(57)【要約】  ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）はパントテン酸を合成できず、増殖培地中にこの必須ビタミンを必要とする。２−デヒドロパントイン酸還元酵素とアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ発現のためのオペロンで形質転換されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、パントテン酸を欠く培地中で増殖できた。これらの株は、種培養および発酵培地へのパントテン酸補給なしで、エタノール製造のために使用されてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株。
【請求項２】
前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１．１．１．１６９クラスに属する酵素である、請求項１に記載の組換え細菌株。
【請求項３】
前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号４の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素と比較して、位置７のＧ、位置９のＧ、位置１２のＧ、位置７２のＫ、位置９８のＮ、位置９９のＧ、位置１７６のＫ、位置１８０のＮ、位置１８４のＮ、位置２１０のＥ、位置２４４のＳ、位置２４８のＤまたはＳ、および位置２５６のＥからなる群から選択される、少なくとも１０個の保存アミノ酸位置を有する、請求項２に記載の組換え細菌株。
【請求項４】
前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１．４．１．１１クラスに属する酵素である、請求項１に記載の組換え細菌株。
【請求項５】
前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置１１のＨ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置２５のＳ、位置５２のＧ、位置５４のＲ、位置５７のＴ、位置５８のＹ、位置７２のＮ、位置７３のＧ、および位置８６のＩ、からなる群から選択される、少なくとも８個の保存アミノ酸位置を有する、請求項４に記載の組換え細菌株。
【請求項６】
前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置５７のＴ、および位置５８のＹの５個の保存アミノ酸位置を有する、請求項４に記載の組換え細菌株。
【請求項７】
パントテン酸を欠く培地中で増殖する、請求項１に記載の組換え細菌株。
【請求項８】
エタノールを産生する、請求項１に記載の組換え細菌株。
【請求項９】
エタノール生産量を高める遺伝子修飾を含んでなる、請求項８に記載の組換え細菌株。
【請求項１０】
ａ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌株を提供するステップと；
ｂ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと；
ｃ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと
を含んでなり、ステップｂ）およびｃ）が、いずれの順序でも、または同時であってもよく、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性の双方が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）によって作成される株中で発現される、パントテン酸を合成するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作成する方法。
【請求項１１】
ａ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株を提供するステップと；
ｂ）それによって株がエタノールを産生する条件下で、（ａ）の株を発酵培地に接触させるステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
【請求項１２】
前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１１．１．１．１６９クラスに属する酵素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドが、配列番号４の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）４−デヒドロパントイン酸還元酵素と比較して、位置７のＧ、位置９のＧ、位置１２のＧ、位置７２のＫ、位置９８のＮ、位置９９のＧ、位置１７６のＫ、位置１８０のＮ、位置１８４のＮ、位置２１０のＥ、位置２４４のＳ、位置２４８のＤまたはＳ、および位置２５６のＥからなる群から選択される、少なくとも１０個の保存アミノ酸位置を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、ＥＣ１１．４．１．１１クラスに属する酵素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置１１のＨ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置２５のＳ、位置５２のＧ、位置５４のＲ、位置５７のＴ、位置５８のＹ、位置７２のＮ、位置７３のＧ、および位置８６のＩ、からなる群から選択される、少なくとも８個の保存アミノ酸位置を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置５７のＴ、および位置５８のＹの５個の位置に保存アミノ酸を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）に先だって、（ａ）の細菌株をパントテン酸を欠くまたは最適量以下を有する培地に接触させ、種培養を生成して、（ｂ）の発酵培地に接種する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵培地が、パントテン酸を欠き、または最適量以下を有する、請求項１１または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によってその内容全体を援用する、２０１１年４月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４７２６６４号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援に関する記載
本発明は、米国エネルギー省によって交付された契約番号ＤＥ−ＦＣ３６−０７ＧＯ１７０５６の下に、連邦政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子工学分野に関する。より具体的には、パントテン酸生合成経路を提供する酵素発現のために、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が遺伝子操作された。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノール生産は、化石燃料の代替エネルギー源を提供し、したがって最近の重要な研究領域である。細菌ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は天然でエタノールを産生し、改善されたエタノール産生のために遺伝子操作されている。改善点としては、競合経路排除、キシロース利用、およびバイオマス加水分解物を含有する培地中でのより良い能力が挙げられる（例えば特許文献１、２、３、４、非特許文献１、および特許文献５）。リグノセルロース系およびセルロース性バイオマスから生じる加水分解物は、所望の生成物を生産する生体触媒発酵のための、豊富に利用できる低コストの炭素源基質を提供し得る。バイオマス加水分解物は、典型的にキシロース、ならびに発酵抑制物質を含む。
【０００５】
経済的な発酵生産のために、生体触媒は、増殖および生産培地に、いかなる高価な栄養素の追加も必要としないことが所望される。特に、種培養または生産生体触媒培養物には、ビタミン補給剤が要求されないことが所望される。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、パントテン酸（ＰＡ；パントテネート、ビタミンＢ５、３−［（２，４−ジヒドロキシ−３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］プロパン酸とも称される）を合成できないため、増殖培地にこの栄養素の補給を要する。（非特許文献２、およびその中の参考文献）。ＰＡは、多数の重要な細胞機能を持つ化合物である補酵素−Ａ（ＣｏＡ）の合成に必要であるため、重要な細胞成分である。それは多数の動物で必須栄養素である一方、多数の植物はＰＡ合成のための酵素を発現する。
【０００６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はＰＡを合成でき、生合成経路が知られている。経路の酵素をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子が、同定されている。天然でパントテン酸を産生する微生物の生合成経路内における遺伝子過剰発現によって、パントテン酸生産量の増大が達成されている。特許文献６では、パントテン酸生産量増大のための、天然でＤ−パントテン酸を産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における、ｙｂｂＴ、ｙｗｋＡ、ｙｊｍＣ、ｙｔｓＪ、ｍｄｈ、ｃｙｓＫ、ｉｏｌＪ、ｐｄｈＤ、ｙｕｉＥ、ｄｈａｓ、ａｄｋ、ｙｕｓＨ、ｙｑｈＪ、ｙｑｈＫ、および／またはｙｑｈ−Ｉなどのコード領域の発現増大が開示される。これに加えて、ｐａｎＥ、ｙｌｂＱ、ｐａｎＢ、ｐａｎＤ、ｐａｎＣ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＣ、ｙｗｐＪ、および／またはｇｌｙＡの発現が増大されてもよい。特許文献７は、パントテン酸産生微生物中におけるケトパントテン酸（ｋｅｐｔｏｐａｎｔｏａｔｅ）還元酵素をコードするヌクレオチド配列、特にｐａｎＥの増幅を開示する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐａｎＥ−ｉｌｖＣ変異の補完によって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＲＨ０６３ｃ  ＯＲＦが、ケトパントテン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードすることが示された。特許文献８は、ケトパントテン酸還元酵素とアスパラギン酸α−デカルボキシラーゼの過剰発現などにより、既存の生合成経路が操作された微生物中における、パント化合物の生産を開示する。
【０００７】
特許文献９は、パントテン酸生産のために、α−アラニンをβ−アラニンに変換するアラニン２，３−アミノムターゼ活性がある、細胞の使用を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，７４１，１１９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５１４，５８３号明細書
【特許文献３】米国特許第号明細書５，７１２，１３３号明細書
【特許文献４】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット
【特許文献５】米国特許第２００９−０２０３０９９Ａ１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００３００６６６４号パンフレット
【特許文献７】米国特許第６，１７１，８４５号明細書
【特許文献８】米国特許第２００５００８９９７３号明細書
【特許文献９】米国特許第２００５２２１４６６号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３
【非特許文献２】Ｓｅｏら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：６３−６８；Ｎｉｐｋｏｗら（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２３７−２４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
外部から提供されるＰＡの不在下で増殖してエタノールを産生できる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作り出す必要性が依然としてある。これらのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を使用して、この生体触媒を使用するエタノール生産を改善し、コストを低下させもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、異種酵素を発現してＰＡ生合成経路を提供する、組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を提供する。
【００１２】
したがって本発明は、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌株を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌株を提供するステップと；
ｂ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと；
ｃ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップと
を含んでなる、パントテン酸を合成するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を作成する方法を提供し、ステップｂ）およびｃ）は、いずれの順でもまたは同時であってもよく、２−デヒドロパントイン酸還元酵素およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性は、株中で発現される。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、
ａ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子とを含んでなる、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の組換え細菌株を提供するステップと；
ｂ）それによって株がエタノールを産生する条件下で、（ａ）の株を発酵培地に接触させるステップと
を含んでなるエタノールを生産する方法を提供する。
【００１５】
生物学的寄託と配列説明
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
【００１６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】パントテン酸生合成経路の略図であり、太線矢印はザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中に存在してもよい活性を標識し、「Ｘ」がある矢印は活性の不在を標識する。矢印の数字は、示される反応を遂行する酵素のＥＣ番号である。場合によっては、ＥＣ番号（ｎｉｕｍｂｅｒｓ）と関連付けられている遺伝子名が示される。
【図２】一文字略号を使用して、（Ａ）全体構造略図中、（Ｂ）代表的配列中、および（Ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼアミノ酸配列中における、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼポリペプチドの保存アミノ酸位置を示す。
【図３】一文字略号を使用して、（Ａ）全体構造略図中、（Ｂ）代表的配列中、（Ｃ）１０個の配列アラインメントに基づく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素アミノ酸配列中、および（Ｄ）６４８個の配列アラインメントに基づく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素アミノ酸配列中における、２−デヒドロパントイン酸還元酵素ポリペプチドの保存アミノ酸位置を示す。
【図４】ＰＡ枯渇ステップ後に、異なる濃度のパントテン酸（ＰＡ）が添加された最少培地中で培養された、野性型ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ１株の成長曲線のグラフを示す。
【図５Ａ】ＰＡ枯渇ステップ後に、２．５ｍｇ／Ｌのパントテン酸補給ありまたはなしで、最少培地中で培養された、野性型ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）  ＺＷ１株の成長曲線のグラフを示す。
【図５Ｂ】ＰＡ枯渇ステップ後に、２．５ｍｇ／Ｌのパントテン酸補給ありまたはなしで、最少培地中で培養された、野性型ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）  ＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１株（ＺＥＤ＃１とも称される）の成長曲線のグラフを示す。
【図６Ａ】ＰＡ枯渇ステップ後に、２．５ｍｇ／Ｌのパントテン酸補給ありおよびなしの最少培地中のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ８０１−４株の成長曲線のグラフを示す。
【図６Ｂ】ＰＡ枯渇ステップ後に、１５ｍｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸と様々な濃度のパントテン酸とを含有する最少培地中のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ８０１−４株の成長曲線のグラフを示す。
【図７Ａ】ＰＡ枯渇ステップ後に、１５ｍｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、２．５ｍｇ／Ｌのパントテン酸、双方の化合物が添加され、またはどちらも添加されない最少培地中で培養された、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＺＷ８０１−４株の成長曲線のグラフを示す。
【図７Ｂ】ＰＡ枯渇ステップ後に、１５ｍｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、２．５ｍｇ／Ｌのパントテン酸、双方の化合物が添加され、またはどちらも添加されない最少培地中で培養された、ＺＷ８０１−４／ＰａｎＥＤ＃１株の成長曲線のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
参照によって本明細書に援用する付録１は、９５％同一性および９５％重なり冗長性カットオフで、配列番号４の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素に対して０．００００１以下のＥ値を有する、アミノ酸が２５０〜３５０個の２−デヒドロパントイン酸還元酵素６４８個の受入番号と、アノテート付きアイデンティティの一覧である。
【００１９】
参照によって本明細書に援用する付録２は、９５％同一性および９５％重なり冗長性カットオフで、配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼに対して０．００００１以下のＥ値を有する、アミノ酸が１２０〜１５０個のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ６９３個の受入番号と、アノテート付きアイデンティティの一覧である。
【００２０】
本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
【００２１】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含有する特許出願の要件−配列の規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（２００９）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００２２】
配列番号１は、合成キメラ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥおよびｐａｎＤオペロンのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号２は、アクチノプラネス・ミズリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼ遺伝子からのＧＩプロモーターのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３は、２−デヒドロパントイン酸還元酵素をコードする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥ読み取り枠のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号４は、２−デヒドロパントイン酸還元酵素をコードする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥのアミノ酸配列である（Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株ｇｉ｜１６１２８４１０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１４９５９．１｜）。
【００２６】
配列番号５は、シャイン・ダルガノ配列を含む、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンから上流にある、一続きのＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号６は、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼをコードする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＤ読み取り枠のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号７は、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼをコードする、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＤのアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロン中のキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）停止コドンにすぐ続く、小型安定化ステムループ配列に相当する、一続きのＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
配列番号１８は、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼの保存アミノ酸配列を描写し、保存性が低いアミノ酸位置を表記せずに挿入位置を省いて、高度に保存されたアミノ酸位置を示す。
【００３２】
配列番号１９は、２−デヒドロパントイン酸還元酵素の保存アミノ酸配列を描写し、保存性が低いアミノ酸位置を表記せずに挿入位置を省いて、高度に保存されたアミノ酸位置を示す。
【００３３】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、以下の定義を使用してもよい。
【００３４】
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらのあらゆるその他の変化形は、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば要素の一覧を含んでなる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または（ｏｒ）」は排他的またはでなく包括的またはを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００３５】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生率）に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００３６】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一の実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００３７】
本明細書の用法では、本発明で用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際の濃縮物または調製溶液の作成で使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物作成または方法実施で用いられる成分の、製造、供給元または純度の差異などを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００３８】
「遺伝子」は、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列が任意選択的に含まれてもよい、特異的タンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する、核酸断片を指す。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見られるのと異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。
【００３９】
「プロモーター」または「開始制御領域」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプ中で、または異なる発達段階で、または異なる環境条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。
【００４０】
「発現」という用語は、本明細書の用法では、遺伝子に由来する、コード（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。「過剰発現」は、標準または非形質転換生物中の生成レベルを超える、遺伝子組換え生物中における遺伝子産物の生成を指す。
【００４１】
「形質転換」という用語は、本明細書の用法では、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされる、宿主生物への核酸断片の移入を指す。移入核酸は、宿主細胞中で維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの移入核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
【００４２】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書の用法では、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環の、自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中でいくつかのヌクレオチド配列は連結または組換えされて、適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片とＤＮＡ配列とを細胞に導入できる、独自の構造になる。
【００４３】
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列は、プロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動的に結合し得る。
【００４４】
「選択可能なマーカー」という用語は、通常はマーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質耐性に基づいて選択できる、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果は、対象核酸の遺伝形質を追跡し、および／または対象核酸を引き継いだ細胞または生物を同定するために使用される。
【００４５】
本明細書の用法では、「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列の多様性を可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００４６】
様々な宿主の形質転換のための、遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、遺伝子または核酸分子コード領域のコドンの変更を指す。
【００４７】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、微生物が代謝できる炭素源を指す。炭素基質の一種は「発酵性糖類」であり、それは発酵プロセスにおいて、微生物によって炭素源として使用され得る、オリゴ糖類および単糖類を指す。
【００４８】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンとセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系物質はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００４９】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースおよびリグニンを含んでもよい追加的な成分とを含んでなる、組成物を指す。
【００５０】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類生成を指す。
【００５１】
「前処理バイオマス」という用語は、熱、物理的および／または化学的前処理に曝露させて、糖化酵素に対する、バイオマス中の多糖類の可用性を増大させたバイオマスを意味する。
【００５２】
「バイオマス」は、セルロースを含んでなり、任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料をはじめとする、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指す。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは２種以上の原料に由来する混合物を含んでなり得る；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなることもあり得る。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、牧草、コムギ、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、穀物製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花卉、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から得られる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理または予備加工されてもよい。
【００５４】
「異種」という用語は、天然では対象位置に見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、天然では宿主生物中に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。例えばキメラ遺伝子中に存在する異種核酸分子は、天然で互いに結合しないコード領域とプロモーター部分を有する核酸分子などの、天然ではキメラ遺伝子のその他の部分に結合して見られない核酸分子である。
【００５５】
本明細書の用法では、「単離核酸分子」は、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の部分を含んでなってもよい。
【００５６】
核酸断片は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、核酸断片の一本鎖形態が、その他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、特にその中の第１１章および表１１．１（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）で例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、（遠縁の生物からの相同的な配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーニングし得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい一組の条件では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃で３０分間を繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄が使用される。より望ましいストリンジェントな条件の組は、より高い温度を使用し、洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されたことを除いて、上と同じである。別の好ましい高度にストリンジェントな条件の組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃の２回の最後の洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃のハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸がハイブリダイズするためのＴｍ値は、より大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，１１．７−１１．８を参照されたい）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは、長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識する。
【００５８】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００５９】
「％同一性」と言う用語は、当該技術分野で公知のように、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では「同一性」はまた、場合によっては、このような一連の配列間の一致によって測定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって、容易に計算され得る。
【００６０】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムを使用して実施してもよい。
【００６１】
配列の多重アラインメントは、（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２））によって記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラムにある、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと標識されたアラインメント法に相当する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」をはじめとする、アルゴリズムのいくつかの変種を包含する、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。複数のアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【００６２】
さらに「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」が利用でき、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと標識されるアラインメント法に相当する（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇら．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）によって記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ  ｖ８．０プログラムにある。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（タンパク質／核酸で表される（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることが可能である。
【００６３】
その他の種からの同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。％同一性の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これに限定されるものではなく、または５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％の任意の整数百分率が、対象ポリペプチドを同定する上で有用なこともある。適切な核酸断片は、上の同一性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも１２５個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００６４】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターのあらゆる組を意味する。
【００６５】
「Ｅ値」という用語は、バイオインフォマティクス技術分野で公知のように、一致が偶発する確率を提供する「期待値」である。これは、配列一致の統計的有意性を提供する。Ｅ値が低いほど、ヒットはより有意性が高い。
【００６６】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈＥｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２に記載される。
【００６７】
本発明は、増殖および生産培地中で、パントテン酸（ＰＡ；パントテネートおよびビタミンＢ５とも称される）補給なしで増殖する能力を有する、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の遺伝子操作株に関する。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）による、エタノールを生産する発酵のための経済的方法を提供する上での難題は、培地へのビタミン補給、特にＰＡ補給の要求を低下させ、それによって増殖および／または生産培地のコストを低下させることである。本明細書で開示されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、パントテン酸を合成するように遺伝子改変される。
【００６８】
パントテン酸生合成
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）には、パントテン酸を合成する自然能力が欠如しており、したがってこの細菌の増殖に使用される培地中に、このビタミンの存在が必要であることが知られている。ＰＡはＣｏＡ（補酵素Ａ）生成に必要であり、したがって炭水化物、タンパク質、および脂肪酸代謝に重要である。
【００６９】
出願人らは、パントテン酸生合成経路の酵素をコードする可能性について、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムを分析した。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムの完全な配列は知られており（Ｓｅｏら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：６３−６８；ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６５２６．２）、読み取り枠（ＯＲＦ）は、配列分析に基づいて、可能であれば定義された機能があるタンパク質をコードするとアノテートされている。パントテン酸生合成経路中で機能し得る酵素を潜在的にコードするＯＲＦの存在は、ＫＥＧＧ分析を使用して分析された（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ；Ｋａｎｅｈｉｓａら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４２−４６；ＫａｎｅｈｉｓａおよびＧｏｔｏ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２７−３０；Ｋａｎｅｈｉｓａら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：Ｄ３５４−３５７）。ＫＥＧＧの述べているところによると、ＫＥＧＧは、ゲノムおよび分子情報から、細胞および生物の高次体系行動を明らかにするための、知識に基づく方法を提供する。
【００７０】
ＫＥＧＧ分析は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムが、パントテン酸生合成経路のいくつかの段階のための活性があるタンパク質をコードする可能性を有することを示した（図１、太線矢印を参照されたい）。ゲノムは、２−デヒドロパントイン酸とＬ−アスパラギン酸を生じてもよい活性があるタンパク質をコードすると予測される、ＯＲＦを含む。図１の経路略図では、経路中の各酵素活性が属するＥＣグループと、場合によっては酵素をコードする遺伝子名が示される。
【００７１】
２−デヒドロパントイン酸をパントイン酸に変換する活性があるタンパク質をコードする可能性のあるＯＲＦは見られず、Ｌ−アスパラギン酸をβ−アラニンに変換する活性があるタンパク質をコードする可能性のあるＯＲＦも見られなかった。これらの２つの段階は、図１の略図中でＸで標識される。パントイン酸とβ−アラニンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなどの既知のパントテン酸生合成経路内で、共にライゲートされてパントテン酸が生成する。パントイン酸−β−アラニンリガーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をはじめとする、多数の生物中のｐａｎＣ遺伝子によってコードされる。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムは、パントイン酸−β−アラニンリガーゼをコードする可能性を有さない。しかしｐａｎＣとアノテートされるＯＲＦによってコードされるタンパク質は、パントイン酸−β−アラニンリガーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＣ遺伝子と、４６％のみのアミノ酸配列同一性を有する。細胞内には、恐らく利用できるパントイン酸およびβ−アラニン基質がないため、ｐａｎＣとアノテートされるＯＲＦによってコードされるタンパク質の天然機能は、知られていない。
【００７２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における２−デヒドロパントイン酸のパントイン酸への変換は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をはじめとする多数の生物ではｐａｎＥ  ＯＲＦ（配列番号３）によってコードされる、２−デヒドロパントイン酸還元酵素によって触媒される。Ｌ−アスパラギン酸のβ−アラニンへの変換は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をはじめとする多数の生物ではｐａｎＤ  ＯＲＦ（配列番号６）によってコードされる、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼによって触媒される。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中のこれらの２つの活性の発現が、ＰＡを合成する能力をもたらすかどうかは未知であったが、それは、その結論には、配列分析がＰＡ生合成に関与し得ると推測する、推定される既存の天然酵素が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のＰＡ生合成経路の一部の反応を触媒する機能酵素を実際にコードする、という仮説が必要なためである。
【００７３】
本明細書で開示される実験解析に際し、出願人らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥおよびｐａｎＤコード領域発現のために遺伝子操作されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、ＰＡを含有しない培地中で増殖できることを発見した。この結果は、前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が完全な機能性ＰＡ生合成経路を有して、ＰＡを合成することを示唆する。さらに遺伝子改変野性型ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、ＰＡを含有しない培地中でも、限定されない量のＰＡを添加された同一培地中で培養された野性型ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞と同様に増殖する。
【００７４】
本組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細菌株には、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子と、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子とが導入される。これらのポリペプチドは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に導入された、異種核酸分子によってコードされる。
【００７５】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞宿主
２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性とアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする異種核酸分子を、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の任意の株に導入して、パントテン酸生合成経路を作り出してもよい。野性型ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は天然でエタノールを産生し、前記核酸分子の導入宿主として使用されてもよい。別の実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）宿主株は、遺伝子操作されて、エタノール産生のための改良生体触媒になった組換え株であり、エタノール生産量を高めるいくつかの遺伝子修飾を含んでなる。宿主株は、以下の１つまたは複数の方法の任意の組み合わせで、遺伝子操作された株であってもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、エタノール生産のために、バイオマス加水分解物に見られる糖であるキシロースを利用するように改変されている（米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐ．ｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）。エタノールは、遺伝子組み換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）によって、リグノセルロース系バイオマス加水分解物発酵培地中で生産されている（米国特許第７，９３２，０６３号明細書）。キシロース利用および／またはエタノール産生が改善されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）遺伝子改変株は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，２２３，５７５号明細書、米国特許第７，７４１，１１９号明細書、米国特許第７，８９７，３９６号明細書、米国特許第７，９９８，７２２号明細書、および国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット（米国特許第２０１１／００１４６７０号明細書）で開示される。例えばパントテン酸生合成をできるようにする、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードし、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸分子発現のための宿主細胞として、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−４：：□ΔｈｉｍＡ、ＡｃＲ＃３、ＺＷ７０５をはじめとする、開示された株のいずれか、またはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のその他のエタノール産生株を使用してもよい。
【００７６】
酵素活性
本株では、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする、任意の核酸分子を使用してもよい。２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性がある酵素は、２−デヒドロパントイン酸２−還元酵素、２−オキソパントイン酸還元酵素、ケトパントテン酸還元酵素、ケトパントイン酸還元酵素、ＫＰＡ還元酵素、およびＫＰＲとも称される。酵素活性によって触媒される反応は、次のとおりである：
（Ｒ）−パントイン酸＋ＮＡＤＰ＋←→２−デヒドロパントイン酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋
【００７７】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素酵素は、ＥＣ１．１．１．１６９に分類される。本株では、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有する、このＥＣグループに属する任意の酵素をコードする、核酸分子を使用してもよい。
【００７８】
本株では、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、任意の核酸分子を使用してもよい。アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性がある酵素は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）α−デカルボキシラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸α−デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ）α−デカルボキシラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸１−カルボキシ−リアーゼ、ＡＤＣ、ＡｓｐＤＣ、およびＤｇａｄ２とも称される。酵素活性によって触媒される反応は、次のとおりである：
Ｌ−アスパラギン酸←→β−アラニン＋ＣＯ２
【００７９】
アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ酵素は、ＥＣ４．１．１．１１に分類される。本株では、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有する、このＥＣグループに属する任意の酵素をコードする核酸分子を使用してもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＤ遺伝子から翻訳されるタンパク質は、ｐｉ−タンパク質と称される非活性タンパク質である。（Ｒａｍｊｅｅら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２３：６６１−６６９）。このタンパク質は、自己触媒的に自己プロセッシングされて２つのサブユニット（αおよびβ）になり、それは活性酵素を形成する。
【００８０】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性またはアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドはまた、バイオインフォマティクスおよび／または実験的方法を使用して同定されてもよい。これらのポリペプチドのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ），ＢＲＥＮＤＡ（Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をはじめとする、当業者に良く知られているデータベースを使用して、ＥＣ番号、遺伝子名称、および／または酵素名称によって容易に見つけ得る。これに加えて、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）配列（２−デヒドロパントイン酸還元酵素：配列番号４；アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ：配列番号７）を使用して、ＢＬＡＳＴ配列分析などの配列分析ソフトウェアをはじめとするバイオインフォマティクスを使用して、既知の配列に基づいて容易に見出し得る。
【００８１】
続くポリペプチド配列の分析は、ＥＣ  １．１．１．１６９に属する２−デヒドロパントイン酸還元酵素に共通の構造を同定した。最初に、ＢＲＥＮＤＡデータベース（ＢＲａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ  ＥＮｚｙｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ；Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｓｃｈｅｅｒら（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：６７０−６７６）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋデータベース（ＲＣＳＢＰＤＢ；Ｂｅｒｍａｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２３５−２４２）で同定された、実験的に検証された機能および／または特性解析された構造がある、１０個の２−デヒドロパントイン酸還元酵素（配列番号９〜１７および４）のアミノ酸配列を以下のパラメータでＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して配列比較した：Ｓｌｏｗ／Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ＝０．１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０．２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓ。この多重配列アラインメントから、１０個の配列中の単一アミノ酸として９０％〜１００％の保存があるアミノ酸位置が同定され、図３Ａに示される保存構造略図を提供するのに使用される。この図中では、保存アミノ酸は、Ｇ（グリシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｓ（セリン）、およびＤ（アスパラギン酸）として示される。示されるアミノ酸は、それぞれ９０％保存されている２個のアスパラギン（Ｎ）を除いて、全て１００％保存されている。破線は、多重配列アラインメント中の位置を表し、そこではＥＣ  １．１．１．１６９に属する、１０個の分析された２−デヒドロパントイン酸還元酵素アミノ酸配列の１つまたは複数に現れる、Ｎ末端およびＣ末端伸長をはじめとする挿入および欠失がある。図３Ａの保存構造は、図３Ｂの配列（配列番号１９）として表される。この配列では、破線位置が省かれ、それほど高度に保存されていないその他の保存アミノ酸の表記が省かれている。
【００８２】
保存された位置のアミノ酸は、図３Ｃの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素アミノ酸配列（配列番号４）中で強調表示され、位置７のＧ、位置９のＧ、位置１２のＧ、位置１９のＬ、位置７２のＫ、位置９８のＮ、位置９９のＧ、位置１７６のＫ、位置１８０のＮ、位置１８４のＮ、位置２１０のＥ、位置２４４のＳ、位置２４８のＤ、および位置２５６のＥである。当業者は、図３Ｃで強調表示される保存アミノ酸の存在を判定し得るように、図３Ａの構造略図で指示される位置などにおける、伸長、挿入、および欠失を考慮に入れて、候補配列を配列番号４と容易に整合させることができる。配列番号４と比較して、これらの１４個の保存アミノ酸の内、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、または１４個全てを有して、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有する、あらゆるポリペプチドを本株で使用してもよい。
【００８３】
公的に入手できる配列に対して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素（配列番号４）を使用してＡＢＬＡＳＴ検索を実施し、０．００００１以下のＥ値でマッチするタンパク質配列を抽出した。アミノ酸が２５０〜３５０個の範囲内である、マッチしたタンパク質配列を保留した。配列冗長性は、９５％同一性および９５％重複に低下した。この選別は６４８個の配列をもたらし、それらの受入番号で付録１に列挙される。上で使用されるのと同一パラメータでＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して、多重配列アラインメントを実施した。位置１９のＬを除いて、上の１０個の配列アラインメント中で同定されたアミノ酸位置の全てが、６４８個の配列中で高度に保存されていた。これに加えて、位置２４８のＤが配列の約４％においてＳで置換されており、位置１８０および１８４のＮはいくらかの多様性を有する。したがって２−デヒドロパントイン酸還元酵素の広範な群の特性解析は、図３Ｄで示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デヒドロパントイン酸還元酵素アミノ酸配列（配列番号４）中で強調表示される保存アミノ酸がある構造を提供した。これらの位置におけるいくらかのアミノ酸多様性を表すために、位置１８０および１８４のＮは下線付きであるが太字ではない。位置２４８では、Ｄに代えてＳの存在が、保存構造に含まれる。保存アミノ酸は、位置７のＧ、位置９のＧ、位置１２のＧ、位置７２のＫ、位置９８のＮ、位置９９のＧ、位置１７６のＫ、位置１８０のＮ、位置１８４のＮ、位置２１０のＥ、位置２４４のＳ、位置２４８のＤまたはＳ、および位置２５６のＥである。当業者は、図３Ｄの保存アミノ酸の存在を判定し得るように、図３Ａの構造略図で指示される位置などにおける、伸長、挿入、および欠失を考慮に入れて、候補配列を配列番号４と容易に整合させることができる。配列番号４と比較して、これらの１３個の保存アミノ酸の内、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または１３個全てを有して、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有する、あらゆるポリペプチドを本株で使用してもよい。
【００８４】
本株で使用されてもよい核酸分子としては、例えば１）ＥＣ  １．１．１．１６９に属するもの；２）実験的に検証された機能および／または特性解析された構造があるもの（配列番号９〜１７および４）；３）図３Ｂ中の配列として表される、図３Ａの保存構造を有するもの（配列番号１９）；４）図３Ｃの配列番号４中で強調表示される保存アミノ酸を１０個以上有するもの；５）付録１に列挙される６４８個のタンパク質のいずれかと、少なくとも約９５％の配列同一性があるもの；および６）図３Ｄの配列番号４中で強調表示される保存アミノ酸を１０個以上有するものをはじめとする、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有する、任意のタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００８５】
以下のポリペプチド配列分析は、ＥＣ  ４．１．１．１１に属するアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼに共通する構造を同定した。公的に入手できる配列に対して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（配列番号７）を使用してＡＢＬＡＳＴ検索を実施し、０．００００１以下のＥ値でマッチするタンパク質配列を抽出した。アミノ酸が１２０〜１５０個の範囲内である、マッチしたタンパク質配列を保留した。配列冗長性は、９５％同一性および９５％重複に低下した。この選別は４９３個の配列をもたらし、それらの受入番号で付録２に列挙される。以下のパラメータでＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して、多重配列アラインメントを実施した：緩慢／正確ペアワイズパラメータ：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ＝０．１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０；多重パラメータ：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ＝１０，Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０．２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓ。公的に利用できるウェブアプリケーションであるＷｅｂｌｏｇｏを使用して、ＬＯＧＯ抽出によって配列ｌｏｇｏを作成した（Ｃｒｏｏｋｓら（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１４：１１８８−１１９０）；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６０９７−６１００）。提供される情報によると、各ｌｏｇｏは、配列中の各位置毎に１スタックである、シンボルのスタックからなる。スタックの全高が、その位置における配列保存を示すのに対し、スタック内のシンボルの高さは、その位置における各アミノ酸または核酸の相対的頻度を示す。各位置における各アミノ酸の頻度百分率は、４９３個の配列のセットについて計算された。
【００８６】
この分析から、最も高度に保存されたアミノ酸位置は、分析された４９３個の配列の少なくとも９９％に現れる単一アミノ酸を有するものと同定され、図２Ａに示される保存構造略図を提供するのに使用された。この図では、保存アミノ酸は、Ｋ（リジン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｙ（チロシン）、Ｇ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｒ（アルギニン）、Ｔ（スレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、およびＩ（イソロイシン）として示される。破線は、多重配列アラインメント中の位置を表し、そこではＥＣ  ４．１．１．１１に属する、配列比較された４９３個のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼアミノ酸配列の１つまたは複数に現れる、Ｎ末端およびＣ末端伸長をはじめとする挿入および欠失がある。図２Ａの保存構造は、図２Ｂの配列（配列番号１８）として表される。この配列では、破線位置が省かれ、それほど高度に保存されていないその他の保存アミノ酸の表記が省かれている。
【００８７】
最も高度に保存された位置のアミノ酸は、図２Ｃの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼアミノ酸配列（配列番号７）中で強調表示され、位置９のＫ、位置１１のＨ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置２５のＳ、位置５２のＧ、位置５４のＲ、位置５７のＴ、位置５８のＹ、位置７２のＮ、位置７３のＧ、および位置８６のＩである。当業者は、図２Ｃで強調表示される保存アミノ酸の存在を判定し得るように、図２Ａの構造略図で指示される位置などにおける、伸長、挿入、および欠失を考慮に入れて、候補配列を配列番号７と容易に整合させることができる。配列番号７と比較して、これらの１２個の保存アミノ酸の内、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または１２個全てを有して、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有するあらゆるポリペプチドを本株で使用してもよい。
【００８８】
図２Ｂに示される１２個の最も高度に保存されたアミノ酸位置の内、５個は、配列比較された４９３配列の１００％に現れる。これらの１００％保存された位置は、位置９のＫ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置５７のＴ、および位置５８のＹである。一実施形態では、使用されてもよいポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼアミノ酸配列（配列番号７）と比較すると、これらの５個の１００％高度に保存されたアミノ酸位置を全て有する。
【００８９】
本株で使用されてもよい核酸分子としては、例えば１）ＥＣ  ４．１．１．１１に属するもの；２）；２）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（配列番号７）と９５％の配列同一性があるもの；３）図２Ｂ中の配列として表される、図２Ａの保存構造を有するもの（配列番号１８）；４）図２Ｃの配列番号７中で強調表示される保存アミノ酸を８個以上有するもの；５）配列番号７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼと比較して、位置９のＫ、位置２２のＹ、位置２４のＧ、位置５７のＴ、および位置５８のＹの５個の保存アミノ酸位置を有するもの；および６）付録２に列挙される４９３個のタンパク質のいずれかと、少なくとも約９５％の配列同一性があるものをはじめとする、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有する、任意のタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００９０】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性またはアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はまた、バイオインフォマティクスおよび／または実験的方法を使用して同定されてもよい。コード配列は、当業者には周知のように、遺伝子名および／または酵素名を使用して、ＮＣＢＩ（前出）をはじめとするデータベースに見出し得る。２−デヒドロパントイン酸還元酵素をコードする遺伝子は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐａｎＥまたはＡｐｂＡ、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＰＡＮ５をはじめとする、複数の名称を有する。これに加えて、これらのポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）配列（２−デヒドロパントイン酸還元酵素：配列番号３；アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ：配列番号６）を使用して、ＢＬＡＳＴ配列分析などの配列分析ソフトウェアをはじめとするバイオインフォマティクスを使用して、既知の配列に基づいて容易に見出し得る。実験的方法としては、核酸ハイブリダイゼーションに基づくものが挙げられる。
【００９１】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼをコードする核酸分子は、例えばいくつかの細菌（ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を除く）、酵母、および植物をはじめとする、多数の生物中に見られる。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）にとって異種である、これらの起源からのコード領域配列は直接使用されてもよく、またはそれはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中での発現のために最適化されてもよい。例えばそれは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における最適タンパク質発現のためにコドン最適化されてもよく、および／または真核生物コード領域中に存在する場合はイントロンが除去されてもよく、そのどちらも当業者に良く知られている。
【００９２】
酵素活性発現
発現のために、２−デヒドロパントイン酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼをコードする核酸分子は、作動可能に連結するプロモーターおよび典型的に終止配列のあるキメラ遺伝子に、それぞれ構築される。代案としては、コード領域は、プロモーターおよび終止配列と作動可能に連結する、オペロンの一部として構築される。オペロン中では、典型的に、全てのオペロン中の読み取り枠で、リボソーム結合部位が開始コドン上流に位置する。キメラ遺伝子およびオペロンで使用されてもよいプロモーターは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（ＧＡＰプロモーター）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ遺伝子プロモーター（ＥＮＯプロモーター）、およびアクチノプラネス・ミズリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼ遺伝子プロモーター（ＧＩプロモーター）など、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で発現されるプロモーターである。終結シグナルもまた、標的細胞中で発現されるものである。
【００９３】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ発現のためのキメラ遺伝子またはオペロンは、典型的に、さらなる操作のためにベクターに構築され、または移入される。ベクターは、当該技術分野で周知である。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現に特に有用であるのは、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるｐＺＢ１８８などの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の双方で自己複製し得るベクターである。ベクターは、細胞内自律複製のためのプラスミドと、細菌ゲノムに組み込まれるコンストラクトを保有するためのプラスミドとを含んでもよい。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドは、トランスポゾン、標的細菌ゲノムと相同的な核酸配列領域、または組み込みを支持するその他の配列を含んでもよい。追加的なタイプのベクターは、例えばＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販される系統を使用して作成された、トランスポソームであってもよい。所望の標的宿主と所望の機能に適するベクターを、どのように選択するかは良く知られている。
【００９４】
所望のコード領域を保有するベクターは、電気穿孔、凍結解凍形質転換、カルシウム媒介形質転換、または接合などの既知の方法を使用して、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に導入される。コード領域は、細胞中のプラスミド上で維持されてもよく、またはゲノムに組み込まれてもよい。相同的組換え、トランスポゾン挿入、またはトランスポソーム挿入などの当該技術分野で周知の組み込み法を使用してもよい。相同的組換えでは、標的組み込み部位側面に位置するＤＮＡ配列は、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはその他の選択可能なマーカー、および発現のためのキメラ遺伝子またはオペロンと境を接して配置され、選択可能なマーカーおよび発現配列の標的ゲノム部位への挿入をもたらす。これに加えて、選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼ発現後、耐性遺伝子がゲノムから切除されるように、部位特異的組換え部位と境を接してもよい。
【００９５】
２−デヒドロパントイン酸還元酵素およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼを発現する形質転換ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、ＰＡを欠く培地中で増殖するそれらの能力によって、容易に同定されてもよい。本明細書の実施例で記載するように遺伝子操作された、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の野性型株は、ＰＡを欠く最少培地中で、２．５ｍｇ／ＬのＰＡ（すなわちこのビタミンの飽和濃度）を補給して培養された野性型株と同様に増殖できた。キシロース利用酵素活性発現のために以前遺伝子操作された、キシロース上での増殖のために適応されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第７，６２９，１５６号明細書）、および内在性グルコース果糖酸化還元酵素の破壊を通じたエタノール産生改善のために、遺伝子操作されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第７，７４１，１１９号明細書）中では、２−デヒドロパントイン酸還元酵素とアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼを発現する遺伝子が、ＰＡを欠く最少培地中で増殖する能力もまたもたらした。しかし先の遺伝子操作段階で起きる、ｐ−アミノ安息香酸塩シンターゼサブユニットＩをコードするｐａｂＢ遺伝子の破壊のために、この株の増殖にはｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）の補給が必須であった。
【００９６】
パントテン酸産生株によるエタノール生産
２−デヒドロパントイン酸還元酵素とアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼを発現する本遺伝子改変ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を、発酵中で生体触媒として使用して、エタノールを生産してもよい。炭素基質を含有する培地に、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を接触させる。典型的に、１つまたは複数の糖類が炭素基質を提供する。一実施形態では、培地は、培地がＰＡを欠くように、酵母抽出物などのＰＡを含有する複合成分またはＰＡそれ自体が添加されない、最少培地であってもよい。代案としては、培地は、パントテン酸生産のために遺伝子操作されていないザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の増殖および／または生産には最適量以下である、ＰＡを含有してもよい。一実施形態では、種培養は、ＰＡを欠く最少培地中で、または最適量以下のＰＡを有する培地中で培養される。次に種培養を使用して、より大量の発酵培養物に接種する。発酵培地は、ＰＡが欠如していてもよく、または最適量以下のＰＡを有してもよい。代案としては、発酵培地は、パントテン酸生産のために遺伝子操作されていないザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の増殖および／または生産に適量である、ＰＡを含有してもよい。
【００９７】
種培養培地および／または発酵培地は、バイオマス加水分解物を含有してもよく、それは典型的にグルコース、キシロース、およびアラビノースをはじめとする炭素源としての混合糖類を提供する。本遺伝子改変ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、キシロース利用、またはキシロースおよびアラビノース利用のための酵素活性もまた発現することが望ましい。混合糖類濃度が、増殖を阻害するように高い場合、米国特許第７，６２９，１５６号明細書で開示されるように、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含んでもよい。ガラクチトールまたはリビトールが、ソルビトールまたはマンニトールを置き換えてもよく、またはそれと組み合わせられてもよい。本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は培地中で増殖して発酵が起きて、エタノールが生産される。（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）発酵は、空気、酸素、またはその他のガスの補足なしに、少なくとも約２４時間実施され、３０時間以上実施されてもよい。最大エタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、加水分解物培地中に存在し得るように、培地中に抑制物質が存在する場合、より長い発酵時間を要する。発酵は、約４．５〜約７．５のｐＨで、約３０℃〜約３７℃の温度で実施されてもよい。
【００９８】
本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、ＰＡ補給のない培地中で、実験室規模発酵槽内において、および商業的量のエタノールが生産されるスケールアップ発酵中で培養されてもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養手順が適用されてもよい。例えば本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株からの大規模生産は、バッチおよび連続培養手順の双方で生産されてもよい。古典的バッチ培養法は、培地組成物が培養開始時に設定されて、培養工程において人為的変更を受けない閉鎖系である。したがって培養工程開始時に所望の生物を培地に接種して、系に何も添加せずに、増殖または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は、炭素源添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。
【００９９】
標準バッチ系の変法は、流加系である。流加培養工程もまた、本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の増殖に適し、培養の進行と共に基材が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を構成する。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、参照によって本明細書に援用する、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）にある。
【０１００】
エタノールの商業生産はまた、連続培養で達成されてもよい。連続培養は、バイオリアクターに培養液が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、加工のために取り出される。連続培養は、概して細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。
【０１０１】
連続または半連続培養は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはいくつもの要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、全てのその他のパラメータを加減させる。その他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を継続的に変更し得る。連続系は、定常状態増殖条件を維持するように努め、したがって培地の抜き取りに起因する細胞損失は、培養中の細胞増殖率と平衡状態になくてはならない。連続培養工程のために栄養素と増殖因子を調節する方法、ならびに産物生成率を最大化する技術は、工業微生物学の技術分野で周知であり、多様な方法が前出のＢｒｏｃｋに詳述される。
【０１０２】
エタノールは、本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノール産生と同時に、前処理バイオマスが糖化されて、発酵性糖類を含有する加水分解物が生じる、同時糖化発酵（ＳＳＦ）中で生産されてもよい。
【０１０３】
一実施形態では、軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら、振盪フラスコ内のＰＡを欠く最少培地中で、本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を約３０℃〜約３７℃で培養し、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。種培養は、ＯＤ６００が３〜６になるまで種発酵槽内で嫌気的に培養されて、発酵パラメータがエタノール生産のために最適化される生産発酵槽に移される。種培養タンクから生産タンクに移される典型的な種菌体積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、バイオマス加水分解物を含有する。約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールの最終濃度が、培地中に存在する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなどの）苛性溶液と、硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に制御される。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御される。起泡を最小化するために、消泡剤（シリコーンベース、有機ベースなどの任意のクラス）を必要に応じて容器に添加する。本ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株がそれに対して耐性（ｔｏｌｅｒｎａｃｅ）である抗菌剤を任意選択的に使用して、汚染を最小化してもよい。
【０１０４】
上述のあらゆる条件のセット、さらに当該技術分野で周知であるこれらの条件のバリエーションは、パントテン酸産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノール生産に適する条件である。
【実施例】
【０１０５】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修飾を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【０１０６】
一般方法
略称の意味は、次の通り：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔｓ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」は、ミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ＯＤ」または「ＯＤ６００」は６００ｎｍにおける光学濃度を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数であり、「〜」は約を意味する。
【０１０７】
最少培地を用いた振盪フラスコ実験
特に断りのない限り、下述の全ての実験は、ＰＡ枯渇細胞と、パントテン酸を含有しない合成増殖培地ＭＭ−Ｇ５とを使用して、振盪フラスコ（１５ｍｌの緩く栓をした円錐形試験管）内で行われた。ＭＭ−Ｇ５は、Ｇｏｏｄｍａｎら（（１９８２）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：４９６−４９８）で記載される最少培地の変法である。それは、５０ｇ／Ｌのグルコース、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４（７Ｈ２０）、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２（２Ｈ２Ｏ）、１ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４（２Ｈ２０）、５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４（７Ｈ２Ｏ）、およびそれぞれ１ｍｇ／Ｌのピリドキシン、ニコチン酸、ビオチン、およびチアミンを含有し；最終ｐＨはＫＯＨで５．９にされて、溶液は０．２μｍメンブランを通して濾過された。最終容積に近い脱イオン水に最初の５つの成分を溶解した後に、ｐＨをＫＯＨで約５．９に調節して、その他の成分の沈殿を回避することもまた重要である。細胞内および持ち越しＰＡを枯渇させるために、寒天プレートまたはグリセロール保存株からの細胞を、０．１〜０．３のＯＤでＭＭ−Ｇ５培地に接種して、細胞増殖が止まるまで（約１４〜２０時間）、培養物を３３℃で培養した（約１５０ｒｐｍ）。しかし細胞の培養歴、最初の種菌の体積と密度、培養期間中に起きる増殖程度次第で、ＰＡの完全枯渇には、新鮮ＭＭ−Ｇ５培地中における第２の増殖期間、および／またはより長い培養期間が必要なこともある。特に断りのない限り、プラスミド保有株ＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１および８０１／ＰａｎＥＤ＃１を用いて実施された全ての実験において、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を増殖培地に含めた。
【０１０８】
実施例１
合成ＧｉｐａｎＥｐａｎＤオペロンの構築
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中において、推定上のパントテン酸（ＰＡ）生合成経路を完成させるために、本発明者らは、人工キメラ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥおよびｐａｎＤオペロンをコードする、１６２０ｂｐの合成ＤＮＡ断片（配列番号１）をデザインした（下で「ＧｉｐａｎＥｐａｎＤオペロン」または「ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロン」のいずれかと称される）。オペロンの５’末端は、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ１４５３８）ＧＩプロモーターを含有し、３’末端には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロン中のキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）停止コドンにすぐ続く、小型安定化ステムループ配列に相当する、一続きのＤＮＡがある。合成ＤＮＡ断片はまた、その５’末端にＮｃｏＩおよびＳｐｅＩ部位を、その３’末端にＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有し、それはクローニング目的で使用し得る。配列番号１のＤＮＡ配列を参照すると、ヌクレオチド２３〜２０９（配列番号２）は、ＧＩプロモーターに相当し；ヌクレオチド２１０〜１１２１（配列番号３）は、２−デヒドロパントイン酸還元酵素をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥ読み取り枠（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ７３５２８）に相当し；ヌクレオチド１１２２〜１１３９（配列番号５）は、シャイン・ダルガノ配列を含む、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンから上流にある一続きのＤＮＡのヌクレオチド配列に相当し；ヌクレオチド１１４０〜１５２０（配列番号６）は、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＤ読み取り枠（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ７３２４２）に相当し；およびヌクレオチド１５４３−１５７７（配列番号８）は、上述の安定化ｘｙｌＡステムループ構造に相当する。ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロンＤＮＡ断片は、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。
【０１０９】
実施例２
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中におけるＧＩ−ＰａｎＥＤオペロン発現に使用されるシャトルベクターの構築、およびＰａｎＥＤ株の作成
ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロンをＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入するために、上述の合成ＤＮＡ分子をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、得られた断片をプラスミドシャトルベクターｐＺＢ１８８／ａａｄＡのユニークなＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位にライゲートした。参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９−０２４６８７６Ａ１号明細書に記載されるように、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡは、参照によって本明細書に援用する米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるベクターｐＺＢ１８８であり、それはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための複製起点を有するので、双方の細菌種中で自己複製でき、スペクチノマイシン耐性ＤＮＡ断片が付加されている。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を形質転換するための非メチル化プラスミドＤＮＡを作成するために、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧＩｐａｎＥｐａｎＤを化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に導入して、形質転換体をスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地上で選択した。次に単離非メチル化プラスミドＤＮＡを、ＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）およびＺＷ８０１−４中に電気穿孔した。野性型親株ＺＷ１から出発する、キシロース利用組換え株ＺＷ８０１−４の構築の詳細な説明は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，０８４号明細書に提供される。全て米国特許第７，７４１，０８４号明細書に記載されるように、ＺＷ８０１−４株はＺＷ８００株に由来し、それはＺＷ６５８株に由来した。ＺＷ６５８は、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、キシルロキナーゼ（ｘｙｌＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）、およびトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）をコードする、４つのキシロース利用遺伝子を含有する、２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを、逐次遺伝子転位事象によってＺＷ１（ＺＭ４株；ＡＴＣＣ＃３１８２１の改称）のゲノムに組み込んで、Ｘ１３Ｌ３株（ＺＷ６４１の改称）を作成し、それに続いてキシロース含有選択培地に適応させることで構築された。ＺＷ６５８は、ブダペスト条約の下に、ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８として寄託された。ＺＷ６５８中で、宿主媒介二重交差相同的組換えを使用して、グルコース果糖酸化還元酵素をコードする遺伝子を挿入的に不活性化し、スペクチノマイシン耐性を選択可能なマーカーとして、ＺＷ８００株を作り出した。ｌｏｘＰ部位と境を接するスペクチノマイシン耐性マーカーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して部位特異的組換えによって除去され、ＺＷ８０１−４株が作成された。参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属米国特許出願公開第２００９０２４６８４６号明細書で開示されるように、ＺＷ６４８は、ｘｙｌＡコード領域の発現を駆動する、プロモーター（Ｐｇａｐ）中の点変異のために、ＺＷ６４１（Ｘ１３ｂＣ株によって代表される）よりもはるかに高いキシロースイソメラーゼ活性（約４倍高い）を有する。
【０１１０】
ｍＲＭ３−Ｇ５培地（５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物（ＰＡ含有）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４）と、２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンとを含有する寒天プレート上で、形質転換体を選択した。ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧＩｐａｎＥｐａｎＤシャトルベクターを持つ、得られたＺＷ１およびＺＷ８０１−４株は、それぞれＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１および８０１／ＰａｎＥＤ＃１と命名された。下述の振盪フラスコ実験では、各株について２つの一次形質転換体を評価したことに留意すべきである。どちらの場合も、双方の形質転換体は本質的に同じく挙動するので、ＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１および８０１／ＰａｎＥＤ＃１で得られた結果のみを下に提示する。
【０１１１】
実施例３
ＭＭ−Ｇ５培地中におけるＺＷ１増殖にはＰＡ補給を要する
５０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ２、および１．５％の寒天を含有するｍＲＭ３−Ｇ５プレートからのＺＷ１株を、２０ｍｌのＭＭ−Ｇ５（一般方法に記載される）に接種して、培養物を３３℃で約１９時間（１５０ｒｐｍ）培養して、持ち越しパントテン酸を枯渇させた。ＯＤ６００は、培養期間中に０．１７８から０．４０８に増大した。次にＰＡ枯渇細胞のアリコートを新鮮ＭＭ−Ｇ５培地で０．０３５のＯＤ６００に希釈して、得られた培養物の１０ｍｌのアリコートを、様々な量のパントテン酸（最終濃度０、０．０２５、０．０６３、０．１２５、０．２５、０．６３、２．５、または５ｍｇ／Ｌ）を含有する、８本の１５ｍｌ円錐試験管に分配した。このステップ後、８本の培養物を１５０ｒｐｍおよび３３℃で培養し、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）変化を時間の関数として追跡し、増殖をモニターした。図４に示されるように、対数増殖速度と最大細胞密度のどちらも、パントテン酸濃度が飽和に達して増殖がもはやこのビタミンによって制限されなくなるまで、パントテン酸濃度の増大と共に用量依存性に増大した。この実験から、用いられた条件下では、約２．５ｍｇ／Ｌ以上のＰＡ濃度が、ＭＭ−Ｇ５培地中のＺＷ１の最大増殖を支持できることが明らかであった。細胞にパントテン酸が添加された場合を除いて、増殖は観察されなかった。
【０１１２】
実施例４
ＺＷ１中における合成ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロンの効果
補足パントテン酸の存在下および不在下における、ＺＷ１およびＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１の増殖曲線をアッセイした。この実験のプロトコルは、以下の通りであった。ＺＷ１およびＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１株のそれぞれについて、２つの１０ｍｌのＭＭ−Ｇ５培養を開始した。一方にＰＡ（２．５ｍｇ／Ｌ）を添加した一方、他方には等体積の滅菌水を添加した。全ての４つの培養物で、最初のＯＤは約０．１であった。３３℃で１５時間（１５０ｒｐｍ）の培養期間後、これらの培養物のアリコートを使用して、元の培養物と同じ増殖培地を含有する、新しい１０ｍｌの培養を開始した；最初のＯＤは、全例で約０．０５であった。新しい培養物を３３℃（１５０ｒｐｍ）で培養し、ＯＤ６００によって増殖をモニターした。得られた対数増殖曲線は、図５に示される。
【０１１３】
以前の結果と一致して、ＺＷ１がＭＭ−Ｇ５培地中のパントテン酸を枯渇させると、次に同一組成物を有する新鮮培地にそれを移しても、増殖できなかった（図５Ａ）。対照的に、２．５ｍｇ／Ｌのパントテン酸を含有する培地にＺＷ１を移すと、細胞は約２時間の倍加時間で、約１．２の最終ＯＤに指数関数的に増殖した（図５Ａ）。合成ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロンを含有するＺＷ１誘導体では、非常に異なる結果が得られた。図５Ｂに示されるように、ＺＷ１／ＰａｎＥＤ＃１（ＺＥＤ＃１）は、ＭＭ−Ｇ５培地中で、補足ＰＡの存在下または不在下において、同一動態で増殖した。確かにこの株の双方の増殖曲線は、飽和濃度のＰＡが存在した場合のＺＷ１の増殖曲線と、実質的に同一であった。これらの結果は、ｐａｎＥおよびｐａｎＤ遺伝子の導入によって、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）がＰＡを合成でき、ＰＡを欠く最少培地中で最大成長速度を支持するのに十分な量で、ＰＡが生成したことを明確に実証する。
【０１１４】
実施例５
ＺＷ８０１−４中における合成ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロンの効果
ＺＷ８０１−４は、最少培地中での増殖のために、２つのビタミンを要求する。一般方法に記載のとおりに、ＺＷ８０１−４を使用した増殖実験を実施して、得られた増殖曲線を図６に示す。図６Ａに見られるように、ＺＷ８０１−４がＭＭ−Ｇ５中のパントテン酸を枯渇させて同一培地に移されると、それはＺＷ１で得られた結果と同様に増殖できなかった。しかし第２の培養期間中に、増殖培地にパントテン酸（２．５ｍｇ／Ｌ）を添加すると、非常にわずかな増殖もまた観察された（図６Ａ）。この観察には、株構築に関連した遺伝的根拠がある。その他のＺＷ６４１誘導体と同様、ＺＷ８０１−４は、葉酸生合成に必要であり、したがって必須であるビタミンのｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を合成できない。米国特許第７，７４１，０８４号明細書に記載されるように、ＺＷ６４１の構築の最初のステップは、（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーター制御下にある大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼとトランスケトラーゼをコードする）合成ＰｇａｐｔａｌｔｋｔオペロンのＺＷ１染色体への組み込みである。オペロンは、ＤＮＡに無作為に組み込まれるトランスポゾンによって導入され、さらなる代謝操作のために選択された株のトランスポゾン挿入部位は、ＰＡＢＡの生合成に必須のｐ−アミノ安息香酸塩シンターゼサブユニットＩをコードする、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｐａｂＢ遺伝子の読み取り枠内にある。Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔトランスポゾン挿入断片は、全ゲノムＤＮＡ配列分析による測定で、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＥ００８６９２のヌクレオチド１０２０２１と１０２０２２の間に位置する。破壊されたｐａｂＢ遺伝子は機能的でないように見えるので、ＺＷ６４１とそれに由来する全ての株は、最少培地中での増殖のために、２つのビタミン、すなわちＰＡとＰＡＢＡを要求する。
【０１１５】
ＺＷ８０１−４について用量設定実験を実施して、飽和濃度のＰＡＢＡ（１５ｍｇ／Ｌ；図６Ｂ）を含有するＭＭ−Ｇ５培地中における増殖のためのＰＡの最適濃度を判定した。ＺＷ８０１−４株の細胞を２０ｍｌのＭＭ−Ｇ５培地に接種して、培養物を３３℃で約１９時間（１５０ｒｐｍ）培養して、細胞内および持ち越しパントテン酸を枯渇させた。培養期間中、ＯＤは０．１４３から０．３６４に増大した。次にＰＡ枯渇培養物をＭＭ−Ｇ５培地で約０．０３５のＯＤに希釈して、ＰＡＢＡを最終濃度１５ｍｇ／Ｌに添加した。細胞懸濁液のアリコート（１０ｍｌ）を（０〜５ｍｇ／Ｌの範囲にわたる）様々な濃度のＰＡを含有する８本の１５ｍｌ円錐試験管に分配し、得られた培養物を３３℃（１５０ｒｐｍ）で培養して、増殖をモニターした。図６Ｂに示されるように、飽和濃度のＰＡＢＡを含有するＭＭ−Ｇ５培地中におけるＺＷ８０１−４の増殖ためのＰＡの最適濃度は、ＺＷ１の要求（図４）と同様に、約２．５ｍｇ／Ｌであった。
【０１１６】
ＺＷ８０１−４中のＧＩ−ＰａｎＥＤオペロン
ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−４／ＰａｎＥＤ＃１株のそれぞれを１０ｍｌのＭＭ−Ｇ５に接種し、培養物を３３℃で１５時間培養して、パントテン酸を枯渇させ、ＰＡＢＡを部分的枯渇させ；どちらの場合も最初のＯＤは約０．１であった。このステップに続いて、培養物を同一増殖培地で約０．０４のＯＤに希釈して、各細胞懸濁液の四連の１０ｍｌのアリコートを８本の１５ｍｌ円錐試験管に分配した。次に試験管に、ＰＡ、ＰＡＢＡ、双方のビタミンを添加し、またはどちらも添加せずに、得られた培養物を３３℃で培養して、増殖を６００ｎｍでモニターした。存在する場合、ＰＡおよびＰＡＢＡの最終濃度はそれぞれ２．５ｍｇ／Ｌおよび１５ｍｇ／Ｌであり、ビタミンなし対照培養物には、等体積の滅菌水を添加した。得られた増殖曲線は、図７に示される。
【０１１７】
以前の結果と一致して、ＺＷ８０１−４は、増殖培地にＰＡとＰＡＢＡの双方を添加した場合のみ増殖した（図７Ａ）。ＭＭ−Ｇ５培地中における最初の培養期間中は、ＰＡ枯渇ステップ後に常時、少量の残留ＰＡＢＡがあるので、ＰＡのみを添加した培養物中で起きた少量の増殖は持ち越しＰＡＢＡの結果である（すなわち細胞は、ＰＡＢＡを使い果たす前に、全てのＰＡを使い果たす）。上の結果とは対照的に、合成ＧＩ−ＰａｎＥＤオペロンを含有するＺＷ８０１−４株は、パントテン酸を合成できたので、増殖のためにＰＡＢＡのみを要求した（図７Ｂ））。
【０１１８】
双方のビタミンが添加されたＺＷ８０１−４培養物は、ＭＭ−Ｇ５培地中で、対応するＺＷ８０１−４／ＰａｎＥＤ＃１培養物よりもわずかにより良く増殖したことに留意されたい（図７Ａ対７Ｂ）。この結果の最もふさわしい説明は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌系統で頻繁に観察される「プラスミド負荷」である（Ｋｉｍら（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６６：１８６−１９３、およびその中の参考文献）。そうでなければ増殖に利用できるエネルギーが、プラスミドの複製と維持に流用されるこの現象は、恐らく富栄養培地と比較して最少培地中ではるかにより明白であろう。
【０１１９】
この実験における重要な発見は、増殖培地が飽和濃度のＰＡＢＡを含有する場合、ＺＷ８０１−４／ＰａｎＥＤ＃１が、パントテン酸添加の存在下と不在下において、同一動態で同一細胞密度に増殖したことである。総合すると、上の結果は、野性型および組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株中における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐａｎＥおよびｐａｎＤコード領域の同時発現が、パントテン酸が限定的であった条件下での増殖を可能にすることを明確に示す。
【図１】
2014511699.tif 000005
【図２】
2014511699.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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