(57)【要約】  本発明は、好ましくは個体において炎症性障害を予防する又は治療するための、薬剤としてのＬ１９供給源を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための核酸分子であって、
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が（ｉ）又は（ｉｉ）の配列の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
ｉｖ．その配列が遺伝コードの縮重により（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列により表される、核酸分子。
【請求項２】
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が（ｉ）又は（ｉｉ）の配列の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
ｉｖ．その配列が遺伝コードの縮重により（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列により表される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
薬剤として使用するための請求項１又は２に記載の核酸分子にコードされているポリペプチド。
【請求項４】
前記核酸分子又はポリペプチドが、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、リーシュマニア・ブラジリエンシス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ）、リーシュマニア・メキシカーナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）又はリーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）に由来するか、又はそれを起源とする、請求項１又は３に記載の核酸分子又はポリペプチド。
【請求項５】
個体において炎症性障害を予防する又は治療するのに使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子又はポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２の少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれよりも多い連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１、２、４又は５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号１の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２６５、又は２６７の連続するアミノ酸を含むタンパク質断片である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１の少なくとも１４の連続するアミノ酸を含み、配列番号３１、３２、５５、４２、４３、４４、５６、５３、５４及び／又は５７を含む、請求項７に記載のタンパク質断片。
【請求項９】
前記炎症性障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、及び非アルコール性脂肪症、サルコイドーシス、自己免疫性糖尿病、糖尿病、ブドウ膜炎、多発性硬化症、臓器移植後の制御同種移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む炎症性肺疾患（２）、癌（４）全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎並びに癌である、請求項５に記載の核酸分子又はポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子及び／又はポリペプチドを含む組成物であって、好ましくは薬学的に許容される担体、アジュバント、塩、希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である、組成物。
【請求項１１】
個体において炎症性障害を予防する又は治療するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子及び／若しくはポリペプチド又は請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
前記炎症性障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、及び非アルコール性脂肪症、自己免疫性糖尿病、糖尿病、ブドウ膜炎、多発性硬化症、臓器移植後の制御同種移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む炎症性肺疾患（２）、癌（４）全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎並びに癌である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
個体において炎症性障害の１つ若しくは複数の症状（複数可）及び／若しくは特徴（複数可）を軽減するため並びに／又は炎症性障害のパラメータを改善するための方法であって、前記個体に請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子若しくはポリペプチド又は請求項１０に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記炎症性障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、及び非アルコール性脂肪症、自己免疫性糖尿病、糖尿病、ブドウ膜炎、多発性硬化症、臓器移植後の制御同種移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む炎症性肺疾患（２）、癌（４）全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎並びに癌である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、好ましくは個体において炎症性障害を予防する又は治療するための、薬剤としてのＬ１９供給源を提供する。
【０００２】
［発明の背景］
免疫及び関連炎症性疾患は、正常な生理機能において傷害又は損傷の修復を開始することにより傷害又は損傷に応答し、先天性及び後天性応答を開始する複雑で頻繁に相互接続される生物学的経路の発現である。これらの生理的経路が、異常な調節若しくは過剰刺激又はその２つの組合せのいずれかにより引き起こされる過剰応答によりさらに傷害又は損傷を引き起こすと、疾患又は病態が発生する。抗ＴＮＦ剤などの新しい抗炎症薬が出現したにもかかわらず、炎症性疾患は、多くの場合これらの薬物に対する応答性の欠如及び抵抗性のために重要な未だ対処されていない医学的必要性を表し続けている。
【０００３】
抗炎症剤の使用により調節されることがある免疫及び関連炎症性疾患には、自己免疫性糖尿病（類似する他のどんなものでも）、糖尿病、ブドウ膜炎、（１）多発性硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、臓器移植後の制御同種移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む炎症性肺疾患（２）、癌（４）全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ、サルコイドーシス、癌及び乾癬が含まれる。
【０００４】
ＲＡは、全身性自己免疫疾患と考えられており、全身性薬に伴う副作用を最小限に抑えるために典型的には組み合わせて、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）を用いる処置により管理される。これらの薬物の副作用には、潰瘍性口内炎、白血球数の減少が含まれる。
【０００５】
ＩＢＤは、小腸及び／又は大腸の慢性炎症性障害を表す用語である。ＩＢＤの領域内には、潰瘍性大腸炎及びクローン病が含まれる。その正確な原因ははっきりと確立していないが、ＩＢＤは自己免疫疾患であると考えられている。現在利用できる治療法はなく、処置は異常な又は過剰な炎症応答を抑制することに集中している。処置には、副腎皮質ステロイド薬（たとえば、メトトレキサート、アザチオプリン及びメルカプトプリン）及びアミノサリチル酸が含まれる。副腎皮質ステロイド薬の長期使用は、骨の希薄化、感染、白内障並びに性欲及び骨髄効果に関連している。アミノサリチル酸は、吸収されるのが不十分であり、患部に局所的に作用するので、許容される程度が大きい傾向がある。副作用には、頭痛及びまれには膵炎などのさらに重篤状態が含まれる。
【０００６】
乾癬は異なる方法で治療される。副腎皮質ステロイド薬の使用は典型的には一般的治療法であるが、欠点には無効性及び抵抗性の発生が含まれる。光線療法の使用は、減少する炎症に関連するアポトーシスを増加することにより乾癬を治療するのに効果的である。短期の欠点は不快感が増すことと掻痒であり、長期の作用は鱗状細胞及び黒色腫皮膚癌の危険が増加する。全身性薬は乾癬の治療に利用されるが、種々の他の望ましくないことが多い全身作用があり、皮膚科医の緻密な管理及び監視下で使用されなければならない。
【０００７】
したがって、既存の治療の欠点が全てない、ＲＡ、ＩＢＤ及び乾癬などの炎症性疾患に対する新たな治療を設計する必要性がまだ存在する。
【０００８】
［発明の説明］
Ｌ１９供給源
第一の態様では、薬剤として使用するためのＬ１９供給源が提供される。
【０００９】
Ｌ１９はリボソームタンパク質である。リボソームタンパク質はよく保存された細胞質タンパク質である。したがって、Ｌ１９供給源は、植物であれ動物であれ、哺乳動物、爬虫類、魚類、昆虫であれ、原生動物などの他のどんな染色体を有する生物由来であれ、どんな真核生物からでも調製することができる。本発明は、コードされたＬ１９タンパク質産物が、本明細書で後に定義される抗炎症応答を誘導することができる限り、特定のＬ１９供給源に限定されることはない。好ましい原生動物には、プラスモジウム、特にトリパノソーマ類科のメンバー、さらに詳細にはトリパノソーマ原生動物の異なる種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）が含まれる。２０種を超えるリーシュマニアの既知の種が存在し、たとえば、Ｌ．メジャー（Ｌ．ｍａｊｏｒ）を含むコンプレックスＬ．メジャー；Ｌ．シャガシ（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）、Ｌ．ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）とＬ．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）を含むコンプレックスＬ．ドノバニ；Ｌ．アマゾネンシス（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）とＬ．メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）を含むコンプレックスＬ．メキシカーナを含む亜属リーシュマニアの種、並びにＬ．ブラジリエンシス（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）とＬ．ペルビアナ（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａ）を含むコンプレックスＬ．ブラジリエンシス及びＬ．グイアネンシス（Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）とＬ．パナメンシス（Ｌ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）を含むコンプレックスＬ．グイアネンシスを含む亜種ビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）がある。特に興味深いプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種は、プラスモジウム・ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及びプラスモジウム・ビバックス（ｖｉｖａｘ）である。代わりに、Ｌ１９供給源は、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種から得られることがある。トリパノソーマ種は、トリパノソーマ・クルージ（ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（ｂｒｕｃｅｉ）のこともある。好ましい実施形態では、Ｌ１９供給源は、リーシュマニア種、好ましくはリーシュマニア・メジャー、リーシュマニア・インファンタム、リーシュマニア・ドノバニ、リーシュマニア・シャガシ及び／又はリーシュマニア・ブラジリエンシスから得られ又はそれに由来し又はそれを起源とする。さらに好ましいのは、リーシュマニア・メジャーから得られ又はそれに由来し又はそれを起源とするＬ１９供給源である。当業者であれば、Ｌ１９の供給源は、本明細書で同定される同じ生物に由来する又はいくつかの異なる生物に由来する２つ又はそれよりも多いＬ１９供給源を混合することにより調製することもできることは理解するであろう。Ｌ１９供給源の使用は、コードされたＬ１９タンパク質産物が処置を受けた対象において抗炎症応答の発生を誘導することができることが明らかにされているので、魅力的な特性を有することが本明細書において実証されている。
【００１０】
好ましいＬ１９供給源は、核酸分子、オリゴヌクレオチド、タンパク質、タンパク質断片及び／又はペプチドであり、それぞれが本明細書で定義されるＬ１９タンパク質又はポリペプチド又は核酸分子に由来する。Ｌ１９供給源は好ましくは、Ｌ１９タンパク質、Ｌ１９ポリペプチド、Ｌ１９由来ペプチド若しくはＬ１９タンパク質断片及び／又はＬ１９タンパク質若しくはＬ１９ポリペプチド若しくはＬ１９由来ペプチド若しくはＬ１９タンパク質断片をコードする核酸分子を含み又はそれからなり、それぞれが本明細書に定義されている。好ましいＬ１９タンパク質は配列番号１により表される。この好ましいＬ１９タンパク質は好ましくは、配列番号２によりコードされている。別の好ましいＬ１９タンパク質は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９により表される。これらの他のＬ１９タンパク質のそれぞれは好ましくは、それぞれ配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０によりコードされている。
【００１１】
第一の実施形態では、好ましいＬ１９供給源は、
ｉ．配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｉｉ．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．その相補鎖が（ｉ）又は（ｉｉ）の配列の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
ｉｖ．その配列が遺伝コードの縮重により（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列により表される核酸分子である。
【００１２】
第二の実施形態では、好ましいＬ１９供給源は、上で同定される第一の実施形態の核酸分子によりコードされるポリペプチドである。さらに好ましい実施形態では、Ｌ１９供給源は、そのアミノ酸配列が、アミノ酸配列の配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９又は３１を有するポリペプチドと少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドである。
【００１３】
本発明者らは、いくつかのＬ１９タンパク質及び対応するコード核酸分子を同定した。これらのＬ１９タンパク質のそれぞれが、配列番号１の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれよりも多くを有するアミノ酸配列を含む。これらのＬ１９タンパク質のそれぞれをコードする核酸分子のそれぞれが、配列番号２の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれよりも多くを有するヌクレオチド配列を含む。これらのＬ１９タンパク質のそれぞれが、配列番号１により表されるリーシュマニア・メジャーＬ１９タンパク質の相同体を表す。
【００１４】
手短に言えば、本発明者らは、リーシュマニア・ブラジリエンシスから、配列番号５、７又は９により表される３つのＬ１９タンパク質を同定した。これらのタンパク質のそれぞれが好ましくは、以下のヌクレオチド配列それぞれ配列番号６、８又は１０によりコードされる。
【００１５】
本発明者らは、リーシュマニア・インファンタムから、配列番号１１又は１３により表される２つのＬ１９タンパク質も同定した。これらのタンパク質のそれぞれが好ましくは、以下のヌクレオチド配列それぞれ配列番号１２又は１４によりコードされる。
【００１６】
本発明者らは、リーシュマニア・メキシカーナから、配列番号１５又は１７により表される２つのＬ１９タンパク質も同定した。これらのタンパク質のそれぞれが好ましくは、以下のヌクレオチド配列それぞれ配列番号１６又は１８によりコードされる。
【００１７】
本発明者らは、リーシュマニア・ドノバニから、配列番号１９により表される１つのＬ１９タンパク質も同定した。このタンパク質は好ましくは、以下のヌクレオチド配列、配列番号２０によりコードされる。
【００１８】
さらに、本発明者らは、トリパノソーマ・クルージから、配列番号２１、２３、２５又は２７により表される４つのＬ１９タンパク質を同定した。これらのタンパク質のそれぞれが好ましくは、以下のヌクレオチド配列それぞれ配列番号２２、２４、２６又は２８によりコードされる。
【００１９】
本発明者らは、トリパノソーマ・ブルセイから、配列番号２９により表される１つのＬ１９タンパク質も同定した。このタンパク質は好ましくは、以下のヌクレオチド配列、配列番号３０によりコードされる。
【００２０】
特定の同定されたアミノ酸又はヌクレオチド配列と少なくとも５０％同一性又は類似性を有する本明細書に記載される前記アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は本発明に包含されていることが好ましく、コードされたタンパク質ポリペプチド、タンパク質断片又はペプチドが、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９により表されるＬ１９タンパク質により得られる抗炎症応答を少なくともある程度誘導することができる場合は機能的であると言われる。少なくともある程度とは、好ましくは配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９により誘導される抗炎症応答の少なくとも５０％、少なくとも６０％、７０％、８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味する。
【００２１】
抗炎症応答を誘導することは、処置された対象若しくは個体における抗炎症性化合物の検出可能な産生を誘導する能力及び／又は炎症性化合物の産生の減少を誘導する能力と定義される又は好ましくは定義される。抗炎症性化合物は、好ましくはサイトカインである。さらに好ましいサイトカインはＩＬ−１０である。炎症性化合物は、好ましくはサイトカインである。さらに好ましいサイトカインは、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαである。ＩＬ−１０又はＩＦＮγ又はＴＮＦαの産生は、好ましくはＰＣＲを使用してｍＲＮＡレベルで、又はＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ若しくはＦＡＣＳを使用してタンパク質レベルで評価される。これらの技法は全て当業者には公知である。多くの論文が、ＩＬ−１０の上昇を疾患の結果としての炎症の減少と関連付けてきた。ＩＦＮγ又はＴＮＦαの上昇と炎症の存在でも同じことが言える。抗炎症性化合物の産生は、処置された対象について又は前記対象から得られる試料について評価されてもよい。これとの関連において、試料は組織でも体液でも細胞でもよい。好ましい組織には、脾臓又は皮膚又は腸又は肺が含まれる。好ましい体液には血液が含まれる。好ましい細胞には、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）又は皮膚細胞又は腸細胞又は肺細胞が含まれる。抗炎症応答は、Ｌ１９供給源を用いた処置から少なくとも１、２、３、４、５、６、７日後に誘導されることがある。好ましいＬ１９供給源はＬ１９ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片又はペプチドである。抗炎症応答の誘導は、抗炎症応答の誘導の増加であってもよい。これとの関連において、「増加」とは、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の増加を意味していてもよい。抗炎症応答の誘導は、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの量又は含量の減少であってもよい。これとの関連において、「減少」とは、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の減少を意味していてもよい。
【００２２】
好ましい実施形態では、抗炎症性化合物が産生され、検出可能な炎症性化合物（すなわち、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）は検出されない。これとの関連において、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαは検出されない。ＴＮＦα及び／又はＩＦＮγの非存在は好ましくは、ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡを使用して評価される。炎症性化合物の非存在は、抗炎症性化合物についてと同じように、処置された対象について又は前記対象から得られる試料について評価されてもよい。
【００２３】
好ましいアッセイでは、抗炎症応答、さらに好ましくはＩＬ−１０の産生又はＩＬ−１０の増加は、Ｌ１９供給源、好ましくはＬ１９ポリペプチド又はＬ１９ペプチドのＰＢＭＣと一緒のインキュベーションの少なくとも２４時間又は４８時間又は７２時間後に検出される。この好ましいアッセイでは、ＩＦＮガンマの減少量及び／若しくはＴＮＦαの減少量は、Ｌ１９供給源、好ましくはＬ１９ポリペプチド又はＬ１９ペプチドのＰＢＭＣと一緒のインキュベーションの少なくとも２４時間又は４８時間又は７２時間後に検出される、又は検出可能なＩＦＮγ及び／若しくはＴＮＦαは検出されない。ＩＬ−１０、ＩＮＦγ及び／又はＴＮＦαは、実施例の部に記載されるＥＬＩＳＡにより評価されることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、抗炎症応答を誘導することができるＬ１９供給源は、炎症性障害若しくは状態若しくは疾患の発生を予防及び／又は遅延させること並びに／又は本明細書において後に定義される処置された対象由来の細胞若しくは組織の１つ若しくは複数の症状（複数可）及び／若しくは１つ若しくは複数の特徴（複数可）若しくはパラメータ（複数可）を軽減することもできる。
【００２４】
好ましいＬ１９供給源は、上で同定される第一の実施形態の核酸分子である。この好ましい核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８若しくは３０に由来するヌクレオチド配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８若しくは３０若しくはその一部と少なくとも５０％の同一性若しくは類似性を有し、安定性、可溶性若しくはターゲティングを増加させる置換、挿入、欠失並びに追加の５’及び／若しくは３’末端ヌクレオチド又は化学的部分を含むことがある配列により表される。好ましい実施形態では、Ｌ１９供給源は、そのヌクレオチド配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８若しくは３０又はその一部と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性若しくは類似性を有する核酸分子である。
【００２５】
本明細書で定義されるＬ１９核酸分子は、好ましくはオリゴヌクレオチドである。好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０に由来する。さらに好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０により表され、そのコードされた産物が本明細書で前に定義された抗炎症応答を誘導することができる、上で同定された対応するＬ１９核酸分子のうちの少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれよりも多い連続するヌクレオチドを含む。したがって、好ましい実施形態では、本明細書で定義されるＬ１９核酸分子は、好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０のうちの少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれよりも多い連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
したがって、好ましいＬ１９供給源は、配列番号２のうちの少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれよりも多い連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
別の好ましいＬ１９供給源は、上で同定された第一の実施形態の核酸分子によりコードされるポリペプチド、及び／又はそのアミノ酸配列がアミノ酸配列の配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７若しくは２９を有するポリペプチド若しくはその一部と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性若しくは類似性を有するポリペプチドである。
【００２８】
好ましいポリペプチドは、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７若しくは２９若しくはその一部に由来するアミノ酸配列又は配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７若しくは２９若しくはその一部と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性若しくは類似性を有し、安定性、可溶性を増加させる置換、挿入、欠失及び追加のＮ若しくはＣ末端アミノ酸若しくは化学的部分を含むことがある配列により表される。
【００２９】
本明細書で定義されるＬ１９タンパク質断片又はＬ１９由来ペプチド又はＬ１９ポリペプチド又はＬ１９タンパク質は、好ましくは配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９により表され、本明細書で前に定義される抗炎症応答を誘導することができる対応するＬ１９タンパク質のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２６５、又は２６７の連続するアミノ酸を含む断片であることが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、本明細書で定義されるＬ１９タンパク質断片又はＬ１９由来ペプチドは、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２６５、又は２６７の連続するアミノ酸を含む断片であることが好ましい。Ｌ１９供給源は、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９により表されるタンパク質などの完全長Ｌ１９タンパク質を含んでいてもよく、Ｌ１９タンパク質のＮ及び／又はＣ末端に追加のアミノ酸を含んでいる。別の好ましい実施形態では、Ｌ１９供給源は、Ｌ１９タンパク質の少なくとも１つのタンパク質断片を含むタンパク質又はポリペプチドを含む又はそれからなる。好ましいＬ１９供給源は配列番号１のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２６５、又は２６７の連続するアミノ酸を含むタンパク質断片である。
【００３０】
一実施形態では、Ｌ１９の供給源は配列番号１由来のペプチド又は配列番号１の断片である。好ましい断片又はペプチドは、配列番号１のうちの少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２の連続するアミノ酸を含む。実施例３においては、Ｌ１９の３つの領域及びＬ１９由来の特定のペプチドは、ＩＬ−１０の産生を誘導することができると同定されている。Ｌ１９の好ましい領域は、
配列番号３１、３２及び／又は５５を有するペプチドを含む領域１、
配列番号４２、４３、４４及び／又は５６を有するペプチドを含む領域２、
配列番号５３、５４及び／又は５７を有するペプチドを含む領域３
である。
【００３１】
本発明者らは配列番号１のこれらのペプチド又は断片を以下にさらに詳細に定義する。配列番号１の少なくとも１４の連続するアミノ酸を含む及び配列番号３１、３２、５５、４２、４３、４４、５６、５３、５４及び／又は５７を含む配列番号１のタンパク質断片。
【００３２】
配列番号１のさらに好ましい断片は、配列番号３１又は３２又は４２又は４３又は４４又は５３を含み、配列番号１由来の最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０の連続するアミノ酸を含む。前記断片は、配列番号３１又は３２又は４２又は４３又は４４又は５３を含んでいてもよく、最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０のアミノ酸の長さを有していてもよい。前記断片は、好ましくは配列番号３１又は３２又は４２又は４３又は４４又は５３からなる。
【００３３】
配列番号１の別のさらに好ましい断片は、配列番号５４を含み、配列番号１由来の最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５又は１４の連続するアミノ酸を含む。前記断片は配列番号５４を含んでいてもよく、最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５又は１４のアミノ酸の長さを有していてもよい。前記断片は好ましくは配列番号５４からなる。
【００３４】
配列番号１のさらに好ましい断片は、配列番号５７を含み、配列番号１由来の最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５の連続するアミノ酸を含む。前記断片は配列番号５７を含んでいてもよく、最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５のアミノ酸の長さを有していてもよい。前記断片は好ましくは配列番号５７からなる。
【００３５】
配列番号１のさらに好ましい断片は、配列番号５５を含み、配列番号１由来の最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１の連続するアミノ酸を含む。前記断片は配列番号５５を含んでいてもよく、最大４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１のアミノ酸の長さを有していてもよい。前記断片は好ましくは配列番号５５からなる。
【００３６】
配列番号１のさらに好ましい断片は、配列番号５６を含み、配列番号１由来の最大５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２の連続するアミノ酸を含む。前記断片は配列番号５６を含んでいてもよく、最大５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２のアミノ酸の長さを有していてもよい。前記断片は好ましくは配列番号５６からなる。
【００３７】
本明細書で同定される配列番号１の好ましい断片のそれぞれは、好ましくは本明細書で前に定義された抗炎症応答を誘導することができる。
【００３８】
Ｌ１９の供給源は、タンパク質、タンパク質の消化物及び／又はその断片でもよく、精製された形態でも、好ましくは、細菌溶解物、酵母溶解物、真菌溶解物、細菌上清、酵母上清、真菌上清、超音波処理物又はフィクセート（ｆｉｘａｔｅ）などの生物由来の粗製の組成物内に含まれていてもよい。代わりに、Ｌ１９供給源は化学的に合成されても又は無細胞系においてインビトロで若しくは細胞系において酵素的に産生されてもよい。Ｌ１９タンパク質又はその断片の供給源は、ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型由来の、前記タンパク質又はその断片をコードする核酸であってもよい。前記ＲＮＡ又はＤＮＡ分子は「裸の」ＤＮＡであり、好ましくは小胞若しくはリポソームに含まれていてもよく、又はベクターに含まれていてもよい。前記ベクターは、当技術分野で公知のいかなる（組換え）ＤＮＡ又はＲＮＡベクターでもよく、好ましくはプラスミドであり、潜在抗原をコードする遺伝子は、コードされたメッセンジャーを発現及び翻訳する調節配列に動作可能に連結されている。前記ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、変異ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）若しくは鶏痘ウイルスなどのしかしこれらに限定されないいかなるＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスでも、又は前記ポリペプチドを選択された対象に発現させることができる他の任意のウイルスベクターでもよい。ＤＮＡベクターは、エピソーム複製ベクターなどの非組込み型でもよいし、ランダム組込みにより又は相同組換えにより宿主ゲノムに組み込むベクターでもよい。
【００３９】
本発明に従って使用するための本明細書で定義されるＬ１９供給源又は組成物は、炎症性障害に冒されている若しくはこれを発症する危険のある個体の細胞、組織及び／若しくは器官にインビトロ投与するのに適していてもよいし、並びに／又はそのような個体の細胞、組織及び／若しくは器官にインビボ若しくはエクスビボ投与するのに適していてもよいし、並びに／又はそのような個体にインビボ投与するのに適していてもよい。使用される供給源の種類（タンパク質ベース又は核酸ベース）に応じて、当業者であればどの種類の製剤が適切であるかを承知している。Ｌ１９供給源はそのようなもの（裸のタンパク質又は核酸）として投与してもよい。代わりに、核酸ベースの供給源は、本明細書で定義される核酸構築物を使用して投与することができる。本明細書で定義される前記Ｌ１９供給源又は組成物は、炎症性障害に冒されている若しくはこれを発症する危険のある個体の細胞、組織及び／若しくは器官に直接的に若しくは間接的にインビボで、インビトロで若しくはエクスビボで、又はそのような個体にインビボで投与してもよい。前記細胞は炎症性障害に罹っている個体の細胞であることが好ましい。前記組織は炎症性障害に罹っている個体の組織であることが好ましい。炎症性障害に応じて、所与の種類の細胞又は組織は、本発明のＬ１９供給源又は組成物を用いて処置するほうが適していることがある。たとえば、組織は皮膚、血液、腸、肺でよく、適切な細胞はこれらの組織に由来していてもよい。
【００４０】
本発明のＬ１９供給源又は組成物は、当技術分野で公知の適切な手段を使用して間接的に投与することができる。第一の実施形態において定義された核酸分子は、たとえば、前記核酸分子を含み、転写物をコードする発現ベクターの形態で個体、又は前記個体の細胞、組織若しくは器官に提供することができる。発現ベクターは好ましくは遺伝子送達媒体を介して細胞、組織、器官又は個体に導入される。好ましい実施形態では、本明細書で同定される分子の発現又は転写を促進する発現カセット又は転写カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター等である。プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノムにおける標的にされた相同組換え及び組込みに適しているプラスミドも、第一の実施形態において定義された核酸分子の送達に適切に適用することができる。
【００４１】
既にこれまで達成されている前進を考慮すると、個体、又は前記個体の細胞、組織、器官に本明細書で定義されるＬ１９供給源又は組成物を提供するための手段の改良が見込まれる。Ｌ１９供給源又は組成物を投与する場合、前記Ｌ１９供給源又は組成物は送達方法と適合する溶液に溶解されるのが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、皮内、くも膜下腔内及び／又は脳室内投与では、溶液は生理食塩水であることが好ましい。
【００４２】
本発明との関連において、対象又は個体又は患者又は動物は、ヒト又は動物を意味する。本発明の範囲内に包含されている動物は哺乳動物を含む。好ましい哺乳動物はイヌ及びネコを含む。
【００４３】
好ましい実施形態では、少なくとも１μｇのＬ１９供給源を使用して抗炎症応答を誘導する。上に与えられるＬ１９供給源の用量の範囲は、インビトロ又はエクスビボ使用のために好ましい用量である。当業者であれば、使用されるＬ１９供給源、処置される細胞、組織、器官又は対象、使用される培地並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件に応じて、使用されるＬ１９供給源の用量はさらに変化することもあるし、さらに最適化される必要があることもある。
【００４４】
Ｌ１９供給源は好ましくは薬剤であり又は薬剤として使用することを目的とする。前記薬剤は、それを必要とする対象に対して炎症性障害を予防、遅延及び／又は治療することを目的とすることがさらに好ましい。本発明との関連内で、炎症性障害はいかなる炎症性疾患若しくは状態でもあり又は炎症が所与の段階で生じるいかなる状態でもある。炎症性疾患又は状態の例には、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む）、過敏性腸症候群、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、及び非アルコール性脂肪症、糸球体腎炎などの腎炎、喘息、心内膜炎、重症筋無力症、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病（類似する他のいかなるものでも）、糖尿病、ブドウ膜炎、（１）臓器移植後の制御同種移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む炎症性肺疾患（２）、癌（４）全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ、紫外線誘発皮膚炎、アトピー性皮膚炎並びにサルコイドーシスが含まれるがこれらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用されるように、用語「肝炎」とは、少なくとも一部は、肝臓の炎症により特徴付けられる消化器疾患、状態又は障害のことである。肝炎の例には、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する肝炎、又は虚血／再潅流に関連する肝臓炎症が含まれるがこれらに限定されない。
【００４６】
さらに好ましい実施形態では、前記薬剤は処置された患者から１つ若しくは複数の症状（複数可）を軽減することができ、及び／又は処置された患者由来の細胞若しくは組織若しくは器官の１つ若しくは複数の特徴（複数可）若しくはパラメータ（複数可）は本発明のＬ１９供給源若しくは組成物を使用して改善される。炎症性疾患ごとに、当業者であれば、少なくとも１つの症状、パラメータ又は特徴、前記疾患に伴う前記パラメータ又は特徴の値及びその値のそれぞれを評価する方法を承知している。本発明の薬剤が本明細書で前に定義された抗炎症応答を誘導することができる場合、前記薬剤は、炎症性障害若しくは状態若しくは疾患の発生の予防及び／若しくは遅延並びに／又は本明細書で後に定義される処置された対象由来の細胞若しくは組織の１つ若しくは複数の特徴（複数可）若しくはパラメータ（複数可）の改善をすることができると言われる。
【００４７】
下に、それぞれ関節リウマチ、乾癬及び炎症性腸疾患に特異的なパラメータを与えている。
【００４８】
関節リウマチは全身性疾患であり、関節炎のもっとも一般的形態の１つである。関節リウマチは、苦痛、凝り、温感、発赤及び腫脹を引き起こす関節を覆う膜の炎症により特徴付けられる。
【００４９】
当技術分野ではＲＡのいくつかの動物モデルが公知である。一例は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルであり、マウスはヒト関節リウマチによく似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡはＲＡと類似の免疫学的及び病理学的特長を共有するので、このためにＣＩＡはＲＡに対する潜在的治療をスクリーニングするのに適したモデルとなっている。このモデルでは、病変形成の基本的機序は、既に決定されている免疫媒介関節炎に関係する様々な免疫学的及び炎症パラメータを用いて分かっている。これらのパラメータを使用してＣＩＡモデルにおいて化合物有効性を評価することができる（５）。
【００５０】
ＲＡは、対象に関するいくつかのパラメータ及び症状の測定を含む疾患活動性スコア（ＤＡＳ）又は関連ＤＡＳ２８（６）の指標を評価した後で診断するのが好ましい。前記指標の評価は、対象を検査している医師により実行されてもよい。さらに好ましい実施形態では、前記薬剤がＤＡＳ又はＤＡＳ２８の著しい変化を誘導することができる場合は、前記薬剤は処置された患者から１つ若しくは複数の症状（複数可）を軽減することができ、及び／又は処置された患者由来の細胞若しくは組織若しくは器官の１つ若しくは複数の特徴（複数可）若しくはパラメータ（複数可）は本発明のＬ１９供給源又は組成物を使用して改善される。関節リウマチを評価する他の方法は、（６）及び（７）にも記載されている。本明細書で定義される薬剤は、本発明のＬ１９供給源又は組成物を使用する少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長期の治療後であれば１つのパラメータを改善することができる。前記パラメータの値は、治療の開始前の前記パラメータの値と比べて少なくとも１％、２％、５％、１０％又はそれよりも多く改善されていることが好ましい。
【００５１】
本明細書で定義される薬剤は、本発明のＬ１９供給源又は組成物を使用する少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長期の治療後に前記症状又は特徴がもはや検出されなくなれば、患者の又は前記患者の細胞、組織若しくは器官の１つの症状又は１つの特徴を軽減することができる。
【００５２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む結腸及び小腸の炎症状態の群である。潰瘍性大腸炎は結腸の炎症により特徴付けられ、頻繁に結腸排泄を生じ、下痢と関連腹痛、発熱及び体重減を生じる。結腸の内層は損傷を受け、粘液、膿及び血液を放出する潰瘍を形成する。エピソードが繰り返されると、瘢痕組織の形成及び結腸組織の死、又は重病を伴う敗血症が生じることがある。現在の治療は結腸内層における異常な炎症過程を抑制することに焦点を合わせている。
【００５３】
ヒトＩＢＤ、潰瘍性大腸炎及び特にクローン病に対するよく特徴付けられた動物モデルは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデルである。大腸炎はＴＮＢＳの直腸内投与により誘導される。これにより結腸粘膜においてＴ細胞媒介免疫応答が誘導され、大腸の壁全体を通じたＴ細胞及びマクロファージの浸潤により特徴付けられる、広範囲の粘膜炎症が生じる。組織病理学的性質は、漸進性体重減少、血性下痢、大腸壁肥厚を伴う（８）。結腸炎症の現在の動物モデルは、ヒトにおける疾患の複雑さを十分には反映していないが、治療化合物の有効性を評価するには価値あるツールである。
【００５４】
乾癬は、古い皮膚が十分に速く脱落していない場所で新しい皮膚細胞が異常に増殖し、皮膚の炎症性、腫脹及び鱗状斑を生じる一般的な慢性皮膚疾患である。もっとも一般的な形態は、尋常性乾癬であり、銀白色の鱗で覆われた病変に特徴付けられる。乾癬は数種の病変に限定されることもあれば、広い面積の皮膚を伴うこともあり、もっとも一般的には膝、肘、頭皮及び体幹に現れる。軽症の乾癬は局所適用により扱われる。しかし、もっと重症な場合には不便な紫外線療法、又は中毒性副作用のため、長期使用では価値が限られることが多い全身性免疫抑制療法の使用が必要である。さらに、免疫抑制療法をやめた直後を含めて乾癬は再発することが多い。
【００５５】
潜在的疾患モジュレータの評価のためのいくつかの疾患モデルが開発されている。１つのそのようなモデルは、ヒト乾癬皮膚が重症免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植されている乾癬のためのインビボ異種移植片モデルである。炎症を消滅させる又は減少する療法は、ＳＣＩＤマウスに露出しているヒト炎症組織に投与することにより試験することができる。治療の有効性は指標の範囲により評価することができる。乾癬は、対象に関するいくつかのパラメータ及び症状の測定値を含む、乾癬域と重症度インデックス（ＰＡＳＩ）、医者総合評価（ＰＧＡ）（９）又はＮＰＦ乾癬スコア（ＮＰＦ−ＰＳ）の指標を評価した後に診断されるのが好ましい疾患である。前記指標の評価は対象を検査している医師により実行されてもよい。さらに好ましい実施形態では、前記薬剤がＰＡＳＩ、ＰＧＡ又はＮＰＦ−ＰＳの著しい変化を誘導することができる場合は、前記薬剤は処置された患者から１つ若しくは複数の症状（複数可）を軽減することができ、及び／又は処置された患者由来の細胞若しくは組織若しくは器官の１つ若しくは複数の特徴（複数可）若しくはパラメータ（複数可）は本発明のＬ１９供給源又は組成物を使用して改善される。乾癬を評価する他の方法には、皮膚疾患生活質インデックス（ＤＬＱＩ）（１０）及び（１１）にも記載されているサルフォード乾癬インデックス（ＳＰＩ）が含まれる。本明細書で定義される薬剤は、本発明のＬ１９供給源又は組成物を使用する少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長期の治療後であれば１つのパラメータを改善することができる。前記パラメータの値は、治療の開始前の前記パラメータの値と比べて少なくとも１％、２％、５％、１０％又はそれよりも多く改善されていることが好ましい。
【００５６】
本明細書で定義される薬剤は、本発明のＬ１９供給源又は組成物を使用する少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長期の治療後に前記症状又は特徴がもはや検出されなくなれば、患者の又は前記患者の細胞、組織若しくは器官の１つの症状又は１つの特徴を軽減することができる。
【００５７】
本明細書で定義される好ましいＬ１９供給源は、個体における炎症性障害を予防する又は治療することを目的とする。そのようなＬ１９供給源を使用して治療することができる個体は、炎症性障害に罹っていると既に診断されていてもよい。代わりに、そのようなＬ１９供給源を使用して治療することができる個体は、炎症性障害に罹っているとまだ診断されてはいないが、その遺伝的背景を考慮すると将来炎症性障害を発症する危険が増加している個体であってもよい。好ましい個体はヒトである。
【００５８】
組成物
さらなる態様では、本明細書で定義されるＬ１９供給源を含む組成物が提供される。好ましい実施形態では、前記組成物は好ましくは医薬組成物であり、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体、塩、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。
【００５９】
いかなる薬学的に許容される担体、充填剤、塩、保存剤、安定化剤、希釈剤及び／又は賦形剤でも含んでいてよいそのような医薬組成物も提供される。そのような薬学的に許容される担体、充填剤、塩、保存剤、安定化剤、希釈剤及び／又は賦形剤は、たとえば（１２）に見出すことができる。前記組成物のそれぞれの特長は本明細書で前に定義済みである。
【００６０】
いくつかのＬ１９供給源が使用される場合、本明細書で定義される用量とは、使用される全てのＬ１９供給源の総用量、又は使用される若しくは添加されるそれぞれのＬ１９供給源の用量のことであってもよい。したがって、一実施形態では、使用されるＬ１９供給源のそれぞれ又は総量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの量で投与される組成物が提供される。
【００６１】
本発明において特に好ましいのは、本明細書で定義される成分のそれぞれの細胞への及び／又は細胞内への送達に役立つことになる賦形剤の使用である。本明細書で定義されるそれぞれの成分を複合体で又は小胞若しくはリポソームに閉じ込めて細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞、リポソーム、プロテオリポソーム及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができる賦形剤が好ましい。これらの賦形剤の多くは当技術分野では公知である。適切な賦形剤には、本明細書で定義されるそれぞれの成分を細胞へ送達することができる粒子に自己組織化することが可能なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む類似のカチオンポリマー、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチンＴＭ、ＤＯＴＡＰ並びに／又はウイルスカプシドタンパク質が含まれる。
【００６２】
その属性に依存して、当業者であれば、本明細書で定義される成分ごとにどの種類の製剤がもっとも適切かを承知している。好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＬ１９供給源を含む部分のキットの形態である組成物又は調製物を提供する。
【００６３】
本明細書で定義される医薬又は薬剤又は医薬組成物は、局所的に又は全身的に投与してもよい。薬剤は好ましくは、非経口的に、たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、動脈内又は病巣内経路により注射又は注入によって投与される。好ましい投与様式は皮下又は経皮である。経皮投与の例はクリームである。本発明は、本明細書で定義される薬剤又はＬ１９供給源又は組成物の特定の投与様式に限定されない。好ましい投与様式は、カプセル又は錠剤を使用する経口投与である。代わりに、本明細書で定義される薬剤又はＬ１９供給源又は組成物は、カテーテル又はポンプ又は坐薬又はクリームを介して局所的に投与してもよい。代わりに、本明細書で定義される薬剤又はＬ１９供給源又は組成物は局所的に投与されてもよい。本明細書で定義される薬剤又はＬ１９供給源又は組成物の製剤は、目的とする投与及び（治療的）適用様式に依存する。医薬担体は、前記化合物を対象に送達するのに適したいかなる適合性非毒性物質でも可能である。たとえば、減菌水又は不活性固体若しくは賦形剤を、通常、薬学的に許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤等で補完して、担体として使用してもよい。組成物は、液体、たとえば前記化合物若しくは前記化合物を含む組成物の安定化された懸濁液、又は固体及び／若しくは乾燥形態、たとえば粉末のどちらかになる。経口及び直腸内投与では、前記化合物は、カプセル、錠剤、坐薬及び粉末などの固体剤形で、又はエリキシル、シロップ、クリーム、軟膏及び懸濁液などの液体剤形で投与することができる。別の形態は、前記化合物が液状形態としてパッチなどの固体支持体内に又は上に存在している半固体又は半液体形態でもよい。
【００６４】
組成物は、本明細書で既に定義されている液体、固体又は半液体若しくは半固体形態でもよい。
【００６５】
好ましい実施形態では、治療又は予防処置の特異性を改善するために、他の化合物はＬ１９供給源又は組成物と順次又は同時に使用される。たとえば、処置された対象の抗炎症応答をさらに増強することになる他の化合物を使用するのは有利である。そのような化合物は、Ｌ１９供給源又は組成物と一緒の単一組成物には存在しないことがさらに好ましい。そのような化合物は、抗体、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）及び／又は（１３）の表１に記載されている誘導物質などのＩＬ−１０誘導物質でもよい。ＩＬ−１０誘導物質には、コルジセピン、金塩、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ＳＴ１９５９  ３−（２−エチルフェニル）−５−（３−メトキシフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、ＳＲ  ３１７４７Ａ、ＳＳＲ  １２５３２９Ａ、アプロチニン、リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、フマル酸モノメチル、ロリプラム又はシカプロストなどのｃＡＭＰ−上昇剤、カテコールアミン、ビタミンＤ３、ｎ−３多価不飽和脂肪酸を含む魚油、エステリオール性ホルモン、ＫＭ  ２２１０又はベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βなどのＩ型ＩＦＮ、酢酸グラチラマーとしてのミミック自己抗原（コポリマーＩ）、ピリミジルピペラジン又はその誘導体、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）尿素二塩化水素化物、５’−メチルチオアデノシン及び５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピリジン−オンなどのピルフェニドンからなる群から選択される化合物が含まれる。
【００６６】
使用
さらなる態様では、個体における炎症性障害を予防する又は治療することための薬剤の製造における本明細書で定義されるＬ１９供給源の又は組成物の使用が提供される。前記使用のそれぞれの特長は本明細書で前に定義されている。
【００６７】
本発明に従った使用における、又は方法における処置は、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも数ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年又はそれよりも長期である。本発明に従って使用するための本明細書で定義されるそれぞれのＬ１９供給源は、炎症性障害に冒されている又はこれを発症する危険のある個体の細胞、組織及び／又は器官への直接的インビボ、インビトロ又はエクスビボ投与に適していることがあり、前記個体へ直接的にインビボで投与してもよい。本発明のＬ１９供給源又は組成物の投与頻度は、患者の年齢、分子の数（すなわち、用量）、前記分子の製剤などのいくつかのパラメータに依存することがある。前記頻度は、毎日、毎週又は２週間若しくは３週間若しくは４週間若しくは５週間若しくはもっと長い期間に少なくとも１回の幅を持たせてもよい。
【００６８】
方法
さらなる態様では、個体において、前記個体の細胞、組織若しくは器官において炎症性障害の１つ若しくは複数の症状（複数可）を軽減するため又は個体若しくは前記個体の細胞、組織若しくは器官の１つ若しくは複数の特徴（複数可）若しくは症状（複数可）を軽減するための方法であって、本明細書で定義されるＬ１９供給源又は組成物を前記個体に投与することを含む方法が提供される。
【００６９】
一実施形態では、前記方法は、たとえば細胞培養物又は組織培養物を使用してインビトロで実施される。前記方法はエクスビボでもよい。前記方法はインビボであることが好ましい。これらの方法のそれぞれの特長は本明細書で既に定義されている。本発明の方法では、Ｌ１９供給源は、個体における炎症性障害を治療するために使用されることが分かっている追加の化合物と組み合わせてもよい。そのような化合物は、抗体、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）及び／又は（１３）に記載されているＩＬ−１０誘導物質でもよい。好ましいＩＬ−１０誘導物質は本明細書で前に既に同定されている。
【００７０】
定義
核酸分子
核酸分子はｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡでもよい。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖でもよく、一本鎖の場合はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖でもよい。安定性のために又は他の理由で骨格が改変されているＤＮＡ又はＲＮＡは本発明の追加の一部である。核酸分子はヌクレオチド配列により表される。ヌクレオチド配列は、本発明に従ったヌクレオチド配列の対立遺伝子バリアントであってもよい。必要であれば、ヌクレオチド配列は、目的の発現宿主の公知のコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を有利に使用することができるように、合成的に調製される又は変更されることができる。核酸分子のサイズに応じて、核酸分子はオリゴヌクレオチドであると同定することができる。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７１】
ポリペプチド
本明細書で使用される「ポリペプチド」とは、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物又はタンパク質のことである。ポリペプチドはアミノ酸配列により表される。ポリペプチドは、２〜２６７（すなわち、配列番号１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７又は２９の長さ）又は５〜２６５又は８〜２６０又は１０〜２５０アミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチドは２６７を超えるアミノ酸を含んでいてもよい。用語「ポリペプチド」は、天然に存在する又は合成分子を包含する。オリゴペプチドは２〜２０アミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドは５〜１０又は５〜２０又は５〜３０又は５〜５０アミノ酸を含んでいてもよい。
【００７２】
同一性／類似性
「配列同一性」は、配列を比較することにより決定される場合、２つ若しくはそれよりも多いアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質又はペプチド又はタンパク質断片）配列又は２つ若しくはそれよりも多い核酸（ポリヌクレオチド、核酸又はヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド）配列間の関係として本明細書では定義される。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の完全長に又はその部分に基づいて計算される。その一部は好ましくは、両方の配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味する。当技術分野では、「同一性」は、場合により、一連のそのような配列間の一致により決定される場合、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。
【００７３】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、ＰａｒｔＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ、４８：１０７３（１９８８））に記載されている方法を含むがこれらに限定されない公知の方法により容易に計算することができる。
【００７４】
同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムに成文化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、たとえば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の情報源から公開されている（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００７５】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータにはアルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＳＵＭ６２  ｆｒｏｍ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５〜１０９１９（１９９２）；ギャップペナルティ：１２；及びギャップ長ペナルティ：４が含まれる。これらのパラメータを用いると有用なプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公開されている。前述のパラメータはアミノ酸比較のためのデフォルトパラメータである（エンドギャップにはペナルティなしと併せて）。
【００７６】
核酸比較のための好ましいパラメータにはアルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３が含まれる。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓからＧａｐプログラムとして利用可能である。核酸比較のためのデフォルトパラメータは上に与えられている。
【００７７】
場合により、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者であれば、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよく、これは当業者には明らかになることである。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性のことである。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれその場所に異なる残基が挿入されている置換バリアントである。アミノ酸変化は保存的であることが好ましい。天然に存在するアミノ酸ごとの好ましい保存的置換は以下の通りであり、Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；Ｖａｌからｉｌｅ又はｌｅｕである。
【００７８】
ハイブリダイゼーション条件
核酸分子のハイブリダイゼーション条件は、低又は中程度又は高厳密性を有していることがある（サザンブロッティング法）。低又は中程度又は高厳密性条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％  ＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ並びに低又は中程度又は高厳密性それぞれに２５％又は３５％又は５０％ホルムアミドのいずれか中、４２℃での前ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。これに続いて、ハイブリダイゼーション反応は、それぞれ２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ及び低又は中程度又は高厳密性それぞれに５５℃又は６５℃又は７５℃のいずれかを使用して、３０分間３回洗浄される。
【００７９】
核酸構築物／発現／制御配列
核酸構築物は、本明細書で定義されるタンパク質又はタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書で定義される所与のタンパク質又はタンパク質断片をコードする核酸分子を含む核酸構築物は、処置された対象において所与の核酸分子を及び対応するタンパク質又はタンパク質断片を確実に発現することになる。さらに好ましい実施形態では、核酸構築物は１つよりも多い核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は所与のタンパク質又はタンパク質断片をコードする。さらに好ましい実施形態では、核酸構築物は、２つ、３つ、４つの核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は所与のタンパク質又はタンパク質断片をコードする。好ましい実施形態では、核酸構築物は発現カセットを含み、前記発現カセットはそれぞれの必要な核酸分子を含む。それぞれの核酸分子は、存在する他の核酸分子と動作可能に連結されている。もっとも好ましくは、適切なプロモーターは発現カセットと動作可能に連結されて、対象において核酸分子を確実に発現する。
【００８０】
「動作可能に連結された」は、制御配列が、細胞及び／又は対象において本発明のポリペプチドの産生／発現を指令するように、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関連する位置に適切に置かれている配置として本明細書では定義される。
【００８１】
発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むがこれらに限定されないポリペプチドの産生に関与するいかなるステップも含むと理解されることになる。
【００８２】
制御配列は、ポリペプチドの発現に必要又は有利である全ての成分を含むと本明細書では定義される。最小では、制御配列は、プロモーター並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。場合により、核酸構築物に存在するヌクレオチド配列により表されるプロモーターは、本明細書で同定された核酸分子をコードする別のヌクレオチド配列に動作可能に連結されている。
【００８３】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を都合よく受けることができ、細胞及び／又は対象において本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることができるいかなるベクターでもよい。本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置していて、１つ又は複数の遺伝子又は核酸の転写を制御するよう機能し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位並びに転写因子結合部位、リプレッサーとアクチベータータンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を直接的に又は間接的に調節するよう作用することが当業者には公知である他のいかなるヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない他の任意のＤＮＡ配列の存在により同定される結合部位に関係する核酸断片のことである。本発明との関連では、プロモーターは好ましくは、転写開始部位（ＴＳＳ）のヌクレオチド−１で終わる。
【００８４】
他の方法で指示されていなければ、本明細書に記載されるそれぞれの実施形態は本明細書に記載される別の実施形態と組み合わせてもよい。
【００８５】
本明細書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用は非限定的な意味で使用されて、前記単語の後に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が除外されないことを意味する。さらに、動詞「からなる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書で定義されるＬ１９供給源又は組成物が具体的に同定されている成分以外の追加の成分（複数可）を含んでもよく、前記追加の成分（複数可）は本発明の類のない特徴を変更しないことを意味する「本質的に〜からなる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」で置き換えてもよい。
【００８６】
さらに、不定冠詞「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が前記要素が１つ及び１つだけ存在することを要求していなければ、１つよりも多い前記要素が存在する可能性を排除しない。このように、不定冠詞「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００８７】
単語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」又は「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値と関連して使用される場合（およそ１０、約１０）、好ましくは前記値が１０よりも１％多い又は１％少ない所与の値であってもよいことを意味する。
【００８８】
本明細書に引用される全ての参考特許及び参考文献は、これによって参照によりその全体を組み込まれる。本明細書で同定されるそれぞれの実施形態は、他の方法で指示されなければ互いに組み合わせてもよい。
【００８９】
本発明は以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を明確にする働きをするだけである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ｈｉｓ−ＬｍＬ１９の精製を示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ｒＬｍＬ１９タンパク質の精製の異なるステップを示している。（１）分子量標準。カラム通過後（２）及び前（３）の全細菌抽出物。（４）精製されたタンパク質。
【図２ａ】ＬｍＬ１９を用いてインビトロで刺激された無処置のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の脾細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生を示す図である。スチューデントｔ検定により実施された統計解析後に得られたＰ値が示されている。ＬｍＬ１９又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激細胞間のサイトカイン産生における差は、Ｐ＜０．０５＊）の場合には有意であると考えられた。
【図２ｂ】ＬｍＬ１９を用いてインビトロで刺激された無処置のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の脾細胞によるＩＬ−１０産生を示す図である。スチューデントｔ検定により実施された統計解析後に得られたＰ値が示されている。ＬｍＬ１９又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激細胞間のサイトカイン産生における差は、Ｐ＜０．０５＊）の場合には有意であると考えられた。
【図３ａ】ＬｍＬ１９を用いてインビトロで刺激された健康なヒトドナー（ｎ＝３）のＰＢＭＣａによるＩＦＮ−ガンマ産生を示す図である。スチューデントｔ検定により実施された統計解析後に得られたＰ値が示されている。ＬｍＬ１９又はＣｏｎＡ刺激細胞間のサイトカイン産生における差は、Ｐ＜０．０５＊）の場合には有意であると考えられた。
【図３ｂ】ＬｍＬ１９を用いてインビトロで刺激された健康なヒトドナー（ｎ＝３）のＰＢＭＣａによるＩＬ−１０産生を示す図である。スチューデントｔ検定により実施された統計解析後に得られたＰ値が示されている。ＬｍＬ１９又はＣｏｎＡ刺激細胞間のサイトカイン産生における差は、Ｐ＜０．０５＊）の場合には有意であると考えられた。
【図４】ＭＢＰ−ＬｍＬ１９組換えタンパク質の略図である。
【図５】２４時間のインキュベーション後の異なる研究群のＴＮＦαの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。値は平均±標準偏差として表されている。＃；ｐ＜０．００５、対照群と比べた照射なしの試験群。＊；ｐ＜０．００５、対照／ＵＶ群と比べた照射された試験群。
【図６】２４時間のインキュベーション後の異なる研究群のＩＬ−１０の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。値は平均±標準偏差として表されている。＃；ｐ＜０．００５、対照群と比べた照射なしの試験群。＊；ｐ＜０．００５、対照／ＵＶ群と比べた照射された試験群。
【図７】ＬｍＬ１９ペプチドＩＬ−１０産生を示す図である。細胞は本文に指示されている通りに得られ培養された。培養物上清中のＩＬ−１０のレベルはＥＬＩＳＡにより解析された。アッセイは３頭の無処置のマウスから得られたプールされた細胞を使用して１回実施された（２連でアッセイした）。＊それぞれの群が非刺激細胞と比較された場合Ｐ＜０．０５。
【００９１】
［実施例］
実施例１
クローニング及び発現
遺伝子はＬ．メジャーゲノムデータベースにおけるインシリコ検索後に特徴付けられた。配列に基づいて、２つのオリゴヌクレオチドが合成され（下参照）、Ｌ．メジャー［クローンＶＩ（ＭＨＯＭ／ＩＬ／８０（Ｆｒｉｅｄｌｉｎ）］寄生虫から抽出されたＤＮＡを使用するＰＣＲのためのプライマーとして用いられた。得られたＤＮＡはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの対応する部位へクローニングされ、塩基配列決定された。得られたＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列はそれぞれ下に示されている。
【００９２】
Ａ．用いられたオリゴヌクレオチド
ＬｍＬ１９Ｄ：ｃｇＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣ（配列番号３）（下線が施されたＢａｍＨＩ切断部位はクローニング目的で含められた）。
ＬｍＬ１９Ｒ：ｃｃｃＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号４）（下線が施されたＨｉｎｄＩＩＩ切断部位はクローニング目的で含められた）。
【００９３】
Ｂ．核酸配列。（制限酵素切断部位が含まれ、斜字体及び下線でマークされている。これらの部位は、リーシュマニア・メジャー又はＬｍ由来のＬ１９をコードする核酸分子には属していない。）
【００９４】
ＬｍＬ１９の配列解析（配列番号２は、クローニング目的で加えられた下線を施した配列のない下の配列である。）
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡ  ＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣ  ＴＣＣＣＧＣＣＡＣＡ  ＧＴＴＴＴＡＡＧＣＡ  ＧＡＡＣＧＡＡＡＣＧ  ＣＡＧＡＡＣＡＴＧＧ  ＴＧＴＣＴＣＴＧＡＡ  ＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴ  ＣＧＣＣＴＴＧＣＧＴ  ＣＧＡＧＣＡＴＣＣＴ  ＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣ
ＣＧＣＧＣＣＣＧＣＧ  ＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡ  ＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡ  ＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣ  ＧＡＡＣＴＣＧＣＧＣ  ＡＡＧＡＧＣＧＴＧＣ  ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴ  ＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣ  ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣ  ＧＣＡＡＧＣＣＧＧＴ  ＧＡＡＧＧＴＧＣＡＣ  ＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡ  ＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＧＡＣＡ  ＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡ  ＣＡＡＣＧＧＣＧＴＴ  ＧＧＧＣＧＣＣＧＣＧ  ＡＧＧＧＴＡＧＣＣＧ  ＣＧＡＧＧＣＣＣＧＣ  ＡＴＧＣＣＧＡＧＣＡ  ＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧ  ＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣ  ＣＴＧＣＧＣＡＴＴＣ  ＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴ  ＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧ  ＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧ  ＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴ  ＴＧＡＣＣＧＣＣＡＣ
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ＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧ  ＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＣＧＣＣＡＣＧＡＡＧ  ＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧ  ＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣ  ＣＡＣＧＡＡＧＧＧＴ  ＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧ  ＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣ  ＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡ  ＡＡＧＣＴＴ
【００９５】
Ｃ．推定されるアミノ酸配列（配列番号１）
ＭＴＰＬＳＬＳＳＳＲ  ＨＳＦＫＱＮＥＴＱＮ  ＭＶＳＬＫＬＱＡＲＬ  ＡＳＳＩＬＧＣＧＲＡ  ＲＶＷＬＤＰＮＥＡＶ  ＥＩＱＮＡＮＳＲＫＳ  ＶＲＫＬＩＫＤＧＦＩ  ＩＲＫＰＶＫＶＨＳＲ  ＡＲＷＲＫＭＫＥＡＫ  ＤＭＧＲＨＮＧＶＧＲ  ＲＥＧＳＲＥＡＲＭＰ  ＳＫＥＬＷＭＲＲＬＲ  ＩＬＲＲＬＬＲＫＹＲ  ＡＤＫＫＩＤＲＨＶＹ  ＲＤＬＹＭＲＡＫＧＮ  ＶＦＲＮＫＲＮＬＶＥ  ＨＩＨＫＩＫＮＥＫＫ  ＫＥＲＱＬＡＥＱＬＡ  ＡＫＨＬＲＤＥＱＮＲ  ＮＫＡＲＫＱＥＬＫＫ  ＲＥＫＥＲＥＲＡＲＲ  ＤＤＡＡＡＡＡＱＫＫ  ＫＡＤＡＡＫＫＳＡＡ  ＰＡＡＫＳＡＡＰＡＡ  ＫＡＡＡＰＡＴＫＡＡ  ＡＡＡＰＡＴＫＧＡＡ  ＰＶＫＫＳＫＫ＊
【００９６】
ＬｍＬ１９をコードするＤＮＡは、６×ヒスチジンに融合された組換えタンパク質の獲得を可能にするｐＱＥ−３０原核生物発現プラスミドのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングされた。
【００９７】
組換えプラスミドで形質転換されたエシェリキア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｍ１５株）培養物は、組換えタンパク質の発現のために用いられた。最初のアッセイは３７℃で実行されたが、タンパク質が細菌内で分解されているのが観察された。その理由で、タンパク質分解を減少させるために培養物は３０℃で誘導された。これらの条件では、無傷の組換えタンパク質の低産生が観察された。したがって、ｒＬｍＬ１９は変性条件下で親和性クロマトグラフィーにより精製された。得られた精製タンパク質は低いほうの分子量でいくつかの分解バンドを示している（図１）。組換えタンパク質はポリミキシン−アガロースカラムを通過させてエンドトキシンを取り除いた。
【００９８】
組換えｒＬｍＬ１９を用いたマウス脾臓細胞の刺激
脾臓組織からの単細胞調製物は、５×１０６細胞／ｍｌで２４ウェルプレートにデュプリケートで播かれた。細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び１０％熱不活化胎仔ウシ血清単独（バックグラウンド対照；培地）を補充された完全ＲＰＭＩ培地中でインキュベートされ又はｒＬｍＬ１９（１２μｇ／ｍｌ）若しくはＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２中７２時間刺激された。培養上清中のＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−１０放出はサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価された（図２）。組換えＬｍＬ１９タンパク質は非処置のマウスから得られた脾臓細胞によるＩＦＮガンマの産生なしでＩＬ−１０の特異的産生を誘導したと結論付けることができる。
【００９９】
組換えｒＬｍＬ１９を用いたヒト由来ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の刺激
ＰＢＭＣは、フィコールハイパック勾配上の通過によるヘパリン処置静脈血から得られた。ＰＢＭＣは３回洗浄され、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）及び１０％熱不活化ヒトＡＢ血清）を補充されたＲＰＭＩ中濃度５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁された。細胞は濃度５×１０６細胞／ｍｌで２４ウェル組織培養プレートに蒔かれ、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。刺激は、７２時間ｒＬｍＬ１９（２０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ）及びＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）の添加により実施された。上記の通り、培養上清中のＩＦＮガンマ及びＩＬ−１０放出はサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価された（図３）。
【０１００】
マウス脾臓細胞を用いた場合に起きたように、健康なヒトドナー由来のＰＢＭＣは組換えＬｍＬ１９を用いたインビトロ刺激後ＩＬ−１０を産生した。このサイトカインの産生は用量依存性であった。
【０１０１】
マルトース結合タンパク質との融合タンパク質としてのｒＬｍＬ１９の発現
これらの予備結果は、ｒＬｍＬ１９タンパク質はヒト及びマウス白血球からＩＬ−１０放出を誘導することができることを示していた。組換えタンパク質の産生レベルはまだ最適ではなかった。
【０１０２】
タンパク質産生を改善するために、ＬｍＬ９タンパク質をコードするＤＮＡはｐＭａｌ−ｃ２原核生物発現ベクターにクローニングされた。このベクターは、細菌性ＭＢＰタンパク質に融合されたイー・コリにおける異種タンパク質の産生を可能にする。図４に示されるように、融合タンパク質及び異種タンパク質は、両方のタンパク質間にＸａ因子切断部位が存在するために特異的プロテアーゼ（Ｘａ因子）を使用して分離することができる。
【０１０３】
組換えプラスミドで形質転換されたイー・コリ（ＸＬ１−ブルー株）培養物は組換えタンパク質の発現のために用いられた。タンパク質は、アミロースカラムにおける自然条件下で親和性クロマトグラフィーにより精製された可溶性産物として過剰発現された。この系を使用して、さらの高レベルの組換えタンパク質が得られた（示されていない）。
【０１０４】
実施例２：皮膚研究
この研究の目的は、ヒト皮膚外植片におけるＬ１９と名付けられたタンパク質の抗炎症力を評価することであった。これは、皮膚への紫外（ＵＶ）線の照射に対するこのタンパク質の保護効率を研究するスクリーニング法により実行された。
【０１０５】
この研究の基礎は、ＵＶ線を用いた照射に対する前記産物の抗炎症力を評価する皮膚外植片での単回炎症研究の実施である。前記研究は提案された目的を達成するために以下の作業に分けられた。
【０１０６】
基本的細胞傷害性スクリーニング
単回アッセイは、効率スクリーニングにおいてアッセイされる産物の最大濃度を決定するＭＴＴ法を使用して実施された。これは、マウス線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３）の細胞代謝（細胞呼吸）に起因するテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の代謝還元に基づく比色アッセイである。ＭＴＴのこの代謝還元はミトコンドリア酵素コハク酸デヒドロゲナーゼにより引き起こされ、この酵素は青色化合物（ホルマザン）を生成し処置された細胞のミトコンドリアの機能性を決定する。生細胞の数は得られる青色に比例している。前記産物は８つの異なる濃度（それぞれの濃度の６つのレプリカ）で２４時間インキュベートされた。
【０１０７】
抗炎症効率スクリーニング
効率は、ＵＶ照射により引き起こされる炎症中に存在する２つのインターロイキンをＥＬＩＳＡ法を使用して解析する皮膚外植片上での単回アッセイにある抗炎症研究により評価された。
【０１０８】
研究群は以下の通りであった。
健康対照群。３つの皮膚外植片。これらの外植片はＵＶ線照射を受けなかった。
損傷群。３つの皮膚外植片はＵＶ線照射を受けた。
試験群。９つの皮膚外植片はＵＶ線照射を受け、次にイー・コリにおいて発現された組換えＬｍＬ１９（配列番号１）と一緒にインキュベートされた。
試験群２。９つの皮膚外植片はＵＶ線照射を受けず、次にイー・コリにおいて発現された組換えＬｍＬ１９（配列番号１）と一緒にインキュベートされた。
【０１０９】
３つの異なる産物濃度、濃度あたり３つのレプリカ（もっとも高い産物濃度は産物毒性スクリーニングにより決定された）。
【０１１０】
紫外線を用いた外植片の照射後、イー・コリにおいて発現された組換えＬｍＬ１９（すなわち、配列番号１）はインキュベートされ、２４時間後、皮膚上で紫外線により引き起こされる炎症効率に関与する２つのインターロイキン、ＩＬ−１０及びＴＮＦαを測定した。
【０１１１】
材料及び方法
細胞培養物
細胞傷害性スクリーニングのための実験系として、研究では、欧州細胞培養物コレクション（ＥＣＡＣＣ）カタログ番号８６１１０４０１のＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞株由来マウス線維芽細胞の不死化株の細胞培養物が使用された。
【０１１２】
ＥＣＡＣＣ由来の不死化線維芽細胞は、１０％ＦＣＳ（胎仔ウシ血清）を含むＤＭＥＭ培地で増殖した。解凍後、前記細胞は、５％ＣＯ２を含む湿った環境において温度３７℃、単層で培養された。この時間中、培養培地は供給業者の使用説明書に従って２〜３日ごとに変えられた。この期間後、培養フラスコがコンフルエンス８０％に到達すると、細胞はウェルあたり５０００細胞の濃度で９６ウェルプレートに分配された。
【０１１３】
エンドポイント、ＭＴＴを用いる細胞傷害性研究
細胞傷害性アッセイ中、細胞は異なる濃度のＬ１９として知られる研究産物を用いて処理された。２４時間の処理後、ＭＴＴ染色が実施された。このアッセイは３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾールブロマイド（ＭＴＴ）又はテトラゾリウム塩（黄色及び可溶性）の代謝還元に基づいており、これらの化学物質は、処置された細胞のミトコンドリア機能性を決定することができる青色の化合物（ホルマザン）を生成するミトコンドリア酵素コハク酸デハイドロゲナーゼにより生成される。この方法は細胞生存及び増殖を測定するのに広く使用されている。生細胞の数は生成されるホルマザンの量に比例している。死滅した細胞は呼吸しないので、前記酵素を出すことはなくしたがってコハク酸デハイドロゲナーゼを出すことがないために前記化学物質を還元することができない。ＭＴＴの還元が大きくなるにしたがって、色が青くなり細胞生存率も大きくなる。
【０１１４】
実験は、３Ｔ３細胞がコンフルエンス８０％で単層に増殖している９６ウェルプレート上で実施された。これらの細胞傷害性研究により、ＬＣ８０、ＬＣ５０及びＬＣ２０値を決定することができた（細胞生存率をそれぞれ８０％、５０％及び２０％減少させる産物濃度）。
【０１１５】
この作業中、不死化線維芽細胞のプレートは８つの異なる濃度のＬ１９タンパク質と一緒に２４時間インキュベートされ（１産物プレートでアッセイされる濃度あたり６レプリカ）、第二のＭＴＴアッセイ対照プレートは、毒性基準産物として８つの異なる濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（１プレートはＭＴＴと、アッセイされる濃度あたり６レプリカ）と一緒にインキュベートされた。これを使用して細胞死の標準曲線を確立した。全ての研究プレートには、少なくとも１２ウェルに健康対照として使用される線維芽細胞も播種し、３Ｔ３培養物は培養培地のみであり、Ｌ１９は研究プレートには添加されず、ＳＤＳも細胞死対照プレートには添加されなかった（ＳＤＳデータ：ＬＣ２０：０．１２４ｍｇ／ｍｌ；ＬＣ５０：０．１４２ｍｇ／ｍｌ；ＬＣ８０：０．１６３ｍｇ／ｍｌ）。
【０１１６】
ＬＥＴＩにより供給されタンパク質Ｌ１９の濃度に従って、アッセイされた最高濃度は希釈度１対２で２００μｇ／ｍｌであった。使用された最終濃度は下に列挙されている。
Ｃ２：Ｃ３：Ｃ４：Ｃ５：Ｃ６：Ｃ８：１．５６μｇ／ｍｌ
【０１１７】
インキュベーション後、プレートはＭＴＴを用いて現像され、吸光度はＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５４０ｎｍで測定された。得られた結果を使用して、研究中の産物について線維芽細胞培養物において致死濃度値ＬＣ８０、ＬＣ５０及びＬＣ２０を計算した。
【０１１８】
インターロイキン−１０及びＴＮＦα決定アッセイ
インターロイキン−１０及びＴＮＦα定量化アッセイは、皮膚外植片培養培地の上清を用いて実施された。ＩＬ−１０とＴＮＦαの両方の定量的決定は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）製造のＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）ＥＬＩＳＡキット：ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡキットＩＩを用いて実施された。
【０１１９】
Ｌ１９効率は、ヒト皮膚外植片上でのＵＶ照射により誘導されるインターロイキンの定量化により評価された。
【０１２０】
太陽シミュレーター光への曝露
皮膚試料付のプレートは、ＳＯＬ５００（Ｄｒ．Ｈｏｎｌｅ）太陽シミュレーターにより放射されるＵＶ／ｖｉｓ光に曝露された。光強度はＵＶ線メーターにより曝露過程中ずっと測定された。照射量は、５分の曝露中細胞がその強度でほぼ１Ｊ／ｃｍ２を受けることを考慮して、これらの値で調整することができる。皮膚外植片の曝露最終時間は５０分であり、１０Ｊ／ｃｍ２の照射を意味していた。
【０１２１】
研究に含まれる群は、
健康対照群。３つの皮膚外植片。これらの外植片はＵＶ線照射を受けなかった。
損傷群。３つの皮膚外植片はＵＶ線照射を受けた。
試験群。９つの皮膚外植片はＵＶ線照射を受け、次にイー・コリにおいて発現された組換えＬｍＬ１９（すなわち、配列番号１）と一緒にインキュベートされた。
試験群２。９つの皮膚外植片は照射を受けず、次にＬｍＬ１９（すなわち、配列番号１）と一緒にインキュベートされた。
【０１２２】
３つの異なる産物濃度、濃度あたり３レプリカ（最高産物濃度は産物毒性スクリーニングにより決定された）。紫外線（１０Ｊ／ｃｍ２）を用いた外植片の照射後、外植片は産物Ｌ１９と一緒にインキュベートされた。２４時間後、皮膚への紫外線、ＩＬ−１０及びＴＮＦαにより引き起こされる炎症効果に関与する２つのインターロイキンを測定した。
【０１２３】
ＩＬ−１０及びＴＮＦαは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｉｅｓにより製造されたキット中に含まれるＩＬ−１０及びＴＮＦα標準（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）ＥＬＩＳＡセット：ＩＬ−１０カタログ番号５５５１５７及びＴＮＦカタログ番号５５５２１２）のそれぞれの１００μｌ、並びに試料のそれぞれをインキュベートするのに使用される培養培地の１００μｌを添加し、全てはデュプリケートで、ＥＬＩＳＡプレート上、環境温度で２時間インキュベートすることにより定量された。次に、前記ウェルはＰＢＳを用いて洗浄され、２００μｌのコンジュゲート溶液が添加され、インキュベーションは１時間実施された。次に前記ウェルは再び洗浄され、２００μｌの基質溶液が添加され、インキュベーションは環境温度で２分間実施された。最後に、５０μｌのストッパー溶液が添加され、吸光度は５４０ｎｍを参照とし４５０ｎｍで読み取られた。吸光度結果は、基準として両サイトカインの標準を用いて得られた曲線を使用して、ＩＬ−１０及びＴＮＦαの量まで外挿された。
【０１２４】
結果及び考察
基本細胞傷害性スクリーニング
タンパク質Ｌ１９の細胞傷害性研究
効率スクリーニングにおける研究産物の最大濃度を決定するために、線維芽細胞の不死化株であるＢＡＬＢ／３Ｔ３にＭＴＴ法を使用して単回アッセイが実施され、前記細胞はウェルあたり５０００細胞のおよその密度で９６ウェルプレートに播種された。産物は８つの異なる濃度（それぞれの濃度の６レプリカ）で２４時間インキュベートされた。
【０１２５】
このアッセイの結果を使用して、ＬＣ８０、ＬＣ５０及びＬＣ２０を決定するために必要な濃度を定義した。ＬＣは物質の致死濃度である。ＬＣ８０は細胞集団の８０％が死滅する物質の濃度、ＬＣ５０は細胞集団の５０％が死滅する物質の濃度、ＬＣ２０は細胞培養物集団の２０％が死滅する物質の毒性濃度である。
【０１２６】
これらのアッセイでは、それぞれの線維芽細胞プレートは、６つの異なる活性濃度を用いて２４時間インキュベートされた。
Ｃ２：Ｃ３：Ｃ４：Ｃ５：Ｃ６：Ｃ８：１．５６μｇ／ｍｌ
【０１２７】
インキュベーション後、プレートはＭＴＴを用いた解析のために現像されて、吸光度はＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５４０ｎｍで測定された。以下の表は、統計学的有意差なしで産物ごとに（表１）得られたＬＣ８０、ＬＣ５０及びＬＣ２０を示している。
【０１２８】
【表１】
2014515924.tif 000002
【０１２９】
この細胞傷害性アッセイの結果は、１００％生存率の基準として、Ｌ１９産物と一緒にインキュベートされない健康対照培養物において得られた吸光度値を考慮に入れて得られた。細胞死の値を用いて起こるのと同じように、生存率は濃度＞１７５μｇ／ｍｌのＳＤＳ産物を用いて０％であった（ＳＤＳデータ：ＬＣ２０：０．１２４ｍｇ／ｍｌ；ＬＣ５０：０．１４２ｍｇ／ｍｌ；並びにＬＣ８０：０．１６３ｍｇ／ｍｌ）。
【０１３０】
細胞傷害性アッセイにおいて得られた結果により、次の作業、すなわちタンパク質Ｌ１９の抗炎症効率スクリーニングのために、産物の試験する最高濃度を２５μｇ／ｍｌ、並びに１２．５μｇ／ｍｌ及び６．２５μｇ／ｍｌとすることが決められた。
【０１３１】
最高濃度２５μｇ／ｍｌの選択は、ＬＣ２０を参考にしている。この値は産物の最小毒性限度であるので、皮膚上での産物のアッセイに適切である。毒性スクリーニングが線維芽細胞の単回培養で実施されたことにも注目すべきである。単一培養は常に、皮膚外植片などの器官型培養よりも産物の毒性に感受性が高い。
【０１３２】
抗炎症効率スクリーニング
ヒト皮膚外植片上へのＵＶ線照射後のタンパク質Ｌ１９の抗炎症力に関する研究
前記タンパク質の抗炎症効果を調べるために、タンパク質Ｌ１９（２５μｇ／ｍｌ、１２．５及び６．２５μｇ／ｍｌで２４時間）（ＬｍＬ１９又は配列番号１）を用いたヒト皮膚外植片の処置が実施された。研究群は、ＵＶ線を照射され後にタンパク質Ｌ１９と一緒にインキュベートされた外植片と前記産物に曝露されるがＵＶ線を照射されない外植片に分けられた。
【０１３３】
美容外科由来のヒト皮膚外植片の器官型培養物で研究は実施された。アッセイでは２つの対照群、すなわちタンパク質Ｌ１９又は太陽光照射のない培養物、及び損傷対照群、すなわち前記タンパク質はないが太陽光で照射された培養物が使用された。濃度及び条件は下に見る通りである。
対照群：通常培養条件下の皮膚外植片
Ｌ１９−２５μｇ／ｍｌ群：２４時間、２５μｇ／ｍｌのタンパク質と一緒にインキュベートされる皮膚外植片
Ｌ１９−１２．５μｇ／ｍｌ群：２４時間、１２．５μｇ／ｍｌのタンパク質と一緒にインキュベートされる皮膚外植片
Ｌ１９−６．２５μｇ／ｍｌ群：２４時間、６．２５μｇ／ｍｌのタンパク質と一緒にインキュベートされる皮膚外植片
対照／ＵＶ群：正常培養条件下でＵＶ線、１０Ｊ／ｃｍ２を照射される皮膚外植片
Ｌ１９−２５μｇ／ｍｌ／ＵＶ群：ＵＶ線（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射され、次に２４時間、２５μｇ／ｍｌのタンパク質と一緒にインキュベートされる皮膚外植片
Ｌ１９−１２．５μｇ／ｍｌ／ＵＶ群：ＵＶ線（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射され、次に２４時間、１２．５μｇ／ｍｌのタンパク質と一緒にインキュベートされる皮膚外植片
Ｌ１９−６．２５μｇ／ｍｌ／ＵＶ群：ＵＶ線（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射され、次に２４時間、６．２５μｇ／ｍｌのタンパク質と一緒にインキュベートされる皮膚外植片
【０１３４】
インキュベーション期間（２４時間）の終了時、両サイトカイン、ＩＬ−１０及びＴＮＦαの量を決定するＥＬＩＳＡ法を用いて、これらのサイトカインの定量が実施された。この作業では単回アッセイが実施され、ＬＥＴＩ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のタンパク質Ｌ１９が解析された。このアッセイではそれぞれの条件の３レプリカが使用され、それぞれのレプリカはＥＬＩＳＡ法によりデュプリケートで解析された。
【０１３５】
これらの研究群についてのＴＮＦα濃度（図５）及びＩＬ−１０濃度（図６）は、両方ともＵＶ線を照射された皮膚外植片と照射を受けていない皮膚外植片について下に示されている。図５は、皮膚外植片におけるそれが置かれた条件下でのＴＮＦαの産生を示している。
【０１３６】
対照／ＵＶ群においてＵＶ照射により生じる炎症反応（１５３．９±４４ｐｇ／ｍｌ）は照射なしの対照群（２２．９±７．３ｐｇ／ｍｌ）よりも著しく高い。これにより、皮膚外植片上への１０Ｊ／ｃｍ２のＵＶ線の照射（単一培養で、使用される照射は、通常では１Ｊ／ｃｍ２）がこの症例では炎症反応を始動させていることが示されている。この反応は、タンパク質Ｌ１９がこのレベルの照射に曝露された皮膚試料においてインキュベーション後に抗炎症効果を有するかどうかを見るのに十分である。
【０１３７】
前記グラフに示されているように、このタンパク質の統計的研究により、ＵＶ線照射後のＴＮＦαの産生は、後に２５及び１２．５μｇ／ｍｌ濃度のタンパク質Ｌ１９と一緒に（２４時間）インキュベートされた外植片において著しく減少している（それぞれ２３．３±２．８及び２５．９±４．８ｐｇ／ｍｌ）ことが示されている。Ｌ１９−６．２５μｇ／ｍｌ／ＵＶ群は、前記サイトカインの産生に著しい減少を示さなかった。
【０１３８】
一方、前記グラフは、対照群と比べてＬ１９−２５μｇ／ｍｌ、Ｌ１９−１２．５μｇ／ｍｌ及びＬ１９−６．２５μｇ／ｍｌ群（照射を受けていない）におけるＴＮＦαの産生の著しい増加も示している。上記の全てから、タンパク質Ｌ１９はある方法で皮膚に影響を与え、炎症反応を生じることができると考えられる。この最後の点はさらなる研究により実証すべきである。
【０１３９】
対照／ＵＶ群と比べた、太陽光照射された後にタンパク質Ｌ１９処理された培養物におけるＴＮＦα産生の著しい減少により、このタンパク質は抗炎症効果を有する可能性があると考えられる。
【０１４０】
図６は、皮膚外植片におけるそれが置かれた条件下でのＩＬ−１０の産生を示している。タンパク質Ｌ１９と一緒にインキュベートされた照射と非照射群両方におけるＩＬ−１０の解析により、非照射対照群と比べて、研究中のタンパク質の全ての濃度でのＩＬ−１０の産生が著しく増加していることが示された（＃；ｐ＜０．００５）。
【０１４１】
前記統計的研究では、この増加は、ＵＶ線を照射された対照群と比べて観察された程度は低く、Ｌ１９−１２．５μｇ／ｍｌ／ＵＶ群のみが、対照／ＵＶ群（２０３．１±７７）と比べて著しい増加（＊；ｐ＜０．００５）、３６３．７±２２ｐｇ／ｍｌを示している。これは、その他の２つの研究群、Ｌ１９−６．２５μｇ／ｍｌ／ＵＶ及びＬ１９−２５μｇ／ｍｌ／ＵＶ（３６６±９４及び７２４．８±２８８ｐｇ／ｍｌ）における標準偏差に起因し、このために統計的研究では０．００５の統計的有意差よりも高い差を決定している。レプリカの数が増加すれば、統計的有意差は改善されると考えられる。
【０１４２】
得られたデータによれば、抗炎症サイトカインであるＩＬ−１０の産生の増加が示されており、これはＴＮＦαについて得られた結果を実証しており、タンパク質Ｌ１９が皮膚外植片における抗炎症カスケードを始動させ、ＩＬ−１０の産生も増加している可能性がある。
【０１４３】
結論
細胞傷害性研究では、タンパク質Ｌ１９の毒性は２５μｇ／ｍｌの値よりもはるかに低かった。作業２を実施するための２５、１２．５及び６．２５μｇ／ｍｌの選択は細胞傷害性スクリーニングに基づいていた。１０Ｊ／ｃｍ２でのＵＶ線照射により、タンパク質Ｌ１９と一緒にインキュベートされていない皮膚外植片試料に著しい炎症効果が生じ、ＴＮＦαレベルとＩＬ−１０レベルの両方が顕著に増加する（皮膚における内因性抗炎症反応）。
【０１４４】
タンパク質Ｌ１９は、ＵＶ線を照射された皮膚試料においてＴＮＦαサイトカインの産生の検出可能な減少を引き起こす。
【０１４５】
タンパク質Ｌ１９は、ＵＶ線照射を受ける試料に関してもＵＶ線照射を受けない試料に関しても、前記タンパク質と一緒にインキュベートされた群全てにおいてＩＬ−１０レベルの一般的増加を生じる。
【０１４６】
得られた結果によれば、タンパク質Ｌ１９の抗炎症効果を活性化する能力は非常に高い。
【０１４７】
実施例３：ＬｍＬ１９及びＬｍＬ１９由来ペプチドのＩＬ−１０媒介産生
本研究の目的
Ｌ１９（線形エピトープ）のどの領域が脾臓培養物においてＩｌ−１０の産生を誘導することができるかを決定することである。
【０１４８】
材料
２４の異なるペプチドが設計され化学的に合成された。それぞれのペプチドはリーシュマニア・メジャータンパク質Ｌ１９（すなわち、配列番号１）の線形領域に対応している。それぞれのペプチドは、１４アミノ酸のみを含むペプチド２４を除いて、リーシュマニア・メジャーＬ１９（すなわち、配列番号１）に由来する２０アミノ酸を含む。それぞれのペプチドは前のペプチドと９アミノ酸重複している。
１：ペプチド１：ＭＴＰＬＳＬＳＳＳＲＨＳＦＫＱＮＥＴＱＮ（配列番号３１）
２：ペプチド２：ＳＦＫＱＮＥＴＱＮＭＶＳＬＫＬＱＡＲＬＡ（配列番号３２）
３：ペプチド３：ＳＬＫＬＱＡＲＬＡＳＳＩＬＧＣＧＲＡＲＶ（配列番号３３）
４：ペプチド４：ＩＬＧＣＧＲＡＲＶＷＬＤＰＮＥＡＶＥＩＱ（配列番号３４）
５：ペプチド５：ＤＰＮＥＡＶＥＩＱＮＡＮＳＲＫＳＶＲＫＬ（配列番号３５）
６：ペプチド６：ＮＳＲＫＳＶＲＫＬＩＫＤＧＦＩＩＲＫＰＶ（配列番号３６）
７：ペプチド７：ＤＧＦＩＩＲＫＰＶＫＶＨＳＲＡＲＷＲＫＭ（配列番号３７）
８：ペプチド８：ＨＳＲＡＲＷＲＫＭＫＥＡＫＤＭＧＲＨＮＧ（配列番号３８）
９：ペプチド９：ＡＫＤＭＧＲＨＮＧＶＧＲＲＥＧＳＲＥＡＲ（配列番号３９）
１０：ペプチド１０：ＲＲＥＧＳＲＥＡＲＭＰＳＫＥＬＷＭＲＲＬ（配列番号４０）
１１：ペプチド１１：ＳＫＥＬＷＭＲＲＬＲＩＬＲＲＬＬＲＫＹＲ（配列番号４１）
１２：ペプチド１２：ＬＲＲＬＬＲＫＹＲＡＤＫＫＩＤＲＨＶＹＲ（配列番号４２）
１３：ペプチド１３：ＫＫＩＤＲＨＶＹＲＤＬＹＭＲＡＫＧＮＶＦ（配列番号４３）
１４：ペプチド１４：ＹＭＲＡＫＧＮＶＦＲＮＫＲＮＬＶＥＨＩＨ（配列番号４４）
１５：ペプチド１５：ＫＲＮＬＶＥＨＩＨＫＩＫＮＥＫＫＫＥＲＱ（配列番号４５）
１６：ペプチド１６：ＫＮＥＫＫＫＥＲＱＬＡＥＱＬＡＡＫＨＬＲ（配列番号４６）
１７：ペプチド１７：ＥＱＬＡＡＫＨＬＲＤＥＱＮＲＮＫＡＲＫＱ（配列番号４７）
１８：ペプチド１８：ＱＮＲＮＫＡＲＫＱＥＬＫＫＲＥＫＥＲＥＲ（配列番号４８）
１９：ペプチド１９：ＫＫＲＥＫＥＲＥＲＡＲＲＤＤＡＡＡＡＡＱ（配列番号４９）
２０：ペプチド２０：ＲＤＤＡＡＡＡＡＱＫＫＫＡＤＡＡＫＫＳＡ（配列番号５０）
２１：ペプチド２１：ＫＡＤＡＡＫＫＳＡＡＰＡＡＫＳＡＡＰＡＡ（配列番号５１）
２２：ペプチド２２：ＡＡＫＳＡＡＰＡＡＫＡＡＡＰＡＴＫＡＡＡ（配列番号５２）
２３：ペプチド２３：ＡＡＰＡＴＫＡＡＡＡＡＰＡＴＫＧＡＡＰＶ（配列番号５３）
２４：ペプチド２４：ＰＡＴＫＧＡＡＰＶＫＫＳＫＫ（配列番号５４）
【０１４９】
エシェリキア・コリにおいて発現される全組換えリーシュマニア・メジャーＬ１９（ＬｍＬ１９）タンパク質（すなわち、配列番号１）が対照として使用された。
【０１５０】
結果
未処置ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）は、それぞれ個々のペプチド（１００μｇ／ｍｌ）で、２４ペプチドの混合物（１００μｇ／ｍｌ）で、細菌から得られた組換えリーシュマニア・メジャータンパク質（１２μｇ／ｍｌ）で刺激され（最終容積２００μｌ）及び刺激されなかった。４８時間及び７２時間後、上清が収集され、ＩＬ−１０の量が本明細書で前に記載された通りにＥＬＩＳＡにより測定された。
【０１５１】
細菌において得られた組換えＬｍＬ１９は未処置マウス由来の脾臓細胞においてＩＬ−１０合成を誘導することができた。前記ペプチドで前記タンパク質により誘導されたのと同じ量のＩＬ−１０を誘導することができたものはなかった。しかし、統計的に有意な量のＩｌ−１０が、ペプチド１、２、１２、１３、１４、２３及び２４により誘導された。
【０１５２】
誘導されたＩＬ−１０のレベルは全ての場合に刺激の７２時間後のほうが高かった。
【０１５３】
ペプチドを用いた現在の実験
得られた結果を確証するために新たに合成されたペプチドを用いて前記実験を繰り返している。これらの結果によれば、同じペプチドを使用しているが、もっとも高いＩｌ−１０レベルを誘導するペプチドの配列を含有する３つの新たなペプチドを含んでいた。これらのペプチドの組成は、
２５：ペプチド１−２：ＭＴＰＬＳＬＳＳＳＲＨＳＦＫＱＮＥＴＱＮＭＶＳＬＫＬＱＡＲＬＡ（配列番号５５）
２６：ペプチド１２−１３−１４：ＬＲＲＬＬＲＫＹＲＡＤＫＫＩＤＲＨＶＹＲＤＬＹＭＲＡＫＧＮＶＦＲＮＫＲＮＬＶＥＨＩＨ（配列番号５６）
２７：ペプチド：２３−２４：ＡＡＰＡＴＫＡＡＡＡＡＰＡＴＫＧＡＡＰＶＫＫＳＫＫ（配列番号５７）
であった。
【０１５４】
実施例４：Ｌ１９の抗炎症効果の研究のための動物モデル
目的
この研究の目的は、イー・コリにおいて発現されたＬｍＬ１９（すなわち、配列番号１）由来で、腸組織のエクスビボ培養物において試験された活性物質の抗炎症効果を試験し、クローン病の動物モデルにおいて抗炎症効果を調べることである。
【０１５５】
方法論
これらの目的を果たすために、２つの異なるステップが取られる。
１．クローン病患者由来の粘膜外植片、健康対照及び炎症がＰＭＡイオノマイシンを用いてインビトロで導入されている健康試料を用いたインビトロアッセイ。活性物質と一緒の試料の６時間インキュベーション後、上清は、ＴＮＦα、ＩＬ−１０等の炎症促進性サイトカイン、調節サイトカイン及びケモカインの存在について解析されることになる。
サイトカイン、ケモカイン、転写因子、及び炎症シグナルをコードする遺伝子の発現を解析するために、異なる組織からＲＮＡを抽出することになる。
粘膜単核細胞を得るために組織が消化されて、インキュベーション後の樹状細胞の異なる状態を研究するためにいくつかの細胞マーカーの発現が研究されることになる。活性物質に対する応答の特異性を決定するためにリンパ球集団も調査されることになる。
２．デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を有する飲料水の数日間の摂取により慢性大腸炎が動物に誘導されるマウス炎症モデルを使用する活性物質の抗炎症効果のインビボ研究。活性物質は、ＤＳＳを用いた処置前及び後に、動物の皮下に接種されることになる。腸炎症の定量的評価などの異なるパラメータが測定されて、腸病変が評価されることになる（１４）〜（２５）。
【０１５６】
【表２】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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