(57)【要約】  本発明は、抗う蝕剤及び/又は抗口臭剤としての特に歯石予防のための官能的に中性な口腔ケア剤としての、微生物又はその断片に関する。本発明は、ミュータンス連鎖球菌を減少させるための微生物又はその断片を含む組成物にさらに関する。そうした組成物は、例えば、う蝕予防のための又は歯石若しくは口臭予防のための口腔ケア組成物で使用することができる。これらは、口臭の予防若しくは治療のためにも又はその代わりとして使用することができる。本発明による微生物及びその断片は臭気及び味が非常に少なく控え目であるため、これらは、歯石、う蝕、口腔バイオフィルム形成の予防のための及び/又は口臭の予防若しくは治療のための官能的に中性な薬剤として特に適する。したがってこの微生物及びその断片、さらにそうした微生物及び断片を含む組成物は、食品及び飼料組成物、特にペットフードで有利に使用することができる。さらに本発明は、そうした微生物、断片、組成物、食品及び飼料の調製方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは官能的に中性な口腔ケア剤としてのバインダー微生物又はその断片の使用であって、前記バインダー微生物が乳酸菌であり、前記バインダー微生物又はその断片がそれぞれミュータンス・ストレプトコッキィ(mutans Streptococci)の群の微生物に結合することができ、前記結合が、
(i)熱処理に抵抗性、及び/又は
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び/又は
(iii)カルシウム依存性、及び/又は
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される、及び/又は
(v)唾液の存在下で形成される、及び/又は
(vi)マグネシウムと無関係である、
使用。
【請求項２】
化粧用、医薬用又は獣医用組成物を調製するためのバインダー微生物又はその断片の使用であって、前記組成物が口腔ケア組成物であり、前記バインダー微生物が官能的に中性な量で使用され、前記バインダー微生物が乳酸菌であり、前記バインダー微生物又はその断片がそれぞれミュータンス・ストレプトコッキィの群の微生物に結合することができ、前記結合が、
(i)熱処理に抵抗性、及び/又は
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び/又は
(iii)カルシウム依存性、及び/又は
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される、及び/又は
(v)唾液の存在下で形成される、及び/又は
(vi)マグネシウムと無関係である、
使用。
【請求項３】
前記バインダー微生物又はその断片が少なくとも1種の株、好ましくは少なくとも2種の株、より好ましくは少なくとも3種の株に結合することができ、前記株がストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)及びストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)、ストレプトコッカス・ソブリナスDSMZ 20742、ストレプトコッカス・ラティDSMZ 20564、ストレプトコッカス・クリセタスDSMZ 20562、ストレプトコッカス・フェルスDSMZ 20646並びにストレプトコッカス・マカカエDSMZ 20714からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
前記バインダー微生物又はその断片が、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される少なくとも1種の、好ましくは少なくとも2種の、より好ましくは少なくとも3種の、最も好ましくは任意の微生物に結合することができない、請求項1、2又は3のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記バインダー微生物が熱失活した又は凍結乾燥した形態であり、かつ/又は
前記バインダー微生物がラクトバチルス科のもの、好ましくはラクトバチルス属、パララクトバチルス属、ペディオコッカス属若しくはシャーペア属のもの、より好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ種、ラクトバチルス・ラムノサス種、ラクトバチルス・カゼイ種若しくはラクトバチルス・ゼアエ種のもの、最も好ましくはDSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ 16671、DSMZ 16672若しくはDSMZ 16673のうちのいずれかの株、又はそれらの変異体若しくは誘導体である、前記請求項１−４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
-  好ましくは官能的に中性な抗歯石剤としての、若しくは歯石の予防又は治療のための組成物を調製するための、及び/又は
-  官能的に中性な抗う蝕剤としての、若しくはう蝕の予防又は治療のための官能的に中性な組成物を調製するための、及び/又は
-  好ましくは官能的に中性な抗口臭剤としての、若しくは口臭の予防又は治療のための組成物を調製するための、
前記請求項１−５のいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片の使用。
【請求項７】
前記微生物が、
(i)D-ラクトースを代謝するが、L-ソルボース及び/又はD-サッカロース及び/又はD-イヌリンを代謝しない、
(ii)イヌリンを代謝する、
(iii)L-ソルボースを代謝するが、D-ラクトース及び/又はD-サッカロース及び/又はイヌリンを代謝しない、及び
(iv)L-ソルボース、D-ラクトース及びイヌリンを代謝する
微生物からなる群から選択され、
好ましくは前記微生物が、
(i)D-ラクトースを代謝するが、L-ソルボース、D-サッカロース及びイヌリンを代謝しない、
(ii)L-ソルボース、D-ラクトース及びイヌリンを代謝するが、D-サッカロースは代謝しない、
(iii)L-ソルボースを代謝するが、D-ラクトース、D-サッカロース及びイヌリンを代謝しない、及び
(iv)L-ソルボース、D-ラクトース、D-サッカロースを代謝するが、イヌリンを代謝しない
微生物からなる群から選択される、前記請求項１−６のいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片の使用。
【請求項８】
前記ストレプトコッカス株への結合を以下のようにアッセイすることができる、前記請求項１−７のいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片の使用:
(a)前記微生物を定常期まで増殖させ、
(b)前記微生物を、定常期まで増殖させた前記ストレプトコッカスと混合し、
(c)ステップ(b)で得られた混合物を、前記微生物と前記ストレプトコッカスとの凝集物の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
(d)ペレットの出現によって凝集物を検出する。
【請求項９】
歯石の予防若しくは治療のための組成物の調製方法、及び/又はう蝕の予防若しくは治療のための官能的に中性な組成物を調製するための方法、及び/又は口臭の予防若しくは治療のための組成物を調製するための方法であって、
バインダー微生物又はその断片をベース組成物へ加えるステップを含み、前記バインダー微生物が官能的に中性な量で加えられ、前記バインダー微生物が乳酸菌であり、前記バインダー微生物がミュータンス・ストレプトコッキィの群の微生物に結合することができ、前記結合が、
(i)熱処理に抵抗性、及び/又は
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び/又は
(iii)カルシウム依存性、及び/又は
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される、及び/又は
(v)唾液の存在下で形成される、及び/又は
(vi)マグネシウムと無関係であり、
前記ベース組成物が化粧品として、医薬として又は獣医学的に適合する担体を含む、方法。
【請求項１０】
前記バインダー微生物が熱失活した又は凍結乾燥した形態であり、及び/又は
前記バインダー微生物又はその断片が少なくとも1種の株、好ましくは少なくとも2種の株、より好ましくは少なくとも3種の株に結合することができ、前記株がストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)及びストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)、ストレプトコッカス・ソブリナスDSMZ 20742、ストレプトコッカス・ラティDSMZ 20564、ストレプトコッカス・クリセタスDSMZ 20562、ストレプトコッカス・フェルスDSMZ 20646及びストレプトコッカス・マカカエDSMZ 20714からなる群から選択され、好ましくは、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される少なくとも1種の、好ましくは少なくとも2種の、より好ましくは少なくとも3種の、最も好ましくは任意の微生物に結合することができず、及び/又は
前記バインダー微生物がラクトバチルス科のもの、好ましくはラクトバチルス属、パララクトバチルス属、ペディオコッカス属若しくはシャーペア属のもの、より好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ種、ラクトバチルス・ラムノサス種、ラクトバチルス・カゼイ種若しくはラクトバチルス・ゼアエ種のもの、最も好ましくはDSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ 16671、DSMZ 16672若しくはDSMZ 16673のうちのいずれかの株、又はそれらの変異体若しくは誘導体である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
好ましくは分離された若しくは精製された、バインダー微生物又は分離された若しくは精製されたその断片を、
-  歯石形成を予防する若しくは歯石形成を緩徐化するのに十分な、及び/又は
-  口臭を予防する若しくは口臭の強さを低減させるのに十分な、及び/又は
-  う蝕を予防する若しくはう蝕の発生を緩徐化するのに十分な量で、
好ましくは官能的に中性な量で含む組成物であって、
前記バインダー微生物が乳酸菌であり、好ましくは前記バインダー微生物がラクトバチルス科のものであり、より好ましくはラクトバチルス属、パララクトバチルス属、ペディオコッカス属若しくはシャーペア属のものであり、さらにより好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ種、ラクトバチルス・ラムノサス種、ラクトバチルス・カゼイ種若しくはラクトバチルス・ゼアエ種のものであり、最も好ましくはDSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ 16671、DSMZ 16672若しくはDSMZ 16673のうちのいずれかの株であり、又はそれらの変異体若しくは誘導体であり、
前記バインダー微生物がミュータンス・ストレプトコッキィの群の微生物に結合することができ、前記結合が、
(i)熱処理に抵抗性、及び/又は
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び/又は
(iii)カルシウム依存性、及び/又は
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される、及び/又は
(v)唾液の存在下で形成される、及び/又は
(vi)マグネシウムと無関係であり、
好ましくは、モノグリセリド及びジグリセリドの総含有量が最大で組成物全体の20重量%、さらにより好ましくは最大で5重量%、最も好ましくは最大で2重量%である、組成物。
【請求項１２】
ヒト又は動物が使用するためのものであり、及び
-  練り歯磨き、歯磨き剤、歯磨き粉、局所経口ゲル、洗口剤、義歯製品、マウススプレー、ロゼンジ剤、経口錠剤、チューインガム、うがい薬、デンタルフロス、咀嚼製品又は食品、飼料若しくは飲料用の添加物である、又は
-  散剤、錠剤、フィルム製剤、溶液剤、エアゾール剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤若しくは流動エキス剤、シート状食品、瓶詰食品、缶詰食品、レトルト食品若しくは流動食品の形である、又は
-  ガム、スプレー、ベバレッジ、キャンディー、乳児用調整粉乳、アイスクリーム、冷凍デザート、甘いサラダドレッシング、乳調製品、チーズ、クワルク、ヨーグルト、酸乳、コーヒークリーム、ホイップクリーム、バター、チーズ、加工乳及び脱脂乳、肉製品(好ましくはハム、ソーセージ及びハンバーガー)、魚肉、ケーキ製品、卵製品(好ましくは味付けした巻き卵及びエッグカード)、菓子(好ましくはクッキー、ゼリー、スナック及びチューインガム)、パン、麺類、漬物、くん製品、魚の乾物、調味料からなる群から選択される食品又は飲料である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記バインダー微生物又はその断片がそれぞれ、
-  指令2001/18/EC(Directive 2001/18/EC)の添付書類1Bに列挙されている遺伝子改変技術を介して得られるもの以外の、好ましくは前記指令2001/18/EC(Directive 2001/18/EC)の添付書類1Bに列挙されている遺伝子改変技術を介して得られる微生物さえ除いた、前記指令2001/18/EC(Directive 2001/18/EC)の条項2(2)で定義されるような遺伝子改変微生物ではなく、
-  前記バインダー微生物の目、好ましくは科、さらにより好ましくは属、最も好ましくは種に対して異種の遺伝物質の発現から得られる産物を含まない、請求項11又は12に記載の組成物。
【請求項１４】
-  好ましくは官能的に中性な抗歯石剤としての、又はヒト若しくは動物、好ましくはペット動物における歯石の予防若しくは治療で使用するための、及び/又は
-  官能的に中性な抗う蝕剤としての、又はヒト若しくは動物、好ましくはペット動物におけるfう蝕の予防若しくは治療で使用するための、及び/又は
-  好ましくは官能的に中性な抗口臭剤としての、又はヒト若しくは動物、好ましくはペット動物における口臭の予防若しくは治療で使用するための
バインダー微生物又はその断片であって、
前記バインダー微生物が乳酸菌であり、好ましくは前記バインダー微生物がラクトバチルス科のもの、より好ましくはラクトバチルス属、パララクトバチルス属、ペディオコッカス属又はシャーペア属のもの、さらにより好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ種、ラクトバチルス・ラムノサス種、ラクトバチルス・カゼイ種又はラクトバチルス・ゼアエ種のもの、最も好ましくはDSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ 16671、DSMZ 16672又はDSMZ 16673のうちのいずれかの株であり、
前記バインダー微生物又はその断片がそれぞれミュータンス・ストレプトコッキィの群の微生物に結合することができ、前記結合が、
(i)熱処理に抵抗性、及び/又は
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び/又は
(iii)カルシウム依存性、及び/又は
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される、及び/又は
(v)唾液の存在下で形成される、及び/又は
(vi)マグネシウムと無関係である、
バインダー微生物又はその断片。
【請求項１５】
生存可能な、熱失活した又は凍結した形態の請求項14に記載のバインダー微生物であって、
-  1〜5bar、好ましくは1〜3bar、より好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中での処理、最も好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中で、121℃の温度で20分間の熱失活による処理、又は
-  少なくとも1時間-20℃での前記細胞の凍結
によって、前記熱失活した形態が獲得可能な又は獲得される、バインダー微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗う蝕剤及び/又は抗口臭剤としての特に歯石予防のための官能的に中性な口腔ケア剤としての、微生物又はその断片に関する。本発明は、ミュータンス連鎖球菌(mutans Streptococci)を減少させるための微生物又はその断片を含む組成物にさらに関する。そうした組成物は、例えば、う蝕予防のための又は歯石若しくは口臭予防のための口腔ケア組成物に使用することができる。これらは、口臭の予防又は治療のためにも、又はその代わりにも使用することができる。本発明による微生物及びその断片は臭気及び味が非常に少なく控え目であるため、これらは、歯石、う蝕、口腔バイオフィルム形成の予防のための及び/又は口臭の予防又は治療のための、官能的に中性な薬剤として特に適する。したがって、微生物及びその断片、さらにはそうした微生物及び断片を含む組成物は、有利には、食品及び飼料組成物、特にペットフードに使用することができる。さらに本発明は、そうした微生物、断片、組成物、食品及び飼料の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯を有する動物で広く知られている問題の一つに、そうした歯の虫歯がある。この問題は、サメのようには、自身の歯を脱落させて新しいセットで連続的に歯を交換することができない動物にとって特に重要である。虫歯の最も重要な原因の一つはう蝕である。口腔にコロニー形成している微生物の作用によって歯エナメル質が継続的に弱められ最終的に溶解させられることにより、う蝕性病変に至る。そしてそうした病変は、う蝕問題を悪化させるさらなる微生物のコロニー形成に適する。
【０００３】
う蝕形成に関係しない問題として口臭の発生がある。口臭は、口腔にコロニー形成している望ましくない微生物の結果であると考えられる。しかし、口臭の主因として今までに示されている単一の微生物はいない。しかし、口臭はまた歯がなくても生じ得、う蝕は口臭がなくても生じ得ることから、う蝕形成及び口臭形成は独立したプロセスであることは明らかであるように思われる。
【０００４】
特に動物における口腔衛生の別の問題は、歯石形成である。歯の上のカルシウム沈着物は、歯の表面にコロニー形成している微生物によって形成される。一般的には、7〜10日以内に、歯の上のカルシウム沈着物は肉眼で見えるほどまでに成長する。歯石は、さらなる微生物が歯にコロニー形成するのを可能にする巣を形成する。そして、これは口臭の発生、う蝕及び歯肉組織の炎症につながる。したがって、例えば歯石形成を緩徐化させることによって、歯石発生を予防する必要がある。
【０００５】
したがって、これらの問題を独立に改善する試みがしばしば行われてきた。今までで最も注目すべき、当技術分野で一般的な解決策の一つは、練り歯磨き及びうがい薬である。そうした練り歯磨き及びうがい薬は、歯にコロニー形成している微生物、特にう蝕の原因となる微生物及び/又は口臭を発生させる微生物の数を減少させる又はその活動を阻害する、抗菌的に有効な薬剤を一般に含む。しかし、う蝕及び口臭形成に相関性がないため、う蝕に対して有効な多くの薬剤は口臭の予防又は治療のためには有効でなく、逆もまた同じである。また、歯石形成に対する有効性も向上させる必要がある。
【０００６】
別の問題は、抗菌的に有効な物質は、強烈な特有の臭気又は味をしばしば示し、これが消費者及び特にペット動物によってひどく不快であるとみなされることである。したがって、口腔ケア用の組成物は、抗菌的に有効な物質に特有の味又は臭気をマスクする又は変化させるさらなる嗅覚活性剤をしばしば含む。しかし、そうしたさらなる薬剤もまた、そのいっそう強烈な特有の味又は臭気のために、消費者にたやすくは受け入れられない。これは、そうした口腔ケア組成物の製造者の使用推奨に対する、消費者の、望ましくない低コンプライアンスに帰する。
【０００７】
このコンプライアンス問題は、小児及び動物にとって特に重要である。両方とも、口腔ケア組成物を避ける又は例えば飲み込むことによってそれを誤用するずるい方法を考え出す傾向があり、その結果、抗菌的に有効な1種以上の薬剤はその意図された作用を十分に発揮することができない。特にネコ及びイヌのようなペット動物が任意の形態の医薬品に対して抵抗性を示すことがしばしば嘆かれる。また、そうした動物は、他の状態では受け付けるであろう飼料の中に隠した場合でさえも、抗菌的に有効な口腔ケア組成物を含む医薬品を避けることが知られている。加えて、例えば動物はうがいをすることできないため、口腔ケア組成物投与の特定の方法は、動物には利用できない。また、特定の口腔治療は、動物に対して特にストレスが多く、麻酔を必要とする。例えば、ネコ及びイヌのような動物は、歯石除去に猛烈に抵抗する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
要するに、口腔衛生は小児を含めたヒトにとって面倒であると考えられ、ペット動物を含めた動物にとっても同様である。したがって本発明は、従来技術の上記の問題を改善させることを意図する。特に本発明は、ヒト並びに動物及び特にペット動物に対する口腔ケア指示のコンプライアンスを増加させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、コンプライアンスを促進することにとって、歯石、う蝕の予防及び/又は口臭の予防若しくは治療に使用する1種以上の薬剤は、味及び臭いが少ないことが重要である。したがって、さらに強い調味剤又は匂い剤を添加してそうした薬剤の味及び臭気をマスクする又は変化させる代わりに、本発明は異なるアプローチに関する。口腔ケア剤特有の味及び臭気は、今まで見逃されてきた又は主として重要であるとみなされていなかった。さらに、強い特有の味又は臭気なしで、歯石、う蝕の予防及び/又は口臭の予防若しくは治療の両方に有効な薬剤が利用できることが驚いたことに判明した。そうした薬剤は、口腔ケア指示のコンプライアンスを増加させること及び特に小児を含めたヒト及びペット動物を含めた動物における口腔ケア回避行動を軽減することに有用であることも、驚いたことに発見された。また本発明は、抗歯石剤、抗う蝕剤及び/又は抗口臭剤の味又は臭気をマスクする又は変化させるために以前に必要とされたものではない、他の香料又は芳香剤を有する口腔ケア組成物の調製を可能にする。
【００１０】
本発明は、官能的（知覚的）に中性な口腔ケア剤としての微生物又はその断片に関する。本発明は、ミュータンス連鎖球菌を減少させるための微生物又はその断片を含む組成物にさらに関する。そうした微生物及びその断片、さらにそうした組成物は、歯石の治療又は予防に使用することができる。そうした微生物、断片又は組成物は、う蝕の治療又は予防にも使用することができる。これらは、口臭の予防又は治療のためにも、又はその代わりに使用することができる。本発明による微生物及びその断片は臭気及び味が非常に少なく控え目であるため、これらは、う蝕、歯石形成を含めた口腔バイオフィルム形成の予防のための及び/又は口臭の予防若しくは治療のための官能的に中性な薬剤として特に適する。したがって、微生物及びその断片さらにそれらを含む組成物は、食品及び飼料組成物、特にペットフードに有利に使用することができる。さらに本発明は、そうした微生物、断片、組成物、食品及び飼料の調製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ラクトバチルスによるS.ミュータンスの凝集を示す。
【図２】ラクトバチルスによるS.ミュータンスの凝集を示す。
【図３】ラクトバチルスによるミュータンス・ストレプトコッキィの蛍光凝集アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明によれば、官能的に中性な口腔ケア剤として有用な微生物又はその断片は、好ましくは乳酸菌である。
【００１３】
上記で示したように、乳酸菌は、特に歯石の予防及び治療のための、抗う蝕及び/又は抗口臭剤としての、官能的に中性な口腔ケア剤として使用できることが驚いたことに発見された。ヨーグルト及び他の乳製品において、乳酸菌は強い酸味のある若しくは酸性の香り及び/又は臭気を示すことが一般に知られているため、このことは期待され得なかった。
【００１４】
本発明によれば、乳酸菌は分類学的にラクトバチルス(Lactobacillales)目、及び好ましくはラクトバチルス科(Lactobacillaceae)の任意の微生物である。本発明による微生物は、それが、問題としている群又はそのより低い階級以外の分類群に属する任意の基準株よりも、この分類群内又はより低い分類階級内の基準株により類似しているならば、指定の分類群に属すると考えられ、前記分析は、プラスミド及び組み込まれていないウイルスを除いたそれら各遺伝物質の比較に基づく。したがって、ある微生物は、先のセンテンスで定義したように、ラクトバチルス目内別の科に属する種又は属の基準株と比較して、その微生物がラクトバチルス科内の種又は属の基準株に遺伝的により類似しているならば、ラクトバチルス科に属すると考えられる。
【００１５】
本発明による類似性は、Needleman-Wunschグローバルアライメントアルゴリズムを用いて評価する。このアルゴリズムは、2種の核酸配列のギャップを含めた最適アライメントをそれらの全長に沿って見つけるための標準的なアルゴリズムである。NeedlemanとWunschのアルゴリズムは、1970 J.Mol.Biol. 48、443〜453で発表され、ここで、n位のギャップに対するペナルティーは、式
ギャップ開始ペナルティー+(n〜1)×ギャップ伸長ペナルティー
に従って計算される。
【００１６】
ハンギング末端に対するペナルティーはない。
【００１７】
本発明に関連するギャップ開始ペナルティーは10.0である。本発明に関連するギャップ伸長ペナルティーは0.5である。本発明に関連する核酸配列を比較するためのスコアリング行列は、ユニタリDNA単位行列(unitary DNA identity matrix)であり、これは、各同一塩基「置換」に対してスコア1を、及びすべての他の塩基置換に対して-10000を割り当てる。配列アラインメントは、例えばEBIによって提供される公的に利用可能なツールを介して、これらのパラメーターを用いて実施することができる。
【００１８】
ラクトバチルス科の微生物に特有の特別な利点は、この微生物が、ヒト及び動物による消費に対して安全であると一般に考えられ得ることである。例えば、乳酸菌は、例えば乳加工によって食品製造で長年使用されてきた。乳酸菌は、ヒト又は動物の健康に対する危険性が低く、大量で、例えば500lの培養培地バッチで培養しやすいため、取り扱いやすくもある。特に好ましい培養方法は後述する。
【００１９】
ラクトバチルス科のメンバーの中で、本発明によれば、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、パララクトバチルス(Paralactobacillus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属又はシャーペア(Sharpea)属に属するような乳酸菌が特に好ましく、ラクトバチルス属の微生物が最も好ましい。そうした微生物は、食品及び飼料の調製において広く使用されてきた。これらは取り扱いやすく、大量に生産することができる。さらに、口腔ケア剤として、特に抗歯石剤、抗う蝕剤及び/又は抗口臭剤として、官能的に中性かつ有効な微生物を得ることができるのは、ラクトバチルス科内では特にラクトバチルス属の一つである。
【００２０】
本発明の乳酸菌は、好ましくは桿状または球状で、細長いものから短く曲がったものまで様々であり、さらに好ましくは不動性および/または無胞子性であり、発酵代謝の主要なまたは唯一の産物として乳酸を産生するものである。本発明の微生物が属するラクトバチルス属は、好ましい実施形態では、下記の特徴によって3つの主要サブグループに分割され、本発明のラクトバチルス属菌種は3つの主要サブグループのそれぞれに属することができる：
(a) ホモ発酵乳酸菌
(i) グルコースからEmbden-Meyerhof経路を経て少なくとも85％の量で乳酸（好ましくは、乳酸のL-、D-またはDL-異性体）を産生する；
(ii) 45℃で生育するが、15℃では生育しない；
(iii) 長い桿状である；および
(iv) その細胞壁中にグリセロールテイコ酸を有する；
(b) ホモ発酵乳酸菌
(i) Embden-Meyerhof経路を経て乳酸（好ましくは、乳酸のL-またはDL-異性体）を産生する；
(ii) 15℃で生育し、45℃では変動する生育を示す；
(iii) 短い桿状またはコリネ型である；および
(iv) その細胞壁中にリビトールおよび/またはグリセロールテイコ酸を有する；
(c) ヘテロ発酵乳酸菌
(i) グルコースからペントース-リン酸経路を経て少なくとも50％の量で乳酸（好ましくは、乳酸のDL-異性体）を産生する；
(ii) 二酸化炭素とエタノールを産生する；
(iii) 15℃または45℃で変わり易い生育を示す；
(iv) 長いまたは短い桿状である；および
(v) その細胞壁中にグリセロールテイコ酸を有する。
【００２１】
上記の特徴に基づいて、本発明の好ましい微生物は乳酸菌のグループ、特にラクトバチルス属、に属すると分類することができる。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明の微生物は下記の(i)〜(iv)からなる群より選択される代謝的フィンガープリントを有する：
(i) それはD-ラクトースを代謝するが、L-ソルボースおよび/またはD-サッカロースおよび/またはD-イヌリンを代謝しない；
(ii) それはイヌリンを代謝する；
(iii) それはL-ソルボースを代謝するが、D-ラクトースおよび/またはD-サッカロースおよび/またはイヌリンを代謝しない；および
(iv) それはL-ソルボース、D-ラクトースおよびイヌリンを代謝する。
【００２３】
好ましくは、本発明の微生物は下記の(i)〜(iv)からなる群より選択される代謝的フィンガープリントを有する：
(i) それはD-ラクトースを代謝するが、L-ソルボース、D-サッカロースおよびイヌリンを代謝しない；
(ii) それはL-ソルボース、D-ラクトースおよびイヌリンを代謝するが、D-サッカロースを代謝しない；
(iii) それはL-ソルボースを代謝するが、D-ラクトース、D-サッカロースおよびイヌリンを代謝しない；および
(iv) それはL-ソルボース、D-ラクトースおよびD-サッカロースを代謝するが、イヌリンを代謝しない。
【００２４】
当然のことながら、本発明の微生物は上記の代謝的フィンガープリントパターンの糖の代謝に限定されず、他の糖類を代謝する能力を備えていてもよい。
【００２５】
本発明内では、用語「微生物」は、適切な培養条件に置かれた場合に増えることができるような微生物(生存可能微生物)を指すだけではない。そうした生存可能微生物の代わりに、熱失活した又は凍結乾燥した対応する微生物も使用できることは、本発明の特別な利点である。消費者の中には、そうした生存可能微生物が彼らの健康に良いと確信しているにもかかわらず、生存可能微生物を消費するという考え又はそうした生存可能微生物を小児若しくはペット動物へ与えるという考えを嫌うものもいる可能性があるため、このことは特に有用である。本発明が口腔ケア指示のコンプライアンスを増加させることに関するため、そうした根拠のない反対にさえも対処することができることは特別な利点である。したがって、はっきりと言及されない限り、本明細書及び付随的な例、図及び特許請求の範囲は、生存可能な、熱失活した又は凍結乾燥した微生物を区別しない。
【００２６】
本発明によれば、熱失活した細胞は、好ましくは、生存可能微生物細胞を、2barの気圧の飽和蒸気存在下で、121℃の温度で少なくとも20分間オートクレーブすることで得られる。オートクレーブの方法が微生物学分野及び対応するバイオテクノロジー工学で既知の標準的な技術であるため、熱失活した微生物のそうした調製物は標準的な研究用機器を用いて得ることができる。これは、非常に迅速な技術であり、ラクトバチルス科の、特にラクトバチルス属の微生物を失活させるということが証明されている。
【００２７】
別の方法では、本発明による微生物の熱失活は、そうした細胞を-20℃の温度で凍結することによって達成することができる。そうした凍結も標準的な研究用機器を用いて実施しやすい。
【００２８】
熱失活の方法、すなわちオートクレーブ又は凍結にかかわらず、処理によって、生存可能微生物の濃度を少なくとも85%、90%又は95%に、特に好ましくは、少なくとも97%、98%、99%に、さらに特に好ましくは99,1%、99,2%、99,3%、99,4%、99,5%、99,6%、99,7%、99,8%又は99,9%に減らすことが、本発明によれば好ましい。少なくとも3桁(すなわち1000倍)、さらにより好ましくは少なくとも4桁、さらにより好ましくは少なくとも5桁で生存可能微生物の濃度を減らすようなオートクレーブ又は凍結が特に好ましい。
【００２９】
本発明の微生物の特別な利点は、微生物が、官能的に中性な口腔ケア剤、好ましくは抗歯石剤、抗う蝕及び/又は抗口臭剤としてのその有用性を、オートクレーブ又は凍結によるような失活後でさえも保持することである。そうした熱失活した形態において、本発明の微生物は、20℃(相対湿度がこの温度で80%である標準的な環境)であっても特に保管しやすい。本発明による失活した微生物は、「賞味期限」の日付を害するすることなくそうした失活形態を含む食品又は飼料を生産することを可能にするため、この保存性は特に重要である。
【００３０】
同様の利点を、本発明の凍結乾燥した微生物、すなわち凍結乾燥したラクトバチルス科の微生物、特に凍結乾燥したラクトバチルス属の乳酸微生物を用いて本発明によって得ることができる。本発明による凍結乾燥は、好ましくは、室温、すなわち16℃から25℃の間の温度で少なくとも2時間である。
【００３１】
本発明の微生物に加えて又はその代わりに、例えば、生存可能な、熱失活した又は凍結乾燥した形態でそれらの断片を使用することができる。微生物の断片化は、当技術分野で既知の標準的な方法を用いて、特に細胞の溶解及び/又は低温殺菌によって容易に実施することができる。その熱失活した及び/又は凍結乾燥した形態を含めた本発明による微生物を溶解又は断片化するのに用いる方法は、特に問題はない。例えば、好ましくは1種以上のプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼK、リパーゼ又はグリコシダーゼによる酵素処理を含めた化学的方法の中から適切な方法を選択することができる。他の化学物質についての非限定例は、イオノフォア、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、酸又は塩基であり、物理的手段の非限定例は、フレンチプレスのような高圧、容量モル濃度及び例えばガラス又は鉄ビーズを用いる摩砕である。熱失活した及び/又は凍結乾燥本発明による微生物及びその断片を産生するための特に好ましい方法は、WO 2006/027265 A1、25〜28頁及びWO 2009/149816 A1、28〜34頁に記載されている。「本発明の微生物の断片」は、本発明の微生物の任意の細胞部分を包含する。好ましくは、前記断片は、膜調製によって得られる膜画分である。ラクトバチルス科、好ましくはラクトバチルス属に属するバインダー微生物の膜調製物は、当技術分野で既知の方法によって、例えばRollanらInt. J. Food Microbiol. 70 (2001)、303〜307、Matsuquchiら、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003)、259〜266、又はStentzらAppl. Environ. Microbiol. 66 (2000)、4272〜4278、又はVarmanenらJ. Bacteriology 182 (2000)、146〜154に記載されている方法を用いて得ることができる。別の方法では、全細胞調製物も想定される。好ましくは、本明細書に記載される本発明のバインダー微生物の断片は、ミュータンス連鎖球菌及びより好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)に特異的に結合する能力を保持し、このことは本明細書に詳しく記載されている。
【００３２】
本発明で使用する微生物、すなわち、それらのそれぞれ熱失活した又は凍結乾燥した形態の及びその断片を含めた、好ましくはラクトバチルス科又はラクトバチルス属の乳酸菌は、好ましくは抗う蝕剤として使用される。本発明によれば、用語「抗う蝕剤」は、それがヒト又はイヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット若しくはサルのようなペット動物を含めた動物の口腔内に単に存在することによって新しいう蝕性病変が発生する危険性を軽減する、任意の薬剤と定義される。抗う蝕剤として使用される微生物は、それ自体が抗菌的に有効である必要がないことは、本発明の特別な利点である。したがって本発明によれば、共培養において、抗う蝕剤として使用される微生物又はその断片が、う蝕を発生させる微生物、特にミュータンス・ストレプトコッキィ(ミュータンス連鎖球菌)の群に属する微生物の数を減らす必要はない。
【００３３】
したがって、抗う蝕剤として使用される微生物は、ヒト又は動物、特にペット動物の口腔の通常の細菌叢に対して非常に限られた影響しか有さないことは、本発明による別の利点である。適切な微生物を以下に記載する。
【００３４】
本発明で使用する微生物、すなわち、それらのそれぞれ熱失活した又は凍結乾燥した形態及びその断片を含めた、好ましくはラクトバチルス科又はラクトバチルス属の乳酸菌が、抗歯石剤として好ましくは使用される。本発明によれば、用語「抗歯石剤」はヒト又はペット動物を含めた動物の口腔内に単に存在することによって歯石が発生する危険性を軽減する、又はさらなる歯石発生を緩徐化する任意の薬剤と定義される。本発明の抗歯石剤は、歯の上に既に形成している歯石を実際に除去する必要はない。
【００３５】
また、本発明で使用する微生物、すなわち、それらのそれぞれ熱失活した又は凍結乾燥した形態及びその断片を含めた、好ましくはラクトバチルス科又はラクトバチルス属の乳酸菌が、抗口臭剤として好ましくは使用される。本発明によれば、用語「口臭」は、口腔内に起こる任意の不快な臭気を示す。したがって、この用語は、「臭い息」とも称される、疾病とみなされない弱い形態の悪臭、さらに、例えばその強さ又は臭いが原因で疾病症状とみなされるような悪臭の形態の両方に、本発明によって使用される。そうした後者の口臭形態は、口臭症とも呼ばれる。臨床的に意義のある口臭形態、すなわち口臭症は、様々な原因があり得る。全口臭形態に関して最も注目すべき点は、口腔にコロニー形成している微生物による感染症であり、そうした微生物は、有機物、例えば死んだ上皮細胞、他の微生物又は食品若しくは飼料の残留物を消化する。好ましくは、それが臨床的に意義のない臭い息又は臨床的に意義のある口臭症であろうとなかろうと、本発明は、口臭の発生を遅らせる及び/又は口臭の強さを軽減する若しくはその臭いを変化させることになる。しかし、本明細書ではっきりと言及されない限り、用語「口臭」は、口腔を超えて、例えば食道又は胃で起こる悪臭はカバーしない。そうした悪臭は、例えばげっぷ中に目立つ可能性がある。
【００３６】
本発明内では、用語「口腔」は、唇及び歯から口蓋垂まで延びる腔(口蓋垂は含まない)を示す。
【００３７】
口は、口腔粘膜(歯茎、唇、頬、口蓋及び口底)、舌及び(人工構造物を含めた)歯で構成される、哺乳動物、好ましくはヒト又はペットなどの動物の口腔を規定する。
【００３８】
また本発明によれば、用語「官能的に中性な」は、相違なし、わずかに変化した、目立って変化したから明らかに変化したまでの尺度に基づいて判断する場合、10名の熟練した官能試験員のうち最大で5名が全粒小麦粉と本発明による微生物及び/又は断片とのそうした混合物の味及び臭いが目立って変化したとみなすように、2重量%までの全粒小麦粉に置き換わることができるような薬剤と定義される。好ましくは、10名の官能試験員のうち最大で5名がそうした混合物の味及び/又は臭いが目立って変化したとみなすように、5重量%までの全粒小麦粉が微生物及び/又はその断片に置き換えられる得る。
【００３９】
本発明によれば、したがって、
- (a)官能的に中性な量でもあり(b)ヒト又は動物の口腔内のミュータンス連鎖球菌を減少させるために有効な及び/又は口臭を減少させるために有効な量でもあるバインダー微生物又はその断片(ここで、微生物は乳酸菌である)
を含む組成物も提供する。
【００４０】
官能的に中性な薬剤によって抗う蝕効果を発揮するためには口腔内のミュータンス連鎖球菌を減少させるためにバインダー乳酸菌を使用することで十分であることを、驚いたことに発見した。上記のように、そうしたバインダー乳酸菌、その熱失活した又は凍結乾燥した形態、さらにそうしたバインダー乳酸菌の断片は、抗微生物効果を有さない、すなわち、う蝕性微生物それ自体を殺さない又はその増殖を抑制しない、抗う蝕剤として使用することができる。代わりに、バインダー微生物又はその断片が、1種以上のミュータンス連鎖球菌種に結合することで十分である。そうした結合は、結合したミュータンス連鎖球菌の凝集をもたらすことができ、そしてこの凝集は、通常の唾液の飲み込みによって及び飲食中に口腔から除去される。WO 2008/074473 A2に記載されているように、ミュータンス連鎖球菌の口腔からの除去は、口腔内及び歯の上でバイオフィルムが形成される危険性を有意に軽減し、それによって、う蝕が発生する危険性を間接的に低下させる。これは、WO 2006/027265 A1に記載されているように、ストレプトコッカス・ミュータンスに結合するようなバインダー微生物にも特に当てはまる。しかし、そうしたバインダー微生物が官能的に中性な薬剤として、すなわち上記及び以下に詳述するような官能的に中性な濃度で使用できることは今まで知られていなかった。また、ミュータンス連鎖球菌、特にストレプトコッカス・ミュータンスへのそうした結合が口臭発生の危険性を軽減できることは、今まで知られていなかった。
【００４１】
本発明によれば、したがって組成物は、ミュータンス連鎖球菌群に属する細菌に特異的に結合することができる微生物又はその断片を含むことが好ましく、特異的結合は、
(i)熱処理に抵抗性、及び/又は
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び/又は
(iii)カルシウム依存性、及び/又は
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される、及び/又は
(v)唾液の存在下で形成される。
【００４２】
本発明に関連する用語「特異的結合」は、バインダー微生物又はその断片、好ましくはラクトバチルス科に属する、より好ましくはラクトバチルス属の微生物(又は対応する断片)が、ミュータンス連鎖球菌に属する1種以上の株に、好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスに結合するが、他の多くに結合しないこと、好ましくはストレプトコッカス属に属する他の種と結合しないことを意味する。すなわち、バインダー微生物又はその断片は、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)及び/又はストレプトコッカス・ミチス(Streptococcus mitis)及び/又はストレプトコッカス・サンギニス(Streptococcus sanguinis)種に属する細菌に好ましくは結合しない。さらにより好ましくは、バインダー微生物は、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)種に属する細菌にも、より好ましくはサーモフィラス(thermophilus)亜種に属する細菌にも結合しない。より好ましくは、バインダー微生物又はその断片は、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及び/又はストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567に結合しない。さらにより好ましくは、バインダー微生物又はその断片は、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラスにも結合しない。
【００４３】
特異的結合反応は、その断片を含めた本発明のバインダー微生物によって、本明細書に記載のようにストレプトコッカス・ミュータンス又は他のミュータンス連鎖球菌細胞を口内で結合及び好ましくは凝集させることを含む。その結果、この特異的結合は、例えば本明細書に記載のように唾液の流れによって又は洗口剤若しくはうがい薬などによって、この結合細胞を洗い流すことにつながる。好ましくは、ストレプトコッカス・ミュータンス及び/又は他のミュータンス連鎖球菌への本発明のバインダー微生物及びその断片の特異的結合反応は、そうしたストレプトコッカス細胞が一つ以上の歯の表面へ付着することを防止する、又は理論に束縛されるものではないが、一つ以上の歯の表面からストレプトコッカス細胞を剥離することにつながり得る。その結果、特異的結合反応は結合したストレプトコッカス細胞を口の外へ洗い流すことになり、それによってバイオフィルム形成の原因菌を減少させるため、う蝕を予防及び/又は治療する。
【００４４】
バインダー微生物又はその断片は、抗原B、IF、P1、SR、MSL-1又はPAcとしても知られる連鎖球菌(streptococcal)抗原I/IIに特異的に結合することができると考えられている。しかし、バインダー微生物又はその断片は、S.ミュータンスの任意の他のタンパク質又は表面構造に結合することができ、それによって、本明細書に記載のようにS.ミュータンスを凝集させて、口腔からそれを洗い流すことができる。ストレプトコッカス・ミュータンスは、前記連鎖球菌抗原I/IIを介してペリクルに結合することが知られている。したがって、本発明のバインダー微生物が、例えば前記連鎖球菌抗原I/IIに結合することができる場合は、ストレプトコッカス・ミュータンス又は別の各ミュータンス連鎖球菌は歯の表面に結合するのを妨害され、故にこれは、う蝕の予防及び/又は治療に役立つ。
【００４５】
ペリクルは、唾液中に見出される、タンパク質及び脂質を含有する透明な薄膜である。これは、歯の表面をきれいにした後数秒以内に形成される。ペリクル形成は、歯垢形成の第一段階である。歯垢は、歯の上に蓄積するやわらかい沈着物である。歯垢は、ミリグラムあたり1010を超える細菌を有する複雑な微生物群落と定義することができる。歯垢には400もの数の異なる細菌種が見出され得ると推定されている。細菌細胞に加えて、歯垢は、少数の上皮細胞、白血球及びマクロファージを含む。これらの細胞は、細菌性産物及び唾液から形成される細胞外マトリックス内部に含まれる。細胞外マトリックスは、タンパク質、多糖及び脂質を含む。唾液に存在するタンパク質のうちの一つにアグルチニンがあり、一方では、これは、ミュータンス連鎖球菌を口から部分的に除去することにつながると考えられているが、他方ではミュータンス連鎖球菌の歯の表面への固着を促進し、それによってストレプトコッカス細胞の歯への初期の付着が促進され、それによりう蝕の発生が促進されることが疑われている。
【００４６】
好ましくは、上記の乳酸菌群に属するバインダー微生物又はその断片は、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)及び/又は血清型e(NCTC 10923)及び/又は血清型f(NCTC 11060)及び/又はストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)DSMZ 20742及び/又はストレプトコッカス・ラティ(Streptococcus ratti)DSMZ 20564及び/又はストレプトコッカス・クリセタス(Streptococcus cricetus)DSMZ 20562及び/又はストレプトコッカス・フェルス(Streptococcus ferus)DSMZ 20646及び/又はストレプトコッカス・マカカエ(Streptococcus macacae)DSMZ 20714に特異的に結合することができる。
【００４７】
このことは、乳酸菌群に属する上記のバインダー微生物又はその断片は、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、血清型e(NCTC 10923)、血清型f(NCTC 11060)、ストレプトコッカス・ソブリナスDSMZ 20742、ストレプトコッカス・ラティDSMZ 20564、ストレプトコッカス・クリセタスDSMZ 20562、ストレプトコッカス・フェルスDSMZ 20646及びストレプトコッカス・マカカエDSMZ 20714からなる群から選択される少なくとも1種の微生物に好ましくは結合することを意味する。より好ましくは、乳酸菌群に属する上記のバインダー微生物又はその断片は、上記の細菌の任意の組み合わせ、群又は亜群に結合する。さらにより好ましくは、上記の乳酸菌群に属するバインダー微生物又はその断片は上記の細菌すべてに結合する。本発明によれば、「血清型」は、当技術分野で既知の血清学的方法によって同定される、細菌細胞の、好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス又はストレプトコッカス・ソブリナス細胞の抗原特性である。
【００４８】
上記のように、ミュータンス連鎖球菌及び好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスに対するバインダー微生物又はその断片の特異的結合は、好ましくは熱処理に抵抗性である。したがって、熱、例えば55℃より高い温度、さらにより好ましくは65℃を超える温度、特に好ましくは95℃を超える温度、最も好ましくは121℃で本発明のバインダー微生物を処理した場合でも、結合は無効にならない。冷却後、本発明のバインダー微生物又はその断片がミュータンス連鎖球菌に特異的に結合する能力を、本明細書に記載のように決定する。
【００４９】
対応する温度は、特定のバインダー微生物種に依存し得るが、ルーチンな実験によって、例えば対応する細胞を様々な温度でインキュベートして、本明細書に示すような方法を用いてミュータンス連鎖球菌及び/又はストレプトコッカス・ミュータンスに依然として特異的に結合することができるバインダー細胞又はその断片の量を決定することによって、当業者が容易に決定することができる。一般に、熱処理は少なくとも1分間続けるべきである。好ましくは、熱処理は、少なくともn分間続ける(ここで、nは2から60の範囲の整数であり、n=20が特に好ましい)。しかし原理上は、インキュベーション時間には上限がない。しかし、4、3、2又は1時間よりも長くないことが好ましい。最も好ましい熱処理は、2barの気圧の飽和蒸気中で121℃の温度で少なくとも20分である。したがって、オートクレーブすることによって得られる本発明のバインダー微生物の熱失活した形態が特に好ましい。最も好ましい熱処理は、タンパク質のあらゆる機能及び細胞のあらゆる活力を無効にすると考えられ、したがってこのことが、S.ミュータンスに依然として特異的に結合できるという点において、本発明の微生物を他の微生物と区別する。それ故、微生物が生存しているべきでないと望む場合に、本発明の任意の食品、飼料、飲料又は組成物にとって、熱処理は非常に有用である。
【００５０】
バインダー微生物又はその断片の特異的結合は、そのプロテアーゼ処理抵抗性によって、さらに好ましくは特徴付けられる。好ましくは、結合は、プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及びキモトリプシンからなる群から選択される1種以上のプロテアーゼ処理に抵抗性である。これらのプロテアーゼは特異性を示さないため、微生物の細胞表面上にある任意のタンパク質を分解すると考えられる。アミノ酸残基の特定のパターンに対して優先性を有することが知られている他のプロテアーゼは、エラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン(dostripain)、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン、カテプシンDである。後者のプロテアーゼは、S.ミュータンス又は別のミュータンス連鎖球菌へのバインダー微生物又はその断片の特異的結合が後者のより特異的なプロテアーゼに抵抗性であるかどうかを試験するのにも使用することができる。したがって、本明細書に組み込まれるWO 2008/074473 A2又はWO 2006/027265 A1の実施例に記載されているプロテアーゼ処理の後に、バインダー微生物又は断片はストレプトコッカス・ミュータンス/ミュータンス連鎖球菌に依然として特異的に結合することができる。
【００５１】
加えて、バインダー微生物又は断片の特異的結合は、そのカルシウム依存性によってさらに好ましくは特徴付けられる。好ましくは、特異的結合は0.05mMから500mMの間、好ましくは1mMから100mMの間のカルシウムイオン濃度の存在下で起こる。特に好ましいカルシウム濃度は、2mMから30mMの間である。特異的結合のカルシウム依存性は、本明細書に組み込まれるWO 2008/074473 A2又はWO 2006/027265 A1の実施例に記載されているように試験することができる。さらに、バインダー微生物又は断片への特異的結合は、4.0から9.0の間の、好ましくは4.0から7.0の間のpH範囲にわたって好ましくは維持される。特に、特異的結合が依然として起こるpH値は、好ましくは4.5である。上記のpH範囲にわたる特異的結合の維持のアッセイは、上記の実施例に示される。
【００５２】
特異的結合は好ましくはマグネシウムと無関係である。したがって、マグネシウムイオン又はマグネシウム塩が存在する必要はない。
【００５３】
特異的結合の別の好ましい特徴は、唾液の存在下でそれが起こることである。唾液は、唾液腺によって合成される外因性の分泌物である。これは、約99%の水の他に、多様々な有機化合物及び無機化合物を含む複雑な液体である。唾液の生理的成分は、特に、酵素(例えばアミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ)又はタンパク質(例えばムチン、ラクトフェリン、プロリンリッチタンパク質、シスタチン、ヒスタチン若しくはスタテリン)又は可溶性IgAである。このように、唾液には種々の潜在的な干渉物質が存在するが、本発明の微生物の特異的結合は、乱される又は妨害されることはなかった。唾液の存在下で特異的結合を試験するためには、好ましくは上記のストレプトコッカス種を含む唾液を使用するのが好ましい。しかし、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)種を、S.ミュータンスへの特異的結合について唾液の存在下で試験する場合は、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラスを除外するのが好ましい。特異的結合は本明細書に記載のようにアッセイする。乳酸菌群に属するバインダー微生物又はその断片の前述の特徴は、該微生物又は断片は、う蝕の予防及び/又は治療するための強力且つ有効な薬剤になる。なぜらなら、該微生物又は断片は、特に、特定のプロテアーゼを含み、炭水化物含有食糧を摂取した後は低pH値である唾液が存在する口腔及び歯を含めた口に様々な形態で主に投与されるためである。さらに、熱抵抗性には、本発明の微生物を、前記食品又は飼料を調製する間に食品又は飼料へ添加物として添加する際に有益な効果がある。すなわち、食品又は飼料は、微生物の生存能に害となる加熱殺菌、予備調理、低温殺菌などが行われることが多い。
【００５４】
本発明のバインダー微生物及び/又はそれらの対応する断片は、1種以上のミュータンス連鎖球菌及び好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスに特異的に結合することができ、ここでは特異的結合は
(i)熱処理に抵抗性、及び
(ii)プロテアーゼ処理に抵抗性、及び
(v)唾液の存在下で形成される
である。
【００５５】
そうしたバインダー微生物及びその断片は、前述の利点を兼ね備える。特に、その特異的結合が熱処理に抵抗性であるので、殺菌のために熱処理される産物中にこれらを組み込むことができ、それによって、微生物のその断片によって産物へ与えられた口腔衛生の特性を壊すことなく、好ましくは産物の抗歯石効力、抗う蝕効力又は抗口臭効力を壊すことなく、産物の貯蔵寿命を延ばす。また、プロテアーゼ抵抗性のため、そうした産物を熱処理してタンパク質を変性する前でさえも、バインダー微生物及び断片を異なる組成物の様々な産物に組み込むことができる。そして重要なことに、唾液存在下での特異的結合の形成は、口腔から唾液を出さないような産物中でもバインダー微生物及びその断片の使用を可能にする。そして、消費者は口腔の乾燥につながるであろう産物を使用するのを嫌う傾向があるので、この能力は、特に小児及びペット動物を含めた動物における消費者コンプライアンスを増加させる。
【００５６】
これらの理由から、本発明のバインダー微生物及び/又はそれらの対応する断片は、1種以上のミュータンス連鎖球菌及び好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスに、さらにより好ましくは特異的に結合することができ、特異的結合は、
(i)2barの気圧の飽和蒸気中で121℃の温度での20分間の熱処理に抵抗性であり、
(ii)プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及びキモトリプシンから選択される1種以上の酵素処理に抵抗性であり、
(v)唾液の存在下で形成される。
【００５７】
好ましくは、本発明のバインダー微生物及び/又はそれらの対応する断片の特異的結合はまた、
(iii)カルシウム依存性であり、
(iv)4.5から8.5の間のpH範囲内で形成される。
【００５８】
ミュータンス連鎖球菌へのバインダー微生物及びその断片の結合を測定する方法は、本明細書に組み込まれるLangら(2010) Journal of Dental Research 89(2) 175〜179に記載されている。
【００５９】
好ましくは、バインダー微生物又はその断片の特異的結合は以下のようにアッセイすることができる。
【００６０】
(a)前記バインダー微生物を定常期まで増殖させ、又は断片を試験する場合はそうした断片を獲得し、
(b)前記バインダー微生物又は断片を定常期まで増殖させたミュータンス連鎖球菌と混合し、
(c)ステップ(b)で得られた混合物を、前記微生物と前記ストレプトコッカスとの凝集物の形成を可能にする条件下でインキュベートして、
(d)ペレットの出現によって凝集物を検出する。
【００６１】
好ましい実施形態では、そうしたアッセイに用いるミュータンス連鎖球菌群に属する細菌はストレプトコッカス・ミュータンスである。ミュータンス連鎖球菌への特異的結合に関しては、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、さらにより好ましくはすべての微生物への結合を、好ましくは検出することができない。
【００６２】
特に、好ましくはラクトバチルス科の、さらにより好ましくはラクトバチルス属の乳酸菌群に属するバインダー微生物又は対応する断片は、ミュータンス連鎖球菌と3:1から60:1(ミュータンス連鎖球菌:バインダー微生物)の細胞対細胞の比で好ましくは混合する。バインダー乳酸菌とミュータンス連鎖球菌はどちらも、液体培養で定常期まで増殖させる。好ましくは、光学密度を600nmの波長で光学的に測定する。上記の比は1:50から1:2.5までのコロニー形成単位の比に相当する。好ましくは、1mlでのOD600=1は、3×108コロニー形成単位のミュータンス連鎖球菌に相当する。好ましくは、1mlでのOD600=1は、7×109コロニー形成単位の乳酸菌に相当する。好ましくは、ペレット化によって凝集反応をアッセイするためには、細菌を15mlのファルコンチューブに2mlの容量で入れる。必要ならば、この培養懸濁液をPBSバッファーで希釈して上記の容量比を得るが、最終容量は2mlで維持する。
【００６３】
好ましくは、ストレプトコッカスとバインダー乳酸菌又はその断片との混合液を約15秒間ボルテックスし、次に少なくとも5、10、15分間、より好ましくは20分間室温で、すなわち16℃から25℃の間の任意の温度で静置する。凝集は、懸濁液の直接的な濁りとして視認可能であり、少なくとも20分後には、凝集は、目に見えるペレットとして沈降する凝集物によって視認可能であるが、一方非ミュータンス連鎖球菌凝集混合物は懸濁状態のままである。対照として、各バインダー細菌又は断片及びミュータンス連鎖球菌株の自己凝集を、ミュータンス連鎖球菌又はバインダー微生物/断片のいずれかを除外することでアッセイすることができる。
【００６４】
上記のアッセイによるバインダー微生物及びミュータンス連鎖球菌の凝集は、Langら(2010) Journal of Dental Research 89(2) 175〜179に記載されているように又は遠心分離(例えば500×gで30秒間)によって、形成された凝集物を分離することで定量することができる。続いて、上清中に残った非凝集細胞の量を測定することによって、凝集量を測定することができる。この測定は、当業者に既知の任意の適切な方法によって行うことができる。好ましくは、この測定は特定量(例えば1ml)の上清を取り出すことによって行う。続いて、取り出した上清の光学密度を、当業者に既知の任意の適切な波長、例えば600nmで測定することができる。乳酸桿菌(ラクトバチルス菌、lactobacilli)を用いない対応する対照試験の値を引いた後の測定値は、凝集しなかった細胞の量を示す。
【００６５】
本発明による特異的結合を測定するための方法は、WO 2008/74473 A2の実施例4(該刊行物の実施例1に挙げられている各微生物の培養のための対応する指示を含む)に記載されている。両方の実施例は、本発明による特異的結合を測定するための方法を開示する目的で、本明細書に組み込まれる。
【００６６】
別の方法では、自己凝集の起こり得る問題に対処するために、染色剤、好ましくは蛍光染色剤を用いることができる。したがって、さらに好ましい実施形態では、特異的結合は以下のようにアッセイすることができる。
【００６７】
(a)前記微生物を定常期まで増殖させ、
(b) 前記微生物を、定常期まで増殖させて適切な染色剤、好ましくは蛍光染色剤を用いて染色したミュータンス連鎖球菌群に属する細菌と混合し、
(c)ステップ(b)で得られた混合物を、前記微生物とミュータンス連鎖球菌群の細菌との凝集物の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
(d)染色、好ましくは蛍光染色を検出することによって凝集物を検出する。
【００６８】
重ねて、好ましい実施形態では、そうしたアッセイで用いるミュータンス連鎖球菌群に属する細菌はストレプトコッカス・ミュータンスである。
【００６９】
好ましくは、凝集アッセイは、最初にバインダー微生物及びミュータンス連鎖球菌を上記のように定常期まで増殖させるという点で行うことができる。好ましくは、光学密度を600nmの波長で光学的に測定する。好ましくは、1mlでのOD600=1は、3×108コロニー形成単位の各ミュータンス連鎖球菌に相当する。好ましくは、本明細書に記載のように、1mlでのOD600=1は、7×109コロニー形成単位の、特にラクトバチルス科の、さらにより好ましくはラクトバチルス属のバインダー微生物に相当する。
【００７０】
続いて、ミュータンス連鎖球菌を染色する。さらなる好ましい実施形態では、バインダー微生物は染色するが、一方連鎖球菌は染色しない。染色剤として、任意の適切な染色剤が使用でき、好ましくは当業者に既知の蛍光染色剤を使用することができる。好ましくは、特異的又は非特異的蛍光染色剤を使用することができ、例えばインタクトな細胞を染色するためにCFDA-SEを使用することができ、他の有用な染色剤には、カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、BCECF AM及びカルセインAMが含まれる。具体的には、細胞を、例えば遠心分離(好ましくは3200×gで5分間)によって回収する。続いて、得られたペレットは、当業者に既知の任意の適切なバッファー中に、好ましくはPBSバッファー中に再懸濁することができる。バッファーの量は、得られる懸濁液が例えば4.2/mlのOD600を有するように計算することができる。続いて、適切な染色剤で、例えば蛍光染色剤、好ましくは5,6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル(CFDA-SE)、より好ましくは2μlのCFDA-SE溶液(Invitrogen)と懸濁液とを混合することができる。続いて、細胞を、当業者に既知の適切な時間、例えば2時間、当業者に既知の適切な温度、例えば37℃でインキュベートすることができる。さらなるステップでは、染色された細胞を、例えば遠心分離によって回収することができる。好ましくは、遠心分離は3200×gで5分間行う。次に、細胞を、当業者に既知の適切なバッファーに、例えば2mlのPBSバッファー中に再懸濁することができる。
【００７１】
凝集のために、バインダー微生物をミュータンス連鎖球菌と3:1から1:3(ミュータンス連鎖球菌:バインダー微生物)の容量比で好ましくは混合する。より好ましくは、混合物の容量比は1:1である。上記の比は、1:50から1:150までのコロニー形成単位の比に相当する。染色測定、好ましくは蛍光測定を介して凝集反応をアッセイするために、バインダー微生物及びミュータンス連鎖球菌を、当業者に既知の任意の適切な容量で、好ましくは50μlの容量で使用する。好ましくは、混合はマイクロタイタープレート、例えば96ウェルマイクロタイタープレート中で行う。続いて、この混合物を、好ましくは12分間全速でボルテックスすることができる。その後、この混合物を、例えば10秒間500×gで遠心分離することができる。次に、上清を除去することができ、当業者に既知の任意の適切なバッファー中に、好ましくはPBSバッファー中に、任意の適切な容量で、例えば100μlでペレットを再懸濁することができる。この懸濁液の染色は、当業者に既知の任意の適切な方法によって混合物中で測定することができる。好ましくは、蛍光の場合は、例えば励起については495nmの波長及び発光については525nmの波長で、蛍光リーダー中で蛍光を検出することができる。対照として、バインダー微生物のみ及び染色されたミュータンス連鎖球菌のみをアッセイすることができる。任意のバックグラウンド染色、例えば蛍光は、試験されるミュータンス連鎖球菌のみについて測定することができ、各バインダー微生物を含む凝集に対する値から好ましくは引くことができる。バックグラウンド染色、例えば本明細書の上記のように測定した蛍光を、本明細書の上記のようなバインダー微生物含有試料及び本明細書の上記のような試験されるミュータンス連鎖球菌において測定した染色、例えば蛍光から引き、得られた値が少なくともゼロを超える場合は、凝集効果がある。より好ましくは、本明細書の上記のように行われる一連の試験において得られた値が再現性よくゼロを超える場合は、凝集効果がある。「一連の実験」は、少なくとも2、好ましくは3、より好ましくは4、最も好ましくは5回の試験を意味する。
【００７２】
結合試験の代替方法は、WO 2008/074473 A2の実施例5に記載されているように実施することができ、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７３】
バインダー微生物の断片に関しては、結合は、基本的には、上記のような生存可能な又は失活させられたバインダー微生物と同様に測定する。バインダー微生物細胞の代わりに結合測定又は本発明による食品又は飼料組成物の調製に使用される断片の量は、生存可能な又は熱失活したバインダー微生物の細胞壁物質の量と好ましくは同じである。例えば、バインダー微生物内容物のペプチドグリカン含量は、適切な色素を用いて測定することができ、そうした色素測定に基づいた同じ量の断片を使用することができる。
【００７４】
上記結合性（バインダー）微生物は好ましくはラクトバチルス属に属する乳酸菌であり、さらに好ましくは本明細書に記載するラクトバチルス属種である。より好ましくは、前記のラクトバチルスはラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）またはラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）に属する。しかし、ラクトバチルス属の菌種はこれらに限定されない。上記結合性の微生物は好ましくは「分離された」または「精製された」ものである。「分離された」とは、その物質がもとの環境（例えば、それが自然界に存在するのであれば、自然環境）から分離されていることを意味する。例えば、自然界で共存する物質の一部または全部から分離された、自然界に存在する微生物（好ましくは、ラクトバチルス属の菌種）は分離されている。そのような微生物は組成物の一部であってもよく、該組成物がその自然環境の一部でないという点で依然として分離されていると考慮される。したがって純粋培養により生育された微生物は依然として分離（単離）された微生物と判断される。同様に、本発明の微生物の断片は、対応する微生物の少なくとも一部の物質から分離されていれば、「分離」されたものと判断される。
【００７５】
「精製された」という用語は完全精製を必要とせず、むしろ相対的な定義を意図している。ライブラリーから得られる個々の微生物は通常、微生物学的に均一になるまで精製されており、すなわち、それらは当技術分野で公知の方法により寒天プレート上にストリークしたとき単一のコロニーとして増殖する。好ましくは、この目的で使用する寒天プレートは乳酸菌に対して、とくに好ましくはラクトバチルス属種に対して選択的である。そのような選択的寒天プレートは当技術分野で公知である。
【００７６】
断片を取得するには、当技術分野で既知の方法、例えば超音波破砕、フレンチプレス又はボールミル粉砕、により生存している又は熱不活化された結合性微生物細胞を破裂され、断片を遠心分離により他の細胞残渣から分離することが好ましい。断片のペレットは次いで再度洗浄および遠心分離することができ、これにより断片のペレットを取得する。
【００７７】
より好ましくは、上記乳酸菌の群に属する結合性の微生物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）及びラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）からなる群から選択され、これらは、それぞれ、DSMZ受託番号DSMZ 16667 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-KI), DSMZ受託番号DSMZ 16668 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K2), DSMZ受託番号DSMZ 16669 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K3), DSMZ受託番号DSMZ 16670 (L. paracasei ssp. paraca-sei Lb-Ob-K4), DSMZ受託番号DSMZ 16671 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K5), DSMZ受託番号DSMZ 16672 (L. rhamnosus Lb-Ob- K6) and DSMZ受託番号DSMZ 16673 (L. rhamnosus Lb-Ob-K7)を有するものであるか又はこれらの変異体若しくは誘導体、ここで前記変異体若しくは誘導体はミュータンス・ストレプトコッキィ(mutans Streptococci)に特異的に結合する能力を保持するものである。「DSMZ受託番号を有するラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）もしくはラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）」という用語は、the Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に2004年8月26日に寄託されて、次の寄託番号DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672または16673を有するラクトバチルス・パラカゼイ菌またはラクトバチルス・ラムノサス菌に属する微生物の細胞に関する。DSMZはMascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germanyに所在する。上記のDSMZ寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準じて行われたものである。
【００７８】
乳酸菌の群に属する上記の結合性の微生物（好ましくは、寄託されたラクトバチルス・パラカゼイまたはラクトバチルス・ラムノサス細胞）の「変異体または誘導体」は、それぞれの寄託菌株と同じ特性を好ましくは有する。すなわち、それはミュータンス・ストレプトコッキィと特異的に結合する能力を、好ましくは本明細書記載のような結合特性と共に、保持している。例えば、前記誘導体は遺伝子工学的に作製することができる。本発明との関連において、「遺伝子工学的に作製する」という用語は、最も広い意味では、目的の核酸を組換えDNA法によりin vitroおよびin vivoで改変する（その結果、遺伝的改変が生じ、遺伝子が改変される）ために当業者に公知の方法に対して使用される。したがって、前記方法は組換え核酸のクローニング、配列決定、および形質転換を含むことが好ましい。そのために適したベクターは、ラクトバチルス属菌種用の発現ベクターを含み、例えばEP 0 506 789 B1, EP 0 316 677 B1, EP 0 251 064 B1, EP 0 218 230 B1, EP 0 133 046 B1又はWO 89/01970に記載されている。
【００７９】
中間構築物や同様のものをクローニングするためにプライマー、酵素、さらなる宿主細胞が使用されるが、これらは当業者に公知である。好ましくは、遺伝子工学的に作製される変異体には、その細菌染色体もしくは1以上のプラスミドに又はその細菌染色体にかつ又は１以上のプラスミドに含まれる組換え核酸、またはその細菌染色体および/または1以上のプラスミドに含まれる組換え核酸を保有する乳酸菌の群に属する結合性の微生物、好ましくは、ラクトバクテリアケア（lactobacteriaceae）のファミリー、より好ましくはラクトバチルス属の、そして最も好ましくは寄託されたラクトバチルス属菌種のいずれか、の細胞が含まれる。かかる組換え核酸は好ましくは上記の乳酸菌の群に属する結合性の微生物にとって外来の核酸である。「外来」とは、ポリヌクレオチドまたは核酸分子がその宿主細胞に対して異種である、つまり、異なるゲノムバックグラウンドの細胞または生物に由来すること、あるいは、その宿主細胞に対して同種であるが、該核酸分子の天然の対応物とは異なるゲノム環境に配置されていること、を意味する。この場合、異種ポリヌクレオチドはそれ自体のプロモーターの制御下にあっても、異種のプロモーターの制御下にあってもよい。宿主細胞中に存在する上記のベクターまたは核酸分子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれているか、染色体外に何らかの形で維持されているか、のいずれかである。これに関して、上記の核酸分子を用いると、相同組換えにより変異型遺伝子を復元させたり、生成させたりすることができることも理解しておくべきである。プラスミドは低、中、または高コピー数のプラスミドでありうる。前記の遺伝子工学的に作製された変異体は、ショ糖サブユニットのムタン特異的1,3-グリコシド結合を分解できるグルカナーゼまたはムタナーゼをコードする核酸を保有する細胞を含むことができる。菌類のグルカナーゼは、例えば、Fuglsangら, J. Biol. Chem. 275 (2000), 2009-2018に記載されている。また、遺伝子工学的に作製された変異体は、抗体（好ましくは、分泌されるか、細菌の細胞壁に固着される）をコードする組換え核酸を保有することも考えられる。「抗体」なる語は完全な抗体だけでなく、分離された軽鎖と重鎖、Fab、Fab/c、Fv、Fab'、F(ab')2のようなその抗体フラグメントも包含する。「抗体」なる語はまた、ヒト化抗体、二重特異性抗体、および抗体構築物、例えば一本鎖Fv(scFv)または抗体融合タンパク質も含む。さらに、本発明との関連において、「抗体」なる語は、上記の寄託された微生物の誘導体の細胞内で発現される抗体構築物、例えば、当技術分野で公知の方法によって、特にベクターを介して、形質転換されうる抗体構築物をも含むと考えられる。特に、そのような抗体構築物は、例えば連鎖球菌抗原I/IIを、特異的に認識すると予想される。こうしたアプローチは例えばKruegerら, Nat. Biotechnol. 20 (2002), 702-706、またはShiroza. Biochim Biophys Acta 1626 (2003), 57-64に記載されている。
【００８０】
発現された抗体の分泌は、好ましくは、抗体をコードする核酸を分泌シグナル配列と機能的に連結させることで達成される。細菌の細胞壁への固着は酵素ソルターゼの作用機構を利用することで達成されると考えられる。すなわち、グラム陽性細菌の表面タンパク質は、保存されたLeu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG)モチーフの切断を含む作用機構（ペプチドグリカン細胞壁の組み立ての間に起こる）によって細菌の細胞壁に連結される。したがって、細菌の細胞壁にタンパク質を固着させるためにソルターゼによって利用される上記の保存モチーフをコードする配列に、抗体をコードする核酸分子を融合させることができる。
【００８１】
また、乳酸菌の群に属する上記の結合性の微生物は、とりわけストレプトコッカス・ミュータンスに対して有効な、抗菌物質であるロイテリン（reuterin）をコードする核酸分子を保有するように遺伝的に改変しうると考えられる。ロイテリンは例えばTalaricoら, Chemother. 33 (1989), 674-679に記載されている。
【００８２】
乳酸菌の群に属する結合性の微生物の変異体、好ましくは、寄託されたラクトバチルス属菌株の変異体、は好ましくは人工的に変異させたものである。本発明によれば、「変異させた」とは、例えば自然界で引き起こされた、または物理的手段もしくは化合物/化学物質/化学薬剤（EMS、ENUなど）により引き起こされた、遺伝物質（すなわち核酸）の永久的な１以上の改変を意味する。こうした改変には、トランジションまたはトランスバージョンのような点変異、核酸/遺伝子/染色体内の1つ以上の塩基の欠失/挿入/付加（これにより核酸/遺伝子/染色体を改変させる）が含まれ、かかる改変は、とりわけ、異常な遺伝子発現/転写/翻訳を引き起こしたり、不活性な遺伝子産物の原因となることができ、構成的に活性/不活性な遺伝子産物は例えばドミナントネガティブ効果をもたらしうる。好ましくは、変異は、ミュータンス・ストレプトコッキィとの特異的結合能力の増大をもたらす。したがって、１以上の所望の遺伝子中に１以上の変異を有する寄託微生物の変異型細胞も好適である（その際、１以上の所望の遺伝子中の１以上の変異は当業者に公知の方法により誘発される）。当技術分野では、変異させたまたは遺伝子工学的に操作された細菌細胞を適当な方法/表現型によって選択できることも知られている。本発明の文脈において、ミュータンス・ストレプトコッキィと特異的に結合する能力が増大している変異体は、上記の方法に従って試験することができる。しかし、「変異体」という用語には、自然界で生じる自然突然変異をそのゲノム（つまり、細菌の染色体）中に有する上記の乳酸菌の群に属する結合性の微生物の細胞、好ましくは、寄託微生物の細胞、も含まれる。「自然突然変異」とは、自然界で、すなわち人間によるまたは突然変異原への曝露による直接的な遺伝子操作なしに、起こる突然変異である。自然突然変異体の選択は、その菌株を培養して、例えばミュータンス・ストレプトコッキィに結合する改善された変異型細菌の能力により、所望の変異体を選択することによって達成される。自然突然変異体の選択方法は当技術分野で周知である (例えば、Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001); Ausubel. "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)を参照のこと)。例えば、そのような突然変異は培養中に起こる可能性があり、例えば、DNA複製と結びついた通常の細胞分裂過程において、または上記の乳酸菌の群に属する結合性の微生物の変異体を継代および/または保存している間に起こりうる。
【００８３】
しかし、微生物の遺伝子操作は有益な又は大いに有益な特性を微生物に与える可能性があるにもかかわらず、本発明によって使用されるバインダー微生物及び好ましくは全微生物は、本出願の出願日に適用可能な各バージョンのDirective 2001/18/ECの条項2(2)で定義されるような遺伝子改変微生物ではないことがまた好ましい。しかし、Directive 2001/18/ECの条項2(2)で定義されるように、前記Directive 2001/18/ECの添付1Bに列挙されている遺伝子改変技術を介して得られる本発明による微生物は、好ましくは遺伝子改変微生物とみなされない。遺伝子改変微生物を除くことで消費者の合理的及び非合理的な不安は回避され得、それによって、口腔衛生ケア指示の消費者コンプライアンスが増加し得る。
【００８４】
本発明によれば、好ましくはラクトバチルス科の、さらにより好ましくはラクトバチルス属の、最も好ましくは上記の特に好ましい株のうちの一つのバインダー微生物は、交配及び/又は天然の組み換えによって天然に生じないやり方で変化させられた遺伝物質を含まない。そうした技術には、
(1)生物の範囲を超える任意の手段を用いて産生される核酸分子の、任意のウイルス、細菌、プラスミド又は他のベクター系への挿入及び宿主生物へのそれらの組み込み(宿主中でこれらは天然に生じないが継続的伝播ができる)による、遺伝物質の新しい組み合わせの形成を含む組み換え核酸技術、
(2)生物の範囲を超えて調製された遺伝性物質の生物への直接導入を含む技術(マイクロインジェクション、マクロインジェクション及びマイクロカプセル化を含める)、
(3)天然には生じない手段による二つ以上の細胞の融合を介して遺伝性物質の新しい組み合わせを有する生細胞が形成される、プロトプラスト融合又は雑種形成技術を含めた細胞融合。
【００８５】
しかし、本発明によれば、接合、形質導入及び形質転換などの天然の方法は、好ましくは除外しない。本発明によるさらに好ましい除外しない技術は、それが以下に列挙されている一つ以上の技術/方法によって産生されるもの以外の組み換え核酸分子又は遺伝子改変生物の使用を含まないという条件で、
(1)自然突然変異又は誘導性自然突然変異による突然変異誘発、及び
(2)従来の育種方法を介して遺伝物質を交換することができる、微生物のプロトプラスト融合を含めた細胞融合
である。
【００８６】
本発明によれば、本発明によって使用される微生物と同一種の又はそれより好ましくはないが少なくとも同一属の株で天然に見出され得るような遺伝物質を当然ながら除いては、本発明によって使用されるバインダー微生物及び好ましくは任意の他の微生物も、古細菌上界又は真核生物上界の生物の遺伝物質を含まないことがしたがって好ましい。さらに好ましくは、本発明によって使用される微生物は、ファーミキューテス以外の門のみで見出される微生物の遺伝物質を含まず、さらにより好ましくは桿菌以外の綱の微生物のみで見出される又はその微生物から取られた遺伝物質を含まず、さらにより好ましくは、ラクトバチルス以外の目の微生物のみで見出される又はその微生物から取られた遺伝物質を含まない。
【００８７】
本発明によって使用される微生物及び特にバインダー微生物がラクトバチルス科のものである場合は、各微生物は、ラクトバチルス以外の科の微生物のみで見出される、又はその微生物から取られる遺伝物質を含まないことが好ましい。さらにより好ましくは、本発明の微生物及び特にバインダー微生物がラクトバチルス属のものである場合は、各微生物は、ラクトバチルス以外の属の微生物のみで見出される、又はその微生物から取られる遺伝物質を含まない。
【００８８】
好ましくは本発明による組成物は、好ましくは抗う蝕性食品若しくは飼料組成物又は抗う蝕性医薬組成物である。したがって、本発明は、ミュータンス連鎖球菌及び/又はストレプトコッカス・ミュータンスによって引き起こされるう蝕の治療又は予防のための抗う蝕性組成物、好ましくは医薬品又は化粧用組成物を調製するための、上記のバインダー微生物又はその断片の使用に関する。
【００８９】
本発明で使用する場合、用語「組成物」は、少なくとも1種バインダー微生物(おそらく熱失活した又は凍結乾燥した形態)又はその断片、好ましくは、上記のような寄託された微生物(おそらく熱失活した又は凍結乾燥した形態)又は前記微生物の断片を含む組成物を示す。本発明によって使用される組成物は、任意の組み合わせで前述の成分を含むことが想定される。組成物は、う蝕の予防及び/又は治療に適切な少なくとも1種のさらなる成分を場合によっては含んでもよい。それに応じて、組成物は、以下に述べるさらなる成分の任意の組み合わせを場合によっては含んでもよい。用語「う蝕の予防及び/又は治療に適切な成分」は、ミュータンス連鎖球菌の歯の表面への結合、ペリクルへの結合のいずれかを阻害する及び/又はミュータンス連鎖球菌を失活させる化合物又は組成物及び/又はそれらの組み合わせを包含する。より好ましくは、前記用語は、以下で述べるように、ミュータンス連鎖球菌が歯の表面へ固着するのを阻害すること、ミュータンス連鎖球菌のグリコシルトランスフェラーゼの活性を阻害すること、ミュータンス連鎖球菌を阻害する又は失活させること、ミュータンス連鎖球菌のアグルチニン依存性結合を阻害すること及び/又はミュータンス連鎖球菌のサッカロース依存性結合を阻害することができる化合物又は組成物及び/又はそれらの組み合わせを包含する。
【００９０】
本発明の組成物は、好ましくはペット動物の口腔衛生のための組成物であり、さらにより好ましくは歯石の予防又は減少のための組成物である。そうした組成物は、例えばEP 01 41 645 A2、WO 0150882 A2、WO 2001/070043 A2、WO 02/078462 A1、WO 2004/082518 A2、WO 2005/092087 A2及びWO 2010/052467 A2から既知である。これらの文献及び特にこれらの文献中で言及されている実施例に記載されている食品及び飼料は、好ましいベース組成物の例として本明細書に組み込まれる。本発明によるこれらのベース組成物は、本発明のバインダー微生物又はその断片を組み込むことで、さらに改善される。
【００９１】
口腔内の微生物を殺すであろう殺菌剤又は他の化学薬剤の作用に依拠する必要なく、バインダー微生物又はその断片の作用によって、すなわちミュータンス連鎖球菌への特異的な結合によって、最も好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に結合させることによって、歯石の蓄積を遅らせる又は緩徐化することができることは、本発明の特別な利点である。例えば、通常の細菌叢のそうした微生物が栄養摂取の目的で病原体と競合し、それによって、病原体の増殖が制限され感染が避けられるため、通常の口腔細菌叢はヒト及び動物にとって有益ではないかと思われる。本発明は、通常の口腔細菌叢はほとんど乱されないままにしておくことを可能にし、さらに口腔ケア特性、好ましくは歯石形成の予防又は緩徐化を与える。
【００９２】
歯石の予防及び治療における本発明の別の利点は、本発明が、硫酸亜鉛、可溶性ピロリン酸、トリポリリン酸ナトリウム及び可溶性ジホスホン酸のような脱灰剤の存在を必要としないことである。そうした薬剤は、口腔からカルシウムを隔離し、それによって、歯石形成の鍵となる構成成分を除去する。しかし、歯のエナメルは、大部分はカルシウム含量が高いミネラルであるヒドロキシルアパタイトで構成されている。したがって、口腔からのカルシウム除去は、さらなる歯の弱化に関係しており、それは望ましくない。一方で本発明は、健康な歯エナメルの維持に必要とされるであろうカルシウムを隔離することなしに、歯石形成を治療又は予防することを可能にする。
【００９３】
したがって、歯石形成予防において最良の結果を得るために、本発明の組成物はバインダー微生物又はその断片を含み、バインダー微生物は、好ましくはラクトバチルス科の、より好ましくはラクトバチルス属の、最も好ましくは上記のバインダー微生物の寄託された株のうちの一つであり、バインダー微生物又はその断片のミュータンス連鎖球菌への結合が比濁分析で測定した場合に最大で10%低下するような濃度の脱灰剤をさらに含み、好ましくはそうした薬を含まない。そうした好ましい組成物では、脱灰剤は、好ましくは、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、可溶性ピロリン酸、トリポリリン酸ナトリウム及び可溶性ジホスホン酸の群から選択される。
【００９４】
本発明は、好ましくは小児又はペット動物における歯石の予防又は治療用の医薬を調製するための、上記のようなバインダー微生物又はその断片の使用も提供する。上記で示したように、バインダー微生物は熱失活した形態、特にオートクレーブした形態又は凍結乾燥した形態であってもよい。バインダー微生物は、好ましくはラクトバチルス科の、さらにより好ましくはラクトバチルス属の、さらにより好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)種又はラクトバチルス・ラムノサス種のものである。特に、本発明のバインダー微生物は、それぞれ16667から16673の任意のDSMZ受託番号を有するL.パラカゼイ又はL.ラムノサスの上記の株又はそれらの変異体又は誘導体から選択することができる。
【００９５】
最も好ましくは、本発明による組成物は、特に小児又はペット動物用の食品又は飼料組成物である。そうした口腔衛生食品又は飼料組成物は、機能性食品又は機能性飼料と呼ばれることもある。用語「食品」及び「飼料」は、対応する組成物の栄養価にかかわらず本発明で使用されるため、本発明による食品及び飼料組成物はそうした特定の目的に合わせられ得るにもかかわらず、特定の栄養目的に限定されない。したがって、用語「食品」及び「飼料」は、各組成物が口腔内に置かれること及び摂取に適切であることを示す。
【００９６】
本発明によれば、動物のための、好ましくはペット動物のための、最も好ましくはネコ、イヌ、ラット、ハムスター及びモルモットのための食品又は飼料組成物が特に重要である。そうした動物では、う蝕形成は特に広く知られており、歯石除去のような任意の歯科治療はペットの麻酔を必要とするため、治療するのも難しい。したがって、本発明は、そうしたストレスが多い治療をする必要がないようにするのに特に適する。
【００９７】
本発明の飼料組成物は、好ましくはペット飼料、すなわち飼育させられる、繁殖させられる又は飼われる動物のための組成物であり、欧州共同体では通常ヒトが食べるのには使用されない。好ましくは本発明による「ペット」は、食肉目の哺乳動物であり、さらにより好ましくはイヌ亜目又はネコ亜目の哺乳動物、最も好ましくはイヌ科又はネコ科の哺乳動物である。さらなる好ましいペットは、げっ歯目のものであり、特に好ましい動物はマウス、ウサギ、ハムスター及びモルモットである。
【００９８】
ペット飼料については、本発明の化合物が配合飼料、完全飼料、補完飼料又はミネラル飼料であることが好ましい。本発明によれば、用語「配合飼料」は、飼料添加物を含む含まないを問わず、完全飼料又は補完飼料の形で経口的に動物に与えるのための少なくとも二つの飼料材料の混合物を意味する。用語「完全飼料」は、その組成故に一日の配給量に十分である配合飼料を意味する。本発明による用語「補完飼料」は、高含量の特定の物質を有するが、その組成故に、他の飼料との併用で使用した場合のみ一日の配給量に十分である配合飼料を意味する。用語「ミネラル飼料」は、少なくとも40%の粗灰分を含む補完飼料を意味する。最後に、本発明による用語「飼料材料」は、植物又は動物起源の産物を意味し、その主な目的は、飼料添加物を含む含まないを問わず、その天然状態、新鮮な状態又は保存状態における、及びその生産加工に由来する産物における、及び有機又は無機物質における動物の栄養ニーズを満たすことであり、これは、それ自体を直接的に若しくは加工後のいずれかで又は配合飼料の調製物中で又は予混合物の担体として経口的な動物への給餌で使用することが意図される。用語「経口的な動物への給餌」は、動物の栄養必要量を満たすこと及び/又は正常に健康な動物の生産性を維持することを目的として、口を介して動物の消化管の中に飼料を導入することを意味する。
【００９９】
本発明によれば、バインダー微生物を含む組成物はまた、口腔衛生組成物でもあり得る。本発明による口腔ケア組成物の好ましい例は、練り歯磨き、歯磨き剤、歯磨き粉、局所経口ゼリー、洗口剤、義歯製品、マウススプレー、ロゼンジ剤、経口錠剤、チューインガム、デンタルフロス又はデンタルテープであり、特に動物に関しては咀嚼製品である。
【０１００】
本発明による好ましい口腔ケア組成物は、バインダー微生物又はその断片だけでなく経口的に許容可能な担体も含み、そうした担体は、安全且つ有効な方式で口腔に適用することができる任意の適切なビヒクルであり得、その結果、本発明のバインダー微生物及び/又はその断片は、ミュータンス連鎖球菌の1種以上の株、好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスの1種以上の株に結合することができるため、抗歯石及び/又は抗う蝕及び/又は抗口臭効果を発揮する。口腔ケア組成物は、単相組成物でもよいし、多相組成物でもよい。
【０１０１】
とりわけ、本発明の歯磨きは、特に断らないかぎり、ペースト、ジェル、または液体の配合物でありうる。歯磨き組成物は所望のどのような形態であってもよく、例えば、ディープストライプ型、表面ストライプ型、多層型、ペーストの周りにジェルを配置した型、またはこれらの任意の組合せでありうる。歯磨き組成物をディスペンサーの個別の区画に入れて、並べて分配することができる。歯磨き組成物は例えばEP-B1 0 617 608に記載されている。
【０１０２】
好ましい歯磨き組成物はWO 2008/074473 A2の実施例21〜24に記載される。上記の成分に加えて、本発明の歯磨剤組成物は様々な任意の歯磨き成分を含むことができ、それらの一部を以下に記載する。任意成分としては、例えば、接着剤、発泡剤、香味料、甘味料、追加の抗歯垢剤、追加の研磨剤、および着色剤が挙げられるが、これらに限定されない。上記および他の任意成分は、例えばUS 5,004,597、US 4,885,155、US 3,959,458、およびUS 3,937,807に記載されている。
【０１０３】
例えば、練り歯磨きは１以上の界面活性剤、キレート剤、フッ素イオン源、歯を白くする物質および歯の色を変える物質、増粘剤、湿潤剤、香味料および甘味料、アルカリ金属重炭酸塩、その他の種々の担体および/または活性剤を含むことができる。
【０１０４】
本発明に用いる好ましい任意の作用剤の一つに界面活性剤があり、好ましくは、サルコシン酸系界面活性剤、イセチオン酸系界面活性剤、およびタウリン酸系界面活性剤からなる群より選択されるものである。本明細書中で使用するのに好適なものは、これらの界面活性剤のアルカリ金属塩またはアンモニウム塩である。最も好適なものは、以下の界面活性剤のナトリウム塩およびカリウム塩である：ラウロイルサルコシン酸、ミリストイルサルコシン酸、パルミトイルサルコシン酸、ステアロイルサルコシン酸、およびオレオイルサルコシン酸。
【０１０５】
もう一つの好ましい任意の作用剤はキレート剤であり、例えば、酒石酸とその製薬上許容される塩、クエン酸とクエン酸のアルカリ金属塩、およびこれらの混合物がある。キレート剤は細菌の細胞壁に存在するカルシウムと錯体を形成することが可能である。また、キレート剤はカルシウム架橋（これは歯垢のバイオマスをそのままの状態に保持する働きをしている）からカルシウムを取り除くことによって歯垢を破壊することもできる。しかしながら、上記のように、かかる作用剤またはかかる組成物には好ましい最高濃度があり、これらは歯の特に穏やかな処置のために意図される。
【０１０６】
歯磨きおよび他の口腔組成物中に追加の水溶性フッ素化合物を、25℃および/またはそれを使用する時の該組成物に約0.0025〜5.0重量％、好ましくは約0.005〜2.0重量％のフッ素イオン濃度をもたらすのに十分な量で存在させて、付加的な抗う蝕効果を与えることは普通に行われている。本組成物中の可溶性フッ化物源として多種多様なフッ素イオン生成物質を使用することができる。適当なフッ素イオン生成物質の例はUS 3,535,421およびUS 3,678,154に見出せる。代表的なフッ素イオン源としては、フッ化第一スズ、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロリン酸ナトリウムなどが挙げられる。フッ化第一スズとフッ化ナトリウムが特に好ましく、これらの混合物も同様に好ましい。
【０１０７】
本発明の口腔ケア組成物はまた、歯を白くする活性物質を含むことができ、これには漂白剤または酸化剤が含まれ、例えば、過酸化物、過ホウ酸塩、過炭酸塩、ペルオキシ酸、過硫酸塩、亜塩素酸の金属塩、およびこれらの組合せがある。適当な過酸化物化合物としては、過酸化水素、過酸化尿素、過酸化カルシウム、およびこれらの混合物が挙げられる。好適な過炭酸塩としては過炭酸ナトリウムがある。その他の好適な白色化剤には、過硫酸および過ホウ酸のカリウム、アンモニウム、ナトリウムおよびリチウム塩の一水和物および四水和物、ならびにピロリン酸ナトリウム・ペルオキシハイドレートが含まれる。適当な亜塩素酸の金属塩としては、亜塩素酸カルシウム、亜塩素酸バリウム、亜塩素酸マグネシウム、亜塩素酸リチウム、亜塩素酸ナトリウム、および亜塩素酸カリウムがある。好ましい亜塩素酸塩は亜塩素酸ナトリウムである。追加の白色化剤には次亜塩素酸塩と二酸化塩素がある。
【０１０８】
歯を白くする物質としての漂白剤に加えて、歯の色を変更する物質が口腔ケア活性物質の中でも本発明において有用であると考えられる。こうした物質はユーザーの希望するように歯の色を変えるのに適している。かかる物質は、歯の表面に適用されたとき、光の吸収と反射の点から該表面を改変する粒子を含有する。この種の粒子を含有するフィルムが歯の表面を覆うと、外観上の利点が得られる。
【０１０９】
練り歯磨きまたはジェルを製造する際には、何らかの増粘剤を添加する必要があるが、それは、組成物に望ましい粘稠度を付与する、使用時に望ましい活性放出特性を付与する、貯蔵安定性を与える、組成物の安定性を与える、などのためである。好ましい増粘剤はカルボキシビニルポリマー、カラギーナン、ヒドロキシエチルセルロース、ラポナイト（laponite）、およびセルロースエーテルの水溶性塩（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチル・ヒドロキシエチル・セルロースナトリウム）である。カラヤガム、キサンタンガム、アラビアガム、トラガカントガムといった天然のガムも使用することができる。コロイド状のケイ酸マグネシウムアルミニウムや微細なシリカは、きめをさらに改善するために増粘剤の一部として使用することができる。
【０１１０】
本発明の組成物の局所口腔担体の別の任意成分は湿潤剤である。湿潤剤は、練り歯磨き組成物が空気に触れた際に硬くなるのを防止したり、口への湿った感じを組成物に付与したり、特別の湿潤剤の場合には、練り歯磨き組成物に望ましい甘い風味を付与したりするのに役立つ。湿潤剤は、純粋な湿潤剤に基づいて、一般には本組成物の重量の約0〜70％、好ましくは約5〜25％を構成する。本発明の組成物で使用するのに適した湿潤剤には、食用の多価アルコールが含まれ、例えば、グリセリン、ソルビトール、キシリトール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールがあるが、特にソルビトールとグリセリンである。
【０１１１】
香味料および甘味料も本組成物に添加することができる。適当な香味料としては、冬緑油、ペパーミント油、スペアミント油、クローブバッド油、メントール、アネトール、サリチル酸メチル、ユーカリプトール、カシア（cassia）、酢酸1-メンチル、セージ、オイゲノール、パセリ油、キサノン、α-イリソン、マージョラム、レモン、オレンジ、プロペニルグアエトール、シナモン、バニリン、チモール、リナロール、シンナムアルデヒドグリセロールアセタール（CGAとして知られる）、およびこれらの混合物が挙げられる。香味料は一般に組成物の重量の約0.001〜5％のレベルで使用される。
【０１１２】
使用可能な甘味料としては、スクロース、グルコース、サッカリン、デキストロース、レブロース、本明細書に記載したとおりのラクトース、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マルトース、キシリトール、サッカリン塩、タウマチン、アスパルテーム、D-トリプトファン、ジヒドロカルコン、アセスルファム、シクラメート塩（特に、シクラミン酸ナトリウムおよびサッカリンナトリウム）、およびこれらの混合物が挙げられる。幼児用組成物は一般に組成物の重量の約0.1〜10％、好ましくは約0.1〜1％の甘味料を含有する。好ましくは、本発明のペットフードは、ミュータンス・ストレプトコッキィ(mutans Streptococci)の齲蝕原性活性を回避するために、ミュータンス・ストレプトコッキィ(mutans Streptococci)及び好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)により代謝されうるかかる糖の含量が低い。したがって、スクロース、甘蔗糖、キャラメル、コーンシロップ、トウモロコシ糖蜜、グルコース、フルクトース及びソルビトールの含量は好ましくは低く維持され、好ましくは最大含量は全幼児用又はペットフードの20重量%であり、5重量％の最大含量がさらに好ましく、2重量％の最大含量が最も好ましい。同様に、好ましくは、サッカリン、デキストロース、レブロース、ラクトース、マンニトール、マルトース及びキシリトールのそれぞれの含量は20重量％未満であり、より好ましくは5重量％未満であり、最も好ましくは2重量％未満であり、このときキシリトールは好ましくはペットフードに全く含まれない。
【０１１３】
本発明の口腔ケア組成物はさらにアルカリ金属重炭酸塩を含んでいてもよい。アルカリ金属重炭酸塩は水に溶解して、安定化されないかぎり、水性系中で二酸化炭素を放出する傾向がある。重炭酸ナトリウムは、ベーキングパウダーとしても知られているものであるが、好適なアルカリ金属重炭酸塩である。本組成物は約0.5〜30％、好ましくは約0.5〜15％、最も好ましくは約0.5〜5％のアルカリ金属重炭酸塩を含有しうる。商業上好適な口腔組成物の製造に用いる水は、好ましくは低イオン含量のもので、有機不純物を含まない水とすべきである。水は一般に水性練り歯磨き組成物の重量の約10〜50％、好ましくは約20〜40％を構成する。これらの水の量は、添加される遊離水と、他の物質（例えば、ソルビトール）と一緒に導入される水とを合わせたものである。二酸化チタンも本組成物に添加することができる。二酸化チタンは白色の粉末で、組成物に不透明性を付与する。二酸化チタンは歯磨き組成物の重量の約0.25〜5％を構成する。
【０１１４】
本組成物のpHは好ましくは緩衝剤を用いて調整される。本明細書中で用いる「緩衝剤」とは、本組成物のpHを約4.5〜9.5の範囲に調整するのに使用することができる緩衝剤を意味する。緩衝剤としては、リン酸一ナトリウム、リン酸三ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、酸性ピロリン酸ナトリウム、クエン酸、およびクエン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝剤は本組成物の重量の約0.5〜10％のレベルで配合される。歯磨き組成物のpHは歯磨きの3：1水性スラリー（例えば、練り歯磨き1部に対して水3部）から測定される。
【０１１５】
本組成物中で使用できる他の任意の作用物質としてはジメチコーンコポリオールがあり、これはアルキル-およびアルコキシ-ジメチコーンコポリオール、例えばC12〜C20アルキルジメチコーンコポリオールおよびこれらの混合物から選択される。特に好ましいのは、商標名Abil EM90として市販されているセチルジメチコーンコポリオールである。ジメチコーンコポリオールは一般に約0.01〜25％、好ましくは約0.1〜5％、さらに好ましくは約0.5〜1.5％（重量基準）のレベルで存在する。ジメチコーンコポリオールはポジティブな歯の感触効果をもたらすのに役立つ。他の有用な担体には、US 5,213,790、US 5,145,666、US 5,281,410、US 4,849,213、およびUS 4,528,180に開示されるような、2相の歯磨き配合物が含まれる。
【０１１６】
本発明の組成物はまた、抗菌剤のような他の活性物質を含んでいてもよい。そのような抗菌剤の中に含まれるものは、水不溶性の非カチオン性抗菌剤、例えばハロゲン化ジフェニルエーテル、フェノール系化合物、例えばフェノールとその同族体、モノおよびポリ-アルキル芳香族ハロフェノール、レゾルシノールとその誘導体、ビスフェノール系化合物およびハロゲン化サリチルアニリド、安息香酸エステル、ならびにハロゲン化カルバニリドである。水溶性の抗菌剤には、中でも、第四級アンモニウム塩およびビス-ビクアニド塩が含まれる。トリクロサンモノホスフェートはさらなる水溶性抗菌剤である。第四級アンモニウム物質には、第四級窒素上の1または2個の置換基が炭素原子数約8〜20（一般的には約10〜18）の炭素鎖長（典型的にはアルキル基）を有するが、残りの置換基（典型的にはアルキル基またはベンジル基）は、炭素原子数約1〜7（一般的にはメチルまたはエチル基）といった、より少ない炭素原子数を有するものが含まれる。臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラデシルピリジニウム、臭化ドミフェン、塩化N-テトラデシル-4-エチルピリジニウム、臭化ドデシルジメチル(2-フェノキシエチル)アンモニウム、塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、第四級化5-アミノ-1,3-ビス(2-エチル-ヘキシル)-5-メチルヘキサヒドロピリミジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、および塩化メチルベンゼトニウムが典型的な第四級アンモニウム抗菌剤の例である。その他の化合物として、US 4,206,215に開示されるビス[4-(R-アミノ)-1-ピリジニウム]アルカンがある。ビスグリシン酸銅、グリシン酸銅、クエン酸亜鉛、および乳酸亜鉛のような他の抗菌剤も含めることができる。酵素は本発明の組成物に使用しうる別のタイプの活性物質である。有用な酵素には、プロテアーゼ、溶解酵素、歯垢マトリックス阻害剤、およびオキシダーゼのカテゴリーに属するものが含まれる。プロテアーゼとしては、パパイン、ペプシン、トリプシン、フィシン、ブロメリンが挙げられる；細胞壁溶解酵素としては、リゾチームが挙げられる；歯垢マトリックス阻害剤としては、デキストラナーゼ、ムタナーゼが挙げられる；オキシダーゼとしては、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼを含む）が挙げられる。オキシダーゼには、抗菌作用のほかに、歯を白くする/きれいにする働きもある。かかる作用物質はUS 2,946,725およびUS 4,051,234に開示されている。その他の抗菌剤には、クロロヘキシジン、トリクロサン、トリクロサンモノホスフェート、およびチモールのような香油が含まれる。トリクロサンとこのタイプの他の物質はUS 5,015,466およびUS 4,894,220に開示されている。こうした物質は、抗歯垢効果をもたらし、歯磨き組成物の重量基準で約0.01〜5.0％のレベルで存在しうる。
【０１１７】
本明細書中で定義する「チューインガム」とは、噛むのに適しており、任意の適当量の当業者に公知のエラストマーを含む菓子用組成物を意味し、好ましくはエラストマーは組成物の重量基準で、2％以上含有される。適当なロゼンジおよびチューインガム用の成分は例えばUS 4,083,955、US 6,770,264、またはUS 6,270,781に開示されている。好適なロゼンジはWO 2008/074473 A2の実施例19および20に記載のものである。好適なチューインガム組成物はWO 2008/074473 A2の実施例25に記載されている。
【０１１８】
本発明の組成物は好ましくはエラストマーまたは数種の異なるエラストマーの混合物を含んでなる。エラストマー材料は一般に当技術分野で公知であるが、例を挙げると、スチレン-ブタジエンゴム(SBR); 合成ガム; ポリイソブチレンおよびイソブチレン-イソプレンコポリマー; 天然ガム; チクル; 天然ゴム; ジェルトン; バラタ; グッタペルカ; レチ・カスピ(lechi caspi); ソーバ樹液; およびこれらの混合物がある。本発明に用いる組成物は好ましくは重量基準で約2〜30％、より好ましくは約5〜25％のエラストマーを含有する。こうしたレベルはチューインガムの所望の最終質感（テクスチャー）によって決まるが、それは、全体的なエラストマーレベルが約2％より少ないと、基材組成物の弾力性、噛みごたえ、粘着性がなくなり、一方約30％より高いレベルでは、該組成物が硬く、ゴムっぽくなって、噛みにくいからである。本発明に用いる組成物中には好ましくはエラストマー溶剤も存在し、それらはエラストマー成分を柔らかくするのに役立つ。本発明で用いるのに好適なエラストマー溶剤の例としては、部分水素化ウッドロジンのペンタエリスリトールエステル、ウッドロジンのペンタエリスリトールエステル、部分二量体化ロジンのグリセロールエステル、重合ロジンのグリセロールエステル、トール油のグリセロールエステル、ウッドまたはガムロジン、部分水素化ロジンのグリセロールエステル、部分水素化ロジンのメチルエステル、およびこれらの混合物がある。本発明に用いる組成物は、重量基準で、好ましくは約2〜50％、より好ましくは約10〜35％のエラストマー溶剤を含有する。
【０１１９】
本発明のロゼンジは、例えば、圧縮錠剤を形成するための当技術分野で認められた技法により製造することができ、かかる技法では、圧縮可能な固形担体に二糖類を分散させ、場合により適当な錠剤用助剤（例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤）と組み合わせて、それを錠剤に圧縮する。そのような錠剤用組成物の固形担体成分は唾液に溶解する固体、例えば冷水に溶解するデンプンまたは単糖類であってよく、こうしてロゼンジを口の中に含ませておくと、ロゼンジが口の中で溶けて、口腔/咽頭粘膜との接触および該粘膜からの吸収のために、含まれていた二糖酸を唾液中に放出するようになる。上記組成物のpHは約4〜8.5の範囲でありうる。本発明のロゼンジは当技術分野で認められた他の固体単位投与剤形技術を用いて製造することもできる。
【０１２０】
本発明のマウスウォッシュまたはマウスリンスは、EtOHを含んでもよく、EtOH不含であってもよく、また、他の活性成分、例えばクロルヘキシジンのような抗微生物剤を含みうる。本発明の好ましいマウスウォッシュまたはマウスリンスは、次のものでありうる：
A  オリウムメンタエ(Olium menthae) 1.2部
ティンクチュラ・アルニカエ(Tinctura Arnicae)  3.0部
ティンクチュラ・ミラエ(Tinctura Myrrhae)      3.0部
Tween                                        5.0部
B    Spiritus 90%                              50.0部
C    安息香酸ナトリウム                        0.2部
甘味料(例: アスパルテーム)                0.02部
蒸留水を十分量加えて100とする。
【０１２１】
Aを十分に混合し、Bを撹拌しながら添加し、続いてCを添加する。得られた透明な液体を調製後48時間以内に濾過する。別の好適なマウスウォッシュはWO 2008074473 A2の実施例26に記載されている。
【０１２２】
液体か固体かの投与形態に関係なく、本発明の好ましい実施形態では、その投与形態を消費者の口内、好ましくはペットの口内にある時間にわたり保持させて、乳酸菌の群に属する上記の微生物または該微生物の類似体もしくは断片と患者の口腔との接触をうながす。
【０１２３】
本明細書に用いる「デンタルフロス（糸楊枝）」及び「デンタルテープ」という用語は、隣接歯間及び歯肉縁下表面において堆積した分解中の食べ物を除去し取り除くため、並びに口腔に堆積した細菌、プラーク及び／又は歯石を除去し取り除くための材料をいう。デンタルフロス又はデンタルテープはさらに、本明細書に記載した本発明の微生物に加え、クリーナー、研磨剤、歯石コントロール成分、漂白剤、界面活性剤、及び／又はフルオリド類、抗微生物剤、化学療法薬剤又は抗生物質といった活性物質を含みうる。さらなる追加の作用物質は、抗プラーク剤、香味料及び着色剤である。デンタルフロス又はデンタルテープは、当業者に公知の任意の適当な形態とすることができ、例えばUS 3,664,915, US 3,953,566, US 3,962,153, US 4,096,227, US 4,187,390, US 4,256,806, US 4,385,093, US 4,478,665, US 4,776,358, US 5,033,488, US 5,209,251, US 5,220,932, US 5,518,012, US 5,718,251, US 5,765,576又はUS 5,911,228に記載されているPTFE (テフロン（登録商標）)デンタルフロスの形態、例えばUS 3,800,812, US 4,974,615, US 5,760,117, US 5,433,226, US 5,479,952, US 5,503,842, US 5,755,243, US 5,884,639, US 6,003,525又はUS 6,027,592に記載されているモノフィラメント型の隣接歯間デバイスの形態であってもよく、あるいは生物学的要素テープの形態とすることができる。好ましくは、デンタルフロス又はデンタルテープは、例えばUS 20050226820に記載されているエラストマー性のコーティングさｒたモノフィラメントの形態であってもよく、または例えばUS 20020144704に記載されている、方向づけられた熱可塑性物質に基づくデンタルテープの形態であり得る。
【０１２４】
本明細書に記載の口腔ケア化粧品組成物、特に抗歯石組成物、抗齲蝕組成物及び抗口臭組成物は、ヒト口腔投与の範囲で、並びに獣医口腔投与の範囲で使用することができ、好ましくは非ヒト動物、より好ましくはペットに使用できる。該組成物が獣医口腔投与の範囲に使用される場合には、該組成物はさらに、当業者に公知であるように、かかる投与に適した成分を含むことができる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物はさらに、製薬上許容される担体又は賦形剤を好ましくは含む。
【０１２６】
医薬組成物は、治療に有効な量の、上記微生物またはその断片を含んでなり、様々な形態、例えば固体、液体、粉末、水性、凍結乾燥形態に製剤化される。
【０１２７】
医薬組成物は本明細書に記載するように製薬上許容される担体と共に患者に、好ましくはヒト又は動物に、最も好ましくは子供若しくはペット動物に投与される。特定の実施形態において、「製薬上許容される」とは、動物、特にヒトに使用することについて監督機関または他の一般的に認められた薬局方により承認されていることを意味する。好ましい本発明に用いる医薬組成物はラクトースを1％(w/w)〜6％(w/w)の範囲では含まない。医薬組成物は多くて1％(w/w)のラクトースを含むことが好ましく、例えば、それは1％未満、好ましくは0.9％(w/w)、0.8％(w/w)未満等々のラクトースを含み、また、医薬組成物は6％、7％、8％(w/w)以上等々のラクトースを含むことが好ましい。あるいはまた、医薬組成物がラクトースを含まないことも好ましい。
【０１２８】
「担体」なる用語は、治療剤と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルをさす。そのような担体は製薬上許容されるもの、すなわち、用いる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒のものである。好ましくは、それは等張性、低張性、またはやや高張性であって、スクロース溶液により提供されるように、イオン強度が比較的低いものである。かかる製薬上の担体は水や油といった無菌の液体であり、油としては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。食塩水およびデキストロースやグリセロールの水溶液も液状担体として、特に注射液用に、使用することができる。好適な製薬上の賦形剤には次のものが含まれる：デンプン、グルコース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、ナトリウムイオン、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなど。賦形剤は本明細書で上述したようにラクトースを含んでもよいが、最も好ましくはラクトースフリー（無乳糖）である。本組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含んでいてもよい。こうした組成物は溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの形をとることができる。経口製剤は標準的な担体、例えば医薬品級のマルトデキストリン、マンニトール、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. Martin による"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。脱脂乳、脱脂粉乳、ノンミルクまたはノンラクトース製品を使用してもよい。通常は、脱脂粉乳をリン酸緩衝溶液(PBS)中に懸濁し、加圧滅菌または濾過を行ってタンパク質性および生きている混入物を除き、その後フリーズドライ、加熱乾燥、真空乾燥、または凍結乾燥を行う。製薬上の担体として使用しうる物質の他の例を以下にいくつか挙げる：糖、例えばグルコース、スクロース; デンプン、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン; セルロースとその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース; 粉末状トラガカント; 麦芽; ゼラチン; タルク; ステアリン酸; ステアリン酸マグネシウム; 硫酸カルシウム; 炭酸カルシウム; 植物油、例えばピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、テオブロマの油; ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール; 寒天; アルギン酸; 発熱物質フリーの水; 等張食塩水; クランベリーエキスおよびリン酸緩衝溶液; 脱脂粉乳; ならびに医薬製剤に用いられる他の無毒性の適合性物質、例えばビタミンC、エストロゲン、エキナセア。湿潤剤、滑沢剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、香味剤、潤滑剤、賦形剤、錠剤化剤、安定剤、酸化防止剤、および防腐剤が存在してもよい。
【０１２９】
好ましくは、経口製剤は本明細書に記載したとおりにラクトースを含みうるが、最も好ましくはラクトースフリーである。経口投与に適する、当技術分野で周知の各種担体および/または賦形剤を本発明のために使用することができる。非う蝕原性組成物は、所望により、公知の各種添加剤をさらに含んでもよく、例えば、保存剤、硬化剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、精油などを含みうる。かかる組成物は、患者への投与に適した形態とするために、治療に有効な量の上記化合物（好ましくは、精製形態のもの）を適量の担体と共に含有する。製剤は投与方式に適合させるべきである。
【０１３０】
本発明の好ましい組成物はラクトースを1％(w/w)〜6％(w/w)の範囲では含まない。組成物は1％(w/w)を超えないラクトースを含むことが好ましく、例えば、それは1％未満、好ましくは0.9％(w/w)、0.8％(w/w)未満等々のラクトースを含み、また、組成物は6％、7％、8％(w/w)以上等々のラクトースを含むことが好ましい。あるいはまた、組成物がラクトースを含まないことも好ましい。
【０１３１】
さらなる態様において、本発明の組成物は結合性微生物断片を化粧上、経口的に、又は製薬上許容される担体又は賦形剤と配合する工程を含む方法により製造することができる。好ましくは、この微生物は、本明細書に記載の寄託微生物またはその変異体、誘導体、類似体若しくは断片でありうる。本発明の好ましい組成物は、ラクトースを1％(w/w)〜6％(w/w)の範囲では含まない。組成物は1％(w/w)を超えないラクトースを含むことが好ましく、例えば、それは1％未満、好ましくは0.9％(w/w)、0.8％(w/w)未満等々のラクトースを含み、また、組成物は6％、7％、8％(w/w)以上等々のラクトースを含むことが好ましい。あるいはまた、組成物がラクトースを含まないことも好ましい。
【０１３２】
本発明の組成物、好ましくは医薬組成物を含む、食品または飼料組成物は、上記の結合性微生物を、可能性として熱不活性若しくは凍結乾燥形態で、固形の組成物中では、mg当たり102〜1012細胞、好ましくは103〜108細胞という量で含む。液体形態の組成物については、微生物の量はml当たり102〜1013である。しかしながら特定の組成物については、微生物の量は、本明細書に記載の量と異なりうる。
【０１３３】
好ましくは、本発明の組成物中の結合性微生物の濃度は、組成物の合計質量に対して0.01重量%〜10重量%であり得る。より好ましくは、本発明の組成物中の結合性微生物の濃度は、0.025重量%〜2重量%であり得る。上記のように、結合性細胞の代わりに断片を用いるときには、断片の濃度は結合性細胞のペプチドグリカン含量と同じになるように選択される。
【０１３４】
本発明によれば、「食料」なる用語はあらゆる食品または飲料を包含する。したがって、微生物またはその断片を食品や飲料中に含めることができる。これらには、例えば、ガム、スプレー製品、飲物、キャンディー、乳児用調整粉乳、アイスクリーム、フローズンデザート、スィートサラダドレッシング、乳調製品、チーズ、クォーク、無乳糖ヨーグルト、酸性乳、コーヒークリーム、ホイップクリームなどがある。
【０１３５】
乳製品は本発明の範囲内に入ると考えられる。しかし、ミルクはウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、シマウマ、ウマ、ロバ、ラクダといった動物に由来するものを意味すると理解される。ミルクは天然の状態のもの、還元乳、スキムミルク、または細菌の成長もしくはその後の発酵乳の加工に必要とされる配合物（例えば、脂肪、酵母エキスのタンパク質、ペプトンおよび/または界面活性剤）を補充したミルクでありうる。ミルクという用語はまた、通常は野菜ミルクと呼ばれているもの、すなわち、処理されたまたはそうでない植物材料の抽出液にも適用される。例えば、マメ科植物（ダイズ、ヒヨコマメ、レンズマメなど）、または脂肪種子（ナタネ、ダイズ、ゴマ、ワタなど）の抽出液があり、かかる抽出液はタンパク質を溶解状態またはコロイド懸濁状態で含んでいるが、この種のタンパク質は化学的作用、酸発酵および/または加熱によって凝固しうる。最後に、ミルクという語は動物ミルクと野菜ミルクの混合物をも意味する。
【０１３６】
本発明の結合性微生物またはその断片をヨーグルトや同様のものに添加する場合、本発明の微生物を約105〜107細胞/mlの濃度で又はそれと等価な量の断片濃度で添加することで十分である。そのような場合には、飲物自体の品質に大きな影響を及ぼすことなく、
ミュータンス・ストレプトコッキィ（mutans Streptococci）、好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）によるバイオフィルム形成を完全に予防または阻止することが可能であり、したがってう蝕原性株が原因の歯石、口臭又は齲蝕を予防又は遅延させることが可能である。
【０１３７】
そのような食品、飲料または飼料は、食品、飲料または飼料の原料もしくは調理済み材料に活性成分を添加することを含めて、一般的な食品、飲料または飼料の製造方法で製造することができる。本発明による食品、飲料または飼料は、食品、飲料または飼料に一般的に用いられる方法と同様にして成形および造粒することができる。成形および造粒方法には以下の方法が含まれる：流動層造粒、撹拌造粒、押出し造粒、回転造粒、気流造粒、圧縮成形造粒、クラッキング造粒、噴霧造粒、および射出造粒のような造粒法；パンコーティング、流動層コーティング、およびドライコーティングのようなコーティング法；パフドライ、過剰スチーム法、フォームマット法、マイクロ波インキュベーション法のような膨張法、ならびに押出し造粒機と押出し機を用いる押出し法。
【０１３８】
本発明の食品、飲料、又は飼料は、本発明の結合性微生物又はその断片を活性成分として含む任意の食品、飲料、又は飼料を含む。該食品、飲料または飼料中の活性成分は、得られる食品、飲料または飼料がミュータンス・ストレプトコッキィとの特異的合というその活性を発揮できさえすれば、どのような濃度にも特に限定されない。活性成分の濃度は、そのような活性成分を含む食品、飲料または飼料の重量基準で、または本明細書に記載するような細胞数に関して、好ましくは0.001〜100％、さらに好ましくは0.01〜100％、最も好ましくは0.1〜100％である。
【０１３９】
活性成分を添加しうる特定の食品または飲料としては、例えば、以下のものが挙げられる：ジュース、清涼飲料、スープ、茶、サワーミルク飲料、酪農製品（例えば、発酵乳、アイス、バター、チーズ、加工乳、脱脂粉乳）、肉製品（例えば、ハム、ソーセージ、ハンバーガー）、魚肉およびフィッシュケーキ製品、卵製品（例えば、味付けした巻き卵、エッグカード）、菓子（例えば、クッキー、ジェリー、スナック、チューインガム）、パン、麺類、漬物、スモーク製品、魚の乾物、および調味料。食品または飲料の形態としては、例えば、粉末状食品、シート様食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット食品、および液状食品がある。
【０１４０】
ミュータンス・ストレプトコッキィと特異的に結合する活性を有する結合性微生物またはその断片を含む、本発明の食品または飲料は、好ましくは乳幼児用の栄養組成物である。そのような乳幼児用の栄養組成物には、乳幼児用の調製乳、タンパク質分解乳、特定栄養調製乳、またはベビーフードおよび幼児用に調製された食品が含まれる。乳幼児用の栄養組成物の形態には、特に限定するものではないが、乾燥して微粉砕した粉ミルク、およびベビーフードが含まれ、また、アイスクリーム、発酵乳、および乳幼児摂取用のジェリーといった一般食品も含まれる。
【０１４１】
本発明による乳幼児用の栄養組成物、及び動物、特にペット動物のための食品または飼料組成物は主にタンパク質、脂質、糖、ビタミンおよび/またはミネラルから構成される。栄養組成物においては、これらの成分に活性成分をブレンドする。タンパク質には、乳タンパク質、例えば脱脂乳、カゼイン、チーズホエー、ホエータンパク質濃縮物およびホエータンパク質単離物、ならびにそれらの画分、例えばαs-カゼイン、β-カゼイン、α-ラクトアルブミン、およびβ-ラクトグロブリンが含まれる。さらに、卵タンパク質、例えば卵黄タンパク質、卵白タンパク質、もしくは卵アルブミン、またはダイズタンパク質、例えば脱脂ダイズタンパク質、分離ダイズタンパク質、および濃縮ダイズタンパク質を使用することができる。これら以外に、コムギグルテン、魚肉タンパク質、牛肉タンパク質、コラーゲンといったタンパク質も上手に使用することができる。さらに、これらのタンパク質の画分、酸もしくは酵素処理から得られるペプチド、または遊離のアミノ酸も十分に使用しうる。遊離のアミノ酸は窒素源として役立ち、さらに特定の生理作用をもたらすために使用することができる。そのような遊離アミノ酸として、例えば、タウリン、アルギニン、システイン、シスチン、およびグルタミンが挙げられる。イヌについては、これにはアルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン、リシン及びバリンが含まれる。ネコについてはタウリンも必須である。脂質には、動物性油脂（例えば、乳脂肪、ラード、牛脂、魚油）、植物油（例えば、ダイズ油、ナタネ油、コーン油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、ベニバナ油、荏油、亜麻仁油、マツヨイグサ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド、綿実油）、細菌により生成された油脂、ならびにその分留油、その水素添加油、およびそのエステル交換油が含まれる。ブレンドすべき脂質の量は用途により変化する。
【０１４２】
さらなる好ましい食品及び飼料、特にペット飼料の成分は、オメガ6脂肪酸及びオメガ3脂肪酸である。特に好ましくは、好ましくはトウモロコシ油、ダイズ油、キャノーラ油、ベニバナ油及びヒマワリ油、全粒穀物及び/又は家禽の体脂の形のリノレイン酸;好ましくは家禽の体脂、赤肉、卵黄及び/又は魚油の形のアラキドン酸;好ましくはクロフサスグリ種子油、ルリヂサ油及び/又はマツヨイグサ油の形のガンマリノレン酸;好ましくは脾臓、腎臓、副腎及び/又はglaからの代謝物の形のジホモガンマリノレン酸;好ましくは亜麻仁油、キャノーラ油、ダイズ油及び/又はクルミ油の形のアルファリノレン酸;好ましくは冷水魚及びその油の形のエイコサペンタエン酸;好ましくは冷水魚及びその油の形のドコサヘキサエン酸である。
【０１４３】
糖には、例えば1種以上のデンプン、可溶性多糖、デキストリン、本明細書に記載のショ糖、ラクトースなどの単糖、マルトース、グルコース及びフルクトース並びに他のオリゴ糖が含まれる。好ましい糖には、グルコース、フルクトース、ハチミツ、ガラクトース、ラクトース、ショ糖、マルトース、デキストリン、グリコーゲン及びデンプンが含まれる。しかし、上記のように、グルコース、フルクトース、ハチミツ、ガラクトース、ラクトース、ショ糖及びマルトースの最大含量は、好ましくは組成物全体の20重量%、より好ましくは組成物全体の5重量%、最も好ましくは組成物全体の2重量%である。さらにより好ましくは、20重量%、より好ましくは5重量%及び最も好ましくは2重量%の前述の最大含量は、甘ショ糖、カラメル、トウモロコシの糖蜜、コーンシロップ、デキストロース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ハチミツ、ラクトース、レブロース、マルトース、マンニトール、サッカリン、ソルビトール、ショ糖及びキシリトールの群の全物質の総量に対して、最も好ましくは単糖及び糖類の総量に対して適用する。
【０１４４】
好ましくはセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、植物ガム及び植物粘液、ビートパルプ、グアーガム、アラビアガム、キサンタンガム並びにローカストビーンガムから選択される食物繊維も好ましい。そうした糖類の総量は、栄養組成物中の総固形物に対して好ましくは40から80重量%である。さらに、アスパルテームなどの人工甘味剤は、十分使用することができる。人工甘味剤の量は、適切には栄養組成物中の総固形物あたり0.05から1.0重量%である。
【０１４５】
ビタミンには、これらに限定されないが、必須構成成分としてリコピンが含まれ、例えばビタミンA、ビタミンB群、ビタミンC、D及びE及びビタミンK群、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド、カルニチン、コリン、イノシトール及びビオチンなどのビタミンがさらに含まれるが、そうしたビタミンが乳児又はペット動物に投与可能であることが前提である。そうしたビタミンは、好ましくは、乳児用の栄養組成物中の総固形物あたり重量基準で10mgから5gまでである。乳児及び/又は動物、好ましくはペット動物用の栄養組成物のための好ましいビタミンには、以下が含まれる。
【０１４６】
ビタミンA(レチノール)及び/又は前駆物質としてのベータカロチン。このビタミンは、肝臓、魚肝油、ニンジン、緑葉野菜、卵黄及び/若しくは黄色果実の形で、又は合成形態のビタミンA及び/又はベータカロチンの形で好ましくは存在する。
【０１４７】
ビタミンD(カルシフェロール)。このビタミンは、ハリバ肝油及び/若しくはタラ肝油、塩水魚、チーズ、ヨーグルト及び/若しくは卵の形で、又は合成形態のビタミンDの形で好ましくは存在する。
【０１４８】
ビタミンE(トコフェロール)。このビタミンは、胚芽、トウモロコシ、ナッツ、種子、ホウレンソウ及び/若しくは他の緑葉野菜、アスパラガス、植物油の形で、又は合成形態のビタミンEの形で好ましくは存在する。
【０１４９】
ビタミンK(ナフトキノン)。このビタミンは、キャベツ、カリフラワー、ホウレンソウ及び/若しくは他の緑葉野菜、穀類、ダイズ及び/又は他の野菜の形で、又は合成形態のビタミンKの形で好ましくは存在する。好ましくは、食品又は飼料はメナジオンを含まない。
【０１５０】
ビタミンB1(チアミン)。このビタミンは、コムギ胚芽、コメ及び/若しくは他の全粒穀物、赤肉(特に豚肉)、肝臓、魚、酵母、乾燥豆、エンドウマメ及び/若しくはダイズの形で、又は合成形態のビタミンB1の形で好ましくは存在する。
【０１５１】
ビタミンB2(リボフラビン)。このビタミンは、赤肉、肝臓、魚、卵、酵母、チーズ、マメ科植物、ナッツ及び/若しくは緑葉野菜の形で、又は合成形態のビタミンB2の形で好ましくは存在する。
【０１５２】
ビタミンB3(ナイアシン)。このビタミンは、肝臓、赤肉、家禽、魚、ナッツ、酵母、マメ科植物、アスパラガス、種子及び/若しくは緑葉野菜の形で、又は合成形態のビタミンB3の形で好ましくは存在する。
【０１５３】
ビタミンB5(パントテン酸)。このビタミンは、卵、魚、牛の赤身肉、マメ科植物、酵母、ブロッコリー及び/若しくはキャベツの仲間の他の野菜、ジャガイモ及び/も若しくはサツマイモの形で、又は合成形態のビタミンB5の形で好ましくは存在する。
【０１５４】
ビタミンB6(ピリドキシン)。このビタミンは、肉、魚、卵、バナナ及び/若しくは全粒穀物の形で、又は合成形態のビタミンB6の形で好ましくは存在する。
【０１５５】
ビタミンB8(ビオチン)。このビタミンは、生の卵黄、肝臓及び/若しくは野菜の形で、又は合成形態のビタミンB8の形で好ましくは存在する。
【０１５６】
ビタミンB9(葉酸(Folic Acid)、葉酸(Folate))。このビタミンは、ニンジン、酵母、肝臓、卵黄、メロン、アンズ、カボチャ、豆、ライムギ、全粒コムギ及び/若しくは緑葉野菜の形で、又は合成形態のビタミンB9の形で、好ましくは存在する。
【０１５７】
ビタミンB12(コバラミン)。このビタミンは、魚、肝臓、肉、家禽、卵及び/若しくはチーズの形で、又は合成形態のビタミンB12の形で好ましくは存在する。
【０１５８】
ビタミンC(アスコルビン酸)。このビタミンは、柑橘類果実のジュース若しくは果肉、ベリー、トマト、カリフラワー、ジャガイモ、緑葉野菜及び/若しくはグリーンペッパーの形で、又は合成形態のビタミンCの形で好ましくは存在する。適切な形態で、好ましくはアスコルビン酸カルシウムとして補充することは、慢性の関節疾患及び筋骨格障害を罹患しているイヌにおけるその有益効果のため、好ましい。子犬では、そうした障害の発症を予防するのに役立つ。
【０１５９】
さらに、ミネラルとしては、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、銅、亜鉛、リン、塩素、マンガン、セレン、およびヨウ素が挙げられる。このようなミネラルは、乳幼児用の栄養組成物中の全固形分につき重量基準で、好ましくは1 mg〜5 gである。
【０１６０】
上記の成分のほかに、本発明の乳幼児用の栄養組成物、及び動物特にペット動物のための食品または飼料組成物は、栄養組成物中にブレンドすることが望ましい任意の成分、例えば、食物繊維、ヌクレオチド、核酸、香料、着色剤などをブレンドしてもよい。
【０１６１】
本発明にしたがい用いる食品または飲料は、健康食品または飲料として、あるいは、う蝕を予防および/または治療するため及び／又は口臭を予防および/または治療するため、及び／又は歯石を予防および/または治療するための機能性食品または飲料として使用することができる。
【０１６２】
本発明による食品または飲料を摂取する場合、その摂取量は特に限定されない。一般には、摂取量は活性成分の全量に基づいて1日につき0.1〜50 g、好ましくは0.5 g〜20 gである。
【０１６３】
この量で1日から最長5年間、好ましくは2週間から1年間、食品または飲料を継続して摂取する。その際、食品または飲料を摂取する個体の症状の重症度、年齢、体重などに応じて、摂取量を適切な範囲に調整することができる。
【０１６４】
本発明の組成物は、結合性微生物またはその断片に加え、さらに穀類、ふすま、脂肪種子荒挽き粉、動物性飼料原料、その他の飼料原料、および精製産物を含みうる。穀類には、例えば、マイル、コムギ、オオムギ、オートムギ、ライムギ、玄米、ソバ、アワ、キビ、ヒエ、トウモロコシ、ダイズが含まれる。ふすまには、例えば、米ぬか、脱脂米ぬか、最下位等級のコムギ粉、コムギ胚芽、大麦ぬか、篩いかす、コーンブラン、トウモロコシ胚芽が含まれる。脂肪種子荒挽き粉には、例えば、ダイズミール、ダイズ粉、アマニ粕、綿実粕、ひき割りピーナッツ、紅花粕、ココナッツミール、パーム核ミール、セサミミール、ヒマワリミール、ナタネミール、カポック種子粕、および粒マスタードが含まれる。動物性の飼料原料には、例えば、魚粉、インポートミール、ホールミール、およびコーストミール、フィッシュソリュブル、肉粉、肉・骨粉、血液粉、分解毛（decomposed hair）、骨粉、屠殺場からの副産物、羽毛粉、蚕の蛹、脱脂乳、カゼイン、ドライホエー、およびオキアミが含まれる。その他の飼料原料としては、例えば、アルファルファのような植物の茎と葉、ヘイキューブ、アルファルファのリーフミール、およびローカストリーフパウダー、トウモロコシ加工産業からの副産物（例えばトウモロコシグルテンミール、トウモロコシグルテン飼料、トウモロコシスティープリカー）、デンプン、砂糖、酵母、発酵産業からの副産物（例えば、ビール残渣、モルトルート、リカー残渣、醤油残渣）、および農業上の副産物（例えば、かんきつ類加工残渣、ダイズカード残渣、コーヒー残渣、ココア残渣）、キャッサバ、ソラマメ、グアーミール、海草、スピルリナ、およびクロレラが含まれる。精製した産物には、例えば、カゼインやアルブミンのようなタンパク質、アミノ酸、デンプン、セルロース、スクロースやグルコースのような糖類、ミネラル、ビタミンが含まれる。
【０１６５】
本発明の組成物はさらに１以上の添加物を含みうる。かかる食品用添加物は、食品、飲料または飼料用の添加物を製造するための一般的方法で製造することができる。必要ならば、食品、飲料または飼料中で常用される添加物、例えば「食品添加物ハンドブック」(日本食品添加物協会; 1997年1月6日発行)に記載される添加物を添加してもよく、かかる添加物には以下のものが含まれる： 甘味料、着色料、保存料、増粘剤および安定剤、酸化防止剤、色止め剤、漂白剤、防腐剤、ガムベース、ビター（苦味成分）、酵素、光沢剤、酸性化剤、調味料、乳化剤、促進剤（エンハンサー）、製造用物質、香料、およびスパイス抽出物。さらに、医薬用錠剤について先に挙げた、慣用の糖類、デンプン、無機物質、植物粉末、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、および可塑剤を添加してもよい。
【０１６６】
甘味料には、次のものが含まれる。すなわち、ブラゼイン、クルクリン、エリトリトール、グリシルリジン、グリセロール, E422; 水素添加されたデンプン加水分解物、イヌリン、イソマルト, E953; ラクチトール, E966; ラカンカ(Luo han guo); マビンリン; マルチトール, E965; マルト−オリゴ糖; マンニトール, E421; ミラクリン; モンタチン; モネリン; ペンタジン; ソルビトール, E420; ステビア抽出物又は捨て日オールグリコシド類, 特にステビオシド, レバウジオシドA, レバウジオシドC, ダルコシドA, ルブソシド, ステビオールビオシドH及びレバウジオシドB; タガトース; ソーマチン, E957; キシリトール, E967; アセスルファームカリウム, E950; アリテーム; アスパルテーム, E951; アスパルテーム−アセスルフェームの塩, E962; シクラメート, E952; ダルシン; グルシン; ネオヘスペリジンジヒドロカルコン, E959; ネオテーム; P-4000; サッカリン, E954; スクラロース, E955; リコライス; キシロース及びラカンカ(Momordica grosvenori果実)。
【０１６７】
着色料には、カロテノイドおよびウコン色素、フラボノイド、カラメル色素、スピルリナ色素、クロロフィル、ムラサキサツマイモ色素、ムラサキイモ(purple yam)色素、シソ色素、およびブルーベリー色素が含まれる。
【０１６８】
保存料には、例えば、亜硫酸ナトリウム、安息香酸エステル、安息香エキス、ソルビン酸塩、およびプロピオン酸塩が含まれる。
【０１６９】
増粘剤および安定剤には、例えば、アラビアガムやキサンタンガムのようなガム、アルギン酸塩、キチン、キトサン、アロエエキス、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、カゼインナトリウム、トウモロコシデンプン、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、デキストリン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、マイクロファイバーセルロース、微結晶質セルロース、海草セルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、カラギーナン、または酵母細胞壁が含まれる。
【０１７０】
酸化防止剤には、例えば、ビタミンC群、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸カルシウム、エリソルビン酸、オリザノール、カテキン、クエルセチン、チョウジエキス、酵素処理ルチン、リンゴ抽出物、ゴマ種子抽出物、ジブチルヒドロキシトルエン、ウイキョウエキス、セイヨウワサビ抽出物、セリ抽出物、茶抽出物、トコフェロール、ナタネ抽出物、コーヒー豆抽出物、ヒマワリ種子抽出物、フェルリオ酸(ferulio acid)、ブチルヒドロキシアニソール、ブルーベリーリーフエキス、プロポリスエキス、ペッパーエキス、ホウセンカ(garden balsam)エキス、没食子酸、ユーカリエキス、およびローズマリーエキスが含まれる。
【０１７１】
色止め剤としては、例えば亜硝酸ナトリウムがある。漂白剤としては、例えば亜硫酸ナトリウムがある。
【０１７２】
防腐剤としては、例えばo-フェニルフェノールがある。ガムベースには、例えば、アセチルリシノール酸メチル、ウルシロウ、エステルガム、エレミ樹脂、オウリキュウリロウ、カウリガム(kaurigum)、カルナウバロウ、グリセリン脂肪酸エステル、鯨ロウ、コパイババルサム(copaibabalsam)、コパル樹脂、ゴム、コメヌカロウ、サトウキビロウ、シェラック、ジェルトン、スクロース脂肪酸エステル、脱重合天然ゴム、パラフィンワックス、バルサムノキ、プロピレングリコール脂肪酸エステル、粉末パルプ、粉末モミガラ、ホホバ油、ポリイソブチレン、ポリブテン、微結晶質ワックス、マスティックガム、蜜蝋、およびリン酸カルシウムが含まれる。苦味成分には、例えば、イソ-α-ビター酸、カフェイン、カワラタケ(Coriolus versieolor)抽出物、キナ抽出物、オウバク抽出物、ゲンチアナ抽出物、スパイス抽出物、酵素処理ナリンジン、ジャマイカカッシア抽出物、テオブロミン、ナリンジン、カッシア抽出物、アブサン抽出物、ヒキオコシエキス、オリーブティー、ビターオレンジ(Citrus aurantium)抽出物、ホップ抽出物、およびニガヨモギ抽出物が含まれる。酵素としては、例えば、アミラーゼ、トリプシン、レンネットが挙げられる。光沢剤としては、例えば、ウルシロウおよび和蝋がある。酸性化剤には、例えば、アジピン酸、イタコン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、二酸化炭素、乳酸、フィチン酸、フマル酸、リンゴ酸、およびリン酸が含まれる。調味料には、例えば、アミノ酸（例：アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、イソロイシン、グリシン、セリン、シスチン、チロシン、ロイシン、プロリン）、核酸（例：イノシン酸ナトリウム、ウリジン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、シチジル酸ナトリウム、リボヌクレオチドカルシウムおよびリボヌクレオチドナトリウム）、有機酸（例：クエン酸、コハク酸）、塩化カリウム、塩水湖水低塩化ナトリウム液、粗製塩化カリウム、ホエーソルト、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、およびクロレラ抽出物が含まれる。
【０１７３】
促進剤には、例えば、亜鉛塩、ビタミンC群、各種アミノ酸、5-アデニル酸、塩化鉄、ヘスペリジン、各種焼成カルシウム、各種非焼成カルシウム、ジベンゾイルチアミン、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、チアミン塩酸塩、デュナレラ(Dunallella)、オアロテン(Oarotene)、トコフェロール、ニコチン酸、ニンジンカロテン、パーム油カロテン、パントテン酸カルシウム、ビタミンA、ヒドロキシプロリン、ピロリン酸二水素カルシウム、ピロリン酸第一鉄、ピロリン酸第二鉄、フェリチン、ヘム鉄、メナキノン、葉酸、およびリボフラビンが含まれる。
【０１７４】
製造用物質には、例えば、アセトンやイオン交換樹脂のような加工補助剤が含まれる。
【０１７５】
香料としては例えばバニラエッセンスがあり、スパイス抽出物としては例えばトウガラシエキスがある。
【０１７６】
これらの各種添加物は、投与様式を考慮して、本発明に従って活性成分に添加することができる。
【０１７７】
本発明の組成物、好ましくは食品または飼料組成物又は医薬組成物は、上記の乳酸菌の群ぬ属する結合性微生物をプロバイオティック微生物の形態で含むことが想定される。すなわち、プロバイオティック効果の他に、乳酸菌の群に属する上記のプロバイオティック微生物は、ミュータンス・ストレプトコッキィにより引き起こされるバイオフィルム形成を処置及び／又は予防するために有用である。かかるプロバイオティック微生物の量は、健全な医学的判定の範囲内で、治療しようとする症状（好ましくは、う蝕、史跡及び／又は口臭）を大いに改善するのに十分高いが、重大な副作用を避けるには十分低い量（妥当な利益/リスク比）とする。プロバイオティック微生物の有効量は、達成すべき特定の目標、治療対象患者の年齢および体調、根底にある疾患の重症度、治療の持続期間、同時に行う治療法の性質、ならびに使用する特定の微生物により変化する。こうして、プロバイオティック微生物の有効量は望まれるミュータンス・ストレプトコッキィとの特異的結合をもたらす最少量となるだろう。例えば、1×109個の細菌を、生きているかまたは死んでいる全細胞として、0.05 mlのリン酸緩衝溶液中または0.05 mlの寒天懸濁液中に含むもの、あるいは細胞壁断片の乾燥重量等価物は、約0.05〜20 mlの量で投与する場合に有効である。実施上の決定的な利点は、プロバイオティック微生物を経口投与のような都合のよい方法で投与できる点である。投与経路に応じて、プロバイオティック微生物からなる活性成分は、酵素や酸の作用から、また該生物を不活性化する他の自然条件から該生物を保護する材料でコーティングする必要があるかもしれない。プロバイオティック生物を非経口投与以外の方法で投与するためには、不活性化を防止する物質でそれらをコーティングするか、またはかかる物質と一緒に投与すべきである。例えば、プロバイオティック生物を酵素阻害剤と一緒に、またはリポソーム内に保持させて、投与することができる。酵素阻害剤としては、膵臓のトリプシン阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスフェート(DFP)およびトラシロール(trasylol)が挙げられる。リポソームには、W/O/W（water-in-oil-in-water）型P40エマルジョン、および乳酸桿菌やその副産物を尿生殖器表面に輸送する従来の特別設計リポソームが含まれる。分散液を調製することも可能であり、例えばグリセロール、液状ポリエチレングリコール、もしくはこれらの混合物中に、または油中に調製することができる。一般的に、分散液を調製するには、各種の滅菌済みプロバイオティック生物を、基剤の分散媒と他の必要な成分（上で挙げたものから選択される）とを含む無菌ビヒクル中に加えて混合する。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって滅菌濾過した溶液から活性成分と所望の追加成分の粉末をもたらす真空乾燥法および凍結乾燥（freeze-drying）法である。その他の好ましい調製方法として凍結乾燥（lyophilization）および加熱乾燥があるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明の組成物はまた、経口的に、またはバッカル投与されることを意図した製品を包含し、これらは本明細書記載の製薬上許容される担体を含んでおり、それらに上記の乳酸菌の群に属する微生物が新鮮、濃縮又は乾燥形態で添加される。これらの製品は摂取可能な懸濁液剤、ゲル剤、散剤、カプセル剤、ハードゼラチンカプセル剤、シロップ剤、または当業者に公知のいずれか他のガレニク剤の形で提供することが可能である。
【０１７９】
プロバイオティック生物が上記のように適切に保護される場合は、その活性成分を、例えば不活性希釈剤もしくは同化可能な食用担体と共に、経口投与したり、あるいは活性成分をハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル内に封入したり、胃を通過するように設計された錠剤に圧縮したり（すなわち、腸溶コーティングを施したり）、食物に直接混ぜ込んだりすることができる。治療上経口投与する場合は、プロバイオティック生物を賦形剤と均質に混合し、摂取可能な錠剤、バッカル剤、ロゼンジ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、カシェ剤などの剤形で使用する。本発明の組成物または製剤は、経口単位剤形が例えば約1×109個細胞/mlの生存または非生存菌（例えば、乳酸桿菌）を含むように製造される。便利で効果的な投与のために、プロバイオティック生物を上記のような単位剤形中に適当な医薬用または食用担体と共に有効量で配合する。単位剤形は例えば主活性成分を109個/mlの生存または非生存菌（例えば、乳酸桿菌）に近似する量で含有しうる。プレバイオティクスのような補助成分を含む組成物の場合は、かかる成分の常用量と投与方法を参考にして投与量を決定する。
【０１８０】
本発明による食品及び飼料組成物の好ましい成分は、アルファルファ、アルファルファ濃縮粉末、アルファルファ乾燥ミール、アルファルファ栄養素濃縮物、アルファリポ酸、動物ダイジェスト、動物脂肪、アルゲニン(argenine)、人工香料、アスコルビン酸、アスパラガス、枯草菌(bacillus subtilis)、ベーコン、ベーコンフレーバー、オオムギ、オオムギ若葉、オオムギ麦芽粉、バジル、豆、牛肉、牛肉ボーンミール、ビーフブロス、牛肉副産物、ビーフフレーバー、牛肝臓、ビーフミール、牛脂、ビートパルプ、ビートパルプ(糖除去化)、ビート、ベータカロチン、BHA、ビフィドバクテリウム・ロングム(bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム(bifidobacterium pseudolongum)、ビフィドバクテリウム・テルモフィルム(bifidobacterium thermophilum)、ビオチン、青色2号、青色2号及び他の色素、ブルーベリー、ボーンミール、ルリヂサ油、ビール乾燥酵母、ビール酵母、ビール酵母エキス(サッカロミセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae)発酵可溶性物))、酒米、ブロッコリー、玄米、玄米粉、カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、パントテン酸カルシウム、リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、硫酸カルシウム、サトウキビ糖蜜、キャノーラミール、キャノーラ油、カンタキサンチン、カラメル、カラメル色素、カーミン、カラゲナン、カラゲナンガム、ニンジン粉末、ニンジン、カゼイン、ナマズ、ナマズミール、セロリ、セルロース、セルロース粉末、チーズ粉末、キレート化コバルト、キレート化銅、キレート化鉄、キレート化カリウム、鶏肉、チキンブロス、鶏肉副産物臓器のみ、鶏肉副産物、鶏肉副産物ミール、鶏肉副産物臓器肉のみ、天然鶏軟骨、鶏脂、天然鶏脂、チキンフレーバー、鶏臓物、鶏肝臓、鶏肝臓ダイジェスト、鶏肝臓フレーバー、チキンミール、天然鶏肉、鶏肉煮出し汁、チコリーエキス、塩化コリン、コンドロイチン硫酸、シナモン、クエン酸、クエン酸及びローズマリー、クエン酸及びローズマリーエキス、柑橘ペクチン、クローブ芽油、アミノ酸キレートコバルト、炭酸コバルト、コバルトタンパク化合物、タラ、銅、アミノ酸キレート銅、銅アミノ酸複合体、酸化銅、銅タンパク化合物、硫酸銅、トウモロコシ、トウモロコシふすま、トウモロコシ粉、トウモロコシ胚芽ミール、トウモロコシグルテン、トウモロコシグルテンミール、粗びきトウモロコシ、コーンミール、トウモロコシ油、コーンスターチ、改変コーンスターチ、コーンシロップ、ひき割りオオムギ、ひき割り精白オオムギ、クランベリー、クランベリー粉末、骨抜きの鶏肉、骨抜きの子羊肉、骨抜きの七面鳥の肉、脱水アルファルファ、脱水アルファルファミール、脱水ニンジン、脱水ジャガイモ、デキストロース、DHA、リン酸二カルシウム、DL-アルファ酢酸トコフェロール、DL-メチオニン、乾燥動物ダイジェスト、乾燥リンゴ、乾燥バチルス・リケニフォルミス(bacillus licheniformis)発酵エキス、乾燥枯草菌発酵エキス、乾燥ビートパルプ、乾燥ビートパルプ(糖除去化)、乾燥ブルーベリー、乾燥ビール酵母、乾燥バターミルク、乾燥トウガラシ、乾燥ニンジン、乾燥セルロース、乾燥チェダーチーズ、乾燥チーズ、乾燥チーズ粉末、乾燥鶏軟骨、乾燥鶏肝臓��鶏肉煮出し汁、乾燥チコリー根、乾燥柑橘果肉、乾燥調理済み七面鳥肉、乾燥クランベリー、乾燥卵(egg)、乾燥卵粉末、乾燥卵製品、乾燥卵(eggs)、乾燥ニンニク、乾燥ショウガ、乾燥したブドウ絞りかす、乾燥グリーンビーンズ、乾燥ケルプ、乾燥ケルプミール、乾燥肝臓ダイジェスト、乾燥肉副産物、乾燥パプリカ、乾燥パセリフレーク、乾燥エンドウマメ、乾燥プレーンビートパルプ、乾燥ジャガイモ、乾燥ホウレンソウ、乾燥サツマイモ、乾燥したトマト絞りかす、乾燥ニンジン植物繊維、乾燥乳清、乾燥ヤムイモ、カモ肉、デュラム粉、硝酸チアミンを強化したデュラムセモリナ粉、卵麺、卵断片、卵製品、卵、エンテロコッカス・フェシウム(enterococcus faecium)、エトキシキン、ユーカリ油、硫酸鉄、繊維、魚、魚ブロス、フィッシュミール、天然フィッシュミール、魚油、アマミール、アマの種子、アマ種子ミール、葉酸、葉酸ピリドキシン塩酸塩(folic acid pyridoxine hydrochloride)、食品用デンプン、フレッシュ(fresh)、新鮮な鶏肉、新鮮な鶏肉副産物、フラクトオリゴ糖、フマル酸、ニンニク、ニンニクエキス、ニンニクフレーバー、ニンニク油、ニンニク粉末、ゼラチン、ショウガ、ショウガエキス、グルコサミン、塩酸グルコサミン、グリセリン(glycerin)、グリセリン(glycerine)、モノステアリン酸グリセリン、グリシン、グリーンビーンズ、緑茶、粉砕トウモロコシ、粉砕アマ種子、粉砕サイリウム種子、粉砕米、粉砕コムギ、粉砕小麦粉、粉砕全粒オオムギ、粉砕全粒トウモロコシ、粉砕全粒ソルガム、粉砕全粒コムギ、粉砕全エンドウマメ、粉砕全コムギ、粉砕黄トウモロコシ、グアーガム、アラビアガム、オヒョウ、ニシンミール、ニシン油、塩酸、イノシトール、ヨウ素、ヨウ素添加塩、アミノ酸キレート鉄、鉄アミノ酸複合体、酸化鉄、鉄タンパク化合物、硫酸鉄、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスコルビル-2-ポリホスフェート、L-アスコルビル-2-ポリホスフェートa、L-カルニチン、L-リジン、L-リジン一塩酸塩、L-トリプトファン、ラクトバチルス・アシドフィルス(lactobacillus acidophilus)、子羊肉、ラムブロス、子羊肉副産物、子羊肉ダイジェスト、子羊肉脂肪、子羊肝臓、ラムミール、子羊肉煮出し汁、子羊の胃袋、レシチン、ヒラマメ、レタス、肝臓、ローカストビーンガム、ルテイン、リコピン、リジン、サバ、酸化マグネシウム、麦芽エキス、オオムギ麦芽粉、硫酸第一マンガン(managanous sulfate)、アミノ酸キレートマンガン、酸化マンガン、マンガンタンパク質合物、硫酸マンガン、一酸化マンガン、一酸化マンガンヨウ素酸カルシウム(manganous oxide calcium iodate)、第一マンガンタンパク化合物、硫酸第一マンガン(manganous sulfate)、メープルシロップ、マリゴールドエキス、マリゴールドミール、天然肉骨ミール、肉肝臓ミール、肉副産物、メナジオンジメチルピリミジノール亜硫酸水素、メナジオン亜硫酸水素ナトリウム複合体、メナジオンビタミンK3、メンハーデンフィッシュミール、メンハーデン魚油、乳、混合トコフェロール、混合ニンジン植物繊維、改変食品用デンプン、改変デンプン、糖蜜、リン酸一カルシウム、リン酸一ナトリウム、天然及び人工の鶏肉フレーバー、天然及び人工のフレーバー、天然鶏肉フレーバー、天然色素、天然フレーバー、天然家禽フレーバー、天然スモークフレーバー、ナイアシン、ナイアシン及び硫酸鉄、無脂肪ヨーグルト、エンバクふすま、エンバク繊維、ひき割りエンバク、オートミール、エンバク、海魚、海魚ミール、ウグイスアマダイ、オメガ脂肪酸、タマネギエキス、タマネギ粉末、パントテン酸、パプリカオレオレジン、パセリ、パセリフレーク、パセリ油、パセリ粉末、部分的に水素化されたダイズ油、パスタ、エンドウマメ繊維、エンドウマメタンパク質、落花生殻10.8%、精白オオムギ、エンドウマメ、コショウ、ワセリン、フィロキノンビタミンK1、リン酸、豚肉ブロス、豚肉副産物、豚肝臓、ソルビン酸カリウム、カリウムアミノ酸複合体、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ素カリウム、ソルビン酸カリウム、ジャガイモ、ジャガイモ繊維、ジャガイモデンプン、家禽の肉、家禽肉副産物ミール、家禽肉副産物、家禽脂、家禽の臓物、家禽の肝臓、粉末セルロース、粉末セルロース11.1%、プロピオン酸、没食子酸プロピル及びクエン酸、プロピレングリコール、ピリドキシン塩酸塩、サイリウム、ウサギの肉、ウサギ肉副産物、ウサギ肉煮出し汁、赤色3号、赤色40号及び他の色素、トウガラシ、リボフラビン、コメ、米ぬか、米粉、コメグルテン、もみ殻、コメタンパク質濃縮物、ローズマリー、ローズマリーエキス、ローズマリーエキス及びクエン酸、ライムギ、セージ、サーモン、サーモンブロス、サーモンミール、サーモン油、塩、海塩、セレン、小エビ、スモークフレーバー、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、カゼインナトリウム、塩化ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、色保持用の亜硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム(sodium tripolyphoshate)、トリポリリン酸ナトリウム(sodium tripolyphosphate)、ソルビン酸、ソルビトール、ダイズ(soy)粉、ダイズ(soy)外皮、ダイズ(soy)レシチン、ダイズ(soy)タンパク質濃縮物、分離ダイズ(soy)タンパク質、ダイズ(soya)油、ダイズ(soybean)外皮、ダイズ(soybean)ミール、ダイズ(soybean)ミルラン、ダイズ(soybean)油、スペアミント、ホウレンソウ、スピルリナ、デンプン、蒸したボーンミール、ショ糖、加工用の十分な水、砂糖、日干しにしたアルファルファミール、ヒマワリミール、ヒマワリ油、サツマイモ粉末、サツマイモ、獣脂、タピオカデンプン、タウリン、ピロリン酸四ナトリウム、人造肉、チアミン、塩酸チアミン、硝酸チアミン、タイム、二酸化チタン、二酸化チタン色素、トマトフレーク、トマトペースト、トマト絞りかす、トマト、微量金属(硫酸カルシウム)、微量金属(硫酸銅)、微量金属(塩化カリウム)、微量金属(トリポリリン酸ナトリウム)、微量金属(酸化亜鉛)、微量金属(亜鉛タンパク化合物)、微量金属(硫酸亜鉛)、リン酸三カルシウム、マグロ、マグロミール、七面鳥肉、ターキーブロス、七面鳥肉副産物のミール、天然七面鳥肉、七面鳥肉煮出し汁、ウコン、子牛肉、子牛ブロス、植物油、鹿肉、鹿肉副産物、鹿の肝臓、鹿肉ミール、鹿の食肉、鹿肉煮出し汁、ビタミンA、ビタミンA及びD3、ビタミンAアセテート、ビタミンB1、ビタミンB12、ビタミンB12及びD3、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD3、���タミンD3及びE、ビタミンE、ビタミンK、水、ミズタガラシ、加工するのに十分な水、ミズタガラシ及びホウレンソウ、コムギ、コムギふすま、小麦粉、コムギ胚芽ミール、コムギグルテン、粗びきコムギ、コムギミルラン、コムギデンプン、乳清、白身魚(white fish)、白身魚(whitefish)、白身魚ミール、全玄米、全ニンジン、全クランベリー、全卵、全ニンニク小鱗茎、全粒トウモロコシ、全粒コムギ、全粉砕オオムギ、全粉砕玄米、全粉砕エンバク、全粉砕コムギ、全米、全サツマイモ、全コムギ、全粒コムギ粉、ワイルドライス、キサンタンガム、酵母培養物、黄色5号、黄色6号、黄色カボチャ、黄色ズッキーニ、ユッカ・シジゲラ(yucca schidigera)、ユッカ・シジゲラエキス、アミノ酸キレート亜鉛、亜鉛アミノ酸複合体、酸化亜鉛、亜鉛タンパク化合物、亜鉛タンパク化合物及び硫酸亜鉛である。
【０１８１】
最も好ましい成分は以下の通りである。好ましくは健康な皮膚及び/又は被膜の形成を促進するのに十分な量のアルファリポ酸。抗菌目的の好ましい成分は、アルファリポ酸、乾燥ニンニク、ニンニクエキス、ニンニク油及びニンニク粉末である。好ましくは抗酸化物質としてのレシチン。ひき割りオオムギ、ひき割り精白オオムギ、粉砕全粒トウモロコシ、粉砕全粒ソルガム、ニシン油、サバ、メンハーデン魚油、海魚、全玄米及び全サツマイモがエネルギー源として好ましい。好ましい繊維源は乾燥ニンジン、乾燥リンゴ、粉砕全粒オオムギ、エンバクふすま、エンバクひき割り、オートミール、全粉砕オオムギ、全粉砕エンバクである。コバルトタンパク化合物(キレート化コバルト源)、銅タンパク化合物、鉄タンパク化合物、マンガンタンパク化合物、第一マンガンタンパク化合物、微量金属及び亜鉛タンパク化合物は好ましいミネラル源である。好ましいオメガ3脂肪酸源はルリヂサ油、キャノーラ油、(混合トコフェロールで保存された)キャノーラ油及びアマ種子である。ローズマリーエキス及びクエン酸は好ましい防腐剤である。好ましいタンパク質源はビーフミール、チキンミール、乾燥エンドウマメ、オヒョウ、ラムミール、メンハーデンフィッシュミール、ウグイスアマダイ、エンドウマメ、鹿肉ミール、全粉砕玄米及び全粉砕コムギである。好ましいビタミン源はアスコルビン酸カルシウム、ニンジン、乾燥ニンジン、混合トコフェロール、全ニンジンである。好ましい淡水の置換物及びまた好ましいフレーバーはビーフブロス、チキンブロス、ラムブロス、子羊肉煮出し汁及びターキーブロスである。
【０１８２】
最もではないが非常に好ましい成分は以下の通りである。エネルギー源としての、アルファルファ濃縮粉末、アルファルファ乾燥ミール、鶏脂、鶏肝臓、フレッシュ、海魚ミール及び精白オオムギ。繊維源としての、グリーンビーンズ、粉砕全エンドウマメ、エンバク及びエンドウマメ繊維。ミネラル源としての、アミノ酸キレートコバルト、アミノ酸キレート銅、銅アミノ酸複合体、乾燥ケルプミール、アミノ酸キレート鉄、アミノ酸キレートマンガン、硫酸マンガン、カリウムアミノ酸複合体、アミノ酸キレート亜鉛。プレバイオティクスとしての、チコリーエキス、ショウガエキス及びユッカ・シジゲラエキス。優れた防腐剤はニンニク、ローズマリー及びセージである。アルファルファ栄養素濃縮物、ナマズ、ナマズミール、タラ、カモ肉、卵、粉砕全粒コムギ、ニシンミール、エンドウマメタンパク質、ウサギ肉、小エビ、マグロ、鹿肉、鹿の食肉、白身魚(white fish)、白身魚(whitefish)、白身魚ミール、全粒コムギはタンパク質源として好ましい。ベータカロチン及び葉酸は好ましいビタミン源である。鶏肉煮出し汁、ウサギ肉煮出し汁、七面鳥肉煮出し汁、子牛肉ブロス及び鹿肉煮出し汁は淡水の好ましい置換物であり、好ましいフレーバーでもある。
【０１８３】
本発明の飼料組成物の標準的な食品、好ましくはペットフードは、ビタミンB12、ビオチン、炭酸カルシウム、パントテン酸カルシウム、塩化コリン、炭酸コバルト、硫酸銅、ビタミンD3及びEのサプリメント、DL-メチオニン、乾燥ケルプ、硫酸鉄、葉酸、イノシトール、酸化マンガン、一酸化マンガン、硫酸第一マンガン、メナジオン亜硫酸水素ナトリウム複合体、硫酸亜鉛を含めたミネラルサプリメント、天然フレーバー、ナイアシン及び硫酸鉄、ナイアシンサプリメント、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、亜セレン酸ナトリウム、タウリン、チアミン、硝酸チアミン、硝酸チアミン、ビタミンA、ビタミンA及びD3、ビタミンAアセテート、ビタミンB12、ビタミンD3、水、酸化亜鉛及び硫酸亜鉛からなる群の1種以上の成分を好ましくは含む。
【０１８４】
本発明によって使用される飼料は、活性成分としてバインダー微生物又はその断片を含む任意の飼料でもよい。この飼料には、例えば、イヌ、ネコ及びラット用のペット飼料並びに雌ウシ及びブタ用の家畜飼料が含まれる。
【０１８５】
飼料は、上記で示したように、本明細書の上記のような活性成分を、未加工の飼料材料(例えば穀類、ふすま、油料種子ミール、動物由来の未加工の飼料材料、他の未加工の飼料材料が含まれる)及び精製産物に適切に混合することで生産することができる。本発明の好ましい飼料は咀嚼製品である。好ましい製品は、ブタの耳、雄牛の腱、牛の尾、食道、乾燥赤身肉、ブタの足及び乾燥圧縮された雌牛の皮、水牛の皮、又は例えば繊維、ふすまなどとしての植物材料を含む混成型咀嚼製品である。他の咀嚼製品は当技術分野で既知であり、例えばUS 2,988,045、WO 01/50882 A2、EP 1 151 674 A1、EP 1 006 789 A1及びCH 676200 A5の咀嚼製品も好ましい。咀嚼製品は、好ましくは骨、ロール、ドーナッツ、弓形、プレッツェル、8の字又はチップの形である。
【０１８６】
本発明による飼料を動物に与える場合は、摂取される飼料の量は特に制限されないが、活性成分基準で、好ましくは、例えば1日につき体重1kgあたり0.1mgから50g、好ましくは1日につき体重1kgあたり0.5mgから20gである。飼料は1日から5年まで、好ましくは2週間から1年までの期間、この量で継続的に摂取される。また、摂取量を、飼料を摂取している動物の種、年齢及び体重などに応じて適切な範囲に調整することができる。
【０１８７】
本発明の組成物が、バインダー微生物及びその断片と独立に、1種以上のプロバイオティック微生物又はそれらの獲得産物を含むこともさらに好ましい。好ましいプロバイオティック微生物及びそれらの各産物は、枯草菌、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム、ビフィドバクテリウム・テルモフィルム、乾燥バチルス・リケニフォルミス発酵エキス、乾燥枯草菌発酵エキス、エンテロコッカス・フェシウム及びラクトバチルス・アシドフィルスである。
【０１８８】
口臭を予防及び/又は治療するためのさらなる微生物をバインダー微生物又はその断片に加えてさらに含む食品及び飼料組成物が特に好ましい。その全体が本明細書に組み込まれるWO 2009/149816 A1に開示されているような微生物をさらに含む食品及び飼料組成物が最も好ましい。これらの中で、さらなる微生物は、DSMZ受託番号DSMZ 19825、DSMZ 19826, DSMZ 19827を有するラクトバチルス・アシドフィルスからなる群から好ましくは選択される。
【０１８９】
本発明を、選択された実施例及び実施形態によってこれからさらに説明する。これらの実施形態及び実施例は、本明細書の範囲又は特許請求の範囲を限定することなく、本発明の特定の好ましい特色を示すことを意図する。当業者が、彼らの周知の一般的な知識並びに本明細書及び参照により本明細書に組み込む文献に提供される指示及び説明によって、さらなる実施例及び実施形態を考案することができることを理解されたい。
【０１９０】
実施例１：結合性微生物の保存および増殖
菌株の保存および増殖は通常の手順に従って行うことができる。本実施例では、菌株を-80℃で凍結ストックとして保存する。1 mlの培養物をMRS培地中で静止期（OD600: 4〜8）になるまで増殖させ、500μlの無菌50％グリセリン溶液と混合して凍結させる。ミュータンス・ストレプトコッキィの培養物はTSY培地中で静止期（OD600/mL 1〜2）になるまで増殖させ、凍結保存について上記に記載のように処理する。
【０１９１】
ミュータンス・ストレプトコッキィ(ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans), ストレプトコッカス・ソブリヌス(S. sobrinus), ストレプトコッカス・ラッティ(S. ratti), ストレプトコッカス・クリセツス(S. cricetus), ストレプトコッカス・フェラス(S. ferus)又はストレプトコッカス・マカカエ(S. macacae)およびラクトバチルス菌（乳酸桿菌）の培養は、密閉したファルコンチューブ内5 mlの容量で、振とうすることなく37℃で一晩行うことができる。
【０１９２】
具体的には、本出願で用いる菌株は-80℃で凍結ストックとして保存した。MRS培地で静止期（OD600/mL 4〜8）へと増殖させた1 mlの培養物を500μlの無菌50％グリセロール溶液と混合して、凍結させた。
【０１９３】
具体的には、ミュータンス・ストレプトコッキィの培養物はTSY培地で静止期（OD600/mL 1〜2）へと増殖させ、上記のように処理した。
【０１９４】
ミュータンス・ストレプトコッキィ(ストレプトコッカス・ミュータンス(DSMZ 20523,血清型c; NCTC 10923, 血清型e; NCTC 11060, 血清型f), ストレプトコッカス・ソブリヌス(DSMZ 20742), ストレプトコッカス・ラッティ(DSMZ 20564), ストレプトコッカス・クリセツス(DSMZ 20562), ストレプトコッカス・フェラス(DSMZ 20646)又はストレプトコッカス・マカカエ(DSMZ 20714)およびラクトバチルス菌の培養は、密閉ファルコンチューブ内5 mlの容量で、振とうせずに37℃にて一晩行った。実施例５に記載の蛍光アッセイについては、ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans) DSMZ 20523を使用した。
【０１９５】
凝集アッセイのために、ラクトバチルス菌をMRS培地中で増殖させた。5 ml MRS培地を10μlのストックで播種し、好気性条件下で37℃で3日間、インキュベートした。培地の600 nmでの光学密度(OD600)を測定した。培地をついでPBSバッファーを用いて2というOD600へと希釈した。ミュータンス・ストレプトコッキィを7 ml TSY培地中で増殖させた。7 mlのTSY培地を10μlのストックで播種し、嫌気性条件下で37℃でインキュベートした。
【０１９６】
MRS-培地:
MRS-混合物 (Difco, USA) 55 g/l, pH: 6.5
TSY-培地:
TSY-混合物(Difco, USA) 30 g/l
酵母エキス (Deutsche Hefewerke, Germany) 3 g/l
バッファー:
PBS-バッファー:
Na2HPO4 2H2O 1.5 g/l
KH2PO4 0.2 g/l
NaCl 8.8 g/l
pHはHClで調整。
【０１９７】
実施例２：結合性株及びストレプトコッカス菌株の分類
菌株の分類はそれらの炭水化物発酵パターンに基づいて行った。API 50 CH (bioMerieux, フランス) システムを用いてそれを測定し、APILAB PLUSソフトウェア・バージョン3.3.3 (bioMerieux, フランス)を用いて解析した。
【０１９８】
実施例３：細胞の染色
ラクトバチルス菌及びミュータンス・ストレプトコッキィを実施例１に記載のように増殖させた後、蛍光染色を用いてミュータンス・ストレプトコッキィを染色した。このために培地のOD600を測定した。培地を3200 x gにて5分間の遠心分離により回収した。ペレットはPBSバッファーに再懸濁した。バッファーの量は結果的に得られる懸濁物が4というOD600となるよう計算した。その懸濁物2 mlを、製造者の説明書に従い、2μlのCFDA-SE溶液(Invitrogen, USA)と混合した。細胞の染色は該混合物を37℃で2時間インキュベートすることにより行った。染色した細胞を、3200 x gで5分間の遠心分離により回収した。細胞をその後、2mlのPBSバッファーに再懸濁した。
【０１９９】
実施例４：ミュータンス・ストレプトコッキィのペレット凝集アッセイ
アッセイのために、ラクトバチルス菌とミュータンス・ストレプトコッキィの混合は、3:1〜60:1 (ミュータンス・ストレプトコッキィ:ラクトバチルス菌)の容積比で行ったが、この比は1 :50〜1:2,5のコロニー形成比に対応する。
【０２００】
1 ml中の波長600 nmで測定される光学密度は、好ましくはミュータンス・ストレプトコッキィについて3×108コロニー形成単位、乳酸桿菌については好ましくは7×109コロニー形成単位を意味する。混合は15 mLファルコンチューブ内で2 mLの容量にて行った。培養懸濁物をPBSバッファーで希釈して上記の容量比としたが、最終容量は2 mLに保持した。この混合物を15秒間ボルテックス混合した。凝集は懸濁液の急速な濁りとして肉眼で見ることができる。チューブを静かに20分間放置すると、その後凝集物は目に見えるペレットとして沈降するのに対して、非凝集性の混合物は懸濁状態のままである。形成された凝集体は、500 x gにて30秒の遠心分離により分離された。その後、凝集の量は上清に残った非凝集細胞の量を測定することにより定量された。対応して、上清1 mlを注意深くとり、光学密度を測定した。光学密度は600 nmで測定した。ラクトバチルス無しでの対応する対照実験の減算後の値は、凝集しなかった細胞の量を表す。
【０２０１】
対照として、それぞれのラクトバチルス株およびミュータンス・ストレプトコッキィ株の自己凝集を必ず検討したが、その試験はラクトバチルス株またはミュータンス・ストレプトコッキィ株のみをチューブに加えることにより行った。ラクトバチルスによるS.ミュータンスの凝集を図１（左のチューブ）および図２に示す。
【０２０２】
本明細書において上記に記載したラクトバチルス株（特にDSMZに寄託したもの）は、自己凝集の挙動を示すことなく、あらゆる血清型のS.ミュータンスの凝集を呈示した。
【０２０３】
実施例５：ミュータンス・ストレプトコッキィの蛍光凝集アッセイ
アッセイのために、それぞれのラクトバチルスとそれぞれの染色されたミュータンス・ストレプトコッキィ(ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans) DSMZ 20523とLb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. mutans DSMZ 20523とLb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. mutans DSMZ 20523とLb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. mutans DSMZ 20523とLb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. mutans DSMZ 20523とLb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. mutans DSMZ 20523とLb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. mutans DSMZ 20523とLb-OB-K7 (DSMZ 16673); ストレプトコッカス・ソブリヌス(S. sobrinus) DSMZ 20742とLb-OB-KI (DSMZ 16667), S. sobrinus DSMZ 20742とLb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. sobrinus DSMZ 20742とLb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. sobrinus DSMZ 20742とLb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. sobrinus DSMZ 20742とLb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. sobrinus DSMZ 20742とLb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. sobrinus DSMZ 20742とLb-OB-K7 (DSMZ 16673); ストレプトコッカス・クリセツス(S. cricetus) DSMZ 20562とLb-OB-KI (DSMZ 16667), S. cricetus DSMZ 20562とLb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. cricetus DSMZ 20562とLb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. cricetus DSMZ 20562とLb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. cricetus DSMZ 20562とLb- OB-K5 (DSMZ 16671), S. cricetus DSMZ 20562とLb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. cricetus DSMZ 20562とLb-OB-K7 (DSMZ 16673);
ストレプトコッカス・ラッティ(S. ratti) DSMZ 20564とLb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. ratti DSMZ 20564とLb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. ratti DSMZ 20564とLb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. ratti DSMZ 20564とLb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. ratti DSMZ 20564とLb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. ratti DSMZ 20564とLb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. ratti DSMZ 20564とLb-OB-K7 (DSMZ 16673);
ストレプトコッカス・フェラス(S. ferus) DSMZ 20646とLb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. ferus DSMZ 20646とLb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. ferus DSMZ 20646とLb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. ferus DSMZ 20646とLb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. ferus DSMZ 20646とLb-OB-K5 (DSMZ 16671 ), S. ferus DSMZ 20646とLb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. ferus DSMZ 20646とLb-OB-K7 (DSMZ 16673);
ストレプトコッカス・マカカエ(S. macacae) DSMZ 20724とLb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. macacae DSMZ 20724とLb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. macacae DSMZ 20724とLb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. macacae DSMZ 20724とLb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. macacae DSMZ 20724とLb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. macacae DSMZ 20724とLb-OB-K6 (DSMZ 16672)並びにS. macacae DSMZ 20724とLb-OB-K7 (DSMZ 16673))の懸濁物を混合した。ラクトバチルス懸濁物50μlを96ウェルマイクロタイタープレートで50μlのミュータンス・ストレプトコッキィに添加した。該プレートをフルスピードで12分、ボルテックス混合した。その後、プレートを500 x gにて10秒、遠心分離した。上清を注意深く除き破棄した。ペレットを100μlのPBSバッファーに再懸濁した。懸濁物の蛍光を、波長495 nmの励起及び525 nmの発光について、マイクロタイタープレート蛍光リーダーで測定した。対照ラクトバチルスのみおよび染色ミュータンス・ストレプトコッキィは上記のように処置し測定した。対応するミュータンス・ストレプトコッキィ単独について測定されたバックグラウンド蛍光の値を、対応するラクトバチルスとの凝集物について測定された値から減算した。全ての測定は三重反復的に行った。ミュータンス・ストレプトコッキィは、すべての試験したラクトバチルス菌により凝集した（図３を参照のこと）。
【０２０４】
実施例６：口内細菌叢の典型的メンバーに対する凝集の特異性
ラクトバチルス培養物を実施例１に記載のように増殖させた。口内細菌、すなわちStreptococcus salivarius subsp. thermophilus (OrganoBalance)により分離し、API 50 CH (Biomerieux, フランス)をメーカーの使用説明書に従って用いて同定した); Streptococcus oralis (DSMZ 20066); Streptococcus oralis (DSMZ 20395); Streptococcus oralis (DSMZ 20627); Staphylococcus epidermidis (DSMZ 1798); Staphylococcus epidermidis (DSMZ 20044);Streptococcus mitis (DSMZ 12643); Streptococcus sanguinis (DSMZ 20567)を、密閉した15 mLファルコンチューブ内の5 mLのBHI培地中で37℃にて一晩増殖させた。好ましくは、上記口内細菌のそれぞれをラクトバチルス培養物と容量比3：1で混合して、実施例４に記載のようにして凝集をアッセイした。凝集/非凝集の各試験につき、好ましくは試験の結果をすぐに確認するために上記細菌の1種のみを使用する。
【０２０５】
対照として、それぞれの口内細菌ならびに試験したラクトバチルス株の自己凝集を必ず検討したが、その試験はラクトバチルス株または口内細菌叢の菌株のみをチューブに加えることにより行った。
【０２０６】
ラクトバチルス・パラカゼイ(L. paracasei) ssp. paracasei株Lb-OB-KI (DSMZ 16667), Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), Lb-OB-K5 (DSMZ 16671)は上記の口腔細菌を凝集しなかった。したがってこれらは上記定義によると「ミュータンス・ストレプトコッキィに特異的に結合する」。ラクトバチルス・ラムノサス(L. rhamnosus)株Lb-OB-K6 (DSMZ 16672)及びLb-OB-K7 (DSMZ 16673)は、ストレプトコッカス・サルバリウス亜種サーモフィルス(Streptococcus salivarius subsp thermophilus)を凝集した。これらは、にもかかわらず、上記のさほど好ましくない定義によると「ミュータンス・ストレプトコッキィに特異的に結合する」と考慮される。
【０２０７】
BHI-培地:
BHI-混合物 (Difco, USA) 37 g/L pH: 7.2。
【０２０８】
実施例７：ラクトバチルス菌の凝集能の温度抵抗性
細菌を実施例１のように増殖させた。増殖させた乳酸桿菌培養物を飽和水蒸気中121℃、2バールで20分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理済みの培養物を室温まで冷ましてから、乳酸桿菌を、増殖させたS.ミュータンス培養物と容量比1：3で混合し、対照実験も含めて実施例３のように凝集をアッセイした。凝集はまた、実施例６に記載のように口腔細菌を用いてアッセイした。
【０２０９】
試験したS.ミュータンス血清型に対する、または口内細菌に対する乳酸桿菌の凝集挙動はオートクレーブ処理によって変わることはなかったことが見出された。
【０２１０】
実施例８：熱不活性化ラクトバチルス菌による凝集
ラクトバチルス菌を実施例１に記載のように増殖させた。ミュータンス・ストレプトコッキィは実施例１及び３に記載のように増殖させ染色した。増殖ラクトバチルス菌培養物は実施例１に記載のように2というOD600に調整した。その懸濁物1mlを2 bar、121℃にて20分、上記のようにオートクレーブ処理した。オートクレーブした培養物を室温まで冷却後、凝集を実施例５に記載のように測定したが、これには対照実験も含まれる。熱不活性化ラクトバチルス菌は、依然として、全てのミュータンス・ストレプトコッキィを凝集した。
【０２１１】
実施例９：pH値に対する凝集の依存性
細菌を実施例１のように増殖させた。0.5 mlの乳酸桿菌と1.5 mlのS.ミュータンスを3200 g、10分の遠心分離により回収し、上清を捨てた。細胞を、異なるpH値に調整した種々のPBSバッファー中にその最初の容量（それぞれ0.5 mlと1.5 ml）で再懸濁させた。バッファーのpH値は0.5 pH単位きざみで7.0から3.0までのpH値に調整した。凝集挙動アッセイに使用することになっている、それぞれのpH値のバッファーに培養物を再懸濁させた。
【０２１２】
その後、乳酸桿菌を容量比1：3でS.ミュータンス培養物と混合し、対照実験も含めて実施例３のように凝集をアッセイした。乳酸桿菌によるS.ミュータンスの目に見える凝集は、4.5より低いpH値ではまったく起こらなかった。
【０２１３】
実施例１０：凝集のpH値に対する依存性
ラクトバチルス菌を実施例１に記載のように増殖させた。ミュータンス・ストレプトコッキィは実施例１及び３に記載のように増殖させ染色した。その後、凝集を種々のpH値においてアッセイした。この目的のために、ラクトバチルス菌並びにストレプトコッカス菌を、それぞれのpHに調整した酢酸バッファー中に再懸濁した。試験したpH値は4.0, 4.5及び5.0であった。凝集は実施例５に記載のようにアッセイした。4.5未満のpH値ではミュータンス・ストレプトコッキィの凝集は起こらなかった。
【０２１４】
実施例１１：凍結乾燥に対する凝集挙動の感受性
細菌を実施例１のように増殖させた。ラクトバチルス菌培養物の1 mlのアリコートを3200 g、10分の遠心分離により回収した。上清を捨て、ペレットを室温で真空下に2時間凍結乾燥させた。得られた各試験ラクトバチルス株の乾燥ペレットを室温および4℃で、それぞれ1日、1週間、2週間、3週間および4週間保存した。保存期間後、凍結乾燥ペレットを1 mlのPBSバッファー、pH 7.0中に再懸濁させた。再懸濁した乳酸桿菌を新たに増殖させたS.ミュータンス培養物と容量比1：3で混合し、対照実験も含めて実施例４のように凝集をアッセイした。
【０２１５】
S.ミュータンスに対する上記ラクトバチルス菌の凝集挙動は、凍結乾燥または保存法によって変わることはなかった。
【０２１６】
実施例１２：凍結乾燥に対する凝集挙動の感受性
ラクトバチルス菌（乳酸桿菌）を実施例１に記載のように増殖させた。ミュータンス・ストレプトコッキィは実施例１及び３に記載のように増殖させ染色した。実施例１に記載のように増殖ラクトバチルス菌培養物を2というOD600に調整した。該懸濁物1mlを真空下で２時間に渡り凍結乾燥させた。その後、凍結乾燥ペレットを1mlのPBSバッファーに再懸濁した。凝集は、実施例５に記載のように測定し、これには対照実験も含まれた。
【０２１７】
記載したラクトバチルス菌のミュータンス・ストレプトコッキィに対する凝集挙動は、凍結乾燥により変更されることはなかった。
【０２１８】
実施例１３：プロテアーゼ耐性に関する試験
細菌を実施例１のように増殖させた。用いたプロテアーゼはプロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシンであった（すべてドイツのSigma社から入手した）。乳酸桿菌の1 mlのアリコートを3200 g、10分の遠心分離にかけて細胞を回収し、ペレットを1 mlのPBSバッファー(pH 7.0)中に再懸濁させることにより、細胞をPBSバッファーで洗浄した。その後、細胞を上記のように再度回収し、それぞれのプロテアーゼを2.5 mg/mLの最終濃度で含有するPBSバッファー(pH 7.0)中に再懸濁させた。この懸濁液を37℃で1時間インキュベートした。その後細胞を上記のように洗浄してPBSバッファー(pH 7.0)中に再懸濁させた。
【０２１９】
対照実験も含めて、実施例３のように凝集をアッセイした。S.ミュータンスに対する上記乳酸桿菌の凝集挙動は、上記プロテアーゼのいずれで処理しても変化しなかった。
【０２２０】
実施例１４：ラクトバチルス菌の凝集挙動のプロテアーゼ感受性
ラクトバチルス菌を実施例１に記載のように増殖させた。ミュータンス・ストレプトコッキィは実施例１及び３に記載のように増殖させ染色した。用いたプロテアーゼはプロナーゼE, プロテイナーゼK, トリプシン, キモトリプシン(いずれもSigma, Germanyより入手)であった。細胞を3200 x gにて10分間遠心分離することにより回収し、1mlのPBSバッファー（pH 7.0）に再懸濁することにより1mlのラクトバチルス菌のアリコートをPBSバッファー中で洗浄した。その後、細胞を再度上記のように回収しPBSバッファー（pH 7.0）中で再懸濁したが、このPBSバッファーはそれぞれのプロテイナーゼを最終濃度2.5 mgl/mlとなるよう含むものであった。懸濁物を１時間、37℃にてインキュベートした。その後、細胞を上記のように洗浄し、PBSバッファー(pH 7.0)に再懸濁した。凝集は実施例５に記載のようにアッセイしたが、これには対照実験も含まれる。ラクトバチルス菌のミュータンス・ストレプトコッキィに対する凝集挙動は、記載されたプロテアーゼのいずれによる処置によっても変化することはなかった。
【０２２１】
実施例１５：凝集挙動のイオン依存性
細菌を実施例１のように増殖させた。ラクトバチルス菌の1 mlのアリコートを上記のように1 mlの200 mM EDTA溶液で2回洗浄した。その後細胞を回収し、1 mlのPBSバッファー(pH 7.0)中に再懸濁させた。
【０２２２】
凝集を実施例４のようにアッセイしたところ、凝集能の完全な喪失が観察された。200 mM EDTA溶液で2回洗浄した後に乳酸桿菌を1 mlの2 mM カルシウム溶液中に再懸濁させたら、S.ミュータンスに対する凝集能が回復した。EDTA洗浄細胞を100 mMまでのマグネシウム溶液中に再懸濁しても、S.ミュータンスに対する凝集能は元に戻らなかった。
【０２２３】
実施例１６：凝集挙動のイオン依存性
乳酸桿菌を実施例1に記載されているように増殖させた。実施例1及び3に記載されているようにミュータンス連鎖球菌を増殖させ、染色した。1mlの乳酸桿菌分取物を、上記のように1mlの200mM EDTA溶液で2回洗浄した。その後細胞を回収し、1mlのPBSバッファー(pH7.0)中に再懸濁した。実施例5に記載されているように凝集をアッセイし、凝集能力の完全喪失が観察された。200mM EDTA溶液で2回洗浄した後に1mlの2mMカルシウム溶液へ乳酸桿菌を再懸濁すると、S.ミュータンスを凝集する能力が回復した。EDTAで洗浄した細胞を100mMまでのマグネシウム溶液に再懸濁しても、ミュータンス連鎖球菌を凝集する能力は回復しなかった。
【０２２４】
実施例17：唾液の存在下での凝集試験
実施例1と同様に細菌を増殖させた。S.ミュータンス培養液の2mlの分取物を上記のように回収し、2mlの唾液中に再懸濁した。唾液は、2名のボランティアから提供され、入手後直ぐに使用した。実施例4と同様に凝集をアッセイした。
【０２２５】
言及されている乳酸桿菌のS.ミュータンスに対する凝集挙動は、唾液の存在下で変化しなかった。
【０２２６】
実施例18：唾液の存在下でのミュータンス連鎖球菌の凝集
新鮮な唾液をボランティアからサンプリングした。唾液流動を、無糖のチューインガムをかむことで誘導した。ボランティアは、サンプリングごとに15mlの唾液を採取した。アッセイ処理用に、採取した新鮮な唾液をPBSバッファーで1:2に希釈した。乳酸桿菌及びミュータンス連鎖球菌を実施例1に記載されているように培養した。染色処理後に、PBSバッファーの代わりに唾液中に染色された細胞を再懸濁したことを除いて、実施例3に記載されているようにミュータンス連鎖球菌を染色した。対照実験を含めて、実施例5に記載されているように凝集を測定した。唾液の存在は、凝集を阻害しなかった。
【０２２７】
分離の実施例１：さらなる乳酸桿菌の獲得
乳酸桿菌は、任意の供給源から、例えば低量のう蝕及び/又は歯石を有するボランティアの口腔のスワブによって得ることができる。また、乳酸桿菌は、DSMZ及びATCCのような細胞培養コレクションから、又は他の既知の乳酸菌供給源、例えば植物、食品及び飼料から得ることができる。次に、得た株を標準的な微生物学的技術によって純化した。乳酸桿菌用の選択培地は、例えばRogosaら1951. A selective medium for the isolation of oral and fecal lactobacilli、J. Bacteriol. 62:132〜133に記載されている。
【０２２８】
単離した株を、実施例1に記載されているように増殖させる。結合のための選択は、単離の実施例2に記載されているように実施する。
【０２２９】
分離の実施例２
染色されたストレプトコッカス・ミュータンス(DSMZ 20523)を調製し、実施例5で上述したように96ウェルマイクロタイタープレートに分注した。また、実施例5に記載されているように、結合の増大について実施例1に従ってスクリーニングする株50μlを各マイクロタイタープレートのウェルに加えて、全速で12分間ボルテックスした。その後、このプレートを500×gで10秒間遠心分離して、上清を慎重に除去した。ペレットを100μlのPBSに再懸濁して、実施例5に記載されているように懸濁液の蛍光を測定した。
【０２３０】
次に、スクリーニングする株を、S.ミュータンスDSMZ 20523、S.ソブリナスDSMZ 20742、S.クリセタスDSMZ 20562、S.ラティDSMZ 20564、S.フェルスDSMZ 20646及びS.マカカエDSMZ 20724への結合について、実施例5で上述したように試験した。陽性バインダーは凝集物を産生することが判明した。
【０２３１】
食品及び飼料の実施例1：子犬の飼料
主成分:牛肉、玄米、キャノーラ種子、アマ種子ミール、ヒマワリ種子、バックウィート種子(ソバ)、オオムギ、キビ。
【０２３２】
少成分:ニンジン、レッドビート、ブロッコリー、高オレイン酸のヒマワリ油、キャノーラ油、海塩、オレガノ、ニンニク、アスコルビン酸、プロポリス、ビタミン(ビタミンA、B12、D3、C、E、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ナイアシン)、ミネラル(クロム、亜セレン酸ナトリウム、鉄、クエン酸銅、硫酸亜鉛、コバルト)。
【０２３３】
上記の主成分及び少成分を有する1kgのベース組成物に、3gの乾燥オートクレーブ済みバインダー微生物及びその断片を加えた。微生物材料は、実施例1に記載されているようにバインダー微生物を増殖させることによって調製した。すなわち、乳酸桿菌をMRS培地で増殖させた。5mlのMRS培地を10μlの保管液で接種し、好気性条件下で3日間37℃でインキュベートした。微生物を遠心分離によってペレット化して、PBSで1回洗浄した。実施例8に記載されているように、再懸濁した微生物をオートクレーブした。オートクレーブした微生物を乾燥器中で一晩75℃で乾燥させて、乾燥熱失活したバインダー微生物及びその断片を得た。寄託されたラクトバチルス株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673のそれぞれを別々に用いて子犬用食品を調製して、7種の別々の子犬用食品を得た。
【０２３４】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質(最小)26.0
脂肪(最小)14.0
繊維(最大)5.0
水分(最大)10.5
である。
【０２３５】
成犬の飼料
主成分:牛肉、玄米、キャノーラ種子、アマ種子ミール、ヒマワリ種子、バックウィート種子(ソバ)、オオムギ、キビ。
【０２３６】
少成分:ニンジン、レッドビート、ブロッコリー、高オレイン酸のヒマワリ油、キャノーラ油、海塩、オレガノ、ニンニク、アスコルビン酸、プロポリス、ビタミン(すなわちビタミンA、B12、D3、C、E、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ナイアシン)、ミネラル(クロム、亜セレン酸ナトリウム、鉄、クエン酸銅、硫酸亜鉛、コバルト)。
【０２３７】
子犬用食品について記載したように、寄託されたラクトバチルス株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673を別々に用いて、7種の成犬用食品調製物を調製した。
【０２３８】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質(最小)20.0
脂肪(最小)12.0
繊維(最大)5.0
水分(最大)10.5
である。
【０２３９】
菜食主義のイヌの飼料
主成分:ダイズミール、玄米、キャノーラ種子、アマ種子ミール、ヒマワリ種子、バックウィート種子、オオムギ、キビ。
【０２４０】
少成分:ニンジン、レッドビート、ブロッコリー、高オレイン酸のヒマワリ油、キャノーラ油、海塩、オレガノ、ニンニク、アスコルビン酸、プロポリス、ビタミン(すなわちビタミンA、B12、D3、C、E、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ナイアシン)、ミネラル(すなわちクロム、亜セレン酸ナトリウム、鉄、クエン酸銅、硫酸亜鉛、コバルト)。
【０２４１】
子犬用食品について記載したように、寄託されたラクトバチルス株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673を別々に用いて、7種の菜食主義犬用食品調製物を調製した。
【０２４２】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質(最小)20.0
脂肪(最小)12.0
繊維(最大)9.0
水分(最大)10.5
である。
【０２４３】
すべての食品調製物を、別々の群の適切な年齢(それぞれに1〜8か月齢、2〜4年齢及び2〜4年齢)の5匹のイヌに1日1回与えた。イヌの要求に応じて、他の標準的な飼料をその日の他の時間に与えた。しかし、本発明による上記の食品調製物を除いては、各製造者によって口腔衛生を特に促進するとして公表されていた他の飼料は提供しなかった。6か月後に、どのイヌも歯石が発生しなかった。また、最後に飼料を与えてから3時間後に10名のボランティアによって測定したイヌの口臭は、許容可能であるとみなされた。
【０２４４】
食品及び飼料の実施例2：イヌの咀嚼製品
一片の雌ウシの生皮を、バインダー微生物株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673の培養液それぞれに浸した。バインダー微生物を、食品及び飼料の実施例1に記載されているように増殖させた。次に、生皮小片を骨様形状に形成して、食品及び飼料の実施例1に記載されているようにオートクレーブした。
【０２４５】
オートクレーブした小片を空気乾燥した。乾燥骨様小片を、歯石を丁度除去したばかりの5〜8年齢の5匹のイヌに与えた。次に、新しい乾燥骨様小片を1週間につき2回与えた。この乾燥骨様小片を除いては、歯石除去の前の場合と同様にイヌに飼料を与えた。8か月以内に、どのイヌも歯石が再び発生しなかった。また、最後に飼料を与えてから3時間後に10名のボランティアによって測定したイヌの口臭飼料は、許容可能であるとみなされた。
【０２４６】
食品及び飼料の実施例３：さらなるイヌの飼料
子犬の飼料:
主成分:鶏肉、チキンミール、オオムギ、エンドウマメ、玄米、粉砕抽出した全ダイズ、(混合トコフェロールとともに保存された)鶏脂。
【０２４７】
少成分:サーモンミール、天然鶏肝臓フレーバー、ビール乾燥酵母、アマ種子ミール、乾燥卵、リンゴ、ニンジン、塩化カリウム、リン酸二カルシウム、ミネラル(すなわち亜鉛タンパク化合物、鉄タンクパク化合物、銅タンパク化合物、マンガンタンパク化合物、亜セレン酸ナトリウム、コバルトタンパク化合物、ヨウ素酸カルシウム)、塩、塩化コリン、ビタミン(すなわちビタミンEサプリメント、L-アスコルビル-2-ポリホスフェート、ビタミンB12サプリメント、d-パントテン酸カルシウム、ビタミンAサプリメント、ナイアシン、リボフラビン、葉酸、ビオチン、ピリドキシン塩酸塩、硝酸チアミン、ビタミンD3サプリメント、炭酸カルシウム)、酵母培養物(サッカロミセス・セレビシエ)、乾燥エンテロコッカス・フェシウム発酵産物、乾燥ラクトバチルス・アシドフィルス発酵産物、乾燥クロコウジカビ(aspergillus niger)発酵エキス、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(trichoderma longibrachiatum)発酵エキス、乾燥枯草菌発酵エキス及び発酵可溶性物。
【０２４８】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質重量%(最小):28.0
脂肪重量%(最小):15.0
繊維重量%(最大):3.5
水分重量%(最大):10.0
である。
【０２４９】
成犬の飼料:
主成分:鶏肉、チキンミール、オオムギ、エンドウマメ、エンバク、玄米、(混合トコフェロールとともに保存された)鶏脂。
【０２５０】
少成分:天然鶏肝臓フレーバー、ビール乾燥酵母、サーモンミール、乾燥卵、リンゴ、全アマ種子、ニンジン、リン酸二カルシウム、塩化カリウム、塩、ミネラル(すなわち亜鉛タンパク化合物、鉄タンクパク化合物、銅タンパク化合物、マンガンタンパク化合物、亜セレン酸ナトリウム、コバルトタンパク化合物、ヨウ素酸カルシウム)、塩化コリン、ビタミン(すなわちビタミンEサプリメント、L-アスコルビル-2-ポリホスフェート、ビタミンB12サプリメント、d-パントテン酸カルシウム、ビタミンAサプリメント、ナイアシン、リボフラビン、葉酸、ビオチン、ピリドキシン塩酸塩、硝酸チアミン、ビタミンD3サプリメント)、塩酸グルコサミン、コンドロイチン硫酸、酵母培養物(サッカロミセス・セレビシエ)、乾燥エンテロコッカス・フェシウム発酵産物、乾燥ラクトバチルス・アシドフィルス発酵産物、乾燥クロコウジカビ発酵エキス、乾燥トリコデルマ・ロンギブラキアタム発酵エキス、乾燥枯草菌発酵エキス及び発酵可溶性物。
【０２５１】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質重量%(最小):26.0
脂肪重量%(最小):13.0
繊維重量%(最大):3.5
水分重量%(最大):10.0
である。
【０２５２】
体重管理されたイヌの飼料:
主成分:玄米、チキンミール、オオムギ、エンバク、エンドウマメ、鶏肉、(混合トコフェロールとともに保存された)鶏脂。
【０２５３】
少成分:天然鶏肝臓フレーバー、ビール乾燥酵母、サーモンミール、乾燥卵、リンゴ、全アマ種子、ニンジン、リン酸二カルシウム、塩化カリウム、塩、ミネラル(すなわち亜鉛タンパク化合物、鉄タンクパク化合物、銅タンパク化合物、マンガンタンパク化合物、亜セレン酸ナトリウム、コバルトタンパク化合物、ヨウ素酸カルシウム)、塩化コリン、ビタミン(すなわちビタミンEサプリメント、L-アスコルビル-2-ポリホスフェート、ビタミンB12サプリメント、d-パントテン酸カルシウム、ビタミンAサプリメント、ナイアシン、リボフラビン、葉酸、ビオチン、ピリドキシン塩酸塩、硝酸チアミン、ビタミンD3サプリメント)、塩酸グルコサミン、コンドロイチン硫酸、酵母培養物(サッカロミセス・セレビシエ)、乾燥エンテロコッカス・フェシウム発酵産物、乾燥ラクトバチルス・アシドフィルス発酵産物、乾燥クロコウジカビ発酵エキス、乾燥トリコデルマ・ロンギブラキアタム発酵エキス、乾燥枯草菌発酵エキス及び発酵可溶性物。
【０２５４】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質重量%(最小):24.0
脂肪重量%(最小):10.0
繊維重量%(最大):3.5
水分重量%(最大):10.0
である。
【０２５５】
食品及び飼料の実施例1の子犬用食品について記載したように、寄託されたラクトバチルス株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673を別々に用いて、7種の対応する子犬、成犬及び体重管理されたイヌ用食品調製物を調製した。
【０２５６】
高タンパク質な成犬の飼料:
主成分:骨抜きの鶏肉、チキンミール、七面鳥肉ミール、ラセットポテト、シロマス、(混合トコフェロールとともに保存された)鶏脂。
【０２５７】
少成分:サツマイモ、全卵、七面鳥の肉、サーモンミール、サーモン油及びアンチョビ油、サーモン、天然鶏肉フレーバー、ヒマワリ油、日干しにしたアルファルファ、乾燥褐色ケルプ、ニンジン、ホウレンソウ、エンドウマメ、トマト、リンゴ、サイリウム、ダルス、チコリーの根、カンゾウの根、ウコンの根、コロハ、グルコサミンHCl、クランベリー、クロフサスグリ、マリゴールドの花、L-カルニチン、スイートフェンネル、トウモロコシ(zea mays)、ペパーミントの葉、カモミールの花、タンポポ、サマーセイボリー、ローズマリーエキス、コンドロイチン硫酸、ローズヒップ、ビタミン(すなわちビタミンE、塩化コリン、ビタミンA、ビタミンD3、硝酸チアミン、ビタミンB12、葉酸、ビオチン)、海塩、ミネラル(すなわち鉄タンクパク化合物、亜鉛タンパク化合物、マンガンタンパク化合物、銅タンパク化合物)、乾燥ラクトバチルス・アシドフィルス発酵産物、乾燥エンテロコッカス・フェシウム発酵産物。
【０２５８】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質最小:42重量%
脂肪最小:16重量%
繊維最大3重量%
水分最大:10重量%
灰分最大:7重量%
である。
【０２５９】
食品及び飼料の実施例1の子犬用食品について記載したように、寄託されたラクトバチルス株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673を別々に用いて、7種の対応するイヌ用飼料調製物を調製した。
【０２６０】
菜食主義のイヌの飼料
主成分:玄米、キャノーラ種子、アマ種子ミール、ヒマワリ種子、バックウィート種子(ソバ)、オオムギ、キビ、ニンジン、レッドビート、ブロッコリー、高オレイン酸のヒマワリ油。
【０２６１】
少成分:キャノーラ油、海塩、オレガノ、ニンニク、アスコルビン酸、プロポリス、ビタミン(すなわちビタミンA、B12、D3、C、E、K3、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ナイアシン)、ミネラル(すなわちクロム、亜セレン酸ナトリウム、鉄、クエン酸銅、硫酸亜鉛、コバルト)。
【０２６２】
以下の構成要素の総含有量は(総飼料の重量%で)、
タンパク質最小:20重量%
脂肪最小:12重量%
繊維最大:9重量%
水分最大:10.5重量%
である。
【０２６３】
食品及び飼料の実施例1の子犬用食品について記載したように、寄託されたラクトバチルス株DSMZ 16667、16668、16669、16670、16671、16672及び16673を別々に用いて、7種の対応するイヌ用飼料調製物を調製した。
【０２６４】
さらなる実施形態
1.微生物又はその断片が、口腔ケア薬剤として、少なくとも1種の、好ましくは少なくとも2種の、より好ましくは少なくとも3種のミュータンス・ストレプトコッキィ(ミュータンス連鎖球菌)の群のストレプトコッカス株に結合することができ、この結合が熱処理に抵抗性及び/又はプロテアーゼ処理に抵抗性であり、及び/又はカルシウム依存性であり、及び/又は4.0を超えるpH内で形成され、及び/又はマグネシウムに関係なく、及び/又は唾液の存在下で形成される、バインダー微生物又はその断片。
【０２６５】
2.結合が、≧55℃、好ましくは≧65℃、より好ましくは95〜121℃、最も好ましくは121℃での熱処理に抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２６６】
3.結合が、≧15分間、好ましくは15〜120分間、好ましくは15〜30分間、最も好ましくは20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２６７】
4.結合が、1〜5bar、好ましくは1〜3bar、より好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中での熱処理に抵抗性である、実施形態3に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２６８】
5.結合が、1〜5bar、好ましくは1〜3bar、より好ましくは2barの圧力の飽和蒸気中で、95〜121℃の温度で、より好ましくは121℃で、≧15分間、好ましくは15〜120分間、好ましくは15〜30分間、最も好ましくは20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２６９】
6.熱処理が、2barの圧力での飽和蒸気状態における121℃の温度で20分間の熱処理に抵抗性であって、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７０】
7.結合が、プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及び/又はキモトリプシンによるプロテアーゼ処理に抵抗性であり、好ましくはエラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン及び/又はカテプシンDによるプロテアーゼ処理にも抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７１】
8.結合が、プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及びキモトリプシンによるプロテアーゼ処理に抵抗性である、実施形態7に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７２】
9.結合が、エラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン及びカテプシンDによるプロテアーゼ処理に抵抗性である、実施形態7に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７３】
10.結合が、1〜5bar、好ましくは1〜3bar、より好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中で、95〜121℃の温度で、より好ましくは121℃で、≧15分間、好ましくは15〜120分間、好ましくは15〜30分間、最も好ましくは20分間の熱処理に抵抗性であり、さらに、プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及び/又はキモトリプシンによるプロテアーゼ処理に抵抗性であり、好ましくはエラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン及び/又はカテプシンDによるプロテアーゼ処理にも抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７４】
11.結合が、プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及び/又はキモトリプシンによるプロテアーゼ処理に抵抗性であり、好ましくはエラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン及び/又はカテプシンDによるプロテアーゼ処理にも抵抗性である、実施形態6に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７５】
12.結合が、2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態8に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７６】
13.結合が、少なくとも2mM、より好ましくは少なくとも1mM、最も好ましくは少なくとも0.05mM濃度のCa2+イオンの存在に依存している、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断。
【０２７７】
14.結合が、0.05〜500mM、より好ましくは1〜100mM、最も好ましくは2〜30mMの濃度のCa2+イオンの存在に依存している、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７８】
15.結合が、2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態12又は13に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２７９】
16.結合がプロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及び/又はキモトリプシンによるプロテアーゼ処理に抵抗性であり、好ましくはエラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン及び/又はカテプシンDによるプロテアーゼ処理にも抵抗性である、実施形態12又は13に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８０】
17.結合が、4.0〜9.0、好ましくは4.0〜7.0、より好ましくは4.2〜5.0、最も好ましくは4.5のpHで形成される、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８１】
18.結合が、2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態16に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８２】
19.結合が、プロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及び/又はキモトリプシンによるプロテアーゼ処理に抵抗性であり、好ましくはエラスターゼ、トロンビン、アミノペプチダーゼI、カルボキシペプチダーゼ、ドストリパイン、エンドプロテイナーゼ、パパイン、カテプシンB、ペプシン、ガストリクシン、キモシン及び/又はカテプシンDによるプロテアーゼ処理にも抵抗性である、実施形態16に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８３】
20.結合が、少なくとも2mM、より好ましくは少なくとも1mM、最も好ましくは少なくとも0.05mMの濃度のCa2+イオンの存在に依存している、実施形態16に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８４】
21.結合がマグネシウムイオンの存在と無関係であり、好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８５】
22.結合が唾液の存在下で形成され、好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱処理に抵抗性である、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８６】
23.結合が、熱処理に抵抗性であり、プロテアーゼ処理に抵抗性であり、唾液の存在下で形成される、実施形態1に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８７】
24.ミュータンス連鎖球菌の株が、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)、ストレプトコッカス・ソブリナスDSMZ 20742、ストレプトコッカス・ラティDSMZ 20564、ストレプトコッカス・クリセタスDSMZ 20562、ストレプトコッカス・フェルスDSMZ 20646及びストレプトコッカス・マカカエDSMZ 20714からなる群から選択され、好ましくはバインダー微生物又はその断片の特異的結合は、以下のようにアッセイすることができる、前記実施形態のうちのいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片
(a)前記バインダー微生物を定常期まで増殖させ、又は断片を試験する場合は、そうした断片を獲得し、
(b)前記バインダー微生物又は断片を、定常期まで増殖させたミュータンス連鎖球菌と混合し、
(c)ステップ(b)で得られた混合物を、前記微生物と前記ストレプトコッカスとの凝集物の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
(d)ペレットの出現によって凝集物を検出する。
【０２８８】
25.微生物又はその断片が、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)及びストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)からなる群から選択される各株に結合することができる、実施形態1〜22のうちのいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２８９】
26.微生物又はその断片が、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される、少なくとも1種の、好ましくは少なくとも2種の、より好ましくは少なくとも3種の、さらにより好ましくはすべての微生物に結合することができない、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２９０】
27.バインダー微生物が、ラクトバチルス科のもの、好ましくはラクトバチルス属、パララクトバチルス属、ペディオコッカス属若しくはシャーペア属のもの、より好ましくはラクトバチルス・パラカゼイ種、ラクトバチルス・ラムノサス種、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)種若しくはラクトバチルス・ゼアエ種(Lactobacillus zeae)もの、最も好ましくはDSMZ 16667株、DSMZ 16668株、DSMZ 16669株、DSMZ 16670株、DSMZ 16671株、DSMZ 16672株若しくはDSMZ 16673株、うちのいずれか、又はそれらの変異体若しくは誘導体である、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２９１】
28.微生物又はその断片が、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)及びストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)からなる群から選択される各株に結合することができ、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される微生物に結合することができない、実施形態26に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２９２】
29.微生物又はその断片が、2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱処理後に、少なくとも0.05mMのカルシウムイオンの存在下で並びに唾液の存在下で並びにプロナーゼE、プロテイナーゼK、トリプシン及び/又はキモトリプシンによる処理と無関係で、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)、ストレプトコッカス・ソブリナスDSMZ 20742、ストレプトコッカス・ラティDSMZ 20564、ストレプトコッカス・クリセタスDSMZ 20562、ストレプトコッカス・フェルスDSMZ 20646及びストレプトコッカス・マカカエDSMZ 20714からなる群から選択されるミュータンス連鎖球菌に結合する能力を保持し、こうした条件下で、熱処理された微生物又はその断片が、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される微生物に結合することができない、実施形態26又は27に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０２９３】
30.バインダー微生物が、熱失活、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって獲得可能な又は獲得される失活形態の状態であり、熱失活が、
-  前記バインダー微生物の細胞を、2barでの気圧の飽和蒸気の存在下で121℃の温度で少なくとも20分間オートクレーブすること、又は
-  前記細胞を少なくとも1時間-20℃で凍結すること
によって好ましくは達成される、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30のうちのいずれかに記載のバインダー微生物。
【０２９４】
31.≧55℃の温度、好ましくは≧65℃の温度、さらにより好ましくは95〜121℃の温度、最も好ましくは121℃の温度での熱失活によって獲得可能な又は獲得される、実施形態29に記載の失活したバインダー微生物。
【０２９５】
32.≧15分間、好ましくは15〜120分間、好ましくは15〜30分間、最も好ましくは20分間の熱失活によって獲得可能な又は獲得される、実施形態30に記載の失活したバインダー微生物。
【０２９６】
33.1〜5bar、好ましくは1〜3bar、より好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中での熱失活、最も好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱失活によって獲得可能な又は獲得される、実施形態29、30又は31に記載の失活したバインダー微生物。
【０２９７】
34.断片がバインダー微生物の可溶化液又は膜断片である、前記実施形態のうちのいずれかに記載のバインダー微生物の断片。
【０２９８】
35.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33のうちのいずれかに記載の、官能的に中性な口腔ケア剤としてのバインダー微生物又はその断片。
【０２９９】
36.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33のうちのいずれかに記載の、抗歯石剤、官能的に中性な抗う蝕剤及び/又は抗口臭剤としての、バインダー微生物又はその断片。
【０３００】
37.官能的に中性な抗歯石剤、官能的に中性な抗う蝕剤及び/又は官能的に中性な抗口臭剤としての、実施形態35に記載のバインダー微生物又はその断片。
【０３０１】
38.バインダー微生物又はその断片が、分離された又は精製されたバインダー微生物又はその断片である、実施形態34、35又は36のうちのいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片。
【０３０２】
39.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又は37のうちのいずれかに記載の、口腔ケア薬剤としての、好ましくは抗歯石剤、抗う蝕剤及び/又は抗口臭剤としてのバインダー微生物又はその断片を含む組成物。
【０３０３】
40.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又は37のうちのいずれかに記載の、官能的に中性な口腔ケア剤としての、好ましくは官能的に中性な抗歯石剤、官能的に中性な抗う蝕剤及び/又は官能的に中性な抗口臭剤としてのバインダー微生物又はその断片を含む組成物。
【０３０４】
41.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又は37のうちのいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片を、
-  口臭を予防する若しくは口臭の強さを低減させるのに十分な、及び/又は
-  う蝕を予防する若しくはう蝕の発生を緩徐化するのに十分な、及び/又は
-  歯石形成を予防する若しくは歯石形成を緩徐化するのに十分な
量で含む組成物。
【０３０５】
42.実施形態1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36又は37のうちのいずれかに記載のバインダー微生物を、
-  102〜1013細胞/mg、好ましくは102〜1012細胞/mg、さらにより好ましくは103〜108細胞/mg、又は
-  102〜1013細胞/ml、又は
-  組成物全体に対して≧0.01重量%、好ましくは0.01〜10重量%、より好ましくは0.025〜2重量%、又は
-  ≧0.01mg乾燥重量/g組成物全体、好ましくは0.01〜100mg乾燥重量/g組成物全体、及びより好ましくは0.025〜2mg乾燥重量/g組成物全体
の濃度で含む組成物。
【０３０６】
43.実施形態32、33、34、35、36又は37のうちのいずれかに記載のバインダー微生物の断片を、
-  組成物全体に対して≧0.01重量%、好ましくは0.01〜10重量%、より好ましくは0.025〜2重量%、又は
-  ≧0.01mg乾燥重量/g組成物全体、好ましくは0.01〜100mg乾燥重量/g組成物全体、より好ましくは0.025〜2mg乾燥重量/g組成物全体
の濃度で含む組成物。
【０３０７】
44.生存可能な、熱失活した又は凍結乾燥した形態のさらなる微生物含み、熱失活した形態が1〜5bar、好ましくは1〜3bar、より好ましくは2barの圧力での飽和蒸気中での処理によって、最も好ましくは2barでの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間の熱失活によって獲得可能な又は獲得される、実施形態38、39、40、41又は42のうちのいずれかに記載の組成物。
【０３０８】
45.さらなる微生物が、口臭を予防、緩和又は低減するのに十分な濃度の、好ましくはストレプトコッカス・サリバリウスの増殖を刺激することができるがストレプトコッカス・ミュータンス及び/又はポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)の増殖を刺激しない抗口臭微生物である、実施形態43に記載の組成物。
【０３０９】
46.抗口臭微生物がラクトバチルス・アシドフィルス種のもの、好ましくはラクトバチルス株DSMZ 19825、DSMZ 19826又はDSMZ 19827のうちのいずれかである、実施形態44に記載の組成物。
【０３１０】
47.実施形態38、39、40、41、42、43、44又は45のうちのいずれかに記載の組成物であって、
-  ヒト又は動物が使用するためのものであり、練り歯磨き、歯磨き剤、歯磨き粉、局所経口ゲル、洗口剤、義歯製品、マウススプレー、ロゼンジ剤、経口錠剤、チューインガム、うがい薬、デンタルフロス、咀嚼製品又は食品、飼料若しくは飲料用の添加物であり、又は
-  散剤、錠剤、フィルム製剤、溶液剤、エアゾール剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤若しくは流動エキス剤、シート状食品、瓶詰食品、缶詰食品、レトルト食品若しくは流動食品の形であり、又は
-  ガム、スプレー、ベバレッジ、キャンディー、乳児用調整粉乳、アイスクリーム、冷凍デザート、甘いサラダドレッシング、乳調製品、チーズ、クワルク、ヨーグルト、酸乳、コーヒークリーム、ホイップクリーム、バター、チーズ、加工乳及び脱脂乳、肉製品(好ましくはハム、ソーセージ及びハンバーガー)、魚肉、ケーキ製品、卵製品(好ましくは味付けした巻き卵及びエッグカード)、菓子(好ましくはクッキー、ゼリー、スナック及びチューインガム)、パン、麺類、漬物、くん製品、魚の乾物、調味料からなる群から選択される食品又は飲料である
組成物。
【０３１１】
48.組成物が食品又は飼料組成物である、実施形態38、39、40、41、42、43、44又は45のうちのいずれかに記載の組成物。
【０３１２】
49.組成物が乳児用又はペット動物用、好ましくはイヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット又はサル用である、実施形態47に記載の食品又は飼料組成物。
【０３１３】
50.組成物がペット咀嚼製品であり、好ましくは骨、ロール、ドーナッツ、弓形、プレッツェル、8の字又はチップの形である、実施形態48に記載のペットフード又は飼料組成物。
【０３１４】
51.組成物が化粧用、医薬用又は獣医用組成物である、実施形態38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48のうちのいずれかに記載の組成物。
【０３１５】
52.熱失活した又は凍結した形態の失活したバインダー微生物を含み、失活した微生物がミュータンス・ストレプトコッキィの群のストレプトコッカス株に結合することができ、その結合が唾液の存在下で形成され、熱処理に抵抗性であり、カルシウム依存性であり、その熱処理が2barの圧力での飽和蒸気中で121℃の温度で20分間であり、
ミュータンス連鎖球菌株が、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型c(DSMZ 20523)、ストレプトコッカス・ミュータンス血清型e(NCTC 10923)及びストレプトコッカス・ミュータンス血清型f(NCTC 11060)からなる群から選択され、
それらの失活したバインダー微生物が、ストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィラス、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20066、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20395、ストレプトコッカス・オラリスDSMZ 20627、ストレプトコッカス・ミチスDSMZ 12643及びストレプトコッカス・サンギニスDSMZ 20567からなる群から選択される微生物に結合することができず、
バインダー微生物が、
-  口臭を予防する若しくは口臭の強さを低減するのに十分な、及び/又は
-  う蝕を予防する若しくはう蝕の発生を緩徐化するのに十分な、及び/又は
-  歯石形成を予防する若しくは歯石形成を緩徐化するのに十分な
官能的な中性な量で存在する、
ペットフード又は飼料組成物。
【０３１６】
53.失活したバインダー微生物の濃度が、
-  102〜1013細胞/mg、好ましくは102〜1012細胞/mg、さらにより好ましくは103〜108細胞/mg、又は
-  102〜1013細胞/ml、又は
-  組成物全体に対して≧0.01重量%、好ましくは0.01〜10重量%、より好ましくは0.025〜2重量%、又は
-  ≧0.01mg乾燥重量/g組成物全体、好ましくは0.01〜100mg乾燥重量/g組成物全体、より好ましくは0.025〜2mg乾燥重量/g組成物全体
である、実施形態51に記載のペットフード組成物。
【０３１７】
54.実施形態33に記載の断片を、
-  組成物全体に対して≧0.01重量%、好ましくは0.01〜10重量%、より好ましくは0.025〜2重量%、又は
-  ≧0.01mg乾燥重量/g組成物全体、好ましくは0.01〜100mg乾燥重量/g組成物全体、より好ましくは0.025〜2mg乾燥重量/g組成物全体
の濃度で含む、ペットフード又は飼料組成物。
【０３１８】
55.官能的に中性な口腔ケア剤としての、好ましくは官能的に中性な抗歯石剤及び/又は官能的に中性な抗う蝕剤及び/又は官能的に中性な抗口臭剤としての、実施形態1〜37のうちのいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片の使用。
【０３１９】
56.-  歯石形成の予防又は治療のための医薬、
-  う蝕の予防又は治療のための医薬、
-  口臭の予防又は治療のための医薬
のうちのいずれかの製造における、実施形態1〜37のうちのいずれかに記載のバインダー微生物又はその断片の使用(ここで、バインダー微生物及び/又はその断片は官能的に中性な量である)。
【図１】
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【図２】
2014508136.tif 000003
【図３】
2014508136.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月1日(2013.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
練り歯磨きまたはジェルを製造する際には、何らかの増粘剤を添加する必要があるが、それは、組成物に望ましい粘稠度を付与する、使用時に望ましい活性放出特性を付与する、貯蔵安定性を与える、組成物の安定性を与える、などのためである。好ましい増粘剤はカルボキシビニルポリマー、カラギーナン、ヒドロキシエチルセルロース、ラポナイト（LAPONITE(登録商標)、Rockwood Additives Limited社）、およびセルロースエーテルの水溶性塩（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチル・ヒドロキシエチル・セルロースナトリウム）である。カラヤガム、キサンタンガム、アラビアガム、トラガカントガムといった天然のガムも使用することができる。コロイド状のケイ酸マグネシウムアルミニウムや微細なシリカは、きめをさらに改善するために増粘剤の一部として使用することができる。
【国際調査報告】
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