(57)【要約】  新規なウロテンシンＩＩ受容体（ＵＴ）作動薬及び拮抗薬が、本明細書に記載される。より具体的には、ウロテンシンＩＩ関連ペプチド（ＵＲＰ）の新規な誘導体が、本明細書に記載される。
2014518854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2014518854.tif 000032
を有するウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩であって、
式中、Ｘが、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン及び側鎖立体配座的に制限されたフェニルアラニン、若しくは式
【化２】
2014518854.tif 000033
を有するフェニルアラニン類縁体からなる群から選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸であり、
式中、Ｒは、ボロン酸、ボロン酸誘導体、置換ビニル、又は置換アルキニルを使用する金属触媒反応によって導入された置換基であることを特徴とするウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
前記側鎖立体配座異的に制限されたフェニルアラニンが、β−β−ジフェニルアラニン；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸；１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸及び４−アミノ−インドロ［２，３−ｃ］アゼピン−３−オンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記ボロン酸誘導体が、フェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、４−ピリジンボロン酸、４−シアノフェニルボロン酸、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸、３−フランボロン酸、２−フランボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−ニトロ−フェニルボロン酸、トランス−２−クロロメチルビニルボロン酸、トランス−１−プロペン−１−イルボロン酸、２−Ｂｏｃ−インドールボロン酸、アセトアミドフェニルボロン酸、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）フェニルボロン酸、４−フェノキシフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸及び２，４，６−トリフルオロフェニルボロン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
前記置換ビニルが、ビニルベンゼン、１−メチル−４−ビニルベンゼン、１−メチル−３−ビニルベンゼン、１−メチル−２−ビニルベンゼン、１，３，５−トリメチル−２−ビニルベンゼン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、１−イソプロピル−４−ビニルベンゼン、１−（クロロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−クロロ−４−ビニルベンゼン、３−ビニルベンゼン、４−ビニル安息香酸、１−（トリフルオロメチル）−２−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−３−ビニルベンゼン、イソプロペニルベンゼン、４−ニトロスチレン、４−ビニルアラニン、４−ビニルアニソール、１−ｔ−ブトキシ−４−ビニルベンゼン、４−ビニルフェニルアセテート及び１−エトキシ−４−ビニルベンゼンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
前記置換アルキニルが、エチニルベンゼン、１−エチニル−４−フルオロベンゼン、１−エチニル−４−ｔ−ブチルベンゼン、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン、エチニルシクロヘキサン、１−デシン、９−エチニルフェナントレン、１−エチニルナフタレン、４−エチニルベンゾニトリル、１−エチニル−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−エチニルアニリン、４−エチニル−１，１’−ビフェニルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
式
【化３】
2014518854.tif 000034
を有し、
式中、Ｒが、ボロン酸、又はフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、４−ピリジンボロン酸、４−シアノフェニルボロン酸、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸、３−フランボロン酸、２−フランボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−ニトロ−フェニルボロン酸、トランス−２−クロロメチルビニルボロン酸、トランス−１−プロペン−１−イルボロン酸、２−Ｂｏｃ−インドールボロン酸、アセトアミドフェニルボロン酸、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）フェニルボロン酸、４−フェノキシフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸及び２，４，６−トリフルオロフェニルボロン酸からなる群から選択されるボロン酸誘導体を使用する金属触媒反応により導入された置換基であることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
式
【化４】
2014518854.tif 000035
を有し、
式中、前記置換ビニル（Ｒ−Ｃ＝Ｃ−）が、ビニルベンゼン、１−メチル−４−ビニルベンゼン、１−メチル−３−ビニルベンゼン、１−メチル−２−ビニルベンゼン、１，３，５−トリメチル−２−ビニルベンゼン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、１−イソプロピル−４−ビニルベンゼン、１−（クロロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−クロロ−４−ビニルベンゼン、３−ビニルベンゼン、４−ビニル安息香酸、１−（トリフルオロメチル）−２−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−３−ビニルベンゼン、イソプロピニルベンゼン、４−ニトロスチレン、４−ビニルアラニン、４−ビニルアニソール、１−ｔ−ブトキシ−４−ビニルベンゼン、４−ビニルフェニルアセテート及び１−エトキシ−４−ビニルベンゼンからなる群から選択される置換ビニルを使用する金属触媒反応によって導入されることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項８】
式
【化５】
2014518854.tif 000036
を有し、
式中、前記置換アルキニル（Ｒ−Ｃ≡Ｃ−）が、エチニルベンゼン、１−エチニル−４−フルオロベンゼン、１−エチニル−４−ｔ−ブチルベンゼン、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン、エチニルシクロヘキサン、１−デシン、９−エチニルフェナントレン、１−エチニルナフタレン、４−エチニルベンゾニトリル、１−エチニル−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−エチニルアニリン、４−エチニル−１，１’−ビフェニルからなる群から選択される置換アルキニルを使用する金属触媒された反応により導入されることを特徴とする、請求項１に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
式
【化６】
2014518854.tif 000037
を有することを特徴とする、請求項６に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１０】
ｈＵＩＩ関連作用を遮断するためのものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１１】
ＵＲＰ仲介作用に影響を及ぼさないことを特徴とする、請求項１０に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１２】
ＵＩＩイソ型のＮ末端セグメントを実質的に含むことを特徴とする、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１３】
前記Ｎ末端セグメントが、ヤツメウナギ（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）、フグ（Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ）、ガンギエイ（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）、ツノザメ（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）、チョウザメ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ヘラチョウザメ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ハゼ（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、ゼブラフィッシュα（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、ゼブラフィッシュβ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、サッカーＡ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、サッカーＢ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、コイα（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、コイβ１（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、コイβ２（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、コイγ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、ヒラメ（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、マス（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ハタ（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、カエル（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ニワトリ（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ゼブラフィッシュ（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、マウス（Ｐｈｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）、ラット（Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）、ブタＡ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ブタＢ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ウシ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、サル（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）、チンパンジー（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）及びヒト（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１４】
前記ｒＵＩＩイソ型に基づき、かつ式
【化７】
2014518854.tif 000038
を有することを特徴とする、請求項１３に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１５】
ＵＲＰ関連作用を遮断するためのものであることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１６】
ＵＩＩ仲介作用に影響を及ぼさないことを特徴とする、請求項１５に記載のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１７】
式
【化８】
2014518854.tif 000039
を有する放射性標識化ウロテンシン作動性薬であり、
式中、Ｒが、ボロン酸、又はフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、４−ピリジンボロン酸、４−シアノフェニルボロン酸、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸、３−フランボロン酸、２−フランボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−ニトロ−フェニルボロン酸、トランス−２−クロロメチルビニルボロン酸、トランス−１−プロペン−１−イルボロン酸、２−Ｂｏｃ−インドールボロン酸、アセトアミドフェニルボロン酸、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）フェニルボロン酸、４−フェノキシフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸及び２，４，６−トリフルオロフェニルボロン酸からなる群から選択されるボロン酸誘導体を使用する金属触媒反応により導入された置換基であり、
式中Ｚが、放射性同位体を含むリガンドであることを特徴とする、放射性標識化ウロテンシン作動性薬。
【請求項１８】
式
【化９】
2014518854.tif 000040
を有する放射性標識化ウロテンシン作動性薬であり、
式中、前記置換ビニル（Ｒ−Ｃ＝Ｃ−）が、ビニルベンゼン、１−メチル−４−ビニルベンゼン、１−メチル−３−ビニルベンゼン、１−メチル−２−ビニルベンゼン、１，３，５−トリメチル−２−ビニルベンゼン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、１−イソプロピル−４−ビニルベンゼン、１−（クロロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−クロロ−４−ビニルベンゼン、３−ビニルベンゼン、４−ビニル安息香酸、１−（トリフルオロメチル）−２−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−３−ビニルベンゼン、イソプロピニルベンゼン、４−ニトロスチレン、４−ビニルアラニン、４−ビニルアニソール、１−ｔ−ブトキシ−４−ビニルベンゼン、４−ビニルフェニルアセテート及び１−エトキシ−４−ビニルベンゼンからなる群から選択される置換ビニルを使用する金属触媒反応によって導入され、
式中Ｚが、放射性同位体を含むリガンドであることを特徴とする、放射性標識化ウロテンシン作動性薬。
【請求項１９】
式
【化１０】
2014518854.tif 000041
を有する放射性標識化ウロテンシン作動性薬であり、
式中、前記置換アルキニル（Ｒ−Ｃ≡Ｃ−）が、エチニルベンゼン、１−エチニル−４−フルオロベンゼン、１−エチニル−４−ｔ−ブチルベンゼン、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン、エチニルシクロヘキサン、１−デシン、９−エチニルフェナントレン、１−エチニルナフタレン、４−エチニルベンゾニトリル、１−エチニル−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−エチニルアニリン、４−エチニル−１，１’−ビフェニルからなる群から選択される置換アルキニルを使用する金属触媒された反応により導入され、
式中Ｚが、放射性同位体を含むリガンドであることを特徴とする、放射性標識付けウロテンシン作動性薬。
【請求項２０】
前記放射性同位体が、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、９９ｍＴｃ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６２Ｃｕ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、８９Ｓｒ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ及びＢｒ７６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の放射線標識付ウロテンシン作動性薬。
【請求項２１】
ＵＩＩ及び／又はＵＲＰによって仲介される特異的生物学的作用間を識別するための方法であって、
ａ）請求項１又は１２に記載されるウロテンシン作動性薬に大動脈環を曝露するステップと、
ｂ）ＵＩＩ又はＵＲＰに対して濃度反応曲線を作製するステップと、
ｃ）ＵＩＩ又はＵＲＰのいずれかによって誘導された大動脈環収縮に及ぼす前記ウロテンシン作動性薬の効果を評価するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、広くはウロテンシン作動系の新規な作動薬及び拮抗薬に関する。より具体的には、本明細書は、これだけに限らないが、新規なウロテンシンＩＩ受容体（ＵＴ）作動薬及び拮抗薬に関する。本開示はまた、ウロテンシンＩＩ受容体（ＵＴ）作動薬及び拮抗薬の調製のためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在利用可能な薬物療法があるもかかわらず、心血管疾患は、西欧における健康障害の主因の１つのままである。病状を調整し得るＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）等の更なる治療標的の同定が関心対象となってきている。その脱オルファン化（ｄｅｓｏｒｐｈａｎｉｓａｔｉｏｎ）に続いて、ウロテンシンＩＩ受容体（初期は感覚上皮神経ペプチド様受容体又はＧＰＲ１４と呼ばれた）は、健康状態又は疾患状態のいずれかにおける心血管ホメオスタシスにおけるその密接な関係について研究されてきた［１］。
【０００３】
２０年以上前に、硬骨類魚の尾部神経分泌系から最初に単離されたウロテンシンＩＩ（ＵＩＩ）は、その後ヒトを含むいくつかの種で特性化された［２］。この高度に保存される環式ペプチドは、心腎、肺、中枢神経系、及び内分泌機能を含む哺乳類における生物学的作用の広範囲に働く。ウロテンシンＩＩは、心血管機能の重要な仲介物として特性化され、血管保護及び血管障害性効果に関与するとされた。実際、ＵＩＩ及びＵＩＩ  ｍＲＮＡの濃度は、アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、子癇前症、糖尿病、腎疾患及び肝疾患に冒された患者において上昇したことが報告された。
【０００４】
ＵＩＩは、別の非常に強力な血管収縮薬であるエンドセリン−１（ＥＴ−１）よりも２桁分まで強力であり、現在まで最も強力な内因性血管収縮薬として報告されてきた［３］。哺乳類における最近の研究は、ＵＩＩ関連ペプチド（ＵＲＰ）と呼ばれるＵＩＩパラログの前駆体をコード化する第２の遺伝子の存在を示した［４］。ヒト、マウス及びラットで同定されたこのオクタペプチドはまた、ＵＩＩ中で見出された高度に保存される環式ヘキサペプチドコア配列（ＣＦＷＫＹＣ）も含む。しかしながら、これらペプチドは、それらのＮ−末端ドメインにおける長さ及び組成で異なる（表１）。薬理学上では、これらは、ＵＴと呼ばれるＧタンパク質共役受容体の内因性リガンドである。ペプチド及び受容体の双方が、脳、肺、心臓、膵臓及び腎臓並びに血管系を含むいくつかのヒト組織で同定されていて、最近まで、これらは冗長な生物学的活性を及ぼすと考えられた。ごく最近では、証拠がＵＩＩ及びＵＲＰは、共通であるが異なる生理学的作用を及ぼし得ることを示唆した。
【０００５】
以前の構造−活性相関（ＳＡＲ）研究は、ＵＩＩ及びＵＲＰ配列内で同一の環内残基、並びにジスルフィド架橋によって担われる重要な役割を強調した。より具体的には、認識及び活性化プロセスの双方におけるＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（ＷＫＹ）トライアドの重要な役割が第一線に挙げられてきた。実際に、ＵＩＩ中又はＵＲＰ中のいずれかのＬｙｓのオルニチンによる置き換えは、ウロテンシン作動系の拮抗薬を生じ［５、６］、一方ＵＩＩ中のＴｙｓ残基のモノ−又はジ−ヨードチロシンによる置換は、それぞれ完全な作動薬及び部分的作動薬へと導いた［６、３０］。ＵＩＩ又はＵＲＰ中のＴｒｐ残基の配置の逆転は、これら構造内のこの残基の異なる関与効果をもたらした［７−８］。
【０００６】
【表１Ａ】
2014518854.tif 000003
【表１Ｂ】
2014518854.tif 000004
【０００７】
同一の環内コア配列を共有するが、以前のＳＡＲ研究は、それらの認識及び活性化プロセスにおける差異を強調した。実際には、ＵＩＩ、ｈＵＩＩ（４−１１）、最小のｈＵＩＩ等活性断片、又はＵＲＰ中のＴｒｐ残基の配置の逆転は、これら構造におけるこの残基の異なる関与効果を裏付けた［９］。ｈＵＩＩ又はｈＵＩＩ（４−１１）に導入されることで、これは弱い作動薬を生成し、一方ＵＲＰ中の同一の置換は、ＵＩＩ−誘導大動脈環収縮を完全に消失させることが可能な部分的作動薬を生成した。かかる驚くべき挙動はまた、フェニルアラニン部分がシクロヘキシルアラニン残基で置き換えられる場合に観察され、なぜならこの置換は、ｈＵＩＩ（４−１１）配列中で挿入される場合拮抗薬を生成するが、ＵＲＰ中では完全な作動薬を生成するからである。
【０００８】
ＵＩＩ−及びＵＲＰ−関連作用は、特定のＧタンパク質共役受容体、ＵＴによって仲介され、このＵＴは、心血管系を含む主要な哺乳類臓器系の生理学的調節において重要な役割を果たす［２］。実際、ウロテンシンＩＩは、強力な血行動態作用［１０］、陽性の変力作用及び変時反応［１１］並びに浸透圧調節作用［１２］を及ぼし、コラーゲン及びフィブロネクチン蓄積を誘導し［１３、１４］、炎症性応答を調整し［１５］、心臓及び血管の肥大の誘導において役割を果たし［１６］、強力な血管形成効果を引き起こし［１７］、並びにグルコース−誘導インスリン放出を阻害する［１８］。従って、ウロテンシン作動系は、アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、子癇前症、糖尿病、腎臓及び肝臓疾患、静脈瘤出血、潰瘍、並びに心理学的及び神経学的障害を含む多数の病態生理学的状態と関連してきた［１］。
【０００９】
最近の証拠は、ＵＩＩ及びそのパラログペプチドのＵＲＰが、共通ではあるが異なる生理学的作用を及ぼし得ることを示唆した［１９、２０］。例えば、研究は、これら２つのペプチドに関する細胞増殖への異なる作用［１９］、及び特徴的な心筋の収縮活動を報告した［２０］。隔離した虚血性心臓実験において、両ペプチドは、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の低下を通して心筋損傷を低減することが可能であったが、ＵＩＩのみが心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）産生を低減することができた［２０］。更に、ＵＩＩは用量依存的細胞分裂活性を星状膠細胞に及ぼしたが、ＵＲＰは及ぼさなかった。ごく最近では、ＵＩＩ又はＵＲＰ活性化時に、異なる転写調節が、単離された心臓の核で観察された［２１］。更には、高血圧におけるＵＩＩ及びＵＲＰに関する別個の病態生理学的役割が示唆された［２２］。事実、ＵＩＩ及びＵＲＰの双方のｍＲＮＡ発現は、ＳＨＲラットの心房中で、同月齢のＷＫＹラットと比較してアップレギュレートされた。しかしながら、ＳＨＲラットの大動脈及び腎臓においてはＵＲＰ  ｍＲＮＡの特異的なアップレグレーションであるが、ＵＩＩ  ｍＲＮＡはそうでないことは、これらペプチドは、この生物学的系においては独立して作用するという概念を裏付けている［２２］。この系におけるそれぞれのペプチドに関連する特定の役割に関する重大な問題が未だ残ったままである。
【００１０】
過去１０年の間、非ペプチドＵＴ拮抗薬の開発は、研究者がＵＩＩ／ＵＴ系の（病態）生理学的役割の輪郭を描き始めることを可能にした［２３］。しかしながら、既存の拮抗薬（ペプチド及び非ペプチド）のいずれも特定のＵＩＩ−又はＵＲＰ−関連作用を識別するようには設計されなかった。
【００１１】
本明細書は、その内容が、それらの全体で本明細書に組み込まれる多数の文献を参照する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書は、広くは新規なウロテンシンＩＩ受容体（ＵＴ）作用薬及び拮抗薬に関する。一実施形態では、本開示は、ウロテンシンＩＩ関連ペプチド（ＵＲＰ）の新規な誘導体に関する。他の実施形態では、本開示は、ビフェニルアラニンウロテンシンＩＩ関連ペプチド（［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ）に関する。
【００１３】
一実施形態では、本開示は、式：
【化１】
2014518854.tif 000005
を有するウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩に関する。
式中、Ｘは、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン並びにβ−β−ジフェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸及び４−アミノ−インドロ［２，３−ｃ］アゼピン−３−オンを含む側鎖立体配座的に制限されたフェニルアラニン、若しくは式
【化２】
2014518854.tif 000006
を有するフェニルアラニン類似体からなる群から選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸である。
式中、Ｒは、ボロン酸、ボロン酸誘導体、置換ビニル、又は置換アルキニルを使用する金属触媒反応によって導入される置換基である。
【００１４】
一実施形態では、本開示は、式
【化３】
2014518854.tif 000007
を有するウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩である。
式中Ｘは、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン並びにβ−β−ジフェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸；１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸及び４−アミノ−インドロ［２，３−ｃ］アゼピン−３−オンを含む側鎖立体配座的に制限されたフェニルアラニン、若しくは式
【化４】
2014518854.tif 000008
を有するフェニルアラニン類似体からなる群から選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸である。
式中、Ｒは、ボロン酸若しくはフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、４−ピリジンボロン酸、４−シアノフェニルボロン酸、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸、３−フランボロン酸、２−フランボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−ニトロ−フェニルボロン酸、トランス−２−クロロメチルビニルボロン酸、トランス−１−プロペン−１−イルボロン酸、２−Ｂｏｃ−インドールボロン酸、アセトアミドフェニルボロン酸、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）フェニルボロン酸、４−フェノキシフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸及び２，４，６−トリフルオロフェニルボロン酸からなる群から選択されるボロン酸誘導体；ビニルベンゼン、１−メチル−４−ビニルベンゼン、１−メチル−３−ビニルベンゼン、１−メチル−２−ビニルベンゼン、１，３，５−トリメチル−２−ビニルベンゼン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、１−イソプロピル−４−ビニルベンゼン、１−（クロロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−クロロ−４−ビニルベンゼン、３−ビニルベンゼン、４−ビニル安息香酸、１−（トリフルオロメチル）−２−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−３−ビニルベンゼン、イソプロピニルベンゼン、４−ニトロスチレン、４−ビニルアラニン、４−ビニルアニソール、１−ｔ−ブトキシ−４−ビニルベンゼン、４−ビニルフェニルアセテート及び１−エトキシ−４−ビニルベンゼンからなる群から選択される置換ビニル；若しくはエチニルベンゼン、１−エチニル−４−フルオロベンゼン、１−エチニル−４−ｔ−ブチルベンゼン、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン、エチニルシクロヘキサン、１−デシン、９−エチニルフェナントレン、１−エチニルナフタレン、４−エチニルベンゾニトリル、１−エチニル−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−エチニルアニリン、４−エチニル−１，１’−ビフェニルからなる群から選択される置換アルキニルを使用する金属触媒反応により導入される置換基である。
【００１５】
一実施形態では、本開示は、式
【化５】
2014518854.tif 000009
を有するウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩に関する。
式中、Ｒは、ボロン酸若しくはフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、４−ピリジンボロン酸、４−シアノフェニルボロン酸、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸、３−フランボロン酸、２−フランボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−ニトロ−フェニルボロン酸、トランス−２−クロロメチルビニルボロン酸、トランス−１−プロペン−１−イルボロン酸、２−Ｂｏｃ−インドールボロン酸、アセトアミドフェニルボロン酸、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）フェニルボロン酸、４−フェノキシフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸及び２，４，６−トリフルオロフェニルボロン酸からなる群から選択されるボロン酸誘導体を使用する金属触媒反応により導入された置換基である。
【００１６】
一実施形態では、本開示は、式
【化６】
2014518854.tif 000010
を有するウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩に関する。
式中、置換ビニル（Ｒ−Ｃ＝Ｃ−）は、ビニルベンゼン、１−メチル−４−ビニルベンゼン、１−メチル−３−ビニルベンゼン、１−メチル−２−ビニルベンゼン、１，３，５−トリメチル−２−ビニルベンゼン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、１−イソプロピル−４−ビニルベンゼン、１−（クロロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−クロロ−４−ビニルベンゼン、３−ビニルベンゼン、４−ビニル安息香酸、１−（トリフルオロメチル）−２−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−３−ビニルベンゼン、イソプロピニルベンゼン、４−ニトロスチレン、４−ビニルアラニン、４−ビニルアニソール、１−ｔ−ブトキシ−４−ビニルベンゼン、４−ビニルフェニルアセテート及び１−エトキシ−４−ビニルベンゼンからなる群から選択される置換ビニルを使用する金属触媒反応によって導入される。
【００１７】
一実施形態では、本開示は、式
【化７】
2014518854.tif 000011
を有するウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩に関する。
式中、置換アルキニル（Ｒ−Ｃ≡Ｃ−）は、エチニルベンゼン、１−エチニル−４−フルオロベンゼン、１−エチニル−４−ｔ−ブチルベンゼン、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン、エチニルシクロヘキサン、１−デシン、９−エチニルフェナントレン、１−エチニルナフタレン、４−エチニルベンゾニトリル、１−エチニル−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−エチニルアニリン、４−エチニル−１，１’−ビフェニルからなる群から選択される置換アルキニルを使用する金属触媒反応により導入される。
【００１８】
一実施形態では、式
【化８】
2014518854.tif 000012
を有する放射性標識化ウロテンシン作用性薬に関する。
式中、Ｒは、ボロン酸若しくはフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、４−ピリジンボロン酸、４−シアノフェニルボロン酸、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸、３−フランボロン酸、２−フランボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−ニトロ−フェニルボロン酸、トランス−２−クロロメチルビニルボロン酸、トランス−１−プロペン−１−イルボロン酸、２−Ｂｏｃ−インドールボロン酸、アセトアミドフェニルボロン酸、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ）フェニルボロン酸、４−フェノキシフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸及び２，４，６−トリフルオロフェニルボロン酸からなる群から選択されるボロン酸誘導体を使用する金属触媒反応により導入された置換基であり、並びに、
式中Ｚは、放射性同位体を含むリガンドである。
【００１９】
より具体的な実施形態では、この放射性同位体は、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、９９ｍＴｃ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６２Ｃｕ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、８９Ｓｒ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ及びＢｒ７６からなる群から選択される。
【００２０】
一実施形態では、本開示は、式
【化９】
2014518854.tif 000013
を有する放射性標識化ウロテンシン作動性薬に関する。式中、置換ビニル（Ｒ−Ｃ＝Ｃ−）は、ビニルベンゼン、１−メチル−４−ビニルベンゼン、１−メチル−３−ビニルベンゼン、１−メチル−２−ビニルベンゼン、１，３，５−トリメチル−２−ビニルベンゼン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、１−イソプロピル−４−ビニルベンゼン、１−（クロロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−クロロ−４−ビニルベンゼン、３−ビニルベンゼン、４−ビニル安息香酸、１−（トリフルオロメチル）−２−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−４−ビニルベンゼン、１−（トリフルオロメチル）−３−ビニルベンゼン、イソプロピニルベンゼン、４−ニトロスチレン、４−ビニルアラニン、４−ビニルアニソール、１−ｔ−ブトキシ−４−ビニルベンゼン、４−ビニルフェニルアセテート及び１−エトキシ−４−ビニルベンゼンからなる群から選択される置換ビニルを使用する金属触媒反応によって導入され、並びに、式中Ｚは、放射性同位体を含むリガンドである。
【００２１】
より具体的な実施形態では、この放射性同位体は、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、９９ｍＴｃ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６２Ｃｕ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、８９Ｓｒ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ及びＢｒ７６からなる群から選択される。
【００２２】
一実施形態では、本開示は、式
【化１０】
2014518854.tif 000014
を有する放射性標識化ウロテンシン作動性薬に関する。式中、置換アルキニル（Ｒ−Ｃ≡Ｃ−）は、エチニルベンゼン、１−エチニル−４−フルオロベンゼン、１−エチニル−４−ｔ−ブチルベンゼン、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン、エチニルシクロヘキサン、１−デシン、９−エチニルフェナントレン、１−エチニルナフタレン、４−エチニルベンゾニトリル、１−エチニル−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−エチニルアニリン、４−エチニル−１，１’−ビフェニルからなる群から選択される置換アルキニルを使用する金属触媒反応により導入され、並びに、式中Ｚは、放射性同位体を含むリガンドである。
【００２３】
より具体的な実施形態では、この放射性同位体は、Ｉ１２３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、９９ｍＴｃ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６２Ｃｕ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、８９Ｓｒ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ及びＢｒ７６からなる群から選択される。
【００２４】
別の実施形態では、このリガンドは、ペプチドコア上の任意の好適な位置に配置され、更なる放射性標識化誘導体をもたらす。更に別の実施形態では、この放射性同位体は、ペプチドコア上の任意の好適な位置に配置され、更なる放射性標識化誘導体をもたらす。好適な位置の非限定例は、Ｔｙｒ部分及びＰｈｅ部分を含む。なお更に、Ｐｈｅ又はＴｙｒ部分のいずれかの芳香族部分は、１つ以上のリガンド及び／又は放射性同位体の導入のための好適な位置をもたらす。一実施形態では、少なくとも１つのリガンド又は放射性同位体は、ペプチドコア上に位置する。放射性標識化誘導体は、癌及び心血管疾患を含む様々な病理の放射線造影法及び／又は放射線療法に有用である。実際、種々の異なる病理状態（例えば、癌、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病性腎障害）におけるＵＴ受容体の劇的な過発現は、これら薬剤が新規な放射線造影剤及び／又は治療診断薬を表し得ることを示唆する。
【００２５】
本開示の一実施形態では、アラニン部分のＮ−末端は、錯化剤又は共役化剤の添加によって修飾され、放射性同位体の組み込みをもたらしてもよい。明確化のために、リガンドがアラニン部分のＮ−末端に配置される場合、リガンドは、錯化剤又は共役化剤及び放射性同位体を含むことが理解される。かかる錯化剤又は共役化剤の非限定例としては、ＤＯＴＡ−及びＤＴＰＡ−ベースのキレート剤、ＮＯＴＡベースのキレート剤、カルボニル化合物、２−ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、Ｎ４−キレート剤、デスフェリオキサミン及びＮｘＳｙ−キレート剤が挙げられる。Ｎ−末端へのかかる修飾は、薬剤の結合親和性に著しく影響を及ぼすことはないことが理解される。
【００２６】
一実施形態では、本開示は、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩に関し、ここでは、この薬剤は、ＵＩＩイソ型の１つのＮ−末端セグメントを実質的に含む。本開示の一実施形態では、この薬剤は、ヤツメウナギ（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）、フグ（Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ）、ガンギエイ（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）、ツノザメ（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）、チョウザメ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ヘラチョウザメ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ハゼ（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、ゼブラフィッシュα（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、ゼブラフィッシュβ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、サッカーＡ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、サッカーＢ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、コイα（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、コイβ１（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、コイβ２（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、コイγ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ）、ヒラメ（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ）、マス（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ハタ（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、カエル（（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ニワトリ（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ゼブラフィッシュ（Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、マウス（Ｐｈｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）、ラット（Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）、ブタＡ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ブタＢ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、ウシ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）、サル（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）、チンパンジー（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）及びヒト（Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ）ＵＩＩイソ型からなる群から選択されるＮ−末端セグメントから選択される。本開示のより具体的な実施形態では、この薬剤は、ｒＵＩＩイソ型に基づき、式
【化１１】
2014518854.tif 000015
を有する。
【００２７】
一実施形態では、本開示は、ＵＴ活性を調整する拮抗薬に関する。
【００２８】
一実施形態では、本開示は、ＵＴ活性を調整する作動薬に関する。
【００２９】
一実施形態では、本開示は、特異的ＵＩＩ−又はＵＲＰ関連作用間を識別するための拮抗薬に関する。
【００３０】
一実施形態では、本開示は、ウロテンシン作動系の作動薬に関する。
【００３１】
一実施形態では、本開示は、ウロテンシン作動系の拘束された作動薬に関する。
【００３２】
一実施形態では、本開示は、ウロテンシン作動系の拮抗薬に関する。
【００３３】
一実施形態では、本開示は、ＵＩＩ及び／又はＵＲＰによって仲介される特異的生物学的作用間を識別するための方法に関し、方法は、ｉ）本明細書に開示されるようなウロテンシン作動性薬に大動脈環を曝露するステップと、ｉｉ）ＵＩＩ又はＵＲＰに対して濃度−反応曲線を作製するステップと、ｉｉｉ）ウロテンシン作動性薬のＵＩＩ又はＵＲＰのいずれかによって誘導された大動脈環収縮に及ぼす効果を評価するステップとを含む。
【００３４】
本明細書の前述の目的及び他の目的、利点並びに特徴は、添付の図面を参照して、ただ単に例示として提供された、それらの例示的実施形態の以下の非制限的説明を読み取る際に、より明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ｈＵＩＩ、ＵＲＰ及び［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の累積濃度を添加後、ラットの胸部大動脈で得られた代表的濃度−反応曲線の図である。３μＭまでの増大する濃度の［Ｂｉｐ４］ＵＲＰへの曝露は、わずか１週間で血管収縮を誘導した（１０−５．５ＭでＥｍａｘ＝８．７％）。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、ｎ＝５〜１０匹の動物である。
【図２】ラット大動脈環のｈＵＩＩ−及びＵＲＰ−誘導収縮に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の効果の図である。［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは、濃度依存的様式で、ＵＲＰではなくｈＵＩＩへの最大収縮応答を抑制した。１μＭの［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの非存在下（Ａ）及び存在下（Ａ’）でのｈＵＩＩの等活性濃度の二重逆数プロットは、１５．０±０．６の勾配を有する線形（非競合的拮抗性と一致する）であり、７．１５のｐＫｂを示す。［Ｂｉｐ４］ＵＲＰに対する濃度依存的弛緩応答は、４ｎＭのｈＵＩＩにより内皮剥皮大動脈において確立された元のトーン状態の逆転率として表される。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、ｎ＝５〜１０匹の動物である。
【図３】ラット大動脈環のＥＴ−１誘導収縮に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の効果の図である。［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは、エンドセリン−１誘導血管収縮を阻害又は増強しなかった。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、ｎ＝５〜１０匹の動物である。
【図４】ｈＵＩＩ又はＵＲＰの解離速度への［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の影響の図である。結合した１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰの解離時系変化が、ヒトウロテンシンＩＩ受容体を発現する生存するＣＨＯ細胞で評価された。一旦結合が平衡に達すると、超最大濃度のｈＵＩＩ（１０−６Ｍ）又はＵＲＰ（１０−６Ｍ）単独の添加によって、又はｈＵＩＩ（１０−６Ｍ）及び［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１０−６Ｍ）若しくはＵＲＰ（１０−６Ｍ）及び［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１０−６Ｍ）の同時添加によって解離が開始された。１２５Ｉ−ｈＵＩＩの解離定数（０．０５０±０．００６分−１）は、拮抗薬の存在下（０．１５３±０．０１９分−１）で有意に（＊＊Ｐ＜０．０１）に異なり（０．１５３±０．０１９分−１）、これは［Ｂｉｐ４］ＵＲＰがおそらくは、アロステリック部位に結合することを示唆する。驚くべきことに、１２５Ｉ−ＵＲＰの解離速度における有意な変化は観察されなかった（０．０５０±０．００６分−１対０．０５４±０．００６分−１）。
【図５】低投与量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）及び高投与量（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）における［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の固有特性の評価の図である。低濃度ではいずれの効果も観察されなかった。しかしながら、高用量（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）では、これはｈＵＩＩのものに匹敵する血圧降下効果を及ぼした。
【図６】麻酔下のラットにおけるｈＵＩＩ及びＵＲＰの血行動態的作用に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の効果の図である。［Ｂｉｐ４］ＵＲＰのボーラス注射（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、完全なその昇圧効果を保持すると同時に、ｈＵＩＩの血圧降下作用を著しく低下させた。興味深いことに、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、ＵＲＰ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）によって誘導された二相性応答に及ぼす影響を有さず、このことは、ｈＵＩＩの生理学的作用への選択的作用を示唆している。
【図７】反復静脈内ｈＵＩＩ注射に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）の効果の図である。ｈＵＩＩの反復注射は、等価の二相性応答を生じ、これはｈＵＩＩに関する寛容性効果がないことを示唆している。ラットが［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処置された場合、第２のｈＵＩＩ注射後の応答の完全な不在は、言及する価値がある。
【図８】図８Ａは、１２５Ｉ−ＵＲＰの解離速度に及ぼすｈＵＩＩの影響の図である。図８Ｂは、１２５Ｉ−ｈＵＩＩの解離速度に及ぼすＵＲＰの影響の図である。結合された１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰの解離時系変化が、ヒトウロテンシンＩＩ受容体を過発現する生存するＣＨＯ細胞で評価された。有意差（＊＊Ｐ＜０．０１）が、スチューデントの片側ｔ検定によって判定された。
【図９】図９Ａは、麻酔下のラットにおける血行動態に及ぼす反復ｈＵＩＩ注射の効果の図である。図９Ｂは、麻酔下のラットにおける血行動態に及ぼす反復ＵＲＰ注射の効果の図である。図９Ｃは、ＵＲＰ関連血行動態機能に及ぼすｈＵＩＩの効果の図である。図９Ｄは、ｈＵＩＩ関連血行動態機能に及ぼすＵＲＰの効果の図である。有意差（＊＊Ｐ＜０．０５）が、スチューデントの片側ｔ検定によって判定された。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、ｎ＝４〜６匹の動物である。
【図１０】１２５Ｉ−ｈＵＩＩ（Ａ）及び１２５Ｉ−ＵＲＰ（Ｂ）の解離速度へのＡｌａ置換ｈＵＩＩ類縁体の影響、並びに１２５Ｉ−ｈＵＩＩ（Ｃ）及び１２５Ｉ−ＵＲＰ（Ｄ）の解離速度へのｈＵＩＩ（４−１１）の影響の図である。有意差（＊＊Ｐ＜０．０１）が、スチューデントの片側ｔ検定によって判定された。
【図１１】ｈＵＩＩ、ＵＲＰ及びｒＵＩＩ（１〜７）の累積濃度の添加後のラットの胸部大動脈環で取得された濃度反応曲線の図である。図１１Ｂは、ラットの大動脈環のｒＵＩＩ−誘導収縮に及ぼすｒＵＩＩ（１〜７）の効果の図である。図１１Ｃは、ラットの大動脈環のＵＲＰ−誘導収縮に及ぼすｒＵＩＩ（１〜７）の効果の図である。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、ｎ＝５〜８匹の動物である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書で使用される用語の明確かつ一貫した理解をもたらすために、多くの定義が以下に提供される。更に、異なる旨を特記しない限り、本明細書で使用されるような全ての技術的及び科学的用語は、本明細書が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００３７】
特許請求の範囲及び／又は明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用される場合、語「ａ」又は「ａｎ」は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。同様に、語「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２番目の又はそれ以上のものを意味する。
【００３８】
本開示の範囲を理解することにおいて、本明細書で使用するとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び」その派生語は、記載された特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を指定するが、他の記載されていない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を除外しない制約のない用語であることが意図される。上述の内容は、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの派生語等の同様な意味を有する語にも適用する。本明細書で使用するとき、用語「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及びその派生語は、記載された特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を指定するが、他の記載されていない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を除外する排他的用語であることが意図される。本明細書で使用するとき、用語「本質的になる」とは、特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在並びに特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの基本的かつ新規な特性に大きな影響を及ぼさないものを指定するよう意図されている。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「実質的に」、「約」及び「およそ」等の程度を表す用語は、最終的な結果が著しく変更されないよう、修飾された用語の逸脱の妥当な量を意味する。これら程度を表す用語は、この逸脱が、これが修飾する語の意味を否定しない場合、修飾された用語の少なくとも±５％の逸脱を包含するよう解釈されるべきである。
【００４０】
本説明は、当業者によって使用される多数の化学用語及び略号を参照する。しかしながら、選択された用語の定義は、明確性及び一貫性を提供するものである。
【００４１】
略号：ＮＭＲ：核磁気共鳴法；ＭＳ：質量スペクトル法；全ての光学活性アミノ酸は、別途記載のない限り、Ｌ配置である；Ｃｈａ：シクロヘキシルアラニン；Ｄｉｐ：β，β−ジフェニルアラニン、Ｔｉｃ：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；Ｔｉｑ：テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸；Ｔｐｉ：Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸；Ａｉａ：４−アミノ−インドロ［２，３−ｃ］アゼピン−３−オン；Ｔｂｇ：ｔ−ブチル−グリシン；Ｐｈｇ：フェニルグリシン；Ｐｅｎ：β，β−ジメチル−システイン；Ｏｒｎ：オルニチン。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「アルキル」とは、直鎖又は分岐鎖であり得る。この用語はまた、これらが置換基を運ぶか、又は、例えばアルコキシ残基、アルコキシカルボニル残基又はアリールアルキル残基等の他の残基上の置換基として生じる場合、適用される。置換アルキル残基は、任意の好適な位置で置換され得る。１〜１８個の炭素原子を含有するアルキル残基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル及びオクタデシル、並びにイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、ネオペンチル、イソヘキシル、イソデシル、３−メチルペンチル、２，３，４−トリメチルヘキシル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、又はｔ−ペンチル等のこれら全ての残基の分岐状類縁体である。アルキル残基の特定の基は、残基メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルによって形成される。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「低級アルキル」とは、直鎖又は分岐鎖であり得る。この用語はまた、これらが置換基を運ぶか、又は、例えばアルコキシ残基、アルコキシカルボニル残基又はアリールアルキル残基等の他の残基上の置換基として生じる場合、適用される。置換アルキル残基は、任意の好適な位置で置換され得る。１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル残基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びヘキシルである。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「リガンド」とは、適切な可視化技術、例えば、ポジトロン放射形断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射形断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）又は磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）を使用することによって検出され得る検出可能な画像を発生することが可能である部分を指す。特定の例示的放射性同位体は、放射性核種、又は元素の放射活性同位体である。放射性核種の非限定的例としては、Ｉ１２３、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６２Ｃｕ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、８９Ｓｒ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ及び７６Ｂｒが挙げられる。更なる放射性同位体は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を獲得するために好適なものであり、非対スピン原子及びフリーラジカル（例えば、鉄、ランタニド類及びガドリニウム）並びに造影剤（例えば、ＤＴＰＡキレート化マンガン）が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「立体配座的に束縛された」とは、回転自由度又は移動自由度の少なくとも１つが、作動薬又は拮抗薬から低減又は除去されることを意味する。その結果、立体配座に束縛された作動薬又は拮抗薬は、特定の立体配座で遮断され得るか、又は作動薬又は拮抗薬の残部に対して特定の立体配座及び／又は位置に限定された１つ以上の置換基を有し得る。一実施形態では、立体配座的束縛は、環部分の導入によって誘導される。
【００４６】
用語「薬学的に許容可能」とは、被験体、特にヒトの治療で適合性があることを意味する。
【００４７】
用語「薬学的に許容可能な塩」とは、被験体の治療に好適である、又は適合性がある酸添加塩又は塩基添加塩を意味する。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「好適な」とは、特定の化合物又は条件の選択が、実施される特定の合成操作、及び変換される分子の同一性に依存するが、この選択が当該技術分野における当業者の技術の範囲内で十分であることを意味する。本明細書に記載される全てのプロセス／方法ステップは、示される生成物をもたらすのに十分な条件下で実行されるべきである。当業者であれば、例えば、反応溶媒、反応時間、反応温度、反応圧力、反応体比並びに反応が無水条件下又は不活性雰囲気下で実施されるべきかどうかを含む全ての反応条件が、所望の生成物の収率を最適化するために適宜変化し得ること、並びにこのように実行することが当業者の技術の範囲内であることを理解されるであろう。
【００４９】
用語「置換ビニル」及び「置換アルキニル」で使用するとき、用語「置換」とは、少なくとも１つの置換基がビニル又はアルキニル上に存在し得、有機化合物の全ての許容置換基を包含するよう企図されることを意味する。置換基としては、アルコール、エーテル、エステル、アミド、スルホン、スルフィド、ヒドロキシル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アミン、ヘテロ原子、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、アルコキシアルコキシ、アシルオキシ、ハロゲン、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボキシアルコキシ、カルボキシアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、アルキルヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルが挙げられる。上述の基は、可能な場合は、必要に応じて更に置換されてもよい。例示的置換基としては、例えば、以下の表３及び４中で本明細書に記載されるものが挙げられる。
【００５０】
本明細書で使用するとき、被験体の治療に好適である又は適合する酸添加塩とは、任意の塩基性化合物の非毒性有機又は無機塩を意味する。酸添加塩を形成する塩基性化合物としては、例えば、アミノ基を含む化合物が挙げられる。好適な塩を形成する例示的無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸、並びにオルトリン酸一水素ナトリウム及び硫酸水素カリウム等の金属塩が挙げられる。好適な塩を形成する例示的有機酸としては、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、シンナミン酸及びサリチル酸等のモノ−、ジ−、及びトリカルボン酸、並びにｐ−トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。モノ−又はジ−酸塩のいずれかが形成されることができ、かかる塩は、水和型、溶媒和又は実質的に無水型のいずれかで存在してもよい。広くは、酸添加塩は、水中又は種々の親水性有機溶媒中でより可溶性であり、一般的には、それらの遊離塩基型に比べるとより高い融点を示す。適切な塩の選択は、当業者には周知であろう。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、被験体の治療に好適であり、又は適合する塩基添加塩とは、任意の酸性化合物の非毒性有機又は無機塩基添加塩を意味する。塩基添加塩を形成する産生化合物としては、例えば、カルボン酸基を含有する化合物が挙げられる。好適な塩を形成する例示的無機塩基としては、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム又は水酸化バリウムが挙げられる。好適な塩を形成する例示的有機塩基としては、メチルアミン、トリメチルアミン及びピコリン、等の脂肪族、脂肪環式又は芳香族有機アミン、アルキルアンモニア又はアンモニアが挙げられる。適切な塩の選択は、当業者には周知であろう。
【００５２】
所望の化合物縁の形成は、標準的技法を使用して達成される。例えば、中性化合物が、好適な溶媒中で酸又は塩基で処理され、形成された塩が、濾過、抽出又は任意の他の好適な方法によって単離される。
【００５３】
本開示のペプチド及びポリペプチドは、市販のペプチド合成機を使用して合成されてもよい。例えば、特に参照として本明細書に組み込まれる、Ｋａｕｍａｙａら著，（１９９４），「“ＤＥＮＯＶＯ”ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ  ＡＮＤ  ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ  ＡＳ  ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ，ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），１３３−１６４頁に記載される化学的方法が使用されてもよい。例えば、第１のペプチド部分が、１つ以上の第２のペプチド部分とタンデムで合成され、ポリペプチドを形成してもよい。ペプトイドは、同様な機器上での化学特性の修正によって合成されるであろう。
【００５４】
更に別の実施形態では、本出願のペプチド又はポリペプチドは、固体支持体に結合される。この固体支持体は、混合物からのペプチド又はポリペプチド、並びにペプチド又はポリペプチドで形成された複合体の単離を容易にするものである。固体支持体としては、微小ビーズ（例えば、磁気的に又は化学的に活性化された）若しくはマイクロアレイ、微小流体装置又はタイタープレートベースの高容量分析の調製に使用される任意の材料が挙げられるが、これらに制限されない。かかる支持体の例としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ハイブリッドポリスチレン樹脂、ＰＥＧ樹脂及びＤｙｎａｌ（商標）磁気ビーズが挙げられる。固体支持体にペプチドを結合させる方法は、当該技術分野で周知である。
【００５５】
ＵＲＰ誘導体に関する構造−活性相関研究の間に、新規なＵＴ受容体リガンドが同定された。より具体的には、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ［即ち、ウロコントリン］が同定され、そのインビトロ及びインビボの薬理学的プロファイルを確立した。１つの目覚ましい結果は、ｈＵＩＩ誘導血管収縮の効率を低減するが、ＵＲＰ誘導血管収縮の効率は低減しない、この類縁体の能力である。この非定型的挙動に基づいて、ｈＵＩＩ−及びＵＲＰ−仲介作用に起因する特定のペプチド−受容体相互作用の存在が検討され、ＵＩＩイソ型のＮ−末端領域が、選択性競合的拮抗薬として働くことができることが発見された。
【００５６】
本開示のウロテンシン作動性薬は、以下の反応式１）中に示されるように調製された。
【化１２】
2014518854.tif 000016
【００５７】
鈴木−宮浦反応の場合、以下の表２に示されたボロン酸が、ペプチドとのカップリングのための基材として使用された。これらボロン酸は、非限定的例であること並びに他のボロン酸が、本開示に照らし合わせて過度の実験なしに使用され得ることが理解される。
【００５８】
【表２】
2014518854.tif 000017
【００５９】
ヘック反応の場合、以下の表３に示される置換ビニル基材が、ペプチドとカップリングするために使用された。これら置換ビニル基材は、非限定的例であること並びに他の置換ビニル基材が、本開示に照らし合わせて過度の実験なしに使用され得ることが理解される。
【００６０】
【表３】
2014518854.tif 000018
【００６１】
薗頭反応の場合、以下の表４に示される置換アルキニル基材が、ペプチドとのカップリングのために使用された。これら置換アルキニル基材は、非限定的例であること並びに他の置換アルキニル基材が、本開示に照らし合わせて過度の実験なしに使用され得ることが理解される。
【００６２】
【表４】
2014518854.tif 000019
【００６３】
一実施形態では、本明細書は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤と結合した、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上の薬学的有効量を含む医薬組成物に関する。用語「薬学的有効量」とは、ｈＵＩＩ関連作用に任意の測定可能な拮抗効果を及ぼすために、哺乳類への投与時に必要とされるウロテンシン作動性薬の量であるとして理解される。治療方法は、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上で、若しくは同様なものを含む組成物で、薬学的に許容可能な方法で患者を治療するステップを含む。かかる組成物は、錠剤、カプセル、カプレット、粉剤、顆粒剤、ロゼンジ剤、坐剤、再構成可能な粉剤、クリーム、軟膏、ローション、若しくは経口又は無菌非経口溶液又は懸濁液、経皮調製物、吸入用粉末又は溶液等の液体調製物の形態、あるいは任意の他の好適な送達システムの形態であってもよい。
【００６４】
ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、単独で投与されても、又は薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与されてもよい。各担体の比率は、薬剤の溶解度及び化学的性質、投与のルート、及び標準的薬剤処方によって決定される。投与の一貫性を保証するために、本開示の一実施形態では、この医薬組成物は、単位投与形態である。経口投与のための単位投与提供形態は、錠剤又はカプセルであり得、一般的な賦形剤を含有することができる。一般的な賦形剤の非限定的例としては、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、又はポリビニルピロリドン等の結合剤；乳糖、糖、トウモロコシ−デンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン等の充填剤；ステアリン酸マグネシウム等の錠剤化滑沢剤；デンプン、ポリビニルピロリドン、グリコール酸ナトリウムデンプン又は微結晶セルロース等の崩壊剤；若しくは、ラウリル硫酸ナトリウム等の薬学的に許容可能な湿潤剤が挙げられる。更なる賦形剤としては、脂質処方物で使用されるものが挙げられ、この非限定的例はオリーブ油である。
【００６５】
ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、単独で投与されてもよく、又は治療される病理症状の機能で選択される他の活性化合物と組み合わされて投与されてもよい。
【００６６】
ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、非経口的に注射されてもよく、これは、筋肉内、静脈内、又は皮下で注射される。非経口的投与については、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、溶質、例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水又はグルコースを含有する無菌溶液の形態で使用され得る。
【００６７】
ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、デンプン、乳糖、糖等の好適な賦形剤を含有する錠剤、カプセル、又は顆粒剤の形態で経口投与され得る。このウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、着色剤及び／又は風味剤を含有する場合がある溶液の形態で経口投与され得る。このウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、その中で活性成分が糖又はコーンシロップ、風味剤及び色素と混合され、次いで混合物を固形形態に圧縮するのにふさわしいよう十分に脱水されるコンフィット又はロゼンジ剤の形態で舌下に投与されてもよい。
【００６８】
固形経口組成物は、ベンディング、充填、錠剤化等の通常の方法によって調製され得る。反復ベンディング操作は、大量の充填剤を使用して、活性薬剤（即ち、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩）を組成物全体に分配させるよう使用され得る。かかる操作は、当然のことながら、当該技術分野で公知である。錠剤は、通常の薬学的慣例において周知の方法に従って、特に腸溶コーティングでコーティングされてもよい。
【００６９】
経口液体調製物は、エマルジョン、シロップ、又はエリキシル剤の形態であってもよく、若しくは使用前に水又は任意の他の好適なビヒクルでの再構成のための乾燥生成物として供与されてもよい。かかる液体調製物は、一般的な添加剤を含んでもよく又は含まなくてもよい。一般的な添加剤の非限定的例としては、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、又は食用脂肪等の懸濁化剤；モノオレイン酸ソルビタン又はアラビアゴム等の乳化剤；アーモンド油、分画化したココナッツ油、グリシン、プロピレングリコール、エチレングリコール、及びエチルアルコールからなる群から選択される油性エステル等の非水性ビヒクル（これは食用油を含んでもよい）、並びにメチルパラ−ヒドロキシベンゾエート、エチルパラ−ヒドロキシベンゾエート、ｎ−プロピルパラ−ヒドロキシベンゾエート、ｎ−ブチルパラ−ヒドロキシベンゾエート及びソルビン酸等の防腐剤、所望の場合、一般的風味剤又は着色剤が挙げられる。
【００７０】
非経口投与については、液体単位投与形態は、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上及び無菌ビヒクルを使用することによって、並びに使用される濃度に応じて調製され得、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、ビヒクル中に懸濁されても又は溶解されてもよい。一旦溶液になると、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、好適なバイアル又はアンプルを充填し、その後引き続いての担体の密閉又はパッケージの保管の前に濾過滅菌されてもよく、又は無菌条件下で直接的に注射され得る。局所麻酔剤、防腐剤又は緩衝剤等のアジュヴァントは、使用前にビヒクル中に溶解されてもよい。医薬組成物の安定性は、バイアルを充填し、真空下で水分を除去すること（例えば、凍結乾燥）によって増強され得る。非経口懸濁液は、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩がビヒクル中に溶解されるよりはむしろ懸濁されるべきことを除いては、実質的に同一の方法で調製され得る。このステップは、無菌条件下で実行されねばならない。ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩は、無菌ビヒクル中にこれを懸濁させる前に、これを酸化エチレンに曝露することによって滅菌され得る。界面活性剤又は湿潤化溶液が、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の均一の分布を容易にするために、組成物中に好都合に含まれ得る。
【００７１】
局所投与は、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の局所的送達が、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩を含む組成物又は処方物の塗布のポイントで又はその直近で望ましい場合、投与のルートとして使用され得る。
【００７２】
ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩はまた、任意の好適な装置を使用して、乾燥又は液体吸入処方物として計量分配されてもよい。
【００７３】
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるようなウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上の薬学的有効量と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤とを含む。本開示の一実施形態では、医薬組成物は、約０．０００１重量％〜約９９重量％のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上を含有する。本開示の他の実施形態では、医薬組成物は、どの投与の方法が使用されるかに応じて、約０．０００１重量％〜約６０重量％のウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上を含有する。医師は、本治療薬剤（即ち、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩）の最適な投与量を決定するであろう。投与量は、ウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容な塩の１つ以上の投与のモードで異なる場合がある。これに加えて、投与量は、治療中の特定の患者で異なる場合がある。治療で使用されるウロテンシン作動性薬又はその薬学的に許容可能な塩の１つ以上の投与量は、症状、患者の体重、相対的な有効性及び処置医師の判断に応じて異なる場合がある。
【００７４】
偏倚した作動薬活性の概念は、特定のリガンドに誘導された立体配座的変化が、正確に方向付けされたシグナル伝達に誘導することができることを示唆している。理論によって束縛されようとするものではないが、長さ及び組成で異なる伸長したＮ末端ドメインの存在によって、ＵＲＰとは構造的に異なるＵＩＩは、結合時にＵＴの異なる立体配座的変化を誘導する可能性があり、従って多岐にわたる生理学的作用に導く第２のメッセンジャーの異なるセットの活性化の引き金となることが推測される。ＵＲＰのアミノ酸配列は、種全体にわたり厳密に保存されてきたものであり、このことは、受容体第１級アミノ酸配列中の変異のもかかわらず、特異的受容体相互作用もまた保存されてきたことを示唆する。いくつかの脳構造（例えば、延髄吻側腹外側野）及び組織（例えば、心臓、精嚢）中のＵＲＰ  ｍＲＮＡの特異的発現に基づいて、ＵＲＰはＵＩＩよりもむしろ、自律神経、心血管及び生殖機能の調節において生物学的に活性なペプチドであり得る［３２］。本明細書で上記記載のように、ＵＩＩでの構造−活性化相関研究の殆どは、天然又は非天然アミノ酸で、４位のＡｓｐ、６位のフェニルアラニン、８位のＬｙｓ又は９位のＴｙｒのいずれかを置き換えることによって達成された［９］。しかしながら、１つの報告を除いては、ＵＲＰでは広範な構造−活性相関研究は達成されていない［６］。ＵＲＰの受容体相互作用及び生物学的活性に関するＴｒｐ残基の重要性を解明するために、環式残基を含むタンパク質新生部分又は非タンパク質新生部分が、ＵＲＰの天然配列に導入された（反応式２）。各化合物（表５）が、放射性リガンド結合実験並びにエクスビボのラット大動脈環収縮バイオアッセイを使用して薬理学的に評価された。これら化合物の一部は、ＵＴ系の拘束作動薬であることが示された。ＵＩＩ受容体の認識及び活性化に関与する正確な二次構造を画定するために、より強力な作動薬が、モデル化実験で引き続いて使用された。
【化１３】
2014518854.tif 000020
【００７５】
ＵＲＰ仲介生物学的活性におけるＴｒｐの特異的な役割への洞察：結合親和性及び生物学的活性に関する芳香族性及び立体障害の役割を検討した。Ｔｒｐ部分の１−Ｎａｌによる置換、即ち受容体の疎水性領域との芳香族系の改善された相互作用に導き得る立体構造要求誘導体は、天然ペプチド（表６の化合物１及び２）に比べて、ほぼ同等の効力の類縁体（表６の化合物３）へと導いた。これら結果は、インドール対ナフタレンの芳香族環の厳密な性質以上に、芳香族性が適切な受容体認識及び活性化に重要であることを示唆している。予想通りに、配置の逆転は、結合親和性における僅かではあるが明らかな減少を生じ（化合物４、表６）、並びに収縮性効力における劇的な減少を生じた。例えば、３μＭまでの増大する濃度の［Ｄ−Ｎａ］４ＵＲＰへの曝露は、中等度の血管収縮を誘導したに過ぎない（１０−５．５ＭにてＥｍａｘ＝３４％）。前述したように、構造−活性化相関研究は、フェニルアラニン部分によるＴｒｐの置き換えに関するＵＩＩの非感受性を強調している。［Ｐｈｅ（Ｉ）］４ＵＲＰが、ウロテンシン作動系の弱い作動薬（表６の化合物５）として作用することにより、Ｐｈｅ（Ｉ）によるＴｒｐの置換が結合親和性における４倍の下降を誘導することが観察された。従って、このリガンドは、Ｐｄ触媒された交差カップリング反応に由来するペプチドライブラリの発生のためのテンプレートとして働く。興味深いことに、シクロヘキシルアラニン等の嵩高の疎水性アミノ酸の導入（表６の化合物６）は、化合物５（表６）に比べて、結合親和性において３倍の低下を誘発するにすぎなかった。４位で芳香族特性を欠如するこの化合物は、完全ではあるが弱いウロテンシン作動系の作動薬の挙動をなお示した。要するに、これら結果は、４位での芳香族特性の存在は好ましいが、完全な受容体相互作用／活性化について必須ではないことを示唆している。興味深いことに、これら結果によると、Ｄ−ｔ−ブチル−グリシンでのＴｒｐの置き換えは、低結合親和性を有する化合物ではあるが、ラットの大動脈環に存在するＵＴ受容体を完全に活性化させることが可能な化合物（表６の化合物８）を生成する。これら結果は、構造的変化はその同族の受容体の認識プロセスと活性化プロセスの間のペプチド内で起こり得ること、並びにこれら変化は、Ｔｒｐ側鎖に関与する分子内又は分子間の相互作用に連係していることを示唆している。ｈＵＩＩ中のＴｒｐ残基のＰｒｏ部分による置き換えは、弱い作動薬作用をもたらした。例えば、３μＭまでの増大する濃度の［Ｐｒｏ７］ｈＵＩＩへの曝露は、実質的な血管収縮を誘導した（１０−５．５ＭにてＥｍａｘ＝６９％）。従って、天然ペプチド中のインドール基は、適切な認識及び活性化に必要とされると思われるかかる分子内相互作用に関与することが可能である。更には、上述の結果は、少なくともＵＲＰ中のインドール基が、分子内様式で相互作用することによって、有効な受容体相互作用／活性化のための他の環内残基の適切な配向へと導く生理活性の立体配座を安定化することができる可能性が高いことを示唆している。この仮説を裏付けるものとして、有効な受容体活性化のための、ｈＵＩＩのＴｒｐ７、Ｌｙｓ８、及びＴｙｒ９側鎖間の緊��な接触が観察されている。
【００７６】
立体配座プローブの４位での導入：安定な主鎖上の側鎖配向の重要性は、トポグラフィカルデザインの概念へと導いた。アミノ酸の側鎖は、３つの低エネルギー立体配座、即ち、ゴーシュ（−）、ゴーシュ（＋）、及びトランスを採用することができる。これら３つの立体配座間のエネルギー差及びバリアは、比較的小さく、しかる故に全ての３つの配座は接近可能である。初期ペプチド相互作用の間に、臨界側鎖のそれぞれは、これら低立体配座の１つを採用するであろうし、これによって、特徴的なファーマコフォアを作り出す。Ｘ１のねじれ角は、β−炭素における置換によって導入され得るファン・デル・ワールス力で制限され得る。しかる故に、より束縛性の芳香族アミノ酸であるジフェニルアラニン（Ｄｉｐ）の導入は、弱いＵＴ作動薬（表６の化合物９）をもたらし、このことは、Ｔｒｐ受容体結合ポケットを形成するクラスタが、比較的小さくかつコンパクトであり、嵩高の芳香族残基を収容することができないことを示唆している。しかしながら、別の説明としては、Ｃβにおける立体構造要求官能基は、受容体相互作用を損なうＸ１周辺の立体配座拘束を誘導することである。より具体的には、Ｄｉｐは、ゴーシュ（＋）配向を排除して、ゴーシュ（−）及びトランスを同時に占有することが実証されている。従って、側鎖のかかる立体配座制限、即ちＸ１ねじれ角の制限は、観察された作用に起因し得ることが仮定されることができる。以前の報告は、強力なＵＴ作動薬であるＰ５Ｕ、並びに他のＵＴ受容体ペプチド作動薬が、この側鎖においてトランス配向を示すことを強調し、このことは、ゴーシェ（−）配向が適切な受容体相互作用／活性化には有害であることを示唆している。ペプチド側鎖の柔軟性のために、受容体相互作用中の適切なトポグラフィーは、側鎖配座異性体の適当な拘束又は固定によってのみ研究され得る。故に、Ｃα−Ｃβ結合の周りの回転が、側鎖を様々な環構造に組み込むことによって制限された。トランス配向を排除して、側鎖立体配座をゴーシュ（−）又はゴーシュ（＋）に限定するために、その中でＴｒｐ残基がテトラヒドロ−β−カルボリン誘導体によって置き換えられた新しい化合物（化合物１０及び１１）が設計されかつ合成された。４位におけるＬ−Ｔｐｉの導入は、僅かに効力は低下しているが、ｈＵＩＩ又はＵＲＰに匹敵する血管収縮を誘導することが可能であるＵＴに対する高い親和性を有するペプチドをもたらした（表６の化合物１０）。このＴｐｉ部分は、Ｘ１をゴーシュ（＋）配座異性体に限定し、このことは、この配座異性体は、適切な受容体相互作用／活性化に重要であり得ることを示している。この誘導体の配置の逆転（表６の化合物１１）は、結合親和性を実質的に低下させて、大動脈環収縮アッセイにおける弱い作動薬活性（１０−５．５ＭにてＥｍａｘ＝４３％）によって示されるように、受容体の不完全な活性へと至らしめた。同様な推論により、ゴーシュ（＋）又はトランス配座異性体は、Ｔｒｐの芳香族環の後続のアミノ酸の窒素への環化によって固定されることができ、即ち、４−アミノ−１，２，４，５−テトラヒドロ−インドロ［２，３−ｃ］アゼピン−３−オン（Ａｉａ）に導いた。驚くべきことに、このＬ−Ａｉａ誘導体��、低結合親和性によって特性化されるが、大動脈環収縮を誘導するための興味深い能力を保存した（表６の化合物１２）。興味深い点は、配置の逆転は、収縮活性における変更なく、結合親和性を劇的に改善したことである（表６の化合物１３）。この結果は、Ｌ−Ａｉａにおけるゴーシュ（＋）からＤ−Ａｉａにおけるゴーシュ（−）への変更が、結合親和性の増大の原因であり得ることを示唆している。これら結果はまた、この特定の位置が、ペプチド二次構造の結合親和性及び安定化に関与し得ることも示している。［Ｌ−Ｔｐｉ４］ＵＲＰ及び［Ｄ−Ａｉａ４］ＵＲＰは、４位におけるそれらの側鎖の回転異性体配座での差異にかかわらず、これらによってほぼ等価の結合効力が示され、このことは、結合親和性は、４位における側鎖配座の変更に比較的感受性がないことを示している。
【００７７】
全体として、Ｔｒｐ部分の側鎖は、隣接する側鎖、即ちＰｈｅ３、Ｌｙｓ５及びＴｙｒ６の立体配座柔軟性を制限することによる生理活性配座を安定化することを目的とした分子内疎水性相互作用に関与することができる。従って、４位での芳香族基だけが結合親和性のために重要であり、その正確なトポ化学は重要ではない可能性が高い。この可能性を検討するために、Ｐｈｇ（フェニルグリシン）又はＤ−Ｐｈｇ残基を４位で組み込む２つの類縁体（表６の化合物１４及び１５）を設計しかつ合成した。これら類縁体は、Ｃα−Ｃβ結合の周りの回転が排除されると同時に、４位において芳香族基を保持する。従って、［Ｐｈｇ４］ＵＲＰ及び［Ｄ−Ｐｈｇ４］ＵＲＰによって示された高い結合親和性及び低減した生物学的活性は、４位における芳香族の存在が原因であり、そのトポロジーが原因ではないという上述の仮定を裏付ける。
【００７８】
フェニルグリシンの最適な配座異性体は、分子内水素結合ＮＨ・・・Ｏ＝Ｃ、Ｎ−Ｈ・・・π（芳香族環中の最も近いＣ−Ｃ結合との）、及びシス−ＣＯＯＨ相互作用によって安定化される。他の配座異性体は、ヒドロキシル基の水素原子と窒素原子上の孤立電子対との間のＯ−Ｈ・・・Ｎ水素結合を呈する。同様な相互作用を確立することによって、ＵＲＰ中のフェニルグリシン残基は、受容体との適切な相互作用のために必須である立体配座を安定化することが推測された。更なる類縁体、Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸が合成された。［Ｔｉｑ４］ＵＲＰの薬理学特性は、この類縁体が、内因性ペプチドに匹敵する高い結合親和性並びに収縮有効性及び効力を有することを示した（表６の化合物１６）。興味深い点は、配置の逆転は、類縁体、即ち、［Ｄ−Ｔｉｑ４］ＵＲＰ（表６の化合物１７）の薬理学的プロファイルに影響を与えないことである。興味深いことに、ペプチド配列内でゴーシュ（＋）立体配座を採用する、Ｔｉｃ部分の導入（表６の化合物１８）は、結合親和性の劇的損失をもたらし、即ち、収縮活性を低減させた（１０−５．５ＭにてＥｍａｘ＝４３％）。Ｔｉｃ部分の配置の逆転（表６の化合物１９）は、結合親和性及び生物学的活性のほぼ完全な回復を可能にした。アミン窒素へのフェノール芳香族環の環化を介して形成された、その二環式構造のために、Ｔｉｃは生理活性ペプチドリガンドにおけるフェニルアラニンの置き換えのための２つの潜在的利点をもたらし、即ち、１）立体配座拘束がピペコリン酸架橋によってペプチド主鎖に導入されることと、２）芳香族側鎖の配向が制限されることである。故に、この側鎖制限よりもむしろ主鎖制限が、［Ｔｉｃ４］ＵＲＰ及び［Ｄ−Ｔｉｃ４］ＵＲＰ（潜在的に活性な立体配座を安定化させるＤ−異性体）で観察される作用に関与する。
【００７９】
例えば、パラジウム触媒反応、即ち、鈴木−宮浦反応、薗頭反応、及びヘック反応等の金属触媒反応を通しての［Ｐｈｅ（Ｉ）］ＵＲＰ基材の誘導体化は、ウロテンシン作動系の機能的アロステリック調節剤へのアクセスをもたらす。アロステリック部位において相互作用することによって、これら化合物は、ＵＲＰ−仲介発動を維持すると同時に、ＵＩＩ受容体活性化を可能にする特異的受容体立体配座を選択するであろう。選択的かつ競合的ＵＲＰ拮抗薬の生成は、様々なＵＩＩイソ型のＮ末端ドメインの合成を通して容易に達成された。これらセグメントは、生物学的活性における種間差に連係されていて、従って、ＵＲＰ生物学的活性を仲介するための種決定因子を表すことができた。恐らくは受容体相互作用の間に観察されるこれらの二次構造の安定化は、ＵＲＰ仲介作用へと向かうこれらの効力及び有効性を増大させることができた。最近の知見は、ＵＩＩ受容体の強力な活性化（作動薬ファーマコフォア）のための更にコンパクトなＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒモチーフへと傾いている。前に示したように、４位におけるＴｐｉ又はＴｉｑ部分の導入は、恐らくは、ペプチド主鎖を安定化させたが、隣接する側鎖、即ち、Ｐｈｅ３、Ｌｙｓ５、及びＴｙｒ６の立体配座自由度もまた制限した。これら側鎖を近傍に架橋することによって、強力かつ安定なＵＴ作動薬にアクセス可能となることができた。
【００８０】
【表５】
2014518854.tif 000021
【００８１】
【表６】
2014518854.tif 000022
【００８２】
実験−材料及び方法
本明細書による新規なウロテンシンＩＩ受容体拮抗薬である［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（即ち、ウロコントリン）のインビトロ及びインビボの薬学的特性評価が以下に示される。
【００８３】
材料：Ｆｍｏｃ保護化Ｌ−及びＤ−アミノ酸、ウォングポリスチレン樹脂及びペプチドカップリング剤ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）をＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）から購入した。ペプチドの固相合成用の一般的な溶媒を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｎｅｐｅａｎ，ＯＮ，ＣＡＮ）から入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、ＰＳＩＧ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，ＣＡＮ）から入手した。同位体（即ち、Ｎａ１２５Ｉ）は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，ＣＡＮ）から購入した。Ｄ−グルコース、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩、Ｔｒｉｚｍａ（商標）塩基、ウシ血清アルブミン、塩化マンガン（ＩＩ）、クロラミン−Ｔ、亜硫酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；ヒューニッヒ塩基）、イソフルラン、ヘパリン、キシラジン、ケタミン、塩化カリウム、及びリン酸二水素カリウムを含む他の化学薬品は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，ＣＡＮ）から取り寄せた。
【００８４】
動物：体重２５０〜３００ｇ又は３５０〜４００ｇの成熟した雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｉｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ，ＣＡＮ）を、制御された照度（１２：１２時間の明暗周期）、湿度、及び温度（２１〜２３℃）の条件下で群ケージに収容した。ラットは、飲料水及びラット用飼料に自由に接近できた。全ての実験手順は、「実験動物の愛護に関するカナダ協定」からの規定及び倫理指針に従って実施され、「化学研究の国民の協会−アルマン・フラピエ研究所」の施設内動物実験委員会及び「モントリオール心臓研究所」の動物倫理及び治験委員会のそれぞれの承認を受けた。
【００８５】
ペプチド合成及び特性評価：ＵＲＰ及び全てのＵＲＰ誘導体を、Ｆｍｏｃ化学を使用して標準的固相ペプチド合成を用いて手動で合成した。保護されたアミノ酸のカップリングは、１時間にわたって、ＤＭＦ中、ＴＢＴＵ（１当量）及びＤＩＰＥＡ（２当量）によって仲介され、ニンヒドリン定性試験によって監視した。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ウォング樹脂（０．７ｍｍｏｌ／ｇ）の元の置換を基準にして、３当量過剰量の保護化アミノ酸を殆どの場合使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０分間にわたってＤＭＦ中２０％のピペリジンを使用して達成した。パラジウム触媒交差カップリング反応中の不必要なＦｍｏｃ除去を防止するために、最後のアミノ酸をＢｏｃ−誘導体（Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）として導入した。固体支持体上で交差カップリング反応を実行するよう使用された条件は、以下のとおりである：［Ｐｈｅ（Ｉ）４］ＵＲＰペプチジル−樹脂（１当量）、フェニルボロン酸（３当量）及びＮａ２ＣＯ３（３当量）を脱気したＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解した。混合物をアルゴンで１０〜１５分間泡立て、その後Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．１当量）を加えた。反応を引き続いて８０℃で一晩撹拌した。次いで樹脂を濾過し、ＤＭＦ、Ｈ２Ｏ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、及びＤＣＭで連続的に洗浄した。１，２−エタンジチオール（２．５％）、水（２．５％）及びトリ−イソプロピルシラン（１％）を含有するＴＦＡで、室温で１．５時間にわたって処理することによって、全てのペプチドを、同時の側鎖脱保護を伴い、樹脂支持体から切断した。ジエチルエーテルで沈殿させた粗ペプチドを、７０％の酢酸中に溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、次いで安定した橙色が現れるまで、ヨウ素（メタノール中１０％溶液）の添加によって環化した。３０分後に、アスコルビン酸を添加して、過剰ヨウ素を反応停止させた。粗環式凍結乾燥ペプチドを、２分毎１％のＢの漸増で（溶出液Ａ＝Ｈ２Ｏ、０．１％のＴＦＡ；溶出液Ｂ＝６０％のＣＨ３ＣＮ／４０％のＡ、０．１％のＴＦＡ）、溶出液ＡからＢまでの線形勾配を使用するプレパラティブ逆相ＨＰＬＣプロトコルを用いて精製した。精製フラクションの均一性は、マトリックスとしてα−シアノヒドロキシシンナミン酸を使用して、線形モードにおけるＲＰ−ＨＰＬＣ及び質量スペクトル法によって評価した。生成物を含有する（＞９５％）純粋なフラクションをプールし、凍結乾燥にかけた。全体として、ＵＲＰ類縁体のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、全てのペプチドの純度が９７％よりも高いことを示した（表５、７及び１１）。更には、全てのペプチドに関して、ＭＳ解析によって観測された分子量が理論値と一致した（表５、７及び１１）。ヒトウロテンシンＩＩ（ｈＵＩＩ）の合成は、既知の手順に従って実行した。
【００８６】
細胞培養及び結合実験：ヒトウロテンシン受容体を発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＵＴ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕｌ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシンのそれぞれ、並びに４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＨａｍ−Ｆ１２培地中で維持した。合成ｈＵＩＩ（１０μｇ）を、クロラミン−Ｔ技術を使用して、０．５ｍＣｉ  Ｎａ１２５Ｉ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，ＣＡＮ）で放射性標識化した。ヨウ素化１２５Ｉ−ｈＵＩＩを、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ上で精製し、回収し、使用まで−２０℃で保管した。結合アッセイは、ｈＧＰＲ１４で安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用する文献既知の方法に従った。簡単に言うと、細胞を０．２ｎＭの１２５Ｉ−ｈＵＩＩの存在下で、増大する濃度のペプチドに曝露した。室温で９０分間のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、溶解し、γ−カウンタを使用して、細胞結合性放射活性を定量化した。結果は、競合的リガンドの不在下で得られた１２５Ｉ−ｈＵＩＩの特異的結合のパーセンテージとして表した。非特異的結合を、１０μＭのｈＵＩＩの存在下で決定し、総結合の１０％と１５％との間の範囲であった。解離研究については、ＣＨＯ−ＵＴ細胞を、１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰ（０．２ｎＭ）で２時間にわたって平衡化させて、異なる間隔で測定された受容体結合性放射性リガンドの解離を、ｈＵＩＩ（１０−６Ｍ）又はＵＲＰ（１０−６Ｍ）のいずれかの超最大濃度の添加によって、又はｈＵＩＩ（１０−６Ｍ）及びＵＲＰ誘導体（１０−６Ｍ）若しくはＵＲＰ（１０−６Ｍ）及びＵＲＰ誘導体（１０−６Ｍ）の同時添加によって開始した。次いで細胞を洗浄し、溶解し、γ−カウンタ（１４７０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で放射活性を計測した。
【００８７】
器官浴実験：雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２５０〜３００ｇ）をＣＯ２で窒息死させた。次いで胸部大動脈を周辺組織から取り外し、大動脈弓から横隔膜まで切除した。それぞれの血管から結合した組織を除去し、きれいな血管を４ｍｍのリングに切断した。血管の内膜表面を穏やかに擦ることによって内皮を除去した。全ての調製物を、酸素化した標準クレブス−ヘンゼライト溶液で満たした５ｍＬの器官浴中に配置した。各実験の初め及び終了時に、４０ｍＭのＫＣｌに対する収縮応答を対照として使用した。器官浴中のペプチドの濃度を増大させることによって（３×１０−１１〜３×１０−６Ｍ）、作動性活性を測定した。作動薬の挙動については、胸部大動脈環をまず初めに、ＵＲＰ誘導体に１５分間にわたって曝露し、次いで、ｈＵＩＩ、ＵＲＰ又はＥＴ−１（１０−１０〜３×１０−６Ｍ）に対する累積濃度反応曲線を構築した。各濃度のペプチドによって誘導された収縮の振幅は、ＫＣｌ誘導収縮のパーセンテージとして表した。最後に、作動薬がｈＵＩＩ誘導収縮を逆転させる能力も評価した。血管は、４ｎＭのｈＵＩＩ（予め決定されたＥＣ８０）で前収縮され、最大収縮に達した後に、増大するｌｏｇ単位濃度のＵＲＰ誘導体を添加することによって、収縮トーンを逆転させた。半有効濃度（ＥＣ５０）は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表し、ｎ値は、血管が単離された動物の総数を表し、４〜８匹の動物に変化した。
【００８８】
血行動態評価：３５０〜４００ｇの体重の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｏｈｍｅｄａ  Ｔｅｃ  ４麻酔剤ベーパライザ（Ｓｏｍａｔｅｃｈｎｏｌｏｆｙ，Ｉｎｃ．Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）から１００％の酸素中に供給された（１リットル／分）イソフルラン吸入によって麻酔処理した。麻酔は、導入期においては３％までの濃度で、緊急手術処置中には１．５％の濃度で、実験的観察中には０．８〜１．０％の濃度で気化されたイソフルランのマスク吸入によって維持した。麻酔後に、ポリエチレンカテーテル（ＰＥ  １０）を生理食塩水（水中０．９％のＮａＣｌ）又は薬剤を注入するために、右頸静脈に装入した。動脈圧を測定するために、右総頸動脈で切開を行い、ここにマイクロチップ圧力変換器カテーテル（モデルＳＰＲ−４０７、２Ｆ、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を装入した。３０分間の安定化の時間に観察が行われ、次いで以下の実験プロトコルを実施し、動脈圧を評価した。イソフルラン吸入の間に、呼吸合併症又は変化は観察されなかった。ＭＡＰの平均値は、基端で１１４±３ｍｍＨｇであり、生理食塩水ボーラス注入によって変更されなかった。
【００８９】
ヒトＵＩＩの投与量範囲決定：予備研究において、個々のラットは、１〜３０ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲のｈＵＩＩの単回の静脈注射を受けた。次いで、ｈＵＩＩの血圧における変化に及ぼす影響を反映する用量反応曲線を決定した。結果は、血圧におけるもっとも顕著な下降が、１０ｎｍｏｌ／ｋｇで観察されることを示した。この用量は、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの全身的注入のインビボの薬理学的効果を特性評価するよう使用された。
【００９０】
麻酔下のラットにおけるｈＵＩＩ又はＵＲＰの単回静脈注射に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの効果：この実験のセットでは、ラットの５つの群を使用した。群１は、低投与量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）及び高投与量（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）での［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの固有特性を評価するよう使用した。他の群は、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの非存在下（対照）又は存在下（処置された）のｈＵＩＩ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）又はＵＲＰ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）のいずれかの単回静脈注射（１０秒間にわたって２００μｌ）の血行動態プロファイルを評価するよう使用した。処置群では、ｈＵＩＩ又はＵＲＰ投与（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の前に、ラットを［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ又は１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）に３０分間にわたって曝露した。基線血行動態パラメータを、薬剤のボーラス注射前５分間にわたって評価した。血行動態変化を、血圧プローブによって、１時間にわたって記録した。血圧における最大上昇及び最大下降を決定し、ＰｏｗｅｒＬａｂソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）を使用して解析した。
【００９１】
反復静脈注射に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの効果：対照群において、ラットは、第１の注射と第２の注射との間の３０分間の間隔で、ｈＵＩＩ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の２回注射を受けた。処置群については、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の追加的用量が対照群で実施された注射プロトコルに先立って提供されたことを除いては、同一のプロトコルを適用した。
【００９２】
データ解析：結合及び機能実験は、少なくとも三重で実施し、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されたデータを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して解析した。全ての実験において、ｎは、試験された又は個々のアッセイが実施された動物の総数を表す。ＥＣ５０、ｐＥＣ５０、ｐｌＣ５０値並びにＥｍａｘ値を、可変勾配を有するシグモイダル用量反応適合を使用して、濃度反応曲線から決定した。非競合性拮抗薬親和性（ｐＫｂ）を、ＵＲＰ誘導体の非存在下又は存在下で作動薬の等活性濃度が直線回帰式中で比較される、Ｇａｄｄｕｍの方法を使用して決定した。得られた勾配は、以下の等式を使用して平衡定数Ｋｂを算定するよう使用した；Ｋｂ＝［Ｂ］／（勾配−１）；式中［Ｂ］は拮抗薬濃度である。勾配は、拮抗薬の存在下又は非存在下での作動薬の等活性濃度の二重逆数プロットから算定する。ＵＲＰ、ｈＵＩＩ及びＵＲＰ類縁体の結合親和性及び収縮効力の統計的比較は、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって解析し、差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１の場合、有意であると考えられた。
【００９３】
結果
放射性標識化ｈＵＩＩ又はＵＲＰのＵＴ受容体への結合は、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰによって阻害される：ヒトＵＩＩ受容体（ＵＴ）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞である本明細書で使用されるような細胞系は、以前に、ヒトウロテンシンＩＩ受容体に結合するためのｈＵＩＩ類縁体の能力を評価するよう使用された［４］。非標識化ｈＵＩＩ及びＵＲＰは、ＣＨＯ−ＵＴ細胞中で１２５Ｉ−ｈＵＩＩがＵＴ受容体に結合することを、それぞれ１３．２ｎＭ及び１２．４ｎＭのＩＣ５０で、を阻害した（表７）。同様に、非標識化ｈＵＩＩ及びＵＲＰは、１２５Ｉ−ＵＲＰ結合を、それぞれ３２．５ｎＭ及び３１．８ｎＭのＩＣ５０で、を阻害した（表７）。ＵＴ受容体への放射性リガンド結合（１２５Ｉ−ｈＵＩＩ、１２５Ｉ−ＵＲＰ）もまた、それぞれ３８６ｎＭ及び３３９ｎＭの明らかなＩＣ５０で、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰによって阻害された（表７）。全体として、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは、両放射性リガンド、即ち、１２５Ｉ−ｈＵＩＩ、１２５Ｉ−ＵＲＰを１００％まで一貫しかつ完全に置換することができる。
【００９４】
【表７】
2014518854.tif 000023
【００９５】
ラットの大動脈環のｈＵＩＩ−及びＵＲＰ−誘導収縮に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの効果：ラット単離大動脈バイオアッセイにおいて、ｈＵＩＩ及びＵＲＰは、用量依存的収縮を、それぞれ８．９８±０．２１のｐＥＣ５０（４０ｍＭのＫＣｌに応答する１２４±８％のＥｍａｘ；ｎ＝１０）及び８．０９±０．１８のｐＥＣ５０（Ｅｍａｘ＝１００±６；ｎ＝１０）を惹起した（図１）。３μＭまで増大する濃度の［Ｂｉｐ４］ＵＲＰへの曝露は、弱い血管収縮（１０−５．５ＭでＥｍａｘ＝８．７％）を誘導したにすぎなかった。［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは引き続いて、単離ラット大動脈環のｈＵＩＩ又はＵＲＰ−仲介収縮を拮抗するその能力に関して試験された。図２及び表８に示すように、様々な濃度の［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは、ｈＵＩＩ濃度反応曲線のいずれの有意な右側へのシフトはもたらさなかったが、ｈＵＩＩに対する最大応答は達成し得なかった。例えば、１０−５Ｍにて［Ｂｉｐ４］ＵＲＰでの前処理は、濃度反応曲線におけるわずかなシフトを伴い（ｐＥＣ５０＝７．６０±０．２９）、ｈＵＩＩに対する最大収縮反応の顕著な抑制（Ｅｍａｘ＝６１±６％）を生じた。興味深いことに、有効性の非有意な減少を伴い（Ｅｍａｘ＝１０２±５）、僅かではあるが非有意な右側へのシフト（ｐＥＣ５０＝７．７４±０．１２）が、ＵＲＰで観察された。非競合的拮抗性と一致して、１μＭの［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの存在下又は非存在下における作動薬の等活性濃度の二重逆数プロットの勾配は、１５．００±０．６２の勾配で線形であり、これは７．１５のｐＫｂに等しかった（図２）。最終的には、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは、ｈＵＩＩのＥＣ８０用量（４ｎＭのｈＵＩＩ）で、強力に（ｐＩＣ５０＝７．７２±０．１５；ｎ＝６）かつ効果的に（９２％の抑制）ラット単離大動脈で確立された収縮トーンを逆転させた（図２）。
【００９６】
【表８】
2014518854.tif 000024
【００９７】
ラット大動脈環のＥＴ−１誘導収縮に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの効果：［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの特徴を更に特性評価するために、ｈＵＩＩ拮抗薬としてのその特異性を、ＥＴ−１に対する収縮反応に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの効果を検討することによって評価した。実際には、ソマトスタチンリガンド（作動薬及び拮抗薬）がラット大動脈におけるＥＴ−１誘導効果を増強させることができることが立証された［２４］。［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１０−６Ｍ）の有無でのそれぞれの平均ＥＣ５０値は、以下のとおりである：ＥＴ−１  ｐＥＣ５０＝７．８５±０．２５（Ｅｍａｘ＝１２７±１０；ｎ＝８）及び８．０６±０．１５（Ｅｍａｘ＝１１９±６；ｎ＝６）（図３）。従って、この拮抗薬は、ＥＴ−１仲介収縮の濃度反応曲線を変更することはできない。結果的に、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰは、その作用をソマトスタチン受容体の活性化を通して及ぼす可能性は低い。
【００９８】
ｈＵＩＩ又はＵＲＰの解離速度に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの影響：機能的アッセイにおいて観察された［Ｂｉｐ４］ＵＲＰによるｈＵＩＩの打ち勝ちがたい拮抗効果が、作動薬結合ドメインとは異なるアロステリック部位にて結合する化合物に起因するものであるかどうかを決定するために、ＣＨＯ−ＵＴ細胞を、結合平衡に達するまで、１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰのいずれかと共にインキュベートした。次いで結合した放射性リガンドの解離を、過剰の［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの非存在下又は存在下で、高濃度の対応する非標識化ペプチドによって開始した。非標識化ｈＵＩＩ又はＵＲＰの超最大濃度は、結合した放射性リガンドのその受容体部位からの解離を引き起こす。リガンドの添加が放射性リガンドの解離速度を変更させるならば、異なる「アロステリック」部位で相互作用することによってそのようになるはずである［２８］。１２５Ｉ−ｈＵＩＩの半減期（１３．８４分）及びその解離定数（ｋｏｆｆ＝０．０５分−１）は、拮抗薬の存在下で有意に異なり（Ｐ＜０．０１）（ｔ１／２＝４．５２分及びｋｏｆｆ＝０．１５分−１）、このことは、［Ｂｉｐ４］ＵＲＰがおそらくはアロステリック部位に結合することを示唆している（図４及び表９）。驚くべきことに、１２５Ｉ−ＵＲＰの解離速度における変化は観察されなかった。
【００９９】
【表９】
2014518854.tif 000025
【０１００】
麻酔下のラットにおけるｈＵＩＩ又はＵＲＰの血行動態作用に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの効果：ウロコントリンの０．１μ，ｏｌ／ｋｇの用量での全身的注入は、血圧への検出可能な効果を引き起こさなかった。しかしながら、１μｍｏｌ／ｋｇの用量では、これは０．０１μｍｏｌ／ｋｇでのｈＵＩＩのものに匹敵する血圧降下をもたらした（図５）。平均動脈圧に及ぼすウロコントリン又はｈＵＩＩの最大効果は、観察されなかったので、従って、ウロコントリンを弱い作動薬又は部分的作動薬として明確に定義することは不可能である。ｈＵＩＩ（０．０１μｍｏｌ／ｋｇ）又はＵＲＰ（０．０１μｍｏｌ／ｋｇ）のボーラス静脈内注射は、約１分後に発生するピーク（＊Ｐ＜０．０５）を伴う急速かつ一時的昇圧薬相、その後約６分での最低値に達する長く続く降圧相によって特徴付けられる二相の血行動態応答をもたらした（図６Ａ及び６Ｂ）。ＵＲＰのボーラス注射によって同様な効果が観察されたにもかかわらず、降圧効果は、ｈＵＩＩの同一の用量（Ｐ＜０．０５）と比較するとき、有意に著明ではなかった（図５Ｂ）。ウロコントリンのボーラス注射（１μｍｏｌ／ｋｇ）は、その昇圧薬効果を保存すると同時に、ｈＵＩＩ降圧作用を有意に低減した（＊Ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。より低い用量では、即ち、０．１μｍｏｌ／ｋｇでは、ウロコントリンは、ｈＵＩＩの血行動態プロファイルに及ぼす効果を有さなかった（データ示さず）。興味深いことに、ウロコントリン（１μｍｏｌ／ｋｇ）は、ＵＲＰ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）によって誘導される二相応答に及ぼす効果を有さなかった（図６Ｂ）。
【０１０１】
反復静脈内ｈＵＩＩ注射に及ぼす［Ｂｉｐ４］ＵＲＰの影響：最近の報告は、８週齢のＳＨＲラットにおけるｈＵＩＩの反復注射後の、ウロテンシン作動系の脱感受性を立証した［３１］。しかしながら、正常血圧のラットを使用しての実験は実施されなかった。ｈＵＩＩの反復注射は、等価の二相応答を生じ、このことは、ｈＵＩＩに寛容性効果がないことを示唆している（図７Ａ）。注目に値することは、ラットが［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処理された場合のｈＵＩＩの第２番目の注射に対する応答の完全欠失である（図７Ｂ）。
【０１０２】
ｈＵＩＩ及びＵＲＰの結合した１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５−ＵＲＰの解離速度に及ぼす影響：ウロコントリン、即ち［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ、ＵＲＰ誘導体で観察される特殊なパターンが、ｈＵＩＩ解離速度への同様な効果を及ぼすためのＵＲＰの傾向性の評価に駆り立てた。表１０に示すように、ＵＲＰ及びｈＵＩＩは、ｈＵＴ受容体に高い親和性で結合する。１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰのいずれかの結合された放射性リガンドの解離は、過剰量のＵＲＰ又はｈＵＩＩ（１０−６Ｍ）非存在下又は存在下での高濃度の（１０−６Ｍ）の対応する非標識化ペプチドによって開始された。ＵＲＰの存在が、１２５Ｉ−ｈＵＩＩ解離速度の有意な（Ｐ＜０．０１）加速を誘導した（ｋｏｆｆ＝０．０５０±０．００６対０．１７４±０．０２６；図８Ｂ）。驚くべきことに、超最大濃度のｈＵＩＩの添加後に、１２５Ｉ−ＵＲＰの解離速度における変化は観察されなかった（ｋｏｆｆ＝０．０５２±０．００６対０．０５５±０．００９）（図８Ａ）。
【０１０３】
【表１０】
2014518854.tif 000026
【０１０４】
麻酔下のラットにおけるｈＵＩＩ及びＵＲＰ血行動態作用に及ぼすｈＵＩＩ又はＵＲＰの効果：麻酔下のラットにおけるＵＩＩ及びＵＲＰの降圧作用は、以前に検討された［２５、２６］。そのとき、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でのｈＵＩＩ及びＵＲＰは、血圧を有意に変更させることができることが観察された。従って、この濃度を本研究で使用した。図９Ａ及び図９Ｂで示すように、ｈＵＩＩ又はＵＲＰの反復注射は、それぞれのペプチドに関して、等価の二相応答をもたらした。注目すべきは、ＵＲＰ関連血行動態応答が、ｈＵＩＩのものよりも著しく低かったことである。興味深いことに、ｈＵＩＩの単回注射後に、注射後３０分の降圧効果が、著しく低下したことである（図９Ｃ）。しかしながら、ＵＲＰのボーラス注射後３０分でｈＵＩＩが投与された場合、かかる観察は、認められなかった（図９Ｄ）。
【０１０５】
ｈＵＩＩとその同族受容体との間の推定上の相互作用への洞察：以前報告されたように、ｈＵＩＩのＮ−末端環外残基のアラニン部分による置き換え、即ち、［Ａｌａ１］ｈＵＩＩ、［Ａｌａ２］ｈＵＩＩ、［Ａｌａ３］ｈＵＩＩ、［Ａｌａ４］ｈＵＩＩは、ｈＵＴ受容体の非常に強力なリガンドとして出現した類縁体を生成した［８］。１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰのいずれかの結合された放射性リガンドの解離は、Ａｌａ−置換ＵＩＩ類縁体（１０−６Ｍ）の非存在下又は存在下での高濃度の（１０−６Ｍ）対応する非標識化ペプチドによって開始された。示すように、［Ａｌａ２］ｈＵＩＩ、［Ａｌａ３］ｈＵＩＩ、［Ａｌａ４］ｈＵＩＩは、１２５Ｉ−ｈＵＩＩ又は１２５Ｉ−ＵＲＰのいずれかの解離速度には影響を有さなかった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。しかしながら、［Ａｌａ１］ｈＵＩＩは、１２５Ｉ−ｈＵＩＩの解離速度の有意な（Ｐ＜０．０１）変動をもたらし（ｋｏｆｆ＝０．０５０±０．００６対ｋｏｆｆ＝０．１９８±０．０３４）、これは、残基酸性側鎖とヒトウロテンシンＩＩ受容体との間の特異的かつ必須の相互作用の存在を示唆している。更に、ｈＵＩＩの最小等活性配列と考えられるｈＵＩＩ（４−１１）もまた、受容体からの１２５Ｉ−ｈＵＩＩの解離を加速させることができたが、１２５Ｉ−ＵＲＰ解離動態に及ぼす影響は有さなかった（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。
【０１０６】
ラットＵＩＩのＮ末端ドメインのラットＵＩＩ−又はＵＲＰ−誘導ラット大動脈環収縮に及ぼす効果：上述のＵＴとＵＩＩのＮ末端セグメントとの間の推定上の相互作用に基づいて、このＮ末端ペプチド配列がＵＩＩ−又はＵＲＰ−誘導血管収縮に及ぼす影響を検討した。機能的バイオアッセイが、ラット大動脈環収縮の使用を伴うために、同種Ｎ末端ＵＩＩ領域、即ち、環状コアに隣接する全ての残基（Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−アミド）を包含するラットのＵＩＩ（１−７）を使用した（表１１）。作動薬として、この化合物は、１０−６Ｍまでの濃度で、ラット大動脈環の収縮を誘導することができた（図１１Ａ）。ｒＵＩＩ（１〜７）での前処理（１０−６Ｍ、１５分）は、ｒＵＩＩ誘導収縮を有意には変更しなかった（図１１Ｂ）。しかしながら、同一の条件下で、ＵＲＰ関連収縮曲線の有意な右側シフト（Ｐ＜０．０５）が観察され、このことは、ｒＵＩＩのＮ末端セグメントが、競合的及びＵＲＰ−選択性拮抗薬として作用し得ることを示唆している（図１１Ｃ）。
【０１０７】
【表１１】
2014518854.tif 000027
【０１０８】
［パラ−ヨード−Ｐｈｅ４］ＵＲＰ（反応式１）；（Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（４−１）−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＯＨ）；純度≧９８％；Ｍｓ計算値：１１０３．３１；Ｍｓ実測値：１１０４．１。純度パーセンテージは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（０．２１×１５ｃｍ、粒径５μｍ、孔径３００Å）上、１ｍｌ／分の流速で、緩衝液系（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．０６％のＴＦＡ（ｐＨ２．５）及びＢ＝６０％のＣＨ３ＣＮ／４０％のＡ（１％のＢ／分の濃度勾配で））を使用するＰＲ−ＨＰＬＣにより決定した。２１４ｎｍでの検出。モノ同位体の実測された［Ｍ＋Ｈ］＋を、計算されたｍ／ｚモノ同位体質量と比較した。注目すべきことに、この化合物は、ウロテンシンＩＩ受容体の完全な作動薬として作用した。
【０１０９】
［パラ−ヨード−Ｐｈｅ４］ＵＲＰの合成
【化１４】
2014518854.tif 000028
Ｆｍｏｃ化学を使用し、標準固相ペプチド合成を用いて、ペプチドをウォング樹脂上で手動合成した。主鎖アセンブリをＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡで介在させ、カップリング完了を、Ｋａｉｓｅｒテスト（ニンヒドリン）により判定した。ウォング樹脂の最初の置換を基準にして、３倍過剰量の保護アミノ酸を使用し、ピペリジン−仲介脱保護を介して、Ｆｍｏｃ除去を達成した。最後のアミノ酸を、Ｂｏｃ−誘導体（Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）として体系的に導入し、交差カップリング反応中のＦｍｏｃ除去を防止した。
【０１１０】
鈴木−宮浦交差カップリング反応（Ｃ−Ｃカップリング）［２７］のための一般的手順
【化１５】
2014518854.tif 000029
樹脂支持基材上で交差カップリング反応を行うための最適条件は以下のとおりである：［パラ−ヨード−Ｐｈｅ４］ＵＲＰ−ペプチド−樹脂（１当量）、ボロン酸（３当量）、Ｎａ２ＣＯ３（３当量）を脱気したＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ）に加えた。混合物をアルゴンで１０〜１５分間にわたって泡立て、その後Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．１当量）を反応混合物に加えた。反応を８０℃で１２〜２４時間の範囲の時間にわたって撹拌した。引き続いて樹脂を濾過し、ＤＭＦ（×３）、Ｈ２Ｏ（×３）、ＭｅＯＨ（×２）、ＤＭＦ（×３）、及びＤＣＭ（×３）の連続的洗浄後、ペプチド−樹脂を切断し、環化し、以下に記載される手順に従って精製した。
【０１１１】
［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ；（Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｂｉｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＯＨ）；純度≧９８％；Ｍｓ計算値：１０５３．４；Ｍｓ実測値：１０５３．４。純度パーセンテージは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（０．２１×１５ｃｍ、粒径５μｍ、孔径３００Å）上、１ｍｌ／分の流速で、緩衝液系（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．０６％のＴＦＡ（ｐＨ２．５）及びＢ＝６０％のＣＨ３ＣＮ／４０％のＡ（１％のＢ／分の濃度勾配で））を使用するＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。２１４ｎｍでの検出。モノ同位体の実測された［Ｍ＋Ｈ］＋を、計算されたｍ／ｚモノ同位体質量と比較した。
【０１１２】
薗頭反応（Ｃ≡Ｃカップリング）［２６］のための一般的手順
【化１６】
2014518854.tif 000030
樹脂支持基材上で交差カップリング反応を行うための最適条件は以下のとおりである：［パラ−ヨード−Ｐｈｅ４］ＵＲＰ−ペプチド−樹脂（１当量）、アルキン誘導体（３当量）、Ｃｕｌ（０．１当量）及びＴＥＡ（３当量）を脱気したＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ）に加えた。混合物をアルゴンで１０〜１５分間にわたって泡立て、その後ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．１当量）及びＰＣｙ３（０．３当量）を反応混合物に加えた。反応を４０℃で１２〜２４時間の範囲の時間にわたって撹拌した。引き続いて樹脂を濾過し、ＤＭＦ（×３）、Ｈ２Ｏ（×３）、ＭｅＯＨ（×２）、ＤＭＦ（×３）、及びＤＣＭ（×３）の連続的洗浄後、ペプチド−樹脂を切断し、環化し、以下に記載される手順に従って精製した。
【０１１３】
ヘック反応（Ｃ＝Ｃカップリング）［２９］のための一般的手順
【化１７】
2014518854.tif 000031
樹脂支持基材上で交差カップリング反応を行うための最適条件は以下のとおりである：［パラ−ヨード−Ｐｈｅ４］ＵＲＰ−ペプチド−樹脂（１当量）、トリフェニルホスフィン（１当量）、アルケン誘導体（２当量）を脱気したＤＭＦ／水／ＴＥＡ（８５：１０：５、ｖ／ｖ／ｖ）に加えた。混合物をアルゴンで１０〜１５分間にわたって泡立て、その後Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．３当量）を反応混合物に加えた。反応を６０℃で１２〜２４時間の範囲の時間にわたって撹拌した。引き続いて樹脂を濾過し、ＤＭＦ（×３）、Ｈ２Ｏ（×３）、ＭｅＯＨ（×２）、ＤＭＦ（×３）、及びＤＣＭ（×３）の連続的洗浄後、ペプチド−樹脂を切断し、環化し、以下に記載される手順に従って精製した。
【０１１４】
ペプチド切断、環化及び精製：全てのペプチドは、１，２−エタンジチオール（２．５％）、水（２．５％）及びトリ−イソプロピルシラン（１％）を含有するＴＦＡで、室温で１．５時間処理することによって、同時側鎖脱保護と共に、樹脂支持体から切断した。ジエチルエーテルで沈殿された粗ペプチドを、７０％の酢酸中に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、次いで、ヨウ素（メタノール中１０％溶液）の添加によって安定した橙色が出現するまで、環化した。更に３０分後に、アスコルビン酸を添加して、過剰の要素を反応停止させた。凍結乾燥した粗ペプチドを、Ｂの基線パーセンテージから２分毎１％のＢの増加の線形濃度勾配（溶出液Ａ＝Ｈ２Ｏ、０．１％のＴＦＡ、溶出液Ｂ＝６０％のＭｅＣＮ／４０％のＡ、０．１％のＴＦＡ）を使用するプレパラティブ逆相ＨＰＬＣプロトトルを用いて精製した。精製フラクションの均一性を、α−シアノヒドロキシシンナミン酸をマトリクスとして使用する線形モードで、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び質量スペクトル法によって判定した。生成物を含有する純粋なフラクション（＞９５％）をプールし、凍結乾燥した。
【０１１５】
放射性標識化ＵＲＰ誘導体の調製のための一般的手順
ペプチドを、Ｂｏｃ化学を使用する標準的固相ペプチド合成を用いて、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＣＭ樹脂上に手動合成した。主鎖アセンブリをＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡで介在させ、カップリング完了を、Ｋａｉｓｅｒテスト（ニンヒドリン）により判定した。樹脂の最初の置換を基準にして、３倍過剰量の保護アミノ酸を使用し、ＴＦＡ−仲介脱保護を介して、Ｂｏｃ除去を達成した。キレート剤部分の係留を容易にするために、Ｌｙｓ誘導体をＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨとして導入した。次いで、ペプチド樹脂をアニソール（５〜１０％、ｖ／ｖ）の存在下で、無水ＨＦで０℃にて１．５時間処理した。真空下でＨＦを除去後、粗ペプチドを、過酸化物フリーのジエチルエーテルで洗浄し、６０％のアセトニトリル／水中０．１％のＴＦＡで抽出した。凍結乾燥後に、直交保護されたペプチドを、前述のように環化し、プレパラティブＲＰ−ＨＰＬＣ及び２種の連続性溶媒系（溶出液Ａ：ｐＨ２．２５でのＴＥＡＰ及び０．１％のＴＦＡ、溶出液Ｂ：６０％のアセトニトリル／Ａ）を使用して精製した。精製ペプチドを、α−シアノ−４−ヒドロキシシンナミン酸をマトリクスとして用いる、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ上の分析ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって特性評価した。ＤＯＴＡ−、ＤＴＰＡ−、又はＮＯＴＡ−ベースのキレート剤の錯体形成は以下の通りになされた：ＤＭＦ中キレート剤−ＮＨＳエステル（２当量）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３当量）の溶液を、乾燥ＤＭＦ中のペプチド溶液に添加した。混合物を室温で撹拌し、反応の進行を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣで追った。反応の完了（一般的に３時間後に観察される）後に、プレパラティブＲＰ−ＨＰＬＣ生成を実施し、ペプチド結合類縁体を産生した。各フラクションの均一性を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定した。Ｆｍｏｃ基の除去は、２０分間の塩基分解性処理（ＤＭＦ中２０％のピペリジン）を通して達成した。水中で希釈後、ペプチドを先に記載の通りに、再度精製し、分析した。
【０１１６】
ＤＯＴＡ−［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ；（ＤＯＴＡ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｂｉｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＯＨ）；純度≧９８％；Ｍｓ計算値：１４３９．６；Ｍｓ実測値：１４４１．１。純度パーセンテージは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（０．２１×１５ｃｍ、粒径５μｍ、孔径３００Å）上、１ｍｌ／分の流速で、緩衝液系（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．０６％のＴＦＡ（ｐＨ２．５）及びＢ＝６０％のＣＨ３ＣＮ／４０％のＡ（１％のＢ／分の濃度勾配で））を使用するＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。２１４ｎｍでの検出。モノ同位体の実測されたｍ／ｚを、計算された［Ｍ＋Ｈ］＋モノ同位体質量と比較した。
【０１１７】
ＮＯＴＡ−［Ｂｉｐ４］ＵＲＰ；（ＮＯＴＡ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｂｉｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＯＨ）；純度≧９８％；Ｍｓ計算値：１３３８．６；Ｍｓ実測値：１３３９．５。純度パーセンテージは、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（０．２１×１５ｃｍ、粒径５μｍ、孔径３００Å）上、１ｍｌ／分の流速で、緩衝液系（Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．０６％のＴＦＡ（ｐＨ２．５）及びＢ＝６０％のＣＨ３ＣＮ／４０％のＡ（１％のＢ／分の濃度勾配で））を使用するＰＲ−ＨＰＬＣにより決定した。２１４ｎｍでの検出。モノ同位体の実測されたｍ／ｚを、計算された［Ｍ＋Ｈ］＋モノ同位体質量と比較した。
【０１１８】
本明細書は、その適用において、先に記載されるような構成及び部品の詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書は、他の実施形態も可能であり、種々の方法で実行され得る。本明細書に使用される専門語及び技術用語は、説明の目的のためのものであり、限定するものではないことも理解される。従って、本発明はその例示的実施形態として、上記で説明されてきたが、これは添付の特許請求の範囲で定義されるような主題となる開示内容の精神、範囲及び性質から逸脱することなく修正され得る。
【０１１９】
参考文献
１．Ｒｏｓｓ  Ｂ，  ＭｃＫｅｎｄｙ  Ｋ，  Ｇｉａｉｄ  Ａ．  （２０１０）．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９８（５）：  Ｒ１１５６−１１７２．
２．Ｖａｕｄｒｙ  Ｈ．；  Ｄｏ  Ｒｅｇｏ，  Ｊ．  Ｃ．；  Ｌｅ  Ｍｅｖｅｌ  Ｊ．  Ｃ．；  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．；  Ｔｏｓｔｉｖｉｎｔ  Ｈ．；  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ａ．；  Ｔｏｎｏｎ  Ｍ．  Ｃ．；  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｇ．；  Ｃｏｎｌｏｎ  Ｊ．  Ｍ．；  Ｌｅｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ，  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１０，  １２００，  ５３−６６．
３．Ｄｏｕｇｌａｓ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｏｈｌｓｔｅｉｎ  Ｅ．  Ｈ．  （２０００）．  Ｈｕｍａｎ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ，  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｄａｔｅ，  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  １０（６）：  ２２９−２３７．
４．Ｓｕｇｏ  Ｔ．，  Ｍｏｒｉ  Ｍ．  （２００８）．  Ａｎｏｔｈｅｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｉｓｈｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １４．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２９（５）：  ８０９−８１２．
５．Ｃａｍａｒｄａ，  Ｖ．；  Ｇｕｅｒｒｉｎｉ，  Ｒ．；  Ｋｏｓｔｅｎｉｓ，  Ｅ．；  Ｒｉｚｚｉ，  Ａ．；  Ｃａｌｏ，  Ｇ．；  Ｈａｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ａ．；  Ｚｕｃｃｈｉｎｉ，  Ｍ．；  Ｓａｌｖａｄｏｒｉ，  Ｓ．；  Ｒｅｇｏｌｉ，  Ｄ．  Ａ  ｎｅｗ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２，  １３７，  ３１１−４．
６．Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．，  Ｄｕｂｅｓｓｙ  Ｃ．，  Ｌｅｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．，  Ｂｏｕｌａｒａｎ  Ｃ．，  Ｃａｒｌｉｅｒ  Ｌ．，  Ｓｅｇａｌａｓ−Ｍｉｌａｚｚｏ，  Ｉ．，  Ｇｕｉｌｈａｕｄｉｓ，  Ｌ．，  Ｏｕｌｙａｄｉ，  Ｈ．，  Ｄａｖｏｕｓｔ  Ｄ．，  Ｓｃａｌｂｅｒｔ  Ｅ．，  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  Ｂ．，  Ｒｅｎａｒｄ，  Ｐ．，  Ｔｏｎｏｎ  Ｍ．  Ｃ．，  Ｌｉｈｒｍａｎｎ  Ｉ．，  Ｐａｃａｕｄ  Ｐ．，  Ｖａｕｄｒｙ  Ｈ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００４，  ２５，  １８１９−１８３０．
７．Ｌａｂａｒｒｅｒｅ  Ｐ．，  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．，  Ｌｅｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．，  Ｍａｒｉｏｎｎｅａｕ  Ｃ．，  Ｌｏｉｒａｎｄ  Ｇ．，  Ｔｏｎｏｎ  Ｍ．  Ｃ．，  Ｄｕｂｅｓｓｙ  Ｃ．，  Ｓｃａｌｂｅｒｔ  Ｅ．，  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  Ｂ．，  Ｒｅｎａｒｄ  Ｐ．，  Ｃａｌａｓ  Ｂ．，  Ｐａｃａｕｄ  Ｐ．，  Ｖａｕｄｒｙ  Ｈ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｎ  ｒａｔ  ａｏｒｔｉｃ  ｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００３，  １８，  ７７−８８．
８．Ｂｒｋｏｖｉｃ  Ａ．，  Ｈａｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ａ．，  Ｋｏｓｔｅｎｉｓ  Ｅ．，  Ｋｌａｂｕｎｄｅ  Ｔ．，  Ｆｌｏｈｒ  Ｓ．，  Ｋｕｒｚ  Ｍ．，  Ｂｏｕｒｇａｕｌｔ  Ｓ．，  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ａ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓａｙ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００３，  ３０６，  １２００−９．
９．Ｌｅｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．；  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．；  Ｄｕｂｅｓｓｙ  Ｃ．；  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ａ．；  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  Ｂ．；  Ｓｃａｌｂｅｒｔ  Ｅ．；  Ｒｅｎａｒｄ  Ｐ．；  Ｐａｃａｕｄ  Ｐ．；  Ｏｕｌｙａｄｉ  Ｈ．；  Ｓｅｇａｌａｓ−Ｍｉｌａｚｚｏ  Ｉ．；  Ｇｕｉｌｈａｕｄｉｓ  Ｌ．；  Ｄａｖｏｕｓｔ  Ｄ．；  Ｔｏｎｏｎ  Ｍ．  Ｃ．；  Ｖａｕｄｒｙ  Ｈ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ＵＲＰ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００８，  ２９，  ６５８−７３．
１０．Ｋｒｕｍ  Ｈ．，  Ｋｅｍｐ  Ｗ．  （２００７）．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｐ  ９（１）：  ５３−５８．
１１．Ｗａｔｓｏｎ  Ａ．  Ｍ．，  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｇ．  Ｗ．，  Ｓｍｉｔｈ  Ｋ．  Ｊ．，  Ｍａｙ  Ｃ．  Ｎ．  （２００３）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｃｔｓ  ｃｅｎｔｒａｌｌｙ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ  ａｎｄ  ＡＣＴＨ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｏｎｓ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４２（３）：  ３７３−３７９．
１２．Ｓｏｎｇ  Ｗ．，  Ａｂｄｅｌ−Ｒａｚｉｋ  Ａ．  Ｅ．，  Ｌｕ  Ｗ．，  Ａｏ  Ｚ．，  Ｊｏｈｎｓ  Ｄ．  Ｇ．，  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｓ．  Ａ．  （２００６）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６９（８）：  １３６０−１３６８．
１３．Ｄａｉ  Ｈ．  Ｙ．，  Ｋａｎｇ  Ｗ．  Ｑ．，  Ｗａｎｇ  Ｘ．，  Ｙｕ  Ｘ．  Ｊ．，  Ｌｉ  Ｚ．  Ｈ．，  Ｔａｎｇ  Ｍ．  Ｘ．  （２００７）．  Ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ１  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  １４０（１−２）：  ８８−９３．
１４．Ｚｈａｎｇ  Ｙ．  Ｇ．，  Ｌｉ  Ｊ．，  Ｌｉ  Ｙ．  Ｇ．，  Ｗｅｉ  Ｒ．  Ｈ．  （２００８）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ａｏｒｔａ．  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  ２６（６）：  １１１９−１１２６．
１５．Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｙ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ．，  Ｓｕｇｕｒｏ  Ｔ．，  Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｍ．，  Ｋａｔｏ  Ｒ．，  Ｈｏｎｇｏ  Ｓ．  （２００８）．  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｆｏａｍ  ｃｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  ２６（１０）：  １９５５−１９６５．
１６．Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｐ．，  Ｂｏｕｓｅｔｔｅ  Ｎ．，  Ｇｉａｉｄ  Ａ．  （２００８）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２９（５）：  ７６４−７６９．
１７．Ｇｕｉｄｏｌｉｎ  Ｄ．，  Ａｌｂｅｒｔｉｎ  Ｇ．，  Ｒｉｂａｔｔｉ  Ｄ．  （２０１０）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ  ａｓ  ａｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３１（６）：  １２１９−１２２４．
１８．Ｓｉｌｖｅｓｔｒｅ  Ｒ．  Ａ．，  Ｅｇｉｄｏ  Ｅ．  Ｍ．，  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｒ．，  Ｌｅｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．，  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．，  Ｔｏｌｌｅｍｅｒ  Ｈ．  （２００４）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５１（６）：  ８０３−８０９．
１９．Ｊａｒｒｙ  Ｍ．，  Ｄｉａｌｌｏ  Ｍ．，  Ｌｅｃｏｉｎｔｒｅ  Ｃ．，  Ｄｅｓｒｕｅｓ  Ｌ．，  Ｔｏｋａｙ  Ｔ．，  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．  （２０１０）．  Ｔｈｅ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４２８（１）：  １１３−１２４．
２０．Ｐｒｏｓｓｅｒ  Ｈ．  Ｃ．，  Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｍ．  Ｅ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ａ．  Ｍ．，  Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  Ｃ．  Ｊ．  （２００８）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｎｄ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＵＲＰ）  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２９（５）：  ７７０−７７７．
２１．Ｄｏａｎ  Ｎ．  Ｇ．，  Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔ．  Ｔ．  Ｍ．，  Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  Ｍ．，  Ｔｕｒｃｏｔｔｅ  Ｋ．，  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ａ．，  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．  （２０１１）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅａｒｔ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ：  １６６（１）：２４３．
２２．Ｈｉｒｏｓｅ  Ｔ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ．，  Ｍｏｒｉ  Ｎ．，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｔ．，  Ｋｉｋｕｙａ  Ｍ．，  Ｏｈｋｕｂｏ  Ｔ．  （２００９）．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ，  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｓ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３０（６）：  １１２４−１１２９．
２３．Ｍａｒｙａｎｏｆｆ  Ｂ．  Ｅ．，  Ｋｉｎｎｅｙ  Ｗ．  Ａ．  （２０１０）．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｕｇｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５３（７）：  ２６９５−２７０８．
２４．Ｂｅｈｍ  Ｄ．  Ｊ．，  Ｈｅｒｏｌｄ  Ｃ．  Ｌ．，  Ｏｈｌｓｔｅｉｎ  Ｅ．  Ｈ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｓ．  Ｄ．，  Ｄｈａｎａｋ  Ｄ．，  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｓ．  Ａ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＢ−７１０４１１  （Ｃｐａ−ｃ［Ｄ−Ｃｙｓ−Ｐａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ］−Ｃｐａ−ａｍｉｄｅ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｉｃ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２，  １３７，  ４４９−５８．
２５．Ｈａｓｓａｎ  Ｇ．  Ｓ．，  Ｃｈｏｕｉａｌｉ  Ｆ．，  Ｓａｉｔｏ  Ｔ．，  Ｈｕ  Ｆ．，  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｓ．Ａ．，  Ａｏ  Ｚ．，  （２００３）．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｃａｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８１（２）：  １２５−１２８．
２６．Ｓｕｇｏ  Ｔ．，  Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｙ．，  Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｙ．，  Ｈａｒａｄａ  Ｍ．，  Ａｂｅ  Ｍ．，  Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｙ．  （２００３）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ｔｈｅ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１０（３）：  ８６０−８６８．
２７．Ｄｏａｎ  Ｎ．  Ｄ．，  Ｂｏｕｒｇａｕｌｔ  Ｓ．，  Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  Ｍ．，  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  Ａ．  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｚｕｋｉ−Ｍｉｙａｕｒａ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  ２００８，  １０，  ４４−５１．
２８．Ｈｏｆｆｍａｎｎｓ  Ｕ．，  Ｍｅｔｚｌｅｒ−Ｎｏｌｔｅ  Ｎ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  “ｔｗｏ−ｓｔｅｐ”  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２００６，  １７，  ２０４−１３．
２９．Ｋｏｄａｍａ  Ｋ．，  Ｆｕｋｕｚａｗａ  Ｓ．，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｈ．，  Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋ．，  Ｋｉｇａｗａ  Ｔ．，  Ｙａｂｕｋｉ  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｎ．，  Ｓｈｉｒｏｕｚｕ  Ｍ．；  Ｔａｋｉｏ  Ｋ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ．，  Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｋ．  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｏｒｇａｎｏｐａｌｌａｄｉｕｍ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２００７，  ８，  ２３２−８．
３０．Ｂａｔｕｗａｎｇａｌａ  Ｍ．，  Ｃａｍａｒｄａ  Ｖ．，  ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｊ．，  Ｍａｒｚｏｌａ  Ｅ．，  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｄ．  Ｇ．，  Ｎｇ  Ｌ．  Ｌ．，  Ｃａｌｏ  Ｇ．，  Ｒｅｇｏｌｉ  Ｄ．，  Ｔｒａｐｅｌｌａ  Ｃ．，  Ｇｕｅｒｒｉｎｉ  Ｒ．，  Ｓａｌｖａｄｏｒｉ  Ｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ｔｙｒ９  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ（４−１１）：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＴ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００９，  ３０，  １１３０−６．
３１．Ｇｅｎｄｒｏｎ  Ｇ．，  Ｇｏｂｅｉｌ  Ｆ．，  Ｊｒ．；  Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｓ．，  Ｇａｇｎｏｎ  Ｓ．，  Ｒｅｇｏｌｉ  Ｄ．，  Ｄ’Ｏｒｌｅａｎｓ−Ｊｕｓｔｅ  Ｐ．  Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ  （Ｗｋｙ）  ａｎｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  （Ｓｈｒ）  ｒａｔｓ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００５，  ２６，  １４６８−７４．
３２．Ｄｕｂｅｓｓｙ  Ｃ．；  Ｃａｒｔｉｅｒ  Ｄ．；  Ｌｅｃｔｅｚ  Ｂ．；  Ｂｕｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ．；  Ｃｈａｒｔｒｅｌ  Ｎ．；  Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｈａｄｊａｄｊｅ  Ｍ．；  Ｂｉｚｅｔ  Ｐ．；  Ｃｈａｔｅｎｅｔ  Ｄ．；  Ｔｏｓｔｉｖｉｎｔ  Ｈ．；  Ｓｃａｌｂｅｒｔ  Ｅ．；  Ｌｅｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．；  Ｖａｕｄｒｙ  Ｈ．；  Ｊｅｇｏｕ  Ｓ．；  Ｌｉｈｒｍａｎｎ  Ｉ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ，  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ，  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＵＴ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ａｔ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２００８，  １０７，  ３６１−７４．
【図１】
2014518854.tif 000042
【図２】
2014518854.tif 000043
【図３】
2014518854.tif 000044
【図４】
2014518854.tif 000045
【図５】
2014518854.tif 000046
【図６】
2014518854.tif 000047
【図７】
2014518854.tif 000048
【図８】
2014518854.tif 000049
【図９】
2014518854.tif 000050
【図１０】
2014518854.tif 000051
【図１１】
2014518854.tif 000052
【国際調査報告】
2014518854.tif 000053
2014518854.tif 000054
2014518854.tif 000055