(57)【要約】  本発明は、ａ）酵母を自己消化させるステップと；ｂ）自己溶解物を固体／液体分離させ、可溶性画分を回収するステップとを含んでなり、１０ステップｂ）の固体／液体分離が、５．１未満であるが１を上回るｐＨで行われる、本酵母抽出物を製造する方法について記載する。発明の方法は簡単であり、高収率を有して、低濁度の酵母抽出物をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）酵母を自己消化させるステップと；
ｂ）自己溶解物を固体／液体分離させ、可溶性画分を回収するステップと
を含んでなり、ステップｂ）の固体／液体分離が５．１より低く１．０より高いｐＨで行われる、酵母抽出物を製造する方法。
【請求項２】
ステップｂ）のｐＨが４．２以下で１．０よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）中のｐＨが３．５以下で１．０よりも高い、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨが２．０よりも高い、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）の回収が遠心分離によって行われる、請求項１〜４の何れか１つに記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）の後に、
ｃ）ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換するステップを含んでなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）の後に、
ｄ）その他の可溶性材料から５’−リボヌクレオチドを分離するステップを含んでなる、請求項６の何れか一つに記載の方法。
【請求項８】
５％の乾物含量で測定された酵母抽出物の濁度が、３０ＮＴＵ未満であることを特徴とする、酵母抽出物。
【請求項９】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法によって得られる、請求項９に記載の酵母抽出物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、酵母抽出物を製造する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
酵母抽出物は、スープ、クリスプ、チップ、（加工）肉などの、あらゆる種類の塩味食品用途における風味を改善し又は増強するために、一般に食品工業で使用される。
【０００３】
Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘは、「酵母抽出物」を次のように規定する：「酵母抽出物は酵母細胞の水溶性成分を含んでなり、その組成物は、主にアミノ酸、ペプチド、炭水化物、及び塩である。酵母抽出物は、食用酵母中に存在する天然酵素による、又は食品等級酵素の添加による、ペプチド結合の加水分解を通じて生成される」。対照的に、同じＦｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘは、「自己溶解酵母」を「食品等級酵母から得られる、濃縮、非抽出、部分的可溶性消化物。可溶化は、酵母細胞の酵素加水分解又は自己消化によって達成される。食品等級の塩及び酵素が、添加されてもよい。自己消化酵母は、酵母細胞全体に由来する可溶性及び不溶性成分の双方を含有する。これは、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、脂肪、及び塩で主に構成される」と規定する。従って酵母自己溶解物は、酵母抽出物中に存在する全ての興味深い成分に加えて、可溶性画分から分離されない興味深い細胞壁成分もまた含有することから、酵母自己溶解物は「酵母抽出物」と異なる。
【０００４】
酵母抽出物は、一般に、
ａ）酵母を自己消化させるステップと；
ｂ）自己溶解物を固体／液体分離させ、液体画分を回収するステップと
によって生成される。
【０００５】
通常このような工程は、発酵の終わりに酵母細胞収穫後、廃液を除去する、即ち発酵残渣を除去することで、得られるクリーム酵母から始める。次に細胞が破壊されて内容物が放出されるように、クリーム酵母中の酵母細胞を処理する。これは一般に、２つの異なる過程よって行われ、自己分解酵母抽出物又は加水分解酵母抽出物の何れかがもたらされる。
【０００６】
自己分解酵母抽出物は、細胞破壊とポリマー酵母材料の消化（溶解）後に、酵母から得られる可溶性材料濃縮物である。細胞破壊後、培地中に放出される活性酵母酵素が、溶解の原因である。自己分解過程中に、天然ＲＮＡは分解又は変性して、５’−リボヌクレオチドに分解されず又は殆ど分解されない形態になるため、一般にこれらのタイプの酵母抽出物は５’−リボヌクレオチドを含まない。アミノ酸に富むこれらのタイプの酵母抽出物は、基本的味覚提供物として食品工業で使用される。酵母抽出物中に存在するアミノ酸は、食品に、ブイヨン様の肉汁味を付加する。
【０００７】
他方、加水分解酵母抽出物は、細胞破壊、消化（溶解）、及び溶解中の酵母懸濁液へのプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼ、特にヌクレアーゼの添加後に、酵母から得られる可溶性材料の濃縮物である。天然酵母酵素は、溶解に先だって、一般に熱ショックによって不活性化される。
【０００８】
当該技術分野で公知の方法によって得られる酵母抽出物の問題は、溶解時にそれらが濁る場合もあることで、それは澄んだスープなどの用途で不都合になり得る。この濁りの可能な解決策は、限外濾過又は精密濾過などの追加の濾過段階を適用することである。しかしこれは、追加的な工程段階を要するために不経済なだけでなく、濁度を引き起こす物質がフィルターに残留して廃棄されるために、損失もまたもたらす。
【０００９】
簡単であり、乾燥物質を基準にして高収率である、低濁度酵母抽出物を製造する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
［発明の詳細な説明］
第１の態様では、本発明は、
ａ）酵母を自己消化させるステップと；
ｂ）自己溶解物を固体／液体分離させ、可溶性画分を回収するステップとを含んでなる、酵母抽出物を製造する方法を提供し、
ステップｂ）の固体／液体分離は、５．１より低く１．０より高いｐＨで行われる。
【００１１】
本発明の文脈で、ステップｂ）で得られる「回収可溶性画分」は、酵母抽出物である。従って本明細書全体を通じて、「ステップｂ）で得られる回収可溶性画分」という用語は、「ステップｂ）で得られる酵母抽出物」と同じ意味を有する。
【００１２】
本発明の文脈で、酵母の「自己消化」は、酵母細胞壁を（部分的に）損傷及び／又は破壊した後に培地中に放出される活性天然酵母酵素によって、酵母細胞及びポリマー酵母材料の分解が少なくとも部分的にもたらされる過程と定義される。
【００１３】
好ましい酵母の例は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する株、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する株が、最も望ましい。
【００１４】
本発明の方法で使用される酵母は、当該技術分野で公知の任意の適切な発酵プロセスによって調製されてもよい。酵母バイオマスは、本方法での使用に先だって、例えば遠心分離又は濾過によって濃縮されてもよい。例えばクリーム酵母（１５〜２７％ｗ／ｗの乾物含量に濃縮されているパン用酵母）を使用してもよい。任意選択的に、ビール醸造に由来するビール酵母又は残留酵母（消耗ビール酵母）を含んでなる、発酵ブロスを使用してもよい。
【００１５】
本発明は、酵母抽出物の大規模製造に、特に適する方法を提供する。大規模とは、１０ｍ３を上回る発酵槽中で実施される発酵を意味する。
【００１６】
自己分解過程は、酵母細胞壁を損傷及び／又は部分的に破壊することで開始される。このようにして細胞は部分的に開き、少なくとも細胞内容物のいくらかが放出される。酵母細胞壁を損傷及び／又は部分的に破壊するために、当業者に知られている方法を使用して、細胞を化学的、機械的又は酵素的に処理する。
【００１７】
機械的処理としては、均質化技術が挙げられる。この目的で、高圧ホモジナイザーを使用できる。その他の均質化技術としては、例えば砂及び／又はガラスビーズなどの粒子との混合、又は製粉装置（例えばビーズミル）の使用が挙げられ得る。
【００１８】
化学的処理としては、塩、アルカリ及び／又は１つ又は複数の界面活性剤又は洗剤の使用が挙げられる。化学的処理は、特にアルカリを使用した場合に、２’−リボヌクレオチド及び３’−リボヌクレオチドの結果的な形成がある、ＲＮＡの部分的分解をもたらすこともあるので、好ましさに劣る。
【００１９】
発明者らは、ステップｂ）の回収におけるｐＨが５．１より低く１．０より高い場合に、非常に低い濁度を有する酵母抽出物（即ち非常に透明な酵母抽出物）が生成する場合もあることに気付いた。
【００２０】
「ｃｌｏｕｄｉｎｅｓｓ（混濁）」又は「ｈａｚｉｎｅｓｓ（濁り）」とも称される「ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ（濁度）」は、典型的に液体中の懸濁粒子によって引き起こされる。当業者は、濁度をどのように測定するかを知っている。濁度を測定する適切な方法は、実施例１に記載される。本明細書全体を通じて、「透明な酵母抽出物」及び「低濁度を有する酵母抽出物」という用語は、同じ意味を有すると理解される。
【００２１】
一実施形態では、ステップｂ）の固体／液体分離中のｐＨは、５．１より低く、好ましくは４．５以下、より好ましくは４．２以下、なおもより好ましくは４．０以下、最も好ましくは３．５以下であり、又は１．０より高い。好ましいｐＨ範囲は、１．０〜５．０又は１．０〜４．５又は１．０〜４．２又は１．０〜３．５及び２．０〜５．１又は２．０〜４．５又は２．０〜４．２である。最も望ましいのは、２．０〜３．５のｐＨ範囲である。
【００２２】
ステップｂ）の固体−液体分離は、好ましくは通常の固体−液体分離法によって、好ましくは遠心分離又は濾過によって行われる。遠心分離が使用される場合、可溶性画分は上清として回収され得る。
【００２３】
好ましい実施形態では、ステップｂ）の固体−液体分離は遠心分離によって行われる。遠心分離の使用は、特に方法が大規模に実施される場合に、経済的に有利である。
【００２４】
本発明の方法では、自己分解過程で使用される条件は、好ましくはＲＮＡのかなりの部分が、５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままであるような条件である。
【００２５】
「５’−リボヌクレオチド」という用語は、５’−ＧＭＰ、５’−ＣＭＰ、５’−ＵＭＰ、及び更に５’−ＡＭＰ及び／又は５’−ＩＭＰの混合物を意図し、前記５’−ＡＭＰは、部分的に又は完全に５’−ＩＭＰに変換されてもよい。用語「５’−リボヌクレオチド」は、遊離５’−リボヌクレオチドならびにその塩を包含する。
【００２６】
この文脈で、「ＲＮＡのかなりの部分」は、全てステップｂ）に先だつＲＮＡ総量を基準にして、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、７５％、なおもより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも８３％を意味する。５’−リボヌクレオチドに分解できる高い量のＲＮＡは、有利には、非常に低い濁度を有する酵母抽出物をもたらしてもよい。ＲＮＡは、自己分解過程中に完全に無傷のままである必要はないが、少なくともＲＮＡのかなりの部分は、５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままであるべきである。一般に最高１００％のＲＮＡが、５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままであってもよい。「５’−リボヌクレオチドに分解できる形態」は、ＲＮＡが適切な酵素によって、５’−リボヌクレオチドに変換できる形態であるべきことを意味する。好ましくは適切な酵素は、５’−リン酸ジエステラーゼ（５’−Ｆｄａｓｅ）である。
【００２７】
５’−リボヌクレオチドに分解できるＲＮＡの形態は、少なくとも２つのリボヌクレオチド単位を含有するオリゴヌクレオチドを含んでなる。従って５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のＲＮＡは、無傷のＲＮＡと、異なる長さのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとを含んでなる混合物からなってもよい。本発明の文脈では、オリゴヌクレオチドは、２〜１０個のリボヌクレオチド単位を含んでなる一方、ポリヌクレオチドは、１０個のリボヌクレオチド単位を上回る単位を含んでなる。
【００２８】
自己分解過程中に、５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままであるＲＮＡの百分率は、ａ）自己消化とＲＮＡの５’−リボヌクレオチドへの変換とに関与する酵素の不活性化後に、自己溶解物中で測定された５’−ＧＭＰの重量百分率（その二ナトリウム七水和物として塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にして計算）、及びｂ）ＲＮＡのアルカリ加水分解完了後に、出発原料中で測定されたＧＭＰの重量百分率（その二ナトリウム七水和物として塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にして計算）の比率（×１００）と定義される。アルカリ加水分解後に、出発原料中で測定されたＧＭＰの重量百分率（その二ナトリウム七水和物として塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にして計算）は、遊離ＧＭＰ（塩化ナトリウム非含有乾燥物質基準）の対応する重量百分率から、後者に因数１．４７を乗じることで判定し得る。自己溶解物中の５’−ＧＭＰ量及び塩基性加水分解後のＧＭＰ量を判定する方法は、実施例１に記載される。５’−ＧＭＰの量を判定するのに使用される方法はまた、必要ならば、十分に当業者の知識の範囲内であるいくらかの改変を加えて、５’−ＩＭＰ、５’−ＡＭＰ、５’−ＣＭＰ、及び５’−ＵＭＰの量を判定するのに使用し得る。
【００２９】
それによって過程のより良い制御が達成され得ることから、またこの方法が大規模使用に特に適することから、酵母細胞壁の損傷及び／又は部分的破壊は、好ましくは酵素的に行われる。セルラーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ及び／又はペクチナーゼなどのいくつかの酵素製剤を使用し得る。好ましくはプロテアーゼが使用され、より好ましくはエンドプロテアーゼが使用される。自己分解過程を開始するのに使用される条件は、使用される酵素タイプに左右され、当業者によって容易に判定され得る。一般に、酵母細胞壁を酵素的に損傷及び／又は破壊するのに使用される条件は、酵母の自己消化中に適用されるものに相当する。
【００３０】
酵母の自己消化は、酵母細胞壁の（部分的）損傷及び／又は破壊後に、溶液中に放出された天然酵母酵素の活性によって少なくとも部分的にもたらされ、損傷及び／又は破壊酵母細胞壁に添加された化学物質、又はより好ましくは酵素が、酵母細胞及びポリマー酵母物質の分解に寄与してもよい。
【００３１】
特に自己消化の第１段階は、特定温度と組み合わされた特定ｐＨ範囲で実施される。
【００３２】
例えばステップｂ）で、ＲＮＡのかなりの部分が５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままであることを確実にし、及び／又は回収可溶性画分の濁度が低下するように、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の自己消化に適用される条件は、自己消化の第１段階のｐＨが４．５〜９であり、及び／又は温度が５０〜６５℃である。好ましくは自己消化の最初の８時間、より好ましくは自己消化の最初の４時間は、ｐＨ４．５〜５．５及び温度５７〜６５℃、又はｐＨ５．５〜９及び温度５０〜６５℃で実施される。
【００３３】
第１段階後に維持される自己消化条件は、それほど重要でない。第１段階後、ｐＨは一般に４〜１０に保たれ、温度は一般に４０℃〜７０℃に保たれる。しかし好ましくは第１段階後に、ｐＨは５．１未満であり、好ましくは第１段階後にｐＨは４．５以下であり、より好ましくは４．２以下、なおもより好ましくは４．０以下、最も好ましくは３．５以下である。一般に、第１段階を含む自己分解過程の長さは、最大２４時間である。
【００３４】
本発明は、ステップａ）において、ＲＮＡのかなりの部分が５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままである条件下で、酵母に加水分解を実施する方法もまた包含してよい。本発明の文脈で「酵母の加水分解」は、天然酵母酵素が活性化されて、適切な外来性酵素が酵母バイオマスに添加され、酵母細胞及びポリマー酵母材料の分解をもたらす方法と定義される。
【００３５】
自己消化後に、酵母細胞壁画分、かなりの部分が５’−リボヌクレオチドに分解できる形態であってもよいＲＮＡ、及び可溶性細胞成分（例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物など）を含んでなる懸濁液（自己溶解物）が得られる。細胞壁画分は、不溶性細胞残渣、特に細胞壁又はその断片を含んでなる。
【００３６】
自己分解過程の終了時、ステップｂ）の前に、酵母細胞壁を損傷及び／又は部分的に破壊するのに使用された化学物質、及び／又は自己分解過程に関与した酵素は、好ましくは中和及び／又は不活性化されるべきである。自己消化に関与した酵素は、天然酵母酵素であり、任意選択的に自己分解過程を開始するために使用される、あらゆる添加された外来性酵素である。化学物質及び／又は酵素の中和及び／又は不活性化は、ＲＮＡのかなりの部分が、５’−リボヌクレオチドに分解できる形態のままである条件下で起きるべきである。自己消化に関与した酵素の不活性化は、ｐＨ処理によって、又は好ましくは加熱処理によって成し得て、それによって酵素が不活性化される。酵素は、例えば混合物を６５℃〜９５℃の温度で５分間〜１時間加熱することで、より好ましくは６５℃〜７５℃の温度で３０分間〜１時間加熱することで、加熱処理によって不活性化され得て、典型的により高い反応温度でより短い反応時間を使用してもよい。例えば酵素を不活性化するのに、混合物を６５℃で１時間、又は７５℃で３０分間の加熱が十分な場合もある。
【００３７】
本発明の方法のステップｂ）で、自己溶解物に固形／液体分離を実施してＲＮＡ含有細胞壁画分を回収し、その最中のｐＨは５．１より低く、好ましくは４．５以下、より好ましくは４．２以下、なおもより好ましくは４．０以下、最も好ましくは３．５以下であり、１．０より高い。好ましいｐＨ範囲は、１．０〜５．０又は１．０〜４．５又は１．０〜４．２又は１．０〜３．５及び２．０〜５．１又は２．０〜４．５又は２．０〜４．２である。最も望ましいのは、２．０〜３．５のｐＨ範囲である。この固体／液体分離では、主に細胞壁からなる固体画分を可溶性画分から分離する。
【００３８】
一実施形態では、ステップｂ）では、全ＲＮＡの少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％は、細胞壁画分と結合したままである。実施例２は、自己溶解物中の全ＲＮＡの最高９４．７％が、細胞壁画分に結合したままであることを実証する。実施例２ではまた、酵母細胞壁に結合するＲＮＡ百分率と、酵母抽出物の濁度とが、固体／液体分離中のｐＨの関数であることも実証される。より低いｐＨ価では、より多くのＲＮＡが細胞壁に結合したままであり、酵母抽出物の濁度が低下する。
【００３９】
ＲＮＡ総量（即ちステップｂに先だつ）は、ステップａ）で得られる自己溶解物を分析することで判定され得る。ＲＮＡを分析する方法は、実施例１に記載される。
【００４０】
細胞壁画分に結合する高い量のＲＮＡは、低濁度を有する酵母抽出物をもたらす場合もある。
【００４１】
細胞壁画分に結合したままであるＲＮＡの百分率は、ａ）固定量の出発原料から生じる自己溶解物の細胞壁画分中のＲＮＡのグラム量、及びｂ）同一固定量の出発原料中に存在するＲＮＡのグラム量の比率（×１００）と定義される。細胞壁画分中及び出発原料中のＲＮＡ量を判定する方法は、実施例１に記載される。
【００４２】
ステップｂ）の回収可溶性画分の濁度を低下させるために、自己溶解物に、遠心分離又は濾過などの通常の固体−液体分離法の代わりに、限外濾過（ＵＦ）を実施してもよい。一般により大きな分画分子量は、メンブランを通過するより高い流速を可能にするが、より大きな損失及び／又は純度がより低い生成物をもたらし得る。使用される固体−液体分離のタイプ及び前記固体−液体分離の効率は、いくつかある要素の中で特に、本発明の方法のステップｂ）の回収可溶性画分中の塩、炭水化物、アミノ酸、及びタンパク質量に影響を及ぼし得る。
【００４３】
一実施形態では、本発明の方法は、ステップｂ）の後に、ｃ）ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換するステップを含んでなる。
【００４４】
５’−リン酸ジエステラーゼ（５’−Ｆｄａｓｅ）が好ましくは使用されて、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに変換する。５’−リン酸ジエステラーゼは、微生物又は植物性原料（例えば麦芽根抽出物）から得られ得る。市販される微生物５’−Ｆｄａｓｅの一例は、アマノ（日本）によって製造される酵素ＲＰ−１である。
【００４５】
任意選択的に、５’−ＡＭＰは、例えばアデニルデアミナーゼなどのデアミナーゼによって、５’−ＩＭＰに変換される。市販されるデアミナーゼの一例は、アマノ（日本）によって製造されるデアミナーゼ５００である。
【００４６】
５’−Ｆｄａｓｅ及びデアミナーゼによるＲＮＡの処理は、二段階で又は一段階工程で実施され得る。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法はステップｃ）の後に、
ｄ）好ましくは遠心分離又は濾過によって、その他の可溶性物質から、５’−リボヌクレオチドを分離するステップを含んでなる。これによって、非常に低い濁度を有する酵母抽出物と、全て全乾燥物質を基準にして、例えば最高９０％ｗ／ｗ、９５％ｗ／ｗ、又は９８％ｗ／ｗ又は９９％ｗ／ｗなどにさえ至る高い量の５’−リボヌクレオチドとが得られるようになる。
【００４８】
本発明の方法は、いくつかの利点を有する。それは低濁度を有する酵母抽出物の製造を可能にし、またそれは２つのステップのみを含んでなってもよいので、非常に簡単である。それはまた、ＲＮＡに富んだ細胞壁画分の製造を可能にし、それを引き続いて５’−リボヌクレオチドに変換し得て、その５’−リボヌクレオチドを精製して細胞壁画分を形成し、非常に純粋な５’−リボヌクレオチド画分をもたらしてもよい。このようにして、ＲＮＡに富んだ細胞壁画分、及び／又は５’−リボヌクレオチドに富んだ細胞壁画分、及び／又は非常に純粋な５’−リボヌクレオチドを含有する画分に加えて、非常に透明な酵母抽出物を製造してもよい。
【００４９】
第２の態様では、本発明は、５％の乾物含量で測定された酵母抽出物の濁度が、３０ＮＴＵ未満であることを特徴とする、酵母抽出物を提供する。好ましくは、本発明の方法によって酵母抽出物が得られる。
【００５０】
ここで、限定的であることは意図されないいくつかの実施例によって、本発明を例証する。
【００５１】
［実施例］
［実施例１］
［低濁度酵母抽出物の調製］
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの２リットルのクリーム酵母を６０℃に加熱した。引き続いて０．５ｍｌのＡｌｃａｌａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから市販されるセリンプロテアーゼ）を添加して、混合物をｐＨ６．０及び６０℃で４時間インキュベートした。条件をｐＨ５．１及び５１．５℃に調節して、更に２ｍｌのＡｌｃａｌａｓｅを反応混合物に添加した。混合物をｐＨ５．１及び５１．５℃で２０時間インキュベートした。次に混合物又は自己溶解物を６５℃で１時間加熱して、全ての酵素活性を不活性化した。
【００５２】
自己溶解物のＲＮＡ含量は、全乾燥物質を基準にして８．７％ｗ／ｗであった。自己溶解物の一部を５’−リン酸ジエステラーゼで処理して、塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にして、二ナトリウム七水和物として表される２．６５％ｗ／ｗ量の５’−ＧＭＰをもたらした。５’−リボヌクレオチドに分解できたＲＮＡの画分は、８３％（ｗ／ｗ）であったということになる。
【００５３】
自己溶解物のその他の部分には、５．１（比較実験）、４．２（実験１）、又は３．５（実験２）の何れかｐＨでの遠心分離の手段によって、第１の固体／液体分離を実施した。更なるｐＨ調節なしに細胞壁画分を収集して水で２回洗浄し、ＲＮＡ含量について分析した。水を添加することで、（上清としての）透明抽出物を１３％又は２．５％の何れかの乾物含量に調節し、引き続いて濁度について分析した。
【００５４】
細胞壁画分は、６５℃の温度及びｐＨ５．３において、５’−リン酸ジエステラーゼで更に処理した。次に５５℃の温度及びｐＨ５．１で、酵素デアミナーゼによって５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに変換した。５’−リン酸ジエステラーゼ及びデアミナーゼ双方の処理後、遠心分離によって細胞壁画分に第２の固体／液体分離を実施して、透明画分を５’−リボヌクレオチド含量について分析した。
【００５５】
サンプル中に存在するＲＮＡが５’−リボヌクレオチドに変換し得るかどうか（即ちＲＮＡが、例えば５’−Ｆｄａｓｅによって５’−リボヌクレオチドに分解できる形態にあるかどうか）を確立するために、いくつかのサンプルはまた５’−Ｆｄａｓｅと共にインキュベートされ、これらのサンプルのいくつかはまたデアミナーゼで処理されて、５’−ＡＭＰが５’−ＩＭＰに変換された。サンプル中の５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰ、及び５’−ＩＭＰの量（塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にしてその二ナトリウム七水和物の重量百分率として表される）を引き続いて、以下の方法に従ってＨＰＬＣによって判定した。酵母抽出物中の５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰ、及び５’−ＩＭＰは、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ  １０−ＳＡＸカラム、溶出剤としてリン酸緩衝液ｐＨ３．３５、及びＵＶ検出を使用して、ＨＰＬＣによって定量化した。５’−ＧＭＰ、５’−ＩＭＰ、及び５’−ＡＭＰ標準に基づいて、濃度を計算した。塩化ナトリウムは、Ｊｅｎｗａｙ塩化物計ＰＣＬＭ  ３（Ｊｅｎｗａｙ，Ｅｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によって、サンプル中の塩化物イオンを測定し、相当する塩化ナトリウム量を計算して判定した。
【００５６】
【表１】
2014505485.tif 000002
【００５７】
ＲＮＡは、次のように分析された：ＲＮＡは、アルカリ処理中に加水分解された。Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ  １０−ＳＡＸカラム、溶出剤としてｐＨ３．３５のリン酸緩衝液、及びＵＶ検出を使用し、標準として５’−ＧＭＰを使用して、ＧＭＰ（即ちＲＮＡの加水分解から生じる２’−ＧＭＰ及び３’−ＧＭＰ）をＨＰＬＣによって定量化した。塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にしたＲＮＡ含量の重量百分率は、塩化ナトリウム非含有乾燥物質を基準にした遊離ＧＭＰの重量百分率の約４倍に相当する。
【００５８】
濁度は、温度２０°Ｃで、タングステンランプ（４００〜６００ｎｍ）装着ＨＡＣＨ  ２１００  Ｎ濁度計（Ｈａｃｈ−Ｌａｎｇｅ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた比濁分析によって判定された。
【００５９】
［実施例２］
［ｐＨの関数としての細胞壁と上清の間のＲＮＡ分配］
２．０〜５．０１の範囲にわたるｐＨ価で、実施例１の実験を繰り返した。濁度を分析する前に、水添加によって透明抽出物（上清）を５％の乾物含量に調節したこと以外は、全ての条件は同一であった。また細胞壁画分中のＲＮＡは、５’−Ｆｄａｓｅによって消化されなかった。
【００６０】
【表２】
2014505485.tif 000003
【国際調査報告】
2014505485.tif 000004
2014505485.tif 000005