(57)【要約】  本発明は、癌を処置するために使用できる医薬を製造するための、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ酵素（ＰＡＰ）を阻害する化合物およびそれらの組み合わせの使用に関する；ＰＡＰ阻害剤は、エンドサイトーシスを誘導し、かくしてそれらが癌の生存および進行を促進する刺激に接近できないようにすることにより、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、その発癌性変異体およびＥｒｂＢファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を阻止するために使用される；本発明の一部であるＰＡＰ阻害剤は、他の臨床目的で現在使用されている、陽イオン性両親媒性分子であること以外は無関係である薬物を含む；これらには、他の臨床目的で使用される薬物である、プロプラノロール、デシプラミンおよびクロルプロマジンが含まれる；本発明は、スフィンゴシンおよびブロモエノールラクトン、並びに、将来的に発見され得る新たな阻害剤も含む、すべてのＰＡＰ阻害剤を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置に有用な医薬を製造するためのそれらの有用性を特徴とする、酵素ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）の阻害剤の使用。
【請求項２】
癌が、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に依存することを特徴とする、請求項１に記載のＰＡＰ阻害剤の使用。
【請求項３】
ＥＧＦＲが、すべての発癌性変異体および他のＥｒｂＢファミリーのメンバー／ＨＥＲを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＡＰ阻害剤の使用。
【請求項４】
ＰＡＰ阻害剤が、プロプラノロール、デシプラミン、クロルプロマジン、スフィンゴシンおよびブロモエノールラクトンから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＰＡＰ阻害剤がプロプラノロールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
ＰＡＰ阻害剤がプロプラノロールのラセミ混合物から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
ＰＡＰ阻害剤がＤ−プロプラノロールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ＰＡＰ阻害剤が単独で、または、他のＰＡＰ阻害剤と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ＰＡＰ阻害剤のプロプラノロールがデシプラミンと組み合わせて選択されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＰＡＰ阻害剤が、デシプラミンと組み合わせたＤ−プロプラノロールから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に依存する癌が、頭頸部、結腸、卵巣、肺、乳房、前立腺、胃、肝臓の癌および／または神経膠芽腫から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
ＰＡＰ阻害剤が単独で、または、ＰＡＰの阻害とは異なる経路を介してＥＧＦＲを阻害する他の薬物と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
ＰＡＰ阻害剤が単独で、または、放射線療法または外科手術などの他の処置と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単独の化合物またはそれらの組合せとしてのホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）酵素（リピンズ（Lipins）１−３およびＬＰＰ１−３）（１）の阻害剤の、癌の処置に有用な医薬製剤のための使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、その発癌性変異体およびチロシンキナーゼ受容体のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を妨害するために、ＰＡＰ阻害剤を利用し、それらのエンドサイトーシスを誘導し、かくして癌の進行を促進する刺激にそれらが接近できないようにすることを提唱する。
【０００３】
本発明のＰＡＰ阻害剤には、陽イオン性両親媒性分子である（７−１０）ことを除き、それらの間には関連のない他の臨床目的で以前に使用された薬物が含まれる。本発明は、全ての既知のＰＡＰ阻害剤および全ての将来発見されるものを包含する。
【０００４】
本発明のある具体例は、単独で、または、デシプラミンと組み合わせて使用されるＤ−プロプラノロールに相当し、これらは、両者ともＰＡＰ阻害剤として記載されたものである（９）。ラセミ混合物中でそのエナンチオマーのＬ−プロプラノロールと組み合わされたＤ−プロプラノロールは、プロプラノロール（１１,１２）として知られている薬物を構成し、それは、高血圧および他の心血管障害の処置に使用される一般的なベータ−ブロッカーである（１３）。しかしながら、Ｌ−プロプラノロールのみが、ベータ−アドレナリン受容体のブロッカー（ベータ−ブロッカー）として有用であり、それは、抗高血圧効果を担う活性である。Ｄ−プロプラノロールは、Ｌ−プロプラノロールよりも６０−１００倍活性が低いので、プロプラノロールの臨床的用量ではベータ−ブロッカー活性を欠く（１１,１２）。高用量のＤ−プロプラノロールは、ヒトにおけるベータ−アドレナリンの遮断から独立した不整脈の処置のために、過去に実験的に使用された（１４）。デシプラミンもＰＡＰ阻害活性を有するが（７,１５）、現在、ノルエピネフリンの再取り込みを阻害し、それより低い程度でセロトニンの再取り込みも阻害する三環系抗うつ剤として、医院で使用されている（１６）。
【０００５】
本発明は、両方ともＰＡＰ活性のブロッカーとして使用されるＤ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せが、ＥＧＦＲまたはその発癌性変異体、例えば、肺癌で抗ＥＧＦＲ薬に耐性のものとして同定された発癌性突然変異ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ（１７）、および、神経膠芽腫において悪性度の高い癌遺伝子として最初に記載された切断型ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体（１８）に依存する癌細胞の進行を阻害し、その死滅を引き起こすのに有用であることを立証する。
【０００６】
従って、本発明は、Ｄ−プロプラノロールと組み合わせて使用されてもよい、以前に他の臨床目的で使用された既知の薬物の第二の用途に相当する。本発明は、また、ベータ−ブロッカー活性を欠くプロプラノロールの類似体などの、将来的に発見または合成され得る任意の他の種類のＰＡＰ阻害剤も含む。単独の薬物としての、または、現在知られているＰＡＰ阻害剤並びに新しく生じるＰＡＰ阻害剤と組み合わせたＤ−プロプラノロールは、単独で、または、それらの間で、もしくは、ホルモン、抗体および化学療法で使用される薬物を含む、別個の作用メカニズムを有する抗腫瘍薬と組み合わせて、使用できる。
【０００７】
本発明のＰＡＰ阻害剤は、また、他のＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２の機能に干渉する薬物（１９,２０）と同様に、外科手術および放射線療法を含む他の種類の処置と、同時にまたは後で組み合わせて使用できる。ＰＡＰ阻害剤は、化学療法またはＥＧＦＲおよびその発癌性変異体の機能の遮断を対象とする薬物を補足するものとして作用するのみならず（４,２１）、癌の処置にありがちな問題である、癌細胞がＥＧＦＲに対して現在使用されている薬物に対する耐性を発達させた場合に、唯一利用できる治療でもあり得る（１７,２２）。
【０００８】
本発明は、頻繁なＥＧＦＲ（過剰発現または突然変異）またはそのファミリーのメンバーであるＥｒｂＢ２／Ｎｅｕの発癌性変化を示すことが多い、頭頸部、結腸、肺、乳房、前立腺、胃、肝臓由来のものおよび神経膠芽腫などの癌の処置に、新しい可能性を開く。
【０００９】
本発明の分野
本発明は、以下の分野を包含する：
１）癌の病原性の決定要因である、ＥＧＦＲおよびそのチロシンキナーゼ受容体のファミリーのメンバー（ＥｒｂＢ／ＨＥＲ）の発癌性シグナル伝達機能を伴うことが多い癌細胞の生物学。そのような変化は、腫瘍細胞の攻撃性および悪性度を増強し、また、それらの増殖、生存および転移段階への進行に決定的であり、従って、本発明により提唱されるように、新規の抗癌戦略の設計に有効な標的をもたらす；
２）ＥＧＦＲおよびそのＥｒｂＢ／ＨＥＲ１−４ファミリーの他のメンバーの正常および病的機能において決定的な役割を果たす、細胞内輸送；
３）本発明における立証は、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスの挙動の調節に関与し、本発明の基礎のひとつを構成するので、ほぼ未知であったＰＡ／ＰＫＡ（ホスファチジン酸／タンパク質キナーゼＡ）シグナル伝達経路の機能。
４）癌の処置のためのＰＡＰ阻害剤の使用。これは、以前に提唱されていない。
５）既知であり、ＰＡＰ阻害とは別個の作用メカニズムに基づいて他の臨床目的で使用されてきた薬物の第二の用途。例えば、Ｄ−プロプラノロールは、不整脈の処置に実験的に使用されてきて、一方、デシプラミンの現在の用途は、ノルアドレナリン再捕捉のブロッカーとしての抗うつ的処置である。
【００１０】
本発明の基礎は、ＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路について発見された新規の機能およびＥＧＦＲの細胞表面レベルを決定する新規の調節メカニズムと絡み合う、すべてのこれらの分野を含む。これらの調節メカニズムは、エンドサイトーシスによるＥＧＦＲの細胞表面からの除去を誘導し、かくして、様々な外的刺激による活性化へのその利用可能性を低下させることを目的する薬理的操作の影響を受けやすい。
【００１１】
本発明は、エンドサイトーシスによる細胞表面からのＥＧＦＲの除去の誘導、並びに、活性化されたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲとヘテロ二量体を形成する他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーも含む）の細胞内輸送／シグナル伝達の撹乱に基づく新規の抗癌治療を設計するための、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンなどのＰＡＰ阻害剤および元々は他の目的で使用された他の薬物の使用にある。この戦略は、低分子薬で以前に使用されていない。
【００１２】
本発明の利点
本発明は、ＥＧＦＲに依存するか、または、ＥｒｂＢ／ＨＥＲに依存する癌の進行を低減するために現在使用されているものとは別個の戦略を提唱する。癌におけるこれらのチロシン−キナーゼ受容体の発癌性の役割に干渉するために、既に臨床使用されている薬物および研究中の薬物は、受容体またはそのリガンドの分子に対して向けられている。これらの薬物は、外部のリガンド（ＥＧＦ、ＥＧＦ−ＨＢなど）との受容体相互作用を妨害し、受容体のエンドサイトーシスを増やし、免疫エフェクター細胞による認識を促進するヒト化モノクローナル抗体（例えばセツキシマブおよびパニツブマブ）、または、細胞内チロシン−キナーゼ活性を妨害する低分子薬（例えばエルロチニブおよびゲフィチニブ）のからなる（２−５）。両戦略は、活性化されたＥＧＦＲからの発癌性シグナルの生成を減少させる。対照的に、本発明で提唱される化合物は、直接的な標的として、ＥＧＦＲの分子ではなく、代わりに、エンドサイトーシスの機構を介して、その細胞表面到達性およびシグナル伝達の場所の制御に関与する分子を有する。
【００１３】
本発明は、エンドサイトーシスを介するＥＧＦＲの細胞表面からの除去を誘導し、活性化ＥＧＦＲのシグナル伝達に決定的に関与する細胞内輸送を撹乱するための戦略として、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）活性の妨害を提唱する（５６−６０）。そのような戦略は、癌細胞で変化したシグナル伝達経路に主に対抗することに向けて処置を標的化し、かくして正常な細胞における有害な作用を最小にするという現在の傾向に適合する（４,６１）。
【００１４】
他の利点は、ＰＡＰ阻害の能力を共有する既知の構造のいくつかの分子を利用できることであり、かくして、癌細胞と戦うのに有用な可能性のあるＰＡＰ阻害剤の新規ファミリーを設計するための構造情報を提供する。
【００１５】
同時に、本発明は、ＥＧＦＲおよびそれがヘテロ二量体を形成する他のＥｒｂＢ／ＨＥＲのメンバーの発癌機能に対抗するために、以前には知られていなかったメカニズムを導入し、悪性度がそれらの発癌機能に依存する癌の処置に有用であり、従って、既に使用されている処置を補足するものであるか、または、これらの処置がもはや有効ではない場合の唯一の代替物である。
【００１６】
付加的かつ重要な利点は、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ／ＨＥＲのメンバーの発癌機能を含むアプローチの選択性であり、従って、既知の分子マーカー並びにこの特定の処置のために将来発見され得る他のものによる処置を個人化する機会を与え、これは、各場合で分析でき、応答する可能性が高い癌に対して薬物の使用を最適化できる（１７,２５,６２）。ＥＧＦＲおよび他のＥｒｂＢ／ＨＥＲのメンバーの発癌性の変化（過剰発現または突然変異）を示す癌に限定されたＰＡＰ阻害剤の適用は、明確な経済的利点を有する。
【００１７】
最後に、発癌に直接関与しないＰＡＰ酵素活性に対して作用する化合物の使用は、その変化が細胞の形質転換および悪性の癌の表現型への進行を直接的に促進できるＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ／ＨＥＲのメンバーと対照的に、ＥＧＦＲのチロシン−キナーゼを含む発癌性キナーゼを標的とする薬物の主な問題である処置に対する耐性の発生を遅延させるか、最終的に回避させ得る（１７,２２,６３）。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
【図１】図１：プロプラノロールおよびデシプラミンは、培養された腫瘍細胞においてＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する。画像は、７５μＭプロプラノロール、７５μＭデシプラミン、５０μＭメトプロロールまたは５０μＭチモロールの存在下または非存在下でインキュベートされたＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＲの免疫蛍光パターンを例示する。プロプラノロールおよびデシプラミンのみがＥＧＦＲの分布を細胞表面から細胞内の斑点状の局在に変え、ベータブロッカーであるメトプロロールまたはチモロールはこれを変えない。
【図２】図２：エナンチオマーのＬ−およびＤ−プロプラノロール並びにデシプラミンは、放射性リガンド結合により評価されるＥＧＦＲの細胞表面の利用可能性を低下させる。Ａ. Ｌ−およびＤ−プロプラノロール；Ｂ. デシプラミン；Ｃ. 様々な濃度のＤ−プロプラノロール（上の目盛り）とデシプラミン（下の目盛り）の組合せ；Ｄ. Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンのＥＣ５０の組合せ。
【図３】図３：異なる増殖速度の腫瘍モデルとして、神経膠芽腫細胞Ｕ８７および発癌性突然変異ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するように形質転換されたＵ８７（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）。
【図４】図４：神経膠芽腫細胞Ｕ８７およびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ並びに非腫瘍性上皮細胞ＭＤＣＫの生存能に対する、非継続的処置として添加されたＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンの効果。
【図５】図５：低濃度のＤ−プロプラノロール（Ｐｒｏｐ）およびデシプラミン（Ｄｅｓ）による継続的処置は、単独でも組み合わせても、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲを過剰発現する神経膠芽腫の患者由来の初代培養の腫瘍細胞（ＧＢＭ１）において、増殖の増強を選択的に阻害する。
【図６】図６：不整脈のために処置される患者の血液に見いだされるものに近い２種の濃度（１０および３０μＭ）のＤ−プロプラノロールによる継続的処置は、単独で、または、１ｍＭデシプラミンとの併用で、いくつかの腫瘍細胞株およびＥＧＦＲを過剰発現する神経膠芽腫の患者由来の初代培養の腫瘍細胞（ＧＢＭ１）の増殖を選択的に阻害する。
【図７】図７：Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンの効果を基礎とする、ＥＧＦＲに依存する癌の新規処置戦略。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の背景
健康問題としての癌
癌は、異常細胞の制御されない浸潤性の増殖により生じる疾患の群を包含し、それは、有効な処置がなければ、短期間（＜１２ヶ月、または、最も悪性の場合では５−９ヶ月でも）で患者の死亡をもたらし得る。これらの数は、人口の増大、老化をもたらす長い余命およびリスク因子への高い暴露のために、将来的に増加するであろう。次の２０年間に新しい症例は５０％増加し得、２０２０年に向けて１５００万人に達すると推計される。工業化された国々では、４人に１人が癌で死亡する（６５）（６６）。従って、頻度と死亡率により、癌は世界中で公衆衛生の深刻な問題を構成している。
【００２０】
女性に最も多い癌は、乳房、子宮頸、結腸直腸および肺の癌であり、男性では、肺、前立腺、胃および結腸直腸の癌である（６６,６７）。死因として、癌は心血管疾患および感染症に次いで第三位を占めるが、先進国のみでは、一般的に心血管疾患に次ぐ第二の死因である（６６,６７）。２００２年の統計は、この年に何らかの癌に苦しむ２４６０万人の罹患者のうち、１０９０万人の新症例および６７０万人（男性３.７９６.０００人および女性２.９２８.０００人）の死亡例を示している（６７）。癌のうち、最多の死亡を引き起こしたのは肺（１.１７９.０００人の死亡者）、胃（７００.０００人）、肝臓（５９８.０００人）および結腸直腸（５２８.０００人）のものであり、５年後の生存率が２０％未満である最も悪性のものは、肺、食道、胃、肝臓のものおよび神経膠芽腫であった（６６−６８）。
【００２１】
特異的分子標的を使用する癌の処置
細胞および分子レベルでの癌の知識の増加は、発癌部位に応じて、特異的分子標的を対象とし、アプローチを個人化する、新しい処置への期待を開いた。
癌細胞は、新しい特性の獲得を決定する遺伝子の損傷に由来し、正常な挙動から逸脱する（６９−７１）。一般に、３種類の遺伝子が腫瘍形成を導き得る：（ｉ）癌遺伝子、（ｉｉ）腫瘍抑制遺伝子（癌抑制遺伝子）；および（ｉｉｉ）遺伝子の安定性に関与する遺伝子。これらの遺伝子の変化は、以下の異常な特性を特徴とする悪性形質の獲得をもたらす：１）増殖シグナルの自己充足性；２）抗増殖シグナルに対する非感受性；３）アポトーシスの回避；４）無限の複製可能性；５）持続する血管形成；６）組織侵襲および転移。
【００２２】
あらゆるこれらの異常な特性にも拘わらず、癌細胞は、特定の内部シグナルのネットワークの活動亢進に対して、文字通り「中毒」になる。この特性は、現在、対応する活動亢進ネットワークを阻害するように特別に設計された薬物を用いて、それらの悪性度に対抗するために使用されている（６１,７２）。従って、活動亢進したシグナル伝達ネットワークを持続させる遺伝子の変化が各腫瘍で同定され得るなら、最小の二次的作用で、最大の恩恵を得ることが可能である（１７,６２,７３）。遺伝子の病変の同定は、ＥＧＦＲのものを含むいくつかの決定的なシグナル伝達経路について比較的進んでおり、従って、薬物の使用を、第一選択として、または、化学療法と組み合わせて、特定の標的に対して個人化することが可能である。今や、決定的な遺伝子の病変、並びに、癌細胞を正常な細胞と区別する、頻繁に変更される分子的および生化学的過程の知識に基づいて、癌の処置を個人化することに対する傾向と広範な合意がある（６１,６９−７２）。
【００２３】
ＥＧＦＲファミリー
ＥＧＦＲは、悪性腫瘍の表現型の発生および維持に決定的な細胞の過程を制御するチロシン−キナーゼのパラダイムである。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む受容体チロシン−キナーゼファミリーのメンバーである（３）。ＥＧＦＲは、リガンドと相互作用する細胞外ドメインおよびチロシン−キナーゼドメインを有する細胞内ドメインを示す。それは、主に細胞膜に局在し、そこで特異的リガンドの刺激による相互作用で活性化され、最初にその二量体化に至り、続いてその細胞内チロシン−キナーゼが活性化される。ＥＧＦＲキナーゼ活性は、ＥＧＦＲ自体およびいくつかの他の細胞内基質のチロシンをリン酸化し、かくして、すべて腫瘍形成に関与する、細胞増殖、生存および遊走の過程を調節するシグナル伝達経路を開始させる。ＥＧＦＲは、最も広範に分布する受容体の１つであり、これらの過程の調節因子であり、腫瘍細胞により頻繁に分泌されるＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよび腫瘍増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む様々なリガンドにより活性化され得る（７４）。ＥＧＦＲは、また、様々な他の受容体、特にＧＴＰａｓｅ（ＧＰＣＲ）と共役する受容体の刺激によりトランス活性化される（７５）。興味深い例は、より広範に分布するＧＰＣＲの１つであるＰ２Ｙ１受容体と相互作用するＡＴＰなどの細胞外ヌクレオチドによるＥＧＦＲのトランス活性化である（６４）。
【００２４】
癌に関連するＥＧＦＲの変化
ＥＧＦＲの機能の変化は、様々な癌に関連して頻繁に見いだされ、これらの変化の発癌作用は、好ましい抗癌剤の標的を構成する（４,２１,７６）。固形腫瘍のほぼ４０−５０％が、遺伝子の変化に決定されるＥＧＦＲチロシン−キナーゼの活性の増悪に依存する。
【００２５】
ＥＧＦＲの遺伝子の変化の詳細な列挙には、以下が含まれる：（ｉ）タンパク質の過剰発現を導く、ＥＧＦＲ遺伝子対の数の増加。神経膠腫および肺腫瘍は、頻繁にそのような遺伝子の増幅を示す（７７,７８）。しかしながら、胃癌に見られるように、遺伝子の増幅を伴わない、他の未だ不明のＥＧＦＲ過剰発現のメカニズムが存在する（７９,８０）。
【００２６】
ＥＧＦＲの過剰発現は、通常、高い悪性度と関連する；（ｉｉ）活動亢進したＥＧＦＲをもたらす突然変異；ａ）神経膠芽腫において最も重要である、リガンド結合のドメインに一致する細胞外領域を欠失により欠くＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異（８１）；ｂ）ロイシン８５８がアルギニンで置換されているＥＧＦＲＬ８５８Ｒ突然変異および保存配列ＬＲＥＡを除去するエクソン１９の欠失を伴うＥＧＦＲＤｅｌＥ７４６−Ａ７５０、両突然変異は、受容体のチロシン−キナーゼドメインに影響し（ＥＧＦＲＴＫＤｍｕｔ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の１０−１５％に見られる（８２,８３）。
【００２７】
ある種の癌の処置のためにＥＧＦＲに対して現在使用されている薬物
ＥＧＦＲの遺伝子の変化を有する細胞は、受容体から生じる悪化した（発癌性）シグナルに「中毒」になる。ＥＧＦＲの悪化した活性の阻害は、正常な細胞よりも癌細胞に損傷を与える。従って、ＥＧＦＲ機能の阻害剤は、現在、各腫瘍におけるＦＧＥＲの変化の同定後に個人化でき、かくして処置への応答を最適化する、標的化された癌治療を開発するためのパラダイムを構成している（７２,８４）。
【００２８】
現在、ＥＧＦＲに対する２種類の薬物が、ある種の癌を処置するために臨床使用されている（４）：（ｉ）リガンド結合を阻害する、ＥＧＦＲの細胞外領域に対するモノクローナル抗体（セツキシマブおよびパニツムマブ）。セツキシマブ（アービタックス；Merk KGaA, Darmstad, Germany；ＷＯ２００９０９９６４９）は、ＥＧＦＲに高い親和性で結合し、リガンド結合を競合的に妨害するモノクローナルヒト化抗体である。それは、また、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスおよび負の調節も誘導する。それは、主に、ＥＧＦＲを発現する進行した結腸直腸癌の処置に使用される（８５,８６）；（ｉｉ）エルロチニブおよびゲフィチニブなどの、ＥＧＦＲのチロシン−キナーゼを阻害する低分子（４）（ＷＯ０３１０３６７６およびＷＯ２００５１１７８８７）。これらの薬物は、チロシンキナーゼドメインへの結合についてＡＴＰと競合し、かくして、増殖の悪化を促進するシグナル伝達カスケードを開始するのに決定的な、ＥＧＦＲ基質のリン酸化を阻害する。チロシンキナーゼ阻害剤は、転移ＮＳＣＬＣおよび結腸、頭頸部および膵臓の癌の処置に使用できる（４,８７）。他のＥＧＦＲ機能を阻害する抗腫瘍剤の特許には、ＷＯ０３０９７８５５、ＵＳ５７９５８９８が含まれる。
【００２９】
個人化された治療の標的としてのＥＧＦＲ
ＥＧＦＲは、個人化された癌治療のために最も研究され、好まれている標的の一つである（３,６１）（４）。２つの注目に値する例は、ＮＳＣＬＣおよび結腸癌であり、これらでは、ＥＧＦＲ発癌性突然変異の分析が、チロシンキナーゼ阻害剤を好都合に使用できるか否かを決定するのを助ける（８８−９０）。ＮＳＣＬＣでは、患者の１０−２０％のみが、エルロチニブまたはゲフィチニブに応答する（９１,９２）。セツキシマブはあまり有効ではない（９３）。応答性の患者は、チロシンキナーゼドメインに上述の突然変異のいずれかを有するＥＧＦＲＴＫＤｍｕｔ受容体を発現し、それは、発癌性をもたらすのみならず、受容体を薬物に対して感受性にする（８３,９４,９５）。これらの突然変異の同定は、８０−９０％に迫る応答と生存の改善を達成できる、処置の個人化を可能にする（１７,８９,９６−９８）。
【００３０】
利用可能な抗ＥＧＦＲ薬の制限
ＥＧＦＲの発癌機能に対抗する現在の薬物の主な制限は、大部分が応答せず、最初は感受性の腫瘍に耐性が発生するために、比較的低い効力である（１７,７３,８７）。例えば、症例のほぼ８５−９０％を占める、エルロチニブまたはゲフィチニブに感受性のＥＧＦＲ突然変異に依存しないＮＳＣＬＣに罹患している患者には、与えるものは多くない。これは、これらの種類の阻害剤に応答しない他の癌にも該当する。さらに、最初はエルロチニブまたはゲフィチニブに応答する感受性の患者でさえ、腫瘍の増殖が６ヶ月ないし２年の間に回復することが頻繁に観察される。これらの耐性腫瘍のほぼ５０％が、チロシンキナーゼドメインのメチオニン７９０をスレオニンに置換する第二の突然変異を示し、これが、薬物とＡＴＰ結合部位の相互作用を妨害する（１７）。最近の研究は、今度はＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を阻害する新しい薬物を報告している（９９）。しかしながら、キナーゼ阻害剤に共通の問題であるように、新しい薬物に対する耐性発生の可能性は依然として存続している（１００）。一方、耐性を発生するがＴ７９０Ｍ突然変異を持たない、さらに別の５０％の症例があり、そのメカニズムは不明のままである（１７,１０１−１０３）。
【００３１】
まとめると、これらの証拠により、ＥＧＦＲは抗腫瘍薬を設計するのに良好な標的であるが、その発癌機能を妨害するために、既に使用されているものを超える、リガンド結合またはチロシン−キナーゼ活性のブロッカーを継ぐ、代替的なメカニズムを見いだす必要があると結論付けることができる（４）。
【００３２】
本発明は、低分子薬を使用するＥＧＦＲのエンドサイトーシスおよびＥＧＦＲの細胞内輸送の撹乱の薬理的誘導に基づく新規の戦略を提唱し、それは、ＥＧＦＲに依存する癌細胞に有害であり得る、外部のリガンドにより活性化されるための利用可能性の低下およびシグナル伝達の場所の変更を導く（１０４）。
【００３３】
抗腫瘍薬の標的としてのＥＧＦＲエンドサイトーシス
エンドサイトーシスは、ＥＧＦＲの機能を制御する様々な過程の中で重要性が高く（５６−６０）、新しい抗腫瘍の可能性を与える（１０４,１０５）。ＥＧＦＲシグナル伝達を制御するメカニズムは、細胞内輸送を調節するものと密接に絡み合っており、癌細胞は、そのような機能的関連を利用して、ＥＧＦＲの発癌性を高めることができる（６０,１０６−１１１）。リガンド結合は、ＥＧＦＲの二量体化および細胞内チロシンキナーゼ活性の活性化を導き、それは、次いで、下流のシグナル伝達要素を補充するモチーフとして働くいくつかのチロシンでトランスリン酸化を受ける（１１２）。チロシンリン酸化ＥＧＦＲは、また、Ｅ３ユビキチンリガーゼＣｂｌによりユビキチン化される（１１３−１１５）。リガンドに誘導されるエンドサイトーシスの複雑なメカニズムは未だ完全に理解されていないが、クラスリン−アダプターＡＰ２−相互作用モチーフ、受容体のユビキチン化およびアセチル化を含む冗長な機構に繋がると考えられる（１１６）。これらの構造的／生化学的修飾は、活性なＥＧＦＲの細胞内輸送を規定する（１１４,１１６−１１８）。エンドサイトーシスは、後にリソソームと融合する多胞体の腔内小胞への、ユビキチン依存性およびＥＳＣＲＴ介在性のＥＧＦＲの分別を含む、下方調節経路を提供する（１１７,１１９,１２０）。しかしながら、リガンド濃度（１２１）および受容体発現レベル（１０４）を含む様々な要因に応じて、活性化ＥＧＦＲは、分解の前に様々な期間にわたりシグナル伝達能力を保持でき、様々な応答結果を指定する。高い悪性度に関連する一般的な条件である、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞では、ＥＧＦ刺激は、分解経路への分別の遅延および結果的な活性化ＥＧＦＲのエンドソーム蓄積の増加を含むメカニズムを介して、アポトーシスを導く（１０４,１０５）。従って、細胞内輸送は、リガンドに誘導されるＥＧＦＲシグナル伝達の強度、場所および期間を変更する複数の機会を提供し、それは、ＥＧＦＲ依存性腫瘍細胞において、治療的可能性を有し得る。
【００３４】
しかしながら、腫瘍内の癌細胞への接近に制限を有することが多い抗体の代わりに、低分子薬について、細胞表面からの除去に至るＥＧＦＲエンドサイトーシスの薬理的誘導は、抗腫瘍戦略として使用されてこなかった。
【００３５】
我々は、最近、タンパク質キナーゼＡの下方調節に向かうホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）の酵素活性のシグナル伝達経路（ＰＡ／ＰＫＡ経路）を含む、ＥＧＦＲエンドサイトーシスの制御の新しいメカニズムを記載した（１２２）。このメカニズムは、ＰＡＰの薬理的阻害により開始させることができ、ＰＡレベルの上昇、４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）の活性化およびｃＡＭＰレベルおよびＰＫＡ活性の低下を導き、ＥＧＦＲエンドサイトーシスの誘導を決定する。
【００３６】
シグナル伝達のホスファチジン酸（ＰＡ）
ＰＡは、構造およびシグナル伝達の要素として作用し、様々な細胞の機能を媒介する（１２３）。シグナル伝達のＰＡは、主に、ＥＧＦを含む多種多様な細胞外刺激（１２４−１２６）により活性化される酵素であるホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）（１２３）によるホスファチジルコリンの加水分解から生じる（１２７−１２９）。複数の癌が、ＰＬＤ活性または発現の上昇を示し、それは、アポトーシスの抑制およびファゴサイトーシスの主要な調節因子である（１３１）ｍＴＯＲの阻害剤による癌処置への耐性（１２６,１３０）と関連付けられてきた。ＰＡのレベルは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を産生するホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）により下方調節される（１２３）。
【００３７】
ホスファチジン酸ホスファターゼ活性（ＰＡＰ）および既知の阻害剤
２種類の異なる種類の酵素が、ホスファチジン酸をジアシルグリセロールに変換するＰＡＰ活性を有する。ＰＡＰ１は、細胞質および小胞体膜に分布する酵素であり、そこでトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の合成に必要なＤＡＧを産生する。ＰＡＰ１活性は、ＰＡに特異的であり、Ｍｇ２＋依存性であり、Ｎ−エチルマレイミドによる阻害に感受性であり、３つの成分のファミリーを含む：Ｌｉｐｉｎ１、Ｌｉｐｉｎ２およびＬｉｐｉｎ３（１）。ＰＡＰ２は、主に細胞膜およびエンドソーム膜に局在する膜貫通タンパク質であり、Ｍｇ２＋を必要とせず、Ｎ−エチルマレイミドにより阻害されない。ＰＡＰ２のＬＰＰは、ＰＡに特異的ではなく、すべてシグナル伝達に関与する、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、セラミド１−ホスフェート（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン１ホスフェート（Ｓ１Ｐ）およびＤＡＧピロホスフェートを含む幅広い範囲の他の脂質リン酸を加水分解する。従って、ＰＡＰ２は、脂質リン酸ホスファターゼ（ＬＰＰ）とも呼ばれ、ＬＰＰ１、ＬＰＰ２およびＬＰＰ３と名付けられた３種の関連タンパク質を含む（１）。
【００３８】
様々な疾患の臨床実務で現在使用されているいくつかの陽イオン性両親媒性化合物は、副作用としてＰＡＰを阻害する能力を有し、これには、プロプラノロール、デシプラミン、クロルプロマジン、デスメチルイミプラミンおよびトリオフルオロペラジンが含まれる（７−１０）。
【００３９】
ＰＡＰ阻害剤で処置され得る、様々なＥＧＦＲ発癌性変化を有する癌の例
肺癌
癌による全死亡の約３０％が肺癌によるものであり、世界中で癌による死亡の主原因である（１３２）。肺癌の約９０％は、世界中で約１３億人を冒している喫煙によるものであり、一年に約５百万人の３０歳以上の人々を殺している（１３３）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の癌は、大きい死亡のリスクを伴う進行した悪性腫瘍の１つである。処置しなければ、ＮＳＣＬＣおよび転移の患者では、生存期間中央値は４−５ヶ月である。患者の１０％しか、その年に生き残らない。進行または転移ＮＳＣＬＣの標準的な第一選択の治療は、プラチナダブレットと組み合わせた化学療法を基礎とし、それは、生存期間中央値を８−１１ヶ月に延ばし、生存率を１年で約３０％、２年で１４−２０％に高める（１３４）。
【００４０】
胃癌
胃癌は、最も一般的な上皮由来の癌の１つである（１３５）。その発生率は過去５０年間で減少してきたが、依然として、頻度で第４位であり、死因としては肺癌に次いで第２位であり、性別および人種の群で有意差がある。毎年、約１００万件の新しい症例が診断され、この原因で約８００,０００件の死亡がある。局在した癌の患者の５年目の生存率は６０％に登り、一方、転移がある患者では、わずか２％である（１３６）。進行した疾患の場合、処置しなければ、生存期間中央値は１２ヶ月未満である（しばしば、わずか５.４ヶ月）。新しい化学療法の様式は、生存期間中央値を下げるのに失敗し、過去１０−２０年にわたり概して変わらないままである。この癌について、確立された化学療法は存在しない（７９,８０,１３７）。
【００４１】
神経膠芽腫
「神経膠腫」は、膠細胞に起源があると考えられるすべての腫瘍を含み、中枢神経系の最も一般的な腫瘍である。グレードＩＩＩ（未分化星状細胞腫）およびグレードＩＶ（神経膠芽腫）は、悪性神経膠腫とみなされる（６８）。神経膠芽腫は、毎年３／１００,０００人の発生頻度であり、すべてのヒトの癌の中で最も致死的な腫瘍の１つである。神経膠芽腫の生存期間中央値は、数十年間にわたり、約９−１２ヶ月で維持されてきた。６５歳以上の患者の２％のみ、４５歳未満の患者の３０％が、２年間生存し、一方、約７５％が診断の１８ヶ月後には死亡する（１３８,１３９）。浸潤性の特徴と、放射線療法および化学療法を含む標準的処置への応答の乏しさが、予後不良に寄与している（１３９−１４１）。放射線療法および同時のテモゾロミドと、後続の補助的なテモゾロミドの投与という現在の処置は、１２.１ヶ月の生存期間中央値を１４.６ヶ月に延ばす（１４０）。
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＥＧＦＲまたはその発癌性変異に依存する癌細胞の増殖を妨害するための、エンドサイトーシスの誘導に基づく新戦略としての、単独またはデシプラミンと組み合わせたＤ−プロプラノロールによるＰＡＰの阻害に関する。
【００４３】
プロプラノロール（これは、ＤおよびＬプロプラノロールのラセミ混合物を表す）は、ベータ−アドレナリン受容体を発現する癌細胞の腫瘍増殖および転移の実験的弱化のために、ベータ−ブロッカーとして使用されたことがあり、従ってそのような使用は、Ｄ−プロプラノロールではなく、その活性の本質であるＬ−プロプラノロールに集中している。これらの実験では、プロプラノロールは、ストレス条件による腫瘍形成を促進すると考えられるベータ−アドレナリンの刺激を防止するのみであり、強い交感神経の緊張により促進される悪性の特性に対抗すると期待される（１４２−１４４）。実際に、プロプラノロールは、現在、その悪性度がＥＧＦＲまたは他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーの発癌性に依存する癌に対して承認されている処置に含まれない。Ｄ−プロプラノロールは、癌細胞の増殖に対抗するために、いかなる刊行物においても、以前に使用されていない。
【００４４】
より効果的な抗癌作用のためにＤ−プロプラノロールと組み合わせることができるＰＡＰ阻害剤の例として本発明で使用されるデシプラミンに関して、国際公開ＷＯ２００６／０１７１８５において、いくつかの他の化合物と共に、インビトロで抗増殖作用を示すことが言及された。しかしながら、この刊行物は、デシプラミンが細胞増殖の減少を引き起こし得るメカニズムに言及せず、そのような効果が選択的であるのか、正常細胞も冒すのかを分析していない。この刊行物は、抗腫瘍治療における効果的な使用または効果の最適化の可能性を認識させない。国際公開ＷＯ２００８／１１２２９７は、酵素酸スフィンゴミエリナーゼの阻害剤を記載し、その中で、デシプラミンを類似の化合物として挙げ、それが抗癌作用を有し得ると予測しているが、具体的な結果は報告されていない。
【００４５】
ノルエピネフリンおよびセロトニンの再取り込みを阻害する三環系抗うつ剤として使用されるデシプラミン（１６）は、培養中の癌細胞の増殖および生存を低減すると報告された（１４５−１４９）。報告された用量は比較的高く、本発明で使用されるものよりも４０−１００倍高い。そのような高濃度で、デシプラミンは、腫瘍細胞および正常細胞の両方のほとんどの種類の細胞にとって、むしろ毒性である。さらに、これらの研究のいずれも、ＥＧＦＲ依存性またはＰＡＰ阻害を介して作用する可能性を考慮していない。本発明では、デシプラミンは、患者で報告されたものに近い濃度で作用するＤ−プロプラノロールの抗癌特性を改善できるＰＡＰ阻害剤の例である。不整脈（１４）またはうつ病（１５０,１５１）を各々処置された患者により血中で達成されるものに近い濃度で、Ｄ−プロプラノロール（１０−３０マイクロモル濃度）とデシプラミン（１マイクロモル濃度）の組合せは、ＥＧＦＲまたはその突然変異の発癌性に依存する腫瘍細胞に選択的である（図２および３参照）。
【００４６】
本発明の発明者らは、ラセミ混合物としてのプロプラノロールまたはＬ−およびＤ−プロプラノロールがＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導することを発表し、そのメカニズムがＰＡＰ阻害、ＰＡの増加および結果的な４型ホスホジエステラーゼの活性の増加を含み、ｃＡＭＰレベルの低下およびＰＫＡ活性の低下（１２２）をもたらすことを示した。この新規制御システムは、ＥＧＦＲエンドサイトーシスを誘導し、その悪性度が発癌性のＥＧＦＲの機能に依存する腫瘍の増殖を低下させる新しい標的として、ＰＡＰを含むＰＡ／ＰＫＡ経路の様々な酵素を使用する可能性をもたらす。
【００４７】
本発明の発明者らは、以前に、ＥＧＦの非存在下で基底ＰＫＡ活性を阻害することが、空の／不活性のＥＧＦＲの内在化を導き、一方、ＥＧＦの存在下では、リソソームの分解経路への分別の遅延により、リガンドで活性化されたＥＧＦＲの分解速度を遅らせることを示した（１５２）。
【００４８】
次いで、ＰＡＰ阻害剤により開始されるＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路を介するＰＫＡ活性の低下により、薬理学的にＥＧＦＲの内在化を誘導し、それらの刺激への到達性を低下させるのみならず、ＥＧＦＲの細胞内輸送およびシグナル伝達を撹乱することが可能である。このＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路は、以前に記載されたが、その機能は未知のままであった（１５）。研究者の結果は、このＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路が、エンドサイトーシスとリサイクリングの機構に作用して、ＥＧＦＲの細胞表面レベルおよび細胞内輸送を調節することを示す（１２２）。
【００４９】
本発明は、また、以下のさらなる観察に基づく：１）Ｌ−プロプラノロールのベータ−ブロッカー活性を欠くエナンチオマーのＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、両方ともＰＡＰの阻害剤として使用され、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する；２）Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、ＥＧＦＲ過剰発現およびＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異を含む、ＥＧＦＲの発癌性の変化を発現する癌細胞の増殖を阻害する。これらの薬物の効果は悪性細胞に選択的であり、非腫瘍細胞は比較的影響されないか、または、弱く影響される。それらの組合せは、単独の各薬物より明らかに良好である。
【００５０】
ＰＡＰ阻害剤（１５）として使用されるＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスおよび細胞内蓄積を誘導するＰＡ／ＰＤＥ４／ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路を活性化する（１２２）。Ｄ−プロプラノロールを単独またはデシプラミンと組み合わせて使用する本発明は、臨床的処置におけるそれらの以前の使用とは完全に異なる。それは、混合物の中でＬ−プロプラノロールのみにより提供され、Ｄ−プロプラノロールによっては提供されないベータ−ブロッカー活性を必要とする高血圧および他の血管障害を処置するための、ラセミ混合物のプロプラノロールの使用とも異なる。Ｄ−プロプラノロールは、ベータ−アドレナリンの遮断を欠く抗不整脈薬としてヒトで実験的に使用されたが（１４）、一方、デシプラミンは、ノルエピネフリンの再取り込みを阻害し、それより低い程度でセロトニンの再取り込みも阻害する三環系抗うつ剤である（１６）。
【００５１】
細胞生物学では、プロプラノロールは、現在、シグナル伝達、タンパク質輸送および細胞骨格の機能などの様々な細胞の過程におけるＰＡおよびジアシルグリセロールの機能を研究するために、ＰＡＰ阻害剤として使用されている（１２３）。
【００５２】
ＰＡが関与する様々なシグナル伝達経路の中で、ＰＤＥ４の活性化はあまり研究されてこなかった。ＰＡによるＰＤＥ４の活性化は、ｃＡＭＰレベルの低下を、結果的にＰＫＡ活性の低下を導き、これが、そのベータ−ブロッカーの作用とは独立してプロプラノロールにより、そして、そのノルアドレナリン再取り込みへの作用とは独立して、デシプラミンにより誘起される効果である（１５,１５３）。
【００５３】
Ｄ−プロプラノロールおよびベータ−ブロッカー活性を欠く類似体は、単独で、または、デシプラミンと組み合わせて、化学療法またはＥＧＦＲ阻害剤（例えばセツキシマブ、エルロチニブおよびゲフィチニブ）をベースとする処置を補足するＰＡＰ阻害剤として、また、現在の処置への耐性が既に発生している場合に単独の治療として、使用され得る。
【００５４】
本発明は、結腸、肺、乳房、前立腺、胃、頭頸部、肝臓の癌および神経膠芽腫を含む、悪性度が頻繁にＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ２の発癌性変化に依存する癌の処置に、新しい可能性を開く。
【実施例】
【００５５】
実施例
実施例１：１２５Ｉ−ＥＧＦ結合により測定され、免疫蛍光により可視化される、Ｌ−、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンのＥＧＦＲ内在化に対する効果の比較評価
本願発明者らは、ＬおよびＤプロプラノロールのラセミ混合物が、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合の低下により反映される通り、わずか３０分間で細胞表面のＥＧＦＲのレベルを低下させ、最高用量（３００μＭ）で８０％に達し、有効濃度５０％（ＥＣ５０）は約７５−１００μＭであることを記載した（１２２）。
【００５６】
本発明によりＥＧＦＲの発癌作用の妨害のために提唱される、ＰＡＰの阻害剤としてのプロプラノロールの効果は、インビトロで、ベータ−アドレナリンブロッカーとしてのものより、高い濃度を必要とする（１４３,１４４）。Ｌ−プロプラノロールは、Ｄ−プロプラノロールよりもほぼ１００倍強いベータ−アドレナリンブロッカーである。しかしながら、本願発明者らの結果は、Ｌ−プロプラノロールとＤ−プロプラノロールは細胞表面のＥＧＦＲを減らす能力において同等であり（図１,Ａ）、ラセミ混合物について報告されたのと同様に（１２２）、両方とも約７５−１００μＭのＥＣ５０であった。
【００５７】
デシプラミンも、約２０μＭのＥＣ５０で、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合の減少を誘導するのに有効である（図１Ｂ）。デシプラミン（２０μＭ）とプロプラノロール（７５μＭ）のＥＣ５０の組合せは、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合アッセイで評価される通り（図２ＣおよびＤ）、７５−８０％のＥＧＦＲを細胞表面から減らす。
【００５８】
図１Ｅの間接的免疫蛍光は、７５μＭのＤ−またはＬ−プロプラノロールが、細胞表面から細胞内の主に核周囲の場所（それは、この種のエンドソームのマーカーであるトランスフェリンとの共局在により、リサイクリングエンドソームと定義された）へのＥＧＦＲの再分布を誘導することを示す（１２２）。Ｄ−プロプラノロールは、Ｌ−プロプラノロールよりもベータ−ブロッカーとして６０−１００倍活性が弱く、一方、図１Ａに示される通り、Ｄ−およびＬ−プロプラノロールは両方ともＰＡ／ＰＫＡ経路（１５）並びにＥＧＦＲエンドサイトーシスの誘導において同等であるので、この効果は、ベータ−遮断活性によるものではない。同様にＰＡＰ活性に対する阻害作用を有するデシプラミン（１５,１５３）は、プロプラノロールの細胞内の効果を模倣する。
【００５９】
本発明は、プロプラノロールと組み合わせて使用できる任意の既知のＰＡＰ阻害剤、または、さらに高い効力を有し得る単独で使用できる新しいＰＡＰ阻害剤に有効である。ここに示した結果は、例示にすぎず、本発明の分野を限定または制限しない。
【００６０】
実施例２：ＥＧＦＲおよびその発癌性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩに依存する様々な増殖速度の腫瘍細胞モデル
ＥＧＦＲに依存する腫瘍細胞の増殖および生存能の阻害剤としてのＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンの有効性を、培養中の神経膠芽腫細胞で立証する。ヒト神経膠芽腫由来の細胞株Ｕ８７は、低レベルのＥＧＦＲ（データは示さない）を発現し、突然変異のＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するように形質移入されると、増殖速度が非常に高まる（図２）。これらの細胞は、薬物を試験するのに適当な実験モデルを提供する。使用した他のモデル系は、高レベルのＥＧＦＲを発現するがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しない、患者から直接得られた神経膠芽腫多形細胞（ＧＢＭ１）であった。Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せに対する感受性は、Ｕ８７細胞と比較して、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞およびＧＭＢ１細胞で高い。２μＭという低濃度のＤ−プロプラノロール（プロプラノロールによる高血圧の処置中の患者の血漿で報告されたものの２倍にすぎない）と０.６μＭデシプラミン（血漿において記載されたものの半分）は、この発癌性突然変異を発現しない細胞に大きく影響を与えずに、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞で顕著な効果を達成する（図２Ａ）。
【００６１】
Ｄ−プロプラノロールの濃度１０μＭは、最終投与から１２時間後に測定した不整脈の処置中の患者の血液で報告された（１４）。不整脈の患者で臨床使用中に生じるものに近い濃度範囲を反映すると見込まれる１０−３０μＭのＤ−プロプラノロールの効果を、単独で、または、１μＭのデシプラミン（この薬物について報告された有効血中濃度）と組み合わせて使用した。１０−３０μＭというこれらの高用量のＤ−プロプラノロールは、単独で、または、１μＭデシプラミンと組み合わせて、同様の選択的効果を有した（図２Ｂ）。
【００６２】
これらの結果は、ＥＧＦＲまたはその欠失変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する細胞における発癌的寄与に依存する腫瘍増殖に対する、デシプラミンと組み合わせたＤ−プロプラノロールの有効性を立証する。両薬物の組合せの驚異的な結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌のために、臨床的に受け入れられている用量を使用することを可能にする。
【００６３】
実施例３：いくつかの癌細胞株に対するＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンの抗癌効果
選択性の対照として、この実験は、低レベルのＥＧＦＲを発現し、悪性ではないイヌの腎臓上皮性細胞株であるＭＤＣＫ細胞（６４）が、これらの薬物により影響を受けないことを示す。その代わり、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ３に依存すると報告され、抗ＥＧＦＲ薬の研究に幅広く使用されている黒色腫細胞Ｂ１６の系統に属する悪性度の高いマウス黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０（１５４−１５６）、および、発癌性二重突然変異ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍを発現するヒト肺癌細胞Ｈ１９７５（１０１）は、最も感受性が高い。注目すべきことに、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍは、臨床使用において、チロシン−キナーゼ阻害剤エルロチニブまたはゲフィチニブに耐性である（１５７）。これらの薬物は、また、同様にＥＧＦＲを発現すると報告された卵巣癌細胞ＵＣＩ１０１（１５８）に対しても有効である。
【００６４】
まとめると、Ｄ−プロプラノロール（および、ベータ−ブロッカー活性を欠く類似体）およびデシプラミンは、単独で、または組み合わせて、過剰発現（ＢＭＢ１など）または突然変異（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）により与えられるＥＧＦＲの発癌性の変化に悪性度が依存する癌の処置に有用である。
【００６５】
本発明の範囲は、肺癌で記載されたものなどの他の発癌性ＥＧＦＲ変異体、または、他のファミリーのメンバー（例えば、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４）を発現する癌に、そして、Ｄ−プロプラノロールと組み合わせられる既知のＰＡＰ阻害剤である他の阻害剤（スフィンゴシンおよびクロルプロマジン）に、または、単独で使用されて高い有効性を示し得る新しいＰＡＰ阻害剤に及ぶ。
【００６６】
Ｄ−プロプラノロールは報告されたＰＡＰ阻害剤（１５３）であり、高血圧および他の血管障害の処置に現在使用されているベータ−ブロッカーのラセミ混合物であるプロプラノロールよりも高い用量で、ヒトにおいて使用できる。不整脈を制御するためにＤ−プロプラノロールで処置された患者で報告されたような主要な付帯的問題を伴わずに（１４）、ラセミ混合物よりも少なくとも１０倍高い濃度のＤ−プロプラノロールに血中で到達することができる。これらの患者では、最終投与の１２時間後に評価した血中濃度は、１０μＭに近い（１４）。循環中のプロプラノロールの濃度は約４−６時間の半減期で低下し、従って臨床的に意味のある血中濃度を達成するために、患者は１日に４回処置されなければならないので、ここで使用された３０μＭの濃度は、良好に耐容されると期待される。
【００６７】
さらに、Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せは、ＥＧＦＲまたはその発癌性突然変異の発癌性刺激に依存する癌の処置に、各々の薬物単独よりも有効であり得る。
【００６８】
図面の詳細な説明
図１：エナンチオマーのＬ−およびＤ−プロプラノロール並びにデシプラミンは、放射性リガンド結合により測定される細胞表面のＥＧＦＲの利用可能性を低下させ、この作用は、エンドサイトーシスに起因するものである：事前に４時間にわたり血清を除いたＨｅＬａ細胞を、示した用量の様々な薬物で３０分間処理し、次いで、細胞を２０ｎｇ／ｍｌ１２５Ｉ−ＥＧＦと共に４℃で１時間インキュベートして放射性リガンド結合アッセイを実施し、細胞表面のＥＧＦＲを検出した。Ａ. Ｌ−およびＤ−プロプラノロールは、７５μＭ（ＥＣ５０）の濃度で約５０％、２５０μＭで８０％の細胞表面のＥＧＦＲの減少を反映して、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合の低下を引き起こした。Ｌ−およびＤ−プロプラノロールの作用は、区別がつかない；Ｂ. デシプラミンも、ＥＣ５０約２０−２５μＭで、放射性リガンド結合レベルの低下を誘導した；Ｃ. 様々な濃度のＤ−プロプラノロール（上の目盛り）とデシプラミン（下の目盛り）の組合せ；Ｄ. 各々のＥＣ５０で使用されたＤ−プロプラノロール（７５μＭ）およびデシプラミン（２５μＭ）の組合せは、１２５Ｉ−ＥＧＦ結合の約７５％の減少を引き起こした。Ｅ. カバーガラス上で増殖させ、１００μＭＤ−またはＬ−プロプラノロールおよび２０μＭデシプラミンで３０分間処理したＨｅＬａ細胞の、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体ＨＢ８５０６（ＡＴＣＣハイブリドーマ）による間接免疫蛍光。対照細胞は、細胞表面分布を示す境界で殆どのＥＧＦＲ染色を示し、一方、すべての薬物で、パターンは細胞内局在、主に核周囲領域に変化した。
【００６９】
図２：Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、ＥＧＦＲ（ＧＢＭ１）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に依存する腫瘍の神経膠芽腫細胞の増殖を低下させる。
Ａ. 異なる増殖速度の腫瘍細胞のモデルとしての、Ｕ８７および発癌性突然変異ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するように形質移入されたＵ８７（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）。１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＭＥＭ培地を有する２４ウェルプレートに、１０,０００個の細胞を播いた。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃで永続的に形質移入されたＵ８７細胞（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、Ｕ８７細胞よりも高い増殖を示す。
【００７０】
Ｂ. Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよび、ＥＧＦＲを過剰発現するがＥＧＦＲｖＩＩＩはしない神経膠芽腫の患者由来のＧＢＭ１細胞は、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンに選択的に感受性である。ウェル当たり１０,０００個の細胞（Ｕ８７、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＧＢＭ１）を播き、１８時間培養した後、培養培地を、示した薬物、即ち、１０μＭ Ｄ−プロプラノロール（Ｄ−Ｐｒｏｐ）および１μＭデシプラミン（Ｄｅｓ）を単独または両者の組合せで含むか、または含まない（対照）培地で置き換え、培地を４日間にわたり２４時間ごとに交換した。Ｕ８７細胞はこれらの薬物に感受性ではないが、Ｕ８７−ＥＧＧＦＲｖＩＩＩおよびＧＢＭ１の両方とも、これらの薬物の存在下で、薬物の組合せの高い効果で増殖を低下させた。
【００７１】
図３：Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンは、選択的に腫瘍細胞の増殖を損なう
ウェル当たり１０,０００個の細胞を播き、１８時間培養した後、培養培地を、示した薬物、即ち、１０または３０μＭ Ｄ−プロプラノロール（Ｄ−Ｐｒｏｐ）および１μＭデシプラミン（Ｄｅｓ）を単独または両者の組合せで含むか、または含まない（対照）培地で置き換え、培地を４日間にわたり２４時間ごとに交換した。生体染色のトリパンブルーとインキュベートした後、自動細胞計測器で計数した生存細胞を、非処理対照に対する生存細胞の％として表す。腫瘍卵巣細胞（ＵＣＩ１０１）、黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）および非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ；Ｈ１９７５）は、すべてこれらの薬物感受性であったが、腫瘍性ではなく非常に低いレベルのＥＧＦＲを発現するメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）細胞は、Ｄ−プロプラノロールにもデシプラミンにも影響されなかった。
【００７２】
図４：ＥＧＦＲに依存する癌を処置するための、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンの作用に基づく新しい戦略：リガンド結合またはチロシンキナーゼ活性を阻害することを試みてＥＧＦＲ分子を直接的に標的とする現在の戦略とは対照的に、本発明は、ＰＡＰを阻害し、ＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路を活性化する薬物により媒介される受容体のエンドサイトーシスを誘導し、それにより、細胞表面からエンドソームへのＥＧＦＲの再局在化を誘導することを提唱する。
【００７３】
技法の説明
試薬および抗体
組み換えヒトＥＧＦは、Invitrogen (Carlsbad, CA) から、タンパク質Ａ−セファロース、プロプラノロールおよび高グルコースＤＭＥＭは、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) から、ウシ胎児血清は、Hyclone Laboratories (Logan, UT) から、細胞培養試薬は、Invitrogen および Sigma Aldrich から、組織培養用のプラスチックプレートは、Nalge Nunc (Naperville, IL) から購入した。アメリカ培養細胞系統保存機関（the American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA）から購入したハイブリドーマＨＢ８５０６の培養培地を、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の供給源として使用した。ＥＧＦＲのカルボキシル末端ドメインに対するウサギモノクローナル抗体は、Millipore から購入した。
【００７４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌遺伝子の発現用プラスミドの構築
（１５２）に記載のｐＢＫ−ＣＭＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ部位の間にクローニングしたＥＧＦＲのｃＤＮＡを、発癌性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現ベクターの構築に使用した。最初に、エクソン１−２および７−２８に相当するＰＣＲ断片を、第１の断片用にＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶの、第２の断片用にＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩの制限部位を含むプライマーを使用して得た。これらの断片を連結した後、エクソン２−７を欠くＥＧＦＲｖＩＩＩに相当するに相当する新しい断片を得、次いで、ｐｃＤＮＡ３.１およびｐｃＤＮＡ３.１ｍｙｃベクターのＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位の間にクローニングし、ベクターｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃを各々得た。両コンストラクトを、配列解読により分析した。
【００７５】
細胞培養および形質移入
ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを研究するための放射性リガンド結合アッセイおよび免疫蛍光に使用するＨｅＬａ細胞は、我々の研究室で以前に特徴解析した（６４,１２２,１５２）。この細胞を、約８０％のコンフルエンスまで増殖させ、試験前に血清なしで４時間維持した。ＡＴＣＣからのＵ８７ヒトハイブリドーマ細胞を増殖させ、製造業者（Invitrogen）の指示に従いリポフェクタミン法を使用してｐｃＤＮＡ３.１−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃで形質移入した。１００,０００個のＵ８７細胞を１５ｍｍプレートに播き、播いてから４８時間後に、細胞を１μｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｙｃで形質移入した。形質移入の４８時間後に、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）および０.８ｍｇ／ｍｌジェネテシンを添加）を加えた（G418, Sigma）。選択培地中で２週間後、永続的に形質転換された細胞を得た（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）。
【００７６】
多形神経膠芽腫と診断された患者の生検組織からＧＢＭ１細胞を得た。腫瘍の生検組織は、約１ｃｍであった。それをＰＢＳで４回洗浄し、細かく切断し、継続的に撹拌しながら、０.１２５％トリプシン、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、１５分間、３７℃でインキュベートした。パスツールピペットによる機械的破砕後に、卓上遠心機で、１２００ｒｐｍで１０分間、細胞を遠心分離した。ペレットを、オボムコイド阻害剤（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ２ｍｌで再懸濁し、１０分間１２００ｒｐｍで再度遠心分離した。細胞をＮＨ４Ｃｌ／Ｔｒｉｓ ｐＨ７.２に再懸濁し、５分間３７℃でインキュベートし（５０００万個の細胞に５ｍｌ）、１０分間、１２００ｒｐｍでの遠心分離によりペレットにし、最終的に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに再懸濁し、培養した。これらの細胞を少なくとも１０回の継代にわたり維持した。
【００７７】
培養した腫瘍細胞のインビトロの増殖および生存能、並びに、Ｄ−プロプラノロールおよびデシプラミンによる処理の評価
細胞を、１０.０００個／ウェルの密度で、２４ウェルプレートにトリプリケートで播き、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。薬物を含む培地を、２４時間毎に交換した。各対照は、培養培地のみを受容した。４日間の処理後に、生体染色のトリパンブルーとインキュベートした後で、生きている細胞を自動細胞計測器（Countess, Invitrogen）で計数し、非処理対照に対する生存細胞の％として表す。
【００７８】
間接免疫蛍光および共局在分析
カバーガラス上で増殖させたＨｅＬａ細胞を、冷リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＥＧＦＲを細胞表面に蓄積させるために、無血清ＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ培地中、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０.１ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ−ＣＭ）中の４％パラホルムアルデヒドで、３０分間室温で固定した。ＰＢＳプラス０.２％ゼラチン（300 Bloom, Sigma Aldrich, PBS-CM-G）で各回５分間、３回洗浄した後、細胞を０.２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、１０分間、室温で透過処理し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＨＢ８５０６と１２時間、４℃でインキュベートした。ＰＢＳ−ＣＭ−Ｇで少なくとも６回洗浄した後、細胞を、Alexa488 に結合させた二次抗体抗マウスＩｇＧ（１／１０００希釈）と、３０分間、３７℃でインキュベートした。記載された通りに（１５９）、油浸レンズ Plan-Apochromat 63X/1.4 および Zeiss Axiocam カメラを備えた Zeiss Axiophot 顕微鏡で蛍光のデジタル画像を得、画像化ソフトウエア AxioVision (Zeiss, Thorn-wood, NY) を動かしているコンピューターワークステーションで１４ビットに変換した。
【００７９】
リガンド結合アッセイおよびエンドサイトーシス速度定数
放射性リガンド１２５Ｉ−ヒトＥＧＦを、クロラミンＴ法により、記載された（１２２,１５２,１６０）通りに調製し、比活性５００００−７００００ｃｐｍ／ｎｇを得た。記載された（１２２）通りに、２０ｍＭＨ ＥＰＥＳおよび０.２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むハンクス液中、１時間、４℃で、結合アッセイを実施した。４時間にわたり血清を除いたＨｅＬａ細胞を、３０分間、指示された用量の様々な薬物で処理し、次いで、２０ｎｇ／ｍｌ１２５Ｉ−ＥＧＦと、４℃で、結合培地（ＭＥＭ−ハンクス、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０.２％ＢＳＡ ＲＩＡ等級）中、１時間撹拌しながら、インキュベートした。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで２時間、室温で溶解させ、トリプリケートの各サンプルのカウント毎分をガンマカウンターで測定した。過剰（５００倍）のコールドリガンドとのインキュベーションにより得られる非特異的結合のポイントを含めて測定し、その値を各サンプルから差し引いた。飽和条件での放射性リガンド結合は、細胞表面のＥＧＦＲの量の推定値を提供する。
【００８０】
本発明の癌処置のための新規戦略の概要
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥｒｂＢ１−４またはＨＥＲ１−４と呼ばれる４つのメンバーを含むチロシンキナーゼ受容体ファミリーＥｒｂＢ／ＨＥＲに属する。ＥＧＦＲは、いくつかの特異的リガンドにより活性化され、細胞の状況に応じて、各過程または細胞増殖、分化、生存、遊走およびアポトーシスを促進できる細胞内シグナルを広める。すべてのこれらの過程は、発癌の間に変化し、頻繁に、ＥＧＦＲ過剰発現または活動亢進性の突然変異により決定される、発癌性機能不全に関連する。腫瘍細胞は、正常細胞よりも高いＥＧＦＲ阻害剤への感受性に反映される通り、そのような変化したＥＧＦＲから発せられる発癌性シグナルに文字通り中毒になる。同じことが、ヘテロ二量体の形成のために、ＥＧＦＲの発癌作用に決定的でもある他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーにも確実である。従って、ＥＧＦＲは、標的化および個人化された抗腫瘍療法の新しい薬物および戦略を開発するために、重要な標的である。処置は、感受性のバイオマーカーの腫瘍の分析により、個人化および最適化できる。今まで、戦略は、抗体によるリガンド結合または低分子による受容体チロシン−キナーゼ活性の阻害を試みて、薬物をＥＧＦＲ分子自体に向けることに集中してきた。臨床使用されている薬物には、リガンド結合を妨害するヒト化モノクローナル抗体（例えばセツキシマブおよびパニツムマブ）、および、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性部位へのＡＴＰ結合に競合し、その活性を阻害する薬物（ゲフィチニブおよびエルロチニブ）が含まれる。臨床データは、ＥＧＦＲが抗腫瘍処置の標的化および個人化の良好な標的であるという概念を支持するが、これらの薬物の効力は限定されており、通常、感受性の患者の小さい下位群に限られる。加えて、キナーゼ阻害剤に一般的な問題は、処置への耐性を与える突然変異の比較的頻繁な出現である。現在使用されているものと異なり、それを補足する作用メカニズムの、新しい医薬を持つ必要がある。
【００８１】
我々の発明は、ＥＧＦＲの細胞内挙動の薬理学的撹乱のために低分子薬を使用する、革新的な戦略を提唱する。エンドサイトーシスによる内在化を介する細胞表面からのＥＧＦＲ除去の誘導は、細胞外の活性化刺激へのその到達性を低下させ、一方で、活性化ＥＧＦＲの細胞内輸送の変化は、そのシグナル拡散の細胞内局在を変化させる。両方の選択肢が、細胞表面での過剰なＥＧＦＲシグナル伝達活性を悪性度の基礎とする腫瘍細胞にとって有害であり得る。ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する低分子薬は、ＥＧＦＲに依存する腫瘍悪性細胞の増殖および生存能を阻害できる。この戦略（図４に記載）は、新規かつ革新的である。これは、我々の研究室で得られた実験結果に基づくので、以前に使用されたことがない。我々は、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）活性の阻害剤として使用されるプロプラノロール（ＬおよびＤプロプラノロールのラセミ混合物）が、リガンドから独立して、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスおよび細胞内蓄積を誘導することを立証した（１２２）。我々は、また、この作用が、４型ホスホジエステラーゼを活性化するホスファチジン酸（ＰＡ）の増進を含むシグナル伝達経路に依存し、ｃＡＭＰの減少および結果的なＰＫＡ活性の低下を導くことも示した。我々の以前の研究は、ＰＫＡの阻害が、リソソームへの分別を遅らせることにより、活性化ＥＧＦＲの分解を遅らせることも示した。プロプラノロールは、その内容物のＬ−プロプラノロールエナンチオマーのためにベータ−ブロッカー活性を有するので、ＰＡＰ阻害を誘起するのに必要とされる高い濃度では臨床使用できない。本発明では、我々は、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスはベータ−ブロッカー活性を欠くＤ−プロプラノロールによっても引き起こされ得ることを示した。うつ病を処置するために臨床使用される別の薬物であるデシプラミンは、副作用としてＰＡＰ阻害を有し、従って、本発明でＤ−プロプラノロールの効果を高めるために使用された。ＰＡＰ阻害によるＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路の活性化後、ＥＧＦＲは内在化し、かくして、外部の分裂促進的刺激に接近不可能になる。これらの観察は、過剰発現および活性化突然変異を含むＥＧＦＲの発癌性変化に依存する癌の大部分の悪性度に対抗する新しい医薬製剤を設計するために、このＰＡ／ＰＫＡシグナル伝達経路を使用する可能性を開く。
【００８２】
この戦略の実行可能性は、我々のさらなる結果により立証される。我々は、両方ともＰＡＰ阻害剤として使用されるＤ−プロプラノロール（事実上ベータ−ブロッカー活性を欠く）およびデシプラミンが、ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導するのみならず、ＥＧＦＲ（患者由来の神経膠芽腫細胞ＧＢＭ１）または発癌性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩを形質移入されたＵ８７細胞）を過剰発現する腫瘍の癌細胞の増殖を阻害し、生存能を低下させることを観察した。これらの薬物は、また、エルロチニブおよびゲフィチニブに対して耐性の、発癌性二重突然変異ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍを発現する肺癌細胞に対しても有効である。これらの薬物に感受性である他の腫瘍細胞は、黒色腫および卵巣癌細胞であり、これらのすべては、ＥＧＦＲまたは他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーの発癌的寄与に依存すると広範に記載されてきた。Ｄ−プロプラノロールとデシプラミンの組合せは、より有効な結果をもたらす。
【００８３】
本発明は、ＥＧＦＲの他の発癌性変異体またはＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーの他のメンバー（例えばＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３またはＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４）を発現する癌に及ぶ。それは、また、既知の化合物（例えばスフィンゴシンおよびクロルプロマジン）でも、将来現れるかもしれない他の新化合物でも、ＰＡＰの阻害作用を有する他の化合物に拡張できる。本発明で提唱されるＰＡＰ阻害剤は、様々な癌の処置に使用できる。これは、肺、乳房、頭頸部および膵臓の癌など、抗ＥｒｂＢ／ＨＥＲ薬が臨床的処置に承認された癌を含む。それは、また、現在の抗ＥｒｂＢ／ＨＥＲ薬が無効であると示されたか、依然として研究中であるものであっても、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲとヘテロ二量体を形成する他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーがそれらの悪性度に寄与すると報告された癌も含む。卵巣、胃および食道、肝臓、前立腺の癌、並びに黒色腫および神経膠芽腫は、このカテゴリーに含まれる。本発明により提唱される処置は、他の処置を補足できるか、または、化学療法またはＥＧＦＲ阻害薬への耐性がすでに生じている場合、唯一無二のものであり得る。
【００８４】
要旨
本発明は、癌処置において有用な医薬製剤のための、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）の酵素活性を阻害する化合物およびそれらの組合せの使用に関する：ＰＡＰの阻害剤は、ここで、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、その発癌性変異体およびそのＥｒｂＢチロシンキナーゼ受容体ファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を、それらのエンドサイトーシスの誘導および細胞内輸送の撹乱を介して妨害するために使用され、かくして、それらが細胞外の刺激に接近できないようにし、癌の維持および進行を促進するシグナル伝達を変更する；本発明の一部であるＰＡＰ阻害剤は、Ｌ−プロプラノロールのベータ−ブロッカー活性を欠くＤ−プロプラノロールおよびデシプラミンであり、両方とも、以前に他の臨床目的で使用された；本発明は、すべての既知のＰＡＰ阻害剤および将来現れるかもしれないすべての新しいＰＡＰ阻害剤を包含する。
【００８５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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