(57)【要約】  典型的に固相と結合する捕捉抗体及びレポーター基と結合する検出抗体との間でタンパク質分析物を捕捉するサンドイッチ型イムノアッセイにおいて、分析物の各分子と結合するレポーター基の数は、検出抗体上のレポーター基との免疫学的結合、又は複数のビオチン−アビジン型結合部位のようなかかる特徴と併せて、アビジン−ビオチン型結合を用いる様々な方法により増加する。
2014515094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二の免疫学的結合メンバーの各コピーは、複数のコピーのレポーター基で標識され、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し、これによりそれぞれの前記第一の複合体が複数のコピーの前記レポーター基を含んでなり；
（ｃ）前記固体支持体を、これらに結合した前記第一の複合体と共に、前記レポーター基に対するアフィニティーを有する第三の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第三の免疫学的結合メンバーは、これらに結合したアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択される第一のアフィニティー型結合メンバーを有し、複数のコピーの前記第三の免疫学的結合メンバーを前記レポーター基と結合させ、これにより前記第一の複合体を、前記レポーター基のコピーあたり複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを含んでなる第二の複合体に変換し；
（ｄ）前記固体支持体を、これらに結合した前記第二の複合体と共に、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択され、かつ前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対して結合アフィニティーを有する第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体を、前記第一の複合体のレポーター基及び工程（ｃ）により前記第一の複合体に加えられたレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる第三の複合体に変換し；そして
（ｅ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記合計のレポーター基からシグナルを検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）における前記複数のコピーの前記レポーター基のそれぞれが、アビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アビジン−ビオチン型結合が、前記免疫学的結合メンバーと結合するビオチン基と、前記レポーター基と結合するストレプトアビジンとの結合である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のアフィニティー結合メンバーがビオチンであり、複数の前記第一のアフィニティー型結合メンバーが前記第三の免疫学的結合メンバーの各コピーと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）における前記複数のコピーの前記レポーター基のそれぞれが、前記免疫学的結合メンバーと結合したビオチン基と、前記レポーター基と結合したストレプトアビジンとのアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合し、ここで前記第一のアフィニティー型結合メンバーはビオチンであり、複数の前記第一のアフィニティー型結合メンバーは、前記第三の免疫学的結合メンバーのそれぞれのコピーと結合し、前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二の免疫学的結合メンバーの各コピーは、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンからなる群から選択される複数のコピーの第一のアフィニティー型結合メンバーと結合して、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し、これにより前記第一の複合体のそれぞれが複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを含んでなり；
（ｃ）このように結合した前記第一の複合体と共に、前記固体支持体を、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンからなる群から選択され、かつ前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対する結合アフィニティーを有する第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体が前記複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを超える数のレポーター基を含んでなるように、前記第一の複合体を、複数のビオチン基が一つのアビジン又はストレプトアビジン基と結合するアビジン−ビオチン型結合を含んでなる第二の複合体に変換し；そして
（ｄ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記レポーター基からシグナルを検出すること
を含む、方法。
【請求項９】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーであり、かつ前記第二の免疫学的結合メンバーと直接結合するビオチン基とのアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合し、そして前記第一のアフィニティー型結合メンバーは、前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体は、前記第一のアフィニティー型結合メンバー上及び前記第二のアフィニティー型結合メンバー上のレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二の複合体が、第一のアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと、第二のアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二のアフィニティー型結合メンバーの双方と結合したストレプトアビジン基を含んでなることができるように、前記第一のアフィニティー型結合メンバーがストレプトアビジンであり、前記第二の免疫学的結合メンバーと直接的に結合するビオチン基とのアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合し、かつ前記第二のアフィニティー型結合メンバーがビオチンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが前記レポーター基で標識され、そして前記第二の複合体が、前記第一のアフィニティー型結合メンバー上及び前記第二のアフィニティー型結合メンバー上のレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、（ｉ）前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有し、かつ複数のコピーのビオチンと結合する前記第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートして、前記固体支持体と結合した予備的な複合体を形成し、そして（ｉｉ）このように結合した予備的な複合体と共に、前記固体支持体を、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択され、かつレポーター基で標識されたメンバーとインキュベートし、前記第一の複合体を形成することを含んでなり、そして前記第二の複合体が、前記第一のアフィニティー型結合メンバー上及び前記第二のアフィニティー型結合メンバー上のレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）が、前記固体支持体を前記レポーター基で標識されたストレプトアビジンとインキュベートすることを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の複合体が、複数の前記ビオチン基と結合するそれぞれの複数のコピーの前記第二のアフィニティー型結合メンバーを含んでなり、そして前記第二の複合体が、前記第二の免疫学的結合メンバーのそれぞれのコピーと結合する前記複数のコピーの前記ビオチン基を超える数のレポーター基を含んでなるように、前記第一のアフィニティー型結合メンバーがビオチンであり、前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーであり、そして工程（ｃ）が、前記固体支持体をブリッジングメンバーとインキュベートすることをさらに含んでなり、ここで前記ブリッジングメンバーのそれぞれのコピーが、複数のビオチン基と結合し、これにより、前記第二の免疫学的結合メンバー及び前記ブリッジングメンバーの双方が、前記第一の免疫学的結合メンバー上の前記ビオチン基と比較して過剰である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記ブリッジングメンバーが、前記第一のアフィニティー型結合メンバーの複数のコピーと結合する前記第二の免疫学的結合メンバーの更なるコピーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二の免疫学的結合メンバーは、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンマルチマーからなる群から選択される第一のアフィニティー型結合メンバーと結合し、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し；
（ｃ）このように結合した前記第一の複合体と共に、前記固体支持体を、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンマルチマーからなる群から選択される第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対する結合アフィニティーを有し、かつ前記レポーター基で標識され、複数のアビジン−ビオチン型結合、及び分析物の分子あたり複数のレポーター基を含んでなる第二の複合体を形成し：そして
（ｄ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記レポーター基からシグナルを検出すること
を含む、方法。
【請求項２１】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ビオチンマルチマーであり、前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ビオチンデンドリマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーであり、前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、前記第一のアフィニティー型結合メンバーと結合しやすいビオチン部分、及びアビジン−ビオチン型結合を介して前記第一のアフィニティー型結合メンバーのコピーと結合する複数の更なるビオチン部分を有するビオチンマルチマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ポリビオチンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンであり、かつ前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ポリビオチンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここでそれぞれのコピーの前記第二の免疫学的結合メンバーはレポーター基で標識されて、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し、これによりそれぞれの前記第一の複合体は、前記レポーター基を含んでなり；
（ｃ）前記固体支持体を、これに結合した前記第一の複合体と共に、前記レポーター基に対するアフィニティーを有する第三の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第三の免疫学的結合メンバーは、これらに結合するアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択される第一のアフィニティー型結合メンバーを有し、複数のコピーの前記第三の免疫学的結合メンバーを前記レポーター基と結合させ、これにより前記第一の複合体を前記レポーター基のコピーあたり複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを含んでなる第二の複合体に変換し；
（ｄ）前記固体支持体を、これらに結合した前記第二の複合体と共に、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択され、かつ前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対して結合アフィニティーを有する第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体を、前記第一の複合体の前記レポーター基及び工程（ｃ）により前記第一の複合体に加えられたレポーター基と等しい数のレポーター基を含んでなる第三の複合体に変換し；そして
（ｅ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記合計のレポーター基からシグナルを検出すること
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年３月４日に出願された米国仮特許出願第６１／４４９，４６３号の利益を主張する。前述の仮特許出願の内容は、参照によりこの全体において本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質の検出のための多くのイムノアッセイは、分析物タンパク質がまず固相に結合している捕捉抗体と結合し、その後、レポーター基、例えば蛍光体、酵素、又は最終的に検出可能なシグナルを得るための他のタンパク質で標識された検出抗体と結合する、よく知られている「サンドイッチ」方式に従う。レポーター基として用いることができる非酵素的結合メンバーの例としては、ビオチン、アビジン、又はストレプトアビジンが挙げられ、これらの場合、レポーター基を有する検出抗体の結合の後、酵素又は蛍光体を有する結合パートナーを含む、ビオチン‐アビジン結合におけるその結合パートナーとレポーター基との結合が続く。一般的に、シグナルの大きさはレポーター基により決定され、あるいは二又はそれ以上のレポーター基が検出抗体に結合する場合にはレポーター基の数により決定され、さらに増幅されない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の開示
ビオチン‐アビジン結合を更に活用するもの、検出抗体上のレポーター基との免疫学的結合に関するもの、及び複数のビオチン‐アビジン型結合部位、例えばポリビオチンを含む種類に関するものを含む様々な方法により、検出抗体と結合するものを超えてレポーター基の数を増加させることができることを発見した。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、本発明の一つの方法の一例であるプロトコールの模式図である。
【０００５】
【図２】図２は、本発明の第二の方法の一例であるプロトコールの模式図である。
【０００６】
【図３】図３は、図２の例と同一の方法の一例であるプロトコールの模式図である。
【０００７】
【図４】図４は、図２の例と同一の方法の一例であるプロトコールの模式図である。
【０００８】
【図５】図５は、本発明の第三の方法の一例であるプロトコールの模式図である。
【０００９】
【図６】図６は、図５の実施例と同一の方法の例であるプロトコールの模式図である。
【００１０】
【図７】図７は、本発明の第四の方法の一例であるプロトコールの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
選択された実施形態の詳細な説明
これらの方法のそれぞれでは、目的の分析物の存在について分析されるサンプルは、固体支持体と結合する免疫学的結合メンバーと最初にインキュベートされ、前記結合メンバーは、分析物に対して選択的な結合親和性を有するものである。これは、連続する結合反応が、一又は連続した更なる結合反応を介してレポーター基を分析物に結合させるために行なわれる支持体上に分析物を固定化する。
【００１２】
方法の一つでは、サンプル中に存在する場合、分析物と直ちに結合する固体支持体は、分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートされ、「サンドイッチ」方式において、分析物と第一の免疫学的結合メンバーとの複合体を形成する。前記第二の免疫学的結合メンバーは、二又はそれ以上のコピーのレポーター基で標識されたものであり、従って、この工程において形成される複合体は、分析物の各分子について二又はそれ以上のレポーター基を含んでなる。一度この「サンドイッチ」複合体が形成されると、前記固相は、前記レポーター基に対して選択的結合アフィニティーを有する第三の免疫学的結合メンバーとインキュベートされ、従って、複合体中に既に含まれるレポーター基の各コピーについて、少なくとも一つのコピーの第三の免疫学的結合メンバーをさらに添加することにより、固相上の複合体を拡張する。手順によっては、複数（二又はそれ以上）のコピーの第三の免疫学的結合メンバーは、レポーター基の各コピーと結合する。前記第三の免疫学的結合メンバーはまた、アビジン−ビオチンファミリー内のアフィニティー型結合メンバーと結合するという特徴を有する。このファミリーのメンバーは、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ポリビオチン、及び前記ファミリーの別のメンバーとのアビジン−ビオチン相互作用に従事する任意の他の種を含む。前記標識は、従って、例えば、連続する結合反応において、アビジン又はストレプトアビジンのいずれかと複合体を形成するビオチンでもよい。この方法の特定の実施形態では、前記第三の免疫学的結合メンバーは、二若しくはそれ以上のアフィニティー型結合メンバー、又はアビジン−ビオチンファミリー内の二若しくはそれ以上の対応物と結合するアフィニティー型結合メンバーのいずれかと結合する。例えば、ポリビオチンは、複数のコピーのアビジン又はストレプトアビジンと結合し、アビジン及びストレプトアビジンは、それぞれ複数のコピーのビオチンと結合する。好ましくは、しかしながら、第三の免疫学的結合メンバーとする前記アフィニティー型結合メンバーはビオチンであり、二又はそれ以上のコピーのビオチンは、各コピーの第三の免疫学的結合メンバーと結合する。
【００１３】
この第一の方法における最終的な結合反応は、固相を、先の工程において複合体に加えられた結合メンバーとのアビジン−ビオチン相互作用に従事するアビジン−ビオチンファミリーのアフィニティー型結合メンバーとインキュベーションすることにより行なわれる。この第二のアフィニティー型結合メンバーの各コピーは、レポーター基、好ましくはこの最終的な結合反応の前に、最初のインキュベーションにおいて含まれる同一のレポーター基で標識される。固体支持体上の得られる複合体は、従って、分析物の各分子について、第一のインキュベーションからのものに加えて第二のインキュベーションからのものを含む、複数のコピーのレポーター基を含む。
【００１４】
図１は、この第一の方法を説明する。複合体１１は、分析物１２を、固体支持体１４と結合する捕捉抗体１３（第一の免疫学的結合メンバー）と最初にインキュベートし、そしてその後、固体支持体（その結合した分析物を一緒に含む）を、第二の抗体１６（第二の免疫学的結合メンバー）、ビオチン１７、ストレプトアビジン１８及びこの場合においてフィコエリトリンであるレポーター基１９とのコンジュゲート１５とインキュベートすることにより形成される最初のサンドイッチ複合体である。一度サンドイッチ複合体１１が形成されると、これは、複合体に複数のビオチン部位を加えるビオチン結合抗フィコエリトリン抗体２１（第三の免疫学的結合メンバー）とインキュベートされる。最後のインキュベーションは、フィコエリトリン標識ストレプトアビジン２３と行なわれ、様々なアフィニティー型及び免疫学的結合を介した単一の分析物１２分子と結合する多数のフィコエリトリン基を含む最終複合体２４を生成する。この場合、第二の抗体１６は、二つのビオチン部分と結合し、これらのそれぞれは、アビジン−ビオチン結合を介して別のフィコエリトリン基を有し、各ビオチン結合抗フィコエリトリン抗体２１は、二つのフィコエリトリン標識を有する。最終複合体における結果は、分析物分子あたり最低限６個のフィコエリトリン標識であり、図中の描写は８個を示す。
【００１５】
本発明の第二の一般的方法では、最初の分析物固定化工程において第一の免疫学的結合メンバーを介して分析物と結合を形成した固体支持体は、分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートされ、第一の方法においてのように、「サンドイッチ」方式において分析物と第一の免疫学的結合メンバーとの複合体を形成する。前記第二の免疫学的結合メンバーは、得られる複合体が分析物の各分子に対する二又はそれ以上のコピーのアフィニティー型結合メンバーを含むことができるように、アビジン−ビオチンファミリーの二又はそれ以上のコピーの第一のアフィニティー型結合メンバーで標識されるものである。対応物であるアフィニティー型結合メンバー及びレポーター基は、二つの方法：（１）第一のアフィニティー型結合メンバーは、すでに（インキュベーションの前に）レポーター基で標識された対応物であるアフィニティー型結合メンバーと結合する方法、あるいは（２）標識された対応物であるアフィニティー型結合メンバーが、続いて起こるインキュベーションにより、インキュベーション後に結合する方法のうちの一つの方法で複合体に加えられる。いずれの場合も、固相上の得られる複合体は、アビジン−ビオチン複合体を介して一つの分析物分子とそれぞれ結合した二又はそれ以上のレポーター基を含む。前記固相は、その後、先のインキュベーションで用いられたアフィニティー結合メンバーと対になるアビジン−ビオチンファミリーのメンバーとインキュベートされ、この後者のメンバーは、レポーター基で標識され、あるいは免疫学的結合メンバーと結合する。後者の場合、前記免疫学的結合メンバーは、レポーター基の更なる付属物のための橋渡しとして役割を果たす二又はそれ以上のアフィニティー結合メンバーと結合する。従って、最終的な複合体中のアフィニティー結合メンバーは、一つのアビジン（又はストレプトアビジン）部分と結合する二又はそれ以上のビオチン部分、及び分析物の各分子と結合する比較的多数のレポーター基を含む結合を形成する。
【００１６】
図２〜４は、第二の方法によるプロトコールの図説である。図２のプロトコールでは、複合体３１は、分析物１２を、固体支持体１４と結合する捕捉抗体１３（第一の免疫学的結合メンバー）と最初にインキュベートし、そしてその後、固体支持体（この結合した分析物を一緒に含む）を、図１の例に用いられる同一のコンジュゲート１５とのインキュベートすることにより形成される最初のサンドイッチ複合体である。この例における連続する結合反応は、サンドイッチ複合体３１と、ビオチン３３及びフィコエリトリン３４のコンジュゲート３２とである。前記コンジュゲートのビオチン部分３３は、ストレプトアビジン部分１８上の占められていない結合部位と結合を形成し、これによりストレプトアビジン部分に多くのコピーのフィコエリトリン標識を加える。この結果は、最後の二つのインキュベーションに用いられるフィコエリトリン部分の合計と等しいフィコエリトリン部分の合計数を含む最終的な複合体である。この場合、第二の抗体１６は、二つのビオチン部分と結合し、これらのそれぞれは、アビジン−ビオチン結合を介してこれら自身の別々のフィコエリトリン標識を有し、そして前記最終的な複合体は、合計４個のフィコエリトリン標識を含んでなる。
【００１７】
図３のプロトコールでは、複合体４１は、分析物１２を、固体支持体１４と結合する捕捉抗体１３（第一の免疫学的結合メンバー）と最初にインキュベートし、そしてその後、固体支持体（この結合した分析物を一緒に含む）を、分析物に対する特異的な結合アフィニティーを有するビオチン結合抗体４２（第三の免疫学的結合メンバー）とインキュベートすることにより形成される最初のサンドイッチ複合体である。これに、フィコエリトリン及びストレプトアビジンのコンジュゲート２３とのインキュベーションが続き、ビオチン結合抗体４２に含まれる各ビオチン部分についての別々のフィコエリトリン標識４５を含んでなる複合体４４を形成する。この例における最終的な結合反応は、拡張された複合体４４と、ビオチン３３及びフィコエリトリン３４のコンジュゲート３２である。コンジュゲートのビオチン部分３３は、フィコエリトリン−アビジン複合体２３のアビジン部分上の占められていない結合部位と結合を形成し、これによりストレプトアビジン部分に多くのコピーのフィコエリトリン標識を加える。この結果は、ここでまた、最後の二つのインキュベーションにおいて導入されるフィコエリトリン部分の合計と等しいフィコエリトリン部分の合計数を含む最終的な複合体４６である。この場合、第二の抗体４２は、二つのビオチン部分と結合し、これらのそれぞれは、アビジン−ビオチン結合を介して拡張された複合体４４においてこれら自身の別々のフィコエリトリン標識を有し、そして十分な数のフィコエリトリン−ビオチンコンジュゲート３２が、最後のインキュベーションに用いられ、各アビジン部分に加えられる二つの更なるビオチン部分をもたらす。前記最終的な複合体は、合計６個のフィコエリトリン標識を含んでなる。
【００１８】
図４のプロトコールでは、最初のサンドイッチ複合体４１は、図３のプロトコールのものと同じであるが、一度形成されたサンドイッチ複合体は、その後過剰量のフィコエリトリン標識ストレプトアビジン２３及び各抗体が少なくとも二つのビオチン部分で標識されたビオチン化抗体５２の双方とインキュベートされる。このインキュベーションでは、フィコエリトリン標識ストレプトアビジン２３の一部が、最初のサンドイッチ複合体４１の外側部分を形成するビオチン結合抗体４２上のビオチン部分と結合する一方で、ビオチン化抗体５２は、最初のサンドイッチ複合体の一部であるフィコエリトリン標識ストレプトアビジン２３と、第二のインキュベーションで含まれる更なるフィコエリトリン標識ストレプトアビジン２３との橋渡しとしての役割を果たす。従って、前記抗体の抗体結合機能自体は用いられない。この結果は、各分析物分子について複数の標識を含んでなる最終的な複合体５３である。
【００１９】
本発明による第三の一般的方法では、最初の分析物固定化工程において、分析物が第一の免疫学的結合メンバーを介して結合を形成した固体支持体は、連続するインキュベーション工程の一つにおいてビオチンマルチマーとインキュベートされ、マルチマー上の数個又はそれ以上のビオチン部位は、レポーター基で標識されたアビジン又はストレプトアビジンと最終的に結合する。前記最終複合体は、従って、ビオチンマルチマー上のアビジン−ビオチン型結合を介して固相に結合した各分析物分子と結合した複数のコピーのレポーター基を含んでなる。ビオチンマルチマーの例としては、ビオチンデンドリマー及び他のポリビオチンである。この方法の一つの実施は、「サンドイッチ」複合体を完成させる第二の免疫学的結合メンバーと直接的に結合するビオチンマルチマーを使用することである。この場合におけるビオチンマルチマーは、従って、分析物が固相により最初に捕捉された後、最初のインキュベーションの一部となる。別の実施は、「サンドイッチ」複合体を完成させる免疫学的結合メンバーとしてアビジン又はストレプトアビジンと結合する免疫学的結合メンバーを使用すること、及びアビジン又はストレプトアビジン標識サンドイッチ複合体をそれぞれがレポーター基で標識された二又はそれ以上のアビジン又はストレプトアビジン部分と結合するビオチンマルチマーからなる複合体とインキュベートすることである。
【００２０】
図５及び６は、第三の方法によるプロトコールの図説である。図５のプロトコールでは、最初の複合体６１は、分析物１２を、固体支持体１４と結合する捕捉抗体１３（第一の免疫学的結合メンバー）と最初にインキュベートし、そしてその後、固体支持体（この結合した分析物を一緒に含む）を、分析物に対する特異的な結合アフィニティーを有する抗体６３及び少なくとも一つのビオチンマルチマー６４のコンジュゲート６２とインキュベートすることにより形成される。示される例では、二つのビオチンペンタマーは、一つの抗体分子と結合する。連続する工程では、前記複合体は、各マルチマー上の二又はそれ以上のビオチン部位において生じるアビジン−ビオチン型結合を引き起すのに十分な量のフィコエリトリン標識ストレプトアビジン２３とインキュベートされる。最終的な複合体６６上の標識の数は、最後のインキュベーションにおいて結合を形成したマルチマー上のビオチン部位の数と等しく；この場合において、示される合計は、分析物の各分子について６個のフィコエリトリン部分である。
【００２１】
図６のプロトコールでは、最初のサンドイッチ複合体７１は、上述のプロトコールの全てにおいてのように、分析物１２を、固体支持体１４と結合する捕捉抗体１３（第一の免疫学的結合メンバー）と最初にインキュベートし、そしてその後の固体支持体及び結合した分析物を、分析物に対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体７３とストレプトアビジン７４のコンジュゲート７２とインキュベートすることにより形成される。ビオチンマルチマーは、連続するインキュベーションに用いられ、ここで最初のサンドイッチ複合体７１は、ビオチンマルチマー７６及びフィコエリトリン標識ストレプトアビジン７７の複合体７５とインキュベートされる。このインキュベーションは、ビオチンマルチマーを介した各分析物分子と結合した複数のフィコエリトリン標識を含んでなる最終複合体７８をもたらし、これは、示される例において、デンドリマーである。
【００２２】
本発明による第四の一般的方法では、最初の分析物固定化工程において、分析物を第一の免疫学的結合メンバーを介して結合を形成した固体支持体は、分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバー最初にインキュベートし、「サンドイッチ」方式において、分析物及び第一の免疫学的結合メンバーと共に複合体を形成する。前記第二の免疫学的結合メンバーは、レポーター基の一つのコピーで標識されるものである。一度この「サンドイッチ」複合体が形成されると、前記固相は、レポーター基に対して選択的結合アフィニティーを有する複数のコピーの第三の免疫学的結合メンバーとインキュベートされ、これにより、複合体にすでに含まれるレポーター基の各コピーについての第三の免疫学的結合メンバーの少なくとも複数のコピーをさらに加えることにより、固相上の複合体を拡張され、ここで第三の免疫学的結合メンバー自体はビオチンと結合する。固相は、その後、レポーター基で標識されたアビジン又はストレプトアビジンとインキュベートされ、分析物の各分子について複数のコピーのレポーター基を含んでなる最終複合体を生成する。
【００２３】
この方法は、図７において図説され、ここで、最初のサンドイッチ複合体８１は、上述のプロトコールにおいてのように、分析物１２を、固体支持体１４と結合する捕捉抗体１３（第一の免疫学的結合メンバー）と最初のインキュベートし、そしてその後、固体支持体及び結合した分析物を、分析物に対して特異的な結合アフィニティーを有しフィコエリトリン８４で標識された抗体８３のコンジュゲート８２とインキュベートすることにより形成される。得られた複合体を、その後、フィコエリトリン８４に対して特異的なアフィニティーを有する過剰量のビオチン結合抗体８５とインキュベートし、固相の各粒子と結合を形成した複数のコピーのビオチン結合抗体８５を含んでなる複合体８６をもたらす。この複合体８６を、その後、フィコエリトリン標識ストレプトアビジン８７とインキュベートし、分析物１２の一つの分子及び複数のコピーのフィコエリトリンを含んでなる最終的な複合体８８を形成する。
【００２４】
フィコエリトリンが上記の例においてレポーター基である一方で、イムノアッセイにおける使用について知られている任意のレポーター基を用いることができる。他の蛍光体としては、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ、クマリン、シアニン色素、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ローダミンＢ、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）が挙げられる。他のレポーター基は、放射性標識及び酵素である。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。前記固体支持体は、アッセイにおいて反応に不活性であり、かつ、アッセイにおいて液体と分離することができる任意の材料でもよい。ビーズ、マイクロビーズは、一般的な例であるが、平らな固体表面、又は容器の壁を用いることもできる。最終的に、例において抗体が免疫学的結合メンバーとして用いられるが、抗体フラグメントも用いることができる。上記で説明される様々な特徴及び構成要素の他の置き換え及び変形は、当業者に理解される。
【００２５】
本明細書に添付の特許請求の範囲において、用語「一つの（a）」又は「一つの（an）」は、「一又は複数」を意味することを意図する。用語「含む（comprise）」及びこれらのバリエーション、例えば「含む（comprises）」及び「含むこと（comprising）」は、工程又は要素の列挙に先立つ場合、更なる工程又は要素の付加が任意であり、排除されないことを意味することを意図する。全ての特許、特許出願、及び本明細書において引用される他の公開されている参照材料は、これによりこれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される任意の参照材料又は一般的な任意の先行技術と、本明細書の明示的な教示との間の任意の矛盾は、この明細書の教示を尊重して解決されることを意図する。これは、語又は語句の当該技術分野で理解されている定義と、同一の語又は語句の明細書で明示的に提供される定義との間の任意の矛盾を含む。
【図１】
2014515094.tif 000003
【図２】
2014515094.tif 000004
【図３】
2014515094.tif 000005
【図４】
2014515094.tif 000006
【図５】
2014515094.tif 000007
【図６】
2014515094.tif 000008
【図７】
2014515094.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月5日(2013.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二の免疫学的結合メンバーの各コピーは、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンからなる群から選択される複数のコピーの第一のアフィニティー型結合メンバーと結合して、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し、これにより前記第一の複合体のそれぞれが複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを含んでなり；
（ｃ）このように結合した前記第一の複合体と共に、前記固体支持体を、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンからなる群から選択され、かつ前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対する結合アフィニティーを有する第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体が前記複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを超える数のレポーター基を含んでなるように、前記第一の複合体を、複数のビオチン基が一つのアビジン又はストレプトアビジン基と結合するアビジン−ビオチン型結合を含んでなる第二の複合体に変換し；そして
（ｄ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記レポーター基からシグナルを検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーであり、かつ前記第二の免疫学的結合メンバーと直接結合するビオチン基とのアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合し、そして前記第一のアフィニティー型結合メンバーは、前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体は、前記第一のアフィニティー型結合メンバー上及び前記第二のアフィニティー型結合メンバー上のレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二の複合体が、第一のアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと、第二のアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二のアフィニティー型結合メンバーとの双方と結合したストレプトアビジン基を含んでなることができるように、前記第一のアフィニティー型結合メンバーがストレプトアビジンであり、前記第二の免疫学的結合メンバーと直接的に結合するビオチン基とのアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合し、かつ前記第二のアフィニティー型結合メンバーがビオチンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが前記レポーター基で標識され、そして前記第二の複合体が、前記第一のアフィニティー型結合メンバー上及び前記第二のアフィニティー型結合メンバー上のレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）が、（ｉ）前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有し、かつ複数のコピーのビオチンと結合する前記第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートして、前記固体支持体と結合した予備的な複合体を形成し、そして（ｉｉ）このように結合した予備的な複合体と共に、前記固体支持体を、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択され、かつレポーター基で標識されたメンバーとインキュベートし、前記第一の複合体を形成することを含んでなり、そして前記第二の複合体が、前記第一のアフィニティー型結合メンバー上及び前記第二のアフィニティー型結合メンバー上のレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）が、前記固体支持体を前記レポーター基で標識されたストレプトアビジンとインキュベートすることを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の複合体が、複数の前記ビオチン基と結合するそれぞれの複数のコピーの前記第二のアフィニティー型結合メンバーを含んでなり、そして前記第二の複合体が、前記第二の免疫学的結合メンバーのそれぞれのコピーと結合する前記複数のコピーの前記ビオチン基を超える数のレポーター基を含んでなるように、前記第一のアフィニティー型結合メンバーがビオチンであり、前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーであり、そして工程（ｃ）が、前記固体支持体をブリッジングメンバーとインキュベートすることをさらに含んでなり、ここで前記ブリッジングメンバーのそれぞれのコピーが、複数のビオチン基と結合し、これにより、前記第二のアフィニティー型結合メンバー及び前記ブリッジングメンバーの双方が、前記第二の免疫学的結合メンバー上の前記ビオチン基と比較して過剰である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブリッジングメンバーが、前記第一のアフィニティー型結合メンバーの複数のコピーと結合する前記第二の免疫学的結合メンバーの更なるコピーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二の免疫学的結合メンバーの各コピーは、複数のコピーのレポーター基で標識され、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し、これによりそれぞれの前記第一の複合体が複数のコピーの前記レポーター基を含んでなり；
（ｃ）前記固体支持体を、これらに結合した前記第一の複合体と共に、前記レポーター基に対するアフィニティーを有する第三の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第三の免疫学的結合メンバーは、これらに結合したアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択される第一のアフィニティー型結合メンバーを有し、複数のコピーの前記第三の免疫学的結合メンバーを、前記第二の免疫学的結合メンバーを標識する前記レポーター基と結合させ、これにより前記第一の複合体を、前記レポーター基のコピーあたり複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを含んでなる第二の複合体に変換し；
（ｄ）前記固体支持体を、これらに結合した前記第二の複合体と共に、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択され、かつ前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対して結合アフィニティーを有する第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体を、前記第一の複合体のレポーター基及び工程（ｄ）により前記第二の複合体に加えられたレポーター基の合計と等しい数のレポーター基を含んでなる第三の複合体に変換し；そして
（ｅ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記合計のレポーター基からシグナルを検出すること
を含む、方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）における前記複数のコピーの前記レポーター基のそれぞれが、アビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二の免疫学的結合メンバーと前記レポーター基の間の前記アビジン−ビオチン型結合が、前記第二の免疫学的結合メンバーと結合するビオチン基と、前記レポーター基と結合するアビジン又はストレプトアビジンとの結合である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一のアフィニティー結合メンバーがビオチンであり、複数の前記第一のアフィニティー型結合メンバーが前記第三の免疫学的結合メンバーの各コピーと結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）における前記複数のコピーの前記レポーター基のそれぞれが、前記第二の免疫学的結合メンバーと結合したビオチン基と、前記レポーター基と結合したストレプトアビジンとのアビジン−ビオチン型結合を介して前記第二の免疫学的結合メンバーと結合し、ここで前記第一のアフィニティー型結合メンバーはビオチンであり、複数の前記第一のアフィニティー型結合メンバーは、前記第三の免疫学的結合メンバーのそれぞれのコピーと結合し、前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二の免疫学的結合メンバーは、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンマルチマーからなる群から選択される第一のアフィニティー型結合メンバーと結合して、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し；
（ｃ）このように結合した前記第一の複合体と共に、前記固体支持体を、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンマルチマーからなる群から選択される第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対する結合アフィニティーを有し、かつ前記レポーター基で標識され、複数のアビジン−ビオチン型結合、及び分析物の分子あたり複数のレポーター基を含んでなる第二の複合体を形成し：そして
（ｄ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記レポーター基からシグナルを検出すること
を含む、方法。
【請求項２１】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ビオチンマルチマーであり、前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ビオチンデンドリマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、アビジン及びストレプトアビジンからなる群から選択されるメンバーであり、前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、前記第一のアフィニティー型結合メンバーと結合しやすいビオチン部分、及びアビジン−ビオチン型結合を介して前記第一のアフィニティー型結合メンバーのコピーと結合する複数の更なるビオチン部分を有するビオチンマルチマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ポリビオチンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一のアフィニティー型結合メンバーが、ストレプトアビジンであり、かつ前記第二のアフィニティー型結合メンバーが、ポリビオチンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記レポーター基がフィコエリトリンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルを、固体支持体と結合し、かつ前記分析物に対して選択的結合アフィニティーを有する第一の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、前記分析物を前記第一の免疫学的結合メンバーを介して前記固体支持体と結合させ；
（ｂ）このように結合した前記分析物と共に、前記固体支持体を、前記分析物に対するアフィニティーを有する第二の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここでそれぞれのコピーの前記第二の免疫学的結合メンバーはレポーター基で標識されて、前記固体支持体と結合した第一の複合体を形成し、これによりそれぞれの前記第一の複合体は、前記レポーター基を含んでなり；
（ｃ）前記固体支持体を、これに結合した前記第一の複合体と共に、前記レポーター基に対するアフィニティーを有する第三の免疫学的結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第三の免疫学的結合メンバーは、これらに結合するアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択される第一のアフィニティー型結合メンバーを有し、複数のコピーの前記第三の免疫学的結合メンバーを前記レポーター基と結合させ、これにより前記第一の複合体を、前記レポーター基のコピーあたり複数のコピーの前記第一のアフィニティー型結合メンバーを含んでなる第二の複合体に変換し；
（ｄ）前記固体支持体を、これらに結合した前記第二の複合体と共に、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリビオチンからなる群から選択され、かつ前記第一のアフィニティー型結合メンバーに対して結合アフィニティーを有する第二のアフィニティー型結合メンバーとインキュベートし、ここで前記第二のアフィニティー型結合メンバーは、前記レポーター基で標識され、前記第二の複合体を、前記第一の複合体の前記レポーター基及び工程（ｃ）により前記第一の複合体に加えられたレポーター基と等しい数のレポーター基を含んでなる第三の複合体に変換し；そして
（ｅ）前記サンプル中の前記分析物の存在の指標として、前記合計のレポーター基からシグナルを検出すること
を含んでなる、方法。
【国際調査報告】
2014515094.tif 000010