(57)【要約】  本発明は、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法に関する。
2014506117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法であって、健康対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者における軽度の炎症の存在を示す、前記方法。
【請求項２】
患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法であって、インスリン非抵抗性対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者が、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得ることを示す、前記方法。
【請求項３】
患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法であって、インスリン非抵抗性対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、インスリン抵抗性改善薬処置が効果的ではないことを示す、前記方法。
【請求項４】
遺伝子のセットが、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４からなる群より選択された１個以上の遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
遺伝子のセットが、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４の２個、３個、４個又は５個全てを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
遺伝子のセットが、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳからなる群より選択された１個以上の遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
遺伝子のセットが、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳの２個、３個又は４個全てを含む、請求項７の方法。
【請求項８】
遺伝子のセットが、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳからなる群より選択された１個以上の遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
遺伝子のセットが、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個全てを含む、請求項９の方法。
【請求項１０】
患者は、メタボリックな状態を患っている、請求項１〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
メタボリックな状態が、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性状態、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
発現プロファイルの決定が、ｍＲＮＡ発現レベルの決定を含む、請求項１〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
ｍＲＮＡ発現レベルがｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
試験試料における遺伝子のセットの発現レベルの変化は、対照試料と比較して少なくとも約１．５倍の差がある、請求項１〜１３のいずれか１項の方法。
【請求項１５】
ａ）患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定する工程、
ｂ）遺伝子のセットの発現プロファイルを、インスリン抵抗性改善剤を用いての処置の前に患者から採取した全血のリファレンス試料からの遺伝子のセットの発現プロファイルと比較する工程、及び
ｃ）試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルとより類似している場合に治療が効果的であると決定する工程
を含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法。
【請求項１６】
特に前記の実施例を参照にして、本明細書において以前に実質的に記載したような方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月２４日に提出された欧州特許出願第１０１９２４０５．８号の恩典を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、軽度の組織の炎症を検出する方法に関する。
【０００３】
背景
軽度の組織の炎症は、肥満被験者におけるインスリン抵抗性及び糖尿病に関連した主要な因子の１つとして認識されることがますます増えている（１、２）。組織の炎症は、脂肪組織によって分泌される因子（例えばＴＮＦα、ＩＬ６、ＭＩＦ、ＣＳＦＩ、ＭＣＰ１、脂肪酸）によって主に媒介されると考えられており、そしてこれは、炎症状態の増幅及び組織の代謝の変化に関与する、細胞内経路活性化及び小胞体ストレス応答などの一連の細胞応答からなる。例えば、ＴＮＦαは、ＩＫＫｂ及びＪＮＫにより媒介されるＩＲＳセリンリン酸化を通して、インスリンレセプターシグナル伝達の不活性化を媒介する。同時にＩＫＫｂ及びＪＮＫは、また、ＮＦκＢ及びＡＰ−１経路も活性化し、従って、サイトカイン放出の増幅も媒介する。ＮＦκＢ及びＡＰ−１により媒介されるサイトカイン放出は、また、Ｔｏｌｌ様レセプターを通しての遊離脂肪酸、又は小胞体ストレス応答の誘導を通して増加したグルコースなどの、他の循環中の因子によってトリガーされる他の経路の最終工程である。軽度の炎症は、また、肥満及びインスリン抵抗性被験者における心臓血管リスクを増加させる内皮機能不全にも関連している。
【０００４】
組織における軽度の炎症の評価は、インスリン抵抗性改善薬の作用機序の解明のための有用なアプローチであり得、そしてまた、個別化医療のための前糖尿病及び糖尿病個体群内の表現型亜個体群に対する可能性あるアプローチであり得る。しかしながら、臨床場面において組織生検への接近にはいくつかの問題がある。従って、薬力学的目的及び患者層別化の目的のために、炎症経路調節の評価のための代替システムをプロファイリングする必要がある。
【０００５】
末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）は、近年、インスリン抵抗性状態におけるＮＦκＢ関連経路の調節の研究のための可能性ある代替物として探究されてきた。血球におけるＮＦκＢ経路に関連した遺伝子の発現は、（ｉ）全身の慢性炎症を反映し、そしてＴ２Ｄ及び／又は併存症（高血圧、糖尿病性腎症）における組織炎症を再現し（３〜１２）、そして（ｉｉ）ライフスタイル及び治療的介入（例えば肥満、高血圧）によって調節されることが示された（３〜１２）。さらに、自然免疫系の活性化（例えば顆粒球）が肥満と関連していることが示された（１３、１４）。
【０００６】
このような患者を同定し、そして効果的な治療的介入を提供することを助けるために、患者における軽度の炎症の存在を検出するための単純化された方法を提供することが望ましい。
【０００７】
要約
本発明は、患者から採取した全血試料を分析することによって、患者における軽度の炎症の存在を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、患者は、肥満患者及び／又はＩＩ型糖尿病を患う患者である。いくつかの態様において、患者はインスリン抵抗性患者である。
【０００８】
本発明の１つの局面は、患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法を提供する。健康対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者における軽度の炎症の存在を示す。
【０００９】
本発明の別の局面は、患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法を提供し、インスリン非抵抗性対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者が、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得ることを示す。
【００１０】
本発明の別の局面は、患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供し、インスリン非抵抗性対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、インスリン抵抗性改善薬処置が効果的ではないことを示す。
【００１１】
上の局面の１つの態様において、遺伝子のセットは、全血と脂肪組織における発現との間の相関を示す１つ以上の遺伝子を含む。１つの態様において、遺伝子は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４からなる群より選択される。１つの態様において、遺伝子のセットは、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４の２個、３個、４個又は５個全てを含む。
【００１２】
上の局面の１つの態様において、遺伝子のセットは、インスリン抵抗性との関連を示す１つ以上の遺伝子を含む。１つの態様において、遺伝子は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳからなる群より選択される。１つの態様において、遺伝子のセットは、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳの２個、３個又は４個全てを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性は、正常血糖高インスリンクランプ法によって、又はインスリン抵抗性指数としての恒常性モデル評価（homeostasis model assessment as an index of insulin resistance）（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によって決定される。
【００１３】
上の局面の１つの態様において、遺伝子のセットは、上昇したＢＭＩと関連した１つ以上の遺伝子を含む。１つの態様において、遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳからなる群より選択される。１つの態様において、遺伝子のセットは、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個全てを含む。
【００１４】
上の局面の１つの態様において、遺伝子のセットは、表１からの１つ以上の遺伝子を含み、前記遺伝子は、炎症及びＮＦκＢ経路に関連している。
【００１５】
上の局面の１つの態様において、患者は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性状態、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのメタボリック状態を患っている。
【００１６】
１つの態様において、上の局面における発現プロファイルは、ｍＲＮＡ発現レベルを測定することによって決定される。１つの態様において、ｍＲＮＡ発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される。
【００１７】
１つの態様において、試験試料における遺伝子のセットの発現レベルの変化は、対照試料と比較して少なくとも約１．５倍の差がある。
【００１８】
１つの態様において、遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【００１９】
本発明の別の局面は、ａ）患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定する工程、ｂ）遺伝子のセットの発現プロファイルを、インスリン抵抗性改善剤を用いての処置の前に患者から採取した全血のリファレンス試料からの遺伝子のセットの発現プロファイルと比較する工程、及びｃ）試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルとより類似している場合に治療が効果的であると決定する工程を含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供する。１つの態様において、遺伝子のセットは、上の群から選択された１つ以上の遺伝子を含む。１つの態様において、遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】肥満患者と痩せている患者との間の差次的遺伝子発現パターンのグラフ表示。
【図２】肥満患者及び痩せている患者からの全血の遺伝子発現パターンのスピアマン相関を示したプロット。
【図３Ａ】肥満被験者及び痩せている被験者における特定の遺伝子の差次的調節（ΔＣＴ）を示したグラフ。
【図３Ｂ】肥満被験者及び痩せている被験者における特定の遺伝子の差次的調節（ΔＣＴ）を示したグラフ。
【図３Ｃ】肥満被験者及び痩せている被験者における特定の遺伝子の差次的調節（ΔＣＴ）を示したグラフ。
【図３Ｄ】肥満被験者及び痩せている被験者における特定の遺伝子の差次的調節（ΔＣＴ）を示したグラフ。
【図４Ａ】肥満被験者及び痩せている被験者における血球特異的遺伝子の遺伝子発現レベルを示したグラフ。
【図４Ｂ】肥満被験者及び痩せている被験者における血球特異的遺伝子の遺伝子発現レベルを示したグラフ。
【図４Ｃ】肥満被験者及び痩せている被験者における血球特異的遺伝子の遺伝子発現レベルを示したグラフ。
【図５】ＰＢＭＣ及び全血の試料において決定された遺伝子発現を比較したグラフ。
【図６】脂肪と全血との間の相関を示す遺伝子のパネルを含む表。
【図７Ａ】ＨＯＭＡＳ−ＩＲによって決定された、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性に関連した遺伝子のグラフ。
【図７Ｂ】ＨＯＭＡＳ−ＩＲによって決定された、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性に関連した遺伝子のグラフ。
【図７Ｃ】ＨＯＭＡＳ−ＩＲによって決定された、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性に関連した遺伝子のグラフ。
【図８Ａ】正常血糖高インスリンクランプ法によって測定された、正常な耐糖能（ＮＧＴ）、耐糖能異常／空腹時血糖異常（ＩＧＴ／ＩＦＧ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性に関連した遺伝子のグラフ。
【図８Ｂ】正常血糖高インスリンクランプ法によって測定された、正常な耐糖能（ＮＧＴ）、耐糖能異常／空腹時血糖異常（ＩＧＴ／ＩＦＧ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性に関連した遺伝子のグラフ。
【００２１】
本発明の態様の詳細な説明
本発明は、組織の軽度の炎症の代替的評価として、患者における全血の遺伝子発現をプロファイリングする方法を提供する。この方法から得られたデータを、患者の層別化及び／又は薬力学的評価のための、インスリン抵抗性／関連する併存症の補完的な読み出し情報として使用することができる。前記方法は、必要とする患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療又はインスリン抵抗性改善効果を奏功する抗糖尿病治療の効力をモニタリングする際に用途を見出す。インスリン抵抗性改善薬の例としては、例えば、メトホルミン及びチアゾリジンジオン、例えばグリタゾン（トログリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾン）が挙げられる。
【００２２】
前記方法は、また、動物モデル（例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類）にも適用することができ、そして、前臨床試験と臨床試験とを架橋する橋渡しのツールを提供する。本明細書において使用する「患者」は任意の哺乳動物を指し、そしてこれは、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコ及びげっ歯類を含むがそれらに限定されない。１つの態様において、患者はヒトである。１つの態様において、患者は非ヒト霊長類である。
【００２３】
いくつかの態様において、患者は、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又は他のメタボリックに基づいた状態、例えばＮＡＳＨもしくはＮＡＦＬＤを患っているか、あるいは、これらの状態を患っていることが疑われるか、あるいは、これらの状態を患う素因がある。
【００２４】
本明細書において、軽度の炎症の存在を検出するための、インスリン及びインスリン抵抗性改善薬に対する患者の感受性又は抵抗性を評価するための、及びメタボリックな状態に対する処置又は治療の効力をモニタリングするための、遺伝子又は遺伝子のセット（本明細書においてはバイオマーカーともいう）が提供される。また、遺伝子又は遺伝子セットを使用して、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性状態、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのメタボリックな状態の存在又は罹患を検出又は分析することができる。
【００２５】
遺伝子発現プロファイルは、また、本明細書において記載された方法においても使用され得る。発現プロファイル又は遺伝子発現プロファイルは、遺伝子のセットからの各遺伝子について決定された発現レベルから作成されたプロファイルを指す。遺伝子発現プロファイルは、遺伝子のセットに関する変化をモニタリング及び比較するのに有用である。遺伝子発現プロファイルは、例えば、軽度の炎症の存在を検出するために、インスリン及びインスリン抵抗性改善薬に対する患者の感受性又は抵抗性を評価するために、メタボリックな状態の存在又は罹患を決定するために、あるいはメタボリックな状態に対する処置又は治療の効力をモニタリングするために使用され得る。
【００２６】
１つの態様において、遺伝子発現プロファイルを使用して、治療を受けている患者におけるセット遺伝子の発現プロファイルを決定し、そして前記発現プロファイルを、治療前に患者から採取したリファレンス試料からの同じ遺伝子のセットの発現プロファイルと比較することによって、メタボリックな状態を処置するための治療の効力をモニタリングすることができる。その後、発現プロファイルの変化を、メタボリックな状態を患っていない個体又は個体（群）からの同じ遺伝子のセットを使用して作成された対照発現プロファイルと比較することができる。効果的な処置は、治療前に患者から採取した試料の発現プロファイルよりも、対照試料の発現プロファイルにより類似した治療後の遺伝子発現プロファイルによって示される。無効な処置は、治療前の患者の遺伝子発現プロファイルと同じであるか、又は治療前に患者から採取した試料の発現プロファイルよりも、対照試料の発現プロファイルにより類似していない遺伝子発現プロファイルによって示される。
【００２７】
本明細書において使用する対照試料は、比較目的のために使用される任意の試料、標準又はレベルを指す。１つの態様において、対照試料は、患者ではない健康な個体から得られる。特定の態様において、対照試料は、患者ではない１人以上の健康な個体からの単一の試料又は複合された複数の試料である。特定の態様において、対照試料は、代謝障害を患う１人以上の個体からの単一の試料又は複合された複数の試料である。１つの態様において、対照試料は、１人以上の健康個体から採取された全血試料である。いくつかの態様において、健康な個体又は個体（群）は、患者に存在する、又は患者に存在することが疑われる代謝障害を患っていない。１つの態様において、健康な個体又は個体（群）は、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又は他のメタボリックに基づく状態、例えばＮＡＳＨもしくはＮＡＦＬＤを患っていない。例えば、インスリン非抵抗性対照試料は、インスリン非抵抗性患者の遺伝子発現プロファイルを有する試料であり、そしてこれは、例えば、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又は他のメタボリックに基づいた状態、例えばＮＡＳＨもしくはＮＡＦＬＤを患っていない患者から採取した全血から、前記方法において使用された遺伝子のセットの遺伝子発現レベルを決定することによって作製され得る。
【００２８】
本発明の実施に有用な遺伝子は、表１の遺伝子を含む。１つの態様において、本明細書に記載した方法に使用される遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【００２９】
本発明の１つの局面は、患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法を提供する。１つの態様において、健康な個体から採取した全血の対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者における軽度の炎症の存在を示す。１つの態様において、遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【００３０】
１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４などの、全血と脂肪組織における発現との間に相関を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４の１個、２個、３個、４個又は５個全ての発現プロファイルを決定することを含む。
【００３１】
１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳなどの、インスリン抵抗性との関連を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳの１個、２個、３個又は４個全ての発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性は、正常血糖高インスリンクランプ法によって、又はインスリン抵抗性指数としての恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によって決定される。
【００３２】
１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳなどの、上昇したＢＭＩとの関連を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個全ての発現プロファイルを決定することを含む。
【００３３】
１つの態様において、患者における軽度の炎症の存在を検出するための方法は、炎症及びＮＦκＢ経路に関連した表１の１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。
【００３４】
上の方法において、対照試料と比較した場合の患者の試料における遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者における軽度の炎症の存在を示す。
【００３５】
患者は、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又は他のメタボリックに基づいた状態、例えばＮＡＳＨもしくはＮＡＦＬＤを患っているか、あるいは、これらの状態を患っていることが疑われるか、あるいはこれらの状態を患う素因がある。
【００３６】
本発明の別の局面は、患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法を提供し、対照試料と比較した場合の遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者がインスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得ることを示す。１つの態様において、対照試料は、インスリン抵抗性ではない患者から採取した全血試料である。１つの態様において、遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【００３７】
１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４などの、全血と脂肪組織における発現との間に相関を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現レベルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４の１個、２個、３個、４個又は５個全ての発現レベルを決定することを含む。
【００３８】
１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳなどの、インスリン抵抗性との関連を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳの１個、２個、３個又は４個全ての発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性は、正常血糖高インスリンクランプ法によって、又はインスリン抵抗性指数としての恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によって決定される。
【００３９】
１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳなどの、上昇したＢＭＩとの関連を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個全ての発現プロファイルを決定することを含む。
【００４０】
１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、炎症及びＮＦκＢ経路に関連した表１の１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現レベルを決定することを含む。
【００４１】
上の方法において、対照試料と比較した場合の患者の試料における遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、患者がインスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得ることを示す。
【００４２】
１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩典を受け得るとして同定された患者に、この分析の後にインスリン抵抗性改善薬を投与する。１つの態様において、本明細書の方法を、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置のための患者を選択するために一般的に使用される他の臨床パラメーターと組み合わせる。これらの臨床パラメーターとしては、例えば、ＨｂＡ１ｃ及び血漿中グルコースが挙げられる（参照として、Position Statement: Standards of Medical Care in Diabetes-2010, American Diabetes Associationを参照）。
【００４３】
本発明のさらに別の局面は、患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された１つ以上の遺伝子の発現プロファイルを決定することを含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供し、対照試料と比較した場合の１つ以上の遺伝子の発現プロファイルの変化は、インスリン抵抗性改善薬処置が効果的ではないことを示す。１つの態様において、対照試料は、インスリン抵抗性ではない患者から採取した全血試料である。１つの態様において、遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【００４４】
１つの態様において、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４などの、全血と脂肪組織における発現との間に相関を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定する方法は、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４の１個、２個、３個、４個又は５個全ての発現プロファイルを決定することを含む。
【００４５】
１つの態様において、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳなどの、インスリン抵抗性との関連を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法は、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳの１個、２個、３個又は４個全ての発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、インスリン抵抗性は、正常血糖高インスリンクランプ法によって決定される。１つの態様において、インスリン抵抗性は、インスリン抵抗性指数としての恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）によって決定される。
【００４６】
１つの態様において、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳなどの、上昇したＢＭＩとの関連を示す１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現プロファイルを決定することを含む。１つの態様において、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法は、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個全ての発現プロファイルを決定することを含む。
【００４７】
１つの態様において、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法は、炎症及びＮＦκＢ経路に関連した表１の１つ以上の遺伝子を含む遺伝子のセットの発現レベルを決定することを含む。
【００４８】
上の方法において、対照試料と比較した場合の患者の試料における遺伝子のセットの発現プロファイルの変化は、インスリン抵抗性改善薬治療の効力を示す。
【００４９】
１つの態様において、インスリン抵抗性改善薬治療は、この分析に基づいて改変されるか又は中止される。
【００５０】
本発明の別の局面は、ａ）患者から採取した全血の試験試料における、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定する工程、ｂ）遺伝子のセットの発現プロファイルを、インスリン抵抗性改善剤を用いての処置の前に患者から採取した全血のリファレンス試料からの遺伝子のセットの発現プロファイルと比較する工程、及びｃ）試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルとより類似している場合に治療が効果的であると決定する工程を含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供する。逆に、治療は、試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料の発現プロファイルと同じであるか、又は、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルにより類似していない場合に無効であると決定される。治療が無効である場合、処置を改変し得、例えば、同じインスリン抵抗性改善薬の異なる投与量又は投与計画を投与し得、そして同じように効力についてモニタリングし得るか、あるいは異なるインスリン抵抗性改善薬を治療に使用し得る。１つの態様において、遺伝子のセットは、表１の遺伝子の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個又は４２個全てを含む。
【００５１】
本発明の別の局面は、ａ）患者から採取した全血の試験試料における、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４からなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定する工程、ｂ）遺伝子のセットの発現プロファイルを、インスリン抵抗性改善剤を用いての処置の前に患者から採取した全血のリファレンス試料からの遺伝子のセットの発現プロファイルと比較する工程、及びｃ）試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルとより類似している場合に治療が効果的であると決定する工程を含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供する。逆に、治療は、試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料の発現プロファイルと同じであるか、又は、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルにより類似していない場合に無効であると決定される。治療が無効である場合、処置を改変し得、例えば、同じインスリン抵抗性改善薬の異なる投与量又は投与計画を投与し得、そして同じように効力についてモニタリングし得るか、あるいは異なるインスリン抵抗性改善薬を治療に使用し得る。１つの態様において、遺伝子のセットは、レジスチン、レプチン、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７９Ａ及びＣＴＬＡ４の中から選択された遺伝子の１個、２個、３個、４個又は５個全てを含む。
【００５２】
本発明の別の局面は、ａ）患者から採取した全血の試験試料における、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳからなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定する工程、ｂ）遺伝子のセットの発現プロファイルを、インスリン抵抗性改善剤を用いての処置の前に患者から採取した全血のリファレンス試料からの遺伝子のセットの発現プロファイルと比較する工程、及びｃ）試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルとより類似している場合に治療が効果的であると決定する工程を含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供する。逆に、治療は、試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料の発現プロファイルと同じであるか、又は、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルにより類似していない場合に無効であると決定される。治療が無効である場合、処置を改変し得、例えば、同じインスリン抵抗性改善薬の異なる投与量又は投与計画を投与し得、そして同じように効力についてモニタリングし得るか、あるいは異なるインスリン抵抗性改善薬を治療に使用し得る。１つの態様において、遺伝子のセットは、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ３６、ＴＮＦＲＳＦ１０及びＩＣＯＳから選択された遺伝子の１個、２個、３個又は４個全てを含む。
【００５３】
本発明の別の局面は、ａ）患者から採取した全血の試験試料における、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳからなる群より選択された遺伝子のセットの発現プロファイルを決定する工程、ｂ）遺伝子のセットの発現プロファイルを、インスリン抵抗性改善剤を用いての処置の前に患者から採取した全血のリファレンス試料からの遺伝子のセットの発現プロファイルと比較する工程、及びｃ）試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルとより類似している場合に治療が効果的であると決定する工程を含む、患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングする方法を提供する。逆に、治療は、試験試料における遺伝子の発現プロファイルが、リファレンス試料の発現プロファイルと同じであるか、又は、リファレンス試料における遺伝子の発現プロファイルよりも、インスリン非抵抗性対照試料の発現プロファイルにより類似していない場合に無効であると決定される。治療が無効である場合、処置を改変し得、例えば、同じインスリン抵抗性改善薬の異なる投与量又は投与計画を投与し得、そして同じように効力についてモニタリングし得るか、あるいは異なるインスリン抵抗性改善薬を治療に使用し得る。１つの態様において、遺伝子のセットは、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＭＩＦ、ＣＭＫＬＲ１、ＮＦκＢ、ＣＤ３６及びＩＣＯＳの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個全てを含む。
【００５４】
本発明の別の局面は、患者における軽度の炎症の存在を決定するための、インスリン抵抗性改善薬を用いての処置の恩恵を受け得る患者を同定するための、又は患者に与えられたインスリン抵抗性改善薬治療の効力をモニタリングするための、表１の遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は遺伝子のセットの使用を提供する。１つの態様において、遺伝子の発現レベル又は遺伝子のセットの発現プロファイルが決定される。
【００５５】
公知の配列のためのデータベースへのエントリー又はチップ製造業者によって提供された配列情報を使用して、配列を、当業者に周知の技術を使用して検出（発現されている場合）及び測定することができる。遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質フラグメント及び／又は遺伝子コピー数を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の適切な基準に基づいて決定され得る。
【００５６】
試料における種々の遺伝子又はバイオマーカーの発現は、多くの方法によって分析され得、その多くは当技術分野において公知であり、そして当業者によって理解され、これは、免疫組織化学的分析及び／又はウェスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）など、定量的な血液に基づいたアッセイ（例えば血清ＥＬＩＳＡ）（例えば、タンパク質発現のレベルを調べるために）、生化学的な酵素活性アッセイ、in situハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡのノザン分析及び／又はＰＣＲ分析、並びに、遺伝子及び／又は組織アレイ分析によって実施することのできる多種多様なアッセイのいずれか１つを含むがそれらに限定されない。遺伝子の状態及び遺伝子産物を評価するための典型的なプロトコールは、例えば、Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology、ユニット２（ノザンブロット）、４（サザンブロット）、１５（イムノブロット）及び１８（ＰＣＲ分析）に見られる。Rules Based Medicine又はMeso Scale Discovery (MSD)から入手できるものなどのマルチプレックスイムノアッセイも使用し得る。
【００５７】
特定の態様において、試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量が、リファレンス試料又は対照試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量よりも大きい場合、試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現／量は、リファレンス試料又は対照試料中の発現／量と比較して増加している。同様に、試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量が、リファレンス試料又は対照試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量よりも少ない場合、試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現／量は、リファレンス試料又は対照試料中の発現／量と比較して減少している。１つの態様において、発現レベルはｍＲＮＡ発現レベルである。１つの態様において、ｍＲＮＡ発現レベルの変化は増加である。別の態様において、ｍＲＮＡ発現レベルの変化は減少である。特定の態様において、試料は、アッセイしたＲＮＡ又はタンパク質の量における両方の差異、及び使用したＲＮＡ又はタンパク質試料の品質におけるばらつき、及びアッセイ実行間のばらつきのために正規化される。このような正規化は、特定の正規化遺伝子（周知のハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ又はβアクチンを含む）の発現を測定しそして取り込むことによって達成され得る。あるいは、正規化は、アッセイした全ての遺伝子又はその大きなサブセットのシグナルの平均値又は中央値に基づき得る（グローバルな正規化アプローチ）。遺伝子１つ１つに基づいて、測定された正規化された量の患者の腫瘍ｍＲＮＡ又はタンパク質を、リファレンス又は対照セットで見られる量と比較する。患者１人あたり、試験した腫瘍１個あたりの各ｍＲＮＡ又はタンパク質についての正規化された発現レベルを、リファレンス又は対照セットにおいて測定された発現レベルの比率として表現することができる。分析しようとする特定の患者試料において測定された発現レベルは、この範囲内の何パーセンタイルかに該当し、これは当技術分野において周知の方法によって決定することができる。
【００５８】
特定の態様において、試験試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベルは、その発現レベルが、リファレンス試料又は対照試料中の対応する遺伝子又はバイオマーカーの発現レベルに対して約１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍又はそれ以上変化（増加又は減少のいずれか）している場合に変化したと判断することができる。特定の態様において、試験試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベルは、その発現レベルが、リファレンス試料又は対照試料中の対応する遺伝子又はバイオマーカーの発現レベルに対して約５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、５００％又はそれ以上変化（増加又は減少のいずれか）している場合に変化したと判断することができる。１つの態様において、発現レベルはｍＲＮＡ発現レベルである。１つの態様において、発現レベルは、タンパク質発現レベルに基づいて決定される。
【００５９】
本発明の方法はさらに、組織又は細胞試料中の１つ以上のターゲット遺伝子のｍＲＮＡの存在及び／又は発現レベルを試験するプロトコールを含む。
【００６０】
細胞中のｍＲＮＡの評価のための方法は周知であり、そして例えば、１つ以上の遺伝子（表１の遺伝子を含むがそれらに限定されない）に特異的な相補的ＤＮＡプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイ（例えば標識されたリボプローブを使用したin situハイブリダイゼーション）、ノザンブロット及び関連技術、並びに種々の核酸増幅アッセイ（１つ以上の遺伝子に特異的な相補的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ、及び他の増幅型検出法、例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）を含む。
【００６１】
１つの態様において、試料は全血試料である。別の態様において、試料は末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）である。
【００６２】
患者からの試料は、ノザンブロット、ドットブロット又はＰＣＲ分析を使用してｍＲＮＡについて簡便にアッセイされ得る。例えば、定量ＰＣＲアッセイなどのＲＴ−ＰＣＲアッセイは当技術分野において周知である。本発明の例示的な態様において、生物学的試料中のターゲットｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して逆転写によって試料からｃＤＮＡを産生し；このようにして産生されたｃＤＮＡを、センス及びアンチセンスプライマーとしてのターゲットポリヌクレオチドを使用して増幅して、その中のターゲットｃＤＮＡを増幅し；そして、増幅されたターゲットｃＤＮＡの存在を検出することを含む。さらに、このような方法は、生物学的試料中のターゲットｍＲＮＡのレベルを決定することを可能とする（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって）１つ以上の工程を含み得る。場合により、増幅されたターゲットｃＤＮＡの配列を決定してもよい。
【００６３】
本発明の任意の方法は、マイクロアレイ技術によって、試料中のターゲットｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを試験するか又は検出するプロトコールを含む。核酸マイクロアレイを使用して、試験及び対照の組織試料からの試験及び対照のｍＲＮＡ試料を逆転写し、そして、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識する。その後、プローブを、固相支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイゼーションさせる。アレイの配列及び各メンバーの位置が分かるようにアレイを設計する。例えば、その発現が炎症の検出と相関する選択した遺伝子を、固相支持体上に整列させ得る。特定のアレイメンバーと標識されたプローブのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現の分析は価値ある情報を提供することができる。マイクロアレイ技術は核酸ハイブリダイゼーション技術及びコンピューター技術を使用して、１回の実験で何千個もの遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを評価する（例えば、２００１年１０月１１日公開のWO01/75166を参照；（例えば、U.S. 5,700,637, U.S. Patent 5,445,934及びU.S. Patent 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)）、アレイ製作の考察についてはCheung, V.G. et al, Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)を参照）。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基材上で直接に合成されたか又はスポットされたかのいずれかである遺伝子フラグメントを含むミニチュアアレイである。何千個もの遺伝子が、通常、１つのアレイに提示される。典型的なマイクロアレイ実験は、以下の工程を含む：１）試料から単離されたＲＮＡから、蛍光標識されたターゲットの調製、２）標識されたターゲットをマイクロアレイにハイブリダイゼーション、３）アレイの洗浄、染色及び走査、４）走査された画像の分析、及び５）遺伝子発現プロファイルの作成。現在、２つの主要なタイプのＤＮＡマイクロアレイが使用されている：オリゴヌクレオチド（通常２５から７０ｍｅｒ）アレイ及びｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含む遺伝子発現アレイ。アレイの形成の際に、オリゴヌクレオチドは、予め作製され表面にスポットされるか、又は表面上で（in situで）直接合成されるかのいずれかであり得る。
【００６４】
Affymetrix GeneChip（登録商標）システムは、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することによって作製されたアレイを含む、市販のマイクロアレイシステムである。
【００６５】
プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド（通常２５ｍｅｒ）は、半導体に基づいたフォトリソグラフィと固相化学合成技術の組合せによって、ガラスウェーハ上に直接合成される。各アレイは４００，０００個までの異なるオリゴを含み、そして各オリゴは何百万個ものコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブはアレイ上の既知の場所で合成されるので、ハイブリダイゼーションのパターン及びシグナル強度は、Affymetrix Microarray Suiteソフトウェアによって遺伝子同一性と相対的な発現レベルに置き換えられて解釈され得る。各遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによってアレイ上に提示される。各プローブ対は、完全一致のオリゴヌクレオチド及び不一致のオリゴヌクレオチドからなる。完全一致プローブは、特定の遺伝子に対して正確に相補的な配列を有するため、よって、遺伝子の発現を測定する。
【００６６】
不一致プローブは、中心塩基位置における１つの塩基の置換により完全一致プローブとは異なり、これはターゲット遺伝子転写物の結合を妨げる。これは、完全一致オリゴについて測定されたシグナルに寄与するバックグラウンド及び非特異的ハイブリダイゼーションを決定するのを助ける。Microarray Suiteソフトウェアは、完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度から不完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度を差し引いて、各プローブセットについての絶対値又は比強度値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋ及び他のヌクレオチド貯蔵所からの現在の情報に基づいて選択される。配列は、遺伝子の３’末端の特定の領域を認識すると考えられている。GeneChipハイブリダイゼーションオーブン（「回転式（rotisserie）」オーブン）を使用して、一度に６４個までのアレイのハイブリダイゼーションを実施する。
【００６７】
fluidics stationは、プローブアレイの洗浄及び染色を行なう。それは完全に自動化され、そして４つのモジュールを含み、各モジュールは１つのプローブアレイを保持している。各モジュールは、予めプログラム化されたfluidicsプロトコールを使用してMicroarray Suiteソフトウェアを通して個別に制御されている。スキャナーは、プローブアレイに結合した標識ｃＲＮＡによって放出される蛍光強度を測定する、共焦点レーザー蛍光スキャナーである。Microarray Suiteソフトウェアを含むコンピューターワークステーションは、fluidics station及びスキャナーを制御する。Microarray Suiteソフトウェアは、プローブアレイのための予めプログラム化されたハイブリダイゼーション、洗浄及び染色プロトコールを使用して８つまでのfluidics stationを制御することができる。また、ソフトウェアは、ハイブリダイゼーション強度データを獲得して、そして、適切なアルゴリズムを使用して各遺伝子についての存在／非存在情報に変換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析によって、遺伝子発現における実験間の変化を検出して、そしてテキストファイルに出力する。このファイルはさらなるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムに使用することができる。
【００６８】
また、組織又は細胞試料における選択された遺伝子又はバイオマーカーの発現は、機能的又は活性に基づくアッセイによって試験され得る。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、当技術分野において公知のアッセイを実施して、組織又は細胞試料における特定の酵素活性の存在を決定又は検出することができる。
【００６９】
また、表１の遺伝子の発現レベルを特異的に検出することのできる化合物を含むキットも提供され、前記キットはさらに、患者における軽度の炎症を存在を決定するために、又はインスリン抵抗性改善薬治療に対する患者の応答性を予測もしくはモニタリングするためにキットを使用するための説明書を含む。
【００７０】
１つの態様は、容器、容器上のラベル、及び容器内に含まれる組成物（前記組成物は、表Ｉの遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、容器上のラベルは前記組成物を使用して試料中の表Ｉの遺伝子の存在を評価することができることを示す）、及び試料中の表Ｉの遺伝子の存在を評価するためにポリヌクレオチドを使用するための説明書を含む、キットを提供する。１つの態様において、試料は全血試料であるか、又は全血試料に由来する。
【００７１】
キット中の他の任意の成分は、１つ以上の緩衝液（例えば遮断緩衝液、洗浄緩衝液、基質緩衝液など）、他の試薬、例えば酵素標識によって化学的に改変される基質（例えば色素原）、エピトープ回収溶液、対照試料（陽性及び／又は陰性対照）、対照スライド（群）などを含む。
【００７２】
実施例
実施例１−本発明の実施に有用な遺伝子のリスト
表１は、軽度の炎症の存在の検出に使用するための、インスリン及びインスリン抵抗性改善薬に対する患者の感受性又は抵抗性を評価するための、及びメタボリックな状態に対する処置又は治療の効力をモニタリングするためなどを含む、本発明の実施のために有用な遺伝子のリストを提供する。また、表１には、列挙した遺伝子に関連した遺伝子ＩＤ、並びに、本明細書において提供される配列表中の例示的遺伝子配列に言及した配列番号が含まれる。
【００７３】
【表１】
2014506117.tif 000003
【００７４】
実施例２−全血及びＰＢＭＣの分析
痩せた被験者及び肥満被験者及びインスリン抵抗性（ＩＲ）被験者の横断的試料収集物における、炎症経路の重要な中心点に関連した遺伝子のパネル、及び全血調製物に存在する各々の血球の種類に特異的な遺伝子のパネルを測定した。表１。全ての試料の個数は、２０人の肥満被験者及び２０人の正常体重の被験者を含む４０個であった。血球特異的遺伝子が、肥満被験者及び痩せ被験者からの試料における種々の個体群の強化及び／又は活性化状態の間接的な評価を実施する手段として測定された。
【００７５】
定量リアルタイムＰＣＲ
ＰＢＭＣ及び全血の両方からの試料を、定量リアルタイムＰＣＲを使用して分析した。ＲＮＡ抽出は、製造業者のプロトコール（Qiagen）に従ってBioRobot MDxでPAXgene血液から実施され、一方、ＰＢＭＣ試料からのＲＮＡ抽出は、QIAamp RNA Blood kit (Qiagen, Germany)を使用してQiagen QIAcubeを使用して実施された。ＲＮＡを、Quant-IT RiboGreen kit (Molecular Probes, Invitrogen)を用いて５０倍の希釈率でEscherichia coliリボソームＲＮＡ（Roche Diagnostics）の標準曲線に対して定量した。さらに、試料を、また、製造業者の推奨するプロトコール（Agilent）に従ってAgilent BioanlyzerでＲＮＡインテグリティナンバー（RNA integrity number）（ＲＩＮ）について分析した。
【００７６】
ｃＤＮＡ合成は、製造業者のプロトコールに従って、しかしＲＮａｓｅＨによる消化は省いて、４００ngの全ＲＮＡに対して定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ；Invitrogen）のためのSuperScript II First- Strand Synthesis SuperMixを用いて実施された。各逆転写反応について、Universal Human Reference total RNA (Stratagene)を同じプレート上で陽性及び陰性対照（酵素を含まない対照）として実行した。対照をｑＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。予め設計した遺伝子発現アッセイはApplied Biosystemsから得られた。ＴａｑＭａｎアッセイＩＤを表１に示す。
【００７７】
可能であれば、エキソンをまたがるアッセイを選択して、ｃＤＮＡ特異性を確実にした。全ての遺伝子発現アッセイは、ABI PRISM 7900HT配列検出システム（Applied Biosystems）で、推奨された標準設定を用いて実施された。全てのアッセイは、製造業者の推奨に従ってTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて調製された。
【００７８】
全ての実行が、標準曲線用のｃＤＮＡの希釈液、酵素を含まない対照、鋳型を含まない対照及び検量試料を含んだ。標準曲線用のｃＤＮＡはUniversal Human Reference total RNA (Stratagene)から合成され、そして検量試料は健康ドナーからの全血ＲＮＡのプールから合成された。ｃＤＮＡ試料をモレキュラーグレード水で１０倍に希釈し、そして２μLを、１８μLの予め分配されたアッセイMaster Mixに加えた。これは、４ngの全ＲＮＡからのｃＤＮＡに対応する。プレート上の全ての試料を、対象の遺伝子について１つのアッセイ及び内因性対照遺伝子アッセイ、ＧＵＳＢ及びＰＰＩＢ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ；Applied Biosystems）を用いてアッセイした。各測定を３回実施した。
【００７９】
実施例３−ｑＲＴ−ＰＣＲデータの統計分析
各ターゲットについてのＣｔ中央値を計算した。ＡＣｔ値を以下の式を用いて計算した：（ＡＣｔ＝（ターゲット遺伝子のＣｔ中央値）−（ＧＵＳＢ及びＰＰＩＰの幾何平均））。発現値（ΔＣＴ）に−１を乗じることにより、より高い数値はより大きな遺伝子発現を示す。前進選択を使用して他の臨床共変数をモデルに１つずつ参加させ、そして有意な（ｐ＜０．０５）共変数を保持した。complete-case分析を実施した。ＰＢＭＣ及び全血試料を別々に分析した。
【００８０】
データは、それ故、
ｙｉ＝β０＋β１ＢＭＩｉ＋β２年齢ｉ＋β３性別＋εｉ
（式中、・ｙｉ＝個体Ｉについての遺伝子発現；・β０＝インターセプト（intercept）；・β１＝ＢＭＩの効果；・β２＝年齢の効果；・β３＝性別の効果（０＝女性、１＝男性）；及び・εｉ〜Ｎ（０，σ２）
として具現化された。
【００８１】
実施例４−全血遺伝子発現分析は、肥満患者における軽度の炎症を検出する
図１に示したように、肥満被験者（肥満度指数（ＢＭＩ）＞３０）及び痩せた被験者（ＢＭＩ＜２５）のクラスターは、遺伝子発現パターンに基づいて互いに離れている（記述統計分析）。さらに、図２に示したように分析された遺伝子のなかには、ＢＭＩに対する正の相関を示すものがあり（例えばＩＬ６、ＴＮＦα、レジスチン、ＭＩＦ）、一方、負の相関を示すものもある（例えばＩＬ１Ｒ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＬＲ４）。詳細には、図３に示したように（痩せた患者及び肥満患者についての遺伝子のΔＣＴを示す）、分析した３３個の遺伝子の中で、痩せた被験者と比較して肥満被験者の全血中においてアップレギュレートされているものもあれば（ＩＬ６、ＴＮＦα、ＣＥＡＣＡＭ８、レジスチン）、痩せた被験者と比較して肥満被験者の全血においてダウンレギュレートされているものもある（例えばＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＴＬＲ４）。これらの遺伝子のいくつかはＮＦκＢ経路上に位置づけられ（上流ＮＦκＢ：ＴＮＦＲＳＦｓ、ＩＬ１Ｒ１、ＴＬＲ４、下流ＮＦκＢ：ＩＬ６及びＴＮＦα）、これらの結果は、痩せた被験者と比較して肥満被験者の全血におけるＮＦκＢ経路の差次的な調節を支持する。ＩＬ６及びＴＮＦαのアップレギュレーションは以前の所見と一致しており、そして炎症誘発状態において知られるような、ＮＦκＢ活性のアップレギュレーションを明らかに示すが、炎症誘発環境に直接的に直面している細胞膜レセプターをコードする遺伝子（例えばＴＮＦＲＳＦ１Ａ、Ｂ、ＴＬＲ４、ＩＬ１Ｒ１）が何故ダウンレギュレーションされているのかは明らかではない。遺伝子発現は調節フィードバック機序を反映し、これにより遺伝子が、細胞膜上でコードタンパク質のより高い発現／活性に応答してダウンレギュレーションされているのかもしれない。さらに、顆粒球及び活性化単球において発現されるいくつかの遺伝子、例えばＣＥＡＣＡＭ８及びレジスチンは肥満被験者においてアップレギュレーションされており、これは、これらの被験者における自然免疫系の活性化を支持する。興味深いことに、血球特異的遺伝子の遺伝子発現レベルに基づき、全体的な細胞量の変化の証拠は全くなく（図４）、それ故、ＮＦκＢ中心点の上流及び下流の遺伝子の変化は、炎症誘発状態に対応する経路の差次的調節に真に連関しているようである。
【００８２】
本研究は、全血における遺伝子の発現が、ＮＦΚＢなどの、脂肪組織においてもアップレギュレーションされていることが示された重要な経路の活性化を反映し、従って、組織遺伝子発現の代替物としての全血遺伝子発現の使用を支持する。
【００８３】
これらの所見は、ＰＢＭＣにおける記載した遺伝子のいくつかの遺伝子発現及び全血におけるフローサイトメトリー分析に関して、以前の報告（１、２）と一致する。さらに、本研究は、ＣＥＡＣＡＭ８などの、炎症の検出に関連した追加の遺伝子も提供する。
【００８４】
実施例に示されたように、同じターゲットに対する遺伝子発現分析もまた、比較のために適合したＰＢＭＣ試料において実施された。予期されたように、ＰＢＭＣは、全血と比較して全体的に異なる発現プロファイルを示した。図５に示したように、全血は、ＰＢＭＣと比較して、顆粒球特異的遺伝子（例えばＦＣＧＲ３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＶＮＮ２、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１６）の強化を示し（グラフの左部分、数値は０より下）、一方、ＰＢＭＣは、単球特異的遺伝子（例えばＣＳＦ１Ｒ及びＭＡＲＣＯ）の強化を示す。痩せと肥満との間の全血において差次的に調節されていることが判明した遺伝子は、適合したＰＢＭＣ試料においてはわずかな傾向しか示さない（データは示さず）。これは、全体的な炎症状態に対する顆粒球の大きな寄与によって説明され得る。
【００８５】
要約すると、これらの結果は、（ｉ）全血遺伝子発現を、臨床場面において、患者の層別化及び／又は薬力学的評価のための軽度の炎症状態を評価するためのツールとして使用することができ、（ｉｉ）また、前記方法において動物モデル（例えば非ヒト霊長類）にも適用でき、そして前臨床試験と臨床試験を架橋するための橋渡しのツールを提供し得ることを示す。
【００８６】
実施例５−脂肪組織炎症の代替物としての全血遺伝子発現
インスリン抵抗性（レジスチン）、レプチン抵抗性（レプチン）及びＴ細胞（ＣＤ７９Ａ）、制御性Ｔ細胞（ＦｏｘＰ３）及びＢ細胞により媒介される炎症（ＣＴＬＡ４）に関連した遺伝子のセットは、脂肪組織及び全血において相関している。脂肪の炎症におけるＢ細胞、Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞の関与は、以前の証拠によって支持されている（１５、１６、１７）。そうした細胞のマーカーは全血中においても同じように調節されているという所見は、全血を、組織炎症の評価のための代替マトリックスとして使用することができるという概念を支持する。図６。
【００８７】
実施例６−２型糖尿病に関連した遺伝子の発現
恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を使用して、２型糖尿病に関連した遺伝子発現を決定した。ＨＯＭＡ−ＩＲ指数を以下のように計算した（１８）：空腹時インスリン×空腹時血糖値＝２２．５。図７は、２型糖尿病個体群（ｎ＝８７、平均ＨｂＡ１ｃ：７．８％）における、パネルの３つの遺伝子（ＩＬ１Ｒ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＩＣＯＳ）の発現（ΔＣｔ）とインスリン感受性指数（ＨＯＭＡＳ又はＨＯＭＡ−Ｒ）との間の関連を示した散布図を示す。
【００８８】
実施例７−ＮＧＴ、ＩＧＴ／ＩＦＧ及びＴ２ＤにおけるＩＲに関連した遺伝子の発現
正常血糖高インスリンクランプアッセイを使用して、正常な耐糖能（ＮＧＴ）、耐糖能異常／空腹時血糖異常（ＩＧＴ／ＩＦＧ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるインスリン抵抗性に関連した遺伝子発現を決定した。
【００８９】
正常血糖高インスリンクランプ法（ＨＥＣ）を、DeFronzo 1979 (19)及びFerranini 1998 (20)によって確立された原則に基づいて実施した。簡潔に言うと、静脈内カテーテルを、インスリン及び２０％グルコース溶液（インスリン、ヒューマリンＲ、１００m.j./ml、Lilly；グルコース２０％静脈内点滴B.P.Bieffe、組成：グルコース一水和物（Glucosum monohydricum）２２０ｇ＝２００ｇグルコース（Glucosum）／１０００ml）の点滴のために一方の腕の前腕前部の静脈に挿入した。第２のカニューレを手背部静脈に挿入し、動脈血化血液の５分間間隔のサンプリングのために約７０℃で加温した。グルコース点滴速度は血糖濃度の変化に従って調節された。インスリン点滴の持続速度は、ＢＭＩ＜３０kg/m２の患者では１mIU/kg/分であり、そしてＢＭＩ≧３０kg/m２の患者では４０mIU/m２/分であった。最初の１０分間の間は、点滴速度を、より速くインスリン添加するために二倍とした。インスリン点滴は１８０分間維持し、定常状態の期間は１２０分から１８０分間続いた。２つのインスリン感受性指数Ｍ及びＩＳＩは以下に記載のように導かれた：
【００９０】
Ｍの計算
（De Fronzo 1979 (19)による）
グルコース点滴速度ＩＮＦ（時にＧＩＲとも呼ばれる）は、以下のように計算された：
【数１】
2014506117.tif 000004
【００９１】
スペース修正（Space Correction）ＳＣは、定常状態の期間の終了時の血漿中血糖濃度Ｇ２から定常状態の期間の開始時の血漿中血糖濃度Ｇ１を差し引いた差に、単位の修正のために１８を乗じ（mmol/Lからmg/dL）、再度、体内中でグルコースが占める空間の割合を乗じ、これを定常状態の持続期間で割って計算された（より多くの説明についてはDe Fronzo 1979を参照）。
【数２】
2014506117.tif 000005
【００９２】
グルコース代謝率Ｍ値の計算：
Ｍ＝ＩＮＦ−ＳＣ＝mg/（kg・分）
【００９３】
インスリン感受性指数の計算
（Coates 1995 (21)による）
ＩＳＩ＝Ｍ／（Ｇ×ΔＩ）、Ｍは定常状態で代謝されたグルコースであり、Ｇは定常状態の血糖濃度であり、そしてΔＩは空腹時血漿中インスリン濃度と定常状態の血漿中インスリン濃度との間の差である。定常状態の血糖濃度については、１２０分後及び１８０分後における血糖値（mmol/L）の平均をとり、そして１８を乗じて、mg/dLに変換した。ΔＩについては、基礎インスリン濃度（−５分、０分及びクランプ前の数値の平均）を、定常状態の血漿中インスリン濃度（１２０分後及び１８０分後の数値の平均）から差し引いた（全てmIU/L）。結果に１０４を乗じ、１０−２・ｌ２／（ＩＵ・分・kg）の単位で得た。
【００９４】
図８は、パネルのいくつかの遺伝子の発現（ΔＣｔ）と、正常血糖高インスリンクランプ法を用いて得られた２つのインスリン感受性指数（ＩＳＩ及びＭ）との間の関連を示した得られた散布図である。分析した１０個の遺伝子の中で、ＣＤ３６のみが、ＩＳＩ及びＭの両方に対して一貫かつ有意な関連を示し、一方、ＴＮＦαのみが、ＩＳＩとの関連についての傾向を示す。分析した個体群は、以下の特徴を有する正常血糖（ＮＧＴ）、前糖尿病（耐糖能異常、ＩＧＴ）及び糖尿病（Ｔ２Ｄ）の個体を含んだ：
【００９５】
【表２】
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【００９６】
前記の本発明を、理解を明瞭にするために説明及び実施例を用いて幾分詳細に記載したが、本文及び実施例は本発明の範囲を制限するものと捉えるべきではない。本明細書に引用した全ての特許及び科学文献の開示のその全体が参照により明確に組み入れられる。
【００９７】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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