が、Frizzled8およびLRP6受容体リガンドとして機能し得ることならびにβ-カテニンシグナル伝達を誘導し得ることも報告した（非特許文献5）。最近の研究は、RSPOタンパク質とLGR（ロイシンリッチリピート含有、Gタンパク質共役（coupler）受容体）タンパク質（例えば、LGR5（米国特許出願公開第2009/0074782号（特許文献1）および同第2009/0191205号（特許文献2））との相互作用を同定し、これらのデータは、β-カテニンシグナル伝達の活性化に対する副経路を示している。
【０００４】
Wntシグナル経路は、癌治療に対する潜在的な標的として特定されている。Wntシグナル経路は、胚パターン形成、後胚組織の維持、および幹細胞生物学のいくつかの不可欠な制御因子の1つである。より詳細には、Wntシグナル伝達は、細胞極性の発生および細胞運命特定（幹細胞集団による自己複製を含む）において重要な役割を果たす。Wnt経路の無秩序な活性化は、数多くのヒト癌と関連しているが、その活性化は、細胞の発生上の運命を変更し得ると考えられている。Wnt経路の活性化は、腫瘍細胞を未分化な状態で維持することがあり、かつ/または制御されない増殖をもたらすことがある。したがって、発癌は、正常な発生および組織修復を制御する恒常性維持機構を上回ることによって進行し得る（Reya & Clevers, 2005, Nature, 434: 843-50（非特許文献6）; Beachy et al, 2004, Nature, 432: 324-31（非特許文献7）に概説されている）。
【０００５】
Wntシグナル経路は、ショウジョウバエの発生変異体であるwingless（wg）において、およびマウス癌原遺伝子int-1（現在はWnt1）から初めて解明された（Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31: 99-109（非特許文献8）; Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39: 233-40（非特許文献9）; Cabrera et al., 1987, Cell, 50: 659-63（非特許文献10）; Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50: 649-57（非特許文献11））。Wnt遺伝子は、脂質修飾された分泌糖タンパク質をコードする（そのうち19個が哺乳動物において同定されている）。これらの分泌リガンドは、Frizzled（FZD）受容体ファミリーメンバーおよび低密度リポタンパク質（LDL）受容体関連タンパク質5または6（LRP5/6）からなる受容体複合体を活性化する。そのFZD受容体は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）スーパーファミリーの7回膜貫通ドメインタンパク質であり、システインリッチドメイン（CRD）またはFriドメインとして公知の10個の保存されたシステインを有する大きな細胞外のN末端リガンド結合ドメインを含む。10種のヒトFZD受容体、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10が存在する。異なるFZD CRDは、特定のWntタンパク質に対して異なる結合親和性を有し（Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277: 41762-9（非特許文献12））、FZD受容体は、標準的なβ-カテニン経路を活性化するものおよび非標準的な経路を活性化するものに分類されている（Miller et al., 1999, Oncogene, 18: 7860-72（非特許文献13））。
【０００６】
癌においてWntシグナル伝達が果たす役割は、マウスウイルスの近傍挿入（nearby insertion）によって癌化された乳房腫瘍における癌遺伝子としてのWnt1（当初はint1）の同定によって初めて明らかにされた（非特許文献8）。それ以降、乳癌におけるWntシグナル伝達の役割についてのさらなる証拠が蓄積された。例えば、乳腺におけるβ-カテニンのトランスジェニック過剰発現によって過形成および腺癌がもたらされる（Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153: 555-68（非特許文献14）; Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20: 5093-9（非特許文献15））のに対し、Wntシグナル伝達が失われることにより、正常な乳腺の発生が妨害される（Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116: 1137-49（非特許文献16）; Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8: 145-58（非特許文献17））。ヒト乳癌では、β-カテニンの蓄積は、癌腫の50％超においてWntシグナル伝達活性化に関係し、特定の変異は同定されていないが、Frizzled受容体の発現の上方制御が観察されている（Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9: 119-31（非特許文献18）; Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol, 25: 1337-42（非特許文献19））。
【０００７】
Wnt経路の活性化は、結腸直腸癌にも関連する。全ての結腸直腸癌のおよそ5〜10％が遺伝性であり、主要な形態の1つは、罹患個体の約80％が大腸腺腫症（APC）遺伝子に生殖細胞系列変異を含む常染色体優性疾患である家族性腺腫性ポリポーシス（FAP）である。変異は、Axinおよびβ-カテニンをはじめとした他のWnt経路の構成要素においても同定されている。個々の腺腫は、第2の不活性化された対立遺伝子を含む上皮細胞のクローナルな増殖であり、多数のFAP腺腫は、癌遺伝子および/または癌抑制遺伝子におけるさらなる変異によって必然的に腺癌を発生する。さらに、APCにおける機能喪失変異およびβ-カテニンにおける安定化変異を含むWntシグナル経路の活性化は、マウスモデルにおいて過形成の発生および腫瘍成長を誘導し得る（Oshima et al., 1997, Cancer Res., 57: 1644-9（非特許文献20）; Harada et al., 1999, EMBO J, 18: 5931-42（非特許文献21））。
【０００８】
乳癌および結腸癌と同様に、黒色腫も、β-カテニンの核内蓄積によって示唆されるように、Wnt経路が構成的に活性化されていることが多い。いくつかの黒色腫腫瘍および細胞株におけるそのWnt/β-カテニン経路の活性化は、経路の構成要素（例えば、APC、ICAT、LEF1およびβ-カテニン）の改変に起因する（例えば、Larue et al. 2006, Frontiers Biosci., 11: 733-742（非特許文献22）を参照のこと）。しかしながら、黒色腫におけるWnt/β-カテニンシグナル伝達の厳密な役割に関しては、矛盾する報告が文献に存在する。例えばある研究では、上昇したレベルの核β-カテニンが黒色腫からの生存の向上と相関すること、および、活性化されたWnt/β-カテニンシグナル伝達が細胞増殖の減少と関連することが見出された（Chien et al, 2009, PNAS, 106: 1193-1198（非特許文献23））。
【０００９】
癌の薬の研究の焦点は、ヒト癌に関与する遺伝子、タンパク質、および経路を狙った標的化治療に移行している。癌患者に対して治療的利点を提供し得る、シグナル経路を標的化する新しい剤および複数の経路を標的化する剤の新しい組み合わせが必要とされている。したがって、β-カテニンシグナル伝達を妨害する生体分子（例えば、抗RSPO抗体）は、癌ならびに他のβ-カテニン関連疾患に対する新しい治療剤の潜在的な供給源である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第2009/0074782号
【特許文献２】同第2009/0191205号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kim et al, 2006, Cell Cycle, 5: 23-26
【非特許文献２】Kamata et al., 2004, Biochim. Biophys Acta, 1676: 51-62
【非特許文献３】Kazanskaya et al., 2004, Dev. Cell, 7: 525-534
【非特許文献４】Kim et al., 2005, Science, 309: 1256-1259
【非特許文献５】Nam et al, 2006, JBC 281: 13247-57
【非特許文献６】Reya & Clevers, 2005, Nature, 434: 843-50
【非特許文献７】Beachy et al, 2004, Nature, 432: 324-31
【非特許文献８】Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31: 99-109
【非特許文献９】Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39: 233-40
【非特許文献１０】Cabrera et al., 1987, Cell, 50: 659-63
【非特許文献１１】Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50: 649-57
【非特許文献１２】Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277: 41762-9
【非特許文献１３】Miller et al., 1999, Oncogene, 18: 7860-72
【非特許文献１４】Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153: 555-68
【非特許文献１５】Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20: 5093-9
【非特許文献１６】Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116: 1137-49
【非特許文献１７】Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8: 145-58
【非特許文献１８】Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9: 119-31
【非特許文献１９】Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol, 25: 1337-42
【非特許文献２０】Oshima et al., 1997, Cancer Res., 57: 1644-9
【非特許文献２１】Harada et al., 1999, EMBO J, 18: 5931-42
【非特許文献２２】Larue et al. 2006, Frontiers Biosci., 11: 733-742
【非特許文献２３】Chien et al, 2009, PNAS, 106: 1193-1198
【発明の概要】
【００１２】
発明の簡単な概要
本発明は、RSPOタンパク質に結合する結合剤（例えば、抗体）、ならびにその結合剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、抗体、抗体断片、およびそのような抗体に関連する他のポリペプチドなどの新規ポリペプチドである。ある特定の態様において、結合剤は、ヒトRSPO1、RSPO2、および/またはRSPO3に特異的に結合する抗体である。本発明はさらに、腫瘍を有する対象にRSPO結合剤を投与することによって腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。本発明はさらに、癌を処置する必要のある対象にRSPO結合剤を投与することによって癌を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、癌を処置する方法または腫瘍成長を阻害する方法は、RSPO結合剤で癌幹細胞を標的化する工程を含む。ある特定の態様において、該方法は、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる工程、腫瘍内の癌幹細胞の数を減少させる工程、腫瘍の腫瘍形成能を低下させる工程、および/または腫瘍内の癌幹細胞の数もしくは発生頻度を低下させることによって腫瘍の腫瘍形成能を低下させる工程を含む。
【００１３】
一局面において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合する抗体などの結合剤を提供する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸34〜135の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸91〜135の範囲内に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種の他のヒトRSPOに特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、β-カテニン活性を調節し、β-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストであり、β-カテニンシグナル伝達を阻害し、かつ/またはβ-カテニンの活性化を阻害する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1シグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、1種または複数のLGRタンパク質（例えば、LGR4、LGR5、および/またはLGR6）へのRSPO1の結合を阻害するかまたは干渉する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR5へのRSPO1の結合を阻害する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合する抗体などの結合剤を提供する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜205の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸34〜134の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸90〜134の範囲内に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、RSPO1、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種の他のヒトRSPOに特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、β-カテニン活性を調節し、β-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストであり、β-カテニンシグナル伝達を阻害し、かつ/またはβ-カテニンの活性化を阻害する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2シグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、1種または複数のLGRタンパク質（例えば、LGR4、LGR5、および/またはLGR6）へのRSPO2の結合を阻害するかまたは干渉する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR5へのRSPO2の結合を阻害する。
【００１５】
上述の局面および態様の各々のある特定の態様、ならびに本明細書において記載される他の局面および態様において、RSPO結合剤は、抗体である。ある特定の態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の態様において、抗体は、ヒト化抗体である。ある特定の態様において、抗体は、ヒトRSPO1に結合する。ある特定の態様において、抗体は、ヒトRSPO1およびマウスRSPO1に結合する。ある特定の態様において、抗体は、1nM未満のKDでヒトRSPO1に結合し、1nM未満のKDでマウスRSPO1に結合する。
【００１６】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000002
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000003
を含む重鎖CDR3を含む抗体である。いくつかの態様において、抗体はさらに、
2014524746.tif 000004
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、
2014524746.tif 000005
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、（a）TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（b）
2014524746.tif 000006
を含む重鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（c）
2014524746.tif 000007
を含む重鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（d）
2014524746.tif 000008
を含む軽鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（e）WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;および（f）QQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗体である。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００１７】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 10に対して少なくとも80％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 11に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 10に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 11に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。
【００１８】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 55に対して少なくとも80％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 59に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 55に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 59に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。
【００１９】
いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、モノクローナル抗体89M5であり、2011年6月30日にATCCに寄託され寄託番号PTA-11970を有するハイブリドーマ細胞株89M5によって産生される。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、ヒト化型の抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、ヒト化モノクローナル抗体h89M5-H2L2である。
【００２０】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2に結合する抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO2およびマウスRSPO2に結合する。ある特定の態様において、抗体は、SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000009
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000010
を含む重鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、抗体はさらに、
2014524746.tif 000011
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、
2014524746.tif 000012
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（b）
2014524746.tif 000013
を含む重鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（c）
2014524746.tif 000014
を含む重鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（d）
2014524746.tif 000015
を含む軽鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（e）WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;および（f）QQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗体である。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００２１】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 27に対して少なくとも80％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 28に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 27に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 28に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。
【００２２】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 63に対して少なくとも80％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 67に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 63に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 67に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。
【００２３】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 63に対して少なくとも80％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 76に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 63に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または（b）SEQ ID NO: 76に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。
【００２４】
いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、モノクローナル抗体130M23であり、2011年8月10日にATCCに寄託され寄託番号PTA-12021を有するハイブリドーマ細胞株130M23によって産生される。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、ヒト化型の抗体130M23である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、ヒト化モノクローナル抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、ヒト化モノクローナル抗体h130M23-H1L6である。
【００２５】
別の局面において、本発明は、ヒトRSPOタンパク質への特異的結合について本発明の抗体と競合する結合剤（例えば、抗体）を提供する。いくつかの態様において、結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO1への特異的結合について、SEQ ID NO: 10を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。いくつかの態様において、結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO1への特異的結合について、SEQ ID NO: 55を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 59を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤と競合する抗体は、89M5またはh89M5-H2L2である。いくつかの態様において、結合剤は、インビトロ競合結合アッセイにおいてRSPO1への特異的結合について本発明の抗体と競合する。
【００２６】
ある特定の態様において、前記抗体は、本発明の抗体（例えば、89M5）と同じRSPO1上のエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。
【００２７】
なおも別の局面において、結合剤は、本発明の抗体（例えば、89M5）に結合されるRSPO1上のエピトープと重複するRSPO1上のエピトープに結合する抗体である。
【００２８】
別の局面において、本発明は、ヒトRSPO2への特異的結合について本発明の抗体と競合する結合剤（例えば、抗体）を提供する。いくつかの態様において、結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO2への特異的結合について、SEQ ID NO: 27を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 28を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。いくつかの態様において、結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO2への特異的結合について、SEQ ID NO: 63を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 67を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。いくつかの態様において、結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO2への特異的結合について、SEQ ID NO: 63を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 76を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤と競合する抗体は、130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。いくつかの態様において、結合剤は、インビトロ競合結合アッセイにおいて、RSPO2に対する特異的結合に関して本発明の抗体と競合する。
【００２９】
ある特定の態様において、前記抗体は、本発明の抗体（例えば、130M23）と同じRSPO2上のエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。
【００３０】
なおも別の局面において、結合剤は、本発明の抗体（例えば、130M23）に結合されるRSPO2上のエピトープと重複するRSPO2上のエピトープに結合する抗体である。
【００３１】
上述の局面の各々のある特定の態様、ならびに本明細書の他の箇所に記載される他の局面および/または態様において、RSPO結合剤または抗体は、単離されている。
【００３２】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 10および/またはSEQ ID NO: 11を含むポリペプチドを提供する。別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 55および/またはSEQ ID NO: 59を含むポリペプチドを提供する。別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 27および/またはSEQ ID NO: 28を含むポリペプチドを提供する。別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 63および/またはSEQ ID NO: 67を含むポリペプチドを提供する。別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 63および/またはSEQ ID NO: 76を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、RSPO1に結合するポリペプチドは、SEQ ID NO: 25および/またはSEQ ID NO: 26を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、RSPO1に結合するポリペプチドは、SEQ ID NO: 68および/またはSEQ ID NO: 69を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、RSPO2に結合するポリペプチドは、SEQ ID NO: 41および/またはSEQ ID NO: 42を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、RSPO2に結合するポリペプチドは、SEQ ID NO: 70および/またはSEQ ID NO: 71を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、RSPO2に結合するポリペプチドは、SEQ ID NO: 70および/またはSEQ ID NO: 74を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、単離されている。ある特定の態様において、ポリペプチドは、実質的に純粋である。ある特定の態様において、ポリペプチドは、抗体である。
【００３３】
別の局面において、本発明は、上述の局面ならびに本明細書において記載される他の局面および/または態様の各々の抗体および/またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、およびSEQ ID NO: 58からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72、およびSEQ ID NO: 75からなる群より選択される配列を含む。本発明はさらに、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターならびにその発現ベクターおよび/またはポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、ハイブリドーマ細胞株である。ある特定の態様において、細胞は、ATCC寄託番号PTA-11970を有するハイブリドーマ細胞株である。ある特定の態様において、細胞は、ATCC寄託番号PTA-12021を有するハイブリドーマ細胞株である。
【００３４】
他の局面において、本発明は、腫瘍の成長を阻害する方法を提供し、該方法は、該腫瘍をRSPO結合剤または抗体（本明細書において記載されるそれらの各々を含む）の有効量と接触させる工程を含む。
【００３５】
別の局面において、本発明は、対象における腫瘍の成長を阻害する方法を提供し、該方法は、RSPO結合剤または抗体（本明細書において記載されるそれらの各々を含む）の治療有効量を該対象に投与する工程を含む。
【００３６】
別の局面において、本発明は、細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する方法を提供し、該方法は、RSPO結合剤または抗体（本明細書において記載されるそれらの各々を含む）の有効量と該細胞を接触させる工程を含む。いくつかの態様において、細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、膵腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルのRSPO1を発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルのRSPO2を発現する。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇したレベルのRSPO3を発現する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、例えば、腫瘍内の癌幹細胞の数および/または発生頻度を低下させることによって、腫瘍の成長を阻害する。
【００３７】
別の局面において、本発明は、対象における癌を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、上に記載されたRSPO結合剤または抗体ならびに本明細書の他の箇所に記載されるそれらのいずれかの治療有効量を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、癌は、膵癌である。いくつかの態様において、癌は、結腸直腸癌である。いくつかの態様において、結腸直腸癌は、大腸腺腫症（APC）遺伝子における不活性化変異を含む。いくつかの態様において、結腸直腸癌は、APC遺伝子における不活性化変異を含まない。いくつかの態様において、結腸直腸癌は、野生型APC遺伝子を含む。いくつかの態様において、癌は、卵巣癌である。いくつかの態様において、癌は、乳癌である。いくつかの態様において、癌は、肺癌である。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を発現する。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのRSPO1を発現する卵巣癌である。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのRSPO2を発現する結腸癌である。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのRSPO2を発現する膵癌である。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのRSPO2を発現する乳癌である。いくつかの態様において、癌は、上昇したレベルのRSPO2を発現する肺癌である。
【００３８】
別の局面において、本発明は、対象における疾患を処置する方法を提供し、該疾患は、β-カテニンの活性化および/または異常なβ-カテニンシグナル伝達に関連し、該方法は、RSPO結合剤または抗体（本明細書において記載されるそれらの各々を含む）の治療有効量を投与する工程を含む。
【００３９】
上述の局面の各々のある特定の態様、ならびに本明細書の他の箇所に記載される他の局面および/または態様において、処置方法は、少なくとも一種のさらなる治療剤とともにRSPO結合剤を投与する工程を含む。いくつかの態様において、処置方法は、RSPO1結合剤を第2のRSPO結合剤（例えば、RSPO2結合剤、RSPO3結合剤、および/またはRSPO4結合剤）とともに投与する工程を含む。いくつかの態様において、処置方法は、RSPO2結合剤を第2のRSPO結合剤（例えば、RSPO1結合剤、RSPO3結合剤、および/またはRSPO4結合剤）とともに投与する工程を含む。いくつかの態様において、処置方法は、RSPO2結合剤とともにRSPO1結合剤を投与する工程を含む。いくつかの態様において、処置方法は、RSPO1結合剤とRSPO2結合剤と化学療法剤との組み合わせを投与する工程を含む。
【００４０】
上述の局面の各々のある特定の態様、ならびに本明細書の他の箇所に記載される他の局面および/または態様において、処置方法はさらに、腫瘍または癌における少なくとも1種のRSPOタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。
【００４１】
別の局面において、本発明は、RSPO結合剤または抗体（本明細書において記載されるそれらの各々を含むがそれに限定されるわけではない）で処置するためのヒト対象を特定するかまたはヒト対象を選択する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、対象が、正常組織における同じRSPOタンパク質の発現と比べて上昇した発現レベルの特定のRSPO（例えば、RSPO1またはRSPO2）を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、腫瘍が上昇したレベルのRSPO発現を有する場合に、処置するための対象を特定するかまたは処置するための対象を選択する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、対象が、APC遺伝子における不活性化変異を含む腫瘍を有しているかを判定する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、腫瘍がAPC遺伝子における不活性化変異を含む場合に、処置するための対象を特定する工程または処置するための対象を選択する工程を含む。
【００４２】
本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物がさらに提供され、RSPO結合剤を産生する細胞株も提供される。対象（例えば、ヒト）における癌を処置しかつ/または腫瘍成長を阻害する方法（RSPO結合剤を含む組成物の有効量を対象に投与する工程を含む）も提供される。
【００４３】
本発明の局面または態様が、マーカッシュ群または他の代替の組み分けに関して記載される場合、本発明は、列挙されている群全体を全体として包含するだけでなく、該群の各メンバーも個々に包含し、かつ主要な群の潜在的な全ての部分群も包含し、かつまた、該群メンバーのうち1つまたは複数を欠いた該主要な群も包含する。本発明は、主張される発明における任意の群メンバーのうちの1つまたは複数の、明示的な除外も想定する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】腫瘍および正常組織におけるRSPO発現。正常、良性、および悪性組織のヒト試料のマイクロアレイデータの要約が示されている。個別の目盛マークは、RSPO mRNAの発現レベルを示している。A）RSPO1。
【図１Ｂ】腫瘍および正常組織におけるRSPO発現。正常、良性、および悪性組織のヒト試料のマイクロアレイデータの要約が示されている。個別の目盛マークは、RSPO mRNAの発現レベルを示している。B）RSPO2。
【図１Ｃ】腫瘍および正常組織におけるRSPO発現。正常、良性、および悪性組織のヒト試料のマイクロアレイデータの要約が示されている。個別の目盛マークは、RSPO mRNAの発現レベルを示している。C）RSPO3。
【図２】RSPOタンパク質とLGR5との結合の研究。LGR5を発現しているHEK-293細胞のFACS解析。HEK-293細胞を、FLAG-LGR5-CD4TM-GFPをコードするcDNA発現ベクターで一過性にトランスフェクトし、次いで続いて、可溶性RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc、またはRSPO4-Fc融合タンパク質と混合した。抗FLAG抗体を、正の対照として使用し、可溶性FZD8-Fcを、負の対照として使用した。各FACSプロット上の濃い線の四角のオーバーレイ内のシグナルの存在によって特異的結合が示唆される。
【図３】肺腫瘍細胞馴化培地における阻害活性の識別。6xTCF-ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、HEK-293細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を測定した。HEK-293細胞を、可溶性LGR5-Fcの存在下において、Wnt3a L細胞馴化培地を含む対照培地（DMEM培地）、または肺腫瘍細胞馴化培地およびWnt3a L細胞馴化培地を含む培地に曝露した。可溶性Jag-Fcおよび抗体LZ1を、負の対照として使用した。可溶性FZD8-FcおよびWnt3aを遮断する抗FZD抗体を、正の対照として使用した。可溶性LGR5-Fc、Jag-Fc、およびFZD8-Fc融合タンパク質を10μg/mlで使用した。抗FZD抗体およびLZ1抗体を40μg/mlで使用した。
【図４】β-カテニンシグナル伝達の誘導の阻害。6xTCF-ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、HEK-293細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を測定した。HEK-293細胞を、20μg/mlから0.02μg/mlまでの4倍希釈の可溶性LGR5-Fcの存在下において、10ng/mlのRSPO2および25％Wnt3a L細胞馴化培地を含む培地（「RSPO2」）または25％肺腫瘍細胞馴化培地および25％Wnt3a L細胞馴化培地を含む培地（「LT」）に曝露した;RSPO2とLGR5-Fcとの組み合わせ（-□-）およびLTとLGR5-Fcとの組み合わせ（-■-）。可溶性Jag-Fcを負の対照として20μg/mlにおいて、RSPO2（-△-）またはLT（-▲-）とともに使用した。Wnt3aを遮断する可溶性FZD8-Fcを正の対照として20μg/mlにおいて、RSPO2（-○-）またはLT（-●-）とともに使用した。
【図５】RSPO1に結合する抗体の識別。A）融合タンパク質FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFPの略図。B）ヒトRSPO1に対して作製された抗体のFACS解析。相対的な抗体の結合がy軸に示されており、FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFP融合タンパク質の発現がx軸に示されている。陽性の結合は、各FACSプロット上の濃い線の四角のオーバーレイ内のシグナルの存在によって示唆される。抗FLAG抗体を、正の対照として使用した。抗PE抗体を、負の対照として使用した。
【図６】RSPO1によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する抗RSPO1抗体の識別。TOPflashルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、増加させた濃度の抗RSPO1抗体（89M2、89M4、89M5、89M7、89M19、または89M25）または無関係な対照抗体（254M14または254M26）の存在下におけるWnt3a（5ng/ml）とRSPO1（10ng/ml）との組み合わせへの曝露後に、HEK-293細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を測定した。抗体を、10μg/mlから0.625μg/mlまでの2倍希釈物として使用した。対照は、抗体の非存在下における、対照培地（Wnt3a無しおよびRSPO無し）、Wnt3a単独、またはWnt3aとRSPOとの組み合わせへの曝露を含んだ。
【図７】RSPO1/LGR5結合を遮断する抗RSPO1抗体の識別。LGR5を発現しているHEK-293細胞のFACS解析。HEK-293細胞を、FLAG-LGR5-CD4TM-GFPをコードするcDNA発現ベクターで一過性にトランスフェクトし、次いで続いて、個別の抗RSPO1抗体とともに可溶性RSPO1-Fc融合タンパク質と混合した。PEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体を用いて、結合を検出した。相対的なRSPO1-Fcの結合がy軸に示されており、FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合タンパク質の発現がx軸に示されている。陽性の結合は、各FACSプロット上の濃い線の四角のオーバーレイ内のシグナルの存在によって示唆される。抗PE抗体を、負の対照として使用した。
【図８】抗RSPO1抗体による腫瘍成長の阻害。OV19卵巣腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、89M5（-●-）、89M25（-▼-）、タキソール（-◆-）、抗体89M5とタキソールとの併用（-○-）、抗体89M25とタキソールとの併用（-□-）、または対照抗体1B7.11（-■-）で処置した。データは、処置後の日数にわたる腫瘍体積（mm3）として示されている。
【図９】抗RSPO1抗体のエピトープマッピング。A）RSPO1ドメインの欠失シリーズを含む構築された融合タンパク質の略図。これらのコンストラクトの全てが、それらのタンパク質の細胞表面発現を可能にするCD4TMドメインを含む。B）その融合タンパク質でトランスフェクトされた細胞に対する抗RSPO1抗体の結合のFACS解析。相対的な抗体の結合がy軸に示されており、融合タンパク質の発現がx軸に示されている。抗FLAG抗体を、正の対照として使用した。抗PE抗体を、負の対照として使用した。
【図１０】RSPO2に結合する抗体の識別。ヒトRSPO2に対して作製された抗体のFACS解析。相対的な抗体の結合がy軸に示されており、FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFP融合タンパク質の発現がx軸に示されている。抗FLAG抗体を、正の対照として使用した。抗PE抗体を、負の対照として使用した。
【図１１】RSPO2によるβ-カテニンシグナル伝達の誘導を阻害する抗RSPO2抗体の識別。TOPflashルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、RSPO2に対する抗体（mAb130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28）の存在下における、Wnt3a（5ng/ml）とヒトRSPO2（10ng/ml）との組み合わせまたはWnt3a（5ng/ml）とヒトRSPO3（10ng/ml）との組み合わせへの曝露後に、HEK-293細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を測定した。対照は、抗体の非存在下における、対照培地（Wnt3aの添加無しおよびRSPO無し、「細胞」という表示）、Wnt3a単独（「W3A」という表示）、またはWnt3aとRSPOとの組み合わせへの曝露を含んだ。
【図１２】RSPO2/LGR5結合を遮断する抗RSPO2抗体の識別。LGR5を発現しているHEK-293細胞のFACS解析。HEK-293細胞を、FLAG-LGR5-CD4TM-GFPをコードするcDNA発現ベクターで一過性にトランスフェクトし、次いで続けて、個別の抗RSPO2抗体とともに可溶性RSPO2-fc融合タンパク質と混合した。PEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体を用いて結合を検出した。相対的なRSPO2-Fcの結合がy軸に示されており、FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合タンパク質の発現がx軸に示されている。陽性の結合は、各FACSプロット上の濃い線の四角のオーバーレイ内のシグナルの存在によって示唆される。抗FLAG抗体を、正の対照として使用し、抗PE抗体を、負の対照として使用した。
【図１３Ａ】腫瘍細胞馴化培地における阻害活性の識別。STF-293細胞を、可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、または対照融合Fcタンパク質の存在下において、対照培地（DMEM培地）、Wnt3a L細胞馴化培地を含む培地、腫瘍細胞馴化培地を含む培地、または腫瘍細胞馴化培地およびWnt3aL細胞馴化培地を含む培地に曝露した。可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、および対照Fc融合タンパク質を10μg/mlで使用した。腫瘍細胞馴化培地を、肺腫瘍LU2から調製した。
【図１３Ｂ】腫瘍細胞馴化培地における阻害活性の識別。STF-293細胞を、可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、または対照融合Fcタンパク質の存在下において、対照培地（DMEM培地）、Wnt3a L細胞馴化培地を含む培地、腫瘍細胞馴化培地を含む培地、または腫瘍細胞馴化培地およびWnt3aL細胞馴化培地を含む培地に曝露した。可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、および対照Fc融合タンパク質を10μg/mlで使用した。腫瘍細胞馴化培地を、肺腫瘍LU25から調製した。
【図１３Ｃ】腫瘍細胞馴化培地における阻害活性の識別。STF-293細胞を、可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、または対照融合Fcタンパク質の存在下において、対照培地（DMEM培地）、Wnt3a L細胞馴化培地を含む培地、腫瘍細胞馴化培地を含む培地、または腫瘍細胞馴化培地およびWnt3aL細胞馴化培地を含む培地に曝露した。可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、および対照Fc融合タンパク質を10μg/mlで使用した。腫瘍細胞馴化培地を、卵巣腫瘍OV38から調製した。
【図１４】β-カテニンシグナル伝達の誘導の阻害。STF-293細胞を、LU2細胞＋25％肺腫瘍細胞馴化培地＋25％Wnt3a-L細胞馴化培地とインキュベートした。該細胞に抗体130M23（-■-）および可溶性LGR5-Fc（-●-）を50μg/ml〜0.0006μg/mlまでの5倍段階希釈で加えた。同様に希釈された無関係なモノクローナル抗体（-□-）および対照Fc融合タンパク質（-△-、50μg/ml）を負の対照として使用した。
【図１５】抗RSPO抗体による腫瘍成長の阻害。PN31膵腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、抗RSPO1抗体89M5（-□-）、抗RSPO2抗体130M23（-▲-）、ゲムシタビン（-■-）、抗体89M5とゲムシタビンとの併用（-▼-）、抗体130M23とゲムシタビンとの併用（-◇-）、または対照抗体1B7.11（-○-）で処置した。データは、移植後の日数にわたる腫瘍体積（mm3）として示されている。
【図１６Ａ】抗RSPO抗体による腫瘍成長の阻害。PN7膵腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、抗RSPO2抗体130M23（-▼-）、抗FZD抗体18R5（-▲-）、ゲムシタビン（-●-）、130M23と18R5との併用（-○-）、130M23とゲムシタビンとの併用（-□-）、18R5とゲムシタビンとの併用（-△-）、130M23と18R5とゲムシタビンとの併用（-◇-）、または対照抗体1B7.11（-■-）で処置した。データは、処置後の日数にわたる腫瘍体積（mm3）として示されている。
【図１６Ｂ】抗RSPO抗体による腫瘍成長の阻害。PN7膵腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、Wnt経路阻害剤FZD8-Fcとゲムシタビンとの併用（-△-）、130M23とゲムシタビンとの併用（-▼-）、130M23とFZD8-Fcとゲムシタビンとの併用（-◇-）、ゲムシタビン（-●-）、または対照抗体1B7.11（-■-）で処置した。データは、処置後の日数にわたる腫瘍体積（mm3）として示されている。
【図１６Ｃ】得られた腫瘍を処理して単一細胞懸濁液とし、マウスに連続的に移植した。各処置群から得られた腫瘍由来の90個の細胞をNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を処置無しで成長させた。データは、40日目の腫瘍体積（mm3）として示されている（図16C）。
【図１７Ａ】ヒト化RSPO抗体のFACS解析。ヒト化89M5抗体（h89M5-H2L2）および親89M5抗体のFACS解析。各抗体の5倍段階希釈物を試験した。相対的な抗体の結合がy軸に示されており、FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFP融合タンパク質の発現がx軸に示されている。
【図１７Ｂ】ヒト化RSPO抗体のFACS解析。ヒト化130M23抗体（h130M23-H1L2）および親130M23抗体のFACS解析。各抗体の5倍段階希釈物を試験した。相対的な抗体の結合がy軸に示されており、FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFP融合タンパク質の発現がx軸に示されている。
【図１８】抗RSPO1抗体および抗RSPO2抗体による腫瘍成長の阻害。B39トリプルネガティブ乳癌腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、抗RSPO1抗体89M5と抗RSPO2抗体130M23との併用（-○-）、シスプラチン（-▼-）、89M5と130M23とシスプラチンとの併用（-●-）、または対照抗体1B7.11（-■-）で処置した。データは、処置後の日数にわたる腫瘍体積（mm3）として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、RSPOタンパク質（例えば、ヒトRSPO1、RSPO2、および/またはRSPO3）に結合する抗体などのポリペプチドを含むがそれに限定されるわけではない新規剤を提供する。そのRSPO結合剤には、β-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストが含まれる。関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチド、RSPO結合剤を含む組成物、ならびにRSPO結合剤を作製する方法も提供される。新規RSPO結合剤を使用する方法（例えば、腫瘍成長を阻害する方法、癌を処置する方法、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる方法、β-カテニンシグナル伝達を阻害する方法、ならびに/または処置するための対象を特定するおよび/もしくは選択する方法）がさらに提供される。
【００４６】
ヒトRSPO1に特異的に結合するモノクローナル抗体が同定された（モノクローナル抗体89M2、89M4、89M5、89M7、89M19および89M25）（実施例5、図5）。抗RSPO1抗体89M2、89M4、89M5、および89M25は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する（実施例6、図6）。抗RSPO1抗体89M2、89M4、89M5、および89M25は、LGR5への可溶性RSPO1の結合を阻害する（実施例7、図7）。配列データは、その後、抗体89M2、89M4、89M5、および89M25が同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことを証明し、これらの抗体が同じ抗原結合部位を含み得ると結論付けられた。抗RSPO1抗体89M4、89M5、89M7、および89M25は、ヒトRSPO1とマウスRSPO1の両方に対して0.1nM未満の結合親和性を有する（実施例8）。89M5のヒト化バージョンh89M5-H2L2（実施例19）が作製され、それは、ヒトRSPO1に対して0.1nM未満の結合親和性を有する（実施例20）。抗RSPO1抗体89M5および89M25は、卵巣腫瘍異種移植片モデルにおいて、単剤として、および化学療法剤との併用で、腫瘍細胞の成長をインビボにおいて阻害すると見出された（実施例9、図8）。抗RSPO1抗体89M5は、膵腫瘍異種移植片モデルにおいて化学療法剤との併用で腫瘍細胞の成長をインビボにおいて阻害すると示された（実施例17、図15）。予備的なエピトープマッピング研究から、RSPO1のフューリン2ドメイン内のアミノ酸が、抗RSPO1抗体89M5に対する結合部位に含まれることが示唆される（実施例10、図9）。
【００４７】
さらに、ヒトRSPO2に特異的に結合するモノクローナル抗体が同定された（モノクローナル抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28）（実施例11、図10）。抗RSPO2抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28は、β-カテニンシグナル伝達を減少させるかまたは完全に遮断すると示された（実施例12、図11）。抗RSPO2抗体130M23および130M24は、LGR5への可溶性RSPO2の結合を遮断する（実施例13、図12）。抗RSPO2抗体130M23は、ヒトRSPO2に対して0.14nMの、およびマウスRSPO2に対して0.35nMの結合親和性を有する（実施例15）。130M23のヒト化バージョンであるh130M23-H1L2およびh130M23-H1L6が作製された（実施例19）。抗RSPO2抗体h130M23-H1L2は、ヒトRSPO2に対して0.13nMの結合親和性を有し、h130M23-H1L6は、ヒトRSPO2に対して0.15nMの結合親和性を有する（実施例20）。抗RSPO2抗体130M23は、膵腫瘍異種移植片モデルにおいて、単剤として、およびさらなる治療剤との併用で、腫瘍細胞の成長をインビボにおいて阻害すると示された（実施例17および18、図15および16）。
【００４８】
I. 定義
本発明の理解を促すために、いくつかの用語および句を下記で定義する。
【００４９】
本明細書において使用される用語「アンタゴニスト」および「アンタゴニストの」は、標的の生物学的活性および/またはシグナル経路（例えば、β-カテニンシグナル伝達）を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、減少させる、または中和する任意の分子を指す。用語「アンタゴニスト」は、タンパク質（例えば、RSPOタンパク質）の活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、減少させる、または中和する任意の分子を包含するために本明細書において使用される。好適なアンタゴニスト分子としては、具体的には、アンタゴニスト抗体または抗体断片が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００５０】
本明細書において使用される用語「調節」および「調節する」は、生物学的活性の変化または変更を指す。調節には、活性の刺激または阻害が含まれるが、それに限定されるわけではない。調節は、活性の増加もしくは減少（例えば、RSPOシグナル伝達の減少;β-カテニンシグナル伝達の減少）、結合特性の変化、または、タンパク質、経路、もしくは他の関心対象となる生物学的特質の活性に関連する生物学的、機能的、もしくは免疫学的特性におけるその他の任意の変化であり得る。
【００５１】
本明細書において使用される用語「抗体」は、標的（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせ）を免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して認識するおよび特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書において使用されるとき、その用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Fab、Fab'、F（ab'）2、およびFv断片）、一本鎖Fv（scFv）抗体、多重特異性抗体（例えば、少なくとも2つのインタクトな抗体から作製される二重特異性抗体）、単一特異的抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子を、それらの抗体が所望の生物学的活性を示す限り包含する。抗体は、免疫グロブリンの5つの主要なクラス:それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの独自性に基づいて、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMまたはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および3次元配置を有する。抗体は、裸で存在し得るか、または他の分子（トキシンおよび放射性同位体を含むがそれに限定されるわけではない）にコンジュゲートされ得る。
【００５２】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F（ab'）2、およびFv断片、鎖状抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それに限定されるわけではない。本明細書において使用される「抗体断片」は、抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
【００５３】
抗体の「可変領域」という用語は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域の各々は、「超可変領域」としても知られる3つの相補性決定領域（CDRs）によって接続された4つのフレームワーク領域（FR）からなる。各鎖におけるCDRは、フレームワーク領域によって互いに近接して保持され、他の鎖のCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための手法は少なくとも2つある:（1）異種間の配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda MD.）、および（2）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 927-948）。さらに、これらの2つのアプローチの組み合わせが時折、CDRを決定するために当技術分野において使用される。
【００５４】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関わる均質の抗体集団を指す。これは、種々の抗原決定基に対する種々の抗体の混合物を通常含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなおよび完全長のモノクローナル抗体、ならびに抗体断片（例えば、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv）、一本鎖（scFv）抗体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位（抗原結合部位）を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子）の両方を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、任意の数の手法（ハイブリドーマ産生、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物を含むがそれに限定されるわけではない）によって作製されるそのような抗体を指す。
【００５５】
本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、最小の非ヒト配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、CDRの残基が、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のCDR由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリンである（Jones et al., 1986, Nature, 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基は、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種由来の抗体内の対応する残基で置換される。ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、および/または結合能を洗練させるおよび最適化するために、Fvフレームワーク領域におけるおよび/または置換された非ヒト残基内におけるさらなる残基の置換によってさらに改変され得る。通常、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全てまたは実質的に全てを含む少なくとも1つおよび典型的には2つまたは3つの可変ドメインの実質的に全てを含む一方、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体を作製するために使用される方法の例は、例えば、米国特許第5,225,539号に記載されている。
【００５６】
本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、または当技術分野において公知の任意の手法を使用して作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【００５７】
本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する哺乳動物の1つの種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応するが、定常領域は、別の種（通常、ヒト）に由来する抗体における配列と相同であり、それにより、その種における免疫応答の誘発が回避される。
【００５８】
本明細書において使用される句「親和性成熟抗体」は、変更を有しない親抗体と比べて、抗原に対するその抗体の親和性を改善する1つまたは複数の変更を1つまたは複数のCDRに有する抗体を指す。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手順によって作製される。例えば、Marks et al., 1992, Bio/Technology 10: 779-783は、VHおよびVLドメインのシャフリングによる親和性成熟を記載している。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al., 1994, PNAS, 91: 3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154: 3310-9;およびHawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226: 889-896によって記載されている。
【００５９】
用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、本明細書において交換可能に使用され、特定の抗体によって認識されることおよび特異的に結合されることができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドであるとき、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続したアミノ酸と不連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープ（直鎖状エピトープとも呼ばれる）は、典型的には、タンパク質が変性されても保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されたエピトープ（立体構造エピトープとも呼ばれる）は、典型的には、タンパク質が変性されると失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的立体構造において、少なくとも3個およびそれ以上、通常、少なくとも5または8〜10個のアミノ酸を含む。
【００６０】
用語「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、結合剤または抗体が、無関係のタンパク質を含む代替の物質と比べて、エピトープ、タンパク質または標的分子に、より頻繁に、より迅速に、より長い時間にわたって、より高い親和性で、または上記のもののいくつかの組み合わせで、反応するかまたは会合することを意味する。ある特定の態様において、「特異的に結合する」は、例えば、抗体が、約0.1mMまたはそれ以下、より通常では約1μM未満のKDでタンパク質に結合することを意味する。ある特定の態様において、「特異的に結合する」は、抗体が、ある時には少なくとも約0.1μMもしくはそれ以下、またある時には少なくとも約0.01μMもしくはそれ以下、およびまたある時には少なくとも約1nMまたはそれ以下のKDで標的に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性のおかげで、特異的結合は、2以上の種におけるタンパク質（例えば、ヒトRSPO1およびマウスRSPO1）を認識する抗体を含み得る。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある特定の領域内の相同性のおかげで、特異的結合は、2以上のタンパク質（例えば、ヒトRSPO1およびヒトRSPO2）を認識する抗体（または他のポリペプチドまたは結合剤）を含み得る。ある特定の態様において、第1の標的に特異的に結合する抗体または結合部分は、第2の標的に特異的に結合することもあるし、しないこともあることが理解される。よって、「特異的結合」は、必ずしも排他的結合、すなわち、単一標的への結合を要求しない（が、それを含み得る）。したがって、抗体は、ある特定の態様において、2以上の標的に特異的に結合し得る。ある特定の態様において、複数の標的が、抗体上の同じ抗原結合部位によって結合され得る。例えば、抗体は、ある特定の場合において、2つの同一の抗原結合部位を含むことがあり、その各々が、2つ以上のタンパク質（例えば、RSPO1およびRSPO2）上の同じエピトープに特異的に結合する。ある特定の代替の態様において、抗体は、二重特異性または多重特異性であり得、異なる特異性を有する少なくとも2つの抗原結合部位を含む。非限定的な例として、二重特異性抗体は、1つのタンパク質（例えば、ヒトRSPO1）上のエピトープを認識する1つの抗原結合部位を含み、第2のタンパク質上の異なるエピトープを認識する第2の異なる抗原結合部位をさらに含むことがある。通常、結合に対する言及は、特異的結合を意味するが、必ずしもそうではない。
【００６１】
用語「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。それらの用語は、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸ポリマー;例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾（例えば、標識成分とのコンジュゲート）も包含する。例えば、アミノ酸の1つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸を含む）ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含むポリペプチドもこの定義に含められる。本発明のポリペプチドは、抗体に基づくことがあるので、ある特定の態様において、ポリペプチドは、一本鎖または会合した鎖として存在することができることが理解される。
【００６２】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらのアナログ、あるいはDNAまたはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。
【００６３】
「高ストリンジェンシーの条件」は、（1）洗浄に低イオン強度および高温を使用する条件、例えば、50℃における15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム;（2）ハイブリダイゼーション中に、変性剤（例えば、ホルムアミド、例えば、0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％Ficoll/0.1％ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5を含む50％（v/v）ホルムアミド）を、750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムとともに42℃において使用する条件;または（3）42℃の50％ホルムアミド、5×SSC（0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理されたサケ精子DNA（50μg/ml）、0.1％SDS、および10％デキストラン硫酸を、42℃の0.2×SSCおよび55℃の50％ホルムアミドにおける洗浄に続く、55℃におけるEDTAを含む0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄とともに使用する条件によって特定され得る。
【００６４】
2つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」は、配列同一性の部分としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、対応が最大になるように（必要であれば、ギャップを導入して）比較およびアラインメントされた場合、同じであるか、または、同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を特定のパーセンテージで有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって、測定され得る。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用され得る様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが、当技術分野において周知である。これらとしては、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package、およびそれらの変化形が挙げられるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、このことは、対応が最大になるように比較およびアラインメントされた場合に、これらが、配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視検査によって測定される、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％の、およびいくつかの態様において少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを、意味する。いくつかの態様において、同一性は、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約40〜60残基、少なくとも約60〜80残基長またはそれらの間の任意の整数値の配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、60〜80残基より長い領域（例えば、少なくとも約80〜100残基）にわたって存在し、いくつかの態様において、それらの配列は、比較される配列の完全長（例えば、ヌクレオチド配列のコード領域）にわたって実質的に同一である。
【００６５】
「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。例えば、フェニルアラニンへのチロシンの置換は、保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、該ポリペプチドまたは抗体が結合する抗原、すなわち、1つまたは複数のRSPOタンパク質への、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体の結合を無効にしない。抗原結合を取り消さないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当技術分野において周知である。
【００６６】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達することができ、かつ通常は発現することができる、コンストラクトのことを意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のDNAもしくはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したDNAもしくはRNA発現ベクター、およびリポソームに被包されたDNAまたはRNA発現ベクターが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００６７】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然には見られない形態の、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、それらがもはや天然に見られる形態ではない程度にまで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
【００６８】
本明細書において使用される用語「実質的に純粋」は、少なくとも50％純粋（すなわち、夾雑物を含まない）、少なくとも90％純粋、少なくとも95％純粋、少なくとも98％純粋、または少なくとも99％純粋である材料を指す。
【００６９】
本明細書において使用される用語「癌」および「癌性」は、制御されない細胞の成長によって細胞の集団が特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の例としては、癌腫、芽腫、肉腫、および血液癌（例えば、リンパ腫および白血病）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００７０】
本明細書において使用される用語「腫瘍」および「新生物」は、良性（癌性でない）または前癌病変を含む悪性（癌性）のいずれかの、過剰な細胞成長または増殖に起因する、組織の任意の塊を指す。
【００７１】
本明細書において使用される用語「転移」は、癌が、起源の部位から身体の他の領域に広がるまたは移行するプロセス（新しい位置での同様の癌性病変の発生を伴う）を指す。「転移」細胞または「転移する」細胞は、隣接する細胞との付着性の接触を失っており、かつ疾患の原発部位から血流またはリンパ液を介して遊走し隣接する身体構造に浸潤する細胞である。
【００７２】
用語「癌幹細胞」および「CSC」および「腫瘍幹細胞」および「腫瘍開始細胞」は、本明細書において交換可能に使用され、（1）幅広い増殖能力を有する;2）非対称性の細胞分裂を起こして、1つまたは複数のタイプの分化細胞の子孫を産生することができる（ここで、該分化細胞の増殖または発生の潜在能力は低下している）;および（3）自己複製または自己保全のための対称性の細胞分裂を起こすことができる、癌または腫瘍由来の細胞を指す。これらの特性により癌幹細胞は、腫瘍を形成できない大多数の腫瘍細胞と比べて、免疫無防備状態の宿主（例えば、マウス）に連続移植されると腫瘍または癌を形成するまたは確立する能力を与えられる。癌幹細胞は、分化に対して自己複製を無秩序な様式で起こし、変異が生じるにつれて経時的に変化し得る異常な細胞型の腫瘍を形成する。
【００７３】
用語「癌細胞」および「腫瘍細胞」は、癌細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞と、腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、癌または腫瘍または前癌病変に由来する細胞の集団全体を指す。本明細書において使用されるとき、用語「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、癌幹細胞と腫瘍細胞を区別するために、再生および分化する能力を欠く細胞のことを単独で指すときは用語「非腫瘍形成性」によって修飾される。
【００７４】
本明細書において使用される用語「腫瘍形成性」は、他の全ての腫瘍細胞を産生する（分化した腫瘍細胞およびひいては非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる）自己複製（さらなる腫瘍形成性の癌幹細胞を生じる）および増殖の特性を含む、癌幹細胞の機能的特性を指す。
【００７５】
本明細書において使用される用語「腫瘍形成能」は、免疫無防備状態の宿主（例えば、マウス）に連続移植されると、腫瘍由来の細胞のランダムな試料が明白な腫瘍を形成する能力を指す。
【００７６】
用語「対象」は、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、それは、特定の処置のレシピエントになる予定のヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むがそれに限定されるわけではない。典型的には、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に対する言及において本明細書において交換可能に使用される。
【００７７】
用語「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていることもしくは承認可能であること、またはヒトを含む動物において使用するために米国薬局方または他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを指す。
【００７８】
用語「薬学的に許容される賦形剤、担体、または佐剤」または「許容される薬学的担体」は、本開示の少なくとも一種の結合剤（例えば、抗体）とともに対象に投与することができ、かつ、その薬理学的活性を混乱させず、かつ治療効果を送達するのに十分な用量で投与された場合には無毒性である、賦形剤、担体、または佐剤を指す。
【００７９】
用語「有効量」または「治療有効量」または「治療効果」は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」のに有効な、結合剤、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機小分子、または他の薬物の量を指す。癌の場合、治療有効量の薬物（例えば、抗体）は、治療効果を有し、よって、癌細胞の数を減少させることができる;腫瘍形成能、腫瘍形成頻度もしくは腫瘍形成能力を減少させることができる;癌幹細胞の数もしくは発生頻度を低下させることができる;腫瘍サイズを減少させることができる;癌細胞集団を減少させることができる;末梢器官への癌細胞の浸潤（例えば、軟部組織および骨への癌の転移を含む）を阻害することもしくは停止することができる;腫瘍もしくは癌細胞の転移を阻害することおよび停止することができる;腫瘍もしくは癌細胞の成長を阻害することおよび停止することができる;癌に関連する症状の1つまたは複数をある程度軽減することができる;病的状態および死亡を減少させることができる;生活の質を改善することができる;またはそれらの効果の組み合わせである。その剤、例えば、抗体が、成長を予防する限りおよび/または既存の癌細胞を殺滅する限り、それは、細胞分裂抑制および/または細胞傷害性と呼ぶことができる。
【００８０】
用語「処置する（treating）」または「処置」または「処置する（to treat）」または「緩和する（alleviating）」または「緩和する（to alleviate）」は、1）診断された病的な状態または障害を治癒する、減速する、その症状を和らげる、かつ/またはその進行を停止する治療的方法と、2）標的にされている病的な状態または障害の発生を予防するかまたは遅延させる予防的または防止的な方法の両方を指す。したがって、処置の必要がある者には、すでにその障害を有する者;その障害を有する傾向がある者;およびその障害が予防されるべき者が含まれる。いくつかの態様において、患者が以下のうちの1つまたは複数を示す場合、対象は、本発明の方法による「処置」に成功している:癌細胞の数の減少もしくは癌細胞が完全に無くなること;腫瘍サイズの減少;軟部組織および骨への癌細胞の転移を含む末梢器官への癌細胞浸潤の阻害もしくはそれが無くなること;腫瘍または癌細胞の転移の阻害もしくはそれが無くなること;癌の成長の阻害もしくは癌が成長しなくなること;特定の癌に関連する1つもしくは複数の症状の軽減; 病的状態および死亡の減少;生活の質の改善;腫瘍形成能の低下;癌幹細胞の数もしくは発生頻度の低下;または効果のいくつかの組み合わせ。
【００８１】
本開示および請求項において使用されるとき、単数形「1つの」、「ある」および「その」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形を含む。
【００８２】
態様が、語「〜を含む」を用いて本明細書において記載される場合は必ず、「〜からなる」および/または「〜から本質的になる」に関して記載される別途類似の態様も提供されることが理解される。
【００８３】
本明細書における「Aおよび/またはB」などの句において使用される用語「および/または」は、AとBの両方;AまたはB;A（単独）;およびB（単独）を包含することを意図している。同様に、「A、B、および/またはC」などの句において使用される用語「および/または」は、以下の態様の各々を包含することを意図している:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC:AおよびC;AおよびB;BおよびC;A（単独）;B（単独）;ならびにC（単独）。
【００８４】
II. RSPO結合剤
本発明は、ヒトRSPOタンパク質に結合する剤を提供する。これらの剤は、本明細書において「RSPO結合剤」と呼ばれる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、ポリペプチドである。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、RSPO1に結合する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、RSPO2に結合する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、RSPO3に結合する。ある特定の態様において、RSPO剤は、少なくとも1種の他のヒトRSPOに特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤によって結合される少なくとも1種の他のヒトRSPOは、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される。いくつかの態様において、RSPO2結合剤によって結合される少なくとも1種の他のヒトRSPOは、RSPO1、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される。いくつかの態様において、RSPO3結合剤によって結合される少なくとも1種の他のヒトRSPOは、RSPO1、RSPO2、およびRSPO4からなる群より選択される。ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4に対する完全長アミノ酸（aa）配列は、当技術分野において公知であり、SEQ ID NO: 1（RSPO1）、SEQ ID NO: 2（RSPO2）、SEQ ID NO: 3（RSPO3）、およびSEQ ID NO: 4（RSPO4）として本明細書において提供される。
【００８５】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO結合剤（例えば、抗体）の抗原結合部位は、1、2、3、または4種のRSPOに結合することができる（または結合する）。ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO1結合剤（例えば、抗体）の抗原結合部位は、RSPO1、ならびに1、2、または3種の他のRSPOに結合することができる（または結合する）。例えば、ある特定の態様において、RSPO1結合剤の抗原結合部位は、RSPO1、ならびにRSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種の他のRSPOに特異的に結合することができる。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1およびRSPO2に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1およびRSPO3に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1およびRSPO4に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1、RSPO2、およびRSPO3に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1、RSPO2、およびRSPO4に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1、RSPO3、およびRSPO4に特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、ヒトRSPO1に特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO1とマウスRSPO1の両方に特異的に結合する。
【００８６】
ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸31〜263の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸34〜135の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO1のアミノ酸91〜135の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 5の範囲内に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 9の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤または抗体は、RSPO1のフューリン様システインリッチドメインに結合する。いくつかの態様において、前記剤または抗体は、RSPO1のフューリン様システインリッチドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 7の配列内に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 7の配列内に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1のトロンボスポンジンドメインに結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、RSPO1のトロンボスポンジンドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 8の範囲内に結合する。
【００８７】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO2結合剤（例えば、抗体）の抗原結合部位は、RSPO2、ならびに1、2、または3種の他のRSPOに結合することができる（または結合する）。例えば、ある特定の態様において、RSPO2結合剤の抗原結合部位は、RSPO2、ならびにRSPO1、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種の他のRSPOに特異的に結合することができる。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2およびRSPO1に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2およびRSPO3に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2およびRSPO4に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2、RSPO1、およびRSPO3に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2、RSPO1、およびRSPO4に特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2に特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO2とマウスRSPO2の両方に特異的に結合する。
【００８８】
ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜205の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸31〜146の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸31〜89の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸90〜134の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO2のアミノ酸90〜146の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 43の範囲内に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 44の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤または抗体は、RSPO2のフューリン様システインリッチドメインに結合する。いくつかの態様において、前記剤または抗体は、RSPO2のフューリン様システインリッチドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 45またはSEQ ID NO: 46の配列内に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46の配列内に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2のトロンボスポンジンドメインに結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、RSPO2のトロンボスポンジンドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 47の範囲内に結合する。
【００８９】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO3結合剤（例えば、抗体）の抗原結合部位は、RSPO3、ならびに1、2、または3種の他のRSPOに結合することができる（または結合する）。例えば、ある特定の態様において、RSPO3結合剤の抗原結合部位は、RSPO3、ならびにRSPO1、RSPO2、およびRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種の他のRSPOに特異的に結合することができる。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3およびRSPO1に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3およびRSPO2に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3およびRSPO4に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3、RSPO1、およびRSPO2に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3、RSPO1、およびRSPO4に特異的に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3、RSPO2、およびRSPO4に特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、ヒトRSPO3に特異的に結合する。いくつかの態様において、RSPO3結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO3とマウスRSPO3の両方に特異的に結合する。
【００９０】
ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜207の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO3のアミノ酸35〜135の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO3のアミノ酸35〜86の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、抗原結合剤は、ヒトRSPO3のアミノ酸92〜135の範囲内に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO3結合剤は、SEQ ID NO: 48の範囲内に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤または抗体は、RSPO3のフューリン様システインリッチドメインに結合する。いくつかの態様において、前記剤または抗体は、RSPO3のフューリン様システインリッチドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 49またはSEQ ID NO: 50の配列内に結合する。ある特定の態様において、RSPO3結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50の配列内に結合する。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3のトロンボスポンジンドメインに結合する。いくつかの態様において、RSPO3結合剤または抗体は、RSPO3のトロンボスポンジンドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸に結合する。いくつかの態様において、RSPO3結合剤または抗体は、SEQ ID NO: 51の範囲内に結合する。
【００９１】
ある特定の態様において、RSPO結合剤または抗体は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下の解離定数（KD）で少なくとも1種のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤または抗体は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下の解離定数（KD）でRSPO1に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、約1nMもしくはそれ以下のKDでRSPO1に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、約0.1nMもしくはそれ以下のKDでRSPO1に結合する。ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO1結合剤または抗体は、少なくとも1種の他のRSPOに結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOに結合する本明細書において記載されるRSPO1結合剤または抗体は、約100nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下のKDで少なくとも1種の他のRSPOに結合する。例えば、いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4にも約10nMまたはそれ以下のKDで結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、約0.1nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPO1に結合する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、約10nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPOとマウスRSPOの両方に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、約1nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPO1とマウスRSPO1の両方に結合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、約0.1nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPO1とマウスRSPO1の両方に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤または抗体は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下の解離定数（KD）でRSPO2に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、約10nMまたはそれ以下のKDでRSPO2に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、約1nMまたはそれ以下のKDでRSPO2に結合する。ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO2結合剤または抗体は、少なくとも1種の他のRSPOに結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOに結合する本明細書において記載されるRSPO2結合剤または抗体は、約100nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下のKDで少なくとも1種の他のRSPOに結合する。例えば、いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、RSPO1、RSPO3、および/またはRSPO4にも約10nMまたはそれ以下のKDで結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、約1nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPO2に結合する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、約10nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPOとマウスRSPOの両方に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、約1nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPO2��マウスRSPO2の両方に結合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、約0.1nMまたはそれ以下のKDでヒトRSPO2とマウスRSPO2の両方に結合する。いくつかの態様において、RSPOタンパク質に対する結合剤（例えば、抗体）の解離定数は、Biacoreチップ上に固定化されたRSPOタンパク質の少なくとも一部を含むRSPO融合タンパク質を使用して測定された解離定数である。
【００９２】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下の最大半量有効濃度（EC50）で少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMまたはそれ以下の最大半量有効濃度（EC50）でヒトRSPO1に結合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下のEC50でヒトRSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4にも結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下の最大半量有効濃度（EC50）でヒトRSPO2に結合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、約1nMもしくはそれ以下、または約0.1nMもしくはそれ以下のEC50でヒトRSPO1、RSPO3、および/またはRSPO4にも結合する。
【００９３】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、抗体は、組換え抗体である。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト抗体である。ある特定の態様において、抗体は、IgG1抗体である。ある特定の態様において、抗体は、IgG2抗体である。ある特定の態様において、抗体は、抗原結合部位を含む抗体断片である。いくつかの態様において、抗体は、一価、単一特異的、二価、二重特異的、または多重特異的である。いくつかの態様において、抗体は、細胞傷害性部分にコンジュゲートされている。いくつかの態様において、抗体は、単離されている。いくつかの態様において、抗体は、実質的に純粋である。
【００９４】
本発明のRSPO結合剤（例えば、抗体）は、当技術分野において公知の任意の方法によって特異的結合についてアッセイすることができる。使用できるイムノアッセイとしては、Biacore解析、FACS解析、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの手法を使用する競合および非競合アッセイシステムが挙げられるが、それに限定されるわけではない。そのようなアッセイは、当技術分野において慣用かつ周知である（例えば、Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照のこと）。
【００９５】
例えば、ヒトRSPO1への抗体の特異的結合は、ELISAを使用して測定され得る。ELISAアッセイは、抗原を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程、検出可能な化合物（例えば、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ））にコンジュゲートされたRSPO1結合抗体または他のRSPO1結合剤をそのウェルに加える工程、ある時間にわたってインキュベートする工程、およびその抗原に結合した抗体の存在を検出する工程を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合抗体または結合剤は、検出可能な化合物にコンジュゲートされないが、その代わりに、RSPO1結合抗体または結合剤を認識するコンジュゲートされた第2の抗体がウェルに加えられる。いくつかの態様において、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、RSPO結合抗体または結合剤をウェルにコーティングすることができ、コーティングされたウェルに抗原を加えた後に、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第2の抗体を加えることができる。当業者は、検出されるシグナルを増大するために改変され得るパラメータならびに当技術分野において公知のELISAの他のバリエーションに関して精通しているだろう。
【００９６】
別の例では、ヒトRSPO1への抗体の特異的結合は、FACSを使用して測定され得る。FACSスクリーニングアッセイは、融合タンパク質（例えば、RSPO1-FcまたはRSPO1-CD4TM）として抗原を発現するcDNAコンストラクトを作製する工程、該コンストラクトを細胞にトランスフェクトする工程、該抗原を細胞の表面上に発現させる工程、トランスフェクトされた細胞とRSPO1結合抗体または他のRSPO1結合剤を混合する工程、およびある時間にわたってインキュベートする工程を含み得る。RSPO1結合抗体または他のRSPO結合剤によって結合された細胞は、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体（例えば、PEコンジュゲート抗Fc抗体）およびフローサイトメーターを使用することによって識別され得る。当業者は、検出されるシグナルを最適化するために改変され得るパラメータ、ならびにスクリーニング（例えば、遮断抗体についてのスクリーニング）を増強し得るFACSの他のバリエーションに関して精通しているだろう。
【００９７】
抗原（例えば、RSPOタンパク質）への抗体または他の結合剤の結合親和性および抗体と抗原との相互作用の解離速度は、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの一例は、増加量の非標識抗原の存在下において標識抗原（例えば、3Hまたは125I）またはその断片もしくは変異体と関心対象の抗体とをインキュベートした後、標識抗原に結合した抗体を検出する工程を含む、ラジオイムノアッセイである。抗原（例えば、RSPOタンパク質）に対する抗体の親和性および結合の解離速度は、スキャッチャードプロット解析によってそのデータから測定することができる。いくつかの態様において、抗原（例えば、RSPOタンパク質）に結合する抗体または剤の結合速度および解離速度を測定するために、Biacore動態解析が使用される。Biacore動態解析は、表面上に抗原（例えば、RSPOタンパク質）が固定化されたチップへの抗体の結合およびそのチップからの解離を解析することを含む。
【００９８】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、抗体89M5のCDRの1、2、3、4、5、および/または6つを含む（表1を参照のこと）。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、89M5のCDRの1つまたは複数、89M5のCDRの2つもしくはそれ以上、89M5のCDRの3つもしくはそれ以上、89M5のCDRの4つもしくはそれ以上、89M5のCDRの5つもしくはそれ以上、または89M5のCDRの6つ全てを含む。
【００９９】
【表１】
2014524746.tif 000016
【０１００】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤は、TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000017
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000018
を含む重鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤はさらに、
2014524746.tif 000019
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、
2014524746.tif 000020
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、（a）TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000021
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000022
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
2014524746.tif 000023
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3を含む。
【０１０１】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤は、（a）TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（b）
2014524746.tif 000024
を含む重鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（c）
2014524746.tif 000025
を含む重鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（d）
2014524746.tif 000026
を含む軽鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（e）WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;および（f）QQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む。ある特定の態様において、アミノ酸置換は、保存的置換である。
【０１０２】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 10に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 11に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 10に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 10に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 11に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 10を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 11を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 10から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 11から本質的になる軽鎖可変領域を含む。
【０１０３】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 55に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 59に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 55に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 59に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 55に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 59に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 55を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 59を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 55から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 59から本質的になる軽鎖可変領域を含む。
【０１０４】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 25に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 26に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 25に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 26に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 25を含む重鎖および/またはSEQ ID NO: 26を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 25から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO: 26から本質的になる軽鎖を含む。
【０１０５】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 68に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 69に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、（a）SEQ ID NO: 68に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 69に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 68を含む重鎖および/またはSEQ ID NO: 69を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 68から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO: 69から本質的になる軽鎖を含む。
【０１０６】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、抗体130M23のCDRの1、2、3、4、5、および/または6つを含む（表1を参照のこと）。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、130M23のCDRの1つまたは複数、130M23のCDRの2つもしくはそれ以上、130M23のCDRの3つもしくはそれ以上、130M23のCDRの4つもしくはそれ以上、130M23のCDRの5つもしくはそれ以上、または130M23のCDRの6つ全てを含む。
【０１０７】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤は、SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000027
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000028
を含む重鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤はさらに、
2014524746.tif 000029
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、
2014524746.tif 000030
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、（a）SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000031
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000032
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
2014524746.tif 000033
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3を含む。
【０１０８】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤は、（a）SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（b）
2014524746.tif 000034
を含む重鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（c）
2014524746.tif 000035
を含む重鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（d）
2014524746.tif 000036
を含む軽鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;（e）WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体;および（f）QQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む。ある特定の態様において、アミノ酸置換は、保存的置換である。
【０１０９】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 27に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 28に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 27に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 28に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 27に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 28に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 27を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 28を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 27から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 28から本質的になる軽鎖可変領域を含む。
【０１１０】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 67もしくはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 67またはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 67もしくはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 67を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO: 76を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 67から本質的になる軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 63から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 76から本質的になる軽鎖可変領域を含む。
【０１１１】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 41に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 42に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 41に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 42に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 41を含む重鎖および/またはSEQ ID NO: 42を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 41から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO: 42から本質的になる軽鎖を含む。
【０１１２】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合剤（例えば、抗体）を提供し、ここで、該RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 70に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 71もしくはSEQ ID NO: 74に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、（a）SEQ ID NO: 70に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO: 71もしくはSEQ ID NO: 74に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 70を含む重鎖および/またはSEQ ID NO: 71を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 70を含む重鎖および/またはSEQ ID NO: 74を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 70から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO: 71から本質的になる軽鎖を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 70から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO: 74から本質的になる軽鎖を含む。
【０１１３】
本発明は、ヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する抗体を含むがそれに限定されるわけではないポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、該ポリペプチドは、ヒトRSPO1に結合する。いくつかの態様において、該ポリペプチドは、ヒトRSPO2に結合する。いくつかの態様において、該ポリペプチドは、ヒトRSPO3に結合する。
【０１１４】
ある特定の態様において、ポリペプチドは、抗体89M5のCDRの1、2、3、4、5、および/または6つを含む（本明細書における表1を参照のこと）。ある特定の態様において、ポリペプチドは、抗体130M23のCDRの1、2、3、4、5、および/または6つを含む（本明細書における表1を参照のこと）。いくつかの態様において、ポリペプチドは、CDR1つあたり最大4個（すなわち、0、1、2、3または4個）のアミノ酸置換を有するCDRを含む。ある特定の態様において、重鎖CDRは、重鎖可変領域内に含まれる。ある特定の態様において、軽鎖CDRは、軽鎖可変領域内に含まれる。
【０１１５】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 10もしくはSEQ ID NO: 55に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 11もしくはSEQ ID NO: 59に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 10もしくはSEQ ID NO: 55に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 11もしくはSEQ ID NO: 59に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 10もしくはSEQ ID NO: 55に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 11もしくはSEQ ID NO: 59に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 10を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 11を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 55を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 59を含むアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 27もしくはSEQ ID NO: 63に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 67、もしくはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 27またはSEQ ID NO: 63に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 67、またはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 27もしくはSEQ ID NO: 63に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 67、もしくはSEQ ID NO: 76に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 27を含むアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO: 28を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 63を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 67を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 63を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 76を含むアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 25に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 26に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 25に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 26に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 25に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 26に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 25を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 26を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 25および/またはSEQ ID NO: 26から本質的になる。
【０１１８】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 68に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 69に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 68に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 69に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 68に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 69に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 68を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 69を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 68および/またはSEQ ID NO: 69から本質的になる。
【０１１９】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 41に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 42に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 41に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 42に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 41に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 42に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 41を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 42を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 41および/またはSEQ ID NO: 42から本質的になる。
【０１２０】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、該ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 71もしくはSEQ ID NO: 74に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 71またはSEQ ID NO: 74に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 71もしくはSEQ ID NO: 74に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 71を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70を含むアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO: 74を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70および/またはSEQ ID NO: 71から本質的になる。ある特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO: 70および/またはSEQ ID NO: 74から本質的になる。
【０１２１】
いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 68、およびSEQ ID NO: 69からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、およびSEQ ID NO: 76からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【０１２２】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、89M5抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、89M5抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、89M5抗体である。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、89M5抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を、該抗体のヒト化型で含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、h89M5-H2L2抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、89M5抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を、該抗体のヒト化型で含む。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、h89M5-H2L2抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を含む。いくつかの態様において、89M5のヒト化バージョンは、IgG1抗体である。いくつかの態様において、89M5のヒト化バージョンは、IgG2抗体である。89M5抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約の規定に基づき、2011年6月30日にAmerican Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-11970が割り当てられた。
【０１２３】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5を含むか、抗体89M5から本質的になるか、または抗体89M5からなる。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、抗体h89M5-H2L2を含むか、抗体h89M5-H2L2から本質的になるか、または抗体h89M5-H2L2からなる。
【０１２４】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、130M23抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、130M23抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、130M23抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、130M23抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を該抗体のヒト化型で含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、h130M23-H1L2抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、h130M23-H1L6抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、130M23抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を該抗体のヒト化型で含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、h130M23-H1L2抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、h130M23-H1L6抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列を含むまたは含まない）を含む。いくつかの態様において、130M23のヒト化バージョンは、IgG1抗体である。いくつかの態様において、130M23のヒト化バージョンは、IgG2抗体である。130M23抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約の規定に基づき、2011年8月10日にAmerican Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-12021が割り当てられた。
【０１２５】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23を含むか、抗体130M23から本質的になるか、または抗体130M23からなる。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L2を含むか、抗体h130M23-H1L2から本質的になるか、または抗体h130M23-H1L2からなる。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L6を含むか、抗体h130M23-H1L6から本質的になるか、または抗体h130M23-H1L6からなる。
【０１２６】
抗体を含む多くのタンパク質は、様々な位置へのそのタンパク質の輸送を指示するシグナル配列を含む。シグナル配列（シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる）は、新生ポリペプチドのN末端に存在する。それらは、ポリペプチドを小胞体に標的化し、それらのタンパク質は、それらの目的地、例えば、細胞小器官の内腔、内膜、細胞の外膜、または分泌によって細胞の外側に局在化される。ほとんどのシグナル配列は、タンパク質が小胞体に輸送された後、シグナルペプチダーゼによってそのタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列の特定の部位で生じ、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常、特定の1つの切断部位が存在するが、2つ以上の切断部位が、シグナルペプチダーゼによって認識および/または使用されることがあり、ポリペプチドの不均質なN末端が生じる。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位の使用によって、異なるN末端のアミノ酸を有して発現されるポリペプチドが生じ得る。したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、異なるN末端を有するポリペプチドの混合物を含み得る。いくつかの態様において、N末端は、1、2、3、4、または5アミノ酸だけ長さが異なる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、実質的に均一であり、すなわち、それらのポリペプチドは、同じN末端を有する。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、「天然の」または「親の」シグナル配列と比べて、1つまたは複数の（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個などの）アミノ酸置換および/または欠失を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、1つの切断部位を主要にさせるアミノ酸置換および/または欠失を含むことによって、1つのN末端を有する実質的に均一なポリペプチドが得られる。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、異なるシグナル配列で置換される。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、該ポリペプチドの発現レベルに影響する。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、該ポリペプチドの発現レベルを増加させる。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、該ポリペプチドの発現レベルを低下させる。
【０１２７】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、RSPO1への特異的結合について、SEQ ID NO: 10を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 11を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、RSPO1への特異的結合について、SEQ ID NO: 55を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 59を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、RSPO1への特異的結合について、SEQ ID NO: 25を含む重鎖およびSEQ ID NO: 26を含む軽鎖を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、RSPO1への特異的結合について、SEQ ID NO: 68を含む重鎖およびSEQ ID NO: 69を含む軽鎖を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、ヒトRSPO1への特異的結合について抗体89M5またはh89M5-H2L2と競合する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤または抗体は、インビトロ競合結合アッセイにおいてRSPO1への特異的結合について競合する。いくつかの態様において、RSPO1は、ヒトRSPO1である。いくつかの態様において、RSPO1は、マウスRSPO1である。
【０１２８】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、本発明の抗体と同じRSPO1上のエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。別の態様において、RSPO1結合剤は、本発明の抗体によって結合されるRSPO1上のエピトープと重複するRSPO1上のエピトープに結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO1結合剤（例えば、抗体）は、抗体89M5またはh89M5-H2L2と同じRSPO1上のエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。別の態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2によって結合されるRSPO1上のエピトープと重複するRSPO1上のエピトープに結合する抗体である。
【０１２９】
ある特定の態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1への特異的結合について、ATCC寄託指定番号PTA-11970を有するハイブリドーマによって産生される抗体と競合する（例えば、競合結合アッセイにおいて）剤である。
【０１３０】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、RSPO2に対する特異的結合について、SEQ ID NO: 27を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 28を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、RSPO2に対する特異的結合について、SEQ ID NO: 63を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 67またはSEQ ID NO: 76を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、RSPO2に対する特異的結合について、SEQ ID NO: 41を含む重鎖およびSEQ ID NO: 42を含む軽鎖を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、RSPO2に対する特異的結合について、SEQ ID NO: 70を含む重鎖およびSEQ ID NO: 71またはSEQ ID NO: 74を含む軽鎖を含む抗体と競合する。ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、ヒトRSPO2への特異的結合について、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6と競合する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤または抗体は、インビトロ競合結合アッセイにおいてRSPO2に対する特異的結合について競合する。いくつかの態様において、RSPO2は、ヒトRSPO2である。いくつかの態様において、RSPO2は、マウスRSPO2である。
【０１３１】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、本発明の抗体と同じRSPO2上のエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。別の態様において、RSPO2結合剤は、本発明の抗体によって結合されるRSPO2上のエピトープと重複するRSPO2上のエピトープに結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO2結合剤（例えば、抗体）は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6と同じRSPO2上のエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する。別の態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6によって結合されるRSPO2上のエピトープと重複するRSPO2上のエピトープに結合する抗体である。
【０１３２】
ある特定の態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2に対する特異的結合について、ATCC寄託指定番号PTA-12021を有するハイブリドーマによって産生される抗体と競合する（例えば、競合結合アッセイにおいて）剤である。
【０１３３】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO結合剤（例えば、抗体）は、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に結合し、RSPO活性を調節する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPOアンタゴニストであり、RSPO活性を低下させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPOアンタゴニストであり、β-カテニン活性を低下させる。
【０１３４】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO1結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO1に結合し、RSPO1活性を調節する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1アンタゴニストであり、RSPO1活性を低下させる。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、RSPO1アンタゴニストであり、β-カテニン活性を低下させる。
【０１３５】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO2結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO2に結合し、RSPO2活性を調節する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2アンタゴニストであり、RSPO2活性を低下させる。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、RSPO2アンタゴニストであり、β-カテニン活性を低下させる。
【０１３６】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO3結合剤（例えば、抗体）は、ヒトRSPO3に結合し、RSPO3活性を調節する。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3アンタゴニストであり、RSPO3活性を低下させる。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、RSPO3アンタゴニストであり、β-カテニン活性を低下させる。
【０１３７】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質のアンタゴニストである。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、少なくとも1種のRSPOのアンタゴニストであり、RSPO活性を阻害する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、RSPO活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、1、2、3、または4種のRSPOタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の活性を阻害する。ある特定の態様において、ヒトRSPO1活性を阻害するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。ある特定の態様において、ヒトRSPO2活性を阻害するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１３８】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質のアンタゴニストである。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、RSPOシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、1、2、3、または4種のRSPOタンパク質によるシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4のシグナル伝達を阻害する。ある特定の態様において、RSPO1シグナル伝達を阻害するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。ある特定の態様において、RSPO2シグナル伝達を阻害するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１３９】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、β-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストである。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、β-カテニンシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。ある特定の態様において、β-カテニンシグナル伝達を阻害するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。ある特定の態様において、β-カテニンシグナル伝達を阻害するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１４０】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、受容体への少なくとも1種のRSPOタンパク質の結合を阻害する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、該受容体の1つまたは複数へのヒトRSPOタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、少なくとも1種のLGRタンパク質へのRSPOタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、LGR4、LGR5、および/またはLGR6へのRSPOタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR4へのRSPO1の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR5へのRSPO1の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR6へのRSPO1の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR4へのRSPO2の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR5へのRSPO2の結合を阻害する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR6へのRSPO2の結合を阻害する。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質へのRSPO結合剤の結合の阻害は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質への少なくとも1種のRSPOの結合を阻害するRSPO結合剤はさらに、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質へのヒトRSPO1の結合を阻害するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質へのヒトRSPO2の結合を阻害するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１４１】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、受容体への少なくとも1種のRSPOの結合を遮断する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、該受容体の1つまたは複数へのヒトRSPOタンパク質の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、少なくとも1種のLGRタンパク質へのRSPOの結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、LGR4、LGR5、および/またはLGR6への少なくとも1種のRSPOタンパク質の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR4へのRSPO1の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR5へのRSPO1の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、LGR6へのRSPO1の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR4へのRSPO2の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR5へのRSPO2の結合を遮断する。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、LGR6へのRSPO2の結合を遮断する。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質へのRSPO結合剤の結合の遮断は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質への少なくとも1種のRSPOタンパク質の結合を遮断するRSPO結合剤はさらに、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質へのヒトRSPO1の結合を遮断するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。ある特定の態様において、少なくとも1種のLGRタンパク質へのヒトRSPO2の結合を遮断するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１４２】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。β-カテニンシグナル伝達を阻害するRSPO結合剤は、ある特定の態様において、β-カテニンシグナル経路における1つまたは複数の受容体によるシグナル伝達を阻害することがあるが、必ずしも全ての受容体によるシグナル伝達を阻害するわけではないことが理解される。ある特定の代替の態様において、全てのヒト受容体によるβ-カテニンシグナル伝達が阻害され得る。ある特定の態様において、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される1つまたは複数の受容体によるβ-カテニンシグナル伝達が阻害される。ある特定の態様において、RSPO結合剤によるβ-カテニンシグナル伝達の阻害は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％のβ-カテニンシグナル伝達のレベルの低下である。いくつかの態様において、β-カテニンシグナル伝達を阻害するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。いくつかの態様において、β-カテニンシグナル伝達を阻害するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１４３】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、β-カテニンの活性化を阻害する。β-カテニンの活性化を阻害するRSPO結合剤は、ある特定の態様において、1つまたは複数の受容体によるβ-カテニンの活性化を阻害することがあるが、必ずしも全ての受容体によるβ-カテニンの活性化を阻害するわけではないことが理解される。ある特定の代替の態様において、全てのヒト受容体によるβ-カテニンの活性化が阻害され得る。ある特定の態様において、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される1つまたは複数の受容体によるβ-カテニンの活性化が阻害される。ある特定の態様において、RSPO結合剤によるβ-カテニンの活性化の阻害は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％のβ-カテニンの活性化のレベルの低下である。いくつかの態様において、β-カテニンの活性化を阻害するRSPO1結合剤は、抗体89M5またはh89M5-H2L2である。いくつかの態様において、β-カテニンの活性化を阻害するRSPO2結合剤は、抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6である。
【０１４４】
RSPO結合剤（または候補RSPO結合剤）がβ-カテニンシグナル伝達を阻害するかを判定するためのインビボおよびインビトロアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に多コピーのTCF結合ドメインを含むTCF/Lucレポーターベクターを利用する細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイが、インビトロにおいてβ-カテニンシグナル伝達のレベルを測定するために使用され得る（Gazit et al., 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA）。RSPO結合剤の存在下におけるRSPOタンパク質またはRSPO馴化培地有りまたは無しでの1つまたは複数のWnt（例えば、トランスフェクトされた細胞によって発現されるかまたはWnt馴化培地によって提供されるWnt）の存在下におけるβ-カテニンシグナル伝達のレベルが、RSPO結合剤が存在しない場合のシグナル伝達のレベルと比較される。β-カテニンシグナル伝達に対するRSPO結合剤（または候補剤）の効果は、TCF/Lucレポーターアッセイに加えて、β-カテニンによって制御される遺伝子（例えば、c-myc（He et al., 1998, Science, 281: 1509-12）、サイクリンD1（Tetsu et al., 1999, Nature, 398: 422-6）、および/またはフィブロネクチン（Gradl et al. 1999, Mol. Cell Biol., 19: 5576-87））の発現レベルに対するその剤の効果を測定することによって、インビトロまたはインビボにおいて測定され得る。ある特定の態様において、β-カテニンシグナル伝達に対するRSPO結合剤の効果は、Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に対するその剤の効果を測定することによっても評価され得る。
【０１４５】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、以下の効果のうちの1つまたは複数を有する:腫瘍細胞の増殖を阻害すること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍の腫瘍形成能を低下させること、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させることによって腫瘍の腫瘍形成能を低下させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍細胞の細胞死を誘発すること、腫瘍内の細胞の分化を誘導すること、腫瘍形成性細胞が非腫瘍形成性状態に分化すること、腫瘍細胞における分化マーカーの発現を誘導すること、腫瘍細胞の転移を予防すること、または腫瘍細胞の生存を減少させること。
【０１４６】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、腫瘍成長を阻害することができる。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、インビボにおいて（例えば、異種移植片マウスモデル、および/または癌を有するヒトにおいて）腫瘍成長を阻害することができる。
【０１４７】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、腫瘍の腫瘍形成能を減少させることができる。ある特定の態様において、RSPO結合剤または抗体は、動物モデル（例えば、マウス異種移植片モデル）において癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成能を減少させることができる。ある特定の態様において、腫瘍内の癌幹細胞の数または発生頻度は、少なくとも約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍、または約1000倍減少する。ある特定の態様において、癌幹細胞の数または発生頻度の減少は、動物モデルを使用した限界希釈アッセイによって測定される。腫瘍内の癌幹細胞の数または発生頻度の低下を測定するための限界希釈アッセイの使用に関するさらなる例および指針は、例えば、国際公開番号WO2008/042236、米国特許出願公開第2008/0064049号、および米国特許出願公開第2008/0178305号に見られる。
【０１４８】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO結合剤は、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日間、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日間、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有するIgG（例えば、IgG1またはIgG2）抗体である。ポリペプチドおよび抗体などの剤の半減期を延長する（または短縮する）方法は、当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環半減期を延長する公知の方法には、pH6.0における新生児Fc受容体（FcRn）への抗体のpH依存性結合を増加させる変異をFc領域に導入することが含まれる（例えば、米国特許出願公開第2005/0276799号、同第2007/0148164号、および同第2007/0122403号を参照のこと）。Fc領域を欠く抗体断片の循環半減期を延長する公知の方法には、PEG化などのような手法が含まれる。
【０１４９】
いくつかの態様において、RSPO結合剤は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、任意の公知の方法によって調製することができる。いくつかの態様において、ポリクローナル抗体は、関連抗原（例えば、精製されたペプチド断片、完全長組換えタンパク質、または融合タンパク質）の複数回の皮下または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバ）を免疫することによって産生される。その抗原は、任意で担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または血清アルブミン）にコンジュゲートされ得る。その抗原（担体タンパク質有りまたは無し）は、滅菌食塩水に希釈され、安定したエマルジョンを形成するために、通常、アジュバント（例えば、フロイント完全または不完全アジュバント）と混合される。十分な時間が経過した後、免疫された動物の血液、腹水などからポリクローナル抗体が回収される。ポリクローナル抗体は、当技術分野における標準的な方法（アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含むがそれに限定されるわけではない）に従って血清または腹水から精製することができる。
【０１５０】
いくつかの態様において、RSPO結合剤は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知のハイブリドーマ法を使用して調製することができる（例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497を参照のこと）。いくつかの態様において、ハイブリドーマ法を使用するとき、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を、上に記載されたように免疫することにより、リンパ球からの、免疫抗原に特異的に結合する抗体の産生を誘発する。いくつかの態様において、リンパ球は、インビトロにおいて免疫することができる。いくつかの態様において、免疫抗原は、ヒトタンパク質またはその一部であり得る。いくつかの態様において、免疫抗原は、マウスタンパク質またはその一部であり得る。
【０１５１】
免疫した後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、好適なミエローマ細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞が形成され、次いでそれを、融合していないリンパ球およびミエローマ細胞から選択することができる。選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、種々の方法（免疫沈降、免疫ブロット法、およびインビトロ結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、FACS、ELISA、およびラジオイムノアッセイ）を含むがそれに限定されるわけではない）によって識別され得る。そのハイブリドーマは、標準的な方法を使用するインビトロ培養において（J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA）または動物の腹水腫瘍としてインビボにおいて、増殖され得る。そのモノクローナル抗体は、当技術分野における標準的な方法（アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含むがそれに限定されるわけではない）に従って培養培地または腹水から精製することができる。
【０１５２】
ある特定の態様において、モノクローナル抗体は、当業者に公知であるような組換えDNA法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと）。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、該抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するRT-PCRなどによって、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は、従来の手法を使用して決定される。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、別途免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli）、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、またはミエローマ細胞）にトランスフェクトされたときモノクローナル抗体を生成する好適な発現ベクターにクローニングされる。他の態様において、組換えモノクローナル抗体またはその断片は、所望の種のCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（例えば、McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352: 624-628;およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581-597を参照のこと）。
【０１５３】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドはさらに、代替の抗体を作製する組換えDNA技術を使用するいくつかの異なる様式で改変することができる。いくつかの態様において、例えばマウスモノクローナル抗体の、軽鎖および重鎖の定常ドメインを、例えばヒト抗体の該領域の代わりに用いてキメラ抗体を作製することができ、または、非免疫グロブリンポリペプチドの代わりに用いて融合抗体を作製することができる。いくつかの態様において、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を作製するために、定常領域は、切断されるかまたは除去される。モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化するために、可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発を使用することができる。
【０１５４】
いくつかの態様において、ヒトRSPOタンパク質に対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、当業者に公知の方法を使用して、CDRの残基が所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリンである。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基は、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種由来の抗体内の対応する残基で置換されている。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、Fvフレームワーク領域および/または置換された非ヒト残基内におけるさらなる残基の置換によってさらに改変することができ、それにより、抗体の特異性、親和性、および/または性能が洗練されるおよび最適化される。通常、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全てまたは実質的に全てを含む少なくとも1つ、および典型的には2つまたは3つの可変ドメイン領域の実質的に全てを含む一方、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Fc）の少なくとも一部も含み得る。ある特定の態様において、そのようなヒト化抗体は、ヒト対象に投与されると抗原性およびHAMA（ヒト抗マウス抗体）反応を減少させ得るので、治療的に使用される。当業者は、公知の手法に従って、免疫原性が低下した機能的なヒト化抗体を得ることができるだろう（例えば、米国特許第5,225,539号;同第5,585,089号;同第5,693,761号;および同第5,693,762号を参照のこと）。
【０１５５】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な手法を使用して直接調製することができる。いくつかの態様において、インビトロにおいて免疫されたか、または標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された、不死化ヒトBリンパ球が作製され得る（例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147: 86-95;ならびに米国特許第5,750,373号;同第5,567,610号および同第5,229,275号を参照のこと）。いくつかの態様において、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択することができ、ここで該ファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（Vaughan et al, 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95: 6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581）。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用することにより、インビトロにおいて、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片を生成することができる。抗体ファージライブラリーの作製および使用についての手法は、米国特許第5,969,108号;同第6,172,197号;同第5,885,793号;同第6,521,404号;同第6,544,731号;同第6,555,313号;同第6,582,915号;同第6,593,081号;同第6,300,064号;同第6,653,068号;同第6,706,484号;および同第7,264,963号;ならびにRothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376: 1182-1200にも記載されている。チェインシャフリング（Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783）および部位特異的突然変異誘発を含むがそれに限定されるわけではない親和性成熟ストラテジーが当技術分野において公知であり、それは、高親和性ヒト抗体を作製するために使用され得る。
【０１５６】
いくつかの態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスにおいて産生され得る。これらのマウスは、免疫されると、内因性の免疫グロブリンを産生せずに、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;および同第5,661,016号に記載されている。
【０１５７】
本発明は、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質を特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識することおよびそれに特異的に結合することができる。その異なるエピトープは、同じ分子内に（例えば、ヒトRSPO1上の2つのエピトープ）または異なる分子上に（例えば、RSPO1上の1つのエピトープおよびRSPO2上の1つのエピトープ）存在し得る。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、それらの抗体は、細胞防御機構を、第1抗原標的を発現している細胞に集中させるために、第1抗原標的（例えば、RSPO1）ならびに第2抗原標的（例えば、白血球上のエフェクター分子（例えば、CD2、CD3、CD28、またはB7）またはFc受容体（例えば、CD64、CD32、またはCD16））を特異的に認識することおよびそれに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、それらの抗体は、細胞傷害剤を、特定の標的抗原を発現する細胞に向けるために使用することができる。これらの抗体は、抗原に結合するアーム、および細胞傷害剤または放射性核種キレート剤（例えば、EOTUBE、DPTA、DOTA、またはTETA）に結合するアームを有する。ある特定の態様において、二重特異性抗体は、RSPO1、ならびにRSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択されるいずれかのさらなるRSPOタンパク質に特異的に結合する。ある特定の態様において、二重特異性抗体は、RSPO2、ならびにRSPO1、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択されるいずれかのさらなるRSPOタンパク質に特異的に結合する。
【０１５８】
二重特異性抗体を作製するための手法は、当業者に公知である。例えば、Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229: 81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol., 121: 120; Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10: 3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175: 217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148: 1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol., 152: 5368;米国特許第5,731,168号;および米国特許出願公開第2011/0123532号を参照のこと。二重特異性抗体は、インタクトな抗体または抗体断片であり得る。2より高い結合価を有する抗体もまた企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る（Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147: 60）。したがって、ある特定の態様において、RSPO1に対する抗体は、多重特異性である。
【０１５９】
ある特定の態様において、本明細書において記載される抗体（または他のポリペプチド）は、単一特異的であり得る。例えば、ある特定の態様において、抗体が含む1つまたは複数の抗原結合部位の各々は、RSPOタンパク質上の相同エピトープに結合することができる（または結合する）。ある特定の態様において、本明細書において記載される単一特異的抗体の抗原結合部位は、例えば、RSPO1およびRSPO2に結合することができる（または結合する）（すなわち、同じエピトープが、RSPO1とRSPO2の両方のタンパク質上に見られる）。
【０１６０】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、抗体断片である。抗体断片は、インタクトな抗体とは異なる機能または能力を有することがある;例えば、抗体断片は、高い腫瘍透過性を有し得る。抗体断片を作製するための様々な手法が知られており、それらは、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を含むがそれに限定されるわけではない。いくつかの態様において、抗体断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）2断片を含む。いくつかの態様において、抗体断片は、F（ab'）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成されるFab断片を含む。他の態様において、抗体断片は、パパインおよび還元剤による抗体分子の処理によって生成されるFab断片を含む。ある特定の態様において、抗体断片は、組換え的に生成される。いくつかの態様において、抗体断片は、Fvまたは一本鎖Fv（scFv）断片を含む。Fab、Fv、およびscFv抗体断片は、大量のこれらの断片の生成が可能な大腸菌または他の宿主細胞において発現され得るおよびそれらから分泌され得る。いくつかの態様において、抗体断片は、本明細書において論じられるような抗体ファージライブラリーから単離される。例えば、RSPOタンパク質、またはその誘導体、断片、アナログ、もしくはホモログに対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ効率的な識別を可能にするFab発現ライブラリーを構築するための方法を使用することができる（Huse et al, 1989, Science, 246: 1275-1281）。いくつかの態様において、抗体断片は、鎖状抗体断片である。ある特定の態様において、抗体断片は、単一特異的または二重特異的である。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、scFvである。1つまたは複数のヒトRSPOに特異的な一本鎖抗体を作製するための様々な手法を使用することができる（例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと）。
【０１６１】
特に抗体断片の場合において、血清半減期を延長するために抗体を改変することがさらに望ましいことがある。これは、例えば、抗体断片内の適切な領域の変異によってサルベージ受容体結合エピトープを該抗体断片に組み込むことによって、またはそのエピトープをペプチドタグに組み込み、次いでそれを抗体断片のいずれかの末端または中央に（例えば、DNAまたはペプチド合成によって）融合することによって、達成することができる。
【０１６２】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合的に接続された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、望まれない細胞に免疫細胞を標的化するために提案されている（米国特許第4,676,980号）。架橋剤が関与する方法を含む合成タンパク質化学における公知の方法を使用してインビトロにおいてヘテロコンジュゲート抗体が調製され得ることもまた企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的にとって好適な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１６３】
本発明の目的のために、改変された抗体は、標的（すなわち、ヒトRSPO1またはヒトRSPO2）と該抗体の会合を提供する任意のタイプの可変領域を含み得ることが理解されるべきである。この点において、該可変領域は、所望の腫瘍関連抗原に対する体液性応答を惹起するおよび免疫グロブリンを産生するように誘導され得る任意のタイプの哺乳動物を含み得るか、またはそれらに由来し得る。よって、改変された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）、またはウサギ起源であり得る。いくつかの態様において、改変された免疫グロブリンの可変領域と定常領域の両方が、ヒトである。他の態様において、適合性の抗体の可変領域（通常、非ヒト起源に由来する）は、該分子の結合特性を改善するようにまたは該分子の免疫原性を低下させるように操作され得るかまたは特異的に調整され得る。この点において、本発明において有用な可変領域は、ヒト化され得るか、または移入されるアミノ酸配列を含めることによって別途変更され得る。
【０１６４】
ある特定の態様において、重鎖と軽鎖の両方における可変ドメインは、1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的な置換によって、ならびに必要であれば、部分的なフレームワーク領域の置換ならびに配列の改変および/または変更によって、変更される。CDRは、フレームワーク領域の起源である抗体と同じクラスまたはサブクラスの抗体に由来してもよいが、それらのCDRは、異なるクラスの抗体および好ましくは異なる種の抗体に由来することも認識される。1つの可変ドメインから別の可変ドメインに抗原結合能を移行させるために、全てのCDRをドナー可変領域由来の全てのCDRで置換する必要がない場合がある。むしろ、抗原結合部位の活性を維持する必要がある残基を移行させることだけでよい。米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、および同第5,693,762号に示されている説明を考慮すると、慣用の実験の実施または試行錯誤による試験のいずれかにより、免疫原性が低下した機能的な抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６５】
可変領域に対する変更にもかかわらず、本発明の改変された抗体が、所望の生化学的特徴（例えば、天然のまたは変更されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比べて増大した腫瘍局在性または増大した血清半減期）を提供するように定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも一部分が欠失しているかまたはさもなくば変更されている抗体（例えば、完全長抗体またはその免疫反応性断片）を含むことを、当業者は認識するであろう。いくつかの態様において、改変された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含むと考えられる。本発明に適合する定常領域に対する改変は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。本明細書において開示される改変された抗体は、3つの重鎖定常ドメイン（CH1、CH2、またはCH3）の1つもしくは複数および/または軽鎖定常ドメイン（CL）に対する変更または改変を含み得る。いくつかの態様において、改変された抗体の定常領域から、1つまたは複数のドメインを部分的にまたは全体的に欠失させる。いくつかの態様において、改変された抗体は、CH2ドメインの全体が除去された、ドメイン欠失コンストラクトまたは変異体を含む（ΔCH2コンストラクト）。いくつかの態様において、省略された定常領域ドメインは、存在しない定常領域ドメインによって通常付与される分子可撓性のいくらかを提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、10アミノ酸残基）によって置換される。
【０１６６】
いくつかの態様において、改変された抗体は、CH3ドメインを抗体のヒンジ領域に直接融合するように操作される。他の態様において、ペプチドスペーサーは、ヒンジ領域と改変されたCH2および/またはCH3ドメインとの間に挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失しており、残りのCH3ドメイン（改変されているまたは改変されていない）が5〜20アミノ酸スペーサーによってヒンジ領域に接続されている、コンストラクトが発現され得る。そのようなスペーサーは、定常ドメインの調節エレメントが自由かつ到達可能なままであることまたはヒンジ領域が可撓性のままであることを保証するために付加され得る。しかしながら、アミノ酸スペーサーが、場合によっては免疫原性であると証明されることがあることおよびそのコンストラクトに対して望まれない免疫応答を誘発することがあることに注意すべきである。したがって、ある特定の態様において、コンストラクトに付加される任意のスペーサーは、改変された抗体の所望の生物学的品質が維持されるように比較的非免疫原性である。
【０１６７】
いくつかの態様において、改変された抗体は、定常ドメインの部分的な欠失またはいくつかのもしくは単一のアミノ酸の置換だけを有し得る。例えば、CH2ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の変異は、Fc結合を実質的に低下させるため、ならびにそれによって癌細胞の局在性および/または腫瘍透過性を高めるために十分であり得る。同様に、調節される特定のエフェクター機能（例えば、補体C1q結合）を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが、望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的な欠失は、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷のまま維持しながら、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改善し得る。さらに、上で暗示されたように、開示される抗体の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを向上させる1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変され得る。この点において、改変された抗体の配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持しつつ、保存された結合部位によって提供される活性（例えば、Fc結合）を混乱させることが可能であり得る。ある特定の態様において、改変された抗体は、望ましい特徴（例えば、エフェクター機能を減少または増加させること）を向上させるため、またはより多くの細胞毒もしくは炭水化物付着部位を提供するために、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
【０１６８】
定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することは、当技術分野において公知である。例えば、IgGまたはIgM抗体（抗原に結合したもの）のFc領域への補体のC1成分の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は、炎症反応も刺激し、自己免疫性過敏症にも関与し得る。さらに、抗体のFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現する細胞に結合することができる。種々のクラスの抗体に特異的ないくつかのFc受容体（IgG（ガンマ受容体）、IgE（イプシロン受容体）、IgA（アルファ受容体）およびIgM（ミュー受容体）を含む）が存在する。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体でコーティングされた粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体でコーティングされた標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞傷害またはADCCと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、ならびに免疫グロブリン産生の制御を含むいくつかの重要かつ多様な生物学的応答を引き起こす。
【０１６９】
ある特定の態様において、RSPO結合抗体は、変更されたエフェクター機能（それはその後、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響する）を提供する。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段による）は、改変された循環抗体（例えば、抗RSPO1抗体）のFc受容体結合を減少させることがあり、それにより、癌細胞の局在性および/または腫瘍透過性が増加することがある。他の態様において、定常領域の改変は、抗体の血清半減期を延長するまたは短縮する。いくつかの態様において、定常領域は、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を除去するように改変される。本発明に係る定常領域に対する改変は、十分に当業者の範囲内である周知の生化学的手法または分子操作法を使用して容易に行われ得る。
【０１７０】
ある特定の態様において、抗体であるRSPO結合剤は、1つまたは複数のエフェクター機能を有しない。例えば、いくつかの態様において、抗体は、ADCC活性を有さず、かつ/または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有しない。ある特定の態様において、抗体は、Fc受容体および/または補体因子に結合しない。ある特定の態様において、抗体は、エフェクター機能を有しない。
【０１７１】
本発明はさらに、本明細書において示されるキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、またはそれらの抗体断片と実質的に相同である変異体および等価物を包含する。これらは、例えば、保存的置換の変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含み得る。例えば、保存的置換は、あるアミノ酸を、同一の一般的なクラスにおける別のアミノ酸により置換すること、例えば、1つの酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、1つの塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、または、1つの中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置換することを指す。保存的アミノ酸置換が意図するものは、当技術分野において周知であり、本明細書において記載される。
【０１７２】
したがって、本発明は、少なくとも1種のRSPOタンパク質に結合する抗体を作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1種のRSPOタンパク質に結合する抗体を作製するための方法は、ハイブリドーマ法を使用する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO1に結合する抗体を作製するための方法が提供される。いくつかの態様において、該方法は、ヒトRSPO1のアミノ酸31〜263を使用する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸31〜263を使用する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO2に結合する抗体を作製するための方法が提供される。いくつかの態様において、該方法は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜205を使用する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸22〜205を使用する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO3に結合する抗体を作製するための方法が提供される。いくつかの態様において、該方法は、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272を使用する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、SEQ ID NO: 3のアミノ酸22〜272を使用する工程を含む。いくつかの態様において、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に結合する抗体を作製する方法は、ヒトファージライブラリーをスクリーニングする工程を含む。本発明はさらに、少なくとも1種のRSPOタンパク質に結合する抗体を識別する方法を提供する。いくつかの態様において、抗体は、RSPOタンパク質またはその一部への結合についてのFACSによるスクリーニングによって識別される。いくつかの態様において、抗体は、RSPOタンパク質への結合についてのELISAを使用したスクリーニングによって識別される。いくつかの態様において、抗体は、ヒトLGRタンパク質へのRSPOタンパク質の結合の遮断についてのFACSによるスクリーニングによって識別される。いくつかの態様において、抗体は、β-カテニンシグナル伝達の阻害または遮断についてのスクリーニングによって識別される。
【０１７３】
いくつかの態様において、ヒトRSPO1タンパク質に対する抗体を作製する方法は、ヒトRSPO1のアミノ酸31〜263を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO1タンパク質に対する抗体を作製する方法は、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、該哺乳動物から抗体または抗体産生細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの態様において、RSPO1タンパク質に結合するモノクローナル抗体を作製する方法は、（a）ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程;（b）免疫された哺乳動物から抗体産生細胞を単離する工程;（c）該抗体産生細胞をミエローマ細胞株の細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程を含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、（d）RSPO1タンパク質に結合する抗体を発現しているハイブリドーマ細胞を選択する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 5〜9からなる群より選択される。いくつかの態様において、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 9である。いくつかの態様において、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 7である。いくつかの態様において、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 6およびSEQ ID NO: 7である。ある特定の態様において、哺乳動物は、マウスである。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部を含むポリペプチドを使用して選択される。ある特定の態様において、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部を含む、選択のために使用されるポリペプチドは、SEQ ID NO: 5〜9からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体は、RSPO1および少なくとも1種の他のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOタンパク質は、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される。ある特定の態様において、抗体は、RSPO1およびRSPO2に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO1およびRSPO3に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO1およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO1、RSPO2、およびRSPO3に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO1、RSPO2、およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO1、RSPO3、およびRSPO4に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO1とマウスRSPO1の両方に結合する。
【０１７４】
いくつかの態様において、ヒトRSPO2タンパク質に対する抗体を作製する方法は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜205を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO2タンパク質に対する抗体を作製する方法は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、該哺乳動物から抗体または抗体産生細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの態様において、RSPO2タンパク質に結合するモノクローナル抗体を作製する方法は、（a）ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程;（b）免疫された哺乳動物から抗体産生細胞を単離する工程;（c）該抗体産生細胞をミエローマ細胞株の細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程を含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、（d）RSPO2タンパク質に結合する抗体を発現しているハイブリドーマ細胞を選択する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 44〜47からなる群より選択される。いくつかの態様において、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 44である。いくつかの態様において、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 45またはSEQ ID NO: 46である。いくつかの態様において、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 45およびSEQ ID NO: 46である。ある特定の態様において、哺乳動物は、マウスである。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部を含むポリペプチドを使用して選択される。ある特定の態様において、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜243の少なくとも一部を含む、選択するために使用されるポリペプチドは、SEQ ID NO: 44〜47からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体は、RSPO2および少なくとも1種の他のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOタンパク質は、RSPO1、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される。ある特定の態様において、抗体は、RSPO2およびRSPO1に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO2およびRSPO3に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO2およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO2、RSPO1、およびRSPO3に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO2、RSPO1、およびRSPO4に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO2とマウスRSPO2の両方に結合する。
【０１７５】
いくつかの態様において、ヒトRSPO3タンパク質に対する抗体を作製する方法は、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO3タンパク質に対する抗体を作製する方法は、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、該哺乳動物から抗体または抗体産生細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの態様において、RSPO3タンパク質に結合するモノクローナル抗体を作製する方法は、（a）ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部を含むポリペプチドで哺乳動物を免疫する工程;（b）免疫された哺乳動物から抗体産生細胞を単離する工程;（c）該抗体産生細胞をミエローマ細胞株の細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程を含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、（d）RSPO3タンパク質に結合する抗体を発現しているハイブリドーマ細胞を選択する工程を含む。いくつかの態様において、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 48〜51からなる群より選択される。いくつかの態様において、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 48である。いくつかの態様において、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 49またはSEQ ID NO: 50である。いくつかの態様において、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部は、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50である。ある特定の態様において、哺乳動物は、マウスである。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部を含むポリペプチドを使用して選択される。ある特定の態様において、ヒトRSPO3のアミノ酸22〜272の少なくとも一部を含む、選択するために使用されるポリペプチドは、SEQ ID NO: 48〜51からなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体は、RSPO3および少なくとも1種の他のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOタンパク質は、RSPO2、RSPO4、およびRSPO1からなる群より選択される。ある特定の態様において、抗体は、RSPO3およびRSPO1に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO3およびRSPO2に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO3およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO3、RSPO1、およびRSPO2に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO3、RSPO1、およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、抗体は、RSPO3、RSPO2、およびRSPO4に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ヒトRSPO3とマウスRSPO3の両方に結合する。
【０１７６】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法によって作製される抗体は、RSPOアンタゴニストである。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法によって作製される抗体は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。
【０１７７】
いくつかの態様において、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に対する抗体を作製する方法は、単一の抗原結合部位を含む膜結合型ヘテロ二量体分子を使用して抗体を識別する工程を含む。いくつかの非限定的な態様において、抗体は、国際公開WO2011/100566（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている方法およびポリペプチドを使用して識別される。
【０１７８】
いくつかの態様において、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に対する抗体を作製する方法は、抗体発現ライブラリーをヒトRSPOタンパク質に結合する抗体についてスクリーニングする工程を含む。いくつかの態様において、抗体発現ライブラリーは、ファージライブラリーである。いくつかの態様において、スクリーニングは、パニングを含む。いくつかの態様において、抗体発現ライブラリー（例えば、ファージライブラリー）は、ヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部を使用してスクリーニングされる。いくつかの態様において、第1のスクリーニングにおいて識別された抗体は、再度、異なるRSPOタンパク質を使用してスクリーニングされ、それにより、RSPO1および第2のRSPOタンパク質に結合する抗体が識別される。ある特定の態様において、スクリーニングのために使用されるポリペプチドは、SEQ ID NO: 5〜9からなる群より選択されるヒトRSPO1のアミノ酸21〜263の少なくとも一部を含む。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO1および少なくとも1種の他のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOタンパク質は、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される。ある特定の態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO1およびRSPO2に結合する。ある特定の態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO1およびRSPO3に結合する。ある特定の態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO1およびRSPO4に結合する。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、ヒトRSPO1とマウスRSPO1の両方に結合する。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO1アンタゴニストである。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO1によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、抗体発現ライブラリー（例えば、ファージライブラリー）は、ヒトRSPO2のアミノ酸22〜205の少なくとも一部を使用してスクリーニングされる。いくつかの態様において、第1のスクリーニングにおいて識別された抗体は、再度、異なるRSPOタンパク質を使用してスクリーニングされ、それにより、RSPO2および第2のRSPOタンパク質に結合する抗体が識別される。ある特定の態様において、スクリーニングのために使用されるポリペプチドは、SEQ ID NO: 44〜47からなる群より選択されるヒトRSPO2のアミノ酸22〜205の少なくとも一部を含む。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO2および少なくとも1種の他のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、少なくとも1種の他のRSPOタンパク質は、RSPO1、RSPO3およびRSPO4からなる群より選択される。ある特定の態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO2およびRSPO3に結合する。ある特定の態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO2およびRSPO4に結合する。ある特定の態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO2およびRSPO1に結合する。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、ヒトRSPO2とマウスRSPO2の両方に結合する。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて���別される抗体は、RSPO2アンタゴニストである。いくつかの態様において、スクリーニングにおいて識別される抗体は、RSPO2によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。
【０１７９】
ある特定の態様において、本明細書において記載される抗体は、単離されている。ある特定の態様において、本明細書において記載される抗体は、実質的に純粋である。
【０１８０】
本発明のいくつかの態様において、RSPO結合剤は、ポリペプチドである。そのポリペプチドは、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に結合する抗体またはその断片を含む、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得る。本発明のいくつかのアミノ酸配列が、そのタンパク質の構造または機能に有意に影響せずに変更され得ることが当技術分野において認識されるであろう。したがって、本発明はさらに、ヒトRSPOタンパク質に対する抗体またはその断片の実質的な活性を示すかまたはそれらの領域を含む、ポリペプチドのバリエーションを包含する。いくつかの態様において、RSPO結合ポリペプチドのアミノ酸配列のバリエーションは、欠失、挿入、逆位、反復、および/または他のタイプの置換を含む。
【０１８１】
前記ポリペプチド、そのアナログおよび変異体は、通常はそのポリペプチドの一部でないさらなる化学部分を含むようにさらに改変され得る。誘導体化された部分は、そのポリペプチドの溶解性、生物学的半減期、および/または吸収を改善し得る。該部分はまた、そのポリペプチドおよび変異体の任意の望ましくない副作用を減少させ得るかまたは排除し得る。化学部分についての概要は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences, Philadelphia, PAに見られる。
【０１８２】
本明細書において記載される単離されたポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の好適な方法によって作製することができる。そのような方法は、直接的なタンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築およびそれらの配列の好適な宿主内での発現にまで及ぶ。いくつかの態様において、DNA配列は、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離することまたは合成することによって組換え技術を使用して構築される。任意で、該配列は、その機能的アナログを提供する部位特異的突然変異誘発によって変異誘発され得る。例えば、Zoeller et al., 1984, PNAS, 81: 5662-5066および米国特許第4,588,585号を参照のこと。
【０１８３】
いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学合成によって構築され得る。オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、関心対象の組換えポリペプチドを産生する宿主細胞において好まれるコドンを選択して、設計することができる。単離された関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成するために、標準的な方法を適用することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、ライゲートすることができる。その個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的アセンブリのために5'または3'オーバーハングを含む。
【０１８４】
関心対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が（合成、部位特異的突然変異誘発、または別の方法によって）組み立てられたら、発現ベクターに挿入され得、所望の宿主内でのタンパク質の発現に適した発現調節配列に機能的に連結され得る。ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および/または好適な宿主内での生物学的に活性なポリペプチドの発現によって、適切なアセンブリを確認することができる。当技術分野において周知であるように、宿主内におけるトランスフェクト遺伝子の高発現レベルを得るために、該遺伝子は、選択された発現宿主において機能的である転写および翻訳の発現調節配列に機能的に連結されなければならない。
【０１８５】
ある特定の態様において、ヒトRSPOタンパク質に対する抗体またはその断片をコードするDNAを増幅するおよび発現させるために組換え発現ベクターが使用される。例えば、組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する好適な転写および/または翻訳の調節エレメントに機能的に連結された、RSPO結合剤、抗RSPO抗体、またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNA由来DNA断片を有する複製可能なDNAコンストラクトであり得る。転写単位は一般に、（1）遺伝子発現において制御の役割を有する遺伝的エレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（2）mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに（3）適切な転写開始配列および翻訳開始配列ならびに転写終結配列および翻訳終結配列のアセンブリを含む。調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含み得る。宿主において複製する能力（通常、複製起点によって付与される）および形質転換体の認識を促す選択遺伝子がさらに組み込まれ得る。DNA領域は、それらが互いに機能的に関係しているとき、「機能的に連結される」。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に対するDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、該ポリペプチドに対するDNAに機能的に連結される;プロモーターは、それがコード配列の転写を制御する場合、該コード配列に機能的に連結される;またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように配置される場合、コード配列に機能的に連結される。いくつかの態様において、酵母発現系における使用が意図された構造エレメントには、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。他の態様において、組換えタンパク質が、リーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、該組換えタンパク質は、N末端のメチオニン残基を含み得る。最終生成物を提供するために、任意でこの残基を、後に、発現された組換えタンパク質から切断することができる。
【０１８６】
発現調節配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。多種多様の発現宿主/ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主にとって有用な発現ベクターとしては、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルス由来の発現調節配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主にとって有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド（例えば、pCRl、pBR322、pMB9、およびそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド）、およびより広範な宿主範囲のプラスミド（例えば、M13および他の繊維状一本鎖DNAファージ）が挙げられる。
【０１８７】
RSPO結合ポリペプチドまたは抗体（または抗原として使用するためのRSPOタンパク質）の発現にとって好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの支配下の、原核生物、酵母細胞、昆虫細胞、または高等真核細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌またはバチルス属（Bacillus）が含まれる。高等真核細胞には、下記に記載されるような哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も使用され得る。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物の細胞宿主とともに使用するのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Pouwelsらによって記載されている（1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY）。抗体作製を含むタンパク質の作製方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願公開第2008/0187954号、米国特許第6,413,746号および同第6,660,501号、ならびに国際特許公開第WO04009823号に見られる。
【０１８８】
様々な哺乳動物細胞培養系または昆虫細胞培養系が、組換えポリペプチドを発現させるために使用される。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質が一般に、正しく折り畳まれ、適切に修飾され、完全に機能的であるので、好ましい場合がある。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、COS-7（サル腎臓由来）、L-929（マウス線維芽細胞由来）、C127（マウス乳房腫瘍由来）、3T3（マウス線維芽細胞由来）、CHO（チャイニーズハムスター卵巣由来）、HeLa（ヒト子宮頸癌由来）、BHK（ハムスター腎臓線維芽細胞由来）、およびHEK-293（ヒト胎児腎由来）細胞株、ならびにそれらの変異体が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、転写されないエレメント（例えば、複製起点、発現される遺伝子に連結された好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の転写されない5'または3'フランキング配列）、および翻訳されない5'または3'配列（例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに転写終結配列）を含み得る。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、当業者に周知である（例えば、Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6: 47を参照のこと）。
【０１８９】
したがって、本発明は、本明細書において記載されるRSPO結合剤を含む細胞を提供する。いくつかの態様において、該細胞は、本明細書において記載されるRSPO結合剤を産生する。ある特定の態様において、該細胞は、抗体を産生する。ある特定の態様において、該細胞は、抗体89M5を産生する。ある特定の態様において、該細胞は、抗体h89M5-H2L2を産生する。ある特定の態様において、該細胞は、抗体130M23を産生する。ある特定の態様において、該細胞は、抗体h130M23-H1L2を産生する。ある特定の態様において、該細胞は、抗体h130M23-H1L6を産生する。いくつかの態様において、該細胞は、ATCC寄託番号PTA-11970を有するハイブリドーマ細胞株である。いくつかの態様において、該細胞は、ATCC寄託番号PTA-12021を有するハイブリドーマ細胞株である。
【０１９０】
形質転換された宿主によって産生されるタンパク質は、任意の好適な方法に従って精製され得る。標準的な方法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（differential solubility）、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な手法が挙げられる。親和性タグ（例えば、ヘキサ-ヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）が、適切なアフィニティーカラムの通過による容易な精製を可能にするためにタンパク質に付着され得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、およびX線結晶構造解析のような手法を使用して物理的に特徴付けることができる。
【０１９１】
いくつかの態様において、組換えタンパク質を培養培地に分泌する発現系からの上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して濃縮され得る。濃縮工程の後、その濃縮物は、好適な精製マトリックスに適用され得る。いくつかの態様において、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは基材を使用することができる。そのマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において通常使用される他のタイプであり得る。いくつかの態様において、陽イオン交換工程を使用することができる。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。いくつかの態様において、セラミックヒドロキシアパタイト（CHT）を含むがそれに限定されるわけではないヒドロキシアパタイト媒体を使用することができる。ある特定の態様において、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する1つまたは複数の逆相HPLC工程が、RSPO結合剤をさらに精製するために使用することができる。様々な組み合わせでの前述の精製工程の一部または全部が、均一な組換えタンパク質を提供するためにも使用することができる。
【０１９２】
いくつかの態様において、細菌培養物中に生成される組換えタンパク質は、例えば、細胞ペレットからの最初の抽出に続く、1回または複数回の濃縮、塩析、水溶性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって、単離することができる。最後の精製工程のためにHPLCを使用することができる。組換えタンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【０１９３】
抗体および他のタンパク質を精製するための当技術分野において公知の方法としては、例えば、米国特許出願公開第2008/0312425号、同第2008/0177048号、および同第2009/0187005号に記載されている方法も挙げられる。
【０１９４】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、抗体ではないポリペプチドである。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを識別するためおよび作製するための種々の方法は、当技術分野において公知である。例えば、Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol, 18: 295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15: 14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol, 17: 653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275: 2668-76;およびSkerra, 2008, FEBS J., 275: 2677-83を参照のこと。ある特定の態様では、RSPO結合ポリペプチドを作製するためおよび/または識別するためにファージディスプレイ技術が使用され得る。ある特定の態様において、ポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質骨格を含む。
【０１９５】
ある特定の態様において、RSPO結合剤または抗体は、いくつかのコンジュゲート形態（すなわち、免疫コンジュゲートまたは放射性コンジュゲート）または非コンジュゲート形態のいずれか1つとして使用することができる。ある特定の態様において、補体依存性細胞傷害性および抗体依存性細胞毒性を含む対象の天然の防御機構を利用して悪性細胞または癌細胞を排除するために、抗体を、非コンジュゲート形態で使用することができる。
【０１９６】
いくつかの態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体またはポリペプチド）は、細胞傷害剤にコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、メトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤を含むがそれに限定されるわけではない化学療法剤である。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性なトキシン、またはそれらの断片（ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の活性な非結合性断片、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ツルレイシ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテシン（tricothecenes）を含むがそれに限定されるわけではない）である。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、放射性コンジュゲートまたは放射性コンジュゲート抗体を生成する、放射性同位体である。放射性コンジュゲート抗体を作製するために種々の放射性核種（90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re、および212Biを含むがそれに限定されるわけではない）が利用可能である。抗体と、1つまたは複数の小分子トキシン（例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテシン（trichothene）、およびCC1065）およびトキシン活性を有するこれらのトキシンの誘導体とのコンジュゲートも使用され得る。抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、種々の二機能性タンパク質カップリング剤（例えば、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオール（pyridyidithiol））プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートHCL）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド（glutareldehyde））、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアナート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン））を使用して作製される。
【０１９７】
III. ポリヌクレオチド
ある特定の態様において、本発明は、少なくとも1種のヒトRSPOまたはそのようなポリペプチドの断片に特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列だけを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明は、ヒトRSPOタンパク質に対する抗体をコードするかまたはそのような抗体の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれ;二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖は、コーディング鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であり得る。
【０１９８】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 68、およびSEQ ID NO: 69からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、およびSEQ ID NO: 76からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、およびSEQ ID NO: 58からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72、およびSEQ ID NO: 75からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１９９】
いくつかの態様において、プラスミドは、SEQ ID NO: 52を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO: 56を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO: 60を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO: 64を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO: 72を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、SEQ ID NO: 68および/またはSEQ ID NO: 69を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、SEQ ID NO: 70および/またはSEQ ID NO: 71を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、SEQ ID NO: 70および/またはSEQ ID NO: 74を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２００】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、およびSEQ ID NO: 58からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドと少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、およびいくつかの態様において、少なくとも96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72、およびSEQ ID NO: 75からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドと少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、およびいくつかの態様において、少なくとも96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、およびSEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72、またはSEQ ID NO: 75にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある特定の態様において、ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーの条件下である。
【０２０１】
いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 52およびSEQ ID NO: 56を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 60およびSEQ ID NO: 64を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 60およびSEQ ID NO: 72を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０２０２】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞由来のポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、該細胞由来のポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列またはシグナル配列）に同じ読み枠で融合された成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、リーダー配列が宿主細胞によって切断されることにより、成熟型のポリペプチドが形成され得る。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質＋さらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そのタンパク質の不活性型である。プロ配列が切断されたら、活性な成熟タンパク質が残る。
【０２０３】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じ読み枠で融合された成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、該マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するpQE-9ベクターによって供給されるヘキサ-ヒスチジンタグであり得るか、またはマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用されるとき、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来する赤血球凝集素（HA）タグであり得る。いくつかの態様において、マーカー配列は、他の親和性タグとともに使用することができる配列DYKDDDDK（SEQ ID NO: 18）のペプチドであるFLAGタグである。
【０２０４】
本発明はさらに、例えば、断片、アナログ、および/または誘導体をコードする本明細書の上に記載されたポリヌクレオチドの変異体に関する。
【０２０５】
ある特定の態様において、本発明は、本明細書において記載されるRSPO結合剤（例えば、抗体）またはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約80％同一、少なくとも約85％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、およびいくつかの態様において、少なくとも約96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０２０６】
本明細書において使用されるとき、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば95％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという句は、該ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり最大5個の点変異を含み得ることを除いて、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味することを意図されている。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中の最大5％のヌクレオチドを、欠失させるかもしくは別のヌクレオチドで置換することができ、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大5％までのいくつかのヌクレオチドを、参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端部分または該末端部分の間の任意の箇所にあってよく、参照配列内のヌクレオチド内で個別にまたは参照配列内の1つもしくは複数の連続した群として散在していてもよい。
【０２０７】
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方に変更を含み得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレントな置換、付加、または欠失をもたらすがコードされるポリペプチドの特性または活性を変更しない変更を含む。いくつかの態様において、遺伝暗号の縮重に起因するサイレントな置換によってヌクレオチド変異体が生成される。いくつかの態様において、ヌクレオチド変異体は、アミノ酸配列が変化しなかったとしても、発現の差（例えば、高いまたは低い発現）をもたらすヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由のために、例えば、特定の宿主に対してコドン発現を最適化する（すなわち、ヒトmRNAにおけるコドンを大腸菌などの細菌宿主によって好ましいコドンに変更する）ために、生成され得る。
【０２０８】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、単離されている。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
【０２０９】
本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も提供される。いくつかの態様において、発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む。
【０２１０】
IV. 使用方法および薬学的組成物
本発明のRSPO結合剤（ポリペプチドおよび抗体を含む）は、癌の処置などの治療的な処置方法を含むがそれに限定されるわけではない種々の応用法において有用である。ある特定の態様において、それらの剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害するため、腫瘍成長を阻害するため、分化を誘導するため、腫瘍体積を減少させるため、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させるため、および/または腫瘍の腫瘍形成能を低下させるために有用である。それらの使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおける方法であり得る。ある特定の態様において、RSPO結合剤またはポリペプチドまたは抗体は、ヒトRSPO1のアンタゴニストである。ある特定の態様において、RSPO結合剤またはポリペプチドまたは抗体は、ヒトRSPO2のアンタゴニストである。ある特定の態様において、RSPO結合剤またはポリペプチドまたは抗体は、ヒトRSPO3のアンタゴニストである。
【０２１１】
ある特定の態様において、RSPO結合剤は、β-カテニンの活性化、増加したβ-カテニンシグナル伝達、および/または異常なβ-カテニンシグナル伝達に関連する疾患の処置において使用される。ある特定の態様において、該疾患は、β-カテニンシグナル伝達に依存する疾患である。ある特定の態様において、該疾患は、β-カテニン活性化に依存する疾患である。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、増加したレベルの幹細胞および/または前駆細胞を特徴とする障害の処置において使用される。いくつかの態様において、前記方法は、RSPO1結合剤（例えば、抗体）の治療有効量を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、前記方法は、RSPO2結合剤（例えば、抗体）の治療有効量を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、前記方法は、RSPO3結合剤（例えば、抗体）の治療有効量を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。
【０２１２】
本発明は、本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体を使用して腫瘍の成長を阻害するための方法を提供する。ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビトロにおいて細胞をRSPO結合剤（例えば、抗体）と接触させる工程を含む。例えば、不死化細胞株または癌細胞株を、抗RSPO抗体または腫瘍成長を阻害する他の剤が加えられた培地中で培養する。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、患者試料（例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料）から単離され、RSPO結合剤が加えられた培地中で培養されることにより、腫瘍成長が阻害される。
【０２１３】
いくつかの態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビボにおいて腫瘍または腫瘍細胞をRSPO結合剤（例えば、抗体）と接触させる工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍または腫瘍細胞をRSPO結合剤と接触させる工程は、動物モデルにおいて行われる。例えば、RSPO結合剤は、異種移植片を有する免疫無防備状態マウス（例えば、NOD/SCIDマウス）に投与され得る。いくつかの態様において、癌細胞または癌幹細胞を患者試料（例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料）から単離して免疫無防備状態マウスに注射し、次いで該マウスにRSPO結合剤を投与して、腫瘍細胞の成長を阻害する。いくつかの態様において、RSPO1結合剤が動物に投与される。いくつかの態様において、RSPO2結合剤が動物に投与される。いくつかの態様において、RSPO3結合剤が動物に投与される。いくつかの態様において、腫瘍成長を予防するために、腫瘍形成性細胞を動物に導入するのと同時またはそのすぐ後に、RSPO結合剤を投与する（「予防モデル」）。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、腫瘍が特定のサイズに成長した後に治療剤として投与される（「治療モデル」）。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO1抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体89M5である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO2抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体130M23である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO3抗体である。
【０２１４】
ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、TGYTMH（SEQ ID NO: 12）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000037
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000038
を含む重鎖CDR3、ならびに/または
2014524746.tif 000039
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 16）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTPW（SEQ ID NO: 17）を含む軽鎖CDR3を含むRSPO結合剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、SSYAMS（SEQ ID NO: 29）を含む重鎖CDR1、
2014524746.tif 000040
を含む重鎖CDR2、および
2014524746.tif 000041
を含む重鎖CDR3、ならびに/または
2014524746.tif 000042
を含む軽鎖CDR1、WASTRHT（SEQ ID NO: 33）を含む軽鎖CDR2、およびQQHYSTP（SEQ ID NO: 34）を含む軽鎖CDR3を含むRSPO結合剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
【０２１５】
ある特定の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、RSPO結合剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、対象は、ヒトである。ある特定の態様において、対象は、腫瘍を有するか、または腫瘍を除去されたことがある。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現レベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質（例えば、RSPO1、RSPO2、またはRSPO3）を有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1結合剤である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2結合剤である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3結合剤である。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、抗体である。
【０２１６】
ある特定の態様において、腫瘍は、β-カテニンシグナル伝達が活性である腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、β-カテニンシグナル伝達が異常である腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は、APC癌抑制遺伝子における不活性化変異（例えば、短縮型変異）を含む。ある特定の態様において、腫瘍は、APC癌抑制遺伝子における不活性化変異を含まない。いくつかの態様において、腫瘍は、野生型APC遺伝子を含む。いくつかの態様において、腫瘍は、β-カテニン遺伝子における活性化変異を含まない。ある特定の態様において、対象が処置されている癌は、そのような腫瘍を含む。
【０２１７】
ある特定の態様において、腫瘍はRSPO1を発現しており、それに対してRSPO1結合剤または抗体が結合する。ある特定の態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO1を有するか、またはRSPO1を過剰発現している。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO1を有する。通常、タンパク質「の上昇した発現レベルを腫瘍が有する」という句（または類似の句）は、同じ組織タイプの正常組織における同じタンパク質の発現レベルと比べた、腫瘍におけるタンパク質の発現レベルを指す。しかしながら、いくつかの態様において、腫瘍におけるタンパク質の発現レベルは、ある群の組織タイプ内のタンパク質の平均発現レベルと比べて、「上昇した」または「高い」。いくつかの態様において、腫瘍におけるタンパク質の発現レベルは、同じ組織タイプまたは異なる組織タイプの他の腫瘍におけるタンパク質の発現レベルと比べて「上昇した」または「高い」。ある特定の態様において、腫瘍はRSPO2を発現しており、それに対してRSPO2結合剤または抗体が結合する。ある特定の態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO2を有するか、またはRSPO2を過剰発現している。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO2を有する。ある特定の態様において、腫瘍はRSPO3を発現しており、それに対してRSPO3結合剤または抗体が結合する。ある特定の態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO3を有するか、またはRSPO3を過剰発現している。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO3を有する。ある特定の態様において、腫瘍はRSPO4を発現しており、それに対してRSPO4結合剤または抗体が結合する。ある特定の態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO4を有するか、またはRSPO4を過剰発現している。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO4を有する。いくつかの態様において、腫瘍は、正常組織において発現されるRSPOレベルと比べて上昇したレベルのRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4を発現している。いくつかの態様において、正常組織は、腫瘍と同じ組織タイプの組織である。
【０２１８】
さらに、本発明は、対象における腫瘍の成長を阻害する方法を提供し、該方法は、RSPO結合剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍は、癌幹細胞を含む。ある特定の態様において、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度は、RSPO結合剤の投与によって低下する。本発明は、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる方法も提供し、該方法は、腫瘍をRSPO結合剤（例えば、抗RSPO抗体）の有効量と接触させる工程を含む。いくつかの態様において、RSPO結合剤（例えば、抗RSPO抗体）の治療有効量を対象に投与する工程を含む、該対象における腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させる方法が提供される。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO1抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、89M5である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO2抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、130M23である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO3抗体である。
【０２１９】
いくつかの態様において、腫瘍は、固形腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸管腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は、卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、肺腫瘍である。ある特定の態様において、腫瘍は、膵腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、APC遺伝子における不活性化変異を含む結腸直腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、APC遺伝子における不活性化変異を含まない結腸直腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO1を有する卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO2を有する膵腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO2を有する結腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO2を有する肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO2を有する黒色腫腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO2を有する乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO3を有する肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO3を有する卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO3を有する乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO3を有する結腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO4を有する乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO4を有する肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO4を有する卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、上昇した発現レベルのRSPO1を有する卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO2を有する膵腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO2を有する結腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO2を有する肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO2を有する黒色腫腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO2を有する乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO3を有する肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO3を有する卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO3を有する乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO3を有する結腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO4を有する乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO4を有する肺腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、高発現レベルのRSPO4を有する卵巣腫瘍である。
【０２２０】
本発明はさらに、癌を処置するための方法を提供し、該方法は、RSPO結合剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、該癌は、正常組織内の同じRSPOタンパク質の発現レベルと比べて上昇したレベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を発現している細胞を特徴とする。ある特定の態様において、該癌は、RSPO1を過剰発現している細胞を特徴とする。ある特定の態様において、該癌は、RSPO2を過剰発現している細胞を特徴とする。ある特定の態様において、該癌は、RSPO3を過剰発現している細胞を特徴とする。ある特定の態様において、該癌は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種のRSPOタンパク質を過剰発現している。ある特定の態様において、癌は、β-カテニンを発現している細胞を特徴とし、ここで、RSPO結合剤（例えば、抗体）が、RSPOによって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達および/または活性化を干渉する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1に結合し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2に結合し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3に結合し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1に結合し、RSPO1/LGRの相互作用を干渉し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2に結合し、RSPO2/LGRの相互作用を干渉し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3に結合し、RSPO3/LGRの相互作用を干渉し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1に結合し、β-カテニン活性化を阻害し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2に結合し、β-カテニン活性化を阻害し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3に結合し、β-カテニン活性化を阻害し、かつ癌の成長を阻害するまたは減少させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1に結合し、かつ癌における癌幹細胞の発生頻度を低下させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2に結合し、かつ癌における癌幹細胞の発生頻度を低下させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3に結合し、かつ癌における癌幹細胞の発生頻度を低下させる。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO1抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体89M5である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO2抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体130M23である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、抗RSPO3抗体である。
【０２２１】
本発明は、癌を処置するための方法を提供し、該方法は、RSPO結合剤の治療有効量を対象（例えば、処置を必要とする対象）に投与する工程を含む。ある特定の態様において、対象は、ヒトである。ある特定の態様において、対象は、癌性腫瘍を有する。ある特定の態様において、対象は、腫瘍を除去されたことがある。いくつかの態様において、癌を処置する方法は、RSPO結合剤の治療有効量を対象に投与する工程を含み、ここで、該対象は、上昇した発現の少なくとも1種のRSPOタンパク質を有する腫瘍を有する。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO1を有する卵巣腫瘍を有し、RSPO1結合剤を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO1を有する卵巣腫瘍を有し、抗RSPO1抗体を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO1を有する卵巣腫瘍を有し、抗体89M5を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO1を有する卵巣腫瘍を有し、抗体h89M5-H2L2を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する卵巣腫瘍を有し、RSPO2結合剤を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する卵巣腫瘍を有し、抗RSPO2抗体を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する卵巣腫瘍を有し、抗体130M23を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する卵巣腫瘍を有し、抗体h130M23-H1L2を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する膵腫瘍を有し、抗体130M23を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する膵腫瘍を有し、抗体h130M23-H1L2を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する膵腫瘍を有し、抗体h130M23-H1L6を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する結腸腫瘍を有し、抗体130M23を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する結腸腫瘍を有し、抗体h130M23-H1L2を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO2を有する結腸腫瘍を有し、抗体h130M23-H1L6を投与される。いくつかの態様において、対象は、上昇した発現のRSPO3を有する肺腫瘍を有し、抗RSPO3抗体を投与される。
【０２２２】
ある特定の態様において、癌は、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸管癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、神経膠芽腫、および頭頸部癌からなる群より選択される癌である。ある特定の態様において、癌は、膵癌である。ある特定の態様において、癌は、卵巣癌である。ある特定の態様において、癌は、結腸直腸癌である。ある特定の態様において、癌は、乳癌である。ある特定の態様において、癌は、前立腺癌である。ある特定の態様において、癌は、肺癌である。
【０２２３】
さらに、本発明は、対象における腫瘍の腫瘍形成能を低下させる方法を提供し、該方法は、対象にRSPO結合剤の治療有効量を投与する工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍は、癌幹細胞を含む。いくつかの態様において、腫瘍の腫瘍形成能は、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度を低下させることによって低下する。いくつかの態様において、前記方法は、本明細書において記載されるRSPO1結合剤、RSPO2結合剤、またはRSPO3結合剤を使用する工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍内の癌幹細胞の発生頻度は、RSPO結合剤の投与によって低下する。
【０２２４】
ある特定の態様において、前記方法は、腫瘍または癌における少なくとも1種のRSPOタンパク質の発現レベルを測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌におけるRSPOの発現レベルを測定する工程は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルを測定する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍または癌におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルは、正常組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルと比較される。いくつかの態様において、腫瘍または癌におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルは、正常組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の予め測定された発現レベルと比較される。ある特定の態様において、前記方法は、腫瘍または癌がAPC遺伝子における不活性化変異を有しているかを判定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記方法は、腫瘍または癌がβ-カテニン遺伝子における活性化変異を有しているかを判定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、RSPO発現のレベルを測定する工程は、処置前に行われる。いくつかの態様において、腫瘍または癌が、正常組織における同じRSPOタンパク質の発現と比べて上昇したレベルのRSPO発現を有する場合、対象は、本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体を投与される。例えば、いくつかの態様において、腫瘍または癌が、正常組織におけるRSPO1の発現レベルと比べて上昇したレベルのRSPO1発現を有する場合、対象は、RSPO1結合剤（例えば、抗RSPO1抗体）を投与される。いくつかの態様において、腫瘍または癌が、正常組織におけるRSPO2の発現レベルと比べて上昇したレベルのRSPO2発現を有する場合、対象は、RSPO2結合剤（例えば、抗RSPO2抗体）を投与される。いくつかの態様において、腫瘍または癌が、正常組織におけるRSPO3の発現レベルと比べて上昇したレベルのRSPO3発現を有する場合、対象は、RSPO3結合剤（例えば、抗RSPO3抗体）を投与される。腫瘍が、上昇した発現レベルの2種以上のRSPOタンパク質を有する場合、対象は、まず、正常組織と比べて最も過剰発現されているRSPOタンパク質に対するRSPO結合剤または抗体を投与される。いくつかの態様において、腫瘍または癌が、APC遺伝子における変異を有する場合、対象は、本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体を投与される。
【０２２５】
さらに、本発明は、RSPO結合剤で処置するためのヒト対象を特定する方法を提供し、該方法は、該対象が、正常組織における同じRSPOタンパク質の発現と比べて上昇したレベルのRSPO発現を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍が、上昇したレベルのRSPO発現を有する場合、対象は、RSPOタンパク質に特異的に結合する抗体による処置のために選択される。いくつかの態様において、処置のために選択された場合、該対象は、本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体を投与される。いくつかの態様において、腫瘍が、上昇したレベルの2種以上のRSPOタンパク質を有する場合、該対象は、発現レベルが最も高いRSPOタンパク質に結合するRSPO結合剤を投与される。ある特定の態様において、対象は、腫瘍を除去されたことがある。例えば、いくつかの態様において、腫瘍内のRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルが測定され、該腫瘍が、正常組織におけるRSPO1のレベルと比べて上昇したレベルのRSPO1発現を有する場合、該対象は、RSPO1に特異的に結合する抗体による処置のために選択される。処置のために選択された場合、該対象は、本明細書において記載される抗RSPO1抗体を投与される。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体h89M5-H2L2である。ある特定の態様において、対象は、腫瘍を除去されたことがある。いくつかの態様において、腫瘍内のRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルが測定され、該腫瘍が、正常組織におけるRSPO2のレベルと比べて上昇したレベルのRSPO2発現を有する場合、該対象は、RSPO2に特異的に結合する抗体による処置のために選択される。処置のために選択された場合、該対象は、本明細書において記載される抗RSPO2抗体を投与される。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体130M23である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L6である。ある特定の態様において、対象は、腫瘍を除去されたことがある。
【０２２６】
本発明は、RSPO結合剤で処置するためのヒト対象を選択する方法を提供し、該方法は、該対象が、上昇した発現レベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、腫瘍が、上昇した発現レベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を有する場合、該対象は、上昇した発現レベルを有するRSPOタンパク質に特異的に結合する抗体による処置のために選択される。本発明は、RSPO結合剤で処置するためのヒト対象を選択する方法を提供し、該方法は、該対象が、高発現レベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を有する腫瘍を有しているかを判定する工程を含み、腫瘍が、高発現レベルの少なくとも1種のRSPOタンパク質を有する場合、該対象は、高発現レベルを有するRSPOタンパク質に特異的に結合する抗体による処置のために選択される。いくつかの態様において、「上昇した」または「高」発現レベルは、同じ組織タイプの正常組織における同じRSPOタンパク質の発現レベルと比較したものである。いくつかの態様において、「上昇した」または「高」発現レベルは、同じ腫瘍タイプの他の腫瘍における同じRSPOタンパク質の発現レベルと比較したものである。いくつかの態様において、処置のために選択された場合、該対象は、本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体を投与される。ある特定の態様において、対象は、腫瘍を除去されたことがある。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1結合剤である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2結合剤である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、抗RSPO2抗体は、抗体h130M23-H1L6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3結合剤である。
【０２２７】
本発明は、ヒト対象における癌を処置する方法も提供し、該方法は、（a）上昇したまたは高発現レベルのRSPO1を有する癌を有する対象に少なくとも部分的に基づいて処置するための対象を選択する工程、および（b）本明細書において記載されるRSPO1結合剤の治療有効量を該対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体h89M5-H2L2である。
【０２２８】
本発明は、ヒト対象における癌を処置する方法も提供し、該方法は、（a）上昇したまたは高発現レベルのRSPO2を有する癌を有する対象に少なくとも部分的に基づいて処置するための対象を選択する工程、および（b）本明細書において記載されるRSPO2結合剤の治療有効量を該対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L6である。
【０２２９】
本発明は、ヒト対象における癌を処置する方法も提供し、該方法は、（a）上昇したまたは高発現レベルのRSPO3を有する癌を有する対象に少なくとも部分的に基づいて処置するための対象を選択する工程、および（b）本明細書において記載されるRSPO3結合剤の治療有効量を該対象に投与する工程を含む。
【０２３０】
細胞、腫瘍、または癌におけるRSPOの発現レベルを測定するための方法は、当業者に公知である。これらの方法としては、核酸発現の場合は、PCRベースのアッセイ、マイクロアレイ解析、およびヌクレオチド配列決定（例えば、NextGen配列決定法）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。他の方法としては、タンパク質発現の場合は、ウエスタンブロット解析、タンパク質アレイ、ELISA、およびFACSが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【０２３１】
腫瘍または癌が上昇したまたは高レベルのRSPO発現を有しているかを判定するための方法は、種々の試料を使用し得る。いくつかの態様において、試料は、腫瘍または癌を有する対象から採取される。いくつかの態様において、試料は、新鮮な腫瘍/癌試料である。いくつかの態様において、試料は、凍結された腫瘍/癌試料である。いくつかの態様において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である。いくつかの態様において、試料を処理して、細胞可溶化物にする。いくつかの態様において、試料を処理して、DNAまたはRNAにする。
【０２３２】
対象における疾患または障害を処置する方法がさらに提供され、ここで、該疾患または障害は、異常な（例えば、増加したレベル）β-カテニンシグナル伝達に関連する。対象における疾患または障害を処置する方法がさらに提供され、ここで、該疾患または障害は、増加したレベルの幹細胞および/または前駆細胞を特徴とする。いくつかの態様において、それらの処置方法は、RSPO結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1結合剤である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2結合剤である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3結合剤である。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、抗体である。
【０２３３】
本発明は、細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達を阻害する方法も提供し、該方法は、該細胞をRSPO結合剤の有効量と接触させる工程を含む。ある特定の態様において、細胞は、腫瘍細胞である。ある特定の態様において、前記方法は、インビボにおける方法であり、ここで、細胞をRSPO結合剤と接触させる工程は、RSPO結合剤の治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、前記方法は、インビトロまたはエクスビボにおける方法である。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、β-カテニンの活性化を阻害する。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、RSPO/LGR相互作用を干渉する。ある特定の態様において、LGRは、LGR4、LGR5、および/またはLGR6である。ある特定の態様において、LGRは、LGR4である。ある特定の態様において、LGRは、LGR5である。ある特定の態様において、LGRは、LGR6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1結合剤である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体h89M5-H2L2である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2結合剤である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L2である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体h130M23-H1L6である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3結合剤である。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、抗体である。
【０２３４】
腫瘍細胞を含むがそれに限定されるわけではない細胞の分化を誘導するための、本明細書において記載されるRSPO結合剤、ポリペプチド、または抗体の使用も提供される。いくつかの態様において、細胞の分化を誘導する方法は、該細胞を本明細書において記載されるRSPO結合剤（例えば、抗RSPO抗体）の有効量と接触させる工程を含む。ある特定の態様において、対象における腫瘍内の細胞の分化を誘導する方法は、RSPO結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍細胞上に分化マーカーを誘導するための方法は、RSPO結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を投与する工程を含む。いくつかの態様において、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸管腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される。ある特定の態様において、腫瘍は、卵巣腫瘍である。ある特定の他の態様において、腫瘍は、結腸腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は、肺腫瘍である。ある特定の態様において、前記方法は、インビボにおける方法である。ある特定の態様において、前記方法は、インビトロにおける方法である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1結合剤である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2結合剤である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3結合剤である。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、抗体である。
【０２３５】
本発明はさらに、腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性細胞に分化させる方法を提供し、該方法は、該腫瘍形成性細胞をRSPO結合剤と接触させる工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍を有するかまたはそのような腫瘍を除去されたことがある対象にRSPO結合剤を投与する工程を含む。ある特定の態様において、腫瘍形成性細胞は、卵巣腫瘍細胞である。ある特定の態様において、腫瘍形成性細胞は、結腸腫瘍細胞である。いくつかの態様において、腫瘍形成性細胞は、肺腫瘍細胞である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO1結合剤である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO1結合剤は、抗体89M5である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO2結合剤である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体である。いくつかの態様において、RSPO2結合剤は、抗体130M23である。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、RSPO3結合剤である。いくつかの態様において、RSPO3結合剤は、抗体である。
【０２３６】
ある特定の態様において、本明細書において記載されるRSPO結合剤で処置される疾患は、癌ではない。例えば、該疾患は、代謝障害（例えば、肥満症または糖尿病（例えば、II型糖尿病））であり得る（Jin T., 2008, Diabetologia, 51: 1771-80）。あるいは、該疾患は、骨障害（例えば、骨粗鬆症、変形性関節症、または関節リウマチ）であり得る（Corr M., 2008, Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 4: 550-6; Day et al., 2008, Bone Joint Surg. Am., 90 Suppl 1: 19-24）。該疾患は、多発性嚢胞腎などの腎臓障害でもあり得る（Harris et al., 2009, Ann. Rev. Med. , 60: 321-337; Schmidt-Ott et al., 2008, Kidney Int., 74: 1004-8; Benzing et al., 2007, J. Am. Soc. Nephrol , 18: 1389-98）。あるいは、黄斑変性症および家族性滲出性硝子体網膜症を含むがそれに限定されるわけではない眼障害が処置され得る（Lad et al., 2009, Stem Cells Dev., 18: 7-16）。心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、および心臓弁障害を含む心血管障害も処置され得る（Al-Aly Z., 2008, Transl. Res., 151: 233-9; Kobayashi et al., 2009, Nat. Cell Biol., 11: 46-55; van Gijn et al., 2002, Cardiovasc. Res., 55: 16-24; Christman et al., 2008, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 294:H2864-70）。いくつかの態様において、該疾患は、肺障害（例えば、特発性肺動脈高血圧症または肺線維症）である（Laumanns et al., 2008, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2009, 40: 683-691; Konigshoff et al., 2008, PLoS ONE, 3:e2142）。いくつかの態様において、RSPO結合剤で処置される疾患は、肝疾患（例えば、肝硬変または肝線維症）である（Cheng et al., 2008, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol, 294:G39-49）。
【０２３７】
本発明はさらに、本明細書において記載されるRSPO結合剤を含む薬学的組成物を提供する。ある特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの薬学的組成物は、対象（例えば、ヒト患者）における腫瘍成長の阻害および癌の処置における使用法が見出されている。
【０２３８】
ある特定の態様において、本発明の精製された抗体または剤を薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体または賦形剤）と混合することによって、貯蔵および使用のための製剤が調製される。好適な薬学的に許容されるビヒクルとしては、無毒性緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）;塩（例えば、塩化ナトリウム）;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール）;低分子量ポリペプチド（例えば、約10アミノ酸残基未満）;タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）;親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）;アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）;炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリン）;キレート剤（例えば、EDTA）;糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）;塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）;金属錯体（例えば、Zn-タンパク質複合体）;および非イオン性界面活性剤（例えば、TWEENまたはポリエチレングリコール（PEG））が挙げられるが、それに限定されるわけではない。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PA）。
【０２３９】
本発明の薬学的組成物は、局所性または全身性の処置のために任意の数の方法で投与することができる。投与は、表皮パッチもしくは経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体、および粉末による局所的投与;粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹送（噴霧器によるもの、気管内、および鼻腔内を含む）による肺投与;経口投与;または静脈内、動脈内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内（例えば、注射または注入）、もしくは頭蓋内（例えば、硬膜下腔内または脳室内）を含む非経口投与であり得る。
【０２４０】
治療的製剤は、単位剤形で存在し得る。そのような製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、水もしくは非水媒体における溶液もしくは懸濁液、または坐剤が挙げられる。錠剤などの固体組成物において、主要な活性成分は、薬学的担体と混合される。従来の錠剤化成分としては、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴムおよび希釈剤（例えば、水）が挙げられる。これらは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される無毒性の塩の均一な混合物を含む固体の前製剤化組成物を形成するために使用することができる。次いで、その固体の前製剤化組成物は、上に記載されたタイプの単位剤形に細分される。製剤または組成物の錠剤、丸剤などは、コーティングされるかまたは別途調合されることにより、長時間作用の利点をもたらす剤形を提供し得る。例えば、該錠剤または丸剤は、外側成分によって覆われた内側組成物を含み得る。さらに、崩壊に耐えるよう働き、かつ内側成分がインタクトなまま胃を通過することまたは内側成分の放出を遅延させることを可能にする腸溶層によって、該2つの成分を分離することができる。種々の材料を、そのような腸溶層または腸溶コーティングのために使用することができ、そのような材料としては、いくつかのポリマー酸、ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物が挙げられる。
【０２４１】
本明細書において記載されるRSPO結合剤または抗体はまた、マイクロカプセルに封入され得る。そのようなマイクロカプセルは、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PAに記載されているようなマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法もしくは界面重合法によって調製される（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）。
【０２４２】
ある特定の態様において、薬学的製剤には、リポソームと複合体化された本発明のRSPO結合剤（例えば、抗体）が含まれる。リポソームを生成する方法は、当業者に公知である。例えば、いくつかのリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成され得る。リポソームを、規定のポアサイズのフィルターを通過して押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームを得ることができる。
【０２４３】
ある特定の態様において、徐放調製物が生成され得る。徐放調製物の好適な例としては、RSPO結合剤（例えば、抗体）を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここで、該マトリックスは、造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタアクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、L-グルタミン酸および7エチル-L-グルタメートの共重合体、非分解性のエチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸共重合体（例えば、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア））、イソ酪酸酢酸スクロース、ならびにポリ-D-（-）-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２４４】
ある特定の態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）の投与に加えて、前記方法または処置は、少なくとも一種のさらなる治療剤の投与をさらに包含する。さらなる治療剤は、RSPO結合剤の投与の前、投与と同時、および/または投与の後に投与することができる。RSPO結合剤およびさらなる治療剤を含む薬学的組成物も提供される。いくつかの態様において、少なくとも一種のさらなる治療剤は、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のさらなる治療剤を含む。
【０２４５】
2つまたはそれ以上の治療剤との併用療法は、必須ではないものの、異なる作用機序によって働く剤を使用することが多い。異なる作用機序を有する剤を使用する併用療法は、相加効果または相乗効果をもたらし得る。併用療法は、単独療法で使用されるよりも各剤の用量を少なくすることにより、有毒な副作用を減少させ得、かつ/またはその剤の治療指数を上昇させ得る。併用療法は、抵抗性の癌細胞が発生する可能性を低下させ得る。いくつかの態様において、併用療法は、非腫瘍形成性細胞に作用する（例えば、阻害するまたは殺滅する）治療剤および腫瘍形成性CSCに作用する（例えば、阻害するまたは殺滅する）治療剤を含む。
【０２４６】
いくつかの態様において、RSPO結合剤と少なくとも一種のさらなる治療剤との併用により、相加的または相乗的な結果がもたらされる。いくつかの態様において、併用療法は、RSPO結合剤の治療指数の上昇をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、追加の剤の治療指数の上昇をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、RSPO結合剤の毒性および/または副作用の低下をもたらす。いくつかの態様において、併用療法は、追加の剤の毒性および/または副作用の低下をもたらす。
【０２４７】
有用なクラスの治療剤としては、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）、および三核白金錯体、ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール（platinols）、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。ある特定の態様において、第2の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。いくつかの態様において、第2の治療剤は、カルボプラチンまたはシスプラチンなどの白金錯体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、タキサンと併用される白金錯体である。
【０２４８】
RSPO結合剤と併用して投与され得る治療剤には、化学療法剤が含まれる。したがって、いくつかの態様において、前記方法または処置は、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤の混合物と併用される本発明のRSPO1結合剤もしくは抗体の投与を含む。いくつかの態様において、前記方法または処置は、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤の混合物と併用される本発明のRSPO2結合剤もしくは抗体の投与を含む。いくつかの態様において、前記方法または処置は、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤の混合物と併用される本発明のRSPO3結合剤もしくは抗体の投与を含む。RSPO結合剤（例えば、抗体）による処置は、化学療法薬の投与の前、投与と同時、または投与の後に行われ得る。併用投与は、単一の薬学的製剤としての同時投与もしくは別個の製剤を使用した同時投与、またはいずれかの順序であるが一般に全ての活性な剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮できるような時間内の連続投与を含み得る。そのような化学療法剤に対する調製法および投薬スケジュールは、製造者の指示書に従ってまたは当業者によって経験的に決定されるように、使用され得る。そのような化学療法に対する調製法および投薬スケジュールは、The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PAにも記載されている。
【０２４９】
本発明において有用な化学療法剤としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド（CYTOXAN））;スルホン酸アルキル類（例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン（例えば、ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドパ）;エチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamines）（アルトレタミン（altretamine）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaoramide）、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamime）を含む）;ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド（trofosfamide）、ウラシルマスタード）;ニトロソ尿素（nitrosureas）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）;抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）;代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU））;葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）;プリンアナログ（例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）;ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU）;アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）;抗副腎剤（anti-adrenals）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）;葉酸補給剤（例えば、フォリン酸）;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド（aldophosphamide glycoside）;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート（edatraxate）;デホファミン（defofamine）;デメコルチン;ジアジコン;エフロルニチン（elformithine）;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;シゾ���ィラン（sizofuran）;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクォン;2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン（gacytosine）;アラビノシド（Ara-C）;タキソイド、例えば、パクリタキセル（TAXOL）およびドセタキセル（TAXOTERE）;クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）;ビンブラスチン;白金;エトポシド（VP-16）;イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;イバンドロネート;CPT11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）;レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン（XELODA）;および上記のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、それに限定されるわけではない。化学療法剤には、腫瘍に対するホルモンの作用を制御するようにまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4（5）-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON）を含む）;および抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン））;ならびに上記のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、シスプラチンである。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、カルボプラチンである。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、パクリタキセル（タキソール）である。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5-H2L2をシスプラチンと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6をシスプラチンと併用して投与する工程を含む。
【０２５０】
ある特定の態様において、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼIまたはII）の作用を干渉する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤としては、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド（VM-26）、およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、イリノテカンである。したがって、いくつかの態様において、方法は、RSPO1結合剤をトポイソメラーゼ阻害剤と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5-H2L2をイリノテカンと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤をトポイソメラーゼ阻害剤と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23またはh130M23-H1L2をイリノテカンと併用して投与する工程を含む。
【０２５１】
ある特定の態様において、化学療法剤は、代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物と類似しているものの細胞の1つまたは複数の正常な機能（例えば、細胞分裂）を干渉するのに十分な程度に異なっている構造を有する、化学物質である。代謝拮抗物質としては、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラリトレキセド（ralitrexed）、ペメトレキセド（pemetrexed）、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、ゲムシタビンである。したがって、いくつかの態様において、方法は、RSPO1結合剤を代謝拮抗物質と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5-H2L2をゲムシタビンと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤を代謝拮抗物質と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6をゲムシタビンと併用して投与する工程を含む。
【０２５２】
ある特定の態様において、化学療法剤は、チューブリンに結合する剤を含むがそれに限定されるわけではない抗有糸分裂剤である。いくつかの態様において、該剤は、タキサンである。ある特定の態様において、該剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体である。ある特定の態様において、該剤は、パクリタキセル（TAXOL）、ドセタキセル（TAXOTERE）、アルブミン結合型パクリタキセル（ABRAXANE）、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。ある特定の代替の態様において、抗有糸分裂剤は、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン（binblastine）、ビノレルビン、またはビンデシン）、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。いくつかの態様において、抗有糸分裂剤は、キネシンEg5の阻害剤または有糸分裂キナーゼ（例えば、Aurora AまたはPlkl）の阻害剤である。ある特定の態様において、RSPO結合剤と併用して投与される化学療法剤が、有糸分裂阻害剤である場合、処置される癌または腫瘍は、乳癌または乳房腫瘍である。
【０２５３】
いくつかの態様において、さらなる治療剤は、小分子などの剤を含む。例えば、処置は、本発明のRSPO結合剤（例えば、抗体）と、さらなる腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する小分子（EGFR、ErbB2、HER2、および/またはVEGFを含むがそれに限定されるわけではない）との併用投与を含み得る。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、癌幹細胞経路を阻害する小分子である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Notch経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Wnt経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、BMP経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する分子である。
【０２５４】
いくつかの態様において、さらなる治療剤は、抗体などの生物学的分子を含む。例えば、処置は、本発明のRSPO結合剤（例えば、抗体）と、さらなる腫瘍関連抗原に対する他の抗体（EGFR、ErbB2、HER2、および/またはVEGFに結合する抗体を含むがそれに限定されるわけではない）との併用投与を含み得る。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、第2の抗RSPO抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、抗RSPO1抗体と併用して使用される、抗RSPO2抗体、抗RSPO3抗体、および/または抗RSPO4抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、抗RSPO2抗体と併用して使用される、抗RSPO1抗体、抗RSPO3抗体、および/または抗RSPO4抗体である。いくつかの態様において、抗RSPO1抗体は、抗RSPO2抗体と併用して使用される。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、抗癌幹細胞マーカーに特異的な抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Notch経路の構成要素に結合する抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Wnt経路の構成要素に結合する抗体である。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、癌幹細胞経路を阻害する抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Notch経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、Wnt経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、BMP経路の阻害剤である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する抗体である。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、血管新生阻害剤である抗体（例えば、抗VEGFまたはVEGF受容体抗体）である。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、ベバシズマブ（AVASTIN）、トラスツズマブ（HERCEPTIN）、パニツムマブ（VECTIBIX）、またはセツキシマブ（ERBITUX）である。
【０２５５】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、RSPO結合剤の治療有効量をWnt経路阻害剤と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、Wnt経路阻害剤は、frizzled（FZD）タンパク質結合剤「FZD結合剤」である。FZD結合剤の非限定的な例は、米国特許第7,982,013号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に見られる。FZD結合剤としては、抗FZD抗体が挙げられ得るが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、方法は、RSPO結合剤を抗FZD抗体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO結合剤を抗FZD抗体18R5と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、Wnt経路阻害剤は、Wntタンパク質結合剤である「Wnt結合剤」である。Wnt結合剤の非限定的な例は、米国特許第7,723,477号および同第7,947,277号;ならびに国際公報WO2011/088127およびWO2011/088123（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）に見られる。Wnt結合剤としては、抗Wnt抗体およびFZD-Fc可溶性受容体が挙げられ得るが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様において、方法は、RSPO結合剤をFZD-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO結合剤をFZD8-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO1結合剤を抗FZD抗体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5-H2L2を抗FZD抗体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5H2L2を抗FZD抗体18R5と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5-H2L2をFZD-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO1抗体89M5またはh89M5-H2L2をFZD8-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤を抗FZD抗体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23またはh130M23-H1L2を抗FZD抗体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6を抗FZD抗体18R5と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6をFZD-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6をFZD8-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。
【０２５６】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、RSPO結合剤の治療有効量を2つ以上のさらなる治療剤と併用して投与する工程を含む。したがって、いくつかの態様において、方法は、RSPO結合剤を化学療法剤およびWnt経路阻害剤と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤を化学療法剤およびWnt経路阻害剤と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤を化学療法剤および抗FZD抗体18R5と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤を化学療法剤およびFZD8-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、RSPO2結合剤をゲムシタビンおよびWnt経路阻害剤と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6をゲムシタビンおよび抗FZD抗体18R5と併用して投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、抗RSPO2抗体130M23、h130M23-H1L2、またはh130M23-H1L6をゲムシタビンおよびFZD8-Fc可溶性受容体と併用して投与する工程を含む。
【０２５７】
さらに、本明細書において記載されるRSPO結合剤による処置は、他の生物学的分子（例えば、1つまたは複数のサイトカイン（例えば、リンフォカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および/または成長因子））との併用処置を含み得るか、または腫瘍、癌細胞の外科的除去、もしくは処置している医師によって必要と見なされる他の任意の治療を伴い得る。
【０２５８】
ある特定の態様において、前記処置は、放射線治療と併用される本発明のRSPO結合剤（例えば、抗体）の投与を含む。RSPO結合剤による処置は、放射線治療の投与の前、投与と同時、または投与の後に行われ得る。そのような放射線治療に対する投薬スケジュールは、熟練の医師によって決定され得る。
【０２５９】
併用投与は、単一の薬学的製剤としてもしくは別個の製剤を使用した、同時投与、または、いずれかの順序であるが通常は全ての活性な剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮できるような期間内の、連続投与を含み得る。
【０２６０】
RSPO結合剤と少なくとも一種のさらなる治療剤との組み合わせが任意の順序でまたは同時に投与され得ることが認識されるであろう。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、以前に第2の治療剤による処置を受けたことがある患者に投与される。ある特定の他の態様において、RSPO結合剤および第2の治療剤は、実質的に同時にまたは同時に投与される。例えば、対象は、第2の治療剤（例えば、化学療法）による処置の経過を経ながら、RSPO結合剤（例えば、抗体）を投与され得る。ある特定の態様において、RSPO結合剤は、第2の治療剤による処置の1年以内に投与される。ある特定の代替の態様において、RSPO結合剤は、第2の治療剤による任意の処置の10、8、6、4、または2ヶ月以内に投与される。ある特定の他の態様において、RSPO結合剤は、第2の治療剤による任意の処置の4、3、2、または1週間以内に投与される。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、第2の治療剤による任意の処置の5、4、3、2、または1日以内に投与される。2つの（またはそれ以上の）剤または処置がおよそ数時間以内または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）対象に投与され得ることがさらに認識されるであろう。
【０２６１】
疾患を処置するために、本発明のRSPO結合剤（例えば、抗体）の適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、該疾患の重症度および経過、該疾患の応答性、RSPO結合剤または抗体が治療目的で投与されるのかまたは予防目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴などに依存し、全てが処置している医師の裁量による。RSPO結合剤または抗体は、1回もしくは数日間から数ヶ月間続く一連の処置にわたって、または治癒するまでもしくは該疾患状態の減衰が達成されるまで（例えば、腫瘍サイズの減少）投与され得る。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定値から計算することができ、個別の抗体または剤の相対的な効力に応じて変動する。投与する医師は、最適な投与量、投与方法、および反復数を容易に決定することができる。ある特定の態様において、投与量は、0.01μg〜100mg/kg体重、0.1μg〜100mg/kg体重、1μg〜100mg/kg体重、1mg〜100mg/kg体重、1mg〜80mg/kg体重、10mg〜100mg/kg体重、10mg〜75mg/kg体重、または10mg〜50mg/kg体重である。ある特定の態様において、前記抗体または他のRSPO結合剤の投与量は、約0.1mg〜約20mg/kg体重である。ある特定の態様において、1日に、1週間に、1ヶ月に、または1年に1回またはそれ以上、投与が行われ得る。ある特定の態様において、前記抗体または他のRSPO結合剤は、1週間に1回、2週間に1回、または3週間に1回、投与される。
【０２６２】
いくつかの態様において、RSPO結合剤（例えば、抗体）は、初回の、より高い「負荷」用量で投与された後、1回または複数回の、より低い用量で投与され得る。いくつかの態様において、投与の頻度も変化し得る。いくつかの態様において、投与レジメンは、初回用量の投与の後の、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または1ヶ月に1回の追加用量（すなわち「維持」用量）の投与を含み得る。例えば、投与レジメンは、初回負荷用量の投与の後の、毎週の維持用量（例えば、初回用量の2分の1）の投与を含み得る。または投与レジメンは、初回負荷用量の投与の後の、1週間おきの維持用量（例えば、初回用量の2分の1）の投与を含み得る。または投与レジメンは、3週間にわたる3回の初回用量の投与の後の、1週間おきの維持用量（例えば、同じ量）の投与を含み得る。
【０２６３】
当業者に公知であるように、いずれの治療剤の投与も、副作用および/または毒性をもたらすことがある。場合によっては、その副作用および/または毒性は、治療的に有効な用量での特定の剤の投与を不可能にするほど重篤である。場合によっては、薬物治療を中断しなければならず、他の剤が試され得る。しかしながら、同じ治療クラスの多くの剤は類似の副作用および/または毒性を示すことが多く、このことは、患者が治療を中止しなければならないか、または可能であったとしても、その治療剤に関連する不快な副作用に悩まされなければならないことを意味する。
【０２６４】
したがって、本発明は、対象における癌を処置する方法を提供し、該方法は、RSPO結合剤、化学療法剤などの投与に関連する副作用および/または毒性を減少させ得る1つまたは複数の剤を投与するために間欠投与ストラテジーを使用する工程を含む。いくつかの態様において、ヒト対象における癌を処置する方法は、該対象に、治療的に有効な用量のRSPO結合剤を治療的に有効な用量の化学療法剤と併用して投与する工程を含み、ここで、それらの剤の一方または両方が、間欠投与ストラテジーに従って投与される。いくつかの態様において、間欠投与ストラテジーは、初回用量のRSPO結合剤を対象に投与すること、およびその後の用量のRSPO結合剤を2週間に約1回投与することを包含する。いくつかの態様において、間欠投与ストラテジーは、初回用量のRSPO結合剤を対象に投与すること、およびその後の用量のRSPO結合剤を3週間に約1回投与することを包含する。いくつかの態様において、間欠投与ストラテジーは、初回用量のRSPO結合剤を対象に投与すること、およびその後の用量のRSPO結合剤を4週間に約1回投与することを包含する。いくつかの態様において、RSPO結合剤は、間欠投与ストラテジーを使用して投与され、化学療法剤は、毎週投与される。
【０２６５】
V. RSPO結合剤を備えるキット
本発明は、本明細書において記載されるRSPO結合剤（例えば、抗体）を備え、かつ本明細書において記載される方法を行うために使用することができるキットを提供する。ある特定の態様において、キットは、1つまたは複数の容器の中に入った、少なくとも1種のヒトRSPOタンパク質に対する少なくとも1つの精製抗体を備える。いくつかの態様において、該キットは、検出アッセイを行うのに必要および/または十分な構成要素の全て（対照、アッセイを行うための指示書、ならびに解析および結果の提示に必要な任意のソフトウェアの全てを含む）を備える。当業者は、本発明の開示されるRSPO結合剤が、当技術分野において周知の確立されたキット形式の1つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
【０２６６】
RSPO結合剤（例えば、抗RSPO抗体）ならびに少なくとも一種のさらなる治療剤を備えるキットがさらに提供される。ある特定の態様において、第2の（またはそれ以上の）治療剤は、化学療法剤である。ある特定の態様において、第2の（またはそれ以上の）治療剤は、Wnt経路阻害剤である。ある特定の態様において、第2の（またはそれ以上の）治療剤は、血管新生阻害剤である。
【０２６７】
本開示の態様は、本開示のある特定の抗体の調製法および本開示の抗体を使用するための方法を詳細に説明している以下の非限定的な例を参照することによりさらに定義され得る。材料と方法の両方に対する多くの改変が本開示の範囲から逸脱することなく行われ得ることは当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０２６８】
実施例1
ヒト腫瘍内でのRSPOおよびLGRの発現
多数のヒト患者の正常組織、良性腫瘍、および悪性腫瘍試料由来のmRNAをマイクロアレイ解析（Genelogic BioExpress Datasuite）によって解析した。このデータは、腎臓、子宮内膜、および卵巣を含むいくつかの腫瘍タイプにおいて正常組織と比べて悪性組織において上昇した発現レベルのRSPO1を明らかにした。RSPO1は、卵巣癌において頻繁に過剰発現されることが注目された（図1A）。さらに、このデータは、卵巣、膵臓、および肺を含むいくつかの腫瘍タイプにおいて正常組織と比べて悪性組織における上昇した発現レベルのRSPO3を示唆した（図1C）。さらに、LGR5およびLGR6が、正常組織と比べて、悪性の乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、および卵巣腫瘍において過剰発現されるが、LGR4は、肺腫瘍において過剰発現されることが見出された。LGR5およびLGR6の過剰発現は、他の乳房腫瘍のサブタイプと比べてトリプルネガティブ（ERnegPRnegHER2neg）乳房腫瘍に限定されると見られた。
【０２６９】
RNAを、マウス異種移植片において成長された一連のヒト腫瘍から単離した。標識cRNAを生成するための確立されたAffymetrixプロトコルを使用して、RNA試料を調製し、処理した。処理されたRNAを、製造者の技術マニュアルに概説されているようにAffymetrix HG-U133plus2.0マイクロアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA）にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイを洗浄し、走査し、解析した。走査されたアレイのバックグラウンドの補正およびシグナル強度のノーマライゼーションを、GCRMAアルゴリズム（Bioconductor, www.bioconductor.org）を使用して行った。
【０２７０】
特定のヒトRSPOおよびヒトLGRを評価した（RSPO1（241450＿at）、RSPO2（1554012＿at）、RSPO3（228186＿s＿at）、RSPO4（237423＿at）、LGR4（218326＿s＿at）、LGR5（210393＿at）、およびLGR6（227819＿at））。マイクロアレイ解析は、LGR4およびLGR6がほとんど全ての腫瘍において広く発現されているのに対して、多くの腫瘍は、特定のRSPOファミリーメンバーだけおよびLGR5を大いに過剰発現すると見出された（表2）が、これらの発現レベルは、正常組織における発現レベルと比較されなかったことを示した。一般に、単一のRSPOファミリーメンバーだけが所与の腫瘍において高度に発現されることから、RSPOファミリー内に機能的な重複性が存在し得ることが示唆される。
【０２７１】
【表２】
2014524746.tif 000043
【０２７２】
実施例2
LGR5へのRSPOタンパク質の結合
標準的な組換えDNA法を使用して、N末端のFLAGタグおよびCD4の膜貫通ドメインおよびC末端GFPタンパク質タグにヒトLGR5のアミノ酸22〜564をライゲートすることによって、細胞表面LGR5タンパク質を作製した（FLAG-LGR5-CD4TM-GFP）。標準的な組換えDNA法を使用して、RSPO-Fcコンストラクトを作製した。詳細には、完全長ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4を、ヒトFc領域にインフレームでライゲートし、バキュロウイルスを使用して組換えRSPO-Fcタンパク質を昆虫細胞内で発現させた。プロテインAクロマトグラフィーを使用して、その融合タンパク質を昆虫培地から精製した。
【０２７３】
HEK-293細胞をFLAG-LGR5-CD4TM-GFPコンストラクトで一過性にトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、10μg/mlのRSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-FC、RSPO4-Fc、またはFZD8-Fc融合タンパク質の存在下において氷上で15分間インキュベートした。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、Fc融合タンパク質に結合された細胞を検出した。細胞を、正の対照として抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と、および負の対照として抗PE抗体とインキュベートした。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０２７４】
図2に示されるように、RSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4は全て、HEK-293細胞の表面上に発現されたLGR5に結合したが、負の対照であるFZD8は、LGR5に結合しなかった。
【０２７５】
RSPOタンパク質とLGR5との結合親和性を表面プラズモン共鳴によって解析した。標準的な組換えDNA法を使用して、可溶性LGR5-Fcコンストラクトを作製した。詳細には、ヒトLGR5のアミノ酸1〜564をヒトFcにインフレームでライゲートし、その組換えLGR5-Fc融合タンパク質を、バキュロウイルスを使用して昆虫細胞内で発現させた。プロテインAクロマトグラフィーを使用して、その昆虫培地からLGR5-Fc融合タンパク質を精製した。LGR5シグナル配列の切断によって、LGR5のアミノ酸22〜564を含む成熟LGR5-Fc融合タンパク質が得られる。組換えRSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc、およびRSPO4-Fc融合タンパク質を、標準的なアミンベースの化学反応（NHS/EDC）を用いてCM5チップ上に固定化した。可溶性LGR5-Fcの2倍希釈物をそのチップ表面の上に注入した（100nM〜0.78nM）。動態学的データを、Biacore Life Sciences（GE Healthcare）製のBiacore2000システムを使用して経時的に収集し、連立の全体近似式（simultaneous global fit equation）を用いてそのデータを当てはめることにより、各RSPOタンパク質に対する親和性定数（KD値）を得た（表3）。
【０２７６】
【表３】
2014524746.tif 000044
【０２７７】
ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4は全て、LGR5に結合したことから、RSPOタンパク質がLGRタンパク質に対するリガンドであり得ることが証明された。
【０２７８】
実施例3
β-カテニンシグナル伝達の阻害についてのインビトロ試験
細胞懸濁液を調製するために、NOD/SCIDマウスにおいて増殖された新鮮ヒト肺腺癌異種移植片腫瘍（表2中の肺腫瘍＃1）を細かく刻み、300U/mlのコラゲナーゼ3型（Worthington, Lakewood, NJ）および200U/mlのDNase I（Worthington, Lakewood, NJ）を含む培地199（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で37℃において1〜2時間消化した。その肺腫瘍細胞を40μmナイロンストレーナー（BD Falcon, Franklin Lakes, NJ）で濾過し、82×gで5分間遠沈した。赤血球をACK緩衝液（0.8％塩化アンモニウム、0.1mM EDTA、10mM炭酸水素ナトリウム、0.1N HC1）中で溶解し、洗浄し、HBSS（Mediatech, Manassas, VA）、25mM HEPES緩衝液（Mediatech, Manassas, VA）、および2％熱失活ウシ胎児血清（HI-FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA）からなる培地中において150×gで5分間遠心した。死細胞および残骸を、82×gでの8分間のHI-FBS上での遠心分離によって除去した。マウス間質細胞を、SM中の5μg/mlのビオチンコンジュゲート抗H-2Kdおよび2.5μg/mlの抗マウスCD45モノクローナル抗体（BioLegend, San Diego, CA）で染色した後、106細胞/mlあたり50μlのMagnaBindストレプトアビジンビーズ（Thermo Scientific, Waltham, MA）を使用して枯渇させた。
【０２７９】
馴化培地を得るために、B27補給物（Invitrogen, Carlsbad, CA）、インスリン-トランスフェリン-セレン（Invitrogen,Carlsbad, CA）、ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン（Stemcell Technologies, Vancouver, Canada）、20ng/mlのEGF（MBL International, Woburn, MA）、20ng/mlの塩基性FGF（MBL International, Woburn, MA）、および5U/mlのヘパリン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）が補充されたDMEM:F12（3: 1）培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で肺腫瘍細胞を培養した。24時間後、その馴化培地を回収した（本明細書において「LT」と呼ばれる）。
【０２８０】
STF-293細胞を、6xTCF-ルシフェラーゼレポーターベクターで安定的にトランスフェクトする。1体積の肺腫瘍細胞馴化培地（LT）または対照培地を、精製された可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、Jag-Fc融合タンパク質（10μg/ml）、抗FZDモノクローナル抗体（40μg/ml）、または抗体LZ1（40μg/ml）の存在下においてSTF-293細胞に加えた。さらに、Wnt3a L細胞馴化培地を、正の対照として使用し、1: 4の最終希釈で肺腫瘍細胞馴化培地（LT）と組み合わせて試験した。該細胞を16時間インキュベートし、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay Systemを製造者の指示書（Promega, Madison, WI）に従って使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２８１】
精製された可溶性LGR5-FcおよびFZD8-Fc融合タンパク質の効果を対照Jagl-Fcタンパク質と比較し、抗FZDモノクローナル抗体の効果を対照抗細菌リゾチーム抗体LZ1と比較した。図3（左側）に示されるように、肺腫瘍細胞馴化培地（LT）は、Wnt3aによって誘導されるβ-カテニン活性を増強した活性を含む。LT培地中のβ-カテニン活性を増強するタンパク質は、RSPOタンパク質に結合する可溶性LGR5-Fcによって阻害された。この活性は、Wntシグナル伝達を遮断する剤であるFZD8-Fcおよび抗FZD抗体によっても阻害された。可溶性Jag-FcおよびLZ1は、その活性を阻害しなかった。Wnt3aの非存在下でさえ（図3、右側）、LT培地は、β-カテニンシグナル伝達を誘導した。可溶性Jag-FcおよびLZlは、この活性を阻害しなかった。対照的に、可溶性LGR5-Fcは、LT培地によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を阻害して、その応答をほぼ対照レベルにまで低下させた。このデータから、肺腫瘍細胞が、RSPO様活性を有する1種または複数種のタンパク質を産生すること、この活性がLGR5によって阻害されること、およびこの活性がWnt3a活性とは別個であることが示唆された。
【０２８２】
同様の実験を、肺腫瘍細胞馴化培地および卵巣腫瘍細胞馴化培地を使用する共培養アッセイを使用して試みた。上に記載されたように、間質細胞を枯渇させた処理されたばかりの腫瘍細胞を一晩培養した。培養培地および細胞を、Wnt3a L細胞馴化培地有りまたは無しでSTF-293細胞に移した。LGR5-Fc融合タンパク質、FZD8-Fc融合タンパク質、または対照Fc融合タンパク質を加えた（10μg/ml）。該細胞を20時間インキュベートし、上に記載されたようにルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２８３】
図13に示されるように、β-カテニンシグナル伝達活性が、腫瘍細胞および上清によって誘導され、それは、Wnt3a L細胞馴化培地と組み合わせたときさらに増大した（図13A、肺腫瘍LU2;図13B、肺腫瘍LU25;図13C、卵巣腫瘍OV38）。Wnt経路阻害剤であるFZD8-Fcは、Wnt3aによって誘導されるβ-カテニン活性をほぼバックグラウンドレベルにまで低下させたが、LGR5-Fcは、腫瘍に由来するβ-カテニン活性を大きく減少させた。上記のように、このデータから、肺および卵巣腫瘍細胞が、RSPO様活性を有する1種または複数種のタンパク質を産生すること、この活性がLGR5によって阻害されること、およびこの活性がWnt3a活性とは別個であることが示唆された。
【０２８４】
実施例4
可溶性LGR5によるRSPO活性の阻害についてのインビトロ試験
ヒト肺腫瘍＃1細胞の馴化培地を、実施例3に記載されたように調製し、可溶性LGR5-FcおよびRSPO2-Fcを、実施例2に記載されたように作製した。
【０２８５】
HEK-293細胞を6xTCF-ルシフェラーゼレポーターベクター（TOPflash, Millipore, Billerica, MA）でトランスフェクトした。24〜48時間後、トランスフェクトされた細胞を、25％肺腫瘍細胞馴化培地＋25％Wnt3a-L細胞馴化培地を含む培地またはRSPO2（10ng/ml）＋25％Wnt3a-L細胞馴化培地を含む培地とともにインキュベートした。該細胞に可溶性LGR5を20μg/ml〜0.02μg/mlの4倍段階希釈で加えた。可溶性Jag-Fcタンパク質を、20μg/mlにおいて負の対照として使用し、FZD8-Fcタンパク質を、20μg/mlにおいて正の対照として使用した。該細胞を16時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay Systemを製造者の指示書（Promega, Madison, WI）に従って使用して測定した。
【０２８６】
図4に示されるように、可溶性LGR5-Fcの濃度を増加させていくことにより、RSPO2-Fc＋Wnt3a-馴化培地の組み合わせによってルシフェラーゼ活性の誘導が減少し（-□-）、ならびに肺腫瘍細胞馴化培地とWnt3a-馴化培地との組み合わせによってルシフェラーゼ活性の誘導が減少した（-■-）。負の対照のJag-Fcタンパク質は、ルシフェラーゼ活性を遮断しなかったが、Wnt3aを遮断するFZD8-Fcは、ルシフェラーゼ活性を遮断した。重要なことに、LGR5は、RSPO2タンパク質と肺腫瘍細胞馴化培地の両方を用いたときの阻害について同じEC50を示した。このデータは、肺腫瘍細胞によって産生されるRSPO様活性を有するタンパク質が、LGR5によって阻害されること、精製RSPOタンパク質と非常によく似た挙動を示すことを証明し、肺腫瘍細胞馴化培地における活性がRSPOタンパク質に起因することが示唆された。
【０２８７】
実施例5
抗RSPO1モノクローナル抗体の作製
組換えヒトRSPO1タンパク質のアミノ酸31〜263（R&D Systems, Minneapolis, MN）に対する抗体を作製した。標準的な手法を使用して、マウス（n＝3）をRSPO1タンパク質で免疫した。個別のマウス由来の血清を、最初の免疫のおよそ70日後にFACS解析を使用してRSPO1に対してスクリーニングした。最も高い抗体価を有する動物を最後の抗原追加免疫のために選択し、その最後の抗原追加免疫の後、脾臓細胞をハイブリドーマ作製のために単離した。SP2/0細胞をマウス脾臓細胞に対する融合パートナーとして使用した。ハイブリドーマ細胞を、96ウェルプレートの1ウェルあたり1個の細胞で播種し、上清をFACS解析によってヒトRSPO1に対してスクリーニングした。
【０２８８】
抗RSPO1抗体のFACSスクリーニングのために、ヒトRSPO1のN末端のフューリン様ドメインの細胞表面発現を可能にするキメラ融合タンパク質を構築した。図5Aに示されるように、その融合タンパク質は、N末端のFLAGタグ、それに続いて、RSPO1の2つのフューリン様ドメイン（aa34〜135）を含み、そしてヒトCD4の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが融合され、そしてC末端の緑色蛍光タンパク質タグを含む（FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFP）。
【０２８９】
HEK-293細胞を、FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFPでトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、50μlのハイブリドーマ上清の存在下において氷上で30分間インキュベートした。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、抗体に結合された細胞を検出した。細胞を、正の対照として抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と、および負の対照として抗PE抗体とインキュベートした。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０２９０】
89M2、89M4、89M5、89M7、89M19、および89M25を含む、RSPO1に結合したいくつかのハイブリドーマが同定された（図5B）。これらの抗体のいくつかから重鎖可変領域および軽鎖可変領域を配列決定した。解析後、抗体89M2、89M4、89M5、および89M25が、同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことが見出された。抗体89M5を発現しているハイブリドーマ細胞株を、ブダペスト条約の規定に基づき、2011年6月30日にATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託し、ATCC寄託指定番号PTA-11970が割り当てられた。89M5の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 10およびSEQ ID NO: 11である。89M5の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20である。89M5の重鎖CDRおよび軽鎖CDRは、本明細書における表1に列挙されている。89M5の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 21およびSEQ ID NO: 22であり;89M5の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 23およびSEQ ID NO: 24である。
【０２９１】
実施例6
RSPO1によるβ-カテニンシグナル伝達の誘導を阻害する抗RSPO1モノクローナル抗体の識別
HEK-293細胞を、6xTCF-ルシフェラーゼレポーターベクター（TOPflash, Millipore, Billerica, MA）でトランスフェクトした。24〜48時間後、トランスフェクトされたHEK-293細胞を、抗RSPO1抗体89M2、89M4、89M5、89M7、89M19、および89M25、または2つの無関係な対照抗体254M14および254M26（10μg/ml〜0.625μg/mlの2倍希釈物）の存在下においてWnt3a（5ng/ml）とヒトRSPO1（10ng/ml, R&D BioSystems）との組み合わせとともにインキュベートした。該細胞を16時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay Systemを製造者の指示書（Promega, Madison, WI）に従って使用して測定した。
【０２９２】
図6に示されるように、抗RSPO1抗体89M2、89M4、89M5、および89M25の各々は、シグナル伝達を遮断した一方で、抗RSPO1抗体89M7および89M19は、シグナル伝達を遮断しなかった。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列決定によって判定されるように、抗体89M2、89M4、89M5、および89M25は全て、同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むので、おそらく、同じ抗原結合部位を含む。これらの結果は、抗RSPO1抗体が、RSPO1によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を遮断することができることを証明した。
【０２９３】
実施例7
抗RSPO1抗体はLGR5への可溶性RSPO1の結合を遮断する
HEK-293細胞を、FLAG-LGR5-CD4TM-GFPコンストラクト（先の実施例2に記載されたもの）で一過性にトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、RSPO1-Fcタンパク質（10μg/ml）および抗体89M2、89M4、89M5、89M7、89M19、または89M25（10μg/ml）の存在下において氷上でインキュベートした。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、RSPO1-Fc融合タンパク質に結合された細胞を検出した。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０２９４】
図7に示されるように、抗RSPO1抗体89M2、89M4、89M5、および89M25の各々は、LGR5へのRSPO1の結合を遮断した一方で、抗RSPO1抗体89M7および89M19は、LGR5へのRSPO1の結合を遮断しなかった。これらの結果は、6xTCFルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるβ-カテニン活性の誘導を測定するアッセイにおいて抗体89M2、89M4、89M5、および89M25がRSPO1シグナル伝達を遮断する能力を証明した実施例6に示された結果と相関する一方で、抗体89M7および89M19は、RSPO1シグナル伝達を遮断できなかった。上で論じたように、抗体89M2、89M4、89M5、および89M25は全て、同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびにおそらく、同じ抗原結合部位を含むので、これらの抗体の全てが同一ではないにしても類似の様式で機能すると予想され得る。
【０２９５】
実施例8
抗RSPO1抗体の結合親和性
抗体89M4、89M5、89M7、および89M25のKDを、Biacore LifeSciences（GE Healthcare）製のBiacore2000システムを使用して測定した。組換えヒトRSPO1-FcまたはマウスRSPO1-Fcタンパク質を、標準的なアミンベースの化学反応（NHS/EDC）を用いてCM5チップ上に固定化した。前記抗体を、100nMから0.78nMまでHBS-P（0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005％v/v Surfactant P20）で2倍段階希釈し、そのチップ表面の上に注入した。動態学的データを経時的に収集し、連立の全体近似式を用いて当てはめることにより、各抗体に対する親和性定数（KD値）を得た。
【０２９６】
【表４】
2014524746.tif 000045
【０２９７】
表4に示されるように、抗体89M4、89M5、89M7、および89M25は全て、ヒトRSPO1に対して0.1nM未満の親和性定数（KD）を有した。これらの抗体は、マウスRSPO1に対しても0.1nM未満のKDを有した。
【０２９８】
実施例9
抗RSPO1抗体によるインビボにおける卵巣腫瘍成長の阻害
分離されたOV19卵巣腫瘍細胞（1×105細胞）を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスの乳房脂肪パッドに注入した。腫瘍が134mm3という平均体積に達するまで、45日間成長させた。そのマウスを無作為化し（1群あたりn＝10）、抗RSPO1抗体89M5、89M25、タキソール、89M5とタキソールとの併用、89M25とタキソールとの併用、または対照抗体1B7.11で処置した。抗体を15mg/kgで1週間に1回投与し、タキソールを7.5mg/mlで1週間に1回投与した。それらの抗体およびタキソールの投与は、腹腔内への注射によって行われた。腫瘍成長をモニターし、記載の時点において電子ノギスを用いて腫瘍体積を測定した。データは、平均値±S. E. M.として表される。
【０２９９】
35日目において、対照抗体による処置と比べて、抗体89M5による処置は、腫瘍成長を40％減少させ、89M25による処置は、腫瘍成長を25％減少させた（図8、それぞれp＝0.37およびp＝0.19）。タキソールと併用した89M5または89M25による処置は、いずれかの剤単独による処置よりも大きく腫瘍成長を減少させた。89M5およびタキソールによる処置は、成長を48％減少させ（対照群に対してp＝0.12）、89M25およびタキソールによる処置は、成長を43％減少させた（対照群に対してp＝0.16）。したがって、抗体89M5および89M25は、OV19卵巣腫瘍モデルにおいて、単剤として抗腫瘍成長活性を示し、タキソールと併用した場合も抗腫瘍成長活性を示した。
【０３００】
この実験に使用されたマウス（対照マウスと処置マウスの両方）由来の腫瘍のその後の解析から、それらの腫瘍が、ヒト卵巣腫瘍細胞（OV19）とマウスT細胞リンパ腫細胞との混合物であることが明らかになった。
【０３０１】
実施例10
抗RSPO1モノクローナル抗体89M5のエピトープマッピング
抗体89M5に結合するRSPO1の特異的な領域をさらに特徴付けるために、エピトープマッピング実験を行った。ヒトRSPO1の種々の領域を含む一連のコンストラクトを、標準的な組換えDNA技術を使用して作製した（図9Aを参照のこと）。それらのコンストラクトは、各々が、N末端のFLAGタグ、それに続いてRSPO1タンパク質の一部を含み、そしてヒトCD4の膜貫通および細胞内ドメインが融合された、融合タンパク質だった。いくつかのバージョンでは、それらの融合タンパク質は、C末端の緑色蛍光タンパク質タグも含む。
【０３０２】
HEK-293細胞を、個々のコンストラクトでトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、抗RSPO1抗体89M5の存在下において氷上で30分間インキュベートした。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、抗体に結合された細胞を検出した。細胞を、正の対照として抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と、負の対照として抗PE抗体とインキュベートした。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０３０３】
図9Bに示されるように、FACS解析は、RSPO1のフューリン2ドメイン内のアミノ酸が、抗RSPO1抗体89M5に対する結合部位に関与することを示唆する（実施例10、図9）。これらの予備的な結果は、他のRSPO1ドメイン内のアミノ酸がその結合部位に関与し得るという事実を排除しない。
【０３０４】
実施例11
抗RSPO2モノクローナル抗体の作製
組換えヒトRSPO2タンパク質のアミノ酸22〜205（R&D Systems, Minneapolis, MN）に対する抗体を作製した。標準的な手法を使用して、マウス（n＝3）をRSPO2タンパク質で免疫した。個別のマウス由来の血清を、最初の免疫のおよそ70日後にFACS解析を使用してRSPO2に対してスクリーニングした。最も高い抗体価を有する動物を最後の抗原追加免疫のために選択し、その最後の抗原追加免疫の後、脾臓細胞をハイブリドーマ作製のために単離した。SP2/0細胞をマウス脾臓細胞に対する融合パートナーとして使用した。ハイブリドーマ細胞を、96ウェルプレートの1ウェルあたり1個の細胞で播種し、上清をFACS解析によってヒトRSPO2に対してスクリーニングした。
【０３０５】
実施例5に記載されたように、抗RSPO2抗体のFACSスクリーニングのために、ヒトRSPO2のN末端のフューリン様ドメインの細胞表面発現を可能にするキメラ融合タンパク質を構築した。RSPO1に対する図5Aに示されたものと同様に、RSPO2融合タンパク質は、N末端のFLAGタグ、それに続いて、RSPO2のフューリン様ドメイン（aa31〜146）を含み、そしてヒトCD4の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが融合され、C末端の緑色蛍光タンパク質タグを含む（FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFP）。
【０３０６】
HEK-293細胞を、FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFPでトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、50μlのハイブリドーマ上清の存在下において氷上で30分間インキュベートした。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、抗体に結合された細胞を検出した。細胞を、正の対照として抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と、および負の対照として抗PE抗体とインキュベートした。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０３０７】
130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28を含む、RSPO2に結合したいくつかのハイブリドーマが同定された（図10）。これらの抗体のいくつかから重鎖可変領域および軽鎖可変領域を配列決定した。抗体130M23を発現しているハイブリドーマ細胞株を、ブダペスト条約の規定に基づき、2011年8月10日にATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託し、ATCC寄託指定番号PTA-12021が割り当てられた。130M23の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28である。130M23の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 35およびSEQ ID NO: 36である。130M23の重鎖CDRおよび軽鎖CDRは、本明細書における表1に列挙されている。130M23の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 37およびSEQ ID NO: 38であり;130M23の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO: 39およびSEQ ID NO: 40である。
【０３０８】
実施例12
RSPO2によるβ-カテニンシグナル伝達の誘導を阻害する抗RSPO2モノクローナル抗体の識別
HEK-293細胞を、6xTCF-ルシフェラーゼレポーターベクター（TOPflash, Millipore, Billerica, MA）でトランスフェクトした。24〜48時間後、トランスフェクトされたHEK-293細胞を、抗RSPO2抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28の存在下において、Wnt3a（5ng/ml）とヒトRSPO2（10ng/ml, R&D BioSystems）またはヒトRSPO3（10ng/ml, R&D BioSystems）との組み合わせとインキュベートした。細胞を、Wnt3aとRSPOとの組み合わせ、Wnt3aのみとともに、または対照として添加無しでインキュベートした。該細胞を16時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay Systemを製造者の指示書（Promega, Madison, WI）に従って使用して測定した。
【０３０９】
図11に示されるように、抗RSPO2抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28の各々は、RSPO2によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を減少させ、抗RSPO2抗体130M23、130M24は、RSPO2によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を完全に遮断した。対照的に、これらの抗体は、RSPO3によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を遮断しなかった。これらの結果は、抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28が、RSPO2の特異的な阻害剤であること、ならびにRSPO2によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を減少させ、かつ/または完全に遮断することができることを証明した。
【０３１０】
実施例13
抗RSPO2抗体はLGR5への可溶性RSPO2の結合を遮断する
HEK-293細胞を、FLAG-LGR5-CD4TM-GFPコンストラクト（先の実施例2に記載されたもの）で一過性にトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、RSPO2-Fcタンパク質（10μg/ml）、ならびに抗体130M23、130M24、130M25、130M26、130M27、および130M28の存在下において氷上でインキュベートした。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、RSPO2-Fc融合タンパク質に結合された細胞を検出した。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した
【０３１１】
図12に示されるように、抗RSPO2抗体130M23および130M24の各々は、LGR5へのRSPO2の結合を遮断した一方で、抗RSPO2抗体130M25、130M26、130M27、および130M28は、LGR5へのRSPO2の結合を弱く遮断しただけかまたは遮断しなかった。これらの結果は、抗体130M23および130M24がRSPO2によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達を完全に遮断する能力を証明した実施例11に示された結果と相関する一方で、抗体130M25、130M26、130M27、および130M28は、RSPO2によって誘導されるβ-カテニンシグナル伝達のそれほど強力ではない阻害剤だった。
【０３１２】
実施例14
抗RSPO3モノクローナル抗体の作製
組換えヒトRSPO3タンパク質のアミノ酸22〜272（R&D Systems, Minneapolis, MN）に対する抗体を作製する。標準的な手法を使用して、マウス（n＝3）をRSPO3タンパク質で免疫する。個別のマウス由来の血清を、最初の免疫のおよそ70日後にFACS解析を使用してRSPO3に対してスクリーニングする。最も高い抗体価を有する動物を最後の抗原追加免疫のために選択し、その最後の抗原追加免疫の後、脾臓細胞をハイブリドーマ作製のために単離する。SP2/0細胞をマウス脾臓細胞に対する融合パートナーとして使用する。ハイブリドーマ細胞を、96ウェルプレートの1ウェルあたり1個の細胞で播種し、上清をFACS解析によってヒトRSPO3に対してスクリーニングする。
【０３１３】
実施例5に記載されたように、抗RSPO3抗体のFACSスクリーニングのために、ヒトRSPOのN末端のフューリン様ドメインの細胞表面発現を可能にするキメラ融合タンパク質を構築した。RSPO1に対して図5Aに示されたものと同様に、RSPO3融合タンパク質は、N末端のFLAGタグ、それに続いて、RSPO3のフューリン様ドメイン（aa32〜141）を含み、そしてヒトCD4の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが融合され、C末端の緑色蛍光タンパク質タグを含む（FLAG-RSPO3フューリン-CD4TM-GFP）。
【０３１４】
HEK-293細胞を、FLAG-RSPO3フューリン-CD4TM-GFPでトランスフェクトする。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2％FBSおよびヘパリンを含む氷冷PBSに懸濁し、50μlのハイブリドーマ上清の存在下において氷上で30分間インキュベートする。100μlのPEコンジュゲート抗ヒトFc二次抗体との第2のインキュベーションを行うことにより、抗体に結合された細胞を検出する。細胞を、正の対照として抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と、および負の対照として抗PE抗体とインキュベートする。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理する。
【０３１５】
実施例15
抗RSPO2抗体130M23の結合親和性
130M23のKDを、Biacore LifeSciences（GE Healthcare）製のBiacore2000システムを使用して測定した。組換えヒトRSPO2-FcまたはマウスRSPO2-Fcタンパク質を、標準的なアミンベースの化学反応（NHS/EDC）を用いてCM5チップ上に固定化した。抗体を、100nMから0.78nMまでHBS-P（0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005％v/v Surfactant P20）で2倍段階希釈し、そのチップ表面の上に注入した。動態学的データを経時的に収集し、連立の全体近似式を用いて当てはめることにより、各抗体に対する親和性定数（KD値）を得た。
【０３１６】
抗体130M23は、ヒトRSPO2に対して0.14nMの親和性定数（KD）およびマウスRSPO2に対して0.35nMのKDを有した。
【０３１７】
実施例16
抗RSPO2抗体によるRSPO活性の阻害についてのインビトロ試験
ヒト肺腫瘍LU2細胞の馴化培地を、実施例3に記載されたように調製し、可溶性LGR5-Fcを、実施例2に記載されたように作製した。
【０３１８】
STF-293細胞を、LU2細胞＋25％肺腫瘍細胞馴化培地＋25％Wnt3a-L細胞馴化培地とともにインキュベートした。該細胞に抗体130M23および可溶性LGR5-Fcを50μg/ml〜0.0006μg/mlの5倍段階希釈で加えた。同様に希釈された無関係なモノクローナル抗体および対照Fc融合タンパク質（50μg/m1）を負の対照として使用した。該細胞を20時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、Steady-Glo（登録商標）Luciferase Assay Systemを製造者の指示書（Promega, Madison, WI）に従って使用して測定した。
【０３１９】
図14に示されるように、可溶性LGR5-Fcの濃度を増加させていくことにより（-●-）、肺腫瘍細胞馴化培地とWnt3a馴化培地との組み合わせによるルシフェラーゼ活性の誘導が減少した。抗RSPO2抗体130M23の濃度を増加させていくことによっても（-■-）、肺腫瘍細胞馴化培地とWnt3a馴化培地との組み合わせによるルシフェラーゼ活性の誘導が減少した。130M23は、馴化培地によって誘導される活性を129nMのIC50で遮断し、LGR5-Fcよりも100倍超強力だった。対照Fc融合タンパク質（-△-）、ならびに無関係の抗体（-□-）は、ルシフェラーゼ活性を遮断しなかった。
【０３２０】
実施例17
抗RSPO抗体によるインビボにおける膵腫瘍成長の阻害
分離されたPN31膵腫瘍細胞（1×105細胞）を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスの側腹部に皮下注入した。腫瘍が120mm3という平均体積に達するまで、61日間成長させた。そのマウスを無作為化し（1群あたりn＝10）、抗RSPO1抗体89M5、抗RSPO2抗体130M23、ゲムシタビン、89M5とゲムシタビンとの併用、130M23とゲムシタビンとの併用、または対照抗体1B7.11で処置した。抗体を15mg/kgで1週間に1回投与し、ゲムシタビンを30mg/mlで1週間に1回投与した。該抗体およびゲムシタビンの投与は、腹腔内への注射によって行われた。腫瘍成長をモニターし、特定の時点において電子ノギスを用いて腫瘍体積を測定した。データは、平均値±S. E. M.として表される。
【０３２１】
図15に示されるように、単剤としての抗RSPO1抗体89M5または抗RSPO2抗体130M23による処置は、腫瘍成長に対して最小の効果しかなかった。ゲムシタビン単独による処置は、対照と比べて腫瘍成長を49％減少させた（p＝0.09）。しかしながら、ゲムシタビンと併用した89M5または130M23による処置は、いずれかの剤単独による処置よりも大きく腫瘍成長を減少させた。89M5およびゲムシタビンによる処置は、成長を59％減少させ（対照群に対してp＝0.015）、130M23およびゲムシタビンによる処置は、成長を58％減少させた（対照群に対してp＝0.016）。したがって、抗RSPO1抗体89M5および抗RSPO2抗体130M23は、膵臓異種移植モデルにおいてゲムシタビンと併用した場合、強い抗腫瘍成長活性を示した。
【０３２２】
実施例18
Wnt経路阻害剤との併用での抗RSPO抗体によるインビボにおける膵腫瘍成長の阻害
分離されたPN7膵腫瘍細胞（1×105細胞）を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスの側腹部に皮下注入した。腫瘍が130mm3という平均体積に達するまで、25日間成長させた。そのマウスを無作為化し（1群あたりn＝10）、抗RSPO2抗体130M23、抗FZD抗体18R5、ゲムシタビン、130M23とゲムシタビンとの併用、18R5とゲムシタビンとの併用、130M23と18R5との併用、130M23と18R5とゲムシタビンとの併用、または対照抗体1B7.11で処置した。抗RSPO2抗体130M23を10mg/kgで1週間に1回投与し、抗FZD抗体18R5を20mg/kgで1週間に1回投与し、ゲムシタビンを30mg/mlで1週間に1回投与した。それらの抗体およびゲムシタビンの投与は、腹腔内への注射によって行われた。腫瘍成長をモニターし、特定の時点において電子ノギスを用いて腫瘍体積を測定した。データは、平均値±S. E. M.として表される。平行実験セットは、ゲムシタビンとの併用でのFZD8-Fc可溶性受容体（10mg/kg）、ならびに130M23およびゲムシタビンとの併用でのFZD8-Fcで処置されたマウスを含んだ。
【０３２３】
単剤としての抗体130M23または抗体18R5による処置は、対照抗体による処置と比べて腫瘍成長をおよそ55％減少させた（図16A、p＜0.001）。ゲムシタビンと併用した130M23または18R5による処置は、いずれかの剤単独による処置よりも大きく腫瘍成長を減少させた。130M23およびゲムシタビンによる処置は、成長を68％減少させ（対照群に対してp＜0.001）、18R5およびゲムシタビンによる処置は、成長を75％減少させた（対照群に対してp＜0.001）。さらに、130M23とゲムシタビンと18R5との併用は、PN7腫瘍の成長をほぼ完全に阻害した（図16A）。類似の結果が、130M23とゲムシタビンとFZD8-Fc可溶性受容体との併用の場合に見られた（図16B）。したがって、130M23などの抗RSPO2抗体は、膵腫瘍成長の阻害において単剤活性を有する。さらに、抗RSPO2抗体とゲムシタビンとの併用、または抗RSPO2抗体とゲムシタビンおよびWnt経路阻害剤（例えば、抗FZD抗体18R5またはFZD8-Fc可溶性受容体）との併用は、膵腫瘍モデルにおいて、腫瘍成長を阻害するために非常に有効な治療であると示された。
【０３２４】
IHC研究から、抗RSPO2抗体130M23が、無処置マウスと比べて処置マウスのPN7腫瘍の形態学的変化を誘導することが示された。これらの細胞はまた、抗Ki67抗体を使用した際、増殖の有意な減少も示した。これらの結果は、おそらく、腫瘍細胞の喪失および間質の増加を反映している。
【０３２５】
上に記載されたPN7腫瘍を処理することにより、単一細胞懸濁液を得た。ビオチン化抗H2Kdおよび抗CD45抗体、ならびにストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズを使用して、該細胞混合物からマウス細胞を枯渇させた。残りのヒト腫瘍細胞を、新しいマウスのコホートに連続的に移植した。各処置群からの90個の腫瘍細胞をNOD-SCIDマウスの側腹部に注入した（1群あたりn＝10匹のマウス）。腫瘍を、処置せずに40日間成長させ、電子ノギスを用いて腫瘍体積を測定した。
【０３２６】
図16Cは、各群の個別のマウスの腫瘍体積を示している。単剤としてのまたは併用での抗RSPO2抗体130M23または抗FZD抗体18R5で処置されたマウスから単離された細胞は、対照抗体で処置されたマウスから単離された細胞と比べて、腫瘍形成能を大幅に低下させた。この低下した腫瘍形成能は、ゲムシタビン単独を用いたときに観察された腫瘍形成能の低下よりも大きかった。ゲムシタビンと130M23との併用、ゲムシタビンと18R5との併用、またはゲムシタビンとFZD8-Fcとの併用で処置されたマウス由来の細胞は、対照抗体で処置されたマウスから単離された細胞と比べてわずかに低下しただけの腫瘍形成能を示した。興味深いことに、130M23と18R5とゲムシタビンとの併用または130M23とFZD8-Fcとゲムシタビンとの併用で処置されたマウスから単離された細胞は、それらのいずれかの剤単独または2剤併用よりも大きい、腫瘍成長の有意な著しい喪失を示した。これらの結果は、標準的な化学療法に加えて複数の経路を阻害することが、腫瘍形成能および癌幹細胞を減少させる際に、相加的効果およびおそらく相乗効果を有することを示した。
【０３２７】
実施例19
RSPO抗体のヒト化
ヒトRSPO1およびRSPO2に対するヒト化抗体を作製した。マウスモノクローナル抗体89M5および130M23の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、Larrick, J.M., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250およびJones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio/Technology 9: 88に記載されているように本質的に縮重PCRを使用してハイブリドーマ株から単離し、配列決定した。次いで、親の89M5または130M23抗体のアミノ酸配列とおそらく構造的に似ているヒト重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域を、新規の合成フレームワークの設計を行うのを助ける参照ヒトフレームワーク領域とみなした。マウスフレームワークとの類似性を有するヒトフレームワーク領域を同定するために、89M5および130M23のマウス重鎖および軽鎖可変ドメインによってコードされる予測タンパク質配列を、Genbankに寄託されたヒト配列に対するBLAST検索を使用して、発現されるヒトcDNAによってコードされるヒト抗体配列と比較した。候補ヒト化フレームワーク重鎖と親マウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域とのアミノ酸の差異を、起こりうる重要性について評価し、部位における差異の各々が可変領域の適切なフォールディングおよび機能に寄与するかに関して判定した。この解析は、他の抗体断片の解析された結晶構造（例えば、Trakhanov et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999, 55: 122-28に記載されているようなFab2E8の構造、ならびに他のタンパク質の結晶構造（例えば、タンパク質データバンクの構造1ADQおよび1GIG））を検討することによって導かれた。Jmol、quick PDB、およびPymolを含むコンピュータソフトウェアを使用して構造をモデル化した。所与の部位におけるアミノ酸がβ-シートのフレームワークのパッキングに与える潜在的な影響、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との相互作用、アミノ酸側鎖の溶媒への露出の程度、およびアミノ酸がCDRループの位置決めに影響する可能性を考慮した。この解析から、ヒトIgG2定常領域にインフレームで融合された候補重鎖可変領域およびヒトIgKC1定常領域にインフレームで融合された候補軽鎖可変領域を想像し、化学的に合成した。その候補重鎖および軽鎖は、i）天然のヒトフレームワークに似るように設計された合成フレームワークおよびii）親89M5または130M23マウス抗体CDRを含む。
【０３２８】
各候補変異体ヒト化重鎖および軽鎖の機能性を、哺乳動物細胞へのコトランスフェクションによって試験した。上に記載された各候補ヒト化重鎖を、HEK-293細胞にマウス軽鎖cDNAとともにコトランスフェクトし、馴化培地をFACSによってRSPO結合活性についてアッセイした。ヒト化89M5重鎖変異体「89M5-H2」（SEQ ID NO: 68）は、最も頑強な結合を示し、それを選択した。その89M5-H2ヒト化重鎖を、HEK-293細胞に候補ヒト化軽鎖の各々とともにコトランスフェクトし、馴化培地をFACSによって抗原結合について再度アッセイした。軽鎖変異体「89M5-L2」（SEQ ID NO: 69）は、最も頑強な結合を示し、それを選択した。同様に、ヒト化130M23重鎖変異体「130M23-H1」（SEQ ID NO: 70）は、最も頑強な結合を示し、それを選択した。130M23-H1ヒト化重鎖を、HEK-293細胞に候補ヒト化軽鎖の各々とともにコトランスフェクトし、馴化培地をFACSによって抗原結合について再度アッセイした。軽鎖変異体「130M23-L2」（SEQ ID NO: 71）は、最も頑強な結合を示し、それを選択した。
【０３２９】
抗体の産生を増加させるために、130M23-H1L2の変異体を作製した。その変異体は、130M23-H1L2と同じ重鎖を含むが、改変された軽鎖を有し、h130M23-H1L6と呼ばれる。
【０３３０】
実施例20
ヒト化89M5およびヒト化130M23の結合親和性
h89M5-H2L2のKDを、Biacore LifeSciences（GE Healthcare）製のBiacore2000システムを使用して測定した。組換えヒトRSPO1-FcまたはマウスRSPO1-Fcタンパク質を、標準的なアミンベースの化学反応（NHS/EDC）を用いてCM5チップ上に固定化した。それらの抗体を100nMから0.78nMまでHBS-P（0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005％v/v Surfactant P20）で2倍段階希釈し、そのチップ表面の上に注入した。動態学的データを経時的に収集し、連立の全体近似式を用いて当てはめることにより、各抗体に対する親和性定数（KD値）を得た。
【０３３１】
h89M5-H2L2は、ヒトRSPO1およびマウスRSPO1に対して0.1nM未満の親和性定数（KD）を有した。
【０３３２】
h130M23-H1L2およびh130M23-H1L6のKDを、Biacore LifeSciences（GE Healthcare）製のBiacore2000システムを使用して測定した。組換えヒトRSPO2-Fcタンパク質を、標準的なアミンベースの化学（NHS/EDC）を用いてCM5チップ上に固定化した。抗体を、100nMから0.78nMまでHBS-P（0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005％v/v Surfactant P20）で2倍段階希釈し、そのチップ表面の上に注入した。動態学的データを経時的に収集し、連立の全体近似式を用いて当てはめることにより、各抗体に対する親和性定数（KD値）を得た。
【０３３３】
h130M23-H1L2は、ヒトRSPO2に対して0.13nMの親和性定数（KD）を有し、h130M23-H1L6は、ヒトRSPO2に対して0.15nMの親和性定数（KD）を有した。
【０３３４】
実施例21
抗RSPO抗体のFACS結合
HEK293細胞を、FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFPをコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。実施例5に記載されたように、FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFPは、ヒトRSPO1のN末端のフューリン様ドメインの細胞表面発現を可能にするキメラ融合タンパク質である。FLAG-RSPO1フューリン-CD4TM-GFPをトランスフェクトされた細胞を、抗RSPO1抗体89M5またはヒト化抗RSPO1抗体h89M5-H2L2の存在下においてインキュベートした。各抗体の5倍段階希釈物を、RSPO1を発現している細胞に結合する能力について調べた。結合した抗体を明らかにするために細胞をPhycoerythrinコンジュゲート抗IgGで染色した。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０３３５】
図17Aに示されるように、これらの研究は、抗RSPO1抗体89M5とヒト化抗RSPO1抗体h89M5-H2L2の両方がヒトRSPO1に結合することを示唆する。
【０３３６】
HEK293細胞を、FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFPをコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。実施例11に記載されたように、FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFPは、ヒトRSPO2のN末端のフューリン様ドメインの細胞表面発現を可能にするキメラ融合タンパク質である。FLAG-RSPO2フューリン-CD4TM-GFPをトランスフェクトされた細胞を、抗RSPO2抗体130M23またはヒト化抗RSPO2抗体h130M5-H1L2の存在下においてインキュベートした。各抗体の5倍段階希釈物を、RSPO2を発現している細胞に結合する能力について調べた。結合した抗体を明らかにするために細胞をPhycoerythrinコンジュゲート抗IgGで染色した。細胞をFACSCalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）において解析し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを処理した。
【０３３７】
図17Bに示されているように、これらの研究は、抗RSPO2抗体130M23とヒト化抗RSPO2抗体h130M23-H1L2の両方がヒトRSPO2に結合することを示唆する。
【０３３８】
実施例22
化学療法剤との併用での抗RSPO抗体によるインビボにおける乳房腫瘍成長の阻害
分離されたOMP-B39乳房腫瘍細胞（4×105細胞）を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスの側腹部に皮下注入した。OMP-039は、高レベルのRSPO2発現を有するトリプルネガティブ乳癌腫瘍である。さらに、RSPO1のレベルは、実施例1において特徴付けられた他の乳房腫瘍よりも高い（表2を参照のこと）。腫瘍が120mm3という平均体積に達するまで、39日間成長させた。そのマウスを無作為化し（1群あたりn＝10）、抗RSPO1抗体89M5と抗RSPO2抗体130M23との併用、シスプラチン、抗RSPO1とRSPO2抗体とシスプラチンとの併用、または対照抗体で処置した。抗体を15mg/kgで1週間に1回投与し、シスプラチンを1.5mg/mlで1週間に2回投与した。それらの抗体およびシスプラチンの投与は、腹腔内への注射によって行われた。腫瘍成長をモニターし、記載の日に電子ノギスを用いて腫瘍体積を測定した。データは、平均値±S. E. M.として表される。
【０３３９】
図18に示されるように、シスプラチンを伴う抗RSPO1抗体89M5と抗RSPO2抗体130M23との併用は、シスプラチン単独よりも良好に腫瘍成長を阻害した（p＝0.04、併用群対シスプラチン単独）。シスプラチン無しの抗体89M5と130M25との併用は、この腫瘍に対して最小の効果しかなかったという事実にもかかわらず、3重の併用は、有意な効果を有した。
【０３４０】
本明細書において記載される例および態様は、単に例示目的であること、およびそれに照らした様々な改変または変更が当業者に提案され、それは本願の精神および権限の範囲内に包含されることが理解される。
【０３４１】
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、およびアクセッション番号/データベース配列（ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の両方を含む）が、各個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号/データベース配列が、参照により明確かつ個別に組み入れられるとそのように示されたかのように同程度に全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４２】
配列
シグナル配列を有するヒトRSPO1タンパク質配列（SEQ ID NO: 1）
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シグナル配列を有するヒトRSPO2タンパク質配列（SEQ ID NO: 2）
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シグナル配列を有するヒトRSPO3タンパク質配列（SEQ ID NO: 3）
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シグナル配列を有するヒトRSPO4タンパク質配列（SEQ ID NO: 4）
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予測シグナル配列を有しないヒトRSPO1タンパク質配列（SEQ ID NO: 5）
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ヒトRSPO1フューリン様ドメイン1（SEQ ID NO: 6）
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ヒトRSPO1フューリン様ドメイン2（SEQ ID NO: 7）
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ヒトRSPO1トロンボスポンジンドメイン（SEQ ID NO: 8）
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ヒトRSPO1アミノ酸31〜263（SEQ ID NO: 9）
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89M5重鎖可変領域（SEQ ID NO: 10）
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89M5軽鎖可変領域（SEQ ID NO: 11）
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89M5重鎖CDR1（SEQ ID NO: 12）
TGYTMH
89M5重鎖CDR2（SEQ ID NO: 13）
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89M5重鎖CDR3（SEQ ID NO: 14）
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89M5軽鎖CDR1（SEQ ID NO: 15）
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89M5軽鎖CDR2（SEQ ID NO: 16）
WASTRHT
89M5軽鎖CDR3（SEQ ID NO: 17）
QQHYSTPW
FLAGタグ（SEQ ID NO: 18）
DYKDDDDK
89M5重鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 19）
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89M5軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 20）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有する89M5重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 21）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有する89M5軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 22）
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89M5重鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 23）
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89M5軽鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 24）
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予測シグナル配列を有しない89M5重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 25）
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予測シグナル配列を有しない89M5軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 26）
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130M23重鎖可変領域（SEQ ID NO: 27）
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130M23軽鎖可変領域（SEQ ID NO: 28）
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130M23重鎖CDR1（SEQ ID NO: 29）
SSYAMS
130M23重鎖CDR2（SEQ ID NO: 30）
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130M23重鎖CDR3（SEQ ID NO: 31）
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130M23軽鎖CDR1（SEQ ID NO: 32）
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130M23軽鎖CDR2（SEQ ID NO: 33）
WASTRHT
130M23軽鎖CDR3（SEQ ID NO: 34）
QQHYSTP
130M23重鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 35）
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130M23軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 36）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有する130M23重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 37）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有する130M23軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 38）
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130M23重鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 39）
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130M23軽鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 40）
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予測シグナル配列を有しない130M23重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 41）
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予測シグナル配列を有しない130M23軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 42）
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予測シグナル配列を有しないヒトRSPO2タンパク質配列（SEQ ID NO: 43）
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ヒトRSPO2アミノ酸22〜205（SEQ ID NO: 44）
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ヒトRSPO2フューリン様ドメイン1（SEQ ID NO: 45）
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ヒトRSPO2フューリン様ドメイン2（SEQ ID NO: 46）
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ヒトRSPO2トロンボスポンジンドメイン（SEQ ID NO: 47）
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予測シグナル配列を有しないヒトRSPO3タンパク質配列（SEQ ID NO: 48）
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ヒトRSPO3フューリン様ドメイン1（SEQ ID NO: 49）
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ヒトRSPO3フューリン様ドメイン2（SEQ ID NO: 50）
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ヒトRSPO3トロンボスポンジンドメイン（SEQ ID NO: 51）
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h89M5-H2L2重鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 52）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有するh89M5-H2L2重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 53）
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h89M5-H2L2重鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 54）
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h89M5-H2L2重鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO: 55）
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h89M5-H2L2軽鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 56）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有するh89M5-H2L2軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 57）
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h89M5-H2L2軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 58）
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h89M5-H2L2軽鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO: 59）
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h130M23-H1L2重鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 60）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有するh130M23-H1L2重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 61）
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h130M23-H1L2重鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 62）
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h130M23-H1L2重鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO: 63）
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h130M23-H1L2軽鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 64）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有するh130M23-H1L2軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 65）
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h130M23-H1L2軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 66）
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h130M23-H1L2軽鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO: 67）
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予測シグナル配列を有しないh89M5-H2L2重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 68）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有しないh89M5-H2L2軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 69）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有しないh130M23-H1L2重鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 70）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有しないh130M23-H1L2軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 71）
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h130M23-H1L6軽鎖ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 72）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有するh130M23-H1L6軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 73）
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下線が引かれた予測シグナル配列を有しないh130M23-H1L6軽鎖アミノ酸配列（SEQ ID NO: 74）
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h130M23-H1L6軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 75）
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h130M23-H1L6軽鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO: 76）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2014524746.tif 000122
【図１Ｃ】
2014524746.tif 000123
【図２】
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【図３】
2014524746.tif 000125
【図４】
2014524746.tif 000126
【図５】
2014524746.tif 000127
【図６】
2014524746.tif 000128
【図７】
2014524746.tif 000129
【図８】
2014524746.tif 000130
【図９】
2014524746.tif 000131
【図１０】
2014524746.tif 000132
【図１１】
2014524746.tif 000133
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
2014524746.tif 000137
【図１４】
2014524746.tif 000138
【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2014524746.tif 000141
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2014524746.tif 000144
【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月17日(2014.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014524746.tif 000216