(57)【要約】本発明は、アクアポリン4（AQP4）に結合する抗体、およびそのような抗体を、単剤治療としてまたは免疫抑制もしくはプラスマフェレーシスなどの標準的なNMO治療と併用してのいずれかで用いる、視神経脊髄炎（NMO）を処置するための方法に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階
を含む、視神経脊髄炎（NMO）スペクトラム疾患を有する対象を処置する方法。
【請求項２】
対象がヒト対象である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
投与する段階が、眼内投与、動脈内投与、皮下投与、静脈内投与、またはくも膜下経路の投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記試薬が、エフェクター機能を欠く変異Fc領域を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
変異Fc領域が、L234A/L235A置換を有するIgG1配列を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
変異Fc領域が、K322A置換を有するIgG1配列を含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
変異Fc領域が、G237Aアミノ酸置換を有するIgG1配列を含む、請求項4記載の方法。
【請求項８】
変異Fc領域が、L234A/L235A/G237A置換を有するIgG1配列を含む、請求項4記載の方法。
【請求項９】
前記試薬がIgG4抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬が、化学的に改変されたFc領域を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が、抗体Fab断片を含み、かつFc領域を欠いている、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬が、非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬が一本鎖抗体またはF(ab')2を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
処置することが、網膜神経節細胞死、視神経損傷、脊髄損傷、または軸索離断のうちの1つまたは複数を低減させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
処置することが、視神経脱髄、脊髄脱髄、アストロサイト死、またはオリゴデンドロサイト死のうちの1つまたは複数を低減させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬が、長期間および毎日を含む複数回投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬が、NMO発作の発生時またはNMO発作後に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬が、NMO発作から約1時間、6時間、12時間、24時間、または2日以内に投与される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
NMOの1つまたは複数の局面を処置する第二の物質を対象に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
第二の物質が、前記試薬と同時に投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
第二の物質が、前記試薬の投与前または投与後に投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
抗体または抗原結合断片が、SEQ ID NO:6に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:6と80％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:8に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:8と80％の同一性を有する配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
抗体または抗原結合断片が、SEQ ID NO:10に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:10と80％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:12に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:12と80％の同一性を有する配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
抗体または抗原結合断片が、SEQ ID NO:19に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:19と80％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:17に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:17と80％の同一性を有する配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:5を含むか、またはSEQ ID NO:5と70％の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:7を含むか、またはSEQ ID NO:7と70％の同一性を有する配列を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:9を含むか、またはSEQ ID NO:9と70％の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:11を含むか、またはSEQ ID NO:11と70％の同一性を有する配列を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:20を含むか、またはSEQ ID NO:20と70％の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:18を含むか、またはSEQ ID NO:18と70％の同一性を有する配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
抗体または抗原結合断片が、rAb-53またはrAb-58との研究室での名称を有する抗体の抗原結合部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
NMO-IgG（AQP4）血清陽性に関して患者を評価する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
対象がNMO-IgG（AQP4）血清陽性を示す、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
対象が、横断脊髄炎、視神経炎、または他の関連性のない神経機能障害のうちの1つまたは複数を示す、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
関連性のない神経機能障害が、長引く悪心または嘔吐を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階
を含む、対象における視神経脊髄炎（NMO）スペクトラム疾患の増悪を予防するまたは低減させるために対象を長期間処置する方法。
【請求項３４】
抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階
を含む、対象における視神経脊髄炎（NMO）スペクトラム疾患の進行を予防または阻害する方法。
【請求項３５】
抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬。
【請求項３６】
エフェクター機能を欠く変異Fc領域を含む、請求項35記載の試薬。
【請求項３７】
変異Fc領域が、L234A/L235A置換を有するIgG1配列を含む、請求項36記載の試薬。
【請求項３８】
変異Fc領域が、K322A置換を有するIgG1配列を含む、請求項36記載の試薬。
【請求項３９】
変異Fc領域が、G237A置換を有するIgG1配列を含む、請求項36記載の試薬。
【請求項４０】
変異Fc領域が、L234A/L235A/G237A置換を有するIgG1配列を含む、請求項36記載の試薬。
【請求項４１】
IgG4抗体である、請求項1記載の試薬。
【請求項４２】
化学的に改変されたFc領域を含む、請求項1記載の試薬。
【請求項４３】
抗体Fab断片を含み、かつFc領域を欠いている、請求項1記載の試薬。
【請求項４４】
非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含む、請求項1記載の試薬。
【請求項４５】
一本鎖抗体またはF(ab')2を含む、請求項1記載の試薬。
【請求項４６】
IgG2もしくはIgG3抗体、またはその抗原結合断片である、請求項36記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2011年4月21日に提出された米国特許仮出願第61/477,955号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって与えられた助成金番号EY13574、EB00415、DK35124、HL73856、DK86125、およびDK72517の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
1．発明の分野
本発明は、全般的に医学、免疫学、神経学、および病理学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、視神経脊髄炎（NMO）の処置での使用のための免疫試薬の開発に関する。
【背景技術】
【０００４】
2．発明の背景
AQP4（アクアポリン4）は、中枢神経系全体に存在するアストロサイトにおいて発現される水チャネルであり（Lennon et al., 2005）、脳（Manley et al., 2000; Papadopoulos et al., 2004）および脊髄（Saadoun et al., 2008）における水バランス、知覚神経シグナル伝達（Li and Verkman, 2001; Lu et al., 2008）、ならびに発作の機能活動（Binder et al., 2006）および皮質拡延性抑制（Padmawar et al., 2005）およびアストロサイト遊走およびグリア性瘢痕（Saadoun et al., 2005; Auguste et al., 2007）を含む神経興奮現象に関与する。AQP4は、アストロサイトにおいて2つの主なアイソフォームとして、すなわちMet-1で翻訳を開始する長い（M1）アイソフォームおよびMet-23で翻訳を開始するより短い（M23）アイソフォーム（Hasegawa et al., 1994; Jung et al., 1994; Yang et al., 1995; Lu et al., 1996）として発現される。M23 AQP4は、膜において、凍結割断電子顕微鏡によって初めて認められた粒子直交アレイ（OAP）と呼ばれる正方形アレイとして集合する（Landis and Reese, 1974; Wolburg, 1995）。M23によるOAP形成は、その細胞質N末端のMet-23のすぐ下流の残基を含む四量体-四量体相互作用に起因するが、Met-23のすぐ上流のM1 AQP4の残基はこの相互作用を崩壊させる（Crane and Verkman, 2009）。M1はそれ自身OAPを形成しないが、ヘテロ四量体ではM23と共に集合することができ、このためにOAPのサイズは制限される（Neely et al., 1999; Furman et al., 2003; Crane et al. (2009); Tajima et al., 2010）。AQP4によるOAP形成の生物学的意義は、まだ分かっていないが、細胞-細胞接着、AQP4水透過性の増強、およびアストロサイト終足に対するAQP4分極を含む機能が推測されている。
【０００５】
神経炎症脱髄疾患である視神経脊髄炎（NMO）の決定的な特色は、AQP4に対する血清自己抗体（NMO-IgG）の存在である。NMO-IgGの存在は、NMOに特異的であり、いくつかの報告では、血清NMO-IgG力価は、NMOの疾患活動度と相関する（Matiello et al., 2008; Jarius et al., 2008）。齧歯類での試験から、NMO-IgGがNMOの病原体であることが示唆されている。ヒトNMO-IgGは、実験的自己免疫性脳脊髄炎を既に発症したラット（Bennett et al., 2009; Bradl et al., 2009）またはフロイント完全アジュバントによって前処置したラット（Kinoshita et al., 2010）において、およびヒト補体と共に注射した場合はナイーブマウスにおいて（Saadoun et al., 2010）、NMO疾患の多くの特色を生じる。これらの動物は、神経炎症、活性化補体の脈管周囲沈着、脱髄、およびアストロサイトのGFAPおよびAQP4免疫反応性の喪失を伴う特徴的なNMO病変を発症する。現在のところ、NMOの症状に対する処置は限定的であり、基礎となる炎症事象を防ぐ公知の治療はない。
【発明の概要】
【０００６】
このように、本発明に従って、抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合部分を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階を含む、視神経脊髄炎（NMO）スペクトラム疾患を有する対象を処置する方法が提供される。対象は、ヒト対象でありうる。投与は、眼内投与、動脈内投与、皮下投与、静脈内投与、またはくも膜下経路の投与を含みうる。試薬は、Fc領域においてL234A/L235Aアミノ酸置換、L234A/L235A/G237Aアミノ酸置換、および／またはK322Aアミノ酸置換を含むIgG1配列などの、エフェクター機能を欠く変異Fc領域を含みうる。試薬はまた、補体活性化などのエフェクター機能を消失させる置換をFc領域に有するIgG2またはIgG3配列を含みうる。または、試薬はIgG4抗体でありうる。試薬は化学的に改変されたFc領域を含みうる。試薬はまた、抗体Fab断片を含みかつFc領域を欠いているか、または非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含みうる。試薬はまた、一本鎖抗体またはF(ab')2を含みうる。抗体は、抗原結合領域における特定の残基を変異させることによってAQP4結合に関して最適化されうる。
【０００７】
処置することは、網膜神経節細胞死、視神経損傷、脊髄損傷、または軸索離断のうちの1つまたは複数を低減させることを含みうる。処置することは、視神経脱髄、脊髄脱髄、アストロサイト死またはオリゴデンドロサイト死のうちの1つまたは複数を低減させることを含みうる。試薬は、長期間および毎日を含む複数回投与されうる。試薬は、NMO発作の発生時またはNMO発作後に、例えば、NMO発作から約1時間、6時間、12時間、24時間、もしくは2日以内に、投与されうる。方法はさらに、NMOの1つまたは複数の局面を処置する第二の物質を対象に投与する段階を含みうる。第二の物質は、試薬と同時に、または試薬の前もしくは後のいずれかに投与されうる。方法はさらに、NMO-IgG（AQP4）血清陽性に関して患者を評価する段階を含みうる。対象は、NMO-IgG（AQP4）血清陽性を示しうる。対象は、横断脊髄炎、視神経炎、または他の関連性のない神経機能障害（例えば、長引く悪心または嘔吐）のうちの1つまたは複数を示しうる。
【０００８】
他の態様は、抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階を含む、対象における視神経脊髄炎（NMO）スペクトラム疾患の増悪を予防するまたは低減させるために対象を長期間処置する方法を含み、かつ抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階を含む、対象における視神経脊髄炎（NMO）スペクトラム疾患の進行を予防または阻害する方法を含む。
【０００９】
別の態様において、抗アクアポリン4（AQP4）抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬が提供される。試薬は、L234A/L235Aアミノ酸置換、L234A/L235A/G237Aアミノ酸置換を含むIgG1配列および／またはK322A置換を有するIgG1配列を含む領域、またはさらには変異IgG2もしくはIgG3 Fc領域などの、エフェクター機能を欠く変異Fc領域を含みうる。試薬はIgG4抗体でありうる。試薬は、化学的に改変されたFc領域を含みうる。試薬は、抗体Fab断片を含みうるものであり、かつFc領域を欠いている。試薬は、非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含みうる。試薬は、一本鎖抗体またはF(ab)2を含みうる。本明細書において記述される任意の方法または組成物を、本明細書において記述される他の任意の方法または組成物に関して実行することができると企図される。
【００１０】
上記の抗体または抗体の抗原結合断片は、SEQ ID NO:6に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:6と95％、90％、85％、もしくは80％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:8に記載の重鎖配列またはSEQ ID NO:8と95％、90％、85％、もしくは80％の同一性を有する配列を含みうるか；またはSEQ ID NO:10に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:10と95％、90％、85％、もしくは80％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:12に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:12と95％、90％、85％、もしくは80％の同一性を有する配列を含みうるか；またはSEQ ID NO:19に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:19と95％、90％、85％、もしくは80％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:17に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:17と95％、90％、85％、もしくは80％の同一性を有する配列を含みうる。抗体抗原結合断片は、SEQ ID NO:5に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:5と85％、80％、75％、もしくは70％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:7に記載の重鎖配列またはSEQ ID NO:7と85％、80％、75％、もしくは70％の同一性を有する配列によってコードされうるか；またはSEQ ID NO:9に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:9と85％、80％、75％、もしくは70％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:11に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:11と85％、80％、75％、もしくは70％の同一性を有する配列によってコードされうるか；またはSEQ ID NO:20に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:20と85％、80％、75％、もしくは70％の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:18に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:18と85％、80％、75％、もしくは70％の同一性を有する配列によってコードされうる。抗体抗原結合断片は、rAb-53、rAb09-3-33、またはrAb-58との研究室での名称を有する抗体の抗原結合断片を含みうる。
【００１１】
特許請求の範囲および／または明細書における「含む」という用語と共に用いる場合の「1つの（a）」または「1つの（an）」という用語の使用は、「1つ」を意味しうるが、同様に「1つまたはそれ以上」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは1つより多い」という意味とも矛盾しない。「約」という用語は、記載の数字のプラスまたはマイナス5％を意味する。
【００１２】
本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明により様々な変更および修正が当業者には明らかとなるであろうが、それらも本発明の精神および範囲に含まれることから、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の具体的な態様を示しているが、説明のために与えられるに過ぎないと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある局面をさらに証明するために含められる。本発明は、本明細書において提示される具体的な態様の詳細な説明と共にこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図１】AQP4アイソフォームに対するNMO-IgGの結合を定量的に測定するための二色比イメージング法の概略。（図1A）四量体（上）またはOAP（下）へと集合しているAQP4単量体（円柱状）を示す。NMO-IgG（緑色）はAQP4の細胞外ドメインに結合し、参照AQP4抗体（赤色）は細胞質側で結合する。（図1B）参照AQP4抗体は、AQP4 N末端アイソフォームおよびOAP形成とは無関係に、AQP4のC末端に結合する。
【図２】安定的にトランスフェクトしたAQP4発現U87MG細胞の特徴付け。（図2A）共焦点蛍光顕微鏡画像は、M1（上）またはM23（下）を安定的に発現して、NMO-IgG（緑色）およびC末端抗AQP4抗体（赤色）によって標識されたU87MG細胞を示す。（図2B）全反射照明蛍光顕微鏡画像は、M23発現細胞（下）では明瞭なOAPを示し、M1発現細胞（上）ではなめらかな蛍光染色パターンを示す。（図2C）安定的AQP4発現U87MG細胞溶解物のブルーネイティブ電気泳動（上）およびトリシンSDS-PAGE（下）後のAQP4イムノブロット。（図2D）M1またはM23 AQP4による安定的（灰色）または一過性（白色）トランスフェクション後の、表記の組換えモノクローナルNMO-IgGによって標識されたU87MG細胞において測定された緑色対赤色蛍光比（G/R）。
【図３】AQP4（M1対M23）に対するNMO患者血清中のNMO-IgGの差次的結合。（図3A）患者4人からの5％NMO血清（緑色）および参照AQP4抗体（赤色）によって染色したM1およびM23発現U87MG細胞。（図3B）AQP4（M1対M23）に対するNMO患者血清の結合曲線（平均値±S.E.、n＝5）。曲線は、1サイト結合モデルに適合することを表す。
【図４Ａ】AQP4（M1対M23）に対する精製モノクローナルNMO-IgGの差次的結合。（図4A）参照AQP4抗体（赤色）と共に、濃度の関数としてのrAb-53およびrAb-58（緑色）の結合に関する代表的な蛍光顕微鏡写真。
【図４Ｂ】AQP4（M1対M23）に対する精製モノクローナルNMO-IgGの差次的結合。（図4B）AQP4（M1対M23）に対するrAb-53（左）、rAb-58（中央）、およびrAb-186（右）の結合曲線（平均値±S.E.、n＝5）。曲線は、1サイト結合モデルに適合することを表す。
【図５】M1およびM23 AQP4の混合物に対するならびにOAP崩壊変異を含むM23変異体に対する、NMO-IgGの結合。（図5A）表記の比率のM1およびM23 AQP4混合物に関するrAb-53の結合（左）、および量子ドット単粒子追跡によって測定した拡散範囲の累積分布（右）（平均値±S.E.、n＝5）。（図5B）M1変異体CCAを表記の比率で有するM23 AQP4に関するrAb-53の結合（左）および拡散範囲（右）（平均値±S.E.、n＝5）。（図5C）AQP4変異体M23-F26Q（赤色）およびM23-G28P（緑色）に関するrAb-53の結合（左）および拡散範囲（右）（平均値±S.E.、n＝5）。
【図６Ａ】アレイ集合AQP4に対するNMO-IgGの結合親和性増加のメカニズム。（図6A）IgG全体におけるFab結合部位の間隔と比較したAQP4四量体の相対サイズを示す、ヒトIgGおよびAQP4結晶構造（Harris et al., 1998; Ho et al., 2009）。
【図６Ｂ】アレイ集合AQP4に対するNMO-IgGの結合親和性増加のメカニズム。（図6B）二価 対 一価の結合メカニズムの予測。四量体（M1）またはOAP（M23）へと集合しているAQP4単量体（円柱状）を示す。NMO-IgG（緑色）は、AQP4の（不明な）細胞外ドメインに一価または二価で結合する。
【図６Ｃ】アレイ集合AQP4に対するNMO-IgGの結合親和性増加のメカニズム。（図6C）Mycタグ付きAQP4（M1対M23）を発現する細胞に対するモノクローナルマウス抗Mycの結合。
【図６Ｄ】アレイ集合AQP4に対するNMO-IgGの結合親和性増加のメカニズム。（図6D）固定濃度でのマウス抗Myc（左）、rAb-53（中央）、およびrAb-58（右）のIgG全体または精製Fab断片の、M1対M23の相対的結合（平均値±S.E.、n＝5）。
【図７Ａ】アクアポルマブ治療のための高親和性モノクローナル組換え抗AQP4抗体。（図7A）IgG1抗体の結晶構造と同じ尺度で示される、AQP4四量体の結晶構造。
【図７Ｂ】アクアポルマブ治療のための高親和性モノクローナル組換え抗AQP4抗体。（図7B）異なる濃度のrAb-53（左）および固定濃度の異なるNMO rAb（右）の結合／非結合動態を示す、AQP4再構成プロテオリポソームに対する組換え抗体結合の表面プラズモン共鳴測定。
【図７Ｃ】アクアポルマブ治療のための高親和性モノクローナル組換え抗AQP4抗体。（図7C）AQP4発現U87MG細胞に対するrAb-53（25μg/ml）の結合および非結合動態。rAb-53と共に指定の時間インキュベートした後にすすぎ、固定、および二次抗体の添加を行うことによって測定した結合。rAb-53と共に60分間インキュベートした後に、抗体を含まない緩衝液によって指定の時間洗い流しを行って測定した流出。上：rAb-53（赤色）による細胞表面染色を示す代表的な顕微鏡写真。下：平均した結合データ（平均値±S.E.、n＝4）。
【図８Ａ】変異した非病原性rAb-53（アクアポルマブ）はAQP4に対する病原性NMO-IgGの結合を遮断する。（図8A）重鎖（VH）および軽鎖（VL）可変領域、軽鎖定常領域（CL）、およびIgG1重鎖定常領域（CH1-CH3）を示す、rAb-53の概略。CDC（K322A）、ADCC（K326W/E333S）、または両方（L234A/L235A）を低減させるためにCH2ドメインに導入されたアミノ酸変異の位置。
【図８Ｂ】変異した非病原性rAb-53（アクアポルマブ）はAQP4に対する病原性NMO-IgGの結合を遮断する。（図8B）AQP4再構成プロテオリポソームに対する変異rAb-53（L234A/L235A）の結合および流出の表面プラズモン共鳴測定。
【図８Ｃ】変異した非病原性rAb-53（アクアポルマブ）はAQP4に対する病原性NMO-IgGの結合を遮断する。（図8C）変異rAb-53は、AQP4発現細胞に対するCy3標識（非変異）rAb-53の結合を遮断する。表記の（非標識）抗体の100μg/mlの非存在下または存在下で20μg/ml Cy3-rAb-53と共に1時間インキュベートしたAQP4ヌル（最も左側のパネル）またはAQP4発現（他のパネル）細胞において撮像されたCy3蛍光。
【図８Ｄ】変異した非病原性rAb-53（アクアポルマブ）はAQP4に対する病原性NMO-IgGの結合を遮断する。（図8D）関連性のないモノクローナルNMO抗体およびヒトNMO血清が、Cy3標識rAb-53のAQP4結合を遮断する。10％対照（非NMO）もしくはNMO患者血清または100μg/ml組換えNMOモノクローナル抗体rAb-186の非存在下または存在下で20μg/ml Cy3-rAb-53と共に1時間インキュベートした細胞において撮像されたCy3蛍光。
【図９Ａ】変異した非病原性rAb-53アクアポルマブはNMO-IgG曝露AQP4発現細胞におけるCDCおよびADCCを阻止する。（図9A）AQP4発現CHO細胞を、対照（非NMO）mAbまたはrAb-53（2.5μg/ml、非変異または変異）と共にヒト補体に90分間曝露した後の生／死細胞アッセイ。右側に死細胞のパーセンテージをまとめた（平均値±S.E.、n＝4〜6、* rAb-53単独と比較してP＜0.001）。
【図９Ｂ】変異した非病原性rAb-53アクアポルマブはNMO-IgG曝露AQP4発現細胞におけるCDCおよびADCCを阻止する。（図9B）表記のアクアポルマブの12.5μg/mlの存在下で補体＋rAb-53によって行った、図9Aと同じアッセイ。
【図９Ｃ】変異した非病原性rAb-53アクアポルマブはNMO-IgG曝露AQP4発現細胞におけるCDCおよびADCCを阻止する。（図9C）補体の存在下および表記のアクアポルマブの非存在下または存在下で対照（非NMO）血清またはNMO患者血清に60分間曝露した後の生／死細胞アッセイ。
【図９Ｄ】変異した非病原性rAb-53アクアポルマブはNMO-IgG曝露AQP4発現細胞におけるCDCおよびADCCを阻止する。（図9D）対照（非NMO）mAbまたはrAb-53またはアクアポルマブを（個々に）、またはrAb-53およびアクアポルマブを一緒にして、NK細胞と共にインキュベートしたAQP4発現CHO細胞を用いて行ったADCCアッセイ。
【図１０Ａ】アクアポルマブはインビボでマウス脳においてNMO-IgGおよびヒト補体の脳内注射によって生じたNMO様病変を低減させる。（図10A）ヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）ならびにルクソールファストブルー（ミエリン）によって染色し、AQP4（AQP4）およびC5b-9（活性化補体）によって茶色に免疫染色した、脳内注射後24時間でのマウス脳切片のパネル。アクアポルマブ（Aqmab）の非存在下または存在下で、対照（対照IgG、AQP4ノックアウトマウス、Aqmab単独）と共に、NMO-IgG（NMO血清からの精製IgG）およびヒト補体の脳内注射を行った。ピンク色の線は、ルクソールファストブルー染色またはAQP4免疫反応性がない領域を示す。黒色の線は、注射した半球の輪郭を示し、針の進路を示す。矢印、好中球；矢じり形、脈管周囲C5b-9免疫反応性；V、血管、バー、50μm。
【図１０Ｂ】アクアポルマブはインビボでマウス脳においてNMO-IgGおよびヒト補体の脳内注射によって生じたNMO様病変を低減させる。（図10B）ピンク色で輪郭を示した領域／黒色で輪郭を示した領域の％として定量したAQP4およびミエリンの喪失（S.E.M.、1群あたりマウス5匹、*P＜0.01）。
【図１０Ｃ】アクアポルマブはインビボでマウス脳においてNMO-IgGおよびヒト補体の脳内注射によって生じたNMO様病変を低減させる。（図10C）アクアポルマブの非存在下または存在下、マウスの各対に、異なるNMO患者からのNMO-IgGをヒト補体と共に注射した、マウスの対5組に関して示されたミエリンおよびAQP4の喪失（％）。
【図１１Ａ】アクアポルマブはエクスビボ脊髄切片培養においてNMO-IgGおよびヒト補体によって生じたNMO様病変を低減させる。（図11A）切片を7日間培養した後、アクアポルマブ（Aqmab）の非存在下または存在下、NMO-IgG（NMO血清からの精製IgG）およびヒト補体の存在下で3日間培養した、エクスビボ脊髄切片培養モデル。AQP4、GFAP、およびミエリンに関して示される免疫染色。対照は、非NMO-IgG、NMO-IgGまたはAqmab単独、Aqmabと共に補体、およびAQP4ヌルマウスからの切片培養を含む。
【図１１Ｂ】アクアポルマブはエクスビボ脊髄切片培養においてNMO-IgGおよびヒト補体によって生じたNMO様病変を低減させる。（図11B）NMO病変スコア（方法を参照されたい）（S.E.M.、n＝4〜5、P＜0.001）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
例示的な態様の説明
本発明者らは、これまでに、NMO患者の血清および組換えモノクローナルNMO-IgGが各々、AQP4のM23およびM1アイソフォームの両方に結合できることを示したが（Crane et al., 2009）、このことは、1人のNMO患者の血清のM1 AQP4に対する結合は検出できなかったと報告する初期の研究（Nicchia et al., 2009）とは矛盾した。1つのNMO血清検体を分析したこれまでの報告は、OAPがNMO-IgGの唯一の標的であるという結論を下した（Nicchia et al., 2009）。しかし、血清抗AQP4自己抗体についての臨床血清アッセイがM1 AQP4を用いていること（Wingerchuk et al., 2006）、ならびに本発明者ら（Bennett et al., 2009; Crane et al., 2009）および他の研究者（Hinson et al., 2007）が、いくつかのNMO自己抗体が、M1 AQP4のみを発現する細胞に強く結合することを報告したことから、前述の結論が正しいことはありえない。最近の研究により、M23発現細胞を用いることによって、NMO-IgG結合アッセイの臨床的感度を改善できることが示されたが（Mader et al., 2010）、NMO-IgG AQP4特異性に関する定量的試験はなく、またAQP4アイソフォームに対するNMO-IgG結合の親和性も測定されていない。
【００１５】
本発明者らは、AQP4に対するNMO自己抗体の結合を測定するために、蛍光二次抗体によって明らかにされるNMO-IgG結合を、AQP4 C末端に対する抗体を用いて総AQP4タンパク質に対して標準化する量比イメージングを用いた。これらの試験に関して、本発明者らは、トランスフェクション後に形質膜パターンでAQP4を発現するヒトアストロサイト由来細胞株を同定した。NMO-IgG結合に関するAQP4アイソフォームおよびOAPの特異性を個々に評価するための戦略は、異なる比率でM1およびM23 AQP4を発現させること、またはOAPを崩壊させる1アミノ酸置換をそのN末端に含むM23変異体を発現させることであった。NMO患者の血清試料ならびにNMO患者の脳脊髄液中の形質細胞に由来するクローン化配列から組換え技術によって生成された精製モノクローナル抗体に関して測定を行った。モノクローナルNMO抗体を用いる試験により、AQP4に対するNMO-IgGの絶対的結合親和性の測定が初めて可能となった。M23 AQP4のOAP欠損変異体および様々なヘテロ四量体形成混合AQP4アイソフォームを用いる試験により、OAPにおけるAQP4に対するNMO-IgG結合の増強が示された。NMO-IgG全体 対 精製Fab断片を比較する試験により、アレイ集合AQP4に対するNMO-IgG結合の増強に関する分子的基礎が示唆された。
【００１６】
さらに、本発明者らは、AQP4に対するNMO-IgGの結合を選択的に遮断して、NMO-IgG誘導細胞殺傷および病変形成を阻止する、「アクアポルマブ」と呼ばれる非病原性ヒト組換えモノクローナル抗AQP4抗体を生成した。アクアポルマブは、強結合性の抗AQP4 Fabと、補体媒介性および細胞媒介性細胞傷害の機能性を欠く変異Fcとを含む。AQP4発現細胞培養において、アクアポルマブは、ヒト血清中のNMO-IgGの結合を遮断して、補体媒介性および細胞媒介性細胞傷害をほぼゼロに低減した。アクアポルマブは、NMOのエクスビボ脊髄切片モデル、ならびにNMO-IgGおよび補体の脳内注射によって作製されたNMOのインビボマウスモデルにおいて、NMO様病変の発生を阻止した。アクアポルマブ単独は、病態を引き起こさなかった。アクアポルマブによる阻害の広範な効能は、AQP4の細胞外ドメインと比較してその物理的サイズが大きいために、立体的競合による可能性がある。これらの結果は、NMOのアクアポルマブ治療に関する支持を提供する。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の局面を、以下により詳細に記述する。
【００１８】
I．視神経脊髄炎（NMO）
ドヴィック病またはドヴィック症候群としても知られる視神経脊髄炎（NMO）は、ヒトの自分自身の免疫系が視神経および脊髄を攻撃する自己免疫性の炎症障害である。これは、視神経（視神経炎）および脊髄（脊髄炎）の炎症を生じる。炎症はまた、脳にも影響を及ぼしうるが、病変は、関連する病態である多発性硬化症（MS）において観察される病変とは異なる。脊髄の病変により、脚または腕における様々な程度の衰弱または麻痺、知覚喪失（失明を含む）、および／または膀胱および腸管機能障害が起こる。
【００１９】
NMOは、いくつかの点においてMSに似ているが、最適な結果を得るためには異なる処置の経過を必要とするまれな障害である。NMOはまた、急性播種性脳脊髄炎の異型であると示唆されている。NMOを有する少なくとも何人かの患者における自己免疫発作の標的は同定されており、これはアクアポリン4またはAQP4と呼ばれる神経系の細胞のタンパク質である。
【００２０】
NMOの主症状は、視覚の喪失および脊髄機能の喪失である。視神経炎の他の病因に関して、視覚障害は、通常、視力の低下として現れるが、視野の欠損または色覚喪失が、単独でまたは真の失明の前に起こりうる。脊髄の機能障害によって、筋の衰弱、知覚減少、または膀胱および腸管制御の喪失が起こりうる。典型的な患者は、知覚の徴候と共に、脚（不全対麻痺）または四肢全体（四肢不全麻痺）の急性および重度の痙性衰弱を有し、しばしば膀胱制御の喪失を伴う。
【００２１】
NMOは、神経細胞周囲のミエリンの免疫媒介性破壊が存在するという点においてMSと類似している。標準的なMSとは異なり、攻撃は、ミエリン産生細胞（オリゴデンドロサイト）を標的とするのでもなく、または免疫系のT細胞によって主に媒介されるのでもなく、むしろNMO-IgGまたは単にNMO抗体と呼ばれる抗体によって媒介される。これらの抗体は、細胞膜を超えて水を輸送するためのチャネルとして作用する、アストロサイトの細胞膜におけるAQP4を標的とする。AQP4は、血液中の物質が脳内に入るのを阻止する原因となるシステムである血液-脳関門を取り巻くアストロサイトの突起において見いだされる。血液-脳関門は、NMOにおいて弱められるが、現在のところ、NMO-IgG免疫応答によってどのようにオリゴデンドロサイト死および脱髄が引き起こされるのかは分かっていない。
【００２２】
NMOの病態に対するほとんどの研究は、脊髄に集中している。脊髄の損傷は、炎症性脱髄から白質および灰白質の壊死損傷まで及びうる。NMOにおける炎症病変は、タイプII病変（補体媒介性脱髄）として分類されているが、その顕著な脈管周囲分布はMSパターンII病変と異なる。それゆえ、炎症のパターンはしばしば、MSにおいて認められるパターンとは全く異なる。
【００２３】
Mayoクリニックは、2006年にNMOの診断基準の改定版を提唱した。診断に関する新しいガイドラインは、2つの絶対的基準に加えて、以下の3つの支持基準のうちの少なくとも2つを必要とする：
1．絶対基準：
視神経炎
急性脊髄炎
2．支持基準：
疾患発生時にMSの基準を満たしていない脳MRI。
脊髄に比較的大きい病変があることを示す、脊椎分節3つ以上に及ぶ連続的なT2強調像の信号異常を有する脊髄MRI。
NMO-IgG血清陽性状態。NMO-IgG試験は、アクアポリン4抗原に対する抗体の存在をチェックする。
【００２４】
NMO-IgG試験の開発後、NMOを含む障害のスペクトルは拡大された。NMOスペクトルは、現在、以下からなると考えられている：
・  上記の診断基準に従う標準的なNMO。
・  長軸方向の広範囲にわたる脊髄炎の1回または再発性事象、および左右同時または再発性の視神経炎などの、NMOの限定型。
・  アジア視神経脊髄型MS。この異型はMSのようなCNS障害を呈しうる。
・  全身性自己免疫疾患に関連する、長軸方向の広範囲にわたる脊髄炎または視神経炎。
・  視床下部、周室核、および脳幹などの特定の脳の領域の病変に関連する視神経炎または脊髄炎。
【００２５】
NMOが、異なる疾患であるか、または多発性硬化症の広範なスペクトルの一部であるかに関しては議論が分かれている。一般的に、NMOは、現在では別個の神経炎症障害であると考えられている。NMOは以下の点で異なる：NMOは通常、急性エピソード後にMSの場合より重度の続発症を有する点、MSは、横断脊髄炎として現れることはまれである点、ならびにCSF中のオリゴクローナルバンドおよび脳MRIにおける白質病変は、ドヴィック病ではめったにないが、MS患者の90％以上に起こるという点。最近、抗ウイルス免疫応答が、多発性硬化症と視神経脊髄炎とを識別することが見いだされた。
【００２６】
NMOは、併存疾患を有する何人かのNMO患者の事例証拠に基づくと、多くの全身疾患に関連している。そのような状態には、膠原血管病、自己抗体症候群（autoantibody syndrome）、水痘-帯状疱疹ウイルス感染症、エプスタイン-バーウイルス感染症、およびHIV感染症、ならびにクリオキノールおよび抗結核薬に対する曝露が挙げられる。
【００２７】
現在、NMOの治癒はないが、症状を処置することができる。何人かの患者は回復するが、多くは視力および四肢の障害が残り、これらは重度でありうる。発作は、メチルプレドニゾロンの静注などの高用量静脈内コルチコステロイドの短期間投与によって処置される。発作が進行するかまたはコルチコステロイド処置に反応しない場合、プラスマフェレーシスは有効な処置でありうる。これらの処置に関する臨床試験は非常に少数で行われ、ほとんどが対象群を設定していない。
【００２８】
発作を予防する処置の有効性に関する対照臨床試験は確立されていない。多くの臨床医は、発作の頻度および重症度を低減させるためには長期間の免疫抑制の必要があることで一致しているが、その正反対を論じる臨床医もいる。一般的に用いられる免疫抑制剤処置には、アザチオプリン（Imuran）とプレドニゾンの併用、ミコフェノール酸モフェチルとプレドニゾンの併用、リツキシマブ、ミトキサントロン、免疫グロブリン静注（IVIG）、およびシクロホスファミドが挙げられる。2007年に、NMOは、酢酸グラチラマーおよび低用量コルチコステロイドに反応することが報告された。通常、数週間のあいだにある程度の改善が認められるが、残存する徴候および身体上の障害は、時に重度に持続しうる。
【００２９】
疾患は、単相性、すなわち永続的に寛解する単回エピソードでありうる。しかし、患者の少なくとも85％が、横断脊髄炎および／または視神経炎の発作を繰り返す再発型疾患を有する。単相性型の患者では、横断脊髄炎および視神経脊髄炎は、同時にまたは互いに数日以内に起こる。一方、再発型を有する患者では、初回発作間は数週間または数ヶ月ある可能性があり、および初回の横断脊髄炎事象の後によりよい運動機能の回復を有する可能性がある。再発は通常早期に起こり、再発患者の約55％が最初の1年間で、90％が最初の5年間で再発を有する。多発性硬化症とは異なり、NMOでは、患者が寛解することなく次の発作までのあいだに神経学的減退が増加する二次進行相を有することはまれである。そのかわりに、急性発作により身体上の障害が生じる。
【００３０】
単相性NMOを有する患者のおよそ20％が永続的な失明を有し、30％が片脚または両脚に永続的な麻痺を有する。再発型のNMOを有する患者のうち、50％は、5年以内に麻痺または失明を有する。何人かの患者において（1つの試験において33％）は、頚髄に横断脊髄炎が起こると、呼吸不全が起こり、その後死亡した。しかし、NMOのスペクトルは、診断基準の改善によって広くなり、処置の選択肢は改善し、その結果、研究者らはこれらの推定値が引き下げられると考えている。
【００３１】
NMOの有病率および発生数は、その理由の一部が、疾患が認識不足であり、しばしばMSと混同されることから、確立されていない。NMOは、男性より女性において一般的で、女性は患者の2/3以上を含み、再発型の疾患を有する患者の80％より多くが女性である。英国のWalton Centreによれば、「NMOはMSとは異なり、世界中に存在するように見え、これは温帯気候と白人種においてより高い発生率を有する。アフリカ人およびアジア人、特に極東地域では、より高いNMOのリスクを有しうるが、この疾患の正確な発生率は不明であり、明確な結論を難しくしている」。NMOを有する多くの人々が当初MSであると誤診されたが、アフリカ系アメリカ人の35％はしばしば、本当にNMOを有する場合であってもMSであると誤診される。NMOは、アジア系の人々では白人より一般的である。実際に、アジア視神経脊髄型MS（日本におけるMS症例の30％を構成する）は、NMOと同一であると示唆されている（日本人患者における視神経脊髄型MSと古典的MSの差）。熱帯および亜熱帯地域での先住民集団では、MSはまれであるが、出現する場合、MSはしばしば視神経脊髄型MSの形をとる。NMO患者の大多数において、親戚に罹患した人はなく、一般的に非家族性病態であると見なされている。
【００３２】
II．モノクローナル抗体の産生
A．全般的方法
AQP4に結合するモノクローナル抗体は、いくつかの応用において有用性を有すると理解される。これらは、NMOを検出および診断するために用いるための、ならびにNMOを処置するための診断キットの作製を含む。これらの関連では、そのような抗体を診断用もしくは治療用物質に連結させてもよく、それらを競合アッセイにおける捕捉物質もしくは競合物質として用いてもよく、またはそれらを追加の物質を付加させることなく個々に用いてもよい。以下にさらに考察されるように、抗体は変異または改変させてもよい。抗体を調製および特徴付けする方法は、当技術分野において周知である（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;米国特許第4,196,265号を参照されたい）。
【００３３】
モノクローナル抗体（MAb）を生成する方法は一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための手順と同じ手順に沿って始まる。これらの両方の方法の第１段階は、適切な宿主の免疫、または過去の自然感染により免疫された対象の同定である。当技術分野において周知であるように、所定の免疫組成物は、その免疫原性が多様でありうる。それゆえ、宿主免疫系を追加免疫することがしばしば必要であり、これはペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合させることによって行われうる。例示的なおよび好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。卵アルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも同様に、担体として用いることができる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせる手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジン（bis-biazotized benzidine）を含む。同様に、当技術分野において周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激剤を用いることによって増強することができる。例示的なおよび好ましいアジュバントには、フロイント完全アジュバント（ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）死菌を含む免疫応答の非特異的刺激物質）、フロイント不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００３４】
ポリクローナル抗体を産生するために用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質ならびに免疫のために用いられる動物によって異なる。多様な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）を用いて免疫原を投与することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で、免疫した動物の血液を採取することによってモニターされうる。第二の追加免疫注射も同様に行ってもよい。適した力価に達するまで、追加免疫および力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られれば、免疫した動物を出血させて、血清を単離および貯蔵する、および／または動物を用いてMAbを生成することができる。
【００３５】
本発明の組換え抗体は、罹患した個体のCSFから単離された1つの形質芽球またはB細胞を用いて産生される。血液もまた用いることができるが、形質芽球が血液中に存在する量はいくぶん少ない。抗体の重鎖および軽鎖配列を、RT-PCRによって同定する。同定された重鎖および軽鎖の対を、標準的なクローニング技術を用いて発現ベクターに再操作した後、哺乳動物細胞株にトランスフェクトして、抗体を産生する。
【００３６】
いずれかの手段によって産生されたMAbを、望ましければ、濾過、遠心分離、およびFPLCまたはアフィニティクロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いてさらに精製してもよい。本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、および／または化学還元によるジスルフィド結合の切断によって、精製モノクローナル抗体から得ることができる。または、本発明に包含されるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチドシンセサイザーを用いて合成することができる。
【００３７】
同様に、分子クローニングアプローチを用いてモノクローナルを生成してもよいと企図される。これに関して、RNAをハイブリドーマ細胞株から単離して、抗体遺伝子をRT-PCRによって得て、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。または、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリを、細胞株から単離されたRNAから調製して、適切な抗体を発現するファージミドを、ウイルス抗原を用いるパニングによって選択する。通常のハイブリドーマ技術と比較したこのアプローチの利点は、1回のラウンドでおよそ104倍もの多くの抗体を産生してスクリーニングすることができる点、および新規特異性がHとL鎖の組み合わせによって生成され、それによって適切な抗体を発見する機会がさらに増加する点である。
【００３８】
各々が参照により本明細書に組み入れられる、本発明において有用な抗体の産生を教示する他の米国特許には、コンビナトリアルアプローチを用いたキメラ抗体の産生を記述する米国特許第5,565,332号、組換え免疫グロブリン調製を記述する米国特許第4,816,567号、および抗体-治療用物質コンジュゲートを記述する米国特許第4,867,973号が挙げられる。
【００３９】
B．本発明の抗体
本発明による抗体は、第一の例において、この場合はAQP4に対するその結合特異性によって定義されうる。当業者は、当業者に周知の技術を用いて所定の抗体の結合特異性／親和性を評価することによって、そのような抗体が本発明の特許請求の範囲の範囲内に入るか否かを決定することができる。
【００４０】
1つの局面において、AQP4に結合するモノクローナル抗体が提供される。特定のタイプの抗体は、Fc関連エフェクター機能を欠いている抗体である。実際に、AQP4に対する抗体は、疾患を引き起こすことから、それらを安全にするのみならず、防御的にするためには、そのようなAQP4抗体を改変しなければならない。そのような抗体は、そのような機能を示す抗体（例えば、IgG1、またはIgG2、またはIgG3）のFc領域を変異させることによって、そのような機能を本来欠いている抗体（IgG4）を用いることによって、またはそのような抗体のいずれかを、補体活性化および免疫細胞動員の際のそれらの効果をなくすように化学的に改変することによって、産生されうる。
【００４１】
第二の局面において、抗体は、それが結合する構造の領域によって定義されうる。例えば、AQP4の細胞外表面および直交アレイは、抗体が結合するための独自のプラットフォームを提供する。
【００４２】
第三の局面において、抗体は、その結合特異性を決定するその可変配列によって定義されうる。以下に例を提供する：
rAb53重鎖配列（可変領域）核酸（SEQ ID NO:7）：
2014514324.tif 000002
【００４３】
rAb53重鎖配列（可変領域）タンパク質（SEQ ID NO:8）：
2014514324.tif 000003
【００４４】
rAb53軽鎖配列（可変領域＋IgK定常領域）核酸（SEQ ID NO:5）：
2014514324.tif 000004
【００４５】
rAb53軽鎖配列（可変領域＋IgK定常領域）タンパク質（SEQ ID NO:6）：
2014514324.tif 000005
【００４６】
「変異体」として記述される以下の配列は、Fc変異体構築物において用いられるまさにその配列である。rAb-53は元来IgG2分子であり、変異体IgG1 Fc領域を構築するために用いられるクローニング段階は、5' IgG2 Fc配列のいくつかの部分を保持した。アミノ酸レベルで、配列は最初のアミノ酸35個中のアミノ酸4個がIgG1とは異なる。IgG1配列の末尾に、本発明者らはFLAGタグ（LEDYKDDDDK; SEQ ID NO: 16）を付加した。それゆえ、配列は、技術的にはヒトIgG1ではない。これは残基340個中14個、すなわち4％が異なる。最終産物は、変異ヒトIgG1である。
【００４７】
変異体ヒトIgG1 Fc K322変異核酸（SEQ ID NO:3）：
2014514324.tif 000006
【００４８】
変異体ヒトIgG1 Fc K322変異タンパク質（SEQ ID NO:4）：
2014514324.tif 000007
【００４９】
変異体ヒトIgG1 Fc L234A/L235A変異核酸（SEQ ID NO:1）：
2014514324.tif 000008
【００５０】
変異体ヒトIgG1 Fc L234A/L235A変異タンパク質（SEQ ID NO:2）：
2014514324.tif 000009
【００５１】
rAb58重鎖配列（可変領域）核酸（SEQ ID NO:11）：
2014514324.tif 000010
【００５２】
rAb58重鎖配列（可変領域）タンパク質（SEQ ID NO:12）：
2014514324.tif 000011
【００５３】
rAb58軽鎖配列（可変領域＋IgK定常領域）核酸（SEQ ID NO:9）：
2014514324.tif 000012
【００５４】
rAb58軽鎖配列（可変領域＋IgK定常領域）タンパク質（SEQ ID NO:10）：
2014514324.tif 000013
【００５５】
変異体ヒトIgG1 Fc L234A/L235A/G237A変異核酸（SEQ ID NO:14）：
2014514324.tif 000014
【００５６】
変異体ヒトIgG1 Fc L234A/L235A/G237A変異タンパク質（SEQ ID NO:15）：
2014514324.tif 000015
【００５７】
rAb09-3-33重鎖配列（可変領域）タンパク質（SEQ ID NO:17）：
2014514324.tif 000016
【００５８】
rAb09-3-33重鎖配列（可変領域）核酸（SEQ ID NO:18）：
2014514324.tif 000017
【００５９】
rAb09-3-33軽鎖配列（可変領域＋IgK定常領域）タンパク質（SEQ ID NO:19）：
2014514324.tif 000018
【００６０】
rAb09-3-33軽鎖配列（可変領域＋IgK定常領域）核酸（SEQ ID NO:20）：
2014514324.tif 000019
【００６１】
さらに、抗体配列は、任意で以下により詳細に考察される方法を用いて、上記で提供した配列と異なっていてもよい。例えば、核酸配列は以下の点で上記の配列とは異なりうる：（a）可変領域が軽鎖の定常ドメインから分離されていてもよい、（b）核酸が、それによってコードされる残基に影響を及ぼすことがない限り上記の核酸と異なっていてもよい、（c）核酸が、所定のパーセンテージ、例えば70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の相同性があれば上記の核酸と異なっていてもよい、（d）核酸が、高ストリンジェンシー条件、例えば65℃で50％ホルムアミド、0.1×SSC、0.1％SDSでのハイブリダイズ能があれば上記の核酸と異なっていてもよい、（e）アミノ酸が、所定のパーセンテージ、例えば80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の相同性があれば上記のアミノ酸と異なっていてもよい、または（f）アミノ酸が、保存的置換（以下に記述される）を可能にすることで上記のアミノ酸と異なっていてもよい。
【００６２】
C．抗体配列の操作
様々な態様において、発現の改善、交叉反応性の改善、標的以外への結合の減少、または補体の活性化もしくは免疫細胞（例えば、T細胞、単球、またはNK細胞）の動員などの1つもしくは複数の天然のエフェクター機能の抑止などの多様な理由により、同定された抗体の配列を操作することを選択してもよい。以下は、抗体操作のための関連する技術に関する全般的考察である。
【００６３】
ハイブリドーマを培養した後、細胞を溶解し、総RNAを抽出した。ランダムヘキサマーをRTと共に用いてRNAのcDNAコピーを生成した後、全てのヒト可変遺伝子配列を増幅することを期待してPCRプライマーの多重混合物を用いてPCRを行った。PCR産物をpGEM-T Easyベクターにクローニングした後、標準的なベクタープライマーを用いて自動DNAシークエンシングによってシークエンシングした。ハイブリドーマ上清から収集しかつプロテインGカラムを用いるFPLCによって精製した抗体を用いて、結合および中和アッセイを行ってもよい。
【００６４】
組換え完全長IgG抗体は、クローニングベクターからの重鎖および軽鎖Fv DNAをLonza pConIgG1またはpConK2プラスミドベクターにサブクローニングして、293 Freestyle細胞またはLonza CHO細胞にトランスフェクトすることによって生成してもよく、CHO細胞上清から抗体を収集および精製した。他の方法は、Bennett et al. (2009)に記載されている。
【００６５】
最終cGMP製造プロセスと同じ宿主細胞および細胞培養プロセスにおいて産生された抗体を迅速に利用できることは、プロセス開発プログラムの期間を短縮する可能性を有する。Lonzaは、CHO細胞において少量（50 gまで）の抗体を迅速に産生するために、CDACF培地中で増殖させたプールされたトランスフェクタントを用いる一般的方法を開発した。真の一過性のシステムよりわずかに遅いものの、利点には、より高い産物濃度ならびに産生細胞株と同じ宿主およびプロセスを用いることが挙げられる。使い捨てのバイオリアクターにおいて、流加培養モードで作動させる使い捨てのバッグバイオリアクター培養（作業容積5 L）において、モデル抗体を発現するGS-CHOプールの増殖および生産性の例では、トランスフェクションの9週間以内に2 g/Lの収集抗体濃度が得られた。
【００６６】
pConベクター（商標）は、抗体全体を再発現させるための容易な方法である。定常領域ベクターは、pEEベクターにクローニングされた広範な免疫グロブリン定常領域ベクターを提供する一組のベクターである。これらのベクターは、ヒト定常領域を有する完全長の抗体の容易な構築およびGSシステム（商標）の簡便さを提供する。
【００６７】
抗体分子は、例えばmAbのタンパク質分解による切断によって産生される断片（F(ab')、F(ab')2などの）、または例えば組換え手段によって産生可能な一本鎖免疫グロブリンを含む。そのような抗体誘導体は、一価である。1つの態様において、そのような断片を、互いに、または他の抗体断片もしくは受容体リガンドと組み合わせて、「キメラ」結合分子を形成することができる。重要なことに、そのようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープに結合することができる置換基を含みうる。
【００６８】
ヒトの治療に用いる場合のいかなる免疫反応も減弱させるために、非ヒト宿主において産生された抗体を「ヒト化」することが望ましい可能性がある。そのようなヒト化抗体は、インビトロまたはインビボの状況において試験されうる。ヒト化抗体は、例えば抗体の免疫原性部分を、対応するがしかし非免疫原性である部分に置き換えることによって産生されうる（すなわち、キメラ抗体）。PCT出願PCT/US86/02269；欧州特許出願第184,187号；欧州特許出願第171,496号；欧州特許出願第173,494号；PCT出願WO 86/01533；欧州特許出願第125,023号；Sun et al. (1987)；Wood et al. (1985)；およびShaw et al. (1988)；これらの全ては参照により本明細書に組み入れられる。「ヒト化」キメラ抗体に関する全般的論評は、同様に参照により本明細書に組み入れられる、Morrison（1985）によって提供される。または、「ヒト化」抗体は、CDRまたはCEA置換によって産生することができる。Jones et al. (1986); Verhoeyen et al. (1988); Beidler et al. (1988)；これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
関連する態様において、抗体は、開示の抗体の誘導体、例えば開示の抗体のCDR配列と同一のCDR配列を含む抗体である（例えば、キメラ、ヒト化、またはCDR移植抗体）。なおさらなる態様において、抗体は、完全なヒト組換え抗体である。
【００７０】
または、抗体分子に保存的変化を導入することなどの、改変を行いたいと考えてもよい。そのような変化を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指標が検討されうる。タンパク質に相互作用的生物機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特徴が、得られたタンパク質の二次構造に寄与して、次に、二次構造がタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、および抗原などとの相互作用を定義することは通説となっている。
【００７１】
同様に、親水性に基づいて類似のアミノ酸の置換を有効に行うことができることは当技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性（greatest local average hydrophilicity）が、タンパク質の生物特性と相関すると述べている。米国特許第4,554,101号において詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：塩基性アミノ酸：アルギニン（+3.0）、リジン（+3.0）、およびヒスチジン（-0.5）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（+3.0±1）、グルタミン酸（+3.0±1）、アスパラギン（+2.0）、およびグルタミン（+0.2）；親水性非イオン性アミノ酸：セリン（+0.3）、アスパラギン（+0.2）、グルタミン（+0.2）、およびトレオニン（-0.4）；イオウ含有アミノ酸：システイン（-1.0）およびメチオニン（-1.3）；疎水性非芳香族アミノ酸：バリン（-1.5）、ロイシン（-1.8）、イソロイシン（-1.8）、プロリン（-0.5±1）、アラニン（-0.5）、およびグリシン（0）；疎水性芳香族アミノ酸：トリプトファン（-3.4）、フェニルアラニン（-2.5）、およびチロシン（-2.3）。
【００７２】
アミノ酸を、類似の親水性を有する別のアミノ酸に置換して、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質を産生することができると理解される。そのような変化において、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±1以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、および±0.5以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【００７３】
先に概説したように、アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸側鎖の置換基、例えばその疎水性、親水性、電荷、およびサイズなどの相対的類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換が当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【００７４】
本発明はまた、アイソタイプ改変を企図する。異なるアイソタイプを有するようにFc領域を改変することによって、異なる官能性を得ることができる。例えば、IgG4へと変化させることによって、他のアイソタイプに関連する免疫エフェクター機能を低減させることができる。
【００７５】
改変された抗体は、標準的な分子生物学技術による発現またはポリペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製されうる。組換え発現のための方法は、本文書中において他所で扱う。
【００７６】
D．化学的改変
Fc領域におけるIgG機能を損なわせるための別のアプローチは、抗体をカルバミル化、アミド化、またはベンジル化することである。これらの改変のための技術は、Thrasher and Cohen, J. Immunol, 107:672-677 (1971)において提示されている。
【００７７】
E．一本鎖抗体
一本鎖可変断片（scFv）は、短い（通常、セリン、グリシン）リンカーによって共に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、もとの免疫グロブリンの特異性を保持する。この改変は通常、特異性を変化させない。これらの分子は、これまで、1つのペプチドとして抗原結合ドメインを発現させるために非常に簡便であるファージディスプレイを容易にするために作製された。または、scFvは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングした重鎖および軽鎖から直接作製することができる。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子において見いだされる定常Fc領域を欠き、したがって、抗体を精製するためには共通の結合部位（例えば、プロテインA/G）を用いる。プロテインLは、κ軽鎖の可変領域と相互作用することから、これらの断片はしばしば、プロテインLを用いて精製／固定化することができる。
【００７８】
可動性リンカーは一般的に、アラニン、セリン、およびグリシンなどのヘリックスおよびターン促進アミノ酸残基を含む。しかし、他の残基も同様に機能することができる。Tang et al.(1996)は、1本鎖抗体（scFv）のために作製されたリンカーをタンパク質リンカーライブラリから迅速に選択する手段として、ファージディスプレイを用いた。重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子が、可変組成物のアミノ酸18個のポリペプチドをコードするセグメントによって連結される、ランダムリンカーライブラリを構築した。scFvレパートリー（異なるメンバーおよそ5×106個）を、糸状ファージ上に表示して、ハプテンによるアフィニティ選択に供した。選択された変種集団は、結合活性の有意な増加を示したが、かなりの配列多様性を保持した。1054個の個々の変種のスクリーニングにより、その後可溶性型で効率よく産生される触媒的に活性なscFvを生じた。配列分析により、VH C末端の2残基後のプロリンがリンカーにおいて保存されること、ならびに選択されたテザーのごく一般的な特色として他の位置でアルギニンおよびプロリンが豊富に存在することが判明した。
【００７９】
本発明の組換え抗体はまた、受容体の二量体形成または多量体形成を可能にする配列または部分を伴いうる。そのような配列はIgAに由来する配列を含み、それによってJ鎖と共に多量体を形成することができる。別の多量体形成ドメインは、Gal4二量体形成ドメインである。他の態様において、鎖をビオチン／アビジンなどの物質によって改変してもよく、それによって2つの抗体の組み合わせが可能となる。
【００８０】
異なる態様において、非ペプチドリンカーまたは化学単位を用いて受容体の軽鎖および重鎖を結合させることによって、一本鎖抗体を作製することができる。一般的に、軽鎖および重鎖は、別個の細胞において産生され、精製されて、その後適切に連結される（すなわち、重鎖のN末端が適切な化学架橋を介して軽鎖のC末端に付加される）。
【００８１】
架橋試薬は、2つの異なる分子、例えば安定化剤と凝固剤の官能基を結びつける分子架橋を形成するために用いられる。しかし、同じアナログの二量体もしくは多量体、または異なるアナログを含むヘテロマー複合体を作製することができると企図される。2つの異なる化合物を段階的に連結させるために、望ましくないホモポリマー形成を消失させるヘテロ二官能性架橋剤を用いることができる。
【００８２】
例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、2つの反応基、すなわち一級アミン基と反応する基（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド）と、チオール基と反応する基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）とを含む。架橋剤は、一級アミン反応基を開介して1つのタンパク質（例えば、選択された抗体または断片）のリジン残基と反応することができ、かつ第一のタンパク質に既に結びつけられた架橋剤は、チオール反応基を介して他のタンパク質（例えば、選択物質）のシステイン残基（遊離のスルフヒドリル基）と反応する。
【００８３】
血液中で妥当な安定性を有する架橋剤を使用することが好ましい。ターゲティング物質および治療／予防用物質をコンジュゲートさせるためにうまく利用することができる多数のタイプのジスルフィド結合含有リンカーが公知である。立体的に妨害されているジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでより高い安定性を生じることが分かっており、作用部位に達する前にターゲティングペプチドが放出されるのを阻止しうる。このように、これらのリンカーは連結物質の1つのグループである。
【００８４】
別の架橋試薬はSMPTであり、これは隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体的に妨害されている」ジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体妨害は、組織および血液中に存在しうるグルタチオンなどのチオレート陰イオンによる攻撃から結合を保護して、それによって、付加された物質を標的部位に送達する前の、コンジュゲート脱カップリングを阻止するために役立つ機能を果たすと考えられている。
【００８５】
SMPT架橋試薬は、他の多くの公知の架橋試薬と同様に、システインのSHまたは一級アミン（例えば、リジンのイプシロンアミノ基）などの官能基を架橋する能力を与える。別の可能なタイプの架橋剤は、スルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネートなどの切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドを含む。N-ヒドロキシ-スクシンイミジル基は、一級アミノ基と反応して、フェニルアジド（光分解されると）は、いかなるアミノ酸残基とも非選択的に反応する。
【００８６】
妨害されている架橋剤に加えて、妨害されていないリンカーもまた、本発明に従って使用することができる。保護されたジスルフィドを含まないまたは生成しないと考えられる他の有用な架橋剤には、SATA、SPDP、および2-イミノチオラン（Wawrzynczak & Thorpe, 1987）が挙げられる。そのような架橋剤の使用は、当技術分野において十分に理解されている。別の態様は、可動性リンカーを用いることを伴う。
【００８７】
米国特許第4,680,338号は、リガンドとアミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのコンジュゲートを産生するために、特にキレート剤、薬物、酵素、および検出可能な標識などとの抗体コンジュゲートを形成するために有用な二官能性リンカーを記述する。米国特許第5,141,648号および第5,563,250号は、多様な厳しくない条件下で切断可能である不安定な結合を含む切断可能なコンジュゲートを開示している。このリンカーは、関心対象の物質がリンカーに直接結合して、切断によって活性物質が放出されるという点において特に有用である。特定の使用は、抗体または薬物などのタンパク質に遊離のアミノ基または遊離のスルフヒドリル基を付加する段階を含む。
【００８８】
米国特許第5,856,456号は、ポリペプチド構成成分をつないで融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作製するために用いられるペプチドリンカーを提供する。リンカーは、アミノ酸約50個までの長さであり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリジン）の後にプロリンが続く配列を少なくとも1回含み、より高い安定性および低減した凝集を特徴とする。米国特許第5,880,270号は、多様な免疫診断および分離技術において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。
【００８９】
F．精製
ある態様において、本発明の抗体は精製されうる。本明細書において用いられる「精製された」という用語は、タンパク質がその天然に得ることができる状態と比較して何らかの程度精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると意図される。それゆえ、精製タンパク質は、そのタンパク質が天然に存在しうる場合の環境を含まないタンパク質も意味する。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この名称は、タンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成している、例えば、組成物中のタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％またはそれより多くを構成している場合などの、組成物を意味する。
【００９０】
タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、あるレベルで、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を伴う。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、関心対象ポリペプチドを、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製（または均一になるまで精製）を達成してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。他のタンパク質精製法には、硫酸アンモニウム、PEG、および抗体などによる沈殿、または熱変性の後の遠心分離；ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィー；ならびにそのようなおよび他の技術の組み合わせが挙げられる。
【００９１】
本発明の抗体を精製する場合、原核細胞または真核細胞発現システムにおいてポリペプチドを発現させて、変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい可能性がある。ポリペプチドは、タグをつけたポリペプチドの部分と結合するアフィニティカラムを用いて他の細胞成分から精製されうる。当技術分野において一般的に公知であるように、様々な精製段階を行う順序を変更してもよく、またはある段階を省略してもよく、それでもなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの適した調製法が得られうると考えられる。
【００９２】
一般的に、完全な抗体は、抗体のFc部分と結合する物質（すなわち、プロテインA）を利用して分画される。または、抗原を用いて、適切な抗体を同時に精製および選択してもよい。そのような方法はしばしば、カラム、濾紙、またはビーズなどの支持体に結合させた選択物質を利用する。抗体を支持体に結合させて、混入物質を除去し（例えば、洗浄する）、および条件（塩、熱等）を適用して抗体を放出させる。
【００９３】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に公知である。これらは、例えば活性画分の比活性を決定する段階、またはSDS/PAGE分析による分画においてポリペプチドの量を評価する段階を含む。画分の純度を評価する別の方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように精製の程度を計算することである。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、当然、精製後に行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存する。
【００９４】
ポリペプチドの移動が、SDS/PAGEの異なる条件によって時に著しく変化しうることは公知である（Capaldi et al., 1977）。それゆえ、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製発現産物の見かけの分子量は変化しうると認識される。
【００９５】
III．NMOの処置または予防
A．製剤および投与
本発明は、抗AQP4抗体およびそれを生成するための抗原を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、抗体またはその断片の予防的または治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む。具体的な態様において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または動物において、およびより特にヒトにおいて用いるために米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療用物質が共に投与される希釈剤、賦形剤、または媒体を意味する。そのような薬学的担体は、水、ならびに落花生油、大豆油、鉱油、およびゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油などの滅菌液体でありうる。水は、薬学的組成物を静脈内注射する場合の特定の担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として利用することができる。他の適した薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、およびエタノールなどが挙げられる。
【００９６】
組成物は、望ましければ、湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤を微量含むことができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、および徐放性製剤などの剤形をとることができる。経口製剤は、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準的な担体を含むことができる。適した薬剤の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記述されている。そのような組成物は、患者に適切に投与するための剤形を提供するために適量の担体と共に、予防的または治療的有効量の抗体またはその断片を好ましくは精製した形態で含む。製剤は、経口、静脈内、動脈内、口腔内、鼻内、噴霧、気管支吸入、または機械換気呼吸による送達でありうる投与様式に適合すべきである。
【００９７】
人工的に獲得される受動免疫として知られる抗体の受動移入は、一般的に静脈内または筋肉内注射を用いることを伴う。抗体の形状は、ヒトまたは動物の血漿または血清でありうるか、静脈内（IVIG）または筋肉内（IG）で用いるためのプールされたヒト免疫グロブリンとして、免疫されたまたは疾患から回復したドナーの高力価ヒトIVIGまたはIGとして、およびモノクローナル抗体（MAb）としての形状でありうる。そのような免疫は一般的に、短期間に限って持続するが、過敏反応、および特に非ヒト起源のγグロブリンによる血清病の潜在的リスクもある。しかし、受動免疫は即時の防御を提供する。抗体は、注射に適した担体中で、すなわち無菌的でシリンジ操作可能な担体において調合される。
【００９８】
一般的に、組成物の成分は、単位投与剤形で、例えば活性物質の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密容器中で乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、個別にまたは共に混合して供給される。組成物が注入によって投与される場合、組成物を、滅菌薬学等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されうるように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００９９】
組成物は、中性または塩形態で調合することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する塩などの陰イオンによって形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する塩などの陽イオンによって形成された塩が挙げられる。
【０１００】
B．併用治療
本発明の抗体治療の有効性を増加させるために、この処置を、NMOを処置または予防するために有効である他の物質と併用することが望ましい可能性がある。このプロセスは、本発明の抗体と他の物質とを同時に患者に投与する段階を伴いうる。これは、両方の物質を含む1つの薬学的組成物を用いることによって、または1つの組成物が本発明の抗体を含み、他の組成物が第二の物質を含む、2つの別個の組成物を同時に投与することによって、行われうる。
【０１０１】
2つの治療は、いずれの順序で行ってもよく、他方の処置の前または後に数分から数週間の範囲の間隔で行ってもよい。他方の物質が個別に適用される態様においては、その物質がなおも患者に対して有利な併用効果を発揮することができるように、一般的に各送達時間のあいだに著しく長い期間が経過しないように確実にする。そのような場合においては、両方のモダリティが互いに12〜24時間以内に、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に投与されうると企図される。しかし、何らかの状況においては、各々の投与のあいだに数日（2、3、4、5、6、または7日）から数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8週間）が経過する、処置の期間を大幅に延長させることが望ましい場合がある。
【０１０２】
様々な組み合わせを利用することができ、本発明の抗体処置は「A」であり、第二の処置は「B」である：
2014514324.tif 000020
第二の物質の投与は、もしあれば毒性を考慮に入れて、その薬物の全般的プロトコールに従う。処置サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。第二の処置を以下に考察する。
【０１０３】
i．免疫抑制剤
プレドニゾンなどのコルチコステロイド（急性発作に関しては高用量；長期間の治療に関しては低用量）は、NMOの主要な治療であり、したがって本発明の抗AQP4抗体との併用治療として容易に適用される。抗AQP4抗体との併用において用いることができる免疫抑制剤処置には、アザチオプリン（Imuran）とプレドニゾンの併用、ミコフェノール酸モフェチルとプレドニゾンの併用、リツキシマブ、ミトキサントロン、免疫グロブリン静注（IVIG）、およびシクロホスファミドが挙げられる。
【０１０４】
ii．プラスマフェレーシス
プラスマフェレーシスは、血液循環から血漿（の成分）を除去、処置、および戻すことである。このように、これは体外治療（体外で行われる医学的技法）である。方法はまた、多様な薬剤へとさらに製造するための血漿を採取するためにも用いることができる。技法は、重症筋無力症、ギラン-バレー症候群、狼瘡、血栓性血小板減少性紫斑病、およびNMOなどの、免疫系の障害を含む多様な障害を処置するために用いられる。プラスマフェレーシスの際に、血液は最初に針または既に埋め込まれたカテーテルを通して体から採取される。次に、細胞分離器によって血液から血漿を除去する。血球から血漿を分離するために、3つの技法が一般的に用いられる：
・  不連続流遠心分離：1つの静脈カテーテルラインを必要とする。典型的には、一度に300 mlバッチの血液を採取して遠心分離して、血球から血漿を分離する。
・  連続流遠心分離：2つの静脈ラインを用いる。この方法は、血漿を連続的に除去することができることから、体から1回に採取するために必要な血液量がわずかにより少ない。
・  血漿濾過：2つの静脈ラインを用いる。血漿を標準的な血液透析装置を用いて濾過する。この連続プロセスでは、一度に体外に出す必要がある血液は100 ml未満である。
各々の方法はその利点および短所を有する。血漿の分離後、処置を受けている人に血球が戻されるが、抗体を含む血漿は、まず処置された後、従来のプラスマフェレーシスにおいて患者に戻される。（血漿交換において、除去された血漿は廃棄されて、患者は代用ドナー血漿、アルブミン、またはアルブミンと生理食塩水の混合物（通常、70％アルブミンおよび30％生理食塩水）を投与される）。まれに、輸血を嫌がる人では、ヒドロキシエチルデンプンなどの他の代用液が用いられうるが、これらは重度の副作用によりめったに用いられない。血液が凝固しないように維持するための薬剤（抗凝固剤）が、技法のあいだ、患者に与えられる。
【０１０５】
プラスマフェレーシスが重要に用いられるのは、他の内科治療に加えて、疾患を引き起こす自己抗体を血液循環から迅速に除去することが必要である自己免疫障害の治療である。血漿交換治療は、それ自身および単独で疾患プロセスを抑えるために有用であるが、長期間管理するためには内科治療と免疫抑制治療とを同時に行う必要があることに注目することは重要である。血漿交換は、有害な自己抗体を除去するための最も速やかな短期間の解決策を提供する。しかし、免疫系による自己抗体の産生もまた、通常、プレドニゾン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、リツキシマブなどの薬剤、またはこれらの混合物を用いることによって、抑制されなければならない。
【０１０６】
IV．抗体コンジュゲート
抗体を少なくとも1つの物質に連結させて、抗体コンジュゲートを形成してもよい。診断用物質または治療用物質としての抗体分子の効能を増加させるために、少なくとも1つの望ましい分子または部分との連結または共有結合または複合体形成が一般的に行われている。そのような分子または部分は、少なくとも1つのエフェクターまたはレポーター分子でありうるが、これらに限定されるわけではない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば免疫抑制／抗炎症活性を有する分子を含む。そのような分子の非制限的な例は先に記述したとおりである。そのような分子は任意で、標的部位またはその近傍で分子を放出させるように設計された切断可能なリンカーを介して付加される。
【０１０７】
これに対し、レポーター分子は、アッセイを用いて検出されうる任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされるレポーター分子の非制限的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えばビオチンなどが挙げられる。
【０１０８】
抗体コンジュゲートは一般的に、診断用物質として用いるために好ましい。抗体診断薬は、一般的に2つのクラス、すなわち多様な免疫アッセイにおける診断薬などのインビトロ診断において用いるための診断薬と、一般的に「抗体特異的イメージング」として知られるインビボ診断プロトコールにおいて用いるための診断薬に分けられる。多くの適切な造影剤が、それらを抗体に付加させる方法と共に、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,021,236号、第4,938,948号、および第4,472,509号を参照されたい）。用いられるイメージング部分は、常磁性イオン、放射性同位元素、蛍光色素、NMRで検出可能な物質、およびX線造影剤でありうる。
【０１０９】
常磁性イオンに関して、例として、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、および／またはエルビウム（III）、などのイオンが挙げられるが、ガドリニウムが特に好ましい。X線イメージングなどの他の状況において有用なイオンには、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、および特にビスマス（III）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１１０】
治療および／または診断応用のための放射性同位元素に関して、アスタチン211、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Eu、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレン、35イオウ、テクネチウム99m、および／またはイットリウム90が挙げられうる。125Iはしばしば、特定の態様において用いるために好ましく、テクネチウム99mおよび／またはインジウム111も同様に、その低いエネルギーにより、およびロングレンジ検出に対する適性により、好ましい。放射性標識モノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法に従って産生されうる。例として、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはカリウム、および次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤との接触によってヨウ素添加することができる。モノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスによって、例えば過テクネチウム酸をスズ（II）溶液によって還元して、還元されたテクネチウムをSephadexカラム上でキレートを形成させて、および抗体をこのカラムに適用することによって、テクネチウム99mによって標識されうる。または、例えば過テクネチウム酸、SNCl2などの還元剤、フタル酸ナトリウム-カリウム溶液などの緩衝液および抗体をインキュベートすることによる直接標識技術を用いてもよい。金属イオンとして存在するラジオアイソトープを抗体に結合させるためにしばしば用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
【０１１１】
コンジュゲートとして用いることが企図される蛍光標識には、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、オレゴングリーン 488、オレゴングリーン 500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが挙げられる。
【０１１２】
企図される抗体コンジュゲートの別のタイプは、抗体が、色素産生基質に接触すると着色産物を生成する二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結されている、主にインビトロでの使用が意図されるタイプである。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンおよびアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は当業者に周知であり、例えば米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、および第4,366,241号において記述される。
【０１１３】
抗体に対する分子の部位特異的付加のなお別の公知の方法は、ハプテンに基づく親和性標識と抗体との反応を含む。本質的に、ハプテンに基づく親和性標識は、抗原結合部位におけるアミノ酸と反応して、それによってこの部位を破壊して特異的抗原反応を遮断する。しかし、これによって抗体コンジュゲートによる抗原の結合が失われることから、有利ではない可能性がある。
【０１１４】
アジド基を含む分子もまた、強度の低い紫外光によって生成される反応性のニトレン中間体を通じてタンパク質との共有結合を形成するために用いられうる（Potter and Haley, 1983）。特に、プリンヌクレオチドの2-および8-アジドアナログは、粗細胞抽出物においてヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして用いられている（Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985）。2-および8-アジドヌクレオチドはまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマップするためにも用いられており（Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989）、抗体結合物質として用いられうる。
【０１１５】
抗体をそのコンジュゲート部分に付加またはコンジュゲートさせるために、いくつかの方法が当技術分野において公知である。いくつかの付加法は、例えば抗体に付加されたジエチレントリアミン五酢酸無水物（DTPA）、エチレンジアミン四酢酸、N-クロロ-p-トルエンスルホンアミド、および／またはテトラクロロ-3α-6α-ジフェニルグリコウリル(diphenylglycouril)-3などの有機キレート物質を使用する金属キレート錯体を用いることを伴う（米国特許第4,472,509号および第4,938,948号）。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応しうる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許第4,938,948号において、乳腺腫瘍のイメージングはモノクローナル抗体を用いて行われ、検出可能なイメージング部分は、メチル-p-ヒドロキシベンズイミデートまたはN-スクシンイミジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオネートなどのリンカーを用いて抗体に結合する。
【０１１６】
他の態様において、抗体の結合部位を変化させない反応条件を用いて、免疫グロブリンのFc領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が企図される。この方法論に従って産生された抗体コンジュゲートは、寿命、特異性、および感度の改善を示すことが開示されている（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,196,066号）。Fc領域における炭水化物残基にコンジュゲートされるエフェクターまたはレポーター分子の部位特異的付加も同様に文献（O'Shannessy et al., 1987）において開示されている。このアプローチは、現在臨床評価中である診断的および治療的に有望な抗体を産生すると報告されている。
【０１１７】
V．免疫検出法
なおさらなる態様において、AQP4およびその関連する抗原に結合する、それらを精製、除去、定量、およびそうでなければ全般的に検出する免疫検出法が存在する。いくつかの免疫検出法には、例を挙げれば酵素免疫測定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウェスタンブロットが挙げられる。特に、AQP4抗体を検出および定量するための競合アッセイも同様に提供される。様々な有用な免疫検出法の段階が、例えばDoolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)などの科学論文に記述されている。一般的に、免疫結合法は、試料を得る段階、および場合によっては免疫複合体を形成させるために有効な条件で、本明細書において考察される態様に従って試料に第一の抗体を接触させる段階を含む。
【０１１８】
選択した生物試料に、免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるために有効な条件および十分な期間、抗体を接触させる段階は、一般的に抗体組成物を試料に単に添加して、存在するAQP4と抗体が免疫複合体を形成する、すなわち結合するために十分に長い期間、混合物をインキュベートする事である。この期間の後、組織切片、ELISAプレート、ドットブロット、またはウェスタンブロットなどの試料-抗体組成物を一般的に洗浄して、非特異的結合抗体種を除去すると、一次免疫複合体内に特異的に結合した抗体のみが検出される。
【０１１９】
一般的に、免疫複合体形成の検出は当技術分野において周知であり、多数のアプローチの応用を通じて行われうる。これらの方法は一般的に、任意の放射性、蛍光、生物、および酵素タグなどの、標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関する特許には、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、および第4,366,241号が挙げられる。当然、当技術分野において公知である、二次抗体、および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置などの二次結合リガンドを用いることによってもさらなる利点が得られうる。
【０１２０】
検出に用いられる抗体をそれ自身、検出可能な標識に連結してもよく、この標識を単に検出すると、それによって組成物中の一次免疫複合体の量が決定される。または、一次免疫複合体内で結合するようになる第一の抗体を、抗体に対する結合親和性を有する第二の結合リガンドによって検出してもよい。これらの場合、第二の結合リガンドは、検出可能な標識に連結されうる。第二の結合リガンドはそれ自身、しばしば抗体であり、したがって「二次」抗体と呼ばれうる。一次免疫複合体に、二次免疫複合体を形成させるために有効な条件および十分な期間、標識された二次結合リガンドまたは抗体を接触させる。次に、二次免疫複合体を一般的に洗浄して、非特異的に結合したいかなる標識二次抗体またはリガンドも除去して、二次免疫複合体中に残っている標識を検出する。
【０１２１】
さらなる方法は、二段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。抗体に対する結合親和性を有する抗体などの第二の結合リガンドを用いて上記のように二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体に、免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるために再度有効な条件および十分な期間、二次抗体に対して結合親和性を有する第三の結合リガンドまたは抗体を接触させる。第三のリガンドまたは抗体は、検出可能な標識に連結され、このようにして形成された三次免疫複合体を検出することができる。このシステムは、望ましければシグナル増幅を提供しうる。
【０１２２】
1つの免疫検出法は、異なる2つの抗体を用いる。第一のビオチン化抗体を用いて標的抗原を検出し、次に第二の抗体を用いて、複合体化ビオチンに付加されているビオチンを検出する。その方法において、試験される試料を最初に、第一段階の抗体を含む溶液中でインキュベートする。標的抗原が存在すれば、抗体の一部は抗原に結合して、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次に、抗体／抗原複合体は、各段階で抗体／抗原複合体に対して追加のビオチン部位が付加されていて、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化DNA、および／または相補的ビオチン化DNAの溶液中で順にインキュベートすることによって増幅される。適したレベルの増幅が得られるまで増幅段階を繰り返して、得られた時点で、試料をビオチンに対する第二段階の抗体を含む溶液中でインキュベートする。この第二段階抗体は、例えば色素原基質を用いる組織酵素学によって抗体／抗原複合体の存在を検出するために用いることができる酵素によって標識される。適度に増幅すれば、肉眼的に可視可能なコンジュゲートを産生することができる。
【０１２３】
別の公知の免疫検出法は、イムノPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）方法論を利用する。PCR法は、ビオチン化DNAとのインキュベーション段階まではCantorの方法と類似であるが、多数回のストレプトアビジンおよびビオチン化DNAのインキュベーションを用いる代わりに、DNA／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を、抗体を放出させる低pHまたは高塩緩衝液によって洗浄する。次に、得られた洗浄液を使用して、適切な対照を用いて、適したプライマーによるPCR反応を行う。少なくとも理論的に、PCRの膨大な増幅能および特異性を利用して1つの抗原分子を検出することができる。
【０１２４】
1．ELISA
イムノアッセイは、その最も単純で直接的な意味において結合アッセイである。ある好ましいイムノアッセイは、当技術分野において公知の様々なタイプの酵素免疫測定法（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）である。組織切片を用いる免疫組織化学的検出も同様に、特に有用である。しかし、検出はそのような技術に限定されず、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、およびFACS分析なども同様に用いられうることは容易に認識される。
【０１２５】
1つの例示的なELISAにおいて、本発明の抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレートにおけるウェルなどのタンパク質親和性を示す選択された表面に固定される。次に、AQP4を含むと疑われる試験組成物をウェルに添加する。結合および洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗原を検出してもよい。検出は、検出可能な標識に連結された別の抗AQP4抗体の添加によって行われうる。このタイプのELISAは、単純な「サンドイッチELISA」である。検出はまた、第二の抗AQP4抗体を添加した後に、第二の抗体に対して結合親和性を有し、検出可能な標識に連結された第三の抗体を添加することによって行われうる。
【０１２６】
別の例示的なELISAにおいて、AQP4抗原を含むと疑われる試料をウェル表面に固定して、抗AQP4抗体を接触させる。結合および洗浄して非特異的結合免疫複合体を除去した後、結合した抗AQP4抗体を検出する。初回の抗AQP4抗体が検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体は直接検出されうる。同様に、第一の抗AQP4抗体に対して結合親和性を有し、検出可能な標識に連結された第二の抗体を用いても、免疫複合体は検出されうる。
【０１２７】
使用されるフォーマットによらず、ELISAは、コーティング、インキュベートおよび結合、非特異的結合種を除去するための洗浄、および結合した免疫複合体の検出などの一定の特色を共通に有する。これらを以下に記述する。
【０１２８】
プレートを抗原または抗体のいずれかによってコーティングする場合、一般的に、プレートのウェルを抗原または抗体の溶液と共に、終夜または指定の時間インキュベートする。次に、プレートのウェルを洗浄して不完全に吸着された材料を除去する。次に、ウェルに残っているいかなる利用可能な表面も、試験抗血清に関して抗原的に中立である非特異的タンパク質によって「コーティング」する。これらの非特異的タンパク質には、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、または粉乳の溶液が挙げられる。コーティングは、固定表面上の非特異的吸着部位の遮断を可能にして、したがって表面への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを低減させる。
【０１２９】
ELISAでは、直接技法よりむしろ二次または三次検出手段を用いることがおそらくより通例である。このように、タンパク質または抗体をウェルに結合させて、バックグラウンドを低減させるために非反応性材料によってコーティングして、および洗浄して非結合材料を除去した後、免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるために有効な条件で、試験される生物試料を固定表面に接触させる。免疫複合体の検出は、標識された二次結合リガンドまたは抗体、および標識された三次抗体または三次結合リガンドと二次結合リガンドまたは抗体を必要とする。
【０１３０】
「免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるために有効な条件下」とは、条件が好ましくは抗原および／または抗体をBSA、ウシγグロブリン（BGG）、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）／Tweenなどの溶液によって希釈する段階を含むことを意味する。添加されるこれらの物質はまた、非特異的バックグラウンドの低減を助ける傾向がある。
【０１３１】
「適した」条件とはまた、インキュベーションが、有効な結合を可能にするために十分な温度または期間で行われることを意味する。インキュベーション段階は典型的に、好ましくは25℃から27℃の温度で約1から2から4時間等であるか、または約4℃で終夜等でありうる。
【０１３２】
ELISAにおける全てのインキュベーション段階の後、複合体を形成していない材料を除去するために、接触させた表面を洗浄する。好ましい洗浄技法は、PBS/Tweenまたはホウ酸緩衝液などの溶液による洗浄を含む。試験試料と最初に結合した材料とのあいだに特異的免疫複合体が形成された後、洗浄すると、免疫複合体の微量の存在さえも決定することができる。
【０１３３】
検出手段を提供するために、第二または第三の抗体は、検出を可能にするために、関連する標識を有する。好ましくは、これは適切な色素形成基質と共にインキュベートすることによって発色を生成する酵素である。このように、例えば第一および第二の免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または水素ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体と、さらなる免疫複合体の形成の発生にとって都合がよい期間および条件で接触させるまたはインキュベートすること（例えば、PBS-TweenなどのPBS含有溶液中、室温で2時間のインキュベーション）が要求される。
【０１３４】
標識抗体とのインキュベート後、およびその後洗浄して非結合材料を除去した後、標識量は、例えば尿素、またはブロモクレゾールパープル、または2,2'-アジノ-ジ(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS）、または酵素標識としてペルオキシダーゼの場合にはH202などの色素形成基質と共にインキュベートすることによって定量される。定量は、例えば可視スペクトルの分光光度計を用いて、生成された色の程度を測定することによって行われる。
【０１３５】
2．ウェスタンブロット
ウェスタンブロット（または、タンパク質イムノブロット）は、所定の組織ホモジネートまたは抽出物試料中の特定のタンパク質を検出するために用いられる分析技術である。これは、ポリペプチドの長さによって（変性条件）、またはタンパク質の三次元構造によって（ネイティブ／非変性条件）、ネイティブまたは変性したタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を用いる。タンパク質をメンブレン（典型的にニトロセルロースまたはPVDF）に転写して、標的タンパク質に対して特異的な抗体を用いてそれらを探索（検出）する。
【０１３６】
試料は、組織全体または細胞培養物から採取されうる。ほとんどの場合、固体組織を最初に、ブレンダー（試料容積が大きい場合）を用いて、ホモジナイザー（試料容積が小さい場合）を用いて、または超音波によって機械的に破壊する。細胞もまた、上記の機械的方法の1つによって破壊されうる。しかし、細菌、ウイルス、または環境試料は、タンパク質源でありうるため、ウェスタンブロッティングは、細胞の研究のみに限定されないことに注意すべきである。細胞の溶解を促進してタンパク質を可溶化するために、洗浄剤、塩、および緩衝液の組み合わせが使用されうる。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤はしばしば、自身の酵素による試料の消化を阻止するために添加される。組織の調製は、しばしば、タンパク質の変性を回避するために低温で行われる。
【０１３７】
試料のタンパク質を、ゲル電気泳動を用いて分離する。タンパク質の分離は、等電点（pI）、分子量、電荷、またはこれらの要因の組み合わせによって行われうる。分離の性質は、試料の処置およびゲルの性質に依存する。これはタンパク質を決定するために非常に有用な方法である。同様に、1つの試料からのタンパク質を二次元に展開する二次元（2-D）ゲルを用いることも可能である。タンパク質は、第一の次元において等電点（それらが中性の実効電荷を有するpH）に従って分離され、第二の次元においてその分子量に従って分離される。
【０１３８】
抗体検出でタンパク質を利用しやすくするために、それらを、ゲルからニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（PVDF）製のメンブレンへと移動させる。メンブレンをゲルの上に置いて、その上に積み重ねた濾紙を置く。積み重ねたもの全体を緩衝液の中に入れると、緩衝液は毛細管作用によって濾紙を上って、それと共にタンパク質を運ぶ。タンパク質を転写する別の方法は、エレクトロブロッティングと呼ばれ、ゲルからPVDFまたはニトロセルロースメンブレンまでタンパク質を引っ張るために電流を用いる。タンパク質は、ゲル内で得た構成を維持しながら、ゲル内からメンブレン上へと移動する。このブロッティングプロセスの結果、タンパク質は、検出のための表面薄層上に露出する（以下を参照されたい）。どちらの多様なメンブレンも、非特異的タンパク質結合特性（すなわち、全てのタンパク質に等しく良好に結合する）で選択される。タンパク質結合は、疎水性相互作用に基づくのみならず、メンブレンとタンパク質との電荷相互作用に基づく。ニトロセルロースメンブレンは、PVDFより安価であるが、よりいっそう壊れやすく、繰り返しのプロービングに耐えられない。ゲルからメンブレンへのタンパク質転写の均一性および全体的な有効性は、クーマシーブリリアントブルーまたはポンソーS色素によってメンブレンを染色することによってチェックすることができる。転写した後、標識した一次抗体を用いて、または非標識一次抗体の後に、標識したプロテインAもしくは一次抗体のFc領域に結合する二次標識抗体を用いる間接的検出を用いてタンパク質を検出する。
【０１３９】
3．免疫組織化学
抗体はまた、免疫組織化学（IHC）による試験のために調製した新鮮凍結組織ブロック、および／またはホルマリン固定してパラフィン包埋した組織ブロックの両方とともに用いられうる。これらの微粒子検体から組織ブロックを調製する方法は、様々な予後予測因子に関するこれまでのIHC研究に用いることに成功しており、当業者に周知である（Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990）。
【０１４０】
簡単に説明すると、小さいプラスチックカプセルにおいて、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、凍結「粉砕した」組織50 ngを室温で再水和する段階、遠心分離によって粒子を沈降させる段階、粒子を粘度の高い包埋媒体（OCT）中に再懸濁する段階、カプセルを逆さにして、および／または遠心分離によって再度沈降させる段階、-70℃のイソペンタン中で瞬間的に凍結させる段階、プラスチックカプセルを切断する段階、および／または凍結した円柱状組織を取り出す段階、円柱状組織を低温槽ミクロトームチャック上に固定する段階、および／またはカプセルから25〜50個の連続切片を切断する段階によって凍結切片が調製されうる。または、凍結組織試料全体を連続切片切断のために用いてもよい。
【０１４１】
永久切片は、プラスチック製の微量遠心管中で試料50 mgを再水和させる段階、沈降段階、固定するために10％ホルマリン中に4時間再懸濁する段階、洗浄／沈降段階、温2.5％寒天中に再懸濁する段階、沈降段階、氷水中で冷却して寒天を硬化させる段階、組織／寒天ブロックをチューブから取り出す段階、ブロックをパラフィン中で浸潤および／または包埋する段階、および／または50個までの連続永久切片を作製する段階を伴う類似の方法によって調製されうる。この場合も、代わりに組織試料全体を用いてもよい。
【０１４２】
4．免疫検出キット
なおさらなる態様において、上記の免疫検出法と共に用いるための免疫検出キットが存在する。このように、免疫検出キットは、適した容器手段の中に、AQP4抗原に結合する第一の抗体、および任意で免疫検出試薬を含む。
【０１４３】
ある態様において、AQP4抗体を、カラムマトリクスおよび／またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固相支持体に予め結合させてもよい。キットの免疫検出試薬は、所定の抗体に会合または連結されている検出可能な標識を含む、多様な任意の形をとりうる。二次結合リガンドに会合または付加されている検出可能な標識も同様に企図される。例示的な二次リガンドは、第一の抗体に対して結合親和性を有する二次抗体である。
【０１４４】
本発明のキットにおいて用いるためのさらに適した免疫検出試薬は、第一の抗体に対して結合親和性を有する第二の抗体を、第二の抗体に対して結合親和性を有し、検出可能な標識に連結された第三の抗体と共に含む、二成分試薬を含む。先に注目したように、多数の例示的な標識が当技術分野において公知であり、そのような全ての標識が、本明細書において考察される態様に関連して使用されうる。
【０１４５】
キットはさらに、検出アッセイのための検量線を調製するために用いられうるように、標識または非標識にかかわらず、AQP4抗原の適切に分注された組成物を含みうる。キットは、完全なコンジュゲート型、中間型、またはキットのユーザーによってコンジュゲートされる別個の部分のいずれかとして抗体標識コンジュゲートを含みうる。キットの成分は、水性媒体中でまたは凍結乾燥型のいずれかで包装されうる。
【０１４６】
キットの容器手段は、一般的に、その中に抗体が入れられていてもよい、または好ましくは適切に分注されていてもよい、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含む。キットはまた、販売用の箱において抗体、抗原、および他の任意の試薬容器を含むための手段を含む。そのような容器は、その中に所望のバイアルが保持される射出成形または吹込成形プラスチック容器を含みうる。
【実施例】
【０１４７】
VI．実施例
以下の実施例は、好ましい態様を証明するために含められる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者らによって開発された技術が、態様の実践において良好に機能することを表しており、このように、その実践に関する好ましい様式を構成すると見なすことができることは当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な態様に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神および範囲に含まれる同様または類似の結果が得られることを認識すべきである。
【０１４８】
実施例1−材料および方法
DNA構築物、細胞培養物、およびトランスフェクション
完全長のヒトAQP4（M1およびM23アイソフォーム）をコードするDNA構築物を、鋳型として全脳cDNAを用いてPCR増幅によって生成した。いくつかの試験に関して、Mycエピトープ（NH2-EQKLISEEDL-COOH; SEQ ID NO:13）を、鋳型としてタグなしの構築物を用いるPCR増幅によって第二の細胞外ループに挿入した。M1およびM23の変異体を、タグ付けしたまたはタグ付けしていない鋳型のいずれかを用いるPCR増幅によって生成した。PCR断片は全て、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1にライゲートして、完全にシークエンシングした。
【０１４９】
U87MG細胞培養物（ATCC HTB-14）を、10％ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含むEMEM培地において5％CO2/95％空気中37℃で維持した。細胞をカバーガラス上で増殖させ、製造元のプロトコールに従ってLipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて、抗生物質を含まない培地中でDNAをトランスフェクトした。安定的AQP4発現クローンを、ジェネティシン（Invitrogen）中での濃縮後に選択して、96ウェルプレートに非常に低い密度で播いた。
【０１５０】
NMO患者の血清および組換えAQP4自己抗体
臨床疾患に関する改訂診断基準（Wingerchuk et al., 2006）を満たすNMO-IgG血清陽性者4人から、NMO血清を得た。対照（非NMO）ヒト血清は、UCSF細胞培養施設から購入した。組換えモノクローナルNMO抗体を、既に記述されたように（Bennett et al., 2009）、クローン増殖させた脳脊髄液形質芽球から生成した。重鎖および軽鎖構築物をHEK293細胞に同時トランスフェクトして、上清を採取して遠心分離していかなる細胞および破片も除去し、プロテインA-セファロース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と共に4℃で終夜インキュベートした。rAbを0.1 Mグリシン/1M NaCl（pH 3.0）中で溶出させて、0.1 M Tris-HCl pH 8.0によってpH 7.5に調節した。組換えIgGを、Ultracel YM-30微量濃縮器（Millipore, Billerica, MA）を用いて、プロテアーゼを含まない0.1％ウシ血清アルブミンを含むPBS中で交換して濃縮した。固定されたパパインによるIgG全体の消化によってFab断片を生成して、非消化IgGおよびFc断片をプロテインA（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）によって除去することによって精製した。抗体の完全性を、変性およびネイティブゲル電気泳動によって確認して、ヒトIgG捕捉ELISAを用いてIgG濃度をアッセイした。
【０１５１】
定量的免疫蛍光
AQP4発現U87MG細胞を、生細胞ブロッキング緩衝液（6 mMグルコース、1 mMピルビン酸、1％ウシ血清アルブミン、2％ヤギ血清を含むPBS）中で20分間インキュベートした後、ブロッキング緩衝液中でNMO患者血清または組換えNMO-IgGと共に30分間インキュベートした。次に、細胞をPBSによって十分にすすぎ、4％パラホルムアルデヒド中で15分間固定して、0.1％Triton X-100によって透過処理した。細胞を、再度ブロックして、0.4μg/mLポリクローナルC末端特異的ウサギ抗AQP4抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と共に30分間インキュベートした後、PBSによってすすいだ。最後に、細胞を、緩衝液中で4μg/mLヤギ抗ヒトIgGコンジュゲートAlexa Fluor 488およびヤギ抗ウサギIgGコンジュゲートAlexa Fluor 555（Invitrogen）と共に30分間インキュベートした。二次抗体と共にインキュベートした後、細胞をPBS中で十分にすすいで、カバーガラスにVectaMountハードセット培地（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を封入した。いくつかの実験において、U87MG細胞を上記のように、しかしNMO-IgG全体の代わりにモノクローナルマウス抗Myc-IgG（Covance, Emeryville, CA）または精製Fab断片によって標識した。抗Mycをヤギ抗マウスIgGコンジュゲートAlexa Fluor 488（Invitrogen）によって染色したが、Fab断片は、Dylight 488結合F(ab')2特異的二次抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）によって染色した。AQP4抗体結合の定量的分析を、Nikon 10倍対物レンズ（開口数0.3）を備えたNikon Eclipse TE2000S倒立落射蛍光顕微鏡（Nikon, Melville, NY）において行った。緑色および赤色色素を励起して、それぞれ、Chromaフィルターセット#41001および#42001（Chroma, Rockingham, VT）を通して観察した。画像を、CCDカメラ（Hamamatsu Orca, Bridgewater, NJ）によって記録して、顕微鏡に合わせたソフトウェアを用いて強度を決定した。
【０１５２】
全反射照明蛍光顕微鏡
TIRFMは、スルーオブジェクティブ（through-objective）TIRFアタッチメントおよび自動焦点維持モジュール（Nikon）を搭載した100倍TIRF油浸対物レンズ（開口数1.49）を備えたNikon Eclipse TE2000E顕微鏡を用いて行った。Alexa Fluor 555標識AQP4を、Z514/1O倍励起フィルターおよびZ514RDC光二色性ミラーを通してアルゴンイオンレーザーを用いて励起して、ET605/40m吸収フィルター（Chroma）を通して検出した。画像は、QuantEM 512SC 冷却CCDカメラ（Photometrics, Tucson, AZ）を用いて得た。
【０１５３】
単粒子追跡
量子ドット（Qドット）によるAQP4の標識の前に、Mycタグ付きAQP4を発現する細胞を、6 mMグルコースおよび1 mMピルビン酸塩を含むPBS（GP緩衝液) 2 mLによって洗浄して、ブロッキング緩衝液中で5分間インキュベートした。次に、細胞を、ブロッキング緩衝液中で70 ng/mLマウス抗Myc抗体（Covance）と共に5分間インキュベートして、すすぎ、ブロッキング緩衝液中で0.1 nMヤギF(ab')2抗マウスIgGコンジュゲートQドット655（Invitrogen）と共に5分間インキュベートした。細胞を十分にすすいで、実験を通してGP緩衝液中で維持した。SPTは、Nikon 100倍TIRF油浸対物レンズ（開口数1.45）および冷却CCDカメラ（Hamamatsu EM-CCD, Bridgewater, NJ）を備えたNikon Eclipse TE2000S倒立落射蛍光顕微鏡において行った。Qドット蛍光は、E460SPUV励起フィルターおよび475DCXRU光二色性ミラーを用いて励起して、D655/40m吸収フィルター（Chroma）を通して検出した。データを、6秒間、1フレームあたり11 ms（91 Hz）で連続的に得た。連続画像を分析して、以下に詳細に記述されるように（Crane and Verkman, 2008）軌跡を構築した。拡散データは、1秒間での範囲の累積分布の形で報告され、P(範囲)は、粒子の範囲がt＝1秒で所定の距離未満であるかまたは所定の距離に等しい確率として定義される。
【０１５４】
電気泳動およびイムノブロッティング
細胞培養物を、0.5％ドデシル-β-D-マルトシド（EMD chemicals, Gibbstown, NJ）を含むネイティブPAGE試料緩衝液（Invitrogen）によって氷中で10分間溶解した。溶解物を20,000 gで4℃で30分間遠心分離して、沈降物を廃棄した。ブルーネイティブゲル電気泳動（BN-PAGE）に関して、ポリアクリルアミドネイティブ勾配ゲル（3〜9％）を、既に記述されたように（Wittig et al., 2006）調製した。タンパク質10μgを5％クーマシーブルーG-250（Invitrogen）と混合して、各レーンにロードした。フェリチンを分子量標準物質（440および880 kDa）として用いた。泳動用緩衝液は、25 mMイミダゾール、pH 7（正極緩衝液）および50 mMトリシン、7.5 mMイミダゾール、0.02％クーマシーブルーG-250、pH 7（陰極緩衝液）であった。トリシンSDS-PAGEを、既に記述されているように（Schagger and Tricine, 2006）、12％泳動ゲルおよび3％スタッキングゲルによって行った。試料は、ローディング前に加熱しなかった。SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard（Invitrogen）を分子量マーカーとして用いた。タンパク質をポリビニルジフルオリドメンブレン（Bio-Rad, Hercules, CA）上にブロットした。イムノブロット分析に関して、メンブレンを3％BSAによってブロックして、ウサギ抗AQP4一次抗体（Santa Cruz）と共に2時間インキュベートした。メンブレンをすすいで西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG（Jackson ImmunoResearch）と共に1時間インキュベートして、十分にすすぎ、標識されたタンパク質をECL Plus酵素化学発光キット（Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA）を用いて検出した。
【０１５５】
実施例2−結果
AQP4に対するNMO-IgG結合の定量的分析のためのアプローチ
図1は、AQP4に対するNMO-IgG結合の定量的分析のために用いられるアプローチを図示する。指定のAQP4アイソフォームをその形質膜に発現する細胞を、NMO-IgG（NMO患者血清または組換えモノクローナル抗体）と共にインキュベートして、固定し、透過処理した後、抗AQP4抗体と共にインキュベートした（図1A）。抗AQP4抗体は、全てのAQP4アイソフォームに対して共通であるAQP4のC末端を認識する（図1B）。蛍光二次抗体を用いて、緑色蛍光によってNMO-IgGをおよび赤色蛍光によってAQP4を検出した。AQP4に対するNMO-IgGの結合を、緑色対赤色（G/R）蛍光比によって定量した。結合親和性およびストイキオメトリは、NMO-IgG濃度を増加させて滴定することによって決定した。1つのNMO-IgG濃度で行った測定とは対照的に、完全な濃度依存的結合の測定は、AQP4に対するNMO-IgG結合の定量的な偏りのない説明を提供する。
【０１５６】
安定的または一過性トランスフェクション後に、AQP4アイソフォームの有効な形質膜ターゲティングを示すだけでなく、ヒトグリア細胞起源で、迅速に増殖し、かつカバーガラス支持体への強い接着を示す、AQP4に対するNMO-IgG結合を分析するための細胞株を選択した。選択された細胞株であるU87MGは、元来ヒトアストロサイトーマに由来した（Ponten and Macintyre, 1968）。図2Aは、組換えモノクローナルNMO-IgG（緑色）および抗AQP4抗体（赤色）によって染色した、M1またはM23 AQP4を安定的に発現するU87MG細胞の高倍率共焦点顕微鏡写真を示す。AQP4は、細胞形質膜に局在し、細胞内の赤色蛍光はほとんどなかった。図2Bは、抗AQP4抗体染色AQP4発現細胞のTIRFMを示す。他の細胞タイプにおいて見いだされるように（Crane et al., 2008）、なめらかな蛍光パターンがM1-AQP4に関して認められ、かつM23-AQP4に関しては斑点状パターンが認められ、M23-AQP4はトランスフェクトU87MG細胞においてOAPを形成するが、M1-AQP4はそれを形成しないことを確認した。細胞ホモジネートのイムノブロット分析により、AQP4のM1およびM23アイソフォームに関して予想される分子サイズが示された（図2C、下）。M23のみを発現する細胞のBN-PAGEは、大きい超分子凝集体（OAP）の予想される形成に対応する多数の高分子量バンドを示したが、M1-発現細胞は、個々のAQP4四量体に対応する予想される約300 kDaのバンドのみを示した（図2C上）。図2Dは、組換えモノクローナルNMO-IgG（rAb-53、rAb-58、およびrAb-186）または対照抗体（rAb-2B4）（各20μg/mL）をM1またはM23 AQP4発現細胞に結合させた後に測定された緑色対赤色比（G/R）の例を示す。これらの初回測定は、AQP4（M1対M23）アイソフォームに対するNMO-IgGのかなりの多様性を示し、安定的におよび一過性にトランスフェクトしたU87MG細胞の両方において類似の結果が見いだされた。
【０１５７】
NMO血清試料における、AQP4アイソフォームに対する不均一なNMO-IgG結合
M1およびM23 AQP4アイソフォームに対するヒトNMO血清中のNMO-IgGの結合を、蛍光比イメージング法によって測定した。1：100希釈で調べたNMO患者からの血清検体10個について行った初回測定は、0.14から0.67の広範囲のM1：M23の相対的結合を示した。図3Aは、NMO患者4人からの血清検体に関する代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。各血清検体は、M23 AQP4に対する強いNMO-IgG結合を示したが、M1 AQP4に対しては多様な結合を示した。図3Bは、バックグラウンド補正済のR/G比を、血清濃度の関数として決定した濃度依存的NMO-IgG結合を示す。AQP4に対するNMO-IgG結合は飽和可能であり、M23：M1の相対的結合親和性は、0.11（血清1）、0.26（血清2）、0.03（血清3）、および0.21（血清4）であった。興味深いことに、結合データは、NMO血清の組成がポリクローナルであると推定されるにもかかわらず、1サイト飽和結合モデルに、ヒル係数がほぼ1で良好に適合した。総血清IgGにおけるNMO-IgGの比率は不明であることから、またはポリクローナルNMO-IgG組成であることから、血清を用いてAQP4に対するNMO-IgGの絶対的な結合親和性を決定することは不可能である。
【０１５８】
AQP4アイソフォームに対する組換えモノクローナルNMO-IgGの定量的結合
1人のNMO患者からの血清中のNMO-IgGは、複数のモノクローナルNMO-IgGのプールからなるポリクローナルである。以下を決定するために、1人のNMO患者に由来する複数のモノクローナル組換えNMO-IgGを用いて、類似の結合分析を行った：（i）絶対結合親和性；（ii）M23：M1の差次が、1人のNMO患者において不均一であるか否か、および（iii）M23：M1の差次的結合が、NMO-IgG結合親和性および／またはストイキオメトリの差によるものであるか否か。図4Aは、1人のNMO患者からの2つの組換えモノクローナルNMO-IgG（rAb-53およびrAb-58）の蛍光顕微鏡写真を示す。本試験において用いられるモノクローナル抗体は、1人のNMO患者のCSF（図3における「血清1」に対応する）に由来した。各々の場合においてM23 AQP4に対する強いモノクローナル抗体結合が認められたが、M1 AQP4に対する結合は多様であった。図4Bは、1サイト結合モデルに曲線が適合する、3つの組換えNMO-IgGに関する濃度依存的結合曲線をまとめている。各々の場合において、データは、ヒル係数がほぼ1で1サイトモデルに良好に適合した。最も低い解離定数は44 nMであり、これはM23 AQP4に対するrAb-53の結合に関して見いだされた。1人のNMO患者からの複数のモノクローナルNMO-IgGに関して顕著な不均一性が見いだされ、M23：M1の相対的結合親和性は0.02（rAb-53）、0.46（rAb-58）、および0.02（rAb-186）であった。図4Bにおける結合曲線はまた、M23：M1の結合の差が、結合能よりむしろ結合親和性の差によるものであるという結論を支持している。
【０１５９】
NMO-IgGのAQP4アイソフォーム特異的結合のメカニズム
本発明者らは、M23対M1でのAQP4に対するNMO-IgG結合親和性の差が、M23 AQP4によるOAPの形成によるのかどうか、および／またはM23とM1とで異なるN末端によるのかどうかを調べた。以下を発現する細胞に対するNMO-IgG結合の測定を行った：（i）M23：M1の比が異なるAQP4；（ii）M23と同時発現させた場合にOAP崩壊能が減少しているM1変異体；および（iii）OAPの形成能が減少しているM23 AQP4変異体。これらの試験に関して、本発明者らは、一過性にトランスフェクトしたU87MG細胞を用いた。一過性にトランスフェクトした細胞が適性であることは、固定濃度のNMO-IgGを用い、安定的にトランスフェクトした細胞と一過性にトランスフェクトした細胞とで同等の結合が示されることによって、上記で確認した（図2D）。
【０１６０】
図5Aは、AQP4を異なるM23：M1の比で同時発現するU87MG細胞に対するNMO-IgG（rAb-53）の濃度依存的結合を示す。OAP型のAQP4の比率およびOAPの平均サイズは、AQP4のM23：M1比と正比例する。量子ドット単粒子追跡測定を行って、異なるM23：M1比で形成されたOAPの特徴を決定した。図5A（右）は、既に示されるように（Crane et al., 2009）、M1含有量が高ければAQP4の拡散が増加することを示す。AQP4の拡散のこの増加は、M1 AQP4によるOAP成長の能動的崩壊による。意外ではないが、rAb-53は、M23単独との結合と比較すると、M23：M1の3：1および1：1混合物では、徐々に低減するAQP4結合を示した（図5A、左）。
【０１６１】
図5Bは、ネイティブM1を、二重システイン変異体M1-C13A/C17A（CCA）に置換したことを除き、図5Aと類似の実験からのデータを示す。CCA AQP4は、それ自身OAPを形成しないが、M23と同時発現すると、OAPの崩壊能を大きく低減させた（Crane et al., 2009）。それゆえ、同じM23：M1比では、ネイティブM1の代わりにCCA変異体を発現する細胞は、単粒子追跡により確認すると、より多くのOAP含有量を有する（図5B、右）。rAb-53の濃度依存的結合は、M23：M1混合物よりもM23：CCA混合物に対してより強い結合を示した（図5B、左）。M23：CCAを3：1比で発現する細胞に対するrAb-53の結合は、M23単独を発現する細胞の結合と同一であった。
【０１６２】
結合特異性の問題に取り組むための独立したアプローチとして、本発明者らは、OAP崩壊点突然変異を含むM23変異体を発現するU87MG細胞に対するNMO-IgG結合を測定した。これらの変異のOAP崩壊効果を、量子ドット単粒子追跡により確認した。図5C（右）は、M23 AQP4 N末端における変異F26QおよびG28Pが、OAP含有量を大きく低減させることを示しているが、このことはAQP4の対応するラットアイソフォームに関する本発明者らのこれまでの知見と類似である（Crane and Verkman, 2009）。図5C（左）は、ネイティブM23と比較した場合に、これらのM23変異体を発現する細胞に対するrAb-53の濃度依存的結合が大きく低減することを示している。併せて、図5A〜Cの結果は、OAP形成が、M23対M1でAQP4に対するNMO-IgGの親和性が増加することの原因であることを示している。
【０１６３】
可能な2つのメカニズム、二価 対 一価でのNMO-IgG結合は、OAP非会合AQP4よりもOAP会合AQP4に対するNMO-IgGの親和性がより高いことを説明することができる。図6Aは、IgG1における隣接するFab結合部位間の距離（Sosnick et al., 1992; Harris et al., 1998）と、AQP4四量体のサイズ（Ho et al., 2009）との比較を示す。図6Bは、可能な相反する結合メカニズムを図示する。第一のメカニズムは二価の結合である。強いNMO-IgG結合は、Fab部位が両方ともAQP4単量体または四量体に結合しなければならない二価の相互作用を必要とする。M23結合がM1結合よりかなり強いrAb-53の場合、AQP4単量体中の結合エピトープの位置は、Fab部位間の二価の相互作用が1つの四量体内では可能ではないがOAPにおける隣接する四量体を架橋するには最適であるような間隔で、存在する。rAb-58の場合、エピトープは、1つの四量体中で二価の結合が生じてそれによってM1およびM23 AQP4に対して同様に結合することができる位置に、存在しうる。第二のメカニズムは、一価の結合である。NMO-IgG結合は、古典的な一価の相互作用を伴い、そのそれぞれのエピトープに対する個々のFab'の親和性によって主に制御される。rAb-53の場合、OAP形成の際にエピトープ部位の構造が変化して、高い親和性が得られる。rAb-58の場合、エピトープ部位はOAP形成で変化せず、M1とM23とでAQP4に対する類似の親和性が得られる。
【０１６４】
M1およびM23 AQP4に対するFabの結合を、これらの競合するメカニズムを試験するために測定した。NMO-IgGをパパインによって消化して、精製し、Fab'を生じた。二価の結合メカニズムでは、Fab'による結合がほとんどなく、M1とM23とでAQP4に対するFabの結合に差はないと予測する。一価の結合メカニズムでは、M23 AQP4に対するrAb-53の結合の増加が、その個々のFab'に関してもまた観察されると予想する。対照として、本発明者らは、マウスモノクローナル抗Myc抗体から生成されたFab'の、外部Mycタグ付きAQP4アイソフォームに対する結合を測定した。予想されたように、抗Myc IgG全体は、Mycタグ付きM1およびM23 AQP4に等しく結合して、KDは〜10 nMであった（図6C）。図6Dは、AQP4（M1対M23）に対するFab断片の結合を示す。rAb-53のIgG全体およびFab'は、M23 AQP4に対して有意により強い結合を示し、rAb-58のIgG全体およびFab'ならびに抗Mycは、M1とM23とで類似の結合を示した。これらのデータは、一価の結合が関与する第二のメカニズムに対する直接の支持を提供する。
【０１６５】
実施例3−考察
本明細書において、本発明者らは、AQP4に対するNMO-IgGの結合を定量するために、およびNMO-IgG結合におけるAQP4アイソフォームおよびOAPの役割を決定するために、蛍光比イメージングを用いた。この生細胞システムは、モノクローナルNMO-IgGおよびポリクローナルNMO患者血清の特徴を調べるためには頑健な方法が必要であることから開発された。本発明者らは、U87MG細胞が、安定的または一過性トランスフェクション後に形質膜においてAQP4を効率よく発現し、細胞内にはAQP4をほとんどまたは全く発現しないことから、定量的結合測定に適していることを見いだした。U87MG細胞におけるAQP4の優れた膜発現は、おそらくそのグリア起源のためであり、それゆえネイティブヒトグリア細胞の機構と同じ輸送機構を発現することによる。この試験において用いられる安定的にトランスフェクトしたクローンのイムノブロット分析により、個々のAQP4アイソフォームが独占的に発現し、M1細胞株においてはM23が検出可能ではないことが示されている（図2C）。U87MG細胞は、迅速に増殖して、培養支持体に良好に接着するため、自動ハイスループットアッセイに適している。
【０１６６】
調べた全てのモノクローナルおよびポリクローナルNMO抗体に関して、M23発現細胞に対するNMO-IgG結合は、M1発現細胞に対する結合と同等であるかそれより強かかったが、M1に対する測定可能な結合は全ての場合において見いだされた。NMO-IgGは、濃度依存的に各々のAQP4アイソフォームに結合することが見いだされ、これはヒル係数がほぼ1で1サイト飽和結合モデルに良好に適合し、見かけの1サイト非協同的結合と矛盾しない。M23 AQP4に対するNMO-IgGの選択的結合は、より高い結合能よりもむしろより高い結合親和性の結果であることが見いだされた。AQP4のM23およびM1アイソフォームに対するモノクローナル抗体NMO-IgG rAb-53の結合親和性の差は、N末端配列の差よりむしろ、M23 AQP4によるOAP形成の結果であることが見いだされた。このことは、変化したOAP形成能および崩壊能を有するM1およびM23 AQP4の変異体を用いて証明された。二色の単粒子追跡アプローチを用いて、本発明者らは最近、同時発現されたAQP4アイソフォームM1およびM23が、OAPへの異なる集合能を有するAQP4四量体へと共に集合することを示した。本発明者らはまた、OAPのサイズおよび内容物を、M1：M23比を変化させることによって、またはM1 AQP4のパルミトイル化状態を変更することによって、変更することができることを示した（Crane et al., 2009）。本発明者らは、本明細書において、M1およびM23の同時発現がまた、NMO-IgG結合にも影響を及ぼすことを見いだした（図5A）。しかし、パルミトイル化ヌルM1変異体の発現によりM1のOAP崩壊能を低減させることによって、本発明者らは、同一のM23：M1比を有する混合物においてNMO-IgG結合が有意に増加することを見いだした（図5B）。本発明者らは、M23によるOAP形成がMet-23のすぐ下流の24〜26番目の残基においてN末端疎水性相互作用を必要とすることを既に示したが（Crane and Verkman, 2009）、OAPの形成能が大きく低減されたM23変異体（M23-F26QおよびM23-G28P）を発見した。これらのOAP崩壊M23 AQP4変異体は、NMO-IgG結合を大きく低減させた（図5C）。個々のM1およびM23アイソフォームに対するNMO-IgGの結合の等温線とは対照的に、AQP4変異体M23-F26QおよびM23-G28Pに対する結合は、おそらくこれらの変異体の発現が、OAP集合AQP4および非集合AQP4四量体の不均一な集団を生成することから、1サイト結合モデルに適合しない等温線を生じた。
【０１６７】
OAP集合AQP4に対する高親和性NMO-IgG結合のメカニズムを、その一価のFab'に対してNMO-IgG全体（二価）を比較することによって調べた。二価のIgG結合による増強よりむしろ、OAP集合の結果、個々のFab結合部位に関してより高い親和性が得られた。それゆえ、本発明者らは、NMOにおいて見いだされるIgGの多くの結合エピトープが、OAP集合時に作製される四量体／四量体界面に存在しうると提唱する。しかし、結合親和性の差は、おそらくエピトープ構造に応じて異なり、いくつかのNMO-IgG（rAb-58）は、非集合M1 AQP4に対して強い親和性を有する。
【０１６８】
血清NMO-IgG免疫蛍光に関して広く用いられているアッセイを、M1 AQP4発現HEK 293細胞において行う（Lennon et al., 2005）。このデータは、M23 AQP4に対するNMO-IgGの結合が、M1 AQP4に対する結合と同程度に良好、一般的にはM1 AQP4に対する結合よりもかなり良いことから、M23 AQP4発現細胞が優れていることを示している。結合の差は、全てのNMO-IgG濃度で認められ、しばしばヒト血清検体において見いだされるように、低濃度でかなり顕著である。確立された臨床基準によって定義された（Wingerchuk et al., 2006）NMOを有する患者からの血清の最大30％は、通常の方法を用いてアッセイした場合に血清陰性であることが見いだされた。この値は、AQP4のOAP形成M23アイソフォームを強く発現するヒトグリア細胞を利用する本明細書において確立されたイメージングアッセイなどのより感度のよいアッセイを利用すると、実質的により低くなる可能性がある。実際に、多数のヒト血清試料に関する最近の研究により、M1発現細胞の代わりにM23発現細胞を用いると、NMO-IgGの感度が70％から97％へと改善することが示された（Mader et al., 2010）。本明細書において確立されたこの定量的結合アッセイはまた、血清NMO-IgG結合親和性および特異性を、疾患の活動度、処置の状態および患者の特徴などのNMO臨床パラメータと相関させる場合にも有用であるはずである。OAP対OAP非会合AQP4に対するNMO-IgG結合のベースラインでの差は、診断的な意義を有しうるが、結合における自然発生的な変化および処置に関連した変化は、予後予測的な意義を有しうる。
【０１６９】
実施例4−材料および方法
組換えNMO-IgGおよびNMO患者血清
組換えモノクローナルNMO抗体（rAb）を、記述されるように（Bennett et al., 2009）、脳脊髄液（CSF）中のクローン増殖させた形質芽球から生成した。部位特異的変異誘発については、IgG1重鎖定常領域（IgG1Fc）のKpnI-XhoI断片をpSp73Xにクローニングした。GeneTailor部位特異的変異誘発システム（Invitrogen）を用いて、点突然変異をIgG1Fc配列に導入して、CDC（変異K322A）、ADCC（変異K326W/E333S）、または両方（変異L234A/L235A）を欠損している構築物を生成した（Baudino et al., 2008; Duncan and Winter, 1988; Hezareh et al., 2001; Idusogie et al., 2001）。変異IgG1Fc配列のAgeI-XhoI断片を、rAb-53の重鎖可変領域を含むpIgG1Flagにクローニングして、C末端Flagエピトープを有する変異体IgG1 Fc配列を含むアクアポルマブ構築物を生成した。
【０１７０】
二価のrAbおよびアクアポルマブを生成するために、重鎖および軽鎖構築物の対を、リポフェクタミンを用いてHEK293細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をDMEM培地＋10％FBS中で7日間増殖させて、上清を収集し、新鮮な培地を添加して、細胞をさらに7日間増殖させた。細胞培養上清を合わせ、2000 rpmで10分間遠心分離して、細胞および破片を沈降させ、細胞を含まない上清を1 M Tris pH 8.0によってpH 8.0に調節して、プロテインA-セファロース（Sigma-Aldrich）と共に4℃で終夜インキュベートした。rAbをプロテインA-セファロースから0.1 Mグリシン/1M NaCl（pH 3.0）中で溶出させて、0.1 M Tris-HCl pH 8.0によってpH 7.5に調節した。組換えIgGを、プロテアーゼを含まない0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS中で、Ultracel YM-30微量濃縮器（Millipore, Billerica, MA）を用いて、交換および濃縮した。BSAを表面プラズモン共鳴測定のために保存溶液から除去した。抗体の完全性を、変性およびネイティブゲル電気泳動によって確認して、IgG濃度を、ヒトIgG捕捉ELISAを用いてアッセイした。NMO血清を、臨床疾患に関する改訂診断基準（Wingerchuk et al., 2006）を満たしたNMO-IgG血清陽性者計10人から得た。対照（非NMO）ヒト血清を、計3人の非NMO者から得たか、またはUCSF細胞培養施設から購入した。いくつかの試験に関して、Melon Gel IgG精製キット（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）、およびAmicon超遠心フィルターユニット（Millipore, Billerica, MA）を用いて、総IgGを血清から精製して濃縮した。
【０１７１】
細胞培養物およびトランスフェクション
ヒトAQP4をコードするDNA構築物を、鋳型として全脳cDNAを用いるPCR増幅によって生成した。PCR断片を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1にライゲートして、完全にシークエンシングした。COS-7（ATCC CRL-1651）、U87MG（ATCC HTB-14）、およびCHO-K1（ATCC CCL-61）細胞培養物を、5％CO2/95％空気中で、10％ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含む適切な培地中37℃で維持した。CD16を発現するNK-92細胞（CD16-176V-NK92、Fox Chase癌センターから得た）を、5％CO2/95％空気中で、10％ウシ胎児血清、10％ウマ血清、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、2 mMグルタミン、0.2 mMミオイノシトール、2.5μM葉酸、非必須アミノ酸、110μg/mLピルビン酸ナトリウム、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含む、デオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドを有するa-MEM中37℃で培養した。
【０１７２】
表面プラズモン共鳴
AQP4に対するrAbのリアルタイム結合を、Biacore T-100機器（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ）を用いて、報告された技法（Patel et al., 2009）に基づいて25℃での表面プラズモン共鳴によって測定した。精製組換えヒトM1 AQP4（William Harries and Robert Stroud, UCSFによって提供された）を、95：5のL-a-ホスファチジルコリン：L-a-ホスファチジルセリン（Avanti Polar Lipids）比を含むプロテオリポソームに3％（重量/重量）AQP4で再構成した。簡単に説明すると、脂質（計37.5 mg、500 nmol）を40 mM b-オクチルグルコシド（PBS中）375μLに溶解した後、AQP4（300 ml、450 mg、15 nmol）を添加した。混合物を4℃でPBSに対して48時間透析した（10,000ダルトンカットオフ）。AQP4を含まないリポソームを調製するために、等量の40 mM b-オクチルグルコシド（AQP4の代わり）を脂質溶液に添加した。プロテオリポソームを、2μl/分での10分／注入を4回注入して、プロテオリポソーム固定の6000反応単位が得られるように、L1センサーチップ（Biacore）上に固定した。次に、表面を50 mM NaOHの100μl/分での20秒間の2回の注入によって洗浄し、0.01 mg/ml BSAを20μl/分で300秒間注入することによって表面の品質に関してチェックした。フローチャネル1（Fc 1）を参照としての0％AQP4で固定して、Fc 2はAQP4プロテオリポソームを含んだ。結合試験をPBSによって流速15μl/分で行った。PBS中のrAbを80秒間注入した後、注入後期間は240秒間であった。50 mM NaOHを100μl/分で20秒間注入することによって、再生を行った。結合試験を1試料あたり2回ずつ行った。データは、Biacore T100評価ソフトウェアを用いて分析した。
【０１７３】
細胞におけるAQP4に対するNMO-IgG結合
AQP4に対するrAb-53の結合の動態を、記述されるように（Crane et al., 2011）、定量的イメージングによってヒトAQP4-M23を安定的に発現するU87MG細胞において測定した。細胞を生細胞ブロッキング緩衝液（6 mMグルコース、1 mMピルビン酸塩、1％ウシ血清アルブミン、2％ヤギ血清を含むPBS）において20分間インキュベートした後、NMO-IgGと共に指定の時間インキュベートした。次に細胞をすすいで4％パラホルムアルデヒド中で15分間固定して、0.1％Triton X-100によって透過処理した。次に、細胞を再度ブロックして、0.4μg/mLポリクローナルC末端特異的ウサギ抗AQP4抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と共に30分間インキュベートした後、PBSによってすすいだ。最後に、細胞を4μg/mLヤギ抗ヒトIgGコンジュゲートAlexa Fluor 488およびヤギ抗ウサギIgGコンジュゲートAlexa Fluor 555（Invitrogen）と共にブロッキング緩衝液中で30分間インキュベートした。NMO-IgG結合は、記述（39）のように比画像分析によって定量した。いくつかの試験において、rAb-53を、標準的なスクシンイミジルケミストリーを用いてCy3によって蛍光標識した。
【０１７４】
補体依存的細胞傷害（CDC）および抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ADCC）アッセイ
CDCのアッセイに関しては、ヒトAQP4を発現するCHO細胞を、12.5μg/mlアクアポルマブ（または対照IgG）と共に30分間プレインキュベートした後、NMO-IgG（2.5μg/ml）または対照IgGおよび5％ヒト補体と共に37℃で90分間インキュベートした。カルセイン-AMおよびエチジウムホモ二量体（Invitrogen）を添加して生細胞を緑色におよび死細胞を赤色に染色した。1〜2％NMO患者血清（および対照の非NMO血清）および5％ヒト補体による補体媒介性細胞傷害を、同様に、50〜100μg/mlアクアポルマブの非存在下 対 存在下で測定した。ADCCアッセイに関しては、CD16を発現するNK-92細胞をエフェクター細胞として用いた。AQP4発現CHO細胞を15μg/mlアクアポルマブ（または対照IgG）と共に30分間プレインキュベートした後、NMO-IgG（5μg/ml）または対照IgGおよびエフェクター細胞（エフェクター：標的の比30：1）と共に37℃で3時間インキュベートした。細胞をPBSによってすすいだ後、カルセイン-AMおよびエチジウムホモダイマーを添加した。
【０１７５】
インビボNMOモデル
成体マウス（30〜35 g）を2,2,2-トリブロモエタノール（125 mg/kg i.p.）によって麻酔して、定位フレームに固定した。記述されるように（Saadoun et al., 2010）、NMO患者血清（調べた5人の異なるNMO血清陽性患者）から単離された精製総IgG（14μL、6〜38 mg/mL）およびヒト補体（10μL）を、アクアポルマブ（10μg）の非存在下または存在下でマウスに脳内注射した。対照は、非NMOヒトIgG（調べた3人の異なる対照血清）、AQP4ヌルマウスの使用、およびアクアポルマブ単独の注射を含んだ。注射後24時間でマウスを屠殺して、脳をホルマリン中で固定して、パラフィンに処理して、前頭極から1.6 mmで冠状切片を作製した。切片をヘマトキシリン／エオジン、ルクソールファストブルー（ミエリンに関して）によって染色するか、またはAQP4（Millipore, Watford, UK）およびC5b-9（Abcam, Cambridge, UK）に対する抗体によって免疫染色した。顕微鏡写真を、記述のように（Saadoun et al., 2010; Crane et al., 2011）AQP4免疫反応性およびミエリンの喪失に関して定量した。
【０１７６】
エクスビボNMOモデル
改変気液界面培養法を用いて、器官型脊髄切片培養物を調製した。生後7日目のマウス仔を断頭して、脊髄を迅速に摘出して氷冷Hank's緩衝塩類溶液（HBSS、pH 7.2）に入れた。厚さ300μmの頚髄の横断切片を、ビブラトーム（Leica VT-1000S; Leica）を用いて切断した。個々の切片を、培養培地1 mLを含む6ウェル（35 mm）プレートにおいて透明な非コーティングメンブレンインサート（Millipore, Millicell-CM 0.4μm孔、直径30 mm）上に載せて、切片を培養培地の薄膜で覆った。切片を、50％最小必須培地（MEM）、25％HBSS、25％ウマ血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、グルコース（0.65％）およびHEPES（25 mM）（3日毎に交換）中5％CO2中37℃で10日間培養した。7日目に、精製IgG（NMO患者または対照血清から単離、300μg/mL）およびヒト補体（10％）を、アクアポルマブ（L234A/L235AまたはK322A、10μg/ml）の非存在下または存在下で培養培地に添加した。切片をさらに3日間培養して、AQP4、GFAP、およびMBP免疫蛍光のために固定した。切片を以下のように採点した：0、均一でインタクトなGFAPおよびAQP4染色を有するインタクトな切片；1、AQP4染色が減少し、GAFP染色によって認められるいくつかのアストロサイトの膨張を伴うインタクトな切片；2、GFAPおよびAQP4染色を喪失した、切片における少なくとも1つの病変；3、GFAPおよびAQP4染色を喪失した、切片面積の＞30％に及ぶ多数の病変；4、切片面積の＞80％に及ぶGFAPおよびAQP4染色の広範囲の喪失。AQP4ヌルマウスの切片は、GFAP免疫蛍光のみによって採点した。
【０１７７】
実施例5−結果
NMOのアクアポルマブ治療の根本原理を図7Aに描写する。AQP4の細胞外エピトープに結合する病原性の自己抗体（NMO-IgG）は、AQP4四量体より実質的に大きく、1つより多くの抗体が同時に結合するのを阻止する。それゆえ、本発明者らは、結合親和性が高く、流出が遅い非病原性抗体が、病原性抗体の結合と競合して、したがって下流のアストロサイトの損傷および神経炎症を遮断すると推論した。
【０１７８】
適した非病原性AQP4抗体を操作するために、本発明者らは、3人のNMO患者のCSF中のクローンにより増殖させた形質芽球集団に由来する10個の組換えモノクローナルNMO-IgGを生成してスクリーニングした。1つの細胞からの精製重鎖および軽鎖可変領域配列の対を、PCR増幅して、重鎖および軽鎖定常領域配列を含む発現ベクターにクローニングして、HEK293細胞に同時発現させ、かつ組換えIgGを上清から精製した。再構成されたプロテオリポソーム中のAQP4に対する各々のモノクローナル組換え抗体の結合を、表面プラズモン共鳴によって測定した。調べた10個の組換え抗体のうち、本発明者らは、抗体rAb-53が、親和性が最も高く、流出が最も遅いことを見いだした（図7B、左）。AQP4プロテオリポソームに対するrAb-53の結合は数分以内に起こり（結合速度定数1.4×104  M-1s-1）、および何時間もかけて流出し（オフレート定数3.8×10-4 s-1）、見かけの結合親和性は27 nMであった。他の組換えNMO抗体は、実質的に急速な流出および結合親和性の低減を有した（例を図7B、右に示す）。rAb-53の流出が遅いことは、AQP4を発現する生細胞において確認された。図7Cは、5〜10分間のあいだにrAb-53が結合して、3時間のあいだ測定可能な流出がないことを示す。
【０１７９】
AQP4結合Fab配列を保存しながら、CDC（K322A）、ADCC（K326W/E333S）、または両方（L234A/L235A）を阻害するために、 rAb-53のFc部分に点突然変異を導入した（図8A）。これらの変異の導入は、AQP4に対する抗体の結合に影響を及ぼさなかった。変異抗体の1つに関する代表的な表面プラズモン共鳴データを図8Bに示す。予想されたように、Fc変異は、オンまたはオフ結合速度定数を有意には変化させず、結合親和性を低減させなかった。
【０１８０】
変異rAb-53抗体が、非変異rAb-53の結合を遮断するか否かを決定するために、rAb-53を、AQP4に対する結合に影響を及ぼさない条件下でCy3によって蛍光標識した。図8Cは、変異抗体ならびに非変異rAb-53の各々の5倍過剰量がAQP4発現細胞に対するCy3標識rAb-53の結合を遮断したことを示している。非AQP4特異的（アイソタイプ対照）モノクローナル組換え抗体は効果を有しなかった。重要なことに、NMO-IgGのポリクローナル混合物を含むヒトNMO血清は、他のモノクローナルNMO抗体（図8Dに示されるrAb-186）と同様に、Cy3標識rAb-53の結合を遮断した（図8Dに示される5つの代表的なヒトNMO血清の1つ）。非NMO（対照）ヒト血清は効果を有しなかった。これらのデータは、AQP4上の表面エピトープに対する結合に関してNMO自己抗体のあいだで競合があることを示唆している。
【０１８１】
細胞表面AQP4に対するNMO-IgG結合の主要な下流の結末は、補体媒介性細胞殺傷である。図9Aは、生細胞が緑色に染色されて、死細胞が赤色に染色される生／死細胞アッセイを示す。AQP4発現細胞をrAb-53および補体と共にインキュベートすると、大規模な細胞殺傷を引き起こした。補体C1q活性化を欠損しているrAb-53変異体K322AおよびL234A/L235Aは、細胞殺傷をほとんど引き起こさなかったが、インタクトな補体結合を有するK326W/E333Sは、細胞殺傷を引き起こした。対照試験において、補体またはrAb-53単独では、細胞殺傷を引き起こさず、rAb-53および補体はAQP4ヌル細胞と共にインキュベートしても細胞殺傷を引き起こさなかった（示していない）。図9Bは、5倍モル過剰量のK322AまたはL234A/L235Aが、補体とrAb-53による細胞殺傷を大きく低減させたことを示している。
【０１８２】
NMO患者の血清中のNMO-IgGのポリクローナル混合物は、AQP4の細胞外表面上の様々な一部重複する三次元エピトープを認識すると考えられる。図9Cは、rAb-53変異体K322AまたはL234A/L235Aが、異なるNMO患者からのNMO血清による補体媒介性細胞殺傷を遮断したことを示す（患者6人中3人の血清の代表的なデータを示す）。対照（非NMO）血清は細胞殺傷を引き起こさなかった。それゆえ、アクアポルマブrAb53-K322AおよびL234A/L235Aは、おそらくはAQP4表面での立体妨害により、異なるNMO-IgGの結合を遮断して、その結果細胞殺傷を遮断する。
【０１８３】
アクアポルマブがNMO-IgG依存的ADCCを低減できることも同様に確認した。AQP4発現細胞をrAb-53の非存在下または存在下で、およびrAb-53変異体L234A/L235Aの非存在下または存在下でNK細胞と共にインキュベートした。図9Dは、rAb-53の存在下でのNK細胞による顕著な細胞殺傷を示すが、対照抗体またはアクアポルマブの存在下ではNK細胞による細胞殺傷はほとんど見られない。NK細胞およびrAb-53と共にインキュベートする際にアクアポルマブL234A/L235Aを含めると、細胞殺傷は大きく低減した。
【０１８４】
NMO病変の低減におけるアクアポルマブの効能を調べるために、インビボおよびエクスビボNMOモデルにおいて概念実証試験を行った。NMO血清から精製されたIgGをヒト補体と共に実質内注射することによりインビボでNMO病変をマウス脳に作製した。注射後24時間で、顕著な炎症細胞（主に好中球）の浸潤を認め、AQP4およびミエリンが喪失して、注射した半球において血管中心性の補体活性化が認められた（図10A）。対照実験において、（i）補体と共に対照（非NMO）ヒトIgG、（ii）AQP4ヌルマウスにおいて補体と共にNMO-IgG、または（iii）アクアポルマブ単独、の脳内注射後に、炎症細胞の浸潤、ミエリンの喪失、AQP4の喪失または補体活性化はほとんどまたは全く認められなかった。NMO-IgGおよび補体をアクアポルマブと同時注射すると、図10Bにおける一連のマウスに関して定量されたようにAQP4およびミエリンの喪失を大きく低減させた。図10Cは、異なる血清陽性NMO患者からのNMO-IgGをアクアポルマブの存在下または非存在下で注射した5対のマウスからのデータを示す。アクアポルマブは、病変サイズを大きく低減させた。
【０１８５】
マウスの脊髄切片を7日間培養した後、NMO-IgG（NMO患者血清から精製されたIgG）およびヒト補体と共に3日間インキュベートしたNMOのエクスビボ脊髄切片モデルにおいて試験を行った。このエクスビボモデルは、定義された条件で、CNS組織を抗体および補体に曝露させる。図11Aに示されるように、NMO-IgGおよび補体は、AQP4、GFAP、およびミエリン免疫蛍光を顕著に喪失した特徴的なNMO病変を生じたが、これは、補体の非存在下、またはAQP4ヌルマウスの脊髄切片では認められなかった。アクアポルマブを含めると、NMO病変の重症度を大きく低減させ、AQP4、GFAP、およびミエリンは保存された。アクアポルマブ単独または補体と共にインキュベートしても、病態をほとんどまたは全く生じなかった。図11Bは、NMO病変の重症度の組織学スコアをまとめる。アクアポルマブによる類似の防御はrAb-53に対して、および他の2人のNMO患者からのNMO-IgGに対して見いだされた。
【０１８６】
実施例6−考察
本明細書において提示されるデータは、NMO治療のためにアクアポルマブブロッキング抗体の有用性の証拠を提供する。操作された高親和性非病原性組換えモノクローナル抗体は、細胞培養におけるNMO患者の血清中でのポリクローナルNMO-IgGの細胞表面AQP4結合を遮断して、NMOのエクスビボ脊髄およびインビボマウスモデルにおいて下流の細胞傷害およびNMO病変を阻止する。モノクローナル抗体治療は広く多様な標的および疾患のために用いられているが、非病原性ブロッキングモノクローナル抗体という考え方は、自己免疫疾患の治療のために自己抗体-抗原の相互作用を標的とする考え方であることから、新規である。NMOは、病原性自己抗体の1つの標的であるAQP4が、抗体のサイズと比較して小さい細胞外フットプリントを有する形質膜タンパク質であり、病態が抗体エフェクター機能に依存することから、モノクローナル抗体遮断剤治療にとって理想的な独自の疾患である。
【０１８７】
変異した完全なIgG1抗体を、本明細書において最初の概念証明試験に関して用いたが、アクアポルマブの治療効能を増強するために多くの改変が可能である。一本鎖抗体または抗体コンジュゲート（Hagemeyer et al., 2009）の使用などの抗体設計の変更は、アクアポルマブの安定性、およびCNS浸透（Kontermann, 2009）を増加させ、可変ドメインの変異誘発はAQP4結合アビディティ（Igawa et al., 2011; Nieri et al., 2009）を増加させうる。IgG4などの代替抗体アイソタイプは、IgG1 Fc領域における残留エフェクター機能を消失させることによって治療効能を増加させうる（Kaneko and Niwa, 2011）。NMOに関する静脈内アクアポルマブ治療は、疾患の急激な増悪の際、病変部位での血液脳関門が開いている場合に、NMO病態を低減させるために有用であり、かつおそらくは増悪の頻度および重症度を低減させる維持治療のために有用である。アクアポルマブの硝子体内投与は、NMOにおける視神経脊髄炎後の網膜神経節細胞の喪失を制限するために有効でありうる。
【０１８８】
アクアポルマブ自身がCNS病態を生じないことは重要である。病態は、脊髄切片と共にアクアポルマブをインキュベートした後でも、または直接脳内注射によっても認められなかった。NMO発作の重症度は、補体活性化の程度と相関しているが（Hinson et al., 2009）、補体および細胞非依存的NMO病態の可能性が提唱されている（Marignier et al., 2010）。トランスフェクトされた細胞モデルにおけるデータから、NMO-IgGが、NMO病態に寄与しうるAQP4およびEAAT2インターナリゼーションを引き起こすことが示唆されている（Hinson et al., 2008）。これが正しければ、アクアポルマブによっても類似のインターナリゼーションが起こりうる。しかし、本発明者らは、インタクトなCNSのアストロサイトにおいてNMO-IgGによって誘導されるAQP4の喪失またはインターナリゼーションがほとんどまたは全くないことを見いだしている（Ratelade et al., 2011）。実際に、マウスにおいてAQP4が全く存在しない場合は、CNS解剖学構造または機能のベースライン異常を引き起こさず；顕著なストレスのみが、変化した水バランスの表現型（Manley et al., 2000; Papadopoulos et al., 2004）、神経興奮（Binder et al., 2006; Padmawar et al., 2005）、グリア性瘢痕（Auguste et al., 2007; Saadoun et al., 2005）、および神経炎症（Li et al., 2011）を生じた。AQP4はまた、CNSの外部で腎臓、肺、胃、骨格筋、および外分泌腺において発現されるが、マウスにおいてAQP4が欠失している場合は、病態または顕著な機能障害を生じない（Verkman, 2008）。このように、さらなる前臨床開発のためには、毒性の完全な正式の評価が必要ではあるが、アクアポルマブ治療そのものが毒性を生じる可能性は低い。
【０１８９】
結論すると、アクアポルマブ非病原性抗体による、NMO-IgGとAQP4との相互作用の遮断は、NMO治療に関する新規アプローチを表す。非病原性遮断抗体は、他の自己免疫疾患においても同様に治療的有用性を有しうる。
【０１９０】
本明細書において開示および特許請求される組成物および方法は全て、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記述されているが、組成物および方法に、ならびに本明細書において記述される方法の段階または段階の順序に変更を適用してもよく、それらも本発明の概念、精神、および範囲に含まれることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連するある物質を、本明細書において記述される物質の代わりに用いてもよく、それでも同じまたは類似の結果が得られることは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念に含まれると考えられる。
【０１９１】
VIII．参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書において記述される内容を補助する例示的な技法または他の詳細を提供する程度に、具体的に参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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