(57)【要約】本発明は、生物源由来の溶液から生体高分子を分離させるための高塩耐性のイオン交換材料としての使用のための、架橋されたスルホン化ポリマー、又は、アミノ基を含む架橋されたポリマーで被覆された架橋されたスルホン化ポリマーに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物源由来の溶液から高分子を分離するための、架橋されたスルホン化ポリマーの使用であって、
前記架橋されたスルホン化ポリマーが、スルホン化芳香族単位を含み、前記スルホン化芳香族単位が、置換されていないか又は脂肪族基によって置換され、前記スルホン化ポリマーの基本骨格に結合した状態で存在する使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記基本骨格が架橋されたポリビニル骨格である使用。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の使用であって、前記芳香族単位がフェニルスルホン酸基である使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用であって、前記架橋されたスルホン化ポリマーが、スルホン化ポリスチレン／ジビニルベンゼン共重合体である使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用であって、前記架橋されたスルホン化ポリマー架橋度が、０．５〜５０％である使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用であって、重合に用いられスルホン化されるすべてのモノマー単位に対する、スルホン酸基のモル数を基にした、スルホン化度が、１〜８０％である使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用であって、前記架橋されたスルホン化ポリマーが、樹脂粒子の形状で存在する使用。
【請求項８】
請求項７に記載の使用であって、前記樹脂粒子が、１〜１，０００μｍの平均粒子径を有する使用。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の使用であって、前記樹脂粒子が、１０〜４００ｎｍの範囲の平均孔径を有する孔を含む使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用であって、前記高分子がペプチドである使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用であって、前記ペプチドがインスリンである使用。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用であって、前記架橋されたスルホン化ポリマーが、アミノ基を含む架橋ポリマーで被覆されている使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、前記アミノ基を含むポリマーの架橋度が、５〜８０％である使用。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の使用であって、前記アミノ基を含む架橋ポリマーが、架橋されたポリビニルアミンである使用。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の使用であって、架橋に利用されるアミノ基の全てが、架橋後にアミンの状態で存在している使用。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の使用であって、前記高分子が、エンドトキシン、ＤＮＡ、又は、ＲＮＡである使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物資源由来の溶液から高分子を分離するための、架橋されたスルホン化ポリマー、又は、アミノ基を含む架橋されたポリマーで被覆された架橋されたスルホン化ポリマーの、高耐塩性のイオン交換材料としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換樹脂のクーロン相互作用は、クロマトグラフィーの精製工程にて最も用いられる相互作用である。イオン交換樹脂では、強酸（例えば、スルホン酸）、強塩基（例えば、第四級アミン）、弱酸（例えば、カルボン酸）。及び弱塩基（例えば、第一級または第三級アミン）といったイオン性基が、剛直な基材材料に、好ましくは共有結合で基として適用されている。これらのイオン性基は、精製される分子の相補的な官能基と相互作用し、この分子がイオン交換樹脂に結合する。イオン相互作用によって結合した標的分子の溶離は、従来、溶離剤における塩濃度の増加によって行われており、その結果、標的分子は、１種又はそれ以上の種の関連する塩イオンへ変化する。１５０ｍｍｏｌ／ｌの比較的低い塩濃度は、一般的に、クーロン相互作用を断ち切るために、また、標的分子を溶離させるために十分である。
【０００３】
分離される標的分子を含む混合物の起源により、塩濃度は、溶離液で一般的に採用される濃度よりも高くなっていることがある。このことは、高塩濃度の状況下にて標的分子がイオン交換樹脂に結合しないという欠点を有する。具体的には、発酵液、体液、又は植物抽出液といった生物源由来の溶液では、導電率（電気伝導度；塩濃度に関連する因子）が、イオン交換クロマトグラフィーの直接的な使用にとっては、通常、高すぎる。従って、混合物の導電率を下げる（塩濃度の低下）ために、好ましくない希釈工程がしばしば必要となる。
【０００４】
比較的高い塩濃度にて物質と結合できる有用で様々なイオン交換樹脂が知られている。それにも関わらず、今までに知られているどのイオン交換樹脂も、例えばインスリンといった生体高分子と、２５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム濃度以上にて、十分な付加能力で、結合できない。塩化ナトリウムは、原則として、本明細書では、単なる例として記載されているが、他の塩も、このモル量で存在し得る。さらに、今までに知られているイオン交換樹脂は、ｐＨ１〜１４の範囲全体にわたっては安定ではなく、従って、普遍的に採用されるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の課題は、生物源由来の溶液から直接的に高分子を分離する、高分子の分離方法を提供することである。さらには、イオン交換樹脂が、１〜１４のｐＨ範囲にて安定に使用されることが望ましい。塩濃度を下げるためにさらなる希釈工程を実施しないことを、イオン交換樹脂は、高耐塩性により、可能にするべきである。希釈工程を実施しないことは、さらなる希釈工程での溶媒の経費、及び、塩を含む混合物の精製における汚染物質のための操作の経費を下げるという利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した課題を達成するために、本願は、架橋されたスルホン化ポリマーの、生物資源由来の溶液から高分子を分離するための使用を提供し、架橋されたスルホン化ポリマーが、スルホン化された芳香族単位を含み、この芳香族単位が、基本骨格（主鎖）に結合し、置換されていないか又は脂肪族基によって置換されている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】イオン濃度を関数として、インスリンの付加量の測定によって、本発明を使用したイオン交換体、本発明を使用しないイオン交換体、従来の２つのイオン交換体を比較したグラフ。
【図２】本発明のアニオン交換材料に、発酵溶液を通した後の、時間に対する溶離液の吸光度のプロット。
【図３】イオン濃度を関数として、ＤＮＡの付加量の測定によって、本発明を使用したイオン交換体、本発明を使用しないイオン交換体、従来の２つのイオン交換体を比較したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
即ち、本願は、スルホン化された芳香族単位を含む架橋されたスルホン化ポリマーを用いて、生物資源由来の溶液から高分子を分離するため方法に関し、芳香族単位が、基本骨格（主鎖）に結合し、置換されていないか、又は、脂肪族基によって置換されている。
【０００９】
本発明では、高分子は、１０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きいか等しい分子量を有する分子として理解される。具体的には、高分子は、例えば、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡといった生体分子、多糖類、また、例えば、エンドドキシンといったリポ多糖類であることが好ましい。
【００１０】
“分離”との用語は、溶液から標的分子を単離／精製すること、及び、溶液から好ましくない分子を取り除き標的分子を精製溶液中に残存させること、の両方を意味するものとして理解される
【００１１】
架橋されたスルホン化ポリマーの基本骨格は、炭化水素を含有する繰り返し単位で構成された、どのような既知のポリマー基本骨格でもよい。
【００１２】
ポリマーの基本骨格は、ポリマーの主鎖を意味するものとして理解され、この主鎖には、スルホン化芳香族単位といった基が側鎖の態様で結合し得る。スルホン化芳香族単位に加えて、ポリマーは、さらなる側鎖をも含み、斯かる側鎖は、基本骨格として考慮されないが、上述したように、側鎖としてみなされる。即ち、基本骨格は、ポリマーの主鎖を形成し、主鎖における少なくとも２価の少なくとも２つの原子にさらに結合したすべての原子を包含する。上記の原子に結合する、水素原子のような単結合の原子は、同様に、基本骨格の原子としてみなされる。架橋されたスルホン化ポリマーが架橋されたポリスチレンである場合には、結合したビニル単位が基本骨格であり、スルホン化フェニル基が側鎖である。
【００１３】
炭化水素を含有する繰り返し単位は、炭素及び水素から主に構成されるがヘテロ原子を含まない、あり得る化合物を意味するものとして理解される。繰り返し単位のポリマーでの結合は、既知の重合工程によって達成される。フリーラジカル、カチオン、又はアニオンのオレフィン重合は、本発明では特に好ましい。基本骨格は、ポリビニル骨格であることが特に好ましい。架橋されたポリマーが形成されるように、基本骨格は、架橋された基本骨格であることが好ましい。具体的にポリビニル骨格である場合には、１つのビニル基を有するモノマーと、２つのビニル基を有するモノマーとの共重合によって、架橋が起こる。しかしながら、まず作られる直鎖状の基本骨格を有するポリマーも、原理的には考えられ得る。続く架橋は、架橋剤を用いて、側鎖の官能基の反応によって実施される。
【００１４】
本発明で用いられる、架橋されたスルホン化ポリマーは、側鎖にスルホン酸基を含むことが好ましい。本発明の、架橋されたスルホン化ポリマーの側鎖は、後に詳述するように、スルホン化芳香族単位である。スルホン化芳香族単位は、共有結合の一重結合によって基本骨格に結合していることが好ましい。さらに、スルホン化芳香族単位は、脂肪族基によって置換されていることが好ましい。スルホン化芳香族単位は、共有結合の一重結合によって、基本骨格の原子に直接結合していることが特に好ましい。
【００１５】
本発明では、芳香族単位は、置換されていないか又は脂肪族基によって置換されている、単環式又は多環式の芳香族環系を意味すると理解される。本発明と関連して、芳香族環系は、望ましくは、６〜６０の炭素原子、好ましくは６〜３０の炭素原子、より好ましくは６〜１０の炭素原子を有する芳香族環系を意味すると解される。これらの芳香族環系は、単環式又は多環式であってもよく、即ち、１つの環（例えば、フェニル）、又は２つ以上の環を有していてもよく、縮合していても（例えば、ナフチル）、又は、縮合していなくても（例えば、ビフェニル）よく、又は、縮合した環と、共有結合でつながった環とが組み合わさったものであってもよい。
【００１６】
好ましい芳香族環系は、例えば、フェニル、ビフェニル、トリフェニル、ナフチル、アントラシル、ビナフチル、フェナントリル、ジヒドロフェナントリル、ピレン、ジヒドロピレン、クリセン、ペリレン、テトラセン、ペンタセン、ベンツピレン、フルオレン、インデンである。特に好ましい芳香族環系は、フェニル、ビフェニル、ナフチルであり、フェニルがさらに好ましい。
【００１７】
上述したように、芳香族環系は、脂肪族基で置換されていてもよい。芳香族環系が１つの脂肪族基で置換されていることだけでなく、複数の脂肪族基で置換されていることがあり得る。脂肪族基は、１〜２０の又は１〜１０の炭素原子を有する炭化水素基であることが好ましい。本発明の脂肪族炭化水素基は、好ましくは、直鎖状、分岐鎖状、又は環状のアルキル基であり、このアルキル基では、１つ又は２以上（複数）の水素原子がフッ素に置き換わっていてもよい。１〜２０の炭化水素原子を有する脂肪族炭化水素基としては、下記のものが上げられる：メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル（1-メチルプロピル）、tert-ブチル、iso-ペンチル、n-ペンチル、tert-ペンチル（1,1-ジメチルプロピル）、1,2-ジメチルプロピル、2,2- ジメチルプロピル（ネオペンチル）、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、n-ヘキシル、iso-ヘキシル、1,2-ジメチルブチル、1-エチル-1-メチルプロピル、2-メチルブチル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチルブチル、1-メチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2-エチルヘキシル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル。脂肪族炭化水素基としては、メチル又はエチルが好ましい。
【００１８】
架橋されたスルホン化ポリマーのスルホン化芳香族単位としては、置換されていないか又は脂肪族基によって置換されているものであって、フェニルスルホン酸基又はその誘導体になるものが特に好ましい。フェニルスルホン酸基が誘導体である場合には、このことは、脂肪族基によって置換されている誘導体であることを意味する。この場合、フェニル基でのスルホン酸基は、基本骨格に結合したフェニル環の位置に対してパラ位であることが好ましい。本明細書では、脂肪族基は、メチル基又はエチル基であることが好ましく、このメチル基又はエチル基は、基本骨格に結合したフェニル環の位置に対して、フェニル基のオルト位及び／又はメタ位である。
【００１９】
しかしながら、スルホン化芳香族単位が置換されていないことが特に好ましい。具体的には、架橋されたスルホン化ポリスチレンが可能である。スルホン化ポリスチレンの架橋は、スチレンとジビニルベンゼンとを共重合し、続いて、フェニル基をスルホン化することによって実施することが好ましい。しかしながら、２つのビニル基を含む他の架橋剤も、架橋されたコポリマーの調製のために用いられてもよい。
【００２０】
本発明では、架橋されたスルホン化ポリマーの架橋度は、好ましくは０．５〜５０％、より好ましくは５〜４５％、最も好ましくは１０〜３５％である。本発明では、架橋度の百分率表示は、重合されるモノマー単位の総数に対する、２つのビニル基を含み採用される化合物のモル含量の百分率を意味すると理解される。
【００２１】
架橋されたスルホン化ポリマーのスルホン化度は、好ましくは１〜８０％、より好ましくは３〜６０％、最も好ましくは５〜４０％である。スルホン化度の百分率表示は、スルホン化され得る基を含み重合に用いられる全モノマー単位に対する、スルホン酸基のモル数に関連している。スルホン化され得る基を含み重合に用いられるモノマー単位は、スルホン化された芳香族単位を含む全てのモノマー単位と、スルホン化され得る基、好ましくは芳香族単位を含む全てのモノマー単位とを意味するものとして理解され、必要に応じて、スルホン化され得る基又はスルホン化された基を含むのであれば架橋を起こす全ての化合物を意味すると解される。架橋されたスルホン化ポリマーとしてスルホン化されたポリスチレン／ジビニルベンゼン  コポリマーが用いられる場合には、スルホン化度の百分率は、ポリマーに含まれる全てのフェニル基又はフェニレン基に対する、スルホン酸基の数に相当する。
【００２２】
本発明の工程にて、又は、本発明の使用にて用いられる架橋されたスルホン化ポリマーは、規則的に又は不規則に形成された樹脂粒子の形状で存在することが好ましい。本発明では、“規則的に形成”との用語は、面対称像、点対称像、線対称像、又はその組み合わせといった対照操作によって表すことができる形状を意味するものとして理解される。しかしながら、ダンベルとなるように互いにつながった２つの球体も、包含される。不規則な形状は、対照性を有さない崩れたような形状を意味すると解される。樹脂粒子は、好ましくは１〜１，０００μｍ、より好ましくは５〜１００μｍ、さらに好ましくは１０〜５０μｍの平均粒子径を有する。
【００２３】
本発明の工程にて、又は、本発明の使用にて用いられる架橋されたスルホン化ポリマーは、分離される物質と実際に相互作用を起こす孔を有することが好ましい。従って、多孔質ポリマー材料が好ましい。これらの孔は、６〜４００ｎｍの平均直径を有することが好ましく、３０〜１００ｎｍの平均直径を有することがさらに好ましい。孔の直径（孔径）は、逆相のサイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。ここで、試験される相の材料は、クロマトグラフィーカラムに充填され、一連の標準サイズのポリマーが注入される。溶離体積に対する、特定の標準分子量の対数プロットでの曲線から、孔径分布と、平均孔径とが、文献にて既知の方法によって測定できる。
【００２４】
架橋されたスルホン化ポリマーが、１〜３ｍｌ／ｇの範囲の孔容積を有することがさらに好ましい。孔容積は、水の吸収能の測定によって決定される。孔容積を決定するための溶媒（異なる溶媒は、異なる濡れ性を有することから、異なる結果をもたらす）は、乾燥重量を測定した相材料に加えられる。本発明の目的のためには、水がその溶媒として用いられる。過剰な溶媒は、濾過によって取り除かれ、遠心分離によって粒子間にあるさらなる溶媒が、相の材料から取り除かれる。材料は、さらに、再び秤量される。孔のみが未だ溶媒によって満たされている。孔容積は、満たされた孔と、空の孔と、溶媒の密度との間の重量差によって計算することができる。
【００２５】
本発明の工程にて、又は、本発明の使用にて用いられる架橋されたスルホン化ポリマーは、側鎖に芳香族単位を有する親油性基本骨格に加えて、スルホン酸基といったイオン化できる基をも含むという利点を有する。この点では、イオン性の相互作用及び親油性の相互作用の両方によって、高分子との相互作用が起こることが好適である。高分子のカチオンとイオン的に相互作用することができるアニオン性の−ＳＯ3-基として、スルホン酸基が作用することが好ましい。さらに、例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡといった生物源からの分子も、親油性領域を含み、この領域が、架橋されたスルホン化ポリマーの親油性基材としての芳香族単位と相互作用できる。この点では、イオン交換材料から高分子が溶離することを起こさせることなく、生物源由来である溶液であって、塩が１ｍｏｌ／ｌ以下の高塩含量の溶液を採用することが可能である。
【００２６】
本発明にて用いられる架橋されたスルホン化ポリマーは、好ましくは、カチオン性基を含む高分子の単離や精製のために採用される。高分子は、好ましくは、生体高分子である。生体高分子は、好ましくは、ペプチドである。ペプチドは、特に好ましくはインスリンである。即ち、好ましくは、本発明は、生物源由来の溶液からインスリンを精製又は単離するための、架橋されたスルホン化ポリマーの使用に関する。
【００２７】
架橋されたスルホン化ポリマーの製造は、例えば、英国特許ＧＢ１１１６８００及びＧＢ１４８３５８７の架橋されたスルホン化ポリマーの製造で知られているように、スルホン酸及び類似した材料を用いて、既に架橋されたポリマーをスルホン化することによって行うことが好ましい。架橋されたポリマーの製造は、公知技術であり、進歩性を要さずに、ポリマー化学分野の当業者によって実施される。
【００２８】
しかしながら、スルホン化は、下記のようにして行うことが特に好ましい：例えば、所望のスルホン化度に応じて、ポリスチレン／ジビニルベンゼンポリマーを、２〜１５％の水含量を有するスルホン酸及び水の混合液中にて、２０℃〜８０℃の温度で、１〜６時間、撹拌する。スルホン酸含量の増加、温度の上昇、反応時間の延長は、それ自体がそれぞれスルホン化度の増大を導く。これら３つのパラメーター全てを調整することにより、所望のスルホン化度を、比較的正確に達成することができる。反応後、ポリマーを希薄なスルホン酸及び水で洗浄する。
【００２９】
本発明では、架橋されたスルホン化ポリマーが、アミノ基を含む架橋されたポリマーで被覆されることも好ましい。
【００３０】
アミノ基を含む架橋されたポリマーの基本骨格は、上記の架橋されたスルホン化ポリマーと同様であることが好ましい。従って、基本骨格は、ポリビニル骨格であることが特に好ましい。このポリビニル骨格では、アミノ基が、共有結合の一重結合によって基本骨格の原子に直接結合していることが好ましい。
【００３１】
本発明では、アミノ基は、第一級、第二級、第三級、又は第四級アミノ基、また、アミジン基やグアニジン基を意味するものとして理解される。しかしながら、アミノ基を含む架橋されたポリマーは、架橋されたポリビニルアミンであることが特に好ましい。
【００３２】
アミノ基を含む架橋されたポリマーの架橋は、第一級又は第二級のアミノ基を含む直鎖状ポリマーと、アミノ基と２つの末端にて共有結合を形成できる架橋剤とを反応させることによって行うことが好ましい。原則として、考えられるいかなる架橋剤も、架橋のために用いることができる。しかしながら、本発明では、架橋に利用された全てのアミノ基が、架橋後でもなおアミノ基の状態で存在する架橋剤が、特に好ましく採用される。このように、プロトン化／アルキル化されることにより、アミノ基がなおもカチオン性イオン交換基としてはたらくことができることが確保される。これにより、他の親油性基材のうえでイオン交換基が高い密度を有することとなる。架橋後に、予め第一級又は第二級であったアミノ基は、第二級又は第三級のアミノ基として存在することとなる。
【００３３】
アミノ基に正電荷を与えるために、アミノ基をプロトン化させることができる。しかしながら、これの代替として、第一級、第二級、第三級のアミノ基を、アルキル化試薬を用いたトリ、ジ、若しくはモノアルキル化によって、第四級アンモニウムイオンへ変化させることができる。
【００３４】
アミノ基を含む架橋されたポリマーの架橋度は、好ましくは５〜８０％の範囲、特に好ましくは６〜６０％の範囲、最も好ましくは１０〜４０％の範囲である。百分率の値は、架橋していないポリマーの総アミノ基に対する、架橋に利用されたアミノ基の数に相当する。
【００３５】
架橋されたスルホン化ポリマーに対する、アミノ基を含む架橋されたポリマーの重量比は、０．０５〜０．３の範囲にあることが好ましく、０．０８〜０．２５の範囲にあることがより好ましく、０．１１〜０．２０の範囲にあることが最も好ましい。
【００３６】
アミノ基を含む架橋されたポリマーは、層状／被覆膜の態様で、架橋されたスルホン化ポリマーのうえに存在することが好ましい。架橋されたスルホン化ポリマーは、樹脂粒子の形状で用いられ、アミノ基を含む未架橋ポリマーで被覆され、そして、架橋剤で架橋されることが好ましい。このようにして、アミノ基が高濃度であることは、基材の親油性能がこの操作によって完全に失われることなく、表面にて実現できる。高分子のアニオン性基と相互作用できるイオン交換樹脂は、アミノ基のプロトン化／アルキル化によって、提供される。さらに、親油性基材も、高分子との親油的な相互作用を受ける。
【００３７】
スルホン化ポリマーの表面に存在する、アミノ基を含む架橋されたポリマーは、スルホン化ポリマーの樹脂粒子の孔にて、沈着していることが好ましく、即ち、アミノ基を含む架橋されたポリマーは、スルホン化ポリマーの孔に存在することが好ましい。
【００３８】
アミノ基を含む架橋されたポリマーは、好ましくは２０，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、より好ましくは３０，０００〜４６，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有する。
【００３９】
溶液を精製し、ＤＮＡやＲＮＡがない標的分子を溶液から単離できるように、ＤＮＡやＲＮＡといった高分子は、上記のカチオン性イオン交換樹脂によって溶液から取り除かれることが特に好ましい。
【００４０】
最初は、高分子がイオン交換樹脂に結合して留まり、そして、溶液がほぼエンドトキシンのない状態で存在するように、エンドトキシンなどの高分子が、本発明のイオン交換樹脂（アニオン交換）によって溶液から取り除かれることは、同様に好ましい。このようにして元の溶液にエンドトキシンがなくなってさらに用いられてもよく、また、適当な溶液によってイオン交換樹脂からの溶離によってエンドトキシンを得てもよい。エンドトキシンは、生化学物質群の１つを意味するものと理解される。エンドトキシンは、ヒトにおける様々な生理的な反応を引き起こす、バクテリアの分解生成物である。エンドトキシンは、グラム陰性菌又は藍藻類の細胞外膜（ＯＭ＝outer membrane）の構成成分である。エンドトキシンは、化学的には、親水性多糖類成分と、親油性脂質とで構成されるリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンの起源となるバクテリアとは対照的に、エンドトキシンは、熱に非常に安定であり、殺菌処理に耐性を有する。現状では、最も感度の良好なエンドトキシンの測定方法は、カブトガニ（Limulus polyphemus）から単離されたアメーバ様細胞溶解物（amoebocytes）の溶解物における凝固カスケード反応の活性化によって、機能する。この試験は、ＬＡＬ試験として一般的に知られている。
【００４１】
上述したように、本発明の高分子は、生物源由来である。この高分子は、好ましくは１，０００〜０．２ｋＤａの範囲、より好ましくは５００〜１ｋＤａの範囲、最も好ましくは３００〜５ｋＤａの範囲の分子量を有する。
【００４２】
生物源由来の溶液は、例えば、発酵もしくは発酵工程によって得られる溶液、体液、又は、植物抽出液を意味するものとして理解され、これら溶液は、好ましくは０．１ｍＳ／ｃｍ〜１２０ｍＳ／ｃｍの範囲、より好ましくは１〜６０ｍＳ／ｃｍの範囲、最も好ましくは１０〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン導電性を有する。好ましくは、これらの溶液は、水溶液である。これらの溶液は、１．２ｍｏｌ／ｌの塩含有量であることが好ましい。塩含有量は、好ましくは０．０１〜１．２ｍｏｌ／ｌの範囲、より好ましくは０．０５〜１．０ｍｏｌ／ｌの範囲、最も好ましくは０．２５〜０．６ｍｏｌ／ｌの範囲である。本発明では、塩は、生体液体中に好ましくは存在する、無機塩や有機塩といったあらゆる塩を意味するものとして理解される。これらの溶液は、生物源から直接得られて用いられる溶液だけでなく、所定の方法でいったん処理された溶液も意味すると理解される。この“処理”は、本発明の使用の前に、例えば、ｐＨを変えることや物質を分離除去することなどの方法により、事前処理された溶液を意味するものとして理解される。
【００４３】
イオン導電率は、本発明では、Greisinger社のＧＭＨ  ３４３０型導電率測定器によって測定される。
【００４４】
本発明で使用される架橋されたスルホン化ポリマー、又は、アミノ基を含む架橋ポリマーの層で被覆された架橋されたスルホン化ポリマーに対しては、さらなる希釈操作や透析により予め溶液を希釈することなく、非常に高い塩含量の溶液からの生体高分子を結合させることができる。このようにして、本発明は、生体高分子、好ましくはインスリン、モノクローナル抗体、ＤＮＡ、又はＲＮＡの精製のための、安価な工程／安価な使用を提供する。さらに、用いられるイオン交換材料は、生物源由来の液体において起こり得るｐＨ１〜１４の全範囲にて採用できるという利点を有する。
【００４５】
加えて、本発明は、さらなる実施形態にも関連する：
（ｉ）スルホン化芳香族単位を含む架橋されたスルホン化ポリマーを用いて、生物源由来の溶液から高分子を分離する方法であって、
スルホン化芳香族単位が、置換されていないか又は脂肪族基によって置換され、スルホン化ポリマーの基本骨格に結合している。
（ｉｉ）実施形態（ｉ）の方法であって、基本骨格が架橋されたポリビニル骨格である。
（ｉｉｉ）実施形態（ｉ）又は（ｉｉ）の方法であって、芳香族単位がフェニルスルホン酸基である。
（ｉＶ）実施形態（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの方法であって、架橋されたスルホン化ポリマーがスルホン化ポリスチレン／ジビニルベンゼン共重合体（コポリマー）である。
（ｖ）実施形態（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの方法であって、架橋されたスルホン化ポリマー架橋度が、０．５〜５０％である。
（ｖｉ）実施形態（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの方法であって、重合に用いられスルホン化されるすべてのモノマー単位に対する、スルホン酸基のモル数を基にした、スルホン化度が、１〜８０％である。
（ｖｉｉ）実施形態（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの方法であって、架橋されたスルホン化ポリマーが、樹脂粒子の形状で存在する。
（ｖｉｉｉ）実施形態（ｖｉｉ）の方法であって、樹脂粒子が、１〜１，０００μｍの平均粒子径を有する。
（ｉｘ）実施形態（ｖｉｉ）又は（ｖｉｉｉ）の方法であって、樹脂粒子が、１０〜４００ｎｍの範囲の平均孔径を有する孔を含む。
（ｘ）実施形態（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれかの方法であって、高分子がペプチドである。
（ｘｉ）実施形態（ｘ）の方法であって、ペプチドがインスリンである。
（ｘｉｉ）実施形態（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれかの方法であって、架橋されたスルホン化ポリマーが、アミノ基を含む架橋ポリマーで被覆されている。
（ｘｉｉｉ）実施形態（ｘｉｉ）の方法であって、アミノ基を含むポリマーの架橋度が、５〜８０％である。
（ｘｉｖ）実施形態（ｘｉｉ）又は（ｘｉｉｉ）の方法であって、アミノ基を含む架橋ポリマーが、架橋されたポリビニルアミンである。
（ｘｖ）実施形態（ｘｉｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかの方法であって、架橋に利用されるアミノ基の全てが、架橋後にアミンの状態で存在している。
（ｘｖｉ）実施形態（ｘｉｉ）〜（ｘｖ）のいずれかの方法であって、アミノ基を含む架橋ポリマーに対する、架橋されたスルホン化ポリマーの重量比が、３〜２０の範囲である。
（ｘｖｉｉ）実施形態（ｘｉｉ）〜（ｘｖｉ）のいずれかの方法であって、高分子が、エンドトキシン、ＤＮＡ、又は、ＲＮＡである。
【００４６】
図面及び実施例を参照しつつ、以下に本発明について説明するが、本発明は、この保護範囲に限定されると解されるものではない。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）架橋されたスルホン化ポリマーを基にしたカチオン交換樹脂の製造
【００４８】
設定目標：ポリスチレン支持体Amberchrom XT 30（以前はローム＆ハース社、ダウケミカル社、から商業的に入手可能）の２０℃でのスルホン化
【００４９】
温度制御可能な２５０ｍｌ反応器に、１６５ｍｌの濃硫酸を入れた。スルホン酸に３０．０ｇの支持体材料を入れ、また、秤量瓶を２０ｍｌの濃硫酸で３回それぞれ洗浄した。支持体材料を入れた後、懸濁液を撹拌し、温度を２０℃に制御した。２時間の反応時間の後、懸濁液を反応器から取り出し、２つの１５０ｍｌシリンジに分けた。スルホン酸を吸引によって濾過し、続けて、２００ｍｌの希硫酸（６２％濃度）、１２５ｍｌの水、１７５ｍｌのメタノール、１２５ｍｌの水、最後に１７５ｍｌのメタノールで相を洗浄した。相を吸引によって乾燥し、そして、真空で５０℃にて乾燥した。
【００５０】
スルホン酸基の測定は、ＨＰＬＣカラム内にて、酢酸アンモニウムを付加させること、続いて、アンモニウム結合を溶離させること、インドフェノールブルーで検出することによって行った。スルホン酸の含有量が３７５μｍｏｌ／ｍｌとなった。この操作は、約１３％のスルホン化度に相当する。粒子径は、平均で３０μｍであった。粒子は、平均孔径が２２ｎｍであり、平均孔容積が１．２５ｍｌ／ｇである、粒子状であった。
【００５１】
（実施例２）アミノ基を含む架橋ポリマーで被覆された架橋されたスルホン化ポリマーを基にしたアニオン交換体の製造
【００５２】
ローム＆ハース社のAmberchrom CG1000Sをイオン交換材料の基材として用いた。この材料を、実施例１で説明したように、９８％濃度のスルホン酸で８０℃にて３時間スルホン化した。３０μｍの平均粒径を有し、２２〜２５ｎｍの平均孔径を有する粒子をこの操作によって得た。得られたスルホン化ポリスチレンの水吸収能又は孔容積は、乾燥させたスルホン化ポリスチレンを秤量し、同容量の水を加え、そして、過剰の水を遠心分離で取り除くことによって測定した。孔内の水は、この操作によってその位置に留まった。再度秤量した後、乾燥ポリスチレンの重量差から、孔の容積が約１．２〜１．３ｍｌ／ｇであると測定された。
【００５３】
ポリスチレンを被覆するために、３５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するポリビニルアミンを含むポリビニルアミン水溶液を用意した。ｐＨ値を９．５に調整した。ここで、ポリビニルアミンの量は、被覆されるポリスチレンの１５％であり、溶液の容積は、測定されたポリスチレンの孔体積の９５％であった。ポリビニルアミン溶液を、ポリスチレンとともに、密閉できるＰＥＴボトルに入れ、混合物を高振動で６時間、振動機の上で振動させた。これにより十分で完全な混合を確実に行った。この操作の後、ポリビニルアミン溶液自体をポリスチレンの孔へ導入させた。そして、ポリスチレンを５０℃にて一定重量になるまで真空乾燥器内で乾燥させた。ポリビニルアミンの架橋のために、被覆されたポリスチレンに、３倍容積量のイソプロパノールを吸収させ、ポリビニルアミンのアミノ基数に対して５％のジエチレングリコールジグリシジルエーテルを加えた。反応混合物を、５５℃にて６時間反応器中で撹拌した。その後、ガラス製吸引濾過器に移し替え、２倍容積のイソプロパノール、３倍容積の０．５Ｍ  ＴＦＡ溶液、２倍容積の水、４倍容積の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液、最後に、８倍容積の水で洗浄した。
【００５４】
（実施例３）実施例１で製造したカチオン交換体によるインスリンの精製
【００５５】
実施例１で製造した塩耐性のイオン交換体におけるインスリンの付加能力の測定は、５０ｍＭ乳酸を含む３０％イソプロパノールの溶液であってｐＨ３．５の１０ｍｇ／ｍｌインスリン溶液を用いて、様々なＮａＣｌ濃度にて、行った。付加能力は、１０％の破過（漏出］で測定し、２つの競合材料と比較した。結果を図１に示す。使用した比較材料は、市販されているイオン交換材料であり、メルク社の“Eshumo S”（ポリビニルエーテル、イオン容量が５０〜１００μｍｏｌ／ｍｌ）、及び、ＧＥヘルスケア社の“Source 30S”（ポリスチレン／ジビニルベンゼン、粒子径３０μｍ）である。
【００５６】
移動相のＮａＣｌ含量が２５０ｍＭであるときに、比較材料は、非常に低い能力のみ示し、もはや高塩含量で測定できない一方で、本発明で使用したイオン交換体は、１Ｍ  ＮａＣｌまで有意な能力を示した。これは、図１から明確に把握される。
【００５７】
（実施例４）実施例２で製造したアニオン交換樹脂を用いることによるＤＮＡの分離
【００５８】
発酵溶液からモノクローナル抗体を精製する工程の第１の操作は、溶液に含まれるＤＮＡを取り除くことである。これは、実施例２で製造されたアニオン交換体の相にわたって、発酵溶液を“濾過”することによって作用を発揮する。この操作では、ＤＮＡが相に結合し、これにより、定量的に通過した発酵溶液は、ほぼＤＮＡを失う。このために、実施例２で製造されたアニオン交換体を、２１．２ｍｌの容積の２７０×１０ｍｍカラムに充填し、まず、ｐＨ７．０の５００ｍＭ  ＮａＫＰＯ4、次に、ｐＨ７．０の５０ｍＭ  ＮａＫＰＯ4で平衡となるようにした。発酵溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、沈殿物をなくした。３００ｍｌの発酵液を、外部ポンプを用いてカラムに導入した。透過液、ｐＨ６．５の１Ｍ  ＮａＣｌでの溶離液、及び、１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄操作したものを回収した。
【００５９】
透過液と称した図２の分画は、ほとんどモノクローナル抗体のみを含み、ＤＮＡを含まなかった。しかしながら、ＤＮＡの溶離は、ＮａＯＨを利用したときのみ起こった。
【００６０】
透過液中、及び、培養液中のＤＮＡ含量を、メーカーの使用説明書に従って、ピコグリーン法によって測定した。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
ＤＮＡの９９．３％が相材料を超えていく濾過によって取り除かれた。結合したＤＮＡは、１Ｍ  ＮａＣｌ操作にて溶離されなかったが、１Ｍ  ＮａＯＨを用いた洗浄によってのみ溶離した。相のアミノ基が脱プロトン化され、ＤＮＡへの結合がもはや存在しないからである。
【００６３】
実施例２で製造したアニオン交換体の代わりとして、市販されている、アマシャムバイオサイエンス社のQ Sepharose FF 、及び、メルク社のFractogel TMAE も、実施例４の分離用材料として使用した。Q Sepharose FF 、及び、Fractogel TMAEと比較した、様々な塩含量での、界面容積の測定では、開発したイオン交換体の高い付加能力が、高い塩含量であっても生じた。
【００６４】
（実施例５）実施例２で製造されたアニオン交換樹脂を用いることによる、発酵溶液からのエンドトキシンの分離
【００６５】
エンドトキシンを含む発酵溶液を、実施例２で製造されたアニオン交換体の相を超えさせつつ“濾過”した。この操作では、エンドトキシンが相へ結合し、これにより、定量的に透過する発酵液のエンドトキシンがほぼなくなる。
このために、実施例２で製造されたアニオン交換体を、２１．２ｍｌ容積の２７０×１０ｍｍカラムへ充填した。発酵液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、沈殿物をなくした。３００ｍｌの発酵液を、外部ポンプを用いてカラムに導入した。
【００６６】
カラムからの透過液は、発酵液よりも、少なくとも９０％少ないエンドトキシンを含んでいた。エンドトキシン含量を検出するために、ＬＡＬ試験を採用した。このようにして、培養液のエンドトキシンの大部分をなくすことができた。そして、適当な溶離液を用いて、イオン交換体からエンドトキシンを流し出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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